(57)【要約】  本発明は、サンプルを分析し又は標的を検出する電子舌又は鼻用のセンサに関する。このセンサは、１つの表面に複数の感受性領域が位置する支持体を含んでなり、各感受性領域は、少なくとも１つのレセプターを含み、サンプルの少なくとも１つの構成成分又は少なくとも１つの標的と少なくとも１つのレセプターとの相互作用により生成される測定可能なシグナルを発信することができる。このセンサは、それぞれのレセプター組成が互いに異なる少なくとも３つの感受性領域を含み、感受性領域の少なくとも１つが少なくとも２つの異なるレセプターの混合物を含み、他の２つの感受性領域が各々該２つのレセプターの少なくとも１つを含むことを特徴とする。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのレセプターを各々含む複数の感受性領域がその１つの表面に存在する支持体を含んでなり、各感受性領域は、サンプルの少なくとも１つの構成成分又は少なくとも１つの標的と、少なくとも１つのレセプターとの相互作用により生成される測定可能なシグナルを発することができる、サンプルを分析し又は少なくとも１つの標的を検出する電子舌又は鼻センサであって、それぞれのレセプター組成が互いに異なる少なくとも３つの感受性領域を含んでなり、感受性領域の少なくとも１つは少なくとも２つの異なるレセプターの混合物を含み、他の２つの感受性領域が各々前記２つのレセプターの少なくとも１つを含むことを特徴とする電子舌又は鼻センサ。
【請求項２】
少なくとも２つの異なるレセプターの混合物を各々含む複数の感受性領域を含んでなり、異なるレセプターは各混合物中で同じであるが、感受性領域は、含まれている異なるレセプターの比率が互いに異なる、請求項１に記載の電子舌又は鼻センサ。
【請求項３】
感受性領域の少なくとも１つが少なくとも３つの異なるレセプターの混合物を含む、請求項１又は２に記載の電子舌又は鼻センサ。
【請求項４】
少なくとも３つの異なるレセプターの混合物を各々含む複数の感受性領域を含んでなり、異なるレセプターは各混合物中で同じであるが、感受性領域は、含まれている異なるレセプターの比率が互いに異なる、請求項１〜３のいずれか１つに記載の電子舌又は鼻センサ。
【請求項５】
少なくともセンサ中に存在する異なるレセプターの数の、単一レセプターを含む感受性領域を含んでなり、センサの異なるレセプターの各々が、単一レセプターを含む感受性領域の各々にそれぞれ含まれる、請求項１〜４のいずれか１つに記載の電子舌又は鼻センサ。
【請求項６】
全ての感受性領域が発するシグナルのプロフィールによって少なくとも１つの不良感受性領域の存在の同定が可能になるに十分な数の感受性領域を含んでなる、請求項１〜５のいずれか１つに記載の電子舌又は鼻センサ。
【請求項７】
サンプルを分析するための、請求項１〜６のいずれか１つに記載のセンサの使用。
【請求項８】
−  請求項１〜６のいずれか１項に記載のセンサをサンプルに接触させ；
−  センサの感受性領域が発するシグナルを測定し；
−  前の工程で測定したシグナルを、少なくとも１つの他のサンプルと接触させた後に同じセンサ又は第２の類似するセンサの感受性領域が独立して生成するシグナルと比較し；
−  分析サンプルを定性的に評価する
サンプルを分析する方法。
【請求項９】
−  前記センサをサンプルに接触させ；
−  センサの感受性領域が発するシグナルを測定し；
−  前の工程で測定したシグナルを、少なくとも１つのコントロールサンプルと接触させた後に同じセンサ又は第２の類似するセンサの感受性領域が独立して生成するシグナルと比較し；
−  分析サンプルを少なくとも１つのコントロールサンプルに関して定性的に評価する
請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
−  前記センサ又は類似する複数の前記センサを、複数のサンプルと接触させ；
−  各サンプルについてセンサの感受性領域が発するシグナルを測定し；
−  各サンプルについて測定したシグナルを互いに比較し；
−  各サンプルを、分析した全てのサンプルに関してカテゴリー分けする
請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
感受性領域が発するシグナルと少なくとも２つの他の感受性領域が発するシグナルとの比較により、センサの感受性領域の機能性を検証する工程を更に含んでなる、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの標的と相互作用すること又は相互作用しないことが意図される三次元構造体を被覆するためのレセプター混合物のレセプター組成を規定するための、請求項１〜６のいずれか１項に記載のセンサの使用。
【請求項１３】
−  標的を請求項１〜６のいずれか１項に記載のセンサと接触させ；
−  製造する三次元構造体の標的に対する所望の親和性と類似する親和性を示す強度のシグナルを発する感受性領域を特定し；
−  特定された感受性領域のものと類似するレセプター組成を有するレセプター混合物で三次元構造体を被覆する
ことを含んでなる、少なくとも１つの標的と相互作用すること又は相互作用しないことが意図される、レセプター混合物で被覆された三次元構造体を製造する方法。
【請求項１４】
各感受性領域が発するシグナルと少なくとも２つの他の感受性領域が発するシグナルとの比較により、センサの感受性領域の機能性を検証する工程を更に含んでなる、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、電子鼻又は舌の製造に有用なセンサ、及び流体サンプル、特に液体又は気体サンプルの分析のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
技術背景
バイオセンサは２つの別個のファミリーに分けることができる。
第１のファミリーには、１以上の特異的相互作用を利用した分析が含まれる。例として、酵素を利用するグルコースバイオセンサ、又は特異的で選択的な結合(DNA/DNA又は抗原/タンパク質など)を介してリガンドを認識するDNAチップ若しくはタンパク質チップタイプのマルチパラメータシステム(幾つかの感受性領域)を挙げてもよい。これらバイオチップは、広く使用され、単一レセプターから構成される感受性領域を介して関連情報を生成する。
【０００３】
バイオセンサの第２のファミリーは、「非特異的な」システムを含んでなる。この場合、単一レセプターを有する単一感受性領域を介して生成された情報は、解釈可能ではない。なぜならば、分析すべき媒体中の化合物とレセプターとの間の相互作用が既知ではないからである。更に、このタイプのセンサは特異性が低いため、種々のレセプター間の交差反応も観察され得る。したがって、各々が断片的情報を生成する１セットのレセプターが使用される：こうして、全情報によってディジタルフィンガープリントに匹敵するパターンが生成される。分析のためには、これらパターンを、以前の学習から得られたパターンと比較することができる。天然で使用されるプロセスとの類似性により、これらセンサはガス状媒体の研究に関しては「電子鼻」と、液状媒体の研究に関しては「電子舌」と呼ばれるようになった。
【０００４】
したがって、これら電子鼻又は舌は、各々が調べられる媒体と相互作用可能なレセプターから構成されるコーティングを有する１セットの独立した感受性領域から構成される。したがって、各感受性領域は、相互作用を(一般的には、当該相互作用により生じるシグナルの強度を測定することにより)定量するシステムと関連付けられていなければならない。現存しているものの全ての場合で、各感受性領域は、断片的情報を、隣接領域の情報とは独立して生成する。よって、ｎ個の感受性領域のマトリクスは、ｎ個の独立した断片的情報を生成し、このｎ個の断片的情報が、しばしばヒストグラムで表される、相互作用パターンを構築する。感受性領域の数は該領域で測定されるシグナル強度に関係する。
【０００５】
一般に、感受性領域は、分析される媒体に関して、異なる親和性、より一般的には異なる物理化学的性質を有するよう作製される(Turner & Magan(2004) Nature Reviews Microbiology 2:161-166)。最近になって、コンビナトリアルアプローチが出現し、ペプチドレセプターが感受性領域にグラフトされるようになった。この方法は、多数の異なるレセプターを容易に作成することが可能になる(Edwardsら(2007) J. Am. Chem. Soc. 129:13575-13583)。各感受性領域は唯一のタイプのペプチドを含み、生成される断片的情報は非依存性のままである。更に、図は点群(point clouds)の形態で示される。
【０００６】
したがって、このタイプの分析では、各々の断片的情報は、同じ価値を有し、重み付けを実行することは容易でない。したがって、このセンサは連続応答を提供しない。あいにく、これら電子舌又は鼻の分野において、依然としてこの物体の製造は複雑であり、相変わらず感受性領域の１つに欠陥が非常に頻繁に見られることが判明した。したがって、このセンサによる応答は歪められ、重み付けが可能でない(感受性領域が互いに独立している)場合には、生成されたパターンは解釈が困難となる。
【０００７】
更に、光学的読取により連続シグナルを生成する電子鼻タイプのセンサが、Di Nataleら(2009) Sensors & Actuators B 142:412-7に記載されている。このセンサは、透過性ポリマーで覆われた感受性色素層を含んでなる。次いで、分析すべき気体状化合物がポリマー中で拡散した後の色素の反応をカメラを用いて記録する。応答の連続性は、この場合には、レセプター自体ではなく、拡散層の性質によって提供される。このプロセスは、気体状化合物に応じた色素の反応能力により制限されたままである。したがって、このプロセスは、ポリマー中を拡散しない複雑な分子の分析には適用可能ではない。更に、感受性色素層は拡散層の下、すなわちポリマーの下に閉じ込められており、ポリマー障壁はセンサの動作に必要とされているので、このセンサのレセプターとサンプルとの間の直接相互作用は起こることができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、より一般的な適用のための、具体的には連続応答を生じることが可能な電子鼻又は舌タイプのセンサは、依然として、提供されるべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の説明
本発明は、具体的には、支持体を含んでなり、該支持体の複数の部分又は感受性領域上に２つの異なるレセプターの異なる比の混合物が固定されている電子舌又は鼻センサが、異なる感受性領域で該センサのレセプターと接触したサンプルの構成成分の相互作用で生成されたシグナルについて、非線形で、所与の化合物を特徴付けるに十分に複雑であるシグナル伝達プロフィールを示すことを本発明者らが予想外に証明したことに起因する。
【００１０】
シグナルの非線形性は、得られる情報量が、純粋なレセプターから構成される感受性領域で得られるものより多いことを示す。
とりわけ、感受性領域の数を増やすことで、本質的に連続するシグナル伝達プロフィールを得ることが可能になり、このことにより有利には欠陥のある感受性領域を検出して排除することができるようになる。
最後に、少数の異なるレセプターの混合物を使用することで、多数の異なる感受性領域の作成が可能になり、このことは、種々のレセプターの開発に関連する費用を制限する点で経済的に有利である。
【００１１】
よって、本発明は、
少なくとも１つのレセプターを各々含む複数の感受性領域がその１つの表面に存在する支持体を含んでなり、各感受性領域は、サンプルの少なくとも１つの構成成分又は少なくとも１つの標的と、少なくとも１つのレセプターとの相互作用により生成される測定可能なシグナルを発することができる、サンプルを分析し又は少なくとも１つの標的を検出する電子舌又は鼻センサであって、それぞれのレセプター組成が互いに異なる少なくとも３つの感受性領域を含んでなり、感受性領域の少なくとも１つは少なくとも２つの異なる(又は非同一の)レセプターの混合物を含み、他の２つの感受性領域が各々前記２つのレセプターの少なくとも１つを含むことを特徴とする電子舌又は鼻センサに関する。
【００１２】
当業者に明確となるように、本発明によるセンサは、具体的には、電子舌の実現、特に液体状媒体のサンプルの分析に関しての電子舌の実現に、また電子鼻の実現、特に気体状媒体のサンプルの分析に関しての電子鼻の実現に有用である。
よって、本発明はまた、サンプルを分析するための上記センサの使用に関する。
【００１３】
本発明はまた、
−  上記のセンサをサンプルと接触させ；
−  センサの感受性領域が発するシグナルを測定し；
−  前工程で測定したシグナルを、少なくとも１つの他のサンプルと接触させた後に同じセンサ又は第２の類似するセンサの感受性領域が独立して生成するシグナルと比較し；
−  分析サンプルを定性的に評価する
サンプルの分析法に関する。
【００１４】
本発明はまた、少なくとも１つの標的と相互作用すること又は相互作用しないことを意図される三次元構造体を被覆するためのレセプター混合物のレセプター組成を規定するための上記センサの使用に関する。
【００１５】
本発明はまた、少なくとも１つの標的と相互作用すること又は相互作用しないことを意図される、レセプター混合物で被覆された三次元構造体を製造する方法であって、
−  標的を上記センサと接触させ；
−  標的に対する(レセプター混合物で被覆された三次元構造体の)所望の親和性と類似する親和性(強い場合も弱い場合もあり得る)を示す強度のシグナルを発する(センサの)感受性領域を特定し；
−  随意に、必要であれば他の標的についてこの２工程を繰返し；
−  特定された感受性領域のものと類似するレセプター組成を有するレセプター混合物で三次元構造体を被覆する
ことを含んでなる方法に関する。
【００１６】
レセプター
本明細書で理解されるように、「レセプター」は、それ自体が又は混合物内で１以上の他のレセプターと組み立てられてレセプターアセンブリを形成したときに、サンプルの１以上の構成成分又は標的と相互作用することができる、任意の化学種であり得る化合物である。本明細書で理解されるように、レセプターはまた、「サンプルの１以上の構成成分若しくは標的を認識し又は結合するエレメント又は決定基」と呼んでもよい。
【００１７】
好ましくは、本発明によるレセプターは、少なくとも１つの物理化学的特性(例えば、或るときには親水性又は疎水性であり、別のときには電子密度、極性又は電荷であり得る)が互いに異なる。更に、他のコンホメーション又は形状的特徴によってレセプターが区別されてもよい：よって、レセプターは、二次元構造(例えば、ヘリックス又はシート)の存在によって互いに異なってもよいし、互いに立体異性関係にあってもよい。
【００１８】
よって、構造の観点から、本発明によるレセプターは、
−  単純な分子、具体的には1000Da以下のもの、例えば、イオン、金属錯体、有機化合物(特に有機金属化合物)、アミノ酸、ペプチド、単糖、オリゴ糖、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド；又は
−  複雑な分子、具体的には1000Daを超えるもの、例えば、ポリペプチド又はタンパク質(任意にグリコシル化されていてもよい)、多糖、脂質、DNA、RNA又は有機ポリマー
であり得る。
【００１９】
本発明によるレセプターは、分子「レンガ」を構成することもでき、(特に、コンビナトリアル型の)混合物内で組み立てられて、サンプルの１以上の構成成分又は標的と相互作用する分子構築物を生じる。このタイプのレセプターアセンブリは、具体的には、Ojedaら(2007) Carbohydrate Research 342:448-459；Di Gianvincenzoら(2010) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20:2718-2721；Breseeら(2010) Chem. Commun. 46:7516-7518；Breseeら(2011) Small 7:2027-2031；又はWolfenden & Cloninger(2006) Bioconjugate Chem. 17:958-966に記載されている。
【００２０】
好ましくは、本発明によるレセプターは、1,000,000Da未満のサイズを有する。
本明細書で理解されるように、本発明によるレセプターは、互いに独立していても、或いは、分子結合(特に共有結合)で互いに連結していてもよい。レセプターは互いに連結して、サンプルの構成成分との種々の相互作用部位を示す巨大分子を形成することができる(これら部位が本発明によるレセプターに相当する)。
【００２１】
感受性領域
本発明による「感受性領域」は、サンプルの１以上の構成成分と該領域に含まれるレセプターとの間の相互作用により生成されるシグナルを発することができる、支持体の部分である。
【００２２】
この感受性領域は、支持体上で或る面積又は体積を占める(トポロジー及び形状は不定であり得る)。よって、感受性領域は、平面でも又は浮彫り状でもあり得る。すなわち、レセプターは、支持体に直接付着しているか、又は三次元的に分布することで表面より上に位置する或る体積を占める。更に、本発明による感受性領域は任意の形状を採用し得、具体的には円形又は多角形、特に平行六面体であり得る。本発明による感受性領域はまた、少なくとも１つの他の感受性領域から分離していてもよいし、繋がっていてもよい。好ましくは、センサの全ての感受性領域は同じ面積、同じトポロジー及び同じ形状を有する。特に好ましくは、本発明による感受性領域は、平面トポロジー及び円形の形状を有する。また、好ましくは、本発明による感受性領域の面積はおよそ0.25μm2〜10mm2である。加えて、感受性領域の厚さは、好ましくは0.5nm〜100μmである。
【００２３】
サンプルを本発明によるセンサと接触させることで、幾つかの測定可能なシグナル(感受性領域の各々につき少なくとも１つのシグナル)が発せられ、これによりサンプルに特徴的なシグナルプロフィールが生成される。したがって、当業者により明確に理解されるように、感受性領域の数を増加させることによって、測定可能なシグナルプロフィールの分解能を増大させることができる。
よって、好ましくは、本発明によるセンサは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、10、15、20、25、50、100、500、1000、10,000、100,000又は1,000,000の本発明による感受性領域を含んでなり得る。また、好ましくは、本発明によるセンサは、10,000,000、1,000,000、100,000、10,000、5000、1000、500、100、50又は25より少ない本発明による感受性領域を含んでなり得る。
【００２４】
レセプターの表面密度により、測定可能なシグナルの強度を変調することができる。
感受性領域内のレセプターの表面密度は、感受性領域が支持体上で占める面積に対する、この同じ感受性領域に含まれるレセプターの数で与えられる。幾つかの非同一レセプターが感受性領域に存在するときには、該非同一レセプターの各々についてそれぞれ表面密度を規定することができ、レセプターセットの表面密度を規定することもできる。レセプターの表面密度は、感受性領域の全体で均一であってもよいし、変化してもよい。変化するとき、レセプターは、表面密度の勾配に従って、例えば支持体表面が規定する平面内の方向の関数として、分布していてもよい。好ましくは、感受性領域内のレセプターセットの表面密度は、108〜1015レセプター/mm2である。好ましくは、センサの全ての感受性領域は、含まれるレセプターセットについて、均一で本質的に類似する表面密度を有する。
【００２５】
更に、非同一感受性領域の数を増加させることにより、サンプルの構成成分と感受性領域との間の可能な相互作用が増幅することでセンサの感度を増大させることも可能になる；また、この増加により、シグナルプロフィールの多様性が増大し、したがって分析すべきサンプル内のより多くの異なる構成成分の特徴付けが可能になる。加えて、非同一感受性領域の数を増加させることで、センサの感受性領域が発するシグナルのプロフィールの連続性を増大させることができ、このことにより、無関係な情報を生じる不良感受性領域を正確に特定し、排除することが可能になる。
【００２６】
好ましくは、本発明によるセンサは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、10、15、20、25、50又は100の異なる又は非同一のレセプター(これらは、異なるタイプのレセプター又は異なる性質のレセプターと呼ぶこともできる)を含んでなる。また、好ましくは、本発明によるセンサは、最大限1000、100、50、25又は10の異なる又は非同一のレセプターを含んでなる。本発明による同じ感受性領域は、単一のレセプターを含んでもよいし、２〜20の異なる又は非同一のレセプターを含んでもよい。
【００２７】
当業者が明確に理解するように、各レセプター又はレセプターのタイプは、好ましくは、本発明による感受性領域に幾つかのコピーとして存在する。よって、例として、感受性領域は、２つの異なるレセプターを含んでなるという場合、好ましくは、該異なるレセプターの各々の幾つかのコピーを、特には予め規定された表面密度で含んでなる。同様に、感受性領域は、唯１つのタイプのレセプターを含んでなると指摘される場合、唯１つのレセプター又はレセプタータイプの幾つかのコピーを含んでなり得る。
【００２８】
好ましくは、本発明によるセンサにおいて、感受性領域の少なくとも１つは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９又は10の異なる又は非同一のレセプターを含んでなる。
更に、本発明による１つの好適な実施形態において、センサの複数の感受性領域、具体的には少なくとも３、５、10又は100の感受性領域は、各々、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は10の異なる又は非同一のレセプターの混合物を含んでなり(該異なる又は非同一のレセプターは各混合物中で同じである)、該感受性領域に含まれている異なる又は非同一のレセプターの比率に関して互いに異なる。換言すれば、センサは、複数(具体的には少なくとも３、５、10又は100)の感受性領域を含んでなり、各感受性領域には、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９又は10の非同一レセプターが異なる比率で存在する。
【００２９】
よって、本発明の１つの好適な実施形態において、本発明によるセンサはｎ個(ｎは１より大きい整数)の非同一レセプターを含んでなり、感受性領域はこのｎ個の非同一レセプターの混合物を異なる比率で含んでなる。
ｎ＝２である特定の場合、例えば、考慮すべき２つのレセプターＡ及びＢが下記の比率である、均一で互いに等しい(感受性領域に含まれるレセプターセットについての)表面密度を有する６つの異なる感受性領域が存在し得る：Ａ ０％  Ｂ 100％；Ａ 20％  Ｂ 80％；Ａ 40％  Ｂ 60％；Ａ 60％  Ｂ 40％；Ａ 80％  Ｂ 20％；Ａ 100％  Ｂ ０％(パーセンテージは、感受性領域中の総レセプター量に対する感受性領域中の考慮すべきレセプターの量として表す)。レセプターＡの比率の20％の連続増加は「増加量」と呼ばれる。この場合には増加量は一定であるが、可変の増加量(例えば、０、10、20、30、50、70、80、90、100％のＡと、併せて100％となる量のＢ)を想定することもできる
【００３０】
より一般的には、本発明によれば、２つのレセプターの混合物中の第１のレセプターの％比率が100/(k-1)の増加量で変化し、レセプターセットの表面密度が好ましくは各感受性領域について同一である、ｋ個の感受性領域を想定することができる。
よって、本発明の好適な実施形態において、本発明によるセンサはｎ個(ｎは１より多い整数)の非同一レセプターを含み、感受性領域がこのｎ個の非同一レセプターの混合物を異なる比率で含んでなり、提供されるべき感受性領域の好適な数(ｋ)は、増加量ｉ(パーセンテージで表す)の関数として、100/ｉが整数でありｎ＜(100/i)＋１のとき、ｋ＝((100/ｉ)＋ｎ−１)！/(ｎ−１)！(100/ｉ)！)であり、ｎ＞(100/ｉ)＋１のとき、ｋ＝ｎ＾(100/ｉ)/(100/ｉ)！である。
【００３１】
増加量の値を減少させると、シグナルプロフィールの連続性及び分解能が増大する。加えて、この減少により、互いに非常に近似するか又は部分的に冗長でさえあるシグナルを得ることができ、その結果、起こり得る不良感受性領域の修正又は重み付けが可能になる。好ましくは、増加量は50％、33％、20％、10％、５％、４％、３％、２％、１％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％又は0.1％である。
【００３２】
不良感受性領域の検出は可能であり、具体的には、機能性の評価が望まれる感受性領域により発せられたシグナルと、類似の組成を有する感受性領域により発せられたシグナルとを比較することで可能である。よって、本発明による方法の１つの特定の実施形態において、この方法は、感受性領域が発するシグナルと、少なくとも２つの他の感受性領域(特に、機能性の検証が望まれる感受性領域の組成と類似する組成を有する感受性領域)が発するシグナルとの比較により、センサの感受性領域の機能性(すなわち、非不良性)を検証する工程を更に含んでなる。例として、(本発明の目的のためには、機能性の評価が望まれる感受性領域のものと)類似の組成を有する感受性領域は、感受性領域の総レセプター量に対する、感受性領域あたりに存在する異なるレセプターの量のそれぞれのパーセンテージが、好ましくは、機能性の評価が望まれる感受性領域のパーセンテージと50％、33％、20％、10％、５％、２％、１％、0.5％、0.2％又は0.1％未満で異なる感受性領域である。好ましくは、感受性領域１は、この感受性領域が発するシグナルR1が類似の組成を有する２つの感受性領域が発するシグナルR2及びR3と実質的に異なる場合、不良と見なされる。例えば、感受性領域は、絶対値での差(|R1-R2|，|R1-R3|)の小さいほうの値が２つのシグナルR2及びR3の間の差|R2-R3|より少なくとも50、20、10、５、４、３又は２倍大きい場合、不良と見なされる。別の例では、相対的な差を使用することができる；この場合、感受性領域１は、(２|R1R2|/(R1+R2)，２|R1-R3|/(R1+R3))の小さいほうの値が相対的な差２|R2-R3|/(R2+R3)より少なくとも50、20、10、５、４、３又は２倍大きい場合、不良と見なされる。不良感受性領域のその他の定義は、当業者が容易に想定できる。
【００３３】
非同一レセプターの混合物を含む感受性領域から得たシグナルは、同一レセプターのみを各々含む感受性領域から得たシグナルより、サンプルの構成成分に関して多くの冗長でない情報の取得を可能にする。有利なことには、本発明によるセンサを用いて得られるシグナルの非線形性は、限られた数の異なるレセプターを用いて達成することができる(これは費用節約の源である)。
別の１つの好適な実施形態において、本発明によるセンサは、少なくともセンサ中に存在する異なるレセプターの数の(単一種のレセプターを含む)感受性領域を含んでなり、センサの異なるレセプターの各々が、(単一種のレセプターを含む)感受性領域の各々にそれぞれ含まれる。
【００３４】
レセプターは、任意の適切な技法により、本発明による支持体に付着している。例えば、単純な吸着、静電的相互作用又は共有結合的グラフトが考えられる。例として、固体支持体がガラスであるとき、ガラス表面へのグラフトの実行を可能にするシランタイプのレセプター又はレセプター前駆体を用いることが好ましい；固体支持体が金から作製されるか又は金から作製された部分を含んでなるとき、当該金属に容易に結合するチモール官能基を含むレセプター前駆体又はレセプターを用いることが好ましい。支持体表面に配置したポリマーマトリクス中にレセプターを不動化することも可能である。
好ましくは、レセプターの支持体への付着は、その構造がレセプターと実質的に異ならない(相互作用を可能にする官能基が、作製条件に対して保護されていてもよい)レセプター前駆体又は(その性質上可能であれば)レセプター自体を用いて行う。
【００３５】
シグナル
本発明のためには、用語「シグナル」は物理現象を意味するものとする。シグナルは、その存否が決定でき、及び/又は定量できるとき、測定可能であるといえる。
本発明によるシグナルは、サンプルをセンサの少なくとも１つの感受性領域と接触させた後に生じる；その起源は、当該感受性領域内に存在する少なくとも１つのレセプターと、サンプルの少なくとも１つの構成成分との間の相互作用である。相互作用は、一般に、少なくとも１つのレセプターとサンプルの少なくとも１つの構成成分との間の結合の形成に相当し、結合は強いことも弱いこともでき、可逆性であることもできる。本発明によれば、各感受性領域について発せられたシグナルをまとめて測定する。しかし、必要であれば、本発明の１つの好適な実施形態において、全ての感受性領域によって発せられたシグナルを測定する。
【００３６】
シグナルは終時に又はリアルタイムに測定可能である。
好ましくは、本発明によるシグナルはリアルタイムで測定可能である。表現「リアルタイム」は、レセプターとサンプルの構成成分との間の相互作用が生起した本質的にその瞬間にシグナルが発生し、測定されることを意味する。有利には、シグナルの得られるリアルタイム測定値は、シグナルに時間的及び非線形的ディメンションを付加することで本発明によるセンサが提供する情報を更に増大させる追加パラメータである。
また、好ましくは、測定可能なシグナルは、質量、機械的、音響的、電気的又は光学的タイプのものである。本発明によるシグナルは、その性質に依存して、具体的には、光学顕微鏡観察、蛍光顕微鏡観察、共焦点顕微鏡観察、表面プラズモン共鳴、共鳴ミラー、インピーダンス測定、クオーツマイクロバランス、カンチレバー又は光吸収測定により測定する。
【００３７】
好ましくは、センサは、シグナルを直接検出することを可能にする。よって、例えば、シグナルが表面プラズモン共鳴により測定可能であるとき、適切な検出手段は、表面プラズモン共鳴の光学的読み取り用システムである。このシステムは公知であり；システムは、一般には、プラズモン励起を引き起こす光源、例えばLEDタイプの光源と、プラズモン共鳴により生じたシグナルを記録するCCDカメラとが組み合わされている。この点に関して、本発明によるシグナルは画像モードでモニターすることが特に好ましい。当業者が明確に理解するように、画像モードは、使用するCCDカメラの画像を構成する全てのピクセルのシグナルの変動をモニターすることから本質的になる一方、マルチポイントモード自体は、得られたシグナルの平均が選択した画像領域の平均シグナルを反映する画像領域(すなわち、１セットのピクセル)を定義又は予め定義することから本質的になる。
【００３８】
支持体
本発明による支持体はシグナル測定に適切な材料からなる。
好ましくは、本発明によるセンサにおいて、レセプターは、媒体の構成成分と感受性領域との相互作用により発生したシグナルを伝達する(すなわち、発生したシグナルを、代表的な別の性質のシグナルを介して中継する)支持体に付着している。
センサが表面プラズモン共鳴によるサンプル分析用である場合、固体支持体はプラズモン励起及び表面でのエバネセント波(evanescent wave)の伝播に適切なものである。有利には、支持体は、金属層、特に金の、具体的には10〜100nm厚、より具体的には50nm厚の金属層で覆われた透明材料、例えばガラスである。
本発明による支持体は、具体的には、ガラス；ケイ素；有機ポリマー材料、特にアクリレート、PDMS、COC、PEEK若しくはニトロセルロースタイプのもの；金属材料、特に銀、金若しくは白金；炭素系導電材料、特にガラス質炭素、グラファイト、グラフェン、炭素系ナノ構造体若しくはダイアモンドタイプ；又はこれら材料の少なくとも２つの組合せからなってもよい。
【００３９】
サンプル
本発明によるサンプルは任意のタイプのものであり得る。サンプルは、好ましくは流体であり、より好ましくは液体媒体又は気体媒体のサンプルである。
サンプルは、愚弟的には、以下のものであり得る：
−  生物学的サンプル、例えば、血液、血漿、血清、脳脊髄液、尿、糞便、滑液、精液、膣分泌液、口内分泌液、呼吸標本(特に、肺、鼻又は咽頭が起源のもの)、膿、腹水、又は皮膚若しくは結膜漿液標本のサンプル；
−  食物サンプル、特に食物(生、調理済み若しくは加工済みであり得る)、食物成分、スパイス、レディーミール若しくは飲料が起源であり、任意に懸濁状態に置かれたもの；
−  水サンプル、例えば水処理又は配水プラントからのもの；
−  土壌サンプル；
−  気体又は空気サンプル、例えば周囲大気又は空調システムからの空気又は呼気のサンプル。
【００４０】
サンプルは前処理を施されていてもよい。処理は物理的、化学的又は生物学的であり得る；処理は、具体的には、抽出、ろ過、希釈又は濃縮であり得る；処理はまた、特に当初は固体のサンプルである場合には、可溶化、粉砕(milling)、気化又は懸濁であり得る。また、処理は、標本への少なくとも１つのシグナルマーカー(すなわち、追加のシグナルを発するか又は感受性領域によるシグナルの生成を可能にし、促進し若しくは増強することができる化合物)の添加であり得る。シグナルマーカーは、サンプルの構成成分に結合してもよい；シグナルマーカーは、例えば、蛍光性、化学発光性又は放射活性分子であり得る。
【００４１】
処理はまた、サンプルへの、内部コントロール(すなわち、濃度及び/又は構成が既知である化合物)の添加であり得る。
上記の使用及び方法によれば、(サンプルと接触させた)感受性領域が発するシグナルが、優先的に、特にサンプルと本発明によるセンサとの間の接触時間の関数として、測定又は記録される。
【００４２】
標的
本発明による標的は任意のタイプのものであり得る。標的は、好ましくは、細菌、真核細胞、ウイルス、タンパク質、脂質、糖、核酸、揮発性若しくは不揮発性有機化合物又は無機化合物(例えば金属)であることができる。機能の観点から、標的は、特に、医薬、ホルモン、サイトカイン又は細胞レセプターであってもよい。
標的に対する感受性領域の親和性(本明細書においてはアビディティーと同義とみなす)は、感受性領域が発するシグナルに基づいて評価する。例えば、シグナル強度が標的に対する感受性領域の親和性に依存するとき、強いシグナルは強い親和性を示す一方、弱いシグナルは弱い親和性を示す。これらは、求める２つの主要な親和性を構成する。
実際、少なくとも１つの第１の標的に対して強い親和性を有すると同時に少なくとも１つの第２の標的には結合しない三次元構造体を探索することが可能となる。
【００４３】
分析
本発明による分析は、具体的には、サンプルの１以上の構成成分を検出及び/又は定量することを目的とし得る。更に、本発明による分析はまた、２以上の所定のクラスに従ってサンプルを定性的に評価し、カテゴリー分けし又はクラス分けすることを目的とし得、例えば、生物学的起源のサンプルを健常若しくは悪性として又はその成分が代表する病理学的状態(例えばガン)のタイプに従ってクラス分けするか、或いは食物起源のサンプルを規格に適合しているもの又は適合していないものにクラス分けすることを目的としてもよい。この点に関連して、例えば、１つの構成成分を純粋状態で含んでなるか又は規定すべきクラスに代表的であるコントロールサンプルを用いる比較によって行うことができる。
【００４４】
よって、本発明による方法の１つの好適な実施形態において：
−  上記のセンサをサンプルと接触させ；
−  センサの感受性領域が発するシグナルを測定し；
−  前の工程で測定したシグナルを、少なくとも１つのコントロールサンプルと接触させた後に同じセンサ又は第２の類似するセンサの感受性領域が独立して生成するシグナルと比較し；
−  分析サンプルを少なくとも１つのコントロールサンプルに関して定性的に評価する。
【００４５】
加えて、本発明による分析はまた、２以上の予め規定されていないクラスに従ってサンプルを定性的に評価し、カテゴリー分けし又はクラス分けすることを目的とし得る。よって、本発明による方法の別の１つの好適な実施形態において：
−  上記のセンサ又は類似する複数の上記センサを、複数のサンプルと接触させ；
−  各サンプルについてセンサの感受性領域が発するシグナルを測定し；
−  各サンプルについて測定したシグナルを互いに比較し；
−  各サンプルを、分析した全てのサンプルに関してカテゴリー分けする。
【００４６】
上記の比較工程及び続く評価工程は、教師あり又は教師なし学習の工程を必要としてもよい。この学習は、電子舌又は鼻の分野の当業者により容易に行うことができ、当業者は、具体的には、特にJainら(2000) IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence 22. 4-37により記載される従来技法を基礎として使用することができる。例として、主成分分析(PCA)、人工ニューラルネットワーク(Turner & Magan, op. cit.)又は(特に、Cortes & Vapnik(1995) Machine Learning 20:273-297により記載される)サポートベクターマシーン(SVM)による分離を挙げてもよい。サポートベクターマシーン(SVM)による分離は、Brownら(2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:262-267により記載されているように、最近DNAチップについての使用に成功している。
【００４７】
三次元構造体
本明細書で理解されるように、本発明による「三次元構造体」は、具体的には粒子、より具体的にはナノ粒子、すなわち、少なくとも１つのナノメートルオーダー(具体的には１nm〜999nm)の寸法を有する粒子又はマイクロ粒子、すなわち、少なくとも１つのマイクロメートルオーダー(具体的には１μm〜999μm)の寸法を有する粒子である。本発明による三次元構造体は、具体的には、カーボンナノチューブ、グラフェン、デンドリマー、ベシクル、ミセル、リポソーム、ポリマー、ナノ結晶、ナノスレッド(nanothread)、磁性粒子又は多孔性粒子であってもよい。このような三次元構造体は当業者に周知であり、特に、例えば、病理学的標的に結合するための、医薬として有用である。
【００４８】
三次元構造体は、少なくとも１つの標的と相互作用することができるように、本発明によるレセプターで被覆される。好ましくは、本発明による三次元構造体は、レセプターの混合物で被覆され、該混合物(特には、コンビナトリアル型のもの)を組み立てることで、標的と相互作用する分子構築物を生じる。そのような分子構築物は、例えば、Ojedaら(2007) Carbohydrate Research 342:448-459；Di Gianvincenzoら(2010) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20:2718-2721；Breseeら(2010) Chem. Commun. 46:7516-7518；Breseeら(2011) Small 7:2027-2031；又はWolfenden & Cloninger(2006) Bioconjugate Chem. 17:958-966に記載されているものである。
本発明を、以下の(限定的でない)図及び実施例により更に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は本発明によるセンサの取得及び使用を説明する。簡潔には、異なる比率(０、10、20、30、50、70、80、90及び100％のBB 1)のラクトース(BB 1)及び硫酸化ラクトース(BB 2)の９つの混合物を、金で被覆したプリズムからなる支持体の部分に堆積させて、感受性領域を形成する。こうして形成したセンサを、該センサと接触させるべき種々の溶液を循環させることが可能なセル中に配置する。センサの反射率を、発光ダイオード及びCCDカメラを用いる表面プラズモン共鳴画像法(SPRi)により得られるセンソグラムの形態で測定する。
【図２】図２は、本発明のセンサの存在下に配置したアメリカデイゴ(Erythrina cristagalli)レクチン(ECL)の濃度(ｘ軸、nM)の関数として、表面プラズモン共鳴画像法により測定したセンサの反射率の展開(evolution)(ｙ軸、％)を表す。
【図３】図３は、本発明のセンサでECL(200nM)、CXCL12-α(100nM)、CXCL12-γ(100nM)及びIFN-γ(25nM)についてそれぞれ得た種々の連続展開プロフィールを表す。これらプロフィールは、反射率(ｘ軸、％)を、図１に記載の支持体の部分に含まれるBB 1の比率の関数として表す。
【図４】図４は、ECL＋CXCL12-α混合物並びにECL単独及びCXCL12-α単独の連続展開プロフィールを表す。
【図５】図５は、ECL単独(左上)、CXCL12-α単独(右上)及びECL＋CXCL12-α混合物のそれぞれについて得られた連続展開プロフィールの3Dモデルを、センサとの接触時間の関数として表す。
【図６】図６は、食物混合物、すなわち、豆乳(図6A)、牛乳(図6B)及び粥(図6C)について得られた連続展開プロフィールを表す。
【図７】図７は、インターフェロンγD136(IFNgD136)の存在下、本発明によるセンサの感受性領域(各々がラクトース(BB 1)及び硫酸化ラクトース(BB 2)の異なる比率(０、10、20、30、50、70、80、90及び100％のBB 1)の混合物を代表する(ｘ軸))について表面プラズモン共鳴画像法により測定した反射率(ｙ軸、％)を表す。
【図８】図８は、10％ BB 1/90％ BB 2の混合物で覆われたナノ粒子(左)及び90％ BB 1/10％ BB 2の混合物で覆われたナノ粒子(右)を表す。
【図９】図９は、２つのタイプのコーティング：10％ BB 1又は90％ BB 1で官能化した金ナノ粒子の存在下に配置したIFNgD136の相互作用のSPRi測定結果を表す。この効果はナノ粒子の濃度に依存性である。
【図１０】図10は、抗インターフェロン抗体を用いるELISA分析によるIFNgD136のアッセイを表す。IFNgD136を、２つのタイプのコーティング：10％ BB 1又は90％ BB 1で官能化した金ナノ粒子とプレインキュベートする。次いで、上清のIFNgD136濃度をELISAアッセイにより評価する。
【実施例】
【００５０】
実施例
実施例１：感受性領域が２つのレセプターの混合物からなるセンサ
１．センサの製作
２つの単純な分子を構築レンガ(BB)として使用して、レセプター：ラクトース(BB 1)及び硫酸化ラクトース(BB 2)を異なる比率で組み合わせた幾つかの感受性領域を有する支持体を含んでなるセンサを構築した。０、10、20、30、50、70、80、90及び100％の[BB1]/([BB1]+[BB2])比を有する９つの混合物、全体濃度は20μMで一定であった。次いで、混合物を、表面プラズモン共鳴画像法(SPRi)に使用可能なプリズムの金表面で形成された支持体上に堆積させ、該プリズム表面と一晩接触させた。次いで、こうして形成したチップをエタノールで洗浄した後、N2流下で乾燥させた。
その結果、自己組立て後、図１に示すように、各々が異なる比率のBB 1及びBB 2を有する９つの感受性領域を含んでなるセンサを得ることができた。次いで、このセンサを使用して、単一タンパク質を含む媒体をSPRiにより分析した。
【００５１】
２．単一タンパク質を含むコントロール媒体の分析
タンパク質媒体の分析を、脱気装置及び蠕動ポンプに接続した10μlテフロン(登録商標)セル中で行った。500μlのタンパク質媒体を注入した。使用した作用緩衝溶液(working buffer solution)は、10mM HEPES、150mM NaCl、0.005％ Tween 20、２mM MgCl2を含んでなるpH7.4のものであり、使用前にろ過し、脱気した。全ての実験を周囲温度にて100μl/分の流量で行った。非特異的相互作用を回避するため、各タンパク質注入の前に、ウシ血清アルブミンを使用して露出している金表面をブロックした。
糖に結合する４つのタンパク質を試験した：アメリカデイゴレクチン(ECL)、CXCL12ケモカインのα及びγイソフォーム並びに炎症促進性サイトカインであるインターフェロン-γ(IFN-γ)。これらタンパク質は、糖鎖への結合能力に従って２群にクラス分けすることができる：ECLはガラクトースに結合するレクチンである一方、２つの形態のCXCL12及びIFN-γはヘパラン硫酸に結合する。
【００５２】
実際には、ECLを、最初に、幾つかの濃度(200nM、400nM、800nM及び1.6μM)でセンサを試験するために使用した。較正曲線(図２を参照)を確立した。この曲線はラングミュアタイプの吸収プロフィールを有する。このことにより、このシステムが、KD＝300±150nMでセンサとして正しく動作することが確証される。
予備試験の間、発せられるシグナルが匹敵する濃度を選択するため、他のタンパク質については２つの異なる濃度(CXCL12イソフォームについては100及び200nM、IFN-γについては25及び50nM)を使用した。最終的に選択した濃度は以下のとおりである：200nM ECL、100nM CXCL12-α、100nM CXCL12-α及び25nM IFN-γ。各タンパク質の分析後、適切な溶液を用いてセンサを再生したことにも留意すべきである。この目的のため、各タンパク質に適切な溶液を特定するために、種々の溶液を試験した。こうして、損傷を引き起こすことなくセンサの完全な再生を可能にするという理由から、ECLについては0.02Ｍ NaOH溶液、CXCL12-αについては１Ｍ NaCl溶液、CXCL12-γ及びIFN-γについては１％ SDS溶液を選んだ。
【００５３】
選択した濃度の純粋タンパク質をセンサに逐次注入した。その後、センサ支持体上の混合堆積物が種々のグレーレベルで明るくなった。この画像を記録した後、一連のセンソグラムに変換した。
驚くべきことに、本発明者らは、図３に明らかなように、所与のタンパク質について、反射率が感受性領域のBB組成に依存性であることを観察した。特に、種々のBB混合物の応答は、純粋レセプターの応答の単純な線形的相加ではないことが観察された。したがって、この非線形的挙動は、帰納的に、レセプターの比率が異なる種々の感受性領域の使用を正当化する。なぜならば、各感受性領域の応答が追加情報をもたらすからである。更に、所与の感受性領域について、応答強度が注入タンパク質に依存性であることが観察される。このことは、センサが各タンパク質に対して異なって応答することを示している。
【００５４】
各タンパク質の個々の挙動を説明するために、タンパク質注入の終了１分前に測定した反射率値を、混合物中のBB 1の比率の関数として表した(図３)。興味深いことに、連続展開プロフィールの形態の独特なプロフィールが各タンパク質について内挿し得た。本発明者らは、所与のタンパク質について、このプロフィールが、タンパク質の濃度に関わらず本質的に維持され、シグナルの強度に関しては、当然のことながら、濃度の関数として変化することを証明した。
結果として、このセンサは、タンパク質を弁別し同定するためだけでなく、定量目的でも使用することができた。更に、タンパク質に対するこのセンサの応答の連続挙動は、従来の電子鼻及び舌センサで得られるデータセットと比較して有意で重要な利点を提供する。なぜならば、連続展開プロフィールの各々について、或る１つのレセプターのシグナルは他のレセプターのシグナルと相関するので、異常シグナルを排除することができ、このことによって、より精緻でより正確な分析物の同定が可能になるからである。
【００５５】
詳細な様式では、70％のBB 1で最大シグナルを有するECLプロフィールは、10％のBB 1で最大シグナルを有するその他のプロフィールとは全く異なり、このことは、予想されるように、ECLが、ラクトースに富む感受性領域に対し、より大きな親和性を有することを示す。逆に、ヘパラン硫酸に結合するタンパク質は、硫酸化ラクトースBB 2に富む感受性領域に対し、より大きい親和性を有する。結果として、ECLは、その他のものと容易に区別することができる。より有利なことには、αイソフォームのCXCL12は、CXCL12-γ又はIFN-γについて得られるものとは相対的に異なる連続展開プロフィールをもたらす。実際、BB 1の比率が50％以上であるとき、CXCL12-αについての反射率は、実質的に零である一方、CXCL12-γ又はIFN-γについての反射率は遥かにより高い。図３に示される連続展開プロフィールの更なる詳細な分析により、同じ濃度で、CXCL12-γは、感受性領域に対し、CXCL12-αより遥かに高い親和性を有することが明らかになる。よって、100nMのCXCL12-αで、センサのいずれの感受性領域も1.35％より大きな反射率を示さない一方、CXCL12-γでは、2.30％のシグナルが達成される。
【００５６】
ECLが、このセンサを用いて、その他のタンパク質と区別できることを理解することは容易であるが、２つのイソフォームのCXCL12(領域１〜68が同一である)は、IFN-γと対比してCXCL12-γより良好に区別されることに留意すべきである。
しかし、２つのレセプターを異なる比率で有する９つの感受性領域を含んでなるこの第１世代のセンサでは、シグナル強度の差異にもかかわらず、CXCL12-γ及びIFN-γを区別することができない。この点に関して、本発明者らは、感受性領域レベルで多様性が大きくなるようレセプターを追加して製造したセンサによれば、類似するが非同一の電荷トポロジーを有するヘパラン硫酸結合性タンパク質を弁別することが可能になるに違いないと予測する。
【００５７】
３．複雑な媒体の分析への適用
電子鼻及び舌技術の主要な適用は、複雑な媒体の試験及び分析にある。媒体分析における上記センサの有効性を試験するため、本発明者らは、上記センサを２つのタンパク質：ECL(200nM)及びCXCL12-α(100nM)の混合物(混合物１)並びに食品混合物(例えば、豆乳、牛乳又は粥)で試験した。
得られた連続展開プロフィールを、比較用の２つの純粋タンパク質について得られたプロフィールと共に図４に示す。この初期の結果は、このセンサが混合物に対して感受性であり、混合物と純粋タンパク質とを弁別することができることを証明している。実際には、２つのタンパク質の混合物のプロフィールは、純粋タンパク質のプロフィールの単純な相加に近いことも観察される。このことにより、センサの感受性領域上に吸着したタンパク質間に協働的相互作用は実質的に存在しないことが示唆される。この特性の主要な利点は、混合物の個々の成分のそれぞれのプロフィールに基づいて、単純な線形分解により、混合物を検出し定量することが可能になることである。
【００５８】
更に、SPRiにより得られるリアルタイムの吸着・脱離動力学を利用することが有利である。この追加情報は、連続展開プロフィールに加えて、種々のタンパク質を弁別する別の方法を提供し得る。例示として、図５は、ECL＋CXCL12-α混合物の認識プロフィールの時間的展開を三次元で示す。
加えて、３つのタイプの食品サンプル(豆乳、牛乳及び粥)に対する電子舌の応答をより良好に比較するために、各サンプルについてプロフィールを作成した。このプロフィールは、６分間のリンス後の反射率を、感受性領域のラクトース/硫酸化ラクトース(L/SL)比の関数として表す(図６)。豆乳(図6A)について、硫酸化ラクトースに富む(純粋な硫酸化ラクトース、90％ SL、80％ SL、70％ SL、60％ SL及び50％ SLを含む)幾つかの感受性領域との強い親和性の存在が非常に容易に確証される。他方、UHT牛乳(図6B)については、２つの感受性領域(純粋な硫酸化ラクトース及び90％ SL)とのみで強い親和性が存在する。このことは、この電子舌がこれら２つのものを弁別できることを示している。粥(図6C)に関しては、純粋ラクトースから構成される感受性領域で最強の親和性が得られたので、プロフィールは全く異なる。これら結果によい、この電子舌が複雑なサンプルの分析及び弁別に有効であることが示される。更に、各サンプルについて得られたプロフィールは、同定用の署名とみなすことができる。
【００５９】
実施例２：適切なコンビナトリアル表面を選択する方法
治療剤としての装飾ナノ粒子(NP)の使用は、広範に探索されている対象である。何人かの著者らにより、或る特定の有効性を有するシステムが記載されている。使用されたコーティングの中でも、とりわけ、(ｉ)抗体のような特異的リガンド、例えば、標的と直接に(分子-分子で)相互作用するもの、又は(ii)より最近に開発された、小分子から構成されるコーティング(Bowmanら(2008) J. Am. Chem. Soc. 130:6896-6897；Baram-Pintoら(2009) Bioconjugate Chem. 20:1497-1502；Baram-Pintoら(2010) Small 6:1044-1050；Releら(2005) J. Am. Chem. Soc. 127:10132-10133)若しくはそれ自体は個別的に生物学的特性があまりよく規定されていない(Ojedaら(2007) Carbohydrate Research 342:448-459；Di Gianvincenzoら(2010) Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 20:2718-2721；Breseeら(2010) Chem. Commun. 46:7516-7518；Breseeら(2011) Small 7:2027-2031；又はWolfenden & Cloninger(2006) Bioconjugate Chem. 17:958-966)が、ナノ粒子表面に堆積させると特異的性質を生じる小分子のアセンブリのコーティングに言及してもよい。
【００６０】
後者のアセンブリは、コンビナトリアル技術により従来法で製造される：規定された基本レンガセットを混合後、ナノ粒子と共に組み立てる。この混合物の選択は、各タイプのNPの活性をスクリーニングすることで適切な構成が最終的に特定されるので、必ずしも合理的であることを要しない。
したがって、このことは、必ずしも生物学的活性を有さない化合物のライブラリに基づいて活性なコーティングを見出すためには、コンビナトリアル混合物から得られるコーティングを有するNPを数多く製作することが必要となることを意味する。これらNPの生物学的活性のスクリーニングにより、随意に、活性な混合物であるものを検出することができるようになる。この結果として、種々のNPの製造数と活性NPの数との間の比は非常に小さい。
【００６１】
これら混合物の発見の成功率を高めるため、したがって製作する非活性NPの数を減らすためには、迅速な高スループット分析に更に好適なフォーマットで、レセプターを形成する基本レンガの混合物の活性を迅速に評価できることが有利である。
これに関して、本発明者らは、驚くべきことに、二次元(2D)支持体上のレセプターの混合物から構成される表面の活性は、同じ混合物で被覆したナノ粒子の活性と非常に類似していることを示した。
【００６２】
よって、本発明者らは、レセプターを形成する化合物の混合物を表面に有するナノ粒子又はより一般的には三次元構造体の活性を、元の化合物の２つの特定比率の混合物を各々代表する、或る数の感受性領域(例えばスポットの形態のもの)を有する2Dセンサでの試験によって評価することを提案する。標的(例えばタンパク質又は微生物であり得る)をセンサと接触させ、相互作用を例えばSPRiで測定する。測定した標的と種々の感受性領域との相互作用の強度は、三次元構造体(例えばNP)のコーティングの製造に好適である混合物の組成を示唆する。同様に、相互作用を回避することが好ましい場合、規定の標的と僅かな相互作用しか示さない又は全く相互作用を示さない感受性領域のものと類似する混合物組成を選択することが好ましい。
したがって、本発明者らは、三次元構造体(具体的にはナノ物体又はマイクロ物体タイプのもの、例えばNP、デンドリマー又はリポソーム)のコーティングのコンビナトリアル製造と、表面特性の迅速評価に非常に適切である本発明によるセンサを用いる2Dスクリーニング工程とを組み合わせることを提案する。よって、2D特性と3D特性との間の保存は、活性表面の予備選択を可能にし、これにより、将来的な医薬の開発が遥かに加速され、費用が軽減される。
【００６３】
方式の説明：
１−  先ず最初に、センサを、実施例１に示すように、各々が特定比率のレセプター形成用基本レンガの混合物(すなわち、[BB1]/([BB1]+[BB2])比(BB 1はラクトースを表し、BB 2は硫酸化ラクトースを表す)が０、10、20、30、50、70、80、90及び100％であり、総濃度が20μMで一定である９つの混合物)からなる感受性領域を製造することにより構築する。
２−  次いで、標的(本実施例ではインターフェロンγD136(IFNg D136))に対する感受性領域の親和性を、本実施例では実施例１に従ってSPRiにより測定する。
３−  最良の親和性をもたらす感受性領域を選択する。本実施例では、IFNg D136タンパク質について該当する感受性領域は、10％ BB 1/90％ BB 2混合物からなる(図７)。90％ BB1/10％ BB 2混合物の感受性領域を、ネガティブコントロールとして選択した。
４−  NP(同定したものに類似する混合物で被覆した金粒子)を作製する(図８)。このナノ粒子のサイズは20nmである。
５−  製造したNPの標的に対する親和性を、従来の生化学試験(本実施例ではSPRi(図９)又はELISA(図10))により検証する。
【００６４】
SPRiにより、該当するコーティング(10％ BB1)を有するNPは、NP濃度に依存性であるシグナル減少を引き起こす一方、ネガティブコントロールのNP(90％ BB1)はシグナル変動を引き起こさないことが明確に観察される。
ELISAの結果により、標的に対する(二次元支持体上のレセプター混合物からなる)感受性領域の親和性が、同じ混合物で被覆されたナノ粒子の親和性と非常に類似していることが確証される。
更に、同じタイプの方法(工程１〜５)は、幾つかの標的について行うことができる；例えば第１の標的Ａに結合するが、第２の標的Ｂには結合しない粒子が望ましい場合。
【図１】
2015508175.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2015508175.tif 000008
【図７】
2015508175.tif 000009
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年10月21日(2014.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
実施例
実施例１：感受性領域が２つのレセプターの混合物からなるセンサ
１．センサの製作
２つの単純な分子を構築レンガ(BB)として使用して、レセプター：ラクトース(BB 1)及び硫酸化ラクトース(BB 2)を異なる比率で組み合わせた幾つかの感受性領域を有する支持体を含んでなるセンサを構築した。０、10、20、30、50、70、80、90及び100％の[BB1]/([BB1]+[BB2])比を有する９つの混合物(全体濃度は20μMで一定)を調製した。次いで、混合物を、表面プラズモン共鳴画像法(SPRi)に使用可能なプリズムの金表面で形成された支持体上に堆積させ、該プリズム表面と一晩接触させた。次いで、こうして形成したチップをエタノールで洗浄した後、N2流下で乾燥させた。
その結果、自己組立て後、図１に示すように、各々が異なる比率のBB 1及びBB 2を有する９つの感受性領域を含んでなるセンサを得ることができた。次いで、このセンサを使用して、単一タンパク質を含む媒体をSPRiにより分析した。
【国際調査報告】
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