(57)【要約】本発明は、ＭｔｒＥペプチドおよび淋病ワクチンでのその使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号１で示される残基２３〜４６７と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号１で示される残基２３〜１５５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
ｃ）配列番号１で示される残基３１３〜４６７と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、
ｄ）配列番号１で示される残基２３〜４６７と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
ｅ）配列番号１で示される残基２３〜１５５と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
ｆ）配列番号１で示される残基３１３〜４６７と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
ｇ）配列番号１で示される残基２３〜４６７と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
ｈ）配列番号１で示される残基２３〜１５５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
ｉ）配列番号１で示される残基３１３〜４６７と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列、
ｊ）配列番号１で示される残基２３〜４６７のアミノ酸配列、
ｋ）配列番号１で示される残基２３〜１５５のアミノ酸配列、および
ｌ）配列番号１で示される残基３１３〜４６７のアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離ＭｔｒＥタンパク質。
【請求項２】
配列番号１で示される残基２３〜４６７、配列番号１で示される残基２３〜１５５、および配列番号１で示される残基３１３〜４６７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の単離ＭｔｒＥタンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に記載の単離ＭｔｒＥタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５】
請求項４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
宿主細胞が大腸菌である、請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
ＭｔｒＥタンパク質をコードするベクターを有する宿主細胞を、ベクターからのＭｔｒＥタンパク質の発現を宿主で引き起こす培養条件で培養すること、および細胞培養物からＭｔｒＥタンパク質を精製することを含む、請求項１または２に記載の単離ＭｔｒＥタンパク質を製造する方法。
【請求項８】
宿主細胞が大腸菌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ベクターからＭｔｒＥ発現物を発現する培養条件が、宿主細胞を３７℃以下の温度で培養することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ベクターからＭｔｒＥ発現物を発現する培養条件が、宿主細胞を少なくとも８時間培養することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ベクターからＭｔｒＥ発現物を発現する培養条件が、宿主をカゼインの酵素消化物を含む培地で培養することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞培養物からのＭｔｒＥ発現物の精製が、宿主細胞を少なくとも２種類のイオン性界面活性剤の存在下で溶解させることを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１または２に記載の単離ペプチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の医薬組成物を対象に免疫原的有効量で投与することを含む、対象にナイセリア・ゴノレア（Ｎ．ゴノレア）に対する免疫性を与える方法。
【請求項１５】
ナイセリア・ゴノレア（Ｎ．ゴノレア）のＭｔｒＥタンパク質に結合する抗体または抗体断片。
【請求項１６】
ヒト化抗体もしくはその断片、またはモノクローナル抗体もしくはその断片である、請求項１５に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１７】
配列番号２または配列番号３に示されるアミノ酸配列に結合する、請求項１６に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１８】
配列番号２および配列番号３に示されるアミノ酸配列に結合する、請求項１６に記載の抗体または抗体断片。
【請求項１９】
請求項１６に記載の抗体または抗体断片および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１９に記載の医薬組成物をＮ．ゴノレアに対し投与することを含む、ナイセリア・ゴノレア（Ｎ．ゴノレア）の増殖を阻害する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府資金による研究開発の記載
本発明の開発中に実施された業務の一部は、国立衛生研究所助成金番号第Ｕ１９ＡＩ３１４９６号のもと、米国政府資金を利用した。米国政府は本発明で一定の権利を有する。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、ＭｔｒＥペプチド（ＭｔｒＥペプチドを有するキメラペプチドを含む）、および淋病ワクチンでのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
淋病は、疾病対策予防センター（Center for Disease Control）（ＣＤＣ）に２番目に高い頻度で報告される染症であり、それ自体が結果として大幅な公共医療費を生じている。同様に、淋病は米軍で２番目に多く報告されている感染症である。淋病は、全ての性感染症（ＳＴＩ）のように、思春期の若者（adolescent）および若年成人（young adult）で過度に発症し；したがって、淋病の診断および治療が国民皆保険制度（public health care system）に重い負担を掛けている。重篤な病的状態が女性を中心に発生し、これは淋菌感染の子宮内膜および卵管への上昇が骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）を引き起こすためである。ＰＩＤおよび感染後の合併症、慢性骨盤痛、不妊および子宮外妊娠はまた、米国および世界中で高頻度に発生する。子宮外妊娠は生命に関わる状態であり、また米国での妊婦の死亡の４番目の主な要因である。懸念される別の理由は、淋菌感染がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の感染を増大させる危険性に関連するという実証である。
【０００４】
淋病の最近の予防戦略は、安全な性行為のカウンセリング、ならびに感染個体の同定および治療に制限される。驚くことに、抗生物質耐性がナイセリア・ゴノレアでは急速に出現し、抗生物質耐性が最近の管理対策を脅かしている。抗生物質のただ１つのクラス、広域スペクトルセファロスポリン（ＥＳＣ）のみに淋菌感染症の治療が委ねられ、したがって、この病原菌は「超細菌（super bug）」の状況に２００７年で達した（CDC, 2007）。それ以来、ＥＳＣに対する感受性の低減が報告され、２００９年にはＥＳＣ耐性Ｎ．ゴノレア株が日本で単離された（CDC, 2011; Unemoら, 2010）。淋病治療の不能はまもなく現実となるかもしれない。したがって、淋病ワクチンが差し迫って必要である。
【０００５】
淋菌性ＭｔｒＣ−ＭｔｒＤ−ＭｔｒＥ（ＭｔｒＣＤＥ）の能動的な排出ポンプは、雌マウスの実験的な生殖管感染に不可欠である。このポンプの突然変異体は、発明者らがこのモデルで試験を行なった全ての変異体のうち最も弱毒化された変異体である。ＭｔｒＣおよびＭｔｒＤは、それぞれペリプラスムタンパク質および内膜タンパク質である。これに対して、ＭｔｒＥサブユニットは細菌外膜に局在する。他のＲＮＤポンプに対する相同性およびｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの予測されるＭｔｒＥタンパク質の二次構造分析に基づき、ＭｔｒＥは、ワクチンの標的化となる可能性がある表面に露出した２つのループを有するようである。
【発明の概要】
【０００６】
本出願は、配列番号１で示される残基２３〜４６７と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１で示される残基２３〜１５５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１で示される残基３１３〜４６７と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む単離ＭｔｒＥペプチドに関する。
【０００７】
本発明はまた、単離ＭｔｒＥタンパク質を製造する方法に関し、本方法は、ＭｔｒＥタンパク質をコードするベクターを有する宿主細胞を、ベクターからのＭｔｒＥタンパク質の発現が宿主で生じる培養条件で培養すること、およびＭｔｒＥタンパク質を細胞培養物から精製することを含む。
【０００８】
本発明はまた、本発明の単離ＭｔｒＥタンパク質を含む医薬組成物、および本発明の医薬組成物を免疫原的有効量で投与することを含む、対象にナイセリア・ゴノレア（Ｎ．ゴノレア）に対する免疫性を与える方法に関する。
【０００９】
本発明はまた、ナイセリア・ゴノレア（Ｎ．ゴノレア）のＭｔｒＥタンパク質に結合する抗体または抗体断片に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１はＭｔｒＥ２１−４６７特異的抗血清のＮ．ゴノレア表面への結合を示す。
【００１１】
【図２】ＭｔｒＥ２１−４６７特異的抗血清は異なる３種類の淋菌株には殺菌作用を示すが、ＭｔｒＣＤＥ欠損変異株には殺菌作用を示さないことを図２に表す。
【００１２】
【図３】ＭｔｒＥタンパク質のＭｔｒＥペプチド１１２−１１８（予測ループ１）および３１３−３３２（予測ループ２）に対する抗血清の特異性をウエスタンブロットで評価した結果を図３に示す。
【００１３】
【図４】野生型ＦＡ１９バクテリア及びＭｔｒＣＤＥ作用型排出ポンプを過剰生産しているＪＦ−１株において予測ループ２ペプチド（ＭｔｒＥ３１１−３３２）に対するアフィニティ−精製抗体のポンプ機能阻害能を図４に示す。無関係な抗原ＯｐａＳＶに対する抗体は同希釈条件下では阻害作用を示さなかった。
【００１４】
【図５】本発明の構成を図５に示す。右のパネル（Ａ）に、ＭｔｒＥ−ポリンループ８を融合させた構成物から得られたタンパク質ＭｔｒＥのループ１の配列を示す。右の（Ｂ）に、誘導なし及び誘導ありの大腸菌の培養液をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルーで染色し、タンパク質発現を確認した結果を示す。誘導を行った培養液中では５０ｋＤのタンパク質が認められ、ＭｔｒＥ−ポリン融合タンパク質の存在を示している。本バンドは誘導を行わなかった培養液中には認められない。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本出願は、単離ＭｔｒＥペプチドに関する。本明細書で用いられる場合、用語「タンパク質」および「ペプチド」は同じ意味で使用され、また単に少なくともアミノ酸残基の高分子（分岐または非分岐）として使用される。本明細書で用いられる場合、用語「単離された」は、タンパク質および核酸と共に使用される場合、タンパク質または核酸が、そのタンパク質が天然に存在しない形態で存在することを示すように使用される。例えば、本出願のＭｔｒＥタンパク質は、Ｎ．ゴノレアの外膜に天然に存在するタンパク質である。したがって、「単離ＭｔｒＥ」タンパク質は、Ｎ．ゴノレアの外膜の一部として生じないタンパク質である。
【００１６】
本発明の単離タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの設定のいずれでも生じ得る。例えば、本発明のＭｔｒＥタンパク質をコードするベクターを含有する細胞は、本明細書で用いられる場合、用語「単離タンパク質」を包含する。別の例では、ＭｔｒＥタンパク質をその外膜で発現するＮ．ゴノレア以外の細菌もまた、本明細書で用いられる場合、用語「単離タンパク質」に包含される。したがって、ＭｔｒＥを天然に発現しない細胞に存在するＭｔｒＥタンパク質もまた、細胞にいかに導入されたかにかかわらず、本明細書で用いられる場合、用語「単離タンパク質」の範囲に包含される。
【００１７】
しかし、あるライブラリー、例えば、ゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーの一員であるクローンに、そのライブラリーの他の一員から単離されていない例えばそのライブラリーのクローンと他の一員を含有する均質溶液の形態で含有される核酸、または核型と同様に、細胞または細胞溶解物から単離または取り出された染色体、例えば「染色体スプレッド」は、本発明の目的とする「単離」ではない。本明細書でさらに記述するように、本発明による単離核酸分子は、天然に、組換えまたは合成により作製してもよい。
【００１８】
当然ながら、本明細書に記載の単離ＭｔｒＥタンパク質または断片は、精製または実質的に精製され得る。本明細書で用いられる場合、用語「精製される」は、タンパク質または核酸に関して使用される場合、精製される分子濃度が自然環境で作製、発見、または合成する環境で、その分子に関連する他の分子と比較して増大していることを意味する。これらの「他の分子」は、タンパク質、核酸、脂質、および糖類を含むが、一般に精製している分子の完全性を維持し精製し易くするために添加される水、溶媒、緩衝液、および試薬は含まれないことを、当業者なら理解するであろう。例えばタンパク質が親和性クロマトグラフィ中に水性溶媒に希釈した場合でも、必然的に関連する他の分子がカラムに結合せずに対象のタンパク質から分離される場合、タンパク質は、このクロマトグラフィにより精製される。この定義によれば、物質は、その混入物質に関連して考えた場合、５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％純度であってよい。
【００１９】
天然由来のＭｔｒＥタンパク質は、ナイセリア・ゴノレア（Ｎ．ゴノレア）に存在する多重伝達性耐性排出系（multiple transferable resistance efflux system）（ＭｔｒＣＤＥ）の一部である。用語「Ｎ．ゴノレア」（またはナイセリア・ゴノレア）は、本明細書で用いられる場合、これらに限定されるものではないが、ＦＡ１０９０、ＦＡ１９、ＭＳ１１、およびＦ６２株が挙げられる。ＭｔｒＥタンパク質は、排出ポンプの外膜タンパク質部分である。ＭｔｒＥタンパク質は、Ｇｃ  ＭｔｒＣ−ＭｔｒＤ−ＭｔｒＥ（多重伝達性耐性）およびＦａｒＡ−ＦａｒＢ−ＭｔｒＥ（脂肪酸耐性）多剤耐性（ＭＤＲ）排出系の外膜孔を形成する。ＭｔｒＥは内膜輸送体および周辺のアクセサリータンパク質と共に機能して抗菌性基質を獲得し、ペリプラズムを介して外部環境にこれらを輸送する。臨床的証拠により、ＭｔｒＣ−ＭｔｒＤ−ＭｔｒＥ能動的排出ポンプ系がＧｃを先天的な粘膜防御から保護することが示唆されている。泌尿生殖器粘膜または直腸粘膜で認められるＭｔｒＣ−ＭｔｒＤ−ＭｔｒＥおよびＦａｒＡ−ＦａｒＢ−ＭｔｒＥ系の天然基質としては、脂肪酸、胆汁塩、抗菌性ペプチド、および糞便脂質が挙げられる。Ｎ．ゴノレアのＭｔｒＥの全長アミノ酸配列（例えばリーダー配列等）は、本明細書に以下の配列番号１に提示される。配列番号１で示されるアミノ酸配列は残基１〜２０のリーダー配列を含み、したがって、「成熟ＭｔｒＥタンパク質」は、概して以下の配列番号１で示されるアミノ酸２１〜４６７である。ＭｔｒＥペプチドの１１２〜１１８および３１３〜３３２（それぞれ表面露出ループ１および２に対応し、それぞれ一重下線および二重下線で以下に配列を示す）。
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【００２０】
本発明は、全長ＭｔｒＥタンパク質、成熟ＭｔｒＥタンパク質、およびその断片に関する。本明細書で用いられる場合、用語「ＭｔｒＥタンパク質」（または「ＭｔｒＥペプチド」）は、本明細書に開示の、成熟ＭｔｒＥのアミノ酸配列を含むタンパク質（本明細書ではアミノ酸配列として記載）、ならびにその相同分子種、断片、融合体および変異体を意味するように使用される。本明細書に記載のＭｔｒＥタンパク質は、野生型ＭｔｒＥタンパク質の同一機能を有する必要がなく、また、いずれの機能も有する必要がない。本発明の１つの実施形態では、本発明のＭｔｒＥタンパク質は、野生型、成熟ＭｔｒＥタンパク質としての少なくとも一部の機能性を有する。
【００２１】
用語「断片」は、タンパク質に関連する場合、全長または成熟ＭｔｒＥタンパク質から得られる隣接アミノ酸配列を含むペプチドを意味するように使用される。具体的な実施形態では、本発明のＭｔｒＥ断片は、配列番号１で示される約５〜１０、１０〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６０〜６５、６５〜７０、７０〜７５、７５〜８０、８０〜８５、８５〜９０、９０〜９５、９５〜１００、１００〜１０５、１０５〜１１０、１１０〜１１５、１１５〜１２０、１２０〜１２５、１２５〜１３０、１３０〜１３５、１３５〜１４０、１４０〜１４５、１４５〜１５０、１５０〜１５５、１５５〜１６０、１６０〜１６５、１６５〜１７０、１７０〜１７５、１７５〜１８０、１８０〜１８５、１８５〜１９０、１９０〜１９５、１９５〜２００、２００〜２０５、２０５〜２１０、２１０〜２１５、２１５〜２２０、２２０〜２２５、２２５〜２３０、２３０〜２３５、２３５〜２４０、２４０〜２４５、２４５〜２５０、２５０〜２５５、２５５〜２６０、２６０〜２６５、２６５〜２７０、２７０〜２７５、２７５〜２８０、２８０〜２８５、２８５〜２９０、２９０〜２９５、２９５〜３００、３００〜３０５、３０５〜３１０、３１０〜３１５、３１５〜３２０、３２０〜３２５、３２５〜３３０、３３０〜３３５、３３５〜３４０、３４０〜３４５、３４５〜３５０、３５０〜３５５、３５５〜３６０、３６０〜３６５、３６５〜３７０、３７０〜３７５、３７５〜３８０、３８０〜３８５、３８５〜３９０、３９０〜３９５、３９５〜４００、４００〜４０５、４０５〜４１０、４１０〜４１５、４１５〜４２０、４２０〜４２５、４２５〜４３０、４３０〜４３５、４３５〜４４０、４４０〜４４５、４４５〜４５０、４５０〜４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５または４６６の隣接アミノ酸を含む、あるいはこれらからなる。
【００２２】
具体的な実施形態では、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸残基２３〜４６７、配列番号１で示されるアミノ酸残基２３〜１５５または配列番号１で示されるアミノ酸残基３１３〜４６７を含む、あるいはこれらからなるアミノ酸配列を有する単離ＭｔｒＥタンパク質断片を提供する。他の具体的な実施形態では、本発明は、配列番号１で示されるアミノ酸残基１１２〜１１８を含むまたはそれらからなるアミノ酸配列、および配列番号１で示されるアミノ酸残基３１３〜３３２を含むまたはそれらからなるアミノ酸配列を有する単離ＭｔｒＥペプチドを提供する。
【００２３】
本発明はまた、本明細書に記載のＭｔｒＥタンパク質の変異体または断片に関し提供する。変異体としては、これに限定されないが、天然由来の対立遺伝子変異体、ならびに突然変異体、変異体、またはその他の非天然由来変異体が挙げられる。１つの実施形態では、変異体は、本発明のＭｔｒＥペプチドに対する抗体と交差反応する。
【００２４】
対立遺伝子変異体は、自然界には非常によく見られる。例えば、Ｎ．ゴノレアは、軽微な対立遺伝子変異により互いに異なる様々な株または血清型で表される。対立遺伝子変異体は、そのポリペプチドが天然に存在する細胞で、ポリペプチドの生体機能を実質的に変化させない、１以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有することをしばしば特徴とするポリペプチドの代替的形態（alternate form）である。例えば、異なる株で同一の生体機能を果たすポリペプチドは、Ｎ．ゴノレアの様々な株のそれぞれと同一でないアミノ酸配列を有し得る。そのような対立遺伝子変異は、核酸分子濃度にも同等に反映され得る。
【００２５】
対立遺伝子変異体をコードする核酸分子、例えばＤＮＡ分子は、従来方法により抽出されたゲノム細菌ＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により容易に回収され得る。これはコードドメインの５’および３’末端の上流および下流配列に一致する合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用を必要とする。典型的には、プライマーは、１０〜４０、およびさらに１５〜２５ヌクレオチドからなり得、有効なハイブリダイゼーションを確実にするのに十分な割合でＧ／Ｃヌクレオチドを含むプライマーを選択するのに好都合であることが多い。
【００２６】
具体的な例では、本発明は、配列番号１で示される残基２３〜４６７と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１で示される残基２３〜１５５と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列、または配列番号１で示される残基３１３〜４６７の少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、またはこれらから選択的になるＭｔｒＥタンパク質の単離変異体に関する。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１で示される残基２３〜４６７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の同一性を有する配列を含む、またはこれらから選択的になるアミノ酸配列を有する単離ＭｔｒＥタンパク質に関する。さらなる実施形態では、本発明は、配列番号１で示される残基２３〜１５５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の同一性を有する配列を含む、またはこれらから選択的になるアミノ酸配列を有する単離ＭｔｒＥタンパク質に関する。なおさらなる実施形態では、本発明は、配列番号１で示される残基３１３〜４６７と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の同一性を有する配列を含む、またはこれらから選択的になるアミノ酸配列を有する単離ＭｔｒＥタンパク質に関する。なおさらなる実施形態では、本発明は、配列番号１で示される残基１１２〜１１８と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の同一性を有する配列を含む、またはこれらから選択的になるアミノ酸配列を有する単離ＭｔｒＥタンパク質に関する。なおさらなる実施形態では、本発明は、配列番号１で示される残基３１３〜３３２と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％の同一性を有する配列を含む、またはこれらから選択的になるアミノ酸配列を有する単離ＭｔｒＥタンパク質に関する。
【００２７】
本発明のＭｔｒＥタンパク質はまた、置換変異体を含んでもよい。置換変異体は上述のポリペプチドを含み、この際、ＭｔｒＥタンパク質の１以上のアミノ酸残基を取り除いて別の残基に置き換えられる。１つの実施形態では、本発明の置換変異体は、本質的に保存的である。本目的では保存的置換は、以下の表に提示されるように定義され得るが、一般に、タンパク質の総合的な機能または立体構造に影響を与えない置換とみなされる。アミノ酸は、物理的性質、ならびに二次および三次タンパク質構造への寄与にしたがって分類され得る。保存的置換は、当技術分野では、１アミノ酸の、同様の性質を有する別のアミノ酸への置換として認められる。例示的な保存的置換を以下に提示する。
【００２８】
【表１】
2015536347.tif 000003
【００２９】
あるいは、保存的アミノ酸は、以下に記載される、Lehninger (1975) Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, pp. 71-77に記載のように分類され得る。
【００３０】
【表２】
2015536347.tif 000004
【００３１】
また、さらに他の代替物である、保存的置換の例を以下に提示する。
【表３】
2015536347.tif 000005
【００３２】
ＭｔｒＥタンパク質の変異体およびその断片はまた、従来とは異なるアミノ酸残基を含むペプチドを含む。例えば、ＭｔｒＥペプチドおよびその断片は、「Ｄ型」の残基、またはタンパク質で通常生じないアミノ酸、これらに限定されるものではないが一般にシトルリン、オルニチン、ヒプシン、セレノシステインα−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、人口設計（designer）アミノ酸（β−メチルアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸等）、ＰＮＡのおよびアミノ酸の類似体等、を含んでいてもよい。さらに、アミノ酸は、Ｄ体またはＬ体であり得る。
【００３３】
断片は、成熟ＭｔｒＥタンパク質と同様な機能性を有してもよいし、そうでなくてもよい。１つの実施形態では、本発明の断片は、ＭｔｒＥタンパク質の少なくとも１つの既知の機能を有する。別の実施形態では、本発明の断片は、抗原性である。別の実施形態では、本発明の断片は、免疫原性である。例えば、本発明のＭｔｒＥ由来ポリペプチドは、免疫学的交差反応性を有してもよく、動物にＮ．ゴノレア、Ｎ．ゴノレア感染細胞またはＮ．ゴノレア抗原を発現する抗原提示細胞に対する免疫応答を惹起する能力を有してもよく、および／または抗ＭｔｒＥ抗体に結合することが可能である。本明細書で用いられる場合、用語「抗原性の」は、抗体またはＴ−細胞受容体が特異的に結合するペプチドまたは核酸等の物質を指す。用語「免疫原性の」は、少なくとも部分的な免疫応答を惹起するペプチドの機能を指し、これらに限定されるものではないが、生物に投与された場合の、中和抗体の生成、ヘルパーＴ細胞の動員（recruitment）、サイトカインおよび他の炎症性メディエータの生成が挙げられる。当業者なら、本明細書で用いられる場合、「抗原性応答」および「免疫原性応答」の違いを容易に理解できる。
【００３４】
本明細書に記載のペプチドまたは断片の抗原性および／または免疫原性は、補助剤または補助剤の組み合わせ、これらに限定されるものではないが、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、スクアレン、油性補助剤、ビロソーム、ＱＳ２１、ＭＦ５９、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、ＣｐＧ、小分子肥満細胞活性化剤（small molecule mast cell activator）（ＭＰ７）、ＴＬＲ７イミダゾキノリンリガンド３Ｍ−０１９、レシキモド（Ｒ８４８）、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ｎｏｒ−ＭＤＰと称す）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ｄｉｐ−アルミトイル（almitoyl）−ｓｎ−グリセロ−３ヒドロキシホスホリルオキシル）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと称す）、およびＲＩＢＩ（細菌から抽出された３成分、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ８０に含有する）等、の使用を必要とするか、または必ずしも必要としない。表４および表５は、有用であり得る補助剤の情報を提供している。表４は、見込まれる補助剤およびその性質を表す。これらの補助剤は、Ｎ．ゴノレアおよびＭｔｒＥに対する免疫応答を増強させる能力を試験するために単独でまたは組み合わせて使用されてもよい。これらの補助剤は、Ｔｈ１またはＴｈ２反応を促進（drive）させる能力により定義される。表５は、ＭｔｒＥで免疫化されたマウスの補助剤および補助剤の組み合わせを表す。最終の血清力価の幾何平均（geometric mean）を示す。ＭｔｒＥ特異的抗体がＥＬＩＳＡにより検出された。
【００３５】
【表４】
2015536347.tif 000006
【００３６】
【表５】
2015536347.tif 000007
【００３７】
本明細書で用いられる場合、用語「に対応する（correspond(s) to）」および「に対応する（corresponding to）」は、配列アラインメントに関連する場合、基準タンパク質（reference protein）例えば、野生型ＭｔｒＥ内の列挙位置（enumerated position）、および基準タンパク質の位置と整列する（align）改変されたＭｔｒＥでのそれらの位置を意味することを意図する。したがって、対象タンパク質のアミノ酸配列が基準タンパク質のアミノ酸配列と整列する場合、基準配列のある列挙位置に「対応する」対象配列のアミノ酸は、基準配列のこれらの位置と整列するアミノ酸であるが、必ずしも基準配列のこれらの正確な数値的位置である必要はない。配列間で対応するアミノ酸を決定するために配列を整列する方法は、本明細書に記載されている。
【００３８】
本発明のＭｔｒＥタンパク質のアミノ酸残基は、これらに限定されるものではないが、官能基または非官能基（これらに限定されるものではないが、２、３例あげると、アセチル基、水酸基、カルボキシル基、糖質基（carbohydrate group）（糖鎖付加）、リン酸基および脂質群等）の付加等、改変されたものであっても、そうでなくてもよい。多数の化学的改変のうちいずれも既知の技術により実施してもよく、これらに限定されるものではないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的な化学的切断、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシン等の存在下での代謝合成等が挙げられる。
【００３９】
本発明のＭｔｒＥタンパク質は、例えば、これに限定されないが、精製を容易にする領域を含み得るさらなる要素（element）を含んでも、または含まなくてもよい。例えば、「ヒスチジンタグ」（「ｈｉｓタグ」）または「リジンタグ」は、「ＭｔｒＥ融合タンパク質」を作製するためにＭｔｒＥタンパク質に付加または「融合」されてもよい。ヒスチジンタグの例としては、これに限定されないが、ｈｅｘａＨ、ｈｅｐｔａＨおよびｈｅｘａＨＮが挙げられる。リジンタグの例としては、これに限定されないが、ｐｅｎｔａＬ、ｈｅｐｔａＬおよびＦＬＡＧが挙げられる。そのような領域は、ＭｔｒＥタンパク質の最終調製前に取り除いてもよい。第２の融合ペプチドの他の例としては、これに限定されないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）が挙げられる。
【００４０】
ペプチド部分のＭｔｒＥタンパク質への付加は、分泌または排出を生じさせるかにかかわらず、安定性を向上し精製または転移（translocation）を容易にするために、とりわけ、当技術分野でよく知られた日常的な技法であり、アミノ酸をタグと適合するように末端で改変することを含む。例えばＮ末端のアミノ酸は、タグに適合するように例えばアルギニンおよび／またはセリンに改変されてもよい。当然ながら、Ｃ末端のアミノ酸残基もまた、タグを適合するために改変されてもよい。特に有用な１つの融合タンパク質は、タンパク質を可溶化するために使用され得る免疫グロブリンからの異種領域を含む。
【００４１】
本発明により提供される融合タンパク質の他の種類は、これに限定されないが、分泌シグナルおよび他の異種機能領域との融合体が挙げられる。したがって、例として、付加アミノ酸領域、特に荷電アミノ酸領域は、精製中またはその後の操作および保存中に、宿主細胞での安定性および持続性を向上させるために、ＭｔｒＥタンパク質のＮ末端に付加されてもよい。
【００４２】
本発明の融合ポリペプチドの別の特定の例としては、補助活性を有するポリペプチド、コレラ毒素または大腸菌非耐熱性毒素のＢサブユニット等と融合されたＭｔｒＥポリペプチド、その断片または変異体が挙げられる。本発明に包含される融合ポリペプチドの別の特定の例としては、サイトカイン、これらに限定されるものではないが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、またはインターフェロン等と融合されたＭｔｒＥポリペプチドが挙げられる。本発明のＭｔｒＥポリペプチドは、補助活性を有するポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合され得る。あるいは、本発明のＭｔｒＥポリペプチドは、補助活性を有するポリペプチドのアミノ酸配列内に融合され得る。
【００４３】
また、１つの実施形態では、ＭｔｒＥポリペプチド、およびその融合体は、殺菌性またはオプソニン化抗体および／またはＴ−細胞を惹起する、天然のＮ．ゴノレア  ＭｔｒＥポリペプチドの１以上のエピトープを形成する配列を含んでいてもよい。そのようなＭｔｒＥポリペプチドは、Ｎ．ゴノレア細胞に感染した細胞を殺す抗体および／またはＴ−細胞を産生する能力により同定されてもよい。
【００４４】
本発明のＭｔｒＥタンパク質およびＭｔｒＥ融合タンパク質は、組換え細胞培養物から周知の方法により回収および精製され得、これらに限定されるものではないが、硫安沈殿またはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、例えば、固定化金属親和性（metal affinity）クロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィおよびレクチンクロマトグラフィが挙げられる。高速液体クロマトグラフィ（「ＨＰＬＣ」）もまた、精製に使用されてもよい。ＭｔｒＥタンパク質を単離および／または精製の際に変性させる場合に、活性構造を再生するためにタンパク質を再び折り畳む周知の方法を使用してもよい。
【００４５】
所望の場合、融合タンパク質の成分のうち個々のアミノ酸配列を作製し、リンカーにより結合され得る。好適なペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づき選択されてもよい：（１）柔軟に伸長した立体構造を採用する能力、（２）第１および第２のポリペプチドの機能エピトープと相互作用し得る二次構造を採用する能力、（３）ポリペプチド機能エピトープと反応し得る疎水性残基または荷電残基の欠如、（４）溶解性を増大させる能力、および（５）抗原提示細胞による処理に対する感受性を高める能力。そのようなリンカーは、いずれのアミノ酸配列または他の適する連結剤（link agent）または連結剤（joining agent）でもあり得る。
【００４６】
本発明に有用なリンカーとしては、荷電アミノ酸対（ＫＫまたはＲＲ等）を含むリンカー、カテプシンおよび／または他のトリプシン様酵素、トロンビンまたはＦａｃｔｏｒ  Ｘａに感受性を有するリンカー、またはポリペプチドの溶解性の増大をもたらすリンカーが挙げられる。リンカーの具体的な例としては、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含有するリンカーが挙げられる。リンカーとして通常使用されてもよいアミノ酸配列としては、Marateaら, Gene 40:39-46 (1985), Murphy et al., Proc. Nat. Acad Sci USA, 83:8258-8562 (1986)、米国特許第４，９３５，２３３号および米国特許第４，７５１，１８０号（全てが参照により組み込まれる）に開示されたリンカーが挙げられる。リンカー配列長は、１〜約１５０のアミノ酸長、またはさらにそれ以上であってもよい。
【００４７】
ＭｔｒＥタンパク質およびその融合体としては、これに限定されないが化学合成法による生成物、および組換え技術により原核性または真核性宿主（例えば、細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類細胞等）から作製される生成物が挙げられる。組換えによる作製手順で使用される宿主に応じて、本発明のＭｔｒＥタンパク質およびその融合体は、グリコシル化されてもよく、または非グリコシル化されてもよい。さらに、本発明のＭｔｒＥタンパク質およびその融合体はまた、宿主媒介性過程の結果としていくつかみられる場合では、開始改変メチオニン残基を含んでもよい。
【００４８】
本発明はＭｔｒＥタンパク質またはその融合体の供給源を限定しない。例えば、１つの供給源は、ＭｔｒＥポリペプチドまたはその融合体をコードするクローン配列を発現するように遺伝子操作された遺伝子発現系（大腸菌等）からのタンパク質調製物である。
【００４９】
ＭｔｒＥタンパク質および／またはその融合体は、原料物質から、当業者が周知のいずれの生化学的手法および方法をも使用して、単離および精製され得る。１つの方法では、Ｎ．ゴノレアの細胞エンベロープが標準的手法により採取され、内膜タンパク質、周辺タンパク質および外膜タンパク質が、洗浄液または低張液等の可溶化化合物を使用して可溶化される。有用な１つの洗浄液は、オクチルグルコピラノシド（ＯＧ）、サルコシル、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシドまたはＴＲＩＴＯＮ  Ｘ１００（商標）（ｔ−オクチルフェノキシ−ポリエトキシ−エタノール）を含有する洗浄液である。可溶化低張液の１つの例はＬｉＣｌを含有するものであり、また、ＭｔｒＥポリペプチドは可溶化画分であってもよい。抽出物の細胞残屑および不溶性物質は、例えば遠心分離により分離し取り除かれる。抽出物のポリペプチドは遠心分離されて、ＳＤＳ含有Ｌａｅｍｍｌｉゲル試料緩衝液で１００℃、５分間インキュベートされ、次いで変性用のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル（約６％〜約１２％、還元剤を含むかまたは含まない）での電気泳動により分画される。その結果、ＭｔｒＥポリペプチドとして同定されたバンドまたは画分は、ＭｔｒＥポリペプチドを含有する画分またはゲル薄片から直接精製されることもできる。
【００５０】
ＭｔｒＥポリペプチドまたはその融合体を精製する別の方法は、抗ＭｔｒＥ抗体を使用した親和性クロマトグラフィによる方法である。親和性クロマトグラフィは、ポリクローナルまたはモノクローナル抗ＭｔｒＥ抗体のいずれかを使用して実施されてもよい。抗体は、臭化シアンもしくはスクシンアミドエステル（Ａｆｆｉ−Ｇｅｌ、ＢｉｏＲａｄ、Ｉｎｃ．）により、または当業者に公知の他の方法により活性化されたアガロースゲルに共有結合し得る。タンパク質抽出物はゲルの上面にロードし得、また、一定期間をＭｔｒＥポリペプチドが抗体に結合するのに十分な標準の反応条件下でゲルと接触させた状態にし得る。固形支持体は、クロマトグラフィカラムで使用される材料であってもよい。親和性ゲルを洗浄して抗ＭｔｒＥ抗体に結合していない他のタンパク質および細胞物質を取り除く。その結果、ＭｔｒＥポリペプチドが抗体から取り出され、単離または精製した状態でＭｔｒＥポリペプチドを回収する。
【００５１】
ＭｔｒＥポリペプチドおよび／またはその融合体は、単離または精製されたＭｔｒＥポリペプチドを化学的および／または酵素的切断または分解により作製され得る。ＭｔｒＥポリペプチドはまた、ＭｔｒＥポリペプチドの公知のアミノ酸配列、およびキメラまたは融合ポリペプチドの場合、異種ポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、当業者に周知の方法により化学合成され得る。
【００５２】
ＭｔｒＥポリペプチドおよび／またはその融合体はまた、本発明のＭｔｒＥポリペプチドをコードする配列を含む組換え核酸構築物を発現する遺伝子発現系で作製され得る。本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、当業者が周知の手法により合成および／またはクローン化、ならびに発現されてもよい。例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, NY（その全体が参照により組み込まれる）を参照のこと。
【００５３】
所望の場合は、本発明のＭｔｒＥポリペプチドはさらに、標準のタンパク質またはペプチド精製手法、これらに限定されるものではないが、電気泳動、遠心分離、ゲル濾過、沈殿、透析、クロマトグラフィ（イオン交換クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、免疫吸着親和性クロマトグラフィ、色素結合型クロマトグラフィ（dye-binding chromatography）、サイズ排除クロマトグラフィ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ、逆相高速液体クロマトグラフィ、およびゲル浸透高速液体クロマトグラフィ等）、等電点電気泳動、ならびにその変化形および組み合わせを使用して精製されてもよい。
【００５４】
これらの手法の１以上が、その／それらの物理的特徴または化学的特徴により、本発明のＭｔｒＥポリペプチドを単離および／または精製するために設計された手順で順次使用されてもよい。これらの特徴には、タンパク質の疎水性、電荷、結合能、および分子量が含まれる。各手法後に得られた物質の様々な画分は、例えば抗ＭｔｒＥ抗体との結合性、または機能活性について試験される。その後、そのような試験された活性を示す画分をプール（pooled）し、逐次手順での次の手法を受け、新しい画分を再び試験する。工程は、所望されるたびに繰り返され得る。
【００５５】
本発明は、Ｎ．ゴノレアのＭｔｒＥポリペプチドおよび／またはエピトープに特異的に結合する抗体を提供する。そのような抗体の作製に、本発明のＭｔｒＥポリペプチドの単離または精製された調製物が、免疫原性組成物での免疫原として使用され得る。同様の免疫原が、モノクローナル抗ＭｔｒＥ抗体を生成するためのハイブリドーマ系の作製で、マウスを免疫化するために使用され得る。特定の実施形態では、免疫原は、本発明の単離または精製されたＭｔｒＥポリペプチドである。
【００５６】
他の実施形態では、本発明のＭｔｒＥポリペプチドは、免疫原として使用される。ペプチドは、単離または精製されたＭｔｒＥポリペプチドのプロテアーゼ消化、化学的切断により、化学合成により、または組換え発現（その後単離または精製される）により作製されてもよい。そのような単離または精製されたペプチドは、免疫原として直接使用され得る。特定の実施形態では、有用なペプチド断片は、８以上のアミノ酸長である。
【００５７】
有用な免疫原はまた、担体分子（担体タンパク質等）に結合した上述のＭｔｒＥペプチドを含んでもよい。担体タンパク質は、いずれも免疫学で通常使用され得、これに限定されないが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ニワトリアルブミン、キーホールリンペットヘモシニアン（keyhole limpet hemocyanin）（ＫＬＨ）、破傷風トキソイド、合成Ｔ細胞エピトープ等が挙げられる。
【００５８】
１つの実施形態では、抗ＭｔｒＥ抗体はモノクローナル抗体である。別の実施形態では、抗ＭｔｒＥ抗体はポリクローナル抗体である。
【００５９】
さらなる実施形態では、本発明の抗体を惹起するのに有用な免疫原は、上述の個々の免疫原のうちいずれか２以上の混合物を含む。
【００６０】
本明細書に記載の免疫原による動物の免疫化は、例えばヒト、ウサギ、ラット、フェレット、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウシまたはウマでは、抗血清含有ポリクローナル抗体またはハイブリドーマ系分泌モノクローナル抗体を採取する目的で、当業者が周知の以下の手順後に行なわれ得る。
【００６１】
モノクローナル抗体は、標準的手法（本明細書中に教示される）により調製され得る。そのような手法は例えば、米国特許第４，２７１，１４５号および米国特許第４，１９６，２６５号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。簡潔には、動物を免疫原により免疫化する。ハイブリドーマを、免疫化された動物からの脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合することにより調製する。融合生成物を、免疫原に結合する抗体を生成するためにスクリーニングする。陽性ハイブリドーマクローンを分離し、そのモノクローナル抗体をこれらのクローンから回収する。
【００６２】
ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を製造する免疫化レジメンは当業者に周知である。免疫原は、多くの経路、例えば皮下、静脈内、腹腔内、皮内、筋肉内、粘膜（例えば、鼻腔内、腔内、直腸内）のうちいずれか、またはそれらの組合せにより注入されてもよい。免疫原は、当業者に周知の方法および材料を用いて、可溶性形態、凝集形態で注入されてもよく、物理的担体に付着させてもよく、または補助剤と混合されてもよい。抗血清および抗体は、当業者に周知のカラムクロマトグラフィを使用して精製されてもよい。
【００６３】
抗体はまた、本明細書に記載の１以上のＭｔｒＥポリペプチドをコードする挿入物を有するか、または有し得る発現ライブラリーでクローンを同定するためのプローブとして使用されてもよい。抗体またはＭｔｒＥポリペプチドはまた、免疫測定法、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット法で、生体試料のＮ．ゴノレアまたは抗Ｎ．ゴノレア抗体を特異的に検出および／または定量化するために使用されてもよい。本発明の抗ＭｔｒＥ抗体は、それをＮ．ゴノレアからのＭｔｒＥに特異的に結合させて、Ｎ．ゴノレア感染を診断するのに使用され得る。
【００６４】
本発明の抗体は、これらに限定されるものではないが、細胞毒性を有する、細胞増殖抑制性を有する、または中和するものが挙げられ、また、動物、例えばヒト等のＮ．ゴノレア感染を予防または弱める受動免疫化に使用されてもよい。本明細書で用いられる場合、細胞毒性抗体は、抗体が結合した細菌のオプソニン化を増進および／または完全に死滅させる抗体である。本明細書で用いられる場合、中和抗体は、Ｎ．ゴノレアの感染性を緩和および／またはＮ．ゴノレアの標的細胞への結合を阻害するものである。本発明の免疫原に対して引き起こされるポリクローナルまたはモノクローナル抗体の有効濃度は宿主に投与されて、上述の効果を達成し得る。投与される抗体の正確な濃度は、各特異的抗体の調製物により変動するが、当業者に周知の標準的な手法を用いて投与されてもよい。抗体の投与は様々な手法を使用して達成され、これらに限定されるものではないが本明細書に記載の手法が挙げられる。
【００６５】
本発明の別の態様は、本発明の抗原性または免疫原性組成物に対して引き起こされる抗血清、および本発明のＭｔｒＥタンパク質を特異的に結合させる抗血清に存在する抗体に関する。具体的な実施形態では、本明細書に記載の抗体または抗体断片は、配列番号２または配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するペプチドと結合する。
【００６６】
用語「抗体」は、全ての形態、これらに限定されるものではないがポリクローナル、モノクローナル、精製ＩｇＧ、ＩｇＭ、またはＩｇＡ抗体、およびそれらの断片（これらに限定されるものではないが抗体結合性断片（Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ）’断片等）、米国特許第４，９４６，７７８号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示の一本鎖抗体、ならびにVerhoeyen and Winter, in Molecular Immunology 2ed., by B. D. Hames and D. M. Glover, IRL Press, Oxford University Press, 1996, at pp. 283-325（参照により本明細書に組み込まれる）等に開示の相補性決定領域（ＣＤＲ）等、を含むことを意図する。
【００６７】
本発明のさらなる態様は、キメラ抗体またはヒト化抗体（Morrisonら, 1984, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 81:6851；Reichmannら Nature 332:323：米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５８５，０８９号；および第５，５３０，１０１号；Neubergerら, 1984, Nature 81:6851 Riechmannら, 1988, Nature 332:323；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５８５，０８９号；および第５，５３０，１０１号、（全てが参照により本明細書に組み込まれる））であり、その中に、抗ＭｔｒＥ抗体の抗原結合領域の１以上が異種（例えばヒト）抗体のフレームワーク領域に導入される。本発明のキメラ抗体またはヒト化抗体は、非ヒト抗体よりヒトでの抗原性が低いが、所望される抗原結合性および他の活性、例えばこれらに限定されるものではないが中和活性、細胞毒性活性、オプソニン活性または防御活性等を有する。
【００６８】
本発明の１つの態様では、本発明の抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は、例えばヒト免疫グロブリンライブラリ（例えば、ＰＣＴ公開国際公開第９８／４６６４５号、国際公開第９８／５０４３３号、国際公開第９８／２４８９３号、国際公開第９８／１６０５４号、国際公開第９６／３４０９６号、国際公開第９６／３３７３５号、および国際公開第９１／１０７４１号（全てが参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）から、例えば、ファージ提示法（例えば、Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995)；Kettleboroughら, Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994)；Persicら, Gene 187 9-18 (1997)；Burtonら, Advances in Immunology 57:191-280 (1994)；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４号；ＰＣＴ公開国際公開第９０／０２８０９号；国際公開第９１／１０７３７号；国際公開第９２／０１０４７号；国際公開第９２／１８６１９号；国際公開第９３／１１２３６号；国際公開第９５／１５９８２号；国際公開第９５／２０４０１号；および米国特許第５，６９８，４２６号；第５，２２３，４０９号；第５，４０３，４８４号；第５，５８０，７１７号；第５，４２７，９０８号；第５，７５０，７５３号；第５，８２１，０４７号；第５，５７１，６９８号；第５，４２７，９０８号；第５，５１６，６３７号；第５，７８０，２２５号；第５，６５８，７２７号；第５，７３３，７４３号および第５，９６９，１０８号（それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）により分離されてもよい。ヒト抗体はまた、１以上のヒト免疫グロブリンについて遺伝子組換えされた、内因性免疫グロブリンを発現しない動物により産生されてもよい（例えば、米国特許第５，９３９，５９８号（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【００６９】
本発明のさらなる態様は、Ｎ．ゴノレア、Ｎ．ゴノレア感染細胞、またはＮ．ゴノレア抗原を提示する抗原提示細胞に特異的なＴ細胞である。本発明のＭｔｒＥポリペプチドに特異的なＴ−細胞について強化されたＴ−細胞調製物は、当技術分野に公知の方法により製造または単離され得る。
【００７０】
本発明はまた、本明細書に開示の単離ＭｔｒＥタンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明の核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、例えばｍＲＮＡであり得る。核酸分子は二本鎖または一本鎖であり得；一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡは、コードもしくはセンス鎖（strand）または非コードもしくはアンチセンス鎖であり得る。具体的には、核酸は本明細書に開示のＭｔｒＥタンパク質のいずれか、ならびにその変異体のいずれかをコードしてもよい。当然ながら、本発明の核酸は、さらなる要素（ｈｉｓタグ等）をコードしてもよい。例えば、本発明の核酸は、ＭｔｒＥタンパク質およびその変異体のいずれかをコードするものであり得、またグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質、ポリ−ヒスチジン（例えば、Ｈｉｓ６）、ポリ−ＨＮ、ポリ−リジン等を含む。所望の場合、ヌクレオチド配列は、さらなる非コード配列、非コード３’配列および５’配列（例えば制御配列等）を含み得る。
【００７１】
別の具体的な実施形態では、本発明は、本発明のＭｔｒＥポリペプチドをコードする核酸にハイブリッド可能（hybridizable）な核酸を提供する。核酸ハイブリダイゼーションを促進する他の様々なストリンジェントな条件が使用され得る。例えば、６×ＳＳＣ中で約４５℃でのハイブリダイゼーション、その後の２×ＳＳＣ中での５０℃での洗浄が使用されてもよい。あるいは、洗浄段階での塩濃度は、約５×ＳＳＣの５０℃での低いストリンジェント条件から、約２×ＳＳＣの５０℃での中程度のストリンジェント条件、約０．２×ＳＳＣの５０℃での高ストリンジェント条件まであり得る。さらに、洗浄段階の温度は、室温での低ストリンジェント条件から、約４２℃での中程度のストリンジェントまで、約６５℃での高ストリンジェント条件まで上昇し得る。他の条件としては、これに限定されないが、６８℃の０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／７％ＳＤＳでのハイブリダイゼーション、または５０％ホルムアミド／０．２５Ｍ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）／０．２５Ｍ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／７％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションが挙げられ；その後４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／５％ＳＤＳで４２℃で、または４０ｍＭ  ＮａＨＰＯ４（ｐＨ７．２）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１％ＳＤＳで５０℃で洗浄される。温度および塩の両方は変動してもよく、またはあるいは、どれか一方の変数を、他を変化させる間一定のままにしてもよい。
【００７２】
低、中程度および高ストリンジェント条件は、当業者に周知であり、特定の核酸配列の塩基組成物に応じて、またその核酸配列が由来する固有の生物体に応じて予測可能に変動する。そのような条件に関するガイダンスについて、例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, N.YおよびAusubelら, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.を参照のこと。
【００７３】
本発明のＭｔｒＥポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野で周知の方法により作製されてもよい。１つの態様では、ＭｔｒＥポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ方法によるＭｔｒＥポリペプチドコード配列に由来し得る。例えば、ＭｔｒＥポリペプチドのコード配列を変更して、ＭｔｒＥポリペプチドの免疫原性に影響を与えない、またはその免疫原性を向上させ得るアミノ酸置換（上述の保存的または半保存的置換等）をもたらしてもよい。様々な方法が使用されてもよく、例えばこれらに限定されるものではないが、オリゴヌクレオチドに向けられた、部位特異的突然変異が挙げられる。この手法および当技術分野で公知の他の手法が、単一または多重突然変異（例えば、BotsteinおよびShortle, 1985, Science 229:1193-1210（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のような置き換え（replacement）、挿入、欠失、および転位等）を引き起こすために使用されてもよい。
【００７４】
１つの実施形態では、ＭｔｒＥタンパク質をコードする核酸は、宿主細胞での増大した発現のためにコドンが最適化されてきた合成核酸である。遺伝子コードの縮重は天然のＤＮＡ配列でコードされるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを生成している間に、ヌクレオチド配列の変異を可能にする。アミノ酸の個々の同義コドンの頻度は、真核生物および原核生物の間でゲノムからゲノムで大きく異なる。コドン選択パターンのこれらの相違は、ペプチド伸張速度を調節することにより、個々の遺伝子の全般的な発現量に寄与すると思われる。この理由で、コドン頻度が、タンパク質を発現する宿主細胞または生物体のｔＲＮＡ頻度を示す特定の発現系を対象とした核酸分子を設計するのが望ましく、有用であろう。天然のコドンは、宿主細胞で高度に発現された遺伝子のコドンと交換される。例として、核酸分子は、細菌細胞（例えば、大腸菌）、酵母（例えば、ピチア）、昆虫細胞（例えば、ショウジョウバエ）、または哺乳類細胞または動物（例えば、ヒト、ヒツジ、ウシまたはマウス細胞または動物）でのコードされたタンパク質の発現のために最適化され得る。
【００７５】
遺伝子合成およびＤＮＡ操作に必須の制限酵素部位は、核酸およびベクター構築およびコードタンパク質の発現を容易にするように保護または破壊される。本発明の合成遺伝子を構築する際、ＣｐＧ配列は遺伝子抑制（gene silencing）を引き起こす場合があることから、ＣｐＧ配列を回避することが望ましいこともある。コドン最適化配列は、当業者に周知の従来手法を使用して合成および再構築（assemble）され、適切な発現ベクターに挿入され得る。
【００７６】
１つの特定の実施形態では、本発明のＭｔｒＥタンパク質をコードする合成核酸は少なくとも１つのコドン置換を含み、この際、タンパク質をコードする天然の遺伝子での好ましくない（non-preferred）またはあまり好ましくない（less preferred）コドンが、同様のアミノ酸をコードする好ましいコドンで置き換わる。例として、ヒトでは、好ましいコドンは：Ａｌａ（ＧＣＣ）；Ａｒｇ（ＣＧＣ）；Ａｓｎ（ＡＡＣ）；Ａｓｐ（ＧＡＣ）；Ｃｙｓ（ＴＧＣ）；Ｇｌｎ（ＣＡＧ）；Ｇｌｙ（ＧＧＣ）；Ｈｉｓ（ＣＡＣ）；Ｉｌｅ（ＡＴＣ）；Ｌｅｕ（ＣＴＧ）；Ｌｙｓ（ＡＡＧ）；Ｐｒｏ（ＣＣＣ）；Ｐｈｅ（ＴＴＣ）；Ｓｅｒ（ＡＧＣ）；Ｔｈｒ（ＡＣＣ）；Ｔｙｒ（ＴＡＣ）；およびＶａｌ（ＧＴＧ）である。あまり好ましくないコドンは：Ｇｌｙ（ＧＧＧ）；Ｉｌｅ（ＡＴＴ）；Ｌｅｕ（ＣＴＣ）；Ｓｅｒ（ＴＣＣ）；Ｖａｌ（ＧＴＣ）；およびＡｒｇ（ＡＧＧ）である。一般に、特定のコドンの優先度は、高度に発現された遺伝子のコドン保有率（prevalence）で示される。コドンを、高度に発現されたヒト遺伝子でよく見られる別のコドンに置き換えることは、概して哺乳類細胞の遺伝子発現を上昇させる。したがって、本発明は、あまり好ましくないコドンを好ましいコドンに置き換えること、ならびに好ましくないコドンを好ましいまたはあまり好ましくないコドンに置き換えることを含む。
【００７７】
さらに、ＭｔｒＥポリペプチドコード配列を含有する核酸は、制限酵素またはエクソヌクレアーゼ消化により切断（truncate）されてもよい。異種コード配列が、ＭｔｒＥポリペプチドコード配列に、ライゲーションまたはＰＣＲ増幅により付加されてもよい。さらに、本発明のＭｔｒＥポリペプチドの全体または一部をコードするＤＮＡは、化学的に、またはＭｔｒＥポリペプチドの既知もしくは推定のアミノ酸配列に基づくＰＣＲ増幅およびその配列への所望されるいずれかの変更（alteration）を使用して合成されてもよい。
【００７８】
本発明のＭｔｒＥポリペプチドをコードする同定および分離されたＤＮＡは、適切なクローニングベクターに挿入され得る。当技術分野で公知の多数のベクター−宿主系が使用されてもよい。用語「宿主」または「宿主細胞」は、本明細書で用いられる場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの動物またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの哺乳類細胞の培養物のいずれかを指す。
【００７９】
本発明はまた、本発明のＭｔｒＥタンパク質をコードする核酸を含有するベクターを含む。本明細書で用いられる場合、「ベクター」は複数の核酸のうちいずれであってもよく、核酸には所望される配列が、様々な遺伝子環境間での転写、または宿主細胞での発現のために制限酵素切断（restriction）およびライゲーション（ligation）により挿入されてもよい。典型的には、ベクターはＤＮＡから成るが、ＲＮＡベクターもまた入手可能である。ベクターとしては、これに限定されないが、プラスミドおよびファージミドが挙げられる。クローニングベクターは、宿主細胞で複製することができ、また、そのベクターが特定可能な型で切断され、所望されるＤＮＡ配列がライゲートされ得る１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位をさらに特徴とするベクターであり、その結果、新規の組換えベクターが宿主細胞で複製能を保持している。発現ベクターは、所望されるＤＮＡ配列が制限酵素切断およびライゲーションにより挿入されるベクターであり、その結果、ベクターは制御配列に実施可能に連結され、ＲＮＡ転写物として発現され得る。ベクターはさらに、ベクターにより形質転換または形質導入（transfect）された細胞の同定および選定での使用に好適である１以上のマーカー配列を含有してもよい。マーカーとしては、例えば、抗生物質または他の化合物に対する耐性または感受性を増大または減少させるタンパク質をコードする遺伝子、活性が当技術分野で公知の標準的な分析で検出可能な酵素（例えば、β−ガラクトシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）をコードする遺伝子、および形質転換または形質導入された細胞、宿主、コロニーまたはプラークの表現型に明らかに影響を与えない遺伝子が挙げられる。ベクターの例としては、これに限定されないが、自己複製可能なベクター、およびベクターが実施可能に結合されるＤＮＡセグメントに存在する構造遺伝子生成物の発現が可能なベクターが挙げられる。
【００８０】
ある関連では、使用されるべきベクターは、本発明のポリヌクレオチドおよびタンパク質の発現に関するベクターである。概して、そのようなベクターは、発現されるべきポリヌクレオチドと動作可能に連結した宿主での発現に有効なシス作用調節領域（control region）を含む。適するトランス作用因子は、宿主へ導入されると、宿主により供給され、相補的ベクターにより供給され、またはベクターそのものにより供給される。
【００８１】
多くの種類の発現ベクターが本発明のタンパク質を発現するために使用され得る。そのようなベクターとしては、染色体、エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば細菌プラスミドに、バクテリオファージに、酵母染色体要素に、ウイルス（アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、バキュロウイルス、パポバウイルス（ＳＶ４０等）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルスおよびレトロウイルス等）に由来するベクター、およびその組み合わせに由来するベクター（コスミドおよびファージミド等のプラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子要素に由来するベクター等）が挙げられる。本発明のこの態様による発現に、全てが使用され得る。概して、維持、伝搬（propagate）に好適ないずれのベクターも、または宿主での融合タンパク質も、これに関する発現に使用されてもよい。
【００８２】
概して、発現ベクターでのＤＮＡ配列は、適切な発現調節配列（例としてｍＲＮＡ転写を指向するプロモーター等）に実施可能に連結されている。そのようなプロオーターの代表として、これに限定されないが、いくつかの周知のプロモーターを列挙すると、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐおよびｔａｃプロモーター、ＨＩＶプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーターおよびレトロウイルスＬＴＲのプロモーターが挙げられる。一般に、発現構築物は、転写、開始および停止のための部位、および転写領域では翻訳のためのリボソーム結合部位を含有し得る。構築物により発現される成熟転写物のコード部分は、翻訳されるポリペプチドの最初に翻訳開始ＡＵＧコドン、および最後に適切に配置された終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を含む。
【００８３】
さらに、構築物は、発現を制御ならびに生じさせる調節領域を含有してもよい。概して、そのような領域は、転写を調節することにより作用し、とりわけリプレッサー結合部位およびエンハンサー等がある。
【００８４】
伝搬および発現用のベクターは、概して選択可能なマーカーを含む。そのようなマーカーはまた、増幅に好適であり得、ベクターはこの目的でさらなるマーカーを含有してもよい。これに関しては、発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択用の表現型形質をもたらす１以上の選択可能なマーカー遺伝子を含有してもよい。好ましいマーカーとしては、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼまたはネオマイシン耐性、大腸菌および他の細菌の培養用のカナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【００８５】
プロモーター／エンハンサー要素は、挿入された配列の発現を制御するために使用されてもよく、これに限定されないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（BernoistおよびChambon, 1981, Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの３’の長い末端反復（long terminal repeat）に含有するプロモーター（Yamamotoら, 1980, Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、動物細胞での発現用のメタロチオネイン遺伝子の制御配列（Brinsterら、1982、Nature 296:39-42）、ラクタマーゼのプロモーター（Villa-Kamaroffら, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731）、ｔａｃ（DeBoerら, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25）、または細菌細胞での発現用のｔｒｃ（"Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94もまた参照のこと）、ノパリンシンターゼプロモーター領域またはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター（Gardnerら, 1981, Nucl. Acids Res. 9:2871）、および植物細胞での発現用の光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼのプロモーター（Herrera-Estrellaら, 1984, Nature 310:115-120）；Ｇａｌ４プロモーター、酵母または他の糸状菌での発現用のＡＤＣ（alcohol dehydrogenase）プロモーター、ＰＧＫ（phosphoglycerokinase）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターが挙げられる。
【００８６】
利用される宿主−ベクター系に応じて、複数の好適な転写および翻訳要素のうちいずれかを使用してもよい。１つの実施形態では、本発明のＭｔｒＥポリペプチドと宿主細胞のプレ配列および／またはプロ配列とを含む融合タンパク質が発現される。他の実施形態では、例えば親和性精製ペプチド（例えばこれらに限定されるものではないが、マルトース結合タンパク質、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、チオレドキシンまたはヒスチジンタグ等）と融合された本発明のＭｔｒＥタンパク質を含む融合タンパク質が発現される。さらなる実施形態では、本発明のＭｔｒＥポリペプチドおよび有用な免疫原性のペプチドまたはタンパク質を含むキメラタンパク質が発現される。
【００８７】
ＤＮＡ断片をベクターに挿入する当技術分野に公知のいずれの方法も、適切な転写／翻訳調節シグナルを含むＭｔｒＥポリペプチドコード核酸分子およびそのポリペプチドコード配列を含有する発現ベクターを構築するために使用されてもよい。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡおよび合成手法およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換えを含んでもよい。
【００８８】
外因性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法には、スフェロプラストの、またはアルカリ陽イオンで処理された無傷酵母細胞の形質転換が含まれる。形質転換手順は通常、形質転換を受ける酵母種により変わる。例えば、Kurtzら (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142; Kunzeら (1985) J. Basic Microbiol. 25:141；カンジダでは、Gleesonら (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkampら (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302；ハンゼヌラでは; Dasら (1984) J. Bacteriol. 158:1165; De Louvencourtら (1983) J. Bacteriol. 154:1165; Van den Bergら(1990) Bio/Technology 8:135；クリベロマイセスでは；Creggら (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376; Kunzeら (1985) J. Basic Microbiol. 25:141；米国特許第４，８３７，１４８号および米国特許第４，９２９，５５５号；ピチアでは；Hinnenら (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75; 1929; Itoら (1983) J. Bacteriol. 153:163；サッカロミケスでは；Beachら (1981) Nature 300:706；シゾサッカロミセス；Davidowら (1985) Curr. Genet. 10:39を参照のこと。
【００８９】
細菌宿主で異種タンパク質を発現するための市販のベクターとしては、これに限定されないがｐＺＥＲＯ、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１８、ｐＫＫ２２３−３、ｐＥＸ１、ｐＣＡＬ、ｐＥＴ、ｐＳＰＵＴＫ、ｐＴｒｘＦｕｓ、ｐＦａｓｔＢａｃ、ｐＴｈｉｏＨｉｓ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＴｒｃＨｉｓ２、およびｐＬＥｘが挙げられる。例えば、λＧＥＭ（商標）−１１のファージが、宿主細胞（大腸菌ＬＥ３９２等）を形質転換するために使用され得る組換えファージベクターの作製の際に利用されてもよい。好ましい実施形態では、ベクターはｐＱＥ３０またはｐＢＡＤ／ＴｈｉｏＥであり、これらは宿主細胞（大腸菌）等を形質転換するために使用され得る。
【００９０】
多くの酵母株への形質転換用に発現ベクターおよび形質転換ベクターが入手可能である。例えば、以下の酵母について、発現ベクターが開発されてきた：カンジダ・アルビカンス、Kurtz,ら (1986) Mol. Cell. Biol. 6:142；カンジダ・マルトサ、Kunze,ら (1985) J. Basic Microbiol. 25:141；ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、Gleeson,ら (1986) J. Gen. Microbiol. 132:3459; Roggenkampら (1986) Mol. Gen. Genet. 202:302；クリベロマイセス・フラジリス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Dasら (1984) J. Bacteriol. 158:1165；クリベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、De Louvencourtら (1983) J. Bacteriol. 154:737; Van den Berg,ら (1990) Bio/Technology 8:135；ピチア・キリエルモンディ（Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ）、Kunzeら (1985) J. Basic Microbiol. 25:141；ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、Cregg,ら (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376、米国特許第４，８３７，１４８号および米国特許第４，９２９，５５５号；サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、Hinnenら (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, Itoら (1983) J. Bacteriol. 153:163；シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、Beachら (1981) Nature 300:706；およびヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、Davidow,ら (1985) Curr. Genet. 10:380-471, Gaillardin,ら (1985) Curr. Genet. 10:49。
【００９１】
本発明はまた、本明細書に記載の核酸およびベクターを有することを宿主細胞を可能にする。様々な宿主−ベクター系を、ポリペプチド−コード配列の発現に利用してもよい。これらは、これに限定されないが、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス（adenoviris）等）に感染した哺乳類細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母、またはバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌等の微生物、植物細胞は遺伝子組換え植物が挙げられる。
【００９２】
本発明の核酸分子、その断片、類似体または変異体を発現するのに適する宿主としては、大腸菌、バシラス属、ヘモフィラス属、糸状菌、酵母（サッカロミケス属、ピチア、ボルデテラ、またはカンジダ等）、またはバキュロウイルス発現系が挙げられ得る。
【００９３】
さらに、宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節、または遺伝子生成物を所望される固有の型（fashion）に変更および処理する宿主細胞株を選択してもよい。あるプロモーターからの発現は、あるインデューサーの存在下で上昇し得；したがって、遺伝子操作されたＭｔｒＥポリペプチドの発現が制御され得る。さらにまた、宿主細胞により、タンパク質の翻訳および翻訳後の処理ならびに改変に関する特徴および固有のメカニズムが異なる。適切な細胞株または宿主系が、発現される異質のタンパク質の所望される改変および処理を確実にするために選択され得る。
【００９４】
好適な宿主系および増殖条件が確立されると直ちに、組換え発現ベクターが伝搬され、大量に調製され得る。発現すると本発明の組換えポリペプチドは、当技術分野で周知の手法を用いて生成され、細胞ペーストすなわち細胞抽出物から、または組換え細胞培養物の遠心分離後の上清から実質的に精製されて回収され得る。
【００９５】
例として、組換えポリペプチドは、抗体親和性精製、調製用ゲル電気泳動、または組換えポリペプチドに含まれるｔａｇ（例えば、６×ヒスチジンタグ）を使用した親和性精製により精製され得る。
【００９６】
本発明はまた、単離ＭｔｒＥタンパク質を製造する方法に関し、本方法はＭｔｒＥタンパク質をコードするベクターを有する宿主細胞を、ＭｔｒＥタンパク質のベクターからの発現が宿主で生じる培養条件下で培養すること、およびＭｔｒＥタンパク質を細胞培養物から精製することを含む。
【００９７】
本発明はまた、本発明の単離ＭｔｒＥタンパク質を含む医薬組成物に関する。
【００９８】
本発明はまた、治療用組成物および予防用組成物を提供し、これらは、ヒト対象（患者）でのＮ．ゴノレア感染の治療または予防（その可能性を減少させる）用の抗原性組成物、および免疫原性組成物、例えばワクチン等であってもよい。免疫原性組成物としては、ヒトに使用されるワクチンが挙げられる。本発明の抗原性組成物および免疫原性組成物は、当業者に公知の手法により調製され得、また例えば本明細書に開示のＭｔｒＥ免疫原のうちいずれかの免疫学的有効量を、１以上の他の免疫原（例えばＮ．ゴノレア起源または他の細菌起源の脂質、リン脂質、炭水化合物、リポ多糖類、不活化または弱毒化した生物全体および他のタンパク質等）、薬学的に許容可能な担体、随意に適切な補助剤、および随意にワクチンで従来より認められる他の物質を随意に組合せて、またはそれらと融合して、または結合して含む。
【００９９】
一実施形態において、本発明は数種類の免疫原を含むカクテルワクチンを提供する。免疫原を数種類含むことにより、単一病原体の１種若しくは数種の菌株又は１種若しくは数種の病原体に対する免疫を１回の投与により獲得できるメリットがある。他の免疫原の例として、よく知られるＤＰＴワクチンで使用されているもの、C. trachomatisのＨＭＷタンパク質若しくはその断片、C. trachomatisのＭＯＭＰ若しくはその断片、又はC. trachomatisのＰＭＰＨ若しくはＨｔｒＡ若しくはその断片（好ましくは抗原決定基を含む）、クラミジア、ナイセリア、ＨＩＶ、インフルエンザ菌、Moraxella catarrhalis、ヒト乳頭腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、Haemophilus ducreyi、Treponema palladium、Candida albicans及び肺炎球菌等の固体全体若しくはそのサブユニットが含まれるがこれらに限定されない。組成物は必要に応じてＢＩＭタンパク質を含んでもよく又はＨＭＷタンパク質のアミノ末端断片、例えば成熟ＨＭＷタンパク質の１−１００、１−２００、１−３００、１−４００若しくは１−５００残基からなる又はこれらを含む断片を含んでもよい。
【０１００】
特定の実施形態において、医薬又はワクチン組成物はＭｔｒＥポリペプチド及びＨＭＷタンパク質又はその断片（例えば、５、８、１０、２０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００アミノ酸以上の断片とその断片を含む抗原決定基）を含む。別の特定の実施例では、組成物はＭｔｒＥポリペプチド及びＭＯＭＰ又はその断片（例えば、５、８、１０、２０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００、４００若しくは５００アミノ酸以上の断片とその断片を含む抗原決定基）を含む。
【０１０１】
本文中、「免疫原性量」という語句は抗体、Ｔ細胞、及び／又はサイトカイン並びにその他の細胞性免疫応答の構成成分を産生する免疫反応を誘導するために必要な量を意味する。一つの実施形態では、免疫原組成物はＮ．ゴノレア感染の可能性を予防若しくは削減する、又は既存若しくは続発性のＮ．ゴノレア感染の重症度を低下させるために十分な免疫応答を誘発するものである。ワクチンに使用する免疫原の免疫原性量はここで教示する観点から当技術分野で周知の方法により決定される。正確な濃度は投与されるそれぞれの免疫原に依存するが、免疫応答の発生を評価するための当業者に周知の基本的な方法を用いて決定できる。
【０１０２】
本発明のワクチン組成物は被験者の免疫応答を引き起こす。本発明の一態様において、組成物が誘導する抗体には抗ＭｔｒＥタンパク質抗体及びオプソニン化又は殺菌性抗体が含まれる。１つの非限定的な実施形態において、有効量の本発明の組成物は投与後、抗体力価の上昇を引き起こす。その他のより具体的な本発明の実施形態においては、約０．０１から２０００μｇ、又は０．１から５００μｇ、又は５０から２５０μｇのＭｔｒＥタンパク質を宿主に投与する。殺菌性又はＮ．ゴノレアに感染した宿主細胞に対して活性のあるＴ細胞の応答を誘導する組成物は本発明の一態様である。追加成分には少なくとも１種類の補助剤を含む。
【０１０３】
免疫原及び担体又は希釈剤の混合物は水溶液、乳濁液若しくは懸濁液又は乾燥製剤であってよい。適切な担体とは当業者に周知のものであり、安定化剤、希釈剤及び緩衝剤を含む。適切な安定化剤にはソルビトール、ラクトース、マンニトール、でんぷん、スクロース、デキストラン及びグルコースなどの炭水化物並びにアルブミン又はカゼインなどのタンパク質が含まれる。適切な希釈剤には食塩水、ハンクス平衡塩溶液及びリンゲル液が含まれる。適切な緩衝剤にはアルカリ金属リン酸塩、アルカリ金属炭酸塩又はアルカリ土類金属炭酸塩が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の組成物はヒトへの投与用に処方される。
【０１０４】
ワクチンを含む本発明の医薬及び免疫原性組成物はここに教示する内容を踏まえ、当業者に周知の方法により調製する。一般に免疫原は担体と混合し、溶液、懸濁液又は乳濁液とする。ここで扱う１種類又はそれ以上の添加物は担体に加えてもよいし、その後に加えてもよい。ワクチン製剤は保管又は製剤化のため、例えば冷凍乾燥又は噴霧乾燥により、乾燥又は凍結乾燥してもよい。その後、適切な液体キャリアを添加して液体ワクチンに戻してもよいし、又は乾燥製剤のままカプセル若しくは錠剤のように当業者に周知の方法で投与してもよい。
【０１０５】
本発明の抗原性、免疫原性、医薬、ワクチンを含むがこれに限定されない組成物は、有効量を投与する必要がある。ここで「有効量」とは所望の予防的、治療的又は改善的な反応（免疫応答を含むがそれに限定されない）が被験体で得られるのに必要な量である。必要量は使用するＭｔｒＥタンパク質又は核酸の免疫原性並びに投与される被験体の種族及び体重に依存するが、標準的な方法により確定できる。
【０１０６】
さらに、免疫原性、抗原性、医薬及びワクチン組成物は湿潤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤若しくはこれらの有効性を高めるための補助剤などの補助物質を１種類又はそれ以上含んでもよい。免疫原性、抗原性、医薬及びワクチン組成物は鳥、ヒト又は反芻動物、げっ歯類若しくは霊長類などを含む哺乳類に非経口、皮内、腹腔内、皮下又は筋肉内を含む様々な投与経路で投与できる。
【０１０７】
あるいは、本発明に従い調製した免疫原性、抗原性、医薬及びワクチン組成物を粘膜表面で免疫応答を引き起こすよう処方し、投与してもよい。従って、免疫原性、抗原性、医薬及びワクチン組成物は例えば経鼻、経口（胃内）、点眼、細気管支内、膣内又は直腸内経路など粘膜表面への投与も可能である。あるいは、座薬及び経口製剤を含むその他の投与方法が望ましい場合もある。座薬には接合剤及び担体として例えばポリアルカレングリコール又はトリグリセリドなどを含んでもよい。経口製剤には、例えば医薬品グレードのサッカリン、セルロース及び炭酸マグネシウムなど通常用いられる成分を含んでよい。これらの組成物は約０．００１から９５％のＭｔｒＥタンパク質を含み、細粒、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、持続性放出製剤又は粉末の形態を取り得る。一部の剤形は５０μｇから２５０μｇのＭｔｒＥタンパク質を含んでもよい。免疫原性、抗原性、医薬及びワクチン組成物はそれぞれの剤形に対応する方法にて、治療上有効、予防性又は免疫原性を発揮しうる量を投与する。組成物には必要に応じて補助剤を含むことができる。
【０１０８】
さらに、免疫原性、抗原性、医薬及びワクチン組成物は免疫系及び／又は粘液表面の特定の細胞への輸送を担う１種類又はそれ以上の標的分子と共に使用又は結合してもよい。一部の実施例はビタミンＢ１２、細菌性毒素若しくはその断片、モノクローナル抗体及びその他の特定の標的脂質、タンパク質、核酸又は炭水化物を含むがこれらに限定されない。
【０１０９】
最適な初回投与の方法及び追加免疫量も不定だが、初回投与後に追加投与が行われる場合もある。投与量は投与経路にも依存するが、被験体の大きさにも依存する。本発明の抗原性、免疫原性又は医薬組成物中のＭｔｒＥタンパク質濃度は概して約０．００１から９５％であり、具体的には約０．０１から５％である。
【０１１０】
ワクチンを含む抗原性、免疫原性又は医薬製剤は免疫刺激物質として、ＭｔｒＥタンパク質をコードする核酸分子の少なくとも一部を有する核酸ベクターを含んでもよい。
【０１１１】
提供されるワクチンは本文中に記載されているように、１種類又はそれ以上の本発明のＭｔｒＥポリペプチド融合タンパク質をコードする核酸を含むので、ポリペプチドをｉｎ  ｓｉｔｕ生産できる。そのようなワクチンにおいて、核酸分子は核酸発現系、細菌性及びウイルス性の発現系を含む同業者に周知の様々な送達系の何れかに存在可能である。適切な核酸発現系には患者さんの体内での発現に必要なヌクレオチド配列、例えば適切なプロモーター及びターミネーターシグナル等が含まれる。核酸分子はウイルス性発現系（例えば、ワクチン又は他のポックスウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス若しくはアデノウイルス）を用いて導入可能で、非病原性（欠損）ウイルスを使用することもある。核酸分子をそのような発現系に導入する技術は当業者に周知である。核酸分子は「裸」の状態のプラスミドベクターとしても投与可能で、例えばUlmer et al. Science 259:1745-1749 (1992)記載の方法及びCohen, Science 259:1691-1692 (1993)にレビューされている方法がある。そのようなベクターにＤＮＡを導入する技術は当業者に周知である。選択マーカー（形質導入細胞の同定又は選択を補助する）遺伝子及び／又はベクターを標的特異的にするために特定の標的細胞上のレセプターのリガンドをコードする遺伝子などの標的化部分をベクターに追加で導入又は組み込んでもよい。標的化は当業者に周知の方法により抗体を用いて行うこともできる。
【０１１２】
本発明の核酸分子（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）は治療又は予防目的でワクチンとして投与可能である。一般に、ＤＮＡ分子は哺乳類細胞中の発現に適したプロモーター制御下に配置される。プロモーターは偏在性又は組織特異的に機能する。組織非特異的プロモーターの例としてサイトメガロス前初期（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第４１６８０６２号参照）及びラウス肉腫ウイルスプロモーター（Norton and Coffin, Molec. Cell Biol. 5:281 (1985)参照）が含まれるがこれらに限定されない。デスミンプロモーター（Li et al. Gene 78:243 (1989)；Li & Paulin, J. Biol Chem 266:6562 (1991)；及びLi & Paulin, J. Biol Chem 268:10401 (1993)参照）は組織特異的で筋細胞での発現を誘導する。より一般的な有用なベクターは例えば国際公開第９４／２１７９７号及びHartikka et al., Human Gene Therapy 7:1205 (1996)を参照されたい。
【０１１３】
本発明の組成物は本発明の１つ又は数個の核酸分子を含むことができる。また、その他の抗原又は断片誘導体（ＤＰＴワクチン、C. trachomatisのＨＭＷタンパク質又はその断片、C. trachomatisのＭＯＭＰ又はその断片、クラミジア、ナイセリア、ＨＩＶ、インフルエンザ菌、Moraxella catarrhalis、ヒト乳頭腫ウイルス、単純ヘルペスウイルス、Haemophilus ducreyi、Treponema pallidium、Candida albicans及び肺炎球菌等の固体全体又はそのサブユニットが含まれるがこれらに限定されない）をコードする１つ以上の追加核酸分子も含んでよい。また、免疫応答を促進するため、インターロイキン−１又はインターロイキン−１２等のサイトカインをコードする核酸分子も組成物に追加してよい。本発明のＤＮＡ分子及び／若しくは追加ＤＮＡ分子は同一組成物中の異なるプラスミド若しくはベクター上又は同一のプラスミド若しくはベクター上に存在してもよい。
【０１１４】
治療及び予防目的の核酸分子のその他の処方として、滅菌生理食塩水又は滅菌コロイド分散緩衝生理食塩水系、例えば巨大分子複合体、ナノカプセル、シリカ微粒子、タングステン微粒子、金微粒子、細粒、ビーズ並びに水中油型乳濁液、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質系のシステムを含む。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの送達媒体として好ましいコロイド系システムはリポソームである（すなわち人工小胞）。細胞内へ効率的に取り込まれる生分解性ビーズの中及び／又はその上に核酸分子を導入することで裸の核酸分子の取り込みを促進できる可能性がある。その様なシステムの調製及び利用方法は当業界で周知である。
【０１１５】
核酸分子は細胞への取り込みを補助する薬剤と共に使用することもある。例えばブピバカインなどの細胞透過性を変化させる化学物質と共に処方されることもある（例えば国際公開第９４／１６７３７号参照）。
【０１１６】
陽イオン性脂質も当業界で周知であり、ＤＮＡ送達に頻繁に用いられている。そのような脂質としてリポフェクチンＴＭ、別名ＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニノ）プロパン、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドログリシスペルミン）及びＤＣ−Ｃｈｏｌ（３ベータ−（Ｎ−−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノメタン）−カルバモイル）コレステロール等のコレステロール誘導体が含まれる。これらの陽イオン性脂質の概要は欧州特許第１８７７０２号、国際公開第９０／１１０９２号、米国特許第５２８３１８５号、国際公開第９１／１５５０１号、国際公開第９５／２６３５６号及び米国特許第５５２７９２８号に記載されている。例えば、国際公開第９０／１１０９２号に記載されているように、ＤＮＡ送達を目的とした陽イオン性脂質はＤＯＰＥ（ジオレイルフォスファチジルエタノールアミン）等の中性脂質と共に用いられることもある。
【０１１７】
遺伝子導入を促進するその他の化合物も陽イオン性リポソームを含む処方に添加することができる。その例として、ＤＮＡの核膜透過促進に有用なスペルミン誘導体（例えば国際公開第９３／１８７５９号参照）並びに、ＧＡＬ４、グラミシジンＳ及び陽イオン性胆汁酸塩等の膜透過性化合物（例えば国際公開第９３／１９７６８号参照）が含まれる。
【０１１８】
ワクチン被接種者に用いる核酸分子の量は例えばＤＮＡ構築に使用したプロモーターの強度、発現させる遺伝子産物の免疫原性、投与経路及び製剤の種類等に依存する。一般に、治療的又は予防的に有効な投与量である約１μｇから約１ｍｇ、好ましくは約１０μｇから約８００μｇ、より好ましくは約２５μｇから約２５０μｇを成人に投与可能である。投与は単回又は間隔をあけて複数回行ってもよい。
【０１１９】
投与はワクチンに通常用いられるいかなる投与経路で行ってもよい。概要として、本発明の核酸分子は、例えば点眼、鼻腔内、肺内、経口、腸管内、直腸内、膣内及び尿路表面等の粘膜表面；又は例えば静脈内、皮下、腹腔内、皮内、表皮内若しくは筋肉内等の非経口的な経路から投与可能である。選択した製剤によって投与方法が選ばれる。例えば、ブピバカインと共に製剤化された核酸分子は筋肉に投与するのが有益である。
【０１２０】
本発明のＭｔｒＥタンパク質をコードする核酸分子の組み換え発現用に遺伝子操作された組み換え型細菌性ワクチンには赤痢菌、サルモネラ菌、コレラ菌及び乳酸菌が含まれる。組み換え型ＢＣＧ及びＭｔｒＥポリペプチドを発現している連鎖球菌もＮ．ゴノレア感染の予防又は治療に用いることができる。
【０１２１】
Mekalanos et al. Nature 306:551 (1983)及び米国特許第４８８２２７８号の報告によれば、非毒性コレラ菌変異株は経口生ワクチンとして有用である。本発明のＤＮＡ分子にコードされるポリペプチド又はポリペプチド誘導体を発現可能なコレラ菌株の有効量をワクチンとして投与可能である。
【０１２２】
組換え型異種抗原を発現している又は発現していない弱毒化ネズミチフス菌株及びそれらの経口ワクチンとしての使用についてNakayama et al. Bio/Technology 6:693 (1988)及び国際公開第９２／１１３６１号で報告されている。
【０１２３】
ワクチンベクターとして有用なその他の細菌株はHigh et al., EMBO 11:1991 (1992)；Sizemore et al., Science 270:299 (1995) (Shigella flexneri)；Medaglini et al., Proc Natl. Acad. Sci. US 92:6868 (1995) (Streptococcus gordonii)；並びにFlynn, Cell Mol. Biol. 40:31 (1994)；国際公開第８８／６６２６号；国際公開第９０／０５９４号；国際公開第９１／１３１５７号；国際公開第９２／１７９６号；及び国際公開第０２／２１３７６号(Bacille Calmette Guerin)で報告されている。
【０１２４】
遺伝子操作された組み換え型細菌ベクターにおいて、本発明の核酸分子は細菌のゲノムに挿入する、プラスミドに導入する、又は遊離状態であってもよい。
【０１２５】
ワクチン剤として使用する場合、本発明の組み換え型細菌又はウイルスワクチン、核酸分子及びポリペプチドは多段階の免疫化プロセスの一部として順次又は同時に使用可能である。例えば、哺乳類又は鳥類に対しては羊痘ウイルス又はアデノウイルス等のように本発明のワクチンベクターにより（例えば非経口又は粘膜経由で）初回免疫を行った後にポリペプチドにより（例えば粘膜経由で）数回追加免疫することができる。その他、哺乳類にまず粘膜経由でポリペプチドをワクチン接種し、それと同時又は直後に筋肉内に核酸分子を投与するという例がある。
【０１２６】
ＭｔｒＥワクチンを含む組成物にはさらに補助剤を追加できる。体液性免疫応答（ＨＩＲ）及び細胞性免疫（ＣＩＭ）を効率的に誘導するために、免疫原は通常、補助剤中で乳濁化する。免疫原を補助剤と共に投与することで免疫原性を大幅に向上することができる。補助剤は免疫原を投与部位の近傍に留めておくことで、免疫系細胞への緩やかで持続的な抗原放出を促す除放効果をもたらす。補助剤はさらに免疫系細胞を免疫原へ誘導し、それら細胞が免疫応答を発現するよう刺激を加えることができる。
【０１２７】
多くの補助剤は毒性があり、肉芽腫、急性及び慢性の炎症（フロイント完全アジュバント、ＦＣＡ）、細胞溶解（サポニン及びプルロニックポリマー）並びに発熱、関節炎並びに前部ぶどう膜炎（ＬＰＳ及びＭＤＰ）を引き起こす。
【０１２８】
免疫刺激剤又は補助剤は接種者の免疫応答を向上させるためワクチン等に長年使われてきた。リポ多糖類等の内因性の補助剤はワクチンとして使用されている死滅又は弱毒化細菌の成分として通常使われている。外因性の補助剤は一般には抗原に非共有結合しており、接種者の免疫応答を増強させるために配合される免疫調節薬として使われる。よって、補助剤は非経口経路投与された抗原に対する免疫反応増強剤として使用されてきた。水酸化アルミニウム、酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウム（一般的にはまとめてミョウバンと呼ぶ）が補助剤として広くヒト及び動物用ワクチンに用いられている。ミョウバンのジフテリア及び破傷風トキソイドに対する抗原応答増強効果は立証されており、ＨＢｓＡｇワクチンにはミョウバンが補助剤として使用されている。
【０１２９】
その他の外因性補助剤としてケモカイン、サイトカイン（例、ＩＬ−２）、膜タンパク質抗原と会合したサポニン（免疫刺激複合体）、ミネラルオイル添加プルロニックポリマー、ミネラルオイル中の死滅マイコバクテリア、フロイント完全アジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）及びリピドＡを含むリポ多糖類（ＬＰＳ）等の細菌性産物、並びにリポソームが含まれる。
【０１３０】
ここに参考文献として含まれる米国特許第６０１９９８２号では腸管毒素原性大腸菌の易熱性毒素の変異体（ｍＬＴ）について報告されている。ここに参考文献として含まれる米国特許第５０５７５４０号では南アメリカ原産の樹木Quiliaja saponaria molinaの樹皮由来のサポニンをＨＰＬＣ精製して得られた非毒性分画である補助剤ＱＳ２１について報告されている。３Ｄ−ＭＰＬはここに参考文献として含まれる英国特許第２２２０２１１号に報告がある。
【０１３１】
ここに参考文献として含まれる、１９８９年８月８日にLockhoffらに与えられた米国特許第４８５５２８３号はＮ−グリコシルアミド、Ｎ−グリコシルウレア及びＮ−グリコシルカルバマート（それぞれ糖残基がアミノ酸に置換されている）を含む糖脂質アナログが免疫調節剤又は補助剤になりえると報告している。Lockhoffは単純ヘルペスウイルスワクチン及び偽性狂犬病ウイルスワクチンの何れに対してもＮ−glycosphospholipids及びグリセロ糖脂質が強い免疫応答を誘導可能であったと報告している。一部の糖脂質は、天然の脂質残基の機能を模倣するよう、長鎖アルキルアミン及び糖のアノマー炭素原子に直接結合している脂肪酸から合成されている。
【０１３２】
ここに参考文献として含まれる、Moloneyに付与された米国特許第４２５８０２９号はオクタデシルチロシン塩酸塩（ＯＴＨ）、破傷風トキソイド並びにホルマリンで不活化したＩ、ＩＩ及びＩＩＩ型ポリオウイルスワクチンと複合化した場合に補助剤として機能すると報告している。免疫原性を増加させるため、合成ペプチドに脂質を付加する方法もある。
【０１３３】
すなわち本発明によると、ＭｔｒＥタンパク質を含む組成物、又はＭｔｒＥタンパク質をコードする核酸若しくはその断片、ベクター又はそれを発現している細胞から成る、ワクチンを含む免疫原性、抗原性、医薬組成物はさらにミョウバン、ｍＬＴ、ＬＴＲ１９２Ｇ、ＱＳ２１、ＲＩＢＩ  ＤＥＴＯＸＴＭ、ＭＭＰＬ、ＣｐＧ  ＤＮＡ、ＭＦ５９、リン酸カルシウム、ＰＬＧインターロイキン１２（ＩＬ１２）、ＴＬＲ７イミダゾキノリンリガンド３Ｍ−０１９、レシキモド（Ｒ８４８）、低分子マスト細胞活性化因子ＭＰ７及び上記記載の全ての化合物を含むがそれらに限定されない補助剤から成る。補助剤は以下から１つ又は複数選ばれる：ＱＳ２１、ＣｐＧ  ＤＮＡ、ＰＬＧ、ＬＴ、３Ｄ−ｍＰＬ、又はカルメット・ゲラン桿菌（ＢＣＧ）並びに上記の変異又は改変体（特にｍＬＴ及びＬＴＲ１９２Ｇ）。本発明の組成物はさらに生理食塩水、重炭酸塩、ブドウ糖又はその他の水溶液を含むがそれらに限定されない適切な医薬担体を含むことができる。その他の適切な医薬担体は当業界で標準的な参照文献であり、その全てがここに文献として含まれるRemington’s Pharmaceutical Sciences（Mack Publishing Company）に記載されている。
【０１３４】
免疫原性、抗原性及びワクチンを含む医薬組成物は適切な非毒性の医薬担体に導入、ミクロカプセル、ミクロビーズ内に包括及び／又は持続性放出インプラント内に包括されうる。
【０１３５】
免疫原性、抗原性及びワクチンを含む医薬組成物は抗体のレベル及び／又はＴ細胞のレベルを持続するため、間をあけて複数回投与されることが望ましい。免疫原性、抗原性及びワクチンを含む医薬組成物はその他の殺菌性又は静菌性方法と共に用いるとよい。
【０１３６】
また本発明には、有効量の１つ又は複数のＭｔｒＥポリペプチド若しくは本研究のＭｔｒＥポリペプチドをコードする核酸分子で動物を免疫することを含む動物の免疫応答を引き起こす方法、それらを含む組成物及びそれらを含むワクチンも含む。ＭｔｒＥポリペプチド、核酸、組成物及び本発明のＭｔｒＥポリペプチドを含むワクチンは同時又は経時的に投与可能である。同時投与の例として、同一若しくは異なる２種類以上のポリペプチド、核酸、組成物、若しくはワクチンを同一若しくは異なる処方で投与した場合、又は例えば異なる若しくは同一処方だが短時間（分若しくは時間単位）の間隔で別々に投与した場合が含まれる。経時的投与の例として、同一又は異なる２種類以上のポリペプチド、核酸、組成物若しくはワクチンが同時投与又は短時間内で投与されなかった場合、例えば日、週、月又は年をまたいだ間隔で別々に投与された場合である。
【０１３７】
本発明のポリペプチド、核酸分子又は組み換え型細菌性ワクチンは本文中に記載があるように抗体又はＴ細胞の産生にも有用である。Ｔ細胞については、動物（ヒトを含む）は前記の方法で免疫された。免疫化後、ＰＢＬ（末梢血リンパ球）、脾臓細胞又はリンパ節細胞を回収し、ヒト血清含有培地の入ったフラスコに多数のリンパ球を入れｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激を与えた。本発明のポリペプチドをフラスコに添加し、Ｔ細胞を回収後、Ｘ線照射された末梢血単核細胞の入った新しいフラスコに移す。ポリペプチドはこれらのフラスコに直接添加し、細胞はＩＬ−２存在下で培養する。Ｎ．ゴノレア特異的なＴ細胞であると確定した細胞は速やかに高濃度ＩＬ−２（２０ユニット）下の刺激過程に移し、増殖させる。
【０１３８】
あるいは、本発明のポリペプチド存在下で増殖した１つ又は複数のＴ細胞をクローニングによって数を増やすことも可能である。細胞をクローニングする方法は当業界で周知である。例えば、Ｔ細胞株はｉｎ  ｖｉｔｒｏで確立でき、限界希釈法にてクローニングも可能である。Ｘ線照射した自己細胞を充填し、僅かな抗原で刺激を与えることにより得られた培養液中の反応性Ｔ細胞を末梢血から精製する。ＣＤ４＋Ｔ細胞を得るために、ＭｔｒＥポリペプチドを抗体刺激剤として使い、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス感染により不死化した自己Ｐ３Ｌ又はリンパ芽球細胞株（ＬＣＬ）を抗原存在細胞として使う。ＣＤ８＋Ｔ細胞株を作製する際、適切なＭｔｒＥポリペプチドを産生する発現ベクターを導入した自己抗原存在細胞を刺激細胞として使用した。刺激されたＴ細胞をＰＢＬ又はＬＣＬ細胞及び組み換え型インターロイキン−２（ｒｌＬ２）（５０Ｕ／ｍｌ）と共に９６穴平底プレートに播種することにより、抗原刺激後にＴ細胞株を得る。クローン性の増殖が確認されたウェルは初回播種から約２〜３週間後に確定し、自己抗原存在細胞の存在下で適切な抗原にて再度刺激を行い、その後低濃度のＩＬ２を添加し増殖させる。Ｔ細胞クローンは、約２週間に１回、抗原及びＩＬ２で定期的に再刺激を行いながら、２４穴プレートで維持する。
【０１３９】
Ｔ細胞標品をさらに濃縮するため、Kendricksらが米国特許第５５９５８８１号で報告している方法を用いて抗原反応特異的なＴ細胞を単離してもよい。
【０１４０】
本発明のワクチン組成物は例えばヒト等の動物においてＮ．ゴノレア感染に関連する病気若しくは障害などの症状を予防、治療若しくは回復させる、又はヒト等の動物においてＮ．ゴノレア感染に関連する病気若しくは障害の発生若しくは進行を止めるのに有用である。
【０１４１】
本発明はまた、ここに記載する抗体を含む医薬組成物をＮ．ゴノレアと接触させることによりＮ．ゴノレアの増殖を阻害する方法も提供する。
【０１４２】
本発明は、ＭｔｒＥタンパク質をコードするベクターを有する宿主細胞を宿主内でベクター由来のＭｔｒＥタンパク質を発現する培養条件下で培養し、培養液中からＭｔｒＥタンパク質を精製する方法と併せて、ここに記載した単離ＭｔｒＥタンパク質を製造する方法を提供する。
【０１４３】
一つの実施例では、前記方法は３７℃未満の温度で宿主細胞を培養することを含むベクターからのＭｔｒＥ発現物を発現させるための培養条件を含む。
【０１４４】
別の実施例では、前記方法は宿主細胞を８時間以上培養することを含むＭｔｒＥ発現物を発現させるための培養条件を含む。
【０１４５】
別の実施例では、前記方法はカゼインの酵素消化物を含む培地中で宿主を培養することを含むＭｔｒＥ発現物を発現させるための培養条件を含む。
【０１４６】
別の実施例では、前記方法は少なくとも２種類のイオン性界面活性剤の存在下で宿主細胞を溶解することを含むＭｔｒＥ発現物を細胞培養液から精製する方法を含む。
【０１４７】
本発明はここに記載するＭｔｒＥペプチドを含むキメラタンパク質も提供する。一つの実施例では、ここに記載するＭｔｒＥペプチドとポリンタンパク質又はその断片を融合する。具体的には、ポリンＢ（ＰｏｒＢ）配列はここに記載するＭｔｒＥペプチドと融合可能である。Ｎ．ゴノレア株はＰｏｒＢ血清型によりＰｏｒＢ１Ａ及びＰｏｒＢ１Ｂに分類され、表面に露出している領域のアミノ酸配列が異なるためそれぞれの血清型において数種類の抗原性変異体が存在する。ＭｔｒＥペプチドに導入又は融合しているＰｏｒＢ配列にはＰｏｒＢ１Ａ又はＰｒｏＢ１Ｂ分子に通常発現している１つ又は複数の表面に露出したループが含まれるがこれらに限定されない。本発明のＭｔｒＥペプチドに導入又は融合可能な表面に露出しているループの例として以下の表６に示した配列が含まれるがこれらに限定されない。
【０１４８】
【表６】
2015536347.tif 000008
2015536347.tif 000009
【０１４９】
特定の実施例では、本発明のキメラタンパク質はＭｔｒＥ配列と共に表面に露出したＭｔｒＥのループ１に融合された配列（ＰｏｒＢ１Ａで表面に露出しているループ８の残基）ＰＩＡ８を含む。
ＭＮＴＴＬＫＴＴＬＴ  ＳＶＡＡＡＦＡＬＳＡ  ＣＴＭＩＰＱＹＥＱＰ
ＫＶＥＶＡＥＴＦＱＮ  ＤＴＳＶＳＳＩＲＡＶ  ＤＬＧＷＨＤＹＦＡＤ
ＰＲＬＱＫＬＩＤＩＡ  ＬＥＲＮＴＳＬＲＴＡ  ＶＬＮＳＥＩＹＲＫＱ
ＹＭＩＥＲＮＮＬＬＰ  ＴＬＡＡＮＡＮＧＳＲ  ＱＧＳＬＳＧＧＫＧＴ
ＥＫＧＮＶＳＳＳＹＮ  ＶＧＬＧＡＡＳＹＥＬ  ＤＬＦＧＲＶＲＳＳＳ
ＥＡＡＬＱＧＹＦＡＳ  ＶＡＮＲＤＡＡＨＬＳ  ＬＩＡＴＶＡＫＡＹＦ
ＮＥＲＹＡＥＥＡＭＳ  ＬＡＱＲＶＬＫＴＲＥ  ＥＴＹＮＡＶＲＩＡＶ
ＱＧＲＲＤＦＲＲＲＰ  ＡＰＡＥＡＬＩＥＳＡ  ＫＡＤＹＡＨＡＡＲＳ
ＲＥＱＡＲＮＡＬＡＴ  ＬＩＮＲＰＩＰＥＤＬ  ＰＡＧＬＰＬＤＫＱＦ
ＦＶＥＫＬＰＡＧＬＳ  ＳＥＶＬＬＤＲＰＤＩ  ＲＡＡＥＨＡＬＫＱＡ
ＮＡＮＩＧＡＡＲＡＡ  ＦＦＰＳＩＲＬＴＧＳ  ＶＧＴＧＳＶＥＬＧＧ
ＬＦＫＳＧＴＧＶＷＡ  ＦＡＰＳＩＴＬＰＩＦ  ＴＷＧＴＮＫＡＮＬＤ
ＶＡＫＬＲＱＱＡＱＩ  ＶＡＹＥＳＡＶＱＳＡ  ＦＱＤＶＡＮＡＬＡＡ
ＲＥＱＬＤＫＡＹＤＡ  ＬＳＫＱＳＲＡＳＫＥ  ＡＬＲＬＶＧＬＲＹＫ
ＨＧＶＳＧＡＬＤＬＬ  ＤＡＥＲＳＳＹＳＡＥ  ＧＡＡＬＳＡＱＬＴＲ
ＡＥＮＬＡＤＬＹＫＡ  ＬＧＧＧＬＫＲＤＴＱ  ＴＧＫ    （配列番号４）
【０１５０】
特定の実施例において、本発明は配列番号４の２３−４７３アミノ酸残基、配列番号４の２３−１６１アミノ酸残基若しくは配列番号４の３１９−４７３アミノ酸残基を含む又はから成るアミノ酸配列を有する単離タンパク質断片を提供する。別の特定の実施例では、本発明は配列番号４の１１２−１２４アミノ酸残基を含む又はから成るアミノ酸配列を有する単離ＭｔｒＥペプチドを提供する。
【０１５１】
特定の実施例において、本発明は配列番号４の２３−４７３残基と８０％以上同一なアミノ酸配列若しくは配列番号４の２３−１６１残基と８０％以上同一なアミノ酸配列を含む又はから成る単離ＭｔｒＥタンパク質変異体に関する。追加実施例において、本発明は配列番号４の２３−４７３残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％同一な配列を含む又はから成るアミノ酸配列を有する単離ＭｔｒＥタンパク質に関する。追加実施例において、本発明は配列番号４の２３−１６１残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％同一な配列を含む又はから成るアミノ酸配列を有する単離ＭｔｒＥタンパク質に関する。さらなる追加実施例において、本発明は配列番号４の１１２−１２４残基と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及び１００％同一な配列を含む又はから成るアミノ酸配列を有する単離ＭｔｒＥタンパク質に関する。
【実施例】
【０１５２】
実施例１−ＭｔｒＥ発現プラスミドの構築
【０１５３】
ｍｔｒＥ発現プラスミドｐＥＴＡＤ−１は既報のｍｔｒＥプラスミドｐＣＲ−ｍｔｒＥ（Warnerら、２００７）をＰＣＲ増幅することにより構築した。フォワードプライマーｏＡＪＤ−３６（ＧＧＣＡＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴＣＣＴＣＡＡＴＡＣＧＡＧＣＡＧＣ）はＢｓｐＨＩ部位（太字で記載）を含み、成熟タンパク質の３残基目（メチオニン）からｍｔｒＥを増幅する。リバースプライマーｏＡＪＤ−１８（ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＧＣＣＧＧＴＴＴＧＧＧＴＡＴＣＣＣ）はＮｏｔＩ部位（太字で記載）を含み、最終残基（残基４４７、リジン）からｍｔｒＥを増幅する。ＰＣＲはＴａｑポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて行い、得られたＰＣＲ産物をｐＥＴ２８ｂ＋（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に挿入し、発現型プラスミドｐＥＴＡＤ−１を構築した。ｐＥＴＡＤ−１はアミノ末端のシグナル配列を欠損し、制限酵素切断部位を設けるためＣ末端の６−ヒスチジンタグの直前にｐＥＴ２８ｂ＋由来の５残基が追加された組み換え型ＭｔｒＥタンパク質をＴ７プロモーター制御化にコードしている（Ｃ末端配列：ＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨ）。
【０１５４】
ｐＥＴＡＤ−２（Ｎ末端欠損組み換え型ＭｔｒＥ）及びｐＥＴＡＤ−３（Ｃ末端欠損組み換え型ＭｔｒＥ）発現ベクターを前記の方法に従い構築した。フォワードプライマーｏＡＪＤ−３６（前記）及びＮｏｔＩ部位（太字で記載）を含むリバースプライマーｏＡＪＤ−３７（ＡＴＡＧＴＴＴＡＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＣＧＣＴＧＧＣＡＡＡＡＴＡＧＣＣ）を用いてＰＣＲ増幅し、ｐＥＴＡＤ−２を構築した。得られた構築プラスミドは６−ヒスチジンタグを含むＣ末端配列ＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨと融合した組み換え型欠損ＭｔｒＥ（残基３−１３５）をコードしている。ＮｃｏＩ部位（太字で記載）を含むフォワードプライマーｏＡＪＤ−３８（ＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＧＣＡＧＣＧＴＣＧＧＴＡＣＧＧＧ）及びリバースプライマーｏＡＪＤ−１８（前記）を用いたＰＣＲ増幅によりｐＥＴＡＤ−３を構築した。得られた構築プラスミドは６−ヒスチジンタグを含むＣ末端配列ＡＡＡＬＥＨＨＨＨＨＨと融合した組み換え型欠損ＭｔｒＥ（残基２９３−４４７）をコードしている。
【０１５５】
様々な長さの組み換え型ＭｔｒＥをコードするその他全てのベクターはＰＣＲ増幅及び市販のベクターを用いて前記と類似の方法で構築される。ｐＥＴＡＤベクターの発現宿主はＢＬ２１（ＤＥ３）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を含むがこれに限定されない市販の大腸菌株を用いた。
【０１５６】
実施例２−ＭｔｒＥ−ＰｏｒＢ発現プラスミドの構築
【０１５７】
ＭｔｒＥ−ＰｏｒＢ融合タンパク質はポリンループ配列をプライマーにコードするＧｅｎｅ  ＳＯＥｉｎｇ（Hortonら、１９９０）の技術を用いて作製する。ｍｔｒＥコード配列はアウトサイドプライマーｏＡＪＤ−３６及びｏＡＪＤ−１８を用い、２段階ＰＣＲ法にてｐＣＲ−ｍｔｒＥプラスミド（Warnerら、２００７）より増幅する。ＰｏｒＢループ配列はＭｔｒＥの予測ループ領域の表面露出部位の形態を損なわないような方法で、何れかのループ領域内に導入する。いくつかの構築では、組み換え型ＭｔｒＥタンパク質のＮ末端にＰｏｒＢループ配列を付加した。また、いくつかの構築では、組み換え型ＭｔｒＥタンパク質のＣ末端にＰｏｒＢループ配列を付加した。さらにいくつかの構築では、組み換え型ＭｔｒＥタンパク質内部にＰｏｒＢループ配列を挿入した。
【０１５８】
ＭｔｒＥタンパク質に導入するＰｏｒＢループ配列の例を上記の表６に示す。
【０１５９】
実施例３−組み換え型タンパク質の発現と精製
【０１６０】
組み換え型ＭｔｒＥタンパク質は３０μｇ／ｍｌカナマイシンを添加した４００ｍｌのＮＺＣＹＭ培地（ｐＨ７．０）を含む振とうフラスコを用いて発現させた。培養液の６００ｎｍ吸光度が０．６から０．９に達した時点でＩＰＴＧ（イソプロピル−β−ｄ−チオガラクトピラノシド）を０．５ｍＭまで添加した。発現は２５℃で終夜（〜１８時間）行った。発現誘導後、１０，０００ｘｇ、１０分間、４℃にて遠心分離し、細菌沈渣を得た。そして、細胞沈渣は終夜−８０℃で保管した。
【０１６１】
氷上で沈渣を溶解し、沈渣重量に対してＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を５ｍｌ／ｇｒａｍ加え懸濁してＭｔｒＥを精製した。リゾチーム（Ｓｉｇｍａ）０．５ｍｇ／ｍｌ、ベンゾナーゼ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）１μｌ／ｍｌ及びプロテアーゼ阻害剤（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を添加した懸濁液は振とう器上で２０−３０分間、室温にてインキュベートした。１６，０００ｘｇ、２０分間、４℃にて遠心分離し、不溶性の細片／タンパク質を取り除いた。可溶性のＭｔｒＥを精製するため上清を取り除き、沈渣は不溶性のＭｔｒＥの精製のため−８０℃で保管した。
【０１６２】
上清にＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を添加し、結合用緩衝液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭイミダゾール；ｐＨ８．０）で平衡化後、６０分間、４℃で振とうさせながらインキュベートして、可溶性ＭｔｒＥを精製した。結合したタンパク質をベッド体積の２０倍の洗浄用緩衝液（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭイミダゾール；ｐＨ８．０）で２回洗浄後、溶出した（３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２００ｍＭイミダゾール；ｐＨ８．０）。全ての緩衝液は０．７％ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−Ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を含んでいた。精製後、タンパク質は緩衝液交換脱塩カラム（Ｐｉｅｒｃｅ）に供した後、ＰＢＳ＋０．７％ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−Ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ中、−２０℃で保管した。タンパク質濃度は当該タンパク質の吸光係数を用いてＮａｎｏｄｒｏｐにて測定した。
【０１６３】
氷上で前記の不溶性の細片／タンパク質沈渣を溶解し、ＭｔｒＥを封入体（不溶性ＭｔｒＥ）から精製した。沈渣に対して５ｍｌ／ｇｒａｍのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で懸濁した。リゾチーム（０．５ｍｇ／ｍｌ）及びプロテアーゼ阻害剤（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を添加し、懸濁液を室温で５分間インキュベートした。インキュベーション後、６倍量の１０倍希釈したＢｕｇＢｕｓｔｅｒを添加し、得られた溶液を１６，０００ｘｇ、１５分間、４℃で遠心分離した。上清を取り除き、再懸濁及び遠心分離をさらに２回繰り返した。得られた封入体を６ＭＧｕ−ＨＣＬに懸濁し、タンパク質を変性させた。１段階透析法にてＭｔｒＥをリフォールディングした。変性タンパク質は６Ｍ  Ｇｕ−ＨＣＬで２倍希釈し、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（分画分子量２０ｋ）透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ）に添加し、１００倍超の結合用緩衝液＋０．７％ｎ−Ｄｏｄｅｃｙｌ−β−Ｄ−Ｍａｌｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅに対して４℃で終夜、透析した。緩衝液を一度交換し、１２，０００ｘｇ、１０分間、４°℃で遠心分離し沈殿物を除去した。終夜の透析後、遠心分離により再度、沈殿物を除去し、前記の可溶性ＭｔｒＥ精製用プロトコール及び緩衝液を用いてＮｉ−ＮＴＡ樹脂（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にタンパク質を結合させた。
【０１６４】
実施例４−免疫化
【０１６５】
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を１０〜３０μｇ／マウスの可溶性又は不溶性の何れかの分画由来の精製ＭｔｒＥで皮下（ＳＱ）（全身性免疫）又は鼻腔内（ＩＮ）（粘膜性免疫）の何れかの方法で免疫化した。以下の補助剤を用いた：ＴｉｔｅｒＭａｘ  Ｇｏｌｄ（ＣｙｔＲｘ）（ＳＱのみ）、油中水型補助剤（投与量：≧総免疫化体積の５０％）；モノホスホリルＡ（ＭｐｌＡ）、ヒトへの使用が認められているＴＬＲ４作動薬（投与量：２５μｇ／マウス）；コレラ毒素（ＣＴ）、強力な粘膜補助剤（投与量：１μｇ／マウス）。もちろん、その他の補助剤を使用してもよく、ＩＬ−１２、ＣｐＧ（ＯＤＮ１８２６）、イミダゾキノリン化合物３Ｍ−０１９、ＭＰ７、レシキモド（Ｒ８４８）が含まれるがこれらに限定されない。
【０１６６】
実施例５−表面に露出していると予測されるＭｔｒＥループに対する抗血清の作製
【０１６７】
表面に露出しているＭｔｒＥループの配列は以下のように推測されている。外膜タンパク質であるＴｏｌＣ（大腸菌）及びＯｐｒＭ（緑膿菌）は機能的にＭｔｒＥと類似しており、２つの表面露出型のループを形成するとされている。ＭｔｒＥの推定アミノ酸配列は緑膿菌と最も関係性が深いので、ＯｐｒＭの表面に露出している２つのループの近傍に位置する４つの膜貫通領域と相同性のある領域をＭｔｒＥの推定アミノ酸配列内で探した。ＯｐｒＭのＴＭ配列Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３およびＳ４と相同性のある４つの領域がＭｔｒＥに見つかり、ＭｔｒＥタンパク質の介在配列［ＧＳＬＳＧＧＮ（予測表面ループ１、アミノ酸１１２−１１８）及びＧＳＶＧＴＧＳＶＥＬＧＧＬＦＫＳＧＴＧＶ（予測表面ループ２；アミノ酸３１３−３３２）］は表面に露出している可能性があることが分かった。これらの予測はｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析の予測構造からも支持された。これらの領域に対応する直鎖ペプチドに対するアフィニティ−精製ウサギ抗体を企業に作製依頼し（Ｂｅｔｈｙｌ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、得られた抗血清の特異性をウエスタンブロット法にて確認した。
【０１６８】
実施例６−殺菌性評価
【０１６９】
ＭｔｒＥで免疫されたマウスの後眼窩から採血した血清を用い、既報（Cole及びJerse、２００９）に従い殺菌性評価を行った。補体源としてヒト通常血清（ＮＨＳ）を下記の濃度で使用した：淋菌性株ＦＡ１０９０、４％；ＦＡ１９株、１０％；ＭＳ１１株、１％；ＲＤ−１（ＭｔｒＥ−）株、１０％。対照には熱失活させたＮＨＳを用いた。評価は３つ１組で行い、５０％の細菌を死滅させる抗ＭｔｒＥ血清の希釈率を記録した。
【０１７０】
実施例７−表面結合
【０１７１】
ＭｔｒＥ特異的マウス抗体が淋菌表面を認識するのか精査するため、フローサイトメトリー法を用いた。簡略的には、野生型及びＭｔｒＥ欠損Ｎ．ゴノレア株を対数増殖期中期まで増殖させ、１．２μｍフィルターにて濾過した。細菌を９６穴プレートに添加し、１５００ＲＰＭで遠心分離にかけた。細菌は室温で１時間、血清に懸濁させた。（５０〜１００倍希釈）。細菌を１％ＢＳＡ（免疫グロブリン非含有、Ｓｉｇｍａ）で洗浄し、Ａｌｅｘａ４８８結合抗マウス二次抗体（２５０倍、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に３０分間懸濁した。そして細菌を前記の方法で洗浄し、１００μｌ  ＨＢＳＳ２＋に再懸濁した後、４％パラホルムアルデヒドを添加した。マウス通常血清を表面結合の対照として用いた。サンプルはＢＤ  ＬＳＲＩＩ血球計算器で測定した。
【０１７２】
実施例８−排出ポンプ機能の阻害
【０１７３】
ＭｔｒＥ特異的抗血清がＭｔｒＣＤＥ排出ポンプ機能を遮断してヒトカテリシジンＬＬ３７（ｈＬＬ３７）の殺菌効果に対するＮ．ゴノレアの感受性を上昇させられるかを精査するため、細菌を最小必須培地（ＭＥＭ）に懸濁後、ＭＥＭのみ又は徐々に濃度を下げたループ１−若しくはループ２−ペプチド（２．５ｘ１０５ＣＦＵ／チューブ）に対する抗血清を含むＭＥＭの入ったエッペンドルフチューブに加えた。陰性対照には淋菌性Ｏｐａタンパク質の半可変的（ＳＶ）ループ（ＯＰａＳＶ）（Cole及びJerse、２００９）に対応するペプチドに対する抗血清を用いた。３７℃で２０分間インキュベーションした後、ｈＬＬ３７を徐々に濃くなる濃度（０から１２．５ｕｇ／ｍｌ）で含んでいるマイクロタイタープレートに細菌懸濁液を分注した；１ウェルあたりの最終細菌濃度は３ｘ１０４ＣＦＵとした。マイクロタイタープレートを３７℃で１時間インキュベートした後、一定体積のＧＣＢを添加し得られた最終懸濁液のうち２５μｌをＧＣ寒天培地に植え付けた。終夜インキュべート後、各ｈＬＬ３７濃度にて得られたＣＦＵ数を測定した。
【０１７４】
実施例９−ＭｔｒＥ−ポリン発現プラスミドの構築
【０１７５】
ＰｏｒＢのループ８ＡとＭｔｒＥのループ１が結合したＭｔｒＥ−ポリン融合タンパク質はＭｔｒＥ−ＰｏｒＢ発現プラスミドを構築した方法に従い作製した。ポリンＰ１Ａ８ａ配列をポリンエピトープがＭｔｒＥの最初の予測表面露出領域と結合する残基９６に導入した。組み換え型タンパク質は前記の実施例３に記載した方法にて発現及び精製した。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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