(57)【要約】  本発明は、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体およびその製造方法に関し、より詳細には、二本鎖オリゴＲＮＡの生体内安定性を向上させ、細胞伝達効率を改善するために、二本鎖オリゴＲＮＡに高分子化合物を共有結合により連結した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体および前記構造体の製造方法に関する。本発明により最適化した構造を有する二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、二本鎖オリゴＲＮＡの機能が阻害されず、二本鎖オリゴＲＮＡの安定性および細胞膜透過性を効率よく向上させることができ、これにより、比較的低い濃度の投与量でも二本鎖オリゴＲＮＡを細胞内に伝達することができ、ガンおよび感染性疾病などにおいて、二本鎖オリゴＲＮＡ治療用ツールだけでなく、新たな形態の二本鎖オリゴＲＮＡ伝達システムとしても有効に使用されることができる。
2015508998.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（１）の構造を有する二本鎖オリゴＲＮＡ構造体；
【化１】
2015508998.tif 000010
（前記式（１）中、ＡとＢのいずれか一つは親水性物質であり、他の一つは疎水性物質であり、ＸとＹは、それぞれ独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ＡＳは、二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖である）。
【請求項２】
下記式（３）のように二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖の５’末端に疎水性物質が結合し、３’末端に親水性物質が結合した形態の請求項１に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体；
【化２】
2015508998.tif 000011
（前記式（３）中、Ａは、疎水性物質であり、Ｂは、親水性物質であり、ＸとＹは、それぞれ独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ＡＳは、二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖である）。
【請求項３】
前記二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖は、１９〜３１個のヌクレオチドからなる請求項１に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項４】
前記ヌクレオチドは、一つ以上のヌクレオチド内の糖構造の２’炭素位置で‐ＯＨ基が‐ＣＨ３（メチル）、‐ＯＣＨ３、‐ＮＨ２、‐Ｆ、‐Ｏ‐２‐メトキシエチル‐Ｏ‐プロピル、‐Ｏ‐２‐メチルチオエチル、‐Ｏ‐３‐アミノプロピル、‐Ｏ‐３‐ジメチルアミノプロピル、‐Ｏ‐Ｎ‐メチルアセトアミドまたは‐Ｏ‐ジメチルアミドオキシエチルへの置換による修飾；ヌクレオチド内の糖構造内の酸素が硫黄で置換された修飾；及びヌクレオチドの間の結合のホスホロチオエートまたはボラノリン酸、メチルホスホネート結合への修飾が一つまたは二つ以上組み合わされた修飾か、ＰＮＡ、ＬＮＡまたはＵＮＡ形態への修飾を含む請求項３に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項５】
前記二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端にリン酸基が結合されていることを特徴とする請求項１に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項６】
前記アンチセンス鎖の５’末端に結合するリン酸基は１〜３個であることを特徴とする請求項５に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項７】
前記疎水性物質の分子量は２５０〜１，０００であることを特徴とする請求項１に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項８】
前記疎水性物質はステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、１２〜５０個の炭素数を含む不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質及びリポポリアミンからなる群より選択されることを特徴とする請求項７に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項９】
前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメートおよびコレスタニルアミンからなる群より選択されることを特徴とする請求項８に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１０】
前記グリセリド誘導体は、モノ‐、ジ‐およびトリ‐グリセリドから選択されることを特徴とする請求項８に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１１】
前記親水性物質の分子量は２００〜１０，０００であることを特徴とする請求項１に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１２】
前記親水性物質はポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１１に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１３】
前記共有結合は、非分解性結合または分解性結合であることを特徴とする請求項１に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１４】
前記非分解性結合はアミド結合またはリン酸化結合であることを特徴とする請求項１３に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１５】
前記分解性結合はジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とする請求項１３に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１６】
前記二本鎖オリゴＲＮＡはサバイビンのｍＲＮＡ配列に特異的に結合することを特徴とする請求項１に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１７】
前記サバイビンのｍＲＮＡ配列に特異的に結合する二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖は５’‐ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＡＵＣ  ＡＡＣ  ＡＵＵ  ＵＵＣ  Ａ‐３’（配列番号１）の配列を有することを特徴とする請求項１６に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１８】
請求項１〜１７の何れか一項に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の親水性物質にリガンドが結合されていることを特徴とするリガンドが結合された二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項１９】
前記リガンドは受容体を介したエンドサイトーシスにより標的細胞内在化を増進させる受容体と特異的に結合する特性を有することを特徴とする請求項１８に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項２０】
前記リガンドは標的特異的に結合して受容体を介したエンドサイトーシスをする標的特異的な抗体、アプタマ、ペプチドまたは受容体特異的化学物質からなる群より選択されることを特徴とする請求項１９に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項２１】
前記受容体特異的化学物質は、葉酸、Ｎ‐アセチルガラクトサミン、マンノースから選択されることを特徴とする請求項２０に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体。
【請求項２２】
（１）親水性物質が結合した固形支持体をベースとし、ＲＮＡ一本鎖を合成する段階と、
（２）前記親水性物質が結合したＲＮＡ５’末端に疎水性物質を共有結合する段階と、
（３）固形支持体からＲＮＡ‐高分子構造体を分離する段階と、
（４）前記ＲＮＡ‐高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングして二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を形成する段階と、
を含む二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造方法。
【請求項２３】
前記段階（１）のＲＮＡ一本鎖と相補的な配列を有するＲＮＡ一本鎖は５’末端にリン酸基が結合されていることを特徴とする請求項２２に記載の製造方法。
【請求項２４】
（１）官能基が結合している固形支持体をベースとし、ＲＮＡ一本鎖を合成する段階と、
（２）段階（１）で得られた物質に親水性物質を共有結合する段階と
（３）段階（２）で得られた物質を固形支持体から分離する段階と、
（４）段階（３）で得られた物質の３’末端に結合した官能基により疎水性物質を共有結合する段階と、
（５）段階（４）で得られた物質と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングして二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を形成する段階と、
を含む二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造方法。
【請求項２５】
前記段階（１）のＲＮＡ一本鎖と相補的な配列を有するＲＮＡ一本鎖は５’末端にリン酸基が結合されていることを特徴とする請求項２４に記載の製造方法。
【請求項２６】
請求項１〜１７の何れか一項に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子。
【請求項２７】
請求項１８に記載のリガンドが結合された二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子。
【請求項２８】
請求項１〜１７の何れか一項に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を含む薬剤学的組成物。
【請求項２９】
請求項１８のリガンドが結合された二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を含む薬剤学的組成物。
【請求項３０】
請求項２６に記載のナノ粒子を含む薬剤学的組成物。
【請求項３１】
請求項２７に記載のナノ粒子を含む薬剤学的組成物。
【請求項３２】
請求項１〜１７の何れか一項に記載の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を用いた生体内または生体外における遺伝子発現調節方法。
【請求項３３】
請求項２６に記載のナノ粒子を用いた生体内または生体外における遺伝子発現調節方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガンおよび感染性疾病などの治療に有効に使用されることができる化学的に合成された高効率の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体に関する。
【０００２】
前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、細胞内に効率よく伝達されるために、二本鎖ＲＮＡの両末端に親水性物質および疎水性物質を単純共有結合またはリンカー媒介（linker-mediated）共有結合により接合した形態の構造を有しており、水溶液で前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の疎水性相互作用によってナノ粒子の形態に転換することができる。
【０００３】
また、本発明は、前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を含む薬剤学的組成物、前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造方法および前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を用いた二本鎖オリゴＲＮＡ伝達技術に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＲＮＡ干渉（RNA interference、以下、「ＲＮＡｉ」とする）は、その機能が発見されてから各種の哺乳動物細胞（mammalian cell）から配列特異的にｍＲＮＡに作用するという事実が明らかになった（Silence of the transcripts; RNA interference in medicine. J. Mol. Med., 2005, 83; 764-773）。
【０００５】
長鎖のＲＮＡ二本鎖が細胞に伝達されると、伝達されたＲＮＡ二本鎖は、Ｄｉｃｅｒというエンドヌクレアーゼ（endonuclease）によって２１〜２３塩基対（base pair、ｂｐ）からなる低分子干渉ＲＮＡ（small interfering RNA、以下、「ｓｉＲＮＡ」とする）に変換される。ｓｉＲＮＡは、１９〜２７塩基の低分子二本鎖ＲＮＡであって、ＲＩＳＣ（RNA-induced silencing complex）に結合してガイド（アンチセンス）鎖が標的ｍＲＮＡを認識して分解する過程により、標的遺伝子の発現を配列特異的に阻害する（Nucleic-acid therapeutics; basic principles and recent applications. Nature Reviews Drug Discovery. 2002.1, 503-514）。
【０００６】
外部から伝達された長鎖のＲＮＡ二本鎖は、哺乳動物細胞でインターフェロン（interferon）発現により非配列特異的な免疫反応を誘発する問題があるが、これは、短鎖のｓｉＲＮＡにより解消することができるという事実が明らかになった（Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001. 411, 494-498）。
【０００７】
化学的に合成されたｓｉＲＮＡは、大体、約１９〜２７塩基対の二本鎖であり、３’末端部位において２‐ｎｔ（nucleotide）オーバーハング（overhang）構造からなっており、ｓｉＲＮＡ二本鎖が活性を示すための３’水酸基（ＯＨ、hydroxyl group）と５’リン酸基（ＰＯ４、phosphate group）からなる構造が知られている（Effect of asymmetric terminal structures of short RNA duplexes on the RNA interference activity and strand selection. Nucleic Acids Res 1 October 2008; 5812-5821; Strand-specific 5’-O-methylation of siRNA duplexes controls guide strand selection and targeting specificity. RNA 1 February 2008; 263-274）。
【０００８】
商用化した合成ｓｉＲＮＡは、両末端に水酸基を有する構造であり、合成ｓｉＲＮＡが細胞内に伝達されると、リン酸化酵素によってｓｉＲＮＡ５’末端がリン酸化して、ｓｉＲＮＡの機能を示すと知られている（siRNA function in RNAi; A chemical modification analysis. RNA 2003. 9; 1034-1048）。
【０００９】
バートランド（Bertrand）研究チームの研究によると、同じ標的遺伝子に対して、アンチセンスオリゴヌクレオチド（Antisense oligonucleotide、ＡＳＯ）に比べてｓｉＲＮＡの方が、生体内／外におけるｍＲＮＡ発現の阻害効果に優れ、当該効果を長く保つ効果を奏することが明らかになった（Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. 296; 1000-1004）。
【００１０】
また、ｓｉＲＮＡの作用メカニズムは、標的ｍＲＮＡと相補的に結合して配列特異的に標的遺伝子の発現を調節するため、既存の抗体をベースとする医薬品や化学物質（小分子薬剤）に比べて適用可能な対象が著しく拡大されることができるという利点を有する（Progress Towards in vivo Use of siRNAs. MOLECULAR THERAPY. 2006 13(4); 664-670）。
【００１１】
上述の優れた効果および様々な使用範囲を有するｓｉＲＮＡが治療剤として開発されるためには、ｓｉＲＮＡの安定性および細胞伝達効率を改善して、ｓｉＲＮＡが標的細胞に効果的に伝達されるようにする必要がある（Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov Today. 2006 Jan; 11(1-2);67-73）。
【００１２】
また、ｓｉＲＮＡが依然として非特異的な細胞免疫反応（innate immune stimulation）を有しており、これを解消するために２‐メトキシ、２フルオロ置換体が開発された。
【００１３】
ｓｉＲＮＡは、負電荷を帯びており、疎水性の細胞のリン脂質二重層を通過することができないため、単純拡散による細胞内伝達が困難である。
【００１４】
生体内または生体外においてｓｉＲＮＡの伝達効率を高めるために多種の細胞伝達物質が開発された。通常、リポソーム、カチオン系界面活性剤などが多く使用されており、リポソームに遺伝子を融合する方法やカチオンを有する脂質や高分子を用いた方法などの担体を用いた方法、またはｓｉＲＮＡを化学的に修飾するか、接合体（conjugate）を利用する方法が知られている（Mechanisms and strategies for effective delivery of antisense and siRNA oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2008 Jul; 36(12);4158-71）。
【００１５】
ｓｉＲＮＡは、負電荷を帯びており、疎水性の細胞のリン脂質二重層を通過することができず、単純拡散による細胞内伝達が困難であるため、これを解消するために、ｓｉＲＮＡの結合基本構造としてメチルホスホネート（methylphosphonate）やＰＮＡ（peptide nucleic acid）を使用することもある。リポソームに遺伝子を融合する方法やカチオンを有する脂質や高分子を用いた方法などの担体を用いた方法がある（Chemically modified siRNA; tools and applications. Drug Discov. Today. 2008 Oct; 13(19-20);842-855）。
【００１６】
このうち、ナノ担体（nanocarrier）を用いる方法として、リポソーム、カチオン高分子複合体などの様々な高分子を使用する方法は、ナノ粒子の形成によりｓｉＲＮＡをナノ担体（nanocarrier）に乗せて細胞にｓｉＲＮＡを伝達するものである。ナノ担体を用いる方法のうち主に活用される方法は、高分子ナノ粒子（polymeric nanoparticle）、高分子ミセル（polymer micelle）、リポプレックス（lipoplex）を用いる方法などが挙げられるが、このうち、リポプレックスを用いた方法は、カチオン性脂質からなり、細胞のエンドソーム（endosome）のアニオン性脂質と相互作用して、エンドソームの脱安定化効果をもたらし、細胞内に伝達する機能を果たす（Mechanism of oligonucleotide release from cationic liposomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996 Oct 15; 93(21);11493-8）。
【００１７】
また、ｓｉＲＮＡパッセンジャー（passenger；センス（sense））鎖の末端部位に化学物質などを連結して、増進した薬動態学（pharmacokinetics）的特徴を有するようにして、生体内で高い効率を誘導することができると知られている（Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. 2004 Nov11; 432(7014);173-8）。この際、ｓｉＲＮＡセンス（sense；パッセンジャー（passenger））またはアンチセンス（antisence；ガイド（guide））鎖の末端に結合した化学物質の性質に応じてｓｉＲＮＡの安定性が異なる。例えば、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）のような高分子化合物が接合した形態のｓｉＲＮＡは、カチオン性物質が存在する条件下でｓｉＲＮＡのアニオン性リン酸基と相互作用を行い複合体を形成することで、改善したｓｉＲＮＡ安定性を有する担体となる（Local and systemic delivery of VEGF siRNA using polyelectrolyte complex micelles for effective treatment of cancer. J Control Release. 2008 Jul 14; 129(2);107-16）。特に、高分子複合体からなるミセル（micelle）は、薬物伝達の担体として使用される他のシステムである微小球体（microsphere）またはナノ粒子（nanoparticle）などに比べて、その大きさが極めて小さいながらも極めて一定に分布され、自発的に形成される構造を有することで、製剤の品質管理および再現性確保が容易であるという利点がある。
【００１８】
近年、ｓｉＲＮＡの細胞内伝達効率性を向上させるために、ｓｉＲＮＡに生体適合性高分子である親水性物質（例えば、ポリエチレングリコール）を単純共有結合またはリンカー媒介共有結合で接合したｓｉＲＮＡ接合体により、ｓｉＲＮＡの安定性確保および効率的な細胞膜透過性のための技術が開発された（韓国登録特許第８８３４７１号公報参照）。
【００１９】
しかし、ｓｉＲＮＡの化学的修飾およびポリエチレングリコールの接合（PEGylation）だけでは、生体内における安定性が低く、標的臓器への伝達がスムーズでないという欠点が依然として存在する。ｓｉＲＮＡの化学的修飾の際に、ＲＩＳＣに結合して標的ｍＲＮＡを認識するアンチセンス（ガイド）鎖の５’末端に修飾を加えないことがＲＮＡｉメカニズムの開始において非常に重要であり、センス（パッセンジャー）鎖は、既存の研究により両末端のすべてに接合体が結合した場合にもｓｉＲＮＡの機能が確認されて、センス（パッセンジャー）鎖が接合体の結合に活用された（siRNA Conjugate Delivery Systems. Bioconjugate Chem., 2009, 20(1), pp 5-14）。
【００２０】
二本鎖オリゴＲＮＡに親水性および疎水性物質が結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、疎水性物質の疎水性相互作用によって自己組織化ナノ粒子を形成し、前記の自己組織化ナノ粒子を「ＳＡＭｉＲＮＡ」とする（韓国特開２００９‐００４２２９７号公報）。
【００２１】
前記二本鎖オリゴＲＮＡにおいて疎水性および親水性物質を核酸の末端に結合して自己組織化ナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）を形成する技術は、二本鎖オリゴＲＮＡストランドバイアス（strand bias）、すなわち、親水性および疎水性物質が結合した位置に応じてＲＮＡｉ機能が阻害されうる可能性がある。したがって、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の最適化により二本鎖オリゴＲＮＡの機能が阻害されず、効率よく細胞膜を透過できる二本鎖オリゴＲＮＡ伝達技術の開発が必然的に求められる。
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、自己組織化ナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡの生体内効率を極大化できる構造を提供するためのものである。本発明におけるＳＡＭｉＲＮＡは、二本鎖オリゴＲＮＡの末端に親水性および疎水性物質が結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体において疎水性物質間の疎水性相互作用により形成されたナノ粒子を意味する。
【００２３】
本発明の目的は、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体に結合した親水性および疎水性物質の位置に応じてＲＮＡｉの機能が異なることを究明し、これにより、ＳＡＭｉＲＮＡを形成する二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の最適化によってＲＮＡｉ機能が極大化したＳＡＭｉＲＮＡ伝達技術を提供することにある。
【００２４】
本発明による二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、細胞内への伝達を容易にする親水性および疎水性物質を単純共有結合またはリンカー媒介共有結合により結合した形態を有しており、水容液上でナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）に自己組織化する能力を有することで、ガンおよび感染性疾病などの治療に有効に使用されることができる高効率のＲＮＡ阻害剤として使用されることができ、かかる二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を含む疾病治療用薬剤学的組成物の形態で使用されることができる。特に、低い濃度のＳＡＭｉＲＮＡ投与量でも高効率のＲＮＡ阻害活性を示すことができ、ガンおよび感染性疾病などの治療剤として有効に使用されることができる。
【００２５】
特に、本発明による前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、ナノ粒子型合成オリゴＲＮＡ阻害剤であるＳＡＭｉＲＮＡを用いており、生体内で最適の活性を有するようにＳＡＭｉＲＮＡにおいて親水性および疎水性物質の結合とアンチセンス鎖の５’リン酸化により遺伝子特異的にＲＮＡ阻害を行うにあたり、その効率を極大化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）の模式図である。
【図２】Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＰＯ４のアンチセンス鎖の製造結果を示す図であり、（Ａ）は、配列番号１と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖（青，Ｍ．Ｗ．６５９３．１）のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ  ＭＳ分析結果を示すものであり、（Ｂ）は、配列番号１と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖の５’末端に一つのリン酸基が結合した形態（赤，Ｍ．Ｗ．６６７３．１）のＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ  ＭＳ分析結果を示すものであり、（Ｃ）は、配列番号１と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖のリン酸基結合によるＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ  ＭＳ比較グラフであって、リン酸基が結合していない配列（青）の測定値と比較して、リン酸基が一つ結合した場合（赤）の測定値が、リン酸基の分子量（約ＭＷ８０）だけ増加したことを示すものである。
【図３】本発明による最適化した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体のナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）の物性分析結果を示す図であり、（Ａ）は、ナノ粒子の大きさおよび多分散指数（Polydispersity index、ＰＤＩ）のグラフであり、（Ｂ）は、ナノ粒子の臨界ミセル濃度のグラフであり、（Ｃ）は、ナノ粒子の電子顕微鏡写真である。
【図４】ＨｅＬａ細胞株に二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）を処理して、標的遺伝子の発現阻害効果を定量リアルタイムＰＣＲ（Quantitative real time PCR）により確認したグラフである。
【図５】ＨｅＬａ細胞株に二本鎖オリゴＲＮＡ構造体をトランスフェクション（transfection）物質とともに処理して、標的遺伝子の発現阻害効果を定量リアルタイムＰＣＲにより確認したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下、本発明についてより詳細に説明する。
【００２８】
本発明は、下記式（１）の構造を有する、化学物質が結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を提供する。
【化１】
2015508998.tif 000003
（前記式（１）中、ＡとＢのいずれか一つは親水性物質であり、他の一つは疎水性物質であり、ＸとＹは、それぞれ独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ＡＳは、二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖である。ＳとＡＳは、互いに相補的結合により二本鎖構造をなし、前記相補的結合は、必ずしも完璧な相補的（perfect match）結合である必要はなく、一部の配列が相違する場合（mismatch）であってもよい。）
【００２９】
また、本発明は、下記式（２）の構造を有する二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を提供する。
【化２】
2015508998.tif 000004
（前記式（２）中、ＡとＢのいずれか一つは親水性物質であり、他の一つは疎水性物質であり、ＸとＹは、それぞれ独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ｐＡＳは、ＲＮＡの５’末端部位にリン酸基が結合した二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖である。この際、５’末端部位にリン酸基が一つから三つまで結合していてもよい。）
【００３０】
本発明の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体において、前記二本鎖オリゴＲＮＡ鎖は、１９〜３１個のヌクレオチドからなることが好ましい。本発明において使用可能な二本鎖オリゴＲＮＡとしては、遺伝子治療用または研究用に使用されるか使用可能性のあるいかなる遺伝子に対する二本鎖オリゴＲＮＡが採択されてもよい。
【００３１】
前記二本鎖オリゴＲＮＡは、生体内安定性を向上させるために、核酸分解酵素抵抗性を付与し、非特異的免疫反応を減少させるための様々な修飾がなされた形態を有してもよく、前記修飾は、一つ以上のヌクレオチド内の糖構造の２’炭素位置で‐ＯＨ基が‐ＣＨ３（メチル）、‐ＯＣＨ３（メトキシ）、‐ＮＨ２、‐Ｆ（フッ素）、‐Ｏ‐２‐メトキシエチル‐Ｏ‐プロピル、‐Ｏ‐２‐メチルチオエチル、‐Ｏ‐３‐アミノプロピル、‐Ｏ‐３‐ジメチルアミノプロピル、‐Ｏ‐Ｎ‐メチルアセトアミドまたは‐Ｏ‐ジメチルアミドオキシエチルへの置換による修飾、ヌクレオチド内の糖構造内の酸素が硫黄で置換された修飾、ヌクレオチド結合のホスホロチオエートまたはボラノリン酸、メチルホスホネート結合への修飾などにおいて一つまたは二つ以上組み合わされて使用されてもよく、ＰＮＡ（peptide nucleic acid）、ＬＮＡ（locked nucleic acid）またはＵＮＡ（unlocked nucleic acid）形態への修飾が使用されてもよい（Ｃｒｏｏｋｅなど、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．５５；ｐｐ６１−６５  ２００４、米国特許第５，６６０，９８５号、米国特許第５，９５８，６９１号、米国特許第６，５３１，５８４号、米国特許第５，８０８，０２３号、米国特許第６，３２６，３５８号、米国特許第６，１７５，００１号、Ｂｒａａｓｃｈ  Ｄ．Ａ．など、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４；１１３９-１１４３，２００３；Ｃｈｉｕ  Ｙ．Ｌ．など、ＲＮＡ，９；１０３４−１０４８，２００３；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ  Ｍ．など、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３１；５８９-５９５、２００３，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，Ｖｏｌ．３８，Ｎｏ．１７５７６１−５７７３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，Ｖｏｌ．３９，Ｎｏ．５１８２３‐１８３２参照）。
【００３２】
前記疎水性物質は、疎水性相互作用を起こし、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）を形成する機能を果たす。前記疎水性物質の中でも特に炭素鎖やコレステロールの場合、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の合成段階において優れた結合能を有しており、本発明の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造において非常に好適である。
【００３３】
また、前記疎水性物質は、分子量が２５０〜１，０００であることが好ましい。
【００３４】
特に、前記疎水性物質としては、ステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、炭化水素鎖の場合、１２〜５０個の炭素数を含む不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質、リポポリアミンなどが使用されてもよく、これに制限されず、本発明の目的に適合するものであれば、いかなる疎水性物質を使用してもよい点は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者にとっては自明なことである。
【００３５】
特に、前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメートおよびコレスタニルアミンからなる群から選択されてもよく、前記グリセリド誘導体は、モノ‐、ジ‐およびトリ‐グリセリドなどから選択されてもよく、この際、グリセリドの脂肪酸は、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和脂肪酸であることを特徴とする。
【００３６】
また、前記親水性物質は、分子量が２００〜１０，０００のカチオン性または非イオン性高分子物質であることが好ましく、より好ましくは１，０００〜２，０００の非イオン性高分子物質である。例えば、親水性高分子化合物としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリンなどの非イオン性親水性高分子化合物を使用することが好ましいが、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００３７】
前記親水性物質は、必要に応じて、標的特異的リガンドのような他の物質との結合のために必要な官能基を有するように変更されてもよい。前記親水性物質の中でも特にポリエチレングリコールは、様々な分子量と官能基を導入することができ、生体内親和性が良好で、免疫反応を誘導しないなど、生体適合性（bio‐compatibility）に優れており、二本鎖オリゴＲＮＡの生体内での安定性を増加させ、伝達効率を増加させる点から、本発明の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造において非常に好適である。
【００３８】
また、前記共有結合を媒介するリンカーは、親水性物質（または疎水性物質）と二本鎖オリゴＲＮＡの末端で共有結合し、必要に応じて、特定の環境で分解が可能な結合を提供する限り特に限定されるものではない。したがって、前記リンカーとしては、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造過程中にオリゴＲＮＡおよび／または親水性物質（または疎水性物質）を活性化するために結合するいかなる化合物を使用してもよい。
【００３９】
前記共有結合は、非分解性結合または分解性結合のいずれであってもよい。この際、非分解性結合としてはアミド結合またはリン酸化結合が挙げられ、分解性結合としてはジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合または酵素分解性結合などが挙げられ、必ずしもこれに限定されるものではない。
【００４０】
本発明は、下記式（３）のように二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖の５’末端に疎水性物質が結合し、３’末端に親水性物質が結合した形態の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を提供し、かかる二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する過程は、（１）親水性物質が結合した固形支持体をベースとし、ＲＮＡ一本鎖を合成する段階と、（２）前記親水性物質が結合したＲＮＡ５’末端に疎水性物質を共有結合してＲＮＡ‐高分子構造体を製造する段階と、（３）固形支持体からＲＮＡ‐高分子構造体を分離する段階と、（４）前記ＲＮＡ‐高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングして二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を形成する段階と、を含むことを特徴とする。
【化３】
2015508998.tif 000005
（前記式（３）中、Ａは、疎水性物質であり、Ｂは、親水性物質であり、ＸとＹは、それぞれ独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ＡＳは、二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖である。）
【００４１】
より好ましい具体例は、（１’）固形支持体（solid support）、好ましくは、ＣＰＧをベースとし、親水性物質を結合する段階と、（２’）前記親水性物質が結合した固形支持体（ＣＰＧ）をベースとし、ＲＮＡ一本鎖を合成する段階と、（３’）前記ＲＮＡ一本鎖の５’末端に疎水性物質を共有結合してＲＮＡ‐高分子構造体を製造する段階と、（４’）合成が完了すると固形支持体（ＣＰＧ）からＲＮＡ‐高分子構造体を分離する段階と、（５’）製造されたＲＮＡ‐高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングして二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する段階と、を含むことができる。
【００４２】
前記段階（４）または（５’）の後、製造が完了すると、高速液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography、ＨＰＬＣ）により前記反応物を精製した後、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析装置で分子量を測定して、所望の二本鎖オリゴＲＮＡおよび二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が製造されているか否かを確認することができる。
【００４３】
前記製造方法において、（１）または（２’）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階は、独立した合成過程として（１）または（１’）段階の前に行われてもよく、また、（１）〜（４）段階または（１’）〜（５’）段階のいずれか一つの過程中に行われてもよい。
【００４４】
また、（１）または（２’）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖と相補的な配列を有するＲＮＡ一本鎖は、下記式（４）のように５’末端にリン酸基が結合した形態に用いられることができる。
【化４】
2015508998.tif 000006
（前記式（４）中、Ａは、疎水性物質であり、Ｂは、親水性物質であり、ＸとＹは、それぞれ独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ｐＡＳは、５’末端部位にリン酸基が結合した二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖である。この際、５’末端部位にリン酸基が一つから三つまで結合していてもよい。）
【００４５】
本発明はまた、下記式（５）のようなオリゴＲＮＡのセンス鎖の５’末端に親水性物質が結合し、３’末端に疎水性物質が結合した形態の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を提供し、これを製造する過程は、（１’’）官能基が結合している固形支持体をベースとし、ＲＮＡ一本鎖を合成する段階と、（２’’）段階（１’’）で得られた物質に親水性物質を共有結合する段階と、（３’’）段階（２’’）で得られた物質を固形支持体から分離する段階と、（４’’）段階（３’’）で得られた物質の３’末端に結合した官能基により疎水性物質を共有結合してＲＮＡ‐高分子構造体を製造する段階と、（５’’）段階（４’’）で製造されたＲＮＡ‐高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングして二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を形成する段階と、を含むことができる。
【化５】
2015508998.tif 000007
（前記式（５）中、Ａは、疎水性物質であり、Ｂは、親水性物質であり、ＸとＹは、それぞれ独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ＡＳは、二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖である。）
【００４６】
本発明における官能基は、本発明の目的を達成できるものであればいかなるものでも制限なく使用されてもよく、好ましくは、アミン基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、ビオチン基などから選択されてもよい。
【００４７】
また、疎水性物質が結合した固形支持体をベースとし、ＲＮＡ一本鎖を形成し、これに親水性物質を共有結合してＲＮＡ高分子構造体を製造した後、前記ＲＮＡ一本鎖に相補的な配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングして二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を形成することで二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する方法も可能である。
【００４８】
前記段階（５’’）の後、製造が完了すると、高速液体クロマトグラフィーにより前記反応物を精製した後、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析装置で分子量を測定して、所望の二本鎖オリゴＲＮＡおよび二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が製造されているか否かを確認することができる。
【００４９】
前記製造方法において、（１’’）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階は、独立した合成過程として（１’’）段階の前、または（１’’）〜（５’’）段階のいずれか一つの過程中に行われてもよい。
【００５０】
また、（１’’）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖と相補的な配列を有するＲＮＡ一本鎖は、下記式（６）のように５’末端にリン酸基が結合した形態に用いられることができる。
【化６】
2015508998.tif 000008
（前記式（６）中、Ａは、疎水性物質であり、Ｂは、親水性物質であり、ＸとＹは、それぞれ独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ｐＡＳは、二本鎖オリゴＲＮＡの５’末端部位にリン酸基が結合したアンチセンス鎖である。）
【００５１】
一方、本発明のリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体において、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体に結合した親水性物質の特定位置、特に末端に標的特異的リガンドをさらに備えていてもよい。前記標的化部分（targeting moiety）は、受容体を介したエンドサイトーシス（receptor‐mediated endocytosis、ＲＭＥ）により標的細胞内在化（internalization）を増進させる受容体と特異的に結合する特性を有する。かかる物質は、標的特異的抗体やアプタマ（aptamer）、受容体特異的リガンドなどから選択されるペプチドまたは葉酸、Ｎ‐アセチルガラクトサミン（N‐acetyl galactosamine、ＮＡＧ）およびマンノース（mannose）などの化学物質となることができる。この際、標的化部分は、標的受容体特異的に結合して伝達を行うことができる物質であればいかなるものを使用してもよく、前記抗体、アプタマ、ペプチドおよび化学物質に限定されるものではない。
【００５２】
リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する過程は、例えば、（１’’’）官能基が結合している固形支持体（ＣＰＧ）に親水性物質を結合する段階と、（２’’’）官能基‐親水性物質が結合している固形支持体（ＣＰＧ）をベースとし、ＲＮＡ一本鎖を合成する段階と、（３’’’）前記ＲＮＡ一本鎖の５’末端に疎水性物質を共有結合して官能基‐ＲＮＡ‐高分子構造体を製造する段階と、（４’’’）固形支持体（ＣＰＧ）から官能基‐ＲＮＡ‐高分子構造体を分離する段階と、（５’’’）前記官能基を用いて親水性物質の末端にリガンドを結合して、リガンドが結合したＲＮＡ高分子構造体を製造する段階と、（６’’’）製造されたリガンドが結合したＲＮＡ高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングしてリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する段階と、を含むことができる。
【００５３】
本発明における官能基は、本発明の目的を達成できるものであればいかなるものでも制限なく使用されてもよく、好ましくは、アミン基、チオール基、カルボキシル基、アルデヒド基、ビオチン基などから選択されてもよい。
【００５４】
前記（６’’’）段階の後、製造が完了すると、高速液体クロマトグラフィーなどにより前記反応物とリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体および相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を分離して精製した後、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析装置で分子量を測定して、所望のリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体および相補的なＲＮＡが製造されているか否かを確認することができる。前記製造方法において、（２’’’）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階は、独立した合成過程として（１’’’）段階の前または（１’’’）〜（６’’’）段階のいずれか一つの過程中に行われてもよい。
【００５５】
また、本発明は、前記リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）を提供する。二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、疎水性および親水性物質の両方を含んでいる両親媒性であり、親水性物質は、体内に存在する水分子と水素結合などの相互作用により親和力を有することで外側に向かうようになり、疎水性物質は、それらの疎水性相互作用（hydrophobic interaction）により内側に向かうようになり、熱力学的に安定したナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）を形成する。すなわち、ナノ粒子の中心に疎水性物質が位置し、二本鎖オリゴＲＮＡの外側の方向に親水性物質が位置して、二本鎖オリゴＲＮＡを保護する形態のナノ粒子を形成する（図１参照）。このように形成されたナノ粒子は、二本鎖オリゴＲＮＡの細胞内伝達および二本鎖オリゴＲＮＡの機能を向上させ、これを疾病の治療のために応用することができる。より具体的な構造体の合成と二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）の特徴、細胞伝達効率および効果については、後述する実施例の部分でより詳細に説明する。
【００５６】
また、本発明は、前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体またはＳＡＭｉＲＮＡを用いた治療方法を提供する。
【００５７】
具体的に、前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）を準備する段階と、前記ナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）を動物の体に投入する段階と、を含む治療方法を提供する。
【００５８】
また、本発明は、前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体または二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）の薬学的有効量を含む薬剤学的組成物を提供する。
【００５９】
本発明の組成物は、投与のために、前記の有効成分以外に薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んでなることができる。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と両立可能である必要があり、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エチルアルコールおよびこれらの成分のいずれか一つの成分または二つ以上の成分を混合して使用してもよく、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤をさらに添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形に製剤化することができる。特に、凍結乾燥化（lyophilized）した形態の剤形に製剤化して提供することが好ましい。凍結乾燥化の剤形を製造するために、本発明が属する技術分野において通常知られている方法が使用されてもよく、凍結乾燥化のための安定化剤が追加されてもよい。
【００６０】
さらに、当分野の適正な方法またはレミントン薬学科学（Remington’s pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA）に開示されている方法を用いて、各疾病または成分に応じて好ましく製剤化することができる。
【００６１】
本発明の薬剤学的組成物は、通常の患者の症状と疾病の深刻度に応じて本技術分野における通常の専門家が決定することができる。また、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの様々な形態に製剤化することができ、単位投与量または多回投与量容器、例えば、シールしたアンプルおよびビンなどで提供されることができる。
【００６２】
本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与が可能である。本発明による薬剤学的組成物の投与経路は、これらに限定されるものではなく、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、硬皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下または局所投与が可能である。
【００６３】
かかる臨床投与のために、本発明の薬剤学的組成物は、公知の技術を用いて好適な剤形に製剤化することができる。本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、方法、排泄率および疾病の重症度などに応じてその範囲が多様であり、本技術分野における通常の専門家が容易に決定することができる。
【００６４】
本発明は、前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を用いた生体内または生体外における遺伝子発現調節方法を提供する。また、本発明は、前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子を用いた生体内または生体外における遺伝子発現調節方法を提供する。
【００６５】
以下、実施例を参照して本発明についてより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当該技術分野における通常の知識を有する者にとって自明なことである。
【００６６】
実施例１．二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造
以下、実施例では、サバイビンを抑制するためにサバイビンに対する二本鎖オリゴＲＮＡを使用した。サバイビンは、今までテストされたほとんどの新生の腫瘍や形質転換された細胞株において共通して発現するタンパク質であって、抗ガン治療において重要な標的になると予測されている（Survivin; a new target for anti‐cancer therapy. Cancer Treat Rev. 2009 Nov; 35(7); 553‐62）。
【００６７】
本発明のサバイビンに対する二本鎖オリゴＲＮＡは、配列番号１と記載されるセンス鎖とこれに相補的な配列であるアンチセンス鎖からなっており、対照群として使用される二本鎖オリゴＲＮＡは、配列番号２と記載されるセンス鎖とこれに相補的な配列であるアンチセンス鎖からなっている。本実施例に使用された二本鎖オリゴＲＮＡの塩基配列は、下記の通りである。
（配列番号１）５’‐ＡＡＧ  ＧＡＧ  ＡＵＣ  ＡＡＣ  ＡＵＵ  ＵＵＣ  Ａ‐３’
（配列番号２）５’‐ＣＵＵ  ＡＣＧ  ＣＵＧ  ＡＧＵ  ＡＣＵ  ＵＣＧ  Ａ‐３’
【００６８】
前記二本鎖オリゴＲＮＡは、β‐シアノエチルホスホラミダイト（β‐cyanoethylphosphoramidite）を用いてＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル（phosphodiester）結合を連結する方法を用いて、前記二本鎖オリゴＲＮＡ一本鎖の合成を行った（Polymer support oligonucleotide synthesis XVIII; use of beta‐cyanoethyl‐N,N‐dialkylamino‐/N‐morpholinophosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucleic Acids Res. 1984 Jun 11; 12(11); 4539‐57）。
【００６９】
合成過程は、ヌクレオシド（nucleoside）が結合した固形支持体（ＣＰＧ）上から始まり、遮断除去（deblocking）、結合（coupling）、キャッピング（capping）および酸化（oxidation）からなるサイクルを繰り返すことで、所望の配列のＲＮＡ一本鎖を得る。当該一連の二本鎖オリゴＲＮＡの合成過程は、ＲＮＡ合成機（３８４  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、ＢＩＯＮＥＥＲ社製、韓国）を使用した。
【００７０】
二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を構成する二本鎖オリゴＲＮＡと高分子物質の結合位置による二本鎖オリゴＲＮＡの標的遺伝子発現阻害効率を比較して、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の最適化を行うために、次のような構造の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造した。
【００７１】
本発明で製造した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、表１のような構造を有する。
【００７２】
【表１】
2015508998.tif 000009
【００７３】
表１において、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ＡＳは、二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖であり、ＰＯ４は、リン酸基であり、ＰＥＧは、親水性物質のポリエチレングリコールであり、Ｃ２４は、疎水性物質のジスルフィド結合が含まれているテトラドコサンであり、５’および３’は、二本鎖オリゴＲＮＡ末端の方向性を意味する。
【００７４】
二本鎖オリゴＲＮＡ構造体のセンス鎖は、上述した方式通りに、β‐シアノエチルホスホラミダイトを用いてＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結する方法を用いて合成を行った後、５’末端部位にポリエチレングリコールをさらに結合して二本鎖オリゴＲＮＡ構造体のＳＡＭｉＲＮＡＬＰセンス鎖を作製した。
【００７５】
前記二本鎖オリゴＲＮＡ構造体のセンス鎖とアニーリングを行うアンチセンス鎖の場合、上述した方式通りに、β‐シアノエチルホスホラミダイトを用いてＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結する方法を用いて合成を行った後、５’末端部位に疎水性物質であるジスルフィド結合が含まれているテトラドコサン（Ｃ２４）をさらに結合してＳＡＭｉＲＮＡＬＰアンチセンス鎖を作製した。
【００７６】
Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰのセンス鎖の場合、既存の特許（韓国特開２００９‐００４２２９７号公報）の実施例１で製造された３’ポリエチレングリコール‐ＣＰＧを支持体として前記反応を行い、３’末端部位にポリエチレングリコールが結合したセンス鎖の二本鎖オリゴＲＮＡ‐親水性物質構造体を合成した後、ジスルフィド結合が含まれているテトラドコサン（Ｃ２４）を５’末端に結合して所望のＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰのセンス鎖を製造した。前記Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰのセンス鎖とアニーリングを行うアンチセンス鎖の場合、上述した方式通りに、β‐シアノエチルホスホラミダイトを用いてＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結する方法によりセンス鎖と相補的な配列のアンチセンス鎖を製造した。
【００７７】
ＡＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰセンス鎖の場合、上述した方式通りに、β‐シアノエチルホスホラミダイトを用いてＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結する方法により製造した。
【００７８】
前記ＡＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰのセンス鎖とアニーリングを行うアンチセンス鎖の場合、既存の特許（韓国特開２００９‐００４２２９７号公報）の実施例１で製造された３’ＰＥＧ‐ＣＰＧを支持体として前記反応を行い、３’末端部位にポリエチレングリコールが結合したアンチセンス鎖の二本鎖オリゴＲＮＡ‐親水性高分子構造体を合成した後、ジスルフィド結合が含まれているテトラドコサン（tetradocosane）（Ｃ２４）を５’末端に結合して所望のＡＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰのアンチセンス鎖を製造した。
【００７９】
Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＰＯ４は、二本鎖オリゴＲＮＡの効果を極大化するために、センス鎖に親水性および疎水性物質の構造体を結合し、アンチセンス鎖の５’末端部位にリン酸基が結合した形態である。
【００８０】
Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＰＯ４のセンス鎖は、前記Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰのセンス鎖と同じ方法で製造し、アニーリングを行うアンチセンス鎖もまた、上述した方式通りに、β‐シアノエチルホスホラミダイトを用いてＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結する方法により製造してから５’末端にリン酸基を結合するために化学的リン酸化試薬（Chemical Phosphorylation Reagent、ＣＰＲ）である［３‐（４，４’ジメトキシトリチルオキシ）‐２，２‐ジカルボキシエチル］プロピル‐（２‐シアノエチル）‐（Ｎ，Ｎ‐ジイソプロピル）‐ホスホラミダイト（[3‐(4,4’Dimethoxytrityloxy)‐2,2‐dicarboxyethyl]propyl‐(2‐cyanoethyl)‐(N,N‐diisopropyl)‐phosphoramidite）を用いて５’末端にリン酸基が結合したＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＰＯ４のアンチセンス鎖を製造した（図２参照）。もしくは、ＲＮＡ一本鎖をＣＰＧから回収した後、リン酸化酵素の処理を施して５’末端にリン酸基を結合する方法により、リン酸基が結合したＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＰＯ４のアンチセンス鎖を製造した。
【００８１】
合成が完了すると、６０℃の恒温槽で２８％（ｖ／ｖ）のアンモニア処理を施して合成されたＲＮＡ一本鎖およびＲＮＡ‐高分子構造体をＣＰＧから分離した後、脱保護（deprotection）反応により保護残基を除去した。保護残基が除去されたＲＮＡ一本鎖およびＲＮＡ‐高分子構造体は、７０℃のオーブンでＮ‐メチルピロリドン、トリエチルアミンおよびトリエチルアミントリヒドロフルオリドを体積比１０：３：４の割合で処理して２’ＴＢＤＭＳ（tert‐butyldimethylsilyl）を除去した。
【００８２】
また、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の親水性高分子末端部位にリガンドを結合するために、３’ＣＰＧにリガンドが結合可能な官能基を結合した後、親水性高分子を結合して前記反応を行い、リガンドが結合可能なＳＡＭｉＲＮＡＬＰセンス鎖を製造した。より詳細に説明すると、アミン基のような官能基が結合しているアミン‐ＣＰＧにポリエチレングリコールホスホラミダイト試薬を用いて３’アミン‐ＰＥＧ‐ＲＮＡの形態に合成した後、３’アミン‐ＰＥＧ‐ＲＮＡオリゴにＣ２４のような疎水性物質を結合して３’アミン‐ＰＥＧ‐ＲＮＡ‐Ｃ２４を合成した後、合成された３’アミン‐ＰＥＧ‐ＲＮＡ‐Ｃ２４を６０℃の恒温槽で２８％（ｖ／ｖ）のアンモニア処理を施して合成されたＲＮＡ一本鎖およびＲＮＡ‐高分子構造体をＣＰＧから分離した後、脱保護反応により保護残基を除去した。保護残基が除去されたＲＮＡ一本鎖およびＲＮＡ‐高分子構造体は、７０℃のオーブンでＮ‐メチルピロリドン、トリエチルアミンおよびトリエチルアミントリヒドロフルオリドを体積比１０：３：４の割合で処理して２’ＴＢＤＭＳを除去した。これより回収された３’アミン‐ＰＥＧ‐ＲＮＡ‐Ｃ２４をＮ‐ヒドロキシスクシンイミドリガンド形態からなる結合可能なリガンド物質とエステル(ester）反応により３’リガンド結合ＰＥＧ‐ＲＮＡ‐Ｃ２４オリゴを合成した。前記反応物から高速液体クロマトグラフィーによりＲＮＡ一本鎖、ＲＮＡ‐高分子構造体およびリガンドが結合したＲＮＡ‐高分子構造体を分離し、これをＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ質量分析装置（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ‐ＭＳ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製、日本）で分子量を測定して、合成しようとする塩基配列およびＲＮＡ‐高分子構造体と対応するかを確認した。
【００８３】
次に、それぞれの二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造するためにセンス鎖とアンチセンス鎖を同量混合して１Ｘアニーリングバッファー（３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭの酢酸カリウム、２ｍＭの酢酸マグネシウム、ｐＨ７．０〜７．５）に投入し、９０℃の恒温槽で３分間反応させた後、また３７℃で反応させて、所望のＳＡＭｉＲＮＡＬＰおよびリン酸基が結合したＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＰＯ４をそれぞれ製造した。製造されたＳＡＭｉＲＮＡＬＰの電気泳動によりアニーリングを確認した。
【００８４】
実施例２．ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）の物性分析
Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰおよびＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＰＯ４は、二本鎖オリゴＲＮＡの末端に結合した疎水性物質間の疎水性相互作用によってナノ粒子、すなわち、ミセルを形成する（図１参照）。
【００８５】
実施例１で製造されたＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰのナノ粒子の大きさおよび臨界ミセル濃度（critical micelle concentration、ＣＭＣ）値と透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope、ＴＥＭ）分析により該当ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）の形成を確認した。
【００８６】
実施例２‐１．ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子の大きさおよび多分散指数（polydispersity index、以下、「ＰＤＩ」とする）の測定
ゼータ‐電位測定装置（zeta‐potential measurement）により前記ナノ粒子の大きさを測定した。具体的に、前記ＳＡＭｉＲＮＡＬＰを１．５ｍＬのＤＰＢＳ（Dulbecco’s Phosphate buffered saline）に５０μｇ／ｍＬの濃度で溶かした後、超音波分散機（Ｗｉｓｅｃｌｅａｎ、ＤＡＩＨＡＮ社製、韓国）でナノ粒子の大きさを均質化（７００Ｗ；振幅２０％）した。均質化したナノ粒子は、ゼータ‐電位測定装置（Ｎａｎｏ‐ＺＳ、ＭＡＬＶＥＲＮ社製、イギリス）で大きさを測定したが、物質に対する屈折率は、１．４５９、吸収率は０．００１とし、溶媒であるＰＢＳ（phosphate buffered saline）の温度は２５℃、それによる粘度は１．０２００および屈折率は１．３３５の値を入力して測定した。１回の測定は、大きさを２０回繰り返して測定することで行われ、これを３回繰り返した。
【００８７】
Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子は、約１５０ｎｍの大きさと０．４程度のＰＤＩ値を有することが確認された（図３の（Ａ）参照）。ＰＤＩ値が低いほど当該粒子が均一に分布していることを示し、Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子は、比較的均一な大きさのナノ粒子を形成することが分かった。前記構造体からなるナノ粒子の大きさは、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれるために適した大きさであることを確認した（Nanotoxicology; nanoparticles reconstruct lipids. Nat. Nanotechnol. 2009 Feb; 4(2);84‐5）。
【００８８】
実施例２‐２．ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子の臨界ミセル濃度の測定
単分子に疎水基と親水基がともに存在している両親媒性の物質（amphiphile）は、界面活性剤となることができ、界面活性剤が水溶液に溶解されると、疎水基は、水との接触を避けるために中央に集まり、親水基は、外側に向かってミセルを形成する。この際、最初にミセルを形成する濃度を臨界ミセル濃度とする。蛍光染料を用いてＣＭＣを測定する方法は、ミセルが形成される前／後に蛍光染料の蛍光値（intensity）グラフ曲線の傾斜が急激に変化する特性に基づくものである。
【００８９】
Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子の臨界ミセル濃度を測定するために、蛍光染料である０．０４ｍＭのＤＰＨ（１，６‐Ｄｉｐｈｅｎｙｌ‐１，３，５‐ｈｅｘａｔｒｉｅｎｅ、ＳＩＧＭＡ社製，ＵＳＡ）を準備する。Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ１ｎｍｏｌｅ／μＬを０．０９７７μｇ／ｍＬで最高５０μｇ／ｍＬの濃度でＤＰＢＳで段階別に希釈して、計１８０μＬのＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ試料を準備する。準備した試料に０．０４ｍＭのＤＰＨと対照群として使用されるＤＰＨの溶媒であるメタノールをそれぞれ２０μＬずつ添加して均一に混合した後、実施例２‐１と同じ方法で超音波分散機（Ｗｉｓｅｃｌｅａｎ、ＤＡＩＨＡＮ社製、韓国）によりナノ粒子の大きさを均質化（７００Ｗ；振幅２０％）した。均質化した試料は、光を遮断した常温条件で約２４時間反応させた後、蛍光値（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ；３５５ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ；４２８ｎｍ、ｔｏｐ  ｒｅａｄ）を測定した。測定された蛍光値は相対的な蛍光値を確認するものであるため、同じ濃度でＤＰＨが含まれた試料の蛍光値‐メタノールのみが含まれた試料の蛍光値を求めて（Ｙ軸）処理したＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ濃度のｌｏｇ値（Ｘ軸）に対するグラフで示した（図３の（Ｂ）参照）。
【００９０】
各濃度別に測定された蛍光値は、低濃度区間から高濃度区間に移動するにつれて急激に増加するが、このように急激に増加する点の濃度がＣＭＣ濃度となる。したがって、蛍光量が増加しない低濃度区間と蛍光量が増加した高濃度区間をいくつかの点に区分して傾向線を作成し、二つの傾向線が交差する交差点のＸ値がＣＭＣ濃度となる。測定されたＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子のＣＭＣは２．５３μｇ／ｍＬと非常に低く形成されることが観察され、これにより、Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子が非常に低い濃度でもミセルを容易に形成することを確認した。
【００９１】
実施例２‐３．ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子の透過型電子顕微鏡観察
Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子が形成された形態を確認するために、透過型電子顕微鏡により観察した。
【００９２】
具体的に、Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰをＤＰＢＳに最終１００μｇ／ｍＬの濃度で溶かした後、超音波分散機（Ｗｉｓｅｃｌｅａｎ、ＤＡＩＨＡＮ社製、韓国）によりナノ粒子の大きさを均質化（７００Ｗ；振幅２０％）した。Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子は、陰性染色法（negative staining）により電子密度が高い物質と観察された（図３の（Ｃ）参照）。
【００９３】
ＴＥＭにより観察されたナノ粒子は、実施例２‐１で測定されたナノ粒子の大きさと類似した程度にナノ粒子がよく形成されていることが確認された。
【００９４】
実施例３．ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子を用いた腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現抑制
前記実施例１で製造したそれぞれのＳＡＭｉＲＮＡＬＰ、Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰおよびＡＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子を用いて、トランスフェクションされた腫瘍細胞株のサバイビン（Survivin）遺伝子の発現パターンを分析した。
【００９５】
実施例３‐１．腫瘍細胞株の培養
アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American type Culture Collection、ＡＴＣＣ）から取得したヒト子宮頸部癌細胞（ＨｅＬａ）は、ＥＭＥＭ培養培地（ATCC‐formulated Eagle’s Minimum Essential Medium、アメリカ）に１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加して、３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【００９６】
実施例３‐２．ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子を用いた腫瘍細胞株の形質転換
前記実施例３‐１で培養された腫瘍細胞株（１．３×１０５）を実施例３‐１の条件下で６‐ウェルプレートで１８時間ＥＭＥＭ培養培地で培養した後、培地を除去してから各ウェル当たり同量のＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地を分注した。
【００９７】
Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭ培地１００μＬと前記実施例１で製造したそれぞれのＳＡＭｉＲＮＡＬＰ、Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰおよびＡＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰを５０μｇ／ｍＬの濃度でＤＰＢＳに添加して、実施例２‐１と同じ方法で超音波分散機（Ｗｉｓｅｃｌｅａｎ、ＤＡＩＨＡＮ社製、韓国）によりＳＡＭｉＲＮＡＬＰ、Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰおよびＡＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子を均質化（７００Ｗ；振幅２０％）して溶液を製造した。次に、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各ウェルにトランスフェクション用溶液を１００ｎＭと２００ｎＭの濃度で処理し、３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で計４８時間培養した。
【００９８】
実施例３‐３．サバイビン遺伝子のｍＲＮＡ相対定量分析
前記実施例３‐２でトランスフェクションされた細胞株から全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した後、リアルタイムＰＣＲによりサバイビン（Survivin）ｍＲＮＡ発現量を韓国特開２００９‐００４２２９７号公報の方法にしたがって相対定量した（図４参照）。
【００９９】
ＡＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子を処理した場合は、二本鎖オリゴＲＮＡメカニズムで標的ｍＲＮＡと結合するアンチセンス鎖にのみ構造体が結合した場合であって、既存のＳＡＭｉＲＮＡＬＰを処理した場合より低い阻害効率を示した。Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子を処理した場合は、ＡＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子を処理した場合とは反対に、センス鎖にのみ構造体が結合した場合であって、既存のＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子を処理した場合より低い濃度でも高い阻害効率を示した（図４参照）。
【０１００】
Ｓｕｒ５８４は、ＳＡＭｉＲＮＡＬＰの構造別に標的遺伝子であるサバイビンに特異的な二本鎖オリゴＲＮＡ配列（配列番号１）を有するＳＡＭｉＲＮＡＬＰを意味し、ＣＯＮは、標的遺伝子の発現に影響を与えない対照群配列（配列番号２）を含むＳＡＭｉＲＮＡＬＰを意味する。標的遺伝子のｍＲＮＡ発現阻害程度は、ＣＯＮを処理した試料の標的遺伝子の発現量に対するＳｕｒ５８４を処理した試料の標的遺伝子の発現量であって、相対定量法（Comparative Quantitation）により計算された。
【０１０１】
最適化した構造であるＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子を処理した場合、トランスフェクション物質が存在しない条件下でも細胞に容易に伝達されて標的遺伝子のｍＲＮＡ発現阻害効果を奏することが観察され、これは、既存の構造であったＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子を処理した場合に対して１００ｎＭの処理条件で比較したときに、約３倍以上（ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子処理群‐２３．４％発現阻害ｖｓ．Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子処理群‐７７％発現阻害）の二本鎖オリゴＲＮＡの効果が増加することを確認することができた。また、陰性対照群としてすべての構造体がアンチセンス配列に結合したＡＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰからなるナノ粒子が処理された実験群は、高濃度の処理群でも標的遺伝子のｍＲＮＡ発現阻害効果が低く観察された。
【０１０２】
実施例４．ＳＡＭｉＲＮＡＬＰを用いた腫瘍細胞株での標的遺伝子発現抑制
前記実施例１で製造したそれぞれの配列番号１、２のＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰおよびＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＰＯ４をトランスフェクション物質を用いて腫瘍細胞株であるヒト子宮頸部癌細胞株（ＨｅＬａ）をトランスフェクションし、トランスフェクションした腫瘍細胞株のサバイビンの発現パターンを分析した。
【０１０３】
実施例４‐１．ＳＡＭｉＲＮＡＬＰを用いた腫瘍細胞株のトランスフェクション
前記実施例３‐１で培養された腫瘍細胞株１．３×１０５を前記実施例の３‐１条件下で６‐ウェルプレートで１８時間ＥＭＥＭ培養培地で培養した後、培地を除去してから各ウェル当たり８００μＬのＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地を分注した。
【０１０４】
一方、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＲＮＡｉＭａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、アメリカ）２μＬとＯｐｔｉ‐ＭＥＭ培地１９８μＬを混合して、常温で５分間反応させた後、前記実施例１で製造したそれぞれのＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰおよびＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＰＯ４（２５ｐｍｏｌｅ／μＬ）を最終０．２、１および５ｎｍの濃度で処理し、また常温で２０分間反応させて溶液を製造した。
【０１０５】
次に、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各ウェルにトランスフェクション用溶液をそれぞれ２００μＬずつ分注して６時間培養した後、Ｏｐｔｉ‐ＭＥＭ培地を除去した。これに、ＥＭＥＭ培養培地２．５ｍＬを分注した後、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で２４時間培養した。
【０１０６】
実施例４‐２．サバイビン遺伝子のｍＲＮＡ相対定量分析
前記実施例４‐１でトランスフェクションされた細胞株から全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した後、リアルタイムＰＣＲによりサバイビンｍＲＮＡの発現量を韓国特開２００９‐００４２２９７号公報の方法にしたがって相対定量した。
【０１０７】
Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰおよびＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＰＯ４の標的遺伝子発現阻害効果を分析するために、トランスフェクション物質とともに形質転換した後、サバイビン遺伝子のｍＲＮＡ発現程度を比較した結果、Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰおよびＳ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＰＯ４を処理した場合、二本鎖オリゴＲＮＡ末端に何も接合されていないネイキッドの二本鎖オリゴＲＮＡを処理したものと類似した程度の標的遺伝子発現阻害効果を示した。Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＰＯ４は、Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰを処理した場合より比較的高い発現阻害効率を示しており、特に低い濃度（０．２ｎＭ）で高い標的遺伝子発現阻害効果を示した（図５参照）。Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰの高分子が結合している形態は、ＲＮＡｉのメカニズムを阻害しない構造であり、特に、Ｓ‐ＳＡＭｉＲＮＡＬＰ‐ＰＯ４の場合、追加結合したリン酸基によって二本鎖オリゴＲＮＡの効果が増加することが観察された。
【産業上の利用可能性】
【０１０８】
本発明による二本鎖オリゴＲＮＡ構造体またはこれを含む薬剤学的組成物は、様々な疾病の治療に有効に使用されることができ、特に、低い濃度のＳＡＭｉＲＮＡ投与量でも高効率のＲＮＡ阻害活性を示すことができ、ガンおよび感染性疾病などの治療剤として有効に使用されることができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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