(57)【要約】  本発明は、トランスジェニック供給源から組換えヒト活性化第VII因子を精製するのに特に有用である抗第VII因子親和性リガンドに関する。他の直交クロマトグラフィー工程と組み合わせた親和性リガンドは、分解または酸化されたFVII形態の割合が低い、凝集物を含まない完全に活性化された高度に精製されたFVII溶液の調製を可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
供給源生物材料からトランスジェニック第VII因子(TgFVII)および/またはトランスジェニック活性化第VII因子(TgFVIIa)を精製するための方法であって、
(a)TgFVIIおよび/またはTgFVIIaを含有する供給源生物材料を、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaに特異的であるリガンドと、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaがリガンドに結合することを可能にする条件下で接触させる工程と、
(b)前記リガンドとの相互作用を非破壊的な形で分断することによって、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaを回収する工程と
を含む、親和性クロマトグラフィーの工程を含む方法。
【請求項２】
前記リガンドが、少なくとも1つのTgFVIIもしくはTgFVIIaエピトープに対する抗原結合タンパク質、またはその機能的断片もしくは誘導体である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記リガンドが、2つの完全な抗原結合部位を形成する2つのポリペプチド重鎖を含み、ポリペプチド軽鎖を含まない、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記リガンドが、ラクダ科動物の免疫グロブリン重鎖から誘導される、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程(b)が、リガンドからTgFVIIまたはTgFVIIaを溶出させる前に未結合の材料を除去するための少なくとも1つの洗浄工程を含み、さらに場合により、弱く結合した材料を除去するための第2の洗浄工程を含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
供給源生物材料が、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaを生成するトランスジェニック動物から得られる、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
動物が哺乳動物の雌、好ましくはウサギの雌であり、供給源生物材料がミルクである、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
工程(a)の前に、ミルクを採取し、清澄化する予備工程をさらに含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
ミルク清澄化工程が、クエン酸塩の添加、その後の濾過により実施される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
TgFVIIおよび/またはTgFVIIaがイオン交換体上に保持される条件下で、イオン交換体上で、好ましくは陰イオン交換体上で、溶出されたTgFVIIおよび/またはTgFVIIaをクロマトグラフィー精製する工程c)をさらに含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
TgFVIIおよび/またはTgFVIIaが偽親和性樹脂上に保持される条件下で、偽親和性樹脂上で、好ましくはヒドロキシアパタイト上で、溶出されたTgFVIIおよび/またはTgFVIIaをクロマトグラフィー分離する工程d)をさらに含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
サイズ排除支持体上で、溶出されたTgFVIIおよび/またはTgFVIIaをクロマトグラフィー分離する工程e)をさらに含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
好ましくはナノ濾過および/または溶媒/界面活性剤処理により、ウイルスを除去および/または不活化する少なくとも1つの工程をさらに含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
精製されたTgFVIIおよび/またはTgFVIIaを製剤化、滅菌および凍結乾燥する最終工程をさらに含む、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
親和性クロマトグラフィーの工程が、
(a)請求項1から4のいずれか一項に規定のリガンドが固定化されたクロマトグラフィー樹脂に、組換え生成されたTgFVIIおよび/またはTgFVIIaを含有するトランスジェニック雌ウサギ由来のミルクを、リガンドがTgFVIIおよび/またはTgFVIIaに結合することを可能にする条件下で充填する工程と、
(b1)未結合の材料を洗浄する工程と、
(b2)弱く結合した材料を洗浄する工程と、
(b3)樹脂からTgFVIIおよび/またはTgFVIIaを溶出させる工程と
を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記親和性クロマトグラフィー工程中に、弱く結合した材料を除去するための前記第2の洗浄工程が、10%〜50%の疎水性薬剤を含み、そのイオン強度が200〜600mMの範囲であるバッファーを用いて実施される、請求項5から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記親和性クロマトグラフィー工程中に、樹脂からTgFVIIおよび/またはTgFVIIaを溶出させるための前記溶出工程が、20%〜70%の疎水性薬剤を含み、そのイオン強度が500〜2500mMの範囲であるバッファーを用いて実施される、請求項5から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
得られる精製されたトランスジェニックFVIIが、分解、タンパク質分解または酸化された形態を低い割合しか含まない、ほぼ完全に活性化された高純度FVIIである、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
親和性クロマトグラフィー工程および/またはイオン交換クロマトグラフィー工程および/またはサイズ排除クロマトグラフィー工程が、3log10より優れた、好ましくは4log10より優れた、より好ましくは5log10より優れたウイルス減少率を得ることを可能にすることを特徴とする、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、トランスジェニック供給源から組換えヒト活性化第VII因子を精製するのに特に有用である抗第VII因子親和性リガンドに関する。他の直交クロマトグラフィー工程と組み合わせた親和性リガンドは、分解または酸化されたFVII形態の割合が低い、凝集物を含まない完全に活性化された高度に精製されたFVII溶液の調製を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
第VII因子(FVII)は、その活性化形態(FVIIa)においてカルシウムおよび組織因子の存在下で第X因子および第IX因子を活性化する凝固プロセスに参加する、ビタミンK依存的糖タンパク質である。FVIIは406残基の単一ペプチド鎖の形態で分泌され、その分子量は約50kDaである。FVIIは、4つの構造的に異なるドメイン:N末端ガンマ-カルボン酸ドメイン(Gla)、2つの「表皮増殖因子(EGF)様」ドメイン、およびセリンプロテアーゼドメインを含有する。FVIIのFVIIaへの活性化は、Arg152-Ile153ドメイン(アルギニン152-イソロイシン153)結合の切断を特徴とする。したがって、FVIIaは、単一のジスルフィド架橋(Cys135-Cys262)で互いに連結された、約20kDaの分子量を有する152アミノ酸の軽鎖と、約30kDaの分子量を有する254アミノ酸の重鎖とを含む化合物である。
【０００３】
血漿FVIIaは、いくつかの翻訳後改変を含有する:最初の10個のグルタミン酸は、[ガンマ]-カルボキシル化され、Asp63は部分的にヒドロキシル化され、Ser52(セリン52)およびSer60(セリン60)はO-グリコシル化され、それぞれ、グルコース(キシロース)0-2およびフコースパターンを担持し、Asn145(アスパラギン145)およびAsn322(アスパラギン322)は主に二分岐二シアル化複合体構造によってN-グリコシル化される。
【０００４】
FVIIは、凝固因子の他の欠損、例えば、FVIIの先天的欠損を示す患者と同様、第VIII因子(A型血友病)または第IX因子(B型血友病)の欠損を示す血友病に罹患する患者の処置のために用いられる。したがって、注射可能なFVIIaの濃縮液が利用可能になることが必要である。
【０００５】
FVIIa濃縮液を取得するための最も古くからの方法は、血漿分画化から得られる血漿タンパク質からのFVIIaの精製からなっていた。そのために、EP 0 346 241は、吸着、次いで、FVIIおよびFVIIaを含有する血漿タンパク質ならびに第IX因子(FIX)、第X因子(FX)および第II因子(FII)などの他のタンパク質の分画化の二次生成物、特に、PPSB(P=プロトロンビンまたはFII、P=プロコンバーチンまたはFVII、S=Stuart因子またはFXおよびB=抗血友病因子BまたはFIX)の事前溶出液の溶出の後に得られる、FVIIaに富む画分の調製を記載する。このプロセスの欠点は、得られるFVIIが依然としていくらか微量の他の凝固因子を含有することである。
【０００６】
同様に、文献EP 0 547 932は、ビタミンK依存的因子およびFVIIIを実質的に含まない高純度のFVIIa濃縮液の製造プロセスを記載する。このプロセスにより得られるFVIIは、その純度にも拘らず、残留血栓形成活性を示す。
【０００７】
一般的に言うと、これらのプロセスの主な欠点の1つは、それらによって少量の生成物しか得られないということである。さらに、血漿中に存在する他のタンパク質を完全に含まない生成物を得ることは依然として困難である。最後に、ウイルスおよび細菌に関する安全性を確保するために血漿凝固因子の調製の段階毎にいくつかの予防措置(血液ドナーの追跡、既知のウイルスおよび細菌夾雑物の検出のための試験、厳密な精製ならびに血液感染性病原体の伝染の危険をできるだけ低下させるためのウイルス不活化処理)が取られているが、それにも拘らず、病原体の夾雑のあらゆる危険性が排除されるわけではない。さらに、クロイツフェルト・ヤコブ病の新しい変異体の出現により、血液製剤による従来にない病原体の伝染の恐怖が生じた。さらに、ドナーから採取される血漿の容量は、依然として限られている。
【０００８】
したがって、1980年代以降、ヒト第VII因子をコードするDNAが単離され(Hagenら、Proc. Natl. Acad. Sci.、1986、83(8): 2412〜6頁)、様々な発現系において発現された。
【０００９】
組換え第VII因子の精製のための様々なプロセスがさらに記載されている(例えば、WO2009/141418を参照されたい)。現在、組換え第VII因子ポリペプチドは、典型的には、従来の樹脂上でのクロマトグラフィーのみを用いるか、またはタンパク質リガンドと共に親和性樹脂を用いる親和性クロマトグラフィーを用いる、1つまたは2つの異なる多工程プロセスにより精製される。
【００１０】
組換え第VII因子を、発酵バッチから、またはトランスジェニック哺乳動物から生成することができる。特に、雌のウサギの乳腺中で生成されたFVIIの組成物が、例えば、特許出願WO2007/138199に記載されている。次いで、トランスジェニック哺乳動物によりミルク中で生成されたFVIIを、例えば、タンジェント濾過(tangential filtration)およびクロマトグラフィーにより、またはカルシウム沈降、次いで、いくつかのクロマトグラフィー工程により、ミルクから精製することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】EP 0 346 241
【特許文献２】EP 0 547 932
【特許文献３】WO2009/141418
【特許文献４】WO2007/138199
【特許文献５】米国特許第4,784,950号
【特許文献６】EP 0 527 063
【特許文献７】WO2007/138198
【特許文献８】WO2008/099077
【特許文献９】WO94/25591
【特許文献１０】WO94/04678
【特許文献１１】米国特許出願第2002/0087908号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Hagenら、Proc. Natl. Acad. Sci.、1986、83(8): 2412〜6頁
【非特許文献２】Boschetti E.、Egly J.M.、Monsigny M.、1983、Practical Guide for use in Affinity chromatography and related techniques、第2版、IBF Villeneuve-la-garenne、France、1〜157頁
【非特許文献３】Federal Gazette N 84、1994年5月4日
【非特許文献４】Schmidt, N.J. & Emmons, R.W.(1989)、Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infection、第6版
【非特許文献５】Schwartz D.、「Methodes statistiques a l'usage des medecins et des biologistes」、Flammarion Medecine-Sciences、第4版、1993
【非特許文献６】Kaplan M.およびKoprowski H.、「Laboratory techniques in rabies、第3版、World Health Organization(編)、Geneva、1973
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
しかしながら、利用可能な精製方法は、欠点を回避できない。特に、トランスジェニック哺乳動物由来の天然タンパク質、特に、トランスジェニック哺乳動物由来の天然の第VII因子が依然として存在し、ヒト患者への投与時に免疫原性を誘発し得る。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的は、供給源生物材料からトランスジェニック第VII因子(TgFVII)および/またはトランスジェニック活性化第VII因子(TgFVIIa)を精製するための方法であって、
(a)TgFVIIおよび/またはTgFVIIaを含有する供給源生物材料を、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaに特異的なリガンドと、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaがリガンドに結合することを可能にする条件下で接触させる工程と、
(b)前記リガンドとの相互作用を非破壊的な形で分断することによって、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaを回収する工程と
を含む、親和性クロマトグラフィーの工程を含む方法である。
【００１５】
本発明のある実施形態においては、リガンドは、少なくとも1つのTgFVIIおよび/もしくはTgFVIIaエピトープに対する抗原結合タンパク質、またはその機能的断片もしくは誘導体である。好ましくは、リガンドは、2つの完全な抗原結合部位を形成する2つのポリペプチド重鎖を含み、ポリペプチド軽鎖を含まず、ラクダ科動物の免疫グロブリン重鎖に由来する。
【００１６】
ある実施形態においては、本発明の方法は、工程(b)が、リガンドからTgFVIIまたはTgFVIIaを溶出させる前に未結合の材料を除去するための少なくとも1つの洗浄工程を含み、さらに場合により、樹脂上に結合し、TgFVIIまたはTgFVIIaよりも弱い親和性を有する夾雑物を除去するための第2の洗浄工程を含むようなものである。
【００１７】
本発明のある実施形態においては、TgFVIIまたはTgFVIIaを精製するために用いられる供給源生物材料は、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaを生成するトランスジェニック動物から得られる。好ましくは、動物は、哺乳動物の雌であり、好ましくはウサギの雌であり、供給源生物材料はミルクである。
【００１８】
ある実施形態においては、本発明の方法は、工程(a)の前に、ミルクを採取し、清澄化する予備工程をさらに含む。好ましくは、ミルク清澄化工程は、クエン酸塩の添加、その後の濾過により実施される。
【００１９】
ある実施形態においては、本発明の方法は、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaがイオン交換体上に保持される条件下で、イオン交換体上で、好ましくは陰イオン交換体上で、溶出されたTgFVIIおよび/またはTgFVIIaをクロマトグラフィー精製する工程c)をさらに含む。この工程は、好ましくは、TgFVII活性化ならびにTgFVIIおよび/またはTgFVIIa研磨にあてられる。
【００２０】
ある実施形態においては、本発明の方法は、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaが偽親和性樹脂上に保持される条件下で、偽親和性樹脂上で、好ましくはヒドロキシアパタイト上で、溶出されたTgFVIIおよび/またはTgFVIIaをクロマトグラフィー分離する工程d)をさらに含む。この工程は、好ましくは、TgFVIIおよび/またはTgFVIIa研磨ならびにTgFVIIおよび/またはTgFVIIa分解の制御にあてられる。
【００２１】
ある実施形態においては、本発明の方法は、サイズ排除支持体上で、溶出されたTgFVIIおよび/またはTgFVIIaをクロマトグラフィー分離する工程e)をさらに含む。この工程は、好ましくは、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaの研磨および製剤化にあてられる。
【００２２】
ある実施形態においては、本発明の方法は、好ましくはナノ濾過および/または溶媒/界面活性剤処理により、ウイルスを除去および/または不活化する少なくとも1つの工程をさらに含む。
【００２３】
ある実施形態においては、本発明の方法は、精製されたTgFVIIおよび/またはTgFVIIaを製剤化、滅菌、および凍結乾燥する最終工程をさらに含む。
【００２４】
ある実施形態においては、親和性クロマトグラフィーの工程中に、本発明の方法は、
(a)上記で定義されたリガンドが固定化されたクロマトグラフィー樹脂に、組換え生成されたTgFVIIおよび/またはTgFVIIaを含有するトランスジェニック雌ウサギ由来のミルクを、リガンドがTgFVIIおよび/またはTgFVIIaに結合することを可能にする条件下で充填する工程と、
(b1)未結合の材料を洗浄する工程と、
(b2)TgFVIIおよび/またはTgFVIIaよりも弱いリガンドとの親和性を有する夾雑物を洗浄する工程と、
(b3)樹脂からTgFVIIおよび/またはTgFVIIaを溶出させる工程と
をさらに含む。
【００２５】
ある実施形態においては、本発明の方法の親和性クロマトグラフィー工程中に、弱く結合した材料を除去するための前記第2の洗浄工程が、10%〜50%の疎水性薬剤を含み、そのイオン強度が200〜600mMの範囲であるバッファーを用いて実施される。
【００２６】
ある実施形態においては、本発明の方法の親和性クロマトグラフィー工程中に、樹脂からTgFVIIおよび/またはTgFVIIaを溶出させるための前記溶出工程が、20%〜70%の疎水性薬剤を含み、そのイオン強度が500〜2500mMの範囲であるバッファーを用いて実施される。
【００２７】
本発明のさらなる特徴および利点は、以下に列挙される添付の図面を参照して、非限定例として与えられる、本発明の実施形態の以下の説明から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ポリペプチド重鎖を有し、軽鎖を含まないラクダ科動物免疫グロブリンのIgG1、IgG2およびIgG3形態の略図である。
【図２】本発明のプロセス中のRMPクリアランスの略図である。RMPレベルは、プロセスの工程の関数としてppmで示される。
【図３】本発明のプロセス中のDNAクリアランスの略図である。DNAレベルは、プロセスの工程の関数としてppmで示される。
【図４】精製プロセスによるTgFVIIの活性化を示す図である。レーン1〜9はそれぞれ、以下に対応する:レーン1および9:分子量、レーン2:清澄化されたミルク、レーン3:FVIIで選択された溶出液(本発明のリガンド上での親和性クロマトグラフィー後)、レーン4:中間生成物1(限外濾過および透析濾過後)、レーン5:ナノ濾過物、レーン6:QSXL溶出液、レーン7:CHT-I溶出液、レーン8:SECプール。
【図５】事前濾過の工程および溶媒/界面活性剤処理の工程後(初期ロードと命名される試料)ならびに親和性FVII選択クロマトグラフィー上での溶出後(溶出液Aと命名される試料)の試料中のウイルス量のヒストグラムを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
トランスジェニック第VII因子または第VIIa因子
本発明の精製方法は、特に、トランスジェニック第VII因子(TgFVII)および/またはトランスジェニック活性化第VII因子(TgFVIIa)に対する特異的親和性を示すリガンドの使用に依拠する。
【００３０】
本発明における使用のためのトランスジェニック第VII因子および第VIIa因子のアミノ酸配列は公知である。トランスジェニック第VII因子のアミノ酸配列は、特に、米国特許第4,784,950号に開示されたものなどのヒト第VII因子のアミノ酸配列と同一である。
【００３１】
供給源生物材料
本発明の方法は、本明細書では「供給源生物材料」と呼ばれる様々な生物学的起源から得られるトランスジェニックFVIIおよび/またはFVIIaを精製するのに特に有用である。
【００３２】
本発明の一実施形態においては、供給源生物材料は、トランスジェニックFVIIおよび/またはFVIIaを含有し、トランスジェニックFVIIおよび/またはFVIIaを生成するように改変された(または改変された動物の子孫である)トランスジェニック動物由来の体液の分画化から得られる。トランスジェニック動物は、好ましくは、哺乳動物、例えば、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどである。好ましくは、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaを含有する供給源生物材料は、哺乳動物のミルクの試料、すなわち、そのミルク中にトランスジェニックFVIIおよび/またはFVIIaを生成するトランスジェニック哺乳動物ミルクの試料である。
【００３３】
トランスジェニック動物のミルク中でトランスジェニックFVIIタンパク質を生成するための方法は、下記工程:遺伝子がミルク中に天然に分泌されるタンパク質のプロモーターにより制御される、トランスジェニックFVII(ヒトFVIIのものと一致するアミノ酸配列)をコードする遺伝子を含有するDNA分子を、非ヒト哺乳動物の胚に移す工程を含んでもよい。次いで、胚を同じ種の雌の哺乳動物に導入した後、トランスジェニック動物を出産させる。一度、対象が十分に発達したら、哺乳動物の泌乳を誘導し、ミルクを採取する。次いで、ミルクは所望の組換えタンパク質を含有する。人間以外の雌の哺乳動物のミルク中でのトランスジェニックFVII(TgFVII)の調製のためのプロセスの一例は、EP 0 527 063に提供されている。そのような特定の実施形態においては、WAPプロモーターを含有するプラスミドを、WAP遺伝子のためのプロモーターを含有する配列の導入により構築し、このプラスミドを、それがWAPプロモーターに依存するようになった外来遺伝子を受容することができるような方法で作出する。トランスジェニックFVIIをコードする遺伝子を組込み、WAPプロモーターに依存するようにする。プロモーターと、トランスジェニックFVIIタンパク質をコードする遺伝子とを含有するプラスミドを用いて、ウサギ胚の雄性前核へのマイクロインジェクションにより、ウサギなどのトランスジェニック動物を取得する。次いで、胚を、ホルモンで調製された雌の卵管に移す。
【００３４】
精製方法
本発明は、トランスジェニックFVIIおよび/またはFVIIaを精製するための方法を提供する。そのような方法は、特に、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaを含有する供給源生物材料を、TgFVIIおよびTgFVIIaと高度に特異的であるリガンドと接触させることを含む。
【００３５】
トランスジェニックウサギのミルク中でのトランスジェニックFVIIまたはFVIIa(TgFVIIa)の生成は、除去しなければならないいくつかの不純物の存在をもたらす。本発明のプロセスは、付随する夾雑分子、いわゆる、ウサギミルクタンパク質(RMP)だけでなく、ウサギDNAおよびウサギ血清タンパク質としてウサギミルクに夾雑し得る他の分子も含む、宿主関連不純物(HRI)を除去しながら、トランスジェニックウサギのミルクからトランスジェニックFVIIまたはFVIIa(TgFVIIa)を精製するために特に設計される。血流からミルク中への受動的漏出のため、残留血清タンパク質(例えば、アルブミン、ウサギFVII、免疫グロブリンおよびトランスフェリン)がミルク供給源材料中に導入され得る。
【００３６】
実際、ミルクは、可溶性乳清タンパク質、不溶性カゼインミセルおよび乳脂肪球の非滅菌コロイド懸濁液と一致する。乳腺上皮細胞により合成および分泌されるTgFVIIは、可溶性乳清画分中に見出される。潜在的な夾雑RMPとしては、限定されるものではないが、カゼイン、ラクトアルブミン、ラクトグロブリンおよびラクトフェリンが挙げられる。5つのファミリーのタンパク質:トランスフェリン、カゼイン、アルブミン、乳清酸タンパク質および免疫グロブリン(Ig)は、全ウサギミルクタンパク質の約90%を占めることが示された。
【００３７】
さらに、本発明のある実施形態においては、本発明の精製プロセスはまた、ミルク中で発現されたチモーゲンTgFVIIを、TgFVIIaに活性化するように設計される。不幸なことに、一度活性化されたら、TgFVIIaは補足的切断に対して感受性になる。TgFVIIおよび/またはTgFVIIa切断は、Glaに富む領域を部分的もしくは全体的に失うTgFVIIをもたらすか、または分子の効力を制限し得る軽鎖(LC)もしくは重鎖(HC)の切断をもたらす。したがって、TgFVIIaの非活性切断生成物への進行中の分解、または進行中のTgFVII酸化の可能性があり、FVIIの治療好適性を保証するためには除去しなければならない。
【００３８】
清澄化
ミルクの初期の処理としてのミルク清澄化は、場合により特許出願WO2007/138198またはWO2008/099077に記載のような手順によって実施されるが、本発明を適用する前のミルク処理に制限はない。例えば、プロセスの第1工程が流動床親和性捕捉により実施される場合、場合により清澄化を迂回してもよい。場合により、乳業において利用可能な任意の技術による脂肪デカンテーションまたはスキム分離を、精製の前に実施してもよい。本発明のある実施形態においては、ミルクをクエン酸バッファーと混合して、ミルクの安定化された乳漿のような相を迅速に取得した後、遠心分離またはデカンテーション、次いで、深層濾過などの液相分離により脂肪分離を得る。本発明のある実施形態においては、好ましくは深層濾過は、低剪断応力、非酸化技術、および急速なバイオバーデン減少およびミルク採取に由来する関連不純物のサイズ保持の組合せにより、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaの完全な生物活性分子を調製するために有利に実施される。そのような実施形態においては、深層フィルター相対孔径は、30〜0.1μmの範囲であり、深層濾過は、好ましくは、連続的な25〜0.5μmの濾過、次いで、0.5μm〜0.1μmの濾過により実行される。セルロースに基づく深層フィルターは、顆粒状アジュバントまたは他のフィルター補助化合物を用いて、または用いずに、この工程に良好に適合される。本発明のある実施形態においては、クエン酸塩濃度およびプロセス温度は、0.15Mから飽和までのクエン酸塩および15℃〜30℃、好ましくは、0.2M〜0.5Mのクエン酸塩および22℃〜27℃の範囲である。クエン酸塩および温度のこれらの組合せは、ミクロンオーダー未満にミルクタンパク質のサイズ集団を維持し、透明な乳漿様相溶液を得るために必要である。「透明な」とは、本発明のプロセスにおける清澄化されたミルクが、500NTU(正規化濁度単位)未満の制御された濁度または1000AU(相対吸収単位)未満のλ400ナノメートルで分光光度計上で読み取られた光密度を示すことを意味する。
【００３９】
これらの条件において、タンパク質の生物源中のバイオバーデン量を減少させるために、0.2μmの孔径を有する膜での濾過を有利に実施することができる。
【００４０】
得られたバイオバーデンが減少し、安定化された溶液を、場合により数ヶ月間、-20℃未満の低温で保存することができる。
【００４１】
特異的リガンド上での親和性クロマトグラフィー
リガンド
供給源生物材料からTgFVII/TgFVIIaを精製するための本発明の方法は、トランスジェニックFVII/FVIIaに特異的であるリガンド上での親和性クロマトグラフィーによる分離の少なくとも1つの工程を含む。
【００４２】
本発明のある実施形態においては、前記親和性リガンドは、完全な抗原結合部位またはいくつかの抗原結合部位を形成する2つのポリペプチド重鎖を含み、さらにポリペプチド軽鎖を含まない単離された抗原結合タンパク質である。本発明の方法において用いられる抗原結合タンパク質は、したがって、典型的には重鎖の二量体を含み、軽鎖を含まない。2つのポリペプチド重鎖は、1つまたは複数の完全な抗原結合部位を形成するのに十分なものである。「完全な抗原結合部位」とは、本発明によれば、単独で抗原の認識および完全な結合を可能にし、結合親和性の試験に関する任意の公知の方法によって検証することができる部位を意味する。
【００４３】
本発明の方法において用いられる抗原結合タンパク質の重鎖は、対応する軽鎖と相互作用するための特別な特徴を有さず(存在しない)、したがって、免疫グロブリンの一般的な重鎖とは非常に異なる。その特定の構造にも拘らず、前記抗原結合タンパク質は、それにも拘らず標準的な4鎖モデル免疫グロブリンと比較した場合、少なくとも等価であり、好ましくは改善された機能的特性を示すことができる。したがって、前記抗原結合タンパク質を形成する重鎖は、原核および下等真核細胞による分泌にとって本質的により好適であると考えられる。
【００４４】
特定の実施形態においては、本発明の方法における親和性リガンドとして用いられる抗原結合タンパク質は、そのポリペプチド重鎖が可変領域(VH)および定常領域(CH)を含有するが、CH1と呼ばれるその定常領域の第1のドメインを含まないことを特徴とする。CH1ドメインを有さないこれらの抗原結合タンパク質は、したがって、その鎖の可変領域が可変領域のC末端部分のヒンジ領域に直接連結されるようなものである。WO94/25591は、そのような重鎖抗体、またはその断片を大規模に調製するための方法であって、カビまたは酵母を、前記抗体または断片をコードする発現可能なDNA配列で形質転換することを含む方法を開示する。本発明のある実施形態においては、前記抗原結合タンパク質を、WO94/04678に記載のように取得することもできる。
【００４５】
本発明の方法において用いられる重鎖免疫グロブリンの可変ドメインは、重鎖免疫グロブリン中には存在しないVLまたはCH1ドメインとの正常な相互作用部位を有さない。そのような免疫グロブリンはまた、文献中では「VHH」と一般に命名される。
【００４６】
ある実施形態においては、本発明の方法においてリガンドとして用いられる抗原結合タンパク質は、それらの可変領域は位置45に、ロイシン、プロリンまたはグルタミン残基とは異なるアミノ酸を含有することを特徴とする。
【００４７】
特定の実施形態においては、本発明の方法における親和性リガンドとして用いられる抗原結合タンパク質は、それらの可変領域がフレームワーク(FW)および相補性決定領域(CDR)、特に、4つのフレームワークおよび3つの相補性領域を含むことを特徴とする。したがって、それらは、特に、この可変領域自体が抗原結合部位またはいくつかの抗原結合部位を含有してもよく、軽鎖の可変領域の寄与を必要としないという事実によって標準的な4鎖免疫グロブリンとは異なる。
【００４８】
フレームワーク1およびフレームワーク4のアミノ酸配列は、特に、それぞれ、以下:
フレームワーク1ドメインについて、
GGSVQTGGSLRLSCEISGLTFD (配列番号1)
GGSVQTGGSLRLSCAVSGFSFS (配列番号2)
GGSEQGGGSLRLSCAISGYTYG (配列番号3)
GGSVQPGGSLTLSCTVSGATYS (配列番号4)
GGSVQAGGSLRLSCTGSGFPYS (配列番号5)
GGSVQAGGSLRLSCVAGFGTS (配列番号6)
GGSVQAGGSLRLSCVSFSPSS (配列番号7);
フレームワーク4ドメインについて、
WGQGTQVTVSS (配列番号8)
WGQGTLVTVSS (配列番号9)
WGQGAQVTVSS (配列番号10)
WGQGTQVTASS (配列番号11)
RGQGTQVTVSL (配列番号12)および/または、
CDR3ドメインについて、
ALQPGGYCGYGX----------CL (配列番号13)
VSLMDRISQH------------GC (配列番号14)
VPAHLGPGAILDLKKY------KY (配列番号15)
FCYSTAGDGGSGE---------MY (配列番号16)
ELSGGSCELPLLF---------DY (配列番号17)
DWKYWTCGAQTGGYF-------GQ (配列番号18)
RLTEMGACDARWATLATRTFAYNY (配列番号19)
QKKDRTRWAEPREW--------NN (配列番号20)
GSRFSSPVGSTSRLES-SDY---NY (配列番号21)
ADPSIYYSILXIEY--------KY (配列番号22)
DSPCYMPTMPAPPIRDSFGW---DD (配列番号23)
TSSFYWYCTTAPY---------NV (配列番号24)
TEIEWYGCNLRTTF--------TR (配列番号25)
NQLAGGWYLDPNYWLSVGAY---AI (配列番号26)
RLTEMGACDARWATLATRTFAYNY (配列番号27)
DGWTRKEGGIGLPWSVQCEDGYNY (配列番号28)
DSYPCHLL--------------DV (配列番号29)
VEYPIADMCS------------RY (配列番号30)
から選択することができるアミノ酸配列を含む。
【００４９】
ある実施形態においては、抗原結合タンパク質の定常領域は、以下の群の配列:
CH2ドメインについて、
APELLGGPTVFIFPPKPKDVLSITLTP (配列番号31)
APELPGGPSVFVFPTKPKDVLSISGRP (配列番号32)
APELPGGPSVFVFPPKPKDVLSISGRP (配列番号33)
APELLGGPSVFIFPPKPKDVLSISGRP (配列番号34)
CH3ドメインについて、
GQTREPQVYTLA (配列番号35)
GQTREPQVYTLAPXRLEL (配列番号36)
GQPREPQVYTLPPSRDEL (配列番号37)
GQPREPQVYTLPPSREEM (配列番号38)
GQPREPQVYTLPPSQEEM (配列番号39)
から選択されるアミノ酸配列を含むCH2およびCH3ドメインを含む。
【００５０】
好ましくは、抗原結合タンパク質は、そのヒンジ領域が、0〜50個のアミノ酸を含むことを特徴とする。これらのタンパク質のヒンジ領域の特定の領域は、以下の配列:
GTNEVCKCPKCP (配列番号40)または、
EPKIPQPQPKPQPQPQPQPKPQPKPEPECTCPKCP (配列番号41)
である。
【００５１】
短いヒンジ領域はIgG3分子に対応し、長いヒンジ配列はIgG2分子に対応する。
【００５２】
特定の実施形態においては、本発明の方法においてリガンドとして用いられる抗原結合タンパク質を、動物、より特には、ラクダ科動物、好ましくは、ラクダ科動物の血液から単離することができる。さらなる実施形態においては、抗原結合タンパク質は、ラクダ科動物免疫グロブリンに、より特には、旧世界ラクダ(Camelus bactrianusおよびCamelus dromedarius)または新世界ラクダ(Lama pacos、Lama glamaおよびLama vicugna)の免疫グロブリンに由来する。それらが起源とする動物に応じて、抗原結合タンパク質の分子量は、約43kDa〜約47kDa、特に、45kDaであってもよい。
【００５３】
ある実施形態においては、これらの抗原結合タンパク質は、その定常領域の全部または一部の、ヒト抗体の定常領域の全部または一部による置き換えにより改変される、特に、ヒト化されていてもよい。例えば、前記抗原結合タンパク質のCH2および/またはCH3ドメインを、IgGγ3ヒト免疫グロブリンのCH2および/またはCH3ドメインにより置き換えることができる。そのようなヒト化抗原結合タンパク質においては、可変配列の一部、および特に、結合部位に介在しない1つまたは複数のフレームワーク残基は、ヒト抗体フレームワーク残基により置き換えられていてもよい。前記抗原結合タンパク質は、G型免疫グロブリン、特に、クラス2の免疫グロブリン(IgG2)またはクラス3の免疫グロブリン(IgG3)と定義される免疫グロブリンを含んでもよい。
【００５４】
上記抗原結合タンパク質の利点は、軽鎖可変ドメインの欠如が、異なる組合せの可変ドメインと対形成する可能性から生じる抗体レパートリー中の余剰次元の可変性が存在せず、多数の無関係の抗原結合タンパク質の生成を回避する際に特異的抗原(ここでは、トランスジェニックFVII/FVIIa)に対する抗原結合タンパク質を調製することができることを意味するという事実に依拠するものである。第2の利点は、VHHドメインが伝統的な抗体よりも有意に安定であり、前記抗原結合タンパク質に基づくクロマトグラフィー分離が有意により強固であると予想されるということである。さらに、構造的および機能的完全性を維持するための軽鎖可変ドメインとの相互作用への依存性の欠如は、生成の容易性および溶液中での挙動に関して、これらのVHHドメインを、他の小さい抗体断片よりも実質的に有利にする。特に、VHH断片は、その並外れた安定性および抗原の溶出中に頻繁に起こる、完全な変性後に効率的にリフォールディングするその能力のため、免疫親和性精製にとって特に適した分子である。
【００５５】
本発明の方法において用いられる親和性リガンドが上記で定義された抗原結合タンパク質である場合、それは、エピトープがトランスジェニックFVII/FVIIaに特異的であるという条件で、トランスジェニックFVII/FVIIaの任意のエピトープに対するものであってもよい。そのようなエピトープは、アミノ酸、ポリペプチド、炭水化物、またはその混合物を含む任意の構造を含む。
【００５６】
「FVII/FVIIaに特異的であるリガンド」という表現は、本発明の親和性クロマトグラフィー工程に用いられるリガンドが、ウサギまたはヤギのFVIIまたはFVIIaなどの他の種由来のFVIIまたはFVIIaを含む、任意の他のタンパク質に実質的に結合しないか、またはその結合を実質的に制限することを意味する。本発明において用いられるリガンドは、好ましくは、トランスジェニック第VII因子または第VIIa因子に対する1μMを超える親和性を有し、有利には、トランスジェニックFVIIまたはFVIIaに対する少なくとも100nM、より好ましくは、1〜10nMの親和性を有してもよい。特定の実施形態においては、本発明において用いられるリガンドは、ウサギFVIIまたはFVIIaと比較した場合、1logを超える差異でトランスジェニックFVIIまたはFVIIaに結合する。「タンパク質の結合を実質的に制限する」という表現は、本発明において用いられるリガンドが、クロマトグラフィー支持体上に充填された初期溶液中に含まれる宿主関連不純物(HRI)の少なくとも4logまたは99.99%の除去、およびトランスジェニックFVIIを発現させるために用いられるトランスジェニック哺乳動物により内因的に生成されるFVIIまたはFVIIaの少なくとも3logまたは99.99%の除去を可能にすることを意味する。
【００５７】
ある実施形態においては、親和性支持体から溶出した画分中の内因性第VII因子または第VIIa因子の質量は、カラム上に充填された初期溶液内のこれらのタンパク質の質量に関して、100倍、好ましくは1000倍、または最も好ましくは10000倍以上減少する。比較すると、FVII特異的リガンド上に充填され、溶出画分中で回収されるトランスジェニック第VII因子または第VIIa因子の相対質量は、初期充填溶液内のこれらのタンパク質の質量の少なくとも30%、好ましくは少なくとも50%以上である。
【００５８】
特定の実施形態においては、本発明の抗原結合タンパク質(リガンド)は、以下の動的結合定数:Ka=2.58x108MおよびKd=9.88x10-9Mを有する。
【００５９】
上記抗原結合タンパク質の任意の機能的断片または機能的誘導体を、本発明の方法においてトランスジェニック第VII因子および/または活性化第VII因子(FVIIa)に特異的に結合させるためのリガンドとして用いることもできる。
【００６０】
上記抗原結合タンパク質の「機能的断片」は、ヒト第VII因子または第VIIa因子に対する強い親和性を示す、好ましくは、起源とする抗原結合タンパク質とヒトFVIIもしくはFVIIaに関して実質的に同じ親和性を示すか、または起源とする抗原結合タンパク質により示される親和性の少なくとも約50%、さらに好ましくは少なくとも約60、70、80、もしくは90%の親和性を示す断片である。
【００６１】
本発明の方法におけるリガンドとしての使用のために包含される断片は、軽鎖を含まない抗原結合タンパク質の1つのポリペプチド重鎖、上記抗原結合タンパク質の酵素的消化により得られる断片、特に、Fc断片(定常断片)をもたらし、FVHh断片(重鎖の抗原結合部位を含有する)もしくはその二量体F(VHh)2をもたらすパパインを用いる部分消化により得られるもの、またはFc断片のC末端部分に対応するpFc断片をもたらす、Fc断片のパパインを用いるさらなる消化により得られる断片、他のタンパク質分解酵素を用いて得られる相同な断片、抗原結合タンパク質の可変領域の少なくとも10、好ましくは20アミノ酸の断片、または完全な可変領域、特に、単離されたVHドメインもしくはヒンジに連結されたVH二量体に対応する断片、ならびに定常領域の少なくとも10、好ましくは20アミノ酸、もしくは抗原結合タンパク質の完全な定常領域に対応する断片を含む。
【００６２】
「機能的誘導体」とは、誘導体がトランスジェニックFVIIまたはFVIIaに関して結合親和性および特異性を示す程度で、アミノ酸の1つまたは複数の置換、欠失、または付加により、本発明の方法においてリガンドとして用いられる抗原結合タンパク質と異なるポリペプチドを意味する。「機能的誘導体」は、好ましくは、上記抗原結合タンパク質と同じ親和性またはトランスジェニックFVIIaに関して前記抗原結合タンパク質により示される少なくとも約90%、さらに好ましくは少なくとも約50、60、70、もしくは80%の親和性を実質的に示す。前記機能的誘導体は、上記抗原結合タンパク質との高いパーセンテージの同一性を示す相同体を含み、それらは少なくとも80%、85%、90%、95%または99%同一であり、好ましくは、1つまたはいくつかの保存的置換により上記抗原結合タンパク質と異なる。
【００６３】
本発明のある実施形態においては、抗原結合タンパク質は、固相上に固定化される。固定化は、吸着または化学的架橋により達成することができる。
【００６４】
一般に、クロマトグラフィー媒体などの固相表面へのタンパク質の付着は、タンパク質が非特異的結合機構によって固相表面上に吸着されるように、固相表面をタンパク質の溶液に曝露することによってもたらされる。タンパク質をクロマトグラフィー媒体上に固定化するための方法は、文献中でよく確立されており、例えば、Boschetti E.、Egly J.M.、Monsigny M.、1983、Practical Guide for use in Affinity chromatography and related techniques、第2版、IBF Villeneuve-la-garenne、France、1〜157頁を参照されたい。例えば、固相表面がポリスチレンなどの疎水性材料により提供される場合、付着は一般に、タンパク質の疎水性領域の疎水性表面への吸着によってもたらされる。
【００６５】
固定化されたタンパク質表面の調製におけるタンパク質の吸着の方法に対する代替手段、またはそれに対する改善が利用可能である。
【００６６】
1つの代替的な手法は、例えば、Boschetti E.、Egly J.M.、Monsigny M.、1983、Practical Guide for use in Affinity chromatography and related techniques、第2版、IBF Villeneuve-la-garenne、France、1〜157頁に記載の従来のカップリング化学を用いる、活性化された固相表面への共有的付着のためのタンパク質中の残基の化学的架橋を使用することである。システインなどの、スルフヒドリル基を含むアミノ酸残基を、例えば、スクシンイミジル-マレイミドフェニルブチレート(SMPB)などの二特異的試薬を用いて共有的に付着させることができる。
【００６７】
あるいは、リガンド表面に位置するリシン基を、1,エチル-3-[3-ジメチルアミノプロピル]カルボジイミド(EDC)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)を用いる従来のカルボジイミドカップリングにより、固相表面の活性化カルボキシル基にカップリングさせることができる。非共有的吸着により固相に固定化された、ペプチド尾部の形態での伸長を用いるか、または従来の化学的架橋剤を用いることにより、リガンドを付着させることもできる。
【００６８】
本発明の一実施形態によれば、本発明の抗原結合タンパク質は、従来のカップリング化学を用いる共有的架橋によって固相に付着される。固相は、共有的付着にとって好適な架橋可能な残基を自然に含むか、またはそれを被覆もしくは誘導体化して、当業界で周知の方法に従って好適な架橋基を導入することができる。
【００６９】
固定化を行う固相は、様々な材料により提供することができ、好適には、タンパク質の固定化において従来通り用いられる任意の固相担体材料であってよい。本発明の方法は、直接的に、または前処理後に、タンパク質またはタンパク質断片を固定化しやすい任意の固相材料に関して適用可能である。担体材料は、粒子状(例えば、一般には抽出カラム中で用いられるビーズもしくは顆粒)または平面、ヒダのある、もしくは中空の繊維もしくは管であってもよいシート形態(例えば、膜もしくはフィルター、ガラスもしくはプラスチックスライド、マイクロタイターアッセイプレート、ディップスティック、キャピラリー充填デバイスもしくは同様のもの)であってもよい。以下のマトリックスは、例として与えられるものであり、包括的ではなく、そのような例は、シリカ(多孔性非晶質シリカ)、例えば、Biotage(Dyax Corp.社の一部門)により供給される60Aの不規則シリカ(32〜63μmもしくは35〜70μm)を含有するFLASHシリーズのカートリッジ、アガロースもしくはポリアクリルアミド支持体、例えば、Amersham Pharmacia Biotech社により供給されるSepharoseレンジの製品、またはBio-Rad社により供給されるAffi-Gel支持体を含んでもよい。さらに、Bio-Rad社により供給される圧力安定性Affi-Prep支持体などの、マクロ多孔性ポリマーも存在する。用いることができる他の支持体としては、デキストラン、コラーゲン、ポリスチレン、メタクリレート、アルギン酸カルシウム、制御孔ガラス、アルミニウム、チタニウムおよび多孔性セラミックが挙げられる。好ましい実施形態においては、Sephadex(登録商標)、Sepharose(登録商標)、Fractogel(登録商標)、CIMGEL(登録商標)、Toyopearl(登録商標)、HEMA(登録商標)、ならびに架橋アガロース、およびマクロ多孔性ポリスチレンまたはポリアクリレートなどの市販の樹脂を含む樹脂が固相として用いられる。固相はまた、マクロ多孔性ガラスもしくは粘土鉱物などの主に無機性のもの、またはCeramic HyperD(登録商標)もしくはシリカゲルなどの、樹脂と無機物との組合せであってもよい。
【００７０】
充填工程
トランスジェニックFVII/FVIIaを含有する供給源生物材料を場合により前処理(例えば、清澄化または濾過工程)した後、上記リガンドを含む親和性支持体上に充填する。
【００７１】
供給源生物材料は、好ましくは、リガンドを含む親和性支持体上に充填する前に調整される。本発明のある実施形態においては、充填バッファーのpHは、約6.0〜8.0に調整される。本発明のこのクロマトグラフィー工程のために、好適な充填バッファーは、典型的には、緩衝剤、典型的には、リン酸塩、クエン酸塩、またはトリスを含む水性溶液に対応する。それにも拘らず、中性に近いpKを有する全てのカルボン酸バッファーまたは両性イオンバッファーを用いることもできる。カルシウム、マグネシウム、亜鉛などの二価イオンを、0〜50mMの範囲(最終濃度)で充填バッファーに添加することができる。
【００７２】
充填工程は、典型的には、1時間あたり10〜72倍カラム容量(CV)の流速で、好ましくは、18〜54CV/時間で行われる。いくつかの実施形態においては、充填流速は、30〜48CV/時間であり、好ましくは、36CV/時間である。これらの特定の範囲は、非解離性複合体を形成する過剰な時間を含まずに、トランスジェニックFVII/FVIIaのリガンドへの十分な接触時間を可能にするものである。
【００７３】
本発明のある実施形態においては、充填される材料は、非特異的結合剤および夾雑物が溶出されるまで、カラム上への充填後に洗浄される。
【００７４】
第1の洗浄工程-未結合の材料の除去
本発明のある実施形態においては、第1の洗浄工程は、充填された溶液中に含まれる未結合の材料を溶出させるために行われる。前記第1の洗浄は、好ましくは、2〜9の範囲のpHを有する洗浄バッファーを用いて実施される。いくつかの実施形態においては、第1の洗浄バッファーのpHは、親和性樹脂への適用時に、3〜10、3〜7、5〜9、6.5〜8.5または6.5〜10.0の範囲である。いくつかの興味深い実施形態においては、第1の洗浄バッファーのpHは、4.0〜7.0、7.0〜9.0、または4.5〜8.5の範囲である。
【００７５】
第1の洗浄工程中に、供給源材料中に存在する夾雑タンパク質と、固定化されたリガンドとの弱い相互作用を、これらの特定の範囲のpHのそのようなバッファーにより減少させることができる。静電反発力相互作用が、弱く結合したタンパク質を溶出させるために実際に有利に用いられる。
【００７６】
第1の洗浄工程は、典型的には、1時間あたり10〜72倍カラム容量(CV)の流速で、好ましくは、18〜54CV/時間で行われる。いくつかの実施形態においては、洗浄流速は、30〜48CV/時間の範囲、好ましくは、36CV/時間である。本発明のある実施形態においては、第1の洗浄バッファーは、緩衝剤、典型的には、リン酸塩、またはトリスを含む水性溶液である。それにも拘らず、中性に近いpKを有する全てのカルボン酸バッファーまたは両性イオンバッファーを用いることもできる。
【００７７】
ある実施形態においては、第1の洗浄バッファーは、6.5〜8.5のpH、最も好ましくは、pH7.5の0〜100mM、好ましくは、50mMのトリスバッファーを含む。
【００７８】
1つ、2つもしくはいくつかの異なる洗浄バッファーを用いることにより、または勾配洗浄バッファーの適用により、洗浄工程を延長することができることが理解されるべきである。
【００７９】
第2の洗浄工程-弱く結合した材料の除去
本発明のある実施形態においては、第2の洗浄バッファーは、TgFVIIまたはTgFVIIaよりも弱い親和性を有するが、樹脂上に結合した夾雑物を除去するために、TgFVII/TgFVIIaの溶出の前に有利に適用される。ある実施形態においては、第2の洗浄バッファーは、エーテルジオール化合物および少なくとも1つの可溶性塩を含有する。
【００８０】
本発明のある実施形態においては、第2の洗浄バッファーのイオン濃度を、塩化ナトリウムまたはマグネシウムとしてのカオトロピック塩を用いて増加させる。ある実施形態においては、イオン強度を、一価または多価陰イオンおよび/または陽イオン塩などのイオン成分を用いて増加させる。ある実施形態においては、イオン強度またはイオン濃度は、200〜600mM、またはより好ましくは、300〜500もしくは350〜450mMの範囲である。同時に、バッファーの疎水性を、エチレングリコールまたはプロピレングリコールなどの疎水性薬剤を用いて増加させる。ある実施形態においては、第2の洗浄バッファー中の疎水性薬剤のパーセンテージは、10%〜50%、20%〜40%、好ましくは25%〜35%の範囲である。
【００８１】
「弱く結合した材料」とは、第2の洗浄工程が、本発明の方法において用いられる親和性リガンドに対する少なくとも100μM、好ましくは少なくとも10μMの親和性(Kd)を有する材料の除去を誘発することを意味する。
【００８２】
ある実施形態においては、第2の洗浄バッファーのイオン強度および疎水性強度を、可能な限り、好ましくは、全ての、親和性樹脂上に結合した夾雑物を除去するために同時に増加させる。
【００８３】
第2の洗浄バッファーは、好ましくは、6.5〜8.5のpHのトリスバッファー中に、0〜40%のグリコールエーテルおよび0〜0.5Mのナトリウム塩を含む。好ましい実施形態においては、第2の洗浄バッファーは、pH7.5のトリスバッファー中に30%のプロピレングリコールおよび0.4MのNaClを含む。
【００８４】
また、第2の洗浄工程および溶出工程は別個の工程である必要はなく、特に、勾配溶出バッファーを溶出工程において用いる場合は組合せてもよいことに留意すべきである。
【００８５】
溶出工程
洗浄工程の後、親和性カラムのリガンド上に結合したTgFVII/TgFVIIaを、溶出バッファーを用いて溶出させ、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaの精製された溶液を溶出液として採取する。ヒトFVIIまたはFVIIaの脱離は、好ましくは、抗原結合リガンドが最早ヒトFVIIまたはFVIIaに結合しないように物理化学的条件を変化させることによって達成される。溶出は、pH、塩、温度または任意の他の好適な尺度に関する条件を変化させることによって達成することができる。
【００８６】
「前記リガンドとの相互作用を非破壊的な形で分断すること」という表現は、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaの完全性および機能が、前記トランスジェニックFVII形態を溶出させる時点で保存されることを意味する。
【００８７】
ある実施形態においては、溶出は、3.0未満のpHを有するバッファーを用いて実施されるが、溶出した分子の生物活性を維持するためには、6.0を超えるpHへの急速な中和が必要である。
【００８８】
溶出バッファーは、典型的には、緩衝剤、典型的には、リン酸塩、またはトリスを含む水性溶液である。それにも拘らず、中性に近いpKを有する全てのカルボン酸バッファーまたは両性イオンバッファーを用いることもできる。溶出工程は、好ましくは、2〜10のpHを有する溶出バッファーを用いて行われる。いくつかの実施形態においては、pHは、3〜9、5〜8、最も好ましくは、7〜8の範囲である。静電反発力相互作用は、TgFVIIまたはTgFVIIaとリガンドとの特異的親和性相互作用を分断するには十分ではない。溶出バッファーは、さらに有利には、例えば、グリコシル化などの形質導入後の変換を失うことなくTgFVII/TgFVIIaの生物活性を維持させるか、またはその凝集もしくは酸化を回避することができる任意のさらなる成分を含んでもよい。
【００８９】
好ましくは、溶出バッファーのイオン強度を、塩化ナトリウムまたはマグネシウムとしてのカオトロピック塩を用いて増加させる。ある実施形態においては、溶出バッファーのイオン強度は、500〜2500mM、1000〜1800mM、または好ましくは、1200〜1600mMの範囲である。
【００９０】
好ましくは、溶出バッファーの疎水性を、エチレングリコールまたはプロピレングリコールとしての疎水性薬剤を用いて増加させる。ある実施形態においては、溶出バッファー中の疎水性薬剤のパーセンテージは、20%〜70%、30%〜50%、または好ましくは、40%〜50%の範囲である。
【００９１】
最も好ましくは、溶出バッファーのイオン強度および疎水性を、7〜8のpHを有するバッファー中で同時に増加させる。ある実施形態においては、溶出バッファー中の疎水性薬剤のパーセンテージは20%〜60%の範囲であり、そのイオン強度は0.5〜2.0Mの範囲である。好ましくは、疎水性薬剤のパーセンテージは30%〜50%の範囲であり、イオン強度は1.0〜1.8Mの範囲であるか、または疎水性薬剤のパーセンテージは40%〜50%の範囲であり、イオン強度は1.2〜1.6Mの範囲である。
【００９２】
好ましい実施形態においては、活性で安定なTgFVIIおよび/またはTgFVIIa分子の脱離を、pH7.5のトリスバッファー中に45%のプロピレングリコールおよび1.5Mの塩化ナトリウムを含むバッファーを用いて実施する。
【００９３】
溶出工程は、典型的には、1時間あたり10〜72倍カラム容量(CV)の流速で、好ましくは、18〜54CV/時間で行われる。いくつかの実施形態においては、溶出流速は、30〜48CV/時間の範囲であり、好ましくは36CV/時間である。流速を増加させた場合、遊離固定化リガンドへの再会合の可能性が低下し、溶出液画分中でのTgFVII回収が改善される。この効果は主に、TgFVIIまたはTgFVIIaに対するリガンドの強い親和性と関連する。
【００９４】
本発明で提唱される親和性精製の後、90%を超える純粋なTgFVII/TgFVIIaが調製され、これは4を超える常用対数のウサギミルクタンパク質(RMP)の減少(4log10または99.99%の減少)を表す。それにも拘らず、RMPは典型的には500000ppm未満、好ましくは、100000ppm未満、最も好ましくは50000ppm未満である。ウサギトランスフェリンは、最も重要な付随する夾雑RMPの1つであることが示されている。
【００９５】
RMPを非常に低レベルまで、典型的には、5ppm未満に減少させるために、精製スキームは、様々な直交法を統合する必要がある。「直交法」とは、互いに異なる分離機構を用いる多工程の精製手順を意味する。本発明においては、精製は、その選択性、効率および大規模化の容易性のため、クロマトグラフィー法に基づく。これらの方法の組合せを、凝集物を含まず、非常に低レベルの分解および酸化された形態を含む、最終的な大量のTgFVIIおよび/またはTgFVIIaを確保するように特に設計した。
【００９６】
さらに、出願人は、親和性クロマトグラフィーの予期せぬ驚くべき特性、特に、マウス白血病ウイルス(MLV)などのエンベロープウイルスおよびブタパルボウイルス(PPV)などの非エンベロープウイルスのウイルス力価の減少を改善するその能力を発見した。
【００９７】
特定の好ましい様式では、親和性クロマトグラフィーの工程は、3log10より優れた、好ましくは、4log10より優れた、より好ましくは、5log10より優れたウイルス減少率(RF)を得るために実施される。
【００９８】
「ウイルス減少率」とは、クロマトグラフィー工程の実施前に測定されたウイルス量の値(力価×容量)(すなわち、初期量のウイルス力価の値)と、クロマトグラフィー工程の実施後に測定されたウイルス量の値(力価×容量)(すなわち、溶出液中で測定された力価の値)との比の結果を意味する。ウイルス力価は、Federal Gazette N 84、1994年5月4日、およびSchmidt, N.J. & Emmons, R.W.(1989)、Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infection、第6版に記載のSpearman Karberの式を用いて算出される。
【００９９】
限外濾過/透析濾過
本発明によれば、親和性精製された材料を透析濾過または希釈してイオン強度を低下させた後、さらに精製することができる。本発明のある実施形態においては、5〜50kDa、好ましくは10〜30kDaの範囲のカットオフを有する限外濾過膜が用いられる。バッファー交換により、イオン強度は、1〜50mM、好ましくは5〜15mMの範囲の、ナトリウム塩を含有する、本発明のある実施形態においては、クエン酸三ナトリウムを含有するバッファーに減少する。
【０１００】
本発明のある実施形態においては、長期保存を、この工程で、好ましくは-20℃未満の低温で有利に行うことができる。
【０１０１】
本発明のある実施形態においては、減塩、長期保存および微生物除去により安定化された親和性精製された材料を、さらに精製することができる。
【０１０２】
イオン交換クロマトグラフィー
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明のプロセスは、TgFVIIおよびTgFVIIaをさらに精製するための少なくとも1つのイオン交換クロマトグラフィー工程をさらに含む。
【０１０３】
好ましくは、少なくとも1つのクロマトグラフィー工程は、陰イオン交換樹脂上で実施される。前記陰イオン交換クロマトグラフィーを、強塩基または弱塩基型クロマトグラフィー支持体を用いて実行することができる。いくつかの実施形態においては、GE Healthcare社からのQ-Sepharose、最も好ましくは、Q-Sepharose XL型のような様々な市販の樹脂の第4級アンモニウム官能基が使用可能である。この一覧は限定的なものではなく、Bio-Rad社、Pall Biosepra社、Merck社、Millipore社または他の供給業者からの強力な陰イオン交換体を用いることができる。
【０１０４】
有利には、TgFVIIaへのTgFVIIの活性化は、陰イオン交換体上で行われる分離工程の間に増加する。
【０１０５】
充填工程
事前精製された材料を、最初に同じ伝導範囲で平衡化し、使用時に同じ塩で平衡化された陰イオン支持体に吸着させる。
【０１０６】
本発明のある実施形態においては、陰イオン電荷とのRMP相互作用を強化するために、充填の直後に塩交換が導入される。ナトリウム塩、より特には、クエン酸三ナトリウム塩を、より低い伝導性を有するイミダゾールバッファーに切替える。この特異的バッファーにおいて、イミダゾールは1〜50mM、好ましくは5〜30mMの範囲であり、より好ましくは、20mMである。また、バッファーのpHは、6.5〜8.5、好ましくは、7〜8の範囲に維持される。そのような条件において、トランスフェリンおよび他のタンパク質と複合体化した非活性TgFVIIまたはTgFVIIは、陰イオン交換樹脂に対して強化された相互作用を示す。
【０１０７】
第1の洗浄
本発明のある実施形態においては、第1の洗浄は、塩濃度、特に、塩化ナトリウム塩濃度を、50〜175mM、より好ましくは、130〜160mMの範囲に増加させることにより適用される。この洗浄を、勾配または工程により適用することができる。本発明のある実施形態においては、この洗浄は、ミルク内因性トランスフェリンの特異的溶出を示すが、同時に、イミダゾールバッファーの存在下で、TgFVII/TgFVIIaはイオンゲル上に留まり、他のタンパク質と複合体化した微量のトランスジェニックFVIIもまた吸着されたままである。
【０１０８】
TgFVII/TgFVIIaの溶出
本発明の実施形態において、TgFVII/TgFVIIaは、塩濃度、特に、塩化ナトリウム塩濃度を、0〜75mM、より好ましくは、40〜60mMの範囲に減少させ、同時に、2〜9mM、より好ましくは、5〜8mMの範囲の非常に低濃度のカルシウム塩を導入することにより、陰イオン交換体から溶出される。カルシウムと、FVII分子などのglaドメイン含有タンパク質との特異的相互作用が長い間にわたって研究されてきた。FVII分子におけるコンフォメーション変化は、低い伝導性での溶出を可能にする全体的な電荷の変化をもたらす。本発明のある実施形態においては、イミダゾールの存在下では、他のタンパク質と複合体化した微量のTgFVIIは吸着されたままである。トリス-ヒドロキシメチルアミノメタンまたはクエン酸三ナトリウムのような他の塩は、遊離TgFVIIおよび/または他のタンパク質と複合体化したTgFVIIとの同時溶出を示す。
【０１０９】
陰イオン交換体から溶出したTgFVIIは、50%〜100%、より好ましくは、80〜100%の活性化形態のTgFVIIaを含む。
【０１１０】
さらに、出願人は、イオン交換クロマトグラフィーの予期せぬ驚くべき特性、特に、マウス白血病ウイルス(MLV)などのエンベロープウイルスおよびブタパルボウイルス(PPV)などの非エンベロープウイルスのウイルス力価の減少を改善するその能力を発見した。
【０１１１】
特定の好ましい様式では、イオン交換クロマトグラフィーの工程は、3log10より優れた、好ましくは、4log10より優れた、より好ましくは、5log10より優れたウイルス減少率(RF)を得るために実施される。
【０１１２】
好ましくはヒドロキシアパタイト上での偽親和性クロマトグラフィー
本発明のある実施形態においては、陰イオン交換クロマトグラフィーから採取され、TgFVIIおよび/またはTgFVIIaを含有する溶出液を、有利には、ヒドロキシアパタイトゲル[Ca10(PO4)6(OH)2]上での偽親和性クロマトグラフィーによりさらに精製する。
【０１１３】
このさらなる偽親和性クロマトグラフィーは、好ましくは、以下の条件下で実施される:カラムを、7.5〜8.5のpHの、10〜30mMのリン酸カリウムもしくはナトリウムまたはその混合物を含む水性バッファーAを用いて平衡化させる。
【０１１４】
カルシウムを用いて製剤化されたTgFVII/TgFVIIa分子は支持体上に保持されるが、Des-gla-FVIIおよび他の切断は流出液中で除去される(「Des-gla-FVII」とは、おそらくタンパク質分解により除去されたFVIIのGLAドメインを意味する)。
【０１１５】
バッファーAの浸出は、充填工程の直後に、プロセスの間に部分的に切断されたTgFVIIおよび/またはTgFVIIaの一部を溶出し、これにより、活性が低いか、または不活性のTgFVIIaなどの望ましくないFVII形態の良好な除去が可能になる。
【０１１６】
TgFVIIaの溶出は、所定の濃度の、リン酸ナトリウムもしくはカリウムなどのリン酸塩、またはその混合物を含むバッファー、好ましくは、7.5〜8.5のpHの、0.1M〜0.5M、好ましくは、0.1M〜0.2Mのリン酸ナトリウムを含むバッファーBを用いて実施される。得られる溶出液は、切断形態の割合が低い、完全に活性なTgFVIIaを含有する。
【０１１７】
サイズ排除クロマトグラフィー
最終的な微量のRMPは、質量分析または特異的ELISAによってのみ同定することができる。最終的な研磨工程の前に、RMPは50〜500ppmの範囲であり、最も好ましくは、300ppm以下である。
【０１１８】
本発明のある実施形態においては、さらなる精製工程を、サイズ排除クロマトグラフィーによって実施することができる。サイズ排除カラム高、樹脂多孔性およびクロマトグラフィーバッファーは、最良の選択性を達成するために選択しなければならない。Superdex S75調製等級またはより好ましくはSuperdex S200調製等級と同等の高性能樹脂が研磨工程に必要である。60cmより高く120cmより低い、より好ましくは、80cmより高く110cmより低いゲルベッド高により、十分に溶解して2のさらなるlogの微量のRMPを除去することができる。
【０１１９】
ある実施形態においては、SEC中に適用されるバッファー交換は、20〜500ppm、または好ましくは、50〜200ppmの濃度の非イオン性界面活性剤と共に、限定されるものではないが、アルギニンもしくはグリシンなどのアミノ酸または糖を含有する。バッファー中のイオン性界面活性剤の存在は、有利には、SEC中のTgFVII/TgFVIIaの単量体状態を維持するのに役立ち、FVIIと夾雑分子との最適な分離をもたらす。本発明のある実施形態においては、製剤バッファーは、米国特許出願第2012/0087908号に記載のような、様々なアミノ酸と、モノラウリン酸ソルビタンまたは/およびモノオレイン酸ソルビタンとの混合物を含有する。SECカラム容量の1%〜10%、より好ましくはSECカラム容量の2〜5%の範囲の充填容量と組み合わせた、10〜40cm/h、より好ましくは、20〜25cm/hの直線状流速を適用して、RMPの5ppmより下、または99.9995%より高い純度のTgFVIIおよび/またはTgFVIIaの単量体ピークを得る。
【０１２０】
さらに、出願人は、サイズ排除クロマトグラフィーの予期せぬ驚くべき特性、特に、マウス白血病ウイルス(MLV)などのエンベロープウイルスおよびブタパルボウイルス(PPV)などの非エンベロープウイルスのウイルス力価の減少を改善するその能力を発見した。
【０１２１】
特定の好ましい様式では、サイズ排除クロマトグラフィーの工程は、3log10より優れた、好ましくは、4log10より優れた、より好ましくは、5log10より優れたウイルス減少率(RF)を得るために実施される。
【０１２２】
したがって、親和性クロマトグラフィー工程および/またはイオン交換クロマトグラフィー工程および/またはサイズ排除クロマトグラフィー工程は、3log10より優れた、好ましくは、4log10より優れた、より好ましくは、5log10より優れたウイルス減少率(RF)を得ること可能にする。
【０１２３】
ウイルスの除去/不活化
本発明の方法はまた、少なくとも1つのウイルス不活化/除去専用工程を含んでもよいが、最も好ましくは、少なくとも2つの直交ウイルス不活化/除去専用工程を含む必要がある。清澄化されたミルクを、溶媒を用いる化学的処理および/もしくは界面活性剤処理または他の型の効率的処理によりウイルス不活化することができる。本発明のある実施形態においては、溶媒/界面活性剤は、特に、Tween(登録商標)80(1%〜1.5%w/v)とTnBP(トリ-n-ブチルホスフェート0.3%〜0.5%v/v)との混合物の存在下で、エンベロープウイルスを不活化するために用いられる。限定されるものではないが、Octoxynol100またはTriton X114またはコール酸ナトリウムまたはTween(登録商標)20のような他の非イオン性界面活性剤は、Tween(登録商標)80と置き換えるか、またはそれを補完することができる。
【０１２４】
さらに、上記のクロマトグラフィー工程のいずれかから得られる溶出液を、ナノ濾過の工程にかけて、ウイルス、特に、パルボウイルスB19などの非エンベロープウイルスを効率的に除去することができる。特に、15nmより大きいサイズのウイルスを保持するASAHI PLANOVA(商標)15フィルターを用いることができる。
【０１２５】
本発明のある実施形態においては、ナノ濾過は、第1のクロマトグラフィー工程の後に行われ、TgFVII純度が90%より高く、カゼインミセルのようなタンパク質の高い分子サイズの主要部分が十分に除去されてそのような孔径のナノフィルター中での濾過を可能にする。出発FVII濃度は、好ましくは、1.0〜2.5g/L、より好ましくは、1.3〜2.2g/Lであり、典型的な流速は、5〜15LMH、好ましくは、8〜12LMHである(「LMH」とは、リットル/平方メートル/時間、またはL/m2/hを意味する)。
【０１２６】
ウイルス除去に加えて、ナノ濾過はまた、ナノフィルターの幅を通過する篩い機構によって内因性DNAの有利な減少も示す。
【０１２７】
本発明のある実施形態においては、Planova 15ナノメートル平均孔径と等価なナノ濾過フィルターを用いることができる。20ナノメートル孔径のフィルターは、15ナノメートルフィルターと置き換えてもよく、15ナノメートルフィルターはより高い多孔性を有するフィルターと対にしてもよい。本発明のある実施形態においては、連続的な0.2μm/0.1μm、次いで、Planova 20ナノフィルター、次いで、Planova 15ナノフィルターは、TgFVII/TgFVIIaの生物活性を失うことなく、同時に任意の危険性(バイオバーデン、マイコプラズマ、ウイルス、外来薬剤、TSE)を有利に低下させることができる。
【０１２８】
製剤化、滅菌、凍結乾燥
一度、精製されたTgFVIIおよびTgFVIIaを含有する最後の溶出液が回収されたら、前記溶出液を、0.22μmのフィルター上での濾過工程に提出し、容器中に充填した後、凍結/乾燥することができる。
【０１２９】
好ましくは、供給者により記載されたタンパク質の低い結合および非イオン性界面活性剤の低い吸着のため、改変されたPVDF膜が本発明において有利に用いられる。Millipore社からのDurapore(登録商標)膜フィルターは、この工程によく適合し、他の市販のフィルターにも限定されない。
【０１３０】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、本発明を例示するものである。
【実施例】
【０１３１】
(実施例1)
特異的抗FVII/FVIIaリガンドの調製
ラマを、高純度ヒトFVIIa抗原で免疫した。2回目の追加免疫の後、100倍を超える力価の増加が観察され、ヒトFVIIa/FVII抗原に対する特異的富化を示していた。ラマからRNAを採取し、VHH発現ライブラリーを作成した。ヒトFVIIaに結合する能力を有するラマVHHの発現について、クローンをELISAで試験した。23個のVHHクローンを選択し、それらが血漿由来ヒトFVIIおよびFVIIaおよび組換えウサギFVIIに結合する能力についてさらに試験した。全てのクローンが、ヒトFVIIおよびFVIIaに結合することができることが見出され、組換えウサギFVIIに対する架橋は観察されなかった。クローンを、FVII/FVIIaに関するその結合および溶出能力について、ならびに酸性pHでのその結合特性の安定性についてさらに試験した。選択された候補をBAC酵母発現系中に再クローニングし、対応するリガンドを発現させた後、マトリックス1mlあたり2.5mgのリガンド密度でNHS-Sepharose上にカップリングさせた。
【０１３２】
(実施例2)
ミルクからのTgFVIIaの精製
本実施例は、150リットルのウサギミルクからの高度に精製された活性化TgFVII溶液の調製を記載する。
【０１３３】
2.1  ミルク採取
ミルクの複合出発プールは、1Lのボトルに一緒に充填され、生物学的安全性対照(バイオバーデン、内毒素および内因性ウイルス)のために試料化され、次いで、長時間保存(<-20℃で数ヶ月間)のために非常に低い温度(<-60℃)で保存、凍結された、6つの毎日採取されたミルクのミニプールの完全な泌乳サイクルにあった。ミルクを、ミルキングの自然のサイクルに対応する4日目から24日目まで採取した。
【０１３４】
2.2  清澄化
ミルクを含有する凍結したボトルを、32〜37℃に維持された大きい解凍タンクに入れた。各ボトル中に最後の氷片を得るために、解凍時間は約1時間であった。147.4kgの解凍された供給源材料(SM)を、500Lの混合系バッグに移し、プールした。0.315Mのクエン酸三ナトリウムバッファーを添加して、20〜40g/Lの範囲のタンパク質濃度を得た。混合物の温度を24〜26℃に調整した。混合系を停止させて、希釈し、クエン酸化されたSMの上層中の脂肪のデカンテーションを可能にした。
【０１３５】
STAXデバイス(Pall Corporation社)と共に取り扱った15〜0.5μm(PDH4)および0.3〜0.1μm(PEKS)の孔径範囲を有する深層フィルターを、バッファー中で予備平衡化させた。クエン酸バッファーで処置されたミルクを濾過し、444kgの濾液を1回使用バッグに充填した後、0.45/0.2μmのSartobran(登録商標)フィルター(Sartorius Corporation社)を用いて0.2μm濾過を実施した。異なるフィルターの濾過性を、漸増する平均孔径に応じる平方メートルで約2〜15kgのタンパク質から目詰まりなしの濾過のために適合化させた。
【０１３６】
2.3  S/D処理
ポリソルベート80およびトリ-n-ブチルホスフェートの溶液の添加を、材料の清澄化された供給源(CSM)に対して行って、0.8〜1.5%w/vの界面活性剤および0.2〜0.5%v/vの溶媒を含有する509.8kgの溶液を得た。温度を25±2℃に調整し、そのような条件で少なくとも2時間の接触時間を維持して、生物源中の任意の潜在的な非エンベロープウイルスを不活化した。また、ミルクに由来する微量の残留脂質またはトリグリセリドを、界面活性剤および溶媒の添加により化学的に溶解させ、溶液をさらなるクロマトグラフィー工程にとってより好適なものにした。
【０１３７】
2.4  トランスジェニックFVII/FVIIa特異的リガンド上での親和性クロマトグラフィー
カラムを50mMトリスバッファー、pH7.5で平衡化した後、タンパク質を含有する溶液を220L/hで充填した。6リットルの親和性ゲルは、処理されたミルクプールから全てのTgFVIIを吸着させるのに十分に大きいものであった。充填後、第1の洗浄をトリスバッファーを用いて行った。安定な基準への回復を保証するためには、90リットルが必要であった。非特異的相互作用により結合したタンパク質は、この大きい洗浄の間に除去された。
【０１３８】
初期トリスバッファーに対して、イオン強度を500mMの塩化ナトリウムに増加させ、30%v/vのプロピレングリコールを含む相対的疎水性に増加させることにより、RMP溶出を最大化し、FVII脱離を最小化するための最適化された洗浄工程を実施した。
【０１３９】
イオン強度を1500mMの塩化ナトリウムに増加させ、45%v/vのプロピレングリコールを含む相対的疎水性に増加させることにより、RMP脱離を最小化し、FVII溶出を最大化するための最適化された洗浄工程を実施した。
【０１４０】
50.6リットルが親和性溶出液画分中に採取された。親和性溶出液のアミド溶解性FVII/抗原性FVIIの比は1に近く、抗原分子1ユニットにつき、1ユニットの凝固因子に対応する。親和性工程により、4logクリアランスでのRMPの主要部分の除去が可能になった。
【０１４１】
この方法により、凝固性TgFVII/TgFVIIaは上手く免疫精製された。
【０１４２】
2.5  限外濾過
代替手段として、保存することができる中間生成物を、限外濾過技術を用いて製造した。親和性S/D処理された溶出液を、Novasep社からの1回使用のTangenX Sius-LS(登録商標)の30kDaのポリエーテルスルホン膜上で濃縮および安定化した。再循環ポンプ速度の調整により、濃縮段階中に膜貫通圧力を20psigに維持した。2g/Lのタンパク質濃度が得られた場合、クエン酸バッファー中で透析濾過を行って、親水性化合物、塩および化学的溶媒を除去した。
【０１４３】
2.6  滅菌濾過および凍結-中間生成物1
2638ユニットの比活性を有する10.4Lの濃縮された中間体を、1mgずつ、1Lの容器中、層流フード下でSartobran(登録商標)0.45/0.2μmカプセルを用いて無菌濾過した。
【０１４４】
ボトルを<-60℃で保存して、下流のプロセスのための中間生成物を構成させた。
【０１４５】
2.7  0.2/0.1μmでの濾過ならびに20Nおよび15NのPlanovaフィルター上でのナノ濾過
TgFVII/TgFVIIa生成物の臨床および医薬としてのヒトでの使用のためには、さらなる精製が必要であった。最初に、潜在的なウイルス量を減少させるために、中間体を濾過トレインを通して濾過した:
・Sartorius社からの0.2/0.1μmのSartopore 2(登録商標)使い捨てカプセル
・ASAHI KASEI社からの1sq.mのPlanova(登録商標)20、次いで、1sq.mのPlanova(登録商標)15
【０１４６】
9.45Lの中間体を12LMHの初期流速で濾過トレインを通して直接ポンプ注入し、膜貫通圧力を全工程中にモニタリングして、それぞれのナノフィルター上で最大12psigを維持した。プロセスのこの工程で、純度は約95%と算出され、内因性トランスフェリンが主要な夾雑物の1つとして同定された。
【０１４７】
プロセスのこの段階で、TgFVII活性化は還元条件下でのSDS-PAGE分析の定量により20〜50%と評価される。部分的活性化は、精製プロセスの清澄化段階中に放出されたミルクカルシウムに起因するものである。
【０１４８】
2.8  Q Sepharose XL上でのイオン交換クロマトグラフィー
TgFVIIの純度および活性化は、イオン交換クロマトグラフィーおよびカルシウム依存的溶出によって増強された。ナノ濾過された溶液を、pH7.0の10mMクエン酸ナトリウムで予め平衡化させたQ-Sepharose XL陰イオン交換体(GE Healthcare社)上に充填した。
【０１４９】
第1の洗浄工程を、pH7.5の20mMイミダゾールおよび25℃で5mS/cm未満の伝導度を用いて実施した。第2の洗浄工程を、20mMイミダゾールに加えて150mMの塩化ナトリウムを導入して、25℃で18mS/cmの伝導度を達成することにより実施した。洗浄のピークは、主に遊離トランスフェリンを含むと同定された。次いで、塩化ナトリウム塩を50mMに低下させ、同時に、イミダゾールを20mMに維持しながら、塩化カルシウムを最大7mMで添加することにより、TgFVII/TgFVIIaを溶出させた。溶出画分は、還元条件でのSDS-PAGEにより評価された場合、90%を超える活性化形態のTgFVIIaを含有していた。RMPレベルをELISAにより測定し、TgFVIIと比較したところ、残留RMPは500ppm未満と算出された(Table 3(表3)を参照されたい)。
【０１５０】
QSXLクロマトグラフィーは、HRIレベルの減少に寄与し、その平均スコアは2log10であり、そのうち1.6log10はトランスフェリンであった。
【０１５１】
この工程の間に、FVIIaへの活性化は、溶出バッファー中のイオン化カルシウムの存在によって増強された。次いで、Q-Sepharose XL溶出液を+2/+8℃で一晩保存した。
【０１５２】
2.9  ヒドロキシアパタイト上での偽親和性クロマトグラフィー
保存の間に、いくらかのFVII切断、特に、重鎖上での切断が起こる可能性があるが、軽鎖はカルシウムイオンによって保護される。ヒドロキシアパタイトおよびリン酸カルシウム吸着剤は、FVII/FVIIaなどの凝固因子、より広くは、Gla-ドメインを含有するタンパク質を吸着することが周知である。この偽親和性を、プロセスの研磨工程のために用いた。
【０１５３】
トランスジェニックFVII/FVIIaを含有するQ Sepharose XL溶出液を、pH8.0の25mMリン酸カリウムで予め平衡化させたCHTセラミックヒドロキシアパタイトI型カラム(BioRad社)上で濃縮した。
【０１５４】
アイソクラチック洗浄工程を、pH8.0の25mMリン酸カリウムを用いて実施した。この洗浄工程は、タンパク質分解された形態、特に、その重鎖上に1つまたは複数の切断を含有するTgFVII/TgFVIIaを特異的に溶出し、アイソクラチック様式の完全な活性型の最小限の損失に限定するようにモニタリングされた。
【０１５５】
次いで、TgFVII/TgFVIIaを、pH8.0の150mMリン酸カリウムを用いてTgFVIIaの濃縮液として溶出させた。
【０１５６】
2.10  Superdex 200上でのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)
単量体TgFVII/TgFVIIaの安定化を、プロセスの最後の研磨工程によって行った。SECにより、リン酸カリウムの除去ならびに少なくともポリソルベート80およびアルギニンへの製剤化が可能になった。
【０１５７】
ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーカラムから溶出し、TgFVII/TgFVIIaを含有する画分を、5mMクエン酸ナトリウム、114mMアルギニンHCl、46mMイソロイシン、16mMグリシン、6.5mMリシン、0.07%(v/v)Tween 80、pH6.0で予め平衡化させたSuperdex 200カラム(GE Healthcare社)上に充填した。
【０１５８】
トランスフェリン(70kDa)または他のタンパク質と複合体化したFVIIのような、より高い力学的半径またはより高い分子サイズを有するタンパク質は、サイズ排除により単量体TgFVIIa(45kDa)の直前に溶出された。
【０１５９】
カゼインまたはペプチドのようなより低い力学的半径またはより低い分子サイズを有するタンパク質は、単量体TgFVIIa(45kDa)の直後に溶出された。
【０１６０】
TgFVII/TgFVIIaを含有する画分を、カラムを平衡化させるために用いたものと同じバッファーを用いて溶出させた。
【０１６１】
2.11  安定化および製剤化
最終的なTgFVII/TgFVIIa溶液を、5mMクエン酸ナトリウム、114mMアルギニンHCl、46mMイソロイシン、16mMグリシン、6.5mMリシン、0.07%(v/v)Tween 80、pH6.0を含む製剤化バッファー1Lあたり1gのTgFVIIaの濃度で製剤化した。
【０１６２】
93.5%の活性化形態のTgFVIIaを、還元条件でのSDS-PAGEにより評価した。
【０１６３】
2.12  滅菌
次いで、5243mLの製剤化され、安定化されたTgFVII/TgFVIIa溶液を、0.2μmのMillipak 100膜上で無菌濾過した。
【０１６４】
(実施例3)
進行中の分析結果
実施例2に記載の精製プロセス中に生成された試料を分析した。
【０１６５】
3.1  生成プロセスの再現性
8つのバッチに関する各工程のFVIIの収率、次いで、FVIIアミド分解アッセイまたは吸光度を、Table 1(表1)およびTable 2(表2)にまとめる。
【０１６６】
【表１】
2015522600.tif 000002
【０１６７】
【表２】
2015522600.tif 000003
【０１６８】
FVIIの収率は、各工程の平均値に関して10%未満の変動を有する一貫した結果を示した。
【０１６９】
3.2  RMPクリアランス
試験したバッチに関する平均RMPクリアランスを決定し、図2に示す(RMPクリアランス)。
【０１７０】
精製プロセス中のRMPクリアランスは完全に再現性であった。RMPクリアランスに最も寄与した工程は、
-  FVII/FVIIaに特異的であるリガンド上での親和性クロマトグラフィー
-  Q Sepharose XLクロマトグラフィー、および
-  Superdex 200クロマトグラフィー
であった。
【０１７１】
【表３】
2015522600.tif 000004
【０１７２】
プロセスから得られる全体的なRMPクリアランスは、8〜9log10であった。
【０１７３】
3.3  ウサギDNAクリアランス
また、ウサギDNAクリアランスを、Q-PCR技術により異なるプロセス中間体中のその含量をアッセイすることによって評価した。対応する結果を、図3に示す(DNAクリアランス)。結果を、ミルク中でのELISAによって、および他の中間体についてはOD280によってアッセイされたTgFVII/TgFVIIa濃度に関してppbで表す。
【０１７４】
【表４】
2015522600.tif 000005
【０１７５】
最も寄与した工程は、ナノ濾過であった。Q Sepharose XLクロマトグラフィーの後、全てのバッチは定量レベル(LOQ)未満であった。
【０１７６】
プロセスから得られる全体的なDNAクリアランスは、5〜6log10であった。
【０１７７】
3.4  FVII活性化の動力学
上記に開示されたように、TgFVIIはプロセス中にTgFVIIaに活性化し、活性化は主としてQ Sepharose XLクロマトグラフィーを用いた場合に増強する。以下のTable 5(表5)に詳述されるように、プロセスの終わりに、抗原単位による凝固単位の比によって定義される活性化比は、17〜25であった。
【０１７８】
【表５】
2015522600.tif 000006
【０１７９】
TgFVIIは、SDS-PAGEによって大まかかつ容易に追跡することができる(クマシーブルー着色、図4)。
【０１８０】
また、FVIIアイソフォームを、タンパク質マッピング分析[RP(C4)-HPLC-MS]によって、より高い精度で定量することができる。活性化部位(重鎖および軽鎖)から切断されて生物学的に活性なTgFVIIaを生成した形態を決定した。未切断の鎖は、非常に低い生物活性を有する非活性化TgFVIIに対応し、軽鎖および重鎖から切断されたアイソフォームは生物活性の分子分解および不活化に対応していた(%LC:軽鎖切断または%Des-Gla、%HC:重鎖切断)。
【０１８１】
この分析方法は、酸化された形態を特異的に定量することはできなかった。これらの形態は、非活性化形態の定量に含まれていた。
【０１８２】
非活性化、非分解型TgFVIIはプロセス中に漸減したが、これはTgFVIIのTgFVIIaへの活性化の兆候である。3つの試験したバッチについて、活性化は進行的であり、プロセスの終わりに、平均3.6%の非活性化形態が残存していた。この形態は分解されず、プロセス(製剤化操作)において後に、および静脈内投与中に活性化されるその能力を保持していた。それは、ヒト血漿中での活性化のその能力を保持していた。
【０１８３】
3.5  進行中のTgFVIIaの分解
本実施例のために、ヒドロキシアパタイト(CHT)溶出液画分を3.9g/LのTgFVIIaに濃縮し、RP-HPLCの結果を、Table 7(表7)に示されるSECの結果と比較してTable 6(表6)にまとめた。
【０１８４】
【表６】
2015522600.tif 000007
【０１８５】
【表７】
2015522600.tif 000008
【０１８６】
切断も酸化もされなかったTgFVII形態の合計は、CHT溶出液と最終精製生成物(SEC溶出液)の両方について全TgFVIIの90%を超えていた。これは、TgFVII活性化にも拘らずTgFVII分解を制御するCHT工程の能力を明確に示している。
【０１８７】
(実施例4)
高度に精製されたTgFVIIa調製物の品質
4.1  精製溶液中の残留RMPの定量
したがって、より古典的なクロマトグラフィー技術(イオン交換、ヒドロキシアパタイト偽親和性およびサイズ排除)と組み合わせた、ラマ抗体から誘導されるFVII-高特異性リガンドの使用により、ミルクからのTgFVII/TgFVIIaの精製を最適化する、より特には、RMPを可能な限り除去することが可能になった。
【０１８８】
RMPレベルは、Table 8(表8)に記載のようにパイロットバッチ(15Lのミルク)については約10ppmであり、大規模に生成されたバッチ(150Lのミルク)については定量の下限レベル(LLOQ)未満または6ng/ml未満であった。
【０１８９】
トランスフェリンを、精製された生成物中でELISAによりアッセイしたところ、その含量はパイロットバッチについて3ppmに近いことがわかった。
【０１９０】
【表８】
2015522600.tif 000009
【０１９１】
4.2  精製溶液中の残留ウサギDNAの定量
したがって、記載のプロセスは、4ppb未満の標的残留DNAを達成する。
【０１９２】
4.3  ウサギ第VII凝固因子
ウサギはその循環中に内因性第VII因子を有し、血流からミルク中への血清タンパク質のいくらかの受動的漏出が存在するため、精製プロセスがウサギFVIIについてヒトを分離する能力を評価した。精製された生成物中のそのような潜在的な付随タンパク質の存在の調査のために、特異的ELISAを社内で開発した。結果は、LLOQ未満(分析した全調製物について45pg/ml未満)であった。
【０１９３】
(実施例5)
TgFVIIa特異的リガンド上で親和性クロマトグラフィーの工程を実施した後のエンベロープウイルス(MLV、マウス白血病ウイルス)に関するウイルスクリアランス試験
マウス白血病ウイルス(MLV)の特徴を、以下のTable(表9)に記載する。
【０１９４】
【表９】
2015522600.tif 000010
【０１９５】
5.1  感染価滴定アッセイ
5.1.1.  感染価滴定の原理
滴定方法は、ウイルス力価測定が、特定の細胞変性効果の観察による、感染細胞中でのウイルス生成の検出に基づくものである、定量アッセイである。
【０１９６】
滴定アッセイは、以下に記載のように2つの異なる96穴プレート上で行われる:
・試験試料を、96穴プレートにわたって連続3倍希釈(それぞれの希釈率について8回の反復を行う)により培養培地で希釈する(「試料希釈プレート」)。
・次いで、「試料希釈プレート」からの各ウェルを、新しい96穴プレートの対応するウェル上に接種する(「試料滴定プレート」)。
【０１９７】
細胞懸濁液を「試料滴定プレート」の各ウェルに添加した後、CO2雰囲気を用いて、または用いずに(ウイルスに依存する)、適切な温度でプレートをインキュベートする。
【０１９８】
ウイルス複製および隣接細胞の感染を可能にするインキュベーション期間の後、ウイルスに応じて、
・倒立光学顕微鏡下での観察により、感染後に病巣を有するウェルを計数する。
・または染色オーバーレイ(クリスタルバイオレット1p-ガラクトシダーゼ)を添加し、ウェルを細胞変性効果について検査する。感染ウェルは透明な領域として見えるが、非感染ウェルは染色される(もしくはウイルスに応じてその逆)。
【０１９９】
1ミリリットルあたりの50%組織培養感染用量として表される感染価(TCID50/mL)を、適切な式を用いて算出する。
【０２００】
5.1.2  滴定の対照
*陰性対照
各滴定アッセイの間に、細胞を細胞参照対照として調製する。これらの細胞を、それらがスパイクされていない培養培地に接種されることを除いて、予備アッセイ中に作成された試料の滴定に用いられたものと同じ条件で調製する(それぞれの96穴プレート中4〜8ウェル)。
【０２０１】
*陽性滴定対照(ウイルス参照対照)
各滴定アッセイの間に、約103〜105TCID50/mLのウイルス参照対照を、予備アッセイ中に作成された試料の滴定に用いられたものと同じ条件で滴定する。
【０２０２】
5.1.3  滴定アッセイの許容基準
滴定アッセイは、
・各滴定プレートのための細胞参照対照が予想された結果と一致する場合
・得られたウイルス参照対照の感染価が予想された範囲内にある場合
に保持および検証される。
【０２０３】
5.1.4  ウイルス力価の決定
ウイルス力価を、Schwartz D.、1993 (Schwartz D.、「Methodes statistiques a l'usage des medecins et des biologistes」、Flammarion Medecine-Sciences、第4版、1993); Kaplan M.およびKoprowski H.、「Laboratory techniques in rabies、第3版、World Health Organization(編)、Geneva、1973に従って決定する。
【０２０４】
TCID50(50%組織培養感染用量)を、Spearman Karberの式を用いて算出する。TCID50を、量子アッセイにより評価し、接種された培養物の50%に感染することができるウイルス用量と定義する。
【０２０５】
5.2  実験プロトコール
プロセスにおいて実行される工程は以下の通りである:
-  清澄化された供給源材料の解凍;
-  1%のエンベロープウイルスMLVを用いる解凍され清澄化された供給源材料の感染;
-  0.2μmのフィルターを用いる事前濾過;
-  FVII選択カラムへの充填;
-  カラムの洗浄;
-  溶出。
【０２０６】
Table 9(表10)は、親和性FVII選択クロマトグラフィーの工程中に実施されるプロセス条件を提供する。
【０２０７】
【表１０】
2015522600.tif 000011
【０２０８】
5.3  結果
ウイルスクリアランスを、事前濾過の工程の後(ロード2と命名された試料)および親和性FVII選択クロマトグラフィー上での溶出の後(溶出液と命名された試料)の解凍および清澄化された供給源材料の試料中で測定した。結果を、Table 10(表11)に示す。
【０２０９】
【表１１】
2015522600.tif 000012
【０２１０】
Table 10(表11)の結果は、親和性FVII選択クロマトグラフィー工程が、4.37log10より優れてウイルス減少率(RF)を減少させることを示している。
【０２１１】
(実施例6)
TgFVIIa特異的リガンド上で親和性クロマトグラフィーの工程を実施した後の非エンベロープウイルス(PPV、ブタパルボウイルス)のウイルスクリアランス試験
ブタパルボウイルス(PPV)の特徴を、以下のTable(表12)に記載する。
【０２１２】
【表１２】
2015522600.tif 000013
【０２１３】
6.1  実験プロトコール
プロセスにおいて実施される工程は、以下の通りである:
-  清澄化された供給源材料の解凍;
-  1%の非エンベロープウイルスPPVを用いる解凍され、清澄化された供給源材料の感染;
-  0.65/0.45μmおよび0.45/0.2μmのフィルターを用いる事前濾過;
-  溶媒/界面活性剤処理(1時間);
-  FVII選択カラムへの充填;
-  洗浄;
-  溶出。
【０２１４】
【表１３】
2015522600.tif 000014
【０２１５】
6.2  結果
ウイルスクリアランスを、事前濾過および溶媒/界面活性剤処理の工程後(初期ロードと命名された試料)ならびに親和性FVII選択クロマトグラフィー上での溶出の後(溶出液Aと命名された試料)の解凍および清澄化された供給源材料の試料中で測定した。結果を、図5にヒストグラム形態の下で示す。
【０２１６】
図5のヒストグラムは、親和性FVII選択クロマトグラフィー工程が、3.8log10より優れてウイルス減少率(RF)を減少させることを示す。
【０２１７】
(実施例7)
サイズ排除クロマトグラフィーSuperdex S200調製等級の工程を実施した後のエンベロープウイルス(MLV)および非エンベロープウイルス(PPV)に関するウイルスクリアランス試験
7.1  実験プロトコール
プロセスにおいて実施される工程は、以下の通りである:
-  臨床バッチからサンプリングされた出発材料[セラミックヒドロキシアパタイト-1(CHT-1)溶出液]の解凍;
-  1%のスパイク (1%のMLVまたは1%のPPV)を用いる出発材料の感染;
-  0.2μm(MLV)フィルターまたは0.1μm(PPV)フィルターを用いる事前濾過;
-  S200カラム上への2.3%カラム容量(CV)の充填;
-  S200溶出液(FVIIに対応する画分)の採取。
【０２１８】
【表１４】
2015522600.tif 000015
【０２１９】
7.2  結果
ウイルスクリアランスを、0.2μmフィルター(MLVウイルスのため)または0.1μmフィルター(PPVウイルスのため)上での事前濾過工程の後(ロード2と命名された試料)、およびサイズ排除クロマトグラフィーSuperdex S200上での溶出後(溶出液と命名された試料)のCHT-1溶出液の試料中で測定した。結果を、Table 13(表15)に示す。
【０２２０】
【表１５】
2015522600.tif 000016
【０２２１】
Table 10(表11)の結果は、サイズ排除クロマトグラフィーSuperdex S200クロマトグラフィーが、エンベロープウイルス(MLV)については3.01log10に等しいウイルス減少率に減少させ、非エンベロープウイルス(PPV)については3.00log10に等しいウイルス減少率に減少させることを示している。
【０２２２】
まとめると、
-  ウイルスクリアランスの高い減少率は、親和性FVII選択クロマトグラフィーを用いた場合に得られ、それはエンベロープウイルス(MLV)については4.37log10より優れており、非エンベロープウイルス(PPV)については3.8log10に等しい;
-  ウイルスクリアランスの減少率中央値は、サイズ排除クロマトグラフィーSuperdex S200を用いた場合に得られ、それはエンベロープウイルス(MLV)および非エンベロープウイルス(PPV)については3.0log10に等しい;親和性FVII選択クロマトグラフィーは、エンベロープおよび非エンベロープウイルスのウイルス力価を減少させることについて、サイズ排除クロマトグラフィーSuperdex S200よりも効率的である。
【０２２３】
(実施例8)
いくつかの技術を実施した後のエンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスのためのウイルスクリアランス試験
8.1  実験プロトコール
FVII選択親和性クロマトグラフィー、ナノ濾過およびQ Sepharose XLウイルス検証試験を、それぞれの精製単位操作および対象の画分中のスパイクされたウイルスの滴定のために出発材料中の1%スパイクの様々なウイルスを用いて別々に実施した(FVIIであったものは回収される)。それぞれの精製単位操作について得られたLog10減少率を、それぞれのウイルスについて加え、全体的な減少率をウイルスごとに見積もった。
【０２２４】
8.2  結果
結果を、Table 14(表16)に与える。
【０２２５】
【表１６】
2015522600.tif 000017
【０２２６】
Table 14(表16)は、
-  プロセスにおけるFVII選択クロマトグラフィー工程およびナノ濾過およびQ Sepharose XLイオン交換クロマトグラフィー工程の実施は、9.3log10までのウイルス減少の増加をもたらし、PPVウイルスモデルについて18.5log10よりも高いか、またはそれと等しい非エンベロープウイルスに関する全体的減少率をもたらす、
-  プロセスにおけるFVII選択クロマトグラフィー工程およびナノ濾過およびQ Sepharose XLイオン交換クロマトグラフィー工程の実施は、10.5log10までのウイルス減少の増加をもたらし、MLVウイルスモデルについて16.5log10と等しいエンベロープウイルスに関する全体的減少率をもたらす
ことを示している。
【図１】
2015522600.tif 000018
【図２】
2015522600.tif 000019
【図３】
2015522600.tif 000020
【図４】
2015522600.tif 000021
【図５】
2015522600.tif 000022
【配列表】
2015522600000001.app
【国際調査報告】
2015522600.tif 000023
2015522600.tif 000024
2015522600.tif 000025