(57)【要約】【課題】種々の環境及び種々の品目における微生物をモニタリングする方法及びシステムをここに提供し、モニタリングからのデータは、追跡可能、分析可能又は種々の基準若しくはしきい値と比較可能となる。【解決手段】ここに開示する方法及びシステムは、検出を管理するとともに複数の環境内の複数の位置に亘る微生物を報告するプラットホームと、種々の目的のためにそのような検出を用いることと、を更に含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境をモニタリングする方法であって、
設備フロアプランをソフトウェアにおいてデジタル化することと、
前記設備フロアプランのテストポイントを設定することと、
業務ルールに基づいて前記テストポイントに対するサンプリングスケジュールを決定することと、
前記業務ルールに従って特定の診断検査を前記テストポイントにマッピングすることであって、前記診断検査は、前記サンプリングスケジュールに従って前記テストポイントをサンプリングするのに用いられることと、
前記環境をモニタリングするためにある期間に亘る前記テストポイントでの複数のサンプリングからの結果を集めることと、
を備える方法。
【請求項２】
前記テストポイントにマッピングした前記診断検査を用いて前記テストポイントで実行されたサンプリングを通じて生物因子を検出することを更に備える請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物因子は、ファージを微生物に導入した結果として前記微生物によって生成される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
傾向、リスクプロファイル、汚染パターン及び予測される汚染パターンの少なくとも一つを決定するために前記複数のサンプリングの結果を分析することを更に備える請求項１に記載の方法。
【請求項５】
環境条件を改善するための是正措置を決定するために前記複数のサンプリングの結果を分析することを更に備える請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記環境条件に対する前記是正措置の効果を、サンプリングを通じて追跡することを更に備える請求項５に記載の方法。
【請求項７】
微生物の発生を最小にするとともに製品品質、環境の安全性及び環境衛生の少なくとも一つを向上させる予防措置を示唆するために前記複数のサンプリングからの結果を分析することを更に備える請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記複数のサンプリングの結果の報告を作成することを更に備える請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記環境に対する明確な特徴のセットの順守を決定するために前記複数のサンプリングからの結果を分析することを更に備える請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記順守の不備又は陽性検査結果が存在する場合に警報を生成することを更に備える請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
特性を決定するために前記サンプリングを追跡することを更に備える請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記特性を、ユーザ、日付、時間、ロット＃、微生物検出、位置、周囲温度及び完成割合の少なくとも一つとする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法の実行中に追加のテストポイントを追加することを更に備える請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
追加のデータを前記複数のサンプリングからの結果と共に微生物センサ、センサアレイ及び第三者データソースの少なくとも一つから集めることを更に備える請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記追加のデータと前記複数のサンプリングの結果との組合せを、傾向、リスクプロファイル、汚染パターン、予測される汚染パターン、環境条件を改善するための是正措置及び微生物の発生を最小にするとともに製品品質を向上させる予防措置の少なくとも一つを決定するために分析する請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
環境モニタリングプラットホームのダッシュボードにおける前記複数のサンプリングからの結果に基づくデータの視覚化及びやり取りを行うことを更に備える請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数のサンプリングからの結果に対する所定のレベルのアクセスを前記ダッシュボードのユーザに許可する請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記テストポイントの位置を、地理的な位置及び手動入力の少なくとも一方によって決定する請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記テストポイントの位置を、画像及びスキャンできる識別子の少なくとも一方に関連させる請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプリングは、前記テストポイントに関連した識別子をスキャンすることを有する請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプリングは、前記サンプリングを前記テストポイントに配置するために前記テストポイントの位置の画像を取り出すこと及びそれを前記テストポイントに以前に関連した画像と比較することを有する請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記サンプリングによって検出した前記生物因子は、ファージ誘発生物発光産物である請求項３に記載の方法。
【請求項２３】
前記環境をモニタリングすることは、個別の微生物、複数の個別の微生物及び微生物の個別の菌株の少なくとも一つの存在の検出と報告の少なくとも一方を備える請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記設備内の汚染の広がりの影響を決定するために歩行者交通パターンと加工品の流れの少なくとも一方を前記設備フロアプランの前記テストポイントに重ね合せることを更に備える請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
環境をモニタリングするためにコンピュータにより実現されるシステムであって、
コンピュータ可読媒体に格納された設備フロアプランであって、前記設備フロアプランは、少なくとも一つのテストポイントを備える設備フロアプランと、
少なくとも一つのプロセッサにおいて動作するスケジューリングモジュールであって、前記スケジューリングモジュールは、前記テストポイントに対するサンプリングスケジュールを設定するために少なくとも一つの業務ルールを処理するスケジューリングモジュールと、
少なくとも一つのプロセッサにおいて動作する診断マッピングモジュールであって、前記診断マッピングモジュールは、前記業務ルールに従って前記テストポイントに少なくとも一つの診断検査をマッピングし、前記診断検査は、前記サンプリングスケジュールに従って前記テストポイントをサンプリングするために用いられる診断マッピングモジュールと、
前記環境のモニタリングを容易にするために、コンピュータ可読媒体のある期間に亘る前記テストポイントでの複数のサンプリングからの結果を格納するデータベースと、を備えるシステム。
【請求項２６】
傾向、リスクプロファイル、汚染パターン及び予測される汚染パターンの少なくとも一つを決定するために前記複数のサンプリングの結果を分析する分析設備を更に備える請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
環境条件を改善するための是正措置を決定するために前記複数のサンプリングの結果を分析する分析設備を更に備える請求項２５に記載のシステム。
【請求項２８】
新たなテストポイントを示唆するために前記複数のサンプリングの結果を分析する分析設備を更に備える請求項２５に記載のシステム。
【請求項２９】
前記設備内の汚染の広がりの影響を決定するために歩行者交通パターンと加工品の流れの少なくとも一方をマップの前記テストポイントに重ね合せる分析設備を更に備える請求項２５に記載のシステム。
【請求項３０】
前記環境のモニタリングに関するビジュアルコンテンツを提供するとともに前記複数のサンプリングからの結果のやり取りを可能にする環境モニタリングプラットホームの人間に解読可能なコンピュータユーザインタフェースで実現されるダッシュボードを更に備える請求項２５に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
種々の環境サンプリング及び検出方法に由来する結果は、典型的には、必ずしもリアルタイムでない又は必ずしも実用的でない方法でユーザに提供される。さらに、結果は、必ずしも追跡可能、分析可能又は種々の基準若しくはしきい値と比較可能となるような方法で供給されない。したがって、リアルタイム又は準リアルタイムのモニタリング及び分析用のオンラインシステムの必要性が存在する。そのようなシステムを、現場環境モニタリングプラットホームを提供するために迅速かつ信頼のあるその場サンプリング方法と一緒に用いることができる。
【背景技術】
【０００２】
食物、食品の調理／食品サービス環境、並びに、病院、大学、環境微生物が制御される任意の製造設備及び関連の設備を含む他の環境において健康上の危険を生むリステリア菌、サルモネラ菌及び大腸菌のような微生物を検出する方法及びシステムが存在する。そのような方法及びシステムは、大抵の場合にはサンプルを収集する環境からサンプルを除去するとともに富化(enrichment)及び成長のためにサンプルが培養環境に配置される実験室環境にサンプルを運ぶ必要があることを含む複数の障害に悩まされる。さらに、これらの実験室はしばしば現場から離れているので、サンプルを実験室に発送することによる遅延が生じる。サンプルは、一度富化されると、典型的には非常に高価な設備、更に時間を要する培養方法、ＰＣＲ及び／又は他の方法を用いて調べられる。したがって、現在のプロセスは高価であり、サンプリングと結果との間に大きい時間差があり、その時間中に、サンプリングされた状況が変化することがあり、腐りやすい食品のようなサンプリングされた品目は、もはや生存せず、もはや元の管理下(in the originator's control)になく、又は既に破壊されていることがある。迅速かつ信頼性のあるその場サンプリング方法及びシステムの必要性が存在する。また、近代分子(modern molecular)法、例えば、ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ法はしばしば生細胞と死細胞との間の区別を行わず、これによって高い偽陽性率を生じるので、生細胞と死細胞とを区別することができるシステムの必要性が存在する。さらに、起動前（後処理）、処理中又はその両方において設備を有効にするために用いることができるシステムの必要性が存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
種々の環境及び種々の品目における汚染の存在又は微生物のような他の環境要因の存在を検出、報告、モニタリング及び分析する方法及びシステムをここに提供する。一つのそのような検出方法は、遺伝子組み換えファージを環境に導入することによって微生物に誘導されるルシフェラーザ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）又は他のスクリーニング可能な(screenable)マーカーの産出を伴う。所定の実施の形態において、方法及びシステムは、食品生産環境のような現実世界の環境において、微生物を含む可能性があるサンプルを富化することなく、少数の細胞に至るまでの非常に低いレベルの微生物の迅速な検出を含む。ここに開示する方法及びシステムは、検出を管理するとともに複数の環境内の複数の位置に亘る汚染又は微生物のような他の環境要因を報告するプラットホームと、種々の目的のためにそのような検出を用いることと、を更に含む。そのような目的は、是正措置のプラニング、追跡検査のスケジューリング、汚染傾向のマッピング、検査におけるコンプライアンスの確保、報告の提出、検疫された全品目を搬送する際の物流の情報提供及び更に多くの目的を含むが、それに限定されない。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様において、プラットホームは、食品調理環境に存在する微生物のリアルタイムのその場測定のためのリーダーを有することができ、測定は、ファージ誘発産物(phage-induced product)の検出に基づく。所定の実施の形態において、測定を、作業場それ自体において、場合によっては同一施設の小実験室で、及び、場合によっては中央研究室又は第三者の研究室内のように完全に現場から離れて実行することができる。いずれにしても、測定のやり取りを行い、かつ、測定に関連した動作をスケジューリング及び実行するために、データベースを、測定を格納するのに用いることができ、ダッシュボードを、測定を報告するのに用いることができる。プラットホームは、個別の微生物若しくは所定の微生物の個別の菌株又は腐敗細菌のような不所望な生命体(organisms)の存在を検出及び報告することができる。プラットホームは、予め決定されたセットのレベルのリスクに対応する所定の微生物のレベルを定量化及び報告することができる。
【０００５】
一態様において、プラットホームは、ファージ誘発産物の検出に基づいて環境内の微生物を検出する少なくとも一つのモジュールと、環境の安全性に関連する少なくとも一つの他の因子を検出する少なくとも一つのモジュールと、を有することができる。他の因子を、環境内の（アデノシン三リン酸）ＡＴＰレベル、他のタイプの検出器によって測定された微生物、サンプルの温度、時間、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数、サンプル位置、完成製品の微生物検査結果及びサンプリング周波数の少なくとも一つとすることができる。モジュールは、どれだけのサンプルが収集されたかを検出するとともに誰がサンプルを収集したかを検出することもできる。
【０００６】
一態様において、プラットホームは、ファージ誘発産物の存在に基づいて環境内の微生物を検出する少なくとも一つのモジュールと、少なくとも一つのモジュールによって収集された長期的なテストデータ(longitudinal testing data)に基づいて検査すべき領域を予測するプロセッサと、を有し、日中にサンプルを取り出すときを示唆することができる。予測する領域を超えると、プラットホームを、汚染が来る場所を示唆するために傾向を追跡するとともにこの情報を環境の知識に統合するのに用いることもできる。
【０００７】
一態様において、分析プラットホームは、診断分析を通じて環境内の微生物の存在についてのリアルタイムデータのストリームを収集するリーダーと、環境内の微生物の存在についてのリアルタイムデータのストリームを報告するダッシュボードと、環境内の微生物の存在についてのリアルタイムデータのストリームを分析するプロセッサと、環境内の微生物の存在についてのリアルタイムデータのストリームを管理するリーダーマネージャと、を有することができる。環境を食品生産環境とすることができる。プラットホームは、関心のある領域の微生物の成長を追跡するためのソフトウェアにおける環境のモデリングを更に有することができる。プラットホームは、ソフトウェアを通じて動的に生成される物理的な位置（ステータスポイント(status points)の「ヒートマップ」）に関連する追跡した微生物の成長を表示することを更に有することができる。プラットホームは、モデリングの結果を危険分析及び重要管理点（ＨＡＣＣＰ）プログラム、環境制御プラン、公衆衛生プラン並びのこれらのプランの検証に統合することを更に有することができる。プラットホームは、関心のある領域のリスク因子を追跡するためのソフトウェアにおけるモデリングを更に有することができ、この場合、微生物は過渡的なものであってもよく、又は、微生物は成長の生態的地位(growth niches)を形成することができる。
【０００８】
一態様において、プラットホームは、警報、報告、及び環境内の微生物の活動の管理に関連する動作を可能にするための一つ以上の微生物の改変ファージ誘発産物の検出したレベルを報告することができる。
【０００９】
一態様において、環境をモニタリングする方法は、設備フロアプランをソフトウェアにおいてデジタル化することと、設備フロアプランのテストポイントを設定することと、業務ルールに基づいてテストポイントに対するサンプリングスケジュールを決定することと、業務ルールに従って特定の診断検査をテストポイントにマッピングすることであって、診断検査は、サンプリングスケジュールに従ってテストポイントをサンプリングするのに用いられることと、環境をモニタリングするためにある期間に亘るテストポイントでの複数のサンプリングからの結果を集めることと、を備える。テストポイントで実行されたサンプリングを通じた生物因子の検出を、テストポイントにマッピングした診断検査を用いて行うことができる。複数のサンプリングの結果の分析を、傾向、リスクプロファイル、汚染パターン及び予測される汚染パターンの少なくとも一つを決定するために行うことができる。複数のサンプリングの結果の分析を、環境条件を改善するための是正措置を決定するために行うことができる。環境条件に対する是正措置の効果を、サンプリングを通じて追跡することができる。複数のサンプリングからの結果の分析を、微生物の発生を最小にするとともに製品品質、環境の安全性及び環境衛生を少なくとも一つを向上させる予防措置を示唆するために行うことができる。複数のサンプリングの結果の報告を作成することができる。
【００１０】
複数のサンプリングからの結果の分析を、環境に対する明確な特徴のセットの順守を決定するために行うことができる。警報を、順守の不備又は陽性検査結果が存在する場合に生成ことができる。サンプリングの追跡を、特性を決定するために行うことができる。特性を、ユーザ、日付、時間、ロット＃、微生物検出、位置、周囲温度及び完成割合(percent completion)の少なくとも一つとすることができる。
【００１１】
追加のテストポイントの追加を方法の実行中に行うことができる。追加のデータを複数のサンプリングからの結果と共に集めることを、微生物センサ、センサアレイ及び第三者データソースの少なくとも一つを用いることによって行うことができる。追加のデータと複数のサンプリングの結果との組合せを、傾向、リスクプロファイル、汚染パターン、予測される汚染パターン、環境条件を改善するための是正措置及び微生物の発生を最小にするとともに製品品質を向上させる予防措置の少なくとも一つを決定するために分析することができる。
【００１２】
複数のサンプリングからの結果に基づくデータの視覚化及びやり取りを、環境モニタリングプラットホームのダッシュボードにおいて行うことができる。複数のサンプリングからの結果に対する所定のレベルのアクセスをダッシュボードのユーザに許可することができる。テストポイントの位置を、地理的な位置及び手動入力の少なくとも一方によって決定することができる。テストポイントの位置を、画像及びスキャンできる識別子の少なくとも一方に関連させることができる。サンプリングは、テストポイントに関連した識別子をスキャンすることを有することができる。サンプリングは、サンプリングをテストポイントに配置するためにテストポイントの位置の画像を取り出すこと及びそれをテストポイントに以前に関連した画像と比較することを有することができる。生物因子を、ファージ誘発生物発光産物の発現を用いたサンプリングによって検出することができる。環境をモニタリングすることは、個別の微生物、複数の個別の微生物又は微生物の個別の菌株の存在の検出と報告の少なくとも一方を有することができる。歩行者交通パターンと加工品の流れの少なくとも一方を設備フロアプランのテストポイントに重ね合せることを、設備内の汚染の広がりの影響を予測、推定又は決定するために行うことができる。
【００１３】
一態様において、環境モニタリングプラットホームのシステムは、少なくとも一つのテストポイントを備える設備フロアプランと、業務ルールに基づくテストポイントのスケジュールをサンプリングすることと、業務ルールに従ってテストポイントに特定の診断検査をマッピングすることであって、診断検査は、サンプリングスケジュールに従ってテストポイントをサンプリングするために用いられることと、環境のモニタリングするために用いられるある期間に亘るテストポイントでの複数のサンプリングからの結果のデータベースと、を備える。システムは、傾向、リスクプロファイル、汚染パターン及び予測される汚染パターンの少なくとも一つを決定するために複数のサンプリングの結果を分析する分析設備を更に備えることができる。システムは、環境条件を改善するための是正措置を決定するために複数のサンプリングの結果を分析する分析設備を更に備えることができる。システムは、新たなテストポイントを示唆するために複数のサンプリングの結果を分析する分析設備を更に有することができる。システムは、設備内の汚染の広がりの影響を決定するために歩行者交通パターンと加工品の流れの少なくとも一方をマップのテストポイントに重ね合せる分析設備を更に備えることができる。システムは、複数のサンプリングからの結果を視覚化するとともにやり取りを可能にする環境モニタリングプラットホームのダッシュボードを更に備えることができる。複数のサンプリングからの結果に対する所定のレベルのアクセスをダッシュボードのユーザに許可することができる。
【００１４】
本発明のこれら及び他のシステム、方法、目的、特徴及び利点は、好適な実施の形態の以下の詳細な説明及び図面から当業者には明らかになるであろう。
【００１５】
ここで述べる全ての文献は、参照により全体がここに組み込まれる。単数の品目の言及は、明記されない又は本文から明らかでない場合には複数の品目を含むことを理解すべきであり、逆もまた同様である。文法的な連言(grammatical conjunction)は、述べられていない又は本文から明らかでない場合には、等位節、文、語等のありとあらゆる離接的及び接続的な組合せを表現することを意図する。
【００１６】
本発明及び本発明の所定の実施の形態の以下の詳細な説明を、以下の図面を参照することによって理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、システムのブロック図を示す。
【図２】図２は、システムの工程を示す。
【図３】図３は、システムのブロック図を示す。
【図４】図４は、ワークフロー方法を示す。
【図５】図５は、例示的なダッシュボードを示す。
【図６】図６は、ユーザインタフェースの例示的なフロアプランを示す。
【図７】図７は、テストポイント詳細ダイアログブロックを示す。
【図８】図８は、ユーザインタフェースの修正ログを示す。
【図９ａ】図９ａは、ユーザインタフェースのスケジュールページを示す。
【図９ｂ】図９ｂは、ユーザインタフェースのスケジュールページを示す。
【図１０】図１０は、ユーザインタフェースの報告ページを示す。
【図１１】図１１は、バクテリオファージＴ３：：０．７ｌｕｃを有する大腸菌細胞の感染後に異なる時間で検出したルシフェラーゼの量を示す。異なる濃度の細菌の細胞を検出する三つの実験の結果を示す。
【図１２】図１２は、バクテリオファージＴ３：：０．７ｌｕｃを有する大腸菌細胞の混合後のルシフェラーゼ信号の検出の時間を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ここで規定されない限り、この開示に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。さらに、文脈から要求されない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含む。一般的に、ここで説明する生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸化学並びに混成に関連して用いられる命名及びその技術は、当業者に周知であるとともに一般的に用いられるものである。所定の文献及びここで引用する他の文書は、参照によりここに明示的に組み込む。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書は統制を行う。材料、方法及び例は、説明のためだけのものであり、制限することを意図するものではない。
【００１９】
ここで用いる専門用語は特定の実施の形態を説明するためのものであり、制限するためのものでないことを理解すべきである。明細書及び添付した特許請求の範囲で用いられるような単一の形態(singular forms "a", "an" and "the")は、文脈が明らかに指示しない限り複数の指示対象を含む。
【００２０】
ここで用いるような用語「備える」(comprising)は、「含む」(including)又は「包含する」(containing)と同義語であり、包括的及び変更可能であり、他の列挙しない部材、素子又は方法ステップを除外しない。
【００２１】
本明細書の初めから終わりまで、用語「システム」、「衛生モニタリングプラットホーム」、「環境モニタリングプラットホーム」、「微生物モニタリングプラットホーム」及び「プラットホーム」を、区別しないで用いることができる。
【００２２】
ここで用いられるように、用語「体外」(in vitro)は、生命体（例えば、動物、植物又は微生物）内ではなく人工的な環境、例えば、試験管若しくは反応槽、細胞培養、ペトリ皿等で生じる事象を言及する。それに対し、その場(in situ)は、食品、薬剤又は他の品目を貯蔵、搬送又は調整する環境、健康管理環境、微生物が成長するとともに人間又は他の動物に影響を及ぼすおそれがある他の環境、病院、大学、環境微生物が制御される任意の設備及び関連の設備のような、人工的な装置又は材料を必要としない自然環境を言及する。その場環境を、微生物の存在を決定するためにサンプルを自然環境から個別の実験室環境に搬送する必要がないことを示す「現場」(on-site)環境と称することもできる。
【００２３】
ここで用いられるように、「スクリーニング可能なマーカー」を、マーカーを発現する細胞を識別する基礎として用いることができる検出可能なラベルとする。そのような細胞を、スクリーニング可能なマーカーの発現に基づいて「スクリーニング可能な表現型」を有するということもできる。適切なマーカーは、放射性標識、蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、発光標識、発色団標識、ＰＥＴスキャナ用の陽電子放出同位体、化学発光標識又は酵素標識を有する。蛍光標識は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フルオレセイン及びローダミンを有するがそれに限定されない。化学発光標識は、ルシフェラーザ及びβ−ガラクトシダーザを有するがそれに限定されない。酵素標識は、ペルオキダーゼ及びホスファターゼを有するがそれに限定されない。Ｈｉｓタグも検出可能なラベルとなることができる。一部の実施の形態において、異種核酸が細胞に導入され、その後、細胞は、ラベルである又はラベルを備えるタンパク質を発現させる。例えば、導入された核酸は、細胞において活性する調節配列に動作可能に結合したＧＦＰに対するコーディング配列を備えることができる。
【００２４】
改変ファージ又は一体となって働く改変ファージの群（すなわち、ファージカクテル）によって、宿主（例えば、大腸菌、リステリア菌、サルモネラ菌）は、検出可能かつ測定可能なペイロードを生成することができる。２０１２年５月４日に出願された組み換えファージ及び方法の表題の米国仮特許出願第６１／６４２，６９１号に記載されたようなバイオイルミネーション(bioillumination)ファージ技術及び現場でのファージベースの(phage-based)微生物又は衛生状態をモニタリングするための検出技術を利用するシステム又はプラットホームを、ここに記載する。２０１２年５月４日に出願された組み換えファージ及び方法の表題の米国仮特許出願第６１／６４２，６９１号を、参照によりここに組み込み、別紙Ａとしてここに添付する。別紙Ａを参照により全体をここに組み込み、本明細書の一部を構成する。システムの独自の性質は、リアルタイムのデータ生成、実用的な結果を提供するための現場での迅速な分析、及び微生物の富化を要求することのないモニタリングを提供する。特に作業場においてサンプルの富化を回避する利点は、スクリーニングされた微生物の個体群をエリアに導入する可能性を有することである。プラットホームによって、検査は、連続的なモニタリング及びプロセス制御を含むプロセスバリデーション以上のことをすることができる。
【００２５】
改変ファージによって、標的微生物は、ほんの数時間だけ発光酵素を発現させることができ、これによって、結果のターンアラウンドタイムが著しく増大し、更に多くの検査を可能にし、復旧活動を迅速に取り出す（及び追跡する）能力を可能にし、かつ、微生物が設備に入るおそれがある場所からの更に迅速なアクセスを可能にする。食品環境(food setting)の標的微生物は、リステリア菌、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ菌、大腸菌、大腸菌Ｏ１５７及び他の有害な血清型又は腐敗生命体を含むことができる。非食品環境(non-food setting)において、クロストリジウム・ディフィシレ、ブドウ球菌、ＭＲＳＡ等を含む他の細菌種を検査することができる。所定の実施の形態において、検査は、種々の種検査、例えば、サルモネラ菌及びリステリア菌の単一スワブ(single swab)における検査を多重化(multiplexing)する能力を有することができる。
【００２６】
改変ファージアプローチは、低い偽陽性率を生じるために生細胞と死細胞とを区別する（生体タンパク質生成プロセスが信号を生成するために生じる必要があるので、生きている有害又は不所望となりうる細胞のみを検出する）能力を含む速度以外の他の利点を有する。検査を現場で行うことができる。その理由は、検出のために追加の微生物を必要としないからであり、これは、富化を必要としないことを意味し、したがって、微生物をこれ以上成長させず、現場で安全に使用することができる。検査は、研究所経験を有する専門家を必要としない自己完結型(self-contained)の検査であるので、プラットホームは、高い有用性であることを特徴とする。ファージベースの微生物検出の感度は、種々の工場基準、州の基準、連邦政府の基準、会社の基準又は他の基準に従い又はそれを超える。
【００２７】
非常に感度の高いセンサ技術に結合した環境モニタリングシステムによって、このデータを、警報の作成、傾向分析、更なる検査の指示、報告の生成等のためにデータベースモジュール１０４に迅速に送信することができる。
【００２８】
そのようなシステムの他の利点は、ロケーションタグ付け検査(location-tagged testing)によりあり得る問題の根本的原因へのアクセス及びその決定を可能にすることによってＱＡ／食品安全課の職員(QA/food safety personnel)又は（内部、第三者又は政府の）監査役が潜在的な微生物が発生する場所を決定できることである。システム、その構成要素及びワークフローの詳細を、ここで更に説明した図２及び図３に示す。
【００２９】
実施の形態において、プラットホームを、スタンドアロンの製品として用いることができ、又は、種々のダッシュボード若しくは警報及び追跡システムに統合することができる。
【００３０】
図１は、バイオルミネセントファージ技術及び現場環境モニタリングのための検出技術を利用するシステム１００を示す。ここで詳細に説明する実施の形態は、ファージ誘発バイオイルミネーションの検出を用いるが、ファージを、広範囲の検出可能なペイロードの生成を誘発するために改変することができると理解すべきであり、文脈がバイオイルミネーションに特有である場合を除いて、ここに開示する方法及びシステムは、そのような他のタイプのペイロードの検出に適用できるものであると理解すべきである。実際には、プラットホームを、多種多様な分析からの結果を管理、分析及び報告するために用いることができるが、プラットホームは、生物発光を利用する分析に限定されない。本明細書の初めから終わりまで、プラットホームを、生物発光分析からの結果の管理、分析及び報告に関して説明するが、この分析を、プラットホームに有用な分析の種類の例示として選択する。
【００３１】
図１のシステム１００は、リーダーマネージャ１０２と、データベース１０４と、演習ダッシュボード１０６と、を有することができる。リーダーマネージャ１０２は、リーダーネットワーク１１０に結合したリーダーを含有することができ、リーダーネットワーク１１０は、一つ以上のリーダー１１２を含有することができる。一実施の形態において、システム１００を、環境モニタリングプラットホームと称することができる。
【００３２】
一実施の形態において、システム１００を、内部ホストに存在することができ又はクラウドサーバ上でホストされることができるセキュアホストサービスとすることができる。システムは、データがクラウドに格納されているかデータがデータのローカルホストがある場所に格納されているかに関係なくデータセキュリティを可能にする。実施の形態において、データを確保するために、セキュアシステム管理ポリシー(secure system administration policies)を用いることができ、ハードウェア向きセキュリティを用いることができ、又はその組合せを用いることができる。例えば、管理者は、種々の個別のユーザ又はユーザのグループによってデータを閲覧するための許可の設定、安全なログインのためのパスワードの設定等のためのセキュアシステム管理ポリシーを用いることができる。他の例において、アプリを介してプラットホームにアクセスするためにｉＰａｄ（登録商標）を用いるユーザは、多重使用パスワードと併せて用いることができる各ログインに対する新たなパスワードを生成するためにハードウェアトークンを用いることができる。
【００３３】
一実施の形態において、複数のリーダー１１２を、サンプル読出しを容易にするために設備１１４のあらゆる場所で種々の位置に配置することができる。他の実施の形態において、サンプリングキット又はサンプリングステーションを、サンプリングを容易にするために設備のあらゆる場所で種々のテストポイント位置に配置することができる。一実施の形態において、リーダー１１２を、微生物センサ又は他のバイオイルミネーション検出システムとすることができる。代わりに、リーダーを、任意の種類の診断分析から交互の生物ペイロードを検出するように適合させることができる。実施の形態において、リーダー位置は、生産ラインに沿って配置され、出入口のような設備の転移点にあり、倉庫等にある中央サンプル処理センタ又は研究所及び第三者食品研究所を有することができる。他の実施の形態において、システムは、特定の位置をモニタリングするためのハンドヘルドの実施の形態とすることができる一つのリーダー１１２のみを要求することができる。本明細書の初めから終わりまで、「複数のリーダー」又は「リーダー」をどこで示したとしても、単一のリーダーを用いることもできることを理解すべきである。
【００３４】
テストポイントをゾーンベースにすることができる。任意のゾーンの位置をテストポイントとすることができる。例えば、ゾーン１は、生産物接触面、スライサー、コンベヤー、ピーラー、ケーシング除去(casing removal)、器具、棚、作業台、生産設備、器具及びコンテナを言及することができる。ゾーン２は、設備の外側、冷却装置、フレームワーク、設備の筐体、床、エプロン、テーブル、メンテナンス用工具、ホース等を言及することができる。ゾーン２はゾーン１に隣接することができる。ゾーン３は、壁、流し台、フォークリフト、電話機、壁及び床のようなゾーン１とは離間した露出した生産物の部屋のエリアを言及することができる。ゾーン４は、倉庫、衛生洗面所(sanitation wash rooms)、壁、オーバーヘッドドア、棚、事務所、ロッカールーム、浴室又は作業場から物理的に離れているが工場労働者が移動する場所のような生産物が露出した部屋の外側のエリアを言及することができる。一実施の形態において、環境モニタリングプラットホームは、サンプリングが行われるべきである上述したゾーンに基づいて検査の種々のレベルを提案することができる。一実施の形態において、テストポイント識別子を、汚染を取り込むリスクを最小にするために抗菌剤によって処理することができる。テストポイントは、例えば、マシン、表面、完成品等を有することができる。
【００３５】
一実施の形態において、リーダー１１２を、図１の要素１１６によって表される種々の信号をリーダーマネージャ１０２、データベース１０４又は演習ダッシュボード１０６の一つ以上に送信するように構成することができる。信号１１６は、特定のテストポイントに対するテスト結果、リーダーの位置、他の接続されたセンサからのデータ、リーダー装置状態、リーダー識別、オペレーターに対して入力される公示及び更新、検査の時間／日付、オペレーター名又は提供される他の任意の情報を有することができる。
【００３６】
一実施の形態において、リーダー１１２を、無線接続（例えば、Ｗｉ−Ｆｉ（登録商標）、衛星又は携帯電話接続）を介して、高セキュリティのクラウド形態の企業ネットワーク内で同一の設備に配置することができるセキュアリモート記憶装置又は同種のものに接続することができる。一実施の形態において、リーダーマネージャ１０２を、セキュアリモート記憶装置となるように又はセキュアリモート記憶装置を有するように構成することができる。
【００３７】
一実施の形態において、検査又は検査データを、種々のフォーマットでコード化することができ、かつ、更なる処理のためにサンプルキットに含めることができる。リーダー１１２を、種々の手段によりサンプルキットから検査のタイプ及び他の検査データを読み出すように構成することができる。種々の手段は、サンプル管のバーコード又はＱＲコード（登録商標）のようなコードを認識することを有することができる。検査又は検査データを、サンプル管に組み込まれたＲＦＩＤタグにコード化することができる。コンピュータメモリを、検査及び／又は検査データを格納するためにサンプル管に組み込むことができる。
【００３８】
一実施の形態において、テストポイントを任意のゾーンにすることができる。例えば、テストポイントを、汚染の可能性が最大になる製造ラインの最も重大なエリアをカバーするように生産ライン上の若しくは生産ラインの付近の種々のポイント、又は、コンベアベルト、ホッパー、生産ライン設備、保管場所、操作エリア、処理エリア、清浄エリア、衛生エリア、パッキング／組立エリア、積み込み／輸送エリア、廃棄エリア、接触面等のような生産ラインの二つの異なる環境の接点に配置することができる。リーダーマネージャ１０２を、複数のサンプリングテストポイントからデータを集めることによって製造ラインに亘る汚染を連続的にモニタリングするように構成することができる。一実施の形態において、一つのテストポイントを、生産ラインの特定のエリアをカバーするように選択することができ、同時に、他のテストポイントを、生産ラインの異なるエリアを測定するように選択することができ、第３のテストポイントを、生産ラインの特定のエリアを測定するように選択することができ、全体の製造ラインをカバーできるように必要に応じた数のテストポイントが含まれる。
【００３９】
複数のリーダー１１２が設備に存在する一実施の形態において、リーダーネットワーク１１０を、複数のリーダー１１２からデータを収集するとともにデータをリーダーマネージャ１０２に送信するように構成することができる。一実施の形態において、複数のリーダー１１２の各々を、データ送信のためにリーダーマネージャ１０２に操作可能に結合することができる。データ送信は、Ｗｉ−Ｆｉ（登録商標）又はデータのハードワイヤードイーサネット（登録商標）ベースの送信、ＩＥＥＥ８０２．１１、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、セルラー方式（２Ｇ，３Ｇ，４Ｇ，ＧＳＭ（登録商標），ＧＰＲＳ，ＥＶＤＯ等）、ＩＲ、ＲＦ、網型回路網等のような複数の異なるネットワークプロトコルを介して行うことができる。
【００４０】
一実施の形態において、サンプルを、種々のテストポイント位置で取り出すとともに、設備の他の場所、作業場、他の部屋又は研究室で読み出すことができる。サンプルが読み出されるとき、測定とともに（ここで説明するタグを用いて）サンプルを取り出した位置に関するデータをデータベースに送信することができる。更に別の実施の形態において、リーダーを、ユーザがサンプルを取り出すとともにサンプルを即座に測定することができるように携帯リーダー又は携帯装置に対するプラグインモジュールとすることができる。実施の形態において、携帯装置又はリーダーは、通常のネットワークプロトコルを用いてデータを送信することができ、かつ、後に検索するためにデータをメモリに格納することができる。一実施の形態において、システム１００は、検査スワブ(test swabs)のリーダーとして用いるためにｉＰｈｏｎｅ（登録商標）若しくは他のスマートホン、モバイル機器又はタブレットと通信を行うことができる。例えば、ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）／ｉＰａｄ（登録商標）は、検査スワブを受け取るとともに分析するプラグインモジュールとしてのリーダーの実施の形態を有することができる。他の実施の形態において、ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）／ｉＰａｄ（登録商標）は、検査ワークフローを向上させるためにリーダーと連動することができる。例えば、各スワブの後に、ｉＰｈｏｎｅ（登録商標）／ｉＰａｄ（登録商標）は、読出し(read-out)を取得し、時間／日付／ロット＃又はトレーサビリティデータのような他の関連のある情報を読出しに結合し、ワイヤレス送信又は同期によってデータをサーバに送信することができる。リーダーの他の種々の実施の形態を、ここで説明する。
【００４１】
検査から収集した結果を、例えば、ダッシュボードにおいて準リアルタイム報告を可能にするために集めることができる。ダッシュボード警報を、電話機、ページャ及び結果をユーザに結果を通知する他の装置に送信することができる。
【００４２】
サンプリングを容易にするために、システムは、スワブすべきゾーンの補助エミッタ(complementary emitter)を有するスワブのＲＦＩＤタグをモニタリングすることができる。一実施の形態において、ＲＦＩＤタグがエミッタの領域にある必要があり、そうでない場合には情報のやり取りが記録されないように、システムは低電力で作動することができる。これによって、ユーザが意図した検査サイトに近接することを保証する。システム１００は、ＲＦＩＤ／エミッタの情報のやり取りが記録されるときにタイムスタンプを生成することもできる。
【００４３】
システム１００を、画像ベースのテストポイント位置についてここで説明するように、リーダーによって取得した又はデータベースモジュールに格納されたデータにテストポイントの画像を相互に関連付けるように構成することができる。
【００４４】
一実施の形態において、リーダー、サンプリングキッド又はサンプリングステーションは、待機期間、安定化期間又は順応段階を必要とする検査のための管記憶(tubes storage for tests)をサンプリングする温度安定器を有することができる。温度安定器は、適切なサンプル管温度又は時間／温度に到達したときにユーザに警報を出すことができる。一実施の形態において、温度安定器を、コードレス機能を可能にするよう操作されるバッテリとすることができ、又は、温度安定器を、コード付きの装置とすることができる。一実施の形態において、温度安定器を、リーダーに対するプラグインとすることができる。一実施の形態において、プラットホームは、サンプルを温度安定器に配置する必要がある、冷蔵する必要がである、冷凍する必要がある、室温のままにする必要がある、等々をユーザに警告することができる。
【００４５】
一実施の形態において、リーダーを、特定のテストポイントの連続的な検査を行うように構成することができる。例えば、リーダーを、微生物のレベルを周期的にサンプリング及び報告する交換可能なカートリッジ又はスワブを有する自動微生物センサ／モニタとするように構成することができる。データを一元管理することができ、高レベルの微生物検出の場合には警報を発することができる。検査を、特定の機械、医療設定(health care settings)等のような重大な制御ポイントに適用することができる。
【００４６】
一実施の形態において、リーダーマネージャ１０２を、ＨＴＴＰＳ（Ｈｙｐｅｒｔｅｘｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｐｒｏｔｃｏｌ  Ｓｅｃｕｒｅ）又はここで説明するような他のネットワーク技術によってリーダーネットワーク１１０と情報のやり取りを行うように構成することができる。リーダーマネージャ１０２を、ＨＴＴＰＳ接続を管理し又は安全にするように構成することができる。リーダーマネージャ１０２を、入力される結果を受信するように構成することができる。リーダーマネージャ１０２を、複数のリーダーの少なくとも一つからの装置状態をリーダーネットワーク１１０から受信するのに用いることができる。リーダーマネージャ１０２を、ソフトウェア更新及びシステム状態通知をリーダーネットワーク１１０に送信するのに用いることができる。
【００４７】
リーダーマネージャ１０２を、リーダーから受信した情報をデータ処理に関するデータベースモジュール１０４に送信するように構成することができる。データベースモジュール１０４は、ＡＰＩ（アプリケーションプログラミングインタフェース）プロトコルを用いて法人ＩＴ又はＬＩＭＳ／ＬＭＳ（実験室情報管理システム）を有する第三者ホスト１２０と通信を行うことができる。
【００４８】
一実施の形態において、リーダー１１２、データマネージャプラットホーム又はデータベースモジュール１０４を、例えば、ＡＰＩを用いて又は処理及び／又は視覚化される加工されていないデータのダンプ(raw data dump)の受信を介してデータソース１１８と情報のやり取りを行うように構成することができる。データソース１１８は、あらゆる種類の分析からのデータ、第三者実験室、温度又は他の環境センサ、位置ロジスティクス(location logistics)、ＡＴＰ衛生モニタリングシステム、研究室ベースの検査結果（例えば、細胞培養、ＰＣＲ及び免疫測定法）からの確認検査結果、時間及び温度モニタリング、プロセス入力（例えば、大気質及び水質）、アレルゲン及び毒素モニタリング、ペストコントロール、ＲＦＩＤ、地理的な位置、ＩＲを通じて状態を送信する遠隔ＱＣ装置、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）又は無線ネットワークプロトコル、製品コード及びロット番号、追跡可能データ、ＦＤＡデータ、ＵＳＤＡリコールリスト、ＨＡＣＣＰプロトコル、是正措置／予防措置（ＣＡＰＡ）プロトコル、法人ＧＭＰ更新等を有することができる。例えば、種々のソースからのデータを、製造中のテストポイントサンプリング、製品の出発原料のＵＳＤＡリコール及び大気質モニタリングのような特定の製品に関する複数のデータストリームが存在するように集めることができる。さらに、モニタリングのために用いられる（ビデオ又は他のシステムを介した）手洗い順守のデータ及び例えば静水がテストポイントで見つけられた場合の視覚的検査報告からのデータのような事例データを、データソース１１８として含めることもできる。
【００４９】
データベースモジュール１０４を、外部データソース１１８及び第三者ホスト１２０から情報を送信及び受信するように構成することができる。データベースモジュール１０４を、データを受信及び統合するように構成することができる。例えば、データベースモジュール１０４は、上述したような任意の外部結果データソース、法人ＩＴ及びＬＩＭＳ又は他の情報管理システムからデータを受信し、かつ、分析のために相互に関係があるとともに同期された出力を生成するためにデータを統合することができる。他の例において、データベースモジュール１０４は、第三者研究室又は陽性若しくは陰性結果を周期的に評価するために用いられる他の検査からデータを受信することができる。いずれにしても、これらのデータを、リスクデータ、傾向分析、予測される汚染分析等を提供するために異なるデータセットを統合するアルゴリズムによって集めることができる。一実施の形態において、データベースモジュール１０４を、データ構造を作成及び維持するように構成することができる。データベース管理ツールを、データ構造と情報のやり取りを行うとともにデータ構造を維持するのに用いることができる。一実施の形態において、データベースモジュール１０４を、クラウドシステム又はスマートホンのようなモバイルシステムに統合することができる。例えば、リーダーを、直接又はリーダーマネージャを介してデータをクラウドデータベースに送信するように適合させることができる。他の例において、リーダーを、スマートホンに直接結果を配信するように適合させることができ、又は、スマートホンを、リーダーからデータを引き出すように適合させることができる。いずれにしても、スマートホンを、結果を内部メモリのような内部データベースモジュールに格納するように適合させることができ、内部メモリは、そのような目的のために構成される。ここで更に詳細に説明するように、スマートホン又は他の装置を、例えば、モバイルアプリケーションを実行することによって、リーダーから取得した結果を分析するとともにそのような結果の出力として更なるダウンストリーム機能を実行するように適合させることができる。
【００５０】
データベースモジュール１０４を、リーダーマネージャ１０２から検査結果データを受信できるようにするためにリーダーマネージャに操作的に結合することができる。データベースモジュール１０４を、データ分析及び評価を行うとともにリーダーマネージャ１０２及び演習ダッシュボード１０６と情報のやり取りを行うように構成することができる。データベースモジュール１０４を、汚染の根本的原因検出を支援するとともに更に高いレベルの汚染を決定するように構成することができる。データベースモジュールは、進行中のプロセスの二次汚染を決定するのを支援することもできる。データ評価及び分析を、図２及び図３を参照しながらここで更に説明するように行うことができる。
【００５１】
データベースモジュール１０４を、演習ダッシュボード１０６に操作的に結合することができる。演習ダッシュボード１０６を、ウェブ、装置又はスマートホンアクセスを可能にするアプリケーション１２２と情報のやりとりを行うことができる。演習ダッシュボード１０６を、データ分析の結果をデータベースモジュール１０４から受信するとともに結果をアプリケーション１２２で視覚化するように構成することができる。一実施の形態において、演習ダッシュボードに関連したアプリケーション１２２を、ここで更に説明するように検査状態、結果、検査スケジュール、是正プログラム等を追跡するように構成することができる。
【００５２】
所定の実施の形態、例えば、環境モニタリングプラットホームとともに複数のリーダーが用いられる設備において、個別のリーダーを、インターネット又は他のネットワークに対するそれ自体の接続を有することなく無線又は有線で他のリーダー又はリーダーマネージャだけに接続することができる。本例において、リーダーマネージャは、リーダーからデータの全てを集めるとともに、例えば、ここで更に説明するようにデータモジュール、ネットワーク、他のリーダーマネージャ、アプリケーション等に対して、更なるダウンストリーム通信を実行する。所定の実施の形態において、リーダーは、リーダー／リーダーマネージャをデータ取得機能及びデータ通信機能を実行するスタンドアロンユニットとすることができるように統合リーダーマネージャを備えることもできる。更に別の実施の形態において、リーダーは、結果、業務ルール、プロトコル、カレンダーデータベース等を含むデータの一時的又は長期の記憶を行う内蔵メモリを備えることができる。このようにして、リーダー／リーダーマネージャを、データ取得機能、データ通信機能及びデータ格納機能を実行するスタンドアロンユニットとすることができる。更に別の実施の形態において、リーダーは、リーダーマネージャと、内蔵メモリと、プロセッサと、を備えることができ、プロセッサは、測定を行うこと、業務ルール又は設定されたプロトコルに従って測定を分析すること、警報又はカレンダーエントリのような他のイベントを生成すること、根本的原因分析を実行すること、一般的に分析を実行すること等の目的に適う。
【００５３】
一実施の形態において、リーダーを、例えば、ラベル、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、ＭａｘｉＣｏｄｅ、ＲＦＩＤ又は他の手段を用いて検査の位置にタグ付を行うように構成することができる。サンプルを設備で取り出した後に個別の位置で測定する一例において、追跡の便宜のためにサンプル管又はサンプルキットにラベル付けすることができる。ユーザは、スライサー、流し台、冷蔵庫のハンドル等のような特定の位置でサンプルを取り出すことができる。設備が病院、老人ホーム、他の医療の場である場合、サンプルは、浴室、ドアハンドル、医療機器等に由来することができる。本例において、サンプルを、サンプル管に配置されるスワブとすることができる。サンプル管を、サンプリング前にラベル付けし又はサンプリングプロセス中にユーザによってラベル付けすることができ、ラベルは、サンプル位置、オペレーター、日付／時間、周辺温度等のような多種多様な情報をコード化することができる。リーダーを、測定のために管がリーダーに配置されたときにラベルを読み出すように適合させることができる。サンプルからのデータを、ラベルからの情報によってタグ付けし、リーダーマネージャ、データベースモジュール又はダウンストリームシステムにまとめて送信することができる。サンプル管のラベル付けを、サンプル収集キットに関連してここで更に説明する。
【００５４】
他の実施の形態において、ラベルを、一つの機械又はエリアの壁に貼るようにサンプリングテストポイントに配置することができ、サンプルを取り出すときにスキャンする必要がある。例えば、リーダーが携帯型又はプラグイン装置である場合、リーダーを、サンプルからのデータに関連するテストポイント情報を取得するようテストポイントラベルを最初にスキャンするために用いることができる。代わりに、ユーザは、サンプル管ラベルを印刷するためにサンプルを取り出すときにテストポイントラベルをスキャンすることができる。更に別の変形例において、ユーザは、例えば、個別のコード化又はサンプル管収納箱の位置による何らかの方法で識別したサンプル管をテストポイントラベルスキャンに簡単に手作業で関連付けることができる。
【００５５】
リーダーをサンプリングテストポイントに配置又はそれに近接して配置した他の例において、ユーザは、サンプルを取り出し、リーダーに配置するためにそれを準備することができる。リーダーが、位置、日付／時間、環境センサ等についての情報を用いてプログラムされ又はそのような情報を取得するように適合される場合、そのような情報を、リーダーからの送信前にデータポイントに自動的に追加することができる。ユーザは、例えば、カードを通すことによって、ＲＦＩＤタグを用いることによって、又はデータを手入力することによって、オペレーターとしての識別をリーダーに入力することができる。代わりに、ユーザは、それ自体を、サンプルを読み出した後にリーダーに関連させることができる。
【００５６】
一実施の形態において、システムは、種々の関心のある人々に対して、データのカスタマイズされた表示又はデータに対するアクセスのカスタマイズされたレベル、警告、報告、マップ等を提供することができる。一実施の形態において、カスタマイズされた表示／アクセスは、許可又は承認を通じて利用することができる。例えば、リーダーは、データのセキュリティを維持するために被験者に対してリーダーの結果を明らかにすることなく顧客の倉庫に結果を報告することができる。実用的には、環境モニタリングプラットホームは、結果が検査「オペレーター」に見えなくなるようにすることができ、査閲者（例えば、マネージャ）だけが検査結果データを見ることができるようにすることができる。実施の形態において、データを、所定の人々に配送されるときにフィルタリング又は検閲することができる。食品包装工場で実行するシステムの一例において、ＱＡ／食品安全局の職員及びマネージャは、報告される時間に亘る全てのデータを有することができるが、バイヤーは、特定の単位の製造中の期間からのデータしか受け取ることができない。例えば、選択データを、食品が適所で特定の手順で製造されたかを評価するために食品の購入者と共有することができる。これによって、小売人及び他のバイヤーは、発送を受け入れるか否かを決定することができる。これは、プラットホームの種々のユーザに対して異なる「許可」を与えることを意味する。
【００５７】
実施の形態において、システムによって、結果にアクセスする権限を有するユーザに結果を分配することができる。例えば、種々の許可を、特定のユーザ又はユーザのグループが例えばスマートホンの警報によって特定の結果に関する通知を受信することができるように設定することができる。一実施の形態において、テスト結果を読み出す準備ができているという通知を一人以上のユーザに送信することができる。通知を、電子メール、ボイスメール、テキストメッセージ、スマートホンのアプリケーションの警報等を通じて配送することができる。この場合、ユーザは、後に説明するようにユーザインタフェースを介して結果にアクセスすることもできる。
【００５８】
システムをスマートホンのアプリケーションとして用いるとき、是正措置の開始、他のユーザ又はユーザのグループに対する警報の送信、全データセットの閲覧、報告の閲覧等のようなダウンストリームタスクを実行するための警報及び機会に関する更なる詳細のために、ユーザインタフェース又はダッシュボードに対するアクセスを、ここで更に説明するようにしてユーザに提供することができる。演習ダッシュボード１０６を、リーダーマネージャ１０２、データベースモジュール又は他のプラットホーム構成要素を介してリーダーネットワーク１１０に操作的に結合することができる。演習ダッシュボード１０６をユーザインタフェースとして用いることができ、演習ダッシュボード１０６は、ユーザ活動、ログイン情報、スケジュール、ログ、警報、報告及びネットワークのリーダーの追跡状態の記録、リーダーの管理のための中心の位置の提供等を行うことができるログイン認証モジュールを提供することができる。
【００５９】
演習ダッシュボード１０６を、全ての加入／支払情報と、ユーザアクセス及びモニタリング並びにサービスプロバイダのアクセス及びモニタリングの詳細と、を記録するのに用いることができる。
【００６０】
一実施の形態において、ダッシュボードを、是正措置の開始、他のユーザ又はユーザのグループへの警報の送信、全データセットの閲覧、報告の閲覧、マップとしてのデータの閲覧、グラフの閲覧、サンプルの取り出し、特定のオペレーターによって取り出されたデータの比較、特定の時間に取り出されたデータの比較、リーダーの状態のモニタリング／変更、リーダーネットワークの状態のモニタリング／変更、データ検証及び分析結果の報告の閲覧及び提出等の環境モニタリングプラットホームに関連した種々のタスクを権限のあるユーザが実行するカスタマイズ可能なユーザインタフェースとすることができる。例えば、工場長のダッシュボードは、工場でのサンプリングに関連した全ての加工されていないデータの閲覧を有することができるが、それに限定されない。マネージャは、データを分析するとともに種々のフロアプラン、報告、グラフ、ヒートマップ、要約、電子メール等を作成するダッシュボード分析ツールを用いることができる。本例において、マネージャは、時間と共にマップに陽性結果のみを表示する追跡した汚染のマップ／フロアプランとしてのデータを閲覧することができる。マップを他のユーザに送信することができる。マネージャは、マップに表示された特定のデータポイントについての更なる詳細を取得するためにマップをクリックすることができる。
【００６１】
図５を参照すると、プラットホームの種々の態様にアクセスする例示的なダッシュボードを示す。テスト結果を、リーダー及びリーダーマネージャによってプラットホームに自動的に追加することができる。ダッシュボードは、スケジュールされた行われる検査、結果及び（推定される陽性検査結果に基づくとともに浄化及び再検査のような動作を含む）是正措置を継続的に監視する。ダッシュボードは、所定の期間に亘る検査完了の全体に亘る状態を、例えば、棒グラフによって表す。ダッシュボードによって、スケジュール５０２、フロアプラン５０４及び修正／是正措置ログ５０８にアクセスすることができる。本例において、スケジュール５０２のチェックマークは、全ての要求される検査を完了し、全ての要求される検査を少なくとも部分的に完了し又は全ての要求される検査が少なくとも延滞していないことを表す。本例において、一つの推定された陽性結果及び閲覧を要求する二つの修正がある。
【００６２】
一実施の形態において、環境モニタリングプラットホームは、色分け又は他の何らかの指標によって、特定の微生物の存在／非存在を数値的に表すことができる。ダッシュボード形態において、特定の微生物の存在／非存在の追跡を、所定の時間に亘って行うことができ、ゾーン又はテストポイント、微生物の株の型又は他の変数によって体系化することができる。ＳＭＳ、ページャアラート等のような警報を、陽性所見及び陽性所見の位置を取得した場合に特定のユーザに送信することができる。結果を、食品安全コンサルタントのような第三者又は会社の支配人等に送信することができる。
【００６３】
一実施の形態において、データを、エンタープライズリソースプラニング（ＥＲＰ）システム、他の品質管理ソフトウェア、研究室管理ソフトウェア又はプロプライエタリソフトウェアに統合することができる。
【００６４】
一実施の形態において、システム１００を予測的とすることができる。陽性結果を取得する場合、システムは、検査又は再検査のために特定のエリアを示唆することができる。これは、サンプリングプロセスから取り出したテストポイントデータ並びにプロセス及び設備１１４の知識に基づくことができる。代わりに、システムは、外部研究室検査のために収集する新たなサンプルを要求することができる。その後、研究室結果及び推定される陽性は、システムによって照合される。システムは、研究室結果が到着したとき又は延滞であるときに警報を出す。
【００６５】
推定される陽性データポイントを受け取る際に、システム１００は、汚染の根本的原因を識別するのを助けることができる。一実施の形態において、根本的原因分析を誘導ベクトルサンプリング(Guided Vector Sampling)によって行うことができ、この場合、汚染源を決定するとともに効果的かつ適宜な修正を考案することを目的とする。システムは、発端である推定される陽性のテストポイントに集中するとともにベクトルが外に向いた(vector out)ヒートマップ若しくはフロアプランを作成し、又は、陽性のテストポイントから次に検査すべきエリアまでを、例えば、推定される陽性までの距離、推定される陽性が記録されてからの時間、推定される陽性のテストポイントで記録された汚染のタイプ等に基づいて推定することができる。提案される周辺のテストポイントを、検査履歴に基づいて重み付けすることができる。例えば、陽性検査の前歴を有するテストポイントを有するエリアを、陽性検査の前歴を有しないエリアより重み付けを高くする。さらに、システムは、以前に検査されていない又は現在検査すべきスケジュールにない新たなポイントでの検査を提案する。プラットホームが追加の検査を提案するとき、それは、更に多くのテストポイントの作成又は存在するテストポイントの新たな組合せをオペレーターに案内することである。テストポイントは、変動する寿命を有することができる。テストポイントを、予測性のもの、（日和見性サンプルのような）１回の使用のもの又は（２日のベクトルサンプリング中に用いられるような）短期間のものとすることができる。
【００６６】
検査の位置及び量をシステムによって提案及び追跡することができる。ヒートマップ又はフロアプランは、色としての又は他の何かの視覚的な識別子による重み付けされた結果を表示することができる。データが集められると、汚染の可能性があるエリアはだんだん狭くなって特定され、汚染の根本的原因を明らかにすることができる。ヒストリカルベクトルサンプリング結果(historical vector sampling results)を、検査履歴と一致するエリア及びベクトル化中にカバーされない分岐(divergence)と一致するエリアの両方を表すためにヒートマップに重ね合わせることができる。一実施の形態において、各テストポイントに対する複数のデータストリームが存在することができる。例えば、各テストポイントに対するＡＴＰ、研究室結果、完成品検査、画像及びコンテクスト入力のような追加のテストデータを、並列の閲覧で又は重み付けに追加したものとして提示することができる。あり得る出力は、装置のあり得る汚染部分の識別、人間の移動(human traffic issue)、流出又は設備の他の形態を含むことができる。したがって、システムは、汚染物質プロトコルの形態を十分に実現することができる。
【００６７】
一実施の形態において、プラットホーム分析を、問題のあるサプライヤー又は生産ラインを識別するために用いることができる。各テストポイント及びそれに関連する検査結果は、所定のサプライヤーが汚染した製品を供給しているか否かを粒状に(granularly)アクセスすることができる。サンプルを取得することは、食品表面それ自体、食品包装、トラック、エリアの受信、非食品接触面（ゾーン３／４）及び／又は食品接触面（ゾーン１／２）の採取を伴うことができる。プラットホームは、フロアプランに関連する種々のテストポイントに関する豊富なデータの時間ベースの閲覧を可能にする。そのようなフロアプランは、特定のテストポイントが陽性であったときにテストポイントに進んだ製品コードのようなサプライヤー識別子に関係してフロアプランを見ることができるようにすることによって、推定される陽性を見つけたとき及び当該時間に材料を提供したサプライヤーを示すことができる。したがって、プラットホームは、特定のサプライヤー、特定のロット、製品タイプ及び棚卸(inventory)を陽性検査結果までたどるために製品コードを利用することができる。
【００６８】
一実施の形態において、システム１００を、例えば、ダッシュボードの傾向分析ツールを用いることによって、所定の時間に亘る環境モニタリングの傾向を追跡するために用いることができる。システム１００は、例えば、所定の設備の所定の時期の間に特定の微生物のスパイクが存在するか否かを決定するために所定の時間に亘る傾向を監視するとともにユーザに提示することができる。例えば、種々の所定の期間に亘る複数の設備の間の微生物汚染傾向をユーザによって比較できるようにすることができる。一実施の形態において、ユーザは、検査から取得したデータと業界基準とを比較することができる。一実施の形態において、比較報告を、単一の会社、産業、工場等の間の整合性を保証するために種々の設備間で生成することができる。データを、産業間の基準を識別するためにマクロな意味で用いることができる。データは、例えば、完成品に微生物が存在するリスクを低減することにより保険料を減少させることによって、保険業、ＣＦＯ等で有用となることができる。
【００６９】
一実施の形態において、システム１００を、ここで更に説明するようにあり得る危険地点又はリスクを決定するために用いることができる。
【００７０】
一実施の形態において、演習ダッシュボード１０６は、データを複数の設備間で又は産業基準に対して比較することができる。演習ダッシュボード１０６は、結果を、汚染の許容できるレベルのようなしきい値又は心配のしきい値(threshold for concern)と比較することができる。演習ダッシュボード１０６を、種々の指標を生成するために操作的に結合又はプログラムすることができる。指標を、聴覚、視覚、視聴覚、図形又は自然界のスペクトルとすることができる。演習ダッシュボード１０６を、汚染を改善するための動作を推奨するように構成することができる。演習ダッシュボード１０６によって行われる報告を、食品接触面であるゾーン１−２の報告、非食品接触面であるゾーン３−４の報告、地理的にタグ付けされた位置(geo-tagged locations)の報告、他の位置の報告等のように報告をゾーンに結び付けるように構成することができる。
【００７１】
一実施の形態において、種々のデータソース１１８、第三者ホスト１２０、リーダーネットワーク１１０又は他の任意のソースを含む種々のソースから受信した情報をあり得る危険をユーザに警告する全体に亘る食品安全リスクインデックスに組み合わせるアルゴリズムを開発することができる。例えば、データを上述したように重み付けすることができる。アルゴリズムは、例えば、フロアプラン、地理的な位置、コード、画像、日付／時間等に従ってデータを整合することによって、種々のソースからのデータを関連付けることができる。
【００７２】
一実施の形態において、システムからのデータを集めるとともに、製造業、保険会社及び他の関心のある関係者に販売されるリスクモデルに変えることができる。データモデルを、ａ）経費をシニアマネージャに対して正当であると説明すること、ｂ）極めて重要なリスクエリアを識別すること、ｃ）規制者が規制を集中する場所を決定するのを助けること、ｄ）上述したように料金を決める保険料の決定をアクチュアリー(actuary)に通知すること等の一つ以上に対して役立つある種の動的な「計算機」とすることができる。このために用いられるデータを、種々のソースから集めることができる。ソースは、製造業又は食品タイプの間のプロセス比較、顧客動向、季節的傾向、リコールデータ、種々の食品研究室からの微生物検査データ、システム１００によって生成された微生物検査データ、検査傾向、健康データ、Ｐｕｌｓｅｎｅｔ等を含むことができる。
【００７３】
ユーザは、図６に示す表示に到達するためにフロアプランボタン５０４をクリックすることができる。ここで図６を参照すると、例示的なフロアプランが描かれる。フロアプランを２Ｄ又は３Ｄフォーマットとすることができ、フロアプランは、強調された臨界点を有する。プラットホームにおけるフロアプランの作成を、設備によって提供されたフロアプランを用いることによって、又は、工場を歩いて写真を撮った後にこれらの写真を工場のレイアウトに変換することによって容易にすることができる。フロアプランは、主要な壁のレイアウト、排水管、機器、スタッフ配置、製造ワークフロー、人間通行マッピング及びより良い微生物モニタリングを可能にするための設備についての他の関連の視覚情報を含むことができる。フロアプランを、システム１００に格納することができ、参照のために又は以前の記録にアクセスするためにユーザによってフロアプランにアクセスすることができる。設備が食品製造設備である一例において、主要な食品接触ゾーン及び非食品接触ゾーンの全ての位置を表す設備の２Ｄ又は３Ｄマップを作成することができる。実施の形態において、フロアプランを、マークしたテストポイントの各々で統合したテストポイント位置の画像を有する２Ｄ又は３Ｄモデルのハイブリッドとすることができる。一実施の形態において、フロアプランを、例えば、重大な制御ポイントを通じてあり得る危険を識別するために、必須のプログラムの一部の形態の食品製造設備のＨＡＣＣＰ又はＣＡＰＡプランの一部とすることができる。
【００７４】
フロアプランを動的にすることができる。例えば、オペレーターは、追加のテストポイントを動的に追加する能力を有する。例えば、ユーザがフロアプランを閲覧するとき、ユーザは、追加のテストポイントを重大なエリアに追加することを任意に決定することができる。テストポイントを追加することを、ユーザがタッチスクリーンインタフェースを用いて装置のフロアプランにアクセスする場合に位置にタッチすること、又は、例えば、ユーザがデスクトップコンピュータからフロアプランにアクセスする場合に位置をクリックすることと同様に簡単にすることができる。代わりに、ユーザは、テストポイントに関連付けるために位置の写真を撮ることによって新たなテストポイントを追加することができる。いずれにしても、新たなテストポイントを一度検査することができ、又は、新たなテストポイントを、現在行っているスケジュール上で検査すべきポイントとして追加することができる。一実施の形態において、オペレーターは、新たなテストポイントにマッピングすることができるラベルが付されていない検査キットを有することができる。
【００７５】
検査スケジュールを実行する間、オペレーターは、一つ以上の検査を動的に追加するとともに新たなテストポイントをシステムに追加するオプションを有する。検査を追加することによって、業務ルールセットに従ってダッシュボード警報及び是正措置を生成することができる。新たなテストポイントを、例示的なプロセスにおいて次のように追加することができる。「割り当てられていない」サンプルキットを調達する。これは、位置データが設定されていないキットである。ソフトウェアは、ＱＲコード（登録商標）のスキャン、コンピュータメモリへのアクセス等によって、キットを、割り当てられていないものとして認識する。スマートホンアプリのようなアプリケーションによって、ユーザは、新たなテストポイントを追加する。アプリは、ライブ画像を表示することができ、十字線を新たなテストポイントに合わせるようオペレーターに要求する。一旦十字線が合わせられると、オペレーターは画像を取得する。アプリを用いることによって、オペレーターは、割り当てられていない検査キットのＱＲコード（登録商標）をスキャンすることを要求され、これによって、サンプルキット又はサンプル管を、ちょうど取得した画像に関連させる。アプリを通じて又はその後、オペレーターは、例えば、新たなテストポイントの説明文タグ、すぐ近くの一つ以上の存在する位置の選択、新たなテストポイントをスケジュールに永久的に追加するか単一の日和見性のサンプルとして新たなテストポイントを取り除くか等の新たなテストポイントに関する詳細を入力するように指示される。アプリは、動的に追加されたテストポイントの記述が不完全であるときにオペレーターに警告を出す。新たなテストポイントをシステムに追加するプロセスの他の例において、プロセスは、新たなテストポイントを他の位置及び設備に対してまとめて自動的にマッピングするための新たなテストポイントのスマートホンの地理的な配置を有することができる。プロセスの残りを不変にすることができる。更に別の例において、新たな検査を追加するプロセスは、フロアプラン表示の何れかの場所をクリックすることによって開始し、これによって、上述したように、ゾーン、検査タイプ、スケジュール又は画像のような検査詳細を追加するとともにデータ追跡のためにサンプルキットを記録するようオペレーターに指示することができる。
【００７６】
地理的に配置されたサンプル収集ポイントの代わりに、オペレーターは、画像の中心のテストポイントを用いることによって各サンプルキットの画像を取得することを選択することができる。これを、スマートホンアプリ又は他のソフトウェア処理によって行うことができる。この方法を用いる場合、オペレーターは、視覚的なフロアプランとして提供されるスケジュールを有するための携帯電話ソフトウェアの使用又は上述したようなテストポイント画像を有する毎日のサンプルスケジュールの印刷のオプションを有する。この画像ベースのテストポイント位置は、サンプルを取り出す場所をユーザに気付かせるための画像及びテキストタグを用いることによって、毎日のサンプル検査を案内する種々の方法を形成する。これは、地理的配置又は他の三角測量サービスが利用できない又はタスクに対して強固(robust)でない場所で又はオペレーターの選択に従って利用可能である。
【００７７】
一実施の形態において、システム１００は、サンプリングのためのテストポイントをランダムに提案することができる。システム１００は、高いリスクのエリア及びこれまで陽性であったエリアの重み付けの一つ以上を所定の期間に亘って設備全体又は設備のエリアをスワブするという目的とを組み合わせることによって新たなテストポイントを提案することができる。使用は、所定のテストポイントの含有又は除外を保証するためにランダムに選ばれたスケジュールより優位に立つ。
【００７８】
携帯電話ソフトウェアによって視覚的なフロアプランを用いることにより、ユーザは、位置の画像を見るとともにサンプルの収集方法のメモを読むためにテストポイントに関連したアイコンをクリックすることができる。
【００７９】
図６において、製品洗浄ライン(produce washing line)の種々の洗浄装置についての詳細を、原材料準備ライン(raw product prep line)の洗浄装置及び排水管並びに冷却装置(cooler unit)の排水管とともに見つけることができる。アイコン６０２を、フロアプランにマッピングされた各テストポイントに関連付けることができる。アイコン６０２は、ここで説明するようにインタラクティブである。例えば、チェックマークは、確認された陰性結果を表すことができ、感嘆符は、推定される陽性結果又は推定される陽性結果の最近の履歴を表すことができ、ストップウォッチは、結果が進行中又は延滞していることを表すことができ、「＞」は、当該アイコンをクリックすることによって追加の詳細が利用できることを表すことができる。任意の記号、文字又はアイコンを結果状態の表示のために用いることができることに留意されたい。アイコンを、テストポイントで用いられる診断検査の種類を表すために用いることもできる。例えば、図６において“Ｌ”であるアイコン６０８は、リステリア菌の診断検査を言及する。フロアプランは、実設備の種々のテストポイントの実際の位置の描写である。本例において、原材料準備ライン２、排水管１に対して表した一つの警告が存在する。フロアプランの当該位置に関連したアイコン６０２をクリックすることによって、図７の表示にアクセスすることができる。図７は、ユーザがアイコン６０２に接触するときに表示されるダイヤログボックスを表す。ダイヤログボックスは、警告が生じた結果を含む当該特定の位置での検査からの結果及び統計データを表示する。本例において、以前にの推定される陽性結果に関するデータも表示される。ユーザは、この表示から報告及び修正ログ(remediation log)に迅速にアクセスすることができる。さらに、テストポイントに対する第三者データをここに表示することができる。任意の推定される陽性結果によって、是正措置の生成を自動的に行い、それに対しては、ダッシュボードの修正／是正措置ログにアクセスすることができる。図８は、修正ログを表す。第１の項目は、位置、テストポイント、日付、必要とされる是正措置、是正措置の状態、是正措置に対して参照される標準的な操作手順、修正に割り当てられるユーザ及びタスクが行われていることを表すタスクの完了の際に押す動作ボタンを含む公開修正(open remediation)を表す。クリックを行うことによって、修正を閲覧リストに移動させることができる。次の列は、マネージャによって閲覧される必要がある修正のデータを表示する。項目は、位置、テストポイント、日付、表示された是正措置、是正措置閲覧の状態、標準的な操作手順の参照、修正閲覧に割り当てられるユーザ及び閲覧されたことを表す閲覧の完了の際に押す動作ボタンを表す。閲覧の際に修正が延滞している場合、警告を生成することができる。修正履歴をログで閲覧することもできる。
【００８０】
ここで図９Ａ及び図９Ｂを参照すると、ダッシュボードのスケジュールページの例を表す。図９Ａの付けジュールページによって、ユーザは、任意の特定の位置の任意の特定のデータに対するスケジュールされた検査を引き出すことができ、かつ、テストポイント、検査タイプ、スケジュールされた時間、結果の期限、検査に割り当てられるユーザ及びコメントを含むデータを閲覧することができる。図９Ｂのスケジュールページによって、ユーザは、任意の特定のテストポイントにおける任意の特定日のスケジュールされた検査を引き出すことができ、かつ、テストポイント、検査タイプ、位置、収集時間、結果の期限、検査に割り当てられたユーザ及びサンプリングノート(sampling note)を含むデータを閲覧することができる。プラットホームは、検査が時間通りに行われたことを確認するために入力データを実際に追跡するスケジュールを用いることができ、それが行われなかったときにダッシュボードに警報を出す。コメント及びサンプリングノートは、検査を特定の位置に導くことができ、又は、観察されたパドル(observed puddle)のような追加のデータを収集するようにユーザを指導することができる。そのような追加のデータを、特定のテストポイントのデータストリームに追加することができる。スケジュールは、図９Ａに示すように、列をクリックすることによって複数の追加の列を提供するように選択部を展開するとともに表示した期間の種々の位置のスケジュールされた検査をユーザにより迅速に調べることができる折り畳み式の閲覧を形成することができる。折り畳み式の表示を、図９Ｂに示すように、１週間に亘ってスケジュールされた検査を閲覧するために用いることもでき、この場合、毎日は、折り畳み式の閲覧の畳み込みを表す。スケジュールを用いることによって、新たな検査を既知の位置又はランダムに選択した位置に追加することができ、スケジュールを修正することができ、かつ、検査を任意の時間にランダムに挿入することができる。実際には、ユーザが、例えば、フロアプランインタフェースを用いることによって新たな検査を追加する場合、新たなテストポイントは、今収集すべきテストポイントとしてスケジュールに出現することができる。
【００８１】
スケジュールを利用することによって、環境モニタリングプラットホームは、サンプルがプラン通りに収集されたか否かを追跡することができる。環境モニタリングプラットホームを、いつどこで所定のサンプルを取得したかをユーザに思い出させるようにプログラムすることができる。サンプルを取り出した場所についての警報をユーザに出すために（バーコード又はそれ以外によって）サンプル収集キットにテストポイントデータを予め印刷することができ、したがって、複数のサンプルを把握するのを簡単にすることができる。サンプルを、ＧＰＳ、バーコード、ＱＲコード（登録商標）、ＲＦＩＤタグ、ＲＦ三角測量(RF triangulation)等を含む種々の方法を用いることによって地理的に配置することができる。一実施の形態において、ＧＰＳ又は他の地理的配置方法を、検査を行う際にコンプライアンス及び一貫性を確保するためにサンプルが収集された場所を追跡するのに用いることができる。一実施の形態において、サンプルが収集されなかった場合に警報をＳＭＳ又は他の手段によって送信することができる。追跡したデータは、サンプル収集時間、サンプル収集者名等を含むことができる。一実施の形態において、検査を行ったときに検査の特定の位置等を追跡できるソフトウェア上で、サンプリングを製造設備１１４の２Ｄ又は３Ｄマップにマッピングできるようにするために、バーコード、ＱＲコード（登録商標）又はＲＦＩＤタグのような識別子を、スキャンすべき工場全体に亘るテストポイントにサンプリング前に配置することができる。代わりに、サンプルを正確な位置から取り出すことを保証するためにテストポイントの識別子をサンプルキットの識別子と簡単に比較することができる。
【００８２】
ここで図１０を参照すると、ダッシュボードの報告ページを表す。報告は、全ての検査動作の閲覧履歴を含むことができる。報告出力を、十分にカスタマイズすることができ、印刷することができ、ソフトウェアアプリケーションにエクスポートすることができ、又は任意の法人ＩＴインフラに適合／同期させることができる。報告は、第三者データを含むことができる。報告を、傾向及びプラットホーム分析を追跡するのに用いることができる。報告は、検索可能かつエクスポート可能である。一実施の形態において、報告は、エリア、テストポイント数及び位置、ゾーン、検査回数、％陰性検査、％陽性検査、時間超過で失敗に終わった実際の検査結果等を含む各テストポイントのデータを含む。本例において、チェックマークは、陰性結果を表し、‘Ｘ’は、陽性結果を表す。
【００８３】
演習ダッシュボード１０６を、ソフトウェアとして、ティッカー形式(ticker format)で、スマートホン又は同様な装置のアプリケーション形態等として配置することができる。
【００８４】
ここで図２を参照すると、種々の検査を行い、検査データを収集し、かつ、収集したデータを分析することによって所定の環境の微生物のファージベースの検出を行う方法２００を示す。方法２００は、上述したように、ステップ２０２において製造設備１１４又は他の環境をマッピングすること及びフロアプランを生成するために環境をソフトウェア上でモデリングすることを有することができる。方法は、ステップ２０４において、ステップ２０２で生成したフロアプランの特定の場所にテストポイントを更にマッピングすることができる。
【００８５】
方法２００は、毎日実行する検査の回数、検査ごとにサンプルを繰り返す頻度、サンプルを収集すべき場所、ステップ２１０での推定される陽性結果後に生じる是正措置、推定される陽性結果に対する是正措置を満足するために要求される陰性再検査の回数、データを送信する場所、データから生成すべきグラフ／表／報告、警報に対するしきい値、モニタリングプロセスの設定方法等のような種々のパラメータを設定するプラットホームに対するステップ２０８での「業務ルール」のセットを確立することを更に有することができる。例えば、ルールを、陽性結果がゾーン１で得られた場合に是正措置を全ての装置の再洗浄とするというルールとすることができる。実施の形態において、ユーザは、業務ルール、閲覧業務ルール、更新業務ルール等を変更又は追加することができるようにしてもよい。
【００８６】
方法２００は、ステップ２１０において検査データ、推定される陽性と確認された陰性のいずれか一方を、例えば、データの無線若しくはイーサネット（登録商標）ベースの通信又は他のネットワークプロトコルを介した通信による中央サーバに送信することを有することができる。実施の形態において、データを、メモリを閲覧のために他の装置から取り外すことができるように着脱式メモリのようなテストリーダーのメモリに格納することができる。一実施の形態において、情報は、将来の諸問題、傾向の追跡、監査等のためにデータを維持するようサーバ又は顧客サーバと同期をとる。データを、監査役又は検査役による閲覧を容易にするために現場の他のデータと比較できるフォーマットでエクスポート可能／表示可能にする必要がある。例えば、共通フォーマット（Ｅｘｃｅｌ等）のデータの出力を、検査結果の安全な顧客層個を形成するために用いることができる。一実施の形態において、データを、ＱＡ、消費安全局(food safety)、感染予防局(infection control personnel)又は他のユーザによって閲覧することができる。リーダーからの結果の送信を、テストリーダーそれ自体の使用を監視するために用いることができる。
【００８７】
ステップ２１２において、サーバは、結果の送信を予定通りに予測することができ、したがって、サーバは、検査がスキップされたとき又は推定される陽性検査結果を受信したときに警報を生成することができる。リーダー又はサーバは、結果に基づいた追加の検査のサンプルの要求又は取出しを行うために第三者研究室に警報を出すことができる。一実施の形態において、ヒートマップのような報告及びグラフを、微生物又は他の汚染物質に対する陽性結果を有する又は有しないエリアを示すシステムによって生成することができる。
【００８８】
方法２００は、ステップ２１４における是正措置を修正することを更に有することができる。是正措置を、システム１００によって追跡することができ、再検査を、陰性結果を取得するまで行うことができる。業務ルールは、推定される陽性結果に対する是正措置を満足するために要求される陰性再検査の回数を管理することができる。
【００８９】
図３は、システム１００を示すとともにシステム１００に存在する機能階層(functionality layers)を表すブロック図である。
【００９０】
システム１００は、ファージ誘発産物を検出する生物発光分析法を含む任意の数のソースからのデータを供給するデータソース１１８を有することができる。
【００９１】
システム１００は、ここで以前に説明した演習ダッシュボード１０６と同様なダッシュボード又は総括モジュール(overview module)３０２を有することができる。ダッシュボード／総括モジュールを、ユーザインタフェースとして構成することができ、かつ、ユーザとの情報のやり取り、警報（例えば、ＳＭＳ、ページャ警報等）の送出、ＡＰＩ／アプリケーションとの情報のやり取り、プロファイルのユーザ認証及びロギング詳細の維持等を行うように構成することができる。システム１００は、スケジュールモジュール１０４を有することができる。スケジュールモジュール３０４を、ダッシュボード／総括モジュール３０２に操作的に結合することができる。スケジュールモジュール３０４を、例えば、データの収集を行う特定期間、サンプリングの期日、所定のコレクタ／オペレーターに対するタスクの割当て等を設定するために、ダッシュボードのタスクのスケジューリング及び追跡を行うように構成することができる。
【００９２】
一実施の形態において、スケジュールモジュール３０４は、業務ルールに従って、検査が誰かによって行われることになっているときにリマインダーを送信することができる。スケジュールモジュール３０４を、例えば、季節、シフト、ユーザ／オペレーター等に基づいてカスタマイズされたスケジュールを決定するように適合させることができる。スケジュールモジュールを、データベースモジュール１０４に操作的に結合することもできる。一実施の形態において、スケジューリングは、どの装置をいつどの位置で用いるべきかを決定することを含むこともできる。スケジュールモジュールは、タスクが実際に実行されたとき、タスクが完了したか否か、又は、タスクを実行するようにスケジュールされたとき及び存在すべきである完了したタスクに比べてタスクが不十分であるか否かを追跡することもできる。これを、一連の従業員の全体に亘る動作を追跡するために用いることができる。
【００９３】
システム１００は、（ヒートマップ生成モジュール３０６とも称する）フロアプランモジュール３０６を有することができる。フロアプランモジュール３０６を、ダッシュボードモジュール３０２及びリーダーマネージャ１０２に操作的に結合することができる。フロアプランモジュール３０６を、製造設備の（図４に示すような）マップを生成するように構成することができる。マップ生成についての詳細は、図２を参照しながら以前に説明した。実施の形態において、ｉＰａｄ（登録商標）／スマートホンを、サンプルを取り出した場所を追跡するためにプラットホームとともに用いることができる。例えば、ユーザは、ｉＰａｄ（登録商標）／スマートホンのタッチスクリーンに表示されたフロアプランの位置にタッチすることができ、これによって、所定のスワブ＃をテストポイントに結び付ける。さらに、装置上で実行するアプリケーションは、各検査を行った場所、各検査を行ったとき等の情報を検査受取人に提供する。ここで説明するように、サンプルに関連したテストポイントの写真のような写真を装置によって撮影することができる。
【００９４】
システム１００は、是正措置ログ３０８を有することができる。是正措置ログ３０８を、検査結果分析に基づいて是正措置を修正及び格納するように構成することができる。是正措置ログ３０８を、スケジューリングと是正措置との同期を可能にするためにスケジュールモジュール３０４に結合することができる。是正措置ログを、種々のオペレーター、マネージャ等にタスクを割り当てるために用いることができる。さらに、是正措置ログを、陰性結果を返す追跡検査の際の是正措置の完了を確認するために用いることができる。業務ルールとの組合せによって、是正措置ログを、所定の是正措置をＣＡＰＡシステムに入れるか否かを決定するために用いることができる。
【００９５】
環境モニタリングプラットホームは、以前の陽性（及びそれに続く是正措置）の位置での陰性検査を有することによって是正措置を終了したときを追跡することができる。是正措置ログを、所定の陽性結果後に自動的に更新し又はユーザにより手動で更新することができる。是正措置は、是正措置及び閲覧の実現のための個別の職員への示唆を含むことができる。是正措置が命令通りに実行されなかった場合又は是正措置が命令通りに閲覧されなかった場合、警告を生成することができる。一実施の形態において、環境モニタリングプラットホームは、衛生プロトコルを推奨することができ、潜在的には、その製品は、所定の表面で最も有効となる。一実施の形態において、環境モニタリングプラットホームは、微生物の発生を最小にするとともに製品品質を向上させる予防措置を推奨することができる。
【００９６】
システム１００は、将来の参照のために以前の検査、検査結果、報告、グラフ、マップ等を記録及び表示するように構成することができるヒストリカルダッシュボード３１０を有することができる。ヒストリカルダッシュボードを用いることによって、ユーザは、特定の期間に亘る全ての検査及び傾向（例えば、季節性）を見分ける位置又は経時的改善／非改善を全体に亘って見ることができる。実施の形態において、ヒストリカルダッシュボードを、規定された期間からアイテムを表示するように構成したダッシュボードとすることができる。
【００９７】
図４は、食品検査環境におけるファージベースの微生物検出手順の一般的なワークフロー方法の略図を示す。
【００９８】
方法４００は、ステップ４０２における設備１１４のテストポイント現場フロアプランのモデリング及び閲覧並びにテストプランの拡大を有することができる。テストポイントのモデリング及びモニタリングを第三者に委託することができる。テストポイントを、ＨＡＣＣＰプラン、環境プラン又は衛生プランで識別されるような重大な制御ポイントの検証又はモニタリングに関連させることができる。ステップ４０４において、ユーザは、（図６に示すような）動的なフロアプラン及び（図９ａ及び図９ｂに示すような）スケジュールを作成することができ、これらは、進行中の検査及びヒストリカル傾向に結び付けられる。ステップ４０８において、検査を、図５に示すように、簡潔な毎日のダッシュボードから管理することができる。ダッシュボードを、任意の数の装置からアクセスすることができ、スマートホン及びページャのような任意の数の装置に警報及び通知を送信することができる。ステップ４１０において、是正措置を、図７のダイヤログボックス及び図８の修正ログに示すように追跡することができる。ステップ４１２において、図１０に示すように、ヒストリカル傾向を、環境プランを管理するために用いることができる。データをエクスポートすることができ、又は、プラットホームを、環境モニタリングのエンドツーエンドソリューション(end-to-end solution)を容易にするためにＩＴインフラに統合することができる。
【００９９】
システム１００を、コンサルタント又は監査人が参画することができるとともにリスクポイントを記録することができる受動的なプログラム(passive program)として構成することができる。コンサルタントは、設備１１４の図面又はマップを用いることができ、かつ、システム１００を、ホットスポット(hotspot)を用いてプログラムすることができる。システム１００を、図面又はマップを記録及び認識するように構成することができる。コンサルタントは、重大な制御ポイントのあり得る危険を有効に監視できることを保証するためにＨＡＣＣＰプランに従って行われた全ての検査データ及び結果を監視することができる。一実施の形態において、システム１００を、検査が行われるとともに報告が任意の汚染の陰性を見つけた後にある種の認証を与えることができるようにＩＳＯのようなシステム(ISO-like system)とすることができる。スケジュールを、更なる検査及び認証更新のために設定することができる。
【０１００】
一実施の形態において、システム１００を、所定の環境における微生物の存在に対するリアルタイム又は準リアルタイムのその場のモニタリングのためのプラットホームとして用いることができる。一実施の形態において、システム１００を、環境における微生物のリアルタイム又は準リアルタイムモニタリングのためのプラットホームとすることができ、この場合、プラットホームは、検査に応じて個別の微生物又は所定の微生物の個別の菌株の存在を検出及び報告することができる。さらに、サンプルを、特定の検査に続く一般的なスクリーニングのために分割することができる。
【０１０１】
一実施の形態において、システム１００を、環境における微生物のリアルタイム又は準リアルタイムモニタリングのためのプラットホームとして用いることができ、この場合、プラットホームは、所定の微生物のレベルを、予め決定されたセットのリスクのレベルに従って定量化及び報告することができる。一実施の形態において、リスクレベルを、システム１００によって又は手動で入力することによって予め決定することができる。
【０１０２】
準リアルタイム結果は、多くのダウンストリームアクティビティを可能にする。例えば、準リアルタイム結果は、微生物を検出した場合にマシン又はシステムを即座にオフラインにするようにモニタリングをインライン処理(in-line processing)することを可能にする。一実施の形態において、実用的な情報を、再洗浄が必要であるか否か又はシステムを洗浄のために解体する必要があるか否かを決定するために洗浄サイクル中に生成することができる。一実施の形態において、頻繁なスワブによって、汚染のポイント、すなわち、微生物汚染の根本的原因の識別及び汚染の推定発生源の除外を容易にする。さらに、本来備わっている汚染と外部ソースからの微生物の連続的な再取込みとの間の区別を行うことができる。システムは、いつどこでどの洗浄剤を用いるかを決定するために化学薬品の供給者を助けることもできる。
【０１０３】
一実施の形態において、環境モニタリングプラットホームを、複数のセル（例えば、＜１０セル、＞１００セル、＞１０００セル）に信号を関連付けることによって問題の重症度を定量化するために用いることができ、これを、再洗浄及び再検査、設備又は設備の一部のオフライン化、食品の検疫、食品の破棄等のような特定の是正措置に関連付けることができる。一実施の形態において、プラットホームは、移動点を容器から区別するのに有用となることができ、すなわち、低計数を有する表面を、しかるべき状況で取り出すときに特に移動点と見なすことができる。
【０１０４】
一実施の形態において、システム１００を、同一の設備又は第三者の設備に配置された他の検出技術と組み合わせて用いることができる。
【０１０５】
一実施の形態において、システム１００を、ファージ誘発産物に基づいて環境の微生物を検出するとともに環境の安全に関連する少なくとも一つの他の要因を検出するモジュールを有するプラットホームとすることができる。
【０１０６】
一実施の形態において、システム１００を、ファージ誘発産物に基づいて環境の微生物を検出するとともにＡＴＰ（アデノシン三リン酸）又は生物作用の他のマーカー、他のタイプの検出器によって測定された微生物、サンプルの温度、時間、ＣＦＵ（コロニー形成単位）、サンプル位置、サンプル頻度等の少なくとも一つを検出するモジュールを有するプラットホームとすることができる。システム１００を、他の検査から取得した結果とプラットホームによって収集したファージ誘発産物に基づく検査結果とを比較するとともに他の検査から取得した結果を、例えば、地理的位置、コード化又は他の手段を介してプラットホームと同等のもの(counterpart)と関連させるように構成することができる。システムを、ファージ誘発産物に基づく検査が陽性であるとともに他の検出検査の少なくとも一つが陰性である場合に行動指針(course of action)を提言するようにプログラムすることができる。システムを、ファージ誘発産物に基づく検査が陰性であるとともに他の検出検査の少なくとも一つが陽性である場合に行動指針を提言するようにプログラムすることができる。一実施の形態において、ファージ誘発産物に基づく検出検査を、ＡＴＰレベル検査と組み合わせて用いることができる。
【０１０７】
一実施の形態において、システム１００を、検査すべき又は監視下にあるべきエリアを予測するのに用いることができる。システム１００を、ファージ誘発産物に基づいて環境の微生物を検出するとともに長期的な検査データ(longitudinal testing data)に基づいて検査すべきエリアを予測するモジュールを有するプラットホームとすることができる。
【０１０８】
一実施の形態において、システム１００を、検査すべき位置を識別するのに用いることができる。例は、複数の設備又は部屋の備品の分類を含む。又は、例えば、排水管のような基準位置からの固定距離内の領域（例えば、排水管の１０フィート半径内のエリア）を識別する。
【０１０９】
一実施の形態において、システム１００を、複数の環境の微生物の存在についてのリアルタイムデータのストリームを収集、報告、分析及び管理する分析プラットホーム／フレームワーク／ソフトウェア環境とすることができる。
【０１１０】
一実施の形態において、システム１００を、食品生産分析において使用することができる。システム１００を、食品生産環境の微生物の存在についてのリアルタイムデータのストリームを収集、報告、分析及び管理する分析プラットホーム／フレームワーク／ソフトウェア環境とすることができる。
【０１１１】
一実施の形態において、システム１００を、分析及び成長の追跡に用いることができる。システム１００を、環境の微生物の存在についてのリアルタイムデータのストリームを収集、報告、分析及び管理するとともに関心のあるエリアの微生物の成長を追跡するために環境をソフトウェア上でモデリングする分析プラットホーム／フレームワーク／ソフトウェア環境とすることができる。
【０１１２】
一実施の形態において、システム１００を、分析、成長の追跡及びヒートマップに用いることができる。システム１００を、環境の微生物の存在についてのリアルタイムデータのストリームを収集、報告、分析及び管理するとともに関心のあるエリアの微生物の成長を追跡し及び追跡した成長をヒートマップ表記で表示するために環境をソフトウェア上でモデリングする分析プラットホーム／フレームワーク／ソフトウェア環境とすることができる。一実施の形態において、主要な食品接触エリア及び非食品接触エリアの全ての位置を表す生産設備の２Ｄ又は３Ｄマップを作成することができる。一実施の形態において、マップを、必須のプログラムの一部の形態の食品生産設備ＨＡＣＣＰプランの一部とすることができる。一実施の形態において、微生物の陽性結果を有する又は有しないエリアを示すヒートマップを作成することができる。位置ベースのアクセスを利用することによって、（現在と以前の両方の）各テストポイントの履歴を、ヒートマップに表記することができ、実際には、報告、グラフ及びマップを含むデータの任意の表記となる。
【０１１３】
一実施の形態において、システム１００を、分析、成長の追跡及び統合に用いることができる。システム１００を、環境の微生物の存在についてのリアルタイムデータのストリームを収集、報告、分析及び管理し、関心のあるエリアの微生物の成長を追跡するために環境をソフトウェア上でモデリングし、かつ、結果をＨＡＣＣＰプログラム、ＣＡＰＡシステム、環境検証プラン、衛生プラン、現存する研究室管理システム又は企業データベース等に統合する分析プラットホーム／フレームワーク／ソフトウェア環境とすることができる。例えば、ＨＡＣＣＰプログラムは、全てのあり得る危険に対する重大な制御ポイントの環境をモニタリングすることを含む。検査結果を、ＨＡＣＣＰプログラムの順守に要求されるこれらの検査と連携させることができ、それを、実際には、実際に取り出すポイントより少ないポイントとすることができる。例を推進することによって、所定のテストポイントは、陽性結果を有することができるが、これらのテストポイントが重大な制御ポイントとしてＨＡＣＣＰプログラムに含まれない場合、設備は、陽性検査結果を有する間はＨＡＣＣＰプログラムを順守することができる。
【０１１４】
一実施の形態において、設備１１４の配置、工程及びプロトコルタイイン(protocol tie-in)をシステム１００によってマッピングすることができる。
【０１１５】
一実施の形態において、システム１００を、分析、成長の追跡及びリスクのエリアの決定に用いることができる。システム１００を、環境の微生物の存在についてのリアルタイムデータのストリームを収集、報告、分析及び管理するとともに関心のあるエリアのリスク要因を追跡するために環境をソフトウェア上でモデリングする分析プラットホーム／フレームワーク／ソフトウェア環境とすることができる。
【０１１６】
一実施の形態において、システム１００を、種々の目的のために全ての検出したデータを用いるように構成することができる。システム１００を、警報、報告、及び環境の微生物活動の管理に関連した動作の少なくとも一つを可能にする微生物の改変ファージ誘発産物の検出したレベルを報告するのに用いることができる。環境を、システム１００が用いることができる状況と称することができる。
【０１１７】
一実施の形態において、データを、衛生プロトコルを推奨するためにシステム１００によって用いることができ、あり得る当該生成物は、所定の表面において最も有効となる。
【０１１８】
一実施の形態において、ある種のブランディングを行うことができ、又は、生産中に食品安全を監視した購入者（レストラン、スーパーマーケット、フードサービス等）に搬送する食品の箱、大型容器又は包装の外側にシールを配置することができる。
【０１１９】
ブランディングは、食品のソース、例えば、「トレーサビリティ」データ、生産技術、健康情報、材料、有機状態(organic status)、経過情報、調理器具、ロットコード等を含む詳細な製造データを提供するためにスキャンすることができるＱＲコード（登録商標）又は他のメカニズムを有することができる。詳細な製造データを、環境モニタリング結果データに結合することができる。
【０１２０】
一実施の形態において、システム１００を、購入申し込みに基づいてエンドユーザに販売することができる統合されたターンキーサービス(integrated turn-key service)とすることができる。一実施の形態において、食品安全モニタリングのためのターンキーサービスを、大規模な食品サービス会社、販売業者、小売店等におけるような最終消費者又は購入者に毎月の購入申し込みとして販売することができる。システム１００を、微生物、傾向及びリスクの存在を常に監視するために常に動的にすることができる。一実施の形態において、システム１００を、バッチシステムではなくてアラームシステムとすることができる。システム１００を、微生物の事前の検出及びモニタリングを行うように構成することができる。
【０１２１】
個別のユニットとして利用することができる他の微生物検査とは異なり、システム１００を、スワブ、リーダーハードウェア、データ管理及び警報並びに第三者モニタリングを有する完全なシステムして販売することができる。一実施の形態において、価格決定モデルは、所定の数の毎月の検査を有することができる。実施の形態において、全てのモニタリング及び他のサービスを価格決定モデルに含めることができる。システム１００を、食品研究所、クリーニング提供会社(cleaning supply company)又は他の販売会社のような販売業者を通じて販売することができる。一実施の形態において、推定される陽性結果を、培養のために共同研究室に送られる第二のスワブ(secondary swab)を誘発するサービスに組み合わせることができる。
【０１２２】
環境モニタリングプラットホームは、プロセスモニタリング及び洗浄手順、ＨＡＣＣＰプログラム等の評価の両方に対する環境微生物汚染を監視するためにフードチェーン全体に亘って使用することができる。一実施の形態において、環境モニタリングプラットホームを、例えば、食肉、フレッシュカット農産物、シーフード、鶏肉の処理工場で用いることができる。一実施の形態において、環境モニタリングプラットホームを、スーパーマーケット（デリカウンター、魚、インスタント食品製造）のような小売店、レストラン、卸売市場、大規模な食品サービスオペレーター及び販売者、食品製造工場、輸入／輸出機関、米国の食品医薬品局（ＦＤＡ）、農務省（ＵＳＤＡ）及び食品安全検査局（ＦＳＩＳ）のような州政府及び連邦政府の検査サービス、病院、老人ホーム、他の医療の場等で用いることができる。
【０１２３】
一実施の形態において、環境モニタリングプラットホームを、例えば、院内感染が生じうる多様な微生物を監視するために病院、長期介護施設又は民間の医療機関で用いることができる。
【０１２４】
一実施の形態において、環境モニタリングプラットホームを、大学、クルーズ船、幼稚園児及び年配者のケア、競技場、公共公園、レクリエーション用のスポーツ施設若しくはロッカールーム、又は、軍隊の兵舎若しくは軍用艦隊、寄宿舎、サマーキャンプ等のように混雑及び移動(crowding and turnover)が問題となりうるエリアによって用いることができる。
【０１２５】
環境モニタリングプラットホームの市場は、食料部門（製造加工業者、卸売販売業者、小売店）、消費者、小売店チェーン、国際的な食品輸出／輸入、医療機関等を含むことができる。
【０１２６】
環境モニタリングプラットホームによって検出することができる微生物は、大腸菌、リステリア菌、サルモネラ菌、カンピロバクター、特定の大腸菌サブセット（ＳＴＥＣ、ＥＨＥＣ、Ｏ１５７：Ｈ７、Ｏ１１１：Ｈ８、Ｏ１０４：Ｈ２１のようなＯ及びＨ血清型）、ビブリオ属、シゲラ、ブドウ球菌、クロストリジウム属、クリプトスポリジウム属、ブルセラ菌、コリネバクテリウム属、レジオネラ菌、コクシエラ属、プレジオモナス属、エルシニア属、アエロモナス属、又は、他の微生物の存在に対するインジケータと見なされる任意のバクテリアを含む生産環境で制御及び監視される任意の微生物を含むことができる。
【０１２７】
システム１００を、特定腐敗有機体(specific spoilage organisms)（ＳＳＯ）を検出するために用いることもできる。ＳＳＯの存在は、腐敗の傾向があるかもしれない食品の群を識別するのに有用である。これらの群を、更に長い保存可能期間を得るとともに腐敗の進行を遅くするために再処理することができる。
【０１２８】
一実施の形態において、環境モニタリングプラットホームを、ユーザ側のＱＡ又は食品安全局の職員、第三者監査人、感染予防／看護人、清掃係等によって用いることができる。一実施の形態において、環境モニタリングプラットホームを、実用的なデータをユーザ又は他の関連の職員に提供するために微生物を監視するのに用いることができる。
【０１２９】
一度完成品がリーダーによる読出しに従う状態に処理されると、環境モニタリングプラットホームを、図２に示すように完成品検査に用いることができる。一実施の形態において、透過係数を減少させるミセル形成及びコロイドが存在しない場合には、状態を、サンプルの挽き砕き及び密なフィルタによる微粒子の分離後に達成することができる大部分が水溶液とすることができる。一実施の形態において、完成品サンプルの前処理(prep)のための既存／標準の実験方法(lab method)を利用することができる。一実施の形態において、完成品検査養生法(finished product-testing regime)を、完成品の滞留時間を大幅に減少させて保存可能期間を増大することができるようにするために用いることができる。
【０１３０】
本発明の詳細な実施例をここに開示するが、開示した実施の形態は発明の単なる例示であり、本発明を種々の形態で実施できることを理解されたい。したがって、ここに開示する特定の構造及び機能の詳細を、制限するものとして解釈すべきでなく、単に特許請求の範囲の根拠として及び仮想的な任意の適切に詳述した構造において本発明を様々に用いるために当業者に教示する代表の根拠として解釈すべきである。さらに、ここで用いられる用語及び語句は、制限することを意図するのではなく、発明の理解可能な説明を提供することを意図するものである。
【０１３１】
ここで用いられる用語「一つ」("a" or "an")を、一つ又は一つより多いものとして規定する。ここで用いられる用語「他の」を、少なくとも第２の又はそれより多いものとして規定する。ここで用いられる用語「含む」及び／又は「有する」を備える（すなわち、開放移行(open transition)）として規定する。ここで用いられる用語「結合」又は「操作的に結合」を接続として規定するが、直接的又は機械的である必要はない。
【０１３２】
ここで説明する方法及び装置を、コンピュータソフトウェア、プログラムコード及び／又は命令をプロセッサ上で実行するマシンを通じて部分的に又は全体的に展開することができる。プロセッサを、サーバ、クラウドサーバ、クライアント、ネットワークインフラ、モバイルコンピューティングプラットホーム、固定コンピューティングプラットホーム(stationary computing platform)又は他のコンピューティングプラットホームの一部とすることができる。プロセッサを、プログラム命令、コード、２値命令等を実行することができる任意の種類の演算又は処理装置とすることができる。プロセッサは、信号プロセッサ、デジタルプロセッサ、組み込みプロセッサ、マイクロプロセッサ又は格納したプログラムコード又はプログラム命令の実行を直接的又は間接的に容易にするコプロセッサ（算術コプロセッサ、図形コプロセッサ、通信コプロセッサ等）等のような任意の変形となり又は含むことができる。さらに、プロセッサによって、複数のプログラム、スレッド及びコードの実行を可能にする。スレッドを、プロセッサの性能を向上させるとともにアプリケーションの同時処理を容易にするために同時に実行することができる。実現の手段として、ここで説明するメソッド、プログラムコード、プログラム命令等を、一つ以上のスレッドで実現することができる。スレッドは、関連する割り当てられた優先度を有することができる他のスレッドを生じることができ、プロセッサは、優先度に基づいて又はプログラムコードに設けられた命令に基づく他の任意のオーダーに基づいてこれらのスレッドを実行することができる。プロセッサは、ここ及び他の場所で説明するようなメソッド、コード、命令及びプログラムを格納するメモリを有することができる。プロセッサは、ここ及び他の場所で説明するようなメソッド、コード及び命令を格納することができるインタフェースを介して記憶媒体にアクセスすることができる。演算若しくは処理装置によって実行されることができるメソッド、プログラム、コード、プログラム命令、又は、他のタイプの命令を格納するためのプロセッサに関連した記憶媒体は、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、メモリ、ハードディスク、フラッシュドライバ、ＲＡＭ、ＲＯＭ、キャッシュ等の一つ以上とすることができるがそれに限定されない。
【０１３３】
プロセッサは、マルチプロセッサの速度及び性能を向上させることができる一つ以上のコアを有することができる。実施の形態において、プロセスを、二つ以上の独立したコア（ダイと称する）を組み合わせるデュアルコアプロセッサ、クアドコアプロセッサ、他のチップレベルマルチプロセッサ等とすることができる。
【０１３４】
ここで説明する方法及びシステムを、サーバ、クライアント、ファイアウォール、ゲートウェイ、ハブ、ルーター又は他のそのようなコンピュータ及び／又はネットワークハードウェア上でコンピュータソフトウェアを実行するマシンを通じて部分的に又は全体的に展開することができる。ソフトウェアプログラムを、ファイルサーバ、プリントサーバ、ドメインサーバ、インターネットサーバ、イントラネットサーバ、及び、セカンダリサーバ、ホストサーバ、分配サーバ等のような他の変形を有することができるサーバに関連させることができる。サーバは、メモリ、プロセッサ、コンピュータ可読媒体、記憶媒体、ポート（物理的及び仮想的）、通信装置、及び、他のサーバ、クライアント、マシン及び装置に有線又は無線媒体を通じてアクセスすることができるインタフェース、等々の一つ以上を有することができる。ここ及び他の場所で説明するようなメソッド、プログラム又はコードを、サーバによって実行することができる。さらに、本明細書で説明するようにメソッドを実行するのに必要な他の装置を、サーバに関連したインフラの一部と見なすことができる。
【０１３５】
サーバは、クライアント、他のサーバ、プリンタ、データベースサーバ、ファイルサーバ、通信サーバ、分散サーバ、ソーシャルネットワーク等を含むがそれに限定されない他の装置に対するインタフェースを提供することができる。さらに、この結合及び／又は接続によって、ネットワークを通じたプログラムの遠隔実行を容易にする。これらの装置の一部又は全てのネットワークの構築によって、本発明の範囲を逸脱することなく一つ以上の位置でのプログラム又はメソッドの並列処理を容易にする。さらに、インタフェースを介してサーバに取付けられた装置のいずれかは、メソッド、プログラム、コード及び／又は命令を格納することができる少なくとも一つの記憶媒体を有することができる。セントラルリポジトリは、異なる装置で実行されるプログラム命令を提供することができる。この実現において、リモートリポジトリは、プログラムコード、命令及びプログラムの記憶媒体としての役割を果たすことができる。
【０１３６】
ソフトウェアプログラムを、ファイルクライアント、印刷クライアント、ドメインクライアント、インターネットクライアント、イントラネットクライアント、及び、セカンダリクライアント、ホストクライアント、分散クライアント等の他の変形を含むことができるクライアントに関連させることができる。クライアントは、メモリ、プロセッサ、コンピュータ可読媒体、記憶媒体、ポート（物理的及び仮想的）、通信装置、及び、他のサーバ、クライアント、マシン及び装置に有線又は無線媒体を通じてアクセスすることができるインタフェース、等々の一つ以上を有することができる。ここ及び他の場所で説明するようなメソッド、プログラム又はコードを、クライアントによって実行することができる。さらに、本明細書で説明するようにメソッドを実行するのに必要な他の装置を、クライアントに関連したインフラの一部と見なすことができる。
【０１３７】
クライアントは、サーバ、クラウドサーバ、他のクライアント、プリンタ、データベースサーバ、印刷サーバ、ファイルサーバ、通信サーバ、分散サーバ、ソーシャルネットワーク等を含むがそれに限定されない他の装置に対するインタフェースを提供することができる。さらに、この結合及び／又は接続によって、ネットワークを通じたプログラムの遠隔実行を容易にする。これらの装置の一部又は全てのネットワークの構築によって、本発明の範囲を逸脱することなく一つ以上の位置でのプログラム又はメソッドの並列処理を容易にする。さらに、インタフェースを介してクライアントに取付けられた装置のいずれかは、メソッド、プログラム、コード及び／又は命令を格納することができる少なくとも一つの記憶媒体を有することができる。セントラルリポジトリは、異なる装置で実行されるプログラム命令を提供することができる。この実現において、リモートリポジトリは、プログラムコード、命令及びプログラムの記憶媒体としての役割を果たすことができる。
【０１３８】
ここで説明する方法及びシステムを、ネットワークインフラを通じて部分的に又は全体的に展開することができる。ネットワークインフラは、演算装置、サーバ、クラウドサーバ、ルーター、ハブ、ファイアウォール、クライアント、パーソナルコンピュータ、通信装置、ルーティング装置、並びに、従来既知の能動及び受動装置、モジュール及び／又はコンポーネントのような構成要素を有することができる。ネットワークインフラに関連した（一つ以上の）演算及び／又は非演算装置は、他のコンポーネントは別として、フラッシュメモリ、バッファ、スタック、ＲＡＭ、ＲＯＭ等のような記憶媒体を有することができる。ここ及び他の場所で説明するプロセス、メソッド及び命令を、ネットワークインフラ構成要素の一つ以上によって実行することができる。
【０１３９】
ここ及び他の場所で説明するプロセス、メソッド及び命令を、複数のセルを有するセルラーネットワーク上で実現することができる。セルラーネットワークを、周波数分割多元接続（ＦＤＭＡ）ネットワーク又は符号分割多元接続ネットワーク（ＣＤＭＡ）ネットワークとすることができる。セルラーネットワークは、モバイル機器、セルサイト、基地局、リピーター、アンテナ、塔等を有することができる。セルラーネットワークを、ＧＳＭ（登録商標），ＧＰＲＳ、３Ｇ、ＥＶＤＯ、メッシュ又は他のネットワークタイプとすることができる。
【０１４０】
ここ及び他の場所で説明するプロセス、メソッド及び命令を、モバイル機器上で又はモバイル機器を介して実現することができる。モバイル機器は、ナビゲーション装置、携帯電話、携帯無線電話、モバイル携帯端末、ラップトップコンピュータ、パルムトップコンピュータ、ネットブック、ページャ、電子ブックリーダー、音楽プレーヤー等を含むことができる。これらの装置は、他のコンポーネントは別として、フラッシュメモリ、バッファ、スタック、ＲＡＭ、ＲＯＭ及び一つ以上の演算装置のような記憶媒体を有することができる。モバイル機器に関連した演算装置によって、格納したプログラムコード、メソッド及び命令を実行させることができる。代わりに、モバイル機器を、他の装置と共同して命令を実行するように構成することができる。モバイル機器は、サーバに適合するとともにプログラムコードを実行するように構成した基地局と通信を行うことができる。モバイル機器は、ピアツーピアネットワーク、メッシュネットワーク又は他の通信ネットワーク上で通信を行うことができる。プログラムコードを、サーバに関連させるとともにサーバに内蔵された演算装置によって実行される記憶媒体に格納する。基地局は、演算装置及び記憶媒体を有することができる。記憶装置は、基地局に関連した演算装置によって実行されるプログラムコード及び命令を格納することができる。
【０１４１】
コンピュータソフトウェア、プログラムコード及び／又は命令を、所定の時間中に演算のために用いられるデジタルデータを保持するコンピュータ部品、装置及び読出し媒体、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）として知られている半導体記憶装置、光ディスクのような又はハードディスク、テープ、ドラム、カード及び他のタイプのような磁気記憶の形態のような典型的には更に多くの永久記憶媒体のための大容量記憶装置、プロセッサレジスタ、キャッシュメモリ、揮発性メモリ、不揮発性メモリ、ＣＤ及びＤＶＤのような光記憶媒体、フラッシュメモリ（例えば、ＵＳＢスティック又はキー）、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、紙テープ、パンチカード、スタンドアロンＲＡＳＭディスク、ジップドライバ、取り外し可能な大容量記憶装置、オフライン等のような取り外し可能媒体、ダイナミックメモリ、スタティックメモリ、読出し／書込み記憶装置、可変記憶装置、読出し専用、ランダムアクセス、順次アクセス、ロケーションアドレス指定可能、ファイルアドレス指定可能、コンテンツアドレス指定可能、ネットワーク接続ストレージ、ストレージエリアネットワーク、バーコード、磁気インク等のような他のコンピュータメモリを含むことができるマシン可読媒体に格納及び／又は当該マシン可読媒体上でアクセスすることができる。
【０１４２】
ここで説明する方法及びシステムは、物理的及び／又は無形(intangible)アイテムをある状態から他の状態に変換することができる。ここで説明する方法及びシステムは、物理的及び／又は無形(intangible)アイテムを表すデータをある状態から他の状態に変換することができる。
【０１４３】
図面を通じてフローチャート及びブロック図に含まれるここで説明及び表現する構成要素は、構成要素間の論理的な境界(logical boundaries)を暗示する(imply)。しかしながら、ソフトウェア又はハードウェア工学の実務によれば、表現した構成要素及びその機能を、モノリシックソフトウェア構造として、スタンドアロンソフトウェアモジュールとして、又は、ルーチン、コード、サービス等若しくはその任意の組合せを用いるモジュールとして格納したプログラム命令を実行することができるプロセッサを有するマシン上でコンピュータ実行可能媒体を通じて実現することができ、全てのそのような実現を、この開示の範囲内とすることができる。そのようなマシンの例は、携帯端末、ラップトップコンピュータ、パーソナルコンピュータ、携帯電話、他の携帯演算装置、医療機器、有線又は無線通信装置、トランスデューサー、チップ、計算機、衛星、タブレットＰＣ、電子ブック、ガジェット、電子装置、人工知能を有する装置、演算装置、ネットワーク装置、サーバ、ルーター等を含むことができるが、それに限定されない。さらに、フローチャート及びブロック図に表現した構成要素又は他の任意の論理コンポーネントを、プログラム命令を実行することができるマシン上で実現することができる。したがって、上述した図面及び記載は、開示したシステムの機能態様を説明したが、これらの機能態様を実現するソフトウェアの特定の配置を、明記されている場合を除いて又は文脈から明らかである場合を除いてこれらの記載から推測すべきである。同様に、当然のことながら、特定及び上述した種々のステップを変更することができ、ステップの順序を、ここで開示した技術の特定の用途に適合させることができる。全てのそのような変更及び変形は、この開示の範囲内に含めることを意図する。したがって、種々のステップの順序の表現及び／又は記載を、特定の用途によって要求されている場合を除いて、明記されている場合を除いて又は文脈から明らかである場合を除いて、これらのステップの実行の特定の順序を要求するものであると理解すべきでない。
【０１４４】
上述した方法及び／又はプロセス並びのそのステップを、特定の用途に適切なハードウェア、ソフトウェア又はハードウェア及びソフトウェアの任意の組合せにおいて実現することができる。ハードウェアは、汎用コンピュータ、及び／又は、専用演算装置、特定演算装置又は特定演算装置の特定の態様若しくはコンポーネントを含むことができる。プロセスを、内部及び／又は外部メモリとともに一つ以上のマイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、内蔵マイクロコントローラ、プログラマブルデジタル信号プロセッサ又は他のプログラマブル装置で実現することができる。プロセスを、特定用途向け集積回路、プログラマブルゲートアレイ、プログラマブルアレイ論理、又は電子信号を処理するように構成することができる他の任意の装置又は装置の組合せにおいても又はそれにおいて代わりに実行することができる。当然のことながら、プロセッサの一つ以上を、マシン可読媒体上で実行することができるコンピュータ実行可能コードとして実現することができる。
【０１４５】
コンピュータ実行可能コードを、Ｃのような構造化プログラミング言語、Ｃ＋＋のようなオブジェクト指向プログラミング言語、又は、上記装置の一つ並びにプロセッサの異種組合せ、プロセッサアーキテクチャ、異なるハードウェア及びソフトウェアの組合せ、若しくはプログラム命令を実行することができる他の任意のマシンで実行するために格納、コンパイル又は解釈することができる（アセンブリ言語、ハードウェア記述言語、並びにデータベースプログラミング言語及び技術を含む）他の任意のハイレベル又はローレベルプログラミング言語を用いて作成することができる。
【０１４６】
したがって、一態様において、ここで説明する各方法及びその組合せを、一つ以上の演算装置上で実行するときにそのステップを実行するコンピュータ実行可能コードで実施することができる。他の態様において、方法を、そのステップを実行するシステムで実施することができ、複数の方法で装置に分配することができ、又は、機能の全てを、専用のスタンドアロン装置又は他のハードウェアに統合することができる。他の態様において、上述したプロセスに関連したステップを実行する手段は、上述したハードウェア及び／又はソフトウェアのいずれかを有することができる。そのような全ての順列及び組合せは、この開示の範囲内に含めることを意図する。
【０１４７】
この開示の方法及びシステムで用いられる診断検査は、サンプルに他の生物因子を導入した結果として富化することなく生成した生物因子を検出することを備えることができる。一部の実施の形態において、導入及び検出を、単一の製造設備内で行うことができる。一部の実施の形態において、導入及び検出を、単一の製造シフト内で行うことができる。一部の実施の形態において、導入及び検出を、単一の製造シフト内において一の製造設備内で行うことができる。
【０１４８】
富化なく生成した生物因子を検出することの一例は、組み換えファージの組み換えゲノムによってコーディングされるルシフェラーゼである。サンプルに導入される他の生物因子の例は、ルシフェラーゼタンパク質をコーディングする組み換えファージゲノムを備える組み換えファージである。
【０１４９】
したがって、この開示の方法及びシステムで用いられる診断検査は、ａ）標的微生物によって汚染された疑いがあるサンプルを提供することと、ｂ）標的微生物に影響を及ぼすことができる組み換えファージにサンプルを接触させることであって、組み換えファージは、組み換えファージが標的微生物に感染するときに表現されるマーカーをコーディングする異種核酸配列を備えることと、ｃ）標的微生物がサンプル中に存在する場合にマーカーの生成に適切な条件下でファージ接触サンプルを維持することと、ｄ）サンプル中のマーカーの存在を分析することと、を備えることができる。
【０１５０】
一部の実施の形態において、標的微生物が少なくとも約５分間、少なくとも約１０分間、少なくとも約２０分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約４０分間、少なくとも約５０分間、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間又は少なくとも約６時間サンプル中に存在する場合にマーカーの生成に適切な条件下でファージ接触サンプルを維持する。
【０１５１】
一部の実施の形態において、マーカーの存在は、サンプルが組み換えファージに接触した後に約１０分内、約２０分内、約３０分内、約４０分内、約５０分内、約１時間内、約１．５時間内、約２時間内、約２．５時間内、約３時間内、約４時間内、約５時間内又は約６時間内にファージ接触サンプルを検査することである。したがって、一部の実施の形態において、分析は、サンプルを収集した後に約２０分内、約３０分内、約４０分内、約５０分内、約１時間内、約１．５時間内、約２時間内、約２．５時間内、約３時間内、約４時間内、約５時間内又は約６時間内に分析を完了する。
【０１５２】
一部の実施の形態において、分析は、サンプル中に存在し得る標的微生物の任意のセルを富化することを備えない。したがって、そのような実施の形態において、標的微生物によって汚染された疑いがある環境サンプルを収集し、標的微生物に感染することができる組み換えファージを富化する前にサンプルに接触させ、組み換えファージは、組み換えファージが標的微生物に感染するときに表現されるマーカーをコーディングする異種核酸配列を備える。
【０１５３】
一般的に言えば、方法及びシステムで用いられる組み換えファージは、マーカーをコーディングする異種核酸配列を備える。一部の実施の形態において、マーカーをコーディングする異種核酸配列を、組み換えファージゲノムにおいて、ファージゲノムに対しても異種である少なくとも一つの調節酵素に操作的に結合する。一部の実施の形態において、標的細菌のマーカーをコーディングする異種核酸配列の発現を、ファージゲノムに対して異種である調節酵素によって専ら制御する。
【０１５４】
一部の実施の形態において、マーカーをコーディングする異種核酸配列を、組み換えファージゲノムにおいて、ファージゲノムに対して内因性である少なくとも一つの調節酵素に操作的に結合する。換言すれば、マーカーをコーディングする異種核酸配列を、マーカーをコーディングする異種核酸配列が配置された開始ファージゲノム内の位置に基づいて内因性調節酵素に操作的に結合する。一部の実施の形態において、標的細菌のマーカーをコーディングする異種核酸配列の発現を、ファージゲノムに対して内因性である調節酵素によって専ら制御する。一部の実施の形態において、標的細菌のマーカーをコーディングする異種核酸配列の発現を、ファージゲノムに対して内因性である調節酵素によって部分的に制御し、かつ、ファージゲノムに対して異種である調節酵素によって部分的に制御する。
【０１５５】
一部の実施の形態において、マーカーをコーディングする異種核酸配列を備える組み換えファージは、マーカーをコーディングする二つ以上の異種核酸配列を備える。一部の実施の形態において、組み換えファージは、マーカーをコーディングする同一の異種核酸配列の複数の複製を備える（すなわち、複製は同一のマーカーをコーディングする。）。一部の実施の形態において、組み換えファージは、マーカーをコーディングする二つ以上のタイプの核酸配列の複製を備える（すなわち、少なくとも二つの複製は異なるマーカーをコーディングする。）。一部の実施の形態において、二つ以上の複製は、組み換えファージゲノム内の隣接する位置に配置される。他の実施の形態において、二つ以上の複製の少なくとも一つ（から全てに至るまで）は、組み換えファージゲノム内の隣接しない位置に配置される。
【０１５６】
一部の実施の形態において、異種核酸配列の長さは、少なくとも１００ベース、少なくとも２００ベース、少なくとも３００ベース、少なくとも４００ベース、少なくとも５００ベース、少なくとも６００ベース、少なくとも７００ベース、少なくとも８００ベース、少なくとも９００ベース、少なくとも１．０キロベース（ｋｂ）、少なくとも１．１ｋｂ、少なくとも１．２ｋｂ、少なくとも１．３ｋｂ、少なくとも１．４ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも１．６ｋｂ、少なくとも１．７ｋｂ、少なくとも１．８ｋｂ、少なくとも１．９ｋｂ、少なくとも２．０ｋｂ、少なくとも２．１ｋｂ、少なくとも２．２ｋｂ、少なくとも２．３ｋｂ、少なくとも２．４ｋｂ、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも２．６ｋｂ、少なくとも２．７ｋｂ、少なくとも２．８ｋｂ、少なくとも２．９ｋｂ、少なくとも３．０ｋｂ、少なくとも３．１ｋｂ、少なくとも３．２ｋｂ、少なくとも３．３ｋｂ、少なくとも３．４ｋｂ、少なくとも３．５ｋｂ、少なくとも３．６ｋｂ、少なくとも３．７ｋｂ、少なくとも３．８ｋｂ、少なくとも３．９ｋｂ、少なくとも４．０ｋｂ、少なくとも４．５ｋｂ、少なくとも５．０ｋｂ、少なくとも５．５ｋｂ、少なくとも６．０ｋｂ、少なくとも６．５ｋｂ、少なくとも７．０ｋｂ、少なくとも７．５ｋｂ、少なくとも８．０ｋｂ、少なくとも８．５ｋｂ、少なくとも９．０ｋｂ、少なくとも９．５ｋｂ、少なくとも１０．０ｋｂ又はそれより上である。一部の実施の形態において、異種核酸配列の長さは、５００ベース以下、１．０ｋｂ以下、１．５ｋｂ以下、２．０ｋｂ以下、２．５ｋｂ以下、３．０ｋｂ以下、３．５ｋｂ以下、４．０ｋｂ以下、４．５ｋｂ以下、５．０ｋｂ以下、５．５ｋｂ以下、６．０ｋｂ以下、６．５ｋｂ以下、７．０ｋｂ以下、７．５ｋｂ以下、８．０ｋｂ以下、８．５ｋｂ以下、９．０ｋｂ以下、９．５ｋｂ以下又は１０．０ｋｂ以下である。一部のそのような実施の形態において、異種核酸配列の長さは、ファージゲノムによってコーディングされたファージ粒子にパッケージングすることができるとともにファージゲノムを備える異種核酸配列の最大長未満の長さを備える。
【０１５７】
一部の実施の形態において、異種核酸配列の長さは、１００〜５００ベース、２００〜１０００ベース、５００〜１０００ベース、５００〜１５００ベース、１〜２ｋｂ、１．５〜２．５ｋｂ、２．０〜３．０ｋｂ、２．５〜３．５ｋｂ、３．０〜４．０ｋｂ、３．５〜４．５ｋｂ、４．０〜５．０ｋｂ、４．５〜５．５ｋｂ、５．０〜６．０ｋｂ、５．５〜６．５ｋｂ、６．０〜７．０ｋｂ、６．５〜７．５ｋｂ、７．０〜８．０ｋｂ、７．５〜８．５ｋｂ、８．０〜９．０ｋｂ、８．５〜９．５ｋｂ又は９．０〜１０．０ｋｂである。
【０１５８】
一部の実施の形態において、組み換えファージのゲノムの全長に対する異種核酸配列の長さの比は、少なくとも０．０５、少なくとも０．１０、少なくとも０．１５、少なくとも０．２０又は少なくとも０．２５である。一部の実施の形態において、対応する開始ファージのゲノムの長さに対する組み換えファージのゲノムの長さの比は、少なくとも１．０５、少なくとも１．１０、少なくとも１．１５、少なくとも１．２０又は少なくとも１．２５である。
【０１５９】
一部の実施の形態において、異種核酸配列は、内因性開始ファージゲノム配列の損失なく開始ファージゲノムに挿入される。一部の実施の形態において、挿入された異種核酸配列は、内因性開始ファージゲノム配列を置換する。一部のそのような実施の形態において、異種核酸配列は、異種核酸配列の長さ未満である内因性ゲノム配列の量を置換する。したがって、そのような実施の形態において、組み換えファージゲノムの長さは、開始ファージゲノムの長さより長くなる。一部のそのような実施の形態において、異種核酸配列は、異種核酸配列の長さより長い内因性ゲノム配列の量を置換する。したがって、そのような実施の形態において、組み換えファージゲノムの長さは、開始ファージゲノムの長さより短くなる。一部のそのような実施の形態において、異種核酸配列は、異種核酸配列の長さに等しい内因性ゲノム配列の量を置換する。
【０１６０】
一部の実施の形態において、異種オープンリーディングフレームによってコーディングされるタンパク質又はポリペプチドは、ファージ宿主細胞に存在するプロテアーゼによる切断を減少させるように修飾される。例えば、演算アルゴリズムを、既知のプロテアーゼ切断場所を識別するために用いることができ、オープンリーディングフレームの配列を、これらの場所を除去するために同類置換を用いて修飾することができる。代わりに、定方向突然変異誘発を、ファージ宿主細胞又はファージ宿主細胞の培地(culture)に存在する少なくとも一つのプロテアーゼに対して増大した耐性を有する生成物をコーディングするためにオープンリーディングフレーム配列を展開するのに用いる。
【０１６１】
ここで用いるように、「マーカー」は、選択可能及び／又はスクリーニング可能なマーカーを含む。ここで用いるように、「選択可能なマーカー」は、マーカーを発現させない同様な細胞の成長を抑止又は刺激する化学物質の存在下又は不存在下で成長する能力をマーカーを処理する細胞において授けるマーカーである。そのような細胞は、選択可能マーカーの発現による「選択可能な表現型」を有するともいえる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）は、遺伝子を保有し及び発現させる細胞のアンピシリンの存在下で成長する能力を授ける（Sutcliffe, J.G., Proc Natl Acad Sci U S A. 1978 August; 75(8): 3737-3741参照）。他の制限されない例は、クロラムフェニコール、カナマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性を授ける遺伝子を含む。他のマーカーは、上記ウラシル、トリプトファン及びロイシンのそれぞれの不存在下で成長することができるＵＲＡ３、ＴＲＰ及びＬＥＵを含む。
【０１６２】
ここで用いられるように、「スクリーニング可能なマーカー」は、マーカーを発現させる細胞を識別する基準として用いることができる検出可能なラベルである。そのような細胞は、スクリーニング可能なマーカーの発現による「スクリーニング可能な表現型」を有するともいえる（一般的に、選択可能なマーカーの遺伝子産物を、マーカーを発現させる細胞に選択可能性を授けるために遺伝子産物の機能と関係なくマーカーを発現させる細胞を識別する基準として用いることができる限りにおいて、選択可能なマーカーは、スクリーニング可能なマーカーとして機能することもできる。）。組み換えファージによって特異的に検出及びコーディングすることができる任意の分子は、スクリーニング可能なマーカーとしての機能を果たすことができる。スクリーニング可能なマーカーを、一本又は二本鎖のＲＮＡ又はＤＮＡ分子のような核酸分子又はその一部とすることができる。代わりに、スクリーニング可能なマーカーを、タンパク質又はその一部とすることができる。適切なタンパク質マーカーは、検出可能な反応生成物の形成に触媒作用を及ぼす酵素を含む。一例は、発光酵素又はその変異、ｌｕｘＡＢ及びβ−ガラクトシターゼのような化学発光タンパク質である。他の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素である。発光信号を生成するために用いられるタンパク質は、二つの広義のカテゴリー：光を直接生成するタンパク質（ルシフェラーゼ及び関連のタンパク質）及び化学作用によるカスケード反応(chemical cascade)の一部として間接的に光を生成するのに用いられるタンパク質（西洋ワサビペルオキシダーゼ）に分類される。生物学的研究に用いられるもっとも一般的な発光タンパク質は、エクオリン及びルシフェラーゼである。前者のタンパク質は、オワンクラゲから得られ、溶媒中のカルシウム濃度を決定するために用いることができる。タンパク質のルシフェラーゼ群は、広範囲の実験目的に適合された。蛍及びウミシイタケからのルシフェラーゼは、生物学的研究で最も一般的に用いられる。これらのタンパク質は、遺伝子学的には、タンパク質が密接に共局在化されている(closely co-localized)ときにのみ光を生成する二つの個別の機能ドメインに分類される。これらのタンパク質の両方の様々な発光スペクトルシフト突然変異誘導体(emission spectrum-shifted mutant derivatives)は、過去１０年に亘って生成された。これらは、生細胞内の多色画像化及び共局在化のために用いられた。化学発光信号を生成するために用いられるタンパク質の他の群は、ペルオキダーゼ及びホスファターゼである。ペルオキダーゼは、光を生成する反応においてルミノーを酸化する過酸化物を生成する。これらのうちの最も広く用いられているものは、ウエスタンブロット法及びＥＬＩＳＡにおいて検出のために広く用いられた西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である。同様に用いられたタンパク質の第２の群は、基質分子からリン酸塩を除去し、基質分子を不安定化(destabilizing)させ、かつ、カスケード反応を開始させて発光を行うアルカリホスファターゼである。
【０１６３】
他の適切なスクリーニング可能なマーカーは、蛍光タンパク質である。蛍光タンパク質は、青色／紫外蛍光タンパク質（例えば、ＴａｇＢＦＰ、Ａｚｕｒｉｔｅ、ＥＢＦＰ２、ｍＫａｌａｍａｌ、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びＴ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン色蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ａ，ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ及びｍＴＦＰ１）、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ及びｍＷａｓａｂｉ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２及びＴａｇＹＦＰ）、橙色蛍光タンパク質（例えば、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ２）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＡｐｐｌｅ及びｍＲｕｂｂｙ）、遠赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ及びＮｉｒＦＰ）、近赤外蛍光タンパク質（例えば、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４及びｉＲＦＰ）、ロングストークスシフトタンパク質（例えば、ｍＫｅｉｍａ  Ｒｅｄ、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅｌ及びＬＳＳ−ｍＫａｔｅ２）、光活性化蛍光タンパク質（例えば、ＰＡ−ＧＦＰ、ＰＡｍＣｈｅｒｒｙ１及びＰＡＴＴａｇＲＦＰ）、光変換蛍光タンパク質（例えば、Ｋａｅｄｅ（緑色）、Ｋａｅｄｅ（赤色）、ＫｉｋＧＲ１（緑色）、ＫｉｋＧＲ１（赤色）、ＰＳ−ＣＦＰ２、ＰＳ−ＣＦＰ２、ｍＥｏｓ２（緑色）、ｍＥｏｓ２（赤色）、ＰＳｍＯｒａｎｇｅ及びＰＳｍＯｒａｎｇｅ）、及び光変換蛍光タンパク質（例えば、Ｄｒｏｎｐａ）を含むが、それに限定されない。上記例の変形及び変更も当業者に周知であり、適切な用途において置換することができる。
【０１６４】
他の適切なマーカーは、エピトープを含む。例えば、抗体又は他の結合分子を用いて検出することができるエピトープを含むタンパク質は、スクリーニング可能なマーカーの一例である。エピトープを識別する抗体を、（例えば、化学発光又は蛍光タンパク質の共有結合によって）信号生成部分に直接結合することができ、又は、それを、二次抗体のような少なくとも一つの追加の結合試薬(binding reagent)を用いて検出し、例えば、信号生成部分に直接結合することができる。一部の実施の形態において、エピトープは、ファージ又は微生物のタンパク質に存在せず、サンプル中のエピトープの検出は、エピトープを含むタンパク質をコーディングする遺伝子を含む改変ファージによる感染後に微生物によってエピトープを含むタンパク質が生成されたことを示す。他の実施の形態において、マーカーを、標的微生物又はファージに本来存在するタンパク質に関連する浄化タグ(purification tag)とすることができる。例えば、タグ（例えば、６−Ｈｉｓタグ）を、異種タンパク質を他の細菌又はファージタンパク質から浄化するために用いることができ、その後、浄化されたタンパク質を、例えば、抗体を用いて検出することができる。
【０１６５】
一部の実施の形態において、標的微生物を、任意のタイプの古細菌及び／又は細菌とする。一部の実施の形態において、微生物を、（「病原菌」と称することができる）病原微生物とする。一部の実施の形態において、古細菌をユリアーキオータ門とする。一部の実施の形態において、古細菌をクレンアーキオータ門とする。一部の実施の形態において、細菌を、放射菌門、アクウィフェクス門、アルマティモナス門、バクテロデス門、カルディセリクム門、クラミジア門、緑色非硫黄細菌門、クリシオゲネス門、シアノバクテリア門、デフェリバクター門、デイノコックス・テルムス門、ディクチオグロムス門、エルシミクロビウム門、フィブロバクター門、フィルミクテス門、フソバクテリウム門、ジェマティモナス門(Gemmatimonadetes)、ニトロスピラ門、プランクトミケス門、プロテオバクテリア門、スピロヘータ門、シネルギステス門、テネリクテス門、サーモデスルフォバクテリア門及びテルモトガ門から選択した門の一つとする。一部の実施の形態において、細菌を、バシラス属、リステリア属及びスタフィロコッカス属から選択した少なくとも一つのフィルミクテス門とする。一部の実施の形態において、細菌を、アシドバクテリウム属(Acidobacillus)、アエロモナス属、ブルクホルデリア属、ナイセリア属、シュワネラ属、サイトロバクター属、エントロバクター属、エルウイニア属、大腸菌属、クレブシエラ属、クライベラ属、モーガネラ属、サルモネラ属、赤痢菌属、エルシニア属、コクシエラ属、リケッチア属、レジオネラ属、アビバクテリウム属(Avibacterium)、ヘモフィラス属、パスツレラ属、アシネトバクター属、モラクセラ属、シュードモナス属、ビブリオ属及びザントモナス属から選択した少なくとも一つのプロテオバクテリア門とする。一部の実施の形態において、細菌を、マイコプラズマ属、スピロプラズマ属及びウレアプラズマ属から選択した少なくとも一つのテネリクテス門とする。
【０１６６】
ここに開示したシステム及び方法を用いて検出される一般的な細菌汚染は、サルモネラ菌、（微生物大腸菌、大腸Ｏ１５７：Ｈ７、大腸菌を生成する志賀毒素、大腸菌Ｏ２６、大腸菌Ｏ１１１、大腸菌Ｏ１０３、大腸菌Ｏ１２１、大腸菌Ｏ４５及び大腸菌Ｏ１４５を含むがそれに限定されない）大腸菌、（シトロバクター属、エンテロバクター属、ハフニア族、クレブシエラ属及びセラシア属を含むがそれに限定されない）コリフォーム細菌、シゲラ、（リステリア・モノサイトゲネスを含む）リステリア菌、（ボツリヌス菌及びウェルシュ菌を含む）クロストリジウム、（コレラ菌及びビブリオ・バルニフィカスを含む）ビブリオ属、腸内細菌、（黄色ブドウ球菌及び皮膚常在菌を含む）ブドウ球菌、（セレウス菌を含む）バシラス属、（カンピロバクター・ジェジュニを含む）カンピロバクター菌、シュードモナス菌、連鎖球菌、アシネトバクター属、クレブシエラ属、カンピロバクター菌及びエルシニア属を含むがそれに限定されない。
【０１６７】
実施例
実施例１：環境をモニタリングするシステム
１３個のテストサイトを食品製造設備のフロアプランで識別する。テストポイントは、ヒストリカルホットスポットを含む。マークされたフロアプランを、ｐｎｇファイルに変換し、フロアプラン内のテストサイトを識別及び追跡するソフトウェアにインポートする。識別されたテストポイントは、冷凍室（排水管１）、冷凍室（排水管２）、冷凍室（排水管３）、冷凍室（排水管４）冷蔵室（排水管５）、冷凍室（排水管６）、冷凍室（排水管７）、冷凍室（スケール）、冷蔵室（ブートウォッシュ(boot wash)排水管）、冷凍室（廃液受け(drip pan)１）、冷凍室（廃液受け２）、冷凍室（フォークトラック）、及び冷凍室（ドア付近の排水管）である。テストポイントを、週に一度の検査のために三つのグループに分割する。
【０１６８】
この食品製造設備のヒストリカル検査データを、ＭＳ（登録商標）のＥｘｅｌファイルで提供する。データは、二つの部分、すなわち、日付順のデータ及びテストポイント（Ｔａｂ１）と、メタデータを有するテストポイントのリスト（Ｔａｂ２）とに分けられる。このデータは、テストポイント及びそのデータを自動的にアップロードすることができる単一のスプレッドシート（ｃｓｖ）に再フォーマットされる。
【０１６９】
この場合、業務ルールが、サンプリングスケジュールを作成するために用いられる。以下の業務ルールが用いられる。１）サンプルが常に火曜日に週に一度取り出される。２）サンプルは１０個一組で収集される。３）サンプルは、毎週３グループのうちの２グループの間で等しい分布を有する。４）各テストポイントを、１ヶ月に少なくとも一度検査する。５）ある程度のランダム性を保証するためにスケジュールを１ヶ月に１回再検討する。これらの業務ルールは、サンプリングスケジュールを作成するために用いられる。サンプリングスケジュールは印刷され、作業者がサンプルを収集及び検査するために食品製造設備の回りを歩く際に運ばれる。収集を午前１０時に開始して、結果を同日の午後までに所有するようにし、あらゆる必要な修正を同日に実現できるようにする。
【０１７０】
サンプルは、添付書類Ａ（例えば、添付書類Ａの実施例２参照）に記載したファージベースの大腸菌検査方法を用いて大腸菌の存在を検査するために処理される。各サイトの検査結果を、サンプル収集後１時間までに取得する。
【０１７１】
検査結果は、修正計画を生成するために用いられる。修正のために業務ルールは、１）推定される陽性検査結果の各々に対して修正を生成すること、２）修正は、洗浄、検査及び再検査を備えること、３）修正活動は、日付、時間及び所有者とともに記録され、マネージャによって閲覧されること、及び４）陰性結果を取得するまで検査結果は修正プロセスを終了させないことである。同日の結果によって、同一シフト内の改善活動を終了させることができる。これは、製造のコントロールを有した状態で全てのリソース及び職員に対するアクセスを有するためには重大である。
【０１７２】
前月の結果の報告を、食品製造設備の経営陣と共有するために生成する。ある報告は、テストサイトによって分類された検査結果を示す。別の報告は、日付によって分類されるとともに毎日の陽性検査結果の数及び陰性検査結果の数を提供した設備全体の検査結果を示す。
【０１７３】
発明を、図示し及び詳細に説明した好適な実施の形態に関連して開示したが、その種々の変更及び改善は、当業者は見てすぐに分かるであろう。したがって、本発明の精神及び範囲は、上述した例によって限定されるものではなく、法律によって許可される最も広い意味において理解すべきである。
【０１７４】
ここで参照した全ての文献を、参照によりここに組み込む。
【０１７５】
添付書類Ａ：組み換えファージ方法
この添付書類は、この出願の開示の方法、システム及び他の態様を実施する際に任意に用いることができる（特に）方法及び試薬を提供する。
【０１７６】
序論
モデルファージは、異種タンパク質産物を細菌性細胞に配送する分子生物学技術を用いて改変される。例えば、ファージは、細胞外基質を消化するとともに生体膜を破壊するために酵素を生体膜に運ぶように改変された（例えば、米国特許出願公開第２００９／０１５５２１５号明細書）。ファージは、ファージによって感染される疑いがある特定のタイプの細菌性細胞の存在を検出するために視覚化できるタンパク質産物を発現させるよう改変された（例えば、"Construction of Luciferase Reporter Bacteriophage A511 ::luxAB for Rapid and Sensitive Detection of Viable Listeria Cells," M. J. Loessner et. al, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 62, No. 4, pp. 1133-40 (1996)）。しかしながら、今まで改変されたファージの自然宿主域(natural host range)は制限があり、これらのファージは、多くの関連の細菌及び生体膜に感染しない。
【０１７７】
ますます増える宿主域を有する追加のファージを改変する方法は、ファージ改変技術の使用の拡大に寄与する。ファージゲノム及び改変ファージゲノムのバリエーションを作り出すハイスループット方法も、診断及び治療のために有益である多様な特性を有するファージの識別に寄与する。しかしながら、今まで、そのような方法は一般的に不足しており、したがって、ファージを改変する追加の方法は、有益である。
【０１７８】
多様なファージを改変することは、ファージゲノムの特性により一般的には更に困難となる。例えば、ファージゲノムは、比較的少ない制限酵素認識部位を有し、大きく修飾され、従来のクローニング技術をファージとともに利用することは困難(challenging)である。ファージは、非コードＤＮＡがほとんどないコンパクトなゲノムも有し、これによって、従来の改変に適合するゲノム内に部位を見つけるのが困難となる。
【０１７９】
ファージＤＮＡをクローニングする一つのアプローチは、ファージＤＮＡを分離すること、ＤＮＡを制限酵素によって切断すること及び生存可能ファージ(viable phase)に組み替えるためにＤＮＡを宿主に戻すことに依存する。第２のアプローチは、プラスミドのファージゲノムの一部をクローニングし、異種配列に改変し、かつ、当該異種配列を関連の宿主株に変換することである。これらの細胞は、野生型ファージに感染し、ファージと異種配列との間の同種組み換えを可能にする。組み換えファージのスクリーニングは、改変ファージを明らかにする。これらの技術は、隔離状態(isolated instances)において成功した（例えば、"Construction of Luciferase Reporter Bacteriophage A51 l ::luxAB for Rapid and Sensitive Detection of Viable Listeria Cells," M. J. Loessner et. al, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 62, No. 4, pp. 1133-40 (1996)）。しかしながら、任意の改変ファージを検査することができる前にプロセスを完了する必要がある。特定のファージ内の任意の新しい挿入部位に対して全体のプロセスを始めから終わりまで繰り返す必要がある。部位が生存可能でない場合、プロセス全体を次の挿入部位に対して繰り返す必要がある。
【０１８０】
発明者は、ファージゲノム全体をクローニングする変換に関連した組み換え技術を用いることによってファージＤＮＡをクローニングするとともに遺伝子組み換えファージを作成する更に有益な方法を開発しようとした。この技術は、N., Larionov, V., Oct. 2006. TAR cloning: insights into gene function, long-range haplotypes and genome structure and evolution 7 (10), 805-812に記載されている。ラムダファージを用いた実験において、全てのラムダゲノムの８３％より大きい割合が確認された。この結果により、プロセスは多くの使用に不適切であると思われた。
【０１８１】
発明者は、それゆえに驚いたことにファージゲノムが酵母細胞において致死的(lethal)でなく、したがって、ファージを適切なベクターにクローニングするとともに酵母において繁殖させることができることを発見した。発明者は、ファージゲノムを含む組み換えベクターを成長させるためにこの発見を利用した。一部の実施の形態において、ファージゲノムを、異種核酸配列、例えば、オープンリーディングフレームを備える配列を含むように改変する。ベクターは、遺伝子組み換えファージを作成するのに有用である。ファージゲノムをクローニングする方法も提供する。組み換えファージゲノムを作成する方法も提供する。一部の実施の形態において、ファージゲノムを、異種核酸配列、例えば、オープンリーディングフレームを備える配列を含むよう改変する。組み換えファージゲノム及び組み換えファージも提供する。一部の実施の形態において、方法は、複数の組み換えファージゲノム又は組み換えファージを作成する方法のようなハイスループット方法である。組み換えファージゲノム又は組み換えファージの収集も提供する。開示のこれら及び他の態様を、ここで更に十分に説明する。
【０１８２】
概要
一態様において、この開示は、ファージゲノムを含む組み換えベクターを提供する。組み換えベクターの一部の実施の形態において、ファージゲノムを、ファージゲノムを、一本鎖のＤＮＡ、二本鎖のＤＮＡ及びＲＮＡから選択した形態でファージ粒子にパッケージする。組み換えベクターの一部の実施の形態において、ファージをバクテリオファージとする。一部の実施の形態において、ベクターを酵母人工染色体（ＹＡＣ）とする。
【０１８３】
組み換えベクターの一部の実施の形態において、ファージゲノムは、異種核酸配列を含む。一部の実施の形態において、異種核酸配列は、３．１キロベースを含む。一部の実施の形態において、異種核酸配列は、オープンリーディングフレームを備える。一部の実施の形態において、オープンリーディングフレームは、選択可能な表現型及びスクリーニング可能な表現型から選択したベクターを含むベクター宿主細胞の少なくとも一つの表現型を授けるマーカーをコーディングする。一部の実施の形態において、オープンリーディングフレームは、選択可能な表現型及びスクリーニング可能な表現型から選択したファージゲノムを含むベクター宿主細胞の少なくとも一つの表現型を授けるマーカーをコーディングする。一部の実施の形態において、異種核酸配列は、第２のオープンリーディングフレームを含む。一部の実施の形態において、オープンリーディングフレームを、ベクター宿主細胞とファージ宿主細胞の少なくとも一方においてオープンリーディングフレームの発現を管理することができる発現制御配列に操作的に結合する。一部の実施の形態において、発現制御配列は、ファージゲノムに対して内因性である。一部の実施の形態において、発現制御配列は、異種核酸配列内に配置される。
【０１８４】
組み換えベクターの一部の実施の形態において、ベクターを、プラスミド、コスミド及び人工染色体から選択する。一部の実施の形態において、人工染色体を、ＢＡＣ又はＹＡＣとする。
【０１８５】
組み換えベクターの一部の実施の形態において、開始ファージゲノムの配列は既知である。組み換えベクターの一部の実施の形態において、開始ファージゲノムの配列は未知である。
【０１８６】
他の態様において、ベクターの一つを含むベクター宿主細胞を提供する。一部の実施の形態において、ベクター宿主細胞は、細菌細胞又は古細菌細胞である。一部の実施の形態において、ベクター宿主細胞は、真核細胞である。一部の実施の形態において、ベクター宿主細胞は、酵母細胞である。
【０１８７】
他の態様において、ベクターの一つに存在する組み換えファージゲノムを含むファージを提供する。
【０１８８】
他の態様において、ファージゲノムをクローニングする方法を提供する。一部の実施の形態において、方法は、開始ファージゲノムを含む組み換えベクターを設けることと、組み換えベクターをベクター宿主細胞で繁殖させることと、を備える。一部の実施の形態において、ベクター宿主細胞は、ファージ宿主細胞ではない。方法の一部の実施の形態において、開始ファージゲノムをベクターに挿入できるという条件の下で、分離した開始ファージゲノム及びベクターを複数のファージベクター宿主細胞に同時形質転換する(co-transforming)ことと、開始ファージゲノムのベクターへの挿入の結果としての組み換えベクターを含むベクター宿主細胞を選択することと、を備える方法によって、開始ファージゲノムを含む組み換えベクターを作成する。方法の一部の実施の形態において、開始ファージゲノムをベクターに挿入できるという条件の下で、分離した開始ファージゲノムを、ベクターを含む複数のファージベクター宿主細胞に形質転換することと、開始ファージゲノムのベクターへの挿入の結果としての組み換えベクターを含むファージベクター宿主細胞を選択することと、を備える方法によって、開始ファージゲノムを含む組み換えベクターを作成する。一部の実施の形態において、方法は、ファージゲノムをベクターから除去することを更に備える。方法の一部の実施の形態において、ファージゲノムを含む組み換えベクターをコンピテントファージ宿主細胞(competent phage host cells)に形質転換することと、ファージゲノムを含むファージ粒子の製造に十分な条件の下でファージ宿主細胞を培養することと、を備える方法によって、ファージゲノムをベクターから除去する。
【０１８９】
他の態様において、組み換えファージゲノムを作成する方法を提供する。一部の実施の形態において、方法は、開始ファージゲノムを含む組み換えベクターを設けることと、組み換えファージゲノムを提供するために異種核酸配列を開始ファージゲノムに挿入することと、異種核酸配列を備える組み換えファージゲノムを含む組み換えベクターをベクター宿主細胞で繁殖させることと、を備える。一部の実施の形態において、ベクター宿主細胞は、ファージ宿主細胞ではない。方法の一部の実施の形態において、開始ファージゲノムをベクターに挿入できるという条件の下で、分離した開始ファージゲノム及びベクターを複数のファージベクター宿主細胞に同時形質転換することと、開始ファージゲノムのベクターへの挿入の結果としての組み換えベクターを含むベクター宿主細胞を選択することと、を備える方法によって、開始ファージゲノムを含む組み換えベクターを作成する。方法の一部の実施の形態において、開始ファージゲノムをベクターに挿入できるという条件の下で、分離した開始ファージゲノムを、ベクターを含む複数のファージベクター宿主細胞に形質転換することと、開始ファージゲノムのベクターへの挿入の結果としての組み換えベクターを含むファージベクター宿主細胞を選択することと、を備える方法によって、開始ファージゲノムを含む組み換えベクターを作成する。
【０１９０】
組み換えファージゲノムを作成する他の方法も提供する。一部の実施の形態において、方法は、開始ファージゲノムを設けることと、組み換えファージゲノムを提供するために異種核酸配列を開始ファージゲノムに挿入することと、異種核酸配列を備える組み換えファージゲノムを含む組み換えベクターを提供するためにベクターにおいて組み換えファージゲノムを取得することと、異種核酸配列を備える組み換えファージゲノムを含む組み換えベクターをベクター宿主細胞で繁殖させることであって、ベクター宿主細胞は、ファージ宿主細胞ではないことと、を備える。方法の一部の実施の形態において、異種核酸配列を備える組み換えファージゲノムを、ベクターにおいて取得する前に選択する。方法の一部の実施の形態において、組み換えファージゲノムを分離することと、開始ファージゲノムをベクターに挿入できるという条件の下で、分離した組み換えファージゲノム及びベクターを、複数のベクター宿主細胞に同時形質転換することと、組み換えファージゲノムのベクターへの挿入の結果としての組み換えベクターを含むベクター宿主細胞を選択することと、を備える方法によって、組み換えファージゲノムをベクターにおいて取得する。方法の一部の実施の形態において、組み換えファージゲノムを分離することと、開始ファージゲノムをベクターに挿入できるという条件の下で、分離した組み換えファージゲノムを、ベクターを含む複数の宿主細胞に形質転換することと、組み換えファージゲノムのベクターへの挿入の結果としての組み換えベクターを含むベクター宿主細胞を選択することと、を備える方法によって、組み換えファージゲノムを、ベクターにおいて取得する。一部の実施の形態において、方法は、組み換えベクターを選択したベクター宿主細胞から分離することを更に備える。
【０１９１】
組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、異種核酸配列を、非配列特異プロセス(non-sequence specific process)によって開始ファージゲノムに挿入する。方法の一部の実施の形態において、異種核酸配列を、配列特異プロセス(sequence specific process)によって開始ファージゲノムに挿入する。方法の一部の実施の形態において、異種核酸配列を、開始ファージゲノムの遺伝子内領域に挿入する。組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、異種核酸配列を、予め決定された位置で開始ファージゲノムに挿入する。組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、異種核酸配列を、体内でファージゲノムに挿入する。組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、異種核酸配列を、体外でファージゲノムに挿入する。
【０１９２】
組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、方法は、ファージゲノムをベクターから除去することを更に備える。組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、組み換えベクターをコンピテントファージ宿主細胞に形質転換することと、形質転換したファージ宿主細胞からファージゲノムを含むファージ粒子を生じる組み換えファージゲノムを選択することと、を備える方法によって、ファージゲノムをベクターから除去する。
【０１９３】
組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、異種核酸配列は、３．１キロベースを備える。組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、異種核酸配列は、オープンリーディングフレームを備える。一部の実施の形態において、オープンリーディングフレームは、選択可能な表現型及びスクリーニング可能な表現型から選択した少なくとも一つの表現型をベクターを含むベクター宿主細胞に授けるマーカーをコーディングする。一部の実施の形態において、オープンリーディングフレームは、選択可能な表現型及びスクリーニング可能な表現型から選択した少なくとも一つの表現型をファージゲノムを含むファージ宿主細胞に授けるマーカーをコーディングする。組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、異種核酸配列は、第２のオープンリーディングフレームを備える。組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、オープンリーディングフレームを、ベクター宿主細胞とファージ宿主細胞の少なくとも一方においてオープンリーディングフレームの発現を管理することができる発現制御シーケンスに操作的に結合する。一部の実施の形態において、発現制御シーケンスは、ファージゲノムに対して内因性である。一部の実施の形態において、発現制御シーケンスは、異種核酸配列内に配置される。
【０１９４】
組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、ベクターを、プラスミド、コスミド及び人工染色体から選択する。一部の実施の形態において、人工染色体を、ＢＡＣ又はＹＡＣとする。
【０１９５】
組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、開始ファージゲノムの配列は既知である。組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、開始ファージゲノムの配列は未知である。
【０１９６】
組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、開始ファージゲノムは、ファージ宿主細胞に感染することができないファージをコーディングする。組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、開始ファージゲノムは、ファージ宿主細胞に感染することができるファージをコーディングする。
【０１９７】
組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、方法は、異種核酸配列の少なくとも一部を第２の異種核酸配列と交換することを更に備える。
【０１９８】
他の態様において、組み換えファージゲノムを作成する方法の一つによって作成された組み換えファージゲノムを提供する。
【０１９９】
他の態様において、複数の組み換えファージゲノムを作成する方法を提供する。一部の実施の形態において、方法は、各々が開始ファージゲノムを含む複数の組み換えベクターを設けることと、複数の組み換えベクターを提供するために少なくとも一つの異種核酸配列を複数のベクターの各々の開始ファージゲノムに挿入することと、複数の組み換えベクターをベクター宿主細胞において繁殖させることであって、ベクター宿主細胞はファージ宿主細胞でないことと、を備える。方法の一部の実施の形態において、複数の組み換えベクターを設けるために少なくとも一つの開始ファージゲノムを少なくとも一つのベクターに挿入することができるという条件で、少なくとも一つの分離されたファージゲノム及び少なくとも一つのベクターを複数のファージベクター宿主細胞に同時形質転換することと、少なくとも一つの開始ファージゲノムの少なくとも一つのベクターへの挿入の結果として複数の組み換えベクターを含むファージベクター宿主セルを選択することと、を備える方法によって、各々が開始ファージゲノムを含む複数の組み換えベクターを作成する。方法の一部の実施の形態において、複数の組み換えベクターを設けるために少なくとも一つの開始ファージゲノムを少なくとも一つのベクターに挿入することができるという条件で、少なくとも一つの分離されたファージゲノムを複数のベクター宿主細胞に形質転換することと、少なくとも一つの開始ファージゲノムの少なくとも一つのベクターへの挿入の結果として複数の組み換えベクターを含むベクター宿主セルを選択することと、を備える方法によって、各々が開始ファージゲノムを含む複数の組み換えベクターを作成する。
【０２００】
他の態様において、複数の組み換えファージゲノムを作成する他の方法を提供する。一部の実施の形態において、方法は、少なくとも一つの開始ファージゲノムを設けることと、複数の組み換えファージゲノムを設けるために少なくとも一つの異種核酸配列を少なくとも一つの開始ファージゲノムの各々に挿入することと、異種核酸配列を含む複数の組み換えファージゲノムを含む複数の組み換えベクトルを設けるために少なくとも一つのベクターにおいて複数の組み換えファージゲノムを取得することと、少なくとも一つの異種核酸配列を備える組み換えファージゲノムを含む複数の組み換えベクターをベクター宿主細胞において繁殖させることであって、ベクター宿主細胞は、ファージ宿主細胞でないことと、を備える。一部の実施の形態において、少なくとも一つの異種核酸配列を含む複数の組み換えファージゲノムを、ベクターにおいて取得する前に選択する。方法の一部の実施の形態において、複数の組み換えファージゲノムを分離することと、複数の組み換えベクターを設けるために複数の組み換えファージゲノムを少なくとも一つのベクターに挿入することができるという条件で、分離した複数の組み換えファージゲノム及び少なくとも一つのベクターを複数のベクター宿主細胞に同時形質転換することと、少なくとも一つの組み換えファージゲノムをベクターに挿入した結果として組み換えベクターを含む複数のベクター宿主細胞を選択する方法によって、複数の組み換えファージゲノムを少なくとも一つのベクターにおいて取得する。方法の一部の実施の形態において、複数の組み換えファージゲノムを分離することと、複数の組み換えベクターを設けるために複数の組合せファージゲノムを少なくとも一つのベクターに挿入することができるという条件で、分離した複数の組合せファージゲノムをそれぞれが少なくとも一つのベクターを含む複数のベクター宿主細胞に形質転換することと、複数の組み換えファージゲノムのベクターへの挿入の結果として組み換えベクターを含む複数のベクター宿主細胞を選択することと、を備える方法によって、複数の組み換えファージゲノムをベクターにおいて取得することができる。一部の実施の形態において、方法は、複数の組み換えベクターを選択したベクター宿主細胞から分離することを更に備える。
【０２０１】
複数の組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、複数の組み換えベクターは、複数の異なる異種核酸配列を備える。一部の実施の形態において、少なくとも５個の異なる異種核酸配列が、複数の組み換えベクターに存在する。一部の実施の形態において、少なくとも５０個の異なる異種核酸配列が、複数の組み換えベクターに存在する。一部の実施の形態において、少なくとも５００個の異なる異種核酸配列が、複数の組み換えベクターに存在する。
【０２０２】
複数の組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、複数の組み換えベクターは、少なくとも２タイプの組み換えファージゲノムを含み、異種核酸配列は、異なる位置で挿入される。一部の実施の形態において、複数の組み換えベクターは、少なくとも５タイプの組み換えファージゲノムを含み、異種核酸配列は、異なる位置で挿入される。一部の実施の形態において、複数の組み換えベクターは、少なくとも５０タイプの組み換えファージゲノムを含み、異種核酸配列は、異なる位置で挿入される。一部の実施の形態において、複数の組み換えベクターは、少なくとも５００タイプの組み換えファージゲノムを含み、異種核酸配列は、異なる位置で挿入される。
【０２０３】
複数の組み換えファージゲノムを作成する方法の一部の実施の形態において、方法は、異種核酸配列の少なくとも一部を、第２の異種核酸配列を有する複数のベクターの各々に配置することを更に備え、第２の異種核酸配列は、第１の異種核酸配列の挿入、欠失(deletion)及び置換の少なくとも一つを備え、これによって、各々が異なる異種核酸配列を含む複数の異なるベクターを提供する。一部の実施の形態において、少なくとも５個の異なる第２の異種核酸配列が複数の組み換えベクターに存在する。一部の実施の形態において、少なくとも５０個の異なる第２の異種核酸配列が複数の組み換えベクターに存在する。一部の実施の形態において、少なくとも５００個の異なる第２の異種核酸配列が複数の組み換えベクターに存在する。
【０２０４】
他の態様において、組み換えファージゲノムの収集を提供する。一部の実施の形態において、収集中の組み換えゲノムは、少なくとも一つの開始ファージゲノムと、少なくとも一つの異種挿入配列と、開始ゲノムの少なくとも一つの異種挿入配列の挿入の少なくとも一つの部位と、を備える。一部の実施の形態において、収集中の組み換えゲノムは、少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，５００又は１０００の異なるタイプの開始ファージゲノムを含む。一部の実施の形態において、収集中の組み換えゲノムは、少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，５００又は１０００の異なるタイプの異種挿入配列を含む。一部の実施の形態において、収集中の組み換えゲノムは、少なくとも一つの開始ゲノムの少なくとも一つの異種挿入配列の挿入の少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，５００又は１０００の異なる部位を備える。
【０２０５】
組み換えファージゲノムの収集中の一部の実施の形態において、開始ファージゲノムの配列は未知である。組み換えファージゲノムの収集中の一部の実施の形態において、開始ファージゲノムの配列は既知である。
【０２０６】
組み換えファージゲノムの収集の一つを備える組み換えファージの収集を更に提供する。
【０２０７】
組み換えファージゲノム及び組み換えファージの収集の一部の実施の形態において、少なくとも一つの異種核酸配列は、オープンリーディングフレームを備える。
【０２０８】
組み換えファージゲノムを含むベクターを含むベクター宿主細胞の収集も提供する。
【０２０９】
他の態様において、少なくとも一つの標的細胞タイプを備える少なくとも一つの標的細胞集団にオープンリーディングフレームを発現させる方法を提供する。一部の実施の形態において、方法は、少なくとも一つの標的細胞タイプに感染する少なくとも一つのファージを組み換えファージの収集から選択することを備える。一部の実施の形態において、方法は、ファージによる少なくとも一つの標的細胞タイプの感染に十分な条件の下で少なくとも一つの標的細胞タイプを少なくとも一つのファージに提供することと、少なくとも一つの標的細胞タイプでの少なくとも一つのオープンリーディングフレームの発現に十分な条件の下で少なくとも一つの細胞タイプを培養することと、を備える。方法の一部の実施の形態において、少なくとも一つのオープンリーディングフレームは、選択可能な表現型及びスクリーニング可能な表現型から選択した少なくとも一つの表現型を標的細胞タイプに授けるマーカーをコーディングする。方法の一部の実施の形態において、少なくとも一つのオープンリーディングフレームは、少なくとも一つの標的細胞タイプに対して致死性又は条件的致死性であるタンパク質をコーディングする。
【０２１０】
詳細な説明
ここで規定されない限り、この開示に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。さらに、文脈から要求されない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含む。一般的に、ここで説明する生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸化学並びに混成に関連して用いられる命名及びその技術は、当業者に周知であるとともに一般的に用いられるものである。所定の文献及びここで引用する他の文書は、参照によりここに明示的に組み込む。さらに、ここに引用する全てのＵｎｉＰｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔの記録(record)を、参照によりここに組み込む。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書は統制を行う。材料、方法及び例は、説明のためだけのものであり、制限することを意図するものではない。
【０２１１】
別段の指示がない限り、この開示の方法及び技術は、一般的には、当技術分野で周知であるとともに本明細書の全体を通じて引用及び議論される種々の一般的及び更に特殊な文献に記載されているような従来の方法に従って実行される。例えば、Clokie et al, Bacteriophages: Methods and Protocols, Vols. 1 and 2 (Methods in Molecular Biology, Vols. 501 and 502), Humana Press, New York, N.Y. (2009); Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001); Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990); Taylor and Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ. Press (2003); Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corp., Freehold, N.J.; Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol I, CRC Press (1976); Handbook of Biochemistry: Section A Proteins, Vol II, CRC Press (1976); Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)参照。
【０２１２】
この開示は、インターネットにおいて刊行される所定のタンパク質及び遺伝子配列の配列データベースの登録（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ／ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ又はＧＥＮＢＡＮＫの記録）並びにインターネット上の他の情報を言及する。当業者は、配列データベースの登録を含むインターネット上の情報が時々更新され、例えば、特定の配列を言及するために用いられる連続番号が変わることがあることを理解する。配列情報の公開データベース又はインターネット上の他の情報を参照する場合、そのような変更が生じることがあり得るとともにインターネット上の情報の特定の実施態様が現れたり消えたりすることがあり得ることを理解すべきである。当業者はインターネット上で探索を行うことによって相当する情報を見つけることができるので、インターネットウェブページアドレス又は配列データベースの登録は、当該情報を利用できること及び公に普及することを証明する。
【０２１３】
本願のベクター、ゲノム、細胞、ファージ、組成、方法及び他の実施の形態を開示及び説明する前に、ここで用いる専門用語は特定の実施の形態を説明するためのものであり、制限するためのものでないことを理解すべきである。明細書及び添付した特許請求の範囲で用いられるような単一の形態(singular forms "a", "an" and "the")は、文脈が明らかに指示しない限り複数の指示対象を含む。
【０２１４】
ここで用いるような用語「備える」(comprising)は、「含む」(including)又は「包含する」(containing)と同義語であり、包括的及び変更可能であり、他の列挙しない部材、素子又は方法ステップを除外しない。
【０２１５】
ここで用いられるように、用語「体外」(in vitro)は、生命体（例えば、動物、植物又は微生物）内ではなく人工的な環境、例えば、試験管若しくは反応槽、細胞培養、ペトリ皿等で生じる事象を言及する。
【０２１６】
ここで用いられるように、用語「体内」(in vivo)は、生命体（例えば、動物、植物又は微生物）内で生じる事象を言及する。
【０２１７】
ここで用いられるように、用語「分離した」(isolated)は、（１）（自然においてか実験的設定においてかに関係なく）最初に作り出したときに関連した成分の少なくとも一部から切り離された、及び／又は、（２）人の手によって生産、作成及び／又は製造した物質又は実体物を言及する。分離した物質及び／又は実体物を、最初に関連した他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％又はそれより多くから切り離すことができる。一部の実施の形態において、分離した化学物質は、約８０％を超える純粋、約８５％が純粋、約９０％が純粋、約９１％が純粋、約９２％が純粋、約９３％が純粋、約９４％が純粋、約９５％が純粋、約９６％が純粋、約９７％が純粋、約９８％が純粋、約９９％が純粋又は約９９％より高く純粋である。ここで用いられるように、物質は、他の成分がほとんどない場合には「純粋」である。
【０２１８】
ここで用いられるような用語「ペプチド」は、短いポリペプチド、例えば、約５０未満アミノ酸、更に典型的には約３０未満アミノ酸を典型的には包含するものを言及する。ここで用いられるような用語は、構造的したがって生物学的な機能を模倣する(mimic)類似物及び模倣物(mimetics)を含む。
【０２１９】
用語「ポリペプチド」は、自然発生のタンパク質と自然発生でないタンパク質の両方と、その断片、突然変異体、派生物及び類似物と、を含む。ポリペプチドを、単量体又は重合体とすることができる。さらに、ポリペプチドは、各々が一つ以上の個別の活動を有する複数の異なる領域を備えることができる。誤解を避けるために、「ポリペプチド」は、２アミノ酸より大きい長さとすることができる。
【０２２０】
用語「分離したタンパク質」又は「分離したポリペプチド」は、導出の源又はソースが（１）自然状態で伴う自然に関連した成分に関連しない、（２）自然界で見つけられない純度で存在し、純度を、他の細胞物質の存在に関連して調整することができる（例えば、同一の種からの他のタンパク質を含まない）、（３）異なる種からの細胞によって発現される、又は（４）自然発生しない（例えば、自然界で見つけられるポリペプチドの断片であり、又は、自然界で見つけられないアミノ酸類似物若しくは派生物又は普通のペプチド結合以外の結合を含む）ことに起因するタンパク質又はポリペプチドである。したがって、自然発生の細胞とは異なる細胞系で化学的に合成又は合成されたポリペプチドは、自然に関連した成分から「分離される」。ポリペプチド又はタンパク質により、当技術分野で周知のタンパク質精製技術を用いて分離することによって自然に関連した成分をほとんどなくすこともできる。このように規定したように、「分離した」は、そのように説明したタンパク質、ポリペプチド、ペプチド又はオリゴペプチドが合成された細胞から物理的に除去されたことを必ずしも必要とするわけではない。
【０２２１】
ここで用いられるような用語「ペプチド断片」は、欠失、例えば、自然発生したタンパク質のような完全長ポリペプチドに対するアミノ末端及び／又はカルボキ末端欠失を有するポリペプチドを言及する。一実施の形態において、ポリペプチド断片は、断片のアミノ酸配列が自然発生の配列の対応する位置と同一である連続した配列である。断片は、典型的には、少なくとも５，６，７，８，９若しくは１０アミノ酸長、少なくとも１２，１４，１６若しくは１８アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも２５，３０，３５，４０又は４５アミノ酸長、少なくとも５０若しくは６０アミノ酸長、又は、少なくとも７０アミノ酸長である。
【０２２２】
用語「融合タンパク質」は、異種アミノ酸配列に結合したポリペプチド又は断片を備えるポリペプチドを言及する。二つ以上の異なるタンパク質からなることができる二つ以上の所望の構成要素を含むように融合タンパク質を構成することができるので、融合タンパク質は有益である。融合タンパク質は、関心のあるポリペプチドからの連続する少なくとも１０アミノ酸、少なくとも２０若しくは３０アミノ酸、少なくとも４０，５０若しくは６０アミノ酸、又は少なくとも７５，１００又は１２５アミノ酸を備える。融合タンパク質内に含まれる異種ペプチドは、通常、少なくとも６アミノ酸長であり、少なくとも８アミノ酸長であり、又は少なくとも１５，２０若しくは２５アミノ酸長である。ＩｇＧ  Ｆｃ領域のような更に大きなポリペプチドを含み、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような全体のタンパク質さえも含む融合は、特殊な効用を有する。異なるタンパク質又はペプチドをコーディングする核酸配列を有するフレームにおいてポリペプチド又はその断片をコーディングする核酸配列を構成するとともに融合タンパク質を発現させることにより、融合タンパク質を、組み換え技術によって作成することができる。代わりに、ポリペプチド又はその断片を他のタンパク質に架橋することによって、融合タンパク質を化学的に作成することができる。
【０２２３】
ここで用いられているように、タンパク質をコーディングする核酸配列が第２のタンパク質をコーディングする核酸配列と同様な配列を有する場合、タンパク質は、「相同関係」を有し、すなわち、第２のタンパク質と「相同」である。代わりに、二つのタンパク質が同様なアミノ酸配列を有する場合には、タンパク質は、第２のタンパク質と相同である（したがって、用語「相同タンパク質」は、二つのタンパク質が同様なアミノ酸配列を有することを意味するものとして規定される。）。ここで用いられているように、（特に予測される構造的な類似に対する）アミノ酸配列の二つの領域間の相同は、機能の類似性を示すものとして解釈される。
【０２２４】
「相同」をタンパク質又はペプチドと関連して用いるとき、同一でない残基位置はしばしば保存的アミノ酸置換によって異なることが認識される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸が同様な化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を持つ側鎖（例えば、Ｒ基）を有する他のアミノ酸によって置換されたものである。一般的に、保存性アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性をほとんど変更しない。二つ以上のアミノ酸配列が保存性置換によって互いに異なる場合、割合配列同一性(percent sequence identity)又は相同の程度を、置換の保存的な性質を補正するために上げるように調整することができる。この調整を行う手段は、当業者に周知である。例えば、Pearson, 1994, Methods Mol. Biol. 24:307-31 and 25:365-89参照。
【０２２５】
以下の六つの基はそれぞれ、他に対する保存的置換であるアミノ酸を包含する。１）セリン、トレオニン、２）アスパラギン酸、グルタミン酸、３）アスパラギン、グルタミン、４）アルギニン、リジン、５）イソロイシン、ロイシン、メチオニン、アラニン、バリン、及び６）フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン。
【０２２６】
割合配列同一性とも称されるポリペプチドの配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを用いて測定される。例えば、the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group (GCG), University of Wisconsin Biotechnology Center, 910 University Avenue, Madison, Wis. 53705参照。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む種々の置換、欠失及び他の修飾に割り当てられた相同の測定を用いる同様な配列に整合する。例えば、ＧＣＧは、有機体の異なる種からの相同ポリペプチドのような互いに関連したポリペプチドの間又は野生型タンパク質とその突然変異タンパク質との間の配列相同又は配列同一性を決定するためのデフォルトパラメータとともに用いることができる「Ｇａｐ」及び「Ｂｅｓｔｆｉｔ」のようなプログラムを含む。例えば、GCG Version 6.1参照。
【０２２７】
特定のポリペプチド配列を異なる有機体からの多数の配列を含むデータベースと比較するときの例示的なアルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴ (Altschul et al, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish and States, Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden et al, Meth. Enzymol. 266:131-141 (1996); Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); Zhang and Madden, Genome Res. 7:649-656 (1997))、特に、ｂｌａｓｔｐ又はｔｂｌａｓｔｎ (Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))である。
【０２２８】
ＢＬＡＳＴｐの例示的なパラメータは、期待値(Expectation value)：１０（デフォルト）、フィルタ：セグメント(seg)（デフォルト）、ギャップをオープンにするためのコスト(Cost to open a gap)：１１（デフォルト）、ギャップを広げるためのコスト(Cost to extend a gap)：１（デフォルト）、最大アライメント(Max.alignments)：１００（デフォルト）。ワードサイズ(Word size)：１１（デフォルト）、記述の番号(No. of descriptions)：１００（デフォルト）及びペナルティ行列(Penalty Matrix)：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。相同に対して比較されるポリペプチド配列の長さは、一般的には、少なくとも約１６アミノ酸残基、少なくとも約２０アミノ酸残基、少なくとも約２４アミノ酸残基、少なくとも約２８アミノ酸残基又は約３５を超えるアミノ酸残基となる。多数の異なる有機体からの配列を含むデータベースを探索するとき、アミノ酸配列を比較するのが有益となり得る。アミノ酸配列を用いるデータベース検索を、従来既知のｂｌａｓｔｐ以外のアルゴリズムによって評価することができる。例えば、ポリペプチド配列を、ＦＡＳＴＡ又はＧＶＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１のプログラムを用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリーと検索配列との間の最適な重なりの領域のアライメント及び割合配列同一性(percent sequence identity)を提供する。Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)。例えば、アミノ酸配列間の割合配列同一性を、参照によりここに組み込むＧＣＧ  Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１において提供されるようにデフォルトパラメータ（２のワードサイズ及びＰＡＭ２５０スコア行列(PAM250 scoring matrix)）を有するＦＡＳＴＡを用いて決定することができる。
【０２２９】
一部の実施の形態において、高分子（例えば、ポリペプチド配列又は核酸配列）は、これらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％同一である場合には互いに「相同」であると見なされる。一部の実施の形態において、高分子は、これらの配列が少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％類似である場合には互いに「相同」であると見なされる。用語「相同」は、必然的に少なくとも二つの配列（ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列）の間の比較を言及する。一部の実施の形態において、二つのヌクレオチド配列は、それがコーディングするポリペプチドが少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも一つのストレッチ(stretch)に対して少なくとも約５０％同一、少なくとも約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一又は少なくとも約９０％同一である場合には相同であると見なされる。一部の実施の形態において、相同ヌクレオチド配列は、少なくとも４〜５の独自に特定したアミノ酸のストレッチをコーディングする能力によって特徴づけられる。互いに関連するこれらのアミノ酸の同一性と近接した間隔の両方を、相同であると見なされたヌクレオチド配列に対して考察する必要がある。６０ヌクレオチド未満の長さであるヌクレオチド配列の一部の実施の形態において、相同を、少なくとも４〜５の独自に特定したアミノ酸のストレッチをコーディングする能力によって決定する。一部の実施の形態において、二つのタンパク質配列は、タンパク質が少なくとも約２０アミノ酸の少なくとも一つのストレッチ(stretch)に対して少なくとも約５０％同一、少なくとも約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一又は少なくとも約９０％同一である場合には相同であると見なされる。
【０２３０】
ここで用いられるように、「修飾誘導体(modified derivative)」は、主要構造配列において基準ポリペプチドと実質的に相同であるポリペプチド又はその断片を言及するが、例えば、体内若しくは体外の化学的及び生化学的修飾(chemical and biochemical modifications)を含み又は基準ポリペプチドで見つけられないアミノ酸を組み込む。そのような修飾は、例えば、当業者によって容易に理解できるように、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、グリコシル化、ユビキチン化、例えば放射性核種での標識化、及び種々の酵素修飾を含む。ポリペプチドを標識化する種々の方法及びそのために有益な種々の置換基又は標識は、従来周知であり、１２５Ｉ，３２Ｐ，３５Ｓ及び３Ｈのような放射性同位体、標識化された抗リガンド（例えば、抗体）に結合するリガンド、フルオフォア、化学発光剤、酵素、及び、標識化されたリガンドに対する特定の結合対要素(specific binding pair member)としての役割を果たすことができる抗リガンドを含む。標識の選択は、要求される感度、プライマーとの結合の容易さ、安定性の要求及び利用できる器具類に依存する。ポリペプチドを標識化する方法は、従来周知である。例えば、Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992, and Supplements to 2002)参照。
【０２３１】
ここで用いられるように、「突然変異ポリペプチド(polypeptide mutant)」又は「突然変異タンパク質」は、配列が天然又は野生型タンパク質のような基準タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列に対する一つ以上のアミノ酸の挿入、複製、欠失、再配置又は置換を含むポリペプチドを言及する。突然変異タンパク質は、ある点の単一のアミノ酸が他のアミノ酸に変更される一つ以上のアミノ酸点置換、一つ以上のアミノ酸が基準タンパク質の配列においてそれぞれ挿入又は欠失される一つ以上の挿入及び／又は欠失、及び／又は、アミノ端末とカルボキシ端末のいずれか一方又は両方のアミノ酸配列の切断を有することができる。突然変異タンパク質は、基準タンパク質と同一又は異なる生物活性(biological activity)を有することができる。
【０２３２】
一部の実施の形態において、突然変異タンパク質は、例えば、それに対応する基準タンパク質に対して少なくとも８５％の全体に亘る配列相同を有する。一部の実施の形態において、突然変異タンパク質は、野生型タンパク質に対して少なくとも９０％の全体に亘る配列相同を有する。他の実施の形態において、突然変異タンパク質は、少なくとも９５％の配列同一性、又は、９８％、９９％、９９．５％若しくは９９．９％の全体に亘る配列同一性を有する。
【０２３３】
ここで用いられるように、「アフィニティー精製のためのポリペプチドタグ」は、第１の「タグ」ポリぺプチドに融合した第２のタンパク質すなわち関心のあるポリペプチド配列を分離又は生成するために用いることができる結合パートナーを有する任意のポリペプチドである。複数の例は、従来周知であり、Ｈｉｓ−６タグ、ＦＬＡＧエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ（登録商標）ＩＩ、ビオチンタグ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）又は金属アフィニティータグを含む。
【０２３４】
ここで用いられるように、「組み換え型」は、（１）自然発生環境から除去され、（２）ゲノムが自然界で見られるポリヌクレオチドの全て又は一部に関連せず、（３）自然界で結合されていないポリヌクレオチドに操作的に結合され、又は、（４）自然界で生じない生体分子、例えば、ゲノム又はタンパク質を言及する。用語「組み換え型」を、クローンＤＮＡ分離株(cloned DNA isolates)、化学的に合成したポリヌクレオチド類似体又は異種系によって生物学的に合成したポリヌクレオチド類似体、及び、そのような核酸によってコーディングされたタンパク質及び／又はｍＲＮＡに関連して用いることができる。したがって、例えば、微生物によって合成されたタンパク質は、細胞に存在する組み換えゲノムから合成したｍＲＮＡから合成される場合には組み換え型である。
【０２３５】
用語「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、「核酸」又は「核酸配列」は、少なくとも１０塩基の長さのヌクレオチドの多量体型を言及する。この用語は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノム若しくは合成ＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ又は合成ＲＮＡ）、並びに、非天然ヌクレオチド類似体、非天然ヌクレオチド間結合又はその両方を含むＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を含む。核酸を、任意のトポロジー構造(topological conformation)とすることができる。例えば、核酸を、一本鎖、二本鎖、三本鎖(triple-stranded)、四本鎖(quadruplexed)、部分的な二本鎖、分岐、ヘアピン、環状又はパドロック(padlocked)構造とすることができる。
【０２３６】
「合成」ＲＮＡ、ＤＮＡ又は混合ポリマーは、細胞の外側で形成したもの、例えば、化学的に合成したものである。
【０２３７】
ここで用いられるような用語「核酸断片」は、完全長基準ヌクレオチド配列に対する欠失、例えば、５末端(5'-terminal)又は３末端(3'-terminal)欠失を有する核酸配列を言及する。一実施の形態において、核酸断片は、断片のヌクレオチド配列が天然に存在する配列の対応する部分と同一である連続した配列である。一部の実施の形態において、断片は、少なくとも１０、１５，２０若しくは２５ヌクレオチド長、又は、少なくとも２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１１０，１２０，１３０，１４０若しくは１５０ヌクレオチド長である。一部の実施の形態において、核酸の断片は、オープンリーディングフレーム配列の断片である。一部の実施の形態において、そのような断片は、オープンリーディングフレームヌクレオチド配列によってコーディングされたタンパク質の（ここで規定するような）ポリペプチド断片をコーディングする。
【０２３８】
ここで用いられるように、生命体のゲノムの内因性核酸配列（又は当該配列のコーディングされたタンパク質生成物）は、この内因性核酸配列の発現を変更するように異種配列を内因性核酸配列に隣接して配置する場合には「組み換え型」と見なされる。これに関連して、異種配列は、異種配列がそれ自体内因性である（同一の宿主細胞又はその子孫から生じる）か外因性である（異なる宿主細胞又はその子孫から生じる）かに関係なく内因性核酸配列に自然に隣接しない配列である。例として、プロモーター配列を、この遺伝子が変更された発現パターンを有するように（例えば、異種組み換えによって）宿主細胞のゲノムの遺伝子のネイティブなプロモーターの代わりとすることができる。この遺伝子は「組み換え型」となる。その理由は、遺伝子に必然的に隣接する(naturally flank)配列の少なくとも一部から遺伝子が切り離されるからである。
【０２３９】
核酸は、ゲノムの対応する核酸に自然に発生しない任意の修飾を含む場合にも「組み換え型」と見なされる。例えば、内因性コーディング配列は、例えば、人間の介入によって人工的に導入される挿入、欠失又は点変異を含む場合には「組み換え型」と見なされる。「組み換え核酸」は、異種部位の宿主細胞染色体に統合された核酸及びエピソームとして存在する核酸構造も含む。
【０２４０】
ここで用いられるように、基準核酸配列の「縮重変種」という表現は、基準核酸配列から変換されたアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を提供するために基準遺伝子コードに従って変換することができる核酸配列を含む。用語「縮重オリゴヌクレオチド」又は「縮重プライマー」を、必ずしも配列が同一でないが一つ以上の特定の断片内で互いに相同である標的核酸配列とハイブリダイズする(hybridizing)ことができるオリゴヌクレオチドを表すために用いる。
【０２４１】
核酸配列に関連する用語「割合配列同一性」又は「同一」は、最長一致のために整列したときに同一である二つの配列の残基を言及する。配列同一性比較の長さを、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、更に一般的には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、更に典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、一層典型的には少なくとも約３６ヌクレオチド以上のストレッチを超えることができる。ヌクレオチド配列同一性を測定するために用いることができる従来既知の複数の異なるアルゴリズムがある。例えば、ポリヌクレオチド配列を、ウィスコンシン州マディソンに所在のGenetics Computer Group (GCG)のWisconsin Package Version 10.0のプログラムであるＦＡＳＴＡ，Ｇａｐ又はＢｅｓｔｆｉｔを用いて比較することができる。ＦＡＳＴＡは、クエリーと検索配列との間の最適な重なりの領域のアライメント及び割合配列同一性を提供する。Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)。例えば、核酸配列間の割合配列同一性を、参照によりここに組み込まれるデフォルトパラメータ（６のワードサイズ及びスコア行列の非ＰＡＭ因子(NOPAM factor)）を有するＦＡＳＴＡ又はGCG Version 6.1で与えられるようなデフォルトパラメータを有するＧａｐを用いて決定することができる。代わりに、配列を、コンピュータプログラムBLAST (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); Gish and States, Nature Genet. 3:266-272 (1993); Madden et al, Meth. Enzymol. 266: 131-141 (1996); Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997); Zhang and Madden, Genome Res. 7:649-656 (1997)), 特に、blastp又はtblastn (Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))を用いて比較することができる。
【０２４２】
核酸又はその断片を参照するときの用語「実質的に相同」又は「実質的に類似」は、適切なヌクレオチド挿入又は欠失を他の核酸（又はその相補鎖）に最適に整列させたときに上述したようなＦＡＳＴＡ，ＢＬＡＳＴ又はＧａｐのような配列同一性の任意の周知のアルゴリズムによって測定されるヌクレオチド塩基の少なくとも約７６％、８０％、８５％、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のヌクレオチド配列同一性があることを表す。
【０２４３】
代わりに、実質的な相同又は類似は、ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件下で核酸又はその断片を他の核酸、他の核酸のストランド又はその相補鎖にハイブリッドするときに存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験に関連した「ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件」及び「ストリンジェントな洗浄条件」は、複数の異なるパラメータに依存する。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者によって容易に理解されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイゼーション種(hybridizing species)の塩基組成、相補領域の長さ及びハイブリダイゼーション核酸(hybridizing nucleic acids)間のヌクレオチド塩基ミスマッチの数のような条件によって影響が及ぼされる。当業者は、ハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシーを達成するためにこれらのパラメータを変更する方法を知っている。
【０２４４】
一般的に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、特定のセットの条件下で特定のＤＮＡハイブリッドの融点(thermal melting point)（Ｔｍ）より下の約２５℃で行われる。「ストリンジェントな洗浄」は、特定のセットの条件下で特定のＤＮＡハイブリッドのＴｍより下の約５℃で行われる。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全に適合したプローブ(perfectly matched probe)にハイブリッドする温度である。Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), page 9.51参照。このために、「ストリンジェントな条件」は、６ｘＳＳＣ（この場合、２０ｘＳＳＣは３．０Ｍ  ＮａＣｌ及び０．３Ｍ  クエン酸ナトリウムを含む）、１％ＳＤＳにおける６５℃で８〜１２時間の水性ハイブリダイゼーション（すなわち、ホルムアルデヒトなし）としての液相ハイブリダイゼーション及びそれに続く０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける６５℃での２０分の２回の洗浄に対して規定される。ハイブリッドされる配列の長さ及び割合同一性を含む複数の要因に応じて６５℃でのハイブリダイゼーションが異なる速度で生じることが、当業者によって理解される。
【０２４５】
ここで用いられるように、「発現制御配列」は、操作的に結合されるコーディング配列の発現に影響を及ぼすために必要であるポリヌクレオチド配列を言及する。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後のイベント及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列は、適切な転写開始、終了、プロモーター及びエンハンサー行列、スライシング及びポリアデニル化信号のような有効なＲＮＡ処理信号、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる行列、変換効率を向上させる配列（例えば、リボゾーム結合部位）、タンパク質安定性を向上させる配列、及び所望であるときにタンパク質分泌を向上させる配列を含む。そのような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物において、そのような制御配列は、一般的に、プロモーター、リボゾーム結合部位及び転写終了配列を含む。用語「制御配列」は、少なくとも、発現のために存在が必須である任意の構成要素を含むことを意図し、存在するのが有利である他の構成要素、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列を含むこともできる。
【０２４６】
ここで用いられるように、「操作的に結合」又は「操作可能に結合」した発現制御配列は、関心のある遺伝子を制御するために発現制御配列が関心のある遺伝子に隣接する連結及び関心のある遺伝子を制御するためにトランスに(in trans)又は離れて作用する発現制御配列を言及する。
【０２４７】
ここで用いられるように、用語「ベクター」は、結合された他の核酸を運ぶことができる核酸分子を言及することを意図する。ベクターの一つのタイプは、「プラスミド」であり、それは、一般的に、他のＤＮＡ断片を結合することができる環状二本鎖ＤＮＡループを言及するが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅によって生じる又は制限酵素による環状プラスミドの処理によって生じる線状二本鎖分子のような線状二本鎖分子も含む。他のベクターは、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。他のタイプのベクターは、ウイルスベクターであり、この場合、（後に詳細に説明するように）他のＤＮＡ断片をウイルスゲノムに結合することができる。所定のベクターは、それが導入される宿主細胞において自己複製することができる（例えば、宿主細胞で機能する複製の原因を有するベクター）。他のベクターを、宿主細胞に導入する際に宿主細胞のゲノムに統合することができ、これによって、宿主ゲノムとともに複製する。さらに、所定のベクターは、操作的に結合されるゲノムの発現を管理することができる。そのようなベクターを、ここでは、「組み換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称する。
【０２４８】
「組み換えベクター」は、ファージゲノムが挿入されたベクターである。一部の実施の形態において、開始ファージゲノム(starting phage genome)が挿入される。一部の実施の形態において、組み換えファージゲノムが挿入される。一部の実施の形態において、開始ファージゲノムが挿入され、その後、ベクターに組み換えファージゲノムを作成するためにベクターにおいて修飾される。
【０２４９】
用語「組み換え宿主細胞」（又は単に「組み換え細胞」若しくは「宿主細胞」）は、ここで用いられるように、組み換えベクターのような組み換え核酸が導入された細胞を言及することを意図する。一部の場合において、単語「細胞」を細胞のタイプを特定する名称に置き換える。例えば、「組換え微生物」は、微生物宿主細胞である組み換え宿主細胞である。そのような用語が特定の対象細胞(subject cell)だけでなくそのような細胞の子孫も言及することを意図するものであると理解されたい。所定の修飾が突然変異又は環境の影響のために後世に生じることがあるので、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一でないかもしれないが、ここで用いられるように、用語「組み換え宿主細胞」、「組み換え細胞」及び「宿主細胞」の範囲内に含まれる。組み換え宿主細胞を、分離した細胞若しくは培養中に成長した細胞株とすることができ、又は、生体組織若しくは生命体に存在する細胞とすることができる。
【０２５０】
ここで用いられるように、用語「バクテリオファージ」は、バクテリアに感染するウイルスである。同様に、「古細菌ファージ」(archaeophage)は、古細菌に感染するウイルスである。用語「ファージ」を、両方のタイプのウイルスを言及するために用いるが、文脈によって表すような所定の場合においては、特にバクテリオファージ又は古細菌ファージを言及するために縮めた表現として用いることもできる。バクテリオファージ及び古細菌ファージは、宿主生合成機構（すなわち、バクテリアに感染するウイルス）の一部又は全てを利用することによってバクテリア／古細菌内で増殖する偏性細胞内寄生体である。異なるバクテリオファージ及び古細菌ファージが異なる物質を含むかもしれないが、これらは全て核酸及びタンパク質を含み、所定の環境下で脂質膜に包含する(encapsulated)ことができる。ファージに応じて、核酸をＤＮＡとＲＮＡのいずれか一方とすることができ、核酸は種々の形態で存在することができる。
【０２５１】
ここで用いられるように、「異種核酸配列」は、通常発生しないゲノムの位置に配置された任意の配列である。異種核酸配列は、バクテリア／古細菌及び／又はファージで自然に発生しない配列を備えることができ、又は、バクテリア／古細菌及び／又はファージで自然に見つけられるがゲノムの通常発生しない位置に配置される配列のみを備えることができる。一部の実施の形態において、異種核酸配列は、自然のファージ配列ではない。一部の実施の形態において、異種核酸配列は、異なるファージからではあるが自然のファージ配列である。一部の実施の形態において、異種核酸配列は、開始ファージのゲノムで自然に発生する配列であるが、自然に発生しない他の部位に移動し、これによって、当該新しい部位の異種配列となる。
【０２５２】
「開始ファージ」又は「開始ファージゲノム」は、遺伝子操作によって修飾されていない自然又は人工環境から切り離されたファージ又はそのようなファージのゲノムである。
【０２５３】
「組み換えファージ」又は「組み換えファージゲノム」は、異種核酸配列をゲノムに挿入することによって遺伝子操作したゲノムを備えるファージ又は当該ファージのゲノムである。一部の実施の形態において、開始ファージのゲノムを、異種核酸配列を規定した部位のゲノムに導入する組み換えＤＮＡ技術によって組み換える。一部の実施の形態において、異種配列を、内因性ファージゲノムヌクレオチドの対応する損失なく導入する。換言すれば、塩基Ｎ１及びＮ２が開始ファージゲノムにおいて隣接する場合、外因性配列を、Ｎ１とＮ２との間に挿入する。したがって、結果的に得られる組み換えゲノムにおいて、異種配列は、ヌクレオチドＮ１及びＮ２に隣接する。一部のケースにおいて、異種配列を挿入し、内因性ヌクレオチドを除去し又は外因性配列に置換する。例えば、一部の実施の形態において、外因性配列を、除去される内因性配列の一部又は全ての代わりに挿入する。一部の実施の形態において、内因性配列を、外因性配列の挿入の（一つ以上の）部位から離れたファージゲノムの位置から除去する。
【０２５４】
「ファージ宿主細胞」は、子孫ファージ粒子を生じるためにファージによって影響が及ぼされうる細胞である。
【０２５５】
「操作的に結合」又は「操作可能に結合」された発現制御配列は、関心のあるコーディング配列の発現を制御するために発現制御配列が関心のあるコーディング配列に隣接する結合及びコーディング配列の発現を制御するためにトランスに又は離れて作用する発現制御配列を言及する。
【０２５６】
「コーディング配列」又は「オープンリーディングフレーム」は、ポリペプチド又はタンパク質をコーディングするヌクレオチドの配列である。コーディング配列の端末は、開始コドン及び終止コドンである。
【０２５７】
ここで用いられるような用語「発現制御配列」は、操作的に結合されるコーディング配列の発現に影響を及ぼすポリヌクレオチド配列を言及する。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後のイベント及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列は、適切な転写開始、終了、プロモーター及びエンハンサー行列、スライシング及びポリアデニル化信号のような有効なＲＮＡ処理信号、細胞質ｍＲＮＡを安定化させる行列、変換効率を向上させる配列（例えば、リボゾーム結合部位）、タンパク質安定性を向上させる配列、及び所望であるときにタンパク質分泌を向上させる配列を含む。そのような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。原核生物において、そのような制御配列は、一般的に、プロモーター、リボゾーム結合部位及び転写終了配列を含む。用語「制御配列」は、少なくとも、発現のために存在が必須である全ての構成要素を含むことを意図し、存在するのが有利である他の構成要素、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列を含むこともできる。
【０２５８】
ここで用いるように、「選択可能なマーカー」は、マーカーを発現させない同様な細胞の成長を抑止又は刺激する化学物質の存在下又は不存在下で成長する能力をマーカーを処理する細胞において授けるマーカーである。そのような細胞は、選択可能マーカーの発現による「選択可能な表現型」を有するともいえる。例えば、アンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）は、遺伝子を保有及び発現する細胞のアンピシリンの存在下で成長する能力を授ける（Sutcliffe, J.G., Proc Natl Acad Sci USA. 1978 August; 75(8): 3737-3741参照）。他の制限されない例は、クロラムフェニコール、カナマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性を授ける遺伝子を含む。他のマーカーは、上記ウラシル、トリプトファン及びロイシンのそれぞれの不存在下で成長することができるＵＲＡ３、ＴＲＰ及びＬＥＵを含む。
【０２５９】
ここで用いられるように、「スクリーニング可能なマーカー」を、マーカーを発現させる細胞を識別する基礎として用いることができる検出可能なラベルとする。そのような細胞を、スクリーニング可能なマーカーの発現に基づいて「スクリーニング可能な表現型」を有するということもできる。適切なマーカーは、放射性標識、蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、発光標識、発色団標識、ＰＥＴスキャナ用の陽電子放出同位体、化学発光標識又は酵素標識を有する。蛍光標識は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フルオレセイン及びローダミンを有するがそれに限定されない。化学発光標識は、ルシフェラーザ及びβ−ガラクトシダーザを有するがそれに限定されない。酵素標識は、ペルオキダーゼ及びホスファターゼを有するがそれに限定されない。Ｈｉｓタグも検出可能なラベルとなることができる。一部の実施の形態において、異種核酸が細胞に誘発され、その後、細胞は、ラベルである又はラベルを備えるタンパク質を発現する。例えば、誘発核酸は、細胞において活性する調節配列に操作可能に結合したＧＦＰに対するコード配列を備えることができる。
【０２６０】
ここで用いられるように、「ファージゲノム」は、自然に発生するファージゲノム及びその誘導体を含む。一般的に、誘導体は、親として同一の宿主で増殖する能力を持つ。一部の実施の形態において、自然に発生するファージゲノムとファージゲノムの誘導体との間の差は、ゲノムが線状である場合にファージゲノムの少なくとも一端からのヌクレオチドの欠失と付加の少なくとも一方又はゲノムが環状である場合のゲノムの少なくとも一つの点のみである。
【０２６１】
ここで用いられるように、「ベクター宿主細胞」は、少なくとも複数の細胞分裂周期を通じて所定のベクター型を宿主とする(host)ことができる細胞である。したがって、ベクター宿主細胞は、細胞に導入されるベクターを複製するとともに少なくとも複数の細胞分裂周期を通じてベクターの複製を娘細胞の各々に分配することができる。例えば、酵母細胞は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）ベクターのベクター宿主細胞である。
【０２６２】
ここで用いられるように、「ファージ宿主細胞」は、ファージゲノムＤＮＡの特定の型からファージを形成することができる「ファージ宿主細胞」である。一部の実施の形態において、ファージゲノムＤＮＡは、ファージによる細胞の感染によって細胞に導入される。一部の実施の形態において、ファージゲノムＤＮＡは、形質転換(transformation)又は他の任意の適切な技術を用いて導入される。一部の実施の形態において、ファージゲノムＤＮＡは、細胞に導入されるときには実質的に純粋である。一部の実施の形態において、ファージゲノムＤＮＡは、細胞に導入されるときにベクターに存在する。一つの制限されない例示的な実施の形態において、ファージゲノムＤＮＡは、ファージ宿主細胞に導入されるＹＡＣに存在する。その後、ファージゲノムＤＮＡは、複製され、ファージ宿主細胞のファージ粒子追随溶菌(phage particle following lysis)にパッケージされる。「ファージ宿主細胞」の定義は、必然的にファージ間で変わり得る。例えば、大腸菌は、ファージの特定の型のファージ宿主細胞であるが、サルモネラ菌はそうではない。
【０２６３】
ここで用いられるように、「コンピテントファージ宿主細胞」は、ファージ粒子が影響を及ぼすことができるファージ宿主細胞であり、この場合、ファージのゲノムは、細胞からのファージ粒子の生成を管理することができる。したがって、全ての「ファージ宿主細胞」が「コンピテントファージ宿主細胞」ではないが、全ての「コンピテントファージ宿主細胞」は「ファージ宿主細胞」である。
【０２６４】
ここで用いられるように、第１の核酸配列の第２の核酸配列への挿入のプロセスに関連して用いる「非配列特定プロセス(non-sequence specific process)」は、第２の核酸配列の挿入の部位が挿入前に決定されないプロセスである。
【０２６５】
ここで用いられるように、「トランスポーゼース系(transposase system)」は、トランスポーゼース酵素(transposase enzyme)又はトランスポーゼースの発現を管理することができる核酸と、酵素によって動かす(mobilized)ことができる遺伝要素と、を含む。典型的には、遺伝要素は、可動化(mobilization)のために必要な両端の配列と、標的核酸への挿入のための内部異種配列(internal heterologous sequence)と、を備える。トランスポーゼース系の制限されない例は、Ｍｏｓ１（マリナー(mariner)）（Jacobsen et al, PNAS USA, Vol. 83, pp. 8684-8688 (1986)参照）、Ｍｕ，Ｔｎ５（epicentre（登録商標）（www.epicenre.com）から市販されているキット及び試薬）、及び、ピギーバック(piggybac)（米国特許第６，２１８，１８５号明細書参照）を含む。
【０２６６】
ここで用いられるように、異種核酸配列のファージゲノムのような第２の核酸配列への挿入の部位に関連する「予め決定された位置」は、異種核酸配列の第２の核酸配列への挿入前に選択された部位を意味する。
【０２６７】
Ａ．ファージ
バクテリオファージ及び古細菌ファージは、宿主生合成機構（すなわち、バクテリアに感染するウイルス）の一部又は全てを利用することによってバクテリア／古細菌内で増殖する偏性細胞内寄生体である。異なるバクテリオファージ及び古細菌ファージが異なる物質を含むかもしれないが、これらは全て核酸及びタンパク質を含み、脂質膜によって被覆することができる。ファージに応じて、核酸をＤＮＡとＲＮＡのいずれか一方とすることができ、核酸は種々の形態で存在することができる。核酸のサイズは、ファージに応じて変化する。もっとも簡単なファージは、数千ヌクレオチドのサイズのゲノムのみを有し、それに対して、更に複雑なファージは、ゲノムに１００，０００ヌクレオチドを超えるヌクレオチドを有することができ、珍しい例では、ゲノムに１，０００，０００ヌクレオチドを超えるヌクレオチドを有することができる。タンパク質の異なる種類の数及びファージ断片の各種類のタンパク質の量は、ファージに応じて変化する。タンパク質は、環境中のヌクレアーゼから核酸を保護するために感染中に機能する。
【０２６８】
ファージは、多数の異なるサイズ及び形状で出現する。大抵のファージは、２４〜２００ｎｍの直径のサイズ範囲にある。ヘッド(head)又はカプシドは、一つ以上の異なるタンパク質の多数の複製から構成される。核酸は、存在する場合にはヘッドに配置され、それの保護カバーとしての役割を果たす。多数であるが全てでないファージは、ファージヘッドに取付けられるテール(tail)を有する。テールは、感染中に核酸が通過する中空管である。テールのサイズは変化することができ、一部のファージはテール構造を有しない。更に複雑なファージにおいて、テールは、細菌の感染中に収縮する収縮性シース(contractile sheath)によって包囲される。テールの端部において、ファージは、ベースプレート(base plate)と、それに取り付けられる一つ以上のテールファイバー(tail fibers)と、を有する。ベースプレート及びテールファイバーは、ファージの細胞への結合に関連する。全てのファージがベースプレート及びテールファイバーを有するわけではない。これらの場合、他の構造が、ファージ断片の細菌／古細菌への結合に関連する。
【０２６９】
感染過程の第１のステップは、細胞に対するファージの吸収である。このステップは、テールファイバー又はテールファイバーがない他のファージのある同様な構造によってとりなされ、それは可逆である。テールファイバーは、細胞の特定の受容体に結合し、ファージの宿主選択性(host specificity)（すなわち、感染することができる細菌／古細菌）は、通常、ファージが有するテールのタイプによって決定される。細菌／古細菌受容体の性質は、異なる細菌／古細菌に対して変化する。例は、細胞の外面のタンパク質、ＬＰＳ、ピリナッツ及びリポタンパク質を含む。これらの受容体は、他の目的のために細胞に存在し、ファージは、感染のためにこれらの受容体を用いるように進化した。
【０２７０】
テールファイバーを介したファージの細胞への結合は、弱い結合であり、可逆である。ファージの細胞に対する不可逆的結合は、ベースプレートの構成要素の一つ以上によってとりなされる。ベースプレートのないファージは、細胞への強固な結合を開始する他の方法を有する。
【０２７１】
シース（シースを有するファージ）及び中空テールファイバーの収縮となる細胞に対するファージの不可逆的結合は、細菌／古細菌のエンベロープ(envelope)を通じて行われる。収縮性シースを用いないファージは、細菌／古細菌エンベロープを通じてファージ断片を取得する他の機構を用いる。一部のファージは、エンベロープの種々の構成要素を消化する酵素を有する。
【０２７２】
ファージがエンベロープを通じた取得を行うと、ヘッドからの核酸は、中空テールを通過し、細胞に入る。通常、核酸のみが、実際に細胞に入るファージ構成要素である。ファージの残りは、細胞の外側にとどまる。この規則には一部の例外がある。これは、ウイルス断片の大部分が通常細胞に入る動物細胞ウイルスとは異なる。
【０２７３】
溶菌性ファージ又は毒性ファージは、細菌／古細菌のみで増殖するとともに生活環の最後において溶菌によって細胞を殺すファージである。溶菌性ファージの生活環は、暗黒期から始まる。エクリプス期の間、感染性ファージ断片を細胞の内側又は外側で見つけることができない。ファージ核酸は、宿主生合成機構を引き継ぎ、ファージ特有の(phage specified)ｍＲＮＡ及びタンパク質が作られる。動物ウイルス感染で見ることができるように、ファージ管理された巨大分子合成の秩序だった(orderly)発現がある。初期(early)ｍＲＮＡは、ファージＤＡＮ合成に必要な初期タンパク質をコーディングし、宿主ＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質生合成を止める。一部のケースにおいて、初期タンパク質は、実際に宿主染色体を分解する。ファージＤＮＡを作った後、末期(late)ｍＲＮＡ及び末期タンパク質を作る。末期タンパク質は、ファージを含む構造タンパク質及び細菌性細胞の溶解に必要なタンパク質である。次に、細胞内蓄積ファージにおいて、作られた核酸及び構造タンパク質を収集し、感染性ファージ断片は、細胞内に蓄積する。溶菌及び放出期(lysis and release phase)の間に、細菌／古細菌は、ファージ溶菌性タンパク質の蓄積による溶菌を開始し、細胞内ファージが培地に放出される。感染した細胞ごとに放出される断片の数を、１０００以上とすることができる。
【０２７４】
溶菌性ファージを、プラークアッセイによって数えることができる。プラークは、細菌／古細菌の溶菌から固体培地で成長した細菌／古細菌の菌叢となる汚れのない領域(clear area)である。アッセイは、各プラークが単一の感染性ファージから生じるような十分低いファージ濃度で実行される。プラークを生じさせる感染性断片は、ＰＦＵ（プラーク形成単位）と称される。
【０２７５】
溶原性(lysogenic or temperate)ファージは、溶菌サイクルを通じて繁殖することができ又は細胞の休止状態(quiescent state)に入ることができるファージである。この休止状態において、大抵のファージゲノムは転写されない。ファージゲノムは、抑制状態(repressed state)で存在する。この抑制状態でのファージＤＮＡは、プロファージと称される。その理由は、それはファージではなく、ファージを生成する可能性を有するからである。大抵の場合において、ファージＤＮＡは、実際には、宿主染色体に融合し、宿主染色体とともに複製されるとともに娘細胞に伝えられる。プロファージを含む細胞は、プロファージの存在による悪影響が及ぼされず、溶原状態がいつまでも持続することができる。プロファージを含む細胞は、溶原菌と称される。
【０２７６】
溶原性の機構は、ファージ間で異なる。典型例において、ラムダファージ、ファージＤＮＡは、５端末(5'ends)に小さい一本鎖領域を有する二本鎖線状分子である。これらの一本鎖端末は、これらが対の基礎となるとともに環状分子を生成することができるように相補的（付着端）である。細胞において、環の自由端を、共有結合閉環(covalently closed circle)を形成するために結合することができる。ファージコーディング酵素によって触媒作用を受けた部位特異的組み換え現象は、環状ファージＤＮＡの特定部位と宿主染色体の特定部位との間に生じる。その結果、ファージＤＮＡが宿主染色体に融合する。オペレーターと称されるファージＤＮＡの特定部位に結合される、リプレッサーと称されるファージコーディングタンパク質が作られ、ファージコーディングタンパク質は、リプレッサー遺伝子を除く大抵のファージ遺伝子の転写を止める。その結果、安定して抑制された(stable repressed)ファージゲノムが宿主染色体に融合される。各溶原性ファージは、それ自体のＤＮＡのみを抑制し、他のファージからのＤＮＡは抑制せず、したがって、抑制は非常に特有である（同一のファージを有する重複感染に対する免疫）。
【０２７７】
溶原性細菌／古細菌が悪条件にさらされるときはいつでも、溶原性状態を終了させることができる。このプロセスは誘導と称される。溶原性状態の終了を支持する条件は、乾燥、ＵＶ又は電離放射への露出、変異原性化学物質(mutagenic chemicals)等を含む。悪条件によって、リプレッサータンパク質を破壊するプロテアーゼ（ＲｅｃＡタンパク質）を生成する。これによって、ファージ遺伝子の発現、融合プロセスの失敗及び溶菌の増殖が生じる。
【０２７８】
この開示の一部の実施の形態において、開始ファージゲノムは、少なくとも５キロベース（ｋｂ）、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも５５ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも６５ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも７５ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも８５ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも９５ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１０５ｋｂ、少なくとも１１０ｋｂ、少なくとも１１５ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１２５ｋｂ、少なくとも１３０ｋｂ、少なくとも１３５ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１４５ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも１７５ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２２５ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも２７５ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３２５ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも３７５ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４２５ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、少なくとも４７５ｋｂ、少なくとも５００ｋｂ又はそれ以上を含む。
【０２７９】
この開示の一部の実施の形態において、開始ファージを、カウドウイルス、ミクロウイルス、コルチウイルス、テクティウイルス、レヴィウイルス、シストウイルス、イノウイルス、リポスリクスウイルス、ルディウイルス、プラズマウイルス及びフセロウイルスから選択した系列の一つとする。一部の実施の形態において、ファージは、カウドウイルスの系列の一つであり、マイオウイルス、サイフォウイルス及びポドウイルスから選択した群の一つである。
【０２８０】
この開示の一部の実施の形態において、ファージは、生産的に古細菌に感染することができる。一部の実施の形態において、古細菌を、ユリアーキオータ門とする。一部の実施の形態において、古細菌を、クレンアーキオータ門とする。この開示の一部の実施の形態において、ファージは、生産的に細菌に感染することができる。一部の実施の形態において、細菌を、放射菌門、アクウィフェクス門、アルマティモナス門、バクテロデス門、カルディセリクム門、クラミジア門、緑色非硫黄細菌門、クリシオゲネス門、シアノバクテリア門、デフェリバクター門、デイノコックス・テルムス門、ディクチオグロムス門、エルシミクロビウム門、フィブロバクター門、フィルミクテス門、フソバクテリウム門、ジェマティモナス門(Gemmatimonadetes)、ニトロスピラ門、プランクトミケス門、プロテオバクテリア門、スピロヘータ門、シネルギステス門、テネリクテス門、サーモデスルフォバクテリア門及びテルモトガ門から選択した門の一つとする。一部の実施の形態において、ファージは、バシラス属、リステリア属及びブドウ球菌属から選択した少なくとも一つのフィルミクテス門に生産的に感染することができる。一部の実施の形態において、ファージは、アシドバクテリウム属(Acidobacillus)、アエロモナス属、ブルクホルデリア属、ナイセリア属、シュワネラ属、サイトロバクター属、エントロバクター属、エルウイニア属、大腸菌属、クレブシエラ属、クライベラ属、モーガネラ属、サルモネラ属、赤痢菌属、エルシニア属、コクシエラ属、リケッチア属、レジオネラ属、アビバクテリウム属(Avibacterium)、ヘモフィラス属、パスツレラ属、アシネトバクター属、モラクセラ属、シュードモナス属、ビブリオ属及びザントモナス属から選択した少なくとも一つのプロテオバクテリア門に生産的に感染することができる。一部の実施の形態において、ファージは、マイコプラズマ属、スピロプラズマ属及びウレアプラズマ属から選択した少なくとも一つのテネリクテス門に生産的に感染することができる。
【０２８１】
Ｂ．異種核酸配列
一部の実施の形態において、異種核酸配列を、組み換えファージゲノムを作成するために開始ファージゲノムに挿入する。一部の実施の形態において、組み換えファージゲノムは、異なる組み換えファージゲノムを作成するために更に組み換えられる。
【０２８２】
異種核酸配列を、任意の核酸配列とすることができる。一部の実施の形態において、異種核酸配列の長さは、少なくとも１００ベース、少なくとも２００ベース、少なくとも３００ベース、少なくとも４００ベース、少なくとも５００ベース、少なくとも６００ベース、少なくとも７００ベース、少なくとも８００ベース、少なくとも９００ベース、少なくとも１．０キロベース（ｋｂ）、少なくとも１．１ｋｂ、少なくとも１．２ｋｂ、少なくとも１．３ｋｂ、少なくとも１．４ｋｂ、少なくとも１．５ｋｂ、少なくとも１．６ｋｂ、少なくとも１．７ｋｂ、少なくとも１．８ｋｂ、少なくとも１．９ｋｂ、少なくとも２．０ｋｂ、少なくとも２．１ｋｂ、少なくとも２．２ｋｂ、少なくとも２．３ｋｂ、少なくとも２．４ｋｂ、少なくとも２．５ｋｂ、少なくとも２．６ｋｂ、少なくとも２．７ｋｂ、少なくとも２．８ｋｂ、少なくとも２．９ｋｂ、少なくとも３．０ｋｂ、少なくとも３．１ｋｂ、少なくとも３．２ｋｂ、少なくとも３．３ｋｂ、少なくとも３．４ｋｂ、少なくとも３．５ｋｂ、少なくとも３．６ｋｂ、少なくとも３．７ｋｂ、少なくとも３．８ｋｂ、少なくとも３．９ｋｂ、少なくとも４．０ｋｂ、少なくとも４．５ｋｂ、少なくとも５．０ｋｂ、少なくとも５．５ｋｂ、少なくとも６．０ｋｂ、少なくとも６．５ｋｂ、少なくとも７．０ｋｂ、少なくとも７．５ｋｂ、少なくとも８．０ｋｂ、少なくとも８．５ｋｂ、少なくとも９．０ｋｂ、少なくとも９．５ｋｂ、少なくとも１０．０ｋｂ又はそれより上である。一部のそのような実施の形態において、異種核酸配列は、ファージゲノムによってコーディングされたファージ粒子にパッケージングすることができるとともにファージゲノムを備える異種核酸配列の最大長未満の長さを備える。一部の実施の形態において、異種核酸配列は、５００ベース以下、１．０ｋｂ以下、１．５ｋｂ以下、２．０ｋｂ以下、２．５ｋｂ以下、３．０ｋｂ以下、３．５ｋｂ以下、４．０ｋｂ以下、４．５ｋｂ以下、５．０ｋｂ以下、５．５ｋｂ以下、６．０ｋｂ以下、６．５ｋｂ以下、７．０ｋｂ以下、７．５ｋｂ以下、８．０ｋｂ以下、８．５ｋｂ以下、９．０ｋｂ以下、９．５ｋｂ以下又は１０．０ｋｂ以下の長さを備える。
【０２８３】
一部の実施の形態において、異種核酸配列の長さは、１００〜５００ベース、２００〜１００ベース、５００〜１０００ベース、５００〜１５００ベース、１〜２ｋｂ、１．５〜２．５ｋｂ、２．０〜３．０ｋｂ、２．５〜３．５ｋｂ、３．０〜４．０ｋｂ、３．５〜４．５ｋｂ、４．０〜５．０ｋｂ、４．５〜５．５ｋｂ、５．０〜６．０ｋｂ、５．５〜６．５ｋｂ、６．０〜７．０ｋｂ、６．５〜７．５ｋｂ、７．０〜８．０ｋｂ、７．５〜８．５ｋｂ、８．０〜９．０ｋｂ、８．５〜９．５ｋｂ又は９．０〜１０．０ｋｂである。
【０２８４】
一部の実施の形態において、組み換えファージのゲノムの全長に対する異種核酸配列の長さの比は、少なくとも０．０５、少なくとも０．１０、少なくとも０．１５、少なくとも０．２０又は少なくとも０．２５である。一部の実施の形態において、対応する開始ファージのゲノムの長さに対する組み換えファージのゲノムの長さの比は、少なくとも１．０５、少なくとも１．１０、少なくとも１．１５、少なくとも１．２０又は少なくとも１．２５である。
【０２８５】
一部の実施の形態において、異種核酸配列は、内因性開始ファージゲノム配列の損失なく開始ファージゲノムに挿入される。一部の実施の形態において、挿入された異種核酸配列は、内因性開始ファージゲノム配列を置換する。一部のそのような実施の形態において、異種核酸配列は、異種核酸配列の長さ未満である内因性ゲノム配列の量を置換する。したがって、そのような実施の形態において、組み換えファージゲノムの長さは、開始ファージゲノムの長さより長くなる。一部のそのような実施の形態において、異種核酸配列は、異種核酸配列の長さより長い内因性ゲノム配列の量を置換する。したがって、そのような実施の形態において、組み換えファージゲノムの長さは、開始ファージゲノムの長さより短くなる。一部のそのような実施の形態において、異種核酸配列は、異種核酸配列の長さに等しい内因性ゲノム配列の量を置換する。
【０２８６】
一部の実施の形態において、異種核酸配列は、オープンリーディングフレームを含む。
【０２８７】
一部の実施の形態において、オープンリーディングフレームは、選択可能な表現型及びスクリーニング可能な表現型から選択したベクターを含むベクター宿主細胞の少なくとも一つの表現型を授けるマーカーをコーディングする。そのような実施の形態において、ベクターは、ベクター宿主細胞のオープンリーディングフレームの発現を管理することができる発現制御配列を備える。一部の実施の形態において、選択可能な表現型及びスクリーニング可能な表現型は、選択可能な表現型及びスクリーニング可能な表現型から選択したファージゲノムを含むベクター宿主細胞の少なくとも一つの表現型を授けるマーカーをコーディングするオープンリーディングフレームを備えるファージゲノムを含むベクターを備える宿主細胞を識別するために用いられる。一部の実施の形態において、ファージゲノムの外側のベクターは、選択可能な表現型及びスクリーニング可能な表現型から選択したファージゲノムを含むベクター宿主細胞の少なくとも一つの表現型を授けるマーカーをコーディングするオープンリーディングフレームを備える。一部の実施の形態において、ファージゲノムの外側のベクターとファージゲノムに挿入される異種核酸配列の両方は、そのようなマーカーをコーディングする。一部の実施の形態において、ベクター配列のオープンリーディングフレームによってコーディングされたマーカー及び異種核酸配列のオープンリーディングフレームによってコーディングされたマーカーは異なる。
【０２８８】
一部の実施の形態において、オープンリーディングフレームは、選択可能な表現型及びスクリーニング可能な表現型から選択したファージゲノムを含むファージ宿主細胞の少なくとも一つの表現型を授けるマーカーをコーディングする。そのような実施の形態において、オープンリーディングフレームを、ファージ宿主細胞のオープンリーディングフレームの発現を制御することができる発現制御配列に操作的に結合する。発現制御配列を、異種核酸配列に配置することができ、又は、発現制御配列を、内因性ファージゲノム配列に存在することができる（すなわち、それは、開始ファージゲノムに存在する配列となることができる。）。例えば、オープンリーディングフレームを、内因性ファージオープンリーディングフレーム配列の下流に挿入し又はそれの代わりに置くことができる。
【０２８９】
一部の実施の形態において、オープンリーディングフレームは、オープンリーディングフレームを含む異種核酸配列を備える組み換えファージによって感染されるファージ宿主細胞のスクリーニングによって識別することができるマーカーとしての役割を果たすタンパク質をコーディングする。そのようなマーカーの例は、放射性標識、蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、発光標識、発色団標識、ＰＥＴスキャナ用の陽電子放出同位体、化学発光標識又は酵素標識を一例として有するが、それに限定されない。蛍光標識は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、フルオレセイン及びローダミンを有するがそれに限定されない。化学発光標識は、ルシフェラーザ及びβ−ガラクトシダーザを有するがそれに限定されない。酵素標識は、ペルオキダーゼ及びホスファターゼを有するがそれに限定されない。Ｈｉｓタグも検出可能なラベルとなることができる。一部の実施の形態において、異種核酸が細胞に導入され、その後、細胞は、ラベルである又はラベルを備えるタンパク質を発現する。一部の実施の形態において、オープンリーディングフレームは、ファージ宿主細胞によって通常生成されないタンパク質をコーディングする。そのようなタンパク質を、スクリーニングによって、例えば、免疫測定法を用いてタンパク質を検出することによって識別することができるマーカーとして用いることができる。一部の実施の形態において、スクリーニング可能なマーカーを、サンプル中のファージ宿主細胞の存在を識別する分析において検出する。例えば、ファージ宿主細胞を、食品加工工場を汚染する細菌性細胞種類とすることができ、組み換えファージとサンプルとの混合後の細胞のスクリーニング可能なマーカーの発現の検出を、ファージ宿主細胞による食品加工工場の汚染を検出するための分析として用いることができる。
【０２９０】
一部の実施の形態において、オープンリーディングフレームは、ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、グリコシターゼ、グリカナーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、エステラーゼ、ホスホジエステラーゼ、セルラーゼ、ライシン及びキナーゼから選択したタンパク質をコーディングする。一部の実施の形態において、タンパク質を、ヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼ、グリコシターゼ、グリカナーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、エステラーゼ、ホスホジエステラーゼ、セルラーゼ、ライシン及びキナーゼの少なくとも一つ以外の任意のタンパク質とする。
【０２９１】
一部の実施の形態において、オープンリーディングフレームは、表１に挙げたタンパク質をコーディングする。
【表１】
2015531595.tif 000003
【０２９２】
一部の実施の形態において、異種核酸配列は、少なくとも一つの第２のオープンリーディングフレームを含む。一部の実施の形態において、第１のオープンリーディングフレーム及び第２のオープンリーディングフレームを、同一の発現制御配列に操作的に結合する。一部の実施の形態において、第１のオープンリーディングフレーム及び第２のオープンリーディングフレームを、異なる発現制御配列に操作的に結合する。
【０２９３】
一部の実施の形態において、組み換えファージゲノムに存在する異種核酸配列の全て又は一部を、欠失し、及び／又は、異なる異種核酸配列に置換する。欠失及び／又は置換を、例えば、ベクター宿主細胞において実行することができる。一部の実施の形態において、異種オープンリーディングフレームを、開始オープンリーディングフレームによってコーディングされたタンパク質又はポリペプチドの異形又は突然変異タンパク質をコーディングするために修飾する。一部の実施の形態において、これを、指向進化によって遂行する。
【０２９４】
一部の実施の形態において、異種オープンリーディングフレームによってコーディングされたタンパク質又はポリペプチドを、ファージ宿主細胞に存在するプロテアーゼによる切断を減少するために修飾する。例えば、既知のプロテアーゼ切断部位を識別するために演算アルゴリズムを用いることができ、オープンリーディングフレームの配列を、これらの部位を欠失するための同類置換を用いて修飾することができる。代わりに、ファージ宿主細胞又はファージ宿主細胞の培養に存在する一つ以上のプロテアーゼに対する増大した抵抗を有する生成物をコーディングするためのオープンリーディングフレームを進化させるために定方向突然変異誘発を用いることができる。
【０２９５】
異種オープンリーディングフレームを、ファージ宿主細胞に発現したときに安定性を増大するために過給する(supercharged)こともできる。例えば、www.nature.com /nmeth/journal/v6/n5/full/nmeth0509-322.html参照。
【０２９６】
一部の実施の形態において、異種オープンリーディングフレームは、オープンリーディングフレームの発現産物がオープンリーディングフレームによってコーディングされたポリペプチド又はタンパク質に融合されたタグを備えるようにポリペプチドタグをコーディングする配列を備える。
【０２９７】
Ｃ．ファージ操作方法(Phage engineering methods)
１．ファージゲノムの分離
ファージゲノムをファージ土壌及び／又は分離したファージ及び／又は濃縮ファージ生成から分離するために任意の適切な方法を用いる。例えば、以下のカラムベースの方法、ＰＥＧベースの方法、濾過ベースの方法及び塩化セシウム遠心分離法の一つ以上を用いる。
【０２９８】
カラムベース
【０２９９】
ファージ土壌の高力価溶解物を、荷電及び／又は親和性に基づくクロマトグラフィーによって更に濃縮し、大容量の溶解物の濃度を非常に小さい容量にすることができる。ファージのカラムへの通過及びその後の小容量の溶出によって、更なるゲノム操作のためのファージのＤＮＡ収集の材料を提供する。
【０３００】
ＰＥＧベース
【０３０１】
高濃度のポリエチレングリコールの存在によって、低力価で大容量のファージ材料からの活発なファージ粒子の析出を可能にする。このタイプの標準的処理によって、１００倍を超える濃度のファージ溶解物を可能にし、更なるゲノム操作のために多量のＤＮＡを除去することができる。
【０３０２】
濾過ベース
【０３０３】
大きな細胞残骸を除去するための溶解物の濾過及びそれに続く１００ｋＤａサイズの範囲の濾過によって、ファージ溶解物の調合液中の水及び塩分を失うことなくファージ断片の保持を可能にする。これは、更なるゲノム操作のために多量のＤＮＡを分離するようファージを濃縮する更に別の技術である。
【０３０４】
塩化セシウム遠心分離
【０３０５】
濃縮した溶解物を、汚染宿主ＤＮＡを除去するためにデオキシリボヌクレアーゼによって濃縮した溶解物を処理した後にファージ粒子を細胞残骸から精製するための塩化セシウム勾配(cesium chloride gradient)の分離を行うことによって更に精製する。これらの高度に生成した溶解物は、更なる操作のための非常にきれいなＤＮＡを生成する。
【０３０６】
ＤＮＡの精製
【０３０７】
ファージ粒子の精製方法に関係なく、ファージ溶解物は、ファージコートを除去するためにプロテアーゼ及びクロロホルムを用いて任意に処理され、その後、カラムベースのＤＮＡ精製と除去したＤＮＡのエタノール沈殿のいずれか一方を行う。このステップで除去された全てのＤＮＡは、後に説明するように更なる取得及び操作のための準備ができている。
【０３０８】
ファージゲノムＤＮＡの任意配列(optional sequence)
【０３０９】
開始ファージゲノム配列が未知である場合、完全な配列を生成するために以下のプロセスを任意に用いることができる。
【０３１０】
コンティグを生成するための次世代シークエンシングの使用：次世代シークエンシング法は、連続的な塊のファージ配列を集めるために用いることができる大量のデータを生成する。この配列は、単一パスによってファージゲノム全体を閉じることができるのに十分でない。異なるコンティグ間にギャップがある。
【０３１１】
ＰＣＲによるギャップ充填：プライマーは、コンティグの端をアニールするように設計される。これらのプライマーは、ファージゲノムＤＮＡでＰＣＲを行うために組み合わせて用いられる。互いに隣接するコンティグからのプライマーのみが産物を増幅する。これらのＰＣＲ産物の配列を、コンティグ間のギャップを閉じるための従来のサンガーシークエンシングによって決定することができる。
【０３１２】
サンガーシークエンシングによる端の発見：修正したサンガーシークエンシングを、ファージゲノムＤＮＡから直接行うことができる。これは、多くのＤＮＡ（１〜５ｕｇ／ｒｘｎ）を要求するとともに非常に高価であるが、この技術を、この最終配列を取得するためにＰＣＲを用いることができない場合にはファージの端から配列を決定するために用いることができる。これによって、ファージゲノム配列を完成する。
【０３１３】
次世代シークエンシングは、そのような小さいゲノムのゲノム全体を生成する必要がある。しかしながら、ギャップが常に観察される。ファージシークエンシングが通常の動作ではないので、この技術の必要性は一般的に知られていない。この技術は、多数の侵入(incoming)ファージの信頼性のあるシークエンシングに要求される。
【０３１４】
２．ファージゲノムの取得
分離したファージゲノムを、ベクターにおいて取得することができる。適切なベクターの例は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）である。多数の適切な技術及び変形は、従来既知である。一部の実施の形態において、ここでは、ベクターをＹＡＣとする。例示的な手順は、以下の通りである。
【０３１５】
ＢＡＣの取得
【０３１６】
相同組み換え
【０３１７】
ＢＡＣクローニングは、環状低コピープラスミドの巨大ＤＮＡの培養のために大腸菌において十分に達成される。巨大サイズのファージＤＮＡは、制限断片及びリカーゼを用いる標準的なクローニング技術に対する課題を提供する。この問題を回避するために、同相組み換えを、線状ＢＡＣベクターを線状ファージＤＮＡに結合するのに用いることができる。野生型大腸菌において、相同組み換え（ＨＲ）は、非常にまれであるので、ファージを含むＢＡＣ（ファージ−ＢＡＣ）を有益に生成することができない。ファージＤＮＡのクローニングに望ましいＨＲのレベルを支持するために、λ−Ｒｅｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎシステムが任意に用いられる。ラムダファージタンパク質ｅｘｏ、ｂｅｔ及びｇａｍの発現は、ファージＢＡＣの生成のために標的ファージゲノムのＢＡＣへの移植のための有益なレベルまでＨＲ頻度を増大する方策を集合的に提供する。ファージゲノム及びＢＡＣ  ＤＮＡの端のＤＮＡ配列の相同は、ファージを組み替えてファージＢＡＣを生成するＢＡＣベクターとする大腸菌相同組み換え機構を掌握する(usurp)手段を提供する。
【０３１８】
２．末端−修復(end-repair)／連結反応／相同組み換え
【０３１９】
線状ファージの末端に対するアダプターの連結反応は、線状化ＢＡＣベクターに組み替える手段を提供する。アダプターは、通常、４０〜６０ｂｐ長であるとともに挿入部位においてＢＡＣベクターに隣接するＤＮＡに対して相同であるが、必ずしもそうではない。３’及び５’エクソヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼに対するｄＮＴＰの付加によるファージゲノムＤＮＡの３’末端への単一のヌクレオチド突出の付加を、相補的な単一のヌクレオチド付加によってアダプターにおいて連結反応を行うために用いることができる。
【０３２０】
３．末端−修復／ターミナルトランスフェラーゼ／相同組み換え
【０３２１】
ターミナルトランスフェラーゼによる線状化ベクター及び線状ファージのテーリング(tailing)は、ニックトランスレーションによってＤＮＡポリメラーゼＩに結合することができるポリヌクレオチドトラック(polynucleotide track)の相補的なテール(complimentary tails)を作成する一つの方法を提供する。テーリング及びニックトランスレーションされたファージ及びベクターを、大腸菌に形質転換するとともにベクターの選択可能なマーカーの使用のために選択する。
【０３２２】
代わりに、ターミナルトランスフェラーゼによるファージゲノムＤＮＡのテーリングによって、アダプターを、アダプターの３’末端に相補的な六量体を有するファージに結合することができる。５’エクソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによるニックトランスレーションによって、アダプターを、組み換え接合部のＤＮＡポリメラーゼによって生じる二重鎖形成によりファージＤＮＡに結合することができる。大腸菌における変換及び選択によって、クローンファージを含むコロニーを生成する。
【０３２３】
ＹＡＣにおける取得
【０３２４】
１．相同組み換え
【０３２５】
ゲノム配列が既知であるバクテリオファージは、出芽酵母における二重鎖切断修復を用いてゲノムを組み合えて環状酵母人工染色体（ＹＡＣ）にする手段を提供する。最初に、選択可能なマーカーを用いた酵母ベクターの複製が線形化され、線状バクテリオファージゲノムの３’末端からの４０ｂｐの配列及び酵母ベクターの二重鎖切断に隣接するＤＮＡからの４０ｂｐの配列を含む「ステッチング(stitching)」オリゴヌクレオチドが設計される。ファージゲノム、ステッチングオリゴヌクレオチド及び線状化酵母ベクターは、出芽酵母に同時形質転換され、選択培地に固定される。この手順は、ベクター及びファージゲノムの末端の相同配列を用いたＤＮＡ組合せによって形成した環を有する線状化ベクターのために選択を行う方法を提供するクローンＤＮＡ又はダイストラテジ(die strategy)を提示する。その後、選択培地で成長することができる酵母のコロニーは、ＹＡＣ  ＤＮＡとファージＤＮＡとの間の接合の存在のためにスクリーニングされ、ファージＤＮＡのクローニングが成功した場合にのみＤＮＡ構造が生じる。
【０３２６】
２．末端−修復／連結反応／相同組み換え
【０３２７】
線状ファージの末端に対するアダプターの連結反応は、線状化酵母ベクターに組み替える手段を提供する。アダプターは、通常、４０〜６０ｂｐ長であるとともに挿入部位において酵母ベクターに隣接するＤＮＡに対して相同であるが、必ずしもそうではない。ファージゲノムＤＮＡの３’末端への単一のヌクレオチド突出を、３’及び５’エクソヌクレアーゼ活性を欠いているポリメラーゼに対するｄＮＴＰの付加によって挿入し、相補的な単一のヌクレオチド付加によってアダプターにおいて連結反応を行うために用いることができる。ベクターＤＮＡによるこれらの末端−修復ファージの形質転換の結果、連鎖反応したアダプターとファージ主鎖との間に相同組み換えが生じ、その結果、ＹＡＣにおいて完全長ファージゲノムを取得する。酵母ベクターは、選択可能なマーカーを含む。環状ＹＡＣ  ＤＮＡを含む（すなわち、相同組み換えによって大抵生じる）細胞を、アミノ酸のない培地で選択することができる。これらのコロニーは、ファージＤＮＡのクローニングを確認するためのファージＤＮＡの存在に対してスクリーニングされる。
【０３２８】
３．末端−修復／ターミナルトランスフェラーゼ／相同組み換え
【０３２９】
ターミナルトランスフェラーゼによる線状化ベクター及び線状ファージのテーリングは、ポリヌクレオチドトラックの相補的なテールを作成する一つの方法を提供する（例えば、ポリアデノシンによるファージのテーリング及びポリチミンによるベクターのテーリング）。これらを、互いにアニールすることができ、かつ、更に長い領域の相同を作成するためにＤＮＡポリメラーゼによるニックトランスレーションによって安定化させることができる。テーリング及びニックトランスレーションされたファージ及びベクターを、大腸菌に形質転換するとともにベクターの選択可能なマーカーの使用のために選択する。
【０３３０】
ターミナルトランスフェラーゼによるファージゲノムＤＮＡのテーリングによって、アダプターをファージに結合することができる。これらのアダプターは、アダプターの３’末端に相補的な六量体を有することができる。５’エクソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによるニックトランスレーションによって、アダプターを、組み換え接合部のＤＮＡポリメラーゼによって生じる二重鎖形成によりファージＤＮＡに結合することができる。大腸菌における変換及び選択によって、クローンファージを含むコロニーを生成する。伸長(extension)は、共有結合されないとしても、アニールされた断片の安定化を提供する。適合したファージＤＮＡによるベクターの同時形質転換及び酵母における選択によって、クローンファージのコロニー形成を可能にする。
【０３３１】
取得したファージゲノムの検出
【０３３２】
１．ＹＡＣ−プラーク
【０３３３】
ファージを含むＹＡＣを含有する酵母形質転換は、ガラスビーズ溶菌(glass bead lysis)によって妨げられ、これによって、形質転換した細胞からＹＡＣを放出する。ファージを有する放出されたＹＡＣは、適切なファージ宿主細胞にエレクトロポレーションされ、標準的なプラーク分析において固定される。ファージゲノムを有するＹＡＣの形質転換からプラークを生成した。今まで、これは、大腸菌ファージ（Ｔ３及びＴ７）及びサルモネラ菌ファージ（ＦｅｌｉｘＯ１）を用いてうまく達成された。これらの結果は、機能的ファージ(functional phage)をクローンファージゲノムから生成できることを示す。
【０３３４】
２．ＢＡＣ−プラーク
【０３３５】
ＢＡＣ−プラークを、ファージゲノムを含むＢＡＣの巨大構成ＤＮＡ精製(large construct DNA purification)によって実行することができる。これらのＤＮＡは、適切な細菌性宿主株にエレクトロポレーションされる。それに対し、これらのＤＮＡは、これらのＤＮＡを繁殖させる大腸菌においてプラークせず、それの起始宿主(host of origin)（例えば、バシラス）においてプラークする。
【０３３６】
３．ｐｈｉ２９ベース／シークエンシング読出し
【０３３７】
酵母系は、宿主細胞に悪影響を及ぼすことなくファージゲノムを操作するとともに繁殖させる方法を提供する。しかしながら、ファージゲノムを含むＹＡＣは、典型的には、細胞ごとに高コピーで維持されない。ファージ及び操作されたファージの存在の分析を容易にするために、これらのＹＡＣを、体外のゲノムを複製することができるバクテリオファージｐｈｉ２９からのＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅することができる。これらの物質を、形質転換及びシークエンシングに用いることができる。
【０３３８】
ファージゲノムを含むＢＡＣ（ファージ−ＢＡＣ）は、細胞ごとに高コピーで維持されない。ファージ及び操作されたファージの存在の分析を容易にするために、これらのファージ−ＢＡＣを、体外のゲノムを複製することができるバクテリオファージｐｈｉ２９からのＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅することができる。これらの物質を、形質転換及びシークエンシングに用いることができる。
【０３３９】
３．Ｐｈｉ２９／ＲＦＬＰ読出し
【０３４０】
バクテリオファージｐｈｉ２９によるファージＹＡＣ及びファージＢＡＣの増幅によって、高速な全体のゲノム分析のために制限断片長多型（ＲＦＬＰ）を識別するための制限酵素による分析が可能になる。これらの手順は、アガロースゲルにおいて実行され、エチジウムブロマイド染色によって分析される。
【０３４１】
３．異種配列のファージゲノムへの挿入−任意のハンドル挿入
異種核酸配列をクローンファージゲノムに挿入するために複数の技術を用いることができる。方法の一部の実施の形態は、以下説明する。方法の一部の実施の形態において、ここで開示した方法によって作られるＹＡＣ又はＢＡＣクローンを用いる。
【０３４２】
ファージは、ＤＮＡに不活性領域がほとんどない特に高い遺伝子密度を有する。変化を容認することができる部位を見つけることは、困難となり得る。この状況は、ファージゲノムの配列が未知であるとき又は操作前に不完全にしか知られていないときに更に困難となり得る。一度部位が識別されると、当該部位で行われる遺伝子の交換を容易にするその場でのハンドルを形成することが多くの実施の形態において非常に有用であることを発見した。ファージゲノムの特定の場所の部位の操作を容易にすることによって、その場での更なる操作を非常に容易にすることができる。
【０３４３】
一つの方法において、トランスポゾンのホッピングによる既知のＤＮＡのランダムな配送は、挿入を識別するための選択可能なマーカーと任意の新規の制限部位の両方を配送する。トランスポゾン配送は、ファージゲノムの全ての部位のランダムサンプリングを行うことができる。ファージゲノムの特定の部位に対するトランスポゾンの配送後、結果的に得られる組み換えファージを、実現可能性（ファージ粒子を形成する能力）のために検査を行うことができる。組み換えファージが既に選択可能なマーカーを有する場合、この検査は、遺伝子変化を許容する挿入部位並びに挿入された異種核酸のサイズを許容するファージ及び挿入部位を同時に分析する。許容される任意の挿入イベントを、更なる遺伝子組み換え及び導入遺伝子配送のための部位とともに進みながら選択する。遺伝子組み換えの任意の適切な方法を、以下のように用いることができる。
【０３４４】
Ａ．部位特異的突然変異誘発配送(site-directed mutagenesis delivery)
【０３４５】
部位特異突然変異誘発によって、特定部位を選択するとともに導入遺伝子の更なる配送のために特定部位を調整することができる。このアプローチの一部の実施の形態の一つの利点は、導入遺伝子の最適な発現を選択することができること及び実現可能性の見込みに基づいて部位を事前に選別できることである。上述したように、部位特定突然変異誘発は、実行可能性及び挿入を許容するために検査される。
【０３４６】
Ｂ．存在する部位の制限／連結反応（すなわち、合理的配送）
【０３４７】
この方法において、ファージゲノムを切断するために制限酵素が用いられ、適合した末端を有するハンドルがファージゲノムに挿入される。このアプローチは、ファージの独自の制限部位の数によって制限される。
【０３４８】
Ｃ．ハンドル配送の検出
【０３４９】
ハンドル配送の上記方法の全ては、分子に配送されたゲノムハンドルで終了するファージゲノムの１００％未満のファージゲノムを生成する。トランスポゾン配送及び従来のクローニングによって、操作された分子を有する細胞を見つけるための選択可能なマーカーの配送を可能にする。例えば、酵素において、ＵＲＡ３マーカーを、ウラシルがない細胞を成長させることによって選択することができる。細菌において、マーカーを、ファージ成熟に必要な細胞機構を阻害する抗生物質（例えば、テトラサイクリン又はクロラムフェニコール）に対する抵抗を授ける遺伝子とすることができる。ハンドル挿入を検出する他の方法は、緑色蛍光タンパク質のような蛍光マーカーの使用を有し、又は、挿入の頻度が十分高い場合には、ＰＣＲマーカーを検出するのが容易である。ハンドル挿入のための基本的な検出方法としてＰＣＲを用いたファージ挿入に成功した。
【０３５０】
４．オープンリーディングフレームを備える異種配列のファージゲノムへの挿入
Ａ．（関連の生命体の体内での）組み換え
【０３５１】
ハンドル配送ステップは、新規の制限部位を関心のある部位に配送し、更に簡単な操作を可能にする。この部位でのファージの線状化は、ファージの複製を妨害する。多数のファージは、ライフサイクルの一部としてＤＮＡの相同組み換えを必要とする大きな遺伝子組み換え(highly recombinagenic)が可能である。関心のある導入遺伝子ペイロード(transgene payload)に隣接する切断の部位に対して相同性を有するＤＮＡを提供することによって、これらのＤＮＡの組み換えが可能になる。宿主生命体への形質転換後に存続可能なファージ粒子の選択は、導入遺伝子を有する存続可能なファージをこれらの部位に配送する。
【０３５２】
Ｂ．（体外での）組み換え
【０３５３】
ファージ粒子は、ハンドル部位において線形化され、その後、（線形部位に対する）相同ＤＮＡの組み換えによって、導入遺伝子ペイロードＤＮＡを、相同組み換えによりファージゲノムに配送することができる。
【０３５４】
Ｃ．（酵母での）組み換え
【０３５５】
酵母細胞は、大きな遺伝子組み換えが可能である。ハンドル部位でのファージＹＡＣの線形化及び相同であるＤＮＡを切断部位に供給した後の酵母への同時形質転換によって、テンプレートとしての相同ＤＮＡを用いた切断部位の修復が可能になる。これらのファージＹＡＣを、ハンドル部位での適切な導入遺伝子ペイロードの挿入のために、後に説明するように検査することができる。
【０３５６】
Ｄ．切断／ペースト
【０３５７】
従来のクローニング技術は、導入遺伝子ペイロードのハンドル部位への配送のために利用できる。ハンドル部位に配送される独自の制限部位を、ファージを線形化するために利用することができる。ペイロードを、これらの線形化された部位への連結反応によって配送することができ、組み換えを、関心のある宿主への形質転換及び存続可能なファージ粒子の選択によって選択することができる。
【０３５８】
Ｅ．挿入の検出
【０３５９】
大抵のケースにおいて、存続可能なファージ子孫を、異種オープンリーディングフレームを有するファージのために富化する。これを検証するために、ファージを、挿入部位のＰＲＣによって又はオープンリーディングフレームによりコーディングされた生成物の表現型発現によって分析することができる。酵素分析を用いることもできる。ペイロード酵素を有する任意のファージは、高レベルの酵素を発現する必要がある。
【０３６０】
Ｆ．選択性マーカー及び導入遺伝子の同時の配送
【０３６１】
一部のケースにおいて、導入遺伝子は、コンパウンドカセット(compound cassette)の一部としての選択可能なマーカーと同時に配送される。そのようなカセットは、関心のある導入遺伝子と選択可能なマーカーの両方を含み、ファージ染色体と同相で近接する。この分子をファージＹＡＣを含む酵母細胞に形質転換することによって、ファージＤＮＡとの相同組み換えが可能になる。これらの組合せ分子を、選択可能なマーカーに対して適切な土壌で成長させることによって選択することができる。組み換えは、導入遺伝子と選択可能なマーカーの両方を含む。
【０３６２】
５．遺伝子操作されたＤＮＡからのファージ粒子の作成
直接形成転換
【０３６３】
我々の改変ファージをファージＹＡＣ  ＤＮＡから適切な宿主細胞へのように直接形質転換できることを発見した。これらのファージＹＡＣは、複製し、活性化し、かつ、反復性感染症が可能であるファージ粒子にパッケージされる。
【０３６４】
ファージＤＮＡの遊離(liberation)及びそれに続く形質転換
【０３６５】
全てのファージが末端に外来ＤＮＡを有することを許容しない。これを軽減するために、外来性ＤＮＡを除去するためのベクターの線状化を、形質転換効率を向上させるために用いることができる。このために、クローニングベクターを、原ファージゲノムを繰り返すファージＤＮＡを遊離するためにベクターの平坦な切断(flush cutting)を許容するように設計することができる。さらに、ファージ抽出によるこのＤＮＡの培養によって末端を更に保護することにより、形質転換効率を向上させるための末端の保護を可能にする。
【０３６６】
媒介形質転換(trans-mediated transformation)
【０３６７】
ファージ宿主域は、しばしば、細胞の表面のレセプターの有無によって決定される。実質的に同一の複製、転写及び翻訳機構を用いる密接な関係がある生命体は、実際には、異なるファージに対して交差耐性を示すことがある。さらに、一部の細菌宿主は他よりも形質転換が容易である。この観点から、遺伝子的に扱いやすい関連の菌種を、ファージバースト(phage bursts)を作るために用いることができる。ファージゲノムＤＮＡは、バースト菌種(burst strain)に形質転換され、所定の期間後に復元され、そのふぉ、ファージ溶解物を、溶解物を更に高い力価の溶解物に伝播するために敏感な宿主に露出する。トランス形質転換(trans-transformation)によって、形質転換可能でない宿主からファージを復元することができる。
【０３６８】
６．最適な特性を有するファージの選択
表現型スクリーニング
【０３６９】
組み換えファージ及び組み換えファージのライブラリを、関心のある表現型を識別するためにスクリーニングすることができる。一部の実施の形態において、例１〜５の方法のスクリーニングステップの一部を省略することができ、表現型スクリーニングを、関心のある組み換えファージの分析として直接用いる。例えば、生体膜除去又は細菌検出のスクリーニング。
【０３７０】
タンパク質生成スクリーニング
【０３７１】
一部の実施の形態において、組み換えファージに存在する異種核酸配列の発現産物の酵素分析は、最適なファージ特性のわかりやすい兆候を与える。例えば、生体膜基質から起始欄を除去するための高レベルのルシフェラーゼ発現又は高レベルのキシラナーゼ発現を有するファージ。
【０３７２】
大抵の生存ファージの選択
【０３７３】
一部の実施の形態において、競争実験は、選択した増殖特性を任意に含む関心のある特性を有するファージを識別する。ファージの混合及び混合感染の末端の優性ファージの復元は、関心のある組合せを有するファージを識別するために、一部の実施の形態において用いられる。
【０３７４】
Ｄ．異種核酸配列をファージゲノムに挿入する部位の選択
ファージゲノムに挿入された異種オープンリーディングフレームの発現は、ファージライフサイクルの発現のタイミング、プロモーター（転写）強度、リボソーム結合部位（転写）強度、ｍＲＮＡの安定性、タンパク質分解率、コドン使用頻度等を含む多くの要因によって影響が及ぼされる。所望の発現特性を有するファージゲノム内の部位を識別及び予測するためにアルゴリズムを用いることができる。
【０３７５】
経験的アルゴリズムは、時間特性の少なくとも一つと絶対発現レベルの両方に対する天然ファージタンパク質発現のプロテオミクスの分析に基づく。例えば、ファージタンパク質にタグを付けることができ、発現レベルを、経時的に及び／又は異なる条件の下で監視することができる。所望の表現形質を示すファージタンパク質が識別される。一部の実施の形態において、ファージタンパク質を、比較的高いレベルで発現させる。一部の実施の形態において、ファージタンパク質を、ファージライフサイクルの比較的長い期間に亘って発現させる。一部の実施の形態において、ファージタンパク質を、カプシド成分のような構造タンパク質とする。一度所望の表現形質を示すファージタンパク質を識別すると、オープンリーディングフレームを備える異種核酸配列を、識別されたタンパク質をコーディングするオープンリーディングフレームを配置し又は所望の表現形質を示すタンパク質のオープンリーディングフレームの下流に異種核酸配列内のオープンリーディングフレームを配置するためにファージゲノムに挿入する。
【０３７６】
ファージゲノム配列内のファージプロモーターを識別するために演算アルゴリズムを用いる。一つのそのようなアルゴリズムは、Lavigne et al, Bioinformatics, Vol. 20, No. 5, pp. 629-635 (2004)で与えられる。周知のプロモーターと相同な配列を示すプロモーターは、特に有益である。その理由は、そのようなプロモーターが所望の機能特性を示しそうであると予測できるからである。内因性ファージゲノム配列のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）強度を、（参照によりここに組み込む）at https://salis.psu.edu/softvva.re/で市販されているＲＢＳ計算機を用いて見積もることができる。高効率を有すると予測されるＲＢＳ配列は、特に有益である。
【０３７７】
ＤＮＡ配列相同を、他のよく特徴付けられたファージにおいて高レベルで発現することが知られているオープンリーディングフレーム（例えば、Ｔ７、Ｔ３、Ｔ４及びラムダファージのオープンリーディングフレーム）を識別するために用いることもできる。一部の実施の形態において、異種核酸配列は、そのようなオープンリーディングフレームを置換し又はそのようなオープンリーディングフレームの下流で置換される。ＤＮＡ配列相同のないことを、必須でなくかつ挿入を許容する可能性が高いオープンリーディングフレームを識別するのに用いることができる。
【０３７８】
多数のファージは、同様なゲノム構造を有する。これらのゲノム構造に基づいて、対象ファージとよく特徴付けられたファージとの間の配列比較を、対象ファージへの異種核酸配列の挿入の位置を識別するために用いる。例えば、Ｔ７類似ファージの初期遺伝子、中期遺伝子及び後期遺伝子が存在し、初期遺伝子、中期遺伝子及び後期遺伝子は、初期遺伝子、中期遺伝子及び後期遺伝子を発現させるとともにゲノムの位置に関連付ける時系列に対応する。したがって、対象ファージ内の相同位置を識別することができ、かつ、異種核酸配列を、識別した位置に挿入することができる。
【０３７９】
マイクロアレイ実験は、配列以外のファージについての情報をほとんど有することなく発現の初期段階、中期段階及び後期段階でどの遺伝子がオンになるかを識別することができる。これは、新規のファージの詳細な発現プロファイルを取得する迅速な方法である。
【０３８０】
ここに開示した方法及びベクターによって、実験的なファージゲノムへの並列な複数の異なる挿入における検査を容易にする。一部の実施の形態において、複数の挿入部位を、異種オープンリーディングフレームを所望の特性によって発現させる挿入部位を実験的に識別するために検査する。一部の実施の形態において、挿入部位はランダムである。一部の実施の形態において、挿入部位は、予め決定された位置である。一部の実施の形態において、検査された挿入部位は、少なくとも一つのランダムな挿入部位と少なくとも一つの予め決定された挿入部位の組合せである。
【０３８１】
一部の実施の形態において、ファージは、ファージゲノム内の異なる部位に配置された複数の挿入された異種核酸配列を備える。一部の実施の形態において、挿入された配列は同一である。一部の実施の形態において、複数の挿入された異種配列は、少なくとも二つの異なる異種配列を備える。一部の実施の形態において、挿入された異種配列は、ファージライフサイクルの異なる段階において異なるレベルで発現するオープンリーディングフレームを備える。
【０３８２】
ファージ溶菌は、ファージゲノムに挿入された異種オープンリーディングフレームの発現の競合因子である。ファージが非常に迅速に宿主細胞を殺す場合、オープンリーディングフレームの発言は、所望のレベルに到達しない。ファージライフサイクルを、異種オープンリーディングフレーム発現を強めるために変更することができる。例えば、（リシン及びホリンのような）溶解タンパク質の発現を、リボソーム結合配列を変更してファージライフサイクルを延ばすとともに溶解を遅延させることによって減少させることができる。一部の実施の形態において、このプロセスを、ファージライフサイクル中の全体の異種オープンリーディングフレーム発現の少なくとも一つ及びファージライフサイクル中の最大オープンリーディングフレーム発現を増大するために用いる。
【０３８３】
Ｅ．改変ファージの収集を行う方法及び改変ファージの収集
ここに開示した方法によって、組み換えファージの様々な収集のハイスループット生成を可能にする。収集を、複数の異なる開始ファージゲノム、複数の挿入された異種核酸配列、及び、開始ファージゲノムへの異種核酸配列の異なる挿入部位のうちの少なくとも一つを含むように選択することができる。
【０３８４】
一態様において、複数の組み換えファージゲノムを作成する方法を提供する。方法は、各々が開始ファージゲノムを含む複数の組み換えベクターを提供することと、複数の組み換えベクターを提供するために複数のベクターの各々の開始ファージゲノムに少なくとも一つの異種核酸配列を挿入することと、複数の組み換えベクターをベクター宿主細胞で繁殖させることと、を有することができる。ベクター宿主細胞を、ファージ宿主細胞とすることができ、又は、ファージ宿主細胞でない細胞とすることができる。
【０３８５】
方法の一部の実施の形態において、複数の組み換えベクターを提供するために少なくとも一つのベクターへの少なくとも一つの開始ファージゲノムの挿入を可能にする条件下で、少なくとも一つの分離した開始ファージゲノム及び少なくとも一つのベクターを、複数のファージベクター宿主細胞に同時形質転換することと、少なくとも一つのベクターへの少なくとも一つの開始ファージゲノムの挿入の結果として、複数の組み換えベクターを含むファージベクター宿主細胞を選択することと、を有する方法によって、各々が開始ファージゲノムを備える複数の組み換えベクターを作成する。
【０３８６】
方法の一部の実施の形態において、複数の組み換えベクターを提供するために少なくとも一つのベクターへの少なくとも一つの開始ファージゲノムの挿入を可能にする条件下で、少なくとも一つの分離した開始ファージゲノムを、複数のファージベクター宿主細胞に形質転換することと、少なくとも一つのベクターへの少なくとも一つの開始ファージゲノムの挿入の結果として、複数の組み換えベクターを含むベクター宿主細胞を選択することと、を有する方法によって、各々が開始ファージゲノムを備える複数の組み換えベクターを作成する。
【０３８７】
他の態様において、複数の組み換えファージゲノムを作成する他の方法を提供する。方法は、少なくとも一つの開始ファージゲノムを提供することと、複数の組み換えファージを提供するために少なくとも一つの開始ファージゲノムの各々に異種核酸配列を挿入することと、異種核酸配列を備える複数の組み換えファージゲノムを含む複数の組み換えベクターを提供するために少なくとも一つのベクターへの複数の組み換えファージゲノムを取得することと、少なくとも一つの異種核酸配列を備える組み換えファージゲノムを含む複数の組み換えベクターをベクター宿主細胞で培養させることと、を有し、ベクター宿主細胞を、ファージ宿主細胞としない。
【０３８８】
方法の一部の実施の形態において、少なくとも一つの異種核酸配列を備える複数の組み換えファージゲノムを、ベクターにおける取得前に選択する。
【０３８９】
一部の実施の形態において、複数の組み換えファージゲノムを分離することと、複数の組み換えベクターを提供するために少なくとも一つのベクターへの複数の組み換えファージゲノムの挿入を可能とする条件の下で、分離した複数の組み換えファージゲノム及び少なくとも一つのベクターを複数のベクター宿主細胞に同時形質転換することと、ベクターへの少なくとも一つの組み換えファージゲノムの挿入の結果として、組み換えベクターを含む複数のベクター宿主細胞を選択することと、を有する方法によって、複数の組み換えファージゲノムを、少なくとも一つのベクターにおいて取得する。
【０３９０】
一部の実施の形態において、複数の組み換えファージゲノムを分離することと、複数の組み換えベクターを提供するために少なくとも一つのベクターへの複数の組み換えファージゲノムの挿入を可能とする条件の下で、分離した複数の組み換えファージゲノムを、各々が少なくとも一つのベクターを含む複数のベクター宿主細胞に形質転換することと、ベクターへの複数の組み換えファージゲノムの挿入の結果として、組み換えベクターを含む複数のベクター宿主細胞を選択することと、を有する方法によって、複数の組み換えファージゲノムを、少なくとも一つのベクターにおいて取得する。
【０３９１】
一部の実施の形態において、方法は、選択したベクター宿主細胞から複数の組み換えベクターを分離することを更に備える。
【０３９２】
方法を、各々が組み換えファージゲノムを含む複数のファージを作成するために用いることができる。
【０３９３】
一部の実施の形態において、複数の組み換えベクターは、複数の異なる異種核酸配列を備える。異種核酸配列は、一つ以上の方法で異なることができる。例えば、異種核酸配列は、異なる生成物を有する異なるオープンリーディングフレームを備えることができる。代わりに又は追加して、異種核酸配列は、異なる方法、例えば、発現の異なる最大レベルで又はファージ感染ライフサイクル中の異なる時間的プロファイルでオープンリーディングフレームの発現を管理する異なる発現制御配列を備えることができる。例えば、発現制御配列は、プロモーター又はリボソーム結合部位において異なることができる。異種核酸配列は、長さ又はヌクレオチド組成において異なることができる。一部の実施の形態において、複数の異種挿入配列は、それぞれが他の配列とそれぞれ少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％又は少なくとも５０％だけヌクレオチドレベルで異なる配列から成る。一部の実施の形態において、複数の異種挿入配列は、オープンリーディングフレームを備える配列から成り、オープンリーディングフレームは、それぞれが他のオープンリーディングフレームとそれぞれ少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％又は少なくとも５０％だけヌクレオチドレベルで異なる。一部の実施の形態において、複数の異種挿入配列は、オープンリーディングフレームを備える配列から成り、オープンリーディングフレームは、それぞれが他のオープンリーディングフレームコーディング生成物とそれぞれ少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％又は少なくとも５０％だけアミノ酸レベルで異なる生成物をコーディングする。
【０３９４】
一部の実施の形態において、複数の組み換えベクターは、複数の異なる異種核酸配列を備え、少なくとも５個の異なる異種核酸配列が、複数の組み換えベクターに存在する。一部の実施の形態において、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個又は少なくとも５００個の異なる異種核酸配列が、複数の組み換えファージベクターに存在する。
【０３９５】
一部の実施の形態において、複数の組み換えベクターは、少なくとも２タイプの組み換えファージゲノムを備え、異種核酸配列を、異なる位置に挿入する。一部の実施の形態において、複数のベクターに存在する組み換えファージゲノムは、同一の開始ファージゲノムに基づく。したがって、そのような実施の形態において、異種配列を、同一のファージゲノムの異なる部位に挿入する。他の実施の形態において、複数のベクターに存在する組み換えファージゲノムは、少なくとも二つの異なる開始ファージゲノムに基づく。
【０３９６】
一部の実施の形態において、複数の組み換えファージゲノムは、少なくとも５タイプの組み換えファージゲノムを備え、異種核酸配列を、異なる位置に挿入する。一部の実施の形態において、複数の組み換えファージゲノムは、少なくとも１０タイプ、少なくとも１５タイプ、少なくとも２０タイプ、少なくとも２５タイプ、少なくとも３０タイプ、少なくとも３５タイプ、少なくとも４０タイプ、少なくとも４５タイプ、少なくとも５０タイプ、少なくとも６０タイプ、少なくとも７０タイプ、少なくとも７５タイプ、少なくとも８０タイプ、少なくとも８５タイプ、少なくとも９０タイプ、少なくとも９５タイプ、少なくとも１００タイプ、少なくとも２００タイプ、少なくとも３００タイプ、少なくとも４００タイプ又は少なくとも５００タイプの組み換えファージゲノムを備え、異種核酸配列を、異なる位置に挿入する。
【０３９７】
一部の実施の形態において、複数のベクターの各々の異種核酸配列の少なくとも一部を、第２の異種核酸配列に置換し、第２の異種核酸配列は、第１の異種核酸配列に対する挿入、欠失及び置換の少なくとも一つを備え、これによって、各々が異なる第２の異種配列を備える複数の異なるベクターを提供する。一部の実施の形態において、複数の組み換えベクターは、複数の異なる第２の異種核酸配列を備え、少なくとも５個の異なる第２の異種核酸配列が、複数の組み換えベクターに存在する。一部の実施の形態において、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個又は少なくとも５００個の異なる第２の異種核酸配列が、複数の組み換えファージベクターに存在する。
【０３９８】
組み換えファージゲノム及び／又は組み換えゲノムを含む組み換えファージの収集も提供する。収集は、組み換えファージゲノムと、組み換えゲノムを有するファージと、を有し、組み換えゲノムは、少なくとも一つの開始ファージゲノムと、少なくとも一つの異種挿入配列と、少なくとも一つの開始ゲノムへの少なくとも一つの異種挿入配列の挿入の少なくとも一つの部位と、を備える。一部の実施の形態において、収集は、少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，５００又は１０００の異なるタイプの開始ファージゲノムを含む。一部の実施の形態において、収集は、少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，５００又は１０００の異なるタイプの異種挿入配列を含む。一部の実施の形態において、収集は、少なくとも一つの開始ゲノムの少なくとも一つの異種挿入配列の挿入の少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，５００又は１０００の異なる部位を有する。したがって、一部の実施の形態において、単一の異種挿入配列を、同一の開始ファージゲノムの少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，５００又は１０００の異なる部位に挿入する。他の実施の形態において、２個以上の異種挿入配列が収集において存在し、及び／又は、２個以上の開始ファージゲノムが存在し、収集において存在するファージゲノムへの異種核酸配列の挿入の少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，２０，３０，４０，５０，６０，７０，８０，９０，１００，５００又は１０００の異なる部位が存在する。
【０３９９】
一部の実施の形態において、組み換えファージゲノムの収集はファージ粒子にパッケージされない。例えば、一部の実施の形態において、組み換えファージゲノムの収集は、ＹＡＣのようなベクターにおいて存在する。一部の実施の形態において、ベクターは、分離又は精製された形態で蓄積される。他の実施の形態において、ベクターは、冷凍グリセロールストック又は固体培地若しくは液体培地での成長のような任意の形態をとることができる酵母のようなベクター宿主細胞に存在する。
【０４００】
一部の実施の形態において、組み換えファージゲノムの収集は、ファージ粒子にパッケージされる。
【０４０１】
一部の実施の形態において、収集の全て又はほとんどすべての要素(members)は、ファージ粒子を含む液体培養又は異なる酵母細胞のライブラリを含む液体培養のように混合して存在する。他の実施の形態において、収集の全て又はほとんどすべての要素を、例えば、異なる培養又は異なる冷凍グリセロールストックにおいて、互いに分離して蓄積する。
【０４０２】
一部の実施の形態において、ファージ又はファージ染色体の収集を、一つ以上の特徴を共有する収集の一部を識別するためにスクリーニングする。例えば、収集が、異なる開始ファージからのファージゲノムを備える場合、収集を、特定のタイプ又はタイプの組合せの細菌を感染させることができる収集の要素を識別するためにスクリーニングすることができる。代わりに、収取を、所定のレベルより上で異種オープンリーディングフレーム生成物を発現する収集の要素を識別するためにスクリーニングすることができる。
【０４０３】
実施例
実施例１：クローニング及び遺伝子組み換えファージのためのＹＡＣ系
１．ファージ取得
【０４０４】
Ｔ３をクローン化するとともに以下のようにして捜査した。Ｔ３を、宿主としての大腸菌ＤＨ１０Ｂを用いて成長させ、Ｌ培地（ＬＢ）＋２ｍＭ塩化カルシウムにおいて成長させた。ファージ溶解物を、１０％ポリエチレングリコール８０００を用いた４℃での一晩の培養及びそれに続く遠心分離によって濃縮した。ペレットを、ＳＭバッファにおいて再懸濁した(resuspended)(Maniatis)。ＤＮＡを、ＮｏｒｇｅｎのファージＤＮＡキット(Cat# 46700 http://www.norgenbiotek.com/display-product.php?ID=383)を用いて、濃縮したＴ３溶解物から作った。Ｔ３ (NCBI accession #NC_003298)のゲノム配列（www.invitrogen.comで入手可能である配列）を、ｐＹＥＳ１ＬにおいてＴ３を取得するようオリゴを設計するために用いた。
【０４０５】
オリゴを、コンピテントＭａＶ２０３に形質転換した。形質転換した細胞を、ｐＹＥＳＩＬのＴＲＰマーカーのために選択するトリプトファンを用いることなく完全合成培地に配置した。完全合成−ウラシル培地で成長したコロニーを、成功した取得を示すためにＰＣＲによってスクリーニングした。
【０４０６】
２．ＹＡＣ−プラーク
【０４０７】
ガラスビーズ溶解物を作り（Invitrogen（登録商標）のHigh-Order Genetic Assemblyキット）、ＴＯＰ１０大腸菌に対するエレクトロポレーションを行った。形質転換を、寒天のＬＢ＋２ｍＭ塩化カルシウムと混合し、ＬＢ＋２ｍＭ塩化カルシウム寒天プレートに配置する。一晩の培養は、取得したファージに対応するプラークが明らかになる。取得したファージは、典型的には、変換ごとに１×１０２〜１×１０４のプラークを生成した。
【０４０８】
３．ルシフェラーゼ挿入
【０４０９】
以下の挿入を行った。Ｔ３：：０．７ｌｕｅ、Ｔ３：：０．７ＤＲｌｕｃ、Ｔ３：：４．３ＤＲｌｕｃ及びＴ３：：０．７ＩｃｅｕＬｕｃ。複数の遺伝的構造を、蛍ルシフェラーゼを含むファージＴ３に組み込んだ。これらは、無傷ルシフェラーゼを含むカセット、それに続くＵＲＡ３を含むカセット及びそれに続くルシフェラーゼの小断片を含むカセットとして組み込まれた。これらのカセットは、三つのＰＣＲ産物として増幅され、第１のＰＣＲ産物は、ルシフェラーゼ及びファージの部位に対する隣接相同を含み、第２のＰＣＲ産物は、他の二つのＰＣＲ産物に対する隣接相同を有するＵＲＡ産物を含み、第３のＰＣＲ産物は、ルシフェラーゼの断片及びファージ染色体の異なる部位に対する相同を含む。
【０４１０】
各ケース（０．７遺伝子部位及び４．３遺伝子部位）において、３個のＰＣＲ産物を作成し、上述したように、Ｔ３−ＹＡＣを含む酵母に同時形質転換した。ウラシルのない状態で成長したコロニーを、カセットの存在のためにＰＣＲによってスクリーニングした。ＰＣＲにより陽性だったコロニーに対して、生存ファージを復元するために（上述した）ＹＡＣ−プラーク技術を適用した。これらのファージを、カセットの存在のためにＰＣＲによって順次スクリーニングした。
【０４１１】
Ｔ７ｌｕｃを、少し異なる方法で作った。Ｔ７ｄｓｐＢ（T. K. Lu and J. J. Collins, "Dispersing Biofilms with Engineered Enzymatic Bacteriophage," Proceedings of the National Academy of Sciences, vol. 104, no. 27, pp. 11197-11202, July 3, 2007）を、二つの二重オリゴ(duplex oligos)を用いて、Ｔ７ｄｓｐＢ，ｐＹＥＳＩＬのゲノムＤＮＡの形質転換によりｐＹＥＳＩＬにおいて取得した。
【０４１２】
これらは、上述したように、酵母に同時形質転換される。Ｔ７ファージは、上述したように、ＴＡＣ−プラークができることを示した。Ｔ７−ｄｓｐＢ  ＹＡＣを、ガラスビーズ溶解物によって精製し、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて切断した。ルシファーゼを、ＰＣＲによって増幅した。
【０４１３】
二重オリゴを、ＨｉｎｄＩＩＩ切断ＹＡＣ主鎖を修復するためにも作成した。切断ファージ−ＹＡＣ、ルシフェラーゼＰＣＲ産物及び二重修復オリゴは、酵母に同時形質転換され、トリプトファンのない培地で選択され、その結果、ＴＲＰ＋コロニーとなった。改変ファージ−ＹＡＣは、ＰＣＲによって確認され、上述したように、ＹＡＣ−プラーク技術によってファージ粒子に形質転換された。
【０４１４】
４．ファージ発現
【０４１５】
大腸菌細胞の一晩培養を、１／１００に希釈し、ＬＢ＋１ｍＭ塩化カルシウムにおいて中期対数期（約２時間半）で成長させた。細胞を、示すように希釈し、合計で１００ｕｌの膨大なファージ（感染ごとに１×１０７個のファージ）に感染させた。感染は、３７℃で震えなく開始することができた。９０分後、１００ｕｌのＰｒｏｍｅｇａのＳｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼ検出試薬を、２ｕＬの感染に加え、感染を、ＰｒｏｍｅｇａのＧｌｏＭａｘ（登録商標）２０／２０で即座に読み出した。異なる改変ファージは、発現レベルの一部の変動を示したが、Ｔ７：：Ｌｕｃ、Ｔ３：：０．７Ｌｕｃ、Ｔ３：：ＤＲＬｕｃ、Ｔ３：：４．３ＤＲＬｕｃ及びＴ３：：０．７ＩｃｅｕＩＬｕｃは全て、検出可能なレベルのルシフェラーゼを発現させた。
【０４１６】
実施例２：改変ファージを有する細菌の検出
本実施の形態において、比較的少数の大腸菌ＮＥＢ−１０β細胞を、３×１０８ＰＦＵ／ｍＬの改変バクテリオファージＴ３：：０．７ｌｕｃに混合し、ルシフェラーゼ生成物を、２０μＬの溶解物を除去するとともにそれを１００ｕＬのルシフェリン含有検出試薬に結合することによって１時間に１０分ごとに測定した（図１１）。三つの異なる濃度の細胞を３通りで作った。各サンプルに存在する細菌の数を、３通りの組合せサンプル(matched sample in triplicate)において１０倍段階希釈（１００から１０−８までの１０倍希釈）を用いる実験後に決定した。当該方法を用いることによって、実験サンプルを、６（±４．６）個の細胞、６０（±４５．８）個の細胞及び６００（±４５８．０）個の細胞の大腸菌の濃度を有するように決定した。二つの高濃度（６０個及び６００個）に対して、サンプルの最大光生成を、ファージの付加後に４０分観察した。しかしながら、２０分及び３０分において検出の下限より上の検出可能な信号も測定した。最低濃度（６個の細胞）に対して、最大信号を、ファージの付加後に３０分観察した。
【０４１７】
検出をプロメガ株式会社の２０／２０シングルチューブ照度計(20/20 single-tube luminometer)及びプロメガ株式会社のルシフェラーゼ分析キット試薬(Luciferase Assay Kit reagents)を用いて実行する。要約すると、２０ｕＬのファージ感染を含むチューブを、照度計の内側に配置し、１００ｕＬのルシフェラーゼアッセイサブストレート(Luciferase Assay Substrate)（ＡＴＰ、ルシフェリン及び安定剤を含む専売溶液(proprietary solution)）を、合計で１２０μＬ付加する。光生成を、１０の統合(10s integration)によって取得した。
【０４１８】
検出の下限（１１３．７ＲＬＵ）を、適切な濃度の基質（ルシフェリン）と混合したファージ含有（３×１０８ＰＦＵ／ｍＬ）培地（ＬＢ）を測定することによって決定した。下限を、１０サンプルの平均（９８．６ＲＬＵ）に標準偏差（ＳＤ＝５．０６ＲＬＵ）の３倍を加算したものに設定した。
【０４１９】
実施例３：改変ファージを有する細菌の検出
この実験を、Ｔ３：：０．７ｌｕｃ／大腸菌対合(E.coil. pairing)の検出のための最小時間を決定するように設計及び実行した。
【０４２０】
大腸菌（２．５×１０７ＣＦＵ／ｍＬ）の対数期培地を、３×１０８ＰＦＵ／ｍＬのＴ３：：０．７ｌｕｃによって感染させ、微細間において２０μＬの分割量に分割した。１０分ごとに、３回の読出しを、プロメガ株式会社のルシフェラーゼ検出試薬を１００μＬ付加することによるこれらの分割量からの光生成を測定することによって行う。結果を図１２に示す。
【０４２１】
培地を感染後に１０分ごとに測定すると検出のための大きな信号（５１．３９３±２８．１５２ＲＬＵ）が存在することを発見した。上述した実験であるように、最大の信号を生成するまでの時間が４０分だった。
【０４２２】
１０分の時点から遡って推定すると、これらのデータは、５分での検出を意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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