(57)【要約】  乳癌における予後および治療診断のマーカーとしての、近接ライゲーションアッセイによるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋ複合体の検出。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗エストロゲン剤による治療ならびにＳｒｃ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に応答する見込みのある乳癌を識別するための、あるいは、患者において乳癌の予後を判定するための方法であって、下記の工程：
ａ．前記患者から予め採取された乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを測定する工程と、
ｂ．前記癌細胞の細胞質においてＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体が過剰発現される場合に、前記乳癌を抗エストロゲン剤による治療ならびにＳｒｃ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に応答する見込みがある、あるいは、予後不良であるとして分類する工程と
を含んでなる、方法。
【請求項２】
工程ｂ）において、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、健常な乳房組織におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルの中央値と比較する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ）において、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、乳房腫瘍サンプルにおけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルの中央値と比較する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記乳癌がＥＲ＋として分類されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記乳癌が、ＥＲ−として分類されており、かつ、抗エストロゲン剤による治療ならびにＳｒｃ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に応答する見込みがあるとして分類される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗Ｓｒｃ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／Ｓｒｃタンパク質複合体を検出することによって、および／または、抗ＥＲα抗体および抗ＰＩ３Ｋ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体を検出することによって測定する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記患者から予め採取された乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを測定することにより、患者において乳癌の予後を判定するための、あるいは、抗エストロゲン剤による治療ならびにＳｒｃ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に応答する見込みのある乳癌を識別するための方法において使用するための、抗ＥＲα抗体および抗Ｓｒｃ抗体ならびに／または抗ＥＲα抗体および抗Ｓｒｃ抗体を含んでなる組成物。
【請求項８】
ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗Ｓｒｃ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／Ｓｒｃタンパク質複合体を検出することによって、および／または、抗ＥＲα抗体および抗ＰＩ３Ｋ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体を検出することによって測定する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
乳癌患者の治療方法において使用するための、Ｓｒｃ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤を含んでなる組成物であって、前記使用が、下記の工程：
ａ．前記患者から予め採取された乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを測定する工程と、
ｂ．前記癌細胞の細胞質において前記ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体が過剰発現される乳癌腫瘍を有する乳癌患者を選択する工程と、
ｃ．治療上有効な量のＳｒｃ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤を前記患者に投与する工程と
を含んでなる、組成物。
【請求項１０】
工程ｃ）において、前記Ｓｒｃ阻害剤および／または前記ＰＩ３Ｋ阻害剤を抗エストロゲン剤と組み合わせて投与する、請求項９に記載の、乳癌患者の治療方法において使用するための組成物。
【請求項１１】
工程ａ）において、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗Ｓｒｃ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／Ｓｒｃタンパク質複合体を検出することによって測定し、かつ／または、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗ＰＩ３Ｋ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体を検出することによって測定する、請求項９または１０に記載の、乳癌患者の治療方法において使用するための組成物。
【請求項１２】
前記乳癌がＥＲ＋として分類されている、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の、乳癌患者の治療方法において使用するための組成物。
【請求項１３】
前記乳癌がＥＲ−として分類されている、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の、乳癌患者の治療方法において使用するための組成物。
【請求項１４】
治療を必要とする乳癌患者の治療方法であって、下記の工程：
ａ．前記癌細胞の細胞質において前記ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体が過剰発現される乳癌腫瘍を有する乳癌患者を選択する工程と、
ｂ．治療上有効な量のＳｒｃ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤を前記患者に投与する工程と
を含んでなる、方法。
【請求項１５】
工程ｃ）において、前記Ｓｒｃ阻害剤および／または前記ＰＩ３Ｋ阻害剤を抗エストロゲン剤と組み合わせて投与する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
前記乳癌がＥＲ＋として分類されている、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記乳癌がＥＲ−として分類されている、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を用いることにより、前記患者から予め採取された乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを測定することによって前記患者を選択する、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌の予後を判定するための方法、抗エストロゲン剤による治療およびＳｒｃ／ＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に応答する見込みのある乳癌を識別するための方法、ならびに乳癌患者の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌の発生および進行においてＥＲαが果たす重要な役割から、エストロゲンシグナル伝達経路が深く研究されている。乳癌に対する現在の内分泌療法は、主として、ＥＲαシグナル伝達経路の標的化、すなわち、アロマターゼ阻害剤によるエストロゲン存在量の減少、タモキシフェンおよびラロキシフェンによるＥＲα機能の拮抗、またはフルベストラントによるＥＲα発現のダウンレギュレーションに基づいている。しかしながら、内分泌療法に対する抵抗性は、乳癌治療の成功への大きな障害の１つである(Musgrove and Sutherland, 2009)。治療に対する抵抗性を予測するマーカーを見つけることが実際に必要とされている。今のところ、核におけるＥＲα発現が、現在唯一知られている、内分泌療法に対する応答のバイオマーカーである。結果として、非ゲノム的なＥＲαシグナル伝達は、臨床現場で評価されていない。本発明者らはこれまでに、アルギニンメチルトランスフェラーゼＰＲＭＴ１によるアルギニン２６０でのＥＲαのメチル化は、Ｓｒｃ、ＰＩ３Ｋおよび接着斑キナーゼ(the Focal Adhesion Kinase)（ＦＡＫ）との会合だけでなく、その下流エフェクターＡｋｔの活性化の必要条件であることを報告した(Le Romancer M. et al., 2010；Le Romancer M. et al., 2008)。さらに、本発明者らは、この修飾は、正常乳房上皮細胞の細胞質で起こり、乳房腫瘍の一部で発現が高いことを示している。しかしながら、本発明者らは、一連の１６４例の乳癌においてＥＲαのメチル化と患者の生存との間に相関関係を見出していない(Le Romancer M. et al., 2008)。
【０００３】
チロシンキナーゼＳｒｃはまた、潜在的な標的と考えられており、ダサチニブまたはボスチニブのようなＳｒｃ阻害剤は、第ＩＩ相臨床試験において試験されている(Araujo and Logothetis, 2010)。しかしながら、これまでのところ、効果は極めて期待に反するものであった。実際には、単剤として使用されるダサチニブは、ＴＮＢＣの患者、またはあらゆる治療を受けた(heavily treated)転移性乳癌の患者では活性が制限され、それは、ＥＲ陽性腫瘍を進行させる。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究は、抗エストロゲン剤とＳｒｃ阻害剤の組合せが成長阻害を増強することを示している。さらに、ダサチニブと他の療法とを組み合わせるために、臨床試験が行われている。
【０００４】
しかしながら、いくつかの臨床試験によって満足な結果が得られたとしても、これらの阻害剤を単独でまたは組み合わせてどの患者が恩恵を受け得るかを予測するバイオマーカーを同定する必要性が実際に残されている。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本発明の第１の目的は、患者において乳癌の予後を判定するための方法であって、下記の工程：
ａ）前記患者から予め採取された乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを測定する工程と、
ｂ）前記癌細胞の細胞質においてＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体が過剰発現される場合に、前記乳癌を予後不良であるとして分類する工程と
を含んでなる方法である。
【０００６】
好ましい実施態様では、前記乳癌はＥＲ＋として分類されている。
【０００７】
好ましくは、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗Ｓｒｃ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／Ｓｒｃタンパク質複合体を検出することによって測定し、かつ／またはＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗ＰＩ３Ｋ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体を検出することによって測定する。
【０００８】
一実施態様では、工程ｂ）において、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、健常な乳房組織におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルの中央値と比較する。
【０００９】
別の実施態様では、工程ｂ）において、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、乳房腫瘍サンプルにおけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルの中央値と比較する。
【００１０】
本発明の別の目的は、抗エストロゲン剤による治療ならびにＳｒｃ阻害剤(Src inbitors)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に応答する見込みのある乳癌を識別するための方法であって、下記の工程：
ａ）前記患者から予め採取された乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを測定する工程と、
ｂ）前記癌細胞の細胞質において前記ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体が過剰発現される場合に、前記乳癌を抗エストロゲン剤による治療ならびにＳｒｃ阻害剤(Src inbitors)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に応答する見込みがあるとして分類する工程と
を含んでなる方法である。
【００１１】
一実施態様では、前記乳癌はＥＲ＋として分類されている。
【００１２】
別の実施態様では、前記乳癌はＥＲ−として分類されている。
【００１３】
好ましくは、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗Ｓｒｃ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／Ｓｒｃタンパク質複合体を検出することによって測定し、かつ／またはＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗ＰＩ３Ｋ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体を検出することによって測定する。
【００１４】
本発明はさらに、乳癌患者の治療方法において使用するための、Ｓｒｃ阻害剤(Src inbitor)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤を含んでなる組成物であって、前記使用が、下記の工程：
ａ）前記患者から予め採取された乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを測定する工程と、
ｂ）前記癌細胞の細胞質において前記ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体が過剰発現される乳癌腫瘍を有する乳癌患者を選択する工程と、
ｃ）治療上有効な量のＳｒｃ阻害剤(Src inbitor)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤を前記患者に投与する工程と
を含んでなる、組成物に関する。
【００１５】
好ましくは、工程ｃ）において、前記Ｓｒｃ阻害剤(Src inbitor)および／または前記ＰＩ３Ｋ阻害剤を抗エストロゲン剤と組み合わせて投与する。
【００１６】
好ましくは、工程ａ）において、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗Ｓｒｃ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／Ｓｒｃタンパク質複合体を検出することによって測定し、かつ／またはＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗ＰＩ３Ｋ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体を検出することによって測定する。
【００１７】
一実施態様では、前記乳癌はＥＲ＋として分類されている。
【００１８】
別の実施態様では、前記乳癌はＥＲ−として分類されている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＭＣＦ−７細胞における内因性ＥＲα／ＰＩ３ＫおよびＥＲα／Ｓｒｃ相互作用のｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡ検出に関する図である。
【図２】図２は、ＭＣＦ−７細胞におけるＥＲα／ＰＩ３ＫおよびＥＲα／Ｓｒｃ相互作用の経時的推移に関する図である。
【図３】図３は、タモキシフェン処置時のＥＲα／ＰＩ３ＫおよびＥＲα／Ｓｒｃ相互作用のｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡ検出に関する図である。
【図４】図４は、ｓｉＥＲαを用いたＥＲα／ＰＩ３ＫおよびＥＲα／Ｓｒｃ相互作用の制御に関する図である。
【図５】図５は、ＭＣＦ−７細胞における内因性ＦＡＫ／ＳｒｃおよびＦＡＫ／ＥＲα相互作用のｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡ検出に関する図である。
【図６】図６は、ｓｉＰＲＭＴ１を用いたＥＲα／ＰＩ３ＫおよびＥＲα／Ｓｒｃ相互作用の制御に関する図である。
【図７】図７は、ＰＰ１およびＬＹ２９４００２による処置時のＥＲα／ＰＩ３ＫおよびＥＲα／Ｓｒｃ相互作用のｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡ検出に関する図である。
【図８】図８は、ペプチド処置時のＥＲα／ＰＩ３ＫおよびＥＲα／Ｓｒｃ相互作用のｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡ検出に関する図である。
【図９】図９は、ヒト乳癌細胞株における内因性ＥＲα／ＰＩ３ＫおよびＥＲα／Ｓｒｃ相互作用のｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＬＡ検出に関する図である。
【図１０】図１０は、ヒト正常乳房組織（ｎ＝３）におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋ複合体の発現に関する図である。
【図１１】図１１は、ＥＲα／Ｓｒｃ、ＥＲα／ＰＩ３ＫおよびＥＲα／ｍＥＲαデータの分布に関する図である。
【図１２】図１２は、種々のマーカーとｐ−Ａｋｔとの相関分析に関する図である。
【図１３】図１３は、ＥＲα／Ｓｒｃ発現群による臨床パラメーターの分布に関する図である。
【図１４】図１４は、ＥＲα／ＰＩ３Ｋ発現群による臨床パラメーターの分布に関する図である。
【図１５】図１５は、ＥＲα／ｍＥＲα発現群による臨床パラメーターの分布に関する図である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＥＲα／Ｓｒｃ発現群によるＤＦＳのカプラン・マイヤー推定値に関する図である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＥＲα／Ｓｒｃ発現群によるＤＦＳのカプラン・マイヤー推定値に関する図である。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、ＥＲα／Ｓｒｃ発現群によるＤＦＳのカプラン・マイヤー推定値に関する図である。
【図１７】図１７は、ＥＲα／Ｓｒｃを統合する多変量Ｃｏｘモデルに関する図である。
【図１８】図１８は、ＥＲα／Ｓｒｃ発現群によるＯＳのカプラン・マイヤー推定値に関する図である。
【図１９Ａ】図１９Ａは、ＥＲα／ＰＩ３Ｋ発現群によるＤＦＳのカプラン・マイヤー推定値に関する図である。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、ＥＲα／ＰＩ３Ｋ発現群によるＤＦＳのカプラン・マイヤー推定値に関する図である。
【図１９Ｃ】図１９Ｃは、ＥＲα／ＰＩ３Ｋ発現群によるＤＦＳのカプラン・マイヤー推定値に関する図である。
【図２０】図２０は、ＥＲα／ＰＩ３Ｋ発現群によるＯＳのカプラン・マイヤー推定値に関する図である。
【図２１】図２１は、ＥＲα／ＰＩ３Ｋを統合する多変量Ｃｏｘモデルに関する図である。
【図２２Ａ】図２２Ａは、ＤＦＳに関する、ｍＥＲα／ＥＲα発現群全体集団の患者転帰のカプラン・マイヤー推定値（カットオフ値は１細胞当たり３スポット）に関する図である。
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、ＯＳに関する、ｍＥＲα／ＥＲα発現群全体集団の患者転帰のカプラン・マイヤー推定値（カットオフ値は１細胞当たり３スポット）に関する図である。
【発明の具体的説明】
【００２０】
発明の詳細な説明
メチル化型のＥＲαは、乳房細胞の細胞質で検出され、乳房腫瘍の一部で発現が高い。しかしながら、このメチル化レベルは乳癌の予後マーカーではない。本発明は、乳房腫瘍細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋ複合体の過剰発現が乳癌患者の予後不良と関連していることを明確に示す。
【００２１】
本発明は、患者において乳癌の予後を判定するための方法に関連する。
【００２２】
本発明はまた、抗エストロゲン剤による治療ならびに／またはＳｒｃ阻害剤および／もしくはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に応答する見込みのある乳癌を識別するための方法を対象とする。
【００２３】
好ましくは、本発明の方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ法である。
【００２４】
用語「ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋ複合体」は、タンパク質複合体における３つの異なるタンパク質の会合を意味する。このタンパク質複合体は、乳房細胞の細胞質中および乳房腫瘍細胞の細胞質中で報告されている。
【００２５】
用語「ＥＲα」は、ＥＳＲ１遺伝子（ＨＧＮＣ  ＩＤ＝ＨＧＮＣ：３４６７）によりコードされるヒトエストロゲン受容体タンパク質を意味する。
【００２６】
用語「Ｓｒｃ」は、ＳＲＣ遺伝子（ＨＧＮＣ：１１２８３）によりコードされるヒトチロシンキナーゼを意味する。
【００２７】
用語「ＰＩ３Ｋ」は、ＰＩＫ３Ｒ１遺伝子（ＮＭ＿１８１５２３）によりコードされるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ調節サブユニットを意味する。
【００２８】
本発明は、乳房腫瘍細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の検出に基づく。より好ましくは、本発明は、乳房腫瘍細胞の細胞質におけるタンパク質ＥＲαとＳＲＣの間の相互作用の検出、および／またはタンパク質ＥＲαとＰＩ３Ｋとの間の相互作用の検出に基づく。
【００２９】
これらのタンパク質間での相互作用または複合体形成は、任意の適当な方法によって検出および測定することができる。タンパク質複合体の形成をもたらすタンパク質間での相互作用を検出および測定するために、様々な方法が当業者に知られている。本発明では、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、好ましくは、抗ＥＲα抗体および抗Ｓｒｃ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイ（ＰＬＡ）によりＥＲα／Ｓｒｃタンパク質複合体を検出することによって測定し、かつ／またはＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗ＰＩ３Ｋ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体を検出することによって測定する。
【００３０】
当業者に公知の方法による近接ライゲーションアッセイでは、任意の適当な抗体を使用してよい。ＥＲα、ＳｒｃおよびＰＩ３Ｋに対する抗体は様々な商業的供給者から入手可能である。ＰＩ３Ｋについては、Ａｂｃａｍ（商標）により参照番号Ａｂ２２６５３として市販されている抗体を使用してよい。Ｓｒｃ（Ｂ１２）については、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（商標）により参照番号Ｓｃ−８０５６として市販されている抗体を使用してよい。ＥＲαについては、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（商標）により参照番号Ｓｃ−５４２として市販されている抗体を使用してよい。
【００３１】
用語「サンプル」は、組織サンプル、細胞サンプルまたは腫瘍サンプルを含む、患者から取得／採取された任意の生体サンプルを意味する。本発明では、前記サンプルは癌または腫瘍細胞を含有する乳房腫瘍サンプルである。好ましい実施態様では、前記乳房腫瘍サンプルは原発性腫瘍サンプルである。
【００３２】
用語「癌」は、細胞群が制御されない成長／増殖、浸潤および時には転移を呈するあらゆる疾患を意味する。
【００３３】
本発明の方法では、前記ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋ複合体の発現レベルを、好ましくは、対照サンプルと比較する。いくつかの実施態様では、前記対照サンプルは、健常な乳房組織において観察されるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋ複合体の発現レベルの中央値である。より有利には、前記対照サンプルは、乳癌を有する患者から採取された腫瘍サンプル、より好ましくは、原発性乳房腫瘍サンプルにおけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋ複合体の発現レベルの中央値である。
【００３４】
別の実施態様では、前記対照サンプルは、ＥＲ＋（ＥＲ陽性）乳房腫瘍、より好ましくは、ＥＲ＋原発性乳房腫瘍における前記ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋ複合体の発現レベルの中央値である。
【００３５】
別の実施態様では、前記対照サンプルは、ＥＲ−（ＥＲ陰性）乳房腫瘍、より好ましくは、ＥＲ−原発性乳房腫瘍における前記ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋ複合体の発現レベルの中央値である。
【００３６】
ＥＲステータスは、エストロゲン受容体（ＥＲα）の有無に基づいた従来の乳癌マーカーである。一般には、ＥＲ＋乳癌は、予後が「より良好」であるとして分類される。受容体ステータスは、当業者に周知の古典的な方法によって判定してよい。ＥＲ＋サブクラスの乳癌は、予後「良好」であると見なされるが、これらの患者の多くは乳癌の再発を経験する。ＥＲ＋サブクラスに属する乳房腫瘍または乳癌患者は、通常、抗エストロゲン剤／ホルモン療法のために選ばれるか、または前記療法に適していると見なされる。
【００３７】
本発明は、予後不良であり、かつ抗エストロゲン剤ならびにＳｒｃ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤の両方による治療に応答する見込みが高いＥＲ＋乳癌を識別するための方法を対象とする。
【００３８】
本発明はまた、予後不良であり、かつ抗エストロゲン剤ならびにＳｒｃ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤の両方による治療に応答する見込みが高いＥＲ−乳癌を識別するための方法を対象とする。ＥＲ−乳癌は、通常、抗エストロゲン剤／ホルモン療法に応答する見込みがないと見なされる。
【００３９】
本発明では、乳癌患者は、従前に乳房腫瘍を摘出するための乳癌手術を受けていてもよい。
【００４０】
乳癌では、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、典型的には、ホルモン／内分泌療法と併用される。
【００４１】
ホルモン受容体陽性癌では、エストロゲンホルモンは乳癌細胞の成長を促進する。ホルモン療法は、乳癌を治療するために、エストロゲン／プロゲステロンの作用を遮断するまたはそのレベルを下げることを目的とする。ホルモン治療には、例えば、エストロゲン受容体（ＥＲ）を対象とするものもある。ホルモン治療薬には、エストロゲン受容体を遮断する化合物、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェンおよびフルベストラントが含まれる。ホルモン治療薬にはまた、エストロゲンの合成を遮断するアロマターゼ阻害剤、例えば、エキセメスタン、アナストロゾールおよびレトロゾールも含まれる。
【００４２】
ホルモン療法は、術後の癌再発のリスクの軽減を助けるために用いることができるが、治療後に拡散または再発した乳癌にも用いることができる。従って、この療法は、乳癌手術後の補助療法としてまたは転移の場合に用いることができる。
【００４３】
用語「組み合わせて投与される」とは、ある期間にわたる同じ患者への異なる療法の投与を意味する。異なる療法の組合せ投与は、同時にまたは別々に行ってよい。本発明では、Ｓｒｃ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤およびホルモン療法は、同時にまたは別々に投与してよい。好ましくは、Ｓｒｃ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤およびホルモン療法は別々に投与される。
【００４４】
本発明では、Ｓｒｃ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤は、エストロゲン受容体を遮断する治療薬と組み合わせてまたはアロマターゼ阻害剤と組み合わせて投与してよい。好ましい実施態様では、Ｓｒｃ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤は、タモキシフェン、ラロキシフェン、フルベストラント、エキセメスタン、アナストロゾールおよびレトロゾールと組み合わせて投与される。
【００４５】
用語「抗エストロゲン剤」は、ホルモン療法、およびエストロゲン受容体を遮断する治療薬、またはアロマターゼ阻害剤を意味する。好ましくは、「抗エストロゲン剤」とは、タモキシフェン、ラロキシフェン、フルベストラント、エキセメスタン、アナストロゾールおよびレトロゾールを意味する。
【００４６】
用語「Ｓｒｃ阻害剤」は、Ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼを阻害する化合物を意味する。Ｓｒｃ阻害剤としては、ダサチニブ、ボスチニブおよびサラカチニブが挙げられる。
【００４７】
用語「ＰＩ３Ｋ阻害剤」は、ホスホイノシチド３−キナーゼ酵素を阻害する化合物を意味する。「ＰＩ３Ｋ阻害剤」としては、ペリホシン、ＣＡＬ１０１、ＰＸ−８６６、ＢＥＺ２３５、ＳＦ１１２６、ＩＮＫ１１１７、ＩＰＩ−１４５、ＧＤＣ−０９４１、ＢＫＭ１２０、ＸＬ１４７、ＸＬ７６５、パロミド５２９、ＧＳＫ１０５９６１５、ＺＳＴＫ４７４およびＰＷＴ３３５９７が挙げられる。
【００４８】
Ｓｒｃ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤は、転移の場合または補助療法として投与することができる。補助療法は、癌が再発または拡散することを防ぐために、一次療法後に行われる治療として定義される。補助療法は、典型的には、乳癌手術後に適用される。
【００４９】
本発明では、Ｓｒｃ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に応答する見込みが高い乳癌患者が選択される。Ｓｒｃ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療から恩恵を受ける見込みが高い乳房腫瘍／乳癌患者の識別は、補助療法としてのＳｒｃ阻害剤および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤のより広範な利用を促進する。
【００５０】
本発明の第１の目的は、患者において乳癌の予後を判定するための方法であって、下記の工程：
ａ）前記患者から予め採取された乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを測定する工程と、
ｂ）前記癌細胞の細胞質においてＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体が過剰発現される場合に、前記乳癌を予後不良であるとして分類する工程と
を含んでなる方法である。
【００５１】
本発明はまた、患者において乳癌の予後を判定するための方法であって、下記の工程：
ａ）前記患者から乳房腫瘍サンプルを得る工程と、
ｂ）前記乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを測定する工程と、
ｃ）前記癌細胞の細胞質においてＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体が過剰発現される場合に、前記乳癌を予後不良であるとして分類する工程と
を含んでなる方法に関する。
【００５２】
本発明はまた、乳癌と診断された患者の予後を判定する方法に関する。
【００５３】
「予後」は、ある疾患についての起こり得る経過および転帰である。予後には、癌の合併症の見込み、転移の見込み、拡散の見込み、癌のあり得る転帰、回復の見込み、無病生存率、全生存率および／または全死亡率が含まれ得る。好ましくは、それは、患者が回復するか、または癌の再発／再燃を受ける確率である。この情報は、最も効果的な治療コースを決定する際に、患者だけでなく、医師にとっても有用である。癌再燃の見込みまたは転移の見込みの判定は、療法に対してより保存的なアプローチを採るべきか、またはより根治的なアプローチを採るべきかを決定する際に医師の助けとなり得る。予後は、所定の治療計画から恩恵を受けることが予測される患者の選択および分類を与える。
【００５４】
本発明の方法は、乳癌と診断された後および／または治療的処置中に乳癌の予後を提供する。
【００５５】
癌細胞の細胞質における過剰発現レベルまたは高発現レベルのＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体は、無病生存率(disease-free survival)（ＤＦＳ）について予後不良である乳房腫瘍の特徴である。乳癌細胞の細胞質におけるこのタンパク質複合体の過剰発現は、疾患の再発の増加および不良な予後と統計学的に有意に相関している。
【００５６】
本発明は、再発しやすい乳癌および／もしくは乳房腫瘍、ならびに／または浸潤性もしくは転移性の表現型を有しているかもしくは呈しやすい乳癌および／もしくは乳房腫瘍を識別するための方法に関する。さらに詳しくは、本発明は、再発しやすい乳癌および／もしくは乳房腫瘍、ならびに／または浸潤性もしくは転移性の表現型を有しているかもしくは現しやすい乳癌および／もしくは乳房腫瘍を識別するための方法に関する。
【００５７】
用語「ＤＦＳ」は、無病生存率を意味し、ある期間中に疾患増悪なく留まる患者のパーセンテージとして定義される。この場合、カプラン・マイヤー曲線は、ｙ時間後に疾患増悪なく留まる患者の割合ｘ％を表す。
【００５８】
癌細胞の細胞質において過剰発現レベルまたは高発現レベルのＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体を示す乳癌と診断された患者のＤＦＳは、癌細胞の細胞質においてＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の過剰発現のない患者と比べて低い。
【００５９】
好ましい実施態様では、前記乳癌はＥＲ＋として分類されている。ＥＲステータスは、予め判定されていてもよいし、または乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルの測定と同時にもしくはその後に判定してもよい。好ましくは、前記乳癌はＥＲ＋として予め分類されており、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルの測定は、前記乳癌患者が有利なＥＲステータスを持つにもかかわらず、低いＤＦＳを持つかどうかを判断することを目的とする。
【００６０】
好ましくは、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗Ｓｒｃ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／Ｓｒｃタンパク質複合体を検出することによって測定し、かつ／またはＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗ＰＩ３Ｋ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体を検出することによって測定する。
【００６１】
第１の実施態様では、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、工程ｂ）において、健常な乳房組織におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルの中央値と比較する。
【００６２】
第２の実施態様では、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、工程ｂ）において、乳房腫瘍サンプルにおけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルの中央値と比較する。
【００６３】
本発明の第２の目的は、抗エストロゲン剤による治療ならびにＳｒｃ阻害剤(Src inbitors)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に応答する見込みのある乳癌を識別するための方法であって、下記の工程：
ａ）前記患者から予め採取された乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを測定する工程と、
ｂ）前記癌細胞の細胞質において前記ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体が過剰発現される場合に、前記乳癌を抗エストロゲン剤による治療ならびにＳｒｃ阻害剤(Src inbitors)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に応答する見込みがあるとして分類する工程と
を含んでなる方法である。
【００６４】
本発明はまた、抗エストロゲン剤による治療ならびにＳｒｃ阻害剤(Src inbitors)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に応答する見込みのある乳癌を識別するための方法であって、下記の工程：
ａ）前記患者から乳房腫瘍サンプルを得る工程と、
ｂ）前記乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを測定する工程と、
ｃ）前記癌細胞の細胞質において前記ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体が過剰発現される場合に、前記乳癌を抗エストロゲン剤による治療ならびにＳｒｃ阻害剤(Src inbitors)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に応答する見込みがあるとして分類する工程と
を含んでなる方法に関する。
【００６５】
別の実施態様では、本発明はまた、抗エストロゲン剤による治療ならびにＳｒｃ阻害剤(Src inbitors)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に応答する見込みのある腫瘍に罹患する乳癌患者を識別するための方法を対象とする。
【００６６】
抗エストロゲン剤、Ｓｒｃ阻害剤(Src inbitors)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤は、ある期間にわたって、同時にまたは別々に投与してよい。
【００６７】
第１の実施態様では、前記乳癌はＥＲ＋として分類されている。第２の実施態様では、前記乳癌はＥＲ−として分類されている。前記乳癌患者の受容体ステータスは、前記乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルの測定前、測定中または測定後に判定されていてよい。好ましい実施態様では、ＥＲ受容体ステータスは、癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルの測定の前に判定されている。
【００６８】
好ましくは、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗Ｓｒｃ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／Ｓｒｃタンパク質複合体を検出することによって測定し、かつ／またはＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗ＰＩ３Ｋ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体を検出することによって測定する。
【００６９】
第１の実施態様では、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、工程ｂ）において、健常な乳房組織におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルの中央値と比較する。
【００７０】
第２の実施態様では、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、工程ｂ）において、乳房腫瘍サンプルにおけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルの中央値と比較する。
【００７１】
本発明の別の目的は、乳癌患者の治療方法において使用するための、抗エストロゲン剤を含んでなる組成物であり、前記使用は、下記の工程：
ａ）前記患者から予め採取された乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを測定する工程と、
ｂ）前記癌細胞の細胞質において前記ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体が過剰発現される乳癌腫瘍を有する乳癌患者を選択する工程と、
ｃ）治療上有効な量の抗エストロゲン剤を前記患者に投与する工程と
を含んでなる。
【００７２】
好ましい実施態様では、抗エストロゲン剤は、工程ｃ）において、Ｓｒｃ阻害剤(Src inbitor)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤と組み合わせて投与される。
【００７３】
前記乳癌患者は、ＥＲ＋またはＥＲ−として予め分類されていてよい。
【００７４】
好ましい実施態様では、前記乳癌患者は、ＥＲ−として予め分類されている。
【００７５】
本発明はまた、乳癌患者の治療方法であって、前記使用が、下記の工程：
ａ）前記患者から乳房腫瘍サンプルを得る工程と、
ｂ）前記患者由来の乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを測定する工程と、
ｃ）前記癌細胞の細胞質において前記ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体が過剰発現される乳癌腫瘍を有する乳癌患者を選択する工程と、
ｄ）治療上有効な量の抗エストロゲン剤を前記患者に投与する工程と
を含んでなる方法に関する。
【００７６】
好ましい実施態様では、抗エストロゲン剤は、工程ｄ）において、Ｓｒｃ阻害剤(a Src inbitor)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤と組み合わせて投与される。
【００７７】
前記乳癌患者は、ＥＲ＋またはＥＲ−として予め分類されていてよい。
【００７８】
好ましい実施態様では、前記乳癌患者は、ＥＲ−として予め分類されている。
【００７９】
本発明の別の目的は、乳癌患者の治療方法において使用するための、Ｓｒｃ阻害剤( Src inbitor)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤を含んでなる組成物であり、前記使用は、下記の工程：
ａ）前記患者から予め採取された乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを測定する工程と、
ｂ）前記癌細胞の細胞質において前記ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体が過剰発現される乳癌腫瘍を有する乳癌患者を選択する工程と、
ｃ）治療上有効な量のＳｒｃ阻害剤(Src inbitor)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤を前記患者に投与する工程と
を含んでなる。
【００８０】
好ましい実施態様では、Ｓｒｃ阻害剤(Src inbitor)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤は、工程ｃ）において、抗エストロゲン剤と組み合わせて投与される。
【００８１】
前記乳癌患者は、ＥＲ＋またはＥＲ−として予め分類されていてよい。好ましい実施態様では、前記乳癌患者は、ＥＲ＋として予め分類されている。
【００８２】
本発明はまた、乳癌患者の治療方法であって、下記の工程：
ａ）前記患者から乳房腫瘍サンプルを得る工程と、
ｂ）前記患者由来の乳房腫瘍サンプルからの癌細胞の細胞質におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを測定する工程と、
ｃ）前記癌細胞の細胞質において前記ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体が過剰発現される乳癌腫瘍を有する乳癌患者を選択する工程と、
ｄ）治療上有効な量のＳｒｃ阻害剤(Src inbitor)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤を前記患者に投与する工程と
を含んでなる方法に関する。
【００８３】
好ましい実施態様では、Ｓｒｃ阻害剤(Src inbitor)および／またはＰＩ３Ｋ阻害剤は、工程ｄ）において、抗エストロゲン剤と組み合わせて投与される。
【００８４】
前記乳癌患者は、ＥＲ＋またはＥＲ−として予め分類されていてよい。好ましい実施態様では、前記乳癌患者は、ＥＲ＋として予め分類されている。
【００８５】
好ましくは、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗Ｓｒｃ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／Ｓｒｃタンパク質複合体を検出することによって測定し、かつ／またはＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、抗ＥＲα抗体および抗ＰＩ３Ｋ抗体を用いた近接ライゲーションアッセイによりＥＲα／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体を検出することによって測定する。
【００８６】
第１の実施態様では、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、工程ｂ）において、健常な乳房組織におけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルの中央値と比較する。
【００８７】
第２の実施態様では、ＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルを、工程ｂ）において、乳房腫瘍サンプルにおけるＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋタンパク質複合体の発現レベルの中央値と比較する。
【実施例】
【００８８】
実施例１：ヒト乳房腫瘍細胞における内因性ＥＲα／ＰＩ３ＫおよびＥＲα／Ｓｒｃ相互作用の検出
Castoria et al.によって、エストロゲンは、ＭＣＦ−７細胞におけるＥＲαとＳｒｃおよびＰＩ３Ｋとの相互作用を迅速に誘発し、エストロゲン非ゲノム的誘導の細胞増殖に関与する複合体を形成することが報告された。この結果は、大部分は、他者によって、数種の乳房細胞株だけでなく、他の組織でも確認されている。しかしながら、これらの結果のすべては、タンパク質間の相互作用の可視化ができない、細胞株での免疫沈降によって得られた。そのため、このシグナル伝達経路の生理的関連性には疑問が残る。今日まで、前記複合体の免疫蛍光分析は、ごく一部のＥＲαしかＳｒｃおよびＰＩ３Ｋと相互作用しないという事実によって妨げられてきた。この問題を回避するために、本発明者らは、新たに開発された技術、近接ライゲーションアッセイを使用した。タンパク質間相互作用は、近接プローブのペアを用いて高感度かつ特異的に示され、各赤色ドットが相互作用を表すｉｎ  ｓｉｔｕでのサークル増幅(Soderberg et al., 2006)によって検出された。本発明者らは、ウサギ抗ＥＲαをマウス抗ｐ８５抗体と一緒に用いて、ヒト乳房腫瘍細胞株ＭＣＦ−７におけるＥＲα／ＰＩ３Ｋ相互作用を調査した。同じ抗ＥＲαをマウス抗Ｓｒｃ抗体と一緒に用いて、ＥＲα／Ｓｒｃ相互作用を検出した。本発明者らは、両抗体ペアについて赤色ドットの存在により示されるように、ＥＲαが、ＭＣＦ−７細胞の細胞質中のＰＩ３ＫおよびＳｒｃと相互作用することを見出した。細胞１００個当たりのドット数を計数することによって確認した場合、一抗体だけを用いてドットは検出されなかった（図１、５０ドット前後／細胞に対して５未満）。重要なことには、赤色ドット数は、５分のエストロゲン処置後に増加し、その後、１５分後に減少した。このことにより、エストロゲン処置の際の、この複合体の形成が迅速かつ一時的である（図２：））ことが確認された。予想通り、タモキシフェン処置（図３）ならびにＥＲαノックダウン（図４）の際に、ＭＣＦ−７細胞におけるＥＲα／ＰＩ３ＫおよびＥＲα／Ｓｒｃ間の相互作用の減少が観察され、上記結果の特異性を確認された。加えて、本発明者らは、ＰＬＡ技術の特異性をさらにバリデートするために、一連の対照実験を行った。本発明者らは、ＥＲαと、２つの既知ＥＲα核内コアクチベーター、ＳＲＣ３およびｐ３００との間の相互作用を試験した。予想通り、それらは、ＭＣＦ−７細胞の核内でのみ検出された。本発明者らは、他者によって確認されているように(Sanchez et al., 2010)、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）もまた前記複合体中にリクルートされることを従前に確認した(Le Romancer M. et al., 2008)。そのため、本発明者らは、ＰＬＡによりＦＡＫとＥＲαとの相互作用を研究した。図５に見られるように、ＦＡＫはＳｒｃと相互作用するが、ＥＲα／ＦＡＫ相互作用についての赤色ドットは検出されなかった。この結果は、前記複合体中へのＦＡＫのリクルートが、Ｓｒｃとのその相互作用によって媒介されることを示す本発明者らのこれまでのデータと一致している。
【００８９】
本発明者らは、ＥＲα／ＰＩ３Ｋ／Ｓｒｃ複合体の形成には、ＥＲαのメチル化、ならびにＳｒｃおよびＰＩ３Ｋのキナーゼ活性が必要であることを従前に示した(Le Romancer M. et al., 2008)。そこで、本発明者らは、ＰＲＭＴ１ノックダウン細胞を用いて（図６）またはＰＰ１（Ｓｒｃ阻害剤）もしくはＬＹ２９４００２（ＰＩ３Ｋ阻害剤）の添加後に（図７）、ＰＬＡ分析を行った。ＰＬＡ分析により、赤色ドットの有意な減少によりこれらの結果が確認された。さらに、Aurricchioのグループは、ヒトＥＲαの５３７位にあるホスホチロシン残基の前後の配列を模倣する６アミノ酸のペプチド（ｐＹｐｅｐ）が、ＥＲα／Ｓｒｃ相互作用およびエストロゲンにより誘導される増殖を妨害することを発見した(Varricchio et al., 2007)。実際には、リン酸化ペプチドによる処置によって前記複合体の著しい破壊がもたらされ、それは免疫沈降およびＰＬＡ分析の両方により可視化された（図８）。
【００９０】
最後に、本発明者らは、ＥＲα陽性細胞株ＣＬＢ−ＳＡＶ、ＺＲ７５．１およびＣａｍａ−１、ならびにＥＲα陰性細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１を用いて、ＥＲα／ＰＩ３ＫおよびＥＲα／Ｓｒｃ間の相互作用を確認した。両複合体は、ＣＬＢ−ＳＡＶ細胞およびＺＲ７５．１細胞の細胞質中に存在したが、Ｃａｍａ−１細胞およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞には存在しなかった。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞でもＣａｍａ−１細胞でもエストロゲンにより誘導されるメチル化が検出されなかったことから、前記複合体の形成はＥＲαのメチル化と一致していた（図９）。
【００９１】
これらすべてのｉｎ  ｖｉｔｒｏデータにより、ＰＬＡ技術が、ＥＲα／ＰＩ３ＫおよびＥＲα／Ｓｒｃ相互作用を分析するための有力なツールとしてバリデートされる。
【００９２】
実施例２：正常乳房サンプルにおいてＥＲαはＰＩ３ＫおよびＳｒｃと相互作用する
エストロゲン非ゲノム的シグナル伝達に関する重要な問題は、生理学におけるその存在に関係する。まず、乳房形成術からの３つのヒト正常乳房サンプルにおいてＥＲα／Ｓｒｃ／ＰＩ３Ｋ複合体の存在を試験して、この問題に取りくんだ。従って、本発明者らは、前述した２つの抗体ペアを用いてＰＬＡ実験を行い、ＥＲα／ＳｒｃおよびＥＲα／ＰＩ３Ｋ相互作用を研究した。ウサギ抗ＥＲαをマウス抗ｍＥＲα抗体と一緒に用いたＰＬＡ（ｍＥＲα／ＥＲα）によりｍＥＲαを検出して、これらの相互作用をメチル化されたＥＲαの存在と関連付けた。上皮細胞の細胞質においてＥＲα／ＰＩ３Ｋ  ＥＲα／ＳｒｃおよびｍＥＲα／ＥＲαの発現を検出したが、筋上皮細胞では検出されなかった。赤色ドットの定量によって前記複合体の低レベル発現が明らかにされた。正常乳房上皮細胞でのＥＲαの発現はわずかであることから、これは予想された。３つの乳房サンプルすべてで同様の結果を得た（図１０）。
【００９３】
実施例３：ヒト乳癌において、ＥＲαと、ＰＩ３ＫおよびＳｒｃの両方との相互作用は、ＥＲαのメチル化およびＡｋｔの活性化と相関する
次に、１７５例の浸潤性乳房腫瘍において、ＥＲα／ＰＩ３ＫおよびＥＲα／Ｓｒｃ複合体の存在、ならびにｍＥＲα／ＥＲα発現を評価した。各タンパク質カップルのシグナルはゼロから非常に強いシグナルまで強度は様々であった。
【００９４】
明視野顕微鏡による褐色ドットの可視化が可能である異なるＰＬＡリベレーションキット(PLA revelation kit)を使用して、これらの高度にスケーリングされた実験を行った。本発明者らは、同じ腫瘍サンプルに対して抗Ｐ−Ａｋｔ抗体を用いて免疫組織化学分析も行い、ＥＲαのメチル化がＡｋｔの活性化を誘発することを確認した。これらのＰＬＡ実験からの結果を、少なくとも４００個の細胞を計数することによって定量し、材料および方法の節に記載の通り、細胞当たりの平均ドット数として表した（図１１参照）。
【００９５】
興味深いことに、異なるマーカー間の相関分析を行った際に、ＥＲα／ＰＩ３Ｋ、ＥＲα／Ｓｒｃ相互作用とｍＥＲα発現との間に有意な相関が見出された（ｐ＜０．００１）（図１２）。このことは、ｍＥＲαが前記複合体の形成に関与するという本発明者らの仮説を裏付けている。また、各タンパク質カップルとＰ−Ａｋｔ発現との間でも統計学的に有意な相関が見出された。
【００９６】
これらのデータは、一貫して、下流の伝達カスケードへシグナルを伝搬する、エストロゲン受容体とＳｒｃおよびＰＩ３Ｋとの相互作用を媒介するために、ＥＲαのメチル化が必要であることを示している。ｍＥＲαの過剰発現およびシグナル伝達複合体は、Ａｋｔの過剰活性化をもたらす可能性がある。
【００９７】
実施例４：各タンパク質カップルについての細胞当たりのドット数の定量に基づき、１７５例の乳房腫瘍についてのそれらの発現と臨床パラメーターとの関連を分析した
ＥＲα／Ｓｒｃの発現では、ＥＲα、ＰＲまたはＨＥＲ２のステータスとの関連は見つからなかった。しかしながら、年齢＞５０歳および閉経状態は、ＥＲα／Ｓｒｃの低発現と有意に関連していた（それぞれ、ＥＲα／Ｓｒｃが高発現である患者の８０％および７６％と５８％および５５％、ｐ＝０．００３およびｐ＝０．００６）。ＥＲα／Ｓｒｃの発現はまた、リンパ節転移とも関連していた（ＥＲα／Ｓｒｃ低発現患者の４２％にリンパ節転移が認められたのに対して、ＥＲα／Ｓｒｃ高発現患者では５２％であった、ｐ＝０．０３８）（図１３）。従って、ＥＲα／Ｓｒｃの高発現は、予後のあまり良くない因子と関連していた。
【００９８】
ＥＲα／ＰＩ３Ｋの発現に関しては、ＥＲαまたはＰＲの発現との関連は見られなかった。しかしながら、ＥＲα／ＰＩ３Ｋの高発現は、ＨＥＲ２を過剰発現する腫瘍と関連していた（ＥＲα／ＰＩ３Ｋ高発現腫瘍の２５％がＨＥＲ２を過剰発現したのに対して、低発現腫瘍では１０％、ｐ＝０．０１９）。さらに、ＥＲα／ＰＩ３Ｋの高発現は腫瘍グレードと関連しており、ＥＲα／ＰＩ３Ｋの発現が高い場合にグレード２または３を示す腫瘍がより多かった（ｐ＝０．０１４）（図１４）。
【００９９】
本発明者らは、ｍＥＲα／ＥＲαの高発現が、最年少者（＜５０歳）、前閉経状態、より高いグレードのＳＢＲおよびＥＲα発現と有意に関連していることを見出した（図１５）。
【０１００】
全体として、これらのデータは、エストロゲン非ゲノム的シグナル伝達が乳癌患者の一般的な予後不良因子と関連していることを強く示唆している(Weigel and Dowsett, 2010)。
【０１０１】
ＥＲα／ＳｒｃおよびＥＲα／ＰＩ３Ｋ相互作用の生存分析および予測値
本発明者らは、次に、ＥＲα／Ｓｒｃおよび／またはＥＲα／ＰＩ３Ｋ発現が患者転帰とどのように関連しているかを調査した。ＥＲα／Ｓｒｃに関しては、このカップルの高発現が無病生存率（ＤＦＳ）の低下と関連していた（ログ・ランク検定、ｐ＝０．０４４）（図１６Ａ）。さらに、ＥＲα陽性腫瘍のサブグループ内でも、ＥＲα／Ｓｒｃの高発現がＤＦＳの低下と関連していた（ｐ＝０．０３２）（図１６Ｂ）。ＥＲ陰性腫瘍については、患者数がおそらく、結論を下すのに十分ではなかったと思われる（図１６Ｃ）。多変量解析では、ＥＲα／Ｓｒｃの高発現は、リンパ節転移（ＨＲ＝１．９３、９５％ＣＩ［１．０５〜３．５６］、ｐ＝０．０３５調整後も、独立予後因子として残った（ＨＲ＝１．８６、９５％ＣＩ［１．０１〜３．４２］、ｐ＝０．０４７（図１７））。ＳＢＲグレード、ＥＲα発現およびリンパ節転移のようなパラメーターが、最終モデルにおいて独立予後因子として維持されなかったことに留意されたい。全生存率(overall survival)（ＯＳ）に関しては、ＥＲα／Ｓｒｃ高発現腫瘍と低発現腫瘍との間に統計学的差異はなかった（ｐ＝０．２３）（図１８）。
【０１０２】
本発明者らは、ＥＲα／ＰＩ３Ｋ相互作用についても同様の所見を得た。全患者について、ＤＦＳの曲線で傾向が見られる（図１９Ａおよび図２１）が、ＤＦＳまたはＯＳとの統計学的関連性は見出されなかった（それぞれ、ｐ＝０．０９６およびｐ＝０．３０９）。しかしながら、ＥＲα陽性腫瘍を有する患者では、ＥＲα／ＰＩ３Ｋの発現がＤＦＳの予後因子であり、ＥＲα／ＰＩ３Ｋ高発現腫瘍を有する患者は予後が悪かった（ログ・ランク検定、ｐ＝０．０４９）（図１９Ｂ）。ＥＲα／Ｓｒｃ相互作用については、ＥＲα陰性腫瘍を有する患者の数が少なすぎて結論を下せなかった（図１９Ｃ）。多変量解析では、ＥＲα／ＰＩ３Ｋの高発現は、リンパ節転移（ＨＲ＝２．０７、９５％ＣＩ［１．１５〜３．７２］、ｐ＝０．０１５）調整後にＤＦＳと関連している（ＨＲ＝１．８９、９５％ＣＩ［１．０４〜３．４２］、ｐ＝０．００３７）ことが見出された（図２１）。
【０１０３】
ｍＥＲα／ＥＲαのカップルで測定されたように、ＥＲαのメチル化と患者転帰との関連は見出されなかった（図２２Ａ、図２２Ｂ）。
【０１０４】
参照文献
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Varricchio L, Migliaccio A, Castoria G, Yamaguchi H, de FA, Di DM, Giovannelli P, Farrar W, Appella E, and Auricchio F (2007) Inhibition of estradiol receptor/Src association and cell growth by an estradiol receptor alpha tyrosine-phosphorylated peptide. Mol Cancer Res, 5, 1213-1221.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【国際調査報告】
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