(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含み、前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーが外因性生理活性配列を含む、シャペロン／アッシャーファミリーポリマーを提供する。
2015522566.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含むシャペロン／アッシャーファミリーポリマーであって、前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーが外因性生理活性配列を含む、シャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項２】
前記生理活性配列が、実質的に非免疫原性である、請求項１に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項３】
前記モノマーには、天然に存在する接着モチーフが実質的にない、請求項１または２に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項４】
前記モノマーが、ＦＧループ長ファミリーポリペプチドモノマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項５】
前記モノマーが、Ｃａｆ１、Ｓａｆ１およびＡｆａ／Ｄｒからなる群から選択される、請求項４に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項６】
前記モノマーが、Ｃａｆ１ポリペプチドである、請求項５に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項７】
前記モノマーが、配列番号５のポリペプチドと少なくとも７０％同一である、請求項６に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項８】
前記モノマーが、ＦＧループ短ファミリーポリペプチドモノマーである、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項９】
前記モノマーが、ＦｉｍおよびＰａｐからなる群から選択される、請求項８に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項１０】
前記生理活性配列が、細胞接着認識モチーフ、増殖因子配列モチーフおよびプロテアーゼ部位からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項１１】
前記生理活性配列が、細胞接着認識モチーフである、請求項１０に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項１２】
前記細胞接着認識モチーフが、細胞外マトリックス細胞接着認識モチーフである、請求項１１に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項１３】
前記細胞接着認識モチーフが、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニンまたはテネイシンから選択される、請求項１１に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項１４】
前記細胞接着認識モチーフが、アミノ酸配列ＲＧＤを含む、請求項１３に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項１５】
前記細胞接着認識モチーフが、アミノ酸配列ＰＨＳＲＮを含む、請求項１３に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項１６】
前記生理活性配列が、前記ポリペプチドがフォールディングされるとループ構造内に含まれる部位において前記モノマー内に含まれる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項１７】
前記ポリマーが画分１抗原ポリマーであり、前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーがＣＡＦ１ポリペプチドモノマーである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項１８】
前記ポリマーが、少なくとも１つのさらなるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含み、前記さらなるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーが、外因性生理活性配列を含む前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーとは少なくとも１つのアミノ酸が異なる、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項１９】
前記さらなるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーが、請求項１〜１８に記載される前記外因性生理活性配列のないシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーである、請求項１８に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項２０】
前記さらなるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーが、天然に存在するＣＡＦ１ポリペプチドモノマーである、請求項１８または１９に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項２１】
前記少なくとも１つの天然に存在するＣＡＦ１ポリペプチドモノマーが、ペスト菌ＣＡＦ１ポリペプチドである、請求項２０に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項２２】
前記ペスト菌ＣＡＦ１ポリペプチドが、配列番号５のポリペプチド配列を有する、請求項２１に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項２３】
前記さらなるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーが、前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの前記外因性生理活性配列とは明確に異なる外因性生理活性配列を含む、請求項１８に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの前記外因性生理活性配列が、アミノ酸配列ＲＧＤを含む細胞接着認識モチーフであり、前記少なくとも１つのさらなるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの前記外因性生理活性配列が、アミノ酸配列ＰＨＳＲＮを含む細胞接着認識モチーフである、請求項２３に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを含むハイドロゲル。
【請求項２６】
架橋剤をさらに含む、請求項２５に記載のハイドロゲル。
【請求項２７】
前記架橋剤が生分解性架橋剤である、請求項２６に記載のハイドロゲル。
【請求項２８】
前記架橋剤が非分解性架橋剤である、請求項２６に記載のハイドロゲル。
【請求項２９】
前記架橋剤がポリエチレングリコールを含む、請求項２６に記載のハイドロゲル。
【請求項３０】
細胞支持スキャフォールドとしての、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のハイドロゲルの使用。
【請求項３１】
前記スキャフォールドが二次元細胞支持スキャフォールドである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記スキャフォールドが三次元細胞支持スキャフォールドである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３３】
請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のハイドロゲルを含む創傷ドレッシング。
【請求項３４】
創傷の処置において使用するための、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のハイドロゲル。
【請求項３５】
前記創傷が慢性創傷である、または、前記創傷が急性創傷である、請求項３４に記載の使用のためのハイドロゲル。
【請求項３６】
請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のハイドロゲルを含む眼移植片。
【請求項３７】
眼損傷の処置において使用するための請求項２５〜２９のいずれか１項に記載のハイドロゲル。
【請求項３８】
外因性生理活性配列を含む少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含むシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを産生するための方法であって、
ｉ）外因性生理活性配列を含むシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ｉｉ）宿主細胞に前記発現ベクターをトランスフェクトするステップと
を含み、
前記宿主細胞に、前記シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子と、前記シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子とを与え、得られたトランスフェクト宿主細胞がシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを産生する、方法。
【請求項３９】
前記生理活性配列が、実質的に非免疫原性である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記モノマーには、天然に存在する接着モチーフが実質的にない、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記シャペロン／アッシャーファミリーポリマーが画分１抗原ポリマーであり、外因性生理活性配列を含む前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーがＣＡＦ１ポリペプチドモノマーである、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
外因性生理活性配列を含むＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする前記核酸分子が、配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子が、ＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードし、前記シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子が、ＣＡＦ１に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
ＣＡＦ１に特異的な前記ペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子が、配列番号２のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＣＡＦ１に特異的な前記外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子が、配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、請求項４３または請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ｉ）ＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子を、前記宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ｉｉ）前記宿主細胞に前記発現ベクターをトランスフェクトするステップと
により、ＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子を前記宿主細胞に与える、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記発現ベクターが、細胞接着認識モチーフを含むＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする前記核酸分子をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ｉ）ＣＡＦ１に特異的な前記外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子を、前記宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ｉｉ）前記宿主細胞に前記発現ベクターをトランスフェクトするステップと
により、ＣＡＦ１に特異的な前記外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子を前記宿主細胞に与える、請求項４３〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記発現ベクターが、細胞接着認識モチーフを含むＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする前記核酸分子および／またはＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記宿主細胞に、前記シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子をコードする核酸分子をさらに与える、請求項３８〜４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子をコードする前記核酸分子が、ＣＡＦ１に特異的な発現調節因子をコードする、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
ＣＡＦ１に特異的な前記発現調節因子をコードする前記核酸分子が、配列番号４のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記生理活性配列が、細胞接着認識モチーフである、請求項３８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記宿主細胞が、細菌細胞である、請求項３８〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記細菌細胞が、グラム陰性細菌細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細菌細胞が、大腸菌である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
防汚剤としての画分１抗原ポリマーの使用。
【請求項５８】
画分１抗原ポリマーを含む防汚組成物。
【請求項５９】
添付図面を参照して本明細書に記載されるシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【請求項６０】
添付図面を参照して本明細書に記載されるハイドロゲル。
【請求項６１】
添付図面を参照して本明細書に記載される創傷ドレッシング。
【請求項６２】
添付図面を参照して本明細書に記載される眼移植片。
【請求項６３】
添付図面を参照して本明細書に記載されるシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを産生するための方法。
【請求項６４】
添付図面を参照して本明細書に記載される防汚組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外因性生理活性配列を有する組換えタンパク質モノマーを含むタンパク質ポリマーに関する。さらに詳細には、本発明は、少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含み、前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーが外因性生理活性配列を含む、シャペロン／アッシャーファミリーポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
インビボのタンパク質および他の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分は、細胞が統合し相互作用する場である連結メッシュを形成する。この天然の構築物を模倣する１つの方法は、人工ポリマーを架橋して三次元細胞培養系を創造することによる。
【０００３】
細胞培養および組織工学分野はよく発達しており、種々のＥＣＭ同等物が開発されてきた。これらの同等物はスキャフォールドのために使用される材料や、そこで増殖することができる種類の細胞によって異なる。
【０００４】
フィブロネクチン（ＦＮ）は、細胞付着と増殖を仲介する主なＥＣＭタンパク質である。ＦＮは、細胞接着を仲介するトリペプチドＲＧＤおよびペプチドＰＨＳＲＮを含むいくつかのリガンドを含有する。フィブロネクチンなどの天然由来のタンパク質は、インビトロ細胞付着のためのスキャフォールドとして有用になりえる。しかし、いかなる動物由来タンパク質にもある潜在的問題は疾病伝播の可能性があることである。
【０００５】
したがって、天然の三次元組織を再構築する、ある範囲の操作された三次元スキャフォールドが提唱されてきた。現行の三次元スキャフォールドは理想的なものではない（７）。例えば、特定の細胞株または組織タイプに特異的なスキャフォールドを作製するのは困難であり、これらのスキャフォールド間には高バッチ間変動性もあり、他の特性を妨げずにこれらのスキャフォールドの単一の特性を変化させるのは複雑である。例えば、特定のスキャフォールドの粘度を変えようとすれば、最終的には、スキャフォールドを通じた栄養素の拡散特性に影響を与えうるスキャフォールドの接着リガンド密度および提示モードまたは空隙率を同時に改変することがある（１１）。
【０００６】
したがって、改良された細胞培養環境を提供する必要性が依然残っている。
【発明の概要】
【０００７】
一態様では、本発明は、少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含み、前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーが外因性生理活性配列を含む、シャペロン／アッシャーファミリーポリマーを提供する。
【０００８】
好ましくは、生理活性配列は実質的に非免疫原性である。
【０００９】
好ましくは、モノマーには、天然に存在する接着モチーフが実質的にない。
【００１０】
好ましくは、前記モノマーはＦＧループ長（ＦＧ  ｌｏｏｐ  ｌｏｎｇ）ファミリーポリペプチドモノマー、例えば、Ｃａｆ１、Ｓａｆ１およびＡｆａ／Ｄｒからなる群から選択されるＦＧループ長ファミリーポリペプチドモノマーである。さらに好ましくは、前記モノマーはＣａｆ１ポリペプチドである。さらに好ましくは、前記モノマーは配列番号５のポリペプチドと少なくとも７０％同一である。
【００１１】
あるいは、前記モノマーはＦＧループ短（ＦＧ  ｌｏｏｐ  ｓｈｏｒｔ）ファミリーポリペプチドモノマー、例えば、ＦｉｍおよびＰａｐからなる群から選択されるＦＧループ短ファミリーポリペプチドモノマーである。
【００１２】
好ましくは、前記生理活性配列は、細胞接着認識モチーフ、増殖因子配列モチーフおよびプロテアーゼ部位からなる群から選択される。さらに好ましくは、前記生理活性配列は細胞接着認識モチーフである。さらに好ましくは、前記細胞接着認識モチーフは細胞外マトリックス細胞接着認識モチーフである。さらに好ましくは、前記細胞接着認識モチーフは、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニンまたはテネイシンから選択される。好ましくは、前記細胞接着認識モチーフはアミノ酸配列ＲＧＤを含む。あるいは、またはさらに、前記細胞接着認識モチーフはアミノ酸配列ＰＨＳＲＮを含む。
【００１３】
好ましくは、前記生理活性配列は、前記ポリペプチドがフォールディングされるとループ構造内に含まれる部位において前記モノマー内に含まれる。
【００１４】
好ましくは、前記ポリマーは画分１抗原ポリマーであり、前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーはＣＡＦ１ポリペプチドモノマーである。
【００１５】
好ましくは、前記ポリマーは少なくとも１つのさらなるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含み、前記さらなるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーは、外因性生理活性配列を含む前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーとは少なくとも１つのアミノ酸が異なる。さらに好ましくは、さらなるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーは、前記外因性生理活性配列のない本明細書に記載されるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーである。
【００１６】
好ましくは、さらなるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーは天然に存在するＣＡＦ１ポリペプチドモノマーである。さらに好ましくは、前記少なくとも１つの天然に存在するＣＡＦ１ポリペプチドモノマーは、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）ＣＡＦ１ポリペプチドである。さらに好ましくは、前記ペスト菌ＣＡＦ１ポリペプチドは、配列番号５のポリペプチド配列を有する。
【００１７】
好ましくは、前記さらなるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーは、前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの前記外因性生理活性配列とは明確に異なる（ｄｉｓｔｉｎｃｔ）外因性生理活性配列を含む。さらに好ましくは、前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの前記外因性生理活性配列はアミノ酸配列ＲＧＤを含む細胞接着認識モチーフであり、前記少なくとも１つのさらなるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの前記外因性生理活性配列はアミノ酸配列ＰＨＳＲＮを含む細胞接着認識モチーフである。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、本発明によるシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを含むハイドロゲルを提供する。
【００１９】
好ましくは、ハイドロゲルは架橋剤をさらに含む。さらに好ましくは、前記架橋剤は生分解性架橋剤である。あるいは、前記架橋剤は非分解性架橋剤である。
【００２０】
好ましくは、前記架橋剤はポリエチレングリコールを含む。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、細胞支持スキャフォールドとしての本発明によるハイドロゲルの使用を提供する。
【００２２】
好ましくは、前記スキャフォールドは二次元細胞支持スキャフォールドである。あるいは、前記スキャフォールドは三次元細胞支持スキャフォールドである。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、本発明によるハイドロゲルを含む創傷ドレッシングを提供する。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は創傷の処置において使用するための本発明によるハイドロゲルを提供する。
【００２５】
好ましくは、前記創傷は慢性創傷であるまたは前記創傷は急性創傷である。
【００２６】
さらなる態様では、本発明は、本発明によるハイドロゲルを含む眼移植片を提供する。
【００２７】
さらなる態様では、本発明は、眼外傷の処置において使用するための本発明によるハイドロゲルを提供する。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は外因性生理活性配列を含む少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含むシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを産生するための方法であって、
ｉ）外因性生理活性配列を含むシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ｉｉ）宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするステップと
を含み、
前記宿主細胞に、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子と、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子とを与え、こうして得られたトランスフェクト宿主細胞がシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを産生する、方法を提供する。
【００２９】
好ましくは、生理活性配列は実質的に非免疫原性である。
【００３０】
好ましくは、モノマーには、天然に存在する接着モチーフが実質的にない。
【００３１】
好ましくは、前記シャペロン／アッシャーファミリーポリマーは画分１抗原ポリマーであり、外因性生理活性配列を含む前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーはＣＡＦ１ポリペプチドモノマーである。さらに好ましくは、外因性生理活性配列を含むＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする前記核酸分子は配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
【００３２】
好ましくは、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子は、ＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードし、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子は、ＣＡＦ１に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする。さらに好ましくは、ＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子は、配列番号２のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
【００３３】
好ましくは、ＣＡＦ１に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子は配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
【００３４】
好ましくは、前記宿主細胞に
ｉ）ＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ｉｉ）宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするステップと
により、ＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子を与える。
【００３５】
好ましくは、前記発現ベクターは、細胞接着認識モチーフを含むＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする核酸分子をさらに含む。
【００３６】
好ましくは、前記宿主細胞に
ｉ）ＣＡＦ１に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ｉｉ）宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするステップと
により、ＣＡＦ１に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子を与える。
【００３７】
さらに好ましくは、前記発現ベクターは、細胞接着認識モチーフを含むＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする核酸分子および／またはＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子をさらに含む。
【００３８】
好ましくは、前記宿主細胞に、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子をコードする核酸分子をさらに与える。さらに好ましくは、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子をコードする前記核酸分子はＣＡＦ１に特異的な発現調節因子をコードする。
【００３９】
好ましくは、ＣＡＦ１に特異的な発現調節因子をコードする前記核酸分子は配列番号４のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する。
【００４０】
好ましくは、前記生理活性配列は細胞接着認識モチーフである。
【００４１】
好ましくは、前記宿主細胞は細菌細胞である。さらに好ましくは、前記細菌細胞はグラム陰性細菌細胞である。さらに好ましくは、前記細菌細胞は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、防汚剤としての画分１抗原ポリマーの使用を提供する。
【００４３】
さらなる態様では、本発明は画分１抗原ポリマーを含む防汚組成物を提供する。
【００４４】
本発明の実施形態は、添付図面を参照して下にさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１はＦ１抗原をコードする遺伝子およびペスト菌において細菌細胞表面でのＦ１抗原の搬出と組立てに関与する他の遺伝子を含む温度調節されたｃａｆオペロンを含有するカナマイシン耐性プラスミドｐＡＨ３４Ｌの模式図である（３、１２）。
【図２】図２はＦ１線維集合体と細菌細胞表面への搬出の模式図である。Ｃａｆ１Ｍは青色であり、Ｃａｆ１は赤色または緑色であり、Ｃａｆ１Ａは山吹色である。ステージ１ではＦ１サブユニットはペリプラズムに分泌され、ステージ２ではＣａｆ１Ｍ−Ｃａｆ１複合体はペリプラズムにおいて形成され、ステージ３ではＦ１線維は長いポリマーを形成し始める（伸長過程）。重合ステップは１分子のＣａｆ１Ｍを放出する（Ｍ）。ＺａｖｉｏｌｏｖとＫｎｉｇｈｔは、過剰なＣａｆ１Ｍ分子は凝縮して四量体になることを報告した（Ｔ）（１５）。ドナー配列は矢印で示されており、Ｃａｆ１Ｍ中のＡ１およびＧ１鎖形成配列は青色で、Ｃａｆ１中のＧｄ鎖形成配列は赤色または緑色のどちらかである。Ｃａｆ１Ｍ−Ｃａｆ１複合体では、Ｃａｆ１Ｍの第一ドメインとＣａｆ１は融合ヘテロバレルを形成する。
【図３】図３は鋳型としてｐＡＨ３４Ｌベクターを使用するｃａｆオペロンのＰＣＲ増幅およびＰＣＲ産物の制限消化の結果を示す画像である。ａ）ＰＣＲ増幅。Ｍ、分子サイズマーカー（サイズ、左側余白）；レーン１、ｃａｆオペロン。右側余白、ＰＣＲ産物のサイズ。ｂ）ＰＣＲ産物の制限消化。Ｍ、分子サイズマーカー（サイズ、左側余白）；レーン１、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化されたｃａｆオペロンは３７３１ｂｐと１５２０ｂｐの２つのバンドを示した；レーン２、ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｃａｆオペロンは３４９０ｂｐと１０５３ｂｐと７０７ｂｐの３つのバンドを示した；レーン３、ＥｃｏＲＩで消化されたｃａｆオペロンは特異的ＥｃｏＲＩ制限部位の非存在のせいで５２００ｂｐの単一バンドを示した；レーン４、非消化ｃａｆオペロンは５２００ｂｐの単一バンドを示した。右側余白、ｋｂでのＤＮＡ断片のサイズ。
【図４】図４は精製されたｃａｆオペロンＰＣＲ産物とその制限消化の特徴付けを示す画像と表である。ａ）ＰＣＲ産物の定量化。Ｍ、分子サイズマーカー（サイズ、表）；レーンＵ１、精製されたｃａｆオペロン。ｂ）ＰＣＲ産物の制限消化。Ｍ、分子サイズマーカー（サイズ、左側余白）；レーン１、非消化ｃａｆオペロン；レーン２、ＥｃｏＲＩで消化されたｃａｆオペロンは特異的ＥｃｏＲＩ制限部位の非存在のせいで５２００ｂｐの単一バンドを示した；レーン３、ＢａｍＨＩ制限酵素で消化されたｃａｆオペロンは３７３１ｂｐと１５２０ｂｐの２つのバンドを示した；レーン４、ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｃａｆオペロンは３４９０ｂｐと１０５３ｂｐと７０７ｂｐの３つのバンドを示した。右側余白、ＤＮＡ断片のサイズ（ｋｂ）。
【図５】図５はプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹ−ｃａｆオペロン（ｐＧＥＭ−ＴＦ１）にクローニングされたＣａｆ１オペロンの代表的配列決定結果を示す図であり、ｃａｆＲ遺伝子配列を持つｃａｆオペロンの開始とｃａｆ１遺伝子配列を持つｃａｆオペロンの終点を示している。ａ）Ｅｘｐａｓｙツール（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｄｎａ．ｈｔｍｌ）を使用するｃａｆＲ遺伝子配列。ｂ）Ｅｘｐａｓｙツール（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｄｎａ．ｈｔｍｌ）を使用するｃａｆ１遺伝子配列。Ｔ７プロモータープライマー（５’−ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＡＧＧ−３’）またはｐＵＣ／Ｍ１３フォワードプライマー（５’−ＧＴＡ  ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴＧ−３’）などのユニバーサルプライマーを使用して、ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹベクターにより産生されるｓｓＤＮＡの配列を決定した。
【図６】図６はｐＧＥＭ−ＴＦ１の制限消化を示す図と画像である。ゲル電気泳動はＭ、分子サイズマーカーを示している（サイズ、左側余白）；レーン１、ＥｃｏＲＩで消化されたｐＧＥＭ−ＴＦ１は５．２Ｋｂと３Ｋｂの２つのバンドを示した；レーン２、非消化ｐＧＥＭ−ＴＦ１は８．２Ｋｂの単一バンドを示した。（ａ）図はｃａｆオペロンインサート（５．２Ｋｂ）、ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹベクター（３Ｋｂ）およびＥｃｏＲＩ切断部位を示す；（ｂ）図はｃａｆオペロンインサート（５．２Ｋｂ）、ｐＧＥＭ−Ｔ  ＥＡＳＹベクター（３Ｋｂ）およびライゲーション後得られた８．２Ｋｂのプラスミドを示す。
【図７】図７はＳＤＳ−ＰＡＧＥ（左側）および抗Ｃａｆ１抗体を使用するウェスタンブロッティング（右側）を示す画像である。レーン１は分子量マーカータンパク質を含有していた（分子量×１０３ｋｄａ矢印）。分析された試料（１０μｌ）は、３７℃で増殖した一晩細菌細胞培養大腸菌（ｐｇｅｍ−ｔｆ１）から調製した。タンパク質試料は９５℃で５分間加熱し、等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファーをそれぞれの試料に添加して、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に試料を負荷した。ゲルの１つはクーマシーブルーｒ２５０で染色し（レーン３）、その他のゲルはブロットした。得られたブロットは抗Ｃａｆ１抗体を用いてプロービングし（ウェスタンブロットのレーン２）、次に４ｃｎ（４−クロロ−１−ナフトール）と一緒にＨＲＰヤギ抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）カラー現像液で現像した。
【図８】図８は精製されたｃａｆ１タンパク質のペプチド消化の質量分析を示す図であり、遺伝子産物が成熟Ｃａｆ１マイナスリーダーペプチドであることを示している。
【図９】図９はＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過カラムを使用する較正曲線を示す図である。上パネルは、分配係数と対数分子量の間の予測される直線関係を示している。下パネルは較正タンパク質の実際の溶出プロファイルを示しており、およそ４８ｍｌの空隙容量を示す。図９は、上パネルではタンパク質を用いたゲル濾過カラムの較正を、下パネルではその溶出プロファイルを示している。
【図１０】図１０はＣａｆ１タンパク質精製を示している図と画像である。ａ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ＦＰＬＣ上でのゲル濾過カラムクロマトグラフィー。ｃａｆ１画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過ＦＰＬＣカラムに適用した。Ｃａｆ１の主ピークは空隙容量の近くであり、長いポリマーが形成されていることを示している。ｂ）ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル。レーン１は分子量マーカータンパク質を含有していた（分子量×１０３ｋｄａ矢印）。分析された試料（１０μＬ）は、精製Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００の後に調製した。画分は主ピークから収集し、このピークにＣａｆ１の存在を確認した。タンパク質のそれぞれの画分は９５℃で５分間加熱し、等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥバッファーをそれぞれの試料に添加して、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に試料を負荷した。
【図１１】図１１は分光光度計を使用して精製されたＣａｆ１タンパク質濃度の測定を示す図である。
【図１２】図１２はｃａｆ１オリゴマーの形成を示す画像である。リーディングＣａｆ１精製画分（図８）は９５℃で４５秒間加熱して、非共有ポリマーの部分的断片化を誘導した。レーン１〜５はＣａｆ１（新しいプラスミドｐＧＥＭＴＦ１を使用して発現させた）のオリゴマー化を示した。レーン６はこの研究で対照として使用した市販の精製組換えＦ１（ｒＦ１）を示しており、やはり８５℃で加熱した。
【図１３】図１３はＣａｆ１Ｍ：Ｃａｆ１複合体を示す図である。Ｃａｆ１Ｍ、シャペロン（緑色）およびＣａｆ１、Ｆ１線維（青色）。図は公表されているＰＤＢファイル１Ｐ５Ｕを使用するＰｙｍｏｌソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を使用して作成した。Ａ）Ｆ１アミノ酸配列は、ＲＧＤＳペプチドを組み込むのに使用したＦ１線維のループ（サーモンピンク、桃色、橙色、濃青色および黄色で目立たせている）を示している。
【図１４】図１４はＲＧＤＳペプチドのＦ１ループへの挿入が成功していることを示す配列決定から得られる結果を示す図である。上パネル：Ｅｘｐａｓｙツール（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｄｎａ．ｈｔｍｌ）を使用するｃａｆ１遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ、受託番号ＡＹ４５０８４７）の逆配列決定およびｂｌａｓｔから得られるクロマトグラム。下パネル：Ｅｘｐａｓｙツール（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｄｎａ．ｈｔｍｌ）を使用するｃａｆ１遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ、受託番号ＡＹ４５０８４７）の逆配列決定およびｂｌａｓｔから得られるクロマトグラム。ユニバーサルプライマーＴ７プロモータープライマー（５’−ＡＡＴ  ＴＣＴ  ＡＡＴ  ＡＣＧ  ＡＣＴ  ＣＡＣ  ＴＡＴ  ＡＧＧ−３’）を使用して、ｐＧＥＭ−ＴＦ１ベクターにより産生されたｓｓＤＮＡの配列を決定した。
【図１５】図１５はサイズ排除クロマトグラフィー後の精製されたＣａｆ１ＱＤＧＮ７６ＲＧＤＳ変異体の画分を示す画像である。レーン２〜９は、試料を様々な時間９５℃で加熱した場合のＣａｆ１ＱＤＧＮ７６ＲＧＤＳ変異体オリゴマーを示した。
【図１６】図１６はＣａｆ１の線維の透過型電子顕微鏡像を示している。画像はＰｈｉｌｌｉｐｓ  ＣＭ１００透過型電子顕微鏡を使用して得られた。Ｃａｆ１およびＣａｆ１−ＲＧＤＳタンパク質試料は２％（ｗ／ｖ）酢酸ウラニルで染色した。使用した画像倍率は１３００００×であった。
【図１７】図１７はＣａｆ１およびＣａｆ１−ＲＧＤＳタンパク質で被覆されたガラスカバーグラスを使用するＰＣ１２細胞接着アッセイを示す画像である。画像はＺｅｉｓｓ蛍光顕微鏡を使用して得られた。使用した画像倍率は、画像のそれぞれのセットの隣に示される通りに、４００×および２００×であった。スケールバー＝２０μｍ。着色剤はＤＡＰＩ（青色）およびローダミンファロイジン（橙色）である。
【図１８】図１８は本発明の改変ＣＡＦ１ポリマーとフィブロネクチン中のＲＧＤＳペプチドの構造を比較している図である。
【図１９】図１９は本発明の好ましい架橋法の模式図である。球は架橋に適しているリジン残基の部位を表している。
【図２０】図２０はＡ、Ｂ、Ｄ−ＣＡＦ１：４ＮＨＳ−ＰＥＧ（１：５）；Ｃ−ＣＡＦ１：４ＮＨＳ−ＰＥＧ（１：２）；Ａ、Ｂ、Ｃ−２％グルタルアルデヒド固定；Ｄ−フリーズドライアープロセス；Ｅ−ＣＡＦ１：４ＮＨＳ−ＰＥＧ（１：５）ハイドロゲル上に付着したラット骨芽細胞の走査電子顕微鏡像を示している。スケールバー：５０μｍ（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）および２００μｍ（Ｅ）。
【図２１】図２１は、Ａ）フィブロネクチンおよびＢ）ＲＤＧＳを含むＣＡＦ１で被覆された表面上で増殖したラット初代骨芽細胞のＳＥＭおよび蛍光顕微鏡像を示している。スケールバー：１０μｍ。
【図２２】図２２は配列番号１の核酸配列を示す図である。
【図２３】図２３は配列番号２の核酸配列を示す図である。
【図２４】図２４は配列番号３の核酸配列を示す図である。
【図２５】図２５は配列番号４の核酸配列を示す図である。
【図２６】図２６は配列番号５のアミノ酸配列を示す図である。
【図２７】図２７は配列番号６のアミノ酸配列を示す図である。
【図２８】図２８は配列番号７のアミノ酸配列を示す図である。
【図２９】図２９は配列番号８のアミノ酸配列を示す図である。
【図３０】図３０は配列番号９のアミノ酸配列を示す図である。
【図３１】図３１は配列番号１０の核酸配列を示す図である。
【図３２】図３２は配列番号１１のアミノ酸配列を示す図である。
【図３３】図３３は配列番号１２の核酸配列を示す図である。
【図３４】図３４は配列番号１３のアミノ酸配列を示す図である。
【図３５】図３５は配列番号１４の核酸配列を示す図である。
【図３６】図３６は配列番号１５のアミノ酸配列を示す図である。
【図３７】図３７は配列番号１６の核酸配列を示す図である。
【図３８】図３８は配列番号１７のアミノ酸配列を示す図である。
【図３９】図３９は配列番号１８の核酸配列を示す図である。
【図４０】図４０は配列番号１９のアミノ酸配列を示す図である。
【図４１】図４１は配列番号２０の核酸配列を示す図である。
【図４２】図４２は配列番号２１のアミノ酸配列を示す図である。
【図４３】図４３は配列番号２２の核酸配列を示す図である。
【図４４】図４４は配列番号２３のアミノ酸配列を示す図である。
【図４５】図４５は配列番号２４の核酸配列を示す図である。
【図４６】図４６は配列番号２５のアミノ酸配列を示す図である。
【図４７】図４７は配列番号２６の核酸配列を示す図である。
【図４８】図４８は配列番号２７のアミノ酸配列を示す図である。
【図４９】図４９は配列番号２８の核酸配列を示す図である。
【図５０】図５０は配列番号２９のアミノ酸配列を示す図である。
【図５１】図５１は配列番号３０の核酸配列を示す図である。
【図５２】図５２は配列番号３１のアミノ酸配列を示す図である。
【図５３】図５３は配列番号３２の核酸配列を示す図である。
【図５４】図５４は配列番号３３のアミノ酸配列を示す図である。
【図５５】図５５は配列番号３４の核酸配列を示す図である。
【図５６】図５６は配列番号３５のアミノ酸配列を示す図である。
【図５７】図５７は配列番号３６の核酸配列を示す図である。
【図５８】図５８は配列番号３７のアミノ酸配列を示す図である。
【図５９】図５９は配列番号３８の核酸配列を示す図である。
【図６０】図６０はプラスミドｐＡＨ３４ＬおよびｐＢＡＤ３３を使用するＣａｆ１  ＷＴの同時発現を示す画像である。０．２％のＬ−アラビノースの存在下でおよびＤ−グルコースの存在下または非存在下で、大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿Ｃａｆ１、大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＡＨ３４Ｌおよび大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿Ｃａｆ１  ＋  ｐＡＨ３４Ｌを含有するＦａｌｃｏｎチューブの画像を表している。レジェンド：Ｌ−綿状層；Ｐ−細胞ペレット。
【図６１】図６１は調製物ごとのＣａｆ１の綿状層のサイズとＣａｆ１の相対密度の間の関係を示す図である。Ｃａｆ１系を通じて分泌されるタンパク質のレベルは、Ｃａｆ１発現が高アラビノース濃度で増強されるように、アラビノースパーセンテージが増加するに従って増加する。グルコースの添加は、おそらくグルコースが追加の炭素供給源として作用するので、意外なことにタンパク質産生を減少させるのではなく増強し、その抑制は１６時間発酵実行にわたり消失する。
【図６２】図６２はＣａｆ１−ＦＬＡＧエピトープＮＴタンパク質発現のウェスタンブロットを示す図である。上澄み由来の異種Ｃａｆ１タンパク質試料は２×ＳＤＳ試料バッファー中、１００℃で４５秒間または５分間加熱した。２×ＳＤＳ試料バッファー中の非加熱試料もＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷した。（Ａ）モノクローナル抗Ｃａｆ１抗体を用いてＣａｆ１についてプロービングしたｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  ＮＴ−ＦＬＡＧ＋ｐＡＨ３４Ｌ。（Ｂ）抗フラッグエピトープ抗体を用いてＦＬＡＧエピトープについてプロービングしたｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  ＮＴ−ＦＬＡＧ＋ｐＡＨ３４Ｌ。Ｍ、分子量マーカータンパク質（分子量×１０３ｋＤａ）；レーン１、非加熱ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  ＮＴ−ＦＬＡＧ＋ｐＡＨ３４Ｌ試料；レーン２、９５℃で４５秒間加熱したｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  ＮＴ−ＦＬＡＧ＋ｐＡＨ３４Ｌ試料；レーン３、９５℃で５分間加熱したｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  ＮＴ−ＦＬＡＧ＋ｐＡＨ３４Ｌ試料。レーン４、非加熱ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  ＮＴ−ＦＬＡＧ試料；レーン５、９５℃で４５秒間加熱したｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  ＮＴ−ＦＬＡＧ試料；レーン６、９５℃で５分間加熱したｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  ＮＴ−ＦＬＡＧ試料；レーン７、非加熱ｐＡＨ３４Ｌ試料；レーン８、９５℃で４５秒間加熱したｐＡＨ３４Ｌ試料；レーン９、９５℃で５分間加熱したｐＡＨ３４Ｌ試料。
【図６３】図６３はＣａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴタンパク質発現のウェスタンブロットを示す画像である。上澄み由来の異種Ｃａｆ１タンパク質試料は２×ＳＤＳ試料バッファー中、１００℃で４５秒間および５分間加熱した。２×ＳＤＳ試料バッファー中の非加熱試料もＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷した。（Ａ）モノクローナル抗Ｃａｆ１抗体を用いてＣａｆ１についてプロービングしたｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ。（Ｂ）抗ポリヒスチジン抗体を用いてポリヒスチジンについてプロービングしたｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  ６Ｈｉｓ−ＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ。Ｍ、分子量マーカータンパク質（分子量×１０３ｋＤａ）；レーン１、非加熱ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ試料；レーン２、９５℃で４５秒間加熱したｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ試料；レーン３、９５℃で５分間加熱したｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ試料。レーン４、非加熱ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴ試料；レーン５、９５℃で４５秒間加熱したｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴ試料；レーン６、９５℃で５分間加熱したｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴ試料；レーン７、非加熱ｐＡＨ３４Ｌ試料；レーン８、９５℃で４５秒間加熱したｐＡＨ３４Ｌ試料；レーン９、９５℃で５分間加熱したｐＡＨ３４Ｌ試料。
【図６４】図６４はＣａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサータンパク質発現のウェスタンブロットを示す画像である。上澄み由来の異種Ｃａｆ１タンパク質試料は２×ＳＤＳ試料バッファー中、１００℃で４５秒間および５分間加熱した。２×ＳＤＳ試料バッファー中の非加熱試料もＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷した。（Ａ）モノクローナル抗Ｃａｆ１抗体を用いてＣａｆ１についてプロービングしたｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  ６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサー＋ｐＡＨ３４Ｌ。（Ｂ）抗ポリヒスチジン抗体を用いてポリヒスチジンについてプロービングしたｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサー＋ｐＡＨ３４Ｌ。Ｍ、分子量マーカータンパク質（分子量×１０３ｋＤａ）；レーン１、非加熱ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサー＋ｐＡＨ３４Ｌ試料；レーン２、９５℃で４５秒間加熱したｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサー＋ｐＡＨ３４Ｌ試料；レーン３、９５℃で５分間加熱したｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサー＋ｐＡＨ３４Ｌ試料。レーン４、非加熱ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  ６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサー試料；レーン５、９５℃で４５秒間加熱したｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサー試料；レーン６、９５℃で５分間加熱したｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサー試料；レーン７、非加熱ｐＡＨ３４Ｌ試料；レーン８、９５℃で４５秒間加熱したｐＡＨ３４Ｌ試料；レーン９、９５℃で５分間加熱したｐＡＨ３４Ｌ試料。
【図６５】図６５は異種Ｃａｆ１タンパク質発現のウェスタンブロットを示す画像である。上澄み由来の異種Ｃａｆ１タンパク質試料は２×ＳＤＳ試料バッファー中、１００℃で４５秒間加熱した。Ｍ、分子量マーカータンパク質（分子量×１０３ｋＤａ）；レーン１、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−ＰＨＳＲＮループ１＋ｐＡＨ３４Ｌ；レーン２、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−Ｃｙｓ−ＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ；レーン３、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−Ｇ３５Ｃループ４＋ｐＡＨ３４Ｌ；レーン４、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−Ｑ１０６Ｃループ２＋ｐＡＨ３４Ｌ；レーン５、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−ＰＥＮＦＦ−ＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ；レーン６、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−ＰＨＳＲＮループ３＋ｐＡＨ３４Ｌ；レーン７、Ｃａｆ１。
【図６６】図６６は例となるクロスリンカーを示す図である。（ａ）ＤＴＳＳＰクロスリンカー構造；（ｂ）ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳクロスリンカー構造；（ｃ）４アームＮＨＳ−ＰＥＧクロスリンカー構造。
【図６７】図６７は４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋されたＣａｆ１ハイドロゲルの画像を示す。（Ａ）２分間の反応後に形成されたＣａｆ１ハイドロゲル（Ｃａｆ１：４アームＰＥＧ−ＮＨＳ、架橋比１対２）。（Ｂ）ＰＢＳ添加後のポリプロピレン微量遠心管中のＣａｆ１ハイドロゲルの膨潤。Ｃａｆ１対４アームＰＥＧ−ＮＨＳ、架橋比（ｗ／ｗ）：管１−１対１０；管２−１対５；管３−１対３；管４−１対２。
【図６８】図６８は、４〜２０％勾配ポリアクリルアミドゲル電気泳動による様々なクロスリンカーを使用するＣａｆ１タンパク質架橋の分析を示す画像である。レジェンド：Ｍ、分子量マーカータンパク質（分子量×１０３ｋＤａ）；レーン１〜４、ＤＴＳＳＰで架橋されたＣａｆ１ハイドロゲル；レーン５〜８、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳで架橋されたＣａｆ１ハイドロゲル；レーン９〜１２、４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋されたＣａｆ１ハイドロゲル。この研究で使用した架橋比は、レーン１−１対１０；レーン２−１対５；レーン３−１対３；レーン４−１対２；レーン５−１対１０；レーン６−１対５；レーン７−１対３；レーン８−１対２；レーン９−１対１０；レーン１０−１対５；レーン１１−１対３；レーン１２−１対２であった。勾配ポリアクリルアミドゲルはクーマシーブリリアントブルーＧ−２５０着色剤で染色した。プレシジョンＰｌｕｓプロテインスタンダードを使用した。
【図６９】図６９は様々なクロスリンカーで架橋されたＣａｆ１ハイドロゲルのＴＥＭ画像を示している（ｗ／ｗ比１対１０）。スケールバーは１００ｎｍを表している。架橋Ｃａｆ１ハイドロゲルメッシュのサイズ分布も示している。
【図７０】図７０はＣａｆ１ハイドロゲルならびに対照：ｃｐＣａｆ１、４アームＰＥＧ−ＮＨＳおよびＣａｆ１ポリマーの透過型電子顕微鏡像を示している。標本はすべてネガティブ染色した。スケールバーは１００ｎｍを示す。
【図７１】図７１は種々の架橋比で４アームＰＥＧ−ＮＨＳを用いて架橋されたＣａｆ１ポリマーの透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）像を示している（ｗ／ｗ、クロスリンカー；Ｃａｆ１）。標本はすべてネガティブ染色した。スケールバーは１００ｎｍを示す。
【図７２】図７２は４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋されたＣａｆ１ハイドロゲルの走査型電子顕微鏡像を示している（ｗ／ｗ比１対３）。
【図７３】図７３は凍結乾燥後の４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋されたＣａｆ１ハイドロゲルの走査型電子顕微鏡像を示している（ｗ／ｗ比１対３）。Ａ−凍結乾燥過程後のＣａｆ１ハイドロゲルの断片。Ｂ−Ｃａｆ１ハイドロゲルの原画像。Ｃ−Ｃａｆ１ハイドロゲルポアの画像。Ｄ−Ｊｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２．５（Ｒｏｄｕｉｔ、２００７）で処理された画像。ポア径の測定は、ハイドロゲルのポアを横切る画像上に表される赤線として、作図線により行った。ポアのサイズを計算した。この式はＳｏｌｉａｋｏｖら、２０１０から得た。
【図７４】図７４は後の４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋されたＣａｆ１ハイドロゲルの環境制御型走査型電子顕微鏡像を示している（ｗ／ｗ比１対３）。Ａ−Ｃａｆ１ハイドロゲル。Ｂ−Ｃａｆ１ハイドロゲルの原画像。Ｃ−Ｃａｆ１ハイドロゲル。Ｄ−Ｊｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎバージョン１．２．５で処理された画像。ポア径の測定は、ハイドロゲルのポアを横切る画像上に表される赤線として、作図線により行った。
【図７５】図７５は（Ａ）マウス３Ｔ３線維芽細胞。（Ｂ）ラット初代骨芽細胞の走査型電子顕微鏡像を示している。白矢印は細胞を示している。４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋されたＣａｆ１ハイドロゲル上の細胞接着（比１対３）。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明者らは、驚くべきことに、操作されたシャペロン／アッシャータンパク質モノマーから作製される柔軟性タンパク質ナノ線維を使用すれば現実的な細胞微小環境を生み出すことができることを確認した。柔軟性タンパク質ナノ線維を非毒性および非免疫原性クロスリンカーで架橋して、本発明によるハイドロゲルを産生することができる。一実施形態では、ナノ線維ハイドロゲルは、生理活性タンパク質配列を組み込むモノマーフォールディングユニットで構成されている。好ましくは、ハイドロゲルは頑強でプロテアーゼ抵抗性である。
【００４７】
具体的には、本発明者らは、図１８に示されるように、ポリマーのシャペロン／アッシャーファミリー、および特に、ペスト菌Ｃａｆ１、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）Ｓａｆ１および大腸菌Ａｆａ／Ｄｒなどの単一または複合モノマーサブユニット型（複数でもよい）を含む、ＦＧループ長（ＦＧＬ）ファミリーメンバーがフィブロネクチンと思いがけない構造類似性を示すことを確認した。
【００４８】
Ｃａｆ１モノマー画分１抗原ポリマーをモデルとして使用して、本発明者らは、ポリマーのシャペロン／アッシャーファミリー、および特にＦＧループ長（ＦＧＬ）ファミリーメンバーが、画分１抗原ポリマーなどの天然に存在するシャペロン／アッシャーポリマーを含むハイドロゲル（細胞毒性の徴候は全くない）に形成されると細胞付着阻害挙動を示すことを明らかにした。シャペロン／アッシャーポリマーのこの思いがけない特性のおかげで、シャペロン／アッシャーポリマーは、防汚組成物中で使用することができる防汚剤として特に有用になっている。しかし、思いがけないことに、本発明者らは、フィブロネクチン由来の細胞接着モチーフＲＧＤＳなどの一般に使用されている生理活性配列をＣＡＦ１などのシャペロン／アッシャーモノマーに組み込むだけで、付着阻害を逆転させて画分１抗原ポリマーなどのシャペロン／アッシャーポリマーを産生し、このポリマーがハイドロゲルに形成されると細胞付着、生存および増殖を促進することを見出した（図２０および２１参照）。
【００４９】
したがって、本発明のポリマーの天然に存在する領域は、特定の生理活性配列を導入することができる表面を提供し、細胞付着、生存および／または増殖を促進することに関して得られたポリマー挙動は、その中に組み込まれた特定の（１以上の）生理活性配列によって決定される。これらの特性は、本発明のポリマーが、例えば、細胞培養および再生医療の分野で使用される場合、（異なる生理活性配列をポリマーに組み込むことにより）細胞相互作用を促進するまたは阻害することが完全に思いのままにできるので、顕著な利点を与える。したがって、有利なことに、本発明のポリマーを使用してポリマーと標的成分（例えば、ペプチド、タンパク質、架橋ユニット、酵素、抗体、細胞、試薬、等）の間の選択的細胞接着および／または選択的相互作用を、標的成分とポリマーの天然に存在する領域の間の低バックグランド相互作用でまたはバックグランド相互作用なしで促進することができる。
【００５０】
本発明者らは、驚くべきことに、外因性生理活性配列を含むシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーは、そのポリマー形態を保持することができることを見出した。本発明者らは、変異ＦＧループ長ファミリーポリペプチドモノマー、特にｃａｆ１モノマー（例えば、ＲＧＤＳ、ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、等などの外来性（生理活性）配列を含むｃａｆ１モノマー）を使用してこのことを例証した。ある範囲の様々な実験外来性配列を含有するシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを産生した。それぞれの場合に、これらの実験モノマーはポリマー形態を帯びる能力を保持し驚くほど安定であることを明らかにした。これにより、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーのこの特長は特定の外来性配列に限定されず、もっと一般的に適用可能であることが示されている。
【００５１】
有利なことに、本発明のシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを使用すれば、同種または異種の（すなわち、混合の）ポリマーを作製することができる。例を挙げれば、混合ポリマーは天然に存在するモノマーおよび変異モノマーを含むことがある。あるいは、混合ポリマーは、場合により天然に存在するモノマーの存在下で、２つの全く異なる変異モノマーを含むことがある。本発明者らは、野生型ｃａｆ１モノマーとｃａｆ１変異型を含む混合ポリマーの首尾よくいった産生を実証している（例えば、図６２から６５および対応する本文を参照）。そのようなポリマーは、本明細書でさらに詳細に考察する広範囲の利点を有する。
【００５２】
シャペロン／アッシャー（ＣＵ）タンパク質は細胞表面上で長いポリマー線毛を形成する。シャペロンはペリプラズムに分泌されたモノマーを安定化し、外膜アッシャータンパク質内に位置する成長中のポリマー線毛の末端までモノマーを搬送し、このアッシャータンパク質はこの新生ポリマーを細胞表面まで移動させる。重合化機構は「ドナー鎖交換」と呼ばれ、尿路疾患性大腸菌由来のＦｉｍＣ−ＦｉｍＨシャペロン接着複合体についてはじめて記載された。そのサブユニットはβサンドイッチ免疫グロブリンドメインで構成されており、そこではＣ末端のβ鎖と考えられるものが、天然のフォールディングを完了することができないＮ末端に移されている。インビボでは、サブユニットは、分泌後、シャペロン由来のβ鎖の挿入により、まず部分的に安定化される。最終的な安定したフォールディングは、シャペロン平行β鎖がそれに続くサブユニットのＮ末端からの「予備の」逆平行β鎖に置き換えられることにより達成され、このようにしてこれらの鎖は連結されてチェーンを形成する。
【００５３】
Ｃａｆ１（画分１抗原ポリマーとしても知られる）は伝染病細菌、ペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）由来のＣＵタンパク質であり、そこではＣａｆ１はポリマー病毒性因子およびワクチン成分として機能する。Ｃａｆ１は上記のドナー鎖交換（ＤＳＥ）機構によりモノマーから形成される。Ｃａｆ１非定型ポリマーは、病原体を食作用から保護すると考えられているゼラチン状被膜を形成する。
【００５４】
インビボでは、画分１抗原ポリマーの発現、組立ておよび分泌は古典的シャペロン−アッシャー経路を介して実施され（５）、ｃａｆオペロンに組織化されている４つの遺伝子の群により仲介される。画分１抗原ポリマー（ＣＡＦ１モノマー）は、転写活性化因子ｃａｆ１Ｒ遺伝子により温度調節されているｃａｆ１遺伝子によりコードされている。ペリプラズムシャペロン、ｃａｆ１Ｍは伝染病病原体ペスト菌により産生されるＦ１被膜の組立てのために使用され、外膜タンパク質、ｃａｆ１Ａアッシャーは組立てプラットフォーム／分泌機構として機能する（図１参照）（１２、１４、１５）。
【００５５】
Ｃａｆ１は、Ｍｉｌｌｅｒと共同研究者らによりクローニングされて（８）、ｃａｆオペロンを含有する組換え低コピープラスミドｐＡＨ３４Ｌを含有する大腸菌から発現された（図３）。このプラスミドｐＡＨ３４Ｌは、Ｃａｆ１タンパク質発現に優れた系であることが明らかにされている。しかし、その全サイズ（約１１Ｋｂｐ）および都合の良い制限部位の欠如のせいでこのプラスミド内でＦ１を変異させるのは困難であった。
【００５６】
＜モノマー＞
第一の態様では、本発明は外因性生理活性配列を含むシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを提供する。
【００５７】
好ましくは、ポリペプチドは組換えまたは合成であり、すなわち、当技術分野で周知の組換えまたは合成産生技法により産生される。
【００５８】
本明細書で使用されるように、語句「シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマー」とは、典型的にはグラム陰性菌の表面で見つかる長いポリマータンパク質線維のポリペプチドサブユニット、好ましくは主要サブユニットのことであり、その生合成はシャペロン／アッシャー経路により制御されている。
【００５９】
シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドはその高次構造に基づいて２つのグループに分けることができる。本発明のシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドはＦＧループ長ファミリーメンバー（不定形接着ファミリーとしても知られる）である可能性がある。ＦＧループ長（ＦＧＬ）ファミリーメンバーは単一モノマーサブユニット型を含む。ペスト菌Ｃａｆ１、サルモネラＳａｆ１および大腸菌Ａｆａ／Ｄｒ接着は、薄い画像に撮りにくいポリマー線維を形成するＦＧＬまたは不定形接着ファミリーモノマーサブユニットの例である。ＦＧループ短（ＦＧＳ）ファミリーメンバー（典型的接着ファミリーとしても知られる）は、そのシャペロンの構造的特長にちなんで名付けられているが、最大６つの異なるモノマーサブユニットで構成することができる。大腸菌Ｆｉｍ（１型線毛）およびＰａｐ（Ｐ線毛）タンパク質は、ＦＧＳまたは典型的接着ファミリーモノマーサブユニットの例であり、このサブユニットは、サブユニットの緊密に巻かれたヘリックスに基づく棒状直鎖構造を呈する。本発明のシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーはＦＧループ長（ＦＧＬ）ファミリーメンバーのこともあれば、ＦＧループ短（ＦＧＳ）ファミリーメンバーのこともある。
【００６０】
シャペロンアッシャータンパク質ファミリーは、基本的な免疫グロブリンドメインフォールドを共有しており、したがって構造的相同性を有することが見てとれる。これはその配列相同性にも反映されている。相同性のレベルは類似的に構造化されたタンパク質、例えば、ＰａｐおよびＦｉｍファミリーの間では高いが、もっと広いファミリー間ではこの相同性は、三次元構造相同性も考慮されることがなければ、取るに足りないと見なされうるレベルにまで減少する。異種のシャペロンアッシャータンパク質ファミリー内での類似点および相違点の優れた記述は参考文献（１８）の図２に提供されている。
【００６１】
好ましくは、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーサブユニットは、Ｃａｆ１ポリペプチドモノマー、Ｓａｆ１ポリペプチドモノマー、Ａｆａ／Ｄｒポリペプチドモノマー、ＦｉｍＡ、Ｈ、ＧもしくはＦポリペプチドモノマー、またはＰａｐＡ、Ｇ、Ｆ、ＥもしくはＫポリペプチドモノマーである。
【００６２】
ペスト菌由来の天然に存在するＣａｆ１ポリペプチドモノマーのアミノ酸配列は配列番号５に示されている。この配列はおよそ１５０アミノ酸残基長である。ポリペプチドモノマーは、配列番号１に示されているヌクレオチド配列を有するＣａｆ１核酸分子によりコードされている。Ｃａｆ１は２１のアミノ酸切断可能シグナルペプチドで合成され、このペプチドは内膜を通過するモノマーの移行中に切断される。
【００６３】
サルモネラ由来の天然に存在するＳａｆ１ポリペプチドモノマーのアミノ酸配列は配列番号９に示されている。この配列はおよそ１４５アミノ酸長である。ポリペプチドモノマーは、配列番号１０に示されているヌクレオチド配列を有するＳａｆ１核酸分子によりコードされている。
【００６４】
大腸菌由来の天然に存在するＡｆａ／Ｄｒポリペプチドモノマーのアミノ酸配列は配列番号１１に示されている。この配列はおよそ１４０アミノ酸長である。ポリペプチドモノマーは、配列番号１２に示されているヌクレオチド配列を有するＡｆａ／Ｄｒ核酸分子によりコードされている。
【００６５】
大腸菌由来の天然に存在するＦｉｍＡポリペプチドモノマーのアミノ酸配列は配列番号１３に示されている。この配列はおよそ１５０アミノ酸長である。ポリペプチドモノマーは、配列番号１４に示されているヌクレオチド配列を有するＦｉｍＡ核酸分子によりコードされている。
【００６６】
大腸菌由来の天然に存在するＦｉｍＨポリペプチドモノマーのアミノ酸配列は配列番号２５に示されている。この配列はおよそ１５０から２００アミノ酸長である。ポリペプチドモノマーは、配列番号２６に示されているヌクレオチド配列を有するＦｉｍＨ核酸分子によりコードされている。
【００６７】
大腸菌由来の天然に存在するＦｉｍＧポリペプチドモノマーのアミノ酸配列は配列番号２７に示されている。この配列はおよそ１５０から２００アミノ酸長である。ポリペプチドモノマーは、配列番号２８に示されているヌクレオチド配列を有するＦｉｍＧ核酸分子によりコードされている。
【００６８】
大腸菌由来の天然に存在するＦｉｍＦポリペプチドモノマーのアミノ酸配列は配列番号２９に示されている。この配列はおよそ１５０から２００アミノ酸長である。ポリペプチドモノマーは、配列番号３０に示されているヌクレオチド配列を有するＦｉｍＦ核酸分子によりコードされている。
【００６９】
大腸菌由来の天然に存在するＰａｐＡポリペプチドモノマーのアミノ酸配列は配列番号１５に示されている。この配列はおよそ１５０から２００アミノ酸長である。ポリペプチドモノマーは、配列番号１６に示されているヌクレオチド配列を有するＰａｐＡ核酸分子によりコードされている。
【００７０】
大腸菌由来の天然に存在するＰａｐＧポリペプチドモノマーのアミノ酸配列は配列番号３１に示されている。この配列はおよそ３００アミノ酸長である。ポリペプチドモノマーは、配列番号３２に示されているヌクレオチド配列を有するＰａｐＧ核酸分子によりコードされている。
【００７１】
大腸菌由来の天然に存在するＰａｐＦポリペプチドモノマーのアミノ酸配列は配列番号３３に示されている。この配列はおよそ１５０から２００アミノ酸長である。ポリペプチドモノマーは、配列番号３４に示されているヌクレオチド配列を有するＰａｐＦ核酸分子によりコードされている。
【００７２】
大腸菌由来の天然に存在するＰａｐＥポリペプチドモノマーのアミノ酸配列は配列番号３５に示されている。この配列はおよそ１５０から２００アミノ酸長である。ポリペプチドモノマーは、配列番号３６に示されているヌクレオチド配列を有するＰａｐＥ核酸分子によりコードされている。
【００７３】
大腸菌由来の天然に存在するＰａｐＫポリペプチドモノマーのアミノ酸配列は配列番号３７に示されている。この配列はおよそ１５０から２００アミノ酸長である。ポリペプチドモノマーは、配列番号３８に示されているヌクレオチド配列を有するＰａｐＫ核酸分子によりコードされている。
【００７４】
本明細書で使用されるように、用語「核酸分子」にはＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）および、例えばヌクレオチドアナログの使用により作製されるＤＮＡまたはＲＮＡのアナログが含まれる。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でも可能であるが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００７５】
本明細書で使用されるように、「天然に存在する」とは天然に存在するポリペプチド配列または天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有する核酸分子、例えばＲＮＡまたはＤＮＡ分子のことである。前記核酸分子はタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、非コード調節配列およびイントロンをさらに含むことができる。用語「天然に存在する」と「野生型」は本明細書では互換的に使用される。
【００７６】
本明細書で使用されるように、用語「外因性の」とは、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマー配列内に存在しないまたは天然に存在しない異種ポリペプチドまたは核酸配列のことである。異種ポリペプチドまたは核酸配列は、細胞の内因性ポリペプチド配列または核酸配列と同一のまたは部分的に相同なポリペプチドまたは核酸配列を含むことがあることは注目すべきである。本明細書で使用される用語「内因性の」とはシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマー配列内に存在するおよび／または天然に存在する任意のポリペプチドまたは核酸配列のことである。
【００７７】
本発明の一態様内では、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーは外来性配列を含む。外来性配列は生理活性配列のこともあるし他の任意の望ましい外来性配列のこともある。
【００７８】
本明細書で使用されるように、「生理活性配列」とは、特定の生物学的機能を有するペプチド配列のことである。生理活性配列は当技術分野では周知であり、ＥＣＭ成分、細胞接着分子、細胞表面受容体、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、等を含む任意の天然に存在するポリペプチドから引き出しうる。例えば、生理活性配列は細胞接着（または細胞付着）、細胞増殖および／または細胞分化（または細胞表現型の誘導）を媒介しうる。
【００７９】
好ましい実施形態では、生理活性配列は細胞接着認識モチーフ、増殖因子配列モチーフまたはプロテアーゼ部位である。
【００８０】
好ましくは、細胞接着認識モチーフは細胞外マトリックス細胞接着認識モチーフ、例えば、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、ビトロネクチンまたはテネイシンなどの細胞外マトリックス成分由来のモチーフである。好ましくは、細胞接着認識モチーフはフィブロネクチンに由来し、アミノ酸配列ＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）、さらに好ましくはＲＧＤＳ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ）を含む。あるいは、細胞接着認識モチーフはフィブロネクチンに由来し、アミノ酸配列ＰＨＳＲＮ（Ｐｒｏ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ａｓｎ）を含む。
【００８１】
あるいは、細胞接着認識モチーフはコラーゲンＩに由来し、アミノ酸配列ＧＴＰＧＰＱＧＩＡＧＱＲＧＶＶを含む。あるいは、細胞接着認識モチーフはコラーゲンＩＶに由来し、アミノ酸配列ＭＮＹＹＳＮＳを含む。あるいは、細胞接着認識モチーフはラミニンに由来し、アミノ酸配列ＹＩＧＳＲを含む。あるいは、細胞接着認識モチーフはラミニンに由来し、アミノ酸配列ＩＫＶＡＶを含む。あるいは、細胞接着認識モチーフはフィブロネクチンに由来し、アミノ酸配列ＦＨＲＲＩＫＡを含む。あるいは、細胞接着認識モチーフはフィブロネクチンに由来し、アミノ酸配列ＬＤＶＰを含む。あるいは、細胞接着認識モチーフはフィブロネクチンに由来し、アミノ酸配列ＩＤＡＰを含む。
【００８２】
あるいは、生理活性配列は、アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、自己分泌運動性因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、増殖分化因子−９（ＧＤＦ９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヘパトーマ由来増殖因子（ＨＤＧＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、神経成長因子（ＮＧＦ）および他のニューロトロフィン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦ−α）、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、Ｗｎｔシグナル伝達経路、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、胎仔ウシソマトトロピン（ＦＢＳ）、ＩＬ−３およびＩＬ−６のＩＬ−１−補因子（Ｔ細胞を活性化する）、ＩＬ−２−Ｔ細胞増殖因子（ＩＬ−１合成を刺激する、Ｂ細胞とＮＫ細胞を活性化する）、ＩＬ−３（すべての非リンパ系細胞の産生を刺激する）；ＩＬ−４−増殖因子（活性化されたＢ細胞、休止Ｔ細胞、およびマスト細胞の）、ＩＬ−５（活性化されたＢ細胞と好酸球の分化を誘導する）、ＩＬ−６（Ｉｇ合成を刺激する、プラズマ細胞の増殖因子）、ＩＬ−７（プレＢ細胞の増殖因子）、ニューロン増殖因子（ＮＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）または骨形成タンパク質２（ＢＭＰ）由来の増殖因子配列モチーフ、例えば、ＫＩＰＫＡＳＳＶＰＴＥＬＳＡＩＳＴＬＹＬを含む生理活性配列である。
【００８３】
あるいは、生理活性配列は既知のマトリックスメタロプロテイナーゼ切断部位に由来するプロテアーゼ部位である。
【００８４】
好ましい実施形態では、生理活性配列を含むシャペロン／アッシャーファミリーペプチドモノマーは、配列番号５、９、１１、１３、１５、２５、２７、２９、３１、３３、３５および３７のうちのいずれか１つのポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）。
【００８５】
本発明の生理活性配列を含むシャペロン／アッシャーファミリーペプチドモノマーは、シャペロン／アッシャーファミリーモノマー活性、例えば、ポリマータンパク質線維を形成する能力を保持したまま生理活性配列の生物活性を示す。
【００８６】
配列間の配列相同性または同一性（これらの用語は本明細書では互換的に使用される）の計算は以下の通りに実施する。
【００８７】
２つのアミノ酸配列、または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するため、配列は最適比較目的で整列させる（例えば、最適アライメントのために第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができるし、非相同配列は比較目的で無視することができる）。好ましい実施形態では、比較目的で整列させた基準配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８２％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列中の位置を第二の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドが占めている場合、分子はその位置で同一である（本明細書で使用されるように、アミノ酸または核酸「同一性」はアミノ酸または核酸「相同性」と等価である）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適アライメントのために導入する必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮に入れると、配列により共有される同一位置の数の関数である。
【００８８】
２つの配列間の配列比較およびパーセント同一性の決定は数学アルゴリズムを使用して実現することができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、ｔｈｅ  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３）アルゴリズムを使用して決定し、前記アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）に組み込まれており、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、およびギャップウェイト１６、１４、１２、１０、８、６、または４および長さウェイト１、２、３、４、５、または６を使用する。さらに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）を使用して決定し、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよびギャップウェイト４０、５０、６０、７０、または８０および長さウェイト１、２、３、４、５、または６を使用する。特に好ましいセットのパラメータ（および分子が本発明の配列同一性または相同性内にあるかどうかを判定するのにどのパラメータを適用すべきかを実行者が確信できない場合に使用すべきパラメータ）はＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスで、ギャップペナルティー１２、ギャップ伸長ペナルティー４、およびフレームシフトギャップペナルティー５である。
【００８９】
２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、Ｍｅｙｅｒｓら、（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７）のアルゴリズムを使用して決定することができ、このアルゴリズムはＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、ギャップ長さペナルティー１２およびギャップペナルティー４を使用する。
【００９０】
好ましくは、生理活性配列はシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチド内の、前記ポリペプチドがフォールディングされるとループ構造内に含まれる部位に含まれる。アミノ酸の挿入に適したループ領域は、天然に存在するＣａｆ１ポリペプチドのアミノ酸残基１、１５、２７〜４０、５１〜５８、６４〜６９、７７〜８２、９２〜１１７、１２７〜１３５に隣接して存在する。Ｃａｆ１の適切な挿入部位の例は図２６に示されている（挿入部位は下線が施されている）。さらに好ましくは、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドはＣａｆ１ポリペプチドであり、生理活性配列はフォールディングされたＣＡＦ１ポリペプチドのループ５（ＱＤＧＮＮ）内に含まれる。あるいは、生理活性配列はポリペプチドのＮまたはＣ末端に付加することができる。あるいは、生理活性配列は、例えば、合成ペプチド分子をＣａｆ１モノマー内に操作されたシステイン残基に結合させることにより合成的に付加させることができる。
【００９１】
好ましくは、シャペロン／アッシャーポリペプチドモノマーは、前述のループ部位のいずれか１つに、しかし好ましくはポリペプチドのＮ末端（またはＣ末端）に挿入されたアフィニティータグをさらに含む。
【００９２】
好ましくは、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーは、上に記載されているように、２つまたは３つ以上の生理活性配列を含む。
【００９３】
＜ポリマー＞
一態様では、本発明は、本発明による少なくとも１つのシャペロンファミリーポリペプチドモノマーを含むシャペロン／アッシャーファミリーポリマーに関する。
【００９４】
本明細書で使用されるように、「シャペロン／アッシャーファミリーポリマー」とは、典型的には、その生合成がシャペロン／アッシャー経路により制御されているモノマーポリペプチドサブユニットを含むグラム陰性菌の表面に見出される長いポリマータンパク質線維のことである。
【００９５】
ポリマーは混合ポリマー（すなわち、２つまたは３つ以上の全く異なるモノマーユニット、例えば、天然に存在するＣａｆ１モノマーおよび外因性生理活性配列を含むｃａｆ１モノマーを含むポリマー）であってもよい。
【００９６】
好ましくは、本発明によるシャペロン／アッシャーファミリーポリマーは、少なくとも１つのさらなるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含み、前記さらなるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーは、外因性生理活性配列を含む前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーとは少なくとも１つのアミノ酸が異なる。さらに好ましくは、さらなるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーは前記外因性生理活性配列がない上記のシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーである。
【００９７】
混合ポリマーはいくつかの利点がある。例えば、混合ポリマーは、低密度の活性モチーフ（例えば、外因性生理活性配列を含むモノマー）、不活性モノマーと共に分散している（例えば、天然に存在するモノマーまたは外因性生理活性配列を欠くモノマー）のみを含むことがある。ポリマー中の低密度活性モチーフだけで望ましい生物活性を促進する（例えば、ポリマーへの細胞接着を促進する）のに十分である場合がある。混合モノマーサブユニットを使用してポリマーを作製すれば、活性モチーフ（例えば、外因性生理活性配列）を含むモノマーが分泌経路において組み立てられるのに時間がかかる場合に、ポリマーの発現レベルを改良することができる。
【００９８】
ある種の適用では、本発明のモノマーおよび／またはポリマーが実質的に非免疫原性であることが好ましい場合がある。例えば、創傷治癒または眼移植片適用におけるなどのインビボでの細胞増殖のためのスキャフォールドとしてのポリマーの利用の多くは、免疫応答を誘発しないポリマーを用いることから恩恵を受けることがある。
【００９９】
本発明のポリマーは、実質的に非免疫原性シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含みうる。あるいは、またはさらに、本発明のポリマーは、実質的に非免疫原性である外因性生理活性配列を含みうる。
【０１００】
特に、本発明のポリマーは非免疫原性供給源由来である外因性生理活性配列を含みうる。この文脈では「非免疫原性」供給源は、外来性配列を含むポリマーがその後投与されることがある対象において免疫応答を誘発しない供給源（例えば、外来性配列が由来するポリペプチド）であると見なすべきであることは認識されるであろう。例えば、ヒト対象に投与されるポリマーの場合、ヒトポリペプチドは、同様に実質的に非免疫原性である外来性ポリペプチドの適切な非免疫原性供給源を提供すると予想しうる。したがって、本発明のポリマーの適切な例は、ヒト供給源などの哺乳動物供給源由来である外因性生理活性配列を含みうる。
【０１０１】
本発明のポリマー、または外因性生理活性配列もしくはそのような配列の供給源の免疫原性を（または他の方法で）調べることができる種々のアッセイは当業者には周知であり、当業者がそのようなアッセイを適用するのは簡単なことになる。
【０１０２】
本発明の適切なポリマーは細胞接着モチーフなどの天然に存在する接着モチーフがない、または実質的にないシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含みうる。特に、そのようなモノマーはヒト細胞の接着を可能にする部位がない、または実質的にないことがある。
【０１０３】
あるいは、本発明のポリマーは、外因性生理活性配列が唯一の細胞接着（特に、ヒト細胞接着）モチーフ／部位を与えるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含むことがある。本開示の別の場所で考察するように、ある種のシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチド（例えば、Ｃａｆ１）はヒト細胞の接着を阻害するという知見は新しいものでもあり思いがけないものでもある。細胞接着モチーフを含む外因性生理活性配列は、これらのモノマーのポリマーを形成する能力に悪影響を及ぼすことなくそのような他の点では非接着性モノマーに組み込むことができることも驚きである。
【０１０４】
好ましくは、シャペロン／アッシャーファミリーポリマーは画分１抗原ポリマーであり、このポリマーは天然に存在するＣＡＦ１ポリペプチドモノマーおよび／または本発明による外来性（生理活性）配列を含むＣＡＦ１ポリペプチドモノマーを含むまたはからなる。
【０１０５】
本明細書で使用されるように、「画分１抗原ポリマー」または「Ｆ１ポリマー」は互換的に使用され、ＣＡＦ１モノマーサブユニットのポリマーを表す。このポリマーは典型的にはペスト菌により発現される。ポリマーは最長１．５ミクロン長であり２５０のＣＡＦ１モノマーを過剰に含むことがある。Ｆ１ポリマーの発現、組立ておよび分泌は古典的シャペロンアッシャー経路を介して実施され、ｃａｆオペロンに組織されている４つの遺伝子の群に仲介される。Ｆ１被膜構造サブユニットであるＣＡＦ１モノマーはｃａｆ１遺伝子にコードされており、この遺伝子は転写活性化因子ｃａｆ１Ｒ遺伝子により温度調節される。ペリプラズムシャペロンであるｃａｆ１Ｍはペスト菌により産生されるＦ１被膜の組立てのために使用され、外膜タンパク質であるｃａｆ１Ａアッシャーは、遺伝子産物の組立てプラットフォーム／分泌機構として機能する（図２参照）。
【０１０６】
好ましくは、本発明の画分１抗原ポリマーは、本発明による外因性生理活性配列を含む少なくとも１つのＣＡＦ１ポリペプチドモノマーおよび少なくとも１つの天然に存在するＣＡＦ１ポリペプチドモノマーを含有する（すなわち、ポリマーは混合ポリマーである）。
【０１０７】
あるいは、シャペロン／アッシャーファミリーポリマーは画分１抗原ポリマーであり、このポリマーは、天然に存在するＣＡＦ１ポリペプチドモノマーおよび／もしくは本発明による外因性生理活性配列を含むＣＡＦ１ポリペプチドモノマーを含むまたはからなる。さらに好ましくは、画分１抗原ポリマーは、ＲＧＤまたはＰＨＳＲＮなどの細胞接着認識モチーフを含むＣＡＦ１ポリペプチドモノマーを含むまたはからなる。
【０１０８】
あるいは、シャペロン／アッシャーファミリーポリマーはＳＡＦ１ポリマーであり、このポリマーは、天然に存在するＳＡＦ１ポリペプチドモノマーおよび／もしくは本発明による外因性生理活性配列を含むＳＡＦ１ポリペプチドモノマーを含むまたはからなる。
【０１０９】
好ましくは、本発明のＳＡＦ１ポリマーは、本発明による外因性生理活性配列を含む少なくとも１つのＳＡＦ１ポリペプチドモノマーおよび少なくとも１つの天然に存在するＳＡＦ１ポリペプチドモノマーを含有する。
【０１１０】
あるいは、シャペロン／アッシャーファミリーポリマーはＳＡＦ１ポリマーであり、このポリマーは、天然に存在するＳＡＦ１ポリペプチドモノマーおよび／もしくは本発明による外因性生理活性配列を含むＳＡＦ１ポリペプチドモノマーを含むまたはからなる。さらに好ましくは、ＳＡＦ１は、ＲＧＤまたはＰＨＳＲＮなどの細胞接着認識モチーフを含むＳＡＦ１ポリペプチドモノマーを含むまたはからなる。
【０１１１】
あるいは、シャペロン／アッシャーファミリーポリマーはＡｆａまたはＤｒ接着ポリマーであり、このポリマーは、天然に存在するＡｆａ／Ｄｒポリペプチドモノマーおよび／もしくは本発明による外因性生理活性配列を含むＡｆａ／Ｄｒポリペプチドモノマーを含むまたはからなる。
【０１１２】
好ましくは、本発明のＡｆａ／Ｄｒポリマーは、本発明による外因性生理活性配列を含む少なくとも１つのＡｆａ／Ｄｒポリペプチドモノマーおよび少なくとも１つの天然に存在するＡｆａ／Ｄｒポリペプチドモノマーを含有する。
【０１１３】
あるいは、シャペロン／アッシャーファミリーポリマーはＡｆａ／Ｄｒ１ポリマーであり、このポリマーは、天然に存在するＡｆａ／Ｄｒポリペプチドモノマーおよび／もしくは本発明による外因性生理活性配列を含むＡｆａ／Ｄｒポリペプチドモノマーを含むまたはからなる。さらに好ましくは、Ａｆａ／Ｄｒは、ＲＧＤまたはＰＨＳＲＮなどの細胞接着認識モチーフを含むＡｆａ／Ｄｒポリペプチドモノマーを含むまたはからなる。
【０１１４】
好ましくは、シャペロン／アッシャーファミリーポリマーは、ＲＧＤまたはＰＨＳＲＮなどの細胞接着認識モチーフを含むシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含むまたはからなる。あるいは、前記ポリマーは増殖因子配列モチーフまたはプロテアーゼ部位を含むポリペプチドモノマーを含む。
【０１１５】
さらに好ましくは、シャペロン／アッシャーファミリーポリマーは、本発明による外因性生理活性配列を含む第一のシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーおよび本発明による外因性生理活性配列を含む第二のシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含み、前記第一および第二のモノマーは、明確に異なる外因性生理活性配列を含む。この生理活性配列は、細胞接着認識モチーフ、増殖因子配列モチーフまたはプロテアーゼ部位から選択されるのが好ましい。さらに好ましくは、シャペロン／アッシャーファミリーポリマーは天然に存在するシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをさらに含む。
【０１１６】
好ましくは、Ａｆａ型ポリマーなどのシャペロン／アッシャーファミリーポリマーが細胞増殖に影響を与える特性を有する場合、野生型ポリマーを改変して外因性生理活性配列の組込みに先立ってこの活性を取り除いておくことが有用でありうる。
【０１１７】
＜ハイドロゲル＞
一態様では、本発明は、本発明によるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーまたは本発明によるシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを含むまたはからなるハイドロゲルを提供する。
【０１１８】
本明細書で使用されるように、用語「ハイドロゲル」とは、共有結合性架橋によりつなぎ合わされた巨大分子の網目からなる水膨潤性ポリマーマトリックスのことである。このマトリックスは、かなりの量の水を吸収して弾性ゲルを形成することができる。ハイドロゲル膨潤は、ｐＨ、温度、ならびに局所的イオン濃度および種類などのハイドロゲルが置かれる条件により影響を受けることができる。好ましくは、ハイドロゲルは不溶性である。
【０１１９】
ハイドロゲルの膨潤状態は、変化する条件下での膨潤率、ある種の溶質の透過係数、およびその用途の条件下でのハイドロゲルの力学的挙動を含む、いくつかのパラメータに特徴付けられることがある。
【０１２０】
好ましくは、ハイドロゲルのモノマーおよび／またはポリマーはマトリックスに構造および物理的完全性を与えるように架橋される。架橋は化学的、物理的、または放射線架橋に起因していてもよい。
【０１２１】
物理的架橋の場合、この架橋は、水素結合、ファンデルワールス相互作用、イオン結合、またはその組合せから生じることがある。物理的架橋は、インサイチューで結合するまで物理的に離れている２つの前駆体を混合することにより、または、温度、ｐＨ、イオン強度やそれらの組合せを含む生理的環境における一般的な条件の結果として開始されることがある。
【０１２２】
化学的（共有結合性）架橋は、遊離ラジカル重合、縮合重合、アニオンもしくはカチオン重合、段階成長重合、求電子−求核反応またはその組合せを含むがこれらに限定されないいくつかの機構のいずれかにより実現することができる。
【０１２３】
放射線架橋は、ハイドロゲル物品を、可視光線、赤外線、紫外線、電子線、ガンマ線、またはＸ線のうちの少なくとも１つに曝露することを含むがこれらに限定されない任意の数の機構により実現することができる。
【０１２４】
典型的には、ポリマー構成成分は、それが「メッシュ様」不溶性ポリマー網目を形成するように化学的または物理的過程により架橋される。
【０１２５】
好ましくは、ハイドロゲルは架橋剤を含む。これらの架橋剤は、例えば、モノアルデヒド、ジアルデヒド、次亜塩素酸ナトリウム、ジイソシアン酸、ハロゲン化ジカルボン酸および塩素化エポキシドを含むことがある。
【０１２６】
好ましくは、架橋剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。ＰＥＧは反復エチレングリコール単位で構成された化合物であり、細胞スキャフォールドとしてならびに薬物送達デバイスおよび治療タンパク質を確立するのに探求されてきた。しかし、不溶性網目を生み出すには、ＰＥＧ単独では非反応性、非毒性、非免疫原性、可溶性で極めて柔軟性に富んでいるので、架橋基を用いて末端官能基化の必要がある。アクリル酸、チオール、アミン、マレイミドまたはビニルスルホン反応基の付加を含むＰＥＧの官能基化のためにいくつもの化学物質が開発されてきた。架橋網目として、これらの物質は生理条件下で非分解性である。ポリエチレングリコールスペーサーアームは再現性のあるタンパク質改変効果を保証する明確な構造と分子量を有する。さらに、ポリエチレングリコールスペーサーアームは、高分子量でも高い安定性、凝集する傾向の抑制および免疫原性を与える。
【０１２７】
さらに好ましくは、架橋剤は、図１９に示しように、４アームＰＥＧサクシニミジルカルボキシメチルエステルである（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧ  ｗｏｒｋｓ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ＰＳＢ−４６５  ４−Ａｒｍ  ＰＥＧ−ＮＨＳ（ＳＧ）、ＭＷ  ２０ｋ  Ｄａ、スペーサーアーム長およそ２×１９７Å−図６６（ｃ）参照）。本発明の好ましい架橋法も図１９に示している。
【０１２８】
他の考えられるクロスリンカーには、
（ｉ）直鎖ホモ二機能性、短スペーサーアーム、ＤＴＳＳＰ（サルフォ−ＤＳＰ）（３，３’−ジチオビス［スルフォサクシニミジルプロピオン酸］）分子量６０８．５１でスペーサーアームおよそ１２．０Å。ＤＴＳＳＰは水溶性でありチオール切断可能である（図６６（ａ）参照）
（ｉｉ）直鎖ホモ二機能性、長スペーサーアーム、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（Ｏ，Ｏ’−ビス［２−（Ｎ−サクシニミジル−サクシニルアミノ）エチル］ポリエチレングリコール）分子量１００００でスペーサーアームおよそ１９７Å（図６６（ｂ）参照）
が含まれるがこれらに限定されない。
【０１２９】
好ましくは、架橋剤は生分解性架橋剤である。有利なことに、そのような架橋剤を使うことでハイドロゲルは生分解性または吸収性になる。本明細書で使用されるように、用語「生分解性」とは、患者身体において分解する、好ましくは吸収して分解することができる物質またはポリマーのことである。あるいは、架橋剤は非分解性架橋剤である。
【０１３０】
当業者であれば、本発明に従って適切なクロスリンカー対モノマー／ポリマー比を容易に確認すると考えられる。例としてしかし限定するためではなく、１対１２０、１対５、１対３、または１対２の比（モノマー対クロスリンカー（ｗ／ｗ））を使用しうる。
【０１３１】
＜使用＞
本発明のハイドロゲルおよび／またはポリマーは、細胞培養において使用することができる。本発明者らは、驚くべきことに、ハイドロゲル中での本発明のシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマー（または本発明のポリマー）の存在は、細胞生存率を増大させ細胞傷害性を減少させることを見出した。
【０１３２】
一態様では、本発明は細胞支持スキャフォールドとしての本発明のハイドロゲルの使用を提供する。
【０１３３】
用語「スキャフォールド」とは、本明細書で使用されるように、細胞の付着ならびにそれに続く増殖および分化を可能にする任意の物質を意味する。本明細書で使用される「付着」、「付着する」は、基質に直接的にまたは間接的に接着する細胞ならびに他の細胞に接着する細胞のことである。
【０１３４】
本発明のスキャフォールドは線維（すなわち、一次元）、細胞培養プレート（すなわち、二次元）、またはマトリックス（すなわち、三次元）でもよい。二次元細胞培養系は細胞と組織形態形成を調べるための基礎を与えることができ、後成的要因が生理現象にどのように影響を及ぼすのかを調べ、細胞機能と生物の外側の細胞微小環境との相互作用の間の動的関係を調べるのに使用することができる。三次元スキャフォールドを使用すれば組織の天然の三次元構造を再現することができる。
【０１３５】
本発明のスキャフォールドは、細胞ベースのアッセイおよび組織培養系において特に有用である。
【０１３６】
スキャフォールドは細胞が播種されておらず、言い換えれば、細胞がないこともある。あるいは、スキャフォールドは細胞が播種されていることもある。
【０１３７】
本発明のポリマーおよび／またはハイドロゲルは数多くの生物医学的応用がある。例えば、本発明のポリマーおよび／またはハイドロゲルは、創傷の処置のための材料として、薬物放出のための媒体として、または医療機器表面上の被覆として使用しうる。
【０１３８】
したがって、本発明のポリマーおよび／またはハイドロゲルは種々の治療環境において特に有用である。特に、本発明のハイドロゲルを使用すれば、細胞を、それを必要とする組織まで送達することができる。一実施形態では、スキャフォールドを使用して、細胞を哺乳動物対象の目に送達する。あるいは、本発明のスキャフォールドを使用すれば、細胞を、それを必要とする哺乳動物対象の創傷床まで送達することができる。
【０１３９】
したがって、本発明は薬物としての本発明のハイドロゲルの使用を提供する。
【０１４０】
本発明は薬物としての本発明のポリマーの使用も提供する。本発明のポリマーは、創傷を処置する方法において、例えば、創傷治癒において、本発明のハイドロゲルについて下に記載される同等の方法で使用しうる。したがって、本発明は、創傷、例えば、皮膚創傷の処置において使用するための本発明のポリマーを提供する。
【０１４１】
本発明のハイドロゲルを、それを必要とする哺乳動物対象の皮膚、皮膚創傷または皮膚創傷床に埋め込むことを含む皮膚創傷を処置する方法も提供する。この方法は、再上皮形成において特に有用であり、皮膚再上皮形成において特に有用である。用語「再上皮形成」とは、身体内部（皮膚を含む）、または身体外部で損傷上皮の修復、交換、機能回復および最終的再生に関する。
【０１４２】
皮膚創傷の処置において使用するための本発明のハイドロゲルも提供する。
【０１４３】
本明細書で使用されるように、用語「創傷」は、皮膚または組織の完全性が、すなわち、外力、悪い健康状態、老化、日光、熱もしくは化学反応への曝露の結果としてまたは内部生理過程による損傷の結果として破壊される損傷組織、好ましくは損傷皮膚に関する。表皮などの上皮が損傷を受けている創傷は開放創と見なされている。創傷治癒は、好ましくは再上皮形成または再構築による組織の被覆細胞層を再生する過程である。
【０１４４】
正常な皮膚細胞付着および移動および増殖を支持することができるハイドロゲルを導入すれば、横切って移動する創縁で非罹皮膚細胞に即時代替基質を提供することにより創傷治癒を促進するのに寄与する。
【０１４５】
本発明は、本発明のハイドロゲルを、それを必要とする哺乳動物対象の目に埋め込むことを含む、眼外傷を処置する方法を提供する。
【０１４６】
眼外傷を処置するのに使用するための本発明のハイドロゲルも提供する。
【０１４７】
本明細書で使用されるように、用語「眼外傷」とは、幹細胞機能を支持する不十分な角膜実質微小環境をもたらす状態、例えば、無虹彩、角膜炎、神経障害性角膜症、円錐角膜、メースマン角膜変性、角膜上皮基底膜変性症および慢性角膜輪部炎（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｌｉｍｂｉｔｉｓ）または部分的角膜縁幹細胞欠乏、全体幹細胞欠乏、眼性ヘルペス、化学的もしくは熱的損傷、スティーブンス・ジョンソン症候群、眼部瘢痕性類天疱瘡（ｏｃｕｌａｒ  ｃｉｃａｔｒｉｃｉａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ）、コンタクトレンズ装着もしくは微生物感染などの角膜縁幹細胞を破壊する状態のことである。
【０１４８】
本発明のハイドロゲルを含む眼移植片も提供する。
【０１４９】
一実施形態では、ハイドロゲルは、埋め込みに先立って角膜細胞または幹細胞などの細胞を播種される。あるいは、ハイドロゲルは埋め込み後に細胞を播種されることもある。好ましくは、前記細胞は自己由来である、すなわち、前記細胞は処置を受ける個体由来である、またはあるいは、細胞は非自己由来のこともある。
【０１５０】
本発明は、本発明によるハイドロゲルを、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物も提供する。一実施形態では、組成物は以下の増殖因子、脂質、遺伝子、等のうちの１つもしくは複数、または創傷の酸性度／アルカリ度（ｐＨ）を変える化合物、または移植された細胞および創傷／損傷の縁の移植された細胞の増殖および能力を変える化合物をさらに含む。
【０１５１】
本明細書で使用される用語「薬学的に許容される担体」は、１つまたは複数の適合性固体もしくは液体充填剤、希釈剤またはヒトに投与するのに適した被包物質を意味する。投与されると、本発明の医薬組成物は薬学的に許容される調製物で投与される。そのような調製物は、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、サイトカインおよび場合により他の治療剤、好ましくは増殖因子、ペプチド、タンパク質分解抑制剤、細胞外マトリックス成分、ステロイドおよびサイトカインなどの創傷治癒において使用するための薬剤を常に含有することがある。用語「担体」とは、活性成分と結合して適用を促進する、天然であれ合成であれ、有機または無機成分を意味する。用語「薬学的に許容される」は、活性成分の生物活性の有効性を妨害しない非毒性物質を意味する。用語「生理的に許容される」とは、細胞、細胞培養物、組織、または生物などの生命システムと適合する非毒性物質のことである。本明細書で使用されるように、薬学的に許容される担体には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５）に記載される担体など従来の任意の担体が含まれる。
【０１５２】
さらなる態様では、薬物として使用するための、例えば、眼損傷、角膜交換または創傷治癒において使用するための本発明による医薬組成物を提供する。
【０１５３】
本発明の組成物またはハイドロゲルは、有効量で投与される／投与を目的とする。「有効量」とは、単独でまたはさらなる用量と共に所望の応答を生じる組成物またはハイドロゲルの量である。前述の方法で使用される組成物またはハイドロゲルは、好ましくは無菌であり、患者への投与に適した重量または用量の単位で所望の応答を生じるための有効量の活性成分を含有する。応答は、例えば、創傷治癒または角膜修復の速度または程度に対する組成物または微小器官細胞複合体の生理的効果の測定により測定することが可能である。
【０１５４】
さらなる態様では、本発明のモノマーおよび／またはポリマーは、細胞培養装置中でまたはその上で、（例えば、細胞培養装置の表面への細胞接着を促進するために）使用しうる。したがって、一態様では、本発明は、本発明によるモノマーおよび／またはポリマーを含む細胞培養装置（例えば、ペトリ皿、複数ウェルプレートもしくは細胞培養フラスコ、または細胞培養のために使用されるカバーガラスなどの細胞培養容器）を提供する。好ましくは、モノマーおよび／またはポリマーは、本発明によるハイドロゲル内に含まれる。
【０１５５】
＜ベクター＞
本発明は、組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを産生するための発現ベクターを含む。好ましくは、発現ベクターは、細菌細胞内での組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの発現に必要な遺伝要素を含む。細菌細胞中での転写および翻訳に必要な要素には、プロモーター、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーのコード領域、および転写終結因子が含まれる。
【０１５６】
本明細書で使用されるように、用語「発現ベクター」とは、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子のことである。このベクターは自律複製することができ、または、宿主ＤＮＡに組み込まれることができる。ベクターには組換えＤＮＡの挿入のための制限酵素部位が含まれることがあり、１つまたは複数の選択可能マーカーが含まれることがある。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージまたはコスミドの形態の核酸であることが可能である。
【０１５７】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、下記の単一の制御配列または、互いに機能的な関係にある、例えば、コード配列の発現を指示するように連結された関係にあるコード配列と一緒の組合せ制御配列のことである。
【０１５８】
本明細書で使用される「制御エレメント」とは、遺伝子発現を制御することができるＤＮＡまたはＲＮＡエレメントのことである。発現制御配列の例には、プロモーター、エンハンサー、サイレンサー、シャイン・ダルガーノ配列、ＴＡＴＡボックス、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、転写因子の結合部位、転写終結因子、ポリアデニル化部位、ＲＮＡ輸送シグナルまたは紫外線媒介遺伝子応答に重要である配列が含まれる。好ましくは、発現ベクターには、発現される核酸配列に作動可能に連結された１つまたは複数の制御エレメントが含まれる。好ましくは、制御エレメントは転写プロモーターエレメントである。
【０１５９】
「プロモーター」および「転写プロモーターエレメント」は本明細書では互換的に使用され、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を開始するＤＮＡまたはＲＮＡ中のヌクレオチド配列のことである。プロモーターは誘導性に発現されてもよいし、構成的に発現されてもよい。あるいは、プロモーターはリプレッサーまたは刺激タンパク質の制御下にある。好ましくは、プロモーターはＴ７、Ｔ３、ｌａｃ、ｌａｃ  ＵＶ５、ｔａｃ、ｔｒｃ、［ラムダ］ＰＬ、Ｓｐ６または紫外線誘導性プロモーターである。さらに好ましくは、プロモーターは、細菌、例えば、大腸菌中で機能することが分かっているＴ７またはＴ３プロモーターである。野生型Ｃａｆオペロンでは、プロモーターは、タンパク質産生の安価な誘導を可能にする温度感受性である。これと他のプロモーターを有する外のプラスミドを結合させると、モノマーの異なる組合せを制御することが可能になる。
【０１６０】
本明細書で使用される「転写終結因子」とは、ＤＮＡをＲＮＡに転写する原因であるＲＮＡポリメラーゼの機能を終結させるＤＮＡエレメントのことである。好ましい転写終結因子は、ＧＣが豊富な二分子対称領域が先行する一連のＴ残基に特徴がある。さらに好ましくは、転写終結因子はＴ７ファージ由来の終結配列である。
【０１６１】
発現ベクターの設計は、形質転換させる宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベル、および同類のものなどの要因に依存する。本発明の発現ベクターは宿主細胞に導入して、それによってタンパク質またはポリペプチドを産生させることができる。
【０１６２】
本発明の発現ベクターは細菌発現ベクター、例えば、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ、酵母発現ベクター、例えば、組換え酵母発現ベクター、昆虫細胞中での発現のためのベクター、例えば、組換えウイルス発現ベクター、例えば、バキュロウイルス、または植物細胞中での発現のためのベクター、例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶなどの組換えウイルス発現ベクター、またはＴｉプラスミドなどの組換えプラスミド発現ベクターであることが可能である。
【０１６３】
さらに好ましくは、ベクターは細菌発現に、例えば、大腸菌、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ菌、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｏｃｕｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、等に適している。
【０１６４】
好ましくは、ベクターは細菌細胞中での増殖が可能であり、次世代に安定的に伝達される。
【０１６５】
好ましくは、ベクターは細菌発現ベクターである。好ましくは、発現ベクターは高コピー数発現ベクターであり、あるいは、発現ベクターは低コピー数発現ベクター、例えば、Ｍｉｎｉ−Ｆプラスミドである。
【０１６６】
好ましくは、ベクターはＴ７プロモーター系を含む細菌発現ベクターである。あるいは、ベクターはｔａｃプロモーター系を含む細菌発現ベクターである。
【０１６７】
さらに好ましくは、ベクターはｐＧｅｍ発現ベクターである。
【０１６８】
好ましい実施形態では、本発明の発現ベクターは、組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子を含み、前記シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーはＣＡＦ１ポリペプチドモノマー、好ましくは上記される外因性生理活性配列を含む本発明の組換えポリペプチドモノマーである。もっとも好ましくは、ベクターは組換えＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする核酸分子を含み、前記外因性生理活性配列は上に記載される細胞接着認識モチーフである。
【０１６９】
あるいは、本発明のベクターは、組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子を含み、前記シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーはＳＡＦ１ポリペプチドモノマー、好ましくは上記される外因性生理活性配列を含む本発明の組換えポリペプチドモノマーである。もっとも好ましくは、ベクターは組換えＳＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする核酸分子を含み、前記外因性生理活性配列は上に記載される細胞接着認識モチーフである。
【０１７０】
あるいは、本発明のベクターは、組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子を含み、前記シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーはＡｆａ／Ｄｒポリペプチドモノマー、好ましくは上記される外因性生理活性配列を含む本発明の組換えポリペプチドモノマーである。もっとも好ましくは、ベクターは組換えＡｆａ／Ｄｒポリペプチドモノマーをコードする核酸分子を含み、前記外因性生理活性配列は上に記載される細胞接着認識モチーフである。
【０１７１】
さらなる実施形態では、発現ベクターは組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子をさらに含む。
【０１７２】
本明細書で使用されるように、「組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロン」とは、組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの分泌に特異的であるペリプラズムシャペロンのことである。好ましくは、細胞内で、ペリプラズムシャペロンは組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーと相互作用して、安定なシャペロン−モノマー複合体を形成し、細胞膜からのモノマーの放出を促進する。さらに好ましくは、ペリプラズムシャペロンは、活性部位を遮断しそれによって成熟前モノマー−モノマー相互作用を防ぐことによりモノマーと相互作用する。
【０１７３】
好ましくは、ベクターは組換えＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする核酸分子とＣＡＦ１、例えば、ＣＡＦ１Ｍに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子を含む。
【０１７４】
好ましくは、ＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子は、配列番号６のポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）アミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチドをコードする。
【０１７５】
あるいは、ＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子は、配列番号２の核酸分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）ヌクレオチド配列を含むまたはからなる。
【０１７６】
あるいは、ベクターは組換えＳＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする核酸分子とＳＡＦ１、例えば、ＳＡＦＢに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子を含む。
【０１７７】
好ましくは、ＳＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子は、配列番号１７のポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）アミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチドをコードする。
【０１７８】
あるいは、ＳＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子は、配列番号１８の核酸分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）ヌクレオチド配列を含むまたはからなる。
【０１７９】
あるいは、ベクターは組換えＡｆａ／Ｄｒポリペプチドモノマーをコードする核酸分子とＡｆａ／Ｄｒ、例えば、ＤｒａＢに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子を含む。
【０１８０】
好ましくは、Ａｆａ／Ｄｒに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子は、配列番号１９のポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）アミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチドをコードする。
【０１８１】
あるいは、Ａｆａ／Ｄｒに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子は、配列番号２０の核酸分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）ヌクレオチド配列を含むまたはからなる。
【０１８２】
さらなる実施形態では、発現ベクターは、組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子をさらに含む。
【０１８３】
本明細書で使用されるように、「組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質」とは、組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの分泌に特異的である外膜アッシャータンパク質のことである。好ましくは、アッシャータンパク質はシャペロン／モノマー複合体に結合し、ポリマー組立てを開始することができる。シャペロン／モノマー複合体に結合すると、アッシャーはシャペロンからのモノマーの解離を促進し、それによってモノマー−モノマー相互作用のための活性部位を曝露する。このようにして、モノマーはアッシャーを通じて直鎖線維として成長し、この線維は細胞表面に移動される。
【０１８４】
好ましくは、ベクターは組換えＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする核酸分子とＣＡＦ１、例えば、ＣＡＦ１Ａに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子を含む。
【０１８５】
好ましくは、ＣＡＦ１に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子は、配列番号７のポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）アミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチドをコードする。
【０１８６】
あるいは、ＣＡＦ１に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子は、配列番号３の核酸分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）ヌクレオチド配列を含むまたはからなる。
【０１８７】
好ましくは、ベクターは組換えＳＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする核酸分子とＳＡＦ１、例えば、ＳＡＦＣに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子を含む。
【０１８８】
好ましくは、ＳＡＦ１に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子は、配列番号２１のポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）アミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチドをコードする。
【０１８９】
あるいは、ＳＡＦ１に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子は、配列番号２２の核酸分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）ヌクレオチド配列を含むまたはからなる。
【０１９０】
好ましくは、ベクターは組換えＡｆａ／Ｄｒポリペプチドモノマーをコードする核酸分子とＡｆａ／Ｄｒ、例えば、ＤｒａＣに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子を含む。
【０１９１】
好ましくは、Ａｆａ／Ｄｒに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子は、配列番号２３のポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）アミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチドをコードする。
【０１９２】
あるいは、Ａｆａ／Ｄｒに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子は、配列番号２４の核酸分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）ヌクレオチド配列を含むまたはからなる。
【０１９３】
さらなる実施形態では、発現ベクターは組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む。
【０１９４】
本明細書で使用されるように、「組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子タンパク質」とは、組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの転写調節に特異的な発現調節因子タンパク質のことである。
【０１９５】
好ましくは、ベクターは組換えＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする核酸分子とＣＡＦ１、例えば、ＣＡＦ１Ｒに特異的な発現調節因子タンパク質をコードする核酸分子を含む。
【０１９６】
好ましくは、ＣＡＦ１に特異的な発現調節因子タンパク質をコードする前記核酸分子は、配列番号８のポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）アミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチドをコードする。
【０１９７】
あるいは、ＣＡＦ１に特異的な発現調節因子タンパク質をコードする前記核酸分子は、配列番号４の核酸分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）ヌクレオチド配列を含むまたはからなる。
【０１９８】
好ましくは、ベクターは組換えＳＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする核酸分子とＳＡＦ１に特異的な発現調節因子タンパク質をコードする核酸分子を含む。
【０１９９】
さらに好ましくは、ベクターは、ｉ）組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子、ｉｉ）組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子、およびｉｉｉ）組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子タンパク質をコードする核酸分子からなる群から選択される２つまたは３つ以上の核酸分子を含む。
【０２００】
さらに好ましくは、組換えＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする前記核酸分子は、配列番号５のポリペプチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）アミノ酸配列を含むまたはからなるポリペプチドをコードする。あるいは、組換えＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする前記核酸分子は、配列番号１の核酸分子と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である（例えば、全長と同一である）ヌクレオチド配列を含むまたはからなる。
【０２０１】
別の実施形態では、発現ベクターは、宿主細胞での翻訳のためにコドンおよびｍＲＮＡ二次構造を最適化するようにヌクレオチド配列に特定の変化を含む、前述の核酸分子を含む。好ましくは、核酸のコドン使用頻度は宿主細胞での発現に適合されている、例えば、コドン最適化は、Ｃａｌｃｇｅｎｅ、Ｈａｌｅ、ＲＳ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍａｓ  Ｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｅｒ．Ｐｕｒｉｆ．１２、１８５〜１８８ページ（１９９８）、ＵｐＧｅｎｅ、Ｇａｏ、Ｗら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０、４４３〜４４８ページ（２００４）、またはＣｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ、Ｆｕｇｌｓａｎｇ、Ａ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｅｒ．Ｐｕｒｉｆ．３１、２４７〜２４９ページ（２００３）を使用して達成することができる。好ましいコドン最適化に従って核酸を修正することは、少数のコドンの改変、Ｖｅｒｖｏｏｒｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２０６９〜２０７４ページ（２０００）、または核酸配列の大部分、例えば、ＤＮＡの最大１０００ｂｐの書き換え、Ｈａｌｅ，ＲＳおよびＴｈｏｍａｓ  Ｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｅｒ．Ｐｕｒｉｆ．１２、１８５〜１８８ページ（１９９８）を含む、いくつかの異なる実験プロトコールにより達成することができる。核酸配列の書き換えは、所望の配列が重複オリゴヌクレオチドプライマーの伸長により産生される再帰（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ）ＰＣＲにより達成することができる、ＰｒｏｄｒｏｍｏｕおよびＰｅａｒｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．５：８２７〜８２９ページ（１９９２）。ＤＮＡの比較的大きなストレッチの書き換えは、最大３連続ラウンドの再帰ＰＣＲが必要である可能性がある、Ｈａｌｅ，ＲＳおよびＴｈｏｍａｓ  Ｇ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｅｒ．Ｐｕｒｉｆ．１２、１８５〜１８８ページ（１９９８）、Ｔｅ’ｏら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１９０：１３〜１９ページ、（２０００）。
【０２０２】
あるいは、同族ｔＲＮＡのレベルは宿主細胞において上昇させることができる。この上昇は、それぞれのｔＲＮＡ遺伝子のコピー数を増大させることにより、例えば、適合する複数コピープラスミド上の関連ｔＲＮＡ遺伝子を宿主細胞に挿入する、または代わりに発現ベクターそれ自体にｔＲＮＡ遺伝子を挿入することにより達成することができる。大腸菌発現系を使用する場合、ａｒｇＵ発現（ＡＧＧ／ＡＧＡの認識のため）の増強された発現を有する大腸菌宿主細胞を用いることができる。さらに、ｉｌｅｘ（ＡＵＡの認識のため）、ｌｅｕＷ（ＣＵＡの認識のため）、ｐｒｏＬ（ＣＣＣの認識のため）またはｇｌｙＴ（ＧＧＡの認識のため）のためのｔＲＮＡ遺伝子を含む宿主細胞も用いることができる、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、Ｇｅｎｅｓ、８５、１０９〜１１４ページ、（１９８９）、Ｋａｎｅ  ＦＪ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６：４９４〜５００ページ（１９９５）、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５、７１６〜７２２ページ、（１９９３）、Ｓｉｅｄｅｌら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３１、２５９８〜２６０８ページ、（１９９２）。
【０２０３】
発現ベクターの調製のための分子技法は周知である。
【０２０４】
上記のように、本発明の発現ベクター中への組込みのための核酸分子は、プライミングオリゴヌクレオチドと本明細書に記載される核酸配列を交互に使用して核酸分子を合成することにより調製することができる。
【０２０５】
相補的粘着末端を介してＤＮＡをベクターに作動可能に連結させるいくつかの分子技法が開発されている。一実施形態では、相補的ホモポリマートラクト（ｔｒａｃｔｓ）を、ベクターＤＮＡに挿入される核酸分子に付加することができる。次にベクターと核酸分子は相補的ホモポリマーテール間の水素結合により結合されて、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【０２０６】
代わりの実施形態では、与えられる１つまたは複数の制限部位を含有する合成リンカーを使用して、核酸分子を発現ベクターに作動可能に連結させる。一実施形態では、核酸分子は、前述のように制限エンドヌクレアーゼ消化により作製される。
【０２０７】
あるいは、ライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）部位を含むベクターを用いることができる。次に、必要とされるＰＣＲ増幅された核酸分子は、制限消化もライゲーションもなしでＬＩＣベクター中にクローニングすることができる（Ａｓｌａｎｉｄｉｓおよびｄｅ  Ｊｏｎｇ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．１８、６０６９〜６０７４ページ、（１９９０）、Ｈａｕｎ，ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３、５１５〜５１８ページ（１９９２））。
【０２０８】
選ばれたプラスミド内への挿入のために対象の核酸分子を単離するかつ／または改変するために、ＰＣＲを使用するのが好ましい。配列のＰＣＲ調製において使用するのに適したプライマーは、核酸分子の必要とされるコード領域を単離し、制限エンドヌクレアーゼまたはＬＩＣ部位を付加し、コード領域を所望のリーディングフレーム中に置くように設計することができる。
【０２０９】
好ましい実施形態では、本発明の発現ベクター中への組込みのための核酸分子は、適切なオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、Ｓａｉｋｉら、（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９、４８７〜４９１ページにより開示された通りにポリメラーゼ連鎖反応を使用することにより調製する。コード領域は増幅されるが、プライマー自体は増幅された配列産物中に組み込まれる。好ましい実施形態では、増幅プライマーは、増幅された配列産物が適切なベクター中にクローニングされることを可能にする制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含有している。
【０２１０】
本発明の発現ベクターは、単一コピーの前記核酸分子または複数コピーの前記核酸分子を含有することができる。
【０２１１】
＜宿主細胞＞
一態様では、本発明は、本発明の発現ベクターで形質転換されたまたはトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。
【０２１２】
本明細書で使用される「宿主細胞」とは、特定の対象細胞およびそうした細胞の子孫または潜在的子孫のことである。変異または環境の影響により、続く世代にある種の改変が起こることがあるために、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではないことがあるが、それでも本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
【０２１３】
本発明の発現系において使用するための宿主細胞は好気性細胞または代わりに通性嫌気性細胞でもよい。好ましくは、細胞は細菌細胞である。あるいは、細胞は酵母細胞（例えば、サッカロミセス属、ピキア属）、藻類細胞、昆虫細胞、または植物細胞でもよい。
【０２１４】
細菌宿主細胞には、グラム陽性菌とグラム陰性菌が含まれる。適切な細菌宿主細胞にはグラム陰性菌、例えば、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）科の細菌、もっとも好ましくは大腸菌が含まれるが、これらに限定されない。大腸菌は本発明にはもっとも好ましい細菌宿主細胞である。大腸菌における発現には他の発現系よりも有利な点が数多く、特に低い開発コストおよび高い生産収率を提供する。高タンパク質発現に適した細胞には、例えば、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌のＢ株が含まれる。大腸菌ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）、およびＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、ｐＬｙｓＥ、ＤＨ１、ＤＨ４Ｉ、ＤＨ５、ＤＨ５Ｉ、ＤＨ５ＩＦ’、ＤＨ５ＩＭＣＲ、ＤＨ１０Ｂ、ＤｈｌＯＢ／ｐ３、ＤＨ１  ＩＳ、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０１、ＪＭ１０５、ＪＭ１０９、ＪＭ１１０、Ｋ３８、ＲＲ１、Ｙ１０８８、Ｙ１０８９、ＣＳＨ１８、ＥＲ１４５１、ＥＲ１６４７は発現に特に適している。大腸菌Ｋ１２株も、非病原性の標準実験室株であるため好ましく、ＮｏｖａＢｌｕｅ、ＪＭ１０９およびＤＨ５α（Ｎｏｖｏｇｅｎ（登録商標））、大腸菌Ｋ１２  ＲＶ３０８、大腸菌Ｋ１２  Ｃ６００、大腸菌ＨＢ１０１が含まれ、例えば、Ｂｒｏｗｎ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｆａｘ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１））を参照されたい。
【０２１５】
原核宿主においてベクターを増殖させるために標準技法は当業者には周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  １９９５年）参照）。
【０２１６】
大腸菌において組換えタンパク質発現を最大にするために、本発明の発現ベクターは組換えタンパク質をタンパク質分解性に切断する能力が損なわれている宿主細菌においてその中に組み込まれた核酸分子を発現することがある（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．、（１９９０）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、１１９〜１２８ページ）。あるいは、本発明の発現ベクター中に組み込まれた核酸分子は、アミノ酸ごとの個々のコドンが大腸菌において優先的に利用されるコドンであるように弱めることができる（Ｗａｄａら、（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１〜２１１８ページ）。本発明の核酸配列のそのような変更は、標準ＤＮＡ合成法により実施することができる。
【０２１７】
本発明の宿主細胞はシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを産生するための発現系において使用しうる。
【０２１８】
本発明の発現ベクターは、従来の形質転換またはトランスフェクション法により宿主細胞中に導入することができる。
【０２１９】
「形質転換」および「トランスフェクション」とは、本明細書で使用されるように、外来核酸を宿主細胞中に導入するための当技術分野で公知の種々の技法のことである。適切な宿主細胞を本発明の発現ベクターで形質転換することは、当技術分野で公知の方法により実現され、典型的にはベクターと宿主細胞の両方の種類に依存する。前記技法には、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、ケモポレーション（ｃｈｅｍｏｐｏｒａｔｉｏｎ）またはエレクトロポレーションが含まれるがこれらに限定されない。
【０２２０】
細菌宿主細胞の形質転換のための当技術分野で公知の技法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ；Ａｕｓｕｂｅｌら、（１９８７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．、ＮＹ；Ｃｏｈｅｎら、（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９、２１１０ページ；Ｌｕｃｈａｎｓｋｙら、（１９８８）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２、６３７〜６４６ページに開示されている。そのような方法はすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２１】
形質転換に成功した細胞、すなわち、本発明の発現ベクターを含有する細胞は当技術分野で周知の技法により確かめることができる。例えば、本発明の発現ベクターをトランスフェクトされた細胞を培養してシャペロン／アッシャーファミリーメンバーを産生することができる。細胞は当技術分野で周知の技法により発現ベクターＤＮＡの存在について調べることができる。あるいは、シャペロン／アッシャーファミリーメンバーまたはその部分および断片の存在は、それにハイブリダイズする抗体を使用して検出することができる。
【０２２２】
好ましい実施形態では、本発明は形質転換された宿主細胞の培養物を含む。好ましくは、培養物はクローン的に均一である。
【０２２３】
宿主細胞は前述の本発明の発現ベクターの単一コピー、または代わりに発現ベクターの複数のコピー、すなわち、同一のもしくは非同一の発現ベクターの複数のコピーを含有することができる。
【０２２４】
＜ポリマー産生＞
上に記載される核酸分子を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を使用して、シャペロン／アッシャーファミリーポリマーを産生する（すなわち、発現する）ことができる。
【０２２５】
一態様では、本発明は、外因性生理活性配列を含む少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含むシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを産生するための方法であって、ｉ）外因性生理活性配列を含むシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、ｉｉ）宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするステップとを含み、前記宿主細胞にシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子とシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子とを与え、こうして得られたトランスフェクト宿主細胞がシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを産生する方法を提供する。
【０２２６】
好ましくは、シャペロン／アッシャーファミリーポリマーは、上に記載される画分１抗原ポリマー、ＳＡＦ１ポリマーまたはＡｆａ／Ｄｒポリマーである。
【０２２７】
好ましくは、外因性生理活性配列を含む組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子は、上に記載される、外因性生理活性配列を含むＣＡＦ１ポリペプチドモノマー、外因性生理活性配列を含むＳＡＦ１ポリペプチドモノマーまたは外因性生理活性配列を含むＡｆａ／Ｄｒポリペプチドモノマーをコードする。
【０２２８】
好ましくは、前記生理活性配列は、上に記載される、細胞接着認識モチーフ、増殖因子配列モチーフまたはプロテアーゼ部位である。
【０２２９】
好ましくは、組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な前記ペリプラズムシャペロンは、上に記載のＣＡＦ１、ＳＡＦ１またはＡｆａ／Ｄｒに特異的なペリプラズムシャペロンである。
【０２３０】
好ましくは、組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な前記外膜アッシャータンパク質は、上に記載のＣＡＦ１、ＳＡＦ１またはＡｆａ／Ｄｒに特異的な外膜アッシャータンパク質である。
【０２３１】
好ましくは、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子を、宿主細胞における発現のために発現ベクター中に組み込み、宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトすることにより、宿主細胞はシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子を与えられる。発現ベクターは、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子を組み込んでいる同じベクターでもまたは異なる発現ベクターでも可能である。
【０２３２】
好ましくは、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子を、宿主細胞における発現のために発現ベクター中に組み込み、宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトすることにより、宿主細胞はシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子を与えられる。発現ベクターは、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子および／もしくはシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子を、同じベクターまたは異なる発現ベクターに組み込むことも可能である。
【０２３３】
好ましくは、宿主細胞はシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子をコードする核酸分子をさらに与えられる。好ましくは、組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な前記発現調節因子は、上に記載されるＣＡＦ１、ＳＡＦ１またはＡｆａ／Ｄｒに特異的なペリプラズムシャペロンである。
【０２３４】
好ましくは、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子をコードする核酸分子を宿主細胞における発現のために発現ベクター中に組み込み、宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトすることにより、宿主細胞はシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子をコードする核酸分子を与えられる。発現ベクターは、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子および／もしくはシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子および／もしくはシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子を組み込んでいる同じベクターでもまたは異なる発現ベクターでも可能である。
【０２３５】
宿主細胞はいかなる宿主細胞でも可能である。好ましくは、宿主細胞は、上に記載されるグラム陰性菌である。
【０２３６】
本発明は、上に記載される本発明の発現ベクターを利用して、シャペロン／アッシャーファミリーポリマーを大規模産生するための発現系を含む。好ましくは、発現系は大腸菌発現系である。
【０２３７】
本発明の形質転換宿主細胞または本発明の発現ベクターを含む形質転換宿主細胞は、宿主生物に応じて、当業者に公知の方法で増殖されるまたは培養される。概して、宿主細胞は、通常は糖の形態で炭素供給源、通常は酵母抽出物などの有機窒素供給源または硫酸アンモニウムなどの塩の形態で窒素供給源、鉄、マンガンおよびマグネシウムの塩などの微量元素、ならびに適切な場合にはビタミンを含む液体培地において、０℃から１００℃、好ましくは１０℃から６０℃の温度で酸素を供給しながら増殖させる。
【０２３８】
液体培地のｐＨは、一定に保つ、すなわち、培養期間中調節することもまたはしないことも可能である。培養物はバッチ式で、半バッチ式でまたは連続して増殖させることができる。栄養素は発酵の開始時に与えるまたは半連続的にもしくは連続的に与えることが可能である。産生された産物は、当業者に公知のプロセスにより、例えば、抽出、蒸留、結晶化、適切な場合には塩との沈殿、および／またはクロマトグラフィーにより生物から単離することができる。
【０２３９】
公知の培養法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌ（Ｂｉｏｐｒｏｚｅβｔｅｃｈｎｉｋ１．Ｅｉｎｆｕｈｒｕｎｇ  ｉｎ  ｄｉｅ  Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ［Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］（Ｇｕｓｔａｖ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、１９９１年））またはＳｔｏｒｈａｓ（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ  ｕｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ  Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ［Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ］（Ｖｉｅｗｅｇ  Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、１９９４年））による教科書に見ることができる。
【０２４０】
使用する培養培地は問題の株の要件を適切に満たさなければならない。種々の微生物についての培養培地の説明は、教科書「Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．、ＵＳＡ、１９８１年）に見ることができる。
【０２４１】
上記のように、本発明に従って用いることができるこれらの培地は、通常、１つまたは複数の炭素供給源、窒素供給源、無機塩、ビタミンおよび／または微量元素を含む。
【０２４２】
形質転換宿主細胞は好気性または嫌気性条件下で培養することができる。好気性条件下では、好ましくは、酸素は、例えば、還元剤もしくは脱酸素剤の添加により、または反応媒体を中性ガスで除去することにより培養培地から連続的に取り除かれる。
【０２４３】
宿主細胞の大規模培養のための当技術分野で公知の技法は、例えば、Ｂａｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｏｌｌｉｓ（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ；またはＳｈｕｌｅｒ（２００１）Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｂａｓｉｃ  Ｃｏｎｃｅｐｔｓ、Ｐｒｅｎｔｉｃｅ  Ｈａｌｌに開示されている。そのような技法はすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【０２４４】
本発明の宿主細胞は、容器、例えば、バイオリアクターにおいて培養することができる。バイオリアクター、例えば、発酵槽は細胞または酵素を含み、典型的には工業規模での分子の生産のために使用される容器である。分子は組換えタンパク質（例えば、本発明のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー）であることが可能である。典型的には、細胞ベースのバイオリアクターは対象の細胞を含み、反応を実施するのに必要なすべての栄養素および／または補因子を含む。
【０２４５】
したがって、本発明は外因性生理活性配列を含む少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含むシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを産生するための方法であって、ｉ）上に記載される本発明の宿主細胞を含む容器を提供するステップと、ｉｉ）容器に含有される細胞培養物による組換えシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマー発現を促進する細胞培養条件を提供するステップと、任意選択により、ｉｉｉ）容器からシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを収集するステップとを含む方法を提供する。
【実施例】
【０２４６】
１．実験概要
１．１  Ｃａｆ１のサブクローニング、発現および精製
ｃａｆオペロン（サイズは約５．２Ｋｂ）は、オリゴヌクレオチドプライマーペアＦ１フォワード（５’−ＡＴＡ  ＡＡＴ  ＣＧＧ  ＴＴＣ  ＡＧＴ  ＧＧＣ  ＣＴＣ  ＡＡＣ  ＧＣＴ  ＧＴＧ−３’）およびＦ１リバース（５’−ＧＧＴ  ＴＡＧ  ＧＣＴ  ＣＡＡ  ＡＧＴ  ＡＧＧ  ＡＴＡ  ＡＴＴ  Ｃ−３’）、鋳型としてｃａｆオペロンをコードするプラスミドｐＡＨ３４Ｌ（９）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ４５０８４７）ならびに平滑末端断片を生じるＫＯＤ  ＨＯＴ  ＳＴＡＲＴ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＫ）を使用して、ＰＣＲ（３０増幅サイクル；９５℃で２０秒間、５５℃で１０秒間、７０℃で５分間）（ＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｈｙｂａｉｄ、ＵＫ）により増幅した。得られたＰＣＲ産物は臭化エチジウム（０．５ｕｇ／Ｍｌ）で染色された０．７％アガロースゲル上に負荷した。ＤＮＡはトランスイルミネーター（波長２５４ｎｍの紫外線）（Ｇｅｌ−Ｄｏｃ  Ｂｉｏ−ＲＡＤ、ＵＫ）上で可視化した。ｃａｆオペロンに対応するオリゴヌクレオチドのＰＣＲ産物は、無菌外科用メスの刃を使用してアガロースゲルから切除した。抽出されたＤＮＡバンドはＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットおよびＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＫ）で精製した。その後、精製したＤＮＡは臭化エチジウム（０．５μｇ／Ｍｌ）を含有する０．７％アガロースゲル上に負荷し、トランスイルミネーター上で可視化し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅソフトウェア（Ｇｅｌ−Ｄｏｃ  Ｂｉｏ−ＲＡＤ、ＵＫ）を使用して定量化した。ＰＣＲ産物を新しいベクターにサブクローニングする前に、制限解析を実施してＰＣＲ産物の同一性を確認した。次に、精製ＰＣＲ産物を新しいベクターにサブクローニングした。最初、本発明者らはｃａｆオペロンをＰｓｍａｒｔ−ＨＣ−ＡｍｐおよびＰｓｍａｒｔ−ＬＣ−Ｋａｎベクター（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＵＳＡ）にサブクローニングしようと企てた。Ｐｓｍａｒｔ−ＨＣのコピー数はＰｕｃ１９に類似して、細胞あたり約３００〜５００コピーである。Ｐｓｍａｒｔ−ＬＣのコピー数はＰｂｒ３２２に類似して、細胞あたり約１５〜３０コピーである。Ｐｓｍａｒｔベクターは前消化し、平滑脱リン酸化末端を有する。小さなサイズのＰｓｍａｒｔベクター（１．７〜２．０Ｋｂ）であれば大きなインサートＤＮＡのサブクローニングおよび変異誘発実験を容易にすることができる。ＤＮＡ精製後、ＰＣＲ産物はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ）（ＮＥＢ、ＵＫ）で処理して５’−リン酸をオリゴヌクレオチドに付加し、それに続くライゲーションを可能にしなければならない。クローンＳｍａｒｔライゲーション反応では、前処理Ｐｓｍａｒｔベクターに平滑末端リン酸化インサート（２００ｎｇのインサート）をライゲートする。使用する陽性対照はラムダ／Ｈｃｌｌインサート（５００ｎｇ）であり、インサートなしの陰性対照もライゲーションのための製造業者の使用説明書および推奨（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＵＳ）に従って実施した。新しい組換えプラスミドを含有する大腸菌１０Ｇ化学的にコンピテントな細胞の形質転換体［Ｆ−ｍｃｒＡ  Ｄ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５  ΔｌａｃＸ７４  ｅｎｄＡ１  ｒｅｃＡ１ａｒａＤ１３９  Δ（ａｒａ，ｌｅｕ）７６９７  ｇａｌＵ  ｇａｌＫ  ｒｐｓＬ  ｎｕｐＧλ−ｔｏｎＡ］（Ｌｕｃｉｇｅｎ、ＵＳＡ）は、Ｐｓｍａｒｔ  ＨＣ−ＡｍｐおよびＬＣ−Ｋａｎのいずれかに対して適切な抗生物質を含有するＬＢ寒天プレート上で選択した。プレートは３７℃で一晩インキュベートした。その後、インキュベーション時間を４℃で２４時間まで増加するなどのｃａｆオペロンをサブクローニングするための改良を加えた。ｃａｆオペロンをサブクローニングする第二の企てはｐＧｅｍ−Ｔ  Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＫ）を使用して行った。高コピー数ｐＧｅｍ−Ｔ  Ｅａｓｙベクターは、それをＥｃｏＲＶで切断し、３’末端チミジンを両末端に付加することにより調製した。挿入部位でのこれらの単一３’−Ｔオーバーハングは、ベクターの再環状化を防ぎＰＣＲ産物に適合性のオーバーハングを与えることにより、小サイズプラスミド（３Ｋｂ）中へのＰＣＲ産物のライゲーションの効率を大幅に改善する（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＫ）。精製ＰＣＲ産物はＡテーリング法を使用して改変され、この方法はＡテーリング法（Ｐｒｏｍｅｇａ製のｐＧｅｍ−Ｔ  ＥＡＳＹキット、ＵＫ）のための製造業者の使用説明書および推奨に従って平滑末端酵素を使用して増幅されたＰＣＲ産物上に３’末端‘Ａ’オーバーハングを付加する。ライゲーション反応（Ｐｒｏｍｅｇａ製のｐＧｅｍ−Ｔ  ＥＡＳＹキット、ＵＫ）のための製造業者の使用説明書および推奨に従って、標準反応、陽性対照（対照インサートＤＮＡ）およびバックグランド対照（インサートＤＮＡなし）を含むライゲーション反応物を調製し、例外は４℃での２４時間の反応のためのインキュベーション時間と温度であった。その後、ライゲーション反応物は６５℃で１０分間熱変性した。大腸菌（ｐＧｅｍ−ＴＦ１）と名付けられた新しい組換えプラスミドを含有する大腸菌ＤＨ５α細胞［Ｆ−Φ８０ｌａｃＺΔＭ１５  Δ（ｌａｃＺＹＡ−ａｒｇＦ）Ｕ１６９  ｄｅｏＲ  ｒｅｃＡ１  ｅｎｄＡ１  ｈｓｄＲ１７（ｒｋ−、ｍｋ＋）ｐｈｏＡ  ｓｕｐＥ４４  ｔｈｉ−１  ｇｙｒＡ９６  ｒｅ／Ａ１λ−］（インビトロｇｅｎ、ＵＫ）の形質転換体は１００μＬのアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上で選択し、２０μＬのＸ−Ｇａｌ（５０ｍｇ／Ｍｌ）をＬＢ寒天プレート上に広げた。プレートは３７℃で一晩インキュベートした。次の日、それぞれの成功した形質転換から単一コロニーを選び、塩基配列決定に送る（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ−Ｆｏｒｍｅｒｌｙ  Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｇｅｎｉｃｓ、ＵＫ）ために寒天を含有する管に導入した。平行して、プラスミドミニプレップ由来のｐＧｅｍ−ＴＦ１プラスミドの制限解析を実施した。
【０２４７】
タンパク質発現および精製では、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（インビトロｇｅｎ、ＵＫ）をｐＧｅｍ−ＴＦ１で形質転換した。細胞を調製し収穫し、前記の通りにタンパク質単離を実施した（８）。手短に言えば、細胞を３７℃で１９時間振盪しながら（１７０ｒｐｍ）増殖させた。細胞は４℃、１４０００×ｇで４５分間遠心分離し、細胞ペレットおよび凝集剤層（主にＣａｆ１）はｐＨ７．６で１００Ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。３０分のインキュベーション後、再懸濁液は１４０００×ｇで３０分間遠心分離し、上澄みは４０％硫酸アンモニウム飽和まで調整した。４℃、１４０００×ｇで３０分間遠心分離した後、硫酸アンモニウムペレットはＰＢＳに再懸濁し、２７０００×ｇで遠心分離して不溶性物質を取り除き、続いて０．２２μｍ使い捨てフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＫ）を使用してフィルター殺菌した。ｃａｆ１試料の１００μＬアリコートは、ＰＢＳで前もって平衡していたＦＰＬＣ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。ｃａｆ１は０．５Ｍｌ／分の流速で同じバッファーで溶出させた。ピーク画分を収集し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウェスタンブロッティングによりｃａｆ１について分析した（Ｆ１に合わせて産生したモノクローナル抗体を使用して）。タンパク質試料はＰｉｎｎａｃｌｅ−Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｓｅｒｖｉｃｅ  ａｔ  Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙに送り、ペプチドマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）法を使用して研究されたタンパク質との同一性を確認した。
【０２４８】
１．２  部位特異的変異誘発によるＣａｆ１−ＲＧＤＳ変異体の構築、発現および精製
ｃａｆ１遺伝子内の変異は、大きなプラスミドについて（ＸＬ  Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅキット、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）使用して記載の通りに、Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（１８増幅サイクル；９５℃で１分間、９５℃で５０秒間、６０℃で５０秒間、６８℃で８．５分間）（ＰＣＲ  Ｅｘｐｒｅｓｓ、Ｈｙｂａｉｄ、ＵＫ）を使用してｐＧｅｍ−ＴＦ１中に作りだした。コードプライマー（小文字での変異）は表１に示す通りであった。
【表１】
2015522566.tif 000003
【０２４９】
８．２Ｋｂ増幅産物はＤｐｎＩで処理した。大腸菌ＤＨ５αをＤｐｎＩ処理８．２Ｋｂ増幅産物で形質転換した。それぞれの構築物由来の１つの形質転換体で、変異ｃａｆ１の完全配列を確認した（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ−Ｆｏｒｍｅｒｌｙ  Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｏｇｅｎｉｃｓ、ＵＫ）。
【０２５０】
１．３  透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）
タンパク質試料およびネガティブ染色検体は前述の通りに調製した（１０）。手短に言えば、ｃａｆ１−ＷＴおよびｃａｆ１−ＲＧＤＳ変異タンパク質試料は蒸留水中で最終濃度５０μｇ／ｍｌになるように調製した。薄炭素支持フィルム付の電子顕微鏡グリッドを１０μｌ試料液滴に適用し、１０〜２０秒間保持し、フィルターペーパーで水気を切った。次に、バッファーおよび塩を２０μｌの水滴を３回使用して洗い流し、残った炭素吸着タンパク質／アジュバンドは２％酢酸ウラニル液を２０μｌ液滴を添加することによりネガティブ染色した。ネガティブ染色はフィルターペーパーで水気を切り、グリッドは空気乾燥させておいた。ネガティブ染色検体は、１００Ｋｖで作動させるＰｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ１００透過型電子顕微鏡で調べた。電子顕微鏡写真は、常に画像倍率１３００００でタグ付き画像ファイルフォーマット（ＴＩＦＦ）に記録した。
【０２５１】
１．４  細胞接着アッセイ
３Ｔ３線維芽細胞およびＰＣ１２をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｌｇｃｐｒｏｍｏｃｈｅｍａｔｃｃ．ｃｏｍ）より購入し前述の通りに維持した（４）。Ｃａｆ１タンパク質被覆のために、対象のタンパク質（ｃａｆ１  ＷＴおよびｃａｆ１  ＲＧＤＳ変異体）および対照の１００μＬを９６ウェルプレートに添加した。ＢＳＡ、ＯｍｐＡ−ＲＧＤＳは対照として使用した。非被覆ウェルも対照として使用した。タンパク質は１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．６）中に希釈し、所望の濃度、１００μｇ／Ｍｌを得た。タンパク質溶液はすべて０．２μｍフィルターを使用して濾過した。それぞれの溶液は、９６ウェルプレート用のマルチチャンネルピペットを使用して培養プレートにピペットで移した。プレートはパラフィンで密封し、４℃で一晩インキュベートした。タンパク質溶液はプレートウェルから吸引し、１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．６）でウェルを一度洗浄する。ＰＢＳはウェルから除き、プレートは細胞培養のために取っておいた。次に、３Ｔ３線維芽細胞は１０００×ｇで５分間収穫した。細胞ペレットはカルシウムおよびマグネシウムを含む１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に２．５×１０６細胞／Ｍｌの濃度で再懸濁させた。細胞はカルシウムおよびマグネシウムを含む１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１×１０６細胞／Ｍｌの濃度で二度洗浄した。１００μＬの調製細胞懸濁液をそれぞれのウェルに添加した。プレートは３７℃で２時間インキュベーター中に置いた。２時間のインキュベーション後、付着しなかった細胞はプレートを反転させて取り除いた。細胞はカルシウムおよびマグネシウムを含む１０ｍＭのＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５分間二度洗浄し、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中４％パラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）で３０分間固定化した。パラホルムアルデヒド液を取り除き、細胞はＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄ごとに５分間三回洗浄し、その後ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１０μｇ／ＭｌのＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＫ）で２５分間染色した。ＤＡＰＩ溶液を取り除き、細胞はＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄ごとに５分間三回洗浄した。その後、細胞はコンジュゲートされたローダミン−ファロイジン（２００ｎｇ／Ｍｌ）（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）で１５分間染色した。次に、ファロイジン液は取り除き、細胞はＰＢＳ（ｐＨ７．４）で洗浄ごとに５分間三回洗浄した。ウェルはＰＢＳ（ｐＨ７．４）を充填し、測定は蛍光光度計を使用して実現した。蛍光顕微鏡を使用する細胞接着アッセイでは、ガラスカバーグラスは、上記と同じプロトコールに従ってｃａｆ１−ＷＴおよびｃａｆ１−ＲＧＤＳ変異体で被覆した。その後、タンパク質で被覆されたガラスカバーグラスを含有する６ウェル培養プレートのウェルあたり、１×１０５のＰＣ１２細胞を血清なしのＲＰＭＩ１６４０培地に添加した。細胞は、インキュベーター中３７℃、５％ＣＯ２で３時間維持した。３時間後、培養物は２Ｍｌの無菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｃａｍｂｒｅｘ）で一度洗浄し、上記の通りに固定化し、染色した。
【０２５２】
２．結果
２．１  ｃａｆオペロンをサブクローニングする
２．１．１  鋳型としてＰａｈ３４Ｌベクターを使用するｃａｆオペロンのＰＣＲ増幅およびＰＣＲ産物の制限消化
ペスト菌ｃａｆオペロンを含む、大腸菌プラスミドｐＡＨ３４Ｌ（１２）（サイズは約１１Ｋｂｐ）の、Ｆ１ペアのプライマーおよびＰＣＲサイクル条件を使用するＰＣＲによる増幅は、５．２Ｋｂのバンドを示している（図３ａ）。こうして得られたＰＣＲ産物は、ｃａｆオペロンとＥｃｏＲＩを切断するがｃａｆオペロンは切断しないＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ制限酵素で消化した（図３ｂ）。
【０２５３】
得られたＰＣＲ産物は、制限解析によりｃａｆオペロンであることが確認された。
【０２５４】
２．１．２  ｃａｆオペロン精製および定量化および制限消化
得られたＰＣＲ産物がｃａｆオペロンであることを確認した後、予想されるサイズ（５．２Ｋｂ）のＤＮＡ断片はＱＩＡＧＥＮゲル抽出キットを使用して精製し、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ｏｎｅ（登録商標）ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して定量化した（図４ａ）。次に、ＤＮＡ断片の同一性および完全性は、ｃａｆオペロンとＥｃｏＲＩを切断するがｃａｆオペロンは切断しないＨｉｎｄＩＩＩとＢａｍＨＩ制限酵素を用いた制限分析により確かめた（図４ｂ）。
【０２５５】
ＰＣＲ産物が精製され、５．２Ｋｂの単一バンドが電気泳動ゲル上に示されて、制限分析によりバンドがｃａｆオペロンであることが明らかにされた。この精製から６４ｎｇ／μＬの精製ＰＣＲ産物が得られた。
【０２５６】
２．１．３  ｐＧｅｍ−ＴＦ１の配列決定
ｐＡＨ３４Ｌプラスミドからのサブクローニング実験により、発明者らはｃａｆオペロンを担持するプラスミドｐＧｅｍ−Ｔ  Ｅａｓｙを構築することができた。遺伝子塩基配列決定により与えられる結果により、ｐＧｅｍ−Ｔ  Ｅａｓｙにクローニングされたｃａｆオペロンのアミノ酸配列（図５）は、ペスト菌株４８２プラスミドＰｍｔ１−ｃａｆ１オペロン完全配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＹ４５０８４７．１）由来の以前報告された配列と同一であることが示されている。
【０２５７】
塩基配列決定結果により、ｃａｆオペロン由来のＣａｆ１およびｃａｆ１Ｒ遺伝子の完全で正確な配列が明らかにされた。
【０２５８】
２．１．４  ｐＧｅｍ−ＴＦ１の制限消化
ｐＧｅｍ−Ｔ  ＥＡＳＹプラスミドに２つの制限部位を有しインサートを放出することができるＥｃｏＲＩ制限酵素を使用する制限分析ゲルは、２つのバンド、１つはベクターに対応する可能性のある３Ｋｂのバンドを、第二のバンドはインサートに相当する可能性のある５Ｋｂを超えるバンドを示した（図６）。
【０２５９】
インサートを放出するＥｃｏＲＩを使用する制限分析でも、クローニングされたインサートが適切なサイズを有することを確認した（予想サイズ５．２Ｋｂ）。
【０２６０】
２．１．５  ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルおよびウェスタンブロッティング
抗Ｆ１抗体（Ａｖｅｃｉａ、ＵＫ）を使用するＳＤＳ−ｐａｇｅおよびウェスタンブロッティングの結果（図７）では、１５．５ＫｄａであるＦ１抗原の報告されている分子量（２）およびウェスタンブロットでは、それぞれカナマイシン（５０μｇ／Ｍｌ）およびアンピシリン（１００μｇ／Ｍｌ）を含有するＬブロスにおいて３７℃で１９時間増殖された、大腸菌／Ｐａｈ４３Ｌの溶液および大腸菌ｐＧｅｍ−Ｔ  Ｅａｓｙの溶液（両方のプラスミドがｃａｆオペロンを含有する）でもＦ１ポリクローナル抗体と反応している１６０００のＭｒを有するバンドが確認された。
【０２６１】
ｃａｆ１の発現はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗Ｆ１抗体を使用するウェスタンブロッティングにより示された。
【０２６２】
２．１．６  Ｃａｆ１タンパク質の質量分析
１２％ＳＤＳ−ｐａｇｅゲル上で１５．５ｋＤａのバンドの同一性を確認するため、バンドは質量分析に送られた。得られた結果では、１５．５ｋＤａのバンドはｃａｆ１であることが確かめられた（図８）。
【０２６３】
２．２  Ｃａｆ１タンパク質発現および精製
大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＧｅｍ−ＴＦ１）培養物の遠心分離により細菌細胞の沈降が生じその上では凝集物の層が見えた。予備実験では、この凝集物は主にＣａｆ１であることが明らかにされた。余分なｃａｆ１はＰＢＳで穏やかに洗浄することにより細菌細胞の表面から取り除くことができた。ｃａｆ１は硫酸アンモニウム分取により精製し、続いてＦＰＬＣ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過クロマトグラフィーにかけ、培養物１リットル当たりおよそ１０ｍｇのＣａｆ１が生じた。
【０２６４】
２．２．１  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００を使用するサイズ排除クロマトグラフィーおよび較正曲線
ＦＰＬＣ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過クロマトグラフィーカラム（最大圧力：３Ｍｐａ；流速：２Ｍｌ／分；移動相：ＰＢＳバッファー（ｐＨ７．６）；注入試料量：最大５Ｍｌ）をこの研究で使用してｃａｆ１を精製した。Ｃａｆ１は空隙容量（Ｖ０）（５０．５ｍｌ）のゲル濾過カラムに溶出し、全容量（ＶＴ）は１８ｍｌであった。ゲル濾過クロマトグラフィー用の標準タンパク質マーカーは表２に提示されている。結果は図９に示している。
【表２】
2015522566.tif 000004
【０２６５】
２．２．２  クロマトグラムおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
試料は、移動相としてＰＢＳバッファー（ｐＨ７．６）を使用してＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲル濾過カラムに２ｍｌ／分で注入した。それぞれの画分はファルコンチューブに収集した。クロマトグラム（図１０ａ）では、タンパク質溶出が示され、収集されたそれぞれの画分は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷した（図１０ｂ）。
【０２６６】
２．２．３  ＵＶ分光光度計によるタンパク質濃度の決定
図１１に示すように、精製したタンパク質は分光光度計を使用して定量した。
【０２６７】
２．３  Ｃａｆ１オリゴマーの形成
タンパク質精製後、本発明者らはｃａｆ１オリゴマーを調製した。Ｃａｆ１試料は９５℃で４５秒間インキュベートした（図１２）。
【０２６８】
２．４  部位特異的変異誘発を使用するＣａｆ１−ＲＧＤＳ変異体の構築。
＜発現および精製＞
２．４．１  ＣａｆＭ：Ｃａｆ１複合体およびＣａｆ１−ＲＧＤＳ変異体構築
ＰｙＭＯＬおよびアクセス番号（ＧｅｎＢａｎｋ、受託番号ＡＹ４５０８４７）ＲＧＤＳを使用して、ペプチドをＦ１線維モデル構造のループ中に挿入した（図１３）。変異原性プライマーはＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｓｅｒ３．１ソフトウェアを使用して設計した。
【０２６９】
２．４．２  塩基配列決定
部位特異的変異誘発後、それぞれの成功した形質転換のコロニーは塩基配列決定のために送った。Ｃａｆ１ＭＤＮ３１ＧＲＧ；ＤＳ３４ＧＮの遺伝子塩基配列決定から得られた結果は下に示している（図１４）。
【０２７０】
２．４．３  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル
精製Ｃａｆ１ＱＤＧＮ７６ＲＧＤＳ変異タンパク質の画分は１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に負荷した（図１５）。
【０２７１】
２．５  透過型電子顕微鏡
ｐＧｅｍ−ＴＦ１およびｐＧｅｍ−ＴＦ１  Ｃａｆ１ＱＤＧＮ７６ＲＧＤＳの画像は透過型電子顕微鏡を使用して捕捉した（図１６）。
【０２７２】
３．  細胞生物学
３．１  蛍光光度計を使用したｃａｆ１−ＷＴまたはＲＧＤＳ変異体で被覆された９６ウェルプレート上への細胞接着の測定
【表３】
2015522566.tif 000005
【０２７３】
３．２  蛍光顕微鏡を使用したｃａｆ１−ＷＴまたはＲＧＤＳ変異体で被覆されたカバーガラス上へのＰＣ１２細胞接着アッセイ
図１７はＰＣ１２細胞接着アッセイの結果を示している。
【０２７４】
４．  異なる種類のモノマーからの混合Ｃａｆ１ポリマーの形成
以下のデータは、変異Ｃａｆ１を発現している追加のプラスミドを加えることにより、２つの異なるモノマー型を結果としてのｃａｆ１ポリマーに組み込むことが可能であることを実証している。したがって、複合混合ポリマー（すなわち、異種ポリマー）が可能である。
【０２７５】
４．１  ２つの適合性プラスミド、ｐＡＨ３４ＬとｐＢＡＤ３３を使用したＣａｆ１−ＷＴの共発現
同じスキャフォールドが、細胞接着を増強する（例えば、フィブロネクチン由来のＰＨＳＲＮ（およびＣａｆ１−ＲＧＤＳの場合と同じように１つの細胞接着モチーフだけではない））または増殖因子を包含する分化などの他の生物学的プロセスを促進するいくつかの異なるＥＣＭモチーフを含有する細胞培養のための第二世代のスキャフォールドの設計および合成を説明する。例えば、移動を含む細胞発生の特定の時点に細胞により分泌されるメタロプロテイナーゼが認識し切断することができる特定のプロテアーゼ切断可能部位も組み込むことができる。
【０２７６】
混合ポリマーを含むスキャフォールドの生成にはいくつかの利点があることがある。スキャフォールドは、不活性モノマーにより希釈することができる低密度の活性モチーフのみを必要とすることが多い。これにより、モチーフ含有モノマーが分泌経路において組み立てられるのに時間がかかる場合には、ポリマーの発現レベルの改善が可能になる。
【０２７７】
本発明者らは、シャペロン／アッシャー系を通じてＣａｆ１野生型が分散しているＣａｆ１変異体（例えば、追加のモチーフまたは生理活性配列を有する）を首尾よく分泌することが可能であることを実証した。２つの異なる遺伝子の同時発現は共発現と呼ばれ、それぞれが１つのサブユニットの遺伝子（例えば、変異ｃａｆ１または野生型ｃａｆ１）および異なる選択マーカーを担持する２つまたは３つ以上のプラスミドにより一般に達成される。プラスミドは異なる適合性レプリコンを有しているほうがよい（１９）。
【０２７８】
この研究で使用した２つのプラスミドはｐＡＨ３４ＬおよびｐＢＡＤ３３であるが、どんな適切なプラスミドでも使用しうる。ｐＡＨ３４Ｌプラスミド（８）はｃａｆオペロンをコードしており、適合性ｐＢＡＤ３３プラスミドはｃａｆ１遺伝子のみをコードしている。３７℃で最大に発現されるｐＡＨ３４Ｌｃａｆ１遺伝子発現は温度調節されている。この温度より低ければ、ｃａｆ１遺伝子発現のレベルは減少する。プラスミドｐＢＡＤ３３（２０）は低コピープラスミドで、クロラムフェニコール耐性をコードしており、ａｒａＢＡＤ（アラビノース）オペロンのＰＢＡＤプロモーターならびにこのプロモーターの正のおよび負の調節因子をコードする遺伝子（ａｒａＣ）を含有している。
【０２７９】
ｐＢＡＤ３３プラスミド中へのｃａｆ１遺伝子のクローニングはＧｅｎｅＡｒｔにより行った。次に本発明者らはリボソーム結合部位−シャイン・ダルガーノ配列（ＡＧＧＡＧＧ）を開始コドンＡＵＧの８塩基対上流に導入した。プラスミドｐＡＨ３４ＬはＣｏｌＥ１複製起点を含有し、プラスミドｐＢＡＤ３３はｐＡＣＹＣ１８４複製起点を含有している。
【０２８０】
この系には、（１）温度またはアラビノースの濃度のどちらかを制御することによるｃａｆ１遺伝子発現およびタンパク質産生の調節を含む、いくつかの利点がある。ｐＡＨ３４Ｌによりコードされるｃａｆ１の発現は３７℃またはそれよりも高い温度で細胞培養増殖を実施することにより誘導し、温度を３７℃未満まで下げることにより抑制することができる。２３℃では、ｃａｆ１遺伝子の発現レベルは非常に低い。ｐＢＡＤ３３によりコードされるｃａｆ１の発現レベルは様々な範囲のＬ−アラビノース濃度、通常０．００２〜２％にわたり調節し、遺伝子発現を抑制するグルコースの存在により極端に低レベルにまで減少させることができる。この系のさらなる利点は（２）この系がハイブリッドＣａｆ１ポリマー（Ｃａｆ１変異体＋Ｃａｆ１−ＷＴ）を産生することである。
【０２８１】
それぞれが２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、０．２％のＬ−アラビノース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび１００μｇ／ｍＬのアンピシリンと２０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール抗生物質の両方を補充された５ｍＬのＬＢブロス培地を含有する３つのガラス試験管の２つの群に、それぞれｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿Ｃａｆ１、ｐＡＨ３４ＬまたはｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿Ｃａｆ１＋ｐＡＨ３４Ｌの両方のいずれかで形質転換された大腸菌ＴＯＰ１０の単一コロニーを接種した。０．２％のグルコースを一方の試験管群に添加し、もう一方の試験管群にはグルコースを添加しなかった。ガラス試験管はすべて３７℃、１８０ｒｐｍの回転車輪においてインキュベートした。培養物が増殖の対数期中期（６００ｎｍで０．５〜０．６の光学密度）に到達すると、３つの異なる濃度のＬ−アラビノースを別々のガラス試験管にそれぞれの群：０．０２、０．２および２％で添加した。１６時間のインキュベーション後、細菌細胞培養物は１５ｍｌのファルコンチューブに移し、これを４℃、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。すべてのファルコンチューブを写真に撮った。ペレットおよび綿状層のサイズは定規を使用してファルコンチューブ上で直ちに測定した（図６０）。
【０２８２】
図６０は、この研究の培養物の綿状層と細胞ペレットの測定のいくつかの例を示している。綿状層の存在は大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＡＨ３４Ｌまたは大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿Ｃａｆ１＋ｐＡＨ３４Ｌのいずれかを含有するすべての管において観察されたが、０．２％のＤ−グルコースを含有する管においてはＤ−グルコースが添加されていない管よりも綿状層は厚かった。大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿Ｃａｆ１のみを含有する管では、Ｄ−グルコースが存在していても非存在でも綿状層は観察されなかった。
【０２８３】
Ｄ−グルコースの存在下または非存在下で異なる濃度（０、０．０２、０．２および２％）のＬ−アラビノースを使用して同等な実験を実施した。ピペットを使用してそれぞれのファルコンチューブから過剰なＬＢ培地、おおよそ４ｍｌを慎重に取り出した。ピペットを使用して、綿状層を残っているＬＢと共に細胞ペレットから慎重に分離した。この層の試料をＳＤＳ試料に添加し、１００℃で５分間加熱し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に負荷した。ゲルのうちの１つはクーマシーブリリアントブルーで染色し、もう一方のゲルはウェスタンブロットを実施するのに使用した。ブロットは抗Ｃａｆ１抗体を使用してＣａｆ１についてプロービングし、続いてヤギ抗マウスｌｇＡ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを使用して結合した抗体を検出した。結合した抗体は４ＣＮ（４−クロロ−１−ナフトール）基質を使用して検出した。
【０２８４】
ウェスタンブロット膜をＩｍａｇｅＪソフトウェアによりスキャンし分析して、ウェスタンブロット上のバンドの密度を比較した。バンドの相対密度の平均および平均値の標準偏差を決定した。綿状層に存在するＣａｆ１の定量化について得られた結果および測定された綿状層のサイズは図６１に見ることができる。図６１は、綿状層のサイズと綿状層に存在するＣａｆ１タンパク質の量の間の関係を示している。
【０２８５】
４．２  大腸菌中でＣａｆ１サブユニットに融合している異種タンパク質の発現
ｐＢＡＤ３３中のｃａｆ１遺伝子は、（１）そのＮ末端近くの６ヒスチジン（Ｃａｆ１−６ＨｉｓＮＴ）；（２）Ｃａｆ１のループ１におけるフィブロネクチン中のＲＧＤ相乗作用配列であるＰＨＳＲＮモチーフ（Ｃａｆ１−ＰＨＳＲＮ）（Ｃａｆ１−ＰＨＳＲＮループ１）；（３）Ｃａｆ１のＮ末端におけるＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（ｃａｆ１−ＦＬＡＧエピトープＮＴ）；（４）Ｃａｆ１のＮＴ末端におけるシステイン（Ｃａｆ１−Ｃｙｓ−ＮＴ）；（５）Ｃａｆ１のループ４におけるシステイン（Ｃａｆ１−Ｇ３５Ｃループ４）；Ｃａｆ１のループ２におけるシステイン（Ｃａｆ１−Ｑ１０６Ｃループ２）；（６）Ｃａｆ１のＮ末端におけるメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ１３）のＰＥＮＦＦ切断部位（Ｃａｆ１−ＰＥＮＦＦ−ＮＴ）；（７）Ｃａｆ１のＮ末端における６ヒスチジンそれに続くスペーサー連結ペプチド（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（Ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサー）；（８）Ｃａｆ１のＣ末端における６ヒスチジン（Ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＣＴ）；（９）Ｃａｆ１のループ３におけるＰＨＳＲＮモチーフ（Ｃａｆ１−ＰＨＳＲＮループ３）の挿入により変異させた。ｃａｆ１遺伝子におけるこれらの変異はｃａｆ１遺伝子のバリアントとして設計された。バリアントを合成し、ＧｅｎｅＡｒｔ（インビトロｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりｐＢＡＤ３３ベクター中にクローニングした。
【０２８６】
４．２．１  ベクターｐＢＡＤ３３およびｐＡＨ３４Ｌを使用したＣａｆ１変異体の共発現
ｃａｆ１遺伝子（サイズが５２８ｂｐ；ＧｅｎＢａｎｋ、受託番号ＡＹ４５０８４７）変異体はＧｅｎｅＡｒｔにより合成し（表４）ｐＢＡＤ３３ベクターのＫｐｎｌとＸｂａｌ制限部位間にクローニングし、２つの停止コドンが続いた。
【０２８７】
４．２．２  小規模Ｃａｆ１変異体共発現
１００μｇ／ｍｌのアンピシリンまたは２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール抗生物質および１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと２０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール抗生物質の両方を補充したＬＢブロスを、それぞれ大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿Ｃａｆ１変異体、大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＡＨ３４Ｌおよび大腸菌ＴＯＰ１０／ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿Ｃａｆ１変異体＋ｐＡＨ３４Ｌを培養するために使用した。
【０２８８】
それぞれが必要な抗生物質を有する１０ｍｌのＬＢブロス培地を含有する３つのガラス試験管を含む２つの群は、その光学密度が６００ｎｍで０．５〜０．６に到達するまで３７℃、１８０ｒｐｍで振盪しながらインキュベートした。光学密度を測定後、０．２％のＬアラビノースをそれぞれの管に添加した。次の日、細菌細胞培養物は無菌条件下で１５ｍｌのファルコンチューブに移した。培養物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットにより分析するために前記の通りに遠心分離し調製した。この実験は３通り実施した。
【表４Ａ】
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【表４Ｂ】
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【０２８９】
ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿Ｃａｆ１変異体ごとのプラスミドＤＮＡを使用して、ｐＡＨ３４Ｌと共にまたはなしで大腸菌ＴＯＰ１０コンピテント細胞を形質転換した。陽性対照としては、ｐＡＨ３４ＬプラスミドＤＮＡのみを使用して大腸菌ＴＯＰ１０コンピテント細胞を形質転換した。形質転換された細菌細胞は上記の関連抗生物質（複数可）を含有するＬ寒天上で増殖させた。形質転換された大腸菌ＴＯＰ１０コンピテント細胞のプレート由来の個々のコロニーは、それが６００ｎｍで０．５〜０．６の光学密度に到達するまで、関連する抗生物質（複数可）を含有する１０ｍＬの溶原性ブロス（ＬＢ）培地を有するガラス試験管において３７℃で増殖させた。最終濃度０．２％のアラビノースをそれぞれのガラス試験管に添加した。細菌細胞培養物は３７℃で１６時間増殖させておいた。このインキュベーション時間後、培養物は４℃、３０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。綿状層および細胞ペレットは定規を使用して測定した（表５）。
【０２９０】
表５は、０．２％のＬ−アラビノースでの誘導後、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−ＦＬＡＧエピトープＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−Ｇ３５Ｃループ４＋ｐＡＨ３４Ｌ、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサー＋ｐＡＨ３４Ｌ、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＣＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−ＰＨＳＲＮループ３＋ｐＡＨ３４Ｌにおいて綿状層を生み出すのにｐＡＨ３４Ｌと一緒のｐＢＡＤ３３の共発現が必要であったことを示している。
【０２９１】
２つの培養物、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−Ｑ１０６Ｃループ２＋ｐＡＨ３４ＬおよびｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−ＰＨＳＲＮループ１＋ｐＡＨ３４Ｌでは、誘導後綿状層は検出されなかった。ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−ＰＥＮＦＦ−ＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ培養物では、本発明者らは誘導前に綿状層を観察したが、誘導後、綿状層は観察されなかった。
【０２９２】
綿状層は、ポリマーに対する変異体のある程度の寄与を示すことができる非誘導培養物と比べた場合、Ｌアラビノース誘導培養物ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−Ｇ３５Ｃループ４＋ｐＡＨ３４Ｌでは非常に厚かった。ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−ＦＬＡＧエピトープＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌの場合、層のサイズは誘導および非誘導培養物では類似していた。層のサイズをＣａｆ１共発現の指標として使用するだけでは、この結果を理解するのは一層困難であった。
【０２９３】
したがって、ウェスタンブロットを実施し、モノクローナル抗ｃａｆ１抗体およびモノクローナル抗ＦＬＡＧエピトープ抗体を使用してこれらの試料を分析した（図６２）。ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ  ＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ（図６３）についておよびｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサー＋ｐＡＨ３４Ｌ（図６４）については類似する結果を立証した。これら最後の２つの試料は、Ｃａｆ１ではモノクローナル抗Ｃａｆ１抗体を使用しておよびポリヒスチジンではモノクローナル抗ポリヒスチジン抗体を使用してプロービングされた２つのウェスタンブロットにより分析した。ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  ＰＨＳＲＮループ１＋ｐＡＨ３４Ｌ、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  Ｃｙｓ−ＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  Ｇ３５Ｃループ４＋ｐＡＨ３４Ｌ、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  Ｑ１０６Ｃループ２＋ｐＡＨ３４Ｌ、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  ＰＥＮＦＦ−ＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１  ＰＨＳＲＮループ３＋ｐＡＨ３４Ｌについてのウェスタンブロットを、モノクローナル抗Ｃａｆ１抗体を使用して実施した（図６５）。
【表５】
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【０２９４】
図６２は、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−ＦＬＡＧエピトープＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ試料が抗Ｃａｆ１抗体により検出されたＣａｆ１タンパク質を含有しており（図６２−Ａ）、このタンパク質がポリマー形態であることを示している。Ｃａｆ１ポリマーは試料を１００℃で４５秒間加熱した後に観察された（ウェスタンブロットＡ−レーン２）。Ｃａｆ１が検出されなかったｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−ＦＬＡＧエピトープＮＴのみ試料では異なる結果が得られた。ｐＡＨ３４Ｌ試料では、ポリマー形態のＣａｆ１が検出された（ウェスタンブロットＡ−レーン８）。同じ試料について実施したが、抗ＦＬＡＧエピトープを使用したウェスタンブロットでは、ポリマー形態のＣａｆ１−ＦＬＡＧエピトープＮＴの存在が明らかにされた（ウェスタンブロットＢ−レーン２）。Ｃａｆ１−ＦＬＡＧエピトープＮＴをコードしていないｐＡＨ３４Ｌ試料は抗ＦＬＡＧエピトープ抗体では染色しなかった（ウェスタンブロットＢ−レーン７〜９）。ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−ＦＬＡＧエピトープＮＴを含有する試料では、いくつかの弱いバンドが検出され、モノマー形態のＦＬＡＧエピトープのみと対応していた（ウェスタンブロットＢ−レーン５および６）。
【０２９５】
図６３は、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿Ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ試料が抗Ｃａｆ１抗体により検出されるＣａｆ１タンパク質を含有しており（図６３−Ａ）、このタンパク質がポリマー形態であることを示している。Ｃａｆ１ポリマーは試料を１００℃で４５秒間加熱した後に観察された（ウェスタンブロットＡ−レーン２）。ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿Ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴ試料ではＣａｆ１は検出されなかった。ｐＡＨ３４Ｌ試料は、ポリマー形態のＣａｆ１を含有していた（ウェスタンブロットＡ−レーン８）。同じ試料について実施したが、抗ポリヒスチジンを使用したウェスタンブロットでは、ごくわずかな量のＣａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴのモノマー形態での存在が明らかにされた（ウェスタンブロットＢ−レーン１〜３）。ｐＡＨ３４ＬはＣａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴをコードしておらず、バンドは検出されなかった（ウェスタンブロットＢ−レーン７〜９）。ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴを含有する試料では、いくつかの非特異的バンドのみが検出された（ウェスタンブロットＢ−レーン４〜６）。
【０２９６】
図６４は、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサー＋ｐＡＨ３４Ｌ試料が抗Ｃａｆ１抗体により検出されたＣａｆ１タンパク質を含有しており（図６４−Ａ）、このタンパク質がポリマー形態であることを示している。Ｃａｆ１ポリマーは試料を１００℃で４５秒間加熱した後に観察された（ウェスタンブロットＡ−レーン２）。ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサー試料ではＣａｆ１は検出されなかった。ｐＡＨ３４Ｌ試料では、ポリマー形態のＣａｆ１が検出された（ウェスタンブロットＡ−レーン８）。同じ試料について実施したが、抗ポリヒスチジンを使用したウェスタンブロットでは、ダイマーおよびモノマー形態のＣａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサーの存在が明らかにされた（ウェスタンブロットＢ−レーン１〜３）。ｐＡＨ３４Ｌはｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサーをコードしておらず、したがってウェスタンブロットＢ−レーン７〜９ではバンドは検出されなかった。ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサーを含有する試料では、いくつかの非特異的バンドが検出された（ウェスタンブロットＢ−レーン４〜６）。
【０２９７】
図６５は、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−ＰＨＳＲＮループ１＋ｐＡＨ３４Ｌ、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−Ｃｙｓ−ＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−Ｇ３５Ｃループ４＋ｐＡＨ３４Ｌ、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−ＰＥＮＦＦ−ＮＴ＋ｐＡＨ３４Ｌ試料が抗Ｃａｆ１抗体により検出されたポリマーＣａｆ１タンパク質を含有していることを示している。ポリマー形態の精製されたＣａｆ１はモノクローナル抗Ｃａｆ１抗体により検出された。ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−Ｑ１０６Ｃループ２＋ｐＡＨ３４Ｌ試料はモノクローナル抗Ｃａｆ１抗体により検出されず、ｐＢＡＤ３３＿ＳＤ＿ｃａｆ１−ＰＨＳＲＮループ３＋ｐＡＨ３４Ｌ試料はラダーを産生しなかった。
【０２９８】
４．３  考察
４．３．１  Ｃａｆ１  ＷＴの共発現は２つの適合性プラスミド、ｐＡＨ３４ＬおよびｐＢＡＤ３３により媒介された
この研究は、（１）ｐＡＣＹＣ１８４ベクター由来のｐＢＲ３２２適合性ｐ１５Ａ複製起点および（２）クロラムフェニコール抗生物質に対する耐性を含有するプラスミドｐＢＡＤ３３を使用するｃａｆ１遺伝子のコピーならびに異なる複製起点（ＣｏｌＥ１）および抗生物質耐性（カナマイシン）を有するプラスミドｐＡＨ３４Ｌを使用するｃａｆオペロンの共発現のための系を実証しており、したがって細胞はカナマイシン／クロラムフェニコールＬ寒天プレート上で増殖される場合両方のプラスミドを維持することができる。綿状層のサイズに基づいて、２つの適合性プラスミドにより形質転換されＬアラビノースを含有する培地で増殖させたＴＯＰ１０大腸菌細胞はより高レベルのｃａｆ１遺伝子を発現した。このことは、モノクローナル抗Ｃａｆ１抗体を使用するウェスタンブロットにより確かめられた。
【０２９９】
他の研究では、Ｂａｇａと共同研究者ら（１６）は、ＰａｐＡ抗原の電子顕微鏡と免疫ブロット分析によりＰａｐＡ（大きいほうのピリンサブユニット）の過剰産生を調べた。そのため、彼らはＰａｐＡピリンサブユニットのみを過剰産生するプラスミドｐＰＡＰ２６７を構築し、このプラスミドを野生型ｐａｐオペロン（ｐａｐＡピリンの発現の原因となる１１遺伝子で構成されている）を含有するｐＰＡＰ５を宿すＨＢ１０１細胞中に導入し、ＰａｐＡの発現がｐＰａｐ５単独の場合と比べて１０倍であることと線毛が野生型よりも長いことも見出した。これにより、共発現の可能性が示されたが、産生されたポリマーは均一であり、ｐＰＡＰ５産物がポリマーであることの直接的証拠はなかった。
【０３００】
この研究では、一定範囲のＬアラビノース濃度、０．０２から２％にわたり、Ｃａｆ１発現を調節することが可能であった。ｃａｆ１発現のレベルはＬアラビノース濃度の増大と共に増加した（図６１）。Ｌアラビノースの非存在下では、達成されたｃａｆ１発現のレベルは非常に低かった。ＴＯＰ１０株（ａｒａ−）はＬアラビノースを輸送することができるが代謝することはなく、このことはＬアラビノースのレベルは細胞内では一定であり時間とともに減少することはないので、発現研究には重要なことである。
【０３０１】
しかし、ｃａｆ１発現の効率的抑制は０．２％Ｄグルコースの存在下では達成されなかった。実際、グルコースのあるいくつかの場合に、細胞はよりよく増殖しより多くのタンパク質を発現した。
【０３０２】
４．３．２  Ｃａｆ１−ＦＬＡＧおよびＣａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴ＋スペーサーはＣａｆ１−ＷＴと一緒にポリマー中に同時挿入された
本発明者らは、上述の発現系を使用するＣａｆ１変異体のＣａｆ１−ＷＴ（ｃａｆ野生型）と一緒の共発現へのアプローチを開発した。Ｃａｆ１変異体の共発現の分析は、本研究のタンパク質に対する抗体を使用するウェスタンブロットにより実施した。
【０３０３】
Ｃａｆ１−ＷＴタンパク質と一緒に共発現されたＣａｆ１−ＦＬＡＧにより混合ポリマーが生成した。本発明者らが知っている限り、これはこの種の混合ポリマーの初めての実証である。Ｚａｖｉａｌｏｖら（２１）は、大腸菌における組換えタンパク質の異種発現のためのアプローチを提示している。そのため、彼らは、例えば、ヒトインターロイキン−１βをＣａｆ１シグナルペプチドと成熟Ｃａｆ１サブユニットの間に導入し、Ｃａｆ１サブユニットのＣ末端はシャペロンＣａｆ１Ｍとの相互作用に利用できるようにしておくキメラタンパク質をコードする遺伝子を作製した。しかし、この系はポリマーを産生しなかった。
【０３０４】
この研究では、シャペロン−アッシャー系により媒介される大腸菌の表面上に分泌されたＣａｆ１ポリマー（モノクローナル抗ＦＬＡＧエピトープ抗体を使用するＦＬＡＧエピトープについてのウェスタンブロット参照、図６２）において、Ｃａｆ１−ＦＬＡＧおよびＣａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴスペーサーが検出された。実施したウェスタンブロットでは、ポリマー中スペーサーのないＣａｆ１−６Ｈｉｓ−ＮＴの存在は明らかにならなかった。Ｃａｆ１−ＷＴが、その他のＣａｆ１変異体、すなわちＣａｆ１−ＰＨＳＲＮ、Ｃａｆ１−Ｃｙｓ（Ｑ１０６Ｃを除く）およびＣａｆ１−ＰＥＮＦＦと一緒に発現された場合に、成功したポリマー形成が観察された。
【０３０５】
５．  架橋Ｃａｆ１ハイドロゲル
Ｃａｆ１−ＷＴは、異なるスペーサーアーム長（すなわち、コンジュゲート分子間の距離）およびその末端に異なる数の同じ官能基Ｎ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）を含有する３つのクロスリンカーと、共有結合的架橋をしていた。
【０３０６】
ＮＨＳエステルは、一級アミンと反応して共有アミド結合を形成する。この反応は通常、室温で３０分間リン酸バッファーｐＨ７．２〜８．０中で実施される。Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水などの一級アミンバッファーは、反応を巡って競合するために適合性ではないが、一部の手順では、コンジュゲーション手順の終了時にＴｒｉｓまたはグリシンバッファーを添加して反応をクエンチ（停止）することが有用である。この反応はＮ−ヒドロキシサクシニミド（Ｍ．Ｗ．１１５）を放出し、この物質は透析または脱塩により容易に取り除くことができる。
【０３０７】
この研究では、本発明者らはゲル化後従来の走査型電子顕微鏡ＳＥＭにより、ゲル化後続いて凍結乾燥し、環境型走査電子顕微鏡（ＥＳＥＭ）にもよりＣａｆ１−ＷＴハイドロゲルを分析した。ＥＳＥＭ法はＳＥＭの変種であり、低真空で機能し、ペルチェステージを使用して試料温度を一定に維持することによりチャンバー内の水蒸気圧を制御することにより試料を水和状態に保つ能力を有する。さらに、電荷蓄積を避けるために試料の被覆を必要とする高真空ＳＥＭ適用とは違って、炭素または金で被覆することなく試料を調製することができる。
【０３０８】
５．１  実験結果
５．１．１  異なるスペーサーアーム長を用いたＣＡＦ１−ＷＴの架橋
最終濃度３０ｍｇ／ｍｌのＣａｆ１タンパク質を、それぞれ架橋率（ｗ／ｗ、クロスリンカー対Ｃａｆ１）１対１０、１対５、１対３、１対２に対応する最終濃度３、６、９および１５ｍｇ／ｍｌのＤＴＳＳＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＡＧＷｏｒｋｓ）および４アームＮＨＳ−ＰＥＧ（Ｃｒｅａｔｉｖｅ  ＰＥＧＷｏｒｋｓ）溶液を用いて架橋した。架橋のために使用した方法は製造業者の使用説明書に従った。これらの比のＣａｆ１ハイドロゲルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）、生存率／細胞傷害性アッセイを実施してのＣａｆ１ハイドロゲルと哺乳動物細胞との生体適合性および走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）により調べる形態学により分析するそのゲル化時間、膨潤、架橋の程度に関して特徴付けた。
【０３０９】
５．１．２  ゲル化時間
Ｃａｆ１ハイドロゲルのゲル化速度は室温で３０分間、毎分撹拌しながら密封条件下でモニターした。表６は、ＤＴＳＳＰクロスリンカーの濃度を増加させてもゲル化時間に変化はなかったことを示している。３０分後、反応はその流動性を失わず、例えば、管をわずかに反転させると、管中の溶液はガラス試験管の壁に沿って滑ったがゲルを生じることはなく、したがってゲル化時間を確定しなかった（「Ｎ．Ｄ」）。しかし、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（本明細書では「２アームＰＥＧ−ＮＨＳ」とも呼ばれる）の濃度を増加させるとゲル化時間がわずかに減少した。ゲル化時間のさらに目に見える減少は、４アームＰＥＧ−ＮＨＳの添加により観察された。４アームＰＥＧ−ＮＨＳのゲル化速度は、２アームＰＥＧ−ＮＨＳよりも速かった。例えば、４アームＰＥＧ−ＮＨＳとＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳの最も速いゲル化時間はそれぞれ２秒と２４分であった。にもかかわらず、これらの簡単な観察のみに基づいても、異なるクロスリンカーと架橋したすべてのＣａｆ１ハイドロゲルによりＣａｆ１の対応する溶液の粘度に匹敵する試料粘度が得られることに我々は注目した。
【０３１０】
５．１．３  膨潤
ＤＴＳＳＰ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳおよび４アームＰＥＧ−ＮＨＳを用いて異なる濃度で架橋したＣａｆ１ハイドロゲルの膨潤は、クロスリンカー濃度の減少と共に増加する径の変化（膨潤前の最初の径とＰＢＳの添加による膨潤後の最終径の間の差）の分析に基づいて決定した。この傾向はＤＴＳＳＰと架橋したＣａｆ１ハイドロゲルでより明白であった（ｗ／ｗ、１対１０の架橋比）。
【表６】
2015522566.tif 000009
【０３１１】
図６７は、２分後の４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋した透明なＣａｆ１ハイドロゲル（図６７−Ａ）ならびに１対３および１対２よりも１対１０および１対５のほうが高い架橋比に依存するＣａｆ１ハイドロゲルの膨潤特性（図６７−Ｂ）を示している。
【０３１２】
５．１．４  架橋の程度
Ｃａｆ１ポリマーは、それぞれがクロスリンカーのそれぞれの末端のＮＨＳ反応基を提示している３つの異なるクロスリンカーで処理した。ＮＨＳ基はｐＨ７〜８．５でリジンの一級アミン基と反応して安定なアミド結合を形成する。この反応は３０分後に終止させた。架橋後、試料は１００℃、５分間ＳＤＳ試料バッファー中でインキュベートし、電気泳動のために４〜２０％勾配ポリアクリルアミド上に負荷した。図６８は変性Ｃａｆ１タンパク質試料を示しており、架橋の程度を明らかにした。ゲルの下ではおよそ１５ｋＤａのバンドが観察され、非架橋モノマーに対応していた。ＤＴＳＳＰで架橋したＣａｆ１の場合、ダイマーバンドは、２５と３７ｋＤａタンパク質標準マーカーの間で分離している（レーン１〜４）。ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１の場合、ダイマーバンドは、ほぼ３７ｋＤａタンパク質標準マーカーと伴行していた（レーン５〜８）。４アームＰＥＧ−ＮＨＳと架橋しているＣａｆ１は、５０と７５ｋＤａタンパク質標準マーカーの間で分離している第二のバンドを提示している（レーン９から１２）。残りの高分子量バンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析だけでは定義することはできない。異なるクロスリンカーを使用して架橋率を増大させるとＣａｆ１モノマー画分が減少した。
【０３１３】
表７は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して濃度測定により得られた相対密度の値を示している。架橋画分と非架橋画分の分析を実施した。架橋画分についての理論値は、Ｃａｆ１タンパク質試料（クロスリンカーのうちの１つの存在下）非架橋画分からＣａｆ１タンパク質試料（クロスリンカー非存在下）の量を引くことにより決定した。クロスリンカーの濃度を増加すると理論値に従ってＣａｆ１架橋画分が増え、Ｃａｆ１非架橋画分が減少した。例外は１対２の質量比で４アームＰＥＧ−ＮＨＳ試料で架橋しているＣａｆ１であり、非架橋画分と架橋画分の減少を示した。理論値は架橋画分について得られた理論値よりも高かった。
【表７】
2015522566.tif 000010
【０３１４】
図６９は、短スペーサーＤＴＳＳＰ（１２．０Å）、長スペーサーＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（約１９７Å）および４アームＰＥＧ−ＮＨＳを有する長スペーサー（約３９４Å）を同じ分子比１対１０（Ｃａｆ１対クロスリンカー）で使用したＣａｆ１架橋のＴＥＭ画像の例を示している。Ｃａｆ１ハイドロゲルは前記の通りに調製し、ゲル化およびＰＢＳ  ｐＨ７．４中での膨潤後、Ｃａｆ１ハイドロゲルはナノピュアー（ｎａｎｏｐｕｒｅ）水中に希釈した。形成されたハイドロゲルのサイズはＪｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎバージョン１．２．５（Ｒｏｄｕｉｔ、２００７）により決定した。ハイドロゲルメッシュ（ハイドロゲルの小片）の周囲長に沿った線を引いた。グラフはＳＰＳＳバージョン１９を使用して作成した。
【０３１５】
ＴＥＭ画像は、平均サイズ７６ｎｍおよび１０から３００ｎｍの範囲の均一サイズ分布を有する、ＤＴＳＳＰで架橋したＣａｆ１ハイドロゲルの小片を示している。ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１ハイドロゲルは平均サイズ３９３ｎｍおよびメッシュサイズが１０から６００ｎｍのより分散したサイズ分布を提示した。４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１ハイドロゲルは平均サイズ２５４ｎｍおよび約２０ｎｍから１５００ｎｍの極端なサイズ分布を示した。
【０３１６】
６．  生存率および細胞傷害性アッセイ
生存率／細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して使用した材料の細胞生存率および細胞傷害性を評価する。アッセイの第一部分は２つのプロテアーゼ活性を同時に測定し、１つは細胞生存率のマーカー、もう１つは細胞傷害性のマーカーである。生細胞プロテアーゼ活性は無傷の生細胞に制限されており、蛍光発生、細胞浸透性ペプチド基質（グリシルフェニルアラニル−アミノフルオロクマリン；ＧＦ−ＡＦＣ）を使用して測定する。基質は無傷の細胞に入り、生細胞プロテアーゼ活性により切断され、生細胞の数に比例する蛍光シグナルを発生する。この生細胞プロテアーゼは、細胞膜統合性が失われ周囲の培養培地に漏出すると不活性になる。第二の蛍光発生、細胞不透過性ペプチド基質（ビス−アラニルアラニル−フェニルアラニル−ローダミン１１０；ビス−ＡＡＦ−Ｒ１１０）を使用して、膜統合性を失った細胞から放出される死細胞プロテアーゼ活性を測定する。ビス−ＡＡＦ−Ｒ１１０は膜透過性ではないため、無傷の生細胞により発生するこの基質からのシグナルは基本的にない。
【０３１７】
ラット初代骨芽細胞を、標準培養技法を使用してＣａｆ１ハイドロゲル（本発明に従って作製）の表面上で培養した。２４時間後、生存率および膜統合性を生存率／細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により決定した。このアッセイでは無傷の生細胞プロテアーゼ活性は蛍光発生、細胞透過性ペプチド基質（グリシルフェニルアラニル−アミノフルオロクマリン；ＧＦ−ＡＦＣ）を使用して測定し、死細胞プロテアーゼ活性は細胞不透過性ペプチド基質（ビス−アラニルアラニル−フェニルアラニル−ローダミン１１０；ビス−ＡＡＦ−Ｒ１１０）により測定する。表８は、Ｃａｆ１ハイドロゲル上に付着したラット初代骨芽細胞についての生存率および細胞傷害性のパーセンテージを示している。細胞は７０〜８０％生存率および細胞傷害性についての低いパーセンテージにより示されるＣａｆ１ハイドロゲル上での二次元培養を許容した。
【表８】
2015522566.tif 000011
【０３１８】
７．  ４アームＰＥＧ−ＮＨＳと架橋したｃａｆ１ポリマーを含むハイドロゲル
４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１ポリマーのハイドロゲルを形成する能力を調査した。図７０は、Ｃａｆ１のモノマー循環置換バリエーション（ｃｐＣａｆ１）（２２）と４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１ポリマーの両方、４アームＰＥＧ−ＮＨＳのみおよびＣａｆ１単独のＴＥＭ画像を示している。
【０３１９】
ＴＥＭ画像（図７０）は、４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１のモノマー循環置換バリエーション（ｃｐＣａｆ１）（２２）が目に見えるゲル様構造を形成しないことを明らかにした。円により示されているごく小さな構造が観察された。さらに、４アームＰＥＧ−ＮＨＳとＣａｆ１の両方単独では大きなハイドロゲル網目を形成しなかった。これらのハイドロゲルネットワークの一部の例は、様々な架橋比（ｗ／ｗ）で４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１ポリマーを使用して目に見えるようになり始める。
【０３２０】
前述の通りゲル化後１対３００００００、１対３０００００、１対３００００、１対３０００、１対３００、１対６０および１対３０の様々な架橋比（Ｃａｆ１対クロスリンカー、ｗ／ｗ）試料で４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１ポリマーは、ＳＤＳ試料バッファー中１００℃で５分間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に負荷した。ゲルはＩｍａｇｅＪバージョン１．４６により上記の通りにスキャンし分析した。ＩｍａｇｅＪにより決定されたＣａｆ１架橋画分またはＣａｆ１非架橋画分の値は表９に提示している。Ｃａｆ１架橋画分はクロスリンカー濃度の増加と共に増加した。
【表９】
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【０３２１】
ＴＥＭ画像（図７１）は、１対１０（ｗ／ｗ、Ｃａｆ１対クロスリンカー）で４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１ポリマーは図７０よりも高密度なハイドロゲル構造を形成するが、形成されたハイドロゲルは１００ｎｍよりもはるかに小さな寸法の広範な分布のポアを有することを明らかにした。ハイドロゲル構造はクロスリンカーの増加と共にいっそう緻密になる。１対２の比では、ハイドロゲルは非晶構造を呈し、目に見えるポアはなくなる。
【０３２２】
７．１  走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によるＣａｆ１ハイドロゲルの形態
図７２は、非常に緻密な構造を有する１対３の比で４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１ハイドロゲルを示しており、したがってポアの径は決められなかった。しかし、ポアはナノメーターの桁だと思われる。最初のＳＥＭ画像はいくつかの小片に壊れたＣａｆ１ハイドロゲルを示している。次のＳＥＭ画像はこれらのＣａｆ１ハイドロゲル小片の内部を示している。
【０３２３】
図７３は、３μｍから２２μｍの範囲のポア径を示し平均ポア径は８±０．００３μｍであるメッシュ様構造を呈するＣａｆ１凍結乾燥ハイドロゲルを示している。
【０３２４】
非処理水和Ｃａｆ１ハイドロゲルはＥＳＥＭにより可視化した。ＥＳＥＭでは、ハイドロゲルを最小の乾燥で飽和水蒸気環境に曝露させるが、これにより自然な水和状態でのハイドロゲルのポア構造の研究が可能になる。水和Ｃａｆ１ハイドロゲルは１００ｎｍから６００ｎｍの範囲のナノポアを提示した。ポアの平均サイズはおよそ３００±０．００５ｎｍであったが、観察されたサイズ分布は相対的に広いと思われる。Ｃａｆ１タンパク質ハイドロゲルの空隙スペースは脱水Ｃａｆ１ハイドロゲルよりも大きい（図７２）。
【０３２５】
８．  ＳＥＭによるＣａｆ１ハイドロゲル上の哺乳動物細胞の形態
マウス３Ｔ３線維芽細胞およびラット初代骨芽細胞を、本発明に従って作製したＣａｆ１−ＷＴハイドロゲルの表面上で標準培養条件を使用して培養した。２４時間後、細胞は２％のグルタルアルデヒドに固定し、脱水し、金被覆して従来のＳＥＭにより視覚化した。二次元培養物では、骨芽細胞よりも多くの線維芽細胞が細長い形態を呈した（図７５）。大多数の骨芽細胞が円形形態を示し、Ｃａｆ１ハイドロゲルで被覆された表面上に目に見える広がりを示す細胞はごくわずかである。ハイドロゲルを作製するために使用されたＣａｆ１は非接着特性（本明細書で考察される通りの）を有するＷＴ−ｃａｆ１であった。本明細書に示されるデータから、ＲＧＤ型モチーフをＷＴ−ｃａｆ１中へ導入すれば線維芽細胞相互作用は増大すると結論付けることが可能である。この段階で重要なことに、本発明者らはゲルが細胞傷害性ではないことを示した。
【０３２６】
９．  実施例５から８の全体考察
９．１  ４アームＰＥＧ−ＮＨＳと架橋したＣａｆタンパク質はゲル様物質を形成した。
Ｃａｆ１ハイドロゲルは管反転法を使用して室温で調製した。ゲル化時間は、クロスリンカー濃度に応じて、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳでは２４〜２７分以内、４アームＰＥＧ−ＮＨＳでは２〜２２分以内であると視覚的に評価された。これら２つのクロスリンカーの濃度が高いほど、ゲル化時間は速くなる。Ｃａｆ１と異なる濃度のＤＴＳＳＰとの反応では、固体ゲルが観察されなかったために、ゲル化時間の視覚的評価はできなかった（表６）。
【０３２７】
したがって、ゲル化速度はＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳおよびＤＴＳＳＰよりも４アームＰＥＧ−ＮＨＳのほうが著しく速かった。４アームＰＥＧ−ＮＨＳのゲル化速度の増加は、Ｃａｆ１の一次アミン基と反応するその能力に影響を与える４アームＰＥＧの構造に起因する可能性がある。
【０３２８】
本明細書に提供するデータは、４アームＰＥＧ−ＮＨＳの構造がゲルの数分以内の形成に重要であることを明らかにした。１対５、１対３および１対２の比（ｗ／ｗ）で４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１タンパク質は、それぞれ５分、４分および２分でハイドロゲルを形成した（表６）。にもかかわらず、ＤＴＳＳＰで架橋したＣａｆ１タンパク質は、同じタンパク質対クロスリンカー比を使用し密封条件下で３０分後でさえゲル様物質ではなかった（表９）。３０分の架橋反応時間は、利用可能な文献に基づき、製品説明書に記載されている通りに決定した。クロスリンカーは、タンパク質の一次アミン（−ＮＨ２）と直に反応する鎖の末端にＮ−ヒドロキシサクシニミド（ＮＨＳ）エステルを含有しており、水溶液中で迅速に加水分解されうる。
【０３２９】
直鎖ＰＥＧ−ＮＨＳ（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ）で架橋したＣａｆ１ハイドロゲルは同じ比および調製条件でハイドロゲルを形成するには効率性が低かった。この場合、ゲル化時間は４アームＰＥＧ−ＮＨＳよりも遅かった（表６）。おそらく、Ｃａｆ１とＤＴＳＳＰまたはＮＨＳ−ＰＥＧのいずれかとの反応にはゲル化中にさらに緻密な構造を形成するのにさらに時間が必要である。
【０３３０】
ここに報告しているゲル化時間は分の桁であり、ＰＥＧハイドロゲルを使用する他の研究に匹敵するものである。
【０３３１】
９．２  膨潤
ＤＴＳＳＰ、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳおよび４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１ハイドロゲルの液滴の径は、反応に添加したクロスリンカーが増加するにつれほとんど変化しなかった。これは、クロスリンカーの濃度を増加する場合、Ｃａｆ１ポリマーとの反応に添加したクロスリンカーがもっと少ない場合よりも、測定された液滴の最初の径とＰＢＳ中３７℃で１６時間後の同じ液滴の最終的な径の間の差は小さく、したがって２つの径の差と最初の径の間の比はさらに小さい、すなわち、クロスリンカー濃度が少ないＣａｆ１ハイドロゲルはクロスリンカーの濃度がもっと多いＣａｆ１ハイドロゲルよりも広がりが少ないことを意味する。
【０３３２】
比較すると、例えば、１対１０の架橋比でＤＴＳＳＰで架橋したＣａｆ１ハイドロゲルの径変化は、同じ架橋比を使用したＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１ハイドロゲル（４０．３％）および４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１ハイドロゲル（２４．２％）の両方の径変化よりも高い（６１．２％）（表６）。この理論に限定されることなく、この結果は、ハイドロゲル膨潤は、以前の研究と一致しているクロスリンカーの網目構造の関数であることを示している可能性がある。
【０３３３】
９．３  ４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１ハイドロゲルはさらに高度な架橋を示す（図６８）
室温で３０分間のＣａｆ１ハイドロゲル架橋後、１０μｌのそれぞれのハイドロゲルはもちろんＣａｆ１ハイドロゲルの形成のために使用したのと同じ濃度でクロスリンカーのない対照Ｃａｆ１タンパク質をＳＤＳ試料バッファーの存在下、１００℃で５分間加熱し、４〜２０％勾配ゲル上に負荷した。ゲルはクーマシーブリリアントブルーで染色し、ＩｍａｇｅＪバージョン１．４６ソフトウェアによりスキャンし分析した。非架橋Ｃａｆ１試料中のＣａｆ１モノマー（対照）に対応するおよそ１５ｋＤａのバンドはそれに続く分析のための基準として使用した。様々な濃度の異なるクロスリンカーで架橋したＣａｆ１試料中のＣａｆ１モノマーバンドの相対密度を決定した。試料ごとに得られた値と基準試料について得られた値間の比により、計算するバンドごとの相対密度の決定が可能であった。モノマーを使用する計算は、Ｃａｆ１モノマーに対応する約１５ｋＤａの単一バンドが存在するため、ダイマー、トリマー、等の相対量を使用するよりも正確であった。高分子量バンドについての相対密度の計算のほうが複雑だったからである。これらは単一バンドと見なし、「Ｃａｆ１架橋画分」と呼んだ。
【０３３４】
ゲルの低部では、およそ１５ｋＤａのバンドは架橋していないＣａｆ１のモノマーに相当するはずである。ＤＴＳＳＰで架橋したＣａｆ１の場合、２５と３７ｋＤａタンパク質標準マーカーの間で分離しているバンドは１分子のＤＴＳＳＰ（６０８．５１Ｄａ）により連結されたＣａｆ１ダイマー（３５ｋＤａ）に相当する可能性がある（レーン１〜４）。ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１の場合、およそ３７ｋＤａタンパク質標準マーカーのバンドは１分子のＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（１０ｋＤａ）により連結されたＣａｆ１ダイマーに相当する可能性がある（レーン５〜８）。４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋しているＣａｆ１は、１分子の４アームＰＥＧ−ＮＨＳ（２０ｋＤａ）により連結されたＣａｆ１ダイマー（３５ｋＤａ）に相当する可能性がある５０と７５ｋＤａタンパク質標準マーカー間で分離している第二のバンドを提示する（レーン９〜１２）。残りの高分子量バンドはＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル分析だけでそれを定義するのは可能ではない。異なるクロスリンカーを使用する架橋比を増加させると、Ｃａｆ１モノマー画分は減少した。Ｃａｆ１とクロスリンカーにより形成される複合体の質量を決定するもっと正確な技法は質量分析である可能性があるが、モノマーに付着しているクロスリンカーの変化するレベルではこれは困難になると考えられる。
【０３３５】
架橋画分についての理論値は、Ｃａｆ１基準から分析したそれぞれの試料のＣａｆ１非架橋画分の値を引くことにより計算した。クロスリンカーの濃度が増加するに従って、Ｃａｆ１架橋画分も増加した。最も高濃度の４アームＰＥＧ−ＮＨＳ（２００００Ｄａ）の場合、高分子量のＣａｆ１架橋画分では、４アームＰＥＧ−ＮＨＳは勾配ゲルを完全に通過できず、したがって計算したＣａｆ１架橋画分についての値（０．２８）は計算した理論値（０．８４）よりも高かった。
【０３３６】
９．４  ＤＴＳＳＰで架橋したＣａｆ１ハイドロゲルは高度に緻密な構造を明らかにしたが、ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳおよび４アームＰＥＧ−ＮＨＳは多孔性のスキャフォールドを形成した。高濃度の４アームＰＥＧ−ＮＨＳはさらに緻密な構造を生じた（図６９〜７１）
ＤＴＳＳＰなどの短アーム長クロスリンカー（１２．０Å）で架橋したＣａｆ１ポリマーはＣａｆ１線維間のさらに密接な接触を促進し、Ｃａｆ１自己集合の可能性を増大する。したがって、ＴＥＭにより得られた画像は、このＣａｆ１線維近接を反映する緻密なＣａｆ１ハイドロゲルを明らかにした（図６９−Ａ）。
【０３３７】
長スペーサーＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（１９７Å）で架橋したＣａｆ１ポリマーについては異なる結果が得られ、このポリマーはＣａｆ１線維をもっとよく分離させることができる。大きなＣａｆ１ハイドロゲルメッシュがＴＥＭにより観察された（図６９−Ｂ）。
【０３３８】
４つのアームがそれぞれ官能基（ＮＨＳ）を含有するはるかに長いスペーサー（３９４Å）を使用すると、反応に利用可能なＣａｆ１上のＮＨＳ基とリジン残基の数のせいでＣａｆ１と４アームＰＥＧ−ＮＨＳの間の相互作用は頻繁であった。その構造はＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ上の構造よりも凝縮していた（図６９−Ｃ）。ＴＥＭ観察により、ハイドロゲルメッシュ（ハイドロゲルの小片）が明らかにされた。この理論に限定されることなく、これは（１）ＴＥＭ分析のためのハイドロゲルの調製、（２）Ｃａｆ１ポリマー長の違い、（３）Ｃａｆ１とクロスリンカー反応により得られる架橋部位の数に起因する可能性がある（図６９）。おそらく、ハイドロゲルの大きなメッシュは、Ｃａｆ１ポリマーとクロスリンカーの間に形成される化学的相互作用の高安定性の結果である。ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１ハイドロゲルは、もっと多くの架橋部位を有するもっと硬い網目を形成する４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１ハイドロゲルよりもわずかに安定し柔軟性があるように思われる。
【０３３９】
４アームＰＥＧ−ＮＨＳは、それがゲル様網目を形成するという事実により、さらに特徴付けられた。
【０３４０】
Ｃａｆ１ハイドロゲルはＳｏｌｉａｋｏｖとその同僚たち（１０）が見たおよそ最大１．５μｍ長のポリマー形態のＣａｆ１のみを用いて得られ、このポリマーは８リジンを含有する多くのモノマーで構成されており、それぞれのモノマーがクロスリンカー末端に提示されるＮＨＳ官能基と相互作用することができる。Ｃａｆ１モノマー形態では、もう一方の対照、４アームＰＥＧ−ＮＨＳのみの場合と同じくこの大きな網目は見られなかった（図７０）。円で示されている小点はＣａｆ１モノマーとしてＳｏｌｉａｋｏｖとその同僚たち（１０）が分析したビーズ様構造に一致している可能性がある。
【０３４１】
この理論に限定されずに、高度に多孔性のハイドロゲル（図７１）は膨潤および水分取込みに有利である可能性があり、細胞培養のためのスキャフォールドとしてもポアを通る栄養分、酸素の通過が可能になる。ＴＥＭ画像では、Ｃａｆ１ハイドロゲルの形成はクロスリンカー濃度と構造に依存していることが確かめられた。
【０３４２】
９．５  Ｃａｆ１ハイドロゲルは使用する技法に応じて変化するポア径を示した（図７３および７４）
Ｃａｆ１ハイドロゲルのポア径はＳＥＭおよびＥＳＥＭにより評価した。ＳＥＭにより分析した試料は臨界点乾燥により調製し、網目のある程度の崩壊を引き起こすことがある差次的エタノール濃度を使用して脱水した。得られたポア径はナノメーターの桁であり、凍結乾燥ハイドロゲルは平均ポア径が８±０．００３μｍであるもっと大きなポアを提示した（図７３に見ることができる）。
【０３４３】
次に、Ｃａｆ１ハイドロゲルは脱水過程を回避するためにＥＳＥＭにより分析した。画像は、平均ポア径が３００ｎｍであるメッシュ様網目を明らかにした（図７４に見ることができる）。
【０３４４】
９．６  Ｃａｆ１  ＷＴハイドロゲルは細胞に非毒性であるが、低い細胞接着を促進する
細胞ハイドロゲル相互作用は、細胞生存率を測定し４アームＰＥＧ−ＮＨＳで架橋したＣａｆ１ハイドロゲル（ｗ／ｗ  １対２の架橋比）で被覆したガラスカバーグラス表面上に広げることにより調べた。Ｃａｆ１ハイドロゲル上に播種した生存可能な初代骨芽細胞はほとんど細長い拡張を示さず、細胞の大半は丸い形状をしていた。マウス３Ｔ３線維芽細胞は生存率について試験しなかった。にもかかわらず、Ｃａｆ１ハイドロゲル上に播種した場合にはより多くの線維芽細胞が細長い形態を示すことが見て取れた。細胞接着および延展は細胞接着性ペプチド（例えば、ＲＧＤＳ）を添加しメタロプロテイナーゼ切断部位などのタンパク質分解部位も組み込むことにより改善することができた。
【０３４５】
本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通じて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」およびこれらの用語の変形は「含むが限定されない」を意味し、これらの用語は他の部分、添加物、成分、整数またはステップを排除する目的ではなく（排除していない）。本明細書の説明および特許請求の範囲全体を通じて、単数形は、文脈が別段に要求しなければ、複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用されている場合、本明細書は、文脈が別段に要求しなければ、単数だけではなく複数も想定していると理解されるべきである。
【０３４６】
本発明の特定の態様、実施形態または実施例と共に記載される特長、整数、特徴、化合物、化学的部分または基は、本明細書に記載される他のどの態様、実施形態または実施例にも、それと不適合でなければ、適用可能であると理解されるべきである。本明細書（添付されているいかなる特許請求の範囲、要約および図も含む）に開示されている特長のすべて、および／またはそのように開示されているいかなる方法もしくは過程のステップのすべて、そのような特長および／またはステップの少なくとも一部が相互排他的である組合せを除いて、いかなる組合せでも組み合わせることができる。本発明は前述のいずれの実施形態の詳細にも制限されてはいない。本発明は、本明細書（添付されているいかなる特許請求の範囲、要約および図も含む）に開示されている特長のいかなる新規の特長、もしくはいかなる新規の組合せにも、またはそのように開示されているいかなる方法もしくは過程のステップのいかなる新規のステップ、もしくはいかなる新規の組合せにも拡張する。
【０３４７】
読者の関心は、本出願に関連する本明細書と同時にまたはに先んじて提出されており、本明細書に関する公衆縦覧に開かれているすべての論文および文書に向けられており、そのような論文および文書すべての内容は参照により本明細書の一部をなすものとする。
【０３４８】
［参考文献］
【表１０Ａ】
2015522566.tif 000013
【表１０Ｂ】
2015522566.tif 000014
【表１０Ｃ】
2015522566.tif 000015
【０３４９】
本発明のさらなる実施形態は以下の番号付パラグラフに記載されている。
パラグラフ１．外因性生理活性配列を含むシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマー。
【０３５０】
パラグラフ２．ＦＧループ長ファミリーポリペプチドモノマーである、パラグラフ１に記載のポリペプチド。
【０３５１】
パラグラフ３．Ｃａｆ１、Ｓａｆ１およびＡｆａ／Ｄｒからなる群から選択される、パラグラフ２に記載のポリペプチド。
【０３５２】
パラグラフ４．Ｃａｆ１ポリペプチドである、パラグラフ３に記載のポリペプチド。
【０３５３】
パラグラフ５．配列番号５のポリペプチドと少なくとも７０％同一である、パラグラフ４に記載のポリペプチド。あるいは、前記ポリペプチドは最初の２１アミノ酸残基を欠く配列番号５のポリペプチドと少なくとも７０％同一である。
【０３５４】
パラグラフ６．ＦＧループ短ファミリーポリペプチドモノマーである、パラグラフ１に記載のポリペプチド。
【０３５５】
パラグラフ７．ＦｉｍおよびＰａｐからなる群から選択される、パラグラフ６に記載のポリペプチド。
【０３５６】
パラグラフ８．前記生理活性配列が、細胞接着認識モチーフ、増殖因子配列モチーフおよびプロテアーゼ部位からなる群から選択される、パラグラフ１から７のうちのいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０３５７】
パラグラフ９．前記生理活性配列が細胞接着認識モチーフである、パラグラフ８に記載のポリペプチド。
【０３５８】
パラグラフ１０．前記細胞接着認識モチーフが細胞外マトリックス細胞接着認識モチーフである、パラグラフ９に記載のポリペプチド。
【０３５９】
パラグラフ１１．前記細胞接着認識モチーフが、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、オステオポンチン、ビトロネクチンまたはテネイシン由来である、パラグラフ１０に記載のポリペプチド。
【０３６０】
パラグラフ１２．前記細胞接着認識モチーフがアミノ酸配列ＲＧＤを含む、パラグラフ１１に記載のポリペプチド。
【０３６１】
パラグラフ１３．前記細胞接着認識モチーフがアミノ酸配列ＰＨＳＲＮを含む、パラグラフ１１に記載のポリペプチド。
【０３６２】
パラグラフ１４．前記生理活性配列が、前記ポリペプチドがフォールディングされるとループ構造内に含まれる部位において前記ポリペプチド内に含まれる、パラグラフ１から１３のうちのいずれか１つに記載のポリペプチド。
【０３６３】
パラグラフ１５．パラグラフ１から１４のうちのいずれか１つに記載の少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含む、シャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【０３６４】
パラグラフ１６．前記ポリマーが画分１抗原ポリマーであり、前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーがＣＡＦ１ポリペプチドモノマーである、パラグラフ１５に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【０３６５】
パラグラフ１７．前記外因性生理活性配列がアミノ酸配列ＲＧＤを含む細胞接着認識モチーフである、パラグラフ１５またはパラグラフ１６に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【０３６６】
パラグラフ１８．少なくとも１つの天然に存在するＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをさらに含む、パラグラフ１５から１７のうちのいずれか１つに記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【０３６７】
パラグラフ１９．前記少なくとも１つの天然に存在するＣＡＦ１ポリペプチドモノマーがペスト菌ＣＡＦ１ポリペプチドである、パラグラフ１８に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【０３６８】
パラグラフ２０．前記ペスト菌ＣＡＦ１ポリペプチドが配列番号５のポリペプチド配列を有する、パラグラフ１９に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。あるいは、前記ペスト菌ＣＡＦ１ポリペプチドは最初の２１アミノ酸残基を欠く配列番号５のポリペプチド配列を有する。
【０３６９】
パラグラフ２１．パラグラフ１から１４のうちのいずれか１つに記載の少なくとも１つのさらなるポリペプチドモノマーをさらに含み、前記少なくとも１つのさらなるポリペプチドモノマーの前記外因性生理活性配列が、前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの前記外因性生理活性配列とは明確に異なる、パラグラフ１５から２０のうちのいずれか１つに記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【０３７０】
パラグラフ２２．前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーの前記外因性生理活性配列が、アミノ酸配列ＲＧＤを含む細胞接着認識モチーフであり、前記少なくとも１つのさらなるポリペプチドモノマーの前記外因性生理活性配列が、アミノ酸配列ＰＨＳＲＮを含む細胞接着認識モチーフである、パラグラフ２１に記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【０３７１】
パラグラフ２３．パラグラフ１から１４のいずれか１つに記載のポリペプチドを含むハイドロゲルまたはパラグラフ１５から２２のいずれか１つに記載のシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【０３７２】
パラグラフ２４．架橋剤をさらに含む、パラグラフ２３に記載のハイドロゲル。
【０３７３】
パラグラフ２５．前記架橋剤が生分解性架橋剤である、パラグラフ２４に記載のハイドロゲル。
【０３７４】
パラグラフ２６．前記架橋剤が非分解性架橋剤である、パラグラフ２４に記載のハイドロゲル。
【０３７５】
パラグラフ２７．前記架橋剤がポリエチレングリコールを含む、パラグラフ２４に記載のハイドロゲル。
【０３７６】
パラグラフ２８．細胞支持スキャフォールドとしてのパラグラフ２４から２７のいずれか１つに記載のハイドロゲルの使用。
【０３７７】
パラグラフ２９．前記スキャフォールドが二次元細胞支持スキャフォールドである、パラグラフ２８に記載の使用。あるいは、前記スキャフォールドは一次元細胞支持スキャフォールドである。
【０３７８】
パラグラフ３０．前記スキャフォールドが三次元細胞支持スキャフォールドである、パラグラフ２８に記載の使用。
【０３７９】
パラグラフ３１．パラグラフ２３から２７のいずれか１つに記載のハイドロゲルを含む創傷ドレッシング。
【０３８０】
パラグラフ３２．創傷の処置において使用するためのパラグラフ２３から２７のいずれか１つに記載のハイドロゲル。
【０３８１】
パラグラフ３３．前記創傷が慢性創傷であるまたは前記創傷が急性創傷である、パラグラフ３２に記載の使用のためのハイドロゲル。
【０３８２】
パラグラフ３４．パラグラフ２３から２７のいずれか１つに記載のハイドロゲルを含む眼移植片。
【０３８３】
パラグラフ３５．眼損傷の処置において使用するためのパラグラフ２３から２７のいずれか１つに記載のハイドロゲル。
【０３８４】
パラグラフ３６．シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを産生するための発現ベクターであって、
ａ）転写プロモーターエレメント
ｂ）外因性生理活性配列を含むシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子、および
ｃ）転写終結因子
が作動可能に連結されたエレメントを含む発現ベクター。
【０３８５】
パラグラフ３７．外因性生理活性配列を含むシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする前記核酸分子がＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする、パラグラフ３６に記載の発現ベクター。
【０３８６】
パラグラフ３８．前記外因性生理活性配列が細胞接着認識モチーフである、パラグラフ３７に記載の発現ベクター。
【０３８７】
パラグラフ３９．前記核酸分子が配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、パラグラフ３７またはパラグラフ３８に記載の発現ベクター。
【０３８８】
パラグラフ４０．シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子をさらに含む、パラグラフ３６から３９のいずれか１つに記載の発現ベクター。
【０３８９】
パラグラフ４１．シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子が、ＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする、パラグラフ４０に記載の発現ベクター。
【０３９０】
パラグラフ４２．ＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子が、配列番号２のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、パラグラフ４１に記載の発現ベクター。
【０３９１】
パラグラフ４３．シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子をさらに含む、パラグラフ３６から４２のいずれか１つに記載の発現ベクター。
【０３９２】
パラグラフ４４．シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子が、ＣＡＦ１に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする、パラグラフ４３に記載の発現ベクター。
【０３９３】
パラグラフ４５．ＣＡＦ１に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子が、配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、パラグラフ４４に記載の発現ベクター。
【０３９４】
パラグラフ４６．シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子タンパク質をコードする核酸分子をさらに含む、パラグラフ３６から４５のいずれか１つに記載の発現ベクター。
【０３９５】
パラグラフ４７．シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子タンパク質をコードする前記核酸分子が、ＣＡＦ１に特異的な発現調節因子タンパク質をコードする、パラグラフ４６に記載の発現ベクター。
【０３９６】
パラグラフ４８．ＣＡＦ１に特異的な発現調節因子タンパク質をコードする前記核酸分子が、配列番号４のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、パラグラフ４７に記載の発現ベクター。
【０３９７】
パラグラフ４９．パラグラフ３６から４８のいずれか１つに記載の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。
【０３９８】
パラグラフ５０．前記細胞が細菌細胞である、パラグラフ４９に記載の宿主細胞。
【０３９９】
パラグラフ５１．前記細菌細胞がグラム陰性細菌細胞である、パラグラフ５０に記載の宿主細胞。
【０４００】
パラグラフ５２．前記細菌細胞が大腸菌である、パラグラフ５１に記載の宿主細胞。
【０４０１】
パラグラフ５３．外因性生理活性配列を含む少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含むシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを産生するための方法であって、
ｉ）外因性生理活性配列を含むシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーをコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ｉｉ）宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするステップと
を含み、
前記宿主細胞にシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子とシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子とを与え、こうして得られたトランスフェクト宿主細胞がシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを産生する
方法。
【０４０２】
パラグラフ５４．前記シャペロン／アッシャーファミリーポリマーが画分１抗原ポリマーであり、外因性生理活性配列を含む前記少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーがＣＡＦ１ポリペプチドモノマーである、パラグラフ５３に記載の方法。
【０４０３】
パラグラフ５５．外因性生理活性配列を含むＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする前記核酸分子が配列番号１のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、パラグラフ５４に記載の方法。
【０４０４】
パラグラフ５６．シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子はＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードし、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子はＣＡＦ１に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする、パラグラフ５４またはパラグラフ５５に記載の方法。
【０４０５】
パラグラフ５７．ＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする前記核酸分子が配列番号２のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、パラグラフ５６に記載の方法。
【０４０６】
パラグラフ５８．ＣＡＦ１に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする前記核酸分子が配列番号３のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、パラグラフ５６またはパラグラフ５７に記載の方法。
【０４０７】
パラグラフ５９．前記宿主細胞に
ｉ）ＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ｉｉ）宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするステップと
によりＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子を与える、パラグラフ５６から５８のいずれか１つに記載の方法。
【０４０８】
パラグラフ６０．前記発現ベクターが、細胞接着認識モチーフを含むＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする核酸分子をさらに含む、パラグラフ５９に記載の方法。
【０４０９】
パラグラフ６１．前記宿主細胞に
ｉ）ＣＡＦ１に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるための発現ベクターに組み込むステップと、
ｉｉ）宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクトするステップと
によりＣＡＦ１に特異的な外膜アッシャータンパク質をコードする核酸分子を与える、パラグラフ５６から６０のいずれか１つに記載の方法。
【０４１０】
パラグラフ６２．前記発現ベクターが、細胞接着認識モチーフを含むＣＡＦ１ポリペプチドモノマーをコードする核酸分子および／またはＣＡＦ１に特異的なペリプラズムシャペロンをコードする核酸分子をさらに含む、パラグラフ６１に記載の方法。
【０４１１】
パラグラフ６３．前記宿主細胞に、シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子をコードする核酸分子をさらに与える、パラグラフ５３から６２に記載の方法。
【０４１２】
パラグラフ６４．シャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーに特異的な発現調節因子をコードする前記核酸分子がＣＡＦ１に特異的な発現調節因子をコードする、パラグラフ６３に記載の方法。
【０４１３】
パラグラフ６５．ＣＡＦ１に特異的な発現調節因子をコードする前記核酸分子が配列番号４のヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％の同一性を有する、パラグラフ６３またはパラグラフ６４に記載の方法。
【０４１４】
パラグラフ６６．前記生理活性配列が細胞接着認識モチーフである、パラグラフ５３から６５のいずれか１つに記載の方法。
【０４１５】
パラグラフ６７．前記宿主細胞が細菌細胞である、パラグラフ５３から６６のいずれか１つに記載の方法。
【０４１６】
パラグラフ６８．前記細菌細胞がグラム陰性細菌細胞である、パラグラフ６７に記載の方法。
【０４１７】
パラグラフ６９．前記細菌細胞が大腸菌である、パラグラフ６８に記載の方法。
【０４１８】
パラグラフ７０．外因性生理活性配列を含む少なくとも１つのシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマーを含むシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを産生するための方法であって、
ｉ）パラグラフ４９から５２のいずれか１つに記載の宿主細胞を含む容器を提供するステップと、
ｉｉ）容器に含有される細胞培養物によるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマー発現を促進する細胞培養条件を提供するステップと、任意選択により
ｉｉｉ）容器からシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを収集するステップとを含む方法。
【０４１９】
パラグラフ７１．防汚剤としての画分１抗原ポリマーの使用。
【０４２０】
パラグラフ７２．画分１抗原ポリマーを含む防汚組成物。
【０４２１】
パラグラフ７３．添付図面を参照して本明細書に記載されるシャペロン／アッシャーファミリーポリペプチドモノマー。
【０４２２】
パラグラフ７４．添付図面を参照して本明細書に記載されるシャペロン／アッシャーファミリーポリマー。
【０４２３】
パラグラフ７５．添付図面を参照して本明細書に記載されるハイドロゲル。
【０４２４】
パラグラフ７６．添付図面を参照して本明細書に記載される創傷ドレッシング。
【０４２５】
パラグラフ７７．添付図面を参照して本明細書に記載される創傷ドレッシング。
【０４２６】
パラグラフ７８．添付図面を参照して本明細書に記載される眼移植片。
【０４２７】
パラグラフ７９．添付図面を参照して本明細書に記載される発現ベクター。
【０４２８】
パラグラフ８０．添付図面を参照して本明細書に記載される形質転換された宿主細胞。
【０４２９】
パラグラフ８１．添付図面を参照して本明細書に記載されるシャペロン／アッシャーファミリーポリマーを産生するための方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
2015522566.tif 000018
【図４】
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【図５】
2015522566.tif 000020
【図６】
2015522566.tif 000021
【図７】
2015522566.tif 000022
【図８】
2015522566.tif 000023
【図９】
2015522566.tif 000024
【図１０】
2015522566.tif 000025
【図１１】
2015522566.tif 000026
【図１２】
2015522566.tif 000027
【図１３】
2015522566.tif 000028
【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
2015522566.tif 000030
【図１５】
2015522566.tif 000031
【図１６】
2015522566.tif 000032
【図１７】
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【図１８】
2015522566.tif 000034
【図１９】
2015522566.tif 000035
【図２０】
2015522566.tif 000036
【図２１】
2015522566.tif 000037
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
2015522566.tif 000040
【図２５】
2015522566.tif 000041
【図２６】
2015522566.tif 000042
【図２７】
2015522566.tif 000043
【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
2015522566.tif 000045
【図２９】
2015522566.tif 000046
【図３０】
2015522566.tif 000047
【図３１】
2015522566.tif 000048
【図３２】
2015522566.tif 000049
【図３３】
2015522566.tif 000050
【図３４】
2015522566.tif 000051
【図３５】
2015522566.tif 000052
【図３６】
2015522566.tif 000053
【図３７】
2015522566.tif 000054
【図３８】
2015522566.tif 000055
【図３９】
2015522566.tif 000056
【図４０】
2015522566.tif 000057
【図４１】
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【図４２Ａ】
2015522566.tif 000059
【図４２Ｂ】
2015522566.tif 000060
【図４３Ａ】
2015522566.tif 000061
【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
2015522566.tif 000063
【図４４Ｂ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
2015522566.tif 000070
【図５０】
2015522566.tif 000071
【図５１】
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【図５２】
2015522566.tif 000073
【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
2015522566.tif 000081
【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
2015522566.tif 000086
【図６６】
2015522566.tif 000087
【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
2015522566.tif 000091
【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【国際調査報告】
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