(57)【要約】本発明は、対象の末梢血から単離されたＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団を用いた虚血状態および疾患の処置の分野に関する。本発明は、（ｉ）ＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団と、（ｉｉ）血漿タンパク質と、（ｉｉｉ）少なくとも１つの塩を含む等張液とを含む薬学的組成物を提供し、該等張液は、酢酸塩、グルコン酸塩、または酢酸塩およびグルコン酸塩の双方を含む。本明細書では、対象における虚血により損傷された組織を処置する方法、および本発明の薬学的組成物が投与される医学的状態を処置する方法がさらに提供される。本明細書では、骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋細胞の動員を促進する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団と、（ｉｉ）血漿タンパク質と、（ｉｉｉ）少なくとも１つの塩を含む等張液とを含み、前記等張液が、酢酸塩、グルコン酸塩、または酢酸塩およびグルコン酸塩の双方を含む、薬学的組成物。
【請求項２】
前記細胞集団が、不均一な細胞集団であり、前記細胞集団の前記細胞の少なくとも１％が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記細胞集団の前記細胞の少なくとも１０％が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項２に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記細胞集団の前記細胞の少なくとも２５％が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項３に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
前記細胞集団の前記細胞の少なくとも５０％が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項４に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記細胞集団の前記細胞の少なくとも７５％が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項５に記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記細胞集団の前記細胞の少なくとも７０％が、生細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記細胞集団が、ＣＸＣＲ４、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＦＬＫ−１、（ＶＥＧＦＲ−１）、Ｔｉｅ−２、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、ＣＤ１３３、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＤ６１、ＣＤ１４１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４４、ＣＤ７３、ＣＤ９９、ＣＤ２９、およびＣＤ９０からなる群から選択される細胞表面マーカーのうちの１つ以上を発現する細胞のサブセットを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記薬学的組成物を１〜３０℃の温度で約３〜約５日間貯蔵した後、ケモカイン勾配移動アッセイにより試験されたとき、細胞の少なくとも１％が、負の対照の移動指数よりも大きい移動指数を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記薬学的組成物を１〜３０℃の温度で約３〜約５日間貯蔵した後、ケモカイン勾配移動アッセイにより試験されるとき、細胞の少なくとも５％が、負の対照の移動指数よりも大きい移動指数を有する、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記薬学的組成物を１〜３０℃の温度で約３〜約５日間貯蔵した後、ケモカイン勾配移動アッセイにより試験されるとき、細胞の少なくとも１５％が、負の対照の移動指数よりも大きい移動指数を有する、請求項９に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記ＣＤ３４＋細胞が、ヒトから単離されたＣＤ３４＋細胞であり、任意に、前記ＣＤ３４＋細胞が、前記ヒトの末梢血から単離されたＣＤ３４＋細胞である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
ＣＤ３４＋細胞が単離される前に、前記ヒトが、前記ヒトの骨髄から前記末梢血へのＣＤ３４＋細胞の動員を促進するように、サイトカインで処置された、請求項１２に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記薬学的組成物の前記ＣＤ３４＋細胞が、前記ヒトから単離された新たに単離されたＣＤ３４＋細胞であり、任意に、前記薬学的組成物の前記ＣＤ３４＋細胞が、７日を超えない、を超えない、または５日を超えない期間、前記ヒトの体外に存在している、請求項１２または１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記薬学的組成物の前記ＣＤ３４＋細胞が、３日を超えないまたは２日を超えない期間、前記血漿タンパク質および前記等張液で製剤化された、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記薬学的組成物の前記血漿タンパク質（複数可）に起因する総タンパク質濃度が、６０ｇ／Ｌ未満である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
５個を超えない異なる血漿タンパク質を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
３個を超えない異なる血漿タンパク質を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
２個を超えない異なる血漿タンパク質を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
１個を超えない血漿タンパク質を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
アルブミンを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む、請求項２１に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
少なくとも、または約０．５ｗ／ｖ％のＨＳＡを含む、請求項２２に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
約１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％のＨＳＡを含む、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２５】
約３ｗ／ｖ％〜約７ｗ／ｖ％のＨＳＡを含む、請求項２３に記載の薬学的組成物。
【請求項２６】
血漿または血清を含み、任意に、前記血漿または血清が、ヒト血漿またはヒト血清であり、任意に、前記ヒト血漿またはヒト血清が、前記ＣＤ３４＋細胞が単離されたヒトから得られる、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項２７】
前記血漿または血清が、２０ｖ／ｖ％未満の濃度で前記薬学的組成物中に存在する、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
前記血漿または血清が、１０ｖ／ｖ％未満の濃度で、任意に、約３ｖ／ｖ％〜約７ｖ／ｖ％の範囲内で前記薬学的組成物中に存在する、請求項２７に記載の薬学的組成物。
【請求項２９】
前記血漿または血清が、約５ｖ／ｖ％の濃度で前記薬学的組成物中に存在する、請求項２８に記載の薬学的組成物。
【請求項３０】
前記等張液が、約１００ｍＥｑ〜約１８０ｍＥｑのナトリウムを含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３１】
前記等張液が、約１ｍＥｑ〜約９ｍＥｑのカリウムを含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３２】
前記等張液が、約０．５ｍＥｑ〜約５．５ｍＥｑのマグネシウムを含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３３】
前記等張液が、約７０ｍＥｑ〜約１２０ｍＥｑの塩化物を含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３４】
前記等張液が、約１０ｍＥｑ〜約４０ｍＥｑの酢酸塩を含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３５】
前記等張液が、約１０ｍＥｑ〜約４０ｍＥｑのグルコン酸塩を含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３６】
前記等張液が、カルシウムを含まない、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３７】
血漿または血清を含み、前記薬学的組成物中の唯一のカルシウム源が、前記血漿または血清中に存在する前記カルシウムである、請求項２６〜３６に記載の薬学的組成物。
【請求項３８】
前記等張液が、６．５〜約７．８のｐＨを有する、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項３９】
前記等張液が、約２４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜約３７５ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲内のオスモル濃度を有し、任意に、前記等張液の前記オスモル濃度が、約２４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜約３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲内である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項４０】
前記等張液が、電解質を含む、晶質静脈内輸液を含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項４１】
前記晶質静脈内輸液が、デキストロースおよび／または乳酸塩を含まない、請求項４０に記載の薬学的組成物。
【請求項４２】
前記等張液が生理食塩水ではない、請求項４０に記載の薬学的組成物。
【請求項４３】
前記等張液が、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）Ａ、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）１４８、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）５６、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ（登録商標）−Ｒ、Ｉｓｏｌｙｔｅ（登録商標）Ｐ、乳酸化リンガー溶液、リンガー溶液、および５％水中デキストロース（Ｄ５Ｗ）のうちのいずれか１つであるか、またはこれらのうちのいずれか１つと実質的に同一である、請求項４０に記載の薬学的組成物。
【請求項４４】
デキストロースを含まない、請求項１〜４３のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項４５】
静脈内投与のために製剤化される、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項４６】
再使用不可能な容器の中にパッケージングされる、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
【請求項４７】
前記再使用不可能な容器が、シリンジ、またはバイアル、または袋である、請求項４６に記載の薬学的組成物。
【請求項４８】
前記再使用不可能な容器が、前記薬学的組成物の単位用量を含む、請求項４６または４７に記載の薬学的組成物。
【請求項４９】
対象における虚血により損傷された組織を修復する方法であって、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の薬学的組成物を、前記対象における前記組織を修復するのに有効な量で前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５０】
前記組織が、心臓組織、大腸組織、小腸組織、脳組織、四肢組織、腎組織、または皮膚組織である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
処置を必要とする対象における医学的状態を処置する方法であって、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の薬学的組成物を、前記対象における前記医学的状態を処置するのに有効な量で前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５２】
前記医学的状態が、慢性心筋虚血、重症虚血肢、末梢動脈疾患、バージャー病、虚血性心疾患、虚血性大腸炎、腸間膜虚血、脳虚血（ｂｒａｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、脳虚血（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、急性虚血肢、または腎虚血である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記薬学的組成物の前記ＣＤ３４＋細胞が、前記対象に対して自家性である、請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＣＤ３４＋細胞が、前記薬学的組成物の投与の５日以内前に前記対象から単離された、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＣＤ３４＋細胞が前記対象から単離される前に、前記対象に、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が５０μｇ／ｋｇ未満の総投与量で投与された、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＣＤ３４＋細胞が前記対象から単離される直前の４日間、前記Ｇ−ＣＳＦが、約４．８μｇ／ｋｇ／日〜５．２μｇ／ｋｇ／日の用量で前記対象に投与された、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
対象における骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋細胞の動員を促進する方法であって、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を５０μｇ／ｋｇ未満の総投与量で前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５８】
Ｇ−ＣＳＦを約４０μｇ／ｋｇ以下の総投与量で前記対象に投与することを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
Ｇ−ＣＳＦを約３０μｇ／ｋｇ以下の総投与量で前記対象に投与することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
Ｇ−ＣＳＦを約２５μｇ／ｋｇ以下の総投与量で前記対象に投与することを含み、任意に、Ｇ−ＣＳＦを約２０μｇ／ｋｇ以下の総投与量で前記対象に投与することを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記Ｇ−ＣＳＦの総投与量が、７日間以内に投与される、請求項５７〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記Ｇ−ＣＳＦの総投与量が、５日間以内に投与される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６３】
前記Ｇ−ＣＳＦの総投与量が、４日間にわたって前記患者に投与される、請求項５７〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記Ｇ−ＣＳＦが、約２．５μｇ／ｋｇ／日〜約７．０μｇ／ｋｇ／日の用量で前記対象に投与される、請求項５７〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記Ｇ−ＣＳＦが、約４．０μｇ／ｋｇ／日〜６．０μｇ／ｋｇ／日の用量で前記対象に投与される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記Ｇ−ＣＳＦが、約４．８μｇ／ｋｇ／日〜５．２μｇ／ｋｇ／日の用量で５日間、前記対象に投与される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｇ−ＣＳＦが、約４．８μｇ／ｋｇ／日〜５．２μｇ／ｋｇ／日の用量で４日または５日を超えない期間、前記対象に投与される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
ＣＤ３４＋細胞を対象から得る方法であって、請求項５７〜６７のいずれか１項に記載の方法に従って前記対象における骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋細胞の動員を促進するステップと、ＣＤ３４＋細胞を前記対象の前記末梢血から回収するステップとを含む、方法。
【請求項６９】
前記回収ステップが、アフェレーシスを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記回収ステップ後に、ＣＤ３４＋細胞がＣＤ３４−細胞から分離されてＣＤ３４＋細胞の富化集団を提供する富化ステップをさらに含む、請求項６８または６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記富化ステップが、ＣＤ３４-特異的抗体、またはその抗原結合フラグメントの使用を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＣＤ３４＋細胞が、（ｉ）血漿タンパク質と、（ｉｉ）少なくとも１つの塩を含む等張液とを含む薬学的組成物に製剤化される、製剤ステップをさらに含み、任意に、前記等張液が、酢酸塩、グルコン酸塩、または酢酸塩およびグルコン酸塩の双方を含む、請求項６８〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
請求項７２に記載の方法により調製された薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年２月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／６０１，３２６号の利益を主張し、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、対象の末梢血から単離されたＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団を用いた虚血状態および疾患の処置の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
疾患の部位に幹細胞を投与することによって疾患を処置するために幹細胞を用いることが科学者および医師の目標でとなっており、そこでは幹細胞が組織を再生または修復することが望まれる。全ての哺乳類細胞は、それらを正常に機能させるために安定した酸素源を必要とする。それらの酸素へのアクセスが中断されるとき、細胞損傷および細胞死が即時に生じ得る。筋細胞およびニューロンを含むが、これらに限定されないある特定の細胞型は、特に、心筋梗塞および脳卒中に関連する虚血傷害を受け易い。虚血傷害を処置することにおける最近の進展に関わらず、脳卒中および心筋梗塞は、毎年膨大な数の人々を死亡させるか、または障害を与え続けている。したがって、組織傷害、特に脳卒中および心筋梗塞に伴う虚血傷害を処置する改善された方法が必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、投与を必要とする対象への投与に有用なＣＤ３４陽性（ＣＤ３４＋）細胞を含む薬学的組成物を提供する。例示の態様において、ＣＤ３４＋細胞は（例えば、限定されないが、多能性幹細胞、全能性幹細胞、または多分化能幹細胞である）幹細胞であるため、薬学的組成物は、対象における虚血により損傷された組織を修復する方法において、または慢性心筋虚血、重症虚血肢、末梢動脈疾患、バージャー病、虚血性心疾患、虚血性大腸炎、腸間膜虚血、脳虚血（ｂｒａｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、脳虚血（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、急性虚血肢、および腎虚血を含むが、これらに限定されない医学的状態を処置する方法において有用である。
【０００５】
本発明の薬学的組成物は、非凍結温度でのＣＤ３４＋細胞の短期貯蔵、ならびに対象への直接投与の双方に適している。薬学的組成物は、薬学的組成物中の生きた機能細胞の数がその薬学的組成物の投与前に生じる薬学的組成物の貯蔵および／または輸送の経過中に最大化されるように、ＣＤ３４＋細胞の安定した貯蔵環境を適切に提供する。例示の態様において、薬学的組成物は、１〜３０℃（例えば、限定されないが、２〜８℃）の温度で５日間未満（例えば、限定されないが、４日間、３日間、または２日間）のＣＤ３４＋細胞の貯蔵、および対象への直接投与に適している。
【０００６】
したがって、本発明の薬学的組成物は、貯蔵のための溶液および対象への投与のための溶液の２つの別個の溶液が必要となるのを避ける。したがって、ＣＤ３４＋細胞が貯蔵溶液から投与溶液（例えば、限定されないが、薬学的に許容される担体、賦形剤、または希釈剤）に移送される移送ステップは、本発明の薬学的組成物を調製するときに必要とされない。
【０００７】
例示の態様において、薬学的組成物は、（ｉ）ＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団と、（ｉｉ）血漿タンパク質と、（ｉｉｉ）少なくとも１つの塩を含む等張液とを含む。薬学的組成物は、静脈内投与のために任意に製剤化される。例示の態様において、薬学的組成物は、（ｉ）ＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団と、（ｉｉ）血漿タンパク質と、（ｉｉｉ）少なくとも１つの塩を含む等張液とを含み、当該等張液は、保存剤または安定化剤を含む。例示の態様において、薬学的組成物は、（ｉ）ＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団と、（ｉｉ）血漿タンパク質と、（ｉｉｉ）少なくとも１つの塩を含む等張液とを含み、当該等張液は、重炭酸前駆体を含む。例示の態様において、薬学的組成物は、（ｉ）ＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団と、（ｉｉ）血漿タンパク質と、（ｉｉｉ）少なくとも１つの塩を含む等張液とを含み、当該等張液は、酢酸塩、グルコン酸塩、または酢酸塩およびグルコン酸塩の双方を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、細胞集団は、その細胞集団の細胞の少なくとも１％（例えば、限定されないが、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）がＣＤ３４＋細胞である、不均一な細胞集団を含む。細胞集団の細胞は、任意に、ＣＸＣＲ４、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＦＬＫ−１（ＶＥＧＦＲ−１）、Ｔｉｅ−２およびＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、ＣＤ１３３、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＤ６１、ＣＤ１４１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４４、ＣＤ７３、ＣＤ９９、ＣＤ２９、およびＣＤ９０を含むが、これらに限定されない１つ以上の細胞マーカーも発現する。ある特定の態様において、細胞集団は、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ３４＋を共発現する細胞のサブセットを含む。例えば、いくつかの実施形態において、細胞集団中の細胞の少なくとも０．１％は、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ３４＋細胞である。少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、またはそれ以上のＣＸＣＲ４＋／ＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団も企図される。
【０００９】
薬学的組成物中の細胞集団は、任意に、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の生細胞を細胞集団中に含む。いくつかの実施形態において、細胞集団の細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上が、薬学的組成物中で約１時間〜約５日間の期間貯蔵した後の生細胞である。
【００１０】
ある特定の態様において、細胞集団中の細胞の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、またはそれ以上が、例えば、限定されないが、薬学的組成物を約１℃〜約３０℃の温度で約１時間〜約５日間貯蔵した後、ケモカイン勾配移動アッセイにより決定されるときに、対照の移動指数よりも大きい移動指数を有する。
【００１１】
薬学的組成物の等張液は、任意に、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、塩化物、酢酸塩、およびグルコン酸塩のうちの１つ以上を様々な濃度で含む。いくつかの実施形態において、等張液は、約１００ｍＥｑ〜約１８０ｍＥｑのナトリウムを含み、任意に、約１ｍＥｑ〜約９ｍＥｑのカリウム、約０．５ｍＥｑ〜約５．５ｍＥｑのマグネシウム、約７０ｍＥｑ〜約１２０ｍＥｑの塩化物、約１０ｍＥｑ〜約４０ｍＥｑの酢酸塩、および約１０ｍＥｑ〜約４０ｍＥｑのグルコン酸塩のうちの１つ以上をさらに含む。ある特定の態様において、等張液は、約６．５〜約７．８のｐＨ、および約２４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜約３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌのオスモル濃度を有する。例示の態様において、等張液はカルシウムを含まない。薬学的組成物は、任意に、デキストロースを含まない。
【００１２】
例示の態様において、薬学的組成物の血漿タンパク質（複数可）に起因する総タンパク質濃度は、ヒト血漿の総タンパク質濃度未満（例えば、限定されないが、６０ｇ／Ｌ未満）である。例示の態様において、薬学的組成物は、５個を超えない異なる血漿タンパク質を含む。例示の態様において、薬学的組成物は、１個を超えない血漿タンパク質を含む。ある特定の態様において、薬学的組成物の血漿タンパク質は、アルブミン（例えば、限定されないが、ヒト血清アルブミン）である。薬学的組成物は、いくつかの実施形態において、少なくとも、または約０．５ｗ／ｖ％の量のヒト血清アルブミンを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、約１ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％または約３％〜約７％の範囲の量のヒト血清アルブミンを含む。
【００１３】
例示の実施形態において、薬学的組成物は、血清または血漿を含み、薬学的組成物の血漿タンパク質（複数可）に起因する総タンパク質濃度は、６０ｇ／Ｌ未満である。いくつかの実施形態において、血清または血漿は、薬学的組成物中に２０ｖ／ｖ％未満の濃度で存在する。例示の態様において、薬学的組成物は、カルシウムを含まない等張液を含み、その薬学的組成物中の唯一のカルシウム源は、血漿または血清中に存在するカルシウムである。
【００１４】
ある特定の態様において、薬学的組成物は、静脈内投与のために製剤化される。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、シリンジ、バイアル、または袋等のすぐに使用できる容器および／または再使用不可能な容器の中にパッケージングされる。このすぐに使用できる容器および／または再使用不可能な容器は、任意に、本明細書に記載される薬学的組成物の単位用量を含む。
【００１５】
本明細書では、対象における虚血により損傷された組織を修復する方法も記載され、本明細書に記載される薬学的組成物を、対象における損傷した組織を修復するのに有効な量で対象に投与することを含む。処置を必要とする対象における医学的状態（心筋虚血、重症虚血肢、末梢動脈疾患、バージャー病、虚血性心疾患、虚血性大腸炎、腸間膜虚血、脳虚血（ｂｒａｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、脳虚血（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、または急性虚血肢を含むが、これらに限定されない）を処置する方法も提供される。例示の態様において、本明細書に記載される薬学的組成物を、医学的状態を処置するのに有効な量で対象に投与することを含む。
【００１６】
対象における骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋細胞の動員を促進する方法が提供される。そのような方法は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）を、５０μｇ／ｋｇ未満、約４０μｇ／ｋｇ以下、約３０μｇ／ｋｇ以下、または約２５μｇ／ｋｇ以下の総投与量で対象に投与することを含む。ある特定の実施形態において、Ｇ−ＣＳＦの総投与量は、７日間（例えば、限定されないが、７日間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間）以内に投与される。他の実施形態において、Ｇ−ＣＳＦの総投与量は、５日間以内に投与される。さらに他の実施形態において、Ｇ−ＣＳＦの総投与量は、約４日間にわたって投与される。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、ＣＤ３４＋細胞動員を促進するそのような方法は、処置のための後次の回収および投与に十分な数の末梢血中ＣＤ３４＋細胞をもたらすが、対象への疼痛および不快感の可能性を低減し、動員が生じる時間を減少させる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、Ｇ−ＣＳＦは、約２．５μｇ／ｋｇ／日〜約７．０μｇ／ｋｇ／日の用量で、または約４μｇ／ｋｇ／日〜６μｇ／ｋｇ／日の用量で対象に投与される。Ｇ−ＣＳＦは、任意に、４．８μｇ／ｋｇ／日〜５．２μｇ／ｋｇ／日の用量で５日間、対象に投与される。例示の態様において、Ｇ−ＣＳＦは、４．８μｇ／ｋｇ／日〜５．２μｇ／ｋｇ／日の用量で４日または５日を超えない間、対象に投与される。
【００１８】
ＣＤ３４＋細胞を対象から得る方法も提供される。そのような方法は、本明細書に記載されるように、対象における骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋細胞の動員を促進するステップと、動員されたＣＤ３４＋細胞を対象の末梢血から回収するステップとを含む。回収ステップは、任意にアフェレーシスを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、回収ステップ後に、ＣＤ３４＋細胞が、ＣＤ３４−陰性（ＣＤ３４−）細胞から分離され、ＣＤ３４＋細胞の富化集団を提供する、富化ステップをさらに含む。富化ステップは、任意に、ＣＤ３４特異的抗体またはその抗原結合フラグメントの使用を含む。いくつかの実施形態において、この方法は、本明細書に提供される教示に従い、ＣＤ３４＋細胞が、（ｉ）血漿タンパク質と、（ｉｉ）少なくとも１つの塩を含む等張液とを含む薬学的組成物に製剤化される、製剤ステップをさらに含む。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、血漿タンパク質と、少なくとも１つの塩を含有する等張液（例えば、限定されないが、酢酸塩、グルコン酸塩、または酢酸塩もしくはグルコン酸塩の双方を含む等張液）とを含む組成物は、ＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団に安定した環境を提供するという発見に部分的に基づいている。したがって、本明細書では、ＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団を含む組成物が提供される。以下の項は、本発明の薬学的組成物の例示の細胞集団を説明するために提供される。
【００２０】
細胞集団
一般的に言えば、細胞集団の細胞は、細胞表面マーカー表現型により特徴付けられ得る。例えば、細胞集団は、不均一な細胞集団として説明され得、この集団中の細胞のうちのある特定の割合（例えば、限定されないが、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％）が、共通の細胞表面マーカー表現型を有する。様々な態様において、表現型は、細胞マーカーの発現である。代替または追加の態様において、表現型は、細胞マーカーの発現の欠失である。
【００２１】
本発明に関して、細胞集団は、細胞表面マーカーであるＣＤ３４を発現する細胞を含むものである。換言すれば、本明細書に記載される細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞を含む。例示の実施形態において、本明細書に記載される細胞集団は、不均一な細胞集団であり、集団の細胞の全てがＣＤ３４を発現するわけではない。例示の実施形態において、細胞集団は、その細胞集団の細胞の少なくとも１％がＣＤ３４＋細胞である、不均一な細胞集団を含むか、または不均一な細胞集団である。例示の実施形態において、細胞集団は、その細胞集団の細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％がＣＤ３４＋細胞である、不均一な細胞集団を含むか、または不均一な細胞集団である。いくつかの実施形態において、細胞集団は、ＣＤ３４、ＣＸＣＲ４、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＦＬＫ−１（ＶＥＧＦＲ−１）、Ｔｉｅ−２、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、ＣＤ２７１、ＣＤ３１、ＣＤ１３３、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＤ６１、ＣＤ１４１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４４、ＣＤ７３、ＣＤ９９、ＣＤ２９、およびＣＤ９０からなる群から選択される１つ以上の共通の細胞マーカーを発現する、細胞のサブセットを含む。例示の態様において、上記細胞マーカーのうちの１つ以上を発現する細胞の亜集団は、ＣＤ３４も発現する。代替の態様において、上記細胞マーカーのうちの１つ以上を発現する細胞の亜集団は、ＣＤ３４を発現しない。
【００２２】
いくつかの実施形態において、不均一な細胞集団はＣＤ３４＋細胞のみを含むが、この集団はクローン集団ではなく、例えば、互いに遺伝的に区別できないものではない。例示の実施形態において、細胞集団の大部分は、１つ以上の共通の細胞マーカー（例えば、限定されないが、ＣＸＣＲ４、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＦＬＫ−１、（ＶＥＧＦＲ−１）、Ｔｉｅ−２、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、ＣＤ１３３、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＤ６１、ＣＤ１４１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４４、ＣＤ７３、ＣＤ９９、ＣＤ２９、および／またはＣＤ９０）を発現するが、１つ以上の他の細胞マーカーの発現レベルは、集団の細胞の間で異なる。例えば、細胞集団は、ＣＸＣＲ４を発現するＣＤ３４＋細胞、ならびにＣＸＣＲ４を発現しないＣＤ３４＋細胞を含み得る。
【００２３】
例示の態様において、細胞集団は、細胞集団の細胞が種々の程度にＣＤ３４を発現するため、不均一と考慮され得る。例示の態様において、細胞集団は、ＣＤ３４を弱く発現する細胞（すなわち、「ＣＤ３４  ｄｉｍ」細胞）に加えて、ＣＤ３４を強力に発現する細胞（すなわち、「ＣＤ３４  ｂｒｉｇｈｔ」細胞）を含み得る。
【００２４】
本明細書に記載される細胞集団は、いくつかの実施形態において、精製される。「精製された」という用語は、本明細書において使用される場合、元の組成物（すなわち、精製前の組成物）の他の成分から分離された結果として、純度が増加したことを意味する。いくつかの態様において、精製された細胞集団は、少なくとも約１０％以上の単一型の細胞を含む。いくつかの実施形態において、精製された細胞集団は、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約１００％の単一型の細胞を含む。代替または追加として、細胞集団は、「富化された」および／または「選択された」として記載され得る。いくつかの実施形態において、富化または選択は、元の細胞集団、すなわち、富化または選択前の細胞集団中の同一細胞の量または数と比較して、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍多い単一型の細胞である。「純度」、「富化」、および「選択」は、相対用語であり、必ずしも絶対純度または絶対富化または絶対選択と見なされないことが認識される。例示の態様において、純度は、少なくとも、もしくは約５０％、少なくとも、もしくは約６０％、少なくとも、もしくは約７０％、少なくとも、もしくは約８０％、または少なくとも、もしくは約９０％であるか（例えば、限定されないが、少なくとも、もしくは約９１％、少なくとも、もしくは約９２％、少なくとも、もしくは約９３％、少なくとも、もしくは約９４％、少なくとも、もしくは約９５％、少なくとも、もしくは約９６％、少なくとも、もしくは約９７％、少なくとも、もしくは約９８％、少なくとも、もしくは約９９％）、あるいは約１００％である。例示の態様において、富化または選択は、富化または選択前の元の集団に対して、少なくとも、もしくは約５０％、少なくとも、もしくは約６０％、少なくとも、もしくは約７０％、少なくとも、もしくは約８０％、または少なくとも、もしくは約９０％であるか（例えば、限定されないが、少なくとも、もしくは約９１％、少なくとも、もしくは約９２％、少なくとも、もしくは約９３％、少なくとも、もしくは約９４％、少なくとも、もしくは約９５％、少なくとも、もしくは約９６％、少なくとも、もしくは約９７％、少なくとも、もしくは約９８％、少なくとも、もしくは約９９％）、あるいは約１００％である。
【００２５】
例示の態様において、本発明の細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞の富化集団である。ＣＤ３４＋細胞を精製、富化、および／または選択するのに適した技法は、当該技術分野において既知であり、本明細書に記載される。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ／２０１１／０４１４７８号、および第ＷＯ／２０１０／０４５６４５号を参照されたい。いくつかの実施形態において、富化集団中のＣＤ３４＋の割合（％）は、選択または精製前の細胞集団中のＣＤ３４＋の割合（％）よりも約１．５〜約５倍多い。
【００２６】
例示の態様において、細胞集団は、細胞集団の細胞の少なくとも、もしくは約５０％、少なくとも、もしくは約６０％、少なくとも、もしくは約７０％、少なくとも、もしくは約８０％、または少なくとも、もしくは約９０％（例えば、限定されないが、少なくとも、もしくは約９１％、少なくとも、もしくは約９２％、少なくとも、もしくは約９３％、少なくとも、もしくは約９４％、少なくとも、もしくは約９５％、少なくとも、もしくは約９６％、少なくとも、もしくは約９７％、少なくとも、もしくは約９８％、少なくとも、もしくは約９９％）、あるいは約１００％がＣＤ３４＋細胞である程度に精製される。
【００２７】
例示の態様において、細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞を富化または選択するためのステップを経ており、ＣＤ３４＋細胞の富化または選択の程度は、富化または選択前の元の集団に対して、少なくとも、もしくは約５０％、少なくとも、もしくは約６０％、少なくとも、もしくは約７０％、少なくとも、もしくは約８０％、または少なくとも、もしくは約９０％であるか（例えば、限定されないが、少なくとも、もしくは約９１％、少なくとも、もしくは約９２％、少なくとも、もしくは約９３％、少なくとも、もしくは約９４％、少なくとも、もしくは約９５％、少なくとも、もしくは約９６％、少なくとも、もしくは約９７％、少なくとも、もしくは約９８％、少なくとも、もしくは約９９％）、あるいは約１００％である。
【００２８】
「富化」または「選択」の程度は、例示の態様において、収率％に関して特徴付けられてよく、［富化後の細胞集団中の細胞（例えば、限定されないが、ＣＤ３４＋細胞）の総数を、富化前の細胞集団中の細胞（例えば、限定されないが、ＣＤ３４＋細胞）の総数で割った数］に１００を掛けたものとして定義される。収率％の例示は、実施例２として本明細書に提供される。例示の態様において、「純度」の程度は、純度％を単位として特徴付けられてよい。純度％を決定するのに適した方法は、当該技術分野において既知であり、これも実施例２（例えば、限定されないが、表題「サブセット分析」の項）として本明細書に提供される。
【００２９】
いくつかの態様において、本発明の細胞集団は、残屑または死細胞が精製される。
【００３０】
いくつかの実施形態において、不均一な集団は、他の型の細胞、ＣＤ３４＋細胞以外の細胞を含む。いくつかの態様において、不均一な細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞に加えて、白血球（骨髄細胞系列またはリンパ系統の白血球）、赤血球、内皮細胞、循環内皮前駆体細胞、上皮細胞、腎細胞、肺細胞、骨細胞、骨髄細胞、ニューロン、および／または平滑筋細胞を含む。例示の態様において、不均一な集団は、ＣＤ３４＋細胞および他の細胞型を含むが、赤血球および／もしくは血小板を含まないか、または低レベルの赤血球および／もしくは血小板を有する。例えば、細胞集団の細胞の２％未満が、赤血球および／または血小板である。例示の態様において、不均一な集団は、ＣＤ３４＋細胞と、Ｂ細胞、Ｔ細胞、顆粒球、および単球のうちの１つ以上とを含み、赤血球および／または血小板を含まない。例示の態様において、不均一な集団は、主にＣＤ３４＋細胞と、ほんの少量のＢ細胞、Ｔ細胞、顆粒球、血小板、および単球のうちの１つ以上とを含む。例えば、例示の態様において、不均一な集団の７５％超は、ＣＤ３４＋細胞であり、不均一な集団の１５％未満は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、顆粒球、および単球のうちの１つ以上である。例示の態様において、不均一な集団の８５％超は、ＣＤ３４＋細胞であり、不均一な集団の１０％未満が、Ｂ細胞、Ｔ細胞、顆粒球、血小板、および単球のうちの１つ以上である。例示の態様において、不均一な集団の７５％、８５％、もしくは９５％超は、ＣＤ３４＋細胞であり、不均一な集団の約４％以下がＢ細胞であり、不均一な集団の約２％以下がＴ細胞であり、不均一な集団の約１％が単球であり、不均一な集団の約２％以下が顆粒球および／もしくはマクロファージであり、ならびに／または不均一な集団の約５％以下が血小板である。
【００３１】
Ａ．富化または選択された細胞集団
例示の態様において、薬学的組成物の細胞集団は、ドナーから単離された後、ＣＤ３４＋細胞のために精製、富化、または選択された細胞集団である。以下の論考は、そのように単離された集団を、ＣＤ３４＋細胞のために精製、富化、または選択するステップを例示する。
【００３２】
例示の態様において、ＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団は、ドナーから単離されたものである。例示のドナーが以下に記載される。例示の態様において、薬学的組成物の細胞集団は、以下に記載されるように、ドナーから新たに単離される。例示の態様において、ドナーから単離された細胞は、細胞集団内のＣＤ３４＋細胞の総％が、元の、単離されたが富化、精製、または選択されていない細胞集団に対して増加するように、富化または精製または選択ステップを経る。例示の態様において、富化または精製または選択は、細胞集団をドナーから単離して２日以内に生じる。例示の態様において、富化または精製または選択は、細胞集団をドナーから単離して１日以内に生じる。例示の態様において、富化または精製または選択は、細胞集団をドナーから単離するのと同日であるが、ドナーからの細胞の単離に続いて生じる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、細胞集団は、１つ以上の正の選択ステップを経たもの、例えば、これに限定されないが、免疫磁性細胞選択によるものである。この点において、例えば、細胞集団は、いくつかの実施形態において、ＣＤ３４＋細胞により発現される細胞マーカーに特異的な一次抗体を使用することにより富化、選択、または精製される。いくつかの実施形態において、細胞集団の細胞により発現された細胞マーカーは、ＣＤ３４である。例示の実施形態において、一次抗体は、ＣＤ３４に特異的に結合する抗体である。ＣＤ３４特異的抗体は、当該技術分野において既知であり、市販されている。例えば、米国特許第４，９６５，２０４号を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＣＤ３４特異的抗体は、Ｉｓｏｌｅｘ３００ｉキット（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）において提供される抗体である。
【００３４】
例示の態様において、一次抗体は、約０．０１μｇ／１０６  ＣＤ３４＋細胞〜約１０μｇ／１０６  ＣＤ３４＋細胞の範囲内、約０．１μｇ／１０６  ＣＤ３４＋細胞〜約５μｇ／１０６  ＣＤ３４＋細胞の範囲内、約１μｇ／１０６  ＣＤ３４＋細胞〜約３μｇ／１０６  ＣＤ３４＋細胞の範囲内の最終濃度で、単離された（但し、富化されていない）細胞集団と接触される。いくつかの実施形態において、一次抗体は、約２．５μｇ／１０６  ＣＤ３４＋細胞の最終濃度で存在する。
【００３５】
例示の態様において、一次抗体は、ＣＤ３４＋細胞により発現された細胞マーカーに結合する抗体であるが、ＣＤ３４以外の細胞マーカーである。例えば、一次抗体は、ＣＤ４５特異的抗体またはＣＸＣＲ４特異的抗体であり得る。この点において、ＣＤ３４およびＣＤ４５の双方、ならびに／またはＣＸＣＲ４に対して陽性である細胞が選択される。いくつかの態様において、哺乳類対象から得られる生体試料（例えば、限定されないが、血液試料）は、抗ＣＤ３４＋抗体、またはＣＤ３４＋細胞上もしくは細胞中に含有される他のエピトープ／酵素／タンパク質のために選択する抗体とインキュベートされる。
【００３６】
細胞集団を亜集団に分離する一次抗体は、いくつかの実施形態において、固体支持体の上に「捕捉される」。例示の固体支持体としては、膜、表面、ビーズ、樹脂、粒子、および当該技術分野において周知の他の支持体が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、限定されないが、いくつかの態様において、固体支持体はビーズであり、このビーズは、末梢血から得られる細胞集団とインキュベートされる。いくつかの態様において、ビーズ（複数可）を用いたインキュベーションは、一次抗体を用いたこれらの細胞のインキュベーションの前または後に生じる。いくつかの実施形態において、ビーズ（複数可）は、一次抗体と同時に血液試料から得られる細胞集団とともにインキュベートされる。細胞集団がビーズ（複数可）および一次抗体の双方を用いてインキュベートされると、このビーズ、一次抗体、および所望の細胞型または非所望の細胞を含む複合体が形成する。
【００３７】
例示の態様において、一次抗体は、その一次抗体に結合する二次抗体を含む固体支持体により、固体支持体の上に捕捉される。二次抗体は、一次抗体のＦｃ領域に結合するものであり得る。例示の態様において、固体支持体は、タンパク質、例えば、二次抗体に特異的に結合する、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇ、またはタンパク質Ｌ（例えば、限定されないが、黄色ブドウ球菌からのタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇ、またはタンパク質Ｌ）を含むが、これらに限定されない。代替態様において、一次抗体は、二次抗体なしに固体支持体の上に捕捉される。
【００３８】
例示の態様において、固体支持体は磁性である。例示の態様において、固体支持体は磁性ビーズである。例示の態様において、磁性ビーズは、一次抗体に結合するタンパク質を含む。特定の実施形態において、タンパク質は、一次抗体（例えば、限定されないが、一次抗体のＦｃ領域）に特異的に結合する二次抗体である。いくつかの実施形態において、タンパク質は、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇ、またはタンパク質Ｌ（例えば、限定されないが、黄色ブドウ球菌からのタンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、タンパク質Ａ／Ｇ、またはタンパク質Ｌ）である。
【００３９】
例示の態様において、抗体／生体試料混合物（例えば、限定されないが、抗体／血液試料混合物）は、ＣＤ３４＋抗体に対して配向される抗体でコーティングされた常磁性ビーズとともにインキュベートされる。ビーズ−抗体は、ＣＤ３４＋細胞抗体複合体と複合体化し、細胞−抗体−ビーズ複合体を形成する。次いで、このビーズ化複合体は、例示の態様において磁石の使用により血液試料の残りから分離される。次いで、非磁気束縛材料は、束縛材料から洗い流されてよく、次いで得られた束縛材料は、抗ＣＤ３４＋抗体に対して競合するペプチドインキュベートされる。そのようなペプチドは、抗ＣＤ３４＋抗体に対する競合またはより高い親和性を有し、結果として、細胞はビーズ、抗体、および磁石から放出される。ある特定の実施形態において、穏やかな機械的攪拌（例えば、限定されないが、摩砕）を使用して、生体試料中の細胞複合体の凝集を破壊し、ペプチドが抗体およびビーズを除去するのを許し、それによって細胞を放出する。次いで、ペプチド−抗体−ビーズ複合体は、磁石の使用を通して除去される。
【００４０】
例示の態様において、抗体選択技術（Ｉｓｏｌｅｘ  ３００ｉ，Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）を使用して、ヒトＣＤ３４＋幹細胞を患者の血液または骨髄から単離、精製、および採取する（米国特許第５，５３６，４７５号、第６，２５１，２９５号、第５，９６８，７５３号、第６，０１７，７１９号、これらの開示は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様において、富化プロセスは、Ｉｓｏｌｅｘシステム、例えば、限定されないが、Ｉｓｏｌｅｘ  ３００ｉシステムまたはその修正版を用いて実行される（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）。
【００４１】
いくつかの実施形態は、ＣＤ３４＋細胞の選択を包含するが、同様のプロセスを用いて、他の細胞、例えば、ＣＸＣＲ４＋、Ｆｌｋ−１＋（ＶＥＧＦＲ−１）、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、Ｔｉｅ−２＋、ｃ−ｋｉｔ＋（ＣＤ１１７＋）、ＣＤ２７１＋、ＣＤ１３３＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ６４＋、ＣＤ６１＋、ＣＤ１４１＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ３８＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１４６＋、ＣＤ１４４＋、ＣＤ７３＋、ＣＤ９９＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ９０＋、またはＣＤ３１＋細胞を選択することができる。そのような同様のプロセスは、これらの他の細胞マーカー、例えば、抗ＣＸＣＲ４、抗Ｆｌｋ−１、抗ＫＤＲ、抗Ｔｉｅ−２、抗ｃ−ｋｉｔ、抗ＣＤ２７１、抗ＣＤ１３３、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ１４、抗ＣＤ６４、抗ＣＤ６１、抗ＣＤ１４１、抗ＣＤ３３、抗ＣＤ３８、抗ＣＤ１０５、抗ＣＤ１４６、抗ＣＤ１４４、抗ＣＤ７３、抗ＣＤ９９、抗ＣＤ２９、抗ＣＤ９０、または抗ＣＤ３１抗体に特異的な抗体の使用を必要とする。恐らく、そのような例において、薬学的組成物は、１つ以上のこれらのマーカーを発現する細胞を含む。本発明は、これらの選択プロセスのうちのいずれかの単独使用、または最終の得られた増強細胞集団が、これらの細胞のうちの１つまたはそれらの混合物に対して付加されるような他のプロセスのうちの１つ以上と合わせての使用を企図する。
【００４２】
いくつかの実施形態において、細胞集団は、負の選択ステップを経たものである。この点において、例として限定されないが、生体試料は、最終生成物に対してあまり関心がないか、または全く関心がない細胞に対して配向される１つ以上の抗体とともにインキュベートされる。いくつかの実施形態において、関心対象の細胞がＣＤ３４＋細胞であるとき、非所望の非ＣＤ３４＋（またはＣＤ３４−）細胞は、血液試料から得られる細胞を用いてインキュベートされ得るか、または細胞特異的抗体に対して配向された抗体でコーティングされた常磁性ビーズを用いるインキュベーションが続く。上記のプロセスを通じて、そのような非所望（非標的）の細胞は、次いで、細胞集団から任意に単離され、除去される。得られた集団は、より低濃度〜ゼロ濃度の非所望の細胞を含有し、結果として、より高濃度の所望の細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞を含有する。そのような細胞除去の例としては、血液試料中のグリコフォリン−ａを発現する細胞の低減または除去を含む。
【００４３】
いくつかの実施形態において、細胞集団は、正および負の選択ステップの双方を経たものである。
【００４４】
ある特定の態様において、ＣＤ３４＋細胞の富化集団を得る方法は、細胞集団を、ＣＤ３４＋細胞を含む亜集団と、ＣＤ３４＋細胞を欠いた（ＣＤ３４−細胞）亜集団とに、ビーズおよび一次抗体を含む複合体、ならびにＣＤ３４＋細胞または非ＣＤ３４＋（ＣＤ３４−）細胞を、その細胞、ビーズ、および一次抗体を含有する細胞集団から除去することによって分離することを含む。ビーズを除去する方法は、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態において、ビーズは、常磁性ビーズであり、これらのビーズは、磁石を用いて除去される。いくつかの実施形態において、ビーズは、遠心分離によって分離される。
【００４５】
いくつかの実施形態において、固体支持体（例えば、限定されないが、ビーズ）と、一次抗体とを含む複合体は、ＣＤ３４＋細胞または非ＣＤ３４細胞をさらに含む。複合体が非ＣＤ３４細胞を含む実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、ビーズが除去された溶液中に含有される。いくつかの実施形態において、ＣＤ３４＋細胞を富化または精製するためにさらなるステップは取られない。
【００４６】
本明細書に記載される複合体がＣＤ３４＋細胞を含むいくつかの実施形態において、方法は、ＣＤ３４＋細胞を複合体から放出するように１つ以上のさらなるステップを含む。ある特定の態様において、方法は、放出ペプチドとともに複合体をインキュベートすることを含む。本明細書において使用される場合、「放出ペプチド」という用語は、一次抗体を所望の細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）から移動させるペプチド結合を介して接続される少なくとも２つのアミノ酸を含む、任意の分子である。
【００４７】
いくつかの実施形態において、放出ペプチドは、ＣＤ３４のエピトープまたは一次抗体のエピトープであるエピトープ（例えば、限定されないが、一次抗体のＣＤＲ）を含む。いくつかの態様において、放出ペプチドは、可溶性ＣＤ３４（例えば、限定されないが、ＣＤ３４の可溶性フラグメント）、またはＰＲ３４ペプチドであり、米国特許第５，９６８，７５３号および第６，０１７，７１９号に記載される。いくつかの実施形態において、放出ペプチドは、これらの特許に記載されるもののいずれかである。いくつかの実施形態において、放出ペプチドは、Ｉｓｏｌｅｘ  ３００ｉキット（Ｂａｘｔｅｒ，Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）の一部として提供されるものである。
【００４８】
いくつかの実施形態において、放出ペプチドの濃度は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜１０ｍｇ／ｍＬの範囲内、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５ｍｇ／ｍＬの範囲内、または約１ｍｇ／ｍＬ〜約２ｍｇ／ｍＬの範囲内の最終濃度で複合体とともに存在する。いくつかの実施形態において、放出ペプチドは、約２ｍｇ／ｍＬの最終濃度で存在する。
【００４９】
いくつかの実施形態において、放出ペプチドは、回転、振盪、または他の方法で動かしながら複合体を用いてインキュベートされる。いくつかの実施形態において、放出ペプチドは、運動なしにインキュベートされる。
【００５０】
いくつかの実施形態において、複合体は、任意に粉砕されて、細胞（例えば、限定されないが、ＣＤ３４＋細胞）からの一次抗体の放出ペプチドを介した移動の効率を増加させる。いくつかの実施形態において、粉砕は、細胞が通ることができ、複合体形成時に形成される細胞凝集の破壊を促進する比較的小さな穴を有する、シリンジ、ピペット、または同様のツールを用いて達成される。ある特定の態様において、方法は、少なくとも、または約３０秒間、少なくとも、または約１分間、少なくとも、または約５分間、少なくとも、または約１０分間、少なくとも、または約１５分間、少なくとも、または約２５分間、少なくとも、または約３０分間、少なくとも、または約４５分間、少なくとも、または約６０分間、少なくとも、または約９０分間、少なくとも、または約１２０分間、少なくとも、または約２時間、少なくとも、または約３時間、少なくとも、または約４時間粉砕することを含む。いくつかの態様において、方法は、約１０時間を超えない時間、および他の態様において約５時間を超えない時間、粉砕することを含む。
【００５１】
ある特定の実施形態において、粉砕は、放出ペプチドの存在下で生じる。他の実施形態において、粉砕は、放出ペプチドの不在下で生じ、例えば、限定されないが、粉砕は放出ペプチドの添加前に生じる。いくつかの実施形態において、粉砕は、放出ペプチドの添加および粉砕前に生じ、放出ペプチドの添加は、個々に約３０秒以内、約６０秒以内、約１．５分以内、約２分以内、約５分以内、約１０分以内、約１５分以内、約３０分以内、約４５分以内、約６０分以内に生じる。
【００５２】
Ｂ．動員されたＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団
例示の態様において、細胞集団は、ドナーの骨髄から動員されたＣＤ３４＋細胞を含む。例示の態様において、細胞集団は、骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋細胞の動員を誘発または促進するサイトカインまたは他の薬剤で処置されたドナーの骨髄から動員されるＣＤ３４＋細胞を含む。患者における骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋細胞の動員を促進する方法は、当該技術分野において既知である。例示の態様において、細胞集団は、本明細書に記載されるＣＤ３４＋細胞の動員を促進する方法に従って骨髄から末梢血に動員されるＣＤ３４＋細胞を含む。
【００５３】
Ｃ．新たに単離されたＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団
例示の態様において、細胞集団は、ドナーから新たに単離された細胞を含む。「新たに単離された」とは、細胞集団の細胞が、ドナーの体外に７日を超えない期間存在していることを意味する。例示の態様において、新たに単離された細胞は、体外に６日間以下、５日間以下、４日間以下、または３日間以下存在している。例示の態様において、細胞は、生体試料から細胞を得る方法に関する以下の教示に従って新たに単離される。
【００５４】
例示の態様において、細胞集団は、７日間未満（例えば、限定されないが、６日間未満、５日間未満、４日間未満、３日間未満、２日間未満、１日未満）培養または播種されたものである。例示の態様において、細胞集団は、細胞増殖のためのいずれのステップも経ていないものである。例示の態様において、ＣＤ３４＋細胞の正の選択は、アフェレーシスの４８時間以内に生じる。次いで、選択された細胞は、シリンジに重点され、シリンジに充填されて４８時間以内に患者に投与される。そのため、例示の態様において、細胞集団は、投与前５日間未満ドナーの体外に存在している。
【００５５】
Ｄ．生体試料から細胞集団を得る方法
本明細書において参照されるＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団は、当該技術分野において既知の任意の手段により得られてよい。いくつかの実施形態において、細胞集団は、ドナーから単離される。「単離された」という用語は、本明細書において使用される場合、その自然環境から除去されたことを意味する。細胞集団は、所望の細胞集団を含む任意の成体、胎児、または胚組織から単離される。
【００５６】
ドナーは、患者に関して本明細書に記載される宿主のいずれかである。いくつかの態様において、ドナーは哺乳類である。特定の態様において、ドナーはヒトである。いくつかの実施形態において、細胞集団のドナーは、本発明の薬学的組成物で処置される患者または対象と同一である。この点において、細胞集団は、患者または対象に対して「自家性」であるとみなされる。他の実施形態において、細胞集団のドナーは、処置される患者または対象とは異なるが、このドナーおよび患者は同一種である。この点において、細胞集団は、「同種」とみなされる。
【００５７】
細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞を含有すると疑われる任意の生体試料から単離される。例示の生体試料としては、末梢血、骨髄、および脂肪組織が挙げられるが、これらに限定されない。例示の態様において、生体試料は、アフェレーシス（例えば、限定されないが、白血球除去輸血）を介して、ドナーから得られる。例示の態様において、生体試料は、アフェレーシス（例えば、限定されないが、白血球除去輸血）を介してドナーから得られる単核分画である。
【００５８】
ある特定の態様において、細胞集団は、対象ドナーの末梢血から単離される。細胞集団は、骨髄から末梢血への細胞集団の動員を誘発または促進するサイトカインまたは他の薬剤を用いたドナーの前処置に続いて、血液から任意に単離される。サイトカインおよび造血幹細胞動員に関するレビューについては、Ｎｅｒｖｉらを参照されたい（Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９９：６９０−７０５，２００６、参照によりその全体、特に造血幹細胞動員に関する論考に関して組み込まれる）。骨髄から末梢血への細胞集団の動員を誘発または促進する薬剤としては、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＡＭＤ−３１００、ペグ化Ｇ−ＣＳＦ（ペグフィルグラスチム）、トロンボポエチン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＣＸＣＲ４ペプチド（ＣＴＣＥ−００２１；ＳＤ−１α類似体）、ＳＤ−１、ＩＬ−８、単球−化学誘引物質タンパク質−１、マクロファージ炎症性タンパク質１ａ、マクロファージ炎症性タンパク質１ｂ、組み換えヒト成長ホルモン、組み換えヒト副甲状腺ホルモン、ＳＢ−２５１３５３、Ｇｒｏβ、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＡＭＤ−３１００、ＳＣＦ、ＳＢ−２５１３５３、組み換えヒト成長ホルモン、および／またはトロンボポエチンのうちの１つ以上が、Ｇ−ＣＳＦと併せて（同時または連続的のいずれかで）対象ドナーに投与され、骨髄から末梢血への細胞集団の動員を誘発または促進する。
【００５９】
本発明は、対象からＣＤ３４＋細胞を得る方法も提供する。この方法は、対象におけるＣＤ３４＋細胞を骨髄から末梢血への動員を促進するステップと、対象の末梢血からＣＤ３４＋細胞を回収するステップとを含む。対象の骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋細胞の動員を促進するステップは、Ｇ−ＣＳＦを５０μｇ／ｋｇ未満の総投与量で対象に投与することを含む。「総投与量」とは、本明細書において使用される場合、回収が生じるときまでに投与される総量を意味する。この促進ステップは、以下の教示のいずれかに従って実行されてよい。例えば、限定されないが、表題「ＣＤ３４＋細胞の動員を促進する方法」の項を参照されたい。いくつかの実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、アフェレーシスにより回収される。この方法は、任意に、ＣＤ３４＋細胞の回収後、ＣＤ３４＋細胞の富化（本明細書に記載される）をさらに含む。ＣＤ３４＋細胞が対象から得られると、ＣＤ３４＋細胞は、血漿タンパク質と、少なくとも１つの塩を含む等張液とを含む薬学的組成物に製剤化され、任意に、該等張液は、酢酸塩、グルコン酸塩、または酢酸塩およびグルコン酸塩の双方を含む。
【００６０】
ＣＤ３４＋細胞の動員を促進する方法
本発明は、対象における骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋細胞の動員を促進する方法も提供する。この方法は、Ｇ−ＣＳＦを５０μｇ／ｋｇ未満の総投与量で対象に投与することを含む。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、本発明の方法は、対象によって経験される疼痛および不快感の可能性を最小化し、ＣＤ３４＋細胞の動員に必要とされる全体時間を低減するが、後次回収のために十分な数の細胞が循環中に動員されるのを許す。
【００６１】
いくつかの実施形態において、対象の骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋細胞の動員を促進する方法は、約２μｇ／ｋｇ／日未満、約２．５μｇ／ｋｇ／日未満、約３μｇ／ｋｇ／日未満、約３．５μｇ／ｋｇ／日未満、約４μｇ／ｋｇ／日未満、約４．５μｇ／ｋｇ／日未満、約５μｇ／ｋｇ／日未満、約５．５μｇ／ｋｇ／日未満、約６μｇ／ｋｇ／日未満、約６．５μｇ／ｋｇ／日未満、約７μｇ／ｋｇ／日未満、約７．５μｇ／ｋｇ／日未満、約８μｇ／ｋｇ／日未満、約８．５μｇ／ｋｇ／日未満、約９μｇ／ｋｇ／日未満、約９．５μｇ／ｋｇ／日未満、または約１０μｇ／ｋｇ／日未満の用量で、ドナーから末梢血試料を得る直前に、Ｇ−ＣＳＦを（任意に頻回注射で）対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、約２．５μｇ／ｋｇ／日〜約７μｇ／ｋｇ／日または約４μｇ／ｋｇ／日〜約６μｇ／ｋｇ／日の範囲の投与量で、Ｇ−ＣＳＦの頻回注射を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、約４．８μｇ／ｋｇ／日〜約５．２μｇ／ｋｇ／日の範囲の投与量で、Ｇ−ＣＳＦの頻回注射を対象に投与することを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態において、２０用量未満、または具体的に１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１用量のＧ−ＣＳＦは、末梢血試料を得る直前にドナーに投与される。この方法は、いくつかの実施形態において、合計５用量のＧ−ＣＳＦを、末梢血試料を得る前にドナーに投与することを含む。他の実施形態において、この方法は、合計４用量のＧ−ＣＳＦを、末梢血試料を得る前にドナーに投与することを含む。
【００６３】
例示の態様において、約４０μｇ／ｋｇ以下、約３５μｇ／ｋｇ以下、約３４μｇ／ｋｇ以下、約３３μｇ／ｋｇ以下、約３２μｇ／ｋｇ以下、約３１μｇ／ｋｇ以下、約３０μｇ／ｋｇ以下、約２９μｇ／ｋｇ以下、約２８μｇ／ｋｇ以下、約２７μｇ／ｋｇ以下、約２６μｇ／ｋｇ以下、約２５μ／ｋｇ以下、約２４μｇ／ｋｇ以下、約２３μｇ／ｋｇ以下、約２２μｇ／ｋｇ以下、約２１μｇ／ｋｇ以下、約２０μｇ／ｋｇ以下、約１９μｇ／ｋｇ以下、約１８μｇ／ｋｇ以下、約１７μｇ／ｋｇ以下、約１６μｇ／ｋｇ以下、約１５μｇ／ｋｇ以下、約１４μｇ／ｋｇ以下、約１３μｇ／ｋｇ以下、約１２μｇ／ｋｇ以下、約１１μｇ／ｋｇ以下、約１０μｇ／ｋｇ以下、約９μｇ／ｋｇ以下、約８μｇ／ｋｇ以下、約７μｇ／ｋｇ以下、約６μｇ／ｋｇ以下、または約５μｇ／ｋｇ以下のＧ−ＣＳＦの総投与量を対象に投与する。いくつかの実施形態において、Ｇ−ＣＳＦの総投与量は、７日間で投与される。他の実施形態において、Ｇ−ＣＳＦの総投与量は、５日間で投与される。さらに他の実施形態において、Ｇ−ＣＳＦの総投与量は、４日間で投与される。
【００６４】
例示の態様において、Ｇ−ＣＳＦの総投与量は、５０μｇ／ｋｇ未満であるか、または３０μｇ／ｋｇ未満であり、４．８μｇ／ｋｇ／日〜約５．２μｇ／ｋｇ／日の範囲内の投与量は、４日間または５日間対象に投与される。例示の態様において、末梢血の採取前のＧ−ＣＳＦの総投与量は、２０μｇ／ｋｇであり、約５．０μｇ／ｋｇ／日の投与量は、４日間付与される。例示の態様において、末梢血の採取前のＧ−ＣＳＦの総投与量は、２５μｇ／ｋｇであり、約５．０μｇ／ｋｇ／日の投与量は、５日間付与される。
【００６５】
薬学的組成物
血液試料から得られるＣＤ３４＋細胞の富化集団を含む細胞集団は、治療的価値を有する。この点において、本発明は、患者に投与するための細胞を含む薬学的組成物をさらに提供する。薬学的組成物は、ＣＤ３４＋細胞と、血漿タンパク質と、少なくとも１つの塩を含む等張液とを含む。
【００６６】
Ａ．血漿タンパク質
「血漿タンパク質」という用語は、本明細書において使用される場合、哺乳類対象の血漿中に存在するタンパク質を意味する。例示の血漿タンパク質としては、アルブミン（特に、ヒト血清アルブミン）、トランスフェリン、ハプトグロビン、フィブリノゲン、凝固因子、補体成分、免疫グロブリン、酵素阻害剤、アンジオテンシンおよびブラジキニン等の物質ならびに他の型のタンパク質の前駆体、プレアルブミン、α１抗トリプシン、α１酸性糖タンパク質、α１フェトプロテイン、α２−マクログロブリン、γグロブリン、β２マイクログロブリン、ハプトグロビン、セルロプラスミン、補体成分３、補体成分４、リポタンパク質、Ｃ−反応性タンパク質（ＣＲＰ）、リポタンパク質（カイロミクロン、ＶＬＤＬ、ＬＤＬ、ＨＤＬ）、トランスフェリン、プロトロンビン、またはマンナン結合レクチン（ＭＢＬ、マンノース結合タンパク質またはマンナン結合タンパク質またはＭＢＰとしても知られる）。
【００６７】
例示の態様において、本発明の薬学的組成物中の血漿タンパク質は、約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の範囲の濃度で薬学的組成物中に存在する。この点で、いくつかの実施形態において、血漿タンパク質は、約１ｗ／ｖ％、約２ｗ／ｖ％、約２．５ｗ／ｖ％、約３ｗ／ｖ％、約３．５ｗ／ｖ％、約４ｗ／ｖ％、約４．５ｗ／ｖ％、約５ｗ／ｖ％、約５．５ｗ／ｖ％、約６ｗ／ｖ％、約６．５ｗ／ｖ％、約７ｗ／ｖ％、約７．５ｗ／ｖ％、約８ｗ／ｖ％、約８．５ｗ／ｖ％、約９ｗ／ｖ％、または約９．５ｗ／ｖ％、または約１０％の濃度で薬学的組成物中に存在する。他の実施形態において、血漿タンパク質は、約２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、または約２ｗ／ｖ％〜約８ｗ／ｖ％、または約３ｗ／ｖ％〜約７ｗ／ｖ％、または約４ｗ／ｖ％〜約６ｗ／ｖ％の濃度で薬学的組成物中に存在する。
【００６８】
ある特定の態様において、本発明の薬学的組成物中の血漿タンパク質は、血清アルブミンであり、ある特定の態様において、血清アルブミンはヒト血清アルブミンである。いくつかの実施形態において、ヒト血清アルブミンは、約０．５ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％の範囲の濃度で薬学的組成物中に存在する。この点で、いくつかの実施形態において、ヒト血清アルブミンは、約１ｗ／ｖ％、約２ｗ／ｖ％、約２．５ｗ／ｖ％、約３ｗ／ｖ％、約３．５ｗ／ｖ％、約４ｗ／ｖ％、約４．５ｗ／ｖ％、約５ｗ／ｖ％、約５．５ｗ／ｖ％、約６ｗ／ｖ％、約６．５ｗ／ｖ％、約７ｗ／ｖ％、約７．５ｗ／ｖ％、約８ｗ／ｖ％、約８．５ｗ／ｖ％、約９ｗ／ｖ％、または約９．５ｗ／ｖ％、または約１０％の濃度で薬学的組成物中に存在する。他の実施形態において、ヒト血清アルブミンは、約２ｗ／ｖ％〜約１０ｗ／ｖ％、または約２ｗ／ｖ％〜約８ｗ／ｖ％、または約３ｗ／ｖ％〜約７ｗ／ｖ％、または約４ｗ／ｖ％〜約６ｗ／ｖ％の濃度で薬学的組成物中に存在する。
【００６９】
例示の実施形態において、薬学的組成物の血漿タンパク質（複数可）に起因する総タンパク質濃度は、６０ｇ／Ｌ未満である。例示の態様において、血漿タンパク質（複数可）に起因する総タンパク質濃度は、約５０ｇ／Ｌ以下、約４０ｇ／Ｌ以下、約３０ｇ／Ｌ以下、約２０ｇ／Ｌ以下、または約１０ｇ／Ｌ以下である。
【００７０】
例示の態様において、薬学的組成物は、５個を超えない異なる血漿タンパク質、または４個wを超えない異なる血漿タンパク質を含む。例示の態様において、薬学的組成物は、３個を超えない異なる血漿タンパク質、または２個を超えない異なる血漿タンパク質を含む。例示の態様において、薬学的組成物は、１個を超えない血漿タンパク質を含む。薬学的組成物が５個を超えない異なる血漿タンパク質を含む例示の態様において、血漿タンパク質（複数可）に起因する総タンパク質濃度は、約６０ｇ／Ｌ未満であるが、１ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、または４０ｇ／Ｌ超である。例示の態様において、血漿タンパク質（複数可）に起因する総タンパク質濃度は、４０ｇ／Ｌ〜５５ｇ／Ｌ、または４５ｇ／Ｌ〜５３ｇ／Ｌである。例示の態様において、血漿タンパク質（複数可）に起因する総タンパク質濃度は、約５０ｇ／Ｌである。例示の態様において、薬学的組成物は、ヒト血清アルブミンである単一血漿タンパク質のみを含む。例示の態様において、血漿タンパク質は、組み換えタンパク質である。
【００７１】
例示の態様において、薬学的組成物は、５個超の異なる血漿タンパク質、または１０個超の異なる血漿タンパク質を含む。例示の態様において、薬学的組成物は、血漿中に見出されるタンパク質の全てを含む。例示の態様において、薬学的組成物は、血漿または血清を含む。例示の態様において、薬学的組成物は、ヒト血漿またはヒト血清を含む。例示の態様において、ヒト血漿またはヒト血清は、ＣＤ３４＋細胞が単離されたヒトから得られる。そのような態様において、ヒト血漿またはヒト血清は、自家性血漿または自家性血清とみなされる。
【００７２】
例示の態様において、薬学的組成物は、２０ｖ／ｖ％未満の濃度で血漿または血清を含む。例示の態様において、薬学的組成物は、１０ｖ／ｖ％未満の濃度で血漿または血清を含む。例示の態様において、薬学的組成物は、約２ｖ／ｖ％〜約１０ｖ／ｖ％、または約２ｖ／ｖ％〜約８ｖ／ｖ％、または約３ｖ／ｖ％〜約７ｖ／ｖ％、または約４ｖ／ｖ％〜約６ｖ／ｖ％の範囲内の濃度で血漿または血清を含む。例示の態様において、薬学的組成物は、約１ｖ／ｖ％、約２ｖ／ｖ％、約２．５ｖ／ｖ％、約３ｖ／ｖ％、約３．５ｖ／ｖ％、約４ｖ／ｖ％、約４．５ｖ／ｖ％、約５ｖ／ｖ％、約５．５ｖ／ｖ％、約６ｖ／ｖ％、約６．５ｖ／ｖ％、約７ｖ／ｖ％、約７．５ｖ／ｖ％、約８ｖ／ｖ％、約８．５ｖ／ｖ％、約９ｖ／ｖ％、約９．５ｖ／ｖ％、または約１０ｖ／ｖ％の濃度で血漿または血清を含む。薬学的組成物が血漿または血清を含む例示の態様において、血漿タンパク質に起因する総タンパク質濃度は、約３０ｇ／Ｌ以下、約２０ｇ／Ｌ以下、または約１０ｇ／Ｌ以下である。薬学的組成物が血漿または血清を含む例示の態様において、血漿タンパク質に起因する総タンパク質濃度は、約５ｇ／Ｌ以下、例えば、限定されないが、約２．５〜４．５ｇ／Ｌである。
【００７３】
Ｂ．等張液
「等張液」という用語は、本明細書において使用される場合、細胞集団中に細胞の細胞質と同一の塩濃度を有する溶液を意味する。例示の実施形態において、等張液は、血液と同一の浸透圧を有するか、または細胞および血液と同一の塩濃度を有する。
【００７４】
本発明の例示の実施形態において、等張液は、少なくとも１つの塩を含む。例示の態様において、塩は、塩の別個のカチオンおよびアニオンを含む等張液として等張液中に存在する。例示の態様において、塩は、電解質として等張液中に存在する。
【００７５】
例示の実施形態において、等張液は、血漿中に存在する複数の電解質を含む。例示の態様において、等張液は、以下の電解質：ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、および塩化物（Ｃｌ−）のうちの１つ以上を含む。例示の態様において、等張液は、少なくともナトリウム、およびカリウム（Ｋ＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、および塩化物（Ｃｌ−）のうちの１つ以上を含む。例示の態様において、等張液は、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、および塩化物（Ｃｌ−）を含む。例示の態様において、等張液は、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、およびマグネシウム（Ｍｇ２＋）を含む。例示の態様において、等張液は、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、およびカルシウム（Ｃａ２＋）を含む。例示の態様において、等張液は、ナトリウム（Ｎａ＋）およびカリウム（Ｋ＋）を含む。
【００７６】
例示の態様において、等張液は、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、カルシウム（Ｃａ２＋）、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、および塩化物（Ｃｌ−）から選択される少なくとも１つのイオンを含まない。特定の態様において、等張液は、カルシウム（Ｃａ２＋）を含まない。
【００７７】
特定の態様において、等張液は、血漿（例えば、限定されないが、ヒト血漿）中に見出されるものと同一の濃度で、電解質またはイオンを含む。血漿は、１４５ｍＥｑ／Ｌナトリウム（Ｎａ＋）、１１０ｍＥｑ／Ｌ塩化物（Ｃｌ−）、４〜５ｍＥｑ／Ｌカリウム（Ｋ＋）、２ｍＥｑ／Ｌマグネシウム（Ｍｇ２＋）を含む。例示の態様において、等張液は、血漿中に見出されるものと実質的に同一の濃度で、電解質またはイオンを含む。血漿中に見出されるものと実質的に同一の濃度で、電解質またはイオンを含む例示の等張液は、ナトリウム（Ｎａ＋）を１０％±１４５ｍＥｑ／Ｌ以内の濃度で、塩化物（Ｃｌ−）を１０％±１１０ｍＥｑ／Ｌ以内の濃度で、カリウム（Ｋ＋）を１０％±４〜５ｍＥｑ／Ｌ以内の濃度で、マグネシウム（Ｍｇ２＋）を１０％±２ｍＥｑ／Ｌ以内の濃度で含むものである。血漿は、５ｍＥｑ／Ｌカルシウム（Ｃａ２＋）も含む。例示の態様において、等張液は、カルシウム（Ｃａ２＋）を含まない。
【００７８】
ある特定の態様において、等張液は、約１００ｍＥｑ〜約１８０ｍＥｑの範囲（例えば、限定されないが、約１１０ｍＥｑ〜約１７０ｍＥｑ、または約１２０ｍＥｑ〜約１６０ｍＥｑ、または約１３０ｍＥｑ〜約１５０ｍＥｑ）の量のナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、等張液は、約１３１ｍＥｑ、約１３２ｍＥｑ、約１３３ｍＥｑ、約１３４ｍＥｑ、約１３５ｍＥｑ、約１３６ｍＥｑ、約１３７ｍＥｑ、約１３８ｍＥｑ、約１３９ｍＥｑ、約１４０ｍＥｑ、約１４１ｍＥｑ、約１４２ｍＥｑ、約１４３ｍＥｑ、約１４４ｍＥｑ、約１４５ｍＥｑ、約１４６ｍＥｑ、約１４７ｍＥｑ、約１４８ｍＥｑ、約１４９ｍＥｑ、または約１５０ｍＥｑの量のナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、等張液は、約１４０ｍＥｑのナトリウムを含む。
【００７９】
等張液は、約１ｍＥｑ〜約９ｍＥｑ（例えば、限定されないが、約２ｍＥｑ〜約８ｍＥｑ、または約３ｍＥｑ〜約７ｍＥｑ、または約４ｍＥｑ〜約６ｍＥｑ）の範囲の量のカリウムを任意に含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態において、等張液は、約１ｍＥｑ、約２ｍＥｑ、約３ｍＥｑ、約４ｍＥｑ、約５ｍＥｑ、約６ｍＥｑ、約７ｍＥｑ、約８ｍＥｑ、または約９ｍＥｑの量のカリウムを含む。いくつかの実施形態において、等張液は、約５ｍＥｑのカリウムを含む。
【００８０】
ある特定の態様において、等張液は、約０．５ｍＥｑ〜約５．５ｍＥｑ（例えば、限定されないが、約１ｍＥｑ〜約５ｍＥｑ、または約２ｍＥｑ〜約４ｍＥｑ）の範囲の量のマグネシウムを任意に含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態において、等張液は、約２ｍＥｑ、約２．１ｍＥｑ、約２．２ｍＥｑ、約２．３ｍＥｑ、約２．４ｍＥｑ、約２．５ｍＥｑ、約２．６ｍＥｑ、約２．７ｍＥｑ、約２．８ｍＥｑ、２．９ｍＥｑ、約３．０ｍＥｑ、約３．１ｍＥｑのマグネシウム、約３．２ｍＥｑ、約３．３ｍＥｑ、約３．４ｍＥｑ、約３．５ｍＥｑ、３．６ｍＥｑ、約３．７ｍＥｑ、約３．８ｍＥｑ、約３．９ｍＥｑ、または約４ｍＥｑの量のマグネシウムを含む。いくつかの実施形態において、等張液は、約３ｍＥｑマグネシウムを含む。
【００８１】
等張液は、いくつかの実施形態において、約７０ｍＥｑ〜約１２０ｍＥｑ（例えば、限定されないが、約７５ｍＥｑ〜約１１５ｍＥｑ、または約８０ｍＥｑ〜約１１０ｍＥｑ、または約８５ｍＥｑ〜約１０５ｍＥｑ、または約９０ｍＥｑ〜約１００ｍＥｑ）の範囲の量の塩化物を任意に含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態において、等張液は、約９０ｍＥｑ、または約９１ｍＥｑ、または約９２ｍＥｑ、または約９３ｍＥｑ、または約９４ｍＥｑ、または約９５ｍＥｑ、または約９６ｍＥｑ、または約９７ｍＥｑ、または約９８ｍＥｑ、または約９９ｍＥｑ、または約１００ｍＥｑの量の塩化物を含む。いくつかの実施形態において、等張液は、約９８ｍＥｑの塩化物を含む。
【００８２】
例示の態様において、等張液は、血漿中に不在であるか、または血漿中に非常に低いレベルで存在する追加のイオンを含む。
【００８３】
例示の態様において、等張液は、保存剤または安定化剤を含む。本明細書において使用される場合、「保存剤」という用語は、化学損傷（例えば、限定されないが、酸化）または微生物作用から薬学的組成物を保護する任意の物質を指す。例示の態様において、保存剤は、抗酸化剤または抗細菌剤である。本明細書において使用される場合、「安定化剤」という用語は、２つ以上の化学物質間の反応を阻害する傾向がある任意の化学物質を指す。例示の態様において、安定化剤は、抗酸化剤、金属イオン封鎖剤、乳化剤または界面活性剤、紫外線安定化剤（例えば、限定されないが、紫外線吸収剤、消光剤、遊離ラジカルの捕捉剤）である。適切な保存剤および安定化剤は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ，１９８０）を参照されたい。
【００８４】
例示の態様において、等張液は、重炭酸塩前駆体を含む。例示の態様において、等張液は、血漿（例えば、限定されないが、ヒト血漿）中に不在であるか、または血漿中に非常に低いレベルで存在するアニオンを含む。例示の態様において、重炭酸塩前駆体は、保存剤または安定化剤、および血漿中に不在であるか、または血漿中に非常に低いレベルで存在するアニオンでもある。例示の態様において、等張液は、酢酸塩、グルコン酸塩、または酢酸塩およびグルコン酸塩の双方を含む。例示の態様において、等張液は、約０．０６ｍｍｏｌ／Ｌ以上、約０．０７ｍｍｏｌ／Ｌ以上、約０．０８ｍｍｏｌ／Ｌ以上、約０．０９ｍｍｏｌ／Ｌ以上、または約０．１ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度で酢酸塩を含む。例示の態様において、等張液は、さらに高い濃度（例えば、限定されないが、１ｍｍｏｌ／Ｌ以上、５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１０ｍｍｏｌ／Ｌ以上、１５ｍｍｏｌ／Ｌ以上、２０ｍｍｏｌ／Ｌ、または２５ｍｍｏｌ／Ｌ以上の濃度）で酢酸塩を含む。
【００８５】
ある特定の態様において、等張液は、約１０ｍＥｑ〜約４０ｍＥｑ（例えば、限定されないが、約１５ｍＥｑ〜約３５ｍＥｑ、または約２０ｍＥｑ〜約３０ｍＥｑ）の範囲の量の酢酸塩を任意に含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態において、等張液は、約２０ｍＥｑ、約２１ｍＥｑ、約２２ｍＥｑ、約２３ｍＥｑ、約２４ｍＥｑ、約２５ｍＥｑ、約２６ｍＥｑ、約２７ｍＥｑ、約２８ｍＥｑ、約２９ｍＥｑ、または約３０ｍＥｑの量の酢酸塩を含む。いくつかの実施形態において、等張液は、約２７ｍＥｑの酢酸塩を含む。
【００８６】
等張液は、いくつかの実施形態において、約１０ｍＥｑ〜約４０ｍＥｑ（例えば、限定されないが、約１５ｍＥｑ〜約３５ｍＥｑ、または約２０ｍＥｑ〜約３０ｍＥｑの範囲の量のグルコン酸塩を任意に含むか、またはさらに含む。いくつかの実施形態において、等張液は、約２０ｍＥｑ、約２１ｍＥｑ、約２２ｍＥｑ、約２３ｍＥｑ、約２４ｍＥｑ、約２５ｍＥｑ、約２６ｍＥｑ、約２７ｍＥｑ、約２８ｍＥｑ、約２９ｍＥｑ、または約３０ｍＥｑの量のグルコン酸塩を含む。いくつかの実施形態において、等張液は、約２３ｍＥｑのグルコン酸塩を含む。
【００８７】
ある例示の実施形態において、等張液は、約１４０ｍＥｑのナトリウム、約５ｍＥｑのカリウム、約３ｍＥｑのマグネシウム、約９８ｍＥｑの塩化物、約２７ｍＥｑの酢酸塩、および約２３ｍＥｑのグルコン酸塩を含む。例示の態様において、等張液は、ナトリウムを約１０％±１４０ｍＥｑ以内の濃度で、カリウムを約１０％±５ｍＥｑ以内の濃度で、マグネシウムを約１０％±３ｍＥｑ以内の濃度で、塩化物を約１０％±９８ｍＥｑ以内の濃度で、酢酸塩を約１０％±２７ｍＥｑ以内の濃度で、およびグルコン酸塩を約１０％±２３ｍＥｑ以内の濃度で含むとき、上記等張液と実質的に同一である。あるいは、上記等張液と実質的に同一である等張液は、ナトリウムを約５％±１４０ｍＥｑ以内の濃度で、カリウムを約５％±５ｍＥｑ以内の濃度で、マグネシウムを約５％±３ｍＥｑ以内の濃度で、塩化物を約５％±９８ｍＥｑ以内の濃度で、酢酸塩を約５％±２７ｍＥｑ以内の濃度で、およびグルコン酸塩を約５％±２３ｍＥｑ以内の濃度で含む。
【００８８】
例示の態様において、等張液のオスモル濃度は、いくつかの実施形態において、約２４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜約３７５ｍＯｓｍｏｌ／Ｌの範囲である。等張液のオスモル濃度は、いくつかの実施形態において、約２４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜約３５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ（例えば、限定されないが、約２５０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜約３４０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、または約２６０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜約３３０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、または約２７０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜約３２０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、または約２８０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ〜約３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ）の範囲である。いくつかの実施形態において、等張液は、約２８０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２８１ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２８２ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２８３ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２８４ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２８５ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２８６ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２８７ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２８８ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２８９ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２９０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２９１ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２９２ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２９３ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２９４ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２９５ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２９６ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２９７ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２９８ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約２９９ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約３００ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約３０１ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約３０２ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約３０３ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約３０４ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約３０５ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約３０６ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約３０７ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約３０８ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、約３０９ｍＯｓｍｏｌ／Ｌ、または約３１０ｍＯｓｍｏｌ／Ｌのオスモル濃度を有する。
【００８９】
ある特定の態様において、等張液は、約５〜約９（例えば、限定されないが、約６〜約８、約６．５〜約８、または約７〜約８）のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、等張液は、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０のｐＨを有する。
【００９０】
例示の態様において、等張液は、電解質を含む晶質静脈内輸液である。「晶質静脈内輸液」とは、半透過性膜を容易に通って流れる小分子を含有し、血流から細胞および体組織への移動を許す、ナトリウムベースの電解質輸液を意味する。例えば、限定されないが、Ｃｒａｗｆｏｒｄ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓ，″Ｉ．Ｖ．Ｆｌｕｉｄｓ：Ｗｈａｔ  ｎｕｒｓｅｓ  ｎｅｅｄ  ｔｏ  ｋｎｏｗ，″Ｎｕｒｓｉｎｇ  ４１：３０−３８（２０１１）を参照されたい。一般的な晶質静脈内輸液は、当該技術分野において既知であり、生理食塩水、乳酸化リンガー液、リンガー液、水中デキストロース（Ｄ５Ｗ）、ダロー液、および０．１８％塩化ナトリウム、および４％グルコースが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書において使用される場合、「生理食塩水」という用語は、０．９０％（ｗ／ｖ）のＮａＣｌ溶液を指す。
【００９１】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、生理食塩水成分および自家性血漿成分を含み、血漿成分は、約２０％未満（例えば、限定されないが、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、または約１％）の濃度で存在する。薬学的組成物は、いくつかの実施形態において、生理食塩水および自家性血漿であり、血漿は約５％の濃度で存在する。
【００９２】
例示の態様において、等張液は、生理食塩水ではない。しかしながら、等張液は、いくつかの態様において、上述の少なくとも１つの他の電解質とともにナトリウム（Ｎａ＋）を含む。例示の態様において、等張液は、デキストロースおよび／または乳酸塩および／またはグルコースを含まないものである。
【００９３】
例示の態様において、等張液は、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）Ａ、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）１４８、Ｐｌａｓｍａ−Ｌｙｔｅ（登録商標）５６、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ（登録商標）−Ｒ、Ｉｓｏｌｙｔｅ（登録商標）Ｐ、乳酸化リンガー液（ハートマン液としても知られる）、リンガー液、および５％水中デキストロース（Ｄ５Ｗ）のうちのいずれか１つであるか、またはそれと実質的に同一である。本明細書において使用される場合、「と実質的に同一」という用語は、標準液中で見出されるものと同一の構成要素を有するが、各構成要素の量が標準液中で見出される量±１０％以内である溶液を指す。以下の表は、これらの例示の溶液のうちのいくつかの電解質含有量を提供する。
【表１９】
2015508101.tif 000002
【００９４】
Ｃ．ＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団
本発明の薬学的組成物は、ＣＤ３４＋細胞を含む細胞集団を含む。例示の態様において、細胞集団は、本明細書に記載される細胞集団の教示のいずれかに従っている。例えば、限定されないが、表題「細胞集団」の項を参照されたい。したがって、本発明の薬学的組成物の細胞集団は、例示の態様において、ＣＤ３４＋細胞および他の細胞を含む不均一な細胞集団である。例示の態様において、細胞集団は、細胞集団の細胞の少なくとも１％（例えば、限定されないが、少なくとも、もしくは約５％、少なくとも、もしくは約１０％、少なくとも、もしくは約１５％、少なくとも、もしくは約２０％、少なくとも、もしくは約２５％、少なくとも、もしくは約３０％、少なくとも、もしくは約３５％、少なくとも、もしくは約４０％、少なくとも、もしくは約４５％、少なくとも、もしくは約５０％、少なくとも、もしくは約５５％、少なくとも、もしくは約６０％、少なくとも、もしくは約６５％、少なくとも、もしくは約７０％、少なくとも、もしくは約７５％、少なくとも、もしくは約８０％、少なくとも、もしくは約８５％、少なくとも、もしくは約９０％、少なくとも、もしくは約９５％、少なくとも、もしくは約９６％、少なくとも、もしくは約９７％、少なくとも、もしくは約９８％、または少なくとも、もしくは約９９％）がＣＤ３４＋細胞である、不均一な細胞集団である。
【００９５】
さらに例示の態様において、薬学的組成物の細胞集団は、ＣＸＣＲ４、ｃ−ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＦＬＫ−１（ＶＥＧＦＲ−１）、Ｔｉｅ−２、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、ＣＤ１３３、ＣＤ４５、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＤ６１、ＣＤ１４１、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３１、ＣＤ１０５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４４、ＣＤ７３、ＣＤ９９、ＣＤ２９、およびＣＤ９０からなる群から選択される１つ以上の細胞表面マーカーを発現する細胞のサブセットを含む。このサブセットの細胞は、例示の態様において、ＣＤ３４および上記マーカーのうちの１つ以上を発現する。代替の態様において、サブセットの細胞は、上記のマーカーのうちの１つ以上を発現するが、ＣＤ３４を発現しない。
【００９６】
例示の実施形態において、薬学的組成物は、少なくとも約１×１０６、少なくとも約１．１×１０６、少なくとも約１．２×１０６、少なくとも約１．３×１０６、少なくとも約１．４×１０６、少なくとも約１．５×１０６、少なくとも約１．６×１０６、少なくとも約１．７×１０６、少なくとも約１．８×１０６、少なくとも約１．９×１０６、少なくとも約２×１０６、少なくとも約２．１×１０６、少なくとも約２．２×１０６、少なくとも約２．３×１０６、少なくとも約２．４×１０６、少なくとも約２．５×１０６、少なくとも約２．６×１０６、少なくとも約２．７×１０６、少なくとも約２．８×１０６、少なくとも約２．９×１０６、少なくとも約３．０×１０６、少なくとも約３．１×１０６、少なくとも約３．２×１０６、少なくとも約３．３×１０６、少なくとも約３．４×１０６、少なくとも約３．５×１０６、少なくとも約３．６×１０６、少なくとも約３．７×１０６、少なくとも約３．８×１０６、少なくとも約３．９×１０６、少なくとも約４．０×１０６、少なくとも約４．１×１０６、少なくとも約４．２×１０６、少なくとも約４．３×１０６、少なくとも約４．４×１０６、少なくとも約４．５×１０６、少なくとも約４．６×１０６、少なくとも約４．７×１０６、少なくとも約４．８×１０６、少なくとも約４．９×１０６、少なくとも約５．０×１０６、少なくとも約５．５×１０６、少なくとも約６．０×１０６、少なくとも約６．５×１０６、少なくとも約７．０×１０６、少なくとも約７．５×１０６、少なくとも約８．０×１０６、少なくとも約８．５×１０６、少なくとも約９．０×１０６、少なくとも約１０７、少なくとも約１０８個の細胞を含む。例示の態様において、薬学的組成物は、いくつかの実施形態において、少なくとも約１×１０６、少なくとも約１．１×１０６、少なくとも約１．２×１０６、少なくとも約１．３×１０６、少なくとも約１．４×１０６、少なくとも約１．５×１０６、少なくとも約１．６×１０６、少なくとも約１．７×１０６、少なくとも約１．８×１０６、少なくとも約１．９×１０６、少なくとも約２×１０６、少なくとも約２．１×１０６、少なくとも約２．２×１０６、少なくとも約２．３×１０６、少なくとも約２．４×１０６、少なくとも約２．５×１０６、少なくとも約２．６×１０６、少なくとも約２．７×１０６、少なくとも約２．８×１０６、少なくとも約２．９×１０６、少なくとも約３．０×１０６、少なくとも約３．１×１０６、少なくとも約３．２×１０６、少なくとも約３．３×１０６、少なくとも約３．４×１０６、少なくとも約３．５×１０６、少なくとも約３．６×１０６、少なくとも約３．７×１０６、少なくとも約３．８×１０６、少なくとも約３．９×１０６、少なくとも約４．０×１０６、少なくとも約４．１×１０６、少なくとも約４．２×１０６、少なくとも約４．３×１０６、少なくとも約４．４×１０６、少なくとも約４．５×１０６、少なくとも約４．６×１０６、少なくとも約４．７×１０６、少なくとも約４．８×１０６、少なくとも約４．９×１０６、少なくとも約５．０×１０６、少なくとも約５．５×１０６、少なくとも約６．０×１０６、少なくとも約６．５×１０６、少なくとも約７．０×１０６、少なくとも約７．５��１０６、少なくとも約８．０×１０６、少なくとも約８．５×１０６、少なくとも約９．０×１０６、少なくとも約１０７、少なくとも約１０８個のＣＤ３４＋細胞を含む。
【００９７】
いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、本発明の薬学的組成物は、ＣＤ３４＋細胞に安定した環境を提供し、ＣＤ３４＋細胞が、非凍結温度で（例えば、限定されないが、１〜３０℃または２〜８℃）、短期間（例えば、限定されないが、２日間、３日間、４日間、または５日間）、ＣＤ３４＋細胞の集団の全体生存性および機能性を著しく低減することなく安定して貯蔵され得る。したがって、薬学的組成物中の細胞集団は、任意に、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上の生細胞を含む。例えば、いくつかの実施形態において、約１時間〜約５日間の期間、および／または１〜３０℃の範囲内の温度で薬学的組成物中で貯蔵した後、細胞集団の細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上が生細胞である。例の態様において、約２日間の期間、および／または２〜８℃の範囲内の温度で薬学的組成物中で貯蔵した後、細胞集団の細胞の少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上が生細胞である。細胞集団の細胞生存率は、当該技術分野において既知の任意の手段によって決定されることができ、７−ＡＡＤ等の生細胞染色色素の使用を含むが、これに限定されない。正常な細胞膜の存在に起因する７−ＡＡＤを除く総細胞の割合（％）は、総集団の割合（％）として記録される。
【００９８】
細胞生存を測定するためのアッセイは、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｃｒｏｕｃｈら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６０，８１−８）、Ｋａｎｇａｓら（Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．６２，３３８４３，１９８４）、Ｌｕｎｄｉｎら（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３３，２７４２，１９８６）、Ｐｅｔｔｙら（Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｊ．Ｂｉｏｌｕｍ．Ｃｈｅｍｉｌｕｍ．１０，２９−３４，１９９５）、およびＣｒｅｅら（ＡｎｔｉＣａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇｓ  ６：３９８−４０４，１９９５）により説明されている。細胞生存率は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル）−２，５−臭化ジフェニルテトラゾリウム）を含む、多様な方法を使用してアッセイされることができる（Ｂａｒｌｔｒｏｐ，Ｂｉｏｏｒｇ．＆Ｍｅｄ．Ｃｅｈｍ．Ｌｅｔｔ．１：６１１，１９９１、Ｃｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｏｍｍ．３，２０７−１２，１９９１；Ｐａｕｌｌ  Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍ．２５，９１１，１９８８）。細胞生存率のためのアッセイも市販されている。これらのアッセイとしては、ルシフェラーゼ技術を使用してＡＴＰを検出し、培養中の細胞の健康状態または数を定量化する、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、および乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）であるＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率アッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９９】
例示の態様において、細胞集団の細胞の５０％未満が、アポトーシス細胞、すなわち、アポトーシスを経ている細胞である。例示の態様において、細胞集団の細胞の約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、約１０％以下、または約５％以下が、アポトーシス細胞である。薬学的組成物中のアポトーシス細胞の割合は、例えば、限定されないが、ＴＵＮＥＬ（末端デオキシヌクレオチドトランスフェラーゼビオチン−ｄＵＴＰニック末端標識）アッセイ、カスパーゼ活性（特異的にカスパーゼ−３）アッセイ、およびｆａｓリガンドおよびアネキシンＶのアッセイによって決定される。アポトーシスを検出するための市販の製品としては、例えば、Ａｐｏ−ＯＮＥ（登録商標）均一なカスパーゼ−３／７アッセイ、ＦｒａｇＥＬ  ＴＵＮＥＬキット（ＯＮＣＯＧＥＮＥ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ  ＰＲＯＤＵＣＴＳ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＡｐｏＢｒｄＵ  ＤＮＡ断片化アッセイ（ＢＩＯＶＩＳＩＯＮ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）、およびクイックアポトーシスＤＮＡラダー検出キット（ＢＩＯＶＩＳＩＯＮ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。さらに、アポトーシス細胞は、染色質凝縮、細胞収縮、および膜小胞形成を含む特徴的な形態変化によって特徴付けられ、これらは光学顕微鏡を使用して明らかに観察され得る。アポトーシスの生化学的特徴としては、ＤＮＡ断片化、特定の場所でのタンパク質切断、ミトコンドリア膜透過性の増加、および細胞膜表面上のホスファチジルセリンの出現が挙げられる。
【０１００】
例示の態様において、細胞集団のＣＤ３４＋細胞は、機能性ＣＤ３４＋細胞である。例示の態様において、細胞集団のＣＤ３４＋細胞は、短期間（例えば、限定されないが、２日間、３日間、４日間、または５日間）、非凍結温度で（例えば、限定されないが、１〜３０℃）薬学的組成物として貯蔵された後、機能性ＣＤ３４＋細胞である。薬学的組成物中の細胞集団のＣＤ３４＋細胞の機能性は、本明細書において実施例２および３に記載される移動および／またはクローン形成性アッセイ等の当該技術分野において既知の方法によって決定されることができる。いくつかの実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、短期間（例えば、限定されないが、２日間、３日間、４日間、または５日間）、非凍結温度で（例えば、限定されないが、１〜３０℃）貯蔵された後、移動能を呈する。いくつかの態様において、細胞集団中の細胞の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、またはそれ以上が、例えば、薬学的組成物を約１℃〜約３０℃の温度で約１時間〜約５日間、または約２時間、約６時間、約１２時間、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、または約５日間貯蔵した後、ケモカイン勾配移動アッセイにより決定される移動指数を有する。本明細書に記載の移動アッセイで用いる例示のケモカインには、ＳＤＦ−１α（ＣＸＣＬ−１２ａ）およびＳＦＤ−１β（ＣＸＣＬ−１２ｂ）等の間質細胞ケモカインが含まれるが、これらに限定されない。Ａｉｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＥＭ，１８５：１１１−１２０を参照されたい（参照によりその開示全体が本明細書に組み込まれる）。移動能は、試料中の平均ＣＤ３４＋細胞移動事象を負の対照における平均ＣＤ３４＋細胞移動事象で割ったものとして定義される「移動指数」を単位として特徴付けられ得る。例示の態様において、薬学的組成物のＣＤ３４＋細胞は、短期間（例えば、限定されないが、２日間、３日間、４日間、または５日間）、非凍結温度で（例えば、限定されないが、１〜３０℃）貯蔵された後、移動アッセイにより決定される（例えば、限定されないが、実施例２に記載される移動アッセイ）負の対照の移動指数より大きい移動指数を有する。例示の態様において、細胞集団中の細胞の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、またはそれ以上が、短期間（例えば、限定されないが、２日間、３日間、４日間、または５日間）、非凍結温度で（例えば、限定されないが、１〜３０℃）貯蔵された後、移動アッセイにより決定される（例えば、限定されないが、実施例２に記載される移動アッセイ）負の対照の移動指数より大きい移動指数を示す。例示の態様において、移動指数は、実施例２に記載される方法とはわずかに異なる方法で決定される。例えば、移動指数は、これらの細胞によるＣＤ４５発現に関わらず、全てのＣＤ３４＋細胞の数に対して計算され得る。
【０１０１】
例示の態様において、薬学的組成物の細胞集団のＣＤ３４＋細胞は、短期間（例えば、限定されないが、２日間、３日間、４日間、または５日間）、非凍結温度で（例えば、限定されないが、１〜３０℃）薬学的組成物として貯蔵された後、クローン形成能を有する。クローン形成能は、クローン形成アッセイにより測定され得る。細胞のクローン形成能を試験するのに適したアッセイは、当該技術分野において既知であり、本明細書において実施例２および３に記載される。例示の態様において、薬学的組成物の細胞集団のＣＤ３４＋細胞は、短期間（例えば、限定されないが、２日間、３日間、４日間、または５日間）、非凍結温度で（例えば、限定されないが、１〜３０℃）薬学的組成物中に貯蔵された後、クローン形成アッセイにより決定される（例えば、限定されないが、本明細書において実施例２に記載されるコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイ）、クローン形成能を呈する。例示の態様において、薬学的組成物の細胞集団のＣＤ３４＋細胞の少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、またはそれ以上が、短期間（例えば、限定されないが、２日間、３日間、４日間、または５日間）、非凍結温度で（例えば、限定されないが、１〜３０℃）薬学的組成物中に貯蔵された後、クローン形成アッセイ（例えば、限定されないが、本明細書において実施例２に記載されるコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイ）において、コロニーを形成する。
【０１０２】
ある特定の態様において、細胞集団は、ＣＸＣＲ４＋／ＣＤ３４＋を共発現する細胞のサブセットを含む。例えば、いくつかの実施形態において、細胞集団は、約０．１％〜約２０％のＣＸＣＲ４＋／ＣＤ３４＋細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞集団は、約０．５％〜約１５％、または約１％〜約１０％、または約２％〜約８％、または約３％〜約５％、または約１％〜約５％、または約１％〜約２％のＣＸＣＲ４＋／ＣＤ３４＋細胞を含む。いくつかの実施形態において、細胞集団中の細胞の少なくとも０．１％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％が、ＣＸＣＲ＋／ＣＤ３４＋細胞である。
【０１０３】
例示の態様において、ＣＤ３４＋細胞は、ヒトから単離されたＣＤ３４＋細胞である。例示の態様において、ＣＤ３４＋細胞は、ヒトの末梢血から単離されたＣＤ３４＋細胞である。例示の態様において、ヒトは、ＣＤ３４＋細胞が単離される前に、ヒトの骨髄から末梢血へのＣＤ３４＋細胞の動員を促進するように、サイトカインで処置されている。例示の態様において、５０μｇ／ｋｇ未満の総投与量のＧ−ＣＳＦがヒトに投与された。例示の態様において、Ｇ−ＣＳＦは、４．８μｇ／ｋｇ／日〜５．２μｇ／ｋｇ／日の用量で４日間または５日間以下投与された。例示の態様において、ＣＤ３４＋細胞は、新たに単離されたＣＤ３４＋細胞である。例示の態様において、ＣＤ３４＋細胞は、７日間以内、６日間以内、５日間以内、または４日間以内、ドナーの体外に存在している。例示の態様において、薬学的組成物のＣＤ３４＋細胞は、３日間以下または２日間以下、血漿タンパク質および等張液で製剤化された。
【０１０４】
Ｄ．追加の特徴
薬学的組成物は、いくつかの実施形態において、再使用不可能な容器（例えば、シリンジ、バイアル、または袋）の中にパッケージングされる、すぐに使用できる製剤に製剤化される。いくつかの実施形態において、すぐに使用できる製剤は、単位用量の薬学的組成物を含む。例示の態様において、薬学的組成物は、無菌であり、ピロゲンおよび／または内毒素を含まない。
【０１０５】
用途
本明細書に記載される薬学的組成物は、疾患および医学的状態の治療的処置において有用である。したがって、本発明は、追加として、疾患または医学的状態を処置する方法を提供し、その疾患または医学的状態を処置するのに有効な量の本明細書に記載される薬学的組成物のいずれかを患者に投与することを含む。「処置する」という用語、ならびにそこから派生する語は、本明細書において使用される場合、必ずしも標的状態の１００％または完全改善を暗示するとは限らない。むしろ、利益を有するとして当業者が認識する治療効果には様々な程度がある。この点において、本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される医学的状態の任意の量または任意のレベルの治療効果を提供し、したがって、その状態を「処置する」。
【０１０６】
いくつかの態様において、疾患または医学的状態は、慢性心筋虚血、重症虚血肢、末梢動脈疾患、バージャー病、虚血性心疾患、虚血性大腸炎、腸間膜虚血、脳虚血（ｂｒａｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、脳虚血（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）、腎虚血または急性虚血肢である。
【０１０７】
「虚血肢障害」という用語は、一次または二次原因に起因して、不十分なレベルの酸素化された血液が哺乳類の四肢（腕または脚）における組織に送達される、任意の障害または状態を意味する。虚血肢障害は、アテローム性動脈硬化、バージャー病、重症虚血肢、跛行、糖尿病性神経障害、化学療法による神経障害、脳卒中、一過性脳虚血発作、パーキンソン病、および脊椎損傷を含むが、これらに限定されない多くの病的状態および障害と関連付けられる。
【０１０８】
本発明は、対象における虚血によって損傷された組織中の血行再建を媒介する方法、または対象における虚血によって損傷された組織を修復する方法も提供する。この方法は、本明細書に記載される薬学的組成物のいずれかを、損傷した組織中の血管の発生を増加させるのに効果的な量、または対象における組織を修復するのに効果的な量で投与することを含む。いくつかの実施形態において、この方法は、損傷した組織中の微小血管の発生の増加をもたらす。「虚血によって損傷される組織」という表現は、酸素化された血液を組織に供給する動脈の狭窄または閉塞等の血管障害に起因する酸素欠乏（「低酸素症」とも呼ばれる）を有する任意の組織を意味する。欠陥障害は、血液または血管の不全をもたらし、脳血管虚血（例えば、限定されないが、脳卒中）、腎虚血、肢虚血（循環障害または肢再接合術に起因する）、および臓器虚血（例えば、限定されないが、移植された臓器）を含むが、これらに限定されない多数の部位のうちのいずれか１つにおいて虚血を引き起こし得る。いくつかの実施形態において、虚血によって損傷された組織としては、心筋組織、大腸、小腸、脳組織、腎組織、および肝組織が挙げられるが、これらに限定されない。例示の態様において、虚血によって損傷された組織は、心臓組織、大腸組織、小腸組織、脳組織、四肢組織、腎組織、または皮膚組織である。
【０１０９】
虚血の予防、軽減、および／または処置を必要とする個体は、上に列挙されるもの等の組織虚血状態を有する傾向があるか、有すると疑われるか、または有することが知られている。例えば、臓器移植、化学療法処置、糖尿病、または循環を損傷する他の状態に起因する循環障害のある個体は、そのような組織が直接観測されない場合でも虚血を有する傾向があるか、または有すると疑われ得る。臓器移植後の組織も、虚血の傾向があり得る。心血管病および糖尿病のある個体は、虚血の傾向があり得る。
【０１１０】
薬学的組成物がＣＤ３４＋細胞を含むいくつかの態様において、方法は、虚血と闘うための血管新生促進効果；細胞、組織、および／または臓器再生；創傷の治癒；分化；血液供給の再構成；アポトーシスの減少；パラ分泌シグナル伝達；および免疫調節等であるが、これらに限定されない治療効果を提供することを含む。ＣＤ３４およびＣＤ２７１に配向される抗体を使用する正の選択手順を使用して、細胞が選択されるいくつかの態様において、この方法は、炎症を処置する。薬学的組成物がＣＤ３４＋細胞を含む態様において、この方法は、抗アポトーシス効果を提供する。
【０１１１】
例示の態様において、本発明の方法に関して、ＣＤ３４＋細胞は自家性細胞であり得、すなわち、ＣＤ３４＋細胞が単離されたドナーは、処置されている対象または患者と同一の個体である。例示の態様において、薬学的組成物のＣＤ３４＋細胞は、対象への投与の２日、３日、４日、５日、６日または７日より多く経ない前に対象から単離された。例示の態様において、対象は、細胞の単離前にサイトカインを投与された。例示の態様において、対象は、ＣＤ３４＋細胞が対象から単離される前に、５０μｇ／ｋｇ未満の総投与量でＧ−ＣＳＦを投与された。例示の態様において、Ｇ−ＣＳＦは、４．８μｇ／ｋｇ／日〜５．２μｇ／ｋｇ／日の用量で（例えば、限定されないが、約５±１０％μｇ／ｋｇ／日の用量）、ＣＤ３４＋細胞が対象から単離される直前に４日または５日を超えない間、対象に投与された。
【０１１２】
投与の経路
いくつかの実施形態において、細胞を含む薬学的組成物は、非経口投与、皮下投与、静脈内投与、筋内投与、動脈内投与、髄腔内投与、または腹腔内投与のために製剤化される。他の実施形態において、薬学的組成物は、経鼻、噴霧、経口、エアロゾル、直腸、または膣投与を介して投与される。
【０１１３】
細胞を投与する方法は、当該技術分野において既知である。例えば、米国特許第５４２３７７８号、第５５５００５０号、第５６６２８９５号、第５８００８２８号、第５８００８２９号、第５８１１４０７号、第５８３３９７９号、第５８３４００１号、第５８３４０２９号、第５８５３７１７号、第５８５５６１９号、第５９０６８２７号、第６００８０３５号、第６０１２４５０号、第６０４９０２６号、第６０８３５２３号、第６２０６９１４号、第６３０３１３６号、第６３０６４２４号、第６３２２８０４号、第６３５２５５５号、第６３６８６１２号、第６４７９２８３号、第６５１４５２２号、第６５３４０５２号、第６５４１０２４号、第６５５１３３８号、第６５５１６１８号、第６５６９１４７号、第６５７９３１３号、第６５９９２７４号、第６６０７５０１号、第６６３０４５７号、第６６４８８４９号、第６６５９９５０号、第６６９２７３８号、第６６９９４７１号、第６７３６７９９号、第６７５２８３４号、第６７５８８２８号、第６７８７３５７号、第６７９０４５５号、第６８０５８６０号、第６８５２５３４号、第６８６３９００号、第６８７５４４１号、第６８８１２２６号、第６８８４４２７号、第６８８４４２８号、第６８８６５６８号、第６９１８８６９号、第６９３３２８１号、第６９３３２８６号、第６９４９５９０号、第６９６０３５１号、第７０１１８２８号、第７０３１７７５号、第７０３３３４５号、第７０３３６０３号、第７０４９３４８号、第７０７０５８２号、第７０７４２３９号、第７０９７８３２号、第７０９７８３３号、第７１３５１７２号、第７１４５０５５号、第７１５７０８０号、第７１６６２８０号、第７１７６２５６号、第７２４４２４２号、第７４５２５３２号、第７４７０４２５号、および第７４９４６４４号を参照されたい（参照によりそれらの開示全体が組み込まれる）。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、傷害組織に直接送達される。薬学的組成物は、注射によるか、または代替送達方法によって、虚血組織の中心、境界領域、または近隣区域（例えば、限定されないが、心筋、冠状血管、または末梢血管）の中に任意に投与される。一態様において、薬学的組成物は、慢性虚血において見出される組織等のかん流の不十分な組織に送達される。そのような組織としては、虚血組織、心筋組織、血管組織、またはこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。別の態様において、細胞は、付近の組織区域、または薬学的組成物の細胞が虚血組織に移動できるようにするのに十分な距離内の組織区域に導入され得る。
【０１１５】
非経口
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される薬学的組成物は、非経口投与のために製剤化される。非経口投与としては、静脈内、動脈内、筋内、脳内、脳血管内、心臓内、皮下、骨内、皮内、髄腔内、腹腔内、膀胱内、および陰茎海綿体内注入および点滴が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１６】
非経口投与に適した製剤としては、抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬、および製剤を意図される受容体の血液と等張にする溶質を含有することができる水性および非水性の等張無菌注射液、および懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含むことができる水性および非水性の無菌懸濁剤が挙げられる。薬学的組成物は、様々な態様において、薬学的担体中の生理学的に許容される希釈剤、例えば、無菌液または液体の混合（水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液、グリコール（例えば、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコール）、グリセロール、エーテル、ポリ（エチレングリコール）４００、油、脂肪酸、脂肪酸エステルもしくはグリセリド、または薬学的に許容される界面活性剤の添加を伴うか、もしくは伴わないアセチル化脂肪酸グリセリド（例えば、石鹸または洗剤）、懸濁剤（例えば、ペクチン、カルボマー、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、もしくはカルボキシメチルセルロース）、または乳化剤、および他の薬学的補助剤を含む）を介して投与される。
【０１１７】
非経口製剤中で任意に使用される油としては、石油、動物油、植物油、または合成油が挙げられる。油の特定の例としては、ピーナッツ、大豆、ゴマ、綿実、コーン、オリーブ、石油、および鉱物が挙げられる。非経口製剤における使用に適した脂肪酸としては、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびピリスチン酸イソプロピルは、適切な脂肪酸エステルの例である。
【０１１８】
いくつかの実施形態中の非経口製剤は、保存剤または緩衝剤を含有する。注入部位における刺激を最小化または排除するために、そのような組成物は、任意に、約１２〜約１７の親水親油バランス（ＨＬＢ）を有する１つ以上の非イオン性界面活性剤を含有する。そのような製剤中の界面活性剤の量は、典型的に、約５重量％〜約１５重量％の範囲である。適した界面活性剤としては、ポリエチレングリコールソルビタン脂肪酸エステル、例えば、モノオレイン酸ソルビタン、および酸化プロピレンのプロピレングリコールとの縮合によって形成される、疎水性塩基を含む酸化エチレンの高分子量付加物が挙げられる。非経口製剤は、様々な態様において、単一用量または多用量の密封容器（例えば、アンプルおよびバイアル）中に存在し、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）状態で貯蔵されることができ、注入のために、使用直前に無菌液体賦形剤（例えば、水）の添加のみを必要とする。即席の注射液および懸濁液は、ある特定の態様において、前述の種類の滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製される。
【０１１９】
注射用製剤は、本発明に従う。注射用組成物に対して効果的な薬学的担体の要件は、当業者に周知である（例えば、限定されないが、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ  ａｎｄ  Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ  ２３８−２５０（１９８２）、およびＡＳＨＰ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｎ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，ｐａｇｅｓ  ６２２−６３０（１９８６）を参照されたい）。
【０１２０】
細胞送達マトリックス
本明細書に記載される方法を通じて得られる細胞（本明細書に記載される方法によって骨髄から末梢血に最初に動員されたＣＤ３４＋細胞を含む）は、任意に、細胞送達マトリックスを介して投与される。細胞送達マトリックスは、ある特定の実施形態において、コラーゲン、フィブリン、キトサン、マトリゲル、ポリエチレングリコールを含むポリマーおよびヒドロゲル、化学的に架橋性または光架橋性デキストランを含むデキストラン等のうちのいずれか１つ以上を含む。ある特定の実施形態において、細胞送達マトリックスは、コラーゲン（収縮および非収縮コラーゲンゲルを含む）、例えば、限定されないが、フィブリン、アルギニン酸塩、アガロース、ゼラチン、ヒアルロン酸塩、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むヒドロゲル、デキストラン（化学架橋、光架橋、または双方に適したデキストランを含む）、アルブミン、ポリアクリルアミド、ポリグリコール酸、塩化ポリビニル、ポリビニルアルコール、ポリ（ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、親水性ポリウレタン、アクリル誘導体、プルロン（例えば、酸化ポリプロピレンおよび酸化ポリエチレンコポリマー）、３５／６５ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）／ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、Ｐａｎａｃｒｙｌ（登録商標）生体吸収性構成体、Ｖｉｃｒｙｌ（登録商標）ポリグラクチン９１０、および自己集合性ペプチド、および非吸収性材料（例えば、フルオロポリマー（例えば、限定されないが、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）フルオロポリマー）、プラスチック、および金属のうちの１つ以上を含む。
【０１２１】
いくつかの例において、マトリックスは、非分解性材料を含み、例えば、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリ（ブチレンテレフタレート）（ＰＢＴ）、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、シリコーン等、または選択的に分解性の材料、例えば、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体、ＰＬＧＡ）、ＰＬＡ、もしくはＰＧＡであるが、これらに限定されない。（Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２１：２３３５  ２３４６，２０００、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｍａｒｃｈ／Ａｐｒｉｌ  １９９８，ａｔ  ｐａｇｅｓ  ３０  ３７、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｄｏｍｂ，Ｋｏｓｔ，ａｎｄ  Ｄｏｍｂ，ｅｄｓ．，１９９７，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ；Ｒｏｇａｌｌａ，Ｍｉｎｉｍ．Ｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｓｕｒｇ．Ｎｕｒｓ．１１：６７６９，１９９７、Ｋｌｅｉｎ，Ｆａｃｉａｌ  Ｐｌａｓｔ．Ｓｕｒｇ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒ．９：２０５  １８，２００１、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｕｒｇ．Ｏｎｃｏｌ．１１：３３７  ３９，１９８５、Ｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５４：８１２  １５，１９９５、Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．４３：４２２  ２７，１９９８、およびＫｕｉｊｐｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５１：１３６４５，２０００を参照されたい）。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、マトリックスは、生体適合性の足場、格子、自己集合構造等、生体適合性か否かに関わらず、液体、ゲル、または固体を含む。そのようなマトリックスは、治療的細胞処置、外科的修復、組織工学、および創傷治癒の技術分野において既知である。ある特定の態様において、マトリックスは、ＣＤ３４＋細胞で前処置される。他の実施形態において、マトリックスは、そのマトリックスまたはその空間に密接に関連しているＣＤ３４＋細胞が集合している。ＣＤ３４＋細胞は、マトリックスに付着することができるか、またはマトリックス空間内に捕捉または含有されることができる。ある特定の態様において、細胞がマトリックスと密接に関連して成長するマトリックス−細胞複合体は、治療的に使用されるとき、患者自身の腎細胞の成長、修復、および／または再生が刺激および支持され、適切な血管形成が同様に刺激または支持される。マトリックス−細胞組成物は、当該技術分野において既知の任意の方法で、患者の体内に導入されることができ、移植、注入、外科的取り付け、他の組織を用いた移植等を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、マトリックスは、インビボ、またはさらにより好ましくは、原位置で形成し、例えば、原位置重合性ゲルは本発明に従って使用され得る。そのようなゲルの例は、当該技術分野等において既知である。
【０１２３】
細胞は、いくつかの実施形態において、足場、泡、またはヒドロゲル等の３次元フレームワークまたはマトリックス上に播種され、適宜投与される。フレームワークは、ある特定の態様において、実質的に平坦、実質的に円筒形もしくは管状等の様々な形状に構成されるか、または考慮下の補正構造に必要とされ得るか、もしくは所望され得るように、完全に自由形態であり得る。２つ以上の実質的に平坦なフレームワークは、いくつかの態様において、別のフレームワークの上に置かれ、多層フレームワークを生成するために必要に応じて一緒に固定される。
【０１２４】
マトリックス、例えば、本発明の態様に使用され得る足場の例としては、マット（織り、編み、およびより好ましくは不織）、多孔性または半多孔性の発泡体、自己集合ペプチド等が挙げられる。不織マットは、例えば、天然または合成ポリマーからなる繊維を使用して形成され得る。いくつかの実施形態において、商品名ＶＩＣＲＹＬ（登録商標）（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，Ｎ．Ｊ．）で販売されるグリコール酸および乳酸の吸収性コポリマー（ＰＧＡ／ＰＬＡ）を使用して、マットを形成する。米国特許第６，３５５，６９９号に論じられる、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）等の処理によって形成される、ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーからなる発泡体は、足場として機能することもできる。ゲルは、本明細書において使用される場合、適切なマトリックスも形成する。例としては、例えば、自己集合ペプチドからなる原位置重合性ゲルおよびヒドロゲルが挙げられる。これらの材料は、いくつかの態様において、組織の成長のための支持体として使用される。原位置形成分解性ネットワークも、本発明における使用に適している（例えば、限定されないが、Ａｎｓｅｔｈ，Ｋ．Ｓ．ｅｔａｌ．，２００２，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７８：１９９−２０９、Ｗａｎｇ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２４：３９６９−３９８０、Ｈｅらへの米国特許公開第２００２／００２２６７６号を参照されたい）。これらの材料は、いくつかの態様において、注入に適した流体として製剤化された後、多様な方法によって誘導され（例えば、限定されないが、温度の変化、ｐＨ、光への曝露）、原位置またはインビボで分解性ヒドロゲルネットワークを形成し得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、フレームワークは、生体適合性材料（例えば、限定されないが、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンド、またはヒアルロン酸）から作製されたマルチフィラメント糸からなるフエルトである。この糸は、ある特定の態様において、圧着、切断、梳綿、および穿刺からなる標準繊維加工技術を使用して、フエルトにされる。ＣＤ３４＋細胞は、ある特定の態様において、複合構造であり得る発泡体足場の上に播種される。加えて、３次元フレームワークは、いくつかの態様において、修復、置換、または増補される虚血組織中またはその周囲に、特定構造等の有用な形状で成形される。
【０１２６】
フレームワークは、ある特定の態様において、細胞付着を強化するために、ＣＤ３４＋細胞の接種前に処置される。例えば、細胞を接種する前に、ナイロンマトリックスを０．１モル酢酸で処置し、ポリリジン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲン中でインキュベートして、ナイロンをコーティングする。ポリスチレンは、いくつかの態様において、硫酸を使用して同様に処置される。
【０１２７】
追加の実施形態において、３次元フレームワークの外面は、フレームワークの血漿コーティング、または例えば、１つ以上のタンパク質（例えば、限定されないが、コラーゲン、弾性線維、細網線維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、限定されないが、硫酸ヘパリン、コンドロイチン−４−硫酸塩、コンドロイチン−６−硫酸塩、デルマタン硫酸塩、ケラチン硫酸塩）、細胞マトリックス、および／または他の材料（中でも、限定されないが、ゼラチン、アルギニン酸塩、アガー、アガロース、および植物ゴム等）の添加によって、細胞の付着または成長、および組織の分化を改善するように修飾される。
【０１２８】
足場は、いくつかの実施形態において、それを非血栓形成性にする材料を含む。これらの材料は、ある特定の実施形態において、内皮成長、移動、および細胞外マトリックス沈積を促進および維持する。そのような材料の例としては、天然材料（例えば、ラミニンおよびＩＶ型コラーゲン等の基底膜タンパク質）、合成材料（例えば、ｅＰＴＦＥ）、およびセグメント化ポリウレタン尿素シリコーン（例えば、ＰＵＲＳＰＡＮ（登録商標）（Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられるが、これらに限定されない。これらの材料は、足場を非血栓形成性にするようにさらに処置されることができる。そのような処置としては、ヘパリン等の抗血栓薬、および血漿コーティング等の材料の表面電荷を変える処置が挙げられる。
【０１２９】
細胞を含む薬学的組成物は、ある特定の実施形態において、本明細書に記載される成分のいずれかを含む、細胞送達マトリックスの成分のいずれかを含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、幹細胞を含む。幹細胞の虚血傷害のある動物への投与は、米国特許第５，９８０，８８７号に記載されている。
【０１３１】
本発明の態様において、薬学的組成物は、ＣＤ３４＋細胞を含む。処理試薬の全てまたは実質的に全てを欠く強化されたＣＤ３４＋細胞混合物は、次いで、患者への治療的注入に適した媒体中に置かれ得る。そのような培地は、一般に当業者に既知であり、灌流液、細胞培養液等が挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの態様において、ＣＤ３４＋細胞は、いくつかの手段のうちの１つによって患者に送達される。いくつかの実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、筋肉内、腹腔内、頭蓋内、血管内、静脈内、破砕または折れた骨または軟骨等の組織成分間に送達される。
【０１３２】
可能な細胞送達オプションとしては、直接注入（針およびシリンジ）；注入カテーテル（深層組織）；表面への噴霧；任意に生体足場（内部および外部の双方）と併せて予め作られたフィブリンを（皮下または組織層内の深部に）埋め込むことが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の態様において、送達のための標的身体部位は、心臓、四肢、眼、脳、腎臓、神経、肝臓、腎臓、心臓、肺、眼、消化管の臓器、皮膚、および脳であり得る。
【０１３３】
制御放出製剤
薬学的組成物は、ある特定の態様において、デポー形態に改変され、薬学的組成物が、それが投与される身体の中に放出される様式が、時間および体内の場所に関して制御されるようにする（例えば、米国特許第４，４５０，１５０号を参照されたい）。デポー形態は、様々な態様において、細胞集団を含む埋め込み型組成物、およびポリマー等の多孔性または非多孔性材料であり、細胞集団は、残量全体への分散および／または非多孔性材料の分解によってカプセル化される。このデポーは、次いで、体内の所望の場所に埋め込まれ、細胞集団は、既定の速度でインプラントから放出される。
【０１３４】
したがって、薬学的組成物は、ある特定の態様において、任意の種類のインビボ放出プロファイルを有するように修飾される。本発明のいくつかの態様において、薬学的組成物は、即時放出、制御放出、持続放出、長期放出、遅延放出、または二相放出製剤である。
【０１３５】
用量
本明細書における目的のために、投与される薬学的組成物の量または用量は、例えば、限定されないが、治療的または予防的応答を、対象または動物において相応の時間枠にわたって生じさせるのに十分である。例えば、薬学的組成物の用量は、投与の時点から約１２時間、約１８時間、約１〜４日間以上、例えば、限定されないが、５日間、６日間、１週間、１０日間、２週間、１６〜２０日間、またはそれ以上の期間に、疾患または医学的状態を処置または予防するのに十分である。ある特定の実施形態において、この期間はさらに長い。用量は、特定の薬学的組成物の有効性、および受容体（または患者）の状態、ならびに処置される受容体受容体（または患者）の体重によって決定される。
【０１３６】
投与される用量を決定するための多くのアッセイは、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態において、それぞれが異なる用量の細胞を付与される哺乳類群の中の哺乳類に、指定用量のそのような細胞を投与するときに、細胞集団の細胞が損傷部位に局限される程度を比較することを含むアッセイを使用して、哺乳類に投与される開始用量を決定する。ある用量の投与時に細胞が損傷部位に局限される程度は、当該技術分野において既知の方法によってアッセイされることができる。
【０１３７】
それぞれが異なる用量の細胞を付与される哺乳類群の中の哺乳類に、指定用量のそのような細胞を投与するときに、細胞が損傷した後肢の再かん流を引き起こす程度を比較することを含むアッセイも使用して、哺乳類に投与される開始用量を決定する。ある用量の投与時に、細胞が損傷した後肢の再かん流を引き起こす程度は、当該技術分野において既知の方法によってアッセイされることができ、本明細書に記載される。
【０１３８】
薬学的組成物の用量は、特定の薬学的組成物の投与を伴い得る、任意の有害な副作用の存在、性質、および程度によっても決定される。典型的に、担当医は、年齢、体重、一般的な健康、食事、性別、投与される薬学的組成物の治療薬（複数可）（例えば、限定されないが、細胞）、投与経路、および処置される状態の重症度等の様々な要素を考慮して、それぞれの個別患者を処置するための薬学的組成物の投与量を決定する。例として、本発明を限定するものではないが、薬学的組成物の用量は、少なくとも約０．５×１０６個の細胞が、患者に投与されるようなものであり得る。いくつかの実施形態において、少なくとも約１×１０６、少なくとも約１．１×１０６、少なくとも約１．２×１０６、少なくとも約１．３×１０６、少なくとも約１．４×１０６、少なくとも約１．５×１０６、少なくとも約１．６×１０６、少なくとも約１．７×１０６、少なくとも約１．８×１０６、少なくとも約１．９×１０６、少なくとも約２×１０６、少なくとも約２．１×１０６、少なくとも約２．２×１０６、少なくとも約２．３×１０６、少なくとも約２．４×１０６、少なくとも約２．５×１０６、少なくとも約２．６×１０６、少なくとも約２．７×１０６、少なくとも約２．８×１０６、少なくとも約２．９×１０６、少なくとも約３．０×１０６、少なくとも約３．１×１０６、少なくとも約３．２×１０６、少なくとも約３．３×１０６、少なくとも約３．４×１０６、少なくとも約３．５×１０６、少なくとも約３．６×１０６、少なくとも約３．７×１０６、少なくとも約３．８×１０６、少なくとも約３．９×１０６、少なくとも約４．０×１０６、少なくとも約４．１×１０６、少なくとも約４．２×１０６、少なくとも約４．３×１０６、少なくとも約４．４×１０６、少なくとも約４．５×１０６、少なくとも約４．６×１０６、少なくとも約４．７×１０６、少なくとも約４．８×１０６、少なくとも約４．９×１０６、少なくとも約５．０×１０６、少なくとも約５．５×１０６、少なくとも約６．０×１０６、少なくとも約６．５×１０６、少なくとも約７．０×１０６、少なくとも約７．５×１０６、少なくとも約８．０×１０６、少なくとも約８．５×１０６、少なくとも約９．０×１０６、少なくとも約１０７、少なくとも約１０８個の細胞が、患者に投与される。
【０１３９】
投与のタイミング
例示の態様において、薬学的組成物は１日１回、２日に１回、３日に１回、４日に１回、５日に１回、６日に１回、７日に１回、８日に１回、９日に１回、１０日に１回、１１日に１回、１２日に１回、１３日に１回、１４日に１回、１５日に１回、１６日に１回、１７日に１回、１８日に１回、１９日に１回、２０日に１回、２１日に１回、２２日に１回、２３日に１回、２４日に１回、２５日に１回、２６日に１回、２７日に１回、２８日に１回、２９日に１回、３０日に１回、または３１日に１回投与される。
【０１４０】
例示の態様において、薬学的組成物は、細胞がドナーから単離された時点に関して、ある時点で投与される。例示の態様において、薬学的組成物は、細胞がドナーから単離された日の後、１日を超えない、２日を超えない、３日を超えない、４日を超えない、５日を超えない、６日を超えない、または７日を超えない時点で投与される。例示の態様において、薬学的組成物は、細胞がドナーから単離されたのと同日に投与される。
【０１４１】
例示の態様において、薬学的組成物は、細胞が薬学的組成物に製剤化され、再使用不可能な容器に充填された時点に関して、ある時点で投与される。例示の態様において、薬学的組成物は、細胞が薬学的組成物に製剤化され、再使用不可能な容器に充填された日の後、１日を超えない、２日を超えない、３日を超えない、４日を超えない、５日を超えない、６日を超えない、または７日を超えない時点で投与される。例示の態様において、薬学的組成物は、細胞が薬学的組成物に製剤化され、再使用不可能な容器に充填されたのと同日に投与される。
【０１４２】
例示の態様において、薬学的組成物は、処置される損傷が発生した時点に関して、ある時点で投与される。例示の態様において、薬学的組成物は、損傷直後に投与される。本発明のある特定の実施形態において、薬学的組成物の投与は遅延され、つまり、細胞は、傷害直後に投与されない（例えば、限定されないが、傷害後約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、または約１２時間）。
【０１４３】
本発明のいくつかの態様において、薬学的組成物は、傷害から少なくとも約１２時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約２５時間、少なくとも約２６時間、少なくとも約２８時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３２時間、少なくとも約３４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約３８時間、少なくとも約４０時間、少なくとも約４２時間、少なくとも約４４時間、少なくとも約４６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約５０時間、少なくとも約５２時間、少なくとも約５４時間、少なくとも約５６時間、少なくとも約５８時間、少なくとも約６０時間、少なくとも約６２時間、少なくとも約６４時間、少なくとも約６６時間、少なくとも約６８時間、少なくとも約７０時間、または少なくとも約７２時間後に患者に投与される。
【０１４４】
さらなる実施形態において、薬学的組成物は、上記の時点で、および傷害後約１４日間より前、約１３日間より前、約１２日間より前、約１１日間より前、約１０日間より前、約９日間より前、約８日間より前、約７日間より前、約６日間より前、約５日間より前、約４日間より前、または３日間より前に患者に投与される。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、傷害後約２４時間、またはそれからしばらく後であるが、傷害後約１４日間より前に患者に投与される。
【０１４５】
いくつかの態様において、薬学的組成物は、傷害後「Ｘ」時間より後、および障害後「Ｙ」時間より前に投与され、「Ｘ」は、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間、約２５時間、約２６時間、約２７時間、約２８時間、約２９時間、約３０時間、約３１時間、約３２時間、約３３時間、約３４時間、約３５時間、約３６時間、約４０時間、約４８時間、約５２時間、約５８時間、約６４時間、約７２時間、約３．５日、約４日、約５日、約６日、約１週間、約８日、約９日、約１０日からなる群から選択され、「Ｙ」は、約１６日、約１５日、約１４日、約１３日、約１２日、約１１日、約１０日、約９日、約８日、約１週間からなる群から選択され、「Ｘ」は「Ｙ」より短い。本発明のいくつかの態様において、薬学的組成物は、傷害後約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、約２４時間に投与される。
【０１４６】
本発明のいくつかの実施形態において、薬学的組成物は、複数回患者に投与される。薬学的組成物は、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１週間に１回、２、３、４、５、６、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日に１回、または１ヶ月に１回投与され得る。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、傷害後約２４時間以後に投与され、傷害後約４８時間以後に投与される。例示の態様において、投与間のタイミングは、患者における医学的状態が改善するにつれて、または損傷した組織が修復されるにつれて変化する。
【０１４７】
複合体
本発明のいくつかの実施形態において、細胞集団は、例えば、治療薬または診断薬等の第２の部分に付着または結合される。これらの実施形態の細胞集団中の１つ以上の細胞は、それらの細胞が虚血組織に特異的に局限することができるため、標的薬剤として作用する。したがって、本発明は、一態様において、治療薬または診断薬に付着された細胞集団のうちの１つ以上の細胞を含む組成物を提供する。本明細書の目的に適した治療薬および診断薬は、当該技術分野において既知であり、限定されないが、本明細書に記述されるもののいずれかを含む。
【０１４８】
組み合わせ
複合体を含む本明細書に記載される薬学的組成物は、いくつかの実施形態において、それ自体が投与される。他の実施形態において、複合体を含む薬学的組成物は、他の治療薬または診断薬と併せて投与される。いくつかの実施形態において、薬学的組成物は、他の治療薬と併せて投与され、それらは抗血栓薬、抗アポトーシス薬、抗炎症薬、免疫抑制剤（例えば、限定されないが、シクロスポリン、ラパマイシン）、抗酸化剤、または腎臓の損傷または疾患を処置するために当該技術分野において通常使用される他の薬剤（例えば、エプロディセートおよびトリプトリド）、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤（例えば、限定されないが、シムバスタチン、プラバスタチン、ロバスタチン、フルバスタチン、セリバスタチン、およびアトルバスタチン）、細胞溶解物、可溶性細胞分画、膜富化された細胞分画、細胞培養培地（例えば、限定されないが、馴化培地）、または細胞外マトリックス栄養因子を含むが、これらに限定されない。
【０１４９】
ある特定の実施形態において、細胞集団のサブセットは、分化全能性幹細胞、多能性幹細胞、造血幹細胞、および任意の他の幹細胞からなる群から選択される他の幹細胞と合わされる。いくつかの実施形態において、細胞集団のサブセットは、非造血幹細胞（限定されないが、間葉細胞等）と合わされる。細胞は、いくつかの実施形態において、足場（限定されないが、フィブリン、コラーゲン、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）と合わされる。
【０１５０】
選択された細胞は、いくつかの実施形態において、様々な成長因子または他の生物活性剤と合わせて使用される。それらは、上方または下方調節剤として使用するために、遺伝子療法を使用して修飾され得る。
【０１５１】
患者のタイプ
本明細書に記載される発明の方法に関して、患者は任意の宿主である。いくつかの実施形態において、宿主は哺乳類である。本明細書において使用される場合、「哺乳類」という用語は、哺乳類群の任意の脊椎動物を指し、単孔類、有袋類、および胎盤分類群のうちのいずれかを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、哺乳類は、マウスおよびハムスター等の齧歯目の哺乳類、およびウサギ等のウサギ目の哺乳類のうちの１つである。ある特定の実施形態において、哺乳類は、ネコ科（ネコ）およびイヌ科（イヌ）を含む食肉目に由来する。ある特定の実施形態において、哺乳類は、ウシ科（ウシ）およびブタ科（ブタ）を含む偶蹄目、またはウマ科（ウマ）を含む奇蹄目に由来する。いくつかの例において、哺乳類は、霊長目、オマキザル（Ｃｅｂｏｉｄｓ）、もしくはシモイズ（Ｓｉｍｏｉｄｓ）（サル）、または類人目（ヒトおよび類人猿）に由来する。特定の実施形態において、哺乳類はヒトである。
【０１５２】
以下の実施例は、単に本発明を説明するために示され、いかなる方法においてもその範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１５３】
実施例１−ＣＤ３４＋細胞の動員
以下の実施例は、慢性心筋虚血を患うヒト対象におけるＣＤ３４＋細胞の動員に影響を及ぼす要素およびパターンを評価した。
【０１５４】
方法：もはや外科的または介入血行再建術の候補でない慢性心筋虚血（ＣＭＩ）対象（ｎ＝１６７）を、５μｇ／ｋｇ／日の用量で５日間のＧ−ＣＳＦの皮下注射で動員した。末梢血ＣＤ３４＋細胞レベルは、４日目および５日目にフローサイトメトリーを使用して測定した。
【０１５５】
大腿部または頸静脈に配置されたカテーテルを介して、５日目に単一アフェレーシス手順を行った。処理された全血液量（ＴＢＶ）の数は、２〜５の範囲であり、各対象の５日目の末梢血ＣＤ３４＋細胞レベルに基づいて、良好な動員剤の場合に回収時間を最小化し、不良な動員剤から回収されたＣＤ３４＋細胞の数を最大化した。目的は、各対象が潜在的に最高用量の５０００万個のＣＤ３４＋細胞にランダム化するために適切な細胞を有するという目標の下、後次の富化および放出試験に十分なＣＤ３４＋細胞をアフェレーシス単核分画中で採取することであった。３名を除くすべての対象が、５用量のＧ−ＣＳＦを受けた。異なるアフェレーシスデバイスを２２名の対象に使用したところ、全血流量がわずかに変動したが、主な変数は、アフェレーシス中に処理された全血液量の数であった。
【０１５６】
アフェレーシスＭＮＦは、機能的に閉じた自動化されたＩＳＯＬＥＸ３００ｉを使用して、ＣＤ３４＋細胞に対し富化された。ＣＤ３４＋生成物は、遠心分離を介して手動で減容され、約２ｍＬの０．９％正常生理食塩水、５％自家性血漿を含有するＵＳＰ中に再懸濁された。１００μＬの試料を、追加の生理食塩水＋５％自家性血漿中で２ｍＬに希釈された。アリコートは、総細胞数、ヘマトクリット、ＣＤ３４＋列挙、総細胞生存率、およびグラム染色からなる遊離試験に送られた。他のアリコートが、内毒素および微生物試験のために調製され、中核施設に輸送された。対象ランダム化を開始し、１ｃｃシリンジの細胞またはプラセボが、それぞれ０．２ｍＬの１０回の注入を可能にするように調製された。
【０１５７】
統計分析：単回帰を使用して、表１のパラメータと、動員された細胞の数との間の直線関係について検証した。ｐ値は、傾斜が０であるという仮説を検証する。表１は、各パラメータの平均および標準偏差を、動員されたＣＤ３４＋細胞の数の４つのカテゴリー別に報告する。表２に要約される連続パラメータ（年齢およびＢＭＩ）に対し、同一の分析を行った。一元配置分散分析（ＡＯＶ）を、カテゴリーパラメータ（性別、喫煙状態、および糖尿病状態）に関して行った。この分析は、動員されたＣＤ３４＋細胞の数が、異なるレベルのカテゴリーパラメータ（男性対女性、喫煙者対非喫煙者、導尿病患者対非糖尿病患者、およびインスリン糖尿病対非インスリン糖尿病）に対し等しいという仮説を検証する。ＡＯＶを使用して、表５の鬱血性心不全（ＣＨＦ）の履歴のある対象、および履歴のない対象に対し、等しい平均レベルの純度および収率を検証した。共分散の分析を使用して、表６のパラメータと動員されたＣＤ３４＋の数との間の直線関係が、ＣＨＦの履歴のある対象およびＣＨＦの履歴のない対象において類似するかどうかを検証した。ポアソン回帰を使用して、処理された２または３の計画ＴＢＶおよび処理された４または５の計画ＴＢＶを持つ対象における等比率のＭＡＣＥについて検証した。フィッシャーの直接確率検定を使用して、処理された２〜３ＴＢＶと４〜５ＴＢＶとの間に少なくとも１つのＭＡＣＥを持つ等数の対象について検証した。
【０１５８】
結果：全体研究群は、平均年齢６１（±８．９）歳および平均体格指数（ＢＭＩ）３２．０（±５．７）の４１〜９１歳の範囲の男性８７％および女性１３％かなった。１０％は現在の喫煙者であり、６３％は前喫煙者であり、２７％は喫煙の履歴がなかった。対象の４７％は、糖尿病の履歴がなく、残りの５３％は、インスリン依存性（ｎ＝４３）糖尿病、または非インスリン依存性（ｎ＝４５）糖尿病のいずれかであった。
【０１５９】
高血圧、心筋梗塞、鬱血性心不全、頻脈、心膜液貯留、またはペースメーカーの履歴は、個体がＣＤ３４＋細胞を動員する能力に大きな影響を及ぼさなかった。アフェレーシスに対するＴＢＶの標的数を決定するために、臨床プロトコルにおいてデータが層別化されたときにも、同等の関係が観察された。
【０１６０】
結果は、より高い血小板数が、ベースラインのみならず、動員期間全体で良好な動員と相関したことを示した。動員の４日目および５日目まで、増加した白血球数は、ＣＤ３４動員と正に相関したが、単核細胞％（ＭＮＣ）は、不良な動員剤と良好な動員剤との間で異ならなかった。以下の表１を参照されたい。
【表１】
2015508101.tif 000003
【０１６１】
対象の７５％が、１５のＣＤ３４＋細胞／μＬ全血以上を動員することができ、４以下のＴＢＶ（表２）のアフェレーシスを必要とし、アフェレーシス生成物中に平均合計１９７×１０６個のＣＤ３４＋細胞をもたらす。１５のＣＤ３４＋細胞／μＬ全血未満を持つ対象は、５ＴＢＶをアフェレーシスし、アフェレーシス生成物中に平均合計７６×１０６個のＣＤ３４＋細胞をもたらす。
【０１６２】
【表２】
2015508101.tif 000004
【０１６３】
分析の一部として、他の心血管状態の影響を評価したところ、特に大量の（４〜５ＴＢＶ）白血球除去輸血を必要とする対象において、ＣＨＦの履歴は、処置後のフォローアップ中の心臓有害事象率の増加と関連付けられることを実証した。結果は、ＣＨＦの履歴のある対象または履歴のない対象の動員データが、わずかな数値差を示すが、その差は統計的に有意でなかったことを示した。
【０１６４】
より大きいか、またはより小さいＴＢＶを持つ対象の分析は、４未満のＴＢＶを持つ対象の割合（％）が、４以上のＴＢＶを持つ対象よりも数値的に低いＭＡＣＥを（３５％）発症したことを実証する。ＭＡＣＥの総数は、対象が４を超えるＴＢＶを有したとき、９０％を超えて増加した。ＣＨＦの履歴の影響について試験したとき、ＣＨＦが、ＴＢＶに関わらず、この群の対象のＭＡＣＥ率を増加させたが、４を超えるＴＢＶを持つ対象に対し、著しく高いことが分かった。ＭＡＣＥが最も低い群は、３以下のＴＢＶを持ち、ＣＨＦの履歴のない対象であった。
【０１６５】
ＣＨＦの履歴を持つ全ての対象を除外することに対する可能な代替は、（１）対照および処置集団の双方を階層化し、同一数のそのような対象を得ること、および（２）第３相におけるアフェレーシス中に処理されたＴＢＶの数を低減することであり、最大細胞用量１０×１０６個のＣＤ３４＋細胞に対して標的ＣＤ３４細胞用量１×１０５／ｋｇ〜最大１００ｋｇとする。
【０１６６】
表２のデータに基づいて、５日目に血液１μＬ当たり１５未満のＣＤ３４＋細胞を動員した対象は、依然として、３〜３．５ＴＢＶアフェレーシスにおいて、４０００万を超えるＣＤ３４＋細胞を回収することができた。より短い回収時間は、Ｇ−ＣＳＦの５回目の注入の必要性を除外し得る。ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後の収率が５０％（第２相において平均７５％）であり、材料の５％が遊離試験に送られたと想定すると、不良な動員対象ならびに良好な動員対象において、１×１０５個のＣＤ３４＋細胞／ｋｇの用量が達成され得る。
【０１６７】
考察：前述の実施例は、複数の同時医学的状態を持つ高齢の座っていることの多い個体のＣＭＩ集団において、低用量Ｇ−ＣＳＦ動員の効果についての第１の洞察を提供する。全ての対象のうちの７５％超は、１５のＣＤ３４＋／全血μＬ以上を動員し、処置に必要とされる潜在的５０００万個の細胞を達成するために、アフェレーシス中に４未満の全血量を必要とした。
【０１６８】
全体研究群は、８７％男性および１３％女性であった。女性の総数は少ないが、男性よりも良好に動員した。これは明らかな傾向であり、統計的に有意であったが、小さな対象集団であった。この観測は、より大きな集団も代表する場合、審査された正常なドナー集団（Ｔｉｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，４０：１８５−１９２，２００７；Ｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．，１３４：５１７−５２５，２００６、およびＶａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１１２：２０９２−２１００，２００８）または血液学的集団（Ｔｉｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．、上記）からの公表結果とは対照的となる。
【０１６９】
この研究における糖尿病分布は、インスリン依存性２５．７％、非インスリン依存性２６．９％、糖尿病の履歴なし４７．４％であった。インスリン依存性対象が、非インスリン依存性または糖尿病の履歴のない対象よりも統計的に良好な動員対象であったという観察は、現在の正常または血液学的データベースとは対照的である（Ｔｉｇｕｅ、上記；Ｉｎｇｓ、上記）。しかしながら、２型糖尿病に関する近年の臨床研究は、ＣＡＤ患者において、インスリン依存性糖尿病と非インスリン依存性糖尿病との間でＧ−ＣＳＦ動員を比較したとき、インスリン依存性患者が、認め得るほどに良好に動員し、より機能的なＣＤ３４＋細胞を産生したことを示した（Ｈｕｍｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２８：９３４−９３６，２００５）。動員を強化した別の変数は、動員と正に関連付けられるＢＭＩの増加であった（ＢＭＩ３２±５．７）。
【０１７０】
加齢および喫煙は、現在または過去に関わらず、動員に負の影響を及ぼした。加齢は、平均年齢６１±８．９歳および年齢範囲４１〜９１歳で最も影響力の強い因子（６５超）であった。６５歳よりも高齢の対象は、十分な細胞を動員する能力の低下を示すことが観察され、一般に、５０００万個の細胞を産生するのに十分な細胞回復を可能にする総ＣＤ３４＋細胞数を達成するか、またはそれに近付くように３を超える全血量（ＴＢＶ）を有する必要があった。この観察は、正常なドナーおよび血液学的文献（Ｔｉｇｕｅ、上記；Ｉｎｇｓ、上記；およびＶａｓｕ、上記）ならびにＣＤ３４＋  ＥＰＣに対して心臓患者に見られる機能性の喪失（Ｄｉｍｍｅｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，１０２−：１３１９−１３３０，２００８）と一致する。驚くべき結果は、非喫煙者が、現在または喫煙経験者よりも良好に動員したことを示すことを観察した喫煙の影響であった（能動喫煙者１０％、喫煙経験者６３％、および非喫煙者２７％）。この観察は、喫煙経験者が、過去のどこかの時点で喫煙を中断したとしても、現在理解されているＧ−ＣＳＦを用いた遊離機構を介して、骨髄から細胞を動員する能力に対して既に負の影響を及ぼしていたことを示唆する（Ｐｅｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：６８７−３９５，２００２、およびＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ：１１４：１３３１−１３３９，２００９）。
【０１７１】
正常集団または血液学的集団における以前の研究（Ｔｉｇｕｅ、上記；Ｉｎｇｓ、上記；およびＶａｓｕ、上記）は、心血管系の合併症または適応に関し、Ｇ−ＣＳＦに対していかなる実質的影響も示さなかった。第２相研究は、ＴＢＶの増加に対して、対象におけるわずかだが明らかな応答を示した。しかしながら、Ｇ−ＣＳＦ処置およびアフェレーシス中に発生した任意の安全性リスクが、Ｇ−ＣＳＦに特異的に起因したと断言することはできない。この陳述の背後にある論拠は２つの要素からなる：（１）３名を除く全ての対象は、５日間のＧ−ＣＳＦを受け、アフェレーシスされた後、トロポニンおよび他の心臓マーカー評価のための血液試料を、ベースライン採決と一緒に作製した。したがって、アフェレーシスの効果とＧ−ＣＳＦの効果とを区別することはできない。（２）３名を除く全ての対象は、５日間のＧ−ＣＳＦを受けたが、５日目朝のＣＤ３４数レベルに基づいて、異なる程度のアフェレーシスを受けた。したがって、この研究は、Ｇ−ＣＳＦ単独の評価を可能にしない。心血管系の合併症に対するＧ−ＣＳＦの影響を評価するために、Ｇ−ＣＳＦ単独の負の影響をほとんど示さない限られた対象を用いて、多数の心血管系研究（ＡＭＩ）およびいくつかの慢性研究（Ｂｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．，１０９：２１−２７，２００６、Ｌｏｓｏｒｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．，１１５″３１６５−３１７２，２００７、Ｈｕｍｐｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，２８：９３４−９３６，２００５、Ｐｅｔｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３′６８７−３９５，２００２）からのデータを審査することができる。それにも関わらず、いくつかの研究は、いくつかの負の心臓転帰を示した（Ｒｉｐａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｈｅａｒｔ  Ｄｒｕｄ，５：１７７−１８２，２００５）。
【０１７２】
この実施例において提供される血液学的データは、Ｇ−ＣＳＦの５日間ではなく４日間の使用が、１０００万個の細胞用量に到達するのに十分な細胞数よりも多くを提供することができることを示す。
【０１７３】
第２相試験中に処理されたＴＢＶは、全ての対象が５０００万細胞用量群に到達する能力を最大化し、したがってその潜在的なランダム化候補となるように設計された。ＴＢＶは、５日目のＣＤ３４＋細胞数に基づいて調整され、Ｇ−ＣＳＦの追加の注入は、動員プロセスをさらに強化するために、アフェレーシス前に付与された。第２相試験および有害事象分析後、４以上のＴＢＶを必要とする数人の対象において、ＭＡＣＥが著しく上昇したことが認められた。アフェレーシスの３以下のＴＢＶのみを必要とする対象の場合、はるかに低いＭＡＣＥレベルが見られた。単一アフェレーシス回収中に処理されたＴＢＶを調整して、良好な動員対象の回収時間を最小化し、非常に不良な動員対象から回収されるＣＤ３４＋細胞の数を最大化することができる。これらの特徴を特定すること、およびそれらの影響を認識することは、ＣＭＩ集団のみならず、他の集団においても同様に、動員およびアフェレーシスを用いる今後の細胞療法に基づく治験を設計するときに考慮されるべきである。第３相の場合、４用量に限定することによって、Ｇ−ＣＳＦからの潜在的なリスクを低下させ、５日目のアフェレーシスを３．５ＴＢＶを超えないように計画することを最初に推奨している。この手法は、対象に対する潜在的なリスクを最小化し、時間を低減し、予想される１０００万個の細胞用量を満たすことが企図される。
【０１７４】
実施例２−ＣＤ３４＋細胞を含む組成物の貯蔵および安定性（１０μｇ／ｋｇ／日Ｇ−ＣＳＦを受けているドナーから動員される）
本実施例は、注入に適した様々な溶液中でシリンジにおいて濃縮および貯蔵した後、ＩＳＯＬＥＸ選択されたＣＤ３４＋細胞の安定性を評価した。
【０１７５】
動員された末梢血単核細胞（ＭＮＣ）は、健常なヒトドナーに１０μｇ／ｋｇ／日のＧ−ＣＳＦを５日間注入することに続いて、５日目および６日目のアフェレーシスによって、ＡｌｌＣｅｌｌｓ（カタログ番号ｍＰＢ０２６、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）から得られた。動員されたＭＮＣは、３Ｍ  ＴＬ２０温度ロガー（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）を使用して、温度監視条件下２〜８℃で輸送された。平均記録温度範囲は、４．５〜８．８℃であった。各ドナーの２つの動員されたＭＮＣはプールされ、２つのＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ磁気細胞選択システム（バージョン２．５、Ｓ／Ｎ３００２＝デバイスＡおよびＳ／Ｎ３２１０＝デバイスＢ）上での対合化ＣＤ３４＋細胞選択手順の直前に、正の選択手順を用いて分割された。これらの選択は、ラット抗マウスＩｇＧ１（ＲＡＭ）常磁性ビーズおよびＣＤ３４＋抗体、ならびにＩＳＯＬＥＸ幹細胞試薬キットからのＰＲ３４＋遊離剤を用いた。
【０１７６】
試料は、各ＩＳＯＬＥＸデバイスの前選択および後選択した生成物から回収され、細胞数、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５＋細胞列挙、および全細胞生存率について分析され、ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後生成物の収率、純度、および生存率を決定した。これらの試験パラメータは、以下の手順に従って分析した。
【０１７７】
細胞数：ＩＳＯＬＥＸ処理前試料を、ハンク平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中１：１０で希釈し、ＣＯＵＬＴＥＲ  ＡｃＴ  ＤＩＦＦ２（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ，Ｒｅｆ．４）上で、白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）、および血小板（ＰＬＴ）の平均濃度を決定するように、ＩＳＯＬＥＸ処理前および処理後の試料を３連で分析した。
【０１７８】
Ｃ３４＋およびＣＤ４５＋細胞列挙および生存率：Ｃ３４＋細胞およびＣＤ４５＋細胞、ならびに全細胞生存率は、Ｓｔｅｍ−Ｋｉｔ（商標）を使用して決定した。分析前に、ＩＳＯＬＥＸ処理前試料は、３０×１０６個のＷＢＣ／ｍＬの濃度を超えないように、ＨＢＳＳ中１：１０で希釈した（「細胞懸濁液」）。各試料に対し、２０μＬのＣＤ４５−ＦＩＴＣ／ＣＤ３４−ＰＥ抗体を試料管に添加し（３連）、２０μＬのＣＤ４５−ＦＩＴＣ／ＣＴＲＬ−ＰＥ抗体を対照管に添加した。次いで、２０μＬの７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を、管のそれぞれに添加した。
【０１７９】
次いで、約１００μＬの細胞懸濁液を、試料および対照管のそれぞれに添加し、渦流させ、暗所で２０分間室温でインキュベートした。次いで、２ｍＬの希釈された溶解緩衝液を、各試料管に添加した。次いで、試料管を渦流させ、暗所で１０分間室温でインキュベートした。１００μＬのＳｔｅｍ−Ｃｏｕｎｔ  Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅを、各管に添加した。次いで、管を渦流させ、融氷上暗所で貯蔵した。Ｓｔｅｍ−Ｃｏｕｎｔ  Ｆｌｕｏｒｏｓｐｈｅｒｅを添加して１時間以内に、フローサイトメトリーによって試料を分析した。次いで、絶対ＣＤ３４＋およびＣＤ４５＋細胞数、収率（％）、純度（％）、および生細胞の総割合を、以下に記載されるように計算した。
【０１８０】
各デバイスからのＣＤ３４＋選択された生成物の残りをプールし、以下の溶液：製剤Ａ（５％自家性血漿を含む生理食塩水）；製剤Ｂ（５％自家性血漿を含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ）；および製剤Ｃ（５％ＨＳＡを含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ）のそれぞれにおいて、Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞数（±１０％）によって決定されるように、５．０×１０６細胞／ｍＬ（実験２〜６；Ｎ＝５）および７．５×１０６細胞／ｍＬ（実験１、２、４、および５；Ｎ＝４）の近似濃度に再懸濁した。各実験を検証するために選択される細胞濃度（複数可）は、細胞の利用可能性に基づき、最初に５．０×１０６細胞／ｍＬの濃度で細胞を試験するように優先した。十分な量の細胞が利用可能であるかどうかについて、７．５×１０６細胞／ｍＬの濃度も試験した。細胞を１０本の１ｍＬシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、ポリカーボネート、ルアーロック先端、参照番号３０９６２８）の中に、試験される条件につき１６ゲージ針を用いて充填し、静止状態で３日間の期間にわたって２〜８℃で水平に貯蔵した。
【０１８１】
毎日（０日目、１日目、２日目、および３日目）条件につきシリンジのそれぞれから２００μＬの試料を回収し、細胞数について分析した。試料回収前に、シリンジ内の細胞溶液を静かに混合した。このシリンジを両手に挟んで垂直および水平の双方向にそれぞれ１５回回転させた。このプロセスを繰り返した後、５回回転させて混合した。針を除去し、試料を回収した。次の時点まで、シリンジの貯蔵前に針を取り換えた。細胞生存率、アポトーシス、および純度（ＣＤ３４＋細胞の割合および汚染細胞サブセットの割合）を決定した。ＣＤ３４＋細胞のクローン形成能を、ＣＦＵアッセイを使用して形成されたコロニーの数を数えることによって決定した。細胞が化学誘引物質、ヒトストローマ細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）に向かって移動する能力を評価することによって、細胞機能性も１日目〜３日目に分析した。これらの試験パラメータは、以下の手順に従って分析した。
【０１８２】
細胞数：ＣＯＵＬＴＥＲ  ＡｃＴ  ＤＩＦＦ２上で試料を分析し（３連）、白血球の平均濃度を決定した。
【０１８３】
生存率：細胞の生存率は、以下の手順に概説されるように、７−アミノ−アクチノマイシンＤに対して陰性（７−ＡＡＤ、生育可能）であり、７−ＡＡＤに対して陽性（生育不可能）であった細胞の量を測定することによって決定した。
ａ．約５×１０５個の細胞を各試料管に（２連）添加した。
ｂ．１００μＬのＰＢＳを添加した。
ｃ．１０μＬの７−ＡＡＤを添加し、暗所で１０分間室温でインキュベートした。
ｄ．４００μＬのＰＢＳを添加した。
ｅ．フローサイトメトリーによって試料を分析した。
ｆ．データを分析し、７−ＡＡＤに対して陰性である（生育可能）全ての事象の割合を決定した。
【０１８４】
アポトーシス：アポトーシス細胞の割合は、以下に概説される修正版の製造者の指示に従って、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して決定した。
ａ．約５×１０５個の細胞を各試料管に（２連）添加した。
ｂ．細胞を１ｍＬの冷たいＰＢＳで１回洗浄し、それらの細胞を１００μＬの１Ｘ結合緩衝液中に再懸濁した。
ｃ．５μＬのＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣおよび５μＬのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を添加した。
ｄ．試料を静かに渦流させ、暗所で１５分間室温でインキュベートした。
ｅ．４００μＬの１Ｘ結合緩衝液を添加し、フローサイトメトリーによって分析した。
ｆ．データを分析し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ＋／ＰＩ−（早期アポトーシス）またはＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ＋／ＰＩ＋（後期アポトーシスまたは生育不可能）である全ての事象の割合を決定した。
【０１８５】
サブセット分析：ＣＤ３４（幹細胞）、ＣＤ３／４５（Ｔ細胞）、ＣＤ１９／４５（Ｂ細胞）、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ１６（顆粒球／マクロファージ）、およびＣＤ６１（血小板）について試料を分析することによって、純度を決定した。ＣＤ３４／１４およびＣＤ３４／６１に対して陽性の細胞を決定するための分析も行った。この分析の手順を以下に概説する。
管１：ＣＤ３／３４／４５／１９
管２：ＣＤ１６／３４／６１／１４
ａ．５０μＬの試料を１×１０６細胞／ｍＬ〜１０×１０６細胞／ｍＬの近似濃度で、１０μＬの適切な抗体のそれぞれと合わせた（２連）。
ｂ．試料を染色し、暗所で１５分間室温でインキュベートした。
ｃ．試料を１ｍＬのＰＢＳ中２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で洗浄し、０．５ｍＬの２％ＦＢＳ−ＰＢＳ中に再懸濁した。
ｄ．フローサイトメトリーによって試料を分析した。
ｅ．データを分析し、上記のマーカーのそれぞれに対して陽性の全細胞の割合を決定した。
【０１８６】
コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイ：最初に２％ＦＢＳ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カタログ番号０７７００，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ  Ｃａｎａｄａ）を含むイスコブのダルベッコ変法培地（ＩＭＤＭ）中で細胞を希釈し、希釈した細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  ＧＦ＋Ｈ４４３５培地（カタログ番号０４４４５，ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）に添加して、約５００細胞／皿の最終濃度にすることによって、ＣＦＵアッセイを設定した（２連）。ＣＦＵアッセイは、光学顕微鏡を使用して、約３７℃および５％ＣＯ２で、高湿度で１４〜１６日間のインキュベーション後、コロニー形成単位−顆粒球マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、コロニー形成単位赤血球系（ＣＦＵ−Ｅ）、バースト形成単位−赤血球系（ＢＦＵ−Ｅ）、およびＧＭおよび赤血球系コロニーの双方を含むコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の存在について採点した。
【０１８７】
移動アッセイ：以下に概説される手順に従って、化学誘引物質ＳＤＦ−１αの存在下、細胞が膜全体を移動する能力について細胞を分析した。
ａ．細胞を、０．５％ＨＳＡ−ＲＰＭＩ中１×１０６細胞／ｍＬの近似濃度に調製した。
ｂ．ＳＤＦ−１αを１％ＨＳＡ−ＲＰＭＩ中で１０、５０、１００、２００、および４００ｎｇ／ｍＬに希釈し、使用する準備ができるまで氷上に置いた。
ｃ．６００μＬの各濃度のＳＤＦ−１αをウェルにピペットで取り（１試料当たり３連）、６００μＬの１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩを１試料当たり３つの追加のウェルにピペットで取って負の対照とした。
ｄ．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートをウェルの中に置き、インサートの側面に沿って細胞を分注することによって、１００μＬの細胞を各挿入物の中にピペットで取った。
ｅ．３７℃、５％ＣＯ２、高湿度で２〜３時間インキュベートした。
ｆ．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートをウェルから除去し、プレートウェルの底部にある含有物を吸引して、１２×７５管の中に移した。
ｇ．５００μＬの１％ＨＳＡ／ＲＰＭＩをウェルの中にピペットで取り、静かに攪拌した。
ｈ．ウェルの含有物を吸引し、最初の吸引から対応する管に移した。
ｉ．フローサイトメトリーアッセイを以下のように行った。
ｉ．アッセイ対照を設定するために、１００μＬの細胞ストックを、アイソタイプ、ＣＤ４５−ＦＩＴＣ、およびＣＤ３４−ＰＥと標識された管の中にピペットで撮った。
ｉｉ．１ｍＬの１％ＨＳＡ−ＲＰＭＩを各管に添加した。
ｉｉｉ．全ての管を約３０００ｒｐｍで３分間室温で遠心分離した。
ｉｖ．上澄みを静かに移し、２００μＬの１％ＦＢＳ−ＰＢＳを各管に添加した。
ｖ．１０μＬの各抗体を管に添加し、軽く渦流させた。
１．ＩｇＧ１−ＦＩＴＣ、ＩｇＧ１−ＰＥ（細胞ストック）
２．ＣＤ４５−ＦＩＴＣ（細胞ストック）
３．ＣＤ３４−ＰＥ（細胞ストック）
４．ＣＤ４５−ＦＩＴＣ／ＣＤ３４−ＰＥ（試料管）
ｖｉ．管を暗所で１５分間室温でインキュベートした。
ｖｉｉ．２ｍＬの１％ＦＢＳ／ＰＢＳを各管に添加し、静かに渦流させた。
ｖｉｉｉ．管を約３０００ｒｐｍで３分間室温で遠心分離した。
ｉｘ．上澄みを静かに移し、２５０μＬの１％ＦＢＳ／ＰＢＳを各試料管に添加し、５００μＬを各細胞ストック管に添加した。
ｘ．フローサイトメトリーによって試料を分析した。
ｘｉ．各試料の移動指数を計算した＝（試料中の平均ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋事象／負の対照中の平均ＣＤ３４＋ＣＤ４５＋事象）。
【０１８８】
処理手順の全ては、無菌条件下で完了させた。この研究は、ＧＬＰおよびＧＤＰ標準に従って行った。
【０１８９】
許容基準：ＣＤ３４＋細胞の安定性が維持された条件（複数可）の決定のための許容基準は、主に細胞の生存率に基づいた。８０％を超える生存率を、許容可能であると見なした。アポトーシスを経ている細胞の割合は、５０％未満でなければならない。アポトーシス％の基準は、この測定の臨床的有意性を支持するために現在使用可能なデータがないという前提で選択された。
【０１９０】
移動およびクローン形成アッセイによって評価されたＣＤ３４＋細胞の機能性は、合否の許容基準を用いて測定した。移動アッセイの失敗は、各濃度のＳＤＦ−１αにおいて、１．０の移動指数（対照と同一）をもたらすＳＤＦ−１αに応答するＣＤ３４＋細胞の移動はないとして定義される。クローン形成アッセイの失敗は、インキュベーション期間の最後に観察可能なコロニー形成がないとして定義される。移動および／またはクローン形成アッセイに合格した試料は、それぞれＳＤＦ−１αおよび観測されるコロニーの数に応答するＣＤ３４＋細胞の移動の頑健性に関する定質的評価を受ける。
【０１９１】
データ分析：生存率について８０％、アポトーシス細胞について５０％の基準を検証した。反復測定を用いる分散分析を、これらの２つのパラメータに関して行った。この分析における独立因子は、試験液、貯蔵される日数、および試験液と貯蔵日数との間の交互作用であった。最小二乗平均の推定値は、試験液のそれぞれ、および各貯蔵日について、これらの推定値の９５％信頼区域に沿って計算した。双方の濃度（５．０×１０６細胞／ｍＬおよび７．５×１０６細胞／ｍＬ）で試験製剤から回収されたデータについて、この分析を完了させた。生存率について、９５％信頼区域の下限を計算した。この値が８０％を超える場合、基準は満たされる。アポトーシス細胞について、９５％信頼区域の上限を計算した。この値が５０％未満である場合、基準は満たされる。
【０１９２】
各分析日における各溶液対の最小平方平均間の差を計算するように、生存率およびアポトーシスデータセットのそれぞれに関して、追加の分析を完了させた。０．０５未満の結果のｐ値は、それらが等しくないという証拠を提供した。
【０１９３】
移動およびクローン形成アッセイの基準は、失敗がない場合に満たされる。
【０１９４】
結果：
この研究において使用するためのＣＤ３４＋細胞を選択するために、６つの対合したＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ選択を完了させた。各手順において、同一ドナーからプールおよび分割された動員ＭＮＣは、２つのＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ磁気細胞選択システム（デバイスＡおよびデバイスＢ）上でＲＡＭビーズと平行して処理された。
【０１９５】
細胞数：各ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉデバイスの処理前生成物および処理後生成物から３連の試料を回収し、分析して白血球（ＷＢＣ）、赤血球（ＲＢＣ）、および血小板（ＰＬＴＳ）の濃度を決定した。単位当たりの細胞総数（各ＩＳＯＬＥＸデバイスの上に載置される生成物）を計算した。単位当たりの総ＷＢＣの平均結果は、以下の表１に要約される。
【０１９６】
単位当たりの３．６９×１０１０〜５．０１×１０１０個のＷＢＣの範囲が、ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉデバイスの上に載置された。これらの単位は、合計８２．３×１０９〜１５４．７×１０９個のＲＢＣおよび３．２×１０１１〜５．１×１０１１個のＰＬＴＳを含有した。ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後生成物の全体ＷＢＣ数は、平均して単位当たり３．５１×１０８であり、単位当たり１．５５×１０８〜５．７６×１０８個のＷＢＣを含む範囲を有した。ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後生成物はいずれも、Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞数に基づいて、任意の測定可能なレベルのＲＢＣまたはＰＬＴＳを含有することが認められなかった。
【０１９７】
前試料および後試料のそれぞれにおけるＣＤ３４＋およびＣＤ４５＋細胞の総数が、フローサイトメトリー分析によって決定された。この測定値は、各ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理前生成物および処理後生成物におけるこれらの細胞型の総数の正確な決定を提供する。ＣＤ３４＋およびＣＤ４５＋細胞列挙データは、それぞれ以下の表３および４に示される。
【表３】
2015508101.tif 000005
【表４】
2015508101.tif 000006
【０１９８】
各ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ選択から得られるＣＤ３４＋細胞の収率を決定するために、ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後生成物のそれぞれにおけるＣＤ３４＋細胞の総数を、以下の等式を用いて、対応する前試料に対して得られた値と比較した。
【数１】
2015508101.tif 000007
【０１９９】
列挙データも分析し、ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後生成物のそれぞれの純度％を決定した。
【０２００】
ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ選択のそれぞれからのＣＤ３４＋細胞の収率は、４４．６６％〜７９．２１％の範囲であった。デバイスＡおよびデバイスＢを用いて得られた平均収率は、それぞれ６０．３７％および６４．９７％であった。ＩＳＯＬＥＸ処理後生成物の平均純度は、デバイスのそれぞれを用いて約９３％であり、８８．０６％〜９８．５９％の範囲であった。収率および純度の双方は、選択手順の大部分に対して、対合したＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理間で相当に一致していた。このデータは、表５に表示される。
【表５】
2015508101.tif 000008
【０２０１】
各デバイスからのＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後生成物をプールし、濃縮して、以下の溶液：製剤Ａ（５％自家性血漿を含む生理食塩水）；製剤Ｂ（５％自家性血漿を含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ）；および製剤Ｃ（５％ＨＳＡを含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ）のそれぞれにおいて、５．０×１０６個の細胞／ｍＬおよび／または７．５×１０６個の細胞／ｍＬの標的濃度に再懸濁した。試験製剤のそれぞれの濃度は、５．０×１０６個の細胞／ｍＬまたは７．５×１０６個の細胞／ｍＬ標的濃度の±１０％以内に調整し、ＷＢＣ濃度の確認は、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｃｔ  Ｄｉｆｆ２を用いた分析によって決定した。ＣＤ３４＋細胞を、様々な試験製剤中で適切な濃度に調整し、冷蔵（２〜８℃）条件下で最長３日間、シリンジ中で貯蔵した。試験製剤のそれぞれは、毎日サンプリングした（０日目、１日目、２日目、および３日目）。各条件のシリンジのそれぞれからの試料をプールし、分析してＷＢＣ濃度を決定した。
【０２０２】
全ての時点のためにシリンジを充填した直後、０日目のシリンジを、手に挟んで垂直および水平の双方向にそれぞれ１５回回転させる一貫したプロセスに従って混合した。このプロセスを繰り返した後、５回回転させて混合した。興味深いことに、試験製剤のそれぞれを用いて０日目の試料上で観測された平均ＷＢＣ濃度は、標的濃度より低かった（５．０×１０６個の細胞／ｍＬまたは７．５×１０６個の細胞／ｍＬ）。５．０×１０６個の細胞／ｍＬに調製された試験製剤は、サンプリングの時点で（０日目）３．８×１０６個の細胞／ｍＬ〜４．２×１０６個の細胞／ｍＬの範囲であったが、７．５×１０６個の細胞／ｍＬに調製された試験製剤は、５．５×１０６個の細胞／ｍＬ〜６．５×１０６個の細胞／ｍＬの範囲であった。１日目、２日目、および３日目に観測された平均ＷＢＣ濃度は、一般に、０日目に観測されたものよりも高く、経時的にわずかに増加した。これは、細胞がシリンジ中で貯蔵される間に、細胞の均一に混合された試料を達成する複雑性を示唆する。
【０２０３】
３日のサンプリング時間にわたるシリンジ外の細胞の回復率を決定するために、１日当たりのプールした試料のそれぞれにおいてカウントされる細胞の平均数を合計した。この分析の結果は、細胞の大部分（８９％〜９８％の範囲）が、３日間の貯蔵期間にわたって回収されたことを決定した。
【０２０４】
０〜３日目に、プールした細胞試料を、生存率、アポトーシス、純度、および機能性について、それらのクローン形成能の分析によって後次に分析した。ＣＤ３４＋細胞の機能性も、化学誘引物質ＳＤＦ−１αへのそれらの移動を評価することによって、１日目、２日目、および３日目に分析した。本明細書に提示されるデータは、最長３日間の細胞の貯蔵後に得られたデータを用いて完了させた実験のそれぞれからの結果の平均値を表す。
【０２０５】
細胞生存率：細胞の生存率は、細胞生存確認用色素７−ＡＡＤを用いて決定した。７−ＡＡＤは、損傷した膜を持つ非生細胞においてのみ検出され得る、膜不透過性色素である。正常な細胞膜の存在に起因する７−ＡＡＤを除く総細胞の割合（％）が、総集団の割合として記録された。双方の細胞濃度（５．０×１０６個の細胞／ｍＬおよび７．５×１０６個の細胞／ｍＬ）で調製された細胞の生存率は、分析の各時点で非常に類似した結果をもたらした。０日目の細胞の生存率は、９６．３８％〜９７．２０％の範囲であった。製剤ＢおよびＣ中に貯蔵された細胞は、最長３日間、高いレベルの生存率を維持し、その時点の平均生存率は約９５％であった。製剤Ａ中に貯蔵された細胞の生存率は、１日目以降に減少し始め、平均生存率は、２日目に約９１％、３日目に約８７％であった。以下の表６を参照されたい。
【表６】
2015508101.tif 000009
【０２０６】
ＣＤ３４＋細胞の貯蔵に最適な溶液の決定のための許容基準は、主に細胞の生存率に基づいていた。この許容基準に定義されるように、これらの間隔のより低い境界が８０％よりも大きい場合、細胞は、所与の日数の間、その濃度でその溶液中に貯蔵され得る。この許容基準は、最長３日間、双方の濃度で溶液のそれぞれにおける細胞の貯蔵の場合に満たされた。
【０２０７】
各分析日における各溶液対の最小平方平均間の差を計算するように、このデータセットに関して追加の統計分析を完了させた。この分析の結果は、双方の細胞濃度で、１日目に製剤Ａと製剤Ｃとの間に有意な差があり、２日目および３日目には製剤Ａと製剤ＢおよびＣの双方との間に有意な差があったことを決定した。
【０２０８】
細胞の生存率は、非生育可能なものに対する、アポトーシスの様々な段階を経ている細胞の割合（％）を決定することによってさらに探求された。この分析は、Ａｎｎｅｘｉｎ  ＶおよびＰＩで染色することによって、ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後生成物中に存在する細胞集団全体について完了させた。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖは、細胞膜のリン脂質二重層の成分であるホスファチジルセリン（ＰＳ）に対する強力な特異的親和性を持つタンパク質である。アポトーシス細胞死の早期段階において、結晶膜のリン脂質非対称性が撹乱され、ＰＳは細胞血漿膜の外層へ移行する。細胞膜上に露出したＰＳは、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖに結合し、アポトーシス細胞の検出を可能にする。この段階において、細胞膜は正常なままである。したがって、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖで染色することを、７−ＡＡＤに類似し、損傷した膜を持つ細胞においてのみ検出され得る膜不透過性色素であるＰＩと併せて完了させた。これは、アポトーシスまたは壊死プロセスのいずれかから生じる細胞死の最終段階を経ている細胞に対して、早期アポトーシス細胞（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ＋／ＰＩ−）の特定を可能にした。この段階において、細胞膜の完全性は損なわれ、細胞はＡｎｎｅｘｉｎ  ＶおよびＰＩの双方で染色される。後期アポトーシスまたは非生細胞の平均割合は、以下の表７に示される。
【表７】
2015508101.tif 000010
【０２０９】
表６に示されるように、０日目の溶液のそれぞれにおける細胞の約２％〜３％の平均は、アポトーシスの後期（または非生育可能）であると決定された。後期アポトーシス（または非生育可能な）細胞の割合は、貯蔵期間（３日目まで）の間、開始細胞濃度に関わらず、試験製剤のそれぞれについて約５％未満のままであった。これらの結果は、７−ＡＡＤを用いた生存率分析で観測された結果と十分に相関する（表６および７）。
【０２１０】
試験製剤のそれぞれにおける早期アポトーシス細胞の割合（％）は、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ陽性およびＰＩ陰性染色によって特定された。この分析の結果は、以下の表８で以下に示される。
【表８】
2015508101.tif 000011
【０２１１】
表８に示されるように、０日目のアポトーシスの早期段階にある細胞の平均割合（％）は、試験製剤のそれぞれにおいて（試験された双方の濃度で）２．３２％〜５．４３％の範囲であった。１日貯蔵された細胞で観測された早期アポトーシスのレベルは、用いられる試験溶液に関係なく、０日目に観測されたものに非常に類似していた。細胞完全性は、製剤Ｂ中での細胞の貯蔵の間に全体的に最も安定し、３日目までに細胞の７％未満がアポトーシスの早期段階であった。製剤Ｃ中に貯蔵された細胞の分析は、３日目までに細胞の１２％以下がアポトーシスの早期段階であったことを決定した。製剤Ａ中に貯蔵された細胞は、製剤Ｃ中に貯蔵された細胞で観測されたものに類似する結果をもたらした（３日目までに最大約１４％）。
【０２１２】
各分析日における各溶液対の最小平方平均間の差を計算するように、このデータセットに関して追加の統計分析を完了させた。この分析の結果は、双方の細胞濃度で、２日目および３日目に製剤Ｂと製剤Ａおよび製剤Ｃの双方との間に有意な差があったことを決定した。
【０２１３】
試料の純度：各時点で試料の純度を試験するために、広範なサブセット分析を完了させた。ＣＤ３４（幹細胞）、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ１４（単球）、ＣＤ１６（顆粒球／マクロファージ）、およびＣＤ６１（血小板）について陽性の細胞の割合（％）を決定した。さらに、ＣＤ６１／３４（共凝集体）およびＣＤ１４／３４（潜在的内皮前駆細胞。ＥＰＣ）について二重陽性であった細胞を決定した。双方の開始濃度（それぞれ５．０×１０６個の細胞／ｍＬおよび７．５×１０６個の細胞／ｍＬ）での試験製剤のそれぞれについて、結果が表９〜１０（以下）に要約される。
【表９】
2015508101.tif 000012
【表１０】
2015508101.tif 000013
【０２１４】
上記表９および１０に示されるように、０日目の試験製剤のそれぞれは、非常に高い純度を有し、ＣＤ３４＋細胞の平均組成が９６．６２％〜９７．８９％の範囲であることを決定した。これらの結果は相関し、列挙アッセイからのＩＳＯＬＥＸ処理後生成物について決定された純度結果を確認する（上記表５に示される）。０日目に観測された純度は、３日目まで試験製剤のそれぞれについて双方の濃度で維持された。試験製剤のそれぞれは、ＩＳＯＬＥＸ処理後生成物の中に非特異的に運ばれたわずかな割合の汚染細胞を含有した。これらの細胞の大部分は、Ｂ細胞であり、降順でＴ細胞、顆粒球、および単球が続いた。試験製剤のそれぞれにおけるＣＤ１４／３４＋細胞のレベルは低かった（０．３％未満）。汚染細胞サブセットの分析は、試験製剤のそれぞれに存在する細胞の約１００％を占めた。生成物中で特定された血小板の割合は、平均して３．２％以下であった。各例において、特定された血小板の大部分は、ＣＤ３４＋細胞（ＣＤ６１／３４＋）と共凝集した。全体として、これらの結果は、試験製剤のそれぞれにおける細胞の組成が、試験された溶液または細胞が貯蔵された期間に関わらず、非常に類似していたことを示す。
【０２１５】
クローン形成能：細胞のクローン形成能を、各時点（０日目〜３日目）における細胞の貯蔵後に評価した。細胞のアリコートを試験製剤のそれぞれから回収し、培地の中に約２週間置いた。各プレート上のコロニーは、コロニー形成単位−顆粒球マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、コロニー形成単位赤血球系（ＣＦＵ−Ｅ）、バースト形成単位−赤血球系（ＢＦＵ−Ｅ）、およびＧＭおよび赤血球系コロニーの双方を含むコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の存在について採点した。生成されたコロニーの数にドナー間の変動性が見られた。したがって、この分析の結果は、試験溶液に相関されるクローン形成能の一般傾向が決定され得るように平均化された。
【０２１６】
ＣＦＵ−ＧＭコロニーは、０日目に試験製剤のそれぞれからサンプリングされた細胞の培養後に観測されたコロニーの最大数を占めた。この時点で、平均ＣＦＵ−ＧＭカウントは、９３．５〜１０９．４の範囲であった。ＣＦＵ−ＧＭコロニーの平均数は、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤ＢおよびＣ）中に貯蔵された細胞を用いて、貯蔵期間にわたって最良に維持された。これらの条件下で、ＣＦＵ−ＧＭコロニー数の漸減が観測され、平均コロニー数は３日目に６６．４〜７７．５の範囲であった。ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤ＢおよびＣ）からなる溶液中の細胞の貯蔵の３日目以降に観測されたものと同様に、自家性血漿を含む生理食塩水（製剤Ａ）中の細胞の貯蔵の１日目以降にコロニー数のより大きな減少が観測された。平均コロニー数は、経時的に減少し続け、３日目までに約５０％以上減少した。
【０２１７】
ＣＦＵ−ＧＭコロニーの形成で観測されたように、ＢＦＵ−Ｅコロニーの最大数が、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤ＢおよびＣ）中に貯蔵された細胞を用いて、貯蔵期間の間維持された。これらの試験製剤の培養物は、１日目に６２．６〜７７．０の範囲で平均ＢＦＵ−Ｅコロニー数を生成し、３日目に５２．８〜６４．３の範囲で漸減した。１日目に、自家性血漿（製剤Ａ）を含む生理食塩水中に貯蔵された細胞は、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤ＢおよびＣ）中に貯蔵された細胞に類似する数のＢＦＵ−Ｅコロニーを生成することが認められたが、貯蔵期間が増加するにつれて、比較してより少ない数が観測された。ＣＦＵ−ＧＭコロニーの形成に関して見られるように、これは、３日目までに約５０％以上のＢＦＵ−Ｅコロニーの減少をもたらした。
【０２１８】
ＣＦＵアッセイにおいてＣＤ３４＋細胞で典型的に観察されたように、ほんの少数のＣＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーが、１〜３日間の貯蔵後に試験製剤のそれぞれから細胞の培養後に生成された。生成されたコロニーが少数であったため、この分析から結論を決定することはできない。
【０２１９】
ＣＦＵアッセイの許容基準は、成功か失敗かであった。クローン形成アッセイの失敗は、インキュベーション期間の最後に観察可能なコロニー形成がないとして定義される。この許容基準は、３日間の試験製剤のそれぞれにおける細胞の貯蔵の場合に満たされた。
【０２２０】
細胞の平均クローン形成能（クローン形成率）を、観測された細胞型のそれぞれを合計し、最初にプレートされた細胞の数（５００細胞／プレート）で割ることによって、試験製剤のそれぞれについて計算した。結果は、０日目に、試験製剤のそれぞれのクローン形成能が３３．６％〜４２．３％の範囲であったことを示した。試験製剤のそれぞれのクローン形成能は、開始細胞濃度に関わらず非常に類似した結果をもたらし、貯蔵期間にわたって減少した。これは、自家性血漿（製剤Ａ）を含む生理食塩水中に貯蔵された細胞で最も顕著に観察された。この条件下で貯蔵された細胞は、３日目に１８．７％以下の平均に徐々に減少し、最低のクローン形成率を有した。ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤ＢおよびＣ）からなる溶液中に貯蔵された細胞は、より長期間、より高いレベルのクローン形成能を維持した。１日目に、これらの試験製剤のクローン形成率は、製剤ＢおよびＣ中でそれぞれ約２％〜７％減少した。これは、製剤ＢおよびＣ中で２日目まで維持された後、３日目に２４．４％以上のレベルに減少した。
【０２２１】
細胞の機能性：細胞の機能性は、試験製剤のそれぞれにおいて１〜３日間貯蔵した後に測定し、それらが漸増濃度の化学誘引物質ＳＤＦ−１αの存在下で、膜全体を移動する能力を評価した。ＳＤＦ−１αに応答して移動する能力におけるＣＤ３４＋細胞の機能性にドナー間の変動性が見られたため、この分析の結果を平均して、移動パターンの一般傾向が試験溶液に相関するようにした。
【０２２２】
結果は、１日目に、製剤Ａ中に貯蔵された細胞が、それぞれ５．０×１０６個の細胞／ｍＬおよび７．５×１０６個の細胞／ｍＬの開始濃度で、平均移動指数８４．８および５３．２を有したことを示した。貯蔵２日目に、平均移動指数は、それぞれ２８．５および１４．３に減少した。２日目に観測されたほぼ同一レベルの移動能力は、３日間の貯蔵後も維持された。
【０２２３】
製剤Ｂ中に貯蔵された細胞は、１日の貯蔵後に可変範囲の移動能を示し、５．０×１０６個の細胞／ｍＬおよび７．５×１０６個の細胞／ｍＬの開始濃度でそれぞれ１９９．１および７８．８の平均移動指数を有した。この変動性は、試験した２つの濃度間で観察されたが、製剤Ｂ中の細胞貯蔵後に観測された移動レベルは、３日間の細胞貯蔵後も６６．３以上の指数に良好に維持された。実際に、７．５×１０６個の細胞／ｍＬ製剤で観測された移動レベルは、貯蔵期間にほぼ同一であった。
【０２２４】
開始濃度５．０×１０６個の細胞／ｍＬで製剤Ｃ中に貯蔵された細胞は、健全なレベルの移動（１日目の平均移動指数１２２．７）を呈し、貯蔵３日目まで維持された（平均移動指数１００．９）。これまで提示されたデータとは異なり、開始濃度７．５×１０６個の細胞／ｍＬで製剤Ｃ中に貯蔵された細胞は、可変範囲の移動能を示し、平均して貯蔵期間にわたって減少しなかった。実際に、１日目最低であり（平均移動指数５４．９）、２日目に最高であり（平均移動指数１４８．６）、貯蔵３日目に減少した（平均移動指数９１．６）。これは事実であるが、一般に、５４．９以上の平均移動指数が観測されるように、この条件下で貯蔵された細胞の移動能の傾向が形成され得る。
【０２２５】
全体として、容量依存性移動応答が、各分析非の試験製剤のそれぞれについて観察された。観察された移動能のレベルは、１日目の試験製剤のそれぞれとかなり類似していた。その時点の後に、製剤ＢおよびＣからなる試験溶液のそれぞれに貯蔵された細胞で最高レベルの移動が認められた。このように貯蔵された細胞は、最長３日間、漸増濃度のＳＤＦ−１αに用量依存的に移動する最大能力を維持した。
【０２２６】
移動アッセイの許容基準は、成功か失敗かであった。移動アッセイの失敗は、各濃度のＳＤＦ−１αにおいて、１．０の移動指数（対照と同一）をもたらすＳＤＦ−１α応答するＣＤ３４＋細胞の移動はないとして定義される。細胞移動は、各貯蔵日に試験製剤のそれぞれについて測定された。したがって、このパラメータの許容基準は、３日間の試験製剤のそれぞれにおける細胞の貯蔵について達成された。これらの結果は、ＳＤＦ−１α（ＣＸＣＲ−４）の受容体が、これらの条件下で少なくとも３日間の貯蔵期間に細胞上である程度維持されることを示す。したがって、選択されたＣＤ３４＋細胞は、これらの細胞を虚血区域に注入した後、サイトカインに応答してそれらの部位に戻ることができ得る。
【０２２７】
結論
この試験は、シリンジにおいて２つの濃度で３日間にわたり２〜８℃でＣＤ３４＋細胞を貯蔵するために、自家性血漿を含む生理食塩水に代わる溶液（すなわち、製剤Ａ）を評価した。この研究の目標は、細胞の安定性が維持される条件（複数可）を決定することであった。つまり、以下の重要な観察が、この試験中になされた。
【０２２８】
双方の細胞濃度で製剤のそれぞれに貯蔵された細胞の生存率は、３日目まで維持された（８０％超）。１〜３日目のＨＳＡを含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤Ｃ）、ならびに２日目および３日目の自家性血漿を含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤Ｂ）と比較して、自家性血漿を含む生理食塩水（製剤Ａ）中に保存された細胞の生存率の間に有意な差が観測された。全体として、最高レベルの生存率が、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（すなわち、製剤ＢおよびＣ）中に貯蔵された細胞で観察された。これらの溶液中に貯蔵された細胞の生存率は、３日目まで９５％以上を維持した。
【０２２９】
早期アポトーシス細胞のレベルは、３日目まで双方の細胞濃度で溶液のそれぞれに貯蔵された細胞の場合、５０％未満であった。溶液のそれぞれにおける貯蔵は、１日目まで同様の結果をもたらした。２日目および３日目に、自家性血漿を含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤Ｂ）中の細胞の貯蔵で、最小程度の早期アポトーシスが認められた。これは、自家性血漿を含む生理食塩水（製剤Ａ）またはＨＳＡを含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤Ｃ）中に貯蔵された細胞で観測されたレベルとは著しく異なっていた。
【０２３０】
ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤ＢおよびＣ）中に貯蔵された細胞は、３日の貯蔵期間中に同一型の細胞分化パターンを生成した。これらの溶液の双方に貯蔵された細胞のクローン形成能は、１日目から２日目まで比較的一定レベルで維持され（３０％超）、次いで３日目までに約２４％に減少した。自家性血漿を含む生理食塩水（製剤Ａ）中に貯蔵された細胞は、最低のクローン形成率を有し、３日目に平均１９％未満まで経時的に徐々に減少した。
【０２３１】
用量依存性細胞移動応答を、各貯蔵日に試験製剤のそれぞれについて測定した。細胞が移動する能力は、１日目の試験製剤のそれぞれについて非常に類似していた。その期間の後に、自家性血漿を含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤Ｂ）およびＨＳＡを含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤Ｃ）中に貯蔵された細胞は、最高移動能を維持した。
【０２３２】
全体として、この試験に用いられる細胞の濃度に起因する結果の差は観測されなかった。溶液のそれぞれに貯蔵される細胞は、１日目まで高度の生存率、低レベルのアポトーシス、および類似レベルのクローン形成能および移動能を維持した。その期間の後に、自家性血漿またはＨＳＡを含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤ＢおよびＣ）中の細胞の貯蔵が、生存率および機能性を最大程度まで維持した。早期段階のアポトーシスを経ている細胞の程度は、その時点で自家性血漿を含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤Ｂ）中に貯蔵された細胞において最低であることが決定された。これは事実であるが、早期アポトーシス細胞のレベルは、ＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤ＢおよびＣ）からなるいずれかの溶液中で細胞を貯蔵した後、全体として比較的低かった（１２％未満）。
【０２３３】
実施例３−ＣＤ３４＋細胞（１日当たり５μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦを受けるドナーから動員された）を含む組成物の貯蔵および安定性を評価するさらなる実験
本実施例は、注入に適した様々な溶液中でシリンジにおいてＣＤ３４＋細胞を濃縮および貯蔵した後、ＩＳＯＬＥＸ選択されたＣＤ３４＋細胞追加実験の安定性を評価した。
【０２３４】
実験設計：動員末梢血単核細胞（ＭＮＣ）を、最終投与に続く細胞回収手順を用いて、５日間連続して１日１回Ｇ−ＣＳＦを健常なヒトドナーに注入することによって、ＡｌｌＣｅｌｌｓ（Ｒｅｇｉｍｅｎ  Ｅ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＣＡ）から得た。ドナーは、１日に体重１ｋｇ当たりカスタマイズされた用量、または１日当たり５ｍｃｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦを受けた。動員されたＭＮＣは、３Ｍ  ＴＬ２０温度ロガー（Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ）を使用して、１〜１０℃の温度監視条件で終夜輸送され、回収の２４時間以内に受領された。「０日目」試験と称されるＩＳＯＬＥＸ選択およびシリンジサンプリングの前日であったため、アフェレーシス生成物の受領日の試験は、「−１日目」（マイナス１日）と称された。動員されたアフェレーシス単位の受領後（−１日目）、生成物をサンプリングし、Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＡｃＴ  Ｄｉｆｆ２血液分析器上で分析し、ＷＢＣ（白血球）、ＲＢＣ（赤血球）、およびＰＬＴ（血小板）濃度の決定を集めた。手動分化を行って、生成物中に存在する好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、および未成熟細胞の割合を決定した。フローサイトメトリーを用いて、ＣＤ３４＋（幹細胞）、ＣＤ３＋（Ｔ細胞リンパ球）、およびＣＤ１９＋（Ｂ細胞リンパ球）細胞の生存率および割合を決定した。アフェレーシス生成物が検査室に受領され、分析のためにサンプリングされた後、生成物を冷蔵条件下で終夜貯蔵した。
【０２３５】
アフェレーシス回収後２日目である翌日に、生成物を再度サンプリングし、自動細胞カウント、手動ＷＢＣ文化、サブセット分析、および生存率決定を得た。ＩＳＯＬＥＸ選択の日であり、選択された細胞の試験製剤中での貯蔵を開始したため、この日の試験は、０日目と指定された。正の選択を用いるＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ磁気細胞選択システム（バージョン２．５）を使用し、９Ｃ５  ＣＤ３４モノクローナル抗体およびＩＳＯＬＥＸ試薬キット（コード番号４Ｒ９７３４）からのＰＲ３４＋遊離剤、およびラット抗マウスＩｇＧ１（ＲＡＭ）常磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｍ−４５０、カタログ番号４２８．０１Ｄ）を利用してＣＤ３４＋細胞を選択した。試料は、前選択および後選択した生成物から収集され、細胞数、ＣＤ３４＋およびＣＤ４５＋細胞列挙について分析され、ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後生成物の収率、純度、および生存率を決定した。これらの試験パラメータを、実施例２に上述される手順に従って分析した。
【０２３６】
ＣＤ３４＋選択された生成物を濃縮し、以下の溶液：５％自家性血漿を含む生理食塩水（製剤Ａ）、５％自家性血漿を含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤Ｂ）または５％ＨＳＡを含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤Ｃ）中、適切な濃度５×１０６個の細胞／ｍＬ（±１０％）で、Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞数によって決定されるように再懸濁した。シリンジを３本の１ｍＬシリンジ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ、ポリカーボネート、ルアーロック先端）の中に全量２．５ｍＬまで充填し、それらのシリンジをＣｒyｄｏ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４−１２９６熱輸送容器に納め、１日間、２日間、または３日間（１日目、２日目、および３日目）にわたって１〜１０℃で貯蔵した。３つのＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ選択の後に、培地条件のそれぞれについて、２．５ｍＬの細胞を３本のシリンジに濃縮および充填するために使用可能な細胞が十分にないことが決定された。それらの実験では、５％自家性血漿を含む生理食塩水（製剤Ａ）および５％自家性血漿を含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤Ｂ）の試験を保証するために、試験製剤を５％ＨＳＡを含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤Ｃ）の試験よりも優先した。
【０２３７】
それぞれが１日目、２日目、または３日目の試料および温度モニターを含有する３つのＣｒyｄｏ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４−１２９６熱輸送容器は、Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｕｒｉｅｒを介して終夜ＮＦＯ（一番早い空輸便）により輸送され、翌日（自家試験の場合は１日目と指定される）研究室に返送された。２日目および３日目の試料を含有する輸送箱は、適切な試験日まで未開封のまま室温で貯蔵した。１日目の貯蔵箱は受領時に開封し、状態を記録した。温度モニターログは、研究文書に含まれ、分析のために試料をシリンジから回収した。２日目の箱は、細胞選択手順の約２日後に開封し、３日目の箱は、細胞選択手順の約３日後に開封した。
【０２３８】
各日（１日目、２日目、および３日目）に、細胞をシンジから回収し、試験製剤に従ってプールして分析した。試料回収前に、両手で垂直および水平方向双方にシリンジを回転させた後、回転混合技法によって、シリンジ中の細胞溶液を混合した。実施例２にて上述の手順を使用して、細胞生存率、アポトーシス、および純度（ＣＤ３４＋細胞および汚染細胞サブセットの割合）を決定した。実施例２にて上述の手順を使用して、細胞移動およびＣＦＵ（コロニー形成単位）アッセイを行うことによって、ＣＤ３４＋細胞の機能性およびクローン形成能を決定した。
【０２３９】
許容基準は、実施例２に提供されるものと同様であった。
【０２４０】
データ分析：生存率について８０％、アポトーシス細胞について５０％の基準を以下のように検証した。反復測定を用いる分散分析を、全ての分析において使用した。分析における従属因子または応答は、それぞれ生存率およびアポトーシスであった。この分析における独立因子は、貯蔵液、貯蔵される日数、および貯蔵液と貯蔵日数との間の交互作用であった。反復測定因子は、ＣＤ３４＋生成物であった（ＩＳＯＬＥＸ選択日）。最小二乗平均の推定値を、各溶液および各貯蔵日について、これらの推定値の９５％信頼区域に沿って計算した。０．０５未満の結果のｐ値は、それらが等しくないという証拠を提供した。移動およびクローン形成アッセイの基準は、失敗がない場合に満たされる。
【０２４１】
結果：この試験において使用するためのＣＤ３４＋細胞を選択するために、１２のＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ選択を完了させた。各手順において、単一ドナーからの動員単位を、２つのＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ磁気細胞選択システム装置Ａ（シリアル番号３００２）および装置Ｂ（シリアル番号３２１０）のうちの１つでＲＡＭビーズを用いて処理した。処理のうちの６つが、３つの試験製剤の全ての分析を可能にするために十分な数の細胞を選択した。処理のうちの３つが、５％ＨＳＡを含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤Ｃ）ではなく、５％自家性血漿（製剤Ａ）を含む生理食塩水、および５％自家性血漿を含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（製剤Ｂ）の分析を可能にするために十分な細胞を選択した。
【０２４２】
追加の３つの処理が、障害条件に起因して、細胞選択後の様々な時点で終了した。第１の処理は、製剤ＡおよびＢを作製するために使用される血漿が、ＡｌｌＣｅｌｌｓにおける処理時に細菌感染したことが発見された後に終了した。第６の処理は、ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ選択が、試験製剤のうちの少なくとも２つを用いた３日間の試験に十分な数の細胞を産生しなかったため終了した。第１０の処理は、輸送箱中の熱パネルがユーザーガイドに従って冷却しなかったこと、および細胞が輸送プロセスにおいて不注意に凍結したことが発見された後に終了した。
【０２４３】
２つのＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ装置間で細胞選択を均等に分配するよう試みた。完了した処理のうち、５つは装置Ａ上で行われ、４つは装置Ｂ上で行われた。
【０２４４】
この試験の目的のため、アフェレーシスＭＮＣ生成物の受領日は、−１日目と称され（マイナス１日目）、その翌日は０日目と称される。−１日目は、アフェレーシス生成物の回収の約１日後であり、０日目はアフェレーシス生成物の回収の約２日後である。ＣＤ３４＋細胞のＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ選択は、０日目に発生した。これもまた、試験製剤が調製され、その試験製剤中の細胞の試験が開始したときである。表１１〜１３は、−１日目および０日目の試料に関するアフェレーシスＭＮＣ生成物中のＷＢＣ（白血球）、ＲＢＣ（赤血球）、およびＰＬＴＳ（血小板）の決定結果を要約する。
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【０２４５】
Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＡｃＴ  Ｄｉｆｆ２血液分析器から得られる平均ＷＢＣ、ＲＢＣ、およびＰＬＴ数は、−１日目〜０日目まで同等であった。これらの結果は、終夜、冷蔵条件でのアフェレーシス生成物の貯蔵が、試験されたパラメータについて、細胞数の喪失をもたらさないことを示唆する。
【０２４６】
アフェレーシスＭＮＣ生成物中に存在する好中球、リンパ球、単球、および未成熟細胞の割合は、−１日目および０日目の試料で同等であった。リンパ球および単球の割合（％）に関していくらかの変動性が見られるが、−１日目から０日目の平均値は、標準偏差を考慮に入れると同等である。好酸球および好塩基球は、試料のいずれかにおいて不可視であったため、表に示されていない。未成熟細胞の数は、ドナー間で高度に変動するが、平均して−１日目から０日目の数は同等であった。割合は、１００個の細胞数に基づく。これらの結果は、終夜、冷蔵条件でのアフェレーシス生成物の貯蔵が、可視化されたＷＢＣ集団の喪失をもたらさないことを示唆する。
【０２４７】
アフェレーシスＭＮＣ生成物の平均生存率は、−１日目に９５．８０±５．６８、０日目に９３．１３±３．１５であった。処理の平均は、０日目の生存率が−１日目の生存率よりもわずかに低いことを示唆するが、これらの値は、標準偏差を考慮すると同等である。これらの結果は、終夜、冷蔵条件でのアフェレーシス生成物の貯蔵が、生存率の大幅な減少をもたらさないことを示唆する。
【０２４８】
ＣＤ３４＋幹細胞の割合は、平均して−１日目に０．７３±０．４１であり、０日目に０．８４±０．３９であった。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、平均して−１日目に３８．７４±９．２３であり、０日目に４３．７９±１１．６９であった。ＣＤ１９＋Ｂ細胞は、平均して−１日目に１０．７２±３．９８であり、０日目に１２．０７±４．４０であった。ＣＤ３４、ＣＤ３、およびＣＤ１９細胞の割合を合わせると、アフェレーシスＭＮＣ集団全体の５６．７０％を占める。
【０２４９】
ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ選択後、ＣＤ３４＋細胞の試料を分析して、存在するＷＢＣ、ＲＢＣ，およびＰＬＴの濃度を決定した。ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理前および処理後生成物の試料を使用して、単位当たりの総細胞数（各ＩＳＯＬＥＸ装置の上に載置された生成物）を計算した。
【０２５０】
単位当たり３．４２×１０１０〜７．２１×１０１０の範囲のＷＢＣを、単位当たり平均５．４４×１０１０ＷＢＣでＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉデバイスの上に載置した。この範囲は、最大８．０×１０１０個の細胞以下であり、ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ選択２当たりに処理され得る細胞の最大数を表す。アフェレーシス単位は、単位当たり平均１４０．５７×１０９個のＲＢＣを含有し、処理に対して７９．５６×１０９〜２０７．０８×１０９の範囲を有した。血小板は、単位当たり平均７３５．８４×１０９ＰＬＴであり、処理に対して単位当たり４７２．９９×１０９〜９６７．７０×１０９の範囲を有した。
【０２５１】
ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後生成物のＷＢＣ数全体は、単位当たり平均２．６８×１０８であり、単位当たり１．２５×１０８〜６．７７×１０８個のＷＢＣを含む範囲を有した。ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後生成物は、Ｃｏｕｌｔｅｒ細胞数に基づいて、測定可能なレベルのＲＢＣまたはＰＬＴＳを含有しなかった。処理２、３、および９は、この試験に含まれる９回の処理のうちのアフェレーシス単位当たりの最低ＷＢＣ数を有した。処理２、３、および９は、最低ＩＳＯＬＥＸ処理後ＷＢＣ数ももたらし、結果としてこれらの処理に対して、３つの試験製剤のうち２つを検証するのに十分な数に過ぎなかった。
【０２５２】
前試料および後試料のそれぞれにおけるＣＤ３４＋およびＣＤ４５＋細胞の総数を、フローサイトメトリー分析によって決定した。この測定値は、各ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理前生成物および処理後生成物におけるこれらの細胞型の総数の正確な決定を提供した。
【０２５３】
各ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ選択から得られるＣＤ３４＋細胞の収率を決定するために、ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後生成物のそれぞれにおけるＣＤ３４＋細胞の総数を、以下の等式を用いて、対応するＩＳＯＬＥＸ処理前試料に対して得られた値と比較した。
【数２】
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【０２５４】
データをＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後生成物のそれぞれの純度％を決定するためにも分析した。
【０２５５】
ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ選択からのＣＤ３４＋細胞の収率％は、平均して６０．４２％±１．９２％であり、５７．９３％〜６３．０８％の範囲の値を有した。ＩＳＯＬＥＸ処理後生成物の純度％は、平均して９７．３１％±１．２６％であり、９５．７４％〜９９．０８％の範囲の値を有した。
【０２５６】
ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後生成物のＷＢＣ数を決定した後、適切な数の細胞を濃縮し、次いで以下の溶液のそれぞれにおいて標的濃度５．０×１０６個の細胞／ｍＬに再懸濁した。
【０２５７】
製剤Ａ：５％自家性血漿を含む生理食塩水
【０２５８】
製剤Ｂ：５％自家性血漿を含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ
【０２５９】
製剤Ｃ：５％ＨＳＡを含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ
【０２６０】
試験製剤のそれぞれの濃度を、５．０×１０６個の細胞／ｍＬ標的濃度の±１０％以内に調整し、ＷＢＣ濃度の確認を、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ａｃｔ  Ｄｉｆｆ２血液分析器を用いた分析によって決定した。次いで、様々な試験溶液中のＣＤ３４＋細胞を、１６ゲージ針を使用して吸引し、Ｌｕｅｒ−Ｌｏｋ（商標）先端（Ｒｅｆ．３０９６２８）を持つＢＤ  １ｍＬシリンジの中に入れ、元の針キャップで被覆して、シリンジ中で最長３日間、温度制御された輸送容器内で１〜１０℃で貯蔵した。１日当たりの試験製剤条件につき合計２．５ｍＬを含む３つのシリンジを調製した。各試験製剤条件について、２つのシリンジが１ｍＬを含み、１つのシリンジが０．５ｍＬを含むように、シリンジを調製した。
【０２６１】
１〜１０℃の温度範囲を９６時間超保持する特定の熱性能を理由に、Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｔｈｅｒｍａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅからのＣｒyｄｏ  Ｓｅｒｉｅｓ  ４−１２９６熱輸送容器を選択した。温度ロガーを各箱に含め、温度を貯蔵期間の間記録した。培地条件当たり３つのシリンジを、２つの非断熱発泡材片の間に水平に挟むことによって、シリンジを輸送器の中に納めた。温度ロガーを、発泡材の第１の層と第２の層との間に挟み、箱の中に置いた。輸送器は、ＮＦＯ（一番早い出発便）サービスを使用して、Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｕｒｉｅｒを介して陸路および空路を移動し、Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｕｒｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｈｙｄｅ  Ｐａｒｋ  １１０４０に送達された。次いで、輸送器は陸路および空路でＲｏｕｎｄ  Ｌａｋｅ  ６００７３に返送され、元の輸送の翌日正午までに到着する。１日目の試験のためのシリンジを含む輸送器を開封し、温度ロガーを回収し、シリンジの状態を調べた。２日目および３日目のためのシリンジを含む輸送器を、適切な試験日まで未開封のまま室温条件で貯蔵した。３日目の試験に使用される輸送器を含む輸送器の全て（処理１０を除く）は、１〜１０℃の温度範囲内で維持された。処理１０の試験は、ユーザーガイドが推奨する−２０℃ではなく、−７０℃というＣｒyｄｏ熱パネルの事前条件に起因して、輸送中に細胞が凍結した後に終了した。
【０２６２】
シリンジに貯蔵された試験製剤を、両手で各シリンジを垂直および水平の双方向にそれぞれ１５回回転させる一貫したプロセスに従って、毎日（０日目、１日目、２日目、および３日目）サンプリングした。このプロセスを繰り返した後、５回回転させて混合した。試験製剤に従って、シリンジのそれぞれからの試料をプールし、分析してＷＢＣ濃度を決定した。ＷＢＣ濃度の分析を利用して、各分析日の生存率、アポトーシス、移動、およびＣＦＵアッセイに必要とされる細胞の量を決定し、貯蔵期間にわたって細胞数の潜在的変化を観測した。
【０２６３】
前シリンジＷＢＣ濃度は、０日目のシリンジ濃度に非常に類似し、それらがシリンジの中に充填される間の試験製剤の完全混合を示唆する。試験製剤のそれぞれについて、ＷＢＣ濃度は、３日間の貯蔵期間にわたって０日目のＷＢＣ濃度の１０％以内に維持された。製剤Ａ中に貯蔵された細胞は、０日目の４．８×１０６個の細胞／ｍＬから３日目の４．４×１０６個の細胞／ｍＬへのＷＢＣ濃度の平均減少を呈した。製剤Ｂ中に貯蔵された細胞は、０日目の４．９×１０６個の細胞／ｍＬから３日目の４．６×１０６個の細胞／ｍＬへのＷＢＣ濃度の平均減少を呈した。製剤Ｃ中に貯蔵された細胞は、０日目および３日目に平均５．１×１０６個の細胞／ｍＬで安定していた。
【０２６４】
０、１、２、および３日目に、生存率、アポトーシス、純度、およびクローン形成能について、プールした細胞試料を分析した。ＣＤ３４＋細胞の機能性も、細胞が化学誘引物質ＳＤＦ−１αに向かって移動する能力を評価することによって、１日目、２日目、および３日目に分析した。本明細書に提示されるデータは、最長３日間の細胞の貯蔵後に得られたデータを用いて完了させた実験のそれぞれからの結果の平均値を表す。
【０２６５】
細胞の生存率を、細胞生存確認用色素７−ＡＡＤを用いて決定した。７−ＡＡＤは、損傷した膜を持つ非生細胞においてのみ検出され得る、膜不透過性色素である。正常な細胞膜の存在に起因する７−ＡＡＤを除く総細胞の割合（％）が、総集団の割合（％）として記録された。
【０２６６】
０日目の細胞の生存率は、平均約９７％で試験製剤のそれぞれについて類似していた。これらの結果は、最長３日間の貯蔵前の細胞の同様の開始条件を示す。自家性血漿を含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  ＡおよびＨＳＡを含むＰＬＡＳＭＡ−ＬＹＴＥ  Ａ（それぞれ試験製剤ＢおよびＣ）中に貯蔵された細胞は、最長３日間、高いレベルの生存率を維持し、その時点で約９４％〜９５％の平均生存率を有した。自家性血漿を含む生理食塩水（製剤Ａ）中に貯蔵された細胞の生存率は、１日目以降に減少し始め、平均生存率は、２日目に約８６％、３日目に約７９％であった。この試験の一次許容基準は、８０％を超える生存率に基づく。この基準に基づくと、製剤Ａ中に３日間貯蔵された細胞は、許容基準を満たさなかった。
【０２６７】
このデータセットに関して、統計分析も完了させた。この許容基準に定義されるように、これらの間隔のより低い境界が８０％よりも大きい場合、細胞は、所与の日数の間、その濃度でその溶液中に貯蔵され得る。
【０２６８】
表１４は、０日目〜３日目まで貯蔵された生成物について、ＣＤ３４＋細胞の生存率の推定値（最小平方平均）を提供する。推定値およびそれらの推定値の９５％信頼区域（ＣＩ）も提供する。９５％  ＣＩの下限が８０％よりも大きい場合、所与の溶液を使用して所与の日数の間貯蔵することが、「許容可能」とみなされ得る。この定義を使用して、全ての溶液は、２日間だけ貯蔵され得る製剤Ａを除いて、３日間貯蔵され得る。
【表１４】
2015508101.tif 000018
【０２６９】
各試験日における各溶液対の最小平方平均間の差も計算した。結果が、表１５に要約される。これは、これらの差がゼロに等しいという仮説を検証する。０．０５未満のｐ値は、それらが等しくないという証拠を提供する。２日間および３日間の貯蔵において、製剤Ａと、製剤Ｂと、製剤Ｃとの間に統計的差異があった。２日間および３日間の貯蔵において、製剤Ａ〜Ｃの間に統計的差異はなかった。
【表１５】
2015508101.tif 000019
【０２７０】
細胞の生存率は、アポトーシスの様々な段階を経ている細胞の割合（％）を決定することによってさらに探求された。この分析は、Ａｎｎｅｘｉｎ  ＶおよびＰＩで染色することによって、ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後生成物中に存在する細胞集団全体について完了させた。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖは、細胞膜のリン脂質二重層の成分であるホスファチジルセリン（ＰＳ）に対する強力な特異的親和性を持つタンパク質である。アポトーシス細胞死の早期段階において、結晶膜のリン脂質非対称性は妨げられ、ＰＳは細胞血漿膜の外層へ移行する。細胞膜上に露出したＰＳは、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖに結合し、アポトーシス細胞の検出を可能にする。この段階において、細胞膜は正常なままである。したがって、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖで染色することは、７−ＡＡＤに類似し、損傷した膜を持つ細胞においてのみ検出され得る膜不透過性色素であるＰＩと併せて完了させた。これは、アポトーシスまたは壊死プロセスのいずれかから生じる細胞死の最終段階を経ている細胞に対して、早期アポトーシス細胞（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ／ＰＩ−）の特定を可能にした。この段階において、細胞膜の完全性は損なわれ、細胞はＡｎｎｅｘｉｎ  ＶおよびＰＩの双方で染色される。
【０２７１】
０日目に、各試験製剤中の細胞の平均約２％が、アポトーシスの最終段階（または非生育可能）であると決定された。後期アポトーシス（または非生育可能な）細胞の割合は、試験の３日目までに製剤Ｂの場合は平均３．２９％および製剤Ｃの場合は３．９４％にわずかに増加した。製剤Ａ中の後期アポトーシス細胞の割合は、３日間の試験期間にわたって、３日目までに平均９．７０％に増加した。
【０２７２】
試験製剤のそれぞれにおける早期アポトーシス細胞の割合が、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ陽性およびＰＩ陰性染色によって特定された。
【０２７３】
０日目に、アポトーシスの早期段階の細胞の平均割合は、３つの試験製剤間で２．６２％〜３．７５％の範囲であった。１日貯蔵した後、早期アポトーシス細胞の割合は、製剤Ｂの場合安定していたが、アポトーシスの割合は、製剤Ａおよび製剤Ｃを含む生理食塩水中に貯蔵された細胞においてほぼ倍増した（製剤Ａは３．５９％から６．６３％、製剤Ｃは２．６２％から６．７６％）。細胞完全性は、製剤Ｂ中での細胞の貯蔵の間に全体的に最も安定し、試験の３日目までに細胞の平均約６％がアポトーシスの早期段階であった。製剤Ｃ中に貯蔵された細胞の分析は、３日目までに細胞の約１２％がアポトーシスの早期段階であったことを決定した。製剤Ａ中に貯蔵された細胞は、３日目までに約１７％の平均を持つ細胞に対し、早期アポトーシス細胞において最大の増加をもたらした。
【０２７４】
ＣＤ３４＋細胞の貯蔵に最適な溶液の決定のための二次許容基準のうちの１つは、アポトーシスのレベルであった。統計分析を、早期アポトーシスデータセット上で完了させた。表１５は、０〜３日間貯蔵された早期アポトーシス細胞データに対し、最小平方平均および９５％  ＣＩの推定値を提供する。定義された許容基準に従って、これらの間隔の上限が５０％未満である場合、細胞は、所与の日数の間、その濃度でその溶液中に貯蔵され得る。この定義を使用したところ、許容基準は、最長３日間、双方の濃度で溶液のそれぞれにおける細胞の貯蔵の場合に満たされた。
【表１６−１】
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【表１６−２】
2015508101.tif 000021
【０２７５】
各分析日における各溶液対の最小平方平均間の差を計算するように、アポトーシスデータセットに関して追加の統計分析を完了させた。結果の要約が、以下の表１７に見出され得る。
【表１７】
2015508101.tif 000022
【０２７６】
この追加の分析の結果は、２日間および３日間の貯蔵において、製剤Ｂと製剤Ａおよび製剤Ｃの双方との間に統計的に有意な差があったことを決定した。３日間の貯蔵において、製剤Ａと製剤Ｃとの間にも統計的差異があった。
【０２７７】
各時点で試料の純度を試験するために、広範なサブセット分析を完了させた。ＣＤ３４（幹細胞）、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ１４（単球）、およびＣＤ１６（顆粒球／マクロファージ）について陽性の細胞の割合を決定した。さらに、ＣＤ６１／３４（血小板／幹細胞共凝集体）、ＣＤ１４／３４（潜在的内皮前駆細胞、ＥＰＣ）、およびＣＤ１９／３４（未成熟Ｂ細胞）について二重陽性であった細胞を決定した。試験製剤のそれぞれについて、結果が以下の表１８に要約される。
【表１８】
2015508101.tif 000023
【０２７８】
０日目の試験製剤のそれぞれは、非常に高い純度を有し、ＣＤ３４＋細胞の平均組成が９７．９４％〜９８．５５％の範囲であることを決定した。これらの結果は相関し、列挙アッセイからのＩＳＯＬＥＸ処理後生成物について決定された純度結果を確認する。０日目に観測された純度は、３日目まで試験製剤のそれぞれについて維持された。試験製剤のそれぞれは、ＩＳＯＬＥＸ処理後生成物の中に非特異的に運ばれたわずかな割合の汚染細胞を含有した。これらの細胞の大部分は、Ｂ細胞であり、降順でＴ細胞、顆粒球、および単球が続いた。ＣＤ１９＋Ｂ細胞の平均割合は、１．０１％以下であった。ＣＤ１９／３４＋未成熟Ｂ細胞の平均割合は、０．５２％以下であった。試験製剤のそれぞれにおけるＣＤ１４／３４＋細胞のレベルは低かった（０．３％未満）。汚染細胞サブセットの分析は、試験製剤のそれぞれに存在する細胞の約１００％を占めた。ＣＤ３４＋に共凝集された血小板（ＣＤ６１＋）の割合は、平均して２．５％以下であった。全体として、これらの結果は、試験製剤のそれぞれにおける細胞の組成物が、試験される溶液または細胞が貯蔵される期間に関わらず、非常に類似したままであったことを示す。Ｃ３４＋細胞の平均割合によって定義されるＩｓｏｌｅｘ選択後の純度は、試験日の全てに対し非常に高いままであり、３つの試験製剤間で一定であった。３日間の試験期間にわたって、３つの試験製剤全ての平均純度は、約９８％のままであった。
【０２７９】
ＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合（％）は、３つの試験製剤の全てに対し、０日目に平均して１．２１％以下であった。３日間の試験期間にわたって、ＣＤ１９＋Ｂ細胞の平均割合は、３つの試験製剤全てにおいて減少した。ＣＤ１９＋Ｂ細胞の割合は、３つの試験製剤の全てに対し、３日目に平均して０．８３％以下であった。
【０２８０】
ＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ処理後生成物において認められるＣＤ１９＋Ｂ細胞のうち、約半分がＣＤ３４＋でもある。これは、Ｃ１９＋集団の一部分は、その生成物の中に日特異的に運ばれないが、不均一なＣＤ３４＋集団の活性部分に運ばれる。
【０２８１】
細胞のクローン形成能を、細胞の貯蔵後の各時点において評価した（０日目〜３日目）。細胞のアリコートを試験製剤のそれぞれから回収し、培地の中に約２週間置いた。各プレート上のコロニーは、コロニー形成単位−顆粒球マクロファージ（ＣＦＵ−ＧＭ）、コロニー形成単位赤血球系（ＣＦＵ−Ｅ）、バースト形成単位−赤血球系（ＢＦＵ−Ｅ）、およびＧＭおよび赤血球系コロニーの双方を含むコロニー形成単位（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）の存在について採点した。生成されたコロニーの数にドナー間の変動性が見られた。したがって、この分析の結果は、試験溶液に相関されるクローン形成能の一般傾向が決定され得るように平均化された。
【０２８２】
ＣＦＵ−ＧＭ、すなわち顆粒球およびマクロファージコロニーのコロニー形成単位が、試験製剤のそれぞれからの細胞の培養後に観測された全コロニーの大部分を占めた。この時点において、平均ＣＦＵ−ＧＭ数は、製剤Ａの８４．９から製剤ＢおよびＣの９３．５および９２．４の範囲であった。ＣＦＵ−ＧＭコロニーの平均数は、製剤ＢおよびＣ中に貯蔵された細胞を用いて、貯蔵期間にわたって最良に維持された。これらの条件下で、ＣＦＵ−ＧＭコロニー数の漸減が観察され、３日目に７１．４〜７８．１の範囲内に平均コロニー数を有した。コロニー数の最大減少は、製剤Ａ中で細胞を１日貯蔵した後に開始することが観察され、３日間の貯蔵期間にわたって継続した。製剤Ａの３日目の平均コロニー数は２６．０であったが、製剤ＢおよびＣ中に貯蔵された細胞は、７１．４および７８．１のコロニー数を生成した。
【０２８３】
ＢＦＵ−Ｅ（赤血球コロニーを生成するバースト形成単位）が、０日目にＣＦＵ−ＧＭに類似する全コロニーの一部分を占めた。この時点で、平均ＢＦＵ−Ｅ数は、製剤Ａの８３．８から製剤ＢおよびＣのそれぞれ９１．３および９３．７の範囲であった。ＢＦＵ−Ｅコロニーの平均数は、製剤ＢおよびＣ中に貯蔵された細胞を用いて、貯蔵期間にわたって最良に維持された。これらの条件下で、コロニー数は１日目を通して安定したままであった。２日目に、ＢＦＵ−Ｅコロニー数の減少が観察され、平均コロニー数は３日目に７２．８〜７６．３の範囲であった。コロニー数の最大減少は、自家性血漿を含む生理食塩水（製剤Ａ）中で細胞を１日貯蔵した後に開始することが観察され、３日間の貯蔵期間にわたって継続した。製剤Ａの３日目の平均コロニー数は４３．５であったが、製剤ＢおよびＣ中に貯蔵された細胞は、７２．８および７６．３のコロニー数を生成した。
【０２８４】
ＣＦＵアッセイにおいてＣＤ３４＋細胞で典型的に観察されるように、ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーは、試験製剤のそれぞれから細胞の培養後に生成されたコロニーのごく一部を占めた。０日目に、平均ＣＦＵ−ＧＥＭＭ数は、２．９〜３．３の範囲であった。他のコロニーで観察されたように、ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニーの最大数は、製剤ＢおよびＣ中に貯蔵された細胞を用いて、貯蔵期間の間に維持された。製剤ＢおよびＣの培養物は、１日目に２．４〜３．６の範囲の平均ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニー数を生成し、３日目に１．１〜１．８の範囲に漸減した。製剤Ａ中に貯蔵された細胞は、１日目に平均３．０コロニーを生成し、３日目までに０．８コロニーに減少した。
【０２８５】
ＣＦＵ−ＧＥＭＭと同様に、ＣＦＵ−Ｅコロニーも、典型的に、観測された全コロニーのごく一部を占める。０日目に、平均ＣＦＵ−Ｅコロニーは、２．８〜３．５の範囲であった。他のコロニーで観察されたように、ＣＦＵ−Ｅコロニーの最大数は、製剤ＢおよびＣ中に貯蔵された細胞を用いて、貯蔵期間の間に維持された。製剤ＢおよびＣの培養物は、１日目に３．１〜３．５の平均ＣＦＵ−Ｅコロニー数を生成し、３日目に１．５〜１．７の平均に漸減した。製剤Ａ中に貯蔵された細胞は、１日目に平均２．８コロニーを生成し、３日目までに０．８コロニーに減少した。
【０２８６】
細胞の平均クローン形成能（クローン形成率）は、観測されたコロニー型のそれぞれを合計し、最初に播種された細胞の数（５００細胞／プレート）で割ることによって、試験製剤のそれぞれについて計算された。０日目に、試験製剤のそれぞれのクローン形成能は３４．９％〜３８．６％の範囲であった。試験製剤のそれぞれのクローン形成能は、貯蔵期間にわたって減少した。これは、製剤Ａ中に貯蔵された細胞で最も顕著に観察された。この条件下で貯蔵された細胞は、３日目に１４．２％の平均に徐々に減少し、最低のクローン形成率を有した。製剤ＢおよびＣからなる溶液中に貯蔵された細胞は、３日間の貯蔵期間にわたって、より高いレベルのクローン形成能を維持した。製剤ＢおよびＣのクローン形成能は、約３％減少して３５．０％および３４．８％（それぞれ製剤Ｂおよび）となった２日目まで、比較的安定したままであった。３日目までに、割合は２９．３％および３１．６％（それぞれ製剤ＢおよびＣ）に減少した。
【０２８７】
ＣＦＵアッセイの許容基準は、成功か失敗かであった。クローン形成アッセイの失敗は、インキュベーション期間の最後に観察可能なコロニー形成がないとして定義される。３日間の試験製剤のそれぞれにおける細胞の貯蔵の場合に失敗はなかった。生成されたコロニーの数および型は、２日間の貯蔵を通して製剤ＢおよびＣに対し類似していた。試験の３日目に、製剤Ｃは、製剤Ｂよりもわずかに高いコロニー数を生成した。
【０２８８】
細胞の機能性：細胞の機能性は、溶液のそれぞれにおいて１〜３日間貯蔵した後に測定し、それらが漸増濃度の化学誘引物質ＳＤＦ−１αの存在下で、膜全体を移動する能力を評価した。ＳＤＦ−１αに応答して移動する能力におけるＣＤ３４＋細胞の機能性にドナー間の変動性が見られたため、この分析の結果を平均して、移動パターンの一般傾向が試験溶液に相関するようにした。
【０２８９】
１日目に、製剤Ａ中に貯蔵された細胞は、平均移動指数５２．０を有し、ＳＤＦ−１αの最高濃度は４００ｎｇであった。貯蔵の２日目に、平均移動指数は２５．２まで減少し、３日目までに平均移動指数は、なおもさらに１１．７まで減少し、ＳＤＦ−１αは４００ｎｇであった。
【０２９０】
１日目に、生理食塩水製剤Ｂ中に貯蔵された細胞は、ＳＤＦ−１αの最高濃度４００ｎｇで平均移動指数１０９．１を有した。貯蔵の２日目に、平均移動指数は７０．１に減少し、３日目までに平均移動指数は、４００ｎｇのＳＤＦ−１αで、なおもさらに３４．９まで減少した。
【０２９１】
１日目に、製剤Ｃ中に貯蔵された細胞は、平均移動指数１６４．２を有し、ＳＤＦ−１αの最高濃度は４００ｎｇであった。貯蔵の２日目に、平均移動指数は８３．５に減少し、３日目までに平均移動指数は、４００ｎｇのＳＤＦ−１αで、なおもさらに３９．０まで減少した。
【０２９２】
全体として、ＣＤ３４＋細胞は、漸増濃度のＳＤＦ−１αに対する用量応答を呈し、最大用量のＳＤＦ−１α、４００ｎｇに対応する最大移動指数を有した。製剤Ｃは、試験の１日目、２日目、および３日目に３つの試験製剤の最高機能応答を有した。製剤Ｂは、試験の１日目、２日目、および３日目に製剤Ａよりも高い機能応答を有した。
【０２９３】
移動アッセイの許容基準は、成功か失敗かであった。移動アッセイの失敗は、各濃度のＳＤＦ−１αにおいて、１．０の移動指数（対照と同一）をもたらすＳＤＦ−１αに応答するＣＤ３４＋細胞の移動はないとして定義される。正の移動指数、各貯蔵日に試験製剤のそれぞれについて測定された。したがって、このパラメータの許容基準は、３日間の試験製剤のそれぞれにおける細胞の貯蔵について達成された。これらの結果は、ＳＤＦ−１α（ＣＸＣＲ−４）の受容体が、これらの条件下で少なくとも３日間の貯蔵期間に細胞上である程度維持されることを示す。したがって、選択されたＣＤ３４＋細胞は、これらの細胞を虚血区域に注入した後、サイトカインに応答してそれらの部位に戻ることができ得る。
【０２９４】
結論：この実施例は、潜在的注入剤（すなわち、製剤Ａ、Ｂ、またはＣ）中で濃縮され、シリンジに充填され、市販の輸送容器内で毎日１〜１０℃の監視温度条件下で３日間輸送された後の選択したＣＤ３４＋細胞（１日当たり５μｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦを５日間受けたドナーから動員されたもの）の安定性を評価した。この試験の目標は、細胞の安定性が維持される条件（複数可）を決定することであった。つまり、以下の重要な観察が、この試験中になされた。
【０２９５】
１）細胞の安定性が維持されたかを決定するための一次許容基準は、細胞の生存率に基づき、８０％より大きい生存率が許容可能であると見なされた。製剤ＢおよびＣ中に貯蔵された細胞は、最長３日間、高いレベルの生存率を維持し、３日目の平均生存率は約９４％〜９５％であった。製剤Ａ中に貯蔵された細胞は、生存率の低下を経験し、平均生存率は、２日目に約８６％、３日目に約７９％であった。この基準に基づくと、製剤Ａ中に３日間貯蔵された細胞は、この試験の一次許容基準を満たさなかった。
【０２９６】
２）生存率の統計的評価は、２日間および３日間の貯蔵において、製剤Ａと、製剤Ｂおよび製剤Ｃとの間に統計的差異があったことを報告した。２日間および３日間の貯蔵において、製剤Ｂと製剤Ｃとの間に統計的差異があった。統計的評価は、最長２日間だけ貯蔵され得る製剤Ａを除いて、全ての溶液が最長３日間貯蔵され得ることを報告した。
【０２９７】
３）早期アポトーシス細胞のレベルが５０％未満である必要があるとする二次許容基準は、３日目までに溶液のそれぞれに貯蔵された細胞について満たされた。溶液のそれぞれにおける貯蔵は、１日目に同様の結果をもたらした。細胞完全性は、製剤Ｂ中での細胞の貯蔵の間に全体的に最も安定し、試験の３日目までに細胞の平均約６％がアポトーシスの早期段階であった。製剤Ｃ中に貯蔵された細胞の分析は、３日目までに細胞の約１２％がアポトーシスの早期段階であったことを決定した。製剤Ａ中に貯蔵された細胞は、３日目までに約１７％の平均を持つ細胞に対し、早期アポトーシス細胞において最大の増加をもたらした。
【０２９８】
４）早期アポトーシス細胞の統計的評価は、２日間および３日間の貯蔵において、製剤Ｂと、製剤Ａおよび製剤Ｃとの間に統計的有意差があったことを報告した。３日間の貯蔵において、製剤Ａと製剤Ｃとの間にも統計的差異があった。
【０２９９】
５）Ｃ３４＋細胞の平均割合によって定義されるＩＳＯＬＥＸ  ３００ｉ選択後の純度は、試験日の全てに対し非常に高いままであり、３つの試験製剤間で一定であった。３日間の試験期間にわたって、３つの試験製剤全ての平均純度は、約９８％のままであった。わずかな割合の汚染細胞が、ＩＳＯＬＥＸ処理後生成物の中に非特異的に運ばれた。これらの細胞の大部分は、Ｂ細胞であり、降順でＴ細胞、顆粒球、および単球が続いた。
【０３００】
６）コロニー形成のＣＦＵアッセイ許容基準は、３日間の試験製剤のそれぞれにおける細胞の貯蔵の場合に満たされた。コロニー形成能は、２日間の貯蔵を通して製剤ＢおよびＣに対し類似していた。試験の３日目に、製剤Ｃは、製剤Ｂよりもわずかに高いコロニー数を生成した。製剤Ａを含む生理食塩水中に貯蔵された細胞は、最低レベルのコロニー形成を有し、３日間の貯蔵期間にわたって徐々に減少した。
【０３０１】
７）正の移動の機能的許容基準が、３日間の試験製剤のそれぞれにおける細胞の貯蔵の場合に満たされた。３つの試験製剤の全てにおいて、ＣＤ３４＋細胞は、漸増濃度のＳＤＦ−１αに対する用量応答を呈し、最大用量のＳＤＦ−１α、４００ｎｇに対応する最大移動指数を有した。製剤Ｃは、試験の１日目、２日目、および３日目に３つの試験製剤の最高機能応答を有した。製剤Ｂは、試験の１日目、２日目、および３日目に製剤Ａよりも高い機能応答を示した。
【０３０２】
全体として、製剤ＢおよびＣ中に貯蔵された細胞は、３日間の試験期間にわたって高レベルの生存率を維持した。製剤Ａ中に貯蔵された細胞は、２日間の試験期間に８０％超の生存率を維持した。製剤Ｂ中に貯蔵された細胞は、３つの試験製剤の最低レベルのアポトーシスを維持し、２日間の貯蔵と３日間の貯蔵における差異は統計的に有意であった。３日間の試験期間にわたって、３つの試験製剤全てのＣＤ３４＋細胞純度は、約９８％のままであった。コロニー形成能は、２日間の貯蔵を通して製剤ＢおよびＣ中に貯蔵された細胞に対し類似していた。試験の３日目に、製剤Ｃ中に貯蔵された細胞は、製剤Ｂ中に貯蔵された細胞よりもわずかに高いコロニー数を生成した。製剤は、試験の１日目、２日目、および３日目に３つの試験製剤の最高機能応答を示した。
【０３０３】
本明細書に引用される、刊行物、特許出願、および特許出願を含む全ての参照文献は、各参照文献が、個別かつ明確に参照により組み込まれることが示され、その全体が本明細書に記載されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３０４】
本発明を示す文脈中（特に以下の請求項の文脈中）の用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および同様の指示物は、本明細書中に別段の定がない限りまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を含むと解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、別段の記載がない限り、無制限の用語（すなわち、「を含むが、これらに限定されない」）と解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中に別段の定めがない限り、その範囲に入る各別々の値を個々に言及する省略法として働くと単に意図され、各別々の値が、本明細書中に個々に列挙されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書中に示される全ての方法は、本明細書中に別段の定めがない限り、または別様に文脈により明らかに矛盾しない限り、いかなる好適な順序でも行われ得る。本明細書中に提供されるいかなるおよび全ての実施例または例示の表現（例えば、「等の」）の使用は単に本発明をよりよく例示することが意図され、別様に請求されていない限り、本発明の範囲についての限定を提示しない。本明細書中のどの表現も本発明の実施に本質的な非請求要素を示すと解釈されるべきでない。
【０３０５】
本発明のある特定の実施形態が本明細書に記載され、本発明を実行するために発明者らに既知の最良の形態を含む。それらの好適な実施形態の変形は、前述の説明を読むことで当業者に明らかとなるであろう。発明者らは、熟練者がそのような変形を適切に用いることを予期し、また発明者らは、本発明が本明細書に特異的に記載されるのとは別の方法で実践されることを意図する。したがって、本発明は、適用可能な法律によって許可されるように、本明細書に付随する請求の範囲に列挙される主題の全ての修正および相当物を含む。さらに、上記に示される要素の、それらの全ての可能な変形の、どんな組み合わせも、本明細書中に別段の定めがない限り、また別様に文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に含まれる。
【国際調査報告】
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