(57)【要約】本発明は、（a）骨格筋由来細胞（SMDC）のAChE活性を測定する工程、および（b）工程（a）で測定されたAChE活性に基づいて、SMDCの、骨格筋機能障害の処置のために使用される可能性を評価する工程を含む、SMDCについての効力アッセイに関する。さらに、本発明は、筋機能障害の処置における使用のための骨格筋由来細胞（SMDC）に関する。最後に、本発明は、骨格筋由来細胞用のインビトロ分化マーカーとしてのAChE活性の使用、および本発明による効力アッセイを実施するためのキットに関する。2015531230.tif 000010
2015531230.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）骨格筋由来細胞（SMDC）のAChE活性を測定する工程、および
（b）工程（a）で測定されたAChE活性に基づいて、SMDCの、骨格筋機能障害の処置のために使用される可能性を評価する工程
を含む、SMDCについての効力アッセイ。
【請求項２】
工程（a）のSMDCがCD56陽性かつ／またはデスミン陽性である、請求項1記載の効力アッセイ。
【請求項３】
SMDCのAChE活性が非筋原細胞のAChE活性より少なくとも2倍高い場合、骨格筋機能障害の処置のために使用される可能性をSMDCが有している、前記請求項のいずれか一項記載の効力アッセイ。
【請求項４】
非筋原細胞がCD56陰性かつ／またはデスミン陰性である、請求項3記載の効力アッセイ。
【請求項５】
以下の工程を含む、請求項1記載の効力アッセイ：
（a）骨格筋由来細胞を細胞増殖培地においてインキュベートする工程、
（b）工程（a）で入手された細胞を分化培地と共にインキュベートする工程、
（c）工程（b）の開始日にAChE活性の1回目の検出を実施する、2回またはそれ以上の異なる時点でAChE活性を検出する工程、および
（d）2回の異なる時点でのAChE活性間の差が骨格筋由来細胞の効力を示す、2回またはそれ以上の異なる時点でのAChE活性を比較する工程。
【請求項６】
工程（a）のSMDCが、CD56および／またはデスミンを発現する骨格筋由来細胞を少なくとも60％含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の効力アッセイ。
【請求項７】
2回の異なる時点の間の時間差が3日、4日、5日、6日、または7日である、請求項5または6のいずれか一項記載の効力アッセイ。
【請求項８】
骨格筋機能障害が、失禁、具体的には、尿失禁および／または肛門失禁である、前記請求項のいずれか一項記載の効力アッセイ。
【請求項９】
CD56陽性かつ／またはデスミン陽性細胞を少なくとも60％含み、かつAChE活性が非筋原細胞のAChE活性より少なくとも2倍高い、筋機能障害の処置における使用のための骨格筋由来細胞（SMDC）。
【請求項１０】
請求項1〜8のいずれか一項記載の効力アッセイによって同定可能である、請求項9記載の使用のための骨格筋由来細胞。
【請求項１１】
対象に対して異種または自己である、請求項9〜10のいずれか一項記載の使用のための骨格筋由来細胞。
【請求項１２】
初代細胞である、請求項9〜11のいずれか一項記載の使用のための骨格筋由来細胞。
【請求項１３】
骨格筋機能障害が、失禁、具体的には、尿失禁および／または肛門失禁である、請求項9〜12のいずれか一項記載の使用のための骨格筋由来細胞。
【請求項１４】
骨格筋由来細胞用のインビトロ分化マーカーとしてのAChE活性の使用。
【請求項１５】
請求項1〜8のいずれか一項記載の効力アッセイを実施するための手段を含む、SMDCの、骨格筋機能障害の処置において使用される可能性を評価するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、（a）骨格筋由来細胞（SMDC）のAChE活性を測定する工程、および（b）工程（a）で測定されたAChE活性に基づいて、SMDCの、骨格筋機能障害の処置のために使用される可能性を評価する工程を含む、SMDCについての効力アッセイに関する。さらに、本発明は、筋機能障害の処置における使用のための骨格筋由来細胞（SMDC）に関する。最後に、本発明は、骨格筋由来細胞用のインビトロ分化マーカーとしてのAChE活性の使用、および本発明による効力アッセイを実施するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
筋芽細胞を含む骨格筋由来細胞は、成人における筋損傷を修復するために分化することができる骨格筋前駆細胞として公知である。
【０００３】
単核筋芽細胞の分化は、筋肉の発達および修復のために必須の過程である。筋芽細胞分化は、細胞周期からの離脱、筋特異的遺伝子の転写活性化、および最終的な多核筋管への細胞融合を含む多段階過程である。インビトロの筋芽細胞分化の分析は、筋線維の多核化が、筋芽細胞の物理的融合を通してのみ起こり得るという知見に至った。分化の間に遺伝子発現が変化することは公知である。従って、単核筋芽細胞の多核筋管への分化の間に抑制されるかまたは活性化される多くの遺伝子が存在し得る。胚ニワトリ筋芽細胞についての研究は、膜結合型アセチルコリンエステラーゼ（AChE）が骨格筋芽細胞についての初期分化マーカーであるらしいことを明らかにした。この酵素の活性型は分化の間の筋芽細胞の単核段階ですら明白であり、繊維芽細胞には真のアセチルコリンエステラーゼ活性が見出され得ないことが発見された。ウサギ筋芽細胞において、AChE活性は、増殖期の間に低く、筋芽細胞融合の間に増加し、筋管変性の間に減少することが説明された。C2-C12筋芽細胞におけるAChE遺伝子および発現パターンの分析は、n-AChRサブユニットのような他の筋原分化マーカーとは対照的に、AChEの転写速度が、筋芽細胞においても筋管においても同レベルであり、n-AChR遺伝子の転写速度は、分化過程の間に増加することを示した。これは、筋芽細胞分化の間のAChEタンパク質のレベルの増加が、mRNA転写物の安定化によって起こることを意味する。従って、AChE遺伝子の転写は、多くの組織において（10T1/2繊維芽細胞系統ですら）遍在性であるようであるが、大部分の組織において、転写物は分解され、タンパク質発現が検出され得る組織においては、転写物が安定化されている。レポーター遺伝子アッセイは、AChE転写物の3'-UTRが、分化中のC2C12細胞においてAChE転写物の安定性および発現を増加させるHuRタンパク質のための標的であることを明らかにした。AChE発現が神経筋接合部におけるシグナルターミネーターとしての機能を提供するために筋芽細胞分化の間に増加するという知見とは別に、最近の研究によって、ヒト筋芽細胞におけるアポトーシスの誘導は、AChE-Rスプライスバリアントの発現の増加に至り得るが、H型およびT型には影響を与えないという推測がなされた。
【０００４】
例えば、筋芽細胞は、コンチネンスの維持に関与する筋損傷、具体的には、尿失禁および／または肛門失禁を修復するために使用され得る。尿コンチネンスおよび／または肛門コンチネンスの喪失は、物理的、生理学的、および社会的なハンディキャップをもたらす。一般に、主として高齢者および心身障害者が尿失禁および／または肛門失禁に罹患すると考えられているが、これらの症状はあらゆる年齢の人々において起こり得る。このための理由は、多層性で複雑であり得る。影響を受けた個体の極度に損なわれた生活の質とは無関係に、肛門コンチネンス障害は、公衆衛生上の過小評価されるべきでないコスト要因をもたらす。
【発明の概要】
【０００５】
筋損傷の処置、例えば、失禁の処置において筋芽細胞を使用するためには、好ましくは、処置される対象の骨格筋生検材料から、筋芽細胞を単離する。しかしながら、融合コンピテント骨格筋由来細胞のみが、筋損傷を修復することができる。単離された筋由来細胞が、実際に、筋損傷の処置において使用するために適当であるか否かを試験するための定量可能な試験は従来入手不可能であった。従って、本発明の目的は、骨格筋由来細胞が筋損傷の処置において使用するために適当であるか否かを評価するかまたは検証するための効力アッセイの提供である。具体的には、本発明の目的は、骨格筋由来細胞が、失禁、具体的には、尿失禁および／または肛門失禁の処置において使用するために適当であるか否かを評価するかまたは検証するための定量可能な効力アッセイの提供である。
【０００６】
この目的は、特許請求の範囲において定義される主題によって解決される。
【０００７】
以下の図面は、本発明を例示する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】混合SMDC集団のCD56発現を例示する。44％CD56陽性細胞（A）。筋原前駆細胞；92％CD56陽性細胞（B）および非筋原前駆細胞；1％CD56陽性細胞（C）の各々のCD56発現。赤色ピークは、CD56-フィコエリトリンモノクローナル抗体と共にインキュベートされた細胞のヒストグラムを表し、白色ピークは、アイソタイプ対照を表す。
【図２】AChE活性の開始：Fau0113207；筋芽細胞分化の間のAChE活性の変化（240000細胞、CD56陽性：95.03％）を示す。試薬とのインキュベーションの開始時と60分後との間のOD412nmの変化を測定した。
【図３】アッセイ緩衝液およびPBSにおけるAChE活性の開始を示す：Fau0113305；6日以内の分化の間の各日に（4日目および5日目を除いて）10分の反応時間の後に測定された、OD412nm。各ケースにおいて240000個の細胞（CD56陽性：92,83％）を試験。分化の間、膜AChE活性（PBS緩衝液）が、全体AChE活性（アッセイ緩衝液）と同一の比率で増加することが示される。
【図４】異なる細胞数のAChE活性を示す：Fau0113305；回帰直線の例示。異なる細胞数のCD56陽性SMDC（92,83％）を4日間分化させ、最後に、AChE活性を決定した。従って、インキュベーションの開始時から60分後までのOD412nmの変化を、プレートリーダにおいて測定した。
【図５】CD56+/-細胞のAChE活性を示す：Fau0113166；5日間分化させた筋原細胞（CD56陽性）および非筋原細胞（CD56陰性）（各ウェルに240000個）の混合物（100％、60％、30％、および0％）のアセチルコリンエステラーゼアッセイのタイムドライブ（Time drive）。グラフの出発点を0に設定した。
【図６】CD56+/-細胞のAChE活性を示す：Fau0113166；CD56陽性細胞の純度と、60分間のインキュベーションにおけるOD412nmの変化との間の回帰直線。1ウェル当たり240000個のCD56陽性細胞およびCD56陰性細胞の混合物（0％、30％、60％、および100％）を、5日間分化させた。
【図７】筋管のコラゲナーゼ消化を示す：Fau0113305；6日間の分化の後の多核筋芽細胞（CD56陽性：＞90％）のコラゲナーゼ消化の前後のアセチルコリンエステラーゼ活性。細胞をコラゲナーゼ溶液と共に2時間インキュベートした。非膜透過性PBS緩衝液においてAChE活性を測定した。グラフを0に設定した。
【図８】筋管のトリプシン消化を示す：トリプシン溶液のアセチルコリンエステラーゼ活性を、多核筋管（CD56陽性：＞90％）の消化の前後に試験した。細胞を1×トリプシン溶液と共にインキュベートした。
【図９】各々、60％CD56陽性細胞を含む細胞の混合物と比較した、骨格筋由来CD56陽性細胞の3つの異なる試料の増倍率（0〜12）を示す。
【図１０】5日間の分化の間の50,000細胞のAChE活性の増倍率（0〜25）を示す。これは、CD56陽性細胞および陰性細胞の異なる混合物に基づく効力アッセイの直線性を証明する。
【図１１】101人の患者の筋生検材料から単離された分化SMDCに対して実施されたインビトロAChEアッセイのデータ分析を示す。試験試料が≧60mUrel/120000細胞を有しており、細胞の少なくとも60％がCD56+である場合、AChEアッセイを陽性と見なす。データは平均値±SEMとして表され、一元配置のANOVAは有意であった（**p＜0.01および***p＜0.001  CD56陰性細胞集団に対して、または異なるCD56％を有する群の間で）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
「（a）」または「（an）」という単語の使用は、特許請求の範囲および／または明細書において、「含む」という用語と共に使用された時、「1」を意味し得るが、「1またはそれ以上」、「少なくとも1」、および「1または1を上回る」の意味とも一致する。
【００１０】
「約」という用語は、記述された値、記述された値の5％のプラスもしくはマイナス、または所定の値の測定の標準誤差が企図されることを意味する。
【００１１】
本明細書において使用される「アセチルコリンエステラーゼ」または「AChE」という用語は、神経筋シナプスに一般的に存在し、シグナル終結の機能を有している酵素アセチルコリンエステラーゼをさす。従って、それは、骨格筋におけるニューロンとの相互作用を提供する融合中の筋芽細胞の能力のために必要である。「AChE活性」という用語は、AChEを発現する細胞の特性をさす。好ましくは、それは、単核筋芽細胞の多核筋管への分化の間の機能性のAChE発現をさし、そのAChE発現は定量化される。「AChE活性」という用語は、好ましくは、全体AChE活性および／または膜結合型AChE活性をさす。AChE活性は、例えば、エルマンアッセイ（Ellman et al.,Biochemical Pharmacology,1961,Vol.7,pp.88-95）および修飾型エルマンアッセイによって決定され得る。
【００１２】
本明細書において使用される「効力アッセイ」という用語は、細胞集団の品質または状態の評価のための試験をさす。具体的には、それは、細胞集団の発達のための初期の固有の能力をさす。好ましくは、本明細書において使用される「効力アッセイ」という用語は、定量可能なアッセイをさす。
【００１３】
本明細書において使用される「尿失禁」という用語は、尿の望まれていない喪失をさす。それは、腹圧性尿失禁、切迫性尿失禁、混合型尿失禁、および溢流性尿失禁のような全ての種類の尿失禁を含む。腹圧性失禁とは、笑った時、くしゃみ、咳をした時、階段を上った時、またはその他の物理的なストレッサーによって、腹腔、従って、膀胱に対する腹圧が増加した後に起こる尿の漏出をさす。切迫性尿失禁は、切迫を伴うか、または切迫の直後に起こる不随意の漏出である。混合型尿失禁とは、腹圧性失禁と切迫性失禁との組み合わせをさす。
【００１４】
本明細書において使用される「肛門失禁」または「便失禁」という用語は、屁、液状または固形の便のような、肛門を通した腸の内容物の望まれていない喪失をさす。その用語は、3つの重症度等級を全て含む：等級1＝気体のみ、等級2＝液体および軟便、等級3＝固形の有形便。
【００１５】
本明細書において使用される「尿道括約筋（urinary sphincter）」または「尿道の括約筋（urethral sphincter）」という用語は、具体的には、膀胱内の尿の、尿道からの排出を調節するために使用される、2種の筋肉をさす。それらの2種の筋肉とは、尿道の外括約筋および尿道の内括約筋である。尿道の内括約筋は、膀胱の下端および尿道の近位部、尿道と膀胱との接続部に位置している。内括約筋は、排尿筋から続き、平滑筋で作成されており、従って、不随意のまたは自律的な調節の下にある。これは、尿の放出を禁止するための主要な筋肉である。女性においては膀胱の遠位下方、男性においては前立腺の下方に位置する外側の尿道の括約筋（尿道括約筋）は、尿道を通る尿の流れを調節する二次的な括約筋である。内括約筋と異なり、外括約筋は骨格筋で作成されており、従って、体性神経系の随意調節の下にある。「尿道括約筋」または「尿道の括約筋」という用語は、骨格筋組織からなる尿道の外括約筋のみをさす場合もある。
【００１６】
本明細書において使用される「肛門括約筋」または「肛門括約筋装置」という用語は、具体的には、肛門挙筋の一部としての外肛門括約筋および恥骨直腸筋をさす。しかしながら、それは、恥骨尾骨筋、尾骨筋、腸骨尾骨筋、および陰部神経も含む。
【００１７】
「骨格筋由来細胞」または「SMDC」という用語は、初代細胞および／もしくはインビトロ培養細胞であり得る、多核融合コンピテント細胞、例えば筋芽細胞、あるいは、筋組織を形成する可能性を有するその他の細胞（例えば、脂肪吸引組織、または骨髄などの幹細胞を保持しているその他の組織に由来）をさす。その用語は、骨格筋細胞の培養のために単離され使用され得る脂肪に由来する細胞も含む。「骨格筋由来細胞」または「SMDC」という用語は、筋組織から単離された細胞集団もさす。一般に、そのような細胞集団は、筋組織を形成する可能性を有しないさらなる細胞を含む。そのような細胞は、本明細書において「非筋原細胞」または「骨格筋由来非筋原細胞」と呼ばれ、好ましくは、CD56陰性かつ／またはデスミン陰性である。従って、本明細書において使用される「骨格筋由来細胞」または「SMDC」という用語は、好ましくは、多核融合コンピテント細胞を少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または100％含む細胞集団をさす。
【００１８】
本明細書において使用される「穿通」という用語は、注射過程に影響を与えることなく、注射器、例えば、針を身体組織へ導入する過程をさす。
【００１９】
本明細書において使用される「注射」という用語は、注射器からの、上記細胞を含む注射溶液の、ヒト体内の特定の部位、具体的には、尿コンチネンスおよび／または肛門コンチネンスを提供する筋組織またはその近傍への排出をさす。注射過程は、静的、即ち、注射器が到達した位置に留まるものであり得るが、これに限定されない。あるいは、注射過程は動的である。例えば、本発明のいくつかの態様において、注射は、注射の部位からの注射器の回収と同時に行われる。
【００２０】
本明細書において使用される「注射部位」という用語は、注射過程が開始される、尿コンチネンスおよび／または肛門コンチネンスを提供する筋組織またはその近隣のような、ヒト体内の部位をさす。注射部位は、注射過程が終了する部位と同一である必要はない。
【００２１】
本明細書において使用される「注射器」という用語は、関心対象の注射部位に到達するためにヒト組織を穿通するために適当であって、溶液、具体的には、筋由来細胞を含む溶液を、関心対象の注射部位へ送達することができる装置をさす。
【００２２】
本明細書において使用される「受動失禁」という用語は、尿および／または便の喪失の感覚認識の欠如をさす。
【００２３】
本明細書において使用される「強制的排便」または「強制的切迫」とは、人が5分より長く排便を遅らせることができないことをさす。そのような患者は、直ちにトイレに行かなければならない。
【００２４】
本明細書において使用される「CD56+」または「CD56陽性」という用語は、細胞マーカーCD56を発現する細胞をさす。「CD56+」または「CD56陽性」という用語は、好ましくは細胞集団の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または99％が細胞マーカーCD56を発現する場合は、異なる細胞型を含む細胞集団についても使用され得る。
【００２５】
本明細書において使用される「CD56-」または「CD56陰性」という用語は、細胞マーカーCD56を発現しない細胞をさす。「CD56-」または「CD56陰性」という用語は、好ましくは細胞集団の多くとも49％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、または0％が細胞マーカーCD56を発現する場合は、異なる細胞型を含む細胞集団についても使用され得る。
【００２６】
本明細書において使用される「デスミン陽性」という用語は、細胞マーカーデスミンを発現する細胞をさす。「デスミン陽性」という用語は、好ましくは細胞集団の少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、または99％が細胞マーカーデスミンを発現する場合は、異なる細胞型を含む細胞集団についても使用され得る。
【００２７】
本明細書において使用される「デスミン陰性」という用語は、細胞マーカーデスミンを発現しない細胞をさす。「デスミン陰性」という用語は、好ましくは細胞集団の多くとも49％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、または0％が細胞マーカーデスミンを発現する場合は、異なる細胞型を含む細胞集団についても使用され得る。
【００２８】
本明細書において使用される「分化培地」という用語は、多核融合コンピテント細胞または筋原細胞、例えば、筋芽細胞において融合を誘導する細胞培養培地をさす。しかしながら、その用語は、多核融合コンピテント細胞または筋原細胞がそれぞれの誘導なしに融合することができる場合、融合の誘導のために必要な物質を含まない細胞培養培地もさす。
【００２９】
本明細書において使用される「細胞増殖培地」という用語は、インキュベーション容器の表面への哺乳動物細胞の付着を可能にする、SMDCのような哺乳動物細胞のインキュベーションのために適当な培地をさす。
【００３０】
本発明の発明者らは、アセチルコリンエステラーゼ活性が多核融合コンピテント細胞、例えば、インビトロで多核筋管へ融合する筋芽細胞についての分化マーカーであること、およびAChE活性と多核融合コンピテント細胞の純度との間に関係が存在することを見出した。従って、本発明の発明者らは、驚くべきことに、多核融合コンピテント細胞についての定量可能な試験として、AChE活性の測定を使用することができることを見出した。さらに、具体的には、膜結合型活性の増加に至るアポトーシス誘導を除外することができるため、全体AChE活性のみならず、膜AChE活性も、可能なマーカーとして使用することができる。従って、AChE活性（全体または膜結合型）の増加は、骨格筋由来細胞の分化、細胞数、および筋原効力に依るイベントとして説明され得る。具体的には、筋組織を形成する可能性を有する骨格筋由来細胞のみが、分化の間にAChE活性の増加を有していたため、AChE活性は、筋組織を形成する可能性を有する細胞についての定量可能な試験において、骨格筋に由来する初代細胞の筋原効力を試験するための信頼性のあるマーカーとなる。さらに、筋組織から単離された細胞集団が、骨格筋機能障害の処置のために使用され得るか否かを認定するため、AChE活性を使用することができる。
【００３１】
本発明は、骨格筋由来細胞（SMDC）についての効力アッセイに関する。効力アッセイは、以下の工程を含む、骨格筋由来細胞の効力を決定する方法である：
（a）骨格筋由来細胞を含む細胞集団を細胞増殖培地においてインキュベートする工程、
（b）工程（a）で入手された細胞を分化培地と共にインキュベートする工程、
（c）工程（b）の開始日にAChE活性の1回目の検出を実施する、少なくとも2回の異なる時点でAChE活性を検出する工程、および
（d）少なくとも2回の異なる時点でのAChE活性間の差が骨格筋由来細胞の効力を示す、少なくとも2回の異なる時点でのAChE活性を比較する工程。
【００３２】
骨格筋由来細胞の集団の効力は、好ましくは、多核筋管へ融合する効力および／または筋細胞へ分化する効力である。さらに、骨格筋由来細胞の集団の効力は、骨格筋組織を再生させる効力であり得る。さらに、効力は、失禁、具体的には、尿失禁および／または肛門失禁のような骨格筋機能障害の処置におけるSMDCの使用のための効力であり得る。
【００３３】
本発明による効力アッセイは、好ましくは、定量可能な試験を提供する。即ち、本発明による効力アッセイは、好ましくは、多核筋管へ融合する効力および／または筋細胞へ分化する効力を有するSMDCを定量化するための試験である。
【００３４】
骨格筋由来細胞（SMDC）は、好ましくは、筋組織、具体的には、骨格筋組織、より好ましくは、ヒト骨格筋組織から単離された細胞である。好ましくは、骨格筋由来細胞は、多核融合コンピテント細胞または筋原細胞、例えば、筋芽細胞である。好ましくは、細胞は、少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、CD56+細胞からなる。特に好ましい態様において、SMDCは、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、または99％、CD56+細胞からなる。あるいは、またはさらに、細胞は、少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％、デスミン陽性細胞からなり、より好ましくは、少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、または99％、デスミン陽性細胞からなる。骨格筋由来細胞は、筋組織、具体的には、骨格筋組織から、例えば、筋生検によって入手された細胞であり得る。それらは、筋芽細胞または筋芽原細胞のような多核融合コンピテント細胞または筋原細胞と、筋細胞、繊維芽細胞等のような非多核融合コンピテント細胞との混合物であり得る。本発明の好ましい態様において、骨格筋由来細胞は、精製されかつ／または単離されている。例えば、筋生検から入手された骨格筋由来細胞を精製しかつ／または単離する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、Websterら（Exp Cell Res.1988 Jan;174(1):252-65）またはRandoら（J Cell Biol.1994 Jun;125(6):1275-87）に記載されている。
【００３５】
本発明による方法の工程（a）は、好ましくは、SMDCがインキュベーション容器の表面に付着するために適当な条件の下で実施される。例えば、フィブロネクチンによってコーティングされた容器を使用することができる。好ましくは、工程（a）は、マルチウェルプレート、例えば、6穴、12穴、24穴、48穴、および96穴のフォーマットにおいて実施される。フィブロネクチンコーティングのためには、容器またはマルチウェルプレートにフィブロネクチンを充填し、容器またはマルチウェルプレートの表面をフィブロネクチンによってコーティングするために十分な条件の下で十分な時間インキュベートする。例えば、100μlのフィブロネクチン（1〜10μg/ml）を、96穴プレートにおいて、約20℃〜約50℃の温度で、好ましくは、約37℃で、少なくとも40分間インキュベートすることができる。好ましくは、インキュベーションは、約1〜約10％CO2の雰囲気、より好ましくは、約5％CO2の雰囲気において実施される。インキュベーションの後、容器またはマルチウェルプレートを、好ましくは、PBSで、好ましくは、10×PBSで1〜5回、洗浄する。
【００３６】
本発明による方法の工程（a）において使用される細胞数は、好ましくは、約1000〜約1×106細胞、より好ましくは、約10000〜約100000細胞、最も好ましくは、約50000細胞である。
【００３７】
工程（a）のインキュベーションは、好ましくは、約20℃〜約50℃の温度で、好ましくは、約37℃で実施される。好ましくは、インキュベーションは、約1〜約10％CO2の雰囲気、好ましくは、約5％CO2の雰囲気において実施される。インキュベーションは、容器またはマルチウェルプレートの表面へ細胞を付着させるために十分な時間実施される。好ましくは、インキュベーションは、約6時間〜約72時間、好ましくは、約12時間〜約36時間、好ましくは、約16〜約24時間実施される。
【００３８】
本発明による方法の工程（a）において使用される増殖培地は、好ましくは、多核融合コンピテント細胞、例えば、筋芽細胞のインキュベーションのために適当な増殖培地である。
【００３９】
好ましくは、本発明による方法は、工程（a）の後、工程（b）の前に、増殖培地の除去および分化培地の添加を含む工程（a'）を含む。増殖培地の除去のためには、それを、例えば、廃棄するかまたは吸引することができる。工程（a'）は、分化培地による洗浄を含み得る。好ましくは、工程（a）で入手された細胞を、分化培地で1回洗浄する。分化培地による洗浄の後、工程（b）を実施するため、新鮮な分化培地を添加することができる。
【００４０】
工程（b）のインキュベーションは、好ましくは、約20℃〜約50℃の温度で、好ましくは、約30℃〜約40℃で、最も好ましくは、約37℃で実施される。好ましくは、インキュベーションは、約1〜約10％CO2の雰囲気、より好ましくは、約5％CO2の雰囲気において実施される。インキュベーションは、少なくとも60％CD56+骨格筋由来細胞が使用される場合、AChE活性の1回目の検出と比較したAChE活性の増加を検出するために十分な時間実施される。好ましくは、インキュベーションは、約1日〜14日間、好ましくは、約2〜約7日間、より好ましくは、約3〜約6日間、最も好ましくは、約4〜約5日間実施される。
【００４１】
本発明の工程（c）におけるAChE活性の1回目の検出は、工程（a）で入手された細胞の分化培地とのインキュベーションが開始されるのと同一の日に実施される。好ましくは、分化培地と接触させられていない工程（a）で入手された細胞において、検出が実施される。1回目の検出のため、好ましくは、工程（a）を実施した後、増殖培地を廃棄するかまたは吸引する。その後、好ましくは、細胞を洗浄する、好ましくは、PBSで1回洗浄する。その後、基質溶液を細胞に添加する。基質溶液は、好ましくは、100μl PBS中に1mgの基質を含む。基質溶液を添加した後、AChE活性を検出するため、試料のODを決定する。AChE検出のためには、試料を、好ましくは、プレートリーダ（例えば、Anthos 2010）において412nmのODで測定する。60秒毎に、計60分間、検出を実施することができる。あるいは、基質の添加後1〜60分以内、好ましくは約10分後に、直線区域において検出を実施し、標準試料に基づきAChE活性を計算する。
【００４２】
AChE活性の2回目の検出は、好ましくは、工程（a）で入手された細胞の分化培地とのインキュベーションが開始された日の約1日〜14日後、より好ましくは、約2〜約7日後、より好ましくは、約3〜約6日後、最も好ましくは、約4〜約5日後に実施される。従って、2回の異なる時点の間の時間差は、好ましくは、3日、4日、5日、6日、または7日である。2回目の検出のため、好ましくは、工程（b）を実施した後、分化培地を廃棄するかまたは吸引する。2回目の検出のための以降の手法は、1回目の検出について記載されたのと同様に実施され得る。任意で、1回目の検出において実施された洗浄工程は、省略されてもよい。
【００４３】
本発明による方法の工程（d）において、ODの変化は、好ましくは、単一の検出の60分後と開始時との間で計算される。1〜60分以内に1回のみAChE活性が測定される場合（時間曲線ではなく直線区域）、ODの変化は、少なくとも2回目の検出時のAChE活性および1回目の検出時のAChE活性に関して計算される。その変化は「OD変化」と呼ばれる。次いで、1回目の検出と2回目の検出との間の期間内のAChE活性の増倍を計算するため、1回目の検出および2回目の検出のOD変化を除算することができる。
【００４４】
上述のような効力アッセイの態様において記載されるように、分化培地におけるインキュベーションの後のSMDCのAChE活性を、分化培地におけるインキュベーションの前のSMDCのAChE活性と比較する代わりに、分化培地におけるインキュベーションの前のSMDCのAChE活性を無視し得る程度であると見なしてもよい。
【００４５】
従って、本発明は、
（a）SMDCのAChE活性を測定する工程、および
（b）SMDCの効力を評価する工程
を含む、骨格筋由来細胞（SMDC）についての効力アッセイにも言及する。
【００４６】
そのため、SMDCの効力は、好ましくは、多核筋管へ融合するSMDCの能力であり、ひいては、SMDCの、骨格筋機能障害の処置のために使用される可能性である。従って、上述のような効力アッセイの工程（a）におけるSMDCのAChE活性に基づいて、SMDCの、骨格筋機能障害の処置のために使用される可能性を評価することができる。
【００４７】
工程（a）は、好ましくは、SMDCが分化培地と共にインキュベートされた後、実施される。SMDCの分化培地とのインキュベーションは、好ましくは、上記と同一の条件の下で、同一の時間範囲で実施される。
【００４８】
効力アッセイに供されるSMDCは、好ましくは、少なくとも細胞マーカーCD56を発現する細胞である。さらに、SMDCは、デスミンのようなさらなる細胞マーカーを発現し得る。従って、効力アッセイは、SMDCがCD56および／またはデスミンのような特異的な細胞マーカーを発現しているか否かを決定する工程をさらに含み得る。その工程は、好ましくは、上記において概略を述べたように、工程（a）の前に実施される。
【００４９】
SMDCを筋組織から単離する時、入手される細胞集団は、通常、筋芽細胞または筋芽原細胞のような多核融合コンピテント細胞または筋原細胞と、筋細胞、繊維芽細胞等のような非多核融合コンピテント細胞との混合物である。従って、あるいは、またはさらに、効力アッセイは、デスミン陽性かつ／またはCD56陽性であるSMDCを濃縮する工程を、上述のような工程（a）の前に含み得る。デスミン陽性かつ／またはCD56陽性細胞を濃縮する方法は、当技術分野において周知である。適当な濃縮法の一例は、磁気細胞選別（magnetic-activated cell sorting）（MACS（登録商標））である。MACS法は、特定の表面抗原に対する抗体によってコーティングされた磁性ナノ粒子と共に細胞をインキュベートすることによって、細胞の分離を可能にする。その後、インキュベートされた細胞を、磁場に置かれたカラムに移す。この工程において、抗原を発現しており、従って、ナノ粒子に付着する細胞は、カラム上に留まり、抗原を発現していない他の細胞は、カラムを素通りする。この方法によって、特定の抗原に関してポジティブにかつ／またはネガティブに、細胞を分離することができる。適当な濃縮法のもう一つの例は、例えば、Websterら（Exp Cell Res.1988 Jan;174(1):252-65）に記載されているような蛍光標示式細胞選別（FACS（登録商標））である。
【００５０】
細胞集団が細胞マーカーCD56および／またはデスミンを発現しており、かつCD56および／またはデスミンを発現しているSMDCのAChE活性がCD56および／またはデスミンを発現していない非筋原細胞のAChE活性より少なくとも2倍高い場合、骨格筋組織から単離された細胞集団およびSMDC試料が、それぞれ、骨格筋機能障害の処置において使用され得るか否かを検証することが可能であることを、本発明の発明者らは見出した。
【００５１】
従って、本発明の好ましい態様の効力アッセイは、以下を含む：
（a）SMDCのAChE活性を測定する工程、および
（b）SMDCの、骨格筋機能障害の処置のために使用される可能性を評価する工程であって、SMDCのAChE活性が非筋原細胞のAChE活性より少なくとも2倍高い場合に、SMDCは、骨格筋機能障害の処置のために使用される可能性を有する、工程。
【００５２】
非筋原細胞は、好ましくは、本発明の教示による骨格筋機能障害の処置において使用され得ない細胞集団である。本発明の教示による骨格筋機能障害の処置において使用され得ない細胞または細胞集団は、多核筋管へ融合しかつ／または筋細胞へ分化することができない細胞である。好ましくは、そのような細胞または細胞集団は、特異的な細胞マーカーを発現する特性によって決定される。非筋原細胞は、好ましくは、CD56陰性かつ／またはデスミン陰性である。さらに、非筋原細胞は、好ましくは、骨格筋由来非筋原細胞である。例えば、骨格筋由来非筋原細胞は、効力アッセイにおいて試験されるSMDCと同一の対象またはさらには同一の対象の試料に由来し得る。例えば、磁気細胞選別（MACS（登録商標））または蛍光標示式細胞選別（FACS（登録商標））によって、SMDCがCD56陽性かつ／またはデスミン陽性細胞について濃縮される場合、MACS（登録商標）またはFACS（登録商標）によって入手されたCD56陰性かつ／またはデスミン陰性細胞が、非筋原細胞として役立ち得る。
【００５３】
好ましい態様において、骨格筋組織から単離された細胞集団は、細胞集団のAChE活性が非筋原細胞のAChE活性より少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、または16倍高い場合、骨格筋機能障害の処置のために使用される可能性を有する。特に好ましい態様において、細胞集団のAChE活性は、非筋原細胞のAChE活性より少なくとも4倍高い。好ましくは、SMDCのAChE活性は、同一条件下で測定された非筋原細胞のAChE活性と比較される。
【００５４】
上記のような効力アッセイの好ましい態様において、SMDCは、CD56陽性かつ／またはデスミン陽性である。より好ましい態様において、SMDCの少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、または98％が、CD56陽性かつ／またはデスミン陽性である。非筋原細胞は、好ましくは、CD56陰性かつ／またはデスミン陰性である。好ましい態様において、非筋原細胞の少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、または97％、最も好ましくは、少なくとも98％が、CD56陰性かつ／またはデスミン陰性である。
【００５５】
SMDCまたは非筋原細胞が、それぞれ、CD56陽性、デスミン陽性、CD56陰性、およびデスミン陰性であるか否かを検証するためには、細胞マーカーCD56および／またはデスミンの発現を検証することができる。この検証は、本発明の効力アッセイに、好ましくは、工程（a）の前または後に組み入れられ得る。あるいは、SMDCおよび非筋原細胞は、例えば、磁気細胞選別（MACS（登録商標））または蛍光標示式細胞選別（FACS（登録商標））のような適当な方法によって、一方ではCD56+細胞および／またはデスミン陽性細胞について濃縮され、他方ではCD56-細胞およびまたはデスミン陰性細胞について濃縮され得る。
【００５６】
SMDCの骨格筋機能障害の処置のために使用される可能性を評価するため、各試験においてCD56陽性SMDCのAChE活性を非筋原細胞と比較する必要はない。本発明の効力アッセイによるAChE活性に基づく、SMDCの、骨格筋機能障害の処置のために使用される可能性の評価は、非筋原細胞の平均AChE活性に基づき実施されてもよい。非筋原細胞の平均AChE活性は、相当数の非筋原細胞のAChE活性を測定することによって容易に決定可能である。好ましくは、非筋原細胞は、評価されるSMDCが由来したのと同一の種および／または筋組織に由来する。好ましくは、本発明の実施例に記載された条件の下で5日間分化させられた約240000個の非筋原細胞の光学密度を412nmで60分間測定する場合、非筋原細胞の光学密度の変化は、0〜0.2の範囲、より好ましくは、0.1〜0.19の範囲、最も好ましくは、0.15〜0.18の範囲にある。
【００５７】
本発明の方法は、骨格筋から単離された骨格筋由来細胞を、骨格筋機能障害の処置のために使用することができるか否かを検証するために使用され得る。従って、本発明は、特定のAChE増倍率を有している、筋機能障害の処置における使用のための骨格筋由来細胞（SMDC）にも関する。好ましくは、骨格筋機能障害は、失禁の原因となる骨格筋機能障害、具体的には、尿失禁または肛門失禁である。本発明の方法は、骨格筋から単離された骨格筋由来細胞を、失禁、具体的には、尿失禁または肛門失禁の処置のために使用することができるか否かを検証するために使用され得る。
【００５８】
本発明の発明者らは、SMDCのAChE増倍率が、60％融合コンピテントCD56+細胞を含む混合物のAChE増倍率と少なくとも一致する場合、その骨格筋由来細胞（SMDC）を、失禁、具体的には、尿失禁または肛門失禁の処置のために使用することができることを見出した。混合物の残りの細胞は、好ましくは、40％CD56-細胞である。あるいは、60％CD56+細胞および40％CD56-細胞の代わりに、それぞれ、50％、70％、80％、または90％CD56+細胞、および50％、30％、20％、または10％CD56-細胞を、使用することができる。AChE増倍率は、同一の試験条件で、各ケースで、本発明による方法によって決定される。あるいは、本発明による方法によって検出されるAChE増倍率が、少なくとも3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、16倍、17倍、18倍、19倍、または20倍である場合、そのMSDCは上述の目的のために使用され得る。好ましい態様において、筋機能障害の処置において使用するために適当であるSMDCは、分化培地において少なくとも4倍のAChE増倍率を示す。好ましくは、その増倍率は、2回目の検出が1回目の検出の5日後に実施される場合に入手される。さらなる代替法として、SMDCのAChE活性が非筋原細胞のAChE活性より少なくとも2倍高い場合、そのSMDCは上述の目的のために使用され得る。より好ましい態様において、SMDCが少なくとも60％CD56陽性かつ／またはデスミン陽性細胞を含み、かつSMDCのAChE活性が非筋原細胞のAChE活性より少なくとも2倍高い場合、そのSMDCは上述の目的のために使用され得る。より好ましい態様において、SMDCは、少なくとも70％、80％、90％、95％、98％CD56陽性かつ／またはデスミン陽性細胞を含む。あるいは、またはさらに、SMDCのAChE活性は、非筋原細胞のAChE活性より少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、または16倍高い。
【００５９】
失禁の処置において使用するためのMSDCは、好ましくは、レシピエントに対して同属である。より好ましい態様において、MSDCは、レシピエントに対して自己または異種である。MSDCは、例えば、レシピエントの二頭筋の生検によって入手され得る。自己MSDCは、MSDCがレシピエントへ注射された後のアレルギー反応のリスクを低下させるかまたは最小化する。好ましくは、MSDCは、筋芽細胞のような多核融合コンピテント細胞または筋原細胞である。より好ましくは、MSDCはヒト細胞である。
【００６０】
筋繊維の前駆体である筋芽細胞は、他の型の細胞とは多くの点で異なる単核筋細胞である。筋芽細胞は、天然に融合して、生理活性タンパク質の長期発現および送達をもたらす有系分裂後多核筋管を形成する。筋芽細胞は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのような筋関連疾患のためにも、非筋関連疾患のためにも、筋肉への遺伝子送達のために使用されている（例えば、アデノシンデアミナーゼ欠損症候群のためのヒトアデノシンデアミナーゼの遺伝子送達；糖尿病のためのヒトプロインスリンの遺伝子移入；パーキンソン病のためのチロシン水酸化酵素の発現のための遺伝子移入；血友病Bのための第IX因子の移入および発現、発達遅滞のためのヒト成長ホルモンの送達）。
【００６１】
本発明による効力アッセイの提供を考慮すると、本発明は、尿路の筋組織、尿道括約筋系、直腸、肛門括約筋系、および／または外肛門括約筋へMSDCを送達することによる、尿失禁および／または肛門失禁の防止または処置のためのより有効な方法を提供する。従って、本発明は、（a）以前に入手されたMSDCの効力を、本発明による効力アッセイによって検証する工程、（b）患者の皮膚または尿道へ注射器を導入する工程、（c）注射器が関心対象の注射部位に到達するまで、注射器を移動させる工程、および（d）以前に入手され検証されたMSDCを、注射器を介して、関心対象の注射部位へ注射する工程を含む、尿失禁および／または肛門失禁を防止するかまたは処置する方法に関する。本法において、関心対象の注射部位とは、尿コンチネンスおよび／または肛門コンチネンスを提供する筋組織またはその近傍である。工程（d）は、関心対象の部位から注射器を引き抜き、同時に、関心対象の注射部位への注射器の移動によって作製された注射路の少なくとも一部に沿って、注射器から筋由来細胞を分配し、それによって、注射バンドを作製する工程をさらに含み得る。一つの態様において、注射バンドは、直径約600μm以下であり得、かつ／または注射バンドの長さは、注射されている筋肉と同じ長さであり得る。
【００６２】
具体的な態様において、尿コンチネンスおよび／または肛門コンチネンスを提供する筋組織は、肛門括約筋系、内肛門括約筋、および外肛門括約筋である。さらなる態様において、肛門コンチネンスのための筋組織は、恥骨直腸筋である。尿コンチネンスを提供する筋組織は、好ましくは、尿道括約筋系、内尿道括約筋、および外尿道括約筋である。
【００６３】
さらに、本発明は、（a）以前に入手されたMSDCの効力を、本発明による効力アッセイによって検証する工程、（b）患者の直腸および／または尿路へ注射器を導入する工程、（c）注射器が関心対象の注射部位の面に到達するまで、注射器を直腸に沿って移動させる工程；（d）尿道壁および／または皮膚と直腸壁との間の区域を注射器によって穿通する工程；ならびに（e）注射器が関心対象の注射部位に到達するまで、注射器を移動させる工程、ならびに、その後、（f）以前に入手された筋由来細胞を、注射器を介して、関心対象の注射部位へ注射する工程を含む、尿失禁および／または肛門失禁を防止するかまたは処置する方法に関する。本法において、関心対象の注射部位とは、尿コンチネンスおよび／または肛門コンチネンスを提供する筋組織またはその近傍である。工程（f）は、関心対象の部位から注射器を引き抜き、同時に、関心対象の注射部位への注射器の移動によって作製された注射路の少なくとも一部に沿って、筋由来細胞を注射器から分配し、それによって、注射バンドを作製する工程をさらに含み得る。一つの態様において、注射バンドは、直径約600μm以下であり得、かつ／または注射バンドの長さは、注射されている筋肉と同じ長さであり得る。
【００６４】
一つの態様において、注射される骨格筋由来細胞は、自己骨格筋由来細胞（例えば、筋芽細胞および筋由来幹細胞（MDC））であり得る。本発明を実施する時、これらの細胞型は、尿コンチネンスおよび／または肛門コンチネンスを提供する損傷を受けた筋組織またはその近傍へ注射され得、例えば、肛門失禁の防止もしくは処置の手段として、損傷を受けた外肛門括約筋へ、または尿失禁の防止もしくは処置の手段として、尿道括約筋へ注射され得る。
【００６５】
以前に入手された、即ち、本発明の方法を実施する前に入手された骨格筋由来細胞は、反復注射のための十分な量の筋細胞を生成することができる培養細胞であり得る。あるいは、骨格筋由来細胞は初代細胞である。
【００６６】
従って、本発明は、尿道括約筋および／または肛門括約筋を増強するために自己筋由来細胞を使用することによる、尿失禁および／もしくは肛門失禁を有するかまたは尿失禁および／もしくは肛門失禁を発症するリスクを有する男女のための単純な予防アプローチまたは処置法も提供する。そのような筋由来細胞治療は、傷害を受けた尿道括約筋および肛門括約筋の修復および改善を可能にする。本発明による処置は、例えば、筋由来細胞を入手するための針吸引、および培養され調製された細胞を患者へ注射するための短期フォローアップ処置を含む。本発明によると、特定の尿失禁患者および／または肛門失禁患者から採集され培養された筋芽細胞および筋由来幹細胞（MDC）を使用した自己筋細胞注射は、尿道および／または直腸の壁を増大させ、それによって、癒合を増強し、尿道括約筋および／または肛門括約筋を改善するための非アレルギー性薬剤として利用され得る。本発明のこの局面において、単純な自己筋細胞移植が、上述のように実施される。
【００６７】
本明細書に記載された方法または組成物は、本明細書に記載された任意の他の方法または組成物と共に実現され得ることが企図される。
【００６８】
本発明によると、筋芽細胞を含む骨格筋由来細胞は、初代細胞または培養細胞であり得る。それらは、ヒトを含むレシピエントに対して組織適合性（自己）または非組織適合性（同種）であり得る。本発明の具体的な態様は、レシピエントに対して外来性と認識されないであろう自己の筋芽細胞および筋由来幹細胞を含む、筋芽細胞および筋由来幹細胞である。これに関して、筋芽細胞は、主要組織適合性遺伝子座（ヒトにおけるMHCまたはHLA）に関して適合するものであり得る。そのようなMHCまたはHLAが適合した細胞は、自己であり得る。あるいは、細胞は、同一または類似のMHCまたはHLA抗原プロファイルを有する者に由来し得る。患者は、同種MHC抗原に対して寛容を有する場合もある。本発明は、米国特許第5,538,722号に記載されたような、MHCクラスIおよび／またはII抗原を欠く細胞の使用も包含する。
【００６９】
筋組織の単離された細胞からの初代骨格筋由来細胞培養物の樹立は、当業者に周知の方法によって、例えば、筋生検を介して、入手され得る。骨格筋由来細胞の起源として役立つそのような筋生検材料は、損傷の部位の筋肉から、または臨床外科医にとってより容易にアクセス可能であり得る他の区域から入手され得る。上述のように、骨格筋由来細胞は、必ずしも、処置される患者から入手される必要はない。しかしながら、本発明の一態様は、筋生検材料が尿失禁および／または肛門失禁に罹患している患者から採取されるものである。生検の部位は、限定されないが、上腕からのような骨格筋であり得る。二頭筋の生検が特に好ましい。生検材料のサイズは、およそ1cm×1cm×1cm以上を含み得る。この生検試料から、衛生細胞、即ち、融合し（少なくとも3個の細胞のシンシチウム）、方向性のある収縮性の細胞骨格（アクチン-ミオシンの並び）を確立することができる細胞を、単離し培養する。約60〜約5億個の細胞を、単一の処置のために培養することができる。さらに、血液試料を患者から入手し、その後、インビトロで細胞の培養のために使用することができる。あるいは、ウシ胎仔血清を培養のために使用する。細胞培養物中の筋芽細胞を、確立されているテクノロジー（Rando and Blau,1994）またはその他の方法を使用してさらに精製することができる。これらの筋細胞をインビトロで培養する。
【００７０】
筋生検において、筋組織の小さな区域は、一般に、培養中に数百万個の骨格筋由来細胞を産生するために十分な筋原細胞を含有している。筋芽細胞について、一度細胞を単離し培養物中で増殖させると、筋芽細胞はインビトロで融合して細長い筋管を形成するため、他の細胞型から純粋な筋芽細胞を区別することは容易である。
【００７１】
筋機能障害の処置のため、具体的には、尿失禁および／または肛門失禁のような失禁の処置のために使用され得るMSDCは、好ましくは、特徴的な発現パターンを示す。好ましくは、MSDCの約60％、70％、80％、90％、95％、または98％以上が、CD56および／またはデスミンを発現している。好ましくは、MSDCは、CD34、Sca-1、およびMyoDを発現しない。従って、「発現しない」という用語は、好ましくは、MSDCの40％、30％、20％、10％、5％、または2％未満がマーカーを発現していることを意味する。上記のようなMSDCの発現パターンは、分化の必要性なしに、細胞培養物の筋原性指数を決定するために使用され得る。従って、筋機能障害の処置のため、具体的には、尿失禁および／または肛門失禁のような失禁の処置のために骨格筋由来細胞を使用することができるか否かを検証するため、本発明の効力アッセイに加えてまたは本発明の効力アッセイの代わりに、MSDCの発現パターンを使用することができる。
【００７２】
一般に、所定の損傷の組織または部位への、筋芽細胞、骨格筋由来幹細胞、または筋組織を形成する可能性を有するその他の細胞（上記参照）を含む骨格筋由来細胞の注射は、治療的に有効な量の細胞の溶液または懸濁物、例えば、注射溶液100μl当たり約1×105〜約6×106細胞を含む。具体的には、尿失禁の処置のためには、100,000〜300,000細胞の量、より好ましくは、200,000個が好ましい。肛門失禁の処置のためには、より多量の細胞が好ましい。注射溶液は、自己血清を含むかまたは含まない生理学的に許容される培地である。生理学的に許容される培地は、非限定的な例として、生理食塩水またはリン酸緩衝溶液であり得る。
【００７３】
本発明の一つの態様において、外肛門括約筋および尿道括約筋への骨格筋由来細胞注射、自己筋芽細胞注射は、それぞれ、括約筋を増強し、改善し、かつ／または修復するため、それぞれ、肛門失禁および尿失禁のための処置として利用される。筋芽細胞のような骨格筋由来細胞は、括約筋へ注射され、生存し、筋線維へ分化して、括約筋機能を改善する。外肛門括約筋への筋芽細胞注射の実行可能性および生存が検証された。この態様によると、自己骨格筋由来細胞注射（即ち、特定の失禁患者から採集され培養された骨格筋由来細胞）は、筋肉の横紋筋線維へ組み込まれることによって、直腸壁および／または尿道壁を増大させ、それによって、癒合を増強し、括約筋機能を改善するための非アレルギー性薬剤として使用され得る。
【００７４】
本発明によると、尿道括約筋および／または肛門括約筋へ直接投与された自己骨格筋由来細胞は、長期の生存を示す。従って、自己筋芽細胞注射は、尿道括約筋および／または肛門括約筋における安全かつ非免疫原性の筋線維の長期生存をもたらす。
【００７５】
本発明による具体的な態様において、約50〜約200μlの骨格筋由来細胞懸濁物（注射溶液100μl当たり約1×105〜約6×106細胞の濃度）を、尿道括約筋へ注射する。注射される細胞懸濁物を含有している容器に、注射器を接続することができる。肛門失禁の処置のためには、好ましくは、約50μl〜約1ml、より好ましくは、約0.5mlの骨格筋由来細胞懸濁物（約1×105〜約6×106細胞の濃度）を、外肛門括約筋または尿道括約筋へ注射する。注射される細胞懸濁物を含有している容器に、注射器を接続することができる。
【００７６】
もう一つの態様において、注射工程は、骨格筋由来細胞懸濁物の約20〜約40回の注射のような数回の個々の注射を含んでいてもよく、その場合、各注射において、約50〜約200μlの骨格筋由来細胞懸濁物が注射され、各注射が肛門括約筋の別々の領域に適用される。しかしながら、これらのパラメーターは、例示的なものに過ぎないと見なされなければならず、当業者は、個々の各患者のための処置の必要性にこれらの手法を適応させることが容易にできるであろう。
【００７７】
本発明のもう一つの態様において、尿道括約筋および／または肛門括約筋への注射器の移動は、超音波検査および／またはEMG（筋電図検査）手段によってモニタリングされる。具体的な態様において、経直腸プローブが導入され、経直腸プローブの位置が、本発明による方法による尿道括約筋および／または肛門括約筋の処置のために最適に調整される。もう一つの具体的な態様において、骨格筋由来細胞は、尿道括約筋および／または肛門括約筋の欠陥の周囲の区域、および／または、特に、尿道括約筋および／または肛門括約筋の欠陥の区域に植え込まれる。本発明による尿失禁および／または肛門失禁の処置を促進するため、患者は、細胞の注射の翌朝に体操を行うことができる。
【００７８】
もう一つの態様において、処置は繰り返される。例えば、最後の処置の後の1年以内、最後の処置の10ヶ月後、9ヶ月後、8ヶ月後、7ヶ月後、6ヶ月後、5ヶ月後、4ヶ月後、3ヶ月後、2ヶ月後、もしくは1ヶ月後、または最後の処置の後の1〜8週間以内、好ましくは、2〜3週間以内、もしくは10〜20日以内に、処置を繰り返すことができる。具体的には、最後の処置の後の2〜3週間以内に、先の処置のために使用されたのと全く同一の細胞培養物に由来する細胞によって処置を繰り返すことができる。このアプローチは、注射1回当たりの注射容量の低下を可能にし、細胞が適応し、組み込まれ、筋肉を構築するための時間をより多くする。さらに具体的な態様において、注射は、尿コンチネンスおよび／または肛門コンチネンスの改善が達成されるまで、2〜3週間の時間間隔で繰り返される。
【００７９】
上述のように、具体的な穿通経路は、患者の皮膚を通した、直腸の進路と平行したものである。しかしながら、損傷を受けた筋肉に近い直腸から直接、穿通を行ってもよいことが企図される。具体的には、穿通および注射の過程は、超音波検査イメージング手段を介してモニタリングされる。さらに、代替的な穿通経路、即ち、経膣注射が、女性について企図される。このシナリオにおいては、注射器によって膣の壁を穿通し、所望の注射部位に到達するまで移動させる。具体的には、このシナリオにおいても、穿通および注射の過程は、超音波検査および／またはEMG（筋電図検査）イメージング手段によってモニタリングされる。
【００８０】
もう一つの態様において、注射は、骨格筋由来細胞を「注射バンド」の形態で注射する工程を含む。本明細書において使用される「注射バンド」とは、注射の軌道の全長または一部に沿って、即ち、針の筋組織への挿入によって作製された路に沿って、細胞を配置することをさす。換言すると、注射の後、針を引き抜き、同時に、注射の軌跡に沿って注射針を移動させながら、具体的には後退させながら、細胞を連続的または断続的にシリンジから排出する。細胞のそのような一定の分配は、注射器／針が標的筋組織に入った時に形成された注射路に沿った、細胞を含む注射溶液の連続的な送達を提供する。具体的な態様において、約600μmより大きい直径は、注射路の中心の骨格筋由来細胞の壊死に至り、結果的に、有害な炎症およびその他の過程をもたらすため、注射バンドまたは路は、それ以下の直径を有するべきである。
【００８１】
本発明の方法によって使用するための注射器は、ヒト組織を穿通することができ、溶液、具体的には、骨格筋由来細胞を含む溶液を、対象、具体的には、ヒト対象の生物内の所望の位置へ送達することができる装置であり得る。注射器は、例えば、中空針を含み得る。注射器は、骨格筋由来細胞の注射のために適当な任意の型のシリンジであってもよい。より高度の態様において、注射器は、例えば、気圧を加えることによって細胞懸濁物を注射する注射銃であり得る。具体的には、注射器は、それぞれキーホール適用およびキーホールサージャリーのために適したものである。
【００８２】
特定の直径を有する注射針を選ぶことによって、1mm3当たりの注射容量を正確に予定することができる。筋構造の傷害に至る場合があるため、注射針の直径は通常5mmを超えないであろう。
【００８３】
注射器の位置および動作をモニタリングするための超音波検査イメージング手段は、当技術分野において公知の標準的な超音波イメージング装置によって達成され得る。モノプレーン型（monoplanar）またはバイプレーン型（biplanar）の標準的な超音波プローブに加えて、例えば、3D超音波検査またはカラードプラ超音波検査等のような新しい超音波テクノロジーも使用することができる。具体的な態様において、上述のように、注射器は超音波検査イメージング手段を含む。
【００８４】
本発明のさらなる局面は、骨格筋由来細胞用のインビトロ分化マーカーとしてのAChE活性の使用である。
【００８５】
最後に、本発明のさらなる局面は、本発明による効力アッセイを実施するための手段を含むキットである。キットは、例えば、本発明による効力アッセイを実施するためのマルチウェルプレート、増殖培地、分化培地、および／または基質溶液を含み得る。キットは、好ましくは、多核筋管へ融合する効力および／または筋細胞へ分化する効力を有するSMDCを定量化するためのキットである。より好ましくは、キットは、骨格筋機能障害、具体的には、SMDCの、尿失禁および／または肛門失禁の処置のために使用される可能性を評価するためのキットである。
【００８６】
以下の実施例は、本発明を説明するものであって、限定的であるとは見なされない。
【実施例】
【００８７】
実施例1−融合コンピテント細胞（筋芽細胞）を含むヒトSMDCの単離
患者の二頭筋生検材料からSMDCを単離した。筋生検材料を無菌ペトリ皿に置いた。数滴のPBSを添加し、筋肉を剃刀によってスラリーへ切り刻んだ。次いで、2.5mMの終濃度のCaCl2が補足された組織1g当たり2mlのディスパーゼ（等級II、2.4U/ml、Roche Applied Science）およびコラゲナーゼ（クラスII、1％）の溶液の添加によって、細胞を酵素的に解離させた。スラリーを37℃で30〜45分間維持した後、5mlプラスチックピペットによって15分毎に破砕し、次いで、80μmナイロンメッシュ（Nitex；Tetko）に通した。解離した細胞を沈殿させるため、濾液を350gでスピンした。ペレットを増殖培地に再懸濁させ、コラーゲンによってコーティングされたディッシュに懸濁物を播種した。初代培養物の最初の数回の継代の間に、例えば、Richlerら（Dev.Biol,1970,23:1-22）に記載されたようなプレプレーティングによって、融合コンピテント細胞を濃縮した。
【００８８】
実施例2−接着初代細胞培養物の培養
筋芽細胞を含むSMDCを、10％FCS、bFGF、およびゲンタマイシンが補足されたハムF10基本培地において培養した。0.2μmフィルタによる滅菌濾過を実施した。増殖のため標準的な培養フラスコに細胞を播種し、培地を3日毎に交換した。継代培養および採集のため、細胞をPBSで1回洗浄し、インキュベータ（37℃、5％CO2）において（PBSで1:10希釈された）トリプシン溶液と共に5分間インキュベートした。次いで、細胞を培養培地で濯ぎ、使い捨てチューブにおいて1300rpm（400rcf）で10分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを増殖培地に再懸濁させた。
【００８９】
実施例3−細胞数
chemometec nucleocounter（商標）のマニュアルに従って、細胞の計数を実施した。この方法は、核のヨウ化プロピジウム染色を使用し、0.2ml中の細胞数を計算する。自動計数の前に、100μlの細胞懸濁物を（細胞膜を透過処理するため）200μlの試薬A（溶解緩衝液）と混合し、室温で5分間インキュベートした。次いで、200μlの試薬B（安定化緩衝液）を添加した。懸濁物を混合し、ヌクレオカセット（nucleocasette）によって収集し、最後に測定した。
【００９０】
実施例4−細胞の凍結保存
細胞を以下のように凍結保存した：最初に、細胞を採集し、1300rpm（400rcf）で10分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを100万細胞当たり1mlのCryomaxx-Medium I（商標）に再懸濁させた。最後に、懸濁物をクライオバイアルに移し、ICE-Cube（商標）によって-140℃に凍結させ、液体窒素が充填されたクライオタンクで保存した。凍結保存された細胞の再培養のため、凍結したチューブを解凍するため水浴（37℃）へ入れた。その後、細胞懸濁物を加温（37℃）増殖培地で1:30希釈し、培養フラスコに播種した。
【００９１】
実施例5−細胞分化
ヒト筋芽細胞のシンシチウム筋管への分化は、増殖培地を無血清分化培地に交換した時に起こる。骨格筋細胞分化培地（カタログ番号23061、Promo Cell）に、（培地が入手された会社のプロトコルに記載されたような）骨格筋細胞分化培地補充パックおよび250μlのゲンタマイシンを補足した。分化の開始のため、4穴または24穴のディッシュに（増殖培地中の）細胞を播種した（60000〜480000細胞）。細胞がディッシュに付着した後（一晩）、増殖培地を廃棄し、細胞を分化培地で1回洗浄し、500μlの分化培地で覆った。
【００９２】
実施例6−FACS分析
FACS分析のため、（実施例2に記載されたように）細胞を採集し、1ml当たりの細胞数を決定しなければならなかった（実施例3に記載された）。50000個の細胞をバイアルへ入れ、増殖培地によって全量を600μlにした。40μlの7AAD生存可能性色素を細胞懸濁物に添加した。次いで、20μlの各抗体を別々のチューブに充填し、その後、事前に混合された懸濁物300μlを充填した。次いで、チューブを暗所で15分間インキュベートした。懸濁物をよく混合した後、蛍光を測定することができた。フィコエリトリンコンジュゲート抗体のため、FL1（黄色蛍光）チャネルを活性化し、7AAD生存可能性色素のため、FL4（赤色蛍光）チャネルを活性化した。全てのパラメーターを定義し、フィコエリトリンおよび7AADの補償も実施して、全てのFACS測定のための標準的なプロトコルを予め作成した。
【００９３】
実施例7−磁気細胞選別
磁気細胞選別は、1種（またはそれ以上）の細胞表面抗原に依存して細胞を精製する方法である。この方法のため、磁性マイクロビーズに事前にコンジュゲートさせた抗体を使用した。実験は、CD56抗体が入手されたMACS（登録商標）社のプロトコルとほぼ等しく実施され、以下のように進行した。（実施例2に記載されたように）細胞を採集し、全細胞数を測定した後（実施例3）、細胞を1300rpm（400rcf）で10分間再び遠心分離し、上清を廃棄し、10mlのMACS緩衝液に再懸濁させた。もう1回の遠心分離工程（1300rpm、10分）および上清の廃棄の後、ペレットを、80μlのMACS緩衝液に再懸濁させた（各107細胞、80μl以上）。その後、107細胞当たり20μlの磁性CD56抗体を添加し、4℃で15分間インキュベートした。その後、Mini MACS SeparatorおよびMSカラムを用いて、MACSプロトコルに記載されたように、細胞の選別を実施した。
【００９４】
実施例8−蛍光コンジュゲート二次抗体による間接免疫染色
間接免疫蛍光染色を接着細胞に対してのみ実施した。細胞を、500μl PBSで2回洗浄し、その後、（PBSで希釈された）2％(v/v)ホルムアルデヒド500μlと共に室温で20分間インキュベートした。500μl PBSで2回洗浄した後、細胞を500μlの抗体によって覆った。使用された一次抗体（AChEまたはAChR）は、PBSで、40μg/ml(w/v)の終濃度に予め希釈された。次いで、覆われた細胞を、少なくとも90分間インキュベートした（37℃、5％CO2）。（上記のような）もう1回の洗浄工程の前に、細胞を、500μlの二次抗体（40μg/ml）によって覆い、37℃および5％CO2で60分間インキュベートした。その後、細胞を、500μl PBSで3回洗浄し、次いで、蛍光顕微鏡を通して分析することができた。
【００９５】
ビオチンコンジュゲート二次抗体による間接免疫染色
細胞培養ディッシュの最初の上清を廃棄し、細胞をPBSで3回洗浄した。室温で20分間、2％ホルムアルデヒド溶液（v/v；PBSで希釈）によって細胞を覆うことによって、透過処理および固定を実施した。次いで、実施された各インキュベーション工程の後、細胞をPBSで3回洗浄した。その後、細胞を500μlの過酸化水素ブロックによって覆い、室温で5分間インキュベートした。40μg pro ml(w/v)の終濃度の一次抗体（AChEまたはデスミン）を、ピペットで細胞に移し、少なくとも90分間インキュベートした（37℃、5％CO2）。次いで、細胞を500μlビオチンコンジュゲート二次抗体（ヤギ抗ウサギ、ポリクローナル）によって覆い、一次抗体と同様に、ただし少なくとも60分間インキュベートした。抗体結合の可視化のため、（PBSで希釈された）2〜5μg/mlの終濃度の西洋ワサビストレプトアビジンペルオキシダーゼ500μlを添加し、37℃、5％CO2で20分間インキュベートした後、500μlの色素原単一溶液によって細胞を覆い、5〜15分後にそれを除去した。PBSによる最終洗浄工程を実施した後、結果を観察した。
【００９６】
実施例9−AChE酵素活性の定量分析
改良型エルマンアッセイ（Ellman,G.L.,Biochem.Pharmacol.,7,88-95,1961）に基づくアセチルコリンエステラーゼアッセイキット（Quantichrom Acetylcholinesterase Assay）を使用することによって、AChE活性の定量的測定を実施した。従って、マニュアル上の指示を考慮したが、結果を改良するため変化させた。
【００９７】
試薬の調製：200μlの選ばれた緩衝液を2mgの基質に添加することによって、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)およびヨウ化アセチルチオコリンを、PBSまたはアッセイ緩衝液のいずれかで希釈した。
【００９８】
分光計の測定基本設定：
以下の属性は、全ての分光測定について同一であり、使用されたソフトウェア、UV-Winlabに調和する。
全体の基本設定：
座標最大値：2
座標最小値：0
可視ランプ：オン
応答時間：0,5秒
スリット幅：1,0nm
ランプ変化：326nm
測定された吸光：412nm
セルチェンジャー：オン
タイムドライブ実験に応じた基本設定：
時間間隔：60秒
表示：連続
細胞の調製：2通りの細胞調製を下記のように実施した。
【００９９】
表面からの剥離による細胞の測定
4穴培養皿において培養された細胞の上清を最初に廃棄し、細胞を200μlのトリプシンによって覆った。37℃および5％CO2での5分間のインキュベーションの後、細胞をPBSで濯ぎ、15mlファルコンチューブへ入れた。次に、細胞を800gで10分間遠心分離した。上清を廃棄し、（PBSまたはアッセイ緩衝液のいずれかで希釈された）300μlの試薬を添加した。次いで、細胞を短時間混合し、適切なサイズのキュベットに移した。次いで、分光計でタイムドライブとして光学濃度（OD）を測定することができた。各測定について、300μlの蒸留滅菌H2Oが充填されたキュベットおよび標準物質を含むキュベットも測定した。実験条件に依って、必要である場合には、ブランク値も測定した。最後に、製品説明書に記載されたように、1リットル当たりの単位数［U/L］でAChE活性を計算することができた：AChE活性＝(OD10-OD2)/(ODCAL-ODH2O)*200。この式は、血液およびその他の可溶性試料のAChE活性測定のために作成されたため、本発明者らの実験には使用されなかった。しかしながら、412nmの波長での光の吸収の変化によって、AChE活性を決定した。
【０１００】
表面からの剥離なしの細胞の測定
上清を廃棄した後、予備調製された300μlの試薬-緩衝液混合物を、（4穴または24穴の培養皿において培養された）細胞に添加した。次いで、37℃および5％CO2で、（実験に関連する時間に依存する）時間、細胞をインキュベートした。その後、上清をキュベットへ移し、ODを分光計で測定した。従って、412nmでのODは、細胞内の活性型AChEの量と直接相関している。プレートリーダ（Anthos 2010）によってAChE活性を測定するため、平底96穴培養皿に筋芽細胞増殖培地で細胞を播種し、37℃、5％CO2でインキュベートした。翌日、増殖培地を骨格筋細胞分化培地に交換した。上記のようなさらなるインキュベーション。数日の分化の後、分化培地を交換し、細胞をPBSで1回洗浄した。既に記載されたように、AChEアッセイ試薬を調製し、100μlを各ウェルに置いた。次いで、動力学的測定を通して、Anthos Plate Readerで60分間、OD412nmを測定した。
【０１０１】
酵素消化のため、筋芽細胞を、（実施例5に記載されたように）4穴プレートで分化させ、コラゲナーゼ消化溶液またはトリプシン消化溶液のいずれかによって処理した。従って、培養細胞の上清を廃棄し、選ばれた酵素溶液を300μl添加した。コラゲナーゼ消化溶液およびトリプシン消化溶液は、予備調製されなければならず、以下のような成分を含有する。
コラゲナーゼ消化溶液：
・98.43％(v/v)乳酸リンゲル（1,8mM）
・0.13％(v/v)CaCl2（150mM）
・1.4％(v/v)コラゲナーゼI
トリプシン消化溶液：
・10×トリプシン溶液をPBSで1×トリプシン溶液へ1:10希釈したもの
【０１０２】
次いで、細胞を37℃および5％CO2で2時間インキュベートした。消化によって、細胞は表面との接続を喪失し、再懸濁させ、遠心管へ入れることが可能となった。次に、細胞を800gで10分間遠心分離した。次いで、上清またはペレットのいずれかのアセチルコリンエステラーゼ活性を測定した。従って、300μlの上清を採取し、3mgのAChE活性試薬を添加した。ペレットの測定のため、3mgのAChE活性試薬を、300μlの緩衝液（アッセイ緩衝液またはPBSのいずれか）で可溶化した。次いで、上記のようにOD412nmを測定することができた。
【０１０３】
酵素消化による膜結合型AChEの除去
酵素消化のため、筋芽細胞を、（上記のように）4穴プレートで分化させ、コラゲナーゼ消化溶液またはトリプシン消化溶液のいずれかによって処理した。従って、培養細胞の上清を廃棄し、選ばれた酵素溶液を300μl添加した。コラゲナーゼ消化溶液およびトリプシン消化溶液は、予備調製されなければならず、以下のような成分を含有する。
コラゲナーゼ消化溶液：
・98.43％(v/v)乳酸リンゲル（1,8mM）
・0.13％(v/v)CaCl2（150mM）
・1.4％(v/v)コラゲナーゼI
トリプシン消化溶液：
・10×トリプシン溶液をPBSで1×トリプシン溶液へ1:10希釈したもの
【０１０４】
細胞を37℃および5％CO2で2時間インキュベートした。消化によって、細胞は表面との接続を喪失し、再懸濁させて遠心分離チューブへ入れることが可能となった。次に、細胞を800gで10分間遠心分離した。次いで、上清またはペレットのいずれかのアセチルコリンエステラーゼ活性を測定した。従って、300μlの上清を採取し、3mgのAChE活性試薬を添加した。ペレットの測定のため、3mgのAChE活性試薬を、300μlの緩衝液（アッセイ緩衝液またはPBSのいずれか）で可溶化した。次いで、上記のようにOD412nmを測定することができた。
【０１０５】
実施例10−筋原前駆細胞の分離
従って、骨格筋由来細胞の培養物は、全部が、筋組織を形成する可能性を有しているのではない。筋原前駆細胞をMACS（登録商標）分離技術によって分離した。培養SMDCのCD56（NCAM1）発現を、（実施例7に記載されたような）MACSカラムの実行の前後に（実施例6に記載されたような）FACS分析によって測定した。培養SMDCはCD56陽性細胞集団のみならずCD56陰性細胞集団も有していることが観察された。これらの集団を、MACS（登録商標）によって、CD56陽性亜集団とCD56陰性亜集団とに分離することができた。CD56陽性亜集団は約98％のCD56陽性SMDCを含み、CD56陰性亜集団は約98％のCD56陰性骨格筋由来非筋原細胞を含んでいた。
【０１０６】
実施例11−筋芽細胞分化の間の機能性AChE発現の開始
単核筋芽細胞の多核筋管への分化の間の機能性AChE発現の開始を、インビトロで定量的に査定し、非筋原細胞と比較した。AChE活性は筋芽細胞の分化の間に増加し、数日後に極期に達するようである。よって、実施例6に記載されたように、AChE活性を計算した。AChE活性の各測定日に写真を撮影した。分化の1日目に筋芽細胞が整列し始め、3日目に筋管が出現することが可視である。従って、分化の2日目に最も大きな増加を有することが示されたAChE活性は、相互に接触しているがまだ融合していない単核筋芽細胞の段階で起こることが明らかになる。実施例9に記載されたように、さらなる実験を実施した。従って、分化中の筋芽細胞のAChE活性を、細胞膜透過性PBS緩衝液または非透過性アッセイ緩衝液のいずれかにおいて、分化の間に試験した。AChE活性は分化の間に増加し、アッセイ緩衝液における活性はPBSより高いが、分化の間、関連する傾向を示すことが観察された。
【０１０７】
実施例12−AChE活性に対する細胞数の影響
全体AChE活性に関する細胞数の役割を同定するため、異なる細胞数の分化中の筋芽細胞を試験した。CD56陽性筋芽細胞（95.03％）を6日間分化させ、その後、（実施例9に記載されたように）プレートリーダでAChE活性を試験した。細胞数と決定されたAChE活性との間に、直線回帰が存在することが観察された。
【０１０８】
実施例13−AChE活性に対する筋原前駆細胞の純度レベルの影響
骨格筋筋原前駆細胞（CD56陽性）と骨格筋由来非筋原細胞との間のAChE活性の差を測定した。両方の細胞型が同一の骨格筋から抽出されたため、CD56陽性細胞とCD56陰性細胞とを分離するため、（実施例7に記載されたような）MACSを使用した。これらの筋原前駆細胞および非筋原前駆細胞の混合物を、作製し、数日間分化させ、分化の前後に、（実施例9に記載されたような）アセチルコリンエステラーゼアッセイによってAChE活性を検出した。SMDCにおけるCD56およびデスミンの発現パターンの可視の相関のため、CD56陽性細胞と陰性細胞との混合物を調製した。デスミン陽性SMDCの量は、培養中、CD56陽性SMDCの量と類似して増加することが観察された。CD56陰性SMDCはデスミン陰性でもあった。次いで、この実験のデータを、1ミリリットル当たりの単位数でAChE活性を計算するために分析した。AChE活性は、試験された筋原前駆細胞（CD56陽性およびデスミン陽性）の純度に比例することが観察された。
【０１０９】
実施例14−膜結合型AChEに対するトリプシンおよびコラゲナーゼの影響
膜結合型AChEに対するタンパク質分解酵素の効果を検出するため、上記のように、コラゲナーゼまたはトリプシンによる多核筋管の消化を実施した。従って、消化された細胞または上清のいずれかのAChE活性を測定した。（非膜透過性緩衝液、PBSにおいて測定された）多核筋管のAChE活性は、2時間のコラゲナーゼ消化の後に減少することが示された。トリプシン消化も、消化溶液のAChE活性が筋管との2時間のインキュベーションの後に増加したため、膜結合型AChEに影響を及ぼすようである。
【０１１０】
実施例15−効力アッセイ
96穴プレートにおける細胞の付着を増加させるため、96ウェルにおいて各100μlのフィブロネクチン（5μg/ml）を、37℃、5％CO2で、少なくとも40分間インキュベートすることによって、96穴プレートをフィブロネクチンによってコーティングした。その後、ウェルを、10×PBSで1回洗浄した。
【０１１１】
患者の二頭筋生検材料から単離されたSMDCSを、FACS分析によって、CD56の発現について分析した。その後、2枚の96穴プレート（プレート1および2）の各ウェルに、50000個のCD56+細胞をピペットで移した。3枚目の96穴プレート（プレート3）においては、96穴プレートの各ウェルに、60％CD56+細胞および40％CD56-細胞から構成された50000個の細胞をピペットで移した。その後、各200μlの筋芽細胞培地を添加し、96穴プレートを、37℃、5％CO2で一晩インキュベートした。翌日、プレート1および3の筋芽細胞培地を吸引した。ウェルを分化培地で1回洗浄した。その後、200μlの分化培地を各ウェルに添加し、プレートを37℃、5％CO2で5日間インキュベートした。分化培地をプレート1および3に添加したのと同一の日に、プレート2のAChE活性を測定した。プレート1および3のAChE活性を、インキュベーションの後、従って、分化培地の添加の5日後に測定した。プレート2のAChE活性を測定するため、筋芽細胞培地を吸引し、96穴プレートをPBSで1回洗浄した。その後、100μlの基質溶液（100μl PBS中1mg基質）を各ウェルに添加した。その後、412nmにおけるODを、プレートリーダ（Anthos 2010）で、各60秒、全部で60分間測定した。プレート2のAChE活性の測定の5日後に、プレート1および3のAChE活性を測定するため、分化培地を吸引する。次いで、100μlの基質培地を、96穴プレートのウェルへ直接添加した。以降の工程は、プレート2のAChE活性の測定のために実施されたのと同一であった。
【０１１２】
入手されたデータを評価するため、各単一測定の60分後と開始との間のODの変化を計算し、「OD変化」と呼ぶ。次いで、プレート1および3ならびにプレート2のOD変化を、5日間の分化の間のAChE活性の増倍率を計算するため、分割する。
【０１１３】
3人の異なる患者から入手された3つの異なるオーダー（FAU）について、上記のような効力アッセイを実施した。FAUの各々におけるCD56+細胞の量は、以下の通りであった：Fau0114516（96.57％CD56陽性）、Fau0114523（96.715％CD56陽性）、およびFau0114517（75％CD56陽性）。結果は下記表に示される。
2015531230.tif 000003
【０１１４】
従って、AChE活性の増倍率は、融合コンピテントCD56+細胞の割合と共に増加する。さらに、CD56-細胞と混合されていない細胞のAChE活性は、全てのケースで、60％CD56+細胞を含む混合物のAChE活性より高いことが示された。
【０１１５】
実施例16−効力アッセイの直線性
効力アッセイの直線性を立証するため、いずれも患者の二頭筋生検材料から入手された融合コンピテントCD56+細胞およびCD56-細胞の混合物を、100％、80％、60％、および0％のCD56+細胞の比率で調製した。実施例15に記載されたように、効力アッセイを実施した。3つの異なる試験の結果は下記表に示される。
2015531230.tif 000004
2015531230.tif 000005
【０１１６】
表に示されたように、AChE活性の増倍率は、CD56+細胞の割合と共に増加する。
【０１１７】
実施例17−AChE標準物
最高酵素濃度500mU/mLで、全部で8つのAChE標準酵素希釈物を調製し、最低は4mU/mLであった。全ての希釈物を、0.1％トリトンX-100を含む0.14Mリン酸緩衝液（pH7.2）で調製し、二重に試験した。AChE酵素以外の全ての試薬から構成されたブランク反応も含まれていた。200μLの各AChE酵素希釈物を24穴プレートに置いた。（0.1％トリトン-X 100を含む0.14Mリン酸緩衝液（pH7.2）で調製された）300μLの0.5mM DTNBを、各酵素希釈物に添加した。その後、（蒸留水で調製された）50μLの5.76mMヨウ化アセチルチオコリン（ATI）を添加した。測定を、412nMおよび30℃で、プレートリーダで15分間（15サイクル）実施した。平均OD412からブランク測定を差し引くことによって、補正OD412値を入手した。「非直線回帰」後に直線方程式を利用することによって、GraphPadプリズム5ソフトウェアにおいて、AChEについての標準曲線を開発し、0.9980という優れたR2（決定係数）値を得た。AChEについての直線方程式［1］は、以下のように入手された。
Y＝0.003282X - 0.01372［1］
以下のように方程式［1］から導出される方程式［2］によって、未知の試料（X）のAChE活性を決定することができる。
2015531230.tif 000006
式中、Yは、AChE効力アッセイに供された未知の試料のOD412を表す。
【０１１８】
実施例18−AChE効力アッセイ
2％、60％、80％、および80％超のCD56+細胞を含有しているCD56+画分の4つの異なるクラスを、以下のように調製した：患者から単離されたSMDC細胞を、磁気細胞選別（MACS（登録商標））によって、CD56-細胞およびCD56+細胞へ分離した。aSMDCからのCD56-細胞の単離のため、Miltenyi Biotec GmbH（Bergisch Gladbach,Germany）から、CD56 MicroBeads（ヒト）キットを購入した。製造業者の指示に従って、分離を実施した。患者の試料からMSDCを単離し、全細胞数を測定した後、細胞を1300rpm（400×g）で10分間遠心分離し、上清を廃棄し、10mlのMACS緩衝液に再懸濁させた。もう1回の遠心分離工程（1300rpm、10分）および上清の廃棄の後、ペレットを、80μlのMACS緩衝液に再懸濁させた（各107細胞、80μl以上）。その後、107細胞当たり20μlの磁性CD56抗体を添加し、4℃で15分間インキュベートした。その後、Mini MACS SeparatorおよびMSカラムを用いて、MACSプロトコルに記載されたように、細胞の選別を実施した。
【０１１９】
その後、下記表に示されるように、（全細胞集団の筋芽細胞画分に相当する）CD56+細胞集団によってカテゴリ化された、4つの異なる細胞クラス（クラス1〜クラス4）を生成した。60％CD56+画分を含む細胞集団におけるAChE酵素単位のカットオフ値を入手するため、これらの4つの細胞型のクラスを生成した。
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【０１２０】
クラス1およびクラス4（上記のようなMACSによってSMDCから単離されたCD56-画分およびCD56+画分）の細胞を、CD56-画分と混合することなく使用した。クラス1（＞80％CD56+）およびクラス4（98％CD56-）の細胞を、それぞれ、80％および60％CD56+画分を含むクラス2およびクラス3を得るため、混合した。各クラスについて全部で120,000個の細胞を、myomedium（Skeletal Muscle Cell Differentiation Medium−製造業者：PromoCell）と共に、24穴プレートに播種した。37℃での2日間のインキュベーションの後、SMDCを1×PBSで洗浄し、培地を分化培地に交換した（実施例5を参照のこと）。さらに6日後、マイクロプレートリーダによって412nmでAChE活性を測定した。そのため、培地を24穴プレートから吸引し、（0.1％トリトン-X 100を含む0.14Mリン酸緩衝液（pH7.2）で調製された）300μLの0.5MM 5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)（DTNB）を各ウェルに添加した。30℃での2分間のインキュベーションの後、（蒸留水で調製された）50μLの5.76mM ATIを添加した。さらに10分間の30℃でのインキュベーションの後、Anthos Zeneyth 340rtマイクロプレートリーダ（Zenyth 340rtマイクロプレートリーダユーザーズマニュアル、2010）において、30℃で、412nmで、50分間（50サイクル）AChE活性を測定した。入手されたデータを、AChE標準曲線と比べて評価した。
【０１２１】
実施例19−腹圧性尿失禁を有する患者におけるAChE活性
全部で101の患者試料をAChE効力アッセイに供した。各試料を、実施例18に記載されたような4つのクラス（＞80、80、60、2のCD56％を有するクラス1、クラス2、クラス3、クラス4）へカテゴリ化した。実施例17に記載されたようなAChE標準物についての直線方程式［1］を参照して、AChE活性をmUrel（相対ミリ単位）で計算した。「相対ミリ単位」という用語は、標準希釈物においては、15分後に1mL当たりのAChE活性が測定されたが、患者試料においては、50分後に24穴プレートにおいて120,000 aSMDC当たりのAChE活性が決定されたという事実のため、使用された。全てのCD56+試料（クラス1、2、および3）のAChE活性は、60mUrel〜452mUrelの範囲であり、このことは、異なる患者間の高度に可変性のAChE発現を意味していた。結果は下記表に要約される。
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【０１２２】
同一患者内で、CD56+クラスが著しく変動することが観察され、例えば、ある患者は、＞80％CD56+（290mUrel）と比較して、80％CD56+において最高AChE活性（452mUrel）を示し、60％CD56+（389mUrel）ですら、＞80％CD56+画分を上回っていた。この傾向についての可能性のある理由は、6日間分化培地に置いた後の培地の吸引の間に、24穴プレート内に形成された大きな筋管が失われたというものである。101人の患者におけるAChE活性についての現在のデータは、QA試験に従う参照範囲が≧60mUrelに設定されることを強く示唆する。この参照範囲は、CD56+を有する細胞画分とCD56-発現を有する細胞画分との間の境界を明白にマークする。CD56-画分における平均AChE活性は15.42±0.64mUrelであり、それは、138.69±7.00mUrelであることが見出された60％CD56+画分より有意に低かった（***p＜0.001 60％CD56+対2％CD56+）。
【０１２３】
さらに、101人の患者からのAChE効力（活性）データを、下記表に示されるような6つのカテゴリへ分類した。
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【０１２４】
このカテゴリ化によって、AChE活性が、24穴プレートに播種されたCD56+細胞の数に直接比例することが立証され得た。例えば、60％CD56+細胞画分を有する、＞200mUrel AChE活性を有する患者（カテゴリ6）の数は、80％または＞80％と比較して、ほぼ二倍の数であった。AChEのCD56+画分との比例は、カテゴリ1（≧60〜70mUrel）の観察によっても確認された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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