(57)【要約】  本開示は、アンジオポエチン２（Ａｎｇ−２）に特異的に結合する抗体を含む医薬製剤を提供する。製剤は、抗Ａｎｇ−２抗体に加えて、少なくとも１種のアミノ酸、少なくとも１種の糖、または少なくとも１種の非イオン性界面活性剤を含有することができる。本開示の医薬製剤は、数カ月間保存後において、ならびに熱的ストレスおよび他の物理的ストレスに曝された後において相当な程度の抗体安定性を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ヒトアンジオポエチン２（ヒトＡｎｇ−２）に特異的に結合する抗体；（ｉｉ）ｐＨ６．０±０．３での緩衝剤；（ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤；および（ｉｖ）安定剤を含む医薬製剤。
【請求項２】
抗体は、配列番号４のＨＣＤＲ１、配列番号６のＨＣＤＲ２、配列番号８のＨＣＤＲ３、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１４のＬＣＤＲ２、および配列番号１６のＬＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の医薬製剤。
【請求項３】
抗体は、配列番号１８のＨＣＶＤおよび配列番号２０のＬＣＶＤを含む、請求項１または２に記載の医薬製剤。
【請求項４】
（ａ）抗体の９６％超は１５１ｋＤａ±１ｋＤａの分子量を有し；
（ｂ）抗体の少なくとも５３％は約８．１３±０．０１の等電点を有し；および
（ｃ）抗体の約９０％〜約９２％はフコシル化されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項５】
抗体濃度は、約２５ｍｇ／ｍＬ±０．３７５ｍｇ／ｍＬまたは約５０ｍｇ／ｍＬ±７．５ｍｇ／ｍＬである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項６】
緩衝剤はヒスチジンである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項７】
ヒスチジン濃度は１０ｍＭ±１．５ｍＭである、請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項８】
非イオン性界面活性剤はポリソルベート２０である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項９】
ポリソルベート２０濃度は約０．２％ｗ／ｖ±０．０３％である、請求項８に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
安定剤はスクロースである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
スクロース濃度は約１０％±１．５％（ｗ／ｖ）である、請求項１０に記載の医薬製剤。
【請求項１２】
抗体濃度は２５ｍｇ／ｍＬ±３．７５ｍｇ／ｍＬであり、緩衝剤は１０ｍＭ±１．５ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６±０．３であり、非イオン性界面活性剤は０．２％ｗ／ｖ±０．０３％であり、および安定剤は１０％ｗ／ｖ±１．５％のスクロースである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１３】
抗体濃度は５０ｍｇ／ｍＬ±７．５ｍｇ／ｍＬであり、緩衝剤は１０ｍＭ±１．５ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６±０．３であり、非イオン性界面活性剤は０．２％ｗ／ｖ±０．０３％であり、および安定剤は１０％ｗ／ｖ±１．５％のスクロースである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１４】
抗体の少なくとも９３％は、４５℃で２８日後において天然の高次構造を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
抗体の少なくとも３２％は、４５℃で２８日後において抗体の主要な電荷バリアントである、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１６】
抗体の少なくとも９７％は、２５℃で２８日後において天然の高次構造を有する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
抗体の少なくとも５３％は、２５℃で２８日後において抗体の主要な電荷バリアントである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１８】
抗体の少なくとも９６％は、３７℃で２８日後において天然の高次構造を有する、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項１９】
抗体の少なくとも４５％は、３７℃で２８日後において抗体の主要な電荷バリアントである、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２０】
抗体の少なくとも９７％は、５℃で６カ月後において天然の高次構造を有する、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２１】
抗体の少なくとも５５％は、５℃で６カ月後において抗体の主要な電荷バリアントである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２２】
５℃で６カ月後の抗体のパーセント相対力価（ｐｅｒｃｅｎｔ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｃｙ）は、保存前の抗体の力価の少なくとも１００％である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２３】
抗体の少なくとも９７％は、−８０℃で６カ月後において天然の高次構造を有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２４】
抗体の少なくとも５５％は、−８０℃で６カ月後において抗体の主要な電荷バリアントである、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２５】
−８０℃で６カ月後の抗体のパーセント相対力価は、保存前の抗体の力価の少なくとも８５％である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２６】
抗体の少なくとも９６％は、−３０℃で６カ月後において天然の高次構造を有する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２７】
抗体の少なくとも５５％は、−３０℃で６カ月後において抗体の主要な電荷バリアントである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２８】
−３０℃で６カ月後の抗体のパーセント相対力価は、保存前の抗体の力価の少なくとも８４％である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項２９】
抗体の少なくとも９６％は、−２０℃で６カ月後において天然の高次構造を有する、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項３０】
抗体の少なくとも５５％は、−２０℃で６カ月後において抗体の主要な電荷バリアントである、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項３１】
−２０℃で６カ月後の抗体のパーセント相対力価は、保存前の抗体の力価の少なくとも９０％である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の医薬製剤。
【請求項３２】
（ａ）２５ｍｇ／ｍＬ±３．７５ｍｇ／ｍＬの抗Ａｎｇ−２抗体、（ｂ）１０ｍＭ±１．５ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６±０．３、（ｃ）０．２％ｗ／ｖ±０．０３％のポリソルベート２０、および（ｄ）１０％ｗ／ｖ±１．５％のスクロースを含む医薬製剤であって、
（ａ）抗体は配列番号１８のＨＣＶＤおよび配列番号２０のＬＣＶＤを含み；
（ｂ）抗体の９６％超は１５１ｋＤａ±１ｋＤａの分子量を有し；
（ｃ）抗体の少なくとも５３％は約８．１３±０．０１の等電点を有し；および
（ｄ）抗体の約９０％〜約９２％はフコシル化されている、上記医薬製剤。
【請求項３３】
水中の（ａ）２５ｍｇ／ｍＬ±３．７５ｍｇ／ｍＬの抗体、（ｂ）１０ｍＭ±３ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６±０．３、（ｃ）０．２％ｗ／ｖ±０．０３％のポリソルベート２０、および（ｄ）１０％ｗ／ｖ±１．５％のスクロースから成る請求項３２に記載の医薬製剤。
【請求項３４】
（ａ）５０ｍｇ／ｍＬ±７．５ｍｇ／ｍＬの抗Ａｎｇ−２抗体、（ｂ）１０ｍＭ±１．５ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６±０．３、（ｃ）０．２％ｗ／ｖ±０．０３％のポリソルベート２０、および（ｄ）１０％ｗ／ｖ±１．５％のスクロースを含む医薬製剤であって、
（ａ）抗体は配列番号１８のＨＣＶＤおよび配列番号２０のＬＣＶＤを含み；
（ｂ）抗体の９６％超は１５１ｋＤａ±１ｋＤａの分子量を有し；
（ｃ）抗体の少なくとも５３％は約８．１３±０．０１の等電点を有し；および
（ｄ）抗体の約９０％〜９２％はフコシル化されている、上記医薬製剤。
【請求項３５】
水中の（ａ）５０ｍｇ／ｍＬ±７．５ｍｇ／ｍＬの抗体、（ｂ）１０ｍＭ±１．５ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６±０．３、（ｃ）０．２％ｗ／ｖ±０．０３％のポリソルベート２０、および（ｄ）１０％ｗ／ｖ±１．５％のスクロースから成る請求項３４に記載の医薬製剤。
【請求項３６】
容器内に含有されている、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
容器はバイアルである、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
バイアルはガラスである、請求項３７に記載の医薬組成物。
【請求項３９】
容器はＩＶ点滴袋である、請求項３６に記載の医薬組成物。
【請求項４０】
袋はポリ塩化ビニル製である、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４１】
袋はポリオレフィン製である、請求項３９に記載の医薬組成物。
【請求項４２】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載の医薬組成物、容器および使用説明書を含むキット。
【請求項４３】
容器は、ＦＬＵＲＯＴＥＣがコーティングされた４０２３／５０ゴム栓が取り付けられているガラスバイアルである、請求項４２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療用抗体製剤の分野に関する。より具体的には、本発明は、アンジオポエチン２（Ａｎｇ−２）に特異的に結合する抗体を含む医薬製剤の分野に関する。
【０００２】
配列表
ＳＴ．２５に準拠したコンピュータ読み込み可能な配列表のテキストファイルを、ＰＣＴ規則５．２および実施細則セクション８０２に従って本明細書と同時に提出する。テキストファイルの内容を参照によって本明細書に組み入れる。ＳＴ．２５に準拠したコンピュータ読み込み可能なテキストファイルと内容が同一である配列表のハードコピーを本明細書の一部として含め、参照によって本明細書に組み入れる。
【背景技術】
【０００３】
血管形成は、新しい血管が形成される生物学的過程である。異常な血管形成は、例えば増殖性網膜症、関節リウマチおよび乾癬等のいくつかの病状に関連する。加えて、血管形成が腫瘍の増殖および維持に重要であることが十分に立証されている。アンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）はＴｉｅ−２受容体（Ｔｉｅ−２）に対するリガンドであり、血管形成に関与することが明らかとなっている。Ａｎｇ−２はまた、当分野ではＴｉｅ−２リガンドとも称される（特許文献１；非特許文献１）。
【０００４】
Ａｎｇ−２に結合する抗体および他のペプチド阻害剤が、例えば特許文献２；特許文献３；特許文献４；特許文献５および特許文献６にある程度は記載されている。当分野では、血管形成によって引き起こされるまたは悪化する疾患および状態の治療に使用され得る、Ａｎｇ−２抗体等の新規なＡｎｇ−２調節剤が求められている。
【０００５】
治療用抗体は、該抗体を患者への投与に適させる様式だけでなく、保存およびその後の使用の間にも抗体の安定性を維持する様式で製剤化される必要がある。例えば、溶液中の治療用抗体は、溶液が適切に製剤化されない限り、分解、凝集または望まれない化学修飾を起こしやすい。液剤中の抗体の安定性は、製剤に使用される賦形剤の種類だけでなく、複数の賦形剤相互の量および割合にも依存する。更に、安定性とは別に他の検討事項を、液状の抗体製剤を調製する場合に検討する必要がある。そのような更なる検討事項の例として、所与の製剤化によって調節され得る溶液の粘度および抗体の濃度、ならびに製剤の視覚的な品質または訴求力が挙げられる。そのため、治療用抗体を製剤化する場合には、安定のままである、十分な濃度の抗体を含有する、ならびに適切な粘度および製剤が患者へ都合よく投与されることを可能にする他の特性を有する製剤に達するために細心の注意を払う必要がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】ＵＳ５，６４３，７５５
【特許文献２】ＵＳ６，１６６，１８５
【特許文献３】ＵＳ７，５２１，０５３
【特許文献４】ＵＳ７，２０５，２７５
【特許文献５】ＵＳ２００６／００１８９０９
【特許文献６】ＵＳ２００６／０２４６０７１
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｙａｎｃｏｐｏｕｌｏｓら、２０００、Ｎａｔｕｒｅ４０７：２４２〜２４８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
アンジオポエチン−２タンパク質（Ａｎｇ−２）に対する抗体は、適切な製剤を必要とする治療に関連する巨大分子の一例である。いくつかの抗Ａｎｇ−２抗体が知られているが、それにも関わらず、十分に安定しており患者への投与に適した抗Ａｎｇ−２抗体を含む新規の医薬製剤が当分野で依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ヒトアンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）に特異的に結合するヒト抗体を含む医薬製剤を提供することにより、前述した要求を満たす。
【００１０】
一態様では、（ｉ）アンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）に特異的に結合する抗体；（ｉｉ）緩衝剤；（ｉｉｉ）有機共溶媒；および（ｉｖ）安定剤を含む液状の医薬製剤が提供される。
【００１１】
一実施形態では、抗体は、約５±０．７５ｍｇ／ｍＬ〜約１５０±２２．５ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される。別の実施形態では、抗体は、約５ｍｇ／ｍｌ±０．７５ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される。別の実施形態では、抗体は、約２５ｍｇ／ｍＬ±３．７５ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される。別の実施形態では、抗体は、約５０ｍｇ／ｍＬ±７．５ｍｇ／ｍＬの濃度で提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明の例示的な抗Ａｎｇ−２抗体およびＡｎｇ−２抗原結合フラグメントは、（ｉ）配列番号４、６、８、１２、１４および１６（例えばＨ１Ｈ６８５）；（ｉｉ）配列番号２８、３０、３２、３６、３８および４０（例えばＨ１Ｈ６９０）；（ｉｉｉ）配列番号５２、５４、５６、６０、６２および６４（例えばＨ１Ｈ６９１）；（ｉｖ）配列番号１４８、１５０、１５２、１５６、１５８および１６０（例えばＨ１Ｈ６９６）；（ｖ）配列番号１９６、１９８、２００、２０４、２０６および２０８（例えばＨ１Ｈ７０６）；（ｖｉ）配列番号２６８、２７０、２７２、２７６、２７８および２８０（例えばＨ１Ｍ７２４）；および（ｖｉｉ）配列番号４３６、４３８、４４０、４４４、４４６および４４８（例えばＨ２Ｍ７４４）から成る群からそれぞれ選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３のドメインを含む。
【００１３】
関連する実施形態では、本発明は、Ａｎｇ−２に特異的に結合する抗Ａｎｇ−２抗体または抗体の抗原結合フラグメントを含み、抗体または抗原結合フラグメントは、配列番号２／１０、１８／２０、２２／２４、２６／３４、４２／４４、４６／４８、５０／５８、６６／６８、７０／７２、７４／８２、９０／９２、９４／９６、９８／１０６、１１４／１１６、１１８／１２０、１２２／１３０、１３８／１４０、１４２／１４４、１４６／１５４、１６２／１６４、１６６／１６８、１７０／１７８、１８６／１８８、１９０／１９２、１９４／２０２、２１０／２１２、２１４／２１６、２１８／２２６、２３４／２３６、２３８／２４０、２４２／２５０、２５８／２６０、２６２／２６４、２６６／２７４、２８２／２８４、２８６／２８８、２９０／２９８、３０６／３０８、３１０／３１２、３１４／３２２、３３０／３３２、３３４／３３６、３３８／３４６、３５４／３５６、３５８／３６０、３６２／３７０、３７８／３８０、３８２／３８４、３８６／３９４、４０２／４０４、４０６／４０８、４１０／４１８、４２６／４２８、４３０／４３２、４３４／４４２、４５０／４５２、４５４／４５６、４５８／４６６、４７４／４７６、４７８／４８０、４８２／４９０、４９８／５００、および５０２／５０４から成る群から選択される重鎖および軽鎖の可変領域配列内に含有される、重鎖および軽鎖のＣＤＲドメイン（即ちＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を含む。一実施形態では、抗体またはそのフラグメントは、配列番号１８／２０、４２／４４、６６／６８、１６２／１６４、２１０／２１２、２６６／２７４および４３４／４４２のアミノ酸配列対から選択されるＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ内に含有されるＣＤＲ配列を含む。
【００１４】
一実施形態では、液剤のｐＨは、約ｐＨ６．０±０．５、ｐＨ６．０±０．４、ｐＨ６．０±０．３、ｐＨ６．０±０．２、ｐＨ６．０±０．１、ｐＨ６．０±０．０５、ｐＨ６．０±０．０１またはｐＨ６．０である。具体的な実施形態では、液剤のｐＨは約ｐＨ６．０±０．３である。一実施形態では、液状の医薬緩衝剤は１種またはそれ以上の緩衝剤を含み、該緩衝剤は約ｐＨ５．５〜約ｐＨ７．４の有効緩衝範囲または約６．０のｐＫａを有する。
【００１５】
一実施形態では、緩衝剤はヒスチジンである。一実施形態では、ヒスチジンは５ｍＭ±０．７５ｍＭ〜５０ｍＭ±７．５ｍＭの濃度で存在する。一実施形態では、ヒスチジンは５ｍＭ±０．７５ｍＭまたは約５ｍＭの濃度で存在する。一実施形態では、ヒスチジンは１０ｍＭ±１．５ｍＭまたは約１０ｍＭの濃度で存在する。一実施形態では、ヒスチジンは１５ｍＭ±２．２５ｍＭまたは約１５ｍＭの濃度で存在する。一実施形態では、ヒスチジンは２０ｍＭ±３ｍＭまたは約２０ｍＭの濃度で存在する。一実施形態では、ヒスチジンは２５ｍＭ±３．７５ｍＭまたは約２５ｍＭの濃度で存在する。一実施形態では、ヒスチジンは３０ｍＭ±４．５ｍＭまたは約３０ｍＭの濃度で存在する。一実施形態では、ヒスチジンは３５ｍＭ±５．２５ｍＭまたは約３５ｍＭの濃度で存在する。一実施形態では、ヒスチジンは４０ｍＭ±６ｍＭまたは約４０ｍＭの濃度で存在する。一実施形態では、ヒスチジンは４５ｍＭ±６．７５ｍＭまたは約４５ｍＭの濃度で存在する。一実施形態では、ヒスチジンは５０ｍＭ±７．５ｍＭまたは約５０ｍＭの濃度で存在する。
【００１６】
一実施形態では、有機共溶媒は、ポリオキシエチレン部分を含有する非イオン性ポリマーである。いくつかの実施形態では、有機共溶媒は、ポリソルベート２０、ポロクサマー１８８およびポリエチレングリコール３３５０の内の任意の１つまたはそれ以上である。具体的な実施形態では、有機共溶媒はポリソルベート２０である。
【００１７】
一実施形態では、有機共溶媒は約０．００５％±０．０００７５％〜約１％±０．１５％「重量対体積」または「ｗ／ｖ」の濃度で存在し、例えば０．１ｇ／ｍｌ＝１０％であり、０．０１ｇ／ｍｌ＝１％である。一実施形態では、有機共溶媒はポリソルベート２０であり、該ポリソルベート２０は約０．２％±０．０３％ｗ／ｖの濃度で存在する。別の実施形態では、有機共溶媒はポリソルベート２０であり、該ポリソルベート２０は０．０１％±０．００１５％ｗ／ｖまたは約０．０１％ｗ／ｖの濃度で存在する。
【００１８】
一実施形態では、安定剤は糖である。一実施形態では、糖は、スクロース、マンニトールおよびトレハロースから成る群から選択される。具体的な実施形態では、安定剤はスクロースである。
【００１９】
一実施形態では、安定剤は１％±０．１５％ｗ／ｖ〜２０％±３％ｗ／ｖの濃度で存在する。具体的な実施形態では、安定剤は、５％±０．７５％ｗ／ｖまたは約５％ｗ／ｖの濃度のスクロースである。別の具体的な実施形態では、安定剤は、７．５％±１．１２５％ｗ／ｖまたは約７．５％ｗ／ｖの濃度のスクロースである。別の具体的な実施形態では、安定剤は、１０％±１．５％ｗ／ｖまたは約１０％ｗ／ｖの濃度のスクロースである。別の具体的な実施形態では、安定剤は、１２．５％±１．８７５％ｗ／ｖまたは約１２．５％ｗ／ｖの濃度のスクロースである。別の具体的な実施形態では、安定剤は、１５％±２．２５％ｗ／ｖまたは約１５％ｗ／ｖの濃度のスクロースである。別の具体的な実施形態では、安定剤は、２０％±３％ｗ／ｖまたは約２０％ｗ／ｖの濃度のスクロースである。
【００２０】
一実施形態では、製剤の粘度は約１センチポアズ〜約１０センチポアズである。一実施形態では、製剤の粘度は、１．４センチポアズ±０．２１センチポアズまたは約１．４センチポアズである。
【００２１】
一実施形態では、製剤の質量オスモル濃度は生理学的範囲内である。一実施形態では、製剤は約３００ミリオスモル毎キログラム（ｍＯｓｍ）〜約４００ｍＯｓｍの質量オスモル濃度を有する。一実施形態では、製剤の質量オスモル濃度は、３６３ｍＯｓｍ±５４ｍＯｓｍまたは約３６３ｍＯｓｍである。
【００２２】
一実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定した場合、−８０℃での６カ月の保存後に液状の医薬製剤から回収した抗Ａｎｇ−２抗体の少なくとも９６％は凝集していない、および分解されていない。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーにより決定した場合、−８０℃での６カ月の保存後に液状の医薬製剤から回収した抗Ａｎｇ−２抗体の少なくとも５５％は、非塩基性および非酸性形態（即ち、主要ピークまたは主要な電荷形態（ｃｈａｒｇｅ  ｆｏｒｍ）または「領域２ピーク」）である。
【００２３】
一実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定した場合、−３０℃での６カ月の保存後に液状の医薬製剤から回収した抗Ａｎｇ−２抗体の少なくとも９６％は凝集していない、および分解されていない。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーにより決定した場合、−３０℃での６カ月の保存後に液状の医薬製剤から回収した抗Ａｎｇ−２抗体の少なくとも５５％は主要な電荷形態である。
【００２４】
一実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定した場合、−２０℃での６カ月の保存後に液状の医薬製剤から回収した抗Ａｎｇ−２抗体の少なくとも９６％は凝集していない、および分解されていない。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーにより決定した場合、−２０℃での６カ月の保存後に液状の医薬製剤から回収した抗Ａｎｇ−２抗体の少なくとも５５％は主要な電荷形態である。
【００２５】
一実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定した場合、５℃での９カ月の保存後に液状の医薬製剤から回収した抗Ａｎｇ−２抗体の少なくとも９６％は、非凝集および非分解の形態である。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーにより決定した場合、５℃での９カ月の保存後に液状の医薬製剤から回収した抗Ａｎｇ−２抗体の少なくとも５６％は主要な電荷形態である。
【００２６】
一実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定した場合、２５℃での３カ月の保存後に液状の医薬製剤から回収した抗Ａｎｇ−２抗体の少なくとも９８％は、非凝集および非分解の形態である。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーにより決定した場合、２５℃での３カ月の保存後に液状の医薬製剤から回収した抗Ａｎｇ−２抗体の少なくとも５４％は主要な電荷形態である。
【００２７】
一実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定した場合、３７℃での１カ月の保存後に液状の医薬製剤から回収した抗Ａｎｇ−２抗体の少なくとも９７％は、非凝集および非分解の形態である。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーにより決定した場合、３７℃での１カ月の保存後に液状の医薬製剤から回収した抗Ａｎｇ−２抗体の少なくとも４７％は主要な電荷形態である。
【００２８】
一実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーにより決定した場合、４５℃での２８日の保存後に液状の医薬製剤から回収した抗Ａｎｇ−２抗体の少なくとも９５％は、非凝集および非分解の形態である。一実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーにより決定した場合、４５℃での２８日の保存後に液状の医薬製剤から回収した抗Ａｎｇ−２抗体の少なくとも３２％は主要な電荷形態である。
【００２９】
一態様では、（ｉ）ヒトＡｎｇ−２に特異的に結合する５±０．７５ｍｇ／ｍｌ〜１５０±２２．５ｍｇ／ｍｌのヒト抗体；（ｉｉ）５ｍＭ±０．７５ｍＭ〜５０ｍＭ±７．５ｍＭのヒスチジン；（ｉｉｉ）０．００５％±０．０００７５％〜１％±０．１５％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；および（ｉｖ）１％±０．１５％〜２０％±３％（ｗ／ｖ）のスクロースを、約５．５〜約６．５のｐＨで含む液状の医薬製剤が提供される。この態様の抗Ａｎｇ−２抗体は、重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含み、その結果、ＨＣＶＲ／ＬＣＶＲの組合せは重鎖相補性決定領域および軽鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３）を含み、これらの領域は、配列番号４−６−８／配列番号１２−１４−１６のアミノ酸配列をそれぞれ含む。特定の実施形態では、抗Ａｎｇ−２抗体は、配列番号１８および配列番号２０のアミノ酸配列をそれぞれ含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）および軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）を含む（参照によって全体を本明細書に具体的に組み入れる米国特許出願公開第２０１１００２７２８６号の抗体ＨＩＨ６８５Ｐ）。
【００３０】
別の実施形態では、液剤は、（ｉ）５０±７．５ｍｇ／ｍＬのＨＩＨ６８５Ｐ；（ｉｉ）１０±１．５ｍＭのヒスチジン；（ｉｉｉ）０．２％±０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；および（ｉｖ）１０％±１．５％（ｗ／ｖ）のスクロースを、６．０±０．５のｐＨで含む。
【００３１】
本態様の一実施形態では、液剤は、（ｉ）２５±３．７５ｍｇ／ｍＬのＨＩＨ６８５Ｐ；（ｉｉ）１０±１．５ｍＭのヒスチジン；（ｉｉｉ）０．２％±０．０３％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；および（ｉｖ）１０％±１．５％（ｗ／ｖ）のスクロースを、６．０±０．５のｐＨで含む。この特定の製剤の一実施形態では、２８日間４５℃での製剤の保存後において、抗体の９５％以上は天然であり、抗体の３２％以上は主要な電荷形態である。この特定の製剤の一実施形態では、１カ月間３７℃での製剤の保存後において、抗体の９７％以上は天然であり、抗体の４７％以上は主要な電荷形態である。この特定の製剤の一実施形態では、３カ月間２５℃での製剤の保存後において、抗体の９８％以上は天然であり、抗体の５４％以上は主要な電荷形態である。この特定の製剤の一実施形態では、９カ月間５℃での製剤の保存後において、抗体の９６％以上は天然であり、抗体の５６％以上は主要な電荷形態である。この特定の製剤の一実施形態では、３カ月間−２０℃での製剤の保存後において、抗体の９％以上は天然であり、抗体の５５％以上は主要な電荷形態である。この特定の製剤の一実施形態では、６カ月間−３０℃での製剤の保存後において、抗体の９６％以上は天然であり、抗体の５５％以上は主要な電荷形態である。この特定の製剤の一実施形態では、６カ月間−８０℃での製剤の保存後において、抗体の９６％以上は天然であり、抗体の５５％以上は主要な電荷形態である。
【００３２】
一態様では、先の態様のいずれかの液状の医薬製剤は容器中に設けられる。一実施形態では、容器はポリカーボネートバイアルである。別の実施形態では、容器はガラスバイアルである。一実施形態では、ガラスバイアルは、フルオロカーボンがコーティングされたブチルゴム栓を備えたタイプ１のホウケイ酸塩ガラスバイアルである。別の実施形態では、容器はマイクロ注入器である。別の実施形態では、容器は注射器である。具体的な実施形態では、注射器は、フルオロカーボンがコーティングされたプランジャーを含む。具体的な一実施形態では、注射器は、２７−Ｇ針、フルオロカーボンがコーティングされたブチルゴム栓、およびラテックスフリーである非細胞毒性のゴム先端キャップを備えた、約５００十億分率未満のタングステンを含有する１ｍＬ長のガラス注射器である。より具体的な実施形態では、注射器は、２７−Ｇの薄壁針、ＦＬＵＲＯＴＥＣがコーティングされた４０２３／５０ゴム栓、およびＦＭ２７ゴム先端キャップを備えた、ＮＵＯＶＡ  ＯＭＰＩの１ｍＬ長のガラス注射器である。別の具体的な実施形態では、注射器は、２７−Ｇ針が取り付けられている１ｍＬまたは３ｍＬのプラスチック注射器である。より具体的な実施形態では、プラスチック注射器はＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮにより供給される。一実施形態では、容器はポリ塩化ビニルのＩＶ袋である。別の実施形態では、容器はポリオレフィンのＩＶ袋である。
【００３３】
一態様では、（ａ）５０ｍｇ／ｍＬ±７．５ｍｇ／ｍＬの抗Ａｎｇ−２抗体、（ｂ）１０ｍＭ±１．５ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６±０．５、（ｃ）０．２％ｗ／ｖ±０．０３％のポリソルベート２０、および（ｄ）１０％ｗ／ｖ±１．５％のスクロースを含む医薬製剤が提供され、（ａ）抗体は配列番号１８のＨＣＶＤおよび配列番号２０のＬＣＶＤを含み、（ｂ）製剤中の抗体の９６％超は約１５０．９ｋＤａ±１ｋＤａの分子量を有し、（ｃ）製剤中の抗体の少なくとも５３％は約８．１３±０．０１の等電点を有し、（ｄ）製剤中の抗体の約９０％〜約９２％はフコシル化されており、および（ｅ）抗体の重鎖の約２．５％はＣ末端リシンを欠失している。
【００３４】
一実施形態では、（ａ）５０ｍｇ／ｍＬ±７．５ｍｇ／ｍＬの抗Ａｎｇ−２抗体、（ｂ）１０ｍＭ±１．５ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６±０．５、（ｃ）０．２％ｗ／ｖ±０．０３％のポリソルベート２０、および（ｄ）１０％ｗ／ｖ±１．５％のスクロースから成る医薬製剤が提供され、（ａ）抗体は配列番号１８のＨＣＶＤおよび配列番号２０のＬＣＶＤを含み、（ｂ）製剤中の抗体の９６％超は約１５０．９ｋＤａ±１ｋＤａの分子量を有し、（ｃ）製剤中の抗体の少なくとも５３％は約８．１３±０．０１の等電点を有し、（ｄ）製剤中の抗体の約９０％〜約９２％はフコシル化されており、および（ｅ）抗体の重鎖の約２．５％はＣ末端リシンを欠失している。
【００３５】
一態様では、（ａ）２５ｍｇ／ｍＬ±３．７５ｍｇ／ｍＬの抗Ａｎｇ−２抗体、（ｂ）１０ｍＭ±１．５ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６±０．５、（ｃ）０．２％ｗ／ｖ±０．０３％のポリソルベート２０、および（ｄ）１０％ｗ／ｖ±１．５％のスクロースを含む医薬製剤が提供され、（ａ）抗体は配列番号１８のＨＣＶＤおよび配列番号２０のＬＣＶＤを含み、（ｂ）製剤中の抗体の９６％超は約１５０．９ｋＤａ±１ｋＤａの分子量を有し、（ｃ）製剤中の抗体の少なくとも５３％は約８．１３±０．０１の等電点を有し、（ｄ）製剤中の抗体の約９０％〜約９２％はフコシル化されており、および（ｅ）抗体の重鎖の約２．５％はＣ末端リシンを欠失している。
【００３６】
一実施形態では、（ａ）２５ｍｇ／ｍＬ±３．７５ｍｇ／ｍＬの抗Ａｎｇ−２抗体、（ｂ）１０ｍＭ±１．５ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６±０．５、（ｃ）０．２％ｗ／ｖ±０．０３％のポリソルベート２０、および（ｄ）１０％ｗ／ｖ±１．５％のスクロースから成る医薬製剤が提供され、（ａ）抗体は配列番号１８のＨＣＶＤおよび配列番号２０のＬＣＶＤを含み、（ｂ）製剤中の抗体の９６％超は約１５０．９ｋＤａ±１ｋＤａの分子量を有し、（ｃ）製剤中の抗体の少なくとも５３％は約８．１３±０．０１の等電点を有し、（ｄ）製剤中の抗体の約９０％〜約９２％はフコシル化されており、および（ｅ）抗体の重鎖の約２．５％はＣ末端リシンを欠失している。
【００３７】
一態様では、先の態様のいずれか１つの医薬組成物、容器、および使用説明書を含むキットが提供される。一実施形態では、容器は充填済み注射器である。一実施形態では、容器は、ＦＬＵＲＯＴＥＣがコーティングされた４０２３／５０ゴム栓が取り付けられているホウケイ酸塩バイアルである。
【００３８】
本発明の別の実施形態は、次の詳細な説明の概説から明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明を説明する前に、本発明は、説明された特定の方法および実験条件に限定されないことを理解すべきであり、なぜならば、そのような方法および条件は変更され得るからである。また、本明細書で使用される専門用語は特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図しないことも理解すべきであり、なぜならば、本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲によってのみ制限されるからである。
【００４０】
特に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で使用する場合、用語「約」は、具体的に列挙した数値または値の範囲に関して使用される場合、列挙した値が該値から２％以下だけ変更され得ることを意味する。例えば、本明細書で使用する場合、語句「約１００」は、９８および１０２ならびに間の全ての値（例えば９８．００、９８．０１、９８．０２、９８．０３、９８．０４、・・・、１０１．９６、１０１．９７、１０１．９８、１０１．９９、１０２．００）を含む。
【００４１】
本明細書に記載したものと類似したまたは同等の任意の方法および材料が本発明の実施または試験に使用され得るが、好ましい方法および材料を今から説明する。本明細書で言及した全ての刊行物は、その全体を説明するために参照によって本明細書に組み入れる。
【００４２】
医薬製剤
本明細書で使用する場合、語句「医薬製剤」は、少なくとも１種の有効成分（例えば、ヒトまたは非ヒト動物において生物学的効果を発揮することができる小分子、巨大分子、化合物等）と、有効成分または１種もしくはそれ以上の追加の不活性成分と組み合わされる場合にヒトまたは非ヒト動物への治療的投与に適している少なくとも１種の不活性成分との組合せを意味する。用語「製剤」は本明細書で使用する場合、特に示さない限り「医薬製剤」を意味する。本発明は、少なくとも１種の治療用ポリペプチドを含む医薬製剤を提供する。本発明のある実施形態によれば、治療用ポリペプチドは、ヒトアンジオポエチン−２（Ａｎｇ−２）タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。より具体的には、本発明は、（ｉ）ヒトＡｎｇ−２に特異的に結合するヒト抗体、（ｉｉ）ヒスチジン緩衝剤；（ｉｉｉ）非イオン性界面活性剤である有機共溶媒；および（ｉｖ）炭水化物である熱安定剤を含む医薬製剤を含む。本発明に含まれる成分および製剤の具体例を以下に詳細に説明する。
【００４３】
ＡＮＧ−２に特異的に結合する抗体
本発明の医薬製剤は、ヒトＡｎｇ−２に特異的に結合するヒト抗体またはその抗原結合フラグメントを含むことができる。本明細書で使用する場合、用語「Ａｎｇ−２」または「ＡＮＧ２」はヒトアンジオポエチン２を意味しており、該ヒトアンジオポエチン２は、Ｔｉｅ２活性化の自己分泌型アンタゴニストとして一般に知られている。Ａｎｇ−２は、サイトカインの効果を受けるために血管内皮を「刺激する」ことが当分野で一般に知られている。Ａｎｇ−２は腫瘍血管系で強く発現され、血管形成および腫瘍の進行を促進するために他のサイトカイン（即ち血管内皮成長因子）と相乗的に作用すると一般に考えられている。例示的なヒトＡｎｇ−２アミノ酸配列を配列番号５１８に記載する。ヒトＡｎｇ−２に対する抗体が特許出願公開であるＵＳ２０１０／０１６６７６８、ＵＳ２０１１／００６５９０２、ＷＯ２０１０／０７７８５４およびＵＳ２０１１／００２７２８６に記載されており、これらを参照によって本明細書に組み入れる。
【００４４】
用語「抗体」は本明細書で使用する場合、２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖がジスルフィド結合で相互接続されている４本のポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子ならびにその多量体（例えばＩｇＭ）を指すことを一般に意図するが、重鎖のみから成る（即ち軽鎖を欠いている）免疫グロブリン分子も用語「抗体」の定義に包含される。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＨＣＶＲまたはＶＨと略す）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は３つのドメイン、即ちＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＬＣＶＲまてはＶＬと略す）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散在している相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分化され得る。各ＶＨおよびＶＬは３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端に以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。
【００４５】
特に示さない限り、用語「抗体」は本明細書で使用する場合、完全な抗体分子およびその抗原結合フラグメントを包含することを理解すべきである。抗体の用語「抗原結合部分」または「抗原結合フラグメント」（または単に「抗体部分」または「抗体フラグメント」）は本明細書で使用する場合、ヒトＡｎｇ−２またはそのエピトープに特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたはそれ以上のフラグメントを指す。
【００４６】
「単離抗体」は本明細書で使用する場合、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、ヒトＡｎｇ−２に特異的に結合する単離抗体は、ヒトＡｎｇ−２以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）を指すことを意図する。
【００４７】
用語「特異的に結合する」等は、抗体またはその抗原結合フラグメントが生理学的条件下で比較的安定な抗原と複合体を形成すること意味する。特異的な結合は、少なくとも約１×１０−６Ｍまたはより大きい解離定数で特徴付けられ得る。２つの分子が特異的に結合するか否かを決定する方法は当分野に周知であり、該方法として、例えば平衡透析、表面プラズモン共鳴等が挙げられる。しかしながら、ヒトＡｎｇ−２に特異的に結合する単離抗体は、他の抗原、例えば他の種由来のＡｎｇ−２分子（相同分子種）への交差反応性を有することができる。本発明に関して、ヒトＡｎｇ−２および１種またはそれ以上の更なる抗原に結合する多重特異的（例えば二重特異的）抗体は、ヒトＡｎｇ−２に「特異的に結合する」とみなされる。更に、単離抗体は、他の細胞質物質または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００４８】
本発明の医薬製剤に含まれ得る例示的な抗ヒトＡｎｇ−２抗体は、特許出願公開であるＵＳ２０１０／０１６６７６８、ＵＳ２０１１／００６５９０２、ＵＳ２０１１／００２７２８６およびＷＯ２０１０／０７７８５４に記載されており、これらの開示の全体を参照によって本明細書に組み入れる。
【００４９】
本発明のある実施形態によれば、抗ヒトＡｎｇ−２  ＨＩＨ６８５Ｐ抗体は、ＩＧＨＶ３−１３．０１サブタイプである重鎖可変領域およびＩＧＫＶ３−２０．０１サブタイプである軽鎖可変領域を含むヒトＩｇＧ１である（ＢａｒｂｉｅおよびＬｅｆｒａｎｃ、Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｋａｐｐａ  Ｖａｒｉａｂｌｅ（ＩＧＫＶ）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｉｎｇ（ＩＧＫＪ）Ｓｅｇｍｅｎｔｓ、Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１９９８；１５：１７１〜１８３頁；ならびにＳｃａｖｉｎｅｒ、Ｄ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｓｐｌａｙｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｈｅａｖｙ，Ｋａｐｐａ  ａｎｄ  Ｌａｍｂｄａ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｉｎｇ  Ｒｅｇｉｏｎｓ、Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．、１９９９；１６：２３４〜２４０頁を参照）。生殖細胞系ＩＧＨＶ３−１３およびＩＧＫＶ３−２０配列ならびに本明細書に示すアミノ酸位置割り当て番号は、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ら、ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ、３７、Ｄ１００６−Ｄ１０１２（２００９）に記載されている国際免疫遺伝学（ＩＭＧＴ）情報システムに適合する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、抗ヒトＡｎｇ−２  ＨＩＨ６８５Ｐは、標準的な重鎖可変領域に対する少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、これにより、生殖細胞系ＩＧＨＶ３−１３配列と比べて抗体の露出面を変化させることが合理的に予期される、ＣＤＲ内のペプチド鎖の回転角の変化が生じる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＩＧＨＶ３−１３のＣＤＲ２内の３９位でのプロリンのイソロイシンへの置換を含む。
【００５１】
いくつかの実施形態では、抗ヒトＡｎｇ−２  ＨＩＨ６８５Ｐ抗体は少なくとも１つのアミノ酸置換を含み、これにより、生殖細胞系ＩＧＫＶ３−２０の３番目のＣＤＲ内で電荷変化が生じる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換（単数または複数）は、（ａ）ＩＧＨＶ３−２０のＣＤＲ３内で（例えば１０６位で）非電荷極性アミノ酸に置換される塩基性アミノ酸、および（ｂ）ＩＧＫＶ３−２０のＣＤＲ３内で（例えば１０８位で）非電荷極性アミノ酸に置換される酸性アミノ酸から成る群から選択される。ＣＤＲ表面で呈する電荷の変化は、抗体の溶媒との境界面に影響を及ぼし、そのため溶液中における抗体の安定性の維持または促進に予測不能な状態を作ると予想される。
【００５２】
本発明のある実施形態によれば、抗ヒトＡｎｇ−２抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号４の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号６のＨＣＤＲ２、および配列番号８のＨＣＤＲ３を含む。ある実施形態では、抗ヒトＡｎｇ−２抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１８のＨＣＶＤを含む。
【００５３】
本発明のある実施形態によれば、抗ヒトＡｎｇ−２またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１２の軽（カッパ）鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号１４のＬＣＤＲ２、および配列番号１６のＬＣＤＲ３を含む。ある実施形態では、抗ヒトＡｎｇ−２抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号２０のＬＣＶＤを含む。
【００５４】
本明細書の実施例で使用する、限定されない例示的抗体は、ＵＳ２０１１／００２７２８６の場合と同様に「ＨＩＨ６８５Ｐ」と呼ばれる。この抗体は、配列番号１８／２０を有するＨＣＶＲ／ＬＣＶＲアミノ酸配列対、および配列番号４−６−８／配列番号１２−１４−１６で示すＨＣＤＲ１−ＨＣＤＲ２−ＨＣＤＲ３／ＬＣＤＲ１−ＬＣＤＲ２−ＬＣＤＲ３ドメインを含む。
【００５５】
本発明の医薬製剤に含有される抗体またはその抗原結合フラグメントの量は、製剤に望まれる特定の性質と、製剤を使用することが意図される具体的な状況および目的とに応じて変更され得る。ある実施形態では、医薬製剤は、５±０．７５ｍｇ／ｍＬ〜１５０±２２．５ｍｇ／ｍＬの抗体；７．５±１．１２５ｍｇ／ｍＬ〜１４０±２１ｍｇ／ｍＬの抗体；１０±１．５ｍｇ／ｍＬ〜１３０±１９．５ｍｇ／ｍＬの抗体；１２．５±１．８７５ｍｇ／ｍＬ〜１２０±１８ｍｇ／ｍＬの抗体；１５±２．２５ｍｇ／ｍＬ〜１１０±１６．５ｍｇ／ｍＬの抗体；１７．５±２．６２５ｍｇ／ｍＬ〜１００±１５ｍｇ／ｍＬの抗体；２０±３ｍｇ／ｍＬ〜９０±１３．５ｍｇ／ｍＬの抗体；２２．５±３．３７５ｍｇ／ｍＬ〜８０±１２ｍｇ／ｍＬの抗体；２５±３．７５ｍｇ／ｍＬ〜７０±１０．５ｍｇ／ｍＬの抗体；２７．５±４．１２５ｍｇ／ｍＬ〜６０±９ｍｇ／ｍＬの抗体；３０±４．５ｍｇ／ｍＬ〜５０±７．５ｍｇ／ｍＬの抗体；２５±３．７５ｍｇ／ｍＬの抗体；または５０±７．５ｍｇ／ｍｌを含有することができる液剤である。例えば、本発明の製剤は、ヒトＡｎｇ−２に特異的に結合する、約２０ｍｇ／ｍＬ；約２５ｍｇ／ｍＬ；約３０ｍｇ／ｍＬ；約３５ｍｇ／ｍＬ；約４０ｍｇ／ｍＬ；約４５ｍｇ／ｍＬ；約５０ｍｇ／ｍＬ；約５５ｍｇ／ｍＬ；または約６０ｍｇ／ｍＬの抗体またはその抗原結合フラグメントを含むことができる。
【００５６】
賦形剤およびｐＨ
本発明の医薬製剤は、１種またはそれ以上の賦形剤を含む。用語「賦形剤」は本明細書で使用する場合、所望の硬度、粘度または安定効果をもたらすために製剤に添加される任意の非治療薬を意味する。
【００５７】
ある実施形態では、本発明の医薬製剤は、乱暴な取り扱いまたは撹拌、例えばボルテックス等の条件下でヒトＡｎｇ−２抗体を安定化させる種類および量で少なくとも１種の有機共溶媒を含む。いくつかの実施形態では、「安定化させる」が意味するのは、乱暴に取り扱っている間に（モル基準で）抗体の総量の４％超が凝集した抗体が形成されるのを防止することである。いくつかの実施形態では、乱暴な取り扱いとは、約６０分または約１２０分にわたって、抗体および有機共溶媒を含有する溶液をボルテックスすることである。
【００５８】
ある実施形態では、有機共溶媒は、アルキルポリ（エチレンオキシド）等の非イオン性界面活性剤である。本発明の製剤に含まれ得る具体的な非イオン性界面活性剤として、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート２８、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、ポリソルベート６５、ポリソルベート８０、ポリソルベート８１およびポリソルベート８５等のポリソルベート；ポロクサマー１８１、ポロクサマー１８８、ポロクサマー４０７等のポロクサマー；またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ポリソルベート２０は、ＴＷＥＥＮ２０、ソルビタンモノラウレートおよびポリオキシエチレンソルビタンモノラウレートとしても知られている。ポロクサマー１８８はＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ６８としても知られている。
【００５９】
本発明の医薬製剤に含有される非イオン性界面活性剤の量は、製剤に望まれる特定の性質と、製剤を使用することが意図される具体的な状況および目的とに応じて変更され得る。ある実施形態では、製剤は、０．０１％±０．００１５％〜１％±０．１５％の界面活性剤を含有することができる。例えば、本発明の製剤は、約０．００８５％；約０．０１％；約０．０２％；約０．０３％；約０．０４％；約０．０５％；約０．０６％；約０．０７％；約０．０８％；約０．０９％；約０．１％；約０．１１％；約０．１２％；約０．１３％；約０．１４％；約０．１５％；約０．１６％；約０．１７％；約０．１８％；約０．１９％；約０．２０％；約０．２１％；約０．２２％；約０．２３％；約０．２４％；約０．２５％；約０．３％；約０．４％；約０．５％；約０．６％；約０．７％；約０．８％；約０．９％；約１％；約１．１％；約１．１５％；または約１．２％のポリソルベート２０もしくはポロクサマー１８８を含むことができる。
【００６０】
本発明の医薬製剤はまた、熱的ストレスの条件下でヒトＡｎｇ−２抗体を安定化させる種類または量で１種またはそれ以上の安定剤を含むこともできる。いくつかの実施形態では、「安定化させる」が意味するのは、抗体および熱安定剤を含有する溶液を約２８日以下にわたって約４５℃で維持する場合に、抗体の約９３％超が天然の高次構造に維持されることである。いくつかの実施形態では、「安定化させる」が意味するのは、抗体および熱安定剤を含有する溶液を約２８日以下にわたって約４５℃で維持する場合に、抗体の約４％未満が凝集することである。いくつかの実施形態では、「安定化させる」が意味するのは、抗体および熱安定剤を含有する溶液を約２８日以下にわたって約３７℃で維持する場合に、抗体の約９６％超が天然の高次構造に維持されることである。いくつかの実施形態では、「安定化させる」が意味するのは、抗体および熱安定剤を含有する溶液を約２８日以下にわたって約３７℃で維持する場合に、抗体の約２％未満が凝集することである。本明細書で使用する場合、「天然の」は、一般に抗体の無傷なモノマーである、サイズ排除による抗体の主要な形態を意味する。
【００６１】
ある実施形態では、熱安定剤は、スクロース、ソルビトール、グリセリン、トレハロースおよびマンニトールまたはそれらの任意の組合せから選択される糖または糖アルコールであり、製剤に含有されるものの量は、具体的な状況および製剤を使用することが意図される目的に応じて変更され得る。ある実施形態において、製剤は、約３％〜約２０％の糖もしくは糖アルコール；約４％〜約１９％の糖もしくは糖アルコール；約５％〜約１８％の糖もしくは糖アルコール；約６％〜約１７％の糖もしくは糖アルコール；約７％〜約１６％の糖もしくは糖アルコール；約８％〜約１５％の糖もしくは糖アルコール；約９％〜約１６％の糖もしくは糖アルコール；約７％〜約１３％の糖もしくは糖アルコール；約８％〜約１２％の糖もしくは糖アルコール；約９％〜約１１％の糖もしくは糖アルコール；または約１０％の糖もしくは糖アルコールを含有することができる。例えば、本発明の医薬製剤は、４％±０．６％；５％±０．７５％；６％±０．９％；７％±１．０５％；８％±１．２％；９％±１．３５％；１０％±１．５％；１１％±１．６５％；１２％±１．８％；１３％±１．９５％；または約１４％±２．１％の糖または糖アルコール（例えばスクロース、トレハロースまたはマンニトール）を含むことができる。
【００６２】
本発明の医薬製剤はまた、緩衝剤または緩衝系を含むこともでき、該緩衝剤または緩衝系は、安定したｐＨを維持するおよびヒトＡｎｇ−２抗体の安定化を促進する役割を果たす。いくつかの実施形態では、「安定化させる」が意味するのは、抗体および緩衝剤を含有する溶液を約２８日以下にわたって約４５℃で維持する場合に、抗体の５％±０．５％未満または約４．３％以下が凝集することである。いくつかの実施形態では、「安定させる」が意味するのは、抗体および緩衝剤を含有する溶液を約２８日以下にわたって約４５℃で維持する場合に、サイズ排除クロマトグラフィーで決定した場合に抗体の少なくとも９２％±０．５％がその天然の高次構造であることである。「天然の」または「天然の高次構造」は、凝集していないまたは分解されていない抗体画分を意味する。このことは一般に、抗体本体の相対的なサイズを測定するアッセイ、例えばサイズ排除クロマトグラフィーアッセイにより決定される。凝集していないおよび分解されていない抗体は、天然抗体と等しいおよび一般に主要な溶出画分である画分に溶出する。凝集した抗体は、天然抗体よりも大きいサイズを示す画分に溶出する。分解された抗体は、天然抗体よりも小さいサイズを示す画分に溶出する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、「安定させる」が意味するのは、抗体および緩衝剤を含有する溶液を約２８日以下にわたって約４５℃で維持する場合に、陽イオン交換クロマトグラフィーで決定した場合に抗体の少なくとも５２％±０．５％がその主要な電荷形態であるということである。「主要な電荷」または「主要な電荷形態」は、主要ピークでイオン交換樹脂から溶出する抗体の画分を意味し、主要ピークは一般に、一方でより「塩基性の」ピークに隣接し、他方でより「酸性の」ピークに隣接する。
【００６４】
本発明の医薬製剤は、約５．５〜約６．５のｐＨを有することができる。例えば、本発明の製剤は、約５．５；約５．６；約５．７；約５．８；約５．９；約６．０；約６．１；約６．２；約６．３；約６．４；または約６．５のｐＨを有することができる。いくつかの実施形態では、ｐＨは、６．０±０．４；６．０±０．３；６．０±０．２；６．０±０．１；約６．０；または６．０である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、緩衝剤または緩衝系は、ｐＨ５．５〜７．４の範囲と完全にまたは部分的に重複する緩衝範囲を有する少なくとも１種の緩衝剤を含む。一実施形態では、緩衝剤は約６．０±０．５のｐＫａを有する。ある実施形態では、緩衝剤はヒスチジン緩衝剤を含む。ある実施形態では、ヒスチジンは５ｍＭ±０．７５ｍＭ〜１５ｍＭ±２．２５ｍＭ；６ｍＭ±０．９ｍＭ〜１４ｍＭ±２．１ｍＭ；７ｍＭ±１．０５ｍＭ〜１３ｍＭ±１．９５ｍＭ；８ｍＭ±１．２ｍＭ〜１２ｍＭ±１．８ｍＭ；９ｍＭ±１．３５ｍＭ〜１１ｍＭ±１．６５ｍＭ；１０ｍＭ±１．５ｍＭ；または約１０ｍＭの濃度で存在する。ある実施形態では、緩衝系は、６．０±０．３または６．４±０．３のｐＨにおいて１０ｍＭ±１．５ｍＭでヒスチジンを含む。
【００６６】
例示的な製剤
本発明の一態様によれば、医薬製剤は、低粘度の、即ち１０センチポアズ未満または約１．４±０．２１センチポアズの粘度を有する、一般に生理学的に等張な、即ち３００〜４００ｍＯｓｍまたは約３６３±５４ｍＯｓｍである液剤であり、該液剤は、（ｉ）２５ｍｇ／ｍＬ±３．７５ｍｇ／ｍＬまたは５０ｍｇ／ｍＬ±７．５ｍｇ／ｍＬの濃度でヒトＡｎｇ−２に特異的に結合するヒト抗体（例えばＨＩＨ６８５Ｐ）；（ｉｉ）約ｐＨ６．０±０．３で十分な緩衝をもたらす緩衝系；（ｉｉｉ）熱安定剤としての役割を果たす糖；および（ｉｖ）抗体の場合に構造的完全性を保護する有機共溶媒を含む。
【００６７】
一実施形態によれば、医薬製剤は、（ｉ）ヒトＡｎｇ−２に特異的に結合し、置換されたＩＧＨＶ３−１３．０１タイプの重鎖可変領域および置換されたＩＧＫＶ３−２０．０１タイプの軽鎖可変領域を含む、２０±３ｍｇ／ｍＬ〜約６０±９ｍｇ／ｍＬの濃度のヒトＩｇＧ１抗体（例えばＨＩＨ６８５Ｐ）；（ｉｉ）ヒスチジンを含み、約ｐＨ６．０±０．３で効果的に緩衝する緩衝系；（ｉｉｉ）スクロース；および（ｉｖ）ポリソルベート等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００６８】
一実施形態によれば、医薬製剤は、（ｉ）ヒトＡｎｇ−２に特異的に結合し、配列番号４のＨＣＤＲ１、配列番号６のＨＣＤＲ２、配列番号８のＨＣＤＲ３、配列番号１４のＬＣＤＲ１、配列番号１４のＬＣＤＲ２、および配列番号１６のＬＣＤＲ３、を含む、約２５ｍｇ／ｍｌ±３．７５ｍｇ／ｍＬの濃度のヒトＩｇＧ１抗体；（ｉｉ）ｐＨ６．０±０．３で緩衝する１０ｍＭ±１．５ｍＭのヒスチジン；（ｉｉｉ）１０％ｗ／ｖ±１．５％ｗ／ｖのスクロース；および（ｉｖ）０．２％ｗ／ｖ±０．０３％ｗ／ｖのポリソルベート２０を含む。
【００６９】
一実施形態によれば、医薬製剤は、（ｉ）ヒトＡｎｇ−２に特異的に結合し、配列番号４のＨＣＤＲ１、配列番号６のＨＣＤＲ２、配列番号８のＨＣＤＲ３、配列番号１４のＬＣＤＲ１、配列番号１４のＬＣＤＲ２、および配列番号１６のＬＣＤＲ３、を含む、約５０ｍｇ／ｍｌ±７．５ｍｇ／ｍＬの濃度のヒトＩｇＧ１抗体；（ｉｉ）ｐＨ６．０±０．３で緩衝する１０ｍＭ±１．５ｍＭのヒスチジン；（ｉｉｉ）１０％ｗ／ｖ±１．５％ｗ／ｖのスクロース；および（ｉｖ）０．２％ｗ／ｖ±０．０３％ｗ／ｖのポリソルベート２０を含む。
【００７０】
一実施形態によれば、医薬製剤は、（ｉ）ヒトＡｎｇ−２に特異的に結合し、配列番号１８の重鎖可変領域および配列番号２０の軽鎖可変領域を含む、２５ｍｇ／ｍｌ±３．７５ｍｇ／ｍＬの濃度のヒトＩｇＧ１抗体；（ｉｉ）ｐＨ６．０±０．３で緩衝する１０ｍＭ±１．５ｍＭのヒスチジン；（ｉｉｉ）１０％ｗ／ｖ±１．５％ｗ／ｖのスクロース；および（ｉｖ）０．２％ｗ／ｖ±０．０３％ｗ／ｖのポリソルベート２０を含む。
【００７１】
一実施形態によれば、医薬製剤は、（ｉ）ヒトＡｎｇ−２に特異的に結合し、配列番号１８の重鎖可変領域および配列番号２０の軽鎖可変領域を含む、約５０ｍｇ／ｍｌ±７．５ｍｇ／ｍＬの濃度のヒトＩｇＧ１抗体；（ｉｉ）ｐＨ６．０±０．３で緩衝する１０ｍＭ±１．５ｍＭのヒスチジン；（ｉｉｉ）１０％ｗ／ｖ±１．５％ｗ／ｖのスクロース；および（ｉｖ）０．２％ｗ／ｖ±０．０３％のポリソルベートを含む。
【００７２】
以下に示す実施例を含む、本発明に包含される医薬製剤の追加の非限定的な例を本明細書の他の個所に記載する。
【００７３】
医薬製剤の安定性および粘度
本発明の医薬製剤は、典型的には高レベルの安定性を示す。用語「安定な」は医薬製剤に関して本明細書で使用する場合、医薬製剤中の抗体が規定の条件下での保存後に許容される程度の化学構造または生物学的機能を保持することを意味する。製剤に含有される抗体が規定量の時間保存後にその化学構造または生物学的機能を１００％維持しなくても、製剤は安定であることができる。ある状況下において、規定量の時間保存後の抗体の構造または機能の約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の維持を「安定している」とみなすことができる。
【００７４】
特に、規定温度での規定量の時間保存後に製剤中に残る天然抗体の割合を測定することにより、安定性を評価することができる。天然抗体の割合を、特に、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー［ＳＥ−ＨＰＬＣ］）により決定することができ、その結果、天然は、非凝集および非分解を意味する。「許容される程度の安定性」はそのフレーズを本明細書で使用する場合、天然形態の抗体の少なくとも９０％が、所与の温度で規定量の時間保存後に製剤中において検出され得ることを意味する。ある実施形態では、天然形態の抗体の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、規定温度で規定量の時間保存後に製剤中において検出され得る。その後に安定性が評価される規定量の時間は、少なくとも１４日間、少なくとも２８日間、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間、少なくとも５カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも７カ月間、少なくとも８カ月間、少なくとも９カ月間、少なくとも１０カ月間、少なくとも１１カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも１８カ月間、少なくとも２４カ月間、またはそれ以上であることができる。安定性を評価する場合に医薬製剤を保存することができる規定温度は−約８０℃〜約４５℃の任意の温度であることができ、例えば−約８０℃、−約３０℃、−約２０℃、約０℃、約４〜８℃、約５℃、約２５℃、約３５℃、約３７℃または約４５℃での保存であることができる。例えば、５℃での９カ月の保存後に天然抗体の約９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％超がＳＥ−ＨＰＬＣで検出される場合には、医薬製剤は安定であるとみなすことができる。２５℃での６カ月の保存後に天然抗体の約９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％超がＳＥ−ＨＰＬＣで検出される場合には、医薬製剤は安定であるとみなすこともできる。３７℃での２８日の保存後に天然抗体の約９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％超がＳＥ−ＨＰＬＣで検出される場合には、医薬製剤は安定であるとみなすこともできる。４５℃での２８日の保存後に天然抗体の約９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％超がＳＥ−ＨＰＬＣで検出される場合には、医薬製剤は安定であるとみなすこともできる。−２０℃での６カ月の保存後に天然抗体の約９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％超がＳＥ−ＨＰＬＣで検出される場合には、医薬製剤は安定であるとみなすこともできる。−３０℃で６カ月の保存後に天然抗体の約９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％超がＳＥ−ＨＰＬＣで検出される場合には、医薬製剤は安定であるとみなすこともできる。−８０℃での６カ月の保存後に天然抗体の約９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％超がＳＥ−ＨＰＬＣで検出される場合には、医薬製剤は安定であるとみなすこともできる。
【００７５】
特に、規定温度での規定量の時間保存後の製剤中において凝集体を形成する抗体の割合を測定することにより安定性を評価することができ、安定性は、形成される凝集体の割合に反比例する。凝集した抗体の割合を、特に、サイズ排除クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー［ＳＥ−ＨＰＬＣ］）により決定することができる。「許容される程度の安定性」はそのフレーズを本明細書で使用する場合、抗体の６％以下が、所与の温度で規定量の時間保存後の製剤中において凝集形態で検出されることを意味する。ある実施形態では、許容される程度の安定性は、抗体の約６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％以下を所与の温度で規定量の時間保存後の製剤中において凝集体で検出することができることを意味する。その後に安定性が評価される規定量の時間は、少なくとも２週間、少なくとも２８日間、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間、少なくとも５カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも７カ月間、少なくとも８カ月間、少なくとも９カ月間、少なくとも１０カ月間、少なくとも１１カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも１８カ月間、少なくとも２４カ月間、またはそれ以上であることができる。安定性を評価する場合に医薬製剤を保存することができる温度は−約８０℃〜約４５℃の任意の温度であることができ、例えば−約８０℃、−約３０℃、−約２０℃、約０℃、約４〜８℃、約５℃、約２５℃、約３５℃、約３７℃または約４５℃での保存であることができる。例えば、５℃での９カ月の保存後に抗体の約２％、１．７５％、１．５％、１．２５％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％または０．１％未満が凝集形態で検出される場合には、医薬製剤は安定であるとみなすことができる。２５℃での６カ月の保存後に抗体の約２％、１．７５％、１．５％、１．２５％、１％、０．７５％、０．５％、０．２５％または０．１％未満が凝集形態で検出される場合には、医薬製剤は安定であるとみなすこともできる。４５℃での２８日の保存後に抗体の約４％、３．５％、３％、２．５％、２％、１．５％、１％、０．５％または０．１％未満が凝集形態で検出される場合には、医薬製剤は安定であるとみなすこともできる。−２０℃、−３０℃または−８０℃での３カ月の保存後に抗体の約２％、１．９％、１．８％、１．７％、１．６％、１．５％、１％、０．５％または０．１％未満が凝集形態で検出される場合には、医薬製剤は安定であるとみなすこともできる。
【００７６】
特に、イオン交換中に抗体の主要な画分（「主要な電荷形態」）よりも酸性の画分（「酸性形態」）に移行する抗体の割合を決定することにより安定性を測定することができ、安定性は酸性形態の抗体の画分に反比例する。理論によって拘束されることを望まないが、抗体の脱アミド化により、非脱アミド化抗体と比べて抗体をより負に帯電させ、それにより、より酸性にさせることができる（例えばＲｏｂｉｎｓｏｎ，Ｎ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅａｍｉｄａｔｉｏｎ、ＰＮＡＳ、２００２年４月１６日、９９（８）：５２８３〜５２８８頁を参照）。「酸性化」抗体の割合を、イオン交換クロマトグラフィー（例えば陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー［ＣＥＸ−ＨＰＬＣ］）によって決定することができる。「許容される程度の安定性」はそのフレーズを本明細書で使用する場合、抗体の多くとも５２％が、規定温度での規定量の時間保存後の製剤中において、より酸性形態で検出されることを意味する。ある実施形態では、許容される程度の安定性は、抗体の多くとも約５２％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％が、所与の温度で規定量の時間保存後の製剤中において酸性形態で検出され得ることを意味する。その後に安定性が測定される規定量の時間は、少なくとも２週間、少なくとも２８日間、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間、少なくとも５カ月間、少なくとも６カ月間、少なくとも７カ月間、少なくとも８カ月間、少なくとも９カ月間、少なくとも１０カ月間、少なくとも１１カ月間、少なくとも１２カ月間、少なくとも１８カ月間、少なくとも２４カ月間、またはそれ以上であることができる。安定性を評価する場合に医薬製剤を保存することができる温度は−約８０℃〜約４５℃の任意の温度であることができ、例えば−約８０℃、−約３０℃、−約２０℃、約０℃、約４〜８℃、約５℃、約２５℃または約４５℃での保存であることができる。例えば、−８０℃、−３０℃または−２０℃での３カ月の保存後に抗体の約２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％未満がより酸性形態である場合には、医薬製剤は安定であるとみなすことができる。５℃での９カ月の保存後に抗体の約２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％未満がより酸性形態である場合には、医薬製剤は安定であるとみなすこともできる。２５℃での２８日の保存後に抗体の約３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％また���０．１％未満がより酸性形態である場合には、医薬製剤は安定であるとみなすこともできる。３７℃での２８日の保存後に抗体の約３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％未満がより酸性形態である場合には、医薬製剤は安定であるとみなすこともできる。４５℃での２８日の保存後に抗体の約５２％、５１％、５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％または０．１％未満がより酸性形態で検出され得る場合には、医薬製剤は安定であるとみなすこともできる。
【００７７】
抗体のその標的に対する結合親和性の測定を、安定性の評価に使用することもできる。例えば、規定量の時間（例えば１４日〜６カ月）の間、例えば−８０℃、−３０℃、−２０℃、５℃、２５℃、３７℃、４５℃等での保存後に、製剤中に含有される抗Ａｎｇ−２抗体が、前記保存前の抗体の結合親和性の少なくとも８４％、９０％、９５％またはそれ以上の親和性でＡｎｇ−２に結合する場合には、本発明の製剤は安定であるとみなすことができる。結合親和性を、例えばＥＬＩＳＡまたはプラズモン共鳴等の任意の方法で決定することができる。Ａｎｇ−２活性アッセイにより、例えばＡｎｇ−２を発現する細胞と抗Ａｎｇ−２抗体を含む製剤とを接触させることにより、生物活性を決定することができる。そのような細胞への抗体の結合を、例えばＦＡＣＳ分析により直接的に測定することができる。あるいは、Ａｎｇ−２系の下流の活性を抗体の存在下で測定し、抗体の不存在下でのＡｎｇ−２系の活性と比較することができる。いくつかの実施形態では、Ａｎｇ−２は細胞に対して内因性であることができる。他の実施形態では、Ａｎｇ−２を細胞中において異所的に発現（即ち異種発現）させることができる。
【００７８】
製剤中における抗体の安定性を評価するための更なる方法を下記の実施例で示す。
【００７９】
容器および投与方法
本発明の医薬製剤は、医薬品および他の治療用組成物の保存または投与に適した任意の容器内に含有され得る。例えば、医薬製剤は、規定の体積を有する、密封されたおよび滅菌されたプラスチック容器またはガラス容器内に、例えばバイアル、アンプル、注射器、カートリッジ、ボトルまたはＩＶ袋内に含有され得る。例えば透明のおよび不透明（琥珀色）のガラスバイアルまたはプラスチックバイアル等の、様々なタイプのバイアルが本発明の製剤を含有するために使用され得る。同様に、任意のタイプの注射器が、本発明の医薬製剤を含有するまたは投与するために使用され得る。
【００８０】
本発明の医薬製剤を、「通常のタングステン」注射器または「低タングステン」注射器中に含有させることができる。当業者に認識されるように、ガラス注射器を作製するプロセスでは一般に、ガラスに孔を開けるように機能する熱いタングステンロッドが使用され、それにより、液体を注射器から引き出して排出することができる孔が形成される。このプロセスにより、注射器の内表面上に微量のタングステンが堆積される。その後の洗浄および他の処理工程を、注射器中のタングステンの量を低減させるために使用することができる。本明細書で使用する場合、用語「通常のタングステン」は、注射器が５００十億分率（ｐｐｂ）以上のタングステンを含有することを意味する。用語「低タングステン」は、注射器が５００ｐｐｂ未満のタングステンを含有することを意味する。例えば、低タングステン注射器は、本発明によれば、約４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、３９０、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０未満またはそれ以下のｐｐｂのタングステンを含有することができる。
【００８１】
注射器で使用されるゴムプランジャーとバイアルの開口部を閉じるために使用されるゴム栓とは、注射器もしくはバイアルの医薬内容物のコンタミネーションを防止するために、またはそれらの安定性を保つためにコーティングされ得る。そのため、本発明の医薬製剤は、ある実施形態によれば、コーティングされたプランジャーを含む注射器中に、またはコーティングされたゴム栓で密封されているバイアル中に含有され得る。例えば、プランジャーまたは栓は、フルオロカーボンフィルムでコーティングされ得る。本発明の医薬製剤を含有するバイアルおよび注射器での使用に適した、コーティングされた栓またはプランジャーの例は、例えば米国特許第４，９９７，４２３号；第５，９０８，６８６号；第６，２８６，６９９号；第６，６４５，６３５号；および第７，２２６，５５４号に記載されており、これらの内容の全体を参照によって本明細書に組み入れる。本発明に関して使用され得る特定の例示的なコーティングされたゴム栓およびプランジャーは、Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｌｉｏｎｖｉｌｌｅ、ＰＡ）から入手可能な商品名「ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標）」で市販されている。ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標）は、医薬品のゴム表面への付着を最小化するまたは防止するために使用されるフルオロカーボンコーティングの一例である。
【００８２】
本発明のある実施形態によれば、医薬製剤は、フルオロカーボンがコーティングされたプランジャーを含む低タングステン注射器内に含有され得る。
【００８３】
医薬製剤は、非経口経路、例えば注射（例えば皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内等）または経皮、経粘膜、経鼻、経肺または経口投与によって患者に投与され得る。多数の再使用可能なペンまたはオートインジェクター送達デバイスが、本発明の医薬製剤を皮下に送達するために使用され得る。例として、ＡＵＴＯＰＥＮ（商標）（Ｏｗｅｎ  Ｍｕｍｆｏｒｄ，Ｉｎｃ．、ウッドストック、イギリス）、ＤＩＳＥＴＲＯＮＩＣ（商標）ペン（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、バーグドーフ、スイス）、ＨＵＭＡＬＯＧ  ＭＩＸ７５／２５（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＯＧ（商標）ペン、ＨＵＭＡＬＩＮ７０／３０（商標）ペン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏ．、インディアナポリス、インディアナ州）、ＮＯＶＯＰＥＮ（商標）Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、コペンハーゲン、デンマーク）、ＮＯＶＯＰＥＮ  ＪＵＮＩＯＲ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ、コペンハーゲン、デンマーク）、ＢＤ（商標）ペン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、フランクリンレイクス、ニュージャーシー州）、ＯＰＴＩＰＥＮ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＰＲＯ（商標）、ＯＰＴＩＰＥＮ  ＳＴＡＲＬＥＴ（商標）およびＯＰＴＩＣＬＩＫ（商標）（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ、フランクフルト、ドイツ）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の医薬製剤の皮下送達への適用を有する使い捨てペンまたはオートインジェクター送達デバイスの例として、ＳＯＬＯＳＴＡＲ（商標）ペン（ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＦＬＥＸＰＥＮ（商標）（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）およびＫＷＩＫＰＥＮ（商標）（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）、ＳＵＲＥＣＬＩＣＫ（商標）オートインジェクター（Ａｍｇｅｎ、サウザンドオークス、カリフォルニア州）、ＰＥＮＬＥＴ（商標）（Ｈａｓｅｌｍｅｉｅｒ、シュツットガルト、ドイツ）、ＥＰＩＰＥＮ（Ｄｅｙ，Ｌ．Ｐ．）ならびにＨＵＭＩＲＡ（商標）ペン（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｓ、アボットパーク、イリノイ州）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８４】
本発明の医薬製剤を送達するためのマイクロ注入器の使用も本明細書で考えられる。本明細書で使用する場合、用語「マイクロ注入器」は、長時間（例えば約１０、１５、２０、２５、３０分またはそれ以上）にわたって大量（例えば約２．５ｍＬまたはそれ以上まで）の治療用製剤を徐々に投与するように設計されている皮下送達デバイスを意味する。例えばＵ．Ｓ．６，６２９，９４９；ＵＳ６，６５９，９８２；およびＭｅｅｈａｎら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ４６：１０７〜１１６頁（１９９６）を参照。マイクロ注入器は、高濃度（例えば約１００、１２５、１５０、１７５、２００ｍｇ／ｍＬもしくはそれ以上）でまたは粘性溶液中に含有される大用量の治療用タンパク質の送達に特に有用である。
【００８５】
一実施形態では、医薬製剤はＩＶ点滴により投与され、その結果、製剤は、生理学的に許容される溶液を含有するＩＶ袋中で希釈される。一実施形態では、医薬組成物は、静脈内点滴袋中で配合された無菌調製物であり、その結果、単回用量の医薬品は、１００ｍＬ、２５０ｍＬ（または点滴送達に適した類似の量）の生理学的緩衝液（例えば０．９％生理食塩水）に希釈される。いくつかの実施形態では、点滴袋はポリ塩化ビニル（例えばＶＩＡＦＬＥＸ、Ｂａｘｔｅｒ、ディアフィールド、イリノイ州）製である。いくつかの実施形態では、点滴袋はポリオレフィン（ＥＸＣＥＬ  ＩＶ袋、Ｂｒａｕｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、ベスレヘム、ペンシルバニア州）製である。
【００８６】
医薬製剤の治療的使用
本発明の医薬製剤は、Ａｎｇ−２によって媒介される疾患または障害を含む、Ａｎｇ−２活性に関連する任意の疾患または障害の治療、予防または改善に特に有用である。本発明の医薬製剤の投与によって治療され得るまたは予防され得る例示的で非限定的な疾患および障害として、生物学的過程であり、それにより新しい血管が形成される血管形成を含む様々な疾患が挙げられる。異常な血管形成は、例えば増殖網膜症、リウマチ性関節炎および乾癬を含む、いくつかの病状と関連する。加えて、血管形成が腫瘍の増殖および維持に重要であることが十分に立証されている。
【実施例】
【００８７】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物をどのように構成するかおよび使用するかを当業者に完全に開示するおよび説明するために示され、本発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図しない。使用した数（例えば量、温度等）に関する精度を確実にするように努力したが、多少の実験誤差および偏差を考慮すべきである。特に示さない限り、部はモル部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、および圧力は大気圧または大気圧付近である。
【００８８】
最初の製剤開発の作業に、静脈注射および皮下注射のために生理学的な質量オスモル濃度および低粘度付近を維持しつつタンパク質に適合して該タンパク質の安定性を増大させる賦形剤を特定すべく、経験的な実験、ならびに抗Ａｎｇ−２抗体の液剤および凍結乾燥製剤中における有機共溶媒、熱安定剤および緩衝剤をスクリーニングすることを含めた。最大のタンパク質安定性に最適のｐＨを決定するために、緩衝条件も調べた。
【００８９】
〔実施例１〕
抗Ａｎｇ−２製剤の開発
製剤開発の作業に、タンパク質の安定性を増大させる賦形剤を特定すべく抗Ａｎｇ−２抗体の液剤中における緩衝剤、有機共溶媒および熱安定剤をスクリーニングすることを含めた。最大のタンパク質安定性に最適のｐＨを決定するために、緩衝条件も調べた。これらの調査からもたらされた結果を、臨床用途に適した安定な液剤の開発に使用した。抗Ａｎｇ−２（例えばＨＩＨ６８５Ｐ）を２５±３．７５ｍｇ／ｍｌおよび５０±７．５ｍｇ／ｍｌで製剤化した。一実施形態では、抗Ａｎｇ−２抗体を、１０±１．５ｍＭのヒスチジン（ｐＨ６．０±０．３）、０．２％±０．０３％のポリソルベート２０、１０％±１．５％のスクロースで製剤化する。
【００９０】
〔実施例２〕
緩衝剤およびｐＨ
抗Ａｎｇ−２の安定性へのｐＨおよび緩衝剤のタイプの影響を検討した。２５ｍｇ／ｍＬのＨＩＨ６８５Ｐを４５℃でアセテート（ｐＨ５．０〜５．５）、シトレート（ｐＨ５．５〜６．０）、スクシネート（ｐＨ６．０）、ヒスチジン（ｐＨ５．５〜６．５）、ホスフェート（ｐＨ６．０〜８．０）またはトリス（ｐＨ８．０）のいずれかの緩衝剤中においてインキュベートし、タンパク質の熱安定性への緩衝剤およびｐＨの影響を評価した（表１）。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）によるタンパク質安定性の分析によって、アセテート（ｐＨ５．５）、ホスフェート（ｐＨ６．０）、ヒスチジン（ｐＨ５．５〜６．５）およびスクシネートでは、他の緩衝系よりもＨＩＨ６８５Ｐの製剤化が良好であることが明らかになった。ＨＩＨ６８５ＰをｐＨ６．０においてヒスチジン緩衝剤で製剤化した場合、陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ  ＨＰＬＣ）で決定した場合に最大のタンパク質安定性を観測した。これらの分析により、抗体の分解によって凝集体、切断産物および電荷バリアントの形成が主にもたらされることも明らかとなった。ヒスチジン緩衝剤中ではＨＩＨ６８５Ｐの安定性に最適なｐＨが６．０であることを観測したが、良好な安定性を５．５〜６．５の範囲のｐＨで観測した。これらの結果に基づいて、抗体医薬品（ＤＰ）の製剤化のために、ｐＨ６．０の１０ｍＭのヒスチジン緩衝剤を選択した。
【００９１】
【表１】
2015505539.tif 000002
【００９２】
表１に示す結果に関して、ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標）がコーティングされた４４３２／５０ブチルゴム栓を備える２ｍＬのタイプ１のホウケイ酸塩ガラスバイアル中において、１０ｍＭの試験緩衝剤中の０．３５ｍＬの２５ｍｇ／ｍＬ  ＨＩＨ６８５Ｐを２８日間４５℃で試験した。１濁度を出発物質と比較して４０５ｎｍでのＯＤの相対変化として報告した。２ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＣＥＸ−ＨＰＬＣの出発物質の結果は、１４例全ての製剤に関する出発物質の平均であった。ＯＤ＝光学密度；ＲＰ−ＨＰＬＣ＝逆相高速液体クロマトグラフィー；ＳＥ−ＨＰＬＣ＝サイズ排除高速液体クロマトグラフィー；ＣＥＸ−ＨＰＬＣ＝陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー。
【００９３】
〔実施例３〕
撹拌ストレスに対する保護剤の選択
ＨＩＨ６８５Ｐ抗Ａｎｇ−２抗体（即ち、医薬物質または「ＤＳ」）は、撹拌ストレスに曝される場合に限定された安定性を示した。撹拌したＤＳの濁度分析により、ＨＩＨ６８５Ｐを１２０分にわたってボルテックスした場合に４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）が増加することが明らかになった（表２、共溶媒なしのデータを参照）。濁度のこの増加は、撹拌ストレスの結果としての粒子の著しい形成を示す。共溶媒の不存在下での製剤の撹拌により、凝集体形成の著しい増加ももたらされる。評価した任意の共溶媒を含む製剤では、濁度およびＨＩＨ６８５Ｐの凝集レベルの撹拌依存性の増加が防止された（表２）。しかしながら、０．２％のプルロニックＦ６８、２０％のＰＥＧ３００、１０％のＰＥＧ３００および２０％のプロピレングリコールの製剤への添加により、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＣＥＸ−ＨＰＬＣで決定した場合にＨＩＨ６８５Ｐの熱安定性が著しく減少した（表３）。ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、およびＰＥＧ３３５０を含有する製剤は、ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＣＥＸ−ＨＰＬＣで決定した場合にＨＩＨ６８５Ｐの熱安定性への大きな影響を有さず、これらの共溶媒はＨＩＨ６８５Ｐの製剤に適していた（表３）。ポリソルベート２０を、ＨＩＨ６８５Ｐ製剤の開発のための有機共溶媒として選択した。なぜならば、ポリソルベート２０は撹拌ストレスに対してタンパク質を安定化させ、タンパク質の熱安定性への影響を有さず、ポリエチレングリコールと比べてタンパク質を安定化させるのに必要な共溶媒濃度が低いからであった。
【００９４】
表２に示す抗体安定性の結果に関して、ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標）がコーティングされた４４３２／５０ブチルゴム栓を備える２ｍＬのタイプ１のホウケイ酸塩ガラスバイアル中において、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０〜６．１中の０．８ｍＬの５ｍｇ／ｍＬ  ＨＩＨ６８５Ｐを有機共溶媒と組み合わせ、１２０分間ボルテックスした。１濁度を出発物質と比較して４０５ｎｍでのＯＤの相対変化として報告した。２ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＣＥＸ−ＨＰＬＣの出発物質の結果は、９例全ての製剤に関する出発物質の平均であった。ＯＤ＝光学密度；ＲＰ−ＨＰＬＣ＝逆相高速液体クロマトグラフィー；ＳＥ−ＨＰＬＣ＝サイズ排除高速液体クロマトグラフィー。
【００９５】
【表２】
2015505539.tif 000003
【００９６】
【表３】
2015505539.tif 000004
【００９７】
表３に示す抗体安定性の結果に関して、ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標）がコーティングされた４４３２／５０ブチルゴム栓を備える２ｍＬのタイプ１のホウケイ酸塩ガラスバイアル中において、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０〜６．１中の０．３５ｍＬの５ｍｇ／ｍＬ  ＨＩＨ６８５Ｐを有機共溶媒と組み合わせ、２８日間４５℃に曝した。１濁度を出発物質と比較して４０５ｎｍでのＯＤの相対変化として報告した。２ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＣＥＸ−ＨＰＬＣの出発物質の結果は、９例全ての製剤に関する出発物質の平均であった。ＯＤ＝光学密度；ＲＰ＝逆相高速液体クロマトグラフィー；ＳＥ＝サイズ排除高速液体クロマトグラフィー；ＣＥＸ＝陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー。
【００９８】
〔実施例４〕
熱的ストレスに対する保護剤の選択
安定剤、例えば糖、アミノ酸および無機塩のＨＩＨ６８５Ｐの熱安定性を向上させる能力を調べた。調べた熱安定性の要約を表４に示す。２０％のスクロース、１０％のマンニトールおよび２０％のトレハロースを含有する製剤では、熱的ストレス後にＳＥ−ＨＰＬＣおよびＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析で決定した場合にＨＩＨ６８５Ｐ分解は最小量であった。しかしながら、マンニトールを含む製剤では、複数回の凍結融解サイクルに対するタンパク質が弱体化した。スクロースまたはトレハロースを含む製剤の場合、ＨＩＨ６８５Ｐは熱的ストレスに対して同様の安定性を有した。スクロースを、液状のＨＩＨ６８５Ｐ製剤の開発のための熱安定剤として選択した。
【００９９】
ｐＨ６．０においてヒスチジン、ポリソルベート２０およびスクロースの存在下で製剤化した場合、ＨＩＨ６８５Ｐは最大の安定性を示した。等浸透圧に近い１０％のスクロースをＨＩＨ６８５Ｐ  ＤＰ製剤用に選択した。ＨＩＨ６８５Ｐ液剤の開発中に確認した主な分解経路は、凝集体、切断産物および電荷バリアントの形成であり、タンパク質を４５℃でインキュベートした場合に最高の分解率（電荷バリアントの増加）を観測した。
【０１００】
表４に示す抗体安定性の結果に関して、ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標）がコーティングされた４４３２／５０ブチルゴム栓を備える２ｍＬのタイプ１のホウケイ酸塩ガラスバイアル中において、０．３５ｍＬの１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０〜６．２、０．２％のポリソルベート２０および２５ｍｇ／ｍＬのＨＩＨ６８５Ｐ、更に示した熱安定剤を２８日間４５℃に曝した。１濁度を出発物質と比較して４０５ｎｍでのＯＤの相対変化として報告した。２ＳＥ−ＨＰＬＣおよびＣＥＸ−ＨＰＬＣの出発物質の結果は、４５℃でインキュベートしていない１０例全ての製剤に関する出発物質の平均値を表す。ＯＤ＝光学密度；ＲＰ＝逆相高速液体クロマトグラフィー；ＳＥ＝サイズ排除高速液体クロマトグラフィー；ＣＥＸ＝陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー。
【０１０１】
【表４】
2015505539.tif 000005
【０１０２】
〔実施例５〕
安定した液状の医薬製剤
結論として、ＨＩＨ６８５Ｐ  ＤＰを、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０、０．２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０、１０％（ｗ／ｖ）のスクロースおよび２５ｍｇ／ｍＬのＨＩＨ６８５Ｐを含有する、最適化した水性緩衝化製剤中における液体として製造した。ＨＩＨ６８５Ｐ  ＤＰは、様々なストレス条件に曝した場合に２５ｍｇ／ｍＬで物理的におよび化学的に安定であった（表５）。ＤＰを複数回ボルテックスし、凍結し、および融解した場合に、または１４日わたり２５℃でインキュベートした場合に、ｐＨ、外観、濁度、または回収したＨＩＨ６８５Ｐの量への影響はなかった。３７℃での２８日のインキュベーション後に、ＤＰは、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析で決定した場合に、ストレスをかけていないサンプルである対照と比べて０．６％以上分解し、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析で決定した場合に１０．１％以上分解した（％主要ピークにおける低下）。４５℃での２８日のインキュベーション後に、ＤＰは、ＳＥ−ＨＰＬＣ分析で決定した場合に、ストレスをかけていない対照と比較して３．６％以上分解し、ＣＥＸ−ＨＰＬＣ分析で決定した場合に２３．８％以上分解した（％主要ピークにおける低下）。任意のストレスをかけたサンプルに関しては、以下に記載するＨＩＨ６８５Ｐ結合アッセイを使用して決定した場合に力価の著しい低下を観察しなかった。
【０１０３】
【表５】
2015505539.tif 000006
【０１０４】
競合サンドイッチＥＬＩＳＡ（結合アッセイ）を用いて、ヒトＴｉｅ２−マウスＦｃ融合タンパク質（ｈＴｉｅ２−ｍＦｃ）でコーティングしたプレートへのヒトアンジオポエチン２−Ｈｉｓタグ融合タンパク質（ｈＡｎｇ２−Ｈｉｓ）の結合を遮断するＨＩＨＰ６８５Ｐの能力を測定することにより、製剤化したＨＩＨ６８５Ｐの力価を決定した。ｈＡｎｇ２−Ｈｉｓを様々な量のＨＩＨ６８５Ｐで滴定した。単量体の分子量を５０．１ｋＤａと仮定して、ｈＡｎｇ２−Ｈｉｓ濃度を算出した。リガンド−抗体複合体を２５℃で１時間インキュベートした後に、ｈＴｉｅ−ｍＦｃでコーティングしたマイクロタイタープレートに移した。１時間のインキュベーション後にウェルを洗浄し、結合したｈＡｎｇ２−Ｈｉｓを、ＨＲＰがコンジュゲートした抗Ｈｉｓタグモノクローナル抗体で検出した。Ｔｉｅ２−ｍＦｃへのＨｉｓタグｈＡｎｇ２の５０％を遮断するのに必要な抗体の濃度として定義される、算出したＩＣ５０値を遮断力価の指標として使用した。
【０１０５】
表５に示す抗体安定性の結果に関して、ＦｌｕｒｏＴｅｃ（登録商標）がコーティングされた４４３２／５０ブチルゴム栓を備える２ｍＬのタイプ１のホウケイ酸塩ガラスバイアル中において、０．３５ｍＬの１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ６．０〜６．１、０．２％のポリソルベート２０、１０％のスクロースおよび２５ｍｇ／ｍＬのＨＩＨ６８５Ｐを有機共溶媒と組み合わせ、示した様々なストレスに曝した。１濁度を出発物質と比較して４０５ｎｍでのＯＤの相対変化として報告した。２結合アッセイに関する合格基準は、参照標準の５０〜１５０％であった。ＯＤ＝光学密度；ＲＰ＝逆相高速液体クロマトグラフィー；ＳＥ＝サイズ排除高速液体クロマトグラフィー；ＣＥＸ＝陽イオン交換高速液体クロマトグラフィー。
【０１０６】
〔実施例６〕
製剤化した抗Ａｎｇ−２抗体の安定性
２５ｍｇ／ｍＬの抗体、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０±０．３、０．２％のポリソルベート２０および１０％のスクロースを含有する抗Ａｎｇ−２抗体製剤の保存安定性およびストレス安定性の両方を決定するために、安定性の調査を行った。濁度およびＲＰ−ＨＰＬＣアッセイを使用して、抗体の物理的安定性を評価した。物理的安定性を、溶液中における可溶形態の抗Ａｎｇ−２抗体の回収率として定義する。タンパク質の喪失は、タンパク質の沈殿または表面吸着を起因とする可能性があった。溶液中における粒子の存在は、外観検査により、または４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ）測定（濁度測定）により検出され得る。この後者のアッセイにおいて、ＯＤの増加は、粒子の形成に起因する濁度の増加を示す。ＯＤ測定により決定した場合の粒子の存在は、サンプルが安定性を維持することができなかったことを示す。抗体の回収率をＲＰ−ＨＰＬＣで測定した。ＲＰ−ＨＰＬＣアッセイにおいて、抗Ａｎｇ−２抗体は、単一のピークとして逆相カラムから溶出される。各試験サンプルの濃度を、規定のタンパク質負荷の抗体標準を使用して生成した校正曲線と比較した、溶出した抗体ピークの面積から決定する。
【０１０７】
化学的安定性は、サンプル中における抗Ａｎｇ−２抗体の化学構造の完全性に関する。ほとんどの化学的不安定性は、抗体の共有結合的に修飾された形態（例えば共有結合凝集体、切断産物または電荷バリアント）および抗体の非共有結合的に修飾された形態（例えば非共有結合集合体）の形成に起因する可能性がある。これまで、検出されているＨＩＨ６８５Ｐの分解産物のみが分子量または電荷のいずれかで異なる種である。分子量がより高いおよびより低い分解産物を、ＳＥ−ＨＰＬＣにより天然抗体から分離することができる。サイズ排除クロマトグラフィー法における天然の割合を、全ての抗Ａｎｇ−２抗体のピークの総面積に対する天然ピークの面積の比により決定する。
【０１０８】
抗Ａｎｇ−２抗体の電荷バリアント形態を、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して天然抗体から分離した。主要ピークの保持時間よりも早い保持時間でＣＥＸ−ＨＰＬＣカラムから溶出したピークを「酸性ピーク」と分類し、主要ピークの保持時間よりも遅い保持時間でＣＥＸ−ＨＰＬＣカラムから溶出したピークを「塩基性ピーク」と分類した。陽イオン交換クロマトグラフィー法における分解した抗Ａｎｇ−２抗体の割合を、全ての抗Ａｎｇ−２抗体のピークの総面積と比較した主要ピーク、酸性ピークおよび塩基性ピークの面積の相対的な割合の変化により決定する。
【０１０９】
抗体に様々なストレス試験を行うことにより、加速条件下で抗体の評価を実施した。これらの試験は、製剤化した医薬物質が製造、保存または医薬物質の輸送の間に曝される可能性がある極端な取り扱い条件を表す。凝集条件、凍結／融解のサイクル条件、および凍結保存条件用に、製剤化した抗Ａｎｇ−２抗体を５ｍＬのポリカーボネートバイアルに充填した。製剤化した抗体をガラスバイアルに充填し、高温でのストレス安定性を試験した。
【０１１０】
〔実施例７〕
保存安定性
−８０℃、−３０℃、−２０℃および５℃で６カ月にわたっておよび５℃で９カ月にわたって保存した場合に、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０±０．３、０．２％のポリソルベート２０および１０％のスクロースを含有する２５ｍｇ／ｍＬのＨＩＨ６８５Ｐ抗体製剤の物理的安定性および化学的安定性に変化を観測しなかった。−８０℃、−３０℃および−２０℃での６カ月において、結合活性（上記に記載したＥＬＩＳＡ競合アッセイ）のわずかな減少、即ち、それぞれベースラインの約８６％、約８４％および約９１％を観測した。表６を参照。
【０１１１】
〔実施例８〕
ストレス安定性
製剤に撹拌、熱的ストレス（４５℃、３７℃、２５℃）および凍結融解ストレスをかけることにより、１０ｍＭのヒスチジン、ｐＨ６．０±０．３、０．２％のポリソルベート２０、１０％のスクロース中で製剤化した２５ｍｇ／ｍＬの抗Ａｎｇ−２抗体（ＨＩＨ６８５Ｐ）のストレス安定性を判断した。０．３５ｍＬの製剤を、ＦｌｕｒｏＴｅｃがコーティングされた４４３２／５０ブチルゴム栓が取り付けられている２ｍＬのタイプ１のホウケイ酸塩ガラスバイアルに充填した。結果を表７に示す。
【０１１２】
〔実施例９〕
分子質量の決定
一連の分析技術、生化学技術および生物物理学技術を使用して、製剤化したＨＩＨ６８５Ｐ抗体の特性を明らかにした。還元条件下でのキャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）分析後に、グリコシル化されたＨＩＨ６８５Ｐ抗体サンプルおよび脱グリコシル化されたＨＩＨ６８５Ｐ抗体サンプルの重鎖および軽鎖の分子量を決定した。サンプルを、０．５％ｗ／ｖのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および４０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）中において６０℃で１０分間変性させた。変性および還元後に、１×Ｇ７緩衝液ｖ／ｖ（１％のノニデット４０および５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．５）をサンプルに添加した。ＨＩＨ６８５Ｐ（５０μｇ）の脱グリコシル化を、１２５０単位のペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ）の添加および３７℃での３時間インキュベーションにより完了した。未処理の対照サンプルを、３時間のインキュベーションからＰＮＧａｓｅ  Ｆ酵素を省略した以外は同じように調製した。サンプルをインキュベーション後に脱塩し、ＣＥ−ＳＤＳ分析を妨げる可能性がある反応緩衝液の成分を除去した。脱塩したサンプルを、１％ｗ／ｖのＳＤＳおよび４．５％ｗ／ｖのβ−メルカプトエタノール中で完全に変性させ、８０℃で１０分間インキュベートした。１０ｋＤａ分子量標準（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を各サンプルに添加して内部標準として使用し、ピークの実体を決定し、およびタンパク質移動度を算出した。
【０１１３】
【表６】
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【０１１４】
ＨＩＨ６８５Ｐ未処理の対照サンプルの電気泳動図において３つの主なピークを観測した。ピーク１は、約２８ｋＤａ（３４．０〜３４．１％総ピーク面積）の算出した分子量を有する、還元した軽鎖を表す。ピーク２および３は、グリコシル化していない重鎖（約５１ｋＤａ；３．１〜３．８％）およびグリコシル化された重鎖（約５６ｋＤａ；６２．２〜６２．８％総ピーク面積）をそれぞれ表す。重鎖および軽鎖の合計（ピーク１、２および３）は、両方のＨＩＨ６８５Ｐロットサンプルに関してこの方法により検出したピークの全割合の９９％以上を占める。
【０１１５】
【表７】
2015505539.tif 000008
【０１１６】
ＰＮＧａｓｅ  Ｆで試験したサンプルでは、各電気泳動図においてピーク３の強度が実質的に低下すると共にピーク２の強度が同時に増加し、これは、グリコシル化された重鎖由来のグリカン鎖の除去を示す。ＰＮＧａｓｅ  Ｆで処理したＨＩＨ６８５Ｐロットサンプルのキャピラリー電気泳動後に生成した電気泳動図からのピーク２の平均的な補正ピーク面積の割合（６６％）は、対照であるＰＮＧａｓｅ  Ｆで未処理のサンプルのキャピラリー電気泳動後に生成した電気泳動図からのピーク２および３の主要ピークの面積割合の合計（６６％）と等しく、これは、ＰＮＧａｓｅ  Ｆインキュベーション後の重鎖の完全な脱グリコシル化を示す。予測したように、軽鎖の分子量および相対的な移動時間は変化しなかった。
【０１１７】
多角レーザー光散乱（ＭＡＬＬＳ）は、タンパク質または糖タンパク質の分子質量の推定値を提供する分析法である。光散乱検出器のフローセルとゲルろ過カラムとを接触させ、分離した医薬物質成分それぞれの分子質量分析を可能にすることにより（ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ）、天然のＨＩＨ６８５Ｐの分子質量を分析した。タンパク質濃度を示差屈折率検出器および吸光度検出器でモニタリングした。製剤化したＨＩＨ６８５Ｐロットサンプルを、ＴＳＫ  Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ０８５４１；カラム寸法０．７８ｃｍ×３０ｃｍ、５μｍ粒径、および２５０Åの空隙率）上に直接注入し、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．１緩衝液（ＳＥＣ緩衝液）で予備平衡化した。高イオン強度の移動相緩衝液に対して補正した比屈折率増分（タンパク質濃度の変化で除される屈折率の変化（ｄｎ／ｄｃ）として定義される）を使用して、Ａｓｔｒａソフトウェア（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でデータを分析した。ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析により、ＨＩＨ６８５Ｐに関する主要ピーク（ピーク４、約７．９ｍＬの溶出体積）は、約１５１ｋＤａの分子量に相当した。主要ピーク（ピーク４）に関して特定したモル質量は無傷の抗Ａｎｇ−２抗体に相当し、該抗Ａｎｇ−２抗体は、溶液中に存在する主な種であった（総タンパク質ピーク面積の９６．１〜９６．９％）。非常に少ない割合の、ピーク２（約６．２ｍＬの溶出体積）およびピーク３（６．５ｍＬの溶出体積）に相当する２つの高分子量種と、ピーク５（約８．４ｍＬの溶出体積）およびピーク６（約９．８ｍＬの溶出体積）に相当する２つの低分子量種とを、試験した全ての製剤化したＨＩＨ６８５Ｐサンプルで検出した。約３００ｋＤａのピーク３（約６．５ｍＬの溶出体積）から算出したモル質量はＨＩＨ６８５Ｐ抗体の二量体形態と一致し、溶液中に存在する抗体の分子量形態全体のごく一部（１．５〜１．９％）を占める。ピーク５（約８．４ｍＬの溶出体積）に関して算出した分子量は約６６ｋＤａであり、サンプル中に存在する分子量形態全体の１．５％以下を占める。ピーク６は、ピーク面積全体の約０．２〜０．３％を占める。ＨＩＨ６８５Ｐ医薬物質のＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ分析の結果から、大部分のタンパク質が、平均モル質量が約１５１ｋＤａである無傷の抗体として存在することが実証された。
【０１１８】
製剤化したＨＩＨ６８５Ｐの独立したロットを更に分析し、質量測定により無傷のタンパク質の分子量を確認した。各タンパク質サンプル１．５μｇを、質量測定用のＷａｔｅｒｓ  Ｓｙｎａｐｔ質量分析計に接続した１．７μｍのＢＥＨ１３０  Ｃ１８カラム上に注入した。１１回反復する最大エントロピーアルゴリズムを使用して、無傷のタンパク質に関してＥＳＩ−ＴＯＦマススペクトルをデコンボリュートした（ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｅｄ）。ＨＩＨ６８５Ｐの重鎖ｃＤＮＡ配列および軽鎖ｃＤＮＡ配列に基づいて、無傷の抗体（重鎖のＣ末端Ｌｙｓが除去されている）は１４４６０４．４Ｄａの分子量を有すると予測した。複数の無傷のＨＩＨ６８５Ｐロットのデコンボリュートしたマススペクトルは同様のパターンを示し、各スペクトルは１４６ダルトン（フコース）または１６２ダルトン（ガラクトース）のいずれかの質量だけ異なる多重ピークを含有しており、グリコシル化関連の微不均一性の存在を示唆している。予測した分子量１４４６０４．４を観測した無傷の質量から減じることにより、これらのグリカン質量を得た。例えば、２番目のＥＳＩ／ＭＳピークのｍ／ｚは１４７４９３Ｄａであり、無傷なモノクローナル抗体の分子量１４４６０４．４Ｄａを減じるとグリカン質量２８８９Ｄａとなる。グリカンはＦｃの両側上に付加されることから、グリカン質量は１４４５Ｄａのはずである。
【０１１９】
これらのグリカン質量を使用して、主要なＨＩＨ６８５Ｐのグリカン構造形態を特定した。分析により、これらのグリカンは、グリカン鎖末端で０個、１個および２個のガラクトースを有するフコシル化複合体の二分岐構造（ｂｉ−ａｎｔｅｎｎａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）で主に構成されていることが明らかとなった。タンパク質のアミノ酸配列に関する予測した質量と観測した質量との間の質量差（４ダルトン）は、Ｓｙｎａｐｔ  ＭＳの質量精度の仕様内であった。これらの結果から、一次配列レベルでのＨＩＨ６８５Ｐの実体を確認した。
【０１２０】
〔実施例１０〕
等電点の決定
天然条件下での一次元等電点電気泳動（ＩＥＦ）によりＨＩＨ６８５Ｐを分析し、無傷の抗体の等電点（ｐＩ）を決定した。タンパク質のバンドがコロイダルブルー染色により視覚化されている一連のｐＩ標準を本調査に含めた。ＨＩＨ６８５Ｐの全てのサンプル調製物は、８．２のｐＩを有する主な形態を含む、７．９および８．４のｐＩの間で移動する様々な強度の合計８つのバンドを示した。約８．２のｐＩでのバンド移動は、無傷の抗体に関して予測した８．６のｐＩよりもわずかに低いｐＩを示した。この主要なバンドは、Ｃ末端リシンを欠失している、完全にグリコシル化された無傷の抗体（８．５４の予測ｐＩ）を表す可能性が最も高い。この解釈は、タンパク質分解および逆相分離後の重鎖のマススペクトロメトリー分析と一致する。マススペクトロメトリー分析では、ＨＩＨ６８５Ｐの重鎖由来の主なＣ末端ペプチドが、ｃＤＮＡ配列から存在すると予測される末端リシン残基を欠失していることを観測した。３つの主要ではない塩基性バリアント（８．３〜８．４のｐＩ範囲に相当する）を観測した。理論によって拘束されることを望まないが、これらの主要ではない種は、抗体の部分形態、例えば重鎖二量体のみを有する抗体形態（８．９の予測ｐＩ）、または１つもしくは２つのＣ末端リシンを欠失している重鎖二量体を表す可能性がある。あるいは、これらの種は、１つまたは２つのＣ末端リシンを含有する無傷の抗体の少量の電荷バリアント形態と一致する可能性がある。この解釈は、トリプシン消化および逆相クロマトグラフィーによるペプチドの分離後の重鎖のマススペクトロメトリー分析と一致する。マススペクトロメトリーにより、ＨＩＨ６８５Ｐの重鎖の約２．５％がＣ末端リシンを含有することを確認した。
【０１２１】
ＨＩＨ６８５Ｐ由来の天然の単量体形態のカッパ軽鎖のｐＩは６．４であると予測する。用いた条件下において６．４のｐＩに相当するバンドは検出されず、たとえあったとしても、製剤化したＨＩＨ６８５Ｐ調製物中に存在するフリーの軽鎖は最小量であることを示唆する。現在は未確認ではあるが、主なバンド（７．９〜８．１のｐＩ範囲に相当する）に対してより酸性のｐＨに移動した４つの更なる主要ではないバンドが、試験した全てのサンプルに存在しており、該バンドは、脱アミド化形態を有するグリコシル化された無傷の抗体、誤って形成された分子間ジスルフィド結合、または少量の切断形態の抗体を表すと推測され得る。
【０１２２】
キャピラリー電気泳動を使用する等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）に基づく方法により、製剤化したＨＩＨ６８５Ｐの電荷不均一性も定量的に評価した。本調査に関しては、各ＨＩＨ６８５Ｐサンプルを、３９ｍＭのアルギニン、２．３ｍＭのイミノ二酢酸および３−１０Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１２μＬ）を含有するｃＩＥＦゲル（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ｃａｔ４７７４９７）中で０．４ｍｇ／ｍＬ（１００μｇ）に希釈した。様々な強度の合計７つのピークを７．７７〜８．４８の範囲で観測した。ｃＩＥＦで観測した産物関連のピークのｐＩ範囲は、キャピラリーの分解能の増加に起因して、ゲルをベースとする等電点電気泳動法（７．９〜８．４のｐＩ範囲）で観測したｐＩ範囲よりもわずかに大きい。試験した各ＤＳロットの電気泳動図から、非常に類似した定性的なピークパターンを観測した。全ピーク面積の約９２〜９３％を占める合計４つの主要なピーク（ピーク４〜７）が存在した。理論によって拘束されることを望まないが、これらのピークは、Ｃ末端リシンを欠失している無傷の抗体、抗体の切り詰められた形態もしくは部分的形態、抗体の非共有結合性の無傷な形態、または誤って形成されたジスルフィドを有する形態を表す可能性がある。これらのピークの内のいくつかは、サンプルの調製中に、または用いた電気泳動条件下で現れ得る可能性がある。ピーク４は、ｐＩが約８．１であり、および試験した２つの製剤化ＨＩＨ６８５Ｐサンプルロットのそれぞれに関して平均ピーク面積割合が５７．５％および５３．４％である主な電荷バリアント種を表す。
【０１２３】
ＨＩＨ６８５Ｐ製剤化抗体の電荷不均一性を更に調べるために、いくつかのサンプルを２次元ゲル電気泳動で分析した。２次元ゲル法に関しては、タンパク質を還元し、次いで等電点電気泳動を使用する第１の次元中において電荷に基づいて分離した。その後、還元条件下で行うＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用し、分子量に基づく第２の次元中において、分離した荷電種を更に分解した。還元したＨＩＨ６８５Ｐサンプル（２μｇ）をそれぞれ、Ｂｉｏ−Ｒｅｄ  ２−Ｄ  ｐＩ標準の存在下または不存在下で、第１の次元中での分析用のｐＨ３〜１０に固定したｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ上に負荷した。等電点電気泳動後に、ＩＰＧストリップを、第２の次元での分析用の４〜２０％のＮｏｖｅｘトリスグリシンゲル上に負荷した。第２の次元を分子量標準の存在下で作動させた。加えて、一連の既知のｐＩの内部標準を等電点電気泳動分析に含めた。全てのタンパク質をクーマシーブルー染色で可視化した。２−Ｄゲル電気泳動およびタンパク質のスポット分析後に、全てのＨＩＨ６８５Ｐロットサンプルは、おそらく重鎖の同等の不均一性に起因する同様の電荷バリアント種の存在により類似のスポットパターンを示した。おおよそ５５ｋＤａの質量に相当する合計３つのＨＩＨ６８５Ｐ関連スポットをゲル中に観測し、１つは約８．２に相当するｐＩを示す非常に多量な形態である。このスポット（約８．２のｐＩ）は、マススペクトロメトリー分析で検出した、Ｃ末端リシンを欠失している、還元およびグリコシル化した重鎖ポリペプチドと一致する。２−Ｄゲルで検出した２つの未同定の主要ではないスポットは、約ｐＨ７．５〜８．０の間で等電点を示した。１つの理論的なシナリオでは、これらのスポットは、アッセイ依存性の脱アミド化タンパク質形態または重鎖の切り詰められた形態から成る可能性がある。あるいは、サンプル処理またはゲルの人工産物はスポット拡散を引き起こしている可能性があり、様々な等電点の更なる主要ではないスポットの出現をもたらしている可能性がある。
【０１２４】
予測したように、ＨＩＨ６８５Ｐの軽鎖は、分子量が約２５ｋＤａである約６．０のｐＩに相当する単一の主要なスポットとして２Ｄゲル内に移動した。分子量が約２５ＫＤａである未同定の主要ではないスポット（約５．８のｐＩ）も観測した。このスポットは、わずかな割合の脱アミド化軽鎖を表す可能性があり、マススペクトロメトリー分析でも検出された。
【０１２５】
〔実施例１１〕
翻訳後修飾
ほとんどのＩｇＧ１抗体と同様に、ＨＩＨ６８５Ｐの重鎖は、タンパク質の発現中に未特定の塩基性カルボキシペプチダーゼによる除去を受けやすいＣ末端Ｌｙｓ残基を有する、予想したアミノ酸配列Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓで終結する。末端Ｌｙｓの部分的除去により、抗体医薬物質内の電荷不均一性がもたらされる可能性があった。還元したＨＩＨ６８５Ｐのペプチドマッピング分析から、トリプシンペプチド中の大部分のＣ末端Ｌｙｓ４５２残基が重鎖から除去され、４４５ＳＬＳＬＳＰＧ４５１（配列番号５３２）の配列を有するＣ末端ペプチドとなることを確認した。Ｃ末端Ｌｙｓ残基を含有する非常に小さい割合のトリプシンペプチド（４４５ＳＬＳＬＳＰＧＫ４５２；配列番号５３３）をトリプシンマップで観測した。ＨＩＨ６８５Ｐの各ロット由来の２つのトリプシンＣ末端重鎖ペプチドの積分したピーク面積に基づくと、毒性ロットおよび臨床ロットにおいて、ＨＩＨ６８５Ｐ抗体の重鎖の約１．０％および１．５％がＣ末端Ｌｙｓ４５２をそれぞれ含有した。
【０１２６】
アスパラギンの非酵素的な脱アミド化は、抗体中で頻繁に観測される別の一般的な修飾である。加水分解後にスクシンイミド中間体の形成を経て起こる脱アミド化により、イソアスパラギン酸塩およびアスパラギン酸塩が形成される。各脱アミド化事象により、１つの付加的な負の電荷が抗体に導入されて電荷不均一性が生じる。一次アミノ酸配列内におけるグリシンまたはセリンを伴うアスパラギン残基は、タンパク質内での脱アミド化に特に最も敏感な部位である。ＨＩＨ６８５Ｐでは、重鎖中の２つのアスパラギン残基（Ａｓｎ３２０およびＡｓｎ３８９）の直後にグリシン残基があり、従って、重鎖中の２つのアスパラギン残基は脱アミド化の候補部位である。マススペクトロメトリー分析により、任意のＨＩＨ６８５Ｐサンプルロットにおいて、わずかな脱アミド化がＡｓｎ３２０で起きたことが示された。収束質量分析により、ピーク５３として溶出したペプチド内でＡｓｎ３８９が同定されることが明らかとなった。Ａｓｎ３８９の脱アミド化形態を含有するペプチドがピーク５２内に溶出した。ピーク５２内の他の共溶出ペプチドのために、ＵＶシグナルに基づく脱アミド化の相対量の定量分析を得ることは不可能であった。しかしながら、マススペクトルからの強度を使用して、ＨＩＨ６８５Ｐのいずれかのロットにおける脱アミド化Ａｓｎ３８９の相対割合が２％未満であることを決定した。ＨＩＨ６８５Ｐの還元したペプチドマップでは、マススペクトロメトリー分析はまた、セリンを伴うアスパラギン９４の天然形態を含有する軽鎖のトリプシンペプチドとしてピーク４９を同定した。軽鎖由来のＡｓｎ９４の脱アミド化形態を含有する等価のペプチドも同定した（ピーク４８）。これらの２つのピークの積分により、毒性ロットおよび臨床ロットの両方において、このアスパラギンの全量の約４．２％が脱アミド化形態で存在することが明らかとなった。軽鎖のアスパラギン９４を、ＨＩＨ６８５Ｐにおける脱アミド化の最終産物を示す唯一のＡｓｎ−Ｓｅｒ含有ペプチドとして同定した。軽鎖のＡｓｎ９４は、３番目の相補性決定領域（ＣＤＲ）内に位置する。ペプチドマッピングサンプルの調製に使用した構造的な破壊条件のために、Ａｓｎ９４で観測した脱アミド化はトリプシン消化手順中に生じている可能性を排除することができない。任意の他のアスパラギン残基では、脱アミド化を任意の観測可能なレベルまで観測しなかった。本結果は、アスパラギンの脱アミド化がＨＩＨ６８５Ｐの産生中に任意の検出可能なレベルまで生じると予測されないことを示唆する。
【０１２７】
ＨＩＨ６８５Ｐの安定性および活性に潜在的に影響を与える可能性がある、表面メチオニン残基の酸化の可能性も調べた。ＨＩＨ６８５Ｐは、重鎖内に位置する３つのメチオニン残基を含有する。いくつかのメチオニン残基は、それらを酸化され易くする抗体の表面上に位置することが予測される。メチオニン側鎖のスルフィド形態への酸化により、側鎖質量が１６ダルトンまで増加し、および側鎖がより極性になる。メチオニン含有ペプチドに集中した広範な質量データ分析により、試験したＨＩＨ６８５Ｐの任意のロットでは任意の３つのメチオニン残基に酸化はないことが明らかとなり、このことは、発現プロセスおよび精製プロセスならびに医薬物質の保存条件はタンパク質の化学的変化もたらさないことを示唆する。
【０１２８】
〔実施例１２〕
グリコシル化パターン
グリコシル化は、抗体の分子質量不均一性をもたらす可能性がある主要な翻訳後修飾である。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ抗体は、重鎖定常領域（Ｆｃドメイン）内に位置する単一の基準アスパラギン結合（Ｎ−結合）グリコシル化部位を含有する。還元したＨＩＨ６８５Ｐトリプシンマップの分析により、Ｆｃドメイン由来の２つのトリプシンペプチドに対応する２つの糖ペプチドを同定した（２９８ＥＥＱＦＮＳＴＹＲ３０６（配列番号５３４）および２９４ＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲ３０６（配列番号５３５）のアミノ酸配列）。ＭＳ分析に基づいて、これらの糖ペプチドに関する主要なグリカン形態を解明し、表８にまとめる。糖ペプチドの質量分析により、ＨＩＨ６８５ＰのＮ結合糖は、グリカン鎖末端でコアフコースおよび０個、１個または２個のガラクトース残基を有する、二分岐構造体である複合体から主に構成されることが明らかになった。これらの構造は、哺乳動物の細胞から発現される組み換え抗体で発見されている典型的なグリカン形態と一致する。ＬＣ／ＭＳ分析により、Ｆｃグリコシル化部位（Ａｓｎ３０２）を含有するがグリカンの占有が不足しているペプチドも明らかになった（ピーク１８およびピーク２３）。ＵＶクロマトグラムにおけるピーク面積の積分により、ＦｃでのＮ結合部位の４．８％および５．２％が毒性ロットおよび臨床ロットにおいてグリカン占有をそれぞれ示さないことが明らかになった。これらの結果は、キャピラリー電気泳動分析と一致する。トリプシンマップから生成した各ペプチドのＭＳ分析から、ＨＩＨ６８５Ｐは、ＨＩＨ６８５Ｐ抗体分子内の他のＮ結合またはＯ結合グリコシル化部位を有さないことが明らかになる。
【０１２９】
【表８】
2015505539.tif 000009
【０１３０】
【表９】
2015505539.tif 000010
【０１３１】
【表１０】
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【０１３２】
ａカラム１：クロマトグラフィーのピーク数に対応するピーク数。ｂカラム２：各ペプチドピークの保持時間（分）。ｃカラム３：ＨＩ６８５Ｐ配列内のペプチドの位置。ＨおよびＬは、ＨＩＨ６８５Ｐの重鎖および軽鎖内に位置する配列をそれぞれ示す。ｄカラム４：ＬＣ／ＭＳおよびＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析から実験的に決定したペプチド質量。ｅカラム５：ＨＩＨ６８５Ｐ配列のアミノ酸配列内での予測したトリプシン消化切断部位から算出した理論的ペプチド質量。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2015505539.tif 000014
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