(57)【要約】本発明は、胃癌と関連する生物学的マーカーを提供する。特に本発明は、対象における胃癌（ＧＣ）の診断方法を提供し、この方法は、１つ又は複数のタンパク質が、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される、対象における１つ又は複数のタンパク質の発現レベルを測定する工程、対象におけるタンパク質又はそれぞれのタンパク質の発現レベルを、タンパク質又はそれぞれのタンパク質の基準発現レベルと比較する工程、及び前記比較に基づいて対象におけるＧＣを診断する工程を含む。胃癌と関連する生物学的マーカーの同定に基づき、本発明はまた、対象が胃癌の発症に感受性を有するかどうかの判定方法、対象における胃癌の進行の評価方法、対照における胃癌の治療に有用な候補治療剤のスクリーニング方法、及び対象における胃癌の診断のためのキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１つ又は複数のバイオマーカーが、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される、対象における前記１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程、
（ｂ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する工程、及び
（ｃ）前記比較に基づいて対象におけるＧＣを診断する工程
を含む、対象における胃癌（ＧＣ）の診断方法。
【請求項２】
１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルが対象から得られる検体中で測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
検体が血清検体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程が検体中のバイオマーカータンパク質のレベルを測定する工程を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
検体が組織検体である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程が検体中のバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを測定する工程を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
バイオマーカーがヒトＶＤＢＰである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ＶＤＢＰの基準発現レベルより低い、対象におけるＶＤＢＰの発現レベルが、対象におけるＧＣを示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
バイオマーカーがヒトクラスタリンである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
クラスタリンの基準発現レベルより低い、対象におけるクラスタリンの発現レベルが、対象におけるＧＣを示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
バイオマーカーがヒトＩＧＦＡＬＳである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＩＧＦＡＬＳの基準発現レベルより高い、対象におけるＩＧＦＡＬＳの発現レベルが、対象におけるＧＣを示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
バイオマーカーがヒトアファミンである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
アファミンの基準発現レベルより低い、対象におけるアファミンの発現レベルが、対象におけるＧＣを示す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）１つ又は複数のバイオマーカーが、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される、対象における前記１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程、
（ｂ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する工程、及び
（ｃ）前記比較に基づいて対象がＧＣの発症に感受性を有するかどうかを判定する工程
を含む、対象が胃癌（ＧＣ）の発症に感受性を有するかどうかの判定方法。
【請求項１６】
１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルが対象から得られる検体中で測定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
検体が血清検体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程が検体中のバイオマーカータンパク質のレベルを測定する工程を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
検体が組織検体である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程が検体中のバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを測定する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
バイオマーカーがヒトＶＤＢＰである、請求項１５から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
ＶＤＢＰの基準発現レベルより低い、対象におけるＶＤＢＰの発現レベルが、対象におけるＧＣを示す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
バイオマーカーがヒトクラスタリンである、請求項１５から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
クラスタリンの基準発現レベルより低い、対象におけるクラスタリンの発現レベルが、対象におけるＧＣを示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
バイオマーカーがヒトＩＧＦＡＬＳである、請求項１５から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ＩＧＦＡＬＳの基準発現レベルより高い、対象におけるＩＧＦＡＬＳの発現レベルが、対象におけるＧＣを示す、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
バイオマーカーがヒトアファミンである、請求項１５から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
アファミンの基準発現レベルより低い、対象におけるアファミンの発現レベルが、対象におけるＧＣを示す、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
（ａ）１つ又は複数のバイオマーカーが、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される、対象における前記１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程、
（ｂ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する工程、及び
（ｃ）前記比較に基づいて対象におけるＧＣの進行を評価する工程
を含む、対象における胃癌（ＧＣ）の進行の評価方法。
【請求項３０】
対象がＧＣの治療を受けている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルが対象から得られる検体中で測定される、請求項２９又は請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
検体が血清検体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程が検体中のバイオマーカータンパク質のレベルを測定する工程を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
検体が組織検体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程が検体中のバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを測定する工程を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
バイオマーカーがヒトＶＤＢＰである、請求項２９から３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ＶＤＢＰの基準発現レベルより低い、対象におけるＶＤＢＰの発現レベルが、対象におけるＧＣを示す、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
バイオマーカーがヒトクラスタリンである、請求項２９から３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
クラスタリンの基準発現レベルより低い、対象におけるクラスタリンの発現レベルが、対象におけるＧＣを示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
バイオマーカーがヒトＩＧＦＡＬＳである、請求項２９から３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
ＩＧＦＡＬＳの基準発現レベルより高い、対象におけるＩＧＦＡＬＳの発現レベルが、対象におけるＧＣを示す、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
バイオマーカーがヒトアファミンである、請求項２９から３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
アファミンの基準発現レベルより低い、対象におけるアファミンの発現レベルが、対象におけるＧＣを示す、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルをモジュレートする活性について、候補治療剤をアッセイする工程を含む、対象における胃癌（ＧＣ）の治療に有用な候補治療剤のスクリーニング方法。
【請求項４５】
（ａ）候補治療剤を対象に投与する工程、
（ｂ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを測定する工程、及び
（ｃ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する工程、
を含み、
バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルが、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと近似するか、又は同一である場合、候補治療剤は対象におけるＧＣの治療に有用である、
請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
（ａ）候補治療剤をバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーを発現する細胞に曝露する工程、
（ｂ）前記細胞におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルの変化を測定する工程、及び
（ｃ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する工程、
を含み、
バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルが、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと近似するか、又は同一である場合、候補治療剤は対象におけるＧＣの治療に有用である、
請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
候補治療剤が、対象又は細胞におけるＶＤＢＰの発現レベルを、ＶＤＢＰの基準発現レベルと近似するか、又は同一であるレベルまで増加させる、請求項４５又は請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
候補治療剤が、対象又は細胞におけるクラスタリンの発現レベルを、クラスタリンの基準発現レベルと近似するか、又は同一であるレベルまで増加させる、請求項４５又は請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
候補治療剤が、対象又は細胞におけるＩＧＦＡＬＳの発現レベルを、ＩＧＦＡＬＳの基準発現レベルと近似するか、又は同一であるレベルまで減少させる、請求項４５又は請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
候補治療剤が、対象又は細胞におけるアファミンの発現レベルを、アファミンの基準発現レベルと近似するか、又は同一であるレベルまで増加させる、請求項４５又は請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
対象又は細胞においてバイオマーカーであるアポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）及び／又はバイオマーカーであるハプトグロビンの発現レベルを測定する工程をさらに含む、請求項１から５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
１つ又は複数のバイオマーカーが、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される、対象における前記１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する手段を含む、対象における胃癌（ＧＣ）を診断するための、対象がＧＣの発症に感受性を有するかどうかを判定するための、又は対象におけるＧＣの進行を評価するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
本国際特許出願は、２０１２年１月２０日出願の豪州仮特許出願第２０１２９００２３３号に基づく優先権を主張し、その内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、胃癌と関連する生物学的マーカーの同定に関する。具体的には、胃癌と一定数のタンパク質の差次的発現との間の関連性が同定された。生物学的マーカーは、胃癌の診断方法、胃癌感受性である個体の同定方法、及び胃癌の進行の評価方法を含む様々な目的のために利用できる。
【背景技術】
【０００３】
胃癌（本明細書では「ＧＣ」ともいう）は、世界で４番目に最も一般的な癌であり、癌死亡の２番目の主因である。西洋諸国では、診断時の期待５年生存率は１０〜３０％に過ぎない。これは、診断症状が少なく、それゆえ末期に内視鏡診断されることに帰することができる。不幸なことに、ＧＣの症状が現れたときには、＞８０％の症例で転移がすでに生じている。
【０００４】
日本はＧＣの発症率が世界で最も高い国の１つである。日本における胃Ｘ線間接撮影法による無症状の個体に対するマススクリーニングプログラムの実施は、早期発見されるＧＣ症例数を増加させ、全体の５年生存率を５０％超まで向上させた。胃Ｘ線間接撮影法の感度及び特異度はそれぞれ、７０〜９０％及び８０〜９０％で良好である。しかしながら、費用対効果研究により、胃Ｘ線間接撮影法プログラムは、ＧＣの発症率が低い西洋諸国では実行可能でないことが示されている。より好適な診断アプローチは、ＧＣの病因と関連するＧＣバイオマーカーの検出のための、正確で、非侵襲的で、費用対効果の高い試験を伴うものと考えられる。
【０００５】
ＧＣに使用される現存の臨床マーカーである癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen：ＣＥＡ）、糖鎖抗原（carbohydrate antigen：ＣＡ）１９−９及びＣＡ７２−４は、定期的スクリーニングのためには感度も特異度も十分でなく、主に治療後の疾患の進行をモニターするために使用される。ペプシノーゲンＩ／ＩＩの血清比に、アジア人集団における代替的ＧＣ指標として一定の見込みがあることが示されているが、西洋人集団を含む他の人種群への適用可能性に関して疑問が残る。
【０００６】
ＧＣのバイオマーカー発見に関連するいくつかの根本的障害がある。早期疾患のヒト検体を得ることは、その無症状性を鑑みると困難である。ヒト集団の遺伝的多様性及び制御できない環境要因の影響により、問題はさらに複雑になる。すなわち、バイオマーカー発現における高度の自然変異により潜在的バイオマーカーが特定されにくくなり得ることを意味する。
【０００７】
前述のこれら困難ゆえに、ＧＣを示す感度及び特異度の高いバイオマーカーは少なかった。したがって、大集団における早期ＧＣの検出に好適な新しいバイオマーカーの同定が緊急の課題である。
【０００８】
本明細書におけるいずれの先行技術への言及も、かかる先行技術が任意の国における一般常識の一部を形成するものであると認めること、又は何らかの形で示唆することとしては理解されず、理解されるべきではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
前述の困難に対処する際に、本発明者らは、炎症関連ＧＣの遺伝子組換えモデルマウス（ｇｐ１３０Ｆ／Ｆ）を利用した。ｇｐ１３０Ｆ／Ｆマウスは、胃の腺部に自然発症的に再現性良く腺腫を発症し、かかる腺腫は、ピロリ菌（H. pylori）への慢性感染により生じるヒトにおける腸型ＧＣと関連する進行性の組織学的特徴のすべてを示す。これは、早期ＧＣの新しいバイオマーカー指標の同定をもたらした。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、第１の態様において、本発明は、対象における胃癌（ＧＣ）の診断方法を提供し、この方法は、
（ａ）１つ又は複数のバイオマーカーが、ビタミンＤ結合タンパク質（vitamin D binding protein：ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（insulin like growth factor binding protein complex acid labile subunit：ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミン（afamin）からなる群から選択される、対象における１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程、
（ｂ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する工程、及び
（ｃ）前記比較に基づいて対象におけるＧＣを診断する工程
を含む。
【００１１】
一実施形態において、１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルは、対象から得られる検体中で測定される。一実施形態において、検体は血清検体である。この点において、１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定することは、検体中のバイオマーカータンパク質のレベルを測定することを含む。一実施形態において、検体は組織検体である。この点において、１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定することは、検体中のバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを測定することを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーはヒトＶＤＢＰである。一実施形態において、ＶＤＢＰの基準発現レベルより低い、対象におけるＶＤＢＰの発現レベルは、対象におけるＧＣを示す。
【００１３】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーはヒトクラスタリンである。一実施形態において、クラスタリンの基準発現レベルより低い、対象におけるクラスタリンの発現レベルは、対象におけるＧＣを示す。
【００１４】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーはヒトＩＧＦＡＬＳである。一実施形態において、ＩＧＦＡＬＳの基準発現レベルより高い、対象におけるＩＧＦＡＬＳの発現レベルは、対象におけるＧＣを示す。
【００１５】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーはヒトアファミンである。一実施形態において、アファミンタンパク質の基準発現レベルより低い、対象におけるアファミンタンパク質のレベルは、対象におけるＧＣを示す。
【００１６】
第２の態様において、本発明は、対象が胃癌（ＧＣ）の発症に感受性を有するかどうかの判定方法を提供し、この方法は、
（ａ）１つ又は複数のバイオマーカーが、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される、対象における１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程、
（ｂ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する工程、及び
（ｃ）前記比較に基づいて対象がＧＣの発症に感受性を有するかどうかを判定する工程
を含む。
【００１７】
一実施形態において、１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルは、対象から得られる検体中で測定される。一実施形態において、検体は血清検体である。この点において、１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定することは、検体中のバイオマーカータンパク質のレベルを測定することを含む。一実施形態において、検体は組織検体である。この点において、１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定することは、検体中のバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを測定することを含む。
【００１８】
本発明の第２の態様のいくつかの実施形態において、バイオマーカーはヒトＶＤＢＰである。一実施形態において、ＶＤＢＰの基準発現レベルより低い、対象におけるＶＤＢＰの発現レベルは、対象におけるＧＣを示す。
【００１９】
本発明の第２の態様のいくつかの実施形態において、バイオマーカーはヒトクラスタリンである。一実施形態において、クラスタリンの基準発現レベルより低い、対象におけるクラスタリンの発現レベルは、対象におけるＧＣを示す。
【００２０】
本発明の第２の態様のいくつかの実施形態において、バイオマーカーはヒトＩＧＦＡＬＳである。一実施形態において、ＩＧＦＡＬＳの基準発現レベルより高い、対象におけるＩＧＦＡＬＳの発現レベルは、対象におけるＧＣを示す。
【００２１】
本発明の第２の態様のいくつかの実施形態において、バイオマーカーはヒトアファミンである。一実施形態において、アファミンタンパク質の基準発現レベルより低い、対象におけるアファミンタンパク質のレベルは、対象におけるＧＣを示す。
【００２２】
第３の態様において、本発明は、対象における胃癌（ＧＣ）の進行の評価方法を提供し、この方法は、
（ａ）１つ又は複数のバイオマーカーが、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される、対象における１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程、
（ｂ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する工程、及び
（ｃ）前記比較に基づいて対象におけるＧＣの進行を評価する工程
を含む。
【００２３】
一実施形態において、対象はＧＣの治療を受けている。
【００２４】
本発明の第３の態様のいくつかの実施形態において、１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルは、対象から得られる検体中で測定される。一実施形態において、検体は血清検体である。この点において、１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定することは、検体中のバイオマーカータンパク質のレベルを測定することを含む。一実施形態において、検体は組織検体である。この点において、１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定することは、検体中のバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを測定することを含む。
【００２５】
本発明の第３の態様のいくつかの実施形態において、バイオマーカーはヒトＶＤＢＰである。一実施形態において、ＶＤＢＰの基準発現レベルより低い、対象におけるＶＤＢＰの発現レベルは、対象におけるＧＣを示す。
【００２６】
本発明の第３の態様のいくつかの実施形態において、バイオマーカーはヒトクラスタリンである。一実施形態において、クラスタリンの基準発現レベルより低い、対象におけるクラスタリンの発現レベルは、対象におけるＧＣを示す。
【００２７】
本発明の第３の態様のいくつかの実施形態において、バイオマーカーはヒトＩＧＦＡＬＳである。一実施形態において、ＩＧＦＡＬＳの基準発現レベルより高い、対象におけるＩＧＦＡＬＳの発現レベルは、対象におけるＧＣを示す。
【００２８】
本発明の第３の態様のいくつかの実施形態において、バイオマーカーはヒトアファミンである。一実施形態において、アファミンタンパク質の基準発現レベルより低い、対象におけるアファミンタンパク質のレベルは、対象におけるＧＣを示す。
【００２９】
第４の態様において、本発明は、対象における胃癌（ＧＣ）の治療に有用な候補治療剤のスクリーニング方法を提供し、この方法は、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルをモジュレートする活性について、候補治療剤をアッセイする工程を含む。
【００３０】
本発明の第４の態様の一実施形態において、この方法は、
（ａ）候補治療剤を対象に投与する工程、
（ｂ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを測定する工程、及び
（ｃ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する工程、
を含み、
バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルが、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと近似するか、又は同一である場合、候補治療剤は対象におけるＧＣの治療に有用である。
【００３１】
本発明の第４の態様の一実施形態において、この方法は、
（ａ）候補治療剤をバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーを発現する細胞に曝露する工程、
（ｂ）前記細胞におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルの変化を測定する工程、及び
（ｃ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する工程、
を含み、
バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルが、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと近似するか、又は同一である場合、候補治療剤は対象におけるＧＣの治療に有用である。
【００３２】
本発明の第４の態様のいくつかの実施形態において、候補治療剤は、対象又は細胞におけるＶＤＢＰの発現レベルを、ＶＤＢＰの基準発現レベルと近似するか、又は同一であるレベルまで増加させる。いくつかの実施形態において、候補治療剤は、対象又は細胞におけるクラスタリンの発現レベルを、クラスタリンの基準発現レベルと近似するか、又は同一であるレベルまで増加させる。いくつかの実施形態において、候補治療剤は、対象又は細胞におけるＩＧＦＡＬＳの発現レベルを、ＩＧＦＡＬＳの基準発現レベルと近似するか、又は同一であるレベルまで減少させる。いくつかの実施形態において、候補治療剤は、対象又は細胞におけるアファミンの発現レベルを、アファミンの基準発現レベルと近似するか、又は同一であるレベルまで増加させる。
【００３３】
本発明の前述の態様のいくつかの実施形態において、この方法は、対象又は細胞においてバイオマーカーであるアポリポタンパク質Ｅ（apolipoprotein E：ＡｐｏＥ）及び／又はバイオマーカーであるハプトグロビンの発現レベルを測定する工程をさらに含む。
【００３４】
第５の態様において、本発明は、対象における胃癌（ＧＣ）を診断するための、対象がＧＣの発症に感受性を有するかどうかを判定するための、又は対象におけるＧＣの進行を評価するためのキットを提供し、このキットは、１つ又は複数のバイオマーカーが、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される、対象における１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する手段を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
本発明の態様及び利点のさらなる理解のため、添付の図面とともに解釈される、以下の詳細な説明及び実施例を参照すべきである。
【図１】図示された遺伝子型の１週齢マウスに対し、実施例１に関する組織学的分析を実施した。胃の切除及び外側湾曲に沿った開口後、胃を内腔が観察者側を向くように留めた（挿入図）。点線に沿った縦断切片をＨ＆Ｅで染色し、胃洞が左側に来るように配向した。すべてのｇｐ１３０Ｆ／Ｆ及びｇｐ１３０Ｆ／Ｆ；Ｉｌ６−／−マウスの胃には、胃洞の腺部（ａ）内に４〜６個の別個の腺腫様腫瘍（矢印）が見られ、これらは、炎症性浸潤と関連する細長く、多くの場合枝分かれした腺により特徴付けられる（アスタリスク）。過形成性上皮の小領域を、ｇｐ１３０Ｆ／Ｆ；Ｓｔａｔ３＋／−マウスに見ることができ（矢印）、腫瘍形成の遅延及び減弱化を示唆する１１。胃底の扁平上皮（ｆ）は過形成の徴候を一切示さない。バーは２００μｍ（挿入図）及び５０μｍ（Ｈ＋Ｅ切片）である。
【図２】（Ａ）胃癌（ＧＣ）の候補血清タンパク質バイオマーカーの発見、ベリフィケーション及びバリデーションのために実施例１で使用されたストラテジーの模式図。長方形のボックスで描かれている工程が、実験プロセスであり、一方でひし形で表されているのが分析プロセスであった。破線は、ステージ１で同定された３つのタンパク質がステージ２のベリフィケーションをとばして、ステージ３でヒト検体におけるＥＬＩＳＡによる直接バリデーションを受けたことを示す。（Ｂ）非ＧＣ表現型を有する野生型検体の代表２Ｄゲルスポットマップ。（Ｃ）ＧＣ表現型を有するｇｐ１３０Ｆ／Ｆ遺伝子型マウス（ＦＦ）検体の代表２Ｄゲルスポットマップ。（Ｄ）５１２個のマッチングされたスポットから生成された階層クラスタリング樹状図。（Ｅ）５１２個のマッチングされたスポットから生成された主成分分析（principal component analysis：ＰＣＡ）スコアプロット。それぞれの主成分に帰される分散のパーセンテージが示されている。
【図３】３８個のマルチプルアフィニティ除去システム（multiple affinity removal system：ＭＡＲＳ）枯渇マウス血清検体に基づく候補ＧＣバイオマーカーの同定のために実施例１において使用された実験ワークフローを描写するフローチャート。次に、マウス遺伝子型の多重比較、受信者動作特性（receiver operating characteristics：ＲＯＣ）分析、及び質量分析（mass spectrometry：ＭＳ）同定後の候補優先順位決定を伴う洗練されたストラテジーが、バリデーション及びヒト血清におけるバリデーションのために８つの最も関連性の高いタンパク質を選択するために用いられた。
【図４】実施例１において同定され、ＧＣ表現型よりもむしろｇｐ１３０Ｆ／Ｆ突然変異と関連することが見出された、２次元ディファレンスゲル内電気泳動（two-dimensional difference in-gel electrophoresis：２Ｄ  ＤＩＧＥ）スポットの、ボリュームとしても言及される、標準化された存在量値の箱ひげ図。
【図５】（Ａ）実施例１において同定された８つの候補バイオマーカータンパク質に対応する３８個の目的のスポットの位置を示す、ＧＣ（緑）及び非ＧＣ（赤）検体の代表的なオーバーレイ２Ｄ  ＤＩＧＥ画像。緑で囲まれたスポットはＧＣにおいてアップレギュレートされており、赤で囲まれたスポットはダウンレギュレートされていた。（Ｂ）２Ｄ  ＤＩＧＥでの目的の８つのタンパク質と関連するマッチングされたスポットボリュームの箱ひげ図。３８のスポットすべてについて、ＧＣ表現型群（すなわち、ＦＦ／ＦＦＩＬ６遺伝子型）について得られた平均スポットボリュームは、非ＧＣ表現型群（すなわち、ＷＴ／ＩＬ６／ＦＦＳｔａｔ３遺伝子型）の平均と、ステューデントのＴ検定のＰ値＜０．０１で有意に異なっていた。
【図６】（Ａ）ＧＣマウス（ＦＦ遺伝子型、ｎ＝５）及び非ＧＣ（ＷＴ、ｎ＝５）マウスの血清における、実施例１において同定された４つの候補バイオマーカーのウエスタンブロット検出。デンシトメトリー分析のためのインプット対照として、免疫グロブリン軽鎖を使用した。（Ｂ）マウスａｐｏＥ、フィブロネクチン、アファミン、及びクラスタリンのウエスタンブロットデンシトメトリー。Ｐ値は、マン−ホイットニーＵ検定を使用して計算した。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。（Ｃ）ＧＣ患者（ｎ＝１１）及び対照（ｎ＝１３）血清における５つの候補バイオマーカーのウエスタンブロット検出。デンシトメトリー分析のためのインプット対照として、免疫グロブリン軽鎖を使用した。（Ｄ）ヒトアファミン、ａｐｏＥ、クラスタリン、フィブロネクチン、及びハプトグロビンのウエスタンブロットデンシトメトリー。Ｐ値は、マン−ホイットニーＵ検定を使用して計算した。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図７】（Ａ）実施例１において、ＧＣ患者（ｎ＝１１）及び対照（ｎ＝１３）血清で実施した７つのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。Ｐ値は、マン−ホイットニーＵ検定を使用して計算した。中の空いたデータ点は、女性対象を示す。エラーバーは、平均及び平均の標準誤差を表す。（Ｂ）ＧＣ患者と対照との間でタンパク質濃度における統計的に有意な差異を示した４つのタンパク質、及びＣＡ７２−４について得られたＲＯＣ曲線。曲線下面積（Area Under the Curve：ＡＵＣ）値をそれぞれについて示す。
【図８】実施例１におけるＡＡＣＴ及びフィブロネクチンについてＥＬＩＳＡの結果（標準化濃度）を示す散布図であり、ＧＣ患者と対照との間で明確な調節は示さなかった。Ｐ値は、マン−ホイットニーＵ検定を使用して計算した。中の空いたデータ点は、女性対象を示す。エラーバーは、平均及び平均の標準誤差を表す。
【図９】実施例２における胃癌（ＧＣ）患者（ｎ＝２５）及び対照（ｎ＝１０）血清で実施した５つのＥＬＩＳＡの結果を示すグラフ。Ｐ値は、マン−ホイットニーＵ検定を使用して計算した。ＧＣ血清は丸印、対照血清は四角で示される。緑の記号は女性を示し、黒の記号は男性を示す。白丸は早期ＧＣを示し、黒丸は末期ＧＣを示す。タンパク質レベルで何倍変化したかをＸ軸に示し、対照からＧＣへのレギュレーション示す。
【図１０】感度（有病正診率（true positive rate）−ＴＰＲ）、特異度（無病誤診率（false positive rate）、ＦＰＲ）及び曲線下面積（ＡＵＣ）を示す、実施例２において分析された５つのタンパク質それぞれについて得られたＲＯＣ曲線。
【図１１】実施例２において分析された５つのタンパク質（アファミン−Ａ、クラスタリン−Ｃ、ハプトグロビン−Ｈ、ＩＧＦＡＬＳ−Ｉ、ＶＤＢＰ−Ｖ）の二次的組合せについて得られたＲＯＣ曲線。
【図１２】実施例２において分析された５つのタンパク質（アファミン−Ａ、クラスタリン−Ｃ、ハプトグロビン−Ｈ、ＩＧＦＡＬＳ−Ｉ、ＶＤＢＰ−Ｖ）の三次的組合せについて得られたＲＯＣ曲線。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
発明の詳細な説明
本発明は部分的には、一定数のバイオマーカーの同定に基づき、かかるバイオマーカーの発現レベルは、胃癌（ＧＣ）に罹患した対象から得られる検体において改変される。これらバイオマーカーの差次的発現は、それらが、ＧＣのための診断及び予後試験の基礎を形成し得る好適なマーカーであることを示す。
【００３７】
バイオマーカーは事実上、ある表現型状態（例えば、疾患に罹患している）の対象から採取される検体において、他の表現型状態（例えば、疾患に罹患していない）と比較して、差次的に存在する有機生体分子である。異なる表現型状態群間でバイオマーカーが差次的に存在するのは、バイオマーカーの発現レベルの平均又は中央値が群間で異なって（すなわち、より高く又は低く）計算される場合である。したがって、バイオマーカーは、単独で又は組み合わせて、対象がある表現型状態に属するか、又は他の表現型状態に属するかの指標を提供する。
【００３８】
したがって、第１の態様において、本発明は、対象における胃癌（ＧＣ）の診断方法を提供し、この方法は、
（ａ）１つ又は複数のバイオマーカーが、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される、対象における１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程、
（ｂ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する工程、及び
（ｃ）前記比較に基づいて対象におけるＧＣを診断する工程
を含む。
【００３９】
炎症関連ＧＣの遺伝子組換えモデルマウス（ｇｐ１３０Ｆ／Ｆ）の使用により、本発明者らは、前述のバイオマーカーが胃腺腫の発症早期に差次的に発現することを特定した。
【００４０】
したがって、第２の態様において、本発明は、対象が胃癌（ＧＣ）の発症に感受性を有するかどうかの判定方法を提供し、この方法は、
（ａ）１つ又は複数のバイオマーカーが、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される、対象における１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程、
（ｂ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する工程、及び
（ｃ）前記比較に基づいて対象がＧＣの発症に感受性を有するかどうかを判定する工程
を含む。
【００４１】
本明細書を通じて使用される「胃癌」又は「ＧＣ」なる用語は、胃の腺癌を含む胃の癌を意味するものと解釈される。当業者には理解されるだろうが、胃は以下の４つの区画を含む。すなわち、噴門（噴門切痕を含む）、胃底、胃体又はコーパス（胃角又は角切痕を含む）、及び幽門（幽門括約筋、幽門洞及び幽門管を含む）である。「胃癌」又は「ＧＣ」なる用語はまた、消化管の他の領域の癌を包含する。
【００４２】
上で言及した本発明の態様の方法は、バイオマーカーであるＶＤＢＰ、クラスタリン、ＩＧＦＡＬＳ及びアファミンのうちの１つ又は複数の発現レベルを測定する工程を要する。これらのマーカーを下で詳細に論じる。
【００４３】
本明細書において使用される、バイオマーカーの「発現レベルを測定する工程」なる用語は、（１）対応する遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子への転写のレベルを測定する工程、及び／又は（２）ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳のレベルを測定する工程（すなわち、タンパク質それ自体のレベルを測定する工程）、及び／又は（３）翻訳されたタンパク質の活性のレベルを測定する工程を含む。実質的には、バイオマーカーの発現レベルは、ＲＮＡ及び／又はタンパク質の発現段階で測定され得る。
【００４４】
したがって、本明細書において使用される「バイオマーカー」なる用語は、タンパク質（ポリペプチド）、ポリヌクレオチド（例えばｍＲＮＡ）及び／又は代謝産物を含むが、これに限定されるものではなく、胃癌に罹患した対象又は胃癌に罹患した対象から採取される検体におけるその発現レベル（例えば、転写のレベル、翻訳のレベル、及び／又は活性のレベル）は、正常検体における同じバイオマーカーの発現レベル（すなわち基準発現レベル）と比較して増加又は減少している。本明細書において言及される任意のバイオマーカーはまた、当業者が容易に同定できるそれら遺伝子及びタンパク質のシノニムを含む。
【００４５】
「遺伝子」なる用語は、タンパク質に転写されて翻訳されるコード領域を含む、（核又はミトコンドリア）ゲノムヌクレオチド配列の領域を意味するものと理解されるべきである。したがって、本発明の文脈における「遺伝子」は、その遺伝子と関連する調節領域（例えば、プロモーター領域）、転写領域、エクソン、イントロン、非翻訳領域並びに他の機能性及び／又は非機能性配列領域を含み得る。したがって、一実施形態において、対象又は検体におけるバイオマーカーの「発現レベル」は、対象又は検体における対応する遺伝子のｍＲＮＡへの転写の程度を反映したものであってもよい。
【００４６】
当業者には理解されるだろうが、タンパク質は、主にアミノ酸からなる機能性生体分子であり、そのアミノ酸配列は対応する遺伝子により決定される。したがって、一実施形態において、対象又は検体におけるバイオマーカーの「発現レベル」は、対象又は検体における対応する遺伝子のｍＲＮＡのタンパク質への翻訳の程度を反映したものであってもよい。
【００４７】
ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳のレベルの測定方法は、当技術分野において知られている。例えば、タンパク質のレベルは、抗体ベースの試験（ウエスタンブロッティング、イムノブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbant assay：ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（radioimmunoassay：ＲＩＡ）、免疫沈降及び解離増強ランタニド蛍光イムノアッセイ（dissociation-enhanced lanthanide fluoro immuno assay：ＤＥＬＦＩＡ）を含む）、プロテオミクス技術、表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance：ＳＰＲ）、多用途ファイバーベースＳＰＲ（versatile fibre-based SPR）、化学発光、蛍光偏光、リン光、免疫組織化学、免疫蛍光、ＷＯ２００９／００４５７６に記載のマトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry：ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）、（表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析（surface enhanced laser desorption/ionization mass spectrometry：ＳＥＬＤＩ−ＭＳ）、特に表面増強親和性捕捉（surface-enhanced affinity capture：ＳＥＡＣ）、タンパク質マイクロアレイ、表面増強ニード脱離（surface-enhanced need desorption：ＳＥＮＤ）又は表面増強光標識結合及び放出（surface-enhanced photo label attachment and release：ＳＥＰＡＲ）を含む）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析、マイクロサイトメトリー（microcytometry）、マイクロアレイ、顕微鏡検査、蛍光活性化細胞選別（fluorescence activated cell sorting：ＦＡＣＳ）、及びフローサイトメトリーを含む手法により測定されてもよいが、これに限られるものではない。
【００４８】
抗体ベースの試験法、例えば免疫組織化学及びイムノブロッティングに関して、研究対象のそれぞれのタンパク質に特異的な抗体又は抗血清、好ましくはポリクローナル抗血清、最も好ましくはモノクローナル抗体が、タンパク質存在量を検出するために使用される。抗体は、例えば放射性標識、蛍光標識、ハプテン標識、例えばビオチン、又は酵素、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼで、抗体自体を直接標識することにより検出され得る。或いは、非標識一次抗体を、一次抗体に特異的な抗血清、ポリクローナル抗血清又はモノクローナル抗体を含む、標識二次抗体と併せて使用してもよい。免疫組織化学プロトコル及びキットは、当技術分野においてよく知られており、市販されている。当技術分野においてよく知られている方法により、例えば研究対象のタンパク質で動物を免疫化することにより、抗体を製造できる。
【００４９】
例えばＥＬＩＳＡを含むサンドイッチイムノアッセイを含む従来のイムノアッセイ又は蛍光ベースのイムノアッセイや、他の酵素イムノアッセイもまた考えられる。比濁分析は、液相において実施されるアッセイであり、抗体は溶液中にある。研究対象のタンパク質の抗体への結合は、吸光度の変化をもたらし、これを測定する。ＳＥＬＤＩベースのイムノアッセイでは、目的のタンパク質のための生体分子特異的捕捉試薬が、ＭＳプローブ、例えばプレ活性化されたＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐアレイの表面に付着している（下を参照のこと）。次に、この試薬によりバイオチップ上で、タンパク質を特異的に捕捉し、捕捉したタンパク質を質量分析により検出する（下を参照のこと）。
【００５０】
抗体ベースプラットフォームを使用したタンパク質レベルを評価するさらなる手法には、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ２０１１／１１３０８５に記載の多用途ファイバーベース表面プラズモン共鳴（versatile fibre-based surface plasmon resonance：ＶｅＳＰＲ）バイオセンサーが含まれる。従来のＳＰＲは、誘電体基板と薄い金属コーティングとの間の界面での自由電子の励起に依拠する非標識バイオセンシングのための十分確立された方法である。入射光がプラズモン波とカップリングする条件は、入射光の入射角及び波長とともに、センサー自体の物理的性質（比誘電率／屈折率）及び周囲環境に依存する。こうした理由から、ＳＰＲは、センサー近傍における密度（屈折率）の小さな変動に対してさえ感度が高く、蛍光標識の使用を要しない。センサー表面への結合生体分子、例えばタンパク質により誘発される屈折率の小さな変動は、入射光の入射角又は波長のいずれかを介してカップリング条件をモニターすることにより測定できる。現存のＳＰＲ系は、かさ高く高価なクレッチマンプリズム配置を使用し、プリズムの一方の側が、プラズモン波を支持できる金属、例えば金又は銀で被覆される。ファイバーの短い区間の周囲に金属コーティングを沈着させた光ファイバーベースの、代替的なＳＰＲ構造が開発されてきた。このアプローチは、かかるセンサーの複雑さ及び費用を減少させ、別の用途、例えばディップセンシング（dip sensing）への道を開く。センサー表面の物質を、表面プラズモンへのカップリングにより吸収される広域スペクトル内の波長をモニターすることによりプローブする。これらの手法には、慎重な温度校正の必要性と関連する実際的な制約があり、多数の検体を整合的に分析することを困難にしている。ＶｅＳＰＲとして知られる、光ファイバーベースのＳＰＲセンサーの新規で強力な改良型が近年開発されてきた。ＶｅＳＰＲは、現存のＳＰＲ手法と比較して一定数の実証された利点を有し、これら利点には、（ｉ）より高い信号対雑音比と、そのことによるより高い感度、（ｉｉ）変換信号の自己参照と、そのことによる高価な／かさ高い温度調節の回避、及び（ｉｉｉ）単一のファイバーを使用して異なる分析物の多重検出を実行する能力が含まれる。
【００５１】
ある時点で検体に存在する目的のタンパク質の発現レベルを分析するために、プロテオミクスもまた使用できる。特に、検体中のタンパク質発現の全体的変化を評価するために、プロテオミクス技術を使用できる（発現プロテオミクスとも呼ばれる）。プロテオミクス分析は、典型的には、（ｉ）２−Ｄゲル電気泳動（２−Ｄ  ＰＡＧＥ）による検体中の個々のタンパク質の分離、（ｉｉ）例えば質量分析又はＮ末端シークエンシングによる、ゲルから回収された個々のポリペプチドの同定、及び（ｉｉｉ）バイオインフォマティクスを使用したデータの分析を含む。
【００５２】
検体中の目的のタンパク質の発現のレベルを判定するために、タンパク質マイクロアレイ（バイオチップとも呼ばれる）もまた使用してもよい。多くのタンパク質バイオチップが当技術分野において記述されており、例えば、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（フレモント、ＣＡ）、Ｚｙｏｍｙｘ（ヘイワード、ＣＡ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールスバッド、ＣＡ）、Ｂｉａｃｏｒｅ（ウプサラ、スウェーデン）及びＰｒｏｃｏｇｎｉａ（バークシャー、英国）製造のタンパク質バイオチップを含む。かかるタンパク質バイオチップの例は、以下の特許又は公開特許出願に記載されている。すなわち、米国特許番号第６，２２５，０４７号、第６，５３７，７４９号、第６，３２９，２０９号及び第５，２４２，８２８号、並びにＰＣＴ国際公開番号ＷＯ００／５６９３４及びＷＯ０３／０４８７６８である。
【００５３】
目的のタンパク質の発現レベルはまた、気相イオンを検出するために質量分析計を用いる方法である質量分析により測定できる。質量分析計の例には、飛行時間型、磁場セクター型、四重極フィルター型、イオントラップ型、イオンサイクロトロン共鳴型、静電セクター分析器（electrostatic sector analyzer）型及びこれらの混成がある。質量分析計は、レーザー脱離／イオン化質量分析計であってもよい。レーザー脱離／イオン化質量分析において、検出されるべき１つ又は複数のタンパク質は、イオン化及び質量分析計内への導入のため、質量分析計のプローブインターフェースに連結して、１つ又は複数のタンパク質をイオン化エネルギーにさらすよう適合させた装置である、質量分析プローブの表面上に置かれる。分析物を表面から脱離し、揮発させイオン化させ、質量分析計のイオン光学に供するために、レーザー脱離質量分析計は、レーザーエネルギーを用い、それは典型的には紫外レーザーからのものであるが、赤外レーザーからのものでもある。ＬＤＩによるタンパク質の分析は、下で述べるように、ＭＡＬＤＩ又はＳＥＬＤＩの形態をとることができる。
【００５４】
ＳＥＬＤＩ法は、例えば、米国特許番号第５，７１９，０６０号及び第６，２２５，０４７号に記載されており、脱離／イオン化気相イオン分光分析（例えば、質量分析）の方法と関係し、そこでは分析物（この場合、１つ又は複数の検出されるべきタンパク質）がＳＥＬＤＩ質量分析プローブの表面上で捕捉される。ＳＥＬＤＩはまた、親和性捕捉質量分析、表面増強親和性捕捉（ＳＥＡＣ）及びＰｅｎｎｏ  ＭＡら、２０１２年（Ｒｅｓ．  Ｖｅｔ．  Ｓｃｉ．、９３：６１１〜６１７頁）に記載のイムノキャプチャー質量分析（immuno-capture mass spectrometry：ｉｃＭＳ）を包含する。これらのプラットフォームは、物質とタンパク質との間の非共有結合性親和性相互作用（吸着）によりタンパク質を捕捉するプローブ表面上の物質を有するプローブの使用を伴う。この物質は、「吸着剤」、「捕捉試薬」、「親和性試薬」又は「結合成分」と様々に呼ばれる。かかるプローブは、「親和性捕捉プローブ」と呼ぶことができ、「吸着表面」を有するものと呼ぶことができる。捕捉試薬は、タンパク質に結合可能な任意の物質であり得る。捕捉試薬は、物理吸着又は化学吸着によりプローブ表面に付着させる。機能性バイオチップ又は電磁ビーズの形態をとっていてもよいプローブは、表面にすでに付着されている捕捉試薬を有していてもよく、又はプローブはプレ活性化され、例えば共有又は配位共有結合を形成する反応を介して捕捉試薬に結合可能な反応成分を含む。エポキシド及びアシル−イミジゾール（acyl-imidizole）が、タンパク質捕捉試薬、例えば抗体又は細胞受容体に共有結合するために有用な反応成分である。ニトリロ三酢酸及びイミノ二酢酸は、ヒスチジン含有タンパク質と非共有相互作用する金属イオンに結合するために、キレート化剤として機能する有用な反応成分である。吸着剤は一般に、クロマトグラフィー吸着剤及び生体分子特異的吸着剤に分類される。
【００５５】
クロマトグラフィー吸着剤とは、クロマトグラフィーにおいて典型的に使用される吸着物質を指す。クロマトグラフィー吸着剤は、例えば、イオン交換物質、金属キレート剤（例えばニトリロ三酢酸又はイミノ二酢酸）、固定化金属キレート剤、疎水性相互作用吸着剤、親水性相互作用吸着剤、色素、単純生体分子（例えばヌクレオチド、アミノ酸、単糖及び脂肪酸）及び混合モード吸着剤（例えば疎水性引力／静電反発力吸着剤）を含む。
【００５６】
生体分子特異的吸着剤とは、生体分子、例えば核酸分子（例えばアプタマー）、ポリペプチド、多糖、脂質、ステロイド又はこれらのコンジュゲート（例えば糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、核酸（例えばＤＮＡ−タンパク質コンジュゲート）を含む吸着剤を指す。ある例において、生体分子特異的吸着剤は、巨大分子構造、例えば多タンパク質複合体、生体膜又はウイルスであり得る。生体分子特異的吸着剤の例は、抗体、受容体タンパク質及び核酸である。生体分子特異的吸着剤は、典型的には、標的タンパク質に対してクロマトグラフィー吸着剤よりも高い特異性を有する。
【００５７】
一般に、吸着表面を有するプローブは試験される検体と、研究対象のタンパク質が吸着剤に結合することを可能とするのに十分な期間接触させる。インキュベーション期間後、基質を洗浄し、結合していない物質を除去する。任意の好適な洗浄溶液を使用することができ、好ましくは、水溶液が用いられる。分子が結合され続ける範囲は、洗浄の厳密さを調整することにより操作できる。洗浄溶液の溶出特性は、例えば、ｐＨ、イオン強度、疎水性、カオトロピズムの程度、洗剤強度、及び温度に依存し得る。プローブがＳＥＡＣ及びＳＥＮＤ特性（本明細書に記載）の両方を有しないのであれば、エネルギー吸収分子が結合されたバイオマーカーとの基質に適用される。
【００５８】
さらなるアプローチにおいて、研究対象のタンパク質は、タンパク質に特異的に結合する抗体を有する固相結合免疫吸着剤で捕捉できる。吸着剤を洗浄して結合していない物質を除去した後、タンパク質を固相から溶出し、タンパク質に結合するバイオチップに適用することにより検出する。
【００５９】
基質に結合する研究対象のタンパク質は、気相イオン分光計、例えば飛行時間型質量分析計において検出される。タンパク質は、イオン化源、例えばレーザーによりイオン化され、生成されたイオンはイオン光学アセンブリにより収集され、次に質量分析器が通過イオンを分散させ分析する。次に、検出器が検出されたイオンの情報を質量対電荷比へと翻訳する。タンパク質の検出は、典型的には、信号強度の検出を伴う。このようにして、タンパク質の量及び質量の両方を判定できる。
【００６０】
レーザー脱離質量分析の別の方法は、表面増強ニート脱離（surface-enhanced neat desorption：ＳＥＮＤ）と呼ばれる。ＳＥＮＤは、プローブ表面と化学結合するエネルギー吸収分子を含むプローブ（「ＳＥＮＤプローブ」）の使用を伴う。「エネルギー吸収分子（energy absorbing molecules：ＥＡＭ）」なる文言は、レーザー脱離／イオン化源からのエネルギーを吸収可能であり、しかる後に、分析物分子と接触してその脱離及びイオン化に寄与する分子を意味する。ＥＡＭのカテゴリーには、ＭＡＬＤＩにおいて使用され、多くの場合「マトリックス」と呼ばれる分子が含まれ、桂皮酸誘導体、シナピン酸（sinapinic acid：ＳＰＡ）、シアノ−ヒドロキシ−桂皮酸（cyano-hydroxy-cinnamic acid：ＣＨＣＡ）及びジヒドロキシ安息香酸、フェルラ酸、及びヒドロキシアセト−フェノン誘導体が例として挙げられる。エネルギー吸収分子は、線状又は架橋ポリマー、例えばポリメタクリレート内に組み込まれてもよい。例えば、組成物は、α−シアノ−４−メタクリロイルオキシ桂皮酸及びアクリレートのコポリマーであり得る。或いは、組成物は、α−シアノ−４−メタクリロイルオキシ桂皮酸、アクリレート及び３−（トリ−エトキシ）シリルプロピルメタクリレートのコポリマーであってもよく、又は、α−シアノ−４−メタクリロイルオキシ桂皮酸及びオクタデシルメタクリレートのコポリマーであってもよい（「Ｃｌ  ８  ＳＥＮＤ」）。ＳＥＮＤは、米国特許番号第６，１２４，１３７号及びＰＣＴ国際公開番号ＷＯ０３／６４５９４にさらに記載されている。
【００６１】
ＳＥＡＣ／ＳＥＮＤは、レーザー脱離質量分析の一種であり、捕捉試薬及びエネルギー吸収分子の両方が、検体提示表面に付着される。したがって、ＳＥＡＣ／ＳＥＮＤプローブは、親和性捕捉及びイオン化／脱離により、外部マトリックスを適用する必要性なしに、研究対象のタンパク質の捕捉を可能にする。Ｃｌ  ８  ＳＥＮＤバイオチップは、ＳＥＡＣ／ＳＥＮＤの一種であり、捕捉試薬として機能するＣｌ  ８成分、及びエネルギー吸収成分として機能するＣＨＣＡ成分を含む。
【００６２】
別の種類のＬＤＩは、表面増強感光性結合及び放出（surface-enhanced photolabile attachment and Release：ＳＥＰＡＲ）と呼ばれる。ＳＥＰＡＲは、表面に付着した成分を有するプローブの使用を伴い、このプローブは、タンパク質と共有結合し、光、例えばレーザー光への曝露後に、この成分中の感光性結合を切断することによりタンパク質を放出できる。ＳＥＰＡＲ及び他の形態のＳＥＬＤＩが、本発明の方法に必要なタンパク質又はタンパク質プロファイルの検出へと容易に適合させられる。
【００６３】
ＭＡＬＤＩは、レーザー脱離／イオン化の従来の方法である。あるＭＡＬＤＩ法では、試験される検体を、マトリックスと混合し、ＭＡＬＤＩチップ上に直接置く。試験される検体に応じて、試験されるタンパク質は、好ましくはまず、固体支持体、例えば樹脂と組み合わされた（例えばスピンカラム内の）生体分子特異的（例えば抗体）又はクロマトグラフィー物質で捕捉される。検出されるタンパク質と結合し得る特異的親和性物質は上で述べた。親和性物質上での精製後、研究対象のタンパク質を溶出し、次にＭＡＬＤＩにより検出する。
【００６４】
飛行時間型質量分析によるタンパク質の分析は、飛行時間スペクトルを生成する。最終的に分析された飛行時間スペクトルは、典型的には、検体に対するイオン化エネルギーの単一パルスからの信号を示さず、むしろ複数のパルスからの信号の和を示す。これは、雑音を減らし、ダイナミックレンジを増加させる。次に、この飛行時間データを、専用ソフトウェアを使用したデータ処理にかける。データ処理は典型的には、質量スペクトルを生成するためのＴＯＦ対Ｍ／Ｚ変換、機器のオフセットを除去するためのベースライン減算、及び高周波ノイズを減少させるための高周波ノイズフィルタリングを含む。
【００６５】
タンパク質の脱離及び検出により生成されたデータを、プログラム可能なデジタルコンピュータを使用して分析できる。検出されたタンパク質の数、並びに任意選択でそれぞれの検出されたタンパク質の信号の強度及び判定分子量を示すために、コンピュータプログラムはデータを分析する。データ分析は、タンパク質の信号強度を判定する工程及び所定の統計的分布から逸脱するデータを除去する工程を含み得る。例えば、観察されたピークは、何らかの基準に対するそれぞれのピークの高さを計算することにより正規化され得る。コンピュータは、結果として得られるデータを表示用の様々なフォーマットに変換できる。標準スペクトルを表示できるが、ある有用なフォーマットでは、ピークの高さ及び質量の情報のみがスペクトルビューから維持され、より明確な画像を生み出して、ほぼ同一の分子量を有するタンパク質をより見えやすくすることを可能にする。別の有用なフォーマットでは、２つ以上のスペクトルが比較され、便利なことに、検体間で異なる発現レベルを有するタンパク質が強調表示される。これらフォーマットのいずれかを使用して、検体中に特定のタンパク質が存在するかどうか、及びどのレベルで存在するのかを容易に判定できる。
【００６６】
分析は一般に、タンパク質からの信号を示す、スペクトルにおけるピークの同定を伴う。ピークの選択は、視覚的に行えるが、ピークの検出を自動化するために市販のソフトウェアを使用できる。一般に、このソフトウェアは、選択された閾値を超える信号対雑音比を有する信号を同定し、ピーク信号のセントロイドでピークの質量を標識化することにより機能する。ある有用な使用法では、質量スペクトルのある選択されたパーセンテージで存在する同一のピークを同定するために多くのスペクトルが比較される。このソフトウェアの一種は、一定の質量範囲内の様々なスペクトルに現れるすべてのピークをクラスタリングし、質量（Ｍ／Ｚ）クラスターの中点に近いすべてのピークに質量（Ｍ／Ｚ）を割り当てる。
【００６７】
信号が研究対象のタンパク質に対応する信号のピークを表すかどうかを判定するために、データを分析するために使用されるソフトウェアは、アルゴリズムを信号の分析に適用するコードを含み得る。検査対象の特定の臨床パラメータのステータスを示すタンパク質ピーク又はタンパク質ピークの組合せが存在するかどうかを判定するために、ソフトウェアはまた、観察されたタンパク質ピークに関するデータを、分類ツリー又はＡＮＮ分析にかけることができる。データの分析は、検体の質量分析から直接又は間接に得られる様々なパラメータに「適合され（keyed）」ていてもよい。これらパラメータは、１つ又は複数のピークの存在又は非存在、ピークの形又はピークの群、１つ又は複数のピークの高さ、１つ又は複数のピークの高さの対数、及びピークの高さのデータについての他の算術的操作を含むが、これに限られるものではない。
【００６８】
タンパク質の活性を測定することに関して、使用されるアッセイのタイプは、研究対象のタンパク質の機能により決定されると考えられる。例えば、ＶＤＢＰはビタミンＤ３及びその代謝産物の主要な血漿担体であり、ビタミンＤが肝臓に、２５（ＯＨ）２Ｄ３が腎臓に、１，２５（ＯＨ）２Ｄ３が標的細胞及び臓器に輸送されることを保証する。ＶＤＢＰはまた、マクロファージ活性化において重要な役割を果たし、これはそのビタミンＤ結合能力とは切り離された役割である。例えば、ＶＤＢＰは、マクロファージ活性化因子の前駆体である活性化された補体ペプチドの白血球遊走能を増強することが示されてきた。かかる作用は、ＶＤＢＰタンパク質の活性をアッセイする基礎を形成し得る。クラスタリンに関しては、このタンパク質は、プログラム細胞死、補体媒介性細胞溶解の調節、膜再利用、細胞間接着及びｓｒｃ誘導形質転換を含む様々な作用と関連していた。クラスタリンはまた、補体の攻撃複合体の一部として、補体阻害剤としても作用する。これらの作用を果たす際に、クラスタリンは、数多くのパートナー、例えば免疫グロブリン、脂質、ヘパリン、細菌、補体成分、パラオキソナーゼ、ベータアミロイド、レプチン等と結合する。かかる作用及び結合パートナーは、クラスタリンタンパク質の活性をアッセイする基礎を形成し得る。ＩＧＦＡＬＳに関しては、このタンパク質は、インスリン様成長因子に結合し、その半減期及び血管局在を増加させることが知られている。例えば、ＩＧＦＡＬＳは、インスリン様成長因子結合タンパク質−３（insulin-like growth factor binding protein-3：ＩＧＦＢＰ−３）と結合し、それゆえ２つのタンパク質間の結合の程度を測定するアッセイを利用できる。さらに、アファミンは、ビタミンＥ結合活性を有することが知られており、それゆえ２つの間の結合の量又はレベルを測定するアッセイは、特定の検体中のアファミンタンパク質のレベルを反映したものと考えられる。このレベルは、正常対照検体における結合レベルと比較できる。
【００６９】
遺伝子のｍＲＮＡへの転写のレベルの測定方法もまた、当技術分野において知られている。例えば、ｍＲＮＡのレベルは、ノーザンブロッティング、ＲＮＡインサイチューハイブリダイゼーション、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイム（定量的）ＲＴ−ＰＣＲ、マイクロアレイ又は「タグベースの」技術、例えばＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続分析）を含む手法により測定してもよいが、これに限られるものではない。マイクロアレイ及びＳＡＧＥを、複数の遺伝子の発現を同時定量するために使用してもよい。プライマー又はプローブを、遺伝子又はその転写物のヌクレオチド配列に基づいて設計してもよい。Ｐａｉｋら、２００４年（ＮＥＪＭ、３５１（２７）：２８１７〜２８２６頁）、又はＡｎｄｅｒｓｏｎら、２０１０年（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、１２（５）：５６６〜５７５頁）に開示のものと類似する方法論を、１つ又は複数の目的の遺伝子の発現を測定するために使用してもよい。多くの方法がまた、標準的な分子生物学の教科書、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年）に開示されている。
【００７０】
ＲＴ−ＰＣＲに関しては、第１の工程は典型的には、研究対象から得られる検体からの全ＲＮＡの単離である。この例における典型的な検体は、組織検体、例えば胃腫瘍検体（及び、可能なら対応する正常胃組織）であると考えられるが、下に述べるように他の検体供給源も考えられる。ＲＮＡの供給源が腫瘍である場合、例えば、以前に対象から得られた、冷凍又は保管されたパラフィン包埋及び固定（例えば、ホルマリン固定）組織検体から、ＲＮＡを抽出することもできる。続いてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を全ＲＮＡ検体から精製してもよい。次に、好適な逆転写酵素を使用して、全ＲＮＡ検体（又は精製ｍＲＮＡ）をｃＤＮＡへと逆転写する。逆転写工程は、典型的には、ＲＮＡテンプレートに応じて、オリゴ−ｄＴプライマー、ランダムヘキサマー、又は関係する遺伝子に特異的なプライマーを使用してプライムする。次に、逆転写反応に由来するｃＤＮＡを、典型的なＰＣＲ反応のテンプレートとして供する。この点に関して、関係する遺伝子に特異的な２つのオリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ産物を生成する。他の２つのＰＣＲプライマーの間に位置するヌクレオチド配列を検出するために設計された第３のオリゴヌクレオチド、又はプローブもまた、ＰＣＲ反応において使用する。このプローブは、ＰＣＲ反応において使用されるＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素によって伸長可能ではなく、レポーター蛍光色素及び消光蛍光色素で標識する。レポーター色素からのいかなるレーザー誘導発光も、プローブ上で２つの色素が近接して位置する際に、消光色素によって消光する。ＰＣＲ増幅反応の間、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ酵素は、テンプレート依存的にプローブを切断する。この結果生じるプローブ断片は、溶液中で分離し、放出されたレポーター色素からの信号は、第２の蛍光体の消光効果から解放される。レポーター色素の１分子が、それぞれの合成される新しい分子のために遊離し、非消光レポーター色素の検出は、データの定量的解釈のための基礎を提供する。
【００７１】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて、ＰＣＲ反応において形成される産物の量、及び産物が形成されるタイミングは、開始テンプレートの量と相関する。ＲＴ−ＰＣＲ産物は、標準又は「正常」検体と比較して、高いｍＲＮＡレベルを有する検体中により速く蓄積すると考えられる。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、色素、例えばＳｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎを合成ＰＣＲ産物内へとインターカレートしたＤＮＡの蛍光を測定するか、又は二重標識化蛍光発生プローブ（すなわち、ＴａｑＭａｎプローブ）によりＰＣＲ産物蓄積を測定できる。ＲＴ−ＰＣＲ反応の進行は、産物蓄積をリアルタイムで測定するＰＣＲ機器、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製Ｐｒｉｓｍ  ７０００又はＲｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを使用してモニターできる。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、定量的競合ＰＣＲ及び定量的比較ＰＣＲの両方に適合する。前者は正規化のため、それぞれの標的配列の内部競合者を使用し、一方で後者は検体中に含有される正規化遺伝子、又はＲＴ−ＰＣＲのためのハウスキーピング遺伝子を使用する。
【００７２】
転写レベルでの遺伝子の発現のレベルを測定するためのマイクロアレイの作製及び適用は、当技術分野においてよく知られている。一般に、マイクロアレイにおいて、１つ又は複数の関係する遺伝子の一部又は全体を表すヌクレオチド配列（例えばオリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、又はゲノムＤＮＡ）は、基質上の既知の位置を占める。典型的には、基質は、１つ又は複数の関係する遺伝子を同時にアッセイできるように、多数のヌクレオチド配列を含む。次に、目的の対象から得られた核酸標的検体（例えば全ＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を、マイクロアレイとハイブリダイズし、アレイ上でそれぞれのプローブにハイブリダイズした標的核酸の量を定量し、標準又は「正常」検体で生じたハイブリダイゼーションと比較する。１つの典型的な定量方法は、共焦点顕微鏡及び蛍光標識を使用することである。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ（商標）アレイシステム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、サンタクララ、カリフォルニア）及びＡｔｌａｓ（商標）ヒトｃＤＮＡ発現アレイシステムが、ハイブリダイゼーションの定量のために特に好適である。しかしながら、任意の同様のシステム又は他の事実上同等の検出方法も使用できることは当業者にとって明らかであると考えられる。蛍光標識化ｃＤＮＡプローブはまた、核酸標的検体を表していてもよい。かかるプローブは、試験される対象の検体から抽出された全ＲＮＡ又はｍＲＮＡの逆転写中に蛍光ヌクレオチドを組み込むことにより生成できる。マイクロアレイに適用される標識化ｃＤＮＡプローブは、アレイ上のＤＮＡに相当するスポットに特異的にハイブリダイズすると考えられる。それぞれのアレイされた要素のハイブリダイゼーションの定量化は、標準又は「正常」検体中で観察される存在量と比較した、検体中の対応するｍＲＮＡ存在量の評価を可能にする。二色蛍光を用いて、ＲＮＡの２つの供給源から生成される別々に標識化されたｃＤＮＡプローブを、アレイに対にしてハイブリダイズする。こうして、それぞれの特定された遺伝子に対応する２つの供給源からの転写物の相対存在量を同時に判定する。マイクロアレイ分析を使用したハイブリダイゼーションの小型化スケール（miniaturized scale）は、多数の遺伝子の発現パターンの簡便で迅速な評価を提供する。かかる方法は、１細胞当たり数コピーで発現する希有な転写物を検出するのに必要な感度を有し、発現レベルの少なくとも約２倍の差を再現可能な形で検出することが示されてきた。
【００７３】
対象において、１つ又は複数のタンパク質の発現レベルが直接測定されてもよく、又は代替的な実施形態において、１つ又は複数のタンパク質の発現レベルが対象から得られる検体中で測定されてもよい。本発明の方法により分析される対象から得られる検体が、以前に対象から得られていてもよく、例えば、適切な保管所で貯蔵されていてもよいことが明確にされるべきである。この例において、検体は対象から、本発明の方法とは隔離されて、そしてそれゆえ本発明の方法とは別個に得られたものと考えられる。
【００７４】
対象から得られる検体は、血液検体、又は血液に由来する検体（例えば血清検体又は血漿検体又は血液、血清若しくは血漿検体の画分、血液細胞）、唾液、頬側スワブ、胃液、糞便検体、膀胱洗浄、精液、尿、及び消化管組織検体（例えば胃又は食道組織検体）を含んでいてもよいが、これに限られるものではない。一定の状況において、検体は獲得後に任意の方法、例えば試薬での処置、可溶化、又は研究対象である関係するタンパク質若しくはポリヌクレオチド等の一定の成分の濃縮により操作されてもよい。
【００７５】
一実施形態において、検体は対象から得られる血清検体である。血清は、血液の黄色い液体成分である血漿に由来し、その中で全血中の血液細胞が通常懸濁されている。それは全血液量の約５５％を占める。それはほとんど水（容積で９０％）であり、溶解されたタンパク質、ブドウ糖、凝固因子、無機イオン、ホルモン及び二酸化炭素を含有する。血漿は、遠心分離機で新鮮血液の試験管を、試験管の底に血液細胞が落ちるまで回転させることで調製される。次に、血漿を注ぎ出すか、又は取り出す。血漿は、好ましくは凝固抑制剤、例えばヘパリン又はＥＤＴＡを添加され、約１．０２５ｋｇ／１の密度を有する。血清は、フィブリノーゲン又は他の凝固因子を有さない血漿（すなわち、全血から細胞及び凝固因子の両方を除いたもの）である。
【００７６】
一実施形態において、検体は対象から得られる組織検体である。例えば、組織検体は、腫瘍から採取された生検材料であってもよい。組織検体は、固定されて無期限に又は分析が行われるまで貯蔵されてもよい。検体から採取された組織切片は、組織学的分析のため及び上述のアッセイを行い、検体中に存在するバイオマーカータンパク質のレベルを判定するために染色され得る。或いは、ＲＮＡを対象から得られる組織検体から抽出してもよく、このＲＮＡを上述のアッセイにかけて、検体中に存在するバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを判定する。検体が組織検体である例において、理想的には、隣接する正常胃組織の検体が比較のために得られるものと考えられる。
【００７７】
１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを対象において、又は対象から得られる検体において測定したならば、その発現レベルをそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する。特定のバイオマーカーの基準発現レベルは、既知の胃癌（ＧＣ）状態と関連するバイオマーカーの発現のレベル、すなわち、ＧＣに罹患していない対象（本発明の文脈においては「正常」対象）において見出されることが知られている発現のレベルである。それぞれのバイオマーカーの基準発現レベルは、少なくとも１体の正常対象に由来してもよく、好ましくは正常対象の平均（例えばｎ＝２から１００以上）に由来し、この１体又は複数の対象にＧＣの既往歴はない。それぞれのバイオマーカーの基準発現レベルは、ＧＣ罹患が疑われる対象からの１つ又は複数の正常検体からも得られ得る。例えば、それぞれのバイオマーカーの基準発現レベルは、少なくとも１つの正常検体から得られてもよく、好ましくは正常検体の平均（例えばｎ＝２から１００以上）から得られ、対象はＧＣ罹患が疑われる。
【００７８】
いくつかの実施形態において、１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルは、１つ又は複数の正常検体に由来する基準発現レベルと比較して、試験される検体において増加してもよい。いくつかの実施形態において、１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルは、１つ又は複数の正常検体に由来する基準発現レベルと比較する際に、試験される検体において減少してもよい。これは、下でさらに詳細に記述する。
【００７９】
上述のとおり、本発明の方法は、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程を伴う。これらバイオマーカーの関連遺伝子及びコードされるタンパク質に関する詳細については、国立バイオテクノロジー情報センターのＧｅｎＢａｎｋデータベースからアクセスしてもよい（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。例えば、ヒトＶＤＢＰの遺伝子ＩＤ番号は２６３８、ヒトクラスタリンは１１９１、ヒトＩＧＦＡＬＳは３４８３、及びヒトアファミンは１７３である。これらＧｅｎＢａｎｋ登録の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
翻訳段階で１つ又は複数の前述のバイオマーカーの発現のレベルを測定すること、例えばタンパク質それ自体のレベルを測定することを要する本発明の実施形態において、それぞれのバイオマーカーによりコードされるアミノ酸配列の詳細についてもまた、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからアクセスできる。例えば、ヒトＶＤＢＰ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００５７４．２（変異体１）、ＮＰ＿００１１９１２３５．１（変異体２）及びＮＰ＿００１１９１２３６．１（変異体３）により表される３つのタンパク質変異体をコードする。ヒトクラスタリン遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１８２２．３により表されるタンパク質をコードする。ヒトＩＧＦＡＬＳ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１３９４７８．１（変異体１）及びＮＰ＿００４９６１．１（変異体２）により表される２つのタンパク質変異体をコードする。最後に、ヒトアファミン遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１１２４．１により表されるタンパク質をコードする。或いは、それぞれのバイオマーカーによりコードされるアミノ酸配列の詳細については、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）からアクセスでき、ヒトＶＤＢＰタンパク質（それぞれの変異体を含む）のＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤはＰ０２７７４、ヒトクラスタリンタンパク質はＰ１０９０９、ヒトＩＧＦＡＬＳはＱ８ＴＡＹ０（変異体１及び２）及びＰ３５８５８（変異体２）、及びヒトアファミンタンパク質はＰ４３６５２である。
【００８１】
転写段階で１つ又は複数の前述のバイオマーカーの発現のレベルを測定すること、例えば対応する遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定することを要する本発明の実施形態において、転写ヌクレオチド配列（複数可）の詳細についてもまた、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからアクセスできる。例えば、ヒトＶＤＢＰ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００５８３．３（変異体１）、ＮＭ＿００１２０４３０６．１（変異体２）及びＮＭ＿００１２０４３０７．１（変異体３）により表される３つの変異体へと転写される。ヒトクラスタリン遺伝子もまた、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１８３１．３（変異体１）、ＮＲ＿０３８３３５．１（変異体２）及びＮＲ＿０４５４９４．１（変異体３）により表される３つの変異体へと転写される。しかしながら、転写物変異体１のみが、機能性タンパク質をコードする。ヒトＩＧＦＡＬＳ遺伝子もまた、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１４６００６．１（変異体１）、ＮＭ＿００４９７０．２（変異体２）及びＮＲ＿０２７３８９．１（変異体３）により表される３つの変異体へと転写される。しかしながら、第３の変異体は、機能性タンパク質をコードしない。最後に、ヒトアファミン遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１１３３．２により表されるヌクレオチド配列へと転写される。
【００８２】
２つ上の段落について、ＶＤＢＰ、クラスタリン、ＩＧＦＡＬＳ及びアファミンへの言及が、これらバイオマーカーの天然に存在する変異体への言及を含むことが明確にされるべきである。この点に関して、バイオマーカーの「変異体」は、ネイティブのバイオマーカーと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、又は少なくとも９９．９％同一のアミノ酸又は核酸配列を示してもよい。いくつかの実施形態において、ネイティブのバイオマーカーの変異体は、ネイティブの生物学的活性又はそれとの実質的な等価性を維持していてもよい。いくつかの実施形態において、変異体は実質的な生物学的活性を有さなくてもよく、例えば生物学的に活性なバイオマーカーの前駆体である変異体であってもよい。ＶＤＢＰ、クラスタリン、ＩＧＦＡＬＳ及びアファミンの天然に存在する変異体の例は、上で述べた。
【００８３】
本明細書において使用される「対象」なる用語は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、シカ、ブタ、げっ歯類動物、及びＧＣに罹患することが知られている任意の他の動物を含む、任意の動物（例えば哺乳類）を指し、これらに限られるものではない。したがって、ヒトアミノ酸及びｍＲＮＡ配列について上で言及した一方で、本発明の方法がヒトに限られるものではないことが認められるべきである。様々な種についての具体的なタンパク質及びそれと関連するアミノ酸及びｍＲＮＡ配列の詳細については、ＧｅｎＢａｎｋ及びＵｎｉＰｒｏｔデータベースから容易にアクセスし得る（例えば、ハツカネズミ（Mus musculus）ＶＤＢＰの遺伝子ＩＤは１４４７３、クラスタリンは１２７５９、ＩＧＦＡＬＳは１６００５、アファミンは２８０６６２である）のであり、又は配列はＢＬＡＳＴ検索により同定されてもよい。いくつかの例において、１つの種においてタンパク質／遺伝子発現を測定するために使用してもよいプライマー、プローブ又は抗体はまた、無関係の種について使用してもよい。
【００８４】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーはＶＤＢＰであってもよく、例えばヒトＶＤＢＰを含む。いくつかの実施形態において、ＶＤＢＰの発現レベルを測定することは、例えば上で詳細に述べた方法を使用することにより、対象におけるＶＤＢＰタンパク質又はｍＲＮＡのレベルを測定することを含む。
【００８５】
本発明者らは、ＶＤＢＰの基準発現レベルより低い、対象におけるＶＤＢＰの発現レベルは、対象におけるＧＣ示すか、又は対象がＧＣの発症に感受性を有することを示すことを見出した。ＶＤＢＰを含む本明細書において言及されるバイオマーカーの発現レベルに関する、本明細書における「より低い」への言及は、翻訳（タンパク質）段階であるか転写（ｍＲＮＡ）段階であるかにかかわらず、例えば、基準発現レベルと比較してバイオマーカーの発現レベルの少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、５倍、５．１倍、５．２倍、５．３倍、５．４倍、５．５倍、５．６倍、５．７倍、５．８倍、５．９倍、６．０倍、１０倍、２０倍、５０倍、又は１００倍の減少を意味することを意図している。
【００８６】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーはクラスタリンであってもよく、例えばヒトクラスタリンを含む。いくつかの実施形態において、クラスタリンの発現レベルを測定することは、例えば上で詳細に述べた方法を使用することにより、対象におけるクラスタリンタンパク質又はｍＲＮＡのレベルを測定することを含む。
【００８７】
本発明者らは、クラスタリンの基準発現レベルより低い、クラスタリンの発現レベルは、対象におけるＧＣを示すか、又は対象がＧＣの発症に感受性を有することを示すことを見出した。
【００８８】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーはＩＧＦＡＬＳであってもよく、例えばヒトＩＧＦＡＬＳを含む。いくつかの実施形態において、ＩＧＦＡＬＳの発現レベルを測定することは、例えば上で詳細に述べた方法を使用することにより、対象におけるＩＧＦＡＬＳタンパク質又はｍＲＮＡのレベルを測定することを含む。
【００８９】
本発明者らは、ＩＧＦＡＬＳの基準発現レベルより高い、対象におけるＩＧＦＡＬＳの発現レベルは、対象におけるＧＣを示すか、又は対象がＧＣの発症に感受性を有することを示すことを見出した。ＩＧＦＡＬＳを含む本明細書において言及されるバイオマーカーの発現レベルに関する、本明細書における「より高い」への言及は、翻訳（タンパク質）段階であるか転写（ｍＲＮＡ）段階であるかにかかわらず、例えば、基準発現レベルと比較してバイオマーカーの発現レベルの少なくとも１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、２倍、２．１倍、２．２倍、２．３倍、２．４倍、２．５倍、２．６倍、２．７倍、２．８倍、２．９倍、３倍、３．１倍、３．２倍、３．３倍、３．４倍、３．５倍、３．６倍、３．７倍、３．８倍、３．９倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍、又は１００倍の増加を意味することを意図している。
【００９０】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーはアファミンであってもよく、例えばヒトアファミンを含む。いくつかの実施形態において、アファミンの発現レベルを測定することは、例えば上で詳細に述べた方法を使用することにより、対象におけるアファミンタンパク質又はｍＲＮＡのレベルを測定することを含む。
【００９１】
本発明者らは、アファミンの基準発現レベルより低い、アファミンの発現レベルは、対象におけるＧＣを示すか、又は対象がＧＣの発症に感受性を有することを示すことを見出した。
【００９２】
ＧＣにおける前述のバイオマーカーの差次的発現の同定はまた、ＧＣの治療の対象における治療効率の評価方法を可能にする。
【００９３】
したがって、第３の態様において、本発明は、対象における胃癌（ＧＣ）の進行の評価方法を提供し、この方法は、
（ａ）１つ又は複数のバイオマーカーが、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される、対象における１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する工程、
（ｂ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する工程、及び
（ｃ）前記比較に基づいて対象におけるＧＣの進行を評価する工程
を含む。
【００９４】
本発明のいくつかの実施形態において、１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルは、複数の時点で測定される。かかる「逐次」サンプリングは、例えば、胃癌の進行のモニタリングによく適している。逐次サンプリングは、任意の所望のタイムラインで、例えば月毎、四半期毎（すなわち３ヵ月毎）、半年毎、１年毎、２年毎、又はより少ない頻度で実施できる。対象において測定される発現レベルと基準発現レベルとの間の比較を、新たな検体が測定される度に実施してもよく、又はレベルに関するデータはより頻度の少ない分析のために取っておかれてもよい。
【００９５】
本発明の第３の態様の一実施形態において、対象はＧＣの治療を受けている。治療は従来の治療法、例えば化学療法又は放射線療法であってもよく、又は治療は代替的治療法であってもよい。代替的な実施形態において、対象は治療を一切受けていなくてもよい。
【００９６】
本発明の第３の態様のいくつかの実施形態において、バイオマーカーであるＶＤＢＰ、クラスタリン、ＩＧＦＡＬＳ、及び／又はアファミンの発現レベルを測定することは、対象における、又は対象から採取される検体における、ＶＤＢＰ、クラスタリン、ＩＧＦＡＬＳ、及び／又はアファミンタンパク質又はｍＲＮＡのレベルを測定することを含む。いくつかの実施形態において、ＶＤＢＰ、クラスタリン、及び／又はアファミンの基準発現レベルより低い、それぞれのバイオマーカーの発現レベルは、対象におけるＧＣの進行を示す。いくつかの実施形態において、ＩＧＦＡＬＳの基準発現レベルより高い、ＩＧＦＡＬＳの発現レベルは、対象におけるＧＣの進行を示す。
【００９７】
いくつかの実施形態において、本発明の第３の態様による方法を、新薬の臨床試験を実施するために使用してもよく、この薬剤を投与された対象の進行をモニターするために使用してもよい。治療法又は臨床試験は、試験される薬剤を特定の投与計画で投与することを伴う。投与計画は、薬剤の単回投与又は経時的な薬剤の複数回投与を伴っていてもよい。医師又は臨床研究者は、投与期間中、対象に対する薬剤の効果をモニターする。薬剤がＧＣに対して薬理学的影響を及ぼしている場合には、前述のバイオマーカーの発現レベルが、そのタンパク質の基準発現レベルと近似するか、又は同一であると考えられる。したがって、バイオマーカーの発現レベルの傾向を、治療期間中、対象においてモニターできる。１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルは、上で詳細に述べた方法を使用して判定できる。この方法の一実施形態は、薬剤治療期間中、少なくとも２つの異なる時点について、例えば、第１時点と第２時点について、前述のバイオマーカーの発現レベルを判定し、バイオマーカーの発現レベルの変化があれば、それを比較することを伴う。例えば、バイオマーカーの発現レベルは、薬剤投与の前後又は薬剤投与中の２つの異なる時点で測定できる。治療法の効果を、これら比較に基づいて判定する。治療が有効である場合、前述のバイオマーカーの発現レベルが、そのバイオマーカーの基準発現レベルと近似するか、又は同一であると考えられる一方で、治療が有効でない場合には、前述のバイオマーカーの発現レベルは、そのバイオマーカーの基準発現レベルより高い又は低いままであると考えられる。
【００９８】
第４の態様において、本発明は、胃癌の治療に有用な候補治療剤のスクリーニング方法を提供し、この方法は、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルをモジュレートする活性について、候補治療剤をアッセイする工程を含む。
【００９９】
スクリーニングアッセイは、インビトロ及び／又はインビボで実施してもよい。例えば、有望な物質を、細胞ベースのアッセイにおいて、胃癌の治療のための候補治療剤を同定するためにスクリーニングしてもよい。この点に関して、それぞれの有望な物質を、培養細胞（例えば正常対象の消化管から又は胃癌に罹患した対象から得られる細胞、又は正常又は罹患対象に由来する細胞株）とともにインキュベートし、バイオマーカーの発現レベルのモジュレーションを測定する。したがって、本発明の第４の態様の一実施形態において、この方法は、
（ａ）候補治療剤をバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーを発現する細胞に曝露する工程、
（ｂ）前記細胞におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルの変化を測定する工程、及び
（ｃ）対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する工程、
を含み、
バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルが、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと近似するか、又は同一である場合、候補治療剤は対象におけるＧＣの治療に有用である。
【０１００】
別の一例において、候補治療剤は、培養臓器ベースのアッセイにおいてスクリーニングしてもよい。この点に関して、それぞれの有望な物質を、非ヒト動物に由来する臓器全体又は臓器の一部（例えば正常又は罹患対象の消化管の一部）のいずれかとともにインキュベートし、標的バイオマーカーの発現レベルのモジュレーションを測定する。
【０１０１】
スクリーニング方法はまた、有望な治療剤を胃癌に罹患した対象に投与する工程を用いてもよい。したがって、本発明の第４の態様の一実施形態において、この方法は、対象においてバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを測定する工程を含み、発現レベルは、候補治療剤の対象への投与後に測定される。次に、対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルを、バイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと比較する。対象におけるバイオマーカー又はそれぞれのバイオマーカーの発現レベルが、それぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと近似するか、又は同一である場合、候補治療剤はＧＣの治療に有用であると言うことができる。１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルは、上で詳細に述べた方法により測定してもよい。
【０１０２】
本発明の第４の態様のいくつかの実施形態において、候補治療剤は、対象又は細胞におけるＶＤＢＰ、クラスタリン又はアファミンの発現レベルを、それぞれのバイオマーカーの基準発現レベルと近似するか、又は同一であるレベルまで増加させるか、又は、ＩＧＦＡＬＳの発現レベルを、そのバイオマーカーの基準発現レベルと近似するか、又は同一であるレベルまで減少させると考えられる。
【０１０３】
本発明の前述の態様の方法は、バイオマーカーであるＶＤＢＰ、クラスタリン、ＩＧＦＡＬＳ又はアファミンのうちの１つ又は複数の発現レベルが測定されることを要する。しかしながら、ＶＤＢＰ、クラスタリン、ＩＧＦＡＬＳ及び／又はアファミンに加えて、又はそれらと同時に、他のバイオマーカーの発現レベルが測定されてもよいことは、当業者によく理解されると考えられる。例えば、ＧＣにおいて差次的に発現することが知られているバイオマーカーもまた、本発明の方法に組み込まれ得る。
【０１０４】
例えば、本発明者らはまた、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）及びハプトグロビンがＧＣ検体において差次的に発現することを示した。具体的には、ＧＣ検体におけるＡｐｏＥ及びハプトグロビンの発現レベルは、「正常」検体における発現レベルよりも高い。したがって、本発明の方法は、ＶＤＢＰ、クラスタリン、ＩＧＦＡＬＳ又はアファミンのうちの１つ又は複数の発現レベルを測定する工程を、ＡｐｏＥ及びハプトグロビンのうちの１つ又は両方の発現レベルを測定する工程と組み合わせて包含していてもよい。ＡｐｏＥ及びハプトグロビンの発現レベルは、上で詳細に述べた方法を使用して測定できる。
【０１０５】
バイオマーカーであるＡｐｏＥ及びハプトグロビンに関する詳細については、国立バイオテクノロジー情報センターのＧｅｎＢａｎｋデータベースからアクセスしてもよい（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）。例えば、ヒトＡｐｏＥの遺伝子ＩＤ番号は３４８、ヒトハプトグロビンは３２４０である。これらＧｅｎＢａｎｋ登録の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０６】
翻訳段階でバイオマーカーであるＡｐｏＥ及びハプトグロビンの発現のレベルを測定すること、例えばタンパク質それ自体のレベルを測定することを要する本発明の実施形態において、それぞれの遺伝子によりコードされるアミノ酸配列の詳細についてもまた、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからアクセスできる。例えば、ヒトＡｐｏＥ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００００３２．１により表されるタンパク質をコードし、ヒトハプトグロビン遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５１３４．１（変異体１）及びＮＰ＿００１１１９５７４１．１（変異体２）により表される２つのタンパク質変異体をコードする。或いは、これらバイオマーカーのそれぞれによりコードされるアミノ酸配列の詳細については、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）からアクセスでき、ヒトＡｐｏＥタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔ  ＩＤはＰ０２６４９、ヒトハプトグロビンタンパク質はＰ００７３８である。
【０１０７】
転写段階でバイオマーカーであるＡｐｏＥ及びハプトグロビンの発現のレベルを測定すること、例えば対応する遺伝子のｍＲＮＡレベルを測定することを要する本発明の実施形態において、転写ヌクレオチド配列（複数可）の詳細についてもまた、ＧｅｎＢａｎｋデータベースからアクセスできる。例えば、ヒトＡｐｏＥ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００００４１．２により表されるヌクレオチド配列へと転写される。ヒトハプトグロビン遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００５１４３．３（変異体１）及びＮＭ＿００１１２６１０２．１（変異体２）により表される２つの変異体へと転写される。
【０１０８】
第５の態様において、本発明は、対象における胃癌（ＧＣ）を診断するための、対象がＧＣの発症に感受性を有するかどうかを判定するための、又は対象におけるＧＣの進行を評価するためのキットを提供する。キットは、１つ又は複数のバイオマーカーが、ビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）、クラスタリン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）、及びアファミンからなる群から選択される、対象における１つ又は複数のバイオマーカーの発現レベルを測定する手段を含む。
【０１０９】
一実施形態において、キットは、固体支持体、例えばチップ、センサー、マイクロタイタープレート又は捕捉試薬が付着されたビーズ若しくは樹脂を含み、捕捉試薬は、本発明のバイオマーカーのうちの１つに対応するタンパク質に結合する。したがって、例えばキットは、ＳＥＬＤＩのための質量分析プローブ、例えばＰｒｏｔｅｉｎＣｈｉｐ（登録商標）アレイ、又は多用途ファイバーベースＳＰＲ検出装置を含み得る。生体分子特異的捕捉試薬の場合、キットは、反応表面を有する固体支持体、及び生体分子特異的捕捉試薬を含む容器を含み得る。
【０１１０】
一実施形態において、キットはまた、洗浄溶液又は洗浄溶液作製のための指示書を含み得るのであり、捕捉試薬及び洗浄溶液の組合せは、続いて例えば質量分析により検出するための、固体支持体上での１つ又は複数のバイオマーカータンパク質の捕捉を可能にする。キットは、複数のタイプの吸着剤を含んでいてもよく、それぞれが異なる固体支持体上に存在する。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、かかるキットは、ラベル又は別個の挿入物の形態で、好適な操作パラメータのための指示書を含み得る。例えば指示書は、消費者に検体の収集方法、プローブの洗浄方法又は検出される１つ又は複数の特定のバイオマーカータンパク質について伝えてもよい。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、キットは、それぞれのバイオマーカーについて基準発現レベルを示し、したがって校正の基準として使用されるべき検体を伴う、１つ又は複数の容器を含み得る。
【０１１３】
明瞭さと理解を目的として本発明がある程度詳細に述べられた一方で、本明細書に記載の実施形態及び方法に対する様々な修正及び変更が、この明細書に開示された本発明の概念の範囲を逸脱することなくなされ得ることは、当業者にとって明らかであると考えられる。
【０１１４】
最後に、本発明に包含される基本的手法を実施する方法を含む分子生物学の標準的教科書に言及する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２００１年を参照のこと。
【０１１５】
本発明を、以下の実施例においてさらに例証する。実施例は、特定の実施形態のみを記述することを目的とし、上の記述に関して限定することを意図してはいない。
【実施例１】
【０１１６】
胃癌のバイオマーカーの同定
本発明者らは、ｇｐ１３０Ｆ／Ｆ遺伝子組換えマウス（genetically engineered mouse：ＧＥＭ）をバイオマーカー発見のための炎症関連胃癌（ＧＣ）モデルとして利用し、ヒト検体でこれをバリデートした。上で示したように、ｇｐ１３０Ｆ／Ｆマウスは、胃の腺部に自然発症的に再現性良く腺腫を発症し、かかる腺腫は、ピロリ菌への慢性感染により生じるヒトにおける腸型ＧＣと関連する進行性の組織学的特徴のすべてを示す。ｇｐ１３０Ｆ／Ｆマウスは、サイトカイン受容体ｇｐ１３０に調節性チロシン残基のフェニルアラニン（Ｆ）置換突然変異を有するので、インターロイキン−６（ＩＬ−６）及びインターロイキン−１１（ＩＬ−１１）を含む同族ｇｐ１３０受容体リガンドに対し、過剰なＳｔａｔ３シグナリングで応答する。したがって、ｇｐ１３０Ｆ／Ｆマウスにおける胃腫瘍形成の開始及び進行は、複合ｇｐ１３０Ｆ／Ｆ；Ｓｔａｔ３＋／−（ＦＦＳｔａｔ３）マウスにおいてＳｔａｔ３の発現に遺伝的制約を課すことにより抑制される。驚くべきことに、ＩＬ６の遺伝子除去は、対応するｇｐ１３０Ｆ／Ｆ；Ｉｌ６−／−（ＦＦＩＬ６）マウスにおける胃腫瘍形成に影響することなく、ｇｐ１３０Ｆ／Ｆマウスの汎炎症性表現型特性を選択的に正常化する。こうしたものとして、様々なｇｐ１３０Ｆ／Ｆ複合突然変異体は、炎症関連胃腫瘍形成の遺伝的解剖を可能にし、ＩＬ６により誘発される全身性の炎症急性期反応は、様々な病変と同時発生する。
【０１１７】
材料と方法
ＧＥＭモデル
動物を伴うすべての実験が、ラドウィグ癌研究所倫理委員会により承認された。ｇｐ１３０Ｆ／Ｆ（ＦＦ）、ｇｐ１３０Ｆ／Ｆ；Ｉｌ６−／−（ＦＦＩＬ６）、ｇｐ１３０Ｆ／Ｆ；Ｓｔａｔ３＋／−（ＦＦＳｔａｔ３）、Ｉｌ６−／−（ＩＬ６）、及びｇｐ１３０Ｆ／Ｆ；Ｉｌ１１ｒα−／−（ＦＦＩＬ１１Ｒａ）ＧＥＭの作製が、以前に記述されている（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＢＪら、２００５年、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １１：８４５〜８５２頁；Ｔｅｂｂｕｔｔ  ＮＣら、２００２年、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８：１０８９〜１０９７頁；Ｊｕｄｄ  ＬＭら、２００９年、Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ２１７：５５２〜５６２頁；Ｅｒｎｓｔ  Ｍら、２００８年、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１８：１７２７〜３８頁を参照のこと）。突然変異を欠く年齢適合同腹仔を野生型（ＷＴ）として示す。１２〜１４週齢の顎下放血により、Ｍｉｃｒｏｖｅｔｔｅ  ５００血清ゲルチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、ニュンブレヒト、ドイツ）へと直接血液を収集した。検体を室温で３０分間静置した後に６，６００ｘｇで５分間の遠心分離にかけ、血清を得た。血清上清を約１００μＬの容積へと分注し、すぐに−８０℃で貯蔵した（一次アリコート）。ある時、検体を氷上で解凍し、２０μＬの容積へと再分注し、−８０℃で再凍結した（二次アリコート）。ウエスタンブロッティングに適用するため、二次アリコートを氷上で解凍し、超純水で１／７０に希釈し、約７μｇの総血清タンパク質を含有する６．５μＬの容積に分注し、−８０℃で再凍結した（三次アリコート）。
【０１１８】
ヒト研究集団
ヒトを伴うすべての実験が、ピーターマッカラム癌研究所及びアデレード大学の倫理委員会により承認された。腸型胃腺癌（ローレン分類）に罹患した１１人の手術前ＧＣ患者からの血清を、ピーターマッカラム癌研究所組織バンクをとおして入手し、１００μＬの一次アリコートに−８０℃で貯蔵した。Ｖａｃｕｔｔｅ  Ｚ  Ｓｅｒｕｍ  Ｓｅｐ  Ｃｌｏｔ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒチューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ、フリッケンハウゼン、ドイツ）を使用して、消化管疾患が報告されていない１３人の健常ボランティアから対照血清を収集した。血清を室温で２０〜４０分間凝固させた後に、１，８００×ｇで１０分間の遠心分離にかけた。血清上清を４００μＬの容積に分注し（一次アリコート）、−８０℃で貯蔵した。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びウエスタンブロッティングによるベリフィケーションを目的として、マウス血清と同様に、ヒト血清の二次及び三次調製物を作製した。２４人のヒト対象の個体群統計学的情報を表１に提供する。
【０１１９】
【表１】
2015505370.tif 000002
【０１２０】
高存在量血清タンパク質の枯渇及び２Ｄ  ＤＩＧＥ
製造者の推奨に軽微な修正を加えてマルチプルアフィニティ除去システム（ＭＡＲＳ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、サンタクララ、ＣＡ）を使用して、アルブミン、トランスフェリン及びＩｇＧをマウス血清から枯渇させた。簡潔に述べると、この研究で利用されたＧＥＭマウスが比較的多数（ｎ＝３８）であったため、血清検体を、実験１（３×ＷＴ、４×ＩＬ６、４×ＦＦＳｔａｔ３、４×ＦＦ及び４×ＦＦＩＬ６）及び実験２（４×ＷＴ、３×ＩＬ６、４×ＦＦＳｔａｔ３、４×ＦＦ及び４×ＦＦＩＬ６）と示す２群に分けた。マルチプルアフィニティ除去クロマトグラフィー（ＭＡＲＳ）枯渇及び２Ｄ  ＤＩＧＥを、実験１及び実験２について別々に実施した。
【０１２１】
血清の二次アリコート（２０μＬ）をＭＡＲＳ緩衝液Ａ（９０μＬ）で希釈し、０．２２μｍ遠心装置（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して濾過した。Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  １０９０  ＨＰＬＣシステムを使用して、ＭＡＲＳ−Ｍ３カラム（４．６×１００ｍｍ）に注入された１００μＬの希釈血清で、０．５ｍＬ／ｍｉｎでクロマトグラフィーを実施した。器具方法は以下のとおりであった。すなわち、０〜１０分、０．５ｍＬ／ｍｉｎで１００％緩衝液Ａ；１０．０１〜１７分、１ｍＬ／ｍｉｎで１００％緩衝液Ｂ；１７．０１〜２８分、１ｍＬ／ｍｉｎで１００％緩衝液Ａ。フロースルーのピーク（２ｍＬ）を氷上で収集し、冷たい１００％アセトン（８ｍＬ）をすぐに添加した。アセトン中の画分を、−２０℃で５日間まで維持し、その後タンパク質を遠心分離（５，０００×ｇ、１０分間、１０℃）で回収した。タンパク質ペレットを、冷たい８０％アセトン（１０ｍＬ）で一度洗浄し、ＴＵＣ４％緩衝液（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、３０ｍＭトリス、４％ＣＨＡＰＳ；５００μＬ）で再可溶化し、−２０℃で１週間まで貯蔵した。検体をさらに脱塩し、等電点電気泳動（isoelectric focusing：ＩＥＦ）との適合性を保証するため、枯渇血清検体を解凍し、１０ｋＤａＭＷＣＯ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ５００遠心装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）を使用して、ＴＵＣ４％中で２ラウンドの緩衝液交換にかけた。最終検体はＴＵＣ４％で約２００μＬまでとし、Ｈｏｒｉｂａ  Ｔｗｉｎ  Ｃｏｎｄ伝導率計（モデルＢ−１７３、Ｈｏｒｉｂａ、京都、日本）を使用して伝導性を評価し、レベルが３００μＳ未満であることを確認した。製造者の推奨に従い、ＥＺＱアッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、ＣＡ）により、検体のタンパク質濃度を判定した。
【０１２２】
凍結乾燥された２５ｎｍｏｌ  ＤＩＧＥ  ＦｌｕｏｒミニマルＣｙ２、Ｃｙ３及びＣｙ５  ＣｙＤｙｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、１２５μＬ  無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ）中に再懸濁し、２００ｐｍｏｌ／μＬストック溶液を作製した。ストックをねじ口チューブに分注し（１μＬ）、アルゴン下、−８０℃で、＞１２ヵ月間、感知できるほどの感度の損失なしに貯蔵した。標識化が必要な際には、７０μｇのタンパク質を含有する適切な容積の個々の枯渇血清検体を、Ｃｙ３及びＣｙ５アリコートに直接添加した（２００ｐｍｏｌ／７０μｇの色素／タンパク質比）。潜在的な色素関連バイアスを制御するため、生物学的複製物の色素スワップを実施した。特定の実験に含まれる検体からの３５μｇのタンパク質をプールする（軽微な例外あり）ことにより、２つの実験のそれぞれについて別々の内部標準を調製した（結果セクションを参照のこと）。内部標準を、２００ｐｍｏｌ色素／７０μｇタンパク質の比でＣｙ２で標識化した。標識化反応を氷上で３０分間暗い中で実施し、２００ｐｍｏｌの色素当たり１μＬの１０ｍＭリシンを添加して消光した。適切なＣｙ３及びＣｙ５検体を、７０μｇの内部標準及び十分な量のＴＵＣ４％と混合し、検体を等容積とした（補足表１及び２を参照のこと）。ジチオトレイトール（ＤＴＴ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びｐＨ４〜７の担体両性電解質（ＩＰＧ緩衝液、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）もまた添加し、最終検体が２１０μｇタンパク質、７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、３０ｍＭトリス、４％ｗ／ｖ  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、０．５％ｖ／ｖ両性電解質を含有するようにし、微量のブロモフェノールブルーを着色のため加えた。１０ｋＤａ分子量カットオフＶｉｖａｓｐｉｎ  ５００遠心装置（５〜１０分、８，２００×ｇ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、検体容積を約１５０μＬまで減らし、その後、４５０μＬの再水和緩衝液（０．５％ｖ／ｖ両性電解質、１．２％ｖ／ｖ  ＤｅＳｔｒｅａｋ試薬［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］及び微量のブロモフェノールブルーを含有するＴＵＣ４％）中で一晩再水和させた２４ｃｍ  ４〜７  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  ＤｒｙＳｔｒｉｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にカップローディングした。必要なＣｙ３、Ｃｙ５及びＣｙ２検体を、電気泳動分離のため混合した。ＩＰＧｐｈｏｒ  ＩＩ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、一次元でのＩＥＦを全７０，０００ボルトアワー実施した。
【０１２３】
ＩＥＦ後にストリップを還元緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．８、６Ｍ尿素、３０％ｖ／ｖグリセロール、２％ｗ／ｖ  ＳＤＳ、１％ｗ／ｖ  ＤＴＴ）中で１５分間、次にアルキル化緩衝液（上のものにＤＴＴの代わりに２．５％ｗ／ｖのヨードアセトアミド（ＩＡＡ）を伴う）中で平衡化した。市販のカソード緩衝液（Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）中の１％ｗ／ｖ低融点アガロースの融解溶液を使用して、ストリップを２ＤＧｅｌ  ＤＡＬＴ  ＮＦ  １２．５％プレキャストゲル（Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、ハイデルベルク、ドイツ）の上部にシールした。蛍光標識化ＥＣＬ  Ｐｌｅｘ  Ｒａｉｎｂｏｗマーカー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を選択した少数のゲル上に含めた。ＥｔｔａｎＤＡＬＴ  １２ユニット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、アノード及びカソード緩衝液（Ｓｅｒｖａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）の存在下、２５℃で、以下の３段階プログラムを使用して、二次元でのタンパク質分離を実施した。すなわち、（１）５０Ｖ；５ｍＡ／ゲル、１時間、（２）１００Ｖ；１０ｍＡ／ゲル、１時間、（３）２５０Ｖ；３０ｍＡ／ゲル、１４時間。Ｅｔｔａｎ  ＤＩＧＥ  Ｉｍａｇｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１００μｍの解像度で、以下の露光を使用して、ゲルをスキャンした。すなわち、Ｃｙ２チャンネル、０．４秒；Ｃｙ３チャンネル、０．０７秒；Ｃｙ５チャンネル、０．１秒。スキャンされたゲルを、固定せずに−８０℃で、スポットピッキングで必要とされるまで貯蔵した。
【０１２４】
比較画像分析
ＤｅＣｙｄｅｒ  ２Ｄソフトウェア（バージョン６．５及び７．０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、画像分析を行った。ＤｅＣｙｄｅｒのゲル内変動解析（Differential In-gel Analysis：ＤＩＡ）モジュールでそれぞれのゲル画像を別々に処理し、その後生物学的変動解析（Biological Variation Analysis：ＢＶＡ）へとエクスポートした。ボリューム＜３０，０００のスポットを排除する除外フィルターを用いて、推定１０，０００スポットに基づくＤＩＡスポット検出を実施した。バックグラウンド減算及びゲル内正規化をソフトウェアで自動的に実行した。ＤＩＡワークスペースを、マスターゲルに対するマニュアルでのスポットマッチングのためＢＶＡへとインポートした。タスクをソフトウェアで実施した際に効果的にマッチングされない多数のスポット列ゆえに、マニュアルでのスポットマッチングが必要であった。スポット同一性の一貫性を保証するため、実験１及び２に同じユーザー定義のマスターゲルを使用した。実験１においては、マスターゲルもまた分析用ゲルを構成した。実験２においては、マスターゲルをＢＶＡへとこの目的のためだけにエクスポートし、統計分析には含めなかった。
【０１２５】
ＤｅＣｙｄｅｒの拡張データ解析（Extended Data Analysis：ＥＤＡ）モジュール（バージョン７．０）を使用して、＞７０％のゲルで検出されたスポットに基づき、階層クラスタリング及び主成分分析（principal component analysis：ＰＣＡ）による多変量統計的検定を実施した。一変量統計的検定のため、マッチングされたスポットの正規化されたボリュームを、ＤｅＣｙｄｅｒからＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、レッドモンド、ＷＡ）へとエクスポートした。標準化された存在量値（本明細書において「スポットボリューム」と呼ぶ）を、それぞれのゲルについてＣｙ３及びＣｙ５チャンネルのスポットボリュームをＣｙ２チャンネルで割ることにより算出した。次に、所定の比較内でそれぞれの群についてスポットボリュームをｌｏｇ１０変換し、データを正規分布させ、それぞれのスポットの標準偏差（standard deviation：ＳＤ）を計算した。ｌｏｇ１０変換スポットボリュームに基づき、Ｅｘｃｅｌでステューデントの独立両側Ｔ検定も実施し、Ｐ値をＤｅＣｙｄｅｒにより得られたものと相互参照し、それらが等価であることを確認した。Ｐｉｆａｃｅ（バージョン１．６４、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｓ．ｕｉｏｗａ．ｅｄｕ／〜ｒｌｅｎｔｈ／Ｐｏｗｅｒ／で入手可能）を使用して、それぞれの比較について事後検定力計算（post-hoc power calculation）（Ｌｅｎｔｈ  ＲＶ、２００７年、Ｊ．  Ａｎｉｍ．  Ｓｃｉ．  ８５：Ｅ２４〜２９頁）を、以前に記述されたように実施した（Ｐｅｎｎｏ  ＭＡら、２００９年、Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ８：２８１２〜２８２６頁）。簡潔に述べると、検討されたそれぞれの群について、マッチングされたスポットボリュームのすべての標準偏差の７５％パーセンタイル値を、σの尺度として使用し（Ｋａｒｐ  ＮＡ及びＬｉｌｌｅｙ  ＫＳ、２００５年、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、５：３１０５〜３１１５頁）、有意水準を０．０１に設定し（α）、必要な検定力は８０％であり、生物学的複製物の数はそれぞれの群に固有であった（ｎ）。結果として得られるエフェクトサイズを累乗してｌｏｇ１０変換を元に戻し、そのことで、比較された群の平均スポットボリュームが有意に異なるとみなされ得る最小倍変化（fold-change）を提供した。多重仮説検定の問題を考慮し（Ｋａｒｐ  ＮＡら、２００７年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、６：１３５４〜１３６４頁）、スコットランド生物数学・統計学研究所（Biomathematics and Statistics Scotland）のＧｒａｈａｍ  Ｈｏｒｇａｎ博士が開発したＥｘｃｅｌスプレッドシート（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｏｗｅｔｔ．ａｃ．ｕｋ／〜ｇｗｈ／ｑｖａｌ．ｘｌｓよりダウンロード）を使用して、それぞれのマッチングされたスポットについてｑ値を決定した。所定の比較についてＰ値をスプレッドシートにエクスポートし、Ｓｔｏｒｅｙ  ＪＤ及びＴｉｂｓｈｉｒａｎｉ  Ｒ、２００３年（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１００：９４４０〜９４４５頁）の式に基づいてｑ値を計算した。
【０１２６】
差次的に発現したスポットであると認められるには、４つの基準を満たす必要があった。すなわち、
１．スポットは、スポットマップの＞７０％上に存在することを要した（すなわち≧２７／３８）。５１２個のスポットがこの基準を満たし、続く分析において検討された。
２．スポットは、所定の比較についてｌｏｇ１０変換スポットボリュームに基づき、ステューデントの独立両側Ｔ検定Ｐ値＜０．０１を有することを要した。
３．スポットボリュームにおける判定された倍変化が、事後検定力計算による判定で、比較１について＞２．１のマグニチュード、比較２についても＞２．１、比較３については＞１．８であることを要した。倍変化は、ｌｏｇ１０変換ボリュームではなく、平均スポットボリュームに基づいて計算した。１未満の発現値（すなわち、比較において他の群に対してある群でスポットがダウンレギュレートされている）を割って−１とし、その変化を反映させた。
４．スポットは、多重仮説検定に関連する高い偽発見率を制御するため、ｑ値＜０．０１を有することを要した。
【０１２７】
２Ｄ  ＤＩＧＥデータの受信者動作特性（ＲＯＣ）分析によるさらなる統計的検定をＥｘｃｅｌで実施した。
【０１２８】
タンパク質同定
ＤｅＣｙｄｅｒで生成されたピックリストに基づき、Ｅｔｔａｎ  Ｓｐｏｔ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｒｏｂｏｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、目的のスポットを分析用ゲルから切除した。一晩トリプシン（２０μＬの５ｍＭ重炭酸アンモニウム、１０％アセトニトリル［ＡＣＮ］中の１００ｎｇのシークエンシンググレード修飾トリプシン［Ｐｒｏｍｅｇａ、フィッチバーグ、ＷＩ］）で消化するために、２〜６個のゲルからプラグをプールした。ＨＰＬＣ−Ｃｈｉｐ  Ｃｕｂｅに格納されたＰｒｏｔｅｉｎ  ＩＤ  Ｃｈｉｐカラムアセンブリ（０．０７５×４３ｍｍ  Ｃ−１８分析カラムを伴う４０ｎＬトラップカラム）を備えた１１００  ＨＰＬＣシステム（すべてＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、抽出したトリプシンペプチドを分離した。これは、正イオンモードで動作するＨＣＴ  Ｕｌｔｒａ  ３Ｄ−Ｉｏｎ−Ｔｒａｐ質量分析計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ビルリカ、ＭＡ）に直接接続された。０．１％ＦＡ、３％ＡＣＮ、０．５μＬ／ｍｉｎでカラムを平衡化し、ＡＣＮ勾配で検体を溶出した（３２分にわたり３％〜３１％）。イオン化種（ionizable species）（３００＜ｍ／ｚ＜１，２００）をトラップし、その時点で溶出した最も強度の高いイオンの１つ又は２つを、衝突誘起解離により断片化した。前駆イオンを除外するため、２つのスペクトルを得た後３０秒間、積極的除外（active exclusion）を使用した。ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ（バージョン３．４、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用して、ＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルをピーク検出及びデコンボリューションにかけた。ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ質量リストをＢｉｏＴｏｏｌｓ（バージョン３．１、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）にエクスポートし、次にＭａｓｃｏｔ（バージョン２．２）に提示した。検索諸元は次のとおりだった。すなわち、データベース＝ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  ５６．４、分類＝哺乳類（６３８２６配列）、酵素＝トリプシン、固定修飾＝システインのカルバミドメチル化、可変修飾＝メチオニンの酸化、ペプチド質量許容誤差＝±０．３Ｄａ、断片質量許容誤差＝±０．４Ｄａ、切れ残り（missed cleavages）＝１、及びペプチド電荷＝１＋、２＋及び３＋。指定の閾値を超えるイオンスコアを有する少なくとも２つのマッチングペプチドを有するかどうかに基づき、タンパク質同定を行った。トリプシンとのマッチ及び混入ヒトケラチンは無視した。タンパク質同定において重複性が観察された際、例えば、異なるタンパク質アイソフォームが同一質量のリストとマッチした際には、全長配列に対応する最も好適なデータベースエントリー及び／又は付加質量がタンパク質のアイソフォーム特異的領域にマッチしたエントリーのみが検討された。スポット内に複数のタンパク質が同定された際には、最大ｅｍＰＡＩスコアを有するエントリーのみが、スポットの主要成分として、それゆえその差次的調節に寄与する可能性が高いものとして検討された（Ｉｓｈｉｈａｍａ  Ｙら、２００５年、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、４：１２６５〜１２７２頁）。ＵｎｉＰｒｏｔのＢＬＡＳＴ機能（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｂｌａｓｔ／）を使用して、マウスタ��パク質のヒトホモログを同定した（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、２０１１年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３９：Ｄ２１４〜２１９頁）。
【０１２９】
ウエスタンブロッティング
６．５μＬの希釈血清を含有する三次アリコートを、２．５μＬのＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（４Ｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１μＬの０．５Ｍ  ＤＴＴと混合した。検体を９５℃で５分間加熱し、次に１レーン当たり１０μＬの容積をＮｕＰＡＧＥ  Ｎｏｖｅｘ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｇｅｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上にロードした。さらなるバリデーションのために選ばれた１０個のマウス検体を単一ゲル上に流し、１回の実験で分析されたクラスタリンを除いて、結果を２回のテクニカル反復によりバリデートした。２４個のヒト検体を、３つの別々のゲル上に同時に流し、それぞれのゲルが、同数のＧＣ患者検体及び年齢（可能な場合）／性別適合対照を含んでいた。ゲルは、２００Ｖで５０分間、ＮｕＰＡＧＥ  ＭＯＰＳ  ＳＤＳ  Ｒｕｎｎｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で流し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  ＰＶＤＦ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビルリカ、ＭＡ）に１５Ｖで５０分間、Ｔｏｗｂｉｎ緩衝液（０．０２５Ｍトリス、０．１９２Ｍグリシン、２０％メタノール）でトランスファーした。トランスファー後、ＡｍｉｄｏＢｌａｃｋ染色溶液（１０％（ｖ／ｖ）酢酸中の０．１％（ｗ／ｖ）アミドブラック［ナフトールブルーブラック、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］）で膜を染色し、メタノール中で脱染する前にデジタルスキャンした。次に、膜を５％脱脂乳で１時間、室温でブロッキングし、一晩４℃で標的タンパク質に対する一次抗体とともにインキュベートした。この研究で使用された６つの一次抗体は次のとおりだった。すなわち、
１．ウサギ抗ヒトアファミン（Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、英国）
２．ウサギ抗マウスアポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）（Ｔｈｅｒｍｏ、ロックフォード、ＩＬ）
３．マウス抗ヒトａｐｏＥ（Ａｂｃａｍ）
４．ウサギ抗ヒトアポリポタンパク質Ｊ（クラスタリン）（Ａｂｃａｍ）
５．ウサギ抗ヒトフィブロネクチン（Ａｂｃａｍ）
６．ウサギ抗ヒトハプトグロビン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）
【０１３０】
一次抗体中での一晩のインキュベーション後に、膜をＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．６）で３回洗浄し、次に１時間、室温で西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体とともにインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体は次のとおりだった。すなわち、（１）ウサギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、ギルバーツビル、ＰＡ）、（２）ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ）、及び（３）ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｔｈｅｒｍｏ）。膜をさらに３回、ＴＢＳ−Ｔで洗浄し、次にＳｉｇｍａ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ又はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ）及び自動記録フィルム（Ａｇｆａ、モルツェル、ベルギー）で検出した。ＩｍａｇｅＪ（国立衛生研究所；ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）又はＩｍａｇｅＱｕａｎｔ  ＴＬ（バージョン７．０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ウエスタンブロットデンシトメトリーを実施した。ゲルローディングにおける電位差を制御するため、目的のバンドの強度を、ＡｍｉｄｏＢｌａｃｋ染色膜上に約２５ｋＤａで現れる免疫グロブリン軽鎖バンドの強度に正規化した。それぞれのタンパク質について、ＧＣ及び非ＧＣ群の正規化強度値の分布をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン５；ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ラホーヤ、ＣＡ）にエクスポートし、ノンパラメトリックマン−ホイットニー検定をＰ＜０．０５の有意性閾値で使用して比較した。
【０１３１】
酵素結合免疫吸着アッセイ
製造者の推奨に従い、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を実施した。この研究で使用された９つのＥＬＩＳＡキットは次のとおりだった。すなわち、
１．アファミンＥＬＩＳＡキット（Ｕｓｃｎｋ、ウーハン、中国）
２．ヒトアポリポタンパク質Ｅ  ＥＬＩＳＡ（Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）
３．ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトクラスタリンＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）
４．ＱｕａｎｔｉＭａｔｒｉｘ  ＥＬＩＳＡフィブロネクチンキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ビルリカ、ＭＡ）
５．ハプトグロビンヒトＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ）
６．ヒトアルファ１−抗キモトリプシンＥＬＩＳＡ（Ｋａｍｉｙａ、シアトル、ＷＡ）
７．ビタミンＤ結合タンパク質ＥＬＩＳＡ（Ｋａｍｉｙａ）
８．インスリン様成長因子結合タンパク質酸不安定性サブユニットＥＬＩＳＡキット（Ｕｓｃｎ、中国）
９．糖鎖抗原（ＣＡ）７２−４  ＥＬＩＳＡ、ヒト（Ｋａｍｉｙａ）
【０１３２】
血清タンパク質濃度を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で生成したキット特異的標準曲線から内挿した。結果として得られる血清タンパク質濃度を、対照群においてそれぞれ測定されたタンパク質について得られる平均濃度に対し標準化した。これは、等価な尺度上でのマーカーの候補間比較を容易にした（Ｆａｃａ  ＶＭら、２００８年、ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ．  ５：ｅ１２３頁）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍでマン−ホイットニーＵ検定（両側、有意性閾値Ｐ＜０．０５）及びＲＯＣを実施した。
【０１３３】
結果
ＦＦ突然変異体マウスの生物学的特性
ホモ接合ｇｐ１３０Ｆ／Ｆ突然変異体マウスは、胃の腺部に自然発症的に再現性良く明確な腺腫を発症し、かかる腺腫は、３〜５個の個別の病変として、約４〜６週齢までに組織学的に視覚可能となる。それらは、その後２〜３ヵ月にわたり継続的に成長し、約２５０ｍｇの最大腫瘍組織量をもたらし、それゆえこれらマウスの全体重の０．８〜１％を占める。これら腫瘍は１００％の浸透率で、マウスの遺伝的背景と無関係に生じる。これら病変が、ピロリ菌への慢性的感染から生じるヒトにおける腸型ＧＣと関連する多くの進行性の組織学的特徴を再現することが以前に示されてきた（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＢＪら、２００５年、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １１：８４５〜８５２頁；Ｔｅｂｂｕｔｔ  ＮＣら、２００２年Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ８：１０８９〜１０９７頁；Ｅｒｎｓｔ  Ｍ、Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＢＪ．  ２００４年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  ２０：２３〜３２頁。及びＣｏｒｒｅａ  Ｐら、１９７５年、Ｌａｎｃｅｔ  ２：５８〜６０頁）。したがって、これら病変は同時に、萎縮性胃炎、腸上皮化生及び上皮性形成異常の特徴を示すが、これらが腺癌へと進行するのは稀である。腫瘍形成は、抗菌治療又はＴｏｌｌ受容体介在性シグナリングの遺伝的欠失後に減弱化するので、これらｇｐ１３０Ｆ／ＦＧＥＭは、ヒトにおける早期炎症関連腸型ＧＣの前臨床的にバリデートでされたモデルとなる。
【０１３４】
ｇｐ１３０Ｆ／ＦＧＥＭは、サイトカイン受容体ｇｐ１３０に調節性チロシン残基のフェニルアラニン置換突然変異を有するので、これらマウスは、ＩＬ−６及びＩＬ−１１を含む同族ｇｐ１３０受容体リガンドに対し、過剰なＳｔａｔ３シグナリングで応答する。したがって、ＦＦマウスにおける胃腫瘍形成の開始及び進行は、複合ＦＦＳｔａｔ３マウスにおいて潜在的転写因子であるＳｔａｔ３の発現に遺伝的制約を課すことにより抑制され、遅延させられる（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＢＪら、２００５年、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １１：８４５〜８５２頁）（図１）。驚くべきことに、ＩＬ６の遺伝子除去は、対応するＦＦＩＬ６マウスにおける胃腫瘍形成に影響することなく、ＦＦマウスの汎炎症性表現型特性を選択的に正常化する。同様に、ＦＦＩＬ６の全生存率は、ＦＦマウスのそれと比較して向上し、その腫瘍組織量よりもむしろその汎炎症性反応が生存率を制限するものとなることを示唆する。対照的に、ＦＦＩＬ１１Ｒαマウスは、ＩＬ１１−特異的ＩＬ１１Ｒα受容体サブユニットの発現を欠損しており、それゆえＩＬ１１に応答することができないが、このマウスは胃腫瘍を発症せず、ＦＦＩＬ１１Ｒαマウスの生存率は、対応する能力を有するＩＬ１１Ｒαの生存率と同等のままである。ｇｐ１３０Ｆ／Ｆ；Ｉｌ１１ｒα−／＋においてただ１つのＩｌ１１ｒα対立遺伝子の除去が腫瘍形成を遅延させ、減弱化させたので、ＩＬ１１依存性ｇｐ１３０／Ｓｔａｔ３活性化への薬理学的干渉は、確立した疾患に罹患したＦＦマウスにおける全腫瘍組織量を減少させた［Ｅｒｎｓｔ  ２００８年、データは示さず］。したがって、ＦＦＩＬ６マウスとＦＦＩＬ１１Ｒαマウスの間の表現型の分離は、全身性のＩＬ６介在性炎症性反応とＩＬ１１依存性胃腺腫形成促進との間の遺伝的分離を可能にする。一方で、複合ＦＦＳｔａｔ３マウスにおけるＳｔａｔ３発現の包括的な遺伝的制約は、ＩＬ１１依存性腫瘍形成と、ＩＬ６依存性全身性炎症とを障害する（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ＢＪら、２００５年、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １１：８４５〜８５２頁）。
【０１３５】
ＧＥＭモデルにおけるＧＣの血清バイオマーカーの同定
この研究において用いられるバイオマーカー同定ワークフローは、３つの段階に広くカテゴライズされ得る。発見段階は、胃癌（ＧＣ）モデルである遺伝子組換えマウス（ＧＥＭ）から収集した血清を検査し、差次的に発現するタンパク質を候補血清バイオマーカーとして同定した。第２段階は、ウエスタンブロッティングの半定量的手法を適用し、ＧＥＭモデルにおける候補バイオマーカーのサブセットの差次的発現をベリファイした。第３段階は、ウエスタンブロッティング及び臨床的に関係する診断プラットフォームである定量的ＥＬＩＳＡも使用して、マウスにおいてベリファイされたバイオマーカーをＧＣ患者及び健常対照のヒト血清中で試験した（図２Ａ）。
【０１３６】
発見段階で、ＦＦ／ＦＦＩＬ６遺伝子型を示す１６匹のＧＣ表現型マウス、及びＦＦＳｔａｔ３／ＷＴ／ＩＬ６遺伝子型を示す２２匹の非ＧＣ表現型マウスからのＭＡＲＳ枯渇血清を２Ｄ  ＤＩＧＥにより分析し、３８個のスポットマップが生成された。ＧＣ及び非ＧＣ表現型血清の代表的なスポットマップを図２Ｂに示す。ＤｅＣｙｄｅｒソフトウェアを使用して、全部で５１２個のスポットを、スポットマップの＞７０％にマッチングさせ（すなわち３８個のうち≧２７個）、続く統計分析に含めた。５１２個のマッチングされたスポットボリュームに基づく教師なし階層クラスタリングは、階層の最下位レベルでマウス遺伝子型に基づくクラスターを、より高いレベルでＧＣ対非ＧＣ表現型に基づくクラスターを明らかにした（図２Ｃ）。主成分分析はまた、ＧＣマウスと非ＧＣマウスとの間で明確に二分される、遺伝子型に基づく別のグルーピングを明らかにし（図２Ｄ）、複数のマッチングされたスポットの発現が、ＧＣ表現型と関連付けられることを示唆した。さらに、第１主成分に基づくＧＣ及び非ＧＣ群の顕著な分離は、この表現型が実験内の変異の主要な供給源であることを強調した。
【０１３７】
５１２個のマッチングされたゲルスポットのうち、ＩＬ６介在性急性期反応との関連において調節されたものと、ＧＣに関連するもの（すなわち候補バイオマーカー）とを区別をするためのフィルタリングストラテジーを開発した。このプロセスを、図３に図表で要約する。最初に、複数の突然変異体遺伝子型を研究に含めることにより、５１２個のマッチングされたスポットのボリュームの３つの比較を容易なものとした。第１の比較において、Ｔ検定（Ｐ＜０．０１）、偽発見率の計算（ｑ＜０．０１）及び事後検定力計算（倍変化＞マグニチュード２．１；補足情報１．４節を参照のこと）を使用して、７匹のＷＴマウスのスポットを７匹のＩＬ６マウスと比較した。第２の比較において、比較１について述べたのと同じパラメータを使用して、８匹のＦＦマウスの５１２個のスポットボリュームを８匹のＦＦＩＬ６マウスと比較した。第３の比較において、やはりＴ検定（Ｐ＜０．０１）、偽発見率の計算（ｑ＜０．０１）及びマグニチュード１．８の最小倍変化で事後検定力計算を使用して、１６匹のＧＣ表現型マウス（ＦＦ／ＦＦＩＬ６遺伝子型）を２２匹の非ＧＣ表現型（ＷＴ／ＩＬ６／ＦＦＳｔａｔ３遺伝子型）マウスと比較した。ベン図で要約された結果（図３に示す）は、３つのスポットがＧＣ非存在下のＩＬ６ノックアウトとの関連において差次的に豊富であり（Ｃ１）、５１個のスポットがＧＣ存在下のＩＬ６ノックアウトと関連し（Ｃ２）、一方で１０個のスポットがＧＣと独立にＩＬ６ノックアウトと関連する（Ｃ１／Ｃ２共通部分）ことを示した。１７個のスポットが、ＧＣにおいて調節されるＩＬ６介在性急性期反応タンパク質である可能性が高く（Ｃ２／Ｃ３共通部分）、１３２個のスポットがＧＣにおいて差次的に豊富だった（Ｃ３）。
【０１３８】
ＲＯＣ分析を使用して、１３２個のＧＣ関連スポットボリュームをＧＣ表現型と非ＧＣ表現型との間で区別することができるかがさらに探究された。それぞれのスポットのボリュームについて２つのＲＯＣ計算を行った。ＲＯＣ１において、ＧＣ表現型（ＦＦ／ＦＦＩＬ６遺伝子型）は陽性であり、非ＧＣ（ＷＴ／ＩＬ６／ＦＦＳｔａｔ３遺伝子型）は陰性とみなされた。９つのスポットが、曲線下面積１（ＡＵＣ１）値＜０．８５を返し、データセットから除外された。ＲＯＣ２において、ＦＦ突然変異は陽性とみなされ（ＦＦ／ＦＦＩＬ６／ＦＦＳｔａｔ３遺伝子型）、野生型ｇｐ１３０は陰性とみなされた（ＷＴ／ＩＬ６遺伝子型）。１１個のスポットがＡＵＣ２＞ＡＵＣ１値を返し、ＧＣ対非ＧＣ表現型よりも、ＦＦ突然変異体遺伝子型を有するマウスにおいて類似して有意に調節されていることを意味した。これらスポットと関連する箱ひげ図の視覚的検査は、それらのＦＦ突然変異との明らかな関連を確認した（図４）。要約すると、最初の１３２個のＧＣ関連スポットのうち、９つがＧＣ対非ＧＣ表現型の識別因子として不十分とみなされ、１１個がｇｐ１３０変異と関連するようであった。興味深いことに、１１個のＦＦ突然変異関連スポットのうち８つが、顕著なタンパク質成分として肝臓カルボキシルエステラーゼＮを含むことが見出された（ＵｎｉＰｒｏｔアイデンティファイアーＥＳＴＮ＿ＭＯＵＳＥ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ２３９５３、データは示さず）。ｇｐ１３０突然変異との関連におけるこのタンパク質の有意性は不明である。これにより、ＩＬ−６シグナリングとは独立したＧＣ対非ＧＣ表現型マウスにおける、特異的に調節され、差次的に豊富な目的の１１２個のスポットがもたらされた。
【０１３９】
液体クラマトグラフィーＭＳにより１１２個のＧＣ関連スポットを分析し（「タンパク質同定」で上述のとおり）、２８個のヒトタンパク質ホモログに対応する３１個の異なるマウスタンパク質の同定をもたらした。この比較的多数のタンパク質に鑑み、候補ベリフィケーション及びバリデーションのプロセスを促進するため、優先順位決定ストラテジーを使用した（Ｃｉｍａ  Ｉら、２０１１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０８：３３４２〜３３４７頁；及びＳｕｒｉｎｏｖａ  Ｓら、２０１１年、Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １０：５〜１６頁）。
【０１４０】
第１に、包括的な調節を示すタンパク質のみ（すなわち、これらタンパク質を含むすべての同定されたスポットがアップレギュレート又はダウンレギュレートされている−表２を参照のこと）が検討された。なぜなら、かかる候補の発現は、よく特徴付けられた技術、例えばウエスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡを使用して、より容易に探究できるからである。
【０１４１】
第２に、オンラインバイオインフォマティクスリソースであるＤＡＶＩＤ（アノテーション、視覚化、及び総合的発見のためのデータベース；国立アレルギー感染病研究所、国立衛生研究所；ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／ｈｏｍｅ．ｊｓｐ）（Ｈｕａｎｇ  ｄａ  Ｗら、２００９年、Ｎａｔ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  ４：４４〜５７頁；及びＨｕａｎｇ  ｄａ  Ｗら、２００９年、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３７：１〜１３頁）を、候補と生物学的経路との間の既知の関連性、発現の組織特異的パターン、及び疾患クラスを探究し、要約するために使用した。
【０１４２】
第３に、以前の文献における候補とＧＣとの関連性について検討した。最後に、２Ｄ  ＤＩＧＥ実験で観察された倍変化のマグニチュードもまた検討した。
【０１４３】
【表２−１】
2015505370.tif 000003
【表２−２】
2015505370.tif 000004
【０１４４】
これら４つの検討に基づいて、２Ｄゲル上の３８個のスポットを示す８つのタンパク質のサブセットをその後の分析の候補バイオマーカーとして同定し、それらはすなわち、アファミン、アルファ−１−抗キモトリプシン（ＡＡＣＴ、マウスセリンプロテアーゼ阻害剤Ａ３Ｋのヒトホモログ）、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏＥ）、クラスタリン、フィブロネクチン、ハプトグロビン、インスリン様成長因子結合タンパク質複合体酸不安定性サブユニット（ＩＧＦＡＬＳ）及びビタミンＤ結合タンパク質（ＶＤＢＰ）であった（表２を参照のこと）。３８個のスポットのＭＳ要約統計を表３に提供する。
【０１４５】
代表２Ｄ  ＤＩＧＥオーバレイゲル上の８つのタンパク質の位置を図５Ａに示す。関連スポットボリュームの箱ひげ図の視覚的検査は、ＧＣ対非ＧＣ表現型（ＦＦ／ＦＦＩＬ６対ＷＴ／ＩＬ６／ＦＦＳｔａｔ３）において、それぞれが特異的に調節されていることを示した（図５Ｂ）。
【０１４６】
マウス血清における候補ＧＣバイオマーカーのベリフィケーション
非ＧＣマウス血清に対するＧＣマウス血清におけるアファミン、ａｐｏＥ、クラスタリン及びフィブロネクチンの全タンパク質レベルの調節を、５匹のＷＴ及び５匹のＦＦ遺伝子型マウスからの血清を使用してウエスタンブロッティングによりベリファイした。免疫グロブリン軽鎖に対し、すべての４つのタンパク質を検出し（図６Ａ）、定量する（図６Ｂ）ことに成功した。ＦＦ対ＷＴマウスにおいて、ａｐｏＥ（Ｐ＜０．０１）及びフィブロネクチン（Ｐ＝０．０１６）の両方の血清レベルが、有意に上昇していることが見出された一方で、アファミン（Ｐ＜０．０１）及びクラスタリン（Ｐ＜０．０１）は有意にダウンレギュレートされていた。ウエスタンブロッティングにより得られた結果は、非ＧＣ表現型に対するＧＣ表現型における調節の方向の観点において、２Ｄ  ＤＩＧＥデータを裏付けた。
【０１４７】
ヒト血清における候補ＧＣバイオマーカーのバリデーション
アファミン、ａｐｏＥ、クラスタリン、フィブロネクチン及びハプトグロビンの全タンパク質レベルの調節を、１１人の手術前ＧＣ患者及び１３人の健常対照からの検体を使用してヒト血清において研究した。ウエスタンブロッティングによりすべての５つのタンパク質を検出し、定量することに成功した（図６Ｃ）。
【０１４８】
ＧＣ患者対対照のデンシトメトリー解析（図６Ｄ）は、それぞれのタンパク質が、ａｐｏＥ、フィブロネクチン及びハプトグロビンが発現レベルの増加を示し、アファミン及びクラスタリンが発現レベルの減少を示すという、ＧＥＭモデルにおいて観察された、予測された変化の方向を示したことを明らかにした。ＧＣ患者血清と対照血清との間で、アファミン（Ｐ＝０．００４）及びハプトグロビン（Ｐ＝０．０２４）の発現レベルが有意に異なっていた（図６Ｄ）。
【０１４９】
【表３】
2015505370.tif 000005
【０１５０】
臨床的に関係する分析プラットフォームを使用してより多くの定量的データを得るため、アファミン、ａｐｏＥ、ハプトグロビン、フィブロネクチン、及びクラスタリンの血清レベルを、ＶＤＢＰ、ＩＧＦＡＬＳ及びＡＡＣＴとともにＥＬＩＳＡにより測定した。この研究において同定された候補バイオマーカータンパク質の相対感度及び特異度を、現在実施されている臨床マーカーと比較するため、血清ＣＡ７２−４のＥＬＩＳＡもまた実施した。より高いＣＡ７２−４レベルが、ＧＣによる死亡のリスクの増加と関連付けられてきたのであり、そのことを示唆する証拠は、ＣＥＡ及びＣＡ１９−９よりもＧＣについてより予後診断的で具体的である（Ｕｃａｒ  Ｅら、２００８年、Ａｄｖ．  Ｔｈｅｒ．  ２５：１０７５〜１０８４頁）。９つのタンパク質の濃度を、それぞれの個別の結果を対照群におけるタンパク質の平均濃度で割ることにより標準化した。したがって、対照群におけるすべてのタンパク質の平均濃度は１であった。これは、等価な尺度上でのマーカーの候補間比較を容易にした（Ｆａｃａ  ＶＭら、２００８年、ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ．  ５：ｅ１２３頁）。
【０１５１】
アファミン、ａｐｏＥ、クラスタリン及びハプトグロビンの血清濃度が、ＧＣ患者と対照との間で有意に異なることが見出された（Ｐ＜０．０５）（図７Ａ）。ＩＧＦＡＬＳ及びＶＤＢＰもまた、倍変化のマグニチュードに基づき、これらの群間で差次的発現を示した（Ｐ＞０．０５）。ＣＡ７２−４は、ＧＣ群においてわずかに、有意でない１．３倍の発現増加で上昇した（図７Ａ）。ＧＣ患者と対照との間で明確な調節は示されなかった（Ｐ＞０．５）、ＡＡＣＴ及びフィブロネクチンについてＥＬＩＳＡの結果を示す散布図を図８に提供する。重要なことに、すべての候補についてウエスタンブロッティング及び／又はＥＬＩＳＡにより測定され、ＧＣ患者対対照血清において観察された調節の方向は（統計的有意性を示さなかったものでさえも）、ＧＥＭモデルにおいて２Ｄ  ＤＩＧＥ及びウエスタンブロット分析を使用して得られたデータと一致する。
【０１５２】
調節されたタンパク質であるアファミン、ａｐｏＥ、クラスタリン、及びハプトグロビンの診断能力が、ＣＡ７２−４とともにＲＯＣ分析によりさらに探究された（図７Ｂ）。アファミン及びクラスタリンの感度及び特異度は、共にそれぞれ９１％及び９２％であった（共に１０／１１真陽性、１２／１３真陰性）。ａｐｏＥの感度及び特異度は、それぞれ９１％及び８５％であった（１０／１１真陽性、１１／１３真陰性）一方で、ハプトグロビンについては感度が６４％で１００％の特異度であった（７／１１真陽性、１３／１３真陰性）。対照的に、ＣＡ７２−４の感度及び特異度は、それぞれ３６％及び７７％に過ぎなかった（４／１１真陽性、１０／１３真陰性）。
【０１５３】
考察
現在のところ、目標を絞った内視鏡診断前のＧＣ検出について感度及び特異度の高いバイオマーカーを欠いている。この実施例において、以下に基づくバイオマーカー発見ストラテジーを開発した。すなわち、（ｉ）高度に予測可能で臨床的に関係するヒト疾患のモデルマウスの使用、（ｉｉ）候補バイオマーカー同定に関する最先端のプロテオミクスアプローチ、及び（ｉｉｉ）よく特徴付けられた診断プラットフォームであるＥＬＩＳＡを使用した、ヒト検体における同定された候補バイオマーカーの翻訳に基づく。
【０１５４】
ヒト癌の多くの重要な特徴を再現する遺伝的に同系交配されたマウスは、それが事実上環境的及び遺伝的な変異性を消去していることに鑑みると、バイオマーカーの魅力的な供給源である。均質なＧＥＭモデルを利用する近年の試みは、候補バイオマーカーを生み出し、それらバイオマーカーは続いて、膵臓癌、結腸癌、乳癌、卵巣癌、肝細胞癌、前立腺癌及び肺癌に関し、ヒト組織における直交したバリデーションを受けることに成功してきた（Ｆａｃａ  ＶＭら、上記；Ｈｕｎｇ  ＫＥら、２００９年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．  Ｒｅｓ．（Ｐｈｉｌａ．）、２：２２４〜２３３頁；Ｐｉｔｔｅｒｉ  ＳＪら、２００８年、Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ７：１４８１〜１４８９頁；Ｐｉｔｔｅｒｉ  ＳＪら、２００９年、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、４：ｅ７９１６頁；Ｒｉｔｏｒｔｏ  ＭＳら、２０１１年、Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １０：３０１２〜３０３０頁；Ｃｉｍａ  Ｉら、２０１１年、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、１０８：３３４２〜３３４７頁；及びＴａｇｕｃｈｉ  Ａら、２０１１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２０：２８９〜２９９頁）。
【０１５５】
マウスにおいてＧＣバイオマーカーを同定する努力は、概して、ヒトＧＣ細胞株を注射されたヌード異種移植マウス（ＸＭ）をモデルとして使用して行われてきた。ａｐｏＡ１及びインター−アルファ−トリプシン阻害剤重鎖Ｈ３（inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H3：ＩＴＩＨ３）を含む、こうして同定されたいくつかのタンパク質の発現レベルが、ヒト血漿において確証されてきた（Ｃｈｏｎｇ  ＰＫら、２０１０年、Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ９：３６７１〜３６７９頁；及びＪｕａｎ  ＨＦら、２００４年、Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、４：２７６６〜２７７５頁）。しかしながら、かかるモデルにおける対照群の適切な処置及びいかにしてＧＣ特異的タンパク質変化が偏在する急性期反応から外挿され得るのかに関して疑問は残る。かかる懸念については、本明細書では、全身性炎症の非存在下で胃腫瘍を発症する、ＦＦＩＬ６マウスを含む複数の突然変異体遺伝子型を表すマウスを含めることで対処してきた。したがって、これらマウスは、胃腫瘍形成及びＩＬー６及びＩＬ−１１の両方により励起される全身性急性期反応と関連するプロテオミクス的変化を同定し、ベリファイするための遺伝的手段を提供する。加えて、本研究は、癌研究におけるＧＥＭモデルの継続的使用のためのさらなる証拠を提供するのであり、マウスにおいて本明細書で同定されたすべてのタンパク質が、２つの異なるプラットフォーム（ウエスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡ）を使用して、ヒト血清において倍変化の予測された方向でバリデートされた。
【０１５６】
２Ｄ  ＤＩＧＥによるＭＡＲＳ枯渇ＧＥＭ血清のプロテオミクス分析は、２８個のヒトホモログに対応する、３１個の差次的に発現するマウスタンパク質の同定をもたらした。８つのタンパク質のサブセットが、ベリフィケーション及びバリデーション実験においてさらに調査された。一般に、８つのマウスタンパク質について２Ｄ  ＤＩＧＥゲル上で観察された分子量及び等電点はそれぞれ、表３に示すように、アミノ酸配列に基づき予測された値よりもより大きく、より酸性であった。これは、これらのタンパク質が翻訳後修飾を受けた可能性を示した。マウスタンパク質のＵｎｉＰｒｏｔエントリーは、８つのうち７つが、グリコシル化することが知られている多くの部位で、潜在的なＮ−結合グリコシル化配列を含むことを明らかにした。マウスにおける唯一の例外はａｐｏＥであったが、ヒトａｐｏＥのＵｎｉＰｏｒｔエントリーは、それがＮ−結合及びＯ−結合グリカンにより修飾されることを示す。
【０１５７】
循環血清糖タンパク質は、癌バイオマーカーの有望な供給源である。タンパク質発現及び糖構造の両方における変化が、早期の癌の特徴として認識されてきたのであり、糖タンパク質が腫瘍浸潤及び転移において重要な役割を果たしている。実際に、現在の臨床マーカーであるＣＡ７２−４は糖タンパク質である。本明細書でのＲＯＣ分析によりＣＡ７２−４について得られた感度及び特異度の値（３６％の感度、７７％の特異度）は、文献に記載されているものよりもわずかに低かった（４０％の感度、＞９５％の特異度）。しかしながら、これは、本明細書におけるデータセットの小さなサイズ及び／又は用いられた特定のＥＬＩＳＡを反映したものであり得る。にもかかわらず、同じ患者及び対照の検体を使用して、アファミン、ＩＧＦＡＬＳ、ＶＤＢＰ、クラスタリン、及びハプトグロビンについて得られた結果は、ＣＡ７２−４と比較して、ＧＣ患者の対照からのより正確な分離を示した。さらに、アファミン及びクラスタリンの個別の感度及び特異度は、日本で使用されている代表的なスクリーニング試験である、胃Ｘ線間接撮影法について報告されていた値よりも高かった。したがって、この実施例において同定されたバイオマーカーのうちの６つ（すなわち、アファミン、ＩＧＦＡＬＳ、ＶＤＢＰ、クラスタリン、ａｐｏＥ及びハプトグロビン）は、ＧＣ患者及び健常人を区別する有効な手段を提供する。さらに、これらバイオマーカーの診断上の有用性を、多重分析アッセイにおけるそれらの組合せにより向上させてもよい。
【実施例２】
【０１５８】
追加胃癌患者におけるバリデーション
上の実施例１において言及された結果は、胃癌患者の第２コホートにおいてさらにバリデートされる（全２５人）。この実験において、男性及び女性患者の両方から手術時に血液が収集され、その血清を−８０℃で、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で必要とされるまで貯蔵した。患者の癌は５の早期（Ｔ１）及び２０の末期（Ｔ４）組織学的サブタイプの組合せを含んでいた。この実験のために全部で１０の対照検体が含まれており、血液は健常なボランティアから経験豊かな瀉血専門医により収集された。対照血液からの血清もまた、ＥＬＩＳＡで必要とされるまで−８０℃で貯蔵された。実施例１と同様に、すべての実験が、ピーターマッカラム癌研究所及びアデレード大学の倫理委員会により承認された。
【０１５９】
アファミン、クラスタリン、ハプトグロビン、ＩＧＦＡＬＳ及びＶＤＢＰタンパク質のためのサンドイッチＥＬＩＳＡキットを、一貫性を保証するために単一の供給業者（Ｕｓｃｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、ウーハン、中国）から入手し、製造業者の指示に従いアッセイを実施した。要約すると、収集した血清を解凍し、ＰＢＳで希釈し、標準を調製し、すべての検体を、特定の目的のタンパク質のための適切な抗体でコートされた９６ウェルマイクロタイタープレートに二重に添加した。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされたアビジンを、それぞれのウェルに添加してインキュベートした。この後、ＴＭＢ基質を添加し、結果として、特定のタンパク質、バイオコンジュゲートされた抗体、及びアビジンにコンジュゲートされた酵素を含有するウェルのみが変色を示した。続いて、硫酸を添加して反応を停止させ、変色を分光光度的に４５０ｎｍで測定した。次に、検体の光学密度を標準曲線と比較することにより、特定のタンパク質の濃度を判定した。標準の光学密度を、両対数グラフ上に、標準の既知の濃度に対して、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ及びこれから内挿された未知の濃度を使用してプロットした。実施例１に記載したように、５つのタンパク質の濃度を、それぞれの試験検体の結果を対照群におけるタンパク質の平均濃度で割ることにより標準化／正規化した。したがって、対照群におけるすべてのタンパク質の平均濃度は１であった。これは、等価な尺度上でのマーカーの候補間比較を容易にした。
【０１６０】
内挿された結果から、それぞれのタンパク質について個別のグラフを作成し（±ＳＥ）、胃癌（ＧＣ）血清検体及び対照血清検体からの結果を比較した。結果を図９に示し、表４に要約する。続いて、図１０に示すようにそれぞれのタンパク質についてＲＯＣ曲線を作成したのであり、タンパク質の組合せについてのＲＯＣ曲線を図１１（二次的組合せ）及び図１２（三次的組合せ）に示す。
【０１６１】
【表４】
2015505370.tif 000006
【０１６２】
この研究の目的は、アファミン、クラスタリン、ハプトグロビン、ＩＧＦＡＬＳ及びＶＤＢＰが（実施例１に示すように）胃癌の検出のための一連のバイオマーカーを表すのに好適であることを確認するものであった。実施例１のＥＬＩＳＡの結果に基づいて、１つの製造業者からのＥＬＩＳＡキットを使用して患者の新しいコホートの分析を行い、タンパク質の分析をとおして一貫性を提供した。
【０１６３】
５つのタンパク質のそれぞれの差次的調節は、実施例１の結果と一貫しており、胃癌患者からの血清は、アファミン（ｐ＝０．０２１）、クラスタリン（ｐ＜０．０００１）及びＶＤＢＰ（ｐ＜０．０００１）のより低い濃度、並びにハプトグロビン（ｐ＝０．３７３）及びＩＧＦＡＬＳ（ｐ＝０．０８７）のより高い濃度を、健常対照からの血清におけるこれらタンパク質の濃度と比較して有していた（図９）。
【０１６４】
この研究の第２の目的はまた、これら５つのバイオマーカーを、早期ＧＣを同定するために使用できるかどうかを判定することだった。疾患の病理ゆえに、早期（Ｔ１）胃癌患者からの血清を得ることは困難であったが、これら検体（ｎ＝５）は、末期（Ｔ４）胃癌検体（ｎ＝２０）からの分離を示さなかった。早期の腫瘍の検出が早期治療を可能にし、患者により良い結果をもたらすことを鑑みると、これは特に興味深い。
【０１６５】
それぞれのタンパク質の感度及び特異度が有病正診測定値を無病誤診測定値と区別することを示す受信者動作条件（Receiver Operating Condition：ＲＯＣ）曲線（図１０）は、ＶＤＢＰ、クラスタリン及びＩＧＦＡＬＳが個別に特に興味深いことを示す。図１１は、ハプトグロビン及びＶＤＢＰ、ＩＧＦＡＬＳ及びＶＤＢＰ、ＩＧＦＡＬＳ及びアファミン、クラスタリン及びアファミン、並びにＶＤＢＰ及びアファミンについてのＲＯＣ曲線の二次的組合せを示す。これらのペアリングは、展開される任意の診断について、この一連のタンパク質を使用して、有病正診率を増加させ、無病誤診率を減少させるその潜在性ゆえに特に注目される。図１２のＲＯＣ曲線に示される三次的組合せもまた、展開される任意の診断について、これらタンパク質の組合せが、有病正診率を増加させ、無病誤診率を減少させる能力を有する証拠を提供する。
【図４】
2015505370.tif 000007
【図８】
2015505370.tif 000008
【図１０】
2015505370.tif 000009
【図１１】
2015505370.tif 000010
【図１２】
2015505370.tif 000011
【図１】
2015505370.tif 000012
【図２】
2015505370.tif 000013
【図３】
2015505370.tif 000014
【図５】
2015505370.tif 000015
【図６】
2015505370.tif 000016
【図７】
2015505370.tif 000017
【図９】
2015505370.tif 000018
【国際調査報告】
2015505370.tif 000019
2015505370.tif 000020
2015505370.tif 000021
2015505370.tif 000022
2015505370.tif 000023
2015505370.tif 000024