(57)【要約】  本発明は、薬物と、ゲノムと結合する1つ以上の因子との相互作用を、ゲノム全域においてマッピングする方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬物が相互作用するゲノム上の1つ以上の部位を同定する方法であって、
a) 細胞または細胞溶解物と該薬物を接触させる工程；
b) 該細胞または細胞溶解物を、該薬物が、ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用し得る条件下で維持する工程；
c) 該細胞または細胞溶解物のゲノムを断片化し、それによりゲノム断片を含む混合物を生じる工程、ここで該ゲノム断片の1つ以上は、該薬物と相互作用する因子の1つ以上と結合する；および
d) 該薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定する工程
を含み、それにより該薬物が相互作用するゲノム上の1つ以上の部位を同定する、方法。
【請求項２】
該1つ以上の因子をゲノムに共有結合させ、それにより該1つ以上の因子とゲノムの間に共有結合を生じる工程をさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ゲノムと結合する1つ以上の因子が細胞または細胞溶解物のゲノムに共有結合した後に、該細胞または細胞溶解物と該薬物を接触させる、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ゲノムと結合する1つ以上の因子が細胞または細胞溶解物のゲノムに共有結合する前に、該細胞または細胞溶解物と該薬物を接触させる、請求項２記載の方法。
【請求項５】
該細胞または細胞溶解物と架橋剤を接触させる工程を含む方法により、ゲノムと結合する1つ以上の因子を、細胞または細胞溶解物のゲノムに共有結合させる、請求項２記載の方法。
【請求項６】
架橋剤による架橋を終結させる工程をさらに含む、請求項５記載の方法。
【請求項７】
細胞または細胞溶解物と、TRISを含むバッファを接触させることにより架橋を終結させる、請求項６記載の方法。
【請求項８】
該架橋剤が、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドである、請求項５記載の方法。
【請求項９】
ホルムアルデヒドが、1%または0.5%の濃度である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
該薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定する前に、共有結合を逆にする(reverse)工程をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
該薬物が、治療薬または薬学的に活性な低分子である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
該薬物が抗癌薬である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該薬物が、検出可能な標識を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
該検出可能な標識が、蛍光分子、ペプチド、ハプテンまたはそれらの組み合わせである、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
該検出可能な標識がビオチンである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ゲノムと結合する1つ以上の因子が、転写調節タンパク質もしくはその複合体、ゲノムの完全性の維持に関連するタンパク質もしくはその複合体、またはそれらの組み合わせである、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
該転写調節タンパク質が、転写因子、クロマチン修飾タンパク質、核ホルモン受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテオソーム、プロテオソーム成分またはそれらの組み合わせである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該ゲノムの完全性の維持に関連するタンパク質が、DNAの複製および修復のタンパク質、トポイソメラーゼまたはそれらの組み合わせである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
音波破砕、せん断誘導法、酵素消化またはそれらの組み合わせを使用してゲノムが断片化される、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
ポリメラーゼ連鎖反応、大規模並行配列決定(massively parallel sequencing)またはそれらの組み合わせを使用して、薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の配列を決定する、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の配列を決定する前に、該薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片を、混合物中の他のゲノム断片から分離する、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
混合物と、該薬物に特異的に結合する薬剤を含む固相支持体を接触させることにより、混合物中の他のゲノム断片から、1つ以上のゲノム断片を分離する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
該固相支持体がビーズを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
該薬剤が、抗体、ストレプトアビジンまたはそれらの組み合わせである、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
該細胞が生細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
該細胞が真核生物細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項２７】
該真核生物細胞がヒト細胞である、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
該細胞が、正常細胞または異常細胞である、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
該異常細胞が癌細胞である、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
ゲノム全域における1つ以上の部位が、非標的部位(off-target site)である、請求項１記載の方法。
【請求項３１】
該薬物と1つ以上の因子の相互作用が、ゲノムの1つ以上の真正染色質領域で起こる、請求項１記載の方法。
【請求項３２】
薬物と、ゲノムと結合する1つ以上の因子との相互作用を、ゲノム全域においてマッピングする方法であって、
a) 細胞または細胞溶解物と、該薬物を接触させる工程；
b) 該細胞または細胞溶解物を、該薬物が、ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用し得る条件下で維持する工程；
c) 該細胞または細胞溶解物のゲノムを断片化し、それによりゲノム断片を含む混合物を生じる工程、ここで該ゲノム断片の1つ以上は、該薬物と相互作用する因子の1つ以上と結合する；および
d) 該薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定する工程
を含み、それにより該薬物と、該ゲノムと結合する1つ以上の因子との相互作用を、ゲノム全域においてマッピングする、方法。
【請求項３３】
該1つ以上の因子をゲノムに共有結合させ、それにより該1つ以上の因子とゲノムの間に共有結合を生じる工程をさらに含む、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
ゲノムと結合する1つ以上の因子が細胞または細胞溶解物のゲノムに共有結合した後に、該細胞または細胞溶解物と該薬物を接触させる、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ゲノムと結合する1つ以上の因子が細胞または細胞溶解物のゲノムに共有結合する前に、該細胞または細胞溶解物と該薬物を接触させる、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
該細胞または細胞溶解物と架橋剤を接触させる工程を含む方法により、ゲノムと結合する1つ以上の因子を、該細胞または細胞溶解物のゲノムに共有結合させる、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
架橋剤による架橋を終結させる工程をさらに含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
該細胞または細胞溶解物と、TRISを含むバッファを接触させることにより架橋を終結させる、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
該架橋剤が、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドである、請求項３６記載の方法。
【請求項４０】
ホルムアルデヒドが、1%または0.5%の濃度である、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
該薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定する前に、共有結合を逆にする工程をさらに含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４２】
該薬物が、治療薬または薬学的に活性な低分子である、請求項３２記載の方法。
【請求項４３】
該薬物が抗癌薬である、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
該薬物が、検出可能な標識を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項４５】
該検出可能な標識が、蛍光分子、ペプチド、ハプテンまたはそれらの組み合わせである、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
該検出可能な標識がビオチンである、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
該ゲノムと結合する1つ以上の因子が、転写調節タンパク質もしくはその複合体、ゲノムの完全性の維持に関連するタンパク質もしくはその複合体、またはそれらの組み合わせである、請求項３２記載の方法。
【請求項４８】
該転写調節タンパク質が、転写因子、クロマチン修飾タンパク質、核ホルモン受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテオソーム、プロテオソーム成分またはそれらの組み合わせである、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
該ゲノムの完全性の維持に関連するタンパク質が、DNAの複製および修復のタンパク質、トポイソメラーゼまたはそれらの組み合わせである、請求項４７記載の方法。
【請求項５０】
音波破砕、せん断誘導法、酵素消化またはそれらの組み合わせを使用してゲノムが断片化される、請求項３２記載の方法。
【請求項５１】
ポリメラーゼ連鎖反応、大規模並行配列決定またはそれらの組み合わせを使用して、薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の配列を決定する、請求項３２記載の方法。
【請求項５２】
薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の配列を決定する前に、該薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片を、混合物中の他のゲノム断片から分離する、請求項３２記載の方法。
【請求項５３】
混合物と、該薬物に特異的に結合する薬剤を含む固相支持体を接触させることにより、混合物中の他のゲノム断片から、1つ以上のゲノム断片を分離する、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
該固相支持体がビーズを含む、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
該薬剤が、抗体、ストレプトアビジンまたはそれらの組み合わせである、請求項５３記載の方法。
【請求項５６】
該細胞が生細胞である、請求項３２記載の方法。
【請求項５７】
該細胞が真核生物細胞である、請求項３２記載の方法。
【請求項５８】
該真核生物細胞がヒト細胞である、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
該細胞が、正常細胞または異常細胞である、請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
該異常細胞が癌細胞である、請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
ゲノム全域においてマッピングされた1つ以上の領域が、非標的部位である、請求項３２記載の方法。
【請求項６２】
該薬物と1つ以上の因子の相互作用が、ゲノムの1つ以上の真正染色質領域で起こる、請求項３２記載の方法。
【請求項６３】
ゲノム全域において、疾患のサイン(signature)を同定する方法であって、
a) 細胞または細胞溶解物と、該疾患を治療するために使用されるかまたは潜在的に使用され得る薬物を接触させる工程；
b) 該細胞または細胞溶解物を、該薬物が、ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用し得る条件下で維持する工程；
c) 細胞または細胞溶解物のゲノムを断片化して、それによりゲノム断片を含む混合物を生じる工程、ここで該ゲノム断片の1つ以上は、該薬物と相互作用する因子の1つ以上と結合する；および
d) 該薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定する工程
を含み、それによりゲノム全域において、疾患のサインを同定する、方法。
【請求項６４】
該1つ以上の因子をゲノムに共有結合させ、それにより該1つ以上の因子とゲノムの間に共有結合を生じる工程をさらに含む、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
ゲノムと結合する1つ以上の因子が細胞または細胞溶解物のゲノムに共有結合した後に、該細胞または細胞溶解物と該薬物を接触させる、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
ゲノムと結合する1つ以上の因子が細胞または細胞溶解物のゲノムに共有結合する前に、該細胞または細胞溶解物と該薬物を接触させる、請求項６４記載の方法。
【請求項６７】
該細胞または細胞溶解物と架橋剤を接触させる工程を含む方法により、ゲノムと結合する1つ以上の因子を、細胞または細胞溶解物のゲノムに共有結合させる、請求項６４記載の方法。
【請求項６８】
架橋剤による架橋を終結させる工程をさらに含む、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
該細胞または細胞溶解物と、TRISを含むバッファを接触させることにより架橋を終結させる、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
該架橋剤が、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドである、請求項６７記載の方法。
【請求項７１】
ホルムアルデヒドが、1%または0.5%の濃度である、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
該薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定する前に、共有結合を逆にする工程をさらに含む、請求項６４記載の方法。
【請求項７３】
該薬物が、治療薬または薬学的に活性な低分子である、請求項６３記載の方法。
【請求項７４】
該薬物が抗癌薬である、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
該薬物が、検出可能な標識を含む、請求項６３記載の方法。
【請求項７６】
該検出可能な標識が、蛍光分子、ペプチド、ハプテンまたはそれらの組み合わせである、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
該検出可能な標識がビオチンである、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
ゲノムと結合する1つ以上の因子が、転写調節タンパク質もしくはその複合体、ゲノムの完全性の維持に関連するタンパク質もしくはその複合体、またはそれらの組み合わせである、請求項６３記載の方法。
【請求項７９】
該転写調節タンパク質が、転写因子、クロマチン修飾タンパク質、核ホルモン受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテオソーム、プロテオソーム成分またはそれらの組み合わせである、請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
該ゲノムの完全性の維持に関連するタンパク質が、DNAの複製および修復のタンパク質、トポイソメラーゼまたはそれらの組み合わせである、請求項７８記載の方法。
【請求項８１】
音波破砕、せん断誘導法、酵素消化またはそれらの組み合わせを使用してゲノムが断片化される、請求項６３記載の方法。
【請求項８２】
ポリメラーゼ連鎖反応、大規模並行配列決定またはそれらの組み合わせを使用して、薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の配列を決定する、請求項６３記載の方法。
【請求項８３】
薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の配列を決定する前に、該薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片を、混合物中の他のゲノム断片から分離する、請求項６３記載の方法。
【請求項８４】
混合物と、該薬物に特異的に結合する薬剤を含む固相支持体を接触させることにより、混合物中の他のゲノム断片から、1つ以上のゲノム断片を分離する、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
該固相支持体がビーズを含む、請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
該薬剤が、抗体、ストレプトアビジンまたはそれらの組み合わせである、請求項８４記載の方法。
【請求項８７】
該細胞が生細胞である、請求項６３記載の方法。
【請求項８８】
該細胞が真核生物細胞である、請求項６３記載の方法。
【請求項８９】
該真核生物細胞がヒト細胞である、請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
該細胞が、正常細胞または異常細胞である、請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
該異常細胞が癌細胞である、請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
ゲノム全域においてマッピングされた1つ以上の領域が、非標的部位である、請求項６３記載の方法。
【請求項９３】
該薬物と1つ以上の因子の相互作用が、ゲノムの1つ以上の真正染色質領域で起こる、請求項６３記載の方法。
【請求項９４】
工程d)において得られたサインを、対照と比較する工程をさらに含む、請求項６３記載の方法。
【請求項９５】
該対照が、疾患を治療するために使用される、工程a)において使用される薬物以外の薬物を使用して得られた疾患のサインである、請求項９４記載の方法。
【請求項９６】
状態の治療を必要とする個体において、薬物が、状態を効果的に治療するかどうかを決定する方法であって、
a) 該個体の細胞または細胞溶解物と、該薬物を接触させる工程；
b) 該細胞または細胞溶解物を、該薬物が、ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用し得る条件下で維持する工程；
c) 該細胞または細胞溶解物のゲノムを断片化し、それによりゲノム断片を含む混合物を生じる工程、ここで該ゲノム断片の1つ以上は、該薬物と相互作用する因子の1つ以上と結合する；および
d) 該薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定し、それにより個体のゲノムの全域における薬物の相互作用のサイン(signature)を得る工程、
を含み、ここで個体のゲノム全域における薬物の相互作用のサインが陽性対照のサインと同様、実質的に同様または同一である場合、該薬物は個体における状態を効果的に治療し、および/または個体のゲノム全域における薬物の相互作用のサインが陰性対照のサインと同様、実質的に同様または同一である場合、該薬物は、個体における状態を効果的に治療しない、方法。
【請求項９７】
該1つ以上の因子をゲノムに共有結合させ、それにより該1つ以上の因子とゲノムの間に共有結合を生じる工程をさらに含む、請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
ゲノムと結合する1つ以上の因子が細胞または細胞溶解物のゲノムに共有結合した後に、該細胞または細胞溶解物と該薬物を接触させる、請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
ゲノムと結合する1つ以上の因子が細胞または細胞溶解物のゲノムに共有結合する前に、該細胞または細胞溶解物と該薬物を接触させる、請求項９７記載の方法。
【請求項１００】
該細胞または細胞溶解物と架橋剤を接触させる工程を含む方法により、ゲノムと結合する1つ以上の因子を、細胞または細胞溶解物のゲノムに共有結合させる、請求項９７記載の方法。
【請求項１０１】
架橋剤による架橋を終結させる工程をさらに含む、請求項１００記載の方法。
【請求項１０２】
細胞または細胞溶解物と、TRISを含むバッファを接触させることにより架橋を終結させる、請求項１０１記載の方法。
【請求項１０３】
該架橋剤が、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドである、請求項１００記載の方法。
【請求項１０４】
ホルムアルデヒドが、1%または0.5%の濃度である、請求項１０３記載の方法。
【請求項１０５】
該薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定する前に、共有結合を逆にする工程をさらに含む、請求項９７記載の方法。
【請求項１０６】
該対照が、該薬物により効果的に治療される1つ以上の個体由来のサインである、請求項９７記載の方法。
【請求項１０７】
該薬物が、治療薬または薬学的に活性な低分子である、請求項９６記載の方法。
【請求項１０８】
該薬物が抗癌薬である、請求項１０７記載の方法。
【請求項１０９】
該薬物が、検出可能な標識を含む、請求項９６記載の方法。
【請求項１１０】
該検出可能な標識が、蛍光分子、ペプチド、ハプテンまたはそれらの組み合わせである、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１１】
該検出可能な標識がビオチンである、請求項１１０記載の方法。
【請求項１１２】
ゲノムと結合する1つ以上の因子が、転写調節タンパク質もしくはその複合体、ゲノムの完全性の維持に関連するタンパク質もしくはその複合体、またはそれらの組み合わせである、請求項９６記載の方法。
【請求項１１３】
該転写調節タンパク質が、転写因子、クロマチン修飾タンパク質、核ホルモン受容体、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテオソーム、プロテオソーム成分またはそれらの組み合わせである、請求項１１２記載の方法。
【請求項１１４】
該ゲノムの完全性の維持に関連するタンパク質が、DNAの複製および修復のタンパク質、トポイソメラーゼまたはそれらの組み合わせである、請求項１１２記載の方法。
【請求項１１５】
音波破砕、せん断誘導法、酵素消化またはそれらの組み合わせを使用してゲノムが断片化される、請求項９６記載の方法。
【請求項１１６】
ポリメラーゼ連鎖反応、大規模並行配列決定またはそれらの組み合わせを使用して、薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の配列を決定する、請求項９６記載の方法。
【請求項１１７】
薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の配列を決定する前に、該薬物と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片を、該混合物中の他のゲノム断片から分離する、請求項９６記載の方法。
【請求項１１８】
混合物と、該薬物に特異的に結合する薬剤を含む固相支持体を接触させることにより、混合物中の他のゲノム断片から、1つ以上のゲノム断片を分離する、請求項１１７記載の方法。
【請求項１１９】
該固相支持体がビーズを含む、請求項１１８記載の方法。
【請求項１２０】
該薬剤が、抗体、ストレプトアビジンまたはそれらの組み合わせである、請求項１１８記載の方法。
【請求項１２１】
該細胞が生細胞である、請求項９６記載の方法。
【請求項１２２】
該細胞が真核生物細胞である、請求項９６記載の方法。
【請求項１２３】
該真核生物細胞がヒト細胞である、請求項１２２記載の方法。
【請求項１２４】
該細胞が、正常細胞または異常細胞である、請求項１２３記載の方法。
【請求項１２５】
該異常細胞が癌細胞である、請求項１２４記載の方法。
【請求項１２６】
ゲノム全域においてマッピングされた1つ以上の領域が、非標的部位である、請求項９６記載の方法。
【請求項１２７】
該薬物と1つ以上の因子の相互作用が、ゲノムの1つ以上の真正染色質領域で起こる、請求項９６記載の方法。
【請求項１２８】
該状態が癌である、請求項９６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2012年6月14日に出願された米国仮特許出願第61/659,750号および2012年7月6日に出願された米国仮特許出願第61/668,718号および2012年9月14日に出願された米国仮特許出願第61/701,434号および2013年3月15日に出願された米国仮特許出願第61/800,060号の利益を主張する。
【０００２】
上記出願の全教示は、参照により本明細書中に援用される。
【０００３】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所のRO1-HG002668および米国癌学会のPF-11-042-01-DMCのもと、政府支援によりなされたものである。政府は、本発明において一定の権利を有するものである。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
最近の技術的進歩は、DNAの特定の領域または関連するクロマチンにタンパク質を局在化することにより遺伝子調節ネットワークのゲノム全域(genome-wide)の研究を可能にした。関連する(directed)抗体を使用して折りたたまれた目的のタンパク質に結合するDNAのディープシークエンシング(deep sequencing)は、ゲノム組織化の空間的マッピングに高い解決をもたらす。生物学者は、クロマチン免疫沈降を用いたディープシークエンシング(chromatin immunoprecipitation with deep sequencing)(ChIP-seq)と称される、細胞および疾患の生物学を理解し得るための新しいレンズを有している。しかしながら、この技術には重大な制限がある。該手法は、検証された特異的な免疫グロブリンの存在を必要とし、個々のタンパク質/DNA複合体のみが単離され得る。この実験の複雑さは、クロマチン関連低分子の効果を理解し、特徴付けるためのChIP-seqの使用を制限している。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
Chem-seq技術と称される、化学実体とそれらの標的分子の間の相互作用のゲノム全域評価が本明細書に記載される。
【０００６】
したがって、一局面において、本発明は、薬物または薬物候補と、ゲノムに結合する1つ以上の因子の相互作用を、ゲノム全域で(across a genome)マッピングする方法に関する。該方法は、クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物と薬物を接触させることを含む。クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物は、薬物または薬物候補が、ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用し得る条件下で維持される。クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物のゲノムは断片化され、それによりゲノム断片を含む混合物が生じ、ここで該ゲノム断片の1つ以上は、薬物と相互作用する因子の1つ以上と結合する。薬物または薬物候補と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列が決定され、それにより、ゲノム全域で、薬物または薬物候補と、ゲノムに結合する1つ以上の因子の相互作用がマッピングされる。
【０００７】
別の局面において、本発明は、薬物または薬物候補が相互作用するゲノム上の1つ以上の部位を同定する方法に関する。該方法は、クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物と、薬物または薬物候補を接触させること、該クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物を、薬物または薬物候補が、ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用し得る条件下で維持することを含む。クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物のゲノムは断片化され、それによりゲノム断片を含む混合物が生じ、ここでゲノム断片の1つ以上は、薬物と相互作用する因子の1つ以上と結合する。薬物または薬物候補と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定し、それにより薬物または薬物候補が相互作用するゲノム上の1つ以上の部位が同定される。
【０００８】
別の局面において、本発明は、ゲノム全域における状態または疾患(例えば症候群)のサイン(signature)を同定する方法に関する。該方法は、クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物と、疾患を治療するために使用されるかまたは潜在的に使用され得る薬物または薬物候補を接触させること、および該クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物を、薬物または薬物候補が、ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用し得る条件下で維持することを含む。いくつかの局面において、該細胞またはその溶解物は、疾患を有する1つ以上の個体から得られる細胞またはその溶解物である。クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物は断片化され、それによりゲノム断片を含む混合物が生じ、ここでゲノム断片の1つ以上は、薬物と相互作用する因子の1つ以上と結合する。薬物または薬物候補と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片のそれぞれの全てまたは一部の配列を決定して、それによりゲノム全域において状態または疾患のサインが同定される。
【０００９】
さらに別の態様において、本発明は、薬物または薬物候補が、状態(例えば症候群；癌、心臓疾患等の疾患)の治療を必要とする個体において、状態を効果的に治療するかどうかを決定する方法に関する。該方法は、個体のクロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物と、薬物または薬物候補を接触させること、および該クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物を、薬物または薬物候補が、ゲノムに結合する1つ以上の因子と相互作用し得る条件下で維持することを含む。クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物のゲノムを断片化し、それによりゲノム断片を含む混合物を生じ、ここで該ゲノム断片の1つ以上は、薬物と相互作用する因子の1つ以上と結合する。薬物または薬物候補と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定し、それにより個体のゲノム全域にわたり、薬物の相互作用のサインが得られ、ここで個体のゲノム全域における薬物の相互作用のサインが、陽性対照のサインと同様、実質的に同様または同一である場合、薬物または薬物候補は、個体において状態を効果的に治療し、および/または個体のゲノム全域における薬物の相互作用のサインが、陰性対照のサインと同様、実質的に同様または同一である場合、薬物または薬物候補は、個体において状態を効果的に治療しない。
【００１０】
(a)一局面において、該開示はキットを特徴とし、該キットは、
(b)クロマチンを含む細胞もしくは細胞溶解物もしくは核抽出物か、またはクロマチンを含む細胞溶解物もしくは核抽出物を作製するために有用な試薬；
(c)薬物または薬物候補、ここで該薬物または薬物候補は、ビオチンなどの検出可能な標識に結合または固相支持体に連結される(例えば直接的または間接的)；
(d)該標識と相互作用する因子(例えば、該因子はビーズなどの固相支持体に取り付けられる)(例示的な因子としては(例えば、固相支持体に取り付けられる)抗体が挙げられる)；
(e)任意に、試薬、例えばキットの指示書の方法により同定される1つ以上の配列を配列決定するためのプライマーまたはPCRオリゴなどのオリゴ；ならびに
薬物または薬物候補と、クロマチンを含む細胞もしくは細胞溶解物もしくは各抽出物を、該薬物または薬物候補が、ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用し得、ゲノムと結合する1つ以上の因子が、細胞のゲノムと共有結合する条件下で維持するための指示書；クロマチンを含む細胞または細胞溶解物または核抽出物のゲノムを断片化し、それによりゲノム断片を含む混合物を生じるための指示書、ここでゲノム断片の1つ以上は、薬物または薬物候補と相互作用する因子の1つ以上と結合する；ならびに薬物または薬物候補と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の配列の全てまたは一部を決定し、それにより薬物または薬物候補と、ゲノムと結合する1つ以上の因子の相互作用を、ゲノム全域においてマッピングするための指示書
の1つ以上(例えば、それらのそれぞれ)を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図1は、Chem-Seqアプローチの概略図である。
【図２】図2は、JQ1-PEG-ビオチンの合成を示す。
【図３】図3は、JQ1-PEG-ビオチンの示差走査蛍光測定法(DSF)の結果を示す。
【図４】図4は、bio-JQ1と、MYCおよびMITF座の近位のゲノム領域の結合のchem-seq分析を示す。DMSO(陰性対照)、bio-JQ1およびBrd4(JQ1のタンパク質標的)の配列決定された読み(read)の富化は、MYC(A)およびMITF(B)遺伝子の近位の領域を含むゲノム全域における、bio-JQ1とBrd4の高い程度の重複を示す。
【図５】図5は、Chem-Seqのインビボアプローチおよびインビトロアプローチの概略図である。インビボChem-Seqにより、生細胞における薬物-ゲノム結合の分析が可能になる。インビトロChem-Seqは、薬物または細胞透過性でない化学実体についてのゲノム結合部位を決定するための代替的なChem-Seqアプローチである。
【図６−１】図6は、bio-JQ1と、癌細胞におけるゲノム領域の結合のChem-Seqインビボ分析を示す。インビボChem-Seqは、生細胞における薬物JQ1に結合されたゲノム部位を明らかにした。比較のために、JQ1標的タンパク質BRD4のゲノム位置分析(ChIP-Seq)を示す。インビボでJQ1に結合される部位とBRD4に占められる部位の間の重複の程度に注意。A：第1染色体の領域上のJQ1の占められる部位の視覚化。
【図６−２】B：CCNL1遺伝子座のJQ1インビボChem-Seq分析。
【図７−１】図7は、癌細胞中のゲノム領域に結合するbio-JQ1のChem-seqインビトロ分析を図示する。インビトロChem-Seqにより、薬物JQ1により結合されるゲノム部位が明らかになる(赤色)。比較のために、JQ1標的タンパク質BRD4(黒色)のゲノム位置分析(ChIP-Seq)を示す。インビトロでJQ1に結合される部位とBRD4により占められる部位の間の重複の程度に注意。A：第1染色体の領域上のJQ1に占められる部位の視覚化。
【図７−２】B：インビトロChem-SeqによりインビボChem-Seqと同じ結果が生じることを示す、IRF4遺伝子座のJQ1インビトロChem-Seq分析：JQ1標的部位は、BRD4結合部位と重複する。
【図８−１】図8は、本明細書に記載されるChem-Seq法による分析のためのビオチニル化化合物の例を示す。
【図８−２】図8は、本明細書に記載されるChem-Seq法による分析のためのビオチニル化化合物の例を示す。
【図８−３】図8は、本明細書に記載されるChem-Seq法による分析のためのビオチニル化化合物の例を示す。
【図９】図9は、化合物Bio-JQ1(S)の合成を示す。
【図１０】図10。ビオチニル化JQ1(bio-JQ1)の生化学的特徴付け。A. BRD4の精製したブロモドメイン、BRD4 (1)およびDMSO、JQ1、bio-JQ1およびJQ1Rを使用した示差走査蛍光測定法の結果。B. 等温滴定熱量測定法およびビオチニル化JQ1(nio-JQ1)についての解離定数の決定の結果。
【図１１】図11。Chem-SeqデータとChIP-Seqデータの間の重複に基づく特異性分析。A. MM1.S細胞におけるCCND2遺伝子でのChIP-SeqによるBRD4およびChem-SeqによるJQ1の複製の占有。B. 25060個の重ねたBRD4/JQ1領域でのBRD4シグナルに対する標準化したJQ1の倍数変化。差異的結合分析により、25060個の重ねたBRD4/JQ1領域のうちわずか10個の統計的に有意な領域が差異的な結合を示すことが明らかになった(赤色ドット、FDR<=0.25、赤丸内に強調)。C. MM1.S細胞における10個の差異的結合部位のうちの1つでのChIP-SeqによるBRD4およびChem-SeqによるJQ1の複製の占有。D. 差異的結合部位としてCTCFピークの変数が導入された場合に擬似的JQ1ピークの同定率(%)が示される。擬似的JQ1データセットにおいて、約1%、2%、5%または10%のJQ1領域に等しいランダムCTCF領域を、差異的結合部位の真の陽性としてコンピューター上で導入した場合、同定率はそれぞれ95.3%、98.5%、99.8%および99.7%であった。
【図１２】図12。CDK9のゲノム全域占有および遺伝子転写に対するCDKインヒビターAT7519の効果。A. ChIP-Seq分析で決定した場合のMM1.S細胞におけるCCND2遺伝子座でのCDK9、BRD4、H3K27Ac、MED11およびRNA Pol IIの占有。B. サイクリンD2(CCND2)遺伝子でのRNAポリメラーゼII占有。MM1.S細胞を、DMSO(青色)または2□M AT7519(赤色)のいずれかで6時間処理し、その後RNA Pol II ChIP-Seq分析を行った。C. DMSO(青色)または2□M AT7519(赤色)で処理したMM1.S細胞におけるRNAポリメラーゼII移動率(traveling ration)分布。
【図１３】図13。Chem-Seqにより明らかにされたプロテインキナーゼインヒビターAT7519のゲノム全域結合プロフィール。A. 汎CDKインヒビターAT7519およびそのビオチニル化版bio-AT7519の化学構造。B. AT7519(左パネル)およびそのビオチニル化版(bio-AT7519、右パネル)の、MM1.S細胞増殖に対する効果。細胞を、示されるように種々の濃度の薬物で72時間処理した。C. PRCC遺伝子座でのbio-AT7519(赤色)およびDMSO(ビヒクル、青色)インビトロChem-SeqならびにCDK9 ChIP-Seq分析(マゼンタ)の占有を示す遺伝子トラック。D. bio-AT7519 Chem-SeqシグナルとCDK9 ChIP-Seqシグナルの間の相関(左パネル、スピアマン相関：r=0.785)。対照において、CDK9と関連しないタンパク質(CTCF、右パネル)由来のbio-AT7519 Chem-SeqシグナルとChIP-Seqシグナルの間に相関(r=0.472)は観察されなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
治療実体は、特定のタンパク質または他の分子への結合によりその効果を発揮し、これらの標的分子のいくつかは、ゲノムと結合する。クロマチン生物学のタンパク質成分は、癌、炎症および心臓血管疾患において治療標的を押し付ける(pressing)ことにより現れている。実際に、癌配列決定の努力により、多くの変異、再配置、または増幅されたクロマチン関連因子および転写因子が同定され、世界的なクロマチン創薬における協調的な努力が加速された。薬物が、ゲノムと結合するタンパク質または他の分子実体とどのように相互作用するかを直接決定することは可能になっていない。質量分光学を使用して低分子化学物質と結合するタンパク質を同定ことは可能であるが、このアプローチでは、かかる化学結合タンパク質により占有されるゲノム中の部位は同定されない。ChIP-seqを使用してゲノム中の特定のタンパク質と結合する部位を同定することは可能であるが、このアプローチでは、これらのタンパク質が目的の分子と結合するかどうかが明らかにされない。
【００１３】
分子(例えば、化合物、薬物)と直接的および/または間接的に結合するゲノム中の部位を同定する方法の開発を本明細書に記載する。効果的に、これらのデータは、ゲノム上の化合物(例えば、治療剤)の作用部位に対する分子的解決を提供し、空間的な標的解決を提供する。この情報は、例えば有力な治療化学物質の標的、ゲノム中で化学物質が作用する部位(遺伝子)を決定するため、化学物質の特異性を評価するため、および/または疾患および治療のためのバイオマーカーを同定するために有用である。
【００１４】
直接的または間接的(標的タンパク質を介して)のいずれかで核酸に結合することが分かっているリガンドと相互作用する広範囲の核酸(例えば、DNA、RNA)は、細胞、組織または他の生物学的材料由来のDNAまたはRNAを富化するための親和性「分子」として使用され得る。
【００１５】
いくつかの局面において、該方法は、図1に示す以下の工程の1つ以上を含み、これらは、以下に示される順序または代替的な順序で実施され得る。細胞タンパク質またはタンパク質複合体は、(例えば共有的または非共有的に)細胞核酸(例えば、DNAまたはRNA)に結合する。細胞タンパク質またはタンパク質複合体が共有結合する場合の態様において、結合は、例えばホルムアルデヒドなどの化学架橋剤での処理により達成され得る。インビボ、細胞内またはインビトロのいずれかで架橋は達成される(図1)。架橋した生物学的試料は、化学バッファに可溶化され、希釈される。可溶化された架橋生物学的試料に含まれる核酸は断片化される。これは、例えば時間的に制御された音波破砕により達成され得る(図1)。修飾薬物、酵素インヒビターおよび他の化学的または天然の低分子化合物は、他の材料からの分離を可能にするビーズまたは他の実体に化学的に結合される(例えば共有的、非共有的)。得られた化合物結合ビーズ/実体を生物液または生物試料に添加して、混合し、インキュベートする(図1)。生物試料中でのインキュベーション後、前記化合物結合ビーズ/実体を回収して精製する。精製後、前記化合物結合ビーズ/実体から核酸を溶出する。溶出後、核酸を精製、濃縮および検出する。例えば、配列決定、定量的ポリメラーゼ連鎖反応または他の定量的方法により検出を達成し得る。配列決定する場合、得られた配列決定結果により、薬物または薬物候補が直接的または間接的に(例えば前記薬物標的タンパク質を介して)結合する結合部位が明らかになる(図2)。
【００１６】
架橋工程を含む方法において、架橋後に薬物または薬物候補を添加し得るか、または代替的に、該方法は、架橋する前に、例えば薬物または薬物候補または化合物で(例えば、細胞透過性化合物または化合物含有リポソーム、または化合物を細胞に導入する他の方法を使用して)処理した細胞(例えば、生細胞またはその溶解物)を使用することを含み得る。別の適用は、健常細胞または疾患細胞を有する組織切片を使用することである。
【００１７】
したがって、一局面において、(1つ以上の)薬物または薬物候補とゲノムの相互作用を、ゲノム全域においてマッピングする方法が本明細書中に提供される。いくつかの局面において、該薬物または薬物候補はゲノムと直接相互作用し得る。他の局面において、薬物または薬物候補は、ゲノムと間接的に相互作用し得、例えば薬物または薬物候補は、ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用する。
【００１８】
該方法において、ゲノムを目的の薬物または薬物候補(評価される薬物または薬物候補)と接触させ、それにより組み合わせを生じる。特定の局面において、薬物または薬物候補を、細胞および/または細胞溶解物中に存在するゲノムと接触させる。該組み合わせを、例えば、(例えば、クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物の)ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用させることにより、薬物または薬物候補がゲノムと直接および/または間接的に相互作用し得る条件下に維持する。ゲノムを断片化し、それによりゲノム断片を含む混合物を生じ、ここでゲノム断片の1つ以上は、薬物または薬物候補と直接および/または間接的に結合する。次いで、薬物または薬物候補と直接または間接的に結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定し、それにより薬物または薬物候補とゲノムの相互作用を、ゲノム全域においてマッピングする。
【００１９】
特定の局面において、本発明は、薬物または薬物候補と、ゲノムと結合する1つ以上の因子の相互作用を、ゲノム全域においてマッピングする方法に関する。該方法は、クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物と、薬物または薬物候補を接触することを含む。クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物を、薬物または薬物候補が、ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用し得る条件下で維持する。クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物のゲノムを断片化し、それによりゲノム断片を含む混合物を生じ、ここでゲノム断片の1つ以上は、薬物または薬物候補と相互作用する因子の1つ以上と結合する。薬物または薬物候補と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定し、それにより薬物または薬物候補と、ゲノムと結合する1つ以上の因子との相互作用を、ゲノム全域においてマッピングする。
【００２０】
本明細書において使用する場合、「クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物の相互作用を、ゲノム全域においてマッピングすること」は、特定の薬物または薬物候補が、直接または間接的(例えば、インビボ、インビトロ)のいずれかで相互作用するゲノムの領域の同定のことをいう。同定された領域は、薬物または薬物候補の標的部位(薬物が相互作用することが期待または意図されるゲノムの部位)、および非標的部位(off-target site)(薬物または薬物候補が相互作用することが期待または意図されないゲノムの部位)を含み得る。
【００２１】
別の局面において、本発明は、薬物または薬物候補が相互作用するゲノム上の1つ以上の部位を同定する方法に関する。該方法は、クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物と、薬物または薬物候補を接触させ、該クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物を、薬物または薬物候補が、ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用し得る条件下で維持することを含む。クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物のゲノムを断片化し、それによりゲノム断片を含む混合物を生じ、ここでゲノム断片の1つ以上は、薬物または薬物候補と相互作用する因子の1つ以上と結合する。薬物または薬物候補と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定し、それにより薬物または薬物候補が相互作用するゲノム上の1つ以上の部位を同定する。
【００２２】
別の局面において、本発明は、ゲノム全域において、状態または疾患(例えば症候群)のサインを同定する方法に関する。該方法は、クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物と、疾患を治療するために使用されるかまたは潜在的に使用され得る薬物または候補薬物を接触させ、該クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物を、薬物または薬物候補が、ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用し得る条件下で維持することを含む。いくつかの局面において、細胞またはその溶解物は、疾患を有する1つ以上の個体から得られる細胞またはその溶解物である。クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物のゲノムを断片化し、それによりゲノム断片を含む混合物を生じ、ここでゲノム断片の1つ以上は、薬物または薬物候補と相互作用する因子の1つ以上と結合する。薬物または薬物候補と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片のそれぞれの全てまたは一部の配列を決定し、それによりゲノム全域において、状態または疾患のサインを同定する。
【００２３】
さらに別の局面において、本発明は、薬物または薬物候補が、状態の治療を必要とする個体において、状態(例えば症候群；癌、心臓疾患等の疾患)を効果的に治療するかどうかを決定する方法に関する。該方法は、個体のクロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物と、薬物または薬物候補を接触させ、該クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物を、薬物または薬物候補が、ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用し得る条件下で維持することを含む。クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物のゲノムを断片化し、それによりゲノム断片を含む混合物を生じ、ここで該ゲノム断片の1つ以上は、薬物または薬物候補と相互作用する因子の1つ以上と結合する。薬物または薬物候補と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定し、それにより個体のゲノム全域における薬物または薬物候補の相互作用のサインを得、個体のゲノム全域における薬物または薬物候補の相互作用のサインが、陽性対照のサインと同様、実質的に同様または同一である場合、薬物または薬物候補は、個体における状態を効果的に治療し、および/または個体のゲノム全域における薬物または薬物候補の相互作用のサインが、陰性対照のサインと同様、実質的に同様または同一である場合、薬物または薬物候補は個体における状態を効果的に治療しない。当業者に明らかなように、種々の陽性および/または陰性対照を使用し得る。陽性対照の例は、薬物または薬物候補により成功裡に治療されるかまたは治療された1つ以上の個体から得られる細胞またはその溶解物のゲノム全域における薬物または薬物候補の相互作用のサインである。陰性対照の例は、薬物または薬物候補により成功裡に治療されないかまたは治療されなかった1つ以上の個体から得られる細胞またはその溶解物のゲノムの全域における薬物または薬物候補の相互作用のサインである。
【００２４】
典型的に、ゲノムに密接に結合する因子(例えば、ヒストン)は、本明細書に記載されるアッセイ条件下で結合したままであるが、ゲノムに密接に結合しない因子は、本明細書に記載されるアッセイ条件下で結合したままでないことがある。したがって、本明細書に記載されるように、該方法はさらに、ゲノムに結合する1つ以上の因子を、ゲノムに共有結合させることを含み得る。1つ以上の因子は、ゲノムと薬物もしくは薬物候補の接触前、またはゲノムと薬物もしくは薬物候補の接触後のいずれかに、ゲノムと共有結合され得る。一局面において、クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物は、ゲノムと結合する1つ以上の因子が、ゲノムに共有結合された後、薬物または薬物候補と接触され得る。別の局面において、クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物は、1つ以上の因子がゲノムに共有結合する前に、薬物または薬物候補と接触され得る。
【００２５】
クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物のゲノムと結合する1つ以上の因子を共有結合させるための方法は、当業者に公知である。一局面において、クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物は、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドなどの架橋剤と接触される。別の局面において、クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物は、(例えば、光透過機により)UV光に曝露される。
【００２６】
本明細書に記載されるように、該方法はさらに、1つ以上の因子とゲノムの間の共有結合(例えば、架橋)を逆にすること(reverse)を含み得る。いくつかの局面において、共有結合は、薬物または薬物候補と直接および/または間接的に相互作用する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定する前に逆にされる。他の局面において、共有結合は、薬物または薬物候補と相互作用する1つ以上の因子と結合するゲノム断片を、薬物または薬物候補と相互作用する1つ以上の因子と結合しない混合物中の他のゲノム断片から分離した後に逆にされ得る。
【００２７】
本発明の方法に使用され得るゲノムの例としては、原核生物ゲノム(例えば、細菌ゲノム)および真核生物ゲノム(例えば、哺乳動物ゲノム)が挙げられる。一局面において、ゲノムは哺乳動物(例えば、霊長類、イヌ、ネコ、マウス等)ゲノムである。特定の局面において、ゲノムはヒトゲノムである。
【００２８】
薬物または薬物候補と相互作用するものと同定され得るゲノムの領域は、ゲノムの1つ以上の異質染色質領域(ヘテロクロマチン)および/またはゲノムの1つ以上の真正染色質領域(ユークロマチン)を含む。特定の態様において、本明細書に提供される方法は、薬物または薬物候補と、ユークロマチンの相互作用を、ゲノム全域においてマッピングする。
【００２９】
本明細書に記載されるように、薬物または薬物候補は、細胞(インビボChem-Seq)または細胞溶解物(インビトロChem-Seq)中に存在するゲノムと接触され得る。したがって、該方法はさらに、クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物を得ることを含み得る。細胞および/またはその溶解物を得る方法は、当該技術分野で周知である(例えば、参照により本明細書に援用されるMarson et al., Cell, 134(3):521-533 (2008)および米国特許第6,410,243号参照)。例えば、1つ(1つ以上)の細胞が、個体(例えば、患者)または市販供給源、例えば細胞および/または組織バンクまたは貯蔵施設から得られ得る。特定の局面において、細胞は、1つ以上の個体由来の試料(例えば、生物液(例えば、血液、尿、リンパ液等)、組織試料、生検)から得られ得る。当業者に明らかなように、細胞溶解物を得るために、細胞は、機械的および/または化学的に(例えば、細胞を、本明細書に記載されるような種々の溶解バッファのいずれかに懸濁することにより)操作され得る。
【００３０】
種々の細胞およびその溶解物を本発明に使用し得る。細胞およびその溶解物の例としては、原核生物細胞、真核生物細胞およびそれらの溶解物が挙げられる。特定の局面において、哺乳動物(例えば、霊長類、イヌ、ネコ、マウス等)細胞またはその溶解物が使用される。さらに別の局面において、ヒト細胞またはその溶解物が使用される、さらに別の局面において、生細胞が使用される。該方法の他の局面は、正常細胞、異常細胞および/またはそれらの溶解物の使用を含む。異常細胞としては、癌細胞、心臓疾患細胞等の疾患細胞が挙げられる。いくつかの態様において、細胞は新鮮であるか、凍結されるかまたは保存される(例えば、該細胞は、ヒト試料または非ヒト哺乳動物由来の試料由来の保存された細胞である)。いくつかの態様において、細胞を含む試料は、被験体、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物から得られ得、ここで薬物または薬物候補は被験体に投与される。細胞は、始原細胞、不死化細胞、細胞株の細胞、遺伝的に改変された細胞等であり得る。細胞は、任意の細胞型であり得るか、または種々の態様において任意の臓器もしくは組織由来であり得る。細胞は、例えば上皮細胞、肝細胞、免疫細胞、神経幹細胞、筋細胞、繊維芽細胞であり得る。
【００３１】
いくつかの態様において、用語「薬物または薬物候補」は、目的の標的に対して(向かって)活性(例えば、標的(例えば、転写因子)に対して約1mM未満または約100μM未満のIC50(例えば、約10μM未満、約1μM未満、または約0.1μM未満)を有する化合物のことをいう。明らかなように、化合物は、本発明に使用される薬物であるためにはFDA(または任意の支配権における医薬の規制の責任のある任意の政府機関)の承認を必要としない。タンパク質(例えば、転写因子などの転写に関連するタンパク質)などの1つ以上の標的に対して活性な化合物(例えば、低分子)が本発明に包含される。いくつかの態様において、薬物または薬物候補は、1つ以上のインビトロまたはインビボアッセイにおいて、試験され、活性を示している。活性は、例えば、(例えば標的に対する)結合活性、(例えば標的に対する)阻害活性または活性化活性、細胞表現型または細胞状態を変化させる活性、化合物が疾患の治療に有用であることを潜在的に示唆するかまたは示す活性等であり得る。例示的な薬物候補としては、標的に対して公知の活性を有するツール化合物または参照化合物、スクリーニングアッセイなどのアッセイにおいて同定された化合物、またはかかる化合物のアナログもしくは誘導体、例えば少なくとも部分的にスクリーニングにおいてヒットした化合物に基づいて合成、設計もしくは同定されたアナログもしくは誘導体が挙げられる。薬物または薬物候補は、目的の標的を改変、例えば阻害または活性化し得る。薬物または薬物候補は、種々の態様において種々の方法のいずれかで標的を改変し得る。例えば、薬物または薬物候補は、標的に結合し得、標的に結合する1つ以上の他の成分に結合し得、標的の安定性または立体構造を改変し得、標的の位置特定に影響し得る。
【００３２】
また、種々の化合物または薬物もしくは薬物候補を、本発明の方法、組成物、キットに使用し得る。例えば、薬物または薬物候補は、核酸(例えば、アンチセンスRNA、低干渉RNA(siRNA)、ショートヘアピンRNA(shRNA))、ペプチド、低分子(例えば、低分子有機化合物)、天然産物(produce)(例えば大環状分子)であり得る。特定の局面において、薬物または薬物候補は、治療的薬物または薬物候補である。別の局面において、薬物または薬物候補は、薬学的に活性な低分子である。さらに別の局面において、薬物または薬物候補は、抗癌薬物または薬物候補である(例えば、JQ1、タモキシフェン)。いくつかの態様において、薬物または薬物候補は、タンパク質を標的化し、例えば、転写因子またはキナーゼなどのタンパク質を阻害または活性化する。いくつかの態様において、薬物または薬物候補は、DNAまたはクロマチンを直接標的化する。
【００３３】
用語「低分子」は、約7500amu未満、約5000amu未満、約2500amu未満、好ましくは約2000amu未満、さらに好ましくは約1500amu未満、さらに好ましくは約1000amu未満、または最も好ましくは約750amu未満の分子量を有する化合物をいう。
【００３４】
当業者に明らかなように、薬物または薬物候補は、種々の方法でゲノムと「相互作用」し得る。例えば、薬物または薬物候補は、ゲノムと直接結合することにより相互作用し得るか、および/または薬物または薬物候補は、ゲノムと結合する(associated)(例えば結合する(bound))因子に結合することにより、間接的にゲノムと相互作用し得る。
【００３５】
さらなる局面において、本明細書に記載される薬物または薬物候補は、本明細書に記載される方法の1つ以上の工程で薬物または薬物候補の検出および/または分離を可能にする、種々の検出可能な標識(例えば、ハンドル)の1つ以上を含み得る。かかる検出可能な標識は当業者に周知である。検出可能な標識の例としては、(1つ以上の)蛍光分子、ペプチド(例えば、アビジン、ストレプトアビジン)、ハプテン(例えば、ジニトロフェニル(DNP)、ジゴキシゲニン、ニトロチロシン)、低分子(例えば、ビオチン)またはそれらの組み合わせが挙げられる。薬物または薬物候補に標識を導入するための方法は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書中に援用されるBecer, CR., et al., Angew Chem Int Ed, 48:4900-4908 (2009) and Hein, CD, et al., Pharm Res, 25(10):2216-2230 (2008)参照。
【００３６】
種々の態様において、薬物または薬物候補は、例えばリンカーを介して標識に取り付けられる。本明細書に記載される例示的な薬物または薬物候補は、以下の式(I)
【化１】
2015522259.tif 000002
の化合物中に提供され、式中、
薬物または薬物または薬物候補は低分子であり、
リンカーは共有結合-Xn-共有結合を含み；
各Xは、独立して、共有結合であるか、または二価の直鎖または分岐、飽和または不飽和の任意に置換されたC1-50炭化水素鎖であり、ここで1つ以上のメチレン単位は、任意にかつ独立して、-O-、-S-、-Se-、-OP(O)OH-O-、-N(R)P(O)OH-N(R)-、-Si(R)2-、-N(R)-、-C(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-N(R)C(O)-、-C(O)N(R)-、-(R)NC(O)N(R)-、-(R)C=NN(R)-、-N=N-、-S(O)-、-S(O)2-、-N(R)SO2-、-SO2N(R)-、ハロアルキル基(例えば、-CF2-)、複素環基、アリール基、またはヘテロアリール(例えば、トリアゾール)基で置換され；
ここでRのそれぞれの出現は、独立して、水素、適切な保護基またはアシル部分、アリールアルキル部分、脂肪族部分、アリール部分、ヘテロアリール部分、またはヘテロ脂肪族部分であり；
nは1〜50の整数であり；
標識は、本明細書に記載される方法またはキットにおいて薬物または薬物候補を単離および/または同定するために使用され得る部分である(例えば、蛍光分子、ペプチド、ハプテンまたはハロ含有化合物)。
【００３７】
いくつかの態様において、リンカーは、ポリエチレングリコール部分(PEG)またはその誘導体(例えば、PEG2、PEG6、PEG8、PEG20、PEG40、PEG100、PEG300、PEG400、PEG1000)を含む。
【００３８】
いくつかの態様において、リンカーは、ペプチド (例えば、15までのアミノ酸残基ペプチド)を含む。
【００３９】
いくつかの態様において、リンカーは、「クリック化学(click chemistry)」(例えばWO 2006/115547に記載される)を使用して形成された部分を含む。一態様において、リンカーは、アミド結合、エステル結合、ジスルフィド結合またはトリアゾールを含む。
【００４０】
本明細書に記載されるように、薬物または薬物候補は、ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用することにより、ゲノムと間接的に相互作用し得る。本明細書で使用される場合、「ゲノムと結合する因子」としては、1つ以上の特定の領域でゲノムと結合する1つの因子または因子の組み合わせ(転写複合体などの因子の複合体)が挙げられる。ゲノムと結合する種々の因子は当業者に周知である。当業者に周知であるように、これらの因子は、種々の方法でゲノムと「結合(associate)」し得る。例えば、ゲノムに結合することによりゲノムと結合し得る。かかる因子の例としては、ヒストンなどのタンパク質、転写タンパク質(例えば、転写調節タンパク質またはその複合体)、ゲノム完全性の維持に関与するタンパク質またはその複合体(例えば、DNA複製および修復タンパク質；トポイソメラーゼ)、クロマチン修飾タンパク質、クロマチン結合因子、受容体(例えば、ステロイド受容体；核ホルモン受容体)、キナーゼ、ホスファターゼ、プロテオソーム(protesome)、プロテオソーム成分、構造因子または骨格因子およびそれらの複合体が挙げられる。具体例を表1〜4に示す。
【００４１】
本明細書に記載されるChem-Seq法による分析のためのビオチニル化化合物の具体例を図8に示し、BDRインヒビター(BRDi)、HDACインヒビター(HDACi)、EZH2インヒビター(EZH2i)、DOT1Lインヒビター(DOT1Li)およびCDKインヒビター(CDKi)が挙げられる。SAHAは、ヒドロキサム酸HDACiのものと関連があるような汎HDAC(HDACクラスIおよびクラスII)インヒビターである。FK228は、クラスI HDACを阻害する。クラスIは、HDAC1、2、3および8を含む。クラスII(AおよびB)は、HDAC4、5、6、7、9、10を含む。CDKiについて、AT7519はCdk9インヒビターである。PD0332991化合物はCdk4/6インヒビターである。DOT1Liは、EpizymeのDaigle et al. Cancer Cell 2011のEPZ004777のbio-PEG版である。EZH2インヒビターは、例えば、WO 2011/140324に記載される。他の例を表1に示す。
【００４２】
本明細書中に示される方法において、クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物は、薬物または薬物候補と接触され、それにより組み合わせが生じ、該組み合わせは、薬物または薬物候補が、ゲノムと結合する1つ以上の因子と相互作用し得る条件下で維持される。(例えばクロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物と、架橋剤を接触させることにより)ゲノムと結合する1つ以上の因子をゲノムに架橋することをさらに含む方法において、該組み合わせはまた、ゲノムと結合する1つ以上の因子が、細胞のゲノムと共有結合する条件下で維持される。いくつかの態様において、標的はゲノム自体である。当業者に明らかなように、かかる条件は、適切な温度、pH、インキュベーション期間、バッファ等を含み、アッセイ条件(例えば、評価される薬物または薬物候補)に依存する。
【００４３】
本明細書中に示される方法はまた、クロマチンを含む細胞、細胞溶解物または核抽出物のゲノムを断片化し、それによりゲノムの断片(ゲノム断片)を含む混合物を生じる工程を含み、ここで該断片の1つ以上は、直接または間接的のいずれかで、薬物または薬物候補と結合する。ゲノムを断片化する方法は当業者に周知である。例えば、ゲノムは、例えば音波破砕および/またはせん断誘導法(shear-inducing method)を使用して機械的に、および/または酵素消化(例えば、単球菌ヌクレアーゼ)を使用して化学的に断片化され得る。
【００４４】
本発明の方法はさらに、薬物または薬物候補と直接または間接的に相互作用する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の(1つ以上の)配列を決定すること(ゲノム内の配列の同定を可能にする(例えば、明確な、特有の)部分を同定すること)をさらに含む。特定の局面において、該方法は、薬物または薬物候補と相互作用する1つ以上の因子と結合する1つ以上のゲノム断片の全てまたは一部の配列を決定することを含む。薬物または薬物候補と相互作用する配列の全てまたは一部を決定するための方法は当該技術分野で周知である。かかる方法の例としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、大規模並行配列決定(massively parallel sequencing)、固定化核酸ポリマー(immobilized nucleic acid polymer)、次世代配列決定等が挙げられる。
【００４５】
当業者に明らかなように、本明細書に記載される方法はさらに、ゲノム断片の混合物から、薬物または薬物候補と直接または間接的に結合するゲノム断片の1つ以上(例えば全て)を単離すること(例えば、薬物または薬物候補と結合しないゲノム断片から、薬物または薬物候補と結合する1つ以上のゲノム断片を分離すること)を含み得る。
【００４６】
ゲノム断片の混合物から、薬物または薬物候補と結合する1つ以上のゲノム断片を単離または分離するために種々の方法を使用し得る。特定の局面において、かかるゲノム断片は、ゲノム断片の混合物と、薬物または薬物候補と直接または間接的に、特異的に結合する薬剤を接触させることにより単離される。薬物または薬物候補上に存在する標識(例えば、検出可能な標識)に特異的に結合し得る薬剤の例としては、ペプチド(例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン)、酵素(例えば、アルカリ性ホスフォターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ)および抗体(例えば、一次抗体、二次抗体)が挙げられる。
【００４７】
特定の局面において、ゲノム断片の混合物は、薬物または薬物候補と直接または間接的に、特異的に結合する薬剤を含む固相支持体と接触される。該方法における使用のための固相支持体の例としては、ビーズ、アレイ、スライドガラス、ウェル、カラム等が挙げられる。
【００４８】
本明細書に記載される方法はさらに、適切な対照と結果を比較することを含み得る。該方法に使用される対照は、陽性対照および/または陰性対照であり得る。当業者に明らかなように、種々のかかる対照が使用され得る。薬物または薬物候補と、ゲノムと結合する1つ以上の因子との相互作用を、ゲノム全域においてマッピングする方法、および/または薬物または薬物候補が相互作用するゲノム上の1つ以上の部位を同定する方法における使用のための対照の例としては、公知の作用機構を有する1つ以上の薬物または薬物候補について得られた(1つ以上の)ゲノムマップ(例えば、同様の作用機構を有する複数の薬物または薬物候補(例えば薬物または薬物候補の群)由来のゲノムマップ；異なる(例えば種々の)作用機構を有する複数の薬物または薬物候補(例えば薬物または薬物候補の複数の群)由来のゲノムマップ)が挙げられる。ゲノム全域において疾患のサインを同定する方法における使用のための対照の例としては、同じまたは同様の薬物または薬物候補(例えば、同様の作用機構を有するか、または有すると考えられる薬物または薬物候補)を使用して、同様の疾患(状態、症候群)について得られるサイン(例えば、公知のサイン)が挙げられる。状態の治療を必要とする個体において、薬物または薬物候補が状態を効果的に治療するかどうかを決定する方法における使用のための対照の例としては、薬物または薬物候補で成功裡に治療されるかまたは治療された1つ以上の個体から得られた細胞またはその溶解物のゲノム全域における薬物または薬物候補の相互作用のサイン(例えば陽性対照)、および/または薬物または薬物候補で成功裡に治療されないかまたは治療されなかった1つ以上の個体から得られる細胞またはその溶解物のゲノム全域における薬物または薬物候補の相互作用のサイン(例えば陰性対照)が挙げられる。
【実施例】
【００４９】
実施例
実施例1 インビトロChem-Seq
方法/材料
本明細書において(S)-JQ1またはJQ1Sと称されるJQ-1のSエナンチオマーからビオチニル化JQ1を合成した。(S)-JQ1をギ酸に溶解して、室温で撹拌し、遊離酸1を得た。次いで、該酸を一保護PEG-ジアミンと共役させてアミド2を得た。酸性条件下で保護基(Trt)を除去して、得られたアミンとビオチンを共役させて、最終的なJQ1-PEG-ビオチンを得た(例えば、図4参照；参照により本明細書中に援用されるWO 2011/143669参照)。
【００５０】
図2は、ブロモドメイン4(BRD4)に結合したJQ1-PEG-ビオチンの示差走査蛍光測定法(DSF)の結果を示す。タンパク質(例えばBrd4)への低分子(例えばJQ1S)の結合は、通常、タンパク質のより高い安定性を生じる。そのため、結合したBrd4が展開される温度は、結合しなかったBrd4が展開される温度と比較して高くなる。この温度変化は、BRD4タンパク質の疎水性部分に親和性を有する色素の蛍光の増加により測定し得る。低分子、ジメチルスルホキシド(DMSO、対照として)、JQ1のSエナンチオマー(JQ1S)、JQ1のRエナンチオマー(JQ1R、対照として)およびJQ1-ビオチン(JQ1-PEG-ビオチン)と、タンパク質および色素を混合して実験を行った。BRD4とJQ1の間の特有の構造および結合のために、Sエナンチオマーのみが活性であり、そのためRエナンチオマーは、対照として使用し得る。次いで、PCRマシンを使用して、溶液をゆっくり温め、タンパク質がそれぞれの低分子に結合する場合に展開される温度を測定した。図2に示すように、データにより、JQ1-SおよびJQ1-ビオチンがBRD4に結合して、より安定になり、JQ1SおよびJQ1-ビオチンに結合したBRD4を展開させるために高温が必要であることを確認した。
【００５１】
ヒトSK-MEL-5細胞を、それぞれの位置分析反応について最終的な1〜2x108の細胞数を有する80%コンフルエントまで増殖させた。1/10体積の新鮮な11%ホルムアルデヒド溶液を室温で15分間添加して、細胞を化学的に架橋した。シリコン製のヘラを使用して細胞を回収し、遠心分離して、得られたペッレトを1xPBSで3回洗浄した。液体窒素中で細胞ペレットを急速に凍結し、使用前に-80℃で保存した。
【００５２】
細胞を再懸濁して、溶解バッファに溶解し、音波破砕して可溶化し、架橋したDNAをせん断した。音波破砕条件は、細胞、培養条件、架橋、設備および薬物または薬物候補に依存して変化する。Misonix Sonicator 3000を使用して、パワー8で、10x30秒間パルス処理(パルス処理の間に60秒間停止)で音波破砕を行った。全ての時点で試料は氷上に維持した。
【００５３】
得られた全細胞抽出物を、JQ1と以下のようにあらかじめインキュベートした100μlのストレプトアビジンDynal(MyOneストレプトアビジンT1)磁性ビーズと、4℃で一晩インキュベートした(親和性精製)。ここで、該磁性ビーズは、5ulの10mM JQ1/DMSO溶液を、100ulのストレプトアビジンDynalビーズ懸濁液と混合し、一晩(o.n.)インキュベートされた。薬物結合ビーズをBSAブロッキング溶液で4回洗浄し、未結合薬物を除去した。
【００５４】
親和性精製を一晩進行させた。以下のバッファ：(1)溶解バッファ1、(2)溶解バッファ2、(3)音波破砕バッファ、(4)高塩音波破砕バッファ、(5)LiClバッファおよび(6)TE含有50mM NaClで連続的に洗浄した。結合した複合体を、必要に応じてボルテックスにかけながら65℃で加熱してビーズから溶出し、65℃で一晩のインキュベーションにより架橋を逆にした。全細胞抽出物DNA(音波破砕工程から逆にした)をさらに、架橋逆転(crosslink reversal)について処理した。
【００５５】
次いで、親和性精製したDNAおよび全細胞抽出物DNAをRNAse A、プロテイナーゼKで処理し、複数のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール抽出で精製した。
【００５６】
精製したDNAを、Illumina/Solexa Genomic DNAプロトコルの改変版に従った配列決定のために調製した。末端を修復して、指向性ライゲーションをさせるための1アデニンヌクレオチド突出を付加して、断片化DNAを、Solexaリンカーのライゲーションのために調製した。1:100希釈のアダプターオリゴ混合物(Illumina)をライゲーション工程に使用した。その後のPCR工程は増幅サイクルを制限して(18)、断片にさらなるリンカー配列を付加して、ゲノム分析器フローセルへのアニーリングのために調製した。増幅後、2%アガロースゲルでの分離および150〜300bpのバンドの切り出しにより、狭い範囲の断片サイズを選択した(50〜200ntの長さのせん断断片および約100bpのプライマー配列が現れた)。アガロースからDNAを生成し、フローセルへの充填のために10nMに希釈した。
【００５７】
IlluminaのCluster Stationデバイスを使用して、DNAライブラリー(2〜4pM)をフローセルに適用した(フローセルあたり8試料)。一本鎖DNA由来の架橋増幅工程においてポロニー(polonies)が生じるように、フローセルに適用したライブラリーの濃度を較正した。架橋増幅工程において複数回分の増幅試薬を細胞全域に流して、1μmの直径のスポット中に約1,000本のポロニーを生成した。1:5000希釈のSYBR Green I (Invitrogen)で染色して蛍光照射下で顕微鏡により視覚化して、密度および形態について、二本鎖ポロニーを視覚的に調べた。検証したフローセルを配列決定まで4℃で保存した。
【００５８】
フローセルを、保存物から除去し、直線化およびCluster Stationでの配列決定プライマーのアニーリングに供した。プライマー付加されたフローセルをIllumina Genome Analyzer 1Gに充填した。合成配列決定反応において第1塩基が取り込まれた後、重要な定性対照チェックポイントの間反応を停止した。それぞれのレーンの小画分を画像化し、全ての4塩基についての平均強度の値を最小閾値と比較した。低い第1塩基強度を有するフローセルに再度プライマー付加し、シグナルが回収されなかった場合にフローセルを中止した。最低閾値に適合するシグナル強度を有するフローセルを再開し、26サイクルの間配列決定した。
【００５９】
結果：
JQ1は、複数のヒト癌において有力な適用を有するBETブロモドメインインヒビターである(Delmore, J.E. et al., Cell 146, 904-917; Filippakopoulos, P. et al., Nature 468, 1067-1073; Zuber, J. et al., Nature 478, 524-528)。これは、競合的なBrd2、Brd3、Brd4およびBrdTインヒビターでありアセチル-リジン結合と競合する。JQ1作用機構は主に、BETブロモドメインの標的化のためであり(through)、結果的にMyc遺伝子発現の消失を生じるが、これがどのようにゲノム全域において標的分子に結合するかはわかっていない。ビオチニル化JQ1を使用して、これがSKMEL5黒色腫細胞のゲノムと結合する場所を決定するためにChem-seqを使用した。ビーズ単独のバックグラウンドレベルを決定するためにDMSOを使用した。図4に示されるように、Chem-Seqにより決定されたbio-JQ1占有のパターンの高い程度の重複があり、これは、ChIP-Seqにより決定されたタンパク質標的Brd4のゲノム全域占有である(with it’s the genome-wide occupancy)。これらの結果は、JQ1が、ゲノム全域にわたりBrd4に結合することを示す。
【００６０】
図4は、bio-JQ1と、MYC座およびMITF座の近位のゲノム領域の結合のchem-seq 分析を示す。DMSO(陰性対照)、bio-JQ1およびBrd4(JQ1のタンパク質標的)についての配列決定された読み(sequenced read)の富化は、MYC (A)およびMITF (B)遺伝子の近位の領域を含むゲノム全域における領域でのbio-JQ1およびBrd4について高い程度の重複を示す。
【００６１】
該方法は、目的のタンパク質標的についてのリガンドが利用可能である場合、(タンパク質：DNA相互作用の局在化のために抗体または親和性タグを使用する)相補的な従来のChIPに対して広範囲な適用可能性を有する。重要なことに、これらのリガンドの利用可能性および多様性は、過去数年間で急激に上がっている。
【００６２】
該方法を使用して、薬物の作用機構および薬物の特異性が明らかにされ得る。具体的に、該方法は、いくつかのタンパク質標的とゲノムが結合する場合に、タンパク質または核酸との結合により低分子治療剤がその効果を発揮する特異性および機構のゲノム全域の正確な評価を可能にする。本明細書に記載される技術は、薬物-ゲノム相互作用の標的および非標的特徴付けの決定を可能にする。
【００６３】
該方法は、所定の作用機構を共有する全酵素およびタンパク質のファミリーに対する世界的なDNA/RNA結合試験に有用である。この場合、ゲノムに対する全タンパク質ファミリーの機能および結合は、全タンパク質ファミリーを標的化するように改変された化合物を使用した単一の分析によりアクセス可能である。例は、ゲノム全域分析およびKinome、HTMome、HDACome等の特徴付けである。
【００６４】
癌などの疾患の診断および管理において、該方法はツールとして有用であり、そのため診断研究室において使用され得る。薬物は一般的に、抗体よりも高い安定性を有するが、図4に示されるように、高い感度で検出され得る比較的安定な分子であるDNAの選択的な富化を記載する本明細書に報告される発明に従って使用される場合、核酸の富化において親和性試薬として同様に効果的である。
【００６５】
実施例2 インビボChem-Seq
実施例1に記載されるインビトロChem-Seqと同じプロトコルでインビボChem-Seqを行ったが、以下の工程で、インビトロChem-Seqとは異なった。
【００６６】
1.  ヒト多発性骨髄腫(MM1.S)細胞(1〜2x108の最終的な数)を、5uMのbio-JQ1で種々のインキュベーション時間(0、10、20、30分)処理し、次いで新鮮なホルムアルデヒド溶液(細胞培地中の最終ホルムアルデヒド濃度は1%)を室温で20分間添加した。次いで、細胞を1xPBSで2回洗浄した後、液体窒素中で細胞ペレットを急速に凍結し、使用前に-80度で保存した。
【００６７】
2.  核細胞抽出物(化合物で処理した細胞由来)を、200ulのストレプトアビジンDynal磁性ビーズと一晩(o.n.)インキュベートした。
【００６８】
結果を図5および6に示す。インビトロ方法を繰り返し、インビボ方法と比較した(図7参照)。
【００６９】
実施例3
材料および方法
細胞培養および非ビオチニル化薬物での処理
多発性骨髄腫MM1.S細胞(CRL-2974、ATCC)を、10%ウシ胎仔血清および1% GlutaMAX (Invitrogen、35050-061)を補充したRPMI-1640中に維持した。JQ1処理実験について、非同時性の細胞を種々の濃度のJQ1またはビヒクル(DMSO)で、6の間(for 6)処理した。代替的に、細胞は、2μMのAT7519 (Selleck Chemicals)で6時間処理した。
【００７０】
薬物標的タンパク質のゲノム全域占有分析(ChIP-Seq)
大規模並行DNA配列決定と合わせたChIP(ChIP-Seq)を、以前記載されたとおりに実施した(33)。クロマチン免疫沈降(ChIP)について以下の抗体を使用した：□nti-BRD4 (Bethyl Labs、A301-985A)、□nti-MED1 (Bethyl Labs、A300-793A)、□nti-H3K27Ac (Abcam、ab4729)、□nti-RNA-Pol II (Santa Cruz、sc-899)、□nti-CTCF (Millipore、07-729)および□nti-CDK9 (sc-484)。Illumina配列決定、ライブラリー構築およびChIP-Seq分析法は以前に記載された(33)。
【００７１】
Bio-JQ1(S)の合成
活性Bio-JQ1(S)の合成は、ブロモドメイン過剰末端(BET)サブファミリーを阻害する活性エナンチオマーである(S)-JQ1で開始した。以下のスキームS1に示されるように、(S)-JQ上のエステルのtert-ブチル基の除去により酸S1を得た。次いで、得られた酸を、一保護(PEG)2結合ジアミンに共役させて、アミドS2を得た。化合物S2の末端アミン上のTrt保護基を酸性条件下で除去して、遊離アミンを生成し、これをさらにビオチンと共役させて、最終活性Bio-JQ1(S)を得た。不活性エナンチオマー(R)-JQ1を使用した同じ合成経路で、ビオチニル化不活性エナンチオマーBio-JQ1(R)を合成した。図9参照。
【００７２】
組み換えBRD4の発現(1)
以前に記載された(18)ように、大腸菌中で発現させたポリ-ヒスチジンタグ付加組み換えヒトタンパク質として、BRD4の第1のブロモドメインを精製した。
【００７３】
示差走査蛍光測定法
7300リアルタイムPCRマシン(AB Applied Biosystems)を使用して熱溶融実験を行った。タンパク質を10mM HEPES、pH 7.5、500mM NaCl中で緩衝化し、96ウェルプレート中、20μLの体積中1μMの終濃度でアッセイした。化合物は、10μMの終濃度で添加した。SYPRO Orange (Molecular Probes)を蛍光プローブとして、1:1000の希釈で添加した。SYPRO-Orange色素についての励起および発光フィルターをそれぞれ465nmおよび590nmにセットした。1分あたり4℃で、25℃から96℃まで温度を上げて、それぞれの間隔で蛍光読み取りを行った。観察された温度変化ΔTm obsを、試料ウェルと、同じプレート中でリガンドなしのタンパク質を含む参照(DMSO)ウェルの間の遷移中点(transition midpoint)の差として記録した。
【００７４】
等温滴定熱量測定法
MicroCalTM(Northampton, MA)のITC200マイクロ熱量計を使用して、ITCを行った。全ての実験は、ITCバッファ(50mM HEPES、pH7.4、25℃、150mM NaCl)中、1000rpmで撹拌しながら25℃で行った。マイクロシリンジにタンパク質試料の溶液(ITCバッファ中190μM)を充填した。全ての滴定は、0.2μlの最初の注入後、5秒間(1回の注入当たり)で2μlの19回の同じ注入、注入の間に90秒の間隔をあけて行った。独立滴定(バッファ中にタンパク質)により希釈熱を測定し、実験データから差し引いた。回収したデータを、結合のエンタルピー(ΔH)および結合定数(Ka)を得るための機器を備えたMicroCalTM Originソフトウェアに含ませた(implicate)。一結合部位モデルを使用した。解離定数および熱力学的パラメーターを表5に示す。
【００７５】
ビオチニル化JQ1のインビボゲノム全域占有分析(インビボChem-Seq)
指数関数的に増殖するMM1.S細胞(試料当たり2x108細胞)を、5uMのビオチニル化JQ1(Bio-JQ1)またはDMSO(ビヒクル)のいずれか、および1%ホルムアルデヒドで同時に20分間、細胞培養培地中で処理した。TRISバッファ、pH7.5を、300mM TRISの終濃度まで添加して、化学的架橋を終結させた。シリコン製のヘラを使用して細胞を回収し、遠心分離して、得られたペレットをPBSで3回洗浄した。細胞核は以下のように調製した：細胞を、50mM HEPES、pH7.5、140mM NaCl、1mM EDTA、10%グリセロール、0.5% NP-40、0.25% Triton X-100 + プロテアーゼインヒビターカクテル「完全」(Roche)に溶解して、細胞核を10mM Tris-HCL、pH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTAおよびプロテアーゼインヒビターで1回洗浄した。核を再懸濁して、50mM Hepes-KOH、pH7.5、140mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、1% Triton X-100、0.1% Na-デオキシコール酸、0.1% SDS (音波破砕バッファ)およびプロテアーゼインヒビターカクテル中、18Wで10サイクル(それぞれ30秒)、氷上で、各サイクル間を30秒間隔にして音波破砕した。音波破砕した溶解物を、遠心分離により清澄化して、磁性ストレプトアビジンDynabeads (MyOneストレプトアビジンT1、Invitrogen)(ビーズは、このインキュベーション工程前に0.5% BSAを含むPBS中でブロッキングした)と共に4℃で16〜20時間インキュベートした。核音波破砕溶解物中のインキュベーション後、ビーズを音波破砕バッファで2回、500mM NaClを含む音波破砕バッファで1回、LiClバッファ(20mM Tris-HCL、pH8.0、1mM EDTA、250mM LiCl、0.5% NP-40、0.5% Na-デオキシコール酸)で1回、および10mM TRIS、pH7.5、0.1mM EDTAで1回洗浄した。結合したタンパク質-DNA複合体を、続いて50mM Tris-HCL、pH8.0、10mM EDTA、10% SDSに65℃で15分間溶出し、溶出物を65℃で一晩インキュベートして架橋を逆にした。RNAおよびタンパク質の夾雑は、RNaseおよびプロテイナーゼKのそれぞれの添加により消化し、以前に記載したようにDNAを精製した(34)。最終的に、精製したDNA断片を、大規模並列配列決定して、配列決定データを記載の通りに解析した(33)。
【００７６】
ビオチニル化JQ1のインビトロゲノム全域占有分析(インビトロChem-Seq)
指数関数的に増殖している未処理MM1.S細胞を、細胞培養培地中、1%ホルムアルデヒドで20分間固定した。上述のように、化学的架橋を終結させ、核を調製し、音波破砕核溶解物を得た。しかしながら、インビボプロトコルとは異なり、ストレプトアビジンDynabeadsは、0.5% BSA、および200□Mのビオチニル化薬物またはビヒクル(DMSO)のいずれかを含むPBS中で6時間プレインキュベートした。続いて薬物結合ビーズをPBS/0.5%BSA中で4回洗浄し、未結合薬物を除去し、核音波破砕溶解物中、4℃で16〜20時間インキュベートした。全ての以下の工程は、上述のもの(インビボChem-Seq法)と同じである。
【００７７】
ビオチニル化AT7519を使用したインビトロゲノム全域占有分析(インビトロChem-seq)
指数関数的に増殖している未処理MM1.S細胞を、細胞培養培地中、0.5%ホルムアルデヒドで5分間固定した。300mM TRISの終濃度までTRISバッファ、pH7.5を添加して化学的架橋を終結させた。細胞をPBS中で3回洗浄し、細胞核は以下の通りに調製した：細胞核を、50mM HEPES、pH7.5、140mM NaCl、1mM EDTA、10%グリセロール、0.5% NP-40、0.25% Triton X-100 ＋ プロテアーゼインヒビターカクテル「完全」(Roche)に溶解し、細胞核を、10mM Tris-HCL、pH8.0、200mM NaCl、1mM EDTA、0.5mM EGTAおよびプロテアーゼインヒビターで1回洗浄した。核を再懸濁し、50mM Hepes-KOH、pH7.5、140mM NaCl、1mM EDTA、1mM EGTA、0.5% NP-40、0.5% Triton-X(音波破砕バッファ)中で音波破砕した。ペレットを、9〜12Wで4サイクル(それぞれ30秒)、Misonix音波破砕機中、氷上で、サイクル間に1分の休止間隔で音波破砕した。薬物結合ビーズを清澄化した音波破砕物に添加して、沈殿を12〜18時間進行させた。続いて薬物結合ビーズを音波破砕バッファ中で4回洗浄し、タンパク質を1% SDSに溶出し、溶出物を1% SDS中、65℃で一晩インキュベートして架橋を逆にした。RNAおよびタンパク質の夾雑は、RNase AおよびプロテイナーゼKで連続的にインキュベートして消化し、以前に記載されるとおりにDNAを精製した(34)。精製したDNA断片を大規模並行配列決定(Illumina)に供し、配列決定データを記載される通りに解析した(33)。
【００７８】
Chem-seqおよびChIP-Seqデータ分析
全てのChIP-SeqおよびChem-seqのデータセットを、Bowtie (バージョン0.12.2) (35)を用いて整列し、ヒトゲノムのバージョンNCBI36/HG18を構築した。本発明者らは、MACSバージョン1.4.1(ChIP-Seqのモデルベース分析) (36)ピーク発見アルゴリズムを使用して、バックグラウンドに対するChIP-Seq富化の領域を同定した。全てのデータセットに対して1e-9の富化のp-値閾値を使用した。任意の領域における標準化したChIP-Seqデータセットの読み密度を得るために、該領域に対して整列したChIP-Seq読みを、MACSにより自動的に拡張し、塩基対(bp)当たりの読みの密度を計算した。それぞれの領域中の読みの密度を100万のマッピングした読みの合計数に対して標準化し、bp当たり100万のマッピングした読み当たりの読み(rpm/bp)の単位の読み密度を得た。
【００７９】
GEO受託番号
GEO受託番号GSE43743で、整列したデータおよび生データを見ることができた。
【００８０】
転写された遺伝子の規定
H3K4me3またはRNA Pol IIのいずれかについて富化された領域がTSSの+/-5kb内に配置される場合に、転写された遺伝子を規定した。H3K4me3は、転写開始に関連するヒストン修飾である(37)。
【００８１】
活性エンハンサーの規定
プロモーターの外側のH3K27Acについての富化の領域として活性エンハンサーを規定した(任意のTSSから5kbより離れている)。H3K27Acは、活性エンハンサーに関連するヒストン修飾である(38、39)。活性エンハンサーは、プロモーターと共に、メディエーター複合体により促進されるループを形成する(25)。したがって、エンハンサーの規定H3K27Acは、メディエーターサブユニットMed1についてのChIP-Seqデータを使用して検証された。Med1由来の富化された領域は、全てのデータセットにおいてH3K27Ac領域と、>90%の重複を有した。
【００８２】
RNA Pol II移動率の決定
移動率(TR)として公知の基準値である、開始領域から伸長領域におけるRNA Pol II ChIP-Seqレベルの比率を決定した(40)。開始領域は、TSSの周囲+/-300bpと規定した。伸長領域は、TSSから+300bpから、遺伝子末端後の+3,000bpまでと規定した。より高い信頼比較を行うために、分析は、全ての試料中の開始領域および伸長領域内の雑音より高い検出可能なシグナルを有する遺伝子に限定した。移動率の分布における変化の統計的な有意さは、両側t検定を使用して決定した。
【００８３】
近位プロモーターにおけるChIP-seq占有の差の定量
プロモーター領域(転写開始部位(TSS)の+/-1kbにおけるRNA Pol II ChIP-Seq読みの密度を増加することにより全ての遺伝子を順位付けし、100遺伝子の増加に入れた(binned)。それぞれのビン内のプロモーター領域についての中位ChIP-Seq密度は、Pol II、BRD4、MED1、H3K27Ac、CDK9の全てについてrpm/bpで計算した。
【００８４】
合成ChIP-seq占有プロフィール
ChIP-Seq密度プロフィールの合成図(composite view)中の中心で、活性エンハンサーを整列した。50bpのビン(bin)内の活性エンハンサーを中心として周囲+/-5kbの平均ChIP-Seq読み密度を計算した。それらの転写開始部位および転写終結部位の位置および方向を使用して遺伝子を整列した。データは、50bpのビン内のゲノム全域ChIP-Seq読み密度平均として表した。Chem-seqシグナルとChIP-Seqシグナルの相関は、ChIP-seqからの低分子(BRD4およびCDK9)の標的からの富化した領域を使用して計算した。CTCF富化領域を比較として使用した。Chem-seqおよびChIP-seqの読み密度プロフィールは、散乱プロットとして示した。
【００８５】
Chem-SeqデータとChIP-Seqデータの重複に基づく特異性分析
BRD4およびJQ1の部位はJQ1の非標的相互作用を示し得るので、Chem-SeqデータおよびChIP-Seqデータを分析して、実質的なJQ1 Chem-Seqシグナルを有するが、有意なBRD4 ChIP-Seqシグナルは有さないゲノム領域を同定した。一般線形モデル(GLM法)を適用して、異なるシグナルを有する領域を同定した(41、42)。考慮される6個のデータセット(3個の複製JQ1 Chem-Seqデータセットおよび3個の複製BRD4 ChIP-Seqデータセット)のいずれかにおいて、JQ1 Chem-SeqシグナルまたはBRD4 ChIP-Seqシグナルについて富化されたゲノム領域のセットを最初に同定した。別のデータセット由来の領域と重複したデータセット由来の領域を一緒に重ねて、合わされたゲノム領域に及ぶ代表的な領域を形成した。合計25,060個の領域を同定した。それぞれの領域における読み密度は、それぞれのデータセットについて、bp当たり100万のマッピングされた読み当たりの読みの単位(rpm/bp)で計算した。3重データセットの間の雑音のための技術的変形およびJQ1 Chem-SeqとBRD4 ChIP-Seqのデータセットの間のシグナルの差のための生物学的変形をモデル化するために、edgeRパッケージを使用した(41)。配列決定深さ(sequencing depth)およびTMM技術を使用して、共通のタグワイズ分散(tagwise dispersion)を推定した後のデータセットを標準化した。正確な検定を使用して、JQ1 Chem-SeqシグナルとBRD4 ChIP-Seqシグナルの間の差の統計的な有さを計算し、得られたP値をBenjamini-Hochberg複数試験補正(multiple testing correction)に供した。該分析により、試験された25,060個のゲノム領域のうち10個が同定され、JQ1 Chem-SeqとBRD4 ChIP-Seqのシグナルの有意差を示した(FDR<=0.25)。10個全ての領域は、JQ1 Chem-Seqシグナルに対して、より高いBRD4 ChIP-Seqシグナルを示し、本発明者らは、実質的なJQ1 Chem-SeqシグナルおよびBRD4 ChIP-Seqシグナルの欠如を検出しなかった。これらのデータは、これらの実験的な条件下では、BRD4を有さないゲノムの領域において、JQ1 Chem-Seqシグナルを生じる同定可能な非標的相互作用は存在しないことを示す。
【００８６】
本明細書に記載される差異的結合分析の限度を調べるために、BRD4 ChIP-Seqシグナルと重複しないJQ1 Chem-Seqシグナルの存在をモデル化する擬似的データセットを作成した。次いで、どのようにして良好な分析を行い、これらのコンピューター上で導入された異なるシグナルの領域を同定できるかを尋ねた。擬似的データセットを作成するために、JQ1 Chem-Seqのそれぞれの複製データセットを、CTCF ChIP-Seq実験由来のマッピングされた一組の読みでスパイクした。読みをCTCF富化の領域に特異的にマッピングし、JQ1 Chem-SeqシグナルまたはBRD4 ChIP-Seqシグナルのいずれかとの重複を避けるために選択された領域を選んだ。JQ1 Chem-Seqデータセットにおいてさらに1%、2%、5%または10%の富化された領域の存在を模倣するために、読みの変数を付加した。CTCF ChIP-Seq読みをBRD4 ChIP-Seqデータに付加しない場合は、擬似的データセット内のCTCF ChIP-Seq-由来シグナルの領域は、異なるシグナルを同定する能力を試験する場合、真の陽性となった。次いで上述のようにGLM-系分析を行った。GLM分析により、擬似的データセットに導入された異なるシグナルの本質的に全ての領域が同定されることが見出された。真の陽性としてさらに1%の領域をコンピューター上で導入した疑似的データセットにおいて、これらの領域の95%は、異なるシグナルを有すると同定された。真の陽性としてさらに2%、5%または10%の領域をコンピューター上で導入したデータセットにおいて、同定率はそれぞれ98.5%、99.8%および99.7%であった。それと一緒に、これらのデータは、シグナルがまれにしか起こらない場合であっても、GLM法により、異なるシグナルの例を適切に同定し得ることを示す。
【００８７】
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【００８８】
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【００８９】
本明細書に引用される全ての特許、公開特許出願および参照文献の教示は、それらの全体において、参照により援用される。
【００９０】
本発明は、その例示的態様に関して、具体的に示され、記載されてきたが、添付の特許請求の範囲包含される発明の範囲を逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更が本発明においてなされ得ることが、当業者に理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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