(57)【要約】  高い親和性、効力および安定性を有する細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）のバリアント。例えば、月１回以下の頻度の投与間隔における皮下または静脈内投与用の高濃度におけるＣＴＬＡ−４バリアントの配合。関節リウマチおよび他の炎症障害を治療するためのＣＴＬＡ−４バリアントの使用。改善された安定性およびより長いインビボ半減期を有するＣＴＬＡ−４とＩｇＧＦｃとの融合物。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
野生型ＣＴＬＡ−４の配列番号３５と比較して大きいヒトＣＤ８０結合親和性、大きい効力および／または大きい安定性を有する単離ＣＴＬＡ−４ポリペプチドであって、配列番号３５のバリアントであるアミノ酸配列を含み、前記バリアントは、配列番号３５中の以下のアミノ酸突然変異の５つ以上を含むポリペプチド：
Ｉ１６におけるＲ、Ｓ、ＶまたはＴ；
Ａ２４におけるＴ；
Ｓ２５におけるＮまたはＰ；
Ｇ２７におけるＳ；
Ｖ３２におけるＩ；
Ｄ４１におけるＧ；
Ｓ４２におけるＧ；
Ｖ４４におけるＥ；
Ｍ５４におけるＫ；
Ｎ５６におけるＳまたはＧ；
Ｌ５８におけるＡ、Ｇ、ＳまたはＰ；
Ｔ５９におけるＳまたはＡ；
Ｆ６０におけるＴ；
Ｌ６１におけるＱまたはＰ；
Ｄ６２におけるＧ；
Ｄ６３におけるＹ；
Ｓ６４におけるＰ；
Ｉ６５におけるＮ、Ｄ、ＶまたはＴ；
Ｓ７０におけるＡ、Ｔ、ＭまたはＨ；
Ｑ８０におけるＲ；
Ｍ８５におけるＱ、Ｓ、Ｖ、Ｒ、ＫまたはＬ；
Ｔ８７におけるＳ；
Ｋ９３におけるＱ、Ｈ、Ｔ、ＥまたはＭ；
Ｌ１０４におけるＲ、ＱまたはＥ；
Ｉ１０６におけるＶ；
Ｎ１０８におけるＤまたはＳ；
Ｉ１１５におけるＶまたはＦ；
Ｃ１２０におけるＳ；
Ｔ５１における欠失。
【請求項２】
配列番号３５と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項３】
以下のアミノ酸突然変異の５つ以上を含む、請求項１または２に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド：
Ｉ１６におけるＲ、ＳまたはＶ；
Ａ２４におけるＴ；
Ｓ２５におけるＮ；
Ｇ２７におけるＳ；
Ｍ５４におけるＫ；
Ｎ５６におけるＳ；
Ｌ５８におけるＡまたはＧ；
Ｔ５９におけるＳ；
Ｆ６０におけるＴ；
Ｌ６１におけるＱ；
Ｄ６３におけるＹ；
Ｓ６４におけるＰ；
Ｉ６５におけるＮまたはＤ；
Ｓ７０におけるＡ；
Ｑ８０におけるＲ；
Ｍ８５におけるＱまたはＳ；
Ｋ９３におけるＱまたはＨ；
Ｃ１２０におけるＳ。
【請求項４】
置換Ｓ２５ＮまたはＳ２５Ｐを含む、請求項１または２に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項５】
置換Ｓ２５Ｎ、Ｋ９３ＱまたはＫ９３Ｈを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項６】
配列番号３６〜５５のいずれかと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列、またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項７】
残基５９〜６５におけるアミノ酸モチーフの配列番号６９を含み、前記残基ナンバリングは、配列番号３５に準拠する、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項８】
以下から選択される突然変異の組合せを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド：
−  １３１５突然変異、すなわち、Ｉ１６におけるＳ；Ｓ２５におけるＮ；Ｌ５８におけるＧ；Ｓ７０におけるＡ；Ｑ８０におけるＲ；Ｍ８５におけるＳ；およびＫ９３におけるＱ；
−  １３２２突然変異、すなわち、Ｓ２５におけるＮ；Ｇ２７におけるＳ；Ｍ５４におけるＫ；Ｎ５６におけるＳ；Ｔ５９におけるＳ；Ｆ６０におけるＴ；Ｌ６１におけるＱ；Ｄ６３におけるＹ；Ｓ６４におけるＰ；Ｉ６５におけるＮ；およびＫ９３におけるＱ；
−  １３２１突然変異、すなわち、Ｉ１６におけるＳ；Ｓ２５におけるＮ；Ｍ５４におけるＫ；Ｌ５８におけるＧ；Ｓ７０におけるＡ；Ｑ８０におけるＲ；Ｍ８５におけるＳ；およびＫ９３におけるＱ；
−  １１１５突然変異、すなわち、Ｉ１６におけるＶ；Ｓ２５におけるＮ；Ｌ５８におけるＧ；Ｓ７０におけるＡ；Ｍ８５におけるＱ；およびＫ９３におけるＱ；
−  １２９９突然変異、すなわち、Ｉ１６におけるＲ；Ａ２４におけるＴ；Ｓ２５におけるＮ；Ｇ２７におけるＳ；Ｌ５８におけるＡ；Ｓ７０におけるＡ；Ｍ８５におけるＱ；およびＫ９３におけるＱ；ならびに
−  １２２７突然変異、すなわち、Ｉ１６におけるＳ；Ｓ２５におけるＮ；Ｇ２７におけるＳ；Ｌ５８におけるＡ；Ｓ７０におけるＡ；Ｍ８５におけるＱ；およびＫ９３におけるＨ。
【請求項９】
配列番号３６〜５５から選択されるアミノ酸配列を含み、またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含み、または最大１０のアミノ酸突然変異を有するそれらの配列のいずれかのバリアントを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号３６〜５５から選択されるアミノ酸配列を含み、またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含み、または最大５つのアミノ酸突然変異を有するそれらの配列のいずれかのバリアントを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号３６〜５５から選択されるアミノ酸配列を含み、またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含み、または最大３つのアミノ酸突然変異を有するそれらの配列のいずれかのバリアントを含む、請求項１０に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項１２】
配列番号３６〜５５から選択されるアミノ酸配列を含み、またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項１３】
配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２、配列番号４７から選択されるアミノ酸配列、またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項１４】
野生型ＣＴＬＡ−４の配列番号３５と比較して大きいヒトＣＤ８０結合親和性、大きい効力および／または大きい安定性を有する単離ＣＴＬＡ−４ポリペプチドであって、
（ｉ）アミノ酸配列の配列番号６８、配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２もしくは配列番号４７；
（ｉｉ）最大１０のアミノ酸突然変異を含有する（ｉ）のバリアントであるアミノ酸配列であって、残基２５は、突然変異しておらず、Ｎであるアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）１つ以上のアミノ酸突然変異を含む（ｉ）のバリアントであるアミノ酸配列であって、残基２５は、突然変異しておらず、Ｎであり、前記バリアントは、（ｉ）と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または
（ｉｖ）ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列
を含むポリペプチド。
【請求項１５】
配列番号６８、配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２もしくは配列番号４７、または最大５つのアミノ酸突然変異を有するそれらの配列のいずれかのバリアントを含む、請求項１４に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項１６】
配列番号６８、配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２もしくは配列番号４７、または最大３つのアミノ酸突然変異を有するそれらの配列のいずれかのバリアントを含む、請求項１５に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項１７】
配列番号６８、配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２または配列番号４７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項１８】
配列番号６８、配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２または配列番号４７と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項１９】
５０ｎＭ以下のヒトＣＤ８０結合親和性を有し、前記親和性は、表面プラズモン共鳴により決定されるＫＤである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項２０】
２０ｎＭ以下のヒトＣＤ８０結合親和性を有し、前記親和性は、表面プラズモン共鳴により決定されるＫＤである、請求項１９に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項２１】
野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）よりも大きいヒトＣＤ８６結合親和性を有する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項２２】
−  残基１６におけるＳ；残基２５におけるＮ；残基５８におけるＧ；残基７０におけるＡ；残基８０におけるＲ；残基８５におけるＳ；および残基９３におけるＱ；
−  残基２５におけるＮ；残基２７におけるＳ；残基５４におけるＫ；残基５６におけるＳ；残基５９におけるＳ；残基６０におけるＴ；残基６１におけるＱ；残基６３におけるＹ；残基６４におけるＰ；残基６５におけるＮ；および残基９３におけるＱ；
−  残基１６におけるＳ；残基２５におけるＮ；残基５４におけるＫ；残基５８におけるＧ；残基７０におけるＡ；残基８０におけるＲ；残基８５におけるＳ；および残基９３におけるＱ；
−  残基１６におけるＶ；残基２５におけるＮ；残基５８におけるＧ；残基７０におけるＡ；残基８５におけるＱ；および残基９３におけるＱ；
−  残基１６におけるＲ；残基２４におけるＴ；残基２５におけるＮ；残基２７におけるＳ；残基５８におけるＡ；残基７０におけるＡ；残基８５におけるＱ；および残基９３におけるＱ；または
−  残基１６におけるＳ；残基２５におけるＮ；残基２７におけるＳ；残基５８におけるＡ；残基７０におけるＡ；残基８５におけるＱ；および残基９３におけるＨ
を含む、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項２３】
最大３つのアミノ酸突然変異を有するアミノ酸配列の配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２または配列番号４７を含む、請求項１４〜２２のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項２４】
１６位におけるＲ、Ｉ、ＳまたはＶ；２４位におけるＴまたはＡ；２７位におけるＳまたはＧ；５４位におけるＭまたはＫ；５６位におけるＮまたはＳ；５８位におけるＡ、ＬまたはＧ；５９位におけるＴまたはＳ；６０位におけるＦまたはＴ；６１位におけるＬまたはＱ；６３位におけるＤまたはＹ；６４位におけるＳまたはＰ；６５位におけるＩ、ＮまたはＤ；７０位におけるＡまたはＳ；８０位におけるＱまたはＲ；８５位におけるＱ、ＭまたはＳ；９３位におけるＱまたはＨ；および１２０位におけるＣまたはＳを含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１４〜１８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチドであって、前記アミノ酸突然変異は、残基１６における置換Ｔ；残基３２における置換Ｉ；残基４１における置換Ｇ；残基４２における置換Ｇ；残基４４における置換Ｅ；残基５６における置換Ｇ；残基５８における置換ＳまたはＰ；残基５９における置換Ａ；残基６１における置換Ｐ；残基６２における置換Ｇ；残基６５における置換ＶまたはＴ；残基７０における置換Ｔ、ＭまたはＨ；残基８５における置換Ｖ、Ｒ、ＫまたはＬ；残基８７における置換Ｓ；残基９３における置換Ｔ、ＥまたはＭ；残基１０４における置換Ｒ、ＱまたはＥ；残基１０６における置換Ｖ；残基１０８における置換ＤまたはＳ；残基１１５における置換ＶまたはＦ；残基１２０における置換Ｓ；残基５１における欠失から選択される、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項２６】
アミノ酸配列の配列番号６８、配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２もしくは配列番号４７を含み、またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含む、請求項１４に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項２７】
ＣＤ８６結合親和性よりも少なくとも１０倍大きいＣＤ８０結合親和性を有する単離ＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項２８】
ＣＤ８６結合親和性よりも少なくとも５０倍大きいＣＤ８０結合親和性を有する、請求項２７に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項２９】
請求項１〜２６のいずれかに定義される、請求項２７または２８に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項３０】
ＩｇＧＦｃアミノ酸配列にコンジュゲートしている、請求項１〜２９のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項３１】
前記ＩｇＧＦｃは、Ｆｃエフェクター機能を低減させるように改変されたヒトＩｇＧ１Ｆｃであり、天然ヒトＩｇＧ１Ｆｃヒンジ領域を含む、請求項３０に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項３２】
請求項３０または３１に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチドにおいて、前記ＩｇＧＦｃアミノ酸配列は、以下の残基群の一方または両方が以下のとおりに置換されている：
残基２０におけるＦ；残基２１におけるＥ；残基１１７におけるＳ；および
残基３８におけるＹ、残基４０におけるＴ、残基４２におけるＥ、
前記残基ナンバリングは、配列番号５６に準拠して定義される、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域を含むＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項３３】
前記ＩｇＧＦｃアミノ酸配列は、配列番号５９を含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項３４】
ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされる１２９９ＣＴＬＡ−４−Ｉｇアミノ酸配列を含む、単離ＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項３５】
マルチマーである、請求項１〜３４のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項３６】
ダイマーである、請求項３５に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項３７】
テトラマーである、請求項３５に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項３８】
前記テトラマーは、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドの２つのペアを含み、それぞれのペアは、抗体軽鎖定常領域に融合しているＣＴＬＡ−４ポリペプチドおよび抗体重鎖定常領域に融合しているＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含む、請求項３７に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【請求項３９】
核酸を含有する宿主細胞であって、前記核酸は、ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された１２９９ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ核酸配列を含む宿主細胞。
【請求項４０】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド；および
１つ以上の医薬賦形剤を含む組成物。
【請求項４１】
ＩｇＧＦｃアミノ酸配列にコンジュゲートしているアミノ酸配列の配列番号６８、配列番号４３、配列番号４７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２  配列番号４７またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含むＣＴＬＡ−４ポリペプチド；および
１つ以上の医薬賦形剤
を含む組成物。
【請求項４２】
前記ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号５９を含むＩｇＧＦｃアミノ酸配列にコンジュゲートしている、請求項４０または４１に記載の組成物。
【請求項４３】
ＩｇＧＦｃにコンジュゲートしている前記ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、アミノ酸配列の配列番号１３、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６を含む、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされる１２９９ＣＴＬＡ−４−Ｉｇポリペプチドおよび１つ以上の医薬賦形剤を含む組成物。
【請求項４５】
少なくとも７０ｍｇ／ｍｌの濃度で前記ＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含む、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
少なくとも１００ｍｇ／ｍｌの濃度で前記ＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
皮下または静脈内投与による患者の治療方法における使用のための、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド、または請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
関節リウマチ、多発性硬化症、喘息、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデスまたは移植片拒絶の治療方法における使用のための、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド、または請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチドまたは請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の組成物を患者に２８日間隔において投与することを含む治療方法における使用のための、請求項１〜３８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド、または請求項４０〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
配列番号３６〜５５から選択されるＣＴＬＡ−４ポリペプチドアミノ酸配列またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列の突然変異によりさらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを産生する方法であって：
アミノ酸配列の配列番号３６〜５５またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含み、またはそれからなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを提供すること；
１つ以上の突然変異を前記アミノ酸配列中に導入してさらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを提供すること；
前記さらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドの安定性、親和性および／または効力を試験すること；ならびに
前記さらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを、１つ以上の医薬賦形剤を含む組成物に配合すること
を含む方法。
【請求項５１】
前記さらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドがＦｃ領域にコンジュゲートしている、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
電子的に提出された配列表の参照
本出願とともに出願された、ＡＳＣＩＩテキストファイル（名称ＣＴＬＡ４１０１Ｐ１Ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：１０７，８１４バイト；および作成日：２０１２年５月１１日）の電子的に提出された配列表の内容は、参照により本明細書に全体として組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ＩｇＧＦｃに場合により融合している細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）のバリアントを含む組成物、および特に炎症病態、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）に関するＴ細胞活性化を阻害するためのその治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ナイーブＴ細胞の活性化は、２シグナルの機序により進行すると考えられる。抗原提示細胞（ＡＰＣ）と接触時、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に関するペプチドと相互作用し、したがって第１の活性化シグナルをＴ細胞に送達する。この初期シグナルは、Ｔ細胞活性化をもたらすためには不十分であり、共刺激受容体からの第２のシグナルが絶対要件である。最も重要で、最良に記載された共刺激受容体の１つは、ＣＤ２８であり、それは、マクロファージ、樹状細胞ならびにＢおよび活性化Ｔリンパ球の表面上のＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）と相互作用する。
【０００４】
ＣＤ８６遺伝子は、Ｉ型膜タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ３３６８１）をコードする。選択的スプライシングは、異なるアイソフォームをコードするＣＤ８６遺伝子の２つの転写物バリアントをもたらす。追加の転写物バリアントが記載されているが、それらの全長配列は決定されていない。
【０００５】
関連タンパク質ＣＤ８０（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ４２０８１）は、ＣＤ８６と類似の二次構造を有する。ＣＤ８０は、ＣＤ８６とそれぞれ２６％および４６％の同一および類似アミノ酸残基を共有する。ＣＤ８０は、休眠ＡＰＣ中で低レベルにおいてのみ発現されるが、活性化後に上方調節され得る。ＣＤ８０は、Ｔ細胞上の同一受容体ＣＤ２８およびＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）を認識するが、それらにはＣＤ８６よりも約２から４倍高い親和性で結合する。
【０００６】
ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ−４への結合を担う共有される直鎖ペプチドエピトープは、同定されていない（Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５６，２７００−２７０９）が、二次構造（ＣＤ８０およびＣＤ８６のＩｇＶシート）中の保存残基は、ＣＴＬＡ−４との相互作用において見出されている（Ｓｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１０，６０４−６０８）。
【０００７】
ＣＤ２８からのシグナル伝達は、Ｔ細胞活性化およびＣＴＬＡ−４共阻害受容体の上方調節をもたらす。ＣＴＬＡ−４は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８と比較して増加した親和性およびアビディティーでＣＤ８０およびＣＤ８６に結合し、活性化シグナルを有効に下方調節する。
【０００８】
ＣＴＬＡ−４への結合におけるＣＤ８０およびＣＤ８６の相対的な役割に関して種々の理論が仮定されている。Ｓｌａｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．１９（１）：１−２４  １９９９）は、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４およびＣＤ８０／ＣＤ８６ファミリーのシグナリングおよび機能を概説している。Ｓａｎｓｏｍ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０１：１６９−１７７  ２０００）は、ＣＤ８０とＣＤ８６との相違を調査したいくつかの試験をまとめた。
【０００９】
Ｏｄｏｂａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２４：５０３−５１３  ２００８）は、エフェクターＴ細胞応答におけるＣＤ８０およびＣＤ８６の役割を調査した。この試験は、関節炎の抗原誘導マウスモデルにおける抗ＣＤ８０および抗ＣＤ８６モノクローナル抗体の効果を調査した。ＣＤ８０およびＣＤ８６の両方の遮断は、対照抗体処理マウスと比較して低減した疾患重症度に向かう傾向を引き起こすことが報告された。個々の抗体の処理の結果に基づき、著者らは、ＣＤ８０は、全身性ＩＬ−４を下方調節し、関節中のＴ細胞蓄積を増加させることにより関節炎を悪化させる一方、ＣＤ８６は、ＩＬ−１７を上方調節し、関節中のエフェクターＴ細胞の蓄積を増加させることによりＴｈ１発生にもＴｈ２発生にも影響せずに疾患重症度を向上させることを結論づけた。しかしながら、この試験は、ＣＤ８０およびＣＤ８６の両方が遮断された場合、関節炎重症度のさらなる追加の低減が観察されないことを報告しており、このことは、最大の疾患改善を得るためにいずれかの共刺激分子の阻害が適切であったことを示唆する。このモデルは、関節腔中で直接注射された抗原（この試験においてＢＳＡ）に対するリコール応答に基づいた。
【００１０】
別の試験は、内因性抗原（コラーゲン）に対する寛容の破壊を含むネズミコラーゲン誘導関節炎モデルを使用した。この試験において、ＣＤ８０およびＣＤ８６の両方の遮断が、最大利益に要求されることが報告された（Ｗｅｂｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６（１０）：２３２０−２３２８  １９９６）。
【００１１】
改変ＩｇＧ１Ｆｃドメインに結合しているＣＴＬＡ−４（「ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ」）の細胞外ドメインを含む組換え融合タンパク質は、ＣＤ８０およびＣＤ８６にインビボで結合し、ＣＤ２８介在性Ｔ細胞活性化を有効に抑制することが示されている（Ｋｌｉｗｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２００５；２５（３）：１６５−７１）。
【００１２】
ＣＴＬＡ−４融合タンパク質は、関節リウマチ（ＲＡ）用治療剤として開発されている。ＲＡは、軟骨および骨破壊をもたらす進行性変性疾患である。免疫系の多くの武器が、線維芽細胞様滑膜細胞ならびに破骨細胞介在性関節損傷ならびに軟骨および骨破壊をもたらす炎症プロセスに関与する証拠が存在する。複数の試験は、滑膜中の増加したＴ細胞活性化を示しており、炎症パンヌスに浸潤する細胞の最大５０％がＴリンパである。さらに、ＲＡ患者の滑膜中のＴ細胞は、活性化関連マーカー、例えば、ＣＤ４４、ＣＤ６９、ＣＤ４５ＲＯ、ＶＬＡ−１およびＣＤ２７の増加した発現を示す活性化エフェクター表現型を示す。
【００１３】
活性化Ｔ細胞は、ＲＡ滑膜中で見出される病的炎症応答の樹立および維持における重要な役割を担うことが示されている。活性化Ｔ細胞は、炎症促進性サイトカイン、例えば、ＩＦＮγ、ＩＬ−１７およびＴＮＦαの重要な源である。これらの因子は、軟骨破壊のメディエーターであるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の分泌ならびに炎症性メディエーター、例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１およびＴＮＦαの分泌をもたらす線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＳ）およびマクロファージ様滑膜細胞（ＭＬＳ）の強力な活性化因子である。活性化ＣＤ４＋細胞は、疾患進行にさらに寄与する抗体、例えば、リウマチ因子（ＲＦ）の産生をもたらすＢリンパ球へのコグネイト補助（ｃｏｇｎａｔｅ  ｈｅｌｐ）も提供し得る。
【００１４】
アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））は、ＩｇＧ１のＦｃに融合しているＣＴＬＡ−４の細胞外ドメインを含有するＣＴＬＡ−４Ｉｇ融合タンパク質である。得られる可溶性タンパク質は、約９２ｋＤａの分子量を有するダイマーである。これは診療所におけるＲＡ患者の治療において利益効果を有することが示されており、このことは、ＣＤ８０およびＣＤ８６を含む共刺激経路の阻害がＲＡについての実行可能な治療アプローチであることを実証する。アバタセプトによるＲＡ治療は、静脈内の月１回または週１回の皮下注射のいずれかとして施される。
【００１５】
アバタセプトは、そのＣＤＲ３様ループ中で、ＣＤ２８とＣＴＬＡ−４との間で共有され、Ｂ７リガンドへの結合に必要であると報告されているアミノ酸ヘキサペプチドモチーフＭＹＰＰＰＹを含有する。このモチーフ中の最初のチロシン（Ｙ）のアラニン（Ａ）への突然変異は、ＣＤ８０への結合を消失させるが、ＣＤ８６への結合の低減ももたらす一方、フェニルアラニン（Ｆ）置換は、ＣＤ８６結合の全損と共に、完全なＣＤ８０親和性の保持を可能とする（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９７）１８５：１７７−１８２）。ＣＤＲ３様およびＣＤＲ１様領域中の他の残基も、アバタセプトとそのリガンドとの相互作用に重要である。したがって、１０４位におけるロイシン（Ｌ）に代えてグルタミン酸（Ｅ）を有し、２９位におけるアラニン（Ａ）に代えてチロシン（Ｙ）を有する突然変異分子は、アバタセプトよりも約２倍大きいＣＤ８０（Ｂ７−１）結合アビディティーおよび約４倍大きいＣＤ８６（Ｂ７−２）結合アビディティーを示す。この化合物ＬＥＡ−２９Ｙ（ベラタセプト、Ｎｕｌｏｊｉｘ（登録商標））は、ＣＤ８０結合に対しＣＤ８６結合と類似の親和性（それぞれ、３．６６ｎＭおよび３．２１ｎＭ）を有することが報告されている。ベラタセプトは、移植用の免疫抑制剤として開発されており（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００５）５：４４３−４５３；Ｇｕｐｔａ  ＆  Ｗｏｍｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ  Ｔｈｅｒ  ４：３７５−３８２  ２０１０）、近年、腎臓移植を受ける成人患者における臓器拒絶の予防について承認された。アバタセプト自体は、移植片拒絶に対して限定された有効性を示し、これは、ＣＤ８０依存性共刺激とは異なりＣＤ８６依存性共刺激のその低い阻害に起因する知見である（Ｇｕｐｔａ  ＆  Ｗｏｍｅｒ、前掲）。
【００１６】
皮下投与用のアバタセプトおよびベラタセプトの配合は、国際公開第２００７／０７６５４号パンフレットに記載されている。
【００１７】
改善された親和性および安定性の選択は、ＣＴＬＡ−４の改善されたバリアントを単離するリボソームディスプレイを使用して既に実施されている。遺伝子配列全体を突然変異させるエラープローンＰＣＲ突然変異誘発、および突然変異を重要な領域に標的化する位置指定突然変異誘発の両方が、タンパク質進化について成功している。例えば、国際公開第２００８／０４７１５０号パンフレットは、野生型と比較して増加した活性および増加した安定性を示すＣＴＬＡ−４のタンパク質バリアントを報告した。
【００１８】
Ｍａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．は、ＲＡの治療のためにＰｅｒｓｅｉｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ＬＬＣとＡｓｔｅｌｌａｓ  Ｐｈａｒｍａ  Ｉｎｃにより共同開発され、ＡＳＰ２４０８と命名されたＣＴＬＡ−４−Ｉｇ治療分子を報告した。このＣＴＬＡ−４−Ｉｇは、Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標）（アバタセプト）と比較して改善された効力を示すことが報告された（国際公開第２００９／０５８５６４号パンフレット）。
【００１９】
米国特許第６，７５０，３３４号明細書（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、免疫グロブリンの一部に融合しているＣＴＬＡ−４を含む可溶性融合タンパク質のＣＴＬＡ−４−Ｃγ４を記載した。ヒンジ領域ならびにＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン定常領域は、補体活性化またはＦｃ受容体相互作用を低減するように少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、付加または欠失により改変されている。
【００２０】
Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．は、近年、バリアントＣＴＬＡ−４部分および免疫グロブリンＦｃ領域を含むＣＴＬＡ４−Ｉｇ分子を記載した（国際公開第２０１１／１０３５８４号パンフレット）。より大きいＴ細胞阻害活性を有するＣＴＬＡ４−Ｉｇバリアントを生成するためのＣＴＬＡ−４部分のアミノ酸配列中の多数のアミノ酸置換が記載された。国際公開第２０１１／１０３５８４号パンフレットは、例えば、ＦｃγＲへの結合を改善するため、Ｆｃ介在性エフェクター機能を向上させるため、および／またはＣＴＬＡ４−Ｉｇのインビボ半減期を延長させるためのＦｃ改変も記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】国際公開第２００７／０７６５４号
【特許文献２】国際公開第２００８／０４７１５０号
【特許文献３】国際公開第２００９／０５８５６４号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Ｓｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１０，６０４−６０８
【非特許文献２】Ｏｄｏｂａｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １２４：５０３−５１３  ２００８
【非特許文献３】Ｓａｎｓｏｍ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０１：１６９−１７７  ２０００
【非特許文献４】Ｗｅｂｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６，１０：２３２０−２３２８  １９９６
【非特許文献５】Ｋｌｉｗｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．２００５；２５（３）：１６５−７１
【非特許文献６】Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９９７）１８５：１７７−１８２
【非特許文献７】Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００５）５：４４３−４５３
【非特許文献８】Ｇｕｐｔａ  ＆  Ｗｏｍｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ  Ｔｈｅｒ  ４：３７５−３８２  ２０１０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００２３】
第１の態様において、本発明は、野生型ＣＴＬＡ−４のバリアントであるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを提供する。本発明のＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、１つ以上の改善された特性、例えば、野生型よりも高い効力、高いＣＤ８０および／もしくはＣＤ８６親和性、向上したＣＤ８６を上回るＣＤ８０選択性、良好な交差反応性、ならびに／または高い安定性を有し得る。
【００２４】
ＣＴＬＡ−４の改善は、可溶性ＣＴＬＡ−４としても公知のヒト野生型ヒトＣＴＬＡ−４細胞外ドメインのアミノ酸配列の突然変異により達成することができる。アミノ酸置換、挿入または欠失であり得る１つ以上のアミノ酸突然変異をＣＴＬＡ−４アミノ酸配列中に導入して本明細書に記載の改善されたＣＴＬＡ−４ポリペプチドを産生することができる。ポリペプチドは、例えば、野生型ＣＴＬＡ−４に対して増加した効力、親和性および／または安定性を示し得る。
【００２５】
ＣＴＬＡ−４細胞外ドメインは、野生型アミノ酸配列の配列番号３５を含む。配列番号３５は、細胞外ドメイン全体ではなく、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ（登録商標））において用いられる領域である。
【００２６】
本発明のＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、さらなるＣＴＬＡ−４残基または配列番号３５に対応する領域外の配列を含んでも含まなくてもよい。好ましくは、本発明のＣＴＬＡ−４ポリペプチドは可溶性である。したがって、一般に、それは、ＣＴＬＡ−４膜貫通領域を含まない。
【００２７】
本発明において、改善された効力、親和性および／もしくは安定性に関連し、または他の目的のため、例えば、ダイマー化に影響を与えるために導入することができるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列内の多数の突然変異が同定される。
【００２８】
野生型ＣＴＬＡ−４中のアミノ酸置換の例は：Ｉ１６におけるＲ、Ｓ、ＶまたはＴ；Ａ２４におけるＴ；Ｓ２５におけるＮまたはＰ；Ｇ２７におけるＳ；Ｖ３２におけるＩ；Ｄ４１におけるＧ；Ｓ４２におけるＧ；Ｖ４４におけるＥ；Ｍ５４におけるＫまたはＶ；Ｎ５６におけるＳまたはＧ；Ｌ５８におけるＡ、Ｇ、ＳまたはＰ；Ｔ５９におけるＳまたはＡ；Ｆ６０におけるＴ；Ｌ６１におけるＱまたはＰ；Ｄ６２におけるＧ；Ｄ６３におけるＹ；Ｓ６４におけるＰ；Ｉ６５におけるＮ、Ｄ、ＶまたはＴ；Ｓ７０におけるＡ、Ｔ、ＭまたはＨ；Ｑ８０におけるＲ；Ｍ８５におけるＱ、Ｓ、Ｖ、Ｒ、ＫまたはＬ；Ｔ８７におけるＳ；Ｋ９３におけるＱ、Ｈ、Ｔ、ＥまたはＭ；Ｌ１０４におけるＲ、ＱまたはＥ；Ｉ１０６におけるＶ；Ｎ１０８におけるＤまたはＳ；Ｉ１１５におけるＶまたはＦおよびＣ１２０におけるＳである。アミノ酸欠失の一例は、Ｔ５１の欠失である。残基ナンバリングは、図１Ａおよび図２に示されるＣＴＬＡ−４配列に準拠し、最初の残基を１位の「配列ナンバリング」としてナンバリングする。図１は、比較のためのＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔナンバリングも示す。
【００２９】
ＣＴＬＡ−４バリアントは、例えば、ヒト野生型可溶性ＣＴＬＡ−４中の最大１２または最大２０のアミノ酸突然変異を有し得る。突然変異としては、上記列記のアミノ酸突然変異のいずれかまたは全て、および場合により１つ以上の異なる突然変異、例えば、それらまたは他の残基位置における異なる置換を挙げることができる。バリアントアミノ酸配列は、列記のアミノ酸突然変異の１つ以上、例えば、少なくとも５、６または７つを有するヒト野生型ＣＴＬＡ−４配列の配列番号３５を含み得る。
【００３０】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号３５と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またはそれからなっていてよい。
【００３１】
本発明によるＣＴＬＡ−４バリアントアミノ酸配列の例としては、図１Ａに示される配列番号３６〜５５のものが挙げられる。ＣＴＬＡ−４バリアントは、ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされる「１２９９」ＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含み得る。ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８は、免疫グロブリンＦｃ領域に融合している１２９９ＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコードする。コードされる１２９９ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、コードされるＦｃ領域、およびＦｃ領域に融合している１２９９ＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含むコードされるポリペプチドは、その全てがＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされ、全て本発明の個々の実施形態である。
【００３２】
好ましい突然変異は、以下から選択されるアミノ酸置換である：Ｉ１６におけるＲ、ＳまたはＶ；Ａ２４におけるＴ；Ｓ２５におけるＮ；Ｇ２７におけるＳ；Ｍ５４におけるＫ；Ｎ５６におけるＳ；Ｌ５８におけるＡまたはＧ；Ｔ５９におけるＳ；Ｆ６０におけるＴ；Ｌ６１におけるＱ；Ｄ６３におけるＹ；Ｓ６４におけるＰ；Ｉ６５におけるＮまたはＤ；Ｓ７０におけるＡ；Ｑ８０におけるＲ；Ｍ８５におけるＱまたはＳ；Ｋ９３におけるＱまたはＨ；およびＣ１２０におけるＳ。したがって、バリアントアミノ酸配列は、規定の異なる残基により置換されているそれらのアミノ酸残基位置の１つ以上、例えば、少なくとも５または６つ、または全てを有するヒト野生型ＣＴＬＡ−４配列の配列番号３５を含み得る。
【００３３】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチド配列は、好ましくは、１６位におけるＲ、Ｉ、ＳもしくはＶ；２４位におけるＴもしくはＡ；２５位におけるＮ；２７位におけるＳもしくはＧ；５４位におけるＭもしくはＫ；５６位におけるＮもしくはＳ；５８位におけるＡ、ＬもしくはＧ；５９位におけるＴもしくはＳ；６０位におけるＦもしくはＴ；６１位におけるＬもしくはＱ；６３位におけるＤもしくはＹ；６４位におけるＳもしくはＰ；６５位におけるＩ、ＮもしくはＤ；７０位におけるＡもしくはＳ；８０位におけるＱもしくはＲ；８５位におけるＱ、ＭもしくはＳ；９３位におけるＱもしくはＨ；および／または１２０位におけるＣもしくはＳを含む。他の残基位置は、ヒト野生型であり得、または１つ以上のさらなる突然変異を受けていてよい。
【００３４】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、２５位におけるＮを含み得、この位置における野生型Ｓの置換を表す。ポリペプチドは、９３位におけるＱまたはＨを含み得、この位置における野生型Ｋの置換を表す。下記の実施例により説明されるとおり、残基２５および９３におけるこれらの置換は、ＣＴＬＡ−４の親和性、効力および／または安定性の改善に強力に関連すると考えられる。
【００３５】
複数の高い効力のバリアントにおいて観察された好ましいアミノ酸モチーフは、ＳＴＱＤＹＰＮ（配列番号６９）である。このモチーフは、残基５９〜６５において位置し、結合構造中でＣＤ８０およびＣＤ８６に近接すると思われるループ領域中に存在する。したがって、ある実施形態において、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、残基５９〜６５における配列番号６９を含む。残基ナンバリングは、図１Ａ（１から始まる上行のナンバリング）および図２に示されるとおりである。挿入または欠失が存在する場合、ポリペプチドの実際の残基ナンバリングは、参照配列とは異なり得る。図１Ａは、比較のためのＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔナンバリングも示す。
【００３６】
１２０位におけるＣを、例えば、Ｓによる置換により突然変異させ、この位置におけるＣＴＬＡ−４分子間で形成するジスルフィド架橋を除去し、ＣＴＬＡ−４ダイマー化を阻害することが望ましいこともある。他の状況において、ＣＴＬＡ−４ダイマー化またはより高次のマルチマー化（例えば、テトラマー形成）を保持または増進することが望ましい。このことは、例えば、Ｃ１２０の保持を介しておよび／または例えばＩｇＧＦｃ領域へのＣＴＬＡ−４のコンジュゲーションによるダイマー化ドメインの付加を介して達成することができる。そのようなドメインの付加およびＣＴＬＡ−４を含む巨大分子の形成は、さらに以下に考察される。
【００３７】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、アミノ酸配列の配列番号６８を含み得、または１つ以上の突然変異を有する配列番号６８を含み得る。例えば、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、最大１２の突然変異、最大１０のアミノ酸突然変異、または最大５つの突然変異、例えば、１、２または３つのアミノ酸突然変異を有する配列番号６８を含み得る。配列番号６８は、図２に説明され、実施例に記載のとおり産生された、非常に良好な機能活性を有する６つのＣＴＬＡ−４ポリペプチドのグループ中で見出される残基のコンセンサス配列である。６つのポリペプチドは図１Ａに示されるアミノ酸配列を有し、配列番号は以下のとおりである：配列番号４３（バリアント１２９９）、配列番号３７（バリアント１３２２）、配列番号３８（バリアント１３２１）、配列番号３６（バリアント１３１５）、配列番号４２（バリアント１１１５）および配列番号４７（バリアント１２２７）。これらの６つの配列、およびそれらの６つの配列のいずれかの中の１つ以上のアミノ酸突然変異、例えば、最大１２、例えば、最大１０のアミノ酸突然変異、例えば、最大５つの突然変異、例えば、１、２または３つのアミノ酸突然変異を有するバリアントは、本発明の例を表す。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸突然変異、例えば、最大１２、例えば、最大１０のアミノ酸突然変異、例えば、最大５つの突然変異、例えば、１、２または３つのアミノ酸突然変異を有するＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された「１２９９」ＣＴＬＡ−４ポリペプチド配列を含み得る。
【００３８】
本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号６８と、配列番号３６〜５５のいずれかと、またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもの寄託された「１２９９」ＣＴＬＡ−４ポリペプチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、またはそれからなっていてよい。
【００３９】
突然変異は、アミノ酸置換を含み、またはそれからなっていてよく、場合により以下から選択することができる。
【００４０】
残基１６におけるＴ；残基２５におけるＰ；残基３２におけるＩ；残基４１におけるＧ；残基４２におけるＧ；残基４４におけるＥ；残基５４におけるＶ；残基５６におけるＧ；残基５８におけるＳまたはＰ；残基５９におけるＡ；残基６１におけるＰ；残基６２におけるＧ；残基６５におけるＶまたはＴ；残基７０におけるＴ、ＭまたはＨ；残基８５におけるＶ、Ｒ、ＫまたはＬ；残基８７におけるＳ；残基９３におけるＴ、ＥまたはＭ；残基１０４におけるＲ、ＱまたはＥ；残基１０６におけるＶ；残基１０８におけるＤまたはＳ；残基１１５におけるＶまたはＦ；残基１２０におけるＳ；残基５１における欠失。
【００４１】
好ましくは、ポリペプチドは、２５位におけるＮを含み、および／または９３位におけるＱもしくはＨを含む。ポリペプチドは、１２０位におけるＳを場合により含み得る。
【００４２】
上記のとおり、ポリペプチドは、好ましくは、１６位におけるＲ、Ｉ、ＳもしくはＶ；２４位におけるＴもしくはＡ；２５位におけるＮ；２７位におけるＳもしくはＧ；５４位におけるＭもしくはＫ；５６位におけるＮもしくはＳ；５８位におけるＡ、ＬもしくはＧ；５９位におけるＴもしくはＳ；６０位におけるＦもしくはＴ；６１位におけるＬもしくはＱ；６３位におけるＤもしくはＹ；６４位におけるＳもしくはＰ；６５位におけるＩ、ＮもしくはＤ；７０位におけるＡもしくはＳ；８０位におけるＱもしくはＲ；８５位におけるＱ、ＭもしくはＳ；９３位におけるＱもしくはＨ；および／または１２０位におけるＣもしくはＳを含む。したがって、ポリペプチドは、野生型ＣＴＬＡ−４の配列番号３５に対する以下のアミノ酸置換の１つ以上、例えば、少なくとも５または６つ、または全てを含む：Ｉ１６におけるＲ、ＳまたはＶ；Ａ２４におけるＴ；Ｓ２５におけるＮ；Ｇ２７におけるＳ；Ｍ５４におけるＫ；Ｎ５６におけるＳ；Ｌ５８におけるＡまたはＧ；Ｔ５９におけるＳ；Ｆ６０におけるＴ；Ｌ６１におけるＱ；Ｄ６３におけるＹ；Ｓ６４におけるＰ；Ｉ６５におけるＮまたはＤ；Ｓ７０におけるＡ；Ｑ８０におけるＲ；Ｍ８５におけるＱまたはＳ；Ｋ９３におけるＱまたはＨ。
【００４３】
野生型と比較した配列番号３６〜５５中の突然変異は、図１Ａに説明される。本発明によるポリペプチドは、バリアント中で例示される１つ以上の突然変異、例えば、配列番号３６〜５５のいずれかに存在する突然変異の組合せを有する野生型ＣＴＬＡ−４の配列番号３５を含み得る。ポリペプチドは、上記のさらなる突然変異、例えば、場合により１または２つのさらなる突然変異を場合により含み得る。
【００４４】
例えば、ポリペプチドは、以下から選択される突然変異の組合せを含み得る：
−  １３１５突然変異、すなわち、Ｉ１６におけるＳ；Ｓ２５におけるＮ；Ｌ５８におけるＧ；Ｓ７０におけるＡ；Ｑ８０におけるＲ；Ｍ８５におけるＳ；およびＫ９３におけるＱ；
−  １３２２突然変異、すなわち、Ｓ２５におけるＮ；Ｇ２７におけるＳ；Ｍ５４におけるＫ；Ｎ５６におけるＳ；Ｔ５９におけるＳ；Ｆ６０におけるＴ；Ｌ６１におけるＱ；Ｄ６３におけるＹ；Ｓ６４におけるＰ；Ｉ６５におけるＮ；およびＫ９３におけるＱ；
−  １３２１突然変異、すなわち、Ｉ１６におけるＳ；Ｓ２５におけるＮ；Ｍ５４におけるＫ；Ｌ５８におけるＧ；Ｓ７０におけるＡ；Ｑ８０におけるＲ；Ｍ８５におけるＳ；およびＫ９３におけるＱ；
−  １１１５突然変異、すなわち、Ｉ１６におけるＶ；Ｓ２５におけるＮ；Ｌ５８におけるＧ；Ｓ７０におけるＡ；Ｍ８５におけるＱ；およびＫ９３におけるＱ；
−  １２９９突然変異、すなわち、Ｉ１６におけるＲ；Ａ２４におけるＴ；Ｓ２５におけるＮ；Ｇ２７におけるＳ；Ｌ５８におけるＡ；Ｓ７０におけるＡ；Ｍ８５におけるＱ；およびＫ９３におけるＱ；ならびに
−  １２２７突然変異、すなわち、Ｉ１６におけるＳ；Ｓ２５におけるＮ；Ｇ２７におけるＳ；Ｌ５８におけるＡ；Ｓ７０におけるＡ；Ｍ８５におけるＱ；およびＫ９３におけるＨ。
【００４５】
したがって、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、野生型に対する配列番号３６〜５５のいずれかの置換残基の組合せを含むものであり得、例えば、それは、以下を含み得る：
−  残基１６におけるＳ；残基２５におけるＮ；残基５８におけるＧ；残基７０におけるＡ；残基８０におけるＲ；残基８５におけるＳ；および残基９３におけるＱ；
−  残基２５におけるＮ；残基２７におけるＳ；残基５４におけるＫ；残基５６におけるＳ；残基５９におけるＳ；残基６０におけるＴ；残基６１におけるＱ；残基６３におけるＹ；残基６４におけるＰ；残基６５におけるＮ；および残基９３におけるＱ；
−  残基１６におけるＳ；残基２５におけるＮ；残基５４におけるＫ；残基５８におけるＧ；残基７０におけるＡ；残基８０におけるＲ；残基８５におけるＳ；および残基９３におけるＱ；
−  残基１６におけるＶ；残基２５におけるＮ；残基５８におけるＧ；残基７０におけるＡ；残基８５におけるＱ；および残基９３におけるＱ；
−  残基１６におけるＲ；残基２４におけるＴ；残基２５におけるＮ；残基２７におけるＳ；残基５８におけるＡ；残基７０におけるＡ；残基８５におけるＱ；および残基９３におけるＱ；または
−  残基１６におけるＳ；残基２５におけるＮ；残基２７におけるＳ；残基５８におけるＡ；残基７０におけるＡ；残基８５におけるＱ；および残基９３におけるＨ。
【００４６】
突然変異は、好ましくは、置換であり、保存的置換であり得る。「保存的置換」は、第１および第２のアミノ酸残基が類似の生物物理学的特徴を有する側鎖を有する、第１のアミノ酸残基の第２の異なるアミノ酸残基による置換を意味する。類似の生物物理学的特徴としては、疎水性、電荷、極性または水素結合を提供もしくは許容する能力が挙げられる。保存的置換の例としては、セリンのトレオニンまたはトリプトファンへの変化、グルタミンのアスパラギンへの変化、リジンのアルギニンへの変化、アラニンのバリンへの変化、アスパラギン酸のグルタミン酸への変化、バリンのイソロイシンへの変化、アスパラギンのセリンへの変化が挙げられる。
【００４７】
本発明によるポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸配列突然変異（アミノ酸残基の置換、欠失、および／または挿入）を含み得、約１５  １４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２つ未満のアミノ酸配列突然変異を含み得る。
【００４８】
突然変異は、通常、機能の損失をもたらさないため、そうして変化したアミノ酸配列を含むポリペプチドは、ヒトＣＤ８０および／またはＣＤ８６への結合能を保持し得る。それは、例えば、本明細書に記載のアッセイにおいて計測されたときに、変化がなされていないポリペプチドと同一の結合親和性または機能を保持し得る。
【００４９】
突然変異は、１つ以上のアミノ酸残基を、非天然存在もしくは非標準アミノ酸により置き換えること、１つ以上のアミノ酸残基を非天然存在もしくは非標準形態に改変すること、または１つ以上の非天然存在もしくは非標準アミノ酸を配列中に挿入することを含み得る。本発明の配列中の変化の数および場所の例は、本明細書の他箇所において記載される。天然存在アミノ酸としては、それらの標準１文字コードにより、Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｙ、Ｃ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｅとして識別される、２０の「標準」Ｌ−アミノ酸が挙げられる。非標準アミノ酸としては、ポリペプチド骨格中に取り込むことができる任意の他の残基が挙げられ、またはそれは既存のアミノ酸残基の改変から生じる。非標準アミノ酸は、天然存在でも非天然存在でもよい。いくつかの天然存在非標準アミノ酸は当分野において公知であり、例えば、４−ヒドロキシプロリン、５−ヒドロキシリジン、３−メチルヒスチジン、Ｎ−アセチルセリンなどである［Ｖｏｅｔ  ＆  Ｖｏｅｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ｗｉｌｅｙ）１９９５］。Ｎ−アルファ位において誘導体化されているアミノ酸残基は、アミノ酸配列のＮ末端のみにおいて局在する。通常、本発明において、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸であるが、Ｄ−アミノ酸であってもよい。したがって、変化は、Ｌ−アミノ酸をＤ−アミノ酸に改変すること、またはＬ−アミノ酸をＤ−アミノ酸により置き換えることを含み得る。アミノ酸のメチル化、アセチル化および／またはリン酸化形態も公知であり、本発明のアミノ酸はそのような改変を受けていてよい。
【００５０】
本発明のポリペプチド中のアミノ酸配列は、上記の非天然または非標準アミノ酸を含み得る。非標準アミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸）は、合成の間、またはアミノ酸配列の合成後に「元の」標準アミノ酸の改変もしくは置換によりアミノ酸配列中に取り込むことができる。
【００５１】
非標準および／または非天然存在アミノ酸の使用は、構造的および機能的多様性を増加させ、したがって、所望の結合および中和特性を達成する潜在性を増加させ得る。さらに、Ｄ−アミノ酸および類似体は、動物、例えば、ヒトへの投与後に、Ｌ−アミノ酸を有するポリペプチドのインビボ分解により、標準Ｌ−アミノ酸と比較して異なる薬物動態プロファイルを有することが示されており、このことは、Ｄ−アミノ酸が一部のインビボ用途に有利であることを意味する。
【００５２】
バリアントは、１つ以上の選択されたＶＨおよび／またはＶＬ遺伝子のランダム突然変異誘発を使用して可変ドメイン全体内の突然変異を生成することにより生成することができる。そのような技術は、エラープローンＰＣＲを使用したＧｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．［Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０］により記載されている。使用することができる別の方法は、突然変異誘発をポリペプチド中の特定の領域または場所に指向することである。そのような技術はＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．［Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：３８０９−３８１３］およびＳｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．［Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７］により開示されている。
【００５３】
上記の技術は全て、当分野において自体公知であり、当業者は、そのような技術を使用し、当分野における定型的な方法を使用して本発明のポリペプチドを提供することができる。
【００５４】
２つのアミノ酸配列の％同一性を計算するために使用することができるアルゴリズムとしては、例えば、デフォルトのパラメーターを用いる、例えば、ＢＬＡＳＴ［Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０５−４１０］、ＦＡＳＴＡ［Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８］、またはＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム［Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７］が挙げられる。
【００５５】
本発明によれば、改善された生物学的活性、例えば、野生型ＣＴＬＡ−４と比較して向上したＣＤ８６を上回るＣＤ８０選択性、より高い親和性および／もしくはより高い効力を有し、ならびに／または良好な交差反応性、改善された安定性および／もしくは延長された半減期を示し得るＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含有する組成物を提供することができる。本明細書において詳細に考察されるとおり、そのような特性は、より大きい治療有効性に寄与し得、低減またはより低頻度の投与量における治療利益の達成を可能とし得る。改善された安定性は、医薬組成物への製造および配合を促進し得る。
【００５６】
本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、例えば、融合タンパク質としてＩｇＧＦｃ領域に場合によりコンジュゲートしている。Ｆｃ領域は、分子のインビボ半減期を増加させ、組成物の全体安定性に寄与する一方、不所望なＦｃエフェクター機能を回避するように設計することができる。改善された安定性は、例えば、皮下投与用の高濃度における産物の配合を促進する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】（Ａ）ＣＴＬＡ−４バリアント配列（配列番号３６〜５５）と野生型ヒトＣＴＬＡ−４（配列番号３５）とのアラインメント。野生型からの突然変異を灰色の枠において示す。１から始まる上行のナンバリングは、特に記載のない限り、本明細書において称されるナンバリングである。Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔナンバリングを比較のために下方に示す。（Ｂ）ＩｇＧ１Ｆｃ配列の配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０のアラインメント。１から始まる上行のナンバリングは、特に記載のない限り、本明細書において称されるナンバリングである。Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔナンバリングを比較のために下方に示す。
【図２】ＣＴＬＡ−４ポリペプチド配列の配列番号６８。１位としてのＭｅｔから始まる連続ナンバリングを用いると、配列番号６８は、１２４残基を有し、残基１６、２４  ２７、５４、５６、５８、５９、６０、６１、６３、６４、６５、７０、８０、８５および９３における変異性を有する。これらの変異位置のそれぞれにおけるアミノ酸残基は、それぞれの例において示される残基からなる群から選択される。
【図３】（Ａ）Ｒａｊｉ−Ｊｕｒｋａｔ二重細胞アッセイ；（Ｂ）プライマリーヒトＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイ；（Ｃ）カニクイザル混合リンパ球反応アッセイにおける、ＣＴＬＡ−４バリアントおよびＦｃ融合フォーマットの野生型ＣＴＬＡ−４のＩＣ５０プロファイル。
【図４】他の関連タンパク質リガンドと比較したＣＤ８０およびＣＤ８６についてのＣＴＬＡ−４バリアントの特異性。（Ａ）バリアント１２９９。（Ｂ）バリアント１３２２。
【図５】ＴＭおよびＹＴＥ改変を有するＣＴＬＡ−４バリアントについてのエフェクター機能（ＡＤＣＣおよびＣＤＣ）の無効化の実証。（Ａ）ＡＤＣＣ。（Ｂ）ＣＤＣ。
【図６】Ｆｃ融合フォーマットの野生型ＣＴＬＡ−４と比較したＣＴＬＡ−４バリアントのＣＤ８０およびＣＤ８６に対する一価親和性の改善。
【図７】（Ａ）テトラマーＣＴＬＡ−４タンパク質のための構築物設計。（Ｂ）テトラマーＣＴＬＡ−４と、Ｆｃ融合フォーマットの野生型ＣＴＬＡ−４とのＲａｊｉ  Ｊｕｒｋａｔアッセイにおける効力比較。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本明細書全体で使用されるＣＴＬＡ−４残基のナンバリングは、特に記載のない限り、図１Ａ（上行、配列ナンバリング）および図２に示されるとおりである。ＣＴＬＡ−４は、開裂されるリーダー配列を有し、成熟タンパク質の少なくとも２つの異なるナンバリング系が考えられる。ＣＴＬＡ−４配列は、とりわけ、１位におけるＡｌａ（米国特許第５，４３４，１３１号明細書）から、または１位におけるＭｅｔ（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ（２００５）５：４４３−４５３）から始まり得る。文脈が特に明示しない限り、本明細書において使用されるナンバリング系は、１位がＭｅｔであるものである。これは、製品アバタセプトの残基を指すために一般に使用されるナンバリングにも対応する。
【００５９】
本明細書全体で使用されるＦｃ残基のナンバリングは、特に記載のない限り、図１Ｂ（上行、１から始まる）に示されるとおりである。
【００６０】
以下のナンバリングされた項は、本発明の態様を表す。
【００６１】
１．野生型ＣＴＬＡ−４の配列番号３５と比較して大きいヒトＣＤ８０結合親和性、大きい効力および／または大きい安定性を有する単離ＣＴＬＡ−４ポリペプチドであって、配列番号３５のバリアントであるアミノ酸配列を含み、前記バリアントは、配列番号３５中の以下のアミノ酸突然変異の５つ以上を含むポリペプチド：
Ｉ１６におけるＲ、Ｓ、ＶまたはＴ；
Ａ２４におけるＴ；
Ｓ２５におけるＮまたはＰ；
Ｇ２７におけるＳ；
Ｖ３２におけるＩ；
Ｄ４１におけるＧ；
Ｓ４２におけるＧ；
Ｖ４４におけるＥ；
Ｍ５４におけるＫ；
Ｎ５６におけるＳまたはＧ；
Ｌ５８におけるＡ、Ｇ、ＳまたはＰ；
Ｔ５９におけるＳまたはＡ；
Ｆ６０におけるＴ；
Ｌ６１におけるＱまたはＰ；
Ｄ６２におけるＧ；
Ｄ６３におけるＹ；
Ｓ６４におけるＰ；
Ｉ６５におけるＮ、Ｄ、ＶまたはＴ；
Ｓ７０におけるＡ、Ｔ、ＭまたはＨ；
Ｑ８０におけるＲ；
Ｍ８５におけるＱ、Ｓ、Ｖ、Ｒ、ＫまたはＬ；
Ｔ８７におけるＳ；
Ｋ９３におけるＱ、Ｈ、Ｔ、ＥまたはＭ；
Ｌ１０４におけるＲ、ＱまたはＥ；
Ｉ１０６におけるＶ；
Ｎ１０８におけるＤまたはＳ；
Ｉ１１５におけるＶまたはＦ；
Ｃ１２０におけるＳ；
Ｔ５１における欠失。
【００６２】
２．配列番号３５と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含む、項１に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００６３】
３．以下のアミノ酸突然変異の５つ以上を含む、項１または２に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド：
Ｉ１６におけるＲ、ＳまたはＶ；
Ａ２４におけるＴ；
Ｓ２５におけるＮ；
Ｇ２７におけるＳ；
Ｍ５４におけるＫ；
Ｎ５６におけるＳ；
Ｌ５８におけるＡまたはＧ；
Ｔ５９におけるＳ；
Ｆ６０におけるＴ；
Ｌ６１におけるＱ；
Ｄ６３におけるＹ；
Ｓ６４におけるＰ；
Ｉ６５におけるＮまたはＤ；
Ｓ７０におけるＡ；
Ｑ８０におけるＲ；
Ｍ８５におけるＱまたはＳ；
Ｋ９３におけるＱまたはＨ；
Ｃ１２０におけるＳ。
【００６４】
４．置換Ｓ２５ＮまたはＳ２５Ｐを含む、項１または２に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００６５】
５．置換Ｓ２５Ｎ、Ｋ９３ＱまたはＫ９３Ｈを含む、項１〜３のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００６６】
６．配列番号３６〜５５のいずれかと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％もしくは９８％同一であるアミノ酸配列、またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９８もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む、項１〜５のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００６７】
７．残基５９〜６５におけるアミノ酸モチーフの配列番号６９を含み、前記残基ナンバリングは、配列番号３５に準拠する、項１〜６のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００６８】
８．以下から選択される突然変異の組合せを含む、項１〜６のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド：
−  １３１５突然変異、すなわち、Ｉ１６におけるＳ；Ｓ２５におけるＮ；Ｌ５８におけるＧ；Ｓ７０におけるＡ；Ｑ８０におけるＲ；Ｍ８５におけるＳ；およびＫ９３におけるＱ；
−  １３２２突然変異、すなわち、Ｓ２５におけるＮ；Ｇ２７におけるＳ；Ｍ５４におけるＫ；Ｎ５６におけるＳ；Ｔ５９におけるＳ；Ｆ６０におけるＴ；Ｌ６１におけるＱ；Ｄ６３におけるＹ；Ｓ６４におけるＰ；Ｉ６５におけるＮ；およびＫ９３におけるＱ；
−  １３２１突然変異、すなわち、Ｉ１６におけるＳ；Ｓ２５におけるＮ；Ｍ５４におけるＫ；Ｌ５８におけるＧ；Ｓ７０におけるＡ；Ｑ８０におけるＲ；Ｍ８５におけるＳ；およびＫ９３におけるＱ；
−  １１１５突然変異、すなわち、Ｉ１６におけるＶ；Ｓ２５におけるＮ；Ｌ５８におけるＧ；Ｓ７０におけるＡ；Ｍ８５におけるＱ；およびＫ９３におけるＱ；
−  １２９９突然変異、すなわち、Ｉ１６におけるＲ；Ａ２４におけるＴ；Ｓ２５におけるＮ；Ｇ２７におけるＳ；Ｌ５８におけるＡ；Ｓ７０におけるＡ；Ｍ８５におけるＱ；およびＫ９３におけるＱ；ならびに
−  １２２７突然変異、すなわち、Ｉ１６におけるＳ；Ｓ２５におけるＮ；Ｇ２７におけるＳ；Ｌ５８におけるＡ；Ｓ７０におけるＡ；Ｍ８５におけるＱ；およびＫ９３におけるＨ。
【００６９】
９．配列番号３６〜５５から選択されるアミノ酸配列を含み、またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含み、または最大１０のアミノ酸突然変異を有するそれらの配列のいずれかのバリアントを含む、項１〜８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００７０】
１０．配列番号３６〜５５から選択されるアミノ酸配列を含み、またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含み、または最大５つのアミノ酸突然変異を有するそれらの配列のいずれかのバリアントを含む、項１〜９のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００７１】
１１．配列番号３６〜５５から選択されるアミノ酸配列を含み、またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含み、または最大３つのアミノ酸突然変異を有するそれらの配列のいずれかのバリアントを含む、項１０に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００７２】
１２．配列番号３６〜５５から選択されるアミノ酸配列を含み、またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含む、項１または２に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００７３】
１３．配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２、配列番号４７から選択されるアミノ酸配列、またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含む、項１２に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００７４】
１４．野生型ＣＴＬＡ−４の配列番号３５と比較して大きいヒトＣＤ８０結合親和性、大きい効力および／または大きい安定性を有する単離ＣＴＬＡ−４ポリペプチドであって、
（ｉ）アミノ酸配列の配列番号６８、配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２もしくは配列番号４７；
（ｉｉ）最大１０のアミノ酸突然変異を含有する（ｉ）のバリアントであるアミノ酸配列（残基２５は、突然変異しておらず、Ｎである）；
（ｉｉｉ）１つ以上のアミノ酸突然変異を含む（ｉ）のバリアントであるアミノ酸配列（残基２５は、突然変異しておらず、Ｎであり、前記バリアントは、（ｉ）と少なくとも７０％の配列同一性を有する）；または
（ｉｖ）ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列
を含むポリペプチド。
【００７５】
１５．配列番号６８、配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２もしくは配列番号４７、または最大５つのアミノ酸突然変異を有するそれらの配列のいずれかのバリアントを含む、項１４に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００７６】
１６．配列番号６８、配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２もしくは配列番号４７、または最大３つのアミノ酸突然変異を有するそれらの配列のいずれかのバリアントを含む、項１５に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００７７】
１７．配列番号６８、配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２または配列番号４７と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項１４に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００７８】
１８．配列番号６８、配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２または配列番号４７と少なくとも９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、項１７に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００７９】
１９．５０ｎＭ以下のヒトＣＤ８０結合親和性を有し、前記親和性は、表面プラズモン共鳴により決定されるＫＤである、項１〜１８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００８０】
２０．２０ｎＭ以下のヒトＣＤ８０結合親和性を有し、前記親和性は、表面プラズモン共鳴により決定されるＫＤである、項１９に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００８１】
２１．野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）よりも大きいヒトＣＤ８６結合親和性を有する、項１〜２０のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００８２】
２２．−  残基１６におけるＳ；残基２５におけるＮ；残基５８におけるＧ；残基７０におけるＡ；残基８０におけるＲ；残基８５におけるＳ；および残基９３におけるＱ；
−  残基２５におけるＮ；残基２７におけるＳ；残基５４におけるＫ；残基５６におけるＳ；残基５９におけるＳ；残基６０におけるＴ；残基６１におけるＱ；残基６３におけるＹ；残基６４におけるＰ；残基６５におけるＮ；および残基９３におけるＱ；
−  残基１６におけるＳ；残基２５におけるＮ；残基５４におけるＫ；残基５８におけるＧ；残基７０におけるＡ；残基８０におけるＲ；残基８５におけるＳ；および残基９３におけるＱ；
−  残基１６におけるＶ；残基２５におけるＮ；残基５８におけるＧ；残基７０におけるＡ；残基８５におけるＱ；および残基９３におけるＱ；
−  残基１６におけるＲ；残基２４におけるＴ；残基２５におけるＮ；残基２７におけるＳ；残基５８におけるＡ；残基７０におけるＡ；残基８５におけるＱ；および残基９３におけるＱ；または
−  残基１６におけるＳ；残基２５におけるＮ；残基２７におけるＳ；残基５８におけるＡ；残基７０におけるＡ；残基８５におけるＱ；および残基９３におけるＨ
を含む、項１４〜２１のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００８３】
２３．最大３つのアミノ酸突然変異を有するアミノ酸配列の配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２または配列番号４７を含む、項１４〜２２のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００８４】
２４．１６位におけるＲ、Ｉ、ＳまたはＶ；２４位におけるＴまたはＡ；２７位におけるＳまたはＧ；５４位におけるＭまたはＫ；５６位におけるＮまたはＳ；５８位におけるＡ、ＬまたはＧ；５９位におけるＴまたはＳ；６０位におけるＦまたはＴ；６１位におけるＬまたはＱ；６３位におけるＤまたはＹ；６４位におけるＳまたはＰ；６５位におけるＩ、ＮまたはＤ；７０位におけるＡまたはＳ；８０位におけるＱまたはＲ；８５位におけるＱ、ＭまたはＳ；９３位におけるＱまたはＨ；および１２０位におけるＣまたはＳを含む、項１４〜１８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００８５】
２５．前記アミノ酸突然変異は、以下から選択される、項１４〜１８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド：残基１６における置換Ｔ；残基３２における置換Ｉ；残基４１における置換Ｇ；残基４２における置換Ｇ；残基４４における置換Ｅ；残基５６における置換Ｇ；残基５８における置換ＳまたはＰ；残基５９における置換Ａ；残基６１における置換Ｐ；残基６２における置換Ｇ；残基６５における置換ＶまたはＴ；残基７０における置換Ｔ、ＭまたはＨ；残基８５における置換Ｖ、Ｒ、ＫまたはＬ；残基８７における置換Ｓ；残基９３における置換Ｔ、ＥまたはＭ；残基１０４における置換Ｒ、ＱまたはＥ；残基１０６における置換Ｖ；残基１０８における置換ＤまたはＳ；残基１１５における置換ＶまたはＦ；残基１２０における置換Ｓ；残基５１における欠失。
【００８６】
２６．アミノ酸配列の配列番号６８、配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２もしくは配列番号４７を含み、またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含む、項１４に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００８７】
２７．ＣＤ８６結合親和性よりも少なくとも１０倍大きいＣＤ８０結合親和性を有する単離ＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００８８】
２８．ＣＤ８６結合親和性よりも少なくとも５０倍大きいＣＤ８０結合親和性を有する、項２７に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００８９】
２９．項１〜２６のいずれかに定義される、項２７または２８に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００９０】
３０．ＩｇＧＦｃアミノ酸配列にコンジュゲートしている、項１〜２９のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００９１】
３１．前記ＩｇＧＦｃは、Ｆｃエフェクター機能を低減させるように改変されたヒトＩｇＧ１Ｆｃであり、天然ヒトＩｇＧ１Ｆｃヒンジ領域を含む、項３０に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００９２】
３２．前記ＩｇＧＦｃアミノ酸配列は、以下の残基群の一方または両方が以下のとおり置換されているヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域を含む、項３０または３１に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド：
残基２０におけるＦ；残基２１におけるＥ；残基１１７におけるＳ；および
残基３８におけるＹ、残基４０におけるＴ、残基４２におけるＥ
（前記残基ナンバリングは、配列番号５６に準拠して定義される）。
【００９３】
３３．前記ＩｇＧＦｃアミノ酸配列は、配列番号５９を含む、項３０〜３２のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００９４】
３４．ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされる１２９９ＣＴＬＡ−４−Ｉｇアミノ酸配列を含む、単離ＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００９５】
３５．マルチマーである、項１〜３４のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００９６】
３６．ダイマーである、項３５に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００９７】
３７．テトラマーである、項３５に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００９８】
３８．前記テトラマーは、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドの２つのペアを含み、それぞれのペアは、抗体軽鎖定常領域に融合しているＣＴＬＡ−４ポリペプチドおよび抗体重鎖定常領域に融合しているＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含む、項３７に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド。
【００９９】
３９．核酸を含有する宿主細胞であって、前記核酸は、ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された１２９９ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ核酸配列を含む宿主細胞。
【０１００】
４０．項１〜３９のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド；および
１つ以上の医薬賦形剤
を含む組成物。
【０１０１】
４１．ＩｇＧＦｃアミノ酸配列にコンジュゲートしているアミノ酸配列の配列番号６８、配列番号４３、配列番号４７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２  配列番号４７またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含むＣＴＬＡ−４ポリペプチド；および
１つ以上の医薬賦形剤
を含む組成物。
【０１０２】
４２．前記ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号５９を含むＩｇＧＦｃアミノ酸配列にコンジュゲートしている、項４０または４１に記載の組成物。
【０１０３】
４３．ＩｇＧＦｃにコンジュゲートしている前記ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、アミノ酸配列の配列番号１３、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６を含む、項４２に記載の組成物。
【０１０４】
４４．ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされる１２９９ＣＴＬＡ−４−Ｉｇポリペプチドおよび１つ以上の医薬賦形剤を含む組成物。
【０１０５】
４５．少なくとも７０ｍｇ／ｍｌの濃度で前記ＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含む、項４０〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【０１０６】
４６．少なくとも１００ｍｇ／ｍｌの濃度で前記ＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含む、項４５に記載の組成物。
【０１０７】
４７．皮下または静脈内投与による患者の治療方法における使用のための、項１〜３８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド、または項４０〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【０１０８】
４８．関節リウマチ、多発性硬化症、喘息、クローン病、潰瘍性大腸炎、全身性エリテマトーデスまたは移植片拒絶の治療方法における使用のための、項１〜３８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド、または項４０〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【０１０９】
４９．項１〜３８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチドまたは項４０〜４６のいずれか一項に記載の組成物を患者に２８日間隔において投与することを含む治療方法における使用のための、項１〜３８のいずれか一項に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチド、または項４０〜４６のいずれか一項に記載の組成物。
【０１１０】
５０．配列番号３６〜５５から選択されるＣＴＬＡ−４ポリペプチドアミノ酸配列またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列の突然変異によりさらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを産生する方法であって：
アミノ酸配列の配列番号３６〜５５またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含み、またはそれからなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを提供すること；
１つ以上の突然変異を前記アミノ酸配列中に導入してさらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを提供すること；
前記さらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドの安定性、親和性および／または効力を試験すること；ならびに
前記さらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを、１つ以上の医薬賦形剤を含む組成物に配合すること
を含む方法。
【０１１１】
５１．前記さらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドがＦｃ領域にコンジュゲートしている、項５０に記載の方法。
【０１１２】
生物学的効力
可溶性ＣＴＬＡ−４は、Ｔリンパ球の表面上で発現されたＣＤ２８と競合し、阻害がなければＴリンパ球の共刺激および活性化をもたらすＣＤ２８へのリガンドＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）の結合を阻害する。したがって、可溶性ＣＴＬＡ−４は、Ｔリンパ球の活性化を阻害する。外因性可溶性ＣＴＬＡ−４によるこの阻害の効力は、インビトロアッセイにおいて測定することができる。ＣＴＬＡ−４は、例えば、融合タンパク質として別の分子に場合によりコンジュゲートしていてよい。例えば、ＩｇＧＦｃが、本明細書の他箇所において記載のとおり存在し得る。アッセイを使用し、野生型ＣＴＬＡ−４（状況に応じて、Ｆｃに場合によりコンジュゲートしている）を対照として使用してＣＴＬＡ−４ポリペプチドが野生型よりも強力か強力でないかを定性的に測定することができ、効力の差の大きさに関する定量的情報も提供し得る。そのようなアッセイを実施する方法およびデータの統計的有意性を分析して定性または定量的情報を確実に生成する方法は、当分野において公知である。
【０１１３】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドの結合は、ＣＤ８０およびＣＤ８６へのＣＴＬＡ−４の結合がＩＬ−２産生を減衰させるため、ＩＬ−２の産生を介して計測することができる。好適なアッセイは、産生されたＩＬ−２の量を、例えば、ＥＬＩＳＡにより検出することを含み得る。
【０１１４】
ＩＬ−２産生の量の低減は、一部でも全部でもよい。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ＩＬ−２産生を試験濃度において少なくとも５０％、７５％または８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、９０％または９５％低減させ得る。
【０１１５】
二重細胞アッセイを使用し、野生型よりも高い効力を有するＣＴＬＡ−４ポリペプチドを同定することができる。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドをアッセイしてシグナリングの阻害を計測する。ＣＤ２８を発現するＴ細胞（例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞）ならびにＣＤ８０およびＣＤ８６を発現するＢ細胞（例えば、Ｒａｊｉ細胞）の共培養は、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）の存在下でＣＤ２８とリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用に起因してＩＬ−２の産生をもたらす。次いで、ＩＬ−２をＥＬＩＳＡを介して検出する。このアッセイの詳細な実施例については実施例３を参照のこと。
【０１１６】
プライマリーヒトＴ細胞活性化アッセイを使用して選択されたポリペプチドの効力をさらに評価することができる。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、プライマリーヒトＣＤ４＋Ｔリンパ球からのＣＤ８０／８６介在性ＩＬ−２分泌を阻害するそれらの能力に基づき順位付けすることができる。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ＣＤ８０およびＣＤ８６を発現するＲａｊｉ細胞の存在下でヒトＣＤ４＋リンパ球の抗ＣＤ３刺激増殖を阻害するそれらの能力に基づいても順位付けすることができる。増殖は、ホモジニアス発光アッセイ（ＡＴＰ  ｌｉｔｅ）を使用してアッセイすることができる。このアッセイの利点は、それがプライマリーヒトＣＤ４＋リンパ球の活性化を遮断するＣＴＬＡ−４ポリペプチドの効力を計測することである。このアッセイの詳細な実施例については実施例４を参照のこと。
【０１１７】
本発明によるあるＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、Ｔ細胞活性化を計測するアッセイにおいて高い効力でＣＤ８０およびＣＤ８６に結合することが示された。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、リガンドＣＤ８０およびＣＤ８６を遮断し、それにより、それらの分子からの追加の活性化シグナルを妨害し、ＩＬ−２産生の低減をもたらす。
【０１１８】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドの効力は、当業者に公知のおよび／または本明細書に記載もしくは参照される１つ以上のアッセイを使用して測定または計測することができる。効力は、効果を生成するために要求される量に関して発現される活性の尺度である。典型的には、ポリペプチドの用量調整物を細胞アッセイにおいて比較し、ＩＣ５０値を報告する。機能アッセイにおいて、ＩＣ５０は、生物学的応答をその最大の５０％だけ低減させる産物の濃度である。ＩＣ５０は、最大生物学的応答の％を産物濃度のｌｏｇの関数としてプロットし、ソフトウェアプログラム、例えば、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してシグモイド関数をデータにフィットさせてＩＣ５０値を生成することにより計算することができる。ＩＣ５０値が低いほど、産物の効力が大きい。
【０１１９】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、参照（例えば、野生型）ＣＴＬＡ−４ポリペプチドと比較して増加した効力を有し、ＩＬ−２産生の阻害を生成するために必要とされる量がより少ないと記載することができる。このことは、報告されたＩＣ５０値においても反映される。好ましいＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ヒト野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）と比較して増加した効力を有する。
【０１２０】
本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号３５を含む野生型ＣＴＬＡ−４よりも大きい効力を有し得、効力は、Ｂ細胞により活性化されたＴ細胞を使用するＩＬ−２産生のアッセイにおけるＩＣ５０の低減である。効力は、野生型よりも少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍または少なくとも５０倍大きくあり得る。本明細書における実施例において記載されるとおり、１つのポリペプチド配列番号３６（バリアント１３１５）は、野生型ＣＴＬＡ−４よりも約１２０倍大きい効力を有することが示された。効力は、例えば、野生型よりも最大１５０倍、最大１３０倍、最大１２０倍、最大１００倍、最大８０倍、最大７０倍、または最大６０倍大きくあり得る。効力改善は、例えば、野生型よりも１０倍から１００倍大きい範囲内であり得る。
【０１２１】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドの効力は、野生型に準拠するのではなく（またはさらに野生型に準拠して）本明細書に例示されるＣＴＬＡ−４ポリペプチド配列に準拠して決定することができ、例えば、効力を、配列番号３７（バリアント１３２２）、配列番号３８（バリアント１３２１）、配列番号４３（バリアント１２９９）、配列番号３６（バリアント１３１５）、配列番号４２（バリアント１１１５）、配列番号４７（バリアント１２２７）またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるバリアント１２９９のいずれかと比較することができる。したがって、これらのＣＴＬＡ−４バリアントの１つをアッセイにおいて対照として使用することができる。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、これらのバリアントの１つ以上と少なくとも同程度に強力であり得、例えば、配列番号４３（バリアント１２９９）または配列番号４７（バリアント１２２７）と少なくとも同程度に強力であり得る。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号３６（バリアント１３１５）の効力とほぼ同一またはそれ未満の効力を有し得る。
【０１２２】
親和性
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドのＣＤ８０またはＣＤ８６結合親和性は、一価親和性として表面プラズモン共鳴を使用して測定してＫＤを決定することができる。結合親和性を計測し、ＫＤを決定するための表面プラズモン共鳴の使用の実施例については実施例８を参照のこと。得られるＫＤは、野生型ＣＴＬＡ−４の配列番号３５のものと比較することができ、またはＣＴＬＡ−４ポリペプチド配列番号３７（バリアント１３２２）、配列番号３８（バリアント１３２１）、配列番号４３（バリアント１２９９）、配列番号３６（バリアント１３１５）、配列番号４２（バリアント１１１５）、配列番号４７（バリアント１２２７）もしくはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるバリアント１２９９の１つのものと比較して相対親和性を決定することができる。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、野生型ＣＴＬＡ−４の親和性と比較して大きいヒトＣＤ８６および／またはヒトＣＤ８０結合親和性を有し得る。
【０１２３】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、野生型ＣＴＬＡ−４よりも大きいヒトＣＤ８０結合親和性を有し得、例えば、野生型よりも少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍または少なくとも１４０倍大きい。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、少なくとも、配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２および配列番号４７の１つ以上のヒトＣＤ８０結合親和性または少なくとも、ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４バリアント１２９９の親和性を有し得る。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号３７の親和性とほぼ同一またはそれ未満のヒトＣＤ８０結合親和性を有し得る。ヒトＣＤ８０結合ＫＤは、５０ｎＭ以下、例えば、２５ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、または１０ｎＭ以下であり得る。例えば、ＫＤは、５から５０ｎＭの範囲内であり得る。
【０１２４】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、野生型ＣＴＬＡ−４よりも大きいヒトＣＤ８６結合親和性を有し得、例えば、野生型よりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍または少なくとも１０倍大きい。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、少なくとも、配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２および配列番号４７の１つ以上のヒトＣＤ８６結合親和性または少なくとも、ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４バリアント１２９９の親和性を有し得る。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号３７の親和性とほぼ同一またはそれ未満のヒトＣＤ８６結合親和性を有し得る。ヒトＣＤ８６結合ＫＤは、２μＭ以下、例えば、１．５μＭ以下または１μＭ以下であり得る。例えば、ＫＤは、０．５から２μＭの範囲内であり得る。
【０１２５】
ＣＤ８６を上回るＣＤ８０選択性
本明細書に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ＣＤ８０およびＣＤ８６の両方に結合し得るが、ＣＤ８６に優先してＣＤ８０に選択的に結合し得る。野生型ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ８６と比較して大きいＣＤ８０結合親和性を有することが公知であり、本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドも、ＣＤ８６結合親和性よりも大きいＣＤ８０結合親和性を有し得る。しかしながら、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、野生型ＣＴＬＡ−４と比較して大きい、ＣＤ８６に優先するＣＤ８０結合選択性を有し得る。例えば、本明細書に記載の表面プラズモン共鳴アッセイにおいて、野生型ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ８６結合親和性よりも約４倍大きいＣＤ８０結合親和性を示した。対照的に、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ＣＤ８６結合親和性よりも１０倍超、２０倍超、３０倍超、４０倍超または５０倍超大きいＣＤ８０結合親和性を示し得る。例えば、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ＣＤ８６結合親和性よりも最大１２０倍または１３０倍大きいＣＤ８０結合親和性を示し得る。したがって、野生型ＣＴＬＡ−４の親和性と比較した場合、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ＣＤ８６結合親和性よりもＣＤ８０結合親和性の大きい増加を示し得る。ＣＤ８６を上回るＣＤ８０選択的優位性は、ヒトＣＤ８０およびヒトＣＤ８６について確認することができる。
【０１２６】
さらに、同一の選択的優位性は、カニクイザルからのＣＤ８０およびＣＤ８６について保持することができる。ＣＤ８６を上回るＣＤ８０結合親和性の倍の差は、ヒトおよびカニクイザルＣＤ８０およびＣＤ８６についてほぼ同一であり得る。
【０１２７】
ＣＤ８０結合親和性の改善は、医学的使用のためのより良好な生物学的プロファイルを付与すべきである。活性免疫応答に関して抗原提示細胞上で上方調節されるＣＤ８０への結合により、ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞上のＣＤ２８へのＣＤ８０の結合を阻害し、それによりＴ細胞への活性化シグナルを遮断する。したがって、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドを使用してＴ細胞応答をインビボで減衰させ、本明細書の他箇所に記載の、それが有益である病態を治療することができる。
【０１２８】
ＣＤ８６を上回ってＣＤ８０を選択的に標的化するＣＴＬＡ−４ポリペプチドを設計することにより、極めて大きいＣＤ８０結合親和性を獲得することができる。文献は、ＣＤ８０およびＣＤ８６の相対的役割に関して結論に達していないが、本発明のポリペプチドは、ＣＤ８６を上回ってＣＤ８０に選択的に結合し、種々のアッセイにおいて示されるとおり治療的使用に好適な卓越した生物学的プロファイルを示す。理論により拘束されるものではないが、本発明ＣＴＬＡ−４ポリペプチドの特質は、少なくとも部分的に、高いＣＤ８０結合親和性および／またはＣＤ８６を上回ってＣＤ８０の優先的結合に起因し得る。
【０１２９】
種々のデータは、増加した活性化シグナルをＴリンパ球に送達するＣＤ８０についての役割を指摘する。例えば：
ＣＤ８０形質導入ＣＨＯ細胞は、ＣＤ８６形質導入ＣＨＯ細胞と比較して増加したプライマリーヒトＴ細胞からのＩＬ−２産生を誘導し（Ｓｌａｖｉｋ  ｅｔ  ａｌ．ＪＢＣ  ２７４（５）：３１１６−３１２４  １９９９）；
ＣＤ８０は、Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞中でＣＤ８６と比較して増加したＮＦκＢおよびＡＰ−１転写因子活性を誘導し（サイトカイン産生、例えば、ＩＬ−２に重要な因子）（Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（４）：４９９−５０６  １９９８）；
ＣＤ８０は、ウイルス感染樹状細胞と相互作用するＣＤ８＋Ｔ細胞中でＣＤ８６と比較して増加したＣＤ２５発現を誘導し（Ｔ細胞の生存および増殖に重要）（Ｐｅｊａｗａｒ−Ｇａｄｄｙ  ＆  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ−Ｍｉｌｌｅｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：４４９５−４５０２  ２００６）；
アレルギー喘息のネズミモデルにおいて、突然変異ＣＴＬＡ−４Ｉｇ分子を使用して、ＣＤ８６ではなくてＣＤ８０が肺好酸球増加症の主なドライバーであることが見出された（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５（１）１９９７）。
【０１３０】
したがって、ＣＤ８０に対するＣＴＬＡ−４の親和性の優先的増加は、より有効なＣＤ８０Ｔ細胞活性化経路を標的化することによりＴ細胞活性化の改善された阻害をもたらし得る。
【０１３１】
さらに、ＣＤ８６シグナリングが一部の疾患モデルにおける利益的な抗炎症効果を有し得るいくつかの証拠が存在する。例えば、マウス敗血症モデルにおいて、重症度および致死率は、ＣＤ８０の上方調節およびそれに付随するＣＤ８６の下方調節と関連することが観察された（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ４（８）：６６００  ２００９）。したがって、ＣＤ８６を上回るＣＤ８０の選択的結合は、それがＣＤ２８へのＣＤ８０を阻害し得る一方、ＣＤ２８の相互作用をより少ない程度に低減させるため、利点を提供し得る。
【０１３２】
ＣＤ８０およびＣＤ８６陽性細胞の両方は、関節リウマチ患者の関節中で見出すことができ、それらの両方のＢ７分子の結合は、治療有効性に寄与し得る一方、ＣＤ８６を上回るＣＤ８０選択性は、Ｔ細胞活性化の阻害における所望の定量および定性効果にさらに寄与し得る。したがって、本発明のＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ＣＤ８０およびＣＤ８６の両方に結合し得、野生型ＣＴＬＡ−４よりも高いＣＤ８０親和性を有し得、野生型ＣＴＬＡ−４よりも高いＣＤ８６親和性も有し得る。
【０１３３】
交差反応性
好ましくは、本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、野生型ＣＴＬＡ−４の交差反応性プロファイルを保持する。
【０１３４】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、カニクイザルおよび／またはマウスＣＤ８０およびＣＤ８６、ならびにヒトＣＤ８０およびＣＤ８６への結合についての交差反応性を示し得る。ヒトＣＤ８０と比較したカニクイザルＣＤ８０親和性の差は、１０倍以内、５倍以内、２倍以内、１．５倍以内または１．２倍以内であり得る。ヒトＣＤ８６と比較したカニクイザルＣＤ８６親和性の差は、１０倍以内、５倍以内、２倍以内、１．５倍以内または１．２倍以内であり得る。ヒトＣＤ８０と比較したマウスＣＤ８０親和性の差は、１０倍以内、５倍以内、２倍以内、１．５倍以内または１．２倍以内であり得る。ヒトＣＤ８６と比較したマウスＣＤ８６親和性の差は、１０倍以内、５倍以内、２倍以内、１．５倍以内または１．２倍以内であり得る。
【０１３５】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、例えば、カニクイザルからの末梢血単核細胞を使用する混合リンパ球反応におけるＩＬ−２産生の阻害として計測されるカニクイザルＴリンパ球の活性化を阻害し得る。ポリペプチドは、カニクイザルＴリンパ球の活性化の阻害についてのアッセイにおいて野生型ＣＴＬＡ−４よりも大きい効力を示し得る。
【０１３６】
本発明の代表的なＣＴＬＡ−４ポリペプチドについての種交差反応に関するデータを、実施例８に示す。
【０１３７】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、Ｂ７ファミリーにおける他の関連タンパク質に優先するＣＤ８０およびＣＤ８６特異的結合を示し得る。したがって、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ３Ｂとの交差反応性が欠落し得る。
【０１３８】
特異性を測定するためのアッセイは、当分野において公知である。例えば、酵素免疫アッセイを使用することができる。好適なアッセイの実施例については実施例６を参照のこと。
【０１３９】
安定性
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも野生型ＣＴＬＡ−４の安定性を保持し、好ましくは、例えば、下記のとおりＣＴＬＡ−４単独またはＦｃ領域にコンジュゲート（例えば、融合）しているＣＴＬＡ−４について計測されたときに野生型よりも安定である。
【０１４０】
より安定なＣＴＬＡ−４Ｆｃコンジュゲート（「ＣＴＬＡ−４Ｉｇ」）は、皮下送達に要求される高い（例えば、≧１００ｍｇ／ｍｌ）濃度における配合をより良好に許容し得ると考えられる。
【０１４１】
安定性は、分解アッセイにおいて試験することができる。典型的には、これは、産物を固定温度（例えば、５℃または２５℃）において一定期間、例えば、１ヵ月インキュベートし、その月にわたる純度損失の程度（分解の程度）を測定することを含む。凝集および／または断片化が純度損失に寄与し得、それぞれを別個に計測して割合を決定することができ、この２つの値の合計が％純度損失である。分解アッセイの実施例を実施例９および実施例１０において記載する。
【０１４２】
改善された安定性を有するＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、有効性を増加させるだけでなく、誘発される中和または結合抗体のリスクも低減させる低減した凝集のため、投与経路、例えば、皮下経路に、より好適であり得る。
【０１４３】
Ｆｃへのコンジュゲーション
一実施形態において、本発明は、皮下または静脈内配合のための、および中程度から重度のＲＡまたは記載の他の病態の治療のための月１回、２８日間隔以下の頻度の投与のための、延長された半減期を場合により有する（例えば、本明細書にさらに記載のＹＴＥ突然変異を含む）親和性最適化ＣＴＬＡ−４Ｉｇ分子を提供する。
【０１４４】
本発明は、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド配列からなり、またはペプチドもしくはポリペプチド配列、例えば、抗体分子もしくは抗体分子の一部を含み、もしくはそれにコンジュゲートしているポリペプチドを提供する。例えば、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、抗体Ｆｃアミノ酸配列、例えば、ＩｇＧＦｃにコンジュゲートしていてよい。Ｆｃ領域は、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。好ましくは、ＩｇＧは、ヒトＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４である。
【０１４５】
ＩｇＧ１のアロタイプバリアントが公知である。好ましくは、ＩｇＧ１Ｆｃ領域は、残基１４２におけるＥおよび残基１４４におけるＭを含む（図１に示される１から始まる配列番号５６に対応するナンバリング）。このアロタイプは、一般集団において十分表わされる。異なるアロタイプを表す代替的なＩｇＧ１Ｆｃ領域は、残基１４２におけるＤおよび残基１４４におけるＬを含む。このアロタイプは、アバタセプトにおいて用いられる。
【０１４６】
ＩｇＧＦｃアミノ酸配列は、ある突然変異を有するヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４）Ｆｃのアミノ酸配列を含み得る。例えば、ヒトＩｇＧがＩｇＧ１である場合、アミノ酸配列は、Ｆｃエフェクター機能、例えば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を低減または消失させるように突然変異させることができる。Ｆｃエフェクター機能の除去は、公知の定型アッセイにおいて確認することができる。ＡＤＣＣおよびＣＤＣを測定する例示的なアッセイについては実施例７を参照のこと。
【０１４７】
ＩｇＧ１エフェクター機能は、ＩｇＧ１Ｆｃヒンジ領域の突然変異により低減させることができることが公知である。この一例は、アバタセプトＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ１Ｆｃ構築物であり、それは突然変異ヒンジ配列をＩｇＧ１Ｆｃ領域中で取り込み、その野生型ＣがＳに突然変異している。アバタセプトのＩｇＧ１領域は、野生型ＣがＳにより置換されている野生型ヒトＩｇＧ１Ｆｃアミノ酸配列の配列番号７０に対応するアミノ酸配列の配列番号７１を含む。置換は、Ｆｃ領域の残基６、１２および１５におけるものである。
【０１４８】
【化１】
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【０１４９】
本発明に関して、驚くべきことに、この突然変異は、Ｆｃドメインの安定性を低減させ、その結果、アバタセプトＣＴＬＡ４−ＩｇＧ１Ｆｃ融合物が、野生型ＩｇＧ１Ｆｃ配列が使用されるＣＴＬＡ−４−ＩｇＧ１Ｆｃ融合物よりも低い全体安定性を有することが発見された。この安定性損失は不所望であるが、それにもかかわらず、ＩｇＧ１Ｆｃエフェクター機能を低減させ、または回避することは重要である。
【０１５０】
本発明のＣＴＬＡ−４ポリペプチドにコンジュゲートしているＦｃ領域は、好ましくは、配列番号７１を含まない。好ましくは、Ｆｃの残基６、１２および／または１５におけるシステインが保持される。好ましくは、本発明によるＣＴＬＡ−４−Ｆｃコンジュゲートは、野生型ヒトＩｇＧ１Ｆｃヒンジ領域を含む。好ましくは、Ｆｃ領域は配列番号７０を含む。Ｆｃ領域は、ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされる１２９９ＣＴＬＡ４−ＩｇポリペプチドのＦｃ領域であり得る。
【０１５１】
アバタセプトＦｃの野生型への復帰は、Ｆｃ突然変異により引き起こされる不安定性を除去する一方、これは、多くの治療用途において不所望であるＩｇＧ１Ｆｃのエフェクター機能も回復させる。したがって、この突然変異は、アバタセプトＦｃドメインの安定性を改善するが、不所望なエフェクター機能の再導入を犠牲とする。
【０１５２】
より低いエフェクター機能を有し、またはエフェクター機能を有さない他のＩｇＧＦｃ領域、例えば、ＩｇＧ２を使用することができる。
【０１５３】
本発明は、ＩｇＧ１Ｆｃ欠落エフェクター機能を使用する一方、アバタセプト突然変異に固有の低減した安定性の課題を克服する手法を提供する。本発明によるＦｃ領域は、三重突然変異（ＴＭ）Ｌ２０Ｆ、Ｌ２１Ｅ、Ｐ１１７Ｓ（Ｏｇａｎｅｓｙａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００８  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  Ｄ  Ｂｉｏｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．６４：７００−４）を含むＩｇＧ１Ｆｃであり得る。この突然変異は、安定性を低減させずにＦｃエフェクター機能を低減させる。したがって、そのようなＦｃドメインは、皮下投与用組成物の生成に好適である高濃度におけるＣＴＬＡ−４−Ｆｃ構築物の形成を促進する。
【０１５４】
いっそうさらなる利益は、Ｆｃ領域中の「ＹＴＥ」突然変異の取り込みを介して達成することができる（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ  ２００６  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８１：２３５１４−２４）。ＹＴＥ突然変異は、延長されたインビボ半減期を提供し、それは治療有効性を改善し得、および／または低減もしくはより低頻度の投与、例えば、月１回の投与における治療利益の達成を可能とし得る。本発明の産物において使用されるＦｃドメインは、残基３８におけるＹ、残基４０におけるＴ、および残基４２におけるＥを含み得る。これは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃからの突然変異Ｍ３８Ｙ、Ｓ４０Ｔ、Ｔ４２Ｅを表す。
【０１５５】
上記のＹＴＥおよび／または三重突然変異以外、Ｆｃドメインの他の残基は、野生型ヒトＩｇＧ残基であることが好ましい。ヒトＩｇＧ１Ｆｃ中の一部の変異が公知であり、Ｆｃ領域は、ＹＴＥおよび／または三重突然変異を有する任意のヒトＩｇＧ１を含み得る。
【０１５６】
好ましくは、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ＩｇＧ１Ｆｃアミノ酸配列の配列番号５９にコンジュゲートしている。これは、ヒトＩｇＧ１Ｆｃヒンジ領域を含み、ＣのＳへのアバタセプト突然変異を欠き、エフェクター機能を低減させる三重突然変異を取り込み、ＹＴＥ半減期延長を含む。
【０１５７】
本明細書に記載の改善されたＦｃ領域は、野生型ＣＴＬＡ−４とともに使用することができるが、本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドにコンジュゲートしている場合、いっそうさらなる利益を提供する。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、場合により１つ以上の結合アミノ酸またはリンカーペプチドを介して、そのＣ末端においてＦｃ領域のＮ末端にコンジュゲートしていてよい。好ましくは、コンジュゲートは、ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ融合タンパク質である。
【０１５８】
例えば、アミノ酸配列の配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２または配列番号４７を含むＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ＩｇＧＦｃアミノ酸配列の配列番号５９またはＩｇＧＦｃアミノ酸配列の配列番号６０にコンジュゲートしていてよい。
【０１５９】
本発明によるＣＴＬＡ−４−ＩｇＧＦｃ融合タンパク質は、配列番号１３、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６を含み得る。
【０１６０】
ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされる１２９９ＣＴＬＡ−４−ＩｇＧＦｃポリペプチドは、本発明の一実施形態である。ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされる１２９９ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、代替的に、所望により異なるＦｃ領域にコンジュゲートしていてよい。
【０１６１】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチド産物
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ＣＴＬＡ−４−Ｆｃを含め、モノマーまたはマルチマー、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマーまたはペンタマーであり得る。本明細書の他箇所において考察されるとおり、ＣＴＬＡ−４は、ダイマーを形成し得る。この天然ダイマー化は、ＣＴＬＡ−４をＦｃドメインまたは他のダイマー化ドメインにコンジュゲートすることにより増進することができる。
【０１６２】
複数のＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含むポリペプチドマルチマーは、本発明の一態様である。マルチマー内の複数のＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、同一でも互いに異なっていてもよい。マルチマーは、いくつかの同一のポリペプチドおよび／またはいくつかの異なるポリペプチドを含み得る。マルチマーは、１つ以上の本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチド、および１つ以上の他のポリペプチドを含み得る。１つ以上の他のポリペプチドとしては、例えば、野生型ＣＴＬＡ−４および／またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドでないポリペプチドを挙げることができる。
【０１６３】
マルチマーは、２つの本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含むダイマーであり得、それらは同一（ホモダイマー）でも異なって（ヘテロダイマー）いてもよい。
【０１６４】
マルチマーは、４つの本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含むテトラマーであり得、それらは全て同一であり得（ホモテトラマー）、または１つ以上の異なる本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含み得る（ヘテロテトラマー）。マルチマーは、２つの本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチド（同一または互いに異なる）および２つの他のＣＴＬＡ−４ポリペプチド、例えば、野生型ＣＴＬＡ−４を含むテトラマーであり得る。
【０１６５】
ＣＴＬＡ４がマルチマー形態である場合、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃ領域および／または抗体分子と場合によりコンジュゲートしている。コンジュゲートは、抗体抗原結合部位、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを含んでも含まなくてもよい。
【０１６６】
本発明の一態様は、１つ以上、例えば、２、３、４または５つのＣＴＬＡ−４ポリペプチドおよび抗体分子または抗体ドメイン、好ましくは、ヒト抗体分子または抗体ドメインを含むコンジュゲートである。ダイマー化ＣＴＬＡ−４ドメインは、抗体重鎖−軽鎖ペアにコンジュゲートしていてよい。抗体分子は、２つの重鎖−軽鎖ペアを含み得、それぞれの重鎖は、ＶＨドメインおよび１つ以上の定常重鎖ドメイン（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）を含み、それぞれの軽鎖は、ＶＬドメインおよび軽鎖定常領域を含み、２つの重鎖−軽鎖ペアは、重鎖定常ドメインのダイマー化を介して結合しており、４つのＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、抗体分子にコンジュゲートしており、１つのＣＴＬＡ−４は、４つの可変ドメインのそれぞれに結合している。軽鎖定常領域は、ラムダまたはカッパ軽鎖であり得る。ＣＴＬＡ−４分子のペアは、それぞれのＶＨ−ＶＬドメインペアに結合していてよく、ＶＨドメインに結合しているＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ＶＬドメインに結合しているＣＴＬＡ−４ポリペプチドとのダイマーを形成する。好ましくは、ＣＴＬＡ−４のＣ末端は、ＶＨまたはＶＬドメインのＮ末端に融合している。好ましくは、ＶＨおよびＶＬペア形成は、公知のヒト抗原へのいかなる結合も付与しない。
【０１６７】
場合により、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドがＶＨおよび／またはＶＬドメインに代えて、またはその一部に代えて含まれるように、抗体ＶＨおよび／またはＶＬドメインの一部または全部が欠失している。したがって、ダイマーは、一方が抗体軽鎖定常領域に融合しており、一方が抗体重鎖定常領域に融合しているＣＴＬＡ−４ポリペプチドのペアを含み得る。したがって、テトラマーは、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドの２つのペアを含み得、それぞれのペアは、抗体軽鎖定常領域に融合しているＣＴＬＡ−４ポリペプチドおよび抗体重鎖定常領域に融合しているＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含む。上記のとおり、重鎖定常領域は、１つ以上の重鎖定常ドメイン、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含み、軽鎖定常領域は、ラムダまたはカッパであり得る。
【０１６８】
本発明は、ＣＴＬＡ４ペンタマーも含む。５つのＣＴＬＡ４ポリペプチドがアセンブルし、場合により、結合抗体Ｆｃ領域のペンタマー化を介してペンタマーを形成していてよい。ペンタマー形成は、天然でペンタマーであるＩｇＭのＦｃ領域を使用して促進される。したがって、ＩｇＭ、好ましくは、ヒトＩｇＭのＦｃ領域を含む５つのＣＴＬＡ４−Ｆｃポリペプチドは、ペンタマーとして配列していてよい。ペンタマーＣＴＬＡ４は、記載されている（Ｙａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０（７）：５１３−５１８  １９９６）。
【０１６９】
マルチマー内のポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合により共有結合していてよい。共有結合は、ＣＴＬＡ４ポリペプチド間および／またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドに結合している任意のＦｃ領域間で存在し得る。Ｆｃ領域および／または他の抗体ドメインが用いられる場合、ポリペプチドは、そのようなＦｃドメインおよび／または他の抗体ドメインについて天然存在と同一の様式で結合していてよい。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドのシステイン残基間のジスルフィド結合の形成は、本明細書の他箇所において記載される。
【０１７０】
そのようなマルチマーおよびコンジュゲートは、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドについて本明細書に記載の任意の方法においてまたは任意の使用に使用することができる。マルチマー構造は、ＣＴＬＡ−４の生物学的活性、例えば、Ｔ細胞活性化の阻害を増進し得る。野生型ＣＴＬＡ−４の阻害は、テトラマー形態において向上することが示されている（実施例１１、図７）。
【０１７１】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、標識されていても標識されていなくてもよい。標識は、ＣＴＬＡ−４配列またはそれにコンジュゲートしているＦｃ領域に付加することができる。
【０１７２】
ＣＴＬＡ−４および／またはＦｃ領域は、グルコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。好ましくは、ＣＴＬＡ−４および／またはＦｃは、それらの通常のヒトグリコシル化を担持する。
【０１７３】
本明細書に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチドをさらに改変および発達させて、改善され、または変化した追加のバリアントを提供することができる。例えば、本明細書に記載の本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドのアミノ酸配列は、１つ以上の突然変異、例えば、置換を導入することにより改変してさらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを提供することができ、次いでそれを本明細書の他箇所において記載のとおり効力、親和性（ＣＤ８０および／またはＣＤ８６について）および／または安定性について試験することができる。
【０１７４】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、好ましくは、本明細書に記載の１つ以上の所望の機能特性を保持する。そのような特性としては、ＣＤ８０および／もしくはＣＤ８６への結合能、野生型ＣＴＬＡ−４よりも大きい親和性でのＣＤ８０および／もしくはＣＤ８６への結合能、ならびに／または本発明のＣＴＬＡ−４ポリペプチドについて本明細書に記載の効力、親和性および／もしくは安定性、例えば、表面プラズモン共鳴により決定される５０ｎＭ以下のヒトＣＤ８０結合ＫＤが挙げられる。本明細書に記載のとおり、本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、典型的には、野生型ＣＴＬＡ−４の配列番号３５と比較して大きいヒトＣＤ８０結合親和性、大きい効力および／または大きい安定性を有する。
【０１７５】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号３６〜５５のいずれかと、例えば、配列番号４３、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３６、配列番号４２または配列番号４７と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を有するアミノ酸配列を含み、またはそれからなっていてよい。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、配列番号６８と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を有するアミノ酸配列を含み、またはそれからなっていてよい。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を有するアミノ酸配列を含み、またはそれからなっていてよい。
【０１７６】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、１つ以上のアミノ酸突然変異を有する配列番号３６〜５５のいずれか、配列番号６８またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含み、またはそれからなっていてよい。例えば、それは、最大１２、例えば、最大１０のアミノ酸突然変異、例えば、最大５つの突然変異、例えば、１、２または３つのアミノ酸突然変異を含み得る。突然変異の例は、本明細書の他箇所において記載される。
【０１７７】
１つ以上の突然変異の導入後、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、所望の機能特性、例えば、ＣＤ８０および／もしくはＣＤ８６への結合能、野生型ＣＴＬＡ−４よりも大きい親和性でのＣＤ８０および／もしくはＣＤ８６への結合能、ならびに／または本発明のＣＴＬＡ−４ポリペプチドについて本明細書に記載の効力、親和性および／もしくは安定性、例えば、表面プラズモン共鳴により決定される５０ｎＭ以下のヒトＣＤ８０結合ＫＤについて試験することができる。
【０１７８】
本発明の一態様は、
本明細書に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチドアミノ酸配列を含み、またはそれからなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを提供すること；
１つ以上の突然変異をアミノ酸配列中に導入してさらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを提供すること；ならびに
さらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドの安定性、親和性および／または効力を試験すること
を含む方法である。
【０１７９】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドアミノ酸配列は、例えば、配列番号３６〜５５のいずれかまたは配列番号６８またはＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされるＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を含み、またはそれからなっていてよい。例えば、アミノ酸配列は、配列番号４３、３７、３６、３８、４２または４７であり得る。
【０１８０】
１から２０の突然変異（両端含む）を、場合により導入することができ、それは置換、欠失、挿入またはそれらのいずれかの混合物を含み得る。例えば、１つ以上の置換、例えば、１から２０の置換（両端含む）を導入することができる。
【０１８１】
さらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドの安定性、親和性および／または効力を試験するアッセイの例は、本明細書に記載される。さらなるポリペプチドは、それが由来したＣＴＬＡ−４ポリペプチドよりもそれほど低くない、または大きい安定性、親和性および／または効力を有し得る。
【０１８２】
本方法は、さらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドが本発明のＣＴＬＡ−４ポリペプチドについて本明細書に記載の効力、親和性および／または安定性を有すること、例えば、それが表面プラズモン共鳴により決定される５０ｎＭ以下のヒトＣＤ８０結合ＫＤを有することを決定することを含み得る。
【０１８３】
本発明のＣＴＬＡ−４ポリペプチドについて本明細書に記載の効力、親和性および／または安定性を有すると同定されたさらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、次いで、医薬組成物に配合し、または本明細書に記載の治療方法を含む方法において使用することができる。
【０１８４】
本方法は、さらなるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物に配合することを含み得る。そのような組成物、その使用および配合は、本明細書の他箇所においてより詳細に記載される。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、本明細書に記載の任意のフォーマットで提供することができ、例えば、それは、記載のとおりＦｃ領域にコンジュゲートしていてよい。
【０１８５】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、例えば、ＣＴＬＡ−４−Ｆｃ構築物をコードする核酸分子を産生することができる。例えば、核酸分子は、本発明による任意のＣＴＬＡ−４ポリペプチドアミノ酸配列またはＣＴＬＡ−４−Ｆｃアミノ酸配列をコードし得る。核酸は、１２９９ＣＴＬＡ−４−Ｉｇポリペプチドをコードし、または少なくともそのＣＴＬＡ−４ポリペプチド領域をコードするＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸配列を含み得る。核酸分子は、単離することができ、ベクター、例えば、細胞中の核酸発現用の組換えベクター中で含めることができる。インビトロ細胞は、ベクターを含み得、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドまたはＣＴＬＡ−４Ｆｃ産物の発現に使用することができる。ポリペプチドは、ＮＣＩＭＢ寄託アクセッション番号４１９４８の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞系により発現させることができる。
【０１８６】
本明細書に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ポリペプチドをコード核酸から発現させることを含む方法により産生することができる。これは、そのようなベクターを含有する宿主細胞を培養物中で、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドの発現を引き起こし、または可能とする適切な条件下で成長させることにより簡便に達成することができる。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、インビトロ系、例えば、網状赤血球ライセート中で発現させることもできる。発現によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドの産生後、その活性、例えば、ＣＤ８６またはＣＤ８０へのその結合能を定型的に試験することができる。
【０１８７】
種々の異なる宿主細胞中のポリペプチドのクローニングおよび発現系が周知であり、ＣＴＬＡ−４−Ｆｃポリペプチドを含む本明細書に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチドの発現に用いることができる。好適な宿主細胞としては、細菌、真核細胞、例えば、哺乳動物および酵母、ならびにバキュロウイルス系が挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当分野において利用可能な哺乳動物細胞系としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＣＯＳ細胞および多くの他のものが挙げられる。一般の好ましい細菌宿主は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。適切な調節配列、例として、プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子および他の配列を必要に応じて含有する好適なベクターを選択または構築することができる。ベクターは、必要に応じてプラスミド、ウイルス、例えば、バクテリオファージ、またはファージミドであり得る。例えば、核酸構築物の調製、突然変異誘発、配列決定、細胞中へのＤＮＡの導入および遺伝子発現における核酸の操作、ならびにタンパク質の分析のための多くの技術およびプロトコルは、公知である。
【０１８８】
一般に、本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコードする核酸は、単離物として、単離および／または精製形態で、または汚染物質不含または実質的に不含で提供される。核酸は、全部または一部が合成であり得、核酸としてはゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを挙げることができる。
【０１８９】
核酸は、複製ベクターの一部として提供することができ、本発明のＣＴＬＡ−４ポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、特に、コードされるポリペプチドを適切な条件下で発現させることができる任意の発現ベクター、およびそのような任意のベクターまたは核酸を含有する宿主細胞である本発明により提供することもできる。これに関する発現ベクターは、関心対象のポリペプチドをコードする核酸およびインビトロ発現系、例えば、網状赤血球ライセート、またはインビボ、例えば、真核細胞、例えば、ＣＯＳもしくはＣＨＯ細胞もしくは原核細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中のポリペプチドの発現に適切な調節配列を含む核酸分子である。
【０１９０】
宿主細胞は、本明細書に開示の核酸を含有し得る。本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）中に統合することができる。統合は、標準的技術に従ってゲノムとの組換えを増進する配列の包含により増進することができる。核酸は、細胞内の染色体外ベクター上に存在し得る。
【０１９１】
核酸は、宿主細胞中に導入することができる。導入は、一般に、限定されるものではないが、「形質転換」または「形質移入」と称されることがあり（特にインビトロ導入について）、任意の利用可能な技術を用い得る。真核細胞については、好適な技術としては、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム介在性形質移入およびレトロウイルスまたは他のウイルス、例えば、牛痘、もしくは昆虫細胞についてはバキュロウイルスを使用する形質導入を挙げることができる。細菌細胞については、好適な技術としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーションおよびバクテリオファージを使用する形質移入を挙げることができる。
【０１９２】
当分野において周知のマーカー遺伝子、例えば、抗生物質耐性または感受性遺伝子を、関心対象の核酸を含有するクローンの同定において使用することができる。
【０１９３】
導入後、コードされるポリペプチドが産生されるように、核酸からの発現を引き起こし、または可能とし、例えば、宿主細胞（実際に形質転換された細胞を挙げることができるが、細胞は、形質転換細胞の子孫である可能性がより高い）を遺伝子の発現のための条件下で培養することができる。ポリペプチドが適切なシグナルリーダーペプチドに連結して発現される場合、それは、細胞から培養培地に分泌され得る。発現による産生後、ポリペプチドは、宿主細胞および／または培養培地から単離および／または精製することができ、状況に応じて、続いて所望により、例えば、１つ以上の追加の成分を含み得る組成物、例えば、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤、ビヒクルまたは担体（例えば、以下参照）を含む医薬組成物の配合において使用することができる。
【０１９４】
本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、例えば、コード核酸からの発現による産生後に単離および／または精製することができる（例えば、抗体を使用）。したがって、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、汚染物質不含または実質的に不含で提供することができる。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、他のポリペプチド不含または実質的に不含で提供することができる。単離および／または精製されたＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、少なくとも１つの追加の成分を含み得る組成物、例えば、薬学的に許容可能な賦形剤、ビヒクルまたは担体を含む医薬組成物の配合において使用することができる。本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含む組成物は、本明細書の他箇所において考察される予防および／または治療的治療において使用することができる。
【０１９５】
したがって、本発明の一態様は、本発明のＣＴＬＡ−４ポリペプチド、場合により、ＩｇＧＦｃにコンジュゲートしているＣＴＬＡ−４ポリペプチド、および１つ以上の医薬賦形剤を含み、またはそれらからなる組成物である。本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドの多数の例は、本明細書の他箇所において記載され、いずれもＦｃ領域にコンジュゲートしていてよい。
【０１９６】
例えば、本組成物は、
ＩｇＧＦｃアミノ酸配列の配列番号５９にコンジュゲートしている、アミノ酸配列の配列番号４３（バリアント１２９９）、配列番号３７（バリアント１３２２）、配列番号３８（バリアント１３２１）、配列番号３６（バリアント１３１５）、配列番号４２（バリアント１１１５）または配列番号４７（バリアント１２２７）を含むＣＴＬＡ−４ポリペプチド；および
１つ以上の医薬賦形剤
を含み、またはそれらからなっていてよい。
【０１９７】
本組成物は、ＮＣＩＭＢアクセッション番号４１９４８のもとで寄託された核酸によりコードされる１２９９ＣＴＬＡ−４Ｉｇポリペプチド、および１つ以上の医薬賦形剤を含み、またはそれらからなっていてよい。
【０１９８】
例えば、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、アミノ酸配列の配列番号１３、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６を含み得る。
【０１９９】
本発明による組成物は、少なくとも７０ｍｇ／ｍｌ、例えば、少なくとも８０ｍｇ／ｍｌ、少なくとも９０ｍｇ／ｍｌまたは少なくとも１００ｍｇ／ｍｌの濃度でＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含み得る。濃度は、グルコシル化を含むポリペプチドの質量として計算され、存在する場合、Ｆｃ領域を含む。ポリペプチド濃度は、グルコシル化（存在する場合）を含むポリペプチドの計算質量に基づく吸光係数を使用する分光光度計測の標準的方法により測定することができる。グリコシル化が存在する場合、それは、完全であると想定することができる。好適な方法は、実施例に説明される。例えば、１２９９ＣＴＬＡ−４−Ｆｃについて例示されるとおり濃度測定に１．０９の吸光係数を使用することができる。
【０２００】
配合および医学的使用
本発明のＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、月１回以下の頻度の投与により投与することができる。低頻度の投与は、一般に、患者および臨床医に対する負荷を低減させるために望ましいが、より低い治療有効性のリスクおよび／または製品用量の増加の必要性と関連し得る。本発明による効力、親和性および／または半減期の改善は、そのようなリスクを低減させ、従来の投与レジメンと比較して少ないまたは低頻度の投与の可能性を提供する。
【０２０１】
多くの患者について、治療は、長期間にわたり、例えば、数年間、場合により、患者の生涯にわたり要求される。したがって、複数の投与量が投与されることが予測される。投与間の間隔は、数日、１週間、または１ヵ月のオーダーであり得る。好ましくは、投与は、少なくともまたは約１４、２１または２８日間の間隔におけるものである。好ましくは、患者への投与は、皮下送達により、２８日間以上の投与間隔、例えば、月１回の投与である。
【０２０２】
投与は、静脈内であり得、または任意の他の好適な投与経路によるものであり得る。例えば、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、皮下注射により投与することができ、自宅での患者による自己投与を促進し、静脈内投与レジメンと比較して診療所への患者の来訪を低減させる潜在的利点を提供する。
【０２０３】
皮下投与に好適な低減した容量へのＣＴＬＡ−４の配合は、典型的には、静脈内投与用の配合と比較して高い濃度のＣＴＬＡ−４産物を要求する。典型的には、少なくとも７０ｍｇ／ｍｌの濃度が、皮下投与に好ましく、より好ましくは、少なくとも１００ｍｇ／ｍｌである。本発明によるＣＴＬＡ−４組成物の改善された安定性は、例えば、皮下投与用の高濃度における配合を促進する。
【０２０４】
本発明による、および本発明による使用のための医薬組成物は、活性成分に加え、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、緩衝剤、安定剤または当業者に周知の他の材料を含み得る。そのような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨げるべきでない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路に依存し、それは、任意の好適な経路であり得るが、注射（針を用いるまたは用いない）、特に皮下注射である可能性が最も高い。他の好ましい投与経路としては、吸入による投与または鼻腔内投与が挙げられる。
【０２０５】
静脈内、皮下または筋肉内注射については、活性成分は、パイロジェンフリーで好適なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形態である。当業者は、例えば、等張ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液、または乳酸リンガー注射液を使用して好適な溶液を十分に調製することができる。保存剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤および／または他の添加剤を必要により含めることができる。
【０２０６】
本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、ヒトまたは動物体、好ましくは、ヒトを診断または治療する方法において使用することができる。
【０２０７】
治療する方法は、本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドの投与、例えば、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含む医薬組成物の投与を含み得る。本明細書に記載のＣＴＬＡ−４ポリペプチドまたはＣＴＬＡ−４ポリペプチドを含む組成物は、皮下または静脈内投与により患者を治療する方法において使用することができる。
【０２０８】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、好ましくは、個体に利益を示すために十分な「予防有効量」または「治療有効量」（状況に応じて、予防は、治療とみなすことができるが）での投与により個体に与えることができる。実際の投与量、ならびに投与速度およびタイムコースは、治療されるものの性質および重症度に依存する。治療の処方、例えば、投与量の決定などは、一般実施者および他の医師の責務の範囲内である。
【０２０９】
組成物は、治療すべき病態に応じて単独で、または他の治療との組合せで同時にまたは連続的に投与することができる。
【０２１０】
ＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、Ｔ細胞応答の減衰に有用であり、したがって、Ｔ細胞応答の減衰が利益的な病態の治療に使用することができる。ＣＴＬＡ−４ポリペプチドを使用して治療利益を提供することができる臨床適応症としては、自己免疫疾患および／または炎症疾患が挙げられる。治療適応症の例は、関節リウマチ（ＲＡ）、若年性関節炎、乾癬性関節炎、乾癬、多発性硬化症、喘息、クローン病、ループス腎炎、全身性エリテマトーデス、強直性関節炎、移植片拒絶、Ｉ型糖尿病、シェーグレン症候群および潰瘍性大腸炎ならびに他の自己免疫病態、例えば、脱毛症（ａｌｌｏｐｅｃｉａ）である。本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドは、中程度から重度のＲＡを有する患者に特に好適とみなされる。
【０２１１】
本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドまたは医薬組成物により治療される患者は、中程度から重度に活性のＲＡを有する者であり得、合成疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）またはＣＴＬＡ−４以外、例えば、アバタセプト以外の生物剤による以前のまたは継続中の治療を問わない。本発明によるＣＴＬＡ−４ポリペプチドを使用して患者を単剤療法により、慣用のＤＭＡＲＤとの組合せで、慣用のＤＭＡＲＤに対して不適切な応答を示す患者、または生物剤が不適合の患者において治療することができる。
【０２１２】
治療の有効性はモニタリングすることができ、データを関節損傷の進行および／または患者機能に関して得ることができる。
【実施例】
【０２１３】
以下のＣＴＬＡ４−Ｉｇ配列をＮＣＩＭＢに寄託した：
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＨ５ａバリアント１２９９＝ＮＣＩＭＢ４１９４８
寄託日＝２０１２年３月１３日
ＣＴＬＡ−４Ｆｃ融合分子を生物学的効力を最適化するために使用される戦略は、２つの主要なアクティビティーからなるものであった。１つのアクティビティーは、ＣＴＬＡ−４ドメインの指向進化を実施してリガンドＣＤ８０およびＣＤ８６に対する改善された親和性、ならびにそのドメインの改善された安定性を選択するためのリボソームディスプレイの使用であった。リボソームディスプレイ選択からのアウトプットは、ＣＴＬＡ−４バリアントの多様な集団からなり、それを配列決定し、それらのコードユニーク配列をインビボＴ細胞刺激アッセイにおいて直接試験するためにＦｃ融合相手とともに発現させた。このアプローチの利点は、多くの異なるＣＴＬＡ−４バリアント（＞１，０００を試験した）を薬物様フォーマットで、すなわち、ダイマー化を増進するＦｃドメインに関して生物学的関連アッセイにおいて順位付けすることであった。この戦略の追加の特徴は、改善された生物学的機能に関連するＣＴＬＡ−４突然変異の組換えを実施して相乗作用を介してさらなる効力の獲得を達成することであった。
【０２１４】
このアプローチは、より高い親和性のＣＴＬＡ−４バリアントおよびタンパク質安定性を同時に選択し得た。親和性選択は、減少濃度の標的リガンド、この場合、ＣＤ８０／８６を用いてより高い親和性のＣＴＬＡ−４バリアントを選択的に濃縮する。改善された安定性の選択は、脱安定剤、例えば、ＤＴＴ、または疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ビーズのいずれかを使用して選択プールからより安定でない、またはより折り畳まれない傾向のバリアントを除去する。したがって、安定性および親和性圧力は、後続の並行アプローチではなく単一選択内で適用することができる。
【０２１５】
第２のアクティビティーは、Ｆｃ介在性エフェクター機能を除去し、インビボでの分子の循環半減期を向上させることが公知の突然変異を導入するＦｃドメインの合理的設計であった。異なるバリアントＦｃ領域を、ＣＴＬＡ−４への融合物として調製し、加速インビトロ安定性試験において試験して最適な安定性プロファイルを有するＦｃ領域を選択した。
【０２１６】
これら２つの並行アクティビティーおよび後続のスクリーニング後、複数のインビトロＴ細胞刺激アッセイにおける阻害により計測された最も強力なＣＴＬＡ−４ドメインを、加速インビトロ安定性試験により計測された最も安定な遺伝子操作Ｆｃドメインと組み合わせた。生物学的効力およびタンパク質安定性についてのさらなるインビトロ試験は、最終薬物フォーマットの分子の相対的順位付けを可能とした。
【０２１７】
実施例１．ＣＴＬＡ−４バリアントのライブラリーの構築ならびに改善された効力および安定性のリボソームディスプレイ選択
リボソームディスプレイは、Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ１６４１０、Ｆｃ領域が付属しない細胞外ドメインの残基３８〜１６１に対応するモノマーヒトＣＴＬＡ−４ドメインに対して実施した。この配列（配列番号３５）は、野生型ＣＴＬＡ−４とも称される。ＣＴＬＡ−４リボソームディスプレイ構築物は、ヒトＣＴＬＡ−４ｃＤＮＡの要求部分を、リボソームディスプレイに要求される５’および３’調節エレメントを含有するベクター中にクローニングすることにより得た（Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）３２８：４０４）。この構築物は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の後に、ＣＴＬＡ−４コード配列の上流の原核リボソーム結合部位（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列）を含む。ヒトＣＴＬＡ−４のダイマー化界面中のアミノ酸１２０（またはＳｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ１６４１０におけるナンバリングによる１５７位）におけるシステインを、セリンに突然変異させ、他では改善されたＣＴＬＡ−４配列の選択を妨げ得るリボソームディスプレイフォーマットにおけるＣＴＬＡ−４分子のダイマー化を防止した。ＣＴＬＡ−４配列の下流で、線状ファージからの遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部を、スペーサーとして作用するように含めてリボソームトンネル外へのＣＴＬＡ４バリアントのディスプレイを可能とした。ＣＴＬＡ−４リボソームディスプレイ構築物は、ヌクレアーゼ分解に対するｍＲＮＡライブラリーの安定化を補助するためのｍＲＮＡレベルにおける５’および３’ステム−ループ配列も含有した。
【０２１８】
エラープローンライブラリー
上記のヒトＣＴＬＡ−４リボソームディスプレイ構築物を、テンプレートとしても使用してエラープローンＰＣＲを使用してランダムバリアントのライブラリーを生成した。エラープローンＰＣＲは、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ  ＰＣＲ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を製造業者の説明書に従って使用してＣＴＬＡ−４遺伝子に適用した。反応を、分子当たり平均４つのアミノ酸突然変異および約２．５×１０１０のバリアント分子のライブラリーを与えるように調整した。このランダム突然変異誘発手順は、さらに選択プロセス中に取り込み、それを第３の選択ラウンドのアウトプットに適用してより多くの多様性をバインダーの濃縮集団に導入してからさらに選択した。
【０２１９】
「Ｌｏｏｐ４」指定ライブラリー
ヒトＣＴＬＡ−４リボソームディスプレイ構築物をテンプレートとしても使用し、ＣＤ８０およびＣＤ８６との相互作用に寄与する潜在性を有するＣＴＬＡ−４分子の領域に標的化された突然変異誘発を有するバリアントのライブラリーを生成した。ヒトＣＴＬＡ−４：ヒトＣＤ８０複合体（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）：１Ｉ８Ｌ）およびヒトＣＴＬＡ−４：ヒトＣＤ８６複合体（ＰＤＢ：１Ｉ８５）の共結晶構造を試験して分子間、特にリガンドに近接するＣＴＬＡ−４のアミノ酸側鎖間の結合相互作用を可視化した。アミノ酸５９から６５位（またはＣＴＬＡ−４エントリーＰ１６４１０のＳｗｉｓｓＰｒｏｔナンバリングによる９６から１０２位）を含むヒトＣＴＬＡ−４タンパク質（配列番号３５）の領域は、ＣＤ８０およびＣＤ８６の方向に延びるループを形成することが確認された。この領域中の残基のそれぞれを、飽和（ＮＮＳ）突然変異誘発を使用して完全にランダム化して約３．４×１０１０のバリアント分子のライブラリーを創成した。この「Ｌｏｏｐ４」ライブラリーは、重複オリゴヌクレオチド（配列番号３３および配列番号３４）を使用して標準的な技術により構築した。
【０２２０】
改善された親和性および安定性の選択
ヒトＣＤ８０およびＣＤ８６へのヒトＣＴＬＡ−４バリアントの改善された結合の選択を、Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．（２０００）３２８：４０４）に記載のリボソームディスプレイ親和性ベース選択を使用して実施した。手短に述べると、ＣＴＬＡ−４バリアントＤＮＡライブラリーを転写させ、次いで無細胞原核翻訳系中で翻訳させ、翻訳反応を停滞させて三元リボソームディスプレイ選択複合体（ｍＲＮＡ−リボソーム−タンパク質）を生成し、次いでそれをヒトＣＤ８０またはヒトＣＤ８６Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）のいずれかとインキュベートした。ＣＤ８０またはＣＤ８６結合複合体を、プロテインＧコート磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）とのインキュベーションにより捕捉し、結合三元複合体を磁気分離により回収した一方、未結合複合体を洗浄除去した。結合ＣＴＬＡ−４バリアントをコードするｍＲＮＡを逆転写およびＰＣＲにより回収した。改善された結合を有するＣＴＬＡ−４バリアントの選択をドライブするため、選択プロセスを、減少濃度のＣＤ８０またはＣＤ８６をいくつかのラウンドにわたり使用して繰り返した。
【０２２１】
ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する改善された親和性の選択とともに、ＣＴＬＡ−４バリアントプールを改善された安定性についてのリボソームディスプレイにより同時に選択した。早期の選択ラウンド（ラウンド１および３）においてＤＴＴを使用してより安定なＣＴＬＡ−４バリアントの回収に好ましい選択圧力を適用した（Ｊｅｒｍｕｔｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００１  Ｊａｎ  ２；９８（１）：７５−８０）。０．５ｍＭの最終濃度のＤＴＴを翻訳反応物中で含め、その後に反応物を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のスラリーと、さらに０．５ｍＭのＤＴＴの存在下でインキュベートした。ＨＩＣステップを使用して不十分に折り畳まれたバリアントを捕捉し、それらを反応物から遠心分離により除去してから、ＣＤ８０とインキュベートし、上記の親和性選択を行った。
【０２２２】
ホットスポット突然変異誘発ライブラリー、および重要な突然変異の合理的組換え
エラープローンＰＣＲおよびＬｏｏｐ４指定ライブラリーからのＣＴＬＡ−４バリアントの初回スクリーニング後、改善された活性に関連する突然変異を同定し、それを使用してさらなるＣＴＬＡ−４バリアントを設計した。１つの戦略において、飽和（ＮＮＳ）突然変異誘発を使用して配列番号３５の１６、２５、５８、７０、８５および９３位（またはＣＴＬＡ−４エントリーＰ１６４１０のＳｗｉｓｓＰｒｏｔナンバリングによる５３、６２、９５、１０７、１２２および１３０位）が単一ライブラリー中で完全にランダム化されたホットスポット突然変異誘発ライブラリーを構築した。ライブラリーは、重複および突然変異誘発オリゴヌクレオチド（配列番号６１から配列番号６７（両端含む））を使用して創成した。次いで、このライブラリーを上記のとおり改善された親和性について選択した。
【０２２３】
代替アプローチにおいて、改善された活性に関連するエラープローン、Ｌｏｏｐ４およびホットスポット突然変異誘発ライブラリーから同定されたより少数の突然変異を、オリゴヌクレオチド指定突然変異誘発により組み合わせて合理的組換え体を創成し、次いでそれを生物学的活性について直接試験した。この戦略のために選択された突然変異は：Ｉ１６Ｓ、Ｓ２５Ｎ、Ｓ２５Ｐ、Ｇ２７Ｓ、Ｍ５４Ｋ、Ｎ５６Ｓ、Ｌ５８Ｇ、Ｔ５９Ｓ、Ｆ６０Ｔ、Ｌ６１Ｑ、Ｌ６１Ｐ、Ｄ６２Ｇ、Ｄ６３Ｙ、Ｓ６４Ｐ、Ｉ６５Ｎ、Ｉ６５Ｖ、Ｓ７０Ａ、Ｑ８０Ｒ、Ｍ８５ＳおよびＫ９３Ｑ（または、ＣＴＬＡ−４  ＳｗｉｓｓＰｒｏｔエントリーＰ１６４１０によるナンバリング：Ｉ５３Ｓ、Ｓ６２Ｎ、Ｓ６２Ｐ、Ｇ６４Ｓ、Ｍ９１Ｋ、Ｎ９３Ｓ、Ｌ９５Ｇ、Ｔ９６Ｓ、Ｆ９７Ｔ、Ｌ９８Ｑ、Ｌ９８Ｐ、Ｄ９９Ｇ、Ｄ１００Ｙ、Ｓ１０１Ｐ、Ｉ１０２Ｎ、Ｉ１０２Ｖ、Ｓ１０７Ａ、Ｑ１１７Ｒ、Ｍ１２２ＳおよびＫ１３０Ｑ）であった。
【０２２４】
実施例２．Ｆｃ融合タンパク質としてのＣＴＬＡ−４野生型およびバリアントの発現
リボソームディスプレイ選択からのバリアントＣＴＬＡ−４遺伝子を、ベクターｐＥＵ７．１中にクローニングした。このベクターは、ＩｇＧ１Ｆｃ領域（配列番号５６）とのインフレーム融合物としてのＣＴＬＡ−４遺伝子の発現を可能とする。リボソームディスプレイアウトプットをＰＣＲ増幅させ、ｐＥＵ７．１中にクローニングしてから大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５−アルファ細胞中に形質転換した。ＰＣＲクローニングに使用されたオリゴヌクレオチドは、１２０位（Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ１６４１０におけるナンバリングによる残基１５７）におけるセリンを野生型アミノ酸のシステインに復帰するようにも設計した。個々の形質転換体の配列決定後、ユニークなＣＴＬＡ−４アミノ酸配列を有する合計１，０００を上回るバリアントをタンパク質発現のために選択した。８８のバリアントのバッチにおいて、コードプラスミドＤＮＡを供給業者のプロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）に従って精製し、ＤＮＡ濃度を使用して形質移入のための正確な量のＤＮＡを計算することができるように分光光度法により２６０ｎｍにおいて定量した。
【０２２５】
２４ウェルプレートからのＣＴＬＡ−４タンパク質の発現、精製および定量
３ｍｌのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＥＣＡＣＣ）を、２４ウェルプレート（Ｗｈａｔｍａｎ  ７３４−２５５８）の別個のウェル中で、２５μＭのＬ−メチオニンスルホキシイミン（Ｓｉｇｍａ  Ｍ５３７９）を含有するＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １０７４３−０２９）中で１ｍｌ当たり１００万の細胞において播種した。細胞を含有する２４ウェルプレートを通気性サンドイッチ蓋（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｚ３６５００１２２４）により密封し、ディープウェルプレート（Ａｐｐｌｉｋｏｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｚ３６５００１７００）用クランプ中に配置した。細胞を２５０ｒｐｍ、湿度８０％、５％のＣＯ２および３７℃において振とうした。形質移入のため、３μｇのプラスミドＤＮＡを含有する５０μｌのＮａＣｌ  １５０ｍＭを、２１μｇの直鎖２５ｋＤａ  ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、２３９６６）を含有する５０μｌと混合した。形成されたＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を細胞に添加し、複合体形成の開始と細胞への添加の間を１５分間以下とした。形質移入から１６から２４時間後、細胞を３００μｌ／ウェルのＣＤ−ＣＨＯ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ１０２４０）の添加によりフィードした。プレートを、２５０ｒｐｍ、湿度８０％、５％のＣＯ２および３７℃においてさらに５から６日間振とうして成長培地中にタンパク質を発現させた。発現後、タンパク質を含有する使用済みの培養培地を３０００ｒｐｍにおける１０分間の遠心分離により澄明化した。Ｆｒｅｅｄｏｍ  Ｅｖｏ（登録商標）液体ハンドリングロボット（Ｔｅｃａｎ）を使用して澄明化された上清（１．２ｍｌ）を９６ウェルフィルタープレート（３Ｍ  Ｅｍｐｏｒｅ，１２１４６０３６）に再分注した。残留細胞残屑を、真空ポンプおよびＱＩＡｖａｃ  ６Ｓバキュームマニホールド（Ｑｉａｇｅｎ）を使用する濾過により除去した。１．８ｍｌの澄明化された濾過上清を、ＰｈｙＴｉｐ（ＲＴＭ）プロテインＡ親和性カラム（Ｐｈｙｎｅｘｕｓ、ＰＴＰ−９２−２０−０１）、２０μｌの樹脂床容量）を使用してＭｉｎｉｔｒａｃｋ（ＲＴＭ）液体ハンドリングロボット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により実施される精製のために処理した。ＰｈｙＴｉｐ（ＲＴＭ）カラムを５００μｌのＮａＰ  ２０ｍＭ  ｐＨ７．０によりコンディショニングした。次いで、ＰｈｙＴｉｐ（ＲＴＭ）カラムを、６×３００μｌバッチにおける粗製物上清を流すことによりロードし、２００μｌのＤ−ＰＢＳ、２００μｌのＮａＰ  ２０ｍＭ  ｐＨ７．０により洗浄し、１２０μｌの１００ｍＭのＨＥＰＥＳ  １４０ｍＭのＮａＣｌ  ｐＨ３により溶出させ、２０μｌの１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０により中和した。
【０２２６】
精製されたタンパク質を９６ウェル黒色ポリプロピレンプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、６５５２０９）に移し、次いで１４５μｌのＰＢＳ、０．０２％のＴｗｅｅｎ２０、１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．０５％のアジ化ナトリウム緩衝液（Ｏｃｔｅｔ  ｂｕｆｆｅｒ）を添加した。同一緩衝液中の既に精製されたＣＴＬＡ−４野生型Ｆｃ融合タンパク質を使用して標準曲線を作成した。一組の標準濃度を黒色ポリプロピレンプレート中で１５０μｌの容量中で、５００μｇ／ｍｌの出発濃度および３倍希釈で調製した。プロテインＡコートバイオセンサーを有するＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｉｎｃ、１８−０００４）を使用して２００ｒｐｍの流量で１２０秒間の読取時間を使用して定量を実施した。８つのバイオセンサーの１つのカラムを、試料のそれぞれの９６ウェルプレートに使用した。バイオセンサーは、９６ウェルプレート中の２００μｌの１０ｍＭのグリシンｐＨ１．７（Ｓｉｇｍａ、Ｇ−７４０３）への添加により再生させた。バイオセンサーを中和してから、２００μｌのＯｃｔｅｔ緩衝液への添加により次の試料を処理した。３回の再生／中和サイクルを、３０秒間の時間および２００ｒｐｍの流量で実施した。未知試料の濃度を、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤデータ分析ソフトウェアパッケージを使用する未知試料と標準曲線との間の結合率の比較により測定した。
【０２２７】
より大規模のＣＴＬＡ−４タンパク質の発現、精製および定量
Ｆｃ融合物としての個々のＣＴＬＡ−４タンパク質のより大規模の調製のため、２４ウェルプレート法に使用したものと同一の一般ステップを適用した。ＩｇＧ１Ｆｃへのインフレーム融合物としてのバリアントＣＴＬＡ−４遺伝子を含有するプラスミドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞から調製した。＞１００ｍｇスケールにおけるタンパク質の調製のため、ＩｇＧ１Ｆｃ遺伝子との直接インフレームでＣＴＬＡ−４遺伝子を含有する構築物全体を、遺伝子合成により調製した。全ての場合、関心対象のタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡを調製し、発現のためにＣＨＯ細胞中に形質移入した。２４ウェルプレートに代えて、より大きい容量の細胞を組織培養フラスコまたはウエーブバッグ（ｗａｖｅ−ｂａｇ）中で成長させてから培養物上清から精製した。ハーベストをプールし、濾過してからプロテインＡクロマトグラフィーにより精製した。培養物上清を適切サイズのＣｅｒａｍｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ（ＢｉｏＳｅｐｒａ）のカラム上でロードし、５０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｈｃｌ  ｐＨ８．０、２５０ｍＭのＮａＣｌにより洗浄した。０．１Ｍのクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）を使用して結合ＩｇＧをカラム（ｏｃｌｕｍｎ）から溶出させ、Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ｐＨ９．０）の添加により中和した。Ｎａｐ１０カラム（ＧＥ、１７−０８５４−０２）を使用して溶出した材料をＰＢＳに緩衝液交換し、タンパク質のアミノ酸配列に基づく吸光係数を使用してＩｇＧの濃度を分光光度的に測定した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して精製されたタンパク質を凝集または分解について分析した。
【０２２８】
実施例３．Ｒａｊｉ（Ｂ細胞）およびＪｕｒｋａｔ（Ｔ細胞）二重細胞アッセイ中のＣＴＬＡ−４バリアントの生物学的活性
本明細書に記載のスクリーニング戦略は、インビトロＴ細胞刺激アッセイにおける、Ｆｃ融合相手とともに発現された１，０００を上回るＣＴＬＡ−４バリアントの生物学的活性の計測を含んだ。全ての異なる突然変異誘発戦略（エラープローンＰＣＲ、標的化突然変異誘発、ホットスポット組換えおよび合理的組換えを含む）からのＣＴＬＡ−４バリアントを、生物学的活性について試験し、同様にＦｃ融合フォーマットで発現された野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）に対するそれらの生物学的活性により順位付けした。
【０２２９】
ＣＴＬＡ−４バリアントの生物学的活性を測定するため、試料を、Ｒａｊｉ（Ｂ細胞）およびＪｕｒｋａｔ（Ｔ細胞）細胞からなる二重細胞アッセイに添加した。Ｊｕｒｋａｔ細胞により発現されたＣＤ２８と、Ｒａｊｉ細胞上で発現されたＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）リガンドとの相互作用は、Ｔ細胞受容体のための共活性化シグナル（例えば、ＰＨＡ（フィトヘマグルチニン））と組み合わせられ、Ｊｕｒｋａｔ細胞からのインターロイキン−２（ＩＬ−２）放出をもたらす。可溶性ＣＴＬＡ−４は、ＣＤ８０およびＣＤ８６リガンドに結合し得、それらとＣＤ２８との相互作用を遮断し、この応答を減衰させる。したがって、ＣＴＬＡ−４Ｉｇクローンの効力は、ＩＬ−２ＨＴＲＦアッセイ（ＣｉｓＢｉｏ  ６４ＩＬ２ＰＥＣ）において計測されるＴ細胞からのＩＬ−２放出の阻害により測定する。
【０２３０】
３８４ウェル低タンパク質結合プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＃７８１２８０）を使用して試験試料の１１の１対３段階希釈を実施し、それは完全成長培地（ＲＰＭＩ１６４０  Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃６１８７０、１０％のＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＃１５１４０）中で行った。全ての試料希釈物を、細胞上の５〜３０μｇ／ｍｌの頂部細胞濃度から出発して二重で作製した。
【０２３１】
ＲａｊｉおよびＪｕｒｋａｔ懸濁細胞を、フラスコから遠心分離バイアルに移し、２４０ｇにおいて５分間回転させた。両方の細胞系を成長培地中で７５０，０００の細胞／ｍｌの濃度において再懸濁させ、それぞれを０．０２ｍｌ／ウェル（＝１５，０００の細胞／細胞系／ウェル）において３８４ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ４６４７１８）中にプレートアウトした。０．０２ｍｌを試料希釈物プレートから細胞プレートに移し、０．０２ｍｌの４０μｇ／ｍｌのＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｌ−１６６８）（または陰性対照ウェルについては０．０２ｍｌの培地）を全ての他のウェルに添加して１０μｇ／ｍｌの最終濃度を得、３７℃において５％のＣＯ２でインキュベートした。
【０２３２】
２０〜２４時間後、細胞上清をハーベストし、市販のＩＬ−２ＨＴＲＦキット（ＣｉｓＢｉｏ  ６４ＩＬ２ＰＥＣ）を使用してＩＬ−２分泌を計測した。手短に述べると、抗ｈＩＬ−２クリプテート（ドナーフルオロフォア）および抗ｈＩＬ−２ｄ２（アクセプターフルオロフォア）の「マスターミックス」を、新たに構成されたコンジュゲート緩衝液（０．２％のＢＳＡ／０．８ＭのＫＦ／ＰＢＳ）中で１／２００希釈することにより構成した。２ｎｇ／ｍｌの頂部濃度を有する培地中で１対２希釈されたＩＬ−２（ＮＩＢＳＣ  ＃９６／５０４）を使用して８点の標準曲線を作成した。等容量の試薬マスターミックスおよび試料を３８４ウェル低容量アッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ３６７６）中で混合し、室温において３〜１６８時間インキュベートした。Ｅｎｖｉｓｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上で３２０ｎｍの励起波長ならびに６２０ｎｍおよび６６５ｎｍの発光波長を使用してプレートを読み取った。
【０２３３】
％デルタＦおよび特異的結合値は、それぞれのウェルについて以下のとおり計算した。
【０２３４】
【数１】
2015523328.tif 000003
【０２３５】
培地のみのウェル（最小／非特異的結合（ＮＳＢ））をバックグラウンドとして使用し、ＰＨＡのみのウェル（最大／合計）のウェルを使用してアッセイについての最大シグナルを決定した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ｖ５．０１）ソフトウェアを使用して結果を分析し、最小二乗フィット法を使用する非線形回帰曲線フィットモデル（Ｌｏｇ［阻害剤］対応答、可変傾斜）を使用してＩＣ５０濃度を決定した。
【０２３６】
以下の表は、同様にＦｃ融合フォーマットで発現された野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）に対して生物学的効力の有意な改善を有するとカテゴライズされたＣＴＬＡ−４バリアント分子の数をまとめる。
【０２３７】
【表１】
2015523328.tif 000004
【０２３８】
これら１０７のＣＴＬＡ−４バリアントの反復試験後、正確なＩＣ５０計測値を決定し、Ｆｃ融合フォーマットの野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）を上回る倍の改善が計算された。以下の表は、このデータを、突然変異誘発戦略のそれぞれからの最も強力なＣＴＬＡ−４バリアントの一部についてまとめる。
【０２３９】
【表２】
2015523328.tif 000005
【０２４０】
これらのＣＴＬＡ−４バリアントの配列を図１Ａに示す。
【０２４１】
Ｒａｊｉ−Ｊｕｒｋａｔ二重細胞アッセイにおける最も強力なＣＴＬＡ−４バリアントの６つおよびＦｃ融合フォーマットの野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）のＩＣ５０プロファイルを、図３Ａに示す。
【０２４２】
実施例４．Ｒａｊｉ（Ｂ細胞）およびプライマリーヒトＣＤ４＋Ｔ細胞二重細胞アッセイにおけるＣＴＬＡ−４バリアントの生物学的活性
ヒト血液をＣＰＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ回収チューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で回収し、４００μｌのＣＤ４＋ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ精製試薬（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。２０分間のインキュベーション後、チューブを１７００ｇにおいて２５分間回転させた。細胞を回収し、５０ｍｌのコニカルチューブに移し、３５０ｇにおいて１０分間回転沈降させた。赤血球を、２０ｍｌのＶｉｔａｌｉｚｅ試薬中で再懸濁させ、３０分から１時間インキュベートすることにより溶解させた。次いで、細胞を３５０ｇにおいて１０分間回転沈降させ、Ｔ細胞培地（１％のＡｎｔｉ／Ａｎｔｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給したＸｖｉｖｏ−１５培地（Ｌｏｎｚａ））により１回洗浄した。１ｍｌ当たり１００万の細胞のＲａｊｉおよびプライマリーヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の懸濁液を完全Ｔ細胞培地中で調製し、９６ウェルアッセイプレートに添加する直前まで別個に保持した。別個の９６ウェルプレート（低タンパク質結合）において、ＣＴＬＡ−４バリアント分子の希釈物を、完全Ｔ細胞培地中で１００μｇ／ｍｌの初期濃度から出発し、１２の１：５段階希釈を行って作製した。１００μｌのＣＴＬＡ−４バリアント濃度のそれぞれを組織培養処理９６ウェルアッセイプレートに分注した。ＲａｊｉおよびヒトＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞懸濁液を、１：１の比において混合し、抗ＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ））を１０μｇ／ｍｌの最終濃度まで添加した。１００μｌの細胞懸濁液を、ＣＴＬＡ−４バリアントを含有するそれぞれのウェルに分注し、１８から２４時間インキュベートした。次いで、プレートを、３５０ｇにおいて５分間遠心分離し、上清を新たな９６ウェルプレートに移すことによりハーベストした。ヒトＩＬ−２Ｄｕｏｓｅｔキットを製造業者のプロトコル（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に従って使用してＩＬ−２分泌を計測した。
【０２４３】
最も強力なＣＴＬＡ−４バリアントの６つについてのプライマリーヒトＣＤ４＋Ｔ細胞アッセイにおけるＦｃ融合フォーマットの野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）との効力の比較を、図３Ｂに示す。
【０２４４】
実施例５．カニクイザルからの末梢血単核細胞を使用する混合リンパ球反応におけるＣＴＬＡ−４バリアントの生物学的活性
２つの別個の動物からのカニクイザル血液をＣＰＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ回収チューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で回収し、１７００ｇにおいて２５分間回転沈降させた。細胞を回収し、５０ｍｌのコニカルチューブに移し、３５０ｇにおいて１０分間回転沈降させた。赤血球を、２０ｍｌのＶｉｔａｌｉｚｅ試薬中で再懸濁させ、３０分から１時間インキュベートすることにより溶解させた。次いで、細胞を３５０ｇにおいて１０分間回転沈降させ、Ｔ細胞培地（１％のＡｎｔｉ／Ａｎｔｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給したＸｖｉｖｏ−１５培地（Ｌｏｎｚａ））により１回洗浄した。別個の９６ウェルプレート（低タンパク質結合）において、ＣＴＬＡ−４バリアント分子の希釈物を、完全Ｔ細胞培地中で１００μｇ／ｍｌの初期濃度から出発し、１２の１：５段階希釈を行って作製した。１００μｌのＣＴＬＡ−４Ｉｇ希釈物を組織培養処理９６ウェルアッセイプレートに分注した。それぞれの動物からのＰＢＭＣ細胞懸濁液を１；１の比において混合し、１００μｌの細胞懸濁液を、ＣＴＬＡ−４Ｉｇ希釈物を含有する全てのウェルに分注し、２４時間インキュベートした。次いで、プレートを３５０ｇにおいて５分間回転させ、上清を新たな９６ウェルプレートに移すことによりハーベストした。カニクイザルＩＬ−２ＥＬＩＳＡキットを製造業者のプロトコル（ＭＡＢＴｅｃｈ）に従って使用してＩＬ−２分泌を計測した。
【０２４５】
最も強力なＣＴＬＡ−４バリアントの２つについてのカニクイザル混合リンパ球反応アッセイにおけるＦｃ融合フォーマットの野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）との効力の比較を、図３Ｃに示す。
【０２４６】
実施例６．ＣＤ８０およびＣＤ８６へのバリアント結合の特異性
活性化ＨＲＰ標識キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してＣＴＬＡ−４バリアントをセイヨウワサビペルオキシダーゼにより標識した。Ｂ７ファミリーメンバー（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の細胞外ドメインのＦｃ融合タンパク質を、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）上でＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの濃度において一晩コートした。プレートを１％のＢＳＡによりブロッキングし、ＨＲＰ標識ＣＴＬＡ−４バリアントを種々の濃度において添加し、発色基質（ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ基質、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して結合タンパク質の量を測定した。
【０２４７】
他の関連タンパク質リガンドと比較したＣＤ８０およびＣＤ８６についての最も強力なＣＴＬＡ−４バリアントの２つの特異性を図４に示す。
【０２４８】
実施例７．Ｆｃ介在性エフェクター機能の分析
抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ
ヒト血液をＣＰＴ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ回収チューブ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で回収し、１７００ｇにおいて２５分間回転沈降させた。細胞を回収し、５０ｍｌのコニカルチューブに移し、３５０ｇにおいて１０分間回転沈降させた。赤血球を、２０ｍｌのＶｉｔａｌｉｚｅ試薬中で再懸濁させ、３０分から１時間インキュベートすることにより溶解させた。次いで、細胞を３５０ｇにおいて１０分間回転沈降させ、Ｔ細胞培地（１％のＡｎｔｉ／Ａｎｔｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補給したＸｖｉｖｏ−１５培地（Ｌｏｎｚａ））により１回洗浄した。５００，０００のＰＢＭＣを２００ｕｌのＸｖｉｖｏ−１５培地中で種々の抗体およびＦｃ融合タンパク質の存在下でプレーティングした。２４時間のインキュベーション後、抗ＣＤ１９抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および７−ＡＡＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）により染色することによりフローサイトメトリーを使用してＢリンパ球生存率を測定した。生存Ｂ細胞の数は、ＣＤ１９＋および７−ＡＡＤ−でもある前方／側方散乱特性による生存ゲート中の細胞の割合に５００，０００を乗じることによりそれぞれの試料について計算した。
【０２４９】
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイ
ヒト血清を血清分離チューブ中で回収し、Ｘｖｉｖｏ−１５培地に最終濃度１０％ｗ／ｖまで添加した。１００，０００のＲａｊｉ  Ｂ細胞を、種々の抗体およびＦｃ融合タンパク質を含有する培地中で１８時間インキュベートした。７−ＡＡＤ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）により染色することによりフローサイトメトリーを使用してＲａｊｉ細胞生存率を測定した。生存細胞の数は、７−ＡＡＤ−でもある前方／側方散乱特性による生存ゲート中の細胞の割合に１００，０００を乗じることによりそれぞれの試料について計算した。既に５６℃において３０分間加熱不活化されたヒト血清を含有する培地を対照として使用して補体介在性細胞傷害を確認した。ＴＭ改変を有する最も強力なＣＴＬＡ−４バリアントの２つについてのエフェクター機能（ＡＤＣＣおよびＣＤＣ）の無効化の実証を図５に示す。
【０２５０】
実施例８．ヒト、カニクイザルおよびマウスＣＤ８０およびＣＤ８６へのＣＴＬＡ−４バリアント結合のカイネティック分析
ＣＤ８０およびＣＤ８６試薬のクローニングおよび発現
ヒトおよびマウスからのＣＤ８０およびＣＤ８６の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）をコードするｃＤＮＡ分子を、プライマー伸長ＰＣＲクローニングにより合成し、ｐＤＯＮＲ２２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２５３６−０１７）中にクローニングした。ヒトおよびマウスＣＤ８０およびＣＤ８６についてのデータベース配列を使用した（表１参照）。カニクイザル配列は利用可能でなかったため、カニクイザルとアカゲザルとの間の予測される高い相同性に基づき、アカゲザルＣＤ８０（ｅｎｓｅｍｂｌｅアクセッション番号ＥＮＳＭＭＵＧ００００００１６３６７）およびＣＤ８６（ｅｎｓｅｍｂｌｅアクセッション番号ＥＮＳＭＭＵＧ００００００００９１２）の配列を使用してカニクイザル中の遺伝子のコード配列を増幅させ得るプライマーを設計した。
【０２５１】
次いで、ＬＲ  Ｇａｔｅｗａｙ  Ｃｌｏｎａｓｅ  ＩＩ酵素を製造業者の説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１２５３８−１２０）に従って使用して細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ断片を哺乳動物発現ベクターｐＤＥＳＴ１２．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に移した。ｐＤＥＳＴ１２．２ベクターは、ＦＬＡＧ１０×ｈｉｓタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫＡＡＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ）を関心対象の挿入遺伝子とインフレームで含有するように、およびＥＢＮＡ−１遺伝子産物を発現する細胞系（例えば、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞）中への形質移入時にエピソームプラスミド複製を可能とするｐＣＥＰ４ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｖ０４４−５０）からのｏｒｉＰ複製起点の挿入によっても改変していた。ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ上清中で発現されたタンパク質を、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性クロマトグラフィー（Ｈｉｓｔｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７−５２４８−０２））を使用して精製し、次いでサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号１７−１０６９−０１））を使用して精製した。
【０２５２】
【表３】
2015523328.tif 000006
【０２５３】
【表４】
2015523328.tif 000007
【０２５４】
結合親和性の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
ＣＴＬＡ−４：ＣＤ８０およびＣＤ８６相互作用のＳＰＲ分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００  ＳＰＲ装置上で実施した。約２００ＲＵのＣＴＬＡ４バリアントを、ＣＭ５  Ｂｉａｃｏｒｅチップ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＢＲ−１０００−１４）にアミンカップリングキット（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＢＲ−１０００−５０）を使用して第１級アミン基を介して共有結合させた。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅカタログ番号ＢＲ−１００１−８８）中のＣＤ８０およびＣＤ８６の用量調整物を、固定化ＣＴＬＡ−４バリアント上で流動させた。全てのトレースを二重参照減算した。会合および解離定数をフィットさせる１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒモデルを使用するＢｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを使用して分析を実施した。バリアントが極めて急速なカイネティックスを有した場合、平衡分析を実施した。
【０２５５】
ヒト、カニクイザルおよびマウスリガンドについての選択ＣＴＬＡ−４バリアントおよびＦｃ融合フォーマットの野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）の一価親和性（Ｋｄ、ｎＭ）を以下に示す。
【０２５６】
【表５】
2015523328.tif 000008
【０２５７】
ヒト、カニクイザルおよびマウスリガンドについての選択ＣＴＬＡ−４バリアントの親和性の改善（Ｆｃ融合フォーマットの野生型ＣＴＬＡ−４を上回る倍の改善）を以下に示す。
【０２５８】
【表６】
2015523328.tif 000009
【０２５９】
生物学的活性アッセイにおいて試験される最も強力なバリアントであるこれらのバリアントは、ヒトＣＤ８６リガンドよりも大きいヒトＣＤ８０リガンドに対する親和性獲得を実証することが見出された（図６にまとめるとおり）。類似のパターンのＣＤ８６よりも大きいＣＤ８０親和性獲得は、カニクイザルリガンドを使用して観察された。
【０２６０】
実施例９．Ｆｃ突然変異を有する野生型ＣＴＬＡ−４の加速安定性試験
ＣＴＬＡ−４タンパク質の発現、精製および定量
Ｆｃバリアント１から４と融合している天然ＣＴＬＡ４細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを、ｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ）中にクローニングし、ＣＨＯ細胞中で発現させた。手短に述べると、１×１０６のＣＨＯＫ１ＳＶ細胞（Ｌｏｎｚａ）を、プログラムＵ−０２４および５ｍｃｇの線形化プラスミドＤＮＡを有するＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖを使用するｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（Ｌｏｎｚａ）により形質移入した。形質移入後、細胞をＣＤ−ＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１×ＧＳサプリメント、および５０μＭのＭＳＸ中で培養した。細胞は形質移入から約２週間後に成長し始め、そのとき、それらをタンパク質産生のために振とうフラスコ中に拡張させた。精製のため、Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ捕捉ステップから出発し、次いでＳｕｐｅｒＱアニオン交換ポリッシングステップを行い、次いでＳＥＣを行って凝集物を除去する一連のステップを使用した。タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．２中で貯蔵した。
【０２６１】
安定性試験
異なるＦｃバリアントに融合しているＣＴＬＡ−４分子に対して安定性試験を実施してそれらの安定性を比較し、最も安定なＦｃ構成を決定した。試験された分子は：ＣＴＬＡ−４Ｆｃバリアント−１（配列番号７）；ＣＴＬＡ−４Ｆｃバリアント−２（配列番号８）；ＣＴＬＡ−４Ｆｃバリアント−３（配列番号９）；およびＣＴＬＡ４Ｆｃバリアント−４（配列番号１０）を含んだ。Ｆｃバリアント−１（配列番号５７）、Ｆｃバリアント−２（配列番号５８）、Ｆｃバリアント−３（配列番号５９）およびＦｃバリアント−４（配列番号６０）についてＦｃ領域中のアミノ酸相違を図１Ｂで強調する。
【０２６２】
ＣＴＬＡ−４Ｆｃバリアント−１（配列番号７）は、改変ヒンジを有するＩｇＧ１Ｆｃ領域（配列番号５７）に融合している野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）を含むアバタセプト分子である。
【０２６３】
ＣＴＬＡ−４Ｆｃバリアント−２（配列番号８）は、Ｆｃ領域中でＹＴＥ突然変異を取り込むように改変されたアバタセプトであり、改変ヒンジおよびＹＴＥ突然変異を有するＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号５８）に融合している野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）を含む。
【０２６４】
ＣＴＬＡ−４Ｆｃバリアント−３（配列番号９）は、野生型ヒンジを含み、三重突然変異（ＴＭ）およびＹＴＥ突然変異をさらに含む、アバタセプト中で見られるＣ＞Ｓ突然変異が復帰しているＩｇＧ１Ｆｃ（配列番号５９）に融合している野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）を含む。
【０２６５】
ＣＴＬＡ−４Ｆｃバリアント−４（配列番号１０）は、ＹＴＥ突然変異および１１１位におけるプロリンを含むヒンジ領域突然変異を含むＩｇＧ４Ｆｃ（配列番号６０）に融合している野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）を含む。
【０２６６】
Ｓｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔナンバリングの１１１位は、図１に示される対応するＩｇＧ１配列の配列番号５６の残基１４、またはＩｇＧ４の全長定常領域中の残基２２８に対応する。この位置におけるセリンのプロリンへの突然変異の導入は、鎖間ジスルフィド相互作用を安定化し、したがってＩｇＧ４半分子の形成を最小化することが公知であり（Ａａｌｂｅｒｓｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０５（１）：９−１９  ２００２；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔ  Ｋｏｌｆｓｃｈｏｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０７（５８４４）：１５５４−７  ２００７；Ａｎｇａｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０（１）：１０５−８  １９９３；Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３８（１）：１−８  ２００１）、したがって、候補薬物開発に伴う困難を最小化する。さらに、このプロリン残基はＩｇＧ１の対応位置中で見出されるため、いかなる免疫原性の懸念も生じないと予期される。
【０２６７】
分子を液体形態で約１０ｍｇ／ｍＬにおいてＰＢＳ緩衝液中に入れた。Ａｍｉｃｏｎ  μｌｔｒａ遠心式フィルター、３０，０００ＭＷカットオフを使用して４つの分子を濃縮した。分子を標的容量が達成されるまで（３０〜６０分間）４２００ｇにおいて遠心分離した。濃度を標準的な抗体吸光係数１．４を使用して分光光度的に計測した。最終濃度を７１〜８５ｍｇ／ｍｌになるように計算した。この実施例において、抗体吸光係数１．４を使用したが、ポリペプチドの実際の吸光係数は、１．１により近いことが続いて決定された。したがって、これらの計算濃度は、実際に、９１〜１０８ｍｇ／ｍｌの濃度範囲を表す。所望により、超遠心を継続し、容量制限に供することにより高い濃度を達成することができる。
【０２６８】
それぞれのＦｃバリアントの試料を５℃および２５℃において１ヵ月インキュベートした。サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）は、４つの分子について分解率を決定し、比較するために使用される安定性を示すアッセイであった。ＳＥ−ＨＰＬＣは、ＳＯＰ  ＤＶ−９５２５に従って１ｍｌ／分の流量で実行した。ＨＰＬＣクロマトグラム中のモノマーピーク前に溶出する任意のピーク（モノマーの溶出時間未満の溶出時間を有する）を、凝集物ピークと命名する。ＨＰＬＣクロマトグラム中のモノマーピーク後に溶出する任意のピーク（モノマーの溶出時間よりも長い溶出時間を有する）を、断片ピークと命名する。凝集物および断片の総割合は、クロマトグラム中の全てのタンパク質ピークの総面積分率としての凝集物ピークおよび断片ピークの面積により決定する。インキュベーション前、ＳＥ−ＨＰＬＣを全ての試料に対して時点０のデータ点について実行した。その後、ＳＥ−ＨＰＬＣデータを、２５℃の安定性試験については毎週、５℃の安定性試験については２週間毎に回収した。両方の試験についての総持続時間は１ヵ月であった。１ヵ月データへの線形フィットを使用して計算された凝集、断片化および分解率を以下に示す。
【０２６９】
【表７】
2015523328.tif 000010
【０２７０】
【表８】
2015523328.tif 000011
【０２７１】
このデータに基づき、Ｆｃバリアント−３（配列番号５９）を、５℃および２５℃の両方における最小の純度損失率に基づく最適な融合相手として選択した。
【０２７２】
実施例１０．Ｆｃバリアント−３に融合しているＣＴＬＡ−４バリアントの加速安定性試験
Ｆｃバリアント−３（配列番号５９）に融合している最も強力なＣＴＬＡ−４バリアント分子の６つに対して安定性試験を実施して最も安定なＣＴＬＡ−４バリアントを決定した。このフォーマットで試験された分子は：バリアント１１１５（配列番号１５）、バリアント１２２７（配列番号１６）、バリアント１２９９（配列番号１３）、バリアント１３１５（配列番号１４）、バリアント１３２１（配列番号１２）、バリアント１３２２（配列番号１１）であった。
【０２７３】
分子を液体形態で約１０ｍｇ／ｍＬにおいてＰＢＳ緩衝液中に入れた。Ａｍｉｃｏｎ  μｌｔｒａ遠心式フィルター、３０，０００ＭＷカットオフを使用して６つの分子を濃縮した。分子を標的容量が達成されるまで（３０〜６０分間）４２００ｇにおいて遠心分離した。アミノ酸配列を使用して吸光係数を計算した。計算吸光係数は、１３１５および１３２１については１．１０；１１１５、１２２７、１２９９および１３２２については１．０９であった。適切な吸光係数を使用して濃度を計測した。最終濃度は９４．６〜１０１．６ｍｇ／ｍｌであった。
【０２７４】
安定性試験は、上記セクションに記載の同一の指針に従って５℃および２５℃において実施し、但し５℃の安定性試験について０および１ヵ月の時点のみで回収した。両方の試験についての総持続時間は１ヵ月であった。１ヵ月データへの線形フィットを使用して計算された凝集、断片化および分解率を以下に示す。
【０２７５】
【表９】
2015523328.tif 000012
【０２７６】
【表１０】
2015523328.tif 000013
【０２７７】
バリアント１２９９および１３２２は、１ヵ月にわたる５℃および２５℃試験の両方において最小の純度損失レベルを有することが見出された。したがって、安定性試験をバリアント１２９９および１３２２について５℃において６ヵ月まで延長した。月１回の時点から得られた結果を以下に示す。
【０２７８】
【表１１】
2015523328.tif 000014
【０２７９】
【表１２】
2015523328.tif 000015
【０２８０】
実施例１１．四価ＣＴＬＡ−４分子の構築
四価ＣＴＬＡ−４発現ベクターの設計および構築
ニトロフェノール結合ＩｇＧ  ＮＩＰ７４（重鎖配列番号１７；軽鎖配列番号１８）を足場として使用して、ＣＴＬＡ−４を抗体ＶＨおよびＶＬ鎖の両方のアミノ末端に融合することにより四価ＣＴＬＡ−４を産生した（図７Ａ）。２ステップＰＣＲ戦略を使用してＣＴＬＡ−４をＶＨおよびＶＬに融合し、次いでＰＣＲ産物を、抗体定常ドメインを含有するＩｇＧ発現ベクター中にサブクローニングすることにより発現構築物を産生した。一次ＰＣＲは、フレキシブルリンカーをＣＴＬＡ−４の３’末端ならびにＶＨおよびＶＬの５’末端において付加する遺伝子特異的プライマー（配列番号２１〜２８）によりＣＴＬＡ−４およびＩｇＧＶＨおよびＶＬを増幅させた。二次「プルスルー（ｐｕｌｌ−ｔｈｒｏｕｇｈ）」ＰＣＲは、相補的リンカー配列のアニーリングによりＣＴＬＡ−４をＶＨおよびＶＬの５’末端に結合させた。最終ＣＴＬＡ−４−ＶＨ構築物は、ＢｓｓＨＩＩを５’末端において、およびＢｓｔＥＩＩ部位を３’末端において導入するプライマー（配列番号２９〜３０）を使用して増幅させた。最終ＣＴＬＡ−４−ＶＬ構築物は、ＡｐａＬＩを５’末端において、およびＰａｃＩ部位を３’末端において導入するプライマー（配列番号３１〜３２）を使用して増幅させた。次いで、ＰＣＲ産物をそれぞれの制限酵素により消化してからそれらを予め消化されたＩｇＧ発現ベクター（ＣＴＬＡ−４−ＶＨカセットについてはｐＥＵ１．４、ＣＴＬＡ−４−ＶＬカセットについてはｐＥＵ３．４）中に直接ライゲートし、それを使用して化学的にコンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５−アルファ細胞を形質転換した。配列番号１９および２０に対応する正確なクローンを発現試験のために配列分析により同定した。
【０２８１】
テトラマーＣＴＬＡ−４の発現および精製
形質移入に要求されるプラスミド、ＣＴＬＡ−４重鎖融合物をコードするものおよびＣＴＬＡ−４軽鎖融合物をコードするものの両方について、単一コロニーを使用して１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１００ｍｌの２×ＴＹブロスに植菌した。培養物を、３７℃および３００ｒｐｍにおいて一晩（１６時間）インキュベートした。ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ；１２３６２）を製造業者の説明書に従って使用してプラスミドＤＮＡを細菌ペレットから単離した。形質移入の朝、ＣＨＯ細胞を、２５μＭのＬ−メチオニンスルホキシイミン（Ｓｉｇｍａ；Ｍ５３７９）を含有するＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１０７４３−０２９）中で１ｍｌ当たり１００万の細胞において播種した。細胞を５００ｍｌの容量で培養し、３７℃、１４０ｒｐｍ、８０％の湿度および５％のＣＯ２においてインキュベートした。形質移入のためのＤＮＡ−ＰＥＩ複合体を形成するため、２５０μｇのそれぞれのベクターを混合し、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で希釈して１ｍｌの最終容量で５００μｇのＤＮＡを得た。次いで、ＤＮＡを１ｍｌの５ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ；２３９６６）と混合し、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で希釈し、室温において１分間インキュベートした。次いで、ＤＮＡ−ＰＥＩミックスをＣＥＰ６培養物に慎重に添加し、次いでそれを２４時間インキュベートしてから１５０ｍｌのＣＤ−ＣＨＯ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｆｅｅｄ  Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ａ１０２４０）を添加した。次いで、培養物をさらに６日間インキュベートした。
【０２８２】
培養物を２０００ｇにおいて３０分間遠心分離し；次いで澄明化された培養物上清を５００ｍｌのＳｔｅｒｉｃｕｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；ＳＣＧＶＵ０５ＲＥ）に通して濾過した。澄明化された培養物上清からの四価ＣＴＬＡ−４の精製は、ＡｅＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ１０システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；２８−４０６２−６４）および親和性クロマトグラフィーに続くゲル濾過クロマトグラフィーを使用して実施した。５ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１１−００３４−９４）を、１０カラム容量のＤ−ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；１４０４０−１７４）により平衡化した。澄明化された培養物上清をカラム上に流してからカラムをさらなる１０カラム容量のＤ−ＰＢＳにより洗浄した。結合タンパク質を０．１Ｍのグリシン、ｐＨ２．７により溶出させ、１ｍｌのフラクションを回収した。それぞれのフラクションを１００μｌの１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ１０により中和し、溶出タンパク質を含有するフラクションをプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ、１０，０００ＭＷＣＯ濾過ユニット（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ；ＶＳ２００２）を製造業者の説明書に従って使用して２ｍｌに濃縮した。２ｍｌ濃縮試料を、Ｄ−ＰＢＳ中で平衡化されたＨｉＬｏａｄ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００、１６／６０ゲル濾過カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；１７−１０６９−０１）上にロードした。プロセス全体にわたり、１．２ｍｌのフラクションを回収した。正確な分子量の標的タンパク質を含有するフラクション（５６ｍｌの保持容量）をプールし、Ｖｉｖａｓｐｉｎ、１０，０００ＭＷＣＯ濾過ユニットを使用して１ｍｌに濃縮し、−８０℃において貯蔵した。
【０２８３】
精製されたテトラマーＣＴＬＡ−４を、Ｒａｊｉ−Ｊｕｒｋａｔ二重細胞アッセイにおいてＦｃ融合フォーマットの野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）とともにプロファイリングし、データを図８に示す。テトラマーＣＴＬＡ−４およびＦｃ融合フォーマットの野生型ＣＴＬＡ−４（配列番号３５）についてのこのアッセイにおけるＩＣ５０値は、それぞれ１．９３ｎＭおよび１１．３９ｎＭであった。このことは、ダイマーＦｃ融合フォーマットからテトラマーＩｇＧ様フォーマットへの変換時に５．９倍の効力の獲得を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015523328.tif 000024
2015523328.tif 000025