(57)【要約】  本発明は、１６００〜１７００ｃｍ−１を含むラマンスペクトル領域、９１０〜９８０ｃｍ−１を含むラマンスペクトル領域、７３０〜７６０ｃｍ−１を含むラマンスペクトル領域および／または３９０〜４５０ｃｍ−１を含むラマンスペクトル領域の少なくとも１つの少なくとも１つのスペクトル値を得ることを含んでなり、前記スペクトル値によって、アルツハイマー病の状態に関連するタンパク質構造の存在または非存在の指標を得ることができる、ヒト血液サンプル、好ましくは、ヒト血漿サンプルのラマン分光法による分析から、アルツハイマー病における全般的な認知低下と関連するタンパク質構造を決定するためのラマン分光法に関する。本発明は、さらに、１６００〜１７００ｃｍ−１を含む赤外線スペクトル領域、および／または１０００〜１１５０ｃｍ−１を含む赤外線スペクトル領域および／または１１４０〜１１９０ｃｍ−１を含む赤外線スペクトル領域の少なくとも１つのスペクトル値をさらに得ることによって、血液サンプルを赤外線分光法によって分析するための方法にも関する。場合により、ラマン分光法は、さらに、同じ血液サンプルの赤外線分光分析を含む。本発明は、さらに、血漿サンプルのラマンスペクトルおよび／または赤外線スペクトルを測定することを含む、アルツハイマー病を診断するための診断方法にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液サンプル中の、アルツハイマー病における認知低下と関連するタンパク質構造を決定するための振動分光法であって、
（ａ）前もって得たヒト血液サンプルのラマンスペクトルを記録する工程と；
（ｂ）以下のラマンスペクトル領域
Ｒ．１．  １６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．２．  ９１０〜９８０ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．３．  ７３０〜７６０ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．４．  ３９０〜４５０ｃｍ−１を含む領域
の少なくとも１つのラマンスペクトル値を得る工程であって、ここで前記スペクトル値が、バンド間ラマン強度比の値、前記スペクトル領域の面積値および／または周波数値から選択されるものである工程と；
（ｃ）血液サンプルを下記：
Ｉ．アルツハイマー病において認知低下以外と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル；
ＩＩ．アルツハイマー病において認知低下と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル
の分類の１つに分類する工程であって、当該分類が、工程ｂで得られたラマンスペクトル値と、分類ＩまたはＩＩを区別することができる参照スペクトル値とを比較することによって、または、工程ｂで得られたラマンスペクトル値と、分類Ｉおよび分類ＩＩの参照ラマンスペクトル値とを比較する多変量分析によって行われる工程
とを含んでなる、振動分光法。
【請求項２】
血液サンプル中の、アルツハイマー病における認知低下と関連するタンパク質構造を決定するための振動分光法であって、
（ａ）前もって得たヒト血液サンプルの赤外線スペクトルを記録する工程と；
（ｂ）以下の赤外線スペクトル領域
ＩＲ．１．  １６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域；
ＩＲ．２．  １０００〜１１５０ｃｍ−１を含む領域；
ＩＲ．３．  １１４０〜１１９０ｃｍ−１を含む領域；
の少なくとも１つの赤外線スペクトル値を得る工程であって、ここで前記赤外線スペクトル値が、前記スペクトル領域の面積値、前記スペクトル領域の強度比および／または前記スペクトル領域のバンド間面積の百分率値から選択されるものである工程と；
（ｃ）血液サンプルを下記：
Ｉ．アルツハイマー病において認知低下以外と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル；
ＩＩ．アルツハイマー病において認知低下と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル
の分類の１つに分類する工程であって、当該分類が、工程ｂで得られた赤外線スペクトル値と、分類ＩまたはＩＩを区別することができる参照赤外線スペクトル値とを比較することによって、または、工程ｂで得られた赤外線値と、分類Ｉまたは分類ＩＩの参照赤外線スペクトル値とを比較する多変量分析によって行われる工程
とを含んでなる、振動分光法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法を同じ被検体からのサンプルに適用する工程をさらに含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが、工程ｂで得られたスペクトル値と、分類Ｉおよび分類ＩＩの参照ラマン値、ならびに分類Ｉおよび分類ＩＩの参照赤外線スペクトル値とを比較するの多変量分析によって分類される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
振動分光法によって、血液サンプル中のアルツハイマー病における認知低下と関連するタンパク質構造を決定することを含んでなる、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れる被検体を特定するための方法であって、
（１）
（ａ）前もって得たヒト血液サンプルのラマンスペクトルを記録する工程と；
（ｂ）以下のラマンスペクトル領域
Ｒ．１．  １６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．２．  ９１０〜９８０ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．３．  ７３０〜７６０ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．４．  ３９０〜４５０ｃｍ−１を含む領域
の少なくとも１つのラマンスペクトル値を得る工程であって、前記スペクトル値が、バンド間ラマン強度比の値、前記スペクトル領域の面積値および／または周波数値から選択されるものである工程と；
（ｃ）血液サンプルを下記：
Ｉ．アルツハイマー病において認知低下以外と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル；
ＩＩ．アルツハイマー病において認知低下と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル
の分類の１つに分類する工程であって、当該分類が、工程ｂで得られたラマンスペクトル値と、分類ＩまたはＩＩを区別することができる参照スペクトル値とを比較することによって、または、工程ｂで得られたラマンスペクトル値と、分類Ｉおよび分類ＩＩの参照ラマンスペクトル値とを比較する多変量分析によって行われる工程と、および／または
（２）
（ａ）前もって得たヒト血液サンプルの赤外線スペクトルを記録する工程と；
（ｂ）以下の赤外線スペクトル領域
ＩＲ．１．  １６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域；
ＩＲ．２．  １０００〜１１５０ｃｍ−１を含む領域；
ＩＲ．３．  １１４０〜１１９０ｃｍ−１を含む領域；
の少なくとも１つの赤外線スペクトル値を得る工程であって、前記赤外線スペクトル値が、前記スペクトル領域の面積値、前記スペクトル領域の強度比および／または前記スペクトル領域のバンド間面積の百分率値から選択されるものである工程と；
（ｃ）血液サンプルを下記：
Ｉ．アルツハイマー病において認知低下以外と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル；
ＩＩ．アルツハイマー病において認知低下と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル
の分類の１つに分類する工程であって、当該分類が、工程ｅで得られた赤外線スペクトル値と、分類ＩまたはＩＩを区別することができる参照赤外線スペクトル値とを比較することによって、または、工程ｂで得られた赤外線値と、分類Ｉおよび分類ＩＩの参照赤外線スペクトル値とを比較する多変量分析によって行われる工程と
を含んでなり、
ここで、タンパク質構造を含有する血液サンプルが、アルツハイマー病の認知低下と関連する場合、前記被検体が、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れるものであることを示すとする、方法。
【請求項６】
アルツハイマー病を治療するのに適切な治療が、少なくとも１つのコリンエステラーゼ阻害剤および／またはＮ−メチル−Ｄ−アスパルテート受容体アンタゴニストを含むものである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記血液サンプルが血漿分画サンプルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ラマンスペクトルが、近赤外レーザー励起線を用いて記録される、請求項１、３〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｒ．１で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値が、１６７１ｃｍ−１および１６５８ｃｍ−１付近で得られるラマン強度比を含むか、または、１７２０〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンド領域に対し、１６６０ｃｍ−１および１６６２ｃｍ−１での第１の誘導体の平均を含み、前記Ｒ．４で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値が、４０９ｃｍ−１および４２３ｃｍ−１付近で得られるラマン強度比を含むか、または１７２０〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンドの領域に対し、４３０ｃｍ−１に第１の誘導体を含み、前記Ｒ．２で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値が、９１０〜９８０ｃｍ−１を含むラマンスペクトルプロフィールの領域を含み、および／または前記Ｒ．３で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値が、７５８ｃｍ−１付近のバンドの最大、７４０〜７５０ｃｍ−１領域に位置するバンドの最大で得られるラマン強度比、または７４０〜７５０ｃｍ−１のラマンスペクトル領域に含まれるバンドの周波数からなる群から選択されるものである、請求項１および３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＩＲ．１で定義される赤外線スペクトル領域のスペクトル値が、１６７０〜１６２３ｃｍ−１のアミドＩ領域に対し、第２の誘導体であらわされる１６４０〜１６２３ｃｍ−１のスペクトルプロフィール領域の百分率を含み、および／または前記ＩＲ．２で定義される赤外線スペクトル領域のスペクトル値が、３０１０〜２８００ｃｍ−１の領域の面積に対し、１１５０〜１０００ｃｍ−１のスペクトルプロフィールの面積の百分率を含み、および／または前記ＩＲ．３で定義される赤外線スペクトル領域のスペクトル値が、１１５６ｃｍ−１付近で得られる強度と、１１７１ｃｍ−１領域に位置するバンドの最大との比率を含むか、または、１１７０ｃｍ−１でのスペクトルプロフィールに対し、（Ｉ１１６０＋Ｉ１１６２＋Ｉ１１６５）／Ｉ１１７７に対応する絶対値を含み、ここで、Ｉ１１６０、Ｉ１１６２およびＩ１１６５は、それぞれ、１１６０、１１６２および１１６５ｃｍ−１でのスペクトルの第１の誘導体の絶対値であり、Ｉ１１７７は、１１７７ｃｍ−１に位置する最小の第１の誘導体の絶対値である、請求項２〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
工程ｂが、前記Ｒ．１、前記Ｒ．２、前記Ｒ．３および前記Ｒ．４で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値を得ることを含んでなり、工程ｃの分類が、前記スペクトル値と、分類Ｉの参照ラマンスペクトル値および分類ＩＩの参照ラマンスペクトル値との多変量分析比較を含み、ここで前記参照スペクトル値が、工程ｂで得られた値と比較される、請求項１、３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
工程ｂが、前記Ｒ．１、前記Ｒ．２、前記Ｒ．３および前記Ｒ．４で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値を得ること、前記ＩＲ．１、前記ＩＲ．２および前記ＩＲ．３で定義される赤外線スペクトル領域のスペクトル値を得ることとを含んでなり、工程ｃが、分類Ｉの参照ラマンスペクトル値、分類ＩＩの参照ラマンスペクトル値、分類Ｉの参照赤外線スペクトル値および分類ＩＩの参照赤外線スペクトル値との多変量分析比較によって前記スペクトル値を分類することを含んでなり、ここで前記参照スペクトル値が、工程ｂで得られた値と比較される、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
分類ＩＩの参照値が、
ＩＩ−ａ．  Ｒｅｉｓｂｅｒｇの認知低下スケールでＧＤＳ−３の値を有する、アルツハイマー病において軽度な認知低下に関連する血液サンプル、
ＩＩ−ｂ．  Ｒｅｉｓｂｅｒｇの認知低下スケールでＧＤＳ−４の値を有する、アルツハイマー病において軽度な認知低下に関連する血液サンプル、
ＩＩ−ｃ．  Ｒｅｉｓｂｅｒｇの認知低下スケールでＧＤＳ−５の値を有する、アルツハイマー病において軽度な認知低下に関連する血液サンプル、
ＩＩ−ｄ．  Ｒｅｉｓｂｅｒｇの認知低下スケールでＧＤＳ−６の値を有する、アルツハイマー病において軽度な認知低下に関連する血液サンプル、
ＩＩ−ｅ．  Ｒｅｉｓｂｅｒｇの認知低下スケールでＧＤＳ−７の値を有する、アルツハイマー病において軽度な認知低下に関連する血液サンプル
の副分類の血液サンプルの少なくとも１つの参照スペクトル値である、請求項１１または１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記参照スペクトル値が、請求項１または２の工程ａ〜ｂに記載したのと同じ条件で、分類Ｉおよび分類ＩＩで定義した参照血液サンプル、または分類Ｉで定義した参照血液サンプル、副分類ＩＩ−ａ、副分類ＩＩ−ｂ、副分類ＩＩ−ｃ、副分類ＩＩ−ｄおよび副分類ＩＩ−ｅで定義した参照血液サンプルから得られたものである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記多変量分析が、
独立変数として、
−工程ｂで得られたスペクトル値と、参照スペクトル値
を用い、
群分け変数として、
−分類Ｉおよび分類ＩＩの参照スペクトル値の指標となる変数
を用いた判別分析である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
血漿分画サンプルが、
（ａ）所定体積の血漿分画を乾燥するまで完全に蒸発させ、少なくとも１〜３ｍｇの前記分画の乾燥固体残渣を得て、前記分画の体積の蒸発が、低温よりも迅速に蒸発させるため、２〜２５℃、好ましくは１５〜２５℃の温度で行われ、
（ｂ）ＦＲ−ラマン分光法のための従来の小さな乳鉢を用いることによって、前記乾燥分画を集め、直径が２ｍｍの半円球型の中空部を有する円筒形アルミニウム皿に移すことを含む方法に従ってラマンスペクトルを記録するために調製される、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
血液サンプルの赤外線分光分析を含み、当該サンプルが、信頼性の高いスペクトルを得るために、工程ｈで得られた所定体積の分画をＺｎＳｅ結晶に広げ、血漿の場合の体積が、好ましくは、３〜７μＬであり、２〜２５℃、好ましくは１５〜２５℃の温度で乾燥するまで完全に蒸発させることを含む方法に従って調製されたものである、請求項７〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記血漿分画が、前もって得たヒト末梢血液サンプルから遠心分離−濾過血液分画によって得られたものである、請求項７〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
血液サンプル中のアルツハイマー病の状態の存在または非存在の指標を得るための請求項１〜４、７〜１８のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項２０】
被検体のアルツハイマー病を診断するための診断方法であって、
（ａ）前記被検体からの血漿サンプルのラマンスペクトルを測定し、β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびトリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドからなる群から選択される少なくとも１つのラマンバンドを得る工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られたラマンスペクトルと、参照サンプルのスペクトルとを比較する工程とを含んでなり、
ここで、前記参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するペプチド結合の角変形に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するα−らせんタンパク質構造に特異的な強度の減少の指標となるラマンスペクトルの変動、および／または参照スペクトルに対するタンパク質三次構造中のトリプトファン残基に特異的な振動の増加の指標となるラマンスペクトルの変動が、アルツハイマー病の患者であるとする指標となる、診断方法。
【請求項２１】
前記βシートタンパク質に特異的な振動を含むラマンバンドが約１６７１ｃｍ−１のバンドであり、前記ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むラマンバンドが約４０９ｃｍ−１のバンドであり、前記α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドが９８０〜９１０ｃｍ−１のスペクトルプロフィールによって定義されるものであり、および／または前記タンパク質三次構造中のトリプトファン残基に特異的な振動を含むラマンバンドが約７４０〜７５０ｃｍ−１領域のバンドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
−参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動が、１６７１ｃｍ−１および１６５８ｃｍ−１付近に位置する強度比の増加であり、
−参照スペクトルに対するタンパク質三次構造中のトリプトファン残基に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動が、ほぼ７５８ｃｍ−１に位置するバンドの最大の強度と、７４３ｃｍ−１付近に位置するバンドの強度との比率の増加、または７４０〜７５０ｃｍ−１範囲のバンドの周波数の増加であり、
−参照スペクトルに対するα−らせんタンパク質構造に特異的な強度の減少の指標となるラマンスペクトルの変動が、９８０〜９１０ｃｍ−１のスペクトルプロフィールの面積の減少であり、および／または
−参照スペクトルに対するペプチド結合の角変形に特異的な振動の増加の指標となるラマンスペクトルの変動が、４０９ｃｍ−１および４２３ｃｍ−１付近に位置するバンドの強度比の増加である、請求項２０〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
被検体のアルツハイマー病を診断するための診断方法であって、
（ａ）前記被検体からの血漿サンプルのＩＲスペクトルを測定し、β−タンパク質構造の存在に特異的な少なくとも１つのバンドおよび／または酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる少なくとも１つの特異的なバンドを得る工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られるＩＲスペクトルと、参照サンプルのスペクトルとを比較する工程とを含んでなり、
参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造の増加の指標となるＩＲスペクトルの変動、および／または参照スペクトルに対する酸化ストレス中にサンプル内で生成する化合物の濃度の増加の指標になるＩＲスペクトルの変動が、アルツハイマー病の患者であるとする指標となる、診断方法。
【請求項２４】
前記β−タンパク質構造の存在に特異的なバンドが約１６４０〜１６２３ｃｍ−１のバンドであり、および／または前記酸化工程中に生成する化合物の存在に特異的なバンドが、１１５０ｃｍ−１〜１０００ｃｍ−１のバンドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造の増加の指標となるＩＲスペクトルの変動が、１６４０〜１６２３ｃｍ−１の領域のスペクトルプロフィール面積の増加であり、および／または参照スペクトルに対する酸化ストレス中にサンプル内で生成する化合物の濃度の増加の指標になるＩＲスペクトルの変動が、１１５０ｃｍ−１〜１０００ｃｍ−１の領域のスペクトルプロフィール面積の増加である、請求項２３または２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記１６４０〜１６２３ｃｍ−１の領域のスペクトルプロフィール面積の増加が、１６７０〜１６２３ｃｍ−１のアミドＩ領域の面積に対する、第２の誘導体であらわされる１６４０〜１６２０ｃｍ−１の領域の面積の百分率として決定され、および／または前記酸化ストレス中に生成する化合物の濃度の増加が、３０１０ｃｍ−１〜２８００ｃｍ−１の領域の面積に対する、スペクトルの１１５０ｃｍ−１〜１０００ｃｍ−１の領域の面積の百分率として決定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法を同じ被検体からのサンプルに適用する工程をさらに含んでなる、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法が、ラマンスペクトルを測定し、β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびトリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドを得ることを含んでなり、
請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法が、ＩＲスペクトルを測定し、β−タンパク質構造の存在に特異的なバンドおよび酸化工程中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なバンドを得ることを含んでなり、
参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するペプチド結合の角変形に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するα−らせんタンパク質構造に特異的な強度の減少の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するタンパク質構造中のトリプトファン残基に特異的な強度の減少の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するβシートタンパク質構造の増加の指標となるＩＲスペクトルの変動、および参照スペクトルに対する酸化ストレス中にサンプル内で生成する化合物の濃度の増加の指標になるＩＲスペクトルの変動が、アルツハイマー病の患者であるとする指標となる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記血漿サンプルが、脱水した血漿である、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記参照サンプルが、コントロール患者から得られた血漿である、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記コントロール患者が、ＧＤＳスケールに従ってステージ１と分類される患者である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
血漿サンプル分析のための装置であって、
（ｉ）血漿サンプルを受け入れるための容器と、
（ｉｉ）ラマン分光計およびＩＲ分光計から選択される少なくとも１つの分光計と、
（ｉｉｉ）請求項２０〜３１のいずれか一項に記載の診断方法を実施するための手段を含むコンピュータシステムと
を含んでなる、装置。
【請求項３３】
ラマン分光計およびＩＲ分光計を含んでなる、請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
請求項２０〜３１のいずれか一項に記載の診断方法を行うのに適したコードを含んでなる、コンピュータプログラム。
【請求項３５】
請求項３４に記載のコンピュータプログラムを含んでなる、データ記憶媒体。
【請求項３６】
前記被検体が、請求項５〜１８のいずれか一項に記載の方法に従って選択される、被検体のアルツハイマー病を治療するのに使用するためのアルツハイマー病を治療するのに適切な治療法。
【請求項３７】
前記治療が、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニスト、抗β−アミロイド免疫治療、およびγ−セクレターゼ阻害剤からなる群から選択される、請求項３６に記載の使用のための治療法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、振動分光法（ＦＴ−ラマン、ＦＴ−赤外線またはＦＴ−赤外線と組み合わせたＦＴ−ラマン）によって血漿タンパク質を分析し、それによって、タンパク質の二次構造および三次構造と、アルツハイマー病（ＡＤ）における認知発達の相関関係の存在を示す新規方法に関し、本出願の主要な分野は、健康分野である。本発明は、特に、振動分光法に基づいてＡＤを診断するための診断方法に関し、この分光装置に関連する商業的な分野にとっても関心が高いだろう。
【背景技術】
【０００２】
認知症患者の数は、人口統計学上の変化および寿命の延長の結果として、２０００年には世界中で２５００万人であり、２０３０年には６３００万人まで増え、２０５０年には１億１４００万人まで増えると予想される。広範囲の複雑な神経変性障害が存在し、そのすべてが、これらの疾患の進行と関係するような最終的に神経細胞の死を引き起こす神経機能障害を特徴とする。アルツハイマー病（ＡＤ）は、最も一般的である。認知症患者の過半数がＡＤであると算出されており、この数は、２０年ごとに２倍になるだろう。神経変性認知症の臨床徴候は、脳の最も罹患した領域と関係があることが多く、組み合わせた病状の発生が一般的であり、初期段階での臨床症状は多くが似ている。さらに、１種類の病状が異なる認知結果を引き起こすことがあり、診断を困難なものにする。最初の臨床症状の発生より数十年前に、認知症を示す疾患の病的な変化が始まっているという証拠がある。ＡＤおよび他の認知症に効果的な治療を見つけるという挑戦は、可能な限り初期に発症前の変化を検出し、その病状（または複数の病状）を信頼性高く正確に特定することの探求と同等である。
【０００３】
従って、これらの考慮事項は、社会および健康系に対して多くの課題をはらんでおり、従って、適切な治療を投与し、その進行を正確に追うために、これらの疾患を初期に検出することができるバイオマーカーの研究が必要である。今日、ＡＤの最も効果的で決定的な診断は、検死解剖に限定されており、専門家が、認知症が存在するか否かを分析した後に切除によって臨床診断が行われ、認知症の原因を説明する症状および徴候は発見されていない。診断試験を開発するのに有用であり、結果が理論的に、または実際に得られる遺伝学、バイオマーカー検出／定量化、神経画像処理の３つの分野が存在する。これらのすべての系統は、非常に高価な場合があり、例えば、神経画像処理は、特定の成功が得られているが、診断に必要な信頼性および特異性が８０％を超える診断プロトコルはまだ得られていない。ＡＤには、最終的な死後診断および神経病理学的な変化の特性決定だけではなく、早期診断および患者の進行の追跡を含む多くの問題がある。これらすべての技術は、感度が高く、信頼性が高く、実行および繰り返しが容易であり、低コストな方法の開発を必要とする。
【０００４】
ＡＤの原因は知られていないが、ＡＤの最終的な神経変性段階を引き起こす「病的な１つ以上の事象の１つ以上のカスケード」に対する議論があり、疾患の指標となる可能なバイオマーカーを定義することができるように行われる退行過程について十分な知識が存在する。ＡＤの最も重要な病的な特徴の１つは、脳内の線維タンパク質の蓄積であり、この蓄積は、（神経外の）老人斑の生成および（神経細胞内の）神経原線維濃縮体の生成として表出し、その主要な成分は、Ａβ−アミロイドペプチドである。末梢血中のいくつかのアミロイドペプチドの濃度を実証している著者もおり、末梢血は、生体液を抽出するのが簡単であり、疾患の特定の段階または罹患するリスクと相関関係をとるのが簡単であり、特定の症例で予測的な値を有する（Ｇｒａｆｆ−Ｒａｄｆｏｒｄら、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６４、３５４−６２（２００７）；Ｂａｒａｎｏｗｓｋａ−Ｂｉｋら、Ｎｅｕｒｏ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２９、７５−７９（２００８）；Ｍｏｄｒｅｇｏら、Ａｍ．Ｊ．Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．Ｏｔｈｅｒ  Ｄｅｍｅｎ．２３、２８６−２９０（２００８））。他の研究において、酸化ストレス（遊離ラジカルまたは過酸化物化された大分子（脂質、タンパク質、血液細胞のＤＮＡ）またはラジカルを生成または中和する系（過酸化物ジスムターゼ酵素など）と関連する特定のバイオマーカーが、アルツハイマー患者の血液中で増加することがわかっている（Ｂａｌｄｅｉｒａｓら、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒｓ  Ｄｉｓ．１５、１１７−１２８（２００８）；Ｂｅｒｍｅｊｏら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｒｅｓ．４２、１６２−１７０（２００８）；Ｇｒｅｉｂｅｌｇｅｒら、Ｆｒｅｅ  Ｒａｄ．Ｒｅｓ．４２、６３３−６３８（２００８））。
【０００５】
多くの研究実験の診断技術の中で、振動分光法は、迅速であり、非侵襲性であり、比較的低コストであるという点で利点を有する。振動分光法は、これらの用途で有用な生体系の分子成分についての分析的情報および構造的情報も与える。生化学的変化として見出される脳組織中のスペクトル、アミロイドβペプチドの堆積、コレステロールおよび高リン酸化されたｔａｕタンパク質を測定する手段によって、ＡＤ診断にはラマン分光法が適用されてきた（Ａｒｃｈｅｒら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｐｔｉｃｓ（ＥＣＢＯ）、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ、２００７；Ｃｈｅｎら、Ａｐｐｌ．Ｏｐｔｉｃｓ  ４８、４７４３−４７４８（２００９））。しかし、この研究は、脳組織においてＡＤを検出するとき、この技術には特異性および感度がなく、さらにこの組織は、生体液を抽出するのが簡単であることが知られている末梢血ほど利用可能なものではない。さらに、脳組織で生じる変化は、必ず同様に末梢血で起こるとは言えない。
【０００６】
ＡＤ診断目的のために末梢血血小板を試験するために、ラマン分光法も使用されてきた（Ｃｈｅｎら、Ｌａｓｅｒ  Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．８、５４７−５５２（２０１１））。しかし、この論文には以下の欠点がある。
−６３３ｎｍ励起レーザー線の使用は、他の可視光スペクトルのレーザー線と同様に、対象サンプルのラマンスペクトルを少なくとも部分的に覆い隠す蛍光が生体物質から発生することがあり、その後の分析は役に立たなくなる。ラマン共鳴効果に起因して、可視光スペクトルレーザー線を用いたラマン励起は、着色した少量の血漿成分（カロチノイド、ビリルビン、ヘモグロビン）のバンドを大きく増大させる場合があり、この分画の主要な成分（タンパク質、脂質）を大きく覆い隠してしまうことがある。これらの着色した少量成分の含有量が一定しない場合、その後のラマンシグナルの強度も一定せず、従って、正しいサンプルの分類が複雑なものとなる。従って、診断目的のために、ほとんどのサンプルの蛍光の可能性を最低限にするフーリエ変換ラマン分光計（ＦＴ−ラマン分光計）に関連する近赤外での励起を有するもっと実用的なレーザーを使用することが必要である。Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｖｉｂｒａｔｉｏｎａｌ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＲｅｓｅａｒｃｈおよびＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）。Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、Ｅｎｇｌａｎｄ、２００７、３５３−３６２）。
−この論文においてラマン分光法によって分析された血小板サンプルはトランスジェニックマウスに由来し、この血小板サンプルのタンパク質は、ヒトタンパク質と同一ではない。従って、これらのげっ歯類の一連のＡＤにおける分析的な構造の変化は、本発明で示されたように、ヒトの末梢血で起こる変化とは異なる場合がある。さらに、上述の分光法による血小板研究のサンプル数は、非常に少なく（ＡＤマウス１０匹および健康なコントロール８匹）、現行のＡＤに罹患するトランスジェニックマウスモデルには、この疾患を有するヒトと完全に同等なものはない（ＷｉｓｎｉｅｗｓｋｉおよびＳｉｇｕｒｄｓｓｓｏｎ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １８０２、８４７−８５９（２０１０））。
【０００７】
次に、ＡＤを診断する目的のために、単核白血球の透過赤外線（ＩＲ）分光法も使用されてきた（Ｃａｒｍｏｎａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４０２、２０１５−２０２１（２０１２））。１つの診断パラメータとしてβ−シート構造の百分率を用い、得られた感度は、健康なコントロールの群に属するサンプルと、軽度、中等度および重度のＡＤの群に属するサンプルを分類するときに８０％に近い。しかし、この観点で、赤外線分光法のみでは、以下に記載し得るラマン分光法についての欠点を有する。室温で、乾燥サンプル中に水が少量見出される場合であっても、８５０ｃｍ−１未満でバックグラウンド吸収が生じ、対象サンプルの生体物質のバンドを覆い隠す。このことは、サンプル分析に利用可能なスペクトル範囲が、ラマンよりも赤外線で短いことを意味し、従って、得られる情報が少ない。さらに、高分子構造に固有の因子および分光法の選択規則の中で、赤外線は、タンパク質二次構造についての情報を得る技術であるが、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、シスチン／システインを含む側鎖の三次構造についての情報を得る技術ではないことを指摘しなければならない。
【０００８】
従って、アルツハイマー病と関連する認知低下と関係する血液のタンパク質構造および酸化ストレスパターンを見つけることができ、アルツハイマー病の状態をもっと正確に区別することができる分析技術を開発することが必要である。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、末梢血の血漿サンプルのラマン、赤外線またはラマン／赤外線による分析、およびアルツハイマー病の認知発達との相関関係に関する。実施例１および２に示すように、本発明の方法を行うために従来の血液サンプル分画が可能であり、これらの分画サンプルは、ヘパリン化された管に集められ、遠心分離処理される。約５０マイクロリットルの上澄みをサンプルホルダに置き、室温で約３０分間乾燥させる。均質化した後に得られる固体サンプルのラマンスペクトルを測定する。スペクトルを正規化し、ベースラインを補正し、その後、アミロイドβペプチドの生成によって生じるか、および／または一連のＡＤにおけるタンパク質の二次構造および三次構造の変化によって生じる分光パラメータ（周波数、バンド高さ比および面積）の変化を決定する。分光パラメータについて、その後、ＡＤ存在下または非存在下で特定のスペクトル領域との相関関係に基づく判別分析を行う。ラマン分光法におけるこれらの領域は、アミドＩ領域（１７００〜１６００ｃｍ−１）、９８０〜９１０ｃｍ−１を含む領域（α−らせんの典型的なＣ−Ｃ伸縮バンドを含む）、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造の７６０〜７３０ｃｍ−１領域、角変形の４５０〜３９０ｃｍ−１領域、３１００〜２８００ｃｍ−１を含むＣ−Ｈ伸縮領域である。赤外線分光法の適切な領域は、タンパク質構造についてはアミドＩ領域（１７００〜１６００ｃｍ−１）であり、酸化ストレスについては１１５０〜１０００ｃｍ−１を含む領域である。これらのスペクトル領域の分光パラメータの判別分析によって、健康な被検体またはＡＤ患者からの血漿サンプルを９０％を超える感度および特異性を有しつつ分類することができる。
【００１０】
一態様において、本発明は、血液サンプル中の、アルツハイマー病における認知低下と関連するタンパク質構造を決定するための振動分光法であって、
（ａ）前もって得たヒト血液サンプルのラマンスペクトルを記録する工程と；
（ｂ）以下のラマンスペクトル領域
Ｒ．１．  １６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．２．  ９１０〜９８０ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．３．  ７３０〜７６０ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．４．  ３９０〜４５０ｃｍ−１を含む領域
の少なくとも１つのラマンスペクトル値を得る工程であって、ここで前記スペクトル値が、バンド間ラマン強度比の値、前記スペクトル領域の面積値および／または周波数値から選択されるものである工程と；
（ｃ）血液サンプルを下記：
Ｉ．アルツハイマー病において認知低下以外と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル；
ＩＩ．アルツハイマー病において認知低下と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル
の分類の１つに分類する工程であって、当該分類が、工程ｂで得られたラマンスペクトル値と、分類ＩまたはＩＩを区別することができる参照スペクトル値とを比較することによって、または、工程ｂで得られたラマンスペクトル値と、分類Ｉおよび分類ＩＩの参照ラマンスペクトル値とを比較する多変量分析によって行われる工程
とを含んでなる、振動分光法に関する。
【００１１】
別の態様において、本発明は、血液サンプル中の、アルツハイマー病における認知低下と関連するタンパク質構造を決定するための振動分光法であって、
（ａ）前もって得たヒト血液サンプルの赤外線スペクトルを記録する工程と；
（ｂ）以下の赤外線スペクトル領域
ＩＲ．１．  １６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域；
ＩＲ．２．  １０００〜１１５０ｃｍ−１を含む領域；
ＩＲ．３．  １１４０〜１１９０ｃｍ−１を含む領域；
の少なくとも１つの赤外線スペクトル値を得る工程であって、ここで前記赤外線スペクトル値が、前記スペクトル領域の面積値、前記スペクトル領域の強度比および／または前記スペクトル領域のバンド間面積の百分率値から選択されるものである工程と；
（ｃ）血液サンプルを下記：
Ｉ．アルツハイマー病において認知低下以外と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル；
ＩＩ．アルツハイマー病において認知低下と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル
の分類の１つに分類する工程であって、当該分類が、工程ｂで得られた赤外線スペクトル値と、分類ＩまたはＩＩを区別することができる参照赤外線スペクトル値とを比較することによって、または、工程ｂで得られた赤外線値と、分類Ｉまたは分類ＩＩの参照赤外線スペクトル値とを比較する多変量分析によって行われる工程とを含んでなる、振動分光法に関する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、振動分光法によって、血液サンプル中のアルツハイマー病における認知低下と関連するタンパク質構造を決定することを含んでなる、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れる被検体を特定するための方法であって、
（１）
（ａ）前もって得たヒト血液サンプルのラマンスペクトルを記録する工程と；
（ｂ）以下のラマンスペクトル領域
Ｒ．１．  １６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．２．  ９１０〜９８０ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．３．  ７３０〜７６０ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．４．  ３９０〜４５０ｃｍ−１を含む領域
の少なくとも１つのラマンスペクトル値を得る工程であって、ここで前記スペクトル値が、バンド間ラマン強度比の値、前記スペクトル領域の面積値および／または周波数値から選択されるものである工程と；
（ｃ）血液サンプルを下記：
Ｉ．アルツハイマー病において認知低下以外と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル；
ＩＩ．アルツハイマー病において認知低下と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル
の分類の１つに分類する工程であって、当該分類が、工程ｂで得られたラマンスペクトル値と、分類ＩまたはＩＩを区別することができる参照スペクトル値とを比較することによって、または、工程ｂで得られたラマンスペクトル値と、分類Ｉおよび分類ＩＩの参照ラマンスペクトル値とを比較する多変量分析によって行われる工程と、および／または
（２）
（ａ）前もって得たヒト血液サンプルの赤外線スペクトルを記録する工程と；
（ｂ）以下の赤外線スペクトル領域
ＩＲ．１．  １６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域；
ＩＲ．２．  １０００〜１１５０ｃｍ−１を含む領域；
ＩＲ．３．  １１４０〜１１９０ｃｍ−１を含む領域；
の少なくとも１つの赤外線スペクトル値を得る工程であって、前記赤外線スペクトル値が、前記スペクトル領域の面積値、前記スペクトル領域の強度比および／または前記スペクトル領域のバンド間面積の百分率値から選択されるものである工程と；
（ｃ）血液サンプルを下記：
Ｉ．アルツハイマー病において認知低下以外と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル；
ＩＩ．アルツハイマー病において認知低下と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル
の分類の１つに分類する工程であって、当該分類が、工程ｅで得られた赤外線スペクトル値と、分類ＩまたはＩＩを区別することができる参照赤外線スペクトル値とを比較することによって、または、工程ｂで得られた赤外線値と、分類Ｉおよび分類ＩＩの参照赤外線スペクトル値とを比較する多変量分析によって行われる工程とを含んでなり、
ここで、タンパク質構造を含有する血液サンプルが、アルツハイマー病の認知低下と関連する場合、前記被検体が、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れるものであることを示すとすることの指標である、方法に関する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、血液サンプル中のアルツハイマー病の状態の存在または非存在の指標を得るための本発明の方法の使用に関する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、被検体のアルツハイマー病を診断するための診断方法であって、
（ａ）前記被検体からの血漿サンプルのラマンスペクトルを測定し、β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびトリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドからなる群から選択される少なくとも１つのラマンバンドを得る工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られたラマンスペクトルと、参照サンプルのスペクトルとを比較する工程とを含んでなり、
ここで、前記参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するペプチド結合の角変形に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するα−らせんタンパク質構造に特異的な強度の減少の指標となるラマンスペクトルの変動、および／または参照スペクトルに対するタンパク質三次構造中のトリプトファン残基に特異的な振動によって生成するラマンスペクトルの変動が、アルツハイマー病患者であるとする指標となる、診断方法に関する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、被検体のアルツハイマー病を診断するための診断方法であって、
（ａ）前記被検体からの血漿サンプルのＩＲスペクトルを測定し、β−タンパク質構造の存在に特異的な少なくとも１つのバンドおよび／または酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる少なくとも１つの特異的なバンドを得る工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られるＩＲスペクトルと、参照サンプルのスペクトルとを比較する工程とを含んでなり、
ここで、前記参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造の増加の指標となるＩＲスペクトルの変動および／または参照スペクトルに対する酸化ストレス中にサンプル内で生成する化合物の濃度の増加の指標になるＩＲスペクトルの変動が、アルツハイマー病の患者であるとする指標となる、診断方法に関する。
【００１６】
別の態様において、本発明は、血漿サンプル分析のための装置であって、
（ｉ）血漿サンプルを受け入れるための容器と、
（ｉｉ）ラマン分光計およびＩＲ分光計から選択される少なくとも１つの分光計と、
（ｉｉｉ）本発明の診断方法を実施するための手段を含むコンピュータシステムとを含んでなる、装置に関する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、本発明の診断方法を行うのに適したコードを含んでなる、コンピュータプログラムに関する。
【００１８】
別の態様において、本発明は、本発明のコンピュータプログラムを含むデータ記憶媒体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】健康なコントロール（ａ）、軽度（ｂ）、中等度（ｃ）および重度（ｄ）のＡＤ患者から得た末梢血の血漿の３６００〜３００ｃｍ−１領域のラマンスペクトルを示す。
【図２】健康なコントロール（−）、軽度（−−−）および中等度（・・・・・・）のＡＤから得た末梢血の血漿の１７２０〜１６００ｃｍ−１領域のラマンスペクトルを示す。
【図３】健康なコントロール（−）、軽度（−−−）および中等度（・・・・・・）のＡＤから得た末梢血の血漿の４５０〜３８０ｃｍ−１領域のラマンスペクトルを示す。
【図４】健康なコントロール（−）、軽度（−−−）、中等度（・・・・・・）および重度（−・−・−・）のＡＤから得た末梢血の血漿の１０００〜９００ｃｍ−１領域のラマンスペクトルを示す。
【図５】健康なコントロール（−）、軽度（−−−）、中等度（・・・・・・）および重度（−・−・−・）のＡＤから得た末梢血の血漿の７８０〜７２０ｃｍ−１領域のラマンスペクトルを示す。
【図６】老年期コントロールからの血漿（−）、中等度（−−−−−）ＡＤ患者からの血漿の赤外線スペクトルを示す。（Ａ）：アミドＩ領域。元々のスペクトル（上側）および第２の誘導体で発現するスペクトル（下側）。（Ｂ）：１１５０〜１０００ｃｍ−１の領域。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
アルツハイマー病における認知低下と関連するタンパク質構造を決定し、アルツハイマー病を診断するための方法
ＡＤの全体的な悪化を決定するための方法と、ＡＤを診断するための方法を得るときの問題は、本発明の実施例３〜６に示すように、タンパク質の二次構造および三次構造に関連するスペクトルパラメーターを与えるラマン分光法を、赤外線分光技術と組み合わせて分析に適用し、酸化ストレスに関連するさらなる情報をさらに与えることによって、本発明の方法によって解決した。
【００２１】
本発明は、β−シートタンパク質構造および酸化工程が、健康なコントロールから得られた血漿よりもＡＤ患者から得られた血漿で多く、一方、α−らせん構造の含有量が、健康なコントロールよりもＡＤ患者の方が少ないという知見に基づく。さらに、この疾患の全体的な悪化スケール（ＧＤＳ）と、１７００〜１６００ｃｍ−１（アミドＩ）および１１５０〜１０００ｃｍ−１の赤外線スペクトルプロフィール、アミドＩ（１７００〜１６００ｃｍ−１）領域、９８０〜９１０ｃｍ−１を含む領域（α−らせんの特徴的なＣ−Ｃ伸縮バンドを含む）、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造の７６０〜７３０ｃｍ−１領域、角変形の４５０〜３９０ｃｍ−１領域、および３１００〜２８００ｃｍ−１を含むＣ−Ｈ伸縮領域のラマンスペクトルプロフィールとに特定の相関関係がある。
【００２２】
すでに述べたように、ラマン分光法は、トリプトファン、フェニルアラニン、チロシン、シスチン／システインを含む側鎖のタンパク質の二次構造および三次構造に関する分析的な構造情報を与える。健康な被検体からの血漿サンプルとアルツハイマー病患者からの血漿サンプルの差異に起因する因子は、本発明に示されるように、アミドＩバンドだけではなく、トリプトファンの側鎖の三次構造に起因するバンド、およびラマン分光法では検出可能であるが、赤外線分光法では見えない５００ｃｍ−１未満に位置する他のバンドである。実際に、本発明の利点の１つは、初めて検出されたサンプルの分類のために、アミロイドβペプチドに起因し得る５００〜４００ｃｍ−１領域の新しいパラメータまたは分光マーカーからなることである。一方、赤外線分光法は、ＡＤに関連するアミドＩ領域のタンパク質構造および１１５０〜１０００ｃｍ−１の領域の酸化ストレスに関する情報も与える。
【００２３】
本発明の範囲において、認知低下スケール（本明細書でＧＤＳとも呼ばれる）は、アルツハイマー病の進行ステージを詳細に記述するために、Ｒｅｉｓｂｅｒｇによって定義される全体的な悪化スケール（Ｇｌｏｂａｌ  Ｄｅｔｅｒｉｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｃａｌｅ）に関する。このスケールは、７レベルからなり、本発明の範囲において、以下のように定義される。
−ＧＤＳ−１：認識低下がなく、正常な臨床段階の正常な個体に対応する。
−ＧＤＳ−２：非常に軽度の認識低下（主観的な認知低下）レベルと、物忘れの臨床段階を有する個体に対応する。
−ＧＤＳ−３：軽度の認識低下レベルと、初期の混乱の臨床段階を有する個体に対応する。
−ＧＤＳ−４：中等度の認識低下レベルと、後期混乱の臨床段階を有する個体に対応する。
−ＧＤＳ−５：中等度から重度の認識低下レベルと、初期認知症の臨床段階を有する個体に対応する。
−ＧＤＳ−６：重度の認識低下レベルと、軽度認知症の臨床段階を有する個体に対応する。
−ＧＤＳ−７：非常に重度の認識低下レベルと、重度認知症の臨床段階を有する個体に対応する。
【００２４】
本明細書の目的のために、ＧＤＳ−３ステージは、軽度アルツハイマー病（軽度ＡＤ）の発症レベルと考え、ＧＤＳ−４ステージおよびＧＤＳ−５ステージは、中等度アルツハイマー病（中等度ＡＤ）の進行レベルと考え、ＧＤＳ−６ステージおよびＧＤＳ−７ステージは、進行した、重篤または重度のアルツハイマー病（重度ＡＤ）のレベルと考える。
【００２５】
本発明の第１の態様は、振動分光法によって、血液サンプル中のアルツハイマー病における認知低下と関連するタンパク質構造を決定するための方法（本発明の第１の方法）であって、
（ａ）前もって得たヒト血液サンプルのラマンスペクトルを記録する工程と；
（ｂ）以下のラマンスペクトル領域
Ｒ．１．  １６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．２．  ９１０〜９８０ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．３．  ７３０〜７６０ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．４．  ３９０〜４５０ｃｍ−１を含む領域
の少なくとも１つのラマンスペクトル値を得る工程であって、ここで前記スペクトル値が、バンド間ラマン強度比の値、前記スペクトル領域の面積値および／または周波数値から選択されるものである工程と；
（ｃ）血液サンプルを下記：
Ｉ．アルツハイマー病において認知低下以外と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル；
ＩＩ．アルツハイマー病において認知低下と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル
の分類の１つに分類する工程であって、当該分類が、工程ｂで得られたラマンスペクトル値と、分類ＩまたはＩＩを区別することができる参照スペクトル値とを比較することによって、または、工程ｂで得られたラマンスペクトル値と、分類Ｉおよび分類ＩＩの参照ラマンスペクトル値とを比較する多変量分析によって行われる工程とを含んでなる、方法に関する。
【００２６】
本発明の範囲において、「ラマンスペクトル」という表現は、３９０〜１７００ｃｍ−１を含むスペクトル領域を含むラマンスペクトルを指し、このスペクトル領域を含むもっと広い範囲のスペクトル領域を有することができる。実際に、本願発明者らは、ＡＤの存在または非存在と相関関係がある３００〜３６００ｃｍ−１を含むスペクトル領域に、Ｒ．１〜Ｒ．４で定義される領域だけではなく、３１００〜２８００ｃｍ−１を含むＣ−Ｈ伸縮領域に対応するＲ．５領域を含む５つのスペクトル領域の存在を発見した。このような場合には、分析にＲ．５領域を含めるために、前記ラマンスペクトルが３９０〜３１００ｃｍ−１のスペクトル領域を含むと都合がよい。本発明に記載する方法を用いてより良い結果を得るために、血液サンプルに含まれる生体物質によってスペクトル中で生成し、対象サンプルのラマンスペクトルを少なくとも部分的に覆い隠す蛍光シグナルを除去することが都合がよい。可視光スペクトルにおいて、レーザー線を用いたラマン励起で生成するラマンスペクトルの蛍光は、使用するマイクロスペクトロメータを最適化することによって最低限にすることができるが、蛍光抑制は１００％にはなり得ない。従って、近赤外線励起を用いたレーザー線（例えば、１０６４ｎｍのネオジム−ＹＡＧレーザー線）を用いてスペクトルを得ることが都合がよい。さらに、近ＩＲレーザーを使用すると、タンパク質および脂質のスペクトルも覆い隠してしまいかねない着色した少量成分の有害なラマン共鳴がなくなる。
【００２７】
ラマンスペクトルを記録することを含む本発明の方法の特定の実施形態において、前記ラマンスペクトルは、近赤外線励起線を用いて記録される。
【００２８】
別の特定の実施形態において、本発明の第１の方法は、２つ以上の領域のスペクトル値の組み合わせを決定することを含む。
【００２９】
「スペクトル値」という用語は、本明細書で使用する場合、スペクトルから得ることができ、いくつかのスペクトルを比較するために用いることができる任意の測定可能なパラメータを指す。本発明に使用可能な適切なスペクトル値としては、限定されないが、強度比、周波数値およびピーク面積が挙げられる。
【００３０】
「面積」という用語は、本明細書で使用する場合、ピークに沿ってベースラインを描き、ピークに囲まれた面積を測定することによって計算することができるスペクトルのピークによって定義される面積を指す。ベースラインは、典型的には、スペクトルのピーク前後の点に基づいて描かれる。
【００３１】
「強度比」という用語は、所与の波長でのピーク強度を第２の波長でのピーク強度で割ったものを指す。
【００３２】
「周波数値」は、あるバンドを参照して本明細書で使用する場合、そのバンド内のピークの周波数を指す。
【００３３】
特定の実施形態において、本発明の第１の方法は、１６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域と、９１０〜９８０ｃｍ−１を含む領域；１６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域と、７３０〜７６０ｃｍ−１を含む領域；１６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域と、３９０〜４５０ｃｍ−１を含む領域；９１０〜９８０ｃｍ−１を含む領域と、７３０〜７６０ｃｍ−１を含む領域；９１０〜９８０ｃｍ−１を含む領域と、３９０〜４５０ｃｍ−１を含む領域；７３０〜７６０ｃｍ−１を含む領域と、３９０〜４５０ｃｍ−１を含む領域からなる群から選択される２つのラマンスペクトル領域の任意のいずれかの組み合わせのスペクトル値を決定することを含む。別の特定の実施形態において、本発明の第１の方法は、１６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域と、９１０〜９８０ｃｍ−１を含む領域と、７３０〜７６０ｃｍ−１を含む領域；１６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域と、９１０〜９８０ｃｍ−１を含む領域と、３９０〜４５０ｃｍ−１を含む領域；１６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域と、７３０〜７６０ｃｍ−１を含む領域と、３９０〜４５０ｃｍ−１を含む領域；９１０〜９８０ｃｍ−１を含む領域と、７３０〜７６０ｃｍ−１を含む領域と、３９０〜４５０ｃｍ−１を含む領域からなる群から選択される３つのラマンスペクトル領域の任意のいずれかの組み合わせのスペクトル値を決定することを含む。別の特定の実施形態において、本発明の第１の方法は、４つのラマンスペクトル領域、具体的には、１６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域と、９１０〜９８０ｃｍ−１を含む領域と、７３０〜７６０ｃｍ−１を含む領域と、３９０〜４５０ｃｍ−１を含む領域のラマンスペクトル値を得ることを含む。
【００３４】
本発明によれば、同じ血液サンプル、好ましくは、同じ血漿サンプルの相補的なＩＲ分光法試験は、ＩＲスペクトルのアミドＩ領域を分析することによって、アルツハイマー病における認知低下と関連するタンパク質構造の存在を決定するためのさらなる情報を与えることができる。さらに、前記ＩＲスペクトルは、１１５０〜１０００ｃｍ−１の領域、１１４０〜１１９０ｃｍ−１を含む領域の別のさらなるマーカーも与える。前記マーカーは、この疾患の全体的な悪化スケール（ＧＤＳ）との特定の相関関係を示し、ＡＤに関連する酸化ストレスに関係し、このマーカーの使用は、アルツハイマー病に関連するタンパク質構造の含有量に従ってサンプルを分類するために都合がよい。
【００３５】
別の態様において、本発明は、血液サンプル中の、アルツハイマー病における認知低下と関連するタンパク質構造を決定するための振動分光法（本発明の第２の方法）であって、
（ａ）前もって得たヒト血液サンプルの赤外線スペクトルを記録する工程と；
（ｂ）以下の赤外線スペクトル領域
ＩＲ．１．  １６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域；
ＩＲ．２．  １０００〜１１５０ｃｍ−１を含む領域；
ＩＲ．３．  １１４０〜１１９０ｃｍ−１を含む領域；
の少なくとも１つの赤外線スペクトル値を得る工程であって、ここで前記赤外線スペクトル値が、前記スペクトル領域の面積値、前記スペクトル領域の強度比および／または前記スペクトル領域のバンド間面積の百分率値から選択されるものである工程と；
（ｃ）血液サンプルを下記：
Ｉ．アルツハイマー病において認知低下以外と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル；
ＩＩ．アルツハイマー病において認知低下と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル
の分類の１つに分類する工程であって、当該分類が、工程ｂで得られた赤外線スペクトル値と、分類ＩまたはＩＩを区別することができる参照赤外線スペクトル値とを比較することによって、または、工程ｂで得られた赤外線値と、分類Ｉまたは分類ＩＩの参照赤外線スペクトル値とを比較する多変量分析によって行われる工程とを含んでなる、振動分光法に関する。
【００３６】
本発明の範囲において、「赤外線（ＩＲ）スペクトル」という表現は、１０００〜１１５０ｃｍ−１のスペクトル領域、１６００〜１７００ｃｍ−１のスペクトル領域および１１４０〜１１９０ｃｍ−１のスペクトル領域を含むＩＲスペクトルを指し、このスペクトルは、前記スペクトル領域を含むもっと広い範囲のスペクトル領域からなることができ、９１０〜１７００ｃｍ−１のスペクトル領域を少なくとも含むスペクトルが好ましい。
【００３７】
別の態様において、本発明は、本発明の第２の方法の工程をさらに含む、同じ被検体からのサンプルに適用される本発明の第１の方法に従う方法（本発明の第３の方法）に関する。本発明の第３の方法の特定の実施形態において、サンプルは、工程ｂで得られたスペクトル値と、分類Ｉおよび分類ＩＩの参照ラマン値および分類Ｉおよび分類ＩＩの参照赤外線スペクトル値との多変量分析によって分類される。
【００３８】
本発明の範囲において、「多変量分析比較」は、判別分析、クラスター分析およびニュートラルネットワーク構造分析の３つの代替的な方法のいずれかによる比較を指す。判別分析が、（本発明の２つの群についての）判断関数で構成されるモデルが、これらの群の良好な判断を可能にする予測変数の線形の組み合わせに基づくため、比較のための他の代替的な方法を用いて得られる結果よりも良好なサンプル分類結果を与えるので、判別分析による比較が好ましい。
【００３９】
当業者は、本発明の方法が、本発明の方法のラマンスペクトルを記録した後、または本発明の方法の赤外線スペクトルを記録した後に、好ましい実施形態において、本発明は、スペクトルのベースラインを補正することと、アミドＩバンドの面積に対して前記スペクトルを正規化することを想定することを理解するだろう。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「アミドＩバンド」は、主にポリペプチド骨格のカルボニル基の伸縮振動からなるペプチドおよびタンパク質のバンドを指す。アミドＩバンドは、それぞれのＣ＝Ｏ結合の振動周波数が、水素結合と、両アミド基の相互作用に依存し、両方とも二次構造に影響を与えるため、ポリペプチド骨格の二次構造の高感度マーカーである。
【００４１】
本発明で理解されるように、分析される血液サンプルは、すでに得られた（すなわち、被検体から前もって抽出した）ヒト血液サンプルであり、得るのが簡単なため、ヒト末梢血の血液サンプルが好ましい。ヒト血液は、細胞分画（血漿）および種々の細胞分画（例えば、赤血球、白血球）および血小板成分で構成され、分析すべき血液サンプルとして本発明の範囲で使用することができ、上述の分析方法をおこなうために血漿分画サンプルが好ましい。
【００４２】
本発明で理解されるように、「血漿」は、血液の液体成分を指し、血液の全体積の６０％をあらわし、赤血球と白血球を含まない。血漿分画は、得るのが簡単なため、血小板分画より好ましく、その上、血小板凝集または破裂現象に起因して血小板を得ることの困難性がよく知られているという事実もある。
【００４３】
本発明は、血小板を実質的に含まない血漿で行われてもよい。または、血小板を豊富に含む血漿サンプルが別の態様で好ましい。本明細書で使用される場合、「血小板を豊富に含む血漿」は、血小板を豊富に含む、一般的に、３００／μＬより多く、３５０，０００／μＬまでの血小板を含む血漿を指す。ＡｎｉｔｕａおよびＡｎｄｉａ、Ｐｕｅｓｔａ  ａｌ  Ｄｉａ  Ｐｕｂｌｉｃａｃｉｏｎｅｓ、２０００：１３−５５；Ｄｅ  Ｏｂａｒｒｉｏら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｅｎｔｉｃｓ  Ｒｅｓｔ  Ｄｅｎｔ  ２０００；２０：４８７−４９７およびＣａｍａｒｇｏおよびＬｅｃｋｏｖｉｃｓ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  Ｒｅｓ  ２００２；３７：３００−３０６；Ｏｋｕｄａら、Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２００３；７４：８４９−８５７ｙ  Ｋａｗａｓｅら、Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ２００３；７４：８５８−８６４）に記載される方法を含む当該技術分野で知られている種々の方法を、血小板を豊富に含む血漿を得るために使用することができる。種々の方法は、抗凝固剤を含む管に血液を得て、異なるプロトコルに従って異なる遠心分離条件にさらし、密度に基づいて血液を基本的な成分に分離し、血小板を豊富に含む血漿に対応する分画を選択することからなる。または、市販のキット、例えば、ＲｅｇｅｎＰＲＰ−Ｋｉｔ（ＲｅｇｅｎＬａｂ）を使用してもよい。
【００４４】
本発明によれば、分析すべき血漿分画を、標準的な血液分画工程のいずれか、例えば、遠心分離−濾過分画を用いてあらかじめ得ておいたヒト血液サンプル（好ましくは、ヒト末梢血）から前もって得てもよい。それにもかかわらず、ラマンスペクトルおよび／または赤外線スペクトルを得るために前もっての分画工程は必須ではないが、ＩＲスペクトルを記録すべきときにラマンスペクトルを記録すべき場合には、血漿分画サンプルは、おそらく別に調製されなければならないだろう。
【００４５】
実施形態の記録条件において、血漿分画サンプルは、
（ａ）所定体積の血漿分画を乾燥するまで完全に蒸発させ、少なくとも１〜３ｍｇの前記分画の乾燥固体残渣を得て、前記分画の体積の蒸発が、低温よりも迅速に蒸発させるため、２〜２５℃、好ましくは１５〜２５℃の温度で行われ、
（ｂ）ＦＲ−ラマン分光法のための従来の小さな乳鉢を用いることによって、前記乾燥分画を集め、直径が２ｍｍの半円球型の中空部を有する円筒形アルミニウム皿に移すことを含む方法に従ってラマンスペクトルを記録するために調製される。
【００４６】
一方、実施形態の記録条件において、血漿分画サンプルは、３〜７μＬの体積の血漿分画をＺｎＳｅ結晶に広げ、２〜２５℃、好ましくは１５〜２５℃の温度で乾燥するまで完全に蒸発させることを含む方法に従って赤外線スペクトルを記録するために調製された。
【００４７】
ラマンスペクトルまたは赤外線スペクトルを記録するために血漿分画サンプルが調製される場合、本発明の目的のためにサンプルの変化を観察することなく、２〜２５℃の温度で所定体積の前記分画を乾燥するまで蒸発させてもよい。蒸発は、好ましくは、迅速なサンプル蒸発の目的のために、１５〜２５℃で行われる（両端値を含む）。
【００４８】
一般的な様式および非限定的な様式において、分画していないヒト血液サンプルを最初に使用する場合、本発明のラマン分光分析に適切な血液分画サンプル（好ましくは、血漿サンプル）は、
ａ．前もって得たヒト末梢血液サンプルからの前記血液分画（好ましくは、血漿分画）を、一般的に使用される既知の遠心分離−濾過血液分画工程を用いて得る工程と；
ｂ．所定容積の前記分画（約４０μＬ）を乾燥するまで完全に蒸発させ、少なくとも１〜３ｍｇの前記分画の乾燥固体残渣を得て、前記分画の体積の蒸発が、比較的低温で、具体的には、２〜２５℃を含む温度範囲、より好ましくは１５〜２５℃を含む温度範囲（いずれも境界値を含む）の温度で行われる工程と；
ｃ．ＦＲ−ラマン分光法のための従来の小さな乳鉢を用いることによって、前記乾燥分画を集め、直径が２ｍｍの半円球型の中空部を有する円筒形アルミニウム皿に移すことを含む方法に従って、分光データを獲得する前に調製することができる。
【００４９】
本発明の方法が、血液サンプルのラマン分光分析に加え、血液サンプル（好ましくは、同じ血液の血漿サンプル）の赤外線分光分析も含む場合、血液サンプルまたは血漿サンプルは、分光データを獲得する前に、ＩＲスペクトルを記録するのに適した条件で調製されなければならない。非限定的な例によって、分画していないヒト血液サンプルが最初に用いられる場合、赤外線分光分析に適した血漿分画サンプルは、
（ａ）前もって得たヒト末梢血の血液サンプルからの前記血液分画（好ましくは、血漿分画）を、一般的に使用される既知の遠心分離−濾過血液分画工程を用いて得る工程と；
（ｂ）工程ａで得られた所定体積の分画をＺｎＳｅ結晶に広げ、信頼性の高いスペクトルを得て、血漿の場合の体積は、好ましくは、３〜７μＬであり、２〜２５℃、好ましくは１５〜２５℃の温度で乾燥するまで完全に蒸発させる工程とを含む方法に従って、前もって調製される。
【００５０】
本発明によれば、「ラマンスペクトル値」は、Ｒ．１〜Ｒ．４で定義される領域のいずれかのラマンスペクトルプロフィールから得られる値を指す。好ましいラマンスペクトル値としては、限定されないが、前記領域中で強度の大きな２つのバンド間のラマン強度比、前記スペクトル領域の２つの最小値の間に含まれる面積値、前記領域のバンドの１つの周波数値またはアミドＩバンドを用いてスペクトルを正規化した後に得られた２つの異なるピークでの第１の誘導体の平均が挙げられる。本願発明者らは、これらのバンドが、その強度と、全体的な悪化スケール（ＧＤＳ）との間に最も大きな差を有し、「約」１６７１、１６５８、９６０、９３８、７５８、７４３、４２３、４０９ｃｍ−１「のバンド」または１６７１、１６５８、９６０、９３８、７５８、７４３、４２３、４０９ｃｍ−１「付近に位置するバンド」であることを発見した。従って、これらのバンドの強度、またはこれらいずれかのバンドの２つの間に含まれるスペクトルプロフィールおよび同じスペクトル領域で囲まれる面積は、適切なスペクトル値であり得る。
【００５１】
上述の分光値またはパラメータの生化学的構造分析は、血液中に存在する種々の種類の生体分子に特徴的なスペクトルを用いて行われてきた（Ｄｅ  Ｇｅｌｄｅｒら、Ｊ．Ｒａｍａｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．  ３８、１１３３−１１４７（２００７）；Ｓｏｃｒａｔｅｓ、Ｉｎｆｒａｒｅｄ  ａｎｄ  Ｒａｍａｎ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  Ｇｒｏｕｐ  Ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ（第３版）。Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、２００１）。ＡＤ患者における１６７１ｃｍ−１および４０９ｃｍ−１の最も高いラマン強度（図２〜３）（好ましくは、１６７１ｃｍ−１および１６５８ｃｍ−１の強度比および４０９ｃｍ−１および４２３ｃｍ−１の強度比によって決定される）は、血液サンプルと同じスペクトル記録条件で本発明で測定したＡβ−４０アミロイドペプチドおよびＡβ−４２アミロイドペプチドのラマンスペクトルと比較することによって、群の周波数の考慮に起因して、β−シートタンパク質構造の生成に帰属することができる。一連のこの疾患における９８０〜９１０ｃｍ−１の面積の減少（図４）は、α−らせんタンパク質構造の減少という観点で解釈することができ、最終的には、７６０〜７４０ｃｍ−１のスペクトルプロフィールの変化（図５）（この範囲でのバンドの周波数として決定される）は、トリプトファンのこのスペクトル範囲で明確に示される特定のタンパク質の三次構造の変化に帰属することができる。
【００５２】
従って、好ましい実施形態において、
−スペクトル値が、１６７１ｃｍ−１および１６５８ｃｍ−１での強度間の比率である場合、サンプルが、参照サンプルに対し、増加したスペクトル値を示す場合、このサンプルはＡＤ患者に属すると考え、
−スペクトル値が、４０９ｃｍ−１および４２３ｃｍ−１での強度間の比率である場合、サンプルが、参照サンプルに対し、増加したスペクトル値を示す場合、このサンプルはＡＤ患者に属すると考え、
−スペクトル値が、９８０ｃｍ−１および９１０ｃｍ−１での強度間の比率である場合、サンプルが、参照サンプルに対し、減少したスペクトル値を示す場合、このサンプルはＡＤ患者に属すると考え、
−スペクトル値が、７６０〜７４０ｃｍ−１の間隔内のバンドの周波数である場合、サンプルが、参照サンプルに対し、増加したスペクトル値を示す場合、このサンプルはＡＤ患者に属すると考え、
−スペクトル値が、７５８ｃｍ−１〜７４３ｃｍ−１付近のバンドの強度比である場合、サンプルが、参照サンプルに対し、増加したスペクトル値を示す場合、このサンプルはＡＤ患者に属すると考え、
−スペクトル値が、１７２０〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンドの面積に対し、元々のスペクトルを正規化した後に得られた１６６０ｃｍ−１および１６６２ｃｍ−１での第１の誘導体の平均である場合、サンプルが、参照サンプルに対し、増加したスペクトル値を示す場合、このサンプルはＡＤ患者に属すると考え、
−スペクトル値が、１７２０〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンドの面積に対し、元々のスペクトルを正規化した後に得られた４３０ｃｍ−１での第１の誘導体の値である場合、サンプルが、参照サンプルに対し、増加したスペクトル値を示す場合、このサンプルはＡＤ患者に属すると考える。
【００５３】
同様に、本発明によれば、「赤外線スペクトル値」は、ＩＲ．１、ＩＲ．２およびＩＲ．３で定義される領域の１つの赤外線スペクトルプロフィールから得られた値、例えば、特に、例えば、前記領域のスペクトルプロフィールの要素のバンド面積の百分率、または前記領域のスペクトルプロフィールの正規化された面積を指す。すでに述べたように、アルツハイマー病における認知低下と関連するタンパク質構造を決定するときに、１６００〜１７００ｃｍ−１を含むスペクトル領域は、分析すべき血液サンプルのβ−ペプチド構造合計の含有量を指す情報を与え、さらに具体的には、１６２３〜１６４０ｃｍ−１に含まれるスペクトル領域の面積である。しかし、１０００〜１１５０ｃｍ−１を含むスペクトル領域は、ＡＤに関連する酸化ストレスのマーカーと関連し、アルツハイマー病における認知低下と関連するタンパク質構造を決定するときに分析すべき血液サンプルの良好な判断を得るのに役立つ。
【００５４】
従って、好ましい実施形態において、
−スペクトル値が、１６７０〜１６２３ｃｍ−１のアミドＩ領域に対し、１６４０〜１６２３ｃｍ−１のスペクトルプロフィール領域の百分率である場合、サンプルが、参照サンプルに対し、増加したスペクトル値を示す場合、このサンプルはＡＤ患者に属すると考え、
−スペクトル値が、３０１０〜２８００ｃｍ−１の領域に対し、１１５０〜１０００ｃｍ−１の領域の面積の百分率である場合、サンプルが、参照サンプルに対し、増加したスペクトル値を示す場合、このサンプルはＡＤ患者に属すると考え、
−スペクトル値が、１１５６ｃｍ−１付近のバンドの強度と、１１７１ｃｍ−１付近のバンドの強度との比率である場合、サンプルが、参照サンプルに対し、増加したスペクトル値を示す場合、このサンプルはＡＤ患者に属すると考え、
−スペクトル値が、１１７０ｃｍ−１でのスペクトルプロフィールに対し、（Ｉ１１６０＋Ｉ１１６２＋Ｉ１１６５）／Ｉ１１７７値であり、Ｉ１１６０、Ｉ１１６２およびＩ１１６５が、それぞれ、１１６０、１１６２および１１６５ｃｍ−１でのスペクトルの第１の誘導体の絶対値であり、Ｉ１１７７が、１１７７ｃｍ−１に位置する最小の第１の誘導体の絶対値である場合、サンプルが、参照サンプルに対し、増加したスペクトル値を示す場合、このサンプルはＡＤ患者における患者に属すると考える。
【００５５】
本発明の範囲において、「分類ＩまたはＩＩを区別することができるＲｉ領域の参照スペクトル値」という表現は、領域Ｒｉのスペクトル変数のためにＲＯＣ曲線を用いて得られるカットオフ値（最も高い感度および特異性に関連する）を指す。工程ｃの分類が、すでに定義した２つ以上のスペクトル領域（Ｒ．１〜Ｒ．４のラマン領域および／またはＩＲ．１，ＩＲ．２およびＩＲ．３の赤外線領域）を考慮した多変量分析を用いることによって行われる場合、参照スペクトル値は、対応する判断カットオフ点（Ｃ）、すなわち、２つの群ＩおよびＩＩの重心の平均値（ＤＩおよびＤＩＩ）を指し、それぞれの重心は、各群の各判断変数の平均についての判断スコア（判断関数値）である。言い換えると、群の重心は、その座標が各判断変数の群の平均である点である。サンプルｉの判断スコアＤｉが、絶対値でのＤｉ−ＤＩの差が絶対値でのＣ−ＤＩの差より小さいようなスコアである場合、このサンプルは、Ｉ群に属すると考えられ、それ以外は、ＩＩ群に属するだろう。
【００５６】
本発明によれば、適切なラマンスペクトル値は、以下のものであってもよい。
−１６７１ｃｍ−１付近および１６５８ｃｍ−１付近で得られるラマン強度比、
−１７２０〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンドの面積に対し、１６６０ｃｍ−１〜１６６２ｃｍ−１での第１の誘導体の平均、
−４０９ｃｍ−１付近および４２３ｃｍ−１付近で得られるラマン強度比、
−１７２０〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンドの面積に対し、４３０ｃｍ−１での第１の誘導体、
−９１０〜９８０ｃｍ−１を含むラマンスペクトルプロフィールの面積、
−７５８ｃｍ−１付近および７４３ｃｍ−１付近で得られるラマン強度比、または７４０〜７５０ｃｍ−１のラマンスペクトル領域に含まれるバンドの周波数。
【００５７】
本発明で使用するのに適した赤外線スペクトル値は、特に、
−好ましくは、アミドＩ赤外線領域で測定されるβ−シートタンパク質の面積の百分率、
−酸化ストレスに関連する１１５０〜１０００ｃｍ−１の赤外線スペクトルプロフィールの面積、
−１１５６ｃｍ−１付近で得られる強度と、１１７１ｃｍ−１領域に位置するバンドの最大との比率、
−１１７０ｃｍ−１でのスペクトルプロフィールに対し、（Ｉ１１６０＋Ｉ１１６２＋Ｉ１１６５）／Ｉ１１７７に対応する絶対値（ここで、Ｉ１１６０、Ｉ１１６２およびＩ１１６５は、それぞれ、１１６０、１１６２および１１６５ｃｍ−１でのスペクトルの第１の誘導体の絶対値であり、Ｉ１１７７は、１１７７ｃｍ−１に位置する最小の第１の誘導体の絶対値である）
である。
【００５８】
より良い結果を得るために、すでに述べた２つ以上のスペクトルを組み合わせることも可能である。
【００５９】
本発明の方法の好ましい実施形態において、前記方法が、本発明の第１の方法の工程ａ〜ｃを含むとともに、本発明の第１の方法の工程ａ〜ｃに加え、本発明の第２の方法の工程ａ〜ｃを含む場合、Ｒ．１で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値は、１６７１ｃｍ−１付近および１６５８ｃｍ−１付近に位置する強度比を含むか、または１７２０〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンドの面積に対し、１６６０ｃｍ−１〜１６６２ｃｍ−１での第１の誘導体の平均を含む。
【００６０】
本発明の範囲において、「ｃｍ−１で表現される周波数値ｖｉ付近のバンド」という表現は、ｖｉ±Ｘｃｍ−１によって決定される周波数範囲中に最大強度で得られる（ラマンまたはＩＲ）振動スペクトルバンドを指し、ここで、Ｘは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０またはこれらより大きい周波数値の変数である。好ましい実施形態において、Ｘは、値が２である。従って、１６５８ｃｍ−１の周波数値付近のバンドは、例えば、周波数値で表現される１６５６〜１６６０ｃｍ−１範囲中で得られる最大バンドを指す。本明細書において、この用語は、「ｃｍ−１で表現される約周波数値のバンド」とも呼ぶことができる。バンド周波数の±Ｘｃｍ−１の増加は、周波数測定の精度が異なる種々の分光計で測定可能な同じバンドの周波数範囲の振れ幅を定義するために示される。従って、本明細書であらわす周波数値ｖｉは、使用する分光計に依存して、その周波数値に関し、±Ｘｃｍ−１変動し得ることが理解されなければならない。
【００６１】
従って、「ｃｍ−１であらわされる周波数値ｖｉ付近に得られるラマン強度」という用語は、ｖｉ±Ｘｃｍ−１によって決定される周波数範囲に現れるバンドの最大で得られるラマンスペクトルの強度値を指すと理解すべきである。Ｘが２の値を有する場合には、１６７１ｃｍ−１の周波数値付近で得られるラマン強度は、１６６９ｃｍ−１〜１６７３ｃｍ−１を含む周波数範囲で得られる最大の強度値に対応する。同様に、「ｃｍ−１であらわされる周波数値ｖｉ付近に得られるＩＲ強度」は、ｖｉ±Ｘｃｍ−１によって決定される周波数範囲に現れるバンドの最大で得られるＩＲスペクトルの強度値を指す。
【００６２】
本発明の方法の好ましい実施形態において、前記方法が、本発明の第１の方法の工程ａ〜ｃを含むとともに、本発明の第１の方法の工程ａ〜ｃに加え、本発明の第２の方法の工程ａ〜ｃを含む場合、Ｒ．１で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値は、１６７１ｃｍ−１付近および１６５８ｃｍ−１付近で得られるラマン強度比を含むか、または、１７２０〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンドの面積に対し、１６６０ｃｍ−１〜１６６２ｃｍ−１での第１の誘導体の平均を含む。
【００６３】
本発明の方法の別の好ましい実施形態において、前記方法が、本発明の第１の方法の工程ａ〜ｃを含むとともに、本発明の第１の方法の工程ａ〜ｃに加え、本発明の第２の方法の工程ａ〜ｃを含む場合、Ｒ．４で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値は、４０９ｃｍ−１付近および４２３ｃｍ−１付近で得られるラマン強度比を含むか、または１７２０〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンドの面積に対し、４３０ｃｍ−１に第１の誘導体を含む。本発明の方法のさらに好ましい実施形態において、Ｒ．４で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値は、４０９ｃｍ−１付近および４２３ｃｍ−１付近で得られるラマン強度比を含むか、または１７２０〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンドの面積に対し、４３０ｃｍ−１に第１の誘導体を含み、Ｒ．１で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値は、１６７１ｃｍ−１および１６５８ｃｍ−１付近で得られるラマン強度比を含み、１７２０〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンドの面積に対し、１６６０ｃｍ−１〜１６６２ｃｍ−１での第１の誘導体の平均を含む。
【００６４】
本発明の方法の別の好ましい実施形態またはその以前の実施形態のいずれかにおいて、前記方法が、本発明の第１の方法の工程ａ〜ｃを含むとともに、本発明の第１の方法の工程ａ〜ｃに加え、本発明の第２の方法の工程ａ〜ｃを含む場合、Ｒ．２で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値は、９１０〜９８０ｃｍ−１を含むラマンスペクトルプロフィールの面積を含む。
【００６５】
本発明の方法の別の好ましい実施形態またはその以前の実施形態のいずれかにおいて、前記方法が、本発明の第１の方法の工程ａ〜ｃを含むとともに、本発明の第１の方法の工程ａ〜ｃに加え、本発明の第２の方法の工程ａ〜ｃを含む場合、Ｒ．３で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値は、７５８ｃｍ−１付近のバンドの最大および７４０〜７５０ｃｍ−１領域に位置するバンドの最大で得られるラマン強度の比率を含むか、または、７４０〜７５０ｃｍ−１のラマンスペクトル領域に含まれるバンドの周波数を含む。
【００６６】
この方法の好ましい実施形態において、前記方法が、本発明の第２の方法の工程ａ〜ｃを含む場合、ＩＲ．１で定義される赤外線スペクトル領域のスペクトル値は、第２の誘導体であらわされる１６４０〜１６２３ｃｍ−１のスペクトルプロフィールの面積の百分率を含む。
【００６７】
この方法の別の好ましい実施形態において、前記方法が、本発明の第２の方法の工程ａ〜ｃを含む場合、ＩＲ．２で定義される赤外線スペクトル領域のスペクトル値は、１１５０〜１０００ｃｍ−１のスペクトルプロフィールの面積の百分率を含む。本発明の第２の方法の工程ａ〜ｃを含む方法のもっと好ましい実施形態において、ＩＲ．２で定義される赤外線スペクトル領域のスペクトル値は、１１５０〜１０００ｃｍ−１のスペクトルプロフィールの面積の百分率を含み、ＩＲ．１で定義される赤外線スペクトル領域のスペクトル値は、さらに、第２の誘導体であらわされる１６４０〜１６２３ｃｍ−１のスペクトルプロフィールの面積の百分率を含む。
【００６８】
別の好ましい実施形態において、前記方法が、本発明の第２の方法の工程ａ〜ｃを含む場合、ＩＲ．３で定義される赤外線スペクトル領域のスペクトル値は、１１５６ｃｍ−１付近で得られる強度と、１１７１ｃｍ−１領域に位置するバンドの最大との比率を含むか、または、１１７０ｃｍ−１でのスペクトルプロフィールに対し、（Ｉ１１６０＋Ｉ１１６２＋Ｉ１１６５）／Ｉ１１７７に対応する絶対値を含む。Ｉ１１６０、Ｉ１１６２およびＩ１１６５は、それぞれ、１１６０、１１６２および１１６５ｃｍ−１での第１の誘導体を指し、Ｉ１１７７は、１１７７ｃｍ−１付近での第１の誘導体の絶対値を指す。このスペクトル値の決定は、水平のベースラインが、１１８５ｃｍ−１でのスペクトルを通過するように考慮し、約１１７０ｃｍ−１でのバンドによる元々のスペクトルの正規化を必要とする。
【００６９】
好ましい実施形態において、１６４０〜１６２３ｃｍ−１領域の面積の百分率は、１６４０〜１６２３ｃｍ−１のプロフィールの面積と１６７０〜１６２３ｃｍ−１のアミドＩバンドの面積との商に１００を掛け算することによって計算される。
【００７０】
好ましい実施形態において、領域の面積の百分率は、１１５０〜１０００ｃｍ−１のスペクトルプロフィール領域の指数との面積と、３０１０〜２８００ｃｍ−１のスペクトルプロフィールの面積との商に１００を掛け算することによって計算される。
【００７１】
本発明によれば、上に定義する方法は、第１の方法の工程ｂが、Ｒ．１で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値を得ることを含むように行うことができ、１６００〜１７００ｃｍ−１の領域の前記スペクトル値が、１６７１ｃｍ−１付近および１６５８ｃｍ−１付近で得られるラマン強度比である（つまり、言い換えると、１６５８ｃｍ−１付近のアミドＩバンドの高さに対し、正規化された１６７１ｃｍ−１付近のβ−タンパク質構造のバンドの高さである）場合に好ましい。従って、この値は、得られた分析すべき血液サンプルのβ−タンパク質構造の百分率に比例する相対的なラマン強度である。代替的な方法は、Ｇａｕｓｓｉａｎ関数の合計にアミドＩスペクトルプロフィールをフィッティングすることであり、この面積の百分率としてβ構造の百分率を決定する。しかし、１６７１ｃｍ−１付近のβ構造のラマンシグナルが弱く、入力した初期パラメータに依存するためにこのフィッティングがかなりの程度で主観的になるため、結果が固有値にならない場合があり、この従来のスペクトルプロフィールのフィッティング方法は、実際には、この研究にはうまく適用されなかった。または、Ｒ．１で定義されるラマンスペクトル領域は、１７２０〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンドの面積に対し、１６６０〜１６６２ｃｍ−１での第１の誘導体の平均を含む。
【００７２】
得られた試験血液サンプルのβ−ペプチド構造の百分率に比例する相対的なラマン強度は、上に定義したように、両分類の境界値として役立つ参照数値パラメータとの比較によって、前記サンプルを分類Ｉのまたは分類ＩＩに分類するための判別値として機能することができる。この境界値となる参照数値パラメータは、実験的な統計試験の結果である。特定の実施形態において、前記相対的なラマン強度が０．８５以下である場合、得られる試験血液サンプルは、分類Ｉ（認知低下なし）に属し、０．８５より大きい場合には、その血液サンプルは、分類ＩＩ（アルツハイマー病に関連する認知低下）に属する。このラマンスペクトルの分類によれば、約７０％程度の感度および特異性を有する結果が得られる。この感度は、この方法による分析を行った分類ＩＩのサンプルが、分類ＩＩの陽性の結果を生じる確率に関し、この百分率は、分類ＩＩのサンプルのヒット数と、分析した分類ＩＩのサンプルの合計数との商に１００を掛け算することによって計算される。特異性に関し、前記分析を行った分類Ｉのサンプルが、分類Ｉの結果および百分率を生じる確率に関し、この百分率は、分類Ｉのサンプルのヒット数と、分析した分類Ｉのサンプルの合計数との商に１００を掛け算することによって計算される。
【００７３】
もっと感度が高く、特異性が高い結果を達成するために、好ましい実施形態は、第１の方法の工程ｂが、Ｒ．１で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値を得ることに加え、Ｒ．２、Ｒ．３およびＲ．４で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値を得ることをさらに含み、前記スペクトル値が、本記載で上に定義したいずれかであってもよい、任意の改変または実施形態に本発明の方法を適用することを含む。この場合には、前記方法の工程ｃにおいて、分類は、前記スペクトル値と、分類Ｉの参照スペクトル値および分類ＩＩの参照スペクトル値との多変量分析比較（例えば、判別分析）によって得られ、この参照値は、工程ｂで得られた値と明らかに類似しているため、比較可能であり、すでに決定されている値であってもよい（例えば、本明細書で上に定義したような分光値のデータベースの一部を形成するか、または、本発明の方法等を用いた連続的な試験に含まれるように、前もって得られ、保存されていてもよい）。領域Ｒ．４の値（４０９／４２３ｃｍ−１の強度比）を導入することの重要な効果は、以下に述べるべきである判別分析によってサンプルを分類するときの感度および特異性に対する効果である。領域Ｒ．４の値を、領域Ｒ．１、Ｒ．２およびＲ．３で定義される他のスペクトル値に加えると、感度および特異性が、約８０％から、９０％を超える値まで上がる（実施例４および５を参照）。
【００７４】
任意の改変または実施形態で本発明の方法を行うことによって、さらに良い結果が得られるための別の可能性が得られ、工程ｂにおいて、Ｒ．１、Ｒ．２、Ｒ．３およびＲ．４で定義されるラマンスペクトル領域のスペクトル値を得ることと、ＩＲ．１、ＩＲ．２およびＩＲ．３で定義される赤外線スペクトル領域のスペクトル値を得ることと、工程ｃにおいて、前記スペクトル値（ラマンおよび赤外線）と、分類ＩおよびＩＩの参照スペクトルプロフィールスペクトル値および分類ＩおよびＩＩの参照赤外線スペクトル値との多変量分析比較によって分類することとを含んでなり、前記参照スペクトル値が、工程ｂで得られた値と比較される、前記方法からなる。判別分析に赤外線パラメータを組み込んでサンプルを分類するときの改善効果も指摘すべきである（実施例６および７を参照）。
【００７５】
本発明の方法を行うための上述の２つの可能性によれば、分類ＩＩの参照スペクトル値（この１つ以上の参照スペクトルプロフィールスペクトル値が、単独であるか、または１つ以上の参照赤外線スペクトル値と組み合わせたものであるかによらない）が、以下の副分類の少なくとも１つの参照スペクトル値を含むことが好ましい。
ＩＩ−ａ．  Ｒｅｉｓｂｅｒｇの認知低下スケールでＧＤＳ−３の値を有する、アルツハイマー病において軽度な認知低下に関連するタンパク質構造を含む血液サンプルに対応するスペクトル値、
ＩＩ−ｂ．  Ｒｅｉｓｂｅｒｇの認知低下スケールでＧＤＳ−４の値を有する、アルツハイマー病において軽度な認知低下に関連するタンパク質構造を含む血液サンプルに対応するスペクトル値、
ＩＩ−ｃ．  Ｒｅｉｓｂｅｒｇの認知低下スケールでＧＤＳ−５の値を有する、アルツハイマー病において軽度な認知低下に関連するタンパク質構造を含む血液サンプルに対応するスペクトル値、
ＩＩ−ｄ．  Ｒｅｉｓｂｅｒｇの認知低下スケールでＧＤＳ−６の値を有する、アルツハイマー病において軽度な認知低下に関連するタンパク質構造を含む血液サンプルに対応するスペクトル値、
ＩＩ−ｅ．  Ｒｅｉｓｂｅｒｇの認知低下スケールでＧＤＳ−７の値を有する、アルツハイマー病において軽度な認知低下に関連するタンパク質構造を含む血液サンプルに対応するスペクトル値。
【００７６】
本発明の方法の好ましい実施形態において、本発明の第１の方法および第２の方法の工程ｂに記載されるのと同じ条件で、分類Ｉおよび分類ＩＩで定義されるような参照血液サンプル、または分類Ｉ、副分類ＩＩ−ａ、副分類ＩＩ−ｂ、副分類ＩＩ−ｃ、副分類ＩＩ−ｄおよび副分類ＩＩ−ｅに定義されるような参照血液サンプルから、参照スペクトル値（任意の参照スペクトルプロフィールスペクトル値および任意の参照赤外線スペクトル値を含む）が得られる。
【００７７】
好ましい実施形態において、この方法が、多変量分析による工程ｃの分類を含む場合、この分析方法は、独立変数として、
−工程ｂで得られる１つ以上のスペクトル値と、参照スペクトル値（すなわち、得られた第１の血液サンプルのスペクトルの１６７１／１６５８、７５８／７４３、４０９／４２３ｃｍ−１の高さ比、７４０〜７５０ｃｍ−１範囲のバンドの周波数、アミドIバンドの面積に対し、正規化された９８０〜９１０ｃｍ−１のスペクトルプロフィールの面積）と、得られた各参照サンプルのスペクトルの１６７１／１６５８、７５８／７４３、４０９／４２３ｃｍ−１の高さ比、７４０〜７５０ｃｍ−１範囲のバンドの周波数、アミドIバンドの面積に対し、正規化された９８０〜９１０ｃｍ−１のスペクトルプロフィールの面積
を用い、群分け変数として、
−それぞれの分光参照値が属する分類Ｉおよび分類ＩＩの指標となる変数
を用いる、判別分析方法である。
【００７８】
本発明の範囲を限定せず、実施例によって、ラマン分光法を用いることによる本発明の方法は、以下
（１）遠心分離−濾過によって、末梢血の血漿分画を得る工程、
（２）固体状態でラマンスペクトルを測定するために室温で５０μＬの血漿を乾燥する工程、
（３）ラマンスペクトル測定、その後、（ａ）上述の分光パラメータを決定し、（ｂ）上述の認知状態の分類Ｉおよび分類ＩＩにサンプルを分類するための判別分析を行うための数学的処理
を含んでいてもよい。
【００７９】
同じ非限定的な様式において、一例として、ラマン振動分光法と赤外線振動分光法を組み合わせて使用することによる本発明の方法は、以下の工程を含んでいてもよい。
（１）遠心分離−濾過によって、末梢血の血漿分画を得る工程。
（２）固体状態でラマンスペクトルを測定するために、室温で５０μＬの血漿を乾燥させる工程。
（３）３〜７μＬの体積の血漿を円形のＺｎＳｅ結晶の上で赤外線分光法のために室温で乾燥させる工程。
（４）ラマンスペクトルおよび赤外線スペクトルを測定し、その後、（ａ）上述の分光パラメータを決定し、（ｂ）上述の認知状態の分類Ｉおよび分類ＩＩにサンプルを分類するための判別分析を行うために、スペクトルの数学的処理をする工程。
【００８０】
本発明の目的は、得られた血液サンプル中のアルツハイマー病の状態の存在または非存在の指標を、前記サンプルを本明細書で定義される分類または副分類に分類することに基づいて得るための判別分析に基づく方法である。従って、この方法によって分析される血液サンプルが分類Ｉに分類される場合、ＡＤが存在しない状態の指標である。同様の様式で、前記分光分析が、血液サンプルを分類ＩＩと分類する場合、または副分類ＩＩ−ａ、ＩＩ−ｂ、ＩＩ−ｃ、ＩＩ−ｄおよびＩＩ−ｅのいずれかに分類する場合、この分析は、ＡＤが存在する状態の指標である。従って、個体から前もって得た血液サンプルから、診断目的のために対象となる個体を評価する臨床目的のために、および／またはアルツハイマー病の個々の進行度を評価するために、本発明の方法を使用してもよい。
【００８１】
従って、本発明の別の態様は、ヒト血液サンプルの分析からアルツハイマー病の状態の存在または非存在の指標を得るための上に定義する本発明の方法に関し、この方法が、多変量分析を用いることによる工程ｃの比較を含むことが好ましい。言い換えると、この第２の態様は、前もって得たヒト血液サンプルの分析からアルツハイマー病の状態の存在または非存在の指標を得るための本発明の方法の使用に関する。
【００８２】
別の態様において、本発明は、ヒト血液サンプルの分析から、アルツハイマー病に関連する認知低下の程度の指標を得るための工程ｃの多変量分析比較を含む本発明の方法を指す。
【００８３】
別の態様において、本発明は、アルツハイマー病を診断するか、またはアルツハイマー病に関連する認知低下を決定するための診断方法（第１の診断方法）であって、
（ａ）前記被検体からの血漿サンプルのラマンスペクトルを測定し、β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびトリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドからなる群から選択される少なくとも１つのラマンバンドを得る工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られたラマンスペクトルと、参照サンプルのスペクトルとを比較する工程とを含んでなり、
ここで、前記参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するペプチド結合の角変形に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するα−らせんタンパク質構造に特異的な強度の減少の指標となるラマンスペクトルの変動、および／または参照スペクトルに対するタンパク質三次構造中のトリプトファン残基に特異的な振動の増加の指標となるラマンスペクトルの変動が、アルツハイマー病患者であるとする指標となる、診断方法に関するか、または、アルツハイマー病に関連する認知低下を患う患者の指標である。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「診断方法」は、被検体が疾患（この場合には、アルツハイマー病）に罹患する確率を評価することを指す。当業者が理解するように、このような評価が、１００％正しいことが好ましいとはいえ、診断すべき被検体の１００％について正しくなくてもよい。しかし、この用語は、この疾患を患う被検体またはこの疾患を患いやすい傾向がある被検体の統計的に有意な部分を特定することができる必要がある。当業者は、種々のよく知られた統計学的評価ツールを用い、例えば、信頼区間を決定すること、ｐ値を決定すること、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定などによって、ある部分に統計学的有意性があるかどうかを決定することができる。このようなツールに関する情報および詳細は、ＤｏｗｄｙおよびＷｅａｄｅｎ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８３中に見出すことができる。好ましい信頼区間は、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％である。ｐ値は、好ましくは、０．０５、０．０２５、０．００１、またはこれより小さい。
【００８５】
「β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド」は、単色光線が当たったときにβ−タンパク質構造によって生成する光子の非弾性散乱の表出であると理解される。「β−タンパク質構造」は、同じタンパク質の２個のアミノ酸鎖を平行に配置することによって作られる構造を指し、この鎖の１つのＮ−Ｈ基が、反対側の鎖のＣ＝Ｏ基と水素結合を形成する。平行な鎖（アミノ基からカルボキシル基に向かう鎖）と、平行ではない鎖（アミノ基からカルボキシル基に向かい、別のカルボキシル基からアミノ基に向かう鎖）の２種類がある。Ｎ−Ｈと隣接する鎖のＣ＝Ｏの水素架橋は、両方の値がもっと大きい平行ではないβシートの場合を除き、長さ（Ｈ・・・Ｏ）が約０．１７〜０．１８ｎｍであり、角度（Ｃ＝ＯとＮ−Ｈ）が約５〜１０°である。
【００８６】
本発明の「ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド」は、単色光線が当たったときにペプチド結合の角変形によって生成する光子の非弾性散乱の表出であると理解される。本明細書で使用される場合、「ペプチド結合の角変形」は、結合軸の外側の原子の移動を指す。移動する原子に従って、種々の種類の変形が存在するが、一般的に、ＮＣ結合の周囲の回転があり、完全な（０°）またはｔｒａｎｓ（１８０°）のｃｉｓ  ω角度の変動を生じる。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド」は、単色光線が当たったときにα−らせんタンパク質の構造によって生成する光子の非弾性散乱の表出を指す。本明細書で使用される場合、「α−らせんタンパク質構造」は、１回転あたり約３．６個のアミノ酸の右回りらせん構造の配置によって作られる構造を指す。それぞれのアミノ酸は、らせんの約１００℃の回転を伴い、２つの連続したアミノ酸のＣαは、１．５Å離れている。このらせんは、密に充填されており、その結果、らせんの中に自由空間は事実上存在しない。すべてのアミノ酸側鎖がらせんの外側に向かって配置されている。α−らせんの最も定義されている特徴の１つは、ペプチド結合のＮ−Ｈと、ペプチド結合ｉ＋４のＣ＝Ｏとの水素結合（ｉ→ｉ＋４）の存在である。標準的なα−らせんについて、この水素架橋は、長さ（Ｈ・・・Ｏ）が約０．１８ｎｍであり、角度（Ｎ−ＨとＣ＝Ｏ）が約３°である。
【００８８】
本発明によれば、「トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンド」は、単色光線が当たったときに、タンパク質の三次構造中のトリプトファン残基によって作られる光子の非弾性散乱の表出を指す。本明細書で使用される場合、「トリプトファン」は、疎水性非極性アミノ酸に分類されるＣＡＳ番号７３−２２−３のアミノ酸を指す。
【００８９】
特定の実施形態において、診断方法は、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドと、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド；
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドと、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド；
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドと、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンド；
−ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンドと、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド；
−ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンドと、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンド；
−α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドと、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンド
からなる群から選択される２つのラマンバンドの任意の１つの組み合わせを得ることを含む。
【００９０】
別の特定の実施形態において、本発明の診断方法は、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドと、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンドと、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド；
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドと、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンドと、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンド；
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドと、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドと、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンド；
−ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンドと、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドと、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンド
からなる群から選択される３つのラマンバンドの任意の１つの組み合わせを得ることを含む。
【００９１】
別の特定の実施形態において、本発明の診断方法は、β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドと、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンドと、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドと、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドとを得ることを含む。
【００９２】
本発明の診断方法の特定の実施形態において、βシートタンパク質に特異的な振動を含むラマンバンドは、１６７１ｃｍ−１付近のバンドである。別の特定の実施形態において、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むラマンバンドは、４０９ｃｍ−１付近のバンドである。別の特定の実施形態において、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドは、９８０〜９１０ｃｍ−１のスペクトルプロフィールによって定義される。別の特定の実施形態において、タンパク質三次構造中のトリプトファン残基に特異的な振動を含むラマンバンドは、７５８ｃｍ−１付近のバンドおよび／または７４０〜７５０ｃｍ−１領域付近のバンドである。
【００９３】
本発明の診断方法の特定の実施形態において、参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動は、１６７１ｃｍ−１および１６５８ｃｍ−１付近に位置する強度間の比率の増加である。本発明の診断方法の別の実施形態において、参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動は、１６６０ｃｍ−１および１６６２ｃｍ−１での第１の誘導体の平均の増加であり、好ましくは、１７２０〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンドの面積に対してスペクトルを正規化した後に得られる。
【００９４】
別の特定の実施形態において、参照スペクトルに対するタンパク質三次構造中のトリプトファン残基に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動は、７５８ｃｍ−１付近に位置するバンド最大の強度の増加、７４０〜７５０ｃｍ−１のスペクトル範囲に位置するバンドの周波数の増加からなる群から選択される。
【００９５】
別の特定の実施形態において、参照スペクトルに対するα−らせんタンパク質構造に特異的な強度の減少の指標となるラマンスペクトルの変動は、９８０〜９１０ｃｍ−１のスペクトルプロフィールの面積の減少である。
【００９６】
別の特定の実施形態において、参照スペクトルに対するペプチド結合の角変形に特異的な振動の増加の指標となるラマンスペクトルの変動は、４０９ｃｍ−１および４２３ｃｍ−１付近に位置するバンドの強度比の増加である。別の特定の実施形態において、参照スペクトルに対するペプチド結合の角変形に特異的な振動の増加の指標となるラマンスペクトルの変動は、好ましくは、１７２０ｃｍ−１〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンドを用いて元々のスペクトルを正規化した後に得られる４３０ｃｍ−１での第１の誘導体の値の増加である。
【００９７】
本発明の診断方法の特定の実施形態において、ラマンスペクトルは、近赤外レーザー励起線を用いて記録される。
【００９８】
別の態様において、本発明は、被検体のアルツハイマー病を診断するための診断方法（第２の診断方法）であって、
（ａ）前記被検体からの血漿サンプルのＩＲスペクトルを測定し、β−タンパク質構造の存在に特異的な少なくとも１つのバンドおよび／または酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる少なくとも１つの特異的なバンドを得る工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られるＩＲスペクトルと、参照サンプルのスペクトルとを比較する工程とを含んでなり、
ここで、前記参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造の増加の指標となるＩＲスペクトルの変動および／または参照スペクトルに対する酸化ストレス中にサンプル内で生成する化合物の濃度の増加の指標になるＩＲスペクトルの変動が、アルツハイマー病の患者であるとする指標となる、診断方法に関する。
【００９９】
ＩＲスペクトルに関し、「β−タンパク質構造の存在に特異的なバンド」は、β−タンパク質構造による赤外線吸収の表出を指す。「β−タンパク質構造」という用語は、第１の診断方法に関連して上に定義した。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「酸化工程中に生成する化合物の存在に特異的なバンド」は、赤外線が当たったときに、反応性酸素種の生成と、生体系が反応性酸素種を解毒する能力との不均衡の状態で生成する化合物による赤外線吸収の表出を指す。本明細書で使用される場合、「反応性酸素種」は、不対電子の層の存在に起因して反応性が高い酸素イオン、遊離ラジカル、有機過酸化物および無機過酸化物を指す。
【０１０１】
本発明の第２の診断方法の特定の実施形態において、前記方法は、前記被検体からの血漿サンプルのＩＲスペクトルを測定し、β−タンパク質構造の存在に特異的なバンドおよび酸化工程中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なバンドを得ることを含む。
【０１０２】
本発明の第２の診断方法の特定の実施形態において、β−タンパク質構造の存在に特異的なバンドは、１６４０〜１６２３ｃｍ−１付近のバンドである。別の特定の実施形態において、参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造の増加の指標となるＩＲスペクトルの変動は、１６４０〜１６２０ｃｍ−１の領域のスペクトルプロフィール面積の増加であり、さらに特定的には、この増加は、第２の誘導体であらわされる１６４０〜１６２０ｃｍ−１の領域の面積の百分率として決定される。１６４０〜１６２３ｃｍ−１の領域の面積の百分率を計算するために、１６４０〜１６２３ｃｍ−１プロフィールの面積と、１６７０〜１６２３ｃｍ−１のアミドＩバンドの面積との商に１００を掛け算する。
【０１０３】
別の特定の実施形態において、酸化ストレス中に生成する化合物の存在に特異的なバンドは、１１５０ｃｍ−１〜１０００ｃｍ−１のバンドである。本発明の第２の診断方法の別の特定の実施形態において、参照スペクトルに対する酸化ストレス中にサンプル内で生成する化合物の濃度の増加の指標になるＩＲスペクトルの変動は、１１５０ｃｍ−１〜１０００ｃｍ−１の領域のスペクトルプロフィール面積の増加である。特定のさらなる実施形態において、この増加は、３０１０〜２８００ｃｍ−１の領域の面積に対して正規化される。１１５０ｃｍ−１〜１０００ｃｍ−１のスペクトルプロフィールの面積の百分率を計算するために、３０１０〜２８００ｃｍ−１のスペクトルプロフィールの面積として値１００を使用する。
【０１０４】
本発明の第２の診断方法の別の特定の実施形態において、参照スペクトルに対する酸化ストレス中にサンプル内で生成する化合物の濃度の増加の指標になるＩＲスペクトルの変動は、１１５６ｃｍ−１付近のバンドと、１１７１ｃｍ−１付近のバンドとの強度比の増加である。
【０１０５】
本発明の第２の診断方法の別の特定の実施形態において、参照スペクトルに対する酸化ストレス中にサンプル内で生成する化合物の濃度の増加の指標になるＩＲスペクトルの変動は、１１７０ｃｍ−１でのスペクトルプロフィールに対し、式（Ｉ１１６０＋Ｉ１１６２＋Ｉ１１６５）／Ｉ１１７７に従って決定された値の増加であり、ここで、Ｉ１１６０、Ｉ１１６２およびＩ１１６５は、それぞれ、１１６０、１１６２および１１６５ｃｍ−１でのスペクトルの第１の誘導体の絶対値であり、Ｉ１１７７は、１１７７ｃｍ−１に位置する最小の第１の誘導体の絶対値である。
【０１０６】
別の態様において、本発明の第１の診断方法は、本発明の第２の方法を同じ被検体からのサンプルに適用する工程をさらに含む。特定の実施形態において、本発明の第１の診断方法は、β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびトリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドからなる群から選択される少なくとも１つのラマンバンドを得ることを含んでなり、
本発明の第２の診断方法は、ＩＲスペクトルを測定し、β−タンパク質構造の存在に特異的なバンドおよび酸化工程中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なバンドを得ることを含んでなり、
ここで、前記参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するペプチド結合の角変形に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するα−らせんタンパク質構造に特異的な強度の減少の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するタンパク質三次構造中のトリプトファン残基に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するβシートタンパク質構造の増加の指標となるＩＲスペクトルの変動および参照スペクトルに対する酸化ストレス中にサンプル内で生成する化合物の濃度の増加の指標になるＩＲスペクトルの変動は、アルツハイマー病の患者であるとする指標となる。
【０１０７】
従って、好ましい実施形態において、本発明の診断方法は、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびβ−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンドおよびβ−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、
−ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびβ−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、
−α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびβ−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、
−トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド
からなる群から選択される２つのスペクトルバンドを決定することを含む。
【０１０８】
好ましい実施形態において、本発明の診断方法は、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンドおよびβ−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびβ−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびβ−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、β−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびβ−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、
−ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびβ−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、
−ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、β−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびβ−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、
−α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、β−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンド、β−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド
からなる群から選択される３つのスペクトルバンドを決定することを含む。
【０１０９】
好ましい実施形態において、本発明の診断方法は、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびβ−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびβ−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、β−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびβ−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、β−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンド、β−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびβ−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、
−ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、β−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンド、β−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンド、β−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド
からなる群から選択される３つのスペクトルバンドを決定することを含む。
【０１１０】
好ましい実施形態において、本発明の診断方法は、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびβ−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、β−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンド、β−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンド、β−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド、
−ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンド、β−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンド
からなる群から選択される５つのスペクトルバンドを決定することを含む。
【０１１１】
別の特定の実施形態において、本発明の診断方法は、β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンド、β−タンパク質構造の存在に特異的なＩＲバンドおよび酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる特異的なＩＲバンドを得ることを含む。
【０１１２】
本発明の診断方法の特定の実施形態において、血漿サンプルは、血小板を含まない血漿である。本発明の診断方法の別の特定の実施形態において、血漿サンプルは、血小板を豊富に含む血漿である。本発明の診断方法の特定の実施形態において、血漿サンプルは、脱水した血漿である。別の特定の実施形態において、参照サンプルは、コントロール患者から得られる血漿であり、さらなる特定の実施形態において、コントロール患者は、ＧＤＳスケールに従ってステージ１に分類される患者である。
【０１１３】
アルツハイマー病に適した治療を用いた治療を受け入れる患者を特定するための方法および前記方法によって選択した患者を治療するための治療方法
別の態様において、本発明は、振動分光法によって、血液サンプル中のアルツハイマー病における認知低下と関連するタンパク質構造を決定することを含む、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れる被検体を特定するための方法（本発明の被検体を特定する第１の方法）であって、
（ａ）前もって得たヒト血液サンプルのラマンスペクトルを記録する工程と；
（ｂ）以下のラマンスペクトル領域
Ｒ．１．  １６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．２．  ９１０〜９８０ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．３．  ７３０〜７６０ｃｍ−１を含む領域；
Ｒ．４．  ３９０〜４５０ｃｍ−１を含む領域
の少なくとも１つのラマンスペクトル値を得る工程であって、ここで前記スペクトル値が、バンド間ラマン強度比の値、前記スペクトル領域の面積値および／または周波数値から選択されるものである工程と；
（ｃ）血液サンプルを下記：
Ｉ．アルツハイマー病において認知低下以外と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル；
ＩＩ．アルツハイマー病において認知低下と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル
の分類の１つに分類する工程であって、当該分類が、工程ｂで得られたラマンスペクトル値と、分類ＩまたはＩＩを区別することができる参照スペクトル値とを比較することによって、または、工程ｂで得られたラマンスペクトル値と、分類Ｉおよび分類ＩＩの参照ラマンスペクトル値とを比較する多変量分析によって行われる工程を含んでなり、
タンパク質構造を含有する血液サンプルが、アルツハイマー病の認知低下と関連する場合、前記被検体が、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れるものであることを示す、方法に関する。
【０１１４】
別の態様において、本発明は、赤外線分光法によって、血液サンプル中のアルツハイマー病における認知低下と関連するタンパク質構造を決定することを含む、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れる被検体を特定するための方法（本発明の被検体を特定する第２の方法）であって、
（ａ）前もって得たヒト血液サンプルの赤外線スペクトルを記録する工程と；
（ｂ）以下の赤外線スペクトル領域
ＩＲ．１．  １６００〜１７００ｃｍ−１を含む領域；
ＩＲ．２．  １０００〜１１５０ｃｍ−１を含む領域；
ＩＲ．３．  １１４０〜１１９０ｃｍ−１を含む領域；
の少なくとも１つの赤外線スペクトル値を得る工程であって、ここで前記赤外線スペクトル値が、前記スペクトル領域の面積値、前記スペクトル領域の強度比および／または前記スペクトル領域のバンド間面積の百分率値から選択されるものである工程と；
（ｃ）血液サンプルを下記：
Ｉ．アルツハイマー病において認知低下以外と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル；
ＩＩ．アルツハイマー病において認知低下と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプル
の分類の１つに分類する工程であって、当該分類が、工程ｂで得られた赤外線スペクトル値と、分類ＩまたはＩＩを区別することができる参照赤外線スペクトル値とを比較することによって、または、工程ｂで得られた赤外線値と、分類Ｉまたは分類ＩＩの参照赤外線スペクトル値とを比較する多変量分析によって行われる工程とを含んでなり、
タンパク質構造を含有する血液サンプルが、アルツハイマー病の認知低下と関連する場合、前記被検体が、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れるものであることを示す、方法に関する。
【０１１５】
本発明の第１の方法および第２の方法の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の異なる実施形態は、上述のアルツハイマー病における認知低下を決定するための方法という観点で記載した実施形態に対応する。
【０１１６】
特定の実施形態において、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れる被検体を特定するための第１の方法は、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れる被検体を特定するための第２の方法の工程を含む。アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れる被検体を特定するための方法の別の特定の実施形態において、この方法が、第１の方法および第２の方法の工程を含む場合、このサンプルは、工程ｂで得られるスペクトル値と、分類Ｉおよび分類ＩＩの参照ラマン値および分類Ｉおよび分類ＩＩの参照赤外線スペクトル値との多変量分析比較によって分類される。
【０１１７】
別の態様において、本発明は、被検体が、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れる被検体を特定するための第１の方法または第２の方法に従って選択された、被検体のアルツハイマー病の治療に使用するためのアルツハイマー病を治療するのに適切な治療法に関する。
【０１１８】
別の態様において、本発明は、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を被検体に投与することを含んでなり、前記被検体が、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れる被検体を特定するための第１の方法または第２の方法に従って選択された、アルツハイマー病を治療するための方法に関する。
【０１１９】
本発明によれば、「アルツハイマー病を治療するのに適切な治療法」は、アルツハイマー病を治療することができる任意の薬物および治療を含み、すなわち、ＡＤの症状を減らし、改善させ、またはなくすための治療を含む。特定の実施形態において、ＡＤを治療するための薬物は、コリンエステラーゼ阻害剤、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパルテート（ＮＭＤＡ）受容体アンタゴニストおよび抗β−アミロイド免疫治療から選択される。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「コリンエステラーゼ阻害剤」は、コリンエステラーゼまたはアンチコリンエステラーゼを阻害し、放出したアセチルコリンの破壊を防ぎ、それによって、その濃度を上げ、神経伝達物質の効果を持続させる化学化合物を指す。ヒトのコリンエステラーゼの全配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔデータベースの寄託番号Ｐ０６２７６を有する（２０１２年８月２日）。
【０１２１】
前臨床試験およびヒトにおけるいくつかの試験から、コリンエステラーゼの阻害が、ＡＤの発病に関与する基本的な方法に影響を与えるという証拠が存在する。例えば、アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）の阻害は、ＡＣｈＥアイソフォームの発現に影響を与え、ニコチン受容体の発現を増やすことができ、両方とも、ＡＤ患者の認知の向上と相関関係がある。ＡＣｈＥ阻害が、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の処理に影響を与え、Ａβ産生の妨害、Ａβ  １−４０およびＡβ  １−４２のレベルの変化およびこのアミロイド前駆体タンパク質の可溶性形態の生成を含む機構によって、Ａβによって誘発される毒性を弱めることも示されている。従って、非限定的な説明によって、軽度から中程度のＡＤの治療に適した治療は、コリンエステラーゼ阻害剤、特に、例えば、Ｃｏｇｎｅｘ（登録商標）（タクリン）、Ａｒｉｃｅｐｔ（ドネペジル）、Ｅｘｅｌｏｎ（登録商標）（リバスチグミン）またはＲａｚａｄｉｎｅ（登録商標）（ガランタミン）である。中等度から重度のＡＤは、ＮＭＤＡアンタゴニスト受容体として作用するＮａｍｅｎｄａ（登録商標）（メマンチン）を用いて治療することができる。ＮＭＤＡアンタゴニストが、コリンエステラーゼ阻害剤とは異なる働きをするため、この両方の種類の医薬を組み合わせて処方することができる。これらの医薬は、ＡＤの症状が悪化するのを遅らせるか、または防ぐのに役立つだろう。本発明の治療は、さらに、特に、音楽治療、身体的な治療、精神運動性の教育、作業療法または動物を用いた治療を含む。
【０１２２】
アルツハイマー病を治療するための３種類のコリンエステラーゼ阻害剤は、現在、世界的に販売されており、具体的には、ドネペジル、ガランタミンおよびリバスチグミンである。ドネペジル（１−ベンジル−４−［（５，６−ジメトキシ−１−インダノン）−２−イル］−メチル−ピペリジン）は、可逆性アセチルコリンエステラーゼ（ＡＣｈＥ）阻害剤である。ガランタミン（［４ａＳ−（４ａα，６β，８ａＲ＊）］−４ａ，５，９，１０，１１，１２−ヘキサヒドロ−３−メトキシ−１１−メチル−６Ｈ−ベンゾフロ［３ａ，３，２−ｅｆ］ベンザアゼピン−６−オール）は、スノードロップＧａｌａｎｔｈｕｓ  ｎｉｖａｌｉｓから単離されたアルカロイドである。ガランタミンは、非常に選択的で、可逆性で、競争型のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤である。リバスチグミン（（Ｓ）−Ｎ−エチル−３−［１−（ジメチルアミノ）エチル］−Ｎ−メチル−フェニル−カルバメート）は、可逆性の非競争型のアセチルコリンエステラーゼ阻害剤およびブチリルコリンエステラーゼ阻害剤である。
【０１２３】
他のコリンエステラーゼ阻害剤、具体的には、塩酸タクリン、（Ｃｌ−９７０、ＴＨＡ・ＨＣｌ）、フペルジンＡ、アコチアミド、ジメボリン、ＤＥＢＩＯ  ９９０２、ＩＮ  １０１、酒石酸フェンセリン、Ｒ−フェンセリン、塩酸スタコフィリン（Ｓ−９９７７、Ｓ−９９７７−２）、ＮＰ−６１、ビスノルシムセリン、ＣＯＬ−２０４、ＳＰＨ  １３７１、ＳＰＨ  １３７３、ＳＰＨ  １３７５、ＳＰ  ０４、ＣＭ  ２４３３、メトリホナート、７−メトキシタクリン（７  ＭＥＯＴＡ）、Ｐ  １１１４９、Ａｒｉｓｕｇａｃｉｎ、ＦＲ  １５２５５８、ＨＵＰ  １３、イソバニフペルジンＡ（ＩＶＨＡ）、ＭＨＰ  １３３、ＮＰ  ７５５７、Ｐ  １０３５８、Ｐ  １１０１２、サリチル酸フィゾスチグミン、マレイン酸ベルナクリン（ＨＰ−０２９、Ｐ８３−６０２９Ａ）、酒石酸エパスチグミン（Ｌ−６９３４８７）、イピダクリン、ザナペジル、ガンスチグミン、マレイン酸イコペジル（ＣＰ−１１８９５４、ＣＰ−１１８９５４−１１）、ＫＷ  ５０９２、キロスチグミン（ＨＰ−２９０、ＮＸＸ−０６６）、ＳＭ  １０８８８、Ｔ  ８２、ＴＡＫ  ８０２、ジフロシロンＭＤＬ−７３７４５）、ＢＧＣ  ２０１２５９、ＣＨＦ  ２０６０、Ｃｌ  １００２、Ｅ  ２０３０、ＥＲ  １２７５２８、ＥＴ  １４２、Ｆ  ３７９６、フプリンＸ、ＭＦ  ２４７、ＭＦ  ２６８酒石酸水素塩、ＭＦ  ８６１５、Ｐ  ２６、ＰＤ  １４２０１２、ＲＯ  ４６５９３４、ＳＳ  ２０、チアトルセリン、酒石酸トルセリン、ＵＲ  １８２７（ＡＤＩＳ  Ｒ＆Ｄ  Ｉｎｓｉｇｈｔ、２５／０２／２０１０）のための臨床治験および／または前臨床治験も行われ、上述のものを本発明のＡＤを治療するために使用することができる。
【０１２４】
コリンエステラーゼを阻害するためのさらなる化合物、例えば、エドロホニウム、デメカリウム、アンベノニウム、ネオスチグミンブロミド、デヒドロエボジアミンクロリド、エセロリン、インペラトリン、スコポレチン（ＳＣＴ）、フペルジンＡ（Ｈｕｐ  Ａ）、酒石酸ヘプチルスチグミン（ＭＦ−２０１）、マレイン酸スロナクリン（ＨＰ−１２８）、ＵＣＢ−１  １０５６、ベルベリンヨージド、ノルピリドスチグミン、キロスチグミン（ＨＰ−２９０、ＮＸＸ−０６６）、ＴＨＢ−０１３、ＰＤ−１４２６７６、酒石酸テレスチグミン（ＣＨＦ−２０６０）、チアシムセリン、ＭＦ−８６１５、ＭＦ−２６８酒石酸水素塩、塩酸アンセクリン（ＫＡ−６７２．ＨＣｌ）、塩酸エンサクリン、マレイン酸イコペジル（ＣＰ−１１８９５４）、サリチル酸エゼリン、サリチル酸フィゾスチグミン、ＪＷＳ−ＵＳＣ−７５ＩＸ、Ｐ１１４６７、Ｐ−１０３５８、ビス（７）−タクリン、ＨＭＲ−２４２０、ＣＰ−１２６９９８、ＴＶ−３２７９、ＭＳＦ、ＴＨＡ−Ｃ８、スベルゴルグ酸、スベロゴージン（ｓｕｂｅｒｏｇｏｒｇｉｎ）、ＳＰＨ−１２８６、フペルジンＢ（Ｈｕｐ  Ｂ）、ピリドスチグミンブロミド（Ｒｏ−１−５１３０）、フプリンＹ、コロナリジン、ＲＳ−１２３３、コボフェノールＡ、ビス（１２）−フペリン、ＲＳ−１２５９、ＩＴＨ−４０１２、ＴＫ−１９、Ｔ−８１、ＴＨ−１７１、ＴＨ−１８５、ジスチグミンブロミド（ＢＣ−５１）、（−）−９−デヒドロガランタミニウムブロミド、メモキン、スコポレチン７−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシド（ＮＳＣ−４０４５６０）、スコポリン（ＳＣＮ）、スコポロシド、ＢＷ−２８４ｃ５１、ウィタフェリンＡ（ＮＳＣ−１０１０８８）、ウィタフェリン（ＮＳＣ−２７３７５７）、（＋）−コリノリン、コリノリン、（Ｓ）−（−）−オキシポイセダニン、オキシポイセダニン、（−）−ボアカンギン、カルボメトキシイボガイン、ボアカンギン、ジェクトール、フロロフコフロエコール（ＰＦＦ）、フロロフコフロエコールＡ、（−）−３−０−アセチルスペクタリン塩酸塩およびラフィアサポニン（ｒｈａｐｈｉａｓａｐｏｎｉｎ）１、またはこれらの塩、遊離塩基、ラセミ体またはエナンチオマーが記載されており、本発明に従ってＡＤを治療するために使用することができる。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト」は、一次侵害受容線維（ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｆｆｅｒｅｎｔ  ｆｉｂｅｒ）の多シナプス性放電によって作られる反応を阻害する化学化合物を指す。アンタゴニストの中で、メマンチン（３，５−ジメチルトリシクロ［３．３．１．１３，７］デカン−１−アミンまたは３，５−ジメチルアダマンタン−１−アミン）が顕著である。
【０１２６】
他のＮＭＤＡアンタゴニストは、ニモジピン（３−（２−メトキシエチル）５−プロパン−２−イル  ２，６−ジメチル−４−（３−ニトロフェニル）−１，４−ジヒドロピリジン−３，５−ジカルボキシレート）、ジゾシルピン、ＡＰ−５（２−アミノ−５−ホスホノペンタン酸）、ＡＰ−７（２−アミノ−７−ホスホノヘプタン酸）、ＣＨＦ  ３３８１（ｎ−（２−インダニル）−グリシンアミド塩酸塩］）およびイフェンプロジル（４−［２−（４−ベンジルピペリジン−１−イル）−１−ヒドロキシプロピル］フェノール）であり、本発明に従ってＡＤを治療するために使用することができる。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、「抗β−アミロイド免疫治療」は、β−アミロイド蓄積によって引き起こされる損傷を遅らせるか、または止めるための免疫系を用いた治療を指す。前記免疫治療は、抗β−アミロイド抗体の投与を含む。本発明の治療に有用な抗β−アミロイド抗体としては、アミロイド斑を直接的に破壊するもの（ミクログリアは、免疫化によって刺激され、すでに以前に生成していたアミロイド斑を貪食する）、アミロイドを捕捉するもの（末梢血内で抗原−抗体複合体を生成し、脳から出たアミロイドを捕捉し、堆積を防ぐ）、または凝集を阻害するもの（抗原−抗体複合体の生成によって、アミロイドが老人斑で凝集するのを防ぐ）が挙げられる。または、抗β−アミロイド免疫治療は、１種類または数種類のβ−アミロイドペプチド（例えば、Ａβ（１−５）、Ａβ（１−６）、Ａβ（１−１２）、Ａβ（１３−２８）、Ａβ（２５−３５）、Ａβ（３５−４２）、Ａβ（３３−４２）およびＡβ（３３−４０））を含む免疫学的組成物の使用を含む（Ａβ（Ｘ−Ｙ）という表現は、Ｙ位のアミノ酸に対してＸ位のアミノ酸からなるβ−アミロイドペプチドから誘導されるペプチドを指す）。β−アミロイドペプチドを、接合体（例えば、ＫＬＨまたはアルブミンに対して接合した）形態、またはアジュバント（例えば、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント、Ｆｒｅｕｎｄの不完全アジュバント、ＱＳ２１、水酸化アルミニウムゲル、ＭＦ５９、リン酸カルシウム、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、Ｅｍｕｌｓｉｇｅｎ中のモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ポリソルベート８０、コレラ毒素（ＣＴ）、ＬＴＫおよびＬＴＫ６３）を含む組成物の形態で投与してもよい。実例となる例として、本発明で有用なワクチンは、ヒトβ−アミロイドタンパク質の人工複製物であるβＡ４２からなるＡＮ−１９７２ワクチンであり、注射すると、免疫系を刺激し、病気のげっ歯類の脳から異常な堆積物が除去される。これにより、老人斑に付着する抗体の生成を刺激し、免疫系の細胞成分（ミクログリア、アストロサイト）によって後に消化される。
【０１２８】
または、γセクレターゼ阻害剤を使用することが可能であり、γセクレターゼは、βアミロイド合成に関与する酵素である。本発明に有用なγセクレターゼ阻害剤は、特に、ＬＹ−４５０１３９（ＣＡＳ番号４２５３８６−６０−３）であり、Ｓｅｍａｇａｃｅｓｔａｔ、ＤＡＰＴ（ＣＡＳ番号２０８２５５−８０−５）、ＣＴＳ−２１１６６またはＭＫ  ８９３１とも呼ばれる。
【０１２９】
別の態様において、本発明は、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れる被検体を特定するための方法（本発明の被検体を特定するための第３の方法）であって、
（ａ）前記被検体からの血漿サンプルのラマンスペクトルを測定し、β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびトリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドからなる群から選択される少なくとも１つのラマンバンドを得る工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られたラマンスペクトルと、参照サンプルのスペクトルとを比較する工程とを含んでなり、
ここで、前記参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するペプチド結合の角変形に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するα−らせんタンパク質構造に特異的な強度の減少の指標となるラマンスペクトルの変動、および／または参照スペクトルに対するタンパク質三次構造中のトリプトファン残基に特異的な振動の増加の指標となるラマンスペクトルの変動は、被検体が、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れるものであることを示す、方法に関する。
【０１３０】
別の態様において、本発明は、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れる被検体を特定するための方法（本発明の被検体を特定するための第４の方法）であって、
（ａ）前記被検体からの血漿サンプルのＩＲスペクトルを測定し、β−タンパク質構造の存在に特異的な少なくとも１つのバンドおよび／または酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる少なくとも１つの特異的なバンドを得る工程と、
（ｂ）工程（ａ）で得られるＩＲスペクトルと、参照サンプルのスペクトルとを比較する工程とを含んでなり、
ここで、前記参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造の増加の指標となるＩＲスペクトルの変動および／または参照スペクトルに対する酸化ストレス中にサンプル内で生成する化合物の濃度の増加の指標になるＩＲスペクトルの変動が、被検体が、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れるものであることを示す、方法に関する。
【０１３１】
別の態様において、本発明は、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れる被検体を特定するための方法（本発明の被検体を特定するための第５の方法）であって、
（ａ）前記被検体からの血漿サンプルのラマンスペクトルを測定し、β−タンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンド、ペプチド結合の角変形に特異的な振動を含むアミロイドペプチドのラマンバンド、α−らせんタンパク質構造に特異的な振動を含むラマンバンドおよびトリプトファン残基を含むタンパク質三次構造に特異的な振動を含むラマンバンドからなる群から選択される少なくとも１つのラマンバンドを得る工程と、
（ｂ）前記被検体からの血漿サンプルのＩＲスペクトルを測定し、β−タンパク質構造の存在に特異的な少なくとも１つのバンドおよび／または酸化ストレス中に生成する化合物の存在の指標となる少なくとも１つの特異的なバンドを得る工程と、
（ｃ）工程（ａ）で得られたラマンスペクトルと、参照サンプルのスペクトルを比較し、工程（ｂ）で得られたＩＲスペクトルと、参照サンプルのスペクトルとを比較する工程とを含んでなり、
ここで、前記参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造に特異的な強度の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するペプチド結合の角変形に特異的な振動の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するα−らせんタンパク質構造に特異的な強度の減少の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するタンパク質構造中のトリプトファン残基に特異的な振動の増加の指標となるラマンスペクトルの変動、参照スペクトルに対するβ−タンパク質構造の増加の指標となるＩＲスペクトルの変動および／または参照スペクトルに対する酸化ストレス中にサンプル内で生成する化合物の濃度の増加の指標になるＩＲスペクトルの変動は、アルツハイマー病患者が、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を受け入れるものであることを示す、方法に関する。
【０１３２】
本発明の第３、第４および／または第５の方法の工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の異なる実施形態は、アルツハイマー病を診断するために、または前の章で記載したアルツハイマー病において認知低下を決定するための診断方法の観点で記載した実施形態に対応する。
【０１３３】
別の態様において、本発明は、被検体が、被検体を特定するための第３または第４の方法に従って選択された、被検体におけるアルツハイマー病を治療するのに適切な治療法に関する。
【０１３４】
別の態様において、本発明は、アルツハイマー病を治療するのに適切な治療を被検体に投与することを含んでなり、被検体が、被検体を特定するための第３または第４の方法に従って選択された、アルツハイマー病を治療するための方法に関する。
【０１３５】
アルツハイマー病を治療するのに適切な治療の特徴を上に述べたが、これも適用可能である。
【０１３６】
本明細書において、ラマン分光法によって、赤外線分光法によって、または赤外線分光法と組み合わせたラマン分光法によって、血液サンプル中のアルツハイマー病における認知低下と関連するタンパク質構造を決定するための方法、個体のためのカスタマイズされた治療を設計するための方法、上に定義したいずれかの値に従った診断方法、およびいずれかの好ましい実施形態は、本発明の方法として本明細書に言及することができる。
【０１３７】
本発明による装置
別の態様において、本発明は、血漿サンプル分析のための装置であって、
（ｉ）血漿サンプルを受け入れるための容器と、
（ｉｉ）ラマン分光計およびＩＲ分光計から選択される少なくとも１つの分光計と、
（ｉｉｉ）本発明の診断方法を実施するための手段を含むコンピュータシステムとを含んでなる、装置に関する。
【０１３８】
ラマン分光計を生成するデバイスは、当該技術分野で知られており、基本的に、レーザーおよびＣＣＤ（電荷結合素子）の光電子増倍管である。この装置は、光学ヘッドに光を導く励起光ファイバーに接続した２つの交換可能な単色光源（例えば、Ｈｅ−ＮｅレーザーおよびＡｒレーザー）によって作成することができ、光学ヘッドは、サンプルに光を集める。サンプルによって散乱した光を同じ光学ヘッドを介して集め、集光光ファイバーによってモノクロメータに導き、空間的およびスペクトルに分ける。ＣＣＤは、モノクロメータによって回折したシグナルを検出し、散乱光の光子をデジタル電気シグナルに変換し、スペクトルは、コンピュータに向かう。本発明の装置のコンピュータシステムの目的は、特に、画像処理および数学処理を含め、散乱したラマンシグナルの獲得およびその分析を制御することである。コンピュータシステムは、特に、ＣＣＤのパラメータ、モノクロメータおよびレーザーの整列の制御も行う。コンピュータシステムは、さらに、スペクトルの特定の操作（例えば、ベースラインの補正、いくつかのスペクトルの比較、面積の計算およびフーリエ変換、分析すべきサンプルのスペクトル値と参照スペクトルとの比較、または、特に、アルツハイマー病において認知低下以外と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプルと、アルツハイマー病において認知低下と関連するタンパク質構造を含有する血液サンプルとの区別を可能にする値を用いた多変量分析比較）を可能にする。
【０１３９】
特定の実施形態において、本発明の装置は、ラマン分光計およびＩＲ分光計を含んでなる。ＩＲ分光計は、分散型ＩＲ分光計またはフーリエ変換ＩＲ分光計であってもよい。好ましい実施形態において、本発明の装置がＩＲ分光計を含んでなる場合、このＩＲ分光計は、フーリエ変換ＩＲ分光計である。
【０１４０】
フーリエ変換分光計（ＦＴＩＲ）は、光源、マイケルソン干渉計および検出器の３つの構成要素を含む。フーリエ変換装置は、散乱要素を含まず、すべての波長を同時に検出し、測定する。モノクロメータの代わりに、赤外線スペクトルの情報を含む干渉パターンを生成する干渉計を使用する。ＦＴＩＲ分光計は、分散型装置と同じ種類の光源を使用する。トランスデューサは、一般的に、焦電性トランスデューサであるトリグリシンサルフェート、または光伝導性トランスデューサである水銀カドミウムテルリドである。波長の関数として放射エネルギーを得るために、干渉計は、数学的なフーリエ変換技術を用いてデコードすることができるように、光源からのシグナルを調節する。この操作は、計算を行うために高速コンピュータを必要とする。
【０１４１】
別の特定の実施形態において、本発明の装置は、さらに、顕微鏡を含む。
【０１４２】
コンピュータシステム、コンピュータプログラムおよびデータ記憶媒体
別の態様において、本発明は、本発明の診断方法を行うのに適したコードを含んでなる、コンピュータプログラムに関する。
【０１４３】
別の態様において、本発明は、本発明のコンピュータプログラムを含むデータ記憶媒体に関する。
【０１４４】
別の態様において、本発明は、診断方法または本発明に従って患者を特定するための方法を実行するための手段とともに与えられるコンピュータシステムに関する。コンピュータシステムは、
（ａ）（ｉ）患者からのサンプルについてのラマンスペクトルデータおよび／またはＩＲスペクトルデータを受け取り、（ｉｉ）被検体からのサンプルから得られたスペクトルと、参照被検体のスペクトルの同一度に基づき、患者を健康な被検体またはアルツハイマー患者に割り当てることを含む方法を実施するためのコンピュータシステムの操作を制御するのに適した少なくとも１つのコンピュータプログラムを含む少なくとも１つのメモリと、
（ｂ）コンピュータプログラムを実行するための少なくとも１つのプロセッサとを備えていてもよい。
【０１４５】
本発明の別の態様は、本発明の第１の方法、第２の方法または第３の方法に従って工程を行うためのコンピュータシステムを制御するためのコンピュータプログラムに関する。
【０１４６】
コンピュータシステムは、１つ以上の汎用プロセッサまたは特定の目的を有するプロセッサと、揮発性および不揮発性のメモリデバイスを含む関連するメモリとを含んでいてもよい。
【０１４７】
本発明のいくつかの実施形態で有用な機械で読み取り可能な物理記録媒体としては、任意の機械で読み取り可能な物理記録媒体、例えば、固体記憶装置（例えば、フラッシュメモリ）、機械で読み取り可能な磁気記録媒体および光学記録媒体、および持続性記録技術を用いた他のメモリが挙げられるだろう。ある実施形態において、機械で読み取り可能な媒体は、コンピュータがコンピュータプログラムおよびデータにアクセス可能な任意の有形の媒体であってもよい。機械で読み取り可能な媒体としては、情報（例えば、機械で読み取り可能な命令、プログラムモジュール、プログラム、データ、データ構造およびデータベース情報）を保存することができる任意の方法または技術で実施される書き換え可能または書き換え不能の有形の揮発性および不揮発性の媒体が挙げられるだろう。本発明の実施形態において、機械で読み取り可能な媒体としては、限定されないが、ＲＡＭ（ランダムアクセスメモリ）、ＲＯＭ（リードオンリーメモリ）、ＥＰＲＯＭ（書き換え可能なプログラマブルリードオンリーメモリ）、ＥＥＰＲＯＭ（電気的に書き換え可能なプログラマブルリードオンリーメモリ）、フラッシュメモリまたは他のメモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ（コンパクトディスクリードオンリーメモリ）、ＤＶＤ（デジタルバーサタイルディスク）または他の光学記録媒体、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶装置または他の磁気記憶媒体、他の種類の揮発性および不揮発性のメモリ、および上述の任意の組み合わせを含め、情報を格納するために使用することができ、機械読み取り可能な任意の他の有形の媒体が挙げられる。
【０１４８】
本発明は、自律型コンピュータで、またはネットワークコンピュータシステムの一部として実行することができる。
【０１４９】
本発明のある実施形態において、参照として使用するラマンスペクトルおよび／またはＩＲスペクトルを使用し、電気的に、またはデジタルで記録し、登録し、検索することができる。
【０１５０】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態および他のすべての態様の実施形態において、システムは、参照データを用いた決定モジュールにおいて決定されたスペクトルを比較するための操作比較のために入手可能な種々のソフトウエアフォーマットおよびプログラムを使用することができる「比較モジュール」において、データを比較することができる。別の実施形態において、比較モジュールは、１つ以上の入力の配列の情報と、１つ以上の参照データパターンとを比較するためにパターン認識技術を用いるように構成される。比較モジュールは、パターンを比較するために既存の市販または使い捨てのソフトウエアを使用するように構成されてもよく、行われる特定のデータ比較のために最適化することができる。
【０１５１】
ある実施形態において、比較モジュールは、あらかじめ定義した基準によって、またはユーザが定義した基準によって、機械で読み取り可能な形態で処理可能な機械で読み取り可能な比較結果を提供し、表示モジュールを用いてユーザによって要求されるように保存することができ、アクセスすることができる比較結果に一部基づく内容を含む報告を与える。ある実施形態において、表示モジュールは、ユーザのための比較結果に一部基づく比較結果に部分的に基づく内容を表示することができ、この内容は、目的の患者からのサンプルから得られるスペクトルと、健康な被検体のスペクトルとを比較した結果の指標となる報告である。
【０１５２】
ある実施形態において、表示モジュールは、エンドユーザのための比較結果に一部分基づく報告または内容を表示することができ、この内容は、患者のスペクトルと参照スペクトルとを比較する結果の指標となる報告である。本発明のこの態様のいくつかの実施形態および他のすべての態様の実施形態において、比較モジュール、または本発明の任意の他のモジュールは、関係データベース管理システム、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂアプリケーション、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂサーバーが動くオペレーションシステム（例えば、ＵＮＩＸ(登録商標)、Ｗｉｎｄｏｗｓ(登録商標)）を含んでいてもよい。Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂアプリケーションは、データベース言語命令［例えば、標準クエリ言語（ＳＱＬ）命令］を作成するために必要な実行可能なコードを含んでいてもよい。
【０１５３】
コンピュータの命令は、ソフトウエア、ファームウエアまたはハードウエアで実行されてもよく、情報処理システムのモジュールによって行われる任意の種類のプログラム化工程を含んでいてもよい。コンピュータシステムを、ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）またはワイドエリアネットワーク（ＷＡＮ）に接続してもよい。
【０１５４】
本発明のこの態様のいくつかの実施形態および他のすべての態様の実施形態において、比較モジュールは、あらかじめ定義された基準またはユーザが定義した基準によって機械で読み取り可能な様式で処理可能な機械で読み取り可能なデータを与え、表示モジュールを用いてユーザによって要求されるように保存し、アクセスすることができる検索内容を与える。
【０１５５】
本発明のある実施形態によれば、コンピュータシステムは、表示モジュール、例えば、コンピュータモニタ、タッチスクリーンまたはビデオディスプレイシステムを含むか、またはこれらに操作可能に接続してもよい。表示モジュールは、ユーザインターフェースの一部として、ユーザの指示をシステムユーザに提示することができ、ユーザがシステムの入力を見ることができ、このシステムは、ユーザに結果を示すことができる。コンピュータシステムは、場合により、システムによって出力される情報の印刷複写物を製造するための印刷デバイスを含んでいてもよく、または印刷デバイスに操作可能に接続していてもよい。
【０１５６】
本発明のある実施形態において、Ｗｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂブラウザを使用し、ユーザが情報を入力するためにシステムと対話し、要求を作成し、検索した内容を示すことができるためのユーザインターフェースを与える。さらに、システムの種々の機能モジュールは、ユーザインターフェースを与えるためにウェブブラウザを用いるように調整することができる。ウェブブラウザを用いることによって、ユーザは、データソース（例えば、データベース）からデータを検索するための要求を作成することができ、比較モジュールと対話し、比較およびパターンマッチングを行うことができる。ユーザは、システムと対話し、システムが本発明の方法を行うためにグラフィカルユーザインターフェースで従来から使用されるユーザインターフェース要素（例えば、ボタン、ドロップダウンメニュー、ディスプレイスメントラインなど）を示し、クリックすることができる。ユーザウェブブラウザを用いて作成された要求は、ネットワークからウェブアプリケーションに送信され、作成したスペクトル、検索された内容に関連する関連情報を与えるために使用可能な１つ以上のデータベースに問い合わせを行うための要求を処理し、フォーマット化し、この情報を処理し、結果を作成することができる
【０１５７】
本発明を、本発明の範囲の非限定的な説明によって与えられる以下の実施例に基づき、以下に説明する。
【実施例】
【０１５８】
実施例１：末梢血の血漿分画を得るための方法
血液サンプルの血漿分画を以下のように得る。健康なコントロールおよびＡＤ患者からの静脈血抽出物から得た血液４ｍＬを、ヘパリン−リチウムを含むＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ管（緑色の栓、参照番号３６８８８４）に採取し、４℃、１７００ｇで１０分間遠心分離処理する。上澄みが、血漿分画に対応する。
【０１５９】
実施例２：血漿分画のラマンスペクトルおよび赤外線スペクトルの測定
ラマンスペクトルの測定を以下の工程に従って行った。
（ａ）サンプルの調製
血漿分画５０μＬを採取し、この容積の空洞を有するサンプルホルダに置き、排気フード中、１５〜２５℃の室温で乾燥させる。サンプルの変化が観察されなければ、サンプルを２〜２５℃の温度で乾燥させてもよい。しかし、もっと速くサンプルを蒸発させるために、１５〜２５℃で行う。得られる固体をサンプルホルダから集め、めのう乳鉢に移し、その後のラマンスペクトル測定のために均質化した。得られた粉砕した固体を、直径が２ｍｍの半円球型の中空部を有する円筒形アルミニウム皿を含むＦＴ−ラマン分光法のための付属品である従来の小さな乳鉢に移し、血漿の粉末固体（１〜３ｍｇ）を小さな乳棒で圧縮する。
（ｂ）スペクトル記録条件
出力が１００ＭＷの１０６４ｎｍのネオジム−ＹＡＧレーザー線を励起光として用い、Ｂｒｕｋｅｒ  ＲＦＳ  １００ラマン分光計でラマンスペクトルを測定した。記録条件は以下のとおりであった。記録範囲：３６００〜３００ｃｍ−１；１，０００スペクトルの蓄積；スペクトル解像度４ｃｍ−１。室温で、同一の分析条件でサンプル表面での光の後方反射によってすべてのスペクトルを得たため、バンドの強度をスペクトル間で直接比較することができる。
【０１６０】
図１は、健康なコントロールおよび軽度、中等度および重度のＡＤ患者からの血漿のラマンスペクトルを示す。全体的に考えたとき、これらの間に有意な差は観察されず、従って、有意な差を観察するために、小さなスペクトル範囲に限定することが必要である。図２は、健康なコントロールからＡＤ患者へと向かうと、β−シートポリペプチド構造生成の結果として、１６７１付近のラマン強度が増加することを示す。ＡＤトランスジェニックマウスの血小板のラマンスペクトル（Ｃｈｅｎら、Ｌａｓｅｒ  Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．８、５４７−５５２（２０１１））とは異なり、１６５４ｃｍ−１付近のアミドＩバンドの強度に有意な減少は観察されない。ＡＤにおけるＡβ−アミロイドペプチドの生成（図３）は、本発明で測定したＡβ−４０ペプチドおよびＡβ−４２ペプチドのラマンスペクトルに特徴的な４０９ｃｍ−１付近のバンドの発生によっても明らかに示される。このバンドは、まだ文献に記載されていないが、周波数群を考慮し、その周波数の値を、一旦、ポリペプチド骨格の角変形の振動と帰属する。このバンドの相対的な強度は、特に、健康なコントロールとＡＤ患者との間の判別パラメータとして本発明で初めて使用された。実施例４および実施例５からわかるように、本文書に記載する他のスペクトル値（本明細書では、分光パラメータとも呼ばれる）に、この強度を加えると、サンプル分類の感度および特異性がかなり向上する。
【０１６１】
図４は、９８０〜９１２ｃｍ−１のスペクトルプロフィールのバンドの面積が、健康なコントロールと比較して、ＡＤ患者では少ないことを初めて示す。このスペクトルの変化は、モデルポリペプチドおよびこの種のポリペプチド構造を有するタンパク質のラマンスペクトルを考慮し、α−らせんタンパク質構造の減少であると解釈することができる。
【０１６２】
図５は、トリプトファン残基を含むタンパク質三次構造を観察することができるスペクトル領域を示す。ＡＤトランスジェニックマウスの血小板のラマンスペクトル（Ｃｈｅｎら、Ｌａｓｅｒ  Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．８、５４７−５５２（２０１１））で観察されるものとは異なり、７４０〜７４３ｃｍ−１付近に位置するバンドは、強度が増加せずにむしろ減少しており、さらに、健康なコントロールからの血漿のスペクトルと比較して、周波数が高い方にシフトしている。
【０１６３】
赤外線スペクトルの測定を以下の工程に従って行った。
（ａ）サンプルの調製
３〜７μＬの体積の血漿分画を採取し、赤外線分光法のためにＺｎＳｅ結晶の上に置き、スパチュラで広げ、排気フード中、１５〜２５℃の室温で乾燥させる。その後、得られた膜を赤外線分光法によって測定する。
（ｂ）スペクトル記録条件
Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒの１７２５Ｘ型フーリエ変換分光計で赤外線スペクトルを測定した。記録条件は以下のとおりであった。記録範囲：４０００〜４００ｃｍ−１；３２スペクトルの蓄積；スペクトル解像度２ｃｍ−１。２０００〜１８００ｃｍ−１の領域に水蒸気のバンドが存在しなくなるまで、水蒸気のスペクトルを適切な因子で妨害することによって環境中の水蒸気のバンドの寄与の可能性を補正した。
【０１６４】
図６Ａは、老齢期コントロールの血漿および中等度のＡＤ患者の平均スペクトルを示す。後者の血漿において、β−シートタンパク質構造に起因し、１６４０〜１６２０ｃｍ−１範囲にわずかに高い吸収を観察することができる。この点は、第２の誘導体で表現されるスペクトルでは、さらに明確に観察することができる。最後に、酸化ストレスから得られる酸化した化合物の生成に起因する１０００〜１１５０ｃｍ−１領域の赤外線吸収の増加は、ＡＤ患者において観察することができる（図６Ｂ）。
【０１６５】
実施例３〜５：末梢血の血漿のラマンスペクトルの判別分析
表１に示したサンプル群を用い、判別分析を行った。１６７１／１６５８、７５８／７４３、４０９／４２３ｃｍ−１の高さ比、７４０〜７５０ｃｍ−１範囲のバンドの周波数、およびアミドＩバンドの面積に対して正規化された９８０〜９１０ｃｍ−１のスペクトルプロフィールの面積が、この目的のために考慮された。この統計処理を行ったスペクトルは、図１に示すようなベースラインを補正した結果である。認知状態に関連する分類Ｉまたは分類ＩＩは、従属変数または群分け変数（Ｇｒｏｕｐ．ｖａｒ．）として考慮され、上述の分光パラメータ（スペクトル値）は、独立変数として考慮された。両群のサンプルについて、あらかじめ同じ確率を考慮した。交差検証を行い、分析モデルのためのサンプルを除いてすべてのサンプルを考慮し、サンプルの分類を予測し、除外したサンプルを使用し、このモデルに従って分類した。この操作を表１の各サンプルについて行った。
【表１】
2015531069.tif 000002
対応するＳＰＳＳコンピュータプログラム、バージョン１９（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、シカゴ、ＩＬ、ＵＳＡ）を用い、これらの判別分析を行った。
【０１６６】
実施例３
１６７１／１６５８ｃｍ−１の高さ比の分光パラメータのみを考慮した判別分析によって表１のサンプルを分類した。表２に含まれる結果は、ほぼ７０％のサンプルの正しい分類が交差検証によって得られることを示す。
【表２】
2015531069.tif 000003
【０１６７】
実施例４
１６７１／１６５８ｃｍ−１および７５８／７４３ｃｍ−１の高さ比、７４０〜７５０ｃｍ−１範囲のバンドの周波数、および９８０〜９１０ｃｍ−１のスペクトルプロフィールの面積といった分光パラメータ（スペクトル値）を考慮した判別分析によって、表１のサンプルを分類した。表３に含まれる結果は、８０％に近いサンプルの正しい分類が交差検証によって得られることを示す。従って、１６７１／１６５８ｃｍ−１の高さ比のパラメータのみを考慮した実施例３と比較して、分類の向上が得られる。
【表３】
2015531069.tif 000004
【０１６８】
実施例５
交差検証を用いたサンプルの正しい分類に対し、４０９／４２３ｃｍ−１の高さ比の分光パラメータまたはスペクトル値を加える効果を、実施例４と比較してこの実施例で分析する。この観点から、表４の結果は、明らかに、ＡＤサンプル中のアミロイドペプチドの存在に関連する分光パラメータを導入することによって、非常に有意な向上（９０％を超える正しい分類）が観察されたことを示す。
【表４】
2015531069.tif 000005
【０１６９】
実施例５と実施例４を比較することによって、このパラメータを導入すると、サンプルの正分類率が約８０％から９０％を超える値まで非常に顕著に向上することが明らかにわかるだろう。
【０１７０】
実施例６
この実施例は、表５に含まれるサンプルの分析において、赤外線分光法とラマン分光法の組み合わせを分析する。この実施例は、実施例５の５つのラマン分光値と、赤外線領域ＩＲ．１およびＩＲ．２の２つの分光値を考慮して行われた。赤外線のこの２つの値は、アミドＩの赤外線領域（領域ＩＲ．１）で測定されるβ−タンパク質シート構造の面積の百分率と、１０００〜１１５０ｃｍ−１の赤外線スペクトルプロフィール（領域ＩＲ．２）の面積を指す。
【表５】
2015531069.tif 000006
【０１７１】
２つのサンプル数の状況、すなわち、一方は、健康なコントロールと軽度のＡＤ患者（ＧＤＳ  ３）とを比較することによるサンプルの分類であり、一方は、健康なコントロールと、あらゆるステージのＡＤ（ＧＤＳ  ３〜７）とを比較することによるサンプルの分類である状況を考慮した。表５は、両方の分光法技術の組み合わせによって、軽度のＡＤ患者から得たとき、サンプルの正しい分類がかなり向上することを示し、この疾患を初期段階で信頼性高く診断することができるという観点から特に興味深い。任意のＧＤＳを有するＡＤ患者が全体的に考慮される場合、両方の技術の組み合わせは、リンパ球分画を用いても起こるため、陽性の効果は有しておらず（Ｃａｒｍｏｎａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．  ４０２、２０１５−２０２１（２０１２））、区別する分光パラメータとしてのβ−タンパク質構造の含有量は、この疾患の初期段階では多く、その後減少する。
【０１７２】
実施例７
この実施例は、サンプルの分類において、赤外線分光法とラマン分光法の組み合わせを分析し、以下の表５に含まれる。この実施例は、実施例５の５つのラマン分光法、さらに、１７２０〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンドの面積に対し、１６６０〜１６６２ｃｍ−１での第１の誘導体の平均、および１７２０〜１６２５ｃｍ−１のアミドＩバンドの面積に対し、４３０ｃｍ−１での第１の誘導体、赤外線領域ＩＲ．１およびＩＲ．２の２つの分光値、ＩＲ．３の２つの値、特に、１１５６ｃｍ−１付近で得られる強度と、１１７１ｃｍ−１領域に位置するバンドの最大との比率、および１１７０ｃｍ−１でのスペクトルプロフィールに対し、（Ｉ１１６０＋Ｉ１１６２＋Ｉ１１６５）／Ｉ１１７７に対応する絶対値を考慮して行われた。
【図１】
2015531069.tif 000007
【図２】
2015531069.tif 000008
【図３】
2015531069.tif 000009
【図４】
2015531069.tif 000010
【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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