(57)【要約】表面の微生物を捕捉、及び中和、又は殺滅する方法は、抗菌剤を含むバリア形成組成物を無生物表面に塗布すること、無生物表面にバリア層を形成させること、そのバリア内において、表面に接触した微生物、及び塗布後に周囲から来て接触した微生物を捕捉し殺滅することを含む。その方法を実施するための組成物も含まれる。捕捉と殺菌の二重作用により、強力で持続性のある殺菌作用又は静菌作用を引き起こす。臭気抑制作用、作用、及び微生物が増殖している表面の外観や変色を改善する作用を有する組成物や方法も含まれる。
2015514758.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面の微生物を捕捉、及び中和、又は殺滅する方法であって、
抗菌剤を含むバリア形成組成物を無生物表面上に塗布することと；
該無生物表面にバリア層を形成させることと；
該バリア内において、表面で接触した微生物、及び塗布ステップ後に周囲から来て接触した微生物を捕捉し殺滅することとを含み；
該バリア層が少なくとも約１時間にわたって殺菌作用又は静菌作用を有するものである方法。
【請求項２】
前記バリア形成組成物が湿潤剤、抗菌剤、及び任意にガムを含み、該ガムが存在する場合、該ガムが該バリア形成組成物全体の約0.01重量%〜約0.4重量%の量で存在する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記バリア形成組成物が、以下の要件を満足する請求項1に記載の方法：
約0.0001%≦C≦約0.4%；
約0.07%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜A
又は
約0%≦C≦約0.4%；
約55%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜Aであり、
ここで、全てのパーセンテージは全組成物の重量によるものであり；
Cは炭水化物ガム；Hは湿潤剤；そしてAは抗菌剤である。
【請求項４】
前記抗菌剤がモノ第4級アンモニウム化合物である、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
汚染表面を識別することを更に含む請求項1に記載の方法であって、該汚染表面は、有害なウイルス、真菌、若しくは細菌性微生物で汚染されていることが知られているか、又は汚染されることが予測され、前記無生物表面が該汚染表面であり；
前記バリア形成組成物を塗布するステップが、汚染されている該表面、あるいは汚染されることが予測される表面の該識別に応じて、又は汚染事象の観察に応じて起こる方法。
【請求項６】
前記バリア形成組成物が500cps未満の粘度を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記無生物表面が、セラミック、ガラス、木材、ニス塗装木材、ステンド木材、ワックス木材、リノリウム、アクリルポリマー及びアルミナ三水和物の組成物、フォーマイカ、金属、ステンレス鋼、鋼鉄、鉄、錬鉄、銅、真鍮、青銅、銀、金、白金、アルミニウム、及び前記金属の合金、セラミック、塗面、炭素繊維、繊維材料、ウール、シルク、コットン、麻、サイザル麻、ベルベット、アラミド、アクリル、オレフィン、ナイロン、レーヨン、スパンデックス、コンクリート、石材、花崗岩、大理石、石鹸石、石灰岩、エルサレムストーン、石英、トラバーチン、スレート、プラスチック、並びにゴムからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前記無生物表面が、
カウンタートップ、テーブルトップ、床、備品、家具、便器、便座、便器水洗ノブ、ドアノブ、蛇口、浴槽、シャワー、温水浴槽、サウナ、シンク、衣類、調理機器、遊具、及び玩具からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
有効量の前記バリア形成組成物が、食用として毒性のないものである、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記バリア層が、約6〜約24時間の持続時間にわたる殺菌作用又は静菌作用を有する、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記該バリア形成組成物が、ガム、湿潤剤、及び抗菌剤を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
スプレーによって前記バリア形成組成物を前記無生物表面上に塗布する、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記バリア形成組成物を拭き塗りすることによって、該バリア形成組成物を含む素材から、該バリア形成組成物を該無生物表面上に塗布する、請求項1に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物が、カンジダ、ニューモニア、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、ポルフィロモナス・ジンジバリス、化膿レンサ球菌、肺炎レンサ球菌、ミュータンスレンサ球菌、黄色ブドウ球菌、エルシニア・エンテロコリチカ、アシネトバクター・バウマニ、サングイスレンサ球菌、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・ゴルドニ、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス、フソバクテリウム・ヌクレアタム、カンジダ・アルビカンス、カンジダクルセイ、カンジダトロピカリス、カンジダグラブラータ、上気道感染を引き起こす微生物、ＨＩＶ、ＥＢＶ、及びインフルエンザウイルスからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１５】
前記微生物が、カンジダ、ニューモニア、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、レンサ球菌、ポルフィロモナス・ジンジバリス、化膿レンサ球菌、肺炎レンサ球菌、ミュータンスレンサ球菌、黄色ブドウ球菌、エルシニア・エンテロコリチカ、アシネトバクター・バウマニ、サングイスレンサ球菌、ストレプトコッカス・オラリス、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・ゴルドニ、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス、フソバクテリウム・ヌクレアタム、カンジダ・アルビカンス、カンジダクルセイ、カンジダトロピカリス、カンジダグラブラータ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、インフルエンザウイルス、上気道感染を引き起こす微生物、臭気の原因となる微生物、センティペーダ・ペリオドンティイ、アイケネラコローデンス、腸内細菌、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタム、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルフム、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ビンセンティ、フゾバクテリウム・ペリオドンティカム、ポルフィロモナス・エンドドンタリス、プレボテラ（バクテロイデス）・メラニノジェニカ、プレボテラ・インテルメディア、バクテロイデス（バクテロイデス）・レーシェイ、ソロバクテリウム・ムーレイ、タンネレラ・フォーサイシア（バクテロイデス・フォーサイシア）、トレポネーマ・デンティコラ、表面の外観を損なう微生物、クロストリジウム・ディフィシレ、百日咳菌、バークホルデリア、アスペルギルス・フミガーツス、ペニシリウム属、クラドスポリウム、HPV、風邪ウイルス、肺炎桿菌、豚コレラ菌、大腸菌（O157:H7）、毛瘡白癬菌、ライノウイルス39型、RSウイルス、ポリオウイルス1型、ロタウイルスWa株、A型インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス1型及び2型、並びにA型肝炎ウイルスからなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項１６】
前記バリア形成組成物の前記湿潤剤が、以下の要件を満足する、請求項3に記載の方法：
約0.07%≦H＜1%。
【請求項１７】
炭水化物ガム、湿潤剤、及び抗菌剤を含む表面処理用のバリア形成組成物であって、
該バリア形成組成物が以下の要件を満足する、バリア形成組成物：
約0.0001%≦C≦約0.4%；
約0.07%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜A
又は
約0%≦C≦約0.4%；
約55%≦H≦約70%；及び
0.0005%＜Aであり、
ここで、全てのパーセンテージは全該組成物の重量によるものであり；
Cは炭水化物ガム；Hは湿潤剤；そしてAは抗菌剤であり；
該バリア組成物が微生物を捕捉、及び中和、又は殺滅する効果がある。
【請求項１８】
前記ガムが存在する場合、該ガムが該バリア形成組成物全体の約0.0001重量%〜約0.4重量%の量で存在する、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
前記バリア形成組成物の前記湿潤剤が以下の要件を満足する、請求項17に記載の組成物：
約0.07%≦H＜1%。
【請求項２０】
前記抗菌剤がモノ第4級アンモニウム化合物である、請求項17に記載の組成物。
【請求項２１】
前記バリア形成組成物のpHが5.5より大きく約8までである、請求項17に記載の組成物。
【請求項２２】
前記バリア形成組成物が、使用のために、他の組成物と混合させて活性化する必要のない、安定な一剤型組成物である、請求項17に記載の組成物。
【請求項２３】
前記バリア形成組成物が、ポリビニルアルコール、研磨剤、又は揮発性有機化合物を含まない、請求項17に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗菌剤が、多価アルコールの脂肪酸エーテル若しくは脂肪酸エステル又はそれらのアルコキシル化誘導体を含まない、請求項17に記載の組成物。
【請求項２５】
前記バリア形成組成物が、有効量で摂取された場合でも、ヒトには毒性のない、請求項17に記載の組成物。
【請求項２６】
前記バリア形成組成物が500cps未満の粘度を有する、請求項17に記載の組成物。
【請求項２７】
前記バリア形成組成物が界面活性剤又は起泡剤を含まない、請求項17に記載の組成物。
【請求項２８】
前記抗菌剤が以下から選択される、請求項17に記載の組成物：
モノ第4級アンモニウム化合物、QAC、セトリミド、塩化ベンザルコニウム、塩化セタルコニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ミリスタルコニウム、ポリサイド、ビクオターナリ（biquaternaries）、ビスビグアニド（クロロヘキシジン、Barquat、ヒビテン）、ビグアニド、ポリマービグアニド、ポリヘキサメチレンビグアニド、バントシル、コスモシル、ジアミジン、塩素系及びヨウ素系化合物を含むハロゲン放出剤、銀及び銀の抗菌化合物、過酢酸（PAA）、スルファジアジン銀、フェノール類、ビスフェノール類、過酸化水素、ヘキサクロロフェン、及びハロフェノール等のカチオン性抗菌剤並びにその薬学的に許容される塩、並びにこれらの混合物。
【請求項２９】
前処理済み使い捨てワイプであり、少なくとも部分的に組成物を浸透させた使い捨てワイプ素材を含み、該組成物が、炭水化物ガム、湿潤剤、及び抗菌剤を含み；
ここで該バリア形成組成物が以下の要件を満足する前処理済み使い捨てワイプ：
約0.0001%≦C≦約0.4%；
約0.07%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜A
又は
約0%≦C≦約0.4%；
約55%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜Aであり、
ここで、全てのパーセンテージは全該組成物の重量によるものであり；
Cは炭水化物ガム；Hは湿潤剤；そしてAは抗菌剤である。
【請求項３０】
請求項29に記載の前処理済み使い捨てワイプであり、表面を拭き塗った後、該表面上に薄いバリアを形成するバリア形成組成物を付着させ、該バリア形成組成物が活性微生物を捕捉して、殺滅又は中和してバリア層を通過させないようにする効果がある、前処理済み使い捨てワイプ。
【請求項３１】
微生物によって生成される臭気を予防又は減少させることを含む方法であって、
抗菌剤を含むバリア形成組成物を無生物表面に塗布し；
少なくとも約1時間の持続時間にわたって、バリア層に接触した微生物を捕捉及び殺滅又は中和する効果がある該バリア層を該無生物表面上に形成させ、それにより、該微生物によって生成される臭気が該バリア層から漏れるのを予防又は減少させる方法。
【請求項３２】
前記バリア形成組成物が以下の要件を満足する、請求項31に記載の方法：
約0.0001%≦C≦約0.4%；
約0.07%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜A
又は
約0%≦C≦約0.4%；
約55%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜Aであり、
ここで、全てのパーセンテージは全該バリア形成組成物の重量によるものであり；
Cは炭水化物ガム；Hは湿潤剤；そしてAは抗菌剤である。
【請求項３３】
臭気の原因となっている前記無生物表面の部位を識別することと、前記バリア形成組成物を該部位に塗布することを更に含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
前記バリア層が、約6〜約24時間の持続時間にわたる殺菌作用又は静菌作用を有する、請求項31に記載の方法。
【請求項３５】
表面で目に見えて増殖する微生物、又は表面の変色が原因である、表面の外観の損耗の予防又は処置を含む方法であって、
抗菌剤を含むバリア形成組成物を表面に塗布し；
少なくとも約1時間の持続時間にわたって、バリア層に接触した微生物を捕捉及び殺滅又は中和する効果がある該バリア層を該表面上に形成させ、それにより、目に見える増殖又は該表面の変色を予防又は減少させる方法。
【請求項３６】
前記バリア形成組成物が以下の要件を満足する、請求項35に記載の方法：
約0.0001%≦C≦約0.4%；
約0.07%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜A
又は
約0%≦C≦約0.4%；
約55%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜Aであり、
ここで、全てのパーセンテージは全バリア形成組成物の重量によるものであり；
Cは炭水化物ガム；Hは湿潤剤；そしてAは抗菌剤である。
【請求項３７】
目に見える微生物増殖又は変色がある前記表面の部位を識別することと、前記バリア形成組成物を該部位に塗布することとを更に含む、請求項35に記載の方法。
【請求項３８】
前記バリア層が、約6〜約24時間の持続時間にわたって殺菌作用又は静菌作用を有する、請求項35に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、バリア形成組成物及び感染症の蔓延を防ぐための表面処理方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
感染症を効果的に防ぐデバイス、組成物、その他の処置法が長年必要とされてきた。この問題を解決する試みとしては、マスク又は人工呼吸器の着用、及び罹患又は病原菌の保持が確認されている又は予想される人や動物の回避又は隔離が挙げられる。このような手段は、公共交通機関や人が集まる場所などの汚染環境に身を置く人々がマスクを着用するような国では一般的である。表面へ使用するさまざまな種類の殺菌剤及び抗菌剤が、表面接触から有害な微生物が拡散することを防ぐために開発されている。
【０００３】
人間や動物に接した微生物を殺滅する諸種の解決策が存在するが、かかる解決策の有効性は、微生物が粘膜表面又は皮膚の外傷部位の宿主細胞に結合し、それによって微生物が体内に入り個体に感染する前に細菌の接触をどれほど迅速に認識し殺菌組成物を適用できるかにかかっている。例えば、抗菌石鹸による洗浄は手の細菌を殺滅するのに効果的であり得るが、人間は無意識のうちに汚染表面に触れ、手を洗う前に口や鼻の内外に手を持っていくことが非常によくある。加えて、「抗細菌性」であるだけで、定義の通り細菌を殺滅する製品の多くが、真菌及びウイルスの蔓延を抑制できないこともある。手洗いや表面消毒は、通常持続時間が短く、多くの微生物がすぐに再増殖するか、又は新しい微生物が表面に付着するようになる。
【０００４】
マスク等の物理的な道具は不快感を与え、亜鉛、ビタミンC及び薬草療法は効果が証明されておらず、既に身体に接触した細菌を殺滅するための表面消毒剤や解決策は、間欠的で一時的な選択肢であり持続的な抗菌効果は実現できないため、感染症の予防に効果的でないことが多い。
【０００５】
家財の表面、健康器具の表面、職場又はオフィスの表面、及び時々汚染されてしまうその他諸種の表面上の病原体を殺滅するため、多くの組成物が開発されてきた。しかし、これら組成物は通常、非常に揮発性である有機化合物を含み、即時に微生物を殺滅するが、すぐさま蒸発し、及び／又は洗浄もしくは拭き取られてしまい、微生物増殖を数分以上にわたり抑制することはない。また、そのような組成物を素早く塗布しても、表面上に存在する全ての微生物を殺滅する可能性は低い。したがって、残った微生物が、当然のことながら短時間で再増殖する。
【０００６】
臭気を隠す作用又は消臭作用、もしくはカビや表面の外観の劣化を引き起こすその他の微生物を殺滅する作用のある組成物もまた開発されてきた。しかし、それらの使用のための、長時間持続し、強力で、概して無毒な解決策の改善が望まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開WO/2012/145307号、"Method of Inhibiting Harmful Microorganisms and Barrier-Forming Composition Therefor."
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】"Gastrointestinal mucosal injury in experimental models of shock, trauma, and sepsis," Crit. Care Med. 1991; 19:627-41.
【非特許文献２】"Prevention and Management of Oral Infections in Cancer Patients" Supportive Care in Cancer, Vol. 7, No. 4, 224-228 (1999), Anders Heimdahl.
【非特許文献３】"Infection and Mucosal Injury," Cancer Treatment Journal of the National Cancer Institute, Monographs No.29 (2001), Shahab A. Khan, John R. Wingard,
【非特許文献４】"Halitosis (breath odor)." Periodontol 2000 48: 66-75, Scully, C. and J. Greenman (2008)
【非特許文献５】Frank-Albert Pitten and Axel Kramer, "Efficacy of Cetylpyridinium Chloride Used as Oropharyngeal Antiseptic," Arzneim.Forsch./Drug Res.51 (II), pp588-595 (2001)
【非特許文献６】Department of Health and Human Services (Food and Drug Administration) (1994) Oral Health Care Drug Products for Over-the-Counter Human Use; Tentative Final Monograph for Oral Antiseptic Drug Products. Proposed Rules (21 CFR Part 356, Docket No. 81N-033A, RIN 0905-AA06). Federal Register 59:6084-124
【非特許文献７】Chandra et al. "In vitro Growth and Analysis of Candida Biofilms" Nature Protocols 3(12):1909-1924 (2008)
【発明の概要】
【０００９】
一実施形態において、表面の微生物を捕捉、中和、又は殺滅する方法であって、抗菌剤を含むバリア形成組成物を無生物表面に塗布すること；該無生物表面にバリア層を形成させること；該バリア内において、表面で接触した微生物、及び塗布ステップ後に周囲から来て接触した微生物を捕捉し殺滅することを含む方法を実行する。バリア層は、少なくとも約１時間の持続時間にわたって殺菌作用又は静菌作用を有するものである。
【００１０】
一実施形態において、表面処理用バリア形成組成物は、炭水化物ガム、湿潤剤、及び抗菌剤を含む。該バリア形成組成物は下記の要件を満足する：
約0.0001%≦C≦約0.4%、
約0.07%≦H≦約70%、かつ
0.0005%＜A、
又は
約0%≦C≦約0.4%、
約55%≦H≦約70%、かつ
0.0005%＜Aであり、
ここでこれらのパーセンテージは全て組成物全体における重量%を指し；
Cは炭水化物ガム；Hは湿潤剤；Aは抗菌剤である。該バリア組成物が微生物を捕捉、中和、又は殺滅する効果がある。
【００１１】
一実施形態において、前処理済み使い捨てワイプは、少なくとも部分的に組成物を浸透させた使い捨てワイプ素材を含む。該組成物は、炭水化物ガム、湿潤剤、及び抗菌剤を含む。該バリア形成組成物が以下の要件を満足する：
約0.0001%≦C≦約0.4%；
約0.07%≦H≦約70%；かつ
0.0005%＜A、
又は
約0%≦C≦約0.4%；
約55%≦H≦約70%；
かつ0.0005%＜Aであり；
ここでこれらのパーセンテージは全て組成物全体における重量%を指し；
Cは炭水化物ガム；Hは湿潤剤；Aは抗菌剤である。
【００１２】
一実施形態において、微生物によって生成される臭気を予防又は減少させることを含む方法は、抗菌剤を含むバリア形成組成物を無生物表面に塗布し；少なくとも約１時間の持続時間にわたって、バリア層に接触した微生物を捕捉及び殺滅又は中和する効果があるバリア層を無生物表面上に形成さることで、微生物によって生成される臭気がバリア層から漏れるのを予防又は減少させる。
【００１３】
一実施形態において、表面で目に見えて増殖する微生物、又は表面の変色が原因である表面の外観の損耗の予防又は処理を含む方法は、抗菌剤を含むバリア形成組成物を表面に塗布し；少なくとも約１時間の持続時間にわたって、バリア層に接触した微生物を捕捉及び殺滅又は中和する効果があるバリア層を該表面上に形成させ、それにより、目に見える増力又は表面の変色を予防又は減少させる。
【００１４】
一実施形態において、感染症を引き起こす微生物を捕捉、及び中和、又は殺滅する方法では、抗菌剤を含むバリア形成組成物を装置表面に塗布すること；少なくとも約1時間の持続時間にわたって、バリア層に接触した微生物を捕捉及び殺滅又は中和する効果があるバリア被膜を該装置表面上に形成させることを含み、それにより、微生物由来の感染の危険性を予防又は低減させる。
【００１５】
本明細書で使用する不定冠詞の「a」及び定冠詞の「the」は、別段の指定がない限り「one or more（1つ又は複数の）」を意味する。
【００１６】
本明細書では「アイテム（item）」及び「装置（apparatus）」という用語を同義に使用する。
【００１７】
本明細書では「治療（therapeutic）」という用語を予防的治療にも用いる。
【００１８】
本明細書で使用する「又は」という用語は、別段の指定がない限り排他的な意味を持つものではない。
【００１９】
本明細書で使用する「哺乳動物」という用語は、一般に哺乳動物として定義されるヒト又は動物を意味する。
【００２０】
本明細書で使用する「遮断する（block）」又は「遮断（blocking）」という用語は、捕捉することで通過を遮断するという意味を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】処理済み及び未処理の無生物表面、並びに微生物と接触した場合の結果を示すフローチャートである。
【図１Ｂ】バリア形成組成物の一実施形態における、提案の抗菌活性機序を示す図である。
【図２】実験例2において記載する、粘膜表面上のバリアの形成を示す概略図である。
【図３】各実験例11〜15における、細胞の増殖及び遊走により6時間後に創部が覆われる、創傷上皮細胞試料の修復プロセスをパーセンテージで示すグラフである。
【図４】創傷上皮試料上における未処理の対照群実験例15並びに処理済みの実験例16及び17に関する、上皮細胞の増殖及び遊走を示す顕微鏡写真を示す図である。
【図５】実験例11〜15における、バリア形成組成物で処理済み及び未処理の操作ヒト口腔粘膜（EHOM）の拡大断面写真を示す図である。
【図６】実験例16〜19及び実験例20〜25のLDHアッセイを示すグラフである。
【図７】実験例27〜28において記載する、EHOMアッセイの上部チャンバ及び下部チャンバ内における微生物増殖の評価方法を示す概略図である。
【図８】実験例27〜28において記載する、EHOMアッセイの上部チャンバ及び下部チャンバ内の微生物増殖を示す寒天培地プレートの写真を示す図である。
【図９】実験例31〜32における、バリア形成組成物で処理済み及び未処理の操作ヒト口腔粘膜（EHOM）の拡大断面写真を示す図である。
【図１０】実験例33-40において記載する、未処理のEHOM上、又は例示的なバリア形成組成物で処理したEHOM上における微生物の増殖と、その後のC. albicans（カンジダ・アルビカンス）への感染を示す写真を示す図である。
【図１１】実験例33-40において記載する、未処理のEHOM上、又は製剤で処理したEHOM上における微生物の増殖と、その後のS. mutansへの感染を示す写真を示す図である。
【図１２】実験例33-40において記載する、例示的なバリア形成組成物で処理したEHOMの（下部チャンバから収集した）「フロースルー」培地に由来する微生物の増殖を示す写真を示す図である。
【図１３】実験例40〜47において記載する、食塩水（対照群）又は例示的なバリア形成組成物で処理したEHOMによるLDH放出と、その後の（A）C. albicans、又は（B）S. mutansへの感染を示すグラフである。
【図１４】実験例48〜61及び実験例61〜69において記載する、細菌及び真菌に対するバリア形成組成物の事後抗菌効果を示すグラフである。
【図１５】実験例71〜76において記載する、未処理又はバリア形成組成物で処理済みのS. sanguis、 C. albicans及びS. mutansを示す走査型電子顕微鏡写真を示す図である。
【図１６】実験例77-79において記載する、細菌及び真菌によって形成されるバイオフィルムに対する例示的なバリア形成組成物の活性を示すグラフである。
【図１７】実験例80〜81において記載する、1分間の曝露後の微生物のバイオフィルムに対する例示的なバリア形成組成物の活性を示すグラフである。
【図１８】実験例85-86において記載する、インフルエンザ（H1N1）に感染したMDCK細胞の細胞変性効果（CPE）に対する例示的なバリア形成組成物の効果を示す蛍光顕微鏡写真を示す図である。
【図１９】実験例85-86において記載する、H1N1ウイルスに対する例示的なバリア形成組成物の効果を示す蛍光顕微鏡写真を示す図である。
【図２０】実験例87〜88において記載する、バリア形成組成物で処理済み及び未処理の感染細胞中のインフルエンザウイルスのレベル（定量PCRで判定）を示すグラフである。
【図２１】実験例89〜91において記載する、防腐剤及びインフルエンザウイルスに対する抗菌剤（CPC）を用いて又は用いずに調製した例示的なバリア形成組成物の直接抗ウイルス活性（定量PCRで判定）を示すグラフである。
【図２２】H1N1ウイルスに対する例示的なバリア形成組成物の6時間中の活性を示す図であり、パネル（A）は未処理の対照群と比較したウイルス増殖の阻害率を示すグラフであり、パネル（B）及び（C）は、（B）が未処理の細胞の顕微鏡写真、（C）がバリア形成組成物で処理した細胞の顕微鏡写真を示す図である。
【図２３】実験例94-96において記載する、HIVに対する製剤の活性を示すグラフである。
【図２４】実験例97において記載する、エプスタインバールウイルス（Epstein-Barr Virus：EBV）に対する実験例8の活性を示すウエスタンブロットを示す図である。
【図２５】実験例154〜159において記載する、未処理（対照群）のEHOM組織、又は実験例5〜7に晒したEHOM組織の細胞完全性の指標となるLDHレベルを示すグラフである。
【図２６】実験例160において記載する、実験例3（5%希釈液）で10分間処理した創傷口腔上皮細胞培養物の代表的な写真を示す図である。写真はそれぞれ創傷の直後（パネルA）、創傷の約6時間後（パネルD）、及び創傷の約24時間後（パネルE）の状態を示し、パネルB及びCはそれぞれ約6時間後及び約24時間後における口腔上皮細胞の未処理対照群融合性培養物上の同等の創傷部を示す。
【図２７】例示的なバリア形成組成物による口腔粘膜表面の被覆能力を証明する写真を示す図である。
【図２８】実験例162〜163において記載する、例示的なバリア形成組成物に1分間晒した後の細菌増殖の経時的顕微鏡検査結果の写真を示す図である。画像はそれぞれ曝露後20分後、120分後、又は360分後の細菌増殖を示す。
【図２９】実験例164〜166において記載する、健康な人間の口腔微生物に対する例示的なバリア形成組成物の単回投与の効果を示すグラフであり、ベースラインと比較した（A）CFUにおける微生物負荷、及び（B）微生物負荷の減少（%）を示す。
【図３０】実験例167〜169において記載する、3人の健康な成人の口腔細菌レベルに対する例示的なバリア形成組成物の5日間にわたる影響を示すグラフである。
【図３１】実験例170〜198において記載する、31人の健康な被験者において例示的なバリア形成組成物を5日間使用した後の、口腔内の微生物負荷に対する該バリア形成組成物の影響を示すグラフである。
【図３２】実験例170〜198において記載する、代表的な3人の研究参加者から得た口腔試料中の微生物負荷を示すグラフである。
【図３３】実験例199〜205において記載する、例示的なバリア形成組成物により形成されたバリアを越える微生物の浸透を評価するためのin vitroフィルター挿入ベースモデルを説明する概略図である。
【図３４】実験例219〜224において記載する、PBS（対照、A、C、E）及び実験例7のバリア形成組成物（B、D、F）で処理したシリコーン・エラストマーディスク表面のMRSAバイオフィルムの増殖を示す写真である。
【図３５】実験例252のバリア形成組成物の異なる時間間隔（a）、（b）、（c）、及び実験例253（d）のバリア形成組成物の実施形態で処理した細胞単層を示す写真である。
【図３６】実験例252のバリア形成組成物の異なる時間間隔（a）、（b）、（c）、及び実験例253（d）のバリア形成組成物の実施形態で処理した細胞単層を示す免疫蛍光の写真である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本願は、2012年4月17日に出願した先行出願PCT/US12/33921で、国際公開WO/2012/145307号で公開された"Method of Inhibiting Harmful Microorganisms and Barrier-Forming Composition Therefor."を、参照により援用するものとする。本願はまた、2012年11月12日に出願した米国仮出願第61/725,375号も参照により援用するものとする。
【００２３】
本願は、表面処理／清掃のための安定した組成物を開示し、該組成物は有害微生物の増殖を阻害又は破壊する長時間持続性の殺菌作用又は静菌作用を有し、またバリア形成特性を持つものである。また、諸実施形態において、該組成物は食用としても安全である。
【００２４】
本明細書に記載のデータは、それが広範な微生物に対して長時間持続する抗菌性のあるバリア形成組成物を示す限りにおいて、多種の表面に対する処理の代表的なデータである。
【００２５】
感染症を引き起こす表面の微生物を遮断及び／又は中和することにより、結果として微生物の体内への移動と拡散、そして感染を阻止又は予防する。
【００２６】
更に、臭気の原因となる表面の微生物を遮断及び／又は中和することにより、結果として臭気が表面から漏れるのを阻止及び／又は予防する。
【００２７】
また、表面の美的外観を損なう、又は表面の美的外観を損なうようになる可能性のある微生物（カビなど）を遮断及び／又は中和することにより、結果として表面の美的外観の損耗を阻止及び／又は止める。
【００２８】
本願の方法と組成物は、細菌、真菌、及びウイルスなどの感染を引き起こすと知られている微生物を阻害する抗菌剤を含む。本願の方法は、バリアフィルム又はバリア被膜を表面に形成することで表面にバリアを提供し、抗菌剤には微生物（細菌、真菌及びウイルス）を殺滅又は阻害するものが含まれる。一実施形態において、バリア形成組成物は臭気の原因及び表面の美的外観の損耗の原因となる微生物に対しても有効である。
【００２９】
本明細書のデータが示す通り、たとえ哺乳動物が表面に接触し、バリア組成物の一部がその体に移り、ヒト又はその他哺乳動物の粘膜、例えば口腔、鼻腔、膣腔、喉及び耳やその他の開口部などの表面に接触したとしても、該組成物は、一実施形態において、そのような摂取には安全で無毒である。実験例で製品が粘膜組織に直接塗布されている通り、表面処理組成物は、例え子供が口を直接処理済みの表面に付け、組成物の一部を摂取したとしても安全であると期待される。別の実験例において、食品に触れるような調理器具又はその他アイテムは該バリア形成組成物で被膜されてもよく、組成物の一部が食品表面に付いて、それによりヒトの粘膜に接触して摂取されたとしてもよい。
【００３０】
活性化病原性微生物が貫通するのを阻害するバリアを形成する、無毒で安全なバリア形成組成物が望ましい。別の望ましい特性は、静菌作用又は殺菌作用により微生物の増殖を長時間にわたって阻止する能力である。理論に縛られるものではないが、本明細書に開示するバリア形成組成物の作用機序は、まず形成したバリア被膜内で細菌を捕捉し、その後抗菌活性成分によって殺滅する相乗的な二重作用機序に基づくものである。一実施形態において、バリア形成組成物は親水性でなく、理論に縛られるものではないが、持続的有効性を増強することが理論付けられている。ある応用例では、組成物は乾燥表面用に接着特性があってもよく、及び／又は疎水性であってもよい。
【００３１】
後述の実施例に示すように、少なくとも下記の10種類のアプローチを使用して、本発明のバリア形成組成物の特性及び多種多様な伝染病の予防に対するその有効性の評価を行った。（1）in vitro抗微生物感受性テスト、（2）in vitroタイムキルアッセイ、（3）in vitroバイオフィルムモデル、（4）in vitroフィルターインサートベースモデル、（5）in vivo様操作ヒト口腔粘膜（EHOM）モデル、（6）電子顕微鏡評価、（7）疎水性アッセイ、（8）物理化学的適合性アッセイ、（9）単層のヒト細胞株を使用した細胞培養ベースモデル、及び（10）ヒト臨床試験。
【００３２】
本明細書に記載する方法及び組成物は、ヒト若しくはより一般的には哺乳動物が損傷した皮膚又は粘膜を有する場合、又は免疫抑制状態に陥るような条件を有する場合、又はその他の状況で感染の危険性がある場合に特に有用であり得る。損傷は創傷、掻き傷、又はその他の皮膚若しくは粘膜の開放創に起因し得る。皮膚及び口腔や消化管（GI）の粘膜は、様々な微生物の局所侵襲又は全身侵襲、並びに口腔及び腸管の内腔に通常存在する微生物産物の吸収を防止するのに役立つ重要な機械的バリアとして働く（"Gastrointestinal mucosal injury in experimental models of shock, trauma, and sepsis," Crit. Care Med. 1991; 19:627-41参照）。粘膜のバリア機能の障害は全身感染症の病態生理学上中心的な役割を果たす。言い換えれば、このような粘膜の損傷は感染症につながる。
【００３３】
第一防御線を突破されるリスクを解消又は低減することが重要であり、粘膜及び皮膚の完全性を維持することが重要である（Anders Heimdahl, "Prevention and Management of Oral Infections in Cancer Patients" Supportive Care in Cancer, Vol. 7, No. 4, 224-228 (1999)参照）。このように、無傷の皮膚又は粘膜を持つことは特に免疫不全患者（例えば癌患者）においては全身感染に対抗する重要な宿主防御となる（Shahab A. Khan, John R. Wingard, "Infection and Mucosal Injury," Cancer Treatment Journal of the National Cancer Institute, Monographs No.29 (2001)参照）。有害な微生物を遮断し殺滅しながらも損傷した皮膚又は粘膜の治癒を妨げないバリア形成組成物は、損傷した皮膚又は粘膜を有する患者、特に免疫不全も有する患者が抱える感受性の問題に対する予期しないユニークな解決策である。
【００３４】
一実施形態において、バリア形成組成物は、周囲環境（表面及び後に処理後の表面に付着する空中微粒子を含む）から微生物が哺乳動物に移動することを予防又は阻止するための方法で投与することができる。予防とは、微生物由来の感染が起こらないことを意味するわけではなく、バリア形成組成物の塗布時、及び／又は塗布後に発生する微生物由来の感染の危険性が低減されることを意味する。
【００３５】
一実施形態において、バリア形成組成物は、有効量で無生物表面に塗布され、微生物がバリアを貫通するのを阻害することなどにより、微生物を捕捉するバリア層を該表面上に提供する。微生物の有害作用を消失又は不活性化（中和）させる抗菌剤が提供される。混合されたバリア及び抗菌剤は、無生物表面上の微生物、又は後に露出しているバリア層の表面上部に接触するような微生物を相乗的に遮断、中和、及び／又は殺滅し、それによって、抗菌剤単独の場合よりも著しく強力で長時間持続する抗菌剤を提供する。バリアは、既に処理済の表面に存在する微生物を補足及び殺滅、又は中和するのに有効であり及び／又はバリア形成組成物の塗布が実施された後に、バリア上部、すなわちバリア層の露出している表面に付着し得る微生物の遮断及び殺滅、又は中和するのに有効である。一実施形態において、バリア層は少なくとも塗布後約1時間効果がある。
【００３６】
この二重作用組成物及び方法（バリア＋抗菌剤）は、家、学校、教会、レストラン、デイケア、職場、車、及び病院などのさまざまな場所にある多種の表面、例えばセラミック、ガラス、木材（ニス塗装木材、ステンド木材、ワックス木材などを含む）、リノリウム、CORIAN（アクリルポリマー及びアルミナ三水和物の組成物）、フォーマイカ、磁器、金属（ステンレス鋼、鋼鉄、鉄、錬鉄、銅、真鍮、青銅、銀、金、白金、アルミニウム、及びそのような金属の合金などを含む）、セラミック、塗面、炭素繊維、繊維材料（ウール、シルク、コットン、麻、サイザル麻、ベルベット、アラミド、アクリル、オレフィン、ナイロン、レーヨン、及びスパンデックスなどを含む）、コンクリート、石材（花崗岩、大理石、石鹸石、石灰岩、エルサレムストーン、石英、トラバーチン及びスレートなどを含む）、プラスチック、タイル、カーペット及びゴムなどの表面に適用可能である。無生物表面の種類には、例えばカウンタートップ、テーブルトップ、床、備品、家具、便器、便座、便器水洗ノブ、ドアノブ、蛇口、浴槽、シャワー、温水浴槽、サウナ、シンク、衣類、調理機器、遊具、及び玩具などが含まれる。
【００３７】
図1Aのフローチャートは、微生物が未処理の無生物表面（左）、及びバリア形成組成物を投与された結果バリア層が形成された無生物表面（右）に接触した場合のフローチャートであり、無生物表面におけるバリア形成組成物の主要な効果を示している。粘膜を微生物による感染から保護する代わりに無生物表面を処理すると、バリア層は微生物が表面に結合してコロニーを作り、バイオフィルムを形成することを防ぐ。バイオフィルムは破壊するのが困難であることが知られている。よってバリア形成組成物は、既に表面に付着した微生物のみを殺滅することにのみ重点を置く洗剤と比べ、衛生的な表面を提供するには目覚ましいほど効果的な解決策を与える。バリアを形成しない抗菌性の解決策は、表面のバイオフィルム中のいくらかの微生物を即座に殺滅する一方、バイオフィルム中の全ての微生物を殺滅することは実質的に不可能であり、バイオフィルムはすぐに再びコロニーを形成し始める。対照的に、バリア形成組成物は最初の段階でバイオフィルムが形成されるのを防ぎ、そしてまた、既に形成されたバイオフィルムを破壊する持続性のある活性を持つ。
【００３８】
一実施形態において、バリア形成組成物は、バリア形成組成物に接触する全ての有害な微生物を捕捉及び／若しくは殺滅、又は中和する。別の実施形態において、バリアは、バリア形成組成物に接触する十分な量の有害な微生物を実質的に捕捉及び／若しくは殺滅、又は中和し、微生物が感染症を引き起こすのを抑制、又は止めさえする。後者の場合において、有害な微生物の粘膜侵入を遅らせかつ／又は弱めることができれば、微生物が疾患又は広範な感染を引き起こすことを防止する、身体固有の能力が強化される。in vitro試験により、バリア形成組成物の諸実施形態が約2時間以上、約6時間以上、約16時間以上、約24時間以上を含む長時間にわたり全ての細菌がバリアを貫通するのを防止することが証明された。in vitro試験から、バリア形成組成物の諸実施形態に曝露したウイルスでは、増殖が約2日間以上（インフルエンザ等）〜約9日間以上（HIV等）阻止され得ることが分かり、その後もウイルス数は例えば約2〜3日間の長期間にわたってMICを下回ることが示された。インフルエンザウイルスに対する阻害活性は最大48時間観察された。
【００３９】
処理済み表面が哺乳動物に触れられた場合、バリア組成物の一部は哺乳動物に移動し、損傷した皮膚又は粘膜表面に接触することもある。微量の活性微生物が移動したバリア組成物に存在している場合もあり、又は他の場所から拾われて移動したバリア組成物に接触する場合もある。このような場合、理論に縛られるものではないが、まだ活性のあるバリア組成物は、損傷した皮膚又は粘膜部位に対して追加的な抗菌予防活性を有すると期待される。図1Bに示すバリア形成組成物の提案される機序を示す一実施形態において、バリア形成組成物は抗ウイルス活性をもたらす。ウイルスが細胞に接触すると宿主細胞上の受容体に結合する。5〜6時間が経過すると、ウイルスは宿主細胞によって取り込まれ宿主細胞内で増殖し、他の宿主細胞に感染する追加のウイルス粒子を発生させる細胞溶解を誘発する。。るを
【００４０】
対照的に、バリア形成組成物に接触した、損傷皮膚若しくは損傷粘膜表面、又は粘膜表面では、宿主細胞の表面上に保護バリアが存在する。このバリアが細胞及び細胞上の受容体を保護し、ウイルス粒子が細胞受容体に結合するのを阻止する。このため感染及び溶解も防止される。同様に、損傷した皮膚若しくは粘膜表面、又は粘膜表面は、細菌又は真菌からも保護される。
【００４１】
バリア形成組成物は、約2時間以上、約6時間以上、約16時間以上、約16時間〜約24時間、又は約24時間以上という長い持続時間にわたってバリアを保持し、それにより宿主細胞を保護し感染を予防する。殺菌作用又は静菌作用も、約2時間以上、約6時間以上、約16時間以上、約24時間以上、又は約48時間以上という長い持続時間にわたって保持され、それにより微生物が哺乳動物に移動する前に微生物を殺滅し、例え哺乳動物に移動したとしても、宿主細胞を保護し続け、感染を予防する。これら持続はウイルス、細菌、及び真菌に適用可能である。
【００４２】
別の実施形態において、バリア形成組成物は、アイテム又は装置が汚染環境に接触する前に、かつアイテム又は装置が哺乳動物の粘膜に接触する前に、当該アイテム又は装置上に投与される。バリア形成組成物により、微生物を捕捉して殺滅するバリアが前記アイテム又は装置上に設けられ、それにより微生物が粘膜に達すること又は感染を引き起こすことが防止される。
【００４３】
有害微生物とは感染症を引き起こすことが知られている下記のような微生物、例えばカンジダ属（例えばC. albicans、 C. glabrata、 C. krusei, C. tropicalis等）、ブドウ球菌種（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌、MRSAを含む）、連鎖球菌種（例えばS. sanguis、S. oralis、S. mitis、S. salivarius、S. gordonii、S. pneumoniae）、アシネトバクター・バウマニ、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス、フゾバクテリウム・ヌクレアタム等の微生物、上気道感染若しくは風邪（ライノウイルス）を引き起こすその他の微生物、及びインフルエンザウイルス、及びニューモニア、ポルフィロモナス・ジンジバリス、エルシニア・エンテロコリチカ、アシネトバクター・バウマニ、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス、臭気の原因となる微生物、表面の外観を損なう微生物、クロストリジウム・ディフィシレ、百日咳菌、バークホルデリア、アスペルギルス・フミガーツス、ペニシリウム属、クラドスポリウム、肺炎桿菌、豚コレラ菌、大腸菌（O157:H7）、毛瘡白癬菌、ライノウイルス39型、RSウイルス、ポリオウイルス1型、ロタウイルスWa株、A型インフルエンザウイルス、単純ヘルペスウイルス1型及び2型、及びA型肝炎ウイルスであり、これらに起因する感染症の処理及び予防である。一実施形態において、本明細書に記載するバリア形成組成物並びに処理及び予防方法は、例えば性感染症（例えばヒト免疫不全ウイルス（HIV）、単純ヘルペス又はヒトパピローマウイルス（HPV）に起因する感染症等）に起因する感染症の予防に有用である可能性がある。
【００４４】
バリア形成組成物は、例えば約30nm以上、例えば約100nm（HIV；球状）、約100nm〜約300nm（インフルエンザ；細長球状）、約120nm〜約260nm（EBV；球状／ディスク状）、約30nm（ライノウイルス；球状）の直径を有する微生物に対して有効性を示した。したがって、バリア組成物は約30nm又は約30nm超の直径を有する他の微生物に対しても有効性を有することになる。
【００４５】
バリア形成組成物は、根絶させるのがかなり困難であるバイオフィルムへの、強力で目覚ましい抑制活性まで示した。一実施形態において、本願の方法はバリア形成組成物を表面上で形成したバイオフィルムに投与すること、又はバリア被膜に接触した微生物がバイオフィルムを形成するのを抑制することを含む。
【００４６】
一実施形態において、本明細書に記載するバリア形成組成物並びに処理及び予防は、例えば、上記に記載のいずれかの表面上に存在する又は増殖している微生物から発する臭気の予防及び／又は処置に有用であり得る。
【００４７】
一実施形態において、本明細書に記載するバリア形成組成物並びに処理及び予防は、例えば、台所や浴槽の表面、又は本明細書に記載するいずれかの表面に付着した微生物が原因となる臭気の予防及び／又は処置に有用であり得る。例えば、バリア形成組成物は、料理中に付着した細菌からの臭気、カーペットや車室にこぼれた飲食物又は体液からの臭気、又は臭気を発生させる微生物が表面に付着又は蓄積するようなその他さまざまな原因で発生する臭気を防ぐために使用されてもよい。
【００４８】
臭気を発生させる微生物には、例えば、細菌及び真菌が含まれる。具体例として挙げられるものには、センティペーダ・ペリオドンティイ、アイケネラコローデンス、腸内細菌、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタム、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ポリモルフム、フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ビンセンティ、フゾバクテリウム・ペリオドンティカム、ポルフィロモナス・エンドドンタリス、ポルフィロモナス・ジンジバリス、プレボテラ（バクテロイデス）・メラニノジェニカ、プレボテラ・インテルメディア、バクテロイデス（バクテロイデス）・レーシェイ、ソロバクテリウム・ムーレイ、タンネレラ・フォーサイシア（バクテロイデス・フォーサイシア）、トレポネーマ・デンティコラなどが含まれ、これらはScully, C.及びJ. Greenmanらによる"Halitosis (breath odor)." Periodontol 2000 48: 66-75 (2008)に開示されており、参照により本願に援用されるものとする。本出願では、臭気を発生させる微生物は、有害な微生物でもあると考えられてもよい。
【００４９】
一実施形態において、本明細書に記載するバリア形成組成物並びに処理及び予防方法は、例えば、表面の美的外観の損耗の処置及び予防に有用であり得る。そのような表面の美的外観の損耗は、表面で目に見えて増殖する微生物、及び／又は表面の変色が原因で引き起こされる。一実施形態において、本明細書に記載するバリア形成組成物並びに処理及び予防方法は、例えば、カビによるタイルグラウトのしみの予防及び／又は処置、又は地下階若しくは壁面の予防及び／又は処理に有用であり得る。
【００５０】
表面の美的外観の損耗の原因となる微生物には、例えば、真菌が含まれる。本出願では、表面の美的外観の損耗の原因となる微生物は、有害な微生物でもあると考えられてもよい。
【００５１】
微生物は空気中の微生物であってもよい。一実施形態において、微生物とは、伝染病を引き起こすようなものである。一実施形態において、微生物とは、アレルギー反応又は歯科疾患、例えば、虫歯（カリエス）、歯肉炎、又は季節性アレルギーなどを引き起こすようなものを含まない。同様に、一実施形態において、本願の予防方法は、歯科疾患又はアレルギー反応、例えば、虫歯（カリエス）、歯肉炎、又は季節性アレルギーなどを、単独で又は追加的に予防はしない。
【００５２】
しかし、別の実施形態において、一般的にアレルゲンと分類されるような真菌、その他アレルゲン、及び空気中の粘膜刺激物のような微生物は、本願のバリア及び方法によって遮断される。アレルギー体質の哺乳動物が、屋外環境のような多くのアレルゲン又は空中刺激物を生じさせると知られている又は予想される場所に身を置く場合に、表面をバリア組成物で処理することは特に有効であり得る。
【００５３】
本明細書に開示する方法及び組成物は、特に免疫不全の患者が接触する表面の処理に適用可能である。また、本発明のバリア形成組成物は、一般的に粘膜又は皮膚の創傷に感染する微生物による感染症の予防及び／又は治療に有用であり得る。
【００５４】
一実施形態において、本明細書に記載するバリア形成組成物並びに処理及び予防方法は、例えば活動関連治療、例えば人工呼吸器の使用（人工呼吸器に関連する医療機器が患者と接触する）で汚染される可能性があるアイテムに由来する感染症の予防及び／又は治療に有用であり得る。汚染アイテムの別の例としては、身体への塗布、及び／又は身体と接触する靴等のアイテム若しくは表面への塗布による真菌感染症の処置及び予防が挙げられる。一実施形態において、汚染アイテムとしては例えば食品、飲料、調理器具、飲料容器及びアクセサリー、子供が使用するアイテム、医療機器、又は歯科装置が挙げられる。
【００５５】
一実施形態において、靴などの足を保護する用具の内部表面は、有効量のバリア形成組成物で処理され、真菌増殖による臭気を破壊、抑制、又は予防する。例えば、人が靴を履く前に、その靴に組成物を投与することで処理される。具体的には、人が運動又は何か活動に参加し、足又は靴が湿る前に靴は処理される。別の実施形態において、足に真菌性疾患を持つ場合、例えば運動選手（汗疱状白癬）などの場合、靴は処理される。別の実施形態において、靴が悪臭を発している場合、靴を処理する。これらそれぞれの諸実施形態において、バリア形成組成物は、真菌又はその他細菌の増殖を捉えて殺滅する、又は予防することにより、ヒトの足への感染の危険性を低減させ、微生物による悪臭を隠す及び／又は中和する。
【００５６】
一実施形態において、医療機器の表面は、人体に接触する前にバリア形成組成物で処理される。バリア形成組成物は、医療機器表面に微生物を補足し殺滅する被膜を設ける。医療機器には、例えば、器具、装置、その他製品が含まれ、ヒト組織、血流、粘膜、開放創、及び体内腔などの人体に接触又は接近するようなものが含まれる。医療機器の例には、人工呼吸器、気管装置、カテーテル、中心静脈カテーテル、尿道カテーテル、腹膜透析カテーテル、コンタクトレンズ、関節全置換プロテーゼ、気管内チューブ、声帯プロテーゼ、陰茎プロテアーゼ、睾丸プロテアーゼ、前立腺ステント、人工尿道括約筋、人工乳房、人工血管、矯正器具、人工弁、外科用メス、スコープ、インプラント置換器具が含まれる。一実施形態において、医療機器には、歯科用品も含まれる。
【００５７】
一実施形態において、医療機器は、人体に接触する最長約12時間前にバリア形成組成物で処理され、例えば、人体に接触する約5分〜約8時間前、約12分〜約6時間前、又は約1時間〜約10時間前に処理される。
【００５８】
一実施形態において、医療機器は、スプレー製剤のバリア形成組成物で処理され、湿った被膜が表面に現れるまで医療機器をスプレーすることで処理される。別の実施形態において、医療機器をバリア形成組成物に浸して取り上げ、医療機器上に被膜層が残るように処理される。
【００５９】
一実施形態において、医療機器はカテーテル又は類似の器具であり、喉、肛門、膣管、又は尿管などの哺乳動物の体管に挿入するものである。被膜は体管に接触する前に医療機器に塗布され、挿入する際は、体管に対して潤滑剤となり、体管に沿って抗菌剤を供給するのに役立つ。
【００６０】
一実施形態において、医療機器は、人工股関節などのインプラント器具である。被膜は体管に接触する前に医療機器に塗布され、持続性があり強力な抗菌性バリアを設け、それにより処理前に医療機器に付着していた微生物及び処理後に医療機器に接触した微生物から保護する。
【００６１】
一実施形態において、医療機器は、カテーテル、スコープ、又は手術中に使用される器具で、体の1箇所以上の部位に接触する。そのような医療機器を、人体に最初に接触する前に処理することは、感染性細菌が1つの部位から他の部位に移動する危険性を低減し得る。
【００６２】
別の実施形態において、バリア形成組成物で表面を処理する方法は、汚染表面を認識することを含み、ここで汚染表面は、有害なウイルス、真菌、又は細菌で汚染されていると知られている、又は予想されるものである。
【００６３】
一実施形態において、バリア形成組成物を塗布するステップは、汚染されていない哺乳動物が汚染表面に接触する前又は接触している間に実施される。一実施形態において、バリア形成組成物の塗布は、汚染されている表面の識別に応じて、又は汚染事象の観測に応じて発生する。例えば、人がくしゃみ、咳、若しくは嘔吐して汚染事象が発生した表面、又は更に一般的に、体液若しくは体から出る物質が付着したような表面にバリア形成組成物は塗布される。
【００６４】
別の実施形態において、バリア形成組成物は、口腔粘膜、咽頭粘膜、又は鼻粘膜などの粘膜に、汚染されていると考えられる環境との接触に応じて、又は汚染事象の観測に応じて塗布される。バリア形成組成物は粘膜表面にバリア被膜を設け、被膜がバリア形成組成物塗布後に接触するような微生物を捕捉及び殺滅し、それにより活性化細菌が粘膜へ移動すること又は感染を引き起こすことを予防又は抑制する。
【００６５】
別の実施形態において、バリア形成組成物で表面を処理する方法は、汚染表面を認識することを含み、ここで汚染表面は、臭気を発生させるウイルス、真菌、又は細菌性微生物で汚染されていると知られている、又は予想されるものである。バリア形成組成物を塗布するステップは、臭気が汚染表面から漏れる前又は漏れている間に実施される。例えば、バリア組成物は、食品が扱われている場所、又は体液が付着している場所、又は本明細書に記載のいずれかの表面に塗布される。
【００６６】
一実施形態において、ある方法は、微生物によって生成される臭気を予防又は減少させることを含み、抗菌剤を含むバリア形成組成物を無生物表面に塗布するステップを実施することで臭気を予防又は減少させる。その後バリア形成組成物はすぐ、少なくとも約１時間の持続時間にわたって、バリア層に接触した微生物を捕捉及び殺滅又は中和する効果があるバリア層を無生物表面上に形成さることで、微生物によって生成される臭気がバリア層から漏れるのを予防又は減少させる。バリア層に接触する微生物とは、既に処理済みの表面に存在するような微生物、又は、組成物塗布後に、露出しているバリア層の表面上部に付着するような微生物であり得る。一実施形態において、本願の方法は臭気の原因である無生物表面の部位を識別すること、及びその部位にバリア形成組成物を塗布することを含む。
【００６７】
別の実施形態において、バリア形成組成物で表面を処理する方法は、汚染表面を認識することを含み、ここで汚染表面は、表面の美的外観の損耗の原因となるウイルス、真菌、又は細菌性微生物で汚染されていると知られている、又は予想されるものである。バリア形成組成物を塗布するステップは、汚染表面の美的外観の損耗が発生する前、発生している間、又は発生後に実施される。例えば、バリア組成物は、カビの増殖が目に見えてわかる、若しくはカビと接触すると予想される浴室のタイルグラウト、又は、カビの増殖が目に見えてわかる、若しくはカビと接触すると予想される、本明細書に記載のその他の表面に塗布されてもよい。
【００６８】
一実施形態において、本願の方法は、表面の美的外観の損耗の予防又は処置を含み、ここで損耗は、表面で目に見える増殖又は表面の変色を生じさせる微生物が原因となる。処置と予防は、抗菌剤を含むバリア形成組成物を表面上に塗布するステップ；少なくとも約１時間の持続時間にわたって、バリア層に接触した微生物を捕捉及び殺滅又は中和する効果があるバリア層を表面上に形成させるステップにより促進され、それにより、目に見える増殖又は表面の変色を予防又は減少させる。バリア層に接触する微生物とは、既に処理済みの表面に存在するような微生物、又は、組成物塗布後に、露出しているバリア層の表面上部に付着するような微生物であり得る。一実施形態において、本願の方法は、表面で目に見える増殖又は表面の変色がある部位を識別するステップ、及びその部位にバリア形成組成物を塗布するステップを含む。
【００６９】
別の実施形態において、バリア形成組成物での表面処理方法は、表面がウイルス、真菌、又は細菌で汚染されていると知られているか、又は予想されるかにかかわらず、積極的に表面をバリア形成組成物で処理することを含む。一実施形態において、投与されたバリア被膜は、処理ステップ後にバリア被膜に接触した微生物を捕捉及び殺滅する。本明細書に開示されているように、バリア被膜は、処理ステップ後長時間持続して、バリア被膜に接触する微生物を殺滅し、それにより予防的処理としての効果を促進し、これは、一部には長時間持続する効果が無いために、予防的処理としては効果のない先行技術の抗菌性組成物とは対照的である。
【００７０】
別の実施形態において、バリア形成組成物での表面処理方法は、食品表面をバリア形成組成物で処理することを含む。例えば、食品表面をバリア形成組成物で処理する方法は、汚染の可能性がある食品表面又は食品表面付近で発生している汚染事象を識別することを含み、ここで表面は、有害なウイルス、真菌、若しくは細菌性微生物で汚染されていることが知られている又は予想され、又はそれらに曝露していることが知られている又は予想される。
【００７１】
例えば食品表面は、果物や野菜などの農産物から選択されてもよく、例えばサラダ野菜、レタス、キャベツ、玉ねぎ、ほうれん草、ブロッコリー、人参、芽キャベツ、じゃがいも、ナッツ、人参、りんご、オレンジ、バナナ、ベリーなどを含む。食品表面は例えば生肉のような肉を含んでもよく、例えば、牛肉、豚肉、ラム肉、鶏肉、及び七面鳥などを含む。食品表面は、ボローニャ、サラミ、ペパローニ、及びフランクフルトなどの加工肉を含んでもよい。
【００７２】
特定の実施形態において、バリア形成組成物は、大腸菌、サルモネラ菌、ボツリヌス菌、又はリステリア菌が存在するという高い危険性があるとみなされる食品表面に塗布されてよい。高い危険性は、ある種類の食品表面、又は一般的な地域で知られている食品表面の汚染で、以前起こった感染についての知識を基にしてもよい。高い危険性は、食品表面の汚染物質への、既知の又は起こり得る曝露を基にしてもよい。
【００７３】
一実施形態において、食品表面は、人が食品表面の付近でくしゃみ又は咳をするなどの汚染事象に応じて処理される。例えば、同じ部屋、車内、又は食品表面の約10ヤード以内など。
【００７４】
一実施形態において、食品表面は、処理後に食品表面に接触する微生物による汚染を予防するために予防的に処理されてもよく、処理後最長24時間、又は処理後約12分〜約6時間の間、若しくは約1時間〜約8時間の間に処理されてよい。一実施形態において、多くの消費者に接触される農産物、例えばスーパーマーケット又はサラダバーにおける農産物などは、汚染事象又は汚染環境からの保護を見込んで、予防的にバリア組成物で処理されてもいい。
【００７５】
食品表面の処理方法の一実施形態において、バリア組成物は摂取される前に洗い流される。しかし、一実施形態において、バリア組成物は処理有効量で食用に安全であり、摂取される前に食品表面から洗い流されることはない。
【００７６】
十分な効果を上げるために、表面に塗布する適量とは、バリア層を形成するのに十分な量のバリア形成組成物で標的粘膜を被覆することができる量を意味し、例えば、これは表面が湿っている又は潤んでいるように見えるかどうかで決定される。例えば、有効量は平方センチメートル当たりの体積換算で表すことができ、例えば約0.5〜約50μL/cm2、例えば約5〜約40μL/cm2、又は約10〜約25μL/cm2；又は約0.625〜約10μL/cm2、例えば約2.5〜約5μL/cm2とすることができる。回転塗布式又は使い捨てワイプなどの他の送達媒体は、濃度及び当業者に知られる他の要因を調整して、これらの範囲に由来する投与量を有することができる。
【００７７】
また、バリア形成組成物から粘膜上に形成される膜の平均厚さは、例えば約0.001〜約0.2mm、例えば約0.01〜約0.1mm又は約0.08〜約0.15mmの範囲であり得る。
【００７８】
予防及び／又は処理の継続投薬法の一実施形態において、バリア形成組成物は分割用量、例えば約1〜2日毎、約2〜4日毎、又は約1〜2週間毎に表面に投与してもよい。本予防及び／又は処理方法は6〜12ヶ月間、又は数年間継続することができる。この継続投薬方法は、インフルエンザの流行期、若しくは特定の病気が発生した場合、又は単に日常的な清掃計画の一部として好ましい。
【００７９】
一実施形態において、バリア形成組成物の投与方法には、例えば、組成物を表面に擦る、モップがけする、拭き塗りする、又はスプレーするなどが含まれる。バリア形成組成物は、下記のような様々な送達系を介して表面に投与することができる。すなわち、希釈可能な液剤、ゲル剤、潤滑剤、機械的作用ポンプでスプレーされる組成物、エアロゾル化スプレー組成物、又は使い捨てワイプのような製品内又は製品上へのバリア形成組成物の注入又は層化である。
【００８０】
一実施形態において、組成物は表面に、霧吹き又は液体の薄層で表面を被膜するのに十分な量でスプレーされる。表面のサイズに応じて、1回以上スプレーをかけることが必要な場合もある。微生物で特に汚染されていると考えられる部位は、その他の部位よりもより重点的に処理される場合がある。拭き塗り又は擦ることは本実施形態では必要ではない。
【００８１】
機械的作用ポンプスプレー装置又はエアロゾル化スプレー装置が使用されてもよい。エアロゾル化の実施形態において、バリア形成組成物は、CO2、窒素、及び炭化水素などの一般的な推進剤と混合されてもよい。しかし、バッグオンバルブの実施形態も使用されてよく、組成物は、推進剤と組成物成分の分離が必要とならないほど十分に安定である。
【００８２】
一実施形態において、バリア形成組成物は、拭き塗りすることによって、バリア形成組成物を含む素材から表面に塗布される。例えば、布、モップ、デッキブラシ、トイレ用ブラシ、又はペーパータオルなどは、少なくとも部分的にバリア形成組成物を浸透させたものである。組成物は拭き塗り若しくはモップがけ、又はその他の方法で素材から表面に塗布される。一実施形態において、組成物は、スプレーした後、スプレーされた組成物を拭き塗りすることによって塗布される。
【００８３】
一実施形態において、使い捨てワイプはバリア形成組成物で前処理済みである。一実施形態において、ワイプは容器から取り出して所望の表面に拭き塗りされるだけで、バリア形成組成物を表面に塗布する。ワイプはその後処分されてもよい。使い捨てワイプ用の一般的な素材には、例えば、木材パルプ、ビスコース、ポリエステル、コットン、及びこれらの組み合わせが含まれる。前処理ステップとして、ワイプはバリア形成組成物に浸され、その後取り出される。ワイプには、少なくとも部分的にバリア形成組成物が浸透されている必要がある。塗布ステップにおいて、有効なバリアを供給するには、表面をワイプで湿らせる必要がある。表面を拭き塗りした後、表面に薄層バリアを形成するバリア形成組成物が付着し、微生物がバリア層を通過するのを抑制する。
【００８４】
一実施形態において、使い捨てワイプは、バリア形成組成物を調理器具に塗布するために、調理器具などのアイテムの処理に使用できる。
【００８５】
理論に縛られるものではないが、本明細書に記載の組成物及び予防方法における抗細菌及び抗真菌活性にも上記及び図1Bに示したものと同じ抗ウイルスバリア機序を適用可能である。
【００８６】
一実施形態において、バリア形成組成物は炭水化物ガム（C）、湿潤剤（H）、及び抗菌剤（A）を含み、以下の要件を満足する：
約0.0001%≦C≦約0.4%；
約0.07%≦H≦約70%；及び
0.0005%＜A
又は
約0%≦C≦約0.4%；
約55%≦H≦約70%；及び
0.0005%＜A
全てのパーセンテージは全組成物の重量によるものである。本実施形態の範囲は、下記表VのMIC試験で報告された、超低希釈時におけるバリア形成組成物の、多くの微生物に対する殺菌力の実証効果を反映している。効果的に塗布された後、バリア層は殺菌作用又は静菌作用を示す。
【００８７】
別の実施形態において、バリア形成組成物は以下の要件を満足する：
約0.01%≦C≦約0.4%；
約4.5%≦H≦約65%；かつ
0.0005%＜A
又は
約0%≦C≦約0.4%；
約55%≦H≦約65%；かつ
0.0005%＜A。
これらのパーセンテージは全て組成物全体における重量%を指す。
【００８８】
別の実施形態において、バリア形成組成物の湿潤剤は以下の要件を満足する：約0.07%≦H＜1%。この低湿潤剤の実施形態は、組成物の粘性又は接着性を低減させ、無生物表面により良い触感を与える。
【００８９】
一実施形態において、バリア形成組成物はグリセリン又は1つ又は複数の同様の保湿物質を含む。一実施形態において、湿潤剤の濃度は組成物全体の約0.07%重量%〜約10重量%の範囲、例えば約3%〜約8%、約0.35%〜約1%未満、又は約0.1%〜約0.5%未満であってよい。別の実施形態において、湿潤剤は組成物全体の約2重量%〜約70重量%の範囲、例えば約4.5%〜約65%、約7%〜約35%、又は約15%〜約45%であってよい。グリセリンと同様の湿潤剤は一般にポリオールとして分類され得る。湿潤剤としては、例えばグリセリン、ソルビトール、キシリトール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物が挙げられる。一実施形態において、グリセリンは、ガムの非存在下で約55%〜約65%等の高濃度で使用可能である。
【００９０】
一実施形態において、組成物はガムを含む。ガムは、例えば多糖類、キサンタンガム、アラビアガム、又はグアーガムであってよい。一般に、このようなガムは全体として負電荷を有する炭水化物ガムとして分類され得る。別の実施形態において、ガムは、例えばキサンタンガム、グアーガム、アラビアガム、トラガントガム、カラヤガム、ローカストビーンガム、イナゴマメガム、及びペクチンであってよい。これらのガムは一般に、全体として負電荷を有する炭水化物ガムとして分類され得る。一実施形態において、ガムは、全組成中の重量パーセントで約0.0001%〜約0.4%、例えば約0.0005%〜約0.25重量%存在してもよい。別の実施形態において、ガムは、全組成中の重量パーセントで約0.01%〜約0.4%、例えば約0.25%〜約0.35%、約0.05%〜約0.25%、又は約0.4重量%存在してもよい。
【００９１】
一実施形態において、バリア組成物は湿潤剤、抗菌剤、及び任意にガムを含み、ガムが存在する場合、ガムがバリア形成組成物全体の約0.0001重量%〜約0.4重量%の量で存在する。
【００９２】
一実施形態において、抗菌剤が組成物中に存在する。例えば、組成物は、1つ以上の抗ウイルス剤、又は抗真菌剤、又は抗細菌剤、又はこれらの組み合わせを含んでよい。また、そのような抗菌剤の効果は、静菌作用及び／又は殺菌作用を含む。
【００９３】
抗菌剤としては、例えばモノ第四級アンモニウム化合物（QAC、セトリミド、塩化ベンザルコニウム、塩化セタルコニウム、塩化セチルピリジニウム、ミリスタルコニウムクロリド、ポリサイド）、ビクオターナリ（biquaternaries）及びビスビグアニド（クロルヘキシジン、Barquat、ヒビテン）、ビグアニド、ポリマービグアニド、ポリヘキサメチレンビグアニド、バントシル、コスモシル、ジアミジン、塩素系及びヨウ素系化合物を含むハロゲン放出剤、銀及び銀の抗菌化合物、過酢酸（PAA）、スルファジアジン銀、フェノール類、ビスフェノール類、過酸化水素、ヘキサクロロフェン、それだけに限らないがクロロキシレノール（4-クロロ-3,5-ジメチルフェノール；p-クロロ-m-キシレノール）を含むハロフェノール等のカチオン性抗菌剤及びそれらの薬学的に許容される塩が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
また、抗微生物剤は、殺菌性及び静菌性の両方を持ち、異なるクラスの抗菌剤、例えばテトラサイクリン、クロラムフェニコール、フシジン酸、フルオロキノロン、マクロライド系抗菌剤、オキサゾリジノン、キノロンカルボン酸及びナフチリドンカルボン酸、シトラール、トリメトプリム及びスルファメトキサゾール（単独及び組み合わせ）、アミノグリコシド、ポリミキシン、ペニシリン並びにこれらの誘導体であってよく、又はこれらを含むものであってもよい。また、抗菌剤は、例えば下記のクラスの抗真菌剤、すなわちアゾール類、ポリエン類、エキノカンジン類、及びピリミジン類も含むことができる。上記抗菌剤の任意の組み合わせも企図される。前述の抗菌剤の多くはカチオン種又はそれらの薬学的に許容される塩であり、一実施形態では組成物中でカチオン性抗菌剤が利用される。一実施形態では、組成物は二酸化塩素、又は反応剤を生成する二酸化塩素などの蒸気を放出することに限定した薬剤である。
【００９５】
一実施形態において、バリア形成組成物は、微生物の変異又は耐性発現を引き起こすことはない。これは、微生物に対する作用機序がバリアによるためであり、及び選ばれた抗菌剤によるためである。
【００９６】
抗菌剤は、例えば全組成中の重量%で約0.0005%〜5%、例えば約0.0025%〜約1%、約0.005%〜約0.006%、又は約0.0006%〜約0.003%の範囲の量で存在してもよい。別の実施形態において、抗菌剤は、例えば全組成中の重量%で約0.05%〜約0.1%、例えば約0.05%〜約0.06%又は約0.06%〜約0.1%の範囲の量で存在してもよい。一実施形態において、抗菌剤の量は、例えば使用される抗菌剤がより高い濃度でも溶解性の問題を引き起こさないとすれば、約5%以下、約3%以下、又は約1.5%以下である。
【００９７】
諸実施形態において、組成物は更に、例えばコポビドン及び他の潤滑剤、メチルパラベンやプロピルパラベン等のパラベン類、香味剤、安息香酸ナトリウム等の保存剤、リン酸一ナトリウムやリン酸二ナトリウム等の緩衝剤、甘味料、酸化エチレン硬化ヒマシ油、及びカルボキシメチルセルロースのような他の成分も含むことができる。これらの成分は、例えば全組成中の重量%で約0.01%〜約5%、例えば約0.1%〜約2%の範囲の量で含有されてもよい。別の実施形態において、該成分は、例えば約0.0001%〜約0.05%の範囲の量で含有されてもよい。緩衝剤（リン酸一ナトリウムやリン酸二ナトリウム等）も使用することができる。
【００９８】
精製水及び／又はアルコールは、組成物の希釈剤成分として使用可能である。一実施形態において、バリア形成組成物は、スプレーに適した自由流動性の液体である。これは、通常自由流動性ではなく、スプレーに適さないペースト又は練り歯磨きとは対照的である。加えて、一実施形態において、バリア組成物は、練り歯磨きに通常使われる研磨剤を含まない。
【００９９】
塩化セチルピリジニウムを含むいくつかの抗菌剤は、活性成分を加えることによりそれ自体の抗菌特性が悪影響を受けることが知られている。したがって、一実施形態において、組成物は本質的にガムと、湿潤剤と、抗菌剤とからなり、バリア又は抗菌作用に影響を与えない防腐剤又は香味剤のみを含む。一実施形態において、組成物は、歯及び／又は歯肉に対して作用する、例えば研磨剤（練り歯磨きに使われるようなもの）、歯のホワイトニング剤又は減感剤等の薬剤を含まない。一実施形態において、組成物はセロオリゴ糖類も含まない。一実施形態において、抗菌剤は、多価アルコールの脂肪酸エーテル若しくは脂肪酸エステル又はそれらのアルコキシル化誘導体などの脂質を含まない。一実施形態において、組成物は、持続放出剤、アレルギー緩和化合物、アゼラスチン、シリコンベース油、精油、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール及び硝酸カリウムのうちの1つ又は複数を含まない。一実施形態において、組成物は、例えば揮発性アルコールなどの揮発性有機化合物を含まない。一実施形態において、組成物は界面活性剤又は起泡剤を含まない。誤解を避けるために、上記のどの記載についても全ての実施形態がこれらの化合物を含まないことを意味するものと解釈すべきではない。
【０１００】
一実施形態において、バリア形成組成物の製造方法は、炭水化物ガムと、湿潤剤と、抗菌剤とを混合して加熱するステップを含む。一実施形態において、加熱するステップを、混合時間を延長することに置き換えられる。他の成分もまた、単回又は複数回の混合ステップで混合される。バリア形成組成物の全ての成分は、一度に混合され、安定した保存期間を持つ組成物を生成する。これは、使用するために短時間で別々に加えなければならない活性成分を有する組成物とは対照的である。したがって一実施形態において、バリア形成組成物は、使用する際、活性化するために他の組成物と混合させる必要のない、安定な一剤型の組成物である。
【０１０１】
一般に、微生物に対するバリア及び抗菌剤を提供する二重作用機序により、in vitro、模擬in vivoの両方を特徴とする長期持続効果がもたらされる。in vivo例を以下に示す。in vivoの例では、バリア形成組成物が少なくとも6時間殺菌効果（殺菌又は静菌）を有することが示され、一方バリア特性は模擬in vivo試験（人工のヒト粘膜EHOMを対象とする）で検査し、バリア自体の持続時間が約6時間超、例えば約8時間超、約6時間〜約16時間、約24時間又はそれより長い時間に大幅に延長されることが示された。また、in vitro試験では、抗菌効果が約2時間超、約6時間超、及び検査した微生物に応じて、例えば8時間超、約6時間〜約16時間、及び約24時間又はそれより長い時間に大幅に延長されることが示された。
【０１０２】
事後抗菌効果（post antimicrobial effect：PAE）は、抗菌剤への限定的な曝露後に持続する微生物の増殖を抑制することと定義される。PAEが長くなるほど微生物の増殖の持続的な阻止が可能となるので抗菌剤にとって有利と考えられ、PAEが長い作用物質はPAEが短い作用物質よりも低頻度の投与を必要とするため投与計画に影響を及ぼす可能性がある。
【０１０３】
本明細書に開示する方法及び組成物の諸実施形態において、粘膜に適用したときの組成物のPAEは、例えば約6時間以上、約6時間〜約16時間、又は約16時間〜24時間持続するPAEを有する。
【０１０４】
一実施形態において、組成物は液体であり、気泡性はない。
【０１０５】
上記記述のように、一実施形態において、組成物はスプレーに適しており、したがってその粘度もまたスプレーに適している。一実施形態において、組成物は500cps未満の粘度、例えば約490 cps〜約10 cps、又は約400 cps〜約15 cpsの粘度を有する。別の実施形態において、組成物は約16 cps〜約20 cpsの粘度、例えば約17 cps〜約19 cpsの粘度を有する。
【０１０６】
一実施形態において、組成物はヒトに無毒であり、ここで少なくとも組成物の一部は、食用に摂取されても安全である。
【０１０７】
理論に縛られるものではないが、バリア形成組成物は親水性でないため、バリア形成組成物が粘膜表面に付着し当該表面を覆うよう、より大きな親和性を有することが可能となる。さらに、一実施形態では、非親水性組成物に埋め込まれる抗菌剤により処理済みの表面における抗菌活性の持続が可能となる。一実施形態において、バリア形成組成物はそれ自体両親媒性であるか両親媒性成分を有する。
【０１０８】
親水性の一つの尺度は、水中クロマトグラフィーによって判定されるRf（relative front）値である。一実施形態において、組成物の水中でのRf値は0〜約0.25、例えば約0.0001〜約0.15、又は約0.03〜約0.1である。
【０１０９】
一実施形態において、組成物のpHは約4〜約8、約5〜約7、又は約6〜約7.5である。別の実施形態において、組成物のpHは約5.5〜約8であり、塩化セチルピリジニウム等の抗菌剤が最も有効である。
【０１１０】
後述の実施例に示すように、本発明のバリア形成組成物は、多岐にわたる代表的な真菌、細菌及びウイルスの通過を捕捉し遮断することが証明されている。ウイルスが最小の感染性微生物のうちの1つであり、また、バリア形成組成物はウイルスを遮断する機械的バリアを形成するので、バリア形成組成物は、ウイルスだけでなく広範な細菌及び真菌を含めたより大型の微生物に対しても有効な予防的処理となることが予想される。
【０１１１】
いくつかの実験を実施して哺乳動物を対象とする組成物の安全性及び操作ヒト口腔粘膜（EHOM）モデル上に保護バリアを形成するスプレー製剤の能力を評価した。実験証拠から、本発明の組成物が組織上にバリアを形成し、このバリアが組織中への微生物の侵入を防止することが示された。
【実施例】
【０１１２】
（実験例1）
＜ヒト歯肉上皮細胞及び線維芽細胞の培養物＞
正常ヒト歯肉細胞（上皮細胞及び線維芽細胞）をScienCell研究所（米国カリフォルニア州カールスバッド）から入手した。線維芽細胞は、胎児ウシ血清（FBS；Gibco社（カナダオンタリオ州バーリントン）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DME；Invitrogen Life Technologies社（カナダオンタリオ州バーリントン））にて最終濃度10%まで培養した。上皮細胞は、5μg/mLのヒトトランスフェリン、2nMの3,3',5'‐トリヨード‐L‐チロニンを添加したダルベッコ改変イーグル培地（DME）／Ham’s F12（3：1）（DMEH）にて培養した。
【０１１３】
0.4μg/mLのヒドロコルチゾン、10ng/mLの上皮成長因子、ペニシリン及びストレプトマイシン、並びに10%FBS（最終濃度）を添加したダルベッコ改変イーグル（DME）／Ham's F12（3:1）（DMEH）培地にて培養した。この培地を上皮細胞については1日1回、線維芽細胞については週に3回取り替えた。培養物が90%コンフルエントに達したときに、0.05%トリプシン‐0.1%エチレンジアミン四酢酸（EDTA）溶液を使用して細胞をフラスコから剥離し、これを2回洗浄し、DMEM（上皮細胞の場合）又はDMEH添加培地（線維芽細胞の場合）の中に再懸濁させた。
【０１１４】
（実験例2）
＜操作ヒト口腔粘膜（EHOM）組織＞
EHOMモデルは、正常なヒト口腔粘膜で見られるものと同様の複雑な三次元空間細胞構成を形成するのに用いた歯肉線維芽細胞及び実験例1の上皮細胞を使用して作製した。固有層は、I型コラーゲン（Gibco-Invitrogen社（カナダオンタリオ州バーリントン））を歯肉線維芽細胞と混合して製造し、10%FBS添加培地で4日間培養した。次いで、この固有層に歯肉上皮細胞を播種してEHOMを得た。固有層の全表面が上皮細胞で覆われるまで、組織標本を浸漬条件下で成長させた。重層上皮を生成するために、EHOMの別の層に至る上皮の組織化を促進するために、EHOMを更に4日間気液界面まで上昇させた。
【０１１５】
粘膜固有層は、上皮下にあって上皮と共に粘膜を構成する緩結合組織の薄い層である。図2は、バリア形成組成物で覆われた粘膜内の位置を矢印で示したEHOMの粘膜組織図である。
【０１１６】
（実験例3〜9）
バリア形成組成物の各例は、50mLの遠心管に下記の成分を追加し、「フリーフロー」に一貫性を与えるためボルテックスすることによって作成した。各組成物の成分及びそれらの近似量を表Iに記載する（表I中の値は全組成中の重量%である）。
【０１１７】
【表１】
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※精製水は組成物の残留部分を含む。
※※防腐剤はメチルパラベン（0.1%）、プロピルパラベン（0.1%）、安息香酸ナトリウム（0.5%）を含む。
【０１１８】
下記の結果から、防腐剤がバリア形成及び抗菌活性に不必要であることが分かった。
【０１１９】
（実験例10）
＜単層創傷修復アッセイ＞
実験例1の上皮細胞及び線維芽細胞の創傷修復アッセイを実施した。簡潔に言えば、歯肉上皮細胞（細胞数：1×104）及び線維芽細胞（細胞数：1×103）を6ウェルプレートのウェルに播種し、5μg/mLのヒトトランスフェリン、2nMの3,3',5'‐トリ‐ヨード‐L‐チロニン、0.4μg/mLのヒドロコルチゾン、10ng/mLの上皮成長因子、ペニシリン及びストレプトマイシン、並びに10%FBS（最終濃度）を含むダルベッコ改変イーグル（DME）／Ham'sF12（3:1）（DMEH）を添加した培地で成長させた。コンフルエンシーに達したときに、200μLピペットチップを使用して各ウェルのコンフルエント単層に傷を付けた。
【０１２０】
（実験例11〜15）
実験例11及び12では、実験例10の上皮細胞培養物を、実験例3及び4の希釈されたバリア形成組成物に約2分間曝露した。実験例13及び14では、実験例10の線維芽細胞培養物を、実験例3及び4の希釈したバリア形成組成物に約2分間曝露した。曝露に先立ち、実験例3を1%濃度になるように生理食塩水で希釈し、実験例4を5%濃度になるように生理食塩水で希釈した。曝露後、スプレーを温かい無菌の培養培地で2回洗い流した後、細胞培養物を、線維芽細胞についてはDMEで、上皮細胞についてはDMEHで覆い、37℃の5%CO2湿潤雰囲気下で6時間及び24時間培養した。実験例10の未処理培養物である対照例15も検査した。
【０１２１】
創傷修復／細胞遊走を光学顕微鏡を使用して確認しデジタル写真を撮影した（Nikon社Coolpix 950）。創傷閉鎖（細胞増殖／遊走）の割合は、次式Iを使用して、バリアスプレーへの曝露前と曝露後の相対的な創傷面積を比較することによって計算した。
【０１２２】
式I：
（初期の傷の大きさ）−（指定培養期間後の大きさ）／（初期の傷の大きさ）の値×100
【０１２３】
図3は、式Iから生成した処理後6時間時点の創傷修復データのグラフを示す。図4は、1%に希釈したバリア形成組成物で処理した上皮細胞培養物及び対照例15の創傷修復を示す写真である。
【０１２４】
バリア形成組成物に接触させた後、上皮細胞（図4A）及び線維芽細胞は、接触後6時間から徐々に実験例11及び12のバリア形成組成物と共に移動を開始した（データは示さず）。上皮細胞は、バリア形成組成物に曝露された培養物と曝露されていない培養物のいずれにおいても（図4A〜図4E）小さい立方形状であった。線維芽細胞は、いずれの培養条件（塩化セチルピリジニウムベース産物に曝露した細胞と曝露していない細胞）においても小さい核を有する細長い細胞であった（データは示さず）。損傷ゾーンをカバーする細胞増殖及び移動は、当初の創傷（図4F）と比較して、対照例15と処理済み実験例11、12のいずれにおいても同程度であった。24時間に及ぶフォローアップから、実験例11及び12がそれぞれコンフルエント単層（図4D〜図4E）を与える傷の縁部をカバーすることが示された。
【０１２５】
この実験を5回ずつ繰り返して同様の結果を得た。処理済み実験例11及び12では、歯肉上皮細胞の増殖／移動に対しても細胞分化に対しても大きな副作用は示されなかった（大型の細胞質及び大型の核を提示する細胞は存在しなかった）。
【０１２６】
（実験例16〜19）
＜細胞毒性アッセイ＞
実験例2の操作ヒト口腔粘膜（EHOM）モデルを使用して、実験例10及び11の組成物が安全であるかどうか、また組織損傷又は細胞壊死を促進しないかどうかを判定した。実験例16及び17では、5%に希釈した実験例3のバリア形成組成物及び1%に希釈した実験例4の組成物の薄層（300μL）（いずれも無血清培地にて希釈）を上皮表面（10cm2）に2分間重層した。期間のばらつきは結果には影響を与えず、手順の実施に要した時間にのみ反映された。対照例18はバリア形成組成物で処理しない対照とした。次いで、EHOM組織を温かい無菌培養培地で2回すすぎ、37℃の5%CO2湿潤雰囲気下で24時間インキュベートした。改変された組織が損傷したかどうかを評価するために、このインキュベーション期間の後、各EHOMにつきバリアスプレー製剤との接触によるホールの有無を肉眼で調べた。かかる可能性を確認するためにこれらのEHOMの写真を撮影した。また、各EHOMから生検を採取し、ヘマトキシリン及びエオシンを使用した組織学的染色に供した。
【０１２７】
実験例16及び17では、未処理の対照例18と同様に1%及び5%希釈液中で実験例3及び4に曝露したEHOMがホールのような巨視的損傷を示さなかった（図5参照）。5%希釈の実験例3の洗口剤（実験例7A）及び1%希釈のスプレー（実験例7B）の各組成物と10分間接触させた組織につき、かかる損傷の有無を観察した。損傷の有無は、線維芽細胞を移入した結合組織の上部に多層上皮組織を示す組織学的解析によって確認した。実験例16又は17のEHOM組織では特定の損傷は認められなかった。実験例16及び17の処理済みEHOM構造は、未処理の対照例18と同等であった。
【０１２８】
実験例19でも、1%希釈物で処理したEHOMを含む点を除いて実験例16と同じ条件下で同様の観察を実施した（データは示さず）。
【０１２９】
図5は、EHOMの巨視的形状及び構造に対するバリア形成組成物の影響を示す。パネルA及びBは対照例18を示す。パネルC及びDは実験例16（スプレー組成物）を、パネルE及びFは実験例17（洗口剤組成物）を示す。
【０１３０】
（実験例20〜25）
EHOM損傷に対するバリアスプレー組成物の副作用が認められた場合は、それらの副作用について細胞内LDHの培養培地への漏出を測定することにより評価した。
【０１３１】
実験例20〜23では、EHOM組織をそれぞれ実験例3及び実験例4の（A）1%希釈液又は（B）5%希釈液に10分間曝露し、その後培養培地で24時間成長させた。実験例24及び25は未処理の対照とした。次いで、実験例20〜25の各上清50μLを滅菌96ウェル平底プレートに移した。各ウェルに再構成した基質混合物50μLを補充し、プレートを室温の暗所にて30分間インキュベートした。LDHレベルを推定するために培養上清のアリコートを回収し、製造業者（Promega社（米国ウィスコンシン州マディソン））のプロトコールによるLDH細胞毒性アッセイに供した。このアッセイでは、放出されたLDHによるL‐乳酸及びNADのピルビン酸及びNADHへの変換が測定される。反応を停止するため各ウェルに停止液50μLを加えた。次に、混合物100μLを96ウェル平底プレートに移し、Xマークマイクロプレート分光光度計（Bio-Rad社（カナダオンタリオ州ミシサガ））を使用して吸光度を490nmで読み取った。
【０１３２】
このLDH及び創傷修復実験では下記の試験法を使用した。各実験は少なくとも4回実施し、実験値は平均値±SDとして表した。対照（バリアスプレーなし）と検体（スプレーあり）の値の差の統計的有意性を一元配置分散分析によって判定した。事後比較はTukey法を使用して行った。正規性及び分散の仮定は、それぞれShapiro-Wilk検定及びBrown-Forsythe検定を使用して検証した。全ての仮定が満足された。P値は≦0.05で有意とした。データはSAS統計パッケージ（バージョン8.2、SAS Institute社（米国ノースカロライナ州ケアリー）を使用して分析した。
【０１３３】
図6に示す結果は、バリア形成組成物で処理した構造体において、未処理の組織と比較してLDHレベルの有意な差が示されなかったことを示している。観察は、バリア形成組成物で処理した実験例に曝露した6時間後（データは示さず）及び24時間後（図6）に行った。図6（A）は、対照例24及び1%希釈の処理済み実験例20及び21、図6（B）は、対照例25及び5%希釈の処理済み実験例22及び23を示す。これらのデータから実験例3及び4の非毒性効果が確認される。同様に、実験例3及び4に2分間接触させた場合も対照例との差は認められなかった（データは示さず）。
【０１３４】
（実験例26）
＜バリア形成組成物がEHOM構造を損傷させるか否かの判定＞
実験例2のEHOMを実験例4で約2分間処理し培養培地で洗浄した後24時間培養した。次いで、組織の巨視的組織損傷の可能性（ホールの有無）を検査した。組織損傷は組織学的分析によっても調査した。この目的のために各EHOMから生検を採取した。これらの生検を4%パラホルムアルデヒド溶液で固定し、次いでパラフィンに包埋した。薄切片（4μm）をエオシン‐ヘマトキシリンで染色した。各セクションに50%グリセロールマウント培地中でカバースリップを載せて光学顕微鏡で観察し写真撮影した。処理したEHOMに損傷は確認されなかった。
【０１３５】
（実験例27及び28）
＜バリア形成組成物が粘膜組織を通る微生物に対するEHOMの機械的バリア機能に影響を及ぼすか否かの判定＞
実験例27及び28では、2つのアプローチを使用して、対照例が粘膜組織を通過する微生物を遮断し、固有の抗菌効果も有するかどうかを判定した。パススルーチャンバ内とEHOM表面上の成長を、寒天培地内の増殖評価によって評価した。
【０１３６】
実験例27では、実験例2のEHOMを実験例4の1%及び5%希釈液（無血清培地にて希釈）に入れて2分間接触させた。次いで、組織を無血清培地で2回洗浄した後、体積300μLの1×106カンジダ菌細胞を重層した。次いで、組織を空気‐液体培養プレート上に置き、37℃の5%CO2湿潤雰囲気下で24時間インキュベートした。次に、EHOM（ベントラルチャンバ）下の培養培地を回収し、微生物が組織を貫通して下記の培養培地に達しているかどうかを確認するためにサブロー寒天プレート上に播種した。EHOM表面からも培養物を回収し、サブロー寒天プレート上に播種した。このプロセスを図7に図示する。
【０１３７】
実験例28では、実験例4の組成物の1%及び5%希釈物で2分間処理した実験例2のEHOMを24時間にわたってカンジダ菌体で覆い、サブローデキストロース寒天プレート上に裏返して置き、所定位置に5分間放置した。次いで、EHOMを除去し、プレートを30℃で24時間インキュベートした後、微生物の増殖を肉眼で確認し写真を撮影した。各実験を5回ずつ繰り返して同様の結果を得た。
【０１３８】
図8は、EHOM面（パネルC及びD）の培養物、及び底部（ベントラル）チャンバ（パネルA及びB）のパススルー液の培養物の結果を示す。パネルA及びCは実験例4の1%希釈液で処理したEHOMであり、パネルB及びDは実験例4の5%希釈液で処理したEHOMSである。これらのデータから、実験例4の組成物によって形成されるバリアは微生物によるEHOM組織の貫通を防止するが固有の抗菌効果を有さないことが示された。
【０１３９】
（実験例29及び30）
実験例29及び30は、EHOMをS. mutansに感染させた点を除いて実験例27及び28の繰り返しである。バリア形成組成物によりS. mutans微生物がバリアを通過することを防止するバリアが形成されるが抗菌効果を有さないことを示す同様の結果が得られた。
【０１４０】
（実験例31及び32）
＜バリア形成組成物が微生物侵入に対抗するEHOMの機械的バリア機能に影響を与えるか否かの判定＞
実験例32では、実験例2のEHOM組織セットを実験例4のバリア形成組成物で処理した後、C. albicansで重層した。対照例31では、対照セットについてはC. albicansで重層する前にバリア形成組成物による処理を行わなかった。各接触時間の経過直後に各EHOMから生検をそれぞれ採取し、パラホルムアルデヒド溶液で固定し、パラフィンに包埋した。薄切片（4μm）をエオシンヘマトキシリンで染色した。光学顕微鏡を使用して切片の観察を行い、組織内の微生物細胞の浸潤／浸透を分析した。顕微鏡観察後、各条件の代表的な写真を撮影し提示した。この実験を3回繰り返し同様の結果を得た。実験例3による処理でも同様の結果が得られた（データは示さず）。
【０１４１】
図9は、EHOM組織の微生物侵入に対するバリア形成組成物の影響を示している。パネル（A）は未処理の対照例31の代表的な写真であり、パネル（B）は処理済み実験例32の写真である。矢印は未処理の対照例31における侵入菌糸を示す。
【０１４２】
（実験例33〜40）
上記のEHOMモデルも使用して、実験例5〜7のバリア形成能を評価した。バリア形成能は、（a）口腔内細菌（S. mutans）及び真菌（Candida albicans）がヒト口腔粘膜に侵入／浸透するのを防止すること、及び（b）宿主細胞を損傷しないことである（細胞毒性アッセイ）。
【０１４３】
実験例33〜40は表IIIに従って調製した。
【０１４４】
【表２】
2015514758.tif 000004
【０１４５】
実験例33〜40では、実験例27及び28の手順に従って前処理及びインキュベーションを行った後、（1）フロースルー培地を下部チャンバから回収し、（2）サブローデキストロース寒天ペトリ皿の表面に裏返して置き24時間インキュベートした。実験例27及び28において記載したように、回収したフロースルー培地を寒天培地プレート上に広げて24時間インキュベートした。表IIIには、裏返した各実験例の培養物上の微生物の増殖を示す各実験例の写真を掲載した参照図番号も示してある。
【０１４６】
図10及び11は、カンジダとストレプトコッカスの両方が実験例5〜6の組成物で処理したEHOMの表面上で成長できたことを示している。対照的に、図12に示すよように、実験例36又は40のEHOMの下部チャンバから収集した「フロースルー」培地、すなわち実験例7の組成物で処理した培地では微生物の増殖は観察されなかった。このことは、実験例7の組成物でEHOMを処理しても、粘膜組織の表面への損傷が起こらず、処理したEHOMに生物が浸透できなかったことを示す。実験例5及び6の組成物で処理したEHOMでも同様の結果が得られた（データは示さず）。これらのデータは、グリセリン及びキサンタンガムの組合せが粘膜組織上に保護バリアを形成することができることを示している。
【０１４７】
（実験例41〜47）
＜検査製剤は毒性がなく細胞／組織を損傷させない＞
実験例41〜47では、EHOMモデルを使用して組成物の毒性を評価した。実験例41〜47は表IVに従って調製した。
【０１４８】
【表３】
2015514758.tif 000005
【０１４９】
実験例27及び28の手順に従って前処理及びインキュベーションを行った後、実施例41〜48のEHOM組織から培養上清を回収しLDH活性の測定に使用した。
【０１５０】
図13に示すように、実験例41〜48では、製剤が保存剤を含む又は含まない塩化セチルピリジニウムを含有するかどうか、またCandida albicans又はS. mutansのいずれかに感染したかどうかに関わらず、LDHレベルの有意な増加は観察されなかった。これらのデータから、実験例のバリア形成組成物の非毒性効果が示され、これらの製剤が宿主粘膜組織の完全性を維持することも示された。
【０１５１】
データは平均±SDであり、上記の実験例25で述べたとおり計算した。未処理組織と処理済み組織との間に有意な差は認められなかった。
【０１５２】
まとめると、上記のデータから、実験例の組成物がヒトの粘膜組織を貫通して侵入する微生物を防止することが可能な効果的かつ安全なバリアを提示することが示された。
【０１５３】
（実験例48〜61）
バリア形成組成物の前臨床評価から、組成物が多くの細菌及び酵母に対して有効であることが示された。S. salivarius、P. gingivalis、S. pyogenes、S. pneumonia、Fusobacterium nucleatum、S. mutans、S. aureus、Y. enterocolitica、S. oralis、S. mitis、C. albicans、C. krusei、C. tropicalis、及びC. glabrataを含む、患者から得た複数の臨床分離株に対して実験例7のバリア形成組成物の抗菌活性を評価した。実験例7のバリア形成組成物の活性は、臨床及び検査標準協会（CLSI）の文書番号M07-A8、M11-A7及びM27-A3に記載されている標準法を使用して最小発育阻止濃度（MIC）を判定することにより評価した。
【０１５４】
いくつかのタイプの好気性又は嫌気性細菌（1×104細胞/mL）の標準化接種材料を、比較例として、実験例7の段階希釈溶液（0.1%又は1μg/mLのCPC含有）又は2%グルコン酸クロルヘキシジン（CHX、20μg/mL）でインキュベートした。細胞を試験薬剤の存在下又は非存在下（成長制御）で24時間成長させた。各作用物質のMICは（無薬物対照と比較して）100%の発育阻止を誘発した濃度として定義した。
【０１５５】
同様の微量希釈ベースのCLSI法（M27-A2）を使用してアルビカンス及び非アルビカンスのカンジダ種に対する実験例7の活性を評価した。
【０１５６】
【表４】
2015514758.tif 000006
【０１５７】
バリア形成組成物は、MRSA、Acinetobacter baumannii、Streptococcus sanguis、S. gordonii、及びAggregatibacter actinomycetemcomitansに対して強力な抗菌活性を有することも判明した。
【０１５８】
表Vから分かるように、実験例7の組成物は多くの好気性及び嫌気性細菌、並びに真菌に対して強力な活性を示した。
【０１５９】
S. oralis及びS. mitisに対する例7のバリア形成組成物のMICは、他の生物に比べて著しく上昇した（500μg/mL）。S. oralis及びS. mitisが口腔の正常な片利共生生物であることは興味深い。一般に使用される抗菌クロルヘキシジン（2%溶液）の活性も同様の方法により判定した。表Vは、種々の微生物に対する比較例として、実験例7のバリア形成組成物及びクロルヘキシジン（2%溶液）のMICを示す。
【０１６０】
まとめると、これらの結果から実験例7が一般に口腔から単離された病原性細菌や真菌に対して強力な活性を有することが実証された。この活性はクロルヘキシジンで観察されるものよりも強力であった。
【０１６１】
実験例10及び11のバリア形成組成物についても類似の活性プロフィルが観察された。
【０１６２】
（実験例62）
更なる比較として、公表されているデータから、試験したバリア形成組成物は、CPC単独比較で（すなわち、本明細書に開示するバリア製剤による組成物中ではなく）優れた又は少なくとも同等のMICを有することが示されている（Frank-Albert Pitten and Axel Kramer, "Efficacy of Cetylpyridinium Chloride Used as Oropharyngeal Antiseptic," Arzneim.Forsch./Drug Res.51 (II), pp588-595 (2001)参照。当該文献の内容を参照により本明細書に援用する）。データは試験微生物に応じて変動するが、例えばS. mutansに対するCPC（単独）のMICは5.0μg/mL〜6.25μg/mLであり、この値は実験例53で報告された1.95μg/mLよりも効果が小さくなる。このことは、CPCが製剤中の他の賦形剤と混合したときにその活性を失うリスクを有することに照らして予想外の結果であった。詳しくはDepartment of Health and Human Services (Food and Drug Administration) (1994) Oral Health Care Drug Products for Over-the-Counter Human Use; Tentative Final Monograph for Oral Antiseptic Drug Products. Proposed Rules (21 CFR Part 356, Docket No. 81N-033A, RIN 0905-AA06). Federal Register 59:6084-124を参照されたい。
【０１６３】
（実験例63〜69）
＜in vitroにおけるバリア形成組成物の抗菌活性持続時間：ポスト抗菌効果（PAE）判定＞
いくつかの微生物に対する実験例8のPAEを実験例63〜68で評価した。対照例69も準備した。いくつかの微生物を実験例8に（MICと等しい濃度で）1分間曝露した後、残留製剤を除去するために3回洗浄した。次いで、処理した細胞を37℃でインキュベートした寒天培地プレート上に広げ、細胞の再成長に要した時間を測定した。PAEは、未処理対照例69と比較して、発育阻止率（%）が実験例63〜68によって維持された時間（hour）として表した。
【０１６４】
図14に示すように、実験例8は、試験した生物（S. aureus、S. pneumonia、S. gordonii、S. sanguis、S. salivarius、及びS. mitis）に応じて4時間〜24時間の間のPAEを示した。実験例8と同様の活性をカンジダに対して観察した（データは示さず）。他の実験例のバリア形成組成物は微生物に対して同様のPAEを示した。
【０１６５】
（実験例70）
CPC含量を0.7%に低下させた同様の比較例と比較した、実験例7のS. mutansに対するバリア形成組成物のPAE試験から、実験例7のPAEは比較実験例70の6時間に対して24時間であることが示された。したがって、実験例7が比較実験例70より長い時間抗菌活性を示し、CPC含量の追加が抗菌活性に対して単なる相加効果以上のものを発揮することが証明された。
【０１６６】
（実験例71〜76）
走査型電子顕微鏡を使用してS. sanguis（実験例71）、S. oralis（実験例72）及びC. albicans（実験例73）の実験例3の組成物による処理が細胞完全性を損なうことが示された。
【０１６７】
実験例71〜73では、細胞を実験例3の存在下で24時間成長させた。次に、細胞を洗浄して残留製剤を除去し、一連のアルコール溶液（10%〜100%（v/v））に通して脱水し、SEM分析用に加工した。対照例74〜76は、実験例3の存在下で成長させなかった点で実験例71〜73と異なる。
【０１６８】
SEM写真から、健康で無傷の細胞（図15A、図15C、図15E）であることが証明された未処理の対照例74〜76とは異なり、実験例3のバリア形成組成物に曝露した微生物が変形し、崩壊し、細胞質物質の漏出の明らかな証拠となる細胞の完全性の全面的な破壊が示された（図15B、図15D、図15F）。
【０１６９】
（実験例77〜79）
バイオフィルムは実験例77〜79における特定の感染症の前駆体であることから、バリア形成組成物が細菌及び酵母菌によるバイオフィルムの形成を防止することができるかどうかを判定する実験を行った。バイオフィルムはin vitroモデルを使用して形成した。in vitroモデルの詳細は、Chandra et al. "In vitro Growth and Analysis of Candida Biofilms" Nature Protocols 3(12):1909-1924 (2008)を参照されたい。
【０１７０】
実験例77〜79では、標準的なバイオフィルムモデルを利用して、実験例3のバリア形成組成物が細菌及び真菌バイオフィルムに対して活性を示すかどうかを判定した。実験例77〜79では、3種類の微生物（C. albicans、S. oralis、S. salivarius）を基板上に90分間接着して接着相にバイオフィルムを形成させた。次に、付着細菌を含むディスクを濃度50%の実験例3（適切な培地で1:1希釈）で15分間、30分間又は60分間インキュベートした。インキュベーション後、バイオフィルムを剥離し、培養培地上に広げ、インキュベートし、コロニー形成単位（CFU）を判定した。リン酸緩衝生理食塩水（PBS（1:1））で希釈した培地を対照として使用した。表VIは0分（対照）、15分、30分及び60分の時点のデータを示す。
【０１７１】
【表５】
2015514758.tif 000007
【０１７２】
実験例77〜79に関するデータは、図16にも阻止率対成長制御のグラフとして示されている。これらの結果から、実験例3のバリア形成組成物がS. salivarius、S. oralis又はC. albicansによって形成されるバイオフィルムに対し0.2%のMICで細菌及び真菌微生物を阻害することが示された。
【０１７３】
（実験例80及び81）
実験例80において、本発明者らはC. albicansの初期段階のバイオフィルムを実験例3に1分間曝露した際の影響を評価した結果、1分程度の短時間の曝露であってもバイオフィルム形成を阻害することができることが分かった（図17）。実験例81は未処理の対照試料とした。
【０１７４】
（実験例82〜84）
＜バリア形成組成物による成熟バイオフィルムの処理能力＞
バリア形成組成物がバイオフィルムを処理することができるかどうかを判定するために、本発明者らは、完全に形成された成熟バイオフィルムに対するバリア形成組成物の活性を評価した。バイオフィルムを成熟期まで成長させ、その後実験例7に2時間又は4時間曝露し、その結果得られたCFUを判定した。未処理の細胞と比較して微生物CFUを少なくとも2 log reductionだけ減少させる組成物は、微生物バイオフィルムに対して有効であると考えられる。
【０１７５】
表VIIに示すように、実験例7への曝露によりC. albicans及びS. oralisによって形成されたバイオフィルムが完全に除去され、S. salivariusによって形成されたバイオフィルムのCFUが未処理対照と比較して3.4 log reductionだけ減少した（log CFUは、それぞれ3.95対7.36）。
【０１７６】
【表６】
2015514758.tif 000008
【０１７７】
要約すると、上記の結果は、実験例7が細菌及び真菌によって形成されるバイオフィルムに対して強力な活性を有することを示している。
【０１７８】
（実験例85〜86）
＜バリア形成組成物はウイルスに対しても活性がある＞
呼吸器系ウイルス（インフルエンザウイルスH1N1、株2009/H1N1/infA）やヒト免疫不全ウイルス（HIV）等のウイルスに対するバリア形成組成物の活性を測定した。
【０１７９】
バリア形成組成物はインフルエンザAの感染性を阻害する
【０１８０】
インフルエンザウイルスの感染性に対するバリア形成組成物の影響を評価するために、メイディン・ダービー・イヌ腎臓（MDCK）細胞を感染前に37℃で≧90%コンフルエントまで増殖させた。MDCK細胞は、インフルエンザウイルスが関与するアッセイのために日常的に使用されている。
【０１８１】
実験例85では、細胞単層を実験例7のバリア形成組成物に曝露した。対照例86では、細胞層をOptiMEM（+P/S、+Lglu）組織培養培地に異なる時間曝露した：（1）T1：30分間曝露、（2）T2：1時間曝露、（3）T3：2時間曝露。次に、製剤を除去し、細胞単層をインフルエンザウイルスに感染させた（感染多重度（MOI）=0.1）。未処理の細胞又は曝露直後（T0）に感染した細胞をベースライン対照として使用した。次いで、感染した細胞を遠心分離し、増殖培地500μLに再懸濁し、32.5℃で48時間インキュベートした。また、免疫蛍光顕微鏡（FITC標識抗インフルエンザ抗体を使用）を使用して、哺乳動物細胞に対するインフルエンザウイルスの感染能に対する実験例7のバリア形成組成物の影響も評価した。
【０１８２】
図18は、インフルエンザに感染したMDCK細胞（実験例85）（パネルA及びC）及び対照例86（パネルB及びD）の細胞変性効果に対する実験例7の影響を示す。画像は下記から取得した。位相コントラスト（A〜B）、及び免疫蛍光顕微鏡（C〜D）：特定の細胞変性効果（CPE）は製剤で処理した細胞では認められなかった。未処理細胞は、局所的な円形化（focal rounding）や退行性変化を含む典型的なCPEを呈した。
【０１８３】
これらのデータから、細胞単層を実験例7に30分間、1時間又は2時間曝露してもコンフルエントかつ健常（実験例85）のままであることが示された。対照的に、未処理の細胞及び感染直前（T0）に処理した細胞（対照例86）では、実質的な細胞変性効果が示された。図18のパネルCに示されるように、実験例86の未処理細胞では蛍光が示されたが（図18、パネルD）、実験例85のバリア形成組成物で処理した細胞では蛍光が観察されなかった。
【０１８４】
実験例85及び86に対応する更なる蛍光顕微鏡像を図19に示す。
【０１８５】
（実験例87及び88）
＜定量PCRを使用したウイルス負荷に対するバリア形成組成物の活性＞
図20は、定量PCRにより判定した、感染した処理済み細胞（実験例87）及び未処理細胞（実験例88）におけるインフルエンザウイルスレベルを示す。実験例87では細胞を実験例7で処理し、対照例88では細胞を未処理のままとした。その後上清を回収してウイルスの有無を分析した。
【０１８６】
実験例87及び88と同様のアッセイから細胞培養上清を回収し、QIAampウイルスRNAキット（QIAGEN社（カリフォルニア州バレンシア））を使用して核酸抽出した。Random Hexamer Primers（Invitrogen社（カリフォルニア州カールズバッド））を使用して各試料のcDNAライブラリーを作成した。逆転写反応は、製造業者（Invitrogen社（カリフォルニア州カールズバッド））の仕様によるM-MLV RTを使用して実施した。定量分析は、StepOne Plus Taqman Real Time PCR（Applied Biosystems社（ニュージャージー州ブランチバーグ））上で、TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems社（ニュージャージー州ブランチバーグ））、cDNA試料2μL、及びプライマー／プローブを使用してインフルエンザマトリックス遺伝子を標的として実施した。参照標準は、従来のRT-PCR、精製ゲル（QIAquick、Qiagen社（カリフォルニア州バレンシア））によって増幅されたH1N1マトリックス遺伝子及びヒトRNase PのcDNA断片を使用して調製し、分光光度計（Beckman Coulter社（カリフォルニア州ブレア）を使用して定量した。
【０１８７】
図20及び表IVに示すように、実験例7で30分間又は60分間処理した実験例87の細胞は、感染後48時間で検出可能なインフルエンザを有さなかった。さらに、実験例7で2時間処理した結果、未処理対照又は感染直線に処理したもの（実験例88）と比較してウイルス負荷が1/6に減少した。
【０１８８】
【表７】
2015514758.tif 000009
【０１８９】
（実験例89〜91）
バリア形成組成物は、インフルエンザウイルスに対する直接的な抗ウイルス効果を有する。
【０１９０】
バリア形成組成物がインフルエンザウイルスに対する直接的な抗ウイルス活性を有するかどうかを判定するために、本発明者らはウイルスアフリカミドリザル腎臓（CV-1）細胞（90%コンフルエントまで24ウェルプレート内で増殖させた）を実験例7で前処理したインフルエンザに感染させた。CV-1細胞は、診断及びウイルス研究のために日常的に使用される高感受性基材である。
【０１９１】
実験例89〜91では、標準化された量のインフルエンザ（0.1 MOI）を室温で5分間、（1）実験例7（実験例89を形成するため）、（2）対照例6、CPCなし防腐剤あり化合物（実験例90を形成するため）、（3）対照例5のプラセボ単独（CPC及び保存剤なしの化合物）（実験例91を形成するため）で前処理した。5分間のインキュベーション後にウイルス／薬物混合物をOptiMEM（+P/S、+Lglu）で追加的な同体積分だけ希釈して処理組成物を希釈した。
【０１９２】
実験例89〜91では、上記で説明したようにCV-1細胞を調製した。次いで、実験例89〜91で処理済みの及び未処理のウイルスを上記のように細胞に接種した。
【０１９３】
インフルエンザウイルス負荷は上述のようにリアルタイムPCRによって判定した。図21に示すデータから、抗菌剤CPC（実験例89）を含有する実験例7のバリア形成組成物で前処理したインフルエンザウイルスについて、バリア形成組成物及び／又は防腐剤を含むがCPCを含まないもの（実験例90及び91）と比較して、ウイルス負荷の有意な減少が示された。実験例7によるウイルスの前処理は、CPCを含まない製剤と比較して、ウイルスコピーの有意な減少を示した。
【０１９４】
これらの結果は、実験例7のバリア形成組成物が実験例5及び6に固有ではないインフルエンザウイルスに対する直接的な抗ウイルス活性を有することを証明している。
【０１９５】
（実験例92及び93）
実験例92及び93では、インフルエンザA（2009/H1N1/infA）の感染を阻害するバリア形成組成物の能力を試験した。アフリカミドリザル腎臓（CV-1）細胞を90%コンフルエントまで24ウェルプレート中で増殖させた。次に、実験例7のバリア形成組成物を実験例92の細胞（20%の実験例7、80%のOptiMem、ワーキングCPC濃度0.02%）に塗布した。各時点は対照例93（形成組成物の塗布なし。100% OptiMem）と一致する。バリア形成組成物を表面上に30分間滞留させた後、細胞単層から除去した。細胞を無菌optiMEM（+PfS、+Lglu）で2回十分に洗浄した。インフルエンザをMOI=0.1にてT0からT＋6時間まで30分間隔で接種した。感染後、細胞を2200rpmで30分間、500μLのoptiMEM（+P/S、+Lglu、2μg/mLのトリプシン（sigma-Aldrich社（ミズーリ州セントルイス））で遠心分離した。感染細胞を32.5℃で96時間、5%CO2にて成長させた。インフルエンザウイルス負荷はリアルタイムPCRによって判定した。
【０１９６】
図22に示すように、グリセリン‐キサンタンガム製剤による宿主単層の前処理により、未処理の対照と比較して最大84.93%ウイルス感染が阻害された。バリア形成組成物の除去にもかかわらず宿主細胞中でウイルス感染の阻害が観察されたという事実は、バリア形成組成物により、ウイルス侵入を少なくとも6時間防止する宿主細胞に対する保護バリアが形成されたことを示している。
【０１９７】
図1Bは、感染の阻害に対処する可能な機序として参照することができる。
【０１９８】
（実験例94及び96）
＜バリア形成組成物はHIVに対して活性を示す＞
実験例94〜96では、バリア形成組成物がHIVに対する活性を有するかどうかを判定した。宿主MT哺乳動物細胞をRPMI／10%FBS／PS中15,000細胞／ウェルの密度で96ウェル丸底プレートに播種した。翌日（2日目）、ウイルスを対照例5（実験例94を形成）、対照例6（実験例95を形成）、又は実験例7（実験例96を形成）で5分間前処理して細胞に添加した。製剤への曝露から24時間後にMT（マカク）哺乳動物細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄し、新鮮な培地に取り替えた。1日目、2日目、5日目、6日目、7日目及び9日目に処理後の上清（10μL）を回収し、逆転写酵素（RT）活性によりウイルス負荷を測定した。図23は、9日間に及ぶ各実験例72〜74のmL当たりのウイルスコピーのグラフを示す。
【０１９９】
図示の結果は、実験例96中の実験例7が処理後の全ての監視時点において抗HIV活性を呈したことを示している。
【０２００】
実験例94及び95におけるCPC及び／又は保存剤なしの対照例5又は対照例6が最も小さい抗HIV活性を示した。
【０２０１】
要約すると、我々の調査結果から、CPCを含むバリア形成組成物の実験例7がHIVに対する長時間持続する抗ウイルス活性を示すことが証明された。
【０２０２】
（実験例97）
代表的な生物ウイルス病変は様々な粘膜組織における重要な感染症である。実験例97では、バリア形成組成物が一般的な口腔エプスタインバールウイルス（EBV）に対する活性を示すかどうかを判定するための実験を行った。ウェスタンブロッティングを使用して、実験例8のバリア形成組成物による溶菌ウイルスタンパク質EAD（ウイルス複製の阻害を示す）の分解能を評価した。
【０２０３】
実験例97では、EBVに感染した胃上皮細胞を実験例8の異なる希釈物（1:16、1:32、1:64）に曝露し、特異的抗体を使用してEADタンパク質の存在を検出した。細胞性β‐アクチンの存在を上皮細胞の完全性の指標とした。図24に示すように、実験例8の1:64希釈液は、細胞性アクチンに影響を及ぼすことなくEADを分解した。これらの結果は、実験例8がウイルス複製を固有に阻害し、したがって有効な抗ウイルスであり、ウイルス感染の防止に有用であることを証明している。
【０２０４】
（実験例98〜100）
＜抗菌バリア対市販洗口製品の持続時間＞
バリア形成組成物が抗菌活性を維持可能な持続時間を判定するために、細菌及び真菌を、ウェル中の実験例7のバリア形成組成物で処理した実験例2のEHOMと、同等の市販品で処理した実験例2のEHOMとに2分間曝露した。細菌及び真菌微生物を、未処理の対照EHOM（実験例98）及び処理済みのEHOM（実験例99及び比較例100）の上に重層した。次に、残留（フロースルー）溶液をウェル底（EHOMモデルの下部チャンバ）から取り出し、寒天培地プレート上に広げた。図7は、この試験法を更に明確化するものである。これらのプレートを37℃でインキュベートし、24時間後の成長微生物細胞数（コロニー形成単位；CFU）を計数した。
【０２０５】
対照例98では未処理のEHOMを試験した。実験例99では、S. mitis細菌を上記のようにバリア形成組成物に重層した。実験例100は、細菌をS. mitis細菌に対する市販のLISTERINE（エタノール（26.9%）、メントール、チモール、サリチル酸メチル及びオイカリプトールを含む）の活性を示す比較例である。結果を表IXに示す。
【０２０６】
【表８】
2015514758.tif 000010
【０２０７】
（実験例101〜103）
実験例101〜103では、Candida albicans細菌を上記のようなバリア形成組成物で試験したこと以外は実験例98〜100と同じ手順を実施した。結果を表Xに示す。実験例103は市販のLISTERINEの活性を示す比較例である。
【０２０８】
【表９】
2015514758.tif 000011
【０２０９】
これらのデータは更に、実験例7のバリア形成組成物が最大24時間を含む活性を維持することを示している。まとめると、これらの結果は、LISTERINEとは異なり、実験例7のバリア形成組成物が最大24時間EHOM組織に無傷のバリアを維持し続けたことを示している。
【０２１０】
（実験例104〜153）
微生物の通過を防止するのに有効なバリアを形成することが可能なグリセリン及びキサンタンガムの濃度の更なる例を識別するために、in vitroフィルターインサートベースバリアモデルを使用して様々な濃度のガムキサンタンガム及び保湿剤グリセリン（5%〜95%のグリセリン、0.005%〜0.5%のキサンタンガム）を単独及び組み合わせて試験した。図33は、実験例104〜153に使用される一般的な試験法を示す。
【０２１１】
直径3μm〜8μmの細孔サイズのフィルターインサートを使用してそれぞれ細菌（Streptococcus salivarius）及び真菌（Candida albicans）の通過を試験した。グリセリン若しくはキサンタンガム又はそれらの組合せ（100μLアリコート）をフィルターの表面上に重層してバリアを形成させた。フィルターの直径は24mmであった。したがって、フィルター上の膜の厚さは約0.01mmであり、この値は口内に処置有効量だけ塗布されたときの組成物膜の厚さの範囲内の値と類似する。次に、細菌又は真菌のいずれかの5×104細胞をフィルターインサート内の形成バリア上に塗布した。次に、本発明者らはこれらのフィルターインサートを6ウェルプレート内の寒天培地（真菌についてはブレインハートインフュージョン（BHI）培地、細菌についてはサブローデキストロース（SD）培地）の表面上に置いた。各プレートをフィルターインサートと共に37℃で24時間、一晩インキュベートした。
【０２１２】
各プレートにつき、寒天培地及びフィルターインサート中の細菌又は真菌の成長CFU（コロニー形成単位）の有無を観察した。フィルターインサート中だけでなく寒天培地中でも微生物の増殖が見られたことから、微生物の通過を防ぐ効果的なバリアがフィルター上に形成されたことが証明された。逆に、フィルターインサート周囲の寒天培地中で増殖が見られた場合は、試験作用物質が効果的なバリアを形成することができず生物によるフィルターの通過を許したことを示唆している。
【０２１３】
表XIに示す結果は、グリセリンが単独で試験した場合に55%以上の濃度でバリアを形成することができることを示している。対照的に、キサンタンガムのみの場合はどの試験濃度でも（0.005%〜0.4%）バリアは形成されなかった。しかしながら、0.01%のキサンタンガムと組み合わせた場合は、グリセリン濃度7%、45%、55%及び65%でバリアの形成が観察された。さらに、0.4%キサンタンガムと、グリセリン濃度7%、15%、25%、35%、45%、55%及び65%の組合せでもバリアが形成された。
したがって、in vitroフィルターインサートベースモデルにおいて微生物の通過を防止するバリアを形成し得るグリセリンとキサンタンガムの特定の組合せが識別された。
【０２１４】
【表１０】
2015514758.tif 000012
【０２１５】
フィルターインサート上に形成された実験例104〜153の組成によって保持される微生物細胞はバリアによって捕捉され生存可能であることが分かり、したがって、形成されたバリアは、抗菌剤を含まない場合は固有の抗菌性を有さないことが証明された。換言すると、バリア内に保持された微生物は活性を維持しており、例えば微生物が摩耗によってバリアから解放され又はバリアが完全性を失った場合には感染への脅威を与えるおそれがある。
【０２１６】
なお、有効な抗菌剤を加えれば、より低いグリセリン濃度及び／又はキサンタンガム濃度で有効なバリアを形成することができる。抗菌剤とバリアとが相まって有害な細菌を阻止及び／又は殺滅するからである。
【０２１７】
（実験例154〜157）
EHOM試料に関する上記の実験例に加えて、更なる試験を実施したところ、バリア形成組成物が（a）宿主組織に損傷を与えず、かつ（b）ヒトの粘膜組織への微生物の侵入を防止することができることが証明された。これらの基準について代表的な2つの組合せ（グリセリン：キサンタンガム＝7%：0.01%、及び35%：0.4%）を対象に試験した。これらの組合せは、実験例104〜153のin vitro結果に基づいて正常にバリアを形成したため代表的な組合せとして選択した。これらの2つの組合せを含む製剤は、粘膜内層に類似する実験例2のEHOMを使用して試験した。
【０２１８】
EHOMを、生理食塩水［0.9%］中1%（実験例154及び155）希釈液又は5%（実験例156及び157）希釈液のいずれかにおいて実験例3及び4の諸種の製剤で約2分間処理して実験例154-157を形成した。各EHOMに試験製剤のうちの1つ（300μL）を重層し、室温（25℃）で10分間無菌フード下に放置した。接触期間の終了時に、組織を培養培地で2回洗浄して製剤を除去した。
【０２１９】
（実験例158）
実験例3及び4で処理した後、EHOMの可能な巨視的組織損傷の有無（ホールの有無）について検査した。組織損傷は組織学的分析によっても調査した。この目的のために、生検を各EHOMから採取し4%パラホルムアルデヒド溶液で固定した後パラフィンに包埋した。薄切片（4μm）をエオシン‐ヘマトキシリンで染色し、50%グリセリン封入培地中でカバースリップを装着し、光学顕微鏡で観察して写真を撮影した。処理済みEHOM及び未処理対照EHOMの巨視的組織損傷及び構造的変化の有無を検査した。5つの異なる試験対象EHOM内の未処理組織又は処理済み組織中に500倍の倍率で視認可能な損傷（ホール）は認められなかった。
【０２２０】
（実験例159）
＜バリア形成組成物に起因する宿主細胞の損傷評価（細胞傷害性アッセイ）＞
次いで、バリア形成組成物の実験例3〜7の5%希釈物で処理した実験例156及び157のEHOMに、体積100μL中1×106細胞のC. albicans又はS. mutans を重層した。次いで、これらのEHOMを空気‐液体培養プレート上に置き、37℃の5%CO2湿潤雰囲気中で24時間インキュベートした。このインキュベーション期間後に培養上清のアリコートを回収し、製造業者（Promega社（米国ウィスコンシン州マディソン）の指示による乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）細胞毒性アッセイに供した。各上清の50μLを滅菌96ウェル平底プレートに移した。各ウェルに再構成した基質混合物50μLを補充し、プレートを室温の暗所にて30分間インキュベートした。反応を停止するため各ウェルに停止液50μLを加えた。次に、混合物100μLを96ウェル平底プレートに移し、Xマークマイクロプレート分光光度計（Bio-Rad社（カナダオンタリオ州ミシサガ））を用いて吸光度を490nmで読み取った。LDHはLDH細胞毒性アッセイを使用して評価した。データは平均±SDである。実験例の組成物で処理したEHOMと、未処理かつ未感染のEHOM対照との間に有意な差は認められなかった。図25は、未処理の対照例と、実験例5、6及び7で処理した例について実施した上記の試験の結果を示すグラフである。実験例3及び4で処理したEHOMについても同様の結果が得られた。試験した実験例は全て粘膜の完全性を維持した。
【０２２１】
（実験例160）
＜歯肉細胞の成長／移行に対するバリア形成組成物製剤の影響＞
創傷修復アッセイを行った。簡潔には、口腔（歯肉）上皮細胞（1×104）及び線維芽細胞（1×103）を6ウェルプレートのウェルに播種し、適切な培養培地中で増殖させた。コンフルエントに達した時点で、各ウェルのコンフルエント単層に200μLピペットチップを使用して傷を付けた。次いで、培養物を実験例3及び4の1%及び5%希釈液に約2分間曝露した。露光に続いて、製剤を温かい無菌の培養培地で2回洗い流した後、細胞培養物に線維芽細胞についてはDEMを重層し、上皮細胞についてはDMEHを重層し、37℃の5%CO2湿潤雰囲気下で6時間及び24時間培養した。創傷修復／細胞遊走を光学顕微鏡を使用して確認し、デジタル写真を撮影した（Nikon社Coolpix 950）。図26は、実験例3（5%希釈液）で10分間処理した創傷口腔上皮細胞培養物の、創傷直後（パネルA）、約6時間後（パネルD）及び約24時間後（パネル後E）の様子を撮影した写真を示す。パネルB及びCは、それぞれ口腔上皮細胞の未処理対照コンフルエント培養物上の同等の傷につき、約6時間後及び約24時間後の様子を示す。実験例4で処理した細胞培養物についても同様の結果が得られた。
【０２２２】
創傷閉鎖（細胞増殖／遊走）の割合は、上述の式Iを使用して製剤への曝露前と曝露後の相対的な創傷面積を比較することによって計算した。
【０２２３】
上皮細胞は処理済み培養物と未処理培養物のいずれにおいても小さい立方形状であった。線維芽細胞を使用した掻き傷創傷モデルについても同様の結果が観察された（データは示さず）。まとめると、これらのデータは実験例の組成物に毒性がなく細胞増殖／遊走及び創傷治癒に悪影響が及ばないことを示している。
【０２２４】
（実験例161）
グリセリン‐キサンタンガム製剤がヒト口腔粘膜上に被膜を形成する
【０２２５】
グリセリン‐キサンタンガム製剤がヒト口腔粘膜上に被膜を形成できるかどうかを判定するために、本発明者らは、マーカー色素としてゲンチアナバイオレット（GV）を用いて実験例7の製剤をスパイクした。スパイクした産物（750μL）をヒトボランティアの口腔に噴霧した。塗布後、口腔内染色の有無を観察し、デジタルカメラを使用して画像を撮影した。図27に示すように、この製剤は両頬と舌の背側／腹側面とを染色した。
【０２２６】
（実験例162及び163）
バリア形成組成物への微生物の曝露が細胞増殖を阻害する経時的顕微鏡検査法
【０２２７】
バリア形成組成物が微生物に対する活性を示す阻害活性及び持続時間を判定するために、未処理の細菌及び真菌と比較して、バリア形成組成物に曝露した細胞について経時的分析を実施した。
【０２２８】
実験例162では、S. mutans菌体を1分間実験例7に曝露し、洗浄して残留物質を除去し、新鮮な増殖培地を収容したペトリ皿内で増殖させた。37℃での生物の増殖を6時間観察し、顕微鏡に接続したカメラを使用して6時間のインキュベーション期間中20分毎に顕微鏡写真を撮影した。
【０２２９】
対象実験例163では、未処理の細胞に同じ手順を実施した。
【０２３０】
図28に示すように、細胞が6時間以内にコンフルエントに達した未処理の細菌とは対照的に、実験例7のバリア形成組成物で処理した微生物は、曝露後の同期間中に再成長しなかった。同様に、実験例7のバリア形成組成物にカンジダ細胞を曝露した場合は、インキュベーション期間中の成長が完全に阻害された（データは示さず）。
【０２３１】
さらに、これらの結果からバリア形成組成物が長期の抗菌活性を有することが確認された。
【０２３２】
（実験例164〜166）
＜in vivo試験：バリア形成組成物（実験例7）はヒトにおける口腔微生物負荷を低減する：短期活性及び長期活性＞
＜短期活性＞
口腔微生物の微生物負荷に対する単回塗布の効果を評価することにより、実験例7の活性持続時間を健康な個体で測定した。実験例164〜166では、（年齢18歳以上の健康な口）3人の健常者のインフォームドコンセントを得て、各自の両頬に実験例7の組成物の単回塗布を依頼した。単回塗布は体積0.25mLずつを3噴霧と定義した。次に、これらの人間からベースライン（処置前）、処置後1時間経過後、処置後2時間経過後及び処置後6時間経過後のスワブを採取したこれらのスワブを好気性又は嫌気性生物に特異的な寒天培地プレート上で培養し、37℃で24〜28時間インキュベートし、CFU数を計数した。微生物負荷に対する実験例7の影響（CFU）を判定し、ベースライン（0分）のCFUを基準にして各露光後時点の阻害率を計算した。
【０２３３】
得られた結果から、実験例7の塗布により最大6時間にわたる微生物負荷の一貫した低下が確認された（代表的な被験者のCFUを示す図29A参照）。バリア形成組成物による処置によって口腔内微生物負荷が69%〜96%低下した（代表的な被験者の微生物負荷の減少を示す図29B参照）。
【０２３４】
（実験例167〜169）
＜長期活性＞
口腔微生物に対する5日間にわたるバリア形成組成物の活性を評価した。実験例167-169では、3人の健常者を登録し、実験例7の単回用量（3回噴霧の合計：0.75mL）を1日3回（目安として午前9時、正午及び午後3時の3回）塗布する処置を5日間（典型的な週5日制）続けることを依頼した。ベースライン（1日目の塗布前）及び5日間の試験期間における各日の終わりに、被験者からスワブを採取した。収集したスワブを寒天培地プレート上で培養し、37℃の5%CO2湿潤雰囲気下で24〜28時間インキュベートし、CFUの数を計数した。
【０２３５】
微生物負荷に対する実験例7のバリア形成組成物の影響を（3名の被験者のメジアンCFUとして）判定し、各露光後時点の阻害率をベースライン（0分）CFUを基準として計算した。図30は、これらの結果をCFU対時間（図30A）、及び微生物負荷の減少対時間（図30B）を示すグラフである。実験例167〜169は、5日間の実験例7の塗布が、5日間の試験期間中一貫した微生物負荷の低下をもたらしたことを証明する（図30Ａ）。実験例7のバリア形成組成物による処置により、研究参加者の口腔内の微生物負荷中央値が65%〜88%減少した（図30B）。
【０２３６】
（実験例170〜198）
臨床試験では、29人の健常者をインフォームドコンセント後に登録した。ベースライン情報（年齢、性別、民族及び登録日）を記録した。口の構内検査を実施し、口（頬）の内側を無菌培養スワブで消毒した。ベースラインの口腔スワブ試料を培養して試験前の細菌負荷を判定した。実験例170〜198では、29人の参加者各自に実験例7のバリア形成組成物を含むスプレーボトルを渡し、それを各自の口の内側に総体積0.75mL噴霧し、その後30秒間口内で攪拌してから飲み込むよう指示した。ほぼ同数の参加者で構成される2つのグループについて検査を行った。一方のグループは、実験例のバリア形成組成物を2時間毎に1日3回5日間（典型的な週間労働日数）にわたって使用した。他方のグループは、実験例のバリア形成組成物を2時間毎に1日4回5日間（典型的な週間労働日数）にわたって使用した。これら2つのグループで大きな差は認められなかった。1日目、2日目、3日目及び5日目の終わり（バリア形成組成物の初回投与時点から8時間後）にスワブを回収し、好気性及び嫌気性細菌に特異的な培地上で培養した。データは好気性と嫌気性に分けて微生物数：合計で表した。図31は総微生物負荷のグラフであり、合計を処理直前と処理5日目の好気性及び嫌気性のカウントに分けて示す。図32は、代表的な3人の研究参加者から得た口腔試料中の5日間にわたる微生物負荷のグラフを示す。
【０２３７】
全体として、in vivo試験から、これらの生物レベルの低下によって測定されるように、バリア形成組成物が短期と長期の両方の持続期間にわたって口腔微生物に対する抗菌活性を有することが示された。
【０２３８】
これらのデータは、バリア形成組成物による処理が全体の好気性微生物及び嫌気性生物について5日間にわたる口腔微生物負荷の減少をもたらしたことを示した。
【０２３９】
（実験例199〜205）
＜微生物侵入を防止するためのバリアを形成する追加的な保湿剤の識別＞
例199では、インビトロフィルタ挿入ベースモデル（図33参照）を使用して様々な濃度の様々な保湿剤を試験した。
【０２４０】
実験例3〜8で使用した混合手順に基づいて、6種の組成物を表12に従って調製した。
【０２４１】
【表１１】
2015514758.tif 000013
【０２４２】
次に、100μLの実験例199〜205をフィルターインサート（細菌と真菌の両方を通過させる孔サイズ：直径0.8μm）に入れて層を形成させた。次に、生物を試験用液により形成した層に重層した。次いで、試験溶液の層及び微生物を含むフィルターインサートを寒天培地プレートの表面上に置き、37℃で24時間インキュベートした。インキュベーション期間経過後、寒天培地プレートについてフィルターインサート上及び寒天培地内の発育の有無を評価した。フィルターインサート上では発育が確認されたが寒天培地内では発育が確認されなかったことから、試験溶液が微生物の通過を防止するバリアを形成したことが示された。対照的に、フィルターインサート及び寒天培地内で微生物の発育が確認された場合はそのようなバリアが形成されなかったことを示す。
【０２４３】
得られた結果から、試験保湿剤（単独又は組合せ）を含むキサンタンガムベースの各溶液が、土台の寒天培地まで微生物が通過することを防止する無傷のバリアをフィルターインサート上に形成したことが示された。
【０２４４】
（実験例206〜213）
＜キサンタンガムの溶解限度の判定＞
キサンタンガムの溶解度を判定するために、キサンタンガムを様々な濃度で水と混合し、塊の有無及び混合物の自由流動を監視することにより溶解度を観察した。表XIIIは結果及び濃度を示す。
【０２４５】
【表１２】
2015514758.tif 000014
【０２４６】
本発明者らは、0.4%で混合した場合にキサンタンガムが自由流動性溶液（表XIII）を形成することを発見した。対照的に、0.45%又は0.5%のキサンタンガムを含有する混合物は、粘性流体を形成するが小塊を含んでいた。塊の程度はキサンタンガムの濃度の上昇（0.6%及び0.7%）と共に増加した。濃度≧0.8%では、キサンタンガム混合物はゼリー様の粘稠度を有し自由流動のない広範囲の塊を含んでいた。
【０２４７】
（実験例214）
バリア形成組成物中のカチオン性CPCとバリア形成組成物中の中性抗菌剤との比較
実験例214では、CPCの代わりに中性剤シトラールを使用した点を除いて、実験例7の製剤を調製した。CPC（0.1%）又はシトラール（0.5%）を含有する製剤の連鎖球菌に対する抗菌活性を確認した。これらの研究を行うために実験例48〜61において上記で説明したアッセイを使用した。
【０２４８】
得られた結果から、シトラールを含有する製剤が抗菌活性（MIC=12.5%）を示すことが示された。しかしながら、シトラールを含有する製剤の活性はCPC（MIC=0.098%）を含有する製剤より大幅に低い。
【０２４９】
（実験例215）
＜疎水性の物理化学的試験及び比較＞
実験例215では、薄層クロマトグラフィー分析を使用して実験例7と疎水性組成物の疎水性を比較した。疎水性組成物の成分は表XIVに示すとおりである。
【０２５０】
【表１３】
2015514758.tif 000015
【０２５１】
10μLの実験例7及び疎水性組成物を予め用意したTLCプレート上に（下端から2cmの距離まで）堆積させた。スポットを5分間空気乾燥し、各プレートを、溶媒として水を含有するTLCクロマトグラフィージャーに入れた。溶媒前線がプレート上端に達するまでTLCシステムを実行した。プレートを取り出して溶媒及び試料前線をマークした。これら2つのサンプルの相対前面（RF）の値を次式IIによって計算した。
【０２５２】
式II：
RF＝スポットの移動距離／溶媒前面の距離
【０２５３】
得られた結果から、疎水性組成物及び実験例7のRf値がそれぞれ0.33及び0であり、これによって疎水性組成物の水混和性が高いことが示された。対照的に、実験例7は水性溶媒中でどのような移動性も示さず、これによって本製剤が疎水性であること又は親水性でないことが証明された。
【０２５４】
（実験例216）
下記の表XVに記載の各種成分を水中で混合し溶液として、バリア形成組成物を調製した。  
米国ホメオパシー薬局方に基づき5倍量のオイカリプトール成分も含めたが試験結果には影響を及ぼさず、この場合も本例の組成物が追加成分と協働して作用することが証明された。以下、「%」は全て重量%を示す。
【０２５５】
【表１４】
2015514758.tif 000016
【０２５６】
（実験例217〜219）
本例のバリア形成組成物は、アレルギーを誘発するカビを殺滅するのに有効であることも示された。ポリスチレンプラスチック表面にてMIC試験を行った。
【０２５７】
実験例217では、実験例216のバリア形成組成物を検査してStachybotrys MRL 9740に対するMICを判定した。実験例7の組成物のMICは0.06μg/mLであった。
【０２５８】
実験例218では、実験例216のバリア形成組成物を検査してAspergillus fumigatus 18748に対するMICを判定した。実験例7の組成物のMICは0.49μg/mLであった。
【０２５９】
実験例219では、実験例216のバリア形成組成物を検査してCladosporiumに対するMICを判定した。実験例7の組成物のMICは0.39μg/mLであった。
【０２６０】
Stachybotrys及びAspergillus fumigatusはカビを発生させる有機物であるので、これらの実験例は更に、バリア形成組成物を表面に塗布してカビの成長又は変色を防止又はそれらに対処する実施形態もサポートする。
【０２６１】
（実験例219〜224）
実験例219〜224では、シリコーンエラストマーディスク表面上でMRSAバイオフィルムに対するバリア形成組成物の影響を評価した。
【０２６２】
実験例219〜221では、直径1cm の3枚のシリコーンエラストマーディスクに実験例7のバリア形成組成物0.25mLを予め噴霧し、60分間37℃でインキュベートした。実験例222〜224では、シリコーンエラストマーディスクを当量のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で60分間処理することにより対照例とし、37℃でインキュベートした。
【０２６３】
実験例219〜224の前処理したディスクをそれぞれ4mLのMRSA懸濁液（1×107細胞/mL）に浸漬し、37℃で90分間インキュベートした（「接着段階」）。次いで、接着細胞を含むディスクを取り出し、4mLのブレインハートインフュージョン（BHI）を含むウェルに移した。これらのウェルをロッカーに置き37℃で24時間インキュベートした。BHI寒天培地における定量培養によりディスク上のバイオフィルム形成評価を行った。スキャナを使用して各ウェルのスキャン画像を記録した。
【０２６４】
表XVIに示されるように、実施例7のバリア形成組成物による前処理を行った場合はディスク表面上にバイオフィルムが形成されなかった。図34は、MRSAにより、PBS処理ディスク（A, C, E）及び実施例7で処理したディスク（B, D, F）上に形成されるバイオフィルム内のコロニー数（colony burden）の画像を示す。
【０２６５】
【表１５】
2015514758.tif 000017
【０２６６】
（実験例225〜246）
実験例7のバリア形成組成物を検査して数株のBordetella pertussisに対する有効性を判定した。実験例225〜235では、実施例7のバリア形成組成物をRegan-Lowe Charcoal Agar BBL #297883プレートに入れ、64μg/mLの水希釈液として寒天ベースアッセイを行った。対照例236〜246は、実施例7のバリア形成組成物を含まない寒天プレートとした。実験例225〜246では、それぞれ細胞数5×104（50μL）のBordetella pertussisを試験面にスポットし、各プレートを37℃で24時間インキュベートした。表XVIIに示されるように、対照例236〜246では密集成長が観察されたが、実験例236〜246では成長が認められなかった。表中「4+」は顕著な成長を示す。
【０２６７】
【表１６】
2015514758.tif 000018
【０２６８】
（実験例247〜252）
実施例7の（様々な希釈濃度の）バリア形成組成物につき、ライノウイルスのATCC VR-1200株に対する抗ウイルス活性を評価した。
【０２６９】
ヒト肝細胞癌（HUH-7）細胞を、10%熱不活性化ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を加えた24ウェルプレート中で調製し、L-グルタミン（Lglu）及びペニシリン／ストレプトマイシン（P/S）（特に明記しない限り、全てGibco社（ニューヨーク州）製の試薬）を補充した。全ての培養細胞をCO2濃度5%、37℃の条件下で90%〜100%コンフルエンスまで増殖させた後、感染前に一度OptiMEM + P/S + Lgluにて洗浄した。
【０２７０】
実験例247〜251では、実験例7の組成物を、0.005%、0.01%、0.015%、0.02%、及び0.05%のCPC作用濃度に対する諸種の濃度（OptiMEM（+ P/ S、+ Lglu）400μL中の希釈濃度5%、10%、15%、20%、50%）で細胞単層に塗布し、それぞれ接種前に1時間滞留させた。対照例252では、400μLのOptiMEM（+ P/S、+ Lglu）を細胞に塗布し、接種前に1時間滞留させた。
【０２７１】
次いで、実験例7の希釈液又は対照のOptiMEMから細胞単層を取り出してライノウイルスを塗布し、感染多重度（MOI）を0.1とした。細胞をウイルスとともに32.5℃で1時間インキュベートした。この後、接種材料を除去し、500μLのOptiMEM + P/S + Lgluを細胞上に置いた。次いで、CO2濃度5%、32.5℃の条件下で細胞を増殖させた。5日間のインキュベーション後、細胞培養上清をライノウイルス負荷の定量化のために収集した。
【０２７２】
実験例247〜251の細胞培養上清のライノウイルス力価は、リアルタイムPCRによって測定した。対照例252と比較して、実験例251ではライノウイルス負荷の有意な減少が示され、実施例7の50%の濃度であった。詳しくは下記の表XVIIIを参照されたい。
【０２７３】
【表１７】
2015514758.tif 000019
【０２７４】
（実験例253及び254）
実験例253は、OptiMEM（+ P/S、+ Lglu）500μL中50%である実施例7の希釈懸濁液（CPC濃度0.05）で調製した。対照例254は、実験例7（500μLのOptiMEM（+ P/S、+ Lglu））を含まない対照溶液として調製した。実験例253及び254を実験例246〜252で開示した細胞に塗布した。前処理の時間間隔は次のとおり定義した：T-1＝感染1時間前、T-30＝感染30分前、T-0＝感染直前。
【０２７５】
次いで、実験例253の懸濁液及び実験例254の対照溶液から細胞単層を取り出した。処理した細胞単層にライノウイルス粒子を感染多重度（MOI）0.1で塗布した。細胞をウイルスと共に32.5℃で1時間インキュベートした。この後、接種材料を除去し、500μLのOptiMEM + P/S + Lgluを細胞上に置いた。次いで、CO2濃度5%、32.5℃の条件下で細胞を5日間成長させた。実験例253及び254で処理した各細胞を毎日観察し、細胞変性効果の有無を確認した。5日間のインキュベーション後、細胞培養上清を免疫蛍光及びライノウイルス負荷の定量化のために収集した。
【０２７６】
図35は、実験例253で処理した細胞の写真を示す。図35（a）はT-1（1時間前）、図35（c）はT-30（30分前）、図35（b）はT-0（直前）である。これらの写真ではいずれも細胞変性効果は確認されず、プレート一面に健康な細胞が成長した。一方、図35（d）に示されるように、実験例254の未処理の対照細胞では巣状円形化(focal rounding)、解離、及び細胞死が確認された。細胞変性効果の判定として、巣状円形化の進行、細胞サイズの拡大又は縮小、合胞体形成、多核巨細胞の発達、及び解離を判定した。
【０２７７】
免疫蛍光測定を以下のように行った。ウイルスに感染した細胞単層及び非感染対照を滅菌PBSで洗浄した。これらの細胞をトリプシン処理し、スライド上のウェル上にスポットし、アセトンで固定した。各スライドを、FITC標識モノクローナル抗体を利用したDFAにより試験した。Light Diagnostics Pan-Enterovirus Detection Kit（Millipore社）を使用して間接免疫蛍光アッセイを行った。この検出キットは、ライノウイルス感染細胞との交差反応性を示すことでよく知られている。全ての抗体滞留ステップを37℃で1時間行った。最終洗浄後、各細胞の蛍光の有無を488nmの波長で評価した。
【０２７８】
図36は、実験例253で前処理した細胞の免疫蛍光写真を示す。図36（d）はT-1（1時間前）、図36（b）はT-30（30分前）、図36（c）はT-0（直前）である。実施例253で処理した細胞は1時間30分にわたって免疫蛍光を示さなかった。実験例253で処理したT-0（直前）の細胞はわずかな蛍光を示した。一方、未処理の対照例254は顕著な免疫蛍光を示し、重度のウイルス感染が示唆された（図36（a）参照）。
【０２７９】
サンプルのウイルス負荷を下記のように定量した。細胞培養上清を回収し、−80℃で保存した。核酸はQIAamp Viral RNA Kit（QIAGEN社（カリフォルニア州バレンシア）を使用して抽出した。Random Hexamer Primers（Invitrogen社（カリフォルニア州カールズバッド））を使用して各試料のcDNAライブラリーを作成した。逆転写反応は、製造業者（Invitrogen社（カリフォルニア州カールズバッド））の仕様によるM-MLV RTを使用して実施した。定量分析は、StepOne Plus Taqman Real Time PCR（Applied Biosystems社（ニュージャージー州ブランチバーグ））上で、TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems社（ニュージャージー州ブランチバーグ））、cDNAサンプル2μL、及びプライマー／プローブを使用してライノウイルスポリプロテイン遺伝子を標的として実施した。参照標準は、従来のRT-PCR 、精製ゲル（QIAquick、Qiagen社（カリフォルニア州バレンシア））によって増幅されたアンプリコンを使用して調製し、分光光度計（Beckman Coulter社（カリフォルニア州ブレア）を使用して定量した。結果を表XIXに示す。
【０２８０】
【表１８】
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【０２８１】
感染5日後、T-1（1時間前）、T-30（30分前）、又はT-0（直前）のいずれの時点でもライノウイルスの増幅は認められなかった。未処理の（対照）細胞では顕著な増幅（>108コピー/mL）が示され、ウイルス感染が示唆された。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５（Ａ）】
2015514758.tif 000026
【図５（Ｂ）】
2015514758.tif 000027
【図５（Ｃ）】
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【図５（Ｄ）】
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【図５（Ｅ）】
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【図５（Ｆ）】
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【図６】
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【図７】
2015514758.tif 000033
【図８（Ａ）】
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【図８（Ｂ）】
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【図８（Ｃ）】
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【図８（Ｄ）】
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【図９（Ａ）】
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【図９（Ｂ）】
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【図１０（Ａ）】
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【図１０（Ｂ）】
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【図１０（Ｃ）】
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【図１０（Ｄ）】
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【図１１（Ａ）】
2015514758.tif 000044
【図１１（Ｂ）】
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【図１１（Ｃ）】
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【図１１（Ｄ）】
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【図１２（Ａ）】
2015514758.tif 000048
【図１２（Ｂ）】
2015514758.tif 000049
【図１３】
2015514758.tif 000050
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2015514758.tif 000053
【図１７】
2015514758.tif 000054
【図１８（Ａ）】
2015514758.tif 000055
【図１８（Ｂ）】
2015514758.tif 000056
【図１８（Ｃ）】
2015514758.tif 000057
【図１８（Ｄ）】
2015514758.tif 000058
【図１９】
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【図２０】
2015514758.tif 000060
【図２１】
2015514758.tif 000061
【図２２】
2015514758.tif 000062
【図２３】
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【図２４】
2015514758.tif 000064
【図２５】
2015514758.tif 000065
【図２６（Ａ）】
2015514758.tif 000066
【図２６（Ｂ）】
2015514758.tif 000067
【図２６（Ｃ）】
2015514758.tif 000068
【図２６（Ｄ）】
2015514758.tif 000069
【図２６（Ｅ）】
2015514758.tif 000070
【図２７】
2015514758.tif 000071
【図２８】
2015514758.tif 000072
【図２９】
2015514758.tif 000073
【図３０】
2015514758.tif 000074
【図３１】
2015514758.tif 000075
【図３２】
2015514758.tif 000076
【図３３】
2015514758.tif 000077
【図３４】
2015514758.tif 000078
【図３５（Ａ）】
2015514758.tif 000079
【図３５（Ｂ）】
2015514758.tif 000080
【図３５（Ｃ）】
2015514758.tif 000081
【図３５（Ｄ）】
2015514758.tif 000082
【図３６（Ａ）】
2015514758.tif 000083
【図３６（Ｂ）】
2015514758.tif 000084
【図３６（Ｃ）】
2015514758.tif 000085
【図３６（Ｄ）】
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【国際調査報告】
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