(57)【要約】  本発明は、医学及び薬化学の分野に属し、具体的には、新規な抗腫瘍医薬組合せに関し、特にビスベンジルイソキノリンアルカロイド（例えばベルバミン及びテトランドリン）及びアントラセン化合物（例えばアクラルビシンＡ）の医薬組合せ並びに腫瘍を治療する際のその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性成分として、式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイド又はその薬学的に許容される塩及び式（II）のアントラセン化合物又はその薬学的に許容される塩
【化１】
2015531356.tif 000017
［式（Ｉ）中、
Ｒ１は、Ｈ又は１〜１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、Ｈ、置換されているアシル、直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、置換されているアシル、直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ４及びＲ５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、ハロゲン原子、ヒドロキシル、又は１〜１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、又はアルコキシ、又はアシルオキシであり、ｎは、０〜４の整数であり、
Ｃ（１）及びＣ（１’）は、ＲＲ、ＳＳ、１Ｓ１’Ｒ、１Ｒ１’Ｓから選択される立体異性配置を有し、
式（II）中、
Ｗ１は、Ｈ、メチル、置換又は非置換のＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｗ２は、Ｈ、グリコシル又はアミノ置換されているグリコシルであり、
Ｗ３及びＷ４はそれぞれ、Ｈ、ヒドロキシル、置換若しくは非置換のアルキル又は置換されているカルボニルであり、
Ｗ５は、Ｈ、置換されているカルボニル基又はエステル基であり、
Ｗ６は、Ｈ又はヒドロキシルであり、
前記置換基は、ハロゲン、アミノ、Ｃ１−Ｃ６置換されているアミノ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、メルカプト及びＣ１−Ｃ６アルキルチオからなる群から選択され、前記置換基は、出現する毎に１又は２以上であってよく、同一であっても異なっていてもよく、それぞれＨ原子を置換している］
を含む抗腫瘍医薬組合せ。
【請求項２】
式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイドが、テトランドリン又はその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の抗腫瘍医薬組合せ。
【請求項３】
式（II）のアントラセン化合物が、アクラルビシンＡである、請求項１に記載の抗腫瘍医薬組合せ。
【請求項４】
式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイドが、組合せの活性成分の総重量の０．１〜９９．９％を構成し、式（II）のアントラセン化合物が、組合せの活性成分の総重量の０．１〜９９．９％を構成することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の抗腫瘍医薬組合せ。
【請求項５】
式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイドが、組合せの活性成分の総重量の１〜９９％を構成し、式（II）のアントラセン化合物が、組合せの活性成分の総重量の１〜９９％を構成することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の抗腫瘍医薬組合せ。
【請求項６】
式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイドが、組合せの活性成分の総重量の１０〜９０％を構成し、式（II）のアントラセン化合物が、組合せの活性成分の総重量の１０〜９０％を構成することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の抗腫瘍医薬組合せ。
【請求項７】
式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイドが、組合せの活性成分の総重量の２０〜８０％を構成し、式（II）のアントラセン化合物が、組合せの活性成分の総重量の２０〜８０％を構成することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の抗腫瘍医薬組合せ。
【請求項８】
抗腫瘍医薬品の製造における活性成分としての、請求項１〜７のいずれかに記載の、式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイド又はその薬学的に許容される塩及び式（II）のアントラセン化合物又はその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項９】
腫瘍に罹患している対象を治療するための方法であって、それを必要とする前記対象に、請求項１〜７のいずれかに記載の、有効量の式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイド又はその薬学的に許容される塩及び式（II）のアントラセン化合物又はその薬学的に許容される塩を投与することを含む方法。
【請求項１０】
抗腫瘍薬剤としての使用のための、請求項１〜７のいずれかに記載の医薬組合せ。
【請求項１１】
腫瘍が、白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、肝がん、胃がん、乳がん、胆管細胞癌、膵がん、肺がん、結腸直腸癌、骨肉腫、ヒト子宮頚がん、神経膠腫、上咽頭癌、喉頭癌、食道がん、中耳腫瘍、黒色腫、卵巣癌、腎癌、子宮癌、骨肉腫及び前立腺がんから選択される、請求項８、９又は１０に記載の使用、方法又は医薬組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学及び薬化学の分野に属し、新規な抗腫瘍医薬組合せに関し、特にビスベンジルイソキノリンアルカロイド及びアントラセン化合物の医薬組合せ並びに腫瘍を治療する際のその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビスベンジルイソキノリンアルカロイドは、非常に重要な天然物の類である。これらは、広範囲の薬効材料に由来し、成熟したプロセスを用いて、分離、抽出及び特性決定することができる。決定された構造を有する複数のこれらの化合物は、ベルバミン、テトランドリン及びファングキノリンなどの臨床用の医薬として使用されている。
【０００３】
ベルバミン（ＢＢＭ, Berbamine）は、６，６’，７−トリメトキシ−２，２’−ジメチルベルバマン−１２−オールとしても知られており、中国の薬用植物であるメギから抽出されるビスベンジルイソキノリンアルカロイドである。
【０００４】
ベルバミンは、骨髄細胞増殖を刺激し、造血幹細胞コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ, hematopoietic stem cell colony stimulating factor）のレベルを改善し、骨髄造血幹細胞及び骨髄系前駆細胞の増殖並びにそれらの顆粒球への分化を促進し、白血球の増殖を促進する効果を有する（LIN Chuanrong, et al., The clinical observations on the treatment of chemotherapy-induced leukopenia with Shengbaijiao (berbamine), Prepared Chinese Medicine, 1994, 16 (7): 29）。
【０００５】
ベルバミンは、細胞のアポトーシスを誘導し、細胞周期に影響を与えることによって、前立腺がんＰＣ−３細胞の増殖を阻害し、時間依存性及び濃度依存性を示す（SUN Peng et al, Induction of apoptosis by berbamine in androgen-independent prostate cancer cell PC-3 in vitro, Chin J Exp Surg, August 2007, Vol 24, No. 8, pp 957）。
【０００６】
ベルバミンは、インビトロにおいて、Ｋ５６２細胞に対して著しい抗増殖効果及び特異的なアポトーシス誘導効果を有し、時間依存性を示す。担腫瘍ヌードマウスにおいて、ベルバミンはまた、Ｋ５６２細胞に対する著しい増殖阻害効果を示し、特に腫瘍組織球ｂｃｒ／ａｂｌ  ｍＲＮＡの発現レベルを低減することができる（WU Dong et al, Effects of Berbamine on K562 Cells and Its Mechanisms in vitro and in vivo, Journal of Experimental Hematology 2005, 13 (3): 373-378）。
【０００７】
ベルバミンは、細胞傷害性Ｔリンパ球を阻害する効果を有し、インビトロでのマウスナチュラルキラー細胞活性を著しく促進し、インビトロ及びインビボで比較的高レベルのインターロイキンII（ＩＬ−２, interleukin II）を誘導することができ、腫瘍の治療のための多量のＩＬ−２の投与によって誘導される毒性効果及び副作用を回避することができる。ベルバミンが放射線障害に対してマウスの免疫系に良好な保護効果を有することが、実験的に実証されている［LIU Xin, et al., The immune regulation action of berbamine on BALB/C mice, Journal of China Medical University, 1996, 25 (3): 229; LUO Chongnian, et al., The inhibition of berbamine on mice splenocytes cytotoxic T lymphocyte activity, Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology, 1995, 9 (2): 159-160; GE Mingzhu, et al., The experimental study of immune protection action of berbamine on irradiated mice, Journal of Immunology, 1998, 14 (4): 238］。
【０００８】
ヒト白血病Ｊｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを誘導するベルバミンの機序についての研究報告も存在する。結果は、ベルバミンが、ヒト白血病Ｊｕｒｋａｔ細胞のアポトーシスを選択的に阻害し、細胞周期をＳ期で停止させ、細胞のカスパーゼ−３タンパク質発現を増加することができることを示している。活性薬物濃度が０．５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬへと増加するにつれて、細胞生存率は９３．６９％〜１４．８５％へと減少する。この薬物濃度の範囲内で、ベルバミンは、正常なヒトの末梢血白血球に対して明白な細胞毒性効果を及ぼさない（HUANG Zhiyu et al, Experimental Study of Berbamine Inducing Apoptosis in Human Leukemia Jurkat Cells, China Cancer, 2007, 16(9), 722）。
【０００９】
ファングキノリン（ＦＡＮ, Fangchinoline）は、ハンファンギチンとしても知られており、中国の漢方粉末であるボウイの根から抽出されるビスベンジルイソキノリンアルカロイドである。ファングキノリンは、天然のカルシウムアンタゴニストであり、広範囲の抗炎症、抗高血圧、糖尿病、肝線維症及び脳細胞の保護などの、種々の疾患に対する著しい治療効果を有する。ここ数年にわたる研究によって、ファングキノリンが著しい抗腫瘍効果も有することが発見されている。
【００１０】
研究は、ヒト結腸がん細胞株ＬｏＶｏに及ぼすファングキノリンの阻害効果を報告している。実験において、担腫瘍ヌードマウスにファングキノリンを６０日間継続的に投与したところ、その結果は、対照群と比較して、処置群が腫瘍の著しい減少及び成長遅延並びに微小血管密度の低下を示すことを示した（WANG Zhenjun et al, Use of fangchinoline in angiogenesis inhibiting medicaments, [P]中国特許出願公開第１５１１５２８Ａ号明細書. 2004-07-14）。
【００１１】
Changdong Wangらは、ヒト前立腺がん細胞ＰＣ３に及ぼすファングキノリンの阻害効果を研究した。細胞周期の進行に関する研究は、ＰＣ３細胞に及ぼすファングキノリンの阻害効果が、Ｇ１／Ｓ期細胞の増加に関係していることを示した。加えて、ファングキノリンは、インビボにおいて抗腫瘍活性を有し、腫瘍体積を減少させ、そのアポトーシスを促進し、ヌードマウスにおける移植された腫瘍ＰＣ３に対して阻害効果を及ぼした（Changdong Wang, et al. Fangchinoline induced G1/S arrest by modulating expression of p27, PCNA, and cyclin D in human prostate carcinoma cancer PC3 cells and tumor xenograft. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2010, 74(3):488-493）。
【００１２】
TANG Yalinらは、グアニン四重鎖の安定性を増加させ、ひいては細胞増殖の能力を弱め、そのアポトーシスを促進するために、グアニン四重鎖ＤＮＡ及びファングキノリンの組合せを研究した。インビトロにおいて、抗がん細胞増殖実験は、グアニン四重鎖ＤＮＡ及びファングキノリンの組合せが、ヒト白血病細胞株ＨＬ−６０、ヒト胃癌細胞株ＢＧＣ−８２３、ヒト肝細胞癌細胞株Ｂｅｌ−７４０２及びヒト上咽頭癌細胞株ＫＢに対して、より良好な阻害効果を有することを示した（TANG Yalin et al, New use of bisbenzylisoquinoline alkaloid, [P]中国特許出願公開第１０１３７１８３９Ａ号明細書. 2009-02-25）。
【００１３】
テトランドリン又はＴＴＤ若しくはＴＥは、６，６’，７，１２−テトラメトキシ−２，２’ジメチルベルバミンの化学式を有し、中国の漢方であるボウイの根塊から抽出されるビスベンジルイソキノリンアルカロイドである。
【００１４】
テトランドリンは、子宮頚がんＨｅＬａ細胞の増殖に対して阻害を示す。研究はＭＴＴ法を使用して、種々の濃度及び異なる時間における、テトランドリンによる子宮頚がんＨｅＬａ細胞株の増殖に対する阻害を検出する。実験によって示されているように、テトランドリンは子宮頚がんＨｅＬａ細胞の増殖に対する阻害を示し、それは時間依存性及び濃度依存性を示す。（ZHU Kexiu et al., Qualitative and quantitative studies on tetrandrine-induced apoptosis of cervical cancer cells, Journal of Xi'an Jiaotong University (Medical Sciences Edition), 2010, 31 (1), 102）。
【００１５】
テトランドリンは、肝細胞がん細胞の増殖を阻害することができる。テトランドリンが肝細胞がん細胞に作用した後に、活性酸素種（ＲＯＳ, reactive oxygen species）が２時間以内に生じ、ＲＯＳの産生は、用量の増加に伴って著しく増加する。テトランドリンは、ミトコンドリア機能を妨げることによって活性酸素種を生じ得、このことが、細胞の脂質過酸化を引き起こし、ＤＮＡ分子を損傷し又はアポトーシスの関連遺伝子を調節し、それによって、肝細胞がん細胞の増殖を阻害することが示唆されている。（Jing Xubin et al., Experimental studies on the tetrandrine-induced oxidative damage of hepatoma cells, Journal of Clinical Hepatology, 2002, 18 (6), 366）。
【００１６】
他方では、アントラセノ６員環並びに側鎖及びアミノ糖を有するアントラセン化合物、ダウノルビシン、イダルビシン、ダウノマイシンフェニルヒドラゾン、ドキソルビシン、エピルビシン、デオキシドキソルビシン、クエラマイシン、ＴＨＰアドリアマイシン、フルオロエチルドキソルビシン、アクラルビシン（Ａｃｌａ, aclarubicin）、ドキシサイクリンなどが、広範囲の抗腫瘍活性を示す。それらは、アポトーシスの誘導、免疫調節及び薬物耐性の発生機構並びに毒性及び副作用に関して、鋭意研究されている。
【００１７】
アクラルビシンＡ（ＡＣＭ−Ａ, Aclarubicin A）は、ストレプトミセス・ガリラエウス（Galilee Streptomyces）ＭＡ−１４４−Ｍ１（ＡＴＣＣ３１１３３）から単離される抗腫瘍抗生物質である。Oki Tらによる研究は、ＡＣＭ−Ａが、良好な抗腫瘍効果を有することを示した。白血病細胞株Ｌ１２１０及びＰ３８８をマウスに接種し、０．５〜５ｍｇ／ｋｇ／日のＡＣＭ−Ａを１０日間連続して投与した。抗生物質を注射しないものと比較して、注射したマウスの生存率は１５０％増加した。加えて、ＡＣＭ−Ａは、リンパ腫６Ｃ３ＨＥＤ、肝がん、食道がん、肉腫−１８０などに対する著しい効果も有する（Oki T. 米国特許第３９８８３１５号明細書, 1976-10-26）。
【００１８】
アクラルビシンＡ（ＡＣＭ, Aclarubicin）は、アントラセンキノン抗腫瘍抗生物質の類に属し、心臓への毒性がアドリアマイシン及びダウノマイシンのものに比べてはるかに低い。ＡＣＭ−Ａは、インビトロで培養されたマウス白血病Ｐ３８８及びヒト胃がん細胞株ＳＧＣ−７９０１の成長を著しく阻害することができる。クローン形成は、０．０１μｇ／ｍｌの濃度で６５．４％阻害することができ、ＥＤ５０は、０．００８５μｇ／ｍｌである。ＡＣＭ−Ａは、白血病マウスに対して著しい治療効果を有し、マウスの寿命を１４３％延長し、マウスの半数が治療された。ＡＣＭ−Ａはまた、エールリッヒ腹水癌及び肉腫−１８０に対して強力な阻害効果を有する。（Yang Jinlong et al., Domestic Aclarubicin A in vitro and in vivo antitumor effects, Acta Pharmaceutica Sinica, 1988, 23 (5): 321-326）。
【００１９】
アクラルビシンＡ（ＡＣＭ）は、ヌードマウスに移植されたさまざまな動物の腫瘍及びヒト腫瘍に対して、成長を阻害する効果を有する。急性リンパ芽球性白血病（ＡＮＬＬ, acute lymphoblastic leukemia）の初期治療は、最大７０％までの完全寛解率（ＣＲ, complete remission rate）を達成し、ＡＮＬＬを治療するための化学療法と組み合わせたＡＣＭは、２３％〜４７％のＣＲを達成している。この医薬は、骨髄異形成症候群、悪性リンパ腫、乳がん及び胃がんにも有効である。（PAN Qichao, Pharmacology and clinic, Aclarubicin A China Pharmaceutical Journal, 1993, 2 (3): 25-28）。
【００２０】
アクラルビシンＡは、急性白血病、リンパ肉腫並びに胃、膵臓、腸、卵巣、肺及び膀胱の転移性腫瘍に対する明らかな治療効果を有し、肝がんに対しても良好な効果を有する。（Eropob JIB, translated by WANG Tieliang, Aclarubicin A: new antitumor antibiotics, foreign medicine. Pharmacy section, 1983, 5: 297-298）。
【００２１】
ラットへのＡＣＭ−Ａの経口投与及び静脈内投与後、ＨＰＬＣを適用して、組織におけるＡＣＭ−Ａのレベルを決定した。組織における濃度は血中薬物レベルよりも高く、リンパ節及び脾臓において最大値に達するが、肺では低濃度を保持し、心臓において最小値に達することが見出された。組織における経口投与の曲線下面積は、静脈内注射のものに比べて２〜７倍低かった。ＡＣＭ−Ａは、経口投与後、急速に吸収され、生物学的半減期ｔ１／２は３６．５ｈであり、バイオアベイラビリティーは３５％であった；静脈内注射後、半減期ｔ１／２は１６〜２１ｈであった。２つの代謝産物の濃度は定常的に増加し、１２〜１８ｈ後に、親薬物ＡＣＭ−Ａの濃度を超えて上昇した。ＡＣＭ−Ａ及び３つの代謝産物の累積バイオアベイラビリティーは、最大８９％までであった。（Geodakyan S V, et al. Antibiotics and Medical Biotechnology, 1987, 32(10):768-72; Firsov A A, et al. Antibiotics and Medical Biotechnology, 1987, 32(10): 773-777）。
【００２２】
他方では、薬物組合せが、ＡＩＤＳの臨床治療の一般的な方法となっている。この方法は、多くの利点を有し、例えば、（ａ）複数の標的部位においてＨＩＶ複製を阻害し、ＨＩＶ感染症の臨床的な進行を遅延させること；（ｂ）ＨＩＶ薬物耐性の発生の可能性を最小限に減じること；（ｃ）ＡＩＤＳ患者の生活の質及び生存率を著しく増加させることである。Dr. David Hoによって提唱されたカクテル療法は、ＡＩＤＳの治療のための３又は４以上の抗ウイルス薬を、組み合わせて使用することによって行われる。この療法を適用することによって、単一薬剤を使用することからの薬物耐性を減じ、ウイルス複製を最大限に阻害することができ、損傷した体の免疫機能の部分的な又は完全な回復をもたらすことができ、ひいては、疾患の進行を遅延させ、患者の寿命を延長し、生活の質を改善することができる。科学者らはいよいよ、ＨＩＶ複製を阻害すること及びインビボにおける薬物耐性ウイルスの出現を防ぐことの両方による混合薬物療法が、ＡＩＤＳに対する最も有効な治療であると考えている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】中国特許出願公開第１５１１５２８Ａ号明細書
【特許文献２】中国特許出願公開第１０１３７１８３９Ａ号明細書
【特許文献３】米国特許第３９８８３１５号明細書
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】LIN Chuanrong, et al., The clinical observations on the treatment of chemotherapy-induced leukopenia with Shengbaijiao (berbamine), Prepared Chinese Medicine, 1994, 16 (7): 29
【非特許文献２】SUN Peng et al, Induction of apoptosis by berbamine in androgen-independent prostate cancer cell PC-3 in vitro, Chin J Exp Surg, August 2007, Vol 24, No. 8, pp 957
【非特許文献３】WU Dong et al, Effects of Berbamine on K562 Cells and Its Mechanisms in vitro and in vivo, Journal of Experimental Hematology 2005, 13 (3): 373-378
【非特許文献４】LIU Xin, et al., The immune regulation action of berbamine on BALB/C mice, Journal of China Medical University, 1996, 25 (3): 229
【非特許文献５】LUO Chongnian, et al., The inhibition of berbamine on mice splenocytes cytotoxic T lymphocyte activity, Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology, 1995, 9 (2): 159-160
【非特許文献６】GE Mingzhu, et al., The experimental study of immune protection action of berbamine on irradiated mice, Journal of Immunology, 1998, 14 (4): 238
【非特許文献７】HUANG Zhiyu et al, Experimental Study of Berbamine Inducing Apoptosis in Human Leukemia Jurkat Cells, China Cancer, 2007, 16(9), 722
【非特許文献８】Changdong Wang, et al. Fangchinoline induced G1/S arrest by modulating expression of p27, PCNA, and cyclin D in human prostate carcinoma cancer PC3 cells and tumor xenograft. Biosci. Biotechnol. Biochem. 2010, 74(3):488-493
【非特許文献９】ZHU Kexiu et al., Qualitative and quantitative studies on tetrandrine-induced apoptosis of cervical cancer cells, Journal of Xi'an Jiaotong University (Medical Sciences Edition), 2010, 31 (1), 102
【非特許文献１０】Jing Xubin et al., Experimental studies on the tetrandrine-induced oxidative damage of hepatoma cells, Journal of Clinical Hepatology, 2002, 18 (6), 366
【非特許文献１１】Yang Jinlong et al., Domestic Aclarubicin A in vitro and in vivo antitumor effects, Acta Pharmaceutica Sinica, 1988, 23 (5): 321-326
【非特許文献１２】PAN Qichao, Pharmacology and clinic, Aclarubicin A China Pharmaceutical Journal, 1993, 2 (3): 25-28
【非特許文献１３】Eropob JIB, translated by WANG Tieliang, Aclarubicin A: new antitumor antibiotics, foreign medicine. Pharmacy section, 1983, 5: 297-298
【非特許文献１４】Geodakyan S V, et al. Antibiotics and Medical Biotechnology, 1987, 32(10):768-72
【非特許文献１５】Firsov A A, et al. Antibiotics and Medical Biotechnology, 1987, 32(10): 773-777
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
患者の多様性及び腫瘍の複雑性のために、ビスベンジルイソキノリンアルカロイド及びアントラサイクリン化合物は、単独で使用されるうちに（注射又は経口）、乏しい選択性、低い阻害率又は低い治癒率、高用量に起因する強い副作用又は毒性などの、それらの限界を示してきた。上記の問題を解決するために、本発明は、腫瘍の治療において、有効性、選択性及び治癒率を改善するための、ビスベンジルイソキノリンアルカロイド及びアントラサイクリン化合物の組合せを提供する。今のところ、ビスベンジルイソキノリンアルカロイド及びアントラサイクリン化合物の組合せが、薬物有効性又は治癒率を改善するために腫瘍の治療に使用されていることは、まだ報告されていない。本発明の目的は、腫瘍を治療するための「カクテル」又は複合医薬を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
本発明の１つの目的は、式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイド及び式（II）のアントラセン化合物並びにその薬学的に許容される塩
【００２７】
【化１】
2015531356.tif 000002
【００２８】
［式（Ｉ）中、
Ｒ１は、Ｈ又は１〜１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、Ｈ、置換されているアシル、直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ、Ｓヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、置換されているアシル、直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ４及びＲ５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、ハロゲン原子、ヒドロキシル、又は１〜１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、又はアルコキシ、又はアシルオキシであり、ｎは、０〜４の整数であり、
Ｃ（１）及びＣ（１’）は、ＲＲ、ＳＳ、１Ｓ１’Ｒ、１Ｒ１’Ｓから選択される立体異性配置を有し、
式（II）中、
Ｗ１は、Ｈ、メチル、置換又は非置換のＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｗ２は、Ｈ、グリコシル又はアミノ置換されているグリコシルであり、
Ｗ３、Ｗ４はそれぞれ、Ｈ、ヒドロキシル、置換若しくは非置換のアルキル又は置換されているカルボニルであり、
Ｗ５は、Ｈ、置換されているカルボニル基又はエステル基であり、
Ｗ６は、Ｈ又はヒドロキシルであり、
前記置換基は、ハロゲン、アミノ、Ｃ１−Ｃ６置換されているアミノ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、メルカプト及びＣ１−Ｃ６アルキルチオからなる群から選択され、前記置換基は、出現する毎に１又は２以上であってよく、同一であっても異なっていてもよく、それぞれＨ原子を置換している。］
を特徴とする抗腫瘍医薬組合せを提供することである。
【００２９】
式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイドは、以下
【００３０】
【化２】
2015531356.tif 000003
【００３１】
から選択することができる。
【００３２】
式（II）のアントラセン化合物は、以下
【００３３】
【化３】
2015531356.tif 000004
【００３４】
から選択することができる。
【００３５】
本発明の第２の目的は、抗腫瘍医薬品としての、式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイド及び式（II）のアントラセン化合物の適した組合せを提供することである。２剤の間の相乗効果、特にテトランドリン及びアクラルビシンの医薬組合せの相乗効果は、より良好な治療効果を達成する。
【００３６】
本発明の第３の目的は、本発明の医薬組合せの使用、特に抗腫瘍の臨床使用を提供することである。それに相当するものとして、本発明は、腫瘍に罹患している対象を治療するための方法であって、それを必要とする前記対象に、本発明の有効量の医薬組合せを投与することを含み、腫瘍が、特に、白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、肝がん、胃がん、乳がん、胆管細胞癌、膵がん、肺がん、結腸直腸癌、骨肉腫、黒色腫、ヒト子宮頚がん、神経膠腫、上咽頭癌、喉頭癌、食道がん、中耳腫瘍及び前立腺がんから選択される方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１Ａ】ヌードマウスの体重に及ぼすＴＴＤの効果の動的曲線を示す図である。
【図１Ｂ】ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍体積に及ぼすＴＴＤの効果の動的曲線を示す図である。
【図１Ｃ】ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍サイズに及ぼすＴＴＤの効果を示す図である。
【図１Ｄ】ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍重量に及ぼすＴＴＤ５０の効果を示す図である。
【図１Ｅ】ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍に及ぼすＴＴＤの阻害効果を示す図である。
【図２Ａ】ヌードマウスのＨｅｐＧ２移植腫瘍体積に及ぼすＴＴＤの効果の動的曲線を示す図である。
【図２Ｂ】ヌードマウスのＨｅｐＧ２移植腫瘍サイズに及ぼすＴＴＤの効果を示す図である。
【図２Ｃ】ヌードマウスのＨｅｐＧ２移植腫瘍重量に及ぼすＴＴＤ５０の効果を示す図である。
【図２Ｄ】ヌードマウスのＨｅｐＧ２移植腫瘍に及ぼすＴＴＤの阻害効果を示す図である。
【図３Ａ】ヌードマウスの体重に及ぼすＡｃｌａＡの効果の動的曲線を示す図である。
【図３Ｂ】ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍体積に及ぼすＡｃｌａＡの効果の動的曲線を示す図である。
【図３Ｃ】ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍サイズに及ぼすＡｃｌａＡの効果を示す図である。
【図３Ｄ】ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍重量に及ぼすＡｃｌａＡの効果を示す図である。
【図３Ｅ】ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍に及ぼすＡｃｌａＡの阻害効果を示す図である。
【図４Ａ】ヌードマウスの体重に及ぼすＴＴＤとＡｃｌａＡとの組合せ使用による効果の動的曲線を示す図である。
【図４Ｂ】ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍体積に及ぼすＴＴＤとＡｃｌａＡとの組合せ使用による効果の動的曲線を示す図である。
【図４Ｃ】ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍サイズに及ぼすＴＴＤとＡｃｌａＡとの組合せ使用による効果を示す図である。
【図４Ｄ】ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍重量に及ぼすＴＴＤとＡｃｌａＡとの組合せ使用による効果を示す図である。
【図４Ｅ】ヌードマウスのＡ５４９移植腫瘍に及ぼすＴＴＤとＡｃｌａＡとの組合せ使用による阻害効果を示す図である。
【図５Ａ】ヌードマウスのＨｅｐＧ２移植腫瘍体積に及ぼすＴＴＤとＡｃｌａＡとの組合せ使用による効果の動的曲線を示す図である。
【図５Ｂ】ヌードマウスのＨｅｐＧ２移植腫瘍サイズに及ぼすＴＴＤとＡｃｌａＡとの組合せ使用による効果を示す図である。
【図５Ｃ】ヌードマウスのＨｅｐＧ２移植腫瘍重量に及ぼすＴＴＤとＡｃｌａＡとの組合せ使用による効果を示す図である。
【図５Ｄ】ヌードマウスのＨｅｐＧ２移植腫瘍に及ぼすＴＴＤとＡｃｌａＡとの組合せ使用による阻害効果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイド及び式（II）のアントラセン化合物
【００３９】
【化４】
2015531356.tif 000005
【００４０】
［式（Ｉ）中、
Ｒ１は、Ｈ又は１〜１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、Ｈ、置換されているアシル、直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ、Ｓヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ２及びＲ３は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に、Ｈ、置換されているアシル、直鎖状若しくは分岐状のアルキルであり、前記アルキルは、Ｏ、Ｎ若しくはＳヘテロ原子で中断されていてもよく、又はＲ４及びＲ５は、一緒になってＯ若しくはＳを表し、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４は、同一であっても異なっていてもよく、そのそれぞれが、独立に、ハロゲン原子、ヒドロキシル、又は１〜１０個の炭素原子を含む直鎖状若しくは分岐状のアルキル、又はアルコキシ、又はアシルオキシであり、ｎは、０〜４の整数であり、
Ｃ（１）及びＣ（１’）は、ＲＲ、ＳＳ、１Ｓ１’Ｒ、１Ｒ１’Ｓから選択される立体異性配置を有し、
式（II）中、
Ｗ１は、Ｈ、メチル、置換又は非置換のＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｗ２は、Ｈ、グリコシル又はアミノ置換されているグリコシルであり、
Ｗ３、Ｗ４はそれぞれ、Ｈ、ヒドロキシル、置換若しくは非置換のアルキル又は置換されているカルボニルであり、
Ｗ５は、Ｈ、置換されているカルボニル基又はエステル基であり、
Ｗ６は、Ｈ又はヒドロキシルであり、
前記置換基は、ハロゲン、アミノ、Ｃ１−Ｃ６置換されているアミノ、ニトロ、シアノ、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、メルカプト及びＣ１−Ｃ６アルキルチオからなる群から選択され、前記置換基は、出現する毎に１又は２以上であってよく、同一であっても異なっていてもよく、それぞれＨ原子を置換している。］
を含むことを特徴とする抗腫瘍医薬組合せを提供する。
【００４１】
式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイドは、以下
【００４２】
【化５】
2015531356.tif 000006
【００４３】
から選択することができる。
【００４４】
式（II）のアントラセン化合物は、以下
【００４５】
【化６】
2015531356.tif 000007
【００４６】
から選択することができる。
【００４７】
式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイドは、中国特許出願公開第１９０３８５６Ａ号明細書、米国特許第６６１７３３５Ｂ１号明細書又は中国特許出願公開第１０１３７１８３９Ａ号明細書などに記載されている方法に従って、調製し、構造及び活性において特性決定することができ、その構造及び活性を特徴とする。式（II）のアントラセン化合物は、米国特許第４３７５５１１Ａ号明細書及びActa Pharmaceutica Sinica 1988,23(5):321-326などに記載されている方法に従って、調製し、構造及び活性において特性決定することができる。
【００４８】
本発明の式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイド及び式（II）のアントラセン化合物の適した組合せが、抗腫瘍医薬品として使用される。２剤の間の相乗効果、特にテトランドリン及びアクラルビシンの医薬組合せの相乗効果は、より良好な治療効果を達成する。
【００４９】
式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイドは、薬学的に許容される無機酸又は有機酸とともに形成されるその対応する塩の形で、医薬組合せ中に存在し得る。
【００５０】
「芳香族ヒドロカルビル」という用語は、アリール、アリールアルキル及びアルキルアリールを含む、ヘテロ原子を有さないアリールを指す。
【００５１】
「芳香族ヘテロシクリル」という用語は、複素環式アリール、複素環式アリールアルキル及びアルキル複素環式アリールを含む、ヘテロ原子を有する芳香族ヒドロカルビルを指す。ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ及びＳを指す。アリール複素環式ラジカルは、１又は２以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。
【００５２】
「ハロゲン」、「ハロ」又は「ｈａｌ」という用語は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素を意味する。
【００５３】
「Ｃ１−Ｃ６置換されているアミノ」という用語は、−Ｎ−Ｃ１−Ｃ６アルキル及び−Ｎ−Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルを指す。
【００５４】
「Ｃ１−Ｃ６アルコキシ」という用語は、−Ｏ−Ｃ１−Ｃ６アルキル及び−Ｏ−Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルを指す。
【００５５】
「Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ」という用語は、−Ｓ−Ｃ１−Ｃ６アルキル及び−Ｓ−Ｃ３−Ｃ６シクロアルキルを指す。
【００５６】
「薬学的に許容される塩」という用語は、トシル酸塩、メタンスルホン酸塩、リンゴ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、マロン酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、安息香酸塩、アスコルビン酸塩、α−ケトグルタル酸塩及びα−グリセロリン酸塩を含むが、これらに限定されない。適した無機塩は、限定されないが、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、重炭酸塩及び炭酸塩、リン酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩なども形成し得る。
【００５７】
本明細書において使用される「治療」、「治療すること」、「治療する」などの用語は、一般に、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを指す。効果は、ある疾患又はその症状を、完全に又は部分的に防ぐという点で、予防的であり得、及び／又は、ある疾患及び／又はその疾患によって引き起こされる副作用の、部分的な又は完全な安定化又は治癒という点で、治療的であり得る。本明細書において使用される「治療」は、（ａ）疾患若しくは症状に罹患しやすい素因があるが、それを有しているとまだ診断されていない対象において、疾患若しくは症状が発生するのを防ぐこと、（ｂ）疾患の症状を阻害すること、すなわち、その発症を抑えること、又は（ｃ）疾患の症状を和らげること、すなわち、疾患若しくは症状の退行をもたらすことを含む、対象における疾患のいずれの治療も包含する。
【００５８】
本発明はまた、抗腫瘍医薬品としての、式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイド及び式（II）のアントラセン化合物の適した組合せを提供する。これらの２剤の間の相乗効果、特にテトランドリン及びアクラルビシンの医薬組合せの相乗効果は、より良好な治療効果を達成する。
【００５９】
本発明は、抗腫瘍医薬品としての、式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイド及び式（II）のアントラセン化合物の２又は３以上の組合せであって、以下のとおり、
（１）テトランドリンが、活性成分の０．１〜８０％、好ましくは１〜５０％を構成し、
（２）アクラルビシンが、活性成分の０．１〜８０％、好ましくは１〜５０％を構成する
ような構成及び重量パーセントを有する組合せに関する。
【００６０】
本発明は、上述のような少なくとも２つの化合物を含み、薬学的に許容される賦形剤を含んでいてもよい医薬組合せを提供する。
【００６１】
ある特定の量の活性成分を有する種々の医薬組成物を調製するための方法は、知られている又は本開示に照らせば当業者には明らかである。REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Martin, E.W., ed., Mack Publishing Company, 19th ed. (1995)に記載されているように、そのような医薬組成物を調製するための方法は、他の適した医薬賦形剤、担体、希釈剤などの組み込みを含む。
【００６２】
本発明の医薬調製物は、通常の混合、溶解又は凍結乾燥のプロセスを含む、知られている方法によって製造される。
【００６３】
本発明の医薬組合せは、医薬組成物中に配合され得、選択される投与方法、例えば、経口投与又は非経口投与に適した経路で（静脈内、筋肉内、局所又は皮下経路によって）、患者に投与され得る。
【００６４】
したがって、本発明の医薬組合せは、不活性な希釈剤又は吸収可能な食用に適した担体などの薬学的に許容される担体とともに、例えば、経口で、全身に投与され得る。それらは、硬ゼラチンカプセル若しくは軟ゼラチンカプセルに封入され得る又は圧縮して錠剤にされ得る。治療のための経口投与に関して、活性化合物は、１又は２以上の賦形剤と組み合わせられ得、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウェハー剤などの形で服用され得る。そのような組成物及び調製物は、少なくとも０．１％の活性化合物を含有すべきである。組成物及び調製物のこの割合は、言うまでもなく、変化する可能性があり、好都合なことに、所与の単位剤形の重量に基づいて、約１％〜約９９％であり得る。活性化合物は、そのような治療上有用な組成物中に、有効な投与量レベルが達成されるような量で存在する。
【００６５】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などは、トラガカントガム、アカシア、トウモロコシデンプン又はゼラチンなどの結合剤；リン酸二カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；及びスクロース、フルクトース、ラクトース若しくはアスパルテームなどの甘味剤又はペパーミント、ウインターグリーン油若しくはサクランボ風味などの着香剤も含み得る。単位剤形としてカプセル剤である場合、それは、上記の材料タイプに加えて、植物油又はポリエチレングリコールなどの液体媒体を含み得る。種々の他の材料は、コーティングとして存在し得る又は固体単位剤形の物理的形状を別の方法で変更し得る。例として、錠剤、丸剤又はカプセル剤は、ゼラチン、ろう、セラック又は糖などでコーティングされ得る。シロップ剤又はエリキシル剤は、活性化合物、スクロース又はフルクトースなどの甘味剤、メチルパラベン又はプロピルパラベンなどの保存剤、色素及び着香剤（サクランボ風味又はオレンジ風味など）を含有し得る。言うまでもなく、いずれの単位剤形を調製する際に使用されるいずれの材料も、用いられる量で薬学的に許容され、実質的に非毒性であるべきである。加えて、活性化合物は、持続放出製剤及びデバイス中に組み込まれ得る。
【００６６】
活性化合物はまた、注入又は注射によって、静脈内又は腹腔内に投与され得る。活性化合物又はその塩の水溶液は、場合によって、非毒性の界面活性剤と混合されて、調製され得る。分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチン及びその混合物中に並びに油中に調製することもできる。普通の保存条件及び使用条件の下で、これらの調製物は、微生物の成長を防ぐために、保存剤を含有する。
【００６７】
注射又は注入に適した医薬剤形は、無菌の注射用又は注入用の液剤又は分散剤の即時調製に適合する有効成分（リポソーム中にカプセル化されていてもよい）を含む、無菌の水溶液若しくは分散剤又は無菌散剤を含むことができる。すべての場合において、最終的な剤形は、製造条件及び保存条件の下で、無菌であり、液体であり、安定でなければならない。液体の担体又は媒体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、植物油、非毒性グリセリルエステル及びその適した混合物を含む、溶媒又は液体分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、リポソームの形成によって、分散剤の場合には、必要とされる粒子サイズの維持によって又は界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の予防は、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの、種々の抗菌剤及び抗真菌剤によって達成することができる。多くの場合、糖、緩衝剤又は塩化ナトリウムなどの等張化剤を含むことが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させるための薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物の使用によって得ることができる。
【００６８】
無菌注射用液剤は、必要量の活性化合物を、適切な溶媒中で、上記に掲載されている種々の追加の成分と、必要に応じて組み合わせた後に、ろ過滅菌を行うことによって調製される。無菌注射用液剤の調製のための無菌散剤の場合には、好ましい調製プロセスは、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、これによって、前もって滅菌ろ過された溶液中に存在する、有効成分及び任意の追加の所望の成分の粉末を得る。
【００６９】
有用な固体担体は、タルク、クレー、微結晶性セルロース、シリカ、アルミナなどの微粉化した固体を含む。有用な液体担体は、本発明の化合物が、場合によって非毒性の界面活性剤を用いて、有効なレベルで溶解又は分散することができる、水、エタノール若しくはエチレングリコール又は水−エタノール／エチレングリコール混合物を含む。所与の適用のための性質を最適化するために、アジュバント（フレーバーなど）及び追加の抗菌剤を加えることができる。
【００７０】
増粘剤（合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸の塩及びエステル、脂肪族アルコール、変性セルロース又は改質鉱物など）も、使用者の皮膚に直接適用するための、塗り広げることができるペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、せっけんなどを形成するために、液体担体とともに使用することができる。
【００７１】
化合物又はその活性塩若しくは誘導体の治療に必要とされる量は、選択される特定の塩によって変化するのみならず、投与経路、治療される状態の性質並びに患者の年齢及び状態によっても変化し、最終的には、主治医又は臨床医の自由裁量で決定される。
【００７２】
上記の製剤は、ヒト又は他の哺乳動物に投与するのに適した単位投与量を含有する、物理的に別個の単位である単位剤形で存在し得る。単位剤形は、カプセル剤若しくは錠剤又は複数のカプセル剤若しくは錠剤であり得る。意図される特定の治療に応じて、単位剤形中の有効成分の量を、約０．１ｍｇ〜約１，０００ｍｇ又はそれ以上の範囲で変化又は調節することができる。
【００７３】
本発明の医薬組成物が製剤にされ、経腸投与又は非経腸投与される場合、それぞれの製剤は、測定の基本単位に基づいて計算される以下の含量の活性成分
（ａ）ビスベンジルイソキノリンアルカロイド：０．１〜１５０ｍｇ、
（ｂ）アントラセン化合物：０．１〜１５０ｍｇ
を有することができる。
例えば、
（ａ）テトランドリン：０．１〜１５０ｍｇ、
（ｂ）アクラルビシン：０．１〜１５０ｍｇ
である。
【００７４】
本発明の医薬組成物の製剤において、それぞれの主成分の含量は、以下の
ビスベンジルイソキノリンアルカロイド：１〜５０％、
アントラセン化合物：１〜５０％、
デンプン：１〜６０％、
デキストリン：０〜２０％、
微結晶性セルロース：０〜２５％、
ナトリウムカルボキシメチルデンプン：０〜５％、
ポリエチレングリコール：０〜５％、
ヒドロキシプロピルメチルセルロース：０〜５％、
ステアリン酸マグネシウム：０〜５％
であり得るが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の使用、特に抗腫瘍の使用を提供する。それに相当するものとして、本発明は、腫瘍に罹患している対象を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、本発明の有効量の医薬組合せを投与することを含む方法を提供する。本発明の式（Ｉ）のビスベンジルイソキノリンアルカロイド及び式（II）のアントラセン化合物の医薬組合せは、数ある腫瘍の中でも、例えば、白血病、多発性骨髄腫、リンパ腫、肝がん、胃がん、乳がん、胆管細胞癌、膵がん、肺がん、結腸直腸癌、骨肉腫、黒色腫、ヒト子宮頚がん、神経膠腫、上咽頭癌、喉頭癌、食道がん、中耳腫瘍、前立腺がんを治療するために使用することができる。
【００７６】
以下の実施例において、本発明をより詳細に説明する。しかし、以下の実施例は、本発明を説明することを意図しているが、本発明の範囲を限定することを決して意図したものではないことが、理解されるべきである。
【００７７】
以下の実施例に使用されている原料化学物質は、市販されている。
［実施例］
パートＩ：インビトロにおける腫瘍細胞に及ぼすＴＴＤとＡｃｌａＡとの組合せ使用による阻害効果
【実施例１】
【００７８】
白血病細胞の阻害のためのＴＴＤとＡｃｌａＡとの医薬組合せ
（１）実験材料
（２）白血病細胞株：Ｋ５６２／ａｄｒ（薬物耐性の慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ, chronic myeloid leukemia）、Ｋａｓｕｍｉ−１（急性骨髄性白血病Ｍ２型、ＡＭＬ−Ｍ２, acute myeloid leukemia M2 type）、Ｊｕｒｋａｔ（急性リンパ芽球性白血病、ＡＬＬ）、これらはすべて、Cancer Research Institute of Zhejiang University, Chinaによって寄贈されたものである。
（３）試薬：
ＴＴＤ（テトランドリン、Jiangxi Jinfurong Pharmaceutical Co., Ltd.社製）、
ＡｃｌａＡ（アクラルビシンＡ、Shenzhen Main Luck Pharmaceuticals Inc.社製）
（４）主要装置：
細胞インキュベーター（Thermo Scientific 3111）
バイオセーフティーキャビネット（Heal Force社製、Hfsafe-1200A2）
マイクロプレートリーダー（Bio-rad社製、Imark）
（５）実験方法
ａ）白血病細胞に関して、化合物ごとの７２時間後のＩＣ５０値を決定する。十分に成長している白血病細胞を入手し、９６−ウェル細胞培養プレートのウェル中に、５０００細胞／ウェルで接種した。種々の濃度の個々の化合物を加え、均一に混合し、３７℃で７２時間インキュベートした（５％ＣＯ２）。次いで、細胞生存率を、ＭＴＴ法によって決定した。この実験では、対照群（いずれの化合物でも処理されない）における細胞生存率を１００％と設定し、７２時間後の白血病細胞の成長に対するＴＴＤ及びＡｃｌａＡの半数阻害濃度（７２時間のＩＣ５０値、μｇ／ｍＬ）を計算した。
ｂ）インビトロにおける白血病細胞に及ぼすＡｃｌａＡと組み合わせたＴＴＤの阻害効果を決定する。細胞の前処理は、ａ）の場合と同じであった。対照群は、投与の間に化合物で処理されなかった。２つの単剤群に、それぞれ活性成分を加え、ａ）における２つの化合物のＩＣ５０が達成される濃度にした。組合せ群については、同じ群のウェル中に２つの化合物を一緒に加えた。最終濃度は、単剤のＩＣ５０が達成される濃度であった。７２時間のインキュベーション後、ＭＴＴ法を使用して、細胞生存率を決定した。この実験では、対照群の細胞生存率を１００％に設定し、細胞生存率（％）に及ぼすＴＴＤ、ＡｃｌａＡ単剤の効果及び組合せ効果を計算した。
（６）実験結果
実験結果を表１に示す。
【００７９】
表１から分かるように、試験された白血病細胞株について、ＡｃｌａＡと組み合わせたＴＴＤのＩＣ５０用量は、単独で使用したＴＴＤ又はＡｃｌａＡに比べて、著しくより低い細胞生存率をもたらす結果となった。加えて、ｋ５６２／ＡＤＲの場合には、ＴＴＤ及びＡｃｌａＡをＩＣ５０投与量で組み合わせた効果の後、細胞生存率は、単剤と比較して３０％近く減少している。
【００８０】
【表１】
2015531356.tif 000008
【実施例２】
【００８１】
ヒトリンパ腫細胞及び多発性骨髄腫細胞の阻害のためのＴＴＤとＡｃｌａＡとの医薬組合せ
（１）実験材料
多発性骨髄腫細胞株：Fuxiang Bio-tech Co. Ltd.社, Shanghai, Chinaから購入されたＲＰＭＩ８２２６（多発性骨髄腫）；China Center For Type Culture Collectionから購入されたＲａｊｉ（ヒトＢｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞）。
（２）試薬：
実施例１と同じ。
（３）主要装置：
実施例１と同じ。
（４）実験方法
ａ）上記の細胞に関して、化合物ごとのの７２時間後のＩＣ５０値を決定する。上記の十分に成長している細胞を入手し、９６−ウェル細胞培養プレートのウェル中に、５０００細胞／ウェルで接種した。種々の濃度の別個の化合物を加え、均一に混合し、３７℃で７２時間インキュベートした（５％ＣＯ２）。次いで、細胞生存率を、ＭＴＴ法によって決定した。この実験では、対照群（いずれの化合物でも処理されない）における細胞生存率を１００％と設定し、７２時間での上記の細胞の成長に対するＴＴＤ及びＡｃｌａＡの半数阻害濃度（７２時間のＩＣ５０値、μｇ／ｍＬ）を計算した。
ｂ）上記の細胞に及ぼすＡｃｌａＡと組み合わせたＴＴＤの阻害効果を決定する。細胞の前処理は、ａ）の場合と同じであった。対照群は、投与の間に化合物で処理されなかった。２つの単剤群に、それぞれ活性成分を加え、ａ）における２つの化合物のＩＣ５０が達成される濃度にした。組合せ群については、同じ群のウェル中に２つの化合物を一緒に加えた。最終濃度は、２つの単剤のＩＣ５０値が対応する濃度であった。７２時間のインキュベーション後、ＭＴＴ法を使用して、細胞生存率を決定した。この実験では、対照群の細胞生存率を１００％に設定し、細胞生存率（％）に及ぼすＴＴＤ、ＡｃｌａＡ単剤の効果及び組合せ効果を計算した。
（５）実験結果
実験結果を表２に示す。
【００８２】
表２から分かるように、試験されたリンパ腫及び骨髄腫細胞株について、ＡｃｌａＡと組み合わせたＴＴＤのＩＣ５０用量は、単独で使用したＴＴＤ又はＡｃｌａＡに比べて、著しくより低い細胞生存率をもたらす結果となった。加えて、Ｒａｊｉ及びＲＰＭＩ８２２６の場合には、ＴＴＤ及びＡｃｌａＡをＩＣ５０投与量で組み合わせた効果の後、細胞生存率は、単剤と比較して２０％近く減少した。
【００８３】
【表２】
2015531356.tif 000009
【実施例３】
【００８４】
ヒト固形腫瘍細胞の阻害のためのＴＴＤとＡｃｌａＡとの医薬組合せ
（１）実験材料
ヒト固形腫瘍細胞株：Ｈｅｐ−２（喉頭癌）、Ａ５４９（ヒト肺がん）、ＣａＥＳ−１７（食道がん細胞）、ＰＣ−３（前立腺がん）、ＣＮＥ（上咽頭癌細胞）、ＳＰＣ−Ａ−１（ヒト肺腺癌細胞）及びＳＫ−ＯＶ−３（卵巣がん細胞）、それらはすべてChina Center For Type Culture Collectionから購入されたものである；ＲＫＯ（ヒト結腸腺癌細胞）、ＭＧＣ８０３（ヒト胃がん細胞）、ＭＧ６３（骨肉腫）及びＵ８７ＭＧ（悪性神経膠腫細胞）、それらはすべてFuxiang Bio-tech Co. Ltd.社, Shanghai, Chinaから購入されたものである；ＰＡＮＣ−１（膵がん）、Ｈｕｈ７（ヒト肝がん細胞）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞癌細胞）、Ｂｅｃａｐ３７（ヒト乳がん細胞）及びＨｅｌａ（ヒト子宮頚がん細胞）、これらはすべてCancer Research Institute of Zhejiang University, Chinaによって寄贈されたものである。
（２）試薬：
実施例１と同じ。
（３）主要装置：
実施例１と同じ。
（４）実験方法
ａ）ヒト固形腫瘍細胞に関して、化合物ごとの７２時間後のＩＣ５０値を決定する。上記の十分に成長している細胞を入手し、９６−ウェル細胞培養プレートのウェル中に、５０００細胞／ウェルで接種した。種々の濃度の個々の化合物を加え、均一に混合し、３７℃で７２時間インキュベートした（５％ＣＯ２）。次いで、細胞生存率を、ＭＴＴ法によって決定した。この実験では、対照群（いずれの化合物でも処理されない）における細胞生存率を１００％と設定し、７２時間でのヒト固形腫瘍細胞の成長に対するＴＴＤ及びＡｃｌａＡの半数阻害濃度（７２時間のＩＣ５０値、μｇ／ｍＬ）を計算した。
ｂ）ヒト固形腫瘍細胞に及ぼすＡｃｌａＡと組み合わせたＴＴＤの阻害効果を決定する。細胞の前処理は、ａ）の場合と同じであった。対照群は、投与の間に化合物で処理されなかった。２つの単剤群に、それぞれ活性成分を加え、ａ）における２つの化合物のＩＣ５０が達成される濃度にした。組合せ群については、同じ群のウェル中に２つの化合物を一緒に加えた。最終濃度は、単剤のＩＣ５０が対応する濃度であった。７２時間のインキュベーション後、ＭＴＴ法を使用して、細胞生存率を決定した。この実験では、対照群の細胞生存率を１００％に設定し、細胞生存率（％）に及ぼすＴＴＤ、ＡｃｌａＡ単剤の効果及び組合せ効果を計算した。
（５）実験結果
実験結果を表３に示す。
【００８５】
表３から分かるように、試験された１６例の固形腫瘍細胞株について、ＡｃｌａＡと組み合わせたＴＴＤのＩＣ５０用量は、単独で使用したＴＴＤ又はＡｃｌａＡに比べて、著しくより低い細胞生存率をもたらす結果となった。加えて、ＰＣ−３の場合には、ＴＴＤ及びＡｃｌａＡをＩＣ５０投与量で組み合わせた効果の後、細胞生存率は、単剤と比較して４０％近く減少した。Ｂｅｃａｐ−３７及びＨｕｈ−７の場合には、ＴＴＤ及びＡｃｌａＡをＩＣ５０投与量で組み合わせた効果の後、細胞生存率は、単剤と比較して３０％近く減少した。
【００８６】
【表３】
2015531356.tif 000010
【００８７】
パートII：インビボにおける腫瘍に及ぼすＡｃｌａＡと組み合わせたＴＴＤの阻害効果
【実施例４】
【００８８】
ヌードマウスにおける肺がん及び肝がん移植腫瘍の阻害のためのＴＴＤ
（１）実験材料
肺がん細胞株：Ａ５４９（ヒト非小細胞肺がん細胞株）、
肝がん細胞株：ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞癌細胞）、
動物：Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences, Chinaから購入されたＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕヌードマウス（免疫不全マウス）８週齢、雌。
（２）試薬：
Ｊｅｆ（ジェフィチニブ（Jefitinib）、LC laboratories社製）
ＴＴＤ（テトランドリン、Jiangxi Jinfurong Pharmaceutical Co., Ltd.社製）；
（３）主要装置：
細胞インキュベーター（Thermo Scientific 3111）
層流ラック（Suhang Brand動物飼育用クリーンキャビネット、DJ-2型）。
（４）実験方法
無菌条件下、上記の腫瘍細胞を対数増殖期において収集した。Ａ５４９を、ヌードマウスの右腋窩下に、１×１０７／０．２ｍＬ／ヌードマウス（細胞生存率９０％超）の量で、皮下注射によって注射し、ＨｅｐＧ２を、ヌードマウスの左腋窩下に、１×１０７／０．２ｍＬ／ヌードマウス（細胞生存率９０％超）の量で、皮下注射によって注射し、こうしてヌードマウスにおける肺がん及び肝がんのそれぞれの移植腫瘍モデルを確立した。投与は、接種後第２日から行った。実験群には実験的に計画された量で胃内投与し、陰性対照群には滅菌水を胃内投与し、陽性対照群にはＪｅｆを胃内投与した。それぞれのマウスに、毎回０．４ｍｌを１日３回、８：００、１４：００及び２０：００に胃内投与した。投与を１０日間継続した。投与の前日を０日目とみなし、マウスの体重及び腫瘍サイズを５日毎に決定して、体重及び腫瘍成長についての動的プロットを作成した。２４日目に、マウスを屠殺し、腫瘍を取り出して、その重量を測定した。医薬品の効果後、対照群の腫瘍阻害率をゼロとし、それに基づいて腫瘍阻害率（％）を計算した。
【００８９】
決定した値を、平均±標準誤差（standard error）（平均±ＳＤ）として提示した。それぞれの群の実験データを、ＳＰＳＳ１８．０統計ソフトウェアの一元配置ＡＮＯＶＡ法を用いて解析した。ｐ＜０．０５は、差が統計的に有意であることを意味する。
【００９０】
【表４】
2015531356.tif 000011
【００９１】
【表５】
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【００９２】
【表６】
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【００９３】
実施例４についての解析及び考察：
この実験は、ヌードマウスにおける肺がん及び肝がん移植腫瘍に及ぼすＴＴＤの効果を試験しており、ＴＴＤは、この実験の投与量で、肺がんに関して最大３８％までの腫瘍阻害率を達成し、阻害効果を示した（図１Ｂ〜図１Ｅを参照のこと）。しかし、ＴＴＤは、この実験において、肝がんに関して良好な阻害効果を示さなかった（図２Ａ〜図２Ｄを参照のこと）。動物の体重の動的変化から、ＴＴＤはこの実験の投与中に、ヌードマウスの体重に一部の減少を引き起こすことが推断された。しかし、投与が終了した後、体重は徐々に回復した（図１Ａを参照のこと）。
【実施例５】
【００９４】
ヌードマウスにおける肺がん移植腫瘍の阻害のためのＡｃｌａＡ
（１）実験材料
肺がん細胞株：Ａ５４９（ヒト非小細胞肺がん細胞株）、
動物：Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences, Chinaから購入されたＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕヌードマウス（免疫不全マウス）８週齢、雌。
（２）試薬：
Ｊｅｆ（ジェフィチニブ、LC laboratories社製）
ＡｃｌａＡ（アクラルビシンＡ、Shenzhen Main Luck Pharmaceuticals Inc.社製）
（３）主要装置：
細胞インキュベーター（Thermo Scientific 3111）
層流ラック（Suhang Brand動物飼育用クリーンキャビネット、DJ-2型）。
（４）実験方法
無菌条件下、上記の腫瘍細胞を対数増殖期において収集した。Ａ５４９を、ヌードマウスの右腋窩下に、６×１０６／０．２ｍＬ／ヌードマウス（細胞生存率９０％超）の量で、皮下注射によって注射して、ヌードマウスにおける肺がんの移植腫瘍モデルを確立した。接種後第２日から、マウスに投与した。実験群には実験的に計画された量で胃内投与し、陰性対照群には滅菌水を胃内投与し、陽性対照群にはＪｅｆを胃内投与した。それぞれのマウスに、毎回０．４ｍｌを１日２回、８：００及び１４：００に胃内投与した。投与を１４日間継続した。投与の前日を０日目とみなし、マウスの体重及び腫瘍サイズを５日毎に決定して、体重及び腫瘍成長についての動的プロットを作成した。２０日目に、マウスを屠殺し、腫瘍を取り出して、その重量を測定した。医薬品の効果後、対照群の腫瘍阻害率をゼロとし、それに基づいて腫瘍阻害率（％）を計算した。
【００９５】
決定した値を、平均±標準誤差（平均±ＳＤ）として提示した。それぞれの群の実験データを、ＳＰＳＳ１８．０統計ソフトウェアの一元配置ＡＮＯＶＡ法を用いて解析した。ｐ＜０．０５は、差が統計的に有意であることを意味する。
【００９６】
【表７】
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【００９７】
実施例５についての解析及び考察：
この実験は、ヌードマウスにおける肺がん移植腫瘍に及ぼすＡｃｌａＡの効果を試験しており、ＡｃｌａＡは、この実験で使用された投与量で、良好な阻害効果を示さなかった（図３Ｂ〜図３Ｅを参照のこと）。動物の体重の動的変化から、ＡｃｌａＡはこの実験の投与中に、ヌードマウスの体重に一部の減少を引き起こすことが推断されたが、投与が終了した後、体重は徐々に回復した（図３Ａを参照のこと）。
【実施例６】
【００９８】
ヌードマウスにおける肺がん及び肝がん移植腫瘍の阻害のためのＴＴＤとＡｃｌａＡとの医薬組合せ
（１）実験材料
肺がん細胞株：Ａ５４９（ヒト非小細胞肺がん細胞株）、
肝がん細胞株：ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞癌細胞）、
動物：Shanghai Laboratory Animal Center of Chinese Academy of Sciences, Chinaから購入されたＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕヌードマウス（免疫不全マウス）８週齢、雌。
（２）試薬：
ＴＴＤ（テトランドリン、Jiangxi Jinfurong Pharmaceutical Co., Ltd.社製）、
Ｊｅｆ（ジェフィチニブ、LC laboratories社製）、
ＡｃｌａＡ（アクラルビシンＡ、Shenzhen Main Luck Pharmaceuticals Inc.社製）、
ＴＡ（テトランドリンとアクラルビシンＡとの組合せ）
（３）主要装置：
細胞インキュベーター（Thermo Scientific 3111）
層流ラック（Suhang Brand動物飼育用クリーンキャビネット、DJ-2型）。
（４）実験方法
無菌条件下、上記の腫瘍細胞を対数増殖期において収集した。Ａ５４９を、ヌードマウスの右腋窩下に、１×１０７／０．２ｍＬ／ヌードマウス（細胞生存率９０％超）の量で、皮下注射によって注射し、一方、ＨｅｐＧ２を、ヌードマウスの左腋窩下に、１×１０７／０．２ｍＬ／ヌードマウス（細胞生存率９０％超）の量で、皮下注射によって注射し、こうしてヌードマウスにおける肺がん及び肝がんのそれぞれの移植腫瘍モデルを確立した。接種後第２日から、マウスに投与した。実験群には実験的に計画された量で胃内投与し、陰性対照群には滅菌水を胃内投与し、陽性対照群にはＪｅｆを胃内投与した。それぞれのマウスに、毎回０．４ｍｌを１日３回、８：００、１４：００及び２０：００に胃内投与した。投与を１０日間継続した。投与の前日を０日目とみなし、マウスの体重及び腫瘍サイズを５日毎に決定して、体重及び腫瘍成長についての動的プロットを作成した。２９日目に、マウスを屠殺し、腫瘍を取り出して、その重量を測定した。医薬品の効果後、対照群の腫瘍阻害率をゼロとし、それに基づいて腫瘍阻害率（％）を計算した。
【００９９】
決定した値を、平均±標準誤差（平均±ＳＤ）として提示した。それぞれの群の実験データを、ＳＰＳＳ１８．０統計ソフトウェアの一元配置ＡＮＯＶＡ法を用いて解析した。ｐ＜０．０５は、差が統計的に有意であることを意味する。
【０１００】
【表８】
2015531356.tif 000015
【０１０１】
【表９】
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【０１０２】
実施例６についての解析及び考察：
この実験は、ヌードマウスにおける肺がん及び肝がん移植腫瘍に及ぼすＴＴＤとＡｃｌａＡとの組合せ効果を試験した。図４Ｂ〜図４Ｅ及び図５Ａ〜図５Ｄに示されているように、ＴＴＤとＡｃｌａＡとの１．０ｍｇ／ｋｇ．／回での組合せ用量は、肺がんに関して最大８９％までの腫瘍阻害率を達成し、肝がんに関して最大５３％までの腫瘍阻害率を達成した。それに対して、ＴＴＤとＡｃｌａＡとの０．５ｍｇ／ｋｇ．／回での組合せ用量は、肺がんに関して最大２４％までの腫瘍阻害率を達成し、肝がんに関して最大５０％までの腫瘍阻害率を達成した。これらの２つの薬物を組み合わせた使用は、対照群と比較して、肝がんの阻害率に関して有意差を達成した。動物の体重の動的変化から、これらの２つの薬物を組み合わせた使用は、この実験において、ヌードマウスの体重に有意な減少を引き起こさないが、一方、陽性対照群Ｊｅｆの動物は、体重に有意な減少を示すことが推断された（図４Ａを参照のこと）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【国際調査報告】
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