(57)【要約】  本発明は、リソソーム酵素とターゲティング部分とを含む化合物、例えば化合物がイズロン酸-2-スルファターゼとAngiopep-2を含む融合タンパク質である化合物に関する。特定の実施形態において、これらの化合物は、ターゲティング部分の存在のため、酵素単独よりも効率的に、脳血管関門を通過することができる又はリソソーム内に蓄積することができる。本発明はまた、かかる化合物を用いたリソソーム蓄積症（例えば、ムコ多糖症II型）の治療方法に関する。【選択図】図２４Ｂ
2015505824.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）150アミノ酸未満のペプチド又はペプチド性ターゲティング部分と、（b）リソソーム酵素、その活性断片、又はその類似体と、を含む化合物であって、前記ターゲティング部分と前記酵素、断片又は類似体とがリンカーで連結されている化合物。
【請求項２】
前記ターゲティング部分が配列番号1〜105及び107〜117のいずれかと少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
前記ターゲティング部分がAngiopep-2（配列番号97）の配列を含む、請求項2に記載の化合物。
【請求項４】
前記ターゲティング部分が、場合により配列番号97に記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含む、請求項3に記載の化合物。
【請求項５】
前記ターゲティング部分が式Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys（式Ia）を含み、
式中、
X3はAsn又はGlnであり、
X4はAsn又はGlnであり、
X5はPhe、Tyr、又はTrpであり、
前記ターゲティング部分が、場合により式Iaに記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含む、請求項1に記載の化合物。
【請求項６】
前記ターゲティング部分が式Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2（式Ib）を含み、
式中、
X3はAsn又はGlnであり、
X4はAsn又はGlnであり、
X5はPhe、Tyr、又はTrpであり、
Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり、
Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr、又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり、
前記ターゲティング部分が、場合により式Ib、Z1又はZ2に記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含む、請求項1に記載の化合物。
【請求項７】
前記ターゲティング部分が式Ib、Z1、又はZ2に記載のアミノ酸の少なくとも3つのD-異性体を含む、請求項6に記載の化合物。
【請求項８】
前記ターゲティング部分が式Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyrを有する、請求項7に記載の化合物。
【請求項９】
前記ターゲティング部分が式Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyrを有する、請求項7に記載の化合物。
【請求項１０】
前記ターゲティング部分が式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6（式IIa）を含み、
式中、
X1はLys又はD-Lysであり、
X2はArg又はD-Argであり、
X5はPhe又はD-Pheであり、
X6はLys又はD-Lysであり、
X1、X2、X5、又はX6の少なくとも1つがD-アミノ酸である、請求項1に記載の化合物。
【請求項１１】
前記ターゲティング部分が式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7（式IIb）を含み、
式中、
X1はLys又はD-Lysであり、
X2はArg又はD-Argであり、
X5はPhe又はD-Pheであり、
X6はLys又はD-Lysであり、
X7はTyr又はD-Tyrであり、
X1、X2、X5、X6、又はX7の少なくとも1つがD-アミノ酸である、請求項1に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ターゲティング部分が式Z1-X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2（式IIc）を含み、
式中、
X1はLys又はD-Lysであり、
X2はArg又はD-Argであり、
X5はPhe又はD-Pheであり、
X6はLys又はD-Lysであり、
X7はTyr又はD-Tyrであり、
Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり、
Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr、又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり、
X1、X2、X5、X6、又はX7の少なくとも1つがD-アミノ酸であり、
前記ターゲティング部分が、場合によりZ1又はZ2に記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含む、請求項1に記載の化合物。
【請求項１３】
前記リンカーが共有結合又は1つ以上のアミノ酸である、請求項1から12のいずれかに記載の化合物。
【請求項１４】
前記共有結合がペプチド結合である、請求項13に記載の化合物。
【請求項１５】
前記化合物が融合タンパク質である、請求項14に記載の化合物。
【請求項１６】
前記リンカーが化学的コンジュゲートである、請求項1から12のいずれかに記載の化合物。
【請求項１７】
以下の構造:
【化１】
2015505824.tif 000045
を有し、
「Lys-NH」基が、酵素に存在するリジン又はN末端若しくはC末端リジンのいずれかを表す、請求項16に記載の化合物。
【請求項１８】
以下の構造:
【化２】
2015505824.tif 000046
を有する、請求項17に記載の化合物。
【請求項１９】
以下の構造:
【化３】
2015505824.tif 000047
又は
【化４】
2015505824.tif 000048
を有し、
それぞれの-NH-基がターゲティング部分及び酵素にそれぞれ存在する一級アミノを表す、請求項16に記載の化合物。
【請求項２０】
以下の構造:
【化５】
2015505824.tif 000049
又は
【化６】
2015505824.tif 000050
を有する、請求項19に記載の化合物。
【請求項２１】
前記リンカーがグリコシル化部位を介してコンジュゲートされている、請求項16に記載の化合物。
【請求項２２】
前記リンカーがヒドラジド又はヒドラジド誘導体である、請求項21に記載の化合物。
【請求項２３】
前記化合物が第2のターゲティング部分をさらに含み、第2のターゲティング部分が前記化合物に第2のリンカーにより連結されている、請求項1から22のいずれかに記載の化合物。
【請求項２４】
1つ以上のナノ粒子を含む組成物であって、前記ナノ粒子が請求項1から23のいずれかに記載の化合物のいずれか1つにコンジュゲートされている組成物。
【請求項２５】
請求項1から23のいずれかに記載の化合物のいずれか1つのリポソーム製剤を含む組成物。
【請求項２６】
請求項1から23のいずれかに記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２７】
リソソーム蓄積症を有する被験体の治療又は予防的処置方法であって、前記被験体に請求項1から26のいずれかに記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項２８】
前記被験体が神経症状を有する、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記被験体が5歳未満で治療を開始する、請求項27に記載の方法。
【請求項３０】
前記被験体が3歳未満で治療を開始する、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記被験体が乳幼児である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記投与が非経口投与を含む、請求項27に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リソソーム酵素及びターゲティング部分を含む化合物、並びに、かかる酵素の欠乏により生じる障害の治療におけるかかるコンジュゲートの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
リソソーム蓄積症（lysosomal storage disorder）は、約50の希有な遺伝性障害の群であり、この障害において対象は、適切な代謝に必要なリソソーム酵素を欠損している。これら疾患は典型的には、常染色体又はX連鎖劣性遺伝子により生じる。群として、これら障害の発症率は約1:5000〜1:10,000である。
【０００３】
Hunter症候群又はムコ多糖症II型（MPS-II）は、ヘパリン硫酸（heparin sulfate）及びデルマタン硫酸のリソソーム分解に必要な酵素である、イズロン酸-2-スルファターゼ（IDS;イデュルスルファーゼとしても知られる）の欠乏により生じる。この障害はX連鎖劣性であるので、主に男性に影響する。この障害に罹患している人は、グリコサミノグリカン又はGAGとしても知られるこれらムコ多糖の分解及び再利用ができない。この欠乏は、全身にわたるGAGの蓄積をもたらし、これは神経系、関節や、心臓、肝臓、及び皮膚を含む様々な器官系に深刻な影響をもたらす。粗大化顔貌特徴、肥大した頭部及び腹部、並びに皮膚障害を含む、数々の身体症状もある。最も重症な場合には、この疾患はティーンエイジで致死性となり得るのであり、重症の精神遅滞を伴う。
【０００４】
MPS-IIに治癒法はない。対症処置に加えて、治療的アプローチには骨髄移植及び酵素補充療法がある。骨髄移植は、心血管異常、肝脾腫大（肝臓及び脾臓の肥大）、関節硬直を含むMPS-IIの周辺症状を安定化することが観察されてきた。しかし、このアプローチは、この疾患に関連する神経心理学的症状を安定化又は解決しなかった（Guffonら、J. Pediatr. 154:733-7、2009）。
【０００５】
IDSの静脈内投与による酵素補充療法もまた、皮膚障害（Marinら、[出版前にオンライン公開]Pediatr. Dermatol. Oct. 13、2011）、内臓サイズ、胃腸機能の改善、及び上気道感染症を治療するための抗生物質の必要性の減少（Hoffmanら、Pediatr. Neurol. 45:181-4、2011）を含む利点のあることが示されてきた。骨髄移植と同様に、このアプローチはMPS-IIと関連する中枢神経系欠陥を改善しない。なぜなら、酵素が血液脳関門（BBB;Wraithら、Eur. J. Pediatr. 1676:267-7、2008）を通過しないと予測されるからである。
【０００６】
くも膜下腔内送達（Feliceら、Toxicol. Pathol. 39:879-92、2011）を含む、脳へのIDSの送達を増加させる方法が研究されてきたのであり、現在も研究されている。しかし、くも膜下腔内送達は高度に侵襲的な技術である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Guffonら、J. Pediatr. 154:733-7、2009
【非特許文献２】Marinら、[出版前にオンライン公開]Pediatr. Dermatol. Oct. 13、2011
【非特許文献３】Hoffmanら、Pediatr. Neurol. 45:181-4、2011
【非特許文献４】Wraithら、Eur. J. Pediatr. 1676:267-7、2008
【非特許文献５】Feliceら、Toxicol. Pathol. 39:879-92、2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、他の症状に加えて神経性疾患症状に対処する、より非侵襲的で効果的なMPS-II治療方法が、きわめて望ましいといえよう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ターゲティング部分及びリソソーム酵素を含む化合物に関する。これら化合物は、MPS-IIを治療するために使用され得るIDS-Angiopep-2コンジュゲート及び融合タンパク質により例示される。これらコンジュゲート及び融合タンパク質はBBBを通過できるので、周辺疾患症状を治療できるだけでなく、CNS症状の治療にも有効であり得る。加えて、ターゲティング部分、例えばAngiopep-2は、酵素をリソソームにターゲティングすることができるので、これらコンジュゲート及び融合タンパク質は、酵素単体より有効であることが予測される。
【００１０】
したがって、第1の態様において、本発明は、（a）ターゲティング部分（例えば、200、150、125、100、80、60、50、40、35、30、25、24、23、22、21、20、又は19アミノ酸未満であってもよいペプチド又はペプチド性ターゲティング部分）と、（b）リソソーム酵素、その活性断片、又はその類似体とを含む化合物であって、ターゲティング部分と酵素、断片又は類似体とがリンカーで連結されている化合物を特徴とする。リソソーム酵素はイズロン酸-2-スルファターゼ（IDS）、IDS活性を有するIDS断片、又はIDS類似体であってもよい。ある実施形態において、IDS酵素又はIDS断片は、ヒトIDSアイソフォームa又はその断片（例えば、アイソフォームaのアミノ酸26〜550）のアミノ酸配列を有し、あるいは、IDS類似体は、ヒトIDSアイソフォームa、アイソフォームb、アイソフォームcの配列、又はアイソフォームaのアミノ酸26〜550と実質的に同一（例えば、少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一）である。特定の実施形態において、IDS酵素は、ヒトIDSアイソフォームa又はアイソフォームaの成熟形態（アイソフォームaのアミノ酸26〜550）の配列を有する。
【００１１】
第1の態様において、ターゲティング部分は、配列番号1〜105及び107〜117のいずれか（例えば、Angiopep-2（配列番号97））と実質的に同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。他の実施形態において、ターゲティング部分は式Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys（式Ia）を含み、式中、X3はAsn又はGlnであり、X4はAsn又はGlnであり、X5はPhe、Tyr、又はTrpであり、ターゲティング部分は、場合により式Iaに記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体をを含んでもよい。他の実施形態において、ターゲティング部分は式Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2（式Ib）を含み、式中、X3はAsn又はGlnであり、X4はAsn又はGlnであり、X5はPhe、Tyr、又はTrpであり、Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり、Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr、又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり、ターゲティング部分は、場合により式Ib、Z1又はZ2に記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含んでもよい。他の実施形態において、ターゲティング部分は式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6（式IIa）を含み、式中、X1はLys又はD-Lysであり、X2はArg又はD-Argであり、X5はPhe又はD-Pheであり、X6はLys又はD-Lysであり、X1、X2、X5、又はX6の少なくとも1つがD-アミノ酸である。他の実施形態において、ターゲティング部分は式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7（式IIb）を含み、式中、X1はLys又はD-Lysであり、X2はArg又はD-Argであり、X5はPhe又はD-Pheであり、X6はLys又はD-Lysであり、X7はTyr又はD-Tyrであり、X1、X2、X5、X6、又はX7の少なくとも1つがD-アミノ酸である。他の実施形態において、ターゲティング部分は式Z1-X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2（式IIc）を含み、式中、X1はLys又はD-Lysであり、X2はArg又はD-Argであり、X5はPhe又はD-Pheであり、X6はLys又はD-Lysであり、X7はTyr又はD-Tyrであり、Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり、Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr、又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり、X1、X2、X5、X6、又はX7の少なくとも1つがD-アミノ酸であり、ポリペプチドは、場合によりZ1又はZ2に記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含んでもよい。
【００１２】
第1の態様において、リンカーは共有結合（例えばペプチド結合）又は1つ以上のアミノ酸である。化合物は融合タンパク質（例えば、Angiopep-2-IDS、IDS-Angiopep-2、又はAngiopep-2-IDS-Angiopep-2、又は図1に示す構造を有する）であってもよい。化合物は、第2のリンカーにより化合物に連結されている第2のターゲティング部分をさらに含んでいてもよい。
【００１３】
本発明はまた、第1の態様の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を特徴とする。
【００１４】
別の態様において、本発明は、リソソーム蓄積症（例えばMPS-II）を有する対象の治療又は予防的処置方法を特徴とする。この方法は、被験体に第1の態様の化合物又は本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。化合物中のリソソーム酵素は、IDSであってもよい。被験体は、重症形態のMPS-II又は減衰形態のMPS-IIのいずれを有していてもよい。被験体は、神経症状（例えば精神遅滞）を経験していてもよい。この方法は、6ヶ月齢、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15若しくは18歳未満の被験体に対して実施又は開始してもよい。対象は乳幼児（例えば、1歳未満）であってもよい。
【００１５】
ある実施形態において、ターゲティング部分は抗体（例えば、内因性BBB受容体、例えばインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、及びIGF受容体等に特異的な抗体又は免疫グロブリン）ではない。
【００１６】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、表1の配列のいずれか又はその断片と実質的に同一のものである。特定の実施形態において、ペプチドベクターは、Angiopep-1（配列番号67）、Angiopep-2（配列番号97）（An2）、Angiopep-3（配列番号107）、Angiopep-4a（配列番号108）、Angiopep-4b（配列番号109）、Angiopep-5（配列番号110）、Angiopep-6（配列番号111）、Angiopep-7（配列番号112）又は逆Angiopep-2（配列番号117）の配列を有する。ターゲティング部分又は化合物を、特定の細胞型（例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓、及び筋肉のいずれか1、2、3、4、若しくは5種）に効率的に輸送するか、又はそれは哺乳動物のBBBを効率的に通過することができる（例えば、Angiopep-1、-2、-3、-4a、-4b、-5、及び-6）。別の実施形態において、ターゲティング部分又は化合物は、特定の細胞型（例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓、及び筋肉のいずれか1、2、3、4、若しくは5種）に進入することができるが、BBBを効率的に通過することはできない（例えば、Angiopep-7を含むコンジュゲート）。ターゲティング部分は、任意の長さのもの、例えば、少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、35、50、75、100、200、若しくは500アミノ酸、又はこれらの数の間の任意の範囲であってよい。特定の実施形態において、ターゲティング部分は、200、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7又は6未満のアミノ酸（例えば10〜50アミノ酸長）である。ターゲティング部分は、組換え遺伝子技術又は化学合成により製造することができる。
【表１】
2015505824.tif 000003
2015505824.tif 000004
2015505824.tif 000005
2015505824.tif 000006
【００１７】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、式：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19
〔式中、X1〜X19の各々（例えば、X1〜X6、X8、X9、X11〜X14、及びX16〜X19）は、独立して、任意のアミノ酸（例えば、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、及びValなどの天然アミノ酸）であるか、又は存在せず、X1、X10及びX15のうちの少なくとも1個（例えば、2個若しくは3個）はアルギニンである。〕
を有するアミノ酸配列を含みうる。いくつかの実施形態において、X7はSer若しくはCysであるか；又はX10及びX15はそれぞれ独立して、Arg若しくはLysである。いくつかの実施形態において、X1〜X19の残基は、包括的に、配列番号1〜105及び107〜116（例えば、Angiopep-1、Angiopep-2、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、及びAngiopep-7）のいずれか1つの任意のアミノ酸配列と実質的に同一である。いくつかの実施形態において、アミノ酸X1〜X19のうちの少なくとも1個（例えば、2、3、4若しくは5個）はArgである。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、該ポリペプチドのN末端、該ポリペプチドのC末端、又はその両方に1個以上の追加のシステイン残基を有する。
【００１８】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys（式Ia）〔式中、X3はAsn又はGlnであり；X4はAsn又はGlnであり；X5はPhe、Tyr又はTrpであり；該ポリペプチドは、場合により長さが200アミノ酸未満（例えば、150、100、75、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、12、10、11、8若しくは7アミノ酸未満、又はこれらの数値の間の任意の範囲）であり；該ポリペプチドは、場合により式Iaに記載されたアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体（例えば、Lys、Arg、X3、X4、X5又はLysのD-異性体）を含んでもよく；該ポリペプチドは表２におけるペプチドではない。〕を含みうる。
【００１９】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、アミノ酸配列Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys（式Ia）〔式中、X3はAsn又はGlnであり；X4はAsn又はGlnであり；X5はPhe、Tyr又はTrpであり；該ポリペプチドは、長さが19アミノ酸未満（例えば、18、17、16、15、14、12、10、11、8若しくは7アミノ酸未満、又はこれらの数値の間の任意の範囲）であり；該ポリペプチドは、場合により式Iaに記載されたアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体（例えば、Lys、Arg、X3、X4、X5又はLysのD-異性体）を含んでもよい。〕を含みうる。
【００２０】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2（式Ib）〔式中、X3はAsn又はGlnであり；X4はAsn又はGlnであり；X5はPhe、Tyr又はTrpであり；Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり；Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり；該ポリペプチドは、場合により式Ib、Z1又はZ2に記載されたアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含んでもよい。〕のアミノ酸配列を含みうる。
【００２１】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分はアミノ酸配列Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lysを含みうる。他の実施形態において、ターゲティング部分はLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyrのアミノ酸配列を有する。さらに他の実施形態において、ターゲティング部分はLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cysのアミノ酸配列を有する。
【００２２】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、X1-X2-Asn-Asn-X5-X6（式IIa）〔式中、X1はLys又はD-Lysであり；X2はArg又はD-Argであり；X5はPhe又はD-Pheであり；X6はLys又はD-Lysであり；X1、X2、X5又はX6の少なくとも1つ（例えば少なくとも2つ、3つ又は4つ）はD-アミノ酸である。〕のアミノ酸配列を有し得る。
【００２３】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7（式IIb）〔式中、X1はLys又はD-Lysであり；X2はArg又はD-Argであり；X5はPhe又はD-Pheであり；X6はLys又はD-Lysであり；X7はTyr又はD-Tyrであり；X1、X2、X5、X6又はX7の少なくとも1つ（例えば少なくとも2つ、3つ、4つ又は5つ）はD-アミノ酸である。〕のアミノ酸配列を有し得る。
【００２４】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2（式IIc）〔式中、X3はAsn又はGlnであり；X4はAsn又はGlnであり；X5はPhe、Tyr又はTrpであり；Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり；Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり；X1、X2、X5、X6又はX7の少なくとも1つはD-アミノ酸であり；該ポリペプチドは、場合によりZ1又はZ2に記載されたアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含んでもよい。〕のアミノ酸配列を有し得る。
【００２５】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr（An2）〔式中、任意の1又はそれ以上のアミノ酸がD-異性体である。〕のアミノ酸配列を有し得る。例えば、ターゲティング部分は、D-異性体である1、2、3、4又は5個のアミノ酸を有することができる。好ましい実施形態において、位置8、10及び11の1若しくはそれ以上又は全てがD-異性体でありうる。また別の実施形態において、位置8、10、11及び15の1若しくはそれ以上又は全てがD-異性体でありうる。
【００２６】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、以下：Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr（3D-An2）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1a）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1b）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys（P1c）；D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys（P1d）；Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P2）；Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P3）；Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P4）；Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P5）；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P5a）；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P5b）；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys（P5c）；Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys（P6）；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Tyr-Cys（P6a）；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Tyr-Cys（P6b）；Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr；及びD-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-D-Tyr-Cys（P6c）；又はこれらの断片でありうる。他の実施形態において、ターゲティング部分は、0〜5個（例えば、0〜4個、0〜3個、0〜2個、0〜1個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、2〜5個、2〜4個、2〜3個、3〜5個、3〜4個又は4〜5個）のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する上記ペプチドの1つの配列を有する。
【００２７】
上記態様のいずれかにおいて、ポリペプチドは、以下：Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；若しくはLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys、又はこれらの断片でありうる。
【００２８】
上記態様のいずれかにおいて、ポリペプチドは、以下：Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr（3D-An2）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1a）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1b）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys（P1c）；D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys（P1d）、又はこれらの断片（例えば、P1、P1a、P1b、P1c又はP1dのN末端から1〜7アミノ酸の欠失； P1、P1a、P1b、P1c又はP1dのC末端からの1〜5アミノ酸の欠失；あるいはP1、P1a、P1b、P1c又はP1dのN末端から1〜7アミノ酸の欠失とP1、P1a、P1b、P1c又はP1dのC末端からの1〜5アミノ酸の欠失）でありうる。
【００２９】
本明細書において記載するターゲティング部分のいずれかにおいて、この部分は、本明細書に記載するアミノ酸配列から（例えば、Lys-Arg-X3-X4-X5-Lysから）作製することができる、1、2、3、4又は5アミノ酸（例えば、1〜3アミノ酸）の付加又は欠失を含んでもよい。
【００３０】
本明細書において記載するターゲティング部分のいずれかにおいて、この部分は、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端又はその両方に、1又はそれ以上の追加のシステイン残基を有してもよい。他の実施形態において、ターゲティング部分は、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端又はその両方に、1又はそれ以上のチロシン残基を有してもよい。またさらなる実施形態において、ターゲティング部分は、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端又はその両方に、アミノ酸配列Tyr-Cys及び／又はCys-Tyrを有してもよい。
【００３１】
上記態様のいずれかの特定の実施形態において、ターゲティング部分は、15より少ないアミノ酸長（例えば、10より少ないアミノ酸長）である。
【００３２】
上記態様のいずれかの特定の実施形態において、ターゲティング部分は、アミド化されたC末端を有してもよい。他の実施形態において、ターゲティング部分は、BBBを通過して効率的に輸送される（例えば、Angiopep-2よりも効率的にBBBを通過して輸送される）。
【００３３】
上記態様のいずれかの特定の実施形態において、融合タンパク質、ターゲティング部分、又はリソソーム酵素（例えばIDS）、断片若しくは類似体を改変（修飾）する（例えば、本明細書に記載のように）。融合タンパク質、ターゲティング部分、又はリソソーム酵素、断片若しくは類似体を、アミド化、アセチル化するか、又はその両方を行うことができる。そのような改変（修飾）を、ポリペプチドのアミノ又はカルボキシ末端で行うことができる。融合タンパク質、ターゲティング部分、又はリソソーム酵素、断片若しくは類似体はまた、本明細書に記載の任意のポリペプチドのペプチド模倣物質（例えば、本明細書に記載のもの）を含んでもよい。融合タンパク質、ターゲティング部分、又はリソソーム酵素、断片若しくは類似体は、多量体形態、例えば、二量体形態（例えば、システイン残基を介してジスルフィド結合により形成される）にあってもよい。
【００３４】
特定の実施形態では、ターゲティング部分、リソソーム酵素（例えばIDS）、酵素断片若しくは酵素類似体は、本明細書に記載のアミノ酸配列を有するが、ただし少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、若しくは12の置換）、挿入、又は欠失を有する。ポリペプチドは、例えば、1〜12、1〜10、1〜5、又は1〜3のアミノ酸置換、例えば、1〜10（例えば9、8、7、6、5、4、3、2まで）のアミノ酸置換を有しうる。アミノ酸置換は、保存的又は非保存的でありうる。例えば、ターゲティング部分は配列番号1、Angiopep-1、Angiopep-2、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、及びAngiopep-7のいずれかのアミノ酸配列の位置1、10、及び15に対応する位置の1、2又は3箇所にアルギニンを有しうる。
【００３５】
上記態様のいずれかにおいて、前記化合物は特に、配列番号1〜105及び107〜117のいずれかを含むか、又はそれからなるポリペプチド（例えば、Angiopep-1、Angiopep-2、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、及びAngiopep-7）を含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のポリペプチド及びコンジュゲートは、配列番号102、103、104、及び105のポリペプチドを含まない。
【００３６】
上記態様のいずれかにおいて、リンカー（X）は、当技術分野で公知であるか、又は本明細書に記載の任意のリンカーであってよい。特定の実施形態において、リンカーは、共有結合（例えば、ペプチド結合）、化学連結剤（例えば、本明細書に記載のもの）、アミノ酸又はペプチド（例えば、2、3、4、5、8、10個以上のアミノ酸）である。
【００３７】
特定の実施形態において、リンカーは、式：
【化１】
2015505824.tif 000007
【００３８】
〔式中、nは2〜15の整数（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14若しくは15）であり；及びYはA上のチオールであり、ZはB上の一級アミンであるか、又はYはB上のチオールであり、ZはA上の一級アミンである。〕
を有する。特定の実施形態において、リンカーは、N-スクシンイミジル(アセチルチオ)アセテート（SATA）リンカー又はヒドラジドリンカーである。リンカーは、酵素（例えば、IDS）又はターゲティング部分（例えば、Angiopep-2）と、遊離アミン、システイン側鎖（例えば、Angiopep-2-Cys若しくはCys-Angiopep-2のもの）を介して又はグリコシル化部位を介してコンジュゲートしうる。
【００３９】
特定の実施形態において、化合物は、式：
【化２】
2015505824.tif 000008
【００４０】
〔式中、「Lys-NH」基は、酵素中に存在するリジン、又はN末端若しくはC末端リジンを表す。〕
を有する。別の例において、化合物は、構造：
【化３】
2015505824.tif 000009
【００４１】
又は
【化４】
2015505824.tif 000010
【００４２】
〔式中、各−NH−基は、それぞれターゲティング部分及び酵素に存在する一級アミノを表す。〕
を有する。特定の実施形態において、酵素はIDSであってもよいし、又はターゲティング部分はAngiopep-2であってもよい。
【００４３】
特定の実施形態において、化合物は、ターゲティング部分（例えば、Angiopep-2）と、リソソーム酵素（例えば、IDS）、酵素断片又は酵素類似体を含む融合タンパク質である。
【００４４】
特定の実施形態において、リンカーは、トリアゾール含有リンカーを形成する、アルキニル基とアジド基との間のヒュスゲン1,3-双極性環化付加反応；4π電子系を有するジエン（例えば、場合により置換されていてもよい1,3-不飽和化合物、例として場合により置換されていてもよい1,3-ブタジエン、1-メトキシ-3-トリメチルシリルオキシ-1,3-ブタジエン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン又はフランなど）と2π電子系を有する親ジエン体（dienophile）又はヘテロ親ジエン体（heterodienophile）（例えば、場合により置換されていてもよいアルケニル基又は場合により置換されていてもよいアルキニル基）との間のディールス・アルダー反応；求核試薬及び歪み（strained）ヘテロシクリル求電子試薬による開環反応；ホスホロチオエート基及びヨード基によるスプリントライゲーション（splint ligation）反応；並びにアルデヒド基及びアミノ基による還元的アミノ化反応からなる群より選択されるクリックケミストリー反応対を含む。本発明の一態様において、リンカーは、モノフルオロシクロオクチン（MFCO）、ジフルオロシクロオクチン（DFCO）、シクロオクチン（OCT）、ジベンゾシクロオクチン（DIBO）、ビアリールアザシクロオクチン（BARAC）、ジフルオロベンゾシクロオクチン（DIFBO）、及びビシクロ[6.1.0]ノニン（BCN）からなる群より選択される。別の態様において、リンカーは、マレイミド基又はS-アセチルチオアセテート（SATA）基である。ペプチドターゲティング部分は、N末端アジド基又はC末端アジド基を介してリンカーに結合する。
【００４５】
一実施形態において、化合物は、BCNリンカーを介してIDSに結合されたAngiopep-2を含む。この化合物は一般構造：
【化５】
2015505824.tif 000011
【００４６】
〔式中、nは、リンカーを介してIDSに結合されたAngiopep-2部分の数であり、1〜6であり、An2はAngiopep-2であり、An2に結合されたNH基はAngiopep-2のN末端アミノ基であり、IDSに結合されたNH基はIDSにおけるリジンからの側鎖一級アミノ基を表す。〕
を有することができる。化合物はまた、以下の構造を有しうる：
【化６】
2015505824.tif 000012
【００４７】
化合物はまた、以下の構造を有しうる：
【化７】
2015505824.tif 000013
【００４８】
上記式のそれぞれにおいて、An2はAngiopep-2であり、An2に結合されたNH基はAngiopep-2のN末端アミノ基であり、IDSに結合されたNH基はIDSにおけるリジンからの側鎖一級アミノ基を表す。
【００４９】
本発明の化合物の上記態様のいずれかにおいて、Angiopep-2は、ポリペプチドのN末端又はC末端においてアジド基で誘導体化されて、そのアジド基が、クリックケミストリー反応においてアルキン誘導体化リンカーと反応し、Angiopep-2をリンカーに結合することができる。本発明はまた、式IIIの化合物であって、nの平均値が1〜6（例えば、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5又は6）である化合物を含む組成物を特徴とする。
【００５０】
BCNリンカーを有する化合物はまた、以下の構造：
【化８】
2015505824.tif 000014
【００５１】
〔式中、nは、リンカーを介してIDSに結合されたAngiopep-2部分の数であり、1〜6であり、An2はAngiopep-2であり、Angiopep-2のC末端におけるリジンの側鎖一級アミノ基を介してリンカーに結合され、IDSに結合されたNH基はIDSにおけるリジンからの側鎖一級アミノ基を表す。〕
を有することができる。
【００５２】
本発明は、式VIの化合物であって、nの平均値が1〜6（例えば、1、1.5、2、2.3、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5又は6）である化合物を含む組成物を特徴とする。
【００５３】
一実施形態において、化合物は、MFCOリンカーを介してIDSに連結されたAngiopep-2を含む。Angiopep-2は、Angiopep-2のN末端アミノ基を介してMFCOリンカーと連結することができる。この化合物は、以下の構造：
【化９】
2015505824.tif 000015
【００５４】
〔式中、nは、リンカーを介してIDSに結合されたAngiopep-2部分の数であり、1〜6であり、An2はAngiopep-2であり、An2に結合されたNH基はAngiopep-2のN末端アミノ基であり、IDSに結合されたNH基はIDSにおけるリジンからの側鎖一級アミノ基を表す。〕
を有することができる。
【００５５】
本発明はまた、式VIIの化合物であって、nの平均値が1〜6（例えば、1、1.5、2、2.5、2.6、3、3.5、4、4.4、4.5、5、5.3、5.5又は6）である化合物を含む組成物を特徴とする。
【００５６】
本発明の一態様において、Angiopep-2は、Angiopep-2のC末端におけるアミノ酸（例えば、リジン）の側鎖一級アミノ基を介してMFCOリンカーと連結しており、化合物は以下の構造： 
【化１０】
2015505824.tif 000016
【００５７】
〔式中、nは、リンカーを介してIDSに結合されたAngiopep-2部分の数であり、1〜6であり、An2はAngiopep-2であり、Angiopep-2のC末端におけるリジンの側鎖一級アミノ基を介してリンカーと結合しており、IDSに結合されたNH基はIDSにおけるリジンからの側鎖一級アミノ基を表す。〕
を有する。本発明は、式VIIIの化合物であって、nの平均値が1〜6（例えば、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、4.9、5、5.5又は6）である化合物を含む組成物を特徴とする。
【００５８】
本発明の別の実施形態において、化合物は、DBCOリンカーを介してIDSと連結されたAngiopep-2を含み、以下の構造：
【化１１】
2015505824.tif 000017
【００５９】
〔式中、nは、リンカーを介してIDSに結合されたAngiopep-2部分の数であり、1〜6であり、An2はAngiopep-2であり、An2に結合されたNH基はAngiopep-2のN末端アミノ基であり、IDSに結合されたNH基はIDSにおけるリジンからの側鎖一級アミノ基を表す。〕
を有する。本発明は、式IXの化合物であって、nの平均値が1〜6（例えば、1、1.3、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5又は6）である化合物を含む組成物を特徴とする。
【００６０】
本発明はまた、Angiopep-2-Cysがマレイミド基を介してIDSに連結している化合物であって、以下の構造：
【化１２】
2015505824.tif 000018
【００６１】
〔式中、nは、リンカーを介してIDSに結合されたAngiopep-2部分の数であり、1〜6であり、An2Cys、An2Cysに結合されたS部分は、Angiopep-2-Cysにおけるシステイン上の側鎖スルフィドを表し、IDSに結合されたNH基はIDSにおけるリジンからの側鎖一級アミノ基を表す。〕
を有する化合物を特徴とする。本発明は、式Xの化合物であって、nの平均値が0.5〜6（例えば、0.5、0.8、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5又は6）である化合物を含む組成物を特徴とする。
【００６２】
別の実施形態において、Cys-Angiopep-2はマレイミド基を介してIDSに連結しており、以下の構造：
【化１３】
2015505824.tif 000019
【００６３】
〔式中、nは、リンカーを介してIDSに結合されたAngiopep-2部分の数であり、1〜6であり、Cys-An2はCys-Angiopep-2であり、Cys-An2に結合されたS部分は、Cys-Angiopep-2におけるシステイン上の側鎖スルフィドを表し、IDSに結合されたNH基はIDSにおけるリジンからの側鎖一級アミノ基を表す。〕
を有する。本発明は、式XIの化合物であって、nの平均値が0.5〜6（例えば、0.5、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5又は6）である化合物を含む組成物を特徴とする。
【００６４】
上記実施形態の一態様において、リンカーは、モノフルオロシクロオクチン（MFCO）、ジフルオロシクロオクチン（DFCO）、シクロオクチン（OCT）、ジベンゾシクロオクチン（DIBO）、ビアリールアザシクロオクチン（BARAC）、ジフルオロベンゾシクロオクチン（DIFBO）、及びビシクロ[6.1.0]ノニン（BCN）からなる群より選択される、アルキン基で官能化されたマレイミド基とすることができ、アルキン官能化マレイミドは、Angiopep-2に結合されたアジド基を介してAngiopep-2に結合される。
【００６５】
本発明の一実施形態において、化合物は、S-アセチルチオアセテート（SATA）基を介してIDSと連結されたAngiopep-2を含み、以下の構造：
【化１４】
2015505824.tif 000020
【００６６】
〔式中、nは、リンカーを介してIDSに結合されたAngiopep-2部分の数であり、1〜6であり、An2はAngiopep-2であり、An2に結合されたNH基はAngiopep-2のN末端アミノ基であり、IDSに結合されたNH基はIDSにおけるリジンからの側鎖一級アミノ基を表す。〕
を有する。本発明は、式XIIの化合物であって、nの平均値が1〜6（例えば、1、1.5、2、2.5、2.6、3、3.5、4、4.5、5、5.5又は6）である化合物を含む組成物を特徴とする。
【００６７】
上述した化合物は、リンカーを介して酵素に結合された1、2、3、4、5又はそれ以上のペプチドターゲティング部分を有することができ、ここでターゲティング部分はAngiopep-2であり、酵素はリソソーム酵素、例えばIDSである。
【００６８】
本発明はまた、上記式により表される化合物であって、各IDSに結合されたAngiopep-2部分の平均数が1〜6（例えば、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5又は6）、好ましくは1.5〜5、より好ましくは2〜4である化合物を含む組成物を特徴とする。上記組成物のいくつかの態様において、各IDSに結合されたAngiopep-2部分の平均数は、約2（例えば、1、1.5、2、2.5又は3）である。より好ましくは、各IDSに結合されたAngiopep-2部分の平均数は、約4（例えば、2、2.5、3、3.5、4、4.5又は5）である。あるいは、各IDSに結合されたAngiopep-2部分の平均数は、約6（例えば、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5又は7）である。
【００６９】
本発明は、上述した化合物のいずれかにコンジュゲートされたナノ粒子を含む組成物を特徴とする。本発明はまた、上述した化合物のいずれかのリポソーム製剤を特徴とする。
【００７０】
本発明は、上に記載した化合物のいずれか1種と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を特徴とする。本発明はまた、リソソーム蓄積症を有する被験体を治療する又は予防的に処置する方法であって、被験体に、上に記載した化合物又は組成物のいずれかを投与することを含む方法を特徴とする。この方法の一態様において、リソソーム蓄積症はムコ多糖症II型（MPS-II）であり、リソソーム酵素はIDSである。この方法の別の態様において、被験体は、MPS-IIの重篤形態又はMPS-IIの減衰形態を有する。この方法のまた別の態様において、被験体は神経症状を有する。被験体は、5歳未満の年齢、好ましくは3歳未満の年齢で治療（処置）を開始することができる。被験体は乳幼児であってもよい。本発明の方法はまた、本発明の化合物及び組成物の非経口投与を含む。
【００７１】
「被験体」は、ヒト又は非ヒト動物（例えば哺乳動物）を意味する。
【００７２】
「リソソーム酵素」は、リソソームに存在するあらゆる酵素を意味し、この酵素の欠損はリソソーム蓄積症の原因となりうる。
【００７３】
「リソソーム蓄積症（障害）」は、リソソーム酵素の欠損により引き起こされる任意の疾患を意味する。およそ50のかかる障害が同定されている。
【００７４】
「ターゲティング部分」とは、特定の細胞型（例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓、若しくは筋肉）に、特定の細胞区画（例えばリソソーム）に、又はBBBを通過して、輸送されることができるポリペプチド又はポリペプチド模倣物質などの化合物又は分子を意味する。特定の実施形態において、ターゲティング部分は、脳の内皮細胞上に存在する受容体に結合し、それによって、トランスサイトーシスによりBBBを通過して輸送することができる。ターゲティング部分は、細胞又はBBBの完全性に影響することなく、高レベルの経内皮輸送が得られる分子であってよい。ターゲティング部分は、ポリペプチド又はペプチド模倣物質であってよく、天然のものであっても、又は化学合成若しくは組換え遺伝子技術により製造されたものであってもよい。
【００７５】
被験体における疾患、障害又は症状を「治療すること」とは、治療薬を被験体に投与することにより、疾患、障害又は症状の少なくとも1種の症候を減少させることを意味する。
【００７６】
被験体における疾患、障害又は症状を「予防的に処置すること」とは、疾患症候の発症の前に、治療薬を被験体に投与することにより、疾患、障害又は症状の発生頻度を低下させる又は重症度を低減することを意味する。
【００７７】
「BBBを通過して効率的に輸送される」ポリペプチドとは、少なくともAngiopep-6と同程度に効率的にBBBを通過する（すなわち、参照により本明細書に組み入れられるものとする、2007年5月29日に提出された米国特許出願第11/807,597号に記載のin situ脳灌流アッセイにおいて、Angiopep-1（250 nM）よりも38.5％以上高い）ことができるポリペプチドを意味する。従って、「BBBを通過して効率的に輸送されない」ポリペプチドは、より低いレベルで脳に輸送される（例えば、Angiopep-6よりも低い効率で輸送される）。
【００７８】
「特定の細胞型に効率的に輸送される」ポリペプチド又は化合物とは、ポリペプチド又は化合物が、対照物質より、又はコンジュゲートの場合、コンジュゲートされていない薬剤と比較して、少なくとも10％（例えば、25％、50％、100％、200％、500％、1,000％、5,000％、若しくは10,000％）を超える程度で、その細胞型に蓄積することができる（細胞への輸送の増加、細胞からの排出の減少、又はその組合せのいずれかによる）ことを意味する。そのような活性は、参照により本明細書に組み入れられるものとする国際特許出願公開第WO 2007/009229号に詳細に記載されている。
【００７９】
「実質的な同一性」又は「実質的に同一の」は、2つの配列（参照配列と対象の配列）を最適に整列した場合、参照配列と同じポリペプチド又はポリヌクレオチド配列をそれぞれ有するか、あるいは、参照配列内の対応する位置において同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドが規定したパーセントであるポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、参照配列と実質的に同一であるアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一性を有する。ポリペプチドについては、比較配列の長さは、一般に少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、90、100、150、200、250、300、又は350個の連続するアミノ酸（例えば、全長配列）であろう。核酸については、比較配列の長さは一般に少なくとも5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個の連続するヌクレオチド（例えば、全長ヌクレオチド配列）であろう。配列同一性は配列分析ソフトウエア（例えば、Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、1710 University Avenue、Madison、WI 53705の配列分析ソフトウエアパッケージ）を用いてデフォルト設定で測定することができる。かかるソフトウエアは様々な置換、欠失、及び他の改変に対して相同性の程度を割り当てることにより類似配列をマッチさせることができる。
【００８０】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】作製したIDS構築物を示す概略図である。
【図２】示した構築物でトランスフェクトしたCHO-S細胞からの細胞培養培地の、抗IDS抗体を用いたウエスタンブロットを示すイメージである。
【図３】以下に記載する実施例においてIDS活性を検出するために用いた蛍光アッセイを示す概略図である。
【図４】示した構築物でトランスフェクトしたCHO-S細胞からの細胞培養培地におけるIDS活性を示すグラフである。
【図５】Aは、示した構築物でのCHO-S細胞のトランスフェクション後7日間にわたるIDS活性を示すグラフである。Bは、CHO-S細胞における7日間にわたるIDS-His又はIDS-An2-Hisのいずれかの発現を示す一連のウエスタンブロットイメージである。
【図６】Aは、示した構築物を発現するCHO-S細胞からの培地での処理の際の、MPS-II線維芽細胞における35S-GAG蓄積の低減を示すグラフである。Bは、精製IDS-An2-Hisによる処理の際の、MPS-II線維芽細胞におけるGAG蓄積の低減を示すグラフである。
【図７】A〜Cは、IDSのアイソフォームの配列（アイソフォームa、図7A；アイソフォームb；図7B；アイソフォームc、図7C）である。
【図８】IDS（JR-032）及びIDS-Angiopep-2コンジュゲートのクーマシーブルー染色及びウエスタンブロット検出を示す一連のイメージである。
【図９】JR-032と比較したIDS-Angiopep-2コンジュゲートの酵素活性を示すグラフである。酵素活性はJCR-032対照に対する％として表す。コンジュゲートに関して、測定の回数は4〜8であり、JR-032についての各バーは15回の測定の平均である。
【図１０】コンジュゲート化されていないJR-032又は個々のコンジュゲート（4ng/ml）で処理されたMPSII患者の線維芽細胞において測定されたGAG濃度を示すグラフである。GAGレベルは健常患者の線維芽細胞において測定されたGAGの割合（％）として表す。
【図１１】Angiopep-2-IDSコンジュゲートがコンジュゲート化されていないJR-032と同様の効力でMPSII線維芽細胞におけるGAG濃度を低減させることを示すグラフである。GAG濃度は、種々の濃度の3つのコンジュゲートのJR-032で処理されたMPSII患者の線維芽細胞において測定した。GAGレベルは健常患者の線維芽細胞において測定されたGAGの割合（％）として表す。
【図１２】A〜Bは、脳の種々の部位におけるJR-032の分布を示す一連のグラフである。
【図１３】単一時点（2分）におけるコンジュゲート化されていないJR-032及び15のコンジュゲートのそれぞれの脳分布を示すグラフである。C末端が特定されていない限り、すべてのリンカーはN末端結合によってAn2に連結されている。
【図１４−１】A〜Dは、70-56-1B、70-56-2B、68-32-2及び70-66-1BコンジュゲートのMALDI-TOF解析を示す一連のグラフである。
【図１４−２】A〜Dは、70-56-1B、70-56-2B、68-32-2及び70-66-1BコンジュゲートのMALDI-TOF解析を示す一連のグラフである。
【図１５】Aは、68-32-2、70-56-1B、70-56-2B及び70-66-1BのSEC解析を示す。Bは、68-32-2、70-56-1B、70-56-2B及び70-66-1BのSP解析を示す。
【図１６】A〜Bは、それぞれ1時間及び16時間での、Alexa488-IDS及びAlexa488-An2-IDS（70-56-2B）のU87細胞による取込みを示す一連のグラフである。
【図１７】共焦点顕微鏡法を用いてAlexa488標識コンジュゲートの細胞内移動を測定するためのプロトコールを示す概略図である。
【図１８】lysotracker色素と比較した、U87細胞におけるAlexa標識IDS（上パネル）及びAlexa標識Angiopep-2-IDS（70-56-2B、下パネル）の局在を示す一連の共焦点顕微鏡写真である。16時間取込み後の共局在化を4つ目のパネル（拡大）に示す。酵素を50nMの濃度で37℃にて16時間インキュベートした。倍率は100Xである。
【図１９】lysotracker色素と比較した、U87細胞におけるAlexa標識IDS（上パネル）及びAlexa標識Angiopep-2-IDS（70-56-2B、下パネル）の局在を示す一連の共焦点顕微鏡写真である。共局在化の欠如を4つ目のパネル（拡大）に示す。酵素を100nMの濃度で37℃にて1時間インキュベートした。倍率は100Xである。
【図２０】lysotracker色素と比較した、U87細胞におけるAlexa標識IDS（上パネル）及びAlexa標識Angiopep-2-IDS（70-56-2B、下パネル）の局在を示す一連の共焦点顕微鏡写真である。共局在化を4つ目のパネル（拡大）に黄色で示す。酵素を100nMの濃度で37℃にて16時間インキュベートした。倍率は100Xである。
【図２１】lysotracker色素と比較した、U87細胞におけるAlexa標識IDS及びAlexa標識Angiopep-2-IDS（70-56-1B）の局在を示す共焦点顕微鏡写真である。酵素を50nMの濃度で37℃にて一晩インキュベートした。倍率は100Xである。右パネルは左パネルの拡大版である。
【図２２】U-87細胞におけるAlexa標識IDS、並びに Alexa488標識An2-IDSコンジュゲート：#68-32-2、70-66-1B、70-56-2B及び68-27-3の取込み及び局在を示す一連の共焦点顕微鏡写真である。
【図２３】JR-032及びイヌリンの脳取込み及び分布を比較したグラフである。
【図２４Ａ】A〜Bは、An2-IDSコンジュゲートのKin及び脳分布をコンジュゲート化されていないJR-032と比較したグラフである。
【図２４Ｂ】A〜Bは、An2-IDSコンジュゲートのKin及び脳分布をコンジュゲート化されていないJR-032と比較したグラフである。
【図２５】A〜Bは、Angiopep-2-IDSコンジュゲートがU87細胞への取込み増大を示すこと、そしてAngiopep-2-IDSコンジュゲートの取込み比の増大が、細胞への取込み増大と相関していることを示すグラフである。
【図２６】IDUA酵素前駆体のアミノ酸配列である。成熟酵素はこの配列のアミノ酸27〜653を含む。
【図２７】ヒスチジン（his）タグあり又はなしのいずれかでAngiopep-2（An2）に融合したIDUAをコードするcDNA構築物のプラスミドマップである。構築物はpcDNA3.1などの好適な発現ベクター中にサブクローニングした。
【図２８】8つのIDUA及びEPiC-IDUA融合タンパク質の概略図である。
【図２９】抗IDUA抗体、抗Angiopep-2抗体又は抗ヘキサヒスチジン抗体を用いたウエスタンブロットであり、CHO-S細胞培地中で検出されたIDUA及びEPiC-IDUA融合タンパク質の発現レベルを示す。
【図３０】Aは、クーマシー染色SDS-PAGEゲルのイメージであり、CHO-S培地から精製されたIDUA及びEPiC-IDUA融合タンパク質を示す。Bは、クーマシー染色SDS-PAGEゲルのイメージであり、Hisタグが除去された又は除去されていないIDUA-His及びAn2-IDUA-Hisタンパク質を示す。下は、Hisタグの存在又は不在（Hisタグの除去を確認するため）及びAn2タグの存在を検出するための抗His抗体又は抗An2抗体を用いたウエスタンブロットである。
【図３１】CHO細胞における組換えIDUAの精製のためのプロトコールを示す表である。
【図３２】Aは、SP-セファロース（強カチオン交換樹脂）を用いた最終ステップの間のIDUAの精製プロフィールを示すグラフである。挿入図は、溶出時の種々の画分におけるIDUAのレベルを示すクーマシー染色SDS-PAGEゲルのイメージである。Bは、Hisタグあり又はなしの種々のバッチからのIDUA及びAn2-IDUAの再現可能な精製を示すクーマシー染色SDS-PAGEゲルである。Cは、in vitro脳灌流及びin vitroアッセイのために十分な量のIDUA及びAn2-IDUAの精製を示すクーマシー染色SDS-PAGEゲルである。
【図３３】基質4-メチルウンベリフェリル-α-L-イズロニドに対するIDUA酵素の反応を示す概略図である。この基質はIDUAにより加水分解されて4-メチルウンベリフェロン（4-MU）となり、これは放出波長450nm及び励起波長365nMを用いてFarrandフィルターフルオロメーターにより蛍光的に検出される。
【図３４】IDUA-His8、IDUA、An2-IDUA-His8、及び市販のIDUA-His10が同様の酵素活性を有することを示す表である。
【図３５】MPS-I線維芽細胞におけるIDUA、IDUA-His及びAn2-IDUA-HisによるGAGの低減を示すグラフである。
【図３６】細胞培養培地中の漸増濃度のIDUA又はAn2-IDUA酵素に暴露した後のMPS-I線維芽細胞における細胞内IDUA活性を示す一連のグラフである。
【図３７】過剰のM6P、RAP又はAn2の存在下におけるMPS-I線維芽細胞によるIDUAタンパク質の取込みを示すグラフである。
【図３８】A〜Cは、漸増する量のAn2（図13のA）及びM6P（図13のB）を用いたMPS-I線維芽細胞によるIDUAタンパク質のM6P受容体依存的取込みを示すグラフである。Cは、漸増する量のLRP1インヒビターRAPの存在下におけるIDUA及びAn2-IDUAの取込みを示す。
【図３９】Aは、An2ペプチド（1mM）、M6P（5mM）及びRAP（1μm）ペプチド（LRP1インヒビター）の存在下におけるU-87神経膠芽腫細胞によるIDUA及びAn2-IDUA（2又は24時間の暴露）の取込みを示す一連のグラフである。Bは、LRP1によるAn2-IDUAの共免疫沈降を示す一連のウエスタンブロットであり、An2-IDUAがLRP1と相互作用することを証明している。
【図４０】Aは、IDUA融合タンパク質におけるPNGase F切断部位を示す概略図である。Bは、非変性又は変性An2-IDUAの脱グリコシル化を示すクーマシー染色SDS-PAGEゲルのイメージである。Cは、PNGase Fによる処理前及び後のIDUA/又はAn2-IDUAを示すクーマシー染色SDS-PAGEゲルのイメージである。Dは、U87細胞におけるIDUA及びAn2-IDUA取込みに対する脱グリコシル化の影響を示すグラフである。
【図４１】健常な線維芽細胞及びMPS-I線維芽細胞におけるAn2のリソソーム取込みを示す一連の蛍光共焦点顕微鏡写真である。
【図４２】U87細胞によるIDUA、An2-IDUA、Alexa-488-IDUA及びAlexa488-An2-IDUAの取込みを示すグラフである。
【図４３】BBBを通過するIDUA及びAn2-IDUAのin situ輸送を示す一連のグラフである。
【図４４】ウシ脳毛細血管内皮細胞と新生ラット星状膠細胞との共培養物から構成されるin vitro BBBモデル（CELLIAL technologies）を示す概略図である。このモデルを用いてBBBを通過する輸送を評価する。
【図４５】図１９に示したin vitro BBBモデルを用いた脳毛細血管内皮細胞を介したAn2-IDUA及びIDUAのトランスサイトーシスの評価を示すグラフである。
【図４６】RAP又はAn2の存在下におけるin vitro BBBモデルを用いた脳毛細血管内皮細胞を介したAn2-IDUA及びIDUAのトランスサイトーシスの評価を示すグラフである。
【図４７】MPS-I患者の線維芽細胞におけるAn2-IDUAの用量応答を示すグラフである。
【図４８】MPS-Iノックアウトマウスの脳ホモジネートにおけるIDUA酵素活性を示すグラフである。ホモジネートは、ノックアウトマウスへのAn2-IDUAの静脈内（IV）注射の60分後に調製した。
【発明を実施するための形態】
【００８２】
詳細な説明
本発明は、リンカー（例えばペプチド結合）で連結されたリソソーム酵素（例えば、IDS）及びターゲティング部分（例えば、Angiopep-2）を含む化合物に関する。ターゲティング部分は、リソソームへ及び／又はBBBを通過して酵素を輸送することができる。そのような化合物の例として、Angiopep-2-IDSコンジュゲート及び融合タンパク質がある。これらのタンパク質は、酵素アッセイ及びMPS-IIの細胞モデルの両方においてIDS酵素活性を維持する。ターゲティング部分（Angiopep-2など）は、BBBを通過してタンパク質を輸送することができるため、これらのコンジュゲートは、末梢活性を有するだけではなく、中枢神経系（CNS）においても活性を有すると予想される。さらに、ターゲティング部分（Angiopep-2など）は、リソソームへの受容体媒介輸送機構（例えばLRP-1）によって細胞に取り込まれる。従って、本発明者は、これらのターゲティング部分はリソソーム内の酵素濃度を高め、それによって、特にLRP-1受容体を発現する組織及び器官（例えば肝臓、腎臓及び脾臓）において、より有効な治療をもたらすことができると考える。
【００８３】
これらの特徴は、IDSの静脈内投与はそれ自体がCNS疾患の症候を治療するものではないため、現在の治療方法の最大の欠点の一部を克服することができる。BBBをバイパスする物理的方法、例えば高度に侵襲的でありそのため一般的にはCNS送達の問題の魅力的な解決手段とはならない髄腔内又は頭蓋内投与とは対照的に、本発明は非侵襲的な脳送達を可能にする。さらに、リソソームへの治療薬の輸送の改善によって、標準的な酵素補充療法と比較して、用量の低減又は投与頻度の低減が可能となる。
【００８４】
リソソーム蓄積症（障害）
リソソーム蓄積症は、脂質、糖タンパク質又はムコ多糖の代謝が酵素機能不全に基づいて妨害される障害の群である。この機能不全は、正確に代謝されることができない物質の細胞内集積に至る。症候は疾患ごとに異なるが、臓器系（肝臓、心臓、肺、脾臓）、骨における問題、並びに神経学的問題はこれらの疾患の多くに存在する。典型的には、これらの疾患は、関連する酵素の稀な遺伝的欠陥により引き起こされる。これらの疾患の大部分は、常染色体劣性形式で遺伝するが、一部、例えばMPS-IIは、X染色体連鎖劣性疾患である。
【００８５】
リソソーム酵素
本発明は、リソソーム蓄積症の治療に有用である当技術分野で公知の任意のリソソーム酵素を用いることができる。本発明の化合物の例は、イズロン酸-2-スルファターゼ（IDS；イデュルスルファーゼとしても知られる）である。この化合物としては、IDS、酵素活性を保持しているIDSの断片、又はヒトIDS配列に対して実質的に同一（例えば、少なくとも70、80、85、90、95、96、97、98又は99％の同一性）であるアミノ酸配列を含みかつ酵素活性を保持しているIDS類似体が挙げられる。
【００８６】
IDSの3つのアイソフォーム、すなわちアイソフォームa、b及びcが知られている。アイソフォームaは、550アミノ酸のタンパク質であり、図7のAに示す。アイソフォームb（図7のB）は、343アミノ酸のタンパク質であり、より長いアイソフォームaと比較して異なるC末端領域を有している。アイソフォームc（図7のC）は、下流開始コドンの使用のためにN末端に変化を有する。これらのアイソフォームのいずれをも本発明の化合物において用いることができる。
【００８７】
特定の断片又は類似体が酵素活性を有するかどうか試験するために、当業者は、適当な任意のアッセイを用いることができる。IDS活性を測定するためのアッセイは、例えば、Hopwood, Carbohydr. Res. 69:203-16, 1979；Bielicki et al., Biochem. J. 271:75-86, 1990；及びDean et al., Clin. Chem. 52:643-9, 2006に記載されたものを含み当技術分野で公知である。同様の蛍光分析アッセイもまた以下に記載する。これらのアッセイのいずれかを使用して、当業者は特定のIDS断片又は類似体が酵素活性を有するかどうか決定することができる。
【００８８】
特定の実施形態において、酵素断片（例えば、IDS断片）を使用する。IDS断片は、少なくとも50、100、150、200、250、300、350、400、450又は500アミノ酸長とすることができる。特定の実施形態において、酵素は、例えば本明細書に記載するポリペプチド修飾のいずれかを用いて、修飾されていてもよい。
【００８９】
ターゲティング部分
本発明の化合物は、本明細書に記載の任意のターゲティング部分、例えば、表1に記載の任意のペプチド（例えば、Angiopep-1、Angiopep-2若しくは逆Angiopep-2）、又はその断片若しくは類似体を特徴とする。特定の実施形態において、ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドに対して少なくとも35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％又はさらには100％の同一性を有してもよい。ポリペプチドは、本明細書に記載の配列の1つと比較して1個以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個）の置換を有してもよい。他の改変を、以下でより詳細に説明する。
【００９０】
本発明はまた、これらのポリペプチドの断片（例えば、機能的断片）をも特徴とする。特定の実施形態において、この断片を、特定の細胞型（例えば、肝臓、眼、肺、腎臓、若しくは脾臓）に効率的に輸送するか、若しくはその中に蓄積させるか、又はBBBを通過して効率的に輸送することができる。前記ポリペプチドのトランケーションは、ポリペプチドのN末端、ポリペプチドのC末端、又はその組合せから1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個又はそれ以上のアミノ酸であってよい。他の断片としては、前記ポリペプチドの内部部分が欠失した配列が挙げられる。
【００９１】
さらなるポリペプチドを、本明細書に記載のアッセイ又は方法の1つを用いることにより同定することができる。例えば、候補ポリペプチドを、従来のペプチド合成により製造し、パクリタキセルとコンジュゲートさせ、実験動物に投与することができる。生物学的に活性なポリペプチドコンジュゲートは、例えば、腫瘍細胞を注入され、コンジュゲートで処置されなかった（例えば、コンジュゲート化されていない薬剤で処置された）対照と比較してコンジュゲートで処置された動物の生存率を増加させる能力に基づいて同定することができる。例えば、生物学的に活性なポリペプチドを、in situ脳灌流アッセイにおいて、実質中のその位置に基づいて同定することができる。
【００９２】
同様に、他の組織での蓄積を決定するためのアッセイを実施することができる。ポリペプチドの標識されたコンジュゲートを動物に投与し、様々な器官における蓄積を測定することができる。例えば、検出可能な標識（例えば、Cy5.5などの近赤外線蛍光分光標識）にコンジュゲートさせたポリペプチドは、生存しているin vivoでの可視化を可能にする。そのようなポリペプチドを動物に投与し、器官中のポリペプチドの存在を検出し、かくして、所望の器官におけるポリペプチドの蓄積の速度及び量を決定することができる。他の実施形態において、ポリペプチドを放射性アイソトープ（例えば、125I）で標識することができる。次いで、ポリペプチドを動物に投与する。一定時間後、動物を犠牲にし、器官を取り出す。次いで、各器官における放射性アイソトープの量を、当技術分野で公知の任意の手段を用いて測定することができる。特定の器官における標識された候補ポリペプチドの量と、標識された対照ポリペプチドの量とを比較することにより、候補ポリペプチドが特定の組織に接近し、そこに蓄積する能力を確認することができる。好適な陰性対照としては、特定の細胞型に効率的に輸送されないことが知られた任意のペプチド又はポリペプチド（例えば、BBBを通過しないAngiopepと関連するペプチド、又は任意の他のペプチド）が挙げられる。
【００９３】
さらなる配列は、米国特許第5,807,980号（例えば、本明細書に記載の配列番号102）、第5,780,265号（例えば、配列番号103）、第5,118,668号（例えば、配列番号105）に記載されている。アプロチニン類似体をコードするヌクレオチド配列の例は、atgagaccag atttctgcct cgagccgccg tacactgggc cctgcaaagc tcgtatcatc cgttacttct acaatgcaaa ggcaggcctg tgtcagacct tcgtatacgg cggctgcaga gctaagcgta acaacttcaa atccgcggaa gactgcatgc gtacttgcgg tggtgcttag（配列番号106；Genbankアクセッション番号X04666）である。アプロチニン類似体の他の例を、国際特許出願第PCT/CA2004/000011号に開示された合成アプロチニン配列（又はその一部）を用いてタンパク質BLAST（Genbank: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を実施することにより見出すことができる。アプロチニン類似体の例は、アクセッション番号CAA37967（GI:58005）及び1405218C（GI:3604747）の下でも見出される。
【００９４】
改変ポリペプチド
本発明において用いられる融合タンパク質、ターゲティング部分、及びリソソーム酵素、断片若しくは類似体は、改変アミノ酸配列を有してもよい。特定の実施形態において、前記改変は所望の生物活性（例えば、BBBを通過する能力又は酵素活性）を有意に破壊しない。この改変は、元のポリペプチドの生物活性を減少させる（例えば、少なくとも5％、10％、20％、25％、35％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、若しくは95％）、それに対する影響を有さないか、又はそれを増加させる（例えば、少なくとも5％、10％、25％、50％、100％、200％、500％、若しくは1000％）ことができる。改変ペプチドベクター又はポリペプチド治療薬は、in vivoでの安定性、生体利用能、毒性、免疫学的活性、免疫学的同一性、及びコンジュゲーション特性などのポリペプチドの特性を有するか、又はそれを最適化することができる。
【００９５】
改変としては、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによるもの、又は当技術分野で公知の化学的改変技術によるものが挙げられる。改変は、ポリペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシ末端を含むポリペプチド中のどこでも行うことができる。同じ型の改変が、所与のポリペプチド中のいくつかの部位に同じ又は異なる程度で存在してもよく、ポリペプチドは2種以上の改変を含んでもよい。ポリペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝状であってもよく、それらは分枝鎖を含むか又は含まない環状であってもよい。環状、分枝状、及び分枝環状ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスの結果生じてもよいし、又は合成的にそれを作製することもできる。他の改変としては、PEG化、アセチル化、アシル化、アセトシドメチル（Acm）基の付加、ADP-リボシル化、アルキル化、アミド化、ビオチン化、カルバモイル化、カルボキシエチル化、エステル化、フィアビンへの共有結合、ヘム部分への共有結合、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド誘導体の共有結合、薬剤の共有結合、マーカー（例えば、蛍光若しくは放射性）の共有結合、脂質若しくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、糖鎖付加、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質溶解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化及びユビキチン化などのタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介性付加が挙げられる。
【００９６】
改変ポリペプチドはまた、ポリペプチド配列中の保存的又は非保存的な、アミノ酸挿入、欠失、又は置換（例えば、Dアミノ酸、デスアミノ酸）を含んでもよい（例えば、そのような変化がポリペプチドの生物活性を実質的に変化させない場合）。特に、本発明のポリペプチドのいずれかのアミノ又はカルボキシ末端への1個以上のシステイン残基の付加は、例えば、ジスルフィド結合による、これらのポリペプチドのコンジュゲーションを容易にすることができる。例えば、Angiopep-1（配列番号67）、Angiopep-2（配列番号97）又はAngiopep-7（配列番号112）を、アミノ末端に1個のシステイン残基（それぞれ、配列番号71、113及び115）又はカルボキシ末端に1個のシステイン残基（それぞれ、配列番号72、114及び116）を含むように改変することができる。アミノ酸置換は、保存的（すなわち、ある残基を同じ一般型若しくは基の別の残基により置換する場合）又は非保存的（すなわち、ある残基を別の型のアミノ酸により置換する場合）であってよい。さらに、非天然アミノ酸を、天然アミノ酸に置換することができる（すなわち、非天然保存的アミノ酸置換又は非天然非保存的アミノ酸置換）。
【００９７】
合成的に作製されたポリペプチドは、DNAによって天然にコードされないアミノ酸の置換（例えば、天然にはない又は非天然アミノ酸）を含んでもよい。非天然アミノ酸の例としては、D-アミノ酸、システインの硫黄原子に結合したアセチルアミノメチル基を有するアミノ酸、PEG化アミノ酸、式NH2(CH2)nCOOH（式中、nは2〜6である）のωアミノ酸、サルコシン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、及びノルロイシンなどの中性非極性アミノ酸が挙げられる。フェニルグリシンはTrp、Tyr、又はPheに置換することができる；シトルリン及びメチオニンスルホキシドは中性非極性であり、システイン酸は酸性であり、オルニチンは塩基性である。プロリンをヒドロキシプロリンで置換することができ、それはコンフォメーション付与特性を保持する。
【００９８】
置換的突然変異誘発により類似体を作製することができ、それは元のポリペプチドの生物活性を保持する。「保存的置換」として同定された置換の例を表2に示す。そのような置換が望ましくない変化をもたらす場合、表2に「例示的置換」として特色付けられるか、又はアミノ酸クラスを参照して本明細書にさらに記載される他の型の置換を導入し、生成物をスクリーニングする。
【００９９】
機能又は免疫学的同一性における実質的な改変を、（a）例えば、シート若しくはらせんコンフォメーションとしての、置換領域中のポリペプチド主鎖の構造、（b）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（c）側鎖のかさ高さ、の維持に対するその影響が大きく異なる置換を選択することにより達成する。天然残基は、一般的な側鎖特性に基づいて以下の群に分割される：
（1）疎水性：ノルロイシン、メチオニン（Met）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、ヒスチジン（His）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、フェニルアラニン（Phe）、
（2）中性疎水性：システイン（Cys）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、
（3）酸性／負荷電：アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、
（4）塩基性：アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、ヒスチジン（His）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、
（5）鎖の向きに影響する残基：グリシン（Gly）、プロリン（Pro）、
（6）芳香族：トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、フェニルアラニン（Phe）、ヒスチジン（His）、
（7）極性：Ser、Thr、Asn、Gln、
（8）塩基性／正荷電：Arg、Lys、His、及び
（9）荷電：Asp、Glu、Arg、Lys、His。
【０１００】
他のアミノ酸置換を表2に列挙する。
【表２】
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【０１０１】
ポリペプチド誘導体及びペプチド模倣物質
天然アミノ酸からなるポリペプチドに加えて、ペプチド模倣物質又はポリペプチド類似体も本発明により包含され、本発明の化合物において用いられる融合タンパク質、ターゲティング部分、又はリソソーム酵素、酵素断片若しくは酵素類似体を形成することができる。ポリペプチド類似体は、鋳型ポリペプチドのものと類似する特性を有する非ペプチド薬剤として製薬業界において一般的に用いられている。非ペプチド化合物は「ペプチド模倣物質」又はペプチド模倣剤と呼ばれる（Fauchereら、Infect. Immun. 54:283-287, 1986及びEvansら、J. Med. Chem. 30:1129-1239, 1987）。治療上有用なペプチド又はポリペプチドと構造的に関連するペプチド模倣物質を用いて、等価な、又は増強された治療又は予防効果をもたらすことができる。一般的には、ペプチド模倣物質は、天然受容体結合ポリペプチドなどの模範的ポリペプチド（すなわち、生物活性若しくは薬理活性を有するポリペプチド）と構造的に類似するが、当技術分野で周知の方法（Spatola, Peptide Backbone Modifications, Vega Data, 1:267, 1983；Spatolaら、Life Sci. 38:1243-1249, 1986；Hudsonら、Int. J. Pept. Res. 14:177-185, 1979；及びWeinstein, 1983, Chemistry and Biochemistry, of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein(編)Marcel Dekker, New York）によって、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-（シス及びトランス）、-CH2SO-、-CH(OH)CH2-、-COCH2-などの結合により置換されていてもよい1個以上のペプチド結合を有する。そのようなポリペプチド模倣物質は、より経済的な生産、より高い化学的安定性、増強された薬理学的特性（例えば、半減期、吸収、効力、効率）、低下した抗原性などの天然ポリペプチドを超える有意な利点を有しうる。
【０１０２】
本明細書に記載のターゲティング部分はBBBを効率的に通過するか、又は特定の細胞型（例えば、本明細書に記載のもの）に標的化することができるが、その有効性はプロテアーゼの存在により減少し得る。同様に、本発明の化合物において用いられるリソソーム酵素、酵素断片又は酵素類似体の有効性も同様に減少し得る。血清プロテアーゼは、切断のためのL-アミノ酸及びペプチド結合などの特定の基質要求性を有する。さらに、血清中のプロテアーゼ活性の多くの顕著な成分であるエキソペプチダーゼは通常、ポリペプチドの第1のペプチド結合に対して作用し、遊離N末端を要する（Powellら、Pharm. Res. 10: 1268-1273, 1993）。これに照らせば、改変された型のポリペプチドを使用することが有利であることが多い。改変ポリペプチドは、元のL-アミノ酸ポリペプチドの構造特性を保持するが、有利には、プロテアーゼ及び／又はエキソペプチダーゼによる切断の影響を容易に受けない。
【０１０３】
コンセンサス配列の1個以上のアミノ酸の同じ型のD-アミノ酸との体系的置換（例えば、エナンチオマー；L-リジンの代わりにD-リジン）を用いて、より安定なポリペプチドを作製することができる。かくして、本明細書に記載のポリペプチド誘導体又はペプチド模倣物質は、全てのL-、全てのD-又は混合D,Lポリペプチドであってよい。ペプチダーゼは基質としてD-アミノ酸を用いることができないため、N末端又はC末端D-アミノ酸の存在は、ポリペプチドのin vivoでの安定性を増加させる（Powellら、Pharm. Res. 10:1268-1273, 1993）。逆-Dポリペプチドは、L-アミノ酸を含むポリペプチドと比較して、逆配列に整列された、D-アミノ酸を含むポリペプチドである。かくして、L-アミノ酸ポリペプチドのC末端残基は、D-アミノ酸ポリペプチドにとってN末端になるなどである。逆D-ポリペプチドは、L-アミノ酸ポリペプチドと同じ三次コンフォメーション、従って、同じ活性を保持するが、in vitro及びin vivoで酵素的分解に対してより安定であり、かくして、元のポリペプチドよりも高い治療効力を有する（Brady及びDodson, Nature 368:692-693, 1994；Jamesonら、Nature 368:744-746, 1994）。逆-D-ポリペプチドに加えて、コンセンサス配列又は実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む制限付きの（constrained）ポリペプチドを、当技術分野で周知の方法により作製することができる（Rizoら、Ann. Rev. Biochem. 61:387-418, 1992）。例えば、制限付きのポリペプチドを、ジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基を付加することにより作製し、それによって環状ポリペプチドを得ることができる。環状ポリペプチドは遊離N又はC末端を有さない。従って、それらはエキソペプチダーゼによるタンパク質溶解の影響を受けにくいが、それらは勿論、エンドペプチダーゼの影響を受けやすく、ポリペプチド末端で切断しない。N末端若しくはC末端D-アミノ酸を有するポリペプチドと環状ポリペプチドのアミノ酸配列は通常、それぞれ、N末端若しくはC末端D-アミノ酸残基の存在、又はその環状構造を除いて、それらが対応するポリペプチドの配列と同一である。
【０１０４】
分子内ジスルフィド結合を含む環状誘導体を、アミノ及びカルボキシ末端などの環化のために選択される位置に好適なS-保護されたシステイン又はホモシステイン残基を組込みながら、従来の固相合成により調製することができる（Sahら、J. Pharm. Pharmacol. 48:197, 1996）。鎖集合の完了後、（1）S-保護基を選択的に除去して、対応する2個の遊離SH-官能基の結果として生じる支持体上での酸化を用いてS-S結合を形成させた後、支持体から生成物を従来通り除去し、好適な精製手順を行うか、又は（2）側鎖を完全に脱保護すると共に支持体からポリペプチドを除去した後、高度に希釈した水性溶液中で遊離SH-官能基を酸化することにより、環化を実施することができる。
【０１０５】
分子内アミド結合を含む環状誘導体を、環化のために選択される位置に、好適なアミノ及びカルボキシル側鎖保護されたアミノ酸誘導体を組込みながら、従来の固相合成により調製することができる。分子内-S-アルキル結合を含む環状誘導体を、環化のために選択される位置に、好適なアミノ保護側鎖を有するアミノ酸残基及び好適なS保護システイン又はホモシステインを組込みながら、従来の固相化学により調製することができる。
【０１０６】
ポリペプチドのN末端又はC末端残基に作用するペプチダーゼに対する抵抗性を付与するための別の有効な手法は、改変ポリペプチドが最早ペプチダーゼの基質ではなくなるように、ポリペプチド末端に化学基を付加することである。1つのそのような化学的改変は、いずれかの末端、又は両方の末端でのポリペプチドのグリコシル化である。特定の化学的改変、特に、N末端グリコシル化は、ヒト血清中でのポリペプチドの安定性を増加させることが示された（Powellら、Pharm. Res. 10:1268-1273, 1993）。血清安定性を増強する他の化学的改変としては、限定されるものではないが、アセチル基などの1〜20個の炭素の低級アルキルからなるN末端アルキル基の付加、及び／又はC末端アミド若しくは置換アミド基の付加が挙げられる。特に、本発明は、N末端アセチル基及び／又はC末端アミド基を担持するポリペプチドからなる改変ポリペプチドを含む。
【０１０７】
また、誘導体がポリペプチドの所望の機能的活性を保持するという条件で、通常はポリペプチドの一部ではないさらなる化学部分を含む他の型のポリペプチド誘導体も本発明に含まれる。そのような誘導体の例としては、（1）アミノ末端若しくは別の遊離アミノ基のN-アシル誘導体（ここで、アシル基はアルカノイル基（例えば、アセチル、ヘキサノイル、オクタノイル）、アロイル基（例えば、ベンゾイル）若しくはF-moc（フルオレニルメチル-O-CO-）などのブロッキング基であってよい）；（2）カルボキシ末端又は別の遊離カルボキシ若しくはヒドロキシル基のエステル；（3）アンモニア若しくは好適なアミンとの反応により産生されたカルボキシ末端若しくは別の遊離カルボキシル基のアミド；（4）リン酸化誘導体；（5）抗体又は他の生物学的リガンドとコンジュゲートした誘導体、及び他の種の誘導体、が挙げられる。
【０１０８】
本明細書に記載のポリペプチドへの追加アミノ酸残基の付加の結果生じるより長いポリペプチド配列も、本発明に包含される。そのようなより長いポリペプチド配列は、上記のポリペプチドと同じ生物活性及び特異性（例えば、細胞指向性）を有すると期待することができる。実質的な数の追加アミノ酸を有するポリペプチドは除外されないが、いくつかの大きいポリペプチドは有効な配列を隠す配置をとり、それによって標的（例えば、LRP受容体ファミリーのメンバー）への結合を阻害し得ると認識されている。これらの誘導体は競合的アンタゴニストとして作用し得る。かくして、本発明はポリペプチド又は伸長を有する本明細書に記載のポリペプチドの誘導体を包含するが、この伸長は化合物の細胞標的化活性又は酵素活性を破壊しないのが望ましい。
【０１０９】
本発明に含まれる他の誘導体は、短いストレッチのアラニン残基又はタンパク質溶解のための推定部位などにより（例えば、カテプシンによる、例えば、米国特許第5,126,249号及び欧州特許第495 049号を参照されたい）、直接的に、又はスペーサーを介して互いに共有結合した、本明細書に記載のような、2個の同じか、又は2個の異なるポリペプチドからなる二重ポリペプチドである。本明細書に記載のポリペプチドの多量体は、同じか、又は異なるポリペプチド又はその誘導体から形成された分子のポリマーからなる。
【０１１０】
本発明はまた、そのアミノ若しくはカルボキシ末端、又はその両方で、異なるタンパク質のアミノ酸配列に連結された、本明細書に記載のポリペプチド、又はその断片を含むキメラ又は融合タンパク質であるポリペプチド誘導体も包含する。そのようなキメラ又は融合タンパク質を、該タンパク質をコードする核酸の組換え発現により製造することができる。例えば、キメラ又は融合タンパク質は、等価な、又はより高い機能的活性を有するキメラ又は融合タンパク質をもたらすことが望ましい1個の記載のポリペプチドと共有される少なくとも6個のアミノ酸を含んでもよい。
【０１１１】
ペプチド模倣物質を同定するためのアッセイ
上記のように、本明細書に記載のポリペプチドの主鎖形状及びファーマコフォア展示を複製するために作製された非ペプチジル化合物（ペプチド模倣物質）は、より高い代謝安定性、より高い効力、より長い作用期間、及びより良好な生体利用能の特性を有することが多い。
【０１１２】
ペプチド模倣化合物を、生物ライブラリー、空間的にアドレス指定可能な平行固相若しくは液相ライブラリー、解析を要する合成ライブラリー方法、「1ビーズ1化合物」ライブラリー方法、及びアフィニティクロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法などの、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー方法におけるいくつかの手法のいずれかを用いて取得することができる。生物ライブラリー手法はペプチドライブラリーに限られるが、他の4つの手法はペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の小分子ライブラリーにも適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des. 12:145, 1997）。分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当技術分野で、例えば、DeWittら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909, 1993）；Erbら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422, 1994）；Zuckermannら（J. Med. Chem. 37:2678, 1994）；Choら（Science 261:1303, 1993）；Carellら（Angew. Chem, Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994及び同書、2061）；及びGallopら（Med. Chem. 37:1233, 1994）に見出すことができる。化合物のライブラリーを、溶液中（例えば、Houghten, Biotechniques 13:412-421, 1992）又はビーズ（Lam, Nature 354:82-84, 1991）、チップ（Fodor, Nature 364:555-556, 1993）、細菌若しくは胞子（米国特許第5,223,409号）、プラスミド（Cullら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869, 1992）上若しくはファージ（Scott及びSmith, Science 249:386-390, 1990）上、又はルシフェラーゼ上で提供し、酵素標識を好適な基質の生成物への変換の決定により検出することができる。
【０１１３】
本明細書に記載のポリペプチドを同定した後は、限定されるものではないが、溶解度の差（例えば、沈降）、遠心分離、クロマトグラフィー（例えば、アフィニティ、イオン交換、及びサイズ排除）などの任意の数の標準的な方法、又はペプチド、ペプチド模倣物質、若しくはタンパク質の精製のために用いられる任意の他の標準的な技術により単離及び精製することができる。同定された目的のポリペプチドの機能特性を、当技術分野で公知の任意の機能アッセイを用いて評価することができる。細胞内シグナル伝達における下流の受容体機能を評価するためのアッセイを用いるのが望ましい（例えば、細胞増殖）。
【０１１４】
例えば、本発明のペプチド模倣化合物を、以下の3段階プロセス：（1）本明細書に記載のポリペプチドを走査して、本明細書に記載の特定の細胞型に標的化するのに必要な二次構造の領域を同定すること；（2）コンフォメーションが制限されたジペプチド代理物を用いて、主鎖形状を改良し、これらの代理物に対応する有機プラットフォームを提供すること；及び（3）最良の有機プラットフォームを用いて、天然ポリペプチドの所望の活性を模倣するように設計された候補のライブラリー中の有機ファーマコフォアを展示すること、を用いて取得することができる。より詳しくは、この3段階は以下の通りである。段階1においては、リード候補ポリペプチドを走査し、その構造を短縮して、その活性のための要件を同定する。一連の元のポリペプチド類似体を合成する。段階2においては、最良のポリペプチド類似体を、コンフォメーションが制限されたジペプチド代理物を用いて調査する。ヨードリジジン-2-オン、ヨードリジジン-9-オン及びキノリジジノンアミノ酸（それぞれ、I2aa、I9aa及びQaa）を、最良のペプチド候補の主鎖形状を研究するためのプラットフォームとして用いる。これらの、及び関連するプラットフォーム（Halabら、Biopolymers 55:101-122, 2000及びHanessianら、Tetrahedron 53:12789-12854, 1997に概説されている）を、ポリペプチドの特定の領域に導入して、異なる向きのファーマコフォアの方向を合わせることができる。これらの類似体の生物学的評価により、活性のための形状要件を模倣する改良されたリードポリペプチドを同定する。段階3においては、最も活性の高いリードポリペプチドに由来するプラットフォームを用いて、天然ペプチドの活性を担うファーマコフォアの有機代理物を展示する。このファーマコフォアと足場を、平行合成形式で混合する。ポリペプチドの誘導及び上記段階を、当技術分野で公知の方法を用いる他の手段により達成することができる。
【０１１５】
前記ポリペプチド、ポリペプチド誘導体、ペプチド模倣物質又は本明細書に記載の他の小分子から決定された構造機能相関を用いて、類似するか、又はより良好な特性を有する類似体分子構造をリファインし、調製することができる。従って、本発明の化合物はまた、本明細書に記載のポリペプチドの構造、極性、電荷特性及び側鎖特性を共有する分子も含む。
【０１１６】
まとめると、本明細書の開示に基づいて、当業者であれば、薬剤を特定の細胞型（例えば、本明細書に記載のもの）に対して標的化するための化合物を同定するのに有用であるペプチド及びペプチド模倣物質スクリーニングアッセイを開発することができる。本発明のアッセイを、低スループット、高スループット、又は超高スループットスクリーニング形式のために開発することができる。本発明のアッセイは、自動化に従うアッセイを含む。
【０１１７】
リンカー
リソソーム酵素（例えばIDS）、酵素断片又は酵素類似体を、ターゲティング部分に直接的に（例えば、ペプチド結合などの共有結合を介して）結合してもよいし、又はリンカーを介して結合することもできる。リンカーとしては、化学的連結剤（例えば、切断可能なリンカー）及びペプチドが挙げられる。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、リンカーは化学的連結剤である。リソソーム酵素（例えばIDS）、酵素断片又は酵素類似体とターゲティング部分を、スルフヒドリル基、アミノ基（アミン）、及び／若しくは炭水化物又は任意の好適な反応基を介してコンジュゲートさせることができる。ホモ二官能性及びヘテロ二官能性架橋剤（コンジュゲーション剤）が、多くの商業的起源から利用可能である。架橋連結に利用可能な領域を、本発明のポリペプチド上に見出すことができる。架橋剤は、可撓性アーム、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個の炭素原子を含んでもよい。架橋剤の例としては、BS3（[ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート]；BS3は、接近可能な一級アミンを標的化するホモ二官能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステルである）、NHS/EDC（N-ヒドロキシスクシンイミドとN-エチル-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド；NHS/EDCは一級アミン基とカルボキシル基とのコンジュゲーションを可能にする）、スルホ-EMCS（[N-e-マレイミドカプロン酸]ヒドラジド；スルホ-EMCSは、スルフヒドリル基及びアミノ基に対して反応するヘテロ二官能性反応基(マレイミド及びNHS-エステル)である）、ヒドラジド（多くのタンパク質は露出した炭水化物を含み、ヒドラジドは一級アミンにカルボキシル基を連結するための有用な試薬である）、並びにSATA（N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート；SATAは、アミンと反応し、保護されたスルフヒドリル基を付加する）が挙げられる。
【０１１９】
共有結合を形成するために、化学反応基として、ヒドロキシル部分が、ペプチドを改変するのに必要なレベルで生理学的に許容し得る、様々な活性カルボキシル基（例えば、エステル）を用いることができる。具体的な薬剤としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、N-ヒドロキシ-スルホスクシンイミド（スルホ-NHS）、マレイミド-ベンゾイル-スクシンイミド（MBS）、γ-マレイミド-ブチリルオキシスクシンイミドエステル（GMBS）、マレイミドプロピオン酸（MPA）、マレイミドヘキサン酸（MHA）、及びマレイミドウンデカン酸（MUA）が挙げられる。
【０１２０】
一級アミンは、NHSエステルのための主要な標的である。タンパク質のN末端上に存在する接近可能なα-アミン基及びリジンのε-アミンはNHSエステルと反応する。NHSエステルコンジュゲーション反応物が一級アミンと反応する時にアミド結合が形成され、N-ヒドロキシスクシンイミドを遊離する。これらのスクシンイミドを含有する反応基を、本明細書ではスクシンイミジル基と呼ぶ。本発明の特定の実施形態において、タンパク質上の官能基はチオール基であり、化学反応基はγ-マレイミド-ブチリルアミド（GMBA若しくはMPA）などのマレイミド含有基であろう。そのようなマレイミド含有基を、本明細書ではマレイド基と呼ぶ。
【０１２１】
マレイミド基は、反応混合物のpHが6.5〜7.4である場合、ペプチド上のスルフヒドリル基に対して最も選択的である。pH 7.0では、マレイミド基とスルフヒドリル（例えば、血清アルブミン又はIgGなどのタンパク質上のチオール基）との反応速度は、アミンとの反応速度よりも1000倍速い。かくして、マレイミド基とスルフヒドリルとの間に安定なチオエーテル結合を形成させることができる。
【０１２２】
他の実施形態において、リンカーは、少なくとも1個のアミノ酸（例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、40又は50個のアミノ酸のペプチド）を含む。特定の実施形態において、リンカーは1個のアミノ酸（例えば、Cysなどの任意の天然アミノ酸）である。他の実施形態において、米国特許第7,271,149号に記載のような、配列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n（式中、nは1、2、3、4、5又は6である）を有するペプチドなどのグリシン-リッチペプチドを用いる。他の実施形態において、米国特許第5,525,491号に記載のような、セリン-リッチペプチドリンカーを用いる。セリンリッチペプチドリンカーとしては、式[X-X-X-X-Gly]y（式中、Xのうち最大2個はThrであり、残りのXはSerであり、yは1〜5である）のもの（例えば、Ser-Ser-Ser-Ser-Gly（式中、yは2以上である））が挙げられる。いくつかの事例においては、リンカーは1個のアミノ酸（例えば、Gly又はCysなどの任意のアミノ酸）である。他のリンカーとしては、固定リンカー（例えば、PAPAP及び(PT)nP、ここでnは2、3、4、5、6又は7である）、並びにα-へリックスリンカー（例えば、A(EAAAK)nA、ここでnは1、2、3、4又は5である）が挙げられる。
【０１２３】
好適なリンカーの例は、コハク酸、Lys、Glu、及びAsp、又はGly-Lysなどのジペプチドである。リンカーがコハク酸である場合、その1個のカルボキシル基は、アミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成し、その他のカルボキシル基は、例えば、ペプチド又は置換基のアミノ基とアミド結合を形成することができる。リンカーがLys、Glu、又はAspである場合、そのカルボキシル基はアミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成し、そのアミノ基は、例えば、置換基のカルボキシル基とアミド結合を形成することができる。Lysをリンカーとして用いる場合、さらなるリンカーを、Lysのε-アミノ基と置換基との間に挿入することができる。1つの特定の実施形態において、さらなるリンカーは、例えば、Lysのε-アミノ基と、及び置換基に存在するアミノ基と、アミド結合を形成するコハク酸である。一実施形態において、さらなるリンカーは、Glu又はAsp（例えば、Lysのε-アミノ基とアミド結合を形成し、置換基に存在するカルボキシル基と別のアミド結合を形成する）である、すなわち、置換基はNε-アシル化リジン残基である。
【０１２４】
クリックケミストリーリンカー
特定の実施形態において、リンカーは、クリックケミストリー反応対の間の反応によって形成される。クリックケミストリー反応対とは、高収量及び高熱力学利益のモジュラー反応に関与し、それによりクリックケミストリーリンカーを生成する反応基の対を意味する。この実施形態において、その反応基の一方を酵素部分に結合し、他方の反応基をポリペプチドに結合する。反応及びクリックケミストリー対の例としては、トリアゾール含有リンカーを形成する、アルキニル基とアジド基との間のヒュスゲン1,3-双極性環化付加反応；4π電子系を有するジエン（例えば、場合により置換されていてもよい1,3-不飽和化合物、例として場合により置換されていてもよい1,3-ブタジエン、1-メトキシ-3-トリメチルシリルオキシ-1,3-ブタジエン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン又はフランなど）と2π電子系を有する親ジエン体（dienophile）又はヘテロ親ジエン体（heterodienophile）（例えば、場合により置換されていてもよいアルケニル基又は場合により置換されていてもよいアルキニル基）との間のディールス・アルダー反応；求核試薬及び歪み（strained）ヘテロシクリル求電子試薬による開環反応；ホスホロチオエート基及びヨード基によるスプリントライゲーション（splint ligation）反応；並びにアルデヒド基及びアミノ基による還元的アミノ化反応が挙げられる（Kolb et al., Angew. Chem. Int. Ed., 40:2004-2021 (2001)；Van der Eycken et al., QSAR Comb. Sci., 26:1115-1326 (2007)）。
【０１２５】
本発明の特定の実施形態において、ポリペプチドは、アルキニル基とアジド基のクリックケミストリー対の間の反応により形成されたトリアゾール含有リンカーによって酵素部分に連結される。このような場合、アジド基はポリペプチドに結合され、アルキニル基は酵素部分に結合される。あるいは、アジド基が酵素部分に結合され、アルキニル基がポリペプチドに結合される。特定の実施形態において、アジド基とアルキニル基との反応は触媒されず、他の実施形態において、この反応は、銅(I)触媒（例えばヨウ化銅(I)）、還元剤の存在下における銅(II)触媒（例えば、アスコルビン酸ナトリウムと共に硫酸銅(II)若しくは酢酸銅(II)）又はルテニウム含有触媒（例えば、Cp*RuCl(PPh3)2若しくはCp*RuCl(COD)）により触媒される。
【０１２６】
リンカーの例としては、モノフルオロシクロオクチン（MFCO）、ジフルオロシクロオクチン（DFCO）、シクロオクチン（OCT）、ジベンゾシクロオクチン（DIBO）、ビアリールアザシクロオクチン（BARAC）、ジフルオロベンゾシクロオクチン（DIFBO）、及びビシクロ[6.1.0]ノニン（BCN）が挙げられる。
【０１２７】
リソソーム蓄積症の治療（処置）
本発明はまた、リソソーム蓄積症、例えばMPS-IIの治療方法に関する。MPS-IIは、グリコサミノグリカン（GAG）の細胞蓄積（個体がこれらの産物を分解する能力がないことによって生じる）を特徴とする。
【０１２８】
特定の実施形態において、治療（処置）は、IDS遺伝子に変異を有すると診断されたが、まだ疾患症候はない被験体（例えば、乳幼児又は2歳未満の被験体）に対して行う。他の実施形態において、治療（処置）は、少なくとも1つのMPS-II症候（例えば、本明細書に記載した症候のいずれか）を有する個体に対して行う。
【０１２９】
MPS-IIは一般的に2つの一般群、すなわち重篤疾患及び減衰（attenuated）疾患に分類される。本発明は、いずれの種類の疾患を有する被験体の治療も含む。重篤疾患は、CNSの関与を特徴とする。重篤疾患では、通常、気道及び心臓疾患を伴う認識低下によって成人前の死に至る。減衰形態の疾患は全般に、CNSの関与がないか又は最小限にすぎない。重篤及び減衰疾患の両方において、非CNS症候は「重篤」形態のものと同程度に重篤でありうる。
【０１３０】
初期MPS-II症候は、約18カ月齢から約5歳で現れ始め、腹部ヘルニア、耳感染、鼻水及び風邪がある。症候としては、粗大化顔貌（例えば、前額突出、鞍鼻及び舌肥大）、大きな頭部（大頭）、腹部腫脹、例えば肥大肝（肝腫大）及び肥大した脾臓（脾腫）等、並びに難聴が挙げられる。本発明の方法は、本明細書に記載した症候のいずれかを有する被験体の治療を含みうる。MPS-IIはまた、骨の肥厚に関連した関節異常を生じる。
【０１３１】
治療（処置）は、任意の年齢、乳幼児から始まり成人までの被験体に行うことができる。被験体は、出生時、6ヵ月齢又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15若しくは18歳に治療を開始することができる。
【０１３２】
投与及び用量
本発明はまた、治療上有効な量の本発明の化合物を含む医薬組成物を特徴とする。本組成物を、様々な薬剤送達系における使用のために製剤化することができる。1種以上の生理学的に許容される賦形剤又は担体を、適切な製剤のために本組成物中に含有させることもできる。本発明における使用のための好適な製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 第17版、1985に見出される。薬剤送達のための方法の簡単な概説については、例えば、Langer（Science 249:1527-1533, 1990）を参照されたい。
【０１３３】
医薬組成物は、予防的及び／又は治療的処置のための、非経口、鼻内、局所、経口、又は経皮手段などによる局所投与のために意図される。医薬組成物を、非経口的に（例えば、静脈内、筋肉内、若しくは皮下注射）、又は経口摂取によるか、又は血管症状若しくは癌症状に罹患した領域での局所適用若しくは関節内注入により投与することができる。さらなる投与経路としては、血管内、動脈内、腫瘍内、腹腔内、心室内、硬膜内、並びに鼻、眼、強膜内、眼窩内、直腸、局所、若しくはエアロゾル吸入投与が挙げられる。デポー注射又は浸食性埋込み物若しくは成分などの手段による、持続放出投与も本発明に特に含まれる。かくして、本発明は、許容される担体、好ましくは、水性担体、例えば、水、緩衝化水、生理食塩水、PBSなどに溶解又は懸濁した上記薬剤を含む非経口投与のための組成物を提供する。前記組成物は、pH調節剤及び緩衝化剤、等張性調節剤、湿潤剤、界面活性剤などの生理学的条件を近似するように必要な製薬上許容される補助物質を含んでもよい。本発明はまた、錠剤、カプセル剤などの製剤化のための結合剤又は充填剤などの不活性成分を含んでもよい、経口送達のための組成物も提供する。さらに、本発明は、クリーム、軟膏などの製剤化のための溶媒又は乳化剤などの不活性成分を含んでもよい局所投与のための組成物を提供する。
【０１３４】
これらの組成物を、従来の滅菌技術により滅菌するか、又は滅菌濾過することができる。得られる水性溶液を、使用のために充填するか、又は凍結乾燥し、凍結乾燥調製物を投与前に滅菌水性担体と混合することができる。調製物のpHは、典型的には、3〜11、より好ましくは5〜9又は6〜8、最も好ましくは7〜8、例えば、7〜7.5であろう。固体形態の得られる組成物を、それぞれ固定量の上記薬剤（1又は複数）を含む複数の単回用量単位中、例えば、錠剤又はカプセル剤の密閉包装中に充填することができる。固体形態の前記組成物を、局所適用可能なクリーム又は軟膏のために設計された絞れるチューブなどの、自在量のための容器中に充填することもできる。
【０１３５】
有効量を含む組成物を、予防的又は治療的処置のために投与することができる。予防的適用においては、組成物を、リソソーム蓄積症に関連した変異（例えばIDS遺伝子における変異）を有すると診断された被験体に投与することができる。本発明の組成物を、被験体（例えば、ヒト）に、上記障害の発症を遅延させる、減少させる、又は好ましくは防止するのに十分な量で投与することができる。治療的適用においては、リソソーム蓄積症（例えばMPS-II）に既に罹患している被験体（例えば、ヒト）に、その障害及びその合併症の症候を治癒するか、又は少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与する。この目的を達成するのに十分な量を、「治療上有効な量」、疾患又は医学的症状に関連する少なくとも1つの症候を実質的に改善するのに十分な量と定義する。例えば、リソソーム蓄積症の治療においては、前記疾患又は症状の任意の症候を減少させ、防止し、遅延させ、抑制するか、又は停止させる薬剤又は化合物は治療上有効であろう。薬剤若しくは化合物の治療上有効な量は、疾患若しくは症状を治癒させるのに必要ではないが、疾患若しくは症状の開始を遅延させる、妨害するか、若しくは防止するか、又は疾患若しくは症状の症候が改善するか、又は疾患若しくは症状の期間が変化するか、又は例えば、個体における重篤度が低いか、又は回復が加速されるような、疾患若しくは症状のための治療を提供するであろう。
【０１３６】
この使用にとって有効な量は、疾患若しくは症状の重篤度及び被験体の体重及び全身状態に依存し得る。イデュルスルファーゼは、0.5mg/kgの毎週の静脈内投与が推奨される。本発明の化合物は、例えば同等の投与量（すなわち、イデュルスルファーゼに対する融合タンパク質の追加の分子量を考慮して）及び頻度で投与しうる。化合物は、イズロン酸（iduronase）等量で、例えば、0.01、0.05、0.1、0.5、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0又は5mg/kgを、毎週、週に2回、一日おき、毎日又は1日2回で投与することができる。哺乳動物（例えば、ヒト）に適用される本発明の方法において用いられる本発明の組成物の治療上有効な量を、当業者であれば、哺乳動物の年齢、体重、及び症状における個々の差異を考慮して決定することができる。本発明の特定の化合物はBBBを通過しリソソームに侵入する高い能力を示すため、本発明の化合物の用量は、コンジュゲート化されていない薬剤の治療効果のために必要な相当する用量よりも低いものであってよい（例えば、約90％、75％、50％、40％、30％、20％、15％、12％、10％、8％、7％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、又は0.1％に等しい又はそれ未満）。治療される被験体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）において望ましい結果（例えば、GAG蓄積の低減）をもたらす量である有効量の本発明の薬剤を、該被験体に投与する。当業者であれば、治療上有効な量を経験的に決定することもできる。
【０１３７】
有効量を含む本発明の組成物の単回又は複数回投与を、治療する医師により選択される用量レベル及びパターンで実行することができる。用量及び投与スケジュールを、被験体における疾患又は症状の重篤度に基づいて決定及び調整し、臨床医により一般的に実施されるか、又は本明細書に記載の方法に従う治療過程を通してモニターすることができる。
【０１３８】
本発明の化合物を、従来の治療方法若しくは療法と共に用いるか、又は従来の治療方法若しくは療法とは別々に用いることができる。
【０１３９】
本発明の化合物を他の薬剤との組合せ療法において投与する場合、それらを個体に対して連続的に、又は同時に投与することができる。あるいは、本発明に係る医薬組成物は、本明細書に記載のような製薬上許容される賦形剤、及び当技術分野で公知の別の治療薬若しくは予防剤と共に、本発明の化合物の組合せを含んでもよい。
【実施例】
【０１４０】
以下の実施例は、本発明を例示する目的であり、本発明を限定するものではない。
【０１４１】
[実施例1]
IDS-Angiopep-2融合タンパク質の設計
一連のIDS-Angiopep-2構築物を設計した。IDS cDNAはOrigeneより入手した（Cat. No. RC219187）。3つの基本構成物を用いた:N末端融合物（An2-IDS及びAn2-IDS-His）、C末端融合物（IDS-An2及びIDS-An2-His）、並びにN及びC末端融合物（An2-IDS-An2及びAn2-IDS-An2-His）、いずれも8xHisタグ有り及び無し（図1）。Angiopep-2無しの対照も作製した（IDS及びIDS-His）。
【０１４２】
[実施例2]
CHO-S細胞における組換えhIDSタンパク質の発現及び活性
次に、これら構築物を、懸濁液中で培養したCHO-S細胞内で発現させた。直鎖25kDaポリエチレンイミン（PEI、Polyscience）をトランスフェクション試薬として用いて、一過性トランスフェクションによりFreeStyle CHO-S細胞（Invitrogen）内でIDS構築物を発現させた。一例において、DNA（1mg）を70mlのFreeStyle CHO発現培地（Invitrogen）と混合し、室温で15分間インキュベートした。別にPEI（2mg）を70mlの培地中で15分間インキュベートし、その後DNA及びPEI溶液を混合し、さらに15分間インキュベートした。DNA/PEI複合体混合物を、CHO-S細胞1×109個を含有する360mlの培地に添加した。適度の撹拌を伴う37℃、8％CO2での4時間のインキュベーション後、500mlの温かい培地を添加した。CHO-S細胞を回収前に、同じ条件で5日間さらにインキュベートした。
【０１４３】
細胞がIDS又はIDS融合タンパク質を発現し分泌しているかどうかを判定するため、抗IDS抗体を用いたウエスタンブロッティングを培養培地上で実施した。図2からわかるように、IDS-His、An2-IDS-His及びIDS-An2-Hisの発現レベルは同様であった。このように、細胞はこれらタンパク質を発現させることができた。
【０１４４】
また、培地中のIDS活性を特性決定した。このアッセイは、2ステップ酵素的アッセイを用いて実施した（図3）。このアッセイは、水中の4-メチルウンベリフェリル-α-L-イズロニド-2-スルフェートをIDSで4時間処理し、4-メチルウンベリフェリル-α-L-イズロニド及びスルフェートを生成することを伴う。第2ステップでは、これらの産物を過剰量のα-L-イズロニダーゼ（IDUA）で24時間処理し、α-L-イズロン酸及び4-メチルウンベリフェロンを生成した。4-メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより、活性を判定した（365nm励起;450nm発光）。
【０１４５】
特定の一例において、このアッセイは以下のとおり実施された。CHO-Sトランスフェクト細胞からの培地10μlを、酢酸バッファー、pH5.0中の20μlの1.25mM 4-メチルウンベリフェリル-α-L-イズロニド-2-スルフェート（Moscerdam Substratesより入手したIDS基質）と混合し、4時間、37℃でインキュベートした。次に、20μlの0.2M Na2HPO4/0.1Mクエン酸バッファー、pH4.5及びウシ精巣から精製されたリソソーム酵素（LEBT）10μlを添加することにより、アッセイの第2ステップを開始した。37℃で24時間後、0.025％ Triton X-100を含有する200μlの0.5M NaHCO3/Na2CO3バッファー、pH10.7で反応を停止した。4-メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより、活性を判定した（365nm励起;450nm発光）。
【０１４６】
懸濁液中で培養したCHO-S細胞のIDS活性の測定値を図4に示し、3つのタンパク質（IDS-His、An2-IDS-His、及びIDS-AN2-His）すべてがIDS活性を有することが示された。
【０１４７】
[実施例3]
発現の特性決定及び最適化
さらに発現を特性決定するため、図5A及び図5Bに示すように、懸濁液中で培養したCHO-S細胞におけるIDS発現及び活性の時間経過評価をIDS-His及びIDS-An2-His融合タンパク質について測定した。これらのデータから、最大IDS発現及び活性は、トランスフェクションの5日後に観察された。これらの実験において、CHO-S細胞によるIDS-An2-Hisの再捕捉は観察されなかった。
【０１４８】
さらにトランスフェクション条件を最適化するため、2つの異なる数の細胞（細胞1.25×107個又は細胞2.5×107個）を用いてトランスフェクションを実施した。DNAとポリエチレンイミン（PEI）との3つの異なる比を用いた（1:1、1:2、1:3、及び1:4）。
【０１４９】
これらの実験から、IDS活性（図5A）及び発現解析（図5B）に示されるように、1:2のDNA:PEI比を用いて最善の結果が得られた。
【０１５０】
[実施例4]
MPS-II線維芽細胞におけるIDS活性
発現タンパク質が細胞中のGAG蓄積を減少させることができるかどうかを判定するため、MPS-II患者から採取された線維芽細胞を用いた。実験の第1セットにおいて、様々なIDS及びIDS融合タンパク質がトランスフェクトされた上述のCHO-S細胞からの細胞培養培地を、線維芽細胞と共にインキュベートした。35S-GAGの存在に基づきGAG蓄積を測定した。図6Aに示されるように、融合タンパク質を用いたGAGの減少は、IDS自体を用いた場合と同様であった。
【０１５１】
これらのアッセイを以下のとおり実施した。MPS II（Coriell institute、GM00298）、又は健常ヒト線維芽細胞（GM05659）を、10％ウシ胎児血清（FBS）を有するDMEM中に細胞250,000個/ウェルで6ウェル皿にプレートし、37℃、5％CO2下で培養した。4日後、細胞をPBSで1回、低スルフェートF-12培地（Invitrogen、catalog # 11765-054）で1回洗浄した。10％透析FBS（Sigma、catalog # F0392）及び10μCi 35S-硫酸ナトリウムを含有する1mlの低スルフェートF-12培地を、組換えIDSタンパク質の不在又は存在下で細胞に添加した。線維芽細胞を37℃、5％CO2下でインキュベートした。48時間後、培地を除去し、細胞をPBSで5回洗浄した。細胞を0.4ml/ウェルの1N NaOH中に溶解し、60℃で60分間加熱し、タンパク質を可溶化した。μBCAタンパク質アッセイのため、アリコートを取り出した。放射活性を液体シンチレーションカウンタで計数した。データをタンパク質1μg当たりの35S CPMとして表す。
【０１５２】
なお一層有望な結果が精製IDS-An2-hisで得られ、それはGAG蓄積を正常ヒト線維芽細胞において測定された正常な対照値まで減少させることが可能だった（図6B）。これらの結果は、本発明の精製融合タンパク質が活性であることを示す。要約すれば、MPS-II線維芽細胞でのこれらデータは、融合タンパク質が活性であり、リソソームに到達して、そこでグリコサミノグリカン（glycoaminoglycans）を切断できることを示す。
【０１５３】
最後に、ウエスタンブロットは、正常及びMPS-II線維芽細胞において、LRP-1が同レベルで発現していることを示す（データは示さず）。
【０１５４】
[実施例5]
クリックケミストリーリンカー
一例において、ターゲティング部分をクリックケミストリーリンカーを介してリソソーム酵素に連結する。このケミストリーの一例を下に示す。
【化１５】
2015505824.tif 000022
【０１５５】
このアプローチは、反応がアジド部分とアルキン部分との間でのみ生じるので、非常に選択的である点で有利である。この反応はまた、水溶液中で生じ、生体適合性であり、生細胞中で実施できる。加えて、反応は急速で定量的であり、希釈液中でのナノモル単位のコンジュゲートの調製を可能にする。最後に、この反応はpH非感受性であるので、pH4〜11のどのpHでも実施できる。本発明で使用する具体的なクリックケミストリーリンカーは、実施例8及び9で論じる。
【０１５６】
[実施例6]
SATA化学結合
別の一例において、ターゲティング部分をSATA化学リンカーを介してリソソーム酵素に連結する。かかるコンジュゲートを生成するための典型的スキームを下に示す。
【化１６】
2015505824.tif 000023
【０１５７】
[実施例7]
他の化学的コンジュゲーション方法
別の一例において、化学的コンジュゲーションは、ヒドラジドリンカーを介して達成される。かかるコンジュゲートの生成のための典型的スキームは以下のとおりである。
【化１７】
2015505824.tif 000024
【０１５８】
別の一例において、化学的コンジュゲーションは、糖部分（例えばグリコシル化部位）を介して過ヨウ素酸で酸化された酵素をヒドラジド誘導体と共に用いて達成される。保護されたプロピオニルヒドラジドを用いるこのアプローチの一例を下に示す。
【化１８】
2015505824.tif 000025
【０１５９】
このアプローチの別の一例を下に示す。
【化１９】
2015505824.tif 000026
【０１６０】
[実施例8]
クリックケミストリーによるIDSのAn2とのコンジュゲーション方法
可能なコンジュゲーション部位、すなわちリジン及びN末端残基を強調表示したイズロネート-2-スルフェートのアミノ酸配列。
【化２０】
2015505824.tif 000027
【０１６１】
化合物の構造
Angiopep2配列
【化２１】
2015505824.tif 000028
【０１６２】
アジド-An2（N末端）
N末端アジド基を有するアジドブチリル-An2（アジド-An2）の構造を下に示す。この化合物は標準的な固相合成法により作製した。
【化２２】
2015505824.tif 000029
【０１６３】
An2-アジド（C末端）
C末端アジド基を有するAn2-[Lys20-N3]（AN2-アジド）の構造を下に示す。この化合物は標準的な固相合成法により作製した。
【化２３】
2015505824.tif 000030
【０１６４】
スキーム構造:
BCNリンカー及びクリックケミストリーを用いたアジドブチリル-Angiopep-2のN末端でのコンジュゲーションを示すIDS-BCN-ブチリル-An2（70-56-1B及び70-56-2B）の構造を下に示す。
【化２４】
2015505824.tif 000031
【０１６５】
MFCOリンカー及びクリックケミストリーを用いたAngiopep-2-Lys20のC末端でのコンジュゲーションを示すAn2-[Lys20]-MFCO-IDS（70-66-1B）の構造を下に示す。
【化２５】
2015505824.tif 000032
【０１６６】
BCNリンカーを用いたAngiopep-2 Lys20のC末端でのコンジュゲーションを示すAn2-[Lys20]-BCN-IDS（68-32-2）の構造を下に示す。
【化２６】
2015505824.tif 000033
【０１６７】
70-56-1B及び70-56-2Bの合成スキーム
【化２７】
2015505824.tif 000034
【０１６８】
ステップ:1-IDSリジンの修飾
BCN:ビシクロ[6.1.0]ノニン
70-56-1Aの合成
pH約7.6のリン酸バッファー20mM中の（7.24mg、95nmole）のIDS（1）に、380nmole（4当量）のBCN-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（2）（以下のとおり調製されたストック溶液から:1000μlの無水DMSO中に5.82mgを溶解）を、室温で5時間、時折手で振盪しながら添加した。修飾IDS 3a、70-56-1Aを、HiPrep 26/10脱塩カラムを用いて、5mL/分で、リン酸バッファー20mM pH7.6でゲル濾過により過剰量の試薬から精製した。収集された画分を、Amicon ultra遠心式フィルタ（リミット10kDa、3000rpm）により3.8mLまで濃縮した（6.5mg、収率90％）。修飾IDS 70-56-1A（3a）を回収し、アジドAn2（N末端）（4）との次のコンジュゲーションステップに用いた。
【０１６９】
ステップ:2-修飾IDSのアジドAn2（N末端）とのコンジュゲーション
（70-56-1B）の合成
修飾IDS誘導体（3a）（6.5mg、85.2nmole）に、8当量のアジドAn2（N末端）（4）を添加した。溶液を手で振盪し、アルミホイルで包み、室温で一晩放置した。次に、pH7の20mM TRISを結合バッファーとして用い、一方でpH7.0の20mM TRIS及び500mM NaClを溶出バッファーとして用いて、コンジュゲート（5）をQセファロース1mLカラムにより精製した。コンジュゲートを単離し、Amicon ultra遠心式フィルタ（10kDaカットオフ、3000rpm）で5回、15mLで洗浄することにより、IDSバッファー（1×:137mM NaCl、17mM NaH2PO4、3mM Na2HPO4、pH約6）と交換し、2.5mLまで濃縮し、70-56-1Bを得た（6mg、収率83％）。
【０１７０】
70-56-2Aの合成
pH約7.6のリン酸バッファー20mM中の7.24mg（95nmole）のIDS（1）に、570nmole（6当量）のBCN-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（2）を、室温で5時間、時折手で振盪しながら添加した。活性化されたIDS 70-56-2B（3b）を、HiPrep 26/10脱塩カラムを用いて、5mL/分で、リン酸バッファー20mM pH7.6でゲル濾過により過剰量の試薬から精製した。収集された画分を、Amicon ultra遠心式フィルタ（10kDa、3000rpm）により3.5mLまで濃縮した（6.5mg、収率90％）。修飾IDS 3b、70-66-2Aを回収し、それをアジドAn2（N末端）（4）との次のコンジュゲーションステップに用いた。
【０１７１】
（70-56-2B）の合成
修飾IDS 3b、70-56-2A（6.5mg、85.2nmole）に、12当量のアジドAn2（N末端）（4）を添加した。溶液を手で振盪し、アルミホイルで包み、室温で一晩放置した。pH7の20mM TRISバッファーを結合バッファーとして用い、pH7.0の20mM TRIS及び500mM NaClを溶出バッファーとして用いて、コンジュゲート（5）をQセファロース1mLカラムにより精製した。コンジュゲートを単離し、Amicon ultra遠心式フィルタ（10kDaリミット、3000rpm）で5回、15mLで洗浄することにより、IDSバッファー（1×:137mM NaCl、17mM NaH2PO4、3mM Na2HPO4、pH約6）と交換し、3mLまで濃縮し、70-56-2Bを得た（6mg、83％）。
【０１７２】
70-66-1Bの合成スキーム
下に示す合成スキームは、MFCOリンカーのIDSへの結合及びAngiopep-2の末端リジンのアミノ基を介したAn2-[Lys20-N3]（アジドAn2）のMFCOリンカーへの結合を示す。
【０１７３】
70-66-1Bの合成スキーム
【化２８】
2015505824.tif 000035
【０１７４】
ステップ:1-IDSリジンの修飾
6、MFCO:モノフルオロシクロオクチン
70-66-1Aの合成
pH約7.6のリン酸バッファー20mM中の（10.6mg、139nmole）のIDS（1）に、1112nmole（8当量）のMFCO-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（6）（以下のとおり調製されたストック溶液から:1000μlの無水DMSO中に7.6mgを溶解）を添加し、時折手で振盪しながら室温で5時間放置した。修飾IDS 70-66-1A（7）を、HiPrep 26/10脱塩カラムを用いて、5mL/分で、pH7.6のリン酸バッファー20mMでゲル濾過により過剰量の試薬から精製した。収集された画分を、Amicon ultra遠心式フィルタ（10kDaリミット、3000rpm）により3mLまで濃縮した（9.4mg、収率89％）。修飾IDS（7）をアジドAn2（C末端）（8）との次のコンジュゲーションステップに用いた。
【０１７５】
ステップ:2-修飾IDSのアジドAn2（C末端）（An2-[Lys20-N3]）とのコンジュゲーション
（70-66-1B）の合成
修飾IDS誘導体（7）（6.1mg、80nmole）に、16当量のアジドAn2（C末端）（8）を添加した。溶液を手で振盪し、アルミホイルで包み、室温で一晩放置した。pH7の20mM TRISを結合バッファーとして用い、一方でpH7.0の20mM TRIS及び500mM NaClを溶出バッファーとして用いて、コンジュゲート（9）をQセファロース1mLカラムにより精製した。コンジュゲートを単離し、Amicon ultra遠心式フィルタ（10K mW、3000rpm）で5回、15mLで洗浄することにより、IDSバッファー（1×:137mM NaCl、17mM NaH2PO4、3mM Na2HPO4、pH約6）と交換し、2.5mLまで濃縮し、70-66-1Bを得た（6.1mg、100％）。
【０１７６】
68-32-2の合成スキーム
【化２９】
2015505824.tif 000036
【０１７７】
ステップ:1-IDSリジンの修飾
68-31-2の合成
pH約7.6のリン酸バッファー20mM中の（14.5mg、190nmole）のIDS（1）に、1520nmole（8当量）のBCN-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（2）（以下のとおり調製されたストック溶液から:1000μlの無水DMSOに5.82mgを溶解）を添加し、時折手で振盪しながら室温で5時間貯蔵した。修飾IDS（10）を、HiPrep 26/10脱塩カラムを用いて、5mL/分で、pH7のリン酸バッファー20mMでゲル濾過により過剰量の試薬から精製した。収集された画分を、Amicon ultra遠心式フィルタ（リミット10kDa、3000rpm）により4mLまで濃縮した（14.5mg、収率100％）。修飾IDSを回収し、アジドAn2（C末端）との次のコンジュゲーションステップに用いた。
【０１７８】
ステップ:2-修飾IDSのアジドAn2（C末端）（An2-[Lys20-N3]）とのコンジュゲーション
68-32-2の合成
修飾IDS誘導体（10）（11mg、144.2nmole）に、16当量のアジドAn2（C末端）を添加した。溶液を手で振盪し、アルミホイルで包み、室温で一晩放置した。pH7の20mM TRISを結合バッファーとして用い、一方でpH7.0の20mM TRIS及び500mM NaClを溶出バッファーとして用いて、コンジュゲート（11）をQセファロース1mLカラムにより精製した。コンジュゲートを単離し、Amicon ultra遠心式フィルタ（10K mW、3000rpm）で5回、15mLで洗浄することにより、IDSバッファー（1×:137mM NaCl、17mM NaH2PO4、3mM Na2HPO4、pH約6）と交換し、2.5mLまで濃縮し、68-32-2を得た（10mg、91％）。
【０１７９】
IDS酵素比活性のためのプロトコル（B-JR032-010-04より修正）
1）  標準物質中のタンパク質JR-032及びコンジュゲート）の濃度をマイクロBCAにより測定する。  
2）  試験溶液の調製:
JR-032及びコンジュゲートをTriton-X100を含有する希釈バッファー中で1/200に希釈する。  
3） 1mLの4-MUストック溶液（0.01mol/L）を、11.5mLのTriton-X100含有バッファー中で希釈することにより標準溶液を調製する（最終濃度800μmol/L）。  
4） 500μLの標準溶液800μmol/Lを、500μLのTriton X100含有バッファー中で希釈し、400μmol/Lの標準溶液とすることにより、標準溶液の段階希釈液を調製する。このプロセスを繰り返し、以下の希釈液を得る:800、400、200、100、50、25、12.5及び6.25μmol/L。  
5） 10μLずつ、ブランク溶液（Triton-X100を含有する希釈バッファー）をマイクロプレートの2つのウェル（n=2）に、標準溶液（6.25μmol/L〜800μmol/L）をマイクロプレートの2つのウェル（n=2）に、試料溶液をマイクロプレートの4つのウェルそれぞれ（n=4）に、各々分配する。  
6）  それぞれのウェルに、100μLの基質溶液（4-MUS）を添加し、穏やかに混合する。  
7）  プレートを覆い、37℃に調整されたインキュベータに載置する。  
8）  正確に60分後に、それぞれのウェルに190μLの停止溶液を添加し、混合して反応を停止させる。  
9）  プレートを蛍光プレートリーダー内にセットし、355nmの励起波長及び460nmの検出波長で蛍光強度を測定する。  
10）  試験間の比較が必要な場合には、参照物質について同じ測定を実施する。
【０１８０】
計算方法:
11）  試料溶液から産生する4-MUの濃度
試料溶液から産生する4-MUの濃度、Cu（μmol/L）を、以下の式を用いて決定する。
【数１】
2015505824.tif 000037
【０１８１】
w:4-MUの量（mg）（176.17:4-MUの分子量）
Cs:標準溶液中の濃度（μmol/L）
【数２】
2015505824.tif 000038
【０１８２】
Au:試料溶液の蛍光強度
As:標準溶液の蛍光強度。
【０１８３】
12）  試料溶液の比活性:以下の式を用いて、試料溶液の比活性、B（mU/mg）を決定する。
【数３】
2015505824.tif 000039
【０１８４】
C:脱塩被検物質の希釈係数
B:比活性（mU/mg）
P:脱塩被検物質中のタンパク質の濃度（mg/mL）。
【０１８５】
グリコサミノグリカン（GAG）蓄積アッセイのプロトコル
材料:
・II型MPS Hunter線維芽細胞（Coriell institute、GM00298）
・健常ヒト線維芽細胞（Coriell institute、GM05659）
・DMEM、ウシ胎児血清（FBS）
・低スルフェートHam's F-12培地（Invitrogen、catalog # 11765-054）
・0.15M NaCl、10000Da MWCOに対し透析されたFBS（Sigma、catalog # F0392）
・35S-硫酸ナトリウム（Perkin-Elmer、catalog # NEX041H002MC）。
【０１８６】
方法:
1. 10％ウシ胎児血清（FBS）を有するDMEM中に細胞250,000個/ウェルで6ウェル皿中のMPS II（GM00298）又は健常ヒト線維芽細胞（GM05659）
- 4日間培養する。  
2. -  培地を廃棄し、温かく無菌のPBSで細胞を洗浄する。  
- 10％透析FBS及び10μCi 35S-硫酸ナトリウムを有する1mL/ウェルの低スルフェートF-12培地を添加する。  
-  組換えIDSタンパク質を添加する。37℃、5％CO2で48時間インキュベートする。  
3. -  培地を廃棄し、冷たいPBSで細胞を洗浄する（1mL、5回洗浄）。  
- 0.4mL/ウェルの1N NaOH中で細胞を溶解する。  
- 60℃で60分間加熱し、タンパク質を可溶化する。  
-  μBCAタンパク質アッセイのため、アリコートを取り出す。  
4.  放射活性を液体シンチレーションカウンタで計数する。  
5.  μBCAタンパク質アッセイ。  
6.  データをタンパク質1μg当たりの35S CPMとして表す。
【０１８７】
in situ脳灌流のプロトコル
Dagenaisら、2000に記載のプロトコルから、実験室でin situ脳灌流法を確立した。簡潔に述べると、鎮静させたマウスに手術を実施し、ケタミン/キシラジン（140/8 mg/kg）を腹腔内（i.p.）注射した。右総頚動脈を露出させ、分岐のレベルで結紮した。次に、26ゲージ針にマウントされた生理食塩水/ヘパリン（25U/ml）溶液を充填したポリエチレンチューブ（0.30mm内径×0.70mm外径）を用いて、総頚動脈に吻方にカテーテル挿入した。研究対象分子を、実験前数日中にPierceから入手したiodo-Beadsを用いて125Iで放射性標識した。遊離ヨウ素をゲル濾過カラム上で除去し、続いて十分な透析を行った（カットオフ10kDa）。放射性標識されたタンパク質を、Bradfordアッセイ及び標準としてJR-032を用いて分量した。
【０１８８】
手術前、KREBS-重炭酸バッファー-9mMグルコースからなる灌流バッファーを調製し、37℃、pH7.4でインキュベートし、95％O2: 5％CO2で安定化させた。灌流バッファーに添加された放射性標識化合物を含むシリンジを、注入ポンプ（HarvardポンプPHD2000;Harvard apparatus）に載置し、カテーテルに接続した。灌流直前に心臓を切断し、脳を2分間、2.5ml/分の流速で灌流した。IDS及びAn2-IDSコンジュゲートの灌流はすべて、5nMの濃度で実施した。灌流後、脳をトレーサーを含まない溶液で短時間灌流し、血管を30秒間洗い流した。灌流の最後に、マウスをすぐ断頭して屠殺し、氷上で右半球を単離し、毛細血管除去（capillary depletion）にかける前にRinger/Hepesバッファー中でホモジナイズした。
【０１８９】
毛細血管除去
毛細血管除去法は、トレーサーの毛細血管への結合を除去することにより、脳実質への灌流分子の蓄積の測定を可能にする。毛細血管除去プロトコルは、Trigueroら、1990に記載の方法を採用した。デキストランの溶液（35％）を脳ホモジネートに添加し、17.5％の最終濃度を得た。手で十分混合した後、混合物を遠心分離した（10分間、10000rpm）。結果として得られたペレットは主に毛細血管を含有し、上清は脳実質に対応する。
【０１９０】
トレーサーシグナルの判定
ホモジネート、上清、ペレット及び灌流液のアリコートを採取し、放射性標識分子におけるその含有量を測定した。[125I]-試料を、Wizard 1470自動ガンマカウンター（Perkin-Elmer Inc、Woodbridge、ON）で計数した。放射性標識沈殿タンパク質画分を得るため、すべてのアリコートをTCAで沈殿させた。結果を、異なる脳区画について、容積分布（ml/100g/2分）で表す。
【０１９１】
[実施例9]
化合物のスクリーニング及び特性決定
スクリーニング
組換えイズロン酸-2-スルファターゼ（IDS）（JCR-032）を、リジン結合を介してAn2にコンジュゲートした。強調表示された潜在的な結合部位を有するIDSアミノ酸配列を、上の実施例8において提示した。これらのコンジュゲートは、IDSに対するAn2:リンカー、の様々な比を代表する。このコンジュゲーション方策で試験されたリンカーは、MFCO（モノフルオロシクロオクチン）、BCN（ビシクロノニン）、SATA（S-アセチルチオアセテート）、DBCO（ジベンジルシクロオクチン）、及びマレイミドを含むクリックケミストリーリンカーだった。すべての場合で、反応に添加されたAn2:リンカー物質の比は2:1であり、IDSに対し4倍、6倍、又は8倍のいずれかの過剰量のAn2を伴う。An2を、Q-セファロースカラムクロマトグラフィーにより反応産物から除去し、MALDI-TOF解析を用い、それぞれのIDSに組み込まれたAn2の平均数を判定した。SP-HPLC解析を用い、コンジュゲートされていないIDSが産物中に存在するかどうかを判定した。SEC解析を用い、コンジュゲーション後のタンパク質の質を検査した。この方法を用い、第1シリーズの9つのコンジュゲートに、凝集体形成の証拠があることが見出され、コンジュゲーション反応を最適化及び反復し、この問題を除去した。加えて、他のリンカーを用いて、5つの新規コンジュゲートを作製した。酵素活性、GAG減少、及びin situ脳灌流の試験のために選択されたリジンコンジュゲートを、下の表3に提示する。組み込まれたAn2の数が平均であることに注意すべきである。なぜなら、複数の種がコンジュゲーション反応産物中に存在していてもよいからである。MALDI TOFによるJR-032の質量は、76,320Daである（11回判定）。これらコンジュゲートについてのウエスタンブロットを図8に示す。
【表３】
2015505824.tif 000040
【０１９２】
これらのコンジュゲートを評価し以下の点について判定した:
1. An2組み込み（1〜5の範囲のAn2/IDS）
2. SECによる凝集の証拠なし
3. SP-解析による2つ以下のメジャーピーク。
【０１９３】
組み込まれるAn2の数をIDS当たり1つに限定（して標準化）する試みの中でシステインを用いた方策も用いたが、20当量までのAn2を含む条件範囲を用いて、An2とのIDSコンジュゲーションは50％以下しか得られなかった。さらに、コンジュゲーション反応産物は、酵素活性の50％の減少を示し、コンジュゲートされた物質が不活性であることを示唆する。したがって、リジンを用いたアプローチが好ましい。
【０１９４】
プロファイリング
リジンコンジュゲートを、JR-032を対照としてin vitro酵素アッセイにかけた。実験の詳細は上述のとおりである。すべてのコンジュゲートが酵素活性を保持している（図9参照）。いくつかの場合には、測定活性はネイティブIDSのそれを超える。これは、タンパク質定量アッセイにおける干渉により生じ得るのであり、より低く算出されるタンパク質濃度及びより高い活性/タンパク質をもたらす。機能的エンドポイント（functional endpoint）を有する酵素活性を確認するため、コンジュゲートを、MPSII患者由来線維芽細胞におけるGAGレベルを減少させる効率についてアッセイした。4ng/ml（50pM）の濃度でGAGレベルを、非疾患線維芽細胞において観察されるレベルであって、JR-032で観察されるレベルに類似するレベルまで減少させた（図10及び11参照）。
【０１９５】
脳灌流に関して、コンジュゲーションが利点を有するかどうかを判定するため、コンジュゲートを放射性ヨウ素標識し、マウスでのin situ脳灌流アッセイで試験した。この実験では酵素（5nM）を頚動脈を介して送達し、それによって脳に選択的に送達される量を最大化した。2分間の曝露に続いて、脳を生理食塩水で灌流し、循環する酵素を除去した。脳の除去の際、毛細血管除去プロトコルを用い、毛細血管関連画分と実質画分とに分離した。放射活性を計数し、被験物質の分布容積を定量した。すべての実験においてJR-032を対照として用い、その結果はプールされて単一の対照値を生成する。酵素活性及びGAG減少に関し、コンジュゲート間で区別するに足る差異は一切観察されなかったので、このin vivo BBB-浸透評価の結果が、化合物選択の主要な判断材料となる。図12及び13はそれぞれ、単一時点（2分）におけるJR-032及び15のコンジュゲートの脳での分布を示す。イヌリンに対するJR-032の脳での分布の比較を図23に記載する。
【０１９６】
図14A、14B、14C、及び14Dはそれぞれ、70-56-1B、70-56-2B、68-32-2、及び70-66-1BのMALDI-TOF解析を示す。図15A及び15Bは、68-32-2、70-56-1B、70-56-2B、及び70-66-1BのSEC及びSP解析を示す。これらコンジュゲートの構造及び合成プロトコルの要約は上に記載のとおりである。68-32-2、70-66-1B、70-56-2B、及び70-56-1Bに組み込まれたAn2の平均数はそれぞれ、2.3、4.9、2.4、及び1.2である。これら解析において、コンジュゲートされていないJR-032は検出されなかった。An2-IDSの2つの集団を代表する2つのピークを、それぞれのコンジュゲートについて見て取ることができ、1つは4-5分で溶出し、第2のものは10分で溶出している。異なるAn2-IDSコンジュゲートについて、類似した間隔を置いたピークの精製が示されている。
【０１９７】
コンジュゲーション産物をAlexa 488色素で標識してU87細胞内での輸送研究において用い、その局在をlysotracker色素の局在と比較した。顕微鏡検査実験の図解を図17に記載し、Alexa 488色素で標識され、その局在をlysotracker色素と比較して示す、68-32-2、70-56-1B、70-56-2B、及び70-66-1Bコンジュゲートの共焦点顕微鏡検査の結果を図18〜22に示す。コンジュゲートのlysotracker色素との共局在は、酸性リソソームにおけるそのコンジュゲートの存在を示す。図16は、1時間又は16時間（図16）のインキュベーション後に、コンジュゲートされたJR-032及びネイティブJR-032の両方の侵入が観察されたことを示すデータの定量化を示す。取込みEC50は、両方の酵素について約10nMであり、より高い最大取込み量は70-56-2Bについて示された。この実験のプロトコルは上に記載するとおりである。An2-IDSのU-87細胞及び脳への取込みを支持するさらなるデータを、図24及び25に示す。
【０１９８】
[実施例10]
切断可能リンカーを用いたIDS-Angiopep-2コンジュゲートの合成
An2を、下に示す2つのスキームにより、切断可能リンカーを含むジスルフィドを介してIDSにコンジュゲートする。第1のスキームにおいて、IDSのリジン側鎖をSPDPリンカーと反応させ、修飾IDSを生成する。修飾IDSをAn2-Cys-SHと反応させ、An2-CysのC末端システインのS部分を介してAn2と結合させ、IDS-An2コンジュゲートを生成する。
【０１９９】
第2のスキームにおいて、IDSをSATAリンカーと反応させ、続いてヒドロキシルアミンと反応させ、修飾IDSを生成する。An2のN末端リジンをSPDPと反応させ、修飾An2を生成する。修飾IDSを修飾An2と反応させ、An2をAn2のN末端アミノ基を介してIDSと結合させ、IDS-An2コンジュゲートを生成する。
【化３０】
2015505824.tif 000041
【化３１】
2015505824.tif 000042
【０２００】
[実施例11]
IDUA融合タンパク質構築物及び哺乳類細胞における発現
完全長ヒトIDUA cDNAクローン（NM_000203.2）をOriGeneから入手した。Angiopep-2（An2）のコード配列及びTEV切断可能ヒスチジンタグのコード配列を、PCRで作製した。Hisタグ有り及び無しのcDNA構築物を、適切な発現ベクター、例えばpcDNA3.1（Qiagen GigaPrep）（図27）内にCMVプロモータの制御下でサブクローニングした。すべての研究対象候補のIDUA及びEPiC-IDUAプラスミド（切断可能ヒスチジンタグ有り/無し）を、トランスフェクション試薬としてポリエチレンイミン（PEI）を用い、Freestyle CHO発現培地（無血清培地、Invitrogen）を用いて、市販のCHO-S発現系（FreeStyle(商標)Max発現系、Invitrogen）内にトランスフェクトした。これらの系において、細胞を懸濁液中で増殖させ、発現プラスミドのトランスフェクションに続いて、融合タンパク質を培養培地で分泌させた。培養及びトランスフェクションパラメータを、小規模実験における最大発現のために最適化した（30ml）。細胞培養培地での組換え融合タンパク質の発現を、蛍光発生基質4-メチルウンベリフェリルα-L-イズロニドを用いてIDUA酵素活性を測定すること、及び、抗IDUA、抗Angiopep-2、又は抗ヘキサヒスチジン抗体を使用したウエスタンブロッティングによりモニターした。図28に示すように、8つのIDUA及びEPiC-IDUA融合タンパク質を設計し、ウエスタンブロットにより細胞培地で検出された発現レベルにより示されるようにCHO-S細胞内で発現させた（図29）。以下の構築物を除き、良好な発現レベルが観察された:IDUA-An2-His、An2-IDUA-An2、及びAn2-IDUA-An2。
【０２０１】
[実施例12]
IDUA融合構築物の発現及び精製
以下のステップは、IDUA融合タンパク質のトランスフェクション、発現、及び精製のための最適化された条件を記述する。
【０２０２】
トランスフェクションは以下のとおり実施された。トランスフェクションの前日に、分裂CHO-S細胞（細胞5×108個/360mlの培地）を、Gibco FreeStyle CHO発現培地+8mM L-グルタミンを培養培地として用いて3-L無菌フラスコ内で分裂させた。翌日に細胞を計数し、総細胞数を細胞約1×109個とした。2つのT-75無菌培養フラスコを用意し、「DNA」及び「PEI」とラベルした。70mlの培養培地をそれぞれの管に添加した。2mlの1mg/ml PEI（2mg）を「PEI」とラベルした管に添加し、1mgのDNAを「DNA」とラベルした管に添加した（DNA:PEI比=1:2）。両方のフラスコを穏やかに混合し、室温で15分間立てておいた。次にPEI溶液をDNA溶液に添加した（逆ではない）。次に管を穏やかに混合し、室温で正確に15分間立てておいた。DNA/PEI複合体（140ml）を3-Lフラスコ内の360mlの懸濁培養物に添加し、フラスコを37℃、8％CO2に設定されたインキュベータ内のオービタルシェーカープラットフォーム（130rpm）上でインキュベートした。4時間のインキュベーション後、500mlの培養培地を添加し、インキュベータの温度を31℃まで下げた。フラスコを5日間、31℃、130rpm、8％CO2下でインキュベートした。次に、遠心分離（2000rpm、5分）により細胞を回収し、馴化培地を濾過し（0.22μm）、4℃で貯蔵した。
【０２０３】
タバコエッチウイルス（Tobacco Etch Virus）に見出される高度に部位特異的なシステインプロテアーゼであるTEVプロテアーゼによる切断可能部位の消化を含む2段階クロマトグラフィーで、ヒスチジンタグを含有する融合タンパク質の精製を実施した。精製配列は以下のとおりである。細胞培養上清の清澄化を、遠心分離により又は清澄化フィルタ（5〜0.6μm）を用いて実施し、続いて0.2μmカットオフフィルタで滅菌濾過した。Ni-NTA（ニッケル2+-ニトリロ三酢酸） Superflow樹脂（QIAGEN）を用いたニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いて、ポリヒスチジンタグ付加タンパク質の捕獲を以下のとおり実施した。まず、カラムを50mM Na2HPO4 pH8.0、200mM NaCl、10％グリセロール、25mMイミダゾールで平衡化した。次に清澄化された上清をロードし、続いてUV280吸光度が安定するまで平衡化バッファーを用いて洗浄した。50mM Na2HPO4 pH8.0、200mM NaCl、10％グリセロール、250mMイミダゾールでカラムからタンパク質を溶出した。最後に、0.5M NaOHを用いて30分の接触時間でカラムをその場で浄化し、続いて平衡化バッファーを用いて再生させた。
【０２０４】
ヒスチジンタグの除去を以下のとおり実施した。高量のタンパク質を含有する画分を、TEVプロテアーゼバッファー（50mM Tris-HCl pH8.0、0.5mM EDTA、及び1mM DTT）で透析した。次に融合タンパク質を、TEVプロテアーゼとともに16時間+4℃でインキュベートした。最後に、融合タンパク質をNi-NTA平衡化バッファー（50mM Na2HPO4 pH8.0、200mM NaCl、10％グリセロール、25mMイミダゾール）で透析した。
【０２０５】
Ni-NTA Superflow樹脂（QIAGEN）を用い、Flowthroughモードで、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによるポリヒスチジンタグ、TEV-His-タグ付加、及び非切断タンパク質の捕獲を以下のとおり実施した。まず、カラムを50mM Na2HPO4 pH8.0、200mM NaCl、10％グリセロール、25mMイミダゾールで平衡化した。消化されたタンパク質をカラムにロードし、続いてUV280吸光度が安定するまで平衡化バッファーを用いて洗浄した。融合タンパク質をフロースルーで収集した。望ましくない物質を、50mM Na2HPO4 pH8.0、200mM NaCl、10％グリセロール、250mMイミダゾールで溶出した。最後に、PBSバッファーでの融合タンパク質を含有するフロースルー画分のバッファー交換により、調合を実施した。
【０２０６】
第1のNi-NTAクロマトグラフィーステップ後に、溶出されたHis-タグタンパク質は良好な純度を示す（図30A）。さらに、Hisタグ付加をTEV切断により除去し、精製IDUA又はAn2-IDUAを提供することができた（図30B）。
【０２０７】
ヒスチジン無しのタンパク質も精製した。ヒスチジンタグの使用は、タンパク質精製を数ステップの容易なものとするためであるが、それはTEVプロテアーゼでの消化によるタグの除去も必要とする。大小にかかわらず、すべてのタグがタンパク質の生物活性に干渉し、その挙動に影響する可能性がある。加えて、構築物内にTEV消化部位を含めるために、切断後にC末端側に残る余分なアミノ酸が必要だった。これもやはりタンパク質の挙動に影響し得る。最後に、市販のTEVプロテアーゼの使用は、たとえ小規模でも厄介であり、製造コストの約10％までを占め得る。この問題を克服するために、Hisタグ無しの構築物を設計し（図27）、高純度を得るための精製プロセスを開発した。図31に記載のプロトコルを用い、Hisタグ無しのIDUAを精製した。SP-セファロース（強カチオン交換樹脂）を用いた最終ステップでのIDUAの精製プロファイルを、図32Aに示す。溶出中の画分のSDS-PAGE/クーマシー（図32Aに挿入）により示されるように、高純度を得ることができた。さらに図32B及び32Cは、IDUA及びAn2-IDUAを複数のバッチから、in vivo脳灌流及びin vitro実験に十分な量で再現性よく精製できたことを示す。
【０２０８】
[実施例13]
EPiC-IDUA活性試験
EPiC-IDUA酵素活性を、未精製タンパク質（依然として培養培地中にある）を用いた、4-メチルウンベリフェリル-α-L-イズロニド（4-MUBI）を基質とする蛍光定量アッセイ（図33）により、in vitroで判定した。基質をIDUAにより4-メチルウンベリフェロン（4-MU）へと加水分解し、それをFarrandフィルタ蛍光光度計で450nmの発光波長及び365nMの励起波長を用いて蛍光定量的に検出した。IDUA活性に比例する4-MUの濃度をアッセイで判定するため、既知量の4-MUの標準曲線を用いた。
【０２０９】
融合タンパク質において酵素の活性は保存され、蛍光定量的ユニットは、基質に添加されるEPiC-IDUA融合タンパク質の質量に比例することが予測される。
【０２１０】
インハウスで細胞培養の細胞培養上清中に発現させた3つの異なるタンパク質の酵素活性を調べ、市販のIDUA-10xHisと比較した。インハウスで作製した酵素の酵素活性は、IDUA-10xHisと類似のレベルを示し（図34）、An2との融合後に酵素活性が保存されていることを示した。
【０２１１】
発現タンパク質が細胞中のGAG蓄積を減少させることができるかどうかを判定するため、MPS-I患者から採取された線維芽細胞を用いた。MPS-I又は健常ヒト線維芽細胞（Coriell institute）を、10％ウシ胎児血清（FBS）を有するDulbecco改変イーグル培地（DMEM）中に細胞250,000個/ウェルで6ウェル皿にプレートし、37℃、5％CO2下で培養した。4日後、細胞をリン酸ウシ血清（phosphate bovine serum:PBS）で1回、低スルフェートF-12培地（Invitrogen、catalog # 11765-054）で1回洗浄した。10％透析FBS（Sigma、catalog # F0392）及び10μCi 35S-硫酸ナトリウムを含有する1mlの低スルフェートF-12培地を、組換えIDUA及びEPiC-IDUAタンパク質の不在又は存在下で細胞に添加した。線維芽細胞を37℃、5％CO2下でインキュベートした。48時間後、培地を除去し、細胞をPBSで5回洗浄した。次に、細胞を0.4ml/ウェルの1N NaOH中で溶解し、60℃で60分間加熱し、タンパク質を可溶化した。μBCAタンパク質アッセイのため、アリコートを除去する。放射活性を液体シンチレーションカウンタで計数する。データをタンパク質μg当たりの35S CPMとして表す。
【０２１２】
第1の実験において、IDUA（Hisタグ有り及び無し）及び1つのEPiC-IDUA誘導体のみを試験した。第1の融合タンパク質についての結果は、Angiopep-2との融合後に酵素の活性が保存されていることを示した。MPS-I線維芽細胞におけるGAGの減少について、健常線維芽細胞において測定されるものと同等の用量反応を観察した（図35）。図47に示すように、同様の結果がAn2-IDUAについても観察された。
【０２１３】
[実施例14]
MPS-I線維芽細胞における細胞内取込み（エンドサイトーシス）のin vitro評価
（a）組換えIDUAタンパク質が細胞により取り込まれるかどうかを判定し、及び（b）ネイティブIDUAと融合IDUAとの間の取込みレベルを比較するため、MPS-I線維芽細胞を、10％ウシ胎児血清（FBS）を有するDulbecco改変イーグル培地（DMEM）中に細胞100,000個/ウェルで12ウェル皿にプレートし、37℃、5％CO2下で培養した。4日後、培地を変え、IDUA及びAn2-IDUA融合タンパク質の取込みをin vitroで以下のとおり評価した。精製IDUA及びAn2-IDUAの濃度を高めながら、それぞれのMPS-I線維芽細胞ウェルに添加した。細胞を37℃で最大24時間さらに培養した。細胞をPBSで十分に洗浄し、24時間の曝露期間内の異なる時点で培地を除去した。最後に、細胞を0.4Mギ酸ナトリウム、pH3.5、0.2％ Triton X-100中で溶解した。酵素活性アッセイをそれぞれの条件について実施した。結果を図36に示す。
【０２１４】
これら結果に基づくと、An2-IDUAはネイティブ酵素IDUAと同様の線維芽細胞に関する親和定数を有し、An2ペプチドがIDUAの取込み及びエンドサイトーシスに影響を与えないことを示している。取込みは24時間まで時間依存的で線型であることが見出された。加えて、取込み機構は高親和性を有する飽和機構であるようである。
【０２１５】
[実施例15]
M6P、An2、及びRAP存在下でのMPS-I線維芽細胞によるin vitro取込み
前節に記載のMPS-I線維芽細胞を24時間、2.4nMのIDUA又はAn2-IDUAとともに、過剰量のM6P、RAP、又はAn2の存在下でインキュベートした。図37に示すように、An2-IDUA及びネイティブIDUAの両方のMPS-I線維芽細胞内への取込みが、主にM6P受容体依存性である。
【０２１６】
酵素のM6P受容体依存性取込みを、M6P、An2の量を高めながら、また、ネイティブ及びEPIC酵素の量を高めながら、LRP1抑制物質であるRAPの存在下でさらに研究した。結果を図38A〜38Cに示す。これら実験は、MPS-I線維芽細胞において、An2-IDUA及びネイティブIDUAの両方の取込みが、用量依存的に遊離M6Pとの共インキュベーションにより阻害されたことを確認した。加えて、An2及びLRP1抑制物質RAPは、高酵素濃度であっても、MPSI線維芽細胞によるAn2-IDUA及びネイティブIDUA取込みに一切影響を与えなかった。
【０２１７】
[実施例16]
LRP1高発現U87神経膠芽腫細胞によるin vitro取込み
LRP1受容体の高発現で知られるU87神経膠芽腫細胞における、IDUA及びAn2-IDUAの取込みを評価した。この実験は、細胞によるIDUA及びAn2-IDUAの取込み機構をさらに理解し、EPIC化合物がLRP1受容体を介する取込みにおいて役割を果たし得るかどうかを特に判定するために行われた。U87細胞を培養し、An2ペプチド（1mM）、M6P（5mM）及びRAP（1μm）ペプチド（LRP1抑制物質）の存在下で2時間及び24時間IDUA及びAn2-IDUAに曝露した。図39Aに示す結果は、以下のことを示す:1） U-87におけるAn2-IDUA及びネイティブIDUAの取込みレベルは、MPSI線維芽細胞と同様である;及び2） U-87において、An2-IDUA及びネイティブIDUAの両方の取込みが主にM6PR依存性である。
【０２１８】
次にLRP1 RAW 264.7細胞発現細胞をIDUA又はAn2-IDUAとともにインキュベートした。IDUAに対する抗体で免疫沈降法を実施し、続いてLRP1についてウエスタンブロッティングした。LRP1はプルダウン（沈降）し（図39B）、An2-IDUAがLRP1と相互作用することを示している。
【０２１９】
[実施例17]
U87神経膠芽腫細胞による脱グリコシル化IDUA/An2-IDUAのin vitro取込み
PNGase Fを用いた脱グリコシル化後のIDUA及びAn2-IDUAのU87神経膠芽腫細胞における取込みを評価した。この実験は、細胞によるIDUA及びAn2-IDUAのM6P受容体依存性取込み機構を検証するために行われた。IDUA/An2-IDUAをN-グリコシダーゼFに曝露することにより、マンノース-6-リン酸残基（M6P）を含むグリコシル化の除去を実施した。N-グリコシダーゼFはPNGase Fとしても知られ、高マンノースの最内側のGlcNAc残基とアスパラギン残基との間を切断するアミダーゼである（図40A）。脱グリコシル化前、An2-IDUAは変性されているか、又は、未変性状態であるかのいずれかである（図40B）。
【０２２０】
U87細胞内の酵素活性の検証前に、SDS-Page/クーマシーにより酵素を解析した（図40C）。U87細胞をグリコシル化/脱グリコシル化IDUA/An2-IDUAに24時間、48nMの酵素濃度で曝露した。これらの結果（図40D）は、グリコシル化がIDUA/An2-IDUAの取込み機構において主要な役割を果たすことを示す。これは、MPS1線維芽細胞及び高比率のLRP1受容体を発現するU87細胞による取込みが主にマンノース6リン酸（M6P）受容体依存性であることを示す、上のすべての結果を確証する。U87細胞において測定された低レベルの酵素活性は、上のクーマシーゲルにおいてグリコシル化/非グリコシル化形態の間のバンドのスメアにより示されるように、PGNase F処理後の酵素の不完全な脱グリコシル化と関係付けることができる。
【０２２１】
[実施例18]
リソソームにおけるAn2-IDUAのin vitro取込み及び局在
An2-IDUA融合タンパク質がリソソームに到達するかどうかを判定するために、異なる実験アプローチを用いて共局在研究を実施した。このin vitro方法を条件付ける（qualify）ため、An2を蛍光色素Alexa Fluor 488（緑色プローブ）で標識した。MPS-I患者由来線維芽細胞における蛍光タンパク質の取込み後、リソソームをlysotracker（赤色プローブ）で染色した。共焦点顕微鏡検査は、lysotracker及びAlexa488-An2の良好な共局在を示した（図41）。
【０２２２】
非タグ付加IDUA/An2-IDUAの酵素活性を緑色蛍光Alexa Fluor 488タグ付加物質と比較することにより、U87神経膠芽腫細胞におけるIDUA及びAn2-IDUAの取込みを評価した。この実験は、タグ付加が取込みに有害な影響を及ぼすかどうかを検証するために行われた。細胞を0、100、及び1000ngのタグ付加/非タグ付加酵素に曝露した後に、U87細胞における酵素活性を評価した。これらの結果は、IDUA及びAn2-IDUAをAlexa Fluor488色素でタグ付加することが、MPSI線維芽細胞における酵素活性及び取込みを損なわないことを示す（図42）。
【０２２３】
[実施例19]
in vitro輸送研究（トランスサイトーシス）-BBB輸送
IDUA及びEPiC-IDUA誘導体の輸送を測定し特性決定するために、Pierce（Rockford、IL、USA）から入手したIodo-beadsキット及びD-Saltデキストラン脱塩カラムを用いて、精製タンパク質を標準的な手法で放射性標識した。定量を、トランスウェルプレートを用いて、モデルを通過する放射性標識分子量を測定することにより行った。加えて、SDS-PAGEにより又はLS/MSにより、融合タンパク質の完全性を解析し、分子量の判定を可能にし、トランスサイトーシス中に分解が一切生じていないことを保証した。
【０２２４】
これら融合タンパク質の脳取込みの試験を、マウスでin vivo脳取込みモデルにより行った（in situ脳灌流としても知られる）。この技術は、血液成分の除去を可能にし、脳を直接放射性標識分子に曝露することを可能にする。簡潔に述べると、マウス脳毛細血管の管腔側からの[125I]-タンパク質の取込みを、マウス脳における薬物取込み研究のために本研究室で採用しているin situ脳灌流法を用いて測定した（Cisterninoら、Pharm. Res. 18:183-90、2001; Dagenaisら、J. Cereb. Blood Flow Metab. 20:381-6、2000）。脳を2〜10分間、1.15ml/分の流速、37℃で、放射性標識化合物で灌流した。放射性標識分子の灌流後、脳を60秒間Krebsバッファーでさらに灌流し、過剰量の[125I]-タンパク質を洗い流した。次にマウスを屠殺し、灌流を停止し、右半球を氷上で単離し、氷冷溶液を用いてデキストラン-70クッション上で前述のとおり毛細血管除去をすぐに実施した（Banksら、J. Pharmacol. Exp. Ther. 302:1062-9、2002）。ホモジネート、上清、ペレット及び灌流液のアリコートを収集し、その含有量を測定し、見かけの分布容積（Vd）を評価した。したがって、BBB初期移動定速（initial transfer constant rate）（Kin）及び放射性化合物の領域分布を判定でき、これは、血清タンパク質との相互作用なしにBBBを通過する化合物の能力を評価することを可能にする。脳実質におけるEPiC-IDUAの目標取込み速度（Kin）は、最低で10-4ml/g/秒となる。比較として、グルコースについて報告されているKinは9.5×10-3であり（Mandulaら、J. Pharmacol. Exp. Ther. 317:667-75、2006）、アルコールについてのKinは1.8×10-4であり（Grattonら、J. Pharm. Pharmacol. 49:1211-6、1997）、モルヒネについてのKinは1.6×10-4である（Seelbachら、J. Neurochem. 102:1677-90、2007）。
【０２２５】
BBB輸送評価をIDUA及びEPIC-IDUAについて以下のパラメータで実施した:50nMの放射性標識物質濃度、1.15ml/分で37℃での2分間の灌流時間、及び30秒のすすぎ時間。結果（図43）は、IDUAのみ脳毛細血管内で結合する又は捕捉される可能性があり、脳実質に到達するのは低量であることを示す。1つの説明は、IDUAが約9の等電点を有するという事実であり得る。したがって、このタンパク質は中性pHで正に荷電している。An2-IDUAの場合、脳全体で分布容積の増加を観察した。興味深いことに、ネイティブ酵素と比較して脳実質内に高量（約7倍）が見出された。全体としてこれら結果は、An2の添加がBBBを通過するIDUAの輸送を増加させることを示す。
【０２２６】
[実施例20]
BBBモデル（CELLIAL technologies）を用いたin vitroBBB評価
BBBを通過するEPiC-酵素誘導体の輸送もまた、ウシ脳毛細血管内皮細胞と新生ラット星状細胞との共培養物からなるin vitroBBBモデルを用いて評価した（図44）。IDUA及びAn2-IDUA誘導体の輸送を測定し特性決定するために、精製タンパク質を標準的な手法で放射性標識した。定量を、トランスウェルプレートを用いて、モデルを通過する放射性標識分子量を測定することにより行った。加えて、SDS-PAGEにより又はLS/MSにより、融合タンパク質の完全性を解析し、分子量の判定を可能にし、トランスサイトーシス中に分解が一切生じていないことを保証した。An2-IDUA及びIDUA酵素の輸送を、in vitroBBBプロトコルを用いて比較した。図45に示す結果は、BBBを通過するEPIC-IDUAの輸送が、酵素のみと比較して約2倍増加したことを示す。
【０２２７】
BBB内皮細胞を通過するEPIC-IDUA及びIDUAの輸送もまた、RAP及びAn2のようなLRP1受容体競合物質の存在下で評価した。図46に示す結果は、IDUAのBBB内皮細胞の通過は、An2輸送依存性であることを示す。
【０２２８】
[実施例21]
MPS-IノックアウトマウスにおけるAn2-IDUAの酵素活性
An2-IDUAの静脈内注射1時間後にMPS-Iノックアウトマウスから調製されたマウス脳のホモジネートにおいてIDUA活性を測定した。図48は、An2-IDUAの単回注射が、MPS-Iノックアウトマウス脳ホモジネートにおけるIDUA酵素活性を35％回復させることを示す。
【０２２９】
[実施例22]
IDUAのペプチドとの化学的コンジュゲーション
ペプチドターゲティング部分、例えばAngiopep-2等を、化学リンカーによりIDUAに結合してもよい。一例において、これは上述のSATAリンカーを用いて達成される。化学的コンジュゲーションは以下のスキームを用いて達成することができる。
【化３２】
2015505824.tif 000043
【０２３０】
このスキームにおいて、4当量のSATAをpH8のリン酸バッファー中の酵素と反応させることにより、リンカーを酵素とコンジュゲートする。次に、酵素-リンカーをヒドロキシルアミンで脱保護し、IDUAの遊離スルフヒドリル中間体を得る。次に、この化合物を6当量のMHA-Angiopep-2とコンジュゲートし、酵素-ペプチドコンジュゲートを生成した。
【０２３１】
別の一例において、下に示すとおり、酵素をトラウト試薬（2-イミノチオラン（2-iminothialone））と反応させ、次にこれを6当量のMHA-Angiopep-2とコンジュゲートした。
【化３３】
2015505824.tif 000044
【０２３２】
他の実施形態
本明細書で言及したすべての特許、特許出願、及び刊行物は、2011年12月1日出願の米国仮出願番号第61/565,764号及び2012年6月15日出願の米国仮出願番号第61/660,564号を含め、それぞれの独立した特許、特許出願、又は刊行物を参照により組み込むと具体的且つ個別に示した場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【図１】
2015505824.tif 000051
【図２】
2015505824.tif 000052
【図３】
2015505824.tif 000053
【図４】
2015505824.tif 000054
【図５】
2015505824.tif 000055
【図６】
2015505824.tif 000056
【図７】
2015505824.tif 000057
【図８】
2015505824.tif 000058
【図９】
2015505824.tif 000059
【図１０】
2015505824.tif 000060
【図１１】
2015505824.tif 000061
【図１２】
2015505824.tif 000062
【図１３】
2015505824.tif 000063
【図１４−１】
2015505824.tif 000064
【図１４−２】
2015505824.tif 000065
【図１５】
2015505824.tif 000066
【図１６】
2015505824.tif 000067
【図１７】
2015505824.tif 000068
【図１８】
2015505824.tif 000069
【図１９】
2015505824.tif 000070
【図２０】
2015505824.tif 000071
【図２１】
2015505824.tif 000072
【図２２】
2015505824.tif 000073
【図２３】
2015505824.tif 000074
【図２４Ａ】
2015505824.tif 000075
【図２４Ｂ】
2015505824.tif 000076
【図２５】
2015505824.tif 000077
【図２６】
2015505824.tif 000078
【図２７】
2015505824.tif 000079
【図２８】
2015505824.tif 000080
【図２９】
2015505824.tif 000081
【図３０】
2015505824.tif 000082
【図３１】
2015505824.tif 000083
【図３２】
2015505824.tif 000084
【図３３】
2015505824.tif 000085
【図３４】
2015505824.tif 000086
【図３５】
2015505824.tif 000087
【図３６】
2015505824.tif 000088
【図３７】
2015505824.tif 000089
【図３８】
2015505824.tif 000090
【図３９】
2015505824.tif 000091
【図４０】
2015505824.tif 000092
【図４１】
2015505824.tif 000093
【図４２】
2015505824.tif 000094
【図４３】
2015505824.tif 000095
【図４４】
2015505824.tif 000096
【図４５】
2015505824.tif 000097
【図４６】
2015505824.tif 000098
【図４７】
2015505824.tif 000099
【図４８】
2015505824.tif 000100
【配列表】
2015505824000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年8月4日(2014.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）50アミノ酸未満のペプチド又はペプチド模倣物質ターゲティング部分であって、配列番号1〜105及び107〜117のいずれかと少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含むターゲティング部分と、（b）リソソーム酵素、その活性断片、又はその類似体と、を含む化合物であって、前記ターゲティング部分と前記酵素とがリンカーで連結されている化合物。
【請求項２】
さらに第2のターゲティング部分を含み、第2のターゲティング部分が第2のリンカーにより前記化合物に連結されている、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
前記ターゲティング部分が、前記酵素を、リソソームへ及び／又は脳血管関門を通過して輸送することができる、請求項1又は2に記載の化合物。
【請求項４】
酵素アッセイ及び／又は細胞アッセイにおいてリソソーム酵素活性を維持している、請求項1から3のいずれかに記載の化合物。
【請求項５】
前記ターゲティング部分がAngiopep-2（配列番号97）の配列を含む、請求項1から4のいずれかに記載の化合物。
【請求項６】
前記ペプチド模倣物質ターゲティング部分がD-アミノ酸を含む、請求項1から4のいずれかに記載の化合物。
【請求項７】
前記ペプチド模倣物質ターゲティング部分が、アミノ末端又は別の遊離アミノ基のN-アシル誘導体を含む、請求項1から4及び6のいずれかに記載の化合物。
【請求項８】
前記ペプチド模倣物質ターゲティング部分がアセチル基を含む、請求項7に記載の化合物。
【請求項９】
前記ターゲティング部分が、配列番号97に記載のアミノ酸配列の1又はそれ以上のD-異性体を含む、請求項6に記載の化合物。
【請求項１０】
前記ターゲティング部分が、配列番号97に記載のアミノ酸配列の2又はそれ以上のD-異性体を含む、請求項9に記載の化合物。
【請求項１１】
前記ターゲティング部分が、配列番号97に記載のアミノ酸配列の3又はそれ以上のD-異性体を含む、請求項9に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ターゲティング部分が式Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyrを有する、請求項11に記載の化合物。
【請求項１３】
前記ターゲティング部分が、配列番号97に記載のアミノ酸配列の4又はそれ以上のD-異性体を含む、請求項9に記載の化合物。
【請求項１４】
前記ターゲティング部分が式Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyrを有する、請求項13に記載の化合物。
【請求項１５】
前記リンカーが共有結合又は1つ以上のアミノ酸である、請求項1から14のいずれかに記載の化合物。
【請求項１６】
前記共有結合がペプチド結合である、請求項15に記載の化合物。
【請求項１７】
前記化合物が化学的コンジュゲートである、請求項1から14のいずれかに記載の化合物。
【請求項１８】
前記リンカーが、前記酵素上の遊離アミンを介して前記酵素にコンジュゲートしている、請求項1から17のいずれかに記載の化合物。
【請求項１９】
前記リンカーが、前記ターゲティング部分上の遊離アミンを介して前記ターゲティング部分にコンジュゲートしている、請求項1から18のいずれかに記載の化合物。
【請求項２０】
以下の構造:
【化１】
2015505824.tif 000101
を有し、
「Lys-NH」基が、酵素に存在するリジン又はN末端若しくはC末端リジンのいずれかを表す、請求項17から19のいずれかに記載の化合物。
【請求項２１】
以下の構造:
【化２】
2015505824.tif 000102
を有する、請求項20に記載の化合物。
【請求項２２】
以下の構造:
【化３】
2015505824.tif 000103
又は
【化４】
2015505824.tif 000104
を有し、
それぞれの-NH-基がターゲティング部分及び酵素にそれぞれ存在する一級アミノを表す、請求項17から19のいずれかに記載の化合物。
【請求項２３】
以下の構造:
【化５】
2015505824.tif 000105
又は
【化６】
2015505824.tif 000106
を有する、請求項22に記載の化合物。
【請求項２４】
1つ以上のナノ粒子を含む組成物であって、前記ナノ粒子が請求項1から23のいずれかに記載の化合物のいずれか1つにコンジュゲートされている組成物。
【請求項２５】
請求項1から23のいずれかに記載の化合物のいずれか1つのリポソーム製剤を含む組成物。
【請求項２６】
請求項1から23のいずれかに記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２７】
リソソーム蓄積症を有する被験体の治療又は予防的処置のための医薬組成物であって、請求項1から23のいずれかに記載の化合物又は請求項24から26のいずれかに記載の組成物を含む医薬組成物。
【請求項２８】
前記被験体が神経症状を有する、請求項27に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
前記医薬組成物による治療を前記被験体が5歳未満で開始する、請求項27に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
前記医薬組成物による治療を前記被験体が3歳未満で開始する、請求項29に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記被験体が乳幼児である、請求項27に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
非経口投与される、請求項27から31のいずれかに記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
2015505824.tif 000107
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