(57)【要約】  ナノ粒子標品を高温で滅菌する方法が提供される。複数のナノ粒子を精製して標品を形成し、ナノ粒子は少なくともコアとシェルとを含み、シェルはコアに結合したリガンド種を１以上含む。ナノ粒子標品は、精製ナノ粒子組成物と、キャリア流体と、コアに結合していない１以上の過剰のリガンド種とによってつくられる。コアに結合したリガンド種と精製後に添加される過剰のリガンド種とは構造的に等しい。本発明によって提供されるナノ粒子標品は、Ｘ線撮影や磁気共鳴撮影などの画像診断方法の造影剤として用いられうる。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）組成物を精製して精製組成物を形成する工程であって、精製組成物がキャリア流体中に１以上のナノ粒子を含んでいて、ナノ粒子がコアとコアに結合したシェルとを含んでおり、シェルがリガンド種を含んでいる、工程と、
（ｂ）ある量のリガンド種を精製組成物に添加して標品を形成する工程であって、リガンド種の添加量の少なくとも一部はコアに結合しないまま残る、工程と、
ｃ）標品を滅菌する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
シェルのリガンド種と精製組成物に添加されるリガンド種とは構造的に等しい、請求項１記載の方法。
【請求項３】
標品が加熱滅菌によって滅菌される、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項４】
標品がオートクレービングによって滅菌される、請求項１又は請求項２記載の方法。
【請求項５】
コアが、タングステン、タンタル、ハフニウム、ジルコニウム、亜鉛、モリブデン、銀、鉄、マンガン、銅、コバルト、ニッケルの酸化物又はこれらの遷移金属酸化物の２種以上の組合せを含む、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
コアが、鉄、マンガン、銅、コバルト、ニッケル又はこれらの組合せを含む常磁性金属を含む、請求項１乃至請求項５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
コアが超常磁性酸化鉄を含む、請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
リガンド種がホスフェート、ホスホネート又はこれらの組合せを含む、請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
ホスフェートリガンド種がモノホスフェート、ビス（ホスフェート）、ポリホスフェート又はこれらの組合せを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ホスホネートリガンド種がモノホスホネート、α−ヒドロキシホスホネート、ビスホスホネート、ポリホスホネート又はこれらの組合せを含む、請求項８記載の方法。
【請求項１１】
リガンド種がポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）官能基をさらに含む、請求項８乃至請求項１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
リガンド種が、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）官能化ホスフェート、ＰＥＧ官能化ホスホネート、ＰＥＧ官能化モノホスフェート、ＰＥＧ官能化ビス（ホスフェート）、ＰＥＧ官能化α−ヒドロキシホスホネート又はこれらの組合せを含む、請求項１乃至請求項１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
リガンド種がＰＥＧ官能化α−ヒドロキシホスホネートを含む、請求項１乃至請求項１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
ナノ粒子が、超常磁性酸化鉄を含むコアと、ＰＥＧ官能化α−ヒドロキシホスホネートを含むシェルとを含む、請求項１乃至請求項１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
ナノ粒子が約１ｎｍ〜１００ｎｍの流体力学的直径を有する、請求項１乃至請求項１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
キャリア流体が水、エタノール又はこれらの組合せを含む、請求項１乃至請求項１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
ある量の流体をキャリア流体に添加する工程をさらに含んでいて、流体がエタノール、水又はこれらの組合せを含む、請求項１乃至請求項１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
マンニトール、デキストロース、プロピレングリコール、生体適合性の塩又はこれらの組合せを含む１種以上の化合物を添加する工程をさらに含む、請求項１乃至請求項１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
薬学的に許容される１種以上の賦形剤をキャリア流体に添加する工程であって、薬学的に許容される賦形剤が、薬学的に許容される塩、薬学的に許容される糖部分又はこれらの組合せを含む、工程をさらに含む、請求項１乃至請求項１８のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ナノ粒子標品を安定化する方法に関する。かかるナノ粒子標品は様々な治療及び診断用途に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子、すなわちその直径がナノメートル単位で適切に測定される粒子は、多様な最終用途に対して関心が持たれてきた。適切なイメージング特性を有するナノ粒子は通常、遷移金属酸化物をベースにし、ＭＲ及び／又はＸ線撮影の造影剤として使用される。酸化鉄のナノ粒子は鉄補充治療、磁気粒子画像法（ＭＰＩ）、薬物ターゲティング、又は遺伝子導入といった様々な治療用途に使用される。ヒトのインビボ用途に用いることを意図した、ナノ粒子組成物を含有する標品は、通常、生物汚染防止のために精製と滅菌を必要とし、また多くの場合、等張水性媒体内で確実な懸濁安定性を示すことが望まれる。
【０００３】
ナノ粒子の滅菌には、ＵＶ照射、エチレンオキシド処理、ホルムアルデヒド処理、滅菌濾過、ガンマ線照射、及びオートクレーブ滅菌など、各種方法がある。注射可能な造影剤に対するオートクレーブ滅菌は、信頼性が最も高くかつ安価な滅菌方法のひとつであると考えられている。
【０００４】
水性懸濁液中のナノ粒子組成物は、オートクレービングなどの加熱滅菌法の実施時に集塊化及び沈殿が発生しやすい。かかるナノ粒子の水性懸濁液安定性を改善するため、かかるナノ粒子の表面特性を各種表面改質剤の添加によって改変する努力が行われてきた。ナノ粒子の凝集が発生する温度を雲点変更剤を用いて変更し、オートクレーブによる滅菌を可能にすることは、代替的な手法である。しかし、場合によっては雲点変更剤は荷電分子であって、ナノ粒子のシェルを構成する分子とは異なるため、ナノ粒子の組成だけでなく、シェル表面の化学的性質まで変えてしまう恐れがある。
【０００５】
ナノ粒子表面の化学的性質を変えることなく、オートクレーブ滅菌時にナノ粒子組成物を高温で安定化する方法が大いに望まれている。加熱滅菌中に優れた安定性、無菌性、高い安全性、及び耐凝集性を示すナノ粒子組成物の標品は様々な用途に好適である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／１５６１４２号明細書
【発明の概要】
【０００７】
１以上の実施形態に係る方法は、組成物を精製して精製組成物を形成する工程であって、精製組成物がキャリア流体中に１以上のナノ粒子を含んでいて、ナノ粒子がコアとコアに結合したシェルとを含んでおり、シェルがリガンド種を含んでいる、工程と、ある量のリガンド種を精製組成物に添加して標品を形成する工程であって、リガンド種の添加量の少なくとも一部はコアに結合しないまま残る、工程と、標品を滅菌する工程とを含む。
【０００８】
別の実施形態に係る方法は、組成物を精製して精製組成物を形成する工程であって、精製組成物がキャリア流体中に１以上のナノ粒子を含み、ナノ粒子はコアとコアに結合したシェルとを含み、シェルはリガンド種を含み、精製組成物には過剰のリガンド種が存在しない、工程と、ある量のリガンド種を精製組成物に添加して標品を形成する工程であって、リガンド種の添加量の少なくとも一部はコアに結合しないまま残る、工程と、標品をオートクレービングによって滅菌する工程とを含む。
【０００９】
本発明のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読むとさらによく理解されるだろう。図中、同じ要素は同じ符号を用いて示している。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施形態に係る、安定化ナノ粒子標品を作製する例示的方法を示すフローチャートである。
【図２】本発明の一実施形態に係る、安定化ナノ粒子標品を作製する例示的方法を示す概略的な流れ図であり、コアシェル型ナノ粒子の理想断面図で示した構造を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下の明細書及び特許請求の範囲では、幾つかの用語について言及しているが、それらは以下の意味をもつものとする。
【００１２】
単数形は複数形を含む。ただし、そうでないことが文脈から明らかな場合を除く。
【００１３】
本明細書及び特許請求の範囲を通して用いる概数表現は、許容範囲内で変動しうる定量表現を、関係する基本機能の変化が生じないように修飾するように適用されうる。したがって、「約」などの言葉で修飾される値は、正確な指定値に制限されることはない。一部の例において、概数表現は値を測定する装置の精度に対応することがある。
【００１４】
本発明の幾つかの実施形態は、組成物を精製して精製組成物を形成する工程を含む方法を含んでいるが、精製組成物はキャリア流体中に１以上のナノ粒子を含んでいて、ナノ粒子はコアとコアに結合したシェルとを含んでおり、シェルはリガンド種を含む。精製工程の後、ある量のリガンド種を精製組成物に添加して標品を形成する工程が続き、リガンド種の添加量の少なくとも一部はコアに結合しないまま残る。その後、標品には滅菌が行われる。
【００１５】
より具体的には、１以上の実施形態では、方法は、少なくともコアとシェルとを含む１以上のナノ粒子を提供する工程を含み、シェルはコアに結合したリガンド種を含む。ナノ粒子組成物は精製されて精製ナノ粒子組成物を形成し、標品が、ある量のリガンド種を添加することによって精製ナノ粒子組成物を用いて形成される。この添加工程は、高温でのオートクレーブ滅菌時に標品を安定化するのに役立ちうる。精製の目的は、組成物中に存在する望ましくない不要な化学種、例えば過剰の出発物質もしくは何らかの不純物などを除去することにある。精製は過剰のリガンド種、すなわち、ナノ粒子組成物中に存在する、ナノ粒子コアと結合していないリガンド種を付随的に除去する。一例において、ナノ粒子の精製は分画分子量に基づく濾過を用いうる。このとき濾膜の孔径により、ある特定の分子量を有する分子のみが孔を通過する。別の例において、ナノ粒子の精製は遠心分離による洗浄とそれに続くキャリア流体中での再懸濁を用いうる。リガンド種とナノ粒子組成物（コアシェル型）の粒径差により、精製においてナノ粒子組成物から過剰のリガンド種を除去する処理が促進される。過剰のリガンド種が精製ナノ粒子組成物に添加されて標品が形成された後、滅菌が行われる。標品の滅菌によって滅菌済み標品が生成される。
【００１６】
既述のように、標品は精製ナノ粒子組成物を含む。幾つかの実施形態では、ナノ粒子組成物は少なくともコアとシェルとを含む。シェルはリガンド種を含み、リガンド種はコアに結合している。本明細書において、コアに結合したリガンド種は「結合リガンド種」と表記することがある。
【００１７】
一実施形態では、ナノ粒子組成物はコアシェル構造を有し、コアは遷移金属を含む（遷移金属酸化物を含むコアなど）。具体例として、タングステン、タンタル、ハフニウム、ジルコニウム、亜鉛、モリブデン、銀、鉄、マンガン、銅、コバルト、ニッケルの酸化物又はこれらの遷移金属酸化物の２種以上の組合せがある。一実施形態では、コアは超常磁性酸化鉄を含む。１以上の実施形態では、標品中の複数のナノ粒子の金属含有量は０．５〜３００ｍｇ／ｍＬの範囲である。コアの構造と組成については、別途（より具体的には図２を参照しながら）詳しく説明する。
【００１８】
１以上の実施形態では、ナノ粒子シェルは、ある原子団（ｍｏｉｅｔｙ）を含むリガンド種を含む。その原子団は有機ホスフェートもしくはホスホネートと１以上の親水基とを含む。一実施形態では、リガンド種は、１以上のホスフェートもしくはホスホネート基と、ポリエチレンエーテル部分、ポリプロピレンエーテル部分、ポリブチレンエーテル部分、もしくは上記部分の２以上の組合せを含む１以上の追加的な基とを含む。幾つかの実施形態では、ナノ粒子シェルは、１以上のホスフェート基もしくはホスホネート基と、ポリエチレンエーテル部分を含む１以上の親水基とを含むリガンド種を含む。幾つかの実施形態では、シェルは１以上のリガンド種を含み、リガンド種はホスフェート、ホスホネート又はこれらの組合せを含む。ホスフェートは、モノホスフェート、ビス（ホスフェート）、ポリホスフェート又はこれらの組合せを含みうる。ホスホネートは、α−ヒドロキシホスホネート、モノホスホネート、ビスホスホネート、ポリホスホネート又はこれらの組合せを含みうる。別の幾つかの実施形態では、リガンド種はポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）官能基をさらに含む。幾つかの実施形態では、シェルはポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）官能化ホスフェート類、ＰＥＧ官能化モノホスフェート類、ＰＥＧ官能化α−ヒドロキシホスホネート類、ＰＥＧ官能化ビス（ホスフェート）類又はこれらの組合せを含む。ＰＥＧは親水ポリマーであり、ＰＥＧ官能化リガンド種でできたシェルは表面水和を大きく増進するため、粒子の可溶性とインビボ適合性が向上する。シェルの構造と組成については、別途（より具体的には図２を参照しながら）詳しく説明する。
【００１９】
１以上の実施形態では、上記方法は、ある量のリガンド種を精製組成物に添加することにより、コアと結合していない過剰のリガンド種を含む標品を形成する工程を含む。標品の作製のために精製ナノ粒子組成物に添加されるリガンド種は、シェル内に存在してナノ粒子コアと結合されるリガンド種と構造的に等しい。既述のように、「リガンド種の添加量の少なくとも一部はコアに結合しないまま残る」という文言は、本明細書において「遊離リガンド種」もしくは「過剰の遊離リガンド種」と同義に使用される。遊離リガンド種も、ナノ粒子コアに結合したリガンド種と構造的に等しい。
【００２０】
高温において、結合リガンド種はコアから解離しうる。それによってナノ粒子の凝集確率が高まる。ナノ粒子が凝集すると標品中の遊離リガンド種の量が減少しうる。理論に束縛されるものではないが、コアから解離したリガンド種が遊離リガンド種と置き換わりうることが示唆されている。その仕組みをここでは「リガンド交換」と呼ぶ。標品中に遊離リガンド種が存在することで、ナノ粒子のコアシェル構造の完全性が高温においても維持される。
【００２１】
１以上の実施形態では、標品中に存在する遊離リガンド種はコアから解離したリガンド種に置き換わりうる。遊離リガンド種と結合リガンド種は構造的に等しいため、ナノ粒子表面の化学的性質は不変である。１以上の実施形態では、遊離リガンド種はポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）官能化モノホスフェート類、ＰＥＧ官能化α−ヒドロキシホスホネート類、ＰＥＧ官能化ビス（ホスフェート）類又はこれらの組合せを含む。一例において、ナノ粒子組成物の結合リガンド種がＰＥＧ官能化α−ヒドロキシホスホネートの場合、標品中に存在する遊離リガンド種もＰＥＧ官能化α−ヒドロキシホスホネートであり、滅菌時のナノ粒子の表面特性が維持される。遊離リガンド種の濃度は標品中のナノ粒子の濃度変化に応じて変化する。１以上の実施形態では、標品に添加される遊離リガンド種の量は、ナノ粒子コア中に存在する金属のモル数に対してリガンド約０．００５〜２モルの範囲である。
【００２２】
既述のように、標品はキャリア流体をさらに含む。１以上の実施形態では、キャリア流体は水、エタノール又はこれらの組合せを含む。ナノ粒子のコアシェル構造は安定した状態を維持する。すなわち、キャリア流体中に不適当に凝集することなく懸濁した状態を維持する。１以上の実施形態では、キャリア流体に追加化合物を添加すると、ナノ粒子標品のイオン強度は上昇しうる。１以上の実施形態では、この追加化合物は、マンニトール、デキストロース、スクロース、ラクトース、ソルビトール、キシリトール、及びマルチトールなどの糖類；プロピレングリコールなどのアルコール類；非改質ＰＥＧ類やポリビニルピロリジノンなどの合成ポリマー；Ｔｗｅｅｎ、Ｃｒｅｍａｐｈｏｒ、及びＬａｂａｓｏｌなどの界面活性剤；及び生体適合性の塩（例えば、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム、重炭酸カリウム）又はその組合せを含む。幾つかの実施形態では、キャリア流体はナノ粒子懸濁液の作製に使用されうる。一例において、キャリア流体としてエタノールが用いられる。エタノールはナノ粒子の水性懸濁液を形成するために標品作製の最終工程において気化されうる。１以上の実施形態では、キャリア流体は希釈剤として用いられうる。キャリア流体は、標品中のナノ粒子もしくは過剰のリガンド種の濃度を最適化又は改変するためにも使用されうる。幾つかの実施形態では、標品が造影剤として使用される場合、キャリア流体はナノ粒子標品を含む注射可能な媒体中に使用される。１以上の実施形態では、キャリア流体は医薬品賦形剤として機能しうる。標品を医薬品の薬物担体として用いる場合、キャリア流体は薬物担体に対する媒体として用いられうる。
【００２３】
幾つかの実施形態では、上記方法は、ある量の流体をキャリア流体に添加する工程をさらに含む。当該量の流体は金属の濃度をある指定範囲内に調整するために組成物に添加される。上記添加量の流体は、エタノール、水又はこれらの組合せを含みうる。別の幾つかの実施形態では、上記方法は、薬学的に許容されるある量の賦形剤（緩衝剤、糖、塩、又は２種以上の賦形剤の組合せなど）を添加する工程をさらに含む。例えば、薬学的に許容される塩は、塩化ナトリウム、臭化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、塩化カリウム、臭化カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム、重炭酸カリウムを含む。他の幾つかの例では、薬学的に許容される糖は、マンニトール、デキストロース、スクロース、ラクトース、ソルビトール、キシリトール、及びマルチトールを含みうる。
【００２４】
既述のように、幾つかの実施形態では、標品は加熱滅菌によって滅菌される。加熱滅菌は乾熱滅菌と湿熱滅菌に大別できる。ある特定の実施形態では、標品はオートクレービングによって加熱滅菌される。
【００２５】
上記方法の１以上の実施形態では、標品は高温のオートクレービングによって滅菌される。オートクレーブ滅菌は、標準的なオートクレーブ滅菌法に対する規制に準拠して実施されうる。本明細書中において、「高温」という用語は１００℃超など、オートクレービングに適した温度を表しうる。加熱滅菌では、滅菌は温置温度及び温置時間に依存する。バクテリア、ウイルス、菌類、及び胞子は、標準値１３４℃で３分以上、又は１２１℃で１５分以上、オートクレービングを行うことによって破壊しうる。１以上の実施形態に係る蒸気もしくは湿熱滅菌では、ナノ粒子標品は約１２１℃の温度で約１５分以上滅菌される。幾つかの実施形態では、１２１℃で約１５分間という条件は、海面付近の高度において大気圧を超える１５ポンド／平方インチ（ｐｓｉ）の圧力の蒸気を用いることによって得られる。乾熱滅菌も実施しうるが、乾熱滅菌に用いる温度は１〜２時間に対して標準値１６０℃である。上記方法の１以上の実施形態では、標品はオートクレービングによって滅菌される。幾つかの実施形態では、オートクレービングにおいて温度は１５分間にわたって１２１℃に保たれる。別の幾つかの実施形態では、標品は約２５６℃の温度で５分以上滅菌される。
【００２６】
ナノ粒子が通常、凝集体を形成する他の加熱滅菌過程とは異なり、本発明の実施形態ではナノ粒子は加熱滅菌中に凝集しにくい。１以上の実施形態では、上記方法は、滅菌時に過剰の遊離リガンド種の１以上が、コアに結合した１以上のリガンド種と交換されることで、ナノ粒子の凝集を防止しうる。リガンド種はナノ粒子のコアの周りにシェルを形成してコアを安定化する。
【００２７】
既述のように、上記方法は、コアとコアに結合したシェルとを含む１以上のナノ粒子を含む組成物を提供する工程を含む。その後、組成物を精製し、キャリア流体中に配置される１以上のナノ粒子を含む精製組成物を形成する。さらに、ある量のリガンド種を精製組成物に添加して標品を形成した後、標品を滅菌する。安定化ナノ粒子標品を提供する方法の例示的実施形態を、図１を参照してより詳しく説明する。
【００２８】
具体的に、図１は、高温において安定的な安定化ナノ粒子標品を作製する例示的方法を示すフローチャートである。複数のコアシェル型ナノ粒子８が、少なくともコアとシェルとを化合させることによって形成される。一般に、ナノ粒子組成物の作製方法は、ナノ粒子状の金属酸化物コアを本発明のシェル組成物と接触させる工程を含み、シェルは、有機ホスフェートもしくはホスホネートと１以上の親水基とを含むリガンド種を含む。通常、接触は少なくとも１種類の有機溶媒と水とを含む混合物中で実施される。ナノ粒子の精製によって精製コアシェル型ナノ粒子１０が生成され、コアシェル前駆体中に存在する不要な化学種や、リガンド種交換後の過剰のリガンド種が除去されて、コアシェル型ナノ粒子、又は粒子に非特異的に結合するその他の物質が形成される。１以上の例において、ナノ粒子は分画分子量の原理に基づく濾過、及びその後の遠心分離による洗浄とそれに続くキャリア流体における精製ナノ粒子の再懸濁によって精製される。同じシェル材料の過剰のリガンド種とキャリア流体とを精製ナノ粒子に添加してナノ粒子標品１２を形成する。次に、標品１２を例えば加熱滅菌する。
【００２９】
上記方法の幾つかの実施形態では、安定化標品はナノ粒子コアと結合したリガンド種と遊離リガンド種との間で平衡状態を有しうる。室温において、ナノ粒子組成物は、結合リガンド種（シェル分子）の大部分がナノ粒子コアと相互作用する平衡状態となることで、十分に被膜されたコアシェル構造を形成し、ナノ粒子の凝集を防止しうる。
【００３０】
既述のように、幾つかの実施形態では、高温での滅菌時、結合リガンド種はコアから解離する。これはナノ粒子のコアシェル構造を不安定化して凝集の確率を高めうる。結合リガンド種は、ナノ粒子の水性懸濁液の水分子と平衡状態にありうる。リガンド種と水分子もしくは他のリガンド種との期待交換速度は、高温であるほど速くなりうる。ある論理的推定に基づくと、結合リガンド種がコアから解離する速度は高温において高速となり、過剰の遊離リガンド種がない状況において水分子は解離したリガンド種と置換しうる。シェルの被覆率が不十分なナノ粒子は凝集体を形成しうる。別の論理的仮説に基づくと、過剰のリガンド種を標品に添加することにより、コアに結合するリガンド種がコアシェル構造の完全性を高温において維持するように平衡を調整しうる。ある仮説によると、オートクレーブ滅菌時（標準値１２１℃）にリガンド種を遊離リガンド種としてコアシェル型ナノ粒子の精製組成物に添加すると、結合リガンド種に対する非結合リガンド種の比率がより大きく上昇し、コアに結合したリガンド種がコアシェル構造の完全性を高温において維持するのに役立つ。
【００３１】
図２を参照する。オートクレーブ滅菌において安定化ナノ粒子標品が形成される様子が１つの例示的方法について示されている。ここではコアシェル構造を有するナノ粒子の理想断面図が描かれている。図２は、ある例示的方法に用いられる一連の工程の概略を詳しく示したものである。ここにおいて、複数のコアシェル型ナノ粒子８は、少なくともコア６とシェル４とを化合させることによって形成される。シェル４はコア６に結合したリガンド種５を含む。ナノ粒子８は過剰のリガンド種９とその他の不純物２とを含む。それらは精製によって除去され、精製ナノ粒子組成物１０が形成される。ナノ粒子組成物は、キャリア流体中に配置される１以上のナノ粒子を含む。精製後、ナノ粒子にはオートクレーブ滅菌を実施しうる。このとき、シェル材料と同じリガンド種をある量添加してもよいし、しなくてもよい。上記添加量のリガンド種がない状況で精製ナノ粒子組成物１０にオートクレーブ滅菌を行うと、ナノ粒子１６の凝集が起こりうる。分岐のもう片方には、ある量のリガンド種１８が精製組成物１０に添加されてナノ粒子標品１２が形成される様子が示されている。ここで、上記添加量のリガンド種はシェル材料のリガンド種と構造的に等しい。次に、標品１２にオートクレーブ滅菌を行って安定化ナノ粒子標品１４を形成する。標品１４はオートクレービング時に高温において耐凝集性を有する。
【００３２】
コアシェル型ナノ粒子は当分野で知られている標準的な手順で作製されうる。コアシェル型ナノ粒子の懸濁液を洗浄し、ナノ粒子に非特異的に結合した過剰のリガンド種もしくは不純物を除去した後、後の使用のためにナノ粒子懸濁液を濃縮する。次に、精製ナノ粒子組成物を用いて、精製ナノ粒子組成物と、シェル材料と構造的に等しい過剰のリガンド種と、キャリア流体とを含む標品を作製する。次に、標品にオートクレーブ滅菌を実施する。本開示の「実施例」のセクションには、本発明によって提供されるナノ粒子組成物の標品に関するさらなる案内が記載されている。
【００３３】
本発明の１以上の実施形態は、図２に示す理想的なコアシェル構造を有するナノ粒子組成物１０に関する。ナノ粒子組成物１０は、図２に示すナノ粒子状の金属酸化物コア６とシェル４とを含む。一実施形態では、本発明が提供するナノ粒子組成物は、高温での加熱滅菌に対して本質的な安定性を示す水性懸濁液を形成する能力を特徴とする。
【００３４】
既述のように、標品は成分となるナノ粒子を含み、ナノ粒子の形状と大きさはそのナノ粒子の作製方法によって異なっていてもよいナノ粒子の断面図形は様々なものとすることができ、球、棒、管、薄片、繊維、板、線条、立方体、及びホイスカが含まれるが、これには限定されない。一実施形態では、粒子の断面図形は円形、楕円形、三角形、長方形、多角形、又は不規則形状の１以上とすることができる。或いは、非球形ナノ粒子は錐体もしくは細長い棒の形状を有しうる。一実施形態では、ナノ粒子の形状は球形である。
【００３５】
通常、ナノ粒子の平均粒径は１μｍ未満である。本明細書において「大きさ」及び「粒径」という用語は、動的光散乱法で測定したナノ粒子の流体力学的直径（ＤH）を言う。一実施形態では、本発明によって提供されるナノ粒子組成物は約２ｎｍ〜約５００ｎｍのＤHを有する。代替的な実施形態では、本発明によって提供されるナノ粒子組成物は約１０ｎｍ〜２５ｎｍのＤHを有する。一実施形態では、本発明によって提供されるナノ粒子組成物は５０ｎｍ未満のＤHを有する。別の実施形態では、本発明によって提供されるナノ粒子組成物は１０未満のＤHを有する。さらに別の実施形態では、本発明によって提供されるナノ粒子組成物は５未満のＤHを有する。粒径が小さいと、例えばナノ粒子組成物を造影剤として用いる画像診断後に、被験者の腎臓及びその他の器官からのナノ粒子組成物の消失を促進させるうえで有利である。
【００３６】
１以上の実施形態では、標品は、ナノ粒子を結晶形態や非晶質形態など様々な形態で含みうる。一実施形態では、標品中に存在するナノ粒子は結晶形態である。代替的な幾つかの実施形態では、標品のナノ粒子は非晶質形態で存在する。幾つかの実施形態では、標品はナノ粒子を結晶形態と非晶質形態の混合物として含みうる。
【００３７】
一実施形態では、標品はナノ粒子の混合物を含み、ナノ粒子の分布は均一である。例えば、標品は一種類のナノ粒子を含んでいてもよく、各ナノ粒子の形状と大きさはほぼ同じである。代替的な実施形態では、標品はナノ粒子の混合物を含み、ナノ粒子の分布は不均一である。別の幾つかの実施形態では、標品は複数種のナノ粒子の混合物を含んでいてもよく、ナノ粒子の大きさ又はナノ粒子の形状は異なっていてもよい
ナノ粒子が標品中に比較的容易に分散することで、室温における集塊化及び／又は凝集を防止しうる。凝集体では複数個のナノ粒子が物理的に互いに接触しうるのに対し、集塊は複数の凝集体が物理的に互いに接触しうる。
【００３８】
ナノ粒子組成物の金属酸化物コアは、ナノメートル単位で適切に測定される寸法を有する。様々な実施形態では、ナノ粒子状の金属酸化物コアは希釈剤中の懸濁物質として調製されうる。また、ナノ粒子状の金属酸化物コアの懸濁粒子における流体力学的直径は、例えば動的光散乱法によって測定されうる。一実施形態では、ナノ粒子状の金属酸化物コアの大きさは透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって測定される。ナノ粒子状の金属酸化物コアの直径は約１ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲にある。代替的な実施形態では、ナノ粒子状の金属酸化物コアは直径が約１〜３０ｎｍである。１以上の実施形態では、ナノ粒子状の金属酸化物コアはナノ粒子状の超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）を含み、ＴＥＭで測定される直径は約２５ｎｍ未満である。
【００３９】
一実施形態では、コアは遷移金属を含む。一部の実施形態では、コアは遷移金属元素の１以上の誘導体（それら遷移金属元素の１以上を含有する、酸化物、炭化物、硫化物、窒化物、りん化物、ほう化物、ハロゲン化物、セレン化物、及びテルル化物など）を含む。「金属」という用語は、遷移金属元素を成分として含む金属もしくは非金属物質が存在することを意味する。
【００４０】
上記のように、一実施形態では、ナノ粒子状の金属酸化物コアは、タングステン、タンタル、ハフニウム、ジルコニウム、亜鉛、モリブデン、銀、鉄、マンガン、銅、コバルト、ニッケルの酸化物を含む遷移金属酸化物又はこれらの遷移金属酸化物の２種以上の組合せを含む。幾つかの実施形態では、金属酸化物コアは遷移金属を含み、その遷移金属は磁性挙動（例えば超常磁性挙動を含む）を示す。幾つかの実施形態では、金属酸化物コアは、鉄、マンガン、銅、コバルト、ニッケル又はこれらの組合せからなる群から選択される常磁性金属を含む。ある具体的な実施形態では、金属酸化物コアは超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）を含む。一実施形態では、酸化鉄は別の金属でドープされる。１以上の実施形態では、ナノ粒子のコアは超常磁性酸化鉄を含み、ナノ粒子の粒径は最大で約５０ｎｍである。
【００４１】
一実施形態では、ナノ粒子状の金属酸化物コアは単一の遷移金属酸化物、例えば酸化タンタル、酸化ハフニウム、又は酸化鉄のみからなる。別の実施形態では、ナノ粒子状の金属酸化物コアは２種以上の遷移金属酸化物を含む。したがって、一実施形態では、ナノ粒子状の金属酸化物コアは酸化タンタルと酸化ハフニウムをともに、又は酸化タンタルと酸化鉄をともに含む。一実施形態では、ナノ粒子状の金属酸化物コアは酸化鉄のみを含む。
【００４２】
通常、ナノ粒子状の金属酸化物コアは、遷移金属酸化物の遷移金属成分を重量比で少なくとも３０％含む。ナノ粒子状の金属酸化物コアにおける遷移金属含有量が比較的高いことから、単位体積当たりの放射線不透過度が比較的高いナノ粒子組成物が生成され、それによって造影剤としてより効果的な性能が実現しうる。遷移金属含有量が比較的高いことで、粒子はコンピュータ断層撮影（ＣＴ）などＸ線撮影用途の造影剤として有用なものとなる。このような特性をもたらしうる遷移金属元素の例として、タングステン、タンタル、ハフニウム、ジルコニウム、モリブデン、銀、及び亜鉛がある。
【００４３】
幾つかの実施形態では、本発明のナノ粒子標品は磁気共鳴（ＭＲ）造影剤として用いられうる。ＭＲ造影剤として使用するため、本発明によって提供されるナノ粒子組成物は、有利にも常磁性金属種を含む。特に関心があるのは、超常磁性金属種を含む組成物である。可能な常磁性及び超常磁性物質の例として、鉄、マンガン、銅、コバルト、ニッケル、又は亜鉛を１種以上含む物質がある。特に関心がある一連の物質は、酸化鉄、とりわけＳＰＩＯをベースとする物質である。それらは通常、コアにおいて重量比で約６５％〜約７５％の鉄を含む。一実施形態では、ナノ粒子状の金属酸化物コアは、一般式［Ｆｅ2+Ｏ3］x［Ｆｅ２+Ｏ3（Ｍ2+Ｏ）］1-xを有する鉄化合物を含む。ただし、１≧ｘ≧０であり、かつＭ2+は鉄、マンガン、ニッケル、コバルト、マグネシウム、銅、亜鉛のカチオン、及びかかるカチオンの組合せなどの金属カチオンである。この一般式の範囲に該当する鉄化合物の例として、金属カチオン（Ｍ2+）が鉄（ＩＩ）イオン（Ｆｅ2+）でｘ＝０のときのマグネタイト（Ｆｅ3Ｏ4）、及びｘ＝１のときの磁赤鉄鉱（γ−Ｆｅ2Ｏ3）がある。
【００４４】
図２に示すように、ナノ粒子組成物１０はナノ粒子状の金属酸化物コア６を完全に被覆するシェル４を含む。したがって、一部の実施形態では、ナノ粒子組成物はコアを実質的に被覆するシェルを含むと言われる。「実質的に被覆する」という文言は、シェル被覆を有さないコアに比べ、シェルによるコアの表面被覆パーセンテージが約２０％超であることを意味する。本明細書において、「表面被覆パーセンテージ」という用語は、シェルに被覆されないコア表面に対する、シェルに被覆されるコア表面の比を表す。幾つかの実施形態では、ナノ粒子の表面被覆パーセンテージは約４０％超である。
【００４５】
幾つかの実施形態では、シェル４は水溶性の改善の促進、凝集体の形成の低減、ナノ粒子の酸化防止、コアシェル体の均質性の維持、及び／又はナノ粒子組成物に対する生体適合性の付与を実現しうる。
【００４６】
シェル４の平均厚さは通常、約１〜約５０ｎｍの範囲である。一実施形態では、シェルの平均厚さは５０ｎｍ未満である。別の実施形態では、シェルの平均厚さは８ｎｍ未満である。さらに別の実施形態では、シェルの平均厚さは５ｎｍ未満である。
【００４７】
１以上の実施形態では、ナノ粒子組成物は、ナノ粒子状の金属酸化物コアの上に配置される複数のシェル層を含みうる。処理条件を好適に選択することにより、ナノ粒子状の金属酸化物コア種は希釈剤中の懸濁物質として調製されうる。その後、第１の条件群のもとで１種以上の安定剤物質によって処理を行い、第１のシェルを含む第１のナノ粒子組成物を生成した後、第１のナノ粒子組成物を第２の条件群のもとで１種以上の異なる安定剤物質によって処理を行い、第１のシェル及び第２のシェルをともに含む第２のナノ粒子組成物を生成しうる。
【００４８】
本発明によって提供されるナノ粒子組成物は、ナノ粒子状の金属酸化物コアと、リガンド種を含有するシェルとの間に１：１の化学量論的比率を示唆するものではなく、ナノ粒子組成物をナノ粒子状の金属酸化物コアとリガンド種を含有するシェルとを含むものとして特定するものである。リガンド種は、１以上の親水基を含む有機ホスフェートもしくはホスホネート基を含む１以上の原子団を含む。既述のように、１以上の親水基を含む有機ホスフェートもしくはホスホネートは完全にプロトン化した形態であってもよく、イオン化形態であってもよい。通常、ある所与のナノ粒子状の金属酸化物コア粒子の表面には、１以上の親水基を含む複数の有機ホスフェートもしくはホスホネートが関与しうる。幾つかの実施形態では、リガンド種は、ナノ粒子状の金属酸化物コアと水素結合を介して結合している。幾つかの実施形態では、リガンド種は、ナノ粒子状の金属酸化物コアと１以上の共有結合を介して結合している。他の実施形態では、リガンド種はナノ粒子状の金属酸化物コアとイオン結合を介して結合しうる。
【００４９】
既述のように、ナノ粒子は、有機ホスフェートもしくはホスホネートと１以上の親水基とを含むリガンド種を含む。親水基はポリエチレンエーテル部分から選択される。ポリエチレンエーテル部分は、オキシエチレンオキシ構造単位−ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ−、及び／又は置換オキシエチレンオキシ構造単位を含む部分として定義される。便宜上、並びにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）という用語と構造が近い関係にあることから、本明細書ではかかる部分を時にＰＥＧ基もしくはＰＥＧ部分ともいう。それらの特性は部分分子量によって示される。同様に、ポリプロピレンエーテル部分はオキシプロピレンオキシ構造単位−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−、及び／又は置換オキシプロピレンオキシ構造単位を含む部分として定義される。便宜上、本明細書ではポリプロピレンエーテル部分を時にポリプロピレングリコール基もしくは部分ともいう。同様に、ポリブチレンエーテル部分はオキシブチレンオキシ構造単位−ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2Ｏ−、及び／又は置換オキシブチレンオキシ構造単位を含む部分として定義される。便宜上、本明細書ではポリブチレンエーテル部分を時にポリＴＨＦ部分ともいう。
【００５０】
幾つかの実施形態では、シェルはホスフェート基を１つ含むリガンド種を含む。本明細書ではこれをモノホスフェートと別称する。１以上の実施形態では、ホスフェートはＰＥＧ部分に結合し、ＰＥＧの分子量は３５０、４４０、７５０、２０００、又は５０００ダルトン（原子質量単位）とすることができる。そのため、本明細書ではリガンド種をｍＰＰ３５０と表記する。ここに、ｍＰＰ３５０はＰＥＧ３５０に連結したモノホスフェートを示す。より具体的には、ｍＰＰ３５０は分子量が３５０ｇ／ｍ程度で、一方の末端水酸基がメトキシル化され、かつもう片方の末端水酸基がホスフェートモノエステルに変換されたＰＥＧ分子として定義される。同様に、ナノ粒子標品には、ｍＰＰ４４０、ｍＰＰ７５０、ｍＰＰ２０００、又はｍＰＰ５０００も用いられうる。
【００５１】
２以上のホスフェート基を含むリガンド種がシェルに含まれる実施形態では、その２つのホスフェート基は互いに対して１，２；１，３；１，４；１，５；又は１，６の空間的関係を成す位置を占めうる。この２以上のホスフェート基における１，２の空間的関係は、１，２−ビスホスフェート；２，３−ビスホスフェート；３，４−ビスホスフェート；４，５−ビスホスフェート；５，６−ビスホスフェートなどの実施形態を含む。この原理を２以上のホスフェート基における１，３；１，４；１，５；及び１，６の空間的関係に拡張することは当業者なら十分に理解するだろう。本明細書では、かかるリガンドを含むナノ粒子組成物について、「１，２−ＢＰＰ３５０」の表記は、１，２の空間的関係にある２つのホスフェート基と、部分分子量が３５０ダルトンのポリエチレンエーテル部分とを含む原子団を表す。同様に、「１，２−ＢＰＰ４４０」の表記は、１，２の空間的関係にある２つのホスフェート基と、部分分子量が４４０ダルトンのポリエチレンエーテル部分とを含むリガンド種を表す。
【００５２】
１以上の実施形態では、シェルはリガンド種を含み、リガンド種はモノホスホネート、ビスホスホネート、又はα−ヒドロキシホスホネートを含む。一実施形態では、ナノ粒子シェルは親水性部分としてホスホネート及びＰＥＧを含む。それにより、リガンド種はＰＥＧ官能化ホスホネートとなっている。幾つかの実施形態では、ナノ粒子シェルはα−ヒドロキシホスホネートと親水性部分とを含み、親水性部分はα−水酸基が結合した炭素原子を介して連結される。１以上の実施形態では、α−ヒドロキシホスホネートはＰＥＧ部分に結合し、ＰＥＧの分子量は３５０、４４０、７５０、２０００、５０００、１００００、又は３００００ダルトンとすることができる。そのため、本明細書ではリガンド種をα−ＨｍＰＰ３５０と表記する。ここに、α−ＨｍＰＰ３５０はＰＥＧ３５０と連結したα−ヒドロキシホスホネートを示す。同様に、ナノ粒子標品には、α−ＨｍＰＰ４４０、α−ＨｍＰＰ７５０、α−ＨｍＰＰ２０００、α−ＨｍＰＰ５０００、α−ＨｍＰＰ１００００、又はα−ＨｍＰＰ３００００も用いられうる。ヒト被験者のインビボ治療に対して検討されるナノ粒子では、α−ヒドロキシホスホネートと親水性部分との結合は炭化水素であってもよく、処置されるナノ粒子とヒト組織とが相互作用する可能性が最小限に抑えられる。
【００５３】
既述のように、リガンド種はポリエチレンエーテル部分を含む親水基を１以上含む。ナノ粒子状の金属酸化物コア（並びに全体としてナノ粒子組成物）を安定化するリガンド種の効果は、その構造に依存することがわかっている。様々な実施形態では、ナノ粒子状の金属酸化物コアを安定化するリガンド種の効果は親水性部分の大きさに依存し、それは本明細書において時に親水基の部分分子量の形で記載されることがある。
【００５４】
一般に、リガンド種の構造は、ある特定のナノ粒子状の金属酸化物コアを効果的に安定化するように編成されうる。また、リガンド種中に存在する親水基は、比較的低い基分子量（例えば１００グラム／「モル」未満）と比較的高い基分子量（例えば１０，０００グラム／「モル」超）のいずれかを有しうる。親水基はポリエチレンエーテル部分を１以上含むため、それらの部分の大きさ及び分子量（本明細書では時に部分分子量と呼ぶ）は親水基全体の基分子量に寄与する。一実施形態では、親水基は、部分分子量が約７５０ダルトン〜約２０，０００ダルトンの範囲にあるポリエチレンエーテル部分を含む。代替的な実施形態では、親水基は、部分分子量が約２０００ダルトンのポリエチレンエーテル部分を含む。さらに別の実施形態では、親水基は、部分分子量が２０，０００ダルトン未満であるポリエチレンエーテル部分を含む。さらなる別の実施形態では、親水基は、部分分子量が２０００ダルトン未満であるポリエチレンエーテル部分を含む。さらに別の実施形態では、親水基は、部分分子量が３５０ダルトン未満であるポリエチレンエーテル部分を含む。本明細書で言う「ダルトン」及び「グラム／モル」は互換的であり、親水基の基分子量、又はポリエチレンエーテル部分及びかかる部分の置換物の部分分子量のいずれかに適用される場合に、その基もしくは部分を含有するリガンド種１モル中に存在する、その基もしくは部分のグラム数の重量を表す。
【００５５】
１以上の実施形態では、ナノ粒子組成物のリガンド種は、一部の実施形態では、ポリアルキレンエーテル部分に見られるエーテル結合（−Ｏ−）以外にも原子団を含む親水基を含む。したがって、リガンド種にはエーテル基以外にも多様な官能基が存在しうる。そのような官能基には、例えば、エステル基、アミン基、アミド基、カルバメート基、尿素基、炭酸基、チオエーテル基、セレノエーテル基、シロキサン基、スルフィニル基、スルホニル基、及び基の２種以上の組合せがある。幾つかの実施形態では、かかる官能基は親水基そのものの構成要素であってもよく、親水基とはみなされないリガンド種の一部であってもよい。ナノ粒子組成物について想定される最終用途はかかる官能基の選択に影響を与えうる。
【００５６】
ナノ粒子組成物について想定される最終用途は、リガンド種に用いられる親水基の選択に影響を与えうる。例えば、ナノ粒子組成物をインビボ、特にヒト被験者のインビボに用いる場合、タンパク質などの組織成分と強く結合しうる親水基は避けるのが望ましい可能性がある。インビボ利用の場合、ポリアルキレンエーテルなど、本質的に正味荷電のない親水基が特に関心の対象となる。さらに、ヒト被験者に使用する場合は、安全性評価のためにナノ粒子組成物の特性評価が容易かつ再現可能に実施できる親水基が特に望ましい。本発明によって提供されるナノ粒子組成物は通常、約−４０ｍＶ〜＋４０ｍＶの範囲のゼータ電位を有する。
【００５７】
既述のように、本発明によって提供されるナノ粒子組成物は通常、遷移金属酸化物のコアと、キャリア流体中に配置されるリガンド種で構成されるシェルとを含む。ナノ粒子組成物において、コアに対するシェルの比率は元素分析によって決定されうる。リガンド種で処理する前の、金属酸化物ナノ粒子の化学的構成及びその平均の大きさの知識から、ナノ粒子状の金属酸化物コアの粒子１つ当たりのリガンド種の量が計算できる。一実施形態では、本発明は、ナノ粒子状酸化鉄コアとリガンド種を含むシェルとを含むナノ粒子組成物を提供し、鉄に対するリガンド種のモル比は約０．０１〜約０．２５の範囲である。
【００５８】
既述のように、本発明によって提供されるナノ粒子組成物は画像診断のための造影剤として用いられうる。かかる用途では、それらのナノ粒子組成物が被験者（一部の実施形態ではほ乳類の被験動物）に投与された後、被験者は撮影を受ける。本発明によって提供されるナノ粒子組成物はＭＲ撮影において特に有用だが、超音波又は放射性トレーサ撮影の造影剤としても有用である。さらに、本発明によって提供されるナノ粒子組成物は、細胞培養浸出など他の分野においても有用である。幾つかの実施形態では、ナノ粒子は治療薬又は診断薬を１種以上含む。幾つかの実施形態では、滅菌済み標品が造影剤として、或いは治療用途に用いられる。例として、磁気共鳴撮影（ＭＲＩ）、薬物送達、遺伝子導入、補充治療などがある。
【００５９】
一実施形態では、本発明は、適正なオスモル濃度及びｐＨを有する安定的な水性コロイド懸濁液として、被験者に投与する前に希釈に適した濃縮水性コロイド懸濁液として、投薬部位に送達されうる診断薬組成物を提供する。代替的な実施形態では、本発明は、凍結乾燥によって得られる等、再構成に適した粉末として診断薬組成物を提供する。
【００６０】
一実施形態では、本発明は、ほ乳類の被験動物への注射に適した診断薬組成物として用いられうる滅菌済み標品を提供する。この診断薬組成物は、本発明のナノ粒子標品と薬学的に許容される担体もしくは賦形剤とを含む。一実施形態では、賦形剤は診断薬組成物の任意選択成分である。適切な賦形剤の好例として、塩、崩壊剤（ｄｉｓｉｎｔｅｇｒａｔｏｒ）、結合剤、充填剤、及び潤滑剤の１以上があるが、これには限定されない。一実施形態では、薬学的に許容される担体は実質的に水である。
【００６１】
本発明によって提供される診断薬組成物は、本発明のナノ粒子組成物を薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と接触させることによって調製されうる。
【００６２】
画像診断、特にほ乳類の被験動物の、より具体的にはヒト被験者の画像診断に使用する場合、本発明によって提供される診断薬組成物は通常、賦形剤を１種以上含みうる（ただし必須ではない）薬学的に許容される担体中の、懸濁物質として投与される。注射、特に非経口注射による投与の場合、担体は通常、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、５％のデキストロース、マンニトール又はこれらの組合せの添加によって等浸透圧とされた水性媒体である。それはまた、通常、約７．３と７．４の間の適切な（生理的）ｐＨを有する。投与の手段は血管内（ＩＭ）、皮下（ＳＱ）、或いは最も一般的な静脈内（ＩＶ）である。ただし、投与はデポ剤の注入によっても行いうる。デポ剤はその後、被験者の血液又は組織にナノ粒子をゆっくりと放出する。或いは、投与は胃腸管撮影のための経口摂取によって、又は肺及び気道の撮影のための吸入によって行いうる。
【００６３】
ヒト被験者への投与、特に静脈内投与の場合、診断薬組成物は使用量において無毒であること、及びバクテリアやウイルスなどの感染体が存在せず、かつ発熱性物質が含まれないことが必要となる。したがって、診断薬組成物中に存在するナノ粒子組成物は必要な精製処理に対して安定的であり、かつその親水性の低下もしくは成分ナノ粒子の大きさの変化が生じないことが求められる。
【００６４】
本明細書は、最良の形態を含む例を用いて本発明を開示している。また、装置もしくはシステムの作製と使用、並びに内包される方法の実施を含め、当業者は本明細書によって本発明を実施することができる。本発明の特許可能範囲は特許請求の範囲によって規定されるとともに、当業者が想到する他の例を含みうる。そのような他の例は、特許請求の範囲の文言とは異ならない構造要素を有する場合、或いは特許請求の範囲の文言と大差のない等価な構造要素を有する場合に、特許請求の範囲の範囲内にあるものと考えられる。
【実施例】
【００６５】
当分野で知られる手順を用いてコアシェル型ナノ粒子を合成及び精製した。本発明の標品をつくるために過剰のリガンド種を合成して下記の実施例に使用した。かかるリガンド種及びコアシェル型ナノ粒子の製造については、米国特許出願公開第２０１１０１０４０７２Ａ１号明細書及び米国特許出願第１２／９６８６４５号明細書に記載がある。本明細書では、α−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホネートなどのリガンド種を合成する標準的な１つの方法について記載する。また本明細書では、α−ヒドロキシホスホネートを有するＰＥＧ３５０、α−ヒドロキシホスホネートを有するＰＥＧ５０００、ビスホスホネートを有するＰＥＧ５０００の合成、及びα−ヒドロキシホスホネートを有するＰＥＧ５０００で被覆した精製ＳＰＩＯの合成に関する実施例を記載している。
【００６６】
実施例１：ＰＥＧ３５０α−ヒドロキシホスホネートなどの過剰のリガンド種の合成
ＰＥＧ−３５０コンジュゲートの合成
【００６７】
【化１】
2015525741.tif 000002
ＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒドの合成：ＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）（３．４３８ｇ、９．８２ｍｍｏｌ）がＣＨ2Ｃｌ2（９８ｍＬ）中に溶解した溶液にデス・マーチン・ペルヨージナン（５．００ｇ、１１．７９ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で２０時間にわたって攪拌した。反応時に微細な白色沈殿物が生じたため、反応終了時にセライトのパッドを用いた濾過によってそれを除去した。真空中で濾液から溶媒を除去すると、黄色い油の中に懸濁する白色固形物が残った。この固形物をジエチルエーテルで粉末化し、セライトのパッドを用いた濾過によって除去した。真空中で濾液から溶媒を除去すると、生成物であるＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒド（３．４２ｇ、１００％）が黄色い油として残留した。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ９．７３（ｔ，Ｊ＝４Ｈｚ，１Ｈ）、４．１６（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ，２Ｈ）、３．６５（ｍ，２４Ｈ）、３．３８（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。ＩＲ（ｎｅａｔ）２８７３、１７３２、１４５５、１３５０、１１０９、１０４０、９４８、８５１、７４９ｃｍ-1。
【００６８】
【化２】
2015525741.tif 000003
ジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホネートの合成：ＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）アセトアルデヒド（３．７１ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）がテトラヒドロフラン（５３ｍＬ）中に溶解した溶液に亜リン酸ジエチル（１．７７ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を０℃まで冷却し、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデク−７−エン（１．９４ｇ、１２．８ｍｍｏｌ）。０℃で１０分間攪拌した後、反応物を室温まで温め、さらに２４時間にわたって攪拌した。真空中で溶媒を除去すると暗黄色の油が残ったので、これをカラムクロマトグラフィー（１００％ＣＨ2Ｃｌ2から１５％ＭｅＯＨ／８５％ＣＨ2Ｃｌ2）を用いて精製すると、３．３０ｇ（６４％）の所望のジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホネート生成物が黄色い油として得られた。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ４．１９（ｍ，６Ｈ）、３．６５（ｍ，２４Ｈ）、３．３８（ｓ，３Ｈ）、１．３４（ｍ，６Ｈ）ｐｐｍ。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２３．１ｐｐｍ。ＩＲ（ｎｅａｔ）３３４３、２８７２、１７２５、１４５３、１２４８、１１０５、９６５、８５０、７９１ｃｍ-1。
【００６９】
【化３】
2015525741.tif 000004
α−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホン酸の合成：ジエチルα−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホネート（３．６１ｇ、７．４３ｍｍｏｌ）が塩化メチレン（７４ｍＬ）中に溶解した溶液に臭化トリメチルシリル（３．４１ｇ、２２．３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で２時間にわたって攪拌した。真空中で溶媒を除去すると褐色の油が残った。得られた油をアセトン（７４ｍＬ）と水（０．５ｍＬ）に溶かし、得られた溶液を室温で１．５時間攪拌した。さらに真空中で溶媒を除去すると、所望のα−ヒドロキシＰＥＧ−３５０モノ（メチルエーテル）ホスホン酸生成物（２．６６ｇ、８４％）が金色の油として残留した。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．６５（ｍ，２４Ｈ）、３．３８（ｓ，３Ｈ）。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２４．０ｐｐｍ。ＩＲ（ｎｅａｔ）３４６０、２８７０、１７２７、１４５６、１３５１、９４５、８４９ｃｍ-1。
【００７０】
実施例２：ＰＥＧ５０００α−ヒドロキシホスホネートなどの過剰のリガンド種の合成
【００７１】
【化４】
2015525741.tif 000005
ｍＰＥＧ５０００−エポキシドの合成：エピクロロヒドリン（８４．６８ｍＬ、１．０８０ｍｏｌ）に水（４．３２ｍＬ）を懸濁させ、ＮａＯＨ（４３．２０ｇ、１．０８０ｍｍｏｌ）、次いで塩酸トリエチルアンモニウム（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（１．１８ｇ、０．００９ｍｏｌ）を添加した。溶液を攪拌しながら７０℃に加熱した。その間、ＰＥＧ５０００モノ（メチルエーテル）（５００ｇ、０．１００ｍｏｌ）を昇温につれて何回かに分けて添加した。得られた懸濁液をその温度で４時間にわたって攪拌した後、室温まで冷却した。水（５００ｍＬ）を加え、生成物をＣＨ2Ｃｌ2（２×１０００ｍＬ）で抽出した。ＣＨ2Ｃｌ2を真空中で除去し（乾燥状態にはせず、濃厚な油の状態にとどめた）、得られた油をＴＨＦ（４００ｍＬ）／ヘキサン類（２００ｍＬ）から再結晶させた（ＴＨＦを添加して加熱した後、ヘキサン類を添加し、透明になるまで３０秒程度、攪拌する）。こうして４９９．９３ｇ（理論的質量の９９％）の所望生成物が灰白色固形物として得られた。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．８１（ｍ，２Ｈ）、３．６４（ｍ，４２２Ｈ）、３．４６（ｍ，２Ｈ）、３．３８（ｓ，３Ｈ）、３．１７（ｍ，１Ｈ）、２．７９（ｍ，１Ｈ）、２．６１（ｍ，１Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７１．９７、７１．８９、７０．５３、５９．００、５０．７６、４４．２２。
【００７２】
【化５】
2015525741.tif 000006
ｍＰＥＧ５０００−ジオールの合成：ｍＰＥＧ５０００−エポキシド（４９９．９３ｇ、９８．８８ｍｍｏｌ）を０．５ＭのＨ2ＳＯ4（２０００ｍＬ）に溶解させ、室温で１．５時間攪拌した（物質を完全に溶かすのに約３０分、さらに反応に１時間）。その後、ＣＨ2Ｃｌ2（２×１０００ｍＬ）を用いて反応物を抽出した。ＣＨ2Ｃｌ2を真空中で除去し（乾燥状態にはせず、濃厚な油の状態にとどめた）、得られた油をＴＨＦ／ヘキサン類（４００ｍＬ：２００ｍＬ）から再結晶させた（ＴＨＦを添加して加熱した後、ヘキサン類を添加し、透明になるまで３０秒程度、攪拌する）。こうして４１１．８８ｇ（理論的質量の８２％）の所望生成物が灰白色固形物として得られた。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．７５（ｍ，２Ｈ）、３．５７（ｍ，４２２Ｈ）、３．３９（ｍ，２Ｈ）、３．３１（ｓ，３Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７２．８８、７１．９１、７０．５５、６３．９３、５９．０２。
【００７３】
【化６】
2015525741.tif 000007
ｍＰＥＧ５０００−アルデヒドの合成：ｍＰＥＧ５０００−ジオール（２０８ｇ、４０．９９ｍｍｏｌ）を水（３２０ｍＬ）に溶かし、室温で約４５分間攪拌した。この不透明溶液に、水（９０ｍＬ）にあらかじめ溶かしたＮａＩＯ4（１０．７ｇ、５０ｍｍｏｌ）の溶液を３０分程度かけて等量に分けて添加した。１．５〜２時間ほどで透明になった後、最終的な酸化剤添加を行った。次に、反応物を１６時間にわたって攪拌し、プロピレングリコール（１．２０ｍＬ）の添加によって急冷した。次いで水性反応混合物をＣＨ2Ｃｌ2（１×１０００ｍＬ、１×５００ｍＬ）で抽出した。有機層を統合し、ＣＨ2Ｃｌ2を真空中で除去した（乾燥状態にはせず、濃厚な油の状態にとどめた）。得られた金色の油をＴＨＦ／ヘキサン類（４００ｍＬ：２００ｍＬ）から再結晶させた（ＴＨＦを添加して加熱した後、ヘキサン類を添加し、透明になるまで３０秒程度、攪拌する）。こうして１８３．７７ｇ（理論的質量の８９％）の所望生成物が白色固形物として得られた。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ９．６６（ｍ，１Ｈ）、４．１０（ｍ，２Ｈ）、３．７５（ｍ，２Ｈ）、３．５８（ｍ，４２２Ｈ）、３．３９（ｍ，２Ｈ）、３．３１（ｓ，３Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２００．９４、７１．９０、７１．１８、７０．５４、５９．０１、５３．５６。
【００７４】
【化７】
2015525741.tif 000008
ジベンジル−α−ＨｍＰＰ５０００の合成：ｍＰＥＧ５０００−アルデヒド（１８１．４５３ｇ、３５．９７ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（８５０ｍＬ）に溶かしてトリエチルアミン（５．０１ｍＬ、３５、９７ｍｍｏｌ）を添加し、約３０分間攪拌した。その後、亜リン酸ジベンジル（９．４３ｇ、３５．９７ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。室温で４８時間の攪拌を行った後、真空中で溶媒を除去した（乾燥状態にはせず、濃厚な油の状態にとどめた）。得られた油をＴＨＦ／ヘキサン類（３５０ｍＬ：１７５ｍＬ）から再結晶させた（ＴＨＦを添加して加熱した後、ヘキサン類を添加し、透明になるまで３０秒程度、攪拌する）。こうして１７５．５９ｇ（理論的質量の９２％）の所望生成物が白色固形物として得られた。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．３４（ｍ，１０Ｈ）、５．１０（ｍ，４Ｈ）、３．７９（ｍ，１Ｈ）、３．７５（ｍ，２Ｈ）、３．６４（ｍ，４６０Ｈ）、３．５３（ｍ，４Ｈ）、３．３７（ｓ，３Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１３６．４０、１３６．２７、１２８．７４、１２８．６０、１２８．４３、１２７．９９、７１．９８、７１．１７、７０．６１、６８．６７、６８．１３、６４．８５、６７．５９、５９．０８。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２３．９２。
【００７５】
【化８】
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α−ＨｍＰＰ５０００の合成：乾燥ジベンジル−α−ＨｍＰＰ５０００（１２２．８０ｇ、２３．１５ｍｍｏｌ）を無水エタノール（５００ｍＬ）と水（２５ｍＬ）に懸濁させ、１０％パラジウム炭素（４．０ｇ）を静かに加えた。次いで、吸収が終わるまでＨ2の雰囲気（バルーン圧）下で反応物を攪拌した。パラジウム炭素はセライトのパッドを用いた濾過によって除去し、溶媒は真空中で濾液から除去した（乾燥状態にはせず、濃厚な油の状態にとどめた）。得られた油をＴＨＦ／ヘキサン類（３００ｍＬ：１５０ｍＬ）から再結晶させ、１０９．７ｇ（理論的質量の９４％）の所望生成物が白色粉末として得られた。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ３．８１（ｍ，４Ｈ）、３．６４（ｍ，３６６Ｈ）、３．４７（ｍ，２Ｈ）、３．３８（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７２．００、７１．０４、７０．５４、５９．１１ｐｐｍ。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ２２．８５ｐｐｍ。
【００７６】
実施例４：ＰＥＧ５ｋビスホスフェート（ＢＰＰ５０００）の合成
【００７７】
【化９】
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ｍＰＥＧ５０００−１，２−ビス（ジベンジルホスフェート）の合成：ジベンジルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミダイト（１６．３４ｇ、９７．３ｍｍｏｌ）をＣＨ2Ｃｌ2（６００ｍＬ）に溶かした。テトラゾール（アセトニトリル中の０．４５Ｍ、４７．３ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を室温で３０分間攪拌した。次いで、ＣＨ2Ｃｌ2（１００ｍＬ）に溶解したｍＰＥＧ５０００−ジオール（６０．０ｇ、１１．８ｍｍｏｌ）を添加し、得られた溶液を５０℃で４８時間にわたって攪拌した。反応物を室温まで冷却し、ｔ−ブチルヒドロペルオキシド（４．２６ｇ、４７．３ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加した。反応物を室温で４．５時間にわたって攪拌した後、それを亜硫酸ナトリウムの１０％（重量／体積）溶液（２００ｍＬ）で洗浄した。得られた水性層をＣＨ2Ｃｌ2（５００ｍＬ）で抽出した。有機層を統合し、真空中で溶媒を除去すると、灰白色の固形物が得られた。これをシリカゲルを用いたカラムクロマトグラフィー（１００％ＣＨ2Ｃｌ2から２０％ＭｅＯＨ／８０％ＣＨ2Ｃｌ2）によって精製すると、４７．４７ｇ（７２％）の所望生成物が白色固形物として得られた。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７．３１（ｍ，２０Ｈ）、５．０４（ｍ，８Ｈ）、４．６３（ｍ，１Ｈ）、４．１４（ｍ，２Ｈ）、３．７４（ｍ，３Ｈ）、３．６５（ｍ，４４０Ｈ）、３．３８（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ０．０３、−０．７５ｐｐｍ。
【００７８】
【化１０】
2015525741.tif 000011
ＰＥＧ５ｋビスホスフェート（ＢＰＰ５０００）の合成：ｍＰＥＧ５０００−１，２−ビス（ジベンジルホスフェート）（４６．４６ｇ、８．３３ｍｍｏｌ）をエタノール（３００ｍＬ）に溶かした。これに１０％パラジウム炭素（２ｇ）を添加し、得られた懸濁液をＨ2（１ａｔｍ）下で４８時間攪拌した。触媒はセライトのパッドを用いた濾過によって除去し、溶媒を濾液から除去すると透明な油が残った。この油を２：１のＴＨＦ／ヘキサン類（３００ｍＬ）から結晶化した。結晶を真空濾過によって回収し、ヘキサン類（２×５０ｍＬ）で洗浄すると、４０．４ｇ（７４％）の所望生成物が白色固形物として得られた。1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ４．７１（ｍ，１Ｈ）、４．２０（ｍ，２Ｈ）、３．６５（ｍ，４４０Ｈ）、３．３８（ｓ，３Ｈ）ｐｐｍ。13Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ７４．９０、７１．７０、７０．３４、６５．８６、５８．８１ｐｐｍ。31Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3）δ１．１８、０．５３ｐｐｍ。
【００７９】
実施例５：ＰＥＧ５０００α−ヒドロキシホスホネート（α−ＨｍＰＰ５０００）でコートした精製ＳＰＩＯナノ粒子の合成
９．１７７ｇのα−ＨｍＰＰ５０００リガンド種を量り取り、それを磁性攪拌棒を備えた１Ｌの三角フラスコに入れた。８．９５５ｍｌのＮａＯＨ溶液（０．２Ｍ）を、１０４ｍｌの純水及び無水ＥｔＯＨ（２００ｍＬ）とともに添加した。フラスコを観察ガラスで覆った後、磁性攪拌棒で攪拌しながら、無色透明の溶液が得られるまでゆっくり加熱した。上記の溶液を２Ｌのジャケット式反応器に注入した。反応器は機械式攪拌機、テフロン（登録商標）製アンカー攪拌機、熱電対、窒素取入れ口とバブラ、及び還流凝縮器を備えていた。フラスコを無水ＥｔＯＨ（２×２５ｍＬ）ですすぎ、すすぎ液を反応器に入れた。無色透明の溶液を１００ｒｐｍで攪拌した。ベンジルアルコールに入れた３３０．６ｍｌの酸化鉄ナノ粒子コア溶液（６．０５ｇＦｅ／ｍｌ）を反応混合物に添加した。添加には、塩基で洗浄し、純水ですすぎ、オーブンで乾燥させたメスシリンダー、及び粉末用漏斗を用いた。メスシリンダーは無水ＥｔＯＨ（２×２５ｍＬ）ですすぎ、すすぎ液を反応器に入れた。単相の暗赤褐色溶液が観察された。攪拌速度を２００ｒｐｍに上げ、反応器に栓をし、攪拌しながら５０℃（内部温度）において窒素下で１８時間にわたり加熱した。１８時間の加熱後、反応器を２５℃まで冷却した。ＥｔＯＡｃ（６６０ｍＬ）と純水（３２０ｍＬ）を反応器に加え、バッフルを挿入して混合を強化した。反応混合物を５００ｒｐｍで１０分間攪拌した。攪拌を止めて相を分離させた。不透明な混合物は１０分以内に相分離を開始し、約３０分後には分離した透明な相が観察された。２４７グラムの暗赤褐色溶液からなる下側の水性相（ＳＰＩＯ粒子を含有）を反応器から２Ｌの２４／４０丸底フラスコに排出した。この溶液を水で８００ｍＬ（理論値は約２．５ｍｇＦｅ／ｍＬ）に希釈し、短時間の回転蒸発を行って残留揮発性有機物を除去した。次に溶液を滅菌濾過し（０．２２μｍ）、５０ｋＤａのＰＥＳ製Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの０．１ｍ2メンブレンを用いたタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって精製した。生成物を２４Ｌの純水で約３時間にわたって約１０ｐｓｉで洗浄した。その間、残液容器内の体積を２．５Ｌに維持した。洗浄の完了後、残液を約１２０グラム（約１６ｍｇＦｅ／ｍＬ）に濃縮した。１５０ｍＭの塩化ナトリウム溶液中で動的光散乱法によって測定した最終粒子の流体力学的直径は１９．２ｎｍであった。
【００８０】
実施例６：過剰のリガンド種を添加したオートクレーム滅菌
モノナトリウム塩（０．０１〜０．２５モル当量、対Ｆｅ）であるリガンド種を、リガンド種で被覆したＳＰＩＯナノ粒子を含む水溶液に溶かした。追加的な水を加え、最終鉄濃度が１〜３０ｍｇＦｅ／ｍＬの溶液を得た。得られた溶液を密封したガラス容器内に入れてオートクレービングした。オートクレービングはＴｕｔｔｎａｕｅｒ２３４０ＥＡ又はＳｔｅｒｉｓＳＶ−１４８Ｈのオートクレーブを用いて１２１℃で１５分間実施した。
【００８１】
実施例７：過剰のリガンド種及び他の添加剤を添加したオートクレーム滅菌
モノナトリウム塩（０．０１〜０．２５モル当量、対Ｆｅ）であるリガンド種を、リガンド種で被覆したＳＰＩＯナノ粒子を含む水溶液に溶かした。追加的な水とその他の添加剤（ＥｔＯＨ；最終体積比１０％、又はｄ−マンニトール；最終体積比５％）を加え、最終鉄濃度が１〜３０ｍｇＦｅ／ｍＬの溶液を得た。得られた溶液を密封したガラス容器内に入れてオートクレービングした。オートクレービングはＴｕｔｔｎａｕｅｒ２３４０ＥＡ又はＳｔｅｒｉｓＳＶ−１４８Ｈのオートクレーブを用いて１２１℃で１５分間実施した。
【００８２】
実施例８：過剰のリガンド種なしでのオートクレーム滅菌
リガンド種で被覆したＳＰＩＯナノ粒子を追加的な水で希釈し、最終鉄濃度が１〜３０ｍｇＦｅ／ｍＬの溶液を得た。得られた溶液を密封したガラス容器内に入れてオートクレービングした。オートクレービングはＴｕｔｔｎａｕｅｒ２３４０ＥＡｍ又はＳｔｅｒｉｓＳＶ−１４８Ｈのオートクレーブを用いて１２１℃で１５分間実施した。
【００８３】
実施例９：他の添加剤は添加されているが、過剰のリガンド種なしでのオートクレーム滅菌
リガンド種で被覆したＳＰＩＯナノ粒子を含有する水溶液を、追加的な水とその他の添加剤（ＥｔＯＨ；最終体積比１０％、又はＤ−マンニトール；最終体積比５％）で希釈し、最終鉄濃度が１〜３０ｍｇＦｅ／ｍＬの溶液を得た。得られた溶液を密封したガラス容器内に入れてオートクレービングした。オートクレービングはＴｕｔｔｎａｕｅｒ２３４０ＥＡ又はＳｔｅｒｉｓＳＶ−１４８Ｈのオートクレーブを用いて１２１℃で１５分間実施した。
【００８４】
実施例１０：動的光散乱法（ＤＬＳ）によるＳＰＩＯナノ粒子径の一般的測定手順
ＳＰＩＯ溶液（オートクレーブ前又は後）の部分標本を０．１〜０．３ｍｇＦｅ／ｍＬの範囲になるように１５０ｍＭのＮａＣｌ水で希釈した。得られた溶液をＷｈａｔｍａｎ  Ａｎｏｔｏｐ１０  ０．２μｍシリンジフィルターに通し、濾液をポリスチレンの無塵ＤＬＳキュベットに回収した。９０度光散乱検出器を備えたＺｅｔａＰＡＬＳ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．）を用いて粒径を測定し、有効直径を記録した。
【００８５】
表１に示すデータは、過剰のリガンド種がある場合とない場合の、オートクレーブ滅菌前後におけるＳＰＩＯナノ粒子の大きさである。α−ＨｍＰＰ３５０、α−ＨｍＰＰ７５０、α−ＨｍＰＰ２０００、α−ＨｍＰＰ５０００、及びα−ＨｍＰＰ３００００などのα−ヒドロキシモノホスフェートリガンド種を含むＳＰＩＯナノ粒子は、過剰のリガンド種と添加剤の存在時において、オートクレーブ滅菌の前後でほぼ同じ大きさを示している。過剰のリガンド種の存在時におけるオートクレーブ滅菌後の各ナノ粒子の大きさは、それぞれ１０．９、１１．２、１５．３、２０．８、及び２９．２ｎｍである。それに対し、過剰のリガンド種がない場合、これらすべての標品においてナノ粒子は凝集体を形成し、その直径は２００ｎｍを超える。
【００８６】
ｍＰＰ２０００及びｍＰＰ５０００を含むＳＰＩＯナノ粒子も、添加剤がない場合に同様の凝集プロファイルを示す。同様に、ｍＰＰ２０００などのモノホスフェートリガンド種を含むＳＰＩＯナノ粒子は、過剰のリガンド種の存在時かつ添加剤の無添加時においてオートクレーブ滅菌の前後でそれぞれ約２３．５と２４ｎｍと、ほぼ同じ大きさを示す。それに対し、標品中に過剰のリガンド種がない場合、ナノ粒子は凝集体を形成し、その直径は２００ｎｍを超える。
【００８７】
ＢＰＰ５０００のようなビスホスフェートリガンド種を含むＳＰＩＯナノ粒子についても同様の観察結果が得られた。過剰のリガンド種とエタノール添加剤の存在時、オートクレーブ滅菌の前後でそれぞれ約２６．４及び２６．６ｎｍと、ほぼ同じ大きさを示す。それに対し、標品中に過剰のリガンド種がない場合、ナノ粒子は直径が約４７．８ｎｍの粒子を形成し、これは単一ナノ粒子組成物よりも大きい。
【００８８】
【表１】
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これまで表示及び説明してきたものは本発明の特徴の一部でしかないが、当業者は多くの改変及び変更を想到するだろう。したがって、添付の特許請求の範囲が本発明の真の趣旨に合致するすべての改変及び変更を対象とするものであることは理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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