(57)【要約】  本発明は、室温での1つ以上の方法工程(例えば、前処理、変性、ハイブリダイゼーション、洗浄)を実施することを含む、生物学的試料中の標的核酸を検出するためのインサイチュハイブリダイゼーション法に関する。本発明はさらに、かかる方法を実施するためのキットに関する。
2015505241.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a)  標的核酸を含む生物学的試料を、約19℃〜約25℃の範囲の温度で、プロテアーゼを含む溶液により前処理する工程；
b)  該試料を変性させる工程；
c)  少なくとも1つのプローブを、該試料中の標的核酸にハイブリダイズさせる工程、ここで、該プローブは、標的核酸中のヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列および少なくとも1つの検出可能な標識を含む；
d)  該試料を洗浄して、標的核酸にハイブリダイズしなかったプローブを除去する工程；ならびに
e)  標的核酸へのハイブリダイゼーション後、オリゴヌクレオチドプローブ上の少なくとも1つの検出可能な標識を検出して、それにより該試料中の標的核酸を検出する工程、
を含む、生物学的試料中の標的核酸を検出するための方法。
【請求項２】
a)における溶液が、約0.1〜約0.3%のペプシンを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
a)における溶液が、酸性のpHを有する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
a)における溶液が、0.01NのHClを含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
該試料が、a)における溶液と、約5〜約20分間接触される、請求項１、２または３記載の方法。
【請求項６】
該試料が、a)における溶液と、約15分間接触される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
工程b)〜d)の1つ以上が、約19℃〜約25℃の範囲の温度で実施される、請求項１〜６いずれか記載の方法。
【請求項８】
該プローブが、約20〜約50ヌクレオチドを含む一本鎖オリゴヌクレオチドプローブである、請求項１〜７いずれか記載の方法。
【請求項９】
該プローブがゲノム断片から調製される、請求項１〜７いずれか記載の方法。
【請求項１０】
生物学的試料が、上皮細胞、皮膚細胞、骨髄細胞、割球、精子細胞、卵母細胞もしくは極体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１〜９いずれか記載の方法。
【請求項１１】
a)  少なくとも1つのプローブを、約19℃〜約25℃の範囲の温度で生物学的試料中の標的核酸にハイブリダイズさせる工程、ここで該プローブは、
1)  約1〜10mMの塩基を含み、約10〜約13の範囲のpHを有するハイブリダイゼーションバッファ中に存在し、
2)  標的核酸中のヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列および少なくとも1つの検出可能な標識を含む；
b)  該試料を洗浄して、標的核酸にハイブリダイズしなかったプローブを除去する工程；ならびに
c)  該試料中の標的核酸へのハイブリダイゼーション後に、プローブ上の少なくとも1つの検出可能な標識を検出し、それにより該試料中の標的核酸を検出する工程、
を含む、生物学的試料中の標的核酸を検出するための方法。
【請求項１２】
ハイブリダイゼーションバッファが、約11〜約12の範囲のpHを有する、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
ハイブリダイゼーションバッファが、約1〜5mMの塩基、約20〜60%のホルムアミドおよび約5〜40%の硫酸デキストランを含む、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
該塩基がNaOHである、請求項１１、１２または１３記載の方法。
【請求項１５】
ハイブリダイゼーションバッファが、約1.0〜3.0mMのNaOH、約30〜50%のホルムアミドおよび約10%の硫酸デキストランを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ハイブリダイゼーションバッファが、約4.2mMのNaOH、約42%のホルムアミドおよび約28%の硫酸デキストランを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
工程a)の変性が、約5分〜約15分である、請求項１１〜１６いずれか記載の方法。
【請求項１８】
該プローブが、約20〜約50のヌクレオチドを含む一本鎖オリゴヌクレオチドプローブである、請求項１１〜１７いずれか記載の方法。
【請求項１９】
該プローブがゲノム断片から調製される、請求項１１〜１７いずれか記載の方法。
【請求項２０】
生物学的試料が、上皮細胞、皮膚細胞、骨髄細胞、割球、精子細胞、卵母細胞もしくは極体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１１〜１９いずれか記載の方法。
【請求項２１】
工程b)が、約19℃〜約25℃の範囲の温度で実施される、請求項１１〜２０いずれか記載の方法。
【請求項２２】
a)  標的核酸を含む生物学的試料を変性させる工程；
b)  少なくとも1つのプローブを、試料中の標的核酸にハイブリダイズさせる工程、ここで、該プローブは、標的核酸中のヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列および少なくとも1つの検出可能な標識を含む；
c)  約10〜約13の範囲のpHを有し、約1〜10mMの塩基を含む洗浄バッファ中、約19℃〜約25℃の範囲の温度で試料を洗浄する工程；ならびに
d)  該試料中の標的核酸にハイブリダイズしたプローブ上の少なくとも1つの検出可能な標識を検出し、それにより該試料中の標的核酸を検出する工程、
を含む、生物学的試料中の標的核酸を検出するための方法。
【請求項２３】
洗浄バッファが、約11のpHを有する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
洗浄バッファが、約1〜3mMの塩基および約2xSSCを含む、請求項２２または２３記載の方法。
【請求項２５】
該塩基がNaOHである、請求項２２、２３または２４記載の方法。
【請求項２６】
洗浄バッファが、約1.75〜2mMのNaOHおよび約2xSSCを含む、請求項２２〜２５いずれか記載の方法。
【請求項２７】
工程c)が、1回以上の洗浄を含み、それぞれの洗浄が、約2分〜約5分の持続時間である、請求項２２〜２６いずれか記載の方法。
【請求項２８】
該プローブが、約20〜約50のヌクレオチドを含む一本鎖オリゴヌクレオチドプローブである、請求項２２〜２７いずれか記載の方法。
【請求項２９】
該プローブがゲノム断片から調製される、請求項２２〜２７いずれか記載の方法。
【請求項３０】
生物学的試料が、上皮細胞、皮膚細胞、骨髄細胞、割球、精子細胞、卵母細胞もしくは極体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２１〜２９記載の方法。
【請求項３１】
工程a)およびb)の1つ以上が、約19℃〜約25℃の範囲の温度で実施される、請求項２１〜３０いずれか記載の方法。
【請求項３２】
a)  生物学的試料と、塩基および約50%〜約80%のアルコールを含む溶液とを接触させることにより、標的核酸を含む生物学的試料を変性させる工程；
b)  少なくとも1つのプローブを、該試料中の標的核酸にハイブリダイズさせる工程、ここで、該プローブは、
1)  約1〜10mMの塩基を含み、約10〜約13の範囲のpHを有するハイブリダイゼーションバッファ中に存在し、
2)  標的核酸中のヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列および少なくとも1つの検出可能な標識を含む；
c)  約10〜約13の範囲のpHを有し、約1〜10mMを含む洗浄バッファ中で該試料を洗浄する工程；ならびに
d)  該試料中の標的核酸にハイブリダイズしたプローブ上の少なくとも1つの検出可能な標識を検出して、それにより該試料中の標的核酸を検出する工程、
を含む、生物学的試料中の標的核酸を検出するための方法であって、
工程a)、b)およびc)のそれぞれが、約19℃〜約25℃の範囲の温度で実施される、方法。
【請求項３３】
a)  標的核酸を含む生物学的試料を変性させる工程；
b)  少なくとも1つのプローブを、該試料と共にインキュベートする工程、ここで、該プローブは、標的核酸中のヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列および少なくとも1つの検出可能な標識を含む；
c)  洗浄バッファ中で該試料を洗浄する工程；ならびに
d)  標的核酸が該試料中に存在するかどうかを、該試料中の標的核酸にハイブリダイズした1つ以上のプローブを検出することにより決定する工程
を含む、標的核酸が生物学的試料中に存在するかどうかを決定するための方法であって、
工程a)、b)およびc)の少なくとも1つが、約19℃〜約25℃の範囲の温度で実施される、方法。
【請求項３４】
工程a)、b)およびc)がそれぞれ、約19℃〜約25℃の範囲の温度で実施される、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
a)  約0.03M〜約0.17Mの塩基および約50%〜約80%のアルコールを含む変性バッファ；
b)  約1〜10mMの塩基を含み、約10〜約13の範囲のpHを有するハイブリダイゼーションバッファ；ならびに
c)  約1〜10mMの塩基を含む洗浄バッファ、ここで、該洗浄バッファは、約10〜約13の範囲のpHを有する、
を含む、生物学的試料中の標的核酸を検出するためのキット。
【請求項３６】
該試料を前処理するための1つ以上のプロテアーゼをさらに含む、請求項３５記載のキット。
【請求項３７】
1つ以上のプロテアーゼがペプシンを含む、請求項３６記載のキット。
【請求項３８】
標的核酸中のヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列および少なくとも1つの検出可能な標識を含む少なくとも1つのプローブをさらに含む、請求項３５、３６または３７記載のキット。
【請求項３９】
変性バッファが、約0.07Mの水酸化ナトリウムおよび約70%のエタノールを含む、請求項３５〜３８いずれか記載のキット。
【請求項４０】
ハイブリダイゼーションバッファが、約1〜5mMの塩基、約20〜60%のホルムアミドおよび約5〜40%の硫酸デキストランを含む、請求項３５〜３９いずれか記載のキット。
【請求項４１】
洗浄バッファが、約1.75〜2mMのNaOHを含む、請求項３５〜４０いずれか記載のキット。
【請求項４２】
洗浄バッファが、約2xSSCをさらに含む、請求項４１記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、2011年12月12日に出願された米国仮特許出願第61/569,656号の利益を主張する。
【０００２】
上記出願の全教示は、参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)は、ヒト染色体上のDNA配列を検出するための分子技術として20年よりも長い間使用されている(Bauman 1985; Pinkel 1986)。過去20年にわたり、FISH技術の種々の局面の改良により、ヒト細胞遺伝学および分子診断の分野が進歩し、それにより充実性腫瘍および造血悪性疾患に関する染色体異常の同定、ならびに感染性疾患の診断が可能になった。(Heim and Mitelman 1995; Klinger 1995; Timm, Podniesinski et al. 1995; Heselmeyer, Macville et al. 1997; Sauer, Wiedswang et al. 2003)。
【０００４】
現在のFISH手順は、集中的な労力を必要とし(labor intensive)、時間を消費し、複数の手動の処理工程ならびに正確な温度および時間要件に対する厳守を必要とするものである。典型的に、標準的なFISH技術は、スライド試料を処理するのに12より多くの工程を必要とし、該工程のいくつかは、異なる温度で実施され、水浴、ホットプレートおよびインキュベーターなどのしばしば費用のかかる非常に多くの温度設備の使用を必要とする。該技術のこれらのおよびその他の制限は、研究および臨床的実験室においてFISH技術がより広範に使用されることを妨げる。
【０００５】
現在、より少ない処理工程、より短い時間およびより少ない設備を必要とする、FISHを実施するより簡単で費用対効果の高い方法の必要性がある。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
一態様において、本発明は、生物学的試料中の標的核酸を検出するための方法に関し、該方法は、約19℃〜約25℃の範囲の温度で、プロテアーゼを含む溶液により、標的核酸を含む生物学的試料を前処理する工程；該試料を変性させる工程；試料中の標的核酸に、少なくとも1つのプローブをハイブリダイズさせる工程ここで、該プローブは、標的核酸中のヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列および少なくとも1つの検出可能な標識を含む；ならびに標的核酸へのハイブリダイゼーション後に該オリゴヌクレオチドプローブ上の少なくとも1つの検出可能な標識を検出し、それにより試料中の標的核酸を検出する工程を含む。
【０００７】
別の態様において、本発明は、生物学的試料中の標的核酸を検出するための方法に関し、該方法は、約19℃〜約25℃の範囲の温度で試料中の標的核酸に、少なくとも1つのプローブをハイブリダイズさせる工程、ここで、該プローブは、約1〜10mMの塩基を含み、約10〜約13の範囲のpHを有するハイブリダイゼーションバッファ中に存在し、標的核酸中のヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列および少なくとも1つの検出可能な標識を含む；ならびに試料中の標的核酸へのハイブリダイゼーション後に、プローブ上の少なくとも1つの検出可能な標識を検出し、それにより試料中の標的核酸を検出する工程を含む。
【０００８】
別の態様において、本発明は、生物学的試料中の標的核酸を検出するための方法に関し、該方法は、標的核酸を含む生物学的試料を変性させる工程；試料中の標的核酸に少なくとも1つのプローブをハイブリダイズさせる工程、ここで、該プローブは、標的核酸中のヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列および少なくとも1つの検出可能な標識を含む；約10〜約13の範囲のpHを有する洗浄バッファ中で、約19℃〜約25℃の範囲の温度で試料を洗浄する工程、ここで、該洗浄バッファは、約1〜10mMの塩基および約0.03M〜約0.09Mの終濃度の1つ以上の塩を含む；ならびに試料中の標的核酸にハイブリダイズしたプローブ上の少なくとも1つの検出可能な標識を検出し、それにより試料中の標的核酸を検出する工程を含む。
【０００９】
さらなる態様において、本発明は、生物学的試料中の標的核酸を検出するための方法に関し、該方法は、該試料と、塩基および約50%〜約80%のアルコールを含む溶液とを接触させることにより標的核酸を含む生物学的試料を変性させる工程；少なくとも1つのプローブを、該試料中の標的核酸にハイブリダイズさせる工程、ここで、該プローブは、約1〜10mMの塩基を含みかつ約10〜約13の範囲のpHを有するハイブリダイゼーションバッファ中に存在し、標的核酸中のヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列および少なくとも1つの検出可能な標識を含む；約10〜約13の範囲のpHを有する洗浄バッファ中で、試料を洗浄する工程、ここで、該バッファは約1〜10mMの塩基および約0.03M〜約0.09Mの終濃度の1つ以上の塩を含む；ならびに試料中の標的核酸にハイブリダイズしたプローブ上の少なくとも1つの検出可能な標識を検出し、それにより試料中の標的核酸を検出する工程を含み、ここで、工程a)、b)およびc)のそれぞれは、約19℃〜約25℃の範囲の温度で実施される。
【００１０】
さらに別の態様において、本発明は、標的核酸が生物学的試料中に存在するかどうかを決定するための方法に関し、該方法は、
標的核酸を含む生物学的試料を変性させる工程；少なくとも1つのプローブを、試料と共にインキュベートする工程、ここで、該プローブは、標的核酸中のヌクレオチド配列に実質的に相補的なヌクレオチド配列および少なくとも1つの検出可能な標識を含む；洗浄バッファ中で試料を洗浄する工程；ならびに試料中の標的核酸にハイブリダイズした1つ以上のプローブを検出することにより、該試料中に標的核酸が存在するかどうかを決定する工程を含み、ここで、工程a)、b)およびc)の少なくとも1つは、約19℃〜約25℃の範囲の温度で実施される。
【００１１】
本明細書中に記載される方法中の任意の工程は、室温で効率的に実施され得る。したがって、室温で全ての方法工程を実施することにより、高価な温度設備の必要性および正確かつ変動する温度の要件への厳守が不要になる。かかる方法は、完了するために、標準的な高温FISH技術よりも少ない工程および短い時間を要する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
該特許または特許出願は、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラー図面を有する本特許または特許出願公報のコピーは、請求および必要な手数料の納付に応じて事務局により提供される。
【図１】図1は、従来の変性条件(青色)または室温変性条件(灰色)を使用したFISH後の、標識されたY染色体およびX染色体のオリゴヌクレオチドプローブにより生じた信号雑音比(SNR)の比較を示すグラフである。
【図２】図2は、室温変性およびハイブリダイゼーション工程および標準洗浄条件を使用したFISH後に、Oligo-FISH(登録商標)X染色体(赤色)およびY染色体(緑色)(矢印)プローブにより生じたシグナルを示す、末梢血由来の中期染色体伸展物(chromosome spread)および間期核の画像である。
【図３】図3は、未処理末梢血細胞上の室温(Iso Hyb (3.0mM NaOH Buff))または37℃(対照)でのハイブリダイゼーション後の染色体3(金色)、染色体6(明緑青色(aqua))、染色体7(緑色)および染色体20(赤色)のプローブについての信号雑音比を示すグラフである。
【図４】図4は、尿路上皮細胞(urothelial cell)上の室温(Iso Hyb (3.0mM NaOH Buff))または37℃(対照)でのハイブリダイゼーション後の染色体3(金色)、染色体6(明緑青色)、染色体7(緑色)および染色体20(赤色)のプローブについての信号雑音比を示すグラフである。
【図５】図5は、本明細書の実施例5に記載されたFISHプロトコルに従って、BACから調製された特有配列の染色体13プローブと室温でハイブリダイズさせた末梢血スライドの画像である。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
定義
そうでないと定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学的用語は本発明が属する分野の通常の技術を有する者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
【００１４】
本明細書で使用される場合、用語「室温」および「RT」は、約19℃〜約25℃の範囲の温度のことをいう。
【００１５】
「室温法」または「室温手順」(例えば「室温FISH」)は、本明細書で使用される場合、標準的な先行技術のインサイチュ検出法において、典型的に高温(例えば25℃よりも高い温度)で実施される少なくとも1つの方法工程(例えば、変性、ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション後洗浄)が、約19℃〜約25℃の範囲で実施される方法のことをいう。好ましくは、本明細書に記載される室温方法において、かかる方法工程の少なくとも2つ、より好ましくは少なくとも3つ、さらに好ましくは全ては、約19℃〜約25℃の範囲で実施される。「室温方法」の2つ以上の工程が室温で実施される場合、これらの工程のそれぞれが実施される温度は、約19℃〜約25℃の範囲にある限り、同じである必要はない。
【００１６】
用語「ヌクレオチド」は、天然に存在するリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのモノマー、ならびに天然には存在しないそれらの誘導体およびアナログのことをいう。したがって、ヌクレオチドとしては、例えば、天然に存在する塩基(例えば、A、G、CまたはT)を含むヌクレオチドおよび改変された塩基(例えば、7-デアザグアノシンまたはイノシン)を含むヌクレオチドが挙げられ得る。
【００１７】
核酸に関連して、用語「配列」は、共有結合(例えば、ホスホジエステル結合)により結合されたヌクレオチドの連続的な列(contiguous series)のことをいう。
【００１８】
用語「核酸」は、複数のヌクレオチドモノマーを有するポリマーのことをいう。核酸は一本鎖または二本鎖であり得、DNA(例えば、cDNAまたはゲノムDNA)、RNAまたはハイブリッドポリマー(例えば、DNA/RNA)であり得る。核酸は、化学的または生化学的に改変され得、および/または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含み得る。核酸改変(modification)としては、例えば、メチル化、アナログによる、天然に存在するヌクレオチドの1つ以上の置換、非電荷結合(例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど)、電荷結合(例えば、ホスホチオエート、ホスホロジチオエートなど)、張り出した(pendent)部分(例えば、ポリペプチド)、インターカレーター(intercalator)(例えば、アクリジン、ソラレンなど)、キレート剤、アルキル化剤および改変された結合(例えば、αアノマー核酸など)などのヌクレオチド間改変が挙げられる。核酸はまた、水素結合および他の化学的相互作用を介して指定された配列に結合する能力において核酸を模倣する合成分子を含む。典型的に、ヌクレオチドモノマーは、ホスホジエステル結合を介して連結されるが、合成形態の核酸は、他の結合(例えば、Nielsen et al., Science 254, 1497-1500, 1991に記載されるようなペプチド核酸(本明細書において「PNA」ともいう))を含み得る。核酸はまた、例えば立体配座的に制限された核酸(例えば、Nielsen et al., J. Biomol. Struct. Dyn. 17:175-91, 1999に記載されるような「ロックド核酸」または「LNA」)、モルホリノ、グリコール核酸(GNA)およびトレオース核酸(TNA)を含み得る。「核酸」は、任意の特定の長さのポリマーのことをいうのではなく、そのため実質的に任意の長さ、典型的に約6ヌクレオチド〜約109以上のヌクレオチドであり得る。二本鎖ポリマーの場合、「核酸」は、いずれかの鎖または両方の鎖のことをいい得る。
【００１９】
用語「オリゴヌクレオチド」は、リン結合(例えば、ホスホジエステル、アルキルおよびアリールホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル)、および/または非リン結合(例えば、ペプチド、スルファメートおよびその他)などの共有結合により連結される短い核酸、典型的には約6〜約100ヌクレオチド塩基長のことをいう。
【００２０】
本明細書で使用される場合、用語「ゲノム断片」は、ゲノムDNAから調製された断片のことをいい、限定されないが、クローン化ゲノム断片および増幅ゲノム断片(例えば、PCR増幅により調製されたゲノム断片)を含む。
【００２１】
用語「標的核酸」は、試料中の存在または非存在が検出されることが望まれる核酸のことをいう。
【００２２】
用語「標的配列」は、オリゴヌクレオチドプローブ上の相補的な配列(例えば、実質的に相補的な配列)と水素結合二重鎖を形成し得る、標的核酸中のヌクレオチド配列のことをいう。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「相補的」は、2つの異なる核酸鎖の間または同じ核酸鎖の2つの領域の間の配列相補性のことをいう。2つの領域が逆平行の様式で配列され、第1の領域の少なくとも1つのヌクレオチド残基が第2の領域の残基と塩基対を形成(すなわち、水素結合)して、水素結合二重鎖を形成し得る場合、核酸の第1の領域は、同じまたは異なる核酸の第2の領域と相補的である。
【００２４】
用語「実質的に相補的」は、本明細書に記載の室温ハイブリダイゼーション条件を含むストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、互いに塩基対を形成して、安定な水素結合二重鎖を形成し得る2本の核酸鎖(例えば、標的核酸の鎖および相補的一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ)のことをいう。一般的に、「実質的に相補的」は、2つの核酸が、少なくとも70%、例えば、約75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%の相補性を有することをいう。
【００２５】
「反復配列」または「反復性配列」は、例えば、αサテライト、サテライト1、サテライト2、サテライト3、βサテライト、γサテライトおよびテロメア由来の反復配列を含むヒトゲノム中のノンコーディングタンデム反復ヌクレオチド配列のことをいう。反復配列は当該技術分野で公知であり、例えば、(Allshire et al., Nucleic Acids Res 17(12): 4611-27 (1989)；Cho et al., Nucleic Acids Res 19(6): 1179-82 (1991)；Fowler et al., Nucleic Acids Res 15(9): 3929 (1987)；Haaf et al., Cell 70(4): 681-96 (1992)；Lee et al., Chromosoma 109(6): 381-9 (2000)；Maeda and Smithies, Annu Rev Genet 20: 81-108 (1986)；Meyne and Goodwin, Chromosoma 103(2): 99-103 (1994)；Miklos (1985). Localized highly repetitive DNA sequences in vertebrate genomes. Molecular evolutionary genetics. I. J. R. Macintyre. NY, Plenum Publishing Corp.: 241-321 (1985)；Tagarro et al., Hum Genet 93(2): 125-8 (1994)；Waye and Willard, PNAS USA 86(16): 6250-4 (1989)；およびWillard and Waye, J Mol Evol 25(3): 207-14 (1987)に記載される。反復配列は、例えば、染色体の動原体領域、動原体周囲(pericentromeric)領域、異質染色質領域およびテロメア領域に局在する。コンセンサス反復配列は、例えばWillard and Waye, J Mol Evol 25(3): 207-14 (1987)およびTagarro et al., Hum Genet 93(2): 125-8 (1994). Vissel and Choo, Nucleic Acids Res. 15(16): 6751-6752 (1987), Cho et al., Nucleic Acids Res 19(6): 1179-82 (1991)に記載される。
【００２６】
用語「染色体特異的核酸配列」または「染色体特異的ヌクレオチド配列」は、本明細書で使用される場合、細胞のゲノム中の特定の染色体に特異的な核酸配列のことをいう。
【００２７】
用語「プローブ」は、標的核酸中の標的配列に実質的に相補的であり、したがって、標的核酸と水素結合二重鎖を形成し得る標的結合領域を含むオリゴヌクレオチドのことをいう。典型的に、プローブは、相補的な標的へのハイブリダイゼーション後にプローブの検出を可能にするために1つ以上の検出可能な標識を有する一本鎖プローブである。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「標的結合領域」は、相補的な標的核酸と水素結合二重鎖を形成し得るオリゴヌクレオチドプローブの一部のことをいう。
【００２９】
用語「検出可能な標識」は、本明細書で使用する場合、それが結合する対応する分子(例えば、プローブ)の存在を示す部分のことをいう。
【００３０】
「間接標識」は、間接標識に特異的に結合する標識された第2の剤またはリガンド結合パートナーを使用して検出される部分(moiety)またはリガンドのことをいう。
【００３１】
「直接標識」は、リガンド結合パートナー相互作用の非存在下で検出可能な部分のことをいう。
【００３２】
用語「生物学的試料」は、生物学的起源の材料(例えば、細胞、組織、器官、体液)のことをいう。
【００３３】
2つの分子(モノマーまたはポリマーのいずれか)の結合の文脈において、「リンカー」は、結合される2つの分子の間に挿入され、それに隣接する分子(モノマーまたはポリマーのいずれか)を意味する。「リンカー」は、例えばオリゴヌクレオチドプローブ配列と標識(例えば、検出可能な標識)を結合させるために使用され得る。リンカーは、ヌクレオチドリンカー(すなわち、非隣接配列の間にあり、それに隣接する核酸の配列)または非ヌクレオチドリンカーであり得る。
【００３４】
用語「ハイブリッド」は、相補的なヌクレオチド間の水素結合により形成される二本鎖核酸分子のことをいう。
【００３５】
用語「ストリンジェンシー」は、ハイブリッドの安定性に影響を及ぼすハイブリダイゼーション条件、例えば、温度、塩濃度、pH、ホルムアミド濃度等のことをいう。これらの条件は、プローブの標的核酸に対する特異的な結合を最大にし、プローブの標的核酸に対する非特異的な結合を最小にするために経験的に最適化される。
【００３６】
用語「フルオロフォア」は、蛍光特性を有する化学基のことをいう。
【００３７】
用語「任意に」は、列挙される工程(例えば、本発明の方法の場合)または成分(例えば、本発明のキットの場合)が含まれても含まれなくてもよいことを意味する。
【００３８】
本発明は、本明細書において「室温FISH」と称される、簡易化され、かつ効果的な代替的蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)技術の発見に部分的に基づき、ここで、試料変性、プローブハイブリダイゼーション、洗浄またはそれらの任意の組み合わせは、室温で実施され得る。従来のFISH法と本発明の2つの異なる室温FISH法の比較を表1に示す。該方法の完了に必要な異なる工程を、必要とされる温度、装置およびオリゴヌクレオチドプローブを用いた使用に必要な時間と共に列挙する。本発明の室温法は、典型的に従来のFISH法に必要とされる高価な精密温度装置(例えば、水浴、ホットプレート、インキュベーター、フリーザーユニット)の必要性を回避する。
【表１】
2015505241.tif 000003
【００３９】
標的核酸を検出するための方法/標的核酸が生物学的試料中に存在するかどうかを決定するための方法
一態様において、本発明は、標的核酸が生物学的試料中に存在するかどうかを決定するための室温方法に関する。別の態様において、本発明は、生物学的試料中の標的核酸を検出するための室温方法に関する。本発明の例示的な方法は、室温で実施される1つ以上の工程を含み、ここで、該工程は、試料を変性する工程；少なくとも1つの検出可能に標識されたプローブ(例えば、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブ、BACプローブ)を、試料中の標的核酸と共にインキュベートする工程；試料を洗浄して、ハイブリダイズしていないプローブを除去する工程；ならびにプローブ上の検出可能な標識を検出して、それにより、存在する場合、試料中の標的核酸を検出する工程からなる群より選択される。好ましい態様において、本明細書に記載される方法の全ての工程は、室温、好ましくは約21℃の温度で実施される。
【００４０】
本発明の方法の種々の工程の詳細な説明を本明細書中、以下に記載する。
【００４１】
試料調製/前処理
本発明の方法のための適切な生物学的試料としては、例えば、細胞(例えば、細胞株、末梢血細胞、上皮細胞)、組織(ホルマリン固定したパラフィン包埋組織(FFPE))、器官、血液、脊髄液、リンパ液、涙、唾液、痰、尿、精液、羊水、毛、皮膚、腫瘍(例えば、生検)が挙げられる。好ましくは、生物学的試料は、染色体DNAを含む。特定の態様において、本発明の方法に使用される生物学的試料は、動物(例えば、ヒト)起源または植物起源の細胞を含む細胞試料である。好ましくは、試料中の細胞は、以下の細胞型、上皮細胞(例えば、尿路上皮細胞、子宮内膜上皮細胞、剥脱された前立腺上皮細胞、結腸上皮細胞)、末梢血細胞、皮膚細胞(例えば、FFPE皮膚組織切片由来の細胞)、骨髄細胞、胚由来の割球、精子細胞、卵母細胞および極体の1つ以上を含む。好ましくは、生物学的試料は、ヒトから得られる。
【００４２】
一態様において、生物学的試料は、単一の標的核酸を含み得るか、または代替的な態様において、複数の標的核酸(例えば、2以上の異なる標的核酸)を含み得る。標的核酸はDNAまたはRNAであり得、遺伝子内、遺伝子間および/またはトランスジェニックヌクレオチド配列を含み得る。したがって、標的核酸は、内因性ゲノムヌクレオチド配列または人工もしくは外来の(例えば、トランスジェニック)ヌクレオチド配列であり得る。典型的に、標的核酸は、染色体特異的ヌクレオチド配列を含む。例示的な染色体特異的ヌクレオチド配列を表2に示す。
【表２】
2015505241.tif 000004
【００４３】
標的核酸は、特有のまたは反復性のヌクレオチド配列を含み得る。好ましくは、標的核酸は、反復性のゲノム配列、例えば特定のヒト染色体(すなわち、染色体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、X染色体またはY染色体)の反復配列を含む。適切な反復配列としては、限定されないが、動原体反復配列、動原体周囲反復配列、異質染色質反復配列、テロメア反復配列、αサテライト反復配列、βサテライト反復配列、γサテライト反復配列、およびサテライト1、2または3反復配列が挙げられる。いくつかの態様において、標的核酸は、特定の反復配列中の約20〜約50個の連続ヌクレオチドの標的配列を含む。
【００４４】
典型的に、本発明の方法に使用される生物学的試料は、固定された試料(例えば、固定細胞試料、固定組織試料、染色体伸展物)である。種々の適切な固定剤は、当該技術分野で公知であり、例えば、酸アセトン溶液、種々のアルデヒド溶液(例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒド)および酸アルコール溶液が挙げられる。染色体調製のための特定の固定剤の例は、例えばTrask et al. (Science 230:1401-1402, 1985)に記載される。生物学的試料は、溶液中、または限定されないが顕微鏡スライドガラス、カバーガラスおよびマルチウェルプレート(例えば、マイクロタイタープレート)などの固体支持体上で調製(例えば固定)され得る。
【００４５】
一態様において、生物学的試料は、プローブと試料をインキュベートする前に、少なくとも1つの塩基(例えば、NaOH)および少なくとも1つのアルコール(例えば、エタノール)を含む溶液と接触(例えば溶液中で変性)される。試料と、塩基およびアルコールを含む溶液を接触させることにより、試料中の核酸は変性され、標的核酸は、相補的なプローブにより接近可能にする。特定の種類の生物学的試料(例えば、精子細胞)において、塩基およびアルコールを含む溶液はまた、試料中の染色体を脱凝縮(decondense)し得、相補的なプローブに対する標的核酸の接近可能性がさらに高められる。
【００４６】
本発明の方法における使用のための適切な塩基としては、限定されないが、水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化セシウム、水酸化ナトリウム、水酸化ストロンチウム、水酸化カルシウム、水酸化リチウム、水酸化ルビジウム、水酸化マグネシウム、ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド、リチウムジエチルアミド、ナトリウムアミド、水素化ナトリウム、リチウムビス(トリメチルシリル)アミド、炭酸ナトリウムおよびアンモニア、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、塩基はアルカリ塩基である。より好ましくは、塩基は水酸化ナトリウムである。本発明の方法に使用される塩基/アルコール溶液中の塩基の適切な濃度は、典型的には、約0.03規定(N)〜約0.17Nの範囲内、例えば約0.05N、約0.06N、約0.07N、約0.08N、約0.09Nまたは約0.1Nである。特定の態様において、該溶液は、約0.07NのNaOHを含み、これは0.07M NaOHと同等である。
【００４７】
本発明の方法における使用のための例示的なアルコールとしては、例えば、特にエタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノールおよびイソアミルアルコールまたはそれらの混合物が挙げられる。特定の態様において、該溶液はエタノールを含む。好ましくは、塩基/アルコール溶液は、約0.07Nの塩基および約70%のエタノールを含む。アルコールは、約50体積%〜約90体積%、例えば約60体積%、約70体積%または約80体積%の濃度で溶液中に存在し得る。好ましくは、アルコールは、約70体積%の濃度で存在する。
【００４８】
典型的には、生物学的試料は、約3分〜約20分、好ましくは約11分〜約17分、より好ましくは約13分〜約15分にわたる時間、塩基/アルコール溶液と接触される。特定の態様において、試料は、約19℃〜約25℃、好ましくは約20℃〜約22℃の範囲の温度、より好ましくは約21℃で塩基/アルコール溶液中でインキュベートされる。
【００４９】
別の態様において、生物学的試料は、高温(例えば72℃)で、非アルカリ性変性バッファ(例えば70%ホルムアミド)中で変性される。
【００５０】
本発明の方法は、試料中の核酸をプローブに対してより接近可能にするために、任意に、従来のインサイチュハイブリダイゼーション手順に一般的に使用される1つ以上のさらなる工程(例えば前処理工程)を含み得る。かかる工程は、例えば、生物学的試料を、1つ以上のプロテイナーゼ(例えば、プロテイナーゼK、トリプシン、ペプシン、コラゲナーゼ)および/または緩い(mild)酸(例えば、0.02〜0.2N HCl、25%〜75%酢酸)で処理することを含む。生物学的試料から残存RNAを除去するために、RNアーゼを用いた任意の前処理も使用され得る。他の任意の前処理工程は、ホルムアルデヒドまたはパラホルムアルデヒドを用いた固定、界面活性剤透過性化処理(permeabilization)、熱変性および試料のエージング(aging)を含む。
【００５１】
一態様において、本発明の方法は、生物学的試料を、約19℃〜約25℃、好ましくは約20℃〜約22℃の範囲の温度、より好ましくは約21℃で、試料を変性する前に、1つ以上のプロテアーゼ(例えばペプシン)で処理(例えば、前処理、消化)する任意の工程を含む。好ましくは、プロテアーゼは、約0.1%〜約0.3%の範囲の濃度でバッファ中に存在する。好ましくは、バッファは酸性バッファである。本発明の方法における使用のための適切な前処理バッファは、限定されないが、0.01N HClを含む。典型的には、生物学的試料は、プロテアーゼで約5分〜約20分間処理(例えば、前処理、消化)される。特定の態様において、生物学的試料は、0.01NのHCl中のペプシンで約15分間前処理される。
【００５２】
プローブハイブリダイゼーション
本発明の方法はさらに、少なくとも1つのプローブ(例えば、オリゴヌクレオチド)を、標的核酸が試料中に存在する場合に、プローブが標的核酸にハイブリダイズするのに適した条件下、室温で試料と共にインキュベートする工程を含む。例えば、ハイブリダイゼーションは、約19℃〜約25℃、好ましくは約20℃〜約22℃の範囲の温度、より好ましくは約21℃で実施され得る。一般的に、ハイブリダイゼーションは、プローブが、生物学的試料中の相補的な標的核酸とハイブリダイズするのに十分な条件(例えば、温度、インキュベーション時間、塩濃度等)下で実施される。インサイチュハイブリダイゼーション技術のための適切なハイブリダイゼーションバッファおよび条件は、一般的に当該技術分野において公知である。(例えば、Sambrook and Russell, 上述; Ausubel et al., 上述参照。また、Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization with Nucleic Acid Probes (Elsevier, NY 1993)参照)。例えば、ホルムアミド、硫酸デキストランおよびクエン酸ナトリウム塩(SSC)を含むハイブリダイゼーションバッファが、本発明の方法に使用され得る。ハイブリダイゼーションバッファ中のホルムアミドの適切な濃度としては、例えば、約20体積%〜約90体積%の範囲の濃度、例えば約60体積%、約70体積%または約80体積%が挙げられる。ハイブリダイゼーションバッファ中の硫酸デキストランの適切な濃度としては、例えば約3%〜約20%が挙げられる。ハイブリダイゼーションバッファ中のSSCの適切な濃度としては、例えば約0.1x〜約4xが挙げられる。ハイブリダイゼーションバッファ中の全塩の濃度は、好ましくは約0.03M〜約0.09Mの範囲である。
【００５３】
特定の態様において、ハイブリダイゼーション工程は、アルカリ性条件下で実施される。例えば、1つ以上の塩基(例えば、NaOH)を含み、約10〜約13、好ましくは約11〜約12のpHを有するハイブリダイゼーションバッファが使用される。塩基およびアルコール変性溶液中の使用に適すると本明細書中に記載される塩基のいずれかも、ハイブリダイゼーションバッファ中で使用し得る。本発明の方法に使用され得る適切なアルカリ性ハイブリダイゼーションバッファは、例えば約20〜60%のホルムアミド、約5〜40%の硫酸デキストランおよび約1〜10mMのNaOHを含み、約10〜約13の範囲のpHを有する。好ましくは、アルカリ性ハイブリダイゼーションバッファは、約30〜50%のホルムアミド、約10%の硫酸デキストランおよび約1〜3mMのNaOHを含み、約11〜約12の範囲のpHを有する。かかる条件は、本明細書に記載される方法において、反復配列プローブ(例えば、オリゴヌクレオチドプローブ)が使用される際に特に適切である。特有配列プローブ(例えばBACプローブ)を使用する場合、本発明の方法における使用のための例示的なハイブリダイゼーションバッファは、例えば、約4.2mMのNaOH、約42%のホルムアミドおよび約28%の硫酸デキストランを含む。
【００５４】
所定の標的配列およびその相補的なプローブのための最適なハイブリダイゼーション条件は、当業者に理解されるように、塩濃度、インキュベーション時間、ならびにプローブの濃度、組成および長さなどのいくつかの要件に依存する。これらおよびその他の公知の要因に基づいて、適切な結合条件は、当業者により容易に決定され得、必要な場合、本発明の方法に従った使用のために最適化され得る。典型的に、ハイブリダイゼーションは、実質的に相補的なヌクレオチド配列の特異的な結合を可能にするストリンジェントな条件下で実施される。100%の相補性を有する標的核酸を特異的に検出するため、または100%より低い相補性(例えば、約70%相補性、約80%相補性、約90%相補性)を有する関連のあるヌクレオチド配列を検出するために、ストリンジェンシーは上げられ得るかまたは下げられ得る。ハイブリダイゼーションバッファ/溶液における、プローブ配列の長さおよび性質(DNA、RNA、塩基組成)、標的ヌクレオチド配列の性質(DNA、RNA、塩基組成、溶液中の存在または固定)、ならびにハイブリダイゼーションバッファ中の塩および他の成分の濃度(例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールおよび/または塩の濃度)などの因子は、低、中または高ストリンジェンシーのいずれかの条件を生じるように変更され得る。これらの条件は、ヌクレオチド塩基の組成および長さ、ならびに使用の状況に基づいて、経験的に、またはかかる変数を決定するための式に基づいて(例えば、Sambrook et al., 上述; Ausubel et al.上述参照)のいずれかで変更され得る。
【００５５】
特定の態様において、2つ以上のプローブの集団(例えばカクテル)を試料と共にインキュベートする。一般的に、プローブカクテル組成物は、複数の異なる標識されたプローブを含み、異なる標識されたプローブのそれぞれは、(a)異なる染色体特異的配列および(b)異なる染色体に特異的なカクテル中の他のプローブ上の検出可能な標識とは識別可能な、異なる検出可能な標識を有する。いくつかの態様において、プローブ上の検出可能な標識は、スペクトル的に識別可能な放出波長を有するフルオロフォアである。スペクトル的に識別可能なフルオロフォアなどの識別可能なマーカーで標識された異なるプローブを使用することで、試料中の(例えば、2つ以上の異なる染色体上の)2つ以上の標的核酸の有無を調べるために、プローブの組み合わせを同時に使用し得る。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、異なる検出可能なマーカーに適切なように調整され得る。
【００５６】
本発明の方法に有用なプローブは、試料中の標的核酸中のヌクレオチド配列(例えば標的配列)に実質的に相補的なヌクレオチド配列からなる標的結合領域を含む。一般的には望ましいが、プローブ中の標的結合領域は、標的核酸に対して100%の相補性を有することを必要としない。例えば、いくつかの態様において、本発明の方法に有用なプローブは、標的核酸中のヌクレオチド配列に対して少なくとも約70%、例えば約80%、約90%、約95%または約99%相補的なヌクレオチド配列を含み得る。
【００５７】
本発明の方法における使用に適切なプローブとしては、限定されないが、DNAプローブ、cDNAプローブ、RNAプローブ、ペプチド核酸(PNA)プローブ、ロックド核酸(LNA)プローブ、モルホリノプローブ、グリコール核酸(GNA)プローブおよびトレオース核酸(TNA)プローブが挙げられる。かかるプローブは、化学的もしくは生化学的に改変され得るか、および/または非天然もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含み得る。例えば、プローブは、改変された塩基(例えば、5-メチルシトシン)および/または改変された糖基(例えば、2'O-メチルリボシル、2'O-メトキシエチルリボシル、2'-フルオロリボシル、2'-アミノリボシル)を有する改変されたヌクレオチドを含み得る。直鎖プローブが好ましいが、有用なプローブは環状もしくは分枝であり得、および/または安定な二次構造(例えば、ステム-およびループおよびループ-ステム-ループヘアピン構造)を形成し得るドメインを含み得る。
【００５８】
本発明の方法を含むインサイチュハイブリダイゼーション法における使用に適したプローブは、当該技術分野において周知であり、例えば、オリゴヌクレオチドプローブ(例えば、合成オリゴヌクレオチド)、ゲノム断片を使用して調製されたプローブ(例えばクローン化ゲノム断片、増幅ゲノム断片)、および全ゲノムアレイ(例えば比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイ)が挙げられる。
【００５９】
特定の態様において、本発明に使用されるプローブは、オリゴヌクレオチドプローブ(例えば、一本鎖DNAオリゴヌクレオチドプローブ)である。本発明の方法に有用な典型的なオリゴヌクレオチドプローブは、直鎖であり、約20〜約100ヌクレオチド、好ましくは約30〜約50ヌクレオチドのサイズの範囲にある。特定の態様において、約30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドプローブが、本発明の方法に使用される。反復ゲノムDNA配列を標的化するオリゴヌクレオチドプローブが好ましい。
【００６０】
別の態様において、本発明に使用されるプローブは、ゲノム断片から調製される。かかるゲノム断片は、限定されないが、ゲノムDNAの増幅(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、例えばロングレンジPCRによる)、例えばプラスミド、コスミド、人工染色体(例えば細菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1-由来人工染色体および哺乳動物人工染色体)およびファージ内に存在するクローン化DNA断片のヌクレアーゼ消化、染色体の顕微解剖(microdissection)、ならびにフローサイトメトリーによる全染色体の選別などの種々の手順により得られ得る。好ましくは、ゲノム断片から調製されるプローブは、特有の、非反復ゲノム配列を標的化する。
【００６１】
本発明の方法に有用なプローブを作製する方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、生化学的、組み換え的、合成的(例えば、化学合成)および半合成的な方法が挙げられる。一態様において、本発明の方法に使用されるオリゴヌクレオチドプローブは、化学合成により作製される。合成オリゴヌクレオチドプローブは、核酸合成について公知の方法(例えばGlick and Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA (ASM Press 1998)参照)を使用して作製され得る。例えば、溶液または固相技術が使用され得る。典型的に、合成手順は自動化され、例えば、ホスホロアミダイト法、亜リン酸トリエステル法、H-ホスフェート法またはリン酸トリエステル法が挙げられ得る。
【００６２】
本発明の方法に有用なプローブはさらに、1つ以上の検出可能な標識を含み得る。本発明に従った使用に適切な標識は、当該技術分野で公知であり、一般的に、その化学的性質、および直接または間接的な手段のいずれかにより、プローブの検出を可能にする識別可能なシグナルを提供する任意の分子を含む。したがって、例えばプローブは、特異的レポーター分子、フルオロフォア、放射性物質または酵素(例えばペルオキシダーゼ、ホスファターゼ)を用いるなど、従来の様式で標識され得る。特定の態様において、本発明の方法に使用されるプローブは、検出可能な標識として、1つ以上のフルオロフォアを含む。
【００６３】
プローブへの結合に適した検出可能な標識は、間接標識または直接標識であり得る。例示的な間接標識としては、例えば、ハプテン、ビオチンまたは他の特異的に結合可能なリガンドが挙げられる。間接標識について、リガンド結合パートナーは典型的に、直接標識を有するか、代替的に間接的に標識される。ハプテンである間接標識の例としては、ジニトロフェノール(DNP)、ジゴキシゲニン、ビオチンおよび種々のフルオロフォアまたは色素(例えば、フルオレセイン、DY490、DY590、Alexa 405/カスケードブルー、Alexa 488、Bodiby FL、ダンシル、オレゴングリーン、ルシファーイエロー、テトラメチルローダミン/ローダミンレッドおよびテキサスレッド)が挙げられる。間接標識としては典型的に、リガンド結合パートナーとして抗ハプテン抗体を使用して、ハプテンが検出される。しかしながら、ハプテンは、代替的なリガンド結合パートナーを使用しても検出され得る(例えば、ビオチンの場合、例えば抗ビオチン抗体またはストレプトアビジンがリガンド結合パートナーとして使用され得る)。さらに、特定の態様において、ハプテンはまた、直接的に検出され得る(例えば、フルオレセインの場合、抗フルオレセイン抗体またはフルオレセインの直接検出が使用され得る)。
【００６４】
例示的な「直接標識」としては、限定されないが、フルオロフォア(例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、Cy3、Cy5、DY fluor (Dyomics GmbH, Jena, Germany)Alexa 532、Alexa 546、Alexa 568またはAlexa 594)が挙げられる。他の直接標識としては、例えば、放射性核種(例えば、3H、35S、32P、125Iおよび14C)、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはβガラクトシダーゼなどの酵素、発色団(例えば、フィコビリンタンパク質)、発光体(luminescer)(例えば、化学発光体および生物発光体)、およびランタニドキレート(例えば、Eu3+またはTb3+の錯体)が挙げられ得る。蛍光標識の場合、フルオロフォアは、単一の種の有機分子には限定されず、無機分子、有機分子および/または無機分子の多分子の混合物、結晶、ヘテロポリマーなどが挙げられる。例えば、シリカシェルに包まれたCdSe-CdSコアシェルナノ結晶は、生物学的分子に結合するために容易に誘導体化され得る(Bruchez et al., Science, 281:2013-2016, 1998)。同様に、超高感度生物学的検出における使用のために、高蛍光性量子ドット(硫化亜鉛キャップセレン化カドミウム)が生体分子に共有結合されている(Warren and Nie, Science, 281: 2016-2018, 1998)。
【００６５】
プローブ標識は、例えば合成中、あるいは合成後に、例えば、ターミナルトランスフェラーゼを使用して、プローブの5'-末端に、標識されたヌクレオチドを酵素的に付加することを含む5'-末端標識を使用してなされ得る。「鎖終結」ヌクレオチドを使用して、単一の標識ヌクレオチドを付加することができる。代替的に、非終結ヌクレオチドを使用して、「尾部(tail)」を形成するように複数のヌクレオチドの付加を生じ得る。合成標識について、標識されたヌクレオチド(例えば、ホスホロアミダイトヌクレオチド)を、化学合成中にプローブに組み込み得る。標識は、プローブの5'、3'もしくは両末端に(例えば、米国特許第5,082,830号参照)、またはODNの内部の位置の塩基に付加され得る。
【００６６】
核酸を標識するための他の方法には、白金ベース標識が利用される。かかる方法としては、Universal Linkage System (ULS, Kreatech Biotechnology B.V., Amsterdam, Netherlands)が挙げられる。白金ベース標識法およびそれらの応用は、例えば米国特許第5,580,990号、第5,714,327号および第6,825,330号；国際特許出願公報WO 92/01699、WO 96/35696およびWO 98/15546；Hernandez-Santoset et al., Anal. Chem. 77:2868-2874, 2005；Raap et al., BioTechniques 37:1-6, 2004；Heetebrij et al., ChemBioChem 4:573-583, 2003；Van de Rijke et al., Analytical Biochemistry 321:71-78, 2003；Gupta et al., Nucleic Acids Research 31:e13, 2003；Van Gijlswijk et al., Clinical Chemistry 48:1352-1359, 2002；Alers et al., Genes, Chromosomes & Cancer 25:301-305, 1999；Wiegant et al., Cytogenetics and Cell Genetics 87:7-52, 1999；Jelsma et al., Journal of NIH Research 5:82, 1994; Van Belkum et al., BioTechniques 16:148-153, 1994；およびVan Belkum et al., Journal of Virological Methods 45:189-200, 1993に記載される。
【００６７】
標識されたヌクレオチド(1つまたは複数)はまた、架橋体またはスペーサーを使用してプローブに取り付けられ得る。架橋体は、ホモ二官能性またはヘテロ二官能性であり得る。適切なホモ二官能性架橋体としては、例えば、各末端にNHSエステルを有するアミン反応性架橋体(例えば、ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート(succinimidylproponate))(DSP)、3,3'-ジチオビス(スルホスクシンイミジルプロピオネート)(DTSSP)、ジスクシンイミジルスベレート(DSS)、ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート(BS3)、エチレングリコールビス(スクシンイミジルスクシネート)(EGS)、エチレングリコールビス(スルホスクシンイミジルスクシネート)(SulfoEGS)など)、両末端にイミドエステルを有するアミン反応性架橋体(例えば、ジメチルアジピミデート(DMA)、ジメチルピメリミデート(DMP)、ジメチルスベリミデート(DMS)、ジメチル3,3'-ジチオビスプロピオニミデート(DTBP)など)、各末端にジチオピリジル基を有するスルフヒドリル反応性架橋体(例えば、1,4-ジ-[3'-(2'-ピリジルジチオ)プロピオンアミド(propionamdo)]ブタン(DPDPB)など)、各末端にマレイミド基を有するスルフヒドリル反応性架橋体(例えばビスマレイミドヘキサン(BMH)など)、各末端にヒドラジド基を有するカルボキシル反応性架橋体(例えば、アジピン酸ジヒドラジドおよびカルボヒドラジド(carbonhydrazide)など)、各末端にエポキシド基を有する複数基反応性架橋体(例えば、1,2:3,4-ジエポキシブタン、1,2:5,6-ジエポキシヘキサン、ビス(2,3-エポキシプロピル)エーテル；1,4-(ブタンジオール)ジグリシジルエーテルなど)が挙げられる。適切なヘテロ二官能性架橋体としては、アミン反応性末端およびスルフヒドリル反応性末端を有する架橋体(例えば、N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、長鎖SPDP(SPDP)、スルホ-LC-SPDP、スクシンイミジルオキシカルボニル-α-メチル-α-(2-ピリジルジチオ(pyridydithio))トルエン(SMPT)、スルホ-LC-SMPT、スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル(maleimidomehyl))シクロヘキサン(SMCC)、スルホ-SMCC、スクシンイミジル6-((ヨードアセチル)アミノ)ヘキサノエート(SIAX)、スクシンイミジル6-(6-(((4-ヨードアセチル)アミノ)ヘキサノイル)アミノ)ヘキサノエート(SIAXX)など)、カルボニル反応性末端およびスルフヒドリル反応性末端を有する架橋体(例えば、4-(4-N-マレイミドフェニル)酪酸ヒドラジド(MPBH)、4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシル-ヒドラジド塩酸塩(M2C2H)、3-(2-ピリジルジチオ)プロピオニル(propinyl)ヒドラジド(PDPH)など)、アミン反応性末端および光反応性末端を有する架橋体(例えば、スルホスクシンイミジル-2-(p-アジドサリチルアミド(azidosalicylicylamido))エチル-1,3'-ジチオプロピオネート(SASD)、スルホスクシンイミジル2-(7-アジド-4-メチルクマリン-3-アセトアミド)エチル-1,3'-ジチオプロピオネート(SAED)など)、スルフヒドリル反応性末端および光反応性末端を有する架橋体(例えば、N-[4-p-アジドサリチルアミド)ブチル]-3'-(2'ピリジルジチオ)プロピオンアミド(APDP)など)、カルボニル反応性末端および光反応性末端を有する架橋体(例えば、4-(p-アジドサリチルアミド)ブチルアミン(butlyamine)(ASBA)など)が挙げられる。適切なスペーサーとしては、dNTPなどの5'ODN改変、およびアミノ-またはスルホ-ホスホロアミダイトなどのアミン反応性スペーサー、例えばブチルホスホロア���ダイト、ペンチルホスホロアミダイト、ヘキシルホスホロアミダイト、ヘプチルホスホロアミダイト、オクチルホスホロアミダイト、ノニルホスホロアミダイト、デシルホスホロアミダイト、ウンデシルホスホロアミダイト、ドデシルホスホロアミダイト、ペンタデシルホスホロアミダイト、オクタデシルホスホロアミダイトなどが挙げられる。他の適切なアミン反応性スペーサーとしては、例えば(モノメトキシ)nグリコール(式中、n=3-18繰り返し単位)などの活性化ポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。さらなる適切な架橋体およびスペーサーはHerman. 「Bioconjugate Chemistry」. Academic Press. New York, NY. 1996に記載される。
【００６８】
洗浄、対比染色および封入
典型的に、インサイチュハイブリダイゼーション技術には、試料から未結合プローブおよび/または非特異的結合プローブを除去するために、ハイブリダイゼーション工程後に、一連の連続した洗浄工程が使用される。かかる洗浄工程は、本発明の室温法で実施され得る。例えば、試料へのプローブのハイブリダイゼーション後に、ハイブリダイズした試料を適切なストリンジェンシーの溶液中で洗浄して、未結合プローブおよび/または非特異的結合プローブを除去し得る。適切なストリンジェンシーは、試料を連続して高ストリンジェンシー溶液中で洗浄し、それぞれの洗浄の間でシグナル強度を読むことにより決定され得る。この様式におけるデータセットの解析は、それを超えると、ハイブリダイゼーションパターンが認め得るほどには変化せず、目的の特定のプローブについて適度なシグナルをもたらす洗浄ストリンジェンシーを明らかにし得る。
【００６９】
インサイチュハイブリダイゼーション法のための適切な洗浄バッファは、当該技術分野において一般的に公知であり(例えば、Sambrook and Russell, 上述、Ausubel et al.,上述参照。また、Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization with Nucleic Acid Probes (Elsevier, NY 1993)参照)、典型的に、限定されないが、1種類以上の塩(例えば、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩)を含む。いくつかの態様において、洗浄バッファはまた、1種類以上の塩基(例えばNaOH)を含み得る。他の態様において、該洗浄バッファはさらに、1種類以上の界面活性剤(例えば、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤)を含み得る。洗浄バッファについての適切な界面活性剤としては、例えばドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、Triton(登録商標)X-100、Tween(登録商標)20、NP-40またはIgepal CA-630が挙げられる。好ましくは、洗浄バッファは、約0.5mM〜約5mMの濃度を有する塩基(例えばNaOH)および約0.03M〜約0.09Mの総濃度を有する1つ以上の塩(例えばクエン酸ナトリウム)を含む。
【００７０】
特定の態様において、本発明の方法における洗浄工程(1つまたは複数)は、アルカリ条件下で実施される。例えば、1つ以上の塩基(例えばNaOH)を含み、約10〜13、好ましくは11〜12のpHを有する洗浄バッファが使用され得る。塩基およびアルコール変性溶液における使用に適切であると本明細書に記載される塩基のいずれかは、洗浄バッファにおいても使用し得る。本明細書に記載される方法に使用され得る適切なアルカリ性洗浄バッファは、例えば約1x〜5xSSCおよび約1〜10mM塩基を含む。一態様において(例えば、反復配列プローブ、例えばオリゴヌクレオチドプローブが使用される場合)、該アルカリ性洗浄バッファは、好ましくは約2xSSCおよび約1.75mMのNaOHを含み、約11のpHを有する。別の態様において(例えば、特有配列プローブ、例えばBACプローブを使用する場合)、アルカリ性洗浄バッファは、好ましくは約2xSSCおよび約3mMのNaOHを含む。
【００７１】
洗浄の回数およびそれぞれの洗浄の持続時間は、当業者により容易に決定され得る。本発明の室温方法のための例示的なアルカリ性洗浄条件は、例えば、2xSSC/1.75mM NaOH中、pH 11.0、室温(例えば約21℃)、洗浄1回あたり少なくとも約2分、好ましくは洗浄1回当たり約5分の1つ以上のハイブリダイゼーション後洗浄を含む。本発明の室温方法のための例示的な非アルカリ性洗浄条件は、例えば2xSSC、5分、室温(例えば約21℃)の最初のハイブリダイゼーション後洗浄、その後0.03M〜0.09Mの一価の塩(例えばSSC)および0.1% SDS、室温、1回の洗浄あたり少なくとも約2分、好ましくは1回の洗浄あたり約2分〜約5分の範囲の1回以上の洗浄を含む。
【００７２】
試料をハイブリダイゼーション後洗浄に供した後、試料中の染色体DNAは、好ましくは、例えば4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)、プロピジウムヨーダイド(PI)またはヘキスト試薬/色素などのスペクトル的に識別可能なDNA特異的染色により対比染色され、アンチフェード試薬を使用して封入される。DNA染色剤は、アンチフェード試薬に直接添加され得るか、または試料と共にインキュベートされ得、除去およびリンスされ得、その後アンチフェード試薬が添加される。試料の対比染色および封入のための試薬および技術は、当該技術分野において一般的に公知である。
【００７３】
標的核酸の検出
本発明の室温方法はさらに、試料中の1つ以上の標的核酸を検出することを含む。標的核酸は、標的核酸にハイブリダイズした標識されたプローブを検出することにより検出される。プローブ標識の検出は、特定の標識に適したアプローチを使用して達成され得、これは当業者により容易に決定され得る。例えば、フルオロフォア標識は、使用される特定のフルオロフォアの放出波長を検出することにより検出され得る。蛍光シグナルを検出するための典型的な方法としては、例えば、スペクトル蛍光測定法、落射蛍光(epifluorescence)顕微鏡検査、共焦点顕微鏡検査およびフローサイトメトリー分析が挙げられる。一般的に、蛍光標識は、低いバックグラウンドを伴い非常に強いシグナルをもたらすので、低レベルの標的の検出に好ましい。さらに、蛍光標識は、高解像度および高感度で、迅速走査法により光学的に検出可能であり、異なる放出波長を有するフルオロフォア(例えば、フルオレセインおよびローダミン)を有する異なるハイブリダイゼーションプローブは、1つの試料について複数の標的核酸を検出するために使用され得る。
【００７４】
蛍光プローブを使用するFISH手順の特定の場合において、ハイブリダイゼーション複合体を検出するために、種々の異なる光学分析が利用できる。スペクトル検出法は、例えば、米国特許第5,719,024号；Schroeck et al. (Science 273:494-497, 1996)；およびSpeicher et al. (Nature Genetics 12:368-375, 1996)に記載される。一般的なFISH手順に関するさらなるガイダンスは、例えば、Gall and Pardue (Methods in Enzymology 21:470-480, 1981)；Henderson (International Review of Cytology 76:1-46, 1982)；およびAngerer et al. in Genetic Engineering: Principles and Methods (Setlow and Hollaender eds., Plenum Press, New York, 1985)に記載される。
【００７５】
典型的には、間接標識の検出は、結合パートナーまたは二次因子の検出を含む。例えば、ビオチンおよび他のハプテン(例えば、ジゴキシゲニン(DIG)、DNPまたはフルオレセイン)などの間接標識は、二次因子としてストレプトアビジン(すなわちビオチンの場合)または抗体との相互作用を介して検出され得る。プローブと標的の結合後、標的-プローブ複合体は、例えば直接標識されたストレプトアビジンまたは抗体を使用して検出され得る。代替的に、二次因子に特異的に結合する直接標識された「三次」因子と共に、標識されていない二次因子を使用し得る(例えば、一次抗体の種およびクラスに特異的な標識された二次抗体を用いて検出され得る非標識抗DIG抗体を使用し得る)。二次因子についての標識は、放射性同位体標識を使用し得るが、典型的には、非同位体標識である。典型的な非同位体標識としては、例えば、二次または三次因子にコンジュゲートされ得る酵素およびフルオロフォアが挙げられる。DNA診断に一般的に使用される酵素としては、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。
【００７６】
使用される酵素標識の型に応じて、例えば、色または色素沈着(例えば、アルカリホスファターゼについてはp-ニトロフェニルホスフェートまたは5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスフェート/ニトロブルーテトラゾリウムおよび西洋ワサビペルオキシダーゼについては3,3'-ジアミノベンジジン-NiCI2)、蛍光(例えば、アルカリホスファターゼについては4-メチルウンベリフェリル(umbelliferyl)ホスフェート)または化学発光(例えば、Lumigen Inc., Detroit Mich.のアルカリホスファターゼジオキセタン基質LumiPhos530またはTropix, Inc.のAMPPDおよびCSPD)を検出することにより、酵素標識の検出は達成され得る。化学発光検出は、X線もしくはポラロイドフィルムを用いて、または(例えば、アルカリホスファターゼ標識プローブについて)単一光子計数ルミノメーターを使用することにより実施され得る。
【００７７】
特定の態様において、デジタル増強または統合を使用して、プローブ上の標識由来のシグナルを検出する。例えば、標識の検出は、顕微鏡(例えば、双眼顕微鏡、単眼顕微鏡または実体顕微鏡)の接眼レンズ筒(tube)に取り付けられたCCDカメラを使用した、顕微鏡画像化の使用を含み得る。いくつかの態様において、標識の検出は、画像走査顕微鏡検査を使用して達成される。例えば、コンピューター画像走査顕微鏡検査の最近の進歩により、蛍光顕微鏡検査を使用したまれな(rare)細胞を検出する能力が大きく高められており、約6x105個の陰性細胞の環境において1個の陽性細胞の検出を可能にする(例えば、Mehes et al., Cytometry 42:357-362, 2000参照)。複数の色を検出できるだけでなく、例えばDNAレベルでの転座の検出に有用な融合または共局在化したシグナルも検出できる進歩した画像走査ソフトウェアが開発されている(MetaSystems Group, Inc.)。典型的に、走査速度は、単一陽性細胞の信頼できる検出に利用されるパラメーターの数に依存する。画像走査はまた、陽性であるとスコアリングされた細胞の画像を確認のために手動で調べることを可能にする。複数の色を検出することができるだけでなく、例えばDNAレベルでの転座の検出に有用な融合または共局在化したシグナルも検出できる、自動化されたスライドベース分析のための進歩した画像走査ソフトウェアが開発されている(Meta System Group, Inc.)。典型的に走査速度は、単一陽性細胞の信頼できる検出のために利用されるパラメーターの数に依存する。自動化スライドベース走査システムは特に、ハイスループットアッセイに向いている(amenable)。
【００７８】
一態様において、例えばMetaCyte Automated Bio-Imaging System (Meta System Group, Inc.)を使用する走査スライド顕微鏡検査が使用される。このシステムは、以下：1) Carl Zeiss Axio Plan 2 MOT蛍光顕微鏡、2)走査型8点ステージ、3) PC Pentium III Processor、4) Jaiカメラ、5)カメラインターフェース、6)ステージ調節器、7)トラックボールおよびマウス、ならびに8)プリンターの構成要素からなる。スライド設定を顕微鏡に装填して、焦点解析が開始される。ステージを動かしながらスライドを走査し、画像を捕捉する。スライド全体の走査後に、ギャラリー(gallery)を作成する。陽性または陰性についての基準設定に基づいて、画像解析により陽性または陰性のいずれかのシグナルが生じる。陰性の場合、まれな事象の分析のためにスライドを再度走査する。陽性の場合、適切な蛍光シグナルのためにフィルターを変更し、5〜7面を捕捉して解析する。8スライドのために立ち去って/一晩操作される(標準または選択的トレイ交換器により100スライド)。適応性検出アルゴリズムおよび自動露出調節機能により均一でない染色条件が補償される。いくつかのマーカーを同時に検出し得る。標準光源は、UVからIRまでの広いスペクトルをカバーする。細胞蛍光強度により1/1000秒の検出が可能な場合、まれな細胞の検出のために1000細胞/秒までの走査速度を使用できる。強いシグナルについて、走査速度を上げるために、より低い倍率が使用できる。
【００７９】
代替的に、プローブの検出は、デジタル増強または統合の非存在下で実施され得る。
【００８０】
標的核酸を検出するためのキット
別の態様において、本発明は、室温条件下で、生物学的試料中の標的核酸(例えば1つ以上の標的核酸)を検出するためのキットに関する。典型的に、該キットは、1つ以上のプローブ、変性バッファ、ハイブリダイゼーションバッファおよび洗浄バッファを含む。いくつかの態様において、該キットは、例えば二次検出試薬、染色体DNAの染色剤、アンチフェード試薬、指示書、プロトコルまたはそれらの組み合わせなどのさらなる任意の構成成分を含み得る。典型的に、該キットは、使用の容易化のために区画化され得、試薬を有する1つ以上の容器を含み得る。一態様において、キット構成成分の全ては一緒にパッケージ化される。代替的に、該キットの1つ以上の個々の構成成分は、他のキット構成成分とは別のパッケージで提供され得る(例えば、変性バッファは、他のキット構成成分とは別にパッケージ化され得る)。
【００８１】
一態様において、本発明のキットは、1つの容器中に、標的核酸中の標的配列に実質的に相補的な標的結合領域を含む少なくとも1つの一本鎖オリゴヌクレオチドプローブを含む。好ましくは、本発明のキット中のそれぞれの一本鎖オリゴヌクレオチドプローブは、染色体特異的プローブである。典型的に、一本鎖オリゴヌクレオチドプローブは、約20〜約50ヌクレオチド、好ましくは約30ヌクレオチドからなる。本発明のキットにおける使用のための適切な種類のオリゴヌクレオチドプローブ(例えばDNA、RNA、PNA)を本明細書に記載する。好ましくは、本発明のキット中のオリゴヌクレオチドプローブはDNAプローブである。
【００８２】
特定の態様において、本発明のキット中の一本鎖オリゴヌクレオチドプローブは標識される(例えば、1つ以上の検出可能な標識を含む)。一本鎖オリゴヌクレオチドプローブのための例示的な検出可能標識を本明細書に記載する。好ましくは、本発明のキット中のオリゴヌクレオチドプローブは、1つ以上のフルオロフォア(例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、Cy3、Cy5、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 568またはAlexa 594)を含む。
【００８３】
いくつかの態様において、本発明のキットは、同一の容器内にプローブカクテル組成物として混合されるか、または別々の容器内に提供されるかのいずれかで、複数の異なる標識されたプローブを含む。かかる態様において、それぞれのプローブは、特定の標的核酸に特異的であり、異なる標的核酸に対して特異性を有する、カクテルまたはキット中の他のプローブ上に存在する検出可能標識から識別可能な検出可能標識を含む。例えば、それぞれのプローブは、スペクトル的に識別可能な放出波長を有するフルオロフォアを含み得る。複数の異なる標識されたプローブを有する本発明のキットにおける使用に適切なフルオロフォアとしては、例えばAlexa 488(492nmで励起最大および520nmで放出最大)およびAlexa 546(555nmで励起最大および570nmで放出最大)が挙げられる。
【００８４】
一態様において、本発明のキットは、別々の容器中に、塩基(例えばNaOH)およびアルコールを含む変性バッファを含む。好ましくは、変性バッファは、約0.03N〜約0.17Nの塩基、例えば約0.05N、約0.06N、約0.07N、約0.08N、約0.09Nまたは約0.1Nの塩基を含む。好ましくは、変性バッファは、約0.07NのNaOH(すなわち0.07MのNaOH)を含む。変性バッファにおける使用のための例示的な塩基としては、例えば水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化セシウム(caesium)、水酸化ナトリウム、水酸化ストロンチウム、水酸化カルシウム、水酸化リチウム、水酸化ルビジウム、水酸化マグネシウム、ブチルリチウム、リチウムジイソプロピルアミド、リチウムジエチルアミド、ナトリウムアミド、水素化ナトリウム、リチウムビス(トリメチルシリル)アミド、炭酸ナトリウムおよびアンモニア、またはそれらの組み合わせが挙げられる。好ましくは、塩基はアルカリ塩基である。より好ましくは、塩基は水酸化ナトリウムである。変性バッファはさらに約50体積%〜約90体積%、例えば約60体積%、約70体積%または約80体積%の濃度の少なくとも1つのアルコールを含む。好ましくは、アルコールは、約70体積%の濃度で存在する。変性バッファにおける使用のための例示的なアルコールとしては、例えばとりわけエタノール、メタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノールおよびイソアミルアルコール、またはそれらの混合物が挙げられる。特定の態様において、変性バッファは、約70%のエタノールを含む。
【００８５】
さらに別の態様において、変性バッファは、アルコールまたは塩基の代わりにホルムアミド(例えば70%ホルムアミド)を含む。
【００８６】
本発明のキットは、別の容器中にハイブリダイゼーションバッファを含む。一態様において、ハイブリダイゼーションバッファは、1つ以上の塩基(例えばNaOH)を含み、約10〜13、好ましくは約11〜12の範囲のpHを有する。変性溶液における使用について適切であると本明細書に記載される塩基のいずれかは、ハイブリダイゼーションバッファ中でも使用され得る。また、ハイブリダイゼーションバッファはさらに、約20〜60%のホルムアミドおよび約5〜40%の硫酸デキストランを含み得る。一態様において、ハイブリダイゼーションバッファは、約30〜50%のホルムアミド、約10%の硫酸デキストランおよび約1〜3mMのNaOHを含み、約11〜約12の範囲のpHを有する。別の態様において、ハイブリダイゼーションバッファは、約4.2mMのNaOH、約42%のホルムアミドおよび約28%の硫酸デキストランを含む。
【００８７】
さらに別の態様において、ハイブリダイゼーションバッファは、ホルムアミド、および塩基の代わりに約0.03M〜約0.09Mの終濃度の1つ以上の塩(例えばナトリウム塩)を含む。好ましくは、1つ以上の塩としてはクエン酸ナトリウムが挙げられる。ハイブリダイゼーションバッファにおける使用のための他の適切な塩としては、塩化ナトリウムが挙げられる。
【００８８】
本発明のキットはさらに、1つ以上の洗浄バッファを含む。特定の態様において、1つ以上の洗浄バッファはそれぞれ、1つ以上の塩基(例えばNaOH)を含み、約10〜13、好ましくは約11〜12のpHを有する。変性バッファおよびハイブリダイゼーションバッファにおける使用に適切であると本明細書に記載される塩基のいずれかは、洗浄バッファにも使用され得る。好ましくは、1つ以上の洗浄バッファは、約1x〜5xSSCおよび約1〜10mMの塩基を含む。特定の態様において、洗浄バッファは、約2xSSCおよび約1.75mMのNaOHを含み、約11のpHを有する。別の態様において、洗浄バッファは、約2xSSCおよび約3mMのNaOHを含む。
【００８９】
さらに別の態様において、1つ以上の洗浄バッファのそれぞれは、約0.03M〜約0.09Mの終濃度の1つ以上の塩(例えば、ナトリウム塩、リチウム塩またはカリウム塩)を含み塩基を含まない。特定の態様において、洗浄バッファは、クエン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムを含む。洗浄バッファはさらに、限定されないがドデシル硫酸ナトリウム(SDS)などの界面活性剤を含み得る。洗浄バッファ中のSDSの適切な濃度は、典型的に、約0.01%〜約1.0%の範囲SDS、好ましくは約0.1% SDSである。また、本発明のキット中の洗浄バッファは、任意にホルムアミドを含み得る。
【００９０】
標識されたプローブを検出するための1つ以上の試薬を提供するさらなる容器も、本発明のキットに含まれ得る。かかるさらなる容器は、プローブ上の標識の種類に対応した検出アッセイにおける使用のために、当業者に認識される試薬または他の要素を含み得る。一態様において、キット中のプローブは、間接標識(例えばビオチン)を含み、キットはさらに、間接標識を検出するための少なくとも二次因子(例えば、フルオロフォアで標識されたストレプトアビジンを提供する容器)を含む。
【００９１】
本発明の例示態様の記載を以下にする。
【実施例】
【００９２】
実施例1：室温変性工程および標準的な高温のハイブリダイゼーション工程および洗浄を使用するFISH手順
細胞遺伝学的スライド調製物
個々の男性ドナーから末梢血培養物を回収して、ヒト染色体スライドを調製した。25mLの培養フラスコあたり1mLのドナー由来の末梢血を、10mL RPMI1640、2mM L-グルタミン、FBS 10%、250μL PHA中、37℃および5% CO2で培養した。培養の72時間後、培養液1mLあたり0.6μlのコルセミド(Karyomax, Invitrogen)を添加して、細胞を有糸分裂中に停止させた。37℃で20分後、培養物を1750rpmで10分間遠心分離して、上清を廃棄して、10mLの低張液および75mMのKClを注意深く添加した。37℃で20分間インキュベートした後、細胞の前固定を行い、細胞を凝集させることなくさらなる固定を容易にするために、チューブに数滴のカルノア固定液(メタノール:酢酸、3:1)を添加した。遠心分離後、細胞をカルノア固定液に再懸濁した。ペレットが明らかに白色になるまで、固定工程を3回繰り返した。最後の固定の間に、スライド調製に必要な固定液の正確な量を決定した。スライド1枚あたり1、2滴の細胞懸濁液を、約22℃、約50%湿度で、SuperFrost(登録商標)スライド上に広げた。スライドを37℃で一晩維持し、次いでFISHを行うまで、乾燥剤入りの密閉式の箱中、-20℃で保存した。
【００９３】
プローブ
XおよびY Oligo-FISH(登録商標)プローブ(Cellay, Inc., Cambridge, MA)を使用した。プローブを合成して、Dyomics, GmbH (Jena, Germany)のDY fluorを使用して、Thermo Fisher Scientific (Ulm, Germany)により標識した。染色体Xプローブは、DY590蛍光色素で標識し、10 ODNからなる。ヒトX染色体の動原体周囲領域には約5000回のDXZ1反復2Kb配列が存在する(Yang 1982)。この2Kbの領域は、不完全な直接反復中に配列される12個の171bpαモノマーからなり、X染色体αサテライト反復プローブを設計することを可能にする。他の染色体αサテライト反復との交差ハイブリダイゼーションを回避するために、プローブは、コンセンサスαモノマー配列と低い相同性を有するDXZ1座の領域に対応するように設計した。染色体Yプローブは、4個のODNからなり、DY490 fluorで標識される。Yq12染色体バンド上のDYZ1領域は、500〜3000コピーで存在する3.4kb配列エレメントからなる。この反復を通じて、異なる長さの特有のY染色体特異的配列エレメントの間に、高コピー数のTTCCAサテライト3ペンタマー配列反復が散在する(Nakahori 1986; Weier 1990; Nakagome 1991)。理想的には、最適なハイブリダイゼーションのために、合成ODN Yプローブは、TTCCAペンタマーに対して不十分に示され(unrepresented)、主に、約50% CG塩基で構成される配列からなる。この領域について30マーのODNプローブを設計し、Basic Local Alignment Tool (BLAST)(Altschul 1990)を使用して、ヒト全ゲノムデータベース(NCBI)と比較した。該配列を、フィルターなしで非重複ゲノムデータベース(nr)と比較した。
【００９４】
室温変性および従来のハイブリダイゼーション工程を使用するFISH
ヒト末梢血から回収して調製した細胞遺伝学的スライドを、70%エタノール中NaOHの溶液で、21℃、3分〜20分の範囲で変化する変性時間変性させた。0.03M〜0.17Mの範囲の異なる濃度のNaOHを試験した。次いで、このスライドを、エタノール勾配(80%、90%および100%)でそれぞれ2分間脱水し、風乾した。等容量のハイブリダイゼーションバッファおよびプローブカクテルを混合して、この手順に使用するハイブリダイゼーションミックスを得た。カクテルは、10μLの作業容量で使用した。それぞれのスライド上の目的の領域は、位相差顕微鏡で場所を確認し、10μL容量のOligoFISH(登録商標)X、Yq12カクテルをスライド上に滴下し、22mmx22mmのカバーガラスでカバーした。37℃で5分間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、スライドを、撹拌しながら2xSSC中で洗浄し、カバーガラスを外して、次いで30秒間の撹拌を使って、50℃で2分間洗浄した(0.2xSSC、0.1% SDS)。最終的に、スライドを2xSSC中に回収し、DAPIを有するアンチフェードを載せ、50mmx22mmのカバーガラス(#1の厚さ)でカバーした。それぞれのプローブについて、50個の間期の核から得られた平均信号対雑音比(SNR)を使用して、FISHデータを比較した。
【００９５】
シグナル強度の決定
信号対雑音比(SNR)によりシグナル強度を決定した。NIS-Elementsソフトウェアを使用して、50個の間期の核(統計解析に必要な最小数)から同一条件下で得たFISH画像を、グレーレベルの閾値によりセグメントに分け、シグナルと細胞核の間で区別した。それぞれの細胞について、測定されたセグメント中のグレーレベルの合計として画定されたグレーレベル平均をピクセルのセグメント面積で割って、標準偏差を計算した。次いで、シグナル平均グレーレベルを、バックグラウンド平均グレーレベルで割って、信号対雑音比を決定した。
【００９６】
蛍光顕微鏡検査および画像取得
CoolSNAPTM HQ2 CCDカメラ(Photometrics Ltd., Tucson, AZ)を備えたNikon Eclipse 90i顕微鏡(Nikon Instruments, Melville, NY)を使用して、蛍光顕微鏡検査分析およびデジタル画像捕捉を行った。Nikon NIS-Elementsソフトウェアを使用して画像を捕捉して測定した。
【００９７】
結果
試験した異なるNaOH濃度のうち、70%エタノール中0.07MのNaOHは最も高いSNRを生じた。また、最適な変性時間は10分であると見出された。図1は、両方の手順に従来のハイブリダイゼーション(37℃)および洗浄(50℃)温度を使用した場合の従来の変性(70%ホルムアミド、72℃)と比較して、10分の室温変性により、XおよびYプローブについて統計的に同様のSNRが生じることを示す。
【００９８】
実施例2：室温変性および洗浄を使用したFISH手順
室温変性および洗浄を使用したFISH
ヒト末梢血から回収して調製した細胞遺伝学スライド(実施例1に記載)を、70%エタノール中の0.07M NaOH中、21℃、15分で変性させた。次いで、スライドを、エタノール勾配(80%、90%および100%)でそれぞれ2分間脱水して風乾させた。それぞれのスライド上の目的の領域は位相差顕微鏡で場所を確認し、10μL容量のOligoFISH(登録商標)X、Yq12カクテルをスライド上に滴下して、22mmx22mmカバーガラスでカバーした。室温(約21℃)で10分間、ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後、撹拌下でスライドを2xSSC中、5分間洗浄して、カバーガラスを外した。ハイブリダイゼーション後、スライドを、種々の濃度のNaOH(1、2および3mM)を有する2xSSCバッファ中、室温で5分間洗浄した。最終的に、スライドを2xSSC中に回収し、DAPIを有するアンチフェードを載せ、50mmx22mmカバーガラス(#1の厚さ)でカバーした。それぞれのプローブについて50個の間期の核から得た平均信号対雑音比(SNR)を使用してFISHデータを比較した。1mMのNaOHは、強いシグナルを生じたがいくつかの二次的なシグナルが見られ、2mMはより弱いシグナルを生じたが非常に特異的であった。そのためさらなる濃度のNaOH、1、1.25、1.50、1.75および2mMを試験した。1.75mMのNaOH、2xSSC、室温は、0.2xSSC、0.1% SDS、48℃の高温洗浄と極めて同様な結果を生じた。
【００９９】
実施例1に一般的に記載したとおりに、細胞遺伝学的スライド調製、プローブ、シグナル強度決定および蛍光顕微鏡検査および画像取得を行った。
【０１００】
結果
室温変性についての最適条件の確立後、実施例1に記載される従来のFISHに使用したものと同じハイブリダイゼーションバッファを使用して、室温、10分間の0.07MのNaOH/70%エタノール中の前処理/変性と組み合わせて、室温洗浄条件(21℃ハイブリダイゼーション、5分)を試験した。ここでは、実施例1に使用したものと同じOligoFISH(登録商標)XおよびYプローブセットならびに従来の洗浄条件(0.2xSSC、0.1% SDS、50℃)を使用した。室温洗浄画像を図2に示す。X(赤色)およびY(緑色)プローブについてのFISHシグナルが、間期の核中および中期伸展物中の対応する染色体上で明確に示される。
【０１０１】
実施例3：室温および塩基性条件下で行ったハイブリダイゼーション工程を使用した末梢血細胞についてのFISH手順
種々の濃度の水酸化ナトリウムを有するハイブリダイゼーションバッファを調製して、実施例1に記載される室温変性工程および実施例2に記載される室温洗浄を使用したFISH手順で試験した。室温(22.7℃)で5分間行ったプローブハイブリダイゼーション工程を含む他の室温処理に対する室温ハイブリダイゼーション工程の独立性を示すために高温70%ホルムアミド変性工程および50℃洗浄に供したスライドも含めた。試験したハイブリダイゼーションバッファ中のNaOHの濃度は1、2、3および4mMとした。ホルムアミドおよび硫酸デキストランの濃度は実施例1と同じにしたが、pHの緩衝化をさけるため、2xSSCは除去した。室温ハイブリダイゼーション条件下のそれぞれの水酸化ナトリウムハイブリダイゼーションバッファを使用して得られた結果(すなわち、信号対雑音比)を、標準ハイブリダイゼーションバッファ(2xSSC、30%ホルムアミド、20%硫酸デキストラン)を使用して、37℃で5分間ハイブリダイゼーションを行った場合に得られた結果と比較した。バッファの選択について、信号対雑音比分析は、実施例1に記載するように行った。全ての実験は、未処理の末梢血スライドを使用して行った。全てのハイブリダイゼーションについて、染色体3(金色)、6(明緑青色)、7(緑色)および20(赤色)の数え上げのためにOligoFISH(登録商標)プローブのパネルを使用した。
【０１０２】
3mM NaOH、30%ホルムアミドおよび20%硫酸デキストランからなるハイブリダイゼーションバッファを用いた室温ハイブリダイゼーションは、37℃で標準バッファを用いたハイブリダイゼーションで生じたシグナルとは視覚的に区別がつかないシグナルを生じた。室温条件下で3mM NaOH、30%ホルムアミドおよび20%硫酸デキストランハイブリダイゼーションバッファを用いて末梢血スライドについて得られた信号対雑音比は、37℃で標準ハイブリダイゼーションバッファ(2xSSC、30%ホルムアミド、20%硫酸デキストラン)を使用して得られたデータとも極めて類似していた(図3)。
【０１０３】
実施例4： 室温での前処理後、全て室温および塩基性条件下で行った変性、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程を使用した尿路上皮細胞についてのFISH手順
室温プロテアーゼ処理、変性、ハイブリダイゼーションおよび洗浄工程を使用したFISH手順を尿路上皮スライド上で行った。0.2%ペプシンを用いて、室温で15分間、プロテアーゼ処理を行った後、1%ホルマリンで短い固定を行った。0.07M NaOH/70%エタノール中、室温で10分間変性を行った後、85%および100%エタノール中、それぞれ1分間脱水を行った。3mM NaOH、30%ホルムアミドおよび20%硫酸デキストランのハイブリダイゼーションバッファ中、室温条件下で10分間、染色体3、6、7および20の数え上げのためにOligoFISH(登録商標)プローブを用いてハイブリダイゼーションを行った。スライドの洗浄は、1.75mM NaOH、2xSSC中、室温で5分間行った。結果を、プロテアーゼ、変性、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を、FISHについての標準試薬を使用して高温で行った場合に得られた結果と比較した。両方の組の条件について、プローブは、試料に10分間ハイブリダイズさせた。信号対雑音分析は、実施例1に記載されるように行った。
【０１０４】
全て室温処理を用いた手順は、高温で標準バッファを用いたハイブリダイゼーションで得られたシグナルと区別がつかないシグナルを生じた。それぞれの手順で得られた信号対雑音比の分析(図4)により、一致する結果が明らかになった。したがって、高濃度のプロテアーゼおよびアルカリ変性、ハイブリダイゼーションならびに洗浄を使用した室温条件は、尿路上皮細胞で行ったFISH手順において成功裡に使用し得る。
【０１０５】
実施例5：BACを用いて生成された特有配列プローブを用いて、室温の変性、ハイブリダイゼーションおよび洗浄を使用した、末梢血細胞についてのFISH手順
染色体13上に位置するBACプローブを含むFISH手順を、いくつかの条件下で成功裡に行った(例えば図5参照)。最初に、スライドを、70%ホルムアミド、2xSSC中、72℃で3分間変性させた。緑色で標識したBACプローブを、42%ホルムアミド、28%デキストランおよび2.8xSSCからなるハイブリダイゼーションバッファに再懸濁した。BACを、この混合物中、72℃で10分間変性させ、37℃で30分間、反復配列に再度ハイブリダイズさせた。プローブをスライドに適用して、37℃で一晩ハイブリダイズさせた。その後、スライドを、0.2xSSC、0.3% NP40中、72℃で5分間洗浄した。OligoFISH(登録商標)プローブに使用した同じ室温変性が作用するかどうかを試験するために、末梢血スライドを、70%エタノール中0.07MのNaOHで10分間処理し、その後、本明細書の実施例1に記載の従来のプロトコルを行なった。プローブシグナルの特異性および強度は、高温ホルムアミドで変性させたスライドとは区別がつかなかった。
【０１０６】
次いで、1.75mM NaOH、2xSSC中で5分間、室温洗浄を行い、同様の結果が得られ、0.2xSSC、0.3% NP40を用いて72℃で洗浄したスライドとは区別がつかないシグナルを生じた。最終的に、特有配列プローブが室温でハイブリダイズする適切な条件を決定するために、ハイブリダイゼーションバッファ中、異なる濃度のNaOH(2、3、4および5mM)を試験した。ホルムアミドの濃度を42%および硫酸デキストランの濃度を28%に維持しながら、NaOHの任意の緩衝化を避けるために2xSSCを除去した。このスライドを室温で一晩ハイブリダイズさせた。37℃でハイブリダイズさせたスライドと比較すると、4mMはかなり同様であるが、わずかに暗いシグナルを生じることが明らかとなった。そのため、ハイブリダイゼーションバッファ中のNaOHの濃度を最適化するために、新しいスライドで4、4.2、4.4、4.8および5mMの濃度を試験した。4.2mMのNaOHを有するバッファは、従来のハイブリダイゼーションバッファを用いて37℃でハイブリダイズさせたスライドとは視覚的に区別がつかないシグナルを生じた。
【０１０７】
本明細書に引用される全ての特許、公開された出願および参考文献の関連のある教示は、その全体において参照により援用される。
【０１０８】
本発明は、その例示態様に関して具体的に示され、記載されてきたが、形態および詳細における種々の変更が、添付の特許請求の範囲に包含される発明の範囲から逸脱することなく、本発明においてなされ得ることが当業者には理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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