(57)【要約】トウモロコシから油を得るための方法が開示され、この方法は、トウモロコシ穀粒を粉砕して粉を形成することと、この粉に水を添加してスラリーを形成することと、このスラリーを、約３〜約７のｐＨで約７５℃〜約１２０℃の温度にて約１０分間〜約１８０分間、α−アミラーゼとインキュベートしてマッシュを形成することと、このマッシュを約１５℃〜約４０℃に冷却して、窒素源、グルコアミラーゼ、酵母、酸性プロテアーゼ、および細胞壁多糖類分解酵素を添加して、エタノールおよび油を含有する約３〜約７のｐＨを有するビールを形成することと、油をこのビールから回収することとを含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウモロコシから油を得るための方法であって、トウモロコシ穀粒を粉砕して粉を形成することと、前記粉に水を添加してスラリーを形成することと、前記スラリーを、約３〜約７のｐＨで約７５℃〜約１２０℃の温度にて約１０分間〜約１８０分間、α−アミラーゼとインキュベートしてマッシュを形成することと、前記マッシュを約１５℃〜約４０℃に冷却し、窒素源、グルコアミラーゼ、酵母、酸性プロテアーゼ、および細胞壁多糖類分解酵素を添加して、エタノールおよび油を含有する約３〜約７のｐＨを有するビールを形成することと、油を前記ビールから回収することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記細胞壁多糖類分解酵素が、セルラーゼおよびヘミセルラーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸性プロテアーゼおよび細胞壁多糖類分解酵素の濃度が、乾燥重量基準でコーンのメートルトン当たり約０．２５ｋｇ〜約１５ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記酸性プロテアーゼおよび細胞壁多糖類分解酵素の濃度が、コーンのメートルトン当たり約０．５ｋｇ〜約１０ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酸性プロテアーゼおよび細胞壁多糖類分解酵素の濃度が、コーンのメートルトン当たり約０．５ｋｇ〜約５ｋｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記粉が、約２〜約０．２５ｍｍの粒径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記粉が、約１．５〜約０．２５ｍｍの粒径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記粉が、約０．６〜約０．２５ｍｍの粒径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
トウモロコシから油を得るための方法であって、トウモロコシ穀粒を粉砕して粉を形成することと、前記粉に水を添加してスラリーを形成することと、前記スラリーを、約３〜約７のｐＨで約７５℃〜約１２０℃の温度にて約１０分間〜約１８０分間、α−アミラーゼとインキュベートしてマッシュを形成することと、前記マッシュを約１５℃〜約４０℃に冷却し、窒素源、グルコアミラーゼ、酵母、酸性プロテアーゼ、および細胞壁多糖類分解酵素を添加して、エタノールおよび油を含有する約３〜約７のｐＨを有するビールを形成することと、前記エタノールを前記ビールから除去して全蒸留廃液を形成することと、前記全蒸留廃液を湿った穀物および薄い蒸留廃液に分離することと、前記薄い蒸留廃液を蒸発させてシロップを形成することと、油を前記シロップから回収することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の参照）
本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１２年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６１／７２４，４５８号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
トウモロコシから油を得るための方法が開示され、この方法は、トウモロコシ穀粒を粉砕して粉を形成することと、この粉に水を添加してスラリーを形成することと、このスラリーを、約３〜約７のｐＨで約７５℃〜約１２０℃の温度にて約１０分間〜約１８０分間、α−アミラーゼとインキュベートしてマッシュを形成することと、このマッシュを約１５℃〜約４０℃に冷却し、窒素源、グルコアミラーゼ、酵母、酸性プロテアーゼ、および細胞壁多糖類分解酵素を添加して、エタノールおよび油を含有する約３〜約７のｐＨを有するビールを形成することと、油をこのビールから回収することとを含む。
【０００３】
現在行われているコーン加工には、乾式粉砕過程および湿式粉砕過程の主に２つの種類がある。湿式粉砕過程は、それらが、コーン油、デンプン、コーングルテンミール、コーングルテン飼料、およびコーンスティープリカーなどの多様な高価値コーン製品を産生するため、コーンを有効に用いる。しかしながら、湿式粉砕過程は、機械に非常に高額な設備投資を必要とする。乾式粉砕エタノール過程は、エタノールおよび動物飼料を産生するために使用される。動物飼料は、コーン油およびゼインよりも実質的に価値が低く、これらは乾式粉砕過程によって動物飼料に残される。
【０００４】
濃縮された薄い蒸留廃液流（シロップ）の遠心分離による発酵後のコーン油の回収（しばしばバックエンド油回収と呼ばれる）は、過去数年間で著しく増加した。米国環境保護庁（ＥＰＡ）は、６０％を超える乾式粉砕のエタノール製造業者が２０１３年までにこの技術を採用するであろうと推測している（ＥＰＡ，２０１１，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｅｌｓ  ａｎｄ  ｆｕｅｌ  ａｄｄｉｔｉｖｅｓ：２０１２  ｒｅｎｅｗａｂｌｅ  ｆｕｅｌ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｆｅｄｅｒａｌ  Ｒｅｇｉｓｔｅｒ  ７６：３８８４４−３８８９０）。本業界によるこの迅速な実装は、好ましい経済的見返り、ならびに既存のエタノール過程に対する最小限の中断に起因する。この技術を使用して回収された油は、この油を食品グレードの油への精製には望ましくないものにする高い遊離酸レベルのため、比較的品質の低いのものである（Ｗｉｎｋｌｅｒ−Ｍｏｓｅｒ，Ｊ．Ｋ．およびＬ．Ｂｒｅｙｅｒ，Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｃｒｏｐｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，３３：５７２−５７８（２０１１）；Ｍｏｒｅａｕ，Ｒ．Ａ．，Ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ，８７：８９５−９０２（２０１０））。これは、現在、バイオディーゼルの生産のための原料として、かつ動物飼料成分として使用されている。
【０００５】
この技術が本業界で迅速に成功を収めているが、これは同時に、多くの重大な技術的問題に悩まされている。主な問題は、低回収率である。いくつかの施設が良好な収率を達成したと報告する一方で、大半は、コーンの１ブッシェル（２５．４ｋｇ）当たり約０．２５ｋｇしか回収していない。供給されるコーン中に存在する油の約２５％を表しており、これは、典型的には、乾燥重量ベースで約４％の油である（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ、８２：６０３−６０８（２００５）；Ｍｏｒｅａｕ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ、８６：４６９−４７４（２００９））。いくつかの施設では、解乳化剤の使用、ならびに機械的および熱的処理が収率の改善に有益であると見出されているが、回収率は、依然として、典型的には、３０％未満であり、これらの付加は、運転コストを増加させる。
【０００６】
我々は、酸性プロテアーゼおよび細胞壁単糖類分解酵素（例えば、セルラーゼおよびへミセルラーゼ）の発酵中の添加が、発酵後の油回収を増加させ、かつ他の加工要素（例えば、コーン粉末の粒径）が乾式粉砕コーンエタノール過程における油回収率に影響を及ぼすことを見出した。
【発明の概要】
【０００７】
トウモロコシから油を得るための方法が開示され、この方法は、トウモロコシ穀粒を粉砕して粉を形成することと、この粉に水を添加してスラリーを形成することと、このスラリーを、約３〜約７のｐＨで約７５℃〜約１２０℃の温度にて約１０分間〜約１８０分間、α−アミラーゼとインキュベートしてマッシュを形成することと、このマッシュを約１５℃〜約４０℃に冷却し、窒素源、グルコアミラーゼ、酵母、酸性プロテアーゼ、および細胞壁多糖類分解酵素を添加して、エタノールおよび油を含有する約３〜約７のｐＨを有するビールを形成することと、油をこのビールから回収することとを含む。
【０００８】
この発明の概要は、以下の発明を実施するための形態で更に説明される概念の選択を簡略化された形態で導入するために提供されるものである。この発明の概要は、特許請求される主題の主要な特徴または本質的な特徴を特定するよう意図されておらず、特許請求される主題の範囲の決定を助けるよう意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本特許または出願ファイルは、カラー作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面（複数可）を伴う本特許または特許出願公開のコピーは、要請時かつ必要な手数料の支払い時に特許庁から提供される。
【００１０】
【図１】以下に記載される５つの酵素調製物および対照（酵素添加なし）の遊離油回収率を示す酵素スクリーニング試験の結果を示す。酵素は、１０ｋｇ酵素／ＭＴ乾燥コーンで添加された。
【図２】以下に記載されるＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＣＰを用いた遊離油回収率を示す。誤差棒は、二重反復平均の±１標準偏差を表す。挿入試料は、示されるＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＣＰの投入量を用いて各４００ｇのマッシュから回収された遊離油の実際の量を表す。
【図３】ＧＣ２２０（四角）およびＦＥＲＭＧＥＮ（商標）（円）を用いた遊離油回収率を示す。誤差棒は、以下に記載される二重反復平均の±１標準偏差を表す。
【図４】以下に記載される油回収率への効果を試験するために用いられたコーン粉の粒径分布を示す。示される結果は、二重反復測定値の平均である。
【図５】以下に記載される遊離油回収率への粒径の効果を試験するために調製されたコーン粉の遊離油回収率を示す。１０ｋｇ酵素／ＭＴ乾燥コーンで、脱発芽機（ｄｅｇｅｒｍｉｎａｔｏｒ）粉砕（Ｄ）、粗粉砕（Ｃ）、中粉砕（Ｍ）、微細粉砕（Ｆ）、ポリトロン粉砕（Ｐ）、ＧＣ２２０の添加（＋）である。
【図６】以下に記載される７ｋｇ酵素／ＭＴ乾燥コーンの一定の総酵素レベルにおけるＧＣ２２０とＦＥＲＭＧＥＮ（商標）の異なる比率の遊離油回収率を示す。誤差棒は、二重反復平均の±１標準偏差を表す。
【図７】以下に記載される１．０ｋｇ酵素／ＭＴ乾燥コーンでのＦＥＲＭＧＥＮ（商標）ならびに２．５ｋｇ酵素／ＭＴ乾燥コーンでのＧＣ２２０、および同じレベルのＦＥＲＭＧＥＮ（商標）とＧＣ２２０の混合物の遊離油回収率を示す。誤差棒は、三重反復平均の±１標準偏差を表す。
【図８】以下に記載される酵素用量に対する、ＧＣ２２０およびＦＥＲＭＧＥＮ（商標）の個別に用いた遊離油回収率、ならびにＧＣ２２０とＦＥＲＭＧＥＮ（商標）の２．５：１の混合物の遊離油回収率を示す。
【図９】以下に記載される２ｋｇ／ＭＴの等しい酵素用量でのＧＣ２２０のＦＥＲＭＧＥＮ（商標）に対する異なる比率を用いた遊離油回収率を示す。
【図１０】以下に記載されるコーン乾式粉砕エタノール過程についての一般的な過程モデルを示す。
【図１１】以下に記載される発酵後の油回収についての一般的な流れ図を示す。点線のボックスは、油回収を達成することができた過程中の２つの別個の場所を表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
トウモロコシから油を得るための方法が開示され、この方法は、トウモロコシ穀粒を粉砕して粉を形成することと、この粉に水を添加してスラリーを形成することと、このスラリーを、約３〜約７のｐＨで約７５℃〜約１２０℃の温度にて約１０分間〜約１８０分間、α−アミラーゼとインキュベートしてマッシュを形成することと、このマッシュを約１５℃〜約４０℃に冷却し、窒素源、グルコアミラーゼ、酵母、酸性プロテアーゼ、および細胞壁多糖類分解酵素を添加して、エタノールおよび油を含有する約３〜約７のｐＨを有するビールを形成することと、油をこのビールから回収することとを含む。
【００１２】
コーンは、例えば、ホールカーネルまたはフレーク状のコーンであってもよい。供給材料の水分含量は、約０〜約１４重量％（例えば、０〜１４重量％）でなければならない。実際にはあらゆる種類および品質の穀粒もエタノールを生成するために使用することができるが、これら過程の原料は、典型的には、「ナンバー２  イエローデントコーン」として知られるコーンである。「ナンバー２」は、当該技術分野において既知の米国穀物検査協会（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｇｒａｉｎ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）およびＵＳＤＡ（米国農務省）穀物調査飼育場管理局（ＵＳＤＡ  Ｇｒａｉｎ  Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ，Ｐａｃｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｏｃｋｙａｒｄｓ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）によって定義されたある特性を有するコーンの品質を指す。「イエローデント」とは、当該技術分野において既知の特定の種類のコーンを指す。
【００１３】
乾式粉砕条件は、一般的には、コーン乾式粉砕エタノール産業により使用されるものと同様である。乾燥したホールカーネルコーンは、それらを粉（ミール）に粉砕するために、乾式粉砕処理工程に投入される。商業的なコーンをエタノールにする施設で典型的に使用されるコーンの粒径データは、Ｒａｕｓｃｈ，Ｋ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｇｒｏｕｎｄ  Ｃｏｒｎ  ａｎｄ  ＤＤＧＳ  ｆｒｏｍ  Ｄｒｙ  Ｇｒｉｎｄ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＳＡＥ、４８（１）：２７３−２７７（２００５）に示されている。コーンは、８５％を超えるものが２．０ｍｍのスクリーンを通過するように粉砕される（Ｒａｕｓｃｈら）。しかしながら、我々は、より微細にコーン（特に胚芽）を粉砕すればするほど、コーンからより多くの油を回収することができることを見出し、好ましくは粉は、約２〜約０．２５ｍｍ（例えば、２〜０．２５ｍｍ）の粒径の、好ましくは約１．５〜約０．２５ｍｍ（例えば、１．５〜０．２５ｍｍ）の、より好ましくは約０．６〜約０．２５ｍｍ（例えば、０．６〜０．２５ｍｍ）の粒子を含有する。粉砕されたミールまたは粉は、水と混合されてスラリーを生成し、アルファ−アミラーゼと呼ばれる市販の酵素が添加される。次いで、アルファ−アミラーゼが糊化デンプンをマルトデキストリンおよびオリゴ糖（グルコース糖分子の鎖）に加水分解し、液化マッシュまたはスラリー（これは、約１５〜約５０重量％（例えば、１５〜５０重量％）の、好ましくは約２０〜約４０重量％（例えば、２０〜４０重量％）の、より好ましくは約２５〜約３５重量％（例えば、２５〜３５重量％）の、最も好ましくは約３２〜約３３重量％（例えば、３２〜３３重量％）の総固形物含量を有する）を生成するために、このスラリーは、ジェットクッキングの有無で、約３〜約７（例えば３〜７）の、好ましくは約４〜約７（例えば、４〜７）の、より好ましくは約５〜約６．５（例えば、５〜６．５）のｐＨにおいて、約７５℃〜約１２０℃（例えば、７５℃〜約１２０℃）に、好ましくは約８５℃〜約１１５℃（例えば、８５℃〜約１１５℃）に、より好ましくは約９０℃〜約１１０℃（例えば、９０℃〜１１０℃）に、約１０〜約１８０分間（例えば、１０〜１８０分間）、好ましくは約２０〜約１００分間（例えば、２０〜１００分間）、より好ましくは約３０〜約９０分間（例えば、３０〜９０分間）にわたって加熱される。これは、別個の糖化および発酵工程に続くが、大部分の商業的な乾式粉砕エタノール過程では、糖化および発酵は同時に起こる（この工程は、業界では「同時糖化発酵」（ＳＳＦ）と呼ばれる）。糖化の際に、液化マッシュは、約１５°〜約４５℃（例えば、１５°〜約４５℃）に、好ましくは約２５°〜約４０℃（例えば、２５°〜約４０℃）に、より好ましくは約３０°〜約３５℃（例えば、３０°〜４５℃）に冷却され、ｐＨを約３〜約７（例えば３〜７）に、好ましくは約３〜約５（例えば、３〜５）に、より好ましくは約３．５〜約４．５（例えば、３．５〜４．５）に低下させた後に、グルコ−アミラーゼとして知られる市販の酵素（例えば、ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｄｕｓ���ｒｉａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得られるＤＩＳＴＩＬＬＡＳＥ（登録商標）ＳＳＦ）が添加される。我々の過程では、油回収率を改善するために、少なくとも１つの酸性プロテアーゼおよび細胞壁多糖類分解酵素（例えば、セルラーゼおよびヘミセルラーゼ（セルラーゼ酵素は実際には純粋ではなく、いくらかのヘミセルラーゼを含有するため））も添加し、理想的には、この酵素は発酵槽が充填されるのと同時に添加される。発酵過程中に、尿素などの窒素源もまた、典型的には、酵母に補給源を供給するために添加される。窒素源は、典型的には、液化の前に加えられるが、この過程の後に加えることもできる。グルコ−アミラーゼは、マルトデキストリンおよび短鎖オリゴ糖を単一のグルコース糖分子に加水分解し、液化マッシュを生成し、これもまた、ＳＳＦが使用される場合、「発酵供給材料」である。発酵の際に、酵母の一般的な菌株（サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が添加され、グルコース糖をエタノールおよびＣＯ２に代謝する。糖化およびＳＳＦの双方は、約３０〜約９０時間もの時間（例えば、３０〜９０時間）、好ましくは約４０〜約８０時間（例えば、４０〜８０時間）、より好ましくは約５０〜約７５時間（例えば、５０〜７５時間）もの時間を要することがあるが、より長い時間またはより短い時間で行うこともできる。完了時には、発酵ブロス（「ビール」）は、約１７％〜約１８％（体積／体積ベース）（例えば、１７〜１８％）のエタノールと、これに加えて全ての残存する穀粒成分からの可溶性および不溶性固形物を含有する。最終エタノール含量は、デンプンの出発濃度および酵素ならびに酵母の転化効率に基づき、高い場合も低い場合もある。
【００１４】
次いで、ビールを処理して、ビールからエタノールを抜き取り、エタノールが一連の上蒸留カラムでさらに精製される。全蒸留廃液（ｗｈｏｌｅ  ｓｔｉｌｌａｇｅ）は、ビールからのエタノール除去後に産生された流である。この蒸留廃液流を、清澄機型遠心分離機内で分離し、固形物（湿潤穀粒）および液体（薄い蒸留廃液（ｔｈｉｎ  ｓｔｉｌｌａｇｅ））部分に分離する。薄い蒸留廃液流が、蒸発によって濃縮され、シロップ（凝縮蒸留可溶物（ＣＤＳ））を生成する。油の回収の現行過程は、典型的には、薄い蒸留廃液流が濃縮されシロップまたは凝縮蒸留可溶物を生成した後に開始する。次いでこのシロップは、この流内で乳化した油の放出を補助するために、熱的および／または化学的処理で処理される。これら追加の処理後に、シロップは再度遠心分離され、遊離油を回収する。化学的処理は、典型的には、乳化油を放出するよう設計されている専売化合物であり、複数の異なる供給元から入手可能である。遠心分離によるシロップからの油の取り出し後に、低脂肪の可溶性物質添加乾燥蒸留穀物残渣（ＤＤＧＳ）に乾燥するために、シロップは湿った穀粒と混合される。
【００１５】
薄い蒸留廃液からの油回収のための代替過程は、全蒸留廃液の固形物部分内に捕捉された油の回収を補助するために、清澄機が全蒸留廃液流を効果的に洗浄するより前にさらなる遠心分離を用いる。薄い蒸留廃液は、その後シロップに蒸発され、上記の通り処理され、油を取り出す。
【００１６】
油の回収は当該技術分野において周知であり、例えば、Ｍｏｒｅａｕ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｑｕｅｏｕｓ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｒｎ  ｏｉｌ  ａｆｔｅｒ  ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｒｙ  ｇｒｉｎｄ  ｅｔｈａｎｏｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ，Ｉｎ：Ｇｒｅｅｎ  Ｏｉｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ、Ｆａｒｒ，Ｗ．およびＡ．Ｐｒｏｃｔｏｒ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＡＯＣＳ  Ｐｒｅｓｓ，Ｕｒｂａｎａ，ＩＬ、５３−７０頁（２０１２）を参照されたい。
【００１７】
現行技術の過程からの油回収率は、典型的には、投入されるコーンの油含量の２５％に過ぎない。薄い蒸留廃液流の熱的および機械的処理なしでは、遊離油をほとんどまたは全く回収できない。
【００１８】
我々が開発した過程は、発酵の直前または発酵中に添加される追加の酵素（例えば、酸性プロテアーゼおよびセルラーゼならびにヘミセルラーゼなどの細胞壁多糖類分解酵素）を利用する。発酵後に、エタノールはビールから抜き取られ、改質された全蒸留廃液流を生成する。この流の特性は、発酵中の酵素処理のために変更される。その後、全蒸留廃液流は、上記記載の通りに処理されることになる：初めに、清澄機を用いて湿った穀粒と薄い蒸留廃液に分離し、次に薄い蒸留廃液をシロップに濃縮し、次いで化学的および／または熱的処理で処理され、その後遠心分離してコーン油を回収する。この新規な過程は、遠心分離を用いる油の回収率の増加を可能にする。酵素的処理からの回収率は、従来の過程で報告された２５％よりもはるかに大きく、約４０％以上（例えば、４０％以上）、好ましくは約４０％〜約５５％（例えば、４０％〜５５％）である。
【００１９】
上で特記したように、我々の過程では、油回収を改善するために、酸性プロテアーゼおよび細胞壁多糖類分解酵素（例えば、セルラーゼおよびヘミセルラーゼ）も添加する。酸性プロテアーゼは、当該技術分野において既知のあらゆる酸性プロテアーゼでもよく、例えば、ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得るＦＥＲＭＧＥＮ（商標）である。セルラーゼは、当該技術分野において既知のあらゆるセルラーゼでもよく、例えば、ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから得るＧＣ２２０である。酸性プロテアーゼおよびセルラーゼ（例えば、ＧＣ２２０およびＦＥＲＭＧＥＮ（商標））のブレンドの成分の少なくとも１つは、組み合わせの約８０重量％（例えば、８０重量％）、好ましくは約６０重量％（例えば、６０重量％）、およびより好ましくはおよそ等しい重量部を示すべきである。酵素濃度（酸性プロテアーゼおよび／またはセルラーゼ）は、乾燥重量ベースでコーンのメートルトン当たりわずか約０．２５ｋｇ〜約１５ｋｇ（例えば、メートルトン当たり０．２５〜約１５ｋｇ）、好ましくはメートルトン当たり約０．５〜約１０ｋｇ（例えば、メートルトン当たり０．５〜約１０ｋｇ）、より好ましくはメートルトン当たり約０．５〜約５ｋｇ（例えば、メートルトン当たり０．５〜５ｋｇ）である。
【００２０】
添加される特定量は、求められる油回収率の増加の量に基づく。反応時間は、酵素の増加レベルを用いて潜在的に低減することができる。アルファ−およびグルコ−アミラーゼは、酵母がその後エタノールに転化するようにコーンカーネル中のデンプンをグルコースに転化するために、現在、約１ｋｇ／ＭＴのレベルで使用されている。
【００２１】
酵素の量を最適化することは、当業者の技術の範囲内のものである。インキュベーション時間は、より少量の酵素を用いることができるように延長することができる。
【００２２】
どの酵素をうまく利用することができるかを決定することも、当業者の技術の範囲内である。この過程で使用することができる他の酵素の選択は、使用される特定の条件の下での活性および安定性を考慮する必要がある。このような酵素は、油が油体内部から、かつ油体膜との可能な会合から放出されるように、油体を分裂させる能力を有する必要がある。油体膜を分裂させる酵素は、油体膜を安定化するオレオシン（構造タンパク質）を分解する他のプロテアーゼまたは油を包囲する油体の膜内のリン脂質単層を分裂させることができるホスホリパーゼであり得る。酵素はまた、油を細胞壁マトリックス内のバリアから放出する能力を有する必要がある。この放出は、細胞壁の特定の構造に応じて、種々の個々の酵素または酵素の組み合わせを必要とする場合があり、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラナーゼ、ペクチナーゼ、およびベータ−グルカナーゼなどの細胞壁多糖類分解酵素（細胞壁分解酵素）の混合物が必要とされ得る可能性がある。酵素はまた、一旦油が油体か遊離すると形成され得るエマルジョンの安定化を妨害することができる。コーン繊維ガム（アラビノキシラン）またはゼイン（疎水性タンパク質）などのカーネルの成分は、遊離油と相互作用し、安定なエマルジョンを形成することができる。これらのエマルジョン安定化成分を加水分解する酵素は、乳化油を放出するか、またはそれが乳化されることを防ぐ。
【００２３】
別途定義されない限り、全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者により通常理解されるものと同一の意味を有する。用語「約」は、プラスまたはマイナス１０パーセントとして定義され、例えば、約１００°Ｆは、９０°Ｆ〜１１０°Ｆを意味する。本明細書に記載されるものと同様または等価のあらゆる方法および材料も本発明の実施または試験で使用することができるが、好ましい方法および材料がここで記載される。
【００２４】
以下の実施例は、本発明を更に例示することのみを意図しており、特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するよう意図するものではない。
【実施例】
【００２５】
材料および方法。酵素：使用した酵素は、ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの贈与物であった。ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）Ｆｒｅｄ（熱安定性アルファ−アミラーゼ）およびＯＰＴＩＤＥＸ（登録商標）Ｌ−４００（グルコアミラーゼ）を用いて、以下に記載されるようにコーンマッシュを調製した。ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＣＰ（セルラーゼ）、ＧＣ２２０（セルラーゼ）、ＦＥＲＭＧＥＮ（商標）（酸性プロテアーゼ）、ＭＵＬＴＩＦＥＣＴ（登録商標）Ｘｙｌａｓｅ（キシラナーゼ／セルラーゼ）、ＡＣＣＥＬＬＥＲＡＳＥ（登録商標）１５００（セルラーゼ／ヘミセルラーゼ）およびＡＣＣＥＬＬＥＲＡＳＥ（登録商標）ＸＹ（キシラナーゼ）を、以下に記載される油回収実験で使用した。
【００２６】
油含量：発酵に使用したコーンの油含量を、以前に説明された（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ８２：６０３０６０８（２００５）；Ｍｏｒｅａｕ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４４：２１４９−２１５４（１９９６））通りに、Ｄｉｏｎｅｘ  ＡＳＥシステムでのヘキサン抽出を用いて決定した。
【００２７】
粉粉砕および分析：イエローデントコーンを、生成される粉が２ｍｍのスクリーンを通過するように、板圧延機（モデルＧ２、Ｂｕｎｎ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＩＬ）内で粉砕した。板の隙間を粉砕サイズが評価される実験のために変更した。粉砕されたコーン粒子を、７つの篩サイズ（ＳＳＢＣ１４、２０、２４、３４、４４、５４ならびに７４）およびパンを備える篩振盪機（Ｇｒｅａｔ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，Ｌｅａｖｅｎｗｏｒｔｈ，ＫＳ）を用いて評価した。粒径範囲を、使用されたスクリーンサイズによって決定し、スクリーン上に保持された１００ｇの試料のパーセントとして報告した：それぞれ１．６ｍｍ以上（１．６ｍｍ）、１．０〜１．６ｍｍ（１．０ｍｍ）、０．８７〜１．０ｍｍ（０．８７ｍｍｍ）、０．５８〜０．８７ｍｍ（０．５８ｍｍ）、０．４４〜０．５８ｍｍ（０．４４ｍｍ）、０．３７〜０．４４ｍｍ（０．３７ｍｍ）、０．２５〜０．３７ｍｍ（０．２５ｍｍ）、および０．２５ｍｍ未満。粉砕されたコーンを、Ｒａｕｓｃｈらに（Ｒａｕｓｃｈ，Ｋ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡＳＡＥ、４８：２７３−２７７（２００５））に記載されるように、篩分けの前に５５℃で一晩乾燥し、塊形成を低減させた。粉の水分含量を、ＡＯＡＣ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ９３０．１５（ＡＯＡＣ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ９３０．１５、Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、第１８版、ＡＯＡＣ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ（２００５））を用いて決定した。
【００２８】
マッシュの調製：適量のコーン粉（水分含量を調整されたもの）および水をビーカーに添加し、３０％の総固体溶液を生成し、総質量を測定し、蒸発のために後で水の追加することで補償した。機械的ミキサーを用いて、１ＭのＨＣｌでｐＨを５．８に調整した。アルファ−アミラーゼ（ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＦＲＥＤ、ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、マッシュのｋｇ当たり０．５ｍＬ（２ｋｇ／ＭＴ乾燥コーン）の投入量で加え、ホットプレートを用いて、このスラリーを９５℃に加熱し、６０分間保持した。次いでマッシュを３０℃に冷却し、尿素を加えた（４００ｐｐｍの窒素）。次いで、１ＭのＨＣｌでｐＨを４．５に調整し、グルコアミラーゼ（ＯＰＴＤＥＸ（登録商標）Ｌ−４００、ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、マッシュのｋｇ当たり０．４ｍＬ（１．６ｋｇ／ＭＴ乾燥コーン）の投入量で加えた。蒸発による損失を補償するために、水を必要に応じて添加し、活性酵母を添加し（マッシュ１ｋｇ当たり１．１グラム）、発酵を開始した（Ｒｅｄ  Ｓｔａｒ  Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ，Ｆｅｒｍｅｎｔｉｓ）。
【００２９】
油回収：３０％の固形物のコーンマッシュを上記の通りに調製した。既に酵母を含有した４００グラムのマッシュを、ゴム栓と発酵中に生成されるＣＯ２をガス抜きするための２１ゲージの針とを備えた、予め秤量した５００ｍＬのエルレンマイアーフラスコのそれぞれに分配した。適当な用量の酵素を各フラスコに加え、最終的なフラスコ重量を測定した。フラスコを、２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で７２時間インキュベートし、定期的に秤量し、ＣＯ２産生による損失を決定した。
【００３０】
発酵後に、最終的なフラスコ質量を測定し、ＨＰＬＣ分析用に少量（１ｍＬ）のサブ試料を取り出した。次いで、内容物全体を６００ｍＬのビーカーに移し、撹拌しながら９０℃に加熱した。発酵後のビールからエタノールの抜き取りを概算するために、試料を約３５０ｍＬの最初の容量からおよそ２５０ｍＬに濃縮した。次いで、ビーカーの内容物を秤量された２５０ｍＬの遠心分離瓶に移し、室温に冷却した。瓶を旋回バケットロータ内で２０００ｘｇで１０分間遠心分離した。デカントにより起こると思われる損失を最小限にとどめるために、表面の油およびエマルジョン層をピペットで２５０ｍＬのビーカーに移した。油およびエマルジョン層を移した後に、液体（薄い蒸留廃液と呼ばれるフラクションとほぼ同等）を同じビーカーにデカントした。残存するペレットを含む瓶の重量を測定した。次いで、シロップの等価物（当業界において凝縮蒸留可溶物（ＣＤＳ）としても知られる）を生成するために、薄い蒸留廃液（約１５０ｍＬ）を９０℃に加熱し、約４５ｍＬまで濃縮した。このシロップを５０ｍＬの遠心分離管に移した。遠心分離管を室温まで冷却し、２４００ｘｇで２０分間遠心分離した。
【００３１】
油およびエマルジョン層を、ピペットで再度取り出し、１５ｍＬの遠心分離管に移した。遊離油を定量的に測定することができるように、この最終的な遠心分離工程を追加することで、遊離油をさらに濃縮した。追加の液体を５０ｍＬの管から移し、各１５ｍＬの管で約１２ｍＬの最終容量にした。次いで、これら管を４０００ｘｇで２０分間遠心分離した。管を視覚により比較し、遊離油およびそのすぐ下のエマルジョン層の容量を決定した。次いで、ピペットを用いて遊離油を小さい秤量したガラス管に注意深く取り出し、回収された遊離油の重量を測定した。
【００３２】
ＨＰＬＣ分析：振盪フラスコからの少量のサブ試料を遠心分離し（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ５４１５Ｄ、１６，０００ｘｇにて）、上澄み液を０．２μｍのフィルタを通して濾過した。次いで、試料を、屈折率検出器およびイオン排除カラム（Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ１２００ＨＰＬＣ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を用いて分析した。カラムを６５℃で維持し、０．６ｍＬ／分の５ｍＭの硫酸を溶出液として用いた。マルトデキストリン（ＤＰ４＋）、マルトトリオース（ＤＰ３）、マルトース、グルコース、フルクトース、コハク酸、乳酸、酢酸、グリセロール、メタノールおよびエタノールの分析標準を用いて、カラムを較正した。試料を、０．２２ｕｍのシリンジフィルタ（Ａｃｒｏｄｉｓｃ、ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＭＩ）を通して濾過し、注入した（５ｕＬ）。結果を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎソフトウェアを用いて分析した。報告された結果は、二通りの注入の平均である。
【００３３】
結果および考察。油回収法の開発：開発され、上述された方法は、ベンチスケールにおいて、発酵後の油を回収するエタノール施設で使用される一般的方法をシミュレートするよう意図したものである。有機溶媒（ヘキサンまたは塩化メチレンなど）はこの方法では使用されず、これはこれらが油回収率を人工的に増加させることができるためである。コーンカーネルの少量の最初の油含量、通常の加工中に放出された少ない量、およびガラス器具への移動ならびに操作の際の回避できない損失が、方法開発を困難にした。１００ｇのマッシュのスケールプロトコルを用いる我々の先行実験は、油収率率における再現可能な増加を達成することでは成功を収めなかった。我々は、より大量の（４００ｇのマッシュ）発酵が、油回収率を正確に測定するために、およびエタノール回収、固形物の分離ならびに液体濃縮工程が行われることを可能にするためにも十分な量であることを決定した。このスケールをテストし、再現性を決定したところ、驚くべきことに、再現可能な結果で許容できる性能を発揮することを見出した。改善された再現性は、最終的には、油の体積を概算するよりはむしろ遊離油を秤量することを通して達成された。
【００３４】
実験室スケールの過程で得られた遊離油回収率は、全油の約２５％が回収される商業的加工施設で報告された油収率よりも比較的低かったことに留意するべきである。理論に拘束されるものではないが、この差は、実験室スケールの回収過程で使用されたより温和な加工条件（例えば、より低い温度の遠心分離および低剪断伝達）に部分的には起因すると考えられる（油収率の低下はまた、移動中の損失に起因した可能性があり、または実験室過程が透明な遊離油のみを回収したためである）。
【００３５】
酵素スクリーニング：いくつかの市販の酵素調製物を、油回収率を増加させるためのそれらの能力についてスクリーニングした。酵素を、発酵条件に適合するｐＨに基づいて選択した。細胞壁分解調製物（セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよびキシラナーゼ）を、プロテアーゼと一緒に選択した。酵素の不在下の対照実験も、試験された各バッチで行った。遊離油回収の質量を、ヘキサン抽出によって決定された発酵で使用されたコーンの総油含量と比べて評価した。結果を、コーン粉のヘキサン抽出によって決定されたマッシュ中の全油の百分率として報告した。
【００３６】
乾燥コーンのＭＴ当たり１０ｋｇと同等の酵素用量を用いた結果を図１に示す。我々の前のスクリーニング実験では、酵素は非常に低いレベル（ＭＴ当たり約１．０ｋｇに等しい）でスクリーニングされたが、対照に対して明確な増加を示さなかった（結果図示せず）。図１に示すように、テストされた調製物の全てが、対照に比べて回収された遊離油の量で測定可能な改善を示したのは、より高い酵素用量が使用された場合だけであった。ＳＰＥＺＹＭＥ  ＣＰおよびＧＣ２２０は、対照に比べて最も顕著な増加を与え、更なる試験のために選択されたが、残念なことに、我々の過程でさらに利用することができるＡｃｃｅｌｌｅｒａｓｅ１５００で追加の実験を行う時間がなかった。
【００３７】
酵素濃度の効果：酵素投入実験を、スクリーニング試験からの最上位の２つのの酵素調製物、ＧＣ２２０およびＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＣＰを用いて行った。両調製物は、有意なセルラーゼ活性を有し、対照に比べて遊離油において有意な増加を生じることを驚くべきことに見出した。ＳＰＥＺＹＭＥ（登録商標）ＣＰおよびＧＣ２２０の漸増用量を用いる実験からの油回収率を、それぞれ図２および３に示す（図３にさらに示したＦＥＲＭＧＥＮ（商標）の用量応答は、以下で説明される）。結果は、漸増量が、追加の酵素がほとんどまたは全く更なる増加をもたらさないポイントまで油回収率の増加に至らしめることを示した。それぞれの酵素を用いることで、最終的な遊離油回収率は４０％以上であった。しかしながら、５０％を超える油が、遠心分離中に除去された固形物中または遊離油のすぐ下の粒子層／エマルジョン層中にまだ捕捉されている。驚くべきことに、より高い酵素濃度は、典型的なエタノールプラントの回収率に比べて遊離油回収率の増加を与えた。しかしながら、より低い酵素レベルは、商業的な施設で典型的に報告されるものよりも少ない遊離油収率を結果としてもたらした。前記のごとく、より低い油収率がより緩和な加工条件または小型の実験室スケールモデルにおける（粘着性の）透明遊離油の回収中に回避不能に発生する移動損失に起因するかどうかは不明である。明確なことは、大量の油が初めの遠心分離の際に分離された固形物フラクション中に捕捉されたままであることであった。
【００３８】
初期粒径の効果：我々は、粒径の減少がエタノール産生中の油放出を改善するために可能な方法であり得るかどうかをテストした。油回収率がさらに改善されるかを決定するために、初期のコーン粒径の低下をテストした。ディスクミルを用いてコーンを３つの異なる粒径分布に粉砕し（粗、中および微細（図４）、粗粒子は、概ね約１．５ｍｍであり、中粒子は概ね１．０ｍｍ以下であり、微細粒子は概ね約０．５ｍｍ以下であり、ならびに元の穀物粒子は概ね１．６ｍｍを超えた）、第４の試料を脱発芽（ｄｅ−ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）ミルを用いて粉砕した（粒径分布を図４に図示）。脱発芽ミルは、胚芽（コーン油の８５％を超える部分）をそのまま残したために、油小胞体の近寄りやすさをかなり制限し、この方法によって粉砕される場合、内胚乳は比較的粗であって、これら試料では最終エタノール収率の減少を結果としてもたらした（データ図示せず）。４つの異なるコーン粉の粒径分布を図４に示す。さらに、コーンが液化法を通して処理されかつ冷却された後に、１つの試料を、ポリトロンホモゲナイザーを用いて、粒径を更に減少させた。均質化は、細かく粉砕されたコーン粉を用いてつくられた１５００ｍＬのマッシュ調製物で、２０ｍｍの標準均質化発生器を用いて高速で１０分間行った。得られたマッシュは、他のマッシュ調製物のいずれと比べてもより滑らかなコンシステンシーを有した。この調製物で粒径分析を行った。
【００３９】
ＧＣ２２０の添加の有無で、様々に粉砕した粉についての発酵後の油回収率を図５に示す。酵素添加がない遊離油回収率は、粒径の減少と油の増加との間の相関関係を示したが、粗粉または胚芽無処理粉から回収可能な遊離油がない状態で、全体の遊離油収率は比較的低かった。粒径を減少させることでの油回収率の増加の同様な意外な傾向が、酵素で処理された試料で観察された。驚くべきことに、全体の回収率は、無処理の胚芽粉を除いては、未処理の粉に比べて酵素処理で有意に高かった。微細に粉砕された胚芽よりはむしろ無処理の胚芽または粗胚芽を使用することは、遊離油回収率における減少を明白にもたらし、この減少は、粒径の減少（特に胚芽の）が、コーン固形物からの油の放出に関して、発酵後の遊離油の回収率で有利に補助することの意外な重要性を強力に示唆した。
【００４０】
プロテアーゼ添加の効果：全体の油回収率を改善することを試みるための酵素の混合物を利用する初期試験は、驚くべきことにほとんど改善はもたらされなかった。ほとんどの場合、結果は別個の調製物に比べてより多量の油を産生しなかった（結果図示せず）。しかしながら、酸性プロテアーゼ（例えば、ＦＥＲＭＧＥＮ（商標））の細胞壁分解調製物（例えば、ＧＣ２２０のようなセルラーゼ）との混合物が、驚くべきことに、相乗効果のように思われることを結果としてもたらすことを我々は発見した。これらの結果を、図６に示す。これらの実験では、一定量（７ｋｇ／ＭＴ乾燥コーン）の酵素を各フラスコに添加したが、ＦＥＲＭＧＥＮ（商標）のＧＣ２２０に対する比率は様々であった。この結果は、比率が主にＦＥＲＭＧＥＮ（商標）が添加されたＧＣ２２０であった場合、油収率は、ＧＣ２２０単独のレベルを上回って驚くべきほど増加したことを明白に示している。驚くべきことに、これはまた、混合物が主としてＦＥＲＭＧＥＮ（商標）であり、ＧＣ２２０が添加された場合も同様であったが、回収率は幾分減少した。ＦＥＲＭＧＥＮ（商標）で比率が増加されるにつれて（ＧＣ２２０で減少されるにつれて）、収率は減少したが、依然としてＦＥＲＭＧＥＮ（商標）単独よりも大きかった。
【００４１】
使用されているＦＥＲＭＧＥＮ（商標）レベルが飽和点になかったこと（酵素の減少が油回収率において対応する減少をもたらさないこと）を確認するために、ＦＥＲＭＧＥＮ（商標）についての投入量反応曲線も構成し（図３）、これは、驚くべきことに、テストされた他の酵素に比べて応答で有意差を示した。ＧＣ２２０単独（同様にＳｐｅｚｙｍｅ  ＣＰ）を用いることは、驚くべきことに、得られる最大遊離油は、油総量の４０％をわずかに上回ったが、ＦＥＲＭＧＥＮ（商標）単独では、最大遊離油は意外にも約２０％に過ぎなかった。これは予想外であり、混合物実験で使用されたレベルが、我々が２つの酵素で相乗効果を観察していることを確認するには高すぎることを示した。しかしながら、この結果は、酵素が異なるメカニズムを用いて油を放出している可能性を示唆した。理論に拘束されるものではないが、これらが同一のメカニズムを用いているとすれば、それがＧＣ２２０およびＳｐｅｚｙｍｅ  ＣＰと同じ収量に達するまで、プロテアーゼは、漸増する用量で収率を増加し続けたと思われる。
【００４２】
各酵素についての飽和点よりも十分に低いレベルを用いて、相乗的観察を確認するために第２の実験を行った。１ｋｇ／ＭＴのＦＥＲＭＧＥＮ（商標）、２．５ｋｇ／ＭＴのＧＣ２２０、およびこの２つのこれら同一レベルでの混合物を用いて、同じマッシュから二通りのフラスコを調製した。遊離油の結果を図７に示し、これは酵素混合物による相乗的応答を、統計的有意差で、驚くべきことにかつ明白に示している。別個に使用された２つの添加と比較するとき、驚くべきことに１０％をわずかに超える遊離油の増加が酵素混合物について観察された（図７では「計算値」で表示）。
【００４３】
エタノール産生：ＨＰＬＣによって測定された重量損失および最終エタノール容量によって決定される発酵速度を、全ての対照および酵素添加実験について測定した。驚くべきことに、エタノール収率値は、平均でＧＣ２２０およびＳｐｅｚｙｍｅ  ＣＰの増加レベルと共に増加することが見出され、この増加は、対照に比べて高レベルの酵素添加において統計的に有意であった（結果図示せず）。ＦＥＲＭＧＥＮ（商標）の添加は、意外にも最終エタノール収率では有意な増加を示さなかったが、対照に比べて発酵速度で有意な増加を示した。このことは、グルコースのエタノールおよび二酸化炭素への転化の増加が大量のグルコースがつくられていることの結果ではなく、むしろ酵母による利用可能な栄養素の改善された利用の結果であることを示唆した。エタノールレベルは、酵素添加によって生じる阻害が存在しないことを確認するための７２時間の発酵の終了時の尺度であった。エタノールレベルがより早い時期に測定されるとすれば、発酵速度の増加のために、結果はかなり異なっていたと思われる。より早い時期には、ＦＥＲＭＧＥＮ（商標）処理のより速い発酵の分析は、未処理試料に比べてエタノールの増加した濃度を生成したと考えられる。グルコース濃度が枯渇するにつれて、転化は減速し、よりゆっくりな非ＦＥＲＭＧＥＮ（商標）処理試料が追いつき、等しいエタノール濃度に達する時間を与えた。
【００４４】
図７で示された相乗効果は、２．５：１（ＧＣ２２０：ＦＥＲＭＧＥＮ（商標））の比率における酵素の単回投入についての結果を示す。この酵素の混合物が、個々の調製物にどのように匹敵するかを確認するために、様々な酵素負荷にわたって同じ混合物をテストした。図８は、その結果を示し、前に示された個々の調製物からのデータを含む。ＧＣ２２０およびＦＥＲＭＧＥＮ（商標）を一緒に含む混合物は、等量負荷で使用されるとき、驚くべきことに、個々の調製物に比べて回収される非常に多量の遊離油をもたらすことを容易に見ることができる。
【００４５】
ＦＥＲＭＧＥＮ（商標）およびＧＣ２２０の混合物による油回収率の効果を更に検討するために、我々は、各酵素の異なる比率を用いて酵素混合物を調製した。次いで、これら混合物を、発酵中に等量（２ｋｇ／ＭＴ）で添加した。この２ｋｇ／ＭＴのレベルは、油回収率の増加または減少を容易に測定することができるように選択された。これらの実験の目標は、特定の酵素混合物が遊離油回収率を改善または減少するかを決定するためのものである。図９は、これら実験の結果を示す。四角のデータ点は、ＧＣ２２０又はＦＥＲＭＧＥＮ（商標）単独の２ｋｇ／ＭＴレベルで予想される収率を表す。このデータは、わずか数パーセントの他の酵素との混合物で、遊離油回収率が驚くべきほど増加することを明確に示した。この最高の収率増加は、意外にも、各酵素の等しい割合の混合物で、またはこの混合物に近いもので生じたが、驚くべきことに、わずか２体積％の他の酵素の組み込みが、純粋な酵素調製物に比べて増加を示した。５〜１０体積％の組み込みで、遊離油回収率は、驚くほどかつ際立って改善された。
【００４６】
結論：上記は、特定の酵素だけが、コーンをエタノールにする発酵についての実験室スケール中に十分なレベルで添加されるとき、発酵後に回収され得る（例えば、遠心分離または浮上分離により）遊離油の量を驚くべきほど改善することを立証した。発酵前のコーンの粒径の減少もまた、添加された酵素で遊離油回収率を驚くべきほど改善することが見出され、驚くべきことに胚芽粒子の減少が特に重要であること見出された。酸性プロテアーゼ／セルラーゼ酵素混合物を用いて得られる遊離油回収率は、発酵の際にこれら酵素を添加することなく油を回収するエタノール生産施設で典型的に報告される値よりも驚くべきほど高い油回収率を結果としてもたらした。酸性プロテアーゼ（例えば、ＦＥＲＭＧＥＮ（商標））のセルラーゼ（例えば、ＧＣ２２０）との特定の混合物の使用は、驚くべきことに、遊離油回収に関する相乗的挙動を呈することを見出した。この驚くべき挙動は、必要とされる酵素の総量の減少をもたらし、酵素補助油回収過程の経済的側面を改善することに役立つことができた。我々の知り得る限りでは、これは、発酵中に添加される酸性プロテアーゼおよびセルラーゼ酵素を、下流の油回収過程を改善するために使用することができることを示す最初の報告である。
【００４７】
米国特許を含める本明細書で引用される参考文献の全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらにその全体が参照により組み込まれるものは以下の参考文献である：Ｍｏｒｅａｕ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｑｕｅｏｕｓ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｏｉｌ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ：Ａ  “Ｇｒｅｅｎ”  ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｏ  ｏｂｔａｉｎ  ｏｉｌ  ｆｒｏｍ  ｃｏｒｎ  ｇｅｒｍ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｏｉｌ−ｒｉｃｈ  ｐｌａｎｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１０１−１２０頁，（ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｇ．ＥｇｇｌｅｓｔｏｎおよびＪ．Ｒ．Ｖｅｒｃｅｌｌｏｔｔｉ，ｅｄｓ（２００７））；Ｍｏｒｅａｕ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｏｉｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｓ’Ｓｏｃｉｅｔｙ、８１：１０７１−１０７５（２００４）；Ｙａｄａｖ  Ｍ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、５５（１５）：６３６６−６３７１（２００７）。さらにその全体が参照により組み込まれるものは以下の参考文献である：米国特許第８，１６８，０３７号；同第８，００８，５１７号；同第８，００８，５１６号；同第７，６０１，８５８号；同第７．６０８．７２９号；同第７，１４８，３６６号；および同第７，１０１，６９１号。
【００４８】
したがって、上記記載を鑑みて、以下を（部分的に）説明する：
【００４９】
トウモロコシから油を得るための方法であり、この方法は、トウモロコシ穀粒を粉砕して粉を形成することと、この粉に水を添加してスラリーを形成することと、このスラリーを、約３〜約７のｐＨで約７５℃〜約１２０℃の温度にて約１０分間〜約１８０分間、α−アミラーゼとインキュベートしてマッシュを形成することと、このマッシュを約１５℃〜約４０℃に冷却し、窒素源、グルコアミラーゼ、酵母、酸性プロテアーゼ、および細胞壁多糖類分解酵素を添加して、エタノールおよび油を含有する約３〜約７のｐＨを有するビールを形成することと、油をこのビールから回収することとを含む。
【００５０】
該細胞壁多糖類分解酵素が、セルラーゼおよびヘミセルラーゼである、上記記載の方法。
【００５１】
該酸性プロテアーゼおよび細胞壁多糖類分解酵素の濃度が、乾燥重量を基準に、コーンのメートルトン当たり約０．２５ｋｇ〜約１５ｋｇである上記記載の方法。該酸性プロテアーゼおよび細胞壁多糖類分解酵素の濃度が、コーンのメートルトン当たり約０．５〜約１０ｋｇである上記記載の方法。該酸性プロテアーゼおよび細胞壁多糖類分解酵素の濃度が、コーンのメートルトン当たり約０．５〜約５ｋｇである上記記載の方法。
【００５２】
該粉が、約２〜約０．２５ｍｍの粒径を有する、上記記載の方法。該粉が、約１．５〜約０．２５ｍｍの粒径を有する、上記記載の方法。該粉が、約０．６〜約０．２５ｍｍの粒径を有する、上記記載の方法。
【００５３】
トウモロコシから油を得るための方法であって、トウモロコシ穀粒を粉砕して粉を形成することと、該粉に水を添加してスラリーを形成することと、該スラリーを、約３〜約７のｐＨで約７５℃〜約１２０℃の温度にて約１０分間〜約１８０分間、α−アミラーゼとインキュベートしてマッシュを形成することと、該マッシュを約１５℃〜約４０℃に冷却し、窒素源、グルコアミラーゼ、酵母、酸性プロテアーゼ、および細胞壁多糖類分解酵素を添加して、エタノールおよび油を含有する約３〜約７のｐＨを有するビールを形成することと、該エタノールを該ビールから除去して全蒸留廃液を形成することと、該全蒸留廃液を湿った穀物および薄い蒸留廃液に分離することと、該薄い蒸留廃液を蒸発させてシロップを形成することと、油を該シロップから回収することと、を含む（またはこれらから本質的になるもしくはなる）方法。
【００５４】
本発明の他の実施形態は、本明細書を検討することによりまたは本明細書に開示される本発明を実施することにより、当業者に明らかになるであろう。明細書および実施例は例示としてのみ、みなされることが意図されており、本発明の真の範囲および主旨は、以下の特許請求の範囲に示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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