(57)【要約】凍結および解凍条件を経た後に安定である、炭疽防御抗原などのワクチン抗原の製剤が提供される。このほか、当該製剤を用いてワクチンを調製する方法が提供される。当該製剤を含むワクチンは、例えば、疾患または感染症、例えば炭疽感染症に関連する疾患または感染症などから保護する、これを抑制するまたはこれを軽減するのに有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルミニウムアジュバントに吸着した少なくとも１つの抗原と、少なくとも２０％（ｗ／ｖ）の非還元糖とを含む、凍結乾燥ワクチンを調製するための組成物。
【請求項２】
アルミニウムアジュバントに吸着した少なくとも１つの抗原と、少なくとも２０％（ｗ／ｖ）の糖とを含む、温度に安定な液状ワクチン組成物。
【請求項３】
凍結乾燥前に、アルミニウムアジュバントに吸着した少なくとも１つの抗原と、少なくとも２０％（ｗ／ｖ）の非還元糖とを含み、復元後に前記非還元糖が少なくとも６％（ｗ／ｖ）である、組成物。
【請求項４】
界面活性剤を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
アルミニウムアジュバントに吸着した少なくとも１つの抗原と、界面活性剤と、少なくとも１５％（ｗ／ｖ）の糖とを含む、凍結乾燥ワクチンを調製するための組成物。
【請求項６】
アルミニウムアジュバントに吸着した少なくとも１つの抗原と、界面活性剤と、少なくとも１５％（ｗ／ｖ）の糖とを含む、温度に安定な液状ワクチン組成物。
【請求項７】
アミノ酸をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
アルミニウムアジュバントに吸着した少なくとも１つの抗原と、界面活性剤と、アミノ酸と、少なくとも１０％（ｗ／ｖ）の糖とを含む、凍結乾燥ワクチンを調製するための組成物。
【請求項９】
アルミニウムアジュバントに吸着した少なくとも１つの抗原と、界面活性剤と、アミノ酸と、少なくとも１０％（ｗ／ｖ）の糖とを含む、安定な液状ワクチン組成物。
【請求項１０】
前記アルミニウムアジュバントが、リン酸アルミニウムおよび硫酸アルミニウムからなる群より選択される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記アルミニウムアジュバントが水酸化アルミニウムである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
約０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含有する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
約０．５ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
約１．５ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記界面活性剤が、ポリソルベート８０およびポリソルベート２０からなる群より選択される、請求項４〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記界面活性剤がポリソルベート８０である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
約０．０２０％または０．０２５％（ｗ／ｖ）の界面活性剤を含有する、請求項４〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
前記糖が、トレハロース、スクロースおよびその組合せからなる群より選択される非還元糖である、請求項１〜１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記糖がトレハロースである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記糖がスクロースである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記糖がトレハロースおよびスクロースである、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２２】
約１５〜４０％（ｗ／ｖ）の糖を含有する、請求項５〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
約２０〜４０％（ｗ／ｖ）の糖を含有する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
約２０〜３５％（ｗ／ｖ）の糖を含有する、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
約２５〜４０％（ｗ／ｖ）の糖を含有する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
約２０％、２１％、２２％、２３％、２４％および２５％（ｗ／ｖ）超の糖を含有する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記抗原が炭疽抗原である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記炭疽抗原が防御抗原である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記防御抗原が、配列番号２のポリペプチドと少なくとも約８０％同一である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
約１５０〜５００μｇ／ｍｌの防御抗原を含む、請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３１】
約１５０μｇ／ｍｌ、１７５μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２２５μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、２７５μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３２５μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、３７５μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、４２５μｇ／ｍｌ、４５０μｇ／ｍｌ、４７５μｇ／ｍｌまたは５００μｇ／ｍｌの防御抗原を含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記炭疽抗原が、非病原性炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）株の無細胞ろ液である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記非病原性炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）株がＶ７７０−ＮＰ１−Ｒである、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記アミノ酸が、アルギニン、アラニン、プロリン、グリシンおよびその任意の組合せからなる群より選択される、請求項７〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３５】
約０．５〜４％（ｗ／ｖ）のアラニンまたはアルギニンを含有する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
約２％（ｗ／ｖ）のアラニンまたはアルギニンを含有する、請求項４０に記載の組成物。
【請求項３７】
約６〜１２％（ｗ／ｖ）のグリシンを含有する、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３８】
約１０％（ｗ／ｖ）のグリシンを含有する、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
真空下で昇華させて凍結乾燥組成物を作製する、請求項１、３〜５、７、８および１０〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
請求項１、３〜５、７、８および１０〜３８のいずれか１項に記載の組成物から凍結乾燥させた、凍結乾燥組成物。
【請求項４１】
水溶液中で復元した請求項３９または４０に記載の凍結乾燥組成物を含む、復元組成物。
【請求項４２】
前記水溶液が、水、トリスＥＤＴＡ（ＴＥ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液または生理食塩水からなる群より選択される、請求項４１に記載の復元組成物。
【請求項４３】
凍結乾燥形態で少なくとも４か月間、５０℃で保管した後、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の純度を保持する、請求項１、３〜５、７、８および１０〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４４】
凍結乾燥形態で少なくとも１か月間、４０℃で保管した後、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の免疫原性を保持する、請求項１、３〜５、７、８および１０〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
病原体に対して対象にワクチン接種する方法であって、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項４６】
病原体に対して対象にワクチン接種する方法であって、請求項３９または４０に記載の凍結乾燥組成物から復元した医薬組成物を対象に投与することを含む方法。
【請求項４７】
効力のあるアラムベースの凍結ワクチンを作製する方法であって、少なくとも約１０％の糖と、アルミニウムアジュバントに吸着した抗原とを含む組成物を懸濁させることと、前記懸濁した組成物を沈降が生じる前に凍結させるのに十分な速度で前記組成物を凍結させることとを含む、方法。
【請求項４８】
前記組成物が少なくとも約１５％の糖を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記組成物が少なくとも約２０％の糖を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
安定な凍結乾燥組成物を調製する方法であって、請求項１、３〜５、７、８および１０〜３８のいずれか１項に記載の組成物を凍結させることを含み、復元した凍結乾燥組成物の安定性をミクロファージ溶解アッセイ（ＭＬＡ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）および／または陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）によって測定する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府の権利）
本発明は、一部は助成ＨＨＳＯ１００２０１００００５９Ｃの下、政府支援を受けてなされたものである。政府は本発明に一定の権利を有し得る。
【０００２】
（電子的に提出された配列表への言及）
本願とともにＡＳＣＩＩテキストファイル（名称「２４７９１１５ＰＣ０２＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」；大きさ：１２，９５４バイト；および作成日：２０１３年６月２５日）で電子的に提出された配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００３】
本発明は、アルミニウムアジュバントに吸着した抗原を含有する温度に安定なワクチン製剤およびこのような製剤の調製方法に関する。本発明には凍結乾燥ワクチン製剤および凍結ワクチン製剤が含まれる。本発明には温度に安定なワクチン、温度に安定なワクチンの作製方法および使用方法が含まれる。
【背景技術】
【０００４】
炭疽はグラム陽性細菌の炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）（Ｂ．ｎｔｈｒａｃｉｓ）によって引き起こされるよく知られた感染症である。３つのタイプの炭疽感染症（皮膚炭疽、胃腸炭疽および吸入炭疽）のうち、皮膚炭疽が最もよくみられ、様々な抗生物質によって比較的容易に治療することができる。他の２つのタイプの炭疽感染症はまれであるが、積極的な抗菌療法を用いても死に至ることが多い。
【０００５】
主要な病原性因子、炭疽毒素は３種類のタンパク質、すなわち防御抗原（ＰＡ、８３キロダルトン、ｋＤａ）、浮腫因子（ＥＦ、８９ｋＤａ）および致死因子（ＬＦ、９０ｋＤａ）からなる。毒素成分は、ＰＡ＋ＥＦ（浮腫毒素）およびＰＡ＋ＬＦ（致死毒素）のように２つ組み合わさって作用する。ＰＡは細胞受容体結合タンパク質であり、感染した細胞の細胞質ゾル内に他の２種類のタンパク質（ＥＦおよびＬＦ）を運ぶ。
【０００６】
炭疽の予防に最も効果的な既知の方法はワクチン接種である。米国内において現時点で唯一、ＦＤＡに承認されている炭疽ワクチン（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ社によりＢｉｏＴｈｒａｘ（登録商標）（吸着炭疽ワクチン）の商標で生産されている）は、非病原性炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）Ｖ７７０−ＮＰ１−Ｒ株の無菌無細胞ろ液から作製される。認可されている炭疽ワクチンは吸着炭疽ワクチン（またはＡＶＡ）とも呼ばれる。このワクチンは主としてＰＡからなり、アジュバントとして水酸化アルミニウムが使用されている。同ワクチンは１９５０年代および１９６０年代に開発され、Ｅｍｅｒｇｅｎｔ  ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ社がＦＤＡによる認可を受けた。同ワクチンが示す全身反応は０．０６％未満である。同ワクチンがヒトに免疫応答を誘発する能力は十分に裏付けられている。ＡＶＡワクチンは現時点で、１８か月にわたって５回投与したのち、１年に１回追加免疫することが認可されている。
【０００７】
ＡＶＡワクチンは効果的で安全であるが、対象を致死性の炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）感染症から保護するワクチンを組換え技術を用いて調製するための新たな免疫原性組成物が開発中である。防御抗原（ＰＡ）はＬＦおよびＥＦの両方の作用に必要な共通の因子であるため、炭疽ワクチンの調製に用いられることが多い。開発中のＰＡワクチンの例としては、米国特許第６，３１６，００６号および同第６，３８７，６６５号ならびに米国特許出願第２０１０／０１８３６７５号、同第２０１１／０２２９５０７号ならびに国際公開第２０１０／０５３６１０号に開示されているものが挙げられる。
【０００８】
ＡＶＡおよびＰＡなどのワクチンは通常、対象の免疫応答を増強するアジュバントを少なくとも１つ含有する。アルミニウム塩アジュバントはアラムと呼ばれることが多く、現時点でヒトでの使用に最も広く用いられているアジュバントである。アラムは通常、水酸化アルミニウムである（ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）（水酸化アルミニウム）またはリン酸アルミニウムとしても市販されている）。ＡＶＡおよび「次世代」炭疽ワクチン（組換えＰＡなど）は抗原と結合するＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬとともに製剤化される。
【０００９】
現在、アラムを含有するワクチンには低温流通体系が必要である。低温流通体系は世界的には、保管および流通の間にワクチンを２〜８℃に維持するようが確立されてきた。低温流通体系の維持は費用がかかり、困難である。低温流通体系に障害が発生すれば、ワクチンが目的の温度よりも高い温度または低い温度に曝され得る。一般に、アラムを含有するワクチンが輸送および保管中に凍結／解凍処理を受けた場合、これを廃棄することが推奨されている。低温流通体系の障害は先進工業国でも開発途上国でも発生する可能性があり、低温流通体系の障害には、例えば設備の故障、資材の不足または順守の低下などの多くの理由がある。インドネシアなどの多くの開発途上国では、過去にベースライン輸送の７５％に凍結温度が記録されており、凍結感受性のものを凍結させることが広く行われている。Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｉｎｄｏｎｅｓｉａｎ  ｃｏｌｄ  ｃｈａｉｎ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ．Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  ２００４；８２：９９−１０５を参照されたい。
【００１０】
低温流通体系に依存するワクチンはほかにも、必要とする者へ時宜に即して流通させるのにより長い時間がかかる場合がある。生物テロリストによる事件などの公衆衛生緊急事態が発生した場合、ワクチンをはじめとする医学的対策を迅速に遂行する能力が極めて重要になる。流通が低温流通体系に依存しなくなれば、様々な気候で医学的対策をより迅速かつ効率的に遂行することが可能になると考えられる。
【００１１】
低温流通体系の必要性を回避するまたは最小限に抑えるため、多くの認可ワクチンが、投与直前に復元することが可能な乾燥粉末組成物として製剤化されている。これまで、米国内での使用が認可されている乾燥粉末ワクチンはすべて、凍結乾燥工程を経てされている。凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）は凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｙｉｎｇ）とも呼ばれ、ワクチンの長期安定性を向上させる工程である。この工程では液状のワクチン製剤を凍結させ、凍結した製剤を真空下で昇華させる。安定な乾燥粉末ワクチンを製造する目的で、噴霧乾燥および泡沫乾燥などの他の技術が開発されている。このようなより新しい技術は、凍結を必要とせずに乾燥粉末ワクチン材料を製造するものであり、アラム含有ワクチンに用いることができる。例えば、Ｃｈｅｎら，２０１０，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：５０９３−５０９９を参照されたい。しかし、これらのより新しい技術は依然として初期段階にあり、米国内では未だ認可ワクチンの生産には用いられていない。
【００１２】
アラムを含有するワクチン組成物を凍結させる（凍結乾燥工程の一部として、または凍結ワクチンを製造するため）と一般に、アルミニウム粒子の凝集が誘発されて、アラムアジュバント上に吸着した抗原の分解が起こり、効力が低下する。さらに、凍結により、沈降したアルミニウムゲルの高さの減少（一般にゲル崩壊と呼ばれる）が引き起こされる。例えば、「Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｐｐｅａｒａｎｃｅ，ｐｏｔｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｓｏｒｂｅｄ  ａｎｄ  ｕｎａｄｓｏｒｂｅｄ  ＤＰＴ  ｖａｃｃｉｎｅｓ」，１９８０，ＷＨＯ  Ｗｅｅｋｌｙ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｃｏｒｄ  ５５：３８５−９２；「Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」，Ａｕｇ  ２００６，ＷＨＯ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＨＯ／ＩＶＢ／０６．１０；Ｄｉｍｉｎｓｋｙら，１９９９，Ｖａｃｃｉｎｅ  １８（１−２）：３−１７；Ｍａａら，２００３，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９２（２）：３１９−３３２を参照されたい。
【００１３】
したがって、凍結に耐え得るアラム含有ワクチンを生産する必要がある。このようなワクチンは製造工程（例えば、凍結乾燥または凍結ワクチン）、輸送工程または保管過程の一部として凍結処理を施し得るものである。本発明は、アラムを含有する温度に安定なワクチンの生産のための新規な製剤を開示する。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、アラムを含有し、効力をほとんどないし全く低下させずに凍結させることができる、ワクチン製剤を提供する。一実施形態では、凍結ワクチン組成物は、凍結の結果としてアラムゲル崩壊をほとんどないし全く示さない。
【００１５】
一実施形態では、ワクチンまたは組成物は、安定剤としての役割を果たす糖を少なくとも２０％含む。一実施形態では、ワクチンまたは組成物は、１５％超、２０％超、２５％超または３０％超の糖を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸および／または界面活性剤などの追加の安定剤を添加した場合、効力を低下させずに糖の量を減らすことができる。凍結ワクチン製剤および凍結乾燥ワクチン製剤ではこのほか、凍結速度の増大によって、および（沈降した粒子ではなく）懸濁した粒子の凍結によって効力を向上させ得る。
【００１６】
本発明は凍結ワクチン組成物、凍結乾燥ワクチン組成物（凍結乾燥工程の一部として凍結処理を受ける）をはじめとする、輸送および保管時に凍結／解凍条件の影響を受けにくいワクチン製剤を含む。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態は、アルミニウムアジュバントに吸着した少なくとも１つの抗原と少なくとも２０％（ｗ／ｖ）の非還元糖とを含む凍結乾燥ワクチンを調製するための組成物を含む。別の実施形態は、アルミニウムアジュバントに吸着した少なくとも１つの抗原と少なくとも２０％（ｗ／ｖ）の糖とを含む、温度に安定な液状ワクチン組成物を含む。さらなる実施形態は、凍結乾燥前に、アルミニウムアジュバントに吸着した少なくとも１つの抗原と少なくとも２０％（ｗ／ｖ）の非還元糖とを含み、復元後に非還元糖が少なくとも６％（ｗ／ｖ）である組成物を含む。本発明の組成物は、界面活性剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、アルミニウムアジュバントに吸着した少なくとも１つの抗原と、界面活性剤と、少なくとも１５％（ｗ／ｖ）の糖とを含み、凍結乾燥ワクチンの調製に使用することができる。
【００１８】
本発明はこのほか、アルミニウムアジュバントに吸着した少なくとも１つの抗原と、界面活性剤と、少なくとも１５％（ｗ／ｖ）の糖とを含む、温度に安定な液状ワクチン組成物を含む。いくつかの実施形態では、組成物はアミノ酸をさらに含む。ほかにも、アルミニウムアジュバントに吸着した少なくとも１つの抗原と、界面活性剤と、アミノ酸と、少なくとも１０％（ｗ／ｖ）の糖とを含む、安定な液状ワクチン組成物が含まれる。
【００１９】
本発明はさらに、アルミニウムアジュバントに吸着した少なくとも１つの抗原と、界面活性剤と、アミノ酸と、少なくとも１０％（ｗ／ｖ）の糖とを含む凍結乾燥ワクチンを調製するための組成物を提供する。
【００２０】
本発明は、アルミニウムアジュバントに吸着した抗原を含有する多数のワクチンに適用することができる。一実施形態では、ワクチンは、ｒＰＡまたは吸着炭疽ワクチンなどの炭疽ワクチンである。
【００２１】
防御抗原の入手源は様々であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）防御抗原タンパク質は非芽胞形成性炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）により産生されるものである。いくつかの実施形態では、非芽胞形成性炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）はΔＳｔｅｒｎｅｌ（ｐＰＡ１０２）ＣＲ４菌株である。いくつかの実施形態では、ＰＡタンパク質は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの他の生物体で発現されるものである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、（例えば、アルミニウムのほかにも）アジュバントをさらに含み得る。
【００２３】
本発明は炭疽感染症を予防および治療する方法を含み、この方法は対象に薬学的有効量の本発明のワクチンの１つを投与することを含む。別の実施形態では、本発明は対象に免疫応答を誘導する方法を含み、この方法は対象に本発明のワクチンを投与することを含む。
【００２４】
本発明はワクチンを凍結乾燥させる方法を提供し、この方法は、（ｉ）本発明の組成物を凍結させることと、（ｉｉ）凍結した組成物を昇華させることとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】２℃〜８℃における糖安定剤を含まないｒＰＡワクチンと、−８０℃で凍結し解凍した同組成物とを比較した写真である。
【図２】２℃〜８℃におけるトレハロース２０％およびアルギニン２％を含むｒＰＡワクチンと、−８０℃で凍結し解凍した同組成物とを比較した写真である。
【図３】２℃〜８℃におけるスクロースを含むｒＰＡワクチンおよび−８０℃の後に解凍した同ワクチン、２℃〜８℃におけるスクロースを含まないｒＰＡワクチンおよび−８０℃の後に解凍した同ワクチンの写真である。
【図４】凍結前および後の無糖ｒＰＡ製剤のＧｅｏＭｅａｎ  ＮＦ５０を示すグラフならびにアラムゲルの崩壊を示す写真である。
【図５】凍結させていない糖を含む凍結乾燥試料および糖を含まない凍結乾燥試料のＧｅｏＭｅａｎＮＦ５０反応を示すグラフである。
【図６】トレハロース２０％を含有するｒＰＡ組成物の凍結／解凍前および後のＧｅｏＭｅａｎＮＦ５０を示すグラフである。
【図７】液状対照と比較した全凍結乾燥試料のＧｅｏＭｅａｎＮＦ５０を示すグラフである。
【図８Ａ−８Ｂ】凍結乾燥ｒＰＡのＮＦ５０を（Ａ）５℃および５０℃についてＡＶＡと比較し均等ＮＦ５０目盛で経時的に示したグラフおよび（Ｂ）５℃および５０℃についてＡＶＡと比較し対数ＮＦ５０目盛で経時的に示したグラフであり、各ワクチンは１：４希釈とした。
【図９Ａ−９Ｂ】凍結乾燥ｒＰＡのＮＦ５０を（Ａ）５℃および５０℃についてＡＶＡと比較し均等ＮＦ５０目盛で経時的に示したグラフおよび（Ｂ）５℃および５０℃についてＡＶＡと比較し対数ＮＦ５０目盛で経時的に示したグラフであり、各ワクチンは１：１６希釈とした。
【図１０Ａ−１０Ｂ】凍結乾燥ｒＰＡのＮＦ５０を（Ａ）５℃および５０℃についてＡＶＡと比較し均等ＮＦ５０目盛で経時的に表したグラフおよび（Ｂ）５℃および５０℃についてＡＶＡと比較し対数ＮＦ５０目盛で経時的に示したグラフであり、各ワクチンは１：６４希釈とした。
【図１１Ａ−１１Ｂ】５℃および５０℃の凍結乾燥ｒＰＡとＡＶＡの（Ａ）第３５日目および（Ｂ）第４２日目におけるＮＦ５０の比較を示すグラフであり、各ワクチンは１：４希釈とした。
【図１２Ａ−１２Ｂ】５℃および５０℃の凍結乾燥ｒＰＡとＡＶＡの（Ａ）第３５日目および（Ｂ）第４２日目におけるＮＦ５０の比較を示すグラフであり、各ワクチンは１：１６希釈とした。
【図１３Ａ−１３Ｂ】５℃および５０℃の凍結乾燥ｒＰＡとＡＶＡの（Ａ）第３５日目および（Ｂ）第４２日目におけるＮＦ５０の比較を示すグラフであり、各ワクチンは１：６４希釈とした。
【図１４】１か月間保管したｒＰＡ液状ワクチン（Ｌｉｑ  ｒＰＡ  Ｆ１）と４か月間保管した凍結乾燥ワクチン（ＬｙｏＡ、ＬｙｏＢおよびＬｙｏＣ）の％ＭＬＡ（ミクロファージ溶解アッセイ）の値を温度の関数として比較したものを示すグラフである。
【図１５Ａ−１５Ｂ】（Ａ）４か月間保管した３種類のｒＰＡ凍結乾燥製剤（ＬｙｏＡ、ＬｙｏＢおよびＬｙｏＣ）のＳＥＣ％純度の標準対照に対する相対的低下を保管温度の関数として１か月間保管した液状ｒＰＡのものと比較し表したグラフである。（Ｂ）ｒＰＡ  ＢＤＳ標準品の典型的なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）のクロマトグラフを示す図である。
【図１６Ａ−１６Ｂ】（Ａ）４か月間保管した３種類のｒＰＡ凍結乾燥製剤（ＬｙｏＡ、ＬｙｏＢおよびＬｙｏＣ）の％ＡＥＸ純度の標準対照に対する相対的低下を保管温度の関数として１か月間保管した液状ｒＰＡのものと比較し表したグラフである。（Ｂ）ｒＰＡ  ＢＤＳ標準品の陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）のクロマトグラフを示す図である。
【図１７Ａ−１７Ｄ】５℃、２５℃および４０℃で１か月間保管したＬｙｏＡの投与量レベル０．２５（パネルＡ）、０．１２５（パネルＢ）、０．０６２５（パネルＣ）および０．０３１２５（パネルＤ）におけるＮＦ５０の比較を示すグラフである。
【図１８Ａ−１８Ｄ】５℃、２５℃および４０℃で１か月間保管したＬｙｏＢの投与量レベル０．２５（パネルＡ）、０．１２５（パネルＢ）、０．０６２５（パネルＣ）および０．０３１２５（パネルＤ）におけるＮＦ５０の比較を示すグラフである。
【図１９Ａ−１９Ｄ】５℃、２５℃および４０℃で１か月間保管したＬｙｏＣの投与量レベル０．２５（パネルＡ）、０．１２５（パネルＢ）、０．０６２５（パネルＣ）および０．０３１２５（パネルＤ）におけるＮＦ５０の比較を示すグラフである。
【図２０Ａ−２０Ｄ】５℃、２５℃および４０℃で１か月間保管した液状ｒＰＡの投与量レベル０．２５（パネルＡ）、０．１２５（パネルＢ）、０．０６２５（パネルＣ）および０．０３１２５（パネルＤ）におけるＮＦ５０の比較を示すグラフである。
【図２１】実施例８に記載される１２種類の製剤のＮＦ５０値および平均値の標準偏差を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
長年、アラム含有ワクチンは凍結させてはならないと考えられてきた。したがって、アラム含有ワクチンが凍結または凍結乾燥（凍結を必要とする）されることはなく、低温流通体系の障害により凍結が生じた場合、アラム含有液状ワクチンは通常、廃棄される。本発明者らは、トレハロースまたはスクロースなどの糖が炭疽ワクチン組成物の約２０％（ｗ／ｖ）以上を占める場合、組成物中のアラムは凍結または解凍によって崩壊しないという刺激的な発見をした。アラム崩壊は確認が容易であり、ワクチン効力の低下および粒子凝集の原因となる。
【００２７】
本発明者らはほかにも、アラムゲル崩壊を防止および軽減するのに役立つ追加の安定化成分および工程パラメータを特定した。例えば、製剤にアミノ酸を添加することによって、アラムゲル崩壊を防ぐのに必要な糖の量を、例えば約１０％（ｗ／ｖ）まで減らすことができる。アラムゲルの高さに正の効果を示す工程変更には、（沈降した粒子ではなく）懸濁した粒子の凍結および凍結速度の増大が含まれる。
【００２８】
本明細書に使用される節の見出しは単に構成を目的とするものであって、記載される発明の内容を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用される、特に限定されないが特許、特許出願、記事、書籍および論文を含めた文献またはその一部分は、任意の目的でその全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。１つまたは複数の組み込まれた文献または文献の一部分が、本願中の用語の定義と矛盾する用語を定義する場合、本願に記載される定義が統制する。
【００２９】
単数形を使用する場合、特に明記されない限り複数形が含まれる。「ａ」または「ａｎ」という単語は、特に明記されない限り「少なくとも１つ」を意味する。「または」を使用する場合、特に明記されない限り「および／または」を意味する。「少なくとも１つ」という語句の意味は、「１つまたは複数」という語句の意味と同じである。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の語形を使用する場合、限定的なものではない。このほか、「要素」または「成分」などの用語は、特に明記されない限り、１つの単位を含む要素または成分と、２つ以上の単位を含む要素または成分の両方を包含する。「約」という単語は、約１単位以内を意味する。
【００３０】
本明細書で使用される防御抗原（ＰＡ）または組換え防御抗原（ｒＰＡ）とは、受容体結合ドメインおよび転移ドメインを含む、炭疽毒素（約８３ｋＤａ）の成分のことである。完全長ＰＡアミノ酸配列の例の１つには以下のものがある：
ＥＶＫＱＥＮＲＬＬＮＥＳＥＳＳＳＱＧＬＬＧＹＹＦＳＤＬＮＦＱＡＰＭＷＴＳＳＴＴＧＤＬＳＩＰＳＳＥＬＥＮＩＰＳＥＮＱＹＦＱＳＡＩＷＳＧＦＩＫＶＫＫＳＤＥＹＴＦＡＴＳＡＤＮＨＶＴＭＷＶＤＤＱＥＶＩＮＫＡＳＮＳＮＫＩＲＬＥＫＧＲＬＹＱＩＫＩＱＹＱＲＥＮＰＴＥＫＧＬＤＦＫＬＹＷＴＤＳＱＮＫＫＥＶＩＳＳＤＮＬＱＬＰＥＬＫＱＫＳＳＮＳＲＫＫＲＳＴＳＡＧＰＴＶＰＤＲＤＮＤＧＩＰＤＳＬＥＶＥＧＹＴＶＤＶＫＮＫＲＴＦＬＳＰＷＩＳＮＩＨＥＫＫＧＬＴＫＹＫＳＳＰＥＫＷＳＴＡＳＤＰＹＳＤＦＥＫＶＴＧＲＩＤＫＮＶＳＰＥＡＲＨＰＬＶＡＡＹＰＩＶＨＶＤＭＥＮＩＩＬＳＫＥＤＱＳＴＱＮＴＤＳＱＴＲＴＩＳＫＮＴＳＴＳＲＴＨＴＳＥＶＨＧＮＡＥＶＨＡＳＦＦＤＩＧＧＳＶＳＡＧＦＳＮＳＮＳＳＴＶＡＩＤＨＳＬＳＬＡＧＥＲＴＷＡＥＴＭＧＬＮＴＡＤＴＡＲＬＮＡＮＩＲＹＶＮＴＧＴＡＰＩＹＮＶＬＰＴＴＳＬＶＬＧＫＱＴＬＡＴＩＫＡＫＥＮＱＬＳＱＩＬＡＰＮＮＹＹＰＳＫＮＬＡＰＩＡＬＮＡＱＤＤＦＳＳＴＰＩＴＭＮＹＮＱＦＬＥＬＥＫＴＫＱＬＲＬＤＴＤＱＶＹＧＮＩＡＴＹＮＦＥＮＧＲＶＲＶＤＴＧＳＮＷＳＥＶＬＰＱＩＱＥＴＴＡＲＩＩＦＮＧＫＤＬＮＬＶＥＲＲＩＡＡＶＮＰＳＤＰＬＥＴＴＫＰＤＭＴＬＫＥＡＬＫＩＡＦＧＦＮＥＰＮＧＮＬＱＹＱＧＫＤＩＴＥＦＤＦＮＦＤＱＱＴＳＱＮＩＫＮＱＬＡＥＬＮＡＴＮＩＹＴＶＬＤＫＩＫＬＮＡＫＭＮＩＬＩＲＤＫＲＦＨＹＤＲＮＮＩＡＶＧＡＤＥＳＶＶＫＥＡＨＲＥＶＩＮＳＳＴＥＧＬＬＬＮＩＤＫＤＩＲＫＩＬＳＧＹＩＶＥＩＥＤＴＥＧＬＫＥＶＩＮＤＲＹＤＭＬＮＩＳＳＬＲＱＤＧＫＴＦＩＤＦＫＫＹＮＤＫＬＰＬＹＩＳＮＰＮＹＫＶＮＶＹＡＶＴＫＥＮＴＩＩＮＰＳＥＮＧＤＴＳＴＮＧＩＫＫＩＬＩＦＳＫＫＧＹＥＩＧ（配列番号１）。
【００３１】
配列番号１は、プラスミドｐＰＡ１０２から発現するｒＰＡ１０２のアミノ酸配列である。炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）ΔＳｔｅｒｎｅ−１（ｐＰＡ１０２）ＣＲ４からｒＰＡ１０２が細胞外間隙に分泌される際、最初の２９アミノ酸（シグナルペプチド）が除去されて７３５アミノ酸の成熟ｒＰＡタンパク質（８２，６７４Ｄａ）が生じる。この成熟ｒＰＡの配列が下線部（配列番号２）である。
【００３２】
ｒＰＡ１０２のアミノ酸配列は、本発明の範囲内にある１つの特定の炭疽タンパク質の一例に過ぎない。このほかにも、様々な炭疽菌株由来の天然タンパク質を含めたＰＡタンパク質のアミノ酸配列が当該技術分野で公知であり、例えば、参照より組み込まれるＧｅｎＢａｎｋアクセション番号：ＮＰ＿６５２９２０．１、ＺＰＪ３２９３７２６１．１、ＺＰ＿０２９０００１３．１、ＺＰ＿０２８８０９５１．１がこれに含まれる。このほか、本明細書の他の箇所に記載されるようなＰＡの毒性を減少させる、またはＰＡの発現特性を向上させる様々なフラグメント、変異および修飾に加えて、様々な融合タンパク質が知られている。このようなフラグメント、変異体および融合タンパク質は、文脈または文章がこれらの形態を除外することを明示しない限り、「ＰＡ」という用語に含まれる。ＰＡのフラグメント、変異体および融合タンパク質が記載される場合（完全長ＰＡであるか、ＰＡフラグメントであるかに関係なく）、これらは毒素中和試験（ＴＮＡ）において活性な抗血清を生じさせるものである。
【００３３】
本明細書で使用される「温度に安定な」、「安定な」または「安定性」は、凍結／解凍サイクル後のアラムゲルの安定性およびワクチンの効力を指す。本明細書で使用される安定なワクチンとは、凍結／解凍サイクル後、２℃〜８℃で維持される同等の液状ワクチンと比較して活性および／または効力の低下ならびに／あるいはアラムゲル崩壊および／または粒子凝集を全くないしほとんど示さないワクチンのことである。安定性は、実施例ならびに活性、効力および／またはペプチド分解を測定するのに用いられる当該技術分野で公知のアッセイを含め、本明細書に記載される１つまたは複数の任意のアッセイを用いて測定することができる。
【００３４】
ある特定の実施形態では、５０％中和係数（ＮＦ５０）を計算することによって抗原またはワクチン、例えば防御抗原の免疫原性を測定し得る。ワクチン製剤のＮＦ５０の幾何平均値（ＧｅｏＭｅａｎまたは＜ＮＦ５０＞ｇｍ）は、ＮＦ５０値に基づいて所与のデータポイント数から計算することができる。ある特定の実施形態では、標準的な毒素中和試験（ＴＮＡ）（Ｈｅｒｉｎｇら，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ３２（２００４）１７−２７；Ｏｍｌａｎｄら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００８）９４６−９５３；およびＬｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００８）３３３：８９−１０６）の血清試料、例えば、免疫感作したマウスまたはウサギの血清を用いてＮＦ５０および／またはＧｅｏＭｅａｎを求める。５０％の毒素中和が得られる血清の希釈度が「ＥＤ５０」である。参照血清のＥＤ５０と被験血清のＥＤ５０の商から参照血清の中和能に対する各被験血清の中和能（５０％中和係数またはＮＦ５０、中和比としても知られる）を計算する、すなわち、中和係数、ＮＦ５０を次のように計算する：
ＮＦ５０＝ＥＤ５０試料／ＥＤ５０標準品。
【００３５】
ある特定の実施形態では、Ｔ検定または一元ＡＮＯＶＡを用いて、異なる製剤のＮＦ５０の幾何平均値を９５％の信頼水準で比較し得る。一実施形態では、ＧｅｏＭｅａｎ  ＮＦ５０のｐ値が０．０５を上回る場合、製剤間にＮＦ５０の有意差はみられない。別の実施形態では、ｐ値が０．０５未満である場合、製剤間のＮＦ５０の幾何平均値に互いに有意差がみられる。
【００３６】
マウス効力アッセイ実験での中和係数（ＮＦ５０）の計算から、ＮＦ５０値、したがって効力がアラムゲル崩壊と相関することがわかっている。したがって、−８０℃で一晩凍結させた後、室温で解凍させたワクチンのアラムゲルを観察し測定することによって、安定性を評価することができる。安定なワクチンであれば、対照ワクチン（２℃〜８℃で保管する以外は同じ組成物）と比較してアラムゲル崩壊をほとんどないし全く示さない。アラムゲルの高さを測定し、凍結／解凍試料と２℃〜８℃の対照との間の％差を求めることができる。一実施形態では、差が約１％、２％、３％、５％、８％、１０％または１２％未満であれば安定なワクチンであることを示している。
【００３７】
安定性はほかにも、組成物を凍結後、インタクトのタンパク質（例えば、アラムに関してインタクトのｒＰＡ）または逆に脱着したタンパク質（例えば、アラムから脱着したｒＰＡ）について分析することにより評価することができる。例えば、ＥＬＩＳＡによって遊離のｒＰＡ１０２（解離）を；例えば、示差走査熱量測定および内因性蛍光によってタンパク質の構造を；Ａ２８０によって脱着した遊離タンパク質を；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥＣおよび／またはＲＰ−ＨＰＬＣによって純度および主鎖分解を；ＩＥＸまたは等電点電気泳動によって電荷の変化を；ならびにミクロファージ溶解アッセイ（ＭＬＡ）によって生化学活性を分析し特徴付けることにより、安定性を判定することができる。
【００３８】
一実施形態では、温度に安定なワクチンとは、凍結／解凍条件に曝露された後、約２℃〜８℃で保管された同等の液状ワクチンと同じまたは少なくとも約９８％、少なくとも約９５％、少なくとも約９３％、少なくとも約９０％、少なくとも約８８％もしくは少なくとも約８５％同じ効力を示すワクチン（例えば、凍結ワクチンまたは凍結乾燥ワクチン）のことである。一実施形態では、炭疽マウス効力アッセイを用いて、凍結または凍結乾燥ワクチンに効力があるかどうかを判定する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、組成物は、凍結乾燥形態で少なくとも１か月間、４０℃で保管された後、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の免疫原性を保持している。
【００４０】
本発明のワクチンは温度に安定なワクチンである。本発明の製剤が安定な温度は一般に約３０℃未満であるが、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃または５０℃を超えてもよい。いくつかの実施形態では、製剤の安定性は約２５℃、約２０℃、約１５℃、約１０℃、約８℃、約５℃、約４℃または約２℃未満の温度に関するものである。したがって、いくつかの実施形態では、温度は約２５℃〜約−１０℃、約２０℃〜約−１０℃、約１５℃〜約−１０℃、約１０℃〜約−１０℃、約８℃〜約−１０℃、約５℃〜約−１０℃、約１５℃〜約−５℃、約１０℃〜約−５℃、約８℃〜約−５℃および約５℃〜約−５℃の範囲内にある。
【００４１】
「実施例」の節には安定性を判定する様々な方法を記載する。いくつかの実施形態では、本発明のワクチンは凍結解凍後、新鮮であり、かつ／または５℃で保管されたこと以外は同じ試料と比較して、安定性の統計学的に有意な低下を全く示さない。いくつかの実施形態では、本発明のワクチンは、−８０℃、−２０℃、２５℃、４０℃および／または５０℃で１か月、２か月、３か月、４か月、５か月、６か月、９か月、１２か月、１８か月、２４か月、３０か月、３６か月、４２か月、４８か月、５４か月または６０か月間保管された後、５℃で同じ期間の保管と比較して、安定性、免疫原性、効力またはその任意の組合せの統計学的に有意な低下を全く示さない。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ミクロファージ溶解アッセイ（ＭＬＡ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）および／または陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）によって組成物の安定性を測定する。
【００４３】
いくつかの実施形態では、組成物は、凍結乾燥形態で少なくとも４か月間、５０℃で保管された後、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の純度を保持している。
【００４４】
本発明のワクチン組成物は、アルミニウムアジュバント（アラム）に吸着した抗原と、製剤を安定化するのに必要な量の糖とを含有する。例えば、本明細書に開示されるワクチン製剤は、凍結／解凍条件に曝露した後、２℃〜８℃で維持された同様の液状ワクチンと比較して効力の低下をほとんどないし全く示さず、かつ／またはアラムゲルの崩壊をほとんどないし全く示さない。
【００４５】
アルミニウムアジュバント（アラム）は、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたは硫酸アルミニウムであり得る。一実施形態では、アジュバントは水酸化アルミニウム（例えば、ＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ）である。アルミニウムの量は、アラムゲルの安定性に全く影響が現れずにかなり変化し得る（換言すれば、組成物中のアラムの量を増加させてもアラムゲルが崩壊する可能性は増大しないと考えられる）。本発明の一実施形態では、ワクチン組成物は約１〜１０ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含む。別の実施形態では、組成物は約１．５〜５ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含む。別の実施形態では、ワクチン組成物は約１．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌまたは５ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含む。
【００４６】
本発明の安定なワクチン組成物を用いて、アラムとともに製剤化された任意の抗原を安定化することができると考えられる。例えば、抗原は炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）組換え防御抗原（ｒＰＡ）またはＶ７７０−ＮＰ１−Ｒなどの非病原性炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）株の無細胞ろ液（例えば、吸着炭疽ワクチン）であり得る。
【００４７】
ＰＡ（ならびにフラグメント、変異体および融合タンパク質）を含めた炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）タンパク質を発現させる方法が、例えば、ＰａｒｋおよびＧｉｒｉに対する米国特許第７，２０１，９１２号、Ｉｖｉｎｓらに対する米国特許第６，３８７，６６５号、Ｗｏｒｓｈａｍらに対する米国特許第６，３１６，００６号およびＬｅｐｐｌａらに対する米国特許第７，２６１，９００号（それぞれその全体が参照により組み込まれる）に記載されている。例えば、米国特許第７，２０１，９１２号に記載されているように、ｐＢＰ１０３は完全長野生型ｒＰＡの発現ベクターである。ｐＢＰ１０３のＰＡ配列は野生型ＰＡのものと同一である。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態には、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）の芽胞形成性もしくは非芽胞形成性株またはその両方での発現を含め、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）で発現されるＰＡを含む製剤が含まれる。例えば、ＰＡは非芽胞形成性炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）株ΔＳｔｅｒｎｅ−１（ｐＰＡ１０２）ＣＲ４に由来するもの（すなわち、ｒＰＡ１０２）であり得る。例えば、ともにＩｖｉｎｓらに対する米国特許第６，３１６，００６号および米国特許第６，３８７，６６５号（それぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。本発明のいくつかの組成物は、非病原性炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）株Ｖ７７０−ＮＰ１−Ｒ由来のＰＡを含む。
【００４９】
本発明の製剤はほかにも、異種生物体によって発現される炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）ＰＡを含み得る。例えば、本発明は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されるＰＡを含む。
【００５０】
さらに、様々なＰＡフラグメント、変異体および融合タンパク質も記載されており、本発明の製剤に使用することができる。例えば、機能的結合部位を欠くようＰＡを修飾することにより、天然のＰＡが結合する炭疽毒素受容体（ＡＴＲ）（Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｋ．Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００１）４１４：２２５−２２９を参照されたい）または天然のＬＦと結合しないようにすることができる。例を挙げれば、アミノ酸残基３１５〜７３５の範囲内もしくはその付近またはドメイン４の残基５９６〜７３５の範囲内もしくはその付近を修飾すると、ＰＡがＡＴＲと結合できなくなり得る。あるいは（またはこれに加えて）、ほとんどの完全長ＰＡ配列の残基１６３〜１６８またはその付近にみられるＰＡフューリン切断部位「ＲＫＫＲ」（配列番号３）の範囲内またはその付近の欠失、挿入または置換によって、そのフューリン切断部位を不活性化することができる。例えば、天然ＰＡのフューリン切断部位残基をすべて欠失させ得る。その他の変異体ＰＡとしては、キモトリプシン耐性になるようジペプチドＰｈｅ−Ｐｈｅが修飾されたＰＡが挙げられる。ＰＡフラグメントまたはＰＡ融合タンパク質はこのほか、ＰＡ変異体であり得る。
【００５１】
ＰＡフラグメントの具体例としては、米国特許第７，２０１，９１２号のＰＡフラグメント、例えば、ｐＢＰ１１１によって発現されるＰＡ６４、ｐＢＰ１１３によって発現されるＰＡ４７、ｐＢＰ１１５によって発現されるＰＡ２７が挙げられる。上記フラグメントの一部のものはほかにも、例えば、フューリン切断部位ＲＫＫＲ（配列番号３）またはジペプチド配列Ｐｈｅ−Ｐｈｅ（ＦＦ）によって形成されるキモトリプシン感受性部位が除去される変異を含み得る。さらに、フラグメントは、Ｎ末端に追加のアミノ酸を１個または２個含み得る。ＰＡを含む融合タンパク質の例としては、米国特許第７，２０１，９１２号の融合タンパク質、例えば、プラスミドｐＢＰ１０７、ｐＢＰ１０８およびｐＢＰ１０９によって発現されるＰＡ−ＬＦ融合タンパク質が挙げられる。本発明にはこのほか、ＨＩＳタグＰＡを含む製剤が含まれる。しかし、フラグメント、変異体または融合タンパク質を使用する場合、そのフラグメント、変異体または融合タンパク質がマウス、モルモットまたはウサギのうちの１つまたは複数において、例えば、ＬＤ５０のＡｍｅｓ株の炭疽芽胞による抗原投与に対して、防御免疫を誘発するのが一般に望ましい。
【００５２】
組換え入手源および／または非組換え入手源由来のＰＡを使用し、本発明の製剤によりこのような調製物の安定性を向上させることができる。
【００５３】
一実施形態では、ワクチン組成物は約７５〜７５０μｇ／ｍｌ、１００〜５００μｇ／ｍｌ、１００〜２５０μｇ／ｍｌ、１００〜７５０μｇ／ｍｌまたは２５０〜７５０μｇ／ｍｌの抗原、例えばｒＰＡを含む。例えば、本発明は約１５０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３５０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、４５０μｇ／ｍｌおよび５００μｇ／ｍｌの抗原、例えばｒＰＡを含むワクチンを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、水酸化アルミニウム１５００μｇ当たり約１７５μｇの抗原（例えば、ｒＰＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンは、約２００ｇ／ｍＬの抗原（例えば、ｒＰＡ）と約０．５ｍｇ／ｍＬの水酸化アルミニウムとを含む。さらなる実施形態では、ワクチンは、水酸化アルミニウム１００〜２５０μｇ当たり約２５０μｇの抗原（例えば、ｒＰＡ）を含む。いくつかの実施形態では、抗原は防御抗原などの炭疽抗原である。いくつかの実施形態では、防御抗原は、配列番号２のポリペプチドと少なくとも約８０％同一である。本発明のいくつかの組成物は、約１５０〜５００μｇ／ｍｌの防御抗原または約１５０μｇ／ｍｌ、１７５μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２２５μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、２７５μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３２５μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、３７５μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、４２５μｇ／ｍｌ、４５０μｇ／ｍｌ、４７５μｇ／ｍｌもしくは５００μｇ／ｍｌの防御抗原を含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は約０．５〜１．５ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含有する。いくつかの実施形態では、組成物は約０．５ｍｇ／ｍｌまたは約１．５ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含有する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、アルミニウムアジュバントは、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよび硫酸アルミニウムからなる群より選択される。
【００５６】
本発明の炭疽ワクチンは、それがｒＰＡを含むワクチンであっても、非病原性炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）株の無細胞ろ液を含むワクチンであっても、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）への曝露前または曝露後に対象に投与することができる。曝露後に投与する場合、ワクチンを抗生物質とともに投与し得る。
【００５７】
別の実施形態では、抗原は、Ｂ型肝炎防御抗原、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）神経毒タンパク質、単純ヘルペスウイルス抗原、インフルエンザ抗原、先天性サイトメガロウイルス抗原、結核抗原、ＨＩＶ抗原、ジフテリア抗原、破傷風抗原、百日咳抗原、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）およびペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）防御抗原ならびにＦ１−Ｖ融合タンパク質からなる群より選択される、タンパク質（例えば、組換えタンパク質）を主体する抗原である。抗原は、例えば、パピローマウイルス（例えば、ＨＰＶ）、インフルエンザ、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス（例えば、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス）、髄膜炎菌（Ｍｅｎｉｎｇｏｃｏｃｃｕｓ）Ａ、ＢおよびＣ、Ｂ型インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）、ピロリ菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）ならびにペスト菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）に由来するものであり得る。
【００５８】
本発明のワクチンは、−８０℃、一晩の凍結に効力の低下もアラムゲルの崩壊もほとんどないし全く示さずに耐え得る。本発明は、凍結液状ワクチンおよび凍結乾燥ワクチン（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ）（本明細書では凍結乾燥ワクチン（ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｉｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ）とも呼ぶ）。本明細書に開示される通り、凍結乾燥工程は液状組成物を凍結させることを含む。次いで、凍結した組成物を凍結下で昇華させる。凍結乾燥ワクチンでは、本開示のワクチンの成分および量は、のちに凍結処理を施す液状組成物に使用する量を指すものであり、必ずしも凍結乾燥ケークまたは復元したワクチンに使用する量を指すわけではない。最終的な凍結乾燥ワクチンのケーク（乾燥組成物）は、乾燥工程により異なる百分率の成分を含有し得る。
【００５９】
本発明はワクチンを凍結乾燥させる方法を提供し、この方法は、（ｉ）本発明の組成物を凍結させることと、（ｉｉ）凍結した組成物を昇華させることとを含む。
【００６０】
一実施形態では、本発明のワクチンは、糖などのガラス形成物質を約２０％以上含む。一実施形態では、ガラス形成物質は還元糖である。一実施形態では、ワクチンは、トレハロースまたはスクロースなどの非還元糖を含む。一実施形態では、ガラス形成物質はトレハロースまたはスクロースである。ワクチンを凍結乾燥させる場合、ワクチンがケーク様組成物を形成するよう凍結乾燥前に約４０％以下の糖を用いるのが好ましい場合がある。ワクチンは、例えば凍結乾燥前に、約１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３５％または４０％の糖を含み得る。一実施形態では、ワクチン組成物は、例えば凍結乾燥前に、約１０〜４０％、１０〜３５％、１０〜３０％、１０〜２５％、１０〜２０％、３５〜４０％、３０〜４０％、２５〜４０％、２０〜４０％、１５〜４０％、２０〜３０％、２０〜２５％、２５〜３０％、２５〜３５％、２１〜４０％、２１〜３５％、２１〜３０％、２１〜２５％または１０％、１５％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％もしくは３６％（ｗ／ｖ）超の糖を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、例えば凍結乾燥前に、約１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％および２５％（ｗ／ｖ）超の糖を含有する。
【００６１】
本明細書に開示される通り、本発明者らは、少なくとも約２０％のトレハロースまたはスクロースを含むアラムワクチン組成物が凍結／解凍条件に耐え得ることを確認した。特定の追加の安定剤（例えば、界面活性剤および／またはアミノ酸）を添加し、かつ／または本明細書に開示される工程改善（例えば、凍結速度の増大、懸濁した粒子の凍結）を組み込むと、ワクチンの効力に影響を及ぼさずに糖の量を約１５％（ｗ／ｖ）または場合により約１０％（ｗ／ｖ）まで減らすことができる。
【００６２】
本発明の一実施形態では、アルミニウムアジュバントに吸着した抗原と糖（例えば、１５％ｗ／ｖ以上）とを含むワクチン組成物はほかにも、例えば凍結乾燥前に、界面活性剤などの可溶化剤を含有する。一実施形態では、界面活性剤はポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）などの非イオン性界面活性剤である。一実施形態では、ワクチン組成物は約０．００１％〜約０．０５％の界面活性剤（ポリソルベート８０など）を含む。一実施形態では、組成物は約０．０２０％、約０．０２５％または約０．０２０％〜０．０２５％（ｗ／ｖ）の界面活性剤（ポリソルベート８０など）を含む。使用し得るその他の界面活性剤としては、特に限定されないが、ポリソルベート２０、プルロニックＬ６８、ポリオキシエチレン９−１０ノニルフェノール（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｎ−１０１、オクトキシルノール（ｏｃｔｏｘｙｌｎｏｌ）９）、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００およびデクソイコルテナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｅｘｏｙｃｈｏｌｔｅ）が挙げられる。一実施形態では、最終製剤中に界面活性剤が全く存在しないよう製造工程でこれを除去する。一実施形態では、例えば、凍結乾燥工程の凍結時に界面活性剤が存在する。いくつかの実施形態では、本発明の製剤は界面活性剤を含まない。
【００６３】
本発明者らは、例えば凍結および／または凍結乾燥前に、アミノ酸（例えば、アラニン、アルギニン、グリシンおよびプロリン）を組成物に添加すれば、効力に対してほとんどないし全く影響を及ぼさずに、かつ／またはアラムゲル崩壊をほとんどないし全く生じさせずに糖の百分率を約１０％（ｗ／ｖ）にまで減らし得ることを発見した。ワクチン組成物に添加するアミノ酸の量は様々であり得る。一実施形態では、ワクチン組成物は０．５〜約１５％（ｗ／ｖ）のアミノ酸またはアミノ酸の組合せを含む。一実施形態では、ワクチン組成物は約２〜１０％（ｗ／ｖ）のアミノ酸またはアミノ酸の組合せを含む。本発明の一実施形態では、ワクチンは約２％のアルギニンまたはアラニンを含む。本発明の別の実施形態では、ワクチンは約１０％のグリシンを含む。いくつかの実施形態では、ワクチン組成物は約２〜１０％、２〜８％、２〜６％、２〜４％、２〜３％、３〜１０％、５〜１０％、７〜１０％、２．５〜５％、３〜５％、３〜７％または４〜６％（ｗ／ｖ）のアミノ酸またはアミノ酸の組合せを含む。いくつかの実施形態では、アラニン、グリシン、プロリンおよび／またはアルギニンから選択されるアミノ酸などのアミノ酸を２種類、３種類またはそれ以上存在する。いくつかの実施形態では、組成物は約０．５〜４％、１〜４％、１．５〜４％、２〜４％、２．５〜４％、３〜４％、３．５〜４％、０．５〜１％、０．５〜１．５％、０．５〜２％、０．５〜２．５％、０．５〜３％、０．５〜３．５％、０．５〜４％、１〜３％、１〜２％、２〜３％または１．５〜２．５％（ｗ／ｖ）のアラニンまたはアルギニンを含有する。いくつかの実施形態では、組成物は約２％、１．７５％、２．２５％、２．５％、２．７５％、３％、３．２５％、３．５％、３．７５％または４％（ｗ／ｖ）のアラニンまたはアルギニンを含有する。いくつかの実施形態では、組成物は約６〜１２％、７〜１２％、８〜１２％、９〜１２％、１０〜１２％、１１〜１２％、６〜１１％、６〜１０％、６〜９％、６〜８％、６〜７％、７〜１１％、８〜１０％、７〜１０％、１１〜９％、７〜８％、８〜９％または９〜１０％（ｗ／ｖ）のグリシンを含有する。いくつかの実施形態では、組成物は約６％、７％、８％、９％、１０％、１１％または１２％（ｗ／ｖ）のグリシンを含有する。いくつかの実施形態では、上に挙げたアミノ酸の濃度は凍結および／または凍結乾燥前の濃度である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、製剤はポリペプチド抗原の一部であるアミノ酸以外に、アミノ酸（１つまたは複数）溶液を含まない、またはアミノ酸（１つまたは複数）を含有しない。
【００６５】
いくつかの実施形態では、製剤は１つまたは複数の追加の成分をさらに含む。例えば、製剤は塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムまたはその組合せなどの塩を１つまたは複数含み得る。各塩は一般に、製剤中に約１０ｍＭ〜約２００ｍＭで存在する。
【００６６】
ワクチン製剤は２０ｍＭトリス−ＨＣＬなどの緩衝液を含有し得る。また、製剤のｐＨは様々であり得る。製剤のｐＨは一般に、約ｐＨ６．２〜約ｐＨ８．０である。一実施形態では、ワクチンのｐＨは約７．４である。
【００６７】
別の実施形態では、製剤はソルビトールなどの糖アルコールをさらに含む。一実施形態では、製剤は０．２５％のソルビトールを含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物およびワクチン製剤は追加のアジュバント、例えば、免疫刺激性配列（ＩＳＳ、ＣｐＧ）およびリン酸カルシウムを含有し得る。ＩＳＳには、一般にタンパク質試料を最終タンパク質濃度５０μｇ／ｍｌで使用する。アジュバントの他の非限定的な例としては、特に限定されないが、ＣＧＰ７９０９（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２２３，７４１号を参照されたい）、ＣｐＧ１０１８（例えば、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０１８３６７５号を参照されたい）、グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）、ポリＩポリＣ（ＰＩＰＣ）、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノル−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ１１６３７、ノル−ＭＤＰと呼ばれる）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’
−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８４０Ａ、ＭＴＰ−ＰＥと呼ばれる）ならびに細菌から抽出される３つの成分、モノホスホリル脂質Ａ、トレハロースジミコラートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）を２％スクアレン／ＴＷＥＥＮ８０乳濁液中に含有するＲＩＢＩが挙げられる。
【００６９】
本発明には以下の製剤を含む組成物が含まれる：
抗原０．１５ｍｇ／ｍＬ、アルミニウム１．５ｍｇ／ｍＬ、トレハロース２０％、アラニン２％および界面活性剤０．０２５％；抗原０．５ｍｇ／ｍＬ、アルミニウム５ｍｇ／ｍＬ、トレハロース２０％、アラニン２％および界面活性剤０．０２５％；抗原０．５ｍｇ／ｍＬ、アルミニウム５ｍｇ／ｍＬ、トレハロース２０％、スクロース１％、アラニン２％および界面活性剤０．０２５％；ならびに抗原０．５ｍｇ／ｍＬ、アルミニウム５ｍｇ／ｍＬ、トレハロース２０％、アラニン２％および界面活性剤０．０２５％。いくつかの実施形態では、これらの製剤中の抗原および／または界面活性剤は、それぞれＰＡおよびＴｗｅｅｎ（登録商標）８０である。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は５ｍＭのＮａＰｉ  ｐＨ７．０緩衝液または２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４を含む。本発明に含まれるその他の組成物については「実施例」に記載する。
【００７０】
本発明のワクチンは、注射剤として使用するために調製することができる。組成物は、温度に安定な（例えば、凍結／解凍サイクルに耐え得る）組成物または凍結組成物である液状製剤であり得る。このほか、組成物を用いて、例えば薬学的に許容される担体により、投与前に復元することができる、凍結乾燥した乾燥粉末ワクチンを作製し得る。ワクチン投与は一般に、従来の経路、例えば、静脈内経路、皮下経路、腹腔内経路または粘膜経路によるものである。投与は非経口注射、例えば、皮下または筋肉内注射によるものであり得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物を凍結させた後、真空下で昇華させて、凍結乾燥組成物を作製する。
【００７２】
「復元される」または「復元」という用語は、保存および／または保管用に予め変化させた物質を、例えば再水和によって、凍結乾燥形態から液体形態に戻すこと、例えば、保管されていた適用する凍結乾燥ｒＰＡ製剤を液状に戻すことを指す。本願の凍結乾燥組成物は、投与に適した安定な水溶液を生じる任意の水溶液で復元することができる。このような水溶液としては、特に限定されないが、滅菌水、ＴＥ（トリスＥＤＴＡ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、トリス緩衝液または通常の生理食塩水が挙げられる。凍結乾燥試料は、試料を凍結乾燥させるのに使用した体積に比して小さい、同じまたは大きい体積で復元することができる。
【００７３】
復元された適用する凍結乾燥ワクチン製剤の投与量は治療する病態、投与経路の選択、個々の患者の年齢、性別および体重ならびに患者の症状の重症度を含めた様々な関連因子を考慮して決定することが可能であり、単回投与、分割投与または反復投与で投与し得ることを理解するべきである。
【００７４】
ワクチンは投与製剤に適合する方法で、予防および／または治療効果が得られる量で投与する。投与する量は一般に、投与１回当たり抗原５μｇ〜５００μｇの範囲内にあり、治療する対象、対象の免疫系が抗体を合成する能力および所望の保護の程度によって決まる。一実施形態では、ワクチンは少なくとも約１０μｇのＰＡ、２５μｇのＰＡ、５０μｇのＰＡ、７５μｇのＰＡ、１００μｇのＰＡ、１２５μｇのＰＡ、１５０μｇのＰＡ、２００μｇのＰＡ、２２５μｇのＰＡ、２５０μｇ、２７５μｇ、３００μｇのＰＡを含む。正確な抗原の量は送達する抗原によって決まる。
【００７５】
ワクチンは単回投与スケジュールまたは任意選択で反復投与スケジュールで投与することができる。例えば、ワクチン組成物を０．５ｍＬの投与量で投与することができる。曝露前予防では、反復投与スケジュールは、最初のワクチン接種過程を１〜６回の別々の投与とし、次いで、２回目の投与に次の時間間隔、例えば１〜４か月で別の投与を実施して免疫応答を維持および／または強化し、必要に応じて、数か月後に次の投与（１回または複数回）を実施するものである。
【００７６】
曝露後予防では、ワクチンを単回投与レジメンまたは反復投与レジメンに従って投与してもよい。例えば、一実施形態では、曝露後０週目、２週目および４週目の時点でワクチンを３回の投与で投与する。投与レジメンはほかにも、少なくとも部分的には、施行者の判断に基づいて、かつ／または試験、例えば、抗原（１つまたは複数）に対する抗体レベルおよび／またはＴ細胞活性などのワクチン／抗原（１つまたは複数）に対する免疫応答レベルの測定に基づいて、個人の必要性により決定される。
【００７７】
さらに、免疫原性抗原（１つまたは複数）を含有するワクチンを他の免疫調節物質、例えば、免疫グロブリン、抗生物質、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２）および／またはサイトカイン（例えば、ＩＦＮ−ベータ、ＩＦＮ−アルファ）とともに投与してもよい。
【００７８】
一実施形態では、対象を炭疽に曝露した後にワクチンを投与する。この実施形態では、ワクチンを抗生物質とともに投与し得る。ワクチンとともに投与し得る抗生物質としては、特に限定されないが、ペニシリン、ドキシサイクリンおよびシプロフロキサシンが挙げられる。
【００７９】
本発明は炭疽感染症を治療（曝露後予防）または予防（曝露前予防）する方法を含み、この方法は対象に薬学的有効量の本発明のワクチンを投与することを含む。一実施形態では、炭疽感染症は炭疽菌の吸入に起因するもの（吸入炭疽）である。本明細書で使用される薬学的有効量のワクチンとは、免疫応答を誘導する量のことである。一実施形態では、薬学的有効量のワクチンは、少なくとも２５μｇのＰＡを含む量である。本明細書で使用される対象とは、ヒトなどの哺乳動物のことである。
【００８０】
本発明はほかにも、免疫応答を刺激するのに十分な量の本発明のワクチンを対象に投与することによって対象の免疫応答を刺激する方法を提供する。一実施形態では、ワクチン中の抗原に特異的な抗体価の増加によって免疫刺激を測定する。さらに別の実施形態では、ワクチン中の抗原に特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球の頻度の増大によって免疫刺激を測定する。
【００８１】
このほか、本発明の組成物を投与することを含む、病原体に対して対象にワクチン接種する方法が提供される。さらに、本発明の凍結乾燥組成物から復元された医薬組成物を対象に投与することを含む、病原体に対して対象にワクチン接種する方法が提供される。本発明はさらに、効力のあるアラムベースの凍結ワクチンを作製する方法を含み、この方法は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２１％、少なくとも約２５％または少なくとも約３０％の糖と、アルミニウムアジュバントに吸着した抗原とを含む組成物を懸濁させることと、懸濁した組成物を沈降が生じる前に凍結させるのに十分な速度で前記組成物を凍結させること、例えば瞬間凍結させることとを含む。
【００８２】
本発明のいくつかの実施形態は、安定な凍結乾燥組成物を調製する方法を提供し、この方法は、本発明の組成物を凍結乾燥させることを含み、復元された凍結乾燥組成物の安定性がミクロファージ溶解アッセイ（ＭＬＡ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）および／または陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）によって測定される。
【００８３】
炭疽ワクチンでは、様々な実施例に記載される通りに製剤の免疫原性を試験し得る。例えば、マウスを、例えばアジュバント乳濁液に懸濁させた１０μｇ、２０μｇまたはそれ以上のｒＰＡで免疫感作し得る。対照マウスをアジュバントで乳化した生理食塩水で免疫感作し、ネガティブ対照として用いる。一般に、マウスを免疫化した後、様々な間隔で、例えば免疫感作後第０日目、第２１日目および第２８日目に採血する。次いで、血清を特異的抗体の存在について、例えばＥＬＩＳＡによって分析し、ほかにも、これを用いて抗血清の力価を求め得る。
【００８４】
このほか、マウスの毒素中和抗体アッセイを用いて、炭疽ワクチン製剤が保護抗体を誘発するかどうかを判定することができる。このアッセイでは、ｒＰＡで免疫感作したマウスを、のちに２種類の致死量の致死毒素（ＰＡおよび致死因子（ＬＦ））のｉ．ｐ．で抗原刺激する。抗原刺激の４日後、マウスの生存個体をスコア化する。
【００８５】
ほかにも、ｒＰＡ製剤を用いて、炭疽毒素に免疫反応を示す中和抗体を含む組成物を調製することができる。得られた抗血清は、炭疽菌曝露を処置する薬物の製造に使用することができる。本発明の一実施形態では、抗体組成物は精製抗ＰＡ抗体を含む。「精製（された）」は、抗体が、天然の状態で結合している他の生物学的材料を実質的に含まないことを意味する。本発明の精製抗体は少なくとも６０重量％の純度、少なくとも７０重量％の純度、少なくとも８０重量％の純度、少なくとも９０重量％の純度または少なくとも９５重量％の純度である。抗血清または抗血清から精製された抗体はこのほか、ＰＡフラグメントまたは天然のタンパク質を検出する診断剤として使用することができる。
【００８６】
凍結速度を増大させることによって、本発明の凍結および凍結乾燥製剤の効力を増大させて製造することができる。一実施形態では、製剤を急速冷凍する。
【００８７】
このほか、沈降した組成物ではなく懸濁した組成物を凍結させることによって効力を増大させることができる。組成物を穏やかな振盪によって懸濁させ、直ちに凍結させることができる。
【００８８】
以下の実施例により本発明がさらに明確になるが、これらの実施例は単に本発明の例示を目的とし、決して限定することを目的とするものではない。
【００８９】
実施例１：トレハロースを含むまたは含まない液状ｒＰＡワクチンおよびＡＶＡワクチンの凍結／解凍
下の表１に概略を示す通り、トレハロースを含むｒＰＡ１０２ワクチン製剤およびトレハロースを含まないｒＰＡ１０２ワクチン製剤を調製した。
【００９０】
【表１】
2015525748.tif 000002
【００９１】
混合後、各試料を１０ｍｌのガラス管に２つの８ｍｌのアリコートに分けて入れた。各試料について、一方の管を一晩穏やかにかき混ぜた後、−８０℃の状態に置き、他方の管を穏やかにかき混ぜた後、２〜８℃の状態に一晩置いた。
【００９２】
翌日、−８０℃で一晩保管した試料を実験台の上で数時間（３〜４時間超）解凍させた後、観察および室温にした２〜８℃の試料との比較を実施した。試料の写真を撮影し、液体およびＡＬＨＹＤＲＯＧＥＬ（水酸化アルミニウム）の高さの合計を測定した。通常のｒＰＡ１０２ワクチンを凍結／解凍の前後で比較した。図１は、２〜８℃のｒＰＡ対照１試料（５℃と標識されている）と解凍後の−８０℃の試料とを比較した写真である。この写真は、凍結／解凍条件に曝露したｒＰＡ対照１試料中のアラムゲルの著しい崩壊を示している。ｒＰＡ１０２を凍結／解凍ストレスから保護した通常の製剤中の糖のレベルを試験した。図１に示される通り、凍結がｒＰＡ１０２ワクチンにダメージを与え、効力（ＭＲＰＴ）のデータが生理化学およびゲルの高さと相関していた（崩壊した）。図２は、２〜８℃のｒＰＡ被験製剤１試料（５℃と標識されている）と解凍後の−８０℃の試料とを比較した写真である。解凍したｒＰＡ被験製剤１試料にはアラムの顕著な崩壊はみられない。％で表した相対的なアラムの高さを表２にまとめる。
【００９３】
【表２】
2015525748.tif 000003
【００９４】
トレハロース１５％、ｒＰＡ  ０．１５ｍｇ／ｍＬ、アラニン２％、ポリソルベート８０  ０．０２５％、２５ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．４を含有する被験組成物と、トレハロース１５％を含まない対照製剤とを比較する同様の凍結／解凍実験を実施したところ、同様の結果が得られた（データ不掲載）。
【００９５】
ＢｉｏＴｈｒａｘ（登録商標）（吸着炭疽ワクチン）、ＡＶＡのバイアルおよびＡＶＡ＋トレハロース２５％のバイアルを穏やかにかき混ぜた後、−８０℃の状態に置いた。ＢｉｏＴｈｒａｘの２つ目のバイアルおよびＡＶＡ＋トレハロース２５％の２つ目のバイアルを穏やかにかき混ぜた後、２℃〜８℃の状態に一晩置いた。翌日、−８０℃のバイアルを解凍させ、全バイアルを調べた。アルミニウムゲルの高さは、２℃〜８℃で保管したＢｉｏＴｈｒａｘ  ｓｔｏｒｅｄおよびトレハロース２５％を含有する２つのＡＶＡ試料でほぼ同じであると思われた。アルミニウムゲルの高さは−８０℃で保管したＢｉｏＴｈｒａｘ（トレハロースを含有しない）の方がはるかに低かった（データ不掲載）。
【００９６】
実施例２：スクロースを含む液状ｒＰＡワクチンおよびスクロースを含まない液状ｒＰＡワクチンの凍結／解凍
下の表３に概略を示す通り、スクロースを含むｒＰＡ１０２ワクチン製剤およびスクロースを含まないｒＰＡ１０２ワクチン製剤を調製した。
【００９７】
【表３】
2015525748.tif 000004
【００９８】
混合後、各試料を１０ｍｌのガラス管に２つの１０ｍｌのアリコートに分けて入れた。各試料について、一方の管を穏やかにかき混ぜた後、−８０℃の状態に一晩置き、他方の管を穏やかにかき混ぜた後、２〜８℃の状態に一晩置いた。
【００９９】
翌日、−８０℃で一晩保管した試料を実験台の上で２〜３時間解凍させた後、観察した。図３は、２〜８℃（５℃と標識されている）および−８０℃の各製剤をともに室温にした後の写真を示している。図からわかる通り、両方の−８０℃の試料（ｒＰＡ対照２およびｒＰＡ被験製剤２）では解凍後、２〜８℃で冷蔵し続けた試料と比較してゲル崩壊がみられた。しかし、ゲル崩壊の量はスクロースを含まないｒＰＡ対照２の方が明らかに多かった。
【０１００】
実施例３：ｉｎ  ｖｉｖｏのマウス効力アッセイ
表４に概略を示す通り、凍結乾燥ワクチンを調製した。乾燥ワクチンを注射用水で復元して最終ｒＰＡ濃度０．１５ｍｇ／ｍｌ（投与量７５μｇ／０．５ｍｌ）にした後、通常の生理食塩水で１０倍に希釈し投与量レベル０．１（ＤＬ）にした。
【０１０１】
この試験には、それぞれが５〜８週齢、体重２０〜２５グラムの雌ＣＤ−１マウスを用いた。０．１ＤＬのワクチンを２０匹の雌ＣＤ−１マウスのグループにＩＰ注射し（０．５ｍｌ）、第２８日目、マウスの毒素中和試験（ＴＮＡ）で炭疽ＬＴ細胞毒性を中和する能力を評価するため血清を採取した。
【０１０２】
【表４】
2015525748.tif 000005
【０１０３】
中和係数（ＮＦ５０）を計算することによりｒＰＡ１０２製剤の免疫原性を検討した。中和係数ＮＦ５０は以下のように定義される：
ＮＦ５０＝ＥＤ５０試料／ＥＤ５０標準品。
【０１０４】
上式中、有効量５０％（ＥＤ５０）の標準品は、−２０℃以下で保管した正規の血清標準品を用いて調製したものである。
【０１０５】
２０匹のマウスの２０個のＮＦ５０値に基づいて、各ワクチン製剤のＮＦ５０の幾何平均値（ＧｅｏＭｅａｎ）を計算した。Ｔ検定または一元ＡＮＯＶＡを用いて、各製剤のＮＦ５０のＧｅｏＭｅａｎを９５％の信頼水準で比較した。ＮＦ５０の幾何平均値のｐ値が０．０５を上回った場合、製剤間にＮＦ５０（効力）の有意差はみられないものとした。ｐ値が０．０５未満であった場合、製剤のＮＦ５０の幾何平均値に互いに有意差がみられるものとした。
【０１０６】
対照（凍結乾燥製剤＃２）は、安定剤を含まないｒＰＡ１０２製剤（ｒＰＡ  ０．１５ｍｇ／ｍｌ、アルミニウム１．５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．４）とした。通常のｒＰＡ１０２製剤について、凍結が比較マウス効力アッセイのＧｅｏＭｅａｎ  ＮＦ５０値に及ぼす影響を図４に示す。対照製剤は凍結／解凍によるダメージを受けやすく、凍結工程後に免疫原性が有意に低下した（図４）。免疫原性の低下は溶液中のアルミニウムゲルの高さの減少に対応していた。
【０１０７】
凍結乾燥試料＃１および＃２は凍結乾燥試料＃３および＃４（トレハロースをそれぞれ３０％および２０％含有していた）よりも有意に低い免疫原性効力を示した。製剤中の糖がｒＰＡ１０２ワクチンの凍結乾燥に及ぼす影響は、図７のＧｅｏＭｅａｎ  ＮＦ５０の結果に示された。凍結乾燥試料＃１（１０％糖）では、ｒＰＡ１０２を凍結乾燥ストレスから保護することができなかった（図７を参照されたい）。これらの結果は、２０％および３０％の糖によりｒＰＡ１０２を凍結乾燥ストレスから保護することが可能であることを示すものであった。ゲル崩壊の発生は効力低下と相関していた。
【０１０８】
トレハロースの有無だけが異なるさらに２種類の製剤：＃１）ｒＰＡ  ０．１５ｍｇ／ｍＬ、アラム１．５ｍｇ／ｍＬ、アルギニン２％、ＴＷＥＥＮ８０（ポリソルベート８０）０．０２５％、２０ｍＭトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．４ならびに＃２および＃３）ｒＰＡ  ０．１５ｍｇ／ｍＬ、アラム１．５ｍｇ／ｍＬ、トレハロース２０％、アルギニン２％、ＴＷＥＥＮ８０（ポリソルベート８０）０．０２５％、２０ｍＭトリス−ＨＣＬ、ｐＨ７．４からＮＦ５０反応を決定し、糖が凍結前にｒＰＡ１０２のＧｅｏＭｅａｎ値に及ぼす影響を図５に示す。図５において、製剤群＃２および＃３はバイアルのみが異なる同じ製剤である。糖を含むおよび糖を含まない凍結させなかった２種類の製剤（３つの試料）のＮＦ５０に統計学的変化がみられなかったことから示される通り、トレハロースの添加は製剤の免疫原性に全く影響を及ぼさなかった（図５）。これらのトレハロース含有製剤の凍結前後のＧｅｏＭｅａｎ値の比較を図６に示す。この製剤を用いた場合、凍結の前後で免疫原性（ＮＦ５０）に統計学的に有意な変化はみられなかった（図６）。さらに、この製剤では、凍結後にアラムゲルの崩壊はみられなかった（ゲルの高さが維持された）（図６の写真）。これらの結果は、トレハロース２０％を含む被験製剤により、このｒＰＡワクチンが凍結／解凍ストレスから保護されたことを示している。
【０１０９】
実施例４：ウサギ免疫原性および安定性試験
ウサギに毒素中和抗体アッセイ（ＴＮＡ）を用いて、５℃で４か月間保管した組換え防御抗原（ｒＰＡ）凍結乾燥ワクチン製剤および５０℃で４か月間保管した同製剤の免疫原性を吸着炭疽ワクチン（ＡＶＡ）（ＢｉｏＴｈｒａｘ（登録商標））と比較した。このウサギ免疫原性試験では２つの免疫感作スケジュール（第０日および第２８日）を用いて、第−１日または第０日、第１４日、第２１日、第２８日、第３５日、第４２日、第５６日および第７０日に血液を採取した。
【０１１０】
表５に示す成分を用いてｒＰＡ凍結乾燥ワクチンを調製した。表５に示される通り、凍結乾燥前および復元後に最終製剤の成分を配合した。簡潔に述べると、懸濁液２ｍＬを１０ｍＬのガラスバイアルに入れた。ＶｉｒＴｉｓ  ＡｄＶａｎｔａｇｅ凍結乾燥器を用いて凍結乾燥を実施した。凍結乾燥後、ワクチンを５℃および５０℃で保管した。
【０１１１】
【表５】
2015525748.tif 000006
【０１１２】
具体的には、ストック溶液を調製し（ＴＷＥＥＮ８０およびＮａＣｌを除く）、０．１Ｎ  ＮａＯＨおよび／または０．１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨを７．４に調整した。ストック溶液を調製した後、以下の製剤配合物：ｒＰＡ  ０．５ｍｇ／ｍＬ、アルミニウム５．０ｍｇ／ｍＬ、トレハロース３０％（ｗ／ｖ）、ソルビトール０．２５％（ｗ／ｖ）、アルギニン１％（ｗ／ｖ）、ＴＷＥＥＮ８０  ０．０２５％、７５ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を２００ｍＬ  Ｎａｌｇｅｎｅボトル中に１５０ｍＬ調製し、これを用いて１０ｍＬバイアルに製剤配合物２ｍＬを満たした。
【０１１３】
バイアルを満たした後、ＶｉｒＴｉｓ  ＡｄＶａｎｔａｇｅ凍結乾燥器を以下のプログラムで用いて試料を乾燥させた：
【０１１４】
【表６】
2015525748.tif 000007
【表７】
2015525748.tif 000008
【表８】
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【０１１５】
表６に記載される通りにバイアルを保管した。免疫感作当日、各バイアルに無菌注射用水６．１１ｍＬを加えて凍結乾燥試料を復元した。全製剤成分が完全に溶解するまでバイアルを回転させてかき混ぜた。各被験物および対照物の希釈物（１：４、１：１６および１：６４）を無菌の通常の生理食塩水で調製した。
【０１１６】
本試験にはＮＺＷウサギを用いた。ＮＺＷウサギは毒性、免疫原性および有効性の研究で試験する炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）疾患の動物モデルとしてよく用いられており、ＮＺＷウサギはヒトにみられるものとほぼ同じ病理発生および臨床症状を示すため、よく特徴付けられたモデルであると考えられている（ＥＫ  Ｌｅｆｆｅｌら，Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９（１８）：１１５８−１１６４，２０１２；ＡＪ  Ｐｈｉｐｐｓら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．６８（４）：６１７−２９，２００４）。第０日および第２８日、各グループのＮＺＷウサギ（１ワクチン群当たり１０匹）に凍結乾燥ｒＰＡワクチン製剤またはＡＶＡの１：４、１：１６および１：６４の希釈物０．５ｍＬを筋肉内注射した。ＡＶＡ（ＢｉｏＴｈｒａｘ（登録商標））は、８３ｋＤａの防御抗原タンパク質を含み、アルミニウム１．２ｍｇ／ｍＬ（水酸化アルミニウムの０．８５％塩化ナトリウム溶液として添加される）、塩化ベンゼトニウム２５ｍｇ／ｍＬおよびホルムアルデヒド１００ｍｇ／ｍＬ（保存剤として添加される）とともに製剤化された、液状炭疽ワクチンである。
【０１１７】
第−１日または第０日、第１４日、第２１日、第２８日、第３５日、第４２日、第５６日および第７０の終了前に血清試料を採取した。第−１日または第０日、第１４日、第３５日および第４２日に採取した血清を用いてＴＮＡアッセイを実施した。表６に試験のデザインをまとめる。
【０１１８】
【表９】
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【０１１９】
ＴＮＡアッセイは、致死的な炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）ＬＦとＰＡの毒素複合体（致死毒素、ＬＴ）を不活性化するのに必要な抗体の量を評価する機能試験である。細胞毒性をアッセイの評価項目として用いることにより、被験血清試料がｉｎ  ｖｉｔｒｏで致死毒素を中和する能力を標準血清試料のものと比較した（ＰＲ  Ｐｉｔｔｍａｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２４（１７）：３６５４−６０，２００６）。
【０１２０】
簡潔に述べると、Ｊ７７４Ａ．１細胞をフラスコ中、ｄ−グルコース４．５ｇ／リットルを含有し熱不活性化ウシ血清１０％、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、ピルビン酸ナトリウム１ｍＭ、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）および炭酸水素ナトリウム０．１１ｍＭを添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で４８〜７２時間培養した。細胞を回収して９６ウェル組織培養プレートに３０，０００細胞／ウェルで播いた後、１６〜２４時間インキュベートした。血清試料を分離型９６ウェルマイクロタイタープレート中、１試料当たり２倍希釈で計７回希釈して調製した。次いで、血清試料を一定濃度のＬＴ（ＰＡ  １００ｎｇ／ｍｌおよびＬＦ  ８０ｎｇ／ｍｌ）とともに１時間インキュベートした。次いで、ＬＴを含む血清試料を細胞を含む組織培養プレートの対応するウェルに加え、４時間インキュベートした後、５ｍｇ／ｍｌのテトラゾリウム塩、３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を２５μｌ／ウェルで加えた。１時間のインキュベーション後、１００μｌ／ウェルの酸性化イソプロパノール（５０％Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（脱イオン水を含む）および２０％ＳＤＳ（５０％ジメチルホルムアミド１リットル中２００ｇ））を用いて細胞を溶解させ、ＨＣｌを用いてｐＨを４．７に調整した。アッセイプレートをさらに１６〜２４時間インキュベートし、構成済みのＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＶｅｒｓａＭａｘプレートリーダーを用いて、５７０ｎｍおよび６９０ｎｍにおける吸光度を５７０ｎｍの吸光度値から６９０ｎｍの吸光度値を減じて測定した。ＳｏｆｆＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア（バージョン５．４．１、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いて、吸光度測定において集団の５０％に量的効果が得られる投与量であるＥＤ５０を求めた。
【０１２１】
マウス参照血清（ロット＃ＭＳ０１１２１１）のＥＤ５０を用いて被験血清試料および陽性対照のＮＦ５０値（ＮＦ５０＝ＥＤ５０被験試料／ＥＤ５０参照試料）を求めた。ＣＰＧ７９０９アジュバントを含有するＡＶＡワクチンでマウス３００匹を免疫感作することにより、マウス標準品を調製した。マウス３００匹の血清を採取してプールし、標準品として−８０℃で凍結保管した。表７Ａ〜７Ｃは、第１４日、第３５日および第４２日それぞれの血清試料から得られた、５℃で保管した凍結乾燥ｒＰＡ、５０℃で保管した凍結乾燥ｒＰＡおよび５℃で保管したＡＶＡ対照の平均動力学データ（ＮＦ５０）の比較を示している。
【０１２２】
【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【０１２３】
第０日、全マウスとも毒素中和活性の試験結果は陰性であった。被験ワクチンは全３種類とも、３つの投与量レベルすべてにおいて＜ＮＦ５０＞が第３５日に最大レベルに達し（図８Ａ〜８Ｂ、９Ａ〜９Ｂおよび１０Ａ〜１０Ｂ）、ｒＰＡが３つの投与量すべてにおいてＡＶＡとほぼ同じかこれより優れた免疫原性動力学を有することが示された。図８Ａ〜８Ｂに示される通り、５℃および５０℃で保管した凍結乾燥ｒＰＡ（１：４希釈）はともに＜ＮＦ５０＞がＡＶＡ（１：４希釈）よりも高かった。１：１６および１：６４の希釈でも同様に、凍結乾燥ｒＰＡの方が同じ希釈のＡＶＡよりも＜ＮＦ５０＞が高かった（図９Ａ〜９Ｂおよび図１０Ａ〜１０Ｂを参照されたい）。
【０１２４】
第３５日の１：４希釈では、５℃で保管した凍結乾燥ｒＰＡおよび５０℃で保管した同製剤の＜ＮＦ５０＞ｇｅｏｍｅａｎ（ｇｍ）がそれぞれ３．１４および２．９８であることが明らかになり、１：４希釈のＡＶＡの＜ＮＦ５０＞ｇｍは１．６１であった。５℃で保管した凍結乾燥ｒＰＡ製剤（１：４）と５０℃で保管した同製剤との間に＜ＮＦ５０＞ｇｍの統計学的差はみられなかった（ｐ＝０．８２（ｔ検定））。合わせたデータ（ｒＰＡ  ｌｙｏ  ５℃および５０℃）の＜ＮＦ５０＞ｇｍは３．０６であることが明らかになり、合わせた＜ＮＦ５０＞ｇｍはＡＶＡ参照（１．６１）のものよりも統計学的に高かった（ｐ＝０．０３４（ｔ検定））。第４２日（１：４）では、５℃で保管したｒＰＡ  ｌｙｏと５０℃で保管した同製剤との間に＜ＮＦ５０＞ｇｍ（それぞれ２．０７および２．１３）の統計学的差はみられず（ｐ＝０．９２（ｔ検定））；合わせた＜ＮＦ５０＞ｇｍは２．１０であることが明らかになった。合わせた＜ＮＦ５０＞ｇｍの２．１０という値はＡＶＡ参照の値（１．０１）よりも統計学的に高かった（ｐ＝０．０２８（ｔ検定））。
【０１２５】
第３５日の１：１６希釈では、５℃で保管した凍結乾燥ｒＰＡおよび５０℃で保管した同製剤の＜ＮＦ５０＞ｇｍは、それぞれ１．７０および０．９４であることが明らかになった。５℃で保管したｒＰＡ  ｌｙｏと５０℃で保管した同製剤との間に＜ＮＦ５０＞ｇｍの統計学的差はみられなかった（ｐ＝０．０８１（ｔ検定））。合わせた＜ＮＦ５０＞ｇｍは１．２７であることが明らかになり、ｒＰＡ  ｌｙｏ（５℃および５０℃）の合わせた＜ＮＦ５０＞ｇｍとＡＶＡ参照の合わせた＜ＮＦ５０＞ｇｍ（０．６７）との間に統計学的差はみられなかった（ｐ＝０．０６４（ｔ検定））。第４２日（１：１６）では、５℃で保管したｒＰＡ  ｌｙｏと５０℃で保管した同製剤との間に＜ＮＦ５０＞ｇｍ（それぞれ１．０８および０．５７）の統計学的差はみられず（ｐ＝０．０７１（ｔ．検定））、合わせた＜ＮＦ５０＞ｇｍは０．７８であることが明らかになった。合わせた＜ＮＦ５０＞ｇｍの０．７８という値はＡＶＡ参照の値（０．４０）よりも統計学的に高かった（ｐ＝０．０５（ｔ検定））。
【０１２６】
第３５日の１：６４希釈では、５℃で保管した凍結乾燥ｒＰＡと５０℃で保管した同製剤との間に＜ＮＦ５０＞ｇｍ（それぞれ１．０６および０．１０）の統計学的差はみられなかった（ｐ＝０．３８６（ｔ検定））。合わせた＜ＮＦ５０＞ｇｍは０．１３であることが明らかになり、ＡＶＡ参照は０．０６であった。第４２日（１：６４）では、５℃で保管したｒＰＡ  ｌｙｏと５０℃で保管した同製剤との間に＜ＮＦ５０＞ｇｍ（それぞれ０．１１および０．１０）の統計学的差はみられず（ｐ＝０．９１（ｔ検定））、合わせた＜ＮＦ５０＞ｇｍは０．１１であることが明らかになった。合わせた＜ＮＦ５０＞ｇｍの値０．１１とＡＶＡ参照（０．０４）との間に統計学的差はみられなかった（ｐ＝０．３５（ｔ検定））。
【０１２７】
５℃で保管した凍結乾燥ｒＰＡおよび５０℃で保管した同製剤のＮＦ５０の幾何平均値（＜ＮＦ５０＞ｇｍ）を第３５日および第４２日の３種類の希釈（１：４、１：１６および１：６４）についてＡＶＡと比較したものを図１１Ａ〜１１Ｂ、図１２Ａ〜１２Ｂおよび図１３Ａ〜１３Ｂに示す。
【０１２８】
第３５日では、５０℃で保管した凍結乾燥ｒＰＡワクチンの＜ＮＦ５０＞ｇｍは投与量１：４、１：１６および１：６４でそれぞれ２．９８、０．９４および０．１であることが明らかになった。５℃で保管した凍結乾燥ｒＰＡワクチンの＜ＮＦ５０＞ｇｍは第３５日においてほぼ同じであり（それぞれ３．１４、１．７および０．１６）であり、５０℃と比較して統計学的有意差はみられなかった（アルファ＝０．０５）。第４２日にもほぼ同じ結果がみられた。これらのデータから、５０℃で４か月間保管した凍結乾燥ｒＰＡワクチンの免疫原性には、５℃で保管した凍結乾燥ｒＰＡワクチンとの間に統計学的差がみられないことが明らかになった。
【０１２９】
第３５日では、合わせた＜ＮＦ５０＞ｇｍ（５℃および５０℃）は投与量１：４、１：１６および１：６４でそれぞれ３．０６、１．２７および０．１であることが明らかになり、合わせた＜ＮＦ５０＞ｇｍを１：４および１：１６についてＡＶＡと比較したｐ値は、それぞれｐ＝Ｏ．０３４およびｐ＝０．０６４であった。合わせた＜ＮＦ５０＞ｇｍはＡＶＡの＜ＮＦ５０＞ｇｍに劣らない（統計学的に高いか差が見られない）ことが明らかになった。第４２日にもほぼ同じ結果がみられる。第４２日では、１：４、１：１６および１：６４の合わせた＜ＮＦ５０＞値はそれぞれ２．１０、０．７８、０．１１であり、合わせた＜ＮＦ５０＞ｇｍを１：４、１：１６および１：６４についてＡＶＡと比較したｐ値は、それぞれｐ＝０．９２、ｐ＝０．０７１およびｐ＝０．９１であった。これらの免疫原性のデータから、５℃で４か月間保管したｒＰＡ凍結乾燥ワクチンおよび５０℃で４か月間保管した同製剤が、少なくともＡＶＡワクチンと同等の免疫原性を示したことがわかる。
【０１３０】
要約すると、以上の結果は、被験凍結乾燥製剤がｒＰＡワクチンを５０℃で少なくとも４か月間安定化することが可能であることを示している。データから、ｒＰＡ凍結乾燥製剤がＡＶＡワクチンよりも優れた熱安定性プロファイルを有することが明らかになった。したがって、これらの結果から、ｒＰＡ凍結乾燥製剤がｒＰＡ炭疽ワクチンの保管に有効であり、被験製剤が室温において安定で、低温流通体系による流通を回避することが可能であることが示された。
【０１３１】
実施例５：モルモット免疫原性試験
モルモット免疫原性試験の概略を表８に示す。
【０１３２】
【表１３】
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【０１３３】
実施例６：マウスにおける免疫原性および生理化学的安定性
３種類の凍結乾燥ｒＰＡワクチン製剤の免疫原性および生理化学的安定性について、液状ｒＰＡワクチンと比較して試験した。ｒＰＡワクチンの含有量および純度（生理化学的安定性）をマクロファージ溶解アッセイ（ＭＬＡ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）により測定した。ＣＤ−１マウスに４種類の投与量レベルでワクチン接種し、マウス血清が炭疽毒素を中和する能力（ＮＦ５０）を試験することにより、ｒＰＡワクチンの免疫原性を評価した。
【０１３４】
液状ｒＰＡワクチン製剤
無菌条件下、ｒＰＡ  ０．１５ｍｇ／ｍＬ、アラム１．５ｍｇ／ｍＬ、アラニン２％、ＴＷＥＥＮ８０  ０．０１％、２５ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．０で液状ｒＰＡ製剤（Ｆ１）を調製した。安定性試験の試料は、液体懸濁液５ｍＬを含み１０ｍＬガラスバイアルに入れたものとした（１バイアル当たり１０投与量）。目的とするヒト投与量は、筋肉内注射により０．５ｍＬ当たり７５μｇ  ｒＰＡ／７５０μｇアラムである。
【０１３５】
凍結乾燥ｒＰＡワクチン製剤
３種類の凍結乾燥ｒＰＡ製剤を調製した。凍結乾燥前の最終製剤を表９に示す。第一のロット（ｌｙｏＡ）をｒＰＡ  ０．１５ｍｇ／ｍＬ、アラム１．５ｍｇ／ｍＬ、トレハロース２０％、Ａｌａ２％、Ｔｗ８０  ０．０２５％および５ｍＭ  ＮａＰｉによりｐＨ７．０で製剤化した。第二および第三のロット（それぞれｌｙｏＢおよびｌｙｏＣ）は、表９に示す通り、３．３倍の濃度のｒＰＡおよびアラム（それぞれ０．５ｍｇ／ｍＬおよび５．０ｍｇ／ｍＬ）ならびにわずかに変化させた糖、アミノ酸および緩衝液を含有するものとした。
【０１３６】
【表１４】
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【０１３７】
大部分のｒＰＡタンパク質がアラムと結合し溶液中に遊離のｒＰＡタンパク質がほとんどないし全く存在しないよう全３種類のｒＰＡ凍結乾燥製剤を設計した。液体懸濁液２ｍＬを１０ｍＬのガラスバイアルに入れた。ＦＴＳ  ＬｙｏＳｔａｒ（登録商標）ＩＩを以下の工程パラメータで用いて凍結乾燥を実施した。
【０１３８】
【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【０１３９】
接種および試験前、全３種類の製剤の最終濃度がｒＰＡ  ０．１５ｍｇ／ｍＬおよびアラム１．５ｍｇ／ｍＬになるように凍結乾燥試料を注射用水（ＷＦＩ）で復元した。第一のロット（ＬｙｏＡ）、第二のロット（ＬｙｏＢ）および第三のロット（ＬｙｏＣ）のバイアルにＷＦＩをそれぞれ１．５５ｍＬ、６．２ｍＬおよび６．１８ｍＬ加えることにより最終濃度を達成した。１バイアル当たりの最終懸濁体積は、ＬｙｏＡを２．０ｍＬ、ＬｙｏＢおよびＬｙｏＣの両ロットを６．７ｍＬとした。復元後のｒＰＡワクチンの濃度を表１０に示す。
【０１４０】
【表１８】
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【０１４１】
ロットＬｙｏＢおよびＬｙｏＣの１バイアル当たりの総用量数はＬｙｏＡのものよりも多くした（１３．３対４．０）。用量数の多いバイアル（１バイアル当たり投与数１３．３など）の製造コストの方が用量数の少ないバイアル（例えば、１バイアル当たり４．０）の製造コストよりも大幅に低い。したがって、より用量数の多いバイアルを製造するための製剤および工程を開発するのが経済的に好ましい。
【０１４２】
安定性および試験アッセイ
ｒＰＡ液状製剤（Ｆ１）を保管温度５℃、２５℃および４０℃の長期安定性プログラムに供した。３種類のｒＰＡ凍結乾燥ロット（ＬｙｏＡ、ＬｙｏＢおよびＬｙｏＣ）を保管温度５℃、２５℃、４０℃および５０℃の長期安定性プログラムに供した。液状ｒＰＡワクチン製剤（Ｆ１）および凍結乾燥ｒＰＡワクチン製剤の両方に生理化学試験を実施した。試料の４か月間の安定性データを収集した。
【０１４３】
一連のアッセイ、すなわちＭＬＡ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＡＥＸ−ＨＰＬＣにより、ｒＰＡ被験ワクチンの生理化学的特性を評価した。これらのアッセイはすべて、アラムから抽出したｒＰＡタンパク質を用いて実施した。この抽出方法では２００ｍＭリン酸カリウム／０．０１％Ｔｗ８０／０．９％ＮａＣｌを用いた。
【０１４４】
−８０℃で保管したｒＰＡ原薬バルク（ＢＤＳ）を標準対照として用いた。ｒＰＡを産生するための非芽胞形成性非毒産生発現系として米国陸軍感染症研究所（ＵＳＡＭＲＩＩＤ）により開発された炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）ΔＳｔｅｒｎｅ−１（ｐＰＡ１０２）ＣＲ４株からＢＤＳ対照を精製した。ｒＰＡ  ＢＤＳを精製し、２０ｍＭトリス、０．９％ＮａＣｌ、ｐＨ７中、−８０℃の凍結条件下で保管した。
【０１４５】
Ｉ．マクロファージ溶解アッセイ（ＭＬＡ）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのマクロファージ溶解アッセイ（ＭＬＡ）を用いて、ｒＰＡのマウスマクロファージ細胞系Ｊ７７７４Ａ．１に対する細胞毒性を判定した。ＭＬＡはｒＰＡおよびｒＬＦ毒素の活性を測定するものでる。このアッセイでは致死因子タンパク質（ｒＬＦ）にｒＰＡタンパク質を加えて致死毒素複合体を形成させ、これによりマクロファージの細胞膜にポア形成を生じさせて細胞溶解を引き起こす。
【０１４６】
ｒＰＡ凍結乾燥ワクチンの活性（アラムから脱着したｒＰＡを用いる）をＢＤＳ標準品に対して測定し、標準品の百分率として報告した。毒素攻撃を生き延びた細胞の百分率を求めた。例えば、ｒＰＡワクチンのＭＬＡ活性が１００％であれば、アラムに吸着した凍結乾燥後のｒＰＡの細胞毒性活性が全く低下してないことを示す。簡潔に述べると、９６ウェルプレートにミクロファージ細胞を５×１０４細胞／ウェルで播き、プレートをＣＯ２インキュベーター内に一晩置いた。翌日、連続希釈したｒＰＡ被験試料またはｒＰＡ標準品（開始ｒＰＡ濃度を８００ｎｇ／ｍｌとし、次いで１：２希釈で０．８ｎｇ／ｍｌにした）１００μｌをｒＬＦ（ｒＬＦ濃度は１００ｎｇ／ｍｌで一定にした）と混合し、ウェルに加えた。４時間後、各ウェルに５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）２５μｌを加え、プレート１．５時間インキュベートした。１．５時間のインキュベーション後、ウェルに可溶性溶液（５０％ジメチルホルムアミドにＳＤＳ  ２０％を溶かした溶液）１００μｌを加え、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートリーダーによりプレートを５７０ｎｍで読み取り、ソフトウェア（ＳｏｆｔＭａｘ）を用いてＯＤ読取り値を４パラメータモデルでグラフ化した。次いで、被験試料ｒＰＡのＥＤ５０値とｒＰＡ標準品のＥＤ５０値とを比較し、その比を用いてｒＰＡ被験試料の相対活性を報告した。アッセイの精度は±３０％であることがわかった。
【０１４７】
ＩＩ．サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）
ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、タンパク質をその分子量および大きさに基づいて分離するのに用いられるクロマトグラフィー技術であり、製剤中のタンパク質の安定性を評価するのによく用いられる。通常、大きいタンパク質の方が小さいタンパク質よりもＳＥＣカラム内での保持時間が短い（より早く溶出する）。分解した（または断片化した）タンパク質は大きさが小さくなり、クロマトグラフィーから溶出するのが遅い。逆に、凝集したタンパク質は溶出するのが早くなる。例えば、凝縮し大きさが増大したｒＰＡタンパク質であれば天然のｒＰＡタンパク質よりも保持時間が短くなり、分解したｒＰＡタンパク質（大きさの崩壊）であれば保持時間が長くなる。
【０１４８】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣは、製剤中のタンパク質の生理化学的安定性を評価するのに用いられる一般的なアッセイである。ＳＥＣ−ＨＰＬＣは一般に、ＭＬＡと比較して感度が高く定量的であり、その精度は同一実行内で％ピーク面積が５％未満、保持時間が０．１％未満である。
【０１４９】
ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐ／Ｎ  Ｍ１１８２−０５Ｍ）にｐＨ７．４の５０ｍＭリン酸ナトリウム／２５０ｍＭ塩化カリウムの移動相を用いてＳＥＣ−ＨＰＬＣを実施した。検出には２１５ｎｍの紫外線（ＵＶ）検出器または２８０ｎｍ（励起）および３３５ｎｍ（放出）の蛍光検出器を用いた。
【０１５０】
ＩＩＩ．陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）
ＡＥＸ−ＨＰＬＣはタンパク質をその正味の静電荷に基づいて分離するものである。このアッセイでは一般に、陰イオン交換カラムを備えたＨＰＬＣにｒＰＡタンパク質溶液を注入した。ｒＰＡタンパク質は静電的相互作用によって陰イオン交換（ＡＥＸ）カラム（固定相）に保持された。次いで、イオン強度（ＮａＣｌ濃度）が漸増する移動相を用いることにより、ｒＰＡタンパク質を溶出させた。ｒＰＡ分子が溶出するイオン強度（または溶出時間）はその正味電荷と関係がある。
【０１５１】
ｒＰＡ分子は脱アミド化機序による分解を受けやすいことが知られており（Ｄ’Ｓｏｕｚａ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１０２（２）：４５４−４６１，２０１３）、その結果、正味の変化が変化する。脱アミド化が起こると、アスパラギン残基からアスパラギン酸（陰性が強い）への変換によりｒＰＡタンパク質の負電荷が増大する。脱アミド化したｒＰＡ（通常、酸性種と呼ばれる）は、天然のｒＰＡタンパク質よりもイオン強度が高い溶液で溶出し、溶出時間が長い。％主要ピークによりｒＰＡの純度を明らかにした。
【０１５２】
Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＰＲＰ−Ｘ５００陰イオン交換カラム（Ｐ／Ｎ７９６４１）にｐＨ８．０の２５ｍＭトリスの移動相ＡおよびｐＨ８．０の２５ｍＭトリス、０．５Ｍ  ＮａＣｌの移動相Ｂを用いてＡＥＸ−ＨＰＬＣを実施した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣと同様にＵＶ検出器または蛍光検出器を用いた。
【０１５３】
ＩＶ．免疫原性試験
毒素中和試験（ＴＮＡ）（Ｈｅｒｉｎｇら，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ３２（２００４）１７−２７；Ｏｍｌａｎｄら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００８）９４６−９５３；およびＬｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００８）３３３：８９−１０６）を用いて免疫原性を評価した。マウス参照血清（上記の通りに調製したもの）のＥＤ５０値を用いて被験血清試料および陽性対照のＮＦ５０値を求めた。最初の１か月間の安定性のデータを本明細書に報告する。
【０１５４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性試験では、１グループ当たり２０匹の雌ＣＤ−１マウスにＬｙｏＡ、ＬｙｏＢ、ＬｙｏＣまたは液状ｒＰＡ（Ｆ１）０．５ｍＬを腹腔内（ｉ．ｐ．）に単回注射した。４種類の希釈投与量レベルを評価した（１：４、１：８、１：１６および１：３２）。希釈物はワクチン接種当日に生理食塩水で調製した。ワクチン接種後第２８日、心採血により血清試料を採取した。
【０１５５】
生理化学的安定性の結果
５℃、２５℃、４０℃および５０℃で４ヵ月間保管した３種類の凍結乾燥製剤ならびにＢＤＳ標準対照のＭＬＡ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＡＥＸ−ＨＰＬＣの結果を表１１にまとめる。
【０１５６】
【表１９】
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【０１５７】
マクロファージ溶解アッセイの結果
これらのＭＬＡの結果から、最高４０℃および５０℃で４か月間保管した３種類の凍結乾燥製剤にはＢＤＳ標準対照と比較してｒＰＡ細胞毒性の有意な低下がみられなかった（±３０％の誤差変動内）ことがわかる。
【０１５８】
これと比較して、５℃、２５℃および４０℃で１か月間保管した液状ｒＰＡワクチン（Ｆ１）にはＭＬＡの値の有意な低下がみられる。ＭＬＡの値は５℃、２５℃および４０℃でそれぞれ、９８％、６５％および０％であることがわかった。図１４は、４か月間保管した３種類の凍結乾燥ロットと１か月間保管したｒＰＡ液状ロット（Ｆ１）のＭＬＡ％を保管温度の関数として比較したものを示している。これらの結果から、３種類の凍結乾燥製剤ではｒＰＡワクチンのＭＬＡ活性が４０℃および５０℃で少なくとも４か月まで維持されたのに対して、液状ｒＰＡワクチンでは４０℃で１か月間保管した後にＭＬＡ活性が消失したことを示している。
【０１５９】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）の結果
ｒＰＡ標準対照（ＢＤＳ）の典型的なＳＥＣクロマトグラフを図１５Ｂに示す。各試料のピークのパーセントピーク面積を計算した。天然のｒＰＡタンパク質（モノマー）は１７．１分に溶出し、％主要ピーク面積は８５％であった。第二のピークは１８．２分に溶出し、凝集ｒＰＡ分子の主要ピーク面積約１５％に対応する。１７．１分の溶出ピークの％面積によりｒＰＡタンパク質の％純度を求めた、すなわち、ｒＰＡタンパク質の純度（％純度ｒＰＡ）＝ｒＰＡピーク（保持時間約１７．１分のモノマーｒＰＡに対応する）のパーセントピーク面積／総ピーク面積）として求めた。
【０１６０】
ＬｙｏＡ、ＬｙｏＢおよびＬｙｏＣの純度の結果は、−８０℃で保管したｒＰＡ標準ＢＤＳの純度８４．０％という結果に匹敵するものであった（表１１を参照されたい）。ＳＥＣ−ＨＰＬＣのデータは、４か月間保管した全３種類の凍結乾燥製剤には、全保管温度で標準対照と比較して純度の有意な低下がみられないことを示していた。
【０１６１】
これと比較として、液状ｒＰＡワクチンでは、高い温度（２５℃、４０℃または５０℃）で１か月間保管したところ純度の有意な低下がみられた。液状製剤のｒＰＡの相対％純度は５℃、２５℃および４０℃でそれぞれ、−３．３％、−７．２％および−９８．６％に低下した。
【０１６２】
ＢＤＳ標準対照の％純度は、凍結乾燥状態および液状のアッセイでそれぞれ８４．０％および９８．６％であることが明らかになった。この２つの試験は異なる時に実施したものである。標準対照の％純度の差は異常なものではなかった。この差はＳＥＣカラムの条件および試料の調製方法の違いによるものであると考えられる。相対％純度（標準対照に対するもの）は通常、安定性の試料を異なる時に異なる研究所間で比較するのに用いられるものである。
【０１６３】
図１５Ａは、３種類の凍結乾燥製剤のｒＰＡのＳＥＣ％純度（ＢＤＳ標準対照に対するもの）の相対的低下を保管温度の関数として液状製剤と比較したものを示している。データは、４０℃または５０℃で少なくとも４か月間保管した凍結乾燥ｒＰＡワクチンのＳＥＣ純度に全く変化がみられなかったのに対して、液状ｒＰＡワクチンは４０℃で１か月間保管した後に完全に分解されたことを示していた。
【０１６４】
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）の結果
ｒＰＡ標準対照（ＢＤＳ）の典型的なＡＥＸクロマトグラフを図１６Ｂに示す。％主要ピーク面積によりｒＰＡの純度を明らかにした。天然のｒＰＡタンパク質は２１．０分に溶出し、主要ピークが約８１．４％であった。脱アミド化したｒＰＡ（通常、酸性種と呼ばれる）は２１．７分〜２２．４分の間に溶出し、面積が１６．６％であった。最初に全ピーク（緩衝液のピークを除く）の曲線下面積を、次いで、保持時間約２１．０分のｒＰＡのピークに対応する％主要ピーク面積を総合することによって、％主要ピーク面積を計算した（すなわち、％主要ピーク面積＝ピーク面積（ＲＴ＝２１．０分）／全ピーク面積の合計）。ＳＥＣ−ＨＰＬＣと同様に、ｒＰＡの純度は％主要ピーク面積と同じであった。ＡＥＸアッセイの精度は約１０〜１５％であった。
【０１６５】
４か月間保管した第一の凍結乾燥ロット（ｌｙｏＡ）のＡＥＸ％純度は、５℃、２５℃および４０℃でそれぞれ８７．１、８６．６、８４．７であることが明らかになった。第二の凍結乾燥ロット（ｌｙｏＢ）のＡＥＸ純度は、５℃、２５℃および５０℃でそれぞれ８７．８％、８６．２％および８５．３％であった。第三の凍結乾燥ロット（ｌｙｏＣ）のＡＥＸ％純度は、５℃、２５℃および５０℃でそれぞれ８７．５％、８４．５％および７０．５％であった。ＬｙｏＡ、ＬｙｏＢおよびＬｙｏＣのこれらの純度の結果は、ｒＰＡ標準対照（ＢＤＳ）の８０．８％という純度に匹敵するものであった。４か月間保管した後の全３種類の凍結乾燥製剤には、全保管温度で標準対照に対して純度の有意な低下がみられなかった。
【０１６６】
１か月間保管した液状ｒＰＡワクチンのＡＥＸ純度は、５℃、２５℃および４０℃でそれぞれ６５．５％、２５．６％および０％であることが明らかになり、ｒＰＡ標準対照（ＢＤＳ）のＡＥＸ純度は、液状ｒＰＡを試験するアッセイに使用した場合、７８．２％であった。ＡＥＸ純度の結果を表１１にまとめる。
【０１６７】
図１６Ａに示される通り、５℃、２５℃および４０℃のｒＰＡ液状製剤（Ｆ１）には、凍結乾燥製剤と比較してＡＥＸ純度の有意な低下がみられた。ＡＥＸのデータは、４０℃または５０℃で少なくとも４か月間保管した凍結乾燥ｒＰＡワクチンには純度の低下が全くみられなかったのに対して、液状ワクチンは４０℃で保管して１か月後に完全に分解されたことを示していた。
【０１６８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫原性の結果
１か月間保管した３種類の凍結乾燥製剤のマウスにおける投与量レベル０．２５、０．１２５、０．０６２５および０．０３１２５でのＮＦ５０の結果をそれぞれ求めた。図１７Ａ〜１７Ｄ、図１８Ａ〜１８Ｄおよび図１９Ａ〜１９Ｄは、ＮＦ５０のデータ（ｎ＝２０）をその対応する製剤および投与量レベルにおいて各種温度間（５℃、２５℃および４０℃）で比較したものである。
【０１６９】
３種類の凍結乾燥製剤の４つの投与量レベルにおける５℃、２５℃および４０℃でのＮＦ５０の幾何平均値（＜ＮＦ５０＞ｇｍ）を表１２Ａ〜１２Ｃにまとめる。
【０１７０】
【表２０】
2015525748.tif 000021
【０１７１】
【表２１】
2015525748.tif 000022
【０１７２】
【表２２】
2015525748.tif 000023
【０１７３】
１か月間保管した後のロットＬｙｏＡでは、投与量レベル０．２５における５℃、２５℃および４０℃での＜ＮＦ５０＞ｇｍがそれぞれ１．１２、１．２０および１．１３であることが明らかになった。３つの保管温度（５℃、２５℃および４０℃）間には、＜ＮＦ５０＞ｇｍの統計学的有意差はみられなかった（ｐ＝０．９７）。同様に、全３種類の凍結乾燥製剤（ＬｙｏＡ、ＬｙｏＢおよびＬｙｏＣ）の他の被験投与量レベル（０．１２５、０．０６２５および０．０１３１５）においても、各種保管温度間に＜ＮＦ５０＞ｇｍの統計学的差はみられないことがわかった。ＮＦ５０のデータは、最高４０℃で１か月後に３種類の凍結乾燥製剤に免疫原性の有意な低下がみられないことが示された。
【０１７４】
これに対して、液状ｒＰＡ製剤（Ｆ１）では、２５℃および４０℃の保管温度で１か月後に免疫原性の有意な低下がみられた。５℃、２５℃および４０℃で１か月間保管したｒＰＡ液状製剤の＜ＮＦ５０＞ｇｍの結果を表１３に示す。
【０１７５】
【表２３】
2015525748.tif 000024
【０１７６】
投与量レベル０．３では、＜ＮＦ５０＞ｇｍが５℃、２５℃および４０℃でそれぞれ１．２６、０．６９および０．３０であることが明らかになり、全＜ＮＦ５０＞ｇｍに統計学的有意差がみられた（ｐ＝０．００２３）。これより低い投与量レベル０．２、０．１および０．０５でも同様に、保管温度の上昇に伴い＜ＮＦ５０＞ｇｍが有意に低下した（図２０Ａ〜２０Ｄを参照されたい）。液状ワクチンを２５℃で保管した場合、全４つの投与量レベルにおいて、ＮＦ５０は５℃と比較して有意に低下し、４０℃ではより漸進的に低下することが明らかになった。
【０１７７】
要約すると、免疫原性のデータから、凍結乾燥ｒＰＡ製剤の方が液状ｒＰＡ製剤よりも優れていることが示された。凍結乾燥製剤ではその免疫原性が２５℃および４０℃で少なくとも１か月間維持されるのに対して、液状製剤の免疫原性は同様の保管条件で大幅に低下する。
【０１７８】
ほとんどの液状ワクチンと同様に、液状ｒＰＡワクチンは高い保管温度（例えば、２５℃および４０℃）で不安定であることが明らかになった。液状ｒＰＡワクチンを４０℃で１か月間保管したところ、その免疫原性および重要な生理化学的特性が失われた。同様に、ワクチンの重要な生理化学的特性も有意に低下した。マクロファージ溶解アッセイ（ＭＬＡ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）および陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）によって測定されるワクチンの含有量および純度は、１か月間で２５℃では有意に低下し、４０℃で１か月間では検出不可能になる。液状ｒＰＡワクチンは、特にアルミニウムに吸着させて高い温度で保管した場合、脱アミド化反応を受けやすいことが知られていた。
【０１７９】
３種類の凍結乾燥製剤をロット番号ｌｙｏＡ、ｌｙｏＢおよびｌｙｏＣとして製造した。この３種類の新規なｒＰＡ凍結乾燥製剤はｒＰＡ液状ワクチンよりも優れた安定性プロファイルを有していた。３種類のロットの凍結乾燥製剤にはいずれも、最高５０℃で４か月間保管した場合、すべての重要な生理化学的アッセイ（ＭＬＡ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣおよびＡＥＸ−ＨＰＬＣ）で純度の統計学的に有意な変化がみられなかった。さらに、凍結乾燥ワクチンを最高４０℃で１か月間保管した場合、４つの投与量レベルにおいて免疫原性（ＮＦ５０）の有意な低下はみられなかった。
【０１８０】
以上の結果は、凍結乾燥ｒＰＡ製剤が液状ｒＰＡ製剤よりも優れた生理化学的および免疫学的安定性プロファイルを有していたことを示している。凍結乾燥製剤では、ＭＬＡ、ＳＥＣおよびＡＥＸにより試験される重要な生理化学的特性が、最高５０℃の保管温度で４か月間の保管期間にわたってすべて維持された。凍結乾燥製剤ではこのほか、最高４０℃の保管温度で少なくとも１か月間、免疫原性が維持された。これに対して、液状ｒＰＡ製剤では、４０℃で１か月間保管した後に生理化学的特性（ＭＬＡ、ＳＥＣおよびＡＥＸ）の完全な消失および免疫原性の有意な低下がみられた。
【０１８１】
実施例７：他のアジュバントを用いた製剤および凍結乾燥
高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）ボトルにＣＰＧ７９０９原薬バルク（ＢＤＳ）を凍結乾燥粉末として包装し、多層（マイラー、ホイル）パウチ中に熱密封し、−２０℃±５℃で保管する。
【０１８２】
グルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）をＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社から入手した。これを凍結乾燥ＧＬＡ粉末２５ｍｇを含む琥珀色の２ｍＬガラスバイアルに包装し、−２０℃±５℃で保管した。ＧＬＡはＡｒｉａｓら（２０１２）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（７）：ｅ４１１４４に記載されている。
【０１８３】
２０ｍＭトリス−ＨＣｌでｐＨ７．４に緩衝した、ｒＰＡ  ２．８１ｍｇ／ｍＬ、ＮａＣｌ  ０．９％の原薬バルク（ＢＤＳ）を使用した。これを−８０℃で保管し、使用前に５℃で一晩解凍させた。
【０１８４】
ポリＩポリＣ（ＰＩＰＣ）をＩｎｖｉｖｉＧｅｎ社からＰＩＰＣ  ５０ｍｇを含有する凍結乾燥ケークとして２０ｍＬガラスバイアルに入れた状態で入手した。これを５℃で保管した。
【０１８５】
【表２４】
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【０１８６】
【表２５】
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【０１８７】
ストック溶液の調製
２０ｍＭトリス緩衝液および５ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液で２つの６０％（ｗ／ｖ）トレハロース溶液を別々に調製し、無菌ろ過した。ＤＩ水でポリソルベート８０の１０％（ｖ／ｖ）溶液を調製した後、無菌ろ過した。２０ｍＭトリス緩衝液および５ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液で２つの１２％（ｗ／ｖ）アラニン溶液を別々に調製し、無菌ろ過した。
【０１８８】
２％ＡｌＯＨ（または１０ｍｇ／ｍＬアルミニウム）３４３ｍＬにｐＨ７．４の１Ｍトリス緩衝液を７ｍＬ加えることにより１つの水酸化アルミニウムストック溶液を緩衝し、ｐＨ７．４になるまで滴定した。２％ＡｌＯＨ３４８．２５ｍＬにｐＨ７．０の１Ｍ  ＮａＰｉ緩衝液を１．７５ｍＬ加えることにより、第二の水酸化アルミニウムストック溶液を緩衝し、ｐＨ７．０になるまで滴定した。いずれの調製においても緩衝液の添加とそれに続く滴定による希釈効果は確認されなかった。
【０１８９】
アジュバントの調製
５０ｍＬのコニカルチューブに粉末３１．２ｍｇを加え、緩衝液１５．６ｍＬを加えることにより、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４でＧＬＡアジュバントを調製した。間に１０秒間の休止を入れて１０秒間ずつ、計６０秒間、最大電力１５Ｗで混合物を超音波処理した。混濁した２ｍｇ／ｍＬ  ＧＬＡの混合物が得られた。
【０１９０】
ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス緩衝液またはｐＨ７．０の５ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液でＣＰＧ７９０９のストックを調製した。調製の際にはそれぞれ、約２００ｍｇのＣＰＧ７９０９粉末を完全に溶かし最終体積を１０ｍＬにした。両調製とも透明な溶液が得られた。
【０１９１】
ｐＨ７．０の５ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液２５ｍＬにＰＩＰＣの凍結乾燥ケーク５０ｍｇを溶かすことによりＰＩＰＣの２ｍｇ／ｍＬストック溶液を調製した。間に１０秒間の休止を入れて１０秒間ずつ、計６０秒間、最大電力１５Ｗで混合物を超音波処理した。肉眼で見える粒子を含まない透明な溶液が得られた。
【０１９２】
配合するための製剤化の方法
調製した製剤の化学組成物を表１６に示す：
【表２６】
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【０１９３】
表１７に示される緩衝ストック溶液を用いて表１６の製剤配合物を調製した。
【０１９４】
【表２７】
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【０１９５】
全添加剤の配合に用いた添加順序は次の通りであった：水酸化アルミニウム→トレハロース→ＴＷＥＥＮ８０→アラニン→緩衝液→ｒＰＡ→ＣＰＧまたはＧLＡアジュバント。
【０１９６】
凍結乾燥する試料１４〜２０、４０〜４５および７６〜８１には最終体積２０ｍＬを調製した。配合物を２ｍＬのアリコートで１０ｍＬガラスバイアルに分け、凍結乾燥用に確保した。
【０１９７】
凍結乾燥の方法
ＶｉｒＴｉｓ  Ｐｌｕｓ  Ｆｒｅｅｚｅ  Ｄｒｙｅｒを用いて試料を凍結乾燥させた。表１８に記載される通り、７３時間のサイクルを採用し入力した。
【０１９８】
【表２８】
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【０１９９】
データのまとめ
マウス（ｎ＝１０）にＩＰ経路を用いて免疫感作を１回実施し、６種類のワクチン製剤の免疫応答を試験した。免疫感作後第２８日に血清を採取した。投与量レベル＝０．４におけるＴＮＡのデータを実施例３に記載される通りに求め、その結果を表１９にまとめる。
【０２００】
試料ＣＰＧ−ｌｉｑ、ＣＰＧ−ｌｙｏ、ＧＬＡ−ｌｉｑ、ＧＬＡ−ｌｙｏ、ＰＩＰＣ／ＣＰＧ−ｌｉｑおよびＰＩＰＣ／ＣＰＧ−ｌｙｏのＮＦ５０の平均値は、それぞれ５３．６、４８．９、６９．９、６４．７、８９．４および７７．３であることが明らかになった。ＣＰＧ、ＧＬＡおよびＰＩＰＣ／ＣＰＧの液状製剤と凍結乾燥製剤との間にＮＦ５０の平均値の統計学的差はみられなかった。このデータから、他のアジュバントの存在下でも凍結乾燥製剤／工程が免疫原性を維持することが可能であることが示された。
【０２０１】
【表２９】
2015525748.tif 000030
【０２０２】
【表３０】
2015525748.tif 000031
【０２０３】
実施例８：凍結乾燥ｒＰＡワクチンの免疫原性
この実施例では、新鮮な液状ワクチンと、５℃で１か月間保管した凍結乾燥ワクチンおよび５０℃で１か月間保管した同ワクチンとを比較し、またＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．０）で作製したＣＰＧ製剤と、クエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）で作製した製剤とを比較する。
【０２０４】
この試験で評価した製剤は４種類である：
ＮａＰｉ（ｐＨ７．０）のｒＰＡアラム
ＮａＰｉ（ｐＨ７．０）のｒＰＡアラム＋ＣＰＧ
クエン酸（ｐＨ５．５）のｒＰＡアラム＋ＣＰＧ
トリス（ｐＨ７．４）のｒＰＡアラム＋ＧＬＡ
【０２０５】
ストック溶液の調製
３つの６０％トレハロース（ｗ／ｖ）溶液を調製し、１つ目は２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、２つ目は５ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．０）、３つ目は２０ｍＭクエン酸Ｎａ（ｐＨ５．５）で調製した。濃縮したＴｗｅｅｎ８０  １０ｍＬをＤＩ水９０ｍＬに入れてかき混ぜることにより、ポリソルベート８０の１０％（ｖ／ｖ）溶液を調製した。３つの１２％（ｗ／ｖ）アラニン溶液を調製し、１つ目は２０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）、２つ目は５ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液（ｐＨ７．０）、３つ目は２０ｍＭクエン酸Ｎａ（ｐＨ５．５）で調製し、すべて無菌ろ過した。
【０２０６】
１Ｍ緩衝液を２％ＡｌＯＨに加えることにより３つの水酸化アルミニウムストック溶液を緩衝した。得られたストックを所望のｐＨになるまで滴定し、使用する緩衝液と一致させた。いずれの調製においても緩衝液の添加とそれに続く滴定による希釈効果は確認されなかった。
【０２０７】
【表３１】
2015525748.tif 000032
【０２０８】
各製剤を配合した後、実施例７に記載されている凍結乾燥工程を用いて、１バイアル当たり２ｍＬで凍結乾燥させた。
【０２０９】
【表３２】
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【０２１０】
動物モデル
１／１６希釈の上記製剤０．５ｍＬを各動物に投与した。１グループ当たり雌モルモット５匹／雄モルモット５匹（ｎ＝１０）。第０日および第１４日にＩＭ免疫感作を実施した。第１４日、第２８日および第３５日に血液採取を実施した。第２８日のＴＮＡのデータを解析し示した。
【０２１１】
ＮＦ５０のデータ
１２種類の製剤のＮＦ５０および平均値の標準偏差を図２１に示す。
【０２１２】
１２種類の製剤の各マウスの数値を表２１に示す。
【０２１３】
表２１：１２種類の製剤それぞれの各マウスのＮＦ５０およびＬｏｇＮＦ５０。
【表３３】
2015525748.tif 000034
【表３４】
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【０２１４】
ＮＦ５０のデータは４種類の凍結乾燥製剤の優れた安定性を示している。このデータによりほかにも、製剤の頑強性が示された。
【０２１５】
全４種類の製剤では、新たな液状製剤と凍結乾燥製剤（５℃および５０℃で１か月）との間にＮＦ５０の平均値およびＧｅｏｍｅａｎの統計学的差はみられない（表２１を参照されたい）。
【０２１６】
ｒＰＡアラム＋ＣＰＧ製剤では、ＮａＰｉ緩衝液とクエン酸緩衝液との間にＮＦ５０の平均値およびｇｅｏｍｅａｎの統計学的差はみられない（表２１を参照されたい）。
【０２１７】
実施例９：インフルエンザ抗原（１つまたは複数）を用いる製剤
インフルエンザ抗原（１つまたは複数）が存在しｒＰＡ抗原が存在しないことを除いて、ｒＰＡ製剤について本明細書に開示される方法と同様の方法を用いて、インフルエンザ抗原（１つまたは複数）を含有する製剤を製剤化する。
【０２１８】
インフルエンザ抗原を含有する製剤の例を表２０に挙げる。
【０２１９】
【表３５】
2015525748.tif 000036
【０２２０】
２組の製剤を作製し、１つはｐＨ７．０の５ｍＭ  ＮａＰｉ緩衝液またはｐＨ７．４の２０ｍＭトリス緩衝液で作製する。インフルエンザ抗原はインフルエンザ赤血球凝集素である。製剤はほかにも、０．５ｍｇ／ｍＬのＣＰＧ、０．５ｍｇ／ｍＬのＰＩＰＣ、０．１ｍｇ／ＭｌのＧＬＡまたはその組合せなどの別のアジュバントを含有し得る。
【０２２１】
実施例７に記載されている凍結乾燥工程を用いて、各製剤を１バイアル当たり２ｍＬ凍結乾燥させる。
【０２２２】
免疫原性試験、安定性試験および／または有効性試験で各製剤を試験する。
【図１】
2015525748.tif 000037
【図２】
2015525748.tif 000038
【図３】
2015525748.tif 000039
【図４】
2015525748.tif 000040
【図５】
2015525748.tif 000041
【図６】
2015525748.tif 000042
【図７】
2015525748.tif 000043
【図８Ａ−８Ｂ】
2015525748.tif 000044
【図９Ａ−９Ｂ】
2015525748.tif 000045
【図１０Ａ−１０Ｂ】
2015525748.tif 000046
【図１１Ａ−１１Ｂ】
2015525748.tif 000047
【図１２Ａ−１２Ｂ】
2015525748.tif 000048
【図１３Ａ−１３Ｂ】
2015525748.tif 000049
【図１４】
2015525748.tif 000050
【図１５Ａ−１５Ｂ】
2015525748.tif 000051
【図１６Ａ−１６Ｂ】
2015525748.tif 000052
【図１７Ａ−１７Ｄ】
2015525748.tif 000053
【図１８Ａ−１８Ｄ】
2015525748.tif 000054
【図１９Ａ−１９Ｄ】
2015525748.tif 000055
【図２０Ａ−２０Ｄ】
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【図２１】
2015525748.tif 000057
【配列表】
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【国際調査報告】
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