(57)【要約】  ＥＧＦＲｖＩＩＩに基づくペプチドを含み、スプライスジャンクションのグリシンを欠く、ペプチドおよびワクチン組成物が開示される。このワクチンによりＥＧＦＲｖＩＩＩに対する免疫応答を誘導することができる。ＥＧＦｖＩＩＩ腫瘍の形成または成長を阻害する方法、ＥＧＦｖＩＩＩ腫瘍の退縮を誘発する方法、ＥＧＦｖＩＩＩ腫瘍に対して免疫化する方法およびＥＧＦｖＩＩＩ腫瘍を有する対象を治療する方法が開示される。【選択図】なし
2015525785.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体とコンジュゲートしたペプチドを予防有効量または治療有効量含むワクチン組成物であって、式：
Ｌ１−Ｅ２−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ６−Ｎ７−Ｙ８−Ｖ９−Ｖ１０−Ｔ１１−Ｄ１２−Ｈ１３−Ｃ１４−担体
を有し、式中、
Ｌ１は存在しないか、Ｌｅｕであり；
Ｅ２は存在しないか、Ｇｌｕであり；
Ｘａａ６はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｎ７は存在しないか、Ａｓｎであり；
Ｙ８は存在しないか、Ｔｙｒであり；
Ｖ９は存在しないか、Ｖａｌであり；
Ｖ１０は存在しないか、Ｖａｌであり；
Ｔ１１は存在しないか、Ｔｈｒであり；
Ｄ１２は存在しないか、Ａｓｐであり；
Ｈ１３は存在しないか、Ｈｉｓであり；
Ｃ１４はＣｙｓであるか、前記ペプチドと担体とを連結することができる連結部分である、
組成物。
【請求項２】
前記担体がハプテンである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記担体がＫＬＨ、ＢＳＡまたはＨＳＡである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
Ｘａａ６がＡｌａ、ＶａｌまたはＰｒｏである、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
Ｌ１−Ｅ２−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ６−Ｎ７−Ｙ８−Ｖ９−Ｖ１０−Ｔ１１−Ｄ１２−Ｈ１３−Ｃ１４が少なくとも４個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも７個のアミノ酸、少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも９個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１１個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、少なくとも１３個のアミノ酸または少なくとも１４個のアミノ酸を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
前記ペプチドが式
α−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−β
を有し、式中、
αは存在しないか、アシル、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ、ＧｌｕまたはＬｅｕであり；
ＸａａはＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
βは存在しないか、Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（配列番号９）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号１０）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号１１）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１２）；Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（配列番号１３）、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号１４）、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号１５）、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１６）、Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号１７）、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号１８）、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１９）、Ｖａｌ−Ｔｈｒ、Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ、Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号２０）、Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号２１）、Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ａｓｐ、Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＨｉｓまたはＴｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号２２）、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｈｉｓ、Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｈｉｓ−ＣｙｓまたはＣｙｓである、
請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
前記担体とコンジュゲートした前記ペプチドが、ペプチドＡ：ＫＬＨ（配列番号６：ＫＬＨ）、ペプチドＶ：ＫＬＨ（配列番号７：ＫＬＨ）およびペプチドＰ：ＫＬＨ（配列番号８：ＫＬＨ）からなる群より選択される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項９】
無菌で発熱物質を含まない組成物である、請求項１〜８のいずれかに記載のワクチン。
【請求項１０】
ヒト対象における天然のＩＩＩ型変異型ＥＧＦ受容体を有する腫瘍の形成または成長を阻害する方法であって、請求項１〜９のいずれかに記載のワクチンを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１１】
ヒト対象における天然のＩＩＩ型変異型ＥＧＦ受容体を有する現存の腫瘍の退縮を誘発する方法であって、請求項１〜９のいずれかに記載のワクチンを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１２】
ＩＩＩ型変異型ＥＧＦ受容体を発現する腫瘍細胞を含む腫瘍が発現するリスクが高いことが確認されているヒト対象をＩＩＩ型変異型ＥＧＦ受容体を有する腫瘍に対して免疫化する方法であって、請求項１〜９のいずれかに記載のワクチンを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１３】
前記ワクチンが、配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
ＩＩＩ型変異型ＥＧＦ受容体を有する１つまたは複数の腫瘍を有するヒト対象を治療する方法であって、
ａ）ｉ）ＩＩＩ型変異型ＥＧＦ受容体を有する少なくとも１つの腫瘍を除去することおよび／またはｉｉ）治療有効量の放射線を照射することおよび／またはｉｉｉ）治療有効量の１つもしくは複数の抗癌化学療法剤を投与することと、
ｂ）請求項１〜９のいずれかに記載のワクチンを前記対象に投与することと
を含む、方法。
【請求項１５】
ｉ）ＩＩＩ型変異型ＥＧＦ受容体を有する少なくとも１つの腫瘍を除去することと、ｉｉ）治療有効量の放射線を照射することとを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ｉｉｉ）治療有効量の１つまたは複数の化学療法剤を投与することを含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ｉｉｉ）テモゾロミドおよび抗ＥＧＦＲ抗体からなる群より選択される１つまたは複数の抗癌化学療法剤を治療有効量投与することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象から取り出した試料中にＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質またはｍＲＮＡを検出することによって、前記腫瘍がＩＩＩ型変異型ＥＧＦ受容体を発現すると診断することを含む、請求項１４〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記ワクチンが、配列番号６、配列番号７または配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項１４〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍が神経膠腫である、請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
単離ペプチドであって、式
Ｌ１−Ｅ２−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ６−Ｎ７−Ｙ８−Ｖ９−Ｖ１０−Ｔ１１−Ｄ１２−Ｈ１３−Ｃ１４
を有し、式中、
Ｌ１は存在しないか、Ｌｅｕであり；
Ｅ２は存在しないか、Ｇｌｕであり；
Ｘａａ６はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｎ７は存在しないか、Ａｓｎであり；
Ｙ８は存在しないか、Ｔｙｒであり；
Ｖ９は存在しないか、Ｖａｌであり；
Ｖ１０は存在しないか、Ｖａｌであり；
Ｔ１１は存在しないか、Ｔｈｒであり；
Ｄ１２は存在しないか、Ａｓｐであり；
Ｈ１３は存在しないか、Ｈｉｓであり；
Ｃ１４はＣｙｓであるか、前記ペプチドと担体とを連結することができる連結部分である、
単離ペプチド。
【請求項２２】
Ｘａａ６がＡｌａ、ＶａｌまたはＰｒｏである、請求項に記載のペプチド。
【請求項２３】
Ｌ１−Ｅ２−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ６−Ｎ７−Ｙ８−Ｖ９−Ｖ１０−Ｔ１１−Ｄ１２−Ｈ１３−Ｃ１４が少なくとも４個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも７個のアミノ酸、少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも９個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１１個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、少なくとも１３個のアミノ酸または少なくとも１４個のアミノ酸を含む、請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２４】
式
α−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−β
を有し、式中、
αは存在しないか、アシル、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ；Ｇｌｕ；またはＬｅｕであり；
ＸａａはＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
βは存在しないか、Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（配列番号９）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号１０）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号１１）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１２）；Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（配列番号１３）、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号１４）、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号１５）、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１６）、Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号１７）、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号１８）、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１９）、Ｖａｌ−Ｔｈｒ、Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ、Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号２０）、Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号２１）、Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ａｓｐ、Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＨｉｓまたはＴｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号２２）、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｈｉｓ、Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｈｉｓ−ＣｙｓまたはＣｙｓである、
請求項２１に記載のペプチド。
【請求項２５】
配列番号６、配列番号７および配列番号８からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドを含む、請求項２１に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＩＩ型変異型上皮成長因子受容体を発現する癌細胞に対する免疫応答を発生させるのに有用な標的であるペプチドに関する。本発明は、ワクチンならびに抗癌治療およびレジメンにこのワクチンを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は米国国立衛生研究所により授与された契約ＣＡ  １２４８３２の下、政府支援を得てなされたものである。政府は本発明に一定に権利を有する。
【０００３】
本願は、２０１２年８月２日に出願された米国仮特許出願第６１／６７８，８００号の優先権を主張するものであり、上述出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ−１；およびヒトではＨＥＲ１とも呼ばれる）は、上皮成長因子（ＥＧＦ）およびトランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）などの特異的リガンドと結合すると活性化される細胞表面受容体である。正常ＥＧＦ受容体に対応するｃＤＮＡ配列は、非特許文献１に開示されている。
【０００５】
非特許文献２および特許文献１は、ＩＩＩ型変異型ＥＧＦ受容体（以降、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）と呼ばれる変異型ＥＧＦＲを含む５つの悪性神経膠腫において、ＥＧＦＲをコードする遺伝子の再編成または欠失による遺伝子変化を報告しており、この変異型ＥＧＦＲはＥＧＦ受容体ｃＤＮＡのヌクレオチド２７５〜１０７５の間の欠失に対応するＥＧＦＲ遺伝子のスプライスバリアントの翻訳産物であり、この欠失はエキソン２〜７に対応する受容体の細胞外ドメインをコードするコード配列部分の欠失に対応し、その結果、エキソン１とエキソン８が連結する。欠失によって形成されたインフレームスプライスジャンクションは、この２つの配列が連結されているグリシン残基をコードするコドンを含む。このグリシン残基コード配列は、正常ＥＧＦＲ遺伝子の正常エキソン１コード配列または正常エキソン８コード配列の対応する位置にはみられない。ＥＧＦＲｖＩＩＩ欠失により、本来離れた位置にあった配列が融合して、この融合接合部に新規なペプチド配列をコードする変異配列が生じる。
【０００６】
ＥＧＦＲｖＩＩＩはヒト腫瘍に最もよくみられる天然の変異型ＥＧＦＲであり、特に多形神経膠芽腫と呼ばれる脳腫瘍によくみられる。ＥＧＦＲｖＩＩＩは膠芽腫腫瘍の５６％および肺非小細胞癌の１６％に存在することが報告されている。非特許文献３には、ＥＧＦＲｖＩＩＩがほかにも、乳癌の７８％に存在することが明らかになったことが報告されている。したがって、ＥＧＦＲｖＩＩＩは、その配列がいずれの正常組織にもみられなかったことから、理想的な腫瘍標的となる可能性を秘めたものとして認められた。
【０００７】
エキソン１とエキソン８が連結する、エキソン２〜７に対応する欠失は、接合部に新規なグリシンのコドンを生じるインフレーム変化である。生じたＥＧＦＲｖＩＩＩタンパク質のアミノ末端はアミノ酸配列ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨ、配列番号１を特徴とし、配列中、Ｌが成熟タンパク質の１番目のアミノ酸を表し、Ｇがエキソン１とエキソン８との融合の結果である。
【０００８】
これまで、ＥＧＦＲｖＩＩＩ接合部に対応するペプチドを含むワクチンを動物モデルに用いて、ＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現する腫瘍を予防する、またはその退縮を誘発することが行われてきた。このワクチンの製剤化は免疫刺激性分子、ＫＬＨとコンジュゲートしたペプチドＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨＣ、配列番号２（コンジュゲーションの目的で末端システインが付加されている）を用いるものである。直接的な実験的証拠は全く存在しないが、グリシンは新規なものであるため、このペプチドが免疫系に異物として認識されるのに重要な特徴であると考えられた。この特定のペプチド：ＫＬＨコンジュゲートワクチンは現時点で、膠芽腫を対象とする第ＩＩ相臨床試験で使用されており、その平均生存期間は、対応する既存対照が１５か月であるのに対して２６か月であることが示された。
【０００９】
スプライスジャンクションによってコードされるタンパク質配列に基づくペプチドが特許文献２〜９に記載されている。さらに、これらの特許には、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの担体とコンジュゲートしたペプチドおよびそのワクチンとしての使用が開示されている。特許文献１０には、異なるＣ末端を有するＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドが開示されており、全般的にはこのペプチドを癌治療プロトコルの補助療法として使用する方法が開示されている。
【００１０】
非特許文献４には、ＫＬＨとコンジュゲートした配列番号２を有するＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドを含むＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＫＬＨコンジュゲートを用いて膠芽腫の患者を治療する、３つの異なる臨床試験の結果が開示されている。１つの試験では、最初に患者に腫瘍切除を実施した後、放射線療法を実施した。その後、患者から樹状細胞（ＤＣ）を単離し、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＫＬＨコンジュゲートを適用し、自己ＤＣとして患者に再導入した。２つ目の試験では、患者に腫瘍切除を実施した後、放射線療法を実施し、次いで、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＫＬＨコンジュゲートを注射により患者に直接投与した。３つ目の試験では、患者に腫瘍切除を実施した後、放射線療法を実施し、その後、ＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＫＬＨコンジュゲートを注射により患者に直接投与するとともに、テモゾロミド（ＴＭＺ）を用いた化学療法を実施した。各臨床試験では、既存の無増悪期間および全生存期間の統計データに比して無増悪期間および全生存期間の改善が観察された。
【００１１】
現時点でのワクチンは生存期間の有意な延長を示すが、治療的なものではない。患者が、長期間の生存が可能な最善の機会が得られる治療を望んでいるのは明らかである。したがって、生存期間を増大させる改善されたＥＧＦＲｖＩＩＩワクチンを提供することが依然として必要とされている。ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する癌を有すると診断された患者の臨床転帰を改善するのに有用な改善された組成物および治療法が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９０／０４４８９号
【特許文献２】米国特許第６，２２４，８６８号
【特許文献３】米国特許第５，２１２，２９０号
【特許文献４】米国特許第５，４０１，８２８号
【特許文献５】米国特許第５，７１０，０１０号
【特許文献６】米国特許第５，８１４，３１７号
【特許文献７】米国特許第５，９８１，７２５号
【特許文献８】米国特許第６，１２７，１２６号
【特許文献９】米国特許第６，４５５，４９８号
【特許文献１０】Ｓａｍｐｓｏｎら，米国特許出願公開第２００９０２２０５５１
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｕｌｌｒｉｃｈら，Ｎａｔｕｒｅ  １９８４  ３０９，４１８−４２５
【非特許文献２】Ｗｏｎｇら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９２，８９，２９６５−２９６９
【非特許文献３】Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９５，５５，５５３６−５５３９
【非特許文献４】ＨｅｉｍｂｅｒｇｅｒおよびＳａｍｐｓｏｎ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００９  Ａｕｇｕｓｔ；９（８）：１０８７−１０９８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は式：
Ｌ１−Ｅ２−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ６−Ｎ７−Ｙ８−Ｖ９−Ｖ１０−Ｔ１１−Ｄ１２−Ｈ１３−Ｃ１４−担体
を有する、担体とコンジュゲートしたペプチドを予防有効量または治療有効量含む、ワクチン組成物に関するものであり、式中、
Ｌ１は存在しないか、Ｌｅｕであり；
Ｅ２は存在しないか、Ｇｌｕであり；
Ｘａａ６はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｎ７は存在しないか、Ａｓｎであり；
Ｙ８は存在しないか、Ｔｙｒであり；
Ｖ９は存在しないか、Ｖａｌであり；
Ｖ１０は存在しないか、Ｖａｌであり；
Ｔ１１は存在しないか、Ｔｈｒであり；
Ｄ１２は存在しないか、Ａｓｐであり；
Ｈ１３は存在しないか、Ｈｉｓであり；
Ｃ１４はＣｙｓであるか、ペプチドと担体とを連結することができる連結部分である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、Ｘａａ６はＡｌａ，ＶａｌまたはＰｒｏである。いくつかの実施形態では、Ｌ１−Ｅ２−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ６−Ｎ７−Ｙ８−Ｖ９−Ｖ１０−Ｔ１１−Ｄ１２−Ｈ１３−Ｃ１４は少なくとも４個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも７個のアミノ酸、少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも９個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１１個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、少なくとも１３個のアミノ酸または少なくとも１４個のアミノ酸を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明は式：
α−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−β
を有する、担体とコンジュゲートしたペプチドを予防有効量または治療有効量含む、ワクチン組成物を提供し、式中、
αは存在しないか、アシル、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ；Ｇｌｕ；またはＬｅｕであり；
ＸａａはＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
βは存在しないか、Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（配列番号９）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号１０）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号１１）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１２）；Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（配列番号１３）、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号１４）、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号１５）、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１６）、Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号１７）、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号１８）、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１９）、Ｖａｌ−Ｔｈｒ、Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ、Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号２０）、Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号２１）、Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ａｓｐ、Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＨｉｓまたはＴｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号２２）、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｈｉｓ、Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｈｉｓ−ＣｙｓまたはＣｙｓである。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明は、担体とコンジュゲートしたペプチドを予防有効量または治療有効量含み、ペプチドが配列番号６（ペプチドＡ）、配列番号７（ペプチドＶ）および配列番号８（ペプチドＰ）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、ワクチン組成物を提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＫＬＨとコンジュゲートした配列番号６、ＫＬＨとコンジュゲートした配列番号７およびＫＬＨとコンジュゲートした配列番号８からなる群より選択される担体とコンジュゲートしたペプチドを予防有効量または治療有効量含む、ワクチン組成物を提供する。
【００１９】
本発明は、ヒト対象における天然のＩＩＩ型変異型ＥＧＦ受容体を有する腫瘍の形成または成長を阻害する方法をさらに含む。この方法は、本明細書に提供されるワクチンを対象に投与することを含む。
【００２０】
本発明は、ヒト対象における天然のＩＩＩ型変異型ＥＧＦ受容体を有する現存の腫瘍の退縮を誘発する方法をさらに提供する。この方法は、本明細書に提供されるワクチンを対象に投与することを含む。
【００２１】
本発明は、ＩＩＩ型変異型ＥＧＦ受容体を発現する腫瘍細胞を含む腫瘍が発現するリスクが高いことが確認されているヒト対象をＩＩＩ型変異型ＥＧＦ受容体を有する腫瘍に対して免疫化する方法をさらに含む。この方法は、本明細書に提供されるワクチンを対象に投与することを含む。
【００２２】
本発明は、ＩＩＩ型変異型ＥＧＦ受容体を有する１つまたは複数の腫瘍を有するヒト対象を治療する方法をさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、ＩＩＩ型変異型ＥＧＦ受容体を有する少なくとも１つの腫瘍を除去する段階および／または治療有効量の放射線を照射する段階および／または治療有効量の１つもしくは複数の抗癌化学療法剤を投与する段階、さらには本明細書に提供されるワクチンを対象に投与する段階を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、治療有効量の放射線を照射する段階および／または治療有効量の１つまたは複数の抗癌化学療法剤を投与する段階、さらには本明細書に提供されるワクチンを対象に投与する段階の前に、腫瘍を除去しない段階を含む。
【００２３】
本発明はほかにも、本明細書に提供されるワクチンに使用する単離ペプチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】実施例１で考察される実験で得られた生存率の経時的データを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
ＥＧＦＲｖＩＩＩ受容体のスプライスジャンクションに形成されるグリシン残基の置換を含めたＥＧＦＲｖＩＩＩの融合接合部と類似したペプチド配列を含むワクチンが提供される。このワクチンに使用するペプチドは、このペプチドに対して発生する免疫応答が癌細胞に発現するＥＧＦＲｖＩＩＩに交差反応を示す程度にＥＧＦＲｖＩＩＩと類似している。このペプチドは一般に、正常ＥＧＦ受容体では元々離れていた２つの部分の各配列に類似した部分を含む。
【００２６】
ワクチンはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）などのハプテン／担体とコンジュゲートしたペプチドを含むのが好ましい。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ワクチンはＬＥＥＫＫＡＮＹＶＶＴＤＨ（配列番号３）、ＬＥＥＫＫＶＮＹＶＶＴＤＨ（配列番号４）およびＬＥＥＫＫＰＮＹＶＶＴＤＨ（配列番号５）からなる群より選択されるペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドはＣ末端システインを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンはＬＥＥＫＫＡＮＹＶＶＴＤＨＣ（配列番号６）、ＬＥＥＫＫＶＮＹＶＶＴＤＨＣ（配列番号７）およびＬＥＥＫＫＰＮＹＶＶＴＤＨＣ（配列番号８）からなる群より選択されるペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンはＫＬＨと連結したペプチドを含み、ＬＥＥＫＫＡＮＹＶＶＴＤＨＣ：ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニンとコンジュゲートした配列番号６）、ＬＥＥＫＫＶＮＹＶＶＴＤＨＣ：ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニンとコンジュゲートした配列番号７）およびＬＥＥＫＫＰＮＹＶＶＴＤＨＣ：ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニンとコンジュゲートした配列番号８）からなる群より選択される。
【００２８】
このほか、スプライスジャンクションのグリシンの置換を有するＥＧＦＲｖＩＩＩ配列に基づくその他のペプチドをこのワクチンおよび方法に使用してもよい。いくつかの実施形態では、ペプチドは任意選択で例えばＫＬＨ、ＢＳＡまたはＨＡＳなどの担体と連結しており、式：
α−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ−β  式Ｉ
を有し、式中、
αは存在しないか、アシル、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ；Ｇｌｕ；またはＬｅｕであり；
ＸａａはＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
βは存在しないか、Ａｓｎ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（配列番号９）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号１０）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号１１）、Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１２）；Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ（配列番号１３）、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号１４）、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号１５）、Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１６）、Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ（配列番号１７）、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号１８）、Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号１９）、Ｖａｌ−Ｔｈｒ、Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ、Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ（配列番号２０）、Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号２１）、Ｔｈｒ、Ｔｈｒ−Ａｓｐ、Ｔｈｒ−Ａｓｐ−ＨｉｓまたはＴｈｒ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（配列番号２２）、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｈｉｓ、Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ、Ｈｉｓ、Ｈｉｓ−ＣｙｓまたはＣｙｓである。いくつかの実施形態では、担体は、任意選択でＣｙｓなどの末端残基と連結し、存在する場合、担体はハプテンであるのが好ましい。いくつかの実施形態では、担体はＫＬＨ、ＢＳＡまたはＨＳＡである。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ワクチンは任意選択で例えばＫＬＨ、ＢＳＡまたはＨＡＳなどの担体と連結した化合物を含み、式：
Ｌ１−Ｅ２−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ６−Ａ７−Ｙ８−Ｖ９−Ｖ１０−Ｔ１１−Ｄ１２−Ｈ１３−Ｃ１４−担体  式ＩＩ
を有し、式中、
Ｌ１は存在しないか、Ｌｅｕであり；
Ｅ２は存在しないか、Ｇｌｕであり；
Ｘａａ６はＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｉｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり；
Ｎ７は存在しないか、Ａｓｎであり；
Ｙ８は存在しないか、Ｔｙｒであり；
Ｖ９は存在しないか、Ｖａｌであり；
Ｖ１０は存在しないか、Ｖａｌであり；
Ｔ１１は存在しないか、Ｔｈｒであり；
Ｄ１２は存在しないか、Ａｓｐであり；
Ｈ１３は存在しないか、Ｈｉｓであり；
Ｃ１４はＣｙｓであるか、ペプチドと担体とを連結することができる連結部分であり；
担体は任意選択であり、存在する場合、ハプテンであるのが好ましい。いくつかの実施形態では、担体はＫＬＨ、ＢＳＡまたはＨＳＡである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ワクチンのペプチドはＬ１−Ｅ２−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｘａａ６−Ｎ７−Ｙ８−Ｖ９−Ｖ１０−Ｔ１１−Ｄ１２−Ｈ１３−Ｃ１４である式ＩＩを有し、ワクチンは少なくとも４個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも６個のアミノ酸、少なくとも７個のアミノ酸、少なくとも８個のアミノ酸、少なくとも９個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１１個のアミノ酸、少なくとも１２個のアミノ酸、少なくとも１３個のアミノ酸または少なくとも１４個のアミノ酸を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｅ２、Ｎ７、Ｙ８、Ｖ９、Ｖ１０、Ｔ１１、Ｄ１２、Ｈ１３およびＣ１４のうちの２つ以上が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＥ２が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＮ７が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＹ８が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＶ９が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＶ１０が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＴ１１が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＤ１２が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＨ１３が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１およびＣ１４が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｅ２およびＮ７が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｅ２およびＹ８が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｅ２およびＶ９が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｅ２およびＶ１０が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｅ２およびＴ１１が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｅ２およびＤ１２が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｅ２およびＨ１３が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｅ２およびＣ１４が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｎ７およびＹ８が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｎ７およびＶ９が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｎ７およびＶ１０が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｎ７およびＴ１１が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｎ７およびＤ１２が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｎ７およびＨ１３が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｎ７およびＣ１４が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｙ８およびＶ９が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｙ８およびＶ１０が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｙ８およびＴ１１が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｙ８およびＤ１２が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｙ８およびＨ１３が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｙ８およびＣ１４が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｖ９およびＶ１０が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｖ９およびＴ１１が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｖ９およびＤ１２が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｖ９およびＨ１３が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｖ９およびＣ１４が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｖ１０およびＴ１１が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｖ１０およびＤ１２が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｖ１０およびＨ１３が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｖ１０およびＣ１４が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｔ１１およびＤ１２が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｔ１１およびＨ１３が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｔ１１およびＣ１４が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｄ１２およびＨ１３が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｄ１２およびＣ１４が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｈ１３およびＣ１４が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｅ２、Ｎ７、Ｙ８、Ｖ９、Ｖ１０、Ｔ１１、Ｄ１２、Ｈ１３およびＣ１４のうちの３つ以上が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｅ２、Ｎ７、Ｙ８、Ｖ９、Ｖ１０、Ｔ１１、Ｄ１２、Ｈ１３およびＣ１４のうちの４つ以上が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｅ２、Ｎ７、Ｙ８、Ｖ９、Ｖ１０、Ｔ１１、Ｄ１２、Ｈ１３およびＣ１４のうちの５つ以上が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｅ２、Ｎ７、Ｙ８、Ｖ９、Ｖ１０、Ｔ１１、Ｄ１２、Ｈ１３およびＣ１４のうちの６つ以上が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｅ２、Ｎ７、Ｙ８、Ｖ９、Ｖ１０、Ｔ１１、Ｄ１２、Ｈ１３およびＣ１４のうちの７つ以上が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｅ２、Ｎ７、Ｙ８、Ｖ９、Ｖ１０、Ｔ１１、Ｄ１２、Ｈ１３およびＣ１４のうちの８つ以上が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｅ２、Ｎ７、Ｙ８、Ｖ９、Ｖ１０、Ｔ１１、Ｄ１２、Ｈ１３およびＣ１４のうちの９つ以上が存在しない。いくつかの実施形態では、Ｌ１、Ｅ２、Ｎ７、Ｙ８、Ｖ９、Ｖ１０、Ｔ１１、Ｄ１２、Ｈ１３およびＣ１４がそれぞれ存在しない。ＸａａはＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＶａｌであり得る。
【００３２】
ペプチドの製造はよく知られている。当業者に周知の技術を使用し、自動ペプチド合成装置を用いてペプチドを作製することができる。当業者であれば、標準的手法および容易に入手可能な出発物質を用いて、ペプチドまたはペプチドを含むタンパク質をコードする核酸分子を作製して発現ベクター内に挿入することができる。タンパク質のクローニングおよび発現はよく知られており、例えば免疫親和性、電荷またはサイズ排除を用いたその精製も同様によく知られている。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ペプチドを担体と連結させるか、ハプテン化して免疫原性を増大させ得る。いくつかの場合には、ハプテン化は、より大きな分子構造とペプチドとのコンジュゲーションである。ハプテン化はよく知られており、容易に実施することができる。ハプテン化ペプチドの調製に使用するのに適用し得るハプテン化の方法としては、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる以下の米国特許に記載されている方法が挙げられる：１９９１年８月６日、Ｓｔｒａｈｉｌｅｖｉｔｚに対して発行された米国特許第５，０３７，６４５号；１９９２年５月１２日、Ｓｈｉｏｓａｋａらに対して発行された米国特許第５，１１２，６０６号；１９８５年７月２日、Ｓｔｅｖｅｎｓに対して発行された米国特許第４，５２６７１６号；１９８２年５月１１日、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｏｎらに対して発行された米国特許第４，３２９，２８１号；および１９７７年５月１０日、Ｇｒｏｓｓに対して発行された米国特許第４，０２２，８７８号。このほか、ペプチドワクチンおよびペプチドを修飾するのに適用し得るペプチドの免疫原性増強の方法がＦｒａｎｃｉｓら，１９８９，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：６５９−６７６に記載され、参照により本明細書に組み込まれる。Ｓａｄら，１９９２，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｌｏｇｙ  ７６：５９９−６０３が参照により本明細書に組み込まれ、ゴナドトロピン放出ホルモンとジフテリアトキソイドとをコンジュゲートすることによって免疫療法ワクチンを作製する方法が教示されている。ペプチドを同様にコンジュゲートして、本発明の免疫療法ワクチンを作製することができる。ＭａｃＬｅａｎら，１９９３，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３６：２１５−２２．２が参照により本明細書に組み込まれ、本発明の免疫療法ワクチンを作製するのに適用し得る免疫療法ワクチン作製のためのコンジュゲーション法が記載されている。ハプテンは、ペプチドとコンジュゲートし得るキーホールリンペットヘモシアニンである。
【００３４】
ペプチドおよびコンジュゲートペプチドを含む医薬製剤は、当業者によってルーチンで製剤化され得る。適切な医薬製剤および成分については、参照により本明細書に組み込まれるこの分野の標準的参考書、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌに記載されている。いくつかの実施形態では、例えば、ワクチンを薬学的に許容される溶媒とともに溶液、懸濁液、乳濁液または凍結乾燥粉末として製剤化することができる。このような溶媒の例には、水、生理食塩水、リンガー溶液、ブドウ糖溶液および５％ヒト血清アルブミンがある。このほか、リポソームおよび不揮発性油などの非水性溶媒を使用し得る。溶媒または凍結乾燥粉末は、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および安定性（例えば、緩衝剤および保存剤）を維持する添加剤を含有し得る。注射用組成物は希釈剤、例えば滅菌水、電解質／ブドウ糖、植物由来の脂肪油、脂肪酸エステルまたはプロピレングリコールおよびポリエチレングリコールなどのポリオールなどにペプチドまたはコンジュゲートペプチドを含み得る。
【００３５】
ワクチンはほかにも、アジュバントを含み得る。ワクチンに有用なアジュバントは当業者に周知であるため、しかるべきアジュバントの選択は本開示の分野の当業者によってルーチンで実施され得る。有用なアジュバントの例としては、特に限定されないが、フロイント完全アジュバントおよびフロイント不完全アジュバント、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチドおよび油乳剤が挙げられる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ワクチンは無菌で、発熱物質を含まず、等張になるよう製剤化され、粒子状物質を含まない、注射用組成物である。注射用組成物に必要な純度の基準はよく知られており、注射用組成物の調製に用いる作製および精製方法も同様によく知られている。
【００３７】
ワクチンは、体の免疫系に免疫原性物質を提示し認識および免疫原性応答の誘導を可能にする任意の手段によって投与することができる。注射用医薬組成物は非経口的に、すなわち静脈内、皮下、筋肉内に注射することができる。いくつかの実施形態では、医薬ワクチン組成物を鼻腔内に投与するか、舌下投与によって口腔内の組織に投与するか、頬組織に投与し得る。
【００３８】
用量は既知の因子、例えば、特定の薬剤の薬力学的特徴およびその投与方式と経路；被投与者の年齢、健康状態および体重；症状の性質および程度、現在受けている治療の種類、治療の頻度ならびに望まれる効果などによって異なる。防御的または治療的に有効な免疫応答を誘導する量の免疫原を送達する。当業者であれば、範囲および至適用量をルーチンの方法によって容易に決定することができる。
【００３９】
ワクチンを用いて、ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現する腫瘍を治療または予防することができる。ＥＧＦＲｖＩＩＩを発現することが知られている腫瘍のタイプとしては、特に膠芽腫、小児脳腫瘍、肺非小細胞癌、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、頭頸部癌および乳房腫瘍が挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、治療前、患者試料におけるＥＧＦＲｖＩＩＩ発現のｖｉｔｒｏ検出、腫瘍試料もしくは腫瘍細胞を含むその他の試料を含めた患者試料のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングもしくはｉｎ  ｖｉｖｏ検出または患者の癌がＥＧＦＲｖＩＩＩを発現することを示すその他の手段によって、ＥＧＦＲｖＩＩＩ発現を確認し得る。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ワクチンによる治療は、外科的切除術および／または放射線療法および／または抗癌化合物、抗体などによる化学療法を含む包括的な治療プロトコルの一部である。いくつかの実施形態では、切除術の後にワクチンを投与する。いくつかの実施形態では、放射線療法の後にワクチンを投与する。いくつかの実施形態では、化学療法とともにワクチンを投与する。いくつかの実施形態では、テモゾロミドを用いる化学療法とともにワクチンを投与する。いくつかの実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体を用いる化学療法とともにワクチンを投与する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ワクチンをｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に送達した後、これを個体に投与する。いくつかの実施形態では、個体から取り出した細胞をｅｘ  ｖｉｖｏでワクチンで処置し、その個人に再導入する自己細胞療法プロトコルの一部としてワクチンを送達する。細胞療法／ワクチンプロトコルでは、樹状細胞をはじめとする免疫細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで処置して使用し得る。
【００４２】
ワクチンは、培養連続細胞株による抗体作製を可能にする任意の技術を用いて、モノクローナル抗体を含めた抗体を作製するための抗原標的として使用することができる。このような技術は当業者に周知であり、特に限定されないが、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  １９７５，２５６，４９５−４９７により最初に記載されたハイブリドーマ技術、Ｋｏｓｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １９８３，４，７２により記載されているヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術ならびにＣｏｌｅら，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ７７−９６により記載されているＥＢＶハイブリドーマ技術がこれに含まれる。モノクローナル抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体を含めた抗体を調製し、治療剤として使用することができる。
【００４３】
以下に非限定的な実施例を記載して本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００４４】
実施例１
ＥＧＦＲｖＩＩＩワクチンの抗腫瘍効果を向上させる研究を実施した。作製し試験したＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド変異を含むワクチンでは、ワクチン接種後に腫瘍退縮の大幅な増大がみられる。これらのＥＧＦＲｖＩＩＩペプチド変異はスプライスジャンクションのグリシンの置換を含むものであった。
【００４５】
一本鎖組換え抗体と結合したＥＧＦＲｖＩＩＩペプチドの構造研究では、新規なグリシンが抗体と接触しないことが明らかになった（Ｌａｎｄｒｙら，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００１；３０８（５）：８８３−９３）。したがって、このグリシンは免疫認識に不可欠なものではないと考えられる。しかし、このペプチドの構造がグリシンの位置で曲がるものであることから、このアミノ酸がペプチドの柔軟性に重要である可能性も考えられる。
【００４６】
グリシンは免疫認識に不可欠なものではないが、構造に寄与する可能性が考えられるため、グリシンにアミノ酸置換を有するペプチドワクチンを調製して、このような修飾がペプチドワクチンの抗腫瘍効果を増強するかどうかを明らかにした。試験したペプチドは以下のものであった：
ペプチドＡ    ＬＥＥＫＫＡＮＹＶＶＴＤＨＣ（配列番号６）
ペプチドＶ    ＬＥＥＫＫＶＮＹＶＶＴＤＨＣ（配列番号７）
ペプチドＰ    ＬＥＥＫＫＰＮＹＶＶＴＤＨＣ（配列番号８）
Ｇを含まないペプチド    ＬＥＥＫＫＮＹＶＶＴＤＨＣ（配列番号９）
ペプチドＧ    ＬＥＥＫＫＧＮＹＶＶＴＤＨＣ（配列番号２）。
【００４７】
これらのペプチドをＫＬＨとコンジュゲートして以下に挙げるコンジュゲートペプチドワクチンを作製した。
ペプチドＡ：ＫＬＨ
ペプチドＶ：ＫＬＨ
ペプチドＰ：ＫＬＨ
Ｇを含まないペプチド：ＫＬＨ
ペプチドＧ：ＫＬＨ
【００４８】
コンジュゲートペプチドワクチンを腫瘍退縮実験で試験し、コンジュゲートペプチドワクチンまたはＫＬＨ単独のうちの一方で治療した動物の間で生存率の結果を比較した。そのデータを表１に示す。ペプチドＡ：ＫＬＨ、ペプチドＶ：ＫＬＨおよびペプチドＰ：ＫＬＨはそれぞれ、元のコンジュゲートペプチドワクチン、ペプチドＧ：ＫＬＨで観察された生存率よりも高い生存率を示した。Ｇを含まないペプチド：ＫＬＨは、ＫＬＨ単独よりもわずかに効果が高いだけのペプチドＧ：ＫＬＨよりも効果が低かった。
【００４９】
【表１】
2015525785.tif 000003
【００５０】
これらのワクチンはより迅速に作用する、すなわち、より短時間で腫瘍退縮を誘発すると思われる。また、これらはより効果的であると思われる、すなわち、ペプチドＧ：ＫＬＨよりもＧ置換を有するワクチンを用いた方がより多くの動物が退縮を示した。したがって、データは、中央のグリシンが作用に不可欠であると考えられ、これを修飾して優れたワクチンを得ることが可能であることを示している。
【００５１】
上記の実験を再び行い追加実験を実施した。追加実験の終了後、データをまとめて表２に記載し、これには全生存率のデータおよび動物の全個体数が示されている。経時的な生存率を図１に示す。全生存率のデータでは、ペプチドＡ：ＫＬＨ、ペプチドＶ：ＫＬＨおよびペプチドＰ：ＫＬＨをそれぞれ使用することにより、ペプチドＧ：ＫＬＨを使用した場合に比してパーセント生存率が高くなり、ペプチドＧ：ＫＬＨはＫＬＨ単独よりもやや高い効果を示した。
【００５２】
【表２】
2015525785.tif 000004
【００５３】
いずれの実験にも、カルボキシ末端にコンジュゲーションの目的で付加されたシステインを有する、示される配列でペプチドを合成した。次いで、ペプチドをマレイミド活性化キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とｗ／ｗ比１：１で２４時間コンジュゲートさせた。コンジュゲーション後、ペプチド：ＫＬＨコンジュゲートをＰＢＳに対して透析して非コンジュゲートペプチドを除去した。
【００５４】
ＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現するよう操作されたＮＩＨ−３Ｔ３細胞系、ＨＣ２  ２０ｄ２／ｃ細胞を２×１０6個、ＮＩＨ  Ｓｗｉｓｓマウスの右側腹部に皮下接種した。この細胞系はこれまで、ＫＬＨとコンジュゲートした配列番号２に対する抗腫瘍応答を研究するのに使用されてきた（Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：１４１９）。接種後第７日目、フロイント完全アジュバント１００μｌで乳化させたＰＢＳ  １００μｌにコンジュゲートペプチド１００μｇを溶かしたものでマウスを免疫化した。第１４日目、フロイント不完全アジュバント１００μｌで乳化させたＰＢＳ  １００μｌにコンジュゲートペプチド１００μｇを溶かしたものでマウスを免疫化した。
【００５５】
実施例２
新たに診断されたＧＢＭでは、腫瘍のＴ１−ガドリニウム増強部分の少なくとも９５％を切除するのが好ましい。ワクチン接種前、全患者に少なくとも標準的な外照射療法を受けさせるのが好ましい。
【００５６】
自己樹状細胞（ＤＣ）をｅｘ  ｖｉｖｏでワクチンで処置し、次いでワクチン処置したＤＣを患者に再導入することによって、ワクチンを患者に直接投与する。いくつかの実施形態では、ワクチンはペプチドＡ：ＫＬＨ、ペプチドＶ：ＫＬＨまたはペプチドＰ：ＫＬＨである。ワクチンを自己ＤＣに負荷し、これを成熟させて免疫化に使用してもよい。ＤＣ作製の準備には患者に白血球除去を実施して末梢血単核球を入手する。ＤＣにワクチン５００μｇを２時間適用する。ワクチン処置した自己ＤＣを用いて患者にワクチン接種を実施し、この接種では放射線療法終了２週間後に開始し、その後２週間毎に、例えば大腿上部、鼠径靭帯の１０ｃｍ下方にワクチン処置した自己ＤＣを皮内投与する。いくつかの実施形態では、患者にＤＣを注射１回当たり約３×１０7個投与し得る。
【００５７】
ワクチンを患者に直接投与してもよい。いくつかの実施形態では、ワクチンはペプチドＡ：ＫＬＨ、ペプチドＶ：ＫＬＨまたはペプチドＰ：ＫＬＨである。新たに診断されたＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＧＢＭ患者には、ＤＣを伴わず、ワクチンをＧＭ−ＣＳＦで皮内投与して治療を実施し得る。いくつかの実施形態では、標準的な外照射療法終了２週間後、２週間間隔で、ＧＭ−ＣＳＦを含む生理食塩水０．８ｍＬにワクチン５００μｇを溶かしたもので３回、患者にワクチン接種を実施する。その後、ワクチンを月１回で継続し得る。
【００５８】
ワクチンを化学療法と併用して患者に直接投与してもよい。いくつかの実施形態では、ワクチンはペプチドＡ：ＫＬＨ、ペプチドＶ：ＫＬＨまたはペプチドＰ：ＫＬＨである。照射終了後、月１回のサイクルで連日テモゾロミド（ＴＭＺ）と併用してワクチンを投与し得る。ワクチン投与前、患者には、ＴＭＺを併用する標準的な放射線療法とともに、腫瘍体積の９５％超の切除術を受けさせる。新たに診断されたＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性ＧＢＭ患者にワクチンをＧＭ−ＣＳＦで皮内投与することにより治療し得る。ワクチンは、左右交互に大腿上部の鼠径部付近に用量５００μｇでＧＭ−ＣＳＦとともに投与し得る。患者にはＴＭＺを２８日サイクルのうちの５日間、用量２００ｍｇ／ｍ2で、または２８日サイクルのうちの２１日間、用量１００ｍｇ／ｍ2で投与する。いくつかの実施形態では、進行するまで各サイクルの第２１日目に患者にワクチン接種を実施する。最初の３回のワクチンを隔週で投与した後、月１回の注射で投与し得る。
【図１】
2015525785.tif 000005
【配列表】
2015525785000001.app
【国際調査報告】
2015525785.tif 000006
2015525785.tif 000007
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