(57)【要約】  本発明は、中和抗体に対して提示される表面ポリペプチドの無作為な変異体を含む組換えウイルスライブラリーへの結合に基づいた、迅速な免疫原選択のための改良法（ＲＩＳ）に関する。本発明はまた、本発明のＲＩＳ法に従って分離された免疫原の、ウイルスにより引き起こされる疾病を治療するための医薬における使用、および患者の中和抗体を同定するための診断における使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
あるポリペプチドに対する中和抗体を誘発可能な免疫原を同定するための方法であって、
（ｉ）前記ポリペプチドに特異的な中和抗体と、組換えウイルスのライブラリーとを接触させる工程であって、当該組換えウイルスは、それぞれ前記ポリペプチドの変異体をコードする無作為の遺伝子を含んでなり、かつ前記ポリペプチドを発現するものである工程と、
（ｉｉ）前記中和抗体への結合能に基づいて、前記中和抗体に結合する組換えウイルスライブラリーメンバーを、結合しないメンバーから分離する工程と、そして
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において選択された組換えウイルスライブラリーメンバーに見出される変異ポリペプチドの配列をディープシーケンシングによって決定する工程と
を少なくとも含んでなる、方法。
【請求項２】
工程（ｉｉｉ）が、変異ポリペプチドをコードする遺伝子の選択された領域の増幅によって得られたアンプリコンにおいて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中和抗体が固定化されたものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記中和抗体が支持体の表面に直接付着されてなるものである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ライブラリーメンバーの分離が、前記結合したメンバー集団に由来するウイルスの少なくとも一つのポリペプチドを定量することによって判定される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ウイルスポリペプチドが、ウイルスカプシドのポリペプチドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ウイルスがレトロウイルスである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記レトロウイルスがＨＩＶである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記無作為の遺伝子が、ｅｎｖ遺伝子である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ポリペプチドの変異体をコードする遺伝子の選択された領域が、配列番号２によってコードされたポリペプチドの、アミノ酸８６〜２２０の配列、アミノ酸４２６〜５３０の配列、またはアミノ酸５２９〜６４３の配列を含むものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（ｉｉ）で決定されたウイルスカプシドのポリペプチドがｐ２４である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記中和抗体が、４Ｅ１０  ｍＡｂ、２Ｆ５  ｍＡｂ、ｂ１２  ｍＡｂ、２Ｇ１２  ｍＡｂ、およびＰＧ１６  ｍＡｂからなる群より選択される、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスに対する中和抗体を誘発可能なポリペプチドであって、当該ポリペプチドが変異体ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０またはその免疫原性断片を含むものであり、ここで前記変異体ｇｐ１２０またはその免疫原性断片が、配列番号２における位置番号８７、８８、８９、１３１、１３２、１３７、１３８、１６０、１６５、１９１、２２５、４７０、５３８、５７８、および６４７からなる群より選択される位置において少なくとも変異を含むポリペプチドからなる群より選択されるものである、ポリペプチド。
【請求項１４】
前記変異が、Ｅ８７Ｇ、Ｎ８８Ｄ、Ｖ８９Ｌ、Ｃ１３１Ｙ、Ｔ１３２Ｎ、Ｎ１３７Ｄ、Ｄ１３８Ｇ、Ｎ１６０Ｙ、Ｍ１６５Ｌ、Ｎ１９１Ｄ、Ａ２２５Ｖ、Ｅ４７０Ｖ、Ｓ５３８Ｔ、Ｋ５７８Ｍ、およびＹ６４７Ｎからなる群より選択されるものである、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
Ｎ８８Ｄ、Ｃ１３１Ｙ、Ｔ１３２Ｎ、Ｄ１３８Ｇ、Ｎ１６０Ｙ、Ｎ１９１Ｄ、およびＡ２２５Ｖ変異、Ｅ８７ＧおよびＶ８９Ｌ変異、またはＭ１６５Ｌ、Ｓ５３８Ｔ、およびＫ５７８Ｍ変異を含む、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドまたはその免疫原性断片が、配列番号２０〜２８からなる群より選択される配列を含むものである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはその免疫原性断片。
【請求項１７】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する、抗体。
【請求項１８】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１９】
請求項１８に記載のポリヌクレオチドを含んでなる、発現ベクター。
【請求項２０】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、または請求項１９に記載の発現ベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、または請求項１９に記載の発現ベクターを含んでなる、免疫原組成物またはワクチン。
【請求項２２】
医薬において使用するための、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、または請求項１９に記載の発現ベクター、または請求項２１に記載の免疫原組成物またはワクチン。
【請求項２３】
ＨＩＶ感染によって引き起こされる疾病の治療または予防において使用するための、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項１８に記載のポリヌクレオチド、または請求項１９に記載の発現ベクター、または請求項２１に記載の免疫原組成物またはワクチン。
【請求項２４】
特定の病原体に対して特異的な中和抗体を試料中に検出するための方法であって、
（ｉ）前記試料と、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のポリペプチドとを接触させる工程と、そして
（ｉｉ）前記ポリペプチドと前記中和抗体との間の免疫複合体の形成を検出する工程と
を少なくとも含んでなる、方法。
【請求項２５】
被験体のウイルス感染に対する中和抗体の応答を検出するための方法であって、請求項２４に記載の方法を用いて、前記被験体における中和抗体の存在を検出する工程を含んでなり、ここで対照被験体に対する前記被験体における中和抗体の存在が、前記被験体におけるウイルス感染に対する中和抗体の応答を示しているとする、方法。
【請求項２６】
前記ウイルスがＨＩＶであり、前記ポリペプチドが請求項１３〜１６のいずれか一項に記載のｇｐ１２０変異ポリペプチドまたはその断片である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料がＨＩＶ−１に感染した患者に由来するか、または前記試料がＡＩＤＳワクチンレシピエントに由来するものである、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い中和抗体（ｎＡｂ）活性を誘発する、迅速な免疫原選択のための改良法に関する。ｎＡｂ活性が増大したこれらの免疫原については。幾つかの例か開示され、例示されている。特に、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖエピトープに対する抗体への親和性が増大した免疫原について開示されている。
【背景技術】
【０００２】
１９８２年以来、全世界で６０００万人を超える人々がヒト免疫不全ウイルスに感染したと推定される。同期間に、これら感染者のうちの半数近くは、結果として後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）により死亡した。ウイルスの蔓延は最近になって停滞しているようではあるが、２００９年には２５０万人の新たなＨＩＶ感染者が報告された。ＨＩＶはなお、公衆衛生上の主要な問題である。ＵＮＡＩＤＳ，２０１０  Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｇｌｏｂａｌ  ＡＩＤＳ  ｅｐｉｄｅｍｉｃを参照されたい。
【０００３】
ＨＩＶ−１は、これまでに報告された最も遺伝的に多様なウイルス性病原体の一つである。ＨＩＶ−１系統樹には、Ｍ（ｍａｉｎ：主要）、Ｎ（ｎｅｗ：新規）、およびＯ（ｏｕｔｌｉｅｒ：外れ値）の、三つの主要な群がある。最も広範に及ぶのはＭ群ウイルスであり、感染全体の９９％を超える。現在この群は、主に短いｅｎｖ（エンベロープ）遺伝子配列に基づき、９の異なった遺伝的亜型または分枝群（ＡからＫ）に分類される。ＭｃＣｕｔｃｈａｎ  Ｆ，ＡＩＤＳ  ２０００；１４（Ｓ３）：Ｓ３１−Ｓ４４およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００；２８８：５５−５６を参照されたい。
【０００４】
Ｅｎｖは最も変化しやすいＨＩＶ−１遺伝子であり、分枝群間で３５％までの配列多様性、分枝群間で２０％までの配列多様性、かつ一人の感染者において１０％までの配列多様性がある。Ｋｕｉｋｅｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  １９９６；１０：３１−３７およびＳｈａｎｋａｒａｐｐａ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９；７３：１０４８９−１０５０２を参照されたい。分枝群Ｂは、ヨーロッパ、アメリカ、およびオーストラリアで優勢である。Ｋｕｉｋｅｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  １９９６；Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２０００；１５２：８１４−８２２を参照されたい。分枝群Ｃは南アフリカ、中国、およびインドにおいて一般的であり、現在、世界中でその他のどの分枝群よりも多くの感染者がみられる。上記のＭｃＣｕｔｃｈａｎ，２０００を参照されたい。中央および東アフリカでは分枝群ＡおよびＤが顕著である。
【０００５】
しかしながら、共に流行するウイルスとの混合によってしばしば分枝群間での組換えが起こるため、多くのウイルスは分枝群に分類することが困難である。Ｈｅｙｎｄｒｉｃｋｘ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００；７４：３６３−３７０およびＭｃＣｕｔｃｈａｎ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９９；２５４：２２６−２３４を参照されたい。実際に幾つかの組換え型は、組換え型流行株（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆｏｒｍ：ＣＲＦ）と呼ばれる重要な流行系列を生じた。最も一般的なＣＲＦは、タイで発見され、最初は分枝群Ｅとして分類されたが、後にゲノム内のｅｎｖのみが分枝群Ｅであり、その他の部分は分枝群Ａであることが見出されたＣＲＦ０１（ＡＥ）、および西アフリカにおける一般的なＡＧ組換え型であるＣＲＦ０２の二つである。上記のＲｏｂｅｒｔｓｏｎ，２０００を参照されたい。全体的には、分枝群ＡからＤ、ならびにＣＲＦ０１  ＡＥおよびＣＲＦ０２  ＡＧ組換え型が、全世界での感染の９０％を超える。
【０００６】
ウイルスエンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）に対する中和抗体（ｎＡｂ）は、感受性細胞への感染を遮断することにより、ＨＩＶ−１への曝露に対する最初の適応免疫防御となる。Ｋｗｏｎｇ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８；３９３：６４８−６５９，Ｍｏｏｒｅ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９４；６８：４６９−４８４，Ｍｏｏｒｅ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６；７０：１８６３−１８７２、およびＰａｒｒｅｎ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  １９９９；１３：Ｓ１３７−Ｓ１６２を参照されたい。幾つかのウイルスに対するワクチンの有効性は、ｎＡｂの誘発能によるものである。Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；２：７０６−７１３およびＺｉｎｋｅｒａｎｇｅｌ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；７９：１−５３を参照されたい。しかしながら、多くの努力にもかかわらず、有効なＨＩＶ−１免疫原の開発にはあまり進展がみられない。ＭｃＭｉｃｈａｅｌ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００３；９：８７４−８８０，Ｂｕｒｔｏｎ，２００２、および上記のＭｏｏｒｅ，１９９６を参照されたい。これらの免疫原の設計には、より良いｎＡｂ応答を誘導可能なエピトープの同定が必要となる。残念ながら現在のところ、広域ｎＡｂ応答を誘発する免疫原を開発しようとする試みの全ては失敗に終わっている。
【０００７】
次世代の配列決定技術においては、進歩したマイクロフルイディクス、ナノテクノロジー、および画像処理による改良を用いることで、単一の試料から多数のＤＮＡ配列を読み取ることが可能となった。特に４５４社のプラットフォームでは、ヌクレオチドの取り込みと発光二次反応との共役によって、４５０塩基対の長さのＤＮＡ配列が供給可能である。Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００５；４３７：３７６−３８０を参照されたい。光シグナルは後に処理され、配列試料のＤＮＡ配列に相補的なヌクレオチドへと解析される（配列の読み取り）。このように該技術は、ＤＮＡライブラリー、例えばＨＩＶ試料から得られたＤＮＡライブラリーを高解像度で詳細に特徴付けるために用いることができる。標準的なサンガーの配列決定とは対照的に、ディープシーケンシングによって、単一のＨＩＶクローンを個別に特徴付けること、および試料中のＨＩＶ集団の詳細を完全に説明することが可能となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
このように、当該技術分野では、より良いｎＡｂ応答を誘導可能である新規なＨＩＶ−１免疫原が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、Ｂ細胞免疫原として用いた際に高いｎＡｂ活性を誘発可能な免疫原を迅速に選択するための改良法（ＲＩＳ）を指す。本方法は、ｉ）関心のある野生型エピトープの配列をコードするヌクレオチドを無作為に変異させて、前記エピトープの変異体のライブラリーを作製する工程、ｉｉ）野生型エピトープへの親和性をもつことが知られる抗体、またはその一部を用いて、該ライブラリーを試験する工程、ｉｉｉ）抗体の親和性を増大させるエピトープ変異体を選択する工程、およびｉｖ）エピトープ変異体をディープシーケンシング解析へ供する工程を含む。好ましくは、エピトープはＨＩＶエピトープである。さらに好ましくは、エピトープはＥｎｖエピトープである。本発明は、２０１２年２月２４日に提出したＰＣＴ／欧州特許出願第２０１２／０５３１８５号に開示した方法を改良したものである。本発明は、より単純、迅速で、かつさらに効率的なＲＩＳ法を提供する。加えて、ウイルス粒子を捕捉するための抗ＦＣアッセイは必要とされず、変異が高率で同定される。
【００１０】
第２の実施形態によれば、本発明は、改良ＲＩＳ法によって得たヌクレオチド配列およびペプチド、例えば配列番号２０〜２８のヌクレオチド配列に関する。
【００１１】
第３の実施形態によれば、本発明は、関心のある野生型エピトープの作用によって全体的または部分的に誘導される疾病の予防および治療のための、改良ＲＩＳ法によって得たヌクレオチド配列およびペプチドの使用に関する。好ましくは、該疾病はＡＩＤＳ、またはＨＩＶ感染により引き起こされる疾病である。
【００１２】
第４の実施形態によれば、本発明は、改良ＲＩＳ法の診断上の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】本発明の改良ＲＩＳ法を用いて同定した変異体の配列を示した図である。最上部の配列は、ＡＣ１０  ｇｐ１６０ポリペプチドのアミノ酸１２１ないし１６０に対応する。単離したクローン内の対応領域の配列については、ドットで示した部分のアミノ酸はＡＣ１０  ｇｐ１６０のアミノ酸と同じであることを示し、また、対応するアミノ酸で示した位置は、変異体の配列が野生型の配列と異なることを示す。
【図２】４Ｅ１０抗体とＬＲ１−Ｃ１特異的変異体との間の提案される相互作用を示した図である。三つの潜在的なＮ−結合型グリコシル化部位の欠損を含む１１アミノ酸の置換を、ｅｎｖ遺伝子全体にわたって示す。Ｃ１３１Ｙ変異は、この置換がＶ１／Ｖ２ループ構造を破壊するＣ１３１とＣ１５７の間の未変性ジスルフィド結合を排除することから、特に関連性がある（Ｂ）。
【図３】本発明の改良ＲＩＳ法を用いて同定したＬＲ１−Ｃ１ウイルス粒子が、広域中和抗体４Ｅ１０に対して親和性を増大させることを示した図である。グラフは、４Ｅ１０抗体によりコートされたか、または未処理のプレートのいずれかに、量を次第に増加させたＡＣ１０野生型分離株およびＬＲ１−Ｃ１分離株を加えることにより判定した、４Ｅ１０抗体をコートしたプレートへのウイルス粒子結合のタイトレーションを示す。ダイアグラムは４Ｅ１０抗体のＬＲ１−Ｃ１への親和性が、野生型変異体と比較して４倍増加したことを示す。
【図４Ａ】４Ｅ１０抗体による本発明の改良ＲＩＳ法を用いて同定したＬＲ１−Ｃ１ウイルス粒子は、その他の広域中和抗体に対して親和性を増大させないことを示した図である。グラフは、抗体によりコートされたか、または未処理のプレートのいずれかに、量を次第に増加させたＡＣ１０野生型分離株、ＬＲ１−Ｃ１分離株、またｅｎｖ遺伝子に欠失をもつウイルス粒子を加えることにより判定した、２Ｆ５（パネルＡ）、２Ｇ１２（パネルＢ）、またはｂ１２（パネルＣ）抗体をコートしたプレートへのウイルス粒子結合のタイトレーションを示す。
【図４Ｂ】図４ＡパネルＢ参照。
【図４Ｃ】図４ＡパネルＣ参照。
【図５Ａ】配列番号４４のＡＣ１０野生型配列に対するアラインメントを示した図である。配列番号４４はＰＧ１６抗体に対する親和性を有する。改変配列は、潜在的なグリコシル化部位内のｉ）Ｎ２０３Ｓ、およびｇｐ４１免疫優性領域内のｉｉ）Ｇ６０４Ｅの二つの変異を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ参照。
【図６Ａ】Ｅｎｖ遺伝子を配列決定するための増幅の設計を示した図である。三つのアンプリコンを設計したが、そのうちの二つは、関心のあるＥｎｖ遺伝子領域を試験するために重複している。
【図６Ｂ】図６Ａ参照。
【図７Ａ】各アンプリコンおよび試料について得られた配列の品質管理を示した図である。各アンプリコンおよび試料における読み取り数を最初の表に示す。「長さ制御」のグラフは、対応するアンプリコンの長さの分布を、一つの試料に対する３回の増幅によって示す。「混入制御」のグラフは、三つのアンプリコンについて、真の試料ではなく混入物に由来した解析配列を除外するために、潜在的な混入源に対する類似性指数を示す。
【図７Ｂ】図７Ａ参照。
【図７Ｃ】図７Ａ参照。
【図８】配列決定した領域内の各ヌクレオチド位置の多様度を示した図である。横軸に、参照とは異なる各ヌクレオチド位置に対する読み取りのパーセンテージ（％）を示す。
【図９】組換えウイルスライブラリーＬ１Ｌ２Ｌ３および野生型ＡＣ１０ライブラリーの多様度を示した図である。横軸に、参照とは異なる各ヌクレオチド位置に対する読み取りのパーセンテージ（％）を示す。
【図１０】組換えウイルスライブラリーＬ１Ｌ２Ｌ３、および抗体Ｒ１を用いた最初の精製後の組換えウイルスライブラリーであるＬ１Ｌ２Ｌ３Ｒ１に、野生型ＡＣ１０からの多様度の増加が観察されることを示した図である。横軸に、参照とは異なる各ヌクレオチド位置に対する読み取りのパーセンテージ（％）を示す。
【図１１】Ｌ１Ｌ２Ｌ３Ｒ１ライブラリーにおけるアミノ酸変異を示した図である。各変異の位置（位置）、読み取り数（深度）、変異命名法をカラム内に示す。各変異の位置（位置）、前記位置の読み取り数（深度）、参照のＡＣ１０を用いた変異の命名法（変異）、変異を決定するための読み取り数（読み取り）、ライブラリー中の変異の頻度（読み取り＊１００／深度）、この位置に構造的事象がある場合にはその事象（事象、Ｇ＝グリコシル化、Ｃ−Ｃ、ジスルフィド橋）、および変異が既に古典的ＲＩＳ法により見出されたか否かによる状態「予測済」を示す。また、変異が観察されたエンベロープ遺伝子の二次構造も示す。
【図１２Ａ−１】得られた各アンプリコンの全配列を示した図である（Ａ：Ａｍｐ＿１、Ｂ：Ａｍｐ＿３、Ｃ：Ａｍｐ＿４）。各配列において、前のスライドにて観察された変異を対照としてＡＣ１０を用いて示す。
【図１２Ａ−２】図１２−Ａ１参照。
【図１２Ｂ−１】図１２−Ａ１参照。
【図１２Ｂ−２】図１２−Ａ１参照。
【図１２Ｃ−１】図１２−Ａ１参照。
【図１２Ｃ−２】図１２−Ａ１参照。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）を免疫原として最適化するための新規なアプローチを指す。このアプローチは、エピトープがウイルス粒子上へ露出されるに従って抗体を誘発する能力を考慮するものである。該方法は、無作為に変異させたエンベロープタンパク質をもつウイルス粒子のライブラリーに由来する、広域ｎＡｂに対する親和性が増大した変異体の選択に基づく。
【００１５】
本発明によれば、ＰＣＲに基づいた方法によって無作為に変異させたエンベロープのライブラリーを作製するため、ＨＩＶ株ＡＣ１０由来の完全長ｅｎｖ遺伝子を用いた。ｐＮＬ４−３内に構築することによってクローニングを行い、２９３Ｔ細胞内への一過性のトランスフェクションによってウイルス粒子を得た。改良された溶液中ウイルス粒子捕捉アッセイ（ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｉｎ−ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｖｉｒｉｏｎ  ｃａｐｔｕｒｅ  ａｓｓａｙ）により、広域ｎＡｂである４Ｅ１０に対する親和性が増大したウイルスを選択した。捕捉したウイルス集団からＲＮＡを抽出した後、さらなる配列決定を行い、かつｐＮＬ４−３内へ構築して再クローニングするために、逆転写ＰＣＲを行って対応するウイルスからｅｎｖ遺伝子を得た。一回目の選択後、４Ｅ１０抗体への親和性が４倍増加したエンベロープが分離された。
【００１６】
１．一般的な用語および表現に対する定義
本明細書で用いられる用語「ＡＩＤＳ」は、ＨＩＶ感染の症候性の段階を指し、これには後天性免疫不全症候群（一般にＡＩＤＳとして知られる）および「ＡＲＣ」、すなわちＡＩＤＳ関連症候群の両方が含まれる。Ａｄｌｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．１９８７；２９４：１１４５−１１４７を参照されたい。ＡＩＤＳの免疫学的および臨床的症状は当該技術分野において公知であり、これには例えば、免疫不全に起因する日和見感染および癌が含まれる。
【００１７】
本明細書で用いられる用語「アンプリコン」は、ＰＣＲ反応もしくはその他の増幅反応または方法によって増幅された、核酸のような増幅産物を指す。該アンプリコンはいずれのサイズであってもよく、例えば約５０ないし約１００ｂｐ、約１００ｂｐないし約２００ｂｐ、または約２００ｂｐないし約ｌｋｂ、または約５００ｂｐないし約５，０００ｂｐ、または約２，０００ないし約２０，０００ｂｐである。
【００１８】
本明細書で用いられる用語「抗体」は、決められた抗原への結合能を有する少なくとも一つのポリペプチドを含み、かつ免疫グロブリン分子の軽鎖または重鎖可変領域の全部もしくは一部を含む単量体または多量体タンパク質に関する。本発明の抗体としては、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、ダイアボディ、トリボディ、テトラボディ、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片（すなわち抗体の最小機能モジュール）、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖα、Ｖβ、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体）、細胞内抗体、ならびに上記のいずれかのエピトープ結合性断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「含んでなる」、または「含む」は、一般的に許容される特許実務に従い、「からなる」も開示する。
【００２０】
本明細書で用いられる用語「ディープシーケンシング」は、典型的には関心のある領域の複数個のコピーによって関心のある領域を複数回読み取る、配列決定の方法を指す。関心のある領域にわたる個別の配列の読み取り数は「深度」として知られる。例えば１，０００分子を別々に配列決定した場合の深度は１，０００であり、「１，０００倍」または「１，０００×」とも表現され得る。本発明によれば、深度は約２ないし約数１０億の範囲、例えば約１０ないし約１００万、約１０ないし約１，０００万、約１００ないし約１０万、または約１，０００ないし約１００万であってよい。深度は約２よりも大きく、約１０よりも大きく、約１００よりも大きく、約１，０００よりも大きく、約１万よりも大きく、約１０万よりも大きく、約１００万よりも大きく、約１，０００万よりも大きく、約１億よりも大きく、約１０億よりも大きくてよい。典型的なディープシーケンシングプロトコルによれば、核酸（例えばＤＮＡ断片）を反応プラットフォーム（例えばフローセル、マイクロアレイ）の表面に付着させる。付着したＤＮＡ分子はｉｎ  ｓｉｔｕで増幅され、検出可能な標識（例えば蛍光可逆化ターミネーターデオキシリボヌクレオチド）を用いた合成シーケンシング（すなわち合成による配列決定）のための鋳型として用いられる。代表的な可逆化ターミネーターデオキシリボヌクレオチドとしては、それぞれが別々に認識可能かつ除去可能なフルオロフォアで標識され、リンカーを通して任意に付着させた、アデニン、シトシン、グアニン、およびチミンの３’−Ｏ−アジドメチル−２’−デオキシヌクレオシド三リン酸を挙げることができる。蛍光タグを用いる際には、取り込みの各サイクルの後に、取り込まれた塩基の同一性が、フルオロフォアの励起（例えばレーザーにより誘導される励起）および増幅により得られた固定化された二重鎖核酸の画像処理によって決定され得る。フルオロフォア、および任意にリンカーは、当該技術分野において公知の方法によって除去されてよく、これによって３’水酸基は、次のヌクレオチド付加サイクルへと利用可能になる。用語「ディープシーケンシング」に含まれる代表的な技術としては、大量平行シグネチャーシーケンシング（ＭＰＳＳ）、合成によるシーケンシング（ＳＢＳ）、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社のＳＢＳピロシーケンス法、ライゲーション系によるＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社のＳＯＬｉＤシーケンシング、およびＨｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社の１分子合成プラットフォームが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態によれば、ディープシーケンシングは基本的に欧州特許第２３４１１５１号に規定される方法によって行われ、該方法はピロリン酸配列決定技術と組み合わせた２段階のＰＣＲ技術を含む。
【００２１】
本明細書で用いられる用語「誘発する」は、免疫応答活性に対する特異的な制御または影響を指し、これには免疫応答を活性化すること、免疫応答を増大させること、免疫応答を増強すること、または免疫応答を変化させること（すなわちある型の免疫応答を誘発することで、被験者において優勢な免疫応答の型が有害または無効な型から有益または保護的な型へと変化すること）が挙げられる。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「ｅｎｖ遺伝子」は、ＨＩＶのエンベロープタンパク質をコードするウイルスゲノムのポリヌクレオチドを指す。関連する用語「Ｅｎｖポリペプチド」または「エンベロープポリペプチド」はＨＩＶエンベロープタンパク質に由来する分子を指す。ＨＩＶのエンベロープタンパク質は約１６０ｋｄの糖タンパク質（ｇｐｌ６０）である。宿主細胞にウイルスが感染している間、ｇｐｌ６０は宿主細胞プロテアーゼによってｇｐｌ２０と内在性膜膜タンパク質であるｇｐ４１とに切断される。
【００２３】
本明細書で用いられる用語「断片」は、本発明のＨＩＶ−１エンベロープポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特有の部分であって、その長さが親配列よりも短い部分を指す。同様に、用語「断片」は、最長が規定のペプチド配列の全長から１アミノ酸残基を差し引いた長さである、本発明のＨＩＶ−１エンベロープポリペプチド、およびそれをコードするヌクレオチド配列を指す。例えば断片は、５ないし２５００の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含んでよい。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子、またはその他の目的のために用いられる断片は、長さが少なくとも５、１０、１５、１６、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１５０、２５０、５００、もしくは少なくとも７００の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸残基であってよい。断片は、分子の特定の領域から優先的に選択されてよい。例えばポリペプチド断片は、特定の規定配列に示されたポリペプチドの最初の２５０もしくは５００アミノ酸（または最初の２５パーセントもしくは５０パーセント）から選択された、特定の長さの連続するアミノ酸を含んでよい。このような長さは明らかに代表的なものであり、配列リスト、表、および図面を含む明細書によって支持されているどのような長さも、本実施形態に包含され得る。
【００２４】
本明細書で用いられる用語「ｇｐ１２０ポリペプチド」は、Ｅｎｖポリペプチドのｇｐ１２０領域に由来する分子である。成熟ｇｐ１２０野生型ポリペプチドは、その一次配列に約５００アミノ酸を有する。Ｇｐ１２０は重度にＮ−グリコシル化されているため、見かけ上の分子量は１２０ｋＤとなる。ｇｐ１２０のアミノ酸配列はおおよそ５１１アミノ酸である。Ｇｐｌ２０は、５個の可変ドメイン（Ｖｌ−Ｖ５）が挿入された、５個の比較的保存されたドメイン（Ｃ１−Ｃ５）を含む。可変ドメインは、アミノ酸の置換、挿入、および欠失を多数含む。「ｇｐｌ２０ポリペプチド」には単一サブユニットおよび多量体の両方が含まれる。ｇｐ４１部分はウイルス粒子の二重膜に固定されて（かつ二重膜に広がって）いるが、ｇｐｌ２０部分は周囲の環境内へ突出している。ｇｐ１２０の受容体結合ドメインは、タンパク質のＮ−末端側に局在する。この後には、受容体を融合機構へ結合させるヒンジまたはきっかけとして作用することが提唱されているプロリンリッチ領域（ＰＲＲ）が続く。ｇｐ１２０のＣ−末端は高度に保存され、ｇｐ４１と相互作用している。野生型ｇｐ１６０ポリペプチドの代表的な配列が入手可能である。ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＡＷ６４２６１（配列番号１に示すポリヌクレオチドによりコードされたもの）、ＡＡＢ０５６０４、およびＡＡＤ１２１４２を参照されたい。
【００２５】
本明細書で用いられる用語「ＨＩＶ」には、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２ならびにＳＩＶが含まれる。「ＨＩＶ−１」は、１型ヒト免疫不全ウイルスを意味する。ＨＩＶ−１には、細胞外ウイルス粒子およびＨＩＶ−１感染細胞に関連するＨＩＶ−１の形態が含まれるが、これらに限定されない。ＨＩＶ−１ウイルスは、既知の主要な亜型（クラスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）のいずれか、または実験室内の系統や初代分離株が含まれる分類外の亜型（Ｏ群）を意味してよい。「ＨＩＶ−２」は、２型ヒト免疫不全ウイルスを意味する。ＨＩＶ−２には、細胞外ウイルス粒子およびＨＩＶ−２感染細胞に関連するＨＩＶ−２の形態が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いられる用語「ＳＩＶ」は、サル、チンパンジー、およびその他の非ヒト霊長類に感染するＨＩＶ様ウイルスである、サル免疫不全ウイルスを指す。ＳＩＶには、細胞外ウイルス粒子およびＳＩＶ感染細胞に関連するＳＩＶの形態が含まれるが、これらに限定されない。
【００２６】
本明細書で用いられる用語「免疫原」は、個体に適応免疫応答を誘導可能な要素の物質を意味することが意図され、ここで前記適応免疫応答は、該免疫原と免疫学的特色を共有する病原性物質に有意に関連した免疫応答を誘導可能である。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「免疫原性組成物」は、特定の免疫原に対する抗体または細胞を介した免疫応答を発生させる免疫応答を誘発する組成物を指す。注射用組成物は、例えば溶液、懸濁液、およびエマルションとして調製されてよい。用語「抗原性組成物」は、ホストの免疫系によって認識され得る組成物を指す。例えば抗原性の組成物は、ホストの免疫系の液性（例えば抗体）および／または細胞性（例えばＴリンパ球）成分によって認識可能なエピトープを含む。
【００２８】
本明細書で用いられる用語「ライブラリー」は、異なる組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドの混合物の多様なコレクションを指す。本発明の方法において使用するライブラリーの大きさおよび複雑さは様々であり得る。例えば本発明の方法は、５００，０００までの異なるメンバーを含むライブラリー、または１×１０６、１×１０８、もしくはそれ以上のメンバーを含むライブラリーをスクリーニングするために用いることができる。典型的なウイルスライブラリーは、１×１０８ないし１×１０１３のメンバーを含み、このようなライブラリーは本発明の方法を用いたスクリーニングが可能である。実際にこのようなライブラリーは好ましいが、該方法は、さらに小さなライブラリー（例えば１，０００ないし５０，０００、５０ないし１，０００、または１００ないし５００、または１０ないし１００、または５ないし１００のメンバーを含むライブラリー）をスクリーニングするためにも使用可能なことが明らかである。変異体ライブラリーには、変異体をコードする遺伝子に、ＤＮＡトリプレットのレベルで変異を誘発すること、例えば個々のコドンを多様化させること（例えばＰＣＲ反応において部分的な無作為化配列のプライマーを用いることにより）によって多様性をもたせることができる。
【００２９】
本明細書で用いられる用語「中和抗体」は、病原体に結合し、病原体の細胞への感染もしくは被験体に疾病を引き起こす能力を妨げるいずれかの抗体またはその抗原結合性断片である。典型的に、本発明の方法で用いられる中和抗体は病原体の表面に結合して、病原体の感染を、一つまたは複数の前記抗体の不在または陰性コントロールの存在下における病原体の感染に比較して、少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、または１０％阻害するかもしくは減少させる。次に、ｎＡｂが中和活性またはＢＮＡｂ活性を有するか否かについて、本明細書に記載するいずれかの方法を用いて試験することができる。中和抗体またはＢＮＡｂがヒト以外の動物から産生された場合には、ＣＤＲを非ヒトフレーム構造からヒトフレーム構造へ移行させて、ヒトへの投与に適した抗体を産生可能である。抗体がｎＡｂであるか否かを決定するための方法は、当該技術分野において記述されている。Ｌｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５；７９：１０１０８−１０１２５、Ｗｅｉ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２００３；４２２：３０７−３１２、およびＭｏｎｔｅｆｉｏｒｉ  Ｄ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；Ｊａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２：Ｕｎｉｔ  １２．１１を参照されたい。これらの方法は、レポーター遺伝子をコードするウイルスを用いた受容性の細胞株を用いてウイルスを１回感染させた後に、レポーター遺伝子の発現の減少を判定することに基づく。
【００３０】
用語「中和抗体」には、ＢＮＡｂのサブクラスが含まれる。本明細書で用いられる「広域中和抗体」または「ＢＮＡｂ」は、いずれかの方法で得た抗体であって、有効量を送達した際、７株を超えるＨＩＶ、好ましくは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれを超える株のＨＩＶに対して、ＨＩＶ感染またはＡＩＤＳの予防もしくは治療のための薬として使用可能な抗体であることが理解される。
【００３１】
本明細書で用いられる用語（中和抗体またはその誘導体へ）「特異的に結合する」は、結合ペア（例えば２種のタンパク質または化合物）の間の相互作用を指す。幾つかの実施形態によれば、相互作用は、最大１０−６モル／リットル、最大１０−７モル／リットル、または最大１０−８モル／リットルの親和定数を有する。一般に「特異的に結合する」との表現は、一つの化合物の他への特異的な結合を指し、ここでいずれかの標準的なアッセイ（例えば免疫アッセイ）によって測定された結合のレベルは、アッセイのためのバックグラウンドコントロールよりも統計的に有意に大きい。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「ＨＩＶ  ｐ２４」は、約２４，０００ダルトンの、見かけ上の相対的分子量を有することで特徴付けられる、ＨＩＶのｇａｇ領域の遺伝子産物を指す。用語「ＨＩＶ  ｐ２４」はまた、ｐ２４の免疫活性を有する、ｐ２４の改変物および断片も指す。
【００３３】
本明細書で用いられる用語「機能的に連結する」は、関心のあるポリヌクレオチドに対する、プロモーター配列の機能的関係および配置を指す（例えばプロモーターまたはエンハンサーは、これがコード配列の転写に影響する場合、該配列へ機能的に連結する）。一般に、機能的に連結したプロモーターは関心のある配列に隣接する。しかしながらエンハンサーは、関心のある配列の発現を制御するためには、それに隣接している必要はない。
【００３４】
本明細書で互換的に用いられる用語「薬剤的に許容される担体」、「薬剤的に許容される希釈剤」、「薬剤的に許容される賦形剤」、および「薬剤的に許容されるビヒクル」は、無毒の固体、半固体、または液体の注入剤、希釈剤、カプセル用材料、もしくは従来のいずれかの製剤補助剤を指す。薬剤的に許容される担体は、レシピエントに対して用いられる投与量および濃度においては本質的に無毒であり、製剤のその他の成分に適合性である。例えば、酸化剤およびポリペプチドに対して有害であることが知られるその他の化合物は、通常ポリペプチドを含む製剤のための担体には含まれない。適切な担体としては、水、デキストロース、グリセロール、生理食塩水、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。担体には、製剤の有効性を増強する、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または補助剤のような追加の薬剤を含有させることができる。補助剤は例えば、ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ｎｏｒ−ムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６８７、ｎｏｒ−ＭＤＰとも称される）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも称される）、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ−８０（登録商標）エマルション中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、リピドＡを含む、リポ多糖およびその様々な誘導体、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイント不完全アジュバント、メルクアジュバント６５、ポリヌクレオチド（例えばポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、マイコバクテリウム属、結核菌由来のワックスＤ、コリネバクテリウム・パルバム、百日咳菌、およびブルセラ属のファミリーに見出される物質、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＡＬＵＮ、リピドＡ誘導体、コレラ毒素誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチド基質すなわちＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１およびＱＳ−２１、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリＩ：Ｃ、ならびにＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択される。Ｈｕｎｔｅｒ  Ｒ，米国特許第５，５５４，３７２号、およびＪａｇｅｒ  Ｅら、国際公開第１９９７０２８８１６号を参照されたい。
【００３５】
本明細書で用いられる用語「ポリヌクレオチド」は、単量体の変数によって形成されるポリマーを指し、ここで該単量体は、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの両方を包含するヌクレオチドである。ポリヌクレオチドとしては、メチル化によって修飾された単量体および修飾されていない単量体が挙げられる。本発明において、用語「ポリヌクレオチド」および「核酸」は互換的に用いられ、この用語にはｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、および組換えポリヌクレオチドが包含される。本発明で用いられるポリヌクレオチドは天然のポリヌクレオチドに限定されず、非天然のヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドおよびヌクレオチド間結合も包含される。
【００３６】
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は、いずれかの長さのアミノ酸の鎖を指し、ここでは異なるアミノ酸が互いにペプチド結合またはジスルフィド橋によって結合している。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「予防する」、「予防している」、および「予防」は、被験体における疾病の、開始の阻害または出現の減少を指す。予防は完全なものであるか（例えば被験体内における病的細胞の完全な不在）、または部分的であってもよい。予防はまた、病態への感受性の低下も指す。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「レトロウイルス」は、遺伝物質が一本鎖ＲＮＡであり、ホスト内でウイルスＲＮＡをＤＮＡに転写するために逆転写酵素を用いるウイルスの分類を指す。本明細書で意図されるレトロウイルスは、詳細にはレトロウイルス科のファミリーに属し、さらに詳細にはオンコウイルス亜科、レンチウイルス亜科、またはスプマウイルス亜科に属する。本明細書で意図されるレトロウイルスは、病原性のものであってよい。Ｅｎｖ配列は、限定はされないが、ＨＩＶ、ＭｕＬＶ、ＳＭＲＶ、ＳＦＶ、ＨＰＶ、ＭＭＴＶ、ＳＲＶ類、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＢＬＶ、ＢＩＶ、ＳＩＶ、ビスナウイルス、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、およびＥＩＡＶを含むいずれかの既知のレトロウイルス、ならびにいずれかのレトロウイルス亜科（例えばオンコウイルス亜科、レンチウイルス亜科、またはスプマウイルス亜科）由来であってよい。ＨＩＶ−１クローンを含む多くのレトロウイルスクローンが十分に特徴付けられ、利用可能である。
【００３９】
本明細書で用いられる用語「治療する」または「治療」は、疾病の臨床徴候が現れた後で、該疾病の進行を制御するために、本発明の化合物もしくは組成物、またはそれを含む薬剤を投与することを指す。疾病の進行の制御は、有益な、または望ましい臨床的結果を意味するものとして理解され、限定はされないが、症状の減少、疾病期間の短縮、病的状態の安定化（具体的にはさらなる悪化の回避）、疾病の進行の遅延、病的状態の改善および寛解（部分的または全体的の両方における）が挙げられる。疾病の進行の制御は、治療を適用しなかった場合に予想される生存時間に比較した生存時間の延長にも関与する。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「ワクチン」は、霊長類、特にヒトであってよいホストへｉｎ  ｖｉｖｏ投与して、疾病、特にウイルス性の疾病から保護するための免疫原性組成物を指す。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「ウイルス」は、生物の生細胞の内部でのみ複製できる、小さな感染病原体を指す。本発明の方法で使用され得るウイルスファミリーの例としては、アデノウイルス科、アフリカブタ熱様ウイルス、アレナウイルス科、アルテリウイルス、アストロウイルス科、バキュロウイルス科、ビルナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、サーコウイルス科、コロナウイルス科、デルタウイルス、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘペウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科、レオウイルス科、レトロウイルス科、およびラブドウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
２．ＨＩＶ中和抗体の同定方法
第１の態様によれば、本発明はあるポリペプチドに対する中和抗体を誘発可能な免疫原を同定するための方法に関し、該方法は、
（ｉ）前記ポリペプチドに特異的な中和抗体と、組換えウイルスのライブラリーとを接触させる工程であって、当該組換えウイルスは、それぞれ前記ポリペプチドの変異体をコードする無作為の遺伝子を含んでなり、かつ前記ポリペプチドを発現するものである工程と、
（ｉｉ）前記中和抗体への結合能に基づいて、前記中和抗体に結合する組換えウイルスライブラリーメンバーを、結合しないメンバーから分離する工程と、そして
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）において選択された組換えウイルスライブラリーメンバーに見出される変異ポリペプチドの配列をディープシーケンシングによって決定する工程と
を少なくとも含んでなる。
【００４３】
Ａ．接触工程
第１の工程によれば、本発明の方法は、前記ウイルスの表面に提示されるポリペプチドに特異的な中和抗体と組換えウイルスのライブラリーとを接触させることに関与し、ここで前記組換えウイルスはそれぞれがウイルスの表面に提示される前記ポリペプチドの変異体をコードする無作為の遺伝子を含む。
【００４４】
本明細書で分子のライブラリーが参照される場合、この用語は核酸またはタンパク質レベル（すなわちコードされたタンパク質の発現が起こる前および後）におけるこのようなライブラリーを指すものとして使用できる。しかしながらこのような発現ライブラリーは、結合パートナーとの相互作用の発生を選択するため、明らかにタンパク質レベルでなければならない。このように、接触工程（ｉ）を成功させるためには、ライブラリーはタンパク質レベルで存在する必要がある（しかしながら、ライブラリーは最初に核酸レベルで存在し得る）。
【００４５】
好ましい実施形態によれば、工程（ｉ）において用いられる中和抗体に対するポリペプチドはウイルスにおいて発現される。好ましい実施形態によれば、ポリペプチドは「ウイルスの表面上に」提示される。本明細書で用いられる際、この用語は、ウイルス構造を破壊を必要とせずに抗体のような試薬に接触可能な、いずれかのポリペプチドを指す。表面に提示されるポリペプチドは、非エンベロープウイルスについてはカプシドポリペプチド、またエンベロープウイルスについてはエンベロープポリペプチドであってよいことが理解されるであろう。好ましい実施形態によれば、ウイルスの表面に提示されるポリペプチドはエンベロープポリペプチドである。
【００４６】
いずれのウイルスエンベロープタンパク質も、組換えウイルスライブラリーを得るために改変されていてよく、ここで前記組換えウイルスはそれぞれ前記ポリペプチドの変異体をコードする無作為の遺伝子を含む。抗原の実例としては、以下に挙げるものから選択される：インフルエンザウイルスヘマグルチニンヒト呼吸器合胞体ウイルスＧ糖タンパク質、デング熱ウイルスのコアタンパク質、基質タンパク質、またはその他のタンパク質、麻疹ウイルスヘマグルチニン、単純ヘルペスウイルス２型糖タンパク質ｇＢ、ポリオウイルスＩ  ＶＰ１、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−ＩＩのエンベロープもしくはカプシド糖タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原、ジフテリア毒素、ストレプトコッカス  ２４Ｍエピトープ、淋菌ピリン（ｇｏｎｏｃｏｃｃａｌ  ｐｉｌｉｎ）、仮性狂犬病ウイルスｇ５０（ｇｐＤ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩ（ｇｐＢ）、仮性狂犬病ウイルスｇＩＩＩ（ｇｐＣ）、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎糖タンパク質１９５、伝染性胃腸炎基質タンパク質、ブタロタウイルス糖タンパク質３８、ブタパルボウイルスカプシドタンパク質、セルプリナ・ヒオディセンテリア保護抗原、ウシウイルス性下痢糖タンパク質５５、ニューカッスル病ウイルスヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ、ブタインフルエンザヘマグルチニン、ブタインフルエンザノイラミニダーゼ、口蹄疫ウイルス、ブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス糖タンパク質Ｅ、糖タンパク質Ｇ、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｇまたは糖タンパク質Ｉ、ラクロスウイルスの糖タンパク質、新生仔ウシ下痢ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、プンタトロウイルス、マウス白血病ウイルス，  マウス乳癌ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質およびＢ型肝炎ウイルス表面抗原またはそれらの断片もしくは誘導体、ウマインフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼ、ウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｂ、およびウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｄを含む、ウマインフルエンザウイルスまたはウマヘルペスウイルスの抗原、ウシ呼吸器合胞体ウイルスまたはウシパラインフルエンザウイルスの抗原、ウシ呼吸器合胞体ウイルス付着タンパク質（ＢＲＳＶ  Ｇ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス融合タンパク質（ＢＲＳＶ  Ｆ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルスヌクレオカプシドタンパク質（ＢＲＳＶＮ）、ウシパラインフルエンザウイルス３型融合タンパク質、ウシパラインフルエンザウイルス３型ヘマグルチニンノイラミニダーゼ、ならびにウシウイルス性下痢ウイルス糖タンパク質４８および糖タンパク質５３。好ましくは、組換えウイルスのライブラリーはレトロウイルスのライブラリーである。
【００４７】
本明細書で特に意図するものは動物に感染するレトロウイルス、好ましくは温血動物のレトロウイルス、さらに好ましくは脊椎動物のレトロウイルス、なお好ましくは哺乳類のレトロウイルス、さらになお好ましくは霊長類のレトロウイルス、最も好ましくはヒトのレトロウイルスである。本明細書では、限定はされないがＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−１、およびＨＴＬＶ−２を含むヒトレトロウイルスが特に好ましい。ＨＩＶ（およびその他のレトロウイルス）の配列情報の十分に確立されたリポジトリとしては、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ、およびＮＣＢＩが挙げられる。十分に特徴付けられたＨＩＶ−１クローンとしては、ＨＸＣＢ２、ＨＩＶ−１−ＭＮ、およびＨＩＶ−１−ＭＮ−ＳＴ．１が挙げられる。Ｈａｌｌ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．１９９２；６６（９）：５５５３−５５６０を参照されたい。
【００４８】
好ましい実施形態によれば、組換えウイルスのライブラリーは、少なくとも一つのポリペプチドの無作為化から得られたＨＩＶウイルスのライブラリーである。さらになお好ましい実施形態によれば、ＨＩＶライブラリーの異なるメンバーはｅｎｖ遺伝子における無作為化である。
【００４９】
ｅｎｖ遺伝子の無作為化は、ｅｎｖ遺伝子の完全な配列にわたって行われてよいか、または標的細胞上の受容体と相互作用し、かつ中和抗体への結合の最良の候補を構成する分子がｇｐ１２０であることから、好ましくはｇｐ１２０のコード領域に対応するｅｎｖ遺伝子の部分にわたって行われてもよい。さらに、ｇｐ１２０をコードするｅｎｖ遺伝子の領域の無作為化は完全な配列にわたって行われてよいか、またはｇｐ１２０ポリペプチドの１以上のドメインに向けて行われてもよい。このように、本発明のＲＩＳ法は、ｇｐ１２０の保存されたループ（Ｃ１ないしＣ５）のいずれかにおける、ｇｐ１２０の可変ループ（Ｖ１−Ｖ５）のいずれかにおける、または保存領域と可変ループとの好ましい組み合わせにおける無作為化によって得られたＨＩＶライブラリーの使用を企図する。好ましい実施形態によれば、無作為化はｅｎｖ遺伝子全体にわたって行われる。別の実施形態によれば、無作為化はｅｎｖ遺伝子のｇｐ１２０に相当する領域において行われる。別の実施形態によれば、無作為化はｅｎｖ遺伝子のｇｐ１２０のＶ１またはＶ２領域に相当する領域において行われる。
【００５０】
核酸分子内に変異を導入するためには、どのような変異誘発技術も用いることができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳ，１９８９）、Ｂｉｓｈｏｐ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ”（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＧＢ，１９８７）、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ  Ｗ，Ｅｄ．，“Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ，ＵＳ，１９８７）、Ｄａｖｉｓ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，１９８６）、Ｓｃｈｌｅｅｆ  Ｍ，Ｅｄ．，“Ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ”（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，ＤＥ  ２００１）、Ａｄｅｒｅｔｈ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２００５，３８：８６４−８６８、Ａｌｌａｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９５；１８：７４６−７５０、Ｂｕｂｅｃｋ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４，７８：８０２６−８０３５、Ｄｏｒａｎ  Ｂ，米国特許出願公開第２００７０１１１２０１号、Ｌｏｃｈｅｒ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００５；２４：２５６−２６３、Ｖａｓｌ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２００４；３７：７２６−７３０、Ｗｅｉｓｓ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２０００；９７：８９５０−８９５４、およびＤｅｌｃｏｕｒｔ  Ｍ，米国特許第６，９２４，１１２号を参照されたい。変異誘発の戦略としては、ランダム変異誘発、Ａｌａ−スキャニング変異誘発、部位特異的変異誘発、およびキメラ組換えが挙げられる。変異誘発キットおよびサービスは、商業的に広く利用可能である。
【００５１】
本発明のＲＩＳ法における使用に適した中和抗体としては、膜近接外部領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ：ＭＰＥＲ）に対する抗体、ＣＤ４結合部位に対する抗体、および高マンノースグリカンに対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態によれば、本発明のＲＩＳ法における使用のための中和抗体としては、
ａ）ウイルス膜に隣接するｇｐ４１外部ドメインの部分を認識する４Ｅ１０抗体、Ｃａｒｄｏｓｏ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００５；２２：１６３−１７３、ＰＨＳＬ受託番号９０．０９１７０３、ＮＩＨ  ＡＲＲＲＰカタログ番号１００９１、およびＫａｔｉｎｇｅｒ  Ｈら、米国特許第５，７５３，５０３号を参照されたい、
ｂ）ウイルス膜に隣接するｇｐ４１外部ドメインの部分を認識する２Ｆ５抗体、Ｏｆｅｋ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４；７８：１０７２４−１０７３７、ＰＨＳＬ受託番号９０．０９１７０４、ＮＩＨ  ＡＲＲＲＰカタログ番号１４７５、および上記のＫａｔｉｎｇｅｒを参照されたい、
ｃ）欧州特許第０８２２９４１に記載される、ＨＩＶ−１の二つの異なる抗原決定基に結合する抗体であって、該抗原決定基がｇｐ１６０の断片であり、ＨＩＶ−１分離株ＢＨ１０の処理されたｇｐ１２０のアミノ酸配列７９ないし１８４および３２６ないし４００に対応する抗体、ＰＨＳＬ受託番号９５０３２２４０および９５０３２２４１を参照されたい、
ｄ）ｇｐｌ２０の外表面の炭水化物を認識する２Ｇ１２（ｍＡｂ  ２Ｇ１２）、Ｔｒｋｏｌａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６；７０：１１００−１１０８、ＥＡＣＣ受託番号９３０９１５１７、およびＮＩＨ  ＡＲＲＲＰカタログ番号１４７６を参照されたい、
ｅ）ＣＤ４結合部位を認識するｂ１２抗体、Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４；２６６：１０２４−１０２７、ＮＩＨ  ＡＲＲＲＰカタログ番号２６４０、およびＢｕｒｔｏｎ  Ｄら、欧州特許第０６７５９０４号を参照されたい、および
ｆ）中和抗体ＰＧ９、ＰＧ１６、ＰＧ２０、ＰＧＧ１４、およびＰＧＣ１４、国際公開第２０１０１０７９３９を参照されたい、
からなる群より選択される１以上の抗体が挙げられる。
【００５２】
抗体がｎＡｂであるか否かを判定するための方法は、当該技術分野において記載されている。これらの方法の幾つかでは、受容性の細胞株を用いてレポーター遺伝子をコードするウイルスを１回感染させた後に、レポーター遺伝子の発現の減少によって、抗体の効果を判定することに基づく。Ｌｉ，２００５，Ｗｅｉ，２００３，上記のＭｏｎｔｅｆｉｏｒｉ，２００５、およびＡｌｖｉｎ  Ｃ、国際公開第２００９１１７６６１号を参照されたい。
【００５３】
本発明による使用のための抗体の中和能は、ＩＣ５０（すなわち、標的細胞の感染を５０％減少させる抗体の濃度）によって特徴付けられてよい。好ましくは、本発明による使用のための中和抗体のＩＣ５０は２μｇ／ｍｌ以下（０．１５μｇ／ｍＬ未満、０．１２５μｇ／ｍＬ未満、０．１０μｇ／ｍＬ未満、０．０７５μｇ／ｍＬ未満、０．０５μｇ／ｍＬ未満、０．０２５μｇ／ｍＬ未満、０．０２μｇ／ｍＬ未満、０．０１５μｇ／ｍＬ未満、０．０１２５μｇ／ｍＬ未満、０．０１μｇ／ｍＬ未満、０．００７５μｇ／ｍＬ未満、０．００５μｇ／ｍＬ未満、または０．００４μｇ／ｍＬ未満であってよい（抗体濃度は１０−８以下、好ましくは１０−９Ｍ以下、好ましくは１０−１０Ｍ以下、すなわち１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ以下）。このことは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＨＩＶの臨床分離株を５０パーセント中和するために必要とされる抗体の濃度は非常に低いことを意味している。効力は、当該技術分野における標準的な中和アッセイを用いて測定できる。
【００５４】
接触工程は、中和抗体へ特異的に結合できる組換えウイルスのライブラリーメンバーが、実際に前記抗体へ結合するために十分な条件下で行われる。
【００５５】
接触工程の間の条件は、当業者により日常の方法を用いて決定可能である。代表的な「接触」条件は、１５分間ないし４時間（例えば４℃、３７℃、または室温で１時間）のインキュベーションを含んでよい。しかしながら、これらは例えば相互作用する結合パートナーの性質によって適切に変化し得る。試料は、任意にかつ好ましく、穏やかな振盪、混合、または回転に供されてよい。加えて、例えば非特異的結合を減少させるブロッキング剤のような、その他の適切な試薬が添加されてもよい。例えば１〜４パーセントＢＳＡまたはその他の適したブロッキング剤（例えばミルク）が用いられてよい。しかしながら、接触工程は様々であり、スクリーニング法の目的に従って当業者により適合させてよいことが理解されるであろう。例えばインキュベーション温度が例えば室温または３７℃である場合、これは、このような条件下における安定な結合を同定する可能性を高めるであろう（例えば３７℃におけるインキュベーションの場合、結合はヒト体内における条件下で安定なものである）。このような性質は、一つまたは両方の結合パートナーがある種の治療応用（例えば抗体）の候補であった場合、非常に有利であり得る。このような適合は、当業者の範囲内にある。
【００５６】
好ましい実施形態によれば、接触工程において用いられる中和抗体は、特許および科学文献中に十分に記載されている当業者に公知の様々な技術を用いて、固相支持体上に固定化されてよい。固相支持体は、抗体が付着し得る、当業者に公知のどのような材料であってもよい。例えば固相支持体は、マイクロタイタープレートもしくはニトロセルロースフィルター、またはその他の適切な膜において十分に試験されてよい。あるいは、支持体はビーズまたはディスク、例えばガラス、グラスファイバー、ラテックス、またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニルのようなプラスチック材料であってもよい。支持体は磁性粒子または光ファイバーセンサーであってもよい。Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ  Ｒら、米国特許第５，３５９，６８１号を参照されたい。
【００５７】
抗体は、特許および科学文献中に十分に記載されている当業者に公知の様々な技術を用いて、固相支持体上に固定化されてよい。本発明との関連では、固定化には吸着のような非共有結合性の会合および共有結合（抗原と支持体上の官能基の間の直接の結合であってよいか、または架橋剤による結合であってもよい）の両方が含まれる。吸着による固定化は、マイクロタイタープレート内のウェルに対するか、または膜に対するものであることが好ましい。このような場合に、吸着は、適切な緩衝液中の抗体と固相支持体を適切な時間接触させることによって達成され得る。接触時間は温度に依存して変動し得るが、典型的には約１時間から１日の間である。一実施形態によれば、プラスチックマイクロタイタープレートのウェル（例えばポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）と、約１０ｎｇないし約１μｇ、好ましくは約１００〜２００ｎｇの範囲の量の抗体とを接触させることが、適切な量のポリペプチドを固定化するためには十分である。
【００５８】
抗体の固相支持体への共有結合は、最初に支持体と、支持体と抗体上のヒドロキシルまたはアミノ基のような官能基との両方に反応する二官能性試薬とを反応させることによっても達成され得る。例えば抗体は、公知の技術を用いて、ベンゾキノンを用いた適切なポリマー塗膜を有する支持体に対し、または支持体上のアルデヒド基と結合パートナー上のアミンおよび活性水素とを縮合させることにより、共有結合性に付着し得る。
【００５９】
抗体が支持体へ非共有結合性に付着する好ましい実施形態によれば、抗体は該抗体のＦｃ領域に特異的な抗体を用いて固定化されるのではない。
【００６０】
Ｂ．分離工程
第２の工程によれば、本発明の改良ＲＩＳ法は、中和抗体への結合能に基づき、中和抗体に結合する組換えウイルスライブラリーメンバーを、結合しないメンバーから分離することを含む。
【００６１】
前記分離工程は、反応混合物からの固相の物理的な分離（例えばビーズまたはＦＡＣＳによる）もしくは除去を指してよいか、または反応混合物のその他の成分を除去するために固相が１以上の洗浄工程に供される工程を指してもよい。固相の物理的な分離または除去が行われる実施形態によれば、好ましくは該固相は次に１以上の洗浄工程にも供される。
【００６２】
洗浄工程は、固相およびそれに付着する相互結合パートナーの性質に応じた、適切ないずれかのやり方によって行われてよい。粒子状固相を洗浄するための適切な方法は当業者に公知である。例えば固相が粒子状である場合、洗浄工程は、粒子がペレットを形成し、上清を除去するような条件下で、粒子を遠心分離することにより行われてよい。次に、粒子は適切な水性培地（例えば接触工程において用いたものと同じ培地）中に再懸濁されてよい。洗浄のストリンジェンシーは（または実際に接触工程は）、例えばバックグラウンドまたは非特異的結合を減少させるため、当業者に公知の適切な試薬（例えばＴｗｅｅｎ）を加えることによって改変してもよい。このようなペレット化および懸濁の工程は１回の洗浄を構成し得る。いずれかの適切な回数の洗浄を行ってよい。しかしながら固相が磁性であった場合には、洗浄工程は、接触工程を行った容器へ磁場を適用し、上清を除去した後、固相を適切な水性培地に再懸濁することによって好都合に行うことができる。このような磁気による分離および再懸濁の工程は１回の洗浄工程を構成してよく、いずれかの適切な回数の洗浄を行ってよい。固相支持体が粒子状ではない場合（例えばプレート、ディッシュ、またはフィルターのような平面の表面である場合）、再び、このような固相を洗浄するための適切な方法は当業者に公知である。
【００６３】
上記の任意の洗浄工程と同様に、１以上の洗浄工程も、ＲＩＳ法におけるいずれかのその他の適切な段階において行われてよいことが理解されなければならない。例えば固相を洗浄するための１以上の工程は、例えば固相に結合しない中和抗体を除去するため、いずれかの固定化工程を行った後でも行われ得る。実際に、このような洗浄工程は好ましいものである。また１以上の洗浄工程は、例えば結合しなかった物質を除去するため、該方法を行う間のその他の適切な時に、固相に対して行われてもよい。必要な洗浄回数は、当業者によって容易に決定可能である。
【００６４】
中和抗体へ弱く、または非特異的に結合した反応混合物の成分がいったん除去されると、中和抗体へ特異的に結合した組換えウイルスのライブラリーメンバーを溶出することにより、最終的に分離工程が行われる。固定化の種類に応じて、前記溶出工程は、例えば非共有結合を破壊するアルカリ、界面活性剤、または類似の薬剤を用い、その後に中和することで相互作用のパートナーをリフォールディングして互いに結合させる方法のような、いずれかの適切な方法によって行われてよい。ビオチンタグの場合、一般的にこのようなタグを含むライブラリーコンストラクトは、切断のためのある種の部位、例えばプロテアーゼ部位、制限酵素部位、またはジチオスレイトール（ＤＴＴ）によって開裂し得るＳ−Ｓリンカー成分を含むように改変される。ＴＥＡもまた用いられてよい。上記のような切断部位は、溶出を可能にするかまたは促進するため、どのような種類のタグにも用いることができる。
【００６５】
溶出工程の結果としての、中和抗体からのウイルスの放出は、典型的には上清中に存在する１以上のウイルスポリペプチドを測定することによって行うことができる。好ましい実施形態によれば、測定されるポリペプチドはウイルスカプシドポリペプチドである。特にＨＩＶライブラリーが用いられる場合、本明細書に示す実施形態での使用に適し得るＨＩＶタンパク質の例としては、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質ｐ５３、ｐ２４、ｐ１７、ｐ７、ｐ６、ｐ２、およびｐ１、ＨＩＶ  ｅｎｖ糖タンパク質ｇｐ１２０、ｇｐ４１、およびｇｐｌ６０、ＨＩＶ酵素であるインテグラーゼ（ｐ３１）、逆転写酵素（ｐ５１またはｐ６６）、ＲＮａｓｅ  Ｈ（ｐ１５）、およびプロテアーゼ（ｐ１０）、ＨＩＶ  ｎｅｆタンパク質（ｐ２５／ｐ２７）、ＨＩＶ  ｖｉｆタンパク質ｐ２３、ＨＩＶ  ｒｅｖタンパク質ｐ１９、ＨＩＶ  ｖｐｒタンパク質（ｐ１２／ｐ１０）、ＨＩＶ  ｖｐｕタンパク質（ｐ１６）、およびＨＩＶ  ｔａｔタンパク質（ｐ１６／ｐ１４）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態によれば、選択されたウイルスが中和抗体から有効に溶出されたか否かを決定するために測定されるＨＩＶポリペプチドはｐ２４である。
【００６６】
Ｐ２４は酵素免疫測定法により測定可能であるが、結合したｐ２４の検出には、複合体を分離させるための酸による前処置が必要である。製造者によって手順は様々であるが、ＨＩＶ  ｐ２４抗原の試験は、抗体ではなく抗原を検出するために改変されたＥＬＩＳＡ技術を用いる。「抗体サンドイッチ」型のような代表的なアッセイでは、固相（マイクロタイタープレートのウェルまたはポリスチレンビーズ）に付着させたＨＩＶ  ｐ２４に対する特異的なモノクローナル抗体が、添加した試料中のウイルス抗原を「捕捉」するために作用する。ウイルス粒子を破壊するために界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００）が添加され、培地中に抗原が存在する場合には、該抗原は固相上のモノクローナル抗体に付着し得る。
Ｃ．検出工程
第３の工程によれば、本発明の改良ＲＩＳ法は、工程（ｉｉ）において選択されたライブラリーメンバーにおけるウイルスの表面上に示された変異ペプチドまたはペプチドの配列を、ディープシーケンシングによって決定することを含む。
【００６７】
本発明の方法によって、相互作用するウイルスライブラリーメンバーの１以上のセットがいったん選択または分離されると、これらはさらなる分析に供される。前記のさらなる分析または使用は、一般に、結合パートナーの候補を中和抗体から脱離、除去、分離、または溶出した後、さらに発現または産生することを必要とする。このように本発明の方法は、中和抗体と特異的に相互作用可能なウイルスライブラリーの前記メンバーを脱離、除去、溶出、もしくは好ましく分離するか、または前記メンバーを互いに分離して発現もしくは産生する工程をさらに含む。前記のさらなる分析は、一般に、結合したウイルスからＲＮＡを分離し、ウイルスＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、前記ｃＤＮＡを適切な発現ベクター内へクローニングすることによって、相互作用するライブラリーメンバーを個別に分離することに関与する。
【００６８】
結合パートナーをコードするＤＮＡをいったん適切な発現ベクター内にクローン化した後、結合パートナーをコードするＤＮＡの配列を決定してよいか、または可溶型のタンパク質を発現させて適切な結合試験に供し、候補をタンパク質レベルでさらに特徴付けてもよい。適切な結合試験は結合パートナーの性質に依存してよく、該結合試験としてはＥＬＩＳＡ、フィルタースクリーニングアッセイ、ＦＡＣＳまたは免疫蛍光アッセイ、ＢｉａＣｏｒｅ親和性測定法または結合定数を測定するためのその他の方法、組織スライドまたは細胞の染色、およびその他の免疫組織化学法が挙げられるが、これらに限定されない。このような方法は文献中で十分に確立されており、これらのうちの一つ以上が、選択されたエンベロープタンパク質変異体の分析に用いられてよい。
【００６９】
上述のように、相互作用する結合パートナーを個別に分析するために適した方法は、当該技術分野において公知である。好ましい一方法は、中和抗体に特異的に結合するライブラリーのウイルスに由来する遺伝物質の配列を決定することであろう。
【００７０】
典型的には、遺伝物質としてＲＮＡを有するレトロウイルスの場合、検出工程は、ＲＮＡを分離すること、ＲＮＡを逆転写して一本鎖ｃＤＮＡを得ること、一本鎖ＤＮＡを処理して二重鎖ＤＮＡを得ること、および二重鎖ｃＤＮＡを選択したベクター内にクローン化して、該ｃＤＮＡの配列を決定することを含む。
【００７１】
逆転写は、当業者に公知の方法を用い、等温にて、かつＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ、例えば限定はされないがＡＭＶ、クローン化ＡＭＶ、ＭＭＬＶ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ、ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ、Ｔｔｈ逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌の逆転写酵素、またはＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔの存在下で耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを用いることによって行われる。本発明で利用される酵素には、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性が減少したか、実質的に減少したか、または完全に除去された酵素が包含される。「ＲＮａｓｅＨ活性が実質的に減少した」酵素とは、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性が、対応する野生型またはＲＮａｓｅ  Ｈ＋酵素、例えば野生型モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性の、約２０％未満、好ましくは約１５％、１０％、または５％未満、最も好ましくは約２％未満の酵素を意味する。どのような酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性も、様々な公知のアッセイによって決定されてよい。Ｋｏｔｅｗｉｃｚ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８８；１６：２６５−２７７，Ｇｅｒａｒｄ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｃｕｓ  １９９２；１４（５）：９１−９３、およびＫｏｔｅｗｉｃｚ  Ｍら、米国特許第５，２４４，７９７号を参照されたい。本発明での使用に特に好ましいポリペプチドとしては、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＡＶ（ラウス随伴ウイルス）逆転写酵素、ＭＡＶ（骨髄芽球症随伴ウイルス）逆転写酵素、およびＨＩＶ逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されない。Ｋｏｔｅｗｉｃｚ  Ｍら、米国特許第５，２４４，７９７号、およびＧｅｒａｒｄ  Ｇら、国際公開第１９９８０４７９１２号を参照されたい。しかしながら当業者は、リボ核酸分子からＤＮＡ分子を産生できる（すなわち逆転写酵素活性を有する）どのような酵素も、本発明の組成物、方法、およびキットにおいて同じように用いられてよいことを理解するであろう。
【００７２】
当該技術分野において公知のいずれかの方法を用いて一本鎖ｃＤＮＡを処理し、二重鎖ＤＮＡを得ることができる。好ましくは、一本鎖ｃＤＮＡから二重鎖ＤＮＡへの変換は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増幅技術、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、分岐ＤＮＡ技術（ｂＤＮＡ）、リンカー補助ＤＮＡ増幅（ＬＡＤＡ）、Ｑベータレプリカーゼ増幅（Ｑベータ）、ループ媒介性等温増幅（ＬＡＭＰ）、およびローリングサークル増幅技術（ＲＣＡＴ）、またはその他の酵素によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増幅技術を用いて行うことができる。増幅工程は、アダプター領域の配列に対応するプライマーを用いて行うことができる。得られた二重鎖ＤＮＡは、精製カラム、プライマーが付着する電磁気ビーズ、またはアガロースゲルを通す電気泳動を用いて精製可能である。
【００７３】
得られた二重鎖ＤＮＡは次に、選択したベクター内に当該技術分野において公知の方法を用いて挿入されてよい。好ましい実施形態によれば、ＰＣＲ増幅工程の間に用いるプライマーは、その５’領域に、選択したベクター内に存在する制限エンドヌクレアーゼ標的部位に適合する末端を作り出す制限エンドヌクレアーゼ標的部位を含む。エンドヌクレアーゼ標的部位は、適切なベクター内へのポリヌクレオチドのクローニングのために使用できる粘着末端を生成させる。
【００７４】
好ましい実施形態によれば、配列決定は、工程（ｉｉ）において選択されたウイルスライブラリーメンバーから得られたｃＤＮＡの、選択された領域において行われる。このことは、さらにディープシーケンシングに供されるアンプリコンを得るため、これら選択された領域のさらなる増幅を必要とする。そのため、増幅プライマーはアダプター領域の配列に対応して設計される。増幅プライマーにはさらに、４５４社のプラットフォームの手順に記載される標準ライブラリー調製手順に従って、アダプター配列が補充される。最終的なライブラリーの増幅、ライゲーション、および配列決定は、標準的な手順に従って行われる。
【００７５】
さらに好ましい実施形態によれば、ポリペプチドの変異体をコードする遺伝子の選択された領域は、配列番号２のポリペプチドの、アミノ酸８６〜２２０の配列、アミノ酸４２６〜５３０の配列、またはアミノ酸５２９〜６４３の配列を含む。
【００７６】
配列決定工程は、化学的配列決定法（マクサム・ギルバート）、サンガージデオキシ配列決定法、ピロシーケンス、蛍光検出配列決定法、およびマススペクトロメトリーＤＮＡ配列決定法のような公知のいずれかの配列決定法を用いて行うことができる。
【００７７】
工程（ｉｉ）にまたは該方法において選択されたウイルス由来のｃＤＮＡのディープシーケンシングまたは選択された領域由来のアンプリコンのディープシーケンシングにより、配列決定したＤＮＡのそれぞれのヌクレオチド位置における変異率の同定が可能となる。
【００７８】
得られた配列決定データは、配列決定した試料それぞれについて多数の配列を読み取った。データを４５４／ＡＶＡソフトウェアによってさらに処理し、各アンプリコン／試料の組み合わせについて配列データセットを得た。各試料について、これらの配列を、Ｍｏｓａｉｋハイスループットアライナソフトウェアを用いて参照配列に対してバイオインフォマティクス的に整列させ、タンパク質配列に翻訳して、各試料についてアンプリコンサイズのハプロタイプを得、かつウイルス集団内に存在する各ハプロタイプを定量化した。タンパク質ハプロタイプは、Ｍｕｓｃｌｅマルチプルアライナソフトウェアを用いて参照のＡＣ１０タンパク質配列と共にさらに整列させた。このように、ウイルスライブラリー内の各変異率および各ハプロタイプの存在度を特徴付けた。
【００７９】
好ましい実施形態によれば、ディープシーケンシング法は、約５０％、２０％、１０％、５％、または２％未満の頻度で出現するハプロタイプを検出し得る。さらに好ましい実施形態によれば、該方法は、約１％、０．５％、０．２％、または０．０２％の頻度で出現するハプロタイプを検出し得る。検出感度の典型的な範囲は、約０．０１％ないし約１００％、約０．０１％ないし約５０％、約０．０１％ないし約１０％、例えば約０．１％ないし約５％であってよい。
【００８０】
３．免疫原性ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本発明による、改良された迅速な免疫原選択（ＲＩＳ）法は、ウイルス表面に提示されるポリペプチドの変異体であって、中和抗体を産生するための候補であり、かつそれ故に免疫原性組成物またはワクチンとして使用されるポリペプチドの同定を可能にする。このように、別の態様によれば、本発明は本発明の方法によって同定されたポリペプチドに関する。
【００８１】
本発明の方法によって選択されたウイルスがレトロウイルスである特定の場合には、該ポリペプチドはエンベロープタンパク質の変異体である。好ましい実施形態によればレトロウイルスはＨＩＶであり、本発明のポリペプチドはｇｐ１２０変異体である。
【００８２】
本発明の改良ＲＩＳ法によって同定されたポリペプチドは、好ましくはＣ１定常領域、Ｖ１可変領域、Ｖ２可変領域、Ｃ２定常領域、Ｃ５定常領域、およびｇｐ４１外部ドメインからなる群より選択される領域に少なくとも一つの変異を含む。
【００８３】
さらに好ましい実施形態によれば、Ｃ１定常領域の変異は、位置８７における変異である。さらに好ましい実施形態によれば、位置８７における変異した残基はＧｌｕである。さらになお好ましい実施形態によれば、Ｃ１定常領域の変異は、Ｅ８７Ｇ変異である。
【００８４】
さらに好ましい実施形態によれば、Ｃ１定常領域の変異は、位置８８における変異である。さらに好ましい実施形態によれば、位置８８における変異した残基はＡｓｎである。さらになお好ましい実施形態によれば、Ｃ１定常領域の変異は、Ｎ８８Ｄ変異である。
【００８５】
さらに好ましい実施形態によれば、Ｃ１定常領域の変異は、位置８９における変異である。さらに好ましい実施形態によれば、位置８９における変異した残基はＶａｌである。さらになお好ましい実施形態によれば、Ｃ１定常領域の変異は、Ｖ８９Ｌ変異である。
【００８６】
さらに好ましい実施形態によれば、Ｖ１可変領域の変異は、位置１３１、１３２、１３７、および１３８からなる群より選択される１以上の位置における変異である。さらに好ましい実施形態によれば、Ｖ１領域の位置１３１、１３２、１３７、および１３８における変異した残基はそれぞれＣ、Ｔ、Ｎ、またはＤである。さらになお好ましい実施形態によれば、Ｖ１可変領域の変異は、Ｃ１３１Ｙ、Ｔ１３２Ｎ、Ｎ１３７Ｄ、および／またはまたはＤ１３８Ｇである。
【００８７】
さらに好ましい実施形態によれば、Ｖ２可変領域の変異は、位置１６０、１６５、および１９１からなる群より選択される１以上の位置における変異である。さらに好ましい実施形態によれば、Ｖ２領域の変異した残基は位置１６０のＮ、位置１６５のＭ、または位置１９１のＮである。さらになお好ましい実施形態によれば、Ｖ２可変領域の変異は、Ｎ１６０Ｙ、Ｍ１６５Ｙ、および／またはＮ１９１Ｄである。
【００８８】
さらに好ましい実施形態によれば、Ｃ２定常領域の変異は、位置２２５における変異である。さらに好ましい実施形態によれば、Ｃ２領域の位置２２５における変異した残基はＡｌａである。さらになお好ましい実施形態によれば、Ｃ２領域の変異は、Ａ２２５Ｖである。
【００８９】
さらに好ましい実施形態によれば、該変異は、位置４７０における変異である。さらに好ましい実施形態によれば、位置４７０における変異した残基はＧｌｕである。さらになお好ましい実施形態によれば、該変異はＥ４７０Ｖである。
【００９０】
さらに好ましい実施形態によれば、該変異は、位置５３８における変異である。さらに好ましい実施形態によれば、位置５３８における変異した残基はＳｅｒである。さらになお好ましい実施形態によれば、該変異はＳ５３８Ｔである。
【００９１】
さらに好ましい実施形態によれば、該変異は、位置５７８における変異である。さらに好ましい実施形態によれば、位置５７８における変異した残基はＬｙｓである。さらになお好ましい実施形態によれば、該変異はＫ５７８Ｍである。
【００９２】
さらに好ましい実施形態によれば、該変異は、位置６４７における変異である。さらに好ましい実施形態によれば、位置６４７における変異した残基はＴｙｒである。さらになお好ましい実施形態によれば、該変異はＹ６４７Ｎである。
【００９３】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明の変異体に従ったｇｐ１２０変異体またはその断片は、Ｎ８８Ｄ、Ｃ１３１Ｙ、Ｔ１３２Ｎ、Ｄ１３８Ｇ、Ｎ１６０Ｙ、Ｎ１９１Ｄ、およびＡ２２５Ｖ変異を有する。
【００９４】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明の変異体に従ったｇｐ１２０変異体またはその断片は、Ｅ８７ＧおよびＶ８９Ｌ変異を有する。
【００９５】
さらに好ましい実施形態によれば、本発明の変異体に従ったｇｐ１２０変異体またはその断片は、Ｍ１６５Ｌ、Ｓ５３８Ｔ、およびＫ５７８Ｍ変異を有する。
【００９６】
好ましい実施形態によれば、本発明の免疫原性ｇｐ１２０変異体またはその断片は、配列番号２０〜２８からなる群より選択される配列を含む。
【００９７】
本明細書で決定した、中和抗体に対する親和性の増大したｇｐ１２０変異体は、ＡＣ１０  ＨＩＶ分離株（ＮＣＢＩ受託番号ＡＹ８３５４４６および配列番号１に示すｅｎｖ遺伝子）由来であるが、本発明の免疫原性ポリペプチドは、その他のＨＩＶ分離株のｅｎｖ遺伝子内の対応する位置の置換により、前記のその他のＨＩＶ分離株に由来し得ることが理解されるであろう。その他のＨＩＶ分離株内の対応する位置は、いずれかの適した配列アラインメントアルゴリズムを用いることによって容易に決定できる。
【００９８】
配列を比較するためのアラインメント法は、当該技術分野において公知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎローカル相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ相同性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ−Ｌｉｐｍａｎ類似性探索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行、または用手でのアラインメントおよび目視での検査によって実行できる。Ｓｍｉｔｈ  Ｔ，Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ｍ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８１；２：４８２−４８９；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｓ，Ｗｕｎｓｃｈ  Ｃ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０；４８：４４３−４５３；Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ，Ｌｉｐｍａｎ  Ｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８；８５：２４４４−２４４８；ｔｈｅ  ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ  ａｎｄ  ＴＦＡＳＴＡ  ｐｒｏｇｒａｍｓ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ；Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，“Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，２００２）を参照されたい。
【００９９】
本開示は、ＨＩＶ−１の抗原性ｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸コンストラクトに関する。これらのポリヌクレオチドとしては、関心のあるポリペプチドをコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡ、およびＲＮＡ配列が挙げられる。
【０１００】
本発明の核酸の操作およびベクター内への挿入方法は、当該技術分野において公知である。上記のＳａｍｂｒｏｏｋ，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ，２００２を参照されたい。典型的には、本発明のｇｐ１２０ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトはプラスミドである。しかしながら、その他のベクター（例えばウイルスベクター、ファージ、コスミド）もまた、核酸を複製するために用いてよい。本発明との関連では、典型的な核酸コンストラクトは、挿入した遺伝配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含む発現ベクターである。発現ベクターは、典型的には複製開始点、プロモーター、および形質転換した細胞の表現型の選択を可能にする特定の核酸配列を含む。
【０１０１】
さらに一般的には、本発明のｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、宿主細胞へ導入した後の核酸を発現することが可能な、いずれかのプロモーターまたはエンハンサーへ機能的に連結されてよい。プロモーターは、核酸の転写を導く核酸制御配列が並んだものである。プロモーターには、例えばポリメラーゼＩＩ型のプロモーターの場合のように、転写開始部位の近傍の（近傍にあってよい）必要な核酸配列が含まれる（ＴＡＴＡエレメント）。プロモーターには、転写開始部位から数千塩基対離れて位置し得る遠位エンハンサーまたは抑制エレメントも含まれ得る。恒常性および誘導性プロモーターが含まれる。Ｂｉｔｔｅｒ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７；１５３：５１６−５４４を参照されたい。
【０１０２】
このような核酸コンストラクトを産生するために、ｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列が、プラスミド発現ベクターのような適切な発現ベクター内へ挿入される。ｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を産生するための手順およびそれらをｉｎ  ｖｉｔｒｏで操作するための手順は当業者に公知である。上記のＳａｍｂｒｏｏｋ，１９８９およびＡｕｓｕｂｅｌ，２００２を参照されたい。
【０１０３】
免疫原性ｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を挿入可能な発現ベクターとしては、配列の挿入または取り込みが可能となるように操作でき、かつ原核生物または真核生物内に発現できるプラスミド、ウイルス、またはその他の媒体が挙げられるが、これらに限定されない。ホストとしては、微生物、酵母、昆虫、および哺乳類の生物が挙げられる。真核生物またはウイルスの配列を有するＤＮＡ配列を原核生物内に発現するための方法は、当該技術分野において公知である。ホストにおける発現および複製が可能な、生物学的に機能性のウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは、当該技術分野において公知である。
【０１０４】
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に公知の従来技術によって行うことができる。ホストが原核生物、例えばＥ．ｃｏｌｉである場合、ＤＮＡの取り込みが可能なコンピテント細胞は、指数関数的増殖期後に収集した後にＣａＣｌ２法によって処理した細胞から、当該技術分野において公知の手順を用いて調製できる。あるいは、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを使用してもよい。所望により、形質転換は宿主細胞のプロトプラスト形成後に行ってもよいか、またはエレクトロポレーションによって行ってもよい。
【０１０５】
ホストが真核生物の場合、このようなＤＮＡのトランスフェクション法としては、リン酸カルシウム共沈殿法、従来の機械的手順、例えば微量注入法、エレクトロポレーション法、リポソームに包まれたプラスミド、またはウイルスベクターの挿入法を用いることができる。真核細胞はまた、免疫原性ｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子のような選択的表現型をコードする第２の外来性ＤＮＡ分子とを共形質転換することもできる。別の方法では、サルウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルスのような真核生物に対するウイルスベクターを用いて、真核細胞を一過性に感染させるかまたは形質転換させた後、タンパク質を発現させる。Ｇｌｕｚｍａｎ  Ｙ，Ｅｄ．，“Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ”（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳ，１９８２）を参照されたい。
【０１０６】
４．抗体
本発明のｇｐ１２０変異体およびその断片は、ＨＩＶウイルスまたはその粒子が被験体の体液中に存在する場合、これを認識し、かつ中和可能な抗体を産生するために用いることもできる。このように別の態様によれば、本発明は、本発明の免疫原性ポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。幾つかの実施形態によれば、抗体はモノクローナル抗体である。その他の実施形態によれば、抗体はＶＨおよびＶＬ領域を含むＦｖ断片である。
【０１０７】
これらの抗体は、本発明のペプチドを用いる従来法によって産生され得る。Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ  Ｔら、国際公開第１９９１００４２７３号を参照されたい。例えばポリクローナル抗体は、上で同定したペプチドの一つかもしくは両方によって、またはそれに対する自然抗体を免疫系に産生させることが可能な多価コンストラクトによって選択した動物の免疫系を従来法で刺激した後、これらの抗体を動物の血液またはその他の体液から回収することによって産生され得る。高力価のポリクローナル抗体は、上記の多価コンストラクトを抗原として用いることによって取得され得る。得られた抗体は、それらが感染被験体の体液中に出現することから、選択されたＨＴＶ抗原に結合することが可能である。
【０１０８】
加えて、本発明のペプチドは、ペプチド配列内に含まれる中和エピトープ構造の内部イメージを有する抗イディオタイプ抗体を産生するための鋳型として用いることのできる抗体の産生にも用いられ得る。ポリクローナルまたはモノクローナルであるこれらの抗体は、次にワクチン製剤または能動免疫療法に用いることができる。従って本発明には、ペプチドの内部イメージを有するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、およびこれらの抗体を産生するための方法も含まれる。上記のＫｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓを参照されたい。
【０１０９】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を取得して、本発明の組成物および方法に使用することが望ましい場合には、入手可能な腫瘍細胞株を用い、公知の従来技術によって望ましいＭＡｂを発現するハイブリドーマ細胞株を産生してもよい。Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９７５；２５６（５５１７）：４９５−４９７を参照されたい。
【０１１０】
組換え抗体は、それらの産生のための公知の技術を用いて産生され得る。Ｈｕｓｅ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９；２４６：１２７５−１２８１を参照されたい。望ましい高力価抗体は、これらの抗原に対して発生させたモノクローナルまたはポリクローナル抗体に対し、公知の組換え技術を応用することによっても産生され得る。Ａｍｉｔ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３３：７４７−７５３，Ｑｕｅｅｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８；８６：１００２９−１００３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８；３３２：３２３−３２７、およびＢａｒｂａｓ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９２；８９：４４５７−４４６１、ならびにＷｉｎｔｅｒ  Ｐ、英国特許第２１８８６３８号を参照されたい。
【０１１１】
５．中和抗体を産生可能な免疫原性組成物
本明細書に開示されるｇｐ１２０変異ポリペプチドおよびｇｐ１２０変異ポリペプチドをコードする核酸分子は、ｇｐ１２０またはｇｐ１２０を発現するウイルスに対する免疫原として、または免疫応答を誘発する免疫原（免疫原性組成物）を産生するために用いられ、例えばＨＩＶ−１感染またはそれに関連する症状を阻止、減少、または制御する。治療上有効な量の開示する治療用組成物を投与した後、被験体はＨＩＶ−１感染、ＨＩＶ−１感染に付随する症状、またはその両方についてモニターされる。このように別の態様によれば、本発明は、本発明のＨＩＶ−１  ｇｐ１２０変異ポリペプチドもしくはその免疫原性断片、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、を含む免疫原性組成物に関する。
【０１１２】
免疫原性組成物における使用に適したｇｐ１２０の適切な免疫原性断片としては、比較的短いペプチド、例えば長さが約５ないし１００アミノ酸、例えば約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００アミノ酸であるペプチドが挙げられる。このように、ｇｐ１２０ポリペプチドの断片（例えばエピトープまたはその他の抗原性断片）、例えば本明細書に記載されるいずれかのｇｐ１２０ポリペプチドまたはその断片が免疫原として用いられてよい。
【０１１３】
本発明の免疫原性組成物は、ＨＩＶ感染により引き起こされる疾病の治療または予防に有用である。さらなる態様によれば、本発明は、ＨＩＶ−１の感染によってもたらされる疾病の治療または予防における使用のための本発明のペプチド、核酸、ベクター、免疫原性組成物、またはワクチンに関する。あるいは本発明は、ＨＩＶ−１の感染によってもたらされる疾病を治療または予防する薬剤を製造するための、本発明のペプチド、核酸、ベクター、免疫原性組成物、またはワクチンの使用に関する。あるいは本発明は、ＨＩＶ−１の感染によってもたらされる疾病の被験体を治療または予防するための方法に関し、該方法は、前記被験体へ、本発明のペプチド、核酸、ベクター、または免疫原性組成物もしくはワクチンを投与することを含む。好ましい実施形態によれば、治療との用語は予防的治療（すなわち、本明細書で定義される病態、疾患、または状態への感受性を低下させるための治療法）に関する。
【０１１４】
本発明の免疫原性組成物は、薬剤的に許容される担体をさらに含んでもよい。
【０１１５】
本発明の変異ｇｐ１２０ポリペプチドは、抗原分子が結合できる免疫原性高分子である担体へ共有結合できる。担体へ結合した際、結合したポリペプチドはさらに免疫原性となる。担体は、結合した分子の免疫原性を増大させるか、または診断上、分析上、または治療上有益な、担体に対する抗体に高い力価を誘発するように選択される。分子が担体へ共有結合すると、免疫原性は増大し、かつＴ細胞依存性となり得る。Ｐｏｚｓｇａｙ  Ｖ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １９９９；９６：５１９４−５１９７，Ｌｅｅ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６；１１６：１７１１−１７１８、およびＤｉｎｔｚｉｓ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １９７６；７３：３６７１−３６７５を参照されたい。有益な担体としては、天然物質（例えば細菌またはウイルス由来の多糖類、ポリペプチド、またはタンパク質）、および反応成分が結合できる１以上の官能基を有する半合成または合成物質であってよい、重合体担体が挙げられる。細菌性産物およびウイルスタンパク質（例えばＢ型肝炎表面抗原およびコア抗原）、ならびに高等生物由来のタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、カブトガニヘモシアニン、エデスチン、哺乳類の血清アルブミン、および哺乳類の免疫グロブリンもまた担体として使用できる。担体として使用するためのさらなる細菌性産物としては、細胞壁タンパク質およびその他の産物（例えば連鎖球菌またはブドウ球菌の細胞壁およびリポ多糖（ＬＰＳ）が挙げられる。
【０１１６】
本発明はさらに、ＨＩＶ感染に関連する症状を予防するか、または減少させることに関する。これらの症状としては、ＨＩＶ感染の軽度の症候性段階に関連する症状、例えば、帯状疱疹、皮膚発疹および爪感染、口内炎、鼻および喉の反復性の感染、ならびに体重減少が挙げられる。加えて、ＨＩＶ感染の主要な症候性段階に関連するさらなる症状として、例えば、口腔および膣鵞口瘡（カンジダ）、持続性の下痢、体重減少、持続性の咳、結核の再活動化、および口唇ヘルペス（単純ヘルペス）のような反復性のヘルペス感染も挙げられる。本発明に従って治療可能な末期ＡＩＤＳの症状としては、例えば、下痢、悪心および嘔吐、鵞口瘡および口唇ヘルペス、持続性かつ反復性の膣感染症および子宮頸癌、持続性全身性リンパ節腫脹（ＰＧＬ）、重度の皮膚感染症、いぼおよび白癬、呼吸器感染症、肺炎、特にニューモシスチス・カリニ肺炎（ＰＣＰ）、帯状疱疹（ｈｅｒｐｅｓ  ｚｏｓｔｅｒ）（すなわち帯状疱疹（ｓｈｉｎｇｌｅｓ））、疼痛、しびれ、または手足の「ピリピリ感」のような神経系の問題、神経性の異常、カポジ肉腫、リンパ腫、結核、およびその他の日和見感染症が挙げられる。
【０１１７】
本発明のペプチド、核酸、およびベクターの有益な効果としては、例えば、ＨＩＶに曝露された個体の初感染を予防または遅延させること、ＨＩＶに感染した個体のウイルス負荷を減少させること、ＨＩＶ感染の無症状期を持続させること、抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）によって減少したＨＩＶ感染患者のウイルス量を低く維持すること、薬物を投与していない患者およびＡＲＴにより治療した患者において、ＨＩＶ−１特異的および非特異的な両方のＣＤ４  Ｔ細胞数を増加させること、またはＣＤ４  Ｔ細胞数の減少を小さくすること、ＡＩＤＳを患う個体の全体的な健康状態または生活の質を上げること、およびＡＩＤＳを患う個体の平均余命を伸ばすことが挙げられる。治療がＡＩＤＳの抑制に有効か否かを決定するため、医師は、免疫付与の効果を、治療前の患者の状態もしくは治療を受けていない患者に予想される状態と比較することができる。
【０１１８】
免疫原性組成物は筋肉内、皮下、または静脈内注射、および経口、経鼻、または肛門内投与のような、当業者に公知のいずれかの方法によって投与できる。Ｂａｎｇａ  Ａ，“Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳ，１９９５）を参照されたい。ペプチドまたはタンパク質が応答を刺激する時間を延長させるため、ペプチドまたはタンパク質は、植込錠、油性注射、または粒子状の系として提供できる。粒子状の系は、微粒子、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノカプセル、または同様の粒子であってよい。上記のＢａｎｇａ，１９９５を参照されたい。合成ポリマーを基にした粒子状の担体は、制御された放出に加えて、免疫応答を増強するアジュバントとしても作用することが知られている。アルミニウム塩もまた、免疫応答を引き起こすアジュバントとして使用できる。
【０１１９】
免疫原性組成物は、正確な投与量を個別に投与するために適した単位剤形として処方することができる。パルス投与については、開示する免疫原を含む免疫原性組成物をボーラス投与した後、開示する免疫原を被験体に投与しない期間を経て、２回目のボーラス投与を行う。免疫原性組成物の治療上有効な量は、単一用量として投与できるか、または複数回用量として、例えば治療期間内に毎日投与できる。特定の、限定されない例によれば、開示する免疫原を含む免疫原性組成物のパルス投与は、一日の間、一週間の間、または一か月の間実施される。
【０１２０】
免疫原性組成物は、効果（例えばＨＩＶ−１感染の徴候、症状、または臨床検査結果の改善）が望まれるときにはいつでも投与できる。一般に用量は、疾病の症状または徴候を、被験体に許容されない毒性をもたらすことなく治療または寛解させるために十分なものである。全身性投与または局所投与を用いることができる。
【０１２１】
治療用に有効な量は、疾病の重症度、および年齢、体重、患者の一般的状態、ならびにその他の臨床的因子に依存し得る。したがって、適切な治療用投与計画の最終決定は、担当医師によって為されるであろう。典型的には、医薬組成物のｉｎ  ｓｉｔｕ投与に有用な量についての有用な指針は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで用いられる投与量によって提供され、特定の疾患を治療するために有効な投与量の決定には動物モデルが用いられてよい。Ｇｉｌｍａｎ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｄｓ．，  Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  ８ｔｈ  Ｅｄ．  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ＵＳ，  １９９０），  ａｎｄ  Ｇｅｎｎａｒｏ  Ａ，  Ｅｄ．，  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  ＵＳ，  １９９０）を参照されたい。典型的には、ｇｐ１２０ポリペプチドの用量範囲は約０．１μｇ／ｋｇ体重ないし約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。その他の適切な範囲には、約１μｇ／ｋｇないし１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量が含まれる。一例として、用量は約１．０μｇないし約５０ｍｇ、例えば一被験体あたり１ｍｇのペプチドのような、１μｇないし１ｍｇである。投薬スケジュールは、ペプチドに対する被験体の感受性および疾病の進行速度のような臨床的因子に依存して、毎日から一年に一回のようにほとんど投与しない場合まで変動し得る。したがって、被験体は開示する治療用分子の初回用量を投与された後、２回目の用量を（またはさらに複数回の用量を）ある時点で、例えば少なくとも一日後、少なくとも一週間後に投与されてよい。
【０１２２】
本明細書に開示する医薬組成物は、用量単位として調製し、投与できる。固体の用量単位としては、錠剤、カプセル、経皮送達系、および坐薬が挙げられる。治療に必要な量の投与は、個別の用量単位または幾つかのそれよりも小さな用量単位の単回投与、およびさらに分割した用量の、特定の間隔での複数回投与の両方により行うことができる。適切な単回の、または分割された用量としては、約０．０１、０．１、０．５、１、３、５、１０、１５、３０、または５０μｇ  タンパク質／ｋｇ／日が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２３】
本明細書に記載される抗原性のｇｐ１２０ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトは、例えば治療に用いる医薬組成物（薬剤）、例えば予防的措置（例えばワクチン）として組み合わせて用いられ、被験体（例えばヒト被験体のような霊長類被験体）に投与して、ＨＩＶの１以上の分枝群または株に対する免疫応答を誘発する。例えば本明細書に記載される組成物は、ＨＩＶの感染に先立ち、ウイルスの複製による感染を阻害するために、ヒト（または非ヒト）被験体に投与されてよい。このように上記の医薬組成物は、ＨＩＶに対する防御免疫反応を誘発するために被験体へ投与されてよい。免疫応答を誘発するためには、治療上有効な（例えば免疫学的に有効な）量の核酸コンストラクトが、ヒト（または非ヒト）被験体のような被験体に投与される。
【０１２４】
例えば核酸コンストラクトによる免疫付与は当該技術分野において公知であり、教示されている。Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｈら、米国特許第５，６４３，５７８号（細胞媒介性または液性応答を誘発する所望の抗原をコードするＤＮＡを導入することによって脊椎動物を免疫するための方法が記載される）；Ｗｅｉｎｅｒ  Ｄら、米国特許第５，５９３，９７２号およびＷｅｉｎｅｒ  Ｄら、米国特許第５，８１７，６３７号（抗原をコードする核酸配列の、発現を可能にする調節性配列への機能的連結について記載される）、およびＵｒｂａｎ  Ｒら、米国特許第５，８８０，１０３号（免疫原性ペプチドまたはその他の抗原をコードする核酸を生物へ送達する幾つかの方法について記載される）を参照されたい。このような方法として、核酸（または合成ペプチド自体）および免疫刺激性コンストラクトのリポソームによる送達、またはコレステロールおよびＱＵＩＬ  Ａ（登録商標）（サポニン）と混合することによって自発的に形成される、陰性に荷電した大きさ３０〜４０ｎｍの籠状構造であるＩＳＣＯＭＳ（登録商標）が挙げられる。
【０１２５】
ｇｐ１２０核酸分子を投与するために、核酸は細胞内へ、例えば適切な核酸発現ベクターからの発現によって送達可能であり、該核酸発現ベクターは、それが細胞内に存在するように、例えばレトロウイルスベクターの使用によって、直接注入によって、微粒子銃（例えば遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ（登録商標）Ｄｕｐｏｎｔ  Ｃｏｒｐ、デラウェア州、米国）の使用によって、脂質コーティングによって、細胞表面受容体もしくはトランスフェクション用薬剤によって投与されるか、または核に進入することが知られているホメオボックス様ペプチドに連結して投与される。Ｍｏｒｇａｎ  Ｊら、米国特許第４，９８０，２８６号、およびＪｏｌｉｏｔ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９１；８８：１８６４−１８６８を参照されたい。本発明には、合成オリゴ、ネイキッドＤＮＡ、プラスミド、およびウイルスを含むあらゆる型の核酸の、ゲノム内に組み込まれるかまたは組み込まれない送達が包含される。
【０１２６】
免疫付与のための核酸を用いようとする別のアプローチによれば、免疫原性ｇｐ１２０ポリペプチドは、弱毒化されたウイルスホストベクターまたは細菌ベクターによっても発現され得る。組換えワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、疱疹ウイルス、レトロウイルス、またはその他のウイルスベクターが、ペプチドまたはタンパク質を発現させるために用いられてよく、これによってＣＴＬ応答が誘発される。例えばＴＢ免疫付与のプロトコルにおいて有用なワクシニアベクターおよび方法が、本発明のペプチドに対して使用可能なその他の媒体を示している。Ｐａｏｌｅｔｔｉ  Ｅら、米国特許第４，７２２，８４８号、およびＳｔｏｖｅｒ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９１；３５１：４５６−４６０を参照されたい。
【０１２７】
一例では、ウイルスベクターが利用される。これらのベクターとして、限定はされないが、アデノウイルス、疱疹ウイルス、ワクシニア、およびＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルスが挙げられる。一例では、レトロウイルスベクターはマウスまたはトリレトロウイルスの誘導体である。単一の外来性遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。被験体がヒトである場合、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）のようなベクターが用いられる。さらなるレトロウイルスベクターの幾つかは、複数の遺伝子を組み入れることができる。これらのベクターは全て、選択性マーカーの遺伝子を移入するかまたは組み入れることで、形質導入された細胞を同定し、かつ産生することができる。ｇｐ１２０ポリペプチドをコードする核酸配列を、特定の標的細胞上の受容体に対するリガンドをコードする別の遺伝子と共にウイルスベクター内へ挿入することにより、例えば、該ベクターは標的特異的となる。レトロウイルスベクターは、例えば，糖、糖脂質、またはタンパク質を付着させることによって標的特異的とすることができる。好ましい標的指向化は、レトロウイルスベクターを標的とする抗体を用いることによって達成される。当業者は過度の実験を行うことなく、レトロウイルスのゲノム内に挿入するか、またはウイルスエンベロープに付着させて、ｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターの標的特異的な送達を可能にする特異的なポリヌクレオチド配列について理解するか、または容易に確認するであろう。
【０１２８】
核酸コンストラクトのための適切な製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、および静菌薬を含んでよい、水性および非水性溶液、等張無菌溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存料を含んでよい水性および非水性無菌懸濁液が挙げられる。製剤は、単位用量または複数回用量の、アンプルおよびバイアルのような密閉したコンテナー内に入れられてよく、かつ使用直前に無菌の液体担体、例えば水を加えるだけでよい、フリーズドライ（凍結乾燥）された状態で保管することができる。無菌の粉末、顆粒、および錠剤から、即時溶液（ｅｘｔｅｍｐｏｒａｎｅｏｕｓ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）および懸濁液が調製されてよい。好ましくは、担体は緩衝食塩水溶液である。さらに好ましくは、本発明の方法で使用するための組成物は、投与前の核酸コンストラクトを損傷から保護するために処方される。例えば組成物は、発現ベクターを調製し、保管し、または投与するために用いられる装置、例えばガラス製品、シリンジ、または針におけるアデノウイルスベクターの損失を減少させるように処方されてよい。組成物は、成分の光感受性および／または温度感受性を減少させるように処方されてよい。そのために組成物は、好ましくは、例えば上記のような薬剤的に許容される液体担体、およびポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される安定剤を含む。
【０１２９】
治療への応用では、治療上有効な量の組成物が、ＨＩＶへの曝露もしくは感染の前または後に、被験体へ投与される。曝露前に投与する場合、治療への応用は予防的投与（例えばワクチンの形として）と称することができる。組成物の単回または複数回の投与は、被験体に必要とされ、かつ許容される投与量および頻度に応じて行われる。一実施形態によれば、投与はボーラスによる単回投与であるが、別の実施形態によれば、防御免疫反応のような治療上の結果が達成されるまで定期的に投与され得る。一般に用量は、疾病の症状または徴候を、被験体に許容されない毒性をもたらすことなく治療または寛解させるために十分なものである。全身性投与または局所投与を用いることができる。
【０１３０】
核酸ワクチンとの関連では、自然免疫に関わる受容体に結合して刺激する天然または合成の免疫刺激性組成物が、ｇｐ１２０ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトと共に投与されてよい。例えば特定のＴｏｌｌ様受容体（例えばＴＬＲ７、ＴＬＲ８、およびＴＬＲ９）を刺激する薬剤が、ｇｐ１２０ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトと組み合わせて投与されてよい。幾つかの実施形態によれば、核酸コンストラクトは、免疫刺激性のＣｐＧオリゴヌクレオチドと組み合わせて投与されてよい。
【０１３１】
ｇｐ１２０ポリペプチドをコードする核酸コンストラクトは、ネイキッドＤＮＡプラスミドとしてｉｎ  ｖｉｖｏ導入できる。ＤＮＡベクターは、当該技術分野において公知の方法によって所望の宿主細胞内へ導入され、該方法としてはトランスフェクション、エレクトロポレーション法（例えば経皮エレクトロポレーション法）、微量注入法、形質導入法、細胞融合法、ＤＥＡＥデキストラン法、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子銃の使用、およびＤＮＡベクター輸送体の使用が挙げられるが、これらに限定はされない。Ｗｕ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：９６３−９６７，Ｗｕ  Ｃ  ａｎｄ  Ｗｕ  Ｇ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８；２６３：１４６２１−１４６２４、およびＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９１；８８：２７２６−２７３０を参照されたい。ネイキッドＤＮＡを処方し、哺乳類の筋肉組織へ投与するための方法もまた公知である。Ｆｅｌｇｎｅｒ  Ｐら、米国特許第５，５８０，８５９号および米国特許第５，５８９，４６６号を参照されたい。その他の分子、例えば陽イオン性オリゴペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質由来のペプチド、または陽イオン性ポリマーもまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける核酸のトランスフェクションを促進するために有用である。Ｂａｚｉｌｅ  Ｄら、国際公開第１９９５０２１９３１号、およびＢｙｋ  Ｇら、国際公開第１９９６０２５５０８号を参照されたい。
【０１３２】
ｇｐ１２０免疫原をコードする核酸コンストラクトを宿主細胞内に導入するために用いることのできる別の公知の方法は、微粒子銃（すなわちｂｉｏｌｉｓｔｉｃ形質転換）である。Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ形質転換は、一般に幾つかのやり方のうちの一つによって達成される。一般的な方法の一つは、細胞において不活性の、または生物学的活性のある粒子を推進することに関わる。Ｓａｎｆｏｒｄ  Ｊら、米国特許第４，９４５，０５０号、米国特許第５，０３６，００６号、および米国特許第５，１００，７９２号を参照されたい。
【０１３３】
あるいは、ベクターはリポフェクションによってｉｎ  ｖｉｖｏ導入できる。陽イオン性の脂質を用いることで陰性に荷電した核酸の被包が促進され、陰性に荷電した細胞膜との融合もまた促進される。Ｆｅｌｇｎｅｒ  Ｐ，Ｒｉｎｇｏｌｄ  Ｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９；３３７：３８７−３８８を参照されたい。核酸の移入に特に有用な脂質化合物および組成物について記載されている。Ｆｅｌｇｎｅｒ  Ｐら、米国特許第５，４５９，１２７号、Ｂｅｈｒ  Ｊら、国際公開第１９９５０１８８６３号、およびＢｙｋ  Ｇ、国際公開第１９９６０１７８２３号を参照されたい。
【０１３４】
免疫原性ポリペプチドと同様に、核酸組成物は、ＨＩＶに対する免疫応答を誘発するため、単一用量により投与されてよいか、または時間間隔で区切られた複数回用量によっても投与することができる。免疫応答を最適化するため、例えば２回用量、または３回用量、または４回用量、または５回用量、または６回用量、またはその回数を超えて、数週間、数か月間、または数年間の期間にわたり、被験体へ投与されてよい。
【０１３５】
本発明に開示する免疫原性組成物を、その他の薬剤、例えばタンパク質、ペプチド、抗体、およびその他の抗ＨＩＶ剤と共に投与することは有利な可能性がある。このような抗ＨＩＶ治療薬の例としては、アバカビル、ＡＺＴ、ジダノシン、エムトリシタビン、ラミブジン、スタブジン、テノホビル、ザルシタビン、およびジドブジンなどのようなヌクレオシド逆転写酵素阻害物質；デラビルジン、エファビレンツ、およびネビラピンのような非ヌクレオシド逆転写酵素阻害物質；アンプレナビル、アタザナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、ホスアンプレナビル、リトナビル、サキナビル、およびチプラナビルなどのようなプロテアーゼ阻害物質；ならびにエンフビルチドなどのような融合タンパク質阻害物質が挙げられる。特定の実施形態によれば、免疫原性組成物はその他の抗ＨＩＶ治療薬と同時に投与される。特定の実施形態によれば、免疫原性組成物はその他の抗ＨＩＶ治療薬と連続的に、例えばその他の薬剤よりも前または後に投与される。当業者は、連続的投与が、直後、または適切な期間の後、例えば数時間、数日、数週間、数か月、または数年後をも意味し得ることを承知するであろう。
【０１３６】
６．生体試料中の抗ＨＩＶ抗体の検出方法および中和抗体反応の検出方法
本発明に記載される免疫原は、患者の試料中に、前記免疫原に対して特異的な抗体を同定することに適する。本発明の免疫原は中和抗体へ特異的に結合することから、該免疫原は、開発した中和抗体を有する患者を同定するために用いることができる。したがって該抗体は、患者が中和抗体を有するか否かに基づいて、個別的な治療法を特定するための助けとなり得る。このように、別の態様によれば、本発明はウイルスに対して特異的な中和抗体を試料中に検出するための方法に関し、該方法は、
（ｉ）前記試料と本発明のポリペプチドとを接触させる工程と、そして
（ｉｉ）前記ポリペプチドとの間の免疫複合体の形成を検出する工程と
を少なくとも含んでなる。
【０１３７】
好ましい実施形態によれば、ウイルスはＨＩＶであり、ポリペプチドは、上で定義したｇｐ１２０変異ポリペプチドまたはその免疫原性断片である。さらに好ましい実施形態によれば、試料はＨＩＶ−１に感染した患者またはＡＩＤＳワクチンレシピエントに由来する。
【０１３８】
様々なアッセイフォーマットのいずれでも、本発明の方法に従って用いられてよい。このようなフォーマットは不均一または均一、連続的または同時的、競合的または非競合的である。Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｍら、米国特許第５，５６３，０３６号、Ｃｈｅｎｇ  Ａら、米国特許第５，６２７，０８０号、Ｌｅｅ  Ｊら、米国特許第５，６３３，１４１号、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｍら、米国特許第５，６７９，５２５号、Ｄｒａｅｔｔａ  Ｇら、米国特許第５，６９１，１４７号、Ｌｕｃａｓ  Ｆら、米国特許第５，６９８，４１１号、Ｙａｎ  Ｃら、米国特許第５，７４７，３５２号、Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｒ、米国特許第５，８１１，５２６号、Ｏｈ  Ｃら、米国特許第５，８５１，７７８号、およびＬａｎｄｒｕｍ  Ｅら、米国特許第５，９７６，８２２号を参照されたい。このようなアッセイは、抗ＨＩＶ抗体の濃度または量を測定するため、定量的に設定されてよいか、または抗ＨＩＶ抗体の存在または不在を測定するため、定性的に設定されてもよい。
本発明の原理に従った使用のために適合されてもよいさらなる免疫アッセイについては、科学文献中に記載されている。Ｇｎａｎｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８９；１７８：６９３−７１４，Ｄｏｐｅｌ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９１；２９：３３１−３３７，Ｍａｎｏｃｈａ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２００３；８５（３）：２７５−２７８），Ｂｒａｔｔｅｇａａｒｄ  Ｋ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  １９９５；９（６）：６５６−６５７，Ｂｅｒｉｓｔａｉｎ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１９９５；９：３４７−３５０，Ｍｏｄｒｏｗ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．１９８９；２：１４１−１４８，Ｇｕｅｙｅ−Ｎｄｉａｙｅ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  １９９３；７：４７５−４８１，Ｓａｂａｔｉｅｒ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  １９８９；３：２１５−２２０，Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００４；４：３４９−３６１，Ａｌｃａｒｏ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．２００３；４：２８５−２９０，Ｓｍｉｔｈ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１９９０；１１４：２５４−２５８，Ｐｅｔｒｏｖ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．１９９０；１：２３９−２４４，Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ  Ｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；４：１９９−２１０，Ｂａｉｌｌｏｕ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９１；２９：１３８７−１３９１、およびＭｃＧａｕｇｈｅｙ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．ＨＩＶ  Ｒｅｓ．２００４；２：１９３−２０４を参照されたい。
【０１３９】
不均一な免疫アッセイ技術には、典型的には反応産物が結合する固相材料の使用が含まれるが、該アッセイは固定化されていない抗原および抗体の結合（すなわち液相免疫アッセイ）を含むように適応されてもよい。固相を反応混合物から取り除くことにより（例えば洗浄によって）、過剰の試料、アッセイ用試薬、およびその他の物質から反応生成物が分離される。本発明に従って用いてもよい固相免疫アッセイの一つの型は、サンドイッチ免疫アッセイである。サンドイッチアッセイでは、試料中に存在する分析物多いほど、多量の標識が固相に存在する。このような型のアッセイフォーマットでは、固相上の標識の様子がさらに容易に検出されるため、一般には特に低濃度の分析物を可視化するために好ましい。
【０１４０】
本発明の好ましい実施形態によれば、抗ＨＩＶ抗体と特異的に反応する本発明のペプチドは固相支持体に結合され（すなわち固定化され）、抗ＨＩＶ抗体の有無を調べる生体試料と接触した状態でインキュベートされる。非特異的結合を減少させるため、ブロッキング剤が添加されてよい。
【０１４１】
ペプチドは、生体試料と共に未結合の状態でインキュベートされ、次に固相支持体に結合（すなわち固定化）されてもよいことが理解されるであろう。続いて支持体はさらに好ましく処理され（例えば洗浄により）、存在し得るが、結合したペプチドに結合できなかった非ＨＩＶ抗体が実質的に除去される。このような処理に続いて、ペプチドと抗ＨＩＶ抗体との間に免疫複合体が形成される。
【０１４２】
次に、検出可能なように標識された二次抗体（一次抗体に結合可能である（例えば抗ヒトＩｇＧ抗体））を好ましく添加し、存在する可能性のあるいずれかの抗ＨＩＶ抗体に二次抗体が結合するために十分な条件下で支持体をインキュベートする。続いて支持体をさらに好ましく処理し（例えば洗浄により）、結合していないいずれの二次抗体も実質的に除去する。試験試料中に抗ＨＩＶ抗体が存在する場合には、二つの抗体と固定化されたペプチドとが免疫複合体（すなわち二次抗体／抗ＨＩＶ抗体／固定化されたペプチドのサンドイッチ）を形成し得る。このようなアッセイにおける、支持体に結合した二次抗体の検出は、試験される試料中に抗ＨＩＶ抗体が存在することを示している。Ｓｃｈｕｕｒｓ  Ａら、米国特許第３，７９１，９３２号および米国特許第４，０１６，０４３号、ならびにＰａｎｋｒａｔｚ  Ｔら、米国特許第５，８７６，９３５号を参照されたい。二次抗体は、非ヒト種から分離した天然の免疫グロブリン（例えばマウス抗ヒトＩｇＧ抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体、ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体）であってよいか、または組換えもしくは合成によって産生できる。抗体は未変化の免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片（例えばＦＡｂ、Ｆ［Ａｂ］２）であってよい。所望により、そのような二次抗体と共に、またはその代わりに、その他の結合分子（抗ＨＩＶ抗体に結合可能である）が用いられてよい。例えば抗ＨＩＶ抗体をビオチン化して、標識したアビジンまたはストレプトアビジンを二次抗体の代わりに用いてもよい。
【０１４３】
未結合のものを分離する工程を除き、化学的結合アッセイに必要な時間と機器を減らすため、均一なアッセイフォーマットが代わりに用いられてよい。このようなアッセイでは、結合ペアのうちの１成分がなお固定化されるが、結合ペアの第２成分の存在が、未結合のものを分離することなく検出される。均一な光学的方法の例としては、蛍光クエンチングの検出を通して操作するＥＭＩＴ法（Ｓｙｖａ，Ｉｎｃ．，サニーベール、カリフォルニア州、米国）；光散乱の変化を検出することにより操作するレーザーネフェロメトリーラテックス粒子凝集法（Ｂｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ  ＡＧ、マールブルグ、独国）；ＬＰＩＡラテックス粒子凝集法（三菱化学株式会社、東京、日本）；ＴＤＸ蛍光脱分極法（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，アボット・パーク、イリノイ州、米国）；および蛍光エネルギー転移法（Ｃｉｓ  Ｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，パリ、フランス）が挙げられる。このようなアッセイのいずれも、本発明の目的に沿うように適応されてよい。
【０１４４】
本発明の結合アッセイは、競合アッセイとして設定されてよい。競合アッセイでは、試験サンプル中により多くの抗ＨＩＶ抗体が存在するほど、固相に存在する標識の量は少なくなる。
【０１４５】
サンドイッチアッセイと同様の様式で、競合アッセイは、標識された抗ＨＩＶ抗体を規定量提供すること、および支持体への結合に対して標識抗体と競合し得る抗ＨＩＶ抗体が含まれるか否かについて決定することによって実施できる。このような競合アッセイでは、捕捉された標識抗体の量は、試験サンプル中に存在する検体の量とは反比例する。この種のアッセイの幾つかは、当該技術分野において記載されている。Ｓｍｉｔｈ  Ｄら、米国特許第４，４０１，７６４号、Ｃｌａｇｅｔｔ  Ｊら、米国特許第４，７４６，６３１号、Ｌｉ  Ｃら、米国特許第４，６６１，４４４号、Ｃｈｉｅｒｅｇａｔｔ  Ｅら、英国特許第２０８４３１７号、Ｍｏｃｈｉｄａ  Ｅら、米国特許第４，１８５，０８４号、Ｓａｄｅｈ  Ｄら、米国特許第４，２４３，７４９号、Ｌｕｃａｓ  Ｆら、米国特許第５，６９８，４１１号、Ｌａｎｄｒｕｍ、上記、Ｌｅｕｖｅｒｉｎｇ  Ｊ、米国特許第４，３１３，７３４号、Ｇｒｉｂｎａｕ  Ｔら、米国特許第４，３７３，９３２号、およびＢａｕｇｈｅｒ  Ｂら、米国特許第５，５０１，９８５号を参照されたい。検出可能な標識（すなわち酵素免疫アッセイまたはＥＩＡ）としては、酵素（特にアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはウレアーゼ）の使用が好ましい。
【０１４６】
酵素標識の存在は、発色性基質（蛍光、ＵＶ、可視光線を発生または吸収するものを含む）の使用を通し、酵素標識の触媒作用に反応して検出され得る。さらに好ましくは、化学標識が用いられてよい（例えばコロイド金、ラテックスビーズ標識）。
【０１４７】
標識は、多重検出器、多重パスフィルター、格子、または異なるスペクトルの蛍光を用いて検出できる。Ｗａｒｄ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，７５９，７８１号を参照されたい。酵素標識としては、ペルオキシダーゼを、特に発色性基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＯＰＤ、またはＡＢＴＳとあわせて用いることが特に好ましい。抗体を標識する酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、過ヨウ素酸塩による技術、またはパートナーにヘテロ二官能性の試薬を連結したことが報告された方法を用いることが可能である。Ｎａｋａｎｅ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１９７４；２２：１０８４−１０９０を参照されたい。本発明の免疫アッセイには、様々な固相支持体のいずれかが用いられてよい。固相支持体に適した材料は、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、またはその他の合成ポリマーのような合成物、セルロースのような天然ポリマー、およびセルロースアセテートまたはニトロセルロースのような誘導体化された天然ポリマー、ならびにガラス、特にガラス繊維である。支持体は、球形、棒状、管、およびマイクロアッセイまたはマイクロタイタープレートの形を取ることができる。ペーパーストリップのようなシート様構造、小プレート、および膜が適すると思われる。担体の表面は、水溶液に対して透過性または不透過性であってよい。
【０１４８】
上の記載は体液（例えば血清、血液、尿、唾液、膵液、脳脊髄液、精液）である生体試料中に抗ＨＩＶ抗体が存在するか否かのアッセイに関するものであるが、どのような流動性の生体試料（例えば組織または生検抽出物、糞便抽出物、痰）も同様に、本発明のアッセイに用いられてもよいことが理解されるであろう。最も好ましくは、アッセイされる生体試料は血清または血漿である。
【０１４９】
本発明の免疫原は広域中和抗体の産生を誘導可能であることから、これらの免疫原は、患者が有する病原体に対する中和抗体の応答を検出するためにも用いることができる。このように別の態様によれば、本発明は、被験体のウイルス感染に対する中和抗体の応答を検出するための方法に関し、該方法は、本発明による中和抗体の検出法を用いて、前記被験体における中和抗体の存在を検出する工程を含んでなり、ここで対照被験体に対する前記被験体における中和抗体の存在は、前記被験体における前記ウイルス感染に対する中和抗体の応答を示している。
【０１５０】
好ましい実施形態によれば、ウイルスはＨＩＶであり、ここでポリペプチドは本発明のｇｐ１２０変異ポリペプチドまたはその免疫原性断片である。さらに好ましい実施形態によれば、試料はＨＩＶ−１に感染した患者またはＡＩＤＳワクチンレシピエントに由来する。
【０１５１】
７．ＨＩＶの予防および治療法
本発明に記載される免疫原は、ＨＩＶ感染に付随する疾病の予防および治療に適する。
【０１５２】
全般的手順
１．試薬
以下の試薬を用いた。
ａ．プラスミド。ｐＮＬ４．３（ＮＩＨ  ＡＲＲＲＰ，米国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国）およびｐｃＤＮＡ  ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，カールスバッド、カリフォルニア州、米国）プラスミドを用いた。
ｂ．ＨＩＶ−１分離株。分枝群Ｂ  ＨＩＶ−１初代分離株であるＡＣ−１０を用いた（ＮｅｕｔＮｅｔ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，ミラノ、イタリア）。
ｃ．細胞株。ＴＺＭ−ｂｌ細胞（ＣＤ４＋ＣＸＣＲ４＋ＣＣＲ５＋）はＮＩＨリポジトリ（米国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州、米国）から得た。２９３ＴおよびＴＺＭ−ｂｌ細胞は、１０％ウシ胎仔血清、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕペニシリン／ｍＬ、および１００μｇストレプトマイシン／ｍｌを含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。
ｄ．抗体。広域中和活性を有する抗Ｅｎｖ−ＨＩＶ−１モノクローナル抗体（ＭＡｂ）（エピトープ特異性は括弧内に示す）を用いた（米国立衛生研究所、ＡＲＲＲＰ，ベセスダ、メリーランド州、米国；Ｐｏｌｙｍｕｎ  ＡＧ，ウィーン、オーストリア）。以下の抗体を用いた：４Ｅ１０（膜近接外部領域（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｐｒｏｘｉｍａｌ  ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）；ＭＰＥＲ）、２Ｆ５（ＭＰＥＲ）、ｂ１２（ＣＤ４結合部位）、２Ｇ１２（ｇｐ１２０高マンノースグリカン）、およびＰＧ１６（ｇｐ１２０ウイルススパイク）。
【０１５３】
２．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏランダム変異誘発
ＨＩＶ−１  ＡＣ−１０  ｅｎｖへの変異は、Ｇｅｎｅｍｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（登録商標）、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，サンタクララ、カリフォルニア州、米国）を用いて導入した。キメラＨＩＶウイルス粒子のライブラリーは、無作為に変異させたエンベロープをｐＮＬ４−３およびｐｃＤＮＡ３．１プラスミドへ移入することによって作製した。移入は、ウイルス配列を保存した制限酵素部位の導入、ならびに酵素ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｉｎｃ．，イプスウィッチ、マサチューセッツ州、米国）を用いた消化によって行った。
【０１５４】
３．クローニングおよびライブラリーの作製
ＰＣＲ産物は、Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  インディアナポリス、インディアナ州）を製造者の仕様書に従って用いることにより、ベクターｐＮＬ４．３およびｐｃＤＮＡ３．１内へクローン化した。ｐＮＬ４．３およびｐｃＤＮＡ３．１の組換えベクターは、それぞれＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）Ｓｔｂｌ２（商標）コンピテント細胞およびＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５α（商標）コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，カールスバッド、カリフォルニア州、米国）へ導入し、３ｍＬの容量で攪拌しながら３０℃で一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  （ＯＮ））増殖させた。変異性の喪失を避けるために幾つかの形質転換を同時に行い、これらを混合して大量増幅させた（２５０ｍＬ、３０℃、攪拌しながらＯＮ）。インキュベーション後に２０μＬをプレートにまき、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，マディソン、ウィスコンシン州、米国）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。両産物をＸｂａＩおよびＮｏｔＩによってさらに消化し、ｅｎｖ遺伝子の存在を確認した。陽性の場合、クローンを配列決定するか、またはトランスフェクションに使用した。ｐＮＬ４．３コンストラクトを用いた２９３Ｔ細胞への一過性のトランスフェクションにより、ウイルスを産生させた。トランスフェクション後２日目にウイルス粒子を含む細胞培養上清を回収し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  ｕｎｉｔを用いてウイルス粒子を濃縮した。ウイルス粒子をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。
【０１５５】
４．ウイルス粒子捕捉アッセイ
マイクロタイターウェルを、捕捉ＭＡｂ（１００μｌのＰＢＳ中、０．０５μｇ／ｍＬ）により、４℃にて一晩コートした。ウェルをＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により、３７℃にて１時間ブロックした。ライブラリー由来のウイルス１００μｌ（ｐ２４の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により、１０００ｎｇ／ｍＬと定量された）を、マイクロタイターウェルへ加えた。２時間のインキュベーション後にウェルをＰＢＳによって６回洗浄し、ｐ２４の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によってウイルス当量を定量するか、またはＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，インディアナポリス、インディアナ州、米国）を製造者の指示に従って用いることにより、ＲＮＡを抽出した。
【０１５６】
ウイルス粒子捕捉アッセイの別のプロトコルは以下のとおりである。「マイクロタイターウェルを、ポリクローナル抗Ｆｃ（１００μｌのＰＢＳ中、５μｇ／ｍＬ）により、４℃にて一晩コートした。ウェルをＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により、３７℃にて１時間ブロックした。ライブラリー由来のウイルス１００μｌ（１０００ｎｇ／ｍＬ）を、固定化抗Ｆｃで予めコートされ、ブロックされたマイクロタイターウェルへ加えた。５μＬの捕捉ＭＡｂ（１００ｎｇ／ｍＬ）を対応するウェルに加え、プレートを３７℃にて攪拌（４５０ｒ．ｐ．ｍ）しながらインキュベートした。２時間のインキュベーション後にウェルをＰＢＳによって６回洗浄し、ｐ２４の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によってウイルス当量を定量するか、またはＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，インディアナポリス、インディアナ州、米国）を製造者の指示に従って用いることにより、ＲＮＡを抽出した。」
【０１５７】
５．ネステッドＲＴ−ＰＣＲによるＨＩＶ−１  ｅｎｖ  ＲＮＡの増幅
分離したＨＩＶ−１  ｅｎｖ  ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲキット（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）Ｇｏｌｄ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，カールスバッド、カリフォルニア州、米国）、およびＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，インディアナポリス、インディアナ州）を用いた逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅した。８μＬの量の鋳型ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ反応に用い、ＲＮＡをプライマー１０２（逆方向）によって５０℃にて２０分間逆転写した。５μＬの量のｃＤＮＡからプライマー１０１（順方向）および１０４（逆方向）を用い、それに続いて２μＬの量の鋳型からプライマー１７９（順方向）および１８０（逆方向）を用いたネステッドＰＣＲによってｅｎｖ領域を増幅した。表１を参照されたい。両方のｅｎｖ  ＰＣＲ増幅の条件は以下のとおりであった：ｉ）９４℃２分を１サイクル、ｉｉ）９４℃２分、５５℃１分、および７２℃３分を３５サイクル、ｉｉｉ）７２℃７分を１サイクル、および４℃にて停止。得られたアンプリコン（２５８３ｂｐ）を、１Ｋｂ分子量マーカーと共に、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎによって染色した１．０％アガロースゲル内に電気泳動した。
【０１５８】
６．ｅｎｖ遺伝子のクローニングおよび配列決定
前工程でのＰＣＲ産物を、上記のようにｐＮＬ４．３およびｐｃＤＮＡ３．１ベクター内へクローン化した。上で説明したように、これらのプラスミドによってＳｔｂｌ２およびＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換させた。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，バレンシア、カリフォルニア州、米国）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した後、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩによりさらに消化して、ｅｎｖ遺伝子の存在を確認した。ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１、ならびにプライマー１８３（順方向）、１８５（順方向）、１８６（順方向）、１９０（逆方向）、１９２（逆方向）、および１９３（逆方向）を用いてＥｎｖ陽性クローンの配列決定を行った。第１表参照。
【０１５９】
７．配列解析
ヌクレオチド配列のアラインメントは、ＢｉｏＥｄｉｔ  ７．０．９．０バージョンに統合されたＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラム（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ＦＴＰ／，２０１２年８月）およびＣｏｎｔｉｇ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＣＡＰ）アプリケーションを用いて行い、次にこれを用手で編集した。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４；２２（２２）：６７３−４６８０およびＨｕａｎｇ  Ｘ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９２；１４（１）：１８−２５を参照されたい。
【０１６０】
【表１】
2015532591.tif 000002
遺伝子の位置はＨＩＶ−１  ＨＸＢ２ゲノム（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｋ０３４５５）に基づく。Ｗｅｉ  Ｘ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００２；４６（６）：１８９６−１９０５
【０１６１】
８．組換えウイルスの産生
関連する変異（潜在的なグリコシル化部位の欠損およびＶ１／Ｖ２ループ構造の変化）に特異的なＭＡｂを捕捉するエンベロープ糖タンパク質を発現するクローンを、２５０ｍＬの容量で攪拌しながら３０℃でＯＮ増殖させた。プラスミドＤＮＡは、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，マディソン、ウィスコンシン州、米国）を用いて精製した後、２９３Ｔ細胞への一過性の共トランスフェクションに用いた。トランスフェクション後２日目にシュードウイルスを含む上清を回収した。ｐ２４の量をＥＬＩＳＡによって定量した。
【０１６２】
９．結合アッセイ
未変化のウイルス粒子に対するＭＡｂ（４Ｅ１０、２Ｆ５、２Ｇ１２、ｂ１２、およびＰＧ１６）の結合を、上に記載した捕捉アッセイによって判定した。最初に、ウイルス−ＢＭＡｂの結合を促進するため、ウイルスとＢＭＡｂとを溶液中でインキュベートした。あるいは、ウイルス−ＢＭＡｂ複合体を予めプレートに固定化した抗ＦＣ抗体によって捕捉した。固定化されたウイルス−ＢＭＡｂを、ＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘによって溶解した。上に記載したように、ウイルスライセート中のｐ２４をＥＬＩＳＡによって定量した。陰性コントロールとしてΔＥｎｖ  ｐＮＬ４．３コンストラクトを用いた。結合親和性の増大を野生型ＡＣ−１０ウイルスとの比較によって判定した。
【０１６３】
１０．ディープシーケンシング
ウイルスライブラリーを詳細に特徴付けるためには、これを適切に調製および増幅してディープシーケンシングに供する必要がある。増幅の出発物質は、予め取得した、ｐＮＬ４．３ベクター内にクローン化されたエンベロープＡＣ１０  ｃＤＮＡである。しかしながらそれ以前のＲＴ−ＰＣＲ工程が行われていれば、出発物質はＨＩＶ  ＲＮＡであってもよい。
【０１６４】
Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＤＮＡ  Ｔａｑ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，インディアナポリス、インディアナ州）を用いてＤＮＡを増幅した。プライマー４５４＿１（アンプリコン１  順方向）、４５４＿２（アンプリコン１  逆方向）、４５４＿３（アンプリコン３  順方向）、４５４＿４（アンプリコン３  逆方向）、４５４＿５（アンプリコン４  順方向）、および４５４＿６（アンプリコン４  逆方向）を用いたＰＣＲによって増幅を行った。第２表参照。プライマーは、対照のＡＣ１０に対し、エンベロープ遺伝子内の関心のある領域、すなわちアンプリコンを増幅するように設計した。アンプリコンは、現在使用される技術の限界に従いながらも、より長い領域にわたるように設計され得る、長さがおおよそ４５０塩基対のＤＮＡ配列である。４５４／ＧＳ／Ｊｕｎｉｏｒ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ（４５４−Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ブランフォード、コネティカット州、米国）に記載されるように、プライマーを、チタニウム配列決定化学に特有の複数識別子（ＭＩＤ）アダプターに連結させた。ＰＣＲの条件は以下のとおりであった：ｉ）９４℃２分を１サイクル、ｉｉ）９４℃３０秒、４９℃３０秒、および６８℃４５秒を２０サイクル、ｉｉｉ）６８℃４５秒、およびｉｖ）４℃にて停止。アンプリコンライブラリーを三通りに調製した後プールし、次に三通りのＰＣＲ産物を、マグネチックビーズ（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ  Ｋｉｔ，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．，ベルンリート、独国）を用いてプライマーダイマーを除去して精製した。分子数は、蛍光光度法（Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，カールスバッド、カリフォルニア州、米国）によって定量化した。４５４チタニウムｅｍＰＣＲプロトコルに従って、エマルジョンＰＣＲ（ｅｍＰＣＲ）を行った。Ｒｏｃｈｅ／４５４  ＧＳ／Ｊｕｎｉｏｒを製造者の指示に従って用い、ピコタイタープレート上で配列決定を実行した。
【０１６５】
【表２】
2015532591.tif 000003
組み合わせはＨＩＶ−１  ＡＣ１０エンベロープ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ８３５４４６）に基づく。Ｌｉ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５；７９（１６）：１０１０８−１０１２５を参照されたい。
【０１６６】
【表３】
2015532591.tif 000004
アミノ酸の組み合わせはＨＩＶ−１  ＡＣ１０エンベロープ遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ８３５４４６）に基づく。上記のＬｉ，２００５を参照されたい。
【０１６７】
得られた配列決定データは、配列決定した試料それぞれについて多数の配列を読み取った。データを４５４／ＡＶＡソフトウェアによってさらに処理し、各アンプリコン／試料の組み合わせについて配列データセットを得た。これらの配列を、Ｍｏｓａｉｋハイスループットアライナソフトウェアを用いて、ＡＣ１０参照配列（受託番号ＡＹ８３５４４６）に対してバイオインフォマティクス的に整列させた。いったん整列させた後、各試料についてアンプリコンサイズのハプロタイプを得るため、アラインメント情報と読み枠の位置を用いて、各配列をタンパク質配列に翻訳した。独特に出現する配列を見出すために、各アンプリコンの配列データセットおよび試料を配列データセット内の各配列の説明情報と共に解析した。これによって、ウイルス集団内に存在する各ハプロタイプについて、アンプリコンサイズの配列の長さが定量化された。このように、ウイルスライブラリー内の各変異率および各ハプロタイプの存在度を特徴付けた。
【０１６８】
【表４】
2015532591.tif 000005
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ８３５４４６。上記のＬｉ，２００５を参照されたい。
【０１６９】
１１．Ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
ａ．免疫原の産生（ＡＴ−２不活化ウイルス粒子）
関連する変異（潜在的なグリコシル化部位の欠損およびＶ１／Ｖ２ループ構造の変化）に特異的なＭＡｂを捕捉するエンベロープ糖タンパク質を発現するクローンと、ディープシーケンシングによって選択されたクローンとを、２９３Ｔ細胞への一過性の共トランスフェクションに用いた。トランスフェクション後２日目にシュードウイルスを含む上清を回収した。上の項目８に記載したように、ｐ２４の量をＥＬＩＳＡによって定量した。
【０１７０】
前工程で得た上清に含まれるＨＩＶを、当該技術分野において公知のプロトコルに従ってアルドリチオール−２（２，２’−ジチオジピリジン）（ＡＴ−２，Ａｄｒｉｔｈｉｏｌ（登録商標）−２、カタログ番号１４３０４９、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，セントルイス、ミズーリ州、米国）によって処理して不活化させた。Ｒｏｓｓｉｏ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９８；７２（１０）：７９９２−８００１およびＡｒｔｈｕｒ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．，ＡＩＤＳ  Ｒｅｓ．Ｈｕｍ．Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ  １９９８；Ｓｕｐｐｌ  ３：Ｓ３１１−Ｓ３１９を参照されたい。上清を１ｍＭのＡＴ−２と共に、３７℃にて２時間、連続的に攪拌しながらインキュベートした。２０１１年１１月２２日に提出した欧州特許第１１３８２３５８．７号を参照されたい。
【０１７１】
ＡＴ−２不活化ウイルス粒子は、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  ｕｎｉｔを用いて濃縮した。ウイルス粒子をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した後、ｐ２４の量をＥＬＩＳＡによって定量した。
【０１７２】
ｂ．免疫付与アッセイ
６ないし８週齢で、特定病原体が除去された（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ：ＳＰＦ）雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。マウスは標準的な食餌を自由に摂取し、１２時間の明−暗サイクルの下で飼育した。各群は５匹の動物から構成された。
【０１７３】
アッセイの始めに顔面静脈穿刺（顎下）によって、２００μＬの血液（抗凝固剤を含まない）を採取した（ｔ＝０）。次に全ての群に対して、予め選択した、エンベロープを有するＡＴ−２不活化ウイルスを１００μＬ（ＥＬＩＳＡによる定量で、ｐ２４は２．５μｇ／ｍＬ）＋フロイント完全アジュバント（１００μＬ）を、各肢の皮下に接種した（全量２００μＬ）。
【０１７４】
２週間後（ｔ＝１４）、全ての群から顔面静脈穿刺（顎下）によって、２００μＬの血液（抗凝固剤を含まない）を採取した。予め選択した、エンベロープを有するＡＴ−２不活化ウイルスを１００μＬ（ＥＬＩＳＡによる定量で、ｐ２４は２．５μｇ／ｍＬ）＋フロイント完全アジュバント（１００μＬ）を、第２群の各肢の皮下に接種した（全量２００μＬ）。
【０１７５】
４週間後（ｔ＝１４）、全ての群から、４００μＬないし１ｍＬの血液を麻酔下の心臓穿刺によって採取した。
【０１７６】
免疫付与したマウスから得た血清中の、５種の異なるＨＩＶ亜型ウイルスのパネルに対する中和活性を、当該技術分野において公知のプロトコルに従って評価した。Ｍｅｄｉｎａ−Ｒａｍｉｒｅｚ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０１１；８５：５８０４−５８１３を参照されたい。
【実施例】
【０１７７】
実施例１：ＬＲ１−Ｃ１ウイルス粒子の分離およびｎＡｂ  ４Ｅ１０に対する親和性
該方法に記載するように、ＨＩＶ−１  ＡＣ−１０  ｅｎｖへ変異を導入した。無作為に変異させたエンベロープをｐＮＬ４−３プラスミドへ移入することによって、キメラＨＩＶウイルス粒子のライブラリーを作製した。ＰＣＲ産物をベクターｐＮＬ４．３内へクローン化し、組換えベクターをＳｔｂｌ２（商標）コンピテント細胞へ導入した。分離したＨＩＶ−１  ｅｎｖ  ＲＮＡを逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅した。得られたアンプリコン（２５８３ｂｐ）を、１Ｋｂ分子量マーカーと共に電気泳動した。プライマー１８３（順方向）、１８５（順方向）、１８６（順方向）、１９０（逆方向）、１９２（逆方向）、および１９３（逆方向）を用いてＥｎｖ陽性クローンの配列決定を行った。関連する変異（潜在的なグリコシル化部位の欠損およびＶ１／Ｖ２ループ構造の変化、図２を参照されたい）に特異的なＭＡｂを捕捉するエンベロープ糖タンパク質を発現するクローンを増殖させ、２９３Ｔ細胞への一過性の共トランスフェクションに用いた。未変化のウイルス粒子に対する４Ｅ１０  ＭＡｂの結合を、上に記載した捕捉アッセイによって判定した。固定化されたウイルス−ｂＭＡｂ複合体を、ＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘによって溶解した。ウイルスライセート中のｐ２４をＥＬＩＳＡによって定量した。広域中和抗体４Ｅ１０に対する親和性の増大したＬＲ１−Ｃ１ウイルス粒子を同定した（図３）。
【０１７８】
実施例２：ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＬＲ１−Ｃ１によって誘導された中和抗体応答の特徴付け
２９３Ｔ細胞への一過性のトランスフェクションによって、ＡＣ１０ウイルス粒子およびｂＮＡｂ  ４Ｅ１０−ＬＲ１−Ｃ１に対する親和性が増大したＥｎｖ変異体を発現するウイルス粒子を産生した後、アルドリチオール−２（ＡＴ−２）により、以前に記載されたプロトコル（Ｒｏｓｓｉｏ，Ｊ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １  ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｗｉｔｈ  ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｏｆ  ｖｉｒｉｏｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２，７９９２−８００１，１９９８）に従って不活化した。ＡＴ−２により化学的に不活化したウイルス粒子とフロイントアジュバントとを用いて、異なる２群に免疫付与した。第１群の４匹にはＷＴウイルス（ＡＣ１０）、第２群の５匹にはＬＲ１−Ｃ１ウイルス粒子を筋肉内に接種した。両群に対し、ゼロ時（免疫付与前）、接種後２週間目、および２週間後の屠殺時に血清学的分析を行った。動物は特定病原体が除去された（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｆｒｅｅ：ＳＰＦ）状態で、標準的な食餌および水を自由に摂取し、制御された温度および湿度ならびに１２時間の光サイクルの下で維持した。この試験に用いた９被験体は、６ないし８週齢の雌であった。
【０１７９】
最初に、免疫付与したマウス由来の血清に対し、ウイルス産生に用いた２９３Ｔ細胞１×１０６によって、１時間室温にて回転させながら前吸収を行った。次に細胞をペレット化し、上清からＩｇＧを精製した。このように、免疫付与に用いたウイルスに含まれる細胞性タンパク質に対して産生された可能性のあるＮＡｂは除去され得た。
【０１８０】
免疫付与したマウスの二つの群から精製したＩｇＧを、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度にて、二つの異なるＨＩＶ−１初代分離株（分枝群Ｂ分離株および親ウイルスＡＣ１０ならびに分枝群Ｂ分離株ＮＬ４．３）、およびコントロールとして水疱性口内炎ウイルスに対する特異的な中和について試験した（表１）。中和活性は、免疫したマウス由来の精製ＩｇＧがウイルスの５０％を中和し得たか否かによって三通りに判定した。
【０１８１】
免疫付与したマウスの血清から精製したＩｇＧは、予想通りＶＳＶシュードタイプウイルスを中和せず、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ特異的なその他のウイルス分離株に対する中和が確認され、かつ細胞性タンパク質を認識する抗体の影響による感染の阻害がないことが確認された。ＬＲ１−Ｃ１によって免疫付与したマウスから精製したＩｇＧは、０．２ｍｇ／ｍｌの濃度にて、ＡＣ１０と比較して中程度に改善された中和の幅を示した。５種の血清のうち３種はＡＣ１０を中和することができ、そのうちの１種はＮＬ４．３を中和することもできたが、ＡＣ１０により免疫付与したマウスからは１種の血清のみがＡＣ１０を中和することができ、ＮＬ４．３は中和しなかった。
【０１８２】
【表５】
2015532591.tif 000006
【０１８３】
実施例３：ｎＡｂ  ４Ｅ１０による選択後のＬ１Ｌ２Ｌ３Ｒ１ライブラリーの調製および詳細な特徴付け
Ｉｎ−ｖｉｔｒｏランダム変異誘発。ＨＩＶ−１  ＡＣ−１０  ｅｎｖへの変異は、ＰＣＲに基づいた方法（Ｇｅｎｅｍｏｒｐｈ  ＩＩ  Ｒａｎｄｏｍ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カリフォルニア州、米国）を用いて導入した。キメラＨＩＶウイルス粒子のライブラリーＬ１Ｌ２Ｌ３は、無作為に変異させたエンベロープをｐＮＬ４−３プラスミドへ移入することによって作製した。移入は、ウイルス配列を保存した制限酵素部位の導入、ならびに酵素ＸｂａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｂｉｏｌａｂｓ；ＮＥＢ，英国）およびＮｏｔＩ（ＮＥＢ，英国）を用いた消化によって行った。
【０１８４】
クローニングおよびライブラリーウイルスの作製。ＰＣＲ産物は、Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の仕様書に従って用いることにより、ベクターｐＮＬ４．３内へクローン化した。ｐＮＬ４．３の組換えベクターは、ＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）Ｓｔｂｌ２（商標）コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ導入し、３ｍＬの容量で攪拌しながら３０℃で一晩（ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ  （ＯＮ））増殖させた。変異性の喪失を避けるために幾つかの形質転換を同時に行い、これらを混合して大量増幅させた（２５０ｍＬ、３０℃、攪拌しながらＯＮ）。インキュベーション後に２０μＬをプレートにまき、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した。産物をＸｂａＩおよびＮｏｔＩによってさらに消化し、エンベロープ遺伝子の存在を確認した。陽性の場合、クローンを配列決定するか、かつ／またはトランスフェクションに使用した。ｐＮＬ４．３コンストラクトを用いた２９３Ｔ細胞への一過性の共トランスフェクションにより、ウイルスを産生させた。トランスフェクション後２日目にウイルス粒子を含む細胞培養上清を回収し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｆｉｌｔｅｒ  ｕｎｉｔを用いてウイルス粒子を濃縮した。ウイルス粒子をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。
【０１８５】
ウイルス粒子捕捉アッセイ（ＶＣＡ）。マイクロタイターウェルを、ポリクローナル抗Ｆｃ（１００μｌのＰＢＳ中、５μｇ／ｍＬ）により、４℃にて一晩コートした。ウェルをＰＢＳ中の３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）により、３７℃にて１時間ブロックした。ライブラリー由来のウイルス１００μｌ（１０００ｎｇ／ｍＬ）を、固定化抗Ｆｃで予めコートされ、ブロックされたマイクロタイターウェルへ加えた。５μＬの捕捉４Ｅ１０ＭＡｂ（１００ｎｇ／ｍＬ）を対応するウェルに加え、プレートを３７℃にて攪拌（４５０ｒ．ｐ．ｍ）しながらインキュベートした。２時間のインキュベーション後にウェルをＰＢＳによって６回洗浄し、ｐ２４の酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によってウイルス当量を定量するか、またはＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を製造者の指示に従って用いることにより、ＲＮＡを抽出した。
【０１８６】
ネステッドＲＴ−ＰＣＲによるＨＩＶ−１  ｅｎｖ  ＲＮＡの増幅。分離したＨＩＶ−１  ｅｎｖ  ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲキット（ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）Ｇｏｌｄ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ）を用いた逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅した。８μＬの量の鋳型ＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ反応に用い、ＲＮＡをプライマー１０２（逆方向）によって５０℃にて２０分間逆転写した。５μＬの量のｃＤＮＡからプライマー１０１（順方向）および１０４（逆方向）を用い、それに続いて２μＬの量の鋳型からプライマー１７９（順方向）および１８０（逆方向）を用いたネステッドＰＣＲによってｅｎｖ領域を増幅した。両方のｅｎｖ増幅ＰＣＲの条件は以下のとおりであった：９４℃２分を１サイクル；９４℃２分、５５℃１分、および７２℃３分を３５サイクル；７２℃７分を１サイクル；および４℃にて保持。得られたアンプリコン（２５８３ｂｐ）を、１Ｋｂ分子量マーカーと共に、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎによって染色した１．０％アガロースゲル内で電気泳動した。
【０１８７】
クローニングおよびライブラリーＬ１Ｌ２Ｌ３Ｒ１。ＰＣＲ産物のｐＮＬ４．３ベクター内へのクローニング、およびそれぞれによるＳｔｂｌ２コンピテント細胞の形質転換は上記のように行った。ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを精製した後、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩによりさらに消化して、エンベロープ遺伝子の存在を確認した。Ｍａｂ  ４Ｅ１０による選択後に得たこの新規ライブラリーを、Ｌ１Ｌ２Ｌ３Ｒ１と命名した。
【０１８８】
ディープシーケンシング。次に全般的手順の１０．に記載したディープシーケンシングを用いて、ライブラリーＬ１Ｌ２Ｌ３Ｒ１を詳細に特徴付けた（図６〜１２を参照されたい）。
【０１８９】
本明細書において、上で言及したすべての刊行物は、その全体が参照によって本明細書に取り込まれる。
【０１９０】
上記の発明は、明確さと理解のために幾つかの詳細な内容を記載しているが、この開示を読んだ当業者は、本発明の真の範囲および添付の請求項から逸脱することなく、形態および細部に様々な変更が為されてよいことを理解するであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ−１】
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【図１２Ａ−２】
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【図１２Ｂ−１】
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【図１２Ｂ−２】
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【図１２Ｃ−１】
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【図１２Ｃ−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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