(57)【要約】  本明細書では、第１の定常ドメインポリペプチドに結合される第１の単鎖Ｆｖポリペプチドを含む第１の単量体ポチペプチドと、第２の定常ドメインポチペプチドに結合した第２の単鎖Ｆｖポリペプチドを含む第２の単量体ポリペプチドとを含み、各定常ドメインポリペプチドは、ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の少なくとも１つを含み、この第１の定常ドメインポリペプチドおよび第２の定常ドメインポリペプチドは、Ｆｃ領域を形成する、単離型免疫グロブリン構築物が開示される。【選択図】図１Ａ
2015531751.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫グロブリン構築物であって、
免疫グロブリン重鎖由来の可変領域ポリペプチド（ＶＨ）と、
免疫グロブリン軽鎖由来の可変領域ポリペプチド（ＶＬ）と、
免疫グロブリン軽鎖由来の定常領域ポリペプチド（ＣＬ）と、
免疫グロブリン重鎖由来の定常領域ポチペプチド（ＣＨ１）と
を含む単鎖Ｆａｂ領域（ｓｃＦａｂ）を含み、
前記ＶＨと前記ＶＬとが、第１のリンカーにより結合され、単鎖Ｆｖ構築物（ｓｃＦｖ）を形成する、
免疫グロブリン構築物。
【請求項２】
前記ＣＬと前記ＣＨ１が、第２のリンカーにより結合される、請求項１記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項３】
前記単鎖Ｆａｂ領域が、ＶＨ−Ｌ１−ＶＬ−ＣＬ−Ｌ２−ＣＨ１を含む配列を有し、Ｌ１およびＬ２が第１のリンカーおよび第２のリンカーである、請求項１または２記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項４】
前記単鎖Ｆａｂ領域が、ＶＨ−Ｌ１−ＶＬ−Ｌ３−ＣＬ−Ｌ２−ＣＨ１を含む配列を有し、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３が、リンカーである、請求項１または２記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項５】
前記単鎖Ｆａｂ領域が、ＶＬ−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−Ｌ５−ＣＬを含む配列を有し、Ｌ４およびＬ５がリンカーである、請求項１または２記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項６】
各リンカーが、約１〜約１００のアミノ酸を含むポリペプチドである、請求項１〜５のいずれか１項記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項７】
前記リンカーが、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＧｌｕ（Ｅ）から選択されるアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む、請求項６記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項８】
前記リンカーは、式（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎのポリペプチドから構成され、式中、ｎが４〜１０の整数である、請求項７記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項９】
免疫グロブリン構築物であって、
免疫グロブリン重鎖由来の可変領域ポリペプチド（ＶＨ）と、
免疫グロブリン軽鎖由来の可変領域ポリペプチド（ＶＬ）と、
免疫グロブリン軽鎖由来の定常領域ポリペプチド（ＣＬ）と、
免疫グロブリン重鎖由来の定常領域ポチペプチド（ＣＨ１）と
を含み、
前記ＶＨと前記ＣＬとが、リンカーポリペプチドにより結合され、前記リンカーポリペプチドが、らせん構造を形成する性向を示す、
免疫グロブリン構築物。
【請求項１０】
前記単鎖Ｆａｂポリペプチドが、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ８−ＶＨ−ＣＨ１を含む配列を有し、Ｌ８が、らせん構造を形成する性向を有するポリペプチドである、請求項９記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項１１】
前記リンカーポリペプチドが、αへリックス、ポリプロリンＩへリックス、ポリプロリンＩＩへリックス、および３１０へリックスの少なくとも１つを形成する、請求項９または１０記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項１２】
前記リンカーが、約１〜約２０巻きのらせんを形成する、請求項１１記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項１３】
前記リンカーが、らせんを安定化させる相互作用を形成する少なくとも一対のアミノ酸を含む、請求項９〜１２のいずれか１項記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項１４】
前記らせんを安定化させる相互作用が、電荷間相互作用、カチオン−π相互作用、疎水性相互作用、およびサイズコンプリメンタリィ相互作用（ｓｉｚｅ  ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の内の少なくとも１つである、請求項１３記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項１５】
前記リンカーポリペプチドが、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｖａｌ（Ｖ）、およびＩｌｅ（Ｉ）から選択されるアミノ酸を含む、請求項９〜１４のいずれか１項記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項１６】
前記リンカーが、少なくとも１つの（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）ｎモチーフを含むアミノ酸配列を有し、式中、ｎが１〜１０の整数である、、請求項１５記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項１７】
免疫グロブリン構築物であって、
請求項１〜１６のいずれか１項記載の第１のｓｃＦａｂと、第１のＣＨ３領域を含む第１の重鎖ポリペプチドとを含む第１のポリペプチド構築物と、
第２のＣＨ３領域を含む第２の重鎖ポリペプチドを含む、第２のポリペプチド構築物と
を含み、
前記第１の重鎖ポリペプチドおよび前記第２の重鎖ポリペプチドの少なくとも１つが、ヘテロダイマーの形成を促進する変異型ＣＨ３領域を任意に含む、
免疫グロブリン構築物。
【請求項１８】
前記第１のポリペプチド構築物および前記第２のポリペプチド構築物が、抗原結合ポリペプチド構築物をさらに含む、請求項１７記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項１９】
前記抗原結合ポリペプチド構築物が、ｓｃＦｖまたはｓｃＦａｂの少なくとも１つである、請求項１８記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項２０】
前記ｓｃＦａｂが、請求項１〜１６のいずれか１項記載のｓｃＦａｂである、請求項１９記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項２１】
前記第１の重鎖ポリペプチドおよび前記第２の重鎖ポリペプチドが、ヘテロダイマーＦｃを形成する、請求項１６〜２０のいずれか１項記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項２２】
前記ヘテロダイマーＦｃが、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む変異型免疫グロブリンのＣＨ３ドメインを含む、請求項２１記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのアミノ酸変異が、天然のホモダイマーＦｃと比較可能な安定性を有する前記ヘテロダイマーＦｃの形成を促進する、請求項２２記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項２４】
前記変異型ＣＨ３ドメインが、約７３℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する、請求項２２または２３記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項２５】
前記ヘテロダイマーＦｃが、少なくとも約７０％の純度で形成される、請求項２２または２３記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項２６】
前記ヘテロダイマーＦｃが、少なくとも約７０％の純度で形成され、前記Ｔｍが少なくとも約７３℃である、請求項２２〜２５のいずれか１項記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項２７】
前記ヘテロダイマーＦｃが、少なくとも約７５％の純度で形成され、前記Ｔｍが約７５℃である、請求項２２〜２５のいずれか１項記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項２８】
前記第１の重鎖ポリペプチドおよび前記第２の重鎖ポリペプチドの少なくとも１つが、前記Ｆｃガンマ受容体の少なくとも１つへの選択的結合を促進するためのアミノ酸変異を含む変異型ＣＨ２ドメインをさらに含む、請求項１７〜２７のいずれか１項記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項２９】
前記第１の重鎖ポリペプチドおよび前記第２の重鎖ポリペプチドの少なくとも１つが、前記Ｆｃガンマ受容体の少なくとも１つへの機能的に有効な結合を防止するアミノ酸修飾を含む変異型ＣＨ２ドメインまたはヒンジを含む、請求項１７〜２８のいずれか１項記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項３０】
前記Ｆｃ領域がグリコシル化される、請求項１７〜２９のいずれか１項記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項３１】
前記Ｆｃ領域がアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）される、請求項１７〜３０のいずれか１項記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項３２】
前記免疫グロブリン構築物が、多重特異性免疫グロブリン構築物である、請求項１７〜３１のいずれか１項記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項３３】
前記免疫グロブリン構築物が、二重特異性である、請求項３２記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項３４】
免疫グロブリン構築物であって、
第１の定常ドメインポリペプチドにリンカーにより結合される第１の単鎖Ｆｖポリペプチドを含む、第１の単量体ポリぺプチドと、
前記第１のＦｖポリペプチドと異なり、前記第１の定常ドメインポリペプチドと異なる第２の定常ドメインポリペプチドにリンカーにより結合される第２の単鎖Ｆｖポリペプチドを含む、第２の単量体ポチペプチドと
を含み、
前記定常ドメインポリペプチドのそれぞれが、ＣＬ領域、ＣＨ１領域、およびＣＨ３領域、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の少なくとも１つを含み、
前記ＣＬ領域と前記ＣＨ１領域とが、リンカーにより結合され、前記第１の定常ドメインポリペプチドと前記第２の定常ドメインポリペプチドとが、Ｆｃ領域を形成する、
免疫グロブリン構築物。
【請求項３５】
前記構築物が、ＣＨ２ドメインを一切含まない、請求項３４記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項３６】
免疫グロブリン構築物であって、
第１の定常ドメインポリペプチドと融合する第１のｓｃＦａｂポリペプチドを含む第１の単量体ポチペプチドと、
前記第１のＦａｂポリペプチドと異なり、第２の定常ドメインポリペプチドと融合する第２のｓｃＦａｂポリペプチドを含む、第２の単量体ポチペプチドと
を含み、
前記第１のｓｃＦａｂポリペプチドおよび前記第２のｓｃＦａｂポリペプチドの少なくとも１つが、らせん構造を形成する性向を備えたリンカーポリペプチドを含み、
前記第１の定常ドメインポリペプチドおよび前記第２の定常ドメインポリペプチドが、天然のホモダイマーＦｃと比較可能な安定性を有する前記ヘテロダイマーの形成を促進する、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む変異型免疫グロブリンＣＨ３領域を含む、ヘテロダイマーＦｃ領域を形成する、
免疫グロブリン構築物。
【請求項３７】
前記構築物が、抗原を発現する少なくとも１つの細胞と結合でき、前記細胞が、白血球、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、内皮下細胞、乳房、胃、子宮、神経、筋肉、分泌細胞および生殖細胞などの免疫細胞を含む一覧から選択される、請求項１７〜３６のいずれか１項記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項３８】
前記構築物が、抗原を発現する少なくとも１つの細胞と結合でき、前記細胞が、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞を含む一覧から選択される、請求項１７〜３６のいずれか１項記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項３９】
前記Ｔ細胞がヒト細胞である、請求項３８記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項４０】
前記Ｔ細胞が非ヒト哺乳動物細胞である、請求項３８記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項４１】
前記少なくとも１つの細胞が疾患と関連する、請求項３８記載の単離型免疫グロブリン構築物。
【請求項４２】
前記疾患が、骨髄腫、芽腫、乳頭腫、腺腫、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫および神経膠腫から選択される癌である、請求項４１記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項４３】
前記癌が、扁平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、骨肉腫および柔組織肉腫の少なくとも１つである、請求項４２記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの細胞が、自己免疫応答性細胞である、請求項３８記載の免疫グロブリン構築物。
【請求項４５】
前記免疫グロブリン構築物をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、請求項１〜４４のいずれか１項記載の免疫グロブリン構築物を発現する少なくとも１つのベクターを含む、組成物。
【請求項４６】
安定した哺乳動物細胞中で、請求項１〜４４のいずれか１項記載の免疫グロブリン構築物を含む発現生成物を生成する方法であって、前記方法は、
安定した哺乳動物細胞を産生するために前記免疫グロブリン構築物をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列で少なくとも１つの哺乳動物細胞をトランスフェクトすることと、
前記免疫グロブリン構築物を含む前記発現生成物を産生する前記安定した哺乳動物細胞を培養することと
を含む、方法。
【請求項４７】
前記哺乳動物細胞が、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＮＳ０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、Ｃａｃｏ−２およびＭＤＣＫ細胞、ならびにそのサブクラスおよび変異体からなる群から選択される、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
請求項１〜４４のいずれか１項に定義される単離型免疫グロブリン構築物、および適切な賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項４９】
請求項４８記載の薬学的組成物の製造方法であって、
請求項１〜４４のいずれか１項で定義されるような免疫グロブリン構築物の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、
前記培養物から産生した免疫グロブリン構築物を回収することと、
薬学的組成物を生成することと
を包含する工程。
【請求項５０】
それを必要とする哺乳動物における癌の処置方法であって、有効量の請求項４８記載の薬学的組成物を含む組成物を哺乳動物に投与することを包含する方法。
【請求項５１】
前記癌が固形腫瘍である、請求項４８記載の方法。
【請求項５２】
前記固形腫瘍が肉腫、癌腫およびリンパ腫のうちの１つ以上である、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
前記癌が、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および白血病のうちの１つ以上である請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
それを必要とする哺乳動物における自己免疫症状の処置方法であって、有効量の請求項４８で提供される薬学的組成物を含む組成物を前記哺乳動物に投与することを包含する方法。
【請求項５５】
前記自己免疫症状が、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、乾癬性関節炎、乾癬、血管炎、ブドウ膜炎、クローン病、および１型糖尿病のうちの１つ以上である、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
それを必要とする哺乳動物における炎症性症状の処置方法であって、請求項４８で提供される薬学的組成物を含む組成物を前記哺乳動物に投与することを包含する方法。
【請求項５７】
請求項１〜４４のいずれか１項で定義されるような免疫グロブリン構築物を含むキット、ならびにその使用説明書。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許出願６１／６７４，８２０（２０１２年７月２３日出願）および米国特許出願６１／８５７，６５２（２０１３年７月２３日出願）（各記載内容は参照により本明細書中で援用される）の利益を主張する。
【０００２】
本発明の技術分野
本発明の技術分野は、生物学的療法のカスタム開発のための免疫グロブリン構築物の合理的設計である。
【背景技術】
【０００３】
治療用モノクローナル抗体（Ｍａｂ）は、ヒトの疾患を治療するために広く使用されている。しかしながら、たった１つの抗原を標的化することは、腫瘍学のような指標では通常不十分であり、腫瘍は潜伏期の後に進行する。既存の抗体をＩｇＧ様の二重特異性に変換する一般的な方法が存在すれば、二重特異性抗体の臨床開発が非常に容易となるであろう。初期の抗体改変から、同時に２つの異なる標的を結合できるような抗体の産生が広く関心を集めてきた。四価ＩｇＧ‐単鎖可変性フラグメント（ｓｃＦｖ）融合物、カツマキソマブ、三機能ラット／マウスハイブリット二重特異性上皮細胞接着分子―ＣＤ３抗体、二重特異性ＣＤ１９−ＣＤ３  ｓｃＦｖ抗体、ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ、「重作用（Ｄｕａｌ  Ａｃｔｉｎｇ）」ＦＡｂ抗体などの二重特異性抗体、ＩｇＧ様二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ‐Ｉｇ）などの四価二重特異性形態の抗体が当業者によく知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの手法は、免疫原性、不十分な薬物動態特性、またはＦｃ（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ）領域の欠損により引き起こされるエフェクター機能などの喪失などによって制限され、免疫原性非ヒトドメインを潜在的に含む可能性がある。最も一般的な形態は、天然ＩｇＧタンパク質の構築物からかなり逸脱していており、あるいは、入手可能な抗体に基づく一般的な方法では、安定した二重特異性ＩｇＧ抗体の特性に適合させることができない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
免疫グロブリン重鎖由来の可変領域ポリペプチド（ＶＨ）、免疫グロブリン軽鎖由来の可変領域ポリペプチド（ＶＬ）、免疫グロブリン軽鎖由来の定常領域ポリペプチド（ＣＬ）、および免疫グロブリン重鎖由来の定常領域ポリペプチド（ＣＨ１）を含む単鎖Ｆａｂ領域（ＳｃＦａｂ）を含む免疫グロブリン構築物であって、ＶＨポリペプチドとＶＬポリペプチドとが、第１のリンカーにより結合され、単鎖Ｆｖ構築物（ｓｃＦｖ）を形成する、免疫グロブリン構築物が、本明細書中で提供される。一部の実施形態では、ＣＬとＣＨ１とは、第２のリンカーにより結合される。ある実施形態では、免疫グロブリン構築物は、ＶＨ−Ｌ１−ＶＬ−ＣＬ−Ｌ２−ＣＨ１を含む配列であって、Ｌ１およびＬ２が第１のリンカーおよび第２のリンカーである、配列を有する。ある実施形態では、免疫グロブリン構築物は、ＶＨ−Ｌ１−ＶＬ−Ｌ３−ＣＬ−Ｌ２−ＣＨ１を含む配列であって、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３がリンカーである、配列を有する。一実施形態では、免疫グロブリン構築物は、ＶＬ−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−Ｌ５−ＣＬを含む配列であって、Ｌ４およびＬ５がリンカーである、配列を有する。このような実施形態の構築物は、本明細書中で代替的に軽鎖挿入断片（ＬＣＩ）を指す。
【０００６】
ある実施形態では、各リンカーは、約１〜約１００のアミノ酸を含むポリペプチドである。一部の実施形態では、このリンカーは、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＧｌｕ（Ｅ）から選択されるアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このリンカーは、式（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎのポリペプチドであって、式中ｎが４〜１０の整数であるポリペプチドを含む。
【０００７】
本明細書では、免疫グロブリン重鎖由来の可変領域ポリペプチド（ＶＨ）、免疫グロブリン軽鎖由来の可変領域ポリペプチド（ＶＬ）、免疫グロブリン軽鎖由来の定常領域ポリペプチド（ＣＬ）、および免疫グロブリン重鎖由来の定常領域ポリペプチド（ＣＨ１）を含む単鎖Ｆａｂ領域（ＳｃＦａｂ）を含む単離型免疫グロブリングロブリン構築物であって、このＶＨおよびＣＬがリンカーポリペプチドにより結合され、このリンカーポリペプチドが、らせん構造を形成する性向を示す、単離型免疫グロブリン構築物を提供する。一部の実施形態では、この単鎖Ｆａｂポリペプチドは、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ８−ＶＨ−ＣＨ１を含む配列であって、Ｌ８は、らせん構造を形成する性向を伴うリンカーである、配列を有する。一部の実施形態では、リンカーの少なくとも約２５％がらせん形態で存在する。一部の実施形態では、リンカーの少なくとも約５０％がらせん形態で存在する。ある他の実施形態では、リンカーの少なくとも約６０％がらせん形態で存在する。別の実施形態では、リンカーの少なくとも約７５％がらせん形態で存在する。別の実施形態では、リンカーの少なくとも約８０％がらせん形態で存在する。さらなる実施形態では、リンカーの約９０％がらせん形態で存在する。さらなる実施形態では、リンカーの約９５％がらせん形態で存在する。ある実施形態では、リンカーは複数のらせん状のセグメントを含む。
【０００８】
本明細書に記載される免疫グロブリン構築物であって、リンカーポリペプチドが、αへリックス、ポリプロリンＩへリックス、ポリプロリンＩＩへリックス、および３１０へリックスの少なくとも１つを形成する免疫グロブリン構築物を提供する。一部の実施形態では、リンカーは、約１〜約２０巻きのらせんを形成する。一実施形態では、リンカーは、約３〜５巻きのらせんを形成する。一実施形態では、リンカーは、約２〜４巻きのらせんを形成する。一実施形態では、リンカーは、約２〜１０巻きのらせんを形成する。一部の実施形態では、リンカーは、らせんを安定化させる相互作用を形成する少なくとも１対のアミノ酸を含む。一実施形態では、らせんを安定化させる相互作用は、電荷間相互作用、カチオン−π相互作用、疎水性相互作用、およびサイズコンプリメンタリィ相互作用（ｓｉｚｅ  ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の内の少なくとも１つである。
【０００９】
本明細書に記載される単離型免疫グロブリン構築物であって、この構築物は、らせんを形成する性向を有する少なくとも１つのリンカーポリペプチドを含み、このリンカーポリペプチドは、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ  （Ｋ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｖａｌ（Ｖ）、およびＩｌｅ（Ｉ）から選択されるアミノ酸を含む、単離型免疫グロブリン構築物が提供される。ある実施形態では、このリンカーポリペプチドは、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、およびＬｙｓ（Ｋ）から選択されるアミノ酸を含む。一実施形態では、リンカーは、少なくとも１つのＰｒｏ（Ｐ）残基を含む。ある実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）ｎモチーフであって、式中ｎが１〜１０の整数である、モチーフを含むアミノ酸配列を有する。
【００１０】
本明細書では、免疫グロブリン構築物であって、本明細書に記載される第１のｓｃＦａｂを含む第１のポリペプチド構築物と、第１のＣＨ３領域を含む第１の重鎖ポリペプチドと、第２のＣＨ３領域を含む第２の重鎖ポリペプチドを含む第２のポリペプチド構築物とを含む免疫グロブリン構築物であって、この第１の重鎖ポリペプチドおよび第２の重鎖ポリペプチドの少なくとも１つが、ヘテロダイマーの形成を促進する変異型ＣＨ３領域を任意に含む、免疫グロブリン構築物を提供する。一部の実施形態では、この第１のポリペプチド構築物および第２のポリペプチド構築物は、抗原結合ポリペプチド構築物をさらに含む。一実施形態は、この抗原結合ポリペプチド構築物は、ｓｃＦｖまたはｓｃＦａｂの少なくとも１つである。一部の実施形態では、このｓｃＦａｂは、本明細書に記載されるｓｃＦａｂである。
【００１１】
一部の実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドおよび第２の重鎖ポリペプチドは、ヘテロダイマーＦｃを形成する。ある実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む変異型免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む。ある実施形態では、この少なくとも１つのアミノ酸変異は、天然のホモダイマーＦｃと比較可能な安定性を有するヘテロダイマーＦｃの形成を促進する。一実施形態では、変異型ＣＨ３ドメインは、約７３℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。一実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、少なくとも約７０％の純度で形成される。一部の実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、少なくとも約７０％の純度で形成され、ＴＭが少なくとも約７３℃である。別の実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、少なくとも約７５％の純度で形成され、Ｔｍが約７５℃である。
【００１２】
本明細書に記載される免疫グロブリン構築物であって、この第１の重鎖ポリペプチドおよび第２の重鎖ポリペプチドが、Ｆｃガンマ受容体の少なくとも１つとの選択的な結合を促進するアミノ酸修飾を含む変異型ＣＨ２ドメインをさらに含む、免疫グロブリン構築物が提供される。一実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドおよび第２の重鎖ポリペプチドの少なくとも１つが、少なくとも１つのＦｃガンマ受容体への機能的に有効な結合を防止するアミノ酸修飾を含む変異型ＣＨ２ドメインまたはヒンジを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、グリコシル化されている。一部の実施形態では、Ｆｃ領域はアグリコシル化（ａｇｌｙｃｏｓｉｌａｔｅｄ）されている。一実施形態では、Ｆｃ領域はフコシル化されている。別の実施形態では、Ｆｃ領域はアフコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）されている。
【００１３】
一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物であって、多重特異性免疫グロブリン構築物である、免疫グロブリン構築物が記載される。一実施形態では、この免疫グロブリン構築物は、二重特異性である。
【００１４】
単離型免疫グロブリン構築物であって、第１の定常ドメインポチペプチドにリンカーにより結合した第１の単鎖Ｆｖポリペプチドを含む第１の単量体ポリペプチドと、第１のＦｖポリペプチドと異なり、第２の定常ドメインポリペプチドにリンカーにより結合する第２の単鎖Ｆｖポリペプチドを含む第２の単量体ポリペプチドとを含み、各定常領域ドメインポリペプチドは、ＣＬ領域、ＣＨ１領域、およびＣＨ３領域、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の内の少なくとも１つを含み、ＣＬおよびＣＨ１領域が、リンカーにより結合され、この第１の定常ドメインポリペプチドおよび第２の定常ドメインポリペプチドが、Ｆｃ領域を形成する、単離型免疫グロブリン構築物が提供される。一部の実施形態では、前記構築物は、ＣＨ２ドメインを一切含まない。一部の実施形態では、第１の定常ドメインポリペプチド由来のＣＨ３ドメインは、第２の定常ドメインポリペプチド由来のＣＨ３ドメインと異なり、かつ、第１の定常ドメインポリペプチドおよび第２の定常ドメインポリペプチドＣＨ３ドメインが、安定したヘテロダイマーＦｃを形成するために対を形成する。
【００１５】
一実施形態では、単離型免疫グロブリン構築物であって、第１の定常ドメインポリペプチドに融合した第１のｓｃＦａｂポリペプチドを含む第１の単量体ポリペプチドと、第１のＦａｂポリペプチドと異なり、第２の定常ドメインポリペプチドに融合する第２のｓｃＦａｂポリペプチドを含む第２の単量体ポリペプチドとを含み、第１のｓｃＦａｂポリペプチドおよび第２のｓｃＦａｂポリペプチドの少なくとも１つが、らせん構造を形成する性向を有するリンカーポリペプチドを含み、第１の定常ドメインポリペプチドおよび第２の定常ドメインポリペプチドが、天然のホモダイマーＦｃと比較可能な安定性を有するヘテロダイマーの形成を促進する少なくとも１つのアミノ酸変異を含む変異型免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロダイマーＦｃ領域を形成する、単離型免疫グロブリン構築物が提供される。
【００１６】
本明細書に記載される免疫グロブリン構築物であって、この構築物が、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、組織因子、およびＣＤ１６aから選択される少なくとも１つの標的抗原と結合する、免疫グロブリン構築物が提供される。ある実施形態では、本明細書中に記載される免疫構築物は、免疫細胞、白血球、内皮下細胞、または癌細胞により発現される少なくとも１つの抗原と結合する。ある実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物は、Ｔ細胞により発現される抗原と結合する。一部の実施形態では、このＴ細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、およびＣＤ１６ａ＋ナチュラルキラーＴ細胞の内の少なくとも１つである。ある実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物は、Ｂ細胞により発現される抗原と結合する。一部の実施形態では、このＢ細胞は、ＣＤ１９＋および癌細胞である。ある実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物は、ＨＥＲ２などの癌細胞により発現される抗原と結合する。一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物は、組織因子などの内皮下細胞または白血球により発現される抗原と結合する。
【００１７】
一実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物であって、この構築物が、少なくとも１つのＴ細胞またはナチュラルキラー細胞、およびある抗原を発現する少なくとも１つの他の細胞と結合できる、免疫グロブリン構築物が提供される。一実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物であって、この構築物が、少なくとも１つのＴ細胞および少なくとも１つのＢ細胞と結合できる、免疫グロブリン構築物が提供される。一部の実施形態では、Ｔ細胞はヒトの細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞は非ヒトの哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物は、ある疾患に関連する細胞上で発現する抗原と結合する。一部の実施形態では、この疾患は癌である。一実施形態では、この癌は、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫および神経膠腫から選択される癌である。一実施形態では、この癌は、肉腫、芽腫、乳頭腫、および腺腫の少なくとも１つである。一部の実施形態では、癌は、扁平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、骨肉腫および柔組織肉腫の少なくとも１つである。
【００１８】
一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物は、自己免疫反応性細胞であるうちの少なくとも１つの細胞上の抗原に結合する。一部の実施形態では、この自己免疫反応性細胞は、リンパ球細胞または骨髄系細胞である。
【００１９】
本明細書では、本明細書に記載される単離型免疫グロブリン構築物と、適切な賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。
【００２０】
一実施形態は、本明細書に記載される薬学的組成物の製造工程であり、この工程は、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、薬学的組成物を生成することとを含む。
【００２１】
それを必要とする哺乳動物における癌の処置方法であって、有効量の本明細書中に記載の薬学的組成物を含む組成物を哺乳動物に投与することを包含する方法が提供される。また、それを必要とする哺乳動物の癌処置において、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物の使用であって、本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物の有効量を含む組成物を哺乳動物に投与することを含む使用が提供される。一実施形態では、前記癌は固形腫瘍である。一部の実施形態では、前記固形腫瘍は肉腫、癌腫およびリンパ腫のうちの１つ以上である。一実施形態では癌は、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫および白血病のうちの１つ以上である。
【００２２】
本明細書では、それを必要とする哺乳動物における自己免疫症状の処置方法であって、有効量の本明細書中で提供される有効量の薬学的組成物を含む組成物を前記哺乳動物に投与することを包含する方法が提供される。また、自己免疫疾患の処置において、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物の使用であって、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物の有効量を含む組成物を提供することを含む、使用を提供する。一部の実施形態では前記自己免疫症状は、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、乾癬性関節炎、乾癬、血管炎、ブドウ膜炎、クローン病、および１型糖尿病のうちの１つ以上である。
【００２３】
それを必要とする哺乳動物における炎症性症状の処置方法であって、本明細書に記載される有効量の薬学的組成物を含む組成物を前記哺乳動物に投与することを包含する方法が提供される。また、個体の炎症性症状の処置における免疫グロブリン構築物の使用であって、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物の有効量をこの個体に提供することを含む、使用が提供される。
【００２４】
本明細書で、本明細書に定義される免疫グロブリン構築物を含むキット、ならびにその使用説明書が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
［図1Ａ〜1Ｂ］基準となるＩｇＧ１抗体構造（図１Ａ）および不斉二重特異性抗体（図１Ｂ）の図形表示を提供する。図１Ａでは、２つのフラグメント抗原結合（Ｆａｂ）アームのうちの１つは、挿入ボックスで強調されている。この軽鎖は、
【化１】
2015531751.tif 000003
諧調により表され、重鎖は、
【化２】
2015531751.tif 000004
諧調により表される。異なる鎖の間のジスルフィド結合は、点線で表示される。この重鎖のＣＨ１ドメインは、Ｆｃを生じる第２の重鎖との組み合わせに関与するＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインに続いてリンカーに導かれる。この分子は、通常のモノクローナル抗体様ＩｇＧ１の２つの重鎖間で軸対称となっているのに対し、非対称性の二重特異性抗体の目的は、２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖の選択的組み合わせに関与する抗体様分子を作成することである。この非対称性二重特異性抗体は、図１Ｂの別々の鎖のパターンにより表され、第２の重鎖は、
【化３】
2015531751.tif 000005
諧調により表され、第２の軽鎖は、
【化４】
2015531751.tif 000006
諧調により表される。
［図８Ｂ］同上
［図２］定常ドメインポリペプチドに結合する単鎖Ｆvポリペプチドの設計の図形表示である。この図は、リンカーがＶＨのＣ末端およびＶＬのＮ末端の間に導入されていることを示している。さらに、第２のリンカーは、ＣＬのＣ末端、およびＣＨ１ドメインのＮ末端の間に導入されている。これらのリンカーは、天然のＦａｂ様抗原結合を与えるＶＬ−ＶＨ幾何学的構造をドメイン間に再構成するように選択される。
［図３］それぞれが定常ドメインポチペプチドに結合した単鎖Ｆvポリペプチドを含む２つの単量体ポリペプチドを含む、二重特異性免疫グロブリン構築物の図形表示を提供する。
［図４］軽鎖が、重鎖のＮ末端に融合し、それにより、ＶＬ−ＣＬ−ＶＨ−ＣＨ１ドメインを含む単鎖としてＦａｂを発現する単鎖Ｆａｂのデザインの図形表示を提供する。ＶＬおよびＶＨドメインは対となり、ＣＬおよびＣＨ１は対となる。
［図５］ＦａｂがＶＬ−ＣＬ−ＶＨ−ＣＨ１ドメインを含む単鎖Ｆａｂである単鎖Ｆａｂで改変した２つの異なる単鎖Ｆａｂセグメントの使用に基づく非対称性二重特異性分子の図形表示を提供する。
［図６Ａ］以下の軽鎖挿入断片（ＬＣＩ）（６Ａ〜６Ｃ）および長いリンカー（ＬＬ）形態（６Ｄ〜６Ｆ）において３つの異なるｓｃＦａｂ（４Ｄ５、ＴＦ、およびＮＭ３Ｅ）の発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。
［図６Ｂ］同上
［図６Ｃ］同上
［図６Ｄ］同上
［図６Ｅ］同上
［図６Ｆ］同上
［図６Ｇ］異なるリンカー挿入断片でｓｃＦａｂ  ＮＭ３Ｅ２のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
［図７］低減条件および非低減条件における各調整物由来のサイズ排除クロマトグラフィーにより単離される単量体単鎖Ｆａｂ種を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルを示す。
［図８Ａ］抗原結合（ＥＬＩＳＡ）を示す。ＴＦに結合するｓｃＦａｂ（Ｄ３Ｈ４４のＬＬおよびＬＣＬ型、ｖ６６５および６７３）、および対照Ｆａｂ（ｖ６９６）。ＨＥＲ２に結合するｓｃＦａｂ（４Ｄ５のＬＬおよびＬＣＬ型、ｖ６５４および６５６）、および対照Ｆａｂ（ｖ６９５）。
［図８Ｂ］同上
［図９Ａ］異なる変異体にて実施される示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を示す。すべてのＤＳＣの実験は、ＧＥまたはＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ熱量側的器具を使用して実施した。
［図９Ｂ］同上
［図９Ｃ］同上
［図９Ｄ］同上
［図９Ｅ］同上
［図１０］単鎖Ｆａｂ形態のベンチトップ安定性アッセイを示す。左図：第１日目：中央図：第３日目、右図：第７日目。結果から、すべての単鎖Ｆａｂ試料は、週単位の試験の間、使用される相対希釈濃度で、再多量体化しないことが示される。
［図１１］単量体二価ｓｃＭａｂ（ヘテロダイマーＦｃ）の発現を示す。
［図１２］ｓｃＭａｂのベンチトップ安定性を例示する、変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
［図１２Ｂ］同上
［図１２Ｃ］同上
［図１３］ＣＨＯ細胞株中の二価二重特異性ｓｃＭａｂ（ヘテロダイマーＦｃ）の発現および精製を示す。
［図１４Ａ］二重特異性ｓｃＭａｂ（ＬＬ／ＬＬ）のＳＥＣプロファイルおよびＳＰＲサンドイッチアッセイを示す。
［図１４Ｂ］同上
［図１４Ｃ］同上
［図１４Ｄ］同上
［図１５Ａ］二重特異性ｓｃＭａｂ（ＬＣＩ／ＬＣＩ）のＳＥＣプロファイルおよびＳＰＲサンドイッチアッセイを示す。
［図１５Ｂ］同上
［図１５Ｃ］同上
［図１６Ａ〜１６Ｃ］二重特異性ｓｃＭａｂ（ＬＣＩ／ＬＣＩ：１３５８；ＬＣＩ／ＬＬ：１３５９）のＳＥＣおよび標的結合のプロファイルを示す。
［図１６Ｂ］同上
［図１６Ｃ］同上
［図１７］スケールアップおよび精製後のＤ３Ｈ４４および４Ｄ５  ｓｃＦａｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
［図１８］ＣＤ３／ＣＤ１９、二価二重特異性ＳｃＭａｂのＳＤＳ−ＰＡＧＥ発現分析を示す。Ａ、Ｂ、およびＣは、発現に使用した鎖Ｂに対する鎖Ａの比率を表す。比率Ａ＝鎖Ａ／鎖Ｂ＝１：１、Ａ／Ｂ＝５０％／５０％であり、比率Ｂ＝鎖Ａ／鎖Ｂ＝２：１、Ａ／Ｂ＝６６％、３４％であり、比率Ｃ＝鎖Ａ／鎖Ｂ＝１：２、Ａ／Ｂ＝３４％／６６％である。
［図１９］軽鎖挿入断片形態の分子モデルである。ＶＬおよびＶＬドメイン、ならびにＣＬおよびＣＨ１ドメインと結合する多様な長さのリンカーを導入することができる。重鎖（．．．ＶＳＳＡＳＴＫＧ）の本来の肘型配列に位置するペプチド結合の位置の１つに切断を導入して、軽鎖挿入断片形態を得るために必要とされる配列トポロジーを可能とすることができる。一部の実施形態では、少数の残基が、この肘型領域の切断部位から除去されてもよい。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
従来より、各特異性で、単量体の二価抗体を発現する２つのハイブリドーマ細胞株を融合するなどの戦略を含む二重特異性抗体の産生（「クアドローマ技術」）が試みられている（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ，  Ｃｕｅｌｌｏ  ＡＣ  （１９８３）  Ｈｙｂｒｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７-５４０）。しかしながら、Ｍｉｌｓｔｅｉｎにより記載される戦略に関わる異なる２つの重鎖および異なる２つの軽鎖が同時に発現することにより、少量のみの望ましい二重特異性抗体を含む１０のほぼ同一であって、ほぼ分離することのできない化合物の混合物が得られることが直ちに明らかとなった（Ｓｕｒｅｓｈ  ＭＲ，  Ｃｕｅｌｌｏ  ＡＣ，  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ  （１９８６）  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｙｂｒｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １２１：２１０-２２８）。
【００２７】
選択的二重特異性抗体の設計において最も重要な課題として、２つの重鎖のヘテロ二量体化の有効な導入、ならびに軽鎖および重鎖の選択的な組み合わせが挙げられる。この重鎖の選択的ヘテロ二量化の導入戦略は、たとえば国際公開第２０１２／０５８７６８号に提供されており、この文献では、さまざまなドメイン（たとえばＣＨ２およびＣＨ３）において非対称性である重鎖を含む抗体構築物であって、各重鎖は、高選択性および高純度の望ましいヘテロダイマーを形成するように修飾されており、得られる重鎖ヘテロダイマーは天然のホモダイマーと比較可能な安定性を有する、抗体構築物が開示されている。
【００２８】
軽鎖および重鎖の選択的な組み合わせは、重鎖および軽鎖の合計４つの可能な組み合わせの選択肢が生じ、そのうちの１つしか所望の化合物ではないため、解決することが困難であった。本明細書において、非対称性多重特異性ＩｇＧ様抗体の選択的アセンブリを行わせ、この問題を解決する方法が提供される。ある実施形態では、本明細書において、Ｆｃ領域のＮ末端に付着する単鎖Ｆａｂセグメントに結合する少なくとも２つの異なる抗原を含む非対称性二重特異性抗体構築物であって、各単鎖Ｆａｂセグメントが、軽鎖および重鎖の選択的な組み合わせを含み、各単鎖Ｆａｂセグメントが、異なる抗原を認識する、構築物が提供される。
【００２９】
絶対的な軽鎖ドメインおよび重鎖ドメインの選択的組み合わせを促進するための抗体のＦａｂ部の特徴を改変する方法が提供される。連続した方法で絶対的ドメインの連続する発現は、優先的に相互作用し、対を作成するために近くのドメインに動力学的に好ましい機会を提供する。ＶＨおよびＶＬの間のループは、２つのドメインの間で天然のＦｖ様のパッキングを可能にするために十分な長さである。同様に、ＣＬおよびＣＨ１ドメインの間のループは、これら２つのドメイン間ので本来の相互作用を許容する適切な長さである。ＣＨ１は、抗体構造中最も遅いフォールディングドメインであり、このドメインのフォールディングは、ＣＬドメインの局所的な存在により誘導される。ＣＨ１ドメインのフォールディングは、ＣＬドメインとの対に結合する。本明細書に提示される軽鎖挿入断片設計においてＣＬおよびＣＨ１ドメインの連続した発現は、ＣＨ１ドメインフォールディングを促進し、絶対的ＣＬドメインと対の形成を促進する。
【００３０】
二重特異性分子を形成するために、抗体の軽鎖および重鎖の共発現を含む従来の手法を使用することにより、２つの異なる重鎖および２つの異なる軽鎖を発現する必要がある。このことは、目的の二重特異性産物から逸脱した不正確な重鎖および軽鎖の形成を引き起こし、目的の正確に対となる二重特異的な種を分離するために複雑な精製を必要する。本明細書に記載される免疫グロブリン構築物は、適切な定常ドメインポリペプチドと組み合わせる際に正確に対となる抗体構造の形成を可能とする単鎖Ｆａｂポリペプチドおよび単鎖Ｆｖｓを含む。
【００３１】
本明細書において、少なくとも２つの異なる単鎖Ｆａｂセグメントを含む非対称二重特異性抗体分子であって、各単鎖Ｆａｂセグメントは、重鎖ポリペプチドに結合される、抗体分子を設計する方法が提供される。
【００３２】
ある実施形態では、独立して開発された２つの単一特異性抗体分子に基づく単鎖Ｆａｂセグメントを含む二重特異性抗体を設計する方法が提供される。本明細書では、抗体構築物を設計する方法であって、それぞれが絶対的軽鎖と対をなす２つの異なる重鎖との対を作成することを含む、方法が提供される。
【００３３】
別記しない限り、本明細書中で用いられる技術用語および科学用語はすべて、特許請求対象物が属する当該技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中の用語に関して複数の定義が存在する事象では、本節における定義が優勢である。ＵＲＬまたはその他のこのような識別子またはアドレスを参照する場合、このような識別子は変化し得るし、インターネット上の特定情報は移り変わるが、しかしインターネット検索により等価の情報が見出され得る、と理解される。それを参照すると、このような情報の利用可能性および公的普及が立証される。
【００３４】
前記の一般的記述および以下の詳細な記述は、単に例示的および解説的なものであって、特許請求されるいかなる対象物をも限定するものではない、と理解されるべきである。この出願において、単数形の使用は、別記しない限り、複数形を包含する。
【００３５】
修飾ＣＨ３ドメインを作成するために使用されるアミノ酸修飾としては、限定するものではないが、アミノ酸の挿入、欠損、置換、および再配置が挙げられる。ＣＨ３ドメインの修飾および修飾ＣＨ３ドメインは、本明細書では、集合的に「ＣＨ３修飾」、「修飾ＣＨ３ドメイン」、「変異型ＣＨ３ドメイン」または「ＣＨ３変異体」を指す。ある実施形態では、本修飾ＣＨ３ドメインは、選択する分子に組み込まれる。したがって、一実施形態では、たとえば、修飾ＣＨ３ドメインを組み込むＦｃ領域（本明細書で使用される「Ｆｃ領域」およびそれに類する用語は、ＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む重鎖定常領域ドメインのいずれかを含む）を含む、免疫グロブリン（たとえば抗体）および他の結合タンパク質などのポリペプチドなどの分子が提供される。修飾ＣＨ３ドメイン（たとえば、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠損、置換、または再配置を含むＣＨ３ドメイン）を含むＦｃ領域を含む分子は、本明細書では、「Ｆｃ変異体」、「ヘテロダイマー」、または「ヘテロ多量体」を指す。本Ｆｃ変異体は、ヘテロダイマーＦｃ変異体または領域を産生するために非対称的に修飾されているＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域は、２つの重鎖定常ドメインポチペプチド‐鎖Ａおよび鎖Ｂを含み、これにより、各Ｆｃ領域が１つの鎖Ａおよび鎖Ｂポリペプチドを含む限り、交互に使用できる。２つの修飾ＣＨ３ドメインがＦｃ変異体を形成する際（たとえば表１参照）、ヘテロダイマーを与える非対称性形態中にＣＨ３にアミノ酸修飾が導入される。本明細書に使用されるように、非対称性アミノ酸修飾は、１つのポリペプチド上に特異的な位置のアミノ酸（たとえば「鎖Ａ」）は、ヘテロダイマーまたはＦｃ変異体の同一の位置に第２のポリペプチド（たとえば「鎖Ｂ」）と異なるいずれかの修飾である。このことは、Ｆｃ変異体の鎖Ａおよび鎖Ｂ由来の２つの異なるアミノ酸に対する２つのアミノ酸のうちの１つの修飾または、両方のアミノ酸の修飾の結果とすることができる。変異型ＣＨドメインは、１つ以上の非対称性アミノ酸修飾を含むことが理解される。
【００３６】
本明細書に使用されるように、「単離された」構築物は、天然の細胞培養環境の成分から同定、分離、および／または回収された構築物を意味する。この天然の環境の汚染成分は、免疫グロブリン構築物の診断および治療のための使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を挙げることができる。
【００３７】
変異型Ｆｃヘテロダイマーは、一般に、実質的に均一に精製される。「実質的に均一性」、「実質的な均一性」、および「実質的に均一な形態」との文言は、産物が望ましくないポリペプチドの組み合わせ（たとえばホモダイマー）に起因する副産物を実質的に含まないことを示す。純度の用語を表す際に、実質的な均一性は、副産物の量が、１０重量％以下、好ましくは５重量％未満、より好ましくは１重量％未満、最も好ましくは０．５重量％未満である。
【００３８】
抗体技術の技術分野の当業者により理解される用語は、各々、本明細書中で別様に定義されない限り、当該技術分野において得られる意味を与えられる。抗体は、可変領域、ヒンジ領域および定常ドメインを有することが知られている。免疫グロブリンの構造および機能は、例えばＨａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，  Ｅｄｓ．，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  １４  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８８）に概説されている。
【００３９】
本発明の記述において、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、別記しない限り、列挙される範囲内の任意の整数の値を、そして適切な場合には、その分数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を包含する、と理解されるべきである。本明細書中で用いる場合、「約」は、別記しない限り、指示される範囲、値、配列または構造の±１０％を意味する。「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、本明細書中で用いる場合、別記しない限り、またはその状況により指図されない限り、列挙された構成成分のうちの「１つ以上」を指す、と理解されるべきである。代替物（例えば「または」）の使用は、代替物のうちの１つ、両方、またはそのいずれかの組合せを意味する、と理解されるべきである。本明細書中で用いる場合、「包含する」および「含む」という用語は、同義的に用いられる。さらに、本明細書中に記載される構造および置換基の種々の組合せから得られる個々の一本鎖ポリペプチドまたは免疫グロブリン構築物は、各一本鎖ポリペプチドまたはヘテロ二量体が個別に記述されるのと同程度に、本出願により開示される、と理解されるべきである。したがって、個々の一本鎖ポリペプチドまたはヘテロ二量体を形成するための特定の構成成分の選択は、本発明の開示の範囲内である。
【００４０】
本明細書中で用いられる節の見出しは、系統化の目的に過ぎず、記載される対象物を限定するよう意図されるべきでない。当該出願中で引用される文書または文書の部分、例えば特許、特許出願、記事、書物、マニュアルおよび学術論文（これらに限定されない）は、任意の目的のためにそれらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。
【００４１】
本明細書中に記載される方法および組成物は、本明細書中に記載される特定の方法、プロトコル、細胞株、構築物および試薬に限定されず、このようなものとして変化し得る、と理解されるべきである。本明細書中で用いられる用語は、特定の実施形態を記載するために過ぎず、本明細書中に記載される方法および組成物の範囲を限定するよう意図されず、これは、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される、ということも理解されるべきである。
【００４２】
本明細書中で記述される出版物および特許はすべて、例えば、本明細書中に記載される方法、組成物および化合物とともに用いられ得る出版物中に記載される構築物および方法を記載し、開示する目的のために、それらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。本明細書中で考察される出版物は、本出願の出願日前に、それらの開示のために提供されるだけである。本明細書中に記載される本発明人等は、以前の発明に基づいて、または任意の他の理由のためにこのような開示に先行するよう授与されない、ということの承認として意図されるべきことは、本明細書中にはない。
【００４３】
本発明の出願において、アミノ酸名および原子名（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｃ等）は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＤａｔａＢａｎｋ  （ＰＤＢ）（ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）により定義されるように用いられるが、これは、ＩＵＰＡＣ命名法（ＩＵＰＡＣ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ  ｆｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  （ｒｅｓｉｄｕｅ  ｎａｍｅｓ，  ａｔｏｍ  ｎａｍｅｓ  ｅｔｃ．），  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １３８，  ９−３７  （１９８４）ならびにＥｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １５２，  １  （１９８５）におけるそれらの修正に基づいている。「アミノ酸残基」という用語は、主として、２０の天然に存在するアミノ酸、すなわち、アラニン（ＡｌａまたはＡ）、システイン（ＣｙｃまたはＣ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、グリシン（ＧｌｙまたはＧ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ｌｌeまたはＩ）、リジン（ＬｙｓまたはＫ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、スレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、バリン（ＶａｌまたはＶ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、およびチロシン（ＴｙｒまたはＹ）からなる群に含まれるアミノ酸残基を示すと意図される。
【００４４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で互換的に用いられる。すなわち、ポリペプチドに向けられる記述は、ペプチドの記述およびタンパク質の記述に等しく当てはまり、その逆も言える。当該用語は、天然アミノ酸ポリマー、ならびに１つ以上のアミノ酸残基が非天然コード化アミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用する。本明細書中で用いる場合、当該用語は、全長タンパク質を包む任意の長さのアミノ酸鎖を包含し、アミノ酸残基は共有ペプチド結合により連結される。
【００４５】
「ヌクレオチド配列」という用語は、２つ以上のヌクレオチド分子の連続ストレッチを示すよう意図される。ヌクレオチド配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成または合成起源のもの、あるいはその任意の組合せであり得る。
【００４６】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」という用語は、一般的に、例えば米国特許第４，６８３，１９５号に記載されているように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの所望のヌクレオチド配列の増幅のための方法を指す。概して、ＰＣＲ法は、鋳型核酸と優先的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドプライマーを用いるプライマー伸長合成の反復周期を包含する。
【００４７】
「細胞」、「宿主細胞」、「細胞株」および「細胞培養」は、本明細書中で互換的に用いられ、このような用語はすべて、細胞の増殖または培養に起因する子孫を含む、と理解されるべきである。「形質転換」および「トランスフェクション」は、細胞中にＤＮＡを導入する過程を指すために互換的に用いられる。
【００４８】
「アミノ酸」という用語は、天然および非天然アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様の方式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を指す。天然にコードされたアミノ酸は、２０の一般的なアミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン）ならびにピロリシンおよびセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同一の基本的な化学構造を有する化合物を指し、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基と結合される炭素を有し、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどである。このような類似体は、修飾化Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または修飾化ペプチド主鎖を有するが、天然アミノ酸と同一の基本的な化学構造を保持する。アミノ酸への言及は、例えば、天然タンパク質原性Ｌ−アミノ酸；Ｄ−アミノ酸、化学修飾化アミノ酸、例えばアミノ酸変異体および誘導体；天然非タンパク質原性アミノ酸、例えばβ−アラニン、オルニチン等；ならびにアミノ酸に特徴的であることが当該技術分野で既知の特性を有する化学合成化合物、を包含する。非天然アミノ酸の例としては、a−メチルアミノ酸（例えば、a−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例えば、２−アミノ−ヒスチジン、b−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン）、側鎖中に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、ならびに側鎖中のカルボン酸官能基がスルホン酸基に置換されるアミノ酸（例えば、システイン酸）が挙げられるが、これらに限定されない。合成非ネイティブアミノ酸、置換アミノ酸、または１つ以上のＤ−アミノ酸を含む非天然アミノ酸を本発明のタンパク質中に組み入れることは、多数の異なる意味で有益であり得る。Ｄ−アミノ酸含有ペプチド等は、Ｌ−アミノ酸含有同等物と比較して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏでの安定性増大を示す。したがって、Ｄ−アミノ酸を組み入れるペプチドなどの構築は、より大きな細胞内安定性が所望されるかまたは必要とされる場合、特に有用であり得る。さらに具体的には、Ｄ−ペプチド等は、内因性ペプチダーゼおよびプロテアーゼに抵抗性であり、それにより、分子の生物学的利用能改善、ならびにｉｎ ｖｉｖｏでの寿命延長が望ましい場合そのような特性を提供する。さらに、Ｄ−ペプチド等は、Ｔヘルパー細胞に対する主要組織適合複合体クラスＩＩ制限提示のために効率的にプロセシングされ得ず、したがって、生物体全体における体液性免疫応答を誘導しにくい。
【００４９】
アミノ酸は、それらの一般的に既知の３文字記号により、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎに推奨される１文字記号により、本明細書中で言及され得る。同様にヌクレオチドは、一般に認められている１文字暗号により言及され得る。
【００５０】
「保存的修飾変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に当てはまる。特定の核酸配列に関して、「保存的修飾変異体」は、同一の、または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を指し、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合、本質的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重のため、多数の機能的に同一の核酸が任意の指定タンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧおよびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定されるすべての位置で、コドンは、コード化ポリペプチドを変更することなく表される対応コドンのいずれかに変更され得る。このような核酸変異は、「サイレント変異」であって、これは、保存的修飾変異の一種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、核酸のすべての考え得るサイレント変異を表す。核酸における各コドン（ただし、ＡＵＧは、普通はメチオニンに関する唯一のコドンであり、ＴＧＧは、普通はトリプトファンに関する唯一のコドンである）は修飾されて、機能的に同一の分子を産生し得る、と当業者は理解する。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は各記載配列に潜在する。
【００５１】
アミノ酸配列に関しては、コード化配列中の単一アミノ酸または小部分のアミノ酸を変更、付加または欠失する核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列に対する個々の置換、欠失または付加は、「保存的修飾変異体」であって、ここで変更によりアミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似のアミノ酸によるアミノ酸の置換を生じる、と当業者は理解する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業者に既知である。このような保存的修飾変異体は、本発明の多形変異体、種間相同体および対立遺伝子のほかに存在し、それらを排除しない。
【００５２】
機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業者に既知である。以下の８群は、各々、互いに関して保存的置換であるアミノ酸を含有する：
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；および
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）
（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．；２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １９９３参照）。
【００５３】
「同一の」または「同一性」パーセントという用語は、２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の状況では、同一である２つ以上の配列または亜配列を指す。配列が比較され、および比較ウィンドウ全体、または指定領域での最大対応のために整列される際に以下の配列比較アルゴリズム（または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）のうちの１つを用いて、または手動整列および目視検査により測定されるように、配列は、それらが、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドのパーセンテージ（すなわち、特定領域に亘って約５０％同一性、約５５％同一性、６０％同一性、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％または約９５％同一性）を有すると、「実質的に同一」である。この定義はまた、試験配列の相補体も指す。同一性は、少なくとも約５０アミノ酸または７５〜１００アミノ酸またはヌクレオチド長である領域全体に、あるいは特定されない場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの全配列を通して存在し得る。本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ヒト以外の種からのホモログを含み、本発明のポリヌクレオチド配列またはその断片を有する標識化プローブを用いる厳しいハイブリダイゼーション条件下でのライブラリーをスクリーニングするステップ、ならびに全長ｃＤＮＡおよび前記ポリヌクレオチド配列を含有するゲノムクローンを単離するステップを包含する工程により獲得され得る。このようなハイブリダイゼーション技法は、当業者に周知である。
【００５４】
ポリペプチドの誘導体または変異体は、それらのアミノ酸配列が元のペプチドからの１００アミノ酸配列と少なくとも５０％の同一性を有する場合、そのペプチドと「相同性」を有する、または「相同である」と言われる。ある実施形態では、誘導体または変異体は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片のものと少なくとも７５％同一である。ある実施形態では、誘導体または変異体は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片のものと少なくとも８５％同一である。ある実施形態では、誘導体のアミノ酸配列は、その誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、誘導体のアミノ酸配列は、誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片と少なくとも９５％同一である。ある実施形態では、誘導体または変異体は、誘導体と同数のアミノ酸残基を有するペプチドまたはペプチドの断片のものと少なくとも９９％同一である。
【００５５】
本明細書中で用いる場合、「単離」ポリペプチドまたは免疫グロブリン構築物は、その天然細胞培養環境の構成成分から同定され、分離され、および／または回収された構築物またはポリペプチドを意味する。その天然環境の夾雑構成成分は、免疫グロブリン構築物に関する診断的または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク様または非タンパク様溶質を含み得る。
【００５６】
「〜と選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」という語句は、特定のヌクレオチド配列が複合混合物（例えば総細胞またはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡ）中に存在する場合、厳しいハイブリダイゼーション条件下でそのヌクレオチド配列だけに分子が結合し、二重化し、またはハイブリダイズすることを指す。
【００５７】
「厳しいハイブリダイゼーション条件」という語句は、当該技術分野で既知であるように、低イオン強度および高温の条件下での、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその他の核酸、あるいはその組合せの配列のハイブリダイゼーションを指す。典型的には、厳しい条件下では、プローブは、核酸の複合混合物（例えば、総細胞またはライブラリーＤＮＡまたはＲＮＡ）中のその標的亜配列とハイブリダイズするが、複合混合物中の他の配列とはハイブリダイズしない。厳しい条件は配列依存性であり、異なる環境では異なる。配列が長いほど、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な指針は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ”（１９９３）に見出される。
【００５８】
本明細書中で用いる場合、「抗体」は、分析物（抗原）を特異的に結合し、認識する単数または複数の免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされるポリペプチドを指す。認識される免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロンおよびミュー定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。軽鎖は、カッパまたはラムダとして分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンとして分類され、これらは今度は、それぞれ免疫グロブリンクラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを限定する。
【００５９】
例示的免疫グロブリン（抗体）構造単位は、２対のポリペプチド鎖からなり、各対は、１つの「軽」鎖（約２５ｋＤ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤ）を有する。各鎖のＮ末端は、主に抗原認識に寄与する約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれこれらの軽鎖および重鎖を指す。ある実施形態では、免疫グロブリン構築物は、治療用ポリペプチドに連結されるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥからの少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書中で提供される免疫グロブリン構築物中に含まれる免疫グロブリンドメインは、ダイアボディまたはナノボディのような免疫グロブリンベースの構築物由来である。ある実施形態では、本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物は、ラクダ科動物抗体のような重鎖抗体からの少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。ある実施形態では、本明細書中で提供される免疫グロブリン構築物は、哺乳動物抗体、例えばウシ抗体、ヒト抗体、ラクダ科動物抗体、マウス抗体または任意のキメラ抗体からの少なくとも１つの免疫グロブリンドメインを含む。
【００６０】
「単鎖Ｆａｂセグメント」または「単鎖Ｆａｂ」（たとえば、図２、図４参照）は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、およびリンカーを含むポリペプチドである。本明細書に記載される単鎖Ｆａｂセグメントの特定の実施形態では、抗体ドメインおよびリンカーは、ＶＨ−リンカー‐ＶＬ‐ＣＬ‐リンカー‐ＣＨ１を含むＮ末端からＣ末端に配列を有する。本明細書に記載される単鎖Ｆａｂセグメントの特定の実施形態では、抗体ドメインおよびリンカーは、ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１を含むＮ末端からＣ末端までの配列を有する。単鎖Ｆａｂセグメントの特定の実施形態では、各リンカーはポリペプチドである。一部の実施形態では、各リンカーは、約３〜約１００のアミノ酸を含むポリペプチドである。単鎖Ｆａｂセグメントの特定の実施形態では、各リンカーは、約５〜約５０のアミノ酸を含むポリペプチドである。単鎖Ｆａｂセグメントの一部の実施形態では、各リンカーは少なくとも２０のアミノ酸を含むポリペプチドである。単鎖Ｆａｂセグメントの特定の実施形態では、リンカーの少なくとも１つは、少なくとも３０のアミノ酸のポリペプチドである。単鎖Ｆａｂセグメントの特定の実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、約３０〜約５０のアミノ酸のポリペプチドである。単鎖Ｆａｂセグメントの特定の実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、約３５〜約５０のアミノ酸のポリペプチドである。単鎖Ｆａｂセグメントの一部の実施形態では、各リンカーは、約３０〜５０のアミノ酸のポリペプチドである。特定の実施形態では、各リンカーは、約３５〜約５０のアミノ酸のポリペプチドである。単鎖Ｆａｂセグメントの特定の実施形態では、各リンカーは、約３０以下のアミノ酸のポリペプチドである。特定の実施形態では、単鎖Ｆａｂセグメントは約２９以下のアミノ酸のポリペプチドである少なくとも１つのリンカーを含む。特定の実施形態では、単鎖Ｆａｂセグメントは、約３〜約２９のアミノ酸のポリペプチドである少なくとも１つのリンカーを含む。特定の実施形態では、単鎖Ｆａｂセグメントは、約３２以下のアミノ酸のポリペプチドである少なくとも１つのリンカーを含む。特定の実施形態では、単鎖Ｆａｂセグメントは、軽鎖ドメインと重鎖ドメインとの間に少なくとも１つの安定したジスルフィド結合を含む。
【００６１】
本明細書で使用されるように、本明細書で記載される「軽鎖挿入断片設計」または「軽鎖挿入断片戦略」または「軽鎖挿入断片」（ＬＣＩ）は、図３に示される重鎖ポリペプチドに結合した単鎖Ｆｖポリペプチドを含む免疫グロブリン構築物の設計を指す。ある実施形態では、「軽鎖挿入断片設計」または「軽鎖挿入断片戦略」、または「軽鎖挿入断片」は、図２に示されるような定常ドメインポリペプチドに単鎖Ｆｖポリペプチドを結合することによる単鎖Ｆａｂの設計を指す。一部の実施形態では、これは、免疫グロブリン重鎖由来の可変領域ポリペプチド（ＶＨ）、免疫グロブリン軽鎖由来の可変領域ポリペプチド（ＶＬ）、免疫グロブリン軽鎖由来の定常領域ポリペプチド（ＣＬ）、および免疫グロブリン重鎖の定常領域ポリペプチド（ＣＨ１）を含む単鎖Ｆａｂ領域（ｓｃＦａｂ）であって、ＶＨポリペプチドおよびＶＬポリペプチドは、単鎖Ｆｖ構築物（ｓｃＦｖ）を形成するために第１のリンカーにより結合される単鎖Ｆａｂ領域（ｓｃＦａｂ）である。一部の実施形態では、このＣＬおよびＣＨ１は、第２のリンカーにより結合する。ある実施形態では、免疫グロブリン構築物は、ＶＨ−Ｌ１−ＶＬ−ＣＬ−Ｌ２−ＣＨ１を含む配列であって、式中、Ｌ１およびＬ２は、第１のリンカーおよび第２のリンカーである、配列を有する。ある実施形態では、免疫グロブリン構築物は、ＶＨ−Ｌ１−ＶＬ−Ｌ３−ＣＬ−Ｌ２−ＣＨ１を含む配列であって、式中、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３がリンカーである、配列を有する。一実施形態では、免疫グロブリン構築物は、ＶＬ−Ｌ４−ＶＨ−ＣＨ１−Ｌ５−ＣＬを含む配列であって、式中、Ｌ４およびＬ５がリンカーである、配列を有する。
【００６２】
ある実施形態では、各リンカーは、約１〜約１００のアミノ酸を含むポリペプチドである。特定の実施形態では、各リンカーは、約１〜５０のアミノ酸を含むポリペプチドである。特定の実施形態では、各リンカーは、約１０〜約２５のアミノ酸を含むポリペプチドである。一部の実施形態では、リンカーは、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、およびＧｌｕ（Ｅ）から選択されるアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。一実施形態ではこのリンカーは一般式（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎのポリペプチドであって、式中ｎが４〜１０の整数であるポリペプチドを含む。ある実施形態では、少なくとも１つのリンカーは、構築物の精製しやすさを増大する性質に基づき選択される。
【００６３】
本明細書に使用されるように、本明細書に記載される「長いリンカーの設計」または「長いリンカーの戦略」または「長いリンカー」（ＬＬ）は、図５に示されるような重鎖ポリペプチドに結合する単鎖Ｆａｂポリペプチドを含む多重特異性または二重特異性免疫グロブリン構築物の設計を意味する。ある実施形態では、「長いリンカー設計」または「長いリンカー戦略」、または「長いリンカー」は、図４に示されるような単鎖Ｆａｂの設計を示す。ある実施形態では、この長いリンカーは、らせんを形成する性向を有するリンカーポリペプチドを含む。一部の実施形態では、リンカーの少なくとも約２５％がらせん形態で存在する。いくるかの実施形態では、リンカーの少なくとも５０％がらせん形態で存在する。ある他の実施形態では、リンカーの少なくとも６０％がらせん形態で存在する。別の実施形態では、リンカーの少なくとも７５％がらせん形態で存在する。別の実施形態では、リンカーの少なくとも８０％がらせん形態で存在する。さらなる実施形態では、リンカーの少なくとも９０％がらせん形態で存在する。さらなる実施形態では、リンカーの少なくとも９５％がらせん形態で存在する。ある実施形態では、リンカーは、複数のらせん状のセグメントを含む。ある実施形態では、らせん状のリンカーは、構築物の精製しやすさを高める性質に基づき選択される。
【００６４】
本明細書に記載される免疫グロブリン構築物であって、リンカーポリペプチドが、αへリックス、ポリプロリンＩへリックス、ポリプロリンＩＩへリックス、および３１０へリックスの少なくとも１つを形成する免疫グロブリン構築物を提供する。一部の実施形態では、リンカーは、約１〜約２０巻きのらせんを形成する。一実施形態では、約３〜約５巻きのらせんを形成する。一実施形態では、リンカーは、約２〜約４巻きのらせんを形成する。一実施形態では、リンカーは約２〜約１０巻きのらせんを形成する。一部の実施形態では、リンカーは、らせんを安定化させる相互作用を形成する少なくとも一対のアミノ酸を含む。一実施形態では、らせんを安定化させる相互作用は、電荷間相互作用、カチオン−π相互作用、疎水性相互作用、およびサイズコンプリメンタリィ相互作用（ｓｉｚｅ  ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ） の内の少なくとも１つである。
【００６５】
本明細書に記載される単離型免疫グロブリン構築物であって、この構築物がらせんを形成する性向を有する少なくとも１つのリンカーポリペプチドを含み、このリンカーポリペプチドが、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｖａｌ（Ｖ）、およびＩｌｅ（Ｉ）から選択されるアミノ酸を含む、構築物が提供される。ある実施形態では、リンカーポリペプチドが、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、およびＬｙｓ（Ｋ）から選択されるアミノ酸を含む。一実施形態では、リンカーポリペプチドは、少なくとも１つのＰｒｏ（Ｐ）残基を含む。ある実施形態では、リンカーは、少なくとも１つの（Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ）ｎモチーフであって、式中、ｎが１〜１０の整数である、モチーフを含むアミノ酸配列を有する。
【００６６】
本明細書で、本明細書に記載される第１のｓｃＦａｂを含む第１のポリペプチド構築物と、第１のＣＨ３領域を含む第１の重鎖ポリペプチドと、第２のＣＨ３領域を含む第２の重鎖ポリペプチドを含む第２のポリペプチド構築物とを含む免疫グロブリン構築物であって、この第１の重鎖ポリペプチドおよび第２の重鎖ポリペプチドの少なくとも１つが、ヘテロダイマーの形成を促進する変異型ＣＨ３領域を任意に含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド構築物および第２のポリペプチド構築物は、抗原結合ポリペプチド構築物をさらに含む。一実施形態では、この抗原結合ポリペプチド構築物は、ｓｃＦｖまたはｓｃＦａｂの少なくとも１つである。一部の実施形態では、ｓｃＦａｂは、本明細書に記載されるｓｃＦａｂである。
【００６７】
ある実施形態では、ｓｃＦａｂまたはｓｃＭａｂの形態において必要とされる変異体に応じて、他の免疫グロブリン構築物ドメインがポリペプチド配列およびこのポリペプチド配列をコードする核酸配列中に含まれる。ある実施形態では、ｓｃＭａｂ構築物は、本明細書に記載されるリンカーを有するＶＨ、ＶＬ、ＣＬ、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン、ならびに天然に存在するヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、野生型ＣＨ３ドメイン配列は、二価モノ特異性抗体分子を得るために使用される。一部の実施形態では、変異型のＣＨ２およびＣＨ３ドメインは、ＦｃＲｎ結合または好ましいＣＨ３ヘテロダイマー形成を変えるために使用される。一部の実施形態では、ＣＨ２配列は、目的のポリペプチド配列中に含まれない。一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ヘテロダイマーＦｃを形成させる変異体を含む。一部の実施形態では、ヘテロダイマーＦｃ形成配列は、二価二重特異性抗体を得るために使用される。
【００６８】
一部の実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドおよび第２の重鎖ポリペプチドが、ヘテロダイマーＦｃを形成する。ある実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む変異型免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む。ある実施形態では、この少なくとも１つのアミノ酸変異は、天然のホモダイマーＦｃと比較可能な安定性を有するヘテロダイマーＦｃの形成を促進する。一実施形態では、変異型ＣＨ３ドメインは、約７３℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。一実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、少なくとも約９０％の純度で形成される。一部の実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、少なくとも約９８％の純度で形成され、かつＴｍが少なくとも約７３℃である。別の実施形態では、ヘテロダイマーＦｃは、少なくとも９０％の純度で形成され、Ｔｍが約７５℃である。
【００６９】
本明細書に記載される免疫グロブリン構築物であって、この第１の重鎖ポリペプチドおよび第２の重鎖ポリペプチドの少なくとも１つが、少なくとも１つのＦｃガンマ受容体との選択的結合を促進するアミノ酸修飾を含む変異型ＣＨ２ドメインをさらに含む、免疫グロブリン構築物が提供される。一実施形態では、第１の重鎖ポリペプチドおよび第２の重鎖ポリペプチドの少なくとも１つは、少なくとも１つのＦｃガンマ受容体への機能的に有効な結合を防止するアミノ酸修飾を含む変異型ＣＨ２ドメインまたはヒンジを含む。一部の実施形態では、Ｆｃ領域はグリコシル化されている。一実施形態では、Ｆｃ領域はアグリコシル化されている。一実施形態では、Ｆｃ領域はフコシル化されている。別の実施形態では、Ｆｃ領域はアフコシル化されている。
【００７０】
一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物であって、多重特異性免疫グロブリン構築物である免疫グロブリン構築物が提供される。一実施形態では、免疫グロブリン構築物は二重特異性である。
【００７１】
単離型免疫グロブリン構築物であって、第１の定常ドメインポリペプチドにリンカーにより結合される第１の単鎖Ｆｖポリペプチドを含む第１の単量体ポリペプチドと、第１の単鎖Ｆｖポリペプチドと異なり、第１の定常ドメインポリペプチドと異なる第２の定常ドメインポリペプチドにリンカーにより結合される第２単鎖Ｆｖポリペプチドを含む第２の単量体ポチペプチドとを含み、各定常ドメインポリペプチドが、ＣＬ領域、ＣＨ１領域、およびＣＨ３領域またはそのフラグメント、変異体、または誘導体の少なくとも１つを含み、ＣＬおよびＣＨ１領域は、リンカーにより結合され、第１の定常ドメインポリペプチドおよび第２の定常ドメインポリペプチドは、Ｆｃ領域を形成する、免疫グロブリン構築物が提供される。一部の実施形態では、前記構築物は、ＣＨ２ドメインを一切含まない。
【００７２】
一実施形態では、単離型免疫グロブリン構築物であって、第１の定常ドメインポリペプチドに融合する第１ｓｃＦａｂポリペプチドを含む第１の単量体ポチペプチドと、第１のＦａｂポリペプチドと異なり、第２の定常ドメインポリペプチドに融合する第２のｓｃＦａｂポリペプチドを含む第２の単量体ポリペプチドとを含み、第１のｓｃＦａｂポリペプチドおよび第２のｓｃＦａｂポリペプチドの少なくとも１つは、らせん構造を形成するための性向を有するリンカーポリペプチドを含み、第１の定常ドメインポリペプチドおよび第２の定常ドメインポリペプチドが、天然のホモダイマーＦｃと比較可能な安定性を有するヘテロダイマーの形成を促進する少なくとも１つのアミノ酸を含む変異型免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロダイマーＦｃ領域を形成する、単離型免疫グロブリン構築物が提供される。
【００７３】
本明細書で、単離型免疫グロブリン構築物であって、第１定常ドメインポリペプチドに結合した第１の単鎖Ｆｖポリペプチドを含む第１の単量体ポリペプチドと、第２の定常ドメインポリペプチドに結合する第２の単鎖Ｆｖポリペプチドを含む第２の単量体ポリペプチドとを含み、各定常ドメインポリペプチドが、ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含み、第１の定常ドメインポリペプチドおよび第２の定常ドメインポリペプチドがＦｃ領域を形成する、単離型免疫グロブリン構築物が提供される。
【００７４】
ある実施形態では、本明細書に記載される単離型免疫グロブリン構築物であって、少なくとも１つの単鎖Ｆｖポリペプチドが、対応する定常ドメインポリペプチドのＣＬドメインにリンカーにより結合される構築物が提供される。ある実施形態では、本明細書に記載される単離型免疫グロブリン構築物であって、少なくとも１つの単鎖Ｆｖポリペプチドが、対応する定常ドメインポリペプチドのＣＨ１ドメインに、リンカーにより結合される、単離型免疫グロブリン構築物が提供される。ある実施形態では、本明細書に記載される単離型免疫グロブリン構築物であって、少なくとも１つの単量体ポリペプチドが、ＶＨ−Ｌ１−ＶＬ−ＣＬ−Ｌ２−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を有する配列であって、Ｌ１およびＬ２がリンカーである、単離型免疫グロブリン構築物が提供される。
【００７５】
ある実施形態では、本明細書に記載される単離型免疫グロブリン構築物であって、少なくとも１つの単量体ポリペプチドは、ＶＨ−Ｌ３−ＶＬ−Ｌ４−ＣＨ１−Ｌ５−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む配列を有し、Ｌ３、Ｌ４、およびＬ５が、リンカーである、単離型免疫グロブリン構築物である。ある実施形態では、本明細書に記載される単離型免疫グロブリン構築物であって、少なくとも１つの単量体ポリペプチドがＶＬ−Ｌ６−ＶＨ−ＣＨ１−Ｌ７−ＣＬ−ＣＨ２−ＣＨ３を含む配列を有し、Ｌ６およびＬ７がリンカーである、単離型免疫グロブリン構築物が提供される。ある実施形態では、本明細書に記載される単離型免疫グロブリン構築物であって、定常ドメインポリペプチドが、ＣＬ１ドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインのうちの１つ以上の少なくとも１つのリンカー結合を任意に含む、単離型免疫グロブリン構築物である。
【００７６】
ある実施形態では、本明細書に記載される単離型免疫グロブリン構築物であって、この第１の定常ドメインポリペプチドおよび第２の定常ドメインポリペプチドがヘテロダイマーＦｃ領域を形成する、単離型免疫グロブリン構築物が提供される。ある実施形態では、このヘテロダイマーＦｃ領域は、少なくとも１つのアミノ酸変異を含む変異型免疫グロブリンＣＨ３ドメインを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸変異は、天然のホモダイマーＦｃと比較可能な安定性を有するヘテロダイマーＦｃ領域の形成を促進する。一部の実施形態では、変異型ＣＨ３ドメインは、約７３℃以上の融解温度（Ｔｍ）を有する。ある実施形態では、ヘテロダイマーＦｃ領域は、約９０％超の純度で形成される。ある実施形態では、ヘテロダイマーＦｃ領域は、少なくとも９８％以上の純度で形成され、Ｔｍは少なくとも約７３℃である。一部の実施形態では、ヘテロダイマーＦｃ領域は、約９０％以上の純度で形成され、Ｔｍが約７５℃である。
【００７７】
ある実施形態では、本明細書に記載される単離型免疫グロブリン構築物であって、少なくとも１つのＦｃガンマ受容体への選択的結合を促進するアミノ酸修飾を含む変異型ＣＨ２ドメインを含む少なくとも１つの定常ドメインポリペプチドを含む、単離型免疫グロブリン構築物が提供される。一部の実施形態では、少なくとも１つの定常ドメインポリペプチドは、少なくとも１つのＦｃガンマ受容体への機能的に有効な結合を防止するアミノ酸修飾を含む変異型ＣＨ２ドメインまたはヒンジを含む。
【００７８】
ある実施形態では、本明細書に記載される単離型免疫グロブリン構築物であって、Ｆｃ領域がグリコシル化されている単離型免疫グロブリン構築物が提供される。一部の実施形態では、本明細書に記載される単離型免疫グロブリン構築物であって、Ｆｃ領域がアグリコシル化されている単離型免疫グロブリン構築物が提供される。
【００７９】
ある実施形態では、本明細書に記載される単離型免疫グロブリン構築物であって、各リンカーが約１〜１００のアミノ酸を含むポリペプチドである、単離型免疫グロブリン構築物が提供される。一部の実施形態では、リンカーポリペプチドは、式（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎであって、式中ｎが１〜２０の整数である、式を有する、単離型免疫グロブリン構築物である。
【００８０】
本明細書に記載される単離型免疫グロブリン構築物であって、この免疫グロブリン構築物は、多重特異性免疫グロブリン構築物である単離型免疫グロブリン構築物が提供される。一部の実施形態では、免疫グロブリン構築物は二重特異性である。
【００８１】
単離型二重特異性免疫グロブリン構築物であって、第１の定常ドメインポリペプチドにリンカーにより結合される第１の単鎖Ｆｖポリペプチドと、第１のＦｖポリペプチドと異なり、第１の定常ドメインポリペプチドと異なる第２の定常ドメインポリペプチドにリンカーにより結合する第２の単鎖Ｆｖポリペプチドを含む第２の単量体ポリペプチドとを含み、各定常ドメインポリペプチドが、ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２領域、およびＣＨ３ドメイン、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の少なくとも１つを含み、第１の定常ドメインポリペプチドおよび第２の定常ドメインポリペプチドが、Ｆｃ域を形成する、単離型二重特異性免疫グロブリン構築物が提供される。
【００８２】
本明細書では、単離型免疫グロブリン構築物であって、第１の定常ドメインポリペプチドに結合する第１の単鎖Ｆｖポリペプチドを含む第１の単量体ポリペプチドと、第２の定常ドメインポリペプチドに結合する第２の単鎖Ｆｖポリペプチドを含む第２の単量体ポリペプチドとを含み、各定常ドメインポリペプチドが、ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の少なくとも１つを含み、第１の定常ドメインポリペプチドおよび第２の定常ドメインポリペプチドがＦｃ領域を形成する、単離型免疫グロブリン構築物が提供される。
【００８３】
本明細書では、単離型二重特異性免疫グロブリン構築物であって、第１の定常ドメインポリペプチドにリンカーにより結合する第１の単鎖Ｆｖポリペプチドを含む第１の単量体ポリペプチドと、第１のＦｖポリペプチドと異なり、第１の定常ドメインポリペプチドと異なる第２の定常ドメインにリンカーにより結合する第２の単鎖Ｆｖポリペプチドを含む第２の単量体ポリペプチドとを含み、各定常ドメインポリペプチドが、ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＣＨ３領域、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体の少なくとも１つを含み、第１の定常ドメインポリペプチドおよび第２の定常ドメインポリペプチドがＦｃ領域を形成する、単離型二重特異性免疫グロブリン構築物が提供される。本明細書では、単離型二重特異性免疫グロブリン構築物であって、第１の定常ドメインポリペプチドに結合した第１の単鎖Ｆｖポリペプチドと、第２の定常ドメインポリペプチドに結合した第２の単鎖Ｆｖポリペプチドを含む第２の単量体ポリペプチドととを含み、各定常ドメインポリペプチドが、ＣＬドメイン、ＣＨ１ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、またはそのフラグメント、変異体、もしくは誘導体を含み、第１の定常ドメインポリペプチドおよび第２の定常ドメインポリペプチドがＦｃ領域を形成する、単離型二重特異性免疫グロブリン構築物が提供される。ある実施形態では、本構築物はＣＨ２ドメインを一切含まない。
【００８４】
本明細書では、定常ドメインポリペプチドに結合する単鎖Ｆｖポリペプチドを含む単鎖Ｆａｂポリペプチドであって、定常ドメインポリペプチドが少なくともＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインを含む、単鎖Ｆａｂポリペプチドが提供される。
【００８５】
本明細書では、第１の定常ドメインポリペプチドに融合する第１の単鎖Ｆａｖポリペプチドと、第１のＦａｂポリペプチドと異なり、第２の定常ドメインポリペプチドと融合する第２の単鎖Ｆａｂポリペプチドを含む第２の単量体ポリペプチドとを含む免疫グロブリン構築物であって、第１および第２の構築物ドメインポリペプチドは、天然のホモダイマーＦｃと比較可能な安定性を有するヘテロダイマーＦｃの形成を促進する少なくとも１つのアミノ酸変異を含む変異型免疫グロブリンＣＨ３領域を含むヘテロダイマーＦｃ領域を形成する、免疫グロブリン構築物を提供する。ある実施形態では、本明細書に記載される多重特異性免疫グロブリン構築物であって、第１の単鎖のＦａｂポリペプチドおよび第２の単鎖Ｆａｂポリペプチドの少なくとも１つは、ＶＨ−Ｌ８−ＶＬ−ＣＬ−Ｌ９−ＣＨ１を含む配列であって、Ｌ８およびＬ９がリンカーである、配列を有する。ある実施形態では、本明細書に記載される多重特異性免疫グロブリン構築物であって、第１の単鎖Ｆａｂポリペプチドおよび第２の単鎖Ｆａｂポリペプチドの少なくとも１つは、ＶＬ−ＣＬ−Ｌ１０−ＶＨ−ＣＨ１を含む配列であって、Ｌ１０がリンカーである配列を有する、多重特異性免疫グロブリン構築物が提供される。
【００８６】
本明細書では、本明細書に定義される単離型免疫グロブリン構築物と、適切な賦形剤とを含む薬学的組成物が提供される。また、このような薬学的組成物の製造工程であって、本明細書に定義される免疫グロブリンの発現が可能となる条件下で宿主細胞を培養することと、培養物から産生した免疫グロブリン構築物を回収することと、薬学的組成物を生成することとを含む、工程が提供される。
【００８７】
ある実施形態では、必要とする哺乳動物の癌を処置する方法であって、本明細書に記載される薬学的組成物の有効量を含む組成物をこの哺乳動物に投与することを含む方法が提供される。ある実施形態では、この癌は固形腫瘍である。一部の実施形態では、前記固形腫瘍は肉腫、癌腫およびリンパ腫のうちの１つ以上である。一部の実施形態では、癌は、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫および白血病のうちの１つ以上である。
【００８８】
ある実施形態では、必要とする哺乳動物の自己免疫症状の処置方法であって、本明細書に記載される薬学的組成物の有効量を含む組成物をこの哺乳動物に投与することを含む方法が提供される。ある実施形態では、この自己免疫症状は、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、乾癬性関節炎、乾癬、血管炎、ブドウ膜炎、クローン病、および１型糖尿病のうちの１つ以上である。
【００８９】
ある実施形態では、必要とする哺乳動物の炎症性症状を処置する方法であって、本明細書に記載される薬学的組成物の有効量を含む組成物をこの哺乳動物に投与することを含む方法が提供される。
【００９０】
本明細書では、本明細書に記載される免疫グロブリンをコードする核酸を含む宿主細胞が提供される。ある実施形態では、第１の単量体タンパク質をコードする核酸および第２の単量体タンパク質をコードする核酸が、単一ベクター中に存在する。ある実施形態では、第１の単量体タンパク質をコードする核酸および第２の単量体タンパク質をコードする核酸は、別個のベクター中に存在する。
【００９１】
また、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物を含むキットおよびその使用説明書を含むキットも提供される。
【００９２】
機能的活性
「機能的活性を有するポリペプチド」は、完全長／天然タンパク質に関連する１つ以上の知られている機能的活性を示すことのできるポリペプチドを指す。このような機能的活性は、限定するものではないが、生物学的活性、抗原性（抗ポリペプチド抗体に結合（または結合するポリペプチドと競合する）性質）、本明細書に記載されるポリペプチドと多量体を形成する性質、およびポリペプチドの受容体またはリガンドと結合する性質が挙げられる。ある実施形態では、機能的活性は、対となるタンパク質の発現および安定性を改善する性質を含む。
【００９３】
「生物学的活性を有するポリペプチド」は、用量依存度の有無により、または有無にかかわらず、特定のバイオアッセイにおいて測定される成熟した形態を含む、本明細書に記載される治療用タンパク質の活性と同様の、また必ずしも必要ではないが、本明細書に記載される治療用タンパク質の活性と同一の活性を示すポリペプチドを指す。用量依存度がある場合、このポリペプチドの活性と同一である必要はないが、本明細書に記載されるポリペプチドと比較して、所定の活性における用量依存度と実質的に同様である活性である（すなわち、候補となるポリペプチドは、本明細書に記載され、または表２に提示されるポリペプチドと比較して、約２５倍以下、または約１０倍以下、または約３倍以下の活性を示す）。
【００９４】
本明細書に記載される免疫グロブリン構築物は、当業者に公知のアッセイ、ならびに本明細書に記載されるアッセイを使用または手順を修正して機能的活性（たとえば生物学的活性）のアッセイを行うことができる。
【００９５】
ある実施形態では、結合相手（例えば、受容体またはリガンド）が、本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物に対して同定され、本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物によるその結合相手との結合は、例えば、当該技術分野で周知の手段である、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、およびアフィニティーブロッティングによりアッセイされる。一般的には、Ｐｈｉｚｉｃｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．５９：９４−１２３（１９９５）を参照。別の実施形態では、この免疫グロブリン構築物のポチペプチドの基質（単数または複数）と結合する免疫グロブリン構築物の生理学的相関物の性質は、当該技術分野で既知の技法を用いて慣例的に検定され得る。
【００９６】
本明細書に記載される免疫グロブリン構築物であって、ＣＤ３、ＣＤ１９、ＨＥＲ２、組織因子、およびＣＤ１６aから選択される少なくとも１つの標的抗原と結合する、構築物が提供される。ある実施形態では、細胞傷害性細胞により発現する抗原と結合する本明細書に記載される免疫グロブリン構築物が提供される。ある実施形態では、Ｔ細胞により発現される抗原と結合する本明細書に記載される免疫グロブリン構築物が提供される。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、およびナチュラルキラーＴ細胞の少なくとも１つである。ある実施形態では、癌細胞により発現される抗原と結合する本明細書に記載される免疫グロブリン構築物が提供される。一部の実施形態では、免疫細胞により発現される抗原と結合する本明細書に記載の免疫グロブリン構築物が提供される。
【００９７】
一実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物であって、この構築物は、少なくとも１つのＴ細胞またはナチュラルキラー細胞、および抗原を発現する少なくとも１つの他の細胞を結合できる、免疫グロブリン構築物が提供される。一実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物であって、少なくとも１つのＴ細胞および少なくとも１つのＢ細胞と結合できる、免疫グロブリン構築物が提供される。一部の実施形態では、Ｔ細胞はヒト細胞である。一実施形態では、Ｔ細胞は、非ヒトの哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物は、ある疾患に関連する細胞に発現する抗原に結合する。一部の実施形態では、この疾患は癌である。一実施形態では、この癌は、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫および神経膠腫から選択される。一実施形態では、癌は、肉腫、芽腫、乳頭腫、および腺腫の少なくとも１つである。一部の実施形態では、癌は、扁平上皮癌、腺癌、移行上皮癌、骨肉腫および柔組織肉腫の少なくとも１つである。
【００９８】
一部の実施形態では、本明細書に記載される免疫構築物は、自己免疫応答細胞である少なくとも１つの細胞上の抗原に結合する。一部の実施形態では、自己免疫応答細胞は、リンパ腫または骨髄系細胞である。
【００９９】
「有効量」という用語は、本明細書中で用いる場合、投与されている免疫グロブリン構築物の量を指し、これは、処置されている疾患、症状または障害の徴候のうちの１つ以上をある程度まで軽減する。本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物を含有する組成物は、予防的、増強的、および／または治療的処置のために投与され得る。
【０１００】
治療用途
一態様では、本明細書に記載の免疫グロブリン構築物は、開示される１つ以上の疾患、障害、または症状を処置するために、この構築物、またはそのフラグメントもしくは変異体を患者に投与することを含む抗体系療法を目的とする。本明細書に記載される治療上化合物は、限定するものではないが、本明細書に記載される免疫グロブリン、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物をコードする核酸を含む。
【０１０１】
特定の実施形態では、限定するものではないが、神経障害、免疫系障害、筋肉障害、生殖障害、消化器系障害、肺性障害、心血管障害、腎臓障害、増殖性障害、および／もしくは癌性障害および症状、ならびに／または本明細書に記載される他の疾患および症状を含む１つ以上の疾患、障害、または症状を処置するために患者に、少なくとも１つの抗体のフラグメントまたは変異体を含む本明細書に記載される免疫グロブリン構築物を投与することを含む、抗体系療法が提供される。
【０１０２】
本免疫グロブリン構築物が治療上使用される方法の概要は、限定するものではないが、体内または、たとえば、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）もしくはエフェクター細胞（ＡＤＤＣ）により媒介されるといった、抗体の直接的な細胞傷害性により局所的または全身的な結合を含む。これらの手法の一部は、以下に詳細に記載される。本明細書中で提供される教示を備えることで、過度の実験を必要とせずに、診断、モニタリングまたは治療目的のための本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物の使用方法が、当業者には分かるであろう。
【０１０３】
少なくとも抗体の断片または変異体を含む本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物は、単独で、または他の型の処置（例えば、放射線療法、化学療法、ホルモン療法、免疫療法および抗腫瘍薬）と組み合わせて投与され得る。一般的に、患者の種と同一種である種起源または種反応性（抗体の場合）の生成物の投与が好ましい。したがって、一実施形態では、ヒト抗体、断片、誘導体、類似体、または核酸が、治療または予防のためにヒト患者に投与される。
【０１０４】
遺伝子治療
特定の一実施形態では、本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物をコードする配列を含む核酸は、遺伝子治療として、タンパク質の異所性発現および／または活性と関連する疾患または障害を処置し、抑制し、または防止するために投与される。遺伝子治療とは、発現されたまたは発現可能な核酸を被験体に投与することにより実施される療法を指す。本発明のこの実施形態では、核酸は、治療的効果を媒介するそれらのコード化タンパク質を産生する。当該技術分野で利用可能な遺伝子治療のための方法のいずれかが用いられ得る。
【０１０５】
治療的または予防的活性の実証：
本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物または薬学的組成物は、ヒトに用いる前に、所望の治療的または予防的活性に関して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、次いでｉｎ ｖｉｖｏで試験される。例えば、化合物または薬学的組成物の治療的または予防的有用性を実証するためのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、細胞株または患者組織試料に及ぼす化合物の作用を包含する。細胞株および／または組織試料に及ぼす化合物または組成物の作用は、当業者に既知の技法、例えばロゼット形成アッセイおよび細胞溶解アッセイを利用して決定され得る。本発明に従って、具体的な一化合物の投与が必要か否かを決定するために用いられ得るｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイはｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイを包含し、アッセイでは患者組織試料が培養中で増殖され、免疫グロブリン構築物に曝露されるか、またはそうでなければ免疫グロブリン構築物を投与され、かつ組織試料に及ぼすこのような免疫グロブリン構築物の作用が観察される。
【０１０６】
治療的／予防的投与および組成物：
有効量の本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物または薬学的組成物の被験体への投与による処置、抑制および予防の方法が提供される。一実施形態では、免疫グロブリン構築物は、実質的に精製される（例えば、その作用を制限するかまたは望ましくない副作用を生じる物質を実質的に含まない）。ある実施形態では、被験体は、動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等（これらに限定されない）であり、ある実施形態では、哺乳動物、最も好ましくはヒトである。
【０１０７】
一実施形態では、本明細書に記載される薬学的組成物の生産工程であって、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養することと、この培養物から産生した免疫グロブリン構築物を回収することと、薬学的組成物を生産することとを含む、工程が提供される。
【０１０８】
それを必要とする哺乳動物の癌を処置する方法であって、本明細書に記載される薬学的組成物の有効量を含む組成物をこの哺乳動物に投与することを含む、方法が提供される。また、それを必要とする哺乳動物の癌の処置の際の本明細書に記載される免疫グロブリン構築物の使用であって、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物の有効量をこの哺乳動物に投与することを含む、方法が提供される。一実施形態では、この癌は固形腫瘍である。一部の実施形態では、この固形腫瘍は、肉腫、細胞腫、およびリンパ腫である。一実施形態では、この癌は、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫および白血病のうちの１つ以上である。
【０１０９】
それを必要とする哺乳動物の自己免疫症状を処置する方法であって、本明細書に記載される薬学的組成物の有効量を含む組成物をこの哺乳動物に投与することを含む、方法が提供される。また、自己免疫疾患の処置において本明細書に記載される免疫グロブリン構築物の使用であって、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物の有効量を含む組成物を提供することを含む、使用が提供される。一部の実施形態では、この自己免疫症状は、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性紅斑性狼瘡、乾癬性関節炎、乾癬、血管炎、ブドウ膜炎、クローン病、および１型糖尿病のうちの１つ以上である。
【０１１０】
それを必要とする哺乳動物の炎症性症状を処置する方法であって、本明細書に記載される薬学的組成物の有効量を含む組成物をこの哺乳動物に投与することを含む、方法が提供される。また、個体の炎症性状態を処置する際の免疫グロブリン構築物の使用であって、本明細書に記載される免疫グロブリンの有効量をこの個体に提供することを含む、使用が提供される。
【０１１１】
種々の送達系が既知であり本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物の処方物を投与するために用いることができ、例えばリポソーム、微小粒子、マイクロカプセル中の封入、化合物を発現し得る組換え体細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９−４４３２（１９８７）参照）、レトロウィルスまたはその他のベクターの一部としての核酸の構築等である。導入方法としては、皮膚内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外、および口腔経路が挙げられるが、これらに限定されない。化合物または組成物は、任意の便利な経路により、例えば注入またはボーラス注射により、上皮または粘膜皮膚内張り（例えば、口腔粘膜、直腸および小腸粘膜等）を通した吸収により投与されてよく、また他の生物学的に活性な作用物質と一緒に投与され得る。投与は、全身的または局所的であり得る。さらに、ある実施形態では、任意の適切な経路により、例えば脳室内およびくも膜下腔内注射により、本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物組成物を中枢神経系に導入することが望ましい；脳室内注射は、例えばＯｍｍａｙａレザバーのようなレザバーに取り付けられる脳室内カテーテルにより容易になり得る。例えば、吸入器またはネブライザー、ならびにエアロゾル化剤を伴う処方物の使用により、肺内投与も用いられ得る。
【０１１２】
特定の一実施形態では、処置を必要とする区域に局所的に、本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物または組成物を投与することが望ましい；これは、例えば外科手術中の局所注入、局所的適用（例えば術後に創傷用包帯とともに）、注射により、カテーテルにより、坐薬により、または移植片により（これらに限定されない）達成され得るが、前記移植片は、多孔性、非多孔性、またはゼラチン性物質であり、シリコーン膜などの膜、または繊維を含む。好ましくは、本発明のタンパク質、例えば抗体を投与する場合、タンパク質が吸収しない物質を用いるよう注意しなければならない。
【０１１３】
別の実施形態では、免疫グロブリン構築物または組成物は、小胞、特にリポソームで送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３  （１９９０）；  Ｔｒｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ  （ｅｄｓ．），  Ｌｉｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ．  ３５３−３６５  （１９８９）；  Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，  ｐｐ．  ３１７−３２７参照；一般的に同書参照）。
【０１１４】
さらに別の実施形態では、免疫グロブリン構築物または組成物は、制御放出系で送達され得る。一実施形態では、ポンプが用いられ得る（Ｌａｎｇｅｒ，上記；Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１（１９８７）；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７（１９８０）；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４（１９８９）参照）。別の実施形態では、ポリマー物質が用いられ得る（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ  （ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１（１９８３）参照；Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０（１９８５）；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１（１９８９）；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５（１９８９）も参照）。さらに別の実施形態では、制御放出系が、治療標的、例えば脳の近位に配置され、したがって全身用量の一部を要するだけである（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，上記、ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−１３８（１９８４）参照）。
【０１１５】
その他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３  （１９９０））による概説で考察されている。
【０１１６】
本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物をコードする核酸を含む特定の一実施形態では、核酸は、それが細胞内に存在するよう適切な核酸発現ベクターの一部としてそれを構築することにより、そのコード化タンパク質の発現を促すためにｉｎ ｖｉｖｏで投与でき、例えばレトロウィルスベクターの使用（米国特許第４，９８０，２８６号参照）により、または直接注射により、または微小粒子衝撃の使用（例えば、遺伝子銃;Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ）により、あるいは脂質または細胞表面受容体またはトランスフェクト化剤で被覆することにより、あるいは核に進入することが既知であるホメオボックス様ペプチドと連結してそれを投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：１８６４−１８６８（１９９１）参照）などにより投与され得る。または相同組換えにより、核酸は細胞内に導入されて発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み入れられ得る。
【０１１７】
また、本明細書で薬学的組成物も提供される。このような組成物は、治療的有効量の免疫グロブリン構築物、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む。特定の一実施形態では、「薬学的に許容可能な」という用語は、動物に、さらに特定的にはヒトに用いるために、連邦政府または州政府の規制行政庁により認可された、あるいは米国薬局方またはその他の一般的に認知されている薬局方に列挙された、ということを意味する。「担体」という用語は、それと一緒に治療薬が投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを指す。このような薬学的担体は、滅菌液体、例えば水および油、例えば石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等であり得る。薬学的組成物が静脈内投与される場合、水が好ましい担体である。生理食塩溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、液体担体として、特に注射溶液用に用いられ得る。適切な薬学的賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール等が挙げられる。組成物は、所望により、少量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放性処方物等の形態をとり得る。組成物は、伝統的結合剤および担体、例えばトリグリセリドを伴って、坐薬として処方され得る。経口処方物は、標準的担体、例えば薬学的等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等を含み得る。適切な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。このような組成物は、患者への適正投与のための形態を提供するために、治療的有効量の化合物（好ましくは精製形態で）を適量の担体と一緒に含有する。処方物は、投与方式に合わせるべきである。
【０１１８】
ある実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物を含む組成物は、ヒトへの静脈内投与のために適合される薬学的組成物として、慣例的手法に従って処方される。典型的には、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物は、可溶化剤および局所麻酔薬、例えばリグノカインも含み、注射部位での疼痛を楽にし得る。一般的に、成分は、別々にまたは単位剤形中に一緒に混合して供給され、例えば、凍結乾燥粉末または無水濃縮物としてアンプルまたはサッシェなどの密閉容器中で活性作用物質の量を示して供給される。組成物が注入により投与されるべきものである場合、それは滅菌薬学的等級水または生理食塩水を含有する注入ボトルを用いて分配され得る。組成物が注射により投与される場合、投与前に成分が混合され得るよう、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０１１９】
ある実施形態では、本明細書中に記載される組成物は、中性または塩形態として処方される。薬学的に許容可能な塩としては、陰イオンを有して生成されるもの、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するもの、および陽イオンを有して生成されるもの、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものを包含する。
【０１２０】
治療用タンパク質の異所性発現および／または活性と関連した疾患または障害の処置、抑制および防止に有効である本明細書中に記載される組成物の量は、標準臨床技法により決定され得る。さらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイは、最適投与量範囲を同定するのを手助けするために任意に用いられ得る。処方物中に用いられるべき精確な用量は、投与経路、ならびに疾患または障害の重篤度によっても決まり、かつ開業医の判断および各患者環境によって決定されるべきである。有効用量は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から得られる用量−応答曲線から推定される。
【０１２１】
免疫グロブリン構築物の組換えおよび合成的製造の方法：
本明細書に記載される免疫グロブリン構築物を発現する少なくとも１つの発現ベクターを含む組成物であって、この免疫グロブリン構築物をコードする少なくとも１つの核酸配列を含む、組成物が提供される。
【０１２２】
ある実施形態では、安定な哺乳動物細胞における、本明細書中に記載される多重特異性免疫グロブリン構築物を含有する発現生成物の産生方法であって、安定した哺乳動物細胞を産生するための免疫グロブリン構築物をコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列と少なくとも１つの哺乳動物細胞をトランスフェクトすることと、前記免疫グロブリン構築物を含む発現生成物を産生するために、安定した哺乳動物細胞を培養することとを含む、方法が提供される。ある実施形態では、哺乳動物細胞は、ＶＥＲＯ、ＨｅＬａ、ＨＥＫ、ＮＳ０、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、Ｃａｃｏ−２およびＭＤＣＫ細胞、ならびにそのサブクラスおよび変異体からなる群から選択される。
【０１２３】
ある実施形態では、酵母、例えば細菌などの微生物、あるいはヒトまたは動物細胞株からの分泌により組換え分子として産生される免疫グロブリン構築物が提供される。実施形態では、ポリペプチドは宿主細胞から分泌される。
【０１２４】
実施形態は、本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物を発現するよう形質転換される細胞、例えば酵母細胞を包含する。形質転換宿主細胞それ自体に加えて、栄養培地中の、それらの細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に均質な）培養物、またはモノクローナル培養物由来の培養物が提供される。ポリペプチドが分泌される場合、培地は、細胞を伴って、あるいはそれらが濾過されまたは遠心分離されていた場合には細胞を伴わずに、ポリペプチドを含有する。多数の発現系が既知であり用いられ得るが、例としては、細菌（例えば、大腸菌および枯草菌）、酵母（例えば、出芽酵母、クルイベロミセス・ラクチスおよびメタノール資化酵母）、糸状真菌（例えばアスペルギルス）、植物細胞、動物細胞および昆虫細胞が挙げられる。
【０１２５】
本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物は、慣用的方法で、例えば宿主染色体中または遊離プラスミド上に挿入されるコード配列から産生される。酵母は、通常の方法のいずれか、例えば電気穿孔で、所望のタンパク質のためのコード配列で形質転換される。電気穿孔による酵母の形質転換方法は、Ｂｅｃｋｅｒ  ＆  Ｇｕａｒｅｎｔｅ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４，１８２に開示されている。
【０１２６】
うまく形質転換された細胞、すなわち本発明のＤＮＡ構築物を含有する細胞は、周知の技法により同定され得る。例えば、発現構築物の導入に起因する細胞は、増殖されて、所望のポリペプチドを産生し得る。細胞は収穫され、溶解されて、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．９８，５０３またはＢｅｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３，２０８により記載された方法と同様の方法を用いて、ＤＮＡの存在に関してそれらのＤＮＡ含有物が調べられる。または、上清中のタンパク質の存在が、抗体を用いて検出され得る。
【０１２７】
有用な酵母プラスミドベクターとしては、ｐＲＳ４０３−４０６およびｐＲＳ４１３−４１６が挙げられ、一般的に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  Ｃａｌｉｆ．  ９２０３７，  ＵＳＡから入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は、酵母組込み型プラスミド（ＹＩｐｓ）であって、酵母選択可能マーカーＨＩＳ３、７ＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を含む。プラスミドｐＲＳ４１３−４１６は、酵母セントロメア型プラスミド（Ｙｃｐｓ）である。
【０１２８】
相補的付着末端を介してベクターにＤＮＡを操作可能的に連結するために、種々の方法が開発されている。例えば、相補的ホモポリマー領域が、ベクターＤＮＡに挿入されるべきＤＮＡセグメントに付加され得る。ベクターおよびＤＮＡセグメントは、次に、相補的ホモポリマー尾部間で水素結合により繋ぎ合わされて、組換えＤＮＡ分子を形成する。
【０１２９】
１つ以上の制限部位を含有する合成リンカーは、ＤＮＡセグメントをベクターに接合する代替的方法を提供する。エンドヌクレアーゼ制限消化により生成されるＤＮＡセグメントは、バクテリオファージＴ４  ＤＮＡポリメラーゼまたは大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１で処理されるが、これらは、それらの３’５’−エキソヌクレオチド分解性活性で突出する一本鎖末端を除去し、それらの重合活性で凹んだ３’末端を充填する酵素である。
【０１３０】
したがって、これらの活性の組合せは、平滑末端ＤＮＡセグメントを生成する。次いで、平滑末端セグメントは、平滑末端ＤＮＡ分子のライゲーションを触媒し得る酵素、例えばバクテリオファージＴ４  ＤＮＡリガーゼの存在下で、多余分モル量のリンカー分子とともにインキュベートされる。したがって、反応の生成物は、それらの末端にポリマーリンカー配列を保有するＤＮＡセグメントである。これらのＤＮＡセグメントは、次に、適切な制限酵素で切断されて、ＤＮＡセグメントの末端と適合性の末端を産生する酵素で切断されている発現ベクターにライゲーションされる。
【０１３１】
種々の制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する合成リンカーは、多数の供給元、例えばＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，  Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，  Ｃｏｎｎ．，  ＵＳＡから市販されている。
【０１３２】
アルブミン融合タンパク質を発現するための宿主として本発明の実施において有用であると意図された酵母の例示的な属は、ピキア（以前はハンセヌラとして分類されていた）、サッカロミセス、クルイベロミセス、アスペルギルス、カンジダ、トルロプシス、トルラスポラ、シゾサッカロミセス、シテロミセス、パキソレン、ジゴサッカロミセス、デバロミセス、トリコデルマ、セファロスポリウム、フミコラ、ムコール、ニューロスポラ、ヤロウィア、メトシュニコヴィア、ロドスポリジウム、ロイコスポリジウム、ボトリオアスクス、スポリジオボルス、エンドマイコプシス等である。好ましい属は、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、クルイベロミセス、ピキアおよびトルラスポラからなる群から選択される。サッカロミセス種の例は、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．イタリクスおよびＳ．ロウキシイである。
【０１３３】
クルイベロミセス種の例は、Ｋ．フラギリス、Ｋ．ラクチスおよびＫ．マルキシアヌスである。適切なトルラスポラ種は、Ｔ．デルブルエッキイである。ピキア（ハンセヌラ）種の例は、Ｐ．アングスタ（以前はＨ．ポリモルファ）、Ｐ．アノマラ（以前はＨ．アノマラ）およびＰ．パストリスである。Ｓ．セレビシエの形質転換のための方法は、一般的に、ＥＰ  ２５１  ７４４、ＥＰ  ２５８  ０６７およびＷＯ  ９０／０１０６３（これらはすべて、その記載内容が参照により本明細書中で援用される）に教示されている。
【０１３４】
好ましい例示的な種のサッカロミセスの例示的な種としては、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．イタリクス、Ｓ．ジアスタティクスおよびジゴサッカロミセス・ロウキシイが挙げられる。クルイベロミセスの好ましい例示的な種としては、Ｋ．フラギリスおよびＫ．ラクチスが挙げられる。ハンセヌラの好ましい例示的な種としては、Ｈ．ポリモルファ（今は、ピキア・アングスタ）、Ｈ．アノマラ（今は、ピキア・アノマラ）およびピキア・カプスラタが挙げられる。ピキアの付加的な好ましい例示的な種としては、Ｐ．パストリスが挙げられる。アスペルギルスの好ましい例示的な種としては、Ａ．ニガーおよびＡ．ニヅランスが挙げられる。ヤロウィアの好ましい例示的な種としては、Ｙ．リポリチカが挙げられる。多数の好ましい酵母種が、ＡＴＣＣから入手可能である。例えば、以下の好ましい酵母種がＡＴＣＣから入手可能であり、アルブミン融合タンパク質の発現において有用である：サッカロミセス・セレビシエ、ハンセン、テレオモルフ菌株ＢＹ４７４３  ｙａｐ３突然変異体（ＡＴＣＣ寄託番号４０２２７３１）；サッカロミセス・セレビシエ  ハンセン、テレオモルフ菌株ＢＹ４７４３  ｈｓｐ１５０突然変異体（ＡＴＣＣ寄託番号４０２１２６６）；サッカロミセス・セレビシエ  ハンセン、テレオモルフ菌株ＢＹ４７４３  ｐｍｔ１突然変異体（ＡＴＣＣ寄託番号４０２３７９２）；サッカロミセス・セレビシエ  ハンセン、テレオモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号２０６２６；４４７７３；４４７７４；および６２９９５）；サッカロミセス・ジアスタティクス  Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  ｅｘ  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ、テレモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号６２９８７）；クルイベロミセス・ラクチス（Ｄｏｍｂｒｏｗｓｋｉ）  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ、テレモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号７６４９２）；ピキア・アングスタ（Ｔｅｕｎｉｓｓｏｎ等）  Ｋｕｒｔｚｍａｎ、テレモルフ（ハンセヌラ・ポリモルファ  ｄｅ  Ｍｏｒａｉｓ  ｅｔ  Ｍａｉａ、テレモルフとして寄託）（ＡＴＣＣ寄託番号２６０１２）；アスペルギルス・ニガー  ｖａｎ  Ｔｉｅｇｈｅｍ、アナモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号９０２９）；アスペルギルス・ニガー  ｖａｎ  Ｔｉｅｇｈｅｍ、アナモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号１６４０４）；アスペルギルス・ニヅランス（Ｅｉｄａｍ）  Ｗｉｎｔｅｒ、アナモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号４８７５６）；およびヤロウィア・リポリチカ（Ｗｉｃｋｅｒｈａｍ等）  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｗａｌｔ  ｅｔ  ｖｏｎ  Ａｒｘ、テレモルフ（ＡＴＣＣ寄託番号２０１８４７）。
【０１３５】
サッカロミセス・セレビシエに関する適切なプロモーターとしては、ＰＧＫＩ遺伝子、ＧＡＬ１またはＧＡＬ１０遺伝子、ＣＹＣＩ、ＰＨ０５、ＴＲＰ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２に関連するもの、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グルコキナーゼ、アルファ−接合因子フェロモン、［接合因子フェロモン］に関する遺伝子、ＰＲＢＩプロモーター、ＧＵＴ２プロモーター、ＧＰＤＩプロモーター、および５’調節領域の部分と他のプロモーターの５’調節領域の部分との、または上流の活性化部位とのハイブリッドを包含するハイブリッドプロモーター（例えば、ＥＰ−Ａ−２５８  ０６７のプロモーター）が挙げられる。
【０１３６】
シゾサッカロミセス・ポンベにおいて用いるための便利な調節可能プロモーターは、Ｍａｕｎｄｒｅｌｌ  （１９９０）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６５，  １０８５７−１０８６４により記載されたようなｎｍｔ遺伝子からのチアミン抑制性プロモーター、ならびにＨｏｆｆｍａｎ  ＆  Ｗｉｎｓｔｏｎ  （１９９０）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２４，  ８０７−８１６により記載されたようなグルコース抑制性ｊｂｐｌ遺伝子プロモーターである。
【０１３７】
外来遺伝子の発現のためにピキアを形質転換する方法は、例えば、Ｃｒｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、ならびに種々のＰｈｉｌｌｉｐｓ特許（例えば、米国特許第４，８５７，４６７号（この記載内容は参照により本明細書中で援用される））に教示されており、ピキア発現キットは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＢＶ，  Ｌｅｅｋ，  ＮｅｔｈｅｒｌａｎｄｓおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆから市販されている。適切なプロモーターとしては、ＡＯＸ１およびＡＯＸ２が挙げられる。Ｇｌｅｅｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２，３４５９−３４６５は、ハンセヌラベクターおよび形質転換に関する情報を包含しており、適切なプロモーターはＭＯＸ１およびＦＭＤ１である；一方、ＥＰ  ３６１  ９９１、Ｆｌｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）およびＲｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒからのその他の出版物は、クルイベロミセス種における外来タンパク質を発現する方法を教示しており、適切なプロモーターはＰＧＫＩである。
【０１３８】
転写終結シグナルは、好ましくは、転写終結およびポリアデニル化のための適正なシグナルを含有する真核生物遺伝子の３’フランキング配列である。適切な３’フランキング配列は、例えば、用いられる発現制御配列と天然に連結された遺伝子の配列であり、すなわち、プロモーターに対応し得る。また、それらは、サッカロミセス・セレビシエＡＤＨＩ遺伝子の終結シグナルが好ましい場合には異なり得る。
【０１３９】
ある実施形態では、所望の免疫グロブリン構築物は最初、分泌リーダー配列を伴って発現され、分泌リーダー配列は選択される酵母において有効な任意のリーダーであり得る。サッカロミセス・セレビシエに有用なリーダーとしては、接合因子アルファポリペプチド（ＭＦa−１）由来のものおよびＥＰ−Ａ−３８７  ３１９のハイブリッドリーダーが挙げられる。このようなリーダー（またはシグナル）が酵母により切断された後、成熟アルブミンが周囲培地中に放出される。さらに、このようなリーダーとしては、ＪＰ  ６２−０９６０８６（９１１０３６５１６として特許付与）に開示されたサッカロミセス・セレビシエインベルターゼ（ＳＵＣ２）、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０５）、ＭＦ  −１のプレ配列、０グルカナーゼ（ＢＧＬ２）およびキラー毒素；サッカロミセス・ジアスタティクスグルコアミラーゼＩｌ；サッカロミセス・カールスベルゲンシス  −ガラクトシダーゼ（ＭＥＬ１）；クルイベロミセス・ラクチスキラー毒素；およびカンジダ・グルコアミラーゼのものが挙げられる。
【０１４０】
本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物をコードするポリヌクレオチドを含有するベクター、宿主細胞、ならびに合成および組換え技法による免疫グロブリン構築物の産生が提供される。ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウィルスまたはレトロウィルスベクターであり得る。レトロウィルスベクターは、複製コンピテントまたは複製欠損性であり得る。後者の場合、ウィルス増殖は、一般的に、相補的な宿主細胞でのみ起こる。
【０１４１】
ある実施形態では、本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物をコードするポリヌクレオチドは、宿主における増殖のために選択マーカーを含有するベクターと結合される。一般的に、プラスミドベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシウム沈殿物中に導入され、あるいは荷電脂質との複合体中に導入される。ベクターがウィルスである場合、それは、適切なパッケージング細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージされ、次いで、宿主細胞中に形質導入され得る。
【０１４２】
ある実施形態では、ポリヌクレオチド挿入物は、適切なプロモーター、例えばファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡおよびｒａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウィルスＬＴＲのプロモーター等に、操作可能的に連結される。その他の適切なプロモーターは、当業者に既知である。発現構築物はさらに、転写開始、終結のための部位を含み、かつ、転写領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。当該構築物により発現される転写体のコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきポリペプチドの始めに翻訳開始コドンを、そして最後に適切に配置される終結コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡまたはＵＡＧ）を包含する。
【０１４３】
上記のように、発現ベクターは、好ましくは少なくとも１つの選択可能マーカーを含む。このようなマーカーとしては、ジヒドロフォレートレダクターゼ、Ｇ４１８、グルタミンシンターゼ、あるいは真核生物培養に関するネオマイシン耐性、ならびに大腸菌およびその他の細菌において培養するためのテトラサイクリン、カナマイシンまたはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表例としては、細菌細胞、例えば大腸菌、ストレプトミセスおよびネズミチフス菌細胞；真菌細胞、例えば酵母細胞（例えば、サッカロミセス・セレビシエまたはピキア・パストリス（ＡＴＣＣ寄託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えばショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞；動物細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＮＳＯ、２９３、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。上記宿主細胞に関する適切な培地および培養条件は、当該技術分野で既知である。
【０１４４】
細菌において用いるために選択されるベクターとしては、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０およびｐＱＥ−９（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ；ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．から入手可能）；ならびにｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．から入手可能）。好ましい真核生物ベクターは、ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１およびｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能）；ならびにｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）。酵母系で用いるための好ましい発現ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＤ１、ｐＴＥＦ１／Ｚｅｏ、ｐＹＥＳ２／ＧＳ、ｐＰＩＣＺ、ｐＧＡＰＺ、ｐＧＡＰＺａｌｐｈ、ｐＰＩＣ９、ｐＰＩＣ３．５、ｐＨＩＬ−Ｄ２、ｐＨＩＬ−Ｓ１、ｐＰＩＣ３．５Ｋ、ｐＰＩＣ９Ｋ、およびＰＡＯ８１５（すべて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｂａｄ，ＣＡから入手可能）が挙げられるが、これらに限定されない。その他の適切なベクターは、当業者には容易に明らかになる。
【０１４５】
一実施形態では、本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物構築物をコードするポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質の局在化を原核生物または真核生物細胞の特定区画に向ける、および／または原核生物あるいは真核生物細胞からの本発明のタンパク質の分泌を指図するシグナル配列と融合される。例えば、大腸菌では、タンパク質の発現をペリプラズム空間に向けたいと考え得る。細菌のペリプラズム空間にポリペプチドの発現を向けるために、免疫グロブリン構築物が融合されるシグナル伝達配列またはタンパク質（またはその断片）の例としては、ｐｅｌＢシグナル配列、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）シグナル配列、ＭＢＰ、ｏｍｐＡシグナル配列、ペリプラズム大腸菌熱不安定性エンテロトキシンＢ−サブユニットのシグナル配列、ならびにアルカリ性ホスファターゼのシグナル配列が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質の局在化を指図する融合タンパク質の構築のためのいくつかのベクターが市販されており、例としては、ｐＭＡＬシリーズのベクター（特に、ｐＭＡＬ−．ｒｈｏ．シリーズ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手可能）が挙げられる。具体的一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドアルブミン融合タンパク質は、ｐｅｌＢペクテートリアーゼシグナル配列と融合されて、グラム陰性細菌におけるこのようなポリペプチドの発現および精製の効率を増大し得る。米国特許第５，５７６，１９５号および第５，８４６，８１８号（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）参照のこと。
【０１４６】
哺乳動物細胞におけるその分泌を指図するために免疫グロブリン構築物と融合されるシグナルペプチドの例としては、ＭＰＩＦ−１シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＢ５１１３４のアミノ酸１〜２１）、ｓｔａｎｎｉｏｃａｌｃｉｎシグナル配列（ＭＬＱＮＳＡＶＬＬＬＬＶＩＳＡＳＡ）、およびコンセンサスシグナル配列（ＭＰＴＷＡＷＷＬＦＬＶＬＬＬＡＬＷＡＰＡＲＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。バキュロウィルス発現系とともに用いられ得る適切なシグナル配列は、ｇｐ６７シグナル配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＡＡＡ７２７５９のアミノ酸１〜１９）である。
【０１４７】
選択可能マーカーとしてグルタミンシンターゼ（ＧＳ）またはＤＨＦＲを用いるベクターは、それぞれ、薬剤メチオニンスルホキシミンまたはメトトレキセートの存在下で増幅され得る。グルタミンシンターゼベースのベクターの利点は、グルタミンシンターゼ陰性である細胞株（例えば、ネズミ骨髄腫細胞株、ＮＳＯ）の利用可能性である。グルタミンシンターゼ発現系は、内因性遺伝子の働きを防止するために付加的阻害薬を提供することにより、グルタミンシンターゼ発現細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞）においても機能し得る。グルタミンシンターゼ発現系およびその構成成分は、ＰＣＴ公告：ＷＯ８７／０４４６２；ＷＯ８６／０５８０７；ＷＯ８９／１００３６；ＷＯ８９／１０４０４；およびＷＯ９１／０６６５７（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に詳述されている。さらに、グルタミンシンターゼ発現ベクターは、Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ．（Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，Ｎ．Ｈ．）から獲得され得る。ネズミ骨髄腫細胞におけるＧＳ発現系を用いるモノクローナル抗体の発現および産生は、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６９（１９９２）ならびにＢｉｂｌｉａ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｐｒｏｇ．  １１：１（１９９５）（これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される）に記載されている。
【０１４８】
本明細書中に記載されるベクター構築物を含有する宿主細胞、ならびに付加的に、当該技術分野で既知の技法を用いて、１つ以上の非相同制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）と操作可能的に連携するヌクレオチド配列を含有する宿主細胞も提供される。宿主細胞は、高等真核生物細胞、例えば哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来細胞）、または下等真核生物細胞、例えば酵母細胞であり得、あるいは宿主細胞は原核生物細胞、例えば細菌細胞であり得る。挿入遺伝子配列の発現を調整するか、あるいは所望の特異的方式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主系統が、選択され得る。あるプロモーターからの発現は、ある誘導物質の存在下で増大され得る;したがって、遺伝子改変ポリペプチドの発現は、制御され得る。さらに、異なる宿主細胞は、タンパク質の翻訳および翻訳後プロセシングおよび修飾（例えば、リン酸化、開裂）のための特質および特異的機構を有する。発現される外来タンパク質の所望の修飾およびプロセシングを保証するために、適切な細胞株が選択され得る。
【０１４９】
宿主細胞中への本発明の核酸および核酸構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、陽イオン性脂質媒介性トランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染またはその他の方法により実施され得る。このような方法は、多数の標準的実験室マニュアル、例えばＤａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９８６）に記載されている。本発明のポリペプチドは、実際に、組換えベクターを欠く宿主細胞により発現され得る、ということが具体的に意図される。
【０１５０】
本明細書中に記載されるベクター構築物を含有する宿主細胞を包含するほかに、本発明は、内因性遺伝物質を欠失するかまたは置換するようおよび／または遺伝物質を含むよう改変されている、脊椎動物起源の、特に哺乳動物起源の一次、二次および不死化宿主細胞も包含する。内因性ポリヌクレオチドと操作可能的に連携する遺伝物質は、内因性ポリヌクレオチドを活性化し、変更し、および／または増幅し得る。
【０１５１】
さらに、当該技術分野で既知の技法を用いて、非相同ポリヌクレオチドおよび／または非相同制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）を、相同組換えにより、治療用タンパク質をコードする内因性ポリヌクレオチド配列と操作可能的に連携し得る（例えば、米国特許第５，６４１，６７０号（１９９７年６月２４日発行）；国際公開番号  ＷＯ  ９６／２９４１１；国際公開番号  ＷＯ  ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：８９３２−８９３５（１９８９）；およびＺｉｊｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：４３５−４３８（１９８９）（これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される）参照）。
【０１５２】
本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物は、周知の方法、例えば硫酸アンモニウムまたはエタノール沈降、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性電荷相互作用クロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーにより、組換え細胞培養から回収され、精製され得る。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）が、精製のために用いられる。
【０１５３】
ある実施形態では、本発明の免疫グロブリン構築物は、陰イオン交換クロマトグラフィー、例えばＱ−セファロース、ＤＥＡＥセファロース、ポロスＨＱ、ポロスＤＥＡＦ、トヨパールＱ、トヨパールＱＡＥ、トヨパールＤＥＡＥ、リソース／ソースＱおよびＤＥＡＥ、フラクトゲルＱおよびＤＥＡＥカラム上でのクロマトグラフィー（これらに限定されない）を用いて、精製される。
【０１５４】
具体的実施形態では、本明細書中に記載されるタンパク質は、陽イオン交換クロマトグラフィー、例えばＳＰ−セファロース、ＣＭセファロース、ポロスＨＳ、ポロスＣＭ、トヨパールＳＰ、トヨパールＣＭ、リソース／ソースＳおよびＣＭ、フラクトゲルＳおよびＣＭカラムならびにそれらの等価物および匹敵物上でのクロマトグラフィー（これらに限定されない）を用いて、精製される。
【０１５５】
さらに、本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物は、当該技術分野で既知の技法を用いて化学的に合成され得る（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，  Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｎ．ＹおよびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１０：１０５−１１１（１９８４）参照）。例えば、ポリペプチドの断片に対応するポリペプチドは、ペプチド合成機の使用により合成され得る。さらに、所望により、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体が、ポリペプチド配列中に置換または付加として導入され得る。非古典的アミノ酸としては、一般のアミノ酸のＤ−異性体、２，４ジアミノ酪酸、アルファ−アミノイソ酪酸、４アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、  −アラニン、フルオロ−アミノ酸、例えば  −メチルアミノ酸、Ｃ  −メチルアミノ酸、Ｎa−メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、、およびアミノ酸類似体が概して挙げられるが、これらに限定されない。さらに、アミノ酸は、Ｄ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
【０１５６】
たとえば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基、タンパク質分解的切断、抗体分子または他の細胞性リガンドとの連結による誘導体化といった翻訳中または翻訳後に異なって修飾される、免疫グロブリン構築物が提供される。多くの化学的修飾のいずれかが、限定するものではないが、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ４による特異的化学切断；アセチル化、ホルミル化、酸化、還元;ならびにツニカマイシン存在下での代謝合成などを含む、知られている技術により実施されてもよい。
【０１５７】
本明細書中に含まれる付加的翻訳後修飾としては、例えば、Ｎ結合型またはＯ結合型炭水化物鎖、Ｎ末端またはＣ末端のプロセシング、アミノ酸主鎖への化学部分の結合、Ｎ結合型またはＯ結合型炭水化物鎖の化学的修飾、ならびに原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加または欠失が挙げられる。本明細書中に記載される免疫グロブリン構築物は、検出可能な標識で、例えば酵素、蛍光、同位体または親和性標識で修飾されて、タンパク質の検出および単離を可能にする。
【０１５８】
適切な酵素標識の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジンビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；そして適切な放射性物質の例としては、ヨウ素、炭素、イオウ、トリチウム、インジウム、テクネチウム、タリウム、ガリウム、パラジウム、モリブデン、キセノン、フッ素が挙げられる。
【０１５９】
具体的実施形態では、免疫グロブリン構築物またはそのフラグメントもしくは変異体は、放射性金属イオンと会合する大環状キレート剤に結合される。
【０１６０】
上述のように、本明細書に記載の免疫グロブリン構築物は、天然過程、例えば翻訳後プロセシングにより、または当該技術分野で周知の化学修飾技法により修飾される。、同一型の修飾が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位で、同一または種々の程度で存在し得ることが理解される。本発明のポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分枝され、かつ、分枝を伴って、または伴わずに、環状である。環状分枝鎖および分枝鎖環状ポリペプチドは、翻訳後天然過程の結果であるか、あるいは合成方法により作成されてもよい。修飾としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスホチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有的架橋の形成、システインの生成、ピログルタメートの生成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペギル化、タンパク質分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、例えばアルギニル化などのタンパク質へのアミノ酸のトランスファーＲＮＡ媒介性付加、およびユビキチン化が挙げられる(例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｔ．  Ｅ．  Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，  Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，  Ｂ．  Ｃ．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｇｓ．  １−１２（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １８２：６２６−６４６（１９９０）；  Ｒａｔｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８−６２（１９９２）参照）。
【０１６１】
ある実施形態では、免疫グロブリン構築物は固体支持体と結合され、これは、本明細書に記載される免疫グロブリン構築物により結合され、それと結合し、またはそれと会合するポリペプチドのイムノアッセイまたは精製のために特に有用である。このような固体支持体としては、硝子、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【０１６２】
以下の具体的且つ非限定的例は、単なる例証として意図されるものであって、いかなる点においても本発明の開示を限定するものではない。さらなる詳細な検討の必要もなく、本明細書中の記載に基づいて、当業者は本発明の開示を最大限利用し得る。本明細書中で引用される出版物はすべて、それらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。ＵＲＬまたはその他のこのような識別子または識別符号を参照する場合、このような識別子は変化し得るし、インターネットにおける特定情報は移り変わり得るが、しかし等価情報はインターネット検索により見出され得る、と理解される。それを参照することは、このような情報の利用可能性および公的普及を立証する。
【０１６３】
実施例１：リンカー組成物
単鎖形態のリンカーペプチド結合ドメインは、タンパク質分解性の安定性、立体構造の安定性、再フォールディングの動力学、多量体化の程度、および抗原親和性などの設計タンパク質の特性に影響を与えることができる。本明細書に記載される長いリンカーの設計は、表１に提示される重鎖ドメインに結合するｓｃＦａｂおよびｓｃＦｖｓの上でいくつかのリンカーの長さおよび組成物を試験することにより同定した。ＧＧＧＳ配列が一般的に使用され、変質した水力学的特性を提供するためにリンカーに電荷を導入することができ、これらのリンカーの一部は、らせん二次構造を形成する性向を有する配列を含む。らせん構造を好ましく形成するポリペプチド配列は当業者に公知である（Ｍａｒｑｕｓｅｅ，Ｓ．  ａｎｄ  Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｒ．Ｌ．  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４，  ８８９８-８９０２）。これらのポリペプチドは、概して、ポリペプチド配列のｉおよび（ｉ＋４）ｔｈ位にお互いに好ましく相互作用する残基を有する。本明細書に記載される構築物は、単鎖形態のＦａｂ分子の設計および作成に、このようならせんを形成するポチペプチドの使用が提供されるという、唯一かつ予測し得ない利点を表している。長いリンカー形態のｓｃＦａｂでは、長いリンカーは、ＣＬドメインおよびＶＨドメインに結合する。表１は、使用されるリンカーを示す。
表１：使用されるリンカー
【表１】
2015531751.tif 000007
【０１６４】
本明細書に記載される軽鎖挿入断片設計は、免疫グロブリン鎖の定常ドメインポリペプチドに結合する単鎖Ｆｖポリペプチドを含む免疫グロブリン構築物の設計を指す。この軽鎖挿入断片設計は、２つの異なる位置、（１つの結合するＶＨドメインおよびＶＬドメイン（ＶＨＶＬリンカー）、ならびに別の結合するＣＨドメインおよびＣＬドメイン（ＣＨＣＬリンカー））に位置するより短いリンカーを含む。分子モデリングを、リンカーの長さを提唱するために使用した。図１９は、典型的な軽鎖挿入断片形態のモデルを示す。
【０１６５】
表２は、軽鎖挿入断片設計で使用したリンカーを示す。
表２：軽鎖挿入断片設計に使用したリンカー。一部の実施形態では、Ｎ末端および／またはＣ末端の他の残基は、これらのリンカーの残基を補足するために導入されてもよい。
【表２】
2015531751.tif 000008
【０１６６】
予測されるように、高いリンカーの可動性により、ｓｃＦｖｓの利用可能な構造でＶＨＶＬリンカーに対応する電子密度は存在しない。ＶＨのＣ末端およびＶＬのＮ末端の相対位置は、リンカー経路はＭＯＥにモデル化されるものと同様であり、ＶＨ：ＶＬの界面に近位的であることが示唆される。
【０１６７】
実施例２：長いリンカー（ＬＬ）戦略の使用したｓｃＦａｂ構築物、または軽鎖挿入断片（ＬＣＩ）戦略の使用によるｓｃＦｖの調製
抗体Ｄ３Ｈ４４の配列は、ＰＤＢの１ＪＰＳ構造から抽出した（ヒト化Ｄ３Ｈ４４Ｆａｂを有する複合体中の組織因子）。同様に、抗体４Ｄ５の配列は、１Ｎ８Ｚ構造（ＨＥＲ２およびハーセプチンＦａｂの細胞外領域の複合体）から取得した。ＮＭ３Ｅ２（抗ＣＤ１６）ｓｃＦｖの配列を、文献から取得した［Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＣＤ１６  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉ−ＨＥＲ２／ｎｅｕ／ａｎｔｉ−ＣＤ１６  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｃＦｖ  ｔｈａｔ  ｔｒｉｇｇｅｒｓ  ＣＤ１６−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｕｍｏｒ  ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ．  ＭｃＣａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９９，  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，  ３６（７）：４３３−４４５］。単鎖Ｆａｂおよび軽鎖挿入断片構造は、上記の表１および２に列挙したリンカーとドメインを結合することによって設計した。これらの構築物を、標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して調製した。たとえば、長いリンカーを伴うｓｃＦａｂでは、長いリンカー構築物の特定の設計を表３に示し、ＬＣＩ構築物の特定の設計を以下の表４に示す。
【０１６８】
ＤＮＡ空間では、すべての配列は、ＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧに対応する先行する単鎖配列、および５′ＥｃｏＲＩおよび３′ＢａｍＨＩの制限部位を有する。すべてのＦａｂは、ＣＬおよびＣＨ１の間のジスルフィド結合形成に必要なシステイン残基を含む。ＬＣＩ挿入の場合リンカーは、１つの端のｓｃＦｖを模倣し、新規に作成したＣＨ１のＮ末端で１つの分散可能なアミノ酸残基の除去を得た他の端のリンカー間のクラッシュを避ける方法において、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメイン中に新規に作成した端に付着した。このｓｃＦａｂ形態構築物は、提示される適切なリンカーを有するＶＨ、ＶＬ、ＣＬ、ＣＨ１ドメインを含む。
表３：ｓｃＦａｂのリンカー配列および説明
【表３】
2015531751.tif 000009
表４：追加のｓｃＦａｂのリンカー配列および説明
【表４】
2015531751.tif 000010
【０１６９】
リンカーの説明：
ＧＳ−１５：（ＧＧＧＧＳ）３
ＧＳ−２０：（ＧＧＧＧＳ）４
ＧＳ−２４：（ＧＧＧＧＳ）４ＧＧＧＧ
ＧＳ−２８：（ＧＧＧＧＳ）５ＧＧＧ
ＧＳ−３０：（ＧＧＧＧＳ）６
ＧＳＴ−１８：ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ
ＧＳＴ−２０：ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＳＧ
ＧＳＴ−２６：ＧＳＴＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＧＳＴＳ
ＧＳＥ−３０：（ＳＧＧＧ）２（ＳＥＧＧＧ）４ＳＧ
ＧＳＥ−３４：（ＳＧＧＧ）２（ＳＥＧＧＧ）４ＳＧＧＧＳＧ
【０１７０】
実施例３：ｓｃＦａｂの発現、精製、および分析
２ｍｌのＨＥＫ２９３（３つ）において発現を実施した。ＰＥＩ（１ｍｇ／ｍｇの水に溶解したリニアのポリエチレンイミン２５ｋＤａ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ＃  ２３９６６）およびＰＥＩ／ＤＮＡの比率が２．５：１を１μｇＤＮＡ／ｍｌ細胞で、指数関数増殖期（１，５００，０００〜２，０００，０００細胞／ｍｌ）に細胞をトランスフェクトした。サケの精子のＤＮＡ（７０％）を添加して１００μｇのＤＮＡを得た。ＰＥＩを総トランスフェクション量が１／２０となるように、トランスフェクション媒体と混合させた。ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物をボルテックスで混合し、室温で３分インキュベートした。トランスフェクション媒体（室温または３７℃で事前に加熱）は、細胞を維持するために使用される媒体と同一である（４ｍＬ−グルタミン、０．１％のプルロニックＦ６８および０．０２５ｍｇ／ｍｌＧ４１８で懸濁したＦ１７培地）。発現を、還元または非還元条件で、煮沸することなく、ＭＯＰ緩衝液を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ４〜１２％により評価した。
【０１７１】
図６Ａ〜Ｆに発現結果を示す。図６Ａは、ジスルフィド、軽鎖挿入断片を含むｓｃＦａｂ４Ｄ５のないＦａｂ発現を示し、図６Ｂは、リンカーが挿入されているｓｃＦａｂ  ４Ｄ５、ｓｃＦａｂ  Ｄ３Ｈ４４の発現を示し、図６Ｃは、リンカーが挿入されているｓｃＦａｂ  Ｄ３Ｈ４４、およびｓｃＦａｂ  ＮＭ３Ｅ２の発現を示し、図６Ｄは、ＤＴＴが存在しない中でのＦａｂ対照、ｓｃＦａｂ  ４Ｄ５、ｓｃＦａｂ  Ｄ３Ｈ４４、ｓｃＦａｂ  ＮＭ３Ｅ２、およびＴＦの発現を示し、図６Ｅは、ｓｃＦａｂ  ４Ｄ５、ｓｃＦａｂ  Ｄ３Ｈ４４の発現を示し、図６Ｆは、Ｆａｂ対照、ｓｃＦａｂ  ＮＭ３Ｅ２、およびＴＦの発現を示し、図６Ｇは、リンカーが挿入されているｓｃＦａｂ  ＮＭ３Ｅ２の発現を示す。この図６Ａ、６Ｂ、および６Ｃ中の５０ｋＤａ近いバンドは、軽鎖挿入断片形態のｓｃＦａｂの形成を示す。図６Ｄ、６Ｅ、６Ｆ、および６Ｇでは、さまざまな種類の長いリンカーを備えたｓｃＦａｂ発現の比較が提示される。予測したモノマー種の発現は、多くの場合観察されたが、形成されたダイマー種と比較して観察されたモノマーのいくつかのレベルは、一部のリンカーがそれ以外の他のリンカーよりも良好に発現したことを示す。抗原標的と異なるらせんリンカー（Ｈ４１）結合を有するｓｃＦａｂ変異体を示す変異型ｖ６５４およびｖ６７３は、Ｆａｂに形成される低量のダイマーよりも一貫して良好に発現する傾向がある。
【０１７２】
スケールアップおよび精製
試料を、５００ｍｌのＨＥＫ２９３細胞でスケールアップした。上清中の発現タンパクを１２５ｍｌまで濃縮し、１ｍｌ／分の流速でＫａｐｐａＳｅｌｅｃｔアフィニティーカラムに充填した。１０ＣＶのＰＢＳ緩衝液で平衡化および洗浄を行い、ｐＨ３．０での０．１Ｍグリシンを用いてタンパク質の溶出を行った。プール分画および脱塩を、エコパックカラム上で実施し、タンパク質をＰＢＳに貯蔵した。
【０１７３】
タンパク質収率を、ナノドロップを介して推定した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、非還元状態および還元状態で行った（図１７）。非還元ゲルは、実際に行う場合には、多量体化を示す。リンカーの存在しない対照分子ｖ６９５（４Ｄ５Ｆａｂ）は、予測される〜５０ｋＤａのＭＣで行い、２５ｋＤａのバンドで示される通り、弱いジスルフィド還元を示す
【０１７４】
スケールアップおよびタンパク質の精製結果を以下の表５にまとめる。
表５：変異収率、ポストアフィニティ精製の概要
【表５】
2015531751.tif 000011
【０１７５】
ＬＣＬ形態およびＬＬ形態の両方における２つの異なる抗原結合Ｆａｂ（４Ｄ５およびＤ３Ｈ４４）のために取得される生成物単鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）は、リンカーなしに取得された形態と比較可能である。
【０１７６】
ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）
以下の製造業社の指示にしたがい、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００（１６／６０）を使用する、標準的なプロトコルによりＳＥＣにより変異体を精製した。ランニングバッファーはＰＢＳであった。精製したタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりアッセイした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの結果を図７に示す。結果を以下の表６にまとめる。
表６：ＳＥＣ精製の概要
【表６】
2015531751.tif 000012
【０１７７】
結合
ＳＰＲおよびＥＬＩＳＡ系抗原結合アッセイを、変異体が標的抗原に結合できることを示すＳＥＣ精製変異体に関して実施した。ＳＰＲでは、ｓｃＦＡｂは、抗ｈｌｇＧで飽和させたチップで補足し、リガンド（Ｈｅｒ２またはＴＦ）を、３００ｎＭでチップの上を通過させた。ＥＬＩＳＡアッセイでは、０．５μｇ／ｍｌのＨｅｒ２または１０μｇ／ｍｌ〜０．１５６μｇ／ｍｌのＴＦを、ＰＢＳを含むアッセイプレート上でプレーティングした。単鎖Ｆａｂ変異体を、４００ｎｇ／ｍｌ〜６．２５ｎｇ／ｍｌに段階希釈した。１：５０００、１：１０，０００、および１：２０，０００の希釈で、特異的なヤギ（Ｆａｂ′）２抗ヒト（Ｆａｂ′）２フラグメントを使用して検出を実施した。図８Ａ〜８Ｂは、変異体６５４、６５８、６９５、および７０５（図８Ａ）、ならびに変異体６８５、６７３、６９６、および７０７（図８Ｂ）でのＥＬＩＳ系抗原結合アッセイの結果を示す。以下の表７は、ＳＰＲを使用して取得した結合データを示す。
表７：ＳＰＲによるｓｃＦａｂ変異体の結合データ
【表７】
2015531751.tif 000013
【０１７８】
なお、単鎖形態に構築物が構築される際の、Ｈｅｒ２および組織因子結合Ｆａｂ（４Ｄ５  ＦａｂおよびＤ３Ｈ４４  Ｆａｂ）の結合親和性は、親Ｆａｂ様抗原結合親和性を保持する。
【０１７９】
安定性
ＳＥＣの精製変異体に関して、示差走査熱量計（ＤＳＣ）を実施し、分子の熱力学的安定性を評価した（図９Ａ〜Ｅ）。ＤＳＣ実験は、ＧＥまたはＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−キャピラリー計器を用いて実施した。タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）に緩衝液交換し、０．３〜０．７ｍｇ／ｍＬに希釈して０．１３７ｍＬで試料セル中に充填し、１℃／分の走査速度にて２０℃〜１００℃で測定した。データを、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析して、ＰＢＳ緩衝液バックグラウンドを差し引いた。
【０１８０】
ＤＳＸの結果を、以下の表８にまとめる。
表８：ｓｃＦａｂ変異体のＤＳＣ結果
【表８】
2015531751.tif 000014
【０１８１】
長いリンカーを有する単鎖形態の変異Ｆａｂは、Ｆａｂ様熱安定性を保持する。軽鎖挿入断片のｓｃＦａｂは、親のＦａｂに対して約１０℃より低い熱安定性を有する。
【０１８２】
実施例４：単鎖Ｆａｂ形態のベンチトップ安定性のアッセイ（図１０）
ベンチトップ安定性試験では、分析下での各タンパク質変異体の試料を採取することと、室温（２０℃）で週単位の長期間にわたり崩壊および／またはオリゴマー化をモニタリングすることとが行われる。サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびＵＰＬＣの前に、ウェルあたり２．５  ｇのタンパク質を充填して、還元型および非還元型ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して評価を実施した。タンパク質濃縮物を、Ａ２８０ナノドロップにより決定した。各タンパク質試料は、単量体画分に対応するサイズ排除精製タンパク質からなる。実験の開始時（０時間）に採取した最初の試料を用いて、タンパク質を室温でバイアル中に保存した（ベンチトップ）。その後試料を、２４時間後、３日後、および７日後に採取した。各試料を、クマシーブルーＳＤＳ緩衝液で変性させ、最終的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価まで−８０℃で保存した。
【０１８３】
このサンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図１０Ａ（第１日）、図１０Ｂ（第３日目）、および図１０Ｃ（第７日目）に示す。この結果を以下の表９および１０にまとめる。
表９：ベンチトップ安定性結果の概要
【表９】
2015531751.tif 000015
表１０：ＳＰＲ結合データ。新鮮なタンパク質および室温で１週間保存した後のタンパク質に関するデータを取得する。保存した試料は、Ｈｅｒ２に結合する標的および組織因子抗原を保持する。
【表１０】
2015531751.tif 000016
【０１８４】
表１０に示したａ４１リンカーは、表３に対する説明に記載されるらせん４１リンカーに対応し、かつ、Ｈ−４１として本明細書の他の部分に示される。この結果から、１週間単位での試験中に使用される比較的希薄な濃度で、単鎖Ｆａｂ試料のすべてが再び多量化しないことが示される。
【０１８５】
実施例５：ＣＨＯ細胞系の二価単一特異性ｓｃＭａｂ（ヘテロダイマーＦｃ）の発現、精製、および分析。２つの鎖のＤＮＡの比率は、１：１（鎖Ａ／鎖Ｂ）であった（図１１）。
表１１に記載する二価単一特異性ｓｃＭａｂを構築した。二価単一特異性ｓｃＭａｂを、標準的な組み換えＤＮＡクローニング法を使用し、実施例２に記載したｓｃＦａｂ設計を使用して構築した。手短に、二価ｓｃＭａｂの各ポリペプチドを、野生型ＩｇＧ１リンカーを介して抗体のＦｃ領域をコードする核酸に関連するｓｃＦａｂ（長いリンカーまたはＬＣＩ設計）をコードする核酸を融合することにより作成した。Ｆｃ領域は、ヘテロダイマー抗体分子の形成を可能にするＣＨ３ドメイン上で、ハーバー（ｈａｒｂｏｒ）変異を使用した。（すなわち鎖Ａは、Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７変異を有し、かつ鎖Ｂは、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ変異を有する。）２ｍｌのＨＥＫ２９３またはＣＨＯにおいて発現を実施した。ＰＥＩ（１ｍｇ／ｍｌの水に溶解したポリエチレンイミン（２５ｋｄａ、リニア）、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｃａｔ＃  ２３９６６）および２．５：１のＰＥＩ／ＤＮＡの比率での１μｇのＤＮＡ／ｍｌ細胞で、細胞を指数関数増殖期（１，５００，０００〜２，０００，０００細胞／ｍｌ）に細胞をトランスフェクトした。サケの精子のＤＮＡ（７０％）を、１００μｇＤＮＡを完成させるために添加した。総トランスフェクションの１／２０容量でトランスフェクション媒体にＰＥＩを混合した。ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物をボルテックスし、３分室温でインキュベートした。トランスフェクション媒体（室温または３７℃で事前に加温）は、細胞の維持のために使用される媒体（４ｍｌ−グルタミン、０．１％プルロニックＦ６８および０．０２５ｍｇ／ｍｌＧ４１８）と同一である。
【０１８６】
精製のために、０．４５μｍのフィルター単位を使用し、精製前に分類した培養媒体を室温に戻し、脱気した。単鎖ヘテロダイマーおよび野生型ＩｇＧ１抗体を、タンパク質Ａ（Ｍａｂｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ）を使用して精製した。このカラムを５ＣＶのＰＢＳで平衡化させた。濾過した媒体を、タンパク質Ａカラム上に充填し、その後、１０ＣＶのＰＢＳで洗浄した。この抗体を、ｐＨ３．６の１０ＣＶクエン酸緩衝液で溶出し、抗体画分を収集した。ｐＨ１１のトリス緩衝液の画分の１／３容量を添加することによりこのｐＨを中和した。精製したタンパク質を、脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ由来のＥｃｏｎｏ−Ｐａｃ  １０ＤＧ）を使用して脱塩した。代表的なＳＤＳページゲルを図（表）１１に示す。
表１１
【表１１】
2015531751.tif 000017
【０１８７】
実施例６：ｓｃＭＡｂのベンチトップ安定性アッセイ（図１２Ａ〜１２Ｃ）
ベンチトップ安定性試験（３回繰り返す）では、分析下で各タンパク質変異体の試料を採取することと、異なる温度で３日の保存課程にわたる崩壊および／オリゴマー化、ならびに−２０℃で保存したタンパク質に対する比較物をモニタリングすることとが行われた。還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ウェルあたり２．５  ｇのタンパク質を充填する評価を行った。Ａ２８０ナノドロップによりタンパク質濃度を判定した。実験の開始時（０時間）に採取した初期の試料を用いて、タンパク質を目的の温度でバイアル中に保存した。その後の試料を、３日後に採取した。各試料を、クマシーブルー緩衝液中で変性させ、最終的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価まで−８０℃で保存した。
【０１８８】
この結果から、３日の長い試験の間、使用される相対希釈濃度で、すべての単鎖Ｍａｂが多種特異性状態を増大しないことが示される。ＩｇＧ１（ハーセプチン）を対照として挙げた。図１２Ａ〜１２Ｃは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価の結果を示す。この結果を表１２にまとめる。
表１２：ｓｃＭａｂのベンチ安定性試験の概要
【表１２】
2015531751.tif 000018
【０１８９】
生成物の有意な分解または多量体化の増大がないことは、ベンチトップ安定性分析の過程で視認可能であった。
【０１９０】
実施例７：図１３にみられるように、ＣＨＯ細胞系中の二価二重特異性ｓｃＭａｂ（ヘテロダイマーＦｃ）の発現および精製。２つの鎖のＤＮＡ比率は１：１であった（鎖Ａ／鎖Ｂ）。
表１３に記載される二重特異性Ｈｅｒ２（トラスツズマブ）／ＴＦ（Ｄ３Ｈ４４）ｓｃＭａｂを以下のように構築した。二重特異性ｓｃＭａｂ分子を作成するために使用される手法は、実施例５に記載されるように設計した重鎖を組み合わせる（すなわち、ヘテロダイマーＡｂ分子の形成を可能にするＣＨ３ドメイン上の変異を許容する）ことであった（すなわち、鎖Ａは、Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ変異を有し、鎖Ｂは、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ変異を有する）ことであった。これらの二価ｓｃＭａｂの重鎖上のＣＨ３ドメイン中の変異は、二重特異性ｓｃＭａｂの複数の組み合わせにより、２つの異なる抗原への結合を保持するのみだけでなく、同一または異なるリンカー種（同一の長いリンカーまたはＬＣＩ骨格内の短いまたは長いリンカー）および、同一または異なる骨格（すなわち長いリンカー対ＬＣＩ）を宿すＦａｂ領域を有する。二重特異性ｓｃＭａｂの以下の群を構築した：同一のリンカーおよび同一の骨格を有する二重特異性分子（すなわちｖ１３５３および１３５７）；同一の骨格であるが異なるリンカー（ｖ１３５２、１３５４、１３５５、１３５８）；異なる骨格、異なるリンカー（ｖ１３５９、１３５６）。実施例３に記載される５０ｍｌのＣＨＯ培養物中で発現を実施した。
【０１９１】
精製では、０．４５μｍのフィルターユニットを使用する精製の前に、分類した培養媒体を室温に戻し、脱気した。単鎖ヘテロダイマーおよび野生型ＩｇＧ１抗体を、タンパク質Ａを使用することにより精製した（Ｍａｂｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ）。カラムを、５ＣＶのＰＢＳで平衡化した。濾過した媒体を、タンパク質Ａカラムに充填し、その後１０ＣＶのＰＢＳで洗浄した。この抗体を、ｐＨ３．６の１０ＣＶクエン酸緩衝液で溶出し、抗体画分を収集した。このｐＨを、ｐＨ１１のトリス緩衝液の１／３容量を添加することにより中和した。精製したタンパク質を、脱塩カラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ由来のエコノパック１０ＤＧカラム）を使用して脱塩した。この親和性精製結果を表１４にまとめる。
表１３：
【表１３】
2015531751.tif 000019
表１４  ｓｃＭａｂの精製の概要
【表１４】
2015531751.tif 000020
【０１９２】
実施例８：二重特異性ｓｃＭａｂ（ＬＬ／ＬＬ）のＳＥＣプロファイルおよびＳＰＲサンドイッチアッセイ（図１４、１５、および１６）
ＨＥＲ２を、ＧＬＭセンサーチップ上で固定化し、ｓｃＭａｂを最初に補足した。ＴＦ結合を、固定化したＨＥＲ２−ｓｃＭａｂ上でＴＦを補足することにより判定した。二量体二重特異性ｓｃＭａｂは、ＨＥＲ２およびＴＦの両方と結合する。
【０１９３】
２５℃のＨＢＳＴランニングバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｎＭ  ＮａＣｌ、３．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．４）でバイオラッドのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６の器具（バイオラッド、ミシサガ市、カナダ）を使用して、すべての表面プラズモン共鳴結合アッセイを実施した。分析物（水平）方向に３０μｌ／分で３００秒間注入した１：５に希釈した標準的なバイオラッドｓＮＨＳ／ＥＤＣ溶液により活性化したＧＬＭセンサーチップを使用してＨｅｒ２補足表面を作成した。活性化の直後に、Ｈｅｒ２を含むｐＨ４．５の１０ｍＭのＮａＯＡｃ４．０μｇ／ｍｌ溶液を、約３０００共鳴単位（ＲＵ）を固定化するまで、２５μｌ／分の流量でリガンド（垂直）方向に注入した。残存する活性基を、分析物方向に、３０μｌ／分で１Ｍのエタノールアミンを３００秒注入することにより反応停止させ、かつこのことは、空の参照のためにモックで活性化された中間物（ｉｎｔｅｒｓｐｏｔ）が生じることを保証するものでもある。５つの単鎖Ｍａｂ変異体のうちの１つを、流速２５μｌ／分で２４０秒間、個々のリガンドチャネル中に同時に注入した。このことは、Ｈｅｒ２−表面上に飽和補足物を与える。抗体補足の後、ＴＦ分析物を、チップの上を通過させ、二重特異性単鎖分子により結合させた。センサーグラムを、バッファーブランク注入および中間物（ｉｎｔｅｒｓｐｏｔ）を使用してアライメントさせ、二重に参照し、ＰｒｏｔｅＯｎマネージャーソフトウェア  バーション３を使用してこの結果として得られるセンサーグラムを分析した。
【０１９４】
図１５Ａ〜１５Ｃに見られるように、二重特異性ｓｃＭａｂ（ＬＣＩ／ＬＣＩ）ＳＥＣプロファイルおよびＳＰＲサンドイッチアッセイを実施した。ＨＥＲ２をチップ上で固定化し、ｓｃＭａｂを最初に補足した。その後、組織因子（ＴＦ）結合を、固定化したＨＥＲ２−ｓｃＭａｂ上でＴＦを補足することにより判定した。ダイマー二重特異性ｓｃＭａｂは、ＨＥＲ２およびＴＦの両方と結合する。単量体種のレベルは、長いリンカーで観察されるレベルよりも顕著に少ないレベルであった。サイズ排除クロマトグラフィーの標準的なプロトコルを、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００（１６／６０）を製造業社の説明書にしたがって使用した。ランニングバッファーはＰＢＳであった。
【０１９５】
図１６Ａ〜１６Ｃに見られるように、二重特異性ｓｃＭａｂ（ＬＣＩ／ＬＣＩ：１３５８；ＬＣＩ／ＬＬ：１３５９）のＳＥＣおよび標的結合プロファイルを実施した。ＨＥＲ２をチップ上で固定化し、ｓｃＭａｂを最初に補足した。その後、ＴＦ結合を、固定したＨＥＲ２−ｓｃＭａｂ上でＴＦを補足することにより判定した。ダイマー二重特異性ｓｃＭａｂは、ＨＥＲ２およびＴＦの両方と結合する。サイズ排除クロマトグラフィーを、製造業社の説明書にしたがったＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  （１６／６０）を用いて使用した。ランニングバッファーはＰＢＳであった。表１５は、試験した変異体のＫＤを示す。   表１５：ＴＦおよびＨＥＲ２の変異体の親和性。ここで記録した値は、異なる方向性（すなわち、ＴＦ系統への方向、ＨＥＲ２を補足型ｓｃＭａｂにわたるＴＦ抗原の流れの方向、
ＩｇＧ補足型ｓｃＭａｂにわたるＴＦ抗原の流れ、ＩｇＧ捕捉型ｓｃＭａｂにわたるＨｅｒ２抗原の流れ、および固定化したｓｃＭａｂにわたるＨｅｒ２抗原の流れの方向）で実施したＳＰＲ測定の平均である。
【表１５】
2015531751.tif 000021
【０１９６】
対照変異体の記載：変異体５０６は、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）の配列に基づき、ＨＥＲ２を結合する対照抗体である。
【０１９７】
表１６は、ＨＥＲ２または組織因子に結合する多様な二重特異性ｓｃＭａｂの性質を示すデータを提供する。この実施例に記載されるサンドイッチＳＰＲ結合アッセイを使用して測定した。
表１６：４Ｄ５およびＤ３Ｈ４４Ｍａｂ（ＬＬ／ＬＬ、ＬＣＩ／ＬＣＩ、およびＬＬ／ＬＣＩ形態）との二重特異性ｓｃＭａｂの二重特異性結合は、標的抗原Ｈｅｒおよび組織因子に対して観察される。両方のアーム上で長いリンカーを備えた変異体ｓｃＭａｂ１３５２および１３５７は、ＴＦを結合できない。
【表１６】
2015531751.tif 000022
【０１９８】
実施例９：二価二重特異性ｓｃＭａｂ（ＣＤ１３／ＣＤ１９）の発現、精製、および試験
二価二重特異性ｓｃＭａｂを、ＣＤ３およびＣＤ１９に結合するよう設計し、かつ、これらの構築物の記載が表１７に見いだされる。これらの構築物を、標準的な組み換えＤＮＡ法を使用して調製した。この構築物を、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ、およびＣＬ要素に抗―ＣＤ３テプリズマブおよび抗―ＣＤ１９ＭＯＲ２０８のＦａｂの配列を分解することにより調製した。ＬＣＩ構築物では、第１のリンカーにより軽鎖（ＶＬおよびＣＬにより構成される）にＦａｂのＣＨを結合させ、第２のリンカーにより、ＦａｂのＣＨに軽鎖を結合した。その後、Ｆａｂを、鎖Ａ上の変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、鎖Ｂ上の変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するＩＧＧ１ヒンジ＋Ｆｃに結合した。ＬＬ構築物では、完全軽鎖（ＶＬおよびＣＬにより構成される）を、リンカーで、鎖Ａ上の変異Ｔ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、および鎖Ｂ上のＴ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗを有するＩＧＧ１ヒンジ＋Ｆｃに結合したＦａｂの重鎖に結合した。変異体１８４０〜１８４７に使用した抗ＣＤ３（テプリズマブ）および抗ＣＤ１９（ＭＯＲ２０８）のＦａｂの配列を文献から取得した（Ｔａｂｓデータベース、Ｃｒａｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ＬＬＣにより提供されるサービス）。１８５３で使用されるＣＤ１９結合ｓｃＦｖは、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）の配列由来であった。変異１８６１のＣＤ３結合ｓｃＦＶ配列はムロノマブ（ｍｕｒｏｎｏｍａｂ）由来であり、変異体１８６２配列は、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）由来であった。これらの変異体は、実施例３にも記載される通り発現かつ精製した。これらの変異体の発現を示す例示的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを、図１８に示す。
【０１９９】
これらの変異体は、フィルタープレートを使用した生存細胞ＥＬＩＳＡ結合アッセイを使用した標的抗原を発現する細胞に結合する性質で試験され、洗浄ステップを、真空マニフォールド（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌ（モントリオール、カナダ）でＡｎｎｅ  Ｍａｒｃｉｌにより開発された方法）を使用して実施した。この方法を以下のように実施した。細胞を、指数関数増殖プレートに維持し、その後洗浄し、５０％培地、５０％ブロッキングバッファーのウェルあたり１０Ｅ５細胞で計測かつ分布した。ブロッキングバッファーの変異体の希釈物を、細胞に添加し、４℃で１時間インキュベートした。収集および培地中で４回洗浄した後、ＨＲＰ−結合型抗ヤギ抗ヒトＩｇＧを、４℃で１時間インキュベートした細胞に添加した。収集および培地中の４回の洗浄、およびＰＢＳ中での３回の洗浄の後、ＴＭＢ物質を、室温で２５分間、インキュベートした細胞に添加した。この反応をＨ２ＳＯ４の添加により停止し、ＯＤを４５０ｎｍで読み取った。ＥＬＩＳＡの結果を、表１７および１８に記載する。Ａ、Ｂ、およびＣは、変異体の発現に使用される鎖Ｂに対する鎖Ｂの比率を示す：比率Ａ＝鎖Ａ／鎖Ｂ＝１．１Ａ／Ｂ＝５０％／５０％；比率Ｂ＝鎖Ａ／鎖Ｂ＝２．１  Ａ／Ｂ＝６６％／３４％；比率Ｃ＝鎖Ａ／鎖Ｂ＝１．２Ａ／Ｂ＝３４％／６６％
表１７：結合データの概要
【表１７】
2015531751.tif 000023
※変異体名は、以下に記載のように作成される。ａ）ｓｃＭＡＢ＿ＬＣＩ＿ＣＤ３×ＣＤ１９＿ＧＳ２０−ＧＳ２４＿ＧＳ２０−ＧＳ２４-単鎖ｓｃＭａｂ、ＬＣＩ設計、鎖Ａ上のＶＨ−ＶＬ間のＧＳ２０リンカーおよびＣＬ−ＣＨ間のＧＳ２４リンカーを備えたＣＤ３Ｆａｂ。鎖Ｂ上のＶＨ−ＶＬ間のＧＳ２０リンカーおよびＣＬ−ＣＨ間のＧＳ２４リンカーを備えたＣＤ１９Ｆａｂ、ならびにｂ）ｓｃＭＡＢ＿ＬＬ＿ＣＤ３ｘＣＤ１９＿ＨＨ４１＿ＨＨ４１-単鎖Ｍａｂ、長いリンカー設計、鎖Ａの軽鎖および重鎖間のＨＨ４１リンカーを備えたＣＤ３Ｆａｂ、ならびに鎖Ｂの軽鎖および重鎖間のＨＨ４１リンカーを備えたＣＤ１９Ｆａｂ。
表１８：対照の結合データ
【表１８】
2015531751.tif 000024
表１６および１７におけるＥＬＩＳＡの結果の説明。
＋＋＋：ＯＤ４５０＞２．０  １／６０希釈
＋＋：ＯＤ４５０（１．０〜２．０）  １／６０希釈
＋：ＯＤ４５０＜１．０  １／６０希釈
＋／−：ＯＤ４５０（０．１００未満）  １／６０希釈、陽性対照より高い（陰性対照より高い）
−：ＯＤ４５０＝または＜陰性対照１０４１
【０２００】
すべての変異体は、テプリズマブ由来の抗ＣＤ３の端を含み、ＲａｊｉＣＤ１９含有細胞にほとんど結合しないことを示した（表１６）。すべての変異体はＭＯＲ２０８由来の抗ＣＤ１９の端を有し、ＨＢＰ−全ＣＤ３含有細胞に結合しないことを示した（表１６）。陰性対照は、変異体と同一のＦｃを含み、抗原に結合しないことを示した（表１７）したがって、各端のと独立して結合することから、両抗原と結合を示す変異体は二重特異性である。表１６は、全ての変異体は、２つの機能的な端を備える二重特異性である。
【０２０１】
実施例１０：提供した配列の概要
以下の表に、これらに列挙される変異体をアミノ酸の配列番号を示す。すべてのアミノ酸および配列は、ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧを含み（これらは、クローニングに使用した制限部位中で産生する単一ペプチド配列および残基を含む）、ストップコドンはアスタリスクで表される。
【表１９】
2015531751.tif 000025
【０２０２】
本明細書中に記載される実施例および実施形態は、例示目的のために過ぎず、それに鑑みて、種々の修正または変更が当業者に示唆されており、本出願の精神および範囲内に、ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるべきものである、と理解されるべきである。
配列番号１
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＳＧＧＧＳＧＳＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＧＧＧＳＧＧＧＳＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ＊ＧＳ
配列番号２
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＳＴＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＧＳＴＳＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ＊ＧＳ
配列番号３
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＲＤＩＫＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＹＡＴＳＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＧＥＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＳＧＧＧＳＧＳＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＧＧＧＳＧＧＧＳＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＥＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＬＩＤＰＥＱＧＮＴＩＹＤＰＫＦＱＤＲＡＴＩＳＡＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＴＡＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ＊ＧＳ
配列番号４
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＳＳＫＳＬＱＮＶＮＧＮＴＹＬＹＷＦＱＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＮＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＩＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＳＧＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＱＧＲＶＴＩＳＳＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＴＹＹＹＧＴＲＶＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＬＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊ＧＳ
配列番号５
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＲＤＩＫＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＹＡＴＳＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＧＥＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＳＧＧＧＳＧＳＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＧＧＧＳＧＧＧＳＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＥＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＬＩＤＰＥＱＧＮＴＩＹＤＰＫＦＱＤＲＡＴＩＳＡＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＴＡＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＭＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊ＧＳ
配列番号６
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＥＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＬＩＤＰＥＱＧＮＴＩＹＤＰＫＦＱＤＲＡＴＩＳＡＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＴＡＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＲＤＩＫＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＹＡＴＳＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＧＥＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＹＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊ＧＳ
配列番号７
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＤＴＹＩＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＹＰＴＮＧＹＴＲＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＡＤＴＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＳＲＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＤＶＮＴＡＶＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＳＡＳＦＬＹＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＲＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＨＹＴＴＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＳＴＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＧＳＴＳＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＭＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊ＧＳ
配列番号８
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＥＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＬＩＤＰＥＱＧＮＴＩＹＤＰＫＦＱＤＲＡＴＩＳＡＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＴＡＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＲＤＩＫＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＹＡＴＳＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＧＥＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＭＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊ＧＳ
配列番号９
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＲＤＩＫＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＹＡＴＳＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＧＥＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＳＧＧＧＳＧＳＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＧＧＧＳＧＧＧＳＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＥＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＬＩＤＰＥＱＧＮＴＩＹＤＰＫＦＱＤＲＡＴＩＳＡＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＴＡＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＹＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊ＧＳ
配列番号１０
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＥＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＬＩＤＰＥＱＧＮＴＩＹＤＰＫＦＱＤＲＡＴＩＳＡＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＴＡＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＲＤＩＫＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＹＡＴＳＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＧＥＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＭＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊ＧＳ
配列番号１１
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＥＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＬＩＤＰＥＱＧＮＴＩＹＤＰＫＦＱＤＲＡＴＩＳＡＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＴＡＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＲＤＩＫＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＹＡＴＳＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＧＥＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＹＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊ＧＳ
配列番号１２
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＴＰＧＫＡＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＱＩＴＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＳＧＧＧＳＧＳＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＧＧＧＳＧＧＧＳＧＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＡＦＬＱＭＤＳＬＲＰＥＤＴＧＶＹＦＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＰＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊ＧＳ
配列番号１３
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＳＳＫＳＬＱＮＶＮＧＮＴＹＬＹＷＦＱＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＮＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＩＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＳＧＧＧＳＧＳＳＡＤＤＡＫＫＤＡＡＫＫＤＤＡＫＫＤＤＡＫＫＤＧＧＧＳＧＧＧＳＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＱＧＲＶＴＩＳＳＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＴＹＹＹＧＴＲＶＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＬＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊ＧＳ
配列番号１４
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＮＩＫＥＹＹＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＬＩＤＰＥＱＧＮＴＩＹＤＰＫＦＱＤＲＡＴＩＳＡＤＮＳＫＮＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＴＡＡＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＲＤＩＫＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＹＡＴＳＬＡＥＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＨＧＥＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴ＊ＧＳ
配列番号１５
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＡＦＬＱＭＤＳＬＲＰＥＤＴＧＶＹＦＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＰＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＴＰＧＫＡＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＱＧＴＫＬＱＩＴＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊ＧＳ
配列番号１６
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＱＧＲＶＴＩＳＳＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＴＹＹＹＧＴＲＶＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＳＳＫＳＬＱＮＶＮＧＮＴＹＬＹＷＦＱＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＮＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＩＴＦＧＡＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＬＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊ＧＳ
配列番号１７
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＣＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＶＫＤＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＡＦＬＱＭＤＳＬＲＰＥＤＴＧＶＹＦＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＰＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＴＰＧＫＡＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＣＧＴＫＬＱＩＴＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＹＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＡＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊ＧＳ
配列番号１８
ＥＦＡＴＭＡＶＭＡＰＲＴＬＶＬＬＬＳＧＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＫＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＳＹＶＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＣＬＥＷＩＧＹＩＮＰＹＮＤＧＴＫＹＮＥＫＦＱＧＲＶＴＩＳＳＤＫＳＩＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＭＹＹＣＡＲＧＴＹＹＹＧＴＲＶＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＤＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＳＳＫＳＬＱＮＶＮＧＮＴＹＬＹＷＦＱＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＲＭＳＮＬＮＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＭＱＨＬＥＹＰＩＴＦＧＣＧＴＫＬＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＶＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＬＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＬＴＷＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ＊ＧＳ
【図１Ａ】
2015531751.tif 000026
【図１Ｂ】
2015531751.tif 000027
【図２】
2015531751.tif 000028
【図３】
2015531751.tif 000029
【図４】
2015531751.tif 000030
【図５】
2015531751.tif 000031
【図６Ａ】
2015531751.tif 000032
【図６Ｂ】
2015531751.tif 000033
【図６Ｃ】
2015531751.tif 000034
【図６Ｅ】
2015531751.tif 000035
【図６Ｆ】
2015531751.tif 000036
【図６Ｇ】
2015531751.tif 000037
【図７】
2015531751.tif 000038
【図１０】
2015531751.tif 000039
【図１１】
2015531751.tif 000040
【図１２Ａ】
2015531751.tif 000041
【図１２Ｂ】
2015531751.tif 000042
【図１２Ｃ】
2015531751.tif 000043
【図１７】
2015531751.tif 000044
【図１８】
2015531751.tif 000045
【図６Ｄ】
2015531751.tif 000046
【図８Ａ】
2015531751.tif 000047
【図８Ｂ】
2015531751.tif 000048
【図９Ａ】
2015531751.tif 000049
【図９Ｂ】
2015531751.tif 000050
【図９Ｃ】
2015531751.tif 000051
【図９Ｄ】
2015531751.tif 000052
【図９Ｅ】
2015531751.tif 000053
【図１３】
2015531751.tif 000054
【図１４Ａ】
2015531751.tif 000055
【図１４Ｂ】
2015531751.tif 000056
【図１４Ｃ】
2015531751.tif 000057
【図１４Ｄ】
2015531751.tif 000058
【図１５Ａ】
2015531751.tif 000059
【図１５Ｂ】
2015531751.tif 000060
【図１５Ｃ】
2015531751.tif 000061
【図１６Ａ】
2015531751.tif 000062
【図１６Ｂ】
2015531751.tif 000063
【図１６Ｃ】
2015531751.tif 000064
【図１９】
2015531751.tif 000065
【配列表】
2015531751000001.app
【国際調査報告】
2015531751.tif 000066
2015531751.tif 000067
2015531751.tif 000068