(57)【要約】  本発明は、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合性断片を提供する。本発明はさらに、このような抗体およびこれをコードする核酸を得る方法を提供する。本発明はさらに、ＰＤＧＦ−Ｂに媒介される疾患、障害、または状態を治療および／または予防するためにこれらの抗体を使用するための組成物および治療方法に関する。【図１】2015536339.tif 000027
2015536339.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合し、
（ａ）配列番号６のＶＨアミノ酸配列のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｈ１）、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４のＶＬアミノ酸配列のＶＬ  ＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｌ１）、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｂ）配列番号６のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ、
（ｃ）配列番号７のＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列、配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｄ）配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｅ）ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３）として寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされるＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびにＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０２）として寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされるＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｆ）ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３）として寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされるＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびにＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０２）として寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされるＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ、
（ｇ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｈ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｊ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｋ）配列番号１４の配列を含む重鎖、および配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖、
（ｌ）配列番号５の核酸配列によってコードされるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３の核酸配列によってコードされるＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３、
（ｍ）配列番号５の核酸配列によってコードされるＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３の核酸配列によってコードされるＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３、
（ｎ）配列番号５の核酸配列によってコードされるＶＨ、および配列番号３の核酸配列によってコードされるＶＬ、
（ｏ）配列番号１３の核酸配列によってコードされる重鎖、および配列番号１５の核酸配列によってコードされる軽鎖、
（ｐ）配列番号４４のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３９のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ、
（ｑ）配列番号４４のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３９のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ、
（ｒ）配列番号７のＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列、配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号４１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｓ）配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号４１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｔ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｕ）配列番号４６の配列を含む重鎖、および配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖、
（ｖ）配列番号４４のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３４のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ、
（ｗ）配列番号４４のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３４のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬ、
（ｘ）配列番号７のＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列、配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号３６のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｙ）配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号３６のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬ、
（ｚ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬ、または
（ａａ）配列番号４６の配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、単離抗体、またはその抗原結合性断片。
【請求項２】
請求項１に記載の抗体、またはその抗原結合性断片をコードする単離核酸。
【請求項３】
ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合性断片をコードする単離核酸であって、
（ａ）配列番号３の核酸配列、
（ｂ）配列番号５の核酸配列、
（ｃ）配列番号１３の核酸配列、
（ｄ）配列番号１５の核酸配列、
（ｅ）配列番号３の核酸配列および配列番号５の核酸配列、
（ｆ）配列番号１３の核酸配列および配列番号１５の核酸配列、
（ｇ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３を有するＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨとして寄託されたベクターのインサートの核酸配列、
（ｈ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０２を有するＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬとして寄託されたベクターのインサートの核酸配列、
（ｉ）配列番号３５の核酸配列、
（ｊ）配列番号４０の核酸配列、
（ｋ）配列番号４５の核酸配列、
（ｌ）配列番号３８の核酸配列、
（ｍ）配列番号４３の核酸配列、
（ｎ）配列番号４７の核酸配列、
（ｏ）配列番号３５および配列番号４５の核酸配列、
（ｐ）配列番号４０および配列番号４５の核酸配列、
（ｑ）配列番号３８および配列番号４７の核酸配列、
（ｒ）配列番号４３および配列番号４７の核酸配列、または
（ｓ）ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３を有するＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨとして寄託されたベクターのインサートの核酸配列、およびＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０２を有するＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬとして寄託されたベクターのインサートの核酸配列
を含む、単離核酸。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項３に記載の核酸を含むベクター。
【請求項６】
請求項５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項７】
細菌性細胞または哺乳動物細胞である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項８】
ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合性断片を産生する方法であって、前記抗体が発現される条件下で請求項４に記載の前記宿主細胞を培養するステップを含み、前記抗体を単離するステップをさらに含む、方法。
【請求項９】
（ａ）ＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ内にないアミノ酸において少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含み、
（ｂ）ＶＨが、配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ内にないアミノ酸において少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含み、または
（ｃ）ＶＬが、配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ内にないアミノ酸において少なくとも１つのアミノ酸置換であるが、５つ以下のアミノ酸置換をさらに含み、ＶＨが、配列番号６のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ内にないアミノ酸において少なくとも１つのアミノ酸置換であるが、５つ以下のアミノ酸置換をさらに含む、
請求項１に記載の単離抗体、またはその抗原結合性断片。
【請求項１０】
ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する単離抗体、またはその抗原結合性断片であって、請求項１に記載の抗体と同じエピトープに結合し、または請求項１に記載の抗体と同様にＰＤＧＦ−ＢのＰＤＧＦＲββ上の結合部位と重複し、かつＡｂｙＤ３２６３でない、単離抗体、またはその抗原結合性断片。
【請求項１１】
ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する単離抗体、またはその抗原結合性断片であって、ＰＤＧＦ−Ｂへの結合をＰＤＧＦＲββと交差競合し、さらに、２ｐＭ〜１００ｐＭの範囲のＫＤでＰＤＧＦ−Ｂに結合する、単離抗体、またはその抗原結合性断片。
【請求項１２】
ＰＤＧＦ−ＢＢ上の少なくとも１種のエピトープに結合し、前記エピトープが、
（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列に関して残基Ｌｅｕ３８、Ｖａｌ３９、およびＴｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６を含むエピトープ、ならびに
（ｂ）配列番号３３のアミノ酸配列に関して残基Ｔｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｇｌｕ７６、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６を含むエピトープ
からなる群から選択される、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１３】
パラトープを含み、前記パラトープが、配列番号１の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいてアミノ酸残基Ｇ２８、Ｓ２９、Ｙ３０、Ｆ３１、Ｄ４９、Ｄ５０、Ｆ９０、Ｔ９１、Ｈ９２、Ｎ９３、Ｓ９４、および配列番号２の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいてアミノ酸残基Ｙ５０、Ｌ５７、Ｙ５９、Ｙ６０、Ｄ６２、Ｗ１０２、Ｙ１０３、Ｇ１０４、Ｇ１０５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１４】
前記パラトープが、配列番号１の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいてアミノ酸残基Ｎ６５、および／または配列番号２の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいて残基Ｗ４７をさらに含みうる、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
約２ｐＭ〜６９ｐＭの範囲のＫＤでＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合し、ＰＤＧＦ−Ｂへの結合をＰＤＧＦＲβと交差競合し、ＰＤＧＦβへのＰＤＦＧ−Ｂの結合によって媒介される活性を阻害する、単離抗体、またはその抗原結合性断片。
【請求項１６】
ＰＤＧＦβへのＰＤＧＦ−Ｂの結合によって媒介される前記活性が、前記ＰＤＧＦβのリン酸化、細胞増殖の誘導、細胞遊走の誘導、および細胞外マトリックスの沈着の増大からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１または９の抗体とＰＤＧＦ−Ｂの結合を競合する、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１８】
約１３ｐＭのＫＤでヒトＰＤＧＦ−ＢＢに特異的に結合する単離抗体、またはその抗原結合性断片であって、
（ａ）ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合をＰＤＧＦββと交差競合し、
（ｂ）
（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列に関して残基Ｌｅｕ３８、Ｖａｌ３９、およびＴｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６を含むエピトープ、ならびに
（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列に関して、残基Ｔｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｇｌｕ７６、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６を含むエピトープ
からなる群から選択される少なくとも１種のエピトープであり、ＰＤＧＦ−ＢＢ上でおよそ１９０Å離れている、エピトープに結合し、
（ｃ）配列番号１の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいてアミノ酸残基Ｇ２８、Ｓ２９、Ｙ３０、Ｆ３１、Ｄ４９、Ｄ５０、Ｆ９０、Ｔ９１、Ｈ９２、Ｎ９３、Ｓ９４、および配列番号２の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいてアミノ酸残基Ｙ５０、Ｌ５７、Ｙ５９、Ｙ６０、Ｄ６２、Ｗ１０２、Ｙ１０３、Ｇ１０４、Ｇ１０５を含むパラトープを含み、
（ｄ）前記パラトープのアミノ酸残基が、
（ｉ）軽鎖可変ドメインについて、Ｔｒｐ４７は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８２と接触し、Ｌｅｕ５７は、ＰＤＧＦ−ＢのＩｌｅ７７と接触し、Ｔｙｒ５９は、ＰＤＧＦ−ＢのＩｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、およびＰｒｏ８２と接触し、Ｔｒｐ１０２は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｅｕ８、Ｖａｌ３９、Ｔｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｉｌｅ７５、およびＰｈｅ８４と接触し、Ｔｙｒ１０３は、ＰＤＧＦ−ＢのＴｒｐ４０、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、およびＰｈｅ８４と接触し、Ｇｌｙ１０４は、ＰＤＧＦ−ＢのＡｒｇ７３およびＰｈｅ８４と接触し、Ｇｌｙ１０５は、ＰＤＧＦ−ＢのＰｈｅ８４と接触し、軽鎖可変ドメインアミノ酸の番号付けは、配列番号１に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいており、
（ｉｉ）重鎖可変ドメインについて、Ｇｌｙ２８は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８６と接触し、Ｓｅｒ２９は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８５およびＬｙｓ８６と接触し、Ｔｙｒ３０は、ＰＤＧＦ−ＢのＩｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６と接触し、Ｐｈｅ３１は、ＰＤＧＦ−ＢのＧｌｎ７１、Ａｒｇ７３、Ｐｈｅ８４、およびＬｙｓ８６と接触し、Ａｓｐ４９は、ＰＤＧＦ−ＢのＡｒｇ７３と接触し、Ａｓｐ５０は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８６と接触し、Ａｓｎ６５は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８６と接触し、Ｐｈｅ９０は、ＰＤＧＦ−ＢのＰｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、およびＰｈｅ８４と接触し、Ｔｈｒ９１は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８１およびＩｌｅ８３と接触し、Ｈｉｓ９２は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８１およびＩｌｅ８３と接触し、Ａｓｎ９３は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８１と接触し、Ｓｅｒ９４は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８１と接触し、重鎖可変ドメインアミノ酸の番号付けは、配列番号２に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいており、
さらに、ＰＤＧＦ−Ｂ接触残基のアミノ酸残基番号付けは、配列番号３３のアミノ酸配列に関するものである、
ように１つの前記エピトープのアミノ酸残基と４Å以内で接触している、
単離抗体、またはその抗原結合性断片。
【請求項１９】
請求項１、２、および９から１８のいずれか一項に記載の抗体、またはその抗原結合性断片、ならびに薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項２０】
それを必要とする対象において細胞外マトリックスの沈着を低減するための方法であって、前記対象に有効量の請求項１９に記載の医薬組成物を投与し、それによって対象における過剰な細胞外マトリックスの沈着を阻害するステップを含む、方法。
【請求項２１】
ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ−Ｂの結合によって媒介される疾患、障害、または状態を予防または治療するための方法であって、それを必要とする対象に有効量の請求項１９に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項２２】
前記疾患、障害、または状態が、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺高血圧症、網膜血管疾患、心臓線維症、肺線維症、肝線維症、腎線維症、全身性硬化症、関節リウマチ、骨関節炎、および腫瘍形成からなる群から選択される少なくとも１つである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
それを必要とする対象において細胞外マトリックスの沈着を低減することにおける使用のための、請求項１、２、９から１８のいずれか一項に記載の抗体、もしくはその抗原結合性断片、または請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ−Ｂの結合によって媒介される疾患、障害、または状態の予防または治療における使用のための、請求項１、２、９から１８のいずれか一項に記載の抗体、もしくはその抗原結合性断片、または請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
それを必要とする対象において細胞外マトリックス沈着を低減するための医薬の製造における、請求項１、２、９から１８のいずれか一項に記載の抗体、もしくはその抗原結合性断片、または請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２６】
ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ−Ｂの結合によって媒介される疾患、障害、または状態を予防または治療する医薬の製造における、請求項１、２、９から１８のいずれか一項に記載の抗体、もしくはその抗原結合性断片、または請求項１９に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板由来増殖因子Ｂ（ＰＤＧＦ−Ｂ：ｐｌａｔｅｌｅｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  Ｂ）に特異的に結合する抗体、例えば、全長抗体およびこれらの抗原結合性断片に関する。本発明はさらに、ＰＤＧＦ−Ｂに対する抗体を含む組成物、および医薬としてこの抗体を使用する方法に関する。ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、ＰＤＧＦＲβ（それぞれ、ＰＤＧＦＲββおよびＰＤＧＦＲαβホモおよびヘテロ二量体受容体の両方）へのＰＤＧＦ−Ｂの結合によって媒介される疾患および障害を治療および予防するのに有用である。
【背景技術】
【０００２】
多くの慢性疾患は、持続性のかつ間断のない炎症、傷害、組織リモデリング、および線維症を特徴とする。例えば、糖尿病性腎症、ＩｇＡ腎症、および増殖性ループス腎炎を含む進行性腎疾患のコホートでは、これらは、メサンギウム細胞増殖ならびに糸球体線維症および尿細管間質性線維症によって組織学的に特徴付けられている。この点において、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）受容体βのリガンドは、おそらく今日までに最もよく特徴付けられたメディエーターである。
【０００３】
ＰＤＧＦは、間葉系起源および神経外胚葉性起源の細胞の主要マイトジェンである。ＰＤＧＦファミリーは、４種の異なるポリペプチド鎖、ＰＤＧＦ−Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤから構成されており、これらは、ホモおよびヘテロ二量体化によって５つの別個のタンパク質、ＰＤＧＦ−ＡＡ、−ＡＢ、−ＢＢ、−ＣＣ、および−ＤＤを形成することが示されている。ＰＤＧＦは、ホモおよびヘテロ二量体（例えば、ＰＤＧＦＲαα、ＰＤＧＦＲαβ、ＰＤＧＦＲββ）を形成する、２種の構造的に関連したチロシンキナーゼ受容体、ＰＤＧＦ−Ｒαおよびβを活性化することによってその生物活性を発揮する。ＰＤＧＦ−Ａは、ＰＤＧＦＲααを活性化し、一方、ＰＤＧＦ−Ｂは、３種すべての受容体二量体、すなわち、ＰＤＧＦ−Ｒαα、ＰＤＧＦ−Ｒαβ、ＰＤＧＦ−Ｒββを活性化することができる。ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−Ｃは、ＰＤＧＦ−ＲααおよびＰＤＧＦ−Ｒαβを活性化し、一方、ＰＤＧＦ−Ｄは、Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋａ（２００８、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、４７：ｖ２〜ｖ４）によって概説されているように、ＰＤＧＦ−Ｒββを優先的に活性化する。
【０００４】
ＰＤＧＦは、それだけに限らないが、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺高血圧症、網膜血管疾患、臓器線維症（例えば、心臓、肺、腎臓（ｒｅｎａｌ）、および腎臓（ｋｉｄｎｅｙ））、関節リウマチ、骨関節炎、腫瘍形成、および全身性硬化症（ＳＳｃ；強皮症）を含めた多種多様なヒト疾患に関係付けられている（例えば、Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋａ、２００８、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ、４７：ｖ２〜ｖ４；Ａｎｄｒａｅら、２００８、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、２２：１２７６〜１３１２を参照）。
【０００５】
より具体的には、４種すべてのＰＤＧＦアイソフォーム、および両受容体鎖は、腎臓で発現され、糸球体および／または間質の位置でのＰＤＧＦの発現の増大が多種多様の腎疾患で記録に残されている。さらに、ＰＤＧＦ受容体の発現の増大は、実験的およびヒト腎疾患で発生する。ＰＤＧＦ−ＢおよびＰＤＧＦ−Ｄの両方は、ヒト腎疾患において特に重要であると思われる。メサンギウム細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＤＧＦ−Ｂを産生し、様々な増殖因子がオートクリンまたはパラクリンＰＤＧＦ−Ｂ−鎖排出の誘導を介してメサンギウム増殖を誘導する（Ｓｉｌｖｅｒら、１９８９、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１０５６〜１０６０；Ｆｌｏｅｇｅら、１９９１、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８６：３３４〜３４１）。ＰＤＧＦ−Ｂ鎖の過剰発現は、メサンギウム増殖およびマトリックス拡大を誘導し（Ｆｌｏｅｇｅら、１９９３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９２：２９５２〜２９６２；Ｉｓａｋａら、１９９３、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、９２：２５９７〜２６０１）、ＰＤＧＦ−Ｂ鎖またはβ受容体ノックアウトマウスは、メサンギウムを発達させることができない（Ｌｅｖｅｅｎら、１９９４、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、８：１８７５〜１８８７；Ｓｏｒｉａｎｏ  Ｐ．、１９９４、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．、８：１８８８〜１８９６）。
【０００６】
抗体、アプタマー、可溶性ＰＤＧＦ受容体またはＰＤＧＦβ−受容体チロシンキナーゼブロッカーを使用してＰＤＧＦ−Ｂを特異的に阻害すると、いくつかの異なる前臨床モデルにおいて、メサンギウム増殖性変化が低減され、長期腎瘢痕化が防止され、腎機能が改善される（Ｆｌｏｅｇｅら、１９９９、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．、１５４：１６９〜１７９；Ｇｉｌｂｅｒｔら、２００１、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、５９：１３２４〜１３３２；Ｎａｋａｍｕｒａら、２００１、Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．、５９：２１３４〜２１４５；Ｏｓｔｅｎｄｏｒｆら、２００１、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．、１２：９０９〜９１８）。
【０００７】
同様に、肝線維症は一般に、慢性肝傷害後に観察される。肝線維形成における主要事象は、肝星状細胞および筋線維芽細胞の増殖、およびこれらによるコラーゲン産生である。糸球体腎炎の場合と同様に、ＰＤＧＦは、強く分裂促進性であり、肝星状細胞および筋線維芽細胞走化性を引き起こす（Ｃｚｏｃｈｒａら、２００６、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．、４５：４１９〜２８）。ヒト硬変肝臓では、ＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦＲβタンパク質発現は、正常な肝臓と比較すると著しく増強される（Ｉｋｕｒａら、１９９７、Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．、３２：４９６〜５０１）。ラットでの胆管結紮（ＢＤＬ：ｂｉｌｅ  ｄｕｃｔ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）によって誘導された胆汁うっ滞性肝傷害モデルでは、ＰＤＧＦ−Ｂ  ｍＲＮＡ発現およびＰＤＧＦ−ＢＢタンパク質産生が胆管セグメント、胆管上皮細胞内で増大し、マクロファージおよび肝星状細胞に浸潤することが観察された（Ｋｉｎｎｍａｎら、２０００、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８０：６９７〜７０７；Ｇｒａｐｐｏｎｅら、１９９９、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．、３１：１００〜１０９；Ｂｏｎｎｅｒ，ＪＣ、２００４、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．、１５：２５５〜２７３）。より最近、ＰＤＧＦ−Ｂ／ＰＤＧＦ−Ｒβ受容体結合の抗体阻害により、肝線維症の発生が低減され（Ｏｇａｗａら、２０１０、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、４０：１１２８〜１１４１）、肝線維症におけるＰＤＧＦ−Ｂシグナル伝達の役割が実証された。
【０００８】
ＰＤＧＦＲβを介したＰＤＧＦ−ＢＢ誘導シグナル伝達は、肝星状細胞増殖、遊走、および筋線維芽細胞への表現型の変化、その後のコラーゲン沈着および線維形成を強く促進する（Ｋｉｎｎｍａｎら、２００１、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８１：１７０９〜１７１６；Ｋｉｎｎｍａｎら、２００３、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８３：１６３〜１７３）。アンチセンスブロッキングｍＡｂ、ドミナント−ネガティブ可溶性ＰＤＧＦＲβ、またはイマチニブ（ＳＴＩ５７１、Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）、Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標））、ＰＤＧＦＲαおよびβの両方を含めたチロシンキナーゼの阻害剤によってＰＤＧＦ−Ｂの効果を阻害すると、ラットでのＢＤＬ誘導肝線維症モデルにおいて肝ヒドロキシプロリン含量、ならびにＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦＲβ、およびコラーゲンタイプ１のｍＲＮＡ発現が低減された（Ｏｇａｗａら、２０１０、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、４０：１１２８〜１１４１；Ｋｉｎｎｍａｎら、２０００、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８０：６９７〜７０７；Ｋｉｎｎｍａｎら、２００１、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８１：１７０９〜１７１６；Ｋｉｎｎｍａｎら、２００３、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８３：１６３〜１７３；Ｂｏｒｋｈａｍら、２００４、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３２１：４１３〜４２３；Ｂｏｒｋｈａｍら、２００４、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８４：７６６〜７７７；Ｎｅｅｆら、２００６、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．、４４：１６７〜１７５）。
【０００９】
総合すると、前臨床線維症モデル、特に腎臓および肝臓モデルで観察されるデータは、望ましくない細胞外マトリックス沈着を制限し、臓器機能を保持するのにＰＤＧＦ−Ｂ／ＰＤＧＦＲβ結合および／またはシグナル伝達を阻害することによって媒介される重要な潜在的治療効果を強調する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
つまり、ＰＤＧＦ−Ｂを含むこれらのリガンドのＰＤＧＦＲβとの相互作用を介してＰＤＧＦ−ＡＢおよび／またはＰＤＧＦ−ＢＢシグナル伝達によって媒介される線維性疾患および障害は、ヒト死亡率および病的状態に多大な犠牲を強いる。したがって、これらの疾患／障害を治療し、または寛解させるための新規潜在的治療剤の長年の切実な必要性があり、本発明は、この必要性を満たす。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合し、配列番号６のＶＨアミノ酸配列のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｈ１）、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４のＶＬアミノ酸配列のＶＬ  ＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｌ１）、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む単離抗体、またはその抗原結合性断片を含む。
【００１２】
一態様では、抗体は、配列番号６のＶＨアミノ酸配列６のＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４のＶＬアミノ酸配列４のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む。
【００１３】
別の態様では、抗体は、配列番号７のＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列、配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００１４】
さらに別の態様では、抗体は、配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００１５】
なおさらなる態様では、抗体は、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３）として寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされるＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびにＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０２）として寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされるＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００１６】
一態様では、抗体は、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３）として寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされるＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびにＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０２）として寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされるＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む。
【００１７】
別の態様では、抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００１８】
別の態様では、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００１９】
さらに別の態様では、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００２０】
さらなる態様では、抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００２１】
さらに別の態様では、抗体は、配列番号１４の配列を含む重鎖、および配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００２２】
一態様では、抗体は、配列番号５の核酸配列によってコードされるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３の核酸配列によってコードされるＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【００２３】
別の態様では、抗体は、配列番号５の核酸配列によってコードされるＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３の核酸配列によってコードされるＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【００２４】
さらに別の態様では、抗体は、配列番号５の核酸配列によってコードされるＶＨ、および配列番号３の核酸配列によってコードされるＶＬを含む。
【００２５】
さらなる態様では、抗体は、配列番号１３の核酸配列によってコードされる重鎖、および配列番号１５の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む。
【００２６】
別の態様では、抗体は、配列番号４４のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３９のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む。
【００２７】
さらなる態様では、抗体は、配列番号４４のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３９のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む。
【００２８】
さらに別の態様では、抗体は、配列番号７のＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列、配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号４１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００２９】
別の態様では、抗体は、配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号４１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００３０】
一態様では、抗体は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００３１】
さらに別の態様では、抗体は、配列番号４６の配列を含む重鎖、および配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００３２】
一態様では、抗体は、配列番号４４のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３４のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む。
【００３３】
さらなる態様では、抗体は、配列番号４４のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３４のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む。
【００３４】
別の態様では、抗体は、配列番号７のＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列、配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号３６のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００３５】
さらなる態様では、抗体は、配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号３６のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００３６】
さらに別の態様では、抗体は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【００３７】
さらなる態様では、抗体は、配列番号４６の配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００３８】
本発明は、抗体、またはその抗原結合性断片をコードする単離核酸であって、抗体は、配列番号６のＶＨアミノ酸配列のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ−Ｈ１）、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、ならびに配列番号４のＶＬアミノ酸配列のＶＬ  ＣＤＲ１（ＣＤＲ−Ｌ１）、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、単離核酸を含む。
【００３９】
一態様では、核酸は、配列番号６のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００４０】
別の態様では、核酸は、配列番号７のＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列、配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００４１】
さらに別の態様では、核酸は、配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００４２】
なおさらなる態様では、核酸は、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３）として寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされるＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびにＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０２）として寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされるＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体をコードする。
【００４３】
一態様では、核酸は、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３）として寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされるＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびにＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０２）として寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされるＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００４４】
別の態様では、核酸は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００４５】
別の態様では、核酸は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００４６】
さらに別の態様では、核酸は、配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００４７】
さらなる態様では、核酸は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００４８】
さらに別の態様では、核酸は、配列番号１４の配列を含む重鎖、および配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体をコードする。
【００４９】
別の態様では、核酸は、配列番号４４のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３９のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００５０】
さらなる態様では、核酸は、配列番号４４のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３９のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００５１】
さらに別の態様では、核酸は、配列番号７のＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列、配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号４１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００５２】
別の態様では、核酸は、配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号４１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号１２のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬ、を含む抗体をコードする。
【００５３】
一態様では、核酸は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００５４】
さらに別の態様では、核酸は、配列番号４６の配列を含む重鎖、および配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体をコードする。
【００５５】
一態様では、核酸は、配列番号４４のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３４のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００５６】
さらなる態様では、核酸は、配列番号４４のＶＨアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３４のＶＬアミノ酸配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００５７】
別の態様では、核酸は、配列番号７のＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列、配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号３６のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００５８】
さらなる態様では、核酸は、配列番号８のＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列、および配列番号９のＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列を含むＶＨ、ならびに配列番号１０のＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列、配列番号１１のＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列、および配列番号３６のＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００５９】
さらに別の態様では、核酸は、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号３４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗体をコードする。
【００６０】
さらなる態様では、抗体は、配列番号４６の配列を含む重鎖、および配列番号３７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００６１】
一態様では、核酸は、配列番号５の核酸配列によってコードされるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３の核酸配列によってコードされるＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体をコードする。
【００６２】
別の態様では、核酸は、配列番号５の核酸配列によってコードされるＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３の核酸配列によってコードされるＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体をコードする。
【００６３】
さらに別の態様では、核酸は、配列番号５の核酸配列によってコードされるＶＨ、および配列番号３の核酸配列によってコードされるＶＬを含む抗体をコードする。
【００６４】
さらなる態様では、核酸は、配列番号１３の核酸配列によってコードされる重鎖、および配列番号１５の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む抗体をコードする。
【００６５】
本発明は、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合性断片をコードする単離核酸であって、配列番号３の核酸配列を含む、単離核酸を含む。
【００６６】
一態様では、核酸は、配列番号５の核酸配列を含む。
【００６７】
別の態様では、核酸は、配列番号１３の核酸配列を含む。
【００６８】
さらに別の態様では、核酸は、配列番号１５の核酸配列を含む。
【００６９】
さらなる態様では、核酸は、配列番号３の核酸配列および配列番号５の核酸配列を含む。
【００７０】
別の態様では、核酸は、配列番号１３の核酸配列および配列番号１５の核酸配列を含む。
【００７１】
さらに別の態様では、核酸は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３を有するＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨとして寄託されたベクターのインサートの核酸配列を含む。
【００７２】
別の態様では、核酸は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０２を有するＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬとして寄託されたベクターのインサートの核酸配列を含む。
【００７３】
一態様では、核酸は、配列番号４５の核酸配列によってコードされるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３５の核酸配列によってコードされるＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体をコードする。
【００７４】
別の態様では、核酸は、配列番号４５の核酸配列によってコードされるＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号３５の核酸配列によってコードされるＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体をコードする。
【００７５】
さらに別の態様では、核酸は、配列番号４５の核酸配列によってコードされるＶＨ、および配列番号３５の核酸配列によってコードされるＶＬを含む抗体をコードする。
【００７６】
さらなる態様では、核酸は、配列番号４７の核酸配列によってコードされる重鎖、および配列番号３８の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む抗体をコードする。
【００７７】
一態様では、核酸は、配列番号４５の核酸配列によってコードされるＣＤＲ−１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４０の核酸配列によってコードされるＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体をコードする。
【００７８】
別の態様では、核酸は、配列番号４５の核酸配列によってコードされるＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨ、ならびに配列番号４０の核酸配列によってコードされるＶＬ  ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体をコードする。
【００７９】
さらに別の態様では、核酸は、配列番号４５の核酸配列によってコードされるＶＨ、および配列番号４０の核酸配列によってコードされるＶＬを含む抗体をコードする。
【００８０】
さらなる態様では、核酸は、配列番号４７の核酸配列によってコードされる重鎖、および配列番号４３の核酸配列によってコードされる軽鎖を含む抗体をコードする。
【００８１】
さらなる態様では、核酸は、配列番号３５の核酸配列を含む。
【００８２】
別の態様では、核酸は、配列番号４０の核酸配列を含む。
【００８３】
一態様では、核酸は、配列番号４５の核酸配列を含む。
【００８４】
別の態様では、核酸は、配列番号３８の核酸配列を含む。
【００８５】
さらに別の態様では、核酸は、配列番号４３の核酸配列を含む。
【００８６】
さらなる態様では、核酸は、配列番号４７の核酸配列を含む。
【００８７】
別の態様では、核酸は、配列番号３５および配列番号４５の核酸配列を含む。
【００８８】
一態様では、核酸は、配列番号４０および配列番号４５の核酸配列を含む。
【００８９】
さらなる態様では、核酸は、配列番号３８および配列番号４７の核酸配列を含む。
【００９０】
さらに別の態様では、核酸は、配列番号４３および配列番号４７の核酸配列を含む。
【００９１】
一態様では、本発明は、核酸を含む宿主細胞を含む。
【００９２】
一態様では、本発明は、核酸を含むベクターを含む。
【００９３】
別の態様では、本発明は、ベクターを含む宿主細胞を含む。
【００９４】
さらに別の態様では、宿主細胞は、細菌性細胞または哺乳動物細胞である。
【００９５】
本発明は、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する抗体、またはその抗原結合性断片を産生する方法であって、抗体が発現される条件下で宿主細胞を培養するステップを含み、抗体を単離するステップをさらに含む、方法を含む。
【００９６】
本発明は、ＶＬが配列番号４のアミノ酸配列を含み、ＣＤＲ内にないアミノ酸において少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む、請求項１に記載の単離抗体、またはその抗原結合性断片を含む。
【００９７】
別の態様では、抗体は、配列番号６のアミノ酸配列含むＶＨを含み、ＣＤＲ内にないアミノ酸において少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む。
【００９８】
さらに別の態様では、抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬを含み、ＣＤＲにないアミノ酸において少なくとも１つのアミノ酸置換、および配列番号６のアミノ酸配列を含むＶＨをさらに含み、ＣＤＲ内にないアミノ酸において少なくとも１つのアミノ酸置換をさらに含む。
【００９９】
本発明は、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する単離抗体、またはその抗原結合性断片であって、本明細書に開示の抗体と同じエピトープに結合し、または本明細書に開示の抗体と同様にＰＤＧＦ−ＢのＰＤＧＦＲββ上の結合部位と重複し、かつＡｂｙＤ３２６３でない、単離抗体、またはその抗原結合性断片を含む。
【０１００】
本発明は、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する単離抗体、またはその抗原結合性断片であって、ＰＤＧＦ−Ｂへの結合をＰＤＧＦＲββと交差競合し、さらに、２ｐＭ〜１００ｐＭの範囲のＫＤでＰＤＧＦ−Ｂに結合する、単離抗体、またはその抗原結合性断片を含む。
【０１０１】
一態様では、抗体は、ＰＤＧＦ−ＢＢ上の少なくとも１種のエピトープに結合し、エピトープは、
配列番号３３のアミノ酸配列に関して残基Ｌｅｕ３８、Ｖａｌ３９、およびＴｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６を含むエピトープ、ならびに
配列番号３３のアミノ酸配列に関して残基Ｔｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｇｌｕ７６、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６を含むエピトープからなる群から選択される。
【０１０２】
別の態様では、抗体は、パラトープを含み、このパラトープが、配列番号１の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいてアミノ酸残基Ｇ２８、Ｓ２９、Ｙ３０、Ｆ３１、Ｄ４９、Ｄ５０、Ｆ９０、Ｔ９１、Ｈ９２、Ｎ９３、Ｓ９４、および配列番号２の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいてアミノ酸残基Ｙ５０、Ｌ５７、Ｙ５９、Ｙ６０、Ｄ６２、Ｗ１０２、Ｙ１０３、Ｇ１０４、Ｇ１０５からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含む。
【０１０３】
別の態様では、パラトープは、配列番号１の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいてアミノ酸残基Ｎ６５、および／または配列番号２の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいて残基Ｗ４７をさらに含みうる。
【０１０４】
本発明は、約２ｐＭ〜６９ｐＭの範囲のＫＤでＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合し、ＰＤＧＦ−Ｂへの結合をＰＤＧＦＲβと交差競合し、ＰＤＧＦβへのＰＤＦＧ−Ｂの結合によって媒介される活性を阻害する、単離抗体、またはその抗原結合性断片を含む。
【０１０５】
一態様では、ＰＤＧＦβへのＰＤＧＦ−Ｂの結合によって媒介される活性は、前記ＰＤＧＦβのリン酸化、細胞増殖の誘導、細胞遊走の誘導、および細胞外マトリックスの沈着の増大からなる群から選択される少なくとも１つである。
【０１０６】
本発明は、約１３ｐＭのＫＤでヒトＰＤＧＦ−ＢＢに特異的に結合する単離抗体、またはその抗原結合性断片であって、
（ａ）ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合をＰＤＧＦββと交差競合し、
（ｂ）
（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列に関して残基Ｌｅｕ３８、Ｖａｌ３９、およびＴｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６を含むエピトープ、ならびに
（ｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列に関して、残基Ｔｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｇｌｕ７６、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６を含むエピトープ
からなる群から選択される少なくとも１種のエピトープであり、ＰＤＧＦ−ＢＢ上でおよそ１９０Å離れている、エピトープに結合し、
（ｃ）配列番号１の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいてアミノ酸残基Ｇ２８、Ｓ２９、Ｙ３０、Ｆ３１、Ｄ４９、Ｄ５０、Ｆ９０、Ｔ９１、Ｈ９２、Ｎ９３、Ｓ９４、および配列番号２の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいてアミノ酸残基Ｙ５０、Ｌ５７、Ｙ５９、Ｙ６０、Ｄ６２、Ｗ１０２、Ｙ１０３、Ｇ１０４、Ｇ１０５を含むパラトープを含み、
（ｄ）前記パラトープのアミノ酸残基が、
（ｉ）軽鎖可変ドメインについて、Ｔｒｐ４７は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８２と接触し、Ｌｅｕ５７は、ＰＤＧＦ−ＢのＩｌｅ７７と接触し、Ｔｙｒ５９は、ＰＤＧＦ−ＢのＩｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、およびＰｒｏ８２と接触し、Ｔｒｐ１０２は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｅｕ８、Ｖａｌ３９、Ｔｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｉｌｅ７５、およびＰｈｅ８４と接触し、Ｔｙｒ１０３は、ＰＤＧＦ−ＢのＴｒｐ４０、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、およびＰｈｅ８４と接触し、Ｇｌｙ１０４は、ＰＤＧＦ−ＢのＡｒｇ７３およびＰｈｅ８４と接触し、Ｇｌｙ１０５は、ＰＤＧＦ−ＢのＰｈｅ８４と接触し、軽鎖可変ドメインアミノ酸の番号付けは、配列番号１に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいており、
（ｉｉ）重鎖可変ドメインについて、Ｇｌｙ２８は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８６と接触し、Ｓｅｒ２９は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８５およびＬｙｓ８６と接触し、Ｔｙｒ３０は、ＰＤＧＦ−ＢのＩｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６と接触し、Ｐｈｅ３１は、ＰＤＧＦ−ＢのＧｌｎ７１、Ａｒｇ７３、Ｐｈｅ８４、およびＬｙｓ８６と接触し、Ａｓｐ４９は、ＰＤＧＦ−ＢのＡｒｇ７３と接触し、Ａｓｐ５０は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８６と接触し、Ａｓｎ６５は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８６と接触し、Ｐｈｅ９０は、ＰＤＧＦ−ＢのＰｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、およびＰｈｅ８４と接触し、Ｔｈｒ９１は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８１およびＩｌｅ８３と接触し、Ｈｉｓ９２は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８１およびＩｌｅ８３と接触し、Ａｓｎ９３は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８１と接触し、Ｓｅｒ９４は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８１と接触し、重鎖可変ドメインアミノ酸の番号付けは、配列番号２に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいており、
さらに、ＰＤＧＦ−Ｂ接触残基のアミノ酸残基番号付けは、配列番号３３のアミノ酸配列に関するものである、
ように１つの前記エピトープのアミノ酸残基と４Å以内で接触している、
単離抗体、またはその抗原結合性断片を含む。
【０１０７】
本発明は、本発明の抗体、またはその抗原結合性断片、および薬学的に許容できる担体または賦形剤を含む医薬組成物を含む。
【０１０８】
本発明は、それを必要とする対象において細胞外マトリックスの沈着を低減するための方法を含む。本方法は、対象に有効量の医薬組成物を投与し、それによって対象において過剰な細胞外マトリックスの沈着を阻害するステップを含む。
【０１０９】
本発明は、それを必要とする対象において細胞外マトリックス沈着を低減するのに使用するための医薬の製造における、本発明の抗体、もしくはその抗原結合性断片、または医薬組成物の使用をさらに含む。
【０１１０】
本発明は、それを必要とする対象において細胞外マトリックス沈着を低減するのに使用するための本発明の抗体、もしくはその抗原結合性断片、または医薬組成物をさらに提供する。
【０１１１】
本発明は、ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ−Ｂの結合によって媒介される疾患、障害、または状態を予防または治療するための方法を含む。本方法は、それを必要とする対象に有効量の医薬組成物を投与するステップを含む。
【０１１２】
本発明は、ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ−Ｂの結合によって媒介される疾患、障害、または状態を予防または治療するための医薬の製造における、本発明の抗体、もしくはその抗原結合性断片、または医薬組成物の使用をさらに提供する。
【０１１３】
本発明は、ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ−Ｂの結合によって媒介される疾患、障害、または状態を予防または治療するための、本発明の抗体、もしくはその抗原結合性断片、または医薬組成物をさらに提供する。
【０１１４】
一態様では、疾患、障害、または状態は、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺高血圧症、網膜血管疾患、心臓線維症、肺線維症、肝線維症、腎線維症、全身性硬化症、関節リウマチ、骨関節炎、および腫瘍形成からなる群から選択される少なくとも１つである。
【０１１５】
前述の概要、ならびに以下の本発明の詳細な説明は、添付図と併せて読むとよりよく理解されよう。本発明を例示するために現在好ましい実施形態が図に示されている。しかし、本発明は、図に示されている厳密な取り合わせおよび手段に限定されないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ＩＭＧＴデータベース内の、最も近い４つのそれぞれの生殖系列Ｖ領域を伴うＭＯＲ−８４５７重鎖可変領域（図１Ａ）および軽鎖可変領域（図１Ｂ）の配列アラインメントを示すパネルＡ〜Ｎを含む図である。同一の残基は（．）と示されており、フレームワークならびにＣＤＲ１およびＣＤＲ２が示されている。図１Ｃは、生殖系列化を伴わないＭＯＲ８４５７−ＶＬのアミノ酸配列（配列番号１）を示し、ＣＤＲに下線が引かれている。図１Ｄは生殖系列化を伴わないＭＯＲ８４５７−ＶＨのアミノ酸配列（配列番号２）を示し、ＣＤＲに下線が引かれている。図１Ｅは生殖系列化後のＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬのアミノ酸配列（配列番号４）を示し、ＣＤＲに下線が引かれている。図１Ｆは生殖系列化後のＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨのアミノ酸配列（配列番号６）を示し、ＣＤＲに下線が引かれている。図１Ｇは、ＶＬ領域が生殖系列化されたＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＬＣのアミノ酸配列（配列番号１６）全長軽鎖を示す。図１Ｈは、生殖系列化されたＶＨ領域および野生型配列「ＬＬＧＬ」が「ＡＡＧＡ」に変異したエフェクターヌル三重変異（３ｍ）を含むヒトＩｇＧ１を含むＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ｈＩｇＧ１−３ｍ−ＨＣのアミノ酸配列（配列番号１４）全長重鎖を示す。ロイシンからアラニンへの置換の部位に下線が引かれている。図１Ｉは工学的に改変されたバリアントＭＯＲ８４５７−１５−ＶＬの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３４）を示し、ＣＤＲに下線が引かれている。図１Ｊは工学的に改変されたバリアントＭＯＲ８４５７−１５−ＶＨおよびＭＯＲ８４５７−１６−ＶＨの重鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号４４）を示し、ＣＤＲに下線が引かれている。工学的に改変されたバリアントＭＯＲ８４５７−１５とＭＯＲ８４５７−１６はどちらも同じ重鎖配列を共有する。図１Ｋは工学的に改変されたバリアントＭＯＲ８４５７−１６−ＶＬの軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３９）を示し、ＣＤＲに下線が引かれている。図１ＬはＭＯＲ８４５７−１５（配列番号３７）全長軽鎖のアミノ酸配列を示し、ＶＬ領域が生物物理学的性質の改善のために工学的に改変されている。図１Ｍは、ＶＨ領域が生物物理学的性質の改善のために工学的に改変されており、定常領域の野生型配列「ＬＬＧＬ」が「ＡＡＧＡ」に変異した、工学的に改変されたＶＨ領域およびエフェクターヌル三重変異（３ｍ）を含むヒトＩｇＧ１を含むＭＯＲ８４５７−１５−ＨＣおよびＭＯＲ８４５７−１６−ＨＣの全長重鎖アミノ酸配列（配列番号４６）を示す。ロイシンからアラニンへの置換の部位に下線が引かれている。図１Ｎは、ＶＬ領域が生物物理学的性質の改善のために工学的に改変されているＭＯＲ８４５７−１６−ＬＣ（配列番号４２）全長軽鎖のアミノ酸配列を示す。
【図２】種々のＰＤＧＦに対するＭＯＲ８４５７抗体の結合カイネティクスを示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示すパネルＡ〜Ｋを含む図である。抗ヒトＩｇＧ抗体（Ａ〜Ｄ、Ｉ〜Ｋ）または抗マウスＩｇＧ抗体（Ｅ〜Ｈ）をＣＭ５センサーチップのフローセル内に固定化した。１μｇ／ｍＬのＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍ（Ａ〜Ｄ）、ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１（Ｅ〜Ｈ）またはＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ｈＩｇＧ１−３ｍ（Ｉ〜Ｋ）を、それぞれ独立に、それぞれの抗ヒト表面または抗マウス表面に１０秒にわたって注射し、それにより、５０〜１００ＲＵの安定な抗ＰＤＧＦ表面がもたらされた。次いで、結合のために、異なる濃度、０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ、および１ｎＭのＰＤＧＦタンパク質を毎分１００μｌの流速で２分にわたって抗体表面に注射した。１０分にわたって複合体を解離させた。１０ｍＭの塩化マグネシウムを３０秒注射することで表面を再生させ、表面を抗ＰＤＧＦ抗体捕捉およびＰＤＧＦ結合カイネティクスの別のラウンドの準備ができた状態にした。これらの３種の抗体のそれぞれがヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（Ａ、Ｅ、Ｉ）、マウスＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｂ、Ｆ、Ｊ）およびラットＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｃ、Ｇ、Ｋ）に密接に結合した。ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍ（Ｄ）およびＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１（Ｈ）はヒトＰＤＧＦ−ＡＢに結合した。示されている各センサーグラムは３つの独立した実験のうちの代表的な１つである。
【図３】ヒトＰＤＧＦ−ＢＢがすでにＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１に結合している場合、ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍはヒトＰＤＧＦ−ＢＢに結合するが、ＰＤＧＦＲβ−ｈＩＧｇ１はヒトＰＤＧＦ−ＢＢに結合しないことを例示するセンサーグラムおよび図である。ＣＭ５センサーチップ上に固定化した抗マウスＩｇＧによってＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１を捕捉し、それにより、２００〜４００ＲＵの安定な表面がもたらされた（注射１）。１ｎＭのヒトＰＤＧＦ−ＢＢを表面飽和に達するまで６分にわたって注射し（注射２）、その後、ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍ（サイクル１、注射３、黒い線）、またはＰＤＧＦＲβ−ｈＩＧｇ１（サイクル２、注射３、灰色の線）、または緩衝液（サイクル３、注射３、破線）を注射した。結合が示されなかったＰＤＧＦＲβ−ｈＩｇＧ１および緩衝液（サイクル２およびサイクル３の線には注射３後のＲＵの増加が示されていない）とは対照的に、ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍは、チップ上に予め組み立てられたＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１／ＰＤＧＦ−ＢＢ複合体に結合し（サイクル１センサーグラムには注射３後の共鳴の増加が示されている）、これにより、ＰＤＧＦ−ＢＢ二量体が２つのＭＯＲ８４５７分子に結合したこと、およびＰＤＧＦ−ＢＢに１つのＭＯＲ８４５７が結合することが、ＰＤＧＦＲββ受容体の結合を遮断するために十分であったことが実証される。示されているデータは、２つの独立した実験のうちの代表的な１つの実験からのものである。
【図４】ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍは、ＰＤＧＦ−ＢＢがｈＰＤＧＦＲβ−ｈＩｇＧ１に結合している場合にヒトＰＤＧＦ−ＢＢに結合することができなかったことを例示するセンサーグラムおよび図である。ＰＤＧＦＲβ−ｈＩｇＧ１を抗ヒトＩｇＧ抗体によってＣＭ５センサーチップ上に捕捉した（注射１）。次いで、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢを１ｎＭの濃度でＰＤＧＦＲβ−ｈＩｇＧ１上の結合部位が飽和するまで６分にわたって注射し（注射２）、その後、ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍ（サイクル１、注射３、黒い線）、または緩衝液（サイクル２、注射３、灰色の線）を注射した。ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍは予め組み立てられたＰＤＧＦＲβ−ｈＩｇＧ１／ＰＤＧＦ−ＢＢ複合体に結合せず、これにより、ＭＯＲ８４５７とＰＤＧＦＲがＰＤＧＦ−ＢＢ上の同じ結合部位を競合することが示唆される。示されているデータは、２つの独立した実験のうちの代表的な１つの実験からのものである。
【図５】パネルＡおよびＢを含み、溶液中で、ＭＯＲ８４５７によりＰＤＧＦＲβ−ｈＩｇＧ１へのヒトＰＤＧＦ−ＢＢの結合が遮断されることを示す図である。図５Ａは、溶液中での競合アッセイのＢｉａｃｏｒｅセットアップを例示する図を示す。ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１をＰＢＳ中に段階的に希釈し、次いで、１ｍＭのヒトＰＤＧＦ−ＢＢと混合し、［角括弧］によって示されている平衡に達するまで２〜８℃で２０時間インキュベートした。次いで、各ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１およびＰＤＧＦ−ＢＢ希釈混合物をＣＭ５チップ上の抗ヒトＩｇＧ１によって捕捉されたＰＤＧＦＲβ−ｈＩｇＧ１の表面全体に注射した。図５Ｂは、濃度反応曲線を示すグラフを示し、ＭＯＲ８４５７により、ＰＤＧＦＲβ−ｈＩｇＧ１へのＰＤＧＦ−ＢＢの結合が阻害されたことが実証されている。示されているデータは、２つの独立した実験のうちの代表的な１つの実験からのものである。
【図６】ＰＤＧＦ−ＢＢ二量体へのＭＯＲ８４５７の結合形式を例示する図である。この図では、ＰＤＧＦ−ＢＢ分子の結合性エピトープ１と２はおよそ１９０Å離れており、したがって、単一のＭＯＲ８４５７抗体はエピトープ１とエピトープ２に同時に結合することができないことが例示されている。したがって、このモデルにより、本明細書の他の箇所で認められる２：１の結合ストイキオメトリーは、遠く離れすぎている２つのエピトープの幾何的制約に起因することが実証される。
【図７】１つのＰＤＧＦ−Ｂ上の１つの結合性エピトープへの１つのＭＯＲ８４５７の結合を示すモデルの図である。この図は、ＭＯＲ８４５７のＶＨドメインおよびＶＬドメインが以下のＰＤＧＦ−Ｂのアミノ酸残基：Ｌｅｕ３８、Ｖａｌ３９、Ｔｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５およびＬｙｓ８６に結合する（すなわち、４Å未満の距離にある残基と接触する）ことをさらに示す。
【図８】パネルＡおよびＢを含み、ＭＯＲ８４５７により、ＰＤＧＦ−ＢＢにより誘導されるヒトメサンギウム細胞増殖が強力に阻害されたことを示す２つのグラフを示す図である。図８Ａは、ＭＯＲ８４５７の不在下でのＰＤＧＦ−ＢＢにより誘導されるヒトメサンギウム細胞増殖の濃度反応曲線を示すグラフを示す。初代ヒトメサンギウム細胞を培養し、９６ウェルプレートに播種した。無血清ＭＣＭ培地を用いて細胞を２４時間にわたって成長停止させた。２４時間後に、段階的に希釈したＰＤＧＦ−ＢＢを用い、３７℃で４時間にわたって細胞を刺激した。最後の１６時間にＢｒｄＵ組み入れアッセイを使用してＤＮＡ合成を決定した。ＰＤＧＦ−ＢＢにより、メサンギウム細胞増殖が強力に誘導され、ＥＣ５０は２．３ｎｇ／ｍＬであった。図８Ｂは、図８Ａに示されているものと同じアッセイにおけるＭＯＲ８４５７の代表的な阻害曲線を示すグラフを示す。すなわち、ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ＩｇＧ１−３ｍを、１００ｎＭから０．１ｎＭまで２分の１対数希釈し、次いで、無血清ＭＣＭ培地中２．５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢと３０分にわたって混合した後、混合物を細胞に添加した。増殖アッセイを図８Ａに記載の通り実施した。３つの独立した実験により決定された平均ＩＣ５０は１３．４±２．８ｐＭであり、最大阻害は８７．９±５．７％であった。
【図９】パネルＡおよびＢを含み、ＭＯＲ８４５７の競合阻害についてのＳｃｈｉｌｄ分析を示す２つのグラフを示す図である。図９Ａは、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、１ｎＭおよび１０ｎＭのＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ＩｇＧ１−３ｍが存在しない場合と存在する場合のＰＤＧＦ−ＢＢの濃度反応曲線を示すグラフを示す。抗体をＰＤＧＦ−ＢＢと混合し、２５℃で２．５時間インキュベートした後、混合物を細胞に添加した。細胞増殖アッセイを図８に記載の通り実施した。図９Ａは、ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ＩｇＧ１−３ｍの濃度が上昇するにつれて曲線が右にシフトし、阻害の程度が高濃度のＰＤＧＦ−ＢＢで克服されたことを示し、これにより、阻害が競合的であることが示唆される。図９Ｂは、Ｓｃｈｉｌｄ回帰分析を示すグラフを示す。Ｓｃｈｉｌｄ分析を記載の通り実施した（Ａｒｕｎｋｌａｋｓｈａｎａ＆Ｓｃｈｉｌｄ、１９５９、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５：４８〜５８）。抗体が存在しない場合と存在する場合に測定されたＰＤＧＦ−ＢＢのＥＣ５０を使用して用量比（ＤＲ）を算出した。一連のｌｏｇ［Ｂ］抗体濃度についての一連のｌｏｇ（ＤＲ−１）値をグラフにプロットした。グラフから推定されるｐＡ２は約２０ｐＭであり、これは、Ｂｉａｃｏｒｅによって測定された結合親和性（すなわち、約１３ｐＭ）と一致する。これらのデータは、機能アッセイにおいてＭＯＲ８４５７が強力かつ競合的な阻害剤であることを示している。
【図１０】パネルＡおよびＢを含み、ラットにおけるＯＸ−７誘導後９日目の抗Ｔｈｙ１．１腎炎腎組織試料におけるメサンギウム細胞増殖に対するＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１の影響を実証するグラフを示す図である。雄ｗｉｓｔａｒラットにモノクローナル抗体ＯＸ−７（１ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｖ．注射することによって腎炎を惹起した。疾患を誘導した１．５日後に、ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１（３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ）ならびにアイソタイプ対照ＩｇＧ（３０ｍｇ／ｋｇ）を動物の別々のコホート（ｎ＝６）に皮下投与した。８日目に、細胞周期のＤＮＡ（Ｓ）期にある細胞を標識するために、全てのラットに５０ｍｇ／ｋｇのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を腹腔内注射した。９日目に動物を屠殺し、腎組織試料を得て、細胞増殖に対するＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１の影響（図１０Ａ）ならびにメサンギウム細胞および有足細胞の活性化に対するＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１の影響を評価した（アルファ平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）についての免疫組織化学的調査、図１０Ｂ）。データは、ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１により、メサンギウム細胞増殖の用量依存的な減少（図１０Ａ）およびアルファ平滑筋アクチン陽性染色の減少（図１０Ｂ）が誘導されたことを示す。
【図１１】７種の抗体の、ｐＨ６．０における予測ＦＡＢ電荷に対してプロットした低塩、ｐＨ６．０、濃度１００ｍｇ／ｍｌにおける粘度を示すグラフを示す図である。予測ＦＡＢ電荷はＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ３．５  ｐＫａ予測因子を使用して算出する。抗体ＡＡＢ−００１、ＲＫ３５、ＩＭＡ−６３８、ＭＯＲ８４５７およびＭＯＲ８４５７−ＧＬの粘度を方法に記載の通り測定する。ＭＡｂ１およびＭＡｂ２の粘度測定値はＹａｄａｖ  ２０１２、上記に記載されている。
【図１２】７種の抗体の、ｐＨ６．０において予測されるＦａｂ双極子モーメントの大きさに対してプロットした低塩、ｐＨ６．０、濃度１００ｍｇ／ｍｌにおける粘度を示す図である。予測ＦＡＢ電荷を、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ３．５  ｐＫａ予測因子を使用して算出した。次いで、これらの電荷を使用して双極子モーメントを算出した。ＡＡＢ−００１、ＲＫ３５、ＩＭＡ−６３８、ＭＯＲ８４５７およびＭＯＲ８４５７−ＧＬの粘度を方法に記載の通り測定した。ＭＡｂ１およびＭＡｂ２の粘度測定値はＹａｄａｖ  ２０１２、上記に記載されている。
【図１３】７種の抗体の、ＣＤＲ領域内の残基の正味の電荷に対してプロットした低塩、ｐＨ６．０、濃度１００ｍｇ／ｍｌにおける粘度を示すグラフを示す図である。正味の電荷は、正電荷を有する残基に＋１、負電荷を有する残基に−１、およびＨｉｓに＋１／２の電荷を与えることによって算出する。ＡＡＢ−００１、ＲＫ３５、ＩＭＡ−６３８、ＭＯＲ８４５７およびＭＯＲ８４５７−ＧＬの粘度を方法に記載の通り測定する。ＭＡｂ１およびＭＡｂ２の粘度測定値はＹａｄａｖ  ２０１２、上記に記載されている。
【図１４】パネルＡ〜Ｇを含み、（Ａ）ＡＡＢ−００１（Ｂ）ＲＫ３５（Ｃ）ＭＡｂ２（Ｄ）ＩＭＡ−６３８（Ｅ）ＭＡｂ１（Ｆ）ＭＯＲ８４５７−ＧＬ（Ｇ）ＭＯＲ８４５７のＣＤＲ領域を強調した、静電気力による位置エネルギー表面を示す図である。表面電荷は、図の右下の棒によって示される通り、正電荷を有するパッチについての黒色から負電荷を有するパッチについての白色までのスペクトルとして示されている。全ての分子が、各ＣＤＲ領域が外側を向き（紙の平面の範囲外に）、重鎖が左側、軽鎖が右側になるような向きで示されている。
【図１５】ＭＯＲ８４５７および工学的に改変されたそのバリアントの粘度測定値を濃度の上昇に応じて示すグラフを示す図である。親のＭＯＲ８４５７抗体は実線で示されている。生殖系列化されたＭＯＲ８４５７−ＧＬは黒塗りの四角を伴う点線で示されている。工学的に改変されたバリアントＭＯＲ８４５７−１５は黒塗りの丸を伴う点線で示されている。工学的に改変されたバリアントＭＯＲＲ８４５７−１６は黒塗りの三角形を伴う点線で示されている。示されているデータにより、ＭＯＲ８４５７−１６の粘度が他の３種のＭＯＲ８４５７抗体と比較して低いことが実証される。
【図１６】パネルＡおよびＢを含み、ＰＤＧＦ−ＢＢ二量体と複合体を形成した（Ａ）ＭＯＲ８４５７−１５および（Ｂ）ＭＯＲ８４５７−１６の構造モデルを示す図である。Ｆａｂが灰色のリボンで示されており、ＰＤＧＦ−ＢＢ二量体が薄い灰色の表面で表示されている。ＰＤＧＦ−ＢＢと直接接触している残基が灰色のスティックで示されており、親抗体と比較して変異した残基が黒色のスティックで示されている。示されているデータにより、工学的に改変されたＭＯＲ８４５７、バリアントのどちらについても、３つの変異のいずれもＰＤＧＦ−Ｂ二量体と相互作用しないことが実証される。
【図１７】パネルＡおよびＢを含み、（Ａ）ＭＯＲ８４５７−ＧＬおよび（Ｂ）ＭＯＲ８４５７−１６の静電気力による位置エネルギー表面を示す図である。この図に示されている電荷表面スケーリングは図１４に示されているものと同じである。ＭＯＲ８４５７−ＧＬではＡｓｎであるのがＭＯＲ８４５７−１６ではＬｙｓに変異した部位Ｌ５３が矢印で示されている。この残基は軽鎖ＣＤＲ内の負電荷を有する大きなパッチ（Ｌ５３部位の上の白色のパッチ）のすぐ隣にあり、これらのデータにより、この残基が親抗体と比較した粘度の低下に関与することが示唆される。
【図１８】リン酸緩衝生理食塩水中でのＭＯＲ８４５７−ＧＬ（四角）、ＭＯＲ８４５７−１５（丸）およびＭＯＲ８４５７−１６（三角形）の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）プロファイルを示すグラフを示す。
【図１９】パネルＡおよびＢを含み、ＭＯＲ８４５７および工学的に改変されたそのバリアントの発現および精製プロファイルをそれぞれ示すグラフを示す。パネルＡは、各抗体についての、２９３培養物において一過性発現させた後の発現レベル（白色の棒でｍｇ／ｍＬとして示されている）およびプロテインＡによる捕捉後の精製収率（灰色の棒で対象のパーセントピーク面積として示されている）を示す棒グラフを示す。パネルＢは、単一のピークが示されている、プロテインＡによる溶出後のＭＯＲ８４５７−１６についての分析的サイズ排除クロマトグラフを示すグラフを示す。
【図２０】パネルＡ〜Ｄを含み、異なるＰＤＧＦアイソフォームに対するＭＯＲ８４５７−１６の結合カイネティクスを示すＢｉａｃｏｒｅセンサーグラムを示す図である。抗ヒトＩｇＧ抗体を使用してＣＭ５チップ上にＭＯＲ８４５７−１６を捕捉した。各ＰＤＧＦアイソフォームの結合カイネティクスを、異なる濃度の各ＰＤＧＦアイソフォームを捕捉されたＭＯＲ８４５７−１６表面全体に流すことによって評価した。Ｈｕ−ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ａ）およびＭｕ−ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｃ）の濃度は０．２５ｎＭ、０．５ｎＭ、および１ｎＭであり、Ｈｕ−ＰＤＧＦ−ＡＢ（Ｂ）およびラット−ＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｄ）の濃度は０．５ｎＭおよび１ｎＭであった。各センサーグラムは２つの独立した実験のうちの代表的な１つである。カイネティクスデータを２重に照会し、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアバージョン４．１を使用してフィッティングした。この図に示されている会合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）および解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）ならびに結合親和性は表８に列挙されている。
【図２１】パネルＡおよびＢを含み、メサンギウム細胞増殖アッセイにおけるＭＯＲ８４５７−１６（Ａ）およびＭＯＲ８４５７−ＧＬ（Ｂ）の阻害曲線を示すグラフを示す図である。２．５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢを用いて細胞増殖を刺激した。アッセイを実施例８に記載の通り実施した。ＭＯＲ８４５７−１６のＩＣ５０は１４ｐＭであり、親ＭＯＲ８４５７−ＧＬのＩＣ５０は２０ｐＭであった。
【発明を実施するための形態】
【０１１７】
ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合し、ＰＤＧＦＲβへのその結合を阻害する抗体が本明細書で開示されている。ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を作製する方法、これらの抗体を含む組成物、およびこれらの抗体を使用する方法が提供されている。ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ−Ｂの結合によって引き起こされ、かつ／またはそれに関連した疾患、障害、または状態の予防および／または治療において使用されうる。このような疾患、障害、または状態としては、それだけに限らないが、アテローム性動脈硬化症、バルーン傷害誘発再狭窄、肺高血圧症、臓器線維症（例えば、心臓、肺、腎臓（ｒｅｎａｌ）、および腎臓（ｋｉｄｎｅｙ））、全身性硬化症、関節リウマチ、骨関節炎、および腫瘍形成がある。
【０１１８】
一般的な技法
本明細書で別段の定義のない限り、本発明とともに使用される科学用語および技術用語は、当業者が一般に理解する意味を有するものとする。さらに、文脈による別段の要求のない限り、単数形の用語は、複数存在することを含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、ならびにタンパク質および核酸化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、ならびにこれらの技法は、当技術分野で周知であり、かつ一般に使用されるものである。
【０１１９】
本発明を実行すると、別段の指定のない限り、当技術分野の技術の範囲内である分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来技法が使用されることになる。このような技法は、文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３〜１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（２００２）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９９８）；Ｃｏｌｉｇａｎら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（２００３）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）などに完全に説明されている。
【０１２０】
酵素反応および精製技法は、当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載されるように、製造者の仕様書に従って実施される。本明細書に記載の分析化学、生化学、免疫学、分子生物学、合成有機化学、ならびに医薬および製薬化学に関連して使用される命名法、ならびにこれらの実験手順および技法は、当技術分野で周知であり、かつ一般に使用されるものである。標準技法が、化学合成、化学分析、医薬調製物、製剤、および送達、および患者の治療に使用される。
【０１２１】
定義
以下の用語は、別段の指定のない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする：用語「単離分子」（ここで分子は、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体である）は、派生のその起源またはソースによって、（１）その天然の状態でそれに随伴する天然に付随した成分と付随していない、（２）同じ種に由来する他の分子を実質的に含まない、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される、または（４）自然において存在しない分子である。したがって、分子であって、化学合成され、またはそれが天然に生じる細胞と異なる細胞系で発現される分子は、その天然に付随した成分から「単離されている」ことになる。分子は、当技術分野で周知の精製技法を使用して単離によって天然に付随した成分を実質的に含まないようにすることができる。分子の純度または均質性は、当技術分野で周知のいくつかの手段によってアッセイすることができる。例えば、ポリペプチド試料の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルの染色を使用してアッセイすることによって、当技術分野で周知の技法を使用してポリペプチドを可視化することができる。ある特定の目的のために、より高い解像度が、ＨＰＬＣまたは精製のための他の当技術分野で周知の他の手段を使用することによってもたらされうる。
【０１２２】
本明細書において、「実質的に純粋な」は、対象とする化学種が、存在する支配的な化学種であり（すなわち、モルベースで、それが組成物中のどの他の個々の化学種よりも豊富であり）、好ましくは、実質的に精製された画分が、対象とする化学種（例えば、抗体または受容体を含めた糖タンパク質）が、存在するすべての巨大分子種の少なくとも約５０パーセント（モルベースで）を占める組成物であることを意味する。一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種の約８０パーセント超、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、および９９％超を占めることになる。最も好ましくは、対象とする化学種は、本質的に均質になる（混入物種を従来の検出法によって組成物中に検出することができない）まで精製され、ここで組成物は、単一の巨大分子種から本質的になる。
【０１２３】
「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置した少なくとも１つの抗原認識部位によって、標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。本明細書において、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、別段の指定のない限り、インタクト抗体と特異的結合を競合するその任意の抗原結合性部分、抗原結合性部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成も包含する。抗原結合性部分としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ、例えば、サメおよびラクダ抗体）、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む断片、単鎖可変断片抗体（ｓｃＦｖ）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲおよびビス−ｓｃＦｖ、ならびにポリペプチドへの特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドがある。抗体には、任意のクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などが含まれ、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分類されうる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は、周知である。
【０１２４】
用語「抗原結合性部分」または抗体の「抗原結合性断片」（もしくは単に「抗体部分」）は、本明細書で互換的に使用され、抗原（例えば、ＰＤＧＦ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合性機能は、全長抗体の断片によって実施されることが示されている。用語の抗体の「抗原結合性部分」の中に包含される結合性断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）、ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４１：５４４〜５４６）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、およびイントラボディがある。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によってコードされるが、これらは、これらが単一タンパク質鎖として作製されるのを可能にする合成リンカーによって、組換え法を使用して接合することができ、このタンパク質鎖ではＶＬおよびＶＨ領域が対になって一価分子を形成する（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知、例えば、Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６（１９８８）、およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３（１９８８）を参照）。このような単鎖抗体も、用語の抗体の「抗原結合性部分」の中に包含されるように意図されている。ダイアボディなどの単鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが、単一ポリペプチド鎖上であるが、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成させることができず、それによってこれらのドメインを別の鎖の相補的なドメインと対形成させ、２つの抗原結合性部位を創製するリンカーを使用して発現される二価二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８（１９９３）；Ｐｏｌｊａｋら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２：１１２１〜１１２３を参照）。
【０１２５】
抗体は、それだけに限らないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウスなどを含めた任意の哺乳動物、または他の動物、例えば、トリ（例えば、ニワトリ）、魚（例えば、サメ）、およびラクダ科の動物（例えば、ラマ）などに由来しうる。
【０１２６】
抗体の「可変領域」は、単独で、または組み合わせて、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。当技術分野で公知であるように、重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても公知の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなり、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する。特に、ＣＤＲ領域の外側（すなわち、フレームワーク領域内）のアミノ酸残基において置換を有する対象可変領域のバリアントが望まれる場合、適切なアミノ酸置換、好ましくは保存的アミノ酸置換は、対象可変領域を対象可変領域と同じカノニカルクラス内にＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を含有する他の抗体の可変領域と比較することによって同定することができる（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６（４）：９０１〜９１７、１９８７）。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、ＣＤＲおよび抗体の結合部位を含む残基の同定の明示的なスケッチは、抗体の構造を解明し、かつ／または抗体−リガンド複合体の構造を解明することによって達成される。ある特定の実施形態では、それは、Ｘ線結晶学などの当業者に公知の様々な技法のいずれかによって達成されうる。ある特定の実施形態では、ＣＤＲ領域を同定し、または見積もるのに分析の様々な方法を使用することができる。ある特定の実施形態では、ＣＤＲ領域を同定し、または見積もるのに分析の様々な方法を使用することができる。このような方法の例としては、それだけに限らないが、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、接触定義、およびコンホメーション定義がある。
【０１２８】
Ｋａｂａｔ定義は、抗体中の残基の番号付けに標準的であり、一般に、ＣＤＲ領域を同定するのに使用される。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｗｕ、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８：２１４〜８を参照。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、Ｋａｂａｔ定義と同様であるが、ある特定の構造ループ領域の位置を考慮に入れる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら１９８６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７〜８３を参照。ＡｂＭ定義は、抗体構造をモデル化するＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐによって作製された、統合された一式のコンピュータープログラムを使用する。例えば、Ｍａｒｔｉｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）、８６：９２６８〜９２７２；「ＡｂＭＴＭ，Ａ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄ．を参照。ＡｂＭ定義は、ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．、３：１９４〜１９８においてＳａｍｕｄｒａｌａら、１９９９、「Ａｂ  Ｉｎｉｔｉｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」によって記載されたものなどの知識データベースとアブイニシオ法の組合せを使用して、一次配列から抗体の三次構造をモデル化する。接触定義は、利用可能な複合体結晶構造の分析に基づく。例えば、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５：７３２〜４５を参照。ＣＤＲの「コンホメーション定義」として本明細書で呼ばれる別の手法では、ＣＤＲの位置を、抗原結合へのエンタルピー的寄与をする残基として同定することができる。例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記手法の１つに厳密には従わず、しかしそれにもかかわらずＫａｂａｔ  ＣＤＲの少なくとも一部と重複することになるが、特定の残基または残基の群が抗原結合に著しくインパクトを与えないという予測または実験的な知見を踏まえて短くし、または長くすることができる。本明細書において、ＣＤＲは、手法の組合せを含めた当技術分野で公知の任意の手法によって定義されるＣＤＲを指す場合がある。本明細書で使用される方法は、これらの手法のいずれかによって定義されるＣＤＲを利用することができる。１つを超えるＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態について、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、接触、および／またはコンホメーション定義のいずれかに従って定義されうる。
【０１２９】
「接触残基」は、抗体またはそれによって特異的に結合される抗原に関して本明細書で使用する場合、同族の抗体／抗原に存在するアミノ酸残基の重原子（すなわち、水素でない）の４Å以下以内にある少なくとも１つの重原子を含む抗体／抗原に存在するアミノ酸残基を指す。
【０１３０】
当技術分野で公知であるように、抗体の「定常領域」は、単独で、または組み合わせて、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
【０１３１】
本明細書において、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体、すなわち、少量で存在しうる可能な天然に存在する突然変異を除いて同一である集団を構成する個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原部位に向けられている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を一般に含むポリクローナル抗体配合物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原の単一決定基に向けられている。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきでない。例えば、本発明によって使用されるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたものなどの組換えＤＮＡ法によって作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４に記載された技法を使用して生成されるファージライブラリーから単離することもできる。本明細書において、「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはこれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合性部分配列など）である非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、レシピエントのＣＤＲに由来する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、またはウサギなどのＣＤＲに由来する残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されないが、抗体性能をさらに洗練および最適化するために含められる残基を含みうる。
【０１３２】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応し、かつ／または本明細書に開示のヒト抗体を作製するための技法のいずれかを使用して作製されたアミノ酸配列を持つものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合性残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【０１３３】
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体などを指すように意図されている。
【０１３４】
用語「抗原（Ａｇ）」は、Ａｇを認識する抗体（Ａｂ）を生成するため、または発現ライブラリー（例えば、とりわけファージ、酵母、もしくはリボソームディスプレイライブラリー）をスクリーニングするために、免疫適格性脊椎動物を免疫化するのに使用される分子的実体を指す。本明細書で、Ａｇは、より広く名付けられており、一般に、Ａｂによって特異的に認識される標識分子を含むように意図されており、したがって、Ａｂを産生させるための免疫化プロセス、またはＡｂを選択するためのライブラリースクリーニングで使用される分子の断片または模倣体を含む。したがって、ＰＤＧＦ−Ｂに結合する本発明の抗体については、その単量体および二量体を含めた、哺乳動物種に由来する全長ＰＤＧＦ−Ｂ（例えば、ヒト、マウス、およびラットＰＤＧＦ−Ｂ）、ならびにＰＤＧＦ−Ｂのトランケートされた、および他のバリアントは、抗原と呼ばれる。
【０１３５】
一般に、用語「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する抗原の範囲または領域、すなわち、抗体と物理的に接触している範囲または領域を指す。したがって、用語「エピトープ」は、抗体の抗原結合性領域の１つまたは複数で抗体が認識および結合しうる分子の部分を指す。一般に、エピトープは、「抗体、またはその抗原結合性断片」（Ａｂ）とその対応する抗原との間の分子間相互作用との関連で定義される。エピトープは、分子の表面基群、例えば、アミノ酸または糖側鎖などからなることが多く、特定の三次元構造特性および特定の帯電特性を有する。いくつかの実施形態では、エピトープは、タンパク質エピトープでありうる。タンパク質エピトープは、線状であっても、立体構造的であってもよい。線状エピトープでは、タンパク質と相互作用分子（抗体など）との相互作用点のすべては、タンパク質の一次アミノ酸配列に直線的に沿って存在する。「非線状エピトープ」または「立体構造エピトープ」は、エピトープに特異的な抗体が結合する抗原タンパク質内に非連続的なポリペプチド（またはアミノ酸）を含む。用語「抗原エピトープ」は、本明細書において、当技術分野で周知である任意の方法、例えば、従来のイムノアッセイによって判定される場合に抗体が特異的に結合しうる抗原の部分として定義される。抗原上の所望のエピトープが決定されると、例えば、本明細書に記載の技法を使用してそのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。代わりに、発見プロセス中に、抗体を生成および特徴付けすると、望ましいエピトープについての情報が解明されうる。この情報から、次いで同じエピトープへの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを実現するための手法は、競合および交差競合試験を行って、ＰＤＧＦ−Ｂへの結合を互いに競合または交差競合する抗体、例えば、抗原への結合を競合する抗体を見つけることである。
【０１３６】
本明細書において、用語「野生型アミノ酸」、「野生型ＩｇＧ」、「野生型抗体」、または「野生型ｍＡｂ」は、ある特定の集団（例えば、ヒト、マウス、ラット、細胞など）内に天然に存在するアミノ酸または核酸の配列を指す。
【０１３７】
本明細書に他で概説したように、抗体分子のある特定の位置を変更することができる。「位置」とは、本明細書において、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順次、または確立したフォーマットによって番号付けてもよく、例えば、ＥＵインデックスおよびＫａｂａｔインデックスを使用して抗体のアミノ酸残基を番号付けることができる。例えば、２９７位は、ヒト抗体ＩｇＧ１内の位置である。対応する位置は、一般に他の親配列との整列によって、上記に概説したように決定される。
【０１３８】
「残基」とは、本明細書において、タンパク質内の位置およびその関連したアミノ酸の素性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７とも呼ばれ、Ｎ２９７とも呼ばれる）は、ヒト抗体ＩｇＧ１内の残基である。
【０１３９】
用語「アンタゴニスト抗体」は、標的に結合し、その標的の生物学的効果を妨げ、または低減する抗体を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、抗体であって、それが結合している標的、例えば、ＰＤＧＦ−Ｂが、生物学的機能、例えば、その同族受容体、ＰＤＧＦＲ−αα、ＰＤＧＦＲαβ、およびＰＤＧＦＲββへの結合を実施するのを妨げる、抗体を表しうる。
【０１４０】
本明細書において、「ＰＤＧＦ−Ｂアンタゴニスト抗体」は、ＰＤＧＦ−Ｂ生物活性、またはＰＤＧＦ−Ｂ（例えば、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢ）を含むホモまたはヘテロ二量体の活性、ならびに／またはそれだけに限らないが、その同族チロシンキナーゼ受容体に結合し、それによってシグナル伝達を媒介し、それによってとりわけ、細胞増殖、遊走、および／もしくは細胞外マトリックス沈着を引き起こすことを含めた、ＰＤＧＦ−Ｂによって媒介される下流事象を阻害することができる抗体を指す。ＰＤＧＦ−Ｂアンタゴニスト抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂによって媒介される下流事象、例えば、ＰＤＧＦ受容体結合、ならびに下流シグナル伝達、細胞増殖および細胞遊走の誘導などを含めたＰＤＧＦ−Ｂ生物活性を遮断、アンタゴナイズ、抑制、または低減する（有意にを含めた、任意の程度に）抗体を包含する。本発明の目的に関して、用語「ＰＤＧＦ−Ｂアンタゴニスト抗体」（「アンタゴニストＰＤＧＦ−Ｂ抗体」、「アンタゴニスト抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体」、「抗ＰＤＧＦ−Ｂアンタゴニスト抗体」、「アンタゴニストＰＤＧＦ−ＢＢ抗体」、「アンタゴニスト抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体」、「抗ＰＤＧＦ−ＢＢアンタゴニスト抗体」、「アンタゴニストＰＤＧＦ−ＡＢ抗体」、「アンタゴニスト抗ＰＤＧＦ−ＡＢ抗体」、または「抗ＰＤＧＦ−ＡＢアンタゴニスト抗体」と互換的に呼ばれる）は、ＰＤＧＦ−Ｂ自体、ＰＤＧＦ−Ｂ生物活性（それだけに限らないが、受容体に結合し、細胞増殖を誘導するその能力を含む）、または生物活性の結果が、実質的に無効にされ、減少し、または任意の意味のある程度において中和されるすべての先に識別した用語、表題、ならびに機能状態および特性を包含することが明示的に理解されることになる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂに結合し、ＰＤＧＦＲβへのその結合を妨げる。いくつかの実施形態では、アンタゴニスト能力は、細胞増殖アッセイを介して特徴付けられ、かつ／または記述される。いくつかの実施形態では、アンタゴニスト能力は、ＩＣ５０またはＥＣ５０値に関して記述される。ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の例は、本明細書に示されている。
【０１４１】
本明細書において、用語「ＰＤＧＦＲβ」は、少なくとも１本のＰＤＧＦＲβポリペプチド鎖を含む受容体を包含する。すなわち、ＰＤＧＦＲβには、本明細書において、単一ＰＤＧＦＲβポリペプチド鎖、ならびにＰＤＧＦＲββホモ二量体、およびＰＤＧＦＲαβヘテロ二量体が含まれる。
【０１４２】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸の鎖を指すのに本明細書で互換的に使用される。鎖は、線状または分岐状であり得、修飾アミノ酸を含み得、かつ／または非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語は、天然に、あるいは介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは修飾によって修飾されたアミノ酸鎖も包含する。例えば、アミノ酸の１種または複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、および当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドもこの定義内に含まれる。ポリペプチドは、単鎖または会合鎖として存在しうることが理解される。
【０１４３】
当技術分野で公知であるように、本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／もしくはこれらの類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって鎖中に組み込まれうる任意の基質でありうる。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドおよびこれらの類似体などを含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、鎖のアセンブリーの前または後にされうる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、標識成分とのコンジュゲーションなどによって重合後にさらに修飾されうる。修飾の他のタイプとしては、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドの１つまたは複数の類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）とのもの、および荷電連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）とのものなど、ペンダント部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）などを含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）とのもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾連結（例えば、アルファアノマー核酸など）とのもの、ならびにポリヌクレオチドの無修飾形態がある。さらに、糖内に通常存在する水酸基のいずれかを、例えば、ホスホネート基、リン酸基によって置き換え、標準的な保護基によって保護し、もしくは活性化して追加のヌクレオチドに追加の連結を用意することができ、または固体支持体にコンジュゲートすることができる。５’および３’末端ＯＨを、リン酸化し、またはアミン、もしくは１〜２０炭素原子の有機キャッピング基部分と置換することができる。他のヒドロキシルを誘導体化して標準的な保護基にすることもできる。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−、または２’−アジド−リボースを含めた当技術分野で一般に公知であるリボースまたはデオキシリボース糖の類似型、炭素環糖類似体、アルファまたはベータアノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース、またはリキソースなど、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体も含有しうる。１つまたは複数のホスホジエステル連結は、代替の連結基によって置き換えられていてもよい。これらの代替の連結基としては、それだけに限らないが、ホスフェートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）によって置き換えられている実施形態があり、式中、各ＲまたはＲ’は、独立してＨ、またはエーテル（−Ｏ−）連結を含有してもよい置換もしくは非置換のアルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジルである。ポリヌクレオチド内のすべての連結が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含めた本明細書で参照されるすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
【０１４４】
本明細書において、平衡解離定数が、実施例６および８で本明細書に開示した方法によって測定した場合、１００ｐＭ以下、好ましくは約６９ｐＭ未満、より好ましくは約５０ｐＭ未満、最も好ましくは約３０ｐＭ未満、より好ましくは約２０ｐＭ未満、さらにより好ましくは約１５ｐＭ未満、さらにより好ましくは約１０ｐＭ未満、さらにより好ましくは約４ｐＭ未満、より好ましくは約２ｐＭ未満であるとき、抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂ「と相互作用する」。一実施形態では、抗体は、ＫＤが約６９ｐＭ〜約２ｐＭの範囲であるとき、ＰＤＧＦ−Ｂと相互作用する。一実施形態では、抗体は、約１０ｐＭのＫＤでＰＤＧＦ−Ｂと相互作用する。
【０１４５】
エピトープに「優先的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書で互換的に使用される）抗体は、当技術分野でよく理解されている用語であり、このような特異的または優先的結合を判定する方法も当技術分野で周知である。分子は、これが、代替の細胞または物質と反応または会合するより、特定の細胞または物質とより長い持続時間および／またはより大きい親和性を伴って、より頻繁に、より急速に反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を呈すると言われる。抗体は、これが、他の物質に結合するより、大きい親和性、結合活性を伴って、より容易に、かつ／またはより長い持続時間を伴って結合する場合、標的に「特異的に結合し」、または「優先的に結合する」。例えば、ＰＤＧＦ−Ｂエピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、これが他のＰＤＧＦ−Ｂエピトープまたは非ＰＤＧＦ−Ｂエピトープに結合するより、大きい親和性、結合活性を伴って、より容易に、かつ／またはより長い持続時間を伴ってこのエピトープに結合する抗体である。例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的に特異的または優先的に結合する場合があり、または結合しない場合があることもこの定義を読むことによって理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的結合を必ずしも必要としない（しかし、これは排他的結合を含みうる）。一般に、しかし必ずしもではなく、結合への言及は、優先的結合を意味する。「特異的結合」または「優先的結合」は、特定の分子を認識し、それに結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識せず、またはそれに結合しない化合物、例えば、タンパク質、核酸、抗体などを含む。例えば、試料中の同族リガンドまたは結合パートナー（例えば、腫瘍抗原に結合する抗ヒト腫瘍抗原抗体）を認識し、またはそれに結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識せず、またはそれに結合しない抗体またはペプチド受容体は、その同族リガンドまたは結合パートナーに特異的に結合する。したがって、指示されたアッセイ条件下で、指定された結合部分（例えば、抗体、またはその抗原結合性部分、またはその受容体もしくはリガンド結合部分）は、特定の標的分子に優先的に結合し、検査試料中に存在する他の成分に有意な量で結合しない。
【０１４６】
対象とする分子に特異的に結合する抗体またはペプチドを選択するのに、様々なアッセイフォーマットを使用することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ：ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ）、およびウエスタンブロット分析は、抗原、または受容体、またはそのリガンド結合部分と特異的に反応する、同族リガンドまたは結合パートナーに特異的に結合する抗体を同定するのに使用されうる多くのアッセイの１つである。一般に、特異的または選択的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍、より一般的にはバックグラウンドの１０倍超となり、さらにより具体的には、抗体は、平衡解離定数（ＫＤ）が１μＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下、より好ましくは１０ｎＭ以下、さらにより好ましくは１００ｐＭ以下、さらにより好ましくは１０ｐＭ以下、さらにより好ましくは１ｐＭ以下であるとき、抗原に「特異的に結合する」と言われる。
【０１４７】
用語「結合親和性」は、２種の分子、例えば、抗体またはその断片と、抗原との非共有結合性相互作用の強度の尺度として本明細書で使用される。用語「結合親和性」は、一価相互作用（内活性）を記述するのに使用される。
【０１４８】
一価相互作用による２種の分子、例えば、抗体またはその断片と抗原との結合親和性は、解離定数（ＫＤ）の判定によって定量化されうる。次に、ＫＤは、複合体形成および解離のカイネティクスの測定、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）法（Ｂｉａｃｏｒｅ）によって判定されうる。一価複合体の会合および解離に対応する速度定数は、それぞれ会合速度定数ｋａ（またはｋｏｎ）および解離速度定数ｋｄ（またはｋｏｆｆ）と呼ばれる。ＫＤは、式ＫＤ＝ｋｄ／ｋａによってｋａおよびｋｂに関係付けられる。
【０１４９】
上記定義に従って、異なる分子間相互作用と関連した結合親和性、例えば、所与の抗原に対する異なる抗体の結合親和性の比較は、個々の抗体／抗原複合体のＫＤ値の比較によって比較されうる。抗体または他の結合パートナーのＫＤ値は、当技術分野で十分確立された方法を使用して判定することができる。ＫＤを判定するための一方法は、一般に、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用して、表面プラズモン共鳴を使用することによるものである。
【０１５０】
本明細書において、「実質的に純粋な」は、少なくとも５０％純粋（すなわち、混入物を含まない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９８％純粋、最も好ましくは少なくとも９９％純粋である材料を指す。
【０１５１】
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチドインサートを組み込むためのベクターのレシピエントでありうる、またはそれであった個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異に起因して元の親細胞と必ずしも完全に同一でない場合がある（モルフォロジーまたはゲノムＤＮＡ相補体において）。ある宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドで、ｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞を含む。
【０１５２】
当技術分野で公知であるように、用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用される。「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域またはバリアントＦｃ領域でありうる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動しうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基またはＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで伸びるように定義される。Ｆｃ領域内の残基の番号付けは、Ｋａｂａｔと同様にＥＵインデックスのものである。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。当技術分野で公知であるように、Ｆｃ領域は、二量体または単量体形態で存在しうる。
【０１５３】
当技術分野で使用される場合、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述する。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するものであり（ガンマ受容体）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的にスプライスされた形態を含めて含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）が含まれ、これらは、その細胞質ドメインが主に異なる同様のアミノ酸配列を有する。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２；Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４；ならびにｄｅ  Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１に概説されている。「ＦｃＲ」には、母系ＩｇＧの胎児への移動を担う新生児受容体、ＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒら、１９７６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７；およびＫｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９）．
【０１５４】
用語「競合する」は、抗体に関して本明細書で使用する場合、第１の抗体またはその抗原結合性部分が、第２の抗体またはその抗原結合性部分の結合と十分同様の様式でエピトープに結合し、その結果、第１の抗体のその同族エピトープとの結合の結果が、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下で検出可能な程度に減少することを意味する。第２の抗体のそのエピトープへの結合も第１の抗体の存在下で検出可能な程度に減少する選択肢は、当てはまりうるが、そうである必要はない。すなわち、第１の抗体は、第２の抗体が第１の抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく、第２の抗体のそのエピトープへの結合を阻害しうる。しかし、各抗体が同じ程度であっても、より大きい程度であっても、より小さい程度であっても、他の抗体のその同族エピトープまたはリガンドとの結合を検出可能な程度に阻害する場合、抗体は、これらのそれぞれのエピトープの結合を互いに「交差競合する」と言われる。競合および交差競合抗体はともに、本発明によって包含されている。このような競合または交差競合が起こる機構（例えば、立体障害、コンホメーション変化、または共通エピトープもしくはその部分への結合）にかかわらず、当業者は、本明細書に示した教示に基づいて、このような競合および／または交差競合抗体は包含されており、本明細書に開示の方法に有用でありうることを理解するはずである。
【０１５５】
「機能性Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を有する。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御がある。このようなエフェクター機能は一般に、Ｆｃ領域が結合性ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされる必要があり、このような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野で公知の様々なアッセイを使用して評価されうる。
【０１５６】
「天然配列Ｆｃ領域」は、自然において見つかるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって天然配列Ｆｃ領域のものと異なるが、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持するアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域、または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域内または親ポリペプチドのＦｃ領域内で約１〜約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５のアミノ酸置換を有する。本明細書でのバリアントＦｃ領域は、好ましくは天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくはそれと少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくはそれと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。
【０１５７】
本明細書において、「治療」は、有益な、または所望の臨床結果を得るための一手法である。本発明の目的に関して、有益な、または所望の臨床結果としては、それだけに限らないが、以下のうちの１つまたは複数がある：生存率の改善（死亡率の低減）、疾患に対する炎症反応の低減、組織線維症の量の低減、疾患病変の外観の改善、局所的な部位への病理学的病変の限定、疾患からの損傷の程度の減少、疾患の持続時間の減少、および／または疾患に関連した症状の数、程度、もしくは持続時間の低減。この用語は、疾患の症状、合併症、もしくは生化学的徴候の発症を予防し、または遅延させ、症状を軽減し、または疾患、状態、もしくは障害のさらなる発達を停止し、もしくは阻害するための本発明の化合物または作用物質の投与を含む。治療は、予防的であり得（疾患の発症を予防し、もしくは遅延させ、またはその臨床的もしくは準臨床的症状の顕在化を予防するため）、または疾患が顕在化した後の症状の治療的な抑制もしくは軽減でありうる。
【０１５８】
「寛解」は、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を投与しないことと比較して１つまたは複数の症状の緩和または改善を意味する。「寛解」は、症状の持続時間の短縮または低減も含む。
【０１５９】
本明細書において、薬物、化合物、または医薬組成物の「有効投与量」または「有効量」は、任意の１つまたは複数の有益な、または所望の結果に影響を与えるのに十分な量である。より具体的な態様では、有効量により、疾患または感染の症状が予防、軽減、もしくは寛解され、かつ／または治療されている対象の生存期間が延長される。予防的使用に関して、有益な、または所望の結果としては、リスクの排除もしくは低減、重症度の緩和、または疾患の生化学的、組織学的な、および／もしくは行動上の症状、その合併症、ならびに疾患の発達中に提示している中間病理学的表現型を含めた、疾患の発症の遅延がある。治療的使用に関して、有益な、または所望の結果としては、臨床結果、例えば、ＰＤＧＦ−Ｂ媒介性疾患、障害、もしくは状態の１つもしくは複数の症状の低減、疾患を治療するのに必要とされる他の薬物療法の用量の減少、別の薬物療法の効果の増強、および／または患者の疾患の進行の遅延などがある。有効投与量は、１回または複数の投与で投与することができる。本発明の目的に関して、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、直接または間接的に予防的または治療的処置を達成するのに十分な量である。臨床状況で理解されるように、薬物、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と併せて実現されてもよく、されなくてもよい。したがって、「有効投与量」は、１つまたは複数の治療剤の投与との関連で考慮することができ、１つまたは複数の他の作用物質と併せて、望ましい結果が実現されうる、または実現される場合、単剤を有効量で投与することが考慮されうる。
【０１６０】
「個体」または「対象」は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、それだけに限らないが、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリなど）、競技動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットも含まれる。いくつかの実施形態では、個体は、ＰＤＧＦ−Ｂのその受容体への結合およびそれによって媒介されるシグナル伝達によって媒介され、またはこれらと関連した疾患、障害、または状態のリスクにあると見なされている。
【０１６１】
本明細書において、「ベクター」は、宿主細胞内に対象とする１つまたは複数の遺伝子または配列を送達し、好ましくは発現させることができるコンストラクトを意味する。ベクターの例としては、それだけに限らないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤に付随したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム内に被包されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞などのある特定の真核細胞がある。
【０１６２】
本明細書において、「発現制御配列」は、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター、例えば、構成的プロモーターもしくは誘導プロモーターなど、またはエンハンサーでありうる。発現制御配列は、転写される核酸配列に作動可能に連結している。
【０１６３】
本明細書において、「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」には、活性成分と組み合わされたとき、成分に生物活性を保持させ、対象の免疫系と反応性でない任意の材料が含まれる。例として、それだけに限らないが、標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤などのいずれかが挙げられる。エアロゾルまたは非経口投与に好適な希釈剤は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）または通常の（０．９％）生理食塩水である。このような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００を参照）。
【０１６４】
本明細書で「約」のついた値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ記述する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。数値範囲は、範囲を定義する数値を包括する。
【０１６５】
本発明の広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似であるにもかかわらず、具体例で示されている数値は、可能な限り正確に報告されている。しかし、任意の数値は、そのそれぞれの検査測定において見出される標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を本質的に含有する。さらに、本明細書に開示のすべての範囲は、その中に含まれている任意かつすべてのサブ範囲を包含することが理解されるべきである。例えば、「１〜１０」の述べられた範囲は、１の最低値と１０の最大値の間の（かつこれらを含む）任意かつすべてのサブ範囲、すなわち、１以上、例えば、１〜６．１の最低値から始まり、１０以下、例えば、５．５〜１０の最大値で終わるすべてのサブ範囲を含むと見なされるべきである。
【０１６６】
実施形態が言い回し「含む」を用いて本明細書で記載されている場合は常に、「からなる」および／または「から本質的なる」に関して記載されている別段の類似の実施形態も用意されていることが理解される。
【０１６７】
本発明の態様または実施形態がマーカッシュ群または選択肢の他の分類に関して記載されている場合、本発明は、全体として列挙された群全体だけでなく、個々に群の各メンバー、および主群のすべての可能な亜群、群メンバーの１つまたは複数を欠く主群も包含する。本発明は、特許請求される発明内の群メンバーのいずれかの１つまたは複数の明確な除外も想定する。
【０１６８】
別段の定義のない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書が定義を含めて支配する。本明細書および特許請求の範囲全体にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または変形「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などは、述べた整数または整数の群を含むが、任意の他の整数または整数の群を除外しないことを暗示すると理解されることになる。文脈による別段の要求のない限り、単数形の用語は、複数存在することを含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。用語「例えば（ｅ．ｇ．）」または「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」に続く任意の例は、網羅的または限定的であるように意味していない。
【０１６９】
例示的な方法および材料が本明細書に記載されているが、本明細書に記載のものと類似または等価な方法および材料も、本発明の実行または試験で使用されうる。材料、方法、および実施例は、例示的であるだけであり、限定的であるように意図されていない。
【０１７０】
ＰＤＧＦ−Ｂ抗体
本発明は、単量体および／または二量体ＰＤＧＦ−Ｂに結合する抗体に関する。抗体は、好ましくはＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合し、すなわち、これらはＰＤＧＦ−Ｂに結合するが、他の分子に検出可能な程度に結合せず、またはより低い親和性で結合する。特に、本発明は、ＰＤＧＦ−Ｂに結合し、その活性を調節する抗体に関する。例えば、本発明の抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂの同族ＰＤＧＦＲβ受容体（ＰＤＧＦＲαβ、ＰＤＧＦＲββ、およびＰＤＧＦＲβ−ＩｇＧ１）への結合を減少させ、または阻害し、それによって受容体シグナル伝達を低減または阻害する能力を有しうる。本発明は、このような抗体を含む組成物、ならびに治療的使用および薬学的使用を含めたこのような抗体のための使用にも関する。
【０１７１】
用語「ＰＤＧＦ−Ｂ」とは、任意の適当な生物に由来しうる、単量体であっても二量体であってもＰＤＧＦ−Ｂの任意の天然に存在する形態を意味する。この用語は、ＰＤＧＦ−Ｂを含む任意の二量体、すなわち、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢを包含する。本明細書において、「ＰＤＧＦ−Ｂ」は、哺乳動物ＰＤＧＦ−Ｂ、例えば、ヒト、ラット、またはマウス、および非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、またはブタＰＤＧＦ−Ｂなどを指す。好ましくは、ＰＤＧＦ−Ｂは、ヒトである。用語「ＰＤＧＦ−Ｂ」は、このようなＰＤＧＦ−Ｂ分子の断片、バリアント、アイソフォーム、および他の同族体も包含する。バリアントＰＤＧＦ−Ｂ分子は、一般に、天然に存在するＰＤＧＦ−Ｂと同じタイプの活性、例えば、ＰＤＧＦＲβに結合する能力、受容体のリン酸化を誘導する能力、このような受容体によってシグナル伝達を媒介する能力、細胞遊走または増殖を誘導する能力、および細胞外マトリックスの沈着を誘導し、または増大させる能力などを有することによって特徴付けられることになる。
【０１７２】
本発明の抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂ（すなわち、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、およびＰＤＧＦ−ＢＢ）に特異的に結合し、ＰＤＧＦＲβ、例えば、ＰＤＧＦＲββおよびＰＤＧＦＲαβとのその相互作用を阻害し、それによってＰＤＧＦ−Ｂ活性を阻害する。本明細書で互換的に使用される用語「ＰＤＧＦ−Ｂ媒介活性」、「ＰＤＧＦ−Ｂ媒介効果」、「ＰＤＧＦ−Ｂ活性」、「ＰＤＧＦ−Ｂ生物活性」または「ＰＤＧＦ−Ｂ機能」とは、それだけに限らないが、ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ−Ｂの結合、ＰＤＧＦＲβのリン酸化、細胞遊走の増大、細胞増殖の増大、細胞外マトリックス沈着の増大、および当技術分野で公知の、または将来解明されるべきＰＤＧＦ−Ｂの任意の他の活性を含めた、同族受容体とのＰＤＧＦ−Ｂの相互作用によって媒介される任意の活性を意味する。
【０１７３】
したがって、本発明の方法は、ＰＤＧＦ−Ｂによって媒介される下流事象を含めたＰＤＧＦ−Ｂ活性を遮断、抑制、または低減する（有意に低減するを含む）本発明の抗体を使用する。本発明のＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、以下の特性の任意の１つまたは複数を呈するはずである：（ａ）ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合し、（ｂ）細胞表面受容体とのＰＤＧＦ−Ｂの相互作用、および下流シグナル伝達事象を遮断し、（ｃ）ＰＤＧＦＲβのリン酸化を遮断し、（ｄ）細胞増殖のＰＤＧＦ−Ｂ媒介誘導を遮断し、（ｅ）細胞遊走の誘導を遮断し、（ｆ）細胞外マトリックスのＰＤＧＦ−Ｂ媒介沈着を遮断または低減する。
【０１７４】
本発明の目的に関して、抗体は、好ましくは、細胞表面受容体、例えば、ＰＤＧＦＲαβおよびＰＤＧＦＲββとのＰＤＧＦ−Ｂの相互作用を遮断する様式でＰＤＧＦ−Ｂと反応する。
【０１７５】
本発明で有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、その突然変異体、抗体部分（例えば、ドメイン抗体）を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、ならびに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合によって修飾された抗体を含めた要求される特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成を包含しうる。抗体は、マウス、ラット、ヒト、または任意の他の起源でありうる（キメラまたはヒト化抗体を含む）。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。
【０１７６】
本発明のＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって作製されうる。ヒトおよびマウス抗体を産生するための一般的な技法は、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。
【０１７７】
ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して同定し、または特徴付けることができ、それによってＰＤＧＦ−Ｂ活性の低減、回復、または中和が検出および／または測定される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、候補剤（例えば、ＰＤＧＦＲββまたはＰＤＧＦＲβ−ＩｇＧ１）をＰＤＧＦ−Ｂとともにインキュベートし、結合性および／またはＰＤＧＦ−Ｂの生物活性の付随的低減もしくは阻害を監視することによって同定される。結合アッセイは、例えば、精製ＰＤＧＦ−Ｂポリペプチド、または様々な受容体を天然に発現する、もしくはＰＤＧＦ−Ｂ受容体を発現するようにトランスフェクトされた細胞を用いて実施されうる。一実施形態では、結合アッセイは競合的結合アッセイであり、この場合、ＰＤＧＦ−Ｂ結合を既知のＰＤＧＦ−Ｂ抗体と競合する候補抗体の能力が評価される。アッセイは、ＥＬＩＳＡフォーマットを含めた様々なフォーマットで実施されうる。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、候補抗体をＰＤＧＦ−Ｂとともにインキュベートし、結合性を監視することによって同定される。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂは、候補抗体（例えば、ヒト抗−ＰＤＧＦ−Ｂ抗体）をＰＤＧＦ−Ｂとともにインキュベートし、第２のＰＤＧＦ−Ｂ抗体（例えば、非ヒト定常領域を含むＰＤＧＦ−Ｂ抗体）のＰＤＧＦ−Ｂへの結合を監視して一抗体がＰＤＧＦ−Ｂの結合を第２の抗体と競合するか否かを評価することによって同定される。
【０１７８】
最初の同定の後、候補ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の活性を、標的生物活性を試験することが知られているバイオアッセイによってさらに確認および洗練することができる。いくつかの実施形態では、候補ＰＤＧＦ−Ｂ抗体をさらに特徴付けるためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイが使用される。例えば、候補抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂとともにインキュベートされ、第２のＰＤＧＦ−Ｂ抗体または受容体の外部ドメインを含む可溶性ＰＤＧＦＲβ（例えば、ＰＤＧＦＲβ−ＩｇＧ１）が添加され、第２の抗体または可溶性受容体によるＰＤＧＦ−Ｂの結合性が監視される。代わりに、バイオアッセイを使用して候補を直接スクリーニングすることができる。ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を同定し、特徴付けるための方法のいくつかは、実施例で詳細に記載されている。
【０１７９】
本発明のＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、以下の特性の任意の１つまたは複数を呈する：（ａ）ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合し、（ｂ）細胞表面受容体とのＰＤＧＦ−Ｂの相互作用、および下流シグナル伝達事象を遮断し、（ｃ）細胞増殖または遊走のＰＤＧＦ−Ｂ媒介誘導を遮断し、（ｄ）細胞外マトリックスのＰＤＧＦ−Ｂ媒介沈着を遮断または低減する。好ましくは、本発明のＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、これらの特徴の２つ以上を有する。より好ましくは、抗体は、特徴の３つ以上を有する。より好ましくは、抗体は、４つすべての特徴を有する。
【０１８０】
ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して特徴付けることができる。例えば、一方法は、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体が結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」である。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９の１１章に記載されている、抗体−抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドベースアッセイを含めて、タンパク質のエピトープの場所をマッピングし、特徴付けるための当技術分野で公知の多くの方法がある。追加の例では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体が結合する配列を決定するのにエピトープマッピングを使用することができる。エピトープマッピングは、様々なソース、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ  １５、８２１９  ＰＨ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ）から市販されている。エピトープは、線状エピトープ、すなわち、アミノ酸の単一ストレッチ内に含有されたもの、または必ずしも単一ストレッチ内に含有されていなくてもよいアミノ酸の三次元相互作用によって形成される立体構造エピトープでありうる。様々な長さ（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸の長さ）のペプチドを単離または合成し（例えば、組換えで）、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を用いた結合アッセイに使用することができる。別の例では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体が結合するエピトープは、ＰＤＧＦ−Ｂ配列に由来する重複ペプチドを使用し、抗体による結合性を判定することによって、系統的なスクリーニングで決定されうる。遺伝子断片発現アッセイによれば、ＰＤＧＦ−Ｂをコードするオープンリーディングフレームを、ランダムに、または特定の遺伝子構築によって断片化することができ、ＰＤＧＦ−Ｂの発現される断片の試験される抗体との反応性が判定される。遺伝子断片は、例えば、放射性アミノ酸の存在下でＰＣＲによって生成され、次いでｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写および翻訳されてタンパク質にされうる。次いで、抗体の放射性標識ＰＤＧＦ−Ｂ断片への結合が、免疫沈降およびゲル電気泳動によって判定される。ある特定のエピトープは、ファージ粒子（ファージライブラリー）または酵母（酵母ディスプレイ）の表面上にディスプレイされたランダムペプチド配列の大きなライブラリーを使用することによっても同定することができる。代わりに、重複ペプチド断片の定義されたライブラリーを、単純な結合アッセイで試験抗体への結合について試験することができる。追加の例では、抗原の突然変異誘発、ドメイン交換実験、およびアラニンスキャニング突然変異誘発を実施して、エピトープ結合に要求され、十分な、かつ／または必要な残基を同定することができる。例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発実験を、ＰＤＧＦ−Ｂポリペプチドの様々な残基がアラニンで置き換えられている突然変異体ＰＤＦＧ−Ｂを使用して実施することができる。抗体の突然変異体ＰＤＧＦ−Ｂへの結合を評価することによって、抗体結合に対する特定のＰＤＧＦ−Ｂ残基の重要性を評価する��とができる。
【０１８１】
ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を特徴付けるのに使用されうるさらに別の方法は、同じ抗原、すなわち、ＰＤＧＦ−Ｂ上の様々な断片に結合することが知られている他の抗体との競合アッセイを使用して、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するか否かを判定することである。競合アッセイは、当業者に周知である。
【０１８２】
さらに、所与の抗体／抗原結合対のエピトープを、様々な実験的な、およびコンピューターによるエピトープマッピング法を使用して異なる詳細度で定義し、特徴付けることができる。実験的方法としては、突然変異誘発、Ｘ線結晶学、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法、水素重水素交換質量分析法（ＨＸ−ＭＳ）、および様々な競合結合法がある。各方法は、ユニークな原理を利用するので、エピトープの記述は、それが判定された方法に密接に結び付けられる。したがって、所与の抗体／抗原対のエピトープは、使用されるエピトープマッピング法に応じて異なって定義されることになる。
【０１８３】
その最も詳細なレベルで、ＡｇとＡｂとの相互作用のエピトープは、Ａｇ−Ａｂ相互作用内に存在する原子接触を定義する空間的座標、および結合熱力学へのこれらの相対的寄与についての情報によって定義されうる。より低い詳細レベルで、エピトープは、ＡｇとＡｂとの間の原子接触を定義する空間的座標によって特徴付けることができる。さらにより低い詳細レベルで、エピトープは、具体的なクリテリウム、例えば、ＡｂおよびＡｇにおける原子間の距離によって定義される場合、エピトープが含むアミノ酸残基によって特徴付けることができる。さらにより低い詳細レベルで、エピトープは、機能によって、例えば、他のＡｂｓとの競合結合によって特徴付けることができる。エピトープは、別のアミノ酸で置換するとＡｂとＡｇとの相互作用の特性が変化することになるアミノ酸残基を含むとしてより一般的に定義することもできる（例えば、アラニンスキャニング）。
【０１８４】
Ａｂ、例えば、Ｆａｂ断片とそのＡｇとの間の複合体の空間的座標によって定義されるＸ線で導出される結晶構造との関連で、用語エピトープは、本明細書では、別段の指定のない限り、または文脈によって矛盾しない限り、Ａｂ内の重原子（すなわち非水素原子）から４Åの距離以内に重原子を有することを特徴とするＰＤＧＦ−Ｂ残基として特に定義される。
【０１８５】
エピトープの記述および定義は、使用されるエピトープマッピング法に応じて、異なる詳細度で得られるという事実から、同じＡｇについての異なるＡｂのエピトープの比較は、異なる詳細度で同様に行われうるということになる。
【０１８６】
アミノ酸レベルで記載される、例えば、Ｘ線構造から決定されるエピトープは、これらが同じセットのアミノ酸残基を含有する場合、同一であると言われる。エピトープは、少なくとも１つのアミノ酸がエピトープによって共有される場合、重複すると言われる。エピトープは、アミノ酸残基がエピトープによってまったく共有されない場合、別個（ユニーク）であると言われる。
【０１８７】
競合結合を特徴とするエピトープは、対応する抗体の結合が相互に排他的である、すなわち、一方の抗体の結合が、他方の抗体の同時のまたは連続した結合を除外する場合、重複していると言われる。エピトープは、抗原が両方の対応する抗体の結合に同時に適応することができる場合、別個（ユニーク）であると言われる。
【０１８８】
用語「パラトープ」の定義は、視点を逆転することによって「エピトープ」の上記定義から導出される。したがって、用語「パラトープ」は、抗原が特異的に結合する、すなわち、自己が抗原（ＰＤＧＦ−Ｂ）と物理的接触をする抗体上の範囲または領域を指す。
【０１８９】
抗体、例えば、Ｆａｂ断片または２つのＦａｂ断片とその抗原との間の複合体の空間的座標によって定義されるＸ線で導出される結晶構造との関連で、用語パラトープは、本明細書では、別段の指定のない限り、または文脈によって矛盾しない限り、ＰＤＧＦ−Ｂ内の重原子（すなわち非水素原子）から４Åの距離以内に重原子を有することを特徴とする抗原残基として特に定義される。
【０１９０】
所与の抗体／抗原対のエピトープおよびパラトープは、常法によって同定されうる。例えば、エピトープの一般的な場所は、本明細書に他で先により完全に記載したように、抗体の異なる断片またはバリアントＰＤＧＦ−Ｂポリペプチドに結合する能力を評価することによって決定されうる。抗体と接触するＰＤＧＦ−Ｂ内の特定のアミノ酸（エピトープ）およびＰＤＧＦ−Ｂと接触する抗体内の特定のアミノ酸（パラトープ）も、実施例に記載したものなどの常法を使用して決定することができる。例えば、抗体および標的分子を組み合わせることができ、抗体／抗原複合体を結晶化することができる。複合体の結晶構造を決定および使用して、抗体とその標的との相互作用の特異的部位を同定することができる。
【０１９１】
本明細書に開示するように、このような結晶構造解析を、ＭＯＲ８４５７抗体とＰＤＧＦ−ＢＢ二量体との相互作用について実施した。この解析を、実施例でより詳細に記載する。
【０１９２】
本発明による抗体のパラトープは、以下の通り定義されうる：前記抗体の軽鎖可変ドメインは、配列番号１の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいて残基Ｇ２８、Ｓ２９、Ｙ３０、Ｆ３１、Ｄ４９、Ｄ５０、Ｆ９０、Ｔ９１、Ｈ９２、Ｎ９３、Ｓ９４を含み、前記抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号２の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいて残基Ｙ５０、Ｌ５７、Ｙ５９、Ｙ６０、Ｄ６２、Ｗ１０２、Ｙ１０３、Ｇ１０４、Ｇ１０５を含む。
【０１９３】
本発明の抗体のパラトープは、配列番号１の配列に関して軽鎖可変ドメインの残基Ｎ６５、および配列番号２の配列に関して重鎖可変ドメインの残基Ｗ４７をさらに含みうる。
【０１９４】
したがって、本発明による抗体の軽鎖可変ドメインは、配列番号１の配列のアミノ酸残基：
−  ２８位に対応する位置におけるＧ
−  ２９位に対応する位置におけるＳ
−  ３０位に対応する位置におけるＹ
−  ３１位に対応する位置におけるＦ
−  ４９位に対応する位置におけるＤ
−  ５０位に対応する位置におけるＤ
−  ６５位に対応する位置におけるＮ
−  ９０位に対応する位置におけるＦ
−  ９１位に対応する位置におけるＴ
−  ９２位に対応する位置におけるＨ
−  ９３位に対応する位置におけるＮ、および
−  ９４位に対応する位置におけるＳ
を含み得、前記抗体の重鎖可変ドメインは、配列番号２のアミノ酸残基：
−  ５０位に対応する位置におけるＹ
−  ５７位に対応する位置におけるＬ
−  ５９位に対応する位置におけるＹ
−  ６０位に対応する位置におけるＹ
−  ６２位に対応する位置におけるＤ
−  １０２位に対応する位置におけるＷ
−  １０３位に対応する位置におけるＹ
−  １０４位に対応する位置におけるＧ、および
−  １０５位に対応する位置におけるＧ
を含みうる。
【０１９５】
本発明による抗体の軽鎖は、配列番号１；５の配列の６５位に対応する位置においてＮをさらに含み得、重鎖可変ドメインは、配列番号２の４７位に対応する位置においてＷをさらに含みうる。
【０１９６】
ＭＯＲ８４５７について、エピトープは、配列番号３３に示したＰＤＧＦ−Ｂの配列に関してアミノ酸Ｌｅｕ３８、Ｖａｌ３９、およびＴｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６から構成されることが判明した。
【０１９７】
したがって一実施形態では、本発明の抗体によって結合されるエピトープは、配列番号３３に示したＰＤＧＦ−Ｂの配列に関してＬｅｕ３８、Ｖａｌ３９、およびＴｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６からなるアミノ酸残基から選択される、少なくとも１個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも２個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも３個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも４個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも５個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも６個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも７個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも８個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも９個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１１個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも１２個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも１３個のアミノ酸残基、より好ましくは少なくとも１４個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも１５個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは少なくとも１６個のアミノ酸残基、さらにより好ましくは１７個すべてのアミノ酸残基を包含する。
【０１９８】
別の実施形態では、抗体は、配列番号１の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいて軽鎖可変ドメイン残基Ｇ２８、Ｓ２９、Ｙ３０、Ｆ３１、Ｄ４９、Ｄ５０、Ｆ９０、Ｔ９１、Ｈ９２、Ｎ９３、Ｓ９４、および配列番号２の配列に関してＫａｂａｔ番号付けに基づいて重鎖可変ドメイン残基Ｙ５０、Ｌ５７、Ｙ５９、Ｙ６０、Ｄ６２、Ｗ１０２、Ｙ１０３、Ｇ１０４、Ｇ１０５を包含するパラトープを含み、ここで抗体は、配列番号３３に示したＰＤＧＦ−Ｂの配列に関して番号付けられたＰＤＧＦ−Ｂ（エピトープ）の以下のアミノ酸残基Ｌｅｕ３８、Ｖａｌ３９、およびＴｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６を含むＰＤＧＦ−Ｂ上のエピトープに結合する。
【０１９９】
別の実施形態では、本発明の抗体は、パラトープのアミノ酸残基が、実施例７の表４に示したＰＤＧＦ−Ｂの対応するアミノ酸残基（エピトープ）と接触する（４Å以下）パラトープを含む。すなわち、抗体の重鎖可変ドメインについて、Ｔｒｐ４７は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８２と接触し、Ｌｅｕ５７は、ＰＤＧＦ−ＢのＩｌｅ７７と接触し、Ｔｙｒ５９は、ＰＤＧＦ−ＢのＩｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、およびＰｒｏ８２と接触し、Ｔｒｐ１０２は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｅｕ８、Ｖａｌ３９、Ｔｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｉｌｅ７５、およびＰｈｅ８４と接触し、Ｔｙｒ１０３は、ＰＤＧＦ−ＢのＴｒｐ４０、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、およびＰｈｅ８４と接触し、Ｇｌｙ１０４は、ＰＤＧＦ−ＢのＡｒｇ７３およびＰｈｅ８４と接触し、Ｇｌｙ１０５は、ＰＤＧＦ−ＢのＰｈｅ８４と接触し、抗体の重鎖可変ドメインについて、Ｇｌｙ２８は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８６と接触し、Ｓｅｒ２９は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８５およびＬｙｓ８６と接触し、Ｔｙｒ３０は、ＰＤＧＦ−ＢのＩｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６と接触し、Ｐｈｅ３１は、ＰＤＧＦ−ＢのＧｌｎ７１、Ａｒｇ７３、Ｐｈｅ８４、およびＬｙｓ８６と接触し、Ａｓｐ４９は、ＰＤＧＦ−ＢのＡｒｇ７３と接触し、Ａｓｐ５０は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８６と接触し、Ａｓｎ６５は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８６と接触し、Ｐｈｅ９０は、ＰＤＧＦ−ＢのＰｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、およびＰｈｅ８４と接触し、Ｔｈｒ９１は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８１およびＩｌｅ８３と接触し、Ｈｉｓ９２は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８１およびＩｌｅ８３と接触し、Ａｓｎ９３は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８１と接触し、Ｓｅｒ９４は、ＰＤＧＦ−ＢのＬｙｓ８１と接触し、ＰＤＧＦ−Ｂ接触残基の残基の番号付けは、配列番号３３の配列に関して示されている。
【０２００】
本発明の抗体は、２本のＰＤＧＦ−Ｂポリペプチド鎖のホモ二量体化によって形成される２つのエピトープのいずれかに結合することができる。したがって、本発明は、ＰＤＧＦ−ＢＢの１つのエピトープに結合する抗体を包含し、エピトープは、配列番号３３に示したＰＤＧＦ−Ｂの配列に関してアミノ酸Ｌｅｕ３８、Ｖａｌ３９、およびＴｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６を含むエピトープ１、ならびに配列番号３３に示したＰＤＧＦ−Ｂの配列に関してアミノ酸Ｔｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｇｌｕｅ７６、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６を含むエピトープ２から選択される。
【０２０１】
本発明の抗体は、両方のエピトープに同時に結合することができない抗体を包含する。したがって、一実施形態では、抗体は、エピトープ１およびエピトープ２の両方に結合することができるが、同時に結合することができない抗体を包含し、理由は、これらのエピトープがＰＤＧＦ−ＢＢホモ二量体分子上で互いにおよそ１９０Å離れて位置しているためである。
【０２０２】
本発明による抗体は、本明細書に特に開示されている本発明の抗体と同じＰＤＧＦ−Ｂのエピトープまたはドメインに結合しうる。例えば、本発明の他の未だ同定されていない抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂへのこれらの結合を、モノクローナル抗体ＭＯＲ８４５７、およびその生殖系列化バリアントのものと比較することによって、または未だ同定されていない抗体の機能をＭＯＲ８４５７のものと比較することによって同定することができる。このような同定の目的に関して使用されうる解析およびアッセイとしては、実施例６に記載のアッセイなどの対象とする抗体とＰＤＧＦＲβとの間および様々な抗ＰＤＧＦ−Ｂ抗体同士間のＰＤＧＦ−Ｂの結合の完了を評価するアッセイ、実施例７に記載の解析などのＰＤＧＦ−Ｂを有する抗体の結晶構造の解析、ヒトメサンギウム細胞増殖の阻害についての実施例８に記載のアッセイ、ならびに腎炎のラットモデルで抗体の効果を評価するために実施例９に記載したｉｎ  ｖｉｖｏモデルがある。
【０２０３】
一実施形態では、本発明の抗体は、本明細書に記載のＭＯＲ８４５７抗体と同じエピトープまたは領域に結合しうる。これらの抗体のＰＤＧＦ−Ｂへの結合は、本明細書に他でより詳細に記載されている。本発明の抗体は、ＭＯＲ５４５７抗体と同じＰＤＧＦ−Ｂ中のエピトープに結合する抗体でありうる。これは、上述したようにＰＤＧＦ−Ｂの特定のアミノ酸と接触しているものを含みうる。例えば、本発明の抗体は、それが配列番号３３に示したＰＤＧＦ−Ｂの配列に関してアミノ酸Ｌｅｕ３８、Ｖａｌ３９、およびＴｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６、または配列番号３３に示したＰＤＧＦ−Ｂの配列に関してアミノ酸Ｔｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｇｌｕ７６、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６と接触している様式でＰＤＧＦ−Ｂに結合しうる。
【０２０４】
本発明の抗体は、配列番号３３の配列に関してＬｅｕ３８、Ｖａｌ３９、およびＴｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｇｌｕｅ７６、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６からなる群から選択される１つまたは複数の残基を含むエピトープに結合することができる場合がある。
【０２０５】
本発明の抗体は、すべて配列番号３３に示したＰＤＧＦ−Ｂの配列に関して、残基Ｌｅｕ３８、Ｖａｌ３９、およびＴｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６を含むエピトープ、または残基Ｔｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｇｌｕ７６、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６を含むエピトープに結合することができる場合がある。
【０２０６】
本発明の抗体は、本明細書に記載したように、ＰＤＧＦ−Ｂへの結合を本発明の別の抗体と競合する能力を有しうる。例えば、本発明の抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂ、またはＭＯＲ８４５７抗体によって結合されるＰＤＧＦ−Ｂの適当な断片もしくはバリアントへの結合を本明細書に記載のＭＯＲ８４５７抗体と交差競合しうる。このような交差競合抗体は、標準的な結合アッセイで本発明の既知の抗体と交差競合するこれらの能力に基づいて同定することができる。例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムを使用することによるＳＰＲ、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはフローサイトメトリーを、交差競合を実証するのに使用することができる。このような交差競合は、２つの抗体が同一の、重複する、または類似のエピトープに結合することを示唆しうる。
【０２０７】
本発明の抗体は、Ｏｇａｗａら、２０１０、Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｒｅｓ．、４０：１１２８〜１１４１に記載のＡｂｙＤ３２６３より高い親和性でＰＤＧＦ−Ｂに結合することができる抗体を包含する。
【０２０８】
したがって、本発明の抗体は、試験抗体が標的分子上の結合部位について本発明の既知の抗体と競合することができるか否かを評価する結合アッセイを含む方法によって同定することができる。競合的結合アッセイを実施するための方法は、本明細書に開示されており、かつ／または当技術分野で周知である。例えば、これらは、抗体が標的分子に結合することができる条件を使用して本発明の既知の抗体を標的分子に結合することを伴う場合がある。次いで、抗体／標的複合体を試験抗体に曝露することができ、試験抗体が本発明の抗体を抗体／標的複合体から外すことができる程度を評価することができる。代替法は、試験抗体を、抗体結合を可能にする条件下で標的分子と接触させ、次いでその標的分子に結合することができる本発明の抗体を添加し、本発明の抗体が試験抗体を抗体／標的複合体から外すことができる程度を評価することを伴いうる。
【０２０９】
本発明の抗体の標的への結合を阻害する試験抗体の能力は、試験抗体が標的への結合を本発明の抗体と競合することができ、したがって試験抗体が本発明の既知の抗体と同じＰＤＧＦ−Ｂタンパク質上のエピトープまたは領域に結合することを実証する。このような方法で本発明の既知の抗体と競合すると同定された試験抗体も、本発明による潜在的な抗体である。試験抗体が本発明の既知の抗体と同じ領域でＰＤＧＦ−Ｂに結合することができ、本発明の既知の抗体と競合することができるという事実は、試験抗体が既知の抗体と同じ結合部位でリガンドとして作用することができ、したがって、既知の抗体の作用を模倣しうることを示唆する。これは、本明細書に記載の試験化合物の存在下でＰＤＧＦ−Ｂの活性を評価することによって確認されうる。
【０２１０】
本発明の既知の抗体は、ＭＯＲ８４５７などの本明細書に記載の抗体、または−ＰＤＧＦ−Ｂに結合する能力を保持する本明細書に記載のその任意のバリアントもしくは断片、例えば、生殖系列化抗体であって、生殖系列化ＶＨ（ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ；配列番号６）および生殖系列化ＶＬ（ＭＯＲ８４５７−ＬＧ−ＶＬ；配列番号４）を含む、その１つが本明細書に開示されている、生殖系列化抗体など、または修飾ＶＨ（ＭＯＲ８４５７−１５−ＶＨ；配列番号４４）および修飾ＶＬ（ＭＯＲ８４５７−１５−ＶＬ；配列番号３４）を含むＭＯＲ８４５７−１５などのバリアント、ならびにＭＯＲ８４５７−１５と同じ修飾ＶＨ（ＭＯＲ８４５７−１６−ＶＨまたはＭＯＲＥ８４５７−１５／１６−ＶＨとしても同定されている）；配列番号４４）および修飾ＶＬ（ＭＯＲ８４５７−１６−ＶＬ；配列番号３９）を含むＭＯＲ８４５７−１６でありうる。本発明の抗体は、本明細書に記載のＭＯＲ８４５７抗体、またはＰＤＧＦ−Ｂに結合する能力を保持する本明細書に記載のその任意のバリアントもしくは断片と同じエピトープに結合することができる。
【０２１１】
本発明の抗体は、実施例でさらに記載されているＭＯＲ８４５７エピトープと同一である、重複する、または類似であるエピトープに結合しうる。例えば、本発明の抗体は、ＭＯＲ８４５７の結合について上記に示したアミノ酸残基の５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、または１０個、または１２個、または１４個、または１６個以上に結合することができる。例えば、配列番号３３のポリペプチドと接触される場合、本発明の抗体は、このポリペプチドに結合し、アミノ酸Ｌｅｕ３８、Ｖａｌ３９、およびＴｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ａｒｇ５６、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６と、またはアミノ酸Ｔｒｐ４０、Ａｓｎ５４、Ｇｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｇｌｕ７６、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５、およびＬｙｓ８６と、またはこれらのアミノ酸のサブセット、例えば、これらのアミノ酸の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、もしくは少なくとも１７個などと接触することができる。
【０２１２】
本明細書に他で先に述べたように、特異的結合は、標的でない分子への抗体の結合を参照して評価されうる。この比較は、標的および別の分子に結合する抗体の能力を比較することによって行うことができる。この比較は、ＫＤまたはＫｉの評価で上述したように行うことができる。このような比較で使用される他の分子は、標的分子でない任意の分子でありうる。好ましくは、他の分子は、標的分子と同一でない。好ましくは、標的分子は、標的分子の断片でない。
【０２１３】
本発明の抗体のＫＤは、５０ｐＭ未満など、３０ｐＭ未満など、２５ｐＭ未満など、１５ｐＭ未満など、１３ｐＭ未満など、１２ｐＭ未満など、１０ｐＭ未満など、４ｐＭ未満など、２ｐＭ未満など、２ｐＭ未満など、および１５ｐＭから２ｐＭの間などの６９ｐＭ未満でありうる。
【０２１４】
特異的結合を判定するのに使用される他の分子は、標的に対して構造または機能において無関係でありうる。例えば、他の分子は、環境において無関係な材料または付随材料でありうる。
【０２１５】
特異的結合を判定するのに使用される他の分子は、標的分子、すなわち、ＰＤＧＦ−Ｂと同じｉｎ  ｖｉｖｏ経路に関与する別の分子でありうる。例えば、標的がＰＤＧＦ−Ｂである場合、比較のために使用される他の分子は、ＰＤＧＦ−Ｂ／ＰＤＧＦＲβシグナル伝達カスケードの一部を形成するタンパク質でありうる。本発明の抗体が別のこのような分子に対してＰＤＧＦ−ＢＢに対する特異性を有することを保証することによって、望まれないｉｎ  ｖｉｖｏ交差反応性が回避されうる。
【０２１６】
本発明の抗体は、標的分子に関係しているいくつかの分子に結合する能力を保持しうる。例えば、全長成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂは、標的として使用されうるが、抗体は、例えば、ヒトＰＤＧＦ−Ｂのプロペプチド形態、ヒトＰＤＧＦ−Ｂの断片もしくはトランケート型、リポタンパク質もしくは細胞に結合しているＰＤＧＦ−Ｂ、または他の哺乳動物ＰＤＧＦ−Ｂなどの他の種に由来するＰＤＧＦ−Ｂにも結合することができる場合がある。
【０２１７】
代わりに、本発明の抗体は、特定の標的分子に対する特異性を有しうる。例えば、これは、本明細書に記載の一標的分子に結合することができるが、本明細書に記載の異なる標的分子に結合することができない、または著しく低減された親和性で結合することができる。例えば、全長成熟ヒトＰＤＧＦ−Ｂは、標的として使用されうるが、その標的に結合する抗体は、例えば、他のＰＤＧＦ（ＰＤＧＦ−ＡもしくはＰＤＧＦ−ＣもしくはＰＤＧＦ−Ｄ）、または他の哺乳動物ＰＤＧＦ−Ｂなどの他の種に由来するＰＤＧＦ−Ｂに結合することができない場合があり、またはより低い親和性で結合しうる。
【０２１８】
本発明の抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂに結合することができ、そうすることでＰＤＧＦ−Ｂの活性を阻害しうる。
【０２１９】
用語「結合親和性」は、２種の分子、例えば、抗体、またはその抗原結合性断片と抗原との非共有結合性相互作用の強度の尺度として本明細書で使用される。用語「結合親和性」は、一価（内活性）を記述するのに使用される。
【０２２０】
上記定義に従って、異なる分子間相互作用に関連した結合親和性、例えば、所与の抗原についての異なる抗体の結合親和性の比較は、個々の抗体／抗原複合体のＫＤ値の比較によって比較されうる。
【０２２１】
同様に、相互作用の特異性は、対象とする相互作用、例えば、抗体と抗原との特定の相互作用のＫＤ値を、対象としない相互作用、例えば、ＰＤＧＦ−Ｂに結合しないと知られている対照抗体のＫＤ値を用いて判定および比較することによって評価することができる。
【０２２２】
一般に、ＰＤＧＦ−Ｂに関する抗体のＫＤは、他の非ＰＤＧＦ−Ｂ分子、例えば、環境内の無関係な材料または付随材料などに関するＫＤより２分の１、好ましくは５分の１、より好ましくは１０分の１低いことになる。より好ましくは、ＫＤは、１００分の１未満、または２００分の１未満などの５０分の１未満、さらにより好ましくは１，０００分の１未満、または１０，０００分の１未満などの５００分の１未満となる。
【０２２３】
解離定数の値は、周知の方法によって直接判定することができ、例えば、Ｃａｃｅｃｉら（１９８４、Ｂｙｔｅ、９：３４０〜３６２）に示されたものなどの方法によって複合混合物についてさえ計算することができる。例えば、ＫＤは、Ｗｏｎｇ＆Ｌｏｈｍａｎ（１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：５４２８〜５４３２）によって開示されたものなどの二重フィルターニトロセルロースフィルター結合アッセイを使用して確立されうる。標的抗原に対する抗体などのリガンドの結合能力を評価するための他の標準アッセイは、当技術分野で公知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、ＲＩＡ、およびフローサイトメトリー分析、および本明細書に他で例示されている他のアッセイを含む。抗体の結合カイネティクスおよび結合親和性はまた、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）システムを使用することによる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの当技術分野で公知の標準アッセイによって評価することができる。
【０２２４】
競合的結合アッセイを行うことができ、このアッセイでは、抗体の抗原への結合が、標的の、その標的の別のリガンド、例えば、別の抗体または標的に他の方法で結合する可溶性受容体（例えば、ＰＤＧＦＲβ−ＩｇＧ１）などによる結合と比較される。５０％阻害が起こる濃度は、Ｋｉとして公知である。理想的条件下で、ＫｉはＫＤと等価である。Ｋｉ値は、決してＫＤ未満にならず、したがってＫｉの測定は、好都合なことには、ＫＤの上限をもたらすために代用されうる。
【０２２５】
本発明の抗体は、１×１０−７Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、または１×１０−９Ｍ以下、または１×１０−１０Ｍ以下、１×１０−１１Ｍ以下、または１×１０−１２Ｍ以下、または１×１０−１３Ｍ以下、１×１０−１４Ｍ以下、または１×１０−１５Ｍ以下のＰＤＧＦ−ＢについてのＫＤを有しうる。
【０２２６】
その標的に特異的に結合する抗体は、高親和性でその標的に結合することができ、すなわち、上記に論じたように低ＫＤを呈し、より低い親和性で他の非標的分子に結合しうる。例えば、抗体は、１×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０−２Ｍ以上のＫＤで非標的分子に結合しうる。本発明の抗体は、好ましくは、別の非ＰＤＧＦ−Ｂ分子への結合についてのその親和性より、少なくとも２倍、１０倍、５０倍、１００倍  ２００倍、５００倍、１，０００倍、もしくは１０，０００倍、またはそれ以上大きい親和性でその標的に結合することができる。
【０２２７】
他の実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体のＰＤＧＦ−Ｂへの結合親和性（ＫＤ）は、約０．００１〜約２５０ｎＭである。いくつかの実施形態では、結合親和性は、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、または約１ｐＭのいずれかである。いくつかの実施形態では、結合親和性は、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約２ｐＭのいずれか未満である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体のＫＤは、約７０ｐＭ〜約１ｐＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ヒトＰＤＧＦ−ＢのＰＤＧＦ−Ｂ抗体のＫＤは、約３０ｐＭ〜約２ｐＭの範囲である。いくつかの実施形態では、本発明のＰＤＧＤ−Ｂ抗体の結合親和性は、約６９ｐＭ、約２８ｐＭ、約２５ｐＭ、約１５ｐＭ、約１３ｐＭ、約１０ｐＭ、約４ｐＭ、および約２ｐＭである。
【０２２８】
一実施形態では、本発明の抗体は、Ｏｇａｗａら、２０１０、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓ．、４０：１１２８〜１１４１に記載の抗体ＡｂｙＤ３２６３でない。
【０２２９】
一実施形態では、本発明の抗体は、ＡｂｙＤ３２６３の結合親和性（ＫＤ）未満のＫＤ、すなわち、１３ｎＭでヒトＰＤＧＦ−ＢＢに結合する。
【０２３０】
本発明は、以下のいずれか、またはＭＯＲ８４５７に由来する軽鎖配列もしくはその部分および重鎖もしくはその部分を有する抗体を含む組成物（医薬組成物を含む）を提供する。
【０２３１】
本発明によるポリペプチドまたは抗体の「断片」または「部分」は、トランケーションによって、例えば、ポリペプチドのＮおよび／またはＣ末端から１つまたは複数のアミノ酸を除去することによって作製されうる。最大１０、最大２０、最大３０、最大４０、またはそれ以上のアミノ酸が、Ｎおよび／またはＣ末端からこのように除去されうる。断片は、１つまたは複数の内部欠失によっても生成されうる。
【０２３２】
本発明の抗体は、ＭＯＲ８４５７抗体の断片またはそのバリアントであり得、またはそれを含みうる。本発明の抗体は、この抗体の抗原結合性部分またはそのバリアントであり得、またはそれを含みうる。例えば、本発明の抗体は、この抗体のＦａｂ断片もしくはそのバリアントであり得、またはこの抗体に由来する単鎖抗体もしくはそのバリアントでありうる。
【０２３３】
ＭＯＲ８４５７抗体の軽（ＭＯＲ８４５７−ＶＬ）鎖および重（ＭＯＲ８４５７−ＶＨ）鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１および２で提供されている。生殖系列化ＭＯＲ８４５７抗体のＶＬおよびＶＨ可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４（ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ）および６（ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ）で与えられている。全長生殖系列化軽鎖のアミノ酸配列（ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＬＣ）は、配列番号１６で提供されており、定常ドメイン内にエフェクター機能三重突然変異をさらに含む全長生殖系列化重鎖のアミノ酸配列（ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ｈＩｇＧ１−３ｍ−ＨＣ）は、配列番号１４で提供されている。さらに、バリアント抗体ＭＯＲ８４５７−１５およびＭＯＲ８４５７−１６のアミノ酸配列が提供されている。ＭＯＲ８４５７−１５のＶＬおよびＶＨのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３４（ＭＯＲ８４５７−１５−ＶＬ）および４４（ＭＯＲ８４５７−１５−ＶＨ）で与えられている。全長ＭＯＲ８４５７−１５軽鎖のアミノ酸配列（ＭＯＲ８４５７−１５−ＬＣ）は、配列番号３７で提供されており、定常ドメイン内にエフェクター機能三重突然変異をさらに含む全長ＭＯＲ８４５７−１５重鎖のアミノ酸配列（ＭＯＲ８４５７−１５−ＨＣ）は、配列番号４６で提供されている。ＭＯＲ８４５７−１６のＶＬおよびＶＨのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３９（ＭＯＲ８４５７−１６−ＶＬ）および４４（ＭＯＲ８４５７−１６−ＶＨ）で与えられている。全長ＭＯＲ８４５７−１６軽鎖のアミノ酸配列（ＭＯＲ８４５７−１６−ＬＣ）は、配列番号４２で提供されており、定常ドメイン内にエフェクター機能三重突然変異をさらに含む全長ＭＯＲ８４５７−１６重鎖のアミノ酸配列（ＭＯＲ８４５７−１６−ＨＣ）は、配列番号４６で提供されている。したがって、ＭＯＲ８４５７−１５およびＭＯＲ８４５７−１６は、配列番号４４で示された同じＶＨアミノ酸配列を共有することが理解される。
【０２３４】
本発明の抗体は、配列番号１もしくは配列番号４のＶＬアミノ酸配列、またはその断片もしくはバリアントを含みうる。本発明の抗体は、配列番号２もしくは配列番号６のＶＨアミノ酸配列またはその断片もしくはバリアントを含みうる。本発明の抗体は、（ａ）配列番号１のＶＬアミノ酸配列もしくはその断片もしくはバリアント、および配列番号２のＶＨアミノ酸配列もしくはその断片もしくはバリアント、または（ｂ）ＶＬ配列番号１のＶＬアミノ酸配列もしくはその断片もしくはバリアント、および配列番号６のアミノ酸配列ＶＨもしくはその断片もしくはバリアント、または（ｃ）配列番号４のＶＬアミノ酸配列もしくはその断片もしくはバリアント、および配列番号２のアミノ酸配列ＶＨもしくはその断片もしくはバリアント、または（ｄ）配列番号４のＶＬアミノ酸配列もしくはその断片もしくはバリアント、および配列番号６のアミノ酸配列ＶＨもしくはその断片もしくはバリアントの両方を含みうる
【０２３５】
本発明の抗体はまた、配列番号３４もしくは配列番号３９のＶＬアミノ酸配列、またはその断片もしくはバリアントを含みうる。本発明の抗体は、配列番号４４のＶＨアミノ酸配列またはその断片もしくはバリアントを含みうる。本発明の抗体は、（ａ）配列番号３４のＶＬアミノ酸配列もしくはその断片もしくはバリアント、および配列番号４４のＶＨアミノ酸配列もしくはその断片もしくはバリアント、または（ｂ）配列番号３９のＶＬアミノ酸配列もしくはその断片もしくはバリアント、および配列番号４４のアミノ酸配列ＶＨもしくはその断片もしくはバリアントの両方を含みうる
【０２３６】
一態様では、抗体は、配列番号１、配列番号４、配列番号３４、または配列番号３９の配列を含むＶＬを含む。別の態様では、抗体は、配列番号２、配列番号６、または配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＨを含む。別の態様では、抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号３４、配列番号３９、および配列番号４４の配列のバリアントを含み、このようなバリアントは、保存的置換および非保存的置換の両方、欠失、ならびに／または付加を含むことができ、一般に、本明細書に開示の特定配列のいずれかと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有するペプチドを含む。
【０２３７】
例えば、一態様では、本開示は、配列番号２、配列番号６、もしくは配列番号４４に示したＶＨ鎖アミノ酸配列を含む単離抗体、もしくはその抗原結合性部分、またはそのバリアントを提供する。一態様では、前記抗体バリアントは、配列番号２、配列番号６、または配列番号４４に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個の保存的もしくは非保存的置換、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個の付加および／もしくは欠失を含む。さらなる態様では、前記バリアントは、配列番号２、配列番号６、または配列番号４４と少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有し、前記抗体、または抗原結合部分は、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する。
【０２３８】
さらなる態様では、本開示は、配列番号１、配列番号４、配列番号３４、もしくは配列番号３９に示したＶＬ鎖アミノ酸配列を含む単離抗体、もしくはその抗原結合性部分、またはそのバリアントを提供する。一態様では、前記抗体バリアントは、配列番号１、配列番号４、配列番号３４、または配列番号３９に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個の保存的もしくは非保存的置換、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個の付加および／もしくは欠失を含む。さらなる態様では、前記バリアントは、配列番号１、配列番号４、配列番号３４、または配列番号３９と少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有し、前記抗体、または抗原結合部分は、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する。
【０２３９】
本発明の抗体は、配列番号２、配列番号６、または配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＨを含む重鎖を含み得、この抗体は、重鎖定常ドメインをさらに含む。本明細書に他でより完全に示されているように、抗体重鎖定常ドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ定常領域から選択されうるが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域である。ＩｇＧ定常領域配列は、異なる個体の中で存在することが知られている様々な対立遺伝子またはアロタイプのいずれか、例えば、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）、およびＧｍ（１７）などでありうる。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子について、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結されうる。ＣＨ１重鎖定常領域は、重鎖遺伝子のいずれかに由来しうる。
【０２４０】
一態様では、抗体は、配列番号２、配列番号６、または配列番号４４のアミノ酸配列を含むＶＨから選択されるＶＨを含み、配列番号１９のアミノ酸配列を含むヒト野生型ＩｇＧ１定常ドメインをさらに含む重鎖を含みうる。別の態様では、ＩｇＧ１定常ドメインは、Ｆｃエフェクター機能を減少させ、または無効にする三重突然変異を含む（ｈＩｇＧ１−３ｍ；配列番号２１）。一態様では、本発明の抗体は、配列番号６の配列を含む生殖系列化ＶＨを含み、ヒトＩｇＧ１−３ｍ定常ドメインをさらに含む重鎖を含み得、その結果、全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号１４（ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ｈＩｇＧ１−３ｍ−ＨＣ）を含む。別の態様では、本発明の抗体は、配列番号４４の配列を含み、ヒトＩｇＧ１−３ｍ定常ドメインをさらに含む重鎖を含み得、その結果、全長重鎖アミノ酸配列は、配列番号４６（ＭＯＲ８４５７−１５−ＨＣまたはＭＯＲ８４５７−１６−ＨＣ）を含む。
【０２４１】
さらなる態様では、本開示は、配列番号１４に示したアミノ酸配列を含む全長重鎖を含む単離抗体もしくはその抗原結合性部分、またはそのバリアントを提供する。一態様では、前記抗体バリアントは、配列番号１４に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個の保存的もしくは非保存的置換、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個の付加および／もしくは欠失を含む。さらなる態様では、前記バリアントは、配列番号１４と少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有し、前記抗体、または抗原結合部分は、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する。
【０２４２】
本発明の抗体は、配列番号１、配列番号４、配列番号３４、または配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬを含む軽鎖を含み得、この抗体は、軽鎖定常ドメインをさらに含む。本明細書に他でより完全に示されているように、抗体軽鎖定常ドメインは、ＣκまたはＣλ定常領域から選択することができ、好ましくはＣλ定常領域である。
【０２４３】
一態様では、抗体は、配列番号１、配列番号４、配列番号３４、または配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＬから選択されるＶＬを含み、配列番号２３のアミノ酸配列を含むヒト野生型Ｃλ定常ドメインをさらに含む軽鎖を含みうる。別の態様では、抗体は、元のＶＬ配列（配列番号１）を含み得、配列ＴＶＬをＩＫＲと置換する不慮の三重突然変異を含むヒトＣλ定常ドメインをさらに含みうる（配列番号１７；ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ＬＣ）。一態様では、本発明の抗体は、配列番号４の配列を含む生殖系列化ＶＬを含み、ヒト野生型Ｃλ定常ドメイン（配列番号２３）をさらに含む軽鎖を含み得、その結果、全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号１６（ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＬＣ）を含む。別の態様では、本発明の抗体は、配列番号３４または配列番号３９の配列を含むバリアントＶＬを含む軽鎖を含み得、その結果、全長軽鎖アミノ酸配列は、配列番号３７（ＭＯＲ８４５７−１５−ＬＣ）または配列番号４２（ＭＯＲ８４５７−１６−ＬＣ）を含む。
【０２４４】
さらなる態様では、本開示は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号３７、もしくは配列番号４２に示したアミノ酸配列を含む全長軽鎖を含む単離抗体、もしくはその抗原結合性部分、またはそのバリアントを提供する。一態様では、前記抗体バリアントは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号３７、または配列番号４２に対して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個の保存的もしくは非保存的置換、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個の付加および／もしくは欠失を含む。さらなる態様では、前記バリアントは、配列番号１６、配列番号１７、配列番号３７、または配列番号４２と少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有し、前記抗体、または抗原結合部分は、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する。
【０２４５】
本発明は、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３）として２０１２年１１月６日にＡＴＣＣに寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされる重鎖可変ドメインアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含む抗体、またはその抗原結合性断片を包含する。一態様では、本発明の抗体、またはその抗原結合性断片は、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３）としてＡＴＣＣに寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされるＶＨドメインアミノ酸配列を含む。
【０２４６】
本発明は、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３）として２０１２年１１月６日にＡＴＣＣに寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされる重鎖可変ドメインアミノ酸配列の２つのＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む抗体、またはその抗原結合性断片を包含する。一態様では、本発明の抗体、またはその抗原結合性断片は、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３）としてＡＴＣＣに寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされるＶＨドメインアミノ酸配列を含み、ここでＣＤＲ−Ｈ１は、存在する必要はない。
【０２４７】
本発明は、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０２）として２０１２年１１月６日にＡＴＣＣに寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされる軽鎖可変ドメインアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含む抗体、またはその抗原結合性断片を包含する。一態様では、本発明の抗体、またはその抗原結合性断片は、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０２）としてＡＴＣＣに寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされるＶＬドメインアミノ酸配列を含む。
【０２４８】
本発明は、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０２）として２０１２年１１月６日にＡＴＣＣに寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされる軽鎖可変ドメインアミノ酸配列の３つのＣＤＲ、およびＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３）としてＡＴＣＣに寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされる重鎖可変ドメインアミノ酸配列の３つのＣＤＲを含む抗体、またはその抗原結合性断片を包含する。
【０２４９】
本発明は、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０２）として２０１２年１１月６日にＡＴＣＣに寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされる軽鎖可変ドメインアミノ酸配列の３つのＣＤＲ、およびＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３）としてＡＴＣＣに寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされる重鎖可変ドメインアミノ酸配列の２つのＣＤＲ、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む抗体、またはその抗原結合性断片を包含する。
【０２５０】
本発明は、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０２）として２０１２年１１月６日にＡＴＣＣに寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされる軽鎖可変ドメインアミノ酸配列、およびＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３）としてＡＴＣＣに寄託されたベクターのポリヌクレオチドインサートによってコードされる重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体、またはその抗原結合性断片を包含する。
【０２５１】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬコードＤＮＡを軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域でありうる。カッパ定常領域は、異なる個体の中に存在することが知られている様々な対立遺伝子のいずれか、例えば、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）、およびＩｎｖ（３）などでありうる。ラムダ定常領域は、３種のラムダ遺伝子のいずれかに由来しうる。
【０２５２】
本発明の抗体は、図１に示したＶＬまたはＶＨアミノ酸配列の１つの断片を含みうる。例えば、本発明の抗体は、配列番号４、６、３４、４０、または４４に由来する少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１５、少なくとも１８、少なくとも２０、または少なくとも２５の連続したアミノ酸の断片を含みうる。このような断片は、好ましくは、ＰＤＧＦ−Ｂに結合する能力などの上記に論じた機能の１つまたは複数を保持することになる。
【０２５３】
これらのＶＨまたはＶＬ配列のいずれかの適当な断片またはバリアントは、ＰＤＧＦ−Ｂに結合する能力を保持することになる。これは、好ましくは、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的結合する能力を保持することになる。これは、好ましくは、これが由来する抗体（ＭＯＲ８４５７）と同じまたは類似のＰＤＧＦ−Ｂ分子のエピトープまたは領域に特異的に結合する能力を保持することになる。これは、好ましくは、これが由来する抗体の１つまたは複数の追加の機能、例えば、とりわけ、その受容体へのＰＤＧＦ−Ｂの結合を阻害する能力、ＰＤＧＦＲシグナル伝達を阻害する活性または能力、細胞増殖のＰＤＧＦ−Ｂ誘導を阻害する能力などを保持することになる。
【０２５４】
適当な断片またはバリアントＶＬ配列は、好ましくは、配列番号１または配列番号４のアミノ酸配列に基づいてＧ２８位、Ｓ２９位、Ｙ３０位、Ｆ３１位、Ｄ４９位、Ｄ５０位、Ｆ９０位、Ｔ９１位、Ｈ９２位、Ｎ９３位、Ｓ９４位のアミノ酸を保持することになる。適当な断片またはバリアントＶＨ配列は、好ましくは、配列番号２または配列番号６の配列に関してＹ５０位、Ｌ５７位、Ｙ５９位、Ｙ６０位、Ｄ６２位、Ｗ１０２位、Ｙ１０３位、Ｇ１０４位、Ｇ１０５位のアミノ酸を保持することになる。表２および３に同定されているように、これらは、ＭＯＲ８４５７がＰＤＧＦ−ＢＢに結合しているとき、ＰＤＧＦ−Ｂの重原子から４Åの距離内に重原子を有するＭＯＲ８４５７軽および重鎖可変ドメイン配列内の残基である。
【０２５５】
本発明の抗体は、配列番号１、２、４、６、３４、３９、または４４内からのＣＤＲ領域などの本明細書に同定された特定の抗体に由来するＣＤＲ領域を含みうる。このような抗体は、好ましくは、本明細書に記載のＰＤＧＦ−Ｂに結合する能力を保持することになる。
【０２５６】
例えば、図１に示したように、Ｋａｂａｔ定義を使用して、ＭＯＲ８４５７の軽鎖内のＣＤＲ配列は、アミノ酸ＳＧＤＳＬＧＳＹＦＶＨ（ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ１；配列番号１０）、ＤＤＳＮＲＰＳ（ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ２；配列番号１１）、またはＳＡＦＴＨＮＳＤＶ（ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ３；配列番号１２）として同定されうる。さらに、バリアント抗体ＭＯＲ８４５７−１５の軽鎖内のＣＤＲ配列は、アミノ酸ＳＧＤＳＬＧＳＹＦＶＨ（ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ１；配列番号１０）、ＤＤＳＮＲＰＳ（ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ２；配列番号１１）、またはＳＡＦＴＨＮＳＮＶ（ＭＯＲ８４５７−１５  ＣＤＲ−Ｌ３；配列番号３６）として同定されうる。さらに、バリアント抗体ＭＯＲ８４５７−１６の軽鎖内のＣＤＲ配列は、アミノ酸ＳＧＤＳＬＧＳＹＦＶＨ（ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ１；配列番号１０）、ＤＤＳＫＲＰＳ（ＭＯＲ８４５７−１６  ＣＤＲ−Ｌ２；配列番号４１）、またはＳＡＦＴＨＮＳＤＶ（ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ３；配列番号１２）として同定されうる。ＭＯＲ８４５７の重鎖内のＣＤＲ配列は、アミノ酸ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳ（ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｈ１；配列番号７）、ＹＩＳＤＤＧＳＬＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｈ２；配列番号８）、またはＨＰＹＷＹＧＧＱＬＤＬ（ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｈ３；配列番号９）として同定されうる。本発明の抗体は、図１Ｃ〜Ｆおよび図１Ｉ〜Ｋに示したＣＤＲ配列の１つまたは複数を含みうる。例えば、本発明の抗体は、配列番号７、８、および９に示したアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つを含みうる。本発明の抗体は、配列番号１０、１１、１２、３６、および４１に示したアミノ酸配列の１つ、２つ、または３つを代替としてまたは追加的に含みうる。本発明の抗体は、配列番号７〜１２、または配列番号７、８、９、１０、１２、４１、または配列番号７、８、９、１０、１１、３６に示した６つすべてのアミノ酸配列を含みうる。
【０２５７】
一態様では、本開示は、配列番号７〜１２、配列番号７、８、９、１０、１２、４１、もしくは配列番号７、８、９、１０、１１、３６の配列を含む６つのＣＤＲを含む単離抗体、もしくはその抗原結合性部分、またはそのバリアントを提供する。一態様では、前記抗体バリアントは、配列番号７〜１２、配列番号７、８、９、１０、１２、４１、または配列番号７、８、９、１０、１１、３６の配列を含むＣＤＲに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個の保存的もしくは非保存的置換、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個の付加および／もしくは欠失を含む。さらなる態様では、前記バリアントは、配列番号７〜１２、配列番号７、８、９、１０、１２、４１、または配列番号７、８、９、１０、１１、３６の配列と少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有し、前記抗体、または抗原結合部分は、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する。
【０２５８】
本発明の抗体は、ＭＯＲ８４５７のＣＤＲ配列またはそのバリアントの５つを代替としてまたは追加的に含みうる。すなわち、本明細書に他で開示した結晶構造データ（実施例７）は、ＣＤＲ−Ｈ１は、ＰＤＧＦ−Ｂと接触しない（すなわち、配列番号７の配列の重原子のいずれもＰＤＧＦ−Ｂの残基の重原子の４Å以内にない）ことを実証し、ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｈ１は、ＰＤＧＦ−Ｂへの結合に寄与しない場合があることを示唆する。したがって、本発明の抗体は、例えば、５つのＣＤＲドメインの以下の組合せを含みうる：ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号９）、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号１０）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号１１）およびＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１２）；またはＣＤＲ−Ｈ２（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号９）、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号１０）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号１１）およびＣＤＲ−Ｌ３（配列番号３６）；またはＣＤＲ−Ｈ２（配列番号８）、ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号９）、ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号１０）、ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号４１）およびＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１２）。
【０２５９】
一態様では、本開示は、配列番号８〜１２、配列番号８、９、１０、１１、および３６、配列番号８、９、１０、４１、および１２の配列を含む５つのＣＤＲを含む単離抗体、もしくはその抗原結合性部分、またはそのバリアントを提供する。一態様では、前記抗体バリアントは、配列番号８〜１２、３６、および４１の配列を含むＣＤＲに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個の保存的もしくは非保存的置換、ならびに／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５個の付加および／もしくは欠失を含む。さらなる態様では、前記バリアントは、配列番号８〜１２の配列と少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有し、前記抗体、または抗原結合部分は、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的に結合する。
【０２６０】
本発明の抗体は、接触残基でないアミノ酸残基が置換されていてもよいＣＤＲ配列を含みうる。すなわち、抗体が以下のＣＤＲのいずれかを含む場合、下線が引かれていないアミノ酸残基は、ＰＤＧＦ−Ｂ上のエピトープ（１または２）と接触していないので、置換されていても欠失してもよい：
・ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｈ１    ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳ（配列番号７）
・ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｈ２    ＹＩＳＤＤＧＳＬＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号８）
・ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｈ３    ＨＰＹＷＹＧＧＱＬＤＬ（配列番号９）
・ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ１    ＳＧＤＳＬＧＳＹＦＶＨ（配列番号１０）
・ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ２    ＤＤＳＮＲＰＳ（配列番号１１）
・ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ３    ＳＡＦＴＨＮＳＤＶ（配列番号１２）
【０２６１】
本発明による抗体の重鎖は、ＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳのＣＤＲ−Ｈ１アミノ酸配列（配列番号７）を含むことができ、これらのアミノ酸の少なくとも１つは、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい。好ましくは、これらのアミノ酸のすべてが置換されていてもよい。
【０２６２】
本発明による抗体の重鎖は、ＹＩＳＤＤＧＳＬＫＹＹＡＤＳＶＫＧのＣＤＲ−Ｈ２アミノ酸配列（配列番号８）を含むことができ、下線が引かれていない少なくとも１つの残基は（下線が引かれている残基がＹ５０、Ｌ５７、Ｙ５９、Ｙ６０、Ｄ６２である場合）、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい。
【０２６３】
本発明による抗体の重鎖は、ＨＰＹＷＹＧＧＱＬＤＬのＣＤＲ−Ｈ３アミノ酸配列（配列番号９）を含むことができ、下線が引かれていない少なくとも１つの残基は（下線が引かれている残基がＷ１０２、Ｙ１０３、Ｇ１０４、Ｇ１０５である場合）、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい。
【０２６４】
本発明による抗体の軽鎖は、ＳＧＤＳＬＧＳＹＦＶＨのＣＤＲ−Ｌ１アミノ酸配列（配列番号１０）を含むことができ、下線が引かれていない少なくとも１つの残基は（下線が引かれている残基がＧ２８、Ｓ２９、Ｙ３０、Ｆ３１である場合）、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい。
【０２６５】
本発明による抗体の軽鎖は、ＤＤＳＮＲＰＳのＣＤＲ−Ｌ２アミノ酸配列（配列番号１１）を含むことができ、下線が引かれていない少なくとも１つの残基は（下線が引かれている残基がＤ４９、Ｄ５０である場合）、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい。
【０２６６】
本発明による抗体の軽鎖は、ＳＡＦＴＨＮＳＤＶのＣＤＲ−Ｌ３アミノ酸配列（配列番号１２）を含むことができ、下線が引かれていない少なくとも１つの残基は（下線が引かれている残基がＦ９０、Ｔ９１、Ｈ９２、Ｎ９３、Ｓ９４である場合）、異なるアミノ酸によって置換されていてもよい。
【０２６７】
バリアント抗体は、上記に論じた特定配列および断片から１、２、３、４、５、最大１０、最大２０、最大３０、またはそれ以上のアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入を含みうる。「欠失」バリアントは、個々のアミノ酸の欠失、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸などのアミノ酸の小さい群の欠失、または特定のアミノ酸ドメインもしくは他の特徴の欠失などのより大きいアミノ酸領域の欠失を含みうる。「挿入」バリアントは、個々のアミノ酸の挿入、２、３、４、もしくは５個のアミノ酸などのアミノ酸の小さい群の挿入、または特定のアミノ酸ドメインもしくは他の特徴の挿入などのより大きいアミノ酸領域の挿入を含みうる。「置換」バリアントは、好ましくは、１つまたは複数のアミノ酸の同じ数のアミノ酸との置き換えを伴い、保存的アミノ酸置換をもたらす。例えば、アミノ酸は、類似の性質を有する代替アミノ酸、例えば、別の塩基性アミノ酸、別の酸性アミノ酸、別の中性アミノ酸、別の荷電アミノ酸、別の親水性アミノ酸、別の疎水性アミノ酸、別の極性アミノ酸、別の芳香族アミノ酸、または別の脂肪族アミノ酸と置換されていてもよい。適当な置換基を選択するのに使用されうる２０種の主要アミノ酸のいくつかの性質は、以下の通りである。
【０２６８】
置換バリアントは、除去された抗体分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基およびその場所に挿入された異なる残基を有する。置換突然変異誘発にとって最も対象とする部位は、超可変領域を含むが、フレームワーク変更も企図されている。保存的置換は、「保存的置換」の表題下で表３に示されている。このような置換が生物活性の変化をもたらす場合、以下に示した、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載される「例示的な置換」と命名されたより実質的な変化を導入することができ、生成物をスクリーニングすることができる。
【０２６９】
【表１】
2015536339.tif 000003
【０２７０】
抗体の生物学的性質の実質的な修飾は、（ａ）例えば、β−シートもしくはヘリックスコンホメーションとしての置換の範囲内のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持することに対するこれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖の性質に基づいていくつかの群に分類される：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）電荷を有さない極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性（負に帯電した）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性（正に帯電した）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【０２７１】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することによって行われる。
【０２７２】
例えば、行うことができる一タイプの置換は、化学反応性でありうる抗体中の１つまたは複数のシステインを、別の残基、例えば、限定することなく、アラニンまたはセリンなどに変更することである。例えば、非カノニカルなシステインの置換が存在しうる。置換は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域内または抗体の定常領域内で行われうる。いくつかの実施形態では、システインは、カノニカルである。抗体の適切なコンホメーションの維持に関与しない任意のシステイン残基も、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止するために、一般にセリンと置換することができる。反対に、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合、システイン結合を抗体に加えてその安定性を改善することができる。
【０２７３】
本発明は、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体を生成、選択、および作製する方法も提供する。本発明の抗体は、当技術分野で公知の手順によって作製されうる。いくつかの実施形態では、抗体は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して組換えで作製し、発現させることができる。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、抗体は、ファージディスプレイ技術によって調製および選択してもよい。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号、同第５，５８０，７１７号、同第５，７３３，７４３号、および同第６，２６５，１５０号、ならびにＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１２：４３３〜４５５、１９９４を参照。代わりに、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５３、１９９０）を使用して、非免疫ドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト抗体および抗体断片を産生することができる。この技法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、糸状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子、例えば、Ｍ１３またはｆｄなどにインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上の機能的な抗体断片としてディスプレイされる。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体の機能的性質に基づく選択も、これらの性質を呈する抗体をコードする遺伝子の選択をもたらす。したがって、ファージは、Ｂ細胞の性質のいくつかを模倣する。ファージディスプレイは、様々なフォーマットで実施されうる。概説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、３：５６４〜５７１、１９９３を参照。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかのソースをファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４〜６２８、１９９１は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さいランダムコンビナトリアルライブラリーから抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。ヒトドナーに由来するＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を、Ｍａｒｋら、１９９１、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１〜５９７、またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、１９９３、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１２：７２５〜７３４によって記載された技法に本質的に従って単離することができる。天然の免疫応答では、抗体遺伝子は、高い割合で突然変異を蓄積する（体細胞超変異）。導入される変化の一部は、より高い親和性を付与し、高親和性表面免疫グロブリンをディスプレイするＢ細胞は、後続の抗原チャレンジ中に優先的に複製および分化される。この自然過程は、「鎖シャッフリング」として公知の技法を使用することによって模倣することができる。（Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．、１０：７７９〜７８３）。この方法では、ファージディスプレイによって得られる「一次」ヒト抗体の親和性は、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を非免疫化ドナーから得られるＶドメイン遺伝子の天然に存在するバリアントのレパートリー（レパートリー）と順次置き換えることによって改善されうる。この技法は、ｐＭ〜ｎＭ範囲の親和性を有する抗体および抗体断片の生成を可能にする。非常に大きいファージ抗体レパートリー（「マザーオブオールライブラリー」としても公知）を作製するためのストラテジー��、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．、２１：２２６５〜２２６６、１９９３によって記載されている。遺伝子シャフリングを使用して、げっ歯類抗体からヒト抗体を導出することもでき、この場合、ヒト抗体は、出発げっ歯類抗体と類似の親和性および特異性を有する。「エピトープ刷り込み」とも呼ばれるこの方法によれば、ファージディスプレイ技法によって得られるげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子は、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置き換えられ、げっ歯類−ヒトキメラが創製される。抗原についての選択は、機能的な抗原結合部位を回復することができるヒト可変領域の単離をもたらし、すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配する（刷り込む）。残りのげっ歯類Ｖドメインを置き換えるためにこのプロセスが繰り返されると、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０６２１３号を参照）。ＣＤＲ移植によるげっ歯類抗体の伝統的なヒト化と異なり、この技法は、げっ歯類起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基をまったく有さない完全ヒト抗体をもたらす。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して作製することができる。ヒトを含めた任意の哺乳動物対象またはそれに由来する抗体産生細胞を、ヒトを含めた哺乳動物のハイブリドーマ細胞株の生成の基礎として機能を果たすように操作することができることが企図されている。本明細書にさらに記載するように、宿主動物の免疫化のルートおよびスケジュールは一般に、抗体の刺激および産生のための確立された技法および従来技法を踏まえている。一般に、宿主動物は、腹腔内、筋肉内、経口的、皮下、足底内、および／または皮内に、本明細書に記載のものを含めたある量の免疫原を接種される。
【０２７６】
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７の一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技法を使用して、またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、１８：３７７〜３８１、１９８２によって改良されたように、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から調製することができる。それだけに限らないが、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３およびＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡからのものを含めた利用可能な骨髄腫株をハイブリダイゼーションで使用することができる。一般に、この技法では、ポリエチレングリコールなどの融合剤を使用して、または当業者に周知の電気的手段によって骨髄腫細胞およびリンパ系細胞が融合される。融合後、細胞は、融合培地から分離され、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ：ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）培地などの選択的増殖培地中で増殖されて、ハイブリダイズしなかった親細胞が排除される。血清が補充された、または補充されていない本明細書に記載の培地のいずれも、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するのに使用することができる。細胞融合技法の別の代替案として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して本主題発明のＰＤＧＦ−Ｂモノクローナル抗体を産生してもよい。ハイブリドーマまたは他の不死化Ｂ細胞が必要に応じて、増やされ、サブクローニングされ、上清が、従来のイムノアッセイ手順（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光イムノアッセイ）によって抗免疫原活性についてアッセイされる。
【０２７７】
抗体のソースとして使用されうるハイブリドーマは、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的なモノクローナル抗体、またはその部分を産生する親ハイブリドーマのすべての誘導体、子孫細胞を包含する。
【０２７８】
このような抗体を産生するハイブリドーマは、公知の手順を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで増殖されうる。モノクローナル抗体は、必要に応じて従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、硫安分画、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過などによって培養培地または体液から単離することができる。望ましくない活性は、存在する場合、例えば、固相に結合した免疫原からできた吸着剤上に調製物を移動させ、免疫原から所望の抗体を溶出または放出することによって、除去することができる。ＰＤＧＦ−Ｂポリペプチド、または免疫化される種内で免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、もしくはダイズトリプシン阻害剤に、二機能性剤もしくは誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基によるコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、もしくはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は、異なるアルキル基である）を使用してコンジュゲートされた標的アミノ酸配列を含有する断片を有する宿主動物を免疫化すると、抗体（例えば、モノクローナル抗体）の集団を得ることができる。
【０２７９】
必要に応じて、対象とするＰＤＧＦ−Ｂ抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を配列決定することができ、次いでポリヌクレオチド配列を発現または増殖のためにベクター中にクローニングしてもよい。対象とする抗体をコードする配列は、宿主細胞内のベクター中に維持することができ、次いで宿主細胞を将来使用するために増やし、凍結させることができる。細胞培養での組換えモノクローナル抗体の産生は、当技術分野で公知の手段によってＢ細胞から抗体遺伝子をクローニングすることによって実施されうる。例えば、Ｔｉｌｌｅｒら、２００８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、３２９、１１２、米国特許第７，３１４，６２２号を参照。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、抗体を「ヒト化」し、または抗体の親和性もしくは他の特性を改善するための遺伝子操作に使用することができる。抗体は、例えば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、およびウシで使用するためにカスタマイズすることもできる。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、完全ヒト抗体は、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように工学的に改変された市販のマウスを使用することによって得ることができる。より望ましい（例えば、完全ヒト抗体）、またはよりロバストな免疫応答を生じるように設計されたトランスジェニック動物も、ヒト化またはヒト抗体の生成に使用することができる。このような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）製のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）、ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）製のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ  Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
【０２８２】
抗体は、宿主動物から抗体および抗体産生細胞を最初に単離し、遺伝子配列を得、この遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）内で組換えによって抗体を発現させることによって組換えで作製することができる。使用されうる別の方法は、植物（例えば、タバコ）またはトランスジェニック乳内で抗体配列を発現させることである。植物または乳内で、組換えで抗体を発現させるための方法は開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９：２７５６、２００１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１３：６５、１９９５；ならびにＰｏｌｌｏｃｋら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３１：１４７、１９９９を参照。抗体の誘導体、例えば、ドメイン、単鎖などを作製するための方法は、当技術分野で公知である。
【０２８３】
イムノアッセイ、および蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリーソーティング技法も、ＰＤＧＦ−Ｂに特異的である抗体を単離するのに使用することができる。
【０２８４】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好適なソースとして機能を果たす。単離した後、ＤＮＡを発現ベクター（ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号に開示された発現ベクターなど）内に配置することができ、次いでこれらは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞、または他の方法で免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞内でのモノクローナル抗体の合成が得られる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号を参照。ＤＮＡはまた、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１：６８５１、１９８４、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部を免疫グロブリンコード配列に非共有結合によって接合することによって修飾することができる。その様式で、本明細書のＰＤＧＦ−Ｂ抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
【０２８５】
抗体断片は、抗体のタンパク質分解もしくは他の分解によって、上述した組換え法（すなわち、単一もしくは融合ポリペプチド）によって、または化学合成によって生成されうる。抗体のポリペプチド、特に最大約５０アミノ酸のより短いポリペプチドは、好都合なことには化学合成によって作製される。化学合成の方法は、当技術分野で公知であり、市販されている。例えば、抗体は、固相法を使用して自動ポリペプチドシンセサイザーによって生成されうる。米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、および同第６，３３１，４１５号も参照。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、抗体ＭＯＲ８４５７の重鎖および／もしくは軽鎖可変領域をコードする配列、またはその生殖系列化バージョンを含む。対象とする抗体をコードする配列は、宿主細胞内のベクター中に維持することができ、次いで宿主細胞を将来使用するために増やし、凍結させることができる。ベクター（発現ベクターを含む）および宿主細胞は、本明細書にさらに記載されている。
【０２８７】
本発明は、親和性成熟した実施形態を含む。例えば、親和性成熟抗体は、当技術分野で公知の手順によって生成することができる（Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３；Ｂａｒｂａｓら、１９９４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ、９１：３８０９〜３８１３；Ｓｃｈｉｅｒら、１９９５、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５；Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜９；Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６；およびＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０５８１８４号）。
【０２８８】
以下の方法は、抗体の親和性を調整するため、およびＣＤＲを特徴付けるために使用されうる。抗体のＣＤＲを特徴付けること、および／または抗体などのポリペプチドの結合親和性を変更すること（改善するなど）の一方法は、「ライブラリースキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。一般に、ライブラリースキャニング突然変異誘発は、以下のように機能する。ＣＤＲ内の１つまたは複数のアミノ酸位置が、当技術分野で承認されている方法を使用して、２個以上（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個など）のアミノ酸と置き換えられる。これにより、それぞれが２つ以上のメンバーの複雑性を伴った（２個以上のアミノ酸があらゆる位置で置換されている場合）、クローンの小さいライブラリー（いくつかの実施形態では、分析されるあらゆるアミノ酸位置について１つ）が生成される。一般に、ライブラリーは、天然（非置換）アミノ酸を含むクローンも含む。各ライブラリーからの少数のクローン、例えば、約２０〜８０のクローン（ライブラリーの複雑性に応じて）が、標的ポリペプチド（または他の結合標的）に対する結合親和性についてスクリーニングされ、増大した結合性、同じ結合性、減少した結合性を有する、または結合性を有さない候補が同定される。結合親和性を判定するための方法は、当技術分野で周知である。結合親和性は、例えば、約２倍以上の結合親和性の差異を検出するＢｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴分析、Ｋｉｎｅｘａ（登録商標）バイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ（登録商標）イムノアッセイ、蛍光消光、蛍光移動、および／または酵母ディスプレイを使用して判定されうる。結合親和性は、適当なバイオアッセイを使用してスクリーニングすることもできる。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）は、出発抗体が相対的に高い親和性、例えば、約１０ｎＭ以下のＫＤで既に結合する場合、特に有用である。
【０２８９】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲ内のあらゆるアミノ酸位置が、当技術分野で承認されている突然変異誘発法（これらのいくつかは本明細書に記載されている）を使用して、２０すべての天然アミノ酸で置き換えられている（いくつかの実施形態では、１つずつ）。これにより、それぞれが２０のメンバーの複雑性を伴った（２０すべてのアミノ酸があらゆる位置で置換されている場合）、クローンの小さいライブラリー（いくつかの実施形態では、分析されるあらゆるアミノ酸位置について１つ）が生成される。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、スクリーニングされるライブラリーは、同じＣＤＲ内であっても、２つ以上のＣＤＲ内であってもよい２つ以上の位置に置換を含む。したがって、ライブラリーは、１つのＣＤＲ内の２つ以上の位置に置換を含みうる。ライブラリーは、２つ以上のＣＤＲ内の２つ以上の位置に置換を含みうる。ライブラリーは、３、４、５、またはそれ以上の位置に置換を含む場合があり、前記位置は、２、３、４、５、または６つのＣＤＲ内に見つかる。置換は、低冗長性コドンを使用して調製されうる。例えば、Ｂａｌｉｎｔら、１９９３、Ｇｅｎｅ、１３７（１）：１０９〜１８の表２を参照。
【０２９１】
ＣＤＲは、重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ３および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ３でありうる。ＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、および／またはＶＬ  ＣＤＲ３の１つまたは複数でありうる。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ、拡張ＣＤＲ、ＡｂＭ  ＣＤＲ、接触ＣＤＲ、またはコンホメーショナルＣＤＲでありうる。
【０２９２】
結合性が改善された候補を配列決定し、それによって改善された親和性（「改善された」置換とも呼ばれる）をもたらすＣＤＲ置換突然変異体を同定することができる。結合する候補も配列決定し、それによって結合性を保持するＣＤＲ置換を同定することができる。
【０２９３】
複数のラウンドのスクリーニングを行うことができる。例えば、結合性が改善された候補（それぞれが１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数の位置でアミノ酸置換を含む）はまた、それぞれの改善されたＣＤＲ位置（すなわち、置換突然変異体が改善された結合性を示したＣＤＲ内のアミノ酸位置）で少なくとも元のアミノ酸および置換されたアミノ酸を含有する第２のライブラリーの設計に有用である。このライブラリーの調製、およびスクリーニングまたは選択を、以下でさらに論じる。
【０２９４】
ライブラリースキャニング突然変異誘発はまた、改善された結合性、同じ結合性、減少した結合性を有する、または結合性を有さないクローンの頻度が、抗体−抗原複合体の安定性についての各アミノ酸位置の重要性に関する情報もたらす限りにおいて、ＣＤＲを特徴付けるための手段を提供する。例えば、ＣＤＲのある位置が２０すべてのアミノ酸に変更されたとき結合性を保持する場合、その位置は、抗原結合に要求される可能性が低い位置として同定される。反対に、ＣＤＲのある位置がほんの小さい割合の置換において結合性を保持する場合、その位置は、ＣＤＲ機能に重要である位置として同定される。したがって、ライブラリースキャニング突然変異誘発法は、多くの異なるアミノ酸（２０すべてのアミノ酸を含む）に変更されうるＣＤＲ内の位置、および変更することができない、またはわずかなアミノ酸に変更されうるだけであるＣＤＲ内の位置に関する情報を生成する。
【０２９５】
親和性が改善された候補は、改善されたアミノ酸、その位置の元のアミノ酸を含む第２のライブラリー内で組み合わせることができ、望まれる、または所望のスクリーニングもしくは選択法を使用して許容されるライブラリーの複雑性に応じて、その位置で追加の置換をさらに含むことができる。さらに、必要に応じて、隣接するアミノ酸位置は、少なくとも２つ以上のアミノ酸に対してランダム化することができる。隣接するアミノ酸をランダム化すると、突然変異体ＣＤＲ内の追加の配座柔軟性が許容される場合があり、それによりひいては、より大きい数の改善突然変異の導入が許容または促進されうる。ライブラリーは、第１のラウンドのスクリーニングで親和性の改善を示さなかった位置で置換を含むこともできる。
【０２９６】
第２のライブラリーは、Ｋｉｎｅｘａ（商標）バイオセンサー分析を使用するスクリーニング、ならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含めた選択のための当技術分野で公知の任意の方法を使用する選択を含めた当技術分野で公知の任意の方法を使用して、結合親和性が改善ならびに／または変更されたライブラリーメンバーについてスクリーニングまたは選択される。
【０２９７】
本発明のＰＤＧＦ−Ｂ抗体を発現させるために、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ断片を、上記に記載の方法のいずれかを使用して最初に得ることができる。様々な修飾、例えば、突然変異、欠失、および／または付加も、当業者に公知の標準方法を使用してＤＮＡ配列中に導入することができる。例えば、突然変異誘発は、ＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準方法を使用して実施することができ、この方法では、ＰＣＲ産物が所望の突然変異または部位特異的突然変異誘発を含有するように、突然変異ヌクレオチドがＰＣＲプライマー中に組み込まれる。
【０２９８】
本発明は、図１に示した可変領域および図１に示したＣＤＲへの修飾を包含する。例えば、本発明は、自己の性質に有意に影響しない機能的に等価な可変領域およびＣＤＲを含む抗体、ならびに活性および／または親和性が増強または減少したバリアントを含む。例えば、アミノ酸配列を突然変異させて、ＰＤＧＦ−Ｂに対する所望の結合親和性を有する抗体を得ることができる。ポリペプチドの修飾は、当技術分野における通常の業務であり、本明細書で詳細に記載される必要はない。修飾ポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換、機能活性を著しく有害に変更しない、もしくはポリペプチドのそのリガンドに対する親和性を成熟させる（増強する）アミノ酸の１つもしくは複数の欠失もしくは付加を有するポリペプチド、または化学的類似体の使用がある。
【０２９９】
アミノ酸配列挿入としては、１個の残基から、１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノおよび／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入がある。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグに融合した抗体がある。抗体分子の他の挿入バリアントには、血液循環内の抗体の半減期を増大させる酵素またはポリペプチドの抗体のＮまたはＣ末端への融合が含まれる。
【０３００】
抗体は、例えば、抗体の結合性を変更するために、例えば、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン内で修飾することもできる。可変領域内の変化は、結合親和性および／または特異性を変更しうる。いくつかの実施形態では、１〜５個以下の保存的アミノ酸置換がＣＤＲドメイン内で行われる。他の実施形態では、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換がＣＤＲドメイン内で行われる。例えば、突然変異をＣＤＲ領域の１つまたは複数の中で行って、ＰＤＧＦ−Ｂに対する抗体のＫＤを増減させ、ｋｏｆｆを増減させ、または抗体の結合特異性を変更することができる。部位特異的突然変異誘発における技法は、当技術分野で周知である。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照。
【０３０１】
修飾または突然変異をフレームワーク領域または定常領域内で行って、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の半減期を増大させることもできる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０９５６０号を参照。フレームワーク領域または定常領域内の突然変異は、抗体の免疫原性を変更し、別の分子への共有結合性もしくは非共有結合性の部位をもたらし、または補体結合、ＦｃＲ結合、および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害などの性質を変更するためにも行うことができる。本発明によれば、単一抗体は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域の任意の１つまたは複数内、または定常領域内に突然変異を有しうる。
【０３０２】
修飾は、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、ならびに他の翻訳後修飾、例えば、異なる糖を用いたグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などを有するポリペプチドも含む。抗体は、これらの定常領域内の保存位置でグリコシル化されている（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、１９９７、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６５：１１１〜１２８；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、ＴｉｂＴＥＣＨ、１５：２６〜３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：１３１１〜１３１８；ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９：４１７５〜４１８０）、ならびに糖タンパク質のコンホメーションおよび提示された三次元表面に影響しうる糖タンパク質の部分同士間の分子内相互作用（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上記の；ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７：４０９〜４１６）に影響する。オリゴ糖は、特定の認識構造に基づいてある特定の分子に対して所与の糖タンパク質を標的にする機能を果たす場合もある。抗体のグリコシル化は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）に影響することも報告されている。特に、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）のテトラサイクリン調節発現、バイセクティングＧｌｃＮＡｃのグリコシルトランスフェラーゼ触媒形成を伴ってＣＨＯ細胞によって産生される抗体は、改善されたＡＤＣＣ活性を有することが報告された（Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：１７６〜１８０）。
【０３０３】
抗体のグリコシル化は一般に、Ｎ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。Ｘがプロリンを除く任意のアミノ酸である、トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−トレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システインは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分への酵素的結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド内にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が創製される。Ｏ結合型グリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つのヒドロキシアミノ酸への結合を指し、最も一般にはセリンまたはトレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリン、または５−ヒドロキシリジンも使用されうる。
【０３０４】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、これが上述したトリペプチド配列の１つまたは複数を含有するように（Ｎ結合型グリコシル化部位について）変更することによって好都合なことには達成される。変更は、元の抗体の配列への１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の付加、またはこれらによる置換によって行うこともできる（Ｏ結合型グリコシル化部位について）。
【０３０５】
抗体のグリコシル化パターンは、基礎をなすヌクレオチド配列を変更することなく変更することもできる。グリコシル化は、大部分は、抗体を発現させるのに使用される宿主細胞に依存する。潜在的な治療剤としての組換え糖タンパク質、例えば、抗体の発現に使用される細胞型は、めったにネイティブ細胞でないので、抗体のグリコシル化パターンのバリエーションが予期されうる（例えば、Ｈｓｅら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：９０６２〜９０７０を参照）。
【０３０６】
宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生中にグリコシル化に影響する要因として、増殖モード、培地処方、培養密度、酸素供給、ｐＨ、精製スキームなどが挙げられる。オリゴサッカライド生成に関与するある特定の酵素を導入することまたは過剰発現させることを含めて、特定の宿主生物内で実現されるグリコシル化パターンを変更するための様々な方法が提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号、同第５，５１０，２６１号、および同第５，２７８，２９９号）。グリコシル化、またはある特定のタイプのグリコシル化は、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を使用して糖タンパク質から酵素的に除去することができる。さらに、組換え宿主細胞は、ある特定のタイプのポリサッカライドのプロセシングに欠陥があるように遺伝子改変することができる。これらの技法および同様の技法は、当技術分野で周知である。
【０３０７】
修飾の他の方法には、それだけに限らないが、酵素的手段、酸化的置換、およびキレート化を含めた当技術分野で公知のカップリング技法の使用が含まれる。修飾は、例えば、イムノアッセイの標識の結合のために使用することができる。修飾ポリペプチドは、当技術分野で確立された手順を使用して作製され、当技術分野で公知の標準アッセイを使用してスクリーニングすることができ、アッセイのいくつかは、以下、および実施例に記載されている。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＦｃガンマ受容体に対する結合親和性が増大した、もしくは減少した、免疫学的に不活性、もしくは部分的に不活性である、例えば、補体媒介溶解を誘発しない、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない、もしくはミクログリアを活性化しない、または補体媒介溶解の誘発、ＡＤＣＣの刺激、もしくはミクログリアの活性化の任意の１つもしくは複数における活性が低減された（無修飾抗体と比較して）修飾定常領域を含む。定常領域の異なる修飾を使用して、エフェクター機能の最適なレベルおよび／または組合せを実現することができる。例えば、Ｍｏｒｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、８６：３１９〜３２４、１９９５；Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５７：４９６３〜９、１５７：４９６３〜４９６９、１９９６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６４：４１７８〜４１８４、２０００；Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４３：２５９５〜２６０１、１９８９；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６、１９９８を参照。いくつかの実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号；および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載されているように修飾される。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、抗体定常領域は、Ｆｃガンマ受容体と補体系および免疫系との相互作用を回避するように修飾されうる。このような抗体を調製するための技法は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されている。例えば、抗体がヒトにおける臨床試験および治療で使用される場合、定常領域は、免疫応答を回避するためにヒト定常領域により類似しているように工学的に改変されうる。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号および同第５，８６６，６９２号を参照。
【０３１０】
いくつかの実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４；ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１号；および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載されているように修飾される。このような実施形態では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４でありうる。Ｆｃは、突然変異Ａ３３０Ｐ３３１〜Ｓ３３０Ｓ３３１（ＩｇＧ２Δａ）を含有するヒトＩｇＧ２であり得、ここでアミノ酸残基は、野生型ＩｇＧ２配列を参照して番号付けられている。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４。いくつかの実施形態では、抗体は、以下の突然変異（Ａｒｍｏｕｒら、２００３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、４０、５８５〜５９３）：Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５〜Ｐ２３３Ｖ２３４Ａ２３５（ＩｇＧ４Δｃ）を含むＩｇＧ４の定常領域を含み、ここで番号付けは、野生型ＩｇＧ４を参照している。さらに別の実施形態では、Ｆｃは、欠失Ｇ２３６を伴ったヒトＩｇＧ４Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５〜Ｐ２３３Ｖ２３４Ａ２３５（ＩｇＧ４Δｂ）である。別の実施形態では、Ｆｃは、ヒンジ安定化突然変異Ｓ２２８〜Ｐ２２８を含有する任意のヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、またはＩｇＧ４Δｃ）である。（Ａａｌｂｅｒｓｅら、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１０５、９〜１９）。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、抗体は、以下の突然変異：Ａ３３０Ｐ３３１〜Ｓ３３０Ｓ３３１（野生型ＩｇＧ２配列を参照したアミノ酸番号付け）を含むヒト重鎖ＩｇＧ２定常領域を含む。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４。さらに他の実施形態では、定常領域は、Ｎ結合型グリコシル化に関して非グリコシル化されている。いくつかの実施形態では、定常領域は、定常領域内のＮ−グリコシル化認識配列の一部であるオリゴ糖付着残基および／またはフランキング残基を突然変異させることによって、Ｎ結合型グリコシル化に関して非グリコシル化されている。例えば、Ｎ−グリコシル化部位Ｎ２９７は、例えば、Ａ、Ｑ、Ｋ、またはＨに突然変異されうる。Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１４３：２５９５〜２６０１、１９８９；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６、１９９８を参照。いくつかの実施形態では、定常領域は、Ｎ結合型グリコシル化に関して非グリコシル化されている。定常領域は、酵素的に（酵素ＰＮＧａｓｅによって炭水化物を除去することなど）、またはグリコシル化欠損宿主細胞内の発現によってＮ結合型グリコシル化に関して非グリコシル化されている。
【０３１２】
他の抗体修飾には、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５８５７２号に記載されているように修飾された抗体が含まれる。これらの抗体は、標的分子に向けられた結合性ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域のすべてまたは一部と実質的に相同のアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、著しい補体依存性溶解、または標的の細胞媒介性破壊を誘発することなく、標的分子に結合することができる。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合することができる。これらは一般に、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。このようにして修飾された抗体は、従来の抗体療法に対する炎症反応および他の有害反応を回避するために長期抗体療法で使用するのに特に適している。
【０３１３】
本開示は、さらに修飾されうる抗体定常ドメインも提供する。Ｆｃ領域のバリアント、例えば、アミノ酸置換、挿入、および／または付加、および／または欠失は、エフェクター機能を増強し、または縮小することが知られている。例えば、Ｐｒｅｓｔａら、２００２、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．、３０：４８７〜４９０；Ｓｔｒｏｈｌ、２００９、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０（６）：６８５〜６９１；米国特許第５，６２４，８２１号、同第５，６４８，２６０号、同第５，８８５，５７３号、同第６，７３７，０５６号、同第７，３１７，０９１号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５８５７２号、同第ＷＯ００／４２０７２号、同第ＷＯ０４／０２９２０７号、同第ＷＯ２００６／１０５３３８号、同第ＷＯ２００８／０２２１５２号、同第ＷＯ２００８／１５０４９４号、同第ＷＯ２０１０／０３３７３６号；米国特許出願公開第２００４／０１３２１０１号、同第２００６／００２４２９８号、同第２００６／０１２１０３２号、同第２００６／０２３５２０８号、同第２００７／０１４８１７０号；Ａｒｍｏｕｒら、１９９９、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２９（８）：２６１３〜２６２４（ＡＤＣＣおよびＣＤＣの低減）；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７６（９）：６５９１〜６６０４（ＡＤＣＣおよびＣＤＣの低減）；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２０００、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６４（８）：４１７８〜４１８４（ＡＤＣＣおよびＣＤＣの増大）；Ｓｔｅｕｒｅｒら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５（３）：１１６５〜１１７４（ＡＤＣＣおよびＣＤＣの低減）；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、２００１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６６（４）：２５７１〜２５７５（ＡＤＣＣおよびＣＤＣの増大）；Ｌａｚａｒら、２００６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０３（１１）：４００５〜４０１０（ＡＤＣＣの増大）；Ｒｙａｎら、２００７、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．、６：３００９〜３０１８（ＡＤＣＣの増大）；Ｒｉｃｈａｒｄｓら、２００８、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．、７（８）：２５１７〜２５２７を参照。
【０３１４】
いくつかの実施形態では、抗体は、無修飾抗体と比較して、ＦｃＲｎに対する結合親和性が増大した、かつ／または血漿半減期が増大した修飾定常領域を含む。
【０３１５】
「生殖系列化」として知られるプロセスでは、ＶＨおよびＶＬ配列内のある特定のアミノ酸を、生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列内で天然に見つかるものとマッチするように突然変異させることができる。特に、ＶＨおよびＶＬ配列内のフレームワーク領域のアミノ酸配列を、生殖系列配列にマッチするように突然変異させて、抗体が投与されるときの免疫原性のリスクを低減することができる。ヒトＶＨおよびＶＬ遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、当技術分野で公知である（例えば、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースを参照；Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７７６〜７９８；およびＣｏｘら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：８２７〜８３６も参照）。
【０３１６】
行われうる別のタイプのアミノ酸置換は、抗体中の潜在的なタンパク質分解部位を除去するためである。このような部位は、抗体の可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域内または定常領域内に存在しうる。システイン残基の置換およびタンパク質分解部位の除去は、抗体生成物内の異種性のリスクを減少させ、したがってその均質性を増大させることができる。別のタイプのアミノ酸置換は、残基の一方または両方を変更することによって、潜在的なアミド分解部位を形成するアスパラギン−グリシン対を排除するためである。別の例では、本発明のＰＤＧＦ−Ｂ抗体の重鎖のＣ末端リシンを切除し、または他の方法で除去することができる。本発明の様々な実施形態では、抗体の重鎖および軽鎖は、シグナル配列を含んでもよい。
【０３１７】
本発明のＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られた後、これらのＤＮＡ断片を標準的な組換えＤＮＡ技法によってさらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨコードＤＮＡ断片は、別のタンパク質、例えば、抗体定常領域または可動性リンカーなどをコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。用語「作動可能に連結された」は、本文脈で使用する場合、２つのＤＮＡ断片が、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように接合されていることを意味するように意図されている。
【０３１８】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨコードＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって全長重鎖遺伝子に変換されうる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ定常領域でありうるが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域である。ＩｇＧ定常領域配列は、異なる個体の中に存在することが知られている様々な対立遺伝子またはアロタイプのいずれか、例えば、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）、およびＧｍ（１７）などでありうる。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域内の天然に存在するアミノ酸置換を代表する。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子について、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結されうる。ＣＨ１重鎖定常領域は、重鎖遺伝子のいずれかに由来しうる。
【０３１９】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬコードＤＮＡを軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換されうる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域でありうる。カッパ定常領域は、異なる個体の中に存在することが知られている様々な対立遺伝子のいずれか、例えば、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）、およびＩｎｖ（３）などでありうる。ラムダ定常領域は、３種のラムダ遺伝子のいずれかに由来しうる。
【０３２０】
ｓｃＦｖ遺伝子を創製するために、ＶＨおよびＶＬコードＤＮＡ断片は、可動性リンカーをコードする別の断片に作動可能に連結され、その結果、ＶＨおよびＶＬ配列は、ＶＬおよびＶＨ領域が可動性リンカーによって接合された、連続した単鎖タンパク質として発現されうる（例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５：５８７９〜５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４を参照）。連結ペプチドの一例は、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１８）であり、これは、一方の可変領域のカルボキシ末端と、他方の可変領域のアミノ末端との間のおよそ３．５ｎｍを架橋する。他の配列のリンカーが設計および使用されている（Ｂｉｒｄら、１９８８、上記の）。リンカーは、次に、追加の機能、例えば、薬物の結合または固体支持体への結合などのために修飾されうる。単鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬが使用される場合一価、２つのＶＨおよびＶＬが使用される場合二価、または２つ以上のＶＨおよびＶＬが使用される場合多価でありうる。ＰＤＧＦ−Ｂおよび別の分子に特異的に結合する二重特異性または多価抗体を生成することができる。単鎖バリアントは、組換えで、または合成的に生成されうる。ｓｃＦｖの合成生成については、自動シンセサイザーを使用することができる。ｓｃＦｖの組換え産生について、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適当なプラスミドを、酵母、植物、昆虫、もしくは哺乳動物細胞などの真核生物、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物の適当な宿主細胞内に導入することができる。対象とするｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの通常の操作によって作製されうる。結果として生じるｓｃＦｖは、当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技法を使用して単離することができる。
【０３２１】
ダイアボディなどの単鎖抗体の他の形態も包含されている。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬが、単一ポリペプチド鎖上であるが、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成させることができず、それによってこれらのドメインを別の鎖の相補的なドメインと対形成させ、２つの抗原結合性部位を創製するリンカーを使用して発現される二価二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６４４４〜６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２：１１２１−１１２３を参照）。
【０３２２】
２つの共有結合によって接合された抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内である。このような抗体は、免疫系細胞を望まれない細胞に向けるため（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染の治療のために（ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／００３６０号および同第ＷＯ９２／２００３７３号；ＥＰ０３０８９）使用されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作製されうる。適当な架橋剤および技法は、当技術分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されている。
【０３２３】
キメラまたはハイブリッド抗体も、架橋剤を伴うものを含めた合成タンパク質化学の公知の技法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製されうる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築されうる。この目的のための適当な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデートがある。
【０３２４】
本発明は、本明細書に開示の抗体に由来する１つまたは複数の断片または領域を含む融合タンパク質も包含する。いくつかの実施形態では、別のポリペプチドに連結した本発明のＰＤＧＦ−Ｂ抗体のすべてのまたは一部を含む融合抗体が作製されうる。別の実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の可変ドメインのみがポリペプチドに連結される。別の実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体のＶＨドメインは、第１のポリペプチドに連結され、一方、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体のＶＬドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用して抗原結合性部位を形成しうる様式で第１のポリペプチドと会合する第２のポリペプチドに連結される。別の好適な実施形態では、ＶＨドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用しうるようにリンカーによってＶＬドメインから分離されている。次いでＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体は、対象とするポリペプチドに連結される。さらに、２つ（またはそれ以上）の単鎖抗体が互いに連結されている融合抗体を創製することができる。単一ポリペプチド鎖上で二価もしくは多価抗体を創製したい場合、または二重特異性抗体を創製したい場合、これは有用である。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、配列番号１もしくは４に示した可変軽鎖領域の少なくとも１０個の連続したアミノ酸、および／または配列番号２もしくは６に示した可変重鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。他の実施形態では、可変軽鎖領域の少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、もしくは少なくとも約３０個の連続したアミノ酸、および／または可変重鎖領域の少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、もしくは少なくとも約３０個の連続したアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号１と２、および４と６の中から選択される配列対のいずれかに示した軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、１つまたは複数のＣＤＲを含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＶＨ  ＣＤＲ３および／またはＶＬ  ＣＤＲ３を含む。本発明の目的に関して、融合タンパク質は、１つまたは複数の抗体、およびこれが天然分子内で結合されていない別のアミノ酸配列、例えば、別の領域に由来する異種配列または相同配列を含有する。例示的な異種配列としては、それだけに限らないが、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグなどの「タグ」がある。タグは、当技術分野で周知である。
【０３２６】
融合ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法、例えば、合成的に、または組換えで創製することができる。一般に、本発明の融合タンパク質は、本明細書に記載の組換え技法を使用してこれらをコードするポリヌクレオチドを発現させて調製することによって作製されるが、これらは、例えば、化学合成を含めた当技術分野で公知の他の手段によって調製してもよい。
【０３２７】
他の実施形態では、他の修飾抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体をコードする核酸分子を使用して調製することができる。例えば、「カッパボディ」（Ｉｌｌら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１０：９４９〜５７）、「ミニボディ」（Ｍａｒｔｉｎら、１９９４、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１３：５３０３〜９）、「ダイアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、上記）、または「ジャヌシン」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．、１０：３６５５〜３６５９、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（Ｓｕｐｐｌ．）、７：５１〜５２）を、本明細書の教示に従って標準的な分子生物学的技法を使用して調製することができる。
【０３２８】
例えば、二重特異性抗体、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体を、本明細書に開示の抗体を使用して調製することができる。二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１２１：２１０を参照）。例えば、二重特異性抗体または抗原結合性断片は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結によって生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ、１９９０、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７９：３１５〜３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４８：１５４７〜１５５３を参照。伝統的に、二重特異性抗体の組換え産生は、異なる特異性を有する２本の重鎖を伴った２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいていた（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ、３０５、５３７〜５３９）。さらに、二重特異性抗体は、「ダイアボディ」または「ジャヌシン」として形成されうる。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＰＤＧＦ−Ｂの２つの異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、上述した修飾抗体は、本明細書に提供されるＰＤＧＦ−Ｂ抗体に由来する可変ドメインまたはＣＤＲ領域の１つまたは複数を使用して調製される。
【０３２９】
二重特異性抗体を作製する一手法によれば、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインが、免疫グロブリン定常領域配列に融合される。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域とのものである。融合物の少なくとも１つの中に存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好適である。免疫グロブリン重鎖融合物、および必要に応じて、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクター内に挿入され、適当な宿主生物内にコトランスフェクトされる。これは、構築物中に使用される不等比の３種のポリペプチド鎖が最適の収率をもたらす実施形態において３種のポリペプチド断片の相互の比率を調整するのに大きな柔軟性をもたらす。しかし、等比の少なくとも２種のポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらす場合、または比が特に重要でない場合、１つの発現ベクター内に２種または３種すべてのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することが可能である。
【０３３０】
一手法では、二重特異性抗体は、一方のアーム内の第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアーム内のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）から構成される。二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖を有するこの非対称構造は、望まれない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を促進する。この手法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０４６９０号に記載されている。
【０３３１】
本発明は、固体支持体へのカップリングを促進する作用物質（ビオチンまたはアビジンなど）にコンジュゲートされた（例えば、連結された）抗体を含む組成物も提供する。簡単にするために、これらの方法が本明細書に記載のＰＤＧＦ−Ｂ結合および／またはアンタゴニストの実施形態のいずれにも当てはまるという理解で、一般に抗体に言及する。コンジュゲーションは一般に、本明細書に記載のこれらの成分の連結を指す。連結（一般に少なくとも投与のために近接会合でこれらの成分を固定している）は、任意の数の方法で実現されうる。例えば、作用物質と抗体との直接反応は、それぞれが他方と反応することができる置換基を有する場合、可能である。例えば、一方の求核基、例えば、アミノまたはスルフヒドリル基などは、他方のカルボニル含有基、例えば、アンヒドリドもしくは酸ハロゲン化物など、または良好な脱離基を含有するアルキル基（例えば、ハロゲン化物）と反応することができる。
【０３３２】
抗体は、多くの異なる担体に結合されうる。担体は、活性および／または不活性でありうる。周知の担体の例としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびに磁鉄鉱がある。担体の性質は、本発明の目的に関しては、可溶性であっても不溶性であってもよい。当業者は、結合抗体の他の適当な担体が分かり、または日常の実験を使用してこのようなものを確認することができるであろう。いくつかの実施形態では、担体は、肺、心臓、または心臓弁を標的にする部分を含む。
【０３３３】
本発明の抗体またはポリペプチドは、標識化剤、例えば、蛍光性分子、放射性分子、または当技術分野で公知の任意の他の標識などに連結されうる。一般にシグナルを（直接または間接的に）もたらす標識は、当技術分野で公知である。
【０３３４】
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本発明は、エフェクター機能が損なわれた抗体などの本明細書に記載の抗体断片および修飾抗体を含めた抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを作り出す方法を提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の手順によって作り出し、発現させることができる。したがって、本発明は、以下のＰＤＧＦ−Ｂ抗体およびその抗原結合性断片のいずれかをコードするポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含む医薬組成物を含めた組成物を提供する：ＭＯＲ８４５７  ＶＬ（配列番号１）、ＭＯＲ８４５７  ＶＨ（配列番号２）、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ（配列番号４）、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ（配列番号６）、ＭＯＲ８４５７−Ｇｌ−ｈＩｇＧ１−３ｍ−ＨＣ（配列番号１４）、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＬＣ（配列番号１６）、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＩＫＲ−ＬＣ（配列番号１７）、ＭＯＲ８４５７−ｈＩｇＧ１−３ｍ−ＨＣ（配列番号１８）、ＭＯＲ８４５７−１５−ＶＬ（配列番号３４）、ＭＯＲ８４５７−１５−ＬＣ（配列番号３７）、ＭＯＲ８４５７−１６−ＶＬ（配列番号３９）、ＭＯＲ８４５７−１６−ＬＣ（配列番号４２）、ＭＯＲ８４５７−１５−ＶＨ／ＭＯＲ８４５７−１６−ＶＨ（配列番号４４）、ＭＯＲ８４５７−１５−ＨＣ／ＭＯＲ８４５７−１６−ＨＣ（配列番号４６）、ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号７）、ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号８）、ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号９）、ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号１０）、ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号１１）、ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１２）、ＭＯＲ８４５７−１５−ＣＤＲ−Ｌ３（配列番号３６）、ＭＯＲ８４５７−１６−ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号４１）またはＰＤＧＦ−Ｂに結合する能力を有するその任意の断片もしくは一部。
【０３３５】
本発明は、ＭＯＲ８４５７  ＶＬ（配列番号１）、ＭＯＲ８４５７  ＶＨ（配列番号２）、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ（配列番号４）、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ（配列番号６）、ＭＯＲ８４５７−Ｇｌ−ｈＩｇＧ１−３ｍ−ＨＣ（配列番号１４）、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＬＣ（配列番号１６）、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＩＫＲ−ＬＣ（配列番号１７）、ＭＯＲ８４５７−ｈＩｇＧ１−３ｍ−ＨＣ（配列番号１８）、ＭＯＲ８４５７−１５−ＶＬ（配列番号３４）、ＭＯＲ８４５７−１５−ＬＣ（配列番号３７）、ＭＯＲ８４５７−１６−ＶＬ（配列番号３９）、ＭＯＲ８４５７−１６−ＬＣ（配列番号４２）、ＭＯＲ８４５７−１５−ＶＨ／ＭＯＲ８４５７−１６−ＶＨ（配列番号４４）、ＭＯＲ８４５７−１５−ＨＣ／ＭＯＲ８４５７−１６−ＨＣ（配列番号４６）、ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｈ１（配列番号７）、ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号８）、ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｈ３（配列番号９）、ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ１（配列番号１０）、ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号１１）、ＭＯＲ８４５７  ＣＤＲ−Ｌ３（配列番号１２）、ＭＯＲ８４５７−１５−ＣＤＲ−Ｌ３（配列番号３６）、ＭＯＲ８４５７−１６−ＣＤＲ−Ｌ２（配列番号４１）またはＰＤＧＦ−Ｂに結合する能力を有するその任意の断片もしくは一部を含めた、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体およびそのもしくは本発明の抗原結合性断片のいずれかをコードするポリヌクレオチド、またはそのポリヌクレオチドを含む組成物であって、ポリヌクレオチドの配列が配列番号３（ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬをコードする）、配列番号５（ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨをコードする）、配列番号１３（ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ｈＩｇＧ１−３ｍ−ＨＣをコードする）、配列番号１５（ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＬＣをコードする）、配列番号３５（ＭＯＲ８４５７−１５−ＶＬをコードする）、配列番号３８（ＭＯＲ８４５７−１５−ＬＣ）、配列番号４０（ＭＯＲ８４５７−１６−ＶＬをコードする）、配列番号４３（ＭＯＲ８４５７−１６−ＬＣをコードする）、配列番号４５（ＭＯＲ８４５７−１５−ＶＨ／ＭＯＲ８４５７−１６−ＶＨをコードする）、および配列番号４７（ＭＯＲ８４５７−１５−ＨＣ／ＭＯＲ８４５７−１６−ＨＣをコードする）の配列を包含する、ポリヌクレオチドまたは組成物を提供する。
【０３３６】
別の態様では、本発明は、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体をコードするポリヌクレオチドおよびそのバリアントであって、そのようなバリアントポリヌクレオチドが、本明細書に開示されている特定の核酸のいずれかと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を共有する、ポリヌクレオチドおよびそのバリアントを提供する。
【０３３７】
そのような配列のいずれかと相補的なポリヌクレオチドも本発明に包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コード鎖またはアンチセンス鎖）であっても二本鎖であってもよく、また、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡまたは合成）であってもＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子はイントロンを含有し、ＤＮＡ分子に１対１様式で対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子を包含する。必ずしもではないが、追加的なコード配列または非コード配列が本発明のポリヌクレオチドに存在してよく、また、ポリヌクレオチドは、必ずしもではないが、他の分子および／または支持材料に連結していてよい。
【０３３８】
ポリヌクレオチドは、ネイティブな配列（すなわち、抗体またはその断片をコードする内在性配列）を含んでもよく、そのような配列のバリアントを含んでもよい。ポリヌクレオチドバリアントは、コードされるポリペプチドの免疫反応性がネイティブな免疫反応性の分子と比較して減弱しないような１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含有する。コードされるポリペプチドの免疫反応性に対する影響は、一般に、本明細書に記載の通り評価することができる。バリアントは、ネイティブな抗体をコードするポリヌクレオチド配列またはその断片に対して少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約８０％の同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％の同一性、および最も好ましくは、少なくとも約９５％の同一性を示すことが好ましい。
【０３３９】
２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、下記の通り対応が最大になるようアラインメントした場合に２つの配列内のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じであれば、「同一」であると言える。２つの配列間の比較は、一般には、比較ウィンドウにわたって配列を比較して配列の局部的な領域の類似性を同定し、比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも約２０、通常は３０〜約７５、または４０〜約５０の連続した位置のセグメントを指し、２つの配列を最適にアラインメントした後に、配列を同じ数の連続した位置の参照配列と比較することができるものである。
【０３４０】
比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標）ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標）、Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）内のＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）プログラムを使用し、初期状態のパラメータを使用して行うことができる。このプログラムにより、以下の参考文献に記載されているいくつかのアラインメントスキームが可能になる：Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．Ｏ．、１９７８、Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ  Ｄａｙｈｏｆｆ、Ｍ．Ｏ．（編）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ  ５巻、補遺３、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ  Ｊ．、１９９０、Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５頁、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１〜１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、１９７１、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．１１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．、Ｎｅｓ，Ｍ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６〜４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．、１９７３、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６〜７３０。
【０３４１】
「配列同一性の百分率」は、２つの最適にアラインメントされた配列を少なくとも２０の位置の比較のウィンドウにわたって比較することによって決定することが好ましく、２つの配列を最適にアラインメントするために、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部は参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセント以下、通常は５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。百分率は、両方の配列内に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、マッチする位置の数を得、マッチする位置の数を参照配列内の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって算出する。
【０３４２】
それに加えて、またはその代わりに、バリアントは、ネイティブな遺伝子、またはその一部もしくは相補物と実質的に相同であってもよい。そのようなポリヌクレオチドバリアントは、中程度にストリンジェントな条件下でネイティブな抗体をコードする天然に存在するＤＮＡ配列（または相補配列）とハイブリダイズすることができる。
【０３４３】
適切な「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液で予洗すること、５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで一晩ハイブリダイズさせること、その後、６５℃で２０分、０．１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ、０．５×ＳＳＣおよび０．２×ＳＳＣのそれぞれで２回洗浄することを含む。
【０３４４】
本明細書で使用される場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」とは、（１）洗浄に低イオン強度および高温、例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で使用すること、（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドなどの変性剤、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドを０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５と一緒に、７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、４２℃と一緒に使用すること、または、（３）５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳ、および１０％デキストラン硫酸、４２℃を、４２℃、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃、５０％ホルムアミドで洗浄し、その後、ＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣ、５５℃からなる高ストリンジェンシー洗浄を行うことと一緒に使用することである。プローブの長さなどの因子に適応させるために必要に応じて温度、イオン強度などをどのように調整するかは当業者には理解されよう。
【０３４５】
遺伝暗号の縮退の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が数多く存在することは当業者には理解されよう。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、コドン使用の差異に起因して変動するポリヌクレオチドは、本発明により具体的に企図されている。さらに、本発明において提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は本発明の範囲内に入る。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換などの１つまたは複数の変異の結果として変更された内在性遺伝子である。生じたｍＲＮＡおよびタンパク質は、必ずしもではないが、構造または機能が変更されていてよい。対立遺伝子は標準の技法（ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列の比較など）を使用して同定することができる。
【０３４６】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え方法、またはＰＣＲを使用して得ることができる。化学的なポリヌクレオチド合成方法は当技術分野で周知であり、本明細書に詳細に記載する必要はない。当業者は、本明細書において提供される配列および市販のＤＮＡ合成機を使用して所望のＤＮＡ配列を産生することができる。
【０３４７】
本明細書でさらに考察する通り、組換え方法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適切なベクターに挿入することができ、今度は、そのベクターを複製および増幅のために適切な宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の手段によって宿主細胞に挿入することができる。外因性ポリヌクレオチドを直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−接合または電気穿孔によって導入することにより、細胞を形質転換する。外因性ポリヌクレオチドは、一旦導入すれば、細胞内に非組み込み型ベクター（例えばプラスミドなど）として維持することもでき、宿主細胞のゲノムに組み込むこともできる。そのように増幅されたポリヌクレオチドは当技術分野で周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照されたい。
【０３４８】
あるいは、ＰＣＲにより、ＤＮＡ配列を複製することが可能になる。ＰＣＲ技術は当技術分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号および同第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４に記載されている。
【０３４９】
ＲＮＡは、単離されたＤＮＡを適切なベクター内に使用し、それを適切な宿主細胞に挿入することによって得ることができる。細胞が複製され、ＤＮＡがＲＮＡに転写されたら、次いで、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記に記載されている当業者に周知の方法を使用してＲＮＡを単離することができる。
【０３５０】
適切なクローニングベクターは、標準の技法に従って構築することもでき、当技術分野において利用可能な多数のクローニングベクターから選択することもできる。選択されるクローニングベクターは使用することが意図された宿主細胞に応じて変動し得るが、一般には、有用なクローニングベクターは自己複製する能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一の標的を有し得、かつ／またはベクターを含有するクローンの選択において使用することができるマーカーの遺伝子を有し得る。適切な例としては、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えばｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターが挙げられる。これらおよび多くの他のクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎなどの民間のベンダーから入手可能である。
【０３５１】
発現ベクターがさらに提供される。発現ベクターは、一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターは、宿主細胞においてエピソームとしてまたは染色体ＤＮＡの不可欠な部分としてのいずれかで複製可能でなければならないことが暗示されている。適切な発現ベクターとしては、これだけに限定されないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含めたウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号に開示されている発現ベクター（複数可）が挙げられる。ベクター構成要素としては、一般に、これだけに限定されないが、以下の１つまたは複数を挙げることができる：シグナル配列、複製開始点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、適切な転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターなど）。発現（すなわち、翻訳）のために、通常はリボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドンなどの１つまたは複数の翻訳制御エレメントも必要である。
【０３５２】
対象のポリヌクレオチドを含有するベクターおよび／またはポリヌクレオチド自体を、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を使用したトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスなどの感染因子である場合）を含めたいくつもの適切な手段のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。導入するベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、多くの場合、宿主細胞の特徴に依存する。
【０３５３】
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞も提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞を、対象の抗体、ポリペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子を単離するために使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非限定的な例としては、これだけに限定されないが、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＣＨＯ細胞が挙げられる。ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号も参照されたい。適切な非哺乳動物宿主細胞としては、原核生物（例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）など）および酵母（例えば出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、分裂酵母（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）など；またはＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ））が挙げられる。宿主細胞は、ｃＤＮＡを、宿主細胞において対応する対象の内在性の抗体またはタンパク質が存在する場合、そのレベルよりも約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、なおより好ましくは２０倍高いレベルで発現することが好ましい。ＰＤＧＦ−Ｂへの特異的な結合についての宿主細胞のスクリーニングをイムノアッセイまたはＦＡＣＳによって実施する。対象の抗体またはタンパク質を過剰発現している細胞を同定することができる。
【０３５４】
発現ベクターを使用して、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の発現を導くことができる。当業者は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて外因性のタンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与に詳しい。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号；同第６，４１３，９４２号；および同第６，３７６，４７１号を参照されたい。発現ベクターの投与としては、注射、経口投与、パーティクルガンもしくはカテーテルによる投与、および局所投与を含めた局部投与または全身投与が挙げられる。別の実施形態では、発現ベクターを交感神経幹もしくは神経節に、または冠状動脈内、心房内、心室内、または心膜内に直接投与する。
【０３５５】
発現ベクター、またはサブゲノムのポリヌクレオチドを含有する治療用組成物の標的化送達も使用することができる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技法は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９３、１１：２０２；Ｃｈｉｏｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編、１９９４；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、２６３：６２１；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４、２６９：５４２；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９０、８７：３６５５；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９１、２６６：３３８に記載されている。遺伝子療法プロトコールでは、局部投与用にポリヌクレオチドを含有する治療用組成物をＤＮＡ約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲で投与する。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇの濃度範囲のＤＮＡも遺伝子療法プロトコールの間に使用することができる。治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは遺伝子送達ビヒクルを使用して送達することができる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源のものであっても非ウイルス起源のものであってもよい（一般に、Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、１：５１；Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、５：８４５；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９５、１：１８５；およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４、６：１４８を参照されたい）。そのようなコード配列の発現は内在性の哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導することができる。コード配列の発現は構成的なものまたは調節されたものいずれかであってもよい。
【０３５６】
所望のポリヌクレオチドを送達し、所望の細胞において発現させるためのウイルスに基づくベクターは当技術分野で周知である。例示的なウイルスに基づくビヒクルとしては、これだけに限定されないが、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０７９３６号；同第ＷＯ９４／０３６２２号；同第ＷＯ９３／２５６９８号；同第ＷＯ９３／２５２３４号；同第ＷＯ９３／１１２３０号；同第ＷＯ９３／１０２１８号；同第ＷＯ９１／０２８０５号；同第米国特許第５，２１９，７４０号および同第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；および欧州特許第０  ３４５  ２４２号を参照されたい）、アルファウイルスに基づくベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、ならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号、同第ＷＯ９３／０３７６９号；同第ＷＯ９３／１９１９１号；同第ＷＯ９４／２８９３８号；同第ＷＯ９５／１１９８４号および同第ＷＯ９５／００６５５号を参照されたい）が挙げられる。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７に記載の死滅させたアデノウイルスと連結したＤＮＡの投与も使用することができる。
【０３５７】
これだけに限定されないが、死滅させたアデノウイルス単独に連結したまたは連結していないポリカチオン凝縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７を参照されたい）；リガンドに連結したＤＮＡ（例えば、Ｗｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９、２６４：１６９８５を参照されたい）；真核細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０７９９４号；同第ＷＯ９６／１７０７２号；同第ＷＯ９５／３０７６３号；および同第ＷＯ９７／４２３３８号を参照されたい）および核電荷中和または細胞膜との融合を含めた非ウイルス性の送達ビヒクルおよび方法も使用することができる。裸のＤＮＡも使用することができる。例示的な裸のＤＮＡの導入方法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとしての機能を果たし得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号；ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／１３７９６号；同第ＷＯ９４／２３６９７号；同第ＷＯ９１／１４４４５号；およびＥＰ０５２４９６８に記載されている。追加的な手法がＰｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、１９９４、１４：２４１１、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９４、９１：１５８１に記載されている。
【０３５８】
治療方法
治療方法は、治療を必要とする対象に、本発明のものであり、また本開示により企図されているＰＤＧＦ−Ｂ抗体、または抗原結合性部分を治療有効量、または「有効量」で投与することを伴う。本明細書で使用される場合、「治療的に有効な」、または「有効な」量とは、単回投与としてまたは複数回投与レジメンに従って、単独で、または他の薬剤と組み合わせて、疾患症状の重症度の低下、疾患無症状期間の頻度および持続時間の増加、または疾患の苦痛に起因する機能障害または能力障害の予防をもたらすために十分な分量である、抗体またはその一部の量を指す。当業者は、そのような量を、対象のサイズ、対象の症状の重症度、および特定の組成物または選択された投与経路などの因子に基づいて決定することができよう。対象は、ヒトであっても非ヒト動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、サルまたは他の下級の霊長類）であってもよい。
【０３５９】
本発明の抗体または抗原結合性部分は公知の医薬と同時投与することができ、また、いくつかの場合には、抗体自体を修飾することができる。例えば、潜在的に有効性をさらに増大させるために、抗体を免疫毒素または放射性同位元素とコンジュゲートすることができる。追加的な治療剤との同時投与については、そのような薬剤として、細胞傷害性薬剤、放射性毒性薬剤または免疫抑制剤を挙げることができる。抗体は、薬剤に連結させることもでき（免疫複合体として）、薬剤とは別に投与することもできる。後者の場合（別々の投与）、抗体は、薬剤の前、その後、またはそれと同時に投与することもでき、他の公知の療法、例えば、抗がん療法、例えば、放射線と同時投与することもできる。そのような治療剤としては、とりわけ、それ自体では患者に対して毒性または準毒性のレベルでのみ有効であるドキソルビシン（アドリアマイシン）、シスプラチン・ブレオマイシン硫酸塩、カルムスチン、クロラムブシル、およびシクロホスファミドヒドロキシウレアなどの抗悪性腫瘍剤が挙げられる。シスプラチンは１００ｍｇの用量で４週間に１回静脈内投与することができ、アドリアマイシンは６０〜７５ｍｇの用量で２１日に１回静脈内投与される。本開示のＰＤＧＦ−Ｂ抗体またはその抗原結合性断片を治療剤と同時投与することにより、異なる機構で作動する２種の薬剤がもたらされ、ヒト疾患に対して治療的であり、おそらく相乗的である効果がもたらされ得る。そのような同時投与により、薬物に対する抵抗性の発生に起因する問題、または、腫瘍形成および／もしくは望ましくない細胞増殖の治療における、腫瘍細胞の抗原性が変化して、抗体に対して非反応性になることに起因する問題が解決され得る。
【０３６０】
本明細書に開示されている抗体および抗原結合性部分は、Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋａ、２００８、Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ４７：ｖ２〜ｖ４；Ａｎｄｒａｅら  ２００８  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２２：１２７６〜１３１２；ＨｅｌｄｉｎおよびＷｅｓｔｅｒｍａｒｋ、１９９９、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｓ．７９（４）：１２３８〜１３１６；Ｌａｉｍｅｒら、２０１２、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１８（１１）：１６９９〜１７０４に概説されている、ＰＤＧＦ−Ｂが望ましくなく発現されているまたは見出される種々の状況における治療または診断用のツールとして使用することができる。ＰＤＧＦ−Ｂが腫瘍形成に関与すること、およびＰＤＧＦ−Ｂが血管新生、細胞増殖、および細胞遊走、および細胞外マトリックスの過剰な沈着において果たす役割、ならびに多数の疾患、障害および状態におけるＰＤＧＦＲβおよびＰＤＧＦ−Ｂの役割を考慮すると、多くのそのような疾患、障害または状態は、本発明の抗体または抗原結合性部分を用いて治療するのに特に適している。これらの疾患、障害または状態としては、これだけに限定されないが、異常な細胞の成長に関連する状態、例えば、中皮腫、肝細胞癌、前立腺癌、腺癌、神経膠腫、神経膠芽腫、卵巣癌、胆管細胞癌、ＮＰＭ−ＡＬＫに駆動されるリンパ腫、結腸直腸がん、皮膚がん、乳がん、膵がん、肺がん、または前述のがんの１つまたは複数の組合せが挙げられる。本発明の抗体またはその断片を用いて治療することができる別のＰＤＧＦ−Ｂ媒介性状態としては、これだけに限定されないが、炎症性の状態（例えば、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、変形性関節症、関節リウマチ、１型糖尿病、慢性閉塞性肺疾患、虚血、脳卒中、血栓症）、線維性の状態（例えば、特発性肺線維症、腎疾患、胆管線維症、肝線維症、特発性腹膜線維症、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎、アルポート症候群、ファンコニー病（Ｆａｎｃｏｎｉ  ｄｉｓｅａｓｅ）、限局性分節性糸球体硬化症、高血圧性腎硬化症、腎炎病（ｎｅｐｈｒｉｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ）、強皮症（ＳＳｃ）、心肥大、原発性硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、ペイロニー病、子宮筋腫、子宮内膜症、肺高血圧症、手術後癒着、皮膚瘢痕、肺動脈性肺高血圧症、原発性硬化性胆管炎（ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ）、移植心冠動脈病変および線維症）；加齢黄斑変性症、糖尿病黄斑浮腫、ドライアイ、狭窄、新生内膜形成、移植片対宿主病、良性前立腺肥大症、肉腫、糖尿病性腎症、血管炎、未分化星状細胞腫、中皮腫、白血病、脳出血、骨折治癒、脳梗塞、アポトーシス、後天性免疫不全症候群／ＨＩＶ感染症、慢性腎不全、硬変症、転移、原発性肺高血圧症、続発性肺高血圧症、川崎病、再灌流傷害、皮膚粘膜リンパ節症候群、良性腫瘍、高脂血症、腹圧性尿失禁、慢性骨髄性白血病、皮膚線維腫、過敏症、髄芽腫、骨髄性白血病（急性および慢性）、骨粗鬆症、グレーブス眼症、脳炎、線維筋痛症、神経系損傷、老化、胆石症、肝疾患、高コレステロール血症、ウイルス性髄膜炎、レプロトックス（ｒｅｐｒｏｔｏｘ）、クレアチン代謝障害、網膜疾患、全身性エリテマトーデス、吸収不良症候群、アロデ���ニア、悪性高血圧症、骨髄線維症、先天性異常、眼毒性、アルツハイマー型認知症、カルチノイド、肺線維症、鼻ポリープ、紫斑病、動脈瘤、扁平上皮癌、慢性膵炎、消化器新生物、甲状腺腫、非定型肺炎、虚弱、アレルギー、毒性、固形腫瘍、２型糖尿病、皮膚瘢痕、神経内分泌がん、喘息、腺腫、神経因性疼痛、サイトメガロウイルス感染症、神経芽細胞腫、網膜症、萎縮、脳障害、ショック、ＣＮＳがん、敗血症、高酸素症、腸がん、細菌性呼吸器疾患、臓器移植、下垂体がん、肥満症、ケロイド瘢痕、ニコチン中毒、全般性不安障害、食道がん、皮膚の基底細胞・扁平上皮細胞がん、高カルシウム血症、胚性致死、肺炎、肺炎症、神経疾患、神経系がん、カポジ肉腫、血液凝固障害、眼疾患、膵炎、毛細血管拡張症、呼吸器疾患、眼および眼窩の炎症、寒冷グロブリン血症、肝細胞がん、心血管障害、およびパーキンソン病が挙げられる。
【０３６１】
前述の障害のいずれかを治療するために、本開示に従って使用するための医薬組成物を、１種または複数種の薬学的に許容できる担体または賦形剤を使用して常法に従って製剤化し、以下により詳細に考察する通り投与することができる。
【０３６２】
本開示による抗体または抗原結合性部分の治療有効量の決定は特定の患者の特性、投与経路、および治療される障害の性質に大きく依存し、これは以下でより詳細に考察する。
【０３６３】
抗体の投与および投薬は以下の他の箇所でより詳細に考察する。
【０３６４】
診断方法
本発明の抗体、工学的に改変された抗体、および工学的に改変された抗体コンジュゲートは、画像診断のために使用することができる。例えば、工学的に改変された抗体コンジュゲートは放射標識されたモノクローナル抗体であってもよい。例えば、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（編）、Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｃｈａｓｅ、「Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｉｓｏｔｏｐｅｓ」、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ｇｅｎｎａｒｏら（編）、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、６２４〜６５２頁（１９９０）；およびＢｒｏｗｎ、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｐｅｚｚｕｔｏら（編）、ＣｈａｐｍａｎおよびＨａｌｌ、２２７〜２４９頁（１９９３）；Ｇｒｏｓｓｍａｎ、１９８６、Ｕｒｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒ．１３：４６５〜４７４；Ｕｎｇｅｒら、１９８５、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｒａｄｉｏｌ．２０：６９３〜７００；およびＫｈａｗら、１９８０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：２９５〜２９７を参照されたい。この技法は免疫シンチグラフィーとしても公知であり、ガンマカメラを使用して、モノクローナル抗体とコンジュゲートしたガンマ線を放出する放射性同位元素の位置を検出する。画像診断を使用して、がん、自己免疫疾患、感染症および／または心血管疾患を診断することができる（例えば、Ｂｒｏｗｎ、上記を参照されたい）。
【０３６５】
一実施形態では、工学的に改変された抗体コンジュゲートを使用して、心血管疾患を診断することができる。例えば、他の使用の中でも、抗ミオシン抗体断片を含む工学的に改変された抗体コンジュゲートを、急性心筋梗塞に関連する心筋壊死を画像化するために使用することができる。
【０３６６】
診断に加えて、モノクローナル抗体画像化を使用して、治療反応をモニタリングすること、疾患の再発を検出すること、およびその後の臨床決定を手引きすることができる。
【０３６７】
診断およびモニタリングのために、放射性同位元素を抗体断片に直接、または中間官能基を使用することによって間接的に結合させることができる。そのような中間官能基としては、例えば、ＤＴＰＡ（ジエチレントリアミン五酢酸）およびＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）が挙げられる。患者に送達される放射線量は、一般には、できるだけ低レベルに維持する。これは、同位元素の、検出および正確な測定が可能になる最小の半減期、最小の体内保持、および最小の分量の組合せが最良になるように同位元素を選択することによって達成することができる。抗体に結合させることができ、画像診断に適した放射性同位元素の例としては、９９ｍＴｃおよび１１１Ｉｎが挙げられる。
【０３６８】
試験により、抗体断片、特にＦａｂおよびＦａｂ’により適切な腫瘍／バックグラウンド比がもたらされることが示される（例えば、Ｂｒｏｗｎ、上記を参照されたい）。
【０３６９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ診断のために、工学的に改変された抗体コンジュゲートを常磁性イオンで標識することもできる。磁気共鳴画像法に特に有用な元素としては、Ｇｄイオン、Ｍｎイオン、Ｄｙイオン、およびＦｅイオンが挙げられる。
【０３７０】
工学的に改変された抗体コンジュゲートにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける特定の抗原の存在を検出することもできる。そのようなイムノアッセイでは、工学的に改変された抗体コンジュゲートを液相で利用することもでき、固相担体に結合させることもできる。例えば、抗体構成要素をポリマーでコーティングしたビーズ、プレート、またはチューブなどの不溶性支持体と連結するために、インタクトな抗体またはその抗原結合性断片をアミノデキストラン（ａｍｉｎｏｄｅｘｔｒａｎ）などのポリマーに付着させることができる。
【０３７１】
あるいは、工学的に改変された抗体コンジュゲートを使用して、組織学的検体から調製した組織切片における特定の抗原の存在を検出することができる。そのようなｉｎ  ｓｉｔｕ検出は、例えば、検出可能に標識された免疫コンジュゲートを組織切片に適用することによって達成することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ検出を使用して、特定の抗原の存在を決定すること、および調査される組織内のその抗原の分布を決定することができる。ｉｎ  ｓｉｔｕ検出の一般的な技法は当業者に周知である（例えば、Ｐｏｎｄｅｒ、「Ｃｅｌｌ  Ｍａｒｋｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍｏｎｋ（編）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１１５〜１３８頁（１９８７）；Ｃｏｌｉｇａｎら、上記を参照されたい）。
【０３７２】
酵素、蛍光化合物、電子移動剤などの検出可能な標識を当技術分野で周知の従来の方法によって担体に連結することができる。これらの標識された担体およびそれらから調製した工学的に改変された抗体コンジュゲートをｉｎ  ｖｉｔｒｏイムノアッセイのため、およびｉｎ  ｓｉｔｕ検出のために使用することができ、同様に、抗体コンジュゲートは標識を抗体に直接付着させることによって調製することができる。工学的に改変された抗体コンジュゲートに複数の標識を負荷させることにより、イムノアッセイまたは組織学的手順の感度が増大し得、その場合、抗体または抗体断片と標的抗原のほんの低い程度の結合が実現される。
【０３７３】
組成物
本発明は、本明細書に記載のＰＤＧＦ−Ｂ抗体を有効量で含む医薬組成物も提供する。そのような組成物の例、ならびにどのように製剤化するかについても本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、組成物は、１つまたは複数のＰＤＧＦ−Ｂ抗体を含む。他の実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体はＰＤＧＦ−Ｂを認識する。他の実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体はヒト抗体である。他の実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、抗体に媒介される溶解またはＡＤＣＣなどの所望の免疫応答を誘発することができる定常領域を含む。他の実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、抗体に媒介される溶解またはＡＤＣＣなどの不必要なまたは望ましくない免疫応答を誘発しない定常領域を含む。他の実施形態では、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体は、抗体の１つまたは複数のＣＤＲを含む（例えば１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または、いくつかの実施形態では、６つのＣＤＲの全てなど）。
【０３７４】
組成物は、２種以上のＰＤＧＦ−Ｂ抗体（例えば、ＰＤＧＦ−Ｂの異なるエピトープを認識するＰＤＧＦ−Ｂ抗体の混合物）を含んでもよいことが理解される。他の例示的な組成物は、同じエピトープ（複数可）を認識する２種以上のＰＤＧＦ−Ｂ抗体、またはＰＤＧＦ−Ｂの異なるエピトープに結合する異なる種のＰＤＧＦ−Ｂ抗体を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＤＧＦ−Ｂの異なるバリアントを認識するＰＤＧＦ−Ｂ抗体の混合物または種々のＰＤＧＦ、例えば、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、ＰＤＧＦ−ＣおよびＰＤＧＦ−Ｄを認識するＰＤＧＦ抗体の混合物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、ＰＤＧＦ−Ｂのエピトープ１およびエピトープ２を認識する単一のＰＤＧＦ−Ｂ抗体を含む。
【０３７５】
本発明において使用する組成物は、薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤を（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ編、ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ）、凍結乾燥製剤または水溶液の形態でさらに含んでもよい。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、また、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド（ｏｃｔａｄｅｃｙｌｄｉｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｙｌ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルパラベンもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含んでもよい。薬学的に許容できる賦形剤はさらに本明細書に記載されている。
【０３７６】
ＰＤＧＦ−Ｂ抗体およびその組成物を、薬剤の効力を増強および／または補完する機能を果たす他の薬剤と併せて使用することもできる。
【０３７７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成物を含めた組成物も提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。さらに他の実施形態では、組成物は、配列番号３および配列番号５に示されている配列を含むポリヌクレオチドのいずれかまたは両方、配列番号１３および配列番号１５に示されているポリヌクレオチドのいずれかまたは両方、配列番号３５および配列番号４５に示されているポリヌクレオチドのいずれかまたは両方、配列番号３８および配列番号４７に示されているポリヌクレオチドのいずれかまたは両方、配列番号４０および配列番号４５に示されているポリヌクレオチドのいずれかまたは両方、または配列番号４３および配列番号４７に示されているポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。
【０３７８】
別の態様では、ポリヌクレオチドは、本発明の抗体のＶＨ、ＶＬおよび／またはその両方をコードしてもよい。すなわち、組成物は、本発明の抗体またはその抗原結合性部分をコードする単一のポリヌクレオチド、または２つ以上のポリヌクレオチドを含む。
【０３７９】
本開示の医薬組成物を併用療法で、例えば、他の薬剤と組み合わせてなどで投与することもできる。例えば、併用療法は、本開示の工学的に改変された抗体またそのコンジュゲートを少なくとも１つの他の療法と組み合わせて含んでよく、他の療法は、外科手術、免疫療法、化学療法、放射線治療、または薬物療法であってもよい。
【０３８０】
本開示の医薬化合物は、１つまたは複数の薬学的に許容できる塩を含んでもよい。そのような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸などの非毒性無機酸に由来するもの、ならびに、例えば、脂肪族モノカルボン酸および脂肪族ジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族スルホン酸および芳香族スルホン酸などの非毒性有機酸に由来するものが挙げられる。塩基付加塩としては、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどのアルカリ土類金属に由来するもの、ならびに、例えばＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなどの非毒性有機アミンに由来するものが挙げられる。
【０３８１】
本開示の医薬組成物は、薬学的に許容できる抗酸化剤も含んでもよい。薬学的に許容できる抗酸化剤の例としては、（１）水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；（２）油溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファトコフェロールなど；および（３）金属キレート化剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが挙げられる。
【０３８２】
本開示の医薬組成物に使用することができる適切な水性担体および非水性担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、および適切なそれらの混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが挙げられる。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料を使用することによって、分散の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。
【０３８３】
これらの組成物は、防腐剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含有してもよい。微生物の存在の予防は、滅菌手順によっても、さまざまな抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などの配合によっても確実にすることができる。糖、塩化ナトリウムなどの等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）も組成物に配合することが望ましい場合がある。さらに、注射可能な医薬形態の持続的な吸収を、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を配合することによってもたらすことができる。
【０３８４】
医薬組成物は、一般には、製造および保管の条件下で、滅菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高薬物濃度に適した他の規則構造として製剤化することができる。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、ならびに適切なそれらの混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。妥当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなど、または塩化ナトリウムを組成物に配合することが適切である。注射用組成物の持続的な吸収は、組成物に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを配合することによってもたらすことができる。
【０３８５】
滅菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を上に挙げられている成分の１つ、または成分の組合せと一緒に適切な溶媒に組み入れ、必要に応じて、その後に滅菌精密濾過することによって調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、基本的な分散媒および必要な他の上に挙げられている成分を含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加的な所望の成分の散剤が予め滅菌濾過したその溶液からもたらされる、真空乾燥およびフリーズドライ（凍結乾燥）である。
【０３８６】
本発明の医薬組成物は、点眼投与に適した製剤として調製、包装、または販売することができる。そのような製剤は、例えば、水性または油性の液体担体中活性成分の０．１  １．０％（ｗ／ｗ）溶液または懸濁液を含めた、点眼剤の形態であってもよい。そのような点眼剤は、緩衝剤、塩、または１つもしくは複数の他の本明細書に記載の追加的な成分をさらに含んでもよい。他の有用な眼に投与可能な製剤としては、活性成分を微結晶性の形態でまたはリポソーム調製物中に含むものが挙げられる。
【０３８７】
本明細書で使用される場合、「追加的な成分」としては、これだけに限定されないが、以下の１つまたは複数が挙げられる：賦形剤；表面活性剤；分散剤；不活性な希釈剤；造粒剤および崩壊剤；結合剤；平滑剤；甘味剤；香味剤；着色剤；防腐剤；ゼラチンなどの生理的に分解可能な組成物；水性のビヒクルおよび溶媒；油性のビヒクルおよび溶媒；懸濁化剤；分散剤または湿潤剤；乳化剤、粘滑剤；緩衝液；塩；増粘剤；充填剤；乳化剤；抗酸化剤；抗生物質；抗真菌剤；安定化剤；および薬学的に許容できるポリマー材料または疎水性材料。本発明の医薬組成物に配合することができる他の「追加的な成分」は当技術分野で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み入れられるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｇｅｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ（１９８５）に記載されている。
【０３８８】
一実施形態では、抗体、工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートを、５ｍｇ／ｍｌ、またはより好ましくは約１０ｍｇ／ｍｌ、またはさらにより好ましくは約１５ｍｇ／ｍｌ、またはなおより好ましくは約２０ｍｇ／ｍｌの抗体を、酢酸ナトリウム、ポリソルベート８０、および塩化ナトリウムと一緒に含有し、ｐＨが約５〜６である滅菌水溶液として、静脈内用製剤で投与する。静脈内用製剤は、５ｍｇ／ｍｌまたは１０ｍｇ／ｍｌの抗体を、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．２ｍｇ／ｍｌのポリソルベート８０、および１４０ｍＭの塩化ナトリウムと一緒に含有し、ｐＨが５．５である滅菌水溶液であることが好ましい。さらに、工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートを含む溶液は、多くの他の化合物の中でも、ヒスチジン、マンニトール、スクロース、トレハロース、グリシン、ポリ（エチレン）グリコール、ＥＤＴＡ、メチオニン、およびそれらの任意の組合せ、ならびに関連する技術分野で公知の多くの他の化合物を含んでもよい。
【０３８９】
一実施形態では、抗体、工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲート製剤の用量の一部を静脈内ボーラスによって投与し、残りを注入によって投与する。例えば、抗体、工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートの０．０１ｍｇ／ｋｇの静脈内注射をボーラスとして与え、所定の工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲート用量の残りを静脈内注射によって投与することができる。抗体または工学的に改変された抗体の所定の用量を、例えば、１時間半から、２時間から５時間までにわたって投与することができる。
【０３９０】
薬剤が例えば低分子である治療剤については、その薬剤は生理的に許容できるエステルまたは塩の形態で、例えば当技術分野で周知の生理的に許容できる陽イオンまたは陰イオンと組み合わせて医薬組成物中に存在してもよい。
【０３９１】
本明細書に記載の医薬組成物の製剤は、薬理学の分野で公知である、または今後開発される任意の方法によって調製することができる。一般に、そのような予備的方法は、活性成分に担体または１つもしくは複数の他のアクセサリー成分を付随させ、次いで、必要または望ましい場合には、製品を所望の単回単位用量または多数回単位用量に形作るまたは包装するステップを含む。
【０３９２】
一実施形態では、本開示の組成物は、内毒素および／または関連する発熱物質を実質的に含まない、パイロジェンフリー製剤である。内毒素は、微生物の内側に限局され、微生物が破壊されたまたは死滅した場合に放出される毒素を包含する。発熱物質は、細菌および他の微生物の外膜に由来する、発熱を誘導する熱安定性の物質（糖タンパク質）も包含する。これらの物質はどちらもヒトに投与されると発熱、低血圧およびショックを引き起こす可能性がある。有害作用の潜在性があるので、少量の内毒素であっても静脈内投与する医薬品溶液から除去することが有利である。食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（「ＦＤＡ」）により、静脈内への薬物の適用に関して、上限が単一の１時間の期間に体重１キログラム当たり用量当たり５内毒素単位（ＥＵ）に設定されている（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎ、Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａｌ  Ｆｏｒｕｍ  ２６（１）：２２３（２０００））。治療用タンパク質を体重１キログラム当たり数百または数千ミリグラムの量で投与する場合、痕跡量の内毒素であっても除去することが有利である。一実施形態では、組成物中の内毒素および発熱物質のレベルは１０ＥＵ／ｍｇ未満、または５ＥＵ／ｍｇ未満、または１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。別の実施形態では、組成物中の内毒素および発熱物質のレベルは、約１０ＥＵ／ｍｇ未満、または約５ＥＵ／ｍｇ未満、または約１ＥＵ／ｍｇ未満、または約０．１ＥＵ／ｍｇ未満、または約０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、または約０．００１ＥＵ／ｍｇ未満である。
【０３９３】
一実施形態では、本開示は、組成物を投与することを含み、前記投与は経口投与、非経口投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、膣内投与、直腸内投与、舌への投与、舌下投与、頬側投与、頬内投与、静脈内投与、皮膚への投与、皮下投与または経皮投与である。
【０３９４】
別の実施形態では、本開示は、組成物を外科手術、化学療法、ホルモン療法、生物学的療法、免疫療法または放射線療法などの他の療法と組み合わせて投与することをさらに含む。
【０３９５】
投薬／投与
本開示の抗体、工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートを含む医薬組成物または滅菌組成物を調製するために、抗体／抗体コンジュゲートを薬学的に許容できる担体または賦形剤と混合する。治療剤および診断剤の製剤は、生理的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤と混合して、例えば、凍結乾燥した粉末、スラリー剤、水溶液、ローション剤、または懸濁剤の形態にすることによって調製することができる（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら、（２００１）Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、およびＷｉｌｋｉｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ａｖｉｓら、（編）（１９９３）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｔａｂｌｅｔｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；Ｌｉｅｂｅｒｍａｎら、（編）（１９９０）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ：Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、ＮＹ；ＷｅｉｎｅｒおよびＫｏｔｋｏｓｋｉｅ（２０００）Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ  Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙを参照されたい）。
【０３９６】
治療薬の投与レジメンの選択は、実体の血清または組織ターンオーバー速度、症状のレベル、実体の免疫原性、および生物学的マトリックス内の標的細胞への接近可能性を含めたいくつかの因子に依存する。ある特定の実施形態では、投与レジメンにより、許容できるレベルの副作用と両立して患者に送達される治療薬の量を最大にする。したがって、送達される生物製剤の量は、一部において、特定の実体および治療される状態の重症度に依存する。抗体、サイトカイン、および低分子の適切な用量の選択において手引きが利用可能である（例えば、Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａｋ、１９９６、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂ．Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ；Ｋｒｅｓｉｎａ（編）、１９９１、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ｂａｃｈ（編），１９９３、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ｂａｅｒｔら、２００３、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：６０１〜６０８；Ｍｉｌｇｒｏｍら、１９９９、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１：１９６６〜１９７３；Ｓｌａｍｏｎら、２００１、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４４：７８３〜７９２；Ｂｅｎｉａｍｉｎｏｖｉｔｚら、２０００、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４２：６１３〜６１９；Ｇｈｏｓｈら、２００３、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４８：２４〜３２；Ｌｉｐｓｋｙら、２０００、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４３：１５９４〜１６０２を参照されたい）。
【０３９７】
適切な用量の決定は、臨床医により、例えば、治療に影響を及ぼすことが当技術分野において公知であるもしくはその疑いがある、または治療に影響を及ぼすことが予測されるパラメータまたは因子を使用して成される。一般に、用量を最適用量よりもいくらか少ない量で開始し、その後、あらゆる負の副作用と比較して所望のまたは最適な効果が実現されるまで少量の増加分ずつ増加させる。重要な診断的な測定値としては、例えば炎症の症状、または産生される炎症性サイトカインのレベルの測定値が挙げられる。
【０３９８】
本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬レベルは、特定の患者、組成物、および投与形式について、患者に対して有毒になることなく所望の治療反応を実現するために有効な量の活性成分を得るために変動し得る。選択される投薬レベルは、使用される本開示の特定の組成物またはそのエステル、塩もしくはアミドの活性、投与経路、投与時間、使用される特定の化合物の排出速度、治療の持続時間、他の薬物、化合物および／または使用される特定の組成物と組み合わせて使用する材料、治療される患者の年齢、性別、重量、状態、全体的な健康および以前の病歴、同様に医学の分野で周知の因子を含めた種々の薬物動態因子に左右される。
【０３９９】
本開示の抗体、工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートを含む組成物は、持続注入によって、または、例えば、１日おき、１週間おき、または１週間当たり１〜７回の用量によってもたらすことができる。用量は、静脈内に、皮下に、局所的に、経口的に、経鼻的に、直腸に、筋肉内に、脳内に、または吸入によってもたらすことができる。特定の用量プロトコールは、著しい望ましくない副作用が回避される最大の用量または用量頻度を伴うものである。１週間の総用量は、体重１ｋｇ当たり少なくとも０．０５μｇ、少なくとも０．２μｇ、少なくとも０．５μｇ、少なくとも１μｇ、少なくとも１０μｇ、少なくとも１００μｇ、少なくとも０．２ｍｇ、少なくとも１．０ｍｇ、少なくとも２．０ｍｇ、少なくとも１０ｍｇ、少なくとも１５ｍｇ、少なくとも２０ｍｇ、少なくとも２５ｍｇ、または少なくとも５０ｍｇである（例えば、Ｙａｎｇら、２００３、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４９：４２７〜４３４；Ｈｅｒｏｌｄら、２００２、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：１６９２〜１６９８；Ｌｉｕら、１９９９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈ．６７：４５１〜４５６；Ｐｏｒｔｉｅｌｊｉら、２００３、Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：１３３〜１４４を参照されたい）。用量は、少なくとも１５μｇ、少なくとも２０μｇ、少なくとも２５μｇ、少なくとも３０μｇ、少なくとも３５μｇ、少なくとも４０μｇ、少なくとも４５μｇ、少なくとも５０μｇ、少なくとも５５μｇ、少なくとも６０μｇ、少なくとも６５μｇ、少なくとも７０μｇ、少なくとも７５μｇ、少なくとも８０μｇ、少なくとも８５μｇ、少なくとも９０μｇ、少なくとも９５μｇ、または少なくとも１００μｇであってもよい。対象に投与される用量は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２、またはそれ以上の数になる。
【０４００】
本開示の抗体または工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートについて、患者に投与される投薬量は、患者の体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇであってもよい。投薬量は、患者の体重１ｋｇ当たり０．０００１ｍｇから２０ｍｇの間、０．０００１ｍｇから１０ｍｇの間、０．０００１ｍｇから５ｍｇの間、０．０００１ｍｇから２ｍｇの間、０．０００１ｍｇから１ｍｇの間、０．０００１ｍｇから０．７５ｍｇの間、０．０００１ｍｇから０．５ｍｇの間、０．０００１ｍｇから０．２５ｍｇの間、０．０００１ｍｇから０．１５ｍｇの間、０．０００１ｍｇから０．１０ｍｇの間、０．００１ｍｇから０．５ｍｇの間、０．０１ｍｇから０．２５ｍｇの間または０．０１から０．１０ｍｇの間であってもよい。
【０４０１】
本開示の抗体または工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートの投薬量は、ｍｇ／ｋｇ単位で投与される用量を掛けたキログラム（ｋｇ）単位の患者の体重を用いて算出することができる。本開示の抗体の投薬量は、患者の体重１ｋｇ当たり１５０μｇ以下、１２５μｇ以下、１００μｇ以下、９５μｇ以下、９０μｇ以下、８５μｇ以下、８０μ以下、７５μ以下、７０μ以下、６５μ以下、６０μ以下、５５μ以下、５０μ以下、４５μ以下、４０μ以下、３５μ以下、３０μ以下、２５μ以下、２０μ以下、１５μ以下、１０μ以下、５μ以下、２．５μ以下、２μ以下、１．５μ以下、１μ以下、０．５μ以下、または０．１μ以下であってもよい。
【０４０２】
本開示の工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートの単位用量は、０．１ｍｇ〜２０ｍｇ、０．１ｍｇ〜１５ｍｇ、０．１ｍｇ〜１２ｍｇ、０．１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．１ｍｇ〜８ｍｇ、０．１ｍｇ〜７ｍｇ、０．１ｍｇ〜５ｍｇ、０．１〜２．５ｍｇ、０．２５ｍｇ〜２０ｍｇ、０．２５〜１５ｍｇ、０．２５〜１２ｍｇ、０．２５〜１０ｍｇ、０．２５〜８ｍｇ、０．２５ｍｇ〜７ｍｇ、０．２５ｍｇ〜５ｍｇ、０．５ｍｇ〜２．５ｍｇ、１ｍｇ〜２０ｍｇ、１ｍｇ〜１５ｍｇ、１ｍｇ〜１２ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、１ｍｇ〜８ｍｇ、１ｍｇ〜７ｍｇ、１ｍｇ〜５ｍｇ、または１ｍｇ〜２．５ｍｇであってもよい。
【０４０３】
本開示の抗体、工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートの投薬量により、対象において少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０ｖ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌ／ｍｌ、または少なくとも４００μｇ／ｍｌ／ｍｌの血清力価が実現される。あるいは、本開示の抗体の投薬量により、対象において少なくとも０．１μｇ／ｍｌ、少なくとも０．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１μｇ／ｍｌ、少なくとも、２μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも６μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも２５μｇ／ｍｌ、少なくとも５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１００μｇ／ｍｌ、少なくとも１２５μｇ／ｍｌ、少なくとも１５０μｇ／ｍｌ、少なくとも１７５μｇ／ｍｌ、少なくとも２００μｇ／ｍｌ、少なくとも２２５μｇ／ｍｌ、少なくとも２５０μｇ／ｍｌ、少なくとも２７５μｇ／ｍｌ、少なくとも３００μｇ／ｍｌ、少なくとも３２５μｇ／ｍｌ、少なくとも３５０μｇ／ｍｌ、少なくとも３７５μｇ／ｍｌ、または少なくとも４００μｇ／ｍｌの血清力価が実現される。
【０４０４】
本開示の抗体、工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートの用量を繰り返すことができ、投与は、少なくとも１日、２日、３日、５日、１０日、１５日、３０日、４５日、２カ月、７５日、３カ月、または少なくとも６カ月離れていてもよい。
【０４０５】
特定の患者に対する有効量は、治療される状態、患者の全体的な健康、投与の方法、経路および用量、ならびに副作用の重症度などの因子に応じて変動し得る（例えば、Ｍａｙｎａｒｄら、１９９６、Ａ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  ＳＯＰｓ  ｆｏｒ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．；Ｄｅｎｔ、２００１、Ｇｏｏｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｕｒｃｈ  Ｐｕｂｌ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫを参照されたい）。投与経路は、例えば、局所もしくは皮膚への適用、静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、病巣内への注射もしくは注入によるもの、または持続放出系もしくは埋め込みによるものであってもよい（例えば、Ｓｉｄｍａｎら、１９８３、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７〜５５６；Ｌａｎｇｅｒら、１９８１、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７〜２７７；Ｌａｎｇｅｒ、１９８２、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８〜１０５；Ｅｐｓｔｅｉｎら、１９８５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８〜３６９２；Ｈｗａｎｇら、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４０３０〜４０３４；米国特許第６，３５０４６６号および同第６，３１６，０２４号を参照されたい）。必要であれば、組成物は、注射部位の疼痛を和らげるためにリドカインなどの可溶化剤および局部麻酔薬も含んでもよい。さらに、例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を伴う製剤を使用することによる肺内投与も使用することができる。例えば、それぞれの全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号、および同第４，８８０，０７８号；およびＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１９２４４号、同第ＷＯ９７／３２５７２号、同第ＷＯ９７／４４０１３号、同第ＷＯ９８／３１３４６号、および同第ＷＯ９９／６６９０３号を参照されたい。一実施形態では、本開示の工学的に改変された抗体もしくは工学的に改変された抗体コンジュゲート、併用療法、または組成物を、Ａｌｋｅｒｍｅｓ  ＡＩＲ（商標）ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｌｋｅｒｍｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ）を使用して投与する。
【０４０６】
本開示の組成物は、当技術分野で公知の種々の方法の１つまたは複数を使用して１つまたは複数の投与経路によって投与することもできる。当業者には理解されるように、投与の経路および／または形式は、所望の結果に応じて変動する。本開示の抗体に対して選択される投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊椎または他の非経口投与経路、例えば、注射または注入によるものが挙げられる。非経口投与とは、経腸投与および局所投与以外の投与形式、通常は、注射によるものを示す場合があり、それらとして、これだけに限定することなく、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内への注射および注入が挙げられる。あるいは、本開示の組成物は、局所、表皮のまたは粘膜投与経路などの非経口投与ではない経路によって、例えば、鼻腔内に、経口的に、膣に、直腸に、舌下にまたは局所に投与することができる。
【０４０７】
本開示の抗体、工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートを制御放出系または持続放出系でポンプを使用して投与すれば、制御放出または持続放出を実現することができる（Ｌａｎｇｅｒ、上記；Ｓｅｆｔｏｎ、１９８７、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０；Ｂｕｃｈｗａｌｄら、１９８０、Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０１；Ｓａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５１４を参照されたい）。
【０４０８】
ポリマー材料を使用して、本開示の療法の制御放出または持続放出を実現することができる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、ＬａｎｇｅｒおよびＷｉｓｅ（編）、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＦＩａ．（１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４）；ＲａｎｇｅｒおよびＰｅｐｐａｓ、１９８３、Ｊ．、Ｍａｃｒｏｍｏｌ．ＳｃＬ  Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１；Ｌｅｖｙら、１９８５、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１  ２２５：１９０；Ｄｕｒｉｎｇら、１９Ｚ９、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１；Ｈｏｗａｒｄら、１９８９、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５）；米国特許第５，６７９，３７７号；米国特許第５，９１６，５９７号；米国特許第５，９１２，０１５号；米国特許第５，９８９，４６３号；米国特許第５，１２８，３２６号；ＰＣＴ特許公開第ＷＯ９９／１５１５４号；およびＰＣＴ特許公開第ＷＯ９９／２０２５３号を参照されたい。持続放出製剤に使用するポリマーの例としては、これだけに限定されないが、ポリ（メタクリル酸２−ヒドロキシエチル）、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−ｃｏ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ乳酸−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが挙げられる。一実施形態では、持続放出製剤に使用するポリマーは不活性であり、浸出し得る不純物を含まず、保管の際に安定であり、滅菌されており、かつ生分解性である。制御放出または持続放出系を予防標的または治療標的の近傍に置くことができ、したがって、必要とされるのは全身用量のほんの一部である（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ、ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、上記、２巻、１１５〜１３８頁（１９８４）を参照されたい）。
【０４０９】
制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒ、１９９０、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７〜１５３３による概説において考察されている。当業者に公知の任意の技法を使用して、本開示の１つまたは複数の抗体またはそのコンジュゲートを含む持続放出製剤を作製することができる。例えば、それぞれの全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第４，５２６，９３８号、国際特許公開第ＷＯ９１／０５５４８号、同第ＷＯ９６／２０６９８号、Ｎｉｎｇら、１９９６、「Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｈｙ  ｏｆ  ａ  Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ−Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｇｅｌ」、Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ５９：１７９〜１８９、Ｓｏｎｇら、１９９５、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ−Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ」、ＰＤＡ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ５０：３７２〜３９７、Ｃｌｅｅｋら、１９９７、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｆｏｒ  ａ  ｂＦＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ」、Ｐｒｏ．Ｍｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３〜８５４、およびＬａｍら、１９９７、「Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  Ｌｏｃａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」、Ｐｒｏｃ．Ｍｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９〜１６０を参照されたい。
【０４１０】
本開示の抗体、工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートを局所投与する場合、軟膏剤、クリーム剤、経皮パッチ剤、ローション剤、ゲル剤、シャンプー剤、噴霧剤、エアロゾル剤、溶液、乳剤の形態、または当業者に周知の他の形態に製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＳｃｉｅｎｃｅｓおよびＩｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．（１９９５）を参照されたい。噴霧できない局所剤形については、局所適用と適合し、いくつかの場合には水よりも大きな動的粘性を有する担体または１つまたは複数の賦形剤を含む粘性〜半固体または固体の形態が一般に使用される。適切な製剤としては、限定することなく、溶液、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、軟膏剤、散剤、リニメント剤、膏薬などが挙げられ、所望であれば、これらを、例えば浸透圧などの種々の特質に影響を及ぼすために滅菌することまたは補助剤（例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤、緩衝液、または塩）と混合することができる。他の適切な局所剤形としては、活性成分が、いくつかの場合には固体または液体の不活性な担体と組み合わせて、加圧した揮発性物質（例えば、フレオンなどの気体噴射剤）との混合物中にまたはスクイーズボトル中に包装された噴霧可能なエアロゾル調製物が挙げられる。所望であれば、モイスチャライザーまたは保湿剤も医薬組成物および剤形に加えることができる。そのような追加的な成分の例は当技術分野で周知である。
【０４１１】
抗体、工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートを含む組成物を鼻腔内に投与する場合、エアロゾルの形態、噴霧剤、ミストまたは滴剤の形態に製剤化することができる。特に、本開示に従って使用するための予防剤または治療剤は、適切な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適切なガス）の使用を伴う、加圧したパックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレーによる提供（ａｅｒｏｓｏｌ  ｓｐｒａｙ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）の形態で都合よく送達することができる。加圧エアロゾルの場合では、投薬量単位は、定量を送達するための弁を用意することによって決定することができる。吸入器または吹き入れ器において使用するためのカプセル剤およびカートリッジ（例えばゼラチンで構成される）は、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な散剤基材の散剤混合物を含有するように製剤化することができる。
【０４１２】
第２の治療剤、例えば、サイトカイン、ステロイド、化学療法剤、抗生物質、または放射線を用いて同時投与または治療するための方法は当技術分野で周知である（例えば、Ｈａｒｄｍａｎら、（編）（２００１）ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、第１０版、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；ＰｏｏｌｅおよびＰｅｔｅｒｓｏｎ（編）（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａ．、Ｐａ．；ＣｈａｂｎｅｒおよびＬｏｎｇｏ（編）（２００１）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＷｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈｉｌａ．、Ｐａを参照されたい）。有効量の治療薬により、症状を少なくとも１０パーセント；少なくとも２０パーセント；少なくとも約３０パーセント；少なくとも４０パーセント、または少なくとも５０パーセント減少させることができる。
【０４１３】
本開示の工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートと組み合わせて投与することができる追加的な療法（例えば、予防剤または治療剤）は、本開示の抗体から５分未満離して、３０分未満離して、１時間離して、約１時間離して、約１時間〜約２時間離して、約２時間〜約３時間離して、約３時間〜約４時間離して、約４時間〜約５時間離して、約５時間〜約６時間離して、約６時間〜約７時間離して、約７時間〜約８時間離して、約８時間〜約９時間離して、約９時間〜約１０時間離して、約１０時間〜約１１時間離して、約１１時間〜約１２時間離して、約１２時間〜１８時間離して、１８時間〜２４時間離して、２４時間〜３６時間離して、３６時間〜４８時間離して、４８時間〜５２時間離して、５２時間〜６０時間離して、６０時間〜７２時間離して、７２時間〜８４時間離して、８４時間〜９６時間離して、または９６時間〜１２０時間離して投与することができる。１回の同じ患者の来診で２種以上の療法を投与することができる。
【０４１４】
本開示の抗体、工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートおよび他の療法は、周期的に投与することができる。周期的療法は、第１の療法（例えば、第１の予防剤または治療剤）をある期間にわたって投与し、その後、第２の療法（例えば、第２の予防剤または治療剤）をある期間にわたって投与し、場合により、その後に第３の療法（例えば、予防剤または治療剤）をある期間にわたって投与することなど、および、療法の１つに対する抵抗性の発生を減少させるため、療法の１つの副作用を回避または軽減するため、および／または療法の有効性を改善するためこの逐次的な投与、すなわち、周期を繰り返すことを伴う。
【０４１５】
ある特定の実施形態では、本開示の抗体、工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける適切な分布が確実になるように製剤化することができる。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）により、多くの高親水性化合物が排除される。本開示の治療用化合物がＢＢＢを渡ることを確実にするために（所望であれば）、例えば、リポソーム中に製剤化することができる。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；同第５，３７４，５４８号；および同第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームには特定の細胞または器官に選択的に輸送される１つまたは複数の部分を含めることができ、したがって、標的化薬物送達を増強することができる（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ、１９８９、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照されたい）。例示的な標的化部分としては、以下のものが挙げられる。葉酸またはビオチン（例えば、米国特許第５，４１６，０１６号を参照されたい）；マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８）；抗体（Ｐ．Ｇ．Ｂｌｏｅｍａｎら、１９９５、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓら、１９９５、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０）；サーファクタントタンパク質Ａ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４）；ｐｌ２０（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０）；Ｋ．Ｋｅｉｎａｎｅｎ；Ｍ．Ｌ．Ｌａｕｋｋａｎｅｎ、１９９４、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；Ｋｉｌｌｉｏｎ；Ｆｉｄｌｅｒ、１９９４；Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３も参照されたい。
【０４１６】
本開示は、本開示の抗体、工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートを含む医薬組成物を単独で、または他の療法と組み合わせて、それを必要とする対象に投与するためのプロトコールを提供する。本開示の併用療法の療法（例えば、予防剤または治療剤）は、同時にまたは逐次的に対象に投与することができる。本開示の併用療法の療法（例えば、予防剤または治療剤）を周期的に投与することもできる。周期的療法は、第１の療法（例えば、第１の予防剤または治療剤）をある期間にわたって投与し、その後、第２の療法（例えば、第２の予防剤または治療剤）をある期間にわたって投与し、療法の１つ（例えば、薬剤）に対する抵抗性の発生を減少させるため、療法の１つ（例えば、薬剤）の副作用を回避または軽減するため、および／または療法の有効性を改善するために、この逐次的な投与、すなわち周期を繰り返すことを伴う。
【０４１７】
本開示の併用療法の療法（例えば、予防剤または治療剤）を対象に同時に投与することができる。「同時に」という用語は、療法（例えば、予防剤または治療剤）を正確に同じ時間に投与することに限定されるのではなく、本開示の抗体、工学的に改変された抗体または工学的に改変された抗体コンジュゲートを含む医薬組成物を連続して、本開示の抗体またはそのコンジュゲートが他の療法（複数可）と一緒に作用して、他のやり方で投与した場合よりも利益が増大するような時間間隔内に対象に投与することを意味する。例えば、各療法を対象に同時にまたは異なる時点で任意の順序で逐次的に投与することができるが、同時に投与しない場合には、所望の治療効果または予防効果がもたらされるよう十分に近い時間内に投与されるべきである。各療法を、対象に任意の適切な形態で任意の適切な経路によって別々に投与することができる。種々の実施形態では、療法（例えば、予防剤または治療剤）を対象に、１５分未満、３０分未満、１時間未満離して、約１時間離して、約１時間〜約２時間離して、約２時間〜約３時間離して、約３時間〜約４時間離して、約４時間〜約５時間離して、約５時間〜約６時間離して、約６時間〜約７時間離して、約７時間〜約８時間離して、約８時間〜約９時間離して、約９時間〜約１０時間離して、約１０時間〜約１１時間離して、約１１時間〜約１２時間離して、２４時間離して、４８時間離して、７２時間離して、または１週間離して投与する。他の実施形態では、２つ以上の療法（例えば、予防剤または治療剤）を同じ患者の来診の間に投与する。
【０４１８】
併用療法の予防剤または治療剤は、同じ医薬組成物中で対象に投与することができる。あるいは、併用療法の予防剤または治療剤は、別々の医薬組成物中で同時に対象に投与することができる。予防剤または治療剤は、同じ投与経路または異なる投与経路によって対象に投与することができる。
【０４１９】
キット
本発明は、本明細書に記載の抗体のいずれかまたは全てを含むキットも提供する。本発明のキットは、本明細書に記載のＰＤＧＦ−Ｂ抗体および本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従った使用説明書を含む１つまたは複数の容器を含む。一般に、これらの説明書は、上記の治療的処置のために抗体を投与することについての記載を含む。いくつかの実施形態では、単回用量の投与単位を作製するためのキットが提供される。ある特定の実施形態では、キットは、乾燥したタンパク質を有する第１の容器と水性製剤を有する第２の容器を含有してもよい。ある特定の実施形態では、アプリケーター、例えば、単一チャンバーの充填済みシリンジおよびマルチチャンバーの充填済みシリンジ（例えば、液体シリンジ（ｌｉｑｕｉｄ  ｓｙｒｉｎｇｅ）および分散シリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットが含まれる。
【０４２０】
いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。ＰＤＧＦ−Ｂ抗体の使用に関する説明書は、一般に、意図された治療についての投薬量、投薬スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルク包装（例えば、複数回用量包装）または亜単位用量であってもよい。本発明のキット内に供給される説明書は、一般には、ラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙のシート）上の使用説明書であるが、機械可読の説明書（例えば、磁気保存ディスクまたは光学保存ディスク上に保有される説明書）も許容できる。
【０４２１】
本発明のキットは、適切に包装されている。適切な包装としては、これだけに限定されないが、バイアル、ビン、ジャー、柔軟な包装（例えば、密閉Ｍｙｌａｒまたはプラスチックバッグ）などが挙げられる。吸入器、経鼻投与デバイス（例えば、噴霧器）または注入デバイス、例えばミニポンプなどの特定のデバイスと組み合わせて使用するための包装も企図されている。キットは滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で穴をあけることができる止め栓を有するバイアルであってもよい）。容器は、滅菌アクセスポートも有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針で穴をあけることができる止め栓を有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明のＰＤＧＦ−Ｂ抗体である。容器は、第２の薬学的に活性な薬剤をさらに含んでもよい。
【０４２２】
キットにより、緩衝液および説明的情報などの追加的な構成要素が、場合により提供され得る。通常、キットは、容器および容器に接したまたは付随するラベルまたは添付文書（複数可）を含む。
【０４２３】
本発明は、本明細書に記載の抗体のいずれかまたは全てを含む診断用キットも提供する。診断用キットは、例えば、試料中のＰＤＧＦ−Ｂの存在を検出するために有用である。いくつかの実施形態では、診断用キットを使用して、ＰＤＧＦ−Ｂに媒介される疾患、障害または状態を発症するリスクがあるとみなすことができる潜在的な疾患、障害または状態を有する個体を同定することができる。いくつかの実施形態では、診断用キットを使用して、個体にブドウ球菌による疾患のリスクがあるかどうかを決定することができる。いくつかの実施形態では、診断用キットを使用して、ＰＤＧＦ−Ｂに媒介される疾患を有する疑いがある個体におけるＰＤＧＦ−Ｂの存在および／またはレベルを検出することができる。
【０４２４】
本発明の診断用キットは、本明細書に記載のＰＤＧＦ−Ｂ抗体および本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従った使用説明書を含む１つまたは複数の容器を含む。一般に、これらの説明書は、ＰＤＧＦ−Ｂに媒介される疾患のリスクがある、またはそれを有する疑いがある個体におけるＰＤＧＦ−Ｂの存在を検出するためのＰＤＧＦ−Ｂ抗体の使用についての記載を含む。いくつかの実施形態では、例示的な診断用キットを、例えば、ＰＤＧＦ−Ｂ抗体などの試薬、陰性対照試料、陽性対照試料、およびキットを使用するための指示書を含有するように形作ることができる。
【０４２５】
生物寄託
本発明の代表的な材料はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０〜２２０９、ＵＳＡに２０１２年１１月６日に寄託された。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０３を有するベクターＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨは、生殖系列化されたＭＯＲ８４５７重鎖可変領域をコードするＤＮＡインサートを含み、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１３３０２を有するベクターＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬは、生殖系列化されたＭＯＲ８４５７軽鎖可変領域をコードするＤＮＡインサートを含む。寄託はＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｂａｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐｏｓｉｔ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｕｒｐｏｓｅ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ａｎｄ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  ｔｈｅｒｅｕｎｄｅｒ（ブタペスト条約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ  Ｔｒｅａｔｙ））のブタペスト条約の規定の下で行われた。これにより、寄託された生存可能な培養物の維持が寄託日から３０年にわたって保証される。寄託は、ＡＴＣＣにより、ブタペスト条約の条項の下で利用可能になり、Ｐｆｉｚｅｒ  ＩｎｃとＡＴＣＣの間の合意の下に置かれ、それにより、どちらが最初であっても関係する米国特許または外国特許出願の公開に際して公共への寄託物の培養物の後代の恒久的かつ制限のない利用可能性が保証され、また、Ｕ．Ｓ．  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ  ｏｆ  Ｐａｔｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅｍａｒｋｓにより３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １２２およびそれに準ずるＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎｅｒ’ｓ  ｒｕｌｅｓ（３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  １．１４、特に８８６ＯＧ６３８の参照を伴う）に従って権利が与えられると決定されたものに対する後代の利用可能性が保証される。
【０４２６】
本出願の指定代理人は、材料の培養物が適切な条件下で培養されている場合に寄託の際に死滅または遺失または破壊された場合には、届け出てその材料を同じものの別のものと即座に取り換えることに同意している。寄託された材料の利用可能性は、あらゆる政府の当局の下でその特許法に従って認められた権利に違反して本発明を実践することの認可であると解釈されない。
【０４２７】
等価物
上記の明細書は、当業者による本開示の実践を可能にするために十分であると考えられる。前述の記載および例では、本開示のある特定の例示的な実施形態が詳述されている。しかし、本文中に出現し得る前述のものがいかに詳述されていても、多くのやり方で本開示を実践することができ、また、本開示は、添付の特許請求の範囲およびあらゆるその等価物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
【０４２８】
特許、特許出願、紙、教科書など、およびそこに引用されている参考文献を含めた、本明細書において引用された全ての参考文献は、まだ組み入れられていなければ、これによりその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０４２９】
例示的な実施形態
本発明を、以下の実験的な例を参照することによりさらに詳細に記載する。これらの実施例は、単に例示するために提供され、別段の指定がない限り、限定を意図するものではない。したがって、本発明は、決して以下の実施例に限定されるものと解釈されるべきではなく、本明細書において提供される教示の結果として明らかになる任意のかつ全ての変形を包含するものと解釈されるべきである。
【実施例】
【０４３０】
（実施例１）
ＨｕＣＡＬ（登録商標）ライブラリーからの抗体生成
ＰＤＧＦ−ＢＢに対する治療用抗体を生成するために、ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ  ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージミドライブラリーを用いた選択を行った。ファージミドライブラリーはＨｕＣＡＬ（登録商標）ｃｏｎｃｅｐｔ（Ｋｎａｐｐｉｋら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２０００、２９６；５７〜８６）に基づき、ファージ表面上にＦａｂを提示するためにＣｙｓＤｉｓｐｌａｙ（商標）技術を使用する（Ｌｏｈｎｉｎｇ、２００１  ＷＯ０１／０５９５０）。フレームワークが異なるＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）抗体−ファージを組み合わせて１つのプール（ＶＨ１〜６）を形成するか、またはサブプール（例えば、ＶＨ１／５、ＶＨ２／４／６、ＶＨ３）に分け、その後、これらのサブプールを下記の通り抗原に対する選択ラウンドに個別に供した。インラインの親和性成熟カッパおよびラムダファージに対しても使用したこれらのファージプールを別々にしておいた。パニングの最初のラウンド用のファージをＨｙｐｅｒｐｈａｇｅ（Ｍ１３ＫＯ７ΔｐＩＩＩ、Ｐｒｏｇｅｎ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって調製した。
【０４３１】
ＰＤＧＦ−ＢＢに対する固相パニング
組換えヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（ＰＨＧ００４３、Ｌｏｔ  ０３２００１；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔ．Ｉｎｃ）を使用して固相パニングを実施した。パニングの３回のラウンドの全てについて、ＰＢＳ中に希釈した４００ｎＭ（１０μｇ／ｍｌ）のｈＰＤＧＦ−ＢＢをＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｆ９６  Ｍａｘｉｓｏｒｐ（商標）、４４２４０２、Ｎｕｎｃ）上の適切な数のウェルに満たした。
【０４３２】
次いで、それぞれのプレートを４℃で一晩インキュベートした。次の日に、ウェルをＰＢＳで２回洗浄し、次いで、ＭＰＢＳＴ（５％（ｗ／ｖ）粉乳、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ））を用いて室温（ＲＴ）で２時間ブロッキングした。元のＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）サブプール（ＶＨ１〜６、ＶＨ１／５およびＶＨ３、ｈｙｐｅｒｐｈａｇｅを用いて調製したもの）由来のファージ（１００μｌ）を使用した。ファージを２．５％粉乳、２．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ溶液中にプレブロッキングした。ファージのプレブロッキングは２ｍｌの反応チューブ中、回転器においてＲＴで２時間にわたって実施した。
【０４３３】
ＰＤＧＦ−ＡＡファージに結合しなかった抗体を選択するために、各サブプールを、並列手法で、１０倍モル過剰のＰＤＧＦ−ＡＡ（ＰＨＧ００３５、Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔ．Ｉｎｃ．）、２．５％粉乳、２．５％ＢＳＡおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ溶液中にプレブロッキングした。
【０４３４】
選択プロセスのために、抗原溶液をプレートから除去、ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。プレブロッキングしたファージを対応するウェルに添加し、プレートをマイクロプレート振とう機においてＲＴで２時間インキュベートした。次いで、ファージ溶液を除去し、ウェルをＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で数回洗浄し（洗浄ストリンジェンシーはパニング戦略および選択ラウンドに依存した）、その後、ＰＢＳを用いた同じ洗浄ステップを行った。洗浄ストリンジェンシーをラウンドごとに増大させた。最後の洗浄ステップ後にＰＢＳを除去し、その後、溶出を続けた。特異的に結合したファージを溶出させるために、１０ｍＭのトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０中、２０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加え、試料をＲＴで１０分インキュベートした。溶出液を使用して対数期の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１培養物に感染させた。感染した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を遠心分離によって回収し、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１％グルコースを補充したＬＢ寒天プレートにプレーティングした。寒天プレートを３０℃で一晩インキュベートした。次の日に、コロニーをこすり取り、続いてヘルパーファージ感染させるためにＤ６００が０．５に達するまで成長させた。
【０４３５】
ヘルパーファージ感染：ＴＧ１細胞にヘルパーファージＶＣＳＭ１３（少なくとも２０の感染多重度）を３７℃で感染させた。感染細胞を遠心分離によって回収し、Ｆａｂ発現を誘導するために、生じたファージを、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンおよび０．２５ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を含有する２×ＹＴ培地に再懸濁させた。細胞を一晩成長させ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）／ＮａＣｌを用いて上清から沈殿させ、ファージをＰＢＳ中に再懸濁させた。インプット力価およびアウトプット力価を点力価測定（ｓｐｏｔ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）によって決定した。
【０４３６】
ＰＤＧＦ−ＢＢに対する溶液パニング
選択のために使用する全てのチューブを、ＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてプレブロッキングした。ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージを、ＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲ（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてブロッキングし、Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）に２回予備吸着させた。プレブロッキングしたファージおよびビオチン化したＰＤＧＦ−ＢＢ（ビオチン−ＰＤＧＦ−ＢＢ）抗原を２ｍｌのチューブ中、回転器においてＲＴで２時間インキュベートした。第１の選択ラウンドについては、１００ｎＭのビオチン−ｈＰＤＧＦ−ＢＢをビーズカップリングのために使用した。第２のパニングラウンドおよび第３のパニングラウンドを、１０ｎＭのビオチン−ｈＰＤＧＦ−ＢＢを使用して実施した。これらのパニングのために、競合剤としてＰＤＧＦ−ＡＡを使用し、ファージをプレブロッキングするために１０倍モル過剰のＰＤＧＦ−ＡＡで使用した。
【０４３７】
予備吸着させたＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）をファージ−抗原溶液に添加し、回転器においてＲＴでさらに１０分インキュベートした。磁気粒子分離器、ＭＰＣ−Ｅ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｏｓｌｏ、Ｎｏｒｗａｙ）を使用して、捕捉された抗原に結合したファージを分離した。ビーズをＰＢＳＴ（ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で数回洗浄し、その後、ＰＢＳを用いたいくつかの洗浄ステップを行った。洗浄ストリンジェンシーをパニングラウンドごとに増大させた。最後の洗浄ステップ後にＰＢＳを除去し、その後、溶出を続けた。固相パニングについて記載されている通り溶出およびさらなるステップを実施した。
【０４３８】
ＲａｐＭＡＴ（商標）技術を使用したインラインの親和性成熟
ＰＤＧＦ−ＢＢに結合する富化されたＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）Ｆａｂの親和性が改善された特異的抗体を得るために、上記の溶液パニングの第２のラウンドの出力ファージをＬＣＤＲ３多様化のために使用した。第２のラウンドのパニングプール由来のＦａｂ断片をコードするファージディスプレイベクターのプラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ番号１２２４３）を使用することによって調製した。ＬＣＤＲ３  ＲａｐＭＡＴ（商標）−ライブラリーについては、ＢｂｓＩおよびＳｐｈＩを用いてＤＮＡを切断し、それにより、ＬＣＤＲ３−ＣＬインサートを放出させ、１％アガロースゲル上で分離した。ＨＣＤＲ２  ＲａｐＭＡＴ（商標）−ライブラリーを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いてＤＮＡを切断し、したがって、ＨＣＤＲ２−ＣＨインサートを放出させ、それも同様に１％アガロースゲル上でベクター骨格から分離することによって実施した。
【０４３９】
ｐＭＯＲＰＨ（登録商標）２３ベクター骨格（約４６５０ｂｐ）の予期されるバンドをゲルから切除し、Ｅａｓｙ  Ｐｕｒｅ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｚｙｍｅ；Ｃａｔ番号３９０００１）を使用して精製した。ベクター骨格を、ＨｕＣＡＬ（登録商標）カッパまたはラムダ軽鎖ＣＤＲカセットまたはＨｕＣＡＬ（登録商標）重鎖ＣＤＲカセットと、それぞれ１：４のモル比でライゲーションした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０Ｆエレクトロコンピテント細胞をライゲーション試料で形質転換した。ＨＣＤＲ２ライブラリーおよびＬＣＤＲ３ライブラリーの増幅のために、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１％グルコースを含有する２×ＹＴ培地を形質転換された細胞に接種し、培養物をＯＤ６００ｎｍが１．５〜２．０に達するまで成長させた。細胞をペレットにし、グリセロール培地に再懸濁させた。生成したカッパライブラリーおよびラムダライブラリーのファージを使用前に混合した。ファージのプレブロッキングをブロッキング溶液（ＰＢＳ、１０％粉乳、１０％ＢＳＡ、１０％ヒトトランスフェリン、および０．２％Ｔｗｅｅｎ２０）中で行った。溶液パニングの第３のラウンドおよび第４のラウンドを上記の通り行った。高親和性抗体を富化するために、第３のラウンドではビーズカップリングのために０．５ｎＭのビオチン−ＰＤＧＦ−ＢＢを使用し、第４のラウンドでは０．０２５ｎＭのビオチン−ＰＤＧＦ−ＢＢを使用することにより、ビオチン−ＰＤＧＦ−ＢＢの抗原濃度を低下させた。洗浄ストリンジェンシーは増大させた。
【０４４０】
選択されたＦａｂ断片のサブクローニングおよび微小発現（ｍｉｃｒｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
可溶性Ｆａｂの急速な発現を容易にするために、選択されたＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ファージのＦａｂをコードするインサートを、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩによって発現ベクターｐＭＯＲＰＨ（登録商標）Ｘ９＿ＭＨにサブクローニングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１  Ｆ細胞を発現プラスミドで形質転換した後、クロラムフェニコール抵抗性の単一のクローンを選び取って、２×ＹＴ培地（３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１％グルコースを補充したもの）を予め満たした滅菌３８４ウェルマイクロタイタープレートのウェルに入れ、３７℃で一晩成長させた。これらのプレートをマスタープレートとみなした。マスタープレートを−８０℃で保管する前に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１  Ｆ培養物を新しい、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび０．１％グルコースを補充した２×ＹＴ培地をウェル当たり４０μｌで予め満たした滅菌３８４ウェルマイクロタイタープレートに接種した。マイクロタイタープレートを、３０℃、マイクロプレート振とう機において４００ｒｐｍで振とうしながら、培養物がわずかに混濁し、ＯＤ６００ｎｍが約０．５になるまで（約２〜４時間）インキュベートした。これらのプレートを発現プレートとみなし、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび５ｍＭのＩＰＴＧを補充した２×ＹＴ培地１０μｌをウェルごとに添加した（最終濃度１ｍＭのＩＰＴＧ）、マイクロタイタープレートを気体透過性テープで密閉し、３０℃、４００ｒｐｍで振とうしながら一晩インキュベートした。全細胞溶解物（ＢＥＬ抽出物）の生成：発現プレートの各ウェルに、ＢＥＬ緩衝液１５μｌを加え、マイクロタイタープレート振とう機（４００ｒｐｍ）において２２℃で１時間インキュベートした。ＢＥＬ緩衝液：２．５ｍｇ／ｍｌのリゾチームを補充した２４．７ｇ／ｌのホウ酸、１８．７ｇのＮａＣｌ／ｌ、１．４９ｇのＥＤＴＡ／ｌ、ｐＨ８．０。
【０４４１】
（実施例２）
ＰＤＧＦ−ＢＢ陽性クローンのスクリーニング
ＰＤＧＦ−ＢＢ陽性クローンを、抗原結合についてＥＬＩＳＡを使用して、ならびに並行して機能的なＰＤＧＦ−ＢＢ阻害活性について受容体阻害アッセイを使用してクローンをスクリーニングすることによって同定した。
【０４４２】
方法
直接コーティングしたＰＤＧＦ−ＢＢに対するスクリーニング
Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロタイタープレートを一晩コーティングするためにヒトＰＤＧＦ−ＢＢを４℃、５μｇ／ｍｌの濃度で（ＰＢＳ中に希釈した）使用した。一晩インキュベートした後、コーティングしたプレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、５％ＭＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ中５％粉乳）を用いてマイクロプレート振とう機においてＲＴで１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴで２回洗浄した後、一次抗体を添加した（微小発現させたＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂの粗抽出物、精製されたＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ、対照抗体Ｆａｂ＿ＭＯＲ０７２９５）。一次抗体を含有するプレートをマイクロプレート振とう機においてＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで２回洗浄し、ＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂを検出するために、二次抗体（ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）２断片特異的−ＡＰ標識、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｃａｔ番号１０９〜０５５−０９７）を添加し、０．５％ＭＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ中０．５％粉乳）中１：５０００に希釈した。二次抗体を含有するプレートをマイクロプレート振とう機においてＲＴで１時間インキュベートした。ウェルをＴＢＳＴ（ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、Ａｔｔｏｐｈｏｓ（ＡｔｔｏＰｈｏｓ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｅｔ、Ｒｏｃｈｅ、ＣＡＴ番号１１６８１９８２００１）を添加し（水中１：１０希釈）、４３０ｎｍにおける励起を用いて５３５ｎｍにおける蛍光発光を記録した。
【０４４３】
ビオチン化したＰＤＧＦ−ＢＢを使用した捕捉スクリーニング
Ｍａｘｉｓｏｒｐ（Ｎｕｎｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ、ＵＳＡ）３８４ウェルプレートを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１：１０００に希釈したヒツジ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｄ断片特異的抗体２０μｌを用いて４℃で１６時間コーティングした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、次いで、５％ＭＰＢＳＴ（ＰＢＳＴ中５％粉乳）を用い、マイクロプレート振とう機においてＲＴで１時間ブロッキングした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄した後に一次抗体を添加し（微小発現させたＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂの粗抽出物、精製されたＨｕＣＡＬ（登録商標）Ｆａｂ、対照抗体Ｆａｂ＿ＭＯＲ０７２９５）、マイクロプレート振とう機においてＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、ビオチン−ＰＤＧＦ−ＢＢ抗原（ＰＢＳ中、０．５μｇ／ｍｌに希釈したもの）をマイクロプレート振とう機においてＲＴで１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で２回洗浄し、その後、ストレプトアビジン−ＡＰ、（Ｚｙｍｅｄ；ＣＡＴ番号４３〜８３２２；Ｌｏｔ：５１１０２０９９；０．５％ＭＰＢＳ中１：２０００に希釈したもの）をマイクロプレート振とう機においてＲＴで１時間インキュベートした。最後に、ウェルをＴＢＳＴ（ＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で５回洗浄し、Ａｔｔｏｐｈｏｓ（ＡｔｔｏＰｈｏｓ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｅｔ、Ｒｏｃｈｅ、Ｃａｔ番号１１６８１９８２００１）を添加し（ｄｄＨ２０中１：１０に希釈したもの）、４３０ｎｍにおける励起を用いて５３５ｎｍにおける蛍光発光を記録した。
【０４４４】
受容体阻害アッセイを使用した機能スクリーニング
３８４ウェルＭＳＤプレートを、２．５μｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−Ｒβ−Ｆｃ融合タンパク質（Ｃａｔ番号３８５−ＰＲ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて４℃で一晩コーティングした。次に、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）粗抽出物２０μｌを、ＢＶ緩衝液（ＰＢＳ／０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０／０．５％ＢＳＡ）中に希釈した３０ｎｇ／ｍｌのビオチン−ＰＤＧＦ−ＢＢ、２０μｌと一緒にマイクロプレート振とう機においてＲＴで１時間プレインキュベートした。ＭＳＤプレートをＢＶ緩衝液５０μｌで３回洗浄し、その後、プレインキュベートした粗抽出物：ビオチン−ＰＤＧＦ−Ｂ複合体を移した。プレートをマイクロプレート振とう機においてＲＴで１時間インキュベートし、その後、ＢＶ緩衝液を用いて３回洗浄した。プレートを、ストレプトアビジン−ＢＶ（ＢＶ緩衝液中１：４００に希釈したもの）を使用して３７℃で１時間インキュベートし、その後、ＢＶ緩衝液でさらに３回洗浄し、ＭＳＤ読み取り緩衝液対照である界面活性剤（ＭＳＤ、ｄＨ２Ｏ中１：４に希釈されたもの）３０μｌを添加した。ＭＳＤ  ＭＡ６０００デバイスを使用して検出を実施した。
【０４４５】
結果
全体で、９５６８の一次ヒットを、抗原結合についてＥＬＩＳＡを使用して、および並行してＰＤＧＦ−ＢＢ／ＰＤＧＦＲβ−Ｆｃ結合の阻害についてスクリーニングした。結合アッセイでは、６００８の一次ＥＬＩＳＡヒット（全てのパニング戦略からのもの）はバックグラウンドに対して５倍のシグナルを示した。これらのうちの２９４９の一次ヒットは、受容体結合阻害アッセイにおいて８０％超阻害活性のシグナルを示した。これらのヒットを、それらのＥＬＩＳＡ活性に基づいて順位付けし、５４０クローンを可変領域の配列決定のために選択した。配列分析により、１６８の独特の配列が生じた。
【０４４６】
（実施例３）
ＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ＦａｂおよびＩｇＧの特徴付け
選択されたＨｕＣＡＬ  ＧＯＬＤ（登録商標）ＦａｂおよびＩｇＧを、下記のいくつかのアッセイを使用して、ならびに実施例２に記載の通りＥＬＩＳＡ技法を用いてさらに特徴付けた。
【０４４７】
方法
ＫＤの決定のための溶液平衡力価測定（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）（ＳＴＥ）法および交差反応性試験
溶液中での親和性の決定を文献に記載の通り実施した（Ｆｒｉｇｕｅｔら、１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７７：３０５〜３１９）。ＳＥＴ法の感度および正確度を改善するために、古典的なＥＬＩＳＡから電気化学発光（ＥＣＬ）に基づくＢｉｏＶｅｒｉｓ技術（Ｈａｅｎｅｌら、２００５、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３９：１８２〜１８４）に移行した。ヤギ抗ヒト（Ｆａｂ）２またはヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃ断片特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、ＢＶ−ｔａｇ（商標）ＮＨＳ−Ｅｓｔｅｒ（Ｂｉｏｖｅｒｉｓ  Ｅｕｒｏｐｅ、Ｗｉｔｎｅｙ、Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を製造者の説明書に従って用いて標識した。ポリプロピレンマイクロタイタープレート、アッセイ緩衝液として０．５％ＢＳＡおよび０．０２％のＴｗｅｅｎ２０を伴うＰＢＳ、ｐＨ７．４中で実験を行った。標識されていない抗原を４ｎシリーズに希釈した。抗原を伴わないウェルを使用してＳｍａｘ値を決定した。１００ｐＭのＦａｂまたはＩｇＧ（最終体積７５μＬ中の最終濃度）を添加した後、混合物をＲＴで２時間インキュベートした。その後、０．２５μｇ／ｍｌのビオチン化した抗原をコーティングしたＤｙｎａｂｅａｄｓ（０．４ｍｇ／ｍｌのＭ−２８０ストレプトアビジン、ＤＹＮＡＬ、Ｈａｍｂｕｒｇ）２５μｌと、最終希釈度が抗ヒトＦａｂについて１：４０００または抗マウスＩｇＧについて１：２０００であるＢＶ−ｔａｇで標識された検出抗体との混合物をウェルごとに添加した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｓｈａｋｅｒ（７００ｒｐｍ）においてＲＴで３０分インキュベートした後、Ｍ−３８４ＳＥＲＩＥＳ（登録商標）Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（Ｂｉｏｖｅｒｉｓ  Ｅｕｒｏｐｅ）を使用してＥＣＬシグナルを検出した。Ｏｒｉｇｉｎ５．０（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）ソフトウェアを用い、カスタマイズされたフィッティングモデルを適用してデータを評価した（Ｆａｂについて：Ｈａｅｎｅｌら、２００５；ＩｇＧについて：Ｐｉｅｈｌｅｒら、１９９７）。
【０４４８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＨｕＣＡＬ−Ｆａｂ抗体の発現および精製
ＴＧ−１  Ｆ細胞におけるｐＭＯＲＰＨＸ９＿ＦＨによりコードされるＦａｂ断片の発現を、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを補充した２×ＴＹ培地１ｌを伴う振とうフラスコ培養物で行った。０．５ｍＭのＩＰＴＧを用いた誘導後、細胞を３０℃で２０時間成長させた。細胞ペレットの全細胞溶解（リゾチーム）を調製し、Ｆａｂ断片をＨＴ−ＩＭＡＣ−精製によって単離した。見かけの分子量を、較正標準を用い、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定した。濃度をＵＶ−分光測定によって決定した。
【０４４９】
ＰＡＥ−ＰＤＧＦ−Ｒβリン酸化アッセイ
ＰＤＧＦ−ＢＢリガンドによるＰＤＧＦ−Ｒβ受容体リン酸化を、培地（１０％ＦＢＳ（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｌｏｔ  Ｐ２５０１１２）、２ｍＭのＬ−グルタミン（ＰＡＡ、Ｃａｔ番号Ｐ０４〜８０１００）および５００μｇ／ｍのジェネテシン（ＰＡＡ；Ｃａｔ番号Ｐ１１〜０１２）を補充した、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ；Ｃａｔ番号２１７６５）を伴うＦ１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｈａｍ培地）で培養した、ＰＤＧＦ−Ｒβで安定にトランスフェクトしたＰＡＥ細胞を使用して分析した。アッセイを開始する前日に、ウェル当たり細胞５×１０５個を９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃｌｏｎ＃１６７００８）に播種した。６時間後に、培地を飢餓培地（培地対照、０．１％ＦＢＳ）と交換し、一晩インキュベートした。次の日に、異なる濃度の抗体（３０ｎｍ〜１．５ｐＭ）を、飢餓培地中に希釈した０．４ｎＭのＰＤＧＦ−ＢＢ（最終濃度）と一緒にプレインキュベートした。細胞の上清を廃棄し、抗体：ＰＤＧＦ−ＢＢ複合体を細胞に添加した。３７℃（インキュベーター内）で正確に１０分置いた後、細胞を氷冷のＰＢＳで１回洗浄し、その後、ＭＳＤ細胞溶解緩衝液を使用して細胞溶解を行った。ＰＤＧＦ−ＲβのＴｙｒ７５１のリン酸化を、ＭＳＤ  Ｍｕｌｔｉｓｐｏｔ  ＰＤＧＦＲｂｅｔａ  ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓｋｉｔ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を製造者のプロトコールを用いて使用して数量化した。
【０４５０】
親和性の決定（Ｂｉａｃｏｒｅ）
反応速度定数であるｋｏｎおよびｋｏｆｆを、共有結合によって固定化された抗原ＰＤＧＦ−ＢＢに結合したそれぞれのＦａｂの段階希釈物を用い、ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｂｉａｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して決定した。共有結合による抗原固定化のために標準のＥＤＣ−ＮＨＳアミンカップリング化学を使用した。ＰＢＳ（１３６ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．７６ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）中、毎分２０μｌの流速で、１．５〜５００ｎＭのＦａｂ濃度範囲を使用してカイネティクス測定を行った。各濃度についての注射時間は１分であり、その後、解離段階が３分であった。再生のために、１０ｍＭのＨＣｌ、５μｌを使用した。全てのセンサーグラムを、ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ３．１（Ｂｉａｃｏｒｅ）を使用してフィッティングした。
【０４５１】
結果
結合および特異性
１６８の独特のクローンを全てＳＥＴ親和性順位付けのために使用し、ＭＯＲ０７２９５１１対照クローンと比較した。最良の親和性を有する４１クローン（配列多様性およびパニング起源を考慮して選択したもの）を強化のために選択した。Ｆａｂを発現させ精製した後、３７クローンが品質管理基準を通り、それらをさらに試験した。
【０４５２】
３７のＦａｂの全てがヒトＰＤＧＦ−ＢＢ（ｈＰＤＧＦ−ＢＢ）に特異的であり、マウスＰＤＧＦ−ＢＢ（ｍＰＤＧＦ−ＢＢ）に対して交差反応性であった。ＥＬＩＳＡによると３７のＦａｂの中でＰＤＧＦ−ＡＡへの結合を示したものはなかった。
【０４５３】
阻害活性
３７のＦａｂの全てを、それらの阻害活性について受容体リン酸化アッセイで試験した。安定にトランスフェクトされたＰＡＥ  ＰＤＧＦ−Ｒβ細胞はＰＤＧＦ−β受容体を構成的に発現し、ＰＤＧＦ−ＢＢにより刺激され、それによりＴｙｒ７５１位での受容体リン酸化が生じ得る。リン酸化を検出するために、特異的な抗Ｐ−Ｔｙｒ７５１抗体によってＰ−Ｔｙｒ７５１を検出することに基づいてＰｈｏｓｐｈｏ−ＰＤＧＦＲｂｅｔａ  ｋｉｔ（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）を使用した。
【０４５４】
力価測定を行うＦａｂの数を絞り込むために、３７種の抗体の全てを最初に４つの濃度のみでリン酸化活性を阻害するそれらの能力について試験した。これらのうち、３つのＦａｂは活性が低いと決定され、したがって、３４／３７のＦａｂを完全な力価測定のために使用した。
【０４５５】
Ｆａｂの完全な力価測定を、６０ｎＭから２７ｐＭまで、または１０ｎＭから１３ｐＭまで、１：３ステップで実施し、４００ｐＭ（１０ｎｇ／ｍｌ）のＰＤＧＦ−ＢＢをプレインキュベートするために使用し、その結果、理論的なアッセイ感度限界２００ｐＭがもたらされた。３連の平均値をＩＣ５０決定のために使用した。
【０４５６】
【表２】
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【０４５７】
リン酸化アッセイ、および生化学的受容体結合阻害アッセイからのデータを使用して、Ｆａｂのパネルを３７から１６までに絞り込んだ。これらのうち４つのＦａｂ：ＭＯＲ８４５７、ＭＯＲ８４９４、ＭＯＲ８４８７およびＭＯＲ８４８８がＮＩＨ３Ｔ３細胞の増殖を一貫して阻害した。リード配列をさらに絞り込んで、遊離のシステイン、およびＡｓｐ−Ｐｒｏ切断部位などの潜在的な化学的障害を含有するものを除去した。
【０４５８】
したがって、上の実施例１〜３に記載されている手順を使用して、本明細書に記載されているＭＯＲ８４５７と名付けた抗体およびそのバリアントを含めた、いくつかの完全ヒト抗ＰＤＧＦ−ＢＢ  ＩｇＧ抗体を産生した。
【０４５９】
ＭＯＲ８４５７重鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＹＩＳＤＤＧＳＬＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＨＰＹＷＹＧＧＱＬＤＬＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号１）
である。
【０４６０】
ＭＯＲ８４５７軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、
ＳＹＥＬＴＱＰＰＳＶＳＶＡＰＧＱＴＡＲＩＳＣＳＧＤＳＬＧＳＹＦＶＨＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＶＬＶＩＹＤＤＳＮＲＰＳＧＩＰＥＲＦＳＧＳＮＳＧＮＴＡＴＬＴＩＳＧＴＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＡＦＴＨＮＳＤＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ（配列番号２）
である。
【０４６１】
（実施例４）
全長ＩｇＧの発現
全長ＩｇＧを発現させるために、重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変ドメイン断片をＦａｂ発現ベクターからヒトＩｇＧとして発現させるために適切なベクターにサブクローニングした。いくつかの場合には、抗ＰＤＧＦ−ＢＢ抗体の重鎖または軽鎖の可変領域をコードする合成ＤＮＡインサートを商業的な遺伝子合成によって創出した。断片を、ヒトまたはマウス定常領域とインフレームで一過性発現のための発現ベクターにサブクローニングした。適用に応じて、定常領域は、ヒト野生型ＩｇＧ２（配列番号２２）、野生型ヒトＩｇＧ１（配列番号１９）、「ＩｇＧ１−３ｍ」と称される、エフェクター機能が除かれるように標的化変異させたヒトＩｇＧ１（配列番号２１）、またはマウスＩｇＧ１（配列番号２０）からなった。いくつかの場合には、生殖系列化されたＭＯＲ８４５７  ＶＬ（配列番号４）を含み、偶発性の配列変更であって、ＰＣＲのクローニングによるエラーの結果としてアミノ酸配列ＴＬＶがＩＫＲで置換された配列変更を軽鎖定常ドメインにさらに含む軽鎖を用いてＭＯＲ８４５７を構築した。生殖系列化されたＭＯＲ８４５７  ＶＬおよびＩＫＲ変異を含む軽鎖定常ラムダドメインを含む全長軽鎖を「ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＩＫＲ−ＬＣ」と名付けた（配列番号１７）。本明細書では「ＩＫＲ」変異を含む軽鎖定常ドメインを含む抗体はいずれも、その名前に「ＩＫＲ」を含めることによって名付けられる。したがって、生殖系列化されたＭＯＲ８４５７  ＶＬ配列（配列番号４）を含み、定常ドメインにＩＫＲ配列変更を含む定常ドメイン（配列番号１７）をさらに含む軽鎖を含み、かつ、生殖系列化されたＭＯＲ８４５７  ＶＨ（配列番号６）を含み、定常領域にヒトＩｇＧ１三重エフェクターヌル変異をさらに含む（配列番号１４）重鎖を含む抗体は、本明細書では、抗体「ＭＯＲ−８４５７−ＧＬ−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍ」と称される。少なくとも１つの生殖系列化されたＶドメインを含む抗体は本明細書では「ＧＬ」の名称で呼ばれ、また、生殖系列化されたドメインを含まない抗体のいずれの名称にもその名前は含まれない。抗体が「ＧＬ」と名付けられる場合にはＶＨドメインとＶＬドメインの両方が生殖系列化されていることがより好ましい。
【０４６２】
全長ＩｇＧの一過性発現および精製
重鎖および軽鎖を別々にコードする発現ベクターをトランスフェクトしたＨＫＢ１１細胞またはＨＥＫ−２９３Ｆ細胞において全長ＩｇＧの一過性発現を実施した。トランスフェクトした３〜７日後に細胞培養上清を回収し、遠心分離によって精製（ｃｌｅａｒ）した。
【０４６３】
濾過後（０．２２μｍまたは０．４５μｍ）、上清を標準のプロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳＵＲＥ、ＧＥ）に供した。タンパク質をｐＨ３で溶出させ、３ＭのＴＲＩＳ、ｐＨ８で中和した。さらに下流の処理は、緩衝液を１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と交換すること、および濾過滅菌すること（０．２μｍ；ＭｉｌｌｉｐｏｒｅまたはＳａｒｔｏｒｉｕｓ）を伴った。純度を変性、還元条件下で、および変性、非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてまたはキャピラリー電気泳動によって分析した。ＨＰ−ＳＥＣを実施してＩｇＧ調製物をそれらのネイティブな状態で分析した。
【０４６４】
（実施例５）
ＭＯＲ８４５７の生殖系列化された抗体バリアントをコードする遺伝子の設計および生成
それぞれ７つの重鎖可変領域および７つの軽鎖可変領域に由来するコンセンサス配列を使用してＭｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＨｕＣＡＬライブラリーを構築した。したがって、このライブラリーから得られるリード配列は多数の位置に、それらのヒト生殖系列対応物とは異なるアミノ酸を含有し、理論的な免疫原性リスクを示す可能性がある。これらの非生殖系列位において生殖系列残基へ戻す配列の変異（「生殖系列化」と称される）を実施して、この潜在的に不利益となるものを取り除いた。
【０４６５】
ファージ由来のＭＯＲ−８４５７リードの可変鎖配列をＩｍｍｕｎｏＧｅｎｅｔｉｃｓ（ＩＭＧＴ）免疫グロブリンレパートリーにおいて入手可能なものと比較した。最も適切なヒト重鎖生殖系列可変性配列（図１Ａ）および軽鎖生殖系列可変性配列（図１Ｂ）をアラインメントによって同定した。図１Ａおよび図１Ｂは、ＭＯＲ８４５７  ＶＨ（図１Ａ）およびＭＯＲ８４５７  ＶＬ（図１Ｂ）と種々の生殖系列配列のそれぞれとの間のアラインメントおよび共有される配列同一性のパーセントを示す。
【０４６６】
重鎖Ｖドメインの生殖系列化
ＭＯＲ−８４５７重鎖（配列番号２）の生殖系列化のために、９８．６％の配列同一性を共有するＩＭＧＴ  ＩＧＨＶ３−２３＊０１（ＤＰ−５４；配列番号２５）によりコードされる生殖系列可変領域が最も適切であると決定された。図１Ａに示されている通り、この可変性遺伝子のフレームワーク領域は、以下の置換Ｖ５ＬおよびＲ９４Ｋ（Ｋａｂａｔ番号付け）を含有する。したがって、新しい生殖系列化された重鎖Ｖドメイン配列（以下「ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ」と称される、配列番号６）を、置換アミノ酸のそれぞれをＤＰ−５４  ｇｅｒｍｌｉｎｅ可変領域と置き換えることによって選択した。
【０４６７】
軽鎖Ｖドメインの生殖系列化
ＭＯＲ−８４５７軽鎖（配列番号１）の生殖系列化のためには、ＭＯＲ８４５７  ＶＬと９２．７％の配列同一性を共有するＩＭＧＴ  ＩＧＬＶ３−１＊０１（ＤＰＬ−２３；配列番号２９）によりコードされる生殖系列可変領域が最も適切であると決定された。図１Ｂに示されている通り、この可変性遺伝子のフレームワーク領域は、ＭＯＲ８４５７（配列番号１）と比較して５つの位置に置換を含有する：Ａ１４Ｓ、Ｒ２０Ｓ、Ｓ２２Ｔ、Ａ４３ＳおよびＥ８１Ｍ（Ｋａｂａｔ番号付け）。したがって、新しい生殖系列化された配列（以下「ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ」と称される、配列番号４）を、置換アミノ酸のそれぞれをＤＰＬ−２３生殖系列可変領域に由来するものと置き換えることによって選択した。
【０４６８】
（実施例６）
ＭＯＲ−８４５７および配列バリアントのＩｇＧとしての特徴付け
ＭＯＲ８４５７の結合親和性、特異性および異種間反応性（ｃｒｏｓｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）
ＭＯＲ８４５７の３種のＩｇＧバリアントの結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ２０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）を使用して決定した。「ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍ」と称される１種のバリアント抗体は、元のＭＯＲ８４５７  ＶＨ領域配列（配列番号２）およびエフェクター機能ヌル変異（ＭＯＲ８４５７−ｈＩｇＧ１−３ｍ；配列番号２１）を含有するヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインを含む全長重鎖（ＭＯＲ８４５７−ｈＩｇＧ１−３ｍ−ＨＣ；配列番号１８）、ならびに元のＶＬ領域配列（配列番号１）およびヒトラムダ軽鎖定常ドメイン（Ｃλ；配列番号２３）を含む全長軽鎖（配列番号１７；ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ＬＣ）であって、軽鎖配列が本明細書の他の箇所で前述されている通り偶発性の配列変異を含む全長軽鎖を含む。
【０４６９】
「ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１」と称される別のバリアントは、元のＭＯＲ８４５７  ＶＨ領域配列（配列番号２）を含む全長重鎖を含み、「ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１−ＨＣ」と称される全長重鎖をもたらすには、マウス野生型ＩｇＧ１重鎖定常ドメイン（配列番号２０）をさらに含む。ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１抗体は、元のＭＯＲ８４５７  ＶＬ領域配列（配列番号１）を含む全長軽鎖（ＭＯＲ８４５７−ｍ−ＬＣ）およびマウス野生型ラムダ定常ドメイン（配列番号２４）をさらに含む。
【０４７０】
生殖系列化されたＭＯＲ８４５７  ＶＨ領域配列（ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＨ；配列番号６）およびエフェクター機能ヌル変異（ｈＩｇＧ１−３ｍ；配列番号２１）を含有するヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインを含む全長重鎖（ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ｈＩｇＧ１−３ｍ−ＨＣ；配列番号１４）を含む、「ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ｈＩｇＧ１−３ｍ」と称されるさらに別のバリアントＭＯＲ８４５７抗体を構築し、当該抗体は、生殖系列化されたＭＯＲ８４５７  ＶＬ領域配列（配列番号４；ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＶＬ）および野生型ヒトラムダ軽鎖定常ドメイン（配列番号２３）を含む全長軽鎖（配列番号１６；ＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＬＣ）をさらに含む。
【０４７１】
ＭＯＲ８４５７抗体はＰＤＧＦ−ＢＢに特異的である
特異性および異種間反応性を試験するために、３種のＭＯＲ８４５７  ＩｇＧバリアント、ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍ、ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１、およびＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ｈＩｇＧ１−３ｍの、ヒトＰＤＧＦ−ＡＡ、ヒトＰＤＧＦ−ＡＢ、ヒトＰＤＧＦ−ＤＤ、ならびにラットＰＤＧＦ−ＢＢ（全てＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮから入手したもの）およびマウスＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を含めた異なるヒトＰＤＧＦリガンドに対する結合親和性を試験した。簡単に述べると、抗ヒトまたは抗マウスＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）抗体を、ＣＭ５センサーチップの隣接するフローセル中に、製造者の指示通り、アミンカップリングを使用して８０００〜１０，０００共鳴単位（ＲＵ）で固定化した。抗体をＰＢＳ−ＮＥＴ（１０ｍＭのリン酸、ｐＨ７．４、２８７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、３．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％のＴｗｅｅｎ２０）中、１μｇ／ｍＬまで希釈し、それぞれ独立に、それぞれの抗ヒト表面または抗マウス表面に１０秒間注射し、それにより、５０〜１００ＲＵの安定な抗ＰＤＧＦ表面がもたらされた。ＰＤＧＦタンパク質をＰＢＳ−ＮＥＴ中に１ｎＭまで希釈し、０．２５ｎＭまで２倍ずつ希釈した。次いで、各濃度のＰＤＧＦを抗体表面に毎分１００μｌの流速で２分間注射した。１０分にわたって複合体を解離させた。表面を、１０ｍＭの塩化マグネシウムの３０秒の注射を用いて再生させ、表面を抗ＰＤＧＦ抗体捕捉およびＰＤＧＦ結合カイネティクスの別のラウンドの準備ができた状態にした。ｓｃｒｕｂｂｅｒ２  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して動力学的なデータを２重に照会し（Ｍｙｓｚｋａら、１９９９、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２  ２７９）、次いで、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアバージョン４．１を使用して１：１結合モデルにフィッティングした。示されている結果は３つの独立した結合試験の平均である。図２には代表的なセンサーグラムが示されており、表２には結合親和性が要約されている。
【０４７２】
【表３】
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【０４７３】
３種の抗体全てでヒトＰＤＧＦ−ＢＢに対して低ｐＭの結合親和性が実証された。生殖系列化された可変ドメインはＫＤ＝１３ｐＭ±３の密接な結合を保持した。マウスＩｇＧ１骨格への変換により、全てのＰＤＧＦに対して、ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１抗体結合の解離速度がＢｉａｃｏｒｅにおける結合カイネティクスの限界を超える程度まで遅くなった（表２に「ＮＡ＊」と示されている）。この種類の結合の親和性は、１０ｐＭ（＜１０）未満であり、かつＢｉａｃｏｒｅ計器の限界を超えると判断された。ＭＯＲ８４５７バリアントがＰＤＧＦ−ＢＢおよびＰＤＧＦ−ＡＢにのみ結合し（表２）、ＰＤＧＦ−ＡＡにもＰＤＧＦ−ＤＤにも結合しなかった（データは示していない）という事実により、種々のＭＯＲ８４５７抗体構築物がＰＤＧＦ−Ｂに対して特異的であることが実証された。ＭＯＲ８４５７がＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢには結合したが、ＰＤＧＦ−ＡＡには結合しなかったことにより、二量体の各ＰＤＧＦ−Ｂサブユニットが露出したＭＯＲ８４５７結合部位を１つずつ有することが示唆される。ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢに対する結合親和性にはわずかな差異が示され、６９ｐＭおよび２８ｐＭであり、これは、ヘテロ−二量体ＰＤＧＦ−ＡＢとホモ二量体ＰＤＧＦ−ＢＢに存在するＰＤＧＦ−Ｂの軽微なコンホメーションの差異に起因する可能性がある。
【０４７４】
ＰＤＧＦ−ＢＢは、ホモ二量体ＰＤＧＦＲ−αα受容体複合体およびホモ二量体ＰＤＧＦＲ−ββ受容体複合体、ならびにヘテロ二量体ＰＤＧＦＲ−αβ受容体複合体に結合するが、ＰＤＧＦ−ＡＢは、ホモ二量体ＰＤＧＦＲ−αα受容体およびヘテロ二量体ＰＤＧＦＲ−αβ受容体に結合して、種々の疾患または障害に関与するスチームシグナル伝達（ｓｔｅａｍ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を誘発する。ＰＤＧＦ−Ｂのその受容体への結合を遮断するＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢへのＭＯＲ８４５７の結合を使用して、ＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢと、それらのそれぞれの受容体複合体との相互作用を遮断し、それにより、種々の病態を媒介するまたはそれに関連する下流のシグナル伝達を阻害することができる。したがって、ＭＯＲ８４５７により、任意のＰＤＧＦ−ＡＢおよびＰＤＧＦ−ＢＢに関連する疾患に対する新規の治療薬がもたらされ得る。さらに、ＭＯＲ８４５７はマウスＰＤＧＦ−ＢＢおよびラットＰＤＧＦ−ＢＢに同様の特性、すなわち、それぞれ１０ｐＭおよび２５ｐＭで結合し、これにより、ＭＯＲ８４５７が前臨床動物モデル試験において使用するための有用な代理の抗体になり、したがって、ＰＤＧＦ−Ｂに媒介されるシグナル伝達疾患または障害を治療するための潜在的な治療薬の開発におけるその潜在的な有用性がさらに増大する。
【０４７５】
ＰＤＧＦ−ＢＢへのＭＯＲ８４５７の結合の結合ストイキオメトリーおよびエピトープマッピング
データにより、本明細書の他の箇所で開示されている、ＭＯＲ８４５７がＰＤＧＦ−ＡＢに結合したことにより、各ＰＤＧＦ−Ｂサブユニットが少なくとも１つのＭＯＲ８４５７結合部位を含むこと示唆されたことが実証される。これにより、ＰＤＧＦ−ＢＢホモ二量体の２つの結合部位が１つの抗体由来の２つのＩｇＶドメインと相互作用するのか２つの抗体由来の２つのＩｇＶドメインと相互作用するのかという疑問が生じる、言い換えれば、ＰＤＧＦ−ＢＢへの抗体結合のストイキオメトリーが１：１であるかまたは２：１であるかは不明であった。この問題に取り組むために、ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１（マウス）とＭＯＲ８４５７−ＧＬ−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍ（ヒト）のＩｇＶドメインは同じであるがＦｃドメインが異なるという事実を活用して、Ｂｉａｃｏｒｅを使用した逐次的な競合結合アッセイを実施して、ＰＤＧＦ−ＢＢへのＭＯＲ８４５７の結合のストイキオメトリーを評価した。
【０４７６】
第１の逐次的な競合結合アッセイでは、ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１をＣＭ５センサーチップ上に固定化した抗マウスＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって捕捉し、それにより２００〜４００ＲＵの安定な表面をもたらした。次いで、図３に示されている図および注射２後の実線によって示されているセンサーグラムにおいて例示されている通り、１ｎＭのヒトＰＤＧＦ−ＢＢを６分間注射し、その後、ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍを注射した。図３では、サイクル１の注射３後について開示されているセンサーグラムデータにより、ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍが予め組み立てられたＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ／ＰＤＧＦ−ＢＢ複合体に結合し（注射２後に形成される）、これにより、ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧがＰＤＧＦ−ＢＢ上の１つの部位にのみ結合し、ＰＤＧＦ−ＢＢ上の他の結合部位は第２の抗体に対して利用可能であり、この場合、第２の部位はＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍ結合に対して利用可能であったことが実証される。したがって、これらのデータにより、ＰＤＧＦ−ＢＢへのＭＯＲ８４５７の結合ストイキオメトリーが２：１であることが実証される。これは、ＰＤＧＦ−ＢＢへのＰＤＧＦＲββホモ二量体外部ドメインの１：１ストイキオメトリー結合と対照をなす（Ｓｈｉｍら、２０１０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７：１１３０７〜１１３１２）。任意の特定の理論に限定されることを望まず、ＭＯＲ８４５７：ＰＤＧＦ−ＢＢの２：１ストイキオメトリー結合形式により、抗体とＰＤＧＦ−ＢＢの間の選択的な架橋結合によって高分子量のＭＯＲ８４５７：ＰＤＧＦ−ＢＢ複合体の形成が可能になり、これにより、薬物クリアランスが強化され、かつ／または抗薬物抗体応答が刺激され得る。したがって、ＭＯＲ８４５７抗体を、単一アーム抗体がもたらされるように再編成し、したがって、多数のＰＤＧＦ−ＢＢと抗体のあらゆる潜在的な架橋を回避するまたは減少させることが望ましいことが当業者には理解されよう。
【０４７７】
ＰＤＧＦＲβへのＰＤＧＦ−ＢＢ結合の抗体阻害
本明細書の他の箇所で前に考察されている通り、ＰＤＧＦ−ＢＢシグナル伝達は、ＰＤＧＦ−ＢＢが細胞表面ＰＤＧＦ受容体β二量体に結合した後、活性化される。ＰＤＧＦ−ＢＢへのＭＯＲ８４５７抗体の結合により、この受容体への結合が遮断され、それにより、下流のシグナル伝達が阻害されるかどうかを試験するために、ＭＯＲ８４５７と、ＰＤＧＦＲβの外部ドメインおよびヒト野生型ＩｇＧ１定常ドメインを含むＰＤＧＦＲβ−ｈＩｇＧ１融合タンパク質との間の競合結合分析を実施して、Ｂｉａｃｏｒｅにおいて、チップ上に逐次的に結合させるか、またはＰＤＧＦ−ＢＢを溶液中で中和させるかのいずれかで可溶性ＰＤＧＦＲβをもたらした。
【０４７８】
固体支持体（Ｂｉａｃｏｒｅチップ）における逐次的な結合分析
チップにおける逐次的な結合分析のために、図４Ａの図に例示されている通り、ＰＤＧＦＲβ−ｈＩｇＧ１を抗ヒトＩｇＧ抗体によってＣＭ５センサーチップ上に捕捉した）。次いで、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢを１ｎＭの濃度で６分間注射して、ＰＤＧＦＲβ−ｈＩｇＧ１上の結合部位を飽和させ、その後、ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１を注射した。ＰＤＧＦ−ＢＢへのＰＤＧＦＲβ−ｈＩｇＧ１の結合により、ＰＤＧＦ−ＢＢへのＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１の結合が遮断された（図４に示されているサイクル１についてのセンサーグラムを参照されたい）。逆に、ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１抗体を最初にチップに捕捉した場合には、ＰＤＧＦ−ＢＢへのＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１の結合により、図３に示されているサイクル２センサーグラムによって示されている通り、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合のＰＤＧＦＲβ−ｈＩｇＧ１融合タンパク質が遮断された。これらの結果により、ＭＯＲ８４５７が、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合をＰＤＧＦＲβと交差競合することが実証され、また、ＭＯＲ８４５７による単一の部位占有がＰＤＧＦ−ＢＢとＰＤＧＦＲβの相互作用を遮断するために十分であることがさらに実証される。これらのデータは、ＭＯＲ８４５７とＰＤＧＦ−ＢＢの間の結合相互作用が示されている、下に開示されている詳細なコンピュータモデリングによってもたらされるデータと一致する。簡単に述べると、以下でより詳細に考察する通り、ＰＤＧＦ−ＢＢとＭＯＲ８４５７  Ｆａｂの共結晶構造によって明らかになった詳細なエピトープマッピングにより、ＰＤＧＦ−ＢＢとＭＯＲ８４５７の間の境界面が受容体結合部位と重複することが確認された。したがって、ＭＯＲ８４５７は、ＰＤＧＦ−ＢＢとの結合をＰＤＧＦＲβ受容体と直接競合し、これにより、その受容体（ＰＤＧＦＲαβおよびＰＤＧＦＲββ）へのＰＤＧＦ−ＢＢの結合によって媒介される疾患または障害を治療するための潜在的な新規の治療薬としてのＭＯＲ８４５７の使用がさらに支持される。
【０４７９】
溶液中での逐次的な結合分析
２：１の結合ストイキオメトリーが複雑であるので、また、チップ上への逐次的な結合によって導入されるいかなる潜在的なアーチファクトも回避するために、図５Ａに示されている図によって例示される通り、溶液中でＰＤＧＦ−ＢＢをＭＯＲ８４５７で中和することによって競合的な結合をさらに確認した。ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１をＰＢＳ中に段階的に希釈し、次いで、１ｍＭのヒトＰＤＧＦ−ＢＢと混合し、２〜８℃で２０時間、平衡に達するまでインキュベートした。次いで、図５Ａの［角括弧］の中に示されている各ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１およびＰＤＧＦ−ＢＢ希釈混合物をＣＭ５チップ上の抗ヒトＩｇＧ１によって捕捉されたＰＤＧＦＲβ−ｈＩｇＧ１の表面全体に注射した。図５Ｂは、ＭＯＲ８４５７阻害の濃度反応曲線を示すグラフを示す。濃度が上昇するにしたがい、ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１によりチップ上でのＰＤＧＦＲβ−ｈＩｇＧ１へのＰＤＧＦ−ＢＢの結合が完全に遮断された。これらのデータの全てにより、ＭＯＲ８４５７とＰＤＧＦＲβの間で共有されるＰＤＧＦ−ＢＢ上の結合部位が実証される。これらのデータにより、ＭＯＲ８４５７のＰＤＧＦ−ＢＢへの結合部位が受容体のＰＤＧＦ−ＢＢへの結合部位と直接競合すること、およびにＰＤＧＦ−ＢＢに１つのＭＯＲ８４５７が結合することが、リガンドのその受容体への結合を遮断するために十分であることがさらに実証される。これらのデータにより、ＰＤＧＦ−Ｂのその受容体への結合によって媒介されるまたはそれに関連する疾患または障害を治療するための新規の治療薬としてのＭＯＲ８４５７の潜在的な有用性がさらに確認される。
【０４８０】
（実施例７）
中和抗体断片Ｆａｂ−ＭＯＲ８４５７と複合体を形成したＰＤＧＦ−ＢＢの結晶構造
ＰＤＧＦ−ＢＢへのＭＯＲ８４５７の結合形式に関する構造的洞察
ＭＯＲ８４５７−Ｆａｂと複合体を形成したＰＤＧＦ−ＢＢを、１８℃で２２％ＰＥＧ３３５０および０．１Ｍのトリス、ｐＨ７．０を含有する溶液から結晶化した。結晶は単斜空間群Ｐ２１と一致する対称性を有し、細胞パラメータはａ＝９０．２Å、ｂ＝６８．５Å；ｃ＝９５．３Å、β＝９７．６°であり、非対称単位格子内に１つのタンパク質複合体を伴う。２．３Å解像度に対するデータセットをＡｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＡＰＳ）においてＩＭＣＡ  ｂｅａｍｌｉｎｅ  １７−ＩＤで単一の凍結結晶から収集した。ａｕｔｏＰＲＯＣおよびＳＣＡＬＡを使用してデータを処理およびスケーリングした。最終的なデータセットは９９．７％完全であり、平均重複性が３．４であり、Ｒｓｙｍｇが５．８％であった。
【０４８１】
ＰＨＡＳＥＲを用いた分子置き換えにより、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ＰＤＢエントリーから調製したｆａｂ断片モデル：２ａｄｇおよび８ｆａｂから、およびエントリーから調製したＰＤＧＦ−ＢＢモデル：３ｍｊｇから開始して構造を解明した。Ｆａｂ分子の４つのドメインのそれぞれについて別々に検索することによって最初の解を得た。この部分的な解を使用して、Ｆａｂ断片の第２のコピーを検索し、その後、ＰＤＧＦ−ＢＢ分子についての最終的な検索を行った。最終的な完全な分子置き換えの解は１つのＰＤＧＦ−ＢＢ二量体に結合した２つのＭＯＲ８４５７−Ｆａｂ断片を含有した。ＣＯＯＴを使用したモデル手動調整およびモデル再構築のいくつかの反復的なラウンドの後、ａｕｔｏＢＵＳＴＥＲを使用した結晶学的精密化を行って複合体の最終的な精密化モデルを得、結晶学的Ｒｗｏｒｋは２１．１％であり、Ｒｆｒｅｅは２４．４７％であった。最終的なＭＯＲ８４５７−Ｆａｂ＋ＰＤＧＦ−ＢＢモデルは、第１のＦａｂコピーの２つの鎖、ＨおよびＬ（重鎖Ｈの残基１Ｈ〜１３３Ｈ、１４２Ｈ〜１９１Ｈ、２００Ｈ〜２２０Ｈおよび軽鎖Ｌの残基３Ｌ〜２０５Ｌ）、第２のＦａｂコピーの２つの鎖、ＢおよびＡ（重鎖Ｂの１Ｂ〜１３４Ｂ、１４１Ｂ〜２２０Ｂおよび軽鎖Ａの２Ａ〜２０７Ａ）ならびにＰＤＧＦ−ＢＢ２つの鎖、ＣおよびＤ（鎖Ｃの１０Ｃ〜１０１Ｃおよび鎖Ｄの７Ｄ〜１０２Ｄ）を含む。いくつかの領域の欠けているアミノ酸は、障害に起因する可能性が非常に高い電子密度の欠如が原因で構造にモデリングされなかった。モデル内に存在する非タンパク質原子には３２７個の水分子が含まれる。
【０４８２】
結晶構造により、図６に示されているリボン図によって例示される通り、２つのＭＯＲ８４５７−Ｆａｂ分子が単一のＰＤＧＦ−ＢＢサイトカインの２つの反対端にある２つの対称部位に結合することが明らかになった。２つのＭＯＲ８４５７−Ｆａｂ分子のＣ末端は約１９０Å離れており、これにより、観察されるストイキオメトリーにある特定の幾何的制約が課され、１つのＰＤＧＦ−ＢＢ分子が２つの空間的に離れたＭＯＲ８４５７抗体と架橋した、ＭＯＲ８４５７およびＰＤＧＦ−ＢＢの２：１の結合ストイキオメトリーがさらに確認される。
【０４８３】
同様の相互作用を有する２つの結合性エピトープ
上記の通り、結晶構造により、２つのＭＯＲ８４５７−Ｆａｂ分子が単一のＰＤＧＦ−ＢＢサイトカインの２つの反対端にある２つの対称部位に結合することが示される（図６のリボン図）。２つのＭＯＲ８４５７−Ｆａｂ分子のＣ末端は約１９０Å離れており、これにより、観察されるストイキオメトリーにある特定の幾何的制約が課される。
【０４８４】
観察された結晶構造およびそれとＰＤＧＦ−ＢＢ／ＰＤＧＦβ−受容体複合体との比較（Ｓｈｉｍら、２０１０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０７：１１３０７〜１１３１２）により、ＭＯＲ８４５７の中和作用が、抗体とＰＤＧＦβ−受容体がＰＤＧＦ−ＢＢ上の同じ結合決定因子を直接競合することに起因することがさらに実証される。Ｓｈｉｍらによって示されている通り、ＰＤＧＦβ−受容体を用いた場合では、ＰＤＧＦ−ＢＢの反対端のそれぞれへのＭＯＲ８４５７の結合により、サイトカイン表面上に２つの相互作用表面、したがって、２つの結合性エピトープ、番号１および２が創出される。これらの結合表面はどちらも同様の相互作用に関与するので、図７に提示されている詳細では、抗体鎖ＨおよびＬ（図７に示されている分子表面で表される）および図７のリボン図で表されるサイトカイン単量体ＣおよびＤを伴う結合性エピトープ番号１の１つのエピトープのみに言及している。
【０４８５】
２つの境界面のそれぞれにおいて、結合に必須であるＰＤＧＦ−ＢＢ残基には両方のＰＤＧＦ−Ｂ単量体が寄与し、相互作用の８７％が一方の単量体（ループ１およびループ３）に由来し、残りの１３％（ループ２）が他方の単量体に由来する。ＰＤＧＦ−ＢＢ由来の合計１７残基とＭＯＲ８４５７−Ｆａｂ由来の２２残基は、４オングストローム（４Å）未満の距離にあり、したがって「接触残基」とみなされているという事実によって示される通り、各境界面における相互作用に関与する。ＣＤＲ−Ｈ１以外の全てのＣＤＲ領域がＰＤＧＦ−ＢＢとの相互作用に関与し、最も大きな寄与はＣＤＲ−Ｈ３に由来する。各結合境界面は、水素結合の相互作用および芳香族環相互作用によって生じ、ＰＤＧＦ−ＢＢ上の負電荷を有するＣＤＲと正電荷を有するＡｒｇ／Ｌｙｓ残基の間に顕著な相補性がある。結合性エピトープ＃１および＃２の両方を包含する４Å以内の全ての直接相互作用が以下の表３に記載されている。したがって、抗体パラトープならびに結合性エピトープ＃１および＃２の両方を包含する４Å以内の全ての直接相互作用が以下の表３に列挙されている。
【０４８６】
【表４−１】
2015536339.tif 000006
【０４８７】
【表４−２】
2015536339.tif 000007
【０４８８】
【表４−３】
2015536339.tif 000008
【０４８９】
【表４−４】
2015536339.tif 000009
【０４９０】
【表４−５】
2015536339.tif 000010
【０４９１】
【表４−６】
2015536339.tif 000011
【０４９２】
【表４−７】
2015536339.tif 000012
【０４９３】
【表４−８】
2015536339.tif 000013
【０４９４】
表３に示されている結果を要約するために、以下に抗体上の接触残基（パラトープ）を示す：
【０４９５】
ＭＯＲ８４５７重鎖ＨＣについては、ＣＤＲ−Ｈ２のＴｒｐ４７、Ｔｙｒ５０、Ｌｅｕ５７、Ｔｙｒ５９、Ｔｙｒ６０およびＡｓｐ６２；ＣＤＲ−Ｈ３のＴｒｐ１０２、Ｔｙｒ１０３、Ｇｌｙ１０４およびＧｌｙ１０５であり、軽鎖Ｌについては、ＣＤＲ−Ｌ１のＧｌｙ２８、Ｓｅｒ２９、Ｔｙｒ３０およびＰｈｅ３１；ＣＤＲ−Ｌ２のＡｓｐ４９、Ａｓｐ５０およびＡｓｎ６５；ＣＤＲ−Ｌ３のＰｈｅ９０、Ｔｈｒ９１、Ｈｉｓ９２、Ａｓｎ９３およびＳｅｒ９４である。
【０４９６】
ＰＤＧＦ−Ｂ上の接触残基（エピトープ）は、エピトープ番号１については以下の通りである：
全て配列番号３３の配列（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆ．Ｓｅｑ．ＮＰ＿００２５９９．１）に関して、Ｃ鎖：ループ１のＬｅｕ３８、Ｖａｌ３９およびＴｒｐ４０；ループ３のＧｌｕ７１、Ａｒｇ７３、Ｉｌｅ７５、Ｉｌｅ７７、Ａｒｇ７９、Ｌｙｓ８０、Ｌｙｓ８１、Ｐｒｏ８２、Ｉｌｅ８３、Ｐｈｅ８４、Ｌｙｓ８５およびＬｙｓ８６；ならびにＤ鎖：ループ２のＡｓｎ５４およびＡｒｇ５６。
【０４９７】
ＭＯＲ８４５７上のアミノ酸残基およびそれらのそれぞれのＰＤＧＦ−ＢＢ上の接触（４Å未満の距離にある残基）残基が以下の表４（エピトープ１）および表５（エピトープ２）に提供される。
【０４９８】
【表５−１】
2015536339.tif 000014
【０４９９】
【表５−２】
2015536339.tif 000015
【０５００】
【表６−１】
2015536339.tif 000016
【０５０１】
【表６−２】
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【０５０２】
本明細書に開示されているデータにより、ＰＤＧＦ−ＢＢ二量体上のＭＯＲ８４５７が結合した２つのエピトープは非常に類似しているが、同一ではないことが実証される。
【０５０３】
いかなる特定の理論にも制約されることなく、Ｂｉａｃｏｒｅによって観察されたＭＯＲ８４５７のＰＤＧＦ−ＡＢへの結合（ＫＤ＝６９ｐＭ）と比較したＰＤＧＦ−ＢＢへの結合（ＫＤ＝２８ｐＭ）結合の低下が比較的小さい（およそ３倍）ことに基づいて、ＰＤＧＦ−ＡＢへのＭＯＲ８４５７の結合形式は、本質的に、ＰＤＧＦ−ＢＢへのＭＯＲ８４５７の結合について結晶構造において観察されたものである可能性があり、ただし、ＰＤＧＦ−ＡＢのヘテロ二量体への会合は、ＰＤＧＦ−ＢＢホモ二量体の両方のＢサブユニットの会合とほとんど同じである。サブユニットのＡＢ二量体およびＢＢ二量体への会合が本質的に同じである場合には、ＰＤＧＦ−ＢのＡｒｇ５６およびＰＤＧＦ−ＡのＳｅｒ５０の置換が存在する単量体Ｄ（エピトープ１について）における４Å以内の直接接触のみに差異がある。この単一の置換が、Ｂｉａｃｏｒｅによって観察された結合における、ＭＯＲ８４５７のＰＤＧＦ−ＡＢへの結合（ＫＤ＝６９ｐＭ）と比較したＰＤＧＦ−ＢＢへの結合（ＫＤ＝２８ｐＭ）のわずかな低下の原因であり得る。
【０５０４】
（実施例８）
ヒトメサンギウム細胞増殖の阻害
当技術分野において蓄積された証拠により、ＩｇＡ腎炎などのメサンギウム増殖性疾患の進行中のメサンギウム細胞増殖および糸球体マトリックス増大におけるＰＤＧＦ−Ｂおよび／またはＰＤＧＦ−Ｄに媒介されるＰＤＧＦＲ−β活性化の中心的な役割が裏付けられる。さらに、多数の試験において、げっ歯類モデルにおけるＰＤＧＦＲ−βシグナル伝達への特異的な介入によるメサンギウム細胞増殖およびマトリックス蓄積の低減が実証されている（Ｏｓｔｅｎｄｏｒｆら、２０１２、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２７：１０４１〜１０５０）。本明細書において前により詳細に記載されている通り（例えば、図３、サイクル２センサーグラム、および図５Ｂを参照されたい）、ＰＤＧＦ−ＢＢへのＭＯＲ８４５７の結合によりＰＤＧＦＲβへのリガンドの結合が遮断されたので、初代ヒトメサンギウム細胞におけるＰＤＧＦ−ＢＢに誘導されるメサンギウム増殖を機能的に阻害するＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ＩｇＧ１−３ｍＭの能力を評価した。
【０５０５】
初代ヒトメサンギウム細胞（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を培養し、黒色不透明底９６ウェルプレート（Ｃａｔ番号３５３３７６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）にウェル当たり細胞１５，０００個で播種した。細胞を洗浄し、無血清ＭＣＭ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて２４時間にわたって成長停止させた。２４時間後に、細胞を、段階的に希釈したＰＤＧＦ−ＢＢ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を用いて３７℃で４時間にわたって刺激した。最後の１６時間に５−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）組み入れアッセイを製造者（Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の説明書に従って使用してＤＮＡ合成を決定した。翌日、細胞を固定し、ＢｒｄＵ組み入れについて製造者のプロトコールに従ってアッセイした。
【０５０６】
図８Ａは、ＭＯＲ８４５７の不在下で漸増濃度のＰＤＧＦ−ＢＢによって誘導されるメサンギウム細胞増殖の用量依存的な増大を示す濃度反応曲線を示すグラフを示す。ＰＤＧＦ−ＢＢにより、ヒトメサンギウム細胞増殖がロバストに刺激され、ＥＣ５０＝２．３ｎｇ／ｍＬ（１００ｐＭ）であった。次いで、ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍによる細胞増殖の阻害を決定した。ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍを、１００ｎＭから０．１ｎＭまで２分の１対数希釈し、次いで、細胞を添加する３０分前に０．１％ＢＳＡを伴う無血清ＭＣＭ培地中２．５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢと混合した。図８Ｂは、漸増濃度のＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍを用いたメサンギウム細胞増殖の阻害を示す代表的な用量依存曲線を示す。３つの独立した実験から平均ＩＣ５０を決定し、それは１３．４±２．８ｐＭであり、最大阻害は８７．９±５．７％であり、これにより、ＭＯＲ８４５７−が、ＰＤＧＦ−Ｂ／ＰＤＧＦ−βに媒介されるヒトメサンギウム増殖の機能的に強力な阻害剤であることが実証される。
【０５０７】
本明細書において前に開示されているデータにより、Ｂｉａｃｏｒｅを使用したＰＤＧＦ−ＢＢの結合についてのＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍとＰＤＧＦＲ−β融合タンパク質の間の競合阻害が実証された（例えば、図４、サイクル１センサーグラムを参照されたい）。Ｂｉａｃｏｒｅを使用して観察された結合相互作用に対する競合阻害がヒトメサンギウム細胞増殖機能アッセイにおける競合阻害に変換されるかどうかを決定するために、Ｓｃｈｉｌｄ分析（Ａｒｕｎｋｌａｋｓｈａｎａ＆Ｓｃｈｉｌｄ、１９５９、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．６５：４８〜５８）を実施した。より詳細には、一定量の抗体を一連の希釈したＰＤＧＦ−ＢＢと混合した後に、細胞に添加した。抗体が存在しない場合と存在する場合に測定されたＰＤＧＦ−ＢＢのＥＣ５０を使用して用量比（ＤＲ）を算出した。一連のｌｏｇ［Ｂ］抗体濃度についての一連のｌｏｇ（ＤＲ−１）値をグラフ上にプロットし、ＰＤＧＦ−ＢＢ濃度反応曲線の２倍のシフトを引き起こす抗体の濃度とみなされるｐＡ２をグラフから推定する。ｐＡ２の値は系非依存性であり、機能的細胞アッセイにおいて抗体の内因性の親和性を反映する。
【０５０８】
図９Ａに示されている通り、ＰＤＧＦ−ＢＢの濃度反応曲線はＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍの濃度が上昇するにしたがって右にシフトし、阻害の程度が克服された（図９Ａ）。推定ｐＡ２は約２０ｐＭであり、これは、Ｂｉａｃｏｒｅによって決定されたもの（１３ｐＭ、表２）と同じ範囲内であった。ＰＤＧＦ−ＢＢへのＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍの２：１結合形式に起因して、濃度反応曲線の右へのシフトは、単純な１：１競合阻害剤で見られると予期されるものと並行しては現れなかった。これは、図９Ｂに示されているＳｃｈｉｌｄプロットの＜１の傾きにも反映された。それにもかかわらず、曲線の右へのシフト、克服可能な阻害および低Ｍ  ｐＡ２値により、ＭＯＲ８４５７−ＩＫＲ−ｈＩｇＧ１−３ｍがヒトメサンギウム細胞増殖に関する強力かつ競合的なＰＤＧＦ−ＢＢ阻害剤であることが確認された。
【０５０９】
メサンギウム細胞増殖は、ＩｇＡ腎症などのメサンギウム増殖性疾患において中心的な役割を果たすことが周知である。いくつかの証拠により、ＰＤＧＦ−ＢＢ発現の増大がＩｇＡ腎症に関連し、ＰＤＧＦ−ＢＢ発現またはシグナル伝達を遮断することにより疾患の重症度が低下することが示されている。したがって、本明細書において提供される本開示を備えた当業者には、メサンギウム細胞増殖を機能的に阻害するＰＤＧＦ−ＢＢの強力な競合阻害剤であるＭＯＲ８４５７が、ＰＤＧＦ−ＢＢのレベルの上昇および／またはＰＤＧＦ−Ｂに媒介されるシグナル伝達に関連するメサンギウム増殖性疾患を治療するための新規の潜在的な治療薬になることが理解されよう。
【０５１０】
（実施例９）
急性Ｔｈｙ１．１ラットモデルにおけるＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１の評価
ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１の、対照ＩｇＧと比較したメサンギウム細胞増殖に対する影響についてのｉｎ  ｖｉｖｏにおける評価を、当技術分野で認められている抗Ｔｈｙ１．１腎炎ラットモデルにおいて、公開された方法に従って行った（Ｂｏｏｒら、２００７、Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２２：１３２３〜１３３１）。簡単に述べると、１５０〜２００ｇの雄ｗｉｓｔａｒラットにおいて、モノクローナル抗Ｔｈｙ１．１抗体ＯＸ−７（１ｍｇ／ｋｇ）をｉ．ｖ．ボーラス注射することによって腎炎を惹起した。疾患を誘導した１．５日後に、ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１（３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ）ならびにアイソタイプ対照ＩｇＧ（３０ｍｇ／ｋｇ）を動物の別々のコホート（ｎ＝６）に皮下投与した。８日目に、細胞周期のＤＮＡ（Ｓ）期にある細胞を標識するために、全てのラットに５０ｍｇ／ｋｇのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を腹腔内注射した。９日目に動物を屠殺し、血清および腎組織試料を得てｍＡｂ曝露を確認し、組織学的／免疫組織化学的技法により、ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１の、細胞増殖に対する影響（有糸分裂像の定量化によって決定する）ならびにメサンギウム細胞および有足細胞の活性化に対する影響（アルファ平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）についての免疫組織化学的調査、デスミンによって評価する）を評価した。図１０Ａに示されている通り、ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１により、ＢｒｄＵの蓄積によって決定されるメサンギウム細胞増殖の用量依存性の低減が誘導された。さらに、アルファ平滑筋アクチン陽性染色の減少によって示されている通り、ＭＯＲ８４５７−ｍＩｇＧ１により、メサンギウム細胞増殖の用量依存性の低減が誘導された（図１０Ｂ）。これらのデータにより、ＭＯＲ８４５７が、ＰＤＧＦ−ＢＢ−ＰＤＧＦＲβ相互作用および／または下流のシグナル伝達によって媒介されるまたはそれに関連する疾患を治療するための潜在的な新規の治療薬であることがさらに示唆される。
【０５１１】
（実施例１０）
工学的改変によるＭＯＲ８４５７抗体の粘度の低下
高濃度のモノクローナル抗体の粘度は、電荷、形状、体積および特異的な自己相互作用を含めたいくつもの因子によって決定される（Ｙａｄａｖら、２０１０、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、９９（１２）：４８１２〜４８２９）。実験結果により、総電荷には高濃度におけるいくらかの粘度が要求されるが、近距離の特異的な相互作用も同等に重要であるとみなされることが示されている（Ｙａｄａｖ  ２０１０、上記）。高濃度での自己会合を決定するためには、電荷の正確なパターニングと共に、総電荷が重要である。粗粒分子ダイナミクスシミュレーションにより、溶液中での粘度の低下がＦａｂ−Ｆａｂ誘引の減少と相関することが示唆される。これは、分子の正味の電荷の全体的な増加に関連する（Ｃｈａｕｄｈｒｉら、２０１３、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ、１１７（５）：１２６９〜１２７９）。電荷分布の非対称性を低下させる電荷スワッピング（ｃｈａｒｇｅ  ｓｗａｐｐｉｎｇ）実験は粘度の低下と相関する（Ｋｅｔｃｈｅｍら、２０１２、「Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ｂｙ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｃｈａｒｇｅ」、ＰＥＧＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、Ｂｏｓｔｏｎ  ＭＡ、およびＹａｄａｖら、２０１２、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ９（４）：７９１〜８０２）。これらにより、負電荷パッチによって媒介される自己会合により高度に粘性の抗体が生じることが示唆される。したがって、高濃度での抗体の粘度を低下させる手法は、総電荷を増大させて斥力を増大させること、または負電荷パッチのサイズもしくは影響を低下させることである。しかし、この設計が抗体−抗原複合体の重要な相互作用の知識を持って成されない場合には抗体の活性は劣る可能性がある（Ｋｅｔｃｈｅｍ  ２０１２、上記）。
【０５１２】
ここで、いくつかのパラメータを調査して、もしあれば、いずれのパラメータが粘度の変化と強力に相関するかを決定した。これは、７種の異なる抗体を調査することによって行った。５種の抗体：ＡＡＢ−００１（バピネオズマブ、ＣＡＳ登録番号６４８８９５〜３８−９）、ＲＫ３５（米国特許第７，８８８，４８６号）、ＩＭＡ−６３８（アンルキンズマブ、ＣＡＳ登録番号９１０６４９〜３２−０）、ＭＯＲ８４５７およびＭＯＲ８４５７−ＧＬの高濃度での粘度を下記の通り測定した。ＭＡｂ１およびＭＡｂ２については、高濃度でのそれらの粘度の測定を含め、Ｙａｄａｖ  ２０１２、上記に記載されている。粘度をＦａｂの総電荷（図１１）、Ｆａｂの双極子モーメント（図１２）およびＣＤＲの正味の電荷（図１３）と比較した。バピネオズマブおよびＩＭＡ−６３８については、Ｆａｂの構造モデルが必要であった。ＲＫ３５、ＭＡｂ１およびＭＡｂ２については、結晶構造が入手可能であった。ＡＡＢ−００１、ＩＭＡ−６３８、ＭＯＲ８４５７およびＭＯＲ８４５７−ＧＬについては、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ３．５のＭｏｄｅｌｅｒパッケージを使用して相同性モデルを生成した。これらのモデルのそれぞれについて、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ３．５の「Ｃａｌｃｕｌａｔｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｉｄｕｅ  ｐＫ」パッケージを用いて電荷の割り当てを生成した。算出された電荷を使用して、ｐＨ６．０におけるＦａｂの総電荷および双極子モーメントを算出した。配列からＣＤＲの正味の電荷を、正電荷を有する残基に＋１、負電荷を有する残基に−１、およびＨｉｓに＋１／２の電荷を与えて取得した。測定値の比較を検討すると、総電荷（Ｒ２＝０．９５）およびＣＤＲの正味の電荷（Ｒ２＝０．５５）が抗体の高濃度での粘度と相関することが明らかである。双極子モーメント（Ｒ２＝０．２９）も粘度といくらか相関したが、強力ではなかった。電荷の特質を示すことに加えて、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ  ３．５のＤｅｌｐｈｉパッケージを使用し、Ｄｅｌｐｈｉ  Ｄｅｆａｕｌｔ  Ｃｈａｒｇｅｓを用いて静電気力による位置エネルギー表面マップを算出した。各抗体の静電気力による位置エネルギー表面が図１４に示されており、粘度が低い抗体がパネルＡ〜Ｄに示されており（それぞれＡＡＢ−００１、ＲＫ３５、ＭＡｂ２およびＩＭＡ−６３８）、粘度が高い抗体がパネルＥ〜Ｇに示されている（それぞれＭａｂ１、ＭＯＲ８４５７−ＧＬ、およびＭＯＲ８４５７）。これらのデータにより、粘度が高い抗体の方が、粘度の低い抗体よりも大きな負電荷パッチ（図のより大きな白色のパッチ）をＣＤＲ領域に有することが実証される。
【０５１３】
設計戦略
図１１〜１４に示されている高濃度での抗体の粘度に対する電荷および電荷分布の影響は、上記の所見と強力に相関する（Ｙａｄａｖ  ２０１０、上記、Ｙａｄａｖ  ２０１２、上記、Ｋｅｔｃｈｅｍ  ２０１２、上記、およびＣｈａｕｄｈｒｉ  ２０１３、上記）。さらに、高濃度での粘度が高いＭＯＲ８４５７−ＧＬについては、抗体が低総電荷（図１１）、ＣＤＲ領域内の負の正味の電荷（図１３）、および大きな負電荷を有するパッチ（図１４Ｆ）を有することが実証された。これらの所見を考慮して、総電荷を増大させ、ＣＤＲ内の負電荷を有する残基を減少させ、かつ／または負電荷を有するパッチを遮断するまたは減少させる可能性がある残基を同定するためのスキームが考案された。抗体の活性の維持に関する他の最適化の難しさを考慮して（Ｋｅｔｃｈｅｍ  ２０１２、上記）、結合親和性が失われないこと、およびフレームワーク領域がヒト生殖系列と高度に相同なままであることを確実にするために追加的な制約を含めた。ＭＯＲ８４５７−ＧＬのアミノ酸配列に基づいて、フレームワーク−Ｈ１、フレームワーク−Ｈ２、フレームワーク−Ｈ３、フレームワーク−Ｈ４、フレームワーク−Ｌ１、フレームワーク−Ｌ２、フレームワーク−Ｌ３およびフレームワーク−Ｌ４およびＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の各部位についてヒト抗体由来のアミノ酸の分布の確率を生成した。各セグメントについて、ＩＭＧＴおよびＰＤＢなどの公的に入手可能なデータベースからのセグメントと長さが同じである全てのヒト抗体をアラインメントし、各位置における頻度を決定した。フレームワーク残基のセットから、Ｌｙｓ残基もしくはＡｒｇ残基の確率が高い（＞１０％）全ての部位、または別の中性残基の確率が高い（＞１０％）野生型ＧｌｕもしくはＡｓｐを有する部位を同定した。部位のそれぞれについて、変異した際の安定性の変化および変異した際の結合親和性の変化を、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ３．５およびＭＯＲ８４５７：ＰＤＧＦ−Ｂ結晶構造を使用して算出した。ＣＤＲ領域については、（ａ）ＧｌｕまたはＡｓｐからＧｌｎ、Ａｓｎおよび最も一般的な残基型への変異全て、ならびに（ｂ）Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＨｉｓへの変異のための他の部位全てを、変異した際の安定性の変化および変異した際の結合親和性の変化について評価した。これらの算出値から、正味の電荷を増大させる一方で安定性または結合親和性には影響を及ぼさないことが予測される変異のセットを決定した（予測ΔΔＧ＜０．５ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。変異の一覧が表６に示されている。
【０５１４】
【表７】
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【０５１５】
これらの変異のサブセットを実験的に試験した。これらに全セグメントまたは周囲の残基がヒト生殖系列において見出された変異およびＣＤＲ内の負電荷パッチの極めて近傍にあった変異を含むように優先順位を付けた（図１４Ｆに示されている通り）。また、セグメントがヒト生殖系列において見出された１つの二重変異体を選択した（ＤＰ−２１、ＩＧＨＶ７−４−１、ＩＭＧＴ受託番号Ｚ１２３２３）。最後に、重鎖変異と軽鎖変異の組合せも選択した。これは、図１１により、＋２または＋３の電荷の変化には粘度を望ましいレベルまで低下させることが必要な場合があることが示唆されたので行った。これらの実験的に試験したＭＯＲ８４５７バリアントおよびそれに組み入れられたそれぞれの変異は表７に記載されている。抗体またはその抗原結合性部分は二量体であるので、単一の変異体は、抗体分子当たり２つの変異、すなわち、Ｈ鎖またはＬ鎖のそれぞれに１つずつ変異を含むことが理解される。同様に、２つの変異が存在する場合には、２つの重鎖および２つの軽鎖が存在するので、抗体は４つの（４）変異を含む。Ｈ鎖またはＬ鎖に１つずつ、および他のＨ鎖またはＬ鎖に２つずつの３つの（３）変異が存在する場合には、抗体は６つの変異を含むなどである。
【０５１６】
【表８】
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【０５１７】
粘度測定
重鎖および軽鎖を別々にコードする発現ベクター（表７のＭＯＲ８４５７−２〜ＭＯＲ８４５７−１８）をトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３Ｆ細胞において全長ＩｇＧの一過性発現を実施した。トランスフェクトした３〜７日後に細胞培養上清を回収し、遠心分離によって精製した。
【０５１８】
濾過後（０．２２μｍまたは０．４５μｍ）、上清を標準のプロテインＡまたはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳＵＲＥ、ＧＥ）に供した。タンパク質をｐＨ３で溶出させ、３Ｍのトリス、ｐＨ８中で中和した。さらに下流の処理は、緩衝液を１×Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と交換すること、および濾過滅菌すること（０．２μｍ；ＭｉｌｌｉｐｏｒｅまたはＳａｒｔｏｒｉｕｓ）を伴った。純度を変性、還元条件下で、および変性、非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてまたはキャピラリー電気泳動によって分析した。ＨＰ−ＳＥＣを実施してＩｇＧ調製物をそれらのネイティブな状態で分析した。
【０５１９】
ＭＯＲ８４５７の工学的に改変されたバリアントの粘度を以下の通り測定した。ＰＢＳ中タンパク質を、膜カセットデバイス１０Ｋ  ＭＷＣＯ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２０ｍＭのヒスチジン、８５ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．０５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０に対して広範囲にわたって透析した。タンパク質を透析から回収し、０．２ミクロンのシリンジフィルターを使用して濾過した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒｓ  １０Ｋ  ＭＷＣＯ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してタンパク質を濃縮した。タンパク質体積が低下し、タンパク質濃度が上昇するにしたがい、試料の一定分量（１２μｌ）をコンセントレーター保持液から除去した。３００ｎｍのビーズ（Ｎａｎｏｓｐｈｅｒｅ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をタンパク質試料および緩衝液ブランクに添加した。ビーズを２０ｍＭのヒスチジン、８５ｍｇ／ｍｌのスクロース、０．０５ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０中に１：１０希釈し、希釈したビーズ０．７５μｌをタンパク質試料にスパイクした。タンパク質／ビーズおよび緩衝液／ビーズ試料を穏やかにボルテックスすることによって混合した。動的光散乱測定（ＤＬＳ）による分析のために試料８μｌを１５３６ウェルプレート（ＳｅｎｓｏＰｌａｔｅ、ｇｌａｓｓ  ｂｏｔｔｏｍ、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）に移した。プレートを光学透明テープで密閉し、２０００ＲＰＭで２分遠心分離して気泡を除去した。
【０５２０】
ＤｙｎａＰｒｏ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用してＤＬＳ測定を行った。試料を２５℃でインキュベートし、１５回の連続した２５秒間の取得を用いて測定した。許容できる減衰曲線を有したデータ取得についてビーズの半径を平均した。粘度をＳｔｏｋｅｓ−Ｅｉｎｓｔｅｉｎ方程式に基づいて算出した。試料の粘度を、測定された見かけの半径を公称ビーズ半径で割り、２５℃における水の粘度０．８９３ｃＰを掛けて算出した。
【０５２１】
データにより、バリアントＭＯＲ８５４７−１６では親のＭＯＲ−８４５７抗体または生殖系列化されたＭＯＲ８４５７−ＧＬ構築物のいずれかと比較して実質的に低下した粘度が示されたことが実証される（図１５）。ＭＯＲ８４５７−１５では、ＭＯＲ８４５７−ＧＬと比較して粘度の低下は示されなかったが、親のＭＯＲ８４５７抗体と比較して粘度の有意な低下が実証された。
【０５２２】
上位のクローンの分析
２つのクローン、ＭＯＲ８４５７−１５およびＭＯＲ８４５７−１６では、親のｍＡｂ  ＭＯＲ８４５７−ＧＬ（実施例を参照されたい１１、１２）と比較して安定性および発現の増大が示された。安定性および発現の改善に加えて、ＭＯＲ８４５７−１６ではＭＯＲ８４５７親の抗体と比較して、およびＭＯＲ８４５７−ＧＬと比較して粘度の低下が示された。どちらのクローンも重鎖Ｅ６Ｑ変異およびＱ１３Ｋ変異を共有し、それと同時にＭＯＲ８４５７−１５は軽鎖Ｄ９６Ｎ変異も有し、ＭＯＲ８４５７−１６は軽鎖Ｎ５３Ｋ変異も有した、すなわち、これらは一般的な重鎖を共有し、軽鎖は単一のアミノ酸残基により異なった。これらの２つの変異体の相同性モデルとＰＤＧＦ−Ｂの複合体が図１６に示されている。これらの相同性モデルはＤｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｔｕｄｉｏ３．５のＭｏｄｅｌｅｒパッケージおよびＭＯＲ８４５７：ＰＤＧＦ−Ｂ結晶構造を使用して生成した。重鎖のＨ６部位およびＨ１３部位は結合部位から遠く離れており、一方、軽鎖のＬ９６部位およびＬ５３部位は結合部位の近くにあるが、ＰＤＧＦ−Ｂと直接は相互作用しない。さらに、図１７は、軽鎖ＣＤＲ領域内の負電荷を有するパッチの近傍のＬ５３部位を示す。この負電荷を有するパッチは結晶構造において、および相同性モデルにおいてＰＤＧＦ−Ｂと直接接触している。いかなる特定の理論にも制約されることなく、変異した軽鎖Ｎ５３Ｋ残基は、この負電荷パッチに関連するまたはそれによって媒介される自己会合の一部を遮断することができると思われるが、同時にＰＤＧＦ−Ｂ結合部位からは結合親和性には影響を及ぼさないほど十分に離れている。
【０５２３】
粘度の低下は、凝集の低減をもたらす可能性があり、また、タンパク質を非経口的にまたは皮下に送達するためにタンパク質を濃縮する能力に影響を及ぼす可能性があるという点で、タンパク質を製造する能力に関するので、タンパク質治療薬の上首尾の商業化において重要な因子である。さらに、粘度の低下により、より小さなボア（すなわち、内径）および／またはゲージ（すなわち、外径）を備えた送達デバイスによって、かつ／またはより速い送達速度で投与する能力を含め、患者への抗体の送達が容易になり得る。また、凝集体は抗薬物抗体（ＡＤＡ）の発生と関連する可能性があるので、また、粘度の増大は凝集の低減に関する可能性があるので、粘度の低下はタンパク質治療薬の上首尾の商業化における重要な因子であり得る。したがって、ＭＯＲ８４５７バリアントの粘度の低下は、抗体に潜在的な新規の治療薬としての有意な利点をもたらすことができる重要な望ましい特性である。
【０５２４】
（実施例１１）
工学的に改変されたＭＯＲ８４５７バリアントの安定性の改善
ＭＯＲ８４５７バリアント抗体の熱安定性を評価するために、タンパク質試料を４００μｌの体積のＰＢＳ（８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、ｐＨ７．２）中、０．３ｍｇ／ｍｌまで希釈した。ＰＢＳを参照細胞における緩衝液ブランクとして使用した。試料を、Ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いてＭｉｃｒｏＣａｌ  ＶＰ−Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ＤＳＣの試料トレイ内に分配した。試料を１０℃で５分にわたって平衡化し、次いで、１時間当たり１００℃の速度で最大１１０℃までスキャンした。１６秒の濾過期間を選択した。生のデータをベースライン補正し、タンパク質濃度を正規化した。Ｏｒｉｇｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ７．０（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ）を使用して、適切な数の転移を伴ってデータをＭＮ２−Ｓｔａｔｅ  Ｍｏｄｅｌにフィッティングした。
【０５２５】
抗体バリアントのうちの２つ、ＭＯＲ８４５７−１５およびＭＯＲ８４５７−１６では、親のｍＡｂ  ＭＯＲ８４５７−ＧＬと比較して熱安定性（図１８）および発現（図１９）の増大が示された。潜在的な治療薬の熱安定性および発現レベルは、とりわけ、商品原価に影響を及ぼすので、新規の治療薬の上首尾の商業化における重要な因子である。
（実施例１２）
【０５２６】
工学的に改変されたＭＯＲ８４５７バリアントの改善された製造可能性プロファイル
ＭＯＲ８４５７−ＧＬおよび工学的に改変されたバリアントの収率および純度分析
分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）およびＵＶ吸収分光法を使用して、ＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現させたＭＯＲ８４５７抗体のパネルのプロテインＡによる捕捉後の純度および収率を評価した（図１９パネルＡ）。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを、まず、ＨＥＫ２９３馴化培地を、０．２ｍｍＰＥＳフィルターを通して濾過し、次いでそれを１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、８．１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）を用いて平衡化したＭａｂ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）プロテインＡカラムにローディングすることによって達成した。次いで、カラムをＰＢＳで洗浄し、２０ｍＭのクエン酸、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ２．５を使用して結合したタンパク質を溶出させた。ピーク画分をプールし、２Ｍのトリス、ｐＨ８．０を用いて中和した。各抗体について、総捕捉タンパク質の数量化を、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収測定およびモル吸光係数を用いて実施した。Ｅｄｅｌｈｏｃｈ法（Ｅｄｅｌｈｏｃｈ  Ｈ．、１９６７、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ６：１９４８〜１９５４）を使用し、ＴｒｐおよびＴｙｒについての吸光係数（Ｐａｃｅら、１９９５、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．４：２４１１〜２４２３）を用いて吸光係数を導出した。Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にフィッティングさせたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＳＥＣを実施した。これについては、およそ２０〜３０μｇのタンパク質を毎分０．５ｍＬの流速で、ＰＢＳで平衡化したカラムに注射し、定組成溶離を６０分にわたって行った。タンパク質を２８０ｎｍにおける吸収によって検出した。この分析の結果は、組合せバリアントにおける純度およびプロテインＡ収率の増大として示されている（図１９パネルＡ；白色の棒と比較して灰色の棒）。特に、ＭＯＲ８４５７−１６では、プロテインＡ収率の上昇に加えて、プロテインＡによる溶出液中で＞９９％の対象のピーク（ＰＯＩ）が示された（図１９パネルＢ）。粘度の低下および収率の増加などの特性を含めた製造可能性の改善は、治療薬の製造および商業化の費用に影響を及ぼす可能性があるので、治療薬の商業的開発における重要な因子である。
【０５２７】
（実施例１３）
ＭＯＲ８４５７−１６バリアントの結合親和性、特異性および効力
異なるＰＤＧＦアイソフォームに対するＭＯＲ８４５７−１６の結合親和性を以前に記載されている通り（実施例６）、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）を使用して決定した。簡単に述べると、抗ヒトＩｇＧ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）抗体をＣＭ５センサーチップのフローセルに、アミンカップリングを製造者の指示通り使用して８，０００〜１０，０００共鳴単位（ＲＵ）で固定化した。試験抗体をＰＢＳ−ＮＥＴ（１０ｍＭのリン酸、ｐＨ７．４、２８７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、３．２ｍＭのＥＤＴＡ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中、０．５μｇ／ｍＬまで希釈し、抗ヒト抗体表面に３０秒にわたって注射し、それにより８２〜１２２ＲＵの安定な抗ＰＤＧＦ表面をもたらした。ＰＤＧＦタンパク質をＰＢＳ−ＮＥＴ中、１ｎＭまで希釈し、０．２５ｎＭまで２倍ずつ希釈した。次いで、各濃度のＰＤＧＦを抗体表面に毎分１００μｌの流速で２分にわたって注射した。１０分にわたって複合体を解離させた。３Ｍの塩化マグネシウムを３０秒注射することで表面を再生させ、表面を抗ＰＤＧＦ抗体捕捉およびＰＤＧＦ結合カイネティクスの別のラウンドの準備ができた状態にした。動力学的なデータを、Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉｏ−Ｌｏｇｉｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して２重に照会し（Ｄ．Ｇ．Ｍｙｓｚｋａら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ  １２：２７９、１９９９）、次いで、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアバージョン４．１を使用して１：１結合モデルにフィッティングした。ＰＤＧＦアイソフォーム全てのタンパク質濃度を、限定物質輸送（ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）の条件下で決定された活性濃度を用いて補正した（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、ＭＥＴＨＯＤＳ：Ａ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６：９９〜１１０、１９９４）。示されている結果は２つの独立した結合試験の平均である。
【０５２８】
ＭＯＲ８４５７−１６抗体ではヒトＰＤＧＦ−ＡＢおよびヒトＰＤＧＦ−ＢＢに対する低ｐＭの結合親和性ならびにマウスＰＤＧＦ−ＢＢおよびラットＰＤＧＦ−ＢＢに対する交差反応性が保持された（図２０および表８）。その結合親和性および特異性は親ＭＯＲ８４５７−ＧＬのものに匹敵し（実施例６）、これにより、粘度の改善を生じる変異にＰＤＧＦへの結合が含まれなかったことが示唆される。
【０５２９】
ＭＯＲ８４５７−１６の機能活性を確認するために、そのメサンギウム細胞増殖の阻害を試験した。アッセイを以前に記載されている通り実施した（実施例８）。簡単に述べると、抗体を１００ｎＭから０．１ｎＭまで２分の１対数希釈し、次いで、細胞を添加する３０分前に０．１％ＢＳＡを伴う無血清ＭＣＭ培地中２．５ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−ＢＢと混合した。図２１は、同じ実験における親ＭＯＲ８４５７−ＧＬ（Ｂ）と比較したＭＯＲ８４５７−１６（Ａ）の阻害曲線を示す。ＭＯＲ８４５７−１６のＩＣ５０は１４ｐＭであり、これは２０ｐＭである親ＭＯＲ８４５７のＩＣ５０と同様であった。
【０５３０】
【表９】
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【０５３１】
【表１０−１】
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【０５３２】
【表１０−２】
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【０５３３】
【表１０−３】
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【０５３４】
【表１０−４】
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【０５３５】
【表１０−５】
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【０５３６】
【表１０−６】
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【０５３７】
開示されている教示は、種々の適用、方法、キット、および組成物を参照して記載されているが、本明細書における教示および以下の特許請求された発明から逸脱することなく種々の変化および改変を行うことができることが理解されよう。前述の例は、開示されている教示をよりよく例示するために提供されており、本明細書で示されている教示の範囲を限定するものではない。本教示はこれらの例示的な実施形態に関して記載されているが、これらの例示的な実施形態の多数の変形および改変が過度な実験を伴わずに可能であることは当業者には容易に理解されよう。そのような変形および改変は全て、本教示の範囲内に入る。
【０５３８】
特許、特許出願、論文、教科書など、およびそこに引用されている参考文献を含めた、本明細書において引用された全ての参考文献は、まだ組み込まれていなければは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。組み入れられた文献および類似した材料の１つまたは複数が、これだけに限定されないが、定義された用語、用語の使用、当該記載の技法などを含めて本出願とは異なる、または矛盾する事象では、本出願に支配される。
【０５３９】
前述の説明および例には、本発明のある特定の具体的な実施形態が詳述され、本発明者らにより企図された最良の形式が記載されている。しかし、本文中に出現し得る前述のものがいかに詳述されていても、多くのやり方で本開示を実践することができ、また、本開示は、添付の特許請求の範囲およびあらゆるその等価物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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