(57)【要約】  本発明は一般的に、抗体、例えばJagged1及び/又はJagged2を認識するヒト完全モノクローナル抗体を包含するモノクローナル抗体の生成、抗体、例えばJagged1及び/又はJagged2を認識する完全ヒト抗体を包含するモノクローナル抗体、抗体をコードする核酸分子、例えばJagged1及びJagged2の両者を認識する完全ヒト交差反応性抗体を包含するモノクローナル抗体をコードする核酸分子、及び治療薬、予防薬、及び診断薬としての抗−Jagged抗体の使用方法に関する。本発明はまた、一般的に、Jagged1及びJagged2に対して特異的に結合する、マスキング成分（ＭＭ）、切断可能成分（ＣＭ）及び抗体（ＡＢ）を含む活性化可能抗体、及びそれらの活性化可能抗−Jagged抗体の製造方法及び種々の治療、診断及び予防指標へのそれらの使用方法にも関する。
2015521625.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２を結合する、単離された完全ヒトモノクローナル抗体。
【請求項２】
前記抗体が、アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ（配列番号２００）を含むＶＨ ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＳＩＤＰＥＧＲＱＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２０８）を含むＶＨ ＣＤ２；アミノ酸配列ＤＩＧＧＲＳＡＦＤＹ（配列番号２０９）を含むＶＨ ＣＤＲ３；アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹ（配列番号２１０）を含むＶＬ ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２１１）を含むＶＬ ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列ＱＱＴＶＶＡＰＰＬ（配列番号２１２）を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、表２に示される組合せから選択された、ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、ＶＨ ＣＤＲ３配列、ＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列及びＶＬ ＣＤＲ３配列の組合せを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、表４に列挙される組合せからの可変Ｈ鎖領域及び可変Ｌ鎖領域の組合せを含む、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２を結合し、そして１つ以上のＪａｇｇｅｄ１又はＪａｇｇｅｄ２がＮｏｔｃｈ受容体に結合するのを妨げる、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、ＩｇＧアイソタイプである、請求項１に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が、ＩｇＧ１アイソタイプである、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体に結合される剤を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
前記剤が、治療剤、抗腫瘍剤、毒素又はそのフラグメント、検出可能成分又は診断剤である、請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記剤が、リンカーを介して前記抗体に結合される、請求項８に記載の抗体。
【請求項１１】
前記リンカーが、切断可能リンカーである、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の抗体及び担体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
活性化された状態で、Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２を結合する活性化可能抗体であって、以下：
Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２に対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）；
活性化可能抗体が未切断状態にある場合、Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２へのＡＢの結合を阻害するマスキング成分（ＭＭ）；及び
ＡＢに結合される切断可能成分（ＣＭ）、ここで、前記ＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである
を含む、活性化可能抗体。
【請求項１４】
前記ＭＭが、Ｊａｇｇｅｄ１及びJａｇｇｅｄ２に対するＡＢの平衡解離定数よりも大きな、ＡＢに結合するための平衡解離定数を有する、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項１５】
前記ＭＭが、活性化可能抗体が切断された状態で存在する場合、Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２に対して結合するためにＡＢを干渉しないか又はＡＢと競争しない、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項１６】
前記プロテアーゼが、組織においてＪａｇｇｅｄ１及び／又はＪａｇｇｅｄ２と共局在し、そして前記プロテアーゼが、活性化可能抗体がプロテアーゼに供される場合、活性化可能抗体中のＣＭを切断する、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項１７】
未切断状態下での前記活性化可能抗体が、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有する、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項１８】
前記活性化可能抗体が、ＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項１９】
前記活性化可能抗体が、ＣＭとＡＢとの間に連結ペプチドを含む、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項２０】
前記活性化可能抗体が、第１連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、そして未切断状態での前記活性化可能抗体が、Ｎ末端からＣ末端側に、次のような構造配置：ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢ又はＡＢ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＭＭを有する、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項２１】
前記２種の連結ペプチドがお互い同一である必要はない、請求項２０に記載の活性化可能抗体。
【請求項２２】
ＬＰ１及びＬＰ２のそれぞれが、約１〜２０個の長さのアミノ酸のペプチドである、請求項２０に記載の活性化可能抗体。
【請求項２３】
前記ＭＭが約２〜４０個の長さのアミノ酸のポリペプチドである、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項２４】
前記ＭＭポリペプチド配列が、Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２の配列とは異なり、そして前記ＭＭポリペプチド配列が、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して５０％以上同一ではない、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項２５】
前記ＣＭが、１５個までの長さのアミノ酸のポリペプチドである、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項２６】
前記その抗原結合フラグメントが、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ′）2フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃａｂ、ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体及び単一ドメインＬ鎖抗体から成る群から選択される、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項２７】
前記ＣＭが、ｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ−ＳＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ−１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３及びＭＭＰ−１４から成る群から選択される酵素のための基質である、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項２８】
前記ＡＢに結合される剤を含む、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項２９】
前記剤が、治療剤、抗腫瘍剤、毒素又はそのフラグメント、検出可能成分又は診断剤である、請求項２８に記載の活性化可能抗体。
【請求項３０】
前記剤が、リンカーを介して前記ＡＢに結合される、請求項２８に記載の活性化可能抗体。
【請求項３１】
前記リンカーが、切断可能リンカーである、請求項３０に記載の活性化可能抗体。
【請求項３２】
前記ＭＭが、表９、表１１、表１２、表１３、表１４、表１９、表２０、表２１、表２２又は表２３に示される配列から成る群から選択される配列を含む、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項３３】
Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２を結合する前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、アミノ酸配列ＳＹＡＭＳ（配列番号２００）を含むＶＨ ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＳＩＤＰＥＧＲＱＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２０８）を含むＶＨ ＣＤ２；アミノ酸配列ＤＩＧＧＲＳＡＦＤＹ（配列番号２０９）を含むＶＨ ＣＤＲ３；アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＳＳＹ（配列番号２１０）を含むＶＬ ＣＤＲ１；アミノ酸配列ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号２１１）を含むＶＬ ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列ＱＱＴＶＶＡＰＰＬ（配列番号２１２）を含むＶＬ ＣＤＲ３を含む、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項３４】
Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２を結合する前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、表２に示される組合せから選択される、ＶＨ ＣＤＲ１配列、ＶＨ ＣＤＲ２配列、ＶＨ ＣＤＲ３配列、ＶＬ ＣＤＲ１配列、ＶＬ ＣＤＲ２配列及びＶＬ ＣＤＲ３配列の組合せを含む、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項３５】
Ｊａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２を結合する前記抗体又はその抗原結合フラグメントが、表４に列挙される組合せからの可変Ｈ鎖領域及び可変Ｌ鎖領域の組合せを含む、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項３６】
配列番号７４、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４及び１９６から成る群から選択されるＬ鎖アミノ酸配列、及び配列番号７６及び１４８から成る群から選択されるＨ鎖アミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の活性化可能抗体。
【請求項３７】
請求項１に記載の抗体又は請求項１３に記載の活性化可能抗体をコードする単離された核酸分子。
【請求項３８】
請求項３７に記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項３９】
抗体又は活性化可能抗体を、前記抗体又は活性化可能抗体の発現を導く条件下で細胞を培養することにより製造する方法であって、ここで、前記細胞が請求項３７に記載の核酸分子を含む、方法。
【請求項４０】
活性化された状態でＪａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２を結合する活性化可能抗体の製造方法であって、以下：
（ａ）前記活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を、前記活性化可能抗体の発現を導く条件下で培養し、ここで、前記活性化可能抗体がマスキング成分（ＭＭ）、切断可能成分（ＣＭ）、及びＪａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、そして
（ｂ）前記活性可能抗体を回収すること
を含む、方法。
【請求項４１】
前記ＣＭが、プロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＣＭが、末切断状態下で、前記ＭＭがＪａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２への前記ＡＢの特異的結合を干渉し、そして切断された状態下で、前記ＭＭがＪａｇｇｅｄ１及びＪａｇｇｅｄ２へのＡＢの特異的結合を干渉しないか又はその結合と競争しないように、活性化可能抗体中に位置する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
対象における癌に関連する臨床学的徴候の症状を緩和するための方法であって、前記方法が、請求項１に記載の抗体又は請求項１３に記載の活性化可能抗体を、癌に関連する臨床学的徴候の症状を緩和するのに十分な量で、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
【請求項４４】
請求項１に記載の抗体又は請求項１３に記載の活性化可能抗体を、血管形成を低減するのに十分な量で、それを必要とする対象に投与することを含む、血管形成を低減するための方法。
【請求項４５】
請求項１に記載の抗体又は請求項１３に記載の活性化可能抗体を、Ｊａｇｇｅｄ１及び／又はＪａｇｇｅｄ２シグナル伝達を低減するのに十分な量で、それを必要とする対象に投与することを含む、Ｊａｇｇｅｄ１及び／又はＪａｇｇｅｄ２シグナル伝達を低減するための方法。
【請求項４６】
前記対象がヒトである、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
請求項１に記載の抗体又は請求項１３に記載の活性化可能抗体を、対象における線維性障害の症状を緩和するのに十分な量で、それを必要とする対象に投与することを含む、線維性障害の症状を緩和するための方法。
【請求項４８】
前記対象がヒトである、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年６月２２日に提出された米国特許仮出願第６１／６６３，３０７号；２０１３年１月４日に提出された米国特許仮出願第６１／７４９,２１２号；２０１３年１月７日に提出された米国特許仮出願第６１／７４９,４８６号；及び２０１３年１月２３日に提出された米国特許仮出願第６１／７５５，８１０号の利益を主張し；それらは参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
【０００２】
本発明は一般的に、抗体、例えばJagged1及び/又はJagged2を認識するヒト完全モノクローナル抗体を包含するモノクローナル抗体の生成、抗体、例えばJagged1及び/又はJagged2を認識する完全ヒト抗体を包含するモノクローナル抗体、抗体をコードする核酸分子、例えばJagged1及びJagged2の両者を認識する完全ヒト交差反応性抗体を包含するモノクローナル抗体をコードする核酸分子、及び治療薬、予防薬、及び診断薬としての抗−Jagged抗体の使用方法に関する。本発明はまた、一般的に、Jagged1及びJagged2に対して特異的に結合する活性化可能抗体、及びそれらの活性化可能抗−Jagged抗体の製造方法及び種々の治療、診断及び予防指標へのそれらの使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
Notchシグナル伝達経路は、広範囲の種類の細胞型及び細胞工程を調節する。Notchシグナル伝達経路は、リガンド、例えばJagged1及びJagged2を包含するリガンド結合により調節される。従って、Jagged1及び/又はJagged2を包含するNotchシグナル伝達経路を標的化する治療薬及び診断薬のための必要性がある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、癌又は線維性疾患の診断及び／又は治療のための組成物を記載する。特に、本発明は、Jagged1及びJagged2の両者を結合し、そしてそれらのNotch受容体への結合及びNotch受容体を介してのシグナル伝達を阻害する抗体を提供する。本発明は、Jagged1及びJagged2を、特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。本発明の抗体は、Notch受容体へのJagged１の結合、Notch受容体へのJagged2の結合、Notch受容体へのJagged1及びJagged2の結合、Jagged１とNotch受容との間の相互反応を介してのシグナル伝達、Jagged2とNotch受容体との間の相互作用を介してのシグナル伝達、及び／又はJagged1、Jagged2及びNotch受容体間の相互作用を介してのシグナル伝達を調節し、例えばブロックし、阻害し、低減し、拮抗し、中和し、又は他方では、干渉する。それらの抗体は本明細書においては、「抗−Jagged抗体」として言及される。本発明の抗−Jagged抗体は、モノクローナル抗体、例えば完全ヒトモノクローナル抗体、並びにヒト化モノクローナル抗体及びキメラ抗体を包含する。いくつかの実施形態によれば、抗体はＩｇＧアイソタイプである。いくつかの実施形態によれば、抗体は、本明細書に開示される任意のアイソタイプの１つを有する。
【０００５】
Jaggedとして最初に同定され、そしてまた、ＪＡＧ１、ＪＡＧＬ１及び／又はＨＪ１としても言及されるJagged1は、Notchのためのトランスメンブランリガンドであることが示されている。Jagged2は、Jagged1に関連するNotchの別のリガンドである。Jagged1及びJagged2の両者は、Notch−１、Notch−２、Notch−３及びNotch−４受容体のためのリガンドである（例えば、Shimizu K et al., “Binding of Delta1, Jagged 1, and Jagged 2 to Notch2 rapidly induces cleavage, nuclear translocation, and hyperphosphorylation of Notch2.” Molecular Cellular Biology 20(18): 6913-6922 (2000); Shimizu K et al., “Physical interaction of Delta1, Jagged 1, and Jagged 2 with Notch1 and Notch3 receptors. Biochemical and Biophysical Research Communications 276(1): 385-389 (2000); Microvasc Res. 60(2):91-103 (2000)を参照のこと）。Jaggedタンパク質は元来、セラート（Serrte）タンパク質として言及されていた。
【０００６】
本発明の典型的なモノクローナル抗体は、例えば、４Ｄ１１抗体、４Ｂ２抗体、４Ｅ７抗体、４Ｅ１１抗体、６Ｂ７抗体及び６Ｆ８抗体を包含する。他の適切な抗体は、４Ｄ１１抗体、４Ｂ２抗体、４Ｅ７抗体、４Ｅ１１抗体、６Ｂ７抗体及び６Ｆ８抗体と同じエピトープに結合する抗体を包含する。
【０００７】
それらの抗体は、ヒトJagged1及びヒトJagged2に対する特異性を示し、そしてそれらは、Notch受容体を介してJagged1及びJagged2介在性シグナル伝達を阻害するか又は他方では、干渉することが示されている。それらの抗体はまた、マウス及びラットJagged１に対する特異性も示す。いくつかの実施形態によれば、それらの抗体はまた、マウス及び／又はラットJagged2に対する特異性も示す。
【０００８】
いくつかの実施形態によれば、本開示の抗−Jagged抗体は、疾病細胞、例えば癌細胞、又は線維性障害に関与する細胞上に発現されるJagged1及び/又はJagged2に対する結合に基づいて内在化され得る。
【０００９】
本発明の抗−Jagged抗体は、表２に示される組合せから選択された、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含む。本発明の抗−Jagged抗体は、表２に示される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含む。
【００１０】
本発明の抗−Jagged抗体は、４Ｄ１１抗体、４Ｂ２抗体、４Ｅ７抗体、４Ｅ１１抗体、６Ｂ７抗体及び６Ｆ８抗体から成る群から選択された少なくとも１つの抗体の、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含む。本発明の抗−Jagged抗体は、４Ｄ１１抗体、４Ｂ２抗体、４Ｅ７抗体、４Ｅ１１抗体、６Ｂ７抗体及び６Ｆ８抗体から成る群から選択された少なくとも１つの抗体のそれぞれのＣＤＲ配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含む。
【００１１】
本発明の抗−Jagged抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含み、ここで少なくとも１つのＣＤＲ配列は、アミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）を含むＶＨ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）を含むＶＨ  ＣＤ２；アミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３から成る群から選択される。
【００１２】
本発明の抗−Jagged抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含み、、ここで少なくとも１つのＣＤＲ配列は、アミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤ２；アミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３から成る群から選択される。
【００１３】
本発明の抗−Jagged抗体は、少なくともアミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）を含むＶＨ  ＣＤＲ１；少なくともアミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）を含むＶＨ  ＣＤ２；少なくともアミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；少なくともアミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及び少なくともアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【００１４】
本発明の抗−Jagged抗体は、アミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤ２；アミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【００１５】
本発明の抗−Jagged抗体は、表４に列挙される組合せから選択された、可変Ｈ鎖領域及び可変Ｌ鎖領域の組合せを含む抗体を含む。本発明の抗−Jagged抗体は、表４に列挙される組合せに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である、可変Ｈ鎖領域及び可変Ｌ鎖領域の組合せを含む抗体を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７４を含むＬ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上,同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７６を含むＨ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７４を含むＬ鎖配列及び配列番号７６を含むＨ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上,同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖配列及び配列番号７６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号５４を含むＬ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上,同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号５６を含むＨ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号５６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号５４を含むＬ鎖配列及び配列番号５６を含むＨ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号５４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上,同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖配列及び配列番号５６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖配列を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体はまた、ＡＢに結合される剤も含む。いくつかの実施形態によれば、前記剤は治療剤である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は抗腫瘍剤である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は毒素（toxin）又はそのフラグメントである。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、リンカーを介して抗−Jagged抗体に結合される。いくつかの実施形態によれば、前記リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、表３０に列挙される群から選択された剤である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、アウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はマイタンシノイド又はマイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、デュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、カリケアマイシン又はその誘導体である。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体はまた、検出可能成分も含む。いくつかの実施形態によれば、前記検出可能成分は、診断剤である。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は天然において、１又は２以上のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、１又は２以上のジスルヂド結合を含むよう操作され得る。
【００２１】
本発明はまた、本明細書に記載される抗−Jagged抗体をコードする単離された核酸分子、及びそれらの単離された核酸配列を含むベクターも提供する。本発明は、そのような核酸分子を含む細胞を、抗−Jagged抗体の発現を導く条件下で培養することによる抗−Jagged抗体の生成方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、細胞は、そのようなベクターを含む。
【００２２】
本発明はまた、マスキング部分（ＭＭ）にカップリングされるか又は他方では、結合されるJagged1及びJagged2を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む活性化可能抗体及び活性化可能抗体組成物も提供し、結果的に、ＭＭのカップリングが、Jagged1及びJagged2を結合する、抗体又はその抗原結合フラグメントの能力を低める。それらの活性化可能抗体は、本明細書においては、活性化可能抗−Jagged抗体として、集合的には言及され、また、抗−Jagged活性化可能抗体又はJagged活性化抗体としても、本明細書においては言及される。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、プロテアーゼ、例えば対象における治療部位又は診断部位でJagged１及び／又はJagged2と共局在するプロテアーゼのための基質を含む配列を介してカップリングされる。本明細書に提供される活性化可能抗−Jagged抗体は、循環において安定し、治療及び／又は診断の意図される部位で活性化されるが、しかし正常、すなわち健康組織においては、活性化されず、そして活性化される場合、対応する未修飾抗体に少なくとも匹敵する、Jagged1及びJagged2への結合を示す。
【００２３】
本発明の活性化可能抗−Jagged抗体は、表２に示される組合せから選択された、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含む。本発明の抗−Jagged抗体は、表２に示される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含む。
【００２４】
本発明の活性化可能抗−Jagged抗体は、４Ｄ１１抗体、４Ｂ２抗体、４Ｅ７抗体、４Ｅ１１抗体、６Ｂ７抗体及び６Ｆ８抗体から成る群から選択された少なくとも１つの抗体の、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含む。本発明の抗−Jagged抗体は、４Ｄ１１抗体、４Ｂ２抗体、４Ｅ７抗体、４Ｅ１１抗体、６Ｂ７抗体及び６Ｆ８抗体から成る群から選択された少なくとも１つの抗体のそれぞれのＣＤＲ配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含む。
【００２５】
本発明の抗−Jagged抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含み、ここで少なくとも１つのＣＤＲ配列は、アミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）を含むＶＨ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）を含むＶＨ  ＣＤ２；アミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３から成る群から選択される。
【００２６】
本発明の抗−Jagged抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含み、、ここで少なくとも１つのＣＤＲ配列は、アミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤ２；アミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３から成る群から選択される。
【００２７】
本発明の抗−Jagged抗体は、少なくともアミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）を含むＶＨ  ＣＤＲ１；少なくともアミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）を含むＶＨ  ＣＤ２；少なくともアミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；少なくともアミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及び少なくともアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【００２８】
本発明の抗−Jagged抗体は、アミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤ２；アミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【００２９】
本発明の活性化可能抗−Jagged抗体は、表４に列挙される組合せから選択された、可変Ｈ鎖領域及び可変Ｌ鎖領域の組合せを含む抗体を含む。本発明の抗−Jagged抗体は、表４に列挙される組合せに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である、可変Ｈ鎖領域及び可変Ｌ鎖領域の組合せを含む抗体を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の抗−Jagged抗体は、配列番号７４を含むＬ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上,同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７６を含むＨ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７４を含むＬ鎖配列及び配列番号７６を含むＨ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上,同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖配列及び配列番号７６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖配列を含む。
【００３１】
いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７４、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４及び１４６から成る群から選択されたアミノ酸配列を含むＬ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７４、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４及び１４６から成る群から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上,同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７６及び配列番号１４８を含むＨ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７４、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４及び１４６から成る群から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７４、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４及び１４６から成る群から選択されたアミノ酸配列を含むＬ鎖配列、及び配列番号７６及び配列番号１４８を含むＨ鎖配列を含む。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体は、配列番号７４、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４及び１４６から成る群から選択されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含むＬ鎖配列、及び配列番号７６及び配列番号１４８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一であるアミノ酸配列を含むＨ鎖配列を含む。
【００３２】
本明細書に記載される活性化された状態での活性化可能抗体は、Jagged1及びJagged2を結合し、そして次のものを含む：（ｉ）Jagged1及びJagged2に対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）；（ｉｉ）活性化可能抗体が未切断状態で存在する場合、Jagged1及びJagged2に対するＡＢの結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）；及び（ｉiｉ）ＡＢにカップリングされる切断可能部分（ＣＭ）、ここでＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＣＭを介してＡＢにカップリングされる。
【００３３】
いくつかの実施形態によれば、未切断状態下での活性化可能抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有する。
【００３４】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体は、ＭＭとＣＭとの間に連結ペプチドを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体は、ＣＭとＡＢとの間に連結ペプチドを含む。
【００３６】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体は第１連結ペプチド（ＬＰ１）及び第２連結ペプチド（ＬＰ２）を含み、そして未切断状態での前記活性化可能抗体は、Ｎ末端からＣ末端側に、次のような構造配置：ＭＭ−ＬＰ１−ＣＭ−ＬＰ２−ＡＢ 又はＡＢ−ＬＰ２−ＣＭ−ＬＰ１−ＭＭを有する。いくつかの実施形態によれば、前記２種の連結ペプチドがお互い同一である必要はない。
【００３７】
いくつかの実施形態によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは、（ＧＳ）n、（ＧＧＳ）n、（ＧＳＧＧＳ）n (配列番号１２３) 及び （ＧＧＧＳ）n (配列番号１２４)（ここで、ｎは少なくとも１の整数である）から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ＬＰ１又はＬＰ２の少なくとも１つは、ＧＧＳＧ (配列番号１２５)、ＧＧＳＧＧ (配列番号１２６)、ＧＳＧＳＧ (配列番号１２７)、ＧＳＧＧＧ (配列番号１２８)、ＧＧＧＳＧ (配列番号１２９)及びＧＳＳＳＧ (配列番号１３０)から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００３８】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体は、Jagged1及びJagged2を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態によれば、Jagged1及びJagged2を結合する抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、モノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ'）2フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃＡｂ、ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体、又は単一ドメインＬ鎖抗体である。いくつかの実施形態によれば、Jagged1及びJagged2を結合するそのような抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、齧歯類（例えば、マウス又はラット）、キメラ、ヒト化又は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【００３９】
いくつかの実施形態によれば、開示の活性化された抗−Jagged抗体（すなわち、切断された状態下での）は、疾病細胞、例えば癌細胞又は線維性障害に関与する細胞上に発現されるJagged1及びJagged2への結合に基づいて、内在化される。
【００４０】
いくつかの実施形態によれば、ＡＢは、Jagged1及びJagged2への結合のために約１００ｎＭ又はそれ以下の平衡解離定数を有する。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、Jagged1及びJagged2へのＡＢの平衡解離定数よりも大きい、ＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。
【００４２】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、Jagged1及びJagged2へのＡＢの平衡解離定数以下である、ＡＢへの結合のための平衡解離定数を有する。
【００４３】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、活性化可能抗体が切断された状態である場合、Jagged1及びJagged2への結合のために、ＡＢを干渉しないか又はＡＢと競争しない。
【００４４】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、約２〜４０個の長さのアミノ酸のポリペプチドである。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、４０個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。
【００４５】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭポリペプチド配列は、Jagged1及びJagged2のその配列とは異なり、そしてＭＭポリペプチド配列は、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して５０％以上、同一ではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭポリペプチド配列は、Jagged1及びJagged2のその配列とは異なり、そしてＭＭポリペプチド配列は、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して２５％以上、同一ではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭポリペプチド配列は、Jagged1及びJagged2のその配列とは異なり、そしてＭＭポリペプチド配列は、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して１０％以上、同一ではない。
【００４６】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭのカップリングは、Jagged1及びJagged2を結合するＡＢの能力を低め、結果的に、Jagged1及びJagged2に向かってＭＭにカップリングされる場合のＡＢの解離定数（Ｋd）は、Jagged1及びJagged2に向かってＭＭにカップリングされない場合のＡＢのＫdよりも、少なくとも２０倍、高い。
【００４７】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭのカップリングは、Jagged1及びJagged2を結合するＡＢの能力を低め、結果的に、Jagged1及びJagged2に向かってＭＭにカップリングされる場合のＡＢの解離定数（Ｋd）は、Jagged1及びJagged2に向かってＭＭにカップリングされない場合のＡＢのＫdよりも、少なくとも４０倍、高い。
【００４８】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭのカップリングは、Jagged1及びJagged2を結合するＡＢの能力を低め、結果的に、Jagged1及びJagged2に向かってＭＭにカップリングされる場合のＡＢの解離定数（Ｋd）は、Jagged1及びJagged2に向かってＭＭにカップリングされない場合のＡＢのＫdよりも、少なくとも１００倍、高い。
【００４９】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭのカップリングは、Jagged1及びJagged2を結合するＡＢの能力を低め、結果的に、Jagged1及びJagged2に向かってＭＭにカップリングされる場合のＡＢの解離定数（Ｋd）は、Jagged1及びJagged2に向かってＭＭにカップリングされない場合のＡＢのＫdよりも、少なくとも１０００倍、高い。
【００５０】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭのカップリングは、Jagged1及びJagged2を結合するＡＢの能力を低め、結果的に、Jagged1及びJagged2に向かってＭＭにカップリングされる場合のＡＢの解離定数（Ｋd）は、Jagged1及びJagged2に向かってＭＭにカップリングされない場合のＡＢのＫdよりも、少なくとも１０,０００倍、高い。
【００５１】
いくつかの実施形態によれば、Jagged1及びJagged2の存在下で、ＭＭは、標的置換アッセイ、例えばＰＣＴ公開番号第ＷＯ２００９／０２５８４６号及び第ＷＯ２０１０／０８１１７３号（それらの内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるアッセイを用いて、インビトロでアッセイされる場合、ＣＭが切断される場合に比較して、ＣＭが切断されていない場合、Jagged1及びJagged2を結合するＡＢの能力を、少なくとも９０％低める。
【００５２】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、切断された状態で、Jagged標的物への結合のために、活性化可能抗体のＡＢを干渉しないか、又はそのＡＢと競争しない。
【００５３】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、表９、１１−１４及び２０−２３に列挙されるそれらの群から選択されたアミノ酸配列である。
【００５４】
いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、組織においてJagged1及びJagged2と共局在し、そしてプロテアーゼは、活性化可能抗体がプロテアーゼに供される場合、活性化可能抗体におけるＣＭを切断する。
【００５５】
いくつかの実施形態によれば、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、未切断状態下で、Jagged1及びJagged2への活性化可能抗体の結合が低められ、Jagged1及びJagged2に結合する未修飾ＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも２０倍、高い平衡解離定数の発生が確認され、そしてところが、切断された状態で、ＡＢはJagged1及びJagged2を結合する。
【００５６】
いくつかの実施形態によれば、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、未切断状態下で、Jagged1及びJagged2への活性化可能抗体の結合が低められ、Jagged1及びJagged2に結合する未修飾ＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも４０倍、高い平衡解離定数の発生が確認され、そしてところが、切断された状態で、ＡＢはJagged1及びJagged2を結合する。
【００５７】
いくつかの実施形態によれば、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、未切断状態下で、Jagged1及びJagged2への活性化可能抗体の結合が低められ、Jagged1及びJagged2に結合する未修飾ＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも５０倍、高い平衡解離定数の発生が確認され、そしてところが、切断された状態で、ＡＢはJagged1及びJagged2を結合する。
【００５８】
いくつかの実施形態によれば、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、未切断状態下で、Jagged1及びJagged2への活性化可能抗体の結合が低められ、Jagged1及びJagged2に結合する未修飾ＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも１００倍、高い平衡解離定数の発生が確認され、そしてところが、切断された状態で、ＡＢはJagged1及びJagged2を結合する。
【００５９】
いくつかの実施形態によれば、ＣＭは活性化可能抗体に位置し、結果的に、未切断状態下で、Jagged1及びJagged2への活性化可能抗体の結合が低められ、Jagged1及びJagged2に結合する未修飾ＡＢの平衡解離定数よりも少なくとも２００倍、高い平衡解離定数の発生が確認され、そしてところが、切断された状態で、ＡＢはJagged1及びJagged2を結合する。
【００６０】
いくつかの実施形態によれば、ＣＭは、１５個までの長さのアミノ酸のポリペプチドである。
【００６１】
いくつかの実施形態によれば、ＣＭは、アミノ酸配列LSGRSDNH（配列番号２１３）を含む。いくつかの実施形態によれば、切断可能部分は、特定のプロテアーゼ、例えば活性可能抗体の標的物と共局在することが知られているプロテアーゼとの使用のために選択される。例えば、本開示の活性化可能抗−Jagged抗体での使用のための適切な切断可能部分は、少なくともプロテアーゼ、例えばウロキナーゼ、レグマイン及び／又はＭＴ−ＳＰ１（マトリプターゼ）により切断され、そして配列TGRGPSWV (配列番号２１４); SARGPSRW (配列番号２１５); TARGPSFK (配列番号２１６); LSGRSDNH (配列番号２１３); GGWHTGRN (配列番号２１７); HTGRSGAL (配列番号２１８); PLTGRSGG (配列番号２１９); AARGPAIH (配列番号２２０); RGPAFNPM (配列番号２２１); SSRGPAYL (配列番号２２２); RGPATPIM (配列番号２２３); RGPA (配列番号２２４); GGQPSGMWGW (配列番号２２５); FPRPLGITGL (配列番号２２６); VHMPLGFLGP (配列番号２２７); SPLTGRSG (配列番号２２８); SAGFSLPA (配列番号２２９); LAPLGLQRR (配列番号２３０); SGGPLGVR (配列番号２３１); 及び/又はPLGL (配列番号２３２)を包含する。
【００６２】
いくつかの実施形態によれば、ＣＭは、表３３に示されるそれらから成る群から選択されたプロテアーゼのための基質である。いくつかの実施形態によれば、前記プロテアーゼは、ｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ−ＳＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ−１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３及びＭＭＰ−１４から成る群から選択される。いくつかの実施形態によれば、プロターゼは、カテプシンである。いくつかの実施形態によれば、ＣＭは、ｕＰＡ（ウロキナーゼプラスミノーゲン活性因子）、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１（マトリプターゼ）から成る群から選択されたプロテアーゼのための基質である。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼはｕＰＡを含む。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼはレグマインを含む。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼはＭＴ−ＳＰ１を含む。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）を含む。
【００６３】
いくつかの実施形態によれば、ＣＭは、少なくとも２つのプロテアーゼのための基質である。いくつかの実施形態によれば、各プロテアーゼは、表３３に示されるそれらから成る群から選択される。いくつかの実施形態によれば、ＣＭは少なくとも２つのプロテアーゼのための基質であり、ここでプロテアーゼの１つは、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択され、そして他のプロテアーゼは、表３３に示されるそれらから成る群から選択される。いくつかの実施形態によれば、ＣＭは、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択された少なくとも２種のプロテアーゼのための基質である。
【００６４】
いくつかの実施形態によれば。活性化可能抗体は少なくとも、第１ＣＭ及び第２ＣＭを含む。いくつかの実施形態によれば、第１ＣＭ及び第２ＣＭはそれぞれ、１５個以下の長さのアミノ酸のポリペプチドである。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体における第１ＣＭ及び第２ＣＭは、未切断状態で、Ｎ末端からＣ末端側への次のような構造配置：ＭＭ−ＣＭ１−ＣＭ２−ＡＢ 又はＡＢ−ＣＭ２−ＣＭ１−ＭＭを有する。いくつかの実施形態によれば、第１ＣＭ及び第２ＣＭの少なくとも１つは、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択されたプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである。いくつかの実施形態によれば、第１ＣＭは、標的組織においてｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択された第１切断剤により切断され、そして第２ＣＭは、標的組織において第２切断剤により切断される。いくつかの実施形態によれば、第１切断剤及び第２切断剤は、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１から成る群から選択された同じプロテーゼであり、そして第１ＣＭ及び第２ＣＭは、酸素のための異なった基質である。いくつかの実施形態によれば、第１切断剤及び第２切断剤は、表３３に示されるそれらから成る群から選択された同じプロテアーゼである。いくつかの実施形態によれば、第１切断剤及び第２切断剤は異なったプロテアーゼである。いくつかの実施形態によれば、第１切断剤及び第２切断剤は標的組織に共局在する。いくつかの実施形態によれば、第１ＣＭ及び第２ＣＭは、標的組織において少なくとも１つの切断剤により切断される。
【００６５】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体がプロテアーゼに供され、そしてプロテアーゼにより切断され、その結果、活性化されたか又は切断された状態下で、活性化された抗体は、プロテアーゼがＣＭを切断した後、ＬＰ２及び／又はＣＭ配列の少なくとも一部を含むＬ鎖アミノ酸配列を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態によれば、ＭＭ及びＣＭは、配列番号１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４及び１９６から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００６７】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体はまた、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態によれば、シグナルペプチドは、スペーサーを介して活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施形態によれば、スペーサーは、シグナルペプチドの不在化で、活性化可能抗体に結合される。いくつかの実施形態によれば、スペーサーは、活性化可能抗体のＭＭに直接結合される。
【００６８】
いくつかの実施形態によれば、未切断状態下で活性化可能抗体は、ＭＭに直接結合されるスペーサーはを含み、そしてＮ末端からＣ末端側にスペーサー−ＭＭ−ＣＭ−ＡＢの構造配置を有する。いくつかの実施形態によれば、スペーサーは、少なくともアミノ酸配列ＱＧＱＳＧＱ（配列番号２３３）を含む。いくつかの実施形態によれば、ＭＭ及びスペーサーは、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態によれば、ＭＭ及びスペーサーは、アミノ酸配列ＱＧＱＳＧＱＣＮＩＷＬＶＧＧＤＣＲＧＷＱＧ（配列番号２３４）を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体はまた、ＡＢに結合される剤も含む。いくつかの実施形態によれば、剤は、治療剤である。いくつかの実施形態によれば、剤は抗腫瘍剤である。いくつかの実施形態によれば、剤は毒素又はそのフラグメントである。いくつかの実施形態によれば、剤はリンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態によれば、リンカーは切断可能リンカーである。いくつかの実施形態によれば、剤は、表３０に列挙される群から選択された剤である。いくつかの実施形態によれば、剤はトラスタチンである。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、アウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はマイタンシノイド又はマイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、デュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、カリケアマイシン又はその誘導体である。
【００７０】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体はまた、検出可能成分も含む。いくつかの実施形態によれば、検出可能成分は、診断剤である。
【００７１】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体のＡＢは天然において、１又は２以上のジスルフィド結合を含む。いくつかの実施形態によれば、ＡＢは、１又は２つ以上のジスルフィド結合を含むよう操作され得る。
【００７２】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも５日である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４日である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３日である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２日である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２０時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１８時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１６時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１４時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３時間である。
【００７３】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化（conjugated）活性化可能抗−Jagged抗体は、単一特異的である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体は、多重特異的であり、例えば非限定な例によれば、二重特異的又は三官能性である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体は、プロ−二重特異的Ｔ細胞エンゲージ（ＢＩＴＥ）分子の一部として処方される。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体は、プロ−キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）修飾されたＴ細胞又は他の操作された受容体の一部として処方される。
【００７４】
本開示はまた、Jagged標的物（例えば、Jagged1及び/又はJagged2を特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含む活性化可能抗−Jagged抗体を含む組成物及び方法も提供し、ここでＡＢは、ＡＢのその標的物を結合する能力を低めるマスキング部分（ＭＭ）に結合される。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体はさらに、プロテアーゼのための基質である切断可能部分（ＣＭ）を含む。本明細書に提供される組成物及び方法は、活性化可能抗−Jagged抗体の活性（例えば、マスキング、活性化又は結合活性）を損なうことなく、ＡＢにおける１又は２以上のシステイン残基への１又は２以上の剤の結合を可能にする。いくつかの実施形態によれば、本明細書に提供される組成物及び方法は、ＭＭ内の１又は２以上のジスルフィド結合を還元し又は他方では、破壊することなく、ＡＢにおける１又は２以上のシステイン残基への１又は２以上の剤の結合を可能にする。本明細書に提供される組成物及び方法は、１又は２以上の剤、例えば任意の種々の治療剤、診断剤及び／又は予防剤に結合される活性可能を抗−Jagged抗体を生成し、好ましくは前記剤の何れも、活性化可能抗−Jagged抗体のＭＭに結合されない。本明細書に提供される組成物及び方法は、ＭＭが未切断状態下で活性化可能抗体のＡＢを、効果的且つ効率的にマスキングする能力を保持する、複合化活性化可能抗−Jagged抗体を生成する。本明細書に提供される組成物及び方法は、複合化活性化可能抗−Jagged抗体を生成し、ここで活性化可能抗体は、ＣＭを切断できるプロテアーゼの存在下でまだ活性されており、すなわち切断されている。
【００７５】
活性化可能抗−Jagged抗体は、剤のための少なくとも１つの結合点を有するが、本明細書に提供される方法及び組成物においては、すべてよりも少ない可能性ある結合点が、剤への結合のために利用できる。いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の結合点は、ジスルフィド結合に含まれる硫黄原子である。いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の結合点は、鎖間ジスルフィド結合に含まれる硫黄原子である。いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の結合点は、鎖間スルフィド結合に含まれる硫黄原子であるが、しかし鎖内ジスルフィド結合に含まれる硫黄原子ではない。いくつかの実施形態によれば、１又は２以上の結合点は、システイン、又は硫黄原子を含む他のアミノ酸残基中の硫黄原子である。そのような残基は、抗体構造中に天然に存在することができるか、又は部位特異的突然変異誘発、化学的変換、又は非天然アミノ酸の誤取り組みにより、抗体中に組み込まれ得る。
【００７６】
ＡＢに１又は２以上の鎖間シスルフィド結合及びＭＭに１又は２以上の鎖内辞スルフィド結合を有する活性化可能抗−Jagged抗体の調製方法もまた提供され、そして遊離チオールと反応性の薬物が提供される。前記方法は一般的に、活性化可能抗体における鎖間ジスルフィド結合を、還元剤、例えばＴＣＥＰにより部分的に還元し；そして前記部分的に還元された活性化可能抗体に、遊離チオールと反応性の薬物を結合することを包含する。本明細書において使用される場合、用語「部分的還元」とは、活性化可能抗−Jagged抗体が、還元剤と接触され、そしてすべてよりも少ないジスルフィド結合、例えばすべてよりも少ない可能性ある結合部位が還元される状況を言及する。いくつかの実施形態によれば、すべての可能性ある結合部位の９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％未満が還元される。
【００７７】
さらなる他の実施形態によれば、剤、例えば薬物を、前記剤の配置下で選択性をもたらす活性化可能抗−Jagged抗体に還元し、そして結合する方法が提供される。前記方法は、一般的に、還元剤により活性化可能抗−Jagged抗体を部分的に還元し、結果的に、活性化可能抗体のマスキング部分又は他の非−ＡＢ部分における任意の結合部位が還元されず、そして前記剤を、ＡＢにおける鎖間チオールに結合することを包含する。結合部位は、所望する部位での結合を可能にする剤の所望する配置を可能にするよう選択される。還元剤は例えば、ＴＣＥＰである。還元反応条件、例えば還元剤：活性可能抗体の比、インキュベーションの長さ、インキュベーションの間の温度、還元反応溶液のｐＨ、等は、ＭＭが未切断状態で活性化可能抗体のＡＢを、効果的に且つ効率的にマスキングする能力を保持する、複合化活性化可能抗体を生成する条件を同定することにより決定される。還元剤：活性化可能抗−Jagged抗体の比は、活性化可能抗体に依存して変化するのであろう。いくつかの実施形態によれば、還元剤：活性化可能抗−Jagged抗体の比は、約２０：１〜１：１、約 １０：１ 〜 １：１、 約 ９：１ 〜 １：１、約 ８：１ 〜 １：１、約 ７：１ 〜 １：１、 約 ６：１ 〜 １：１、約 ５：１ 〜 １：１、約 ４：１ 〜 １：１、約 ３：１ 〜 １：１、約 ２：１ 〜 １：１、約 ２０：１ 〜 １：１．５、約 １０：１ 〜 １：１.５、 約 ９：１ 〜 １：１．５、約 ８：１ 〜 １：１．５、約 ７：１ 〜 １：１．５、約 ６：１ 〜 １：１．５、約 ５：１ 〜 １：１．５、約 ４：１ 〜 １：１．５、約 ３：１ 〜 １：１．５、約 ２：１ 〜 １：１．５、約 １．５：１ 〜 １：１．５又は約 １：１ 〜 １：１．５の範囲で存在するであろう。いくつかの実施形態によれば、前記比は、約５：１〜１．５：１の範囲で存在する。いくつかの実施形態によれば、前記比は、約４：１〜１：１の範囲で存在する。いくつかの実施形態によれば、前記比は、約４：１〜１．５：１の範囲で存在する。
【００７８】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体のＡＢにおける鎖間ジスルフィド結合を還元し、そして剤、例えばチオール含有剤、例えば薬物を、ＡＢ上に剤を選択的に位置決定するために、前記得られる鎖間チオールに結合する方法が提供される。前記方法は一般的に、活性化可能抗体におけるすべての可能性ある鎖間チオールを形成しないで、少なくとも２つの鎖間チオールを形成するために、還元剤によりＡＢを部分的に還元市；前記剤を、部分的に還元されたＡＢの鎖間チオールに結合することを包含する。例えば活性化可能抗体のＡＢは、還元剤：活性化可能抗体の所望する比で、約３７℃で約１時間、部分的に還元される。いくつかの実施形態によれば、還元剤：活性化可能抗体の比は、約２０：１〜１：１、約 １０：１ 〜 １：１、約 ９：１ 〜 １：１、約 ８：１ 〜 １：１、約 ７：１ 〜 １：１、 約 ６：１ 〜 １：１、約 ５：１ 〜 １：１、約 ４：１ 〜 １：１、約 ３：１ 〜 １：１、約 ２：１ 〜 １：１、約 ２０：１ 〜 １：１．５、 約 １０：１ 〜 １：１．５、約 ９：１ 〜 １：１．５、約 ８：１ 〜 １：１．５、約 ７：１ 〜 １：１．５、約 ６：１ 〜 １：１．５、約 ５：１ 〜 １：１．５、約 ４：１ 〜 １：１．５、約 ３：１ 〜 １：１．５、約 ２：１ 〜 １：１．５、約 １．５：１ 〜 １：１．５又は 約 １：１ 〜 １：１．５の範囲で存在するであろう。いくつかの実施形態によれば、前記比は、約５：１〜１：１の範囲で存在する。いくつかの実施形態によれば、前記比は、約４：１〜１：１の範囲で存在する。いくつかの実施形態によれば、前記比は、約４：１〜１．５：１の範囲で存在する。
【００７９】
チオール含有試薬は例えば、システイン又はＮ−アセチルシステインであり得る。還元剤は例えば、ＴＣＥＰであり得る。いくつかの実施形態によれば、還元された活性化可能抗体は、結合の前、例えばカラムクロマトグラフィー、透析又はダイアフィルトレーションを用いて、精製され得る。他方では、還元された抗体は、部分的還元の後、及び結合の前、精製されない。
【００８０】
本発明はまた、部分的に還元された活性化可能抗−Jagged抗体も提供し、ここで前記活性化可能抗体における少なくとも１つの鎖間ジスルフィド結合が、活性化可能抗体中の何れの鎖内ジスルフィド結合も妨害しないで、還元剤により還元されており、ここで前記活性化可能抗体は、Jagged標的物（例えば、Jagged1及び/又はJagged2）に対して特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）、切断されていない状態で、Jagged標的物への活性化可能抗体中のＡＢの結合を阻害するマスキング部分（ＭＭ）、及びＡＢに結合される切断可能部分（ＣＭ）（ここで、ＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドである）を含む。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＣＭを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の１又は２以上の鎖内ジスルフィド結合は、還元剤により妨害されない。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体内のＭＭの１又は２以上の鎖内ジスルフィド結合は、還元剤により妨害されない。いくつかの実施形態によれば、切断されていない状態下での活性化可能抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有する。いくつかの実施形態によれば、還元剤はＴＣＥＰである。
【００８１】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載される抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体は、１又は２以上の追加の剤又は追加の剤の組合せに関連して使用される。適切な追加の剤は、意図される用途、例えば癌のための現医薬品及び／又は外科的療法を包含する。例えば、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体は、追加の化学療法剤又は抗腫瘍剤と組合して使用され得る。例えば、いくつかの実施形態によれば、追加の化学療法剤は、ゲムシタビンである。
【００８２】
いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体、及び追加の剤は、単一治療用組成物に製剤化され、そして抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体、及び追加の剤は、同時に投与される。他方では、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体、及び追加の剤は、お互い別々であり、例えば個々が別々の治療用組成物に製剤化され、そして抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体、及び追加の剤は同時に投与されるか、又は抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体、及び追加の剤は、治療レジメの間、異なる時点で投与される。例えば、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体は、追加の剤の投与の前、投与され、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体は、追加の剤の投与に続いて投与されるか、又は抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体、及び追加の剤は交互に投与される。本明細書に記載されるように、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体、及び追加の剤は単回投与又は複数回投与で投与される。
【００８３】
本発明はまた、本明細書に記載される活性化可能抗−Jagged抗体をコードする単離された核酸分子、及びそれらの単離された核酸配列を含むベクターも提供する。本発明は、活性化可能抗体の発現を導く条件下で、そのような核酸分子を含む細胞を培養することによる、活性化可能抗体の生成方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、前記細胞は、そのようなベクターを含む。
【００８４】
本発明はまた、活性化された状態でJagged1及びJagged2を結合する活性化可能抗体の製造方法も提供し、ここで前記方法は、（ａ）前記活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を、前記活性化可能抗体の発現を導く条件下で培養し、ここで前記活性化可能抗体はマスキング成分（ＭＭ）、切断可能成分（ＣＭ）、及びJagged1及びJagged2を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、そして（ｂ）前記活性可能抗体を回収することを含んで成る。
【００８５】
本発明はまた、（ａ）活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を、前記活性化可能抗体の発現を導く条件下で培養し、ここで前記活性化可能抗体はマスキング成分（ＭＭ）、切断可能成分（ＣＭ）、及びJagged1及びJagged2を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで、（ｉ）ＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するアミノ酸配列を含むポリペプチドであり；そして（ｉｉ）前記ＣＭは、活性化可能抗体に位置し、結果的に、末切断状態下で、ＭＭはJagged1及びJagged2へのＡＢの特異的結合を干渉し、そして切断された状態下で、前記ＭＭはJagged1及びJagged2へのＡＢの特異的結合を干渉しないか又はその結合と競争せず；そして（ｂ）前記活性可能抗体を回収することにより、活性化された状態でJagged1及びJagged2を結合する活性化可能抗体の製造方法も提供する。
【００８６】
本発明はまた、本発明の抗体及び／又は活性化可能抗体を、そのような治療又は予防が所望される対象に投与することにより、異常Jagged1及び/又はJagged2活性（例えば、異常シグナル伝達、例えばＮｏｔｃｈ受容体を介しての異常シグナル伝達）に関連する病理学的症状の進行を治療し、予防し、遅延するか、又は他方では、その症状を緩和するか、又はそのような病理学に関連する症状を軽減するための方法も提供する。本発明はまた、本明細書に記載される抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、対象における血管形成を低め、阻害するか、又は他方では、調節する方法も提供する。治療される対象は、例えばヒト又は他の動物である。いくつかの実施形態によれば、対象は、非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、マウス）、家畜、作業用動物又は動物園動物である。いくつかの実施形態によれば、対象は齧歯動物である。
【００８７】
抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体は、病理に関連する症状を治療し、予防するか、又は緩和するのに十分な量で投与される。対象における病理を治療するか又は予防するのに十分な抗体及び／又は活性化可能抗体の量は例えば、Jagged1及び/又はJagged2シグナル伝達（例えば、Ｎｏｔｃｈ受容体を介してJagged１介在性シグナル伝達、及び／又はNotch受容体を介してJagged２介在性シグナル伝達）を低めるのに十分である量である。本明細書において使用される場合、用語「低められた」（reduced）とは、本発明のモノクローナル抗体及び／又は活性化可能抗体の存在下で、１又は２以上のＮｏｔｃｈ受容体を介しての低められたシグナル伝達を意味する。Jagged1及び/又はJagged2介在性シグナル伝達は、本発明の抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗体の存在下での１又は２以上のNotch受容体を介してのシグナル伝達のレベルは、１又は２以上のＮｏｔｃｈ受容体を介してのシグナル伝達の対照レベル（すなわち、モノクローナル抗体の不在下で１又は２以上のNotch受容体を介してのシグナル伝達のレベル）よりも高いか、又は等しい〜５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、 ８０％、９０％、９５％、９９％、又は１００％低い。１又は２以上のNotch受容体を介してのシグナル伝達のレベルは、種々の標準技法の何れか、例えば、非制限的例によれば、下流遺伝子活性化、例えばＨｅｙ及びＨｅｓの測定、及び／又はNotch受容体活性化に応答するルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて測定される。当業者は、１又は２以上のNotch受容体を介してのシグナル伝達のレベルが種々のアッセイ、例えば市販のキットを用いて測定され得ることを理解するであろう。
【００８８】
本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、治療され、及び／又は予防され、及び／又はその進行が遅延され、及び／又は症状が改善される、病理は、例えば癌を包含する。いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば白血病、例えばＴ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、リンパ芽球性疾患、例えば多発性骨髄腫、及び固形腫瘍、例えば肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌及び乳癌、例えばトリプルネガディブ乳癌の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善する。さらに、notchシグナル伝達は癌幹細胞の生存及び増殖のために重要であるので、Jagged依存性notchシグナル伝達の阻害は、幹細胞増殖及び生存に対して影響を及ぼすであろう。
【００８９】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば原発腫瘍に関係なく、癌における骨疾患又は転移の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【００９０】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば乳癌、例えば非制限的例によれば、ＥＲ/ＰＲ＋乳癌、Ｈｅｒ２＋乳癌、トリプルネガディブ乳癌の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【００９１】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば結腸直腸癌の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【００９２】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば胃癌の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【００９３】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えばグリア芽腫の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【００９４】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば頭頸部癌の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば肺癌、例えば非制限的例によれば、非小細胞肺癌の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【００９６】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば多発性骨髄腫の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【００９７】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば卵巣癌の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【００９８】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば膵臓癌の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【００９９】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば前立腺癌の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【０１００】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば肉腫の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【０１０１】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば腎癌、例えば非制限的例によれば、腎細胞癌の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【０１０２】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば皮膚癌、例えば非制限的例によれば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、黒色腫の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【０１０３】
癌の他に、Jagged依存性Notchシグナル伝達は、筋線維芽細胞、すなわち線維性疾患の発症において中心的役割を有する細胞への上皮及び線維芽細胞の分化に非常に重要である。Jagged依存性notchシグナル伝達の阻害、及び従って、筋線維芽細胞の出現の阻害は、腎臓、肝臓、肺及び皮膚の線維性疾患についての効果的治療である。いくつかの実施形態によれば、抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体が、線維性疾患、例えば特発性肺線維症（ＩＰＦ）を治療するために使用される。
【０１０４】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば線維症の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば特発性肺線維症、腎線維症疾患、肝線維症疾患、腹膜透析誘発性線維症、強皮症の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を用いて、病理、例えば難聴の症状を治療し、予防し、その進行を遅延し、及び／又は改善することができる。
【０１０７】
それらの方法及び使用の実施形態の何れかに使用される抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体は、疾患の任意の段階で投与され得る。例えば、そのような抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体は、初期〜転移性の任意の段階の癌を有する患者に投与され得る。用語、対象及び患者は本明細書においては、交換可能的に使用される。
【０１０８】
それらの方法及び使用の実施形態の何れかに使用される抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体は、ネオアジュバント療法を含む治療養生法に使用され得る。
【０１０９】
それらの方法及び使用の実施形態の何れかに使用される抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体は、単独で、又は１又は２以上の化学療法剤、又は他の生物製剤と組合して投与され得る。
【０１１０】
本発明はまた、種々の診断及び／又は予防徴候に、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体を使用するための方法及びキットも提供する。例えば、本発明は、（ｉ）対象又はサンプルと、活性化可能抗−Jagged抗体とを接触し、ここで前記活性化可能抗−Jagged抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、及び目的の標的物を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで未切断、非活性化状態での活性化可能抗−Jagged抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し、ここで（ａ）ＭＭは、Jagged標的物へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そしてＡＢの天然の結合パートナーの修飾された形ではなく、そして（ｂ）未切断、非活性化状態で、ＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉し、そして切断された、活性化された状態で、ＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉せず、又は競争せず；そして（ｉｉ）対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗−Jagged抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的の標的物の存在又は不在を検出するための方法及びキットを提供し、ここで、対象又はサンプルにおける検出可能レベルの活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体は、切断剤及びJagged標的物が対象又はサンプルに存在することを示唆し、そして対象又はサンプルにおける検出可能レベルの活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体の不在が、切断剤、Jagged標的物、又はそれらの両者が対象又はサンプルに不在であり、及び／又は十分には存在しないことを示唆する。
【０１１１】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗−Jagged抗体である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、剤に結合されな。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態によれば、検出可能標識は、ＡＢ上に位置する。いくつかの実施形態によれば、対象又はサンプルにおける活性化可能抗−Jagged抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態によれば、前記二次試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
【０１１２】
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、検出可能標識を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、検出可能標識は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１又は２以上の金属イオン、又はリガンド系標識を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、イメージング剤は、放射性同位体を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、放射性同位体は、インジウム又はテクネチウムである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼを含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、発光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修正赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質tdimer2 (ＲＦＰ  tdimer2)、ＨＣＲＥＤ、又はユーロピウム誘導体を包含する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、発光標識は、Ｎ−メチルアクリジウム誘導体を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、標識は、Alexa Fluor（登録商標）標識、例えばAlex Fluor（登録商標）６８０又はAlexa Fluor（登録商標）７５０を包含する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、リガンド系標識は、ビオチン、アビジン、ストレプタビジン、又は１又は２以上のハプテンを包含する。
【０１１３】
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、対象は哺乳類である。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、対象はヒトである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、対象は非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、作業動物又は動物園の動物である。いくつかの実施形態によれば、対象は齧歯動物である。
【０１１４】
それらの方法のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、インビボ方法である。それらの方法のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、現場方法である。それらの方法のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、エクスビボ方法である。それらの方法のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、インビトロ方法である。
【０１１５】
前記方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、前記方法又はキットは、本開示の活性化可能抗−Jagged抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、細分するために使用される。例えば、標的物（例えば、Jagged1及び/又はJagged2）、及びそれらの方法において試験される活性化可能抗−Jagged抗体の切断可能部分（ＣＭ）における基質を切断するプロテアーゼの両者についての検査で陽性である患者が、そのようなＣＭを含むそのような活性化可能抗−Jagged抗体による治療のための適切な候補体として同定される。同様に、標的物（例えば、Jagged1及びJagged2）、及びそれらの方法を用いて試験される活性化可能抗体のＣＭにおける基質を切断するプロテアーゼの両者についての検査で陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補体として同定され得る。
【０１１６】
いくつかの実施形態によれば、開示の抗−Jagged活性化可能抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体（例えば、治療剤が結合される活性化可能抗体）による治療、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を、その必要な対象に投与することによる続く治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、細分するために、方法又はキットが使用される。例えば、標的物（例えば、Jagged1及びJagged2）、及びそれらの方法において試験される活性化可能抗−Jagged抗体及び/又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体の切断可能部分（ＣＭ）における基質を切断するプロテアーゼの両者についての検査で陽性である患者が、そのようなＣＭを含むそのような抗体及び/又はそのような複合化活性化可能抗−Jagged抗体による治療のための適切な候補体として同定され、そして次に、前記患者は、治療的有効量の試験された活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を投与される。同様に、標的物（例えば、Jagged1及び/又はJagged2）、及びそれらの方法を用いて試験される活性化可能抗−Jagged抗体のＣＭにおける基質を切断するプロテアーゼの何れか、又は両者についての検査で陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補体として同定され得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態によれば、そのような患者は、治療のための適切な抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭを含む、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体）が同定されるまで、他の抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体により試験され得る。いくつかの実施形態によれば、次に、検査で陽性であった患者は、治療的有効量の活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を投与される。
【０１１８】
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、ＭＭは、約４〜４０個の長さのアミノ酸を有するペプチドである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、リンカーペプチドを含み、ここで前記リンカーペプチドは、ＭＭとＣＭとの間に位置する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、リンカーペプチドを含み、ここで前記リンカーペプチドは、ＡＢとＣＭとの間に位置する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、第１リンカーペプチド（Ｌ１）及び第２リンカーペプチド（Ｌ２）を含み、ここで前記第１リンカーペプチドはＭＭとＣＭとの間に位置し、そして前記第２リンカーペプチドはＡＢとＣＭとの間に位置する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、各Ｌ１及びＬ２は約１〜２０個の長さのアミノ酸のペプチドであり、そして各１及びＬ２は同じリンカーである必要はない。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、Ｌ１及びＬ２の１つ又は両者は、グリシン−セリンポリマーである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、Ｌ１及びＬ２の少なくとも１つは、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ (配列番号１２３)及び（ＧＧＧＳ）ｎ (配列番号１２４)（ここで、ｎは少なくとも１つの整数である）から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、Ｌ１及びＬ２の少なくとも１つは、式（ＧＧＳ）ｎ（ここで、ｎは少なくとも１の整数である）を有するアミノ酸配列を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、Ｌ１及びＬ２の少なくとも１つは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号１２５)、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ (配列番号１２６)、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号１２７)、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ (配列番号１２８)、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号１２９)及び Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号１３０)から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。
【０１１９】
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、ＡＢは、本明細書に提供される交差反応性抗−Jagged抗体配列から選択された抗体又は抗体フラグメント配列を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、ＡＢは、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ又は単鎖抗体（ｓｃＡｂ）を含む。
【０１２０】
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、切断剤は、Jagged標的物と、対象又はサンプルにおいて共局在するプロテアーゼであり、そしてＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドであり、ここで、活性化可能抗−Jagged抗体がプロテアーゼに供される場合、前記プロテアーゼは、活性化可能抗−Jagged抗体におけるＣＭを切断する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、ＣＭは、１５個までの長さのアミノ酸ポリペプチドである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、ＣＭは、ＡＢのＮ末端にカップリングされる。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、ＣＭは、ＡＢのＣ末端にカップリングされる。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、ＣＭは、ＡＢのＶＬ鎖のＮ末端にカップリングされる。
【０１２１】
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、切断剤は酵素であり、そしてＣＭは酵素のための基質である。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、酵素は本明細書に開示されるプロテアーゼである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、酵素は本明細書に開示されるプロテアーゼの１つである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、ｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ−ＳＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ−１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３及びＭＭＰ−１４から成る群から選択される。
【０１２２】
本発明の医薬組成物は、本発明の抗体及び／又は活性化可能抗体、及び担体を含むことができる。それらの医薬組成物は、キット、例えば診断キットに含まれ得る。
【０１２３】
当業者は、本発明の抗体が種々の用途を有することを理解することであろう。例えば、本発明のタンパク質は、種々の障害においてNotch受容体を介してJagged−介在性シグナル伝達の活性化を妨げるために治療剤として使用される。本発明の抗体はまた、診断キットにおける試薬として、又は診断ツールとしても使用され、又はそれらの抗体は、治療試薬を生成するために競争アッセイにおいて使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、抗−Jagged13及び抗−Jagged32としても本明細書において言及される抗−Jagged抗体の、ヒト及びマウスJagged１及びヒトJagged２への結合を示すグラフである。
【図２】図２は、ヒトNotch１へのJagged１の結合を阻害する抗−Jagged13及び抗−Jagged32の能力を示すグラフである。
【図３】図３は、４Ｄ１１（また抗−Jagged４Ｄ１１、抗−Jagged４Ｄ１１抗体、４Ｄ１１抗体又は抗体４Ｄ１１としても本明細書において言及される）として本明細書において言及される抗−Jagged抗体の、ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍の増殖を阻害する能力を示すグラフである。
【図４】図４は、抗−Jagged４Ｄ１１抗体を投与されたマウスによる体重減少を示すグラフである。
【図５】図５は、抗−Jagged４Ｄ１１抗体を投与されたマウスにおけるＴＳＬＰの血清濃度を示すグラフである。
【図６】図６は、接種後３０日以上の間、Ｂ×ＰＣ４異種移植腫瘍の増殖を阻害する抗−Jagged４Ｄ１１抗体を投与されたマウスによる体重減少を示すグラフである。
【図７】図７は、抗−Jagged４Ｄ１１抗体を投与されたマウスによる体重減少を示すグラフである。
【図８】図８は、ヒト骨髄との共培養における多発性骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ８２２６の増殖を阻害する抗−Jagged４Ｄ１１抗体の能力を示すグラフである。
【図９】図９Ａは、ＴＧＦβ１の存在又は不在下でラット線維芽細胞系ＮＲＫ−４９Ｆに対する抗−Jagged抗体の効果を示す一連の写真である。図９Ａは、１００ｎＭの抗−Jagged４Ｄ１１の存在下で培養される場合、ＮＲＫ−Ｆ４９の培養物が特徴的単層を保持することを示す。図９Ｂは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１の存在下で培養されたＮＲＫ−Ｆ４９についての特徴的病巣形成を示す。図９Ｃは、ＴＧＦβ１−刺激された線維性病巣形成が、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１により処理された培養物において１００ｎＭの抗−Jagged４Ｄ１１により完全に阻害されることを示す。
【図１０】図１０は、抗−Jagged４Ｄ１１抗体及びＦａｂフラグメントの存在下で、ランダムペプチドライブラリーのスクリーニングの結果を示す一連の例示である。スクリーニングは、１回のＭＡＣＳ及び２回のＦＡＣＳ分類から構成される。第２回目のＦＡＣＳからの陽性集団は、抗−Jagged４Ｄ１１抗体及びＦａｂへの結合が、組換えJaggedタンパク質により阻害されることが確認された。
【図１１】図１１は、親和性成熟抗−Jaggedマスキング部分ＪＳ５３４０、ＪＳ５３４２、ＪＳ５３４７及びＪＳ５３５８の結合と、抗−Jaggedマスキング部分ＪＳ４８９６の結合とを比較するグラフである。
【図１２】図１２は、インビトロ結合ＥＬＩＳＡにおけるJagged標的物への活性化可能抗−Jagged抗体及び抗−Jaggedマスクド抗体の結合を阻害するＭＭ５３４２の能力を示す一連のグラフである。
【図１３】図１３は、活性化可能抗−Jagged抗体のタンパク質分解活性を示す写真及び表である。
【図１４】図１４は、活性化可能抗−Jagged抗体が、:抗−Jagged４Ｄ１１抗体（親抗体）のように、マウスにおいてＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍を阻害したことを示すグラフである。そのグラフは、初期投与後の日数に対する腫瘍体積としてプロットされる。
【図１５】図１５は、活性化可能抗−Jagged抗体、マスクド抗体又は親抗体を投与されたマウスの体重減少の比較を示すグラフである。
【図１６Ａ】図１６Ａは、マウスＴＳＬＰの血清レベルを示すグラフであり、ここでマウスＴＳＬＰの血清レベルは、各投与の前、及び最終投与の１０日後、各グループから個々のマウスについて定量化され、そして次に、平均化された。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、抗−Jagged４Ｄ１１抗体及び活性化可能抗−Jagged抗体Ｖ３４２−１２０４−４Ｄ１１についてＴＳＬＰ血清濃度の経時変化を示す。
【図１７】図１７は、活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１又は抗−Jagged４Ｄ１１抗体を投与されたマウスの血清における、時間の経過につれての平均ヒトＩｇＧレベルを比較する。
【図１８】図１８は、抗−Jagged４Ｄ１１抗体結合細胞上での発現正常化（normalization）結合を示すグラフである。
【図１９】図１９は、活性化可能抗体の現場イメージングの概略図である。１：組織切片がスライト上に置かれる。２：スライドが、標識された活性化可能抗体を含む溶液により被覆され、そしてインキュベートされる。３：十分な洗浄の後、活性化された抗体の結合が可視化される。
【図２０】図２０は、現場イメージングを用いて示されるように、活性化され、そしてＢｘＰＣ３異種移植腫瘍組織を結合する、活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１の能力を示す一連のイメージである。活性化可能抗体がAlexa Flour（登録商標）６８０により標識され、本明細書においては、それぞれ１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８及びＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６００とも呼ばれる、標識された活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０が生成された。標識された抗−Jagged親抗体４Ｄ１１−ＡＦ６８０がまた試験された。各４Ｄ１１−ＡＦ６８０ (第１列、第１行)、１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０ (第２列、第１行) 及びＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０ (第３列、第１行)を、凍結されたＢｘＰＣ３異種移植腫瘍組織サンプルと共にインキュベートした。第２列のパネルは、広範囲のプロテアーゼインヒビターカルテルにより前処理された凍結ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍組織と共に４Ｄ１１−ＡＦ６８０ (第１列)、１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０ (第２列) 及びＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０ (第３列)をインキュベートした後に得られた蛍光イメージを示す。
【図２１】図２１は、ヒト膵臓癌組織の現場イメージングにより示されるように、活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１の活性化を示す一連のイメージである。各4Ｄ１１−ＡＦ６８０ (４Ｄ１１) (第１列、第１行)、１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０ （１２０４） (第１列、第２行) 及び ＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０ (ＰＬＧＬ) (第１列、第３行)を、膵臓癌を有するヒト患者から単離された凍結組織サンプルと共にインキュベートした。それぞれ第２、３及び４列のパネルは、抗体Ａ１１、すなわちマトリプターゼとして知られている、ＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼの活性部位に特異的に結合する抗体（第２列）；ＭＭＰインヒビター（図２１、第３列）；又は広範囲のプロテアーゼインヒビターカクテル（第４列）により前処理された凍結膵臓癌患者組織と共に４Ｄ１１−ＡＦ６８０、１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０ 及びＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０をインキュベートした後に得られる蛍光イメージを示す。
【図２２】図２２は、抗−Jagged抗体のインビボイメージングを示すイメージ及びグラフである。図２２Ａは、ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍マウスモデルにおいて、標識された４Ｄ１１抗体蛍光シグナルの注射の４８時間後の表示を提供するイメージである。図２２Ｂは、抗体４Ｄ１１用量±ＳＤについての平均放射効果の平均Ｔ／Ｎ比を示すグラフである。
【図２３】図２３は、単独で、又は追加の抗癌剤、ゲムシタビンと組合して投与される場合、ＢｘＰＣ３異種移植マウスモデルにおいて腫瘍の増殖を阻害する:抗−Jagged４Ｄ１１抗体の効果を示すグラフである。
【図２４】図２４は、活性化された（＋ｕＰＡ）及び活性化されていない（未処理又は＋ＰＢＳ）活性化可能抗−Jagged抗体−剤結合体；活性化された及び活性化されていない活性化可能抗−Jagged抗体；及び抗−Jagged及びリツキサン（Rituxan）抗体及び抗体−剤結合体の活性を示すＢｘＰＣ３増殖阻害曲線を示すグラフである。
【図２５】図２５は、抗−Jagged抗体４Ｄ１１−ＭＭＡＥ及び活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＭＭＡＥの両者が、それらの結合されていないカウンターパートよりも、より効果的に、ＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍増殖を阻害したことを示すグラフである。
【図２６】図２６は、抗−Jagged抗体４Ｄ１１、抗−Jagged抗体−ＭＭＡＥ、活性化可能抗−Jagged抗体−５３４２−１２０４−４Ｄ１１又は活性化可能抗−Jagged抗体−剤結合体５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＭＭＡＥを投与された動物に観察される体重減少を示すグラフである。
【図２７Ａ】図２７Ａは、本開示の抗−Jagged抗体が、高い親和性及びヒト／齧歯類交差反応性を伴って、Jagged１及びJagged２を結合することを示す一連の表及びグラフである。図２７Ａにおける表は、抗−Jaggedクローン間での特異性の多様性を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、本開示の抗−Jagged抗体が、高い親和性及びヒト／齧歯類交差反応性を伴って、Jagged１及びJagged２を結合することを示す一連の表及びグラフである。図２７Bにおける表は、抗−Jagged抗体４Ｄ１１が、次の４種のJaggedリガンドについて高い親和性を有することを示す：ヒトJagged１（ｈＪＡＧ１）、ヒトJagged２（ｈＪＡＧ２）、ラットJagged１（ｒＪＡＧ１）及びラットJagged２（ｒＪＡＧ２）。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、本開示の抗−Jagged抗体が、高い親和性及びヒト／齧歯類交差反応性を伴って、Jagged１及びJagged２を結合することを示す一連の表及びグラフである。図２７Ｃにおけるグラフは、本開示の成熟抗−Jagged Fabフラグメント（上部パネル）及び本開示の成熟ＩｇＧ分子（底部パネル）の両者がNotchシグナル伝達を阻害することを示す。
【図２８】図２８は、Ｍ２９２細胞系、すなわちヒト肺癌細胞系による内在化に比較して、時間の経過に対する％内在化としてプロットされる、ＢｘＰＣ３膵臓細胞系による本開示の抗−Jagged抗体の効果的内在化を示すグラフである。内在化は、Gostring L et al, 2010, Int J Oncol 36, 757-763に記載される方法に類似する方法を用いて示された。
【図２９】図２９は、ＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍の増殖を阻害する、ゲムシタビンと組合しての抗−Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１の能力を示すグラフである。
【図３０】図３０は、より高い投与量の抗体及びゲムシタビンは有意な体重減少を示したが、しかし活性化可能抗−Jagged抗体及びゲムシタビンにより投与された動物は、ゲムシタビン単独での体重現象よりも体重減少は示されなかったことを示すグラフである。
【図３１】図３１は、ゲムシタビンと組合しての２０ｍｇ／ｋｇの抗−Jagged抗体の投与のみが高められた血清ｍＴＳＬＳを示したことを示すグラフである。
【図３２】図３２は、抗−Jagged抗体４Ｄ１１がＴＲＡＭＰマウスにおける前立腺腫瘍の増殖の制限において効果的であったことを示すグラフである。
【図３３】図３３は、抗−Jagged４Ｄ１１抗体がＨｅｒ２／ｎｅｕトランスジェニックマウスにおいて自発的腫瘍の増殖を強く阻害したことを示すグラフである。
【図３４】図３４は、標識されていない（すなわち、未標識の）活性化可能抗体、及び検出できる標識を含み、そして活性化可能抗体のＡＢを特異的に結合する第２試薬を用いて現場イメージングを行う実現可能性を示す一連のイメージである。
【図３５】図３５は、トランスジェニック前立腺癌モデル（ＴＲＡＭＰ）の腫瘍組織による、標識されていない抗−Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１の活性化を示す一連のイメージである。
【図３６】図３６は、ヒトJagged１に結合する、抗体４Ｄ１１、活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１、ＭＴ−ＳＰ１−活性化された抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１の能力を示すグラフである。
【図３７】図３７は、抗−Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１がＨ２９４異種移植腫瘍の増殖を阻害したことを示すグラフである。
【図３８】図３８は、活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１は、ＴＳＬＰの上昇を示さなかったが、６．７及び２０ｍｇ／ｋｇで前記抗体を投与された動物は、ＩＶＩｇ処理されたグループに比較して、高められたＴＳＬＰを示したことを示すグラフである。
【図３９】図３９は、過角化症が抗体処理されたグループにおいて観察されたが、ところが活性化可能抗体−処理されたグループは制限された過角化症を示すか、又はまったく示さなかったことを示す一連のイメージである。
【発明を実施するための形態】
【０１２５】
本発明のは、癌の診断及び治療のための新規組成物を記載する。特に、本発明は、Jagged1及びJagged2を結合し、そしてNotch受容体へのそれらの結合及びNotch受容体を介してのシグナル伝達を阻害する抗体を提供する。本発明は、Jagged1及びJagged2を特異的に結合するモノクローナル抗体（すなわち、交差反応性モノクローナル抗体）を提供する。それらの抗体は、集合的には、「抗−Jagged抗体」（anti−Jagged  antibodies）として、本明細書においては言及される。
【０１２６】
Jagged阻害から利益を得るであろう徴候は、癌を包含するであろう。例えば、徴候は、白血病、例えばＴ−細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、リンパ芽球性疾患、例えば多発性骨髄腫、及び固形腫瘍、例えば肺、結腸直腸、前立腺、膵臓及び乳癌、例えばトリプルネガティブ乳癌を包含するであろう。さらに、Notchシグナル伝達は癌幹細胞の生存及び増殖のために重要であるので、Jagged依存性notchシグナル伝達の阻害は、幹細胞増殖及び生存性に影響を及ぼすであろう。例えば、徴候は、一次腫瘍起源にかかわらず、癌における骨疾患又は転移；乳癌、例えば非制限的例によれば、ＥＲ／ＰＲ＋乳癌、Ｈｅｒ２＋乳癌、トリプルネガティブ乳癌；結腸直腸癌；胃癌；神経膠芽腫；頭頸部癌；肺癌、例えば非制限的例によれば、非小細胞肺癌；多発性骨髄腫卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；肉腫；腎癌、例えば非制限的例によれば、腎細胞癌；及び／又は皮膚癌、例えば非制限的例によれば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、黒色腫を包含する。
【０１２７】
癌の他に、Jagged−依存性notchシグナル伝達は、筋線維芽細胞、すなわち線維症の発症において中心的役割を有する細胞への上皮及び線維芽細胞分化に対して重要である。Jagge依存性notchシグナル伝達の阻害、及び従って、筋線維芽細胞の出現の阻害は、腎臓、肝臓、肺及び皮膚の線維性疾患のための効果的治療であろう。例えば、徴候は、線維性疾患、例えば特発性肺線維症（ＩＰＦ）；腎線維症、肝線維症、腹膜透析誘発性線維症、及び/又は強皮を包含するであろう。
【０１２８】
他の適切な徴候は、例えば病理、例えば難聴を包含する。
【０１２９】
本発明の抗体は、１μＭ以下（≦１μＭ）の平衡結合定数（Ｋd）を伴って、Jagged１エピトープ及び／又はJagged２エピトープに結合する。いくつかの実施形態によれば、本発明の抗体は、＜ 100 nM、＜ 10 nM又は＜ 1 nMのＫdを伴って、Jagged１エピトープ及び／又はJagged２エピトープに結合する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に提供される抗−Jagged抗体は、およそ１ｎＭ〜約１ｐＭの範囲でＫdを示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の抗体は、＜ １０-2、＜ １０-3、＜ １０-4又は＜ １０-5の「オフ速度定数」（Ｋoff）を伴って、Jagged１エピトープ及び／又はJagged２エピトープに結合する。いくつかの実施形態によれば、本明細書に提供される抗−Jagged抗体は、＜１０-5のＫoffを示す。いくつかの実施形態によれば、本発明の抗体は、Jagged１及びJagged２のＥＧＦドメインに結合する。いくつかの実施形態によれば、本発明の抗体は、Jagged１及びJagged２のＤＳＬドメインに結合する。
【０１３０】
本発明の抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗体は、Jagged1及び/又はJagged2の生物学的活性を調節し、阻止し、阻害し、低め、拮抗し、中和し、又は他方では、干渉するよう機能する。Jagged1及び/又はJagged2の生物学的活性は例えば、１又は２以上のNotch受容体を介してのシグナル伝達を包含する。例えば、抗−Jagged抗体は、１又は２以上のNotch受容体へのJagged1及び/又はJagged2の結合を、部分的に又は完全に、調節し、阻止し、阻害し、低め、拮抗し、中和し、又は他方では、干渉することにより、又は他方では、Jagged1及び/又はJagged2介在性シグナル伝達活性を部分的に又は完全に、調節し、阻止し、阻害し、低め、拮抗し、中和し、又は他方では、干渉することにより、Jagged1及び/又はJagged2生物学的活性を、完全に又は部分的に阻害する。
【０１３１】
抗−Jagged抗体は、抗−Jagged抗体の存在下でのJagged1及び/又はJagged2の活性レベルが、本明細書に記載される抗−Jagged抗体の不在下での活性レベルに比較して、少なくとも９５％、例えば、９６％、９７％、９８％、９９％ 又は１００％、低められる場合、Jagged1及び/又はJagged2の生物学的活性を、完全に、調節し、阻止し、阻害し、低め、拮抗し、中和し又は他方では、干渉すると思われる。抗−Jagged抗体は、抗−Jagged抗体の存在下でのJagged1及び/又はJagged2の活性レベルが、本明細書に記載される抗−Jagged抗体の不在下での活性レベルに比較して、９５％以下、例えば、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％ 又は９０％、低められる場合、Jagged1及び/又はJagged2の活性を、部分的に、調節し、阻止し、阻害し、低め、拮抗し、中和し又は他方では、干渉すると思われる。Jagged活性の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：細胞分裂及び分化、細胞生存/アポトーシス、上皮間葉移行（ＥＭＴ）及び浸潤、血管新生、癌幹細胞の自己再生及び溶骨性骨病変。理論に束縛されるものではないが、血管新生におけるJaggedの役割はＶＥＧＦのその役割とは異なっていると考えられる。
【０１３２】
定義
特にことわらない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者により通常理解される意味を有するであろう。さらに、特に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含むものとし、そして複数形は単数を含むものとする。一般的に、本明細書に記載される細胞及び組織培養物、分子生物学、及びタンパク質及びオリゴ−又はポリヌクレオチド化学及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法及びそれらの技法は、当業者に良く知られており、そして当業界において通常使用される。標準技法が、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）について使用される。酵素反応及び精製技法は、製造業者の規格に従って、又は当業界において通常達成されるようにして、又は本明細書に記載されるようにして、実施される。前述の技法及び手順は、当業界において良く知られている従来の方法に従って、及び本明細書を通して引用され、そして論じられる種々の一般的及び特定の参照に記載のようにして、一般的に実施される。例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照のこと。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、及び医学及び薬化学に関連して使用される命名法、及び実験手順及び技法は、当業者に良く知られており、そして当業界において通常使用される。標準技法が、化学合成、化学分析、医薬調製、配合、及び送達、及び患者の治療のために使用される。
【０１３３】
本開示に従って使用される場合、次の用語が、特にことわらない限り、次の意味を有することが理解されるであろう。
【０１３４】
本明細書において使用される場合、用語「抗体（antibody）」とは、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分、すなわち抗原を特異的に結合する（抗原と免疫反応する）抗原結合部位を含む分子を言及する。「特異的に結合する（specifically bind）」又は「免疫反応する（immunoreacts with）」又は「免疫特異的に結合する（immunospecifically bind）」とは、抗体が所望する抗原の１又は２以上の抗原決定因子と反応し、そして他のポリペプチドと反応せず、そしてより低い親和性（Ｋd＞１０-6）で結合しないことを意味する。抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂ，及びＦ（ａｂ′）2フラグメント、ｓｃＦｖｓ、及びＦａｂ発現ライブラリーを包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０１３５】
基本的な抗体構造単位は、テトラマーを含むことが知られている。各テトラマーは、同一の２対のポリペプチド鎖から構成され、各対は１つの「Ｌ鎖」（約２５ｋＤａ）及び１つの「Ｈ鎖」（約５０−７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識を主に担当する約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端は、エフェクター機能を主に担当する不変領域を規定する。一般的に、ヒトから得られる抗体分子は、分子に存在するＨ鎖の性質によりお互い異なる、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ及びＩｇＤの何れかに関連する。特定クラスは、サブクラス、例えばＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、及び他のものも有する。さらに、ヒトにおいては、Ｌ鎖はカッパ鎖又はラムダ鎖である得る。
【０１３６】
用語「モノクローナル抗体（monoclonal antibody）」（ｍＡｂ）又は「モノクローナル抗体組成物（monoclonal antibody composition）」とは、本明細書において使用される場合、固有のＬ鎖遺伝子生成物及び固有のＨ鎖遺伝子生成物から成る抗体分子の１つの分子種のみを含む抗体分子集団を言及する。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、前記集団のすべての分子において同一である。ＭＡｂは、抗原のエピトープに対して固有の結合親和性により特徴づけられる抗原の特定エピトープと免疫反応できる抗原結合部位を含む。
【０１３７】
用語「抗原−結合部位（antigen-binding site）」又は「結合部分（binding portion）」とは、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部を言及する。抗原結合部位は、重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）のＮ−末端可変（Ｖ）領域のアミノ酸残基により形成される。「超可変領域（hypervariable regions）」として言及される、Ｈ及びＬ鎖のＶ領域内の３種の高度に分岐するストレッチが、「フレームワーク領域（framework regions）」又は「ＦＲ」として知られているより保存された隣接ストレッチ間に介在される。従って、用語「ＦＲ」とは、免疫グロブリン中の超可変領域間に、及びそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を言及する。抗体分子においては、Ｌ鎖の３種の超可変領域及びＨ鎖の３種の超可変領域が、立体空間においてお互い相対的に配列され、抗原−結合表面が形成される。前記抗原−結合表面は、結合される抗原の立体表面に対して相補的であり、そして各Ｈ及びＬ鎖の３種の超可変領域は、「相補性−決定領域（complementarity-determining regions）」又は「ＣＤＲ」として言及される。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991))、又は Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989)の定義に従う。
【０１３８】
本明細書において使用される場合、用語「エピトープ（epitope）」は、免疫グロブリン、ｓｃＦｖ又はＴ−細胞受容体に対して特異的結合できる任意のタンパク質決定因子を包含する。用語「エピトープ」は、免疫グロブリン又はＴ−細胞受容体に対して特異的結合できる任意のタンパク質決定因子を包含する。エピトープ決定因子は通常、アミノ酸又は糖側鎖などの分子の化学的活性表面基から成り、そして通常、特定の立体構造特性、及び特定の電荷特性を有する。例えば、抗体は、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端ペプチドに対して産生され得る。抗体は、解離定数が≦１μＭ；例えば、いくつかの実施形態によれば、≦１００ｍＭ、及びいくつかの実施形態によれば、≦１０ｎＭである場合、抗原を特異的に結合すると言われる。
【０１３９】
本明細書において使用される場合、用語「特異的結合（specific binding）」、「免疫学的結合（immunological binding）」及び「免疫学的結合性質（immunological binding properties）」とは、免疫グロブリンが特異的である、免疫グロブリン分子と抗原との間に生じるタイプの非共有相互作用を言及する。免疫学的結合相互作用の強度又は親和性は、相互作用の解離定数（Ｋd）により表され、ここでより小さなＫdはより大きな親和性を表す。選択されるポリペプチドの免疫学的結合性質は、当業界において良く知られている方法を用いて定量化され得る。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体形成及び解離の速度を測定することを伴い、ここでそれらの速度は、複雑なパートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方の速度の等しい影響を及ぼす幾何学的パラメーターに依存する。従って、「オン速度定数（on rate constant）」（Ｋon）及び「オフ速度定数（off rate constant）」（Ｋoff）の両者は、濃度、及び会合及び解離の実際の速度の計算により決定され得る（Nature 361:186-87 (1993)を参照のこと）。Ｋoff／Ｋonの比は、親和性に関連しないすべてのパラメーターの取り消しを可能にし、そして解離定数Ｋdに等しい（一般的に、Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473を参照のこと）。本発明の抗体は、アッセイ、例えば放射性リガンド結合アッセイ又は当業者に知られている類似するアッセイにより測定されるように、平衡結合定数（Ｋd）が≦１μＭ、例えば、いくつかの実施形態によれば、≦１００ｎＭ、いくつかの実施形態によれば、≦１０ｎＭ、及びいくつかの実施形態によれば、≦１００Ｍ〜約１ｐＭである場合、ＥＧＦＲに対して特異的に結合すると言われる。
【０１４０】
用語「単離されたポリヌクレオチド（isolated polynucleotide）」とは、本明細書において使用される場合、ゲノム、ｃＤＮＡ又は合成起源、又はそれらのいくつかの組合せのポリヌクレオチドを意味し、その起源によれば、「単離されたポリヌクレオチド」は、（１）「単離されたポリヌクレオチド」が天然に見出されるポリヌクレオチドのすべて又は一部と会合せず、（２）それが天然で連結されないポリヌクレオチドに対して操作可能的に連結されるか、又は（３）大きな配列の一部として、天然に存在しない。本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に示されるＨ鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子、及び本明細書に記載されるＬ鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を含む。
【０１４１】
本明細書に記載される用語「単離されたタンパク質（isolated protein）」とは、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、又は合成起源又はそれらのいくつかの組合せのタンパク質を意味し、その起源、又は誘導の源によれば、「単離されたタンパク質」は、（１）自然界に見出されるタンパク質に関連せず、（２）同じ源からの他のタンパク質を有さず、例えばネズミタンパク質を有さず、（３）異なった種からの細胞により発現され、又は（４）自然界には存在しない。
【０１４２】
用語「ポリペプチド（polypeptide）」は、ポリペプチド配列の天然タンパク質、フラグメント、又は類似体を言及するために一般用語として本明細書において使用される。従って、天然タンパク質、フラグメント及び類似体は、ポリペプチド属の種である。本発明のポリペプチドは、本明細書に示されるＨ鎖免疫グロブリン分子、及び本明細書に示されるＬ鎖免疫グロブリン分子、並びにＬ鎖免疫グロブリン分子、例えばカッパＬ鎖免疫グロブリン分子、及びその逆、並びにそれらのフラグメント及び類似体を含んで成る組合せにより形成される抗体分子を含む。
【０１４３】
本明細書において使用される場合、用語「天然に存在する（naturally-occurring）」とは、目的物に適用される場合、目的物が自然界において見出され得る事実を言及する。例えば、生物（例えば、ウィルス）に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチドは、自然源から単離され、そして実験室においてヒトにより意図的に変性されていないか、又は他方では、天然に存在する。
【０１４４】
用語「操作可能的に連結された（operably linked）」とは、本明細書において使用される場合、記載される成分の意図された様式でのそれらの機能を可能にする関係下にあるそのような成分の位置を言及する。コード配列に「操作可能的に連結された」制御配列は、そのコード配列の発現が制御配列と適合できる条件下で達成されるような手段で連結される。
【０１４５】
用語「制御配列（control sequence）」とは、本明細書において使用される場合、それらが連結されるコード配列の発現及びプロセッシングをもたらすのに必要であるポリヌクレオチド配列を言及する。そのような制御配列の性質は、原核生物における宿主生物に依存して異なり、そのような制御配列は一般的に、真核生物におけるプロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含み、一般的にそのような制御配列は、プロモーター及び転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、それらの存在が発現及びプロセッシングのために必須であるすべての成分を、最低でも含むことが意図され、そしてまた、それらの存在がリーダー配列及び融合パートナー配列のために好都合である追加成分も含むことができる。用語「ポリヌクレオチド」とは、本明細書において使用される場合、少なくとも１０個の長さの塩基のヌクレオチド、リボヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドのいずれか、又は修飾された形のいずれかのタイプのヌクレオチドを意味する。この用語は、単鎖及び二本鎖形のＤＮＡを包含する。
【０１４６】
本明細書に言及される用語「オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）」は、天然に存在し、そして天然に存在しないオリゴヌクレオチド結合により一緒に連結された、天然に存在し、そして修飾されたヌクレオチドを包含する。オリゴヌクレオチドは、２００個の長さか、又はそれよりも少ない長さの塩基を、一般的に含むポリヌクレオチドサブセットである。いくつかの実施形態によれば、オリゴヌクレオチドは、１０〜６０個の長さ、及び例えば、いくつかの実施形態によれば、１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９又は２０〜４０個の長さの塩基である。オリゴヌクレオチドは通常、例えばプローブに関しては、単鎖であり、ところがオリゴヌクレオチドは、遺伝子変異体の構成への使用のためには、二本鎖であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【０１４７】
本明細書において言及される用語「天然に存在するヌクレオチド（naturally occurring nucleotides）」は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを包含する。本明細書において言及される用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾された又は置換された糖基及び同様のものを有するヌクレオチドを包含する。本明細書において言及される用語「オリゴヌクレオチド結合」は、オリゴヌクレオチド結合、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニラデ−ト（phoshoraniladate）、ホスホロンミデート（phoshoronmidate）及び同様のものを包含する。例えば、LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. U.S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990)を参照のこと。オリゴヌクレオチドは、所望には、検出のための標識を含むことができる。
【０１４８】
本明細書において使用される場合、２０個の従来のアミノ酸及びそれらの略語は、従来の使用法に従う。Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991))を参照のこと。２０個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα−、α−二置換されたアミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及び他の非従来型アミノ酸もまた、本発明のポリペプチドのための適切な成分であり得る。非従来型アミノ酸の例は、次のものを包含する：４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、・−Ｎ、Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルリシン、・−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、・−Ｎ−メチルアルギニン、及び他の類似するアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書で使用されるポリペプチド表記法においては、標準用法及び慣例に従って、左側方向はアミノ末端方向であり、そして右側方向はカルボキシ末端方向である。
【０１４９】
同様に、特にことわらない限り、単鎖ポリヌクレオチド配列の左側端は、５′端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は、５′方向として言及される。新生ＲＮＡ転写体の５′から３′付加の方向は、転写方向として言及され、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の及びＲＮＡ転写体の５′末端に対して５′側い存在する配列領域は、「上流配列（upstream sequences）」と呼ばれ、ＲＮＡと同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の、及びＲＮＡ転写体の３′末端に対して３′側に存在する領域は、「下流配列（downstream sequences）」と呼ばれる。
【０１５０】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的に同一（substantial identity）」とは、２種のペプチド配列が、デフォルトギャップ重量を用いて、プログラムＧＡＰ又はＧＥＳＴＦＩＴによれば、適切に整列される場合、少なくとも８０％の配列同一性、例えば、いくつかの実施形態によれば、少なくとも９０％の配列同一性、いくつかの実施形態によれば、少なくとも９５％の配列同一性、及びいくつかの実施形態によれば、少なくとも９９％の配列同一性を共有することを意味する。
【０１５１】
いくつかの実施形態によれば、同一でない残基位置は、保存性アミノ酸置換により異なる。
【０１５２】
本明細書において論じられる場合、抗体又は免疫グロブリン分子のアミノ酸配列におけるマイナーな変動は、アミノ酸配列における変動が少なくとも７５％、例えば、いくつかの実施形態によれば、少なくとも８０％、９０％、９５％及びいくつかの実施形態によれば、９９％維持する場合、本発明により包含されるものとして意図される。特に、保存性アミノ酸置換が企画される。保存性置換は、それらの側鎖に関連するアミノ酸ファミリー内で起こるそれらの置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は一般的に、次のファミリーに分けられる：（１）酸性アミノ酸はアスパラギン酸、グルタミン酸であり；（２）塩基性アミノ酸は、リシン、アルギニン、ヒスチジンであり；（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、そして（４）非荷電性極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸は、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、及びトレオニンを包含する。疎水性アミノ酸は、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン及びバリンを包含する。他のファミリーのアミノ酸は、（ｉ）脂肪族−ヒドロキシファミリーである、セリン及びトレオニン；（ｉｉ）アミド含有ファミリーである、アスパラギン及びグルタミン；（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーである、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン；及び（ｉｖ）芳香族ファミリーである、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンを包含する。例えば、イソロイシン又はバリンによるロイシンの、グルタミン酸によるアスパラギン酸の、セリンによるトレオニンの単離された置換、又は構造的に関連するアミノ酸による１つのアミノ酸の類似する置換は、特にその置換が骨格部位内にアミノ酸を含まない場合、得られる分子の結合又は性質に対して主要効果を有さないであろうことを予測するが妥当である。アミノ酸変化が機能ペプチドをもたらすかどうかは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることにより、容易に決定され得る。アッセイは本明細書に詳細に記載される。抗体又は免疫グロブリン分子のフラグメント又は類似体は、当業者により容易に調製され得る。いくつかの実施形態によれば、フラグメント又は類似体のアミノ−及びカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界近くで存在する。構造的及び機能的ドメインは、公的又は独自の配列データベースとのヌクレオチド及び／又はアミノ酸配列データの比較により同定され得る。コンピューター化された比較方法が、既知構造及び／又は機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフ又は予測されるタンパク質コンホメーションドメインを同定するために使用される。既知立体構造に折り畳むタンパク質配列を同定するための方法は周知である（Bowie et al. Science 253:164 (1991)）。従って、前述の例は、当業者が本発明に従って構造及び機能的ドメインを規定するために使用され得る、配列モチーフ及び構造コンホメーションを認識することができることを示して���る。
【０１５３】
いくつかの実施形態によれば、アミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低め、（２）酸化に対する感受性を低め、（３）タンパク質複合体を形成するために結合親和性を変更し、（４）そのような類似体の他の物理化学的又は機能的性質を付与するか又は修正するそれらの置換である。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の種々のムテインを含むことができる。例えば、単一又は複数のアミノ酸置換（例えば、保存性アミノ酸置換）が、分子間接触を形成する天然に存在する配列（例えば、ドメイン外のポリペプチドの一部）において行われ得る。保存性アミノ酸置換は、親配列の構造特性を実質的変更すべきではない（例えば、置換アミノ酸は、親配列に生じるヘリックスを分解するか、又は親配列を特徴づける他のタイプの二次構造を破壊する傾向であってはならない）。当核分野で認識されるポリペプチド二次及び三次構造の例は、Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H.  Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J.  Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991));及びThornton et at. Nature 354:105 (1991)に記載される。
【０１５４】
用語「ポリペプチドフラグメント（polypeptide fragment）」とは、本明細書において使用される場合、アミノ酸末端及び／又はカルボキシ末端欠失及び／又は１又は２以上の内部欠失を有するが、しかし残るアミノ酸配列は例えば完全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列においてその対応する位置と同一であるポリペプチドを言及する。フラグメントは、典型的には、少なくとも５、６、８又は１０個の長さのアミノ酸、例えば、いくつかの実施形態によれば、少なくとも１４個の長さのアミノ酸、いくつかの実施形態によれば、少なくとも２０個の長さのアミノ酸、通常少なくとも５０個の長さのアミノ酸、及びいくつかの実施形態によれば、少なくとも７０個の長さのアミノ酸でである。用語「類似体」とは、本明細書において使用される場合、推定されるアミノ酸配列の一部に対して実質的な同一性を有し、そして適切な結合条件下でＥＧＦＲに対する特異的結合を有する、少なくとも２５個のアミノ酸のセグメントから構成されるポリペプチドを言及する。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に関して、保存性アミノ酸置換（又は付加又は欠失）を含む。類似体は典型的には、少なくとも２０個の長さのアミノ酸、例えば、いくつかの実施形態によれば、少なくとも５０個又はそれ以上の長さのアミノ酸であり、そしてしばしば、完全な長さの天然に存在するポリペプチドと同じ長さであり得る。
【０１５５】
用語「剤（agent）」は、化学物質、化学物質及び生体高分子の混合物、又は生物学的材料から製造される抽出物を示すために、本明細書において使用される。
【０１５６】
本明細書において使用される場合、用語「標識（label）」又は「標識された（labeled）」とは、例えば放射性標識されたアミノ酸の組込み、又はマークされたアビジン（例えば、光学的又は熱量測定方法により検出され得る蛍光マーカー又は酵素活性を含むストレプタビジン）により検出され得るビオチニル部分のポリペプチドへの結合による、検出可能マーカーの組込みを言及する。一定の状況下で、標識又はマーカーもまた治療性であり得る。ポリペプチド及び糖タンパク質を標識する種々の方法は、周知であり、そして使用され得る。ポリペプチドについての標識の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：放射性同位体又は放射性核種（例えば、3Ｈ、14Ｃ、15Ｎ、35Ｓ、90Ｙ、99Ｔｃ、111Ｉｎ、125Ｉ、131Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ｐ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学ルミネセンス、ゼオチニル基、二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体のための結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。いくつかの実施形態によれば、標識は、可能性ある立体障害を低めるために、種々の長さのスペーサーアームにより結合される。用語「医薬剤又は薬剤（pharmaceutical agent or drug）」とは、本明細書において使用される場合、患者に適切に投与される場合、所望する治療効果を誘発できる化学物質又は組成物を言及する。
【０１５７】
本明細書における他の化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985))により例示されるように、当核技術分野における従来の使用法に従って使用される。
【０１５８】
本明細書において使用される場合、「実質的に純粋な（substantially pure）」とは、目的の種が存在する優性種であり（すなわち、モル基準で、組成物において任意の他の個々の種より豊富である）、そして、実質的に純粋な画分が、目的の種が存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モル基準で）を含む組成物であることを意味する。
【０１５９】
一般的に、実質的に純粋な組成物は、組成物に存在するすべての高分子種の約８０％以上、例えば、いくつかの実施形態によれば、約８５％、９０％、９５％及び９９％以上を含むであろう。いくつかの実施形態によれば、目的の種は、本質的な均質性に精製され（汚染種は従来の検出方法によっては、組成物において検出され得ない）、ここで組成物は単一の高分子種から実質的に成る。
【０１６０】
用語、患者とは、ヒト及び動物種を包含する。
【０１６１】
Jagged阻害から利益を得る徴候は、白血病、例えばＴ−細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、リンパ芽球性疾患、例えば多発性骨髄腫、及び固形腫瘍、例えば肺、結腸直腸、前立腺、膵臓及び乳癌、例えばトリプルネガティブ乳癌を包含するであろう。さらに、Notchシグナル伝達は癌幹細胞の生存及び増殖のために重要であるので、Jagged依存性notchシグナル伝達の阻害は、幹細胞増殖及び生存性に影響を及ぼすであろう。癌の他に、Jagged−依存性notchシグナル伝達は、筋線維芽細胞、すなわち線維症の発症において中心的役割を有する細胞への上皮及び線維芽細胞分化に対して重要である。Jagge依存性notchシグナル伝達の阻害、及び従って、筋線維芽細胞の出現の阻害は、腎臓、肝臓、肺及び皮膚の線維性疾患のための効果的治療であろう。
【０１６２】
抗−Jagged抗体及び活性化可能抗−Jagged抗体
本発明のモノクローナル抗体及び／又は活性化可能抗体は、Notch受容体を介してJagged1及び/又はJagged2介在性シグナル伝達を阻害する能力を有する。阻害は、種々の当核分野で認識されている技法の何れか、例えば本明細書に提供される実施例に記載されるアッセイを用いて決定される。
【０１６３】
本発明の抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体は例えば、Ｈ鎖相補性決定領域（ＶＨ  ＣＤＲ）及びＬ鎖相補性決定領域（ＶＬ  ＣＤＲ）の組合せを包含する。そのようなＣＤＲの例は、下記表２に示されているか、又は本明細書に開示される抗体のＣＤＲ、例えば表３及び表４におけるそれら（但し、それらだけには限定されない）である。いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体は、４Ｄ１１抗体、４Ｂ２抗体、４Ｅ７抗体、４Ｅ１１抗体、６Ｂ７抗体及び６Ｆ８抗体から成る群から選択された少なくとも１つの抗体の、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体は、４Ｄ１１抗体、４Ｂ２抗体、４Ｅ７抗体、４Ｅ１１抗体、６Ｂ７抗体及び６Ｆ８抗体から成る群から選択された少なくとも１つの抗体の配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含む。
【０１６４】
本発明の抗−Jagged抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含み、ここで少なくとも１つのＣＤＲ配列は、アミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）を含むＶＨ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）を含むＶＨ  ＣＤ２；アミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３から成る群から選択される。
【０１６５】
本発明の抗−Jagged抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含み、、ここで少なくとも１つのＣＤＲ配列は、アミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤ２；アミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３から成る群から選択される。
【０１６６】
本発明の抗−Jagged抗体は、少なくともアミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）を含むＶＨ  ＣＤＲ１；少なくともアミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）を含むＶＨ  ＣＤ２；少なくともアミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；少なくともアミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及び少なくともアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１６７】
本発明の抗−Jagged抗体は、アミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤ２；アミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０１６８】
本発明の典型的な抗体及び／又は活性化可能抗体は、例えば４Ｄ１１抗体、４Ｂ２抗体、４Ｅ７抗体、４Ｅ１１抗体、６Ｂ７抗体、６Ｆ８抗体、及びそれらの変異体を含む。それらの抗体は、ヒトJagged1及びJagged2に対して特異性を示し、そしてそれらは、Notch受容体を介してヒトJagged１及び／又はヒトJagged２介在性シグナル伝達を阻害することが示されている。それらの抗体は、表４に列挙され、そして実施例５に示されているアミノ酸及び対応する核酸配列で示されるように、Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）及びＬ鎖可変領域（ＶＬ）の組合せを含む。
【０１６９】
本明細書に記載される抗体と同じエピトープに対して結合する抗体及び／又は活性化可能抗体がまた、本発明に包含される。例えば、本発明の抗体及び／又は活性化可能抗体は、ヒトJagged１に対して特異的に結合し、ここで前記抗体は、ヒトJagged１上の１又は２以上のアミノア酸残基を含むエピトープに結合する（例えば、受託番号AAC52020.1; AAB84053.1; NP_000205.1; P78504.3; AAB39007.1; EAX10341.1; AAI26208.1; AAI26206.1; AAH98393.1; CAC07198.1 及び/又はBAG35596.1で示される）。本発明の抗体及び／又は活性化可能抗体は、ヒトJagged２に対して特異的に結合し、ここで前記抗体は、ヒトJagged２上の１又は２以上のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する（例えば、受託番号AAB61285、AAB71189.1、EAW81901.1、NP_002217.3及び/又はQ9Y219.3を参照のこと）。本発明の抗体はヒトJagged１及びヒトJagged２の両者を特異的に結合し、ここで前記抗体は、ヒトJagged１上の１又は２以上のアミノ酸残基を含むエピトープ、及びヒトJagged２上の１又は２以上のアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。
【０１７０】
当業者は、モノクローナル抗体（例えば、完全ヒトモノクローナル抗体）及び／又は活性化可能抗体が、本発明のモノクローナル抗体及び／又は活性化可能体（例えば、４D１１、４B２、４E７、４E１１、６B７及び/又は６F８抗体及びそれらの抗体を含む活性化可能抗体）と同じか又は類似する特異性を有する場合、前者がJagged１、Jagged２又はJagged1及びJagged2の両者への後者の結合を妨げるかどうかを確かめることにより、過度の実験なしに、決定することが可能であることを認識するであろう。試験されるモノクローナル抗体及び／又は活性化可能抗体が、本発明のモノクローナル抗体及び／又は活性化可能抗体による結合の低下により示されるように、本発明のモノクローナル抗体及び／又は活性化可能抗体と競争する場合、前記２種のモノクローナル抗体及び／又は活性化可能抗体は、同じか、又は密接に関連するエピトープに結合する。
【０１７１】
モノクローナル抗体及び／又は活性化可能抗体が本発明のモノクローナル抗体及び／又は活性化可能抗体の特異性を有するかどうかを決定するための１つの実施形態は、本発明のモノクローナル抗体及び／又は活性化可能抗体を、可溶性Jagged1及び/又はJagged2タンパク質（通常、反応性であるタンパク質と共に）と共にプレインキュベートし、そして次に、試験されるモノクローナル抗体及び／又は活性可能抗体がJagged1及び/又はJagged2を結合するその能力下で阻害されるかどうかを決定するために試験されるモノクローナル抗体及び／又は活性化可能抗体を添加することである。試験されるモノクローナル抗体及び／又は活性化可能抗体が阻害される場合、たぶん、それは、本発明のモノクローナル抗体及び／又は活性化可能抗体と同じか、又は機能的に等しいエピトープ特異性を有する。
【０１７２】
本発明のモノクローナル抗体及び／又は活性化可能抗体のスクリーニングはまた、例えばNotch受容体を介してJagged1及び/又はJagged2介在性シグナル伝達を測定し、そして試験モノクローナル抗体がNotch受容体を介してJagged1及び/又はJagged2介在性シグナル伝達を、調節し、阻止し、阻害し、低め、拮抗し、中和し又は他方では、干渉することができるかどうか決定することにより、実施され得る。Jagged活性の例は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：細胞分裂及び分化、細胞生存/アポトーシス、上皮間葉移行（ＥＭＴ）及び浸潤、血管新生、癌幹細胞の自己再生及び溶骨性骨病変。
【０１７３】
当核分野で公知の種々の手順が、ヒトJagged１及び／又はヒトJagged2、又はその誘導体、フラグメント、類似体、相同体又はオルト体に対して向けられるモノクローナル抗体の生成のために使用され得る（例えば、Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lane D, 1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照のこと、参照により本明細書に組み込まれる）。完全なヒト抗体は、ＣＤＲを含む、Ｌ鎖及びＨ鎖の両者の全配列が、ヒト遺伝子から生じる、抗体分子である。そのような抗体は、本明細書においては、「ヒト抗体」又は「完全ヒト抗体」と呼ばれる。ヒトモノクローナル抗体は、例えば、下記に提供される実施例に記載される手順を用いて、調製される。ヒトモノクローナル抗体はまた、トリオーマ技法；ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技法（Kozbor, et al., 1983 Immunol Today 4: 72を参照のこと）；及びヒトモノクローナル抗体を生成するためのＥＢＶハイブリドーマ技法（Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照のこと）を用いることにより、調製され得る。ヒトモノクローナル抗体は、利用され得、そしてヒトハイブリドーマ（Cote, et al., 1983. Proc Natl Acad Sci USA 80: 2026-2030を参照のこと）を用いることにより、又はインビトロで、エプスタイン・バーウィルス（Epstein Barr Virus）によりヒトＢ細胞を形質転換することにより（Cole, et al., 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照のこと）、生成され得る。
【０１７４】
抗体は、良く知られた技法、例えば免疫血清のＩｇＧ画分を主に提供する、プロテインＡ又はプロテインＧを用いての親和性クロマトグラフィーにより精製される。続いて、又は他方では、求められる免疫グロブリンの標的物である特異的抗原、又はそのエピトープは、免疫親和性クロマトグラフィーにより免疫特異的抗体を精製するためにカラム上に固定され得る。免疫グロブリンの精製は、例えばD. Wilkinson (The Scientist, published by The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol. 14, No. 8 (April 17, 2000), pp. 25-28)により論じられている。
【０１７５】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体である。Notch受容体を介してJagged1及び/又はJagged2介在性シグナル伝達を調節し、阻止し、阻害し、低め、拮抗し、中和し、又は他方では、干渉するモノクローナル抗体は、例えばJagged1及び/又はJagged2、例えばネズミ、ラット又はヒトJagged1及び/又はJagged2、又はその免疫原性フラグメント、誘導体又は変異体により動物を免疫化することにより生成される。他方では、動物が、＃Jagged1及び/又はJagged2をコードする核酸分子を含むベクターによりトランスフェクトされた細胞により免疫化され、結果的に、Jagged1及び/又はJagged2がトランスフェクトされた細胞の表面上で発現され、そして結合される。他方では、抗体は、Jagged1及び/又はJagged2に結合するための抗体又は抗原結合ドメイン配列を含むライブラリーをスクリーニングすることにより得られる。このライブラリーは、例えばアセンブリーされたファージ粒子の表面上で発現されるバクテリオファージコートタンパク質、及びファージ粒子（すなわち、「ファージディスプレイライブラリー（phage displayed library）」）内に含まれるコードＤＮＡ配列へのタンパク質又はペプチド融合体として、バクテリオファージにおいて調製される。次に、骨髄腫／Ｂ細胞融合体に起因するハイブリドーマが、Jagged1及びJagged2に対する反応性のためにスクリーニングされる。
【０１７６】
モノクローナル抗体は例えば、ハイブリドーマ方法、例えばKohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)により記載されるそれらの方法を用いて、調製される。ハイブリドーマ方法においては、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物が典型的には、免疫化剤により免疫化され、免疫化剤に対して特異的に結合するであろう抗体を生成するか又は生成できるリンパ球が誘発される。他方では、リンパ球はインビトロで免疫化され得る。
【０１７７】
免疫化剤は典型的には、タンパク質抗原、そのフラグメント、又はその融合タンパク質を包含するであろう。一般的に、末梢血液リンパ球が、ヒト起源の細胞が所望される場合、使用され、又は脾臓細胞又はリンパ節細胞が、非ヒト哺乳類源が所望される場合、使用される。次に、リンパ球が、適切な融合剤、例えばポリエチレングリコールを用いて、不死化された細胞系により融合され、ハイブリドーマ細胞が形成される（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103）。不死化された細胞系は通常、形質転換された哺乳類細胞、特に齧歯類、ウシ及びヒト起源の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウス骨髄腫細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞が、いくつかの実施形態によれば、融合されていない、不死化細胞の増殖又は生成を阻害する１又は２以上の物質を含む適切な培養培地において培養され得る。例えば、親細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠いている場合、ハイブリドーマのための培養培地は典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠損細胞の増殖を妨げる、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン（「ＨＡＴ培地」を含むであろう。
【０１７８】
いくつかの実施形態によれば、不死化細胞系は、効果的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支持し、そして培地、例えばＨＡＴ培地に対して感受性であるそれらの細胞系である。いくつかの実施形態によれば、不死化細胞系は、例えばSalk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California and the American Type Culture Collection, Manassas, Virginiaから得られるネズミ骨髄腫系である。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞系がまた、モノクローナル抗体の生成のために記載されている（Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63を参照のこと）。
【０１７９】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地は、抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の存在についてアッセイされ得る。ハイブリドーマ細胞により生成されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈澱、又はインビトロ結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定される。そのような技法及びアッセイは、当業界において知られている。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばScatchard analysis of Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)により決定され得る。さらに、モノクローナル抗体の治療用途においては、標的抗原に対して高度の特異性及び高い結合親和性を有する抗体を同定することが重要である。
【０１８０】
所望するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンが制限希釈法によりサブクローニングされ、そして標準方法により増殖され得る（Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103を参照のこと）。このための適切な培養培地は、ダルベッコ変性イーグル培地及びＲＰＭＩ−１６４０培地を包含する。他方では、ハイブリドーマ細胞は、哺乳類において腹水としてインビボで増殖され得る。
【０１８１】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、従来の免疫グロブリン精製法、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又は親和性クロマトグラフィーにより、培養培地又は腹水から単離されるか、又は精製され得る。
【０１８２】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるそれらの方法により製造され得る。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の方法を用いて（例えば、ネズミ抗体のＨ及びＬ鎖をコードする遺伝子に対して特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）、容易に単離され、そして配列決定され得る。単離されると、ＤＮＡは発現ベクター中に配置され、次に、組換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成するために、免疫グロブリンタンパク質を生成しない宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は骨髄腫細胞中にトランスフェクトされる。ネズミハイブリドーマから単離された抗体に関しては、ＤＮＡはまた、例えば相同ネズミ配列の代わりに、ヒトＨ鎖及びＬ鎖定常ドメインについてのコード配列を置換することにより、修飾され得る（米国特許第４，８１６，５６７号；Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)を参照のこと）。抗体−コードＤＮＡは、非免疫グロブリンポリペプチドのためのコード配列のすべて又は一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合され得る。そのような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインにより置換され得るか、又はキメラ二価抗体を創造するために、本発明の抗体の１つの抗原−結合部位の可変ドメインにより置換され得る。
【０１８３】
ヒト抗体及び抗体のヒト適合化
本発明のモノクローナル抗体は、完全ヒト抗体又はヒト適合された抗体を含む。それらの抗体は、投与された免疫グロブリンに対するヒトによる免疫応答を引起さないで、ヒトへの投与のために適切である。
【０１８４】
抗−Jagged抗体は、例えば下記に提供される実施例に記載される手順を用いて、生成される。
【０１８５】
いくつかの方法によれば、抗−Jagged抗体は、例えば、ヒト配列のみを含む抗体を用いて、ファージディスプレイ法により開発される。そのようなアプローチは、当業界において、例えば国際公開第９２／０１０４７号及び米国特許第６，５２１，４０４号（それらは、参照により本明細書に組込まれる）において良く知られている。このアプローチによれば、ランダム対のＬ及びＨ鎖を担持するファージの組合せライブラリーが、Jagged１、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者、又はそれらのフラグメントの天然又は組換え源を用いてスクリーニングされる。別のアプローチによれば抗−Jagged抗体が、前記工程の少なくとも１段階がヒトJagged１タンパク質、Jagged２タンパク質、又はJagged1及びJagged2タンパク質の両者により、トランスジェニック非ヒト動物を免疫化することを包含する方法により生成され得る。このアプローチによれば、この異種非ヒト動物の内因性Ｈ及び／κＬ鎖遺伝子座のいくつかが使用されておらず、そして抗原に応答して免疫グロブリンコードの遺伝子を生成するために必要とされる再配置することができない。さらに、少なくとも１つのヒトＨ鎖遺伝子座及び少なくとも１つのヒトＬ鎖遺伝子座が、動物中に安定してトランスフェクトされて来た。従って、投与される抗原に応答して、ヒト遺伝子座は、抗原に対して免疫特異的なヒト可変領域をコードする遺伝子を提供するために再配置する。従って、免疫化の後、異種マウスは、完全ヒト免疫グロブリンを分泌するＢ−細胞を生成する。
【０１８６】
異種非ヒト動物を生成するための種々の技法は、当業界において良く知られている。例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号（それらは、その全体が参照により本明細書に組込まれる）を参照のこと。この一般的な方策は、１９９４年に公開されたように、最初のXenoMouse（登録商標）株の生成に関連して実証された。その全体が、参照により本明細書に組込まれる、Green et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994)を参照のこと。また、米国特許第６，１６２，９６３号、第６，１５０，５８４号、第６, １１４，５９８号、第６，０７５，１８１号、及び第５，９３９，５９８ 号、及び日本特許第３ ０６８ １８０ Ｂ２号、第３ ０６８ ５０６ Ｂ２号、及び第３ ０６８ ５０７ Ｂ２号、及び欧州特許第０ ４６３ １５１ Ｂ１号、及び国際公開第９４/０２６０２号、第９６/３４０９６号、第 ９８/２４８９３号、第００/７６３１０号、及び関連する種類のメンバーも参照のこと。
【０１８７】
別のアプローチによれば、外因性Ig遺伝子座がそのIg遺伝子座から断片（個々の遺伝子）の包含を通して模倣される、「ミニ遺伝子座（minilocus）」アプローチを使用してきた。従って、１又は２以上のＶＨ遺伝子、１又は２以上のＤH遺伝子、１又は２以上のＪH遺伝子、ｍｕ定常領域及び第２定常領域（例えば、γ定常領域）が、動物中への挿入のためにコンストラクトに形成される。例えば、米国特許第５，５４５，８０６号; 第５，５４５，８０７号; 第５，５９１，６６９号; 第５，６１２，２０５号;第５，６２５，８２５号; 第５，６２５，１２６号; 第５，６３３，４２５号; 第５，６４３，７６３号; 第５，６６１，０１６号; 第５，７２１，３６７号; 第５，７７０，４２９号; 第５，７８９，２１５号;  第５，７８９，６５０号; 第５，８１４，３１８号; 第５，８７７点 ３９７号; 第５，８７４，２９９号; 第６，０２３，０１０号; 及び 第６，２５５，４５８号;及び欧州特許第０ ５４６ ０７３ Ｂ１号;及び国際公開第９２/０３９１８号、第９２/２２６４５号、第９２/２２６４７号、第９２/２２６７０号、第９３/１２２２７号、第９４/００５６９号、第９４/２５５８５号、第９６/１４４３６号、第９７/１３８５２号、及び第９８/２４８８４号、及び関連する種類のメンバーを参照のこと。
【０１８８】
マイクロ細胞融合を介して、大きな断片の染色体又は完全染色体が導入されているマウスからのヒト抗体の生成はまた、実証されている。欧州特許出願第７７３２８８号及び第８４３９６１号を参照のこと。
【０１８９】
ヒト抗−マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答は、キメラ抗体又は他方では、ヒト適合された抗体を調製するために業界を導いて来た。キメラ抗体がヒト定常領域及びネズミ可変領域を有する場合、あるヒト抗−キメラ抗体（ＨＡＣＡ）応答が、特に抗体の慢性的使用又は複数投与量の使用下で観察されるであろうことが予測される。従って、ＨＡＭＡ又はＨＡＣＡ応答の関与及び／又は効果を害するか又は他方では、緩和するために、Jagged１、Jagged２及び／又はJagged1及びJagged2の両者に対する完全ヒト抗体を提供することが所望される。
【０１９０】
低められた免疫原性を有する抗体の生成はまた、適切なライブラリーを用いてのヒト適合化、キメラ化及びディスプレイ技法を通して達成される。ネズミ抗体、又は他の種からの抗体が当業界において良く知られている技法を用いて、ヒト適合化又は霊長類化され得ることは理解されるであろう。例えばWinter and Harris Immunol Today 14:43 46 (1993) 及びWright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992)を参照のこと。目的の抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン及び／又はフレームワークドメインを、その対応するヒト配列により置換するために、組換えＤＮＡ技法により操作され得る（国際公開第９２１０２１９０号、及び米国特許第５，５３０，１０１号、第５，５８５，０８９号、第５, ６９３，７６１号、第５，６９３，７９２号、第５，７１４，３５０号、及び第５，７７７，０８５号を参照のこと）。また、キメラ性免疫グロブリン遺伝子の構成のためへのＩｇ ｃＤＮＡの使用は、当業界において知られている（Liu et al. P.N.A.S. 84:3439 (1987) 及び J. Immunol. 139:3521 (1987)）。ｍＲＮＡは、抗体を生成するハイブリドーマ又は他の細胞から単離され、そしてｃＤＮＡを生成するために使用される。目的のｃＤＮＡは、特異的プライマーを用いてのポリメラーゼ鎖反応により増幅され得る（米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号）。他方では、ライブラリーが製造され、そしてスクリーニングされ、目的の配列が単離される。次に、抗体の可変領域をコードするＤＮＡ配列が、ヒト定常領域配列に融合される。ヒト定常領域遺伝子の配列は、Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of immunological Interest, N.I.H. publication no. 91-3242に見出され得る。ヒトＣ領域遺伝子は、既知クローンから容易に入手できる。そのアイソタイプの選択は、所望するエフェクター機能、例えば補体固定化、又は抗体依存性細胞毒性の活性により導かれるであろう。適切なアイソタイプは、ＩｇＧ1、ＩｇＧ3及びＩｇＧ4である。ヒトＬ鎖定常領域、すらわちκ又はλのいずれかが使用され得る。次に、キメラ抗体が従来の方法により発現される。
【０１９１】
抗体フラグメント、例えばＦｖ、Ｆ（ａｂ′）2及びＦａｂは、プロテアーゼ又は化学的切断による損なわれていないタンパク質の切断により調製され得る。他方では、切断された遺伝子が設計される。例えば、Ｆ（ａｂ′）2フラグメントの一部をコードするキメラ遺伝子は、ＣＨ１ドメイン、及びＨ鎖のヒンジ領域、続いて切断された分子を生成するための翻訳停止コドンをコードするＤＮＡ配列を含む。
【０１９２】
Ｈ及びＬＪ領域のコンセンサス配列は、ヒトＣ領域セグメントへのＶ領域セグメントの続く結合のためにＪ領域中に有用な制限部位を導入するためのプライマーとして使用するためのオリゴヌクレオチドを設計するために使用され得る。Ｃ領域ｃＤＮＡは、ヒト配列において類似する位置に制限部位を配置するために部位特異的突然変異誘発により修飾され得る。
【０１９３】
発現ベクターは、プラスミド、レトロウィルス、ＹＡＣ、ＥＢＶ由来のエピソーム及び同様のものを含む。便利なベクターは、任意のＶＨ又はＶＬ配列が容易に挿入され、そして発現され得るよう操作された適切な制限部位と共に、機能的に完全なヒトＣＨ又はＣＬ免疫グロブリン配列をコードするベクターである。そのようなべクターにおいては、スプライシングが通常、挿入されたＪ領域におけるスプライスドナー部位と、ヒトＣ領域に続くスプライス受容体部位との間で、及びまた、ヒトＣＨエキソン内に発生するスプライス領域で発生する。ポリアデニル化及び転写終結は、コード領域の下流のネイティブ染色体部位で発生する。得られる抗体は、任意の強いプロモーター、例えばレトロウィルスＬＴＲ、例えばＳＶ−４０初期プロモーター（Okayama et al. Mol. Cell. Bio. 3:280 (1983)）、ラウス肉腫ウィルスＬＴＲ（Gorman et al. P.N.A.S. 79:6777 (1982)）、及びモロニーマウス白血病ウィルスＬＴＲ（Grosschedl et al. Cell 41:885 (1985)）に対して結合され得る。また、理解されるように、ネイティブＩｇプロモーター及び同様のものが使用され得る。
【０１９４】
さらに、ヒト抗体又は他の種からの抗体は、ディスプレイ型技法、例えば、制限されるものではないが、ファージディスプレイ、レトロウィルスディスプレイ、リボソームディスプレイ、及び当業界において良く知られている技法を用いての他の技法により、生成され得、そして得られる分子は、当業界において良く知られているように、追加の成熟、例えば親和性成熟にゆだねられ得る（4937-4942 (1997) (リボソームディスプレイ), Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988) (ファージディスプレイ), Scott, TIBS, vol. 17:241-245 (1992), Cwirla et al. PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel et al. Nucl. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom et al. Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992)、及び米国特許第５，７３３，７４３号）。ディスプレイ技法が、ヒトでない抗体を生成するために使用される場合、そのような抗体は、上記のように、ヒト適合され得る。
【０１９５】
それらの技法を用いて、抗体は、Jagged１、Jagged２及び／又はJagged1及びJagged2の両者を発現する細胞、Jagged１自体、Jagged２自体、Jagged1及び/又はJagged2の形、それらのエピトープ又はペプチド、及びそれらに対する発現ライブラリーに生成され得る（例えば、米国特許第５，７０３，０５７号を参照のこと）、その後、それらは本明細書に記載される活性について、上記のようにしてスクリーニングされ得る。
【０１９６】
本発明の抗−Jagged抗体は、上記に記載される単鎖抗体をコードするＤＮＡセグメントを含むベクターにより発現され得る。
【０１９７】
それらは、ベクター、リポソーム、裸ＤＮＡ、アジュバント−アシストＤＮＡ、遺伝子ガン、カテーテル、等を包含することができる。ベクターは、化学結合体、例えば標的部分（例えば、細胞表面受容体に対するリガンド）及び核酸結合部分（例えば、ポリリシン）を有する、国際公開第９３／６４７０１に記載されるそれらの結合体、ウィルスベクター（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡウィルスベクター）、融合タンパク質、例えば標的部分（例えば、標的細胞に対して特異的な抗体）及び核酸結合部分（例えば、プロタミン）を含む融合タンパク質である、ＰＣＴ／ＵＳ９５／０２１４０（国際公開第９５／２２６１８号）に記載されるそれらのタンパク質、プラスミド、ファージ、等を包含する。ベクターは、染色体性、非染色体性、又は合成であり得る。
【０１９８】
適切なベクターは、ウィルスベクター、融合タンパク質及び化学結合体を包含する。レトロウィルスベクターは、モロニーマウス白血病ウィルスを包含する。いくつかの実施形態によれば、ＤＮＡウィルスベクターが好ましい。それらのベクターは、ポックスウィルスベクター、例えば、オルトボックス又はアビポックスベクターヘルペスウィルスベクター、例えば単純ヘルペスＩウィルス（ＨＳＶ）ベクター（Geller, A. I. et al., J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., et al., in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. et al., Proc Natl. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A. I., et al., Proc Natl. Acad. Sci USA 87:1149 (1990)を参照のこと）、アデノウィルスベクター（LeGal LaSalle et al., Science, 259:988 (1993); Davidson, et al., Nat. Genet 3:219 (1993); Yang, et al., J. Virol. 69:2004 (1995)を参照のこと）、及びアデノ−関連ウィルスベクター（Kaplitt, M. G. et al., Nat. Genet. 8:148 (1994)を参照のこと）を包含する。
【０１９９】
ポックスウィルスベクターは、細胞の細胞質内へ遺伝子を導入する。アビポックスウィルスベクターは、核酸の短期発現のみをもたらす。いくつかの実施形態によれば、アデノウィルスベクター、アデノ−関連ウィルスベクター及び単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）ベクターは、神経細胞中に核酸を導入するために好ましい。アデノウィルスベクターは、アデノ−関連ウィルス（約４ヶ月）よりも短期発現（約２ヶ月）をもたらし、これは、ＨＳＶベクターよりも短い。選択される特定のベクターは、標的細胞及び処理される条件に依存するであろう。導入は、標準技法、例えば感染、トランスフェクション、形質導入又は形質転換によってであり得る。遺伝子トランスファーのモードの例は、例えば裸ＤＮＡ、ＣａＰＯ4沈殿、ＤＥＡＥデキストラン、エレクトロポレーション、プロトプラスト融合、リポフェクション、細胞マイクロインジェクション、及びウィルスベクターを包含する。
【０２００】
ベクターは、任意の所望する標的細胞を実質的に標的化するために使用され得る。例えば、定位注入が、所望する位置にベクター（例えば、アデノウィルス、ＨＳＶ）を向けるために使用され得る。さらに、粒子が、ミニポンプ注入システム、例えばSynchroMed注入システムを用いて、脳室内（ｉｃｖ）注入により送達され得る。対流式と称される、大きな流動に基づく方法はまた、脳の延長領域に大きな分子を送達するのに有効であることがわかっており、そして標的細胞にベクターを送達するのに有用である（Bobo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2076-2080 (1994); Morrison et al., Am. J. Physiol. 266:292-305 (1994)を参照のこと）。使用され得る他の方法は、カテーテル、静脈内、非経口、腹腔内及び皮下注入、及び経口投与又は他の既知経路を包含する。
【０２０１】
それらのベクターは、種々の手段に、例えばサンプル中のJagged１、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者の存在を検出するために使用され得る多量の抗体を発現するために使用され得る。抗体はまた、Jagged１、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2−関連シグナル伝達に結合し、そして破壊することを試みるためにも使用され得る。
【０２０２】
技法が、本発明の抗原性タンパク質に対して特異的な単鎖抗体の生成のために適合され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。さらに、方法が、１つのタンパク質又はその誘導体、フラグメント、類似体又は相同体に対する所望する特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの急速且つ効果的な同定を可能にするために、Ｆａｂ発現ライブラリー（例えば、Huse, et al., 1989 Science 246: 1275-1281を参照のこと）の構成のために適合され得る。タンパク質抗原に対するイディオタイプを含む抗体フラグメントは、制限するものではないが、次のものを包含する、当業界において知られている技法により生成され得る：（ｉ）抗体分子のペプシン消化により生成されるＦ（ａｂ′）2フラグメント；（ｉi）Ｆ（ａｂ′）2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することにより生成されるＦａｂフラグメント；（ｉｉｉ）パパイン及び還元剤による抗体分子の処理により生成されるＦａｂフラグメント；及び（ｉｖ）Ｆｖフラグメント。
【０２０３】
本発明はまた、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′及び（ａｂ′）2抗体フラグメント、単鎖抗−Jagged抗体、二重特異的抗−Jagged抗体、多重特異的抗−Jagged抗体、及びヘテロ結合抗−Jagged抗体も包含する。
【０２０４】
二重特異的抗体は、少なくとも２つの異なった抗原に対する結合特異性を有する抗体である。本発明の場合、結合特異性の１つは、Jagged1及びJagged2に対してである。第２結合標的物は任意の他の抗原であり、そして好都合には、細胞表面タンパク質、又は受容体又は受容体サブユニットである。
【０２０５】
二重特異的抗体の製造方法は、当業者において知られている。従来、二重特異的抗体の組換え生成は、２つの免疫グロブリンＨ鎖／Ｌ鎖対の共発現に基づかれ、ここで前記２つのＨ鎖は異なった特異性を有する（Milstein and Cuello, Nature, 305:537-539 (1983)）。免疫グロブリンＨ及びＬ鎖のランダム分類のために、それらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、異なった抗体分子の可能性ある混合物を生成し、それらのうち、わずか１つが正しい二重特異的構造を有する。正しい分子の精製は通常、親和性クロマトグラフィー段階により達成される。類似する方法は、１９９３年５月１３日に公開された国際公開第９３／０８８２９号、及びTraunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)に開示される。
【０２０６】
所望する結合特異性を有する可変ドメイン（抗体−抗原結合部位）は、免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合され得る。いくつかの実施形態によれば、融合体は、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリンＨ鎖定常ドメインとのものである。融合体の少なくとも１つに存在するＬ鎖結合のために必要な部位を含む第１Ｈ鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリンＨ鎖融合体、及び所望には、免疫グロブリンＬ鎖をコードするＤＮＡが、別々の発現ベクターに挿入され、そして適切な宿主生物中に同時トランスフェクトされる。二重特異的抗体の生成についてさらなる詳細については、例えばSuresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照のこと。
【０２０７】
国際公開第９６／２７０１１号に記載される別のアプローチによれば、１対の抗体分子間の界面が、組換え細胞培養物から回収されるヘテロダイマーの％を最大にするよう操作され得る。前記界面は、抗体定常ドメインのＣＨ３領域の少なくとも一部を含む。この方法によれば、第１抗体分子の界面からの１又は２の小アミノ酸側鎖が、大きな側鎖（例えば、チロシン、又はトリプトファン）により置換される。前記大きな側鎖に対して同一か又は類似するサイズの相補的「キャビティ」が、大きなアミノ酸側鎖を、小さな側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）により置換することにより、第２抗体分子の界面上に創造される。これが、所望しない最終生成物、例えばホモダイマーよりもヘテロダイマーの収率を高めるための機構を提供する。
【０２０８】
二重特異的抗体は、完全長抗体又は抗体フラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ′）2二重特異的抗体）として調製され得る。抗体フラグメントから二重特異的抗体を生成するための技法は、文献に記載されている。例えば、二重特異的抗体は、化学結合を用いて調製され得る。Brennan et al., Science 299:81(1985)は、損なわれていない抗体がタンパク質分解的に切断され、F（ａｂ′）2フラグメントが生成される手順を記載する。それらのフラグメントが、ジチオール錯化剤、亜ヒ酸ナトリウムの存在下で還元され、近接ジチオールが安定化され、そして分子間ジスルフィド形成が阻止される。次に、生成されるＦａｂ′フラグメントが、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）誘導体に転換される。次に、Ｆａｂ′−ＴＮＢ誘導体の１つが、メルカプトエチルアミンによる還元によりＦａｂ′−チオールに再転換され、そして等モル量の他のＦａｂ′−ＴＮＢ誘導体と共に混合され、二重特異的抗体が形成される。生成される二重特異的抗体は、酵素の選択的固定化のための剤として使用され得る。
【０２０９】
さらに、Ｆａｂ′フラグメントは、Ｅ．コリ（Ｅ．coli）から直接的に回収され、そして二重特異的抗体を形成するために、化学的カップリングされる。Shalaby et al., J. Exp. Med. 175:217-225 (1992)は、ヒト適合された完全二重特異的抗体F(ab’)2分子の生成を記載する。各Ｆａｂ’フラグメントは、Ｅ．コリから別々に分泌され、そしてインビトロで、指示された化学的カップリングにゆだねられ、二重特異的抗体が生成される。このようにして形成された二重特異的抗体は、ＥｒｂＢ２受容体及び正常ヒトＴ細胞を過剰発現する細胞に結合することができ、そしてヒト乳癌標的物に対するヒト細胞毒性リンパ球の溶解活性を誘導することがきでた。
【０２１０】
組み換え細胞培養物から直接的に、二重特異的抗体フラグメントを製造し、そして単離するための種々の技法がまた、記載されている。例えば、二重特異的抗体は、ロイシンジッパーを用いて生成された（Kostelny et al., J. Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)）。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドは、遺伝子融合により、２種の異なった抗体のＦａｂ’部分に結合された。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元され、モノマーが形成され、そして次に、再び酸化され、抗体ヘテロダイマーが形成された。この方法はまた、抗体ホモダイマーの生成のためにも使用され得る。Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448 (1993)により記載される「二重特異性抗体」（diabody）技法は、二重特異的抗体フラグメントを製造するための別の機構を提供した。前記フラグメントは、同じ鎖上の２種のドメイン間の対合を可能にするために、短過ぎるリンカーにより、Ｌ鎖可変ドメイン（ＶL）に結合されるＨ鎖可変ドメイン（ＶH）を含む。従って、１つのフラグメントのＶH及びＶLドメインは、別のフラグメントの相補的ＶL及びＶHドメインとの対合を強制され、それにより、２種の抗原−結合部分が形成される。短鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ又はＳｃＦｖ）ダイマーの使用により二重特異的抗体フラグメントを製造するための別の方策がまた、報告されている（Gruber et al., J. Immunol. 152:5368 (1994)を参照のこと）。
【０２１１】
二価以上の抗体が企画される。例えば、三重特異的抗体が調製され得る（Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)）。
【０２１２】
典型的な二重特異的抗体は、２種の異なったエピトープに結合することでき。それらの少なくとも１つは、本発明のタンパク質抗原に由来する。他方では、免疫グロブリン分子の抗−抗原性アームが、特定抗原を発現する細胞に細胞防御機構を集中するために、白血球上のトリガー分子、例えばＴ−細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８又はＢ７）、又はＩｇＧ（ＦｃγＲ）のためのＦｃ受容体、例えばＦｃγＲＩ (ＣＤ６４)、 ＦｃγＲＩＩ (ＣＤ３２) 及びＦｃγＲＩＩＩ (ＣＤ１６)に結合するアームと組合され得る。二重特異的抗体はまた、特定抗原を発現する細胞に細胞毒性剤を向けるためにも使用され得る。それらの抗体は、抗原結合アーム、及び細胞毒性剤又は放射性核種キレート剤、例えばＥＯＴＵＢＥ、ＤＰＴＡ、ＤＯＴＡ又はＴＥＴＡを結合するアームを有する。別の二重特異的抗体の実施形態は、本明細書に記載されるタンパク質抗原を結合し、そしてさらに、組織因子（ＴＦ）を結合する。
【０２１３】
ヘテロ結合体抗体もまた、本発明の範囲内である。ヘテロ結合体抗体は、２種の共有結合される抗体から構成される。それらの抗体は例えば、所望しない細胞に免疫系を標的化するために（米国特許第４，６７６，９８０号を参照のこと）、及びＨＩＶ感染の治療のために（国際公開第９１／００３６０号；第９２／２００３７３号；欧州特許第０３０８９号を参照のこと）、提案されて来た。抗体は、合成タンパク質化学において既知の方法、例えば架橋剤を含むそれらの方法を用いて、インビトロで調製され得ることが企画されている。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を用いて、又はチオエーテル結合を形成することにより構成され得る。この目的のための適切な試薬の例は、イミノチオレート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデート、及び米国特許第４，６７６，９８０号に開示されるそれらを包含する。
【０２１４】
Jagged1及び/又はJagged2シグナル伝達に関連する疾患及び障害の治療における抗体の効果を増強するために、エフェクター機能に関して本発明の抗体を修飾することが所望される。例えば、システイン残基がＦｃ領域中に導入され、それにより、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成が可能にされる。このようにして生成されたホモダイマー抗体は、内在化能力を改善し、そして／又は補体介在性細胞殺害及び抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を高めることができた（Caron et al., J. Exp Med., 176: 1191-1195 (1992) and Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)を参照のこと）。他方では、二重Ｆc領域を有する抗体が操作され、そしてそれにより、補体溶解及びＡＤＣＣ能力を増強した（Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3: 219-230 (1989)を参照のこと）。
【０２１５】
本発明はまた、細胞毒性剤、例えば毒素（例えば、細菌、植物又は動物起原の酵素的活性毒素、又はそのフラグメント）、又は放射性同位体（すなわち、放射性結合体）に結合される抗体を含む免疫結合体にも関する。適切な細胞毒性剤は例えば、ドラスタチン及びそれらの誘導体（例えば、アウリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ）を包含する。細胞毒性剤は、モノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、表３０に列挙される群から選択される剤である。いくつかの実施形態によれば、剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態によれば、剤はアウリスタチン又はその誘導体である。アウリスタチン、剤はアウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はマイタンシノイド又はマイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、デュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、カリケアマイシン又はその誘導体である。
【０２１６】
使用され得る酵素活性毒素及びそれらのフラグメントは、次のものを包含する：ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa））、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α-サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチンタンパク質、ヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及び ＰＡＰ−Ｓ）、ゴーヤー（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロシン、サパオナリア・オフィシナリス（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセン。種々の放射性核種が、放射性結合された抗体の生成のために利用できる。例としては、212Ｂｉ、64Ｃｕ、125Ｉ、131Ｉ、131Ｉｎ、99mTc、90Ｙ、186Ｒｅ及び 89Ｚｒを挙げることができる。
【０２１７】
抗体及び細胞毒性剤の結合体は、種々の二官能タンパク質−カップリング剤、例えばN-スクシンイミジル-3-（2-ピリジルジチオール）プロピオネート（SPDP）、イミノチオラン（IT）、イミドエステルの二官能誘導体（例えば、ジメチルアジピミダートＨＣＬ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（p-アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス - ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス − （p−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トリエン２，６−ジイソシアネート）、及びビス - 活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼン）を用いて製造される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)に記載のようにして調製され得る。Ｃ−１４−標識された１−イソチオシアネートベンジル−３−メチルジエチレントリアミン五酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドの結合のための典型的なキレート剤である（国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと）。
【０２１８】
表３０は、本明細書に記載される発明に使用され得る典型的な医薬剤のいくつかを列挙するが、しかし決して網羅的な列挙を意味するものではない。
【０２１９】
【表１】
2015521625.tif 000003
【０２２０】
【表２】
2015521625.tif 000004
【０２２１】
当業者は、多くの種類の可能な部分が本発明の得られる抗体にカップリングされ得ることを理解するであろう（例えば、“Conjugate Vaccines”, Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)を参照のこと；この全内容は参照により本明細書に組込まれる）。
【０２２２】
カップリングは、抗体及び他の部分がそれぞれの活性を保持する限り、それらの２種の分子を結合するであろう任意の化学反応により達成される。この結合は、多くの化学構造、例えば共有結合、親和性結合、インターカレーション、座標結合及び複合体形成を包含する。いくつかの実施形態によれば、しかしながら、好ましい結合は、共有結合である。共有結合は、存在する側鎖の直接な縮合、又は外部架橋分子の組込みのいずれかにより達成され得る。多くのニ価又は多価の結合剤が、タンパク質分子、例えば本発明の抗体の他の分子へのカップリングにおいて有用である。例えば、代表的カップリング剤は、有機化合物、例えばチオエステル、カルボジイミド、スクシンイミドエステル、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド、ジアゾベンゼン及びヘキサメチレンジアミンを包含することができる。この列挙は、当技術分野で公知の種々の種類のカップリング剤を網羅することを意図するものではなく、むしろ、より一般的なカップリング剤の例である（Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982);及びVitetta et al., Science 238:1098 (1987)を参照のこと）。
【０２２３】
適切なリンカーは、文献に記載されている（例えば、ＭＢＳ（Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルの使用を記載する、Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984)を参照のこと）。また、オリゴペプチドリンカーにより抗体にカップリングされるハロゲン化されたアセチルヒドラジド誘導体の使用を記載する米国特許第５，０３０，７１９号も参照のこと。特に適切なリンカーは次のものを包含する：(i) ＳＭＰＴ (４−スクシンイミジルオキシカルボニル−α−メチル−α−（２−ピルジル−ジチオ)−トルエン (Pierce Chem. Co., Cat. (21558G); (ii) ＳＰＤＰ (スクシンイミジル−６ ［３−（２−ピリジルジチオ) プロピオンアミド]ヘキサノエート(Pierce Chem. Co., Cat #21651G); 及び(iii)スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ (スルホスクシンイミジル６ [３−（２−ピリジルジチオ)−プロピオンアミド] ヘキサノエート(Pierce Chem. Co. Cat. #2165-G。
【０２２４】
上記に記載されるリンカーは、異なった属性を有し、従って異なった物理化学的性質を有する結合体を導く成分を含む。例えば、リンカーＳＭＰＴは、立体的ヒンダードジスルフィド結合を含み、そして高められた安定性を有する結合体を形成できる。ジスルフィド結合は、一般的に、ジスルフィド結合はインビトロ切断され、低い利用可能な結合体をもたらすので、他の結合よりも低い安定性である。
【０２２５】
試薬ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩は、カルボン酸及び第一級又は第ニアミンから出発して、カルボキサミドを創造するのに有用である。従って、ＥＤＣは、抗体におけるリシン残基と、リンカー又は毒素におけるカルボン酸とを連結するために、又は抗体におけるアスパラギン酸又はグルタミン酸残基と、リンカー又は毒素におけるアミンとを連結するために使用され得る。ＥＤＣを使用するそのような結合反応は、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）又はスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−３−オキシスルホニルスクシンイミド）の付加により増強され得る。そのような結合反応へのＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳの付加は、結合反応の速度、完全性、選択性及び／又は再現性を増強することができる。
【０２２６】
いくつかの実施形態によれば、リンカーは切断できる。いくつかの実施形態によれば、リンカーは非切断性である。いくつかの実施形態によれば、複数のリンカーが存在する。前記複数のリンカーはすべて同じであり、例えば切断できるか、又は非切断性であり、又は複数のリンカーは異なっており、例えば少なくとも１つは切断でき、そして少なくとも１つは非切断性である。
【０２２７】
本発明は、次のように、ＡＢへの剤の結合のためにいくつかの方法を利用する：（ａ）ＡＢの炭水化物部分への結合、又は（ｂ）ＡＢのスルフヒドリル基への結合、又は（ｃ）ＡＢのアミノ基への結合、又は（ｄ）ＡＢのカルボキシレート基への結合。本発明のによれば、ＡＢは少なくとも２種の反応基（１つはＡＢと反応し、そして１つは剤と反応する）を有する中間リンカーを介して剤に共有結合され得る。任意の適合できる有機化合物を含むリンカーが選択され、結果的に、ＡＢ（又は剤）との反応はＡＢ反応性及び選択性に悪影響を及ぼさない。さらに、剤へのリンカーの結合は、剤の活性を破壊しない。酸化された抗体又は酸化された抗体フラグメントとの反応のための適切なリンカーは、第一級アミン、第ニアミン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、フェニルヒドラジン、セミカルバジド及びチオセミカルバジド基から成る群から選択されたアミンを含むそれらを包含する。そのような反応性官能基は、リンカーの構造の一部として存在することができるか、又はそのような基を含まないリンカーの適切な化学的修飾により導入され得る。
【０２２８】
本発明によれば、還元されたＡＢへの結合のための適切なリンカーは、還元された抗体又はフラグメントのスルフヒドリル基と反応できる一定の反応基を有するそれらを包含する。そのような反応基は、次のものを包含するが、但しそれらだけには制限されない：反応性ハロアルキル基（例えば、ハロアセチル基)、ｐ−マーキュリーベンゾエート基、及びマイケル型付加反応できる基（例えば、マレイミド、及びMitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc. 101: 3097-3110により記載される基を包含する）。
【０２２９】
本発明によれば、酸化も還元もされていないＡｂへの結合のための適切なリンカーは、ＡＢにおける修飾されていないリシン残基に存在する一次アミノ基と反応できる一定の官能基を有するそれらを包含する。そのような反応基は、次のものを包含するが、但しそれらだけに制限されない：ＮＨＳカルボン酸又は炭酸エステル、ペンタフルオロフェニルカルボン酸又は炭酸エステル、アシルイミダゾール、イソシアネート及びイソチオシアネート。
【０２３０】
本発明によれば、酸化も又は還元もされていないＡＢへの結合のための適切なリンカーは、適切な試薬により活性化されている、Ａｂにおけるアスパラギン酸又はグルタミン酸残基に存在するカルボン酸基と反応できる一定の官能基を有するそれらを包含する。適切な活性化試薬は、付加されたＮＨＳ又はスルホ−ＮＨＳを有するか又は有さないＥＤＣ、及びカルボキサミド形成のために使用される他の脱水剤を包含する。それらの場合、適切なリンカーに存在する官能基は、第一級及び第二級アミン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン及びヒドラジドを包含する。
【０２３１】
剤は、リンカーがＡＢに結合される前又はその後、リンカーに結合され得る。ある種の用途によれば、リンカーが関連する剤を有さないＡＢ−リンカー中間体を、まず生成することが所望される。特定の用途に依存して、特定の剤がリンカーに共有結合され得る。他の実施形態によれば、ＡＢはまず、ＭＭ、ＣＭ、及び関連リンカーに結合され、そして次に、結合目的のためのリンカーに結合される。
【０２３２】
分枝状リンカー：特定の実施形態によれば、剤の結合のための複数の部位を有する分枝リンカーが使用される。複数部位リンカーに関しては、ＡＢへの単一の共有結合が、多くの部位で剤を結合できるＡＢ−リンカー中間体をもたらす。部位はアデヒド又はスルフヒドリル基、又は剤が結合され得る何れかの化学部位であり得る。
【０２３３】
他方では、より高い比活性（又はＡＢに対する剤のより高い比率）が、ＡＢ上の複数部位での単一部位リンカーの結合により達成され得る。この複数部位は、２種の方法の何れかによりＡＢ中に導入され得る。最初の方法は、同じＡＢに複数のアルデヒド基及び／又はスルフヒドリル基を生成することができる。第２の方法は、リンカーへの続く結合のための複数の官能部位を有する「分枝状リンカー」を、ＡＢのアルデヒド又はスルフヒドリル基に結合することができる。分枝状リンカー又は複数部位リンカー中の官能部位は、アルデヒド又はスルフヒドリル基であり得、又はリンカーが結合され得る何れかの化学部位であり得る。さらに高い比活性が、それらの２つのアプローチを組合すことにより、すなわちＡＢ上のいくつかの部位で複数部位リンカーを結合することにより得られる。
【０２３４】
切断可能リンカー：補体系の酵素、例えばウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、トリプシン、プラスミン、又はタンパク質分解活性を有する別の酵素（但し、それらだけには限定されない）による分解に対して敏感であるペプチドリンカーは、本発明の１つの実施形態に使用され得る。本発明の１つの方法によれば、剤は、補体による切断に対して感受性のリンカーを介して結合される。抗体は、補体を活性化できる種類から選択される。従って、抗体−剤結合体は、補体カスケードを活性化し、そして標的部位で剤を開放する。本発明の別の方法によれば、剤は、タンパク質分解活性を有する酵素、例えばウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性因子、プラスミン又はトリプシンによる切断に対して感受性のリンカーを介して結合される。それらの切断可能リンカーは、細胞外毒素、例えば非制限的例によれば、表３０に示される細胞外毒素の何れかを含む複合化活性化可能抗体において有用である。
【０２３５】
切断可能リンカー配列の非制限的例が、表３１に提供される。
【０２３６】
【表３】
2015521625.tif 000005
【０２３７】
さらに、剤は、ジスルフィド結合（例えば、システイン分子上のジスルフィド結合）を介してＡＢに結合され得る。多くの腫瘍は自然に高レベルのグルタチオン（還元剤）を放出するので、これはジスルフィド結合を還元し、続いて、送達の部位で剤を開放する。一定の特定の実施形態によれば、ＣＭを修飾する還元剤はまた、複合化活性化可能抗体のリンカーも修飾するであろう。
【０２３８】
スペーサー及び切断可能要素：さらに別の実施形態によれば、剤と、活性化可能抗体のＡＢとの間の空間を最適化するような手段でリンカーを構築することが必要である。これは、下記一般構造のリンカーの使用により達成され得る：
【０２３９】
【化１】
2015521625.tif 000006
【０２４０】
式中、Ｗは、−ＮＨ−ＣＨ2−又は−ＣＨ2−のいずれかであり；
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり；そして
ｎは、０〜２０の整数である。
【０２４１】
さらなる他の実施形態によれば、リンカーは、スペーサー要素及び切断可能要素を含むことができる。スペーサー要素は、ＡＢのコアーから離れて切断可能要素を配置するのに役立ち、結果的に、切断可能要素は切断を担当できる酵素により接近できる。上記に記載される特定の分枝状リンカーがスペーサー要素として役立つことができる。
【０２４２】
この議論を通して、剤へのリンカー（又は切断可能要素へのスペーサー要素の、又は剤への切断可能要素の）の結合は、結合又は反応の特定の様式である必要はない。適切な安定性及び生物学的適合性の生成物を提供する何れかの反応が許容される。
【０２４３】
血清補体及びリンカーの選択：本発明の１つの方法によれば、剤の放出が所望される場合、補体を活性化できる種類の抗体であるＡＢが使用される。得られる結合体は、抗原を結合し、そして補体カスケードを活性化する両能力を保持する。従って、本発明の実施形態によれば、剤は、切断可能リンカー又は切断可能要素の一端に連結され、そしてリンカー基の他端はＡＢ上の特定部位に結合される。例えば、剤がヒドロキシ基又はアミノ基を有する場合、それは、それぞれエステル又はアミド結合を介して、ペプチド、アミノ酸又は他の適切に選択されたリンカーのカルボキシ末端に結合され得る。例えば、そのような剤は、カルボジイミド反応を介してリンカーペプチドに結合され得る。剤がリンカーへの結合を干渉する官能基を含む場合、それらの干渉性官能基は、結合の前、ブロックされ得、そして生成物の結合体又は中間体が製造されると、ブロック解除される。次に、リンカーの反対又はアミノ末端が直接的に、又は補体を活性化できるＡＢへの結合のためにさらなる修飾の後、使用される。
【０２４４】
リンカー（又はリンカーのスペーサー要素）は任意の所望する長さのものであり得、その一端は、活性化可能抗体のＡＢ上の特定部位に共有結合され得る。リンカー又はスペーサー要素の他端は、アミノ酸又はペプチドリンカーに結合され得る。
【０２４５】
従って、それらの結合体が補体の存在下で抗原に結合する場合、リンカーに剤を結合するアミド又はエステル結合が切断され、その活性形での剤の放出がもたらされる。それらの結合体は、対象に投与される場合、標的部位で剤の送達及び放出を達成し、そして表１に提供されるように（但し、それらに限定されない）、医薬剤、抗生物質、代謝拮抗剤、抗増殖剤及び同様のもののインビボ送達のために特に効果的である。
【０２４６】
補体活性化を伴わないでの放出のためのリンカー：標的化された送達のさらなる別の用途によれば、補体活性化を伴わないでの剤の放出が、補体カスケードの活性化は究極的には標的細胞を溶解するので、所望される。従って、このアプローチは、剤の送達及び放出が標的細胞を殺さないで達成される場合、有用である。細胞メディエーター、例えばホルモン、酵素、コルチコステロイド、神経達成物質、遺伝子又は酵素の標的細胞への送達が所望される、そのような場合が、目標である。それらの結合体は、血清プロテアーゼによる切断に対して軽度に影響を受けるリンカーを介して、補体を活性化できないＡＢへの剤の結合により調製され得る。この結合体が個人に投与される場合、抗原−抗体複合体はすばやく形成するが、ところが剤の切断はゆっくり生じ、従って標的部位での化合物の放出がもたらされる。
【０２４７】
生化学的クロスリンカー：他の実施形態によれば、活性化可能抗体は、一定の生化学的クロスリンカーを用いて、１又は２以上の治療剤に結合され得る。クロスリンク試薬は、２種の異なった分子の官能基を一緒に結びつける分子架橋を形成する。２種の異なったタンパク質を段階的に連結するためには、所望しないホモポリマー形成を排除するヘテロ二官能性クロスリンカーが使用され得る。
【０２４８】
リソソームプロテアーゼにより切断できるペプチジルリンカー、例えばＶａｌ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ａｌａ、又は他のジペプチドがまた有用である。さらに、リソソームの低−ｐＨ環境下で切断できる酸−不安定性リンカー、例えばビス−シアリルエーテルが使用され得る。他の適切なリンカーは、カテプシン−不安定性基質、特に酸性ｐＨで最適な機能を示すそれらのものを包含する。
【０２４９】
典型的なヘテロ−二官能性クロスリンカーが表３２に参照される。
【０２５０】
【表４】
2015521625.tif 000007
【０２５１】
非切断可能リンカー又は直接的結合：本発明のさらに他の実施形態によれば、結合体は、剤が標的に送達するが、しかし放出されないよう設計され得る。これは、直接的に、又は非切断可能リンカーを介して、ＡＢに剤を結合することにより達成され得る。
【０２５２】
それらの非切断可能リンカーは、続いて、本明細書に記載される方法によりＡＢへの結合において利用され得る官能基を含むよう修飾され得る、アミノ酸、ペプチド、Ｄ−アミノ酸又は他の有機化合物を包含することができる。そのような有機リンカーのための一般式は、下記式であり得る：
【０２５３】
【化２】
2015521625.tif 000008
【０２５４】
式中、Ｗは、−ＮＨ−ＣＨ2−又は−ＣＨ2−のいずれかであり；
Ｑは、アミノ酸、ペプチドであり；そして
ｎは、０〜２０の整数である。
【０２５５】
非切断可能結合体：他方では、化合物は、補体を活性化しないＡＢに結合され得る。補体活性化できないＡＢを用いる場合、この結合は、活性化された補体による切断に対して敏感であるリンカー、又は活性化された補体による切断に対して敏感ではないリンカーを用いて、達成され得る。
【０２５６】
本明細書に開示される抗体はまた、免疫リポソームとして処方され得る。抗体を含むリポソームは、当業界において知られている方法、例えばEpstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第４，４８５，０４５号 及び第４，５４４，５４５号に記載される方法により調製される。向上された循環時間を有するリポソームが、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。
【０２５７】
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ−誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰE）を含む脂質組成物による逆相蒸発方法により生成され得る。リポソームは、規定の孔サイズのフィルターを通して押出され、所望する直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ′フラグメントは、ジスルフィド−交換反応を介してMartin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982)に記載のようにして、リポソームに結合され得る。
【０２５８】
活性化可能抗−Jagged抗体
本明細書に提供される活性化可能抗体及び活性化可能抗体組成物は、Jagged1及びJagged2を特異的に結合する、抗体又はその抗体フラグメント（集合的には、本開示を通してＡＢとして言及される）を少なくとも含み、ここでＡＢはマスキングが部分（ＭＭ）により修飾される。
【０２５９】
ＡＢがＭＭにより修飾され、そしてJagged1及び/又はJagged2の存在下にある場合、ＡＢのその標的物への特異的結合は、ＭＭにより修飾されていないＡＢの特異的結合、又は標的物への親ＡＢの特異的結合に比較して、低められるか、又は阻害される。
【０２６０】
標的物、すなわちJagged1及びJagged2に対する、ＭＭにより修飾されたＡＢのＫdは、ＭＭにより修飾されていないＡＢ、又は標的物に対する親ＡＢのＫdよりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、５０、０００、１００、０００、５００、０００、１、０００、０００、５、０００、０００、１０、０００、０００、５０、０００、０００又はそれ以上、又は５−１０、１０−１００、１０−１、０００、１０−１０、０００、１０−１００、０００、１０−１、０００、０００、１０−１０、０００、０００、１００−１、０００、１００−１０、０００、１００−１００、０００、１００−１、０００、０００、１００−１０、０００、０００、１、０００−１０、０００、１、０００−１００、０００、1、０００−１、０００、０００、１０００−１０、０００、０００、１０、０００−１００、０００、１０、０００−１、０００、０００、１０、０００−１０、０００、０００、１００、０００−１、０００、０００又は１００、０００−１０、０００、０００倍、高い。逆に言えば、ＭＭにより修飾されたＡＢの標的物、すなわちJagged1及びJagged2に対する結合親和性は、ＭＭにより修飾されていないＡＢ、又は標的物に対する親ＡＢの結合親和性よりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、５０、０００、１００、０００、５００、０００、１、０００、０００、５、０００、０００、１０、０００、０００、５０、０００、０００又はそれ以上、又は５−１０、１０−１００、１０−１、０００、１０−１０、０００、１０−１００、０００、１０−１、０００、０００、１０−１０、０００、０００、１００−１、０００、１００−１０、０００、１００−１００、０００、１００−１、０００、０００、１００−１０、０００、０００、１、０００−１０、０００、１、０００−１００、０００、1、０００−１、０００、０００、１０００−１０、０００、０００、１０、０００−１００、０００、１０、０００−１、０００、０００、１０、０００−１０、０００、０００、１００、０００−１、０００、０００又は１００、０００−１０、０００、０００倍、低い。
【０２６１】
ＡＢに対するＭＭの解離定数（Ｋd）は一般的に、標的物、すなわちJagged1及びJagged2に対するＡＢのＫdよりも大きい。ＡＢに対するＭＭのＫdは、標的物、すなわちJagged1及びJagged2に対するＡＢのＫdよりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、１００、０００、１、０００、０００ 又はさらに １０、０００、０００倍、大きい。逆に言えば、ＡＢに対するＭＭの結合親和性は、一般的に、標的物、すなわちJagged1及びJagged2に対するＡＢの結合親和性よりも低い。ＡＢに対するＭＭの結合親和性は、標的物、すなわちJagged1及びJagged2に対するＡＢの結合親和性よりも少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、１００、０００、１、０００、０００ 又はさらに １０、０００、０００倍、低い。
【０２６２】
ＡＢがＭＭにより修飾され、そして標的物、すなわちJagged1及びJagged2の存在下にある場合、ＡＢのその標的物への特異的結合は、ＭＭにより修飾されていないＡＢの特異的結合、又は標的物への親ＡＢの特異的結合に比較して、低められるか、又は阻害される。ＭＭにより修飾されていないＡＢの結合、又は標的物、すなわちJagged1及びJagged2への親ＡＢの結合に比較される場合、ＭＭにより修飾される場合の標的物を結合するＡＢの能力は、インビボ又はインビトロアッセイにより測定される場合、少なくとも２、４、 ６、 ８、 １２、 ２８、 ２４、 ３０、 ３６、 ４８、 ６０、 ７２、 ８４、又は ９６ 時間、 又は５、 １０、 １５、 ３０、 ４５、 ６０、 ９０、 １２０、 １５０、または１８０ 日間、 又は１、 ２、 ３、 ４、 ５、 ６、 ７、 ８、 ９、 １０、 １１、 又は１２ か月間、又はそれ以上の間、少なくとも５０％、６０％、 ７０％、 ８０％、 ９０％、 ９２％、 ９３％、 ９４％、 ９５％、 ９６％、 ９７％、 ９８％、 ９９％ 及びさらに１００％、低められ得る。
【０２６３】
ＭＭは、標的物、すなわちJagged1及びJagged2へのＡＢの結合を阻害する。ＭＭは、ＡＢの抗原結合ドメインを結合し、そしてJagged1及びJagged2へのＡＢの結合を阻害する。ＭＭは、標的物、すなわちJagged1及びJagged2へのＡＢの結合を立体的に阻害することができる。ＭＭはＡＢのその標的物への結合を、アロステリック的に阻害することができる。それらの実施形態によれば、ＡＢが修飾され、標的物、すなわちJagged1及びJagged2の存在下でＭＭにカップリングされる場合、ＭＭにより修飾されていないＡＢ、親ＡＢ、又はＭＭにカップリングされていないＡＢの標的物への結合に比較して、インビボ又はインビトロアッセイで測定される場合、少なくとも２、４、 ６、 ８、 １２、 ２８、 ２４、 ３０、 ３６、 ４８、 ６０、 ７２、 ８４、又は ９６ 時間、 又は５、 １０、 １５、 ３０、 ４５、 ６０、 ９０、 １２０、 １５０、 または１８０ 日間、 又は１、 ２、 ３、 ４、 ５、 ６、 ７、 ８、 ９、 １０、 １１、 又は１２ か月間、又はそれ以上の間、標的物へのＡＢの結合は存在しないか、又は実質的に存在しないか、又はせいぜい０．００１％、０．０１％、 ０．１％、 １％、 ２％、 ３％、 ４％、 ５％、 ６％、 ７％、 ８％、 ９％、 １０％、 １５％、 ２０％、 ２５％、 ３０％、 ３５％、 ４０％、 又は５０％の標的物へのＡＢの結合が存在する。
【０２６４】
ＡＢがＭＭにカップリングされるか、又はＭＭにより修飾される場合、ＭＭは、Jagged1及びJagged2へのＡＢの特異的結合を、「マスキングするか」又は低めるか、又は他方では、阻害する。ＡＢがＭＭにカップリングされるか、又はＭＭにより修飾される場合、そのようなカップリング又は修飾は、ＡＢのその標的物を特異的に結合する能力を低めるか又は阻害する構造変化をもたらすことができる。
【０２６５】
ＭＭにカップリングされるか、又はＭＭにより修飾されるＡＢは、アミノ（Ｎ）末端領域からカルボキシル（Ｃ）末端領域に順に、以下の式で表され得る：
【０２６６】
【化３】
2015521625.tif 000009
【０２６７】
式中、ＭＭはマスキング部分であり、ＡＢは抗体又は抗体フラグメントであり、そしてＬはリンカーである。多くの実施形態によれば、柔軟性を提供するために、組成物中に、１又は２以上のリンカー、例えば柔軟リンカー（flexible linker）を挿入することが所望される。
【０２６８】
ある実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然結合パートナーに対する相同性を含まないか、又は実質的に含まない。他の実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、５％、１０％、 １５％、 ２０％、 ２５％、 ３０％、 ３５％、 ４０％、 ４５％、 ５０％、 ５５％、 ６０％、 ６５％、 ７０％、 ７５％、又は８０％以下、類似する。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、５％、１０％、 １５％、 ２０％、 ２５％、 ３０％、 ３５％、 ４０％、 ４５％、 ５０％、 ５５％、 ６０％、 ６５％、 ７０％、 ７５％、又は８０％以下、同一である。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、２５％以下、同一である。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、５０％以下、同一である。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、２０％以下、同一である。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、１０％以下、同一である。
【０２６９】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体は、ＭＭにより修飾されるＡＢを含み、そしてまた、１又は２以上の切断可能部分（ＣＭ）も含む。そのような活性可能抗体は、ＡＢの標的物、すなわちJagged1及びJagged2への活性化可能／切り替え可能結合を示す。活性可能抗体は一般的に、マスキング部分（ＭＭ）及び修飾可能又は切断可能部分（ＣＭ）により修飾されたか又はそれらにカップリングされた、抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含む。いくつかの実施形態によれば、ＣＭは、目的のプロテアーゼのための基質として作用するアミノ酸配列を含む。
【０２７０】
活性化可能抗体の要素は、ＭＭ及びＣＭが、切断された（又は比較的活性の）状態で、及び標的物の存在下で、ＡＢが標的物、すなわちJagged1及びJagged2を結合するが、ところが切断されていない（又は比較的不活性の）状態で、標的物の存在下で、ＡＢのその標的物、すなわちJagged1及びJagged2の特異的結合が低められるか又は阻害されるよう位置決定されるよう配置される。ＡＢのその標的物への特異的結合は、ＭＭによりその標的物を特異的に結合するＡＢの能力の阻害又はマスキングのために低められ得る。
【０２７１】
標的物、すなわちJagged1及びJagged2に対する、ＭＭ及びＣＭにより修飾されたＡＢのＫdは、ＭＭ及びＣＭにより修飾されていないＡＢ、又は標的物に対する親ＡＢのＫdよりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、５０、０００、１００、０００、５００、０００、１、０００、０００、５、０００、０００、１０、０００、０００、５０、０００、０００又はそれ以上、又は５−１０、１０−１００、１０−１、０００、１０−１０、０００、１０−１００、０００、１０−１、０００、０００、１０−１０、０００、０００、１００−１、０００、１００−１０、０００、１００−１００、０００、１００−１、０００、０００、１００−１０、０００、０００、１、０００−１０、０００、１、０００−１００、０００、1、０００−１、０００、０００、１０００−１０、０００、０００、１０、０００−１００、０００、１０、０００−１、０００、０００、１０、０００−１０、０００、０００、１００、０００−１、０００、０００又は１００、０００−１０、０００、０００倍、高い。逆に言えば、ＭＭ及びＣＭにより修飾されたＡＢの標的物、すなわちJagged1及びJagged2に対する結合親和性は、ＭＭ及びＣＭにより修飾されていないＡＢ、又は標的物、すなわちJagged1及びJagged2に対する親ＡＢの結合親和性よりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、５０、０００、１００、０００、５００、０００、１、０００、０００、５、０００、０００、１０、０００、０００、５０、０００、０００又はそれ以上、又は５−１０、１０−１００、１０−１、０００、１０−１０、０００、１０−１００、０００、１０−１、０００、０００、１０−１０、０００、０００、１００−１、０００、１００−１０、０００、１００−１００、０００、１００−１、０００、０００、１００−１０、０００、０００、１、０００−１０、０００、１、０００−１００、０００、1、０００−１、０００、０００、１０００−１０、０００、０００、１０、０００−１００、０００、１０、０００−１、０００、０００、１０、０００−１０、０００、０００、１００、０００−１、０００、０００又は１００、０００−１０、０００、０００倍、低い。
【０２７２】
ＡＢがＭＭ及びＣＭにより修飾され、そして標的物の存在下であるが、しかし修飾剤（例えば、プロテアーゼ）の存在下にはない場合、ＡＢのその標的物、すなわちJagged1及びJagged2の特異的結合は、ＭＭ及びＣＭ又は親ＡＢにより修飾されていないＡＢの標的物への特異的結合に比較して、低められるか又は阻害される。親ＡＢの結合、又はＭＭ及びＣＭにより修飾されていないＡＢのその標的物への結合に比較して、ＭＭ及びＣＭにより修飾される場合の標的物を結合するＡＢの能力は、インビボ又はインビトロアッセイにより測定される場合、少なくとも２、４、 ６、 ８、 １２、 ２８、 ２４、 ３０、 ３６、 ４８、 ６０、 ７２、 ８４、又は ９６ 時間、 又は５、 １０、 １５、 ３０、 ４５、 ６０、 ９０、 １２０、 １５０、 または１８０ 日間、 又は１、 ２、 ３、 ４、 ５、 ６、 ７、 ８、 ９、 １０、 １１、 又は１２ か月間の間、又はそれ以上の間、少なくとも５０％、６０％、 ７０％、 ８０％、 ９０％、 ９２％、 ９３％、 ９４％、 ９５％、 ９６％、 ９７％、 ９８％、 ９９％ 及びさらに１００％、低められ得る。
【０２７３】
本明細書において使用される場合、用語、切断された状態とは、プロテアーゼによるＣＭの修飾に続いての活性化可能抗体の状態を言及する。用語、切断れていない状態とは、本明細書において使用される場合、プロテアーゼによるＣＭの切断の不在下での活性化可能抗体の状態を言及する。上記で論じられるように、用語「活性化可能抗体」は、その切断されていない（生来の）状態及びその切断された状態での活性化可能抗体を言及するために、本明細書において使用される。いくつかの実施形態によれば、切断された活性化可能抗体が、プロテアーゼによるＣＭの切断のためにＭＭを欠いており、少なくともＭＭ（例えば、ＭＭは共有結合（例えば、システイン残基間のジスルフィド結合）により活性化可能抗体に連結されていない）の放出をもたらすことは、当業者に明らかであろう。
【０２７４】
活性化可能又は切り替え可能とは、活性化可能抗体が、阻害された、マスキングされた又は切断されていない状態（すなわち、第１コンホメーション）下で、標的物、すなわちJagged1及び/又はJagged2への結合の第１レベル、及び阻害されていない、マスキングされていない及び／又は切断された状態（すなわち、第２コンホメーション）下で標的物、すなわちJagged1及び/又はJagged2への結合の第２レベルを示すことを意味し、ここで標的物結合の第２レベルは、結合の第１レベルよりも大きい。一般的に、活性化可能抗体のＡＢへの標的物の接近性は、ＣＭを切断できる切断剤の存在下で、そのような切断剤の不在下でよりも高い。従って、活性化可能が切断されていない状態下で存在する場合、ＡＢは、標的物結合から阻害され、そして標的物結合からマスキングされ得（すなわち、第１コンホメーション下で、そのようなＡＢは標的物を結合できない）、そして切断された状態で、ＡＢは標的物結合に阻害されないか、又はマスキングされていない。
【０２７５】
活性化可能抗体のＣＭ及びＡＢが選択され、結果的に、ＡＢはJagged1及びJagged2のための結合部分を表し、そしてＣＭは、対象における治療部分又は診断部位でJagged1及びJagged2と共局在するプロテアーゼのための基質を表す。本明細書に開示される活性化可能抗体は、例えばＣＭにおける部位を切断できるプロテアーゼが、非治療部位の組織（例えば、健康な組織）においてよりも、治療部位又は診断部位の標的物含有組織において、比較的高いレベルで存在する場合、特に使用される。
【０２７６】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体は、ＡＢがマスキングされていないか又はJagged1及びJagged2の結合から阻害される場合、非治療部位でＡＢの結合に起因する、低められた毒性及び／又は有害な副作用を提供する。
【０２７７】
一般的に、活性化可能抗体は、目的のＡＢを選択し、そして活性化可能抗体の残りの部分を構成することにより設計され得、結果的に、コンホメーション的に制約される場合、ＭＭはＡＢのマスキング、又はＡＢのその標的物への結合の低下を提供する。構造的設計基準が、この機能的特徴を提供するために考慮されるべきである。
【０２７８】
阻害されていないコンホメーションに対する阻害されたコンホメーションにおいて標的結合のための所望するダイナミック範囲の切り替え可能な表現型を示す活性化可能抗体が、提供される。ダイナミック範囲は一般的に、（ｂ）第２組の条件下でのパラメーターの最小の検出される値に対する（ａ）第１組の条件下でのパラメーターの最大の検出されるレベルの比率を意味する。例えば、活性化可能抗体の場合、ダイナミック範囲とは、（ｂ）プロテアーゼの不在化で活性化可能抗体に結合する、標的タンパク質、すなわちJagged1及びJagged2の最小検出レベルに対する、（ａ）活性化可能抗体のＣＭを切断できるプロテアーゼの存在下で活性化可能抗体に結合する標的タンパク質、すなわちJagged1及びJagged2の最大検出レベルの比率を意味する。活性化可能抗体のダイナミック範囲は、活性化可能抗体切断剤処理の平衡解離定数に対する活性化可能抗体切断剤（例えば、酵素）処理の平衡解離定数の比率として計算され得る。活性化可能抗体のダイナミック範囲が高いほど、活性化可能抗体の切り替え可能表現型は良好である。比較的高いダイナミック範囲（例えば、１以上）を有する活性化可能抗体は、より所望の切り替え可能表現型を示し、結果的に、活性化可能抗体による標的タンパク質結合が、切断剤の不在下でよりも、活性化可能抗体のＣＭを切断できる切断剤（例えば、酵素）の存在化でより高い程度、生じる（例えば、主として生じる）。
【０２７９】
活性化可能抗体は、種々の構造コンホメーションで提供され得る。活性化可能抗体についての典型的な式は、下記に提供される。ＡＢ、ＭＭ及びＣＭのＮ−末端からＣ−末端の順序が、活性化可能抗体内で逆にされ得ることが特に意図される。ＣＭ及びＭＭはアミノ酸配列においてオーバーラップし、例えば結果的に、ＣＭはＭＭ内に含まれることもまた特に意図される。
【０２８０】
例えば、活性化可能抗体は、アミノ（Ｎ）末端領域からカルボキシル（Ｃ）末端領域の順に、下記式によりあらわされ得る：
【０２８１】
【化４】
2015521625.tif 000010
【０２８２】
式中、ＭＭはマスキング部分であり、ＣＭは切断可能部分であり、そしてＡＢは抗体又はそのフラグメントである。ＭＭ及びＣＭは上記式においては異なった成分として示されているが、本明細書に開示されるすべての典型的な実施形態（式を包含する）においては、ＭＭ及びＣＭのアミの酸配列がオーバーラップし、例えば結果的に、ＣＭはＭＭ内に完全に又は部分的に含まれることが意図される。さらに、上記式は、活性化可能抗体要素にＮ−末端又はＣ−末端を位置決定できる追加のアミノ酸配列を提供する。
【０２８３】
ある実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの天然の結合パートナーではない。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然結合パートナーに対する相同性を含まないか、又は実質的に含まない。他の実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、５％、１０％、 １５％、 ２０％、 ２５％、 ３０％、 ３５％、 ４０％、 ４５％、 ５０％、 ５５％、 ６０％、 ６５％、 ７０％、 ７５％、又は８０％以下、類似する。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、５％、１０％、 １５％、 ２０％、 ２５％、 ３０％、 ３５％、 ４０％、 ４５％、 ５０％、 ５５％、 ６０％、 ６５％、 ７０％、 ７５％、又は８０％以下、同一である。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、５０％以下、同一である。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、２５％以下、同一である。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、２０％以下、同一である。いくつかの実施形態によれば、ＭＭは、ＡＢの任意の天然の結合パートナーに対して、１０％以下、同一である。
【０２８４】
多くの実施形態によれば、１又は２以上のＭＭ−ＣＭ接合、ＣＭ−ＡＢ接合、又は両者で、柔軟性を提供するために、１又は２以上のリンカー、例えば柔軟リンカーを、活性化可能抗体コンストラクト中に挿入することが所望される。例えば、ＡＢ、ＭＭ及び／又はＣＭは、所望する柔軟性を提供するのに十分な数の残基（例えば、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、特にＧｌｙ及びＳｅｒ、特にＧｌｙ）を含まない。そのような活性化可能抗体コンストラクトの切切り換え可能表現型は、柔軟リンカーを提供するために、１又は２以上のアミノ酸の導入から利益を得ることができる。さらに、下記のように、活性化可能体がコンホメーション的に制約されたコンストラクトとして提供される場合、柔軟リンカーが、切断された活性化可能抗体において環状構造の形成及び維持を促進するために、操作可能的に挿入され得る。
【０２８５】
例えば、ある実施形態によれば、活性化可能抗体は、下記式の１つを含む（ここで、下記式は、Ｎ−からＣ−末端方向、又はＣ−からＮ−末端方向のいずれかでのアミノ酸配列を表す）：
【０２８６】
【化５】
2015521625.tif 000011
【０２８７】
式中、ＭＭ、ＣＭ及びＡＢは上記に定義される通りであり；Ｌ１及びＬ２はそれぞれ独立して及び任意には、存在しても又は不在であっても良く、少なくとも１つの柔軟アミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）を含む同じか又は異なった柔軟リンカーである。さらに、上記式は、活性化可能抗体要素にＮ−末端又はＣ−末端を位置決定できる追加のアミノ酸配列を提供する。例としては、次のものを挙げることが、但しそれらだけには限定されない：標的部分（例えば、標的組織に存在する細胞の受容体のためのリガンド）、及び血清半減期拡張部分（例えば、血清タンパク質、例えば免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ）又は血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ））を結合するポリペプチド。
【０２８８】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）は、プロテアーゼ、通常細胞外プロテアーゼのための基質として作用できるアミノ酸配列を含む。ＣＭは、活性化可能抗体のＡＢの所望する標的物と共に組織において共局在するプロテアーゼに基づいて選択される。目的の標的物がプロテアーゼと共に共局在する種々の異なった条件は知られており、ここでプロテアーゼの基質は当業界において知られている。癌の例においては、標的組織は、癌性組織、特に固形腫瘍の癌性組織であり得る。多くの癌、例えば固形腫瘍において既知基質を有する高レベルのプロテアーゼの報告が文献に存在する。例えば、La Rocca et al, (2004) British J. of Cancer 90(7): 1414-1421を参照のこと。疾患の非制限的例は次のものを挙げることができる：すべてのタイプの癌（乳癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、黒色腫、頭頸部、膵臓、等）、関節リウマチ、クローン病、ＳＬＥ、心血管障害、虚血、等。例えば、徴候は、白血病、例えばＴ−細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、リンパ芽球性疾患、例えば多発性骨髄腫、及び固形腫瘍、例えば肺、結腸直腸、前立腺、膵臓及び乳癌、例えばトリプルネガティブ乳癌を包含するであろう。さらに、Notchシグナル伝達は癌幹細胞の生存及び増殖のために重要であるので、Jagged依存性notchシグナル伝達の阻害は、幹細胞増殖及び生存性に影響を及ぼすであろう。例えば、徴候は、一次腫瘍起源にかかわらず、癌における骨疾患又は転移；乳癌、例えば非制限的例によれば、ＥＲ／ＰＲ＋乳癌、Ｈｅｒ２＋乳癌、トリプルネガティブ乳癌；結腸直腸癌；胃癌；神経膠芽腫；頭頸部癌；肺癌、例えば非制限的例によれば、非小細胞肺癌；多発性骨髄腫卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；肉腫；腎癌、例えば非制限的例によれば、腎細胞癌；及び／又は皮膚癌、例えば非制限的例によれば、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、黒色腫を包含する。癌の他に、Jagged−依存性notchシグナル伝達は、筋線維芽細胞、すなわち線維症の発症において中心的役割を有する細胞への上皮及び線維芽細胞分化に対して重要である。Jagge依存性notchシグナル伝達の阻害、及び従って、筋線維芽細胞の出現の阻害は、腎臓、肝臓、肺及び皮膚の線維性疾患のための効果的治療であろう。例えば、徴候は、線維性疾患、例えば特発性肺線維症（ＩＰＦ）；腎線維症、肝線維症、腹膜透析誘発性線維症、及び/又は強皮を包含するであろう。他の適切な徴候は、例えば病理、例えば難聴を包含する。
【０２８９】
ＣＭは、約０．００１−１５００ ｘ １０4 Ｍ-1Ｓ-1 又は少なくとも０．００１、０．００５、０．０１、０．０５、０．１、０．５、１、２．５、５、７．５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１２５０、又は 1５００ ｘ １０4 Ｍ-1Ｓ-1の速度で、酵素により特異的に切断される。
【０２９０】
酵素による特異的切断のためには、酵素とＣＭとの間の接触が行われる。ＭＭ及びＣＭにカップリングされるＡＢを含む活性化可能抗体が標的且つ十分な酵素活性の存在下にある場合、ＣＭは切断され得る。十分な酵素活性とは、ＣＭと接触し、そして切断をもたらす酵素の能力を言及する。酵素はＣＭと接近して存在するが、しかし酵素の他の細胞要因又はタンパク質修飾のために、切断できないことが容易に想定され得る。
【０２９１】
典型的な基質は、表３３における１又は２以上の下記酵素又はプロテアーゼによる切断可能な基質を包含するが、但しそれらだけには限定されない：
【０２９２】
【表５】
2015521625.tif 000012
【０２９３】
例えば、いくつかの実施形態によれば、基質は、１又は２以上の次の酵素又はプロテアーゼにより切断できる：ｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ−ＳＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ−１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３及びＭＭＰ−１４。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、ｕＰＡ、レグマイン及びＭＴ−ＳＰ１の群から選択される。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、マトリックスメタロプロテイナーゼである。
【０２９４】
本明細書に記載される組成物に使用するのに適切なリンカーは一般的に、標的物へのＡＢの結合の阻害を促進するために、修飾されたＡＢ又は活性化可能抗体の柔軟性を提供するリンカーである。そのようなリンカーは一般的に、柔軟リンカーとして言及される。適切なリンカーは、容易に選択され得、そして異なった長さのいずれかの適切なもの、例えば１個のアミノ酸（例えば、Ｇｌｙ）〜２０個の長さのアミノ酸、２個のアミノ酸〜１５個の長さのアミノ酸、３個のアミノ酸〜１２個の長さのアミノ酸、４個のアミノ酸〜１０個の長さのアミノ酸、５個のアミノ酸〜９個の長さのアミノ酸、６個のアミノ酸〜８個の長さのアミノ酸、又は７個のアミノ酸〜８個の長さのアミノ酸であり、そして１、２、 ３、 ４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個の長さのアミノ酸であり得る。
【０２９５】
典型的な柔軟リンカーは、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ (配列番号１２３) 及び（ＧＧＧＳ）ｎ (配列番号１２４)、ここでｎは少なくとも１つの整数である）、グリシン−アラニン−セリンポリマー及び当業界において知られている他の柔軟リンカーを包含する。グリシン及びグリシン−セリンポリマーは、比較的構造化されておらず、そして従って、成分間の中立テザーとして機能することができる。グリシンは、アラニンよりも有意にφ−ψ（phi-psi）空間にアクセスし、そしてより長い側鎖を有する残基よりもはるかに低く制限される（Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)を参照のこと）。典型的な柔軟リンカーは、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号１２５)、Gly-Gly-Ser-Gly-Glｙ (配列番号１２６)、 Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号１２７)、 Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ (配列番号１２８)、 Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号１２９)、 Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号１３０)、及び同様のもの。当業者は、活性化可能抗体の企画が、完全に又は部分的に柔軟性であるリンカーを包含することができ、結果的に、前記リンカーは、柔軟リンカー、及び所望する活性化可能抗体構造を提供するために、低い柔軟性構造を与える１又は２以上の部分を含むことができることを理解するであろう。
【０２９６】
上記に記載される要素の他に、活性化可能抗体は、追加の要素、例えば活性化可能抗体のＮ−又はＣ−末端アミノ酸配列を含むことができる。例えば、活性化可能抗体は、目的の細胞又は組織への送達を促進するために標的部分を含むことができる。活性化可能抗体は、剤、例えば、治療剤、抗腫瘍剤、毒素又はそのフラグメント、検出可能成分、又は診断剤に結合され得る。剤の例は、本明細書に開示される。
【０２９７】
活性化可能抗体はまた、結合された剤、リンカー、及び本発明の抗−Jagged抗体に関連する、本明細書に記載される他の成分、例えば非制限的例によれば、表３０に列挙される剤、及び／又は表３１及び／又は表３２に列挙されるリンカーの何れも包含することができる。
【０２９８】
非結合立体部分又は非結合立体部分のための結合パートナーを有する活性化可能抗−Jagged抗体
本発明はまた、非結合立体部分（ＮＢ）又は非結合立体部分のための結合パートナー（ＢＰ）を含む活性化可能抗−Jagged抗体も提供し、ここでＢＰは、活性化可能抗−Jagged抗体に対するＮＢを、リクルートするか、又は他方では、誘引する。本明細書に提供される活性化可能抗−Jagged抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）、切断可能リンカー（ＣＬ）、及びJagged1及びJagged2を結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含む活性化可能抗−Jagged抗体；非結合立体部分（ＢＰ）のための結合パートナー（ＢＰ）、ＣＬ及びＡＢを含む活性化可能抗体；及びＮＢがリクルートされているＢＰ、ＣＬ、及びJagged1及びJagged2を結合するＡＢを含む活性化可能抗−Jagged抗体を包含する。ＮＢが活性化可能抗−Jagged抗体のＣＬ及びＡＢに共有結合されるか、又は活性化可能抗−Jagged抗体のＣＬ及びＡＢに共有結合されるＢＰとの相互作用により結合される活性化可能抗体は、「ＮＢ−含有活性化可能抗−Jagged抗体」として本明細書においては言及される。活性化可能又は切り替え可能とは、活性化可能抗体は、活性化可能抗体が、阻害された、マスキングされた又は切断されていない状態（すなわち、第１コンホメーション）下にある場合、標的物、すなわちJagged1及び/又はJagged2への第１レベルの結合、及び活性化可能抗体が、阻害されていない、マスキングされていない及び／又は切断された状態（すなわち、第２コンホメーション、すなわち活性化された抗体）下にある場合、標的物、すなわちJagged1及び/又はJagged2への第２レベルの結合を示すことを意味し、ここで標的物結合の第２レベルは、標的物結合の第１レベルよりも大きい。活性化可能組成物は、従来の抗体療法に比べて、高められた生物学的利用能、及びより好ましい生体内分布を示すことができる。
【０２９９】
いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体は、抗−Jagged ＡＢがマスキングされないか、又は他方では、非治療部位及び／又は非診断部位への結合から阻害されない場合、そのような部位での抗−Jagged抗体の結合に起因する、低められた毒性及び／又は有害な副作用を提供する。
【０３００】
１つの実施形態によれば、活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；切断可能リンカー（ＣＬ）；及びJagged1及びJagged2に対して特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ここでＮＢはＡＢに対して特異的に結合しないポリペプチドであり；ＣＬは酵素のための基質を含むポリペプチドであり；ＣＬは、未切断状態で、ＮＢがJagged1及び/又はJagged2へのＡＢの結合を干渉し、そして切断された状態で、ＮＢはJagged1及び/又はJagged2へのＡＢの結合を干渉せず；そしてＮＢは酵素によるＣＬの切断を阻害しない。本明細書及び全体を通して使用される場合、用語、ポリペプチドはとは、少なくとも２個のアミノ酸残基を含むいずれかのポリペプチド、例えばより大きなポリペプチド、完全長タンパク質及びそれらのフラグメントを言及し、そして前記用語のポリペプチドは、単鎖ポリペプチドに制限されず、そして複数ユニット、例えば多鎖ポリペプチドを包含する。ポリペプチドが、より短い長さ、例えば合計５０個未満のアミノ酸のものである場合、用語ペプチド及びポリペプチドは、本明細書においては、交換可能的に使用され、そしてポリペプチドがより長い長さ、例えば５０個又はそれ以上の長さのアミノ酸のものである場合、用語ポリペプチド及びタンパク質は、本明細書においては、交換可能的に使用される。
【０３０１】
１つの実施形態によれば、活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；切断可能リンカー（ＣＬ）；及びJagged1及びJagged2に対して特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（ｉ）ＮＢは、ＡＢに対して特異的に結合しないポリペプチドを含み；（ｉｉ）ＣＬは、酵素のための基質（Ｓ）を含む、５０個の長さまでのアミノ酸のポリペプチドであり；（ｉｉｉ）ＣＬは、未切断状態で、ＮＢがJagged1及び/又はJagged2へのＡＢの結合を干渉し、そして切断された状態で、ＮＢがJagged1及び/又はJagged2へのＡＢの結合を干渉しないよう位置決定され；そして（ｉｖ）ＮＢは酵素によるＣＬの切断を阻害しない。例えば、ＣＬは、１５個までの長さのアミノ酸、２０個までの長さのアミノ酸、２５個までの長さのアミノ酸、３０個までの長さのアミノ酸、３５個までの長さのアミノ酸、４０個までの長さのアミノ酸、４５個までの長さのアミノ酸、５０個までの長さのアミノ酸、、１０−５０個までの長さのアミノ酸、１５−５０個までの長さのアミノ酸、２０−５０個までの長さのアミノ酸、２５−５０個までの長さのアミノ酸、３０−５０個までの長さのアミノ酸、３５−５０個までの長さのアミノ酸、４０−５０個までの長さのアミノ酸、４５−５０個までの長さのアミノ酸、１０−４０個までの長さのアミノ酸、１５−４０個までの長さのアミノ酸、２０−４０個までの長さのアミノ酸、２５−４０個までの長さのアミノ酸、３０−４０個までの長さのアミノ酸、３５−４０個までの長さのアミノ酸、１０−３０個までの長さのアミノ酸、１５−３０個までの長さのアミノ酸、２０−３０個までの長さのアミノ酸、２５−３０個までの長さのアミノ酸、１０−２０個までの長さのアミノ酸、又は１０−１５個までの長さのアミノ酸、を有する。
【０３０２】
１つの実施形態によれば、活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；切断可能リンカー（ＣＬ）；及びJagged1及びJagged2に対して特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（ｉ）ＮＢは、ＡＢに対して特異的に結合しないポリペプチドを含み；（ｉｉ）ＣＬは、酵素のための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（ｉｉｉ）ＣＬは、未切断状態で、ＮＢがJagged1及び/又はJagged2へのＡＢの結合を干渉し、そして切断された状態で、ＮＢがJagged1及び/又はJagged2へのＡＢの結合を干渉しないよう位置決定され；そして（ｉｖ）ＮＢは酵素によるＣＬの切断を阻害せず；そして（ｖ）活性化可能抗体は、未切断状態で、次の通りに、Ｎ末端からＣ末端側への構造的配置を有する：ＮＢ−ＣＬ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＬ−ＮＢ。
【０３０３】
１つの実施形態によれば、活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）；切断可能リンカー（ＣＬ）；及びJagged1及びJagged2に対して特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（ｉ）ＮＢは、ＡＢに対して特異的に結合しないポリペプチドを含み；（ｉｉ）ＣＬは、酵素のための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；（ｉｉｉ）ＣＬは、未切断状態で、ＮＢがJagged1及び/又はJagged2へのＡＢの結合を干渉し、そして切断された状態で、ＮＢがJagged1及び/又はJagged2へのＡＢの結合を干渉しないよう位置決定され、そして未切断の活性化可能抗体下で、ＮＢは、Jagged1及び/又はJagged2を結合するＡＢの能力を、Jagged1及び/又はJagged2を結合する、切断されたＡＢの能力に比較して、少なくとも 50%、例えば、 少なくとも 60%、 少なくとも 70%、 少なくとも 75%、 少なくとも 80%、 少なくとも 85%、 少なくとも 90%、 少なくとも 95%、 少なくとも 96%、 少なくとも 97%、 少なくとも 98%、 少なくとも 99%、 少なくとも 100%、低め；そして（ｉｖ）ＮＢは、酵素によるＣＬの切断を阻害しない。Jagged1及び/又はJagged2を結合するＡＢの能力の低下は、例えば本明細書に記載されているアッセイ、又はインビトロ標的物置換アッセイ、例えば国際公開第２００９／０２５８４６号及び第２０１０／０８１１７３号に記載されるアッセイを用いて、決定される。
【０３０４】
１つの実施形態によれば、活性化可能抗体は、非結合立体部分（ＮＢ）のための結合パートナー（ＢＰ）；切断リンカー（ＣＬ）；及びJagged1及びJagged2に対して特異的に結合する抗体又は抗体フラグメント（ＡＢ）を含み、ここでＢＰは、ＮＢに供される場合、ＮＢに結合するポリペプチドであり；ＮＢはＡＢに対して特異的に結合せず；ＣＬは、酵素のための基質（Ｓ）を含むポリペプチドであり；ＣＬは、ＮＢの存在下で、未切断状態で、ＮＢがJagged1及び/又はJagged2へのＡＢの結合を干渉し、そして切断された状態で、ＮＢがJagged1及び/又はJagged2へのＡＢの結合を干渉せず、そしてＢＰはJagged1及び/又はJagged2へのＡＢの結合を干渉するよう位置決定され；そしてＮＢ及びＢＰは、酵素によるＣＬの切断を阻害しない。この実施形態のいくつかの例によれば、活性化可能抗体のＢＰは任意には、ＮＢに結合される。１つの実施形態によれば、ＮＢはインビボで、活性化可能抗体のＢＰによりリクルートされる。
【０３０５】
それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、組成物として処方される。いくつかのそれらの実施形態によれば、組成物はまた、ＮＢを含み、ここでＮＢは、ＢＰ、ＣＬ及びＡＢを含む活性化可能抗−Jagged抗体と共に同時処方される。この実施形態のいくつかの例によれば、ＢＰは、アルブミン結合ペプチド、フィブリノゲン結合ペプチド、フィブロネクチン結合ペプチド，ヘモグロビン結合ペプチド、トランスフェリン結合ペプチド、免疫グロブリンドメイン結合ペプチド、及び他の血清タンパク質結合ペプチドから成る群から選択される。
【０３０６】
それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＮＢは可溶性球状タンパク質である。それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＮＢは、血流において循環するタンパク質である。それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＮＢは、アルブミン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ヘモグロビン、トランスフェリン、免疫グロブリンドメイン、および他の血清タンパク質から成る群から選択される。
【０３０７】
抗−Jagged抗体、ＣＬは、プロテアーゼのための基質（Ｓ）を含むポリペプチドである。それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、プロテアーゼはJagged1及び/又はJagged2と共局在し、そしてプロテアーゼは、活性化可能抗体がプロテアーゼに供される場合、活性化可能抗−Jagged抗体におけるＣＬを切断する。それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、ＣＬは、５０個までの長さのアミノ酸のポリペプチドである。抗−Jagged抗体、ＣＬは、１５個までの長さのアミノ酸、例えば３個の長さのアミノ酸、４個の長さのアミノ酸、５個の長さのアミノ酸、６個の長さのアミノ酸、７個の長さのアミノ酸、８個の長さのアミノ酸、９個の長さのアミノ酸、１０個の長さのアミノ酸、１１個の長さのアミノ酸、１２個の長さのアミノ酸、１３個の長さのアミノ酸、又は１５個の長さのアミノ酸を有する、基質（Ｓ）を含むポリペプチドである。
【０３０８】
それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体は、未切断状態で次の通りに、Ｎ末端からＣ末端側に構造配置を有する：ＮＢ−ＣＬ−ＡＢ、ＡＢ−ＣＬ−ＮＢ、ＢＰ−ＣＬ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＬ−ＢＰ。活性化可能抗−Jagged抗体がＢＰを含み、そして活性化可能抗体がその対応するＮＢの存在下で存在する実施形態によれば、活性化可能抗体は、未切断状態で次の通りに、Ｎ末端からＣ末端側に構造配置を有し：ＮＢ：ＢＰ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＢＰ：ＮＢ、ここで「：」は、ＮＢとＢＰとの間の相互作用、例えば、結合を表す。
【０３０９】
それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体は、Jagged1及びJagged2を特異的に結合する、抗体又はその抗原結合フラグメントを含み、そしてモノクローナル抗体、ドメイン抗体、単鎖、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、ｓｃＦｖ、ｓｃａｂ、ｄＡｂ、単一ドメインＨ鎖抗体及び単一ドメインＬ鎖抗体である。いくつかの実施形態によれば、Jagged1及びJagged2を結合するそのような抗体又はその免疫学的活性フラグメントは、マウス、キメラ、ヒト適合化、又は完全ヒトモノクローナル抗体である。
【０３１０】
それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体は、表２に示される組合せから選択された、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含む。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体は、表２に示される配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含む。
【０３１１】
本発明の抗−Jagged抗体は、４Ｄ１１抗体、４Ｂ２抗体、４Ｅ７抗体、４Ｅ１１抗体、６Ｂ７抗体及び６Ｆ８抗体から成る群から選択された少なくとも１つの抗体の、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含む。
【０３１２】
本発明の抗−Jagged抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含み、ここで少なくとも１つのＣＤＲ配列は、アミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）を含むＶＨ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）を含むＶＨ  ＣＤ２；アミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３から成る群から選択される。
【０３１３】
本発明の抗−Jagged抗体は、ＶＨ  ＣＤＲ１配列、ＶＨ  ＣＤＲ２配列、ＶＨ  ＣＤＲ３配列、ＶＬ  ＣＤＲ１配列、ＶＬ  ＣＤＲ２配列及びＶＬ  ＣＤＲ３配列の組合せを含む抗体を含み、、ここで少なくとも１つのＣＤＲ配列は、アミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤ２；アミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３から成る群から選択される。
【０３１４】
本発明の抗−Jagged抗体は、少なくともアミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）を含むＶＨ  ＣＤＲ１；少なくともアミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）を含むＶＨ  ＣＤ２；少なくともアミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；少なくともアミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及び少なくともアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０３１５】
本発明の抗−Jagged抗体は、アミノ酸配列SYAMS（配列番号２００）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１配列；アミノ酸配列SIDPEGRQTYYADSVKG（配列番号２０８）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤ２；アミノ酸配列DIGGRSAFDY（配列番号２０９）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３；アミノ酸配列RASQSISSY（配列番号２１０）を含むＶＬ  ＣＤＲ１；アミノ酸配列AASSLQS（配列番号２１１）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２；及びアミノ酸配列QQTVVAPPL（配列番号２１２）に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む抗体を含む。
【０３１６】
それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体は、表４に列挙される組合せから選択された、可変Ｈ鎖領域及び可変Ｌ鎖領域の組合せを含む抗体を含む。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体は、表４に列挙される組合せに対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％ 又はそれ以上、同一である、可変Ｈ鎖領域及び可変Ｌ鎖領域の組合せを含む抗体を含む。
【０３１７】
それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体はまた、ＡＢに結合される剤も含む。いくつかの実施形態によれば、前記剤は治療剤である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は抗腫瘍剤である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は毒素又はそのフラグメントである。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、リンカーを介してＡＢに結合される。いくつかの実施形態によれば、前記リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、表３０に列挙される群から選択された剤である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、アウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はマイタンシノイド又はマイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、デュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、カリケアマイシン又はその誘導体である。
【０３１８】
それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体はまた、検出可能成分も含む。いくつかの実施形態によれば、前記検出可能成分は、診断剤である。
【０３１９】
それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体はまた、スペーサーも包含する。それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体はまた、シグナルペプチドも包含する。いくつかの実施形態によれば、シグナルペプチドは、スペーサーを介して活性化可能抗体に結合される。それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、スペーサーは、活性化可能抗体のＭＭに直接的に結合される。
【０３２０】
それらの活性化可能抗−Jagged抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも５日である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４日である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３日である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２日である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２４時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも２０時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１８時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１６時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１４時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１２時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも１０時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも８時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも６時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも４時間である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗体の血清半減期は、生物に投与される場合、少なくとも３時間である。
【０３２１】
本発明はまた、それらの活性化可能抗−Jagged抗体をコードする単離された核酸分子、及びそれらの単離された核酸配列を含むベクターも提供する。本発明は、そのような核酸配列を含む細胞を、活性化可能抗体の発現を導く条件下で培養することによる活性化可能抗体の生成方法を提供する。いくつかの実施形態によれば、細胞は、そのようなベクターを含む。
【０３２２】
標的物に対するＮＢ含有活性化可能抗体の解離定数（Ｋd）は、それがＮＢ又はＮＢ：ＢＰにより結合されない場合、標的物に対するＡＢのＫdよりも高い。標的物に対するＮＢ含有活性化可能抗体の解離定数（Ｋd）は、標的物に対するＡＢのＫdよりも高い。標的物に対するＮＢ含有活性化可能抗体の解離定数（Ｋd）は、標的物に対する親ＡＢのＫdよりも高い。例えば、標的物に対するＮＢ含有活性化可能抗体のＫdは、ＮＢ又はＮＢ：ＢＰにより結合されない場合のＡＢのＫd、又は標的物に対する親ＡＢのＫdよりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、５０、０００、１００、０００、５００、０００、１、０００、０００、５、０００、０００、１０、０００、０００、５０、０００、０００又はそれ以上、又は５−１０、１０−１００、１０−１、０００、１０−１０、０００、１０−１００、０００、１０−１、０００、０００、１０−１０、０００、０００、１００−１、０００、１００−１０、０００、１００−１００、０００、１００−１、０００、０００、１００−１０、０００、０００、１、０００−１０、０００、１、０００−１００、０００、1、０００−１、０００、０００、１０００−１０、０００、０００、１０、０００−１００、０００、１０、０００−１、０００、０００、１０、０００−１０、０００、０００、１００、０００−１、０００、０００又は１００、０００−１０、０００、０００倍、高い。逆に言えば、標的物に対するＮＢ含有活性化可能抗体の結合親和性は、ＮＢ又はＮＢ：ＢＰにより結合されない場合のＡＢの結合親和性、又は標的物に対する親ＡＢの結合親和性よりも、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１、０００、２、５００、５、０００、１０、０００、５０、０００、１００、０００、５００、０００、１、０００、０００、５、０００、０００、１０、０００、０００、５０、０００、０００又はそれ以上、又は５−１０、１０−１００、１０−１、０００、１０−１０、０００、１０−１００、０００、１０−１、０００、０００、１０−１０、０００、０００、１００−１、０００、１００−１０、０００、１００−１００、０００、１００−１、０００、０００、１００−１０、０００、０００、１、０００−１０、０００、１、０００−１００、０００、1、０００−１、０００、０００、１０００−１０、０００、０００、１０、０００−１００、０００、１０、０００−１、０００、０００、１０、０００−１０、０００、０００、１００、０００−１、０００、０００又は１００、０００−１０、０００、０００倍、低い。
【０３２３】
ＮＢ含有活性化可能抗体がJagged1及び/又はJagged2の存在下にある場合、Jagged1及び/又はJagged2へのＡＢの特異的結合は、ＮＢ又はＮＢ：ＢＰにより結合されない場合のＡＢの特異的結合に比較して、低められるか、又は阻害される。ＮＢ含有活性化可能抗体がJagged1及び/又はJagged2の存在下にある場合、Jagged1及び/又はJagged2へのＡＢの特異的結合は、Jagged1及び/又はJagged2への親ＡＢの特異的結合に比較して、低められるか、又は阻害される。ＮＢ又はＮＢ：ＢＰに結合されないＡＢの結合、又はJagged1及びJagged2への親ＡＢの結合に比較される場合、Jagged1及び/又はJagged2を結合するＮＢ含有活性化可能抗体の能力は、インビボ又はインビトロアッセイにより測定される場合、少なくとも２、４、 ６、 ８、 １２、 ２８、 ２４、 ３０、 ３６、 ４８、 ６０、 ７２、 ８４、又は ９６ 時間、 又は５、 １０、 １５、 ３０、 ４５、 ６０、 ９０、 １２０、 １５０、 または１８０ 日間、 又は１、 ２、 ３、 ４、 ５、 ６、 ７、 ８、 ９、 １０、 １１、 又は１２ か月間、又はそれ以上の間、少なくとも５０％、６０％、 ７０％、 ８０％、 ９０％、 ９２％、 ９３％、 ９４％、 ９５％、 ９６％、 ９７％、 ９８％、 ９９％ 及びさらに１００％、低められ得る。
【０３２４】
ＮＢ含有活性化可能抗体がJagged1及びJagged2の存在下にある場合（但し、修飾剤（例えば、プロテアーゼ又は他の酵素）は不在である）、Jagged1及び/又はJagged2へのＡＢの特異的結合は、ＮＢ又はＮＢ：ＢＰにより結合されない場合のＡＢの特異的結合に比較して、低められるか、又は阻害される。ＮＢ含有活性化可能抗体がJagged1及び/又はJagged2の存在下にある場合（但し、修飾剤（例えば、プロテアーゼ、他の酵素、還元剤又は光）は不在である）、Jagged1及び/又はJagged2へのＡＢの特異的結合は、Jagged1及び/又はJagged2への親ＡＢの特異的結合に比較して、低められるか、又は阻害される。ＮＢ又はＮＢ：ＢＰに結合されないＡＢの結合、又はJagged1及び/又はJagged2への親ＡＢの結合に比較される場合、Jagged1及び/又はJagged2を結合するＮＢ含有活性化可能抗体の能力は、インビボ又はインビトロアッセイにより測定される場合、少なくとも２、４、 ６、 ８、 １２、 ２８、 ２４、 ３０、 ３６、 ４８、 ６０、 ７２、 ８４、又は ９６ 時間、 又は５、 １０、 １５、 ３０、 ４５、 ６０、 ９０、 １２０、 １５０、 または１８０ 日間、 又は１、 ２、 ３、 ４、 ５、 ６、 ７、 ８、 ９、 １０、 １１、 又は１２ か月間、又はそれ以上の間、少なくとも５０％、６０％、 ７０％、 ８０％、 ９０％、 ９２％、 ９３％、 ９４％、 ９５％、 ９６％、 ９７％、 ９８％、 ９９％ 及びさらに１００％、低められ得る。
【０３２５】
それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体は、活性化可能抗体結合体を生成するために、ＡＢに結合される剤を含む。それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、前記剤は治療剤である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は診断剤である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は検出可能マーカーである。活性化可能抗体結合体のいくつかの実施形態によれば、前記剤は抗腫瘍剤である。活性化可能抗体結合体のいくつかの実施形態によれば、前記剤は毒素又はそのフラグメントである。活性化可能抗体結合体のいくつかの実施形態によれば、前記剤は、リンカーを介してＡＢに結合される。活性化可能抗体結合体のいくつかの実施形態によれば、前記リンカーは、切断可能リンカーである。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、表３０に列挙される群から選択された剤である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はドラスタチンである。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、アウリスタチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、アウリスタチンＥ又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はマイタンシノイド又はマイタンシノイド誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤はＤＭ１又はＤＭ４である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、デュオカルマイシン又はその誘導体である。いくつかの実施形態によれば、前記剤は、カリケアマイシン又はその誘導体である。
【０３２６】
それらの活性化可能抗体実施形態の何れかのいくつかの例によれば、活性化可能抗体は、二重標的結合活性化可能抗体である。そのような二重標的結合活性化可能抗体は、同じか又は異なった標的物を結合できる２つのＡｂを含む。特定の実施形態によれば、二重標的活性化可能抗体は、二重特異的抗体又は抗体フラグメントを含む。
【０３２７】
二重標的結合活性化可能抗体は、活性化可能抗体のＡＢに結合することができる標的物の１つ又は両者と共に、標的組織において共局在される切断剤により切断されるＣＬを有するよう企画される。同じか又は異なった標的物に対する複数のＡＢを有する二重標的結合活性化可能抗体は、複数のＣＬを有するよう企画され得、ここで第１ＣＬは第１標的組織において切断剤により切断でき、そして第２ＣＬは第２標的組織において切断剤により切断でき、そして１又は２以上の標的物は活性化可能抗体のＡＢに結合する。１つの実施形態によれば、第１及び第２標的組織は、例えば生物における異なった部位で、空間的に分離される。１つの実施形態によれば、第１及び第２標的組織は、一時的に分離される同じ組織、例えば異なった時点での同じ組織であり、ここで第１時点は、組織が初期段階腫瘍である時点であり、そして第２時点は、組織が後期段階腫瘍である時点である。
【０３２８】
本発明はまた、本明細書に記載される活性化可能抗体をコードする核酸分子も提供する。本発明はまた、それらの核酸を含むベクターを提供する。本明細書に記載される活性化可能抗体は、活性化可能抗体の発現を誘導する条件下で、それらの核酸分子又はベクターを含む細胞を培養することにより生成される。
【０３２９】
本発明はまた、活性化可能抗体の製造方法を提供する。１つの実施形態によれば、前記方法は、（ａ）活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を、活性化可能抗体の発現を導く条件下で培養し、ここで前記活性化可能抗体は、（ｉ）非結合立体部分（ＮＢ）；（ｉｉ）切断可能リンカー（ＣＬ）；及び（ｉｉｉ）標的物を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（１）ＮＢはＡＢに対して特異的に結合せず；（２）ＣＬは、酵素のための基質（Ｓ）を含みポリペプチドであり；（３）ＣＬは、未切断状態下で、ＮＢが標的物へのＡＢの結合を干渉し、そして切断された状態下で、ＮＢが標的物へのＡＢの結合を干渉しないよう位置決定され；そして（４）ＮＢが酵素によるＤＬの切断を阻害せず；そして（ｂ）活性化可能抗体を回収する段階を包含する。
【０３３０】
別の実施形態によれば、前記方法は、（ａ）活性化可能抗体をコードする核酸コンストラクトを含む細胞を、活性化可能抗体の発現を導く条件下で培養し、ここで前記活性化可能抗体は、（ｉ）非結合立体部分（ＮＢ）のための結合パートナー（ＢＰ）；（ｉｉ）切断可能リンカー（ＣＬ）；及び（ｉｉｉ）標的物を特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメント（ＡＢ）を含み、ここで（１）ＮＢはＡＢに対して特異的に結合せず；（２）ＣＬは、酵素のための基質（Ｓ）を含みポリペプチドであり；（３）ＣＬは、ＮＢの存在下で、未切断状態下で、ＮＢが標的物へのＡＢの結合を干渉し、そして切断された状態下で、ＮＢが標的物へのＡＢの結合を干渉せず、そしてＢＰが標的物へのＡＢの結合を干渉しないよう位置決定され；そして（４）ＮＢが酵素によるＤＬの切断を阻害せず；そして（ｂ）活性化可能抗体を回収する段階を包含する。この実施形態のいくつかの例によれば、活性化可能抗体のＢＰは、ＮＢに結合される。
【０３３１】
抗−Jagged抗体及び活性化可能抗−Jagged抗体の使用
本発明の治療剤が、改良された転送、送達、耐性及び同様のものを提供するために製剤中に組込まれる、適切な担体、賦形剤及び他の剤と共に投与されることは理解されるであろう。多数の適切な製剤が、すべての製薬化学者に周知の処方に見出され得る：Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975))、特にそこにおける、Blaug、Seymourによるチャプター８７。それらの製剤は、例えば粉末、ペースト、軟膏、ジェリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有小胞（例えば、Lipofection（登録商標））、ＤＮＡ結合体、無水吸水性ペースト、水中油型及び油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体状ゲル、及びカーボワックスを含む半固体状混合物を包含する。前述の混合物のいずれかが、製剤中の活性成分が製剤化により不活性化されず、そして製剤が生理学的に適合でき、そして投与の経路で許容できる場合、本発明による治療及び療法において適切であり得る。また、Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)、及び製薬化学者に周知の製剤、賦形剤及び担体に関連する追加の情報についてのそこにおける引用も参照のこと。
【０３３２】
１つの実施形態によれば、本発明のモノクローナル抗体（例えば、完全ヒトモノクローナル抗体）及び／又は活性化可能抗体を含む、本発明の抗体及び／又は活性化可能抗体は、治療製剤として使用され得る。そのような剤は一般的に、対象におけるNotch受容体を通してJagged1及び/又はJagged2シグナル伝達に関連する疾患又は病状を診断し、予後し、モニターし、処理し、軽減し、及び／又は予防するために使用されるであろう。治療レジメは、対象、例えばヒト患者、又は障害、例えば癌、例えば白血病及び固形腫瘍、又は線維性疾患を有する（又は発症する危険性を有する）他の哺乳類を、標準方法を用いて同定することにより実施される。例えば、いくつかの実施形態によれば、その標的抗原に対して高い特異性及び高い親和性を有する、抗体及び／又は活性化可能抗体調製物が、対象に投与され、そして一般的に、標的物とのその結合に起因する効果を有するであろう。抗体及び／又は活性化可能抗体の投与は、標的物のシグナル伝達機能（例えば、Notch受容体を介してのJagged1及び/又はJagged2介在性シグナル伝達）を抑制するか、又は阻害するか、又は干渉することができる。抗体及び／又は活性可能抗体の投与は、天然下で結合する内因性リガンド（例えば、Notch受容体）との標的物（例えば、Jagged1及び/又はJagged2）の結合を抑制するか、又は阻害するか、又は干渉することができる。例えば、前記抗体及び／又は活性化可能抗体は、標的物に結合し、そしてNotch受容体を介してJagged1及び/又はJagged2介在性シグナル伝達を、調節し、阻止し、阻害し、低め、拮抗し、中和し、又は他方では、干渉する。
【０３３３】
一般的に、疾患又は障害の軽減又は治療は、疾患又は障害に関連する１又は２以上の症状又は医学的問題の軽減を包含する。例えば、癌の場合、治療的有効量の薬物が、以下の１つ又は組み合わせを達成することができる：癌細胞の数を減じ；腫瘍サイズを低め；末梢器官中への癌細胞浸潤を阻害し（すなわち、ある程度、低め、そして／又は停止する）；腫瘍転移を阻害し；腫瘍増殖を、ある程度、阻害し；及び／又は癌に関連する１又は２以上の症状を、ある程度、軽減する。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、対象、例えばヒト又は他の哺乳類、例えば非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、作業動物、又は動物園の動物における疾患又は障害の開始又は再発を予防するために使用され得る。用語、対象及び患者とは、本明細書においては、交換可能的に使用される。
【０３３４】
治療的有効量の本発明の抗体及び／又は活性化可能抗体は一般的に、治療目的を達成するために必要とされる量に関する。上述のように、これは、抗体及び／又は活性化可能抗体と、ある場合、標的物の機能を妨げるその標的抗体との間の結合相互作用であり得る。さらに、投与される必要な量はさらに、その特定の抗原に対する抗体及び／又は活性化可能抗体の結合親和性に依存し、そしてまた、投与される抗体及び／又は活性化可能抗体が、それが投与される自由体積の他の対象から枯渇される速度に依存するであろう。本発明の抗体及び／又は抗体フラグメント及び／又は活性化可能抗体の治療的有効投与量の一般的な範囲は、非制限的な例によれば、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。一般的な投与頻度は例えば、１日２度〜週１度の範囲であり得る。
【０３３５】
治療の有効性は、特定の炎症関連障害の診断又は治療のための任意の既知方法に関連して決定される。癌又は線維性障害の１又は２以上の症状の軽減は、抗体及び／又は活性化可能抗体が臨床的利益を与えることを示す。
【０３３６】
所望する特異性を有する抗体及び／又は活性化可能抗体のスクリーニング方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び当業界において知られている他の免疫学的介在技法を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
【０３３７】
別の実施形態によれば、Jagged1及び/又はJagged2に対して向けられる抗体及び／又は活性化可能抗体が、Jagged1及び/又はJagged2の局在化及び／又は定量化に関連する、当業界において知られている方法に使用され（例えば、適切な生理学的サンプル内のJagged1及び/又はJagged2のレベルの測定への使用のために、診断方法への使用のために、タンパク質のイメージングへの使用のために、及び同様のために）。所定の実施形態によれば、抗体由来の抗原結合ドメインを含む、Jagged1及び/又はJagged2に対して特異的な抗体及び／又は活性化可能抗体、又はその誘導体、フラグメント、類似体又は相同体が、薬理学的活性化化物（この後、「治療剤」として言及される）として使用される。
【０３３８】
別の実施形態によれば、Jagged1及び/又はJagged2に対して特異的な抗体及び／又は活性化可能抗体は、標準技法、例えば免疫親和性、クロマトグラフィー又は免疫沈澱により、Jagged1及び/又はJagged2ポリペプチドを単離するために使用される。Jagged1及び/又はJagged2に対して向けられた抗体及び／又は活性化可能抗体（又はそのフラグメント）は、臨床試験方法の一部として組織におけるタンパク質レベルをモニターするために、例えば所定の治療レジメの効能を決定するために、診断的に使用される。検出は、検出可能物質への抗体のカップリング（すなわち、物理的連結）により促進され得る。検出可能物質の例は、種々の酵素、補欠分子群、蛍光物質、発光物質、生物発光物質及び放射物質を包含する。適切な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを包含し；適切な補欠分子複合体の例は、ストレプトアビジン/ビオチン及びアビジン/ビオチンを包含し；適切な蛍光物質の例は、ンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリンを包含し；発光物質の例は、ルシノールを包含し；生物発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを包含し；そして適切な放射生物質の例は、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓ 又は3Ｈを包含する。
【０３３９】
さらに別の実施形態によれば、本発明の抗体及び／又は活性化可能抗体は、サンプル中のJagged1及び/又はJagged2 (又はそのフラグメント)の存在を検出するための剤として使用され得る。いくつかの実施形態によれば、抗体は、検出可能標識を含む。抗体は、ポリクローナル、又はいくつかの実施形態によれば、モノクローナルである。損なわれていない抗体、又はそのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ又はＦ（ａｂ）2）が使用される。プローブ又は抗体に関して、用語「標識された」とは、プローブ又は抗体に検出可能物質を結合する（すなわち、物理的に連結する）ことによるプローブの直接的標識、及び直接的に標識される別の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接的標識の包含を意図する。間接的標識の例は、蛍光標識された二次抗体を用いての一次抗体の検出、及び蛍光標識されたストレプタビジンにより検出され得るようビオチンによる抗体の末端標識を包含する。用語「生物学的サンプル（biological sample）」とは、対象から単離された組織、細胞及び生物学的流体、並びに対象内に存在する組織、細胞及び体液の包含を意図する。従って、用語「生物学的サンプル」の使用範囲内に包含されるものは、血液、及び血清、血漿又はリンパを含む血液の画分又は成分である。すなわち、本発明の検出方法は、インビトロ及びインビボで、生物学的サンプルにおけるタンパク質を検出するために使用され得る。例えば、分析物タンパク質の検出のためのインビトロ技法は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスターンブロット、免疫沈澱、及び免疫蛍光を包含する。免疫検定を行うための手順は、例えば“ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology”, Vol. 42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; “Immunoassay”, E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; and “Practice and Theory of Enzyme Immunoassays”, P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985に記載される。さらに、分析物タンパク質の検出のためのインビボ技法は、標識された抗−分析物タンパク質抗体を対象中に導入することを包含する。例えば、抗体は、対象における存在及び位置が標識イメージング技法により検出され得る放射性マーカーにより標識され得る。
【０３４０】
本発明の抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体は、診断及び予防製剤に使用される。１つの実施形態によれば、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体は、１又は２以上の前述の癌又は線維製障害を発症する危険性がある患者に投与される。１又は２以上の前述の障害に対する患者又は器官の素因は、遺伝子型、血清学的又は生化学的マーカーを用いて決定され得る。
【０３４１】
本発明の別の実施形態によれば、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体は、１又は２以上の前述の障害に関連する臨床学的徴候を有するものとして診断されたヒト個人に投与される。診断に基づいて、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体は、臨床学的徴候の効果を軽減するか又は無効にするために投与される。
【０３４２】
本発明の抗体及び／又は活性化可能抗体はまた、患者サンプルにおけるJagged1及び/又はJagged2の検出においても有用であり、そして従って、診断としても有用である。例えば、本発明の抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体は、患者サンプルにおけるJagged1及び/又はJagged2レベルを検出するために、インビトロアッセイ、例えばＥＬＩＳＡに使用される。
【０３４３】
１つの実施形態によれば、本発明の抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体は、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定される。固定された抗体及び／又は活性化可能抗体は、試験サンプルに存在できる何れかのJagged1及び/又はJagged2のための保護抗体として機能する。患者サンプルと固定された抗体との接触の前、固体支持体は、すすがれ、そしてブロッキング剤、例えば乳タンパク質又はアルブミンにより、分析物の非特異的吸着を妨げるために処理される。
【０３４４】
結果的に、ウェルは、抗原を含む疑いのある試験サンプル、又は標準量の抗原と含む溶液により処理される。そのようなサンプルは例えば、病理学の診断であると見なされるレベルの循環抗体を有する疑いのある対象からの血清サンプルである。試験サンプル又は標準をすすいだ後、固体支持体は、検出可能的に標識される二次抗体により処理される。標識された二次抗体は、検出抗体として作用する。検出可能標識のレベルが測定され、そして試験サンプル中のJagged抗原の濃度が、標識サンプルから得られる標準曲線との比較により決定される。
【０３４５】
インビトロ診断アッセイで本発明の抗−Jagged抗体を用いて得られる結果に基づけば、Jagged抗体の発現レベルに基づいて対象における疾患を段階的に分けることが可能であることが理解されるであろう。所定の疾患に関しては、血液サンプルが疾患の進行における種々の段階であるものとして診断された患者から、及び／又は疾患の治療処置における種々の点で採取される。進行又は治療の各段階について統計学的に有意な結果を提供するサンプル集団を用いて、各段階の特性と考えられ得る抗原の濃度範囲が示される。
【０３４６】
抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体はまた、診断及び／又はイメージング方法にも使用され得る。いくつかの実施形態によれば、そのような方法は、インビトロ方法である。いくつかの実施形態によれば、そのような方法は、インビボ方法である。いくつかの実施形態によれば、そのような法方は、インサイチュ方法である。いくつかの実施形態によれば、そのような方法はエクスビボ方法である。例えば、酵素切断できるＣＭを有する活性化可能抗−Jagged抗体は、ＣＭを切断できる酵素の存在又は不在を検出するために使用され得る。そのような活性化可能抗−Jagged抗体は、所定の宿主生物の所定の細胞又は組織における活性化された抗−Jagged抗体（すなわち、活性化可能抗−Jagged抗体の切断に起因する抗体）の測定される蓄積を通して酵素活性（又は、いくつかの実施形態によれば、ジスルフィド結合の還元を提供することができる高められた還元電位の環境）のインビボ検出（例えば、定性的又は定量的）を包含することができる診断に使用され得る。活性化された抗−Jagged抗体のそのような蓄積は、組織が酵素活性（又はＣＭの性質に依存する高められた還元電位）を表すことを示すのみならず、また組織が活性化された抗体が結合する標的物を表すことも示唆する。
【０３４７】
例えば、ＣＭは、腫瘍の部位で、ウィルス又は細菌感染の部位で、生成学的に制限された部位で(例えば、膿瘍において、器官において、及び同様において)、及び同様の部位で見出されるプロテアーゼのためのプロテアーゼ基質として選択され得る。ＡＢは、標的抗原を結合するものである。当業者になじみの方法を用いて、検出可能標識（例えば、蛍光標識又は放射性標識又は放射性トレーサー）は、ＡＢ、又は抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体の他の領域に結合され得る。適切な検出可能標識は、上記スクリーニング方法において論じられ、そして追加の特定の例が下記に提供される。その活性が興味ある疾患組織において高められるプロテアーゼと共に、病状のタンパク質又はペプチドに対して特異的なＡＢを用いて、活性化可能抗−Jagged抗体は、ＣＭ特異的酵素が検出可能レベルで存在しないか、又は疾患組織においてよりも低いレベルで存在するか、又は不活性である（例えば、チモーゲン形で、又は阻害剤との複合体下で）、組織と比較して、疾患組織への結合率の増加を示すであろう。小タンパク質及びペプチドは腎臓濾過システムにより血液から急速にクリアランスされるので、及びＣＭに対して特異的な酵素は検出可能レベルで存在しないので（又は非疾患組織に低レベルで存在するか、又は不活性コンホメーション下で存在する）、疾患組織における活性化された抗−Jagged抗体の蓄積は、非疾患組織に対して増強される。
【０３４８】
別の例によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、サンプルにおける切断剤の存在又は不在を検出するために使用され得る。例えば、活性化可能抗−Jagged抗体が酸素による切断に対して敏感なＣＭを含む場合、活性化可能抗−Jagged抗体は、サンプル中の酵素の存在を検出する（定性的に又は定量的に）ために使用され得る。活性化可能抗−Jagged抗体が還元剤による切断に対して敏感なＣＭを含む別の例によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、サンプルにおける還元状態の存在を検出する（定性的に又は定量的に）ために使用され得る。それらの方法での分析を促進するためには、活性化可能抗体は検出可能的に標識され得、そして支持体（例えば、固体支持体、例えばスライド又はビーズ）に結合され得る。検出可能標識は、切断に続いて放出されない活性化可能抗−Jagged抗体の一部上に位置し、例えば検出可能標識は、クエンチ蛍光標識、又は切断が生じるまで検出できない他の標識であり得る。アッセイは、例えば固定された、検出可能的に標識された活性化可能抗−Jagged抗体と、酵素及び／又は還元剤を含む疑いがあるサンプルとを、切断が生じるのに十分な時間、接触し、次に過剰のサンプル及び汚染物を除去するために洗浄することにより実施され得る。次に、サンプル中に切断剤（例えば、酵素又は還元剤）の存在又は不在が、サンプルとの接触の前、活性化可能抗−Jagged抗体の検出可能シグナルの変化、例えばサンプル中の切断剤による活性化可能抗体の切断による検出可能シグナルの存在及び／又は上昇により評価され得る。
【０３４９】
そのような検出方法は、切断される場合、活性化可能抗−Jagged抗体のＡＢを結合できる標的物の存在又は不在の検出を提供できるよう適合され得る。従って、アッセイは、切断剤の存在又は不在、及び興味ある標的物の存在又は不在を評価するように適合され得る。切断剤の存在又は不在は、上記のような活性化可能抗−Jagged抗体の検出可能レベルでの存在及び／又は上昇により検出され得、そして標的物の存在又は不在は標的物−ＡＢ複合体の検出により、例えば検出可能的に標識された抗−標的物抗体の使用により、検出され得る。
【０３５０】
活性化可能抗−Jagged抗体は、例えばプロテアーゼ切断及び特定標的物への結合による、活性化可能抗体活性化の検証のためのインサイチュイメージングにおいても有用である。インサイチュイメージングは、生物学的サンプル、例えば細胞培養物又は組織切片におけるタンパク質分解活性及び標的物の局在化を可能にする技法である。この技法を用いて、所定の標的物への結合、及び検出可能標識（たとえば、蛍光標識）の存在に基づいてのタンパク質分解活性の両者を確認することが可能である。
【０３５１】
それらの技法は、疾患部位（例えば、腫瘍組織）又は健康組織由来の任意の凍結細胞又は組織に関して有用である。それらの技法はまた、新鮮細胞又は組織サンプルに関しても有用である。
【０３５２】
それらの技法によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、検出可能標識により標識される。検出可能標識は、蛍光色素（例えば、蛍光団、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、Alexa Fluor（登録商標）標識）近赤外（ＮＩＲ）色素（例えば、Ｑｄｏｔ（登録商標）ナノ結晶）、コロイド状金属、ハプテン、放射性マーカー、ビオチン及び増幅試薬、例えばストレプタビジン、又は酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ又はアルカリホスファターゼ）であり得る。
【０３５３】
標識された、活性化可能抗−Jagged抗体と共にインキュベートされたサンプル中の標識の検出は、サンプルが標的物、すなわちJagged1及び/又はJagged2を含み、そして活性化可能抗−Jagged抗体のＣＭに対して特異的であるプロテアーゼを含むことを示唆する。いくつかの実施形態によれば、プロテアーゼの存在は、広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載されるそれらを用いて、及び／又はプロテアーゼに対して特異的である剤、例えばプロテアーゼマトリプターゼ（ＭＴ−ＳＰ１）に対して特異的であり、そしてＭＴ−ＳＰ１のタンパク質分解活性を阻害する抗体、例えばＡ１１を用いることにより確認され得る；例えば、国際公開番号第ＷＯ  ２０１０／１２９６０９号（２０１０年１１月１１日に公開された）を参照のこと。広範囲のプロテアーゼ阻害剤、例えば本明細書に記載されるそれらを使用し、及び／又はより選択的な阻害剤を使用する同じアプローチが、プロテアーゼ、又は活性可能抗−Jagged抗体のＣＭに対して特異的な種類のプロテアーゼを同定するために使用され得る。いくつかの実施形態によれば、標的物の存在は、標的物、例えば別のJagged1及び/又はJagged2抗体に対して特異的である剤を用いて確認され得、又は検出可能標識が、標識されていないJagged1及び/又はJagged2と比較され得る。いくつかの実施形態によれば、標識されていない活性化可能抗−Jagged抗体が、標識された二次抗体又はより複雑な検出システムによる検出を伴って、使用され得る。
【０３５４】
類似する技法がまた、対象、例えば哺乳類、例えばヒトにおける蛍光シグナルの検出が、疾患部位が標的物、すなわちJagged1及び/又はJagged2を含み、そして活性化可能抗−Jagged抗体のＣＭに対して特異的であるプロテアーゼを含むことを示唆する、インビボイメージングのためにも有用である。
【０３５５】
それらの技法はまた、活性化可能抗−Jagged抗体におけるプロテアーゼ−特異的ＣＭに基づいて、種々の細胞、組織及び生物におけるプロテアーゼの検出、同定又は特徴化のために、キットにおいて、及び／又は試薬としても有用である。
【０３５６】
本発明はまた、種々の診断及び／又は予防徴候に、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体を使用するための方法も提供する。例えば、本発明は、（ｉ）対象又はサンプルと、活性化可能抗−Jagged抗体とを接触し、ここで前記活性化可能抗−Jagged抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、及び目的の標的物を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで未切断、非活性化状態での活性化可能抗−Jagged抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し、ここで（ａ）ＭＭは、Jagged標的物へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そしてＡＢの天然の結合パートナーの修飾された形ではなく、そして（ｂ）未切断、非活性化状態で、ＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉し、そして切断された、活性化された状態で、ＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉せず、又は競争せず；そして（ｉｉ）対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗−Jagged抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的の標的物の存在又は不在を検出するための方法及びキットを提供し、ここで、対象又はサンプルにおける検出可能レベルの活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体は、切断剤及びJagged標的物が対象又はサンプルに存在することを示唆し、そして対象又はサンプルにおける検出可能レベルの活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体は、切断剤、Jagged標的物、又はそれらの両者が対象又はサンプルに不在であり、そして／又は十分には存在しないことを示唆しない。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗−Jagged抗体である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、剤に結合されな。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態によれば、検出可能標識は、ＡＢ上に位置する。いくつかの実施形態によれば、対象又はサンプルにおける活性化可能抗−Jagged抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態によれば、前記二次試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
【０３５７】
本発明は、（ｉ）対象又はサンプルと、活性化可能抗−Jagged抗体とを、目的のJagged標的物、例えばJagged１及び/又はJagged２の存在下で接触し、ここで前記活性化可能抗−Jagged抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、及び目的の標的物を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで未切断、非活性化状態での活性化可能抗−Jagged抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し、ここで（ａ）ＭＭは、Jagged標的物へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そしてＡＢの天然の結合パートナーの修飾された形ではなく、そして（ｂ）未切断、非活性化状態で、ＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉し、そして切断された、活性化された状態で、ＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉せず、又は競争せず；そして（ｉｉ）対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗−Jagged抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は不在を検出するための方法及びキットを提供し、ここで、対象又はサンプルにおける検出可能レベルの活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体は、切断剤が対象又はサンプルに存在することを示唆し、そして対象又はサンプルにおける検出可能レベルの活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体が、切断剤が対象又はサンプルに不在であり、そして／又は十分には存在しないことを示唆できない。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗−Jagged抗体である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態によれば、検出可能標識は、ＡＢ上に位置する。いくつかの実施形態によれば、対象又はサンプルにおける活性化可能抗−Jagged抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態によれば、前記二次試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
【０３５８】
本発明はまた、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的のJagged標的物（例えば、Jagged1及び/又はJagged2）の存在又は不在の検出方法への使用のためのキットも提供し、ここで前記キットは、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、及び目的の標的物を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含む活性化可能抗−Jagged抗体を少なくとも含み、ここで未切断の非活性化状態で、前記活性化可能抗−Jagged抗体は、次の通りに、Ｎ−末端からＣ−末端側に構造配置を構造配置を含み：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭ；ここで（ａ）ＭＭは、Jagged標的物へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そしてＡＢの天然の結合パートナーの修飾された形ではなく、そして（ｂ）未切断、非活性化状態で、ＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉し、そして切断された、活性化された状態で、ＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉せず、又は競争せず；そして（ｉｉ）対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗−Jagged抗体のレベルを測定することを包含し、ここで、対象又はサンプルにおける活性化された活性化可能抗−Jagged抗体の検出可能レベルは、切断剤が対象又はサンプルに存在することを示唆し、そして対象又はサンプルにおける検出可能レベルの活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体は、切断剤が対象又はサンプルに不在であり、そして／又は十分には存在しないことを示唆しない。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗−Jagged抗体である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、剤に結合されな。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態によれば、検出可能標識は、ＡＢ上に位置する。いくつかの実施形態によれば、対象又はサンプルにおける活性化可能抗−Jagged抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態によれば、前記二次試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
【０３５９】
本発明は、（ｉ）対象又はサンプルと、活性化可能抗−Jagged抗体とを接触し、ここで前記活性化可能抗−Jagged抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、Jagged標的物、例えばJagged1及び/又はJagged2を特異的に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢ）、及び検出可能標識を含み、ここで未切断、非活性化状態での活性化可能抗−Jagged抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し；ここでＭＭは、Jagged標的物へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そしてＡＢの天然の結合パートナーの修飾された形ではなく；そして未切断、非活性化状態で、ＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉し、そして切断された、活性化された状態で、ＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉せず、又は競争せず；そして検出可能標識が、ＣＭの切断に続いて放出される活性化可能抗−Jagged抗体の一部を位置決定され；そして（ｉｉ）対象又はサンプルにおける検出可能標識のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は不在を検出するための方法を提供し、ここで、対象又はサンプルにおける検出可能標識の検出可能レベルは、切断剤が対象又はサンプルに不在であり、そして/又は十分には存在しないことを示唆し、そして対象又はサンプルにおける検出可能標識の検出可能レベルが、切断剤が対象又はサンプルに存在することを示唆しない。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗−Jagged抗体である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態によれば、検出可能標識は、ＡＢ上に位置する。いくつかの実施形態によれば、対象又はサンプルにおける活性化可能抗−Jagged抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態によれば、前記二次試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
【０３６０】
本発明はまた、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的のJagged標的物（例えば、Jagged1及び/又はJagged2）の存在又は不在の検出方法への使用のためのキットも提供し、ここで前記キットは、対象又は生物学的サンプルの接触に使用するための本明細書に記載される活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体（例えば、治療剤が結合される活性化可能抗体）、及び対象又は生物学的サンプルにおける活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体のレベルを検出するための手段を、少なくとも包含し、ここで、対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗−Jagged抗体の検出可能レベルが、切断剤及びJagged標的物が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆し、そして対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗−Jagged抗体の検出可能レベルが、切断剤及びJagged標的物が対象又は生物学的サンプルに不在であり、そして／又は十分には存在しないことを示唆せず、結果的に、活性化可能抗−Jagged抗体のJagged 標的結合及び／又はプロテアーゼ切断は、対象又は生物学的サンプルにおいては検出され得ない。
【０３６１】
本発明はまた、（ｉ）対象又は生物学的サンプルと、活性化可能抗−Jagged抗体とを、Jagged標的物の存在下で接触し、そして（ｉｉ）対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗−Jagged抗体のレベルを測定することにより、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は不在を検出するための方法を提供し、ここで、対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体の検出可能レベルは、切断剤が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆し、そして対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体の検出可能レベルが、切断剤が対象又は生物学的サンプルにおいて、検出可能レベルで不在であり、そして／又は十分には存在しないことを示唆できずない。そのような活性化可能抗−Jagged抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、及び目的の標的物を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで未切断（すなわち、活性化されていない）状態での活性化可能抗−Jagged抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し、ここで（ａ）ＭＭは、Jagged標的物へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そして（ｂ）未切断状態で、活性化可能抗−Jagged抗体のＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉し、そして切断された（すなわち、、活性化された）状態で、ＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉せず、又は競争しない。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗−Jagged抗体である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態によれば、検出可能標識はマスキング部分に結合される。いくつかの実施形態によれば、検出可能標識は、プロテアーゼ切断部分のＮ末端側の切断部分に結合される。いくつかの実施形態によれば、ＡＢの単一抗体結合部位がマスキングされる。本開示の抗体が少なくとも２種の抗原結合部位を有するいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの抗原結合部位がマスキングされ、そして少なくとも１つの抗原結合部位はマスキングされない。いくつかの実施形態によれば、すべての抗原結合部位はマスキングされない。いくつかの実施形態によれば、測定段階は、検出可能標識を含む第二試薬の使用を包含する。
【０３６２】
本発明はまた、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的のJagged標的物（例えば、Jagged1及び/又はJagged2）の存在又は不在の検出方法への使用のためのキットも提供し、ここで前記キットは、対象又は生物学的サンプルと、活性化可能抗−Jagged抗体とを、Jagged標的物の存在下で接触し、そして対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗−Jagged抗体のレベルを測定することへの使用のために本明細書に記載される活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を少なくとも含み、ここで対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体の検出可能レベルは、切断剤が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆し、そして対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体の検出可能レベルが、切断剤が対象又は生物学的サンプルにおいて、検出可能レベルで不在であり、そして／又は十分には存在しないことを示唆できない。そのような活性化可能抗−Jagged抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、及びJagged標的物を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで未切断（すなわち、活性化されていない）状態での活性化可能抗−Jagged抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し、ここで（ａ）ＭＭは、Jagged標的物へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そして（ｂ）未切断状態で、活性化可能抗−Jagged抗体のＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉し、そして切断された（すなわち、、活性化された）状態で、活性化可能抗−Jagged抗体のＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉せず、又は競争しない。いくつかの実施形態によれば、検出可能標識はマスキング部分に結合される。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗−Jagged抗体である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態によれば、検出可能標識はマスキング部分に結合される。いくつかの実施形態によれば、検出可能標識は、プロテアーゼ切断部分のＮ末端側の切断部分に結合される。いくつかの実施形態によれば、ＡＢの単一抗体結合部位がマスキングされる。本開示の抗体が少なくとも２種の抗原結合部位を有するいくつかの実施形態によれば、少なくとも１つの抗原結合部位がマスキングされ、そして少なくとも１つの抗原結合部位はマスキングされない。いくつかの実施形態によれば、すべての抗原結合部位はマスキングされない。いくつかの実施形態によれば、測定段階は、検出可能標識を含む第二試薬の使用を包含する。
【０３６３】
本発明はまた、対象又はサンプルにおける切断剤の存在又は不在の検出方法への使用のためのキットも提供し、ここで前記キットは、対象又は生物学的サンプルの接触に使用するための本明細書に記載される活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体、及び対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体のレベルを検出するための手段を、少なくとも包含し、ここで活性化可能抗−Jagged抗体は、ＣＭの切断に続いて放出される活性化可能抗−Jagged抗体の一部に基づいて位置決定される検出可能標識を含み、ここで対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗−Jagged抗体の検出可能レベルは、切断剤が、対象又は生物学的サンプルに不在であり、そして／又は十分に存在しないことを示唆し、結果的に、活性化可能抗−Jagged抗体のJagged標的結合及び／又はプロテアーゼ切断は対象又は生物学的サンプルには検出され得ず、そして対象又は生物学的サンプルにおける活性化された抗−Jagged抗体の検出可能レベルは、切断剤が対象又は生物学的サンプルに検出可能レベルで存在することを示唆しない。
【０３６４】
本発明は、（ｉ）対象又は生物学的サンプルと、活性化可能抗−Jagged抗体とを接触し、ここで前記活性化可能抗−Jagged抗体は、ＣＭの切断に続いて放出される活性化可能抗−Jagged抗体の一部に基づいて位置決定される検出可能標識を含み、そして（ｉｉ）前記対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体のレベルを測定することにより、対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体のレベルを測定することにより、対象又は生物学的における切断剤及びJagged標的物の存在又は不在を検出するための方法を提供し、ここで対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗−Jagged抗体の検出可能レベルが、切断剤、Jagged標的物、又は切断剤及びJagged標的物の両者が、対象又は生物学的サンプルに不在であり、そして／又は十分に存在しないことを示唆し、結果的に、活性化可能抗−Jagged抗体のJagged標的結合及び／又はプロテアーゼ切断は対象又は生物学的サンプルには検出され得ず、そして前記対象又は生物学的サンプル中の活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体の低められた検出可能レベルが、切断剤及びJagged標的物が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆する。検出可能標識の低められたレベルは例えば、約５％、約１０％、 約 １５％、 約 ２０％、 約 ２５％、 約 ３０％、 約 ３５％、 約 ４０％、 約 ４５％、 約 ５０％、 約 ５５％、 約 ６０％、 約 ６５％、 約 ７０％、 約 ７５％、 約 ８０％、 約 ８５％、 約 ９０％、 約 ９５％ 及び/又は約 １００％の低下率である。そのような活性化可能抗−Jagged抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、及びJagged標的物を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで未切断（すなわち、活性化されていない）状態での活性化可能抗−Jagged抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し、ここで（ａ）ＭＭは、Jagged標的物へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そして（ｂ）未切断状態で、活性化可能抗−Jagged抗体のＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉し、そして切断された（すなわち、活性化された）状態で、活性化可能抗−Jagged抗体のＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉せず、又は競争しない。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗−Jagged抗体である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、検出可能標識である。いくつかの実施形態によれば、検出可能標識は、ＡＢ上に位置決定される。いくつかの実施形態によれば、対象又はサンプル中の活性化可能抗−Jagged抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する第二試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態によれば、第二試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
【０３６５】
本発明はまた、対象又はサンプルにおける切断剤及び目的のJagged標的物の存在又は不在の検出方法への使用のためのキットも提供し、ここで前記キットは、対象又は生物学的サンプルの接触に使用するための本明細書に記載される活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体、及び対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体のレベルを検出するための手段を、少なくとも包含し、ここで対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗−Jagged抗体の検出可能レベルは、切断剤、Jagged標的物、又は切断剤及びJagged標的物両者が、対象又は生物学的サンプルに不在であり、そして／又は十分に存在しないことを示唆し、結果的に、活性化可能抗−Jagged抗体のJagged標的結合及び／又はプロテアーゼ切断は対象又は生物学的サンプルには検出され得ず、そして前記対象又は生物学的サンプル中の活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体の低められた検出可能レベルが、切断剤及びJagged標的物が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆する。検出可能標識の低められたレベルは例えば、約５％、約１０％、 約 １５％、 約 ２０％、 約 ２５％、 約 ３０％、 約 ３５％、 約 ４０％、 約 ４５％、 約 ５０％、 約 ５５％、 約 ６０％、 約 ６５％、 約 ７０％、 約 ７５％、 約 ８０％、 約 ８５％、 約 ９０％、 約 ９５％ 及び/又は約 １００％の低下率である。
【０３６６】
本発明はまた、（ｉ）対象又は生物学的サンプルと、活性化可能抗−Jagged抗体とを接触し、ここで前記活性化可能抗−Jagged抗体は、ＣＭの切断に続いて放出される活性化可能抗−Jagged抗体の一部に基づいて位置決定される検出可能標識を含み、そして（ｉｉ）前記対象又は生物学的サンプルにおける検出可能標識のレベルを測定することにより、対象又は生物学的サンプルにおける活性化された、活性化可能抗−Jagged抗体のレベルを測定することにより、対象又は生物学的における切断剤の存在又は不在を検出するための方法を提供し、ここで対象又は生物学的サンプルにおける検出可能レベルが、切断剤が、検出可能レベルで、対象又は生物学的サンプルに不在であり、そして／又は十分に存在しないことを示唆し、結果的に、活性化可能抗−Jagged抗体のプロテアーゼ切断は対象又は生物学的サンプルには検出され得ず、そして前記対象又は生物学的サンプル中の検出可能レベルの低められた検出可能レベルが、切断剤が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆する。検出可能標識の低められたレベルは例えば、約５％、約１０％、 約 １５％、 約 ２０％、 約 ２５％、 約 ３０％、 約 ３５％、 約 ４０％、 約 ４５％、 約 ５０％、 約 ５５％、 約 ６０％、 約 ６５％、 約 ７０％、 約 ７５％、 約 ８０％、 約 ８５％、 約 ９０％、 約 ９５％ 及び/又は約 １００％の低下率である。そのような活性化可能抗−Jagged抗体は、マスキング部分（ＭＭ）、切断剤により切断される切断可能部分（ＣＭ）、及びJagged標的物を特異的に結合する抗原結合ドメイン又はそのフラグメント（ＡＢ）を含み、ここで未切断（すなわち、活性化されていない）状態での活性化可能抗−Jagged抗体は、次の通りにＮ末端からＣ末端側への構造配置：ＭＭ−ＣＭ−ＡＢ又はＡＢ−ＣＭ−ＭＭを有し、ここで（ａ）ＭＭは、Jagged標的物へのＡＢの結合を阻害するペプチドであり、そしてＭＭはＡＢの天然に存在する結合パートナーのアミノ酸配列を有さず、そして（ｂ）未切断状態で、活性化可能抗−Jagged抗体のＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉し、そして切断された（すなわち、、活性化された）状態で、活性化可能抗−Jagged抗体のＭＭはJagged標的物へのＡＢの特異的結合を干渉せず、又は競争しない。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗−Jagged抗体である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、剤に結合されない。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、検出可能標識である。いくつかの実施形態によれば、検出可能標識は、ＡＢ上に位置決定される。いくつかの実施形態によれば、対象又はサンプル中の活性化可能抗−Jagged抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する第二試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態によれば、第二試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
【０３６７】
本発明はまた、対象又はサンプルにおける目的の切断剤の存在又は不在の検出方法への使用のためのキットも提供し、ここで前記キットは、対象又は生物学的サンプルの接触に使用するための本明細書に記載される活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体、及び対象又は生物学的サンプルにおける活性化された活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体のレベルを検出するための手段を、少なくとも包含し、ここで活性化可能抗−Jagged抗体は、ＣＭの切断に続いて放出される活性化可能抗−Jagged抗体の一部に基づいて位置決定される検出可能標識を含み、ここで対象又は生物学的サンプルにおける検出可能標識の検出可能レベルは、切断剤、Jagged標的物、又は断剤、Jagged標的物の両者が、対象又は生物学的サンプルに不在であり、そして／又は十分に存在しないことを示唆し、結果的に、活性化可能抗−Jagged抗体のJagged標的結合及び／又はプロテアーゼ切断は対象又は生物学的サンプルには検出され得ず、そして前記対象又は生物学的サンプル中の検出可能標識の検出可能レベルが、切断剤及びJagged標的物が対象又は生物学的サンプルに存在することを示唆する。検出可能標識の低められたレベルは例えば、約５％、約１０％、 約 １５％、 約 ２０％、 約 ２５％、 約 ３０％、 約 ３５％、 約 ４０％、 約 ４５％、 約 ５０％、 約 ５５％、 約 ６０％、 約 ６５％、 約 ７０％、 約 ７５％、 約 ８０％、 約 ８５％、 約 ９０％、 約 ９５％ 及び/又は約 １００％の低下率である。
【０３６８】
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、検出可能標識を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、検出可能標識は、イメージング剤、造影剤、酵素、蛍光標識、発色団、色素、１又は２以上の金属イオン、又はリガンド系標識を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、イメージング剤は、放射性同位体を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、放射性同位体は、インジウム又はテクネチウムである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、造影剤は、ヨウ素、ガドリニウム又は酸化鉄を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はβ−ガラクトシダーゼを含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、発光標識は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、修正赤色蛍光タンパク質（ｍＲＦＰ）、赤色蛍光タンパク質tdimer2 (ＲＦＰ  tdimer2)、ＨＣＲＥＤ、又はユーロピウム誘導体を包含する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、発光標識は、Ｎ−メチルアクリジウム誘導体を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、標識は、Alexa Fluor（登録商標）標識、例えばAlex Fluor（登録商標）６８０又はAlexa Fluor（登録商標）７５０を包含する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、リガンド系標識は、ビオチン、アビジン、ストレプタビジン、又は１又は２以上のハプテンを包含する。
【０３６９】
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、対象は哺乳類である。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、対象はヒトである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、対象は非ヒト哺乳類、例えば非ヒト霊長類、愛玩動物（例えば、ネコ、イヌ、ウマ）、家畜、作業動物又は動物園の動物である。いくつかの実施形態によれば、対象は齧歯動物である。
【０３７０】
それらの方法のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、インビボ方法である。それらの方法のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、現場方法である。それらの方法のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、エクスビボ方法である。それらの方法のいくつかの実施形態によれば、前記方法は、インビトロ方法である。
【０３７１】
いくつかの実施形態によれば、インサイチュイメージング及び／又はインビボイメージングは、治療する患者を同定する方法において有用である。例えば、インサイチュイメージングによれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、適切な位置で、例えば腫瘍部位で、適切なプロテアーゼ及び標的物を有するそれらの患者を同定するために、患者サンプルをスクリーニングするために使用される。
【０３７２】
いくつかの実施形態によれば、インサイチュイメージングが、本開示の抗−Jagged活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、細分するために使用される。例えば、標的物（例えば、Jagged1及び/又はJagged2）、及び試験される抗−Jagged活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）（例えば、疾患部位で活性化抗体を蓄積する）における基質を切断するプロテアーゼの両者に対して陽性の患者が、そのようなＣＭを含む抗−Jagged活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定される。同様に、標的物（例えば、Jagged1及び/又はJagged2）、及びそれらの方法を用いて試験される活性化可能抗体中のＣＭにおいて基質を切断するプロテアーゼの何れか又は両者に対して陰性の患者が、別の形の療法のための適切な候補体として同定される。いくつかの実施形態によれば、第１の抗−Jagged活性化可能抗体に関して陰性のそのような患者は、治療のための適切な抗−Jagged活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭを含む抗−Jagged活性化可能抗体）が同定されるまで、異なったＣＭを含む他の抗−Jagged活性化可能抗体により試験され得る。
【０３７３】
いくつかの実施形態によれば、インビボイメージングは、本開示の抗−Jagged活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか又は細分するために使用される。例えば、標的物（例えば、Jagged1及び/又はJagged2）、及び試験される抗−Jagged活性化可能抗体の切断可能部分（ＣＭ）（例えば、疾患部位で活性化抗体を蓄積する）における基質を切断するプロテアーゼの両者に対して陽性の患者が、そのようなＣＭを含むそのような抗−Jagged活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定される。同様に、陰性の患者が、別の形の療法（すなわち、試験される抗−Jagged活性化可能抗体による治療のためには適切でない）のための適切な候補体として同定される。いくつかの実施形態によれば、第１の抗−Jagged活性化可能抗体に関して陰性のそのような患者は、治療のための適切な抗−Jagged活性化可能抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭを含む抗−Jagged活性化可能抗体）が同定されるまで、異なったＣＭを含む他の抗−Jagged活性化可能抗体により試験され得る。
【０３７４】
それらの方法及び／又はキットのいくつかの実施形態によれば、方法及び／又はキットは、開示の抗−Jagged活性化可能抗体による治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、細分し、例えば層別化するために使用される。例えば、標的物（例えば、Jagged1及び/又はJagged2）及びそれらの方法において試験される抗−Jagged活性化可能抗体の切断部分（ＣＭ）において基質を切断するプロテアーゼの両者について検査陽性である患者は、そのようなＣＭを含むそのような抗−Jagged活性化可能抗体による治療のための適切な候補体として同定される。同様に、標的物（例えば、Jagged1及びJagged2）、及びそれらの方法を用いて試験される活性化可能抗体中のＣＭにおける基質を切断するプロテアーゼの何れか又は両者について検査陰性である患者は、別の治療形のための適切な候補体として同定される（すなわち、試験される抗−Jagged活性化可能抗体による治療のために適切でない）。いくつかの実施形態によれば、そのような患者は、治療のための適切な抗−Jagged活性化可能抗体（例えば、患者の部位で患者により切断されるＣＭを含む抗−ＥＧＦＲ活性可能抗体）が同定されるまで、他の抗−Jagged活性化可能抗体により検査され得る。いくつかの実施形態によれば、標的物（例えば、Jagged1又はJagged2）の何れかに対して陰性である患者は、そのようなＣＭを含むそのような活性化可能抗−Jagged抗体による治療のための適切な候補体として同定される。いくつかの実施形態によれば、標的物（例えば、Jagged1又はJagged2）の何れかに対して陰性である患者は、そのようなＣＭを含むそのような活性化可能抗−Jagged抗体による治療のための適切な候補体ではないものとして同定される。いくつかの実施形態によれば、そのような患者は、治療のための適切な抗−Jagged活性化可能抗体（例えば、患者の部位で患者により切断されるＣＭを含む抗−ＥＧＦＲ活性可能抗体）が同定されるまで、他の抗−Jagged活性化可能抗体により検査され得る。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、治療剤が結合される活性化可能抗−Jagged抗体である。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、剤に結合されな。いくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、検出可能標識を含む。いくつかの実施形態によれば、検出可能標識は、ＡＢ上に位置する。いくつかの実施形態によれば、対象又はサンプルにおける活性化可能抗−Jagged抗体のレベルの測定は、活性化された抗体に対して特異的に結合する二次試薬を用いて達成され、ここで前記試薬は検出可能標識を含む。いくつかの実施形態によれば、前記二次試薬は、検出可能標識を含む抗体である。
【０３７５】
いくつかの実施形態によれば、開示の抗−Jagged活性化可能抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体（例えば、治療剤が結合される活性化可能抗体）による治療、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を、その必要な対象に投与することによる続く治療のために適切な患者集団を同定するか、又は他方では、細分するために、方法又はキットが使用される。例えば、標的物（例えば、Jagged1及びJagged2）、及びそれらの方法において試験される活性化可能抗−Jagged抗体及び/又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体の切断可能部分（ＣＭ）における基質を切断するプロテアーゼの両者についての検査で陽性である患者が、そのようなＣＭを含むそのような抗体及び/又はそのような複合化活性化可能抗−Jagged抗体による治療のための適切な候補体として同定され、そして次に、前記患者は、治療的有効量の試験された活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を投与される。同様に、標的物（例えば、Jagged1及び/又はJagged2）、及びそれらの方法を用いて試験される活性化可能抗−Jagged抗体のＣＭにおける基質を切断するプロテアーゼの何れか、又は両者についての検査で陰性である患者は、別の形の治療のための適切な候補体として同定され得る。いくつかの実施形態によれば、そのような患者は、治療のための適切な抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体（例えば、疾患の部位で患者により切断されるＣＭを含む、活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体）が同定されるまで、他の抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体により試験され得る。いくつかの実施形態によれば、次に、検査で陽性であった患者は、治療的有効量の活性化可能抗−Jagged抗体及び／又は複合化活性化可能抗−Jagged抗体を投与される。
【０３７６】
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、ＭＭは、約４〜４０個の長さのアミノ酸を有するペプチドである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、リンカーペプチドを含み、ここで前記リンカーペプチドは、ＭＭとＣＭとの間に位置する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、リンカーペプチドを含み、ここで前記リンカーペプチドは、ＡＢとＣＭとの間に位置する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、活性化可能抗−Jagged抗体は、第１リンカーペプチド（Ｌ１）及び第２リンカーペプチド（Ｌ２）を含み、ここで前記第１リンカーペプチドはＭＭとＣＭとの間に位置し、そして前記第２リンカーペプチドはＡＢとＣＭとの間に位置する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、各Ｌ１及びＬ２は約１〜２０個の長さのアミノ酸のペプチドであり、そして各１及びＬ２は同じリンカーである必要はない。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、Ｌ１及びＬ２の１つ又は両者は、グリシン−セリンポリマーである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、Ｌ１及びＬ２の少なくとも１つは、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ (配列番号１２３)及び（ＧＧＧＳ）ｎ (配列番号１２４)（ここで、ｎは少なくとも１つの整数である）から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、Ｌ１及びＬ２の少なくとも１つは、式（ＧＧＳ）ｎ（ここで、ｎは少なくとも１の整数である）を有するアミノ酸配列を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、Ｌ１及びＬ２の少なくとも１つは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号１２５)、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ (配列番号１２６)、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号１２７)、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ (配列番号１２８)、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号１２９)及び Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ (配列番号１３０)から成る群から選択されたアミノ酸配列を含む。
【０３７７】
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、ＡＢは、本明細書に提供される交差反応性抗−Jagged抗体配列から選択された抗体又は抗体フラグメント配列を含む。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、ＡＢは、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ又は単鎖抗体（ｓｃＡｂ）を含む。
【０３７８】
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、切断剤は、Jagged標的物と、対象又はサンプルにおいて共局在するプロテアーゼであり、そしてＣＭはプロテアーゼのための基質として機能するポリペプチドであり、ここで、活性化可能抗−Jagged抗体がプロテアーゼに供される場合、前記プロテアーゼは、活性化可能抗−Jagged抗体におけるＣＭを切断する。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、ＣＭは、１５個までの長さのアミノ酸ポリペプチドである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、ＣＭは、ＡＢのＮ末端にカップリングされる。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、ＣＭは、ＡＢのＣ末端にカップリングされる。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、ＣＭは、ＡＢのＶＬ鎖のＮ末端にカップリングされる。
【０３７９】
それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、切断剤は酵素であり、そしてＣＭは酵素のための基質である。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、酵素は本明細書に開示されるプロテアーゼである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、酵素は本明細書に開示されるプロテアーゼの１つである。それらの方法及びキットのいくつかの実施形態によれば、プロテアーゼは、ｕＰＡ、レグマイン、ＭＴ−ＳＰ１、ＡＤＡＭ１７、ＢＭＰ−１、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ４、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３及びＭＭＰ−１４から成る群から選択される。
【０３８０】
抗−Jagged抗体の治療的投与及び処方
本発明の治療剤が、改良された転送、送達、耐性及び同様のものを提供するために製剤中に組込まれる、適切な担体、賦形剤及び他の剤と共に投与されることは理解されるであろう。多数の適切な製剤が、すべての製薬化学者に周知の処方に見出され得る：Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975))、特にそこにおける、Blaug、Seymourによるチャプター８７。それらの製剤は、例えば粉末、ペースト、軟膏、ジェリー、ワックス、オイル、脂質、脂質（カチオン性又はアニオン性）含有小胞（例えば、Lipofection（登録商標））、ＤＮＡ結合体、無水吸水性ペースト、水中油型及び油中水型エマルジョン、エマルジョンカーボワックス（種々の分子量のポリエチレングリコール）、半固体状ゲル、及びカーボワックスを含む半固体状混合物を包含する。前述の混合物のいずれかが、製剤中の活性成分が製剤化により不活性化されず、そして製剤が生理学的に適合でき、そして投与の経路で許容できる場合、本発明による治療及び療法において適切であり得る。また、Baldrick P. “Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance.” Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. “Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals.” Int. J. Pharm. 203(1-2):1-60 (2000), Charman WN “Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts.” J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. “Compendium of excipients for parenteral formulations” PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998)、及び製薬化学者に周知の製剤、賦形剤及び担体に関連する追加の情報についてのそこにおける引用も参照のこと。
【０３８１】
いくつかの実施形態によれば、癌又は線維性障害を治療するために使用される抗−Jagged抗体、活性化可能抗−Jagged抗体及び抗−Jagged抗体組成物は、１又は２以上の追加の剤又は追加の剤の組合せに関連して使用される。適切な追加の剤は、意図される用途のための現医薬品及び／又は外科的療法を包含する。例えば、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体は、追加の化学療法剤又は抗腫瘍剤と組合して使用され得る。例えば、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体、及び追加の剤は、単一治療用組成物に製剤化され、そして抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体、及び追加の剤は、同時に投与される。他方では、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体、及び追加の剤は、お互い別々であり、例えば個々が別々の治療用組成物に製剤化され、そして抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体、及び追加の剤は同時に投与されるか、又は抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体、及び追加の剤は、治療レジメの間、異なる時点で投与される。例えば、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体は、追加の剤の投与の前、投与され、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体は、追加の剤の投与に続いて投与されるか、又は抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体、及び追加の剤は交互に投与される。本明細書に記載されるように、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体、及び追加の剤は単回投与又は複数回投与で投与される。
【０３８２】
いくつかの実施形態によれば、追加の剤は、抗−Jagged抗体及び／又は活性化可能抗−Jagged抗体にカップリングされるか、又は他方では、結合される。
【０３８３】
適切な追加の剤は、意図される用途（すなわち、殺傷、細胞増殖の予防、ホルモン療法又は遺伝子療法）に従って選択される。そのような剤は、次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：医薬剤、毒素、毒素のフラグメント、アルキル化剤、酵素、抗体、代謝拮抗剤、抗増殖剤、ホルモン、神経伝達物質、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、アンチセンスＲＮＡ、アプタマ―、診断剤、放射腺不透過染料、放射性同位体、蛍光性化合物、磁気標識、ナノ粒子、マーカー化合物、レクチン、細胞膜透過性を変更する化合物、光化学化合物、小分子、リポソーム、ミセル、遺伝子治療ベクター、ウィルスベクター、及び同様のもの。最後に、剤の組み合わせ、又は異なった種類の剤の組み合わせが使用され得る。
【０３８４】
本発明の抗体及び／又は活性化可能抗体（又は、「活性化合物」として本明細書において言及される）、その誘導体、フラグメント、類似体及び相同体は、投与のために適切な医薬組成物中に組み込まれ得る。そのような組成物の調製に関与する原理及び考慮、及び成分の選択のガイドは、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, et al., editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa. : 1995; Drug Absorption Enhancement : Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; and Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New Yorkに提供される。
【０３８５】
そのような組成物は典型的には、抗体及び医薬的に許容できる担体を含む。活性化可能抗体がＡＢドメインのフラグメントを含む場合、標的タンパク質の結合ドメインに対して特異的に結合するＡＢの最小フラグメントが使用され得る。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列を結合するＡＢの能力を保持するペプチド分子が企画され得る。そのようペプチドは、化学的に合成され、そして／又は組換えＤＮＡ技法により生成され得る（例えば、Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)を参照のこと）。
【０３８６】
本明細書において使用される場合、用語「医薬的に許容できる担体（pharmaceutically acceptable carrier）」とは、医薬投与に適合できる、何れか及びすべての溶媒、分散媒体、コーチング、抗菌及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、及び同様のものを含むよう意図される。適切な担体は、参照により本明細書に組込まれる、分野的標準参考テキストである、Remington’s Pharmaceutical Scienceの最新版に記載される。そのような担体又は希釈剤の適切な例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース液体、及び５％ヒト血清アルブミンを包含するが、但しそれらだけには限定されない。リボソーム及び非水性ビヒクル、例えば固定油がまた使用され得る。医薬敵活性物質のためのそのような媒体及び剤の使用は、周知である。何れかの従来の媒体又は剤が活性化合物と不適合である限りを除いて、組成物へのそれらの使用が企画される。
【０３８７】
インビボ投与のために使用される製剤は、無菌であるべきである。これは、滅菌濾過膜を通しての濾過により、容易に達成される。
【０３８８】
本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合できるよう処方される。投与経路の例は、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（すなわち、局所）、経粘膜、及び直腸投与を包含する。非経口、皮内又は皮下適用のために使用される溶液又は懸濁液は次の成分を含むことができる：無菌希釈剤、例えば注射用蒸留水、生理食塩水溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコール又はメチルパラベン；酸化防止剤、例えばアスコルビン酸又は亜流酸水素ナトリウム；キレート剤、例えばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝液、例えば酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩及び張性の調整のための剤、例えば塩化ナトリウム又はデキストロース。ｐＨは、酸又は塩基、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムにより調節され得る。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器、又はガラス又はプラスチック製の複数投与バイアル中に封入され得る。
【０３８９】
注射使用に適した医薬組成物は、無菌注射用溶液又は分散液の即時調整のための無菌水溶液（ここで、水溶性）又は分散液、及び無菌粉末を含む。静脈内投与に関しては、適切な担体は、生理食塩水、静菌水、Cremophor EL（登録商標）（BASF、Parsippany, N.J.）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。すべての場合、組成物は、無菌であるべきであり、そして容易な注射針通過性が存在する程度に流動する必要がある。それは、製造及び貯蔵の条件下で安定性でなければならず、そして微生物、例えば細菌及び菌類の汚染作用に対して保存されるべきである。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、及び同様のもの）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散性媒体であり得る。適切な流動性は、例えばコーチング、例えばレシチンの使用により、分散液の場合、必要とされる粒度の維持により、及び界面活性剤の使用により維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール及び同様のものにより達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを、組成物に含むことが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延する剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを、組成物に含むことによりもたらされ得る。
【０３９０】
無菌注射用溶液は、上記に列挙される１つの成分又は成分の組合せと共に、適切な溶媒に、必要とされる量の活性化合物を組込むことにより、必要なら、続いて濾過殺菌により調製され得る。一般的に、分散液は、塩基性分散液媒体及び上記に列挙されるそれらからの必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクル中に、活性化合物を組み込むことにより調製される。注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、活性成分の粉末、及び前もって無菌濾過された溶液からの任意の追加の所望する成分の粉末を生成する、真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０３９１】
経口組成物は一般的に、不活性希釈剤又は食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセルに封入されるか、又は錠剤に圧縮される。経口治療投与のためには、活性化合物が、賦形剤と共に組込まれ、そして錠剤、トローチ又はカプセルの形で使用され得る。経口組成物はまた、マウスウォシュとしての使用のために流体担体を用いて調製され得、ここで流体担体中、化合物が経口適用され、うがいされ、そして吐き出されるか、又は飲み込まれる。医薬的に適用できる結合剤及び／又はアジュバント材料が、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、ピル、カプセル、トローチ及び同様のものは、次の成分、又は類似する性質の化合物の何れかを含むことができる：結合剤、例えば微結晶性セルロース、トラガカントゴム又はゼラチン；賦形剤、例えば澱粉又はラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル又はコーンスターチ；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム又はステローツ（Sterotes）；流動促進剤、例えばコロイド状二酸化珪素；甘味剤、例えばスクロース又はサッカリン；又は風味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル又はオレンジ香料。
【０３９２】
吸入による投与に関しては、化合物は、適切な推進剤、例えばガス、例えば二酸化炭素を含む加圧された容器又は分散器、又はネブライザーからエアロゾル噴霧の形で供給される。
【０３９３】
全身性投与はまた、経粘膜又は経皮手段によるものであっても良い。経粘膜又は経皮投与に関しては、浸透されるバリアに適切な浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は一般的に周知であり、そして例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩、及びフシジン酸誘導体を包含する。経粘膜投与は、鼻用スプレー又は坐剤の使用を通して達成され得る。経皮投与に関しては、活性化合物は、一般的に当業界において知られているように、軟膏、膏剤、ゲル又はクリーム中に処方される。
【０３９４】
化合物はまた、直腸送達のためには、坐剤（例えば、従来の坐剤基材、例えばココナツバター及び他のグリセリドを含む）、又は保持浣腸の形でも調製され得る。
【０３９５】
１つの実施形態によれば、活性化合物は、身体からの急速な排除に対して化合物を保護するであろう担体、例えば制御放出製剤、例えばインプラント及びマイクロカプセル化送達システムにより調製される。生分解性、生体適合性ポリマー、例えばエチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸が使用され得る。そのような製剤の調製方法は、当業者に明らかであろう。
【０３９６】
例えば、活性成分はまた、それぞれ、コロイド状薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミン微小球、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）下で、又はマイクロエマルジョン下で、液滴形成技法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに閉じ込められ得る。
【０３９７】
徐放性製剤が調製され得る。除放性製剤の適切な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスを包含し、ここでマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形で存在する。除放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ−（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸及びγエチル−Ｌ−グルタノートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グルコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（登録商標）（乳酸−クリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射用微小球）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を包含する。ポリマー、例えばエチレン−酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸は１００日間にわたって分子を放出できるが、ある種のヒドロゲルは、より短い期間、タンパク質を放出する。
【０３９８】
材料はまた、Alza Corporation and Nova Pharmaceuticals, Incから商業的に得られる。リポソーム懸濁液（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体により、感染された細胞に標的化されるリポソームを含む）はまた、医薬的に許容できる担体としても使用され得る。それらは、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるように、当業者に知られている方法に従って調製され得る。
【０３９９】
容易な投与及び投薬量の均一性のために、投薬単位形で、経口又は非経口組成物を処方することが特に好都合である。投薬単位形とは、本明細書において使用される場合、治療される対象のために単位投与量として適した物理的に別個の単位を言及し；各単位は、必要とされる医薬担体と共に所望する治療効果を生成するために計算された所定量の活性化合物を含む。本発明の単位剤形の仕様は、活性化合物の固有の特性及び達成される特定の治療効果、及び個人の治療のために活性化合物を配合する技術的に固有の制限により決定され、そしてそれらに直接的に依存する。
【０４００】
医薬組成物は、投与についての説明書と共に、容器、パック又はディスペンサーに含まれ得る。
【０４０１】
製剤はまた、治療される特定の徴候のために必要な１以上の活性化合物、好ましくは、お互い悪影響を与えない相補的活性を有するそれらのものも含むことができる。他方では、又はさらに、組成物は、その機能を増強する剤、例えば細胞毒性剤、サイトカイン、化学療法剤、又は成長阻害剤を含むことができる。そのような分子は、意図する目的のために効果的である量での組合せで適切に存在する。
【０４０２】
１つの実施形態によれば、活性化合物は、併用療法で投与され、すなわち病理状態又は障害、例えば自己免疫障害及び炎症性疾患の治療のために有用である他の剤、例えば治療剤と組合される。本明細書における用語「組合して（in combination）」とは、剤が実質的に同時に、例えば同時又は逐次的に与えられることを意味する。逐次的に与えられる場合、第２化合物の投与の開始時で、２種の化合物のうち最初の化合物は、治療の部位で、有効濃度で、まだ検出できる。
【０４０３】
例えば、併用療法は、１又は２以上の追加の治療剤、例えば、下記に詳細に記載されるような、１又は２以上のサイトカイン及び成長因子阻害剤、免疫抑制剤、抗炎症剤、代謝阻害剤、酵素阻害剤及び／又は細胞毒素又は細胞増殖抑制剤と共に同時処方され、そして／又は同時投与される本発明の１又は２以上の抗体を含むことができる。さらに、本明細書に記載される１又は２以上の抗体は、本明細書に記載される複数の治療剤と組合して使用され得る。そのような併用療法は、投与される治療剤の低容量を都合良く用い、従って、種々の単独療法に関連する可能せある毒性又は合併症を回避する。
【０４０４】
他の実施形態によれば、本発明の１又は２以上の抗体が、１又は２以上の抗炎症剤、免疫抑制剤、又は代謝又は酵素阻害剤と共に同時処方され、そして／又は同時投与され得る。本明細書に記載される抗体と組合して使用され得る薬物又は阻害剤の非制限的例は、１又は２以上の次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、例えばイブプロフェン、テニダップ、ナプロキセン、メロキシカム、ピロキシカム、ジクロフェナク、およびインドメタシン；スルファサラジン；コルチコステロイド、例えばプレドニゾロン；サイトカイン抑制性抗炎症剤（ＣＳＡＩＤ）；ヌクレオチド生合成の阻害剤、例えばプリン生合成の阻害剤、葉酸拮抗薬（例えば、メトトレキサート（Ｎ− ［４ − ［［（２，４−ジアミノ−６−プテリジニル）メチル]メチルアミノ]ベンゾイル] −Ｌ−グルタミン酸）；及びピリミジン生合成の阻害剤、例えばジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）阻害剤。本発明の抗体と組合しての使用のための適切な治療剤は、ＮＳＡＩＤ、ＣＳＡＩＤ、（ＤＨＯＤＨ）阻害剤（例えば、レフルノミド）、及び葉酸拮抗薬（例えば、メトトレキサート）を包含する。
【０４０５】
追加の阻害剤の例としては、次の１又は２以上のものを包含する：コルチコステロイド（経口、吸入及び局所注射）；免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ−５０６）；及びｍＴＯＲ阻害剤、例えば、シロリムス（ラパマイシン − ＲＡＰＡＭＵＮＥ（登録商標）又はラパマイシン誘導体、例えば、可溶性ラパマイシン誘導体（例えば、エステルラパマイシン誘導体、例えばＣＣＩ−７７９）；前炎症性サイトカイン、例えばＴＮＦα又はＩＬ−１によりシグナル伝達を干渉する剤（例えば、ＩＲＡＫ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ｐ３８又はＭＡＰキナーゼ阻害剤）；ＣＯＸ２阻害剤、例えば、セレコキシブ、ロフェコキシブ、及びそれらの変異体；ホスホジエステラーゼ阻害剤、例えばＲ９７３４０１（ホスホジエステラーゼIV型阻害剤）；ホスホリパーゼ阻害剤、例えば細胞質ゾルホスホリパーゼ２の阻害剤（ｃＰＬＡ２）（例えば、トリフルオロメチルケトン類似体）；血管内皮細胞増殖因子又は成長因子受容体の阻害剤、例えばＶＥＧＦ阻害剤及び/又はＶＥＧＦ−Ｒ阻害剤；及び血管新生の阻害剤。本発明の抗体と組合しての使用のための適切な治療剤は、つぎのものを包含する：免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、タクロリムス（ＦＫ５０６）；ｍＴＯＲ阻害剤、例えばシロリムス（ラパマイシン）又はラパマイシン誘導体、例えば可溶性ラパマイシン誘導体（例えば、エステルラパマイシン誘導体、例えば、ＣＣＩ−７７９）；ＣＯＸ２阻害剤、例えば、セレコキシブ及びそれらの変異体；及びホスホリパーゼ阻害剤、例えば細胞質ゾルホスホリパーゼ２の阻害剤（ｃＰＬＡ２）、例えば、トリフルオロメチルケトン類似体。
【０４０６】
本発明の抗体を組合わされ得る治療剤の追加の例は、次のものを包含する：６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）;アザチオプリンスルファサラジン；メサラジン；オルサラジン；クロロキン/ヒドロキシクロロキン(ＰＬＡＱＵＥＮＩＬ（登録商標）)；ペニシラミン；アウロチオりんご酸（筋肉内及び経口）；アザチオプリン；コルヒチン；β−２アドレナリン受容体アゴニスト（サルブタモール、テルブタリン、サルメテロール）；キサンチン（テオフィリン、アミノフィリン）；クロモグリク；ネドクロミル；ケトチフェン；イプラトロピウム及びオキシトロピウム；ミコフェノール酸モフェチル；アデノシンアゴニスト;抗血栓剤；補体阻害剤；及びアドレナリン作動薬。
【０４０７】
他の治療剤の企画及び生成
本発明によれば、及びJagged1及び/又はJagged2に関して、本明細書において生成され、そして特徴付けられる抗体の活性に基づいて、抗体部分の他に他の治療様式の企画が促進される。そのような様式は、次ものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：高度抗体治療薬、例えば、二重特異的抗体、免疫毒素、及び放射性標識された治療薬、ペプチド治療薬の生成、遺伝子療法、特に細胞内抗体、アンチセンス療法、及び小分子。
【０４０８】
例えば、二重特異的抗体に関して、(ｉ) Jagged1及びJagged2に関して特異性を有する１つの抗体及び一緒に組合わされる第２抗体に対して特異性を有する別の抗体を有する２種の抗体、（ｉｉ）Jagged1及びJagged2に対して特異的な１つの鎖、及び第２分子に対して特異的な第２の鎖を有する単一抗体、又は（ｉｉｉ）Jagged1及びJagged2に対して特異性を有する単鎖抗体及び第２分子を含む二重特異性抗体が生成され得る。そのような二重特異性抗体は、良く知られている技法を用いて生成される：例えば（ｉ）及び（ｉｉ）に関しては、例えば、Fanger et al. Immunol Methods 4:72-81 (1994) 及び Wright et al. Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992)を参照し、そして（ｉｉｉ）に関しては、例えばTraunecker et al. Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52 (1992)を参照のこと。
【０４０９】
免疫毒性に関しては、抗体は、当業界において知られている技法を用いて、免疫毒素として作用するよう修飾され得る。例えば、Vitetta Immunol Today 14:252 (1993)、及び米国特許第５，１９４，５９４号を参照のこと。放射性標識された抗体の調製に関しては、そのような修飾された抗体が、当業界において良く知られている技法を用いて、容易に調製され得る。例えば、Junghans et al. in Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996))、及び米国特許第４，６８１，５８１号、第４，７３５，２１０号、第５，１０１，８２７号、第５，１０２，９９０ (RE ３５，５００) 号、第５，６４８，４７１号、及び第５，６９７，９０２号を参照のこと。各免疫毒性及び放射性標識された分子はたぶん、Jagged１ 、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者を発現する細胞を殺害できるであろう。
【０４１０】
治療用ペプチドの生成に関して、Jagged１ 、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者、及びそれらに対する抗体、例えば本発明の抗体に関連する構造情報、又はペプチドライブラリーのスクリーニングを通して、Jagged１ 、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者に対して向けられる治療用ペプチドが生成され得る。ペプチド治療剤の企画及びスクリーニングは、Houghten et al. Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985), Pinalla et al. Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake and Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992)により論じられている。免疫毒素及び放射性標識された分子はまた、抗体に関連して上述されたように、ペプチド部分に関連して、類似する態様で調製され得る。Jagged１分子、Jagged２分子、及び／又はJagged１分子及びJagged２分子の両者（又は、形、例えばスプライス変異体又は別の形）が疾患工程において機能的に活性である場合、従来の技法を通して遺伝子及びそれに対するアンチセンス治療薬を企画することもまた可能であろう。そのような形式は、Jagged１ 、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者の機能を調節するのに使用され得る。それに関連して、本発明の抗体は、それに関する機能的アッセイの企画及び使用を促進する。アンチセンス治療剤についての企画及び戦略は、国際公開第９４／２９４４４号に詳細に論じられている。遺伝子療法についての企画及び戦略は良く知られている。しかしながら、特に、細胞内抗体を包含する遺伝子治療技法の使用は、特に好都合であることがわかっている。例えば、Chen et al. Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) and Marasco Gene Therapy 4:11-15 (1997)を参照のこと。遺伝子療法に関する一般的企画及び考慮は、国際公開第９７／３８１３７号にも論じられている。
【０４１１】
Jagged１分子、Jagged２分子、及び／又はJagged1分子及びJagged2分子の両者の構造、及び本発明の他の分子、例えば本発明の抗体及び他のものとのその相互作用から収集される知識が、追加の治療形式を合理的に企画するために利用され得る。この点に関して、合理的薬物企画技法、例えばX−線結晶解析、コンピューター支援（又は助力）分子モデリング（ＣＡＭＭ）、定量的又は定性的構造活性相関（ＱＳＡＲ）、及び類似する技法が、創薬努力を集中するために利用され得る。合理的企画は、Jagged１ 、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者の活性を修飾するか又は調節するために使用され得る分子又はその特定形と相互作用できるタンパク質又は合成構造の予測を可能にする。そのような構造体は、化学的に合成され得るか、又は生物学的システム下で発現され得る。このアプローチは、Capsey et al. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)に再考されている。さらに、組合せライブラリーが企画され、そして合成され、そしてスクリーニングプログラム、例えば高処理スクリーニング努力下で使用される。
【０４１２】
スクリーニング方法
本発明は、Jagged１、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者のシグナル伝達機能を、調節し、阻止し、阻害し、低め、拮抗し、中和し、又は他方では、干渉する、それらの生来の受容体、又は候補体、又は試験化合物又は剤へのJagged１、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者の結合を調節し、阻止し、阻害し、低め、拮抗し、中和し、又は他方では、干渉する、モジュレーター、すなわち候補体又は試験化合物又は剤（例えば、ペプチド、ペプチド擬似体、小分子、又は他の薬物）を同定するための方法（また、本明細書においては、「スクリーニングアッセイ」とも呼ばれる）を提供する。Jagged１ 、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者シグナル伝達に関連する障害を治療するために有用な化合物を同定する方法もまた提供される。本発明はまた、本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにより同定される化合物も包含する。
【０４１３】
１つの実施形態によれば、本発明は、Jagged１、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者のシグナル伝達機能を調整する候補体又は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当業界において知られている組合せライブラリー、例えば生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平衡固相又は液相ライブラリー；デコンボリューションを要する合成ライブラリー法；「ワン−ビーズワン−化合物」（one-bead one-compound）ライブラリー方法；及び親和性クロマトグラフィー選択を用いての合成ライブラリー方法による多くのアプローチの何れかを用いて得られる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに制限されるが、ところが他のアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴまー又は化合物の小分子ライブラリーに適用できる（例えば、Lam, 1997. Anticancer Drug Design 12: 145を参照のこと）。
【０４１４】
「小分子（small molecule）」とは、本明細書において使用される場合、約５ｋＤ以下、及びいくつかの実施形態によれば、約４ｋＤ以下の分子量を有する組成物を表すことを意味する。小分子は、例えば核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド擬似体、炭水化物、脂質又は他の有機又は無機分子であり得る。化学的及び／又は生物学的混合物、例えば菌類、細菌又は藻類抽出物のライブラリーが、当業界において知られており、そして本発明の何れかのアッセイによりスクリーニングされ得る。
【０４１５】
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当業界において、例えばDeWitt, et al., 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6909; Erb, et al., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 11422; Zuckermann, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 2678; Cho, et al., 1993. Science 261: 1303; Carrell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell, et al., 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061; 及びGallop, et al., 1994. J. Med. Chem. 37: 1233に見出され得る。
【０４１６】
化合物のライブラリーは、溶液で（例えば、Houghten, 1992. Biotechniques 13: 412-421を参照のこと）、又はビーズ上（Lam, 1991. Nature 354: 82-84を参照のこと）、チップ上に（Fodor, 1993. Nature 364: 555-556を参照のこと）、細菌上に（米国特許第５，２２３，４０９号を参照のこと）、胞子上に（米国特許第５，２３３，４０９号を参照のこと）、プラスミド上に（Cull, et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1865-1869を参照のこと）、又はファージ上に（Scott and Smith, 1990. Science 249: 386-390; Devlin, 1990. Science 249: 404-406; Cwirla, et al., 1990. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 6378-6382; Felici, 1991. J. Mol. Biol. 222: 301-310; 及び米国特許第５，２３３，４０９号を参照のこと）、提供され得る。
【０４１７】
１つの実施形態によれば、候補体化合物は、抗体−抗原複合体に導入され、そして候補体化合物が抗体−抗原複合体を破壊するかどうかを決定し、ここでこの複合体の破壊が、候補体化合物がJagged１ 、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者のシグナル伝達機能を調節することを示唆する。
【０４１８】
別の実施形態によれば、Jagged1及びJagged2の両者が提供され、そして少なくとも１つのモノクローナル抗体に供される。抗体−抗原複合体の形成が検出され、そして１又は２以上の候補体化合物がその複合体中に導入される。抗体−抗原複合体が、１又は２以上の候補体化合物の導入に続いて破壊される場合、候補体化合物は、Jagged１ 、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者シグナル伝達に関連する障害を治療するために有用である。
【０４１９】
別の実施形態によれば、本発明の可溶性タンパク質が提供され、そして少なくとも１つの中和モノクローナル抗体に供される。抗体−抗原複合体の形成が検出され、そして１又は２以上の候補体化合物が複合体に導入される。抗体−抗原複合体が１又は２以上の候補体化合物の導入に続いて、破壊される場合、候補体化合物は、Jagged１ 、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者シグナル伝達に関連する障害を治療するために有用である。
【０４２０】
抗体−抗原複合体を干渉するか又は破壊する試験化合物の能力の決定は、例えば放射性同位体又は酵素標識により試験化合物をカップリングすることにより達成され、結果的に抗原又はその生物学的活性部分への試験化合物の結合は、複合体における標識された化合物を検出することにより決定され得る。例えば、試験化合物は、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ又は3Ｈにより、直接的に又は間接的に標識され、そして放射性同位体は放射線放出の直接的計数により、又はシンチレーション計数により検出される。他方では、試験化合物は、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はルシフェラーゼにより酵素的に標識され、そして酵素標識は、適切な基質の生成物への転換の決定により検出される。
【０４２１】
１つの実施形態によれば、アッセイは、抗体−抗原複合体と試験化合物とを接触し、そして抗原と相互反応するか、又は他方では、存在する抗体−抗原複合体を破壊する試験化合物の能力を決定することを包含する。この実施形態によれば、抗原と相互反応し、そして／又は抗体−抗原複合体を破壊する試験化合物の能力の決定は、抗体に比べて、抗原又は生物学的活性のその一部を選択的に結合する試験化合物の能力の決定を包含する。
【０４２２】
別の実施形態によれば、アッセイは抗体−抗原複合体と試験化合物との接触、及び抗体−抗原複合体を調節する試験化合物の能力の決定を包含する。抗体−抗原複合体を調節する試験化合物の能力の決定は、例えば試験化合物の存在下で、抗体に結合するか、又は抗体と相互反応する抗原の能力の決定により達成され得る。
【０４２３】
本明細書に開示されるスクリーニング方法は、細胞に基づくアッセイ又は無細胞アッセイとして行われ得る。本発明の無細胞アッセイは、可溶性Jagged１、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者及びそのフラグメントの使用に適している。
【０４２４】
複数の実施形態によれば、候補体化合物の導入に続いて、複合体化された１つ又は両者の未複合体化形からの分離を促進し、そしてアッセイの自動化に対応するよう、抗体又は抗原の何れかを固定することが所望される。候補体化合物の存在及び不在下での抗体−抗原複合体の観察は、反応体を含むのに適切な何れかの容器において達成され得る。そのような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管及びマイクロ遠心管を包含する。１つの実施形態によれば、１又は両タンパク質のマトリックスへの結合を可能にするドメインを付加する融合タンパク質が提供され得る。例えば、ＧＳＴ−抗体融合タンパク質、又はＧＳＴ−抗原融合タンパク質が、グルタチオンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St. Louis, MO）、又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着され、次に、試験化合物と組合わされ、そして混合物が、複合体形成を誘導する条件下で（例えば、塩及びｐＨについての生理学的条件化で）インキュベートされる。インキュベーションに続いて、ビーズ又はマイクロタイタープレートのウェルが洗浄され、未結合成分が除去され、マトリックスがビーズの場合、固定され、複合体が直接的に又は間接的に決定される。他方では、複合体がマトリックスから解離され、そして抗体−抗原複合体の形成レベルが標準技法を用いて決定され得る。
【０４２５】
マトリックス上にタンパク質を固定するための他の技法がまた、本発明のスクリーニングアッセイに使用され得る。例えば、抗体又は抗原（例えば、Jagged１、Jagged２、及び／又はJagged1及びJagged2の両者）の何れかが、ビオチン及びストレプタビジンの結合を利用して固定化され得る。ビオチニル化された抗体又は抗原分子は、当業界において良く知られている技法（例えば、ビオチニル化キット、Pierce Chemicals, Rockford, Ill）を用いて、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から調製され、そしてストレプタビシン被覆された９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定される。他方では、目的の抗体又は抗原と反応性であるが、しかし目的の抗体−抗原複合体の形成を干渉しない他の抗体が、プレートのウェルに誘導体化され、そして未結合抗体又は抗原が抗体結合により、ウェルにトラップされる。ＧＳＴ−固定化された複合体について上記に記載されるそれらの方法の他に、そのような複合体を検出するための方法は、抗体又は抗原と反応性のそのような他の抗体を用いての複合体の免疫検出を包含する。
【０４２６】
本発明はさらに、前述のスクリーニングアッセイの何れかにより同定される新規剤、及び本明細書に記載されるように治療のためへのそれらの使用に関する。
【０４２７】
本明細書に引用されるすべての出版物及び特許文献は、そのような各出版物又は文書が参照により本明細書に組み込まれることが具体的に且つ個別に示されるかのように、参照により本明細書に組み込まれる。出版物及び特許文献の引用は、何れかが関連先行技術である承認として意図するものではなく、また、それらの出版物及び特許文献の内容又は日付に関して、いかなる承認も構成するものではない。本発明は書面による説明により記載されて来たが、但し当業者は、本発明が種々の実施形態で実施され、そして前述の記載及び下記実施例が例示のためであり、次の請求の範囲を制限するものではないことを理解するであろう。
【実施例】
【０４２８】
実施例１：ヒトJagged１を結合する実施形態のヒトＳｃＦｖの選択
この実施例は、Jagged１を結合する実施形態のＳｃＦｖ（単鎖可変フラグメント）が、多様なＣＤＲ配列を有するＳｃＦｖのファージディスプレイライブラリーから選択され得、そしてそのような結合がNotch１により阻害され得ることを示している。
【０４２９】
ＳｃＦｖは、Ｍ１３バクテリオファージ上に示される完全ヒトＳｃＦｖライブラリーから選択され；ＳｃＦｖファージ選択は、Creative Biolabs, Shirley, NYとの契約下で行われた。ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分に融合されるヒトJagged１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）から構成される融合タンパク質（R&D Systems, Minneapolis, MN, カタログ番号1277-JG-050）を、ヒトJagged１を結合するＭ１３バクテリオファージ上に示されるＳｃＦｖのために３ラウンドの選択下で抗原として使用した。すべての選択を、Jagged１の天然のコンホメーションのために必要とされるＣＡ2++、及びヒトＦｃ結合を妨げるためにヒトＩｇＧ１の存在下で行った。最初に、結合されたファージを、トリプシン消化により放し、そして続いて、ファージを、ヒトNotch１−Ｆｃ融合タンパク質（R&D Systems; カタログ番号3637-TK-050）競争により溶出した。ヒトJagged１を結合する５つの固有のＳｃＦｖを単離した。表１は、５種のＳｃＦｖ、及びそれらのそれぞれの核酸配列及びアミノ酸配列の配列番号を列挙する。
【０４３０】
【表６】
2015521625.tif 000013
【０４３１】
各抗＝Jagged  ＳｃＦｖの核酸及びアミノ酸配列が下記に示される：
【０４３２】
【化６】
2015521625.tif 000014
【０４３３】
【化７】
2015521625.tif 000015
【０４３４】
【化８】
2015521625.tif 000016
【０４３５】
【化９】
2015521625.tif 000017
【０４３６】
【化１０】
2015521625.tif 000018
【０４３７】
【化１１】
2015521625.tif 000019
【０４３８】
【化１２】
2015521625.tif 000020
【０４３９】
【化１３】
2015521625.tif 000021
【０４４０】
【化１４】
2015521625.tif 000022
【０４４１】
【化１５】
2015521625.tif 000023
【０４４２】
ヒトJagged１へのJagged 13 ScFv-ファージ 及び Jagged 32 ScFv-ファージのＥＬＩＳＡに基づく結合が、ヒトNotch１により阻害されることが示された．手短に言えば、ヒトJagged１−Ｆｃ（R＆D  Systems：同上）を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに吸着した。ファージを、ヒトNotch−Ｆｃの存在又は不在下でプレートに適用し、結合を可能にした。結合されたファージを、抗−Ｍ１３−ＨＲＰ結合体（GE Healthcare, Piscataway, NY）により可視化し、そして発色性基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Thermo Scientific, Rockford, IL）により展開した。
【０４４３】
実施例２：実施形態の完全ヒトJagged IgG抗体の生成及び試験
この実施例は、ヒトJagged１を結合するJagged  ＳｃＦｖ−ファージが、Jagged1及びJagged2の両者、及びマウスJagged１を結合する完全ＩｇＧ抗体に転換され得ることを示す。ヒトNotch１がそのような結合を阻害することができる。
【０４４４】
Jagged１３及びJagged３２の可変ドメインを含む完全ＩｇＧの生成を、国際公開番号第２０１０／０８１１７３号（同上）に記載されるそれらの技法に類似する技法を用いて達成した。Jagged 13 ScFv-ファージ 及び Jagged 32 ScFv-ファージのJagged１３及び３２可変ドメインをコードするＤＮＡを、完全ヒトＩｇＧの発現のために発現ベクター中にクローン化した。Ｌ鎖（Ｌｃ）可変ドメインを、プライマーＣＸ１１９７（cacttgtcacgaattcggacatccagatgacccagtc)（配列番号８３）及びプライマーＣＸ１１９８（gtgcagccaccgtacgtttgatttccaccttggtccc）（配列番号８４）を用いて、ＳｃＦｖ鋳型から増幅した。ベクター（LcpOP (pCDNA3から修飾された, Invitrogen, Carlsbad, CA)）及び増幅されたＤＮＡを、ＢｃｉＷＩ及びＥｃｏＲIにより一晩、切断し、連結により組合し、そしてＥ．コリＭＣ１０６１細胞を形質転換した。Ｈ鎖（Ｈｃ）可変ドメインを、プライマーＣＸ１１９９（ttgcacttgtcacgaattcggaggtgcagctgttggagtc)（配列番号８５）及びプライマーＣＸ１２０２（ggcccttggtgctagcgctcgagacggtgaccagggttc）（配列番号８６）を用いて、ＳｃＦｖ鋳型から増幅した。インターロイキン２（ＩＬ２）シグナル配列をコードするＤＮＡを、プライマーＣＸ１１８４（gaaccgtcagatcactagaagc）（配列番号８１）及びプライマーＣＸ１１８５（cgaattcgtgacaagtgcaagacttagtg）（配列番号８２）を用いて、ＨｃｐＰＯＰ（ｐＣＤＮＡ３から修飾された、Invitrogen）から増幅し、そしてＨｃ可変ドメインによりアニーリングした。ベクター（HcpOP (pCDNA3から修飾された, Invitrogen)）及びＩＬ２−Ｈｃ−可変ドメインを、HindIII and NheIにより一晩、切断し、連結により組合し、そしてＥ．コリＭＣ１０６１細胞を形質転換した。完全ヒトＩｇＧ（すなわち、Jagged１３ ＩｇＧ及びJagged３２ ＩｇＧ、また本明細書においては、それぞれ抗−Jagged１３（又は抗−Ｊａｇ１３）及び抗−Jagged３２（又は抗−Ｊａｇ３２）とも呼ばれる）を、一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞から発現し、そしてプロテインＡクロマトグラフィーにより、培養上清液から精製された。
【０４４５】
図１に示されるように、ＥＬＩＳＡ−結合実験は、抗-Jagged 13 IgG及び 抗-Jagged 32 IgGが、約３０ｎＭ以上の親和性下でヒト及びマウスJagged１及びヒトJagged２を結合したことを示し：ヒトJagged 1-Fc (R&D Systems; ibid.)、ヒトJagged 2-Fc (R&D Systems; カタログ番号 1726-JG-050)、又は ラットJagged 1-Fc (R&D Systems; カタログ番号 599-JG-100)を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに吸着した。精製された抗−Jagged１３及び抗−Jagged３２抗体を、プレートに適用し、そして結合を可能にした。結合された抗体を、Ｆａｂ特異的抗−ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ結合体（Sigma, St Louis, MO; カタログ番号 A0293-1ML）により可視化し、そして発色性基質ＴＭＢにより展開した。
【０４４６】
図２に示されるように、ＥＬＩＳＡ−結合実験が、抗−Jagged１３及び抗−Jagged３２結合によるJagged１結合がヒトNotch１により阻害されたことを示し：競争実験のために、Notch 1-Fc (R&D Systems; 同上)を、９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに吸着した。ビオチニル化されたヒトJagged 1-Fc (R&D Systems; 同上)を、上昇する濃度の抗-Jagged 13及び 抗-Jagged 32抗体を含むプレートに適用し、そして結合を可能にした。結合されたJagged１を、ストレプタビジン−ＨＲＰ（Thermo Scientific）により可視化し、そして発色性基質ＴＭＢにより展開した。抗-Jagged MAB-12771 (R&D Systems; カタログ番号 MAB12771)を、阻害のための陽性対照として、及びベバシズマブを負の対照として使用した。用語、「古い（old）」及び「新しい（new）」とは、抗体生成の異なったロットを意味する。抗体３２／１３は、抗−Jagged３２Ｌ鎖及び抗−１３Ｈ鎖を有する。
【０４４７】
実施例３．実施形態の抗−Jagged抗体の親和性成熟
この実施例は、改善された結合動態及びJagged結合特異性を有する実施形態の抗体の単離を示す。
【０４４８】
抗−Jagged抗体を、抗−Jagged３２から修飾されたＣＤＲを有するライブラリーから単離した。そのようなライブラリーは、表２に示されるように企画された。抗−Jagged３２の配列に基づく抗体の６種のライブラリーを、Dut/Ung突然変異誘発(例えば、 Kunkel TA, 1985, Proc Natl Acad Sci 82, 488-492を参照のこと)を用いて構成した。残基は、示される各ヌクレオチドのソフトランダム化により、７０％の元のヌクレオチド及び１０％の他の３種の可能性ある各ヌクレオチド（表２における上付き文字１）を保持することにより、又は全体的ランダム化（表２における上付き文字２）により変更された。さらに、ライブラリー３及び６内で、追加の残基を、Ｈ鎖のＣＤ３に付加した。ライブラリーを用いて、Ｅ．コリ株ＴＧ１をトランスフェクトし、そしてファージを、Ｍ１３ＫＯ７（Invitrogen）によりスーパーインフェクションに従って調製した。
【０４４９】
３ラウンドの選択を、上昇する緊縮下で各ライブラリーについて実施した。第３ラウンドに関しては、ヒトJagged 1 (R&D Systems; 同上)を、５μｇ／ｍｌで免疫管（Nunc, Denmark）に吸着した。ファージを、トリス−緩衝液溶液（ＴＢＳ; ４０ ｍＭ のトリス、１２９ ｍＭ のＮａＣｌ、ｐＨ ７．４）中、１００μg／ｍｌのプールされたヒトＩｇＧ（ｈｕＩｇＧ；又はｈＩｇＧ）及び２％脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）によりブロックし、そして次に、結合のために、被覆された管に添加した。結合に続いて、管を、４回の３７℃の洗浄液により、各３０分間、広範囲に洗浄した。洗浄に続いて、残存する結合されたファージを、１００ｍＭのトリエタノールアミン（ＴＥＡ）（Sigma，St．Louis，MO）により溶出し、そしてＥ．コリＴＧ１を通して拡張した。ライブラリー１、２及び５を組合し、ライブラリー１２５を形成し、そしてライブラリー３、４及び６を組合し、ライブラリー３４６を形成し；各ライブラリーを、３ラウンド目の選択について記載されるように、４ラウンド目のライブラリー１２５の選択及び４ラウンド目のライブラリー３４６の選択とも言及される追加のラウンドの選択にゆだねた。
【０４５０】
【表７】
2015521625.tif 000024
【０４５１】
上付き文字１は、示される各ヌクレオチドでのソフトランダム化により、７０％の元のヌクレオチド及び１０％の他の３種の可能性ある各ヌクレオチドを保持することにより変更された残基を示し、上付き文字２は、全体的ランダム化により変更された残基を示す。
【０４５２】
実施例４．親和性成熟抗−Jagged抗体の結合特性
この実施例は、親和性成熟化工程から単離された実施形態の親和性−成熟抗−Jagged抗体の結合特性を示す。
【０４５３】
ライブラリー１２５の４ラウンドの各ラウンドの選択及びライブラリー３４６の４ラウンド目の選択からの４８個のクローンを増殖し、そして１３ＫＯ７により感染せしめ、ファージを生成した。各ファージを、ファージＥＬＩＳＡにより、ヒトJagged 1-Fc (R&D Systems;同上)、ラットJagged 1-Fc (R&D Systems; 同上)、及びホトJagged 2-Fc (R&D Systems; 同上)を結合するその能力について分析した。Jaggedリガンドを、９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに吸着し、各リガンドは別々のプレート上に存在した。ファージを、各プレート上の相関的ウェルに適用し、そして結合を可能にした。結合されたファージを、抗−Ｍ１３−ＨＲＰ結合体により可視化し、そして発色性基質ＴＭＢにより展開した。個々の単離物は異なった結合特異性を示し；それらの特異性は表３に示されている。それらの単離物の個々についての配列番号がまた示されている。
【０４５４】
【表８】
2015521625.tif 000025
【０４５５】
表３における各クローンのアミノ酸配列が下記に示される：
【０４５６】
【化１６】
2015521625.tif 000026
【０４５７】
【化１７】
2015521625.tif 000027
【０４５８】
【化１８】
2015521625.tif 000028
【０４５９】
【化１９】
2015521625.tif 000029
【０４６０】
【化２０】
2015521625.tif 000030
【０４６１】
【化２１】
2015521625.tif 000031
【０４６２】
【化２２】
2015521625.tif 000032
【０４６３】
【化２３】
2015521625.tif 000033
【０４６４】
【化２４】
2015521625.tif 000034
【０４６５】
【化２５】
2015521625.tif 000035
【０４６６】
【化２６】
2015521625.tif 000036
【０４６７】
【化２７】
2015521625.tif 000037
【０４６８】
【化２８】
2015521625.tif 000038
【０４６９】
【化２９】
2015521625.tif 000039
【０４７０】
【化３０】
2015521625.tif 000040
【０４７１】
【化３１】
2015521625.tif 000041
【０４７２】
【化３２】
2015521625.tif 000042
【０４７３】
【化３３】
2015521625.tif 000043
【０４７４】
【化３４】
2015521625.tif 000044
【０４７５】
【化３５】
2015521625.tif 000045
【０４７６】
【化３６】
2015521625.tif 000046
【０４７７】
【化３７】
2015521625.tif 000047
【０４７８】
【化３８】
2015521625.tif 000048
【０４７９】
【化３９】
2015521625.tif 000049
【０４８０】
【化４０】
2015521625.tif 000050
【０４８１】
【化４１】
2015521625.tif 000051
【０４８２】
【化４２】
2015521625.tif 000052
【０４８３】
【化４３】
2015521625.tif 000053
【０４８４】
【化４４】
2015521625.tif 000054
【０４８５】
【化４５】
2015521625.tif 000055
【０４８６】
【化４６】
2015521625.tif 000056
【０４８７】
【化４７】
2015521625.tif 000057
【０４８８】
【化４８】
2015521625.tif 000058
【０４８９】
【化４９】
2015521625.tif 000059
【０４９０】
【化５０】
2015521625.tif 000060
【０４９１】
【化５１】
2015521625.tif 000061
【０４９２】
【化５２】
2015521625.tif 000062
【０４９３】
【化５３】
2015521625.tif 000063
【０４９４】
実施例５．実施形態の親和性成熟抗−Jagged1及び抗−Jagged2抗体の単離及び試験
この実施例は、Jagged1及び/又はJagged2についての増強された結合親和性を示す実施形態の抗体を単離するためへのＣＤＲシャッフリングの使用を記載する。
【０４９５】
第７ライブラリーを、第４ラウンド目の選択のライブラリー１２５からＬ鎖及び第４ラウンド目の選択のライブリー３４６からのＨ鎖を組合すことにより構成した。このＨ／Ｌライブラリーを、２ラウンドの追加のラウンドを通して選択した。第１ラウンドにおいては、ライブラリーを次の２つの部分に分割した：１つの部分は、ヒトJaggd１−Fc（R＆D  Systems；同上）への結合のために選択され、第２部分は、ヒトJaggd２−Fc（R＆D  Systems；同上）への結合のために選択された。第２ラウンドで、ラウンド１からのヒトJagged１−選択ファージを、別々の結合反応において反応において、ヒトJagged 1-Fc (R&D Systems; 同上) 又はヒトJagged 2-Fc (R&D Systems, 同上)への結合のために選択し、それぞれJagged１／１及びJagged１／２と称する２つのプールを生成した。同様に、第１ラウンドからのヒトJagged２−選択ファージを、別々の結合反応において、ヒトJagged 1-Fc (R&D Systems; 同上) 又はヒトJagged 2-Fc (R&D Systems, 同上)への結合のために選択し、それぞれJagged２／１及びJagged２／２と称する２つのプールを生成した。
【０４９６】
９５個の個々の単離物を、４種のプールの個々から選択した。ファージは各単離物に由来し、そしてヒトJagged 1-Fc (R&D Systems; 同上) 又はヒトJagged 2-Fc (R&D Systems, 同上)への結合についてアッセイした。Jaggedリガンドを、９６−ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに吸着し、各リガンドは別々のプレート上に存在する。ファージを、各プレート上の相関ウェルに適用し、そして結合を可能にした。結合されたファージを、抗−Ｍ１３−ＨＲＰ結合体により可視化し、そして発色性基質ＴＭＢにより展開した。ＥＬＩＳＡ及びＤＮＡ配列の結果に基づいて、６個の固有のクローンを、さらなる研究のために選択した。表４は、６種のクローンによりコードされる抗体、及びそれらのそれぞれのＬ鎖及びＨ鎖の核酸配列及びアミノ酸配列についての配列番号を列挙する。
【０４９７】
【表９】
2015521625.tif 000064
【０４９８】
鎖シャッフリングの後、表４における各最終クローンのアミノ酸配列が下記に示される：
【０４９９】
【化５４】
2015521625.tif 000065
【０５００】
【化５５】
2015521625.tif 000066
【０５０１】
【化５６】
2015521625.tif 000067
【０５０２】
【化５７】
2015521625.tif 000068
【０５０３】
【化５８】
2015521625.tif 000069
【０５０４】
【化５９】
2015521625.tif 000070
【０５０５】
【化６０】
2015521625.tif 000071
【０５０６】
【化６１】
2015521625.tif 000072
【０５０７】
【化６２】
2015521625.tif 000073
【０５０８】
【化６３】
2015521625.tif 000074
【０５０９】
【化６４】
2015521625.tif 000075
【０５１０】
【化６５】
2015521625.tif 000076
【０５１１】
【化６６】
2015521625.tif 000077
【０５１２】
【化６７】
2015521625.tif 000078
【０５１３】
【化６８】
2015521625.tif 000079
【０５１４】
【化６９】
2015521625.tif 000080
【０５１５】
【化７０】
2015521625.tif 000081
【０５１６】
【化７１】
2015521625.tif 000082
【０５１７】
【化７２】
2015521625.tif 000083
【０５１８】
【化７３】
2015521625.tif 000084
【０５１９】
【化７４】
2015521625.tif 000085
【０５２０】
【化７５】
2015521625.tif 000086
【０５２１】
【化７６】
2015521625.tif 000087
【０５２２】
【化７７】
2015521625.tif 000088
【０５２３】
ライブラリーを、カルボキシル側のＨｉｓ標識〜Ｆａｂ、及びカルボキシル側のアンバー休止コドン〜Ｈｉｓ標識により構成し、結果的に、６個の親和性成熟抗体をコードするファージミド非アンバーサプレッサー株に存在する場合、ファージミドは、Ｅ．コリの細胞周辺腔から生成され得るＣ−末端Ｈｉｓ標識Ｆａｂの発現を指示した。６種の成熟単離物の親和性、及び抗-Jagged 13及び抗-Jagged 32 Fabの親和性を測定するために、Ｆａｂを発現し、そしてＥ．コリＤＨ１２ｂから精製した。
【０５２４】
個々のＦａｂについてのオフ速度（off rate）を、Octet (ForteBio, Menlo Park, CA)を用いて測定した。抗−ヒトFc Octet チップ(ForteBio, カタログ番号18-5060)を、ビオシチン及び１００μｇ／ｍｌのＢＳＡによりブロックし、そして次に、２５μＭのJaggedリガンド、すなわちヒトJagged 1-Fc (R&D Systems; 同上)、ヒトJagged2-Fc (R&D Systems; 同上) 又はネズミ Jagged 2-Fc (R&D Systems, 同上)を負荷した。洗浄に続いて、負荷されたチップを、結合が平衡に達するまで、２５μＭのＦａｂに供した。次に、チップを、Ｆａｂを有さない新鮮な溶液に除き、そしてＦａｂ解離の速度を測定した。表５に列挙される解離定数は、親和性成熟抗体のオフ速度が、ＳｃＦｖ 抗体 Jagged 13 及びJagged 32に比較して、１０〜１００倍、低められたことを示す。
【０５２５】
【表１０】
2015521625.tif 000089
【０５２６】
実施例６．実施形態の抗−Jagged抗体の生成
この実施例は、実施形態の抗−Jagged抗体の発現及び精製を示す。
【０５２７】
ベクターを次のようにして製造した：ＩＬ２シグナル配列コード領域を、ＫａｓＩ／ＮｃｏＩにより消化されたpFUSE2-CLIg-hk (InvivoGen)に、ＫａｓＩ／ＮｃｏＩフラグメントとしてpINFUSE-hIgG1-Fc2 (InvivoGen, San Diego, CA)から移動し、プラスミドpFIL2-CL-hkを得た。ＩＬ２シグナル配列コード領域を、ＫａｓＩ／ＥｃｏＲＩにより消化されたpFUSE-CHIg-hG1 (InvivoGen)（大きな及び、中位のフラグメント）に、ＫａｓＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントとしてpINFUSE-hIgG1-Fc2から二元連結により移動し、プラスミドpFIL-CHIg-hG1を得た。
【０５２８】
pFIL2-CL-hkベクターからのＬ鎖コード領域を、プライマーＣＸ１１７０及びＣＸ１１６８を用いて増幅し、そして注入クローニングシステム（HD EcoDry, Clontech, Mountain View, CA）により、ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩ部位を用いてｐＯＰ  Ｎｅｏベクター中にクローン化し、ＮｏｔＩを突然変異誘発した。４Ｄ１１可変Ｌ鎖コード領域を、プライマーＣＸ１１９７及びＣＸ１１９８を用いて、前記単離された４Ｄ１１コード配列からＰＣＲ増幅し、そしてＥｃｏＲＩ及びＢｓｉＷＩ制限部位中にクローン化した。プライマーは、表６に提供される。４Ｄ１１Ｌ鎖核酸配列を、配列番号７３により表し、そしてアミノ酸配列を、配列番号７４により表す。
【０５２９】
【化７８】
2015521625.tif 000090
【０５３０】
【化７９】
2015521625.tif 000091
【０５３１】
ｐＦＩＬ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１ベクターからのＨ鎖コード領域を、次の通りにｐＯＰ Ｈｙｇｒベクター(pCDNA3の修飾, Invitrogen)中にクローン化した：２種のオーバーラッピングフラグメントを増幅し、第１のフラグメントは、プライマーＣＸ１１８４及びＣＸ１１８５を用いてのｐＯＰ  Ｈｙｇｒベクターからの５′非コード領域であり、そして第２フラグメントは、プライマーＣＸ１１７２及びＣＸ１１６９を用いてのｐＦＩＬ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１からのコード領域であった。次に、それらの２種のＰＣＲ生成物を、プライマーＣＸ１１８４及びＣＸ１１６９を用いて、最終増幅のために組合し、そしてＨｉｎｄIII 及びＮｏｔＩ制限部位を用いて、ｐＯＰ  Ｈｙｇｒベクター中にクローン化した。４Ｄ１１可変Ｈ鎖コード領域を、プライマーＣＸ１１９９及びＣＸ１２０２を用いて前記単離された４Ｄ１１コード配列から増幅される同じ第１ＤＮＡフラグメント及び第２フラグメントを用いて、類似する手段でクローン化した。前記２種のフラグメントを、プライマーＣＸ１１８４及びＣＸ１２０２を用いて増幅し、そしてＨｉｎｄIII 及びＮｈｅＩ制限部位中にクローン化した。プライマーは、表６に提供される。４Ｄ１１Ｌ鎖核酸配列は配列番号７５により表され、そしてアミノ酸配列は配列番号７６により表される。
【０５３２】
【化８０】
2015521625.tif 000092
【０５３３】
【化８１】
2015521625.tif 000093
【０５３４】
【表１１】
2015521625.tif 000094
【０５３５】
完全ヒトＩｇＧを、一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３細胞から発現し、そしてプロテインＡクロマトグラフィーにより、培養上清液から精製した。
【０５３６】
実施例７．実施形態の抗−Jagged抗体はマウスにおけるＢｘＰＣ−３腫瘍を減じる
この実施例においては、抗−Jagged４Ｄ１１を、ＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍の増殖を減じる能力について分析した。
【０５３７】
ヒト膵臓癌細胞系ＢｘＰＣ−３を、Cell Bank of Shanghai Institute for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciencesから入手した。ＢｘＰＣ−３異種移植片を、Ｂａｌｂ／ｃヌードマウスの右脇腹中にＢｘＰＣ−３細胞を皮下注入することにより成長せしめた。５００−７００ｍｍ3に達すると、腫瘍をインビトロ細胞培養及び一連の継代培養のために収穫した。インビボ適合されたＢｘＰＣ−３細胞（異種移植片由来への細胞）を、空気中、５％ＣＯ2の雰囲気下で、３７℃で、１０％ウシ胎児血清により補充されたＲＰＭＩ−１６４０において増殖した。腫瘍細胞を、日常的に、週２度、継代培養した。細胞を、対数増殖期の間、収穫し、適切な細胞濃度の物理的ＰＢＳに再懸濁し、そして腫瘍誘発のために氷上で維持した。
【０５３８】
各マウスを、腫瘍成長のために、０．１ｍｌのＰＢＳ中、５×１０6個のＢｘＰＣ−３細胞により、右脇腹に皮下接種した。平均腫瘍サイズが約１５０ｍｍ3に達する場合に、治療を開始した。腫瘍サイズを、ノギスを用いて、二次元的に週２度、測定し、体積を、式Ｖ＝０．５ａ×ｂ2（式中、ａ及びｂは、それぞれ、腫瘍の長径及び短径である）を用いて、ｍｍ3で表した。
【０５３９】
マウスは、表７に示されるように、グループ分けされ、そして投与された。
【０５４０】
【表１２】
2015521625.tif 000095
【０５４１】
初期投与後の日数に対する腫瘍体積をプロットする図３は、抗−Jagged ＡＤ１１抗体がＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍の増殖を阻害することを示す。図４は、グループ１及び２における動物の体重減少を示す。マウス胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）の血清濃度を、QuantikineマウスＴＳＬＰイムノアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、その製造業者のプロトコルに従って測定した。マウスＴＳＬＰの血清レベルを、各グループからの個々のマウスについて定量化し、そして平均化し、図５を生成した。
【０５４２】
抗−Jagged  ４Ｄ１１をまた、表８に示されるグループ及び投与量を用いて、上記方法に類似する方法に従って、用量依存性関係下でＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍の増殖を減じる能力について試験した。
【０５４３】
【表１３】
2015521625.tif 000096
【０５４４】
初期投与後の日数に対する腫瘍体積をプロットする図６は、抗−Jagged ＡＤ１１抗体がＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍の増殖を阻害することを示す。図７は、動物による体重減少を示す。
【０５４５】
第２研究においては、抗−Jagged  ４Ｄ１１をまた、第２抗癌剤と組合して、ＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍の増殖を減じる能力についても試験した。この研究においては、抗−Jagged  ４Ｄ１１を、単独で、又はゲムシタビン（膵臓癌における現在の標準の化学療法）と組合して、上記方法に類似する方法、及び図２３に示される投与量を用いて、投与した。それらの研究においては、抗体毒性が、体重減少及び死亡率から明らかであった。それらの研究は、抗−Jagged  ４Ｄ１１及びゲムシタビンの組合せがＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍の増殖を阻害することを示す。図２３に示されるように、抗−Jagged抗体及びゲムシタビンの組合せが、ＢＸＰＣ３膵臓異種移植モデルにおいて付加的効果を生成した。
【０５４６】
実施例８．実施形態の抗―Jagged抗体がヒト骨髄共培養においてＲＰＭＩ８２２６の増殖を阻害する
この実施例は、抗―Jagged４D11が、ヒト骨髄共培養においてＲＰＭＩ８２２６の増殖を阻害することを示す。
【０５４７】
多発性骨髄腫においては、骨髄腫細胞と、骨髄の間質細胞との間の相互作用は、骨髄腫細胞の生存及び増殖、及び付随する溶骨性疾患の発症のために重要である。Notch受容体及びリガンドは、多発生骨髄腫においてアップレギレートされる。多発性骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ８２２６の増殖を阻害する抗−Jagged  ４Ｄ１１の能力を、ＲＰＭＩ８２２６及びヒト骨髄吸引物の共培養においてインビトロで測定した。ヒト骨髄は、AllCells, LLC (Emeryville, CA)から購入された。ＲＰＭＩ８２２６細胞を、ＣＦＳＥにより、その製造業者の説明書（Invitrogen, Carlsbad, CA）に従って標識した。手短には、骨髄を、ＲＰＭＩ−１６４０、１０％ＦＢＳにより希釈し、そして２ｍｌを、６−ウェル組織培養皿のウェル中にプレートした。１ｍｌのＲＰＭＩ１６４０、１０％ＦＢＳ中、５０，０００個のＣＦＳＥ−標識ＲＰＭＩ８２２６細胞を、骨髄を含むウェル中にプレートした。試験用品、すなわち抗−Jagged ４D１１、抗−EGFR (抗体c２２５、セツキシマブUCSF Pharmacy、 Bristol-Myers Squibb, NY, NYにより製造され、そして市販される)又はγセクレターゼ阻害剤ＢＭＳ２９９８９７ (Sigma, St. Louis, MO)を添加し、そしてその培養物を、３７℃及び５％ＣＯ2下で５日間インキュベートした。インキュベーションに続いて、赤血球細胞を溶解し、そして生存細胞を遠心分離により集めた。細胞の蛍光強度を、ＦＡＣＳにより測定した。
【０５４８】
結果は図８に示される。増殖を示唆する、低められた蛍光が、何れかの治療の不在下で又は抗−ＥＧＦＲの存在下で測定された。対照的に、ＢＭＳ２９９８９７（ＧＳＩ）及び抗−Jagged  ４Ｄ１１の両者は、ＣＦＳＥ標識ＲＰＭＩ８２２６の増殖を阻害した。
【０５４９】
実施例９．実施形態の抗−Jagged抗体は線維症の発症をインビトロで阻害する
この実施例は、抗−Jagged  ４Ｄ１１が線維症の発症をインビトロで阻害することを示す。
【０５５０】
ラット線維芽細胞系ＮＲＫ−４９Ｆ (ATCC, Manassas, VA)は、細胞−細胞接触の損失、コラーゲンの高められた生成及び沈着、及び病巣の発生により、ヒト形質転換成長因子β１（ＴＧＦβ１）に応答する。ＮＲＫ−Ｒ４９細胞を、６−ウェル組織培養皿において、５０，０００個の細胞／ウェルでプレートし、そしてＲＰＭＩ−１６４０、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）において一晩、培養し、結合及び単層形成を可能にした。培地を除き、そして細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０、１％熱不活性化ＦＢＳにより２度、洗浄し、そしてＲＰＭＩ−１６４０、１％熱不活性化ＦＢＳにおいて一晩、培養した。一晩のインキュベーションに続いて、Jagged ４Ｄ１１、ＴＧＦβ１、又はＴＧＦβ１及び抗−Jagged ４Ｄ１１の組み合わせを、培養中の細胞に添加した。細胞を５日間、培養し、そしてＴＧＦβ１に対する応答について観察した。
【０５５１】
結果は、図９に示される。パネルＡは、ＮＲＫ−Ｆ４９の培養が、１００ｎＭの抗−Jagged４Ｄ１１の存在下で培養される場合、特徴的単層を保持することを示す。パネルＢは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１の存在下で培養されたＮＲＫ−Ｆ４９についての特徴的病巣形成を示す。パネルＣは、ＴＧＦ６１−刺激された、線維性病巣形成が、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１により処理された培養において、１００ｎＭの抗−Jagged  ４Ｄ１１により完全に阻害されることを示す。
【０５５２】
実施例１０．活性化可能抗−Jagged抗体マスキング部分
この実施例は、活性化可能抗−Jagged抗体のそれらの標的物への結合を低める、マスキング部分（ＭＭ）の同定を記載する。
【０５５３】
抗−Jagged  ４Ｄ１１抗体及びＦａｂが、２０１０年６月１５日に公開された国際公開第２０１０／０８１１７３号に記載される方法に類似する方法を用いて、２×１０10の総多様性を有するランダムＸ15ペプチドライブラリー（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）をスクリーニングするために使用された。スクリーニングは、１ラウンドのＭＡＣＳ及び２ラウンドのＦＡＣＳ分類から成った。最初のＭＡＣＳを、プロテイン−Ａ  Dynabeads（Invitrogen）及び２５０ｎＭの濃度での抗−Jagged  ４Ｄ１１抗体により行った。ＭＡＣＳに関しては、約１×１０11個の細胞を、結合のためにスクリーニングし、そして６×１０6個の細胞を、集めた。StreptAvidin−ＰＥを、最初のＦＡＣＳのために、蛍光プローブとして使用し、そして第２ＦＡＣＳに関しては、抗−ビオチン−ＰＥ（Miltenyi）を用いた。ビオチニル化された抗−Jagged  ４Ｄ１１抗体を、それぞれ、第１及び第２ラウンドのＦＡＣＳにおいて、１００ｎＭ及び１０ｎＭの濃度で使用した。第２ラウンドのＦＡＣＳからの陽性集団が、抗−Jagged  ４Ｄ１１抗体及びＦａｂへの結合から組換えJaggedタンパク質により阻害されることが確認された。個々のペプチドクローンを、配列分析により同定し、そして続いて、図１０に示されるように、抗−Jagged  ４Ｄ１１抗体及びＦａｂを結合するそれらの能力について確証した。
【０５５４】
抗−Jaggedマスキング部分の配列は、表９に列挙される。
【０５５５】
【表１４】
2015521625.tif 000097
【０５５６】
実施例１１．抗−Jaggedマスキング部分の親和性成熟
この実施例は、抗−Jaggedマスキング部分の親和性成熟を記載する。
【０５５７】
抗−Jagged結合ペプチドＪＳ４８７４、ＪＳ４８９６、ＪＳ４８９９及びＪＳ４９０６を、ソフトランダム化アプローチを用いることにより、親和性成熟した。国際公開第２００９／０１４７２６号に記載のようなｅＣＰＸ細胞ディスプレイライブラリーを、表１０に示されるヌクレオチド比率で構成した。次の４種のライブラリーを構成した：４８７４ＳＲ、４８９６ＳＲ、４８９９ＳＲ及び４９０６ＳＲ。各ライブラリーについての最終多様性は、約５×１０9であった。
【０５５８】
【表１５】
2015521625.tif 000098
【０５５９】
各親和性成熟ライブラリーを、別々にスクリーニングした。最初のラウンドのＭＡＣＳを、１００倍以上のライブラリーのオーバーサンプリングを提供する多くの細胞により行った。すべての標識は、一定の穏やかな攪拌下で、４℃で行われた。細胞を、２５ ｎＭ の抗−Jagged Ｆａｂ (ライブラリー４８９６ＳＲ)又は５０ ｎＭ の抗−Jagged抗体(ライブラリー４８７４ＳＲ、４８９９ＳＲ及び４９０６ＳＲ)により標識し、そして次に、約５００μｇのストレプタビジン又はプロテイン−Ａ標識された磁気ビーズ（Dynabeads Invitrogen）に結合した。続いて、ビーズを、０．５％のＢＳＡを含むＰＢＳにより広範に洗浄した。各ライブラリーからの約２×１０6〜２×１０7個の細胞を、初期ラウンドのＭＡＣＳから回収した。
【０５６０】
すべてのラウンドのＦＡＣＳのための細菌細胞を、ビオチニル化された抗−Jagged Ｆａｂにより標識した。使用される第２蛍光標識は、第２標識の観察されるバックグラウンド結合に依存して、抗−ビオチン−ＰＥ（Miltenyi）又はストレプタビジン−ＰＥ（Invitrogen）の何れかであった。抗−ビオチン−ＰＥ（Miltenyi）又はストレプタビジン−ＰＥ（Invitrogen）の何れかであった。すべてのラウンドのＦＡＣＳのために、最も明るい２％の陽性細胞を分類した。ライブラリー４８９６ＳＲのために、ラウンド１（Ｆ１）のＦＡＣＳ及びラウンド２（Ｆ２）のＦＡＣＳについての細胞を、それぞれ２ｎＭ及び１ｎＭのＦａｂにより標識した。ライブラリー４８７４ＳＲ、４８９９ＳＲ及び４９０６ＳＲのために、Ｆ１についての細胞を、１００ｎＭのＦａｂにより標識した。４８７４ＳＲライブラリーのために、Ｆ２についての細胞を１ｎＭのＦａｂにより標識し、そしてライブラリー４８９９ＳＲ及び４９０６ＳＲについての細胞を１０ｎＭにより標識した。第２ラウンドのＦＡＣＳからの配列が、表１１〜１４に示される。
【０５６１】
【表１６】
2015521625.tif 000099
【０５６２】
【表１７】
2015521625.tif 000100
【０５６３】
【表１８】
2015521625.tif 000101
【０５６４】
【表１９】
2015521625.tif 000102
【０５６５】
親マスキング部分ペプチドＪＳ４８９６の結合を、４８９６ＳＲライブラリー（クローンＪＳ５３４０、ＪＳ５３４２、ＪＳ５３４７及びＪＳ５３５８）から選択されたマスキング部分ペプチドの結合に比較した。示されるクローンを含む細胞を、ビオチニル化された抗−Jagged Fabの３種の異なった濃度、すなわち１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭで、ＦＡＣＳ上で分析した。ストレプタビジン−ＰＥを、第２蛍光標識として使用した。ペプチド発現を、国際公開第２００７／０２７９３５号に記載される技法に類似する技法を用いて、ｙＰｅｔ−ＭＯＮＡにより標識することにより定量化した。結果は図１１に示される。
【０５６６】
実施例１２．活性化可能抗−Jagged抗体
この実施例は、本開示の活性化可能抗−Jagged抗体の例を記載する。
【０５６７】
抗−Jaggedマスキング部分、切断可能部分及び本開示の抗−Jagged抗体を含む活性化可能抗−Jagged抗体を、国際公開第２０１０／０８１１７３号に記載の方法に類似する方法に従って生成した。得られる活性化可能抗体の品質管理によれば、ほとんどが少なくとも９５％のモノマーを含んだことが示唆された。本開示のいくつかの活性化可能抗−Jagged抗体のアミノ酸及び核酸配列が下記に提供される。
【０５６８】
マスキング部分ＪＳ５３４２（本明細書においては、ＭＭ５３４２又は５３４２とも呼ばれる）、少なくとも１つのプロテアーゼにより切断され得るＣＭ、及びＡＢ４Ｄ１１のＬ鎖を含むいくつかの活性化可能抗−Jagged抗体のＬ鎖の核酸及びアミノ酸配列を、下記に示す：
【０５６９】
【化８２】
2015521625.tif 000103
【０５７０】
【化８３】
2015521625.tif 000104
【０５７１】
【化８４】
2015521625.tif 000105
【０５７２】
【化８５】
2015521625.tif 000106
【０５７３】
【化８６】
2015521625.tif 000107
【０５７４】
【化８７】
2015521625.tif 000108
【０５７５】
【化８８】
2015521625.tif 000109
【０５７６】
【化８９】
2015521625.tif 000110
【０５７７】
マスキング部分５３４２、非切断可能リンカー及びＡＢ４Ｄ１１のＬ鎖を含むマスキングされた抗体のＬ鎖の核酸及びアミノ酸配列を、下記に示す：
【０５７８】
【化９０】
2015521625.tif 000111
【０５７９】
【化９１】
2015521625.tif 000112
【０５８０】
ＭＭ５３４２、及び本開示の活性化可能抗−Jagged抗体を生成するために、本明細書に記載されるそれらの方法を用いて、本開示の抗−Jagged抗体に連結され得るＣＭを含むいくつかのポリペプチドの核酸又はアミノ酸配列が下記に提供される：
【０５８１】
【化９２】
2015521625.tif 000113
【０５８２】
【化９３】
2015521625.tif 000114
【０５８３】
【化９４】
2015521625.tif 000115
【０５８４】
【化９５】
2015521625.tif 000116
【０５８５】
【化９６】
2015521625.tif 000117
【０５８６】
【化９７】
2015521625.tif 000118
【０５８７】
それらのポリペプチドを生成するのに使用されるカテプシンＥ（Ｃａｔｈ  Ｅ）、ＭＭＰ−１４及びｐａｎＭＭＰ基質（ＣＭ）は、文献に報告されている：Cruz-Monserrate Z et al., 2011, Gut, doi:10.1136/gutjnl-2011-300544; Abeer J et al., 2011, Chem. Biol. 18, 392-401; Zhu L et al., 2011, Theranostics 1, 18-27。
【０５８８】
そのようなＭＭ及びＣＭ含有ポリペプチドが連結され得る抗体の例は、抗−Jagged抗体４Ｄ１１及びその変異体を包含する。４Ｄ１１ Ｈｃ ＱΔＨとして言及される、４Ｄ１１変異体のＨ鎖のアミノ酸及び核酸配列が下記に提供される：
【０５８９】
【化９８】
2015521625.tif 000119
【０５９０】
【化９９】
2015521625.tif 000120
【０５９１】
実施例１３．活性化可能抗−Jagged抗体のインビトロ特徴化
この実施例は、Jagged標的物に結合する本開示のマスキング部分を含む活性化可能抗−Jagged抗体の能力を低めるそのようなマスキング部分の能力を記載する。この実施例はまた、そのような活性化可能抗体のタンパク質分解活性も記載する。
【０５９２】
ヒトJagged１標的結合する、活性化可能抗体５３４２−１２０３−４Ｄ１１、Ｖ３４２−１２０４−４Ｄ１１、Ｖ３４２−１２１４−４Ｄ１１及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１、及びマスキングされた抗体５３４２−ＮＳｕｂ−４Ｄ１１の能力を、本明細書に記載されるようなインビトロ結合アッセイにより、同じ標的物に結合する抗−Jagged抗体４Ｄ１１の能力に比較した。そのような標的物結合を阻害するＭＭ５２４２の能力が、図１２及び表１５に示される。
【０５９３】
表１５．抗−Jagged抗体４Ｄ１１、及びマスキングされた抗体及びその活性化可能抗体によるJagged標的結合の比較（活性化可能抗体の見掛けＫD／抗体４Ｄ１１の見掛けＫD）として計算されるマスキング倍率
【０５９４】
【表２０】
2015521625.tif 000121
【０５９５】
活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０３−４Ｄ１１、Ｖ３４２−１２０４−４Ｄ１１、Ｖ３４２−１２１４−４Ｄ１１及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１、及びマスキングされた抗体５３４２−ＮＳｕｂ−４Ｄ１１を、プロテアーゼにより切断されるそれらの能力について評価した。手短には、２５０ｎｇの活性化可能抗体を、適切な緩衝液（ｕＰＡのためには：ＨＢＳＳ中、０．１Ｍのトリス  ｐＨ８．０；ＭＭＰ−２のためには、ＴＣＮＢ（５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭの ＮａＣｌ、０．０５％の Ｂｒｉｊ、１０ｍＭ のＣａＣｌ2、ｐＨ ９．５）において３７℃で２４時間、１ｎＭのｕＰＡ又は３８７ｎＭのＭＭＰ−２により消化した。消化された物質を、続いて、検出剤としてヤギ抗−ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ′２  ＨＲＰを用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスターンブロットにより分析した。図１３は、タンパク質分解消化が親（すなわち、抗体４Ｄ１１）Ｌ鎖の移動度に類似する移動度を有するタンパク質を生成し、これは、それぞれの活性化可能抗体が、それぞれｕＰＡ又はＭＭＰ−２プロテアーゼにより切断されることを示唆する。
【０５９６】
実施例１４．活性化可能抗−Jagged抗体のインビボ特徴化
この実施例は、マウスＢｘＰＣ３腫瘍モデルにおける本開示の活性化可能抗−Jagged抗体のインビボ有効性及び安全性を記載する。
【０５９７】
活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０３−４Ｄ１１、Ｖ３４２−１２０４−４Ｄ１１、Ｖ３４２−１２１４−４Ｄ１１及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１、及びマスキングされた抗体５３４２−ＮＳｕｂ−４Ｄ１１を、本明細書に記載される方法に類似する方法を用いて、マウス中に移植されたＢｘＰＣＸ異種移植腫瘍の増殖を低めるそれらの能力について調験した。抗−Jagged抗体４Ｄ１１により引き起こされる体重減少に比較して、そのような腫瘍モデルにおける体重減少を低めるそれらの活性化可能及びマスキングされた抗体の能力をまた試験した。グループ、投与量、投与経路及び投与スケジュールが、表１６に示される。有効性結果（腫瘍サイズの減少）が、図１４に示される。安全性結果（体重減少の低減）が、図１５に示される。マウス胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）の血清濃度が、図１６Ａに示される。
【０５９８】
【表２１】
2015521625.tif 000122
【０５９９】
初期投与後の日数に対する腫瘍体積をプロットする図１４は、活性化可能抗−Jagged抗体が、抗−Jagged抗体４Ｄ１１（親抗体）のように、マウスにおけるＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍の増殖を阻害したことを示す。
【０６００】
図１５は、活性化可能抗−Jagged抗体、マスキングされた抗体、又は親抗体を投与されたマウスの体重減少を比較する。親抗体４Ｄ１１を投与された動物は有意な体重減少を示したが、活性化可能抗−Jagged抗体を投与された動物は有意な体重減少を示さなかった。
【０６０１】
マウス胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）の血清濃度を、本明細書に記載のようにして測定した。マウスＴＳＬＰの血清レベルを、各投与の前、及び各グループからの最終投与の１０日後、定量化し、そして平均化し、図１６Ａを生成した。図１６Ｂは、抗−Jagged抗体４Ｄ１１及び活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１についてのＴＳＬＰ血清濃度の経時変化を示す。血清マウスＴＳＬＰは、活性化可能抗−Jagged抗体を投与されたグループにおける血清マウスＴＳＬＰレベルに比較して、親抗−Jagged抗体４Ｄ１１グループにおいては上昇する。
【０６０２】
実施例１５．活性化可能抗−Jagged抗体の薬物動態データ
この実施例は、そのような抗体を投与されたマウスの血清における抗−Jagged親及び活性化可能抗体の薬物動態を比較する。
【０６０３】
抗−Jagged抗体４Ｄ１１又は活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１を投与された非腫瘍担持の雌Ｂａｌ／ｂヌードマウスにおける単回投与薬物動態を評価した。マウスは、表１７に概略される通りに投与された。５匹のマウスのコホートは、０．５、３、８、２４、７２、１６８及び２４０時間で回転採血された。血漿サンプルを、抗−ｈＦｃ捕獲、抗−ｈＩｇＧ Ｆａｂ’２ ＨＲＰ結合体による続く検出によるｈＩｇＧ含有量を分析した。
【０６０４】
【表２２】
2015521625.tif 000123
【０６０５】
図１７は、活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１（また、５３４２−１２０４として本明細書において言及される）、又は抗−Jagged抗体４Ｄ１１の腹腔内投与に続いて、経時と共にマウスの血清における平均ヒトＩｇＧレベルを比較する。抗−Jagged抗体４Ｄ１１を静脈内投与されたマウスは、同じ抗体を腹腔内投与されたマウスのように、経時と共に類似するヒトＩｇＧレベルを示した。
【０６０６】
表１８は、７日目を通して予備的非コンパートメント分析を提供する。データをPhoenix WinNonlin バージョン6.3、スパースサンプリングモードを用いて分析した。
【０６０７】
【表２３】
2015521625.tif 000124
【０６０８】
実施例１６．抗−Jaggedマスキング部分の追加の成熟
この実施例は、本開示の追加の抗−Jaggedマスキング部分の生成を記載する。
【０６０９】
マスキング部分ペプチドファミリーＪＳ４８９６（ＭＭ４８９６又は４８９６としても本明細書において言及される）を、さらに親和性成熟させるために、上記ＳＲライブラリースクリーニングからの配列を用いて、４種の指示される親和性成熟ライブラリーを企画した。ｅＣＰＸ細胞ディスプレイライブラリー、例えば国際公開第２００９／０１４７２６号に記載されるライブラリーを、表１９に示されるヌクレオチド配列により構成した。各ライブラリーについての最終多様性は、約５×１０9個の細胞であった。
【０６１０】
【表２４】
2015521625.tif 000125
【０６１１】
ライブラリー１５１７／１５１９及び１５１８／１５２１
各親和性成熟ライブラリーを、別々に、但し同じ態様でスクリーニングした。最初のＭＡＣＳラウンドを、ライブラリーの１００倍以上のオーバーサンプリングを提供する多くの細胞により行った。すべての標識化は、一定尾穏やかな攪拌下で、４℃で行われた。細胞を、ビオチンにより標識された、２５ｎＭのＦａｂ  ４Ｄ１１により標識した。Ｆａｂに結合される細胞を、スプレプタビジン−標識された磁気ビーズ（Dynabeads, Invitrogen）を用いて捕獲した。続いて、ビーズを、０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳにより広範に洗浄した。各ライブラリーからの約１×１０6個の細胞を、初期ＭＡＣＳラウンドから回収した。
【０６１２】
すべてのＦＡＣＳラウンドのための細菌細胞を、ＤｙＬｉｇｈｔ−４８８標識された抗−Jagged Ｆａｂ  ４Ｄ１１（すなわち、抗−Jagged  ＩｇＧ抗体４Ｄ１１のＦａｂ）により標識した。すべての｝ＦＡＣＳラウンドのために、陽性細胞中の最も明るい０．１％〜０．２％を選別した。ＦＡＣＳラウンド１（Ｆ１）及びＦＡＣＳラウンド２（Ｆ２）のための細胞を、それぞれ、１ｎＭ及び１００ｐＭのＦａｂ  ４Ｄ１１により標識した。ＦＡＣＳラウンド３及び４のために、細胞を、１ｎＭのＤｙＬｉｇｈｔ−標識された抗−Jagged  Ｆａｂ  ４Ｄ１１により標識し、５００μｌのＰＢＳに再懸濁し、そして選択の前、３７℃で５〜１０分間インキュベートした。ＦＡＣＳラウンド４下で選別されたクローンを配列決定し、そしてその結果は表２０及び２１に示される。
【０６１３】
【表２５】
2015521625.tif 000126
【０６１４】
【表２６】
2015521625.tif 000127
【０６１５】
個々のクローンを、Ｆａｂ結合についてＦＡＣＳにより評価した。例は、図１８に示される。指図されるライブラリーからのクローン発現マスキング部分（ＭＭ５８７２、５８７７、５８８５及び５８８７）は、ＳＲライブラリー選別からの単一クローン発現ＭＭ５３４２よりも良好にＦａｂ  ４Ｄ１１を結合した。
【０６１６】
ライブラリー１５５９及び１５６１
親和性成熟ライブラリー１５５９及び１５６１を、別々にではあるが、しかし同じ態様でスクリーニングした。最初のＭＡＣＳラウンドを上記のようにして行ったが、但し、ビオチンにより標識された５０ｎＭのＦａｂ  ４Ｄ１１を用いた。各ライブラリーからの約１×１０6個の細胞を、最初のＭＡＣＳラウンドから回収した。
【０６１７】
すべてのＦＡＣＳラウンドのための細菌細胞を、ＤｙＬｉｇｈｔ−４８８標識された抗−Jagged Ｆａｂ  ４Ｄ１１により標識した。すべてのＦＡＣＳラウンドのために、陽性細胞中の最も明るい０．２％を選別した。ＦＡＣＳラウンド１（Ｆ１）及びＦＡＣＳラウンド２（Ｆ２）のための細胞を、それぞれ、１ｎＭのＦａｂ  ４Ｄ１１により標識した。ＦＡＣＳラウンド３及び４のために、細胞を、１ｎＭのＤｙＬｉｇｈｔ−標識された抗−Jagged  Ｆａｂ  ４Ｄ１１により標識し、５００μｌのＰＢＳに再懸濁し、そして選択の前、３７℃で５〜１０分間インキュベートした。ＦＡＣＳラウンド４下で選別されたクローンを配列決定し、そしてその結果は表２２及び２３に示される。
【０６１８】
【表２７】
2015521625.tif 000128
【０６１９】
【表２８】
2015521625.tif 000129
【０６２０】
実施例１７．追加の活性化可能抗−Jagged抗体
この実施例は、本開示の活性化可能抗−Jagged抗体の追加の例を記載する。
【０６２１】
マスキング部分ＪＳ５８９４（また、ＭＭ５８９４又は５８９４としても言及される）及び方法、例えば本開示の活性化可能抗−Jagged抗体を生成するために、本明細書に記載されるそれらの方法を用いて、本開示の抗−Jagged抗体に連結され得るＣＭを含むいくつかのポリペプチドの核酸及びアミノ酸配列が、下記に提供される：
【０６２２】
【化１００】
2015521625.tif 000130
【０６２３】
【化１０１】
2015521625.tif 000131
【０６２４】
【化１０２】
2015521625.tif 000132
【０６２５】
【化１０３】
2015521625.tif 000133
【０６２６】
【化１０４】
2015521625.tif 000134
【０６２７】
【化１０５】
2015521625.tif 000135
【０６２８】
【化１０６】
2015521625.tif 000136
【０６２９】
【化１０７】
2015521625.tif 000137
【０６３０】
【化１０８】
2015521625.tif 000138
【０６３１】
【化１０９】
2015521625.tif 000139
【０６３２】
【化１１０】
2015521625.tif 000140
【０６３３】
【化１１１】
2015521625.tif 000141
【０６３４】
【化１１２】
2015521625.tif 000142
【０６３５】
【化１１３】
2015521625.tif 000143
【０６３６】
【化１１４】
2015521625.tif 000144
【０６３７】
【化１１５】
2015521625.tif 000145
【０６３８】
【化１１６】
2015521625.tif 000146
【０６３９】
【化１１７】
2015521625.tif 000147
【０６４０】
【化１１８】
2015521625.tif 000148
【０６４１】
【化１１９】
2015521625.tif 000149
【０６４２】
【化１２０】
2015521625.tif 000150
【０６４３】
【化１２１】
2015521625.tif 000151
【０６４４】
【化１２２】
2015521625.tif 000152
【０６４５】
【化１２３】
2015521625.tif 000153
【０６４６】
【化１２４】
2015521625.tif 000154
【０６４７】
【化１２５】
2015521625.tif 000155
【０６４８】
【化１２６】
2015521625.tif 000156
【０６４９】
【化１２７】
2015521625.tif 000157
【０６５０】
【化１２８】
2015521625.tif 000158
【０６５１】
【化１２９】
2015521625.tif 000159
【０６５２】
マスキング部分ＪＳ５８９４、及びマスキングされた抗体を形成するために、本明細書に記載されるような方法を用いて、抗−Jagged抗体に連結され得る非切断可能リンカーを含むポリペプチドの核酸及びアミノ酸配列が、下記に提供される：
【０６５３】
【化１３０】
2015521625.tif 000160
【０６５４】
【化１３１】
2015521625.tif 000161
【０６５５】
【化１３２】
2015521625.tif 000162
【０６５６】
【化１３３】
2015521625.tif 000163
【０６５７】
そのようなＭＭ及びＣＭ含有ポリペプチドが連結され得る抗体の例は、抗−Jagged抗体４Ｄ１１又はその変異体、例えば上記４Ｄ１１ ＱΔＨ変異体を包含する。
【０６５８】
実施例１８．活性化可能抗−Jagged抗体のインサイチュイメージング
この実施例は、本開示の活性化可能抗−Jagged抗体の活性化及び結合のインサイチュイメージングの使用を記載する。その結果は、本開示の活性化可能抗−Jagged抗体が、組織により発現されるプロテアーゼにより活性化され得、そしてその組織上のJagged標的物を結合できることを示唆する。
【０６５９】
活性化可能抗体のインサイチュイメージングは、細胞及び組織におけるプロテアーゼ活性を特徴づけるための特有のアプローチを表す。この技法は、活性化可能抗体の活性化、及び活性化可能抗体を切断できるプロテアーゼを発現する細胞及び組織の組織学的切片における標的物への結合の検証を可能にする。そのようなインサイチュアプローチの概略が図１９に提供される。
【０６６０】
活性化された抗体により認識される標的物と共局在される部位で活性化可能抗体を切断できる細胞又は組織による活性化可能抗−Jagged抗体の活性化及び結合のインサイチュイメージング（本明細書においては、インサイチュイメージングとして言及される）は、次の通りに行われた：凍結された組織切片を、ガラスフライド上に置いた。標識された活性化可能抗−Jagged抗体（例えば、蛍光標識により標識される）を含む溶液を、前記細胞上に適用し、そして１５０ ｍＭ のＮａＣｌ、１００μＭ のＺｎＣｌ2、５ ｍＭ のＣａＣｌ2 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７．４のインキュベーション緩衝液中で、室温（約２２−２４℃）で、１時間インキュベートし；約１μｇ／ｍｌの濃度での活性化可能抗体。次に、組織を徹底的に洗浄し、結合されていない材料を除去し、そして検出可能標識を測定した。例えば、蛍光タグが使用される場合、組織を蛍光顕微鏡に置いた。組織上での活性化された抗体の検出は、組織が、活性化可能抗体を切断するプロテアーゼを発現し、そしてまた、活性化された抗体が結合するJagged標的物を発現したことを示唆する。
【０６６１】
活性化され、そしてＢｘＰＣ３異種移植腫瘍組織を結合する活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１の能力を、インサイチュイメージングを用いて評価した。活性化可能抗体を、Alexa Fluor（登録商標）680 (Invitrogen)により標識し、標識された活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０ 及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０を生成し、ここでそれらは、本明細書においてはまた、それぞれ１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０ 及び ＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０とも呼ばれる。また、標識された抗−Jagged親抗体４Ｄ１１−ＡＤ６８０を試験した。各４Ｄ１１−ＡＦ６８０、１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０及び ＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０を、上記のように、連結ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍組織サンプルと共にインキュベートした。それらの結果は、それぞれ、図２０、パネルＡ、Ｂ及びＣに示される。赤色蛍光組織メイージは、４Ｄ１１抗体、及びそれぞれ活性化可能抗体の組織由来のタンパク質分解性切断により活性化された４Ｄ１１抗体のJaggedへの結合を示す。パネルＤ、Ｅ及びＦは、広範囲のプロテアーゼ阻害剤カクテルセットIII （カタログ番号539134, EMD Millipore）及び５０ｍＭのＥＤＴＡの１：１００希釈溶液により前処理された凍結ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍組織と共に、４Ｄ１１−ＡＦ６８０、１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０及びＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０とインキュベートした後に得られる蛍光イメージを表す。パネルＥ及びＦにおける還元された赤色蛍光は、パネルＢ及びＣに見られる活性化可能抗体１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０ 及び ＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０の結合が、組織由来のプロテアーゼによる活性化可能抗体の切断によりもたらされ；プロテアーゼ阻害剤カクテルは、そのようなタンパク質分解を阻害したことを示した。青色染色は、ＤＡＰＩ核染色を表す。抗−Jagged親抗体４Ｄ１１及び活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１ 及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１の、凍結ＢｘＰＣ３異種移植組織への結合が、標識されていない抗−Jagged親抗体４Ｄ１１によるそのような組織の予備処理により、又はJagged１、Jagged2、又はそれらの組合せによる、そのような組織の予備処理により阻害された。
【０６６２】
活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１の活性化をまた、ヒト膵臓癌組織のインサイチュイメージングにより評価した。各４Ｄ１１−ＡＦ６８０ （４Ｄ１１）、１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０ （１２０４） 及び ＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０ （ＰＬＧＬ）を、膵臓癌を有するヒト患者から単離された凍結サンプルと共にインキュベートした。結果は、それぞれ図２１、第１列、第１、２及び３行のパネル上に示される。それぞれ、第２、３及び４列のパネルは、１０μｇ／ｍｌの抗体Ａ１１（Ａ１１は、マトリプターゼとしても知られているＭＴ−ＳＰ１プロテアーゼの活性部位に対して特異的に結合する抗体である）、５０μＭの広範囲のＭＭＰ阻害剤Galardin（Calbiochem, Millipore）（図２１、第３列）、又は広範囲のプロテアーゼ阻害剤カクテルセットIII （カタログ番号５３９１３４、ＥＭＤ  Millipore）及び５０μＭの広範囲のＭＭＰ阻害剤Galardin（Calbiochem, Millipore）（図２１、第４列）の１：１００希釈溶液により、前処理された凍結膵臓癌患者組織と共に、４Ｄ１１−ＡＦ６８０、１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０及びＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０をインキュベートした後に得られる蛍光イメージを表す。青色染色は、ＤＡＰＩ核染色を表す。その結果は、膵臓組織サンプルが、活性マトリプターゼ及び金属プロテアーゼを生成し、それらの存在がそれぞれの活性化可能抗体切断可能部分の切断をもたらし、それにより、マスキング部分を放出し、そして組織上のJagged標的物への活性化された抗体の安定した結合を可能にすることを示唆する。
【０６６３】
実施例１９．抗−Jagged抗体のインビボイメージング
この実施例は、本開示の抗−Jagged抗体のインビボイメージングを記載する。
【０６６４】
抗−Jagged抗体４Ｄ１１を、Alexa Fluor（登録商標）750により標識し、そして４０ ｋＤａ Thermo Scientific Zeba Spin Desalting Columnsを用いて、結合されていない色素から精製した。約４００−６００ｍｍ2の腫瘍体積を有する、ＢｘＰＣ３−ｌｕｃヒト膵臓癌腫瘍を担持する３匹のマウスのグループに、１０ｍｇ／ｋｇのAlexa Fluor（登録商標）750−標識された４Ｄ１１ 抗体 (ｎ＝３)を、単回腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。マウスをイソフルランにより麻酔し、そして注入の前、及び注入後２４、４８及び７２時間で、Caliper IVIS SpectrumCTイメージングシステム(Caliper, Perkin Elmer, Hopkinton MA)を用いて、７５０ｎｍ近赤外（ＮＩＲ）蛍光について画像化した。マウスは、最後のイメージング時点後、安楽死させた。図２２Ａは、ＢｘＰＣ３異種移植マウスモデルにおける注入の４８時間後の標識された４Ｄ１１抗体蛍光シグナルの代表を提供する。
【０６６５】
インビボイメージングデータを、標準化し、そしてLiving Image（登録商標）4.1ソフトウェアを用いて分析した。定量的比較のために、目的の領域（ＲＯＩ）を、腫瘍（Ｔ）及び正常組織（Ｎ）上に描がいた。各領域に関して、平均放射効率（光子×Ｃｍ-2×Ｓ-1）として定量化される蛍光シグナルを測定した。正常組織ＲＯＩに比較しての腫瘍ＲＯＩにおけるシグナルの比率（Ｔ／Ｎ）を計算し、正常組織に対する腫瘍における抗−Jagged抗体４Ｄ１１蓄積の測定値を提供した。図２２Ｂは、抗体４Ｄ１１投与グループについての平均放射効率の平均Ｔ／Ｎ比率±ＳＤを示すグラフを提供する。
【０６６６】
実施例２０．活性化可能抗−Jagged抗体のインサイチュイメージング
この実施例は、活性化可能抗−Jagged抗体の活性化及び結合のために、膵臓癌異種移植腫瘍組織及びヒト膵臓癌組織をスクリーニングするためへのインサイチュイメージングの使用を記載する。その結果は、本開示の活性化可能抗−Jagged抗体が、そのような組織により発現されるプロテアーゼにより活性化され、そしてそのような組織上のJagged標的物を結合できることを示唆する。
【０６６７】
ＢｘＰＣ3腫瘍サンプル及びヒト膵臓癌組織サンプルを、それぞれ１μｇ／ｍｌ及び５μｇ／ｍｌの濃度で、標識された抗−Jagged抗体４Ｄ１１及び抗−マトリプターゼＡ１１抗体による凍結組織の１時間の処理によりJagged及びＭＴ−ＳＰ１発現についてプロファイリングした。その結果は、それぞれ、表２４、第２及び３列に示される。
【０６６８】
さらに、活性化され、そしてＢｘＰＣ３異種移植及びヒト膵臓癌組織を結合する活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１及び５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１の能力を、インサイチュイメージングを用いて評価した。活性化可能抗体を、上記のようにして（実施例１８）、Alexa Fluor（登録商標）680 (Invitrogen)により標識した。それらの標識された活性化可能抗体、すなわち４Ｄ11−ＡＦ680 (また、本明細書においては１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０とも称する) 及び ５３４２−ＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０ (また、本明細書においてはＰＬＧＬ−４Ｄ１１−ＡＦ６８０とも称する)を、上記インサイチュイメージングのプロトコル（実施例１８）に従って、４人の患者から単離された、凍結ＢｘＰＣ３異種移植組織又はヒト膵臓癌組織サンプルと共にインキュベートした。表２４は、活性化可能抗−Jagged抗体を活性化し、そして活性化された活性化可能抗−Jagged抗体を結合する、ＢｘＰＣ３腫瘍及び膵臓癌患者の組織サンプルの能力を示す結果を要約する。表２４においては、組織サンプル（第２及び３列）に結合する抗−Jagged抗体４Ｄ１１又は抗−マトリプターゼ抗体Ａ１１の量を測定するＩＨＣ染色を、０〜３＋の評点を付けた：０、染色なし；１＋、弱い染色；２＋、中位の染色；及び３＋、強い染色。インサイチュイメージング染色（第４及び５列）評点は、４Ｄ１１抗体染色との比較に基づかれ、そして次の通りに定義される：０、染色内；１＋、親抗体に比較して、弱い染色；２＋、親抗体に比較して、中位の染色；及び３＋、親抗体に類似する染色。ＢｘＰＣ３結果がまた、図２０に示される。
【０６６９】
【表２９】
2015521625.tif 000164
【０６７０】
実施例２１．剤に結合される活性化可能抗体のインビトロ特徴化
この実施例は、培養下でＢｘＰＣ３細胞の増殖を阻害する本開示の活性化可能抗体−剤結合体の能力を記載する。
【０６７１】
活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１、抗−Jagged抗体４Ｄ１１及びリツキサンを、それぞれ、モノメチルアウリスタチンE（ＭＭＡＥ）、合成抗−分裂チューブリン重合阻害剤に結合し、活性化可能抗体−剤結合体５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＭＭＡＥ、抗体−剤結合体４Ｄ１１−ＭＭＡＥ及びリツキサン−ＭＭＡＥを生成した。
【０６７２】
細胞培養下でのＢｘＰＣ３細胞増殖を阻害する次の化合物の能力を決定した：活性化可能抗−Jagged抗体−剤結合体５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＭＭＡＥ；ｕＰＡにより活性化された活性化可能抗−Jagged抗体−剤結合体５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＭＭＡＥ；ｕＰＡにより活性化された活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１；抗−Jagged抗体４Ｄ１１；抗−Jagged抗体−剤結合体４Ｄ１１−ＭＭＡＥ；リツキサン；及びリツキサン−ＭＭＡＥ。活性化可能抗体及び活性化可能抗体−剤結合の活性化を、トリスｐＨ８．５中、活性部位−滴定ｕＰＡ（５００ｎＭ）による３７℃での一晩の消化によりもたらし；活性化を、ＣＥ分析（LabChip  GXII）により測定した。ｕＰＡ−活性化された活性化可能抗体及びｕＰＡ−活性化された活性化可能抗体−剤結合体を、プロテインＡを用いて精製し、そして次に、研究の前、４℃で貯蔵した。
【０６７３】
ヒト膵臓癌細胞系ＢｘＰＣ−３をＡＴＣＣから入手した。ＢｘＰＣ−３細胞を、空気中、５％ＣＯ2の雰囲気下で、３７℃で、完全培地（１０％ウシ胎児血清により補充されたＲＰＭＩ−１６４０）において増殖した。ＢｘＰＣ−３細胞を、対数増殖期に収穫し、完全培地に再懸濁し、そして９６ウェル白色チムニープレートのウェルに、ウェル当たり５０００個の細胞の密度でプレートした。一晩のインキュベーションに続いて、１０μｇで出発して、０で終わる各化合物の１０ポイント１：３連続希釈溶液を、二重反復して、培養中の細胞に添加した。細胞を３日間、培養し、そして細胞生存性を、CellTiterGlo (Promega)及びルミノメーター（Tecan）を用いて、製造業者のプロトコルに従って測定した。データを、Prism  Graphpadを用いて分析した。結果は、図２４に示される。
【０６７４】
実施例２２．活性化可能抗−Jagged抗体結合体のインビボ有効性及び安全性
この実施例は、インビボで、ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍の増殖を低める本開示の活性化可能抗体−剤結合体の能力を記載する。
【０６７５】
活性化可能抗−Jagged抗体及び活性化可能抗−Jagged抗体−剤結合体を、上記方法に類似する方法を用いて、及び表２５に示される化合物、グループ及び投与量を用いて、ＢｘＰＣ３異種移植腫瘍の増殖を低めるそれらの能力について試験した。
【０６７６】
【表３０】
2015521625.tif 000165
【０６７７】
初期投与後の日数に対する腫瘍体積をプロットする図２５は、抗−Jagged抗体４Ｄ１１−ＭＭＡＥ及び活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＭＭＡＥの両者が、ＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍増殖を、それらの結合されていないカウンターパートよりも効果的に阻害したことを示す。
【０６７８】
図２６は、種々のグループの体重減少を示す。抗−Jagged抗体４Ｄ１１又は抗−Jagged抗体−ＭＭＡＥを投与された動物は有意な体重減少を示したが、活性化可能抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１又は活性化可能抗−Jagged抗体−剤結合体５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＭＭＡＥを投与された動物は有意な体重減少を示さなかった。
【０６７９】
実施例２３．ＢｘＰＣ３腫瘍モデルにおけるゲムシタビンと組合しての抗−Jagged抗体及び活性化可能抗体のインビボ有効性及び安全性
抗−Jagged活性化可能抗体を、上記方法に類似する方法、及び表２６に示される抗体、活性化可能抗体、グループ及び投与量を用いて、ＢｘＰＣ3異種移植腫瘍の増殖を低めるそれらの能力について試験した。
【０６８０】
【表３１】
2015521625.tif 000166
【０６８１】
腫瘍接種後の日数に対する腫瘍体積をプロットする図２９は、ゲムシタビンと組合しての抗−Jagged活性化可能５３４２−１２０４−４Ｄ１１が、ＢｘＰＣ−３異種移植腫瘍の増殖を阻害することを示す。最初の投与は、３０日目であった。図３０は、ゲムシタビンのみのグループ及びゲムシタビンと組合して抗体を投与されたグループについての体重減少を示す。より高い投与量の抗体及びゲムシタビンを投与された動物は有意な体重減少を示したが、活性化可能抗体及びゲムシタビンを投与された動物は、ゲムシタビンのみの動物よりも体重減少を示さなかった。２０ｍｇ／ｋｇでの抗体は、ゲムシタビンと組合して与えられる場合、許容されず、体重減少のために４９日目にそのグループの犠牲をもたらした。しかしながら、ゲムシタビンと組合しての２０ｍｇ／ｋｇでの活性化可能抗体は許容され、そしてゲムシタビンと組合して、６．７及び２０ｍｇ／ｋｇでの抗体の有効性と同等の有効性を示した。マウス胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）の血清濃度を、上記のようにして測定した。マウスＴＳＬＰ（ｍＴＳＬＰ）の血清レベルを、第２投与の前、個々のマウスについての定量化した。ゲムシタビングループと組合しての２０ｍｇ／ｋｇの抗体のみが、図３１に示されるように、高められた血清ｍＴＳＬＰを示した。
【０６８２】
実施例２４．前立腺及び乳腺腫瘍モデルにおける抗−Jagged抗体のインビボ有効性
抗−Jagged４Ｄ１１抗体の有効性を、前立腺及び乳腺癌について自生腫瘍モデルにおいて評価した。それらのモデルは、生成される腫瘍が異なった段階の腫瘍発生を受け、そして重要なことには、免疫応答性マウスの使用を可能にするので、ヒトの状態を模倣できる。
【０６８３】
前立腺癌モデル
ＴＲＡＭＰＳマウスは、広く使用される前立腺癌のモデルである（Greenberg NM et al, 1995, Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3439-3443）。初期病変は、生後約２週間で、十分に分化された腺癌に進行する前立腺上皮内過形成（ＰＩＮ）である。低分化腺癌は、生後２４週のＴＲＡＭＰ動物に発生する。生後１８−２４週で、ＴＲＡＭＰマウスを、２種のグループ、すなわち、それぞれ６匹のマウスの対照及び治療グループに分けた。抗−Jagged抗体４Ｄ１１及びＩＶＩｇ対照アリコートを、２０ｍｇ／ｋｇで、それぞれのグループｑ７ＤＸ５にＩＰ投与した。最終投与の７日後、動物を屠殺し、そして腫瘍量を、尿生殖器の重量として測定し、そして対照の野生型Ｃ５７／Ｂ１６マウスに比較した。図３２は、抗−Jagged抗体４Ｄ１１がＴＲＡＭＰマウスにおいて前立腺腫瘍の増殖の制限において有効であったことを示唆する。
【０６８４】
乳癌モデル
ＨＥＲ２／neuトランスジェニック系は、生後２０週で、初産の雌において乳腺腫瘍を発生し、そして生後２５週で１００％の肺転移があった（Siegel PM et al., 1999, The EMBO Journal 18, 2149-2164）。乳癌についての治療を試験する実験のために、ＨＥＲ２／neu雄マウスを、ＦＶＢ野生型雌マウスと交配し、そして子孫を、ＨＥＲ２／neu雌を選択するために遺伝子型を特定した。生後２０週で、ＨＥＲ２／neu雌を２種のグループ、すなわち対照及び治療グループに分けた。抗−Jagged抗体４Ｄ１１及びＩＶＩｇ対照アリコートを、２０ｍｇ／ｋｇでｑ７ＤＸ５にＩＰ投与した。図３３は、抗−Jagged抗体４Ｄ１１が、Ｈｅｒ２／neuトランスジェニックマウスにおいて自発的腫瘍の増殖を強く阻害しことを示唆する。
【０６８５】
実施例２５．二次抗体による検出を伴っての、標識されたか又は標識されていない抗−Jagged活性化可能抗体のインサイチュイメージング
この実施例は、標識されたか又は標識されていない抗−Jagged活性化可能抗体の使用を記載し、ここで切断及び結合が、活性化可能抗体のＡＢ部分に対して特異的に結合する二次抗体を用いて検出された。その結果は、標識されていない活性化可能抗体の活性化及び結合を評価する能力を示唆する。
【０６８６】
ＴＲＡＭＰ前立腺癌腫瘍組織上のAlexa６８０−標識された抗−Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１の活性化及び結合のインサイチュイメージングを、次の通りに実施し：凍結組織切片をガラススライド上に配置した。Alexa６８０−標識された抗−Jagged活性化可能抗体を含む溶液を、組織上に適用し、そして１５０ ｍＭ のＮａＣｌ、１００ μＭ のＺｎＣｌ2、５ ｍＭ のＣａＣｌ2 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む、５０ｍMのトリス−ＨＣl緩衝液ｐＨ７．４のインキュベーション緩衝液下で、室温（約２２−２４℃）で１時間、インキュベートした；約４μｇ／ｍｌの濃度での活性化可能抗体。そのようなインキュベーションの状条は、例えば、次のように変えることにより、組織切片における切断剤の助けになるよう調節され得る：溶液のｐＨ（例えば、約ｐＨ７〜約ｐＨ８．５の範囲内）、インキュベーションの温度（例えば、約２０℃〜約４０℃の範囲内、例えば室温又は３７℃）、インキュベーション時間(例えば、約１５分〜約１５０分の範囲内)及び／又は活性化可能抗体の濃度（例えば、約０．０５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの範囲内）。次に、組織を広範囲に洗浄し、非結合物質を除去した。組織上での活性化された抗体の存在は、６８０ｎｍでのイメージング、及びAlexaFluor４８８により標識された二次抗−ヒトＩｇＧ抗体を用いて検出された。その検出の条件は、検出試薬及び検出様式（例えば、蛍光標識される）に調節され得る。例えば、蛍光標識が使用される場合、組織が蛍光顕微鏡に提出された。図３４に示されるように、抗−Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１は、Alexa６８０（抗−Jagged活性化可能抗体の標識）及びＦＩＴＣチャネル（抗−ヒトＩｇＧ抗体の標識）の両者で同一の染色を示し、このことは、標識されていない活性化可能抗体、及び活性化可能抗体、例えば標識された抗体に対して特異的に結合する二次試薬によりインサイチュイメージングを行うことが可能であることを示唆する。両チャネルに示される蛍光シグナルを、図３４、下行に示されるように、広範囲の阻害剤カクテルセットIII （ＢＳＰＩ）（539134, EMD Millipore, Billerica, MA）及び５０μＭの広範囲のＭＭＰ阻害剤Galardin（Calbiochem, Millipore）の１：１００希釈溶液による組織の前処理により阻害した。
【０６８７】
実施例２６．標識されていない抗−Jagged活性化可能抗体のインサイチュイメージング
この実施例は、標識されていない抗−Jagged活性化可能抗体の使用を記載する。切断及び結合を、活性化可能抗体のＡＢ部分に対して特異的に結合する二次抗体を用いて検出した。
【０６８８】
ＴＲＡＭＰ前立腺癌腫瘍組織上のAlexa６８０−標識されていない抗−Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１の活性化及び結合のインサイチュイメージングを、次の通りに実施し：凍結組織切片をガラススライド上に配置した。Alexa６８０−標識されていない抗−Jagged活性化可能抗体を含む溶液を、組織上に適用し、そして１５０ ｍＭ のＮａＣｌ、１００ μＭ のＺｎＣｌ2、５ ｍＭ のＣａＣｌ2 及び０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む、５０ｍMのトリス−ＨＣl緩衝液ｐＨ７．４のインキュベーション緩衝液下で、室温（約２２−２４℃）で１時間、インキュベートした；約４μｇ／ｍｌの濃度での活性化可能抗体。そのようなインキュベーションの状条は、例えば、次のように変えることにより、組織切片における切断剤の助けになるよう調節され得る：溶液のｐＨ（例えば、約ｐＨ７〜約ｐＨ８．５の範囲内）、インキュベーションの温度（例えば、約２０℃〜約４０℃の範囲内、例えば室温又は３７℃）、インキュベーション時間(例えば、約１５分〜約１５０分の範囲内)及び／又は活性化可能抗体の濃度（例えば、約０．０５μｇ／ｍｌ〜約１０μｇ／ｍｌの範囲内）。次に、組織を広範囲に洗浄し、非結合物質を除去した。組織上での活性化された抗体の存在は、AlexaFluor４８８により標識された二次抗−ヒトＩｇＧ抗体を用いて検出された。その検出の条件は、検出試薬及び検出様式（例えば、蛍光標識される）に調節され得る。例えば、蛍光標識が使用される場合、組織が蛍光顕微鏡に提出された。図３５に示されるように、抗−Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１は、親抗−Jagged抗体と同程度の強度及びパターンでの染色を示した（それぞれ、第２及び１列）。抗−Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１の蛍光シグナルを、図３５、第３列に示されるように、広範囲の阻害剤カクテルセットIII （ＢＳＰＩ）（539134, EMD Millipore, Billerica, MA）及び５０μＭの広範囲のＭＭＰ阻害剤Galardin（Calbiochem, Millipore）の１：１００希釈溶液による組織の前処理により阻害した。データは、標識されていない（すなわち、未標識の）活性化可能抗体、及び検出可能標識を含み、そして活性化可能抗体のＡＢを特異的に結合する二次試薬を用いてインサイチュイメージングを行う実現可能性を示す。
【０６８９】
ヒトトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）及び膵臓癌組織サンプルを、活性化され、そしてインサイチュイメージングを用いてヒト腫瘍を結合する抗−Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４０−４Ｄ１１の能力についてプロファイルした。活性化可能抗体を、上記のようにしてAlexa Fluor（登録商標）680 (Invitrogen)により標識した。得られる活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１−ＡＦ６８０を、本明細書に記載されるインサイチュイメージングのプロトコルに従って、凍結された患者組織サンプルと共にインキュベートした。活性化し、そして抗−Jagged活性化可能抗体を結合するＴＮＢＣ及び膵臓癌患者の組織サンプルの能力についての結果が、表２７及び２８に要約されている。組織サンプルに結合する抗−Jagged（４Ｄ１１）抗体の量を測定するＩＨＣ染色を、次の−〜３＋の評点を付けた：−、染色なし；１＋（すなわち「＋」）、弱い染色；２＋（すなわち、「＋＋」）、中位の染色；及び３＋（すなわち、「＋＋＋」）、強い染色。抗−Jagged活性化可能抗体染色のインサイチュイメージングを、抗−Jagged抗体染色との比較に基づいて定量化した。表２７は、４Ｄ１１結合により検出されるJagged1及び/又はJagged2の発現レベル、及び活性化し、そして抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体を結合するトリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）組織の能力を示す。表２８は、４Ｄ１１結合により検出されるJagged1及び/又はJagged2の発現レベル、及び活性化し、そして抗−ＥＧＦＲ活性化可能抗体を結合する膵臓癌組織の能力を示す。
【０６９０】
【表３２】
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【０６９１】
【表３３】
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【０６９２】
実施例２７．抗−Jagged活性化可能抗体のプロテアーゼ活性化及び結合
この実施例は、インビトロで活性化される抗−Jagged抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１の能力を示す。
【０６９３】
抗−Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１を、ＰＢＳ中で、活性化可能抗体及び活性部位滴定ＭＴ−ＳＰ１を、それぞれ５８．５μＭ及び５７０ｎＭの最終濃度で組合すことにより活性化した。その混合物を、３７℃で２０時間インキュベートした。プロテインＡ精製の前、アリコートを除き、そしてＳＤＳ―ＰＡＧＥにより分析し、５３４２−１２０４−４Ｄ１１のタンパク質分解消化が完結したことを確かめた。
【０６９４】
ＭＴ−ＳＰ１及び切断されたマスキング部分を除くために、活性化された５３４２−１２０４−４Ｄ１１を、標準プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製した。手短には、ＩｍｌのＨｉ−ＴｒａｐプロテインＡカラム（GE Healthcare life sciences）を、ＰＢＳにより平衡化した。結合されたタンパク質を、１Ｍのグリシン、ｐＨ３．０を用いて溶出し、そして０．１Ｍのトリス、ｐＨ８．０により中和し、そして続いて、ＰＢＳ中に一晩、透析した。
【０６９５】
抗−Jagged抗体４Ｄ１１、抗−Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１及び抗−Jagged活性化抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１の組換えヒトJagged１−Ｆｃへの結合を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。手短には、組換えｈＪａｇ１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Systems）を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに、ＨＡＮＫＳ緩衝液中、１μｇ／ｍｌの濃度で、一晩４℃で吸収した。すべての続く段階は室温で行われた。プレートを、ＨＡＮＫＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、４．０％脱脂粉乳により、１時間ブロックした。４Ｄ１１抗体及び活性化された抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１を、１００、３０、１０、３、１、０．３、０．１及び０．０３ｎＭでプレートに添加し、そして活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１を、１０００、３００、１００、３０、１０、３、１、０．３ｎＭでプレートに添加し、そして１時間インキュベートした。すべての測定は三重反復して行われた。プレートをＨＡＮＫＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎにより５度、洗浄した後、抗−ヒトＦＡＢ−ヤギ−ＨＲＰ二次（Ｓｉｇｍａ）を、プレートに、ＨＡＮＫＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、４．０％脱脂粉乳中、１：５０００の濃度で添加し、そして１時間インキュベートし、前述のように５度、洗浄し、そして次に、１−ＳＴＥＰ−ＴＭＢ１ ＥＬＩＳＡ溶液 (Thermo Scientific)を用いて展開した。４５０ｎｍでの吸光度を、ＴＥＣＡＮプレートリーダーを用いて測定した。図３６は、Jagged１に結合する、活性化された抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１の能力が、Jagged１への４Ｄ１１抗体の結合とは区別できないことを示す。
【０６９６】
実施例２８．Ｈ２９２腫瘍モデルにおける抗−Jagged活性化可能抗体のインビボ有効性及び安全性
抗−Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１を、次の方法を用いて、Ｈ２９２異種移植腫瘍の増殖を低める能力について試験した。生後６−８週の雌のｎｕ／ｎｕマウスに、無血清培地及びマトリゲル（１：１）中、５×１０6個のＨ２９２細胞を皮下移植した。目標範囲（約１００−２５０ｍｍ3）の腫瘍を有する４８−６０匹のマウスが、平均腫瘍サイズが１５０−２００ｍｍ3（ｎ＝８−１０／グループ）に達する場合、等しい平均腫瘍体積のグループにランダムに分けられ得るまで、腫瘍を１日おきに測定した。動物は、表２９に示される投与量を用いて処理された。
【０６９７】
【表３４】
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【０６９８】
腫瘍体積を示す図３７は、抗−Jagged活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１がＨ２９２異種移植腫瘍の増殖を阻害したことを示す。マウス胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）の血清濃度を、上記のようにして測定した。マウスＴＳＬＰ（ｍＴＳＬＰ）の血清レベルを、屠殺の後、個々のマウスについて定量化し；結果は図３８に示される。活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１は、ＴＳＬＰの上昇を示さなかったが、ところが６．７及び２０ｍｇ／ｋｇでの抗体下での動物は、ＩＶＩｇ処理されたグループに比較して、高められたＴＳＬＰを示した。
【０６９９】
屠殺の後、皮膚を、２０ｍｇ／ｋｇのＩＶＩｇ、抗体４Ｄ１１又は活性化可能抗体５３４２−１２０４−４Ｄ１１により処理された動物の腹部から採取した。皮膚を、ホルマリンに固定し、パラフィンにより包埋し、そしてＨ＆Ｅ染色した。図３９が示すように、過角化症が抗体−処理されたグループに観察されたが、ところが活性化可能抗体−処理されたグループは、制限された過角化症を示したか、又は無の過角化症を示した。矢印は、有意な過角化症を示す毛包を示す。
【０７００】
他の実施形態
本発明はその詳細な説明と共に記載されて来たが、前述の記載は例示的であり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではない。他の局面、利点及び改変は、以下の範囲内である。
【図１９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
2015521625.tif 000186
【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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