(57)【要約】  クリック核酸単量体およびそのような単量体を含有する重合体が開示される。クリック核酸単量体は、所望により保護されたチオール部分、所望により保護されたチオール−クリック受容体部分、およびいくつかの例ではＡ、Ｇ、Ｔ、Ｕ、またはＣ核酸塩基である所望により保護された核酸塩基（ＮＢ）を含む。いくつかの例において、クリック核酸単量体は、Ｎ−ビニルチオールアセトアミド（ＶＴＡ）骨格を含む。他の例において、クリック核酸単量体は、Ｎ−ビニルチオールエチルアミン（ＶＴＥ）骨格を含む。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の天然核酸重合体の適用、およびＰＮＡまたはモルホリノ核酸等の合成核酸重合体の適用の代わりに、そのような重合体を使用する方法も開示される。
2015514706.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望により保護されたチオールと、
所望により保護されたチオール−クリック受容体と、
所望により保護された核酸塩基（ＮＢ）と、
３以上の結合価を有する原子を含む骨格と、を含み、
前記所望により保護されたチオール、所望により保護されたチオール−クリック受容体部分および所望により保護された核酸塩基は、独立して前記骨格に共有結合により連結されている、
クリック核酸単量体。
【請求項２】
前記クリック核酸単量体が以下の構造：
【化１】
2015514706.tif 000017
を有し、
式中、Ｚは３以上の結合価を有する原子であり、ＮＳは所望により保護された核酸塩基（ＮＢ）を含む核酸塩基側鎖であり、Ｔは所望により保護されたチオールであり、ＴＣＡは所望により保護されたチオール−クリック受容体である、
請求項１に記載のクリック核酸単量体。
【請求項３】
前記クリック核酸の骨格が、３の結合価を有する一つまたは複数の追加の原子を含む、請求項１または２に記載のクリック核酸単量体。
【請求項４】
前記クリック核酸単量体が以下の構造：
【化２】
2015514706.tif 000018
を有し、
式中、ＹおよびＺは３以上の結合価を有する原子であり、ｎは０〜４の整数であり、ＮＳは所望により保護された核酸塩基を含む核酸塩基側鎖であり、Ｔは所望により保護されたチオールであり、ＴＣＡは所望により保護されたチオール−クリック受容体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項５】
前記クリック核酸単量体が以下の構造：
【化３】
2015514706.tif 000019
を有し、
式中、ＹおよびＺは３以上の結合価を有する原子であり、ｎは０〜４の整数であり、ｍは０〜４の整数であり、ＮＳは所望により保護された核酸塩基を含む核酸塩基側鎖であり、Ｔは所望により保護されたチオールであり、ＴＣＡは所望により保護されたチオール−クリック受容体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項６】
前記クリック核酸単量体が以下の構造：
【化４】
2015514706.tif 000020
を有し、
式中、ＹおよびＺは３以上の結合価を有する原子であり、ｎは０〜４の整数であり、ＮＳは所望により保護された核酸塩基を含む核酸塩基側鎖であり、Ｔは所望により保護されたチオールであり、ＴＣＡは所望により保護されたチオール−クリック受容体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項７】
前記クリック核酸単量体が以下の構造：
【化５】
2015514706.tif 000021
を有し、
式中、ｎは０以上の整数であり、ｍは０より大きい整数であり、ｎ＋ｍは１〜７であり、ＮＳは所望により保護された核酸塩基を含む核酸塩基側鎖であり、Ｔは所望により保護されたチオール部分であり、ＴＣＡは所望により置換されたチオール反応性部分であり、Ｚは３以上の結合価を有する原子であり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、所望により置換された、水素、ヒドロキシル、芳香族、アミン、カルボキシル、およびカルボニル基の組合せである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項８】
核酸塩基側鎖がリンカーを含み、前記リンカーが前記核酸塩基を３以上の結合価を有する原子に共有結合により連結させる、請求項１〜７のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項９】
前記リンカーが−Ｃ（Ｏ）Ｃ−を含む、請求項８に記載のクリック核酸単量体。
【請求項１０】
前記所望により保護されたチオール−クリック受容体が、ビニル、ビニルエーテル、アリルエーテル、ノルボルネン、ビニルスルホン、エポキシ、アクリレート、イソシアネート、アルキン、メタクリレート、マレイミド、ハロゲン化物またはそのアルキル伸長物を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項１１】
前記ビニル部分が以下の構造：
−ＣＲ５＝ＣＲ６Ｒ７、
を有し、
式中、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、独立して水素、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、置換ヘテロシクロ、アルキル、置換アルキル、アシル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、または−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、アリールもしくは置換アリールまたは複素環である、請求項１０に記載のクリック核酸単量体。
【請求項１２】
３以上の結合価を有する前記原子が窒素（Ｎ）または炭素（Ｃ）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項１３】
前記単量体が、前記チオール部分および前記所望により保護されたチオール−クリック受容体の末端炭素を含む５〜９原子の反復単位を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項１４】
前記単量体が、前記チオール部分および前記所望により保護されたチオール−クリック受容体の末端炭素を含む６原子の反復単位を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項１５】
前記チオール部分が保護されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項１６】
前記チオール−クリック受容体が保護されている、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項１７】
前記核酸塩基が保護されている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項１８】
ＮＳ基が以下の構造：
【化６】
2015514706.tif 000022
を有し、式中、ＮＢは所望により保護された核酸塩基である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項１９】
前記所望により保護されたチオールが以下の構造：
【化７】
2015514706.tif 000023
を有し、式中、ｐは整数０〜４であり、メチレン基は所望により且つ独立して、アリール、ヒドロキシル、カルボニル、カルボン酸および他の酸、アミノ、アルキルアミド、チオエーテル、環式、複素環式、並びにそれらのアルキル伸長物で置換されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項２０】
前記所望により保護されるチオールが以下の構造：
【化８】
2015514706.tif 000024
を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項２１】
前記所望により保護されたチオール−クリック受容体が、所望により置換されたビニル、ビニルエーテル、アリルエーテル、ノルボルネン、イソシアネート、ビニルスルホン、エポキシ、アクリレート、メタクリレート、マレイミド、ハロゲン化物およびそれらのアルキル伸長物である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項２２】
前記所望により保護されたチオール−クリック受容体が以下：
【化９】
2015514706.tif 000025
のうちの１つを含み、式中、Ｘはハロゲン化物であり、Ｒが水素またはアルキル鎖である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項２３】
前記単量体がＮ−ビニルチオールアセトアミド（ＶＴＡ）骨格を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項２４】
前記単量体がＮ−ビニルチオールエチルアミン（ＶＴＥ）骨格を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項２５】
前記単量体がＡ、Ｇ、Ｔ、Ｕ、またはＣ核酸塩基を含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項２６】
前記単量体が図４、５、７〜１４または１８のいずれか一つに示されるクリック核酸を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載のクリック核酸単量体。
【請求項２７】
チオールとチオール−クリック受容体との反応を介して、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のクリック核酸単量体が請求項１〜２６のいずれか１項に記載のもう１つのクリック核酸単量体に共有結合により連結されたものを含む、クリック核酸重合体。
【請求項２８】
前記クリック核酸重合体がエフェクター分子に共有結合している、請求項２７に記載のクリック核酸重合体。
【請求項２９】
前記エフェクター分子が検出可能なマーカーである、請求項２８に記載のクリック核酸重合体。
【請求項３０】
前記エフェクター分子が生物活性化合物である、請求項２８に記載のクリック核酸重合体。
【請求項３１】
前記チオ−エーテル重合体が表面に結合している、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載のクリック核酸重合体。
【請求項３２】
請求項２７〜３１のいずれか一項に記載のクリック核酸重合体を含む、アレイ。
【請求項３３】
請求項２７〜３０のいずれか１項に記載のクリック可能な核酸重合体を含む、組成物。
【請求項３４】
生理学的に許容できる担体をさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３５】
クリック核酸単量体を作製する方法であって、図５、８および／または１５に示されるスキームを含む、方法。
【請求項３６】
前記クリック核酸単量体が請求項１〜２７のいずれか一項に記載の前記クリック核酸単量体を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
クリック核酸重合体を作製する方法であって、図２、９、または１５に示されるスキームを含む、方法。
【請求項３８】
請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の前記クリック核酸重合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は核酸模倣剤に関し、特にチオエーテル骨格を有する核酸模倣剤、そのような核酸模倣剤を製造する方法、およびその使用に関する。
関連出願の相互参照
【０００２】
本出願は、２０１２年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６１７，１４５号の優先権の利益を主張するものであり、当該仮特許出願の全文は参照することにより本明細書に組み入れられるものとする。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびＰＮＡ等の核酸系分子によって、遺伝子ノックアウトにであれ、アプタマーとしてであれ、薬物送達および標的化にであれ、生物学および生物医学システムにおいて、生物学的検出において、および他の多くの領域において、実施および刺激的な応用が、増大傾向で、継続的に発見されている。
【０００４】
ＤＮＡは、遺伝物質としてまたはアプタマーとして機能し、相補鎖にハイブリダイズし、転写／翻訳において活性があり、そしてナノ構造の組織化および形成を誘導することが可能な、最も有能で強力な分子のうちの１つである。残念ながら、ＤＮＡの技術的利用は、最も価値のある応用、特に材料としての応用以外においての導入が、極めて高価および／または困難なままである。合成による代替物として、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が開発され、相補的ＰＮＡまたはＤＮＡ分子とハイブリダイズすることが発見された。
【０００５】
最初のＰＮＡはアミノエチルグリシン（ＡＥＧ）骨格を用いて合成され、このＡＥＧは、ＤＮＡのリン酸塩−リボース骨格のそれに類似した反復単位距離および最適化された結合角を示した、初歩の分子モデリングに基づいて選択された。その発見から、ＰＮＡのいくつかの変種が合成および評価されており、ハイブリダイゼーションに必要とされる基本的な構造的制約が明らかにされている。最も決定的な制約は、鎖の骨格に沿った側鎖核酸塩基間の距離（６個の原子が最適）であると思われる。ｓｓＤＮＡとのハイブリダイゼーションが、核酸塩基間に５原子または７原子のスペーサーを有するＰＮＡについて観察されているが、６原子のスペーサーを有するＰＮＡ骨格変種が、それらのより高い融解温度によって示されるように、より大きな安定性を示す。ＰＮＡは、自己集合型および標的化型の薬物送達において広く使用されている。ＰＮＡのＤＮＡに対する優位性はあるが、形成反応およびペプチド骨格の特徴によって限定されている。これらの問題の中に、大量の反応物過多の必要、比較的遅い反応速度、および副反応に対する多数の懸念がある。それ故、さらなる核酸模倣剤が必要とされている。本開示はこの必要に応えるものである。
【発明の概要】
【０００６】
ポリチオ−エーテル核酸を作製するために使用することができる単量体ＣＮＡ分子、構造または構成単位が本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、チオ−エーテル核酸単量体は、所望により保護されたチオール部分、所望により保護されたチオール−クリック受容体、所望により保護された核酸塩基、および、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）、またはホウ素（Ｂ）等の３以上の結合価を有する原子を含む骨格を含む。チオール、チオール−クリック受容体、および核酸塩基は、独立して共有結合を介して骨格に連結されている。いくつかの例では、骨格は３以上の結合価を有する追加の原子を含む。いくつかの実施形態において、チオ−エーテル核酸単量体はリンカーをさらに含み、そのリンカーは核酸塩基を３以上の結合価を有する原子に共有結合的に連結させている。いくつかの例では、リンカーは−Ｃ（Ｏ）Ｃ−を含む。いくつかの実施形態において、リンカーおよび核酸塩基は核酸塩基側鎖（ＮＳ）である。
【０００７】
いくつかの実施形態において、クリック核酸単量体は以下の構造：
【化１】
2015514706.tif 000003
を有し、式中、Ｚは、Ｃ、Ｎ、またはＢ（ホウ素）等の３以上の結合価を有する骨格原子であり、ＮＳは、所望により保護された核酸塩基を含む核酸塩基側鎖（ＮＢ）およびＮＢとＺを連結している所望によるリンカーであり、Ｔは、所望により保護されたチオールであり、ＴＣＡは所望により保護されたチオール−クリック受容体である。
【０００８】
いくつかの実施形態において、クリック核酸の骨格は、Ｃ、Ｎ、またはＢ等の、３以上の結合価を有する一つまたは複数の追加の原子を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、クリック核酸単量体は、以下の構造：
【化２】
2015514706.tif 000004
を有し、式中、ＹおよびＺは３以上の結合価を有する原子（例えば炭素、窒素、およびホウ素）であり、ｎは０〜４の整数であり、ＮＳは所望により保護された核酸塩基を含む核酸塩基側鎖であり、Ｔは所望により保護されたチオールであり、ＴＣＡは所望により保護されたチオール−クリック受容体である。
【００１０】
いくつかの実施形態において、クリック核酸単量体は以下の構造：
【化３】
2015514706.tif 000005
を有し、式中、ＹおよびＺは３以上の結合価を有する原子であり、ｎおよびｍは独立して０〜４の整数であり、ＮＳは所望により保護された核酸塩基を含む核酸塩基側鎖であり、Ｔは所望により保護されたチオールであり、ＴＣＡは所望により保護されたチオール−クリック受容体である。
【００１１】
いくつかの実施形態において、クリック核酸単量体は以下の構造：
【化４】
2015514706.tif 000006
を有し、式中、ＹおよびＺは３以上の結合価を有する原子であり、ｎおよびｍは独立して０〜４の整数であり、ＮＳは所望により保護された核酸塩基を含む核酸塩基側鎖であり、Ｔは所望により保護されたチオールであり、ＴＣＡは所望により保護されたチオール−クリック受容体である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、クリック核酸単量体は以下の構造：
【化５】
2015514706.tif 000007
を有し、式中、ｎ＋ｍは１〜７であり、ｎは０以上であり、ｍは０より大きく、ＮＳは所望により保護された核酸塩基を含む核酸塩基側鎖であり、Ｔは所望により保護されたチオールであり、ＴＣＡは所望により保護されたチオール−クリック受容体であり、Ｚは３以上の結合価を有する原子であり、Ｒ１およびＲ２は独立して、所望により置換された、水素、ヒドロキシル、芳香族、アミン、カルボキシル、およびカルボニル基の組合せである。
【００１３】
いくつかの実施形態において、クリック核酸単量体はリンカーをさらに含み、そのリンカーは核酸塩基を３以上の結合価を有する原子に共有結合的に連結している。いくつかの例では、リンカーは−Ｃ（Ｏ）Ｃ−を含む。いくつかの実施形態において、開示のクリック核酸単量体は、Ｎ−ビニルチオールアセトアミド（ＶＴＡ）骨格を含む。他の実施形態では、開示のクリック核酸単量体は、Ｎ−ビニルチオールエチルアミン（ＶＴＥ）骨格を含む。
【００１４】
開示のチオ−エーテル核酸単量体、例えば、開示のチオ−エーテル単量体のうちの一つまたは複数を含む、クリック核酸重合体も開示される。そのような重合体は、チオール部分とチオール−クリック受容体部分の末端との間が末端連結されている。いくつかの例では、ＣＮＡ分子はエフェクター分子等の一つまたは複数の追加の分子と複合体化している。いくつかの実施形態において、例えば治療剤として、チオ−エーテル核酸重合体は、薬学的に許容できる担体を含む組成物等の組成物として提供される。そのような重合体を、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、モルホリノ核酸（ＭＮＡ）および／またはＰＮＡ等の合成核酸模倣剤の代わりとして使用する方法も企図される。
【００１５】
本開示の上記および他の特徴および利点は、添付図への参照と共に進行する以下の発明の詳細な説明からより明白となる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、オリゴヌクレオチド種であるＤＮＡ、ＰＮＡおよびＣＮＡの可能な構造を示している。天然生体高分子であるＤＮＡから、人工生体高分子であるＰＮＡ、および本明細書に記載される１つの可能なＣＮＡ構造までの骨格重合体の構造進化が示される。この例において、ＣＮＡ骨格は、ＰＮＡおよびＤＮＡの両方に似た分子間隔を有し、本明細書で開示されるチオール−エンクリック反応から形成されるチオ−エーテル骨格を有し、ＤＮＡを含む他のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションを起こす能力を有することで、制御された会合および生物学的機能性を誘導するように設計されている。
【図２】図２は、一般化されたラジカル介在性チオール‐エン「クリック」反応機構の１例の模式図である。チオール‐エン反応は、チオールおよびビニル（「エン」）官能基の間で高度に選択的な付加をもたらす急速で連続的な成長および連鎖移動機構を起こす。その非常に高い反応効率は、低濃度の光開始剤が、反応の時間空間的な制御を達成することを可能にする。ＣＮＡ重合体形成において、Ｒ１およびＲ２は、それぞれ、ＣＮＡ重合反応における第一および第二のＣＮＡ単量体である。チオール−エン反応機構が示されているが、本明細書に記載されるように、その反応は、チオール部分と、アルキン、ハロゲン化物、イソシアネートまたはエポキシ部分等のあらゆるチオール−クリック受容体との間で起こり得る。
【図３】図３は、２つのチオール−エン光重合反応の官能基変換を示しており、完全な変換が示されている。トリビニルエーテルおよびジチオール単量体（左）並びにトリアリルエーテルおよびジチオール単量体（右）の化学量論的な混合物の重合における「エン」変換が示されている。示されてはいないが、チオール変換は同一の変換プロファイルに従い、これにより、エンおよびチオールの間の１対１の反応速度論が示される。この結果は、化学量論的な混合物のチオール−エン反応が、本明細書に記載される実施案の多くにとって欠かせない容易性および迅速性を備えて、反応物の完全な変換を達成することを示している。前記反応は、０．１重量％のヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトンを用いて、１０ｍＷ／ｃｍ２、３６５ｎｍ光の下で、光開始された。
【図４】図４はＮ−ビニルチオールエチルアミン（ＶＴＥ）をベースとしたＣＮＡ単量体構造を示している。基本単量体は保護チオール、ビニル、および核酸塩基（ＮＢ）を含有しており、６原子の反復単位を有している。
【図５】図５は、シトシン−ＣＮＡ単量体（Ｃ−ＣＮＡ）の合成を示す模式図である。ＣＮＡ単量体合成は、メトキシトリチル基でのチオール保護からから開始され（ステップｉ）、ブロモ酢酸のアミドカップリングを介して進行し（ステップｉｉ）、その後ビニル基が二級アミンに付加される（ステップｉｉｉ）。シトシンがＢｏｃ保護され、側鎖ブロモアセトアミドにカップリングされることで（ステップｉｖ）、保護された生成物が形成される。全ての生成物はＮＭＲによって確認され、パーセンテージは各ステップの予備的な（すなわち、最適化されていない）収率である。
【図６】図６は、２５℃における相補的Ｇ−ＤＮＡ有りまたは無しでの（それぞれ、青色四角および緑色三角）Ｃ−ＣＮＡオリゴマーのＣＤスペクトルグラフ（上段）、および温度掃引により決定された融解温度（下段）を示している。融解温度（Ｔｍ）は、ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッドよりもＣＮＡ−ＤＮＡハイブリッドにおいてより大きく、一塩基ミスマッチ（すなわち、一塩基多型あるいはＳＮＰ）によってより影響を受けるが、これらはそれぞれ、より高次の安定性および選択性を示すものである。＊注：ＤＮＡ−ＤＮＡ融解温度はＢｉｏＭａｔｈ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを用いて算出された。
【図７】図７は、側鎖ブロモアセトアミドが４種の核酸塩基のうちのいずれにも迅速にカップリングして、１）アデニン（Ａ）−、２）チミン（Ｔ）−、３）グアニン（Ｇ）−、および４）シトシン（Ｃ）−ＣＮＡ単量体（Ｂｏｃ保護）を形成することを示している。
【図８】図８は、Ｎ−ビニルチオールアセトアミド（ＶＴＡ）をベースとしたＣＮＡ単量体の合成スキームを示している。メルカプトアセテートのチオールはメトキシトリチル基を用いることで保護され（ステップｉｖ）、一方、ビニル基はブロモアセトアミドに付加される（ステップｖ）。その２つの生成物はカルボジイミドカップリングされて（ステップｖｉ）、核酸塩基が付加される側鎖ブロモアセトアミドを有するＣＮＡを形成する。
【図９】図９は固体基質を利用したＣＮＡの合成を示している。核酸塩基（ＮＢ）基は、可視光および光開始剤の使用と、その後のＭｍｔ保護基の除去により行われるチオール−エンカップリングに影響を受けない。このプロセスが繰り返されることで複数の核酸塩基（ＮＢｘ）を有するＣＮＡが生成され、その後基質から切断されて、ＣＮＡ生成物が得られる。
【図１０】図１０は、Ｒ１がＶＴＥおよびＶＴＡのそれぞれにおいて水素（Ｈ）またはカルボニル（＝Ｏ）である、基本ＣＮＡ単量体構造を示している。
【図１１】図１１は、核酸塩基側鎖とともにチオール−クリック反応能力を導入する例示的なＣＮＡ単量体の一般構造を示しており、式中、ｎ＋ｍは１〜７であり、ｎは０以上であり、ｍは０より大きく、ＮＳは核酸塩基側鎖であり、ＰＧは（除去されていてもよい）チオール保護基であり、Ｒ１はビニル、アルキン、ハロゲン化物、イソシアネート、またはエポキシ等のチオール−クリック受容体であり得る。Ｒ２側鎖は、水素、ヒドロキシル、芳香族、アミン、カルボキシル、およびカルボニル官能基の組合せであり得る。Ｒ３は炭素または窒素等の３以上の原子価を有する原子である。
【図１２】図１２は、図１１に記載されるような、例示的な単量体の構造を示しており、式中、ｎ＋ｍは１〜７であり、ｎは０以上であり、ｍは０より大きく、ＮＳは核酸塩基側鎖であり、ＰＧはチオール保護基であり、ＥＷＧは所望により含まれていてもよい電子求引基である。Ｒ１側鎖は、水素、ヒドロキシル、芳香族、アミン、カルボキシル、およびカルボニル官能基の組合せであり得る。
【図１３】図１３は、ビニルエーテルをベースとしたＣＮＡ単量体およびアクリレートをベースとしたＣＮＡ単量体の構造を示しており、式中、ｎ＋ｍは１〜７であり、ｎは０以上であり、ｍは０より大きく、ＮＳは核酸塩基側鎖であり、ＰＧは（除去されていてもよい）チオール保護基である。Ｒ１側鎖は、水素、ヒドロキシル、芳香族、アミン、カルボキシル、およびカルボニル官能基の組合せであり得る。
【図１４】図１４は核酸塩基側鎖とともにチオール−クリック反応能力を導入する単量体の一般構造を示しており、式中、ｎ＋ｍは１〜７であり、ｎは０以上であり、ｍは０より大きく、ＮＳは核酸塩基側鎖であり、ＰＧは（除去されていてもよい）チオール保護基である。Ｒ１側鎖は、水素、ヒドロキシル、芳香族、アミン、カルボキシル、およびカルボニル官能基の組合せであり得る。Ｒ３は炭素または窒素等の３以上の原子価を有する原子である。
【図１５】図１５は、例示的な単量体およびそれらの重合体生成物の構造を示している。
【図１６】図１６は、光学的直接描画リソグラフィーによるアドレス可能なＣＮＡアレイの製造を図示している。最初に、集束レーザー光を用いることで、チオール化された表面にＣＮＡを空間選択的に反応させる。エラー増殖を防ぐために次にキャップ形成を用いて、これらの配列は、付加、カップリング、すすぎ、および脱保護という単量体合成サイクルを用いることで、迅速に製造される。
【図１７】図１７は、生物学、化学、工学、および材料科学におけるＣＮＡの合成、開発および実施のための、可能な全体的アプローチを図示している。チオール−エンクリックケミストリーによって構築されるＣＮＡは、ＤＮＡの利点およびその独特な能力を、自己構築（自己会合）、ナノテクノロジー、医学、およびバイオテクノロジーにおける大規模な開発に寄与させる可能性を有している。
【図１８】図１８Ａおよび図１８Ｂは、保護されていないＣＮＡ単量体の例を示しており、式中、ＮＢは核酸塩基である。
【図１９】図１９は、ＣＮＡ−ＤＮＡ（蛍光）ハイブリッド分子を用いて表面を修飾する方法を図示した模式図である。
【図２０】図２０は、表面上のＣＮＡ−ＤＮＡ（Ｆ）ハイブリッドに蛍光検出を使用した結果を示す棒グラフである。
【００１７】
配列表の簡単な説明
本明細書で示される核酸配列およびアミノ酸配列は、米国特許法施行規則１．８２２条に定義されたヌクレオチド塩基およびアミノ酸の標準的な文字略号を用いて示される。各核酸配列の一方の鎖のみが示されるが、表示の鎖へのいかなる参照によってもその相補鎖が含まれることは理解される。配列表は、２０１３年３月１１日に作成された、１キロバイトの、参照により本明細書に組み入れられている、ＣＯＬ＿０１１０ＷＰ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のファイルの形式でＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出される。
【００１８】
配列番号：１および２はＫＲＡＳの例示的な核酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
Ｉ．用語の概要
以下の用語および略語の説明は、本開示をより良く説明し、本開示の実施に際して当業者を手引きするために、提供される。本明細書で使用される場合、「含んで成る（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」を意味し、単数形「ａ」もしくは「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、文脈によって特に明示されない限り複数形の照応も含む。用語「ｏｒ」は、別段の明確な指示が無い限り、表示された選択肢である要素のうちの単一の要素または２つ以上の要素の組合せを指す。
【００２０】
特に明記しない限り、本明細書または特許請求の範囲で使用される成分の量、分子量、パーセンテージ、温度、時間等を表す全ての数は、用語「約」によって修飾されると理解されるものとする。従って、暗示的または明示的に特に示されない限り、記載される数値パラメーターは、求められる所望の特性および／または標準的な試験条件／方法下での検出限界に依存し得る近似である。実施形態を、論じられた先行技術と直接的且つ明示的に区別する場合、本実施形態の数字は、「約」という言葉が記載されない限りは近似ではない。
【００２１】
特に断りの無い限り、技術用語は慣例的用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Ｂｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ，  Ｇｅｎｅｓ  ＩＸ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｌｅｔ，  ２００８  （ＩＳＢＮ  ０７６３７５２２２３）；  Ｋｅｎｄｒｅｗ  ｅｔ  ａｌ．  （ｅｄｓ．），  Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，  １９９４  （ＩＳＢＮ  ０６３２０２１８２９）、およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ  （ｅｄ．），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９５  （ＩＳＢＮ  ９７８０４７１１８５７１０）に見出すことができる。化学における一般用語の定義は、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｊ．  Ｌｅｗｉｓ，  Ｓｒ．  （ｅｄ．），  Ｈａｗｌｅｙ’ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９９７  （ＩＳＢＮ  ０−４７１−２９２０５−２）に見出すことができる。
【００２２】
本開示の種々の実施形態の概説を容易にするために、以下の特定用語の説明が提供される。
【００２３】
投与：対象に本明細書に記載のクリック核酸（ＣＮＡ）等の作用剤をあらゆる有効な経路によって提供し、または与えること。例示的な投与経路としては、限定はされないが、局所的、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、腫瘍内、および静脈内等）、経口的、舌下、直腸、経皮、鼻腔内、膣内および吸入経路が挙げられる。
【００２４】
動物：生きている多細胞脊椎動物、例えば、哺乳動物を含むカテゴリー。「哺乳動物」には、ヒトとマウス等の非ヒト哺乳動物との両方が含まれる。用語「対象」には、ヒト対象およびマウス等の動物対象の両方が含まれる。いくつかの例では、対象は患者である。
【００２５】
アンチセンス化合物：ハイブリダイズする標的核酸分子（例えば少なくとも部分的に相補的な核酸塩基を有するＣＮＡ）の領域に対し少なくとも部分的に相補的なオリゴマー化合物を指す。本明細書で使用される場合、標的核酸分子「に対し特異的な」アンチセンス化合物は、その標的核酸分子と特異的にハイブリダイズし、その標的核酸分子の発現を調節するアンチセンス化合物である。本明細書で使用される場合、「標的」核酸は、アンチセンス化合物が特異的にハイブリダイズし発現を調節するように設計されている核酸分子である。
【００２６】
アンチセンス化合物の例としては、限定はされないが、プライマー、プローブ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびそれを含むＣＮＡが挙げられる。
【００２７】
アルコキシ：本明細書に記載のように、Ｚ１が、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、シリル基およびそれらの組合せから成る群から選択されるＡ−ＯＺ１ラジカル。適切なアルコキシラジカルとしては、例えば、メトキシ、エトキシ、ベンジルオキシ、ｔ−ブトキシ等が挙げられる。関連語は、Ｚ１がアリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、およびそれらの組合せから成る群から選択される「アリールオキシ」である。適切なアリールオキシラジカルの例としては、フェノキシ、置換フェノキシ、２−ピリジンオキシ、８−キナリンオキシ等が挙げられる。
【００２８】
アルキン部分：２つの炭素原子間に三重結合を有し、式‐ＣＣＲ１を有し、式中、Ｒ１が独立して水素、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、置換ヘテロシクロ、アルキル、置換アルキル、アシル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、または−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、アリールもしくは置換アリールまたは複素環であり得る、炭化水素。
【００２９】
アルキル：直鎖、分岐鎖、または環状の炭化水素鎖であり、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニル、オクテニル、ブタジエニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、ヘキシニル、ヘプチニル、およびアレニル基が挙げられる。
【００３０】
アルキル基は、同じであっても異なっていてもよい一つまたは複数のアルキル基置換基で所望により置換されていてもよく、ここで、「アルキル基置換基」としては、アルキル、ハロ、アリールアミノ、アシル、ヒドロキシ、アリールオキシ、アルコキシル、アルキルチオ、アリールチオ、アラルキルオキシ、アラルキルチオ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、オキソおよびシクロアルキルが挙げられる。一つまたは複数の酸素、硫黄または置換もしくは非置換の窒素原子がアルキル鎖に沿って所望により挿入されていてもよく、ここで窒素置換基は水素、アルキル（本明細書では「アルキルアミノアルキル」とも称される）、またはアリールである。「分岐鎖状」とは、メチル、エチルまたはプロピル等のアルキル基が直鎖アルキル鎖に結合しているアルキル基を指す。
【００３１】
アミノ：−ＮＺ１Ｚ２基であって、式中、Ｚ１およびＺ２のそれぞれが独立して、水素、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、置換ヘテロシクロアルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、アルコキシ、アリールオキシ、シリルおよびそれらの組合せから成る群から選択される。
【００３２】
アプタマー：特定の標的分子（例えば標的生体分子、例えば分析物、例えば標的分析物）と結合する、小分子量の核酸および分子。いくつかの例では、アプタマーはＣＮＡ分子である。
【００３３】
アリール：単一の芳香環、あるいは、融合された、共有結合的に連結された、またはメチレンもしくはエチレン部分等の共通の基に連結された複数の芳香環であり得る、芳香族置換基。共通な連結基は、ベンゾフェノン等におけるカルボニル、またはジフェニルエーテル等における酸素、またはジフェニルアミンにおける窒素であってもよい。芳香環には、特にフェニル、ナフチル、ビフェニル、ジフェニルエーテル、ジフェニルアミンおよびベンゾフェノンが含まれ得る。特定の実施形態において、用語「アリール」は、５員および６員の炭化水素および複素環式芳香環を含む、約５〜約１０個の炭素原子を含む環状芳香族を意味する。
【００３４】
アリール基は、同じであっても異なっていてもよい一つまたは複数のアリール基置換基で所望により置換されていてもよく、ここで「アリール基置換基」には、アルキル、アリール、アラルキル、ヒドロキシ、アルコキシル、アリールオキシ、アラルコキシル、カルボキシ、アシル、ハロ、ニトロ、アルコキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、アラルコキシカルボニル、アシルオキシル、アシルアミノ、アロイルアミノ、カルバモイル、アルキルカルバモイル、ジアルキルカルバモイル、アリールチオ、アルキルチオ、アルキレン、並びに、Ｒ’およびＲ”がそれぞれ独立して水素、アルキル、アリールおよびアラルキルであり得る−ＮＲ’Ｒ”が含まれる。
【００３５】
アリール基の具体例としては、限定はされないが、シクロペンタジエニル、フェニル、フラン、チオフェン、ピロール、ピラン、ピリジン、イミダゾール、イソチアゾール、イソキサゾール、ピラゾール、ピラジン、ピリミジン等が挙げられる。
【００３６】
（オリゴヌクレオチドへのＣＮＡの）結合または安定な結合：ＣＮＡは、充分な量のＣＮＡが塩基対を形成するかまたはその標的核酸にハイブリダイズする場合に、標的核酸等の標的に結合または安定に結合する。
【００３７】
結合は、物理的特性または機能的特性のいずれかによって検出することができる。標的とオリゴヌクレオチドまたはＣＮＡの間の結合は、機能的（例えば発現および／または活性の低減）結合アッセイおよび物理的結合アッセイの両方を含む、当業者に公知のいかなる手順によっても検出することができる。
【００３８】
接触：固体形態または液体形態の両方を含む直接的な物理的関連に置くこと（例えば、試料とＣＮＡとの接触）。接触は、インビトロで（例えば、診断検査で）、またはインビボで（例えば作用剤の対象への投与によって）、起こり得る。
【００３９】
共有結合：原子近傍の一つまたは複数の電子対を共有することを特徴とする、２つの原子間の原子間結合。用語「共有結合的に結合した」または「共有結合的に連結した」とは、２つの別々の分子（例えば、核酸塩基およびＣＮＡ骨格、またはＣＮＡ分子およびエフェクター分子等の第二の分子）を、１つの連続した分子にさせることを意味する。
【００４０】
検出可能な標識：第二の分子の検出を容易にするために、ＣＮＡ分子等の第二の分子に直接的または間接的に結合している、検出可能な分子（標識としても知られている）。例えば、検出可能なマーカーは、診断用画像処理技術（ＣＴスキャン、ＭＲＩ、超音波、光ファイバー検査、および腹腔鏡下検査等）によって検出が可能であり得る。検出可能なマーカーの具体例としては、限定はされないが、フルオロフォア、化学発光剤、酵素結合、放射性同位元素および重金属または化合物（例えば、ＭＲＩ検出用の超常磁性酸化鉄ナノ結晶）が挙げられる。ポリペプチドを標識する種々の方法が当該技術分野において公知であり、使用することができる。
【００４１】
検出：作用剤（シグナルまたは特定のＣＮＡプローブ等、またはそのようなＣＮＡプローブに結合された分子）が存在するか存在しないかを決定すること。いくつかの例では、検出には定量化もさらに含まれ得る。
【００４２】
エフェクター分子：治療効果、検出、または他の物理的効果（例えば、限定はされないが、エフェクター分子の局在化）等の所望の効果を有する、またはそれを生み出すことを目的とした分子。エフェクター分子としては、ポリペプチド、放射性同位元素および小分子（例えば薬剤）および標識等の分子が挙げられる。
【００４３】
電子求引基：ビニル結合から電子を引き離すあらゆる置換基。電子求引基の例としては、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ハロゲン、カルボニル、スルホニル、ニトリル、四級アミン、ニトロ、トリハロメチル、イミン、アミジン、オキシム、チオケトン、チオエステル、またはチオアミドが挙げられる。
【００４４】
エポキシド：３つの環原子を有し、それらの原子のうちの２つが炭素であり、残りの原子がその２つの炭素に結合した酸素である、環状エーテル。
【００４５】
ハロゲン化物またはハロ：Ｂｒ、Ｃｌ、ＩおよびＦから成る群から選択される原子。
【００４６】
ヘテロ原子：炭素以外の原子。いくつかの実施形態において、ヘテロ原子は、Ｎ、Ｏ、Ｐ、Ｓ、Ｓｉ、Ｂ、Ｇｅ、Ｓｎ、およびＳｅからなる群から選択される。
【００４７】
ヘテロシクロまたは複素環式：少なくとも１つの環に少なくとも１つのヘテロ原子、および好ましくは各環に５または６個の原子を有する、所望により置換された、完全飽和または不飽和の、単環式または二環式の、芳香族基または非芳香族基。ヘテロシクロ基は、１または２個の酸素原子、１または２個の硫黄原子、および／または１〜４個の窒素原子を環内に有することが好ましく、炭素またはヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合していてもよい。ヘテロシクロの例としては、フリル、チエニル、ピリジル、オキサゾリル、ピロリル、インドリル、キノリニル、またはイソキノリニル等のヘテロ芳香族が挙げられる。置換基の例には、以下の基のうちの一つまたは複数が含まれる：ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、ケト、ヒドロキシル、保護ヒドロキシル、アシル、アシルオキシ、アルコキシ、アルケンオキシ、アルキンオキシ、アリールオキシ、ハロゲン、アミド、アミノ、ニトロ、シアノ、チオール、ケタール、アセタール、エステルおよびエーテル。
【００４８】
ハイブリダイゼーション：オリゴヌクレオチドおよびＣＮＡ等のそれらの類似体は、相補的塩基間の水素結合（例えば、ワトソンクリック水素結合、フーグスティーン水素結合または逆フーグスティーン水素結合）によってハイブリダイズする。一般的に、核酸は、ピリミジン（シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ）、およびチミン（Ｔ））またはプリン（アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ））のいずれかである窒素含有塩基から構成される。これらの窒素含有塩基は、ピリミジンとプリンの間で水素結合を形成し、ピリミジンのプリンへの結合は「塩基対合」と称される。より具体的には、ＡはＴまたはＵに水素結合し、ＧはＣに結合する。「相補」とは、２つの異なる核酸配列間または同じ核酸配列の２つの異なる領域間で起こる塩基対合を指す。
【００４９】
「特異的にハイブリダイズ可能な」および「特異的に相補的な」は、安定且つ特異的な結合がオリゴヌクレオチド（またはＣＮＡ等のその類似体）とＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間で発生するのに充分な程度の相補性であることを示す用語である。オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的配列に対し１００％相補的である必要は無い。オリゴヌクレオチドまたは類似体は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への結合がその標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常機能に干渉し、且つ特異的結合が所望される条件下で非標的配列への非特異的結合を避けるのに充分な程度の相補性がある場合に、特異的にハイブリダイズ可能である。そのような結合は、特異的なハイブリダイゼーションと称される。
【００５０】
特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、選ばれたハイブリダイゼーション法の性質ならびにハイブリダイズ中の核酸配列の組成および長さによって異なる。洗浄時間もストリンジェンシーに影響するが、一般的には、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特にＮａ＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。
【００５１】
炭化水素またはヒドロカルビル：炭素元素および水素元素のみから成る有機化合物またはラジカル。これらの部分としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアリール部分が挙げられる。これらの部分としては、他の脂肪族または環状炭化水素基で部分置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、およびアリール（例えば、アルカリル、アルケンアリール、およびアルキンアリール）も挙げられる。
【００５２】
「置換ヒドロカルビル」は、少なくとも１つの炭素以外の原子で置換されたヒドロカルビル部分、例えば、炭素鎖原子が窒素、酸素、ケイ素、亜リン酸、ホウ素、硫黄、またはハロゲン原子等のヘテロ原子で置換されている部分である。これらの置換基としては、ハロゲン、ヘテロシクロ、アルコキシ、アルケンオキシ、アルキンオキシ、アリールオキシ、ヒドロキシル、保護ヒドロキシ、ケト、アシル、アシルオキシ、ニトロ、アミノ、アミド、ニトロ、シアノ、チオール、ケタール、アセタール、エステルおよびエーテルが挙げられる。
【００５３】
標識：ＣＮＡ等の別の分子、またはＣＮＡが結合する分子の検出を容易にするために、その分子に直接的または間接的に結合され得る、検出可能な化合物または組成物。標識の具体例としては、限定はされないが、蛍光タグ、酵素、および放射性同位元素が挙げられる。標識の例としては、限定はされないが、以下が挙げられる：放射性同位元素または放射性核種（例えば、３５Ｓまたは１３１Ｉ）、蛍光ラベル（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、ランタニド蛍光体、シアニン色素、ＧＦＰ等の蛍光タンパク質）、酵素標識（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光マーカー、ビオチニル基、第二のレポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）、または磁性作用剤（例えば、ガドリニウムキレート）。いくつかの実施形態において、標識は、例えば可能性のある立体障害を減らすために、様々な長さのリンカー等のスペーサーアームによって結合される。
【００５４】
リンカー：２つの異なる分子を機能的に連結するための分子架橋として機能する化合物または部分であり、リンカーのある部分は第一の分子に機能的に連結し、リンカーの別の部分は第二の分子に機能的に連結する。リンカーが分子架橋としてのその目的を果たすことができる限り、リンカーに特定のサイズまたは量の制限は無い。リンカーには、限定はされないが、化学鎖、化学物質、炭水化物鎖、ペプチド、ハプテン等が含まれることが、当業者には知られている。一実施形態では、リンカーは、核酸塩基をＣＮＡ単量体の残りの部分に連結する。別の実施形態では、リンカーはエフェクター分子等の異種分子をＣＮＡ分子に連結する。
【００５５】
模倣体：作用剤の活性および／または構造、例えば、ＲＮＡおよびＤＮＡ等の核酸の活性を模倣する分子（例えば、有機化学物質）。一実施形態では、核酸の模倣体は開示のＣＮＡである。
【００５６】
核酸塩基：ヌクレオチドには、特にデオキシリボ核酸骨格、リボ核酸骨格またはチオ−エーテル骨格等の重合体骨格に結合され得る窒素含有塩基が含まれる。
【００５７】
主要な核酸塩基は、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、ウリジン（Ｕ）である。
【００５８】
核酸塩基には、例えば米国特許第５，８６６，３３６号に記載される改変された塩基も含まれる。改変された塩基部分の例としては、限定はされないが、特に、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、イノシン、Ｎ〜６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸、シュードウラシル、キューオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−Ｓ−オキシ酢酸、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、および２，６−ジアミノプリンが挙げられる。
【００５９】
プローブ：プローブは標的核酸にハイブリダイズすることが可能な単離核酸または開示のＣＮＡを含み、検出可能な標識またはレポーター分子を核酸分子に結合することができる。典型的な標識としては、放射性同位元素、酵素基質、補助因子、リガンド、化学発光剤または蛍光剤、ハプテン、および酵素が挙げられる。
【００６０】
プローブは、一般的には、少なくとも６塩基長（例えば、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、少なくとも４０、少なくとも４１、少なくとも４２、少なくとも４３、少なくとも４４、少なくとも４５、少なくとも４６、少なくとも４７、少なくとも４８、少なくとも４９、少なくとも５０少なくとも５１、少なくとも５２、少なくとも５３、少なくとも５４、少なくとも５５、少なくとも５６、少なくとも５７、少なくとも５８、少なくとも５９、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２０、少なくとも１４０、少なくとも１６０、少なくとも１８０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、またはそれ以上）の、標的核酸分子（例えば、６〜５００ヌクレオチド、２０〜４００ヌクレオチド、１００〜２５０ヌクレオチド、２０〜４０ヌクレオチド、または２０〜３０ヌクレオチド）に対し相補的な、連続した塩基である。
【００６１】
薬学的に許容できる担体：本開示において有用な薬学的に許容できる担体（ビヒクル）は従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ｂｙ  Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９９５）において、本明細書で開示されるナノ粒子の医薬品送達（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ）に適した組成および製剤が記載されている。
【００６２】
一般的に、担体の性質は、使用されている具体的な投与様式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロール等の薬学的且つ生理学的に許容できる液体をビヒクルとして含む注射用液体を含む。固体組成物（例えば、粉末剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤形態）において、従来の非毒性の固体担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。生物学的に中性の（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ−ｎｅｕｔｒａｌ）担体に加え、投与される医薬組成物は、少量の非毒性の補助剤（例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤等、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）を含有し得る。
【００６３】
試料：生物試料等の試料は、ヒト対象等の動物対象から得られる。本明細書で使用される場合、生物試料には、細胞、組織、および体液を含むがこれらに限定はされない全ての臨床試料が含まれ、例えば：血液、血液の派生物および画分、例えば、未固定の、凍結した、ホルマリン固定した、および／またはパラフィン包埋した組織を含む組織生検（例えば、非定型または疑わしい母斑の薄片生検、パンチ生検、または切除生検）である。いくつかの例では、試料は、転移性黒色腫等のメラノーマを有する、有することが疑われる、または有していたことがある、例えばメラノーマであると診断された、対象から得られるものである。
【００６４】
重合体は、化学反応（例えば、重合）を介して形成された、反復する基本構造単位（例えば、単量体、例えば、一つまたは複数の開示のＣＮＡ単量体）を有する分子である。
【００６５】
配列同一性／類似性：２つ以上の核酸配列間、核酸配列とＣＮＡ配列との間、または２つ以上のＣＮＡ配列間の同一性／類似性は、それら配列間の同一性または類似性によって表される。配列同一性は、同一性パーセントによって測定することができ、パーセンテージが高いほど、それらの配列はより同一性がある。
【００６６】
比較のための配列アラインメント法は当該技術分野において周知である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：４８２，  １９８１；  Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４３，  １９７０；  Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４，  １９８８；  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，  Ｇｅｎｅ，  ７３：２３７−４４，  １９８８；  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ＆  Ｓｈａｒｐ，  ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３，  １９８９；  Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １６：１０８８１−９０，  １９８８；  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８，  １５５−６５，  １９９２；およびＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．  ２４：３０７−３１，  １９９４．  Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０，  １９９０に記載されており、配列アラインメント法および相同性計算の詳細な考察が提供されている。
【００６７】
ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−１０，  １９９０）は、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘと一緒に使用するために、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ、米国医療図書館（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）、３８Ａ棟、８Ｎ８０５室、ベテスダ、ＭＤ２０８９４）を含むいくつかのソースから、およびインターネット上で、利用することができる。Ｂｌａｓｔｎは核酸配列を比較するために使用され、一方ｂｌａｓｔｐはアミノ酸配列を比較するために使用される。さらなる情報はＮＣＢＩウェブサイトで見出すことができる。
【００６８】
アラインメントされた後、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両配列内に存在する位置の数をカウントすることにより、一致の数は決定される。配列同一性パーセントは、一致の数を、同定された配列に提示される配列の長さ、または連接した長さ（例えば、同定された配列に提示される配列からの１００個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸残基）のいずれかで除算し、その後、得られた値に１００を乗算することにより、決定される。例えば、１５５４個のヌクレオチドを有する試験配列とアラインメントされた場合に１１６６個の一致を有する核酸配列は、その試験配列に対して７５．０％同一である（１１６６÷１５５４＊１００＝７５．０）。配列同一性パーセント値は小数第一位で四捨五入される。例えば、７５．１１、７５．１２、７５．１３、および７５．１４は７５．１に切り捨てられ、一方、７５．１５、７５．１６、７５．１７、７５．１８、および７５．１９は７５．２に切り上げられる。長さの値は常に整数である。２つの核酸分子および／またはＣＮＡが近縁であることの示唆の１つは、その２つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズするということである。
【００６９】
合成核酸：核酸含有分子（例えば、化学的にまたは他の手段により合成されたまたは増幅された核酸分子）を連結することにより構築されるものを含む重合体分子であり、化学的にまたは他の手段により修飾されているが天然核酸分子または他の合成核酸と塩基対合することができるものも含まれる。１つの例では、合成核酸はＣＮＡである。
【００７０】
クリック核酸またはＣＮＡ、（分子または配列）：ＤＮＡまたはＲＮＡ内に典型的に存在するリン酸塩骨格の代わりにチオ−エーテル骨格を有する、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ模倣重合体。ＣＮＡは二本鎖（ｄｓ）もしくは一本鎖（ｓｓ）または三重らせん体等のさらに多い多重鎖であり得る。一本鎖の場合、核酸はセンス鎖またはアンチセンス鎖であり得る。ＣＮＡは天然核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ／Ｕ、Ｃ、およびＧ）を含み得、天然核酸塩基の類似体（例えば、標識ヌクレオチド）を含み得る。
【００７１】
チオールまたはチオールの部分もしくは基：炭素が結合したスルフヒドリル（‐Ｃ‐ＳＨまたはＲ‐ＳＨ）基。いくつかの例では、チオール部分は保護チオールである。チオール保護基の例は当該技術分野において周知である。
【００７２】
チオールクリックケミストリー：多くの反応機構のうちの１つによって達成される、チオール部分とチオール−クリック受容性基（例えば、ビニル、アルキン、ハロゲン化物、イソシアネートまたはエポキシ部分）の間の反応。チオールクリックケミストリー反応の例は、Ｈｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｔｈｉｏｌ−ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  ａ  ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ  ｔｏｏｌｂｏｘ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ３９  （４）  １３５５−１３８７  （２０１０）（その全文が参照により本明細書に明確に組み入れられる）に見出すことができる。
【００７３】
チオール−クリック受容体：チオール−クリック受容体は、チオエーテルを生成するための、保護基を含有していてもしていなくてもよい、チオールと容易に反応するあらゆる化学的部分である。そのような部分の例は、ビニル、ビニルエーテル、アリルエーテル、ノルボルネン、ビニルスルホン、エポキシ、アクリレート、メタクリレート、マレイミド、ハロゲン化物およびそのアルキル伸長物である。チオール−クリック受容体の例は図１８中にも見出すことができる。
【００７４】
ビニル部分またはビニル基：炭素炭素二重結合を有する基であって、例えば、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３が独立して水素、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、置換ヘテロシクロ、アルキル、置換アルキル、アシル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、または−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、アリールもしくは置換アリールまたは複素環であり得る式‐ＣＲ１＝ＣＲ２Ｒ３を有する基。いくつかの例では、ビニル基は、アリルエーテル、ビニルエーテル、メタクリレート、アクリレート、マレイミド、ノルボルネン、α−ヒドロキシメタクリレート、ビニルスルホン等の一部である。いくつかの例では、ビニル基は保護されている。ビニル保護基の例は当該技術分野において公知である。
【００７５】
本開示を実施または試験するのに適した方法および材料を以下に記載する。そのような方法および材料は説明のみを目的としており、限定を意図するものではない。本明細書に記載のものと類似のまたは等価の他の方法および材料を使用することができる。
【００７６】
ＩＩ．  好ましい実施形態の説明
Ａ．  序論
クリック核酸（ＣＮＡ）分子、そのような分子を作製する方法およびその使用が開示される。本明細書に記載されるように、新規のＣＮＡ分子を作製するチオールクリックケミストリーとオリゴヌクレオチド合成との相乗的な組合せは、数え切れないほどの利点を有しており、重要な技術革新である。ＰＮＡは非生物学的なオリゴヌクレオチドが非常に有用であることを示したが、それらの合成法、利用できる骨格化学の制限、および固相反応の必要性は、それらの広範な実施を著しく制限している。対照的に、本明細書で開示されるクリックケミストリー法の使用は化学量論比の反応物の実現を可能にし、定量的変換の同時達成は多大なる新規性および価値の両方を有している。具体的には、チオール−クリックケミストリー反応の簡易さ、頑強さ、速さ、および化学量論的特徴は、チオール−クリックケミストリー反応を、新規のクラスの機能的オリゴヌクレオチド模倣剤の開発に最適なものにしている。実際に、これらの利点および化学的方法に基づいて、初期のポリＣＮＡ分子は＄１０〜１００／グラムの推定現在価格で、１０ｍｇ／バッチスケールで、容易に生産されたが、一方で、同一のＤＮＡ配列は＄１００，０００／グラム近く費用がかかるであろう。この費用差は、その多大な費用のためにＤＮＡを簡単には考慮することができない膨大な応用において、ＣＮＡを機能分子たらしめるものである。
【００７７】
チオールクリックケミストリー法は、ＤＮＡまたはＰＮＡと比較した場合、いくつかの特定の技術革新を可能にする。重要なことに、化学量論的反応物からの定量的収率は、溶液ベースの方法を使用して、大量の制御された配列を最小費用で生産することを容易にする。最低限のエラーはこの方法にも起こり得るが、ハイブリダイゼーションによる単純な精製で、純粋な生成物を単離することができる。
【００７８】
本明細書に記載されるような、ビニル、ビニルエーテル、アリルエーテル、ノルボルネン、ビニルスルホン、エポキシ、アクリレート、メタクリレート、マレイミド、ハロゲン化物およびアルキレン、アルキン、ハロゲン化物、イソシアネート、エポキシ、およびチオール末端基等の反応性チオール−クリック受容体は、溶解性を向上させるためのＰＥＧ、ペプチド、造影剤および色素、並びに／またはＤＮＡもしくはＲＮＡ等の他のオリゴヌクレオチド等の種々の化合物にさらに機能付与するのに容易な程に適している。さらに、さらなる反応をするその能力も、高分子量のＣＮＡ配列を生成するための経路であり、精製された中間的サイズの５、１０、または２０塩基長の制御された配列を１ステップでカップリングさせることで、配列内の塩基数を迅速に増加させ、高分子量を達成することができる。さらに、ＣＮＡ法の頑強さは、ＣＮＡを生成するための、複数の基本単量体構造の利用を可能にする。本明細書に記載されるクリックチオ−エーテル核酸単量体および重合体ＣＮＡは、優先権利益が主張される２０１２年３月２９日に出願された米国仮特許出願第６１／６１７，１４５号で開示されたチオ−エーテル核酸単量体および重合体ＴＮＡと実質的に同一である。名称のみが変更されている。
【００７９】
Ｂ．  クリック核酸（ＣＮＡ）
所望の塩基配列を形成するためにチオール−エン「クリック」反応を利用している、新規クラスの生体機能的オリゴヌクレオチド、チオ−エーテル核酸あるいはＣＮＡが本明細書で開示される。このアプローチ（その１例がＤＮＡおよびＰＮＡ構造に並んで図示される）は図１に示されており、その重要性を強めるいくつかの明確な利点を有しており、具体的には、（ｉ）クリックケミストリーの使用、（ｉｉ）反応を光開始する能力、および（ｉｉｉ）ＣＮＡ分子の安定性を増強するチオ−エーテル骨格を有する重合体の形成である。
【００８０】
ポリクリック核酸を生成するのに使用することができる単量体ＣＮＡ分子、構造または構成単位が本明細書で開示される。いくつかの実施形態において、チオ−エーテル核酸単量体は、所望により保護されたチオール部分、所望により保護されたチオール−クリック受容体、所望により保護された核酸塩基、並びに、炭素（Ｃ）、窒素（Ｎ）またはホウ素（Ｂ）等の３以上の結合価を有する原子および所望により追加の３以上の結合価を有する原子を含む骨格を含む。チオール部分、チオール反応性部分および核酸塩基は、独立して骨格に共有結合している。いくつかの実施形態において、クリック核酸単量体はリンカーをさらに含み、リンカーは、核酸塩基を、３以上の結合価を有する原子に共有結合的に連結している。いくつかの例では、リンカーは−Ｃ（Ｏ）Ｃ−を含む。いくつかの実施形態において、リンカーおよび核酸塩基は核酸塩基側鎖（ＮＳ）である。いくつかの例では、３以上の結合価を有する原子は窒素（Ｎ）または炭素（Ｃ）である。いくつかの例では、核酸塩基のアミンは保護基によって保護されている。アミン保護基は当該技術分野において周知である。いくつかの例では、チオール基は保護されている。チオール保護基は当該技術分野において周知である。いくつかの例では、チオールは、糖部分により、骨格原子に連結されている。
【００８１】
いくつかの実施形態において、クリック核酸単量体は以下の構造：
【化６】
2015514706.tif 000008
を有しており、ＺはＣ、Ｎ、またはＢ（ホウ素）等の３以上の結合価を有する原子であり、ＮＳは、所望により保護された核酸塩基（ＮＢ）および所望によりリンカー（ＮＢおよびＺを連結する）を含む核酸塩基側鎖であり、Ｔは所望により保護されたチオールであり、ＴＣＡは所望により保護されたチオール−クリック受容体である。
【００８２】
いくつかの実施形態において、クリック核酸の骨格は、Ｃ、Ｎ、またはＢ等の３以上の結合価を有する一つまたは複数の追加の原子を含む。
【００８３】
いくつかの実施形態において、クリック核酸単量体は以下の構造：
【化７】
2015514706.tif 000009
を有し、式中、ＹおよびＺは３以上の結合価を有する原子（例えば炭素、窒素、およびホウ素）であり、ｎは０〜４の整数（例えば、０、１、２、３、または４、例えば１〜１、０〜２、０〜３、０〜４、１〜２、１〜３、１〜４、２〜３、２〜４、または３〜４）であり、ヘテロ原子を含んでいてもよく、例えばアリール、ヒドロキシル、カルボニル、カルボン酸および他の酸、アミノ、アルキルアミド、チオエーテル、環式、複素環式、およびそのアルキル伸長物で独立して置換されていてもよく、ＮＳは所望により保護された核酸塩基を含む核酸塩基側鎖であり、Ｔは所望により保護されたチオールであり、ＴＣＡは、所望により保護されたビニル、ビニルエーテル、アリルエーテル、ノルボルネン、ビニルスルホン、エポキシ、アクリレート、メタクリレート、マレイミド、ハロゲン化物およびそのアルキル伸長物等の所望により保護されたチオール−クリック受容体である。
【００８４】
いくつかの実施形態において、クリック核酸単量体は以下の構造：
【化８】
2015514706.tif 000010
を有し、式中、ＹおよびＺは３以上の結合価を有する原子（例えば炭素、窒素、およびホウ素）であり、ｎは０〜４の整数（例えば、０、１、２、３、または４、例えば１〜１、０〜２、０〜３、０〜４、１〜２、１〜３、１〜４、２〜３、２〜４、または３〜４）であり、ヘテロ原子を含んでいてもよく、例えばアリール、ヒドロキシル、カルボニル、カルボン酸および他の酸、アミノ、アルキルアミド、チオエーテル、環式、複素環式、およびそのアルキル伸長物で独立して置換されていてもよく、ｍは０〜４の整数（例えば、０、１、２、３、または４、例えば１〜１、０〜２、０〜３、０〜４、１〜２、１〜３、１〜４、２〜３、２〜４、または３〜４）であり、ヘテロ原子を含んでいてもよく、例えばアリール、ヒドロキシル、カルボニル、カルボン酸および他の酸、アミノ、アルキルアミド、チオエーテル、環式、複素環式、およびそのアルキル伸長物で独立して置換されていてもよく、ＮＳは所望により保護された核酸塩基を含む核酸塩基側鎖であり、Ｔは所望により保護されたチオールであり、ＴＣＡは、所望により保護されたビニル、ビニルエーテル、アリルエーテル、ノルボルネン、ビニルスルホン、エポキシ、アクリレート、メタクリレート、マレイミド、ハロゲン化物およびそのアルキル伸長物等の所望により保護されたチオール−クリック受容体である。
【００８５】
いくつかの実施形態において、クリック核酸単量体は以下の構造：
【化９】
2015514706.tif 000011
を有し、式中、ＹおよびＺは３以上の結合価を有する原子（例えば炭素、窒素、およびホウ素）であり、ｎは０〜４の整数（例えば、０、１、２、３、または４、例えば１〜１、０〜２、０〜３、０〜４、１〜２、１〜３、１〜４、２〜３、２〜４、または３〜４）であり、ヘテロ原子を含んでいてもよく、例えばアリール、ヒドロキシル、カルボニル、カルボン酸および他の酸、アミノ、アルキルアミド、チオエーテル、環式、複素環式、およびそのアルキル伸長物で独立して置換されていてもよく、ｍは０〜４の整数（例えば、０、１、２、３、または４、例えば１〜１、０〜２、０〜３、０〜４、１〜２、１〜３、１〜４、２〜３、２〜４、または３〜４）であり、ヘテロ原子を含んでいてもよく、例えばアリール、ヒドロキシル、カルボニル、カルボン酸および他の酸、アミノ、アルキルアミド、チオエーテル、環式、複素環式、およびそのアルキル伸長物で独立して置換されていてもよく、ＮＳは所望により保護された核酸塩基を含む核酸塩基側鎖であり、Ｔは所望により保護されたチオールであり、ＴＣＡは、所望により保護されたビニル、ビニルエーテル、アリルエーテル、ノルボルネン、ビニルスルホン、エポキシ、アクリレート、メタクリレート、マレイミド、ハロゲン化物およびそのアルキル伸長物等の所望により保護されたチオール−クリック受容体である。
【００８６】
いくつかの例では、クリック核酸単量体は以下の構造：
【化１０】
2015514706.tif 000012
を有し、式中、ｎ＋ｍは１〜７（例えば、１、２、３、４、５、６、または７）であり、ｎは０以上（例えば、０、１、２、３、４、５、または６）であり、ｍは０より大きく（例えば、１、２、３、４、５、６、または７）、ＮＳは所望により保護された核酸塩基を含む核酸塩基側鎖であり、Ｔは所望により保護されたチオールであり、ＴＣＡは、所望により保護されたビニル、ビニルエーテル、アリルエーテル、ノルボルネン、ビニルスルホン、エポキシ、アクリレート、メタクリレート、マレイミド、ハロゲン化物およびそのアルキル伸長物等の所望により保護されたチオール−クリック受容体であり、Ｚは３以上の結合価を有する原子であり、Ｒ１およびＲ２は独立して、所望により置換された水素、ヒドロキシル、芳香族、アミン、カルボキシル、およびカルボニル基の組合せである。いくつかの例では、ｎ＋ｍは１〜７、例えば、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜７、４〜６、４〜５、５〜６、５〜７、例えば、１、２、３、４、５、６、または７である。いくつかの例では、ｎは０以上、例えば、０、１、２、３、４、５、または６より大きいかまたはそれに等しく、例えば、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３、０〜２、０〜１、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、３〜６、３〜５、３〜４、４〜６、４〜５、または５〜６であり、ｍは０より大きい、例えば、１、２、３、４、５、６、または７より大きく、例えば１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜７、４〜６、４〜５、５〜６、５〜７である。
【００８７】
いくつかの実施形態において、クリック核酸単量体はリンカーをさらに含み、リンカーは、核酸塩基を、３以上の結合価を有する原子に共有結合的に連結している。いくつかの例では、リンカーは−Ｃ（Ｏ）Ｃ−を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ＮＳ基は以下の構造：
【化１１】
2015514706.tif 000013
を有し、式中、ＮＢはあらゆる核酸塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、またはＵ）であり、その核酸塩基上のアミンは保護されていてもよい。
【００８９】
いくつかの実施形態において、所望により保護されたチオールは以下の構造：
【化１２】
2015514706.tif 000014
を有し、式中、ｐは０〜４の整数であり、その中で、メチル基は所望により且つ独立して置換されており、例えば、アリール、ヒドロキシル、カルボニル、カルボン酸または他の酸、アミノ、アルキルアミド、チオエーテル、環式、複素環式、およびそのアルキル伸長物で置換されている。特定の例において、所望により保護されたチオールは以下の構造：
【化１３】
2015514706.tif 000015
を有する。
【００９０】
いくつかの実施形態において、チオール−クリック受容体は、所望により置換されたビニル、ビニルエーテル、アリルエーテル、ノルボルネン、イソシアネート、ビニルスルホン、エポキシ、アクリレート、メタクリレート、マレイミド、ハロゲン化物およびそのアルキル伸長物である。特定の例において、チオール−クリック受容体は以下：
【化１４】
2015514706.tif 000016
のうちの１つに記載される構造を有し、式中、Ｘはハロゲン化物であり、Ｒは水素またはアルキル鎖である。いくつかの例では、チオ−クリック受容体は、図１８Ａおよび図１８Ｂに示される単量体に示される受容体部分である。
【００９１】
いくつかの例では、クリック核酸単量体はアルキン部分を含む。いくつかの例では、クリック核酸単量体はハロゲン化物部分を含む。いくつかの例では、クリック核酸単量体はイソシアネート部分を含む。いくつかの例では、クリック核酸単量体はエポキシ部分を含む。いくつかの例では、クリック核酸単量体はアクリレート部分を含む。いくつかの例では、クリック核酸単量体はビニルエーテル部分を含む。いくつかの例では、ビニル部分（例えば、アクリレートまたはビニルエーテル内のビニル部分）は、−ＣＲ５＝ＣＲ６Ｒ７構造を有し、式中、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は独立して水素、アリール、ヒドロキシル、カルボニル、カルボン酸または他の酸、アミノ、アルキルアミド、チオエーテル、環式、複素環式、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、置換ヘテロシクロ、アルキル、置換アルキル、アシル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、または−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ、アリールもしくは置換アリールまたは複素環であり得る。
【００９２】
いくつかの例では、ＣＮＡ単量体は、例えばビニル基に隣接した、電子求引基を含む。理論に縛られるものではないが、ビニル基に隣接したそのような基はビニル基の反応性の増強をもたらすと考えられる。電子求引基の例としては、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ハロゲン、カルボニル、スルホニル、ニトリル、四級アミン、ニトロ、またはトリハロメチルが挙げられる。いくつかの例では、電子求引基がアルコキシである場合、電子求引基は一般的には、Ｒがヒドロカルビル、置換ヒドロカルビル、またはヘテロシクロである式−ＯＲに一致する。いくつかの例では、電子求引基がメルカプトである場合、電子求引基は一般的には、Ｒが水素、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビルまたはヘテロシクロである式−ＳＲに一致する。いくつかの例では、電子求引基がハロゲン原子である場合、電子求引基はフルオロ、クロロ、ブロモ、またはヨードであり得、典型的には、フルオロまたはクロロである。いくつかの例では、電子求引基がカルボニルである場合、電子求引基はアルデヒド（−Ｃ（Ｏ）Ｈ）、ケトン（−Ｃ（Ｏ）Ｒ）、エステル（−Ｃ（Ｏ）ＯＲ）、酸（−Ｃ（Ｏ）ＯＨ）、酸ハロゲン化物（−Ｃ（Ｏ）Ｘ）、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲａＲｂ）、または無水物（−Ｃ（Ｏ）ＯＣ（Ｏ）Ｒ）であり得、式中、Ｒはヒドロカルビル、置換ヒドロカルビルまたはヘテロシクロであり、ＲａおよびＲｂは独立して水素、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビルまたはヘテロシクロであり、Ｘはハロゲン原子である。いくつかの例では、電子求引基がスルホニルである場合、電子求引基は酸（−ＳＯ３Ｈ）またはその誘導体（−ＳＯ２Ｒ）であり得、式中、Ｒはヒドロカルビル、置換ヒドロカルビルまたはヘテロシクロである。いくつかの例では、電子求引基が四級アミンである場合、電子求引基は一般的には、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃが独立して水素、ヒドロカルビル、置換ヒドロカルビルまたはヘテロシクロである式−Ｎ＋ＲａＲｂＲｃに一致する。いくつかの例では、求引基がトリハロメチルである場合、求引基はトリフルオロメチルまたはトリクロロメチルであることが好ましい。
【００９３】
特定の例において、ＣＮＡ単量体は、硫黄部分およびビニル部分の末端炭素を含む５〜７原子の反復単位を有する。特定の例では、単量体は、チオール部分およびビニル部分の末端炭素を含む６原子の反復単位を有する。いくつかの実施形態において、ＣＮＡ単量体は、Ｎ−ビニルチオールアセトアミド（ＶＴＡ）骨格を有する。いくつかの実施形態において、単量体はＮ−ビニルチオールエチルアミン（ＶＴＥ）骨格を含む。いくつかの実施形態において、単量体は、ビニル部分がエーテル結合を介して骨格の残りの部分に連結されているＮ−ビニルエーテルチオール骨格を含む（例えば図１３を参照）。いくつかの実施形態において、単量体は、反応性ビニル部分がＣ（Ｏ）Ｏ基を介して骨格の残りの部分に連結されているＮ−アクリレートチオール骨格を含む（例えば図１３参照）。特定の例において、ＣＮＡは、図４、５および／または７〜１４、または１８のうちのいずれか１つに示されるＣＮＡ単量体のうちのいずれかの、保護されていてもよい構造を有する。いくつかの例では、ＣＮＡ単量体は、図１８Ａまたは図１８Ｂに示される単量体のうちの１つである。
【００９４】
いくつかの例では、ＣＮＡ単量体はＡ、Ｇ、Ｔ、Ｕ、またはＣ核酸塩基を含むが、限定はされないが上記の用語リストに記載されるもの等の他の核酸塩基も企図される。図４に示されるように、例示的な単量体は６原子反復単位を含有する。いくつかの実施形態において、ＣＮＡ単量体は、例えばチオールの硫黄原子およびＴＣＡ基の末端炭素を含む、３〜１０原子の反復単位間隔、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０またはさらに長い反復単位間隔、例えば、５〜９、５〜７原子の反復単位間隔を有する（例えば図１５参照）。
【００９５】
開示される単量体をさらに改変することで、例えば、不安定性、毒性、骨格の堅さ、電荷、または溶解性の問題に取り組むことができると考えられ、例えば、基本単量体構造を変化させることで、陰イオン部分の追加が容易になりＤＮＡ構造をよりよく模倣することができ、あるいは、骨格反復単位原子の数を変化させることにより、ハイブリダイゼーションの選択性を最適化することができる。さらに、チオールおよびチオール−クリック受容体部分は、追加の置換基（例えば、エフェクター分子、例えば、溶解性を向上させるためのＰＥＧ、ペプチド、造影剤および色素、並びに／またはＤＮＡもしくはＲＮＡ等の他のオリゴヌクレオチド）を付加するために、容易に官能基化することができる。
【００９６】
ＣＮＡ、重合体およびＣＮＡ重合体を製造する方法が開示される。ＣＮＡ重合体は、開示されるＣＮＡ単量体を少なくとも２つ含む。重合体はいかなる長さであってもよい。ＣＮＡ重合体は均一であっても不均一であってもよく、例えば、重合体は、１種類の開示の単量体から、または本明細書で開示される単量体のあらゆる組合せから構成され得る。
【００９７】
当業者に公知のいくつかの手段を用いて、治療成分、診断成分、もしくは検出成分等のエフェクター分子または他の分子をＣＮＡ分子に連結することができる。共有結合的手段および非共有結合的手段の両方を使用することができる。エフェクター分子をＣＮＡ分子に結合するための手順は、エフェクターの化学構造、および結合が起こるべきなのがＣＮＡ分子のどちらの末端であるかに応じる。例えば、ポリペプチドは、典型的には、種々の官能基を含有し、例えば、ＣＮＡ分子上の適切な官能基（例えばＣＮＡ分子の一方の末端に存在するチオールまたはＴＣＡ部分）との反応に利用できるカルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ２）またはスルフヒドリル（−ＳＨ）基は、エフェクター分子の結合をもたらす。この結合は直接的であってもリンカーを介していてもよく、ピアスケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（イリノイ州ロックフォード）から入手できるもの等の、いくつかのリンカー分子のうちのいずれかの結合を含んでいてもよい。リンカーは、ＣＮＡ分子をエフェクター分子に連結させるために使用されるいかなる分子であってもよい。リンカーは、ＣＮＡ分子およびエフェクター分子の両方に対して共有結合を形成することができる。適切なリンカーは当業者に周知であり、限定はされないが、直鎖または分岐鎖状の炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーが挙げられる。
【００９８】
いくつかの場合において、エフェクター分子はＣＮＡ分子から取り除かれることが望ましい。従って、これらの場合では、そのような複合体は切断可能な結合を含む。
【００９９】
種々の放射線診断用化合物、放射線治療用化合物、標識（例えば、酵素または蛍光分子）薬剤、毒素、および他の作用剤を結合するための報告された多くの方法に照らして、当業者は、所与の作用剤をＣＮＡ分子に結合するために適した方法を決定することができる。
【０１００】
ＣＮＡ単量体を製造する方法が本明細書で開示される。Ｎ−ビニルチオールエチルアミン（ＶＴＥ）ベースのＣＮＡ単量体を製造する方法の１例を図５に示す。Ｎ−ビニルチオールアセトアミド（ＶＴＡ）ベースのＣＮＡ単量体を製造する方法の１例を図８に示す。両方の例において、ＣＮＡ単量体は、正確な原子レベルでの単量体設計を可能にするいくつかの単純な分子成分から合成される。単量体構造に対しこの合成制御を行うことで、低い溶解性もしくはハイブリダイゼーション効率という起こり得る偶然性として、またはハイブリダイゼーション安定性のさらなる最適化としての、単純な構造変動がさらに可能になる。図５に示されるように、ＣＮＡ単量体は、３つのカップリング反応（メトキシトリチル基（Ｍｍｔ）を用いるチオール保護、アミドカップリング、およびアミドとのヨウ化ビニル反応）を用いて合成される。図５に示されるように、シトシンをブロモ酢酸にカップリングする最終段階は、残り３つの核酸塩基（アデニン、チミン、およびグアニン）に容易に拡張され、ＤＮＡの全てのＣＮＡ類似体が作製される。
【０１０１】
ＣＮＡ、重合体およびＣＮＡ重合体を製造する方法が開示される。ＣＮＡ重合体は、開示されるＣＮＡ単量体を少なくとも２つ含む。重合体はいかなる長さであってもよい。ＣＮＡ重合体は均一であっても不均一であってもよく、例えば、重合体は、１種類の開示の単量体から、または本明細書で開示される複数の単量体のあらゆる組合せから成り得る。
【０１０２】
ＣＮＡ重合体を製造する方法が本明細書で開示される。ＣＮＡ重合体を作製するため、ＣＮＡ単量体は、種々の方法（例えば、固相、液相、マイクロアレイ型式、および塊状重合）によって重合されて、ホモポリマーを生成する。ＣＮＡ重合の１例が図２に示される。図２に示されるように、単量体ＣＮＡのチオールはチオール部分を露出させるために脱保護される。光開始ラジカル反応を介して、例えば３６５ｎｍ光とともにヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトンを用いることで、ラジカルがチオール上で形成され、それが次に、成長鎖内の次の単量体のビニルエーテルまたはアリルエーテルへの攻撃を進める。この機構を通じて、ＣＮＡ重合体は形成される。ＣＮＡ重合体の固相形成の１例が図９に示される。固相ペプチド合成と類似して、単量体との逐次反応および成長重合鎖に付加された単量体の脱保護を繰り返すことで、いかなる核酸塩基も成長鎖に付加することができる。
【０１０３】
いくつかの例では、重合反応は光開始される。前記反応は、光誘導性光活性化剤、例えばヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトンを用いて、光開始することができる。いくつかの例では、前記反応は、約０．００１重量％〜約１．０％のヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトンを用いて、例えば、約０．０１重量％のヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトン、０．０１重量％のヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトンまたは１．０重量％のヒドロキシ−シクロヘキシル−フェニル−ケトンを用いて、光開始される。いくつかの例では、光活性化剤は、約３５０〜４１０ｎｍの波長を有する約１〜約１００ｍＷ／ｃｍ２の光で活性化される。特定の例では、光活性化剤は、約３６５ｎｍの波長を有する約１０ｍＷ／ｃｍ２の光で活性化される。
【０１０４】
反応を光開始する能力は大きな技術革新である。この能力を用いて、配列のアレイ（アフィメトリクス社ＤＮＡチップに類似）が、生物学的検出、折り紙、または他の応用のために、簡易な方法で、単一チップ上に容易に作製される。
【０１０５】
Ｃ．  使用方法の例
ｉ．  インビトロにおけるＣＮＡ応用の例
ＣＮＡ応用には、生物学的検出、ＳＥＬＥＸ様プロセスの開発、および相補的なＤＮＡまたはＣＮＡ配列の複製が含まれる。ＰＣＲと同様の増幅および結果を目標にして、オリゴマーＣＮＡのインサイチュハイブリダイゼーションおよび選択的ライゲーションによって、相補的なＤＮＡまたはＣＮＡ鎖からＣＮＡ鎖が複製される、指数関数的増幅プロセスが得られる。このプロセスは、大量の高分子量配列を生成する１つの手段として機能し、基質増幅が検出に重要となる生物学的検出における実行に適している。
【０１０６】
ａ．  プローブおよびプライマー
開示のＣＮＡ分子は、標的核酸への結合およびその検出をすることが可能なプローブおよび／またはプライマーとして使用することができる。例えばサザンブロットおよび他の応用のためにはより長いおよび／またはより短い配列も考えられるが、典型的には、そのようなプローブおよびプライマーは、６〜４０ヌクレオチド長、例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８  ２９、３０、３１、３２、３２、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０ヌクレオチド長であり、標的核酸にハイブリダイズすることが可能である。従って、いくつかの例では、プローブまたはプライマーは４０ヌクレオチド長よりも大きく、例えば、少なくとも５０ヌクレオチド長、少なくとも６０ヌクレオチド長、少なくとも７０ヌクレオチド長、少なくとも８０ヌクレオチド長、少なくとも９０ヌクレオチド長、少なくとも１００ヌクレオチド長、少なくとも１５０ヌクレオチド長、少なくとも２００ヌクレオチド長、少なくとも２５０ヌクレオチド長、少なくとも５００ヌクレオチド長、またはさらには少なくとも１０００ヌクレオチド長である。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ＣＮＡプローブおよび／またはプライマーが同位体標識または非同位体標識で検出可能なように標識され、あるいは、標的核酸（例えば、インフルエンザ核酸）が標識される。非同位体標識は、例えば、蛍光もしくは発光分子、ビオチン、酵素もしくは酵素基質または化学物質を含み得る。プローブの標的核酸とのハイブリダイゼーションを検出できるように、そのような標識が優先的に選択される。いくつかの例では、プローブはフルオロフォアで標識される。いくつかの例では、ＣＮＡ分子（例えば、プローブ）は、固体基質、例えば、ビーズおよび／またはアレイに連結される。
【０１０８】
ｂ．  標的核酸の検出および同定
本明細書で開示されるＣＮＡ分子プライマーおよびプローブの主な応用は、試料（例えば、生物試料）中の標的核酸の検出である。本明細書に記載の方法は、検査室および臨床環境等における診断応用および予後診断応用を含む、標的核酸の検出が望まれるあらゆる目的に使用することができる。適切な試料には、あらゆる従来の環境試料または生物試料、例えば、ヒト対象または動物対象から得られる臨床試料、例えば、限定はされないが、細胞、組織（例えば、肺、肝臓および腎臓）、骨髄穿刺液、体液（例えば、血液、血清、尿、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、気管吸引物、痰、鼻咽頭吸引物、中咽頭吸引物、唾液）、眼スワブ、頸部スワブ、膣スワブ、直腸スワブ、便、および便懸濁液が含まれる。
【０１０９】
ｃ．  ＣＮＡアレイ
また、標的核酸を検出するための複数の同種または異種ＣＮＡプローブを含有するアレイが開示される。アレイは、基板上のアドレス可能な位置の並びであり、各アドレスはＣＮＡ（例えば、プローブ）を含有する。いくつかの実施形態において、特定のＣＮＡが複数のアドレスで重複して含有される場合もあるが、各アドレスは単一のタイプまたはクラスのＣＮＡ（例えば、単一プローブ）に対応している。「マイクロアレイ」は、ハイブリダイゼーションの検出に顕微鏡検査を必要とする小型化されたアレイである。より大型の「マクロアレイ」は各アドレスがヒトの肉眼によって認識可能になることを可能にし、いくつかの実施形態において、ハイブリダイゼーションシグナルはさらなる拡大無しで検出可能である。アドレスは、標識されていてもよく、別個のガイドで識別できるようにされていてもよく、あるいはその他の方法で位置による特定がされてもよい。
【０１１０】
標的核酸を含有している可能性がある、さらには標的核酸を含有していることが疑われるいかなる試料（例えば、核酸抽出液、例えば、増幅されたまたは増幅されていないＤＮＡまたはＲＮＡ調製物）も、標的化し分析することができる。アレイ上の個々のアドレスからのハイブリダイゼーションシグナルは、プローブが試料中のヌクレオチドにハイブリダイズしていることを示す。この系により、複数のプローブによる試料の同時分析が可能となり、試料中に含有されるインフルエンザ核酸を特定する情報が得られる。
【０１１１】
核酸は、乾燥または液体形態でアレイ基板上に加えられてもよい。緩衝液、安定剤、ハイブリダイゼーションシグナルの検出試薬、乳化剤、または保存剤等の他の化合物または物質も同様にアレイに加えられてもよい。
【０１１２】
アレイ内において、整列した各ＣＮＡは、少なくとも二次元のアレイ表面内でその位置を確実に且つ一貫して決定できるように、アドレス可能である。従って、整列したアレイは、アレイ内に配置される際の各核酸の位置の割り当てが可能である。通常、各アドレスを適切な核酸と相互関連させるために、アレイのマップまたはキーが与えられる。整列したアレイはしばしば、対称的な格子状に整列されるが、核酸は他のパターン（例えば、放射状に分散した線状、「輻と車輪」パターン、または整列したクラスター）に整列させることもできる。アドレス可能なアレイはコンピューターにより判読することが可能であり、コンピューターをプログラミングすることで、アレイ上の特定のアドレスを、ハイブリダイゼーションまたは結合のデータ（例えば、シグナル強度）等の、その位置における試料についての情報に相互関連させることが可能である。コンピューターで読み取り可能な形式のいくつかの例において、アレイ内の個々の試料または分子は規則的に（例えば、デカルト格子パターンに）整列され、これは、コンピューターによってアドレス情報に相互関連させることが可能である。
【０１１３】
ｄ．  核酸の「折り紙」および定方向構築
開示のＣＮＡ分子は、核酸の折り紙および定方向構築応用において、例えば核酸ステープルとして使用することができる。核酸折り紙は、ナノスケールで任意の二次元および三次元の形状を作製するための、ナノスケールの核酸折り畳みである。相補的な塩基対間の相互作用の特異性により、その塩基配列の設計を通じて、ＤＮＡは有用な構築材料となる。核酸折り紙は、複数のより小さな「ステープル」鎖の助けによる、長い単鎖ウイルスＤＮＡの折り畳みを含む。いくつかの例では、単一の長いＤＮＡ分子で満たされたラスターを用いて画像が描かれる。次にこのデザインは、個々のステープル鎖の配置を算出するコンピュータプログラムに送り込まれる。各ステープルは鋳型ＤＮＡの特異的な領域に結合し、そのため、ワトソンクリック塩基対合によって、全ステープル鎖の必要な配列が認識および表示される。ＤＮＡは混合された後、加熱および冷却される。ＤＮＡが冷却されるにつれて、種々のステープルが長鎖を所望の形状に引き込む。デザインは、原子間力顕微鏡法、またはＤＮＡが蛍光物質に結合される蛍光顕微鏡法を含むいくつかの方法によって直接観察することができる。
【０１１４】
そのような核酸の自己構築は、酵素固定、薬剤運搬カプセル剤、並びに表面上およびバルク溶液または懸濁液中での物質のナノテクノロジー的自己構築および定方向パターン形成等の応用のために、比較的穏やかな条件下でのナノ構造の合成に使用することができる（例えば、所望の特徴を有するナノ粒子）。
【０１１５】
ｉｉ．  インビボにおけるＣＮＡ応用
ＣＮＡの独特な化学的性質および物理的性質を考慮すると、ＣＮＡは、インビボにおける応用にかなりの可能性を有している。ＣＮＡが外側の細胞膜を横断可能であるのは興味深いことである。ＣＮＡの疎水性および中性の骨格を考慮すると、ＣＮＡは細胞の脂質膜に浸透し、本質的に高い細胞透過性を有していることになる。重要なことに、ＣＮＡが細胞に侵入する能力は、ＣＮＡ単量体の親油性を化学的に調整することによって最適化することができる。この能力は、インビボにおける安定性、並びに相補的なＲＮＡおよびＤＮＡに対するＣＮＡの高い親和性および特異性と組み合わされて、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ干渉に利用される。具体的には、ＣＮＡは標的遺伝子および経路全体を抑制するために使用される。この使用は、治療剤および遺伝子制御を含む機構研究に広範囲な影響を与える。さらに、この細胞透過能は、外来性色素または治療用分子（例えば、タンパク質）の送達に有用である。
【０１１６】
ａ．  治療用組成物
開示のＣＮＡ重合体は、細胞または対象にインビボ投与することができる。概して、本組成物は、対象とする用途に適した医薬組成物として調製されることが望ましい。従って、本明細書で上記のＣＮＡを含有する薬剤または医薬組成物を作製する方法が含まれる。典型的に、医薬組成物（薬剤）の調製には、発熱物質、並びにヒトまたは動物に有害であり得る他のいかなる不純物も本質的に含まない医薬組成物を調製することが必要とされる。典型的に、本医薬組成物は、組成物の成分を安定させ、標的細胞（例えば、腫瘍細胞）による取り込みを可能にするために、適切な塩および緩衝液を含有する。
【０１１７】
治療用組成物は、例えば注射または点滴用の非経口用組成物として、提供することができる。そのような組成物は、一般的には、単位投与量注射剤型（溶液、懸濁液、またはエマルジョン）の、所望の純度の開示の治療薬を、薬学的に許容できる担体、例えば、使用される投与量および濃度で受容者に無毒であり、且つ製剤の他の成分と混合可能である担体と混合することによって、製剤化される。さらに、開示の治療薬は、液体担体中に、例えば、ｐＨが約３．０〜約８．０の、好ましくはｐＨが約３．５〜約７．４、３．５〜６．０、または３．５〜約５．０の等張緩衝溶液中に懸濁することができる。有用な緩衝液としては、クエン酸ナトリウム−クエン酸緩衝液およびリン酸ナトリウム−リン酸緩衝液、および酢酸ナトリウム／酢酸緩衝液が挙げられる。活性成分は、所望により賦形剤と一緒に、凍結乾燥物の形態にすることもでき、適切な溶媒の添加によって非経口投与の前に溶液にすることができる。例えば、非経口投与用に使用されるもの等の溶液は、輸液としても使用することができる。
【０１１８】
医薬組成物は、薬学的に許容できる担体または賦形剤中に分散した（例えば、溶解または懸濁した）有効量のＣＮＡを含み得る。薬学的に許容できる担体および／または薬学的に許容できる賦形剤は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ｂｙ  Ｅ．  Ｗ．  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  ＰＡ，  １９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９９５）に記載されている。
【０１１９】
担体の性質は使用されている具体的な投与様式によって異なる。例えば、非経口製剤は通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロール等の薬学的に且つ生理学的に許容できる液体をビヒクルとして含む注射用液体を含有する。固体組成物（例えば、粉末剤、丸剤、錠剤、またはカプセル剤形態）において、従来の非毒性の固体担体には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプンまたはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。さらに、投与される医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤等（例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート）等の少量の非毒性の補助剤を含有していてもよい。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容できる担体」には、あらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に活性な物質へのそのような媒体および作用剤の使用は、当該技術分野において周知である。いかなる従来の媒体または作用剤も、活性成分と混合できない場合を除いては、医薬組成物中のその使用が企図される。副活性成分も組成物中に組み込むことができる。例えば、特定の医薬組成物は、適切な界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）と混合された、水中のＣＮＡを含むことができる。分散系も、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびその混合物中で、および油中で、調製することができる。保存および使用の通常の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含有する。
【０１２１】
治療用組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限り、いかなる通常の経路によるものであってもよい。これには、経口投与、経鼻投与、経眼投与、頬側投与、もしくは他の経粘膜（例えば、直腸または膣内）または局所投与が含まれる。あるいは、投与は、同所性、皮内皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内注射経路によるものである。そのような医薬組成物は、通常、生理学的に許容できる担体、緩衝液または他の賦形剤を含む薬学的に許容できる組成物として投与される。
【０１２２】
本医薬組成物は、溶液または懸濁液として注射用組成物の形態で投与することもでき、注射前の液体への溶解または懸濁に適した固体形態も調製することができる。これらの調製物は乳化されてもよい。そのような目的において典型的な組成物は、薬学的に許容できる担体を含む。例えば、本組成物は、リン酸緩衝食塩水１ミリリットルあたり約１００ｍｇのヒト血清アルブミンを含有していてもよい。他の薬学的に許容できる担体には、水溶液が含まれ、例えば、塩、保存剤、緩衝液等を含む非毒性の賦形剤が使用されてもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油およびオレイン酸エチル等の注射用有機酸エステルである。水性担体には、水、アルコール溶液／水溶液、食塩水、非経口用ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、リンガーデキストロース等が含まれる。静脈用ビヒクルには、液体および栄養補充薬が含まれる。保存剤には、抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスが含まれる。医薬組成物の種々の成分のｐＨおよび正確な濃度は、公知のパラメーターに従って調整される。
【０１２３】
追加の製剤は経口投与に適している。経口用製剤には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム等の賦形剤が含まれ得る。本組成物（薬剤）は、典型的には、溶液、懸濁剤、エアロゾルまたは散剤の形態をとる。
【０１２４】
経路が局所的である場合、形態はクリーム、軟膏剤、膏薬または噴霧剤であり得る。本医薬組成物の有効量は、用途（例えば、ヒト対象または非ヒト対象のワクチン接種）に応じて決定される。適切な用量は、対象の特徴、例えば、その対象がヒトまたは非ヒトであるかどうか、年齢、体重、および対象の状況または状態に関連する他の健康問題、投与の様式、経路、および投与回数、並びに医薬組成物がＣＮＡを含んでいるかどうかによって異なる。
【０１２５】
核酸を投与する際、例えば、ブピバカイン、心臓毒およびスクロース、並びに核酸分子を送達するために通常使用されるリポソーム調製物または脂質調製等のトランスフェクション促進ビヒクル等、核酸の取り込みおよび／または発現の促進剤を含ませてもよい。陰イオン性リポソームおよび中性リポソームは広く利用可能であり、核酸分子を送達することでよく知られている（例えば、Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，  ＲＰＣ  Ｎｅｗ  Ｅｄ．，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９０を参照）。陽イオン性脂質調製物も、核酸分子の送達に使用されることでよく知られているビヒクルである。適切な脂質調製物には、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）という販売名で入手可能なＤＯＴＭＡ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム）、およびＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）が含まれる。例えば、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８４：７４１３−７４１６，  １９８７；  Ｍａｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８６：６０７７−６０８１，  １９８９；米国特許第５，２８３，１８５号および同第５，５２７，９２８号、並びに国際公開第９０／１１０９２号、同第９１／１５５０１号および同第９５／２６３５６号を参照されたい。これらの陽イオン性脂質は、中性脂質、例えばＤＯＰＥ（ジオレイルホスファチジルエタノールアミン）と共に使用されることが好ましい場合がある。上記の脂質またはリポソーム調製物に加えることができる他のトランスフェクション促進組成物には、スペルミン誘導体（例えば、国際公開第９３／１８７５９号参照）、並びにＧＡＬＡ、グラミシジンＳ（Ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎｅ  Ｓ）および陽イオン胆汁酸塩等の膜透過性化合物（例えば、国際公開第９３／１９７６８号参照）が含まれる。
【０１２６】
適切な有効量は当業者によって容易に決定され得る。そのような量は、通例の試験によって決定することができる比較的広い範囲の中に含まれ、例えば、約１０μｇ〜約１ｍｇの範囲内である。しかし、この範囲を上回る用量および下回る用量も効果的である場合がある。
【０１２７】
開示の治療薬を含む治療用組成物は、ポンプによって（Ｌａｎｇｅｒ，  上記；  Ｓｅｆｔｏｎ，  ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｆ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｅｎｇ．  １４：２０１，  １９８７；  Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７，  １９８０；  Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３２１：５７４，  １９８９参照）、または、例えばミニポンプを使用する持続皮下注入によって、送達することができる。静脈内輸液バッグ（ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｂａｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）も使用することができる。適切な用量を選択する際の１つの要素は、本明細書で開示される方法によって測定され実施者によって適切であると判断される、得られた結果である。他の放出制御製剤系はＬａｎｇｅｒ  （Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−３３，  １９９０）において開示されている。
【０１２８】
１例では、ポンプは移植される（例えば、米国特許第６，４３６，０９１号、同第５，９３９，３８０号、および同第５，９９３，４１４号を参照）。移植式薬剤注入装置は、治療薬の一定且つ長期間の投与または注入を患者に与えるために使用される。そのような装置は能動的または受動的のいずれかに分類することができる。
【０１２９】
能動的薬剤注入装置またはプログラム可能注入装置は、薬剤を患者の系の中に送達するためのポンプまたは計量システムを特色とする。現在利用可能なそのような能動注入装置の１例は、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  ＳＹＮＣＨＲＯＭＥＤ（商標）プログラム可能ポンプである。対照的に、受動注入装置はポンプを特色としないが、目的の薬剤を送達するためにに加圧薬剤リザーバーに依存する。そのような装置の１例として、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  ＩＳＯＭＥＤ（商標）が挙げられる。
【０１３０】
特定の例において、開示の治療薬を含む治療用組成物が徐放システムによって投与される。徐放システムの適切な例には、適切な高分子材料（例えば、造形品（例えば、フィルム）の形をとった半透性ポリマーマトリックス、またはマイクロカプセル）、適切な疎水性材料（例えば、受容できる油中のエマルジョンとして）またはイオン交換樹脂、および難溶性誘導体（例えば、難溶性塩等）が含まれる。徐放性組成物は、経口的に、非経口的に、大槽内に、腹腔内に、局所的に（散剤、軟膏剤、ゲル剤、滴剤または経皮貼布等による）、または経口的もしくは経鼻噴霧剤として、投与することができる。徐放性マトリックスには、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸およびγ−エチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７−５５６，１９８３、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート））；（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｍａｔｅｒ．  Ｒｅｓ．１５：１６７−２７７，  １９８１；  Ｌａｎｇｅｒ，  Ｃｈｅｍ．  Ｔｅｃｈ．  １２：９８−１０５，  １９８２、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、同著）またはポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が含まれる。
【０１３１】
重合体はイオン制御放出に使用することができる。制御薬物送達で使用するための種々の分解可能な重合体マトリックスおよび分解不可な重合体マトリックスが当該技術分野において公知である（Ｌａｎｇｅｒ，  Ａｃｃｏｕｎｔｓ  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ２６：５３７，  １９９３）。例えば、ブロックコポリマーであるポロクサマー（ｐｏｌａｘａｍｅｒ）４０７は、低温において粘稠性ではあるが可動性の液体として存在するが、体温において半流動性ゲルを形成する。ポロクサマー４０７は、組換えインターロイキン−２およびウレアーゼの製剤および持続的送達に効果的なビヒクルであることが示されている（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．  ９：４２５，  １９９２；  ａｎｄ  Ｐｅｃ，  Ｊ．  Ｐａｒｅｎｔ．  Ｓｃｉ．  Ｔｅｃｈ．  ４４（２）：５８，  １９９０）。あるいは、ヒドロキシアパタイトが、タンパク質を制御放出するためのマイクロキャリアとして使用されている（Ｉｊｎｔｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  １１２：２１５，  １９９４）。さらに別の態様において、リポソームは脂質内カプセル化薬剤の制御放出並びに薬物標的に使用されている（Ｂｅｔａｇｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｉｎｃ．，  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，  ＰＡ，  １９９３）。治療用タンパク質を制御送達するための多数のさらなるシステムが知られている（例えば、米国特許第５，０５５，３０３号、同第５，１８８，８３７号、同第４，２３５，８７１号、同第４，５０１，７２８号、同第４，８３７，０２８号、同第４，９５７，７３５号、および同第５，０１９，３６９号、同第５，０５５，３０３号、同第５，５１４，６７０号、同第５，４１３，７９７号、同第５，２６８，１６４号、同第５，００４，６９７号、同第４，９０２，５０５号、同第５，５０６，２０６号、同第５，２７１，９６１号、同第５，２５４，３４２号、および同第５，５３４，４９６号）。
【０１３２】
開示のＣＮＡは、検出可能なマーカーと複合体化することもできる。例えば、診断用画像処理技術（例えば、ＣＴスキャン、ＭＲＩ、超音波、光ファイバー検査、および腹腔鏡下検査）により検出が可能な検出可能なマーカーである。検出可能なマーカーの具体例としては、限定はされないが、放射性同位元素および重金属または化合物（例えば、ＭＲＩによる検出のための超常磁性酸化鉄ナノ結晶）が挙げられる。そのような検出可能なマーカーを検出する手段は当業者に周知である。従って、例えば、放射標識を写真フィルムまたはシンチレーションカウンターを用いて検出してもよい。
【０１３３】
本医薬組成物は、単回ボーラス送達で、長期にわたる持続的送達（例えば、持続的な経皮、粘膜または静脈内送達）で、または反復投与プロトコールで（例えば、毎時間、毎日または毎週の、反復投与プロトコールによって）、対象に投与することができる。本化合物の治療効果のある投与量は、例えば、本明細書に記載の標的の疾患もしくは状態に関連する一つもしくは複数の症状もしくは検出可能な状態を軽減するための、臨床的に有意な結果をもたらす長期にわたる予防または治療レジメンに含まれる反復投与として、または、腫瘍をイメージングするために充分な量で、与えることができる。
【０１３４】
適切な用量は、対象の特徴、例えば、対象がヒトであるか非ヒトであるか、年齢、体重、および対象の状況または状態に関連する他の健康問題、投与の様式、経路、および投与回数、投与の時期および経路、同時に投与される他の薬剤または治療、並びに、対象において所望の活性または生物学的反応を誘発するための治療用組成物の具体的な薬効薬理によって異なる。投与計画は、最適な予防反応または治療反応を与えるように調整することができる。
【０１３５】
治療有効量は、治療上有益な作用が、臨床期間において、化合物および／または他の生理活性物質のあらゆる有毒または有害な副作用を上回る量でもある。本開示の方法および製剤に含まれる治療有効量の非限定的な範囲は、用量あたり約０．０００１μｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、用量あたり約０．０００１μｇ／ｋｇ体重〜約０．００１μｇ／ｋｇ体重、用量あたり約０．００１μｇ／ｋｇ体重〜約０．０１μｇ／ｋｇ体重、用量あたり約０．０１μｇ／ｋｇ体重〜約０．１μｇ／ｋｇ体重、用量あたり約０．１μｇ／ｋｇ体重〜約１０μｇ／ｋｇ体重、用量あたり約１μｇ／ｋｇ体重〜約１００μｇ／ｋｇ体重、用量あたり約１００μｇ／ｋｇ体重〜約５００μｇ／ｋｇ体重、用量あたり約５００μｇ／ｋｇ体重〜約１０００μｇ／ｋｇ体重、または用量あたり約１．０ｍｇ／ｋｇ体重〜用量あたり約１０ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０１３６】
Ｄ．キット
本開示は、一つまたは複数の容器中の本開示の一つまたは複数のＣＮＡ分子を含むキットも提供する。いくつかの例では、ＣＮＡ分子は凍結乾燥されており、対象への投与または他の何らかの使用の前に、再構成される。キットは、他の薬剤、例えば薬学的に許容できる担体、説明書等を所望により含むことができる。
【０１３７】
上記の諸態様は、以下の非限定な実施例によって説明される。
【実施例】
【０１３８】
実施例１
ＣＮＡ設計：ＣＮＡ単量体の設計は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）のＤＮＡ模倣体としての利用の成功に触発されたものである。最初のＰＮＡはアミノエチルグリシン（ＡＥＧ）骨格を用いて合成されたが、これは、ＤＮＡのリン酸塩−リボース骨格のそれに類似した反復単位の距離および最適化された結合角を示した初期の分子モデリングに基づいて選択されたものである。その発見から、ＰＮＡのいくつかの変種が合成および評価されており、ハイブリダイゼーションに必要とされる基本的な構造的制約が明らかにされている。最も決定的な制約は、鎖の骨格に沿った側鎖核酸塩基間の距離であり、最適な距離は６個の原子である。ｓｓＤＮＡとのハイブリダイゼーションが、核酸塩基間に５原子または７原子のスペーサーを有するＰＮＡについて観察されているが、６原子のスペーサーを有するＰＮＡ骨格変種が、それらのより高い融解温度によって示されるように、より大きな安定性を示す。
【０１３９】
最初のＣＮＡ単量体の構造は反復単位の間に６原子のスペーサーを有しており、３つの構成成分：チオール、ビニル、および核酸塩基を含有している（図１参照）。これらの必須成分を含有し、同時に反復単位の間に６原子のスペーサーも有する２つの異なる単量体が最初に提唱される。シミュレーション（ＳＹＭＢＹＬ−ｘ１．２）は、Ｎ−ビニルチオールエチルアミン（ＶＴＥ、図４参照）の反復単位の長さが、ＤＮＡ反復単位の長さよりも０．３４Å短いことを示している（比較のために、ＤＮＡとＰＮＡの差は０．３３Åである）。
【０１４０】
合成：ＣＮＡ単量体は、正確な原子レベルでの単量体設計を可能にするいくつかの単純な分子成分から合成される。単量体構造に対しこの合成制御を行うことで、低い溶解性もしくはハイブリダイゼーション効率という起こり得る偶然性として、またはハイブリダイゼーション安定性のさらなる最適化としての、単純な構造変動がさらに可能になる。ＶＴＥ単量体は、３つのカップリング反応：メトキシトリチル基（Ｍｍｔ）を用いるチオール保護、アミドカップリング、およびアミドとのヨウ化ビニル反応を用いることで、合成が成功した。シトシンをブロモ酢酸にカップリングする最終段階は、ＤＮＡの全てのＣＮＡ類似体を作製するために、残り３つの核酸塩基（アデニン、チミン、およびグアニン）に容易に拡張される。Ｃ−ＣＮＡが数百ミリグラム量で合成されたことにおいて示されたように、合成スキームがその他の核酸塩基（Ａ、Ｔ、およびＧ）に容易に拡張されることが示される（図７）。残りのＡ−、Ｔ−、およびＧ−ＣＮＡ単量体が合成される。合成は、これらの物質を、ＳＮＰ検出等の応用およびアンチセンス遺伝子治療学またはナノスケールの薬剤送達系において利用するという壮大な構想に必要不可欠であるように、収率を最適化し、グラム以上の量に生成物をスケールアップするために、調整される。
【０１４１】
Ｍｍｔ基はチオール官能基の速く効率的な脱保護を与える。可能な予備的プランとして、アセトアミドメチルおよびニトロベンジル官能基等の、他のオルソゴナルに除去されるチオール保護基が考えられる。図５に示されるように、保護チオールの官能性は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いるアミドカップリングを介して中心の分子に付加され、これは、効率的であり、精製が容易な生成物をもたらすことが本明細書で示されている。通常の保護チオール‐エン単量体は、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  “Ｃｏｐｐｅｒ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  ａｍｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｃａｒｂａｍａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｖｉｎｙｌ  ｈａｌｉｄｅｓ．”  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５，  ３６６７−３６６９  （２００３）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる））により開発された手順に従ったヨウ化ビニルの触媒カップリングによって生成される。次に、この基本単量体は、図７に示されるように、４つの核酸塩基のいずれかにより修飾される。
【０１４２】
ＣＮＡ骨格への修飾も考慮される。様々な単量体構造の調査によって、ＣＮＡ溶解性、チオール‐エンカップリング、およびＣＮＡハイブリダイゼーション等の基本特性に影響を与える分子パラメーターへの洞察が得られる。予備的な分子シミュレーション（ＳＹＭＢＹＬ−ｘ１．２）によって、Ｎ−ビニルチオールアセトアミド（ＶＴＡ）骨格が、ＤＮＡ反復単位の長さと０．２２Åの差異を有することが明らかにされる（先に記載したように、ＰＮＡとＤＮＡの差異は０．３３Åである）。従って、代わりの候補として、ＶＴＥをベースとした単量体の作成に用いられるのと同じカップリング反応を用いた、ＶＴＡをベースとしたＣＮＡの合成を提唱する。
【０１４３】
重合およびハイブリダイゼーション：単量体Ｃ−ＣＮＡのチオールを脱保護し（図５）、オリゴマーグアニン−ＤＮＡ（１０塩基長Ｇ−ＤＮＡ）の存在下での光重合によりＣＮＡオリゴマーを作製した。生成物をエタノール沈殿で精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を用いて確認した。この実験を通じて、２つの原則的な発見、すなわち：ｉ）ＣＮＡ単量体はＤＮＡ存在下で光開始可能であること、およびｉｉ）チオール‐エン反応は交互の伸長鎖転移機構により進行すること（図２参照）、を確立した。これらの発見は、これらの特定のチオールおよび「エン」官能基がチオール‐エン化学作用に適切であり、核酸をベースとした物質内に存在する官能基に対して化学的にオルソゴナルであるという仮定を裏付けるものである。チオール−エンラジカルの性質および反応全体を通じたその低濃度は、あらゆる塩基損傷を最小限にすることが期待されるが、予備案として、多数の他のチオール−Ｘカップリング反応（例えば、マイケル付加）が使用され得る。
【０１４４】
いくつかの例では、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）と同様に、逐次制御を与え、精製を助けるために、ＣＮＡ分子の連続的な作製が固体基質（すなわち、官能化樹脂）上で行われる。簡潔に説明すると、アミン官能化された切断可能な基質（ＳＰＰＳでしばしば使用される、例えば、Ｒｉｎｋアミド樹脂）が、チオール保護されたメルカプトプロピオネートの標準的なアミドカップリングを介して、チオールに変換される。基質は効率的且つ簡便な反応および精製サイクルを可能にする。所与のサイクルにおいて、チオールは脱保護され、副生成物は洗い落とされ、その後、ＣＮＡ単量体チオール‐エンカップリングによって、新しいチオール保護された表面が生成される（図９参照）。その後、所望のＣＮＡ配列が完成するまでこの手順が繰り返される。最後に、ＣＮＡオリゴマーは表面から切断され、カラムクロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって精製される。その後、生成物は質量分析（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ）を用いて検証、さらには評価される。
【０１４５】
単量体カップリングの最適化：カップリング効率が各チオール−エン反応ステップにおいて評価される。これは、ＣＮＡ作製プロセスの全体を通じて樹脂を一定分量取り出し、生成物をＨＰＬＣおよび質量分析（並びに適切な場合は赤外線およびＮＭＲ分光分析法）によって分析することで達成される。チオール‐エンカップリング効率をさらに最適化するために、光開始剤、樹脂、およびＣＮＡ単量体の濃度、化学量論、照射強度、並びに反応時間等の反応パラメーターは変動される。非定量的な変換は連続的なエラー伸長をもたらすため、反応パラメーターの最適化は重要である。この効果をさらに最小化するため、エラー伸長を減らすための中間的キャップ形成反応（例えば、中間的アクリル酸メチル／ホスフィン溶液でのすすぎ）を用いる等の、ＳＰＰＳに一般的に使用される追加の反応ストラテジーが考慮される。
【０１４６】
円二色性：円二色性（ＣＤ）分光法を用いて、ＣＮＡの光学活性を評価した。オリゴマーＣ−ＣＮＡおよびＧ−ＤＮＡのＣＤ分光法によって、らせん状二次構造の特徴である光学活性が示される（図６参照）。この驚くべき結果は、２０年近く前のＰＮＡの発見以来の、合成ＤＮＡハイブリダイゼーションの最初の例である。さらに、９０℃への試料の温度掃引（２℃／分）により、ＤＮＡ−ＤＮＡ結合等価物を２０℃上回る解離あるいは「融解」温度が明らかとなった（図６）。すなわち、相補的ＣＮＡ−ＤＮＡ結合はＤＮＡ−ＤＮＡよりも安定である。そして、前記ハイブリダイゼーション実験を、配列に単一の変化（すなわち、ＳＮＰ）を含有したＤＮＡ鎖を用いることを別として、繰り返した。一塩基ミスマッチの作用はＤＮＡ−ＣＮＡ対合の劇的な不安定化であったが、このことは、ＣＮＡ物質がＤＮＡのＳＮＰに非常に敏感であろうことを示している。
【０１４７】
ＤＮＡが情報を保存し、その核酸配列およびハイブリダイゼーションによって選択的に対合する能力は、それぞれ、ＤＮＡを最も有能且つ強力な生体分子構造の１つとしている。研究案において、ＤＮＡの能力をより良く模倣し、同時にチオール‐エンクリックケミストリーの効率および手軽な性質の利点を利用する、ＣＮＡオリゴマーの作製が試みられる。
【０１４８】
ハイブリダイゼーション評価：ＣＮＡのＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、購入したＤＮＡオリゴヌクレオチド（インテグレイテッドＤＮＡテクノロジーズ社（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．））および作製されたＣＮＡ相補体を用いて評価される。具体的には、２１核酸塩基のＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＫＲＡＳのコドン１２：５’−ＣＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＣＴＡ  ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＧＴＴ  ＴＡＴ−３’（配列番号１））および合成したＣＮＡ相補体の融解温度が評価される。５’末端および３’末端並びに中間点における一重点および二重点変異がさらに考慮される。そのような情報はＳＮＰ検出におけるＣＮＡの有効性を評価する際に重要である。上記のように、ＣＤ分光法は、２６０ｎｍでの吸光度を測定することによる、ＣＮＡ−ＤＮＡ複合体のハイブリダイゼーション安定性（または「融解」温度）の測定に適切である。典型的な実験において、一本鎖ＣＮＡおよびＤＮＡは７０℃で１０分間インキュベートされ、ゆっくりと室温に冷却される。ＣＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションを最適化するために、および新規の対合特性を調べるために、温度サイクル等のプロトコールの変更が考慮される。
【０１４９】
実施例２
ＤＮＡ  ＳＮＰのＣＮＡオリゴマー検出の実証
ＤＮＡオリゴヌクレオチドアレイは、固体基板に固定された様々なＤＮＡ配列のスポットから成り、これにより、遺伝物質の試料との相補的ハイブリダイゼーション事象の評価が可能になる。この技術は、ゲノム配列決定、病原体ゲノム解析、および遺伝子発現解析等の種々の遺伝子スクリーニング応用で利用されている。ＣＮＡは、ＳＮＰ検出のための診断用ＤＮＡアレイを作製するための簡易な方法を可能にする。巨大な核酸塩基重合体を合成する経路を与えることに加え、チオール−エン化学作用は容易に光誘導され、反応に正確な時間空間的制御をもたらす。チップ上のＣＮＡアレイの作製は、レーザーまたは光の遮蔽を用いて配列特異的な伸長を方向づけることにより、達成される。実証実験として、蛍光標識したＤＮＡを購入し、ＣＮＡマイクロアレイが特異的な配列を捕捉する能力を評価する。特定の例では、ＣＮＡマイクロアレイの、癌診断に一般的に使用されるジェネティックバイオマーカーであるＫＲＡＳ癌遺伝におけるＳＮＰ（コドン１２におけるＣ−＞Ｇ）を検出する効率が評価される。
【０１５０】
ＣＮＡオリゴヌクレオチドアレイの作製：ＣＮＡオリゴヌクレオチドの配列を、チオール化スライドガラス上に直接作製した。そのスライドは、ピラニア洗浄によるスライド表面の酸化、およびそれに続くチオール−シラン剤（すなわち、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン）の蒸着によって準備する。４０５ｎｍレーザーを備えた共焦点顕微鏡の載物台の上にスライドを設置する。光開始剤（Ｉ８１９‐可視光光開始剤）を含んでいてもよいＣＮＡ単量体溶液をスライドの表面上に浮遊させる。４０５ｎｍレーザーを用いてスライド上の狭い面積を照射するように顕微鏡をプログラムし、それにより、最初のＣＮＡ塩基の配置を確立する（図１６参照）。ＣＮＡ溶液は洗い流すが、さらなるカップリングのためにとっておく。このプロセスを残り３つのＣＮＡ塩基について繰り返し、ＣＮＡオリゴヌクレオチドの最初の一部を完成させる。次に、全ての未反応チオールに不可逆的に結合して配列のエラー伸長を軽減する、ヘキシルアクリレート／ジメチルフェニルホスフィン溶液から成るブロッキング溶液を、スライドに添加する。次に、チオール保護基を除去し、次のＣＮＡ付加／すすぎサイクルを開始する。このプロトコールを用いることで、サイズＮのＣＮＡオリゴマーは、最高４ＮのＣＮＡの付加／すすぎサイクルを必要とし、ここでは、各ＣＮＡヌクレオチド溶液は再利用可能である。この手順が、高密度オリゴマイクロアレイの作製に容易に拡張され、ＳＮＰ検出のための診断用遺伝子アレイの単純な作製をはるかに超える意義を有することは、理解されるだろう。
【０１５１】
いくつかの例では、４つの異なる配列（すなわち、配列につき５つの反復）を有する２０スポットのＣＮＡオリゴヌクレオチドアレイが作製される。異なる配列のうちの２つは、野生型または変異型ＫＲＡＳコドン１２の２１ヌクレオチドの相補的ＣＮＡ配列であり得る（すなわち、標的配列は、５’−ＸＡＧ  ＣＴＣ  ＣＡＡ  ＣＴＡ  ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＧＴＴ  ＴＡＴ−３’（配列番号２）であり、ここで野生型およびＧ→Ｒ変異型のそれぞれにおいて、Ｘは「Ｃ」および「Ｇ」である）。残りの２つの異なる配列は、２つの点変異を有する野生型配列および非特異的（ランダム）対照である。異なる蛍光標識末端基（Ｃｙ３およびＣｙ５）を有する野生型配列および変異型配列を有するＤＮＡオリゴマーを購入する。蛍光標識したＤＮＡはアジレントテクノロジー社製Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｃａｎｎｅｒを用いて可視化される。それぞれの試験において、所与のスポットにおけるバックグラウンドと比較した平均蛍光が報告され、相補的配列を含有するスポットに対して正規化される。このように、野生型および変異型ＤＮＡ標的配列の両方を含む試験において、それぞれのカラーチャネル（Ｃｙ３およびＣｙ５フルオロフォアに対応）が陽性結合を測定するために使用される。さらに、ハイブリダイゼーションプロトコールは、変異型ＫＲＡＳ癌遺伝の検出に適した条件を探すために最適化される。
【０１５２】
実施例３
チオエーテル核酸による表面の修飾
開示のＣＮＡ分子が相補ＤＮＡに対してより良好な親和性を有することの簡単な実証として、表面修飾にＣＮＡ配列を組み込んだ。この感度の増加により、ＣＮＡ分子は、表面上でのＤＮＡ鎖検出のための高感度プローブとなる。この試験において、最初のステップは、ＣＮＡ（ポリＴ）鎖およびＤＮＡ（ポリＡ）鎖の両方を、同じ添加量（１μＭ）でスライドガラス上に付着させることであった（図１８参照）。過剰な蛍光相補ＤＮＡ鎖を、スライドガラス上のＤＮＡおよびＣＮＡを検出するための蛍光プローブとして使用した。図１９に示されるように、この試験の結果は、ＣＮＡがＤＮＡよりも多い蛍光強度を有することを示している。このデータは、ＣＮＡ分子が、ＤＮＡそれ自体よりも相補ＤＮＡ鎖に対してより感度が高いことを示している。
【０１５３】
実施例４
ヒドロゲルへのクリック核酸の組込み
ＣＮＡ−ＤＮＡハイブリッドをヒドロゲル形成における架橋剤として導入した。この試験において、４腕のＰＥＧ−ポリＡ（ＤＮＡ）および２腕のＰＥＧポリＴ（ＣＮＡ）を、ＰＥＧ−アクリレートとのチオール−マイケル付加を用いて合成した。これら２つの基質を緩衝液中で混合し（５〜８重量％）、ヒドロゲルの形成を観察した。これらの結果は、例えば生体適合性ヒドロゲルにおける、分子構成単位としての、開示のＣＮＡ分子の弾力性を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015514706.tif 000048