(57)【要約】遺伝子改変マウスが提供される。ここでは、このマウスは、限定された数の軽鎖可変ドメインを特徴とする免疫グロブリン軽鎖レパートリーを発現する。それらの生殖細胞系列において限られたレパートリーからのただ１つまたは少数の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを発現するマウスが提供される。本明細書中に記載されるマウスを使用して、ヒト軽鎖可変領域を含むユニバーサル軽鎖を有している二重特異性抗体を作製するための方法が提供される。多重特異性結合タンパク質、例えば、二重特異性抗体における使用に適しているヒト可変領域を作製するための方法、ならびに宿主細胞が提供される。第一および第二の抗原に結合することができる二重特異性抗体が提供され、ここでは、第一および第二の抗原は、単一のタンパク質の別のエピトープであるか、または、２つの異なるタンパク質上の別のエピトープが提供される。
2015525071.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重特異性抗原結合タンパク質を作製する方法であって、単一のヒト軽鎖可変ドメインおよび複数のヒト重鎖可変ドメインを発現する、同じマウスまたは別のマウスから単離された２つの異なるＢ細胞に由来する２つの異なるヒト重鎖可変領域遺伝子配列を得る工程、ならびに、
前記２つのヒト重鎖可変領域遺伝子配列によりコードされるアミノ酸配列を含有している２つのヒト重鎖と、前記ヒト軽鎖可変ドメインを含有している１つのヒト軽鎖を有している二重特異性抗原結合タンパク質を作製する工程
を含む、方法。
【請求項２】
前記同じマウスまたは別のマウス中で発現された前記単一のヒト軽鎖可変ドメインが、単一の再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖセグメントおよび単一の再構成されたヒト生殖細胞系列Ｊセグメント由来のヌクレオチド配列によりコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記単一の再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖセグメントが、再構成されたヒトＶκ１−３９または再構成されたヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記単一の再構成されたヒト生殖細胞系列Ｊセグメントが、再構成されたヒトＪκ５または再構成されたヒトＪκ１遺伝子セグメントである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記同じマウスまたは別のマウスが、１つ以上の非ヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１つ以上の再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有している重鎖遺伝子座を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記重鎖遺伝子座が、１つ以上のマウス重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された８０の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、および６の再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−２、ＶＨ１−８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−５３、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、またはこれらの組み合わせを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記同じマウスまたは別のマウスが、軽鎖可変ドメインをコードする遺伝子を形成するように再構成することができる内因性の軽鎖可変遺伝子セグメントを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記２つのヒト重鎖可変領域遺伝子配列のそれぞれが、前記同じまたは異なるＶＨセグメントに由来する配列を含み、ここでは、前記ＶＨセグメントが、ＶＨ１−２、ＶＨ１−８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−５３、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１、およびＶＨ６−１より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記２つのヒト重鎖が：
２つの異なる抗原、または
同じ抗原の２つの異なるエピトープ
に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
二重特異性抗原結合タンパク質を作製する方法であって：
単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列に由来する核酸配列によりコードされる単一の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび複数のヒト重鎖可変ドメインを発現する第一のマウスを、第一のエピトープを含有する目的の第一の抗原に対して暴露する工程、
前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列に由来する核酸配列によりコードされる単一の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび複数のヒト重鎖可変ドメインを発現する第二のマウスを、第二のエピトープを含有する目的の第二の抗原に対して暴露する工程、
前記第一および第二のマウスが、それぞれ目的の前記抗原に対する免疫応答を惹起することを可能にする工程、
目的の前記第一の抗原の前記第一のエピトープに結合する前記第一のマウスの第一のヒト重鎖可変ドメインを同定する工程、
目的の前記第二の抗原の前記第二のエピトープに結合する前記第二のマウスの第二のヒト重鎖可変ドメインを同定する工程、
前記第一のヒト重鎖可変ドメインを含有する第一の重鎖をコードする第一の完全ヒト型重鎖遺伝子、および前記第二のヒト重鎖可変ドメインを含有する第二の重鎖をコードする第二の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、
前記第一および第二の重鎖遺伝子を、前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列を含有する単一の完全ヒト型軽鎖遺伝子を含有する細胞に導入する工程、
前記完全ヒト型重鎖遺伝子によりコードされる前記第一および第二の完全ヒト型重鎖と、前記単一の完全ヒト型軽鎖遺伝子によりコードされる完全ヒト型軽鎖とを、細胞中で発現させて、二重特異性抗原結合タンパク質を形成させる工程、ならびに、
前記細胞から前記二重特異性抗原結合タンパク質を単離する工程
を含む、方法。
【請求項１２】
前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列が、再構成されたヒトＶκ１−３９またはＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列が、再構成されたヒトＪκ１またはＪκ５遺伝子セグメントをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一の抗原と前記第二の抗原とが同一ではない；または
前記第一の抗原と前記第二の抗原とが同一であり、かつ前記第一のエピトープと前記第二のエピトープとが同一ではない
請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記完全ヒト型軽鎖は、前記第一の完全ヒト型重鎖と対を形成すると、前記第一の抗原の前記第一のエピトープに特異的に結合し、前記完全ヒト型軽鎖は、前記第二の完全ヒト型重鎖と対を形成すると、前記第二の抗原の前記第二のエピトープに特異的に結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
両方ではなく、前記第一または第二の完全ヒト型重鎖が、プロテインＡに対するその親和性を低下させるアミノ酸改変を保有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記改変が、９５Ｒ（ＥＵＲ  ４３５Ｒ）、９６Ｆ（ＥＵＲ  ４３６Ｆ）、およびこれらの組み合わせより選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列が生殖細胞系列配列である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記第一および第二のマウス中の前記複数のヒト重鎖可変ドメインが、１つ以上の非ヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１つ以上の再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有している重鎖遺伝子座によりコードされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記第一または第二のマウス中の前記重鎖遺伝子座が、１つ以上のマウス重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された８０個の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７個の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、および６個の再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−２、ＶＨ１−８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−５３、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
二重特異性抗原結合タンパク質において使用するための２つのヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを選択する方法であって：
第一のマウスを目的の第一の抗原で免疫して、前記第一の抗原に結合する第一のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを得る工程であって、ここでは、前記第一のマウスが、単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列に由来する単一のヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインとを発現する、工程、および
第二のマウスを目的の第二の抗原で免疫して、前記第二の抗原に結合する第二のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを得る工程であって、ここでは、前記第二のマウスが、前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列に由来する単一のヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインとを発現する、工程
を含む、方法。
【請求項２３】
前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列が、再構成されたヒトＶκ１−３９またはＶκ３−２０遺伝子セグメントを含有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記単一の再構成されたヒト可変領域遺伝子配列が、再構成されたヒトＪκ１またはＪκ５遺伝子セグメントをさらに含有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第一のマウスおよび前記第二のマウスが、免疫グロブリン軽鎖を形成するように再構成することができる内因性の軽鎖可変遺伝子セグメントを含まない、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記第一の抗原および前記第二の抗原が
異なる；または
同じであり、かつ前記第一の重鎖可変ドメインおよび前記第二の重鎖可変ドメインが異なるエピトープに結合する、
請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）第一の抗原に結合する第一のヒト免疫グロブリン重鎖をコードする第一の核酸配列であって、ここでは、前記第一のヒト重鎖が、第一のヒト重鎖可変ドメインの配列を含有し、前記第一のヒト重鎖可変ドメインの前記配列が、前記第一の抗原で免疫された第一のマウスから得られたヌクレオチド配列によりコードされる、第一の核酸配列；
（ｂ）第二の抗原に結合する第二のヒト免疫グロブリン重鎖をコードする第二の核酸配列であって、ここでは、前記第二のヒト重鎖が、第二のヒト重鎖可変ドメインの配列を含有し、前記第二のヒト重鎖可変ドメインの前記配列が、前記第二の抗原で免疫された第二のマウスから得られたヌクレオチド配列によりコードされ、
ここでは、前記第一および第二のマウスはそれぞれ、単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列によりコードされる単一のヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと、複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインとを発現する、第二の核酸配列；ならびに、
（ｃ）前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列を含有する第三の核酸配列であって、ここでは、前記第三の核酸はヒト免疫グロブリン軽鎖をコードする、第三の核酸配列；
を含有する宿主細胞であって、
ここでは、前記第一の核酸配列、前記第二の核酸配列、および前記第三の核酸配列は、前記第一および第二の抗原に結合する抗原結合タンパク質を作製するように発現する、
宿主細胞。
【請求項２８】
前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、再構成されたヒトＶκ１−３９またはＶκ３−２０遺伝子セグメントを含有する、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
前記単一の再構成されたヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子配列が、再構成されたヒトＪκ１またはＪκ５遺伝子セグメントをさらに含有する、請求項２８に記載の宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、ＰＣＴ国際特許出願として２０１３年６月５日に出願され、２０１２年６月５日に出願した米国特許出願第１３／４８８，６２８号に対する優先権を主張する。米国特許出願第１３／４８８，６２８号の開示は、その全体が本明細書に参考として援用される。
【０００２】
分野
多様なヒト可変／マウス定常重鎖と会合している共通のヒト可変／マウス定常軽鎖を有する抗体を発現する遺伝子改変マウスが提供される。マウスのＢ細胞のヒト可変領域遺伝子配列からヒト二重特異性抗体を作製する方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
背景
抗体は、各重鎖モノマーが同一の軽鎖と会合しているホモダイマー重鎖成分を一般的に含む。ヘテロダイマー重鎖成分を有する抗体（例えば、二重特異性抗体）は、治療抗体として望ましい。しかし、二重特異性抗体の重鎖の各々と十分に会合することができる好適な軽鎖成分を有する二重特異性抗体を作製することには、問題があることが判明した。
【０００４】
１つの手法では、全ての軽鎖可変ドメインの使用統計値を調査し、ヒト抗体で最も頻繁に使用される軽鎖を同定し、その軽鎖を異なる特異性の２つの重鎖とｉｎ  ｖｉｔｒｏで対を形成させる（pairing）ことによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。
【０００５】
別の手法では、ファージディスプレイライブラリー（例えば、ヒト軽鎖可変領域配列を含むファージディスプレイライブラリー、例えばヒトｓｃＦｖライブラリー）において軽鎖配列を観察し、最も一般的に用いられる軽鎖可変領域をライブラリーから選択することによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。次に、軽鎖を、目的の２つの異なる重鎖について試験することができる。
【０００６】
別の手法では、目的の両方の重鎖の重鎖可変配列をプローブとして用いて、軽鎖可変配列のファージディスプレイライブラリーを分析することによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。両方の重鎖可変配列と会合する軽鎖は、それら重鎖のための軽鎖として選択することができる可能性がある。
【０００７】
別の手法では、候補軽鎖を重鎖の同系の（cognate）軽鎖とアラインメントさせることができ、両方の重鎖の同系の軽鎖に共通する配列特性により緊密に一致するように軽鎖が改変される。免疫原性の可能性を最小にする必要がある場合、免疫原性の可能性を評価することについて当該技術分野で公知であるパラメータおよび方法（すなわち、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏおよびウェットアッセイ）に基づき、タンパク分解プロセシングがＴ細胞エピトープを生成する可能性が低いように、その改変は好ましくは、公知のヒト軽鎖配列に存在する配列をもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
上記の手法のいずれも、例えば配列同一性、特異的な予め選択された重鎖と会合する能力などのいくつかのアプリオリ制限を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法に依存する。共通する軽鎖を含むヒトエピトープ結合性タンパク質を作製するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件における操作に頼らず、代わりにより生物学的で実用的な手法を使用する組成物および方法への必要性が当該技術分野にある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
概要
ヒト免疫グロブリンの重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを発現し、限られた軽鎖可変レパートリーを有する遺伝子改変マウスが提供される。親和性成熟ヒト重鎖可変ドメインの多様なレパートリーと会合して発現するヒト軽鎖可変ドメインを生成する生物系が提供される。免疫グロブリン可変ドメインを含む結合性タンパク質の作製方法であって、限定された免疫グロブリン軽鎖レパートリーを有するマウスを目的の抗原で免疫すること、および目的の抗原に特異的に結合する結合性タンパク質においてマウスの免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を使用することを含む方法が提供される。方法には、多重特異性抗原結合性タンパク質の作製で用いるのに適するヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの作製方法が含まれる。
【００１０】
再構成されていないヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントのレパートリーに由来する好適な親和性成熟ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを選択する遺伝子操作マウスであって、親和性成熟ヒト重鎖可変ドメインは、１つのヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントに由来する単一のヒト軽鎖可変ドメインと会合して発現する、遺伝子操作マウスが提供される。２つのヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントの選択を提示する遺伝子操作されたマウスも提供される。種々の局面において、１つまたは２つの遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９およびヒトＶκ３−２０を含む。
【００１１】
ヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントの限定されたレパートリーからの、ヒト軽鎖可変ドメインの限定されたレパートリーまたは単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現する遺伝子操作マウスが提供される。マウスは、単一の再構成されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（または２つのヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント）を含むように遺伝子操作され、これは、再構成して、単一の軽鎖を発現する（または２つの軽鎖の一方もしくは両方を発現する）再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子（または再構成された２つの軽鎖可変領域遺伝子）を形成する。再構成されたヒト軽鎖可変ドメインは、マウスによって選択される複数の親和性成熟ヒト重鎖と対を形成することが可能であり、ここで、重鎖可変領域は異なるエピトープと特異的に結合する。
【００１２】
ヒト軽鎖可変領域配列の限定されたレパートリーから、ヒト軽鎖可変ドメインの限定されたレパートリーまたは単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現する遺伝子操作マウスが提供される。マウスは、単一の軽鎖の可変領域を発現する（または２つの可変領域の一方もしくは両方を発現する）単一のＶ／Ｊヒト軽鎖配列（または２つのＶ／Ｊ配列）を含むように遺伝子操作される。可変配列を含む軽鎖は、マウスによってクローン選択される複数の親和性成熟ヒト重鎖と対を形成することが可能であり、ここで、重鎖可変領域は異なるエピトープと特異的に結合する。
【００１３】
一態様では、（１つまたは複数のＪＬセグメントより選択される）ヒトＪ遺伝子セグメントを伴って再構成すること、および免疫グロブリン軽鎖のヒトＶＬドメインをコードすることができる単一のヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）領域遺伝子セグメントを含む遺伝子改変マウスが提供される。別の態様では、マウスは２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含み、その各々が、（１つまたは複数のＪＬセグメントより選択される）ヒトＪ遺伝子セグメントを伴って再構成すること、および免疫グロブリン軽鎖のヒトＶＬドメインをコードすることができる。
【００１４】
一実施形態では、単一のヒト軽鎖ＶＬ遺伝子セグメントはＪκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５から選択されるヒトＪＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結されており、単一のヒトＶＬ遺伝子セグメントは１つもしくは複数のヒトＪＬ遺伝子セグメントのうちのいずれかを有する軽鎖可変領域遺伝子をコードする配列が形成されるように再構成することができる。
【００１５】
一実施形態では、遺伝子改変マウスは、免疫グロブリン軽鎖遺伝子を形成するように再構成することができる内因性のマウスＶＬ遺伝子セグメントを含まない免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。ここで、ＶＬ遺伝子座は、軽鎖遺伝子のＶＬ領域をコードするように再構成することができる単一のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む。具体的な実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントである。一実施形態では、遺伝子改変マウスは、免疫グロブリン軽鎖遺伝子を形成するように再構成することができる内因性のマウスＶＬ遺伝子セグメントを含まないＶＬ遺伝子座を含む。ここで、ＶＬ遺伝子座は、軽鎖遺伝子のＶＬ領域をコードするように再構成することができる２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む。具体的な実施形態では、２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントである。
【００１６】
一態様では、ヒトの免疫グロブリン軽鎖のＶＬドメインをコードする単一の再構成された（Ｖ／Ｊ）ヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）領域（すなわち、ＶＬ／ＪＬ領域）を含む遺伝子改変マウスが提供される。別の態様では、マウスは、ヒトの免疫グロブリン軽鎖のＶＬドメインをコードすることが可能である２つ以下の再構成されたヒトＶＬ領域を含む。
【００１７】
一実施形態では、ＶＬ領域は、再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊ配列または再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊ配列である。一実施形態では、再構成されたＶＬ／ＪＬ配列のヒトＪＬセグメントは、Ｊκ１、Ｊκ２、Ｊκ３、Ｊκ４、およびＪκ５より選択される。具体的な実施形態では、ＶＬ領域は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列である。具体的な実施形態では、マウスは、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列の両方を有する。
【００１８】
一実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトまたはマウスのリーダー配列に作動可能に連結される。一実施形態では、リーダー配列はマウスのリーダー配列である。具体的な実施形態では、マウスのリーダー配列は、マウスＶκ３−７リーダー配列である。具体的な実施形態では、リーダー配列は、再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結される。具体的な実施形態では、リーダー配列は、再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列に作動可能に連結される。
【００１９】
一実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、免疫グロブリンプロモーター配列に作動可能に連結される。一実施形態では、プロモーター配列は、ヒトのプロモーター配列である。具体的な実施形態では、ヒト免疫グロブリンプロモーターは、ヒトＶκ３−１５プロモーターである。具体的な実施形態では、プロモーターは、再構成されていないヒトＶＬ遺伝子セグメントに作動可能に連結される。具体的な実施形態では、プロモーターは、再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列に作動可能に連結される。
【００２０】
一実施形態では、軽鎖遺伝子座は、５’（ＶＬ遺伝子セグメントの転写方向に関して）にヒト免疫グロブリンプロモーターが隣接し、３’に、ヒトＪセグメントと再構成して、内因性マウス軽鎖定常領域（ＣＬ）を含むリバースキメラ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ）軽鎖のＶＬドメインをコードするヒトＶＬ遺伝子セグメントが隣接する、リーダー配列を含む。具体的な実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントはマウスＶκ遺伝子座にあり、マウスＣＬはマウスＣκである。
【００２１】
一実施形態では、軽鎖遺伝子座は、５’（ＶＬ遺伝子セグメントの転写方向に関して）にヒト免疫グロブリンプロモーターが隣接し、３’に、再構成されたヒトＶＬ領域（ＶＬ／ＪＬ配列）Ｊセグメントが隣接しており、内因性マウス軽鎖定常領域（ＣＬ）を含むリバースキメラ軽鎖のＶＬドメインをコードするヒトＶＬ遺伝子セグメントが隣接する、リーダー配列を含む。具体的な実施形態では、再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列はマウスカッパ（κ）遺伝子座にあり、マウスＣＬはマウスＣκである。
【００２２】
一実施形態では、改変マウスのＶＬ遺伝子座はκ軽鎖遺伝子座であり、κ軽鎖遺伝子座はマウスκイントロンエンハンサー、マウスκ３’エンハンサー、またはイントロンエンハンサーおよび３’エンハンサーの両方を含む。
【００２３】
一実施形態では、マウスは、機能しないラムダ（λ）免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。具体的な実施形態では、λ軽鎖遺伝子座は、この遺伝子座の１つまたは複数の配列の欠失を含み、ここで、１つまたは複数の欠失は、λ軽鎖遺伝子座が再構成して軽鎖遺伝子を形成することを不可能にする。別の実施形態では、λ軽鎖遺伝子座のＶＬ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てが欠失されている。
【００２４】
一実施形態では、マウスは、ヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異ＶＬドメインを含む軽鎖を作る。一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異ＶＬドメインおよびマウスＣκ領域を含む。一実施形態では、マウスはλ軽鎖を発現しない。
【００２５】
一実施形態では、遺伝子改変マウスは、ヒトＶＬ領域配列を体細胞超変異させることが可能である。具体的な実施形態では、マウスは、再構成して、ＶＬドメインをコードすることが可能であるヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来する再構成された免疫グロブリン軽鎖遺伝子を含む細胞を含み、再構成された免疫グロブリン軽鎖遺伝子は体細胞変異ＶＬドメインを含む。
【００２６】
一実施形態では、マウスは、マウスＣκに連結された体細胞変異ヒトＶＬドメインを含む軽鎖を発現する細胞を含み、ここで、軽鎖は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異ＶＨドメインを含む重鎖と会合し、重鎖はマウス重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。特定の実施形態では、重鎖は、マウスＣＨ１、マウスヒンジ、マウスＣＨ２、およびマウスＣＨ３を含む。特定の実施形態では、重鎖は、ヒトＣＨ１、ヒンジ、マウスＣＨ２およびマウスＣＨ３を含む。
【００２７】
一実施形態では、マウスは、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントによる内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの置換を含み、ここで、ヒトＶＨ遺伝子セグメントはマウスＣＨ領域遺伝子に作動可能に連結され、したがってマウスはヒトＶＨ遺伝子セグメントを再構成して、ヒトＶＨドメインおよびマウスＣＨを含むリバースキメラ免疫グロブリン重鎖を発現する。一実施形態では、再構成されていないマウスＶＨ遺伝子セグメントの９０〜１００％は、少なくとも１つの再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換される。具体的な実施形態では、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全ては、少なくとも１つの再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換される。一実施形態では、置換は、少なくとも１９個、少なくとも３９個または少なくとも８０個もしくは８１個の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによる。一実施形態では、置換は、少なくとも１２個の機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２５個の機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントまたは少なくとも４３個の機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによる。一実施形態では、マウスは、少なくとも１つの再構成されていないヒトＤＨセグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＨセグメントによる全てのマウスＤＨおよびＪＨセグメントの置換を含む。一実施形態では、少なくとも１つの再構成されていないヒトＤＨセグメントは、１−１、Ｄ１−７、１−２６、２−８、２−１５、３−３、３−１０、３−１６、３−２２、５−５、５−１２、６−６、６−１３、７−２７およびその組合せから選択される。一実施形態では、少なくとも１つの再構成されていないヒトＪＨセグメントは、１、３、４、５、６およびその組合せから選択される。具体的な実施形態では、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、１−２、１−８、１−２４、１−６９、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、３−５３、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１、６−１のヒトＶＨ遺伝子セグメントおよびその組合せから選択される。
【００２８】
一実施形態では、マウスは、目的の抗原に特異的に結合する結合性タンパク質を発現するＢ細胞を含み、ここで、結合性タンパク質はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成またはヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来する軽鎖を含み、細胞は、１−６９、２−５、３−１３、３−２３、３−３０、３−３３、３−５３、４−３９、４−５９および５−５１の遺伝子セグメントから選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントの再構成に由来する再構成された免疫グロブリン重鎖遺伝子を含む。一実施形態では、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、１、２、３、４、５および６から選択されるヒト重鎖ＪＨ遺伝子セグメントと共に再構成される。一実施形態では、１つまたは複数のヒトＶＨおよびＪＨ遺伝子セグメントは、１−１、１−７、１−２６、２−８、２−１５、３−３、３−１０、３−１６、３−２２、５−５、５−１２、６−６、６−１３、および７−２７から選択されるヒトＤＨ遺伝子セグメントと共に再構成される。具体的な実施形態では、軽鎖遺伝子は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ、またはそれより多くの体細胞超変異を有する。
【００２９】
一実施形態では、マウスは、２−５／６−６／１、２−５／３−２２／１、３−１３／６−６／５、３−２３／２−８／４、３−２３／３−３／４、３−２３／３−１０／４、３−２３／６−６／４、３−２３／７−２７／４、３−３０／１−１／４、３−３０／１−７／４、３−３０／３−３／３、３−３０／３−３／４、３−３０／３−２２／５、３−３０／５−５／２、３−３０／５−１２／４、３−３０／６−６／１、３−３０／６−６／３、３−３０／６−６／４、３−３０／６−６／５、３−３０／６−１３／４、３−３０／７−２７／４、３−３０／７−２７／５、３−３０／７−２７／６、３−３３／１−７／４、３−３３／２−１５／４、４−３９／１−２６／３、４−５９／３−１６／３、４−５９／３−１６／４、４−５９／３−２２／３、５−５１／３−１６／６、５−５１／５−５／３、５−５１／６−１３／５、３−５３／１−１／４、１−６９／６−６／５、および１−６９／６−１３／４から選択される、ＶＨ、ＪＨおよびＤＨ領域を含む再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含むＢ細胞を含む。具体的な実施形態では、Ｂ細胞は、マウス重鎖定常領域と融合したヒト免疫グロブリン重鎖可変領域、およびマウス軽鎖定常領域と融合したヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む結合性タンパク質を発現する。
【００３０】
一実施形態では、再構成されたヒトＶＨ領域は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列であり、マウスは、（ｉ）ヒトＶＬ/ＪＬ配列に由来するＶＬドメイン、および（ｉｉ）マウスＣＬを含むリバースキメラ軽鎖を発現し、ここで、軽鎖は、（ｉ）マウスＣＨならびに（ｉｉ）１−２、１−８、１−２４、１−６９、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、３−５３、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１、および６−１のヒトＶＨ遺伝子セグメントおよびその組合せから選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異ヒトＶＨドメインを含むリバースキメラ重鎖と会合している。一実施形態では、マウスは、体細胞変異した軽鎖を発現する。一実施形態では、ＣＬはマウスＣκである。特定の実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、２−５、３−１３、３−２３、３−３０、４−５９、５−５１、および１−６９の遺伝子セグメントから選択される。特定の実施形態では、体細胞変異したヒトＶＨドメインは、１−１、１−７、２−８、３−３、３−１０、３−１６、３−２２、５−５、５−１２、６−６、６−１３、および７−２７から選択されるＤＨセグメントに由来する配列を含む。特定の実施形態では、体細胞変異したヒトＶＨドメインは、１、２、３、４、５および６から選択されるＪＨセグメントに由来する配列を含む。特定の実施形態では、体細胞変異したヒトＶＨドメインは、２−５／６−６／１、２−５／３−２２／１、３−１３／６−６／５、３−２３／２−８／４、３−２３／３−３／４、３−２３／３−１０／４、３−２３／６−６／４、３−２３／７−２７／４、３−３０／１−１／４、３−３０／１−７／４、３−３０／３−３／４、３−３０／３−２２／５、３−３０／５−５／２、３−３０／５−１２／４、３−３０／６−６／１、３−３０／６−６／３、３−３０／６−６／４、３−３０／６−６／５、３−３０／６−１３／４、３−３０／７−２７／４、３−３０／７−２７／５、３−３０／７−２７／６、４−５９／３−１６／３、４−５９／３−１６／４、４−５９／３−２２／３、５−５１／５−５／３、１−６９／６−６／５、および１−６９／６−１３／４から選択される再構成されたヒトＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列によってコードされる。
【００３１】
一実施形態では、再構成されたヒトＶＬ領域は、ヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列であり、マウスは、（ｉ）再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列に由来するＶＬドメイン、および（ｉｉ）マウスＣＬを含むリバースキメラ軽鎖を発現し、ここで、軽鎖は（ｉ）マウスＣＨならびに（ｉｉ）１−２、１−８、１−２４、１−６９、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、３−５３、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１、６−１ヒトＶＨ遺伝子セグメントおよびその組合せから選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異ヒトＶＨを含むリバースキメラ重鎖と会合している。一実施形態では、マウスは、体細胞変異した軽鎖を発現する。一実施形態では、ＣＬはマウスＣκである。特定の実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、３−３０、３−３３、３−５３、４−３９、および５−５１遺伝子セグメントから選択される。特定の実施形態では、体細胞変異したヒトＶＨドメインは、  １−１、１−７、１−２６、２−１５、３−３、３−１６、および６−１３から選択されるＤＨセグメントに由来する配列を含む。特定の実施形態では、体細胞変異したヒトＶＨドメインは、３、４、５および６から選択されるＪＨセグメントに由来する配列を含む。特定の実施形態では、体細胞変異したヒトＶＨドメインは、３−３０／１−１／４、３−３０／３−３／３、３−３３／１−７／４、３−３３／２−１５／４、４−３９／１−２６／３、５−５１／３−１６／６、５−５１／６−１３／５、および３−５３／１−１／４から選択される再構成されたヒトＶＨ／ＤＨ／ＪＨ配列によってコードされる。
【００３２】
一実施形態では、マウスは、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列および再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列の両方を含み、マウスは、（ｉ）ヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列に由来するＶＬドメイン、および（ｉｉ）マウスＣＬを含むリバースキメラ軽鎖を発現し、ここで、軽鎖は（ｉ）マウスＣＨならびに（ｉｉ）１−２、１−８、１−２４、１−６９、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、３−５３、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１、６−１のヒトＶＨ遺伝子セグメントおよびその組合せから選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異ヒトＶＨを含むリバースキメラ重鎖と会合している。一実施形態では、マウスは、体細胞変異した軽鎖を発現する。一実施形態では、ＣＬはマウスＣκである。
【００３３】
一実施形態では、内因性の再構成されていないマウスＶＨ遺伝子セグメントの９０〜１００％は、少なくとも１つの再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換される。具体的な実施形態では、内因性の再構成されていないマウスＶＨ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全ては、少なくとも１つの再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換される。一実施形態では、置換は、少なくとも１８個、少なくとも３９個、少なくとも８０個または８１個の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによる。一実施形態では、置換は、少なくとも１２個の機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２５個の機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントまたは少なくとも４３個の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによる。
【００３４】
一実施形態では、遺伝子改変マウスはＣ５７ＢＬ系統であり、具体的な実施形態では、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択される。具体的な実施形態では、遺伝子改変マウスは、前記の１２９系統および前記のＣ５７ＢＬ／６系統の混合体である。別の具体的な実施形態では、マウスは、前記の１２９系統の混合体または前記のＢＬ／６系統の混合体である。具体的な実施形態では、混合体の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。
【００３５】
一実施形態では、マウスはマウスＣκおよび再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列に由来する体細胞変異ヒトＶＬドメインを含む軽鎖ならびにマウスＣＨおよび１−２、１−８、１−２４、１−６９、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、３−５３、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１および６−１のヒトＶＨ遺伝子セグメントから選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異ヒトＶＨドメインを含む重鎖を含むリバースキメラ抗体を発現し、マウスは完全マウス抗体を発現せず、完全ヒト抗体を発現しない。一実施形態では、マウスは、内因性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントの、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列での置換を含み、且つ全てまたは実質的に全ての内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの、ヒトＶＨ遺伝子セグメントの完全または実質的に完全なレパートリーでの置換を含むκ軽鎖遺伝子座を含む。
【００３６】
一態様では、本明細書中に記載されるマウスに由来する抗原特異的抗体の集団が提供され、ここで、抗体は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成またはヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導された軽鎖遺伝子を含み、ここで、抗体は、１−２、１−３、１−８、１−１８、１−２４、１−４６、１−５８、１−６９、２−５、２−２６、２−７０、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−１６、３−２０、３−２１、３−２３、３−３０、３−３３、３−４３、３−４８、３−５３、３−６４、３−７２、３−７３、４−３１、４−３４、４−３９、４−５９、５−５１、および６−１のヒトＶＨ遺伝子セグメントより選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントの再構成により誘導された再構成された免疫グロブリン重鎖遺伝子を含む。一実施形態では、１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、１、２、３、４、５、および６より選択されるヒト重鎖ＪＨ遺伝子セグメントを伴って再構成される。具体的な実施形態では、軽鎖は、１、２、３、４、もしくは５、またはそれより多くの体細胞超変異を有する。
【００３７】
一実施形態では、軽鎖は、１、２、３、または４の体細胞超変異を有する。一実施形態では、軽鎖遺伝子は、１または２の変異を有する。様々な実施形態では、軽鎖遺伝子は、その配列に沿って多数の変異が起こり得る。
【００３８】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成により誘導され、軽鎖は、少なくとも１つまたは４つ以下の体細胞超変異を有する。一実施形態では、軽鎖は、少なくとも２つの体細胞超変異を含む。一実施形態では、軽鎖は、少なくとも３つの体細胞超変異を含む。一実施形態では、軽鎖は、少なくとも４つの体細胞超変異を含む。具体的な実施形態では、変異は、軽鎖の１つ以上のフレームワーク領域（ＦＷ）中に存在する。具体的な実施形態では、変異は、軽鎖の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）の中に存在する。具体的な実施形態では、変異は、軽鎖の１つ以上のＦＷおよび／または１つ以上のＣＤＲの中に存在する。様々な実施形態では、フレームワーク領域は、フレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）、および／またはこれらの組み合わせより選択される。様々な実施形態では、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、および／またはこれらの組み合わせより選択される。
【００３９】
一実施形態では、重鎖は、１つ以上のＦＷまたは１つ以上のＣＤＲの中に少なくとも１つの変異を含む。一実施形態では、重鎖は、１つ以上のＦＷおよび１つ以上のＣＤＲの中に少なくとも１つの変異を含む。一実施形態では、重鎖は、１つ以上のＦＷおよび１つ以上のＣＤＲの中に少なくとも２つの変異を含む。一実施形態では、重鎖は、１つ以上のＦＷおよび１つ以上のＣＤＲの中に少なくとも３つの変異を含む。一実施形態では、重鎖は、１つ以上のＦＷおよび１つ以上のＣＤＲの中に少なくとも４つの変異を含む。一実施形態では、重鎖は、１つ以上のＦＷおよび１つ以上のＣＤＲの中に少なくとも５つまたは５つより多くの変異を含む。具体的な実施形態では、重鎖は、２つのＦＷの中に少なくとも５つまたは５つより多くの変異を含む。具体的な実施形態では、重鎖は、１つのＦＷおよび１つのＣＤＲの中に少なくとも５つまたは５より多くの変異を含む。
【００４０】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成により誘導され、Ｖκ１−３９／Ｊκ５によって誘導された軽鎖の約９％が、ＦＷ１の中に存在する少なくとも１つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも９％が、ＦＷ１の中に存在する１つの変異を含む。一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成により誘導され、Ｖκ１−３９／Ｊκ５によって誘導された軽鎖の約２５％が、ＣＤＲ１の中に存在する少なくとも１つまたは２つ以下の変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも１９％が、ＣＤＲ１の中に存在する１つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも５％が、ＣＤＲ１の中に存在する２つの変異を有する。
【００４１】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成により誘導され、Ｖκ１−３９／Ｊκ５によって誘導された軽鎖の約２０％は、ＦＷ２の中に存在する少なくとも１つまたは３つ以下の変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも１７％は、ＦＷ２の中に存在する１つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも１％は、ＦＷ２の中に存在する２つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも１％は、ＦＷ２の中に存在する３つの変異を有する。
【００４２】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成により誘導され、Ｖκ１−３９／Ｊκ５によって誘導された軽鎖の約１０％は、ＣＤＲ２の中に存在する少なくとも１つまたは２つ以下の変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも１０％は、ＣＤＲ２の中に存在する１つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも１％は、ＣＤＲ２の中に存在する２つの変異を有する。
【００４３】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成により誘導され、Ｖκ１−３９／Ｊκ５によって誘導された軽鎖の約２９％は、ＦＷ３の中に存在する少なくとも１つまたは４つ以下の変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも２１％は、ＦＷ３の中に存在する１つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも５％は、ＦＷ３の中に存在する２つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも２％は、ＦＷ３の中に存在する３つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも２％は、ＦＷ３の中に存在する４つの変異を有する。
【００４４】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成により誘導され、Ｖκ１−３９／Ｊκ５によって誘導された軽鎖の約３７％は、ＣＤＲ３の中に存在する少なくとも１つまたは４つ以下の変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも２７％は、ＣＤＲ３の中に存在する１つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも８％は、ＣＤＲ３の中に存在する２つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも１％は、ＣＤＲ３の中に存在する３つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも１％は、ＣＤＲ３の中に存在する４つの変異を有する。
【００４５】
一実施形態では、本明細書中に記載されるマウスに由来する抗原特異的抗体の集団が提供され、ここで、抗体は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成により誘導された軽鎖を含み、上記Ｖκ１−３９／Ｊκ５によって誘導された軽鎖の約９％は、ＦＷ１の中に存在する１つ以上の変異を有し、上記Ｖκ１−３９／Ｊκ５によって誘導された軽鎖の約２５％は、ＣＤＲ１の中に存在する１つ以上の変異を有し、上記Ｖκ１−３９／Ｊκ５によって誘導された軽鎖の約２０％は、ＦＷ２の中に存在する１つ以上の変異を有し、上記Ｖκ１−３９／Ｊκ５によって誘導された軽鎖の約１０％は、ＣＤＲ２の中に存在する１つ以上の変異を有し、上記Ｖκ１−３９／Ｊκ５によって誘導された軽鎖の約２９％は、ＦＷ３の中に存在する１つ以上の変異を有し、上記Ｖκ１−３９／Ｊκ５によって誘導された軽鎖の約３７％は、ＣＤＲ３の中に存在する１つ以上の変異を有する。
【００４６】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成により誘導され、重鎖の約３５％は、ＦＷ１の中に存在する少なくとも１つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも２５％は、ＦＷ１の中に存在する１つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも９％は、ＦＷ１の中に存在する２つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも１％は、ＦＷ１の中に存在する３つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも１％は、ＦＷ１の中に存在する５つより多くの変異を有する。
【００４７】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成により誘導され、重鎖の約９２％は、ＣＤＲ１の中に存在する少なくとも１つまたは４つ以下の変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも９２％は、ＣＤＲ１の中に存在する少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも２６％は、ＣＤＲ１の中に存在する１つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも４４％は、ＣＤＲ１の中に存在する２つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも１９％は、ＣＤＲ１の中に存在する３つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも３％は、ＣＤＲ１の中に存在する４つの変異を有する。
【００４８】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成により誘導され、重鎖の約６６％は、ＦＷ２の中に存在する少なくとも１つまたは３つ以下の変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも６６％は、ＦＷ２の中に存在する少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも３５％は、ＦＷ２の中に存在する１つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも２３％は、ＦＷ２の中に存在する２つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも８％は、ＦＷ２の中に存在する３つの変異を有する。
【００４９】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成により誘導され、重鎖の約７０％は、ＣＤＲ２の中に存在する少なくとも１つまたは４つ以下の変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも７０％は、ＣＤＲ２の中に存在する少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの変異を有する。一実施形態では、少なくとも３４％は、ＣＤＲ２の中に存在する１つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも２０％は、ＣＤＲ２の中に存在する２つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも１２％は、ＣＤＲ２の中に存在する３つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも５％は、ＣＤＲ２の中に存在する４つの変異を有する。
【００５０】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成により誘導され、重鎖の約９１％は、ＦＷ３の中に存在する少なくとも１つまたは５つまでもしくはそれより多くまでの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも９１％は、ＦＷ３の中に存在する少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つもしくはそれより多くの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも１９％は、ＦＷ３の中に存在する１つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも３３％は、ＦＷ３の中に存在する２つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも２２％は、ＦＷ３の中に存在する３つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも１１％は、ＦＷ３の中に存在する４つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも７％は、ＦＷ３中に存在する５つまたはそれより多くの変異を有する。
【００５１】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成により誘導され、重鎖の約６３％は、ＣＤＲ３の中に存在する少なくとも１つまたは２つ以下の変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも６３％は、ＣＤＲ３の中に存在する１つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも５４％は、ＣＤＲ３の中に存在する１つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも９％は、ＣＤＲ３の中に存在する２つの変異を有する。
【００５２】
一実施形態では、本明細書中に記載されるマウスに由来する抗原特異的抗体の集団が提供され、ここで、上記抗体は、ヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成により誘導された軽鎖を含み、重鎖の少なくとも３５％は、ＦＷ１の中に存在する１つ以上の変異を有し、重鎖の約９２％は、ＣＤＲ１の中に存在する１つ以上の変異を有し、重鎖の約６６％は、ＦＷ２の中に存在する１つ以上の変異を有し、重鎖の約７０％は、ＣＤＲ２の中に存在する１つ以上の変異を有し、重鎖の約９１％は、ＦＷ３の中に存在する１つ以上の変異を有し、そして重鎖の約６３％は、ＣＤＲ３の中に存在する１つ以上の変異を有する。
【００５３】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導され、軽鎖遺伝子は、少なくとも１つまたは２つ以下の体細胞超変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖遺伝子は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、またはそれより多くの体細胞超変異を有する。具体的な実施形態では、変異は、軽鎖の１つ以上のフレームワーク領域の中に存在する。具体的な実施形態では、変異は、軽鎖の１つ以上のＣＤＲ領域の中に存在する。具体的な実施形態では、変異は、軽鎖の１つ以上のフレームワーク領域および／または１つ以上のＣＤＲ領域の中に存在する。様々な実施形態では、フレームワーク領域は、フレームワーク１（ＦＷ１）、フレームワーク２（ＦＷ２）、フレームワーク３（ＦＷ３）、および／またはこれらの組み合わせより選択される。
【００５４】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導され、Ｖκ３−２０／Ｊκ１によって誘導された軽鎖の約１０％は、ＦＷ１の中に存在する少なくとも１つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも１０％は、ＦＷ１の中に１つの変異を有する。
【００５５】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導され、Ｖκ３−２０／Ｊκ１によって誘導された軽鎖の約５３％は、ＣＤＲ１の中に存在する少なくとも１つまたは２つ以下の変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも２７％は、ＣＤＲ１の中に１つ以上の変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の約５４％は、ＣＤＲ１の中に存在する１つまたは２つの変異を有する。
【００５６】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導され、Ｖκ３−２０／Ｊκ１によって誘導された軽鎖の約６％は、ＦＷ２の中に存在する少なくとも１つまたは２つ以下の変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも６％は、ＦＷ２の中に存在する少なくとも１つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも３％は、ＦＷ２の中に存在する１つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも３％は、ＦＷ２の中に存在する２つの変異を有する。
【００５７】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導され、Ｖκ３−２０／Ｊκ１によって誘導された軽鎖の少なくとも約３％は、ＣＤＲ２の中に存在する少なくとも１つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも３％はＣＤＲ２の中に１つの変異を有する。
【００５８】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導され、Ｖκ３−２０／Ｊκ１によって誘導された軽鎖の約１７％またはそれより多くは、ＦＷ３の中に存在する少なくとも１つまたは２つ以下の変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも２０％は、ＦＷ３の中に存在する１つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも１７％は、ＦＷ３の中に存在する２つの変異を有する。
【００５９】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導され、Ｖκ３−２０／Ｊκ１によって誘導された軽鎖の少なくとも４３％は、ＣＤＲ３の中に存在する少なくとも１つの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも４３％は、ＣＤＲ３の中に１つの変異を有する。
【００６０】
一実施形態では、本明細書中に記載されるマウスに由来する抗原特異的抗体の集団が提供され、ここで、抗体は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導された軽鎖を含み、Ｖκ３−２０／Ｊκ１によって誘導された軽鎖の約１０％は、少なくとも、存在する１つ以上の変異を有し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１によって誘導された上記軽鎖の約５３％は、ＣＤＲ１の中に存在する１つ以上の変異を有し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１によって誘導された上記軽鎖の約６％は、ＦＷ２の中に存在する１つ以上の変異を有し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１によって誘導された上記軽鎖の約３％は、ＣＤＲ２の中に存在する１つ以上の変異を有し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１によって誘導された軽鎖の約３７％は、ＦＷ３の中に存在する１つ以上の変異を有し、Ｖκ３−２０／Ｊκ１によって誘導された軽鎖の約４３％は、ＣＤＲ３の中に存在する１つ以上の変異を有する。
【００６１】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導され、重鎖の約４３％は、ＦＷ１の中に存在する少なくとも１つまたは２つ以下の変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも４１％は、ＦＷ１の中に存在する少なくとも１つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の約４１％は、ＦＷ１の中に存在する１つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の約２％は、ＦＷ１の中に存在する２つの変異を有する。
【００６２】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導され、重鎖の約９２％は、ＣＤＲ１の中に存在する少なくとも１つまたは４つ以下の変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも４３％は、ＣＤＲ１の中に存在する少なくとも１つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも２５％は、ＣＤＲ１の中に存在する少なくとも２つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも１５％は、ＣＤＲ１の中に存在する少なくとも３つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも１０％は、ＣＤＲ１の中に存在する４つ以上の変異を有する。
【００６３】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導され、重鎖の約４６％は、ＦＷ２の中に存在する少なくとも１つまたは３つ以下の変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも３４％は、ＦＷ２の中に存在する少なくとも１つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも１０％は、ＦＷ２の中に存在する２つ以上の変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも２％は、ＦＷ２の中に存在する３つ以上の変異を有する。
【００６４】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導され、重鎖の約８４％は、ＣＤＲ２の中に存在する少なくとも１つまたは５つまで、または５つより多くの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも３９％は、ＣＤＲ２の中に存在する１つ以上の変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも１８％は、ＣＤＲ２の中に存在する２つ以上の変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも２１％は、ＣＤＲ２の中に存在する３つ以上の変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも３％は、ＣＤＲ２の中に存在する４つ以上の変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも２％は、ＣＤＲ２の中に存在する５つ以上の変異を有する。
【００６５】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導され、重鎖の約９２％は、ＦＷ３の中に存在する少なくとも１つまたは５つまで、または５つより多くの変異を有する。一実施形態では、上記軽鎖の少なくとも２１％は、ＦＷ３の中に存在する少なくとも１つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも２０％は、ＦＷ３の中に存在する少なくとも２つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも１３％は、ＦＷ３の中に存在する少なくとも３つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも２０％は、ＦＷ３の中に少なくとも４つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の少なくとも１８％は、ＦＷ３の中に少なくとも５つの変異を有する。
【００６６】
一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導され、重鎖の約７％は、ＣＤＲ３の中に存在する少なくとも１つの変異を有する。一実施形態では、重鎖の約７％は、ＣＤＲ３の中に１つの変異を有する。
【００６７】
一実施形態では、本明細書中に記載されるマウスに由来する抗原特異的抗体の集団が提供され、ここで、抗体は、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成により誘導された軽鎖を含み、重鎖の約４３％は、ＦＷ１の中に存在する１つ以上の変異を有し、重鎖の約９２％は、ＣＤＲ１の中に存在する１つ以上の変異を有し、重鎖の約４６％は、ＦＷ２の中に存在する１つ以上の変異を有し、重鎖の約８４％は、ＣＤＲ２の中に存在する１つ以上の変異を有し、重鎖の約９２％は、ＦＷ３の中に存在する１つ以上の変異を有し、重鎖の約７％は、ＣＤＲ３の中に存在する１つ以上の変異を有する。
【００６８】
一態様では、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列から免疫グロブリン軽鎖を発現するマウスが提供される。ここで、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列は、マウスの生殖細胞系列の中に存在し、ここでは、免疫グロブリン軽鎖はヒト可変配列を含む。一実施形態では、マウスの生殖細胞系列は、再構成された軽鎖配列を含むマウスの全てのＢ細胞中に存在する全ての非サロゲート（ｎｏｎ−ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）軽鎖配列と同じＶセグメントおよび同じＪセグメントに由来する再構成された免疫グロブリン軽鎖配列を含む。
【００６９】
一実施形態では、マウスの生殖細胞系列は、機能性の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｖ遺伝子セグメントを欠く。一実施形態では、マウスの生殖細胞系列は、機能性の再構成されていない免疫グロブリン軽鎖Ｊ遺伝子セグメントを欠く。
【００７０】
一実施形態では、マウスの生殖細胞系列は、１つ以下、２つ以下、または３つ以下の再構成された（Ｖ／Ｊ）軽鎖配列を含む。
【００７１】
一実施形態では、再構成されたＶ／Ｊ配列はκ軽鎖配列を含む。具体的な実施形態では、κ軽鎖配列はヒトκ軽鎖配列である。具体的な実施形態では、κ軽鎖配列は、ヒトＶκ１−３９／Ｊ配列、ヒトＶκ３−２０／Ｊ配列、およびこれらの組み合わせより選択される。具体的な実施形態では、κ軽鎖配列はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５配列である。具体的な実施形態では、κ軽鎖配列はヒトＶκ３−２０／Ｊκ１配列である。
【００７２】
一実施形態では、マウスは、その生殖細胞系列の中に、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列に関して５’にあるマウスκイントロンエンハンサー、マウスκ３’エンハンサー、およびこれらの組み合わせより選択される配列をさらに含む。
【００７３】
一実施形態では、マウスは、再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、および再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントを含み、ここで、上記ＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントは、重鎖定常遺伝子配列に作動可能に連結された免疫グロブリン重鎖可変遺伝子配列を形成するように再構成することができる。一実施形態では、マウスは、複数のヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントを含む。具体的な実施形態では、ヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントが、内因性のマウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座で内因性のマウスＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントにとって代わる。具体的な実施形態では、マウスは、全てまたは実質的に全ての機能性のマウスＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントの、全てまたは実質的に全ての機能性のヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントによる置き換えを含む。
【００７４】
一実施形態では、マウスは、マウス定常配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、ヒト定常配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現する。
【００７５】
一実施形態では、マウスは、ＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、およびこれらの組み合わせより選択されるマウス配列を含む免疫グロブリン重鎖を発現する。
【００７６】
一実施形態では、マウスは、ＣＨ１配列、ヒンジ配列、ＣＨ２配列、ＣＨ３配列、およびこれらの組み合わせより選択されるヒト配列を含む免疫グロブリン重鎖を発現する。
【００７７】
一実施形態では、マウスの生殖細胞系列の中の再構成された免疫グロブリン軽鎖配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座に存在する。具体的な実施形態では、マウスの生殖細胞系列の中の再構成された免疫グロブリン軽鎖配列は、内因性のマウス免疫グロブリン軽鎖遺伝子座で、全てまたは実質的に全てのマウス軽鎖ＶおよびＪ配列にとって代わる。
【００７８】
一態様では、単一のヒトＶセグメントおよび単一のヒトＪセグメントから誘導された再構成された軽鎖遺伝子を含む、非サロゲート軽鎖配列を含む各Ｂ細胞を特徴とするＢ細胞集団を含むマウスが提供され、ここでは、マウスの生殖細胞系列の中の軽鎖可変配列だけが、単一のヒトＶセグメントおよび単一のヒトＪセグメントから誘導された再構成された配列であり、ここでは、再構成された軽鎖遺伝子を含む各Ｂ細胞は、同系のヒト重鎖可変ドメインをコードする遺伝子をさらに含み、ここでは、再構成された軽鎖遺伝子は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの体細胞超変異を含む。
【００７９】
一態様では、本明細書中に記載されるマウスに由来する多能性の、人工多能性の、または全能性の細胞が提供される。具体的な実施形態では、上記細胞は、マウス胚幹（ＥＳ）細胞である。
【００８０】
一態様では、本明細書中に記載されるマウスに由来する組織が提供される。一実施形態では、上記組織は、本明細書中に記載されるマウスの脾臓、リンパ節、または骨髄に由来する。
【００８１】
一態様では、本明細書中に記載されるマウス由来の核が提供される。一実施形態では、核は、Ｂ細胞ではない二倍体細胞由来である。
【００８２】
一態様では、本明細書に記載されるマウスから単離されるマウス細胞が提供される。一実施形態では、細胞はＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞はリンパ球である。一実施形態では、リンパ球はＢ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、ヒト遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含むキメラ重鎖、および再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊ配列、再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊ配列またはその組合せに由来する軽鎖を発現し、ここで、重鎖可変ドメインはマウス定常領域と融合され、軽鎖可変ドメインはマウスまたはヒトの定常領域と融合される。
【００８３】
一態様では、本明細書に記載されるマウスのＢ細胞で作製されるハイブリドーマが提供される。具体的な実施形態では、Ｂ細胞は、目的のエピトープを含む免疫原で免疫された本明細書に記載されるマウスに由来し、Ｂ細胞は、目的のエピトープに結合する結合性タンパク質を発現し、結合性タンパク質は、体細胞変異ヒトＶＨドメインおよびマウスＣＨを有し、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１に由来するヒトＶＬドメインおよびマウスＣＬを有する。
【００８４】
一態様では、本明細書に記載されるマウスに由来するドナーＥＳ細胞を含むマウス胚が提供される。
【００８５】
一態様では、ベクターの５’および３’マウス相同性アームの配列に関して転写方向の５’から３’にかけて、５’マウス相同性アーム、ヒトまたはマウスの免疫グロブリンプロモーター、ヒトまたはマウスのリーダー配列、および再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択されるヒトＶＬ領域、および３’マウス相同性アームを含むターゲティングベクターが提供される。一実施形態では、５’および３’相同性アームはそのベクターを、マウスＣκ遺伝子の５’に存在し、近位であるエンハンサー配列の５’にある配列にターゲティングする。一実施形態では、プロモーターはヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントプロモーターである。具体的な実施形態では、プロモーターはヒトＶκ３−１５プロモーターである。一実施形態では、リーダー配列はマウスのリーダー配列である。具体的な実施形態では、マウスのリーダー配列は、マウスＶκ３−７リーダー配列である。
【００８６】
一態様では、前記の通りであるが、ヒトまたはマウスのプロモーターの５’に、５’マウス相同性アームの代わりに部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ）が隣接し、ヒトＶＬ領域の３’に、３’マウス相同性アームの代わりにＳＲＲＳが隣接する、ターゲティングベクターが提供される。
【００８７】
一態様では、ヒトＶＬおよびマウスＣＬを含む軽鎖ならびにヒトＶＨおよびマウスＣＨを含む重鎖を含む、本明細書に記載されるマウスによって作製されるリバースキメラ抗体が提供される。
【００８８】
一態様では、抗体の作製方法であって、細胞で、（ａ）ヒトＣＨ遺伝子配列と融合される本明細書に記載の免疫マウスの第一のＶＨ遺伝子配列、（ｂ）ヒトＣＬ遺伝子配列と融合される本明細書に記載の免疫マウスのＶＬ遺伝子配列を発現させること、および（ｃ）完全ヒト型抗体を発現させるのに十分な条件の下で単一細胞を維持し、抗体を単離することを含む方法が提供される。一実施形態では、細胞は、ヒトＣＨ遺伝子配列と融合される本明細書に記載の第二の免疫マウスの第二のＶＨ遺伝子配列を含み、第一のＶＨ遺伝子配列は第一のエピトープを認識する第一のＶＨドメインをコードし、第二のＶＨ遺伝子配列は第二のエピトープを認識するＶＨドメインをコードし、ここで、第一のエピトープと第二のエピトープとは同一でない。
【００８９】
一態様では、エピトープ結合性タンパク質の作製方法であって、目的のエピトープを含む免疫原に本明細書に記載のマウスを曝露させること、目的のエピトープに特異的に結合する免疫グロブリン分子をマウスが生成するのに十分な条件の下でマウスを維持すること、および目的のエピトープに特異的に結合する免疫グロブリン分子を単離することを含み、エピトープ結合性タンパク質は、マウスＣＬおよび再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１に由来するヒトＶＬを含む軽鎖に会合している、体細胞変異ヒトＶＨおよびマウスＣＨを含む重鎖を含む方法が提供される。
【００９０】
一態様では、エピトープ結合性タンパク質を発現する細胞であって、（ａ）ヒト免疫グロブリン軽鎖定常ドメインｃＤＮＡ配列（例えば、ヒトκ定常ドメインＤＮＡ配列）と（直接的に、またはリンカーを通して）融合される、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１に由来するヒトＶＬドメインをコードするヒトヌクレオチド配列、および（ｂ）第一のヒトＶＨヌクレオチド配列に由来するヒトＶＨドメインをコードする第一のヒトＶＨヌクレオチド配列であって、ヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインｃＤＮＡ配列と（直接的に、またはリンカーを通して）融合される、第一のヒトＶＨヌクレオチド配列、を含み、エピトープ結合性タンパク質は第一のエピトープを認識する、細胞が提供される。一実施形態では、エピトープ結合性タンパク質は、１０−６Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満または１０−１２Ｍ未満の解離定数で第一のエピトープに結合する。
【００９１】
一実施形態では、細胞は、第二のヒトＶＨドメインをコードする第二のヒトヌクレオチド配列を含み、第二のヒト配列はヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインｃＤＮＡ配列と（直接的に、またはリンカーを通して）融合され、第二のヒトＶＨドメインは第一のエピトープを特異的に認識せず（例えば１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍまたはそれより大きな解離定数を例えば示す）、エピトープ結合性タンパク質は第一のエピトープおよび第二のエピトープを認識し、第一および第二の免疫グロブリン重鎖は（ａ）の同一の軽鎖と各々会合する。
【００９２】
一実施形態では、第二のＶＨドメインは、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満または１０−１２Ｍ未満の解離定数で第二のエピトープに結合する。
【００９３】
一実施形態では、エピトープ結合性タンパク質は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択される再構成されたヒトＶＬ領域に由来する同一の軽鎖と各々会合している第一の免疫グロブリン重鎖および第二の免疫グロブリン重鎖を含み、第一の免疫グロブリン重鎖はナノモル濃度からピコモル濃度の範囲の解離定数で第一のエピトープに結合し、第二の免疫グロブリン重鎖はナノモル濃度からピコモル濃度の範囲の解離定数で第二のエピトープに結合し、第一のエピトープおよび第二のエピトープは同一でなく、第一の免疫グロブリン重鎖は第二のエピトープに結合しないか、マイクロモル濃度の範囲より弱い（例えば、ミリモル濃度の範囲）解離定数で第二のエピトープに結合し、第二の免疫グロブリン重鎖は第一のエピトープに結合しないか、マイクロモル濃度の範囲より弱い（例えば、ミリモルの範囲）解離定数で第一のエピトープに結合し、ＶＬ、第一の免疫グロブリン重鎖のＶＨおよび第二の免疫グロブリン重鎖のＶＨのうちの１つまたは複数は、体細胞変異している。
【００９４】
一実施形態では、第一の免疫グロブリン重鎖はプロテインＡ結合性残基を含み、第二の免疫グロブリン重鎖はプロテインＡ結合性残基を欠く。
【００９５】
一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６ＴＭ細胞）から選択される。
【００９６】
一態様では、ヒトＶＨおよびマウス重鎖定常ドメイン、ヒトＶＬおよびマウス軽鎖定常ドメインを含むリバースキメラ抗体が提供され、ここで、抗体は、本明細書に記載されるマウスをエピトープを含む免疫原で免疫することを含むプロセスによって作製され、抗体は、マウスを免疫した免疫原のエピトープに特異的に結合する。一実施形態では、ＶＬドメインは、体細胞変異している。一実施形態では、ＶＨドメインは、体細胞変異している。一実施形態では、ＶＬドメインおよびＶＨドメインの両方は、体細胞変異している。一実施形態では、ＶＬはマウスＣκドメインに連結されている。
【００９７】
一態様では、内因性マウス重鎖遺伝子座の全てまたは実質的に全てのマウスＶＨ遺伝子セグメントと置き換わったヒトＶＨ遺伝子セグメント、全てのマウス軽鎖遺伝子セグメントと置き換わった再構成されたＶκ１−３９／Ｊおよび再構成されたＶκ３−２０／Ｊまたはその組合せから選択される１つまたは２つ以下の再構成されたヒト軽鎖ＶＬ／ＪＬ配列を含むマウスが提供され、ヒト重鎖可変遺伝子セグメントはマウス定常遺伝子と連結され、再構成されたヒト軽鎖配列はヒトまたはマウスの定常遺伝子と連結される。
【００９８】
一態様では、ヒト重鎖可変遺伝子セグメントによる全てまたは実質的に全てのマウス重鎖可変遺伝子セグメントの置換、および１つまたは２つ以下の再構成されたヒト軽鎖ＶＬ／ＪＬ配列を含むマウスＥＳ細胞が提供され、ここで、ヒト重鎖可変遺伝子セグメントはマウス免疫グロブリン重鎖定常遺伝子と連結され、再構成されたヒト軽鎖ＶＬ／ＪＬ配列はマウスまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常遺伝子と連結される。具体的な実施形態では、軽鎖定常遺伝子は、マウスの定常遺伝子である。
【００９９】
一態様では、本明細書に記載されるマウスによって作製される抗原結合性タンパク質が提供される。具体的な実施形態では、抗原結合性タンパク質は、マウス定常領域と融合されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来するヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、軽鎖定常領域はマウスの定常領域である。
【０１００】
一態様では、本明細書に記載されるマウスからの免疫グロブリン可変領域遺伝子配列から作製される完全ヒト型抗原結合性タンパク質が提供され、ここで、抗原結合性タンパク質は、本明細書に記載されるマウスの配列に由来するヒト可変領域を含む完全ヒト型重鎖、およびＶκ１−３９またはＶκ３−２０を含む完全ヒト型軽鎖を含む。一実施形態では、軽鎖可変領域は１から５個の体細胞変異を含む。一実施形態では、軽鎖可変領域は、マウスのＢ細胞で重鎖可変領域と対になる同系の軽鎖可変領域である。
【０１０１】
一実施形態では、完全ヒト型抗原結合性タンパク質は、第一の重鎖および第二の重鎖を含み、第一の重鎖および第二の重鎖は、本明細書に記載されるマウスに独立して由来する同一でない可変領域を含み、第一および第二の重鎖の各々は、Ｖκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来するヒト軽鎖と関連する宿主細胞から発現する。一実施形態では、第一の重鎖は第一の抗原の第一のエピトープに特異的に結合する第一の重鎖可変領域を含み、第二の重鎖は第二の抗原の第二のエピトープに特異的に結合する第二の重鎖可変領域を含む。具体的な実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は異なる。具体的な実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は同じであり、第一のエピトープおよび第二のエピトープは同一でない。具体的な実施形態では、結合性タンパク質の第一の分子による第一のエピトープの結合は、結合性タンパク質の第二の分子による第二のエピトープの結合をブロックしない。
【０１０２】
一態様では、本明細書に記載されるマウスのヒト免疫グロブリン配列に由来する完全ヒト型結合性タンパク質は、第一の免疫グロブリン重鎖および第二の免疫グロブリン重鎖を含み、第一の免疫グロブリン重鎖は、第二の免疫グロブリン重鎖の可変領域と同一ではない第一の可変領域を含み、第一の免疫グロブリン重鎖は、野生型プロテインＡ結合性決定基を含み、第二の重鎖は、野生型プロテインＡ結合性決定基を欠く。一実施形態では、第一の免疫グロブリン重鎖は単離条件の下でプロテインＡに結合し、第二の免疫グロブリン重鎖はプロテインＡに結合しないか、第一の免疫グロブリン重鎖が単離条件の下でプロテインＡに結合するよりも少なくとも１０倍、１００倍または１０００倍弱くプロテインＡに結合する。具体的な実施形態では、第一および第二の重鎖はＩｇＧ１アイソタイプであり、第二の重鎖は９５Ｒ（ＥＵ  ４３５Ｒ）、９６Ｆ（ＥＵ  ４３６Ｆ）およびその組合せから選択される改変を含み、第一の重鎖はそのような改変を欠く。
【０１０３】
一態様では、二重特異性抗原結合性タンパク質の作製方法であって、本明細書に記載される第一のマウスを、第一のエピトープを含む目的の第一の抗原に曝露させること、本明細書に記載される第二のマウスを、第二のエピトープを含む目的の第二の抗原に曝露させること、第一および第二のマウスに目的の抗原への免疫応答を各々惹起させること、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一のヒト重鎖可変領域を第一のマウスで同定すること、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二のヒト重鎖可変領域を第二のマウスで同定すること、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一の重鎖をコードする第一の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製すること、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二の重鎖をコードする第二の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製すること、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する単一の完全ヒト型軽鎖を発現する細胞で第一の重鎖および第二の重鎖を発現させて二重特異性抗原結合性タンパク質を形成すること、ならびに二重特異性抗原結合性タンパク質を単離することを含む方法が提供される。
【０１０４】
一実施形態では、第一の抗原と第二の抗原とは同一でない。
【０１０５】
一実施形態では、第一の抗原と第二の抗原とは同じであり、第一のエピトープと第二のエピトープとは同一でない。一実施形態では、第一のエピトープへの第一の重鎖可変領域の結合は、第二のエピトープへの第二の重鎖可変領域の結合をブロックしない。
【０１０６】
一実施形態では、ヒト軽鎖は、第一の重鎖と対を形成すると、第一の抗原の第一のエピトープに特異的に結合し、第二の重鎖と対を形成すると、第二の抗原の第二のエピトープに特異的に結合する。
【０１０７】
一実施形態では、第一の抗原は可溶性抗原および細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）から選択され、第二の抗原は細胞表面受容体を含む。具体的な実施形態では、細胞表面受容体は免疫グロブリン受容体である。具体的な実施形態では、免疫グロブリン受容体はＦｃ受容体である。一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は同じ細胞表面受容体であり、第一のエピトープへの第一の重鎖の結合は第二のエピトープへの第二の重鎖の結合をブロックしない。
【０１０８】
一実施形態では、軽鎖の軽鎖可変ドメインは、２から５個の体細胞変異を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、第一または第二の重鎖可変ドメインを有する第一または第二の免疫マウスのＢ細胞で発現される体細胞変異同系軽鎖である。一実施形態では、細胞の軽鎖は生殖細胞系列配列を含む。
【０１０９】
一実施形態では、第一の完全ヒト型重鎖は、プロテインＡへのその親和性を低減するアミノ酸改変を有し、第二の完全ヒト型重鎖はプロテインＡへのその親和性を低減する改変を含まない。
【０１１０】
一態様では、第一および第二の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体を調製する方法が提供される。ここで、上記方法は、（ａ）第一の抗原に特異的な第一のヒト重鎖可変（ＶＨ）ドメインをコードする第一の核酸配列を同定する工程；（ｂ）第二の抗原に特異的な第二のヒト重鎖可変（ＶＨ）ドメインをコードする第二の核酸配列を同定する工程；（ｃ）（ａ）のＶＨ領域と対を形成すると第一の抗原に特異的に結合し、（ｂ）のＶＨ領域と対を形成すると第二の抗原に特異的に結合するヒト軽鎖可変（ＶＬ）領域をコードする第三の核酸配列を提供する工程；（ｄ）第一、第二、および第三の核酸配列を含有している宿主細胞を、第一および第二のヒトＶＨ領域とヒトＶＬ領域の発現を可能にするように培養して、二重特異性抗体を形成させる工程；ならびに、（ｄ）上記二重特異性抗体を回収する工程を含む。様々な態様では、上記第一および第二の抗原が互いに異なる。様々な態様では、上記第一および第二の核酸配列は、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列からヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現する免疫されたマウスから単離され、ここで、上記再構成された免疫グロブリン配列はマウスの生殖細胞系列の中に存在する。
【０１１１】
一実施形態では、ヒトＶＬ領域は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含有する再構成されたヒト軽鎖配列に由来する。具体的な実施形態では、上記再構成されたヒト軽鎖配列は生殖細胞系列配列である（すなわち、Ｖ遺伝子セグメント配列の中に体細胞超変異を含まない）。
【０１１２】
一実施形態では、第三の核酸配列は、マウスの生殖細胞系列の中の再構成された免疫グロブリン軽鎖配列からヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現するマウスから単離される。一実施形態では、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列は、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む。具体的な実施形態では、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列はヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントを含む。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンＶＬ領域は、改変された内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から発現される。
【０１１３】
一実施形態では、第一および第二の抗原は１つの分子上に存在する。一実施形態では、第一および第二の抗原は異なる分子上に存在する。様々な実施形態では、第一または第二の核酸配列は、コードされる重鎖の、プロテインＡに対する親和性を低下させる改変を含む。
【０１１４】
一実施形態では、第一または第二の核酸配列は、以下より選択されるヒト重鎖遺伝子セグメントを含む再構成されたヒト重鎖可変領域配列を含む：ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１、およびＶＨ６−１。具体的な実施形態では、重鎖遺伝子セグメントは、ＶＨ２−５、ＶＨ３−２３、またはＶＨ３−３０である。
【０１１５】
一態様では、第一および第二の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体を調製する方法が提供される。ここで、上記方法は、（ａ）第一の抗原に特異的な第一のヒト重鎖可変（ＶＨ）ドメインをコードする第一の核酸配列を同定する工程；（ｂ）第二の抗原に特異的な第二のヒト重鎖可変（ＶＨ）ドメインをコードする第二の核酸配列を同定する工程；（ｃ）（ａ）のＶＨ領域と対を形成すると第一の抗原に特異的に結合し、（ｂ）のＶＨ領域と対を形成すると第二の抗原に特異的に結合する、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント由来のヒト軽鎖可変（ＶＬ）領域をコードする第三の核酸配列を提供する工程；（ｄ）第一、第二、および第三の核酸配列を含有している宿主細胞を、第一および第二のヒトＶＨ領域とヒトＶＬ領域の発現を可能にするように培養して、二重特異性抗体を形成させる工程；ならびに、（ｄ）上記二重特異性抗体を回収する工程を含む。様々な態様では、第一および第二の抗原は互いに異なる。様々な態様では、第一および第二の核酸配列は、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する再構成された免疫グロブリン配列からヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現する免疫されたマウスから単離され、ここで、再構成されたヒトＶκ１−３９またはＶκ３−３０遺伝子セグメントは、マウスの生殖細胞系列の中に存在する。
【０１１６】
一実施形態では、第三の核酸配列は生殖細胞系列配列である（すなわち、Ｖ遺伝子セグメント配列の中に体細胞超変異を含まない）。一実施形態では、第三の核酸配列は、マウスの生殖細胞系列の中の再構成された免疫グロブリン軽鎖配列により、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来するヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現するマウスから単離される。具体的な実施形態では、第三の核酸配列は、相補性決定領域（ＣＤＲ）および／またはフレームワーク領域（ＦＷＲ）の中に、２つから５つの体細胞超変異を含む。一実施形態では、ヒト免疫グロブリンＶＬ領域は、改変された内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から発現される。
【０１１７】
一実施形態では、第一および第二の抗原は１つの分子上に存在する。一実施形態では、第一および第二の抗原は異なる分子上に存在する。一実施形態では、第一または第二の核酸配列は、コードされる重鎖の、プロテインＡに対する親和性を低下させる改変を含む。
【０１１８】
一実施形態では、第一または第二の核酸配列は、以下より選択されるヒト重鎖遺伝子セグメントを含む再構成されたヒト重鎖可変領域配列を含む：ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１、およびＶＨ６−１。具体的な実施形態では、重鎖遺伝子セグメントは、ＶＨ２−５、ＶＨ３−２３、またはＶＨ３−３０である。
【０１１９】
一態様では、二重特異性抗体を作製するための方法が提供され、上記方法は、本明細書中に記載されるマウスを目的の抗原に対して暴露する工程、マウスが目的の抗原に対する免疫応答を惹起できるようにする工程、目的の抗原の第一のエピトープに結合する第一のヒト重鎖可変領域を同定する工程、目的の抗原の第二のエピトープに結合する第二のヒト重鎖可変領域を同定する工程、目的の抗原の第一のエピトープに結合する第一の重鎖をコードする第一の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、目的の抗原の第二のエピトープに結合する第二の重鎖をコードする第二の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント由来の単一の完全ヒト型軽鎖を発現する細胞の中で第一の重鎖および第二の重鎖を発現させて、二重特異性抗体を形成させる工程、ならびに、二重特異性抗原結合タンパク質を単離する工程を含む。
【０１２０】
一実施形態では、第一のエピトープと第二のエピトープは同一ではない。一実施形態では、第一の重鎖可変領域の第一のエピトープに対する結合は、第二の重鎖可変領域の第二のエピトープに対する結合をブロックしない。一実施形態では、第一および第二の重鎖は、第一および第二のエピトープに同時に結合することができる。
【０１２１】
一実施形態では、二重特異性抗体は、第一および第二のエピトープに同時に結合する。一実施形態では、二重特異性抗体は、第一のエピトープおよび第二のエピトープに独立して結合する。
【０１２２】
一実施形態では、二重特異性抗体の抗原に対する結合応答は、第一の重鎖可変領域の上記抗原に対する結合応答よりも約２倍高い。一実施形態では、二重特異性抗体の抗原に対する結合応答は、第二の重鎖可変領域の上記抗原に対する結合応答よりも約２倍高い。一実施形態では、二重特異性抗体の抗原に対する結合応答は、第一の重鎖可変領域および／または第二の重鎖可変領域の上記抗原に対する結合応答とほぼ同じであるか、またはほぼ等しい。
【０１２３】
一実施形態では、抗原は、可溶性抗原、細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）、および細胞表面受容体より選択される。具体的な実施形態では、細胞表面受容体は、免疫グロブリン受容体である。具体的な実施形態では、免疫グロブリン受容体はＦｃ受容体である。
【０１２４】
一実施形態では、軽鎖の軽鎖可変ドメインは、２つから５つの体細胞変異を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、第一または第二の重鎖可変ドメインのいずれかを持つ、免疫されたマウスのＢ細胞の中で発現される体細胞変異した同系の軽鎖である。
【０１２５】
一実施形態では、第一の完全ヒト型重鎖は、プロテインＡに対するその親和性を低下させるアミノ酸の改変を保有し、そして第二の完全ヒト型重鎖は、プロテインＡに対するその親和性を低下させる改変を含まない。
【０１２６】
様々な実施形態では、二重特異性抗体を作製するための方法は、二重特異性抗体の各重鎖可変領域と対を形成するために共通軽鎖を用いることにより増強される。様々な実施形態では、本明細書中に記載される共通軽鎖を用いることにより、もとの同系の軽鎖を用いことと比較して、二重特異性を欠く免疫グロブリンの不適切な種の数が減少する。様々な実施形態では、二重特異性抗体の重鎖可変領域は、共通軽鎖を含有する単一特異性抗体から同定される。様々な実施形態では、二重特異性抗体の重鎖可変領域は、ヒト重鎖と同系の、限定されたヒト軽鎖レパートリーまたは単一のヒト軽鎖を、目的の抗原への暴露に応答して発現し、１つの、または２つの可能性があるヒト軽鎖可変領域のうちの一方と同系である複数のヒト重鎖可変領域を含有しているキメラ抗体レパートリーを生じるようにあらかじめ操作されているマウスＢ細胞の中でｉｎ  ｖｉｖｏで再構成されるヒト重鎖可変遺伝子セグメントを含み、ここで、上記キメラ抗体は目的の抗原に特異的である。
【０１２７】
様々な態様では、二重特異性抗体を調製する方法が提供され、二重特異性抗体は、１）第一のポリペプチドおよび第二のポリペプチド（ここでは、第一および第二のポリペプチドはそれぞれ、多量体化ドメイン（例えば、免疫グロブリンＦｃドメイン）を含み、第一と第二のポリペプチドが二量体を形成することを可能にし、多量体化ドメインは、第一のポリペプチドと第二のポリペプチドとの間での安定な相互作用を促進し、ここでは、多量体化ドメインのうちの１つは、プロテインＡに対するその親和性を低下させるアミノ酸の改変を保有し、他の多量体化ドメインは改変を持たない）、２）第一および第二のポリペプチドのそれぞれの中に結合ドメイン（各結合ドメインは、可変重鎖および可変軽鎖を含み、ここで、第一のポリペプチドの可変軽鎖と第二のポリペプチドの可変軽鎖は共通するアミノ酸配列を有し、共通する配列は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、そして最も好ましくは１００％の配列同一性の、ポリペプチドのそれぞれのもとの軽鎖に対するアミノ酸配列同一性を有する）を含む。様々な実施形態では、可変軽鎖は、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する。様々な実施形態では、可変軽鎖は、再構成されたヒト軽鎖配列である。様々な実施形態では、可変軽鎖は、本明細書中に記載されるマウスから単離される。
【０１２８】
様々な実施形態では、上記方法は、（ｉ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、および共通軽鎖をコードする核酸を含有している宿主細胞を培養する工程であって、ここで、核酸が発現される工程；ならびに、（ｉｉ）宿主細胞培養物から二重特異性抗体を回収する工程を含む。一実施形態では、第一のポリペプチドをコードする核酸または第二のポリペプチドをコードする核酸は、プロテインＡに対するその親和性を低下させるアミノ酸の改変を保有する。一実施形態では、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、および共通軽鎖をコードする核酸は、単一のベクターまたは別々のベクターの中に存在する。一実施形態では、宿主細胞は、先の段落にしたがって二重特異性抗体を作製するために使用される。
【０１２９】
一態様では、（ａ）本明細書中に記載されるマウスから単離された第一のヒト重鎖可変領域をコードする第一の核酸を選択する工程；（ｂ）本明細書中に記載される同じマウスまたは別のマウスから単離された第二のヒト重鎖可変領域をコードする第二の核酸を選択する工程；（ｃ）本明細書中に記載されるマウスから単離された、または本明細書中に記載される再構成されたヒト軽鎖可変領域に由来する、ヒト軽鎖可変領域をコードする第三の核酸を提供する工程；（ｃ）第一、第二、および第三の核酸を宿主細胞に導入し、第一、第二、および第三の核酸の発現が生じるように宿主細胞を培養する工程；ならびに、（ｄ）細胞培養物から、形成された二重特異性抗体を回収する工程を含む、二重特異性抗体を調製する方法が提供される。
【０１３０】
一実施形態では、第一および第二のヒト重鎖可変領域が体細胞変異させられる。具体的な実施形態では、第一および第二のヒト重鎖可変領域は、独立して、以下より選択される再構成されたヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する：１−２、１−３、１−８、１−１８、１−２４、１−４６、１−５８、１−６９、２−５、２−２６、２−７０、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−１６、３−２０、３−２１、３−２３、３−３０、３−３３、３−４３、３−４８、３−５３、３−６４、３−７２、３−７３、４−３１、４−３４、４−３９、４−５９、５−５１、および６−１のヒトＶＨ遺伝子セグメント。一実施形態では、第一および第二のヒト重鎖可変領域は、独立して、２−５、３−３０、および３−２３より選択される再構成されたヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、第一のヒト重鎖可変領域はヒトＶＨ２−５遺伝子セグメントに由来し、第二のヒト重鎖可変領域はヒトＶＨ３−３０遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、第一のヒト重鎖可変領域はヒトＶＨ３−３０遺伝子セグメントに由来し、第二のヒト重鎖可変領域はヒトＶＨ３−２３遺伝子セグメントに由来する。一実施形態では、第一のヒト重鎖可変領域はヒトＶＨ３−２３遺伝子セグメントに由来し、第二のヒト重鎖可変領域はヒトＶＨ３−３０遺伝子セグメントに由来する。
【０１３１】
一実施形態では、第一または第二の核酸が工程（ｃ）の前に改変され、ここでは、第一または第二の核酸は、それがプロテインＡに対して低下した親和性を有するように改変される。
【０１３２】
一実施形態では、第三の核酸は、本明細書中に記載されるマウスから単離される。一実施形態では、第三の核酸は、２つから５つの体細胞変異を含む。一実施形態では、第三の核酸は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメント由来のヒト軽鎖可変領域をコードする。一実施形態では、第三の核酸は、ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント由来のヒト軽鎖可変領域をコードする。
【０１３３】
一実施形態では、第三の核酸は、再構成されたヒト軽鎖可変領域に由来する。一実施形態では、再構成されたヒト軽鎖可変領域は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント由来の配列を含む。一実施形態では、再構成されたヒト軽鎖可変領域は、生殖細胞系列ヒトＶκ１−３９配列を含む（すなわち、Ｖ遺伝子セグメント配列の中に体細胞超変異を含まない）。一実施形態では、再構成されたヒト軽鎖可変領域は生殖細胞系列ヒトＶκ３−２０配列を含む。
【０１３４】
様々な実施形態では、その生殖細胞系列の中に再構成されたヒト軽鎖配列を欠いている改変されたマウス由来の可変ドメインを含む第一のヒト重鎖が組み込まれている二重特異性抗体を調製する方法が提供される。ここでは、第一のヒト重鎖は、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント由来の再構成されたヒト軽鎖可変領域を含む同系のヒト軽鎖と対を形成する。様々な実施形態では、第一のヒト重鎖とは異なる特異性を持つ第二のヒト重鎖が、本明細書中に記載されるとおりの免疫されたマウスから同定される。２つの重鎖と共通軽鎖とをコードする核酸は、３つの鎖の全ての発現が生じるように、先の段落に記載されたように宿主細胞に導入され、二重特異性抗体が細胞培養物から回収される。
【０１３５】
一実施形態では、マウスは、第一のヒト重鎖可変ドメインを作製するために使用されたものと同じ抗原で免疫される。一実施形態では、マウスは、第一のヒト重鎖可変ドメインを作製するために使用されたものとは異なる抗原で免疫される。
【０１３６】
一態様では、二重特異性抗体をコードする核酸およびこの核酸を含有している宿主細胞を含む、単一のヒト軽鎖と対を形成して二重特異性抗体を作製することができるヒト重鎖を選択する方法が提供される。
【０１３７】
一態様では、単一特異性抗体のような望ましくない生成物を上回る量に、細胞培養物中の望ましい二重特異性抗体の量を増大させる方法が提供され、ここでは、二重特異性抗体の重鎖の１つが、プロテインＡに対するその親和性が低下するように改変される。
【０１３８】
一態様では、単離された宿主細胞が提供される。ここでは、宿主細胞は、（ａ）第一の抗原に結合する第一のヒト重鎖可変領域をコードする第一の核酸配列（ここでは、第一の核酸配列は、マウスの生殖細胞系列の中で、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列からヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現する第一の抗原で免疫されたマウスから単離される）；（ｂ）第二の抗原に結合する第二のヒト重鎖可変領域をコードする第二の核酸配列（ここでは、第二の核酸配列は、マウスの生殖細胞系列の中で、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列からヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現する第二の抗原で免疫されたマウスから単離される）；（ｃ）（ａ）の重鎖可変領域と対を形成すると第一の抗原に特異的に結合し、（ｂ）の重鎖可変領域と対を形成すると第二の抗原に特異的に結合する、ヒト軽鎖可変領域をコードする第三の核酸配列を含む。
【０１３９】
様々な態様では、第一および第二の抗原は互いに異なる。様々な態様では、第一、第二、および第三の核酸配列の発現は、第一および第二の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体の形成を導く。
【０１４０】
一実施形態では、ヒトＶＬ領域は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む再構成されたヒト軽鎖配列に由来する。具体的な実施形態では、再構成されたヒト軽鎖配列は生殖細胞系列配列である（すなわち、可変ドメインの中に体細胞超変異を含まない）。一実施形態では、第三の核酸配列は、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列からヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現するマウスから単離され、ここでは、再構成されたヒト軽鎖配列は、マウスの生殖細胞系列の中に存在する。一実施形態では、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列は、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む。具体的な実施形態では、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントは、少なくとも１つの体細胞超変異を相補性決定領域（ＣＤＲ）またはフレームワーク領域（ＦＷＲ）の中に含む。具体的な実施形態では、第一、第二、および第三の核酸配列が、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列から、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメント由来のヒト免疫グロブリンＶＬ領域を発現するマウスから単離され、ここでは、再構成された免疫グロブリン軽鎖配列は、マウスの生殖細胞系列の中に存在する。
【０１４１】
様々な実施形態では、マウスは、免疫グロブリン軽鎖を形成するように再構成することができる内因性の軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含まない。
【０１４２】
一実施形態では、ヒト免疫グロブリンＶＬ領域は、改変された内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座より発現される。一実施形態では、第一および第二の抗原は、１つの分子上に存在する。一実施形態では、第一および第二の抗原は異なる分子上に存在する。一実施形態では、第一または第二の核酸配列は、コードされる重鎖の、プロテインＡに対する親和性を低下させる改変を含む。
【０１４３】
一実施形態では、第一または第二の核酸配列は、以下より選択されるヒト重鎖遺伝子セグメントを含有する再構成されたヒト重鎖可変領域配列を含む：ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１、およびＶＨ６−１。具体的な実施形態では、重鎖遺伝子セグメントは、ＶＨ２−５、ＶＨ３−２３、またはＶＨ３−３０である。
【０１４４】
一態様では、本発明に従って作製されたヒト重鎖可変ドメインを含む抗体または二重特異性抗体が提供される。別の態様では、完全ヒト型抗体または完全ヒト型二重特異性抗体を作製するための本明細書に記載されるとおりのマウスの使用が提供される。
【０１４５】
一態様では、本明細書に記載される遺伝子改変マウス、胚または細胞は、内因性の調節または制御エレメント、例えばマウスκイントロンエンハンサー、マウスκ３’エンハンサーまたはイントロンエンハンサーと３’エンハンサーとの両方を保持するκ軽鎖遺伝子座を含み、ここで、調節または制御エレメントは、κ軽鎖遺伝子座の発現される配列の体細胞変異および親和性成熟を促進する。
【０１４６】
一態様では、１つ以下または２つ以下の、再構成されたまたは再構成されていない免疫グロブリン軽鎖ＶおよびＪ遺伝子セグメントに由来する免疫グロブリン軽鎖を有していることを特徴とするＢ細胞集団を含むマウスが提供され、ここでは、マウスは、免疫グロブリン軽鎖ＶおよびＪ遺伝子セグメントの野生型相補物を含むマウスとほぼ同じであるκ：λ軽鎖比を示す。
【０１４７】
一実施形態では、免疫グロブリン軽鎖は、１つ以下または２つ以下の、再構成された免疫グロブリン軽鎖ＶおよびＪ遺伝子セグメントに由来する。具体的な実施形態では、軽鎖は、１つ以下の再構成された免疫グロブリン軽鎖ＶおよびＪ遺伝子セグメントに由来する。
【０１４８】
一態様では、１つ以下または２つ以下のヒトＶκ／Ｊκ配列に由来する免疫グロブリン軽鎖を発現する本明細書中に記載されるとおりのマウスが提供され、ここでは、マウスは、１つ以上のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントでの全てまたは実質的に全ての内因性のマウス重鎖可変領域遺伝子セグメントの置き換えを含み、マウスは、約１から約２０の、（ａ）λ軽鎖を有している免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞の、（ｂ）κ軽鎖を有している免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞に対する比を示す。
【０１４９】
一実施形態では、マウスはヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列に由来する単一のκ軽鎖を発現し、λ軽鎖を有している免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞の、κ軽鎖を有している免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞に対する比は、約１から約２０である。一実施形態では、上記比は、約１から少なくとも約６６である。具体的な実施形態では、上記比は約１から６６である。
【０１５０】
一実施形態では、マウスは、ヒトＶκ３−２０Ｊκ５配列に由来する単一のκ軽鎖を発現し、λ軽鎖を有している免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞の、κ軽鎖を有している免疫グロブリンを発現するＣＤ１９＋Ｂ細胞に対する比は、約１から約２０である。一実施形態では、上記比は、約１から約２１である。特定の実施形態では、上記比は１から２０、または１から２１である。
【０１５１】
一態様では、単一の再構成されたκ軽鎖を発現する遺伝子改変マウスが提供され、ここでは、マウスは機能性のλ軽鎖遺伝子座を含み、ここでは、マウスは、同じ単一の再構成されたκ軽鎖に由来するκ軽鎖を発現するＩｇκ＋細胞を含むＢ細胞集団を発現する。一実施形態では、マウスにおけるＩｇκ＋Ｉｇλ＋Ｂ細胞の百分率は、野生型マウスにおける百分率とほぼ同じである。具体的な実施形態では、マウスにおけるＩｇκ＋Ｉｇλ＋Ｂ細胞の百分率は、約２から約６パーセントである。具体的な実施形態では、マウスにおけるＩｇκ＋Ｉｇλ＋Ｂ細胞の百分率（ここでは、単一の再構成されたκ軽鎖はＶκ１−３９Ｊκ５配列に由来する）は、約２から約３である。具体的な実施形態では、百分率は約２．６である。具体的な実施形態では、マウスにおけるＩｇκ＋Ｉｇλ＋Ｂ細胞の百分率（ここでは、単一の再構成されたκ軽鎖はＶκ３−２０Ｊκ１配列に由来する）は、約４から約８である。具体的な実施形態では、百分率は約６である。
【０１５２】
一態様では、遺伝子改変マウスが提供され、ここでは、マウスは、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントに由来する単一の再構成されたκ軽鎖を発現し、ここでは、マウスは、単一の再構成されたκ軽鎖配列由来の単一のκ軽鎖を含むＢ細胞集団を発現し、ここでは、遺伝子改変マウスは、体細胞超変異に対して耐性にはなっていない。一実施形態では、マウスのＢ細胞上で発現されるκ軽鎖の少なくとも９０％が、少なくとも１つから約５つの体細胞超変異を示す。
【０１５３】
一態様では、１つ以下または２つ以下の再構成されたκ軽鎖配列に由来する単一のκ軽鎖を発現するように改変された遺伝子改変マウスが提供され、ここでは、マウスは、野生型マウスにより示されるκ軽鎖の使用頻度（usage）よりも、約２倍もしくはそれより大きな、少なくとも約３倍もしくはそれより大きな、または少なくとも約４倍もしくはそれより大きな、あるいは、κ軽鎖遺伝子セグメントの野生型レパートリーを含有している同じ系統のマウスにより示されるκ軽鎖の使用頻度よりも大きい、κ軽鎖の使用頻度を示す。具体的な実施形態では、マウスは、１つ以下の再構成されたκ軽鎖配列から単一のκ軽鎖を発現する。より具体的な実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１配列より選択される。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ１−３９Ｊκ５配列である。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ３−２０Ｊκ１配列である。
【０１５４】
一態様では、１つ以下または２つ以下の再構成されたκ軽鎖配列に由来する単一のκ軽鎖を発現する遺伝子改変マウスが提供され、ここでは、マウスは、完全なまたは実質的に完全ヒト型κ軽鎖遺伝子座を保有しているマウスにより示される同じκ軽鎖の使用頻度よりも、約１００倍もしくはそれより大、少なくとも約２００倍もしくはそれより大、少なくとも約３００倍もしくはそれより大、少なくとも約４００倍もしくはそれより大、少なくとも約５００倍もしくはそれより大、少なくとも約６００倍もしくはそれより大、少なくとも約７００倍もしくはそれより大、少なくとも約８００倍もしくはそれより大、少なくとも約９００倍もしくはそれより大、少なくとも約１０００倍もしくはそれより大の大きいκ軽鎖の使用頻度を示す。具体的な実施形態では、完全なまたは実質的に完全ヒト型κ軽鎖遺伝子座を保有しているマウスは、機能性の再構成されていないマウスκ軽鎖配列を欠いている。具体的な実施形態では、マウスは、１つ以下の再構成されたκ軽鎖配列から単一のκ軽鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、１コピーの再構成されたκ軽鎖配列を含む（例えば、ヘテロ接合体）。一実施形態では、マウスは、２コピーの再構成されたκ軽鎖配列を含む（例えば、ホモ接合体）。さらに具体的な実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１配列より選択される。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５配列である。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列は、Ｖκ３−２０Ｊκ１配列である。
【０１５５】
一態様では、１つ以下または２つ以下の再構成された軽鎖配列に由来する単一の軽鎖を発現する遺伝子改変マウスが提供され、ここでは、遺伝子改変マウスの中の軽鎖は、完全なまたは実質的に完全な軽鎖遺伝子座を保有しているマウスにより示される同じ再構成された軽鎖の発現よりも、少なくとも１０倍から約１，０００倍、１００倍から約１，０００倍、２００倍から約１，０００倍、３００倍から約１，０００倍、４００倍から約１，０００倍、５００倍から約１，０００倍、６００倍から約１，０００倍、７００倍から約１，０００倍、８００倍から約１，０００倍、または９００倍から約１，０００倍高い発現レベルを示す。一実施形態では、軽鎖はヒト配列を含む。具体的な実施形態では、ヒト配列はκ配列である。一実施形態では、ヒト配列はλ配列である。一実施形態では、軽鎖は完全ヒト型軽鎖である。
【０１５６】
一実施形態では、発現レベルは、転写された軽鎖配列のｍＲＮＡが定量され、そしてこれが完全なまたは実質的に完全な軽鎖遺伝子座を保有しているマウスの転写された軽鎖配列と比較されることを特徴とする。
【０１５７】
一態様では、１つ以下または２つ以下の再構成されたκ軽鎖配列に由来する単一のκ軽鎖を発現する遺伝子改変マウスが提供され、ここでは、マウスは、抗原で免疫されると、同じ抗原で免疫された野生型マウスに匹敵する血清力価を示す。具体的な実施形態では、マウスは、１つ以下の再構成されたκ軽鎖配列から単一のκ軽鎖を発現する。一実施形態では、血清力価は、全免疫グロブリンとして特性決定される。具体的な実施形態では、血清力価はＩｇＭ特異的力価として特性決定される。具体的な実施形態では、血清力価は、ＩｇＧ特異的力価として特性決定される。より具体的な実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列は、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１配列より選択される。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列はＶκ１−３９Ｊκ５配列である。一実施形態では、再構成されたκ軽鎖配列は、Ｖκ３−２０Ｊκ１配列である。
【０１５８】
一態様では、抗原特異的抗体の集団を発現する遺伝子改変マウスが提供され、ここでは、抗原特異的抗体の集団の免疫グロブリン軽鎖の全てが、同じ単一のヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来するヒト軽鎖可変（ＶＬ）領域を含み、免疫グロブリン重鎖が、複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントのうちの１つに由来するヒト重鎖可変（ＶＨ）領域を含む。
【０１５９】
様々な実施形態では、ヒトＶＨ遺伝子セグメントは以下より選択される：ＶＨ１−２、ＶＨ１−３、ＶＨ１−８、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１、およびＶＨ６−１。
【０１６０】
様々な実施形態では、同じ単一のヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントより選択される。様々な実施形態では、全ての免疫グロブリン軽鎖が、ＪκおよびＪλ遺伝子セグメントより選択されるヒト軽鎖Ｊ（ＪＬ）遺伝子セグメントを含む。具体的な実施形態では、ヒトＪＬ遺伝子セグメントは、ヒトＪκ１およびＪκ５遺伝子セグメントより選択される。様々な実施形態では、マウスは、マウス免疫グロブリンＶＬ遺伝子セグメント、マウス免疫グロブリンＪＬ遺伝子セグメント、およびこれらの組み合わせより選択される配列を欠いている。様々な実施形態では、ヒトＶＬ領域は、ヒト、マウス、またはラットの免疫グロブリン軽鎖定常（ＣＬ）領域に作動可能に連結される。具体的な実施形態では、ヒトＶＬ領域は、マウスＣκ領域に作動可能に連結される。具体的な実施形態では、ヒトＶＬ領域はラットＣκ領域に作動可能に連結される。
【０１６１】
様々な実施形態では、ヒトＶＬ領域は、内因性の免疫グロブリン軽鎖遺伝子座より発現される。様々な実施形態では、ヒトＶＨ領域は、ヒト、マウス、またはラットの免疫グロブリン重鎖定常（ＣＨ）領域に作動可能に連結される。様々な実施形態では、（ＣＨ）領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４、および／またはこれらの組み合わせより選択されるヒト配列を含む。様々な実施形態では、ヒトＶＨ領域は、内因性の免疫グロブリン重鎖遺伝子座より発現される。
【０１６２】
一態様では、単一の軽鎖と会合した複数の免疫グロブリン重鎖を発現する遺伝子改変マウスが提供される。一実施形態では、重鎖はヒト配列を含む。様々な実施形態では、ヒト配列は、可変配列、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびこれらの組み合わせより選択される。一実施形態では、単一の軽鎖はヒト配列を含む。様々な実施形態では、ヒト配列は、可変配列、定常配列、およびこれらの組み合わせより選択される。一実施形態では、マウスは、機能しない内因性の免疫グロブリン遺伝子座を含み、トランスジーンまたは染色体外エピソームより重鎖および／または軽鎖を発現する。一実施形態では、マウスは、いくつかもしくは全ての内因性のマウス重鎖遺伝子セグメント（すなわち、Ｖ、Ｄ、Ｊ）、および／またはいくつかもしくは全ての内因性のマウス重鎖定常配列（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、またはこれらの組み合わせ）、および／またはいくつかもしくは全ての内因性のマウス軽鎖配列（例えば、Ｖ、Ｊ、定常、またはこれらの組み合わせ）の内因性のマウス遺伝子座に、１つ以上のヒト免疫グロブリン配列での置き換えを含む。
【０１６３】
一態様では、同じ軽鎖を有する抗体の作製に適しているマウスが提供され、ここでは、このマウスの中で作製される全てまたは実質的に全ての抗体は、同じ軽鎖を伴って発現される。一実施形態では、軽鎖は内因性の軽鎖遺伝子座より発現される。
【０１６４】
一態様では、本明細書中に記載されるマウスから軽鎖配列および重鎖配列を得る工程、ならびに、ヒト抗体の作製において上記軽鎖配列および重鎖配列を用いる工程を含む、ヒト抗体用の軽鎖を作製するための方法が提供される。一実施形態では、ヒト抗体は二重特異性抗体である。
【０１６５】
一態様では、本明細書中に記載される操作された軽鎖を用いて、目的の抗原と結合することができるヒト重鎖可変ドメインを同定するための方法が提供され、ここでは、方法は、抗原に結合することができる第一の抗体に由来する重鎖可変ドメインを提供する工程、重鎖可変ドメインを生殖細胞系列軽鎖配列と再度対を形成させる（repairing）工程、およびそれぞれが第二の抗体を形成するように発現されるように細胞をトランスフェクトする工程、第二の抗体を抗原に対して暴露する工程、ならびに、第二の抗体の抗原に対する結合を測定する工程を含む。
【０１６６】
一実施形態では、第一の抗体の軽鎖がヒトＶκ１−３９配列を含む。一実施形態では、第一の抗体の軽鎖はヒトＶκ３−２０配列を含む。一実施形態では、生殖細胞系列軽鎖配列は、ヒトＶκ１−３９またはＶκ３−２０配列を含む。様々な実施形態では、第二の抗体の抗原に対する結合は、第一の抗体の抗原に対する結合との比較により決定される。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供され、ここでは、方法は、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖を発現する第一のマウスを第一のエピトープを含有する目的の第一の抗原に対して暴露する工程、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖を発現する第二のマウスを第二のエピトープを含有する目的の第二の抗原に対して暴露する工程、第一および第二のマウスがそれぞれ目的の抗原に対する免疫応答を惹起できるようにする工程、第一のマウスにおいて、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一のヒト重鎖可変領域を同定する工程、第二のマウスにおいて、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二のヒト重鎖可変領域を同定する工程、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一の重鎖をコードする第一の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二の重鎖をコードする第二の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、単一の完全ヒト型軽鎖を発現する細胞の中で第一の重鎖および第二の重鎖を発現させて二重特異性抗原結合タンパク質を形成させる工程、ならびに、二重特異性抗原結合タンパク質を単離する工程を含む。
【０１６８】
一部の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供され、ここでは、方法は、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖を発現する第一のマウスを第一のエピトープを含有する目的の第一の抗原に対して暴露する工程、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖を発現する第二のマウスを第二のエピトープを含有する目的の第二の抗原に対して暴露する工程、第一および第二のマウスがそれぞれ目的の抗原に対する免疫応答を惹起できるようにする工程、第一のマウスにおいて、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一のヒト重鎖可変領域を同定する工程、第二のマウスにおいて、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二のヒト重鎖可変領域を同定する工程、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一の重鎖をコードする第一の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二の重鎖をコードする第二の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、単一の完全ヒト型軽鎖を発現する細胞の中で第一の重鎖および第二の重鎖を発現させて二重特異性抗原結合タンパク質を形成させる工程、ならびに、二重特異性抗原結合タンパク質を単離する工程を含み、ここでは、単一の完全ヒト型軽鎖は、再構成されたヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する。
【０１６９】
一部の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供され、ここでは、方法は、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖を発現する第一のマウスを第一のエピトープを含有する目的の第一の抗原に対して暴露する工程、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖を発現する第二のマウスを第二のエピトープを含有する目的の第二の抗原に対して暴露する工程、第一および第二のマウスがそれぞれ目的の抗原に対する免疫応答を惹起できるようにする工程、第一のマウスにおいて、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一のヒト重鎖可変領域を同定する工程、第二のマウスにおいて、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二のヒト重鎖可変領域を同定する工程、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一の重鎖をコードする第一の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二の重鎖をコードする第二の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、単一の完全ヒト型軽鎖を発現する細胞の中で第一の重鎖および第二の重鎖を発現させて二重特異性抗原結合タンパク質を形成させる工程、ならびに、二重特異性抗原結合タンパク質を単離する工程を含み、ここでは、（ａ）第一の抗原と第二の抗原は同一ではない；または（ｂ）第一の抗原と第二の抗原は同一であり、かつ第一のエピトープと第二のエピトープは同一ではない。
【０１７０】
一部の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供され、ここでは、方法は、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖を発現する第一のマウスを第一のエピトープを含有する目的の第一の抗原に対して暴露する工程、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖を発現する第二のマウスを第二のエピトープを含有する目的の第二の抗原に対して暴露する工程、第一および第二のマウスがそれぞれ目的の抗原に対する免疫応答を惹起できるようにする工程、第一のマウスにおいて、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一のヒト重鎖可変領域を同定する工程、第二のマウスにおいて、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二のヒト重鎖可変領域を同定する工程、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一の重鎖をコードする第一の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二の重鎖をコードする第二の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、単一の完全ヒト型軽鎖を発現する細胞の中で第一の重鎖および第二の重鎖を発現させて二重特異性抗原結合タンパク質を形成させる工程、ならびに、二重特異性抗原結合タンパク質を単離する工程を含み、ここでは、ヒト軽鎖は、第一の重鎖と対を形成すると第一の抗原の第一のエピトープに特異的に結合し、第二の重鎖と対を形成すると第二の抗原の第二のエピトープに特異的に結合する。
【０１７１】
一部の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供され、ここでは、方法は、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖を発現する第一のマウスを第一のエピトープを含有する目的の第一の抗原に対して暴露する工程、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖を発現する第二のマウスを第二のエピトープを含有する目的の第二の抗原に対して暴露する工程、第一および第二のマウスがそれぞれ目的の抗原に対する免疫応答を惹起できるようにする工程、第一のマウスにおいて、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一のヒト重鎖可変領域を同定する工程、第二のマウスにおいて、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二のヒト重鎖可変領域を同定する工程、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一の重鎖をコードする第一の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二の重鎖をコードする第二の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、単一の完全ヒト型軽鎖を発現する細胞の中で第一の重鎖および第二の重鎖を発現させて二重特異性抗原結合タンパク質を形成させる工程、ならびに、二重特異性抗原結合タンパク質を単離する工程を含み、ここでは、第一の完全ヒト型重鎖遺伝子は、プロテインＡに対するその親和性を低下させるアミノ酸の改変を保有し、そして第二の完全ヒト型重鎖は、プロテインＡに対するその親和性を低下させる改変を含まない。一部の実施形態では、プロテインＡに対する親和性を低下させる改変は、９５Ｒ（ＥＵＲ  ４３５Ｒ）、９６Ｆ（ＥＵＲ  ４３６Ｆ）、およびこれらの組み合わせより選択される。
【０１７２】
一部の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供され、ここでは、方法は、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖を発現する第一のマウスを第一のエピトープを含有する目的の第一の抗原に対して暴露する工程、単一のヒト免疫グロブリン軽鎖を発現する第二のマウスを第二のエピトープを含有する目的の第二の抗原に対して暴露する工程、第一および第二のマウスがそれぞれ目的の抗原に対する免疫応答を惹起できるようにする工程、第一のマウスにおいて、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一のヒト重鎖可変領域を同定する工程、第二のマウスにおいて、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二のヒト重鎖可変領域を同定する工程、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一の重鎖をコードする第一の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二の重鎖をコードする第二の完全ヒト型重鎖遺伝子を作製する工程、単一の完全ヒト型軽鎖を発現する細胞の中で第一の重鎖および第二の重鎖を発現させて二重特異性抗原結合タンパク質を形成させる工程、ならびに、二重特異性抗原結合タンパク質を単離する工程を含み、ここでは、細胞のヒト軽鎖は生殖細胞系列配列を含む。
【０１７３】
一部の実施形態では、二重特異性抗体において、単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現するマウスの２つの異なるＢ細胞の２つのヒト重鎖可変領域配列を用いる工程を含む、ヒト二重特異性抗体を作製するための方法が提供される。
【０１７４】
一部の実施形態では、二重特異性抗体において、単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現するマウスの２つの異なるＢ細胞の２つのヒト重鎖可変領域配列を用いる工程を含む、ヒト二重特異性抗体を作製するための方法が提供され、ここでは、単一のヒト軽鎖可変ドメインは、再構成されたヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントを含む。
【０１７５】
一部の実施形態では、二重特異性抗体において、単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現するマウスの２つの異なるＢ細胞の２つのヒト重鎖可変領域配列を用いる工程を含む、ヒト二重特異性抗体を作製するための方法が提供され、ここでは、単一のヒト軽鎖可変ドメインの中に、再構成されたヒトＪκ５またはヒトＪκ１遺伝子セグメントがさらに含まれる。
【０１７６】
一部の実施形態では、二重特異性抗体において、単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現するマウスの２つの異なるＢ細胞の２つのヒト重鎖可変領域配列を用いる工程を含む、ヒト二重特異性抗体を作製するための方法が提供され、ここでは、マウスは、１つ以上の非ヒト重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された１つ以上の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、および１つ以上の再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントを含有しているヒト化された重鎖遺伝子座をさらに含む。一部の実施形態では、ヒト化された重鎖遺伝子座は、１つ以上のマウス重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結された８０の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、２７の再構成されていないヒトＤＨ遺伝子セグメント、および６の再構成されていないヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。一部の実施形態では、方法は、含み、ここでは、１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメントが、ヒトＶＨ１−２、ＶＨ１−８、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−５３、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、またはこれらの組み合わせを含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、二重特異性抗体において、単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現するマウスの２つの異なるＢ細胞の２つのヒト重鎖可変領域配列を用いる工程を含む、ヒト二重特異性抗体を作製するための方法が提供され、ここでは、マウスは、免疫グロブリン軽鎖を形成するように再構成することができる内因性の軽鎖可変遺伝子セグメントを含まない。
【０１７８】
一部の実施形態では、マウスを目的の抗原で免疫する工程を含む、二重特異性抗体において使用するための２つのヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを選択する方法が提供され、ここでは、マウスは、単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現し、ここでは、２つのヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、独立して、目的の抗原に結合するために単一のヒト軽鎖可変ドメインと会合する。
【０１７９】
一部の実施形態では、二重特異性抗体において、単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現するマウスの２つの異なるＢ細胞の２つのヒト重鎖可変領域配列を用いる工程を含む、ヒト二重特異性抗体を作製するための方法が提供され、ここでは、単一のヒト軽鎖可変ドメインは再構成されたヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントに由来する。一部の実施形態では、単一のヒト軽鎖可変ドメインは、再構成されたヒトＪκ５遺伝子セグメントをさらに含む。一部の実施形態では、単一のヒト軽鎖可変ドメインは、再構成されたヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する。一部の実施形態では、単一のヒト軽鎖可変ドメインは再構成されたヒトＪκ１遺伝子セグメントをさらに含む。
【０１８０】
一部の実施形態では、マウスを目的の抗原で免疫する工程を含む、二重特異性抗体において使用するための２つのヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを選択する方法が提供され、ここでは、マウスは、単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現し、ここでは、２つのヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、独立して、目的の抗原に結合するために単一のヒト軽鎖可変ドメインと会合し、ここでは、マウスは、免疫グロブリン軽鎖を形成するように再構成することができる内因性の軽鎖可変遺伝子セグメントを含まない。
【０１８１】
本明細書に記載される実施形態および態様のいずれも、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、互いに一緒に用いることができる。他の実施形態は、後に続く記載の概観から当業者にとって明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０１８２】
【図１】図１は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントをヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子領域で置換するためのターゲティング戦略を説明する。
【０１８３】
【図２】図２は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントをヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子領域で置換するためのターゲティング戦略を説明する。
【０１８４】
【図３】図３は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントをヒトＶｐｒｅＢ／Ｊλ５遺伝子領域で置換するためのターゲティング戦略を説明する。
【０１８５】
【図４】図４は、野生型マウス（ＷＴ）、操作されたヒトの再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域（Ｖκ１−３９Ｊκ５ＨＯ）についてホモ接合のマウス、および操作されたヒトの再構成されたＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域（Ｖκ３−２０Ｊκ１ＨＯ）についてホモ接合のマウスの末梢血からのＣＤ１９＋Ｂ細胞（ｙ軸）の百分率を示す。
【０１８６】
【図５Ａ】図５Ａは、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントによる内因性ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの置換についてホモ接合のマウス（Ｈκ）、野生型マウス（ＷＴ）、ならびに操作されたヒトの再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域についてヘテロ接合のマウス（Ｖκ１ー３９Ｊκ５ＨＥＴ）での、操作されたヒトの再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域の接合部に特異的なプローブ（Ｖκ１−３９Ｊκ５接合部プローブ）およびヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントに特異的なプローブ（Ｖκ１−３９プローブ）を用いる定量的ＰＣＲアッセイにおける、Ｖκ１−３９由来軽鎖の相対的ｍＲＮＡ発現（ｙ軸）を示す。シグナルは、マウスＣκの発現に標準化される。Ｎ．Ｄ．：検出されず。
【０１８７】
【図５Ｂ】図５Ｂは、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントによる内因性ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの置換についてホモ接合のマウス（Ｈκ）、野生型マウス（ＷＴ）、ならびに操作されたヒトの再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域についてホモ接合のマウス（Ｖκ１ー３９Ｊκ５ＨＯ）での、操作されたヒトの再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域の接合部に特異的なプローブ（Ｖκ１−３９Ｊκ５接合部プローブ）およびヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントに特異的なプローブ（Ｖκ１−３９プローブ）を用いる定量的ＰＣＲアッセイにおける、Ｖκ１−３９由来軽鎖の相対的ｍＲＮＡ発現（ｙ軸）を示す。シグナルは、マウスＣκの発現に標準化される。
【０１８８】
【図５Ｃ】図５Ｃは、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントによる内因性ＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの置換についてホモ接合のマウス（Ｈκ）、野生型マウス（ＷＴ）、ならびに操作されたヒトの再構成されたＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域についてヘテロ接合（ＨＥＴ）およびホモ接合（ＨＯ）のマウスでの、操作されたヒトの再構成されたＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域の接合部に特異的なプローブ（Ｖκ３−２０Ｊκ１接合部プローブ）およびヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに特異的なプローブ（Ｖκ３−２０プローブ）を用いる定量的ＰＣＲアッセイにおける、Ｖκ３−２０由来軽鎖の相対的ｍＲＮＡ発現（ｙ軸）を示す。シグナルは、マウスＣκの発現に標準化される。
【０１８９】
【図６Ａ】図６Ａは、βガラクトシダーゼで免疫した、野生型（ＷＴ；Ｎ＝２）および操作されたヒトの再構成されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域についてホモ接合のマウス（Ｖκ１−３９Ｊκ５ＨＯ；Ｎ＝２）でのＩｇＭ（左）およびＩｇＧ（右）の力価を示す。
【０１９０】
【図６Ｂ】図６Ｂは、βガラクトシダーゼで免疫した、野生型（ＷＴ；Ｎ＝５）および操作されたヒトの再構成されたＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域についてホモ接合のマウス（Ｖκ３−２０Ｊκ１ＨＯ；Ｎ＝５）での総免疫グロブリン（ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ）の力価を示す。
【０１９１】
【図７Ａ】図７Ａは、それぞれの親単一特異性抗体由来の重鎖可変領域から構築された単一特異性抗体（親−１および親−２）ならびに二重特異性抗体（二重特異性）の模式図を示す。共通軽鎖可変領域（黒色）を二重特異性抗体の中に示す。
【０１９２】
【図７Ｂ】図７Ｂは、目的の抗原についての２つの親モノクローナル抗体（親−１および親−２）の結合特性についての模式図ならびに、それぞれの単一特異性親抗体由来の重鎖可変領域を共通軽鎖と対を形成させることにより構築された二重特異性抗体の結合特性を示す。二重特異性抗体が、目的の抗原の２つの異なるエピトープに別々に（左下）または同時に（右下）のいずれかで結合することができることを示す。
【０１９３】
【図８】図８は、捕捉された単量体抗原Ｅの表面に対する３００ｎＭの二重特異性抗体（黒色の棒）および単一特異性抗体（線を入れた棒および灰色の棒）の結合の棒グラフを、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ単位（ＲＵ）で示す。モノクローナル親−１抗体（Ｐ１  Ａｂ）、モノクローナル親−２（Ｐ２  Ａｂ）抗体、および二重特異性抗体（Ｂｓ  Ａｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１９４】
（詳細な説明）
本発明は特定の方法、および記載される実験条件に限定されず、したがって、方法および条件は変更することができる。本発明の範囲は請求項の範囲によって規定されるので、本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を記載することだけを目的とし、限定するものではないことも理解するべきである。
【０１９５】
別に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての用語および語句は、反対のことが明らかに示されるか、その用語または語句が用いられる文脈から明らかに明白でない限り、その用語および語句が当該技術分野で獲得した意味を含む。本明細書に記載される方法および材料に類似するか同等であるいかなる方法および材料も本発明の実施または試験で用いることができるが、特定の方法および材料がこれから記載される。言及された全ての刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９６】
本明細書で用いる用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続する４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変（ＶＨ）領域および重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変（ＶＬ）領域および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存されている領域の間に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と略すことができ；軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と略すことができる）。用語「高親和性」抗体は、その標的エピトープに関して約１０−９Ｍ以下のＫＤ（例えば、約１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍまたは約１×１０−１２Ｍ）を有する抗体を指す。一実施形態では、ＫＤは表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥＴＭによって測定され、別の実施形態では、ＫＤはＥＬＩＳＡによって測定される。
【０１９７】
語句「二重特異性抗体」は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能な抗体を含む。二重特異性抗体は、２つの異なるモノクローナル抗体（図７Ａ）のフラグメントを含み、そして２つの異なるモノクローナル抗体由来の２つの同一ではない重鎖を一般に含み、各重鎖は、２つの異なる分子上（例えば、２つの異なる免疫原上の異なるエピトープ；図７Ｂの左下を参照のこと）または同じ分子上（例えば、同じ免疫原上の異なるエピトープ；図７Ｂの右下を参照のこと）の異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第一のエピトープおよび第二のエピトープ）に選択的に結合することが可能な場合、第一のエピトープに対する第一の重鎖の親和性は、第二のエピトープに対する第一の重鎖の親和性より少なくとも１桁から２桁、または３桁または４桁またはそれよりも一般に低く、逆もまた同じである。二重特異性抗体が特異的に結合するエピトープは、同じか異なる標的の上（例えば、同じか異なるタンパク質の上；図７Ｂを参照のこと）にあってよい。例示的な二重特異性抗体として、腫瘍抗原に特異的な第一の重鎖、および細胞障害性マーカー（例えば、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩなど）またはＴ細胞マーカー（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８など）に特異的な第二の重鎖を持つものが挙げられる。さらに、第二の重鎖可変領域は、異なる所望される特異性を有している重鎖可変領域で置換することができる。例えば、腫瘍抗原に特異的な第一の重鎖および毒素に特異的な第二の重鎖を持つ二重特異性抗体を、腫瘍細胞に毒素（例えば、サポリン、ビンカアルカロイドなど）を送達するように対を形成させることができる。他の例示的な二重特異性抗体としては、活性化受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃαＲＩ、Ｔ細胞受容体など）に特異的な第一の重鎖、および阻害性受容体（例えば、ＦｃγＲＩＩＢ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７２、ＣＤ３００ａなど）に特異的な第二の重鎖を持つ二重特異性抗体があげられる。このような二重特異性抗体は、細胞活性化と関係がある治療的状態（例えば、アレルギーおよび喘息）のために構築することができる。二重特異性抗体は、例えば、同じかまたは異なる免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作ることができる（図７Ｂ）。例えば、同じかまたは異なる免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、同じかまたは異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合させることができ、そのような配列は免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現させることができる。一般的な二重特異性抗体は、各々３つの重鎖ＣＤＲと、続く（Ｎ末端からＣ末端にかけて）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する２つの重鎖、ならびに、エピトープ結合特異性を付与しないが各重鎖と会合することができるか、または各重鎖と会合することができ、かつ重鎖エピトープ結合性領域が結合するエピトープの１つもしくは複数に結合することができるか、または各重鎖と会合することができ、かつ一方もしくは両方のエピトープへの重鎖の一方もしくは両方の結合��可能にすることができる免疫グロブリン軽鎖を有する。
【０１９８】
用語「細胞」には、組換え核酸配列を発現させるのに適する任意の細胞が含まれる。細胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）のもの、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．など）、マイコバクテリウム細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉなど）、ヒト以外の動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合体、例えばハイブリドーマもしくはクアドローマが含まれる。一部の実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。一部の実施形態では、細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ  ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞および前記細胞に由来する細胞系。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む（例えばウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞））。
【０１９９】
語句「相補性決定領域」または用語「ＣＤＲ」には、通常（すなわち、野生型動物で）免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域の２つのフレームワーク領域の間に現れる、生物体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列が含まれる。ＣＤＲは、例えば、生殖細胞系列配列または再構成されたかまたは再構成されていない配列がコードすることができ、例えば、ナイーヴであるか成熟したＢ細胞またはＴ細胞がコードすることができる。ＣＤＲは体細胞変異してもよく（例えば、動物の生殖細胞系列でコードされている配列と異なる）、ヒト化、および／またはアミノ酸の置換、付加もしくは欠失で改変されてもよい。一部の状況（例えば、ＣＤＲ３に関して）では、ＣＤＲは、２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系列配列）であって、（例えば、再構成されていない核酸配列において）不連続であるが、例えば、配列のスプライシングまたは接続の結果として（例えば、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えによって重鎖ＣＤＲ３を形成する）Ｂ細胞核酸配列において連続している、２つ以上の配列（例えば、生殖細胞系列配列）によってコードされてもよい。
【０２００】
保存的なアミノ酸置換を記載するために用いられる場合、用語「保存的」には、類似した化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が含まれる。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の目的の機能特性、例えば標的エピトープに所望の親和性で特異的に結合する可変領域の能力を実質的に変えない。類似した化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンなどの脂肪族側鎖；セリンおよびトレオニンなどの脂肪族ヒドロキシル側鎖；アスパラギンおよびグルタミンなどのアミドを含む側鎖；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンなどの芳香族の側鎖；リシン、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性側鎖；アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性側鎖；ならびにシステインおよびメチオニンなどの硫黄を含む側鎖が含まれる。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リシン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが含まれる。一部の実施形態では、例えばアラニンスキャニング変異生成で用いられるように、保存的アミノ酸置換は、アラニンによるタンパク質の任意の天然の残基の置換であってよい。一部の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔら（１９９２年）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎｔｉｒｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６巻：１４４３〜４５頁に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで正の値を有する保存的置換がもたらされる。一部の実施形態では、置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで置換が負ではない値を有するような適度に保存的な置換である。
【０２０１】
一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖での残基位置は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖またはその機能的断片（例えば、Ｂ細胞などからの発現および分泌を可能にする断片）における残基位置は、アミノ酸配列が本明細書に記載されている軽鎖と同一ではなく、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。
【０２０２】
語句「エピトープ結合性タンパク質」には、少なくとも１つのＣＤＲを有し、エピトープを選択的に認識することが可能な、例えばエピトープに約１マイクロモル濃度以下のＫＤ（例えば、約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍまたは約１×１０−１２ＭのＫＤ）で結合することが可能であるタンパク質が含まれる。治療的なエピトープ結合性タンパク質（例えば、治療的な抗体）は、ナノモル濃度またはピコモル濃度の範囲のＫＤをしばしば必要とする。
【０２０３】
語句「機能的断片」には、発現、分泌させることができ、マイクロモル濃度、ナノモル濃度またはピコモル濃度の範囲のＫＤでエピトープに特異的に結合するエピトープ結合性タンパク質の断片が含まれる。特異的な認識には、少なくともマイクロモル濃度の範囲、ナノモル濃度の範囲またはピコモル濃度の範囲のＫＤを有することが含まれる。
【０２０４】
用語「生殖細胞系列」には、非体細胞変異細胞、例えば非体細胞変異Ｂ細胞またはプレＢ細胞または造血細胞中の免疫グロブリン核酸配列への言及が含まれる。
【０２０５】
語句「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン重鎖定常領域配列が含まれる。特に明記しない限り、重鎖可変ドメインには３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域が含まれる。重鎖の断片には、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにその組合せが含まれる。一般的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能的断片には、エピトープを特異的に認識する（例えば、マイクロモル濃度、ナノモル濃度またはピコモル濃度の範囲のＫＤでエピトープを認識する）ことが可能で、細胞から発現および分泌させることが可能で、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片が含まれる。
【０２０６】
配列に関連して用いられる場合、用語「同一性」には、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の同一性を測定するために用いることができる当該技術分野で公知であるいくつかの異なるアルゴリズムで決定される同一性が含まれる。本明細書に記載される一部の実施形態では、同一性は、１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１のエクステンドギャップペナルティを使用するＣｌｕｓｔａｌＷ  ｖ．１．８３（スロー）アラインメントを用い、およびＧｏｎｎｅｔの類似度マトリックス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲＴＭ１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ  Ｉｎｃ．、２００８）を用いて決定される。配列の同一性に関して比較される配列の全長は特定の配列に依存するが、軽鎖定常ドメインの場合、全長は、自己会合して正規の軽鎖定常ドメインを形成することが可能な、例えばベータストランドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびヒトまたはマウスの少なくとも１つのＣＨ１ドメインと相互作用することが可能な軽鎖定常ドメインに折り畳まれるのに十分な長さの配列を含むべきである。ＣＨ１ドメインの場合、配列の全長は、ベータストランドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびマウスまたはヒトの少なくとも１つの軽鎖定常ドメインと相互作用することが可能なＣＨ１ドメインに折り畳まれるのに十分な長さの配列を含むべきである。
【０２０７】
語句「免疫グロブリン分子」には、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖が含まれる。重鎖は同一であっても異なってもよく、軽鎖は同一であっても異なってもよい。
【０２０８】
語句「軽鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、特に明記しない限りヒトκおよびλ軽鎖およびＶｐｒｅＢ、ならびに代わりの軽鎖が含まれる。特に明記しない限り、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインには３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が一般に含まれる。一般に、完全長軽鎖には、アミノ末端からカルボキシル末端にかけて、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含むＶＬドメインおよび軽鎖定常ドメインが含まれる。軽鎖には、例えば、軽鎖が現れるエピトープ結合性タンパク質が選択的に結合する第一または第二のエピトープのいずれにも選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖には、軽鎖が現れるエピトープ結合性タンパク質が選択的に結合する１つまたは複数のエピトープに結合し認識するものか、重鎖による結合および認識を助けるものがさらに含まれる。共通の軽鎖は再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列または再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列に由来するものであり、体細胞変異（例えば、親和性成熟）バージョンが含まれる。
【０２０９】
語句「マイクロモル濃度の範囲」は、１〜９９９マイクロモル濃度を意味するものとする。語句「ナノモル濃度の範囲」は、１〜９９９ナノモル濃度を意味するものとする。語句「ピコモル濃度の範囲」は、１〜９９９ピコモル濃度を意味するものとする。
【０２１０】
語句「体細胞変異」には、クラススイッチングを経たＢ細胞からの核酸配列への言及が含まれ、ここで、クラススイッチングされたＢ細胞での免疫グロブリン可変領域の核酸配列（例えば、重鎖可変ドメインまたは重鎖ＣＤＲもしくはＦＲ配列を含む）は、クラススイッチングの前のＢ細胞の核酸配列に同一でなく、例えば、クラススイッチングを経ていないＢ細胞とクラススイッチングを経たＢ細胞との間のＣＤＲまたはフレームワーク核酸配列において差がある。「体細胞変異」には、親和性成熟していないＢ細胞での対応する免疫グロブリン可変領域配列（すなわち、生殖細胞系列細胞のゲノム中の配列）に同一ではない親和性成熟Ｂ細胞からの核酸配列への言及が含まれる。語句「体細胞変異」には、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の後のＢ細胞からの免疫グロブリン可変領域核酸配列への言及も含まれ、ここで、核酸配列は、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の前の対応する核酸配列と異なる。語句「体細胞変異」は、免疫原チャレンジに応じて動物で、例えばヒト免疫グロブリン可変領域核酸配列を有するマウスで生成される、そのような動物で生得的に作動する選択プロセスから生じる抗体からの配列を指す。
【０２１１】
核酸配列に関して用語「再構成されていない」には、動物細胞の生殖細胞系列に存在する核酸配列が含まれる。
【０２１２】
語句「可変ドメイン」には、Ｎ末端からＣ末端（特に明記しない限り）の順序での以下のアミノ酸領域を含む免疫グロブリン軽鎖または重鎖（所望により改変される）のアミノ酸配列が含まれる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【０２１３】
ユニバーサル軽鎖
有用な多重特異性エピトープ結合性タンパク質、例えば二重特異性抗体を作製するこれまでの努力は、共通のパラダイムをしばしば共有する様々な問題によって妨害された：ヘテロダイマー二重特異性ヒト免疫グロブリンを対を形成させるのに適するフォーマットを、合理的に操作するか、試行錯誤を通して遺伝子操作するための配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択または操作。残念ながら、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作手法の全てではないにしてもそのほとんどは、個々の分子に適する（あるとしても）主にその場しのぎの修正を提供する。他方、ヒト治療法へと導くことが可能である適当な対の形成を選択するために複雑な生物体を使用するためのｉｎ  ｖｉｖｏ方法は、実現されていない。
【０２１４】
一般に、天然のマウス配列は、しばしば、ヒトの治療的な配列のための良い供給源ではない。少なくともその理由から、共通のヒト軽鎖と対を形成するマウス重鎖免疫グロブリン可変領域を生成することは、実用性において限定される。共通のヒト軽鎖と結合する能力を維持し、かつエピトープの特異性および親和性を保持することを望みながら、不確定な結果を伴ってマウス重鎖可変配列をヒト化しようと試みるための試行錯誤のプロセスにおいて、より多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作努力が費やされる。そのようなプロセスの終わりに、最終生成物は特異性および親和性の一部を維持し、かつ共通の軽鎖と会合することができる場合があるが、最終的にはヒトでの免疫原性が根深いリスクとして残るだろう。
【０２１５】
したがって、ヒト治療薬を作るのに適するマウスは、内因性のマウス重鎖可変領域遺伝子セグメントの代わりに、ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの好適に大きなレパートリーを含むであろう。ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは、リバースキメラ重鎖（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常領域を含む重鎖）を形成するために、再構成して、内因性マウス重鎖定常ドメインと再結合することができるべきである。重鎖は、クラススイッチングおよび体細胞超変異が可能であるべきであり、これにより、重鎖可変ドメインの好適に大きなレパートリーを、マウスがヒト軽鎖可変領域の限られたレパートリーと会合することができるものを選択するために、利用可能である。
【０２１６】
複数の重鎖について共通の軽鎖を選択するマウスは、実際的な有用性を有する。様々な実施形態では、共通の軽鎖だけを発現することができるマウスで発現する抗体は、同一であるか実質的に同一の軽鎖と会合して発現することができる重鎖を有する。これは、二重特異性抗体の作製で特に有益である。例えば、そのようなマウスは第一の免疫原で免疫して、第一のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。マウス（または、遺伝的に同じマウス）は、第二の免疫原で免疫して、第二のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。重鎖可変領域はＢ細胞からクローニングすることができ、同じ重鎖定常領域および同じ軽鎖と共に発現し、かつ細胞で発現されて二重特異性抗体を作製することができ、ここで、二重特異性抗体の軽鎖成分は、軽鎖成分と会合して発現するようにマウスによって選択される。
【０２１７】
可変領域が生殖細胞系列配列から逸脱する重鎖、例えば親和性成熟または体細胞変異可変領域を含む、重鎖のかなり多様なファミリーと好適に対を形成する免疫グロブリン軽鎖を生成するために、発明者らはマウスを操作した。様々な実施形態では、マウスは、ヒト軽鎖可変ドメインが、体細胞変異を含むヒト重鎖可変ドメインと対を形成するように工夫され、このようにして、ヒト治療薬として使用するのに適する高親和性結合性タンパク質への経路を可能にする。
【０２１８】
生物体における抗体選択の長く複雑なプロセスを介して、遺伝子操作マウスは、ヒト重鎖可変ドメインの多様なコレクションを限定された数のヒト軽鎖選択肢と対を形成させることにおいて、生物学的に適当な選択をする。これを達成するために、多様なヒト重鎖可変ドメイン選択肢と一緒に限定された数のヒト軽鎖可変ドメイン選択肢を提示するようにマウスは操作される。免疫原チャレンジに際して、マウスは免疫原に対する抗体を発生させるためにそのレパートリーにおける解法の数を最大にし、これは、そのレパートリーでの軽鎖選択肢の数によって大きく、またはそれ単独で制限される。様々な実施形態では、これは、軽鎖可変ドメインの好適で適合性の体細胞変異をマウスに達成させることを含み、該変異は、それにもかかわらず、特に体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインを含む、比較的多様なヒト重鎖可変ドメインに適合する。
【０２１９】
限られたレパートリーの軽鎖選択肢を達成するために、天然のマウス軽鎖可変ドメインを作製または再構成する能力を、非機能的または実質的に非機能的にするようにマウスを操作する。これは、例えば、マウスの軽鎖可変領域遺伝子セグメントを欠失させることによって達成することができる。内因性マウス遺伝子座は、次に、外来性のヒト可変領域遺伝子セグメントが内因性マウス軽鎖定常領域遺伝子と結合でき、再構成されたリバースキメラ軽鎖遺伝子（ヒト可変、マウス定常）を形成することができる方法で、選択された外来性の好適なヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（これは、内因性のマウス軽鎖定常ドメインに作動可能に連結される）によって改変され得る。様々な実施形態では、軽鎖可変領域は、体細胞変異させることが可能である。様々な実施形態では、体細胞変異を得る軽鎖可変領域の能力を最大にするために、適当なエンハンサー（複数可）がマウスで保持される。例えば、ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントで内因性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントを置換するためにマウスκ軽鎖遺伝子座を改変することにおいて、マウスのκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーは機能的に維持されるか、破壊されない。
【０２２０】
多様なリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）重鎖と会合する限られたレパートリーのリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）軽鎖を発現する遺伝子操作マウスが提供される。様々な実施形態では、内因性マウスκ軽鎖遺伝子セグメントが欠失し、内因性マウスＣκ遺伝子に作動可能に連結される単一の（または２つの）再構成されたヒト軽鎖領域遺伝子セグメントで置換される。再構成されたヒト軽鎖領域の体細胞超変異を最大にするための実施形態では、マウスκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーが維持される。様々な実施形態では、マウスは非機能的なλ軽鎖遺伝子座、またはその欠失、またはその遺伝子座がλ軽鎖を作製できないようにする欠失をさらに含む。
【０２２１】
様々な実施形態では、内因性マウス軽鎖ＶＬおよびＪＬ遺伝子セグメントを欠き、マウス定常領域に作動可能に連結される再構成されたヒト軽鎖可変領域（一実施形態では再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列）を含む、軽鎖可変領域遺伝子座を含む遺伝子操作マウスが提供され、ここで、遺伝子座は体細胞超変異を経ることが可能であり、および遺伝子座は、マウス定常領域に連結されたヒトＶＬ／ＪＬ配列を含む軽鎖を発現する。したがって、様々な実施形態では、遺伝子座はマウスκ３’エンハンサーを含み、それは正常または野生型のレベルの体細胞超変異と相関している。
【０２２２】
目的の抗原で免疫されるとき、様々な実施形態での遺伝子操作マウスは、１つまたは２つの再構成された軽鎖を発現し、軽鎖と共に機能するヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の多様な再構成を示すＢ細胞を生成し、これには、１つまたは２つの軽鎖が、例えば１から５個の体細胞変異を含むヒト軽鎖可変領域を含む実施形態が含まれる。様々な実施形態では、そのように発現されるヒト軽鎖は、マウスで発現される任意のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域と会合して発現することが可能である。
【０２２３】
複数のエピトープに結合するエピトープ結合性タンパク質
本明細書に記載される組成物および方法は、複数のエピトープに高親和性で結合する結合性タンパク質、例えば二重特異性抗体を作製するために用いることができる。本発明の利点には、その各々が単一の軽鎖と会合する好適に高い結合性の（例えば、親和性成熟した）重鎖免疫グロブリン鎖を選択する能力が含まれる。
【０２２４】
組換え細胞培養物から二重特異性抗体フラグメントを作るためのいくつかの技術が報告されている。しかし、二重特異性結合性タンパク質の合成および発現は、一部は、２つの異なる重鎖と会合して発現することができる好適な軽鎖を同定することに関連する問題のため、および一部は、単離の問題のために厄介であった。様々な実施形態では、本明細書中に記載される組成物および方法は、構成要素の安定性／相互作用を増大させることによる従来の免疫グロブリン構造を維持するための特別の改変（単数または複数）を必要としない、完全長の二重特異性抗体の利点を提供する（図７Ａ）。様々な実施形態では、そのような改変（単数または複数）は、面倒であり、二重特異性抗体技術の開発およびヒトの疾患の処置におけるそれらの可能性のある使用に妨害となることが証明されている。したがって、様々な実施形態では、付加された多重特異性の特性を有している天然の免疫グロブリン構造（すなわち、完全長）を提供することにより、完全長の二重特異性抗体は、これまでの二重特異性断片に欠けていたそれらの重要なエフェクター機能を維持し、より長い半減期の重要な薬物動態学的パラメータを示す治療薬をさらに提供する。
【０２２５】
本明細書に記載される方法および組成物は、遺伝子改変マウスが、他の点では天然であるプロセスを介して、体細胞変異された（例えば、親和性成熟した）重鎖を含む複数の重鎖と会合して発現することができる好適な軽鎖を選択することを可能にする。リバースキメラ重鎖（すなわち、ヒト可変およびマウス定常）を有する親和性成熟抗体を発現する、本明細書に記載される免疫マウスの適するＢ細胞からのヒトＶＬおよびＶＨ配列を同定して、適するヒト定常領域遺伝子配列（例えば、ヒトＩｇＧ１）を有する発現ベクターにインフレームでクローニングすることができる。２つのそのような構築物を調製することができ、ここで、各構築物は異なるエピトープに結合するヒト重鎖可変ドメインをコードする。生殖細胞系列配列における、またはＢ細胞（ここで、配列は体細胞変異されている）からのヒトＶＬの１つ（例えば、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１）は、適するヒト定常領域遺伝子（例えば、ヒトκ定常遺伝子）にインフレームで融合させることができる。これら３つの完全ヒト型の重鎖および軽鎖構築物は、発現のために適する細胞に入れることができる。細胞は、２つの主要な種を発現する：同一の軽鎖を有するホモダイマー重鎖、および同一の軽鎖を有するヘテロダイマー重鎖。これらの主要な種の容易な分離を可能にするために、重鎖の１つはプロテインＡ結合決定基が削除されるように改変され、これにより、ヘテロダイマー結合性タンパク質とは異なるホモダイマー結合性タンパク質の親和性がもたらされる。この問題に対処する組成物および方法は、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１として公開された、２０１０年６月２５日に出願された「Ｒｅａｄｉｌｙ  Ｉｓｏｌａｔｅｄ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｎａｔｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｆｏｒｍａｔ」という名称のＵＳＳＮ１２／８３２，８３８に記載される。
【０２２６】
一態様では、本明細書に記載されるエピトープ結合性タンパク質が提供され、ここで、ヒトＶＬおよびＶＨ配列は、目的のエピトープを含む抗原で免疫されている本明細書に記載されるマウスに由来する。
【０２２７】
一実施形態では、第一および第二のポリペプチドを含むエピトープ結合性タンパク質が提供され、第一のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第一のエピトープに選択的に結合する第一のエピトープ結合性領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３領域を含む定常領域を含み；第二のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第二のエピトープに選択的に結合する第二のエピトープ結合性領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３領域を含む定常領域を含み、第二のＣＨ３領域は、プロテインＡへの第二のＣＨ３ドメインの結合を低減または除去する改変を含む。
【０２２８】
一実施形態では、第二のＣＨ３領域はＨ９５Ｒ改変を含む（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによりＨ４３５Ｒ）。別の実施形態では、第二のＣＨ３領域はＹ９６Ｆ改変をさらに含む（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＹ４３６Ｆ）。
【０２２９】
一実施形態では、第二のＣＨ３領域は改変ヒトＩｇＧ１に由来し、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７ＭおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７ＭおよびＶ４２２Ｉ）からなる群より選択
される改変をさらに含む。
【０２３０】
一実施形態では、第二のＣＨ３領域は改変ヒトＩｇＧ２に由来し、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２ＮおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２ＮおよびＶ４２２Ｉ）からなる群より選択される改変をさらに含む。
【０２３１】
一実施形態では、第二のＣＨ３領域は改変ヒトＩｇＧ４に由来し、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９ＱおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９ＱおよびＶ４２２Ｉ）からなる群より選択される改変をさらに含む。
【０２３２】
複数のエピトープに結合するエピトープ結合性タンパク質を作製するための１つの方法は、目的の第一のエピトープを含む抗原で本発明による第一のマウスを免疫することであり、ここで、マウスは、軽鎖を再構成して形成することが可能な内因性マウスＶＬを含まない内因性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座を含み、ここで、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座はマウス内因性軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される単一の再構成されたヒトＶＬ領域であり、再構成されたヒトＶＬ領域は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択され、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントによって全部または一部が置換され、したがって、マウスによって作製される免疫グロブリン重鎖は、もっぱらまたは実質的に、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを含む重鎖である。免疫されるとき、そのようなマウスは、２つのヒト軽鎖可変ドメインの１つだけ（例えば、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１の１つ）を含むリバースキメラ抗体を作る。目的のエピトープに結合するＶＨをコードするＢ細胞が同定されると、ＶＨ（および、任意選択でＶＬ）のヌクレオチド配列を引き出して（例えば、ＰＣＲによって）、適するヒト免疫グロブリン定常ドメインとインフレームで発現構築物にクローニングすることができる。第二のエピトープに結合する第二のＶＨドメインを同定するためにこのプロセスを繰り返すことができ、第二のＶＨ遺伝子配列を引き出して、第二の適する免疫グロブリン定常ドメインとインフレームで発現ベクターにクローニングすることができる。第一および第二の免疫グロブリン定常ドメインは、同じか異なるアイソタイプであってよく、免疫グロブリン定常ドメインの１つ（他のものではない）を、本明細書またはＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されるように改変することができ、エピトープ結合性タンパク質を適する細胞で発現させ、例えばＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されるように、ホモダイマーエピトープ結合性タンパク質と比較してプロテインＡに対するその異なった親和性に基づいて単離することができる。
【０２３３】
一実施形態では、二重特異性エピトープ結合性タンパク質の作製方法であって、本明細書に記載されるマウスから第一の親和性成熟（例えば、１つまたは複数の体細胞超変異を含む）ヒトＶＨヌクレオチド配列（ＶＨ１）を同定すること、本明細書に記載されるマウスから第二の親和性成熟（例えば、１つまたは複数の体細胞超変異を含む）ヒトＶＨヌクレオチド配列（ＶＨ２）を同定すること、ＶＨ１をＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されるプロテインＡ決定基改変を欠くヒト重鎖とインフレームでクローニングして重鎖１（ＨＣ１）を形成すること、ＶＨ２をＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されるプロテインＡ決定基を含むヒト重鎖とインフレームでクローニングして重鎖２（ＨＣ２）を形成すること、ＨＣ１を含む発現ベクターおよびＨＣ２を含む同じか異なる発現ベクターを細胞に導入することであって、ここで、細胞はヒト軽鎖定常ドメインに融合したヒトＶκ１−３９／ヒトＪκ５またはヒトＶκ３−２０／ヒトＪκ１を含むヒト免疫グロブリン軽鎖をさらに発現する、導入すること、ＶＨ１によってコードされるＶＨドメインおよびＶＨ２によってコードされるＶＨドメインを含む二重特異性エピトープ結合性タンパク質を細胞に発現させること、ならびに単一特異的なホモダイマーエピトープ結合性タンパク質と比較して、プロテインＡに結合するその異なった能力に基づいて二重特異性エピトープ結合性タンパク質を単離すること、を含む方法が提供される。具体的な実施形態では、ＨＣ１はＩｇＧ１であり、ＨＣ２は、改変Ｈ９５Ｒ（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＨ４３５Ｒ）を含み、改変Ｙ９６Ｆ（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＹ４３６Ｆ）をさらに含むＩｇＧ１である。一実施形態では、ＶＨ１によってコードされるＶＨドメイン、ＶＨ２によってコードされるＶＨドメイン、またはその両方は、体細胞変異される。
【０２３４】
共通のヒトＶＬと共に発現するヒトＶＨ遺伝子
４つの異なる抗原に対して形成された親和性成熟抗体からの様々なヒト可変領域は、それらの同系軽鎖、またはヒトＶκ１−３９／Ｊκ５、ヒトＶκ３−２０／Ｊκ１もしくはヒトＶｐｒｅＢ／Ｊλ５から選択される少なくとも１つのヒト軽鎖と共に発現された（実施例１を参照）。抗原の各々に対する抗体について、異なる遺伝子ファミリーからの体細胞変異高親和性重鎖は、再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１領域と上手く対を形成し、重鎖および軽鎖を発現する細胞から分泌された。Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１について、以下のヒトＶＨ遺伝子ファミリーに由来するＶＨドメインが有利に発現した：１−２、１−８、１−２４、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１および６−１。したがって、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１の片方または両方からヒトＶＬドメインの限られたレパートリーを発現するように遺伝子操作されているマウスは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントでマウスＶＨ遺伝子セグメントを置換するように改変されたＶＨ遺伝子座から、体細胞変異ヒトＶＨドメインの多様な集団を生成する。
【０２３５】
単一の再構成された軽鎖（例えば、Ｖκ１−３９／ＪまたはＶκ３−２０／Ｊ）と会合しているリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）免疫グロブリン重鎖を発現するように遺伝子操作されたマウスは、目的の抗原で免疫される場合、多様なヒトＶＨ再構成を含み、かつ多様な特性（リガンドへの抗原の結合をブロックする能力に関して、および抗原のバリアントに結合する能力に関して）を有する多様な高親和性抗原特異的抗体を発現するＢ細胞を生成した（実施例５から１０を参照）。
【０２３６】
したがって、本明細書に記載されるマウスおよび方法は、多様な再構成から生じ、多種多様な親和性を示し（約ナノモル濃度またはそれ以下のＫＤを示すことを含む）、多種多様な特異性を示し（同じ抗原の異なるエピトープへの結合を含む）、同じか実質的に同じヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域と会合して発現する、体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインを含む、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの作製および選択で有用である。
【０２３７】
共通軽鎖を有している完全ヒト型二重特異性抗体
様々な実施形態における第一の工程として、それぞれがヒト重鎖可変ドメイン（および二重特異性抗体を形成する任意のさらなる核酸配列）をコードする、第一および第二の核酸配列が、例えば、異なるエピトープに結合することができること（図７Ａおよび７Ｂを参照）、異なる親和性を有していることなどのような所望される特性を有している親モノクローナル抗体から選択される。通常は、ヒト重鎖可変ドメインをコードする核酸配列は、ヒトへの投与に適するようにヒト重鎖定常領域と融合することを可能にするために、本明細書中に記載されるように、免疫されたマウスから単離される。配列（単数または複数）に対するさらなる改変は、二重特異性抗体に対して付加されたさらなる機能性が達成され得る（例えば、血清半減期の増大（例えば、ＵＳ７，２１７，７９７を参照）および／または抗体依存性細胞媒介性細胞障害性を増大させること（例えば、ＵＳ６，７３７，０５６を参照）を含む）変異を導入することにより作製することができる。抗体の定常領域に変異を導入することは当該分野で公知である。さらに、二重特異性抗体の一部は、細胞培養物中で組換えにより作製することができ、分子の他の部分（単数または複数）は、上記のような技術により作製することができる。
【０２３８】
抗体を生産するためのいくつかの技術が記載されている。例えば、様々な実施形態では、キメラ抗体は、本明細書中に記載されるようにマウスの中で生産される。抗体は、免疫されたマウスのＢ細胞から直接単離することができる（例えば、ＵＳ２００７／０２８０９４５Ａ１を参照）、および／または免疫されたマウスのＢ細胞を、ハイブリドーマを作製するために使用することができる（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７）。本明細書中に記載されるマウス由来の抗体（ヒト重鎖および／または軽鎖）をコードするＤＮＡは、従来技術を使用して容易に単離され、配列決定される。本明細書中に記載されるマウス由来のハイブリドーマおよび／またはＢ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。一旦単離されると、ＤＮＡは発現ベクターの中に配置され得、これは次いで、組換え宿主細胞の中でのモノクローナル抗体の合成が得られるように、免疫グロブリンタンパク質を別の方法では生産しない宿主細胞にトランスフェクトされる。ＤＮＡはまた、例えば、マウスの配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖の定常ドメインのコード配列に置き換えることにより改変され得る。
【０２３９】
様々な実施形態では、ＤＮＡの単離、ならびに、所望される特異性／親和性を有している第一および第二のヒト重鎖可変ドメインをコードする第一および第二の核酸配列、ならびに、ヒト軽鎖ドメイン（生殖細胞系列の再構成された配列または本明細書中に記載されるマウスから単離された軽鎖配列）をコードする第三の核酸配列の選択の後、これらの分子をコードする３つの核酸配列が、当該分野で広く利用されている組換え技術を使用して二重特異性抗体を形成するように発現させられる。多くの場合は、選り抜きの発現系には、二重特異性抗体が適正にグリコシル化されるように（例えば、グリコシル化される抗体ドメインを含有している二重特異性抗体の場合）哺乳動物細胞発現ベクターと宿主が含まれるであろう。しかし、分子はまた、原核生物発現系においても生産することができる。通常は、宿主細胞は、単一のベクター上または独立したベクター上の、第一のヒト重鎖可変ドメイン、第二のヒト重鎖可変ドメイン、ヒト軽鎖ドメインの両方をコードするＤＮＡで形質転換されるであろう。しかし、独立した発現系の中で第一のヒト重鎖可変ドメイン、第二のヒト重鎖可変ドメイン、およびヒト軽鎖ドメイン（二重特異性抗体の構成要素）を発現させ、発現されたポリペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏでカップリングさせることが可能である。様々な実施形態では、ヒト軽鎖ドメインは生殖細胞系列配列を含む。様々な実施形態では、ヒト軽鎖ドメインは、１つ以下、２つ以下、３つ以下、４つ以下、または５つ以下の体細胞超変異を、軽鎖ドメインの軽鎖可変配列とともに含む。
【０２４０】
様々な実施形態では、２つの重鎖および単一のヒト軽鎖をコードする核酸（単数または複数）（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）が、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、および／または発現のために複製可能ベクターに挿入される。多くのベクターを利用することができ、これには一般的には以下のうちの１つ以上が含まれるがこれらに限定されるわけではない：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。各構成成分は個別に、あるいは、選択される宿主細胞または経験的に決定される他の基準に基づいて選択され得る。各構成成分のいくつかの例は当該分野で公知である。
【０２４１】
発現ベクターおよびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識されるプロモーターを含み、二重特異性抗体のそれぞれまたは全ての構成要素をコードする核酸配列に作動可能に連結される。様々な可能性がある宿主細胞により認識される多数のプロモーターが周知である。これらのプロモーターは、制限酵素消化により供給源ＤＮＡからプロモーターを取り出し、単離したプロモーター配列をベクターに挿入することにより、二重特異性抗体をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。
【０２４２】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物由来の有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結に、およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含み得る。このような配列は、一般的には、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの、５’の、および場合により３’の非翻訳領域から入手可能である。これらの領域は、二重特異性抗体構成要素をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分の中に、ポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。様々な実施形態に適切な発現ベクターとして、二重特異性抗体をコードするＤＮＡの哺乳動物細胞中での一時的発現を提供するベクターが挙げられる。一般的には、一時的発現には、宿主細胞の中で効率的に複製することが可能である発現ベクターの使用が含まれ、その結果、宿主細胞は多コピーの発現ベクターを蓄積し、次に、発現ベクターによりコードされる所望されるポリペプチドを高レベルで合成する。適切な発現ベクターと宿主細胞を含む一時的発現系は、クローニングされたＤＮＡによりコードされるポリペプチドの簡便なポジティブな同定を、ならびに、所望される結合特異性／親和性、または第一もしくは第二のヒト重鎖可変ドメインのホモ二量体を有している親抗体と比較して所望されるゲル移動特性を有している二重特異性抗体の迅速なスクリーニングを可能にする。
【０２４３】
様々な実施形態では、一旦、二重特異性抗体の構成要素をコードするＤＮＡが上記のように所望されるベクター（単数または複数）に組み立てられると、これらは、発現および回収に適切な宿主細胞に導入される。宿主細胞のトランスフェクションは、選択される宿主細胞に適切である当該分野で公知の標準的な技術（例えば、エレクトロポレーション、核マイクロインジェクション、細菌の昆虫細胞とのプロトプラスト融合、またはポリカチオン（例えば、ポリブレン、ポリオルニチンなど））を使用して達成され得る。
【０２４４】
様々な実施形態では、構成要素を含有している発現ベクターに最も適し、かつ二重特異性抗体種の最も効率的かつ好ましい生産を可能にする宿主細胞が選択される。発現のための例示的な宿主細胞として、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）のもの、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．など）、マイコバクテリウム細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉなど）、ヒト以外の動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合体、例えばハイブリドーマもしくはクアドローマが含まれる。様々な実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。様々な実施形態では、細胞は、以下の細胞から選択される真核細胞である：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ  Ｋ１、ＤＸＢ−１１  ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３  ＥＢＮＡ、ＭＳＲ  ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ  ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ  ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ  ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ  ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、および上記細胞に由来する細胞系。様々な実施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む（例えばウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６ＴＭ細胞））。
【０２４５】
二重特異性抗体を生産するために使用される哺乳動物宿主細胞は、様々な培地の中で培養され得る。市販されている培地（例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｌｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）が宿主細胞の培養に適している。培地には、必要に応じて、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、もしくは上皮成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびホスフェート）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮＴＭ）、微量元素（マイクロモル濃度範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源が補充され得る。任意の他の補助物質もまた、当業者に公知であるように、適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどのような培養条件は、様々な実施形態では、発現のために選択される宿主細胞にこれまでに使用されてきた条件であり、当業者に明らかであろう。
【０２４６】
二重特異性抗体は、様々な実施形態では、分泌されたポリペプチドとして培養培地から回収されるが、分泌シグナルを伴わずに直接生産される場合は、宿主細胞溶解物から回収される場合もある。二重特異性抗体が膜結合型である場合は、これは、適切な洗剤液（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００）を使用して膜から遊離させることができる。好ましくは、本明細書中に記載される二重特異性抗体は、第一の免疫グロブリンのＣＨ３ドメインおよび第二の免疫グロブリンのＣＨ３ドメインの使用を含み、ここでは、第一および第二の免疫グロブリンのＣＨ３ドメインは、少なくとも１つのアミノ酸が互いに異なり、ここでは、少なくとも１つのアミノ酸の相違は、アミノ酸の相違を持たない二重特異性抗体と比較して、プロテインＡに対する二重特異性抗体の結合を低下させる（ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１を参照；引用により本明細書中に組み込まれる）。一実施形態では、第一の免疫グロブリンのＣＨ３ドメインはプロテインＡに結合し、第二の免疫グロブリンのＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエキソンナンバリンングによる；ＥＵナンバリングによるとＨ４３５Ｒ）のような、プロテインＡ結合を減少させるまたは消滅させる変異を含む。第二のＣＨ３はさらに、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴによる；ＥＵによればＹ４３６Ｆ）を含み得る。第二のＣＨ３の中に見られ得るさらなる改変としては以下が挙げられる：ＩｇＧ１抗体の場合は、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによると、Ｄ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、およびＶ４２２Ｉ）；ＩｇＧ２抗体の場合は、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによると、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、およびＶ４２２Ｉ）；ならびに、ＩｇＧ４抗体の場合は、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９Ｑ、およびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴによる；ＥＵによると、Ｑ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、およびＶ４２２Ｉ）。上記二重特異性抗体の形式のバリエーションは本発明の範囲内にあると想定される。
【０２４７】
二重特異性抗体の二重の性質（すなわち、１つのポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得るか、または１つより多くの標的ポリペプチドに特異的である抗原結合ドメインを含み得る、図７Ｂを参照；例えば、Ｔｕｔｔら、１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０−６９；Ｋｕｆｅｒら、２００４，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：２３８−２４４もまた参照のこと）を理由として、これらは、治療用途について有用な多くの利点をもたらす。例えば、二重特異性抗体は、（例えば、腫瘍細胞を死滅させるための）再指向させられた細胞障害性のために、ワクチンアジュバントとして、血栓溶解剤を血塊に送達するために、標的部位（例えば、腫瘍）で酵素活性化プロドラッグを転換させるために、感染性疾患を処置するために、免疫複合体を細胞表面受容体に対してターゲティングさせるために、または免疫毒素を腫瘍細胞に送達するために使用することができる。
【０２４８】
本明細書中に記載される二重特異性抗体はまた、いくつかの治療的、および非治療的、および／または診断的なアッセイ方法（例えば、酵素イムノアッセイ、２サイトイムノアッセイ、様々な疾患（例えば、がん）のｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ免疫診断、競合結合アッセイ、直接および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに、免疫沈降アッセイ）においても使用することができる。二重特異性抗体の他の使用は当業者に明らかであろう。
【０２４９】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製、使用する方法を当業者に説明するために提供され、発明者が彼らの発明とみなすものの範囲を限定するものではない。用いる数（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証するように努めたが、多少の実験誤差および逸脱があることが考慮されるべきである。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏で示され、気圧は大気圧またはその近くである。
【実施例】
【０２５０】
以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製、使用する方法を当業者に説明するために提供され、発明者が彼らの発明とみなすものの範囲を限定するものではない。用いる数（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証するように努めたが、多少の実験誤差および逸脱があることが考慮されるべきである。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏で示され、気圧は大気圧またはその近くである。
【０２５１】
実施例１
選択されたヒトＶＬ領域と会合するヒトＶＨ領域の同定
単一の再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖を抗原特異的ヒト抗体からのヒト重鎖と共発現させることができるか否かを判定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系を構築した。
【０２５２】
遺伝子改変マウスでヒト抗体を生成する方法は、公知である（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１を参照、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標））。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に応じてヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を生成するように、内因性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結されたヒト重鎖および軽鎖可変領域を含むゲノムを有する遺伝子改変マウスの生成を含む。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスから生成される抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、完全にヒトである。最初に、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体が単離される。下記のように、抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けされ、選択される。マウス定常領域は所望のヒト定常領域で置換され、非ＩｇＭアイソタイプ、例えば野生型または改変されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む完全にヒトの抗体が生成される。選択される定常領域は具体的な用途によって異なることができるが、高親和性抗原結合および標的特異性特性は可変領域に存在する。
【０２５３】
ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを、血管形成を促進する増殖因子（抗原Ｃ）で免疫し、当該技術分野で認められる標準技術を用いて抗原特異的ヒト抗体を単離し、Ｖ遺伝子の使用について配列決定をした。選択された抗体をヒト重鎖および軽鎖定常領域にクローニングし、６９個の重鎖を以下の３つのヒト軽鎖の１つと対を形成することについて選択した：（１）ヒトκ定常領域に連結された同系κ軽鎖、（２）ヒトκ定常領域に連結された再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５、または（３）ヒトκ定常領域に連結された再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ３−２０Ｊκ１。重鎖および軽鎖の各対を、標準技術を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞に共トランスフェクトした。上清中の抗体の存在は、ＥＬＩＳＡアッセイで抗ヒトＩｇＧによって検出された。各重鎖／軽鎖対について抗体力価（ｎｇ／ｍｌ）を決定し、様々な再構成された生殖細胞系列軽鎖による力価を、親の抗体分子（すなわち、同系軽鎖と対になった重鎖）で得られた力価と比較し、天然の力価の百分率を計算した（表１）。ＶＨ：重鎖可変遺伝子。ＮＤ：現在の実験条件下で発現は検出されない。
【表１−１】
2015525071.tif 000003
【表１−２】
2015525071.tif 000004
【０２５４】
類似した実験では、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスをいくつかの異なる抗原で免疫し、抗原特異的ヒト抗体の選択された重鎖を、様々な再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖と対を形成するそれらの能力について試験した（前記の通り）。この実験で用いた抗原には、コレステロールホメオスタシスに関与する酵素（抗原Ａ）、グルコースホメオスタシスの調節に関与する血清ホルモン（抗原Ｂ）、血管形成を促進する増殖因子（抗原Ｃ）および細胞表面レセプター（抗原Ｄ）が含まれた。抗原特異的抗体は各免疫群のマウスから単離され、重鎖および軽鎖可変領域がクローニングされ、配列決定された。重鎖および軽鎖の配列から、Ｖ遺伝子の使用が決定され、選択された重鎖はそれらの同系軽鎖または再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域と対にさせられた。各重鎖／軽鎖対を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に共トランスフェクトし、上清中の抗体の存在はＥＬＩＳＡアッセイで抗ヒトＩｇＧによって検出した。各重鎖／軽鎖対について抗体力価（μｇ／ｍｌ）を決定し、様々な再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖による力価を、親の抗体分子（すなわち、同系軽鎖と対になった重鎖）で得られた力価と比較し、天然の力価の百分率を計算した（表２）。ＶＨ：重鎖可変遺伝子。Ｖκ：κ軽鎖可変遺伝子。ＮＤ：現在の実験条件下で発現は検出されない。
【表２−１】
2015525071.tif 000005
【表２−２】
2015525071.tif 000006
【０２５５】
これらの実験から得られた結果は、様々な遺伝子ファミリーからの体細胞変異高親和性重鎖は、再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１領域と対を形成することができ、細胞から正常な抗体分子として分泌させることができることを示す。表１に示すように、親の抗体の同系軽鎖と比較して、抗体力価は、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖と対にした場合、約６１％（６９中４２個）の重鎖で増加し、再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖と対にした場合、約２９％（６９中２０個）の重鎖で増加した。重鎖の約２０％（６９中１４個）について、親の抗体の同系軽鎖と比較して、再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖の両方が発現の増加を付与した。表２に示すように、再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域は、親の抗体の同系軽鎖と比較して、様々な異なるクラスの抗原に特異的ないくつかの重鎖の発現の増加を付与した。親の抗体の同系軽鎖と比較して、重鎖の約３５％（１５／４３）で抗体力価は２倍を超えて増加した。２つの重鎖（３１５および３１６）では、増加は親の抗体と比較して１０倍を超えていた。親の抗体の同系軽鎖と比較して発現の増加を示した全ての重鎖の中で、ファミリー３（ＶＨ３）の重鎖は、他の重鎖可変領域遺伝子ファミリーと比較してより多く提示されている。これは、再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖と対を形成するヒトＶＨ３重鎖の好ましい関係を示す。
【０２５６】
実施例２
再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖遺伝子座の生成
マウスゲノム細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローン３０２ｇ１２および２５４ｍ０４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照）を用いて、様々な再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖ターゲッティングベクターが作製された。これらの２つのＢＡＣクローンを用いて、ゲノム構築物を単一の再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域を含むように操作し、内因性κ可変および連結遺伝子セグメントを欠失させるために事前に改変しておいた内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入した。
【０２５７】
再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖ターゲッティングベクターの構築
当該技術分野で認められる標準の分子生物学技術を用いて、３つの異なる再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域を作製した。これらの３つの領域を構築するために用いたヒト可変遺伝子セグメントには、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列、再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列および再構成されたヒトＶｐｒｅＢＪλ５配列が含まれた。
【０２５８】
マウスＶκ３−７遺伝子のエクソン１（リーダーペプチドをコードする）およびイントロン１を含むＤＮＡセグメントを、新規ＤＮＡ合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって作製した。天然に存在するＢｌｐＩ制限酵素部位までの５’非翻訳領域の一部が含まれた。ヒトＶκ１−３９およびＶκ３−２０遺伝子のエクソンを、ヒトゲノムＢＡＣライブラリーからＰＣＲ増幅した。フォワードプライマーは、マウスＶκ３−７遺伝子のイントロン１のスプライス受容部位を含む５’伸長部を有した。ヒトＶκ１−３９配列のＰＣＲのために用いられたリバースプライマーは、ヒトＪκ５をコードする伸長部を含んでいたが、ヒトＶκ３−２０配列のＰＣＲのために用いられたリバースプライマーはヒトＪκ１をコードする伸長部を含んでいた。ヒトＶｐｒｅＢＪλ５配列は、新規ＤＮＡ合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって作製した。スプライスドナー部位を含むヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部を、プラスミドｐＢＳ−２９６−ＨＡ１８−ＰＩＳｃｅＩからＰＣＲ増幅した。フォワードＰＣＲプライマーは、ヒトＪκ５、Ｊκ１またはＪλ５配列のいずれかの一部をコードする伸長部を含んでいた。リバースプライマーは、イントロンにおいて事前に操作されたＰＩ−ＳｃｅＩ部位を含んでいた。
【０２５９】
マウスＶκ３−７エクソン１／イントロン１、ヒト可変軽鎖エクソンおよびヒトＪκ−Ｃκイントロン断片を重複伸長ＰＣＲによって一つにまとめ（ｓｅｗ）、ＢｌｐＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩで消化し、ヒトＶκ３−１５可変遺伝子セグメントからのプロモーターを含むプラスミドｐＢＳ−２９６−ＨＡ１８−ＰＩＳｃｅＩにライゲーションした。プラスミドｐＢＳ−２９６−ＨＡ１８−ＰＩＳｃｅＩ内のｌｏｘｅｄハイグロマイシンカセットを、ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩ部位が隣接するＦＲＴｅｄハイグロマイシンカセットで置換した。このプラスミドのＮｏｔＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩ断片を、マウスＪκ−Ｃκイントロンの一部、マウスＣκエクソン、およびマウスＥＳ細胞での相同組み換えのために３’相同性アームを提供したマウスκ遺伝子座の下流のゲノム配列の約７５ｋｂを含んでいた改変マウスＢＡＣ  ２５４ｍ０４にライゲーションした。次にこのＢＡＣのＮｏｔＩ／ＡｓｃＩ断片を、ＦＲＴｅｄネオマイシンカセットおよびマウスＥＳ細胞での相同組み換えのための内因性κ遺伝子座の上流のゲノム配列の約２３ｋｂを含んでいた改変マウスＢＡＣ  ３０２ｇ１２にライゲーションした。
【０２６０】
再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５ターゲッティングベクター（図１）。
ターゲッティングベクターへのクローニングのために、操作軽鎖挿入物の５’末端および３’末端に制限酵素部位を導入した：５’末端にＡｓｃＩ部位、３’末端にＰＩ−ＳｃｅＩ部位。５’ＡｓｃＩ部位および３’ＰＩ−ＳｃｅＩ部位の中で、５’から３’までのターゲッティング構築物は、マウスＢＡＣクローン３０２ｇ１２から得られた内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の５’側配列を含む５’相同性アーム、ＦＲＴｅｄネオマイシン耐性遺伝子、ヒトＶκ３−１５プロモーターを含むゲノム配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのリーダー配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのイントロン配列、再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域のオープンリーディングフレーム、ヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部を含むゲノム配列、ならびにマウスＢＡＣクローン２５４ｍ０４から得られた内因性マウスＪκ５遺伝子セグメントの３’側配列を含む３’相同性アームを含んでいた（図１、中央）。内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の上流および最も３’側のＪκ遺伝子セグメントの下流（例えば、内因性３’エンハンサー）の遺伝子および／または配列は、ターゲッティング構築物によって改変されていなかった（図１を参照）。操作されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子座の配列を、配列番号１に示す。
【０２６１】
再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域中の配列に位置するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＢＡＣ  ＤＮＡへの再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域のターゲッティング挿入を確認した。簡潔には、マウスＶκ３−７リーダー配列の３’側イントロン配列は、プライマーＵＬＣ−ｍ１Ｆ（ＡＧＧＴＧＡＧＧＧＴ  ＡＣＡＧＡＴＡＡＧＴ  ＧＴＴＡＴＧＡＧ；配列番号２）およびＵＬＣ−ｍ１Ｒ（ＴＧＡＣＡＡＡＴＧＣ  ＣＣＴＡＡＴＴＡＴＡ  ＧＴＧＡＴＣＡ；配列番号３）で確認した。再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域のオープンリーディングフレームは、プライマー１６３３−ｈ２Ｆ（ＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡ  ＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣ  Ａ；配列番号４）および１６３３−ｈ２Ｒ（ＴＧＣＡＡＡＣＴＧＧ  ＡＴＧＣＡＧＣＡＴＡ  Ｇ；配列番号５）で確認した。ネオマイシンカセットは、プライマーｎｅｏＦ（ＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧ  ＣＴＡＴＴＣＧＧＣ；配列番号６）およびｎｅｏＲ（ＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧ  ＧＣＡＴＣＡＧ；配列番号７）で確認した。再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域を発現するキメラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を形成するために、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションするために、次にターゲッティングＢＡＣ  ＤＮＡを用いた。
【０２６２】
内因性遺伝子座に挿入された操作されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域に特異的なプローブを用いるＴＡＱＭＡＮＴＭスクリーニングおよび核型分析によって、陽性のＥＳ細胞クローンを確認した。簡潔には、ネオマイシンマーカー遺伝子の中で結合するプローブｎｅｏＰ（ＴＧＧＧＣＡＣＡＡＣ  ＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧ  ＣＴＧ；配列番号８）、マウスＶκ３−７リーダー配列の３’側のイントロン配列中で結合するプローブＵＬＣ−ｍ１Ｐ（ＣＣＡＴＴＡＴＧＡＴ  ＧＣＴＣＣＡＴＧＣＣ  ＴＣＴＣＴＧＴＴＣ；配列番号９）、および再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５オープンリーディングフレーム中で結合するプローブ１６３３ｈ２Ｐ（ＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡ  ＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡ  ＧＣＣＣＣＴ；配列番号１０）。生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域を発現する同腹仔を生ませるために、雌性マウスに移植するために、次に陽性のＥＳ細胞クローンを用いた。
【０２６３】
あるいは、再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域を有するＥＳ細胞は、ターゲッティング構築物によって導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰを発現する構築物でトランスフェクトされる。任意選択で、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスを繁殖させることによって除去される（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）。任意選択で、ネオマイシンカセットは、マウスで保持される。
【０２６４】
再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ３−２０Ｊκ１ターゲッティングベクター（図２）。
同じように、再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域を発現する操作軽鎖遺伝子座を、５’から３’にかけて、マウスＢＡＣクローン３０２ｇ１２から得られた内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の５’側配列を含む５’相同性アーム、ＦＲＴｅｄネオマイシン耐性遺伝子、ヒトＶκ３−１５プロモーターを含むゲノム配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのリーダー配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのイントロン配列、再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域のオープンリーディングフレーム、ヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部を含むゲノム配列、ならびにマウスＢＡＣクローン２５４ｍ０４から得られた内因性マウスＪκ５遺伝子セグメントの３’側配列を含む３’相同性アームを含むターゲッティング構築物を用いて作製した（図２、中央）。操作されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子座の配列を、配列番号１１に示す。
【０２６５】
再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域中の配列に位置するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＢＡＣ  ＤＮＡへの再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域のターゲッティング挿入を確認した。簡潔には、マウスＶκ３−７リーダー配列の３’側イントロン配列は、プライマーＵＬＣ−ｍ１Ｆ（配列番号２）およびＵＬＣ−ｍ１Ｒ（配列番号３）で確認した。再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域のオープンリーディングフレームは、プライマー１６３５−ｈ２Ｆ（ＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣ  ＣＴＧＴＣＴＴＴＧ；配列番号１２）および１６３５−ｈ２Ｒ（ＡＡＧＴＡＧＣＴＧＣ  ＴＧＣＴＡＡＣＡＣＴ  ＣＴＧＡＣＴ；配列番号１３）で確認した。ネオマイシンカセットは、プライマーｎｅｏＦ（配列番号６）およびｎｅｏＲ（配列番号７）で確認した。再構成されたヒト生殖細胞系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖を発現するキメラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を形成するために、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションするために、次にターゲッティングＢＡＣ  ＤＮＡを用いた。
【０２６６】
内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入された操作されたＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域に特異的なプローブを用いるＴＡＱＭＡＮＴＭスクリーニングおよび核型分析によって、陽性のＥＳ細胞クローンを確認した。簡潔には、ネオマイシンマーカー遺伝子の中で結合するプローブｎｅｏＰ（配列番号８）、マウスＶκ３−７リーダー配列の中で結合するプローブＵＬＣ−ｍ１Ｐ（配列番号９）、およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１オープンリーディングフレーム中で結合するプローブ１６３５ｈ２Ｐ（ＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣ  ＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣ  ＡＧＧＧ；配列番号１４）。雌性マウスに移植するために、陽性のＥＳ細胞クローンを次に用いた。ヒト生殖細胞系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域を発現する同腹仔。
【０２６７】
あるいは、ヒト生殖細胞系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域を有するＥＳ細胞は、ターゲッティング構築物によって導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰを発現する構築物でトランスフェクトされてもよい。任意選択で、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスを繁殖させることによって除去されてもよい（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）。任意選択で、ネオマイシンカセットは、マウスで保持される。
【０２６８】
再構成されたヒト生殖細胞系列ＶｐｒｅＢＪλ５ターゲッティングベクター（図３）。
同じようにして、再構成されたヒト生殖細胞系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域を発現する操作軽鎖遺伝子座を、５’から３’にかけて、マウスＢＡＣクローン３０２ｇ１２から得られた内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の５’側配列を含む５’相同性アーム、ＦＲＴｅｄネオマイシン耐性遺伝子、ヒトＶκ３−１５プロモーターを含むゲノム配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのリーダー配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのイントロン配列、再構成されたヒト生殖細胞系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域のオープンリーディングフレーム、ヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部を含むゲノム配列、ならびにマウスＢＡＣクローン２５４ｍ０４から得られた内因性マウスＪκ５遺伝子セグメントの３’側配列を含む３’相同性アームを含むターゲッティング構築物を用いて作製した（図３、中央）。操作されたヒトＶｐｒｅＢＪλ５遺伝子座の配列を、配列番号１５に示す。
【０２６９】
再構成されたヒト生殖細胞系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域軽鎖領域中の配列に位置するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＢＡＣ  ＤＮＡへの再構成されたヒト生殖細胞系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域のターゲッティング挿入を確認した。簡潔には、マウスＶκ３−７リーダー配列の３’側イントロン配列は、プライマーＵＬＣ−ｍ１Ｆ（配列番号２）およびＵＬＣ−ｍ１Ｒ（配列番号３）で確認した。再構成されたヒト生殖細胞系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域のオープンリーディングフレームは、プライマー１６１６−ｈ１Ｆ（ＴＧＴＣＣＴＣＧＧＣ  ＣＣＴＴＧＧＡ；配列番号１６）および１６１６−ｈ１Ｒ（ＣＣＧＡＴＧＴＣＡＴ  ＧＧＴＣＧＴＴＣＣＴ；配列番号１７）で確認した。ネオマイシンカセットは、プライマーｎｅｏＦ（配列番号６）およびｎｅｏＲ（配列番号７）で確認した。再構成されたヒト生殖細胞系列ＶｐｒｅＢＪλ５軽鎖を発現するキメラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を形成するために、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションするために、次にターゲッティングＢＡＣ  ＤＮＡを用いた。
【０２７０】
内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入された操作されたＶｐｒｅＢＪλ５軽鎖領域に特異的なプローブを用いるＴＡＱＭＡＮＴＭスクリーニングおよび核型分析によって、陽性のＥＳ細胞クローンを確認する。簡潔には、ネオマイシンマーカー遺伝子の中で結合するプローブｎｅｏＰ（配列番号８）、マウスＩｇＶκ３−７リーダー配列の中で結合するプローブＵＬＣ−ｍ１Ｐ（配列番号９）、およびヒトＶｐｒｅＢＪλ５オープンリーディングフレーム中で結合するプローブ１６１６ｈ１Ｐ（ＡＣＡＡＴＣＣＧＣＣ  ＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣ  ＣＣＴ；配列番号１８）。生殖細胞系列軽鎖領域を発現する同腹仔を生ませるために、雌性マウスに移植するために、次に陽性のＥＳ細胞クローンを用いる。
【０２７１】
あるいは、再構成されたヒト生殖細胞系列ＶｐｒｅＢＪλ５軽鎖領域を有するＥＳ細胞は、ターゲッティング構築物によって導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰを発現する構築物でトランスフェクトされる。任意選択で、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスを繁殖させることによって除去される（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）。任意選択で、ネオマイシンカセットは、マウスで保持される。
【０２７２】
実施例３
単一の再構成されたヒト軽鎖を発現するマウスの生成
上記のターゲッティングＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７年）Ｆ０  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈａｔ  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｆｕｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｄｏｎｏｒ  ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＥＳ  ｃｅｌｌｓ  ａｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｍｍｅｄｉａｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照）。特有な再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の改変型を用いる遺伝子タイピングによって、操作されたヒト生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域、Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域またはＶｐｒｅＢＪλ５軽鎖領域を独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を同定する。
【０２７３】
再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域の発現を特徴付けするために、仔を遺伝子タイピングし、特有な再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域についてヘテロ接合またはホモ接合である仔を選択する。
【０２７４】
フローサイトメトリー。
共通軽鎖マウスの正常抗体レパートリーでの再構成されたヒト軽鎖領域の発現は、共通軽鎖マウスの脾細胞および末梢血での免疫グロブリンκおよびλの発現の分析によって検証した。野生型（ｎ＝５）、Ｖκ１−３９Ｊκ５共通軽鎖ヘテロ接合体（ｎ＝３）、Ｖκ１−３９Ｊκ５共通軽鎖ホモ接合体（ｎ＝３）、Ｖκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖ヘテロ接合体（ｎ＝２）、およびＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖ホモ接合体（ｎ＝２）マウスの収集された脾臓および末梢血からの細胞懸濁液を標準の方法によって作製し、蛍光標識抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）を用いてＣＤ１９＋、Ｉｇλ＋およびＩｇκ＋で染色した。
【０２７５】
簡潔には、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（クローン２．４Ｇ２、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）と共に１×１０６個の細胞を氷上で１０分間インキュベートし、続いて氷上で３０分間に以下の抗体カクテルで標識した：ＡＰＣコンジュゲート抗マウスＣＤ１９（クローン１Ｄ３、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５コンジュゲート抗マウスＣＤ３（クローン１７Ａ２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＩｇκ（クローン１８７．１、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ）、ＰＥコンジュゲート抗マウスＩｇλ（クローンＲＭＬ−４２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）。染色の後、細胞を洗浄し、２％ホルムアルデヒドで固定した。ＬＳＲＩＩフローサイトメーターでデータ取得を実施し、ＦｌｏｗＪｏで分析した。ゲーティング：総Ｂ細胞（ＣＤ１９＋ＣＤ３−）、Ｉｇκ＋Ｂ細胞（Ｉｇκ＋Ｉｇλ−ＣＤ１９＋ＣＤ３−）、Ｉｇλ＋Ｂ細胞（Ｉｇκ−Ｉｇλ＋ＣＤ１９＋ＣＤ３−）。血液および脾細胞試料から集めたデータは、類似した結果を示した。表３は、Ｉｇλ＋、Ｉｇκ＋またはＩｇλ＋Ｉｇκ＋である各群からの１匹の代表的なマウスの末梢血からの陽性ＣＤ１９＋Ｂ細胞百分率を示す。野生型（ＷＴ）、およびＶκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖についてホモ接合のマウスからの末梢血中のＣＤ１９＋Ｂ細胞の百分率は、図４に示す。
【表３】
2015525071.tif 000007
【０２７６】
共通軽鎖発現。
定量的ＰＣＲアッセイ（例えばＴＡＱＭＡＮＴＭ）を用いて、ヘテロ接合およびホモ接合のマウスで、各共通軽鎖（Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１）の発現を分析した。
【０２７７】
簡潔には、製造業者の仕様に従ってマウスＣＤ１９ミクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、野生型、対応するヒト重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子座によるマウス重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子座の置換についてホモ接合のマウス（Ｈκ）、ならびに各再構成されたヒト軽鎖領域についてホモ接合およびヘテロ接合のマウス（Ｖκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１）の脾臓からＣＤ１９＋Ｂ細胞を精製した。製造業者の仕様に従ってＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＣＤ１９＋Ｂ細胞から全ＲＮＡを精製し、ＲＮアーゼを含まないＤＮａｓｅオンカラム処理（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＲＮＡを除去した。Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて２００ｎｇのｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡにし、生じたｃＤＮＡをＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で増幅した。（１）両共通軽鎖についてのＶκ−Ｊκ接合部、（２）Ｖκ遺伝子単独（すなわちＶκ１−３９およびＶκ３−２０）、および（３）マウスＣκ領域にわたるプライマーおよびＴａｑｍａｎ  ＭＧＢプローブを用いるＡＢＩ  ７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、全ての反応を実施した。表４は、このアッセイのために使用されたプライマーおよびプローブの配列を示す。相対的発現は、マウスＣκ領域の発現に対して標準化した。結果を、図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃに示す。
【表４】
2015525071.tif 000008
【０２７８】
抗原特異的共通軽鎖抗体。
内因性マウスκ軽鎖遺伝子座にＶκ１−３９Ｊκ５またはＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖のいずれかを有する共通軽鎖マウスをβガラクトシダーゼで免疫して、抗体力価を測定した。
【０２７９】
簡潔には、製造業者の指示に従って、βガラクトシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）をｔｉｔｅｒｍａｘアジュバント（Ｓｉｇｍａ）中で乳化した。野生型（ｎ＝７）、Ｖκ１−３９Ｊκ５共通軽鎖ホモ接合体（ｎ＝２）およびＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖ホモ接合体（ｎ＝５）を、１００μｇのβガラクトシダーゼ／Ｔｉｔｅｒｍａｘによる皮下注射で免疫した。５０μｇのβガラクトシダーゼ／Ｔｉｔｅｒｍａｘによる３週間隔で２回の皮下注射によってマウスを追加免疫した。第２の追加免疫の後、製造業者の指示に従って後眼窩放血を用いて麻酔下マウスから血清分離管（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に血液を収集した。抗βガラクトシダーゼのＩｇＭ抗体またはＩｇＧ抗体を測定するために、４℃で一晩、ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を１μｇ／ｍＬのβガラクトシダーゼでコーティングした。過剰な抗原を洗い流した後に、室温で１時間、１％ＢＳＡを有するＰＢＳでブロックした。血清の系列希釈物をプレートに加え、室温で１時間インキュベートしてから洗浄した。次に、室温で１時間、プレートをＨＲＰコンジュゲート抗ＩｇＭ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）または抗ＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と一緒にインキュベートした。さらなる洗浄の後、プレートをＴＭＢ基質（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で発色させた。反応を１Ｎ硫酸で停止させ、Ｖｉｃｔｏｒ  Ｘ５プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてＯＤ４５０を読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍでデータを分析し、バックグラウンドより２倍高い血清の希釈としてシグナルを計算した。結果を図６Ａおよび６Ｂに示す。
【０２８０】
この実施例に示すように、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１共通軽鎖マウスの脾臓および末梢の両方のコンパートメントでのκ／λ  Ｂ細胞の比は、野生型に近いパターンを示した（表３および図４）。しかし、ＶｐｒｅＢＪλ５共通軽鎖マウスはより少ない末梢Ｂ細胞を示した（その約１〜２％が操作されたヒト軽鎖領域を発現する（データは示さず））。内因性κ軽鎖遺伝子座からのＶκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１の再構成されたヒト軽鎖領域の発現レベルは、ヒトＶκおよびＪκ遺伝子セグメントによるマウスＶκおよびＪκ遺伝子セグメントの完全な置換を有する内因性κ軽鎖遺伝子座と比較して上昇した（図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ）。ＶｐｒｅＢＪλ５の再構成されたヒト軽鎖領域の発現レベルは、ヘテロ接合マウスおよびホモ接合マウスの両方で内因性κ軽鎖遺伝子座からの類似した高い発現を示した（データは示さず）。このことは、マウスのλ、κまたは両方の内因性軽鎖遺伝子座との直接的競合で、単一の再構成されたヒトＶＬ／ＪＬ配列が、内因性κ軽鎖遺伝子座から野生型に勝るレベルの発現を生じさせ、正常な脾臓および血液のＢ細胞頻度をもたらすことができることを示す。さらに、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列のいずれかを有する操作されたκ軽鎖遺伝子座の存在は、マウスによってよく許容された。そしてこれは、免疫応答の体液性構成要素の軽鎖レパートリーのかなりの部分を占めることによって、野生型のように機能するようである（図６Ａおよび６Ｂ）。
【０２８１】
実施例４
単一の再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖を発現するマウスの繁殖
この実施例は、複数の遺伝子改変免疫グロブリン遺伝子座を有する複数の遺伝子改変マウス系統を作製するために、本明細書に記載される共通軽鎖マウスのいずれか１つと繁殖させることができる他のいくつかの遺伝子改変マウス系統を記載する。
【０２８２】
内因性Ｉｇλノックアウト（ＫＯ）。
操作された軽鎖遺伝子座の使用を最適化するために、再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域の１つを有するマウスを、内因性λ軽鎖遺伝子座に欠失を含む別のマウスと繁殖させる。この様式において、得られる子孫は、それらの唯一の軽鎖として、実施例２に記載される再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域を発現する。繁殖は、当該技術分野で認められる標準技術によって、あるいは商業的な繁殖家（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって実施される。操作された軽鎖遺伝子座、および内因性λ軽鎖遺伝子座の欠失を有するマウス系統は、特有な軽鎖領域の存在および内因性マウスλ軽鎖の非存在についてスクリーニングされる。
【０２８３】
ヒト化内因性重鎖遺伝子座。
操作されたヒト生殖細胞系列軽鎖遺伝子座を有するマウスは、ヒト重鎖可変遺伝子の遺伝子座による内因性マウス重鎖可変遺伝子の遺伝子座の置換を含むマウスと繁殖させられる（
ＵＳ６，５９６，５４１を参照；ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、マウスが抗原刺激に応じてヒト重鎖可変領域およびマウス重鎖定常領域を含む抗体を生成するように、内因性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結されたヒト重鎖可変領域を含むゲノムを含む。抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結させる。ＤＮＡは次に、抗体の完全ヒト型重鎖を発現することが可能な細胞で発現される。
【０２８４】
ヒトＶＨ遺伝子座による内因性マウスＶＨ遺伝子座の置換、および内因性κ軽鎖遺伝子座に単一の再構成されたヒト生殖細胞系列ＶＬ領域を有するマウスが得られる。目的の抗原による免疫に際して、単一のヒト軽鎖（ヒトＶＬおよびマウスＣＬ）と体細胞変異重鎖（ヒトＶＨおよびマウスＣＨ）を含むリバースキメラ抗体が得られる。抗体を発現するＢ細胞のＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列を同定し、完全にヒトの抗体を、適する発現系でＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列をヒトＣＨおよびＣＬヌクレオチド配列と融合させることによって作製する。
【０２８５】
実施例５
ヒト重鎖および再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域を発現するマウスからの抗体の生成
操作されたヒト軽鎖領域を含むマウスを、他の内因性Ｉｇ遺伝子座（実施例４に記載の）の改変および欠失を含む様々な所望の系統へ繁殖させた後、選択されたマウスを目的の抗原で免疫することができる。
【０２８６】
一般に、単一の再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域の１つを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは抗原でチャレンジされ、リンパ細胞（Ｂ細胞など）が動物の血清から収集される。不死のハイブリドーマ細胞系を調製するためにリンパ細胞を骨髄腫細胞系と融合させ、そのようなハイブリドーマ細胞系は、ヒト可変重鎖および再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖を含む抗体（これは、免疫のために用いる抗原に特異的である）を生成するハイブリドーマ細胞系を同定するためにスクリーニングおよび選択される。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、重鎖および軽鎖の望ましいアイソタイプ定常領域に連結させる。内因性マウス配列の存在および内因性遺伝子座に存在するあらゆるさらなるシス活性エレメントのために、各抗体の単一の軽鎖は体細胞変異することがある。これは、単一の軽鎖および多様な重鎖配列を含む抗原特異的レパートリーにさらなる多様性を加える。生じるクローニングされた抗体配列は、ＣＨＯ細胞などの細胞でその後発現される。あるいは、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡは、抗原特異的リンパ球から直接的に同定される。
【０２８７】
最初に、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体が単離される。上記のように、抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けされ、選択される。体細胞変異したヒト重鎖および本発明の再構成されたヒト生殖細胞系列軽鎖領域に由来する単一の軽鎖を含む完全ヒト型抗体を生成するために、マウス定常領域は所望のヒト定常領域で置換される。適するヒト定常領域には、例えば野生型または改変型のＩｇＧ１またはＩｇＧ４が含まれる。
【０２８８】
ヒトＶＨ、ＤＨおよびＪＨ遺伝子セグメントによる内因性マウス重鎖遺伝子座の置換、ならびに操作された生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５ヒト軽鎖領域または操作された生殖細胞系列Ｖκ３−２０Ｊκ１ヒト軽鎖領域（上記）による内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の置換を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの別々のコホートを、ヒト細胞表面レセプタータンパク質（抗原Ｅ）で免疫した。抗原Ｅは、３〜４日おきの６回の連続的な注射でマウスの後ろの足蹠に直接投与する。注射の前に、２から３マイクログラムの抗原Ｅを１０μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド（カタログ♯ｔｌｒｌ−ｍｏｄｎ−ＯＤＮ１８２６オリゴヌクレオチド；ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）および２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（リン酸アルミニウムゲルアジュバント、カタログ♯Ｈ−７１６３９−２５０；Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と混合する。屠殺の３〜５日前に与えられる最終抗原リコールの前に、合計６回の注射を与える。４回目および６回目の注射の後に血液を収集し、抗体免疫応答を標準の抗原特異的イムノアッセイによってモニタリングする。
【０２８９】
所望の免疫応答が達成されるとき、脾細胞を収集し、それらの生存能力を保存し、ハイブリドーマ細胞系を形成するためにマウス骨髄腫細胞と融合させる。抗原Ｅ特異的な共通軽鎖抗体を生成する細胞系を同定するために、ハイブリドーマ細胞系をスクリーニングし、選択する。この技術を用いて、いくつかの抗抗原Ｅ特異的な共通軽鎖抗体（すなわち、ヒト重鎖可変ドメイン、同じヒト軽鎖可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する抗体）が得られる。
【０２９０】
あるいは、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれるＵ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ１に記載されるように、抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体は、骨髄腫細胞との融合なしに抗原陽性Ｂ細胞から直接的に単離される。この方法を用いて、いくつかの完全ヒト型抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体（すなわち、ヒト重鎖可変ドメイン、操作されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖か操作されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域のいずれか、およびヒト定常ドメインを有する抗体）が得られた。
【０２９１】
この実施例の方法に従って生成された例示的な抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体の生物学的特性は、以下に示されるセクションに詳細に記載される。
【０２９２】
実施例６
抗原特異的共通軽鎖抗体での重鎖遺伝子セグメントの使用
生成されたヒト抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体の構造を分析するために、重鎖抗体可変領域をコードする核酸をクローニングし、配列決定をした。抗体の核酸配列および予測されたアミノ酸配列から、操作されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖か操作されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域のいずれかを含む免疫ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスから得られた、選択された共通軽鎖抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）について、遺伝子使用を特定した。結果を表５および６に示す。それらは、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０に由来する軽鎖だけから軽鎖を発現するマウスを使用するとき、様々な再構成のために、本発明によるマウスが様々なヒト重鎖遺伝子セグメントから抗原特異的共通軽鎖抗体を生成することを示す。２、３、４および５ファミリーのヒトＶＨ遺伝子セグメントは、様々なヒトＤＨセグメントおよびヒトＪＨセグメントと再構成されて、抗原特異的抗体を与えた。
【表５−１】
2015525071.tif 000009
【表５−２】
2015525071.tif 000010
【表６】
2015525071.tif 000011
【０２９３】
実施例７
ＬＵＭＩＮＥＸＴＭアッセイによる抗原特異的共通軽鎖抗体のブロック能力の判定
ビーズベースのアッセイで、抗原Ｅに対する９８個のヒト共通軽鎖抗体を、抗原Ｅへの抗原Ｅの天然のリガンド（リガンドＹ）の結合をブロックするそれらの能力について試験した。
【０２９４】
抗原Ｅの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を２つのｍｙｃエピトープタグおよび６×ヒスチジンタグとコンジュゲートさせ（抗原Ｅ−ｍｍＨ）、ＭＥＳ緩衝液中の２０μｇ／ｍＬの濃度でカルボキシル化マイクロスフェアにアミンカップリングさせた。混合液を室温で２時間インキュベートし、続いて１ＭトリスｐＨ８．０でビーズ非活性化を行い、続いて０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄した。次にビーズを２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）でブロックした。９６穴フィルタープレート中で、抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体を含む上清を緩衝液で１：１５に希釈した。抗体上清と同じ媒質成分による模擬上清を含む陰性対照を調製した。抗原Ｅ標識ビーズを上清に加え、４℃で一晩インキュベートした。ビオチン化リガンドＹタンパク質を０．０６ｎＭの最終濃度まで加え、室温で２時間インキュベートした。抗原Ｅ−ｍｙｃ−ｍｙｃ−６Ｈｉｓ標識ビーズに結合したビオチン化リガンドＹの検出を、ストレプトアビジンとコンジュゲートされたＲ−フィコエリトリン（Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＭＤ）で判定し、続いてＬＵＭＩＮＥＸＴＭフローサイトメトリーベースのアナライザーで測定した。リガンドＹのない試料のバックグラウンド平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、全ての試料から引いた。ブロック百分率は、各試料のバックグラウンドを引いたＭＦＩを調整された陰性対照値で割り、１００を掛け、生じた値を１００から引くことによって計算された。
【０２９５】
同様の実験において、抗原Ｅに対する同じ９８個のヒト共通軽鎖抗体を、リガンドＹ標識ビーズへの抗原Ｅの結合をブロックするそれらの能力について試験した。
【０２９６】
簡潔には、ＭＥＳ緩衝液に希釈した２０μｇ／ｍＬの濃度で、リガンドＹをカルボキシル化マイクロスフェアにアミンカップリングさせた。混合液を室温で２時間インキュベートし、続いて１ＭトリスｐＨ８でビーズの非活性化を行い、続いて０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄した。次にビーズを２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）でブロックした。９６穴フィルタープレート中で、抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体を含む上清を緩衝液で１：１５に希釈した。抗体上清と同じ媒質成分による模擬上清を含む陰性対照を調製した。ビオチン化抗原Ｅ−ｍｍＨを０．４２ｎＭの最終濃度まで加え、４℃で一晩インキュベートした。リガンドＹ標識ビーズを次に抗体／抗原Ｅ混合物に加え、室温で２時間インキュベートした。リガンドＹビーズに結合したビオチン化抗原Ｅ−ｍｍＨの検出は、ストレプトアビジンとコンジュゲートされたＲ−フィコエリトリン（Ｍｏｓｓ  Ｉｎｃ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＭＤ）で判定し、続いてＬＵＭＩＮＥＸＴＭフローサイトメトリーベースのアナライザーで測定した。抗原Ｅのない試料のバックグラウンド平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、全ての試料から引いた。ブロック百分率は、各試料のバックグラウンドを引いたＭＦＩを調整された陰性対照値で割り、１００を掛け、生じた値を１００から引くことによって計算された。
【０２９７】
表７および８は、両方のＬＵＭＩＮＥＸＴＭアッセイで試験された全９８個の抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体のブロック百分率を示す。ＮＤ：現在の実験条件下で判定されない。
【表７−１】
2015525071.tif 000012
【表７−２】
2015525071.tif 000013
【表７−３】
2015525071.tif 000014
【表８】
2015525071.tif 000015
【０２９８】
上記の第一のＬＵＭＩＮＥＸＴＭ実験では、Ｖκ１−３９Ｊκ５操作軽鎖を含む８０個の共通軽鎖抗体を、抗原Ｅ標識ビーズへのリガンドＹ結合をブロックするそれらの能力について試験した。これらの８０個の共通軽鎖抗体のうち、６８個は＞５０％のブロックを示し、１２個は＜５０％のブロック（６個は２５〜５０％のブロック、６個は＜２５％のブロック）を示した。Ｖκ３−２０Ｊκ１操作軽鎖を含む１８個の共通軽鎖抗体については、１２個は抗原Ｅ標識ビーズへのリガンドＹ結合の＞５０％のブロックを示し、６個は＜５０％のブロック（３個は２５〜５０％のブロック、３個は＜２５％のブロック）を示した。
【０２９９】
上記の第二のＬＵＭＩＮＥＸＴＭ実験では、Ｖκ１−３９Ｊκ５操作軽鎖を含む同じ８０個の共通軽鎖抗体を、リガンドＹ標識ビーズへの抗原Ｅの結合をブロックするそれらの能力について試験した。これらの８０個の共通軽鎖抗体のうち、３６個は＞５０％のブロックを示し、４４個は＜５０％のブロック（２７個は２５〜５０％のブロック、１７個は＜２５％のブロック）を示した。Ｖκ３−２０Ｊκ１操作軽鎖を含む１８個の共通軽鎖抗体については、１個はリガンドＹ標識ビーズへの抗原Ｅの結合の＞５０％のブロックを示し、１７個は＜５０％のブロック（５個は２５〜５０％のブロック、１２個は＜２５％のブロック）を示した。
【０３００】
表７および８のデータは、表５および６に記載される再構成が、その同系受容体抗原ＥへのリガンドＹの結合を様々な程度の効力でブロックした抗抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体を生成したことを証明し、このことは、抗原Ｅに関して重複するおよび重複しないエピトープ特異性を有する抗体を含む表５および６の抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体と矛盾しない。
【０３０１】
実施例８
ＥＬＩＳＡによる抗原特異的共通軽鎖抗体のブロック能力の判定
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、抗原Ｅに対するヒト共通軽鎖抗体を、リガンドＹコーティング表面への抗原Ｅの結合をブロックするそれらの能力について試験した。
【０３０２】
リガンドＹをＰＢＳに希釈した２μｇ／ｍＬの濃度で９６穴プレートにコーティングし、一晩インキュベートし、続いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。次にプレートを０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）によって室温で１時間ブロックした。別々のプレート中で、抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を含む上清を緩衝液で１：１０に希釈した。抗体の同じ成分を有する模擬上清を、陰性対照として用いた。抗原Ｅ−ｍｍＨ（上記）を０．１５０ｎＭの最終濃度まで加え、室温で１時間インキュベートした。次に、リガンドＹを含むプレートに抗体／抗原Ｅ−ｍｍＨ混合物を加え、室温で１時間インキュベートした。リガンドＹに結合した抗原Ｅ−ｍｍＨの検出は、抗ペンタ−Ｈｉｓ抗体とコンジュゲートさせた西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で判定し、硫酸によって中和されるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いる標準の比色応答によって発色させた（ｄｅｖｅｌｏｐ）。吸光度をＯＤ４５０で０．１秒間読み取った。抗原Ｅのない試料のバックグラウンド吸光度を、全ての試料から引いた。ブロック百分率は、各試料のバックグラウンドを引いたＭＦＩを調整された陰性対照値で割り、１００を掛け、生じた値を１００から引くことによって計算された。
【０３０３】
表９および１０は、ＥＬＩＳＡアッセイで試験された全９８個の抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体のブロック百分率を示す。ＮＤ：現在の実験条件下で判定されない。
【表９−１】
2015525071.tif 000016
【表９−２】
2015525071.tif 000017
【表１０】
2015525071.tif 000018
【０３０４】
この実施例に記載されているように、リガンドＹコーティング表面への抗原Ｅの結合をブロックするそれらの能力を試験された、Ｖκ１−３９Ｊκ５操作軽鎖を含む８０個の共通軽鎖抗体のうち、２２個は＞５０％のブロックを示し、５８個は＜５０％のブロック（２０個は２５〜５０％のブロック、３８個は＜２５％のブロック）を示した。Ｖκ３−２０Ｊκ１操作軽鎖を含む１８個の共通軽鎖抗体については、１個はリガンドＹコーティング表面への抗原Ｅの結合の＞５０％のブロックを示し、１７個は＜５０％のブロック（５個は２５〜５０％のブロック、１２個は＜２５％のブロック）を示した。
【０３０５】
これらの結果はまた、抗原Ｅに関して重複するおよび重複しないエピトープ特異性を有する抗体を含む抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体プールと矛盾しない。
【０３０６】
実施例９
抗原特異的共通軽鎖抗体についてのＢＩＡＣＯＲＥＴＭ親和性判定
ＢＩＡＣＯＲＥＴＭＴ１００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によって、選択された抗体上清の平衡解離定数（ＫＤ）を判定した。全てのデータは、ランニング緩衝液および試料緩衝液の両方としてＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）を用いて２５℃で得られた。標準のアミンカップリング化学を用いて高密度の抗ヒトＦｃ抗体で事前に誘導体化させたＣＭ５センサーチップ表面で、抗体を粗製上清試料から捕捉した。捕捉工程中、合計３分間、上清を３μＬ／分の流速で抗ヒトＦｃ表面全域に注入した。捕捉工程の後に、３５μＬ／分の流速で２分間の、ランニング緩衝液または１００ｎＭの濃度の分析物の注入が続いた。捕捉された抗体からの抗原の解離を、６分間モニタリングした。捕捉された抗体は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５の短時間注入によって除去した。緩衝液注入からのセンサーグラムを分析物センサーグラムから引き、それによって捕捉表面からの抗体の解離に起因するアーチファクトを除くことによって、全てのセンサーグラムをダブルリファレンス（ｄｏｕｂｌｅ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）とした。ＢＩＡｃｏｒｅＴＭ  Ｔ１００評価ソフトウェアｖ２．１を用いて、各抗体の結合データを、マストランスポートを有する１：１結合モデルにあてはめた。結果を表１１および１２に示す。
【表１１−１】
2015525071.tif 000019
【表１１−２】
2015525071.tif 000020
【表１２】
2015525071.tif 000021
【０３０７】
表５および６に示す再構成を含む共通軽鎖抗体の、表１１および１２に示す結合親和性は様々であり、ほとんど全てはナノモル濃度の濃度範囲のＫＤを示す。親和性データは、高親和性で、一され、体細胞変異している表５および６に記載の再構成された可変ドメインの組合せ会合から生じる共通軽鎖抗体と矛盾しない。前に示すデータと合わせると、表５および６に記載される共通軽鎖抗体は、抗原Ｅの上の１つまたは複数のエピトープに特異性を示す、多様な高親和性抗体の集合を含む。
【０３０８】
実施例１０
ＬＵＭＩＮＥＸＴＭアッセイによる抗原特異的共通軽鎖抗体の結合特異性の判定
選択された抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を、抗原ＥのＥＣＤおよび抗原Ｅ  ＥＣＤバリアントに結合するそれらの能力について試験した（例えば、そのアミノ酸残基の約１０％がヒトタンパク質と異なる、カニクイザルオルソログ（Ｍｆ抗原Ｅ）；ＥＣＤのＣ末端から最後の１０アミノ酸を欠く抗原Ｅの欠失変異体（抗原Ｅ−ΔＣＴ）；ならびにリガンドＹとの相互作用が疑われる位置にアラニン置換を含む２つの変異体（抗原Ｅ−Ａｌａ１および抗原Ｅ−Ａｌａ２））。抗原Ｅタンパク質はＣＨＯ細胞で生成され、各々はｍｙｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ  Ｃ末端タグを含んでいた。
【０３０９】
結合試験のために、抗ｍｙｃモノクローナル抗体（ＭＡｂ  ９Ｅ１０、ハイブリドーマ細胞系ＣＲＬ−１７２９ＴＭ；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）で共有結合コーティングされた１×１０６個のマイクロスフェア（ＬＵＭＩＮＥＸＴＭ）ビーズと一緒での室温で２時間のインキュベーションによって、１ｍＬの培養培地からの抗原Ｅ  ＥＣＤタンパク質またはバリアントタンパク質（上記）を捕捉した。次に、ビーズを使用前にＰＢＳで洗浄した。抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を含む上清を緩衝液で１：４に希釈し、９６穴フィルタープレートに加えた。抗体のない模擬上清を、陰性対照として用いた。捕捉された抗原Ｅタンパク質を含むビーズを次に抗体試料に加え（ウェルにつき３０００個のビーズ）、４℃で一晩インキュベートした。次の日、試料ビーズを洗浄し、結合した共通軽鎖抗体をＲ−フィコエリトリンとコンジュゲートさせた抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。ビーズの蛍光強度（約１００個のビーズを各抗原Ｅタンパク質への各抗体試料の結合について計数した）は、ＬＵＭＩＮＥＸＴＭフローサイトメトリーベースのアナライザーで測定し、ビーズ／抗体相互作用につき少なくとも１００個の計数されたビーズの中央蛍光強度（ＭＦＩ）を記録した。結果を表１３および１４に示す。
【表１３−１】
2015525071.tif 000022
【表１３−２】
2015525071.tif 000023
【表１３−３】
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【表１４】
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【０３１０】
抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体上清は、抗原Ｅ−ＥＣＤに連結されたビーズへの高特異的結合を示した。これらのビーズについては、陰性対照模擬上清は、抗原Ｅ−ＥＣＤビーズ試料と組み合わせたときは無視できるシグナル（＜１０ＭＦＩ）をもたらしたが、抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を含む上清は、強い結合シグナルを示した（９８個の抗体上清については２６２７の平均ＭＦＩ；９１／９８の抗体試料についてはＭＦＩ＞５００）。
【０３１１】
抗原ＥのＥＣＤの上の異なるエピトープを同定する選択された抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体の能力の測定手段として、バリアントに対する抗体の相対的結合を判定した。天然の抗原Ｅ−ＥＣＤ結合試験について上で記載したように、全４つの抗原Ｅバリアントを抗ｍｙｃ  ＬＵＭＩＮＥＸＴＭビーズに捕捉し、相対的な結合比（ＭＦＩバリアント／ＭＦＩ抗原Ｅ−ＥＣＤ）を判定した。表１２および１３に示す９８個の試験された共通軽鎖抗体上清について、平均比（ＭＦＩバリアント／ＭＦＩ抗原Ｅ−ＥＣＤ）は各バリアントで異なり、ビーズ上でのタンパク質の様々な捕捉量を反映しているようである（抗原Ｅ−ΔＣＴ、抗原Ｅ−Ａｌａ１、抗原Ｅ−Ａｌａ２およびＭｆ抗原Ｅについてそれぞれ０．６１、２．９、２．０および１．０の平均比）。各タンパク質バリアントについて、９８個の試験された共通軽鎖抗体のサブセットの結合は、大きく低減された結合を示し、このことは、所与のバリアントを特徴付けた変異への感度を示した。例えば、共通軽鎖抗体試料の１９個は、＜８％のＭＦＩバリアント／ＭＦＩ抗原Ｅ−ＥＣＤでＭｆ抗原Ｅに結合した。この群の多くは高いか適度に高い親和性の抗体（５個はＫＤ＜５ｎＭ、１５個はＫＤ＜５０ｎＭ）を含むので、この群の低いシグナルは、低い親和性からではなく、天然の抗原Ｅ−ＥＣＤと所与のバリアントとの間の配列（エピトープ）の差への感度から生じるようである。
【０３１２】
表５および６に記載される共通軽鎖抗体が、抗原Ｅの上の複数のエピトープを特異的に認識する抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体の多様な群を表すことを、これらのデータは証明する。
【０３１３】
実施例１１
共通軽鎖抗体における軽鎖のシャッフル
選択した抗原特異的共通軽鎖抗体の重鎖を、生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５または生殖細胞系列Ｖκ３−２０Ｊκ１の操作した軽鎖（実施例１に記載したとおり）のいずれかをこの重鎖と再度対を形成させた後、抗原Ｅに対する結合について試験した。
【０３１４】
簡単に説明すると、抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体（Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１）の２４７の重鎖を、生殖細胞系列Ｖκ１−３９または生殖細胞系列Ｖκ３−２０の操作した軽鎖のいずれかでトランスフェクトし、ＬＵＭＩＮＥＸＴＭアッセイ（実施例７および実施例１０に記載したとおり）により抗原Ｅに対する結合について再度スクリーニングした。抗原Ｅに対する結合を、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭにより確認した（実施例９に記載したとおり）。結果を表１５に示す。
【０３１５】
本実施例に示すように、抗原Ｅに特異的である２８の共通軽鎖抗体は、生殖細胞系列形態の軽鎖と再度対を形成させた場合には、抗原Ｅに結合することができた。
【表１５】
2015525071.tif 000026
【０３１６】
実施例１２
共通軽鎖抗体における重鎖遺伝子の使用頻度および体細胞超変異の頻度
抗体鎖の重鎖遺伝子セグメントの使用頻度と体細胞超変異の頻度を比較するために、ＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１およびＵＳ７，１０５，３４８）の中で惹起させた抗体の重鎖および軽鎖の配列（＞６０００）を、操作された軽鎖マウス（上記）を用いた多抗原免疫スキームにより得られた共通軽鎖抗体の重鎖および軽鎖の配列（＞６００）と集合させた。
【０３１７】
重鎖遺伝子の使用頻度。内因性のマウス重鎖遺伝子座のヒトＶＨ、ＤＨ、およびＪＨ遺伝子セグメントでの置き換え、ならびに、ヒト細胞表面受容体（抗原Ｅ）、２つのヒト細胞表面糖タンパク質のヘテロ二量体（抗原Ｆ）、ヒトサイトカイン受容体（抗原Ｇ）、およびヒト腫瘍分化抗原（抗原Ｈ）で免疫された、操作された生殖細胞系列Ｖκ１−３９Ｊκ５ヒト軽鎖領域または操作された生殖細胞系列Ｖκ３−２０Ｊκ１ヒト軽鎖領域（実施例２に記載したとおり）のいずれかでの内因性のマウスκ軽鎖遺伝子座の置き換えを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスから得た重鎖および軽鎖の配列を、重鎖遺伝子セグメントの使用頻度について分析し、ＶＨおよびＪＨ遺伝子セグメントを記録した。結果を表１６〜１８に示す。表１６〜１８の百分率は丸めた値を表し、いくつかの場合は、まとめて加算しても１００％に等しくない場合がある。
【０３１８】
表１６は、ＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体（ＶＩ）、同系のＶκ１−３９軽鎖を有しているＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体（ＶＩ−Ｖκ１−３９）、Ｖκ１−３９で操作された軽鎖マウス由来の抗体（Ｖκ１−３９）、同系のＶκ３−２０軽鎖を有しているＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体（ＶＩ−Ｖκ３−２０）、およびＶκ３−２０で操作された軽鎖マウス由来の抗体（Ｖκ３−２０）についての百分率での重鎖ファミリーの使用頻度を示す。表１７は、ＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体（ＶＩ）、同系のＶκ１−３９軽鎖を有しているＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体（ＶＩ−Ｖκ１−３９）、Ｖκ１−３９で操作された軽鎖マウス由来の抗体（Ｖκ１−３９）、同系のＶκ３−２０軽鎖を有しているＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体（ＶＩ−Ｖκ３−２０）、およびＶκ３−２０で操作された軽鎖マウス由来の抗体（Ｖκ３−２０）についての、百分率でのＶＨおよびＪＨ遺伝子の使用頻度を示す。表１８は、それぞれの免疫群（抗原Ｅ、Ｆ、Ｇ、およびＨ）由来のＶκ１−３９で操作された軽鎖マウス（Ｖκ１−３９マウス）由来の抗体についての百分率でのＶＨ遺伝子の使用頻度、ならびに、選択された免疫群（抗原ＥおよびＧ）由来のＶκ３−２０で操作された軽鎖マウス（Ｖκ３−２０マウス）由来の抗体についての百分率でのＶＨ遺伝子の使用頻度を示す。
【０３１９】
本実施例に示すように、Ｖκ１−３９Ｊκ５で操作された軽鎖マウスにおいて試験した抗原についての重鎖遺伝子の使用頻度を、ＶＨファミリーＩＩＩサブグループ（ＶＨ３−７、ＶＨ３−９、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、およびＶＨ３−４８）の優勢により特性決定した。他のＶＨファミリーサブグループの注目に値する使用頻度は、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−５、ＶＨ４−５９、およびＶＨ６−１の使用頻度により特性決定した。Ｖκ３−２０Ｊκ１で操作された軽鎖マウスにおいて試験した抗原について、重鎖遺伝子の使用頻度を、ＶＨファミリーＩＩＩ、ＶＨファミリーＩＶ、およびＶＨファミリーＶサブグループ（ＶＨ３−１１、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、およびＶＨ５−５１）の優勢により特性決定した。他のＶＨファミリーサブグループの注目に値する使用頻度は、ＶＨ１−１８、ＶＨ１−６９、ＶＨ２−７０、およびＶＨ６−１の使用頻度により特性決定した。
【０３２０】
体細胞超変異の頻度。ＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスおよび操作した軽鎖マウス（上記）において惹起させた抗体由来の重鎖および軽鎖を、各重鎖および／または軽鎖について明らかになった重鎖および軽鎖遺伝子の使用頻度にしたがって、生殖細胞系列配列に対してアラインした。それぞれの配列の重鎖および軽鎖の両方について、各フレームワーク領域（ＦＷ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸変化を計算した。結果を、表１９〜２２に示す。表２１〜２４の百分率は丸めた値を表し、いくつかの場合は、まとめて加算しても１００％に等しくない場合がある。
【０３２１】
表１９は、ＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体の重鎖、Ｖκ１−３９で操作された軽鎖マウス（Ｖκ１−３９マウス）由来の抗体の重鎖、およびＶκ３−２０で操作された軽鎖マウス（Ｖκ３−２０マウス）由来の抗体の重鎖の、それぞれＦＷ領域およびＣＤＲ領域において観察されたアミノ酸（ＡＡ）変化の数を示す。表２０は、ＶＥＬＣＯＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス由来の抗体の軽鎖、Ｖκ１−３９で操作されたマウス（Ｖκ１−３９マウス）由来の抗体の軽鎖、およびＶκ３−２０で操作されたマウス（Ｖκ３−２０マウス）由来の抗体の軽鎖の、それぞれＦＷ領域およびＣＤＲ領域において観察されたアミノ酸（ＡＡ）変化の数を示す。表２１は、選択した免疫群（抗原Ｅ、Ｆ、およびＨ）について、Ｖκ１−３９で操作された軽鎖マウス（Ｖκ１−３９マウス）由来の抗体の重鎖の、それぞれＦＷ領域およびＣＤＲ領域において観察されたアミノ酸（ＡＡ）の変化の数を示す。表２２は、選択した免疫群（抗原ＥおよびＧ）について、Ｖκ３−２０で操作された軽鎖マウス（Ｖκ３−２０マウス）由来の抗体の重鎖の、それぞれＦＷ領域およびＣＤＲ領域において観察されたアミノ酸（ＡＡ）の変化の数を示す。
【表１６】
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【表１７−１】
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【表１７−２】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【０３２２】
実施例１３
ユニバーサル軽鎖を有している二重特異性抗体の結合親和性
完全ヒト型二重特異性抗体を、当該分野で公知の標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して、選択した単一特異性抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体（実施例５に記載）のクローニングしたヒト重鎖可変領域から構築した。表２３は、選択した親単一特異性抗体由来のヒト重鎖（ＨＣ−１およびＨＣ−２）の対形成を示し、各対を、各二重特異性抗体の構築のために、生殖細胞系列の再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊκ５軽鎖とともに用いた。
【０３２３】
抗原Ｅの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する二重特異性抗抗原Ｅ抗体または親である単一特異性抗抗原Ｅ抗体の結合を、ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ２０００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でのリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを使用して決定した。ＥＤＣ−ＮＨＳ化学を使用して抗ｃ−ｍｙｃ特異的モノクローナル抗体（クローン＃９Ｅ１０）で誘導体化したＣＭ５  ＢＩＡＣＯＲＥＴＭセンサー表面を使用して、抗原ＥのＣ末端のｍｙｃ−ｍｙｃ−ヘキサヒスチジンタグをつけたＥＣＤ（抗原Ｅ−ｍｍｈ）を捕捉した。およそ１９０ＲＵの抗原Ｅ−ｍｍｈがＢＩＡＣＯＲＥＴＭセンサー表面上に捕捉され、続いて、３００ｎＭおよび５０ｎＭの濃度の様々な二重特異性抗抗原Ｅ抗体または親単一特異性抗抗原Ｅ抗体を、５０μｌ／分の流速で注入した。この実験は、ＨＢＳＴランニング緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５ＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖのＳｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）の中で、２５℃で行った。３００ｎＭの濃度での抗原Ｅ−ｍｍｈの表面に対する抗体結合の量を、抗体の注入の終了前に３秒間記録し、プロットした。
【０３２４】
表２４および図８は、それぞれ、二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）および単一特異性親抗体（ＰＡｂ−１、ＰＡｂ−２）について観察された結合応答（ＢＩＡＣＯＲＥＴＭ単位；ＲＵ）を示す。各抗体を、同じ抗原Ｅ−ｍｍｈ表面上に飽和条件下で注入したので、結合応答は、抗原捕捉表面に対する各抗体結合についての結合化学量論を反映する。
【０３２５】
本実施例に示すように、各二重特異性抗体について観察された結合応答は、それぞれの親単一特異性抗体についての結合応答よりも、およそ２倍大きかった（表２４および図８）。このことは、抗原特異的モノクローナル抗体の重鎖と、二重特異性抗体分子の中のそれぞれのＦａｂアームが、細胞表面受容体の細胞外ドメイン上にある異なるエピトープに同時に結合する共通軽鎖を使用した、機能性の二重特異性抗体の構築を実証している（抗原Ｅ；図７Ｂ、左下を参照）。
【表２３】
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【表２４】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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