(57)【要約】本発明は、ｉＮＫＴ細胞アゴニストを用いてのインフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置のための方法及び薬学的組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体に治療有効量のｉＮＫＴ細胞アゴニストを投与することを含む、それを必要とする被験体におけるインフルエンザ後の細菌重複感染の予防処置法。
【請求項２】
ｉＮＫＴ細胞アゴニストがα−ガラクトシルセラミド化合物である、請求項１の方法。
【請求項３】
インフルエンザ感染がインフルエンザウイルスＡ型又はＢ型に関連している、請求項１又は２の方法。
【請求項４】
インフルエンザ感染が、ＨＩＮ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２又はＨ５Ｎ１であるインフルエンザウイルスＡ型によって引き起こされる、請求項３の方法。
【請求項５】
細菌重複感染が、下気道感染、中耳感染及び細菌性副鼻腔炎からなる群より選択される、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
細菌重複感染が、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)；黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)；ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenza；マイコプラズマ種及びモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)からなる群より選択された少なくとも１つの生物によって媒介され得る、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
被験体が、少なくとも５０歳である被験体、長期療養施設に滞在する被験体、肺又は心血管系の慢性疾患を有する被験体、慢性代謝疾病、腎機能不全、ヘモグロビン異常症又は免疫抑制のためにその前の年に定期的な医学的フォローアップ又は入院を必要とした被験体、１４歳未満の小児、長期アスピリン療法を受けている６カ月から１８歳までの患者、及びインフルエンザの季節中に妊娠の２番目又は３番目の三半期にいる女性からなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
１歳を超えかつ１４歳未満の被験体；５０歳から６５歳の被験体、及び６５歳を超える成人におけるインフルエンザ後の細菌重複感染の予防に適した、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
ｉＮＫＴ細胞アゴニストが、抗生物質などの抗菌剤と組み合わせて患者に投与される、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
抗生物質が、セフトリアキソン、セフォタキシム、バンコマイシン、メロペネム、セフェピム、セフタジジム、セフロキシム、ナフシリン、オキサシリン、アンピシリン、チカルシリン、チカルシリン／クラブラン酸（チメンチン）、アンピシリン／スルバクタム（ユナシン）、アジスロマイシン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、クリンダマイシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、シナシッド、アモキシシリン、アモキシシリン／クラブラン酸（オーグメンチン）、セフロキシム、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、アジスロマイシン、クリンダマイシン、ジクロキサシリン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、セフィキシム、セフポドキシム、ロラカルベフ、セファドロキシル、セファブチン（cefabutin）、セフジニル、及びセフラジンからなる群より選択される、請求項９の方法。
【請求項１１】
ｉＮＫＴ細胞アゴニストが気道に投与される、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ｉＮＫＴ細胞アゴニストを用いたインフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置のための方法及び薬学的組成物に関する。
【０００２】
発明の背景：
インフルエンザＡ型ウイルス（ＩＡＶ）感染は、呼吸器疾病の最も重要な原因の１つであり、かつ広範な罹患率及び死亡率に関与している（１）。感染後の最初の数日間の間、宿主は、獲得免疫応答が発達するまでの間、ＩＡＶの複製を封じ込めることを可能とする複雑かつ効果的な自然免疫応答を発達させる（２、３）。しかしながら、その後の時点で、細菌重複感染への易罹患性が高まることにより、ＩＡＶの流行及び大流行の最中に死亡し得る（４〜６）。例えば、細菌性肺炎が、１９１８年の大流行（スペイン風邪）において死亡の大半を占めた（世界中で約２０００万人から４０００万人が死亡）（７）。ＩＡＶ後の細菌重複感染を引き起こす主な細菌種には、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)（肺炎球菌）、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenza)及び黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)がある（５）。個々の種類の細菌には特定の特徴の証拠が存在するが、続発的な細菌感染への易罹患性の増強に至る機序は幅広く、かつ、力学的及び免疫学的防御の変化を含むようである（８〜１０）。実際に、細菌の接着及び侵入に対する物理的バリアの変化（粘膜の変化を含む）並びに細菌が新たに付着するための部位の解説が、記載されている。平行して、宿主自然応答（獲得応答ではなくむしろ）の障害が、インフルエンザによる攻撃後の細菌に関連した肺炎の基本的な特徴である（１１）。インフルエンザ後の細菌重複感染へのインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞の寄与は、依然として理解されていない。
【０００３】
インバリアントＮＫＴ細胞は、特に感染中に、重要な免疫刺激機能及び調節機能を遂行する「自然に似た」ＴＣＲαβリンパ球の集団を示す（総説については（１２〜１４））。これらの細胞は、ＣＤ１ｄ分子によって提示される自己及び外来性（糖）脂質を認識する保存されたＴ細胞レセプターを発現する（総説については（１５〜１９））。ＴＣＲのトリガー並びに特定のストレスによって誘発されたサイトカインに応答して、ｉＮＫＴ細胞は、ＩＮＦ−γ、ＩＬ−４及び／又はＩＬ−１７を含む多種多様なサイトカインを直ちに産生する。このサイトカインの炸裂は、自然系及び獲得系の他の細胞をトランス活性化するのに重要である。ｉＮＫＴ細胞は、肺組織には豊富ではないが、この部位で起こる粘膜免疫における重要な役者として活動するようである。特に、それらは呼吸器のウイルス性及び細菌性病原体に対する宿主防御に活発に関与し得る（１３、１４）。一方で、感染中（２０）及び無菌（２０〜２４）条件において、ｉＮＫＴ細胞はまた、肺炎症及び低下した肺機能に強力に関与し得る。
【０００４】
発明の要約：
本発明は、それを必要とする被験体におけるインフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置に使用するためのｉＮＫＴ細胞アゴニストに関する。
【０００５】
発明の詳細な説明：
インフルエンザＡ型ウイルス（ＩＡＶ）は、病原性細菌性（すなわち肺炎連鎖球菌）感染の素因となり、この感染は、ＩＡＶの季節性流行及び大流行の最中における死亡率の多くを説明する。自然免疫応答は、肺炎連鎖球菌感染を防ぐ上で重要な役割を果たすが、ＩＡＶを経験した宿主における免疫抑制の機序は、生産的な抗肺炎球菌自然免疫を妨げる。本発明者らは、ＩＡＶ攻撃後の実験的細菌重複感染における、強力な免疫調節細胞の一集団であるインバリアントナチュラルキラーＴ（ｉＮＫＴ）細胞の潜在的な役割を調べた。本発明者らは、ｉＮＫＴ細胞は単一感染マウスにおける肺炎連鎖球菌血清型１の感染を制御するが、以前にＩＡＶ（Ｈ３Ｎ２）に感染していたマウスでは制御できなかったことを示す。この後者の作用は、肺炎連鎖球菌による攻撃時におけるｉＮＫＴ細胞活性化（ＩＦＮ−γの産生）の欠如に関連する。ＩＬ−１０の中和（その産生は、ＩＡＶによる攻撃から７日後にピークに達する）により、肺炎連鎖球菌による攻撃中におけるｉＮＫＴ細胞の活性化、並びに、細菌に対する宿主防御は回復した。次に、本発明者らは、スーパーアゴニストα−ガラクトシルセラミドを用いてのｉＮＫＴ細胞の直接的で外来性の刺激が、インフルエンザにより誘発された免疫抑制を逆行させて、肺炎連鎖球菌を制御し得るかどうかを調べた。本発明者らは、ｉＮＫＴ細胞アゴニスト（すなわちα−ガラクトシルセラミド）の投与が、インフルエンザ後の細菌重複感染から防御することを示す。
【０００６】
従って、本発明は、必要とされる被験体におけるインフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置に使用するためのｉＮＫＴ細胞アゴニストに関する。
【０００７】
被験体は、インフルエンザに易罹患性のヒト又は任意の他の動物（例えば鳥類及び哺乳動物）であり得る（例えば、飼育動物、例えばネコ及びイヌ；家畜（livestock）及び家畜（farm animal）、例えばウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）。典型的には、前記被験体は、非霊長類（例えばラクダ、ロバ、シマウマ、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ラット及びマウス）及び霊長類（例えばサル、チンパンジー及びヒト）を含む哺乳動物である。特定の態様において、被験体は非ヒト動物である。いくつかの態様において、被験体は家畜又はペットである。別の態様において、被験体はヒトである。
【０００８】
本発明によると、被験体はインフルエンザに感染している。本明細書において使用される「インフルエンザ感染」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、インフルエンザウイルスによる感染によって引き起こされた疾病を指す。本発明のいくつかの態様において、インフルエンザ感染は、インフルエンザウイルスＡ型又はＢ型に関連する。本発明のいくつかの態様において、インフルエンザ感染は、インフルエンザウイルスＡ型に関連している。本発明のいくつかの特定の態様において、インフルエンザ感染は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２又はＨ５Ｎ１であるインフルエンザウイルスＡ型によって引き起こされる。
【０００９】
本明細書において使用される「予防」又は「予防的使用」及び「予防的処置」という用語は、その目的が疾病を予防することである任意の医学的又は公衆衛生的手順を指す。本明細書において使用される「予防する」、「予防」及び「予防すること」という用語は、所与の容態を獲得又は発症するリスクの低減、病気ではないが、疾病を有する被験体の近くにいたかもしくは近くにいた可能性のある被験体における前記容態の再発の低減又は阻止を指す。
【００１０】
本発明の予防法は、下気道感染（例えば肺炎）、中耳感染（例えば中耳炎）及び細菌性副鼻腔炎などであるがそれらに限定されるわけではない、インフルエンザ後の細菌重複感染の予防に特に適している。細菌重複感染は、数多くの細菌性病原体によって引き起こされ得る。例えば、それらは、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、ヘモフィルス・インフルエンザエ(Haemophilus influenza)、マイコプラズマ種、及びモラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)からなる群より選択された少なくとも１つの生物によって媒介され得る。
【００１１】
本発明の予防法は、少なくとも５０歳である被験体、長期療養施設に滞在する被験体、肺又は心血管系の慢性疾患を有する被験体、慢性代謝疾病（糖尿病を含む）、腎機能不全、ヘモグロビン異常症又は免疫抑制（薬物療法によって又はヒト免疫不全（ＨＩＶ）ウイルスによって引き起こされた免疫抑制を含む）のためにその前の年に定期的な医学的フォローアップ又は入院を必要とした被験体、１４歳未満の小児、長期アスピリン療法を受けている６カ月から１８歳までの患者、及びインフルエンザの季節中に妊娠の２番目又は３番目の三半期にいる女性を含む、インフルエンザ後の細菌重複感染を発症するリスクが高いと同定された被験体に特に適している。より具体的には、本発明の予防法は、１歳以上１４歳未満の被験体（すなわち小児）；５０歳から６５歳の被験体、及び６５歳を超える成人における、インフルエンザ後の細菌重複感染の予防に適していると考えられる。
【００１２】
本明細書において使用される「ｉＮＫＴ細胞アゴニスト」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってＣＤ１ｄで典型的には提示され、特異的にｉＮＫＴ細胞によるサイトカインの産生を促進することのできる、脂質に由来する任意の誘導体又は類似体を指す。典型的には、ｉＮＫＴ細胞アゴニストはα−ガラクトシルセラミド化合物である。
【００１３】
本明細書において使用される「α−ガラクトシルセラミド化合物」すなわち「α−ＧａｌＣｅｒ化合物」という用語は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、様々な長さのアシル鎖及びスフィンゴシン鎖を有するセラミド脂質にα結合によって付着したガラクトース糖を含むスフィンゴ糖脂質に由来する任意の誘導体又は類似体を指す（Van Kaer L. α -Galactosylceramide therapy for autoimmune diseases: Prospects and obstacles. Nat. Rev. Immunol. 2005; 5: 31-42）。
【００１４】
様々な刊行物がα−ガラクトシルセラミド化合物及びその合成を記載している。このような参考文献の例示的であるが決して網羅的なリストなものではないリストには、Morita, et al., J. Med. Chern., 25 38:2176 (1995); Sakai, at al., J. Me d. Chern., 38:1836 (1995); Morita, et al., Bioorg. Med. Chern. Lett., 5:699 (1995); Takakawa, etal., Tetrahedron, 54:3150 (1998); Sakai, at al., Org. Lett., 1:359 (1998); Figueroa-Perez, et al., Carbohydr. Res., 328:95 (2000); Plettenburg, at al., J. Org. Chern., 67:4559 (2002); Yang, at al., Angew. Chern., 116:3906 (2004); Yang, at al., Angew. Chern. Int. Ed., 43:3818 (2004); and, Yu, etal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 102(9):3383-3388 (2005)が含まれる。
【００１５】
α−ガラクトシルセラミド化合物の例を記載した特許及び特許出願の例としては、米国特許第5,936,076号;米国特許第6,531,453号、米国特許第5,S53,737号、米国特許第8,022,043号、米国特許出願第2003030611号、米国特許出願第20030157135号、米国特許出願第20040242499号、米国特許出願第20040127429号、米国特許出願第20100104590号、欧州特許第EP0609437号及び国際特許出願第W02006026389号が挙げられる。
【００１６】
典型的なα−ガラクトシルセラミド化合物は、ＫＲＮ７０００（（２Ｓ ３Ｓ，４Ｒ）−１−０−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−Ｎ−ヘキサコサノイル−２−アミノ−１，３，４−オクタデカントリオール））（KRN7000, a novel immunomodulator, and its antitumor activities. Kobayashi E, Motoki K, Uchida T, Fukushima H, Koezuka Y. Oncol Res. 1995;7(10-11):529-34)である。
【００１７】
他の例には以下が含まれる：
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラコサノイルアミノ−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−２−ドコサノイルアミノ（docosanoylamina）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−イコサノイルアミノ−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−オクタデカノイルアミノ−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−２−デカノイルアミノ−１−（ａ−Ｄ−４０ガラクトピラノシルオキシ）−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラコサノイルアミノ−３−テトラデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−３−ヘキサデカノール、
（２Ｒ，３Ｓ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−３−ヘキサデカノール、
（２Ｓ，３Ｓ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−３−ヘキサデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２［（Ｒ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−オクタデカノイルアミノ−４−オクタデセン−３−オール、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｅ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−４−オクタデセン−３−オール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラコサノイルアミノ−３，４−オクタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラコサノイルアミノ−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラコサノイルアミノ−３，４−ペンタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラコサノイルアミノ−３，４−ウンデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−ヘキサコサノイルアミノ−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−３，４−オクタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−３，４−ペンタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−３，４−ウンデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシヘキサコサノイルアミノ］−３，４−オクタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシヘキサコサノイルアミノ］−３，４−ノナデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシヘキサコサノイルアミノ］−３，４−イコサンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｓ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−３，４−ヘキサデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｓ）−２−ヒドロキシテトラコサノイルアミノ］−１６−メチル−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−１６−メチル−２−テトラコサノイルアミノ−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシトリコサノイルアミノ］−１６−メチル−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−［（Ｒ）−２−ヒドロキシペンタコサノイルアミノ］−１６−メチル−３，４−オクタデカンジオール、
（２Ｓ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−オレオイルアミノ−３−オクタデカノール、
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−ヘキサコサノイルアミノ−３，４−オクタデカンジオール；
（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−オクタコサノイルアミノ−３，４−ヘプタデカンジオール、
（２Ｒ，３Ｒ）−１−（α−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシ）−２−テトラデカノイルアミノ−３−ヘキサデカノール、
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−ヘキシル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−３，４−ジヒドロキシオクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール；
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−ヘプチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−３，４−ジヒドロキシオクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール；
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−２−（４−ヘキサデシル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）−３，４−ジヒドロキシオクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール；
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（４−トリコシル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール；
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（４−テトラコシル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４，５−トリオール；
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（４−ペンタコシル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール；
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（４−（６−フェニルヘキシル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール；
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（４−（７−フェニルヘプチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール；
（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−２−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−２−（４−（８−フェニルオクチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−１−イル）オクタデシルオキシ）−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−３，４，５−トリオール；
１１−アミノ−Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２８−ピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）ウンデカンアミド；
１２−アミノ−Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−オキシ）オクタデカン−２−イル）ドデカンアミド；
Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）−１１−ヒドロキシウンデカンアミド；
Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）−１２−ヒドロキシドデカンアミド；
８−（ジヘプチルアミノ）−Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）オクタンアミド；
Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）−１１−（ジペンチルアミノ）ウンデカンアミド；
１１−（ジヘプチルアミノ）−Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）ウンデカンアミド；
Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）−１１−メルカプトウンデカンアミド；
Ｎ−（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−１−（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，５Ｒ）−３，４，５−ジヒドロキシ−６−ヒドロキシメチル）−テトラヒドロ−２Ｈピラン−２−イルオキシ）オクタデカン−２−イル）−１２−メルカプトドデカンアミド。
【００１８】
いくつかの態様において、α−ガラクトシルセラミド化合物はＰＥＧ化されている。本明細書において使用される「ＰＥＧ化」という用語は、化合物部分（すなわちα−ガラクトシルセラミド化合物）と、少なくとも１つのポリアルキレン単位を含むコンジュゲート部分（群）とのコンジュゲーションを指す。特に、ＰＥＧ化という用語は、化合物部分（すなわちα−ガラクトシルセラミド化合物）と、少なくとも１つのポリエチレングリコール単位を有するコンジュゲート部分とのコンジュゲーションを指す。
【００１９】
本発明は、患者に治療有効量の少なくとも１つのｉＮＫＴ細胞アゴニストを投与する工程を含む、それを必要とする被験体におけるインフルエンザ後の細菌重複感染の予防的処置法に関する。
【００２０】
「治療有効量」によって、任意の医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比でインフルエンザ後の細菌重複感染を予防するのに十分な量のα−ガラクトシルセラミド化合物を意味する。
【００２１】
本発明の化合物及び組成物の全１日使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で担当医師によって決定されることが理解されるだろう。任意の特定の患者についての具体的な治療有効投与量レベルは、患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別及び食事；使用される具体的な化合物の投与時刻、投与経路及び排泄速度；処置期間；使用される具体的なポリペプチドと組み合わせて又は同時に使用される薬物；及び医学分野において周知である同様な因子を含む、様々な因子に依存するだろう。例えば、所望の治療効果を達成するのに必要とされるレベルよりも低いレベルで化合物の投薬を始め、所望の効果が達成されるまで投与量を次第に増加させることは当技術の技能範囲内であることは周知である。しかしながら、製品の１日量は、成人１人あたり１日あたり、０．０１〜１，０００mgの幅広い範囲に及び変化し得る。好ましくは、前記組成物は、処置される患者への投与量の症候による調整のために０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、２５０及び５００mgを含む。医薬品は、典型的には、約０．０１mgから約５００mgの活性成分、好ましくは１mgから約１００mgの活性成分を含む。薬物の有効量は、通常、１日あたり０．０００２mg/kgから約２０mg/kg（体重）、特に１日あたり約０．００１mg/kgから７mg/kg（体重）の投与量レベルで供給される。
【００２２】
いくつかの態様において、本発明によるｉＮＫＴ細胞アゴニストは、抗生物質などの抗菌剤と組み合わせて患者に投与される。本発明によるｉＮＫＴ細胞アゴニストと組み合わせて共投与され得る適切な抗生物質としては、セフトリアキソン、セフォタキシム、バンコマイシン、メロペネム、セフェピム、セフタジジム、セフロキシム、ナフシリン、オキサシリン、アンピシリン、チカルシリン、チカルシリン／クラブラン酸（チメンチン）、アンピシリン／スルバクタム（ユナシン）、アジスロマイシン、トリメトプリム−スルファメトキサゾール、クリンダマイシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、シナシッド、アモキシシリン、アモキシシリン／クラブラン酸（オーグメンチン）、セフロキシム、トリメトプリム／スルファメトキサゾール、アジスロマイシン、クリンダマイシン、ジクロキサシリン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、セフィキシム、セフポドキシム、ロラカルベフ、セファドロキシル、セファブチン（cefabutin）、セフジニル、及びセフラジンからなる群より選択された少なくとも１つの抗生物質が挙げられるがそれらに限定されるわけではない。
【００２３】
いくつかの態様において、本発明によるｉＮＫＴ細胞アゴニストは、抗炎症剤又は免疫調節剤、例えばＮＳＡＩＤ、アスピリン、糖質コルチコイド、メトトレキサート、Ｔｏｌｌ様レセプター（すなわちＴＬＲ１、２、３、４、５、６、７、８、又は９）アゴニスト又はアンタゴニスト、腫瘍壊死因子αレセプター（ＴＮＦ−α）アンタゴニスト又はインターロイキン１（ＩＬ１）レセプターアンタゴニストと組み合わせて患者に投与される。例えば、ＴＮＦ−αレセプターアンタゴニストは、中和性（好ましくは枯渇させない）抗ＴＮＦα抗体、例えばアダリムマブ（ヒュミラ（登録商標））又はセルトリズマブペゴル（シムジア（登録商標））であり得、ＩＬ−１レセプターアンタゴニストはアナキンラ（Kineret（登録商標））であり得る。
【００２４】
α-ガラクトシルセラミド化合物は、薬学的に許容される賦形剤及び場合により持続放出マトリックス、例えば生分解性ポリマーと組み合わせて、薬学的組成物を形成し得る。
【００２５】
「薬学的に」又は「薬学的に許容される」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与される場合に、有害反応、アレルギー反応又は他の望ましくない反応を生じない分子実体及び組成物を指す。薬学的に許容される担体又は賦形剤は、任意のタイプの無毒性の固体、半固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、封入材料又は製剤化助剤を指す。
【００２６】
経口、舌下、皮下、鼻腔内、筋肉内、静脈内、経皮、局所又は直腸投与のための本発明の薬学的組成物において、活性成分を単独で又は別の活性成分と組み合わせて、単位投与剤形で、慣用的な薬学的支持体との混合物として、動物及びヒトに投与することができる。適切な単位投与剤形は、経口経路剤形、例えば錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤、及び経口用懸濁剤もしくは液剤、舌下及び頬側投与剤形、エアゾール剤、埋込剤、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、くも膜下腔内及び鼻腔内投与剤形及び直腸投与剤形を含む。
【００２７】
好ましくは、薬学的組成物は、注射することのできる製剤にとって薬学的に許容されるビヒクルを含む。これらは、特に、等張で無菌の食塩水溶液（リン酸一ナトリウム又は二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムもしくは塩化マグネシウムなど、又はこのような塩の混合物）、又は場合に応じて滅菌水もしくは生理食塩水の添加時に注射溶液の構成を可能とする乾燥させた、特に凍結乾燥させた組成物であり得る。
【００２８】
注射用途に適した剤形は、無菌水溶液又は分散液；ゴマ油、ピーナッツ油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び、無菌注射溶液又は分散液の即時調製のための無菌粉末を含む。全ての場合において、剤形は無菌でなければならず、シリンジが容易に扱える程度まで流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、それは細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から防腐されていなければならない。
【００２９】
遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての本発明の化合物を含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製され得る。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びその混合物中で及び油中で調製されてもよい。通常の保存及び使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
【００３０】
α−ガラクトシルセラミド化合物は、天然形又は塩形の組成物へと製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と共に形成される）が挙げられ、これは例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、又は、例えば酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸を用いて形成される。遊離カルボキシル基を用いて形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、又は水酸化鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基から導かれ得る。
【００３１】
担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防御は、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の延長吸収は、組成物に、吸収を遅延する物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを使用することによってもたらされ得る。
【００３２】
無菌注射溶液は、必要量の活性ポリペプチドを、適切な溶媒中に、必要であれば上記に列挙された他のいくつかの成分と共に取り込み、その後、滅菌ろ過することによって調製される。一般的に、分散液は、様々な滅菌された活性成分を、基本分散媒体及び上記に列挙された中の必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクルに取り込むことによって調製される。無菌注射溶液の調製のための無菌粉末の場合、好ましい調製法は真空乾燥技術及び凍結乾燥技術であり、これにより、以前に滅菌ろ過されたその溶液から、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。
【００３３】
製剤時に、溶液は、投与製剤に適合性の様式で、治療有効量で投与される。製剤は、様々な剤形で、例えば、上記したようなタイプの注射液で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども使用され得る。
【００３４】
水溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は、必要であれば適切に緩衝化されるべきであり、液体はまず十分な食塩水又はグルコースを用いて等張とすべきである。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用され得る無菌水性媒体は、本開示に鑑みて当業者には公知である。例えば、１用量を、１mlの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００mlの皮下点滴液に加え得るか又は提案された注入部位に注射するかのいずれかを行ない得る。投与量のいくぶんの変動は、処置される被験体の容態に依存して、必然的に生じるだろう。投与責任者が、任意の事象において、個々の被験体に対する適切な投与量を決定するだろう。
【００３５】
薬学的組成物はまた、気道に投与され得る。気道は、上気道（鼻、中咽頭及び咽頭を含む）、続いて下気道（これはその後、気管支及び細気管支へと分岐される気管を含む）を含む。肺送達用組成物は、患者による分散液の吸入によって送達され得、よって、分散液中の活性成分は肺に到達し得、そこでそれは例えば、肺胞領域を通して直接血液循環中へと容易に吸収され得る。肺送達は、噴霧製剤、エアゾール化製剤、ミセル製剤及び乾燥粉末に基づいた製剤の使用を含む種々のアプローチによって行なわれ得；吸入による投与は、経口及び／又は鼻腔であり得る。送達は、液体噴霧器、エアゾールをベースとした吸入器、及び乾燥粉末分散装置を用いて行なわれ得る。定量装置が好ましい。噴霧器又は吸入器を使用する利点の１つは、装置が内蔵型であるため汚染の可能性が最小限になることである。乾燥粉末分散装置は、例えば、乾燥粉末として容易に製剤化され得る薬物を送達する。本発明の薬学的組成物は、凍結乾燥又は噴霧乾燥粉末として、単独で、又は適切な粉末担体と組み合わせて安定に保存され得る。吸入用の本発明の薬学的組成物の送達は、装置に取り込まれると、エアゾール医薬品投与中における投与量の追跡、コンプライアンスのモニタリング、及び／又は患者への投与のトリガーを可能とする、タイマー、用量計測器、時間測定装置、又は時間表示器を含み得る投与タイミング要素（dosing timing element）によって媒介され得る。エアゾール送達用の薬学的装置の例としては、定量吸入器（ＭＤＩ）、乾燥粉末吸入器（ＤＰＩ）及びエアジェット噴霧器が挙げられる。
【００３６】
α−ガラクトシルセラミド化合物は、１用量あたり約０．０００１〜１．０mg又は約０．００１〜０．１mg、又は約０．１から１．０、又はさらには約１０mgなどを含むように治療混合物内で製剤化され得る。複数の投与量を投与してもよい。
【００３７】
いくつかの態様において、薬学的組成物は、上記したような抗菌剤（例えば抗生物質）を含む。
【００３８】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明されるだろう。しかしながら、これらの実施例及び図面は、いずれにしても本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】肺炎連鎖球菌による攻撃に対するα−ＧａｌＣｅｒにより媒介される防御。マウスをＩＡＶ（５０ＰＦＵ）に感染させ（又は感染させず）、肺炎連鎖球菌への暴露（１×１０４個のＣＦＵ）の２４時間前に（インフルエンザから７日後）、マウスはα−ＧａｌＣｅｒ（２μg）又は対照としてのＰＢＳを受けた（鼻腔内経路）。カプランマイヤー生存曲線の比較についてのログランク検定は、ＰＢＳで処置されたマウスと比較して、α−ＧａｌＣｅｒで処置されたＷＴマウスの生存率の有意な増加を示した。＊＊＊、ｐ＜０．００１（ｎ＝１５匹のマウス／群）。
【００４０】
実施例：
材料及び方法
試薬及び抗体
α−ＧａｌＣｅｒは、Axxora Life Sciences製(Coger, Paris, France)であった。マウスＣＤ５（ＡＰＣとの抱合型）、ＮＫ１．１（ＰＥ又はＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５との抱合型）、ＴＣＲ−β（ＦＩＴＣ又はＶ４５０との抱合型）、ＣＤ６９（ＰｅｒＣｐ−Ｃｙ５．５との抱合型）、ＣＤ４５（ＦＩＴＣ又はｅＦｌｕｏｒ６０５ＮＣとの抱合型）、ＣＤ１１ｃ（ＡＰＣとの抱合型）、Ｆ４／８０（ＰＥ−Ｃｙ７との抱合型）、ＭＨＣクラスＩＩ（パシフィックブルーとの抱合型）、ＣＤ１１ｂ（Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５との抱合型）、Ｌｙ６Ｃ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−７００との抱合型）、ＣＣＲ２（ＡＰＣとの抱合型）、ＩＦＮ−γ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８との抱合型）、ＩＬ−１７Ａ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−６４７との抱合型）に対するモノクローナル抗体及びアイソタイプ対照は、BD Pharmingen (Le Pont de Claix, France)から購入した。ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Fixable Dead Cell Stain Kitは、Invitrogen (Cergy Pontoise, France)から購入した。ＰＥと抱合したＰＢＳ−５７糖脂質のローディングされたＣＤ１ｄテトラマーは、NIAID Tetramer Facility製 (Emory University, Atlanta, GA)であった。
【００４１】
マウス
８週令の雄の野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Janvier (Le Genest-St-Isle, France)から購入した。Ｊα１８−/−マウスは（２５）に記載されている。インフルエンザウイルス及び肺炎連鎖球菌による感染のために、マウスを、リールにあるパスツール研究所の動物資源センターのバイオセーフティレベル２の施設で維持した。全ての動物の研究は、リールにあるパスツール研究所の動物の管理と使用に関する委員会ガイドラインに従った（Comite d'Ethique en Experimentation Animale Nord Pas-De-Calaisの契約番号N°AF 16/20090）。
【００４２】
ｉＮＫＴ活性化の分析
肺単核細胞（ＭＮＣ）を記載の通りに調製した（２６）。ｉＮＫＴ細胞を分析するために、ＭＮＣ懸濁液を、ＰＥと抱合したＰＢＳ−５７のローディングされたＣＤ１ｄテトラマー及びＶ４５０で標識された抗ＴＣＲ−βの適切な希釈液と共に３０分間、２％ＦＣＳ及び０．０１％ＮａＮ３を含むＰＢＳ中でインキュベーションした。細胞を洗浄し、ＩＣ固定緩衝液（eBioscience, CliniSciences, Montrouge, France）を使用して固定した。その後、固定した細胞を、製造業者の指示に従って、透過緩衝液（eBioscience）中で透過処理した。細胞を洗浄し、ＩＦＮ−γに対するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ−４８８及び６４７の結合したｍＡｂ又は対照ラットＩｇＧ１ｍＡｂと共に透過緩衝液中でインキュベーションした。細胞を獲得し、ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）ソフトウェアを使用してLSRFortessa（登録商標）（Becton Dickinson, Rungis, France）血球計測器で分析した。
【００４３】
肺及び肝のｉＮＫＴ細胞の調製及び養子移植
ｉＮＫＴ細胞を精製するために、肝又は肺ＭＮＣを、ＰＥと抱合したＰＢＳ−５７のローディングされたＣＤ１ｄテトラマー及びＦＩＴＣの結合した抗ＴＣＲβ抗体を用いて標識した。細胞表面を標識した後、細胞を、FACSAria (BD Biosciences)を使用して選別した。選別後のＰＢＳ５７のローディングされたＣＤ１ｄテトラマー＋ＴＣＲβ＋細胞純度は一貫して＞９８％であった。レシピエントマウスに、１×１０６個の精製された肝ｉＮＫＴ細胞を静脈内に又は３．５×１０４個の精製された肺ｉＮＫＴ細胞を気管内にいずれかで接種した。
【００４４】
ＩＡＶ感染及び定量ＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現の評価
マウスを麻酔し、５０プラーク形成単位（ＰＦＵ）のウイルス（スコットランド/２０/７４、Ｈ３Ｎ２）を含む５０μlのＰＢＳを鼻腔内に投与した（２７）。偽処置又はＩＡＶ感染マウスの全肺からの全ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡを古典的な手順によって合成した。定量ＲＴ−ＰＣＲを、０．５μMの特異的プライマー及びQuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen)を使用して、ＡＢＩ７５００サーモサイクラー（Applied Biosystems, Foster City, CA）で実施した。ｇａｐｄｈのＰＣＲ増幅を実施して、試料ローディングの制御及び試料間の標準化を可能とした。ΔＣｔ値は、内部標準物質であるｇａｐｄｈｍＲＮＡについて得られた生のサイクル閾値（Ｃｔ値）を推定することによって、調べた遺伝子について得られたＣｔ値から得られた。グラフ表示については、データは、偽処置マウスにおける発現レベルと比較した、ｍＲＮＡレベルの増加倍数として表現される。
【００４５】
肺炎連鎖球菌による感染及び細菌数の評価
肺炎連鎖球菌血清型１（臨床単離株Ｅ１５８６）（２８）感染のために、マウスを麻酔し、細菌（１×１０６個のコロニー形成単位、ＣＦＵ）を含む５０μlのＰＢＳを鼻腔内投与した。マウスを７日間の期間に及び病気及び死亡率について毎日モニタリングした。肺への細菌負荷は、血液寒天プレート上に肺ホモジネートの１０倍連続希釈液を蒔くことによって、感染から２４時間後に測定された。プレートを３７℃で一晩インキュベーションし、２４時間後にＣＦＵを数えた。
【００４６】
ＩＡＶ後の細菌重複感染
３、７、１４又は２８日前にＩＡＶ（５０ＰＦＵ）を感染させた又は感染させていないマウスに、１×１０４個の肺炎連鎖球菌血清型１を鼻腔内に接種した。肺における生細菌数は、肺炎連鎖球菌への暴露から２４時間後に決定された。生存研究のために、マウスを、ＩＡＶによる感染から７日後に１×１０４個の肺炎連鎖球菌に感染させた。マウスを、１５日間の期間に及び病気及び死亡率について毎日モニタリングした。
【００４７】
呼吸器ＤＣ及び炎症性単球の分析
マウスをＩＡＶ感染の７日後に屠殺した。簡潔に言えば、肺ＭＮＣを、製造業者のプロトコールに従って、Live/Dead cell viability kitを用いて死滅細胞について最初に標識した。ＤＣの同定を可能とするために、その後、肺ＭＮＣを、ＦＩＴＣに結合した抗ＣＤ４５抗体、ＡＰＣに結合した抗ＣＤ１１ｃ抗体、ＰＥ−Ｃｙ７に結合した抗Ｆ４／８０抗体及びパシフィックブルーに結合した抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体の適切な希釈液を用いて標識した。炎症性単球／ＤＣの同定のために、ＭＮＣを、ＦＩＴＣに結合した抗ＣＤ４５抗体、ＰＥ−Ｃｙ７に結合した抗Ｆ４／８０抗体、Ｐｅｒｃｐ−Ｃｙ５．５に結合したＣＤ１１ｂ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−７００に結合した抗Ｌｙ６Ｃ抗体、及びＡＰＣに結合した抗ＣＣＲ２抗体を用いて標識した。その後、細胞を、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用してLSR Fortessa (BD Biosciences)で分析した。
【００４８】
ＩＬ−１０Ｒの中和
ＩＡＶ感染マウスに、１mgのラット抗ＩＬ−１０Ｒ（１Ｂ１．３Ａ）又はアイソタイプ対照ｍＡｂ（ＨＲＰＮ）(BioXcell, West Lebanon, NH)を、肺炎連鎖球菌による感染の２４時間前に注射した。
【００４９】
統計分析
結果を平均値±ＳＤ又は±ＳＥＭとして表現する。実験群間の統計学的有意差は、ＡＮＯＶＡと、ボンフェローニポスト検定又は独立スチューデントｔ検定によって計算された（GraphPad Prism 5 Software, San Diego, USA）。これらのパラメトリック検定の使用の妥当性は、集団がガウスであり、かつ分散が均一かどうかを確認することによって評価された（バートレット検定）。マウスの生存率を、カプランマイヤー分析及びログランク検定を使用して比較した。０．０５未満のｐ値を含む結果を有意と判断した。
【００５０】
結果
呼吸器樹状細胞はｉＮＫＴ細胞を活性化して、感染後初期の肺炎連鎖球菌の排除を制御する
本発明者らはまず、実験的肺炎連鎖球菌血清型１感染中の肺ｉＮＫＴ細胞の活性化状態及び可能性ある役割を測定した。偽処置マウスと比較して、ｉＮＫＴ細胞は肺炎連鎖球菌への暴露から３６時間後に、より多くの細胞表面ＣＤ６９を発現し、かつ細胞内ＩＦＮ−γを蓄積した。これに対し、ｉＮＫＴ細胞は、ＩＬ−４については依然として陰性であったが、少数のｉＮＫＴ細胞のみがＩＬ−１７を産生した。ＡＰＣの中で、ＤＣは多くの状況においてｉＮＫＴ細胞の活性化に重要であることが報告されている（１２、２９）。肺炎連鎖球菌感染に関連した呼吸器ＤＣの可能性ある役割を調べるために、トランスジェニックＣＤ１１ｃ．ＤＴＲマウスを使用した。ジフテリア毒素による処置は、肺組織中の呼吸器ＤＣを強力に枯渇させ、これにより、肺炎連鎖球菌に応答したｉＮＫＴ細胞活性化は完全に抑止された。
【００５１】
肺炎連鎖球菌の制御におけるｉＮＫＴ細胞の天然の役割を伝えるために、ＷＴ及びＪα１８−/−マウスに肺炎連鎖球菌を感染させ、生存率について毎日モニタリングした。使用された用量では、ＷＴ動物の６５％が感染から生き延びたが、ほぼ全てのｉＮＫＴ細胞欠損動物は感染に屈した。この増強された死亡率は、肺組織中の肺炎連鎖球菌を排除する能力が低下していることに関連していた。ナイーブｉＮＫＴ細胞をＪα１８−/−マウスに養子移植することにより、宿主の防御機序が回復し、これは肺中の生細菌の決定によって評価された。総合すると、ＤＣによるｉＮＫＴ細胞の内因性活性化は、肺炎連鎖球菌に対する早期の宿主防御機序をトリガーするのに重要である。
【００５２】
ｉＮＫＴ細胞は、ＩＡＶと肺炎連鎖球菌との間の致命的な相乗作用において有害な役割を果たさない
インフルエンザ後の細菌重複感染におけるｉＮＫＴ細胞の可能性ある正又は負の役割を研究する前に、本発明者らは、ウイルスへの曝露と細菌への曝露との間の最適なタイミングを決定して、細菌重複感染を達成した。このために、動物に、軽度で自然治癒的な用量のＩＡＶ（５０ＰＦＵ）を感染させ、その後、致死量以下の肺炎連鎖球菌（１×１０４個のＣＦＵ）を用いて、ウイルス感染後の種々の時点において重複感染させた。インフルエンザから７日後に肺炎連鎖球菌により攻撃されたマウスは、肺内に多数の生細菌を有していたが、３日後に感染させた動物は完全に細菌を排除した。特に、ＩＡＶの２及び４週間後に感染させたマウスは、細菌複製を制御する低い能力を有していたが、肺内の細菌数は、７日間前にＩＡＶを受けていたマウスに見られたものと比較して低かった。残りの研究のために、肺炎連鎖球菌を、ＩＡＶの７日後に投与した。
【００５３】
ＩＡＶによる感染後に起こる続発性細菌感染の最中における致命性を説明する理由の中に、悪化した肺感染及び組織傷害が提唱されている（総説については（８））。ｉＮＫＴ細胞は、いくつかの病的状況において肺炎症に対して負の効果を発揮し得るので（２０〜２４、３０、３１）、本発明者らはまず、これらの細胞が、肺炎を増強することによる細菌重複感染において有害な役割を果たし得るかどうかという可能性を調べた。使用される用量では、ＩＡＶ及び肺炎連鎖球菌によるＷＴマウス及びＪα１８−/−マウスの単一感染によってマウスは死滅しなかった。これに対し、ＷＴマウスをＩＡＶに感染させ、７日後に、肺炎連鎖球菌に感染させると、共感染したマウスは、肺炎連鎖球菌感染から２日後から５日後の間に死滅した。死亡率は肺炎及び肺の炎症の発症に相関した。２つの因子による感染は、Ｊα１８−/−マウスにおける肺炎及び肺の炎症も、死亡率も死亡のタイミングも有意に改変させなかったが、いくつかの実験においてより加速された死亡の傾向が、Ｊα１８−/−マウスにおいて認められた。ＣＦＵ数の分析は、Ｊα１８−/−マウスにおいて増加しているが、有意ではない、生細菌の増強を示した。従って、ｉＮＫＴ細胞の非存在は、ＩＡＶによる攻撃後の細菌重複感染に関連した病態を寛解させず、このことはこれらの細胞が、この状況において負の役割を果たしていないことを示唆する。
【００５４】
ＩＡＶを経験したマウスに由来する肺ｉＮＫＴ細胞は、肺炎連鎖球菌による攻撃時に活性化状態となることができなかった
上記した実験はまた、ｉＮＫＴ細胞が、ＩＡＶを経験したマウスにおける肺炎連鎖球菌感染の制御において正の役割を果たしていないことを示唆し、この状況は、ｉＮＫＴ細胞が肺炎連鎖球菌の早期発症を明瞭に制御したナイーブマウスとは対照的である。本発明者らはまず、これが、肺炎連鎖球菌感染時における肺におけるｉＮＫＴ細胞の数が少ないことに起因し得ると仮定した。肺ｉＮＫＴ細胞数は、ＩＡＶ感染から７日後に有意に改変されなかった。しかしながら、ＩＡＶを経験した動物からの肺ｉＮＫＴ細胞は、肺炎連鎖球菌による攻撃に応答して活性化されなかった。実際に、二重感染動物からのｉＮＫＴ細胞はＩＦＮ−γを産生せず、一方、肺炎連鎖球菌にのみ感染したマウスは産生した。興味深いことに、ｉＮＫＴ細胞活性化の欠如は、肺組織における劇的に減少した呼吸器ＤＣ数と関連していた。他方で、高いレベルのＣＤ１ｄを発現する炎症性単球／ＤＣ（CD11bhi CCR2+ Ly6c+ CD11c+/-）の大量浸潤が観察された。要するに、これらのデータは、ＩＡＶ感染は、ｉＮＫＴ細胞が、肺炎連鎖球菌による攻撃に応答して活性化する能力を損なうことを示唆する。
【００５５】
ＩＡＶ感染マウスへのナイーブｉＮＫＴ細胞の移植は、肺炎連鎖球菌に対する宿主の防御を回復させることができなかった
以前にＩＡＶで感染させておいたマウスにおける肺ｉＮＫＴ細胞は肺炎連鎖球菌感染の脈絡において機能的ではないので、本発明者らは、新鮮なｉＮＫＴ細胞の移植が、肺炎連鎖球菌に対する宿主防御機序を回復させ得るかどうかの可能性を調べた。以前にＩＡＶに感染させたマウスの気道へのナイーブ肺ｉＮＫＴ細胞の養子移植は、インフルエンザで損なわれた抗細菌宿主防御を回復させなかった。なぜなら、移植マウスにおける細菌数は減少しなかったからである。さらに、静脈内経路によって肝ｉＮＫＴ細胞の移植されたマウスは、肺炎連鎖球菌に対する効果的な免疫を促進することができなかった。これらの実験は、肺炎連鎖球菌による攻撃時にｉＮＫＴ細胞活性化を失わせることのできる局所的免疫抑制機序が、ＩＡＶ感染マウスの肺において発達することを示唆した。
【００５６】
ＩＬ−１０の発現は、ｉＮＫＴ細胞によるＩＦＮ−γの放出をおそらく無効にすることによって、細菌重複感染を支援する
可能性ある免疫抑制候補の中で、本発明者らはまず、Ｈ１Ｎ１インフルエンザ後の細菌重複感染において負の役割を果たすと記載されているサイトカインであるＩＬ−１０に焦点を当てた（３２、３３）。ＩＬ−１０ｍＲＮＡの発現は、ＩＡＶから７日後にピークに達し、この時点は、細菌易罹患性のピークと一致する。より重要なことには、抗ＩＬ−１０Ｒ抗体の使用は、肺炎連鎖球菌に対して防御するＨ３Ｎ２ＩＡＶ感染マウスの能力を部分的に回復させた。実際に、抗ＩＬ−１０Ｒで処置された二重感染マウスの生存率は、アイソタイプ対照で処置されたマウスと比較して約６０％増強された。同様に、ＩＬ−１０Ｒ機能の遮断により、肺組織内の細菌数は減少した。
【００５７】
インフルエンザ中のＩＬ−１０の産生と肺炎連鎖球菌による攻撃後のｉＮＫＴ細胞活性化の欠如との間の可能性ある連関を確立するために、ＩＡＶ感染マウスを、肺炎連鎖球菌感染の直前に抗ＩＬ−１０Ｒ抗体で処置した。顕著には、この処置により、ＩＦＮ−γ産生の点でｉＮＫＴ細胞活性化は完全に回復した。要するに、これらのデータは、ＩＬ−１０が、ＩＡＶ経験動物における肺ｉＮＫＴ細胞の活性化を妨害する主な因子であることを実証し、これは、インフルエンザ後の細菌感染への易罹患性の増強に至り得る現象である。
【００５８】
α−ＧａｌＣｅｒによるｉＮＫＴ細胞の内因性活性化は、インフルエンザ後の細菌重複感染から防御する
本発明者ら及び他者は、α−ＧａｌＣｅｒによる肺ｉＮＫＴ細胞の内因性活性化により、高用量の細菌による感染後に肺炎連鎖球菌が排除されることを示した（１２、３４）。以前のインフルエンザ感染の脈絡におけるα−ＧａｌＣｅｒの可能性ある防御的な効果は依然として研究されていない。本発明者らはまず、肺免疫抑制環境が、α−ＧａｌＣｅｒに応答したｉＮＫＴ細胞活性化の勢いを弱めるかどうかを調べた。ＩＡＶ経験動物からのｉＮＫＴ細胞は、ナイーブ動物に由来するｉＮＫＴ細胞と同じレベルのＩＦＮ−γを産生した。さらに、α−ＧａｌＣｅｒの投与は、増強された生存率によって評価されるように、肺炎連鎖球菌による攻撃から約７０％防御した（図１）。総合すると、α−ＧａｌＣｅｒによるｉＮＫＴの内因性活性化は、ＩＡＶにより課される肺における免疫抑制環境を逆転させ、細菌重複感染から防御する。
【００５９】
考察：
続発性細菌感染は、しばしば、肺におけるＩＡＶ感染後に起こり、ヒトにおける重度の疾病の一般的な原因であるが、肺におけるこのウイルスと細菌の相乗作用に関与する機序は、不十分にしか解明されていない。それ故、本発明者らがＩＡＶ後の細菌重複感染の原因及び見込みある処置についてのより良い理解に達することが重要である。ＩＡＶを経験をした宿主における呼吸器粘膜自然免疫の変化が、呼吸器細菌への高い易罹患性に至る基本的な特徴である（８）。マクロファージ、好中球及びＮＫ細胞の機能不全が、細菌重複感染への易罹患性の増強を説明すると記載されているが（３５〜３８）、肺炎連鎖球菌に対する変化した自然応答に至る正確な機序は完全に決定されていない。Ｔｏｌｌ様レセプターなどのいくつかの生得的なセンサーのウイルス後の脱感作（３９）、並びに特定のサイトカイン（ＩＦＮＩ型、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−１０を含む）の明白な発現は、この状況において主要な役割を果たす。ここで、本発明者らは、ＩＡＶ感染により、ＩＬ−１０に依存した現象である、肺におけるｉＮＫＴ細胞応答を損なうことによって、その後の細菌重複感染への易罹患性の増加がもたらされることを示す。本発明者らはまた、α−ＧａｌＣｅｒが、肺における免疫抑制状態を克服し、よって細菌重複感染から防御されるという証拠を提供する。
【００６０】
肺炎連鎖球菌（血清型３）感染の制御におけるｉＮＫＴ細胞の正の役割はすでに記載されている（３４、４１〜４３）。ここで、本発明者らはまず、ヒトにおいて別の主要な血清型である肺炎連鎖球菌血清型１を使用してｉＮＫＴ細胞の天然の役割を再評価した。まず、（４２、４３）と一致して、本発明者らは、肺ｉＮＫＴ細胞が、肺炎連鎖球菌感染後の早期に活性化されるようになることを観察した（ＩＦＮ−γ及び低い程度で−１７を）。本発明者らの近年の所見は、基準の活性化物質であるα−ＧａｌＣｅｒに応答した肺ｉＮＫＴ細胞の活性化における呼吸器ＤＣの役割を強調した（５１）。本発明者らは本明細書において、呼吸器ＤＣも、肺炎連鎖球菌による攻撃の脈絡でｉＮＫＴ細胞活性化における重要な役者であることを示す。興味深いことに、ｉＮＫＴ細胞は、致死以下の感染時に、肺組織において細菌を迅速に排除するために重要であり、これは生存を説明する現象である。致死以下の肺炎連鎖球菌感染に対するｉＮＫＴ細胞により媒介される防御機序を研究する試みが進行中である。マクロファージ活性化及び好中球により媒介される呼吸器細菌の排除において重要であることが示されたｉＮＫＴ細胞に由来するＩＦＮ−γは、この状況において重要な部分を果たしているようである。
【００６１】
本発明者らは次に、ｉＮＫＴ細胞が、細菌重複感染中に役割を果たし得るかどうかを研究した。この目的を達成するために、本発明者らは、Ｈ３Ｎ２ＩＡＶ及び肺炎連鎖球菌による異種感染のマウスモデルを確立した。インフルエンザ及び肺炎連鎖球菌の二重感染動物における重度の病気及び高度な細菌感染は、肺における重度の免疫病態及びその後の死亡に関連していた。ＩＦＮ−γは、細菌重複感染を支援する有害な因子として記載されたので（３６）、ｉＮＫＴ細胞はＩＡＶ感染中に肺において強力にＩＦＮ−γ産生に寄与するので（２６）、本発明者らはまず、ｉＮＫＴ細胞が、細菌重複感染中に有害であり得ると仮定した。この仮説はまた、ｉＮＫＴ細胞が時に肺炎症に関与するという事実に基づいていた（２１、２２、２４、３０、３１）。本発明者らのデータは、Ｊα１８−/−マウスは、依然としてＩＡＶ／肺炎連鎖球菌共感染に屈することを示し、その動態は、ＷＴ動物で観察されたものと類似していた。従って、ｉＮＫＴ細胞は、この系において有害ではない。一方、二重感染動物では、ｉＮＫＴ細胞は病態を支援しないので、ｉＮＫＴの欠失により、肺炎連鎖球菌への易罹患性は増加しなかった。ｉＮＫＴ細胞数の分析により、ＩＡＶ感染マウスにおいてこれらの細胞は全く消失していないことが判明し、これは、増強されたアポトーシスに応答して起こり得る現象である（４５〜４７）。顕著には、ウイルス感染マウスからの常在ｉＮＫＴ細胞は、肺炎連鎖球菌に応答してＩＦＮ−γを産生できなかったので、続発性刺激に不応性となった。さらに、ナイーブｉＮＫＴ細胞の養子移植は、肺におけるｉＮＫＴ細胞機能を回復するのに十分ではなく、細菌重複感染を予防できなかった。このことは、肺炎連鎖球菌による攻撃中のｉＮＫＴ細胞活性化の根底にある機序は、ＩＡＶ経験動物からの肺環境においては作動していないことを示唆する。可能性ある免疫抑制分子の中で、ＩＬ−１０が、細菌重複感染に関与している重要な因子として近年記載されているが（３２）、この所見には、近年、疑問が投げ掛けられている（３６）。ＩＬ−１０転写物の発現の分析は、感染から７日後の強力な増強を示し、この時点は、細菌感染への易罹患性のピークと一致する。（３２）と一致して、本発明者らは、ＩＬ−１０の中和活性（本明細書においては抗ＩＬ１０Ｒ抗体を用いて）は部分的に、肺における不適切な免疫応答を救出し、従って、増強された生存率及び肺組織における肺炎連鎖球菌の高い排除率がもたらされることを確認した。重要なことには、ＩＡＶ感染中のＩＬ−１０Ｒ中和はまた、肺炎連鎖球菌による攻撃後に肺においてｉＮＫＴ細胞活性化を回復した。インフルエンザを経験した動物における欠損したｉＮＫＴ細胞機能は、おそらく、抗肺炎球菌自然免疫において重要であることが知られている、肺胞マクロファージ又は好中球による抑制された抗菌活性の上流機序であるようである（４８〜５０）。ｉＮＫＴ細胞によってトランス活性化されることが知られるナチュラルキラー細胞もまたこの状況において重要であり得る。
【００６２】
本発明者らは、インフルエンザに感染したマウスにおけるｉＮＫＴ細胞の抑制された活性化は、続発性呼吸器感染中におけるＩＬ−１０の合成、並びに高い細菌負荷量及び死亡率に相関することを示す。それ故、発明者らのデータは、不完全なｉＮＫＴ細胞応答は、大流行及び季節性インフルエンザ感染に伴う一般的な続発性細菌性肺炎の１つの可能性ある原因であり得ることを示唆する。従って、本発明者らは、肺炎連鎖球菌による攻撃の直前における、α−ＧａｌＣｅｒによる処置を用いてのｉＮＫＴ細胞の外因性活性化は、ＩＡＶ感染動物の肺において発達した阻害機序を軽減できるかどうかを調べた。本発明者らは、α−ＧａｌＣｅｒの鼻腔内投与によりｉＮＫＴ細胞が活性化されることを示す。これは、肺ｉＮＫＴ細胞が、致命的な攻撃後とは異なり、致死以下のＩＡＶ感染から１週間後に内因的に「反応不顕性」ではないことを示す（２６）。感染から７日後には呼吸器ＤＣは、肺組織において検出できなかったので、常在ＡＰＣではなく新規に補充されたＡＰＣ（特に炎症性単球／ＤＣ）が、α−ＧａｌＣｅｒに応答したｉＮＫＴ細胞活性化において役割を果たすようである。重要なことには、本発明者らは、α−ＧａｌＣｅｒによる処置が、共感染マウスの劇的に増強された生存率によって評価されるように、細菌重複感染から防御することを示す。このことは、自然免疫細胞（すなわちマクロファージ及び好中球）のエフェクター機能の変化が不可逆的ではなく、ｉＮＫＴによって放出された因子が、局所免疫抑制を克服するのに十分であることを示す。抗生物質は細菌重複感染に対する処置の実行可能な選択肢であり得ても、抗生物質耐性問題が増加の一途を辿っていることから、免疫調節は、細菌重複感染を制御するための魅力的な代替選択肢であり得る。この状況において、α−ＧａｌＣｅｒ類似体の使用は、特に流行中にヒト系に使用され得る有望なアプローチを提供する。
【００６３】
参考文献：
本出願全体を通して、様々な参考文献が、本発明が属する技術分野の最新技術を記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。
【表１】
2015531384.tif 000002
2015531384.tif 000003
2015531384.tif 000004
2015531384.tif 000005
2015531384.tif 000006
【図１】
2015531384.tif 000007
【国際調査報告】
2015531384.tif 000008
2015531384.tif 000009
2015531384.tif 000010
2015531384.tif 000011
2015531384.tif 000012