(57)【要約】放射線増感性又は化学増感性化合物であって、ナノパーティクルを含み且つナノパーティクルに付着した、場合により、一つ又はそれを超えるリンカー部分を介してナノパーティクルに付着した（ｉ）ＤＮＡ修復阻害剤；及び（ii）核局在化シグナル要素（ＮＬＳ）を含む化合物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノパーティクル、並びにナノパーティクルに付着した、場合により、一つ又はそれを超えるリンカー部分を介してナノパーティクルに付着した
（ｉ）ＤＮＡ修復阻害剤；及び
（ii）核局在化シグナル要素（ＮＬＳ）
を含む、放射線増感性又は化学増感性化合物。
【請求項２】
ＤＮＡ修復阻害剤及びＮＬＳが、ナノパーティクルに別々に、場合により、リンカー部分を介して付着している、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
ＤＮＡ修復阻害剤が、ナノパーティクルに、場合により、リンカー部分を介して付着し、そしてＮＬＳが、ＤＮＡ修復阻害剤又はリンカー部分に付着している、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
ＮＬＳが、ナノパーティクルに、場合により、リンカー部分を介して付着し、そして、ＤＮＡ修復阻害剤が、ＮＬＳ又はリンカー部分に付着している、請求項１に記載の化合物。
【請求項５】
ＤＮＡ修復阻害剤が、二本鎖切断修復の阻害剤である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
ＤＮＡ修復阻害剤が、ＮＢＳ１、Ｋｕ７０、ＰＡＲＰ１、Ｈ１ｘ、又は他のＤＮＡ修復タンパク質又はその機能性フラグメント及び、ＤＮＡ修復を阻害することが可能なＤＮＡホスホキナーゼ阻害剤又はそのフラグメントである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項７】
ＮＬＳが、アデノウイルス又はＳＶ４０のＮＬＳ、又は合成ＮＬＳである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項８】
ナノパーティクルが、金属ナノパーティクルである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項９】
ナノパーティクルが、金、白金又はパラジウム、又はそれらの混合物である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
リンカーが、金属ナノパーティクルへのアフィニティーを有する、請求項８又は請求項９に記載の化合物。
【請求項１１】
リンカー部分が、チオクト酸、金結合性ペプチド１（ＧＢＰ１）、３Ｒ−ＧＢＰ１、ＣＡＬＮＮペプチド及びグルタチオンより選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
化学療法薬、ＤＮＡ架橋剤、イメージング剤、造影剤及び表面ターゲッティング剤より選択される一つ又はそれを超える部分を更に含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
化学療法薬が、ブレオマイシン、ドキソルビシン又はカンプトテシンである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
ＤＮＡ架橋剤が、シスプラチニン（cis-platinin）である、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
表面ターゲッティング剤が、ビタミンである、請求項１２に記載の化合物。
【請求項１６】
一つ又はそれを超える薬学的に許容しうる担体又は希釈剤との組み合わせでの、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
薬剤として用いるための、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
癌を処置する場合に用いるための、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
対象の癌を処置する方法であって、薬学的有効量の請求項１〜１６に記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項２０】
対象に、放射線療法を更に施す、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
化合物が、金属ナノパーティクルを含み、該化合物の投与後、対象を、金属ナノパーティクルの吸収端に同調した電離放射線源からの放射線療法で処置する、請求項１９又は請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、放射線増感性又は化学増感性化合物であって、ナノパーティクルを含み且つナノパーティクルに付着した、ＤＮＡ修復阻害剤及び核局在化シグナル要素（ＮＬＳ）を含む化合物に関する。このような化合物は、癌などの疾患の処置に用いられる。
【背景技術】
【０００２】
ナノテクノロジーは、ナノメートルスケール範囲の新しい構造体をもたらす原子及び分子の操作に焦点を合わせた科学分野である。これら構造体は、しばしば、独特の且つ予想外の性状を獲得する。癌ナノテクノロジーの場合、その焦点は、診断し、治療薬を送達し、そして癌処置の進行を監視することができるナノスケールデバイスの開発にある。理想的には、何らかのイメージングシステム又は治療的システムを、排他的に、腫瘍細胞集塊又は腫瘍細胞血管系へ標的指向させ、好ましくは、悪性変換の早期にそれを行う能力で標的指向させるであろう。基礎的癌生物学及びＤＮＡ損傷応答についての本発明者の理解では、過去何十年間で顕著な前進が認められたが（Risinger and Groden; Cancer Cell, 6: 539, 2004; O’Driscoll and Jeggo; Nat Rev Genet; 7: 45, 2006, Girard, Kysela et al; Hum Mol Genet 13:1, 2004, Weller, Kysela, Roy et al; Science 297:5527, 2002）、この開発は、臨床では匹敵する進歩を伴うことがなかった。例えば、ヒトの場合の放射線療法は、治療的放射線への癌細胞の生物学的応答の知識に基づく操作によるよりもむしろ、技術的前進及びコンピューター化により多くの利益を得た（Begg et al, Radiother Oncol, 86:295, 2008）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】Risinger and Groden; Cancer Cell, 6: 539, 2004
【非特許文献２】O’Driscoll and Jeggo; Nat Rev Genet; 7: 45, 2006
【非特許文献３】Girard, Kysela et al; Hum Mol Genet 13:1, 2004
【非特許文献４】Weller, Kysela, Roy et al; Science 297:5527, 2002
【非特許文献５】Begg et al, Radiother Oncol, 86:295, 2008
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ナノパーティクルは、細胞中に材料を導入するのに用いることができる。それら細胞は、ナノパーティクルを、それら粒子に付着したいずれかの成分と一緒に飲み込み且つ受け取る。
【０００５】
本出願人は、これが、細胞中への化学増感性・放射線増感性化合物の導入を促す可能性を有するということを認めた。これら化合物の多くは、細胞核において有効であるように標的指向している必要がある。本出願人は、したがって、それら化合物がいったん細胞内に入ったら、それらを細胞核へ向けるように化合物を標的指向可能にする要求も存在するということを認めた。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、したがって、ナノパーティクル、並びにナノパーティクルに付着した、場合により、一つ又はそれを超えるリンカー部分を介してナノパーティクルに付着した、（ｉ）ＤＮＡ修復阻害剤；及び（ii）核局在化シグナル要素（ＮＬＳ）を含む、放射線増感性又は化学増感性化合物を提供する。
【０００７】
ナノパーティクルは、典型的に、直径が１００ｎｍ未満、典型的に、１〜５０ｎｍ、５〜３０ｎｍ又は１０〜１５ｎｍである。
ＤＮＡ修復阻害剤は、細胞を放射線療法薬又は化学療法薬に感受性にするように作用する。
【０００８】
ＤＮＡ修復阻害剤及びＮＬＳは、ナノパーティクルに別々に、場合により、リンカー部分を介して付着していてよい。すなわち、阻害剤及びＮＬＳは、ナノパーティクルの別々の部分に付着していてよい。或いは、ＤＮＡ阻害剤は、ナノパーティクルに、例えば、リンカー部分を介して付着していてよいし、そしてＮＬＳは、ＤＮＡ修復阻害剤に（例えば、融合タンパク質／ペプチドとして）付着していてよい、又はリンカー部分の異なった部分に、例えば、ペンダント部分として付着していてよい。或いは、ＮＬＳは、ナノパーティクルに、例えば、リンカー部分を介して付着していてよいし、そしてＤＮＡ修復阻害剤は、ＮＬＳに又はリンカー部分に（例えば、ペンダント部分として）付着していてよい。
【０００９】
γ線又はｘ線などの多くの放射線療法薬、及び（例えば、ブレオマイシンなどの融合タンパク質としての）化学療法薬は、標的細胞を損傷して、ＤＮＡに鎖切断を誘発する。一本鎖切断は、ＤＮＡ二重らせんの片方が切断されたところで生じる。このような一本鎖切断は、細胞内のＤＮＡ修復システムによって修復することが比較的容易である。しかしながら、ＤＮＡらせんの二本鎖上で潜在的に互いに向かい合って生じる二本鎖切断は、修復することが一層困難である。それらは、ゲノム再編成をもたらすことがありうるので、細胞にとって特に問題である。二本鎖切断（ＤＳＢ）を修復するために、非相同的末端連結；微小相同性で媒介される末端連結；及び相同的組換えの三つの機構が存在する。鎖切断が正しく修復されない、又はＤＮＡ二本鎖切断が全く修復されない場合、細胞は、しばしば、次の有糸分裂で死滅するであろう。
【００１０】
修復阻害剤は、当該技術分野において概括的に知られている。典型的に、阻害剤は、上に論じられたＤＳＢが、化合物が標的指向している細胞を死滅させる又は無能にすると考えられるので、ＤＮＡ二本鎖切断修復の阻害剤であろう。ＤＮＡ阻害剤は、ＮＢＳ１（Nijmegen Breakage Syndrome １、Nibrin）であってよい。これは、ＮＢＳ１／ｈＭｒｅ１１／ＲＡＤ５０二本鎖ＤＮＡ切断修復複合体のメンバーとして識別される７５４アミノ酸タンパク質である。この複合体は、ＤＮＡ損傷を認識し、そして速やかに、ＤＳＢ部位へ再配置し且つ核フォーカスを形成する。典型的なＮＢＳ１配列は、ＫＥＥＳＬＡＤＤＬである。
【００１１】
この及び実は他のＤＮＡ修復阻害剤のフラグメントは、ＤＮＡ修復阻害活性を依然として保持し、それを用いてもよい。
ＤＮＡ阻害剤は、Ｋｕ７０又はそのフラグメントであってよい。Ｋｕ７０は、ＸＲＣＣ６によってエンコードされるタンパク質である。タンパク質は、Ｋｕ８０と一緒に、Ｋｕヘテロ二量体を構成し、それが、ＤＢＳ末端に結合し且つＤＮＡ修復に関与している。Ｋｕ８０タンパク質のドメインに似ている合成ペプチドを用いることができる（ＥＧＧＤＶＤＤＬＤＭＩ）（Kim et al J. Pharmacol. Exp. Therap. (2002) 303:353）。
【００１２】
ＰＡＲＰ１（Poly [ADP-Ribose] Polymerase−１）は、ポリＡＤＰリボシル化によって核タンパク質を修飾する。それは、ＢＲＣＡと共にＤＳＢ修復に関与している。更に、ＰＡＲＰ１は、一本鎖ＤＮＡ切断の修復にも関与している。或いは、主な修復阻害剤は、Ｈ１ｘ又はそのフラグメントであってよい。リンカーヒストンは、全ての体細胞中に偏在的に存在している。例えば、ＰＣＴ／ＧＢ２０１１／０５１１８０号、ＷＯ／２０１１／１６１４５７号を参照されたい。
【００１３】
ＤＮＡホスホキナーゼ阻害剤を用いることもできる。
ＮＬＳは、例えば、アデノウイルス又はＳＶ４０のＮＬＳ、又はＭ４ターゲッティング配列などの合成配列であってよい。Ｍ４ターゲッティング配列は、ＫＫＫＫＫＫＧＧＲＧＤＭＦＧであってよい。アデノウイルスＮＬＳは、ＧＧＦＳＴＳＬＲＡＲＫＡであってよい。
【００１４】
合成ＮＬＳを用いることもできる。合成ＮＬＳは、当該技術分野において概括的に知られている。上によるＭ４ターゲッティング配列は、合成ペプチドであり、Adenoviral ＮＬＳは、天然に存在するターゲッティング配列である。
【００１５】
ナノパーティクルは、典型的に、遷移金属粒子などの金属ナノパーティクルである。これらには、金、白金又はパラジウム、又はそれらの混合物が含まれる。例えば、白金及び金の利点は、このような粒子が、光電子及びオージェ電子の生成によって電離放射線の作用を増大させることができるということである（Zheng et al; Radiat. Res. (2008), 169:19、Hainfeld et al; Phys. Med. Biol. (2004), 49:N309、及び Biston et al; Cancer Res. (2004), 64:2317)。電離放射線は、このような電子の生成を可能にするように同調させることができ、それによって、標的とされた細胞への放射線の作用を増加させることができる。放射線によって生じる電子の作用は、それら作用の原因である二次電子によって移動する短い予測距離のために、ＤＮＡへの近接に依存している（Zheng et al（上記）及び Regulla et al (Rad. Res. (1998) 150:92）。ＮＬＳの存在は、ナノパーティクルを細胞の核へ標的指向させることを助け、それによって、ＤＮＡに近いナノパーティクルの局在化を助ける。
【００１６】
ペプチドに基づくＤＮＡ修復阻害剤及び／又はＮＬＳは、概括的に知られているシステムによってナノパーティクル上に付着することができる。例えば、金属ナノパーティクルへのアフィニティーを有するリンカー部分は、利用することができる。このようなリンカー部分には、チオクト酸などのチオ含有リンカー；金結合性ペプチド１（Brown et al, Nat. Biotech. (1997), 15:269）；３Ｒ−ＧＢＰ１であって、ＭＨＧＫＴＱＡＴＳＧＴＩＱＳの３反復配列を含有し（Tamerler et al; Small (2006) 2:1372）、金及び白金双方の表面に結合するもの；ＣＡＬＮＮペプチド（Levy R, J. Am. Chem. Soc. (2004) 126(32), 10076-84）が含まれる。
【００１７】
一つ又はそれを超える追加部分も、化合物に付着していてよい。追加部分は、例えば、直接的に、例えば、上記のようなリンカー部分を利用してナノパーティクルに付着していてよいし、又は或いは、ＤＮＡ修復阻害剤、ＮＬＳ及び／又はそれらのリンカー部分に付着していてよい。それら一つ又はそれを超える追加部分は、例えば、化学療法薬、ＤＮＡ架橋剤、イメージング剤、造影剤及び表面ターゲッティング剤より選択することができる。二つ又はそれを超える更に別のタイプの部分を用いてよい。
【００１８】
化学療法薬は、例えば、ＤＮＡ一本鎖切断、又は典型的に、二本鎖切断などのＤＮＡ損傷を誘発する物質であってよい。例えば、ブレオマイシンは、ストレプトミセス・ベルティシルス（Streptomyces verticillus）という細菌によって生産される糖ペプチド抗生物質である。これは、抗癌薬として概括的に知られていて、主としてブレオマイシンＡ２及びＢ２である化学療法形態である。それは、ＤＮＡに切断を引き起こすことによって作用する。
【００１９】
化学療法薬は、ドキソルビシンであってもよい。ドキソルビシンは、広範囲の癌の処置に一般的に用いられるアントラサイクリン系抗生物質であり、ＤＮＡ中に介在する。
それは、ブレオマイシン及びカリカエマイシン（calichaemycin）を含めた他の化学療法薬との組み合わせで用いることができる。また更に別の化学療法薬は、カンプトテシン（Camptothecin）であってよい。カンプトテシンは、ＤＮＡ酵素トポイソメラーゼＩを阻害する細胞障害性キノリンアルカロイドである。カンプトテシン及び二つの類似体（トポテカン（topotecan）及びイリノテカン（irinotecan））は、癌化学療法に用いられてきた。このような化合物の類似体を用いることもできる。他の物質には、ナイトロジェンマスタード；テモゾラミド（temozolamide）；及び当該技術分野において概括的に知られている架橋剤であって、シスプラチニン（cis-platinin）を含めたものが含まれる（Brown et. al., J. Am. Soc. (2012) 132, 4676-84）。
【００２０】
イメージング剤は、フルオレセインなどの当該技術分野において概括的に知られている蛍光染料であってよい。
造影剤は、ガドリニウム、酸化鉄、マンガン又は他の常磁性造影剤であってよい。これらは、癌の部位への化合物のターゲッティングを確認することを可能にする。
【００２１】
表面ターゲッティング剤は、癌細胞に特異的に付着することが可能である部分であってよい。その部分は、例えば、癌細胞の表面上に見出される受容体のリガンドであってよい。例えば、フォレート受容体などのビタミン受容体は、多くの癌細胞中で一般的に過発現される。したがって、細胞表面ターゲッティング剤は、例えば、フォレートなどのビタミンであってよい（Leamon et al, J. Drug Target. (1999) 7:157）。特定の細胞に向けてナノパーティクルを標的指向可能にする利点は、それが、正常細胞への毒性副作用を制限するのを助けるということである。例えば、ビタミンに連結した分子は、受容体に媒介されるエンドサイトーシスによってインターナリゼーションを行うことができる。概括的に知られているフォレートで送達される細胞障害性薬の取込みが示されており、それらは、前臨床研究において有望な作用を有する。フォレートなどのビタミンは、例えば、標準的な固相化学によってペプチドに共役することができる。
【００２２】
本発明の化合物は、一つ又はそれを超える薬学的に許容しうる担体又は希釈剤との組み合わせで用いることができる。それは、例えば、癌を処置する場合に用いるための薬剤として用いることができる。
【００２３】
対象の癌を処置する方法であって、薬学的有効量の本発明による化合物を投与することを含む方法も提供する。
その化合物は、静脈内、筋肉内、腹腔内に又は経口で投与することができる。脳腫瘍は、例えば、血液脳関門を越える頭蓋を介する灌流を行って処置することができる。
【００２４】
対象には、更に、放射線療法を行うことができる。例えば、化合物が金属ナノパーティクルを含む場合、化合物の投与後、対象は、金属ナノパーティクルの吸収端に同調した電離放射線源からの放射線療法で処置することができる。これは、上に論じられたように、ナノパーティクルに二次電子を放出させる。
【００２５】
電離放射線源は、例えば、ｘ線源又はシンクロトロン源であってよい。
本発明は、例えば、同じ粒子に付着したＤＮＡ損傷性薬によってか又は、ナノパーティクルそれ自体の金属による放射線によって、ＤＮＡ損傷の局所増加の組み合わせを提供する。これは、ＤＮＡ損傷性薬又は放射線によって損傷した核の同じ領域におけるＤＮＡ修復の局所共力的減少と組み合わされる。
【００２６】
本発明の更に別の利点には、白血病などの癌の化学療法への薬物耐性を実行可能に克服することが含まれる。白血病を処置する場合、多くの患者は、癌細胞による細胞取込み経路の遮断のために、薬物耐性を有する。ナノパーティクルを利用することは、このような耐性を克服するのを助けることができるということが考えられる。
【００２７】
ここで、本発明を、次の図面を参照して、単に例として記載する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１：ＭＲＣ５正常ヒト線維芽細胞における標的指向したＮＰ対非標的指向ＮＰの送達。パネルＡ及びＣ：ＥＳＲＦナノイメージングステーション亜鉛ラインは、細胞核及び細胞質の領域を、金（又は白金）Ｘ線蛍光シグナルに関して容易に区別することができる不可欠な微小構造情報を提供する（次の図面も）。パネルＢ：非標的指向ＮＰに暴露された細胞における金ラインシグナル。パネルＤ：タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したＮＰに暴露された細胞における金ラインシグナル。これら結果は、標的指向したナノパーティクルだけが細胞核に到達しうるということを示している。
【図２】図２：ヒト腫瘍細胞系における標的指向したＮＰ送達。パネルＡ及びＢ：Ａ５４９肺腺癌細胞、Ａ：亜鉛ライン、及びＢ：金ライン。パネルＣ及びＤ：Ｋ５６２ヒト骨髄性白血病懸濁細胞系、Ｃ：亜鉛ライン、及びＤ：金ライン。パネルＢ及びＤは、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したＮＰに暴露された細胞における金ラインシグナルの高度な存在を示す。これら結果は、標的指向したナノパーティクルだけが細胞核に到達しうることを示し、そして線維芽細胞様及びリンパ芽球様双方の腫瘍細胞集団へのターゲッティングペプチドコンストラクトによるペイロード送達の普遍性及び高効率を示している。
【図３】図３：ヒト細胞への標的指向したＮＰ及び放射線の共力的作用の分析。パネルＡ：ＭＲＣ５正常ヒト線維芽細胞の完全クローン産生生存分析。パネルＢ：Ｋ５６２ヒト慢性骨髄性白血病細胞における２Ｇｙ生存画分分析。細胞死滅の増大は、非ターゲッティング対照では認められなかった。これら結果は、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルだけが、放射線による細胞死滅を増大させるということを示している。
【図４ａ】図４：ＭＲＣ５正常ヒト線維芽細胞における細胞周期分布への標的指向したＮＰの影響力のフローサイトメトリー分析。上部列：未暴露対照における細胞周期進行の時間経過。下部列：細胞生存実験と同一の条件下において標的指向したＮＰに暴露された細胞における細胞周期進行の時間経過。細胞周期分布の変化は、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復（repaid）阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルに暴露された細胞と対照細胞との間では認められなかった。これらデータは、細胞生存実験において認められた細胞死滅の増大が、核に標的指向したナノパーティクルによって引き起こされる増加したＤＮＡ損傷／減少したＤＮＡ修復（repaid）作用の結果であるということを強く示唆する。
【図４ｂ】図４：ＭＲＣ５正常ヒト線維芽細胞における細胞周期分布への標的指向したＮＰの影響力のフローサイトメトリー分析。上部列：未暴露対照における細胞周期進行の時間経過。下部列：細胞生存実験と同一の条件下において標的指向したＮＰに暴露された細胞における細胞周期進行の時間経過。細胞周期分布の変化は、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復（repaid）阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルに暴露された細胞と対照細胞との間では認められなかった。これらデータは、細胞生存実験において認められた細胞死滅の増大が、核に標的指向したナノパーティクルによって引き起こされる増加したＤＮＡ損傷／減少したＤＮＡ修復（repaid）作用の結果であるということを強く示唆する。
【図４ｃ】図４：ＭＲＣ５正常ヒト線維芽細胞における細胞周期分布への標的指向したＮＰの影響力のフローサイトメトリー分析。上部列：未暴露対照における細胞周期進行の時間経過。下部列：細胞生存実験と同一の条件下において標的指向したＮＰに暴露された細胞における細胞周期進行の時間経過。細胞周期分布の変化は、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復（repaid）阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルに暴露された細胞と対照細胞との間では認められなかった。これらデータは、細胞生存実験において認められた細胞死滅の増大が、核に標的指向したナノパーティクルによって引き起こされる増加したＤＮＡ損傷／減少したＤＮＡ修復（repaid）作用の結果であるということを強く示唆する。
【図４ｄ】図４：ＭＲＣ５正常ヒト線維芽細胞における細胞周期分布への標的指向したＮＰの影響力のフローサイトメトリー分析。上部列：未暴露対照における細胞周期進行の時間経過。下部列：細胞生存実験と同一の条件下において標的指向したＮＰに暴露された細胞における細胞周期進行の時間経過。細胞周期分布の変化は、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復（repaid）阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルに暴露された細胞と対照細胞との間では認められなかった。これらデータは、細胞生存実験において認められた細胞死滅の増大が、核に標的指向したナノパーティクルによって引き起こされる増加したＤＮＡ損傷／減少したＤＮＡ修復（repaid）作用の結果であるということを強く示唆する。
【図４ｅ】図４：ＭＲＣ５正常ヒト線維芽細胞における細胞周期分布への標的指向したＮＰの影響力のフローサイトメトリー分析。上部列：未暴露対照における細胞周期進行の時間経過。下部列：細胞生存実験と同一の条件下において標的指向したＮＰに暴露された細胞における細胞周期進行の時間経過。細胞周期分布の変化は、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復（repaid）阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルに暴露された細胞と対照細胞との間では認められなかった。これらデータは、細胞生存実験において認められた細胞死滅の増大が、核に標的指向したナノパーティクルによって引き起こされる増加したＤＮＡ損傷／減少したＤＮＡ修復（repaid）作用の結果であるということを強く示唆する。
【図４ｆ】図４：ＭＲＣ５正常ヒト線維芽細胞における細胞周期分布への標的指向したＮＰの影響力のフローサイトメトリー分析。上部列：未暴露対照における細胞周期進行の時間経過。下部列：細胞生存実験と同一の条件下において標的指向したＮＰに暴露された細胞における細胞周期進行の時間経過。細胞周期分布の変化は、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復（repaid）阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルに暴露された細胞と対照細胞との間では認められなかった。これらデータは、細胞生存実験において認められた細胞死滅の増大が、核に標的指向したナノパーティクルによって引き起こされる増加したＤＮＡ損傷／減少したＤＮＡ修復（repaid）作用の結果であるということを強く示唆する。
【図４ｇ】図４：ＭＲＣ５正常ヒト線維芽細胞における細胞周期分布への標的指向したＮＰの影響力のフローサイトメトリー分析。上部列：未暴露対照における細胞周期進行の時間経過。下部列：細胞生存実験と同一の条件下において標的指向したＮＰに暴露された細胞における細胞周期進行の時間経過。細胞周期分布の変化は、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復（repaid）阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルに暴露された細胞と対照細胞との間では認められなかった。これらデータは、細胞生存実験において認められた細胞死滅の増大が、核に標的指向したナノパーティクルによって引き起こされる増加したＤＮＡ損傷／減少したＤＮＡ修復（repaid）作用の結果であるということを強く示唆する。
【図４ｈ】図４：ＭＲＣ５正常ヒト線維芽細胞における細胞周期分布への標的指向したＮＰの影響力のフローサイトメトリー分析。上部列：未暴露対照における細胞周期進行の時間経過。下部列：細胞生存実験と同一の条件下において標的指向したＮＰに暴露された細胞における細胞周期進行の時間経過。細胞周期分布の変化は、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復（repaid）阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルに暴露された細胞と対照細胞との間では認められなかった。これらデータは、細胞生存実験において認められた細胞死滅の増大が、核に標的指向したナノパーティクルによって引き起こされる増加したＤＮＡ損傷／減少したＤＮＡ修復（repaid）作用の結果であるということを強く示唆する。
【図５ａ】図５：５Ｇｙでの放射線後２４時間のγＨ２ＡＸフォーカス分析。パネルＡは、対照ＭＲＣ５細胞を示し、パネルＢは、標的指向した金ＮＰで予め処理されたＭＲＣ５細胞を示す。リン酸化ヒストン変異型Ｈ２ＡＸの増加したレベルは、ＤＮＡ損傷性薬（例えば、電離放射線）によって引き起こされたＤＮＡ二本鎖切断の増加したレベルの代理的測定値である。この結果は、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復（repaid）阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルが、放射線によって引き起こされた未修復／修復不能ＤＮＡ損傷の比率を増加させることによって細胞死滅を増大させるということを示している。
【図５ｂ】図５：５Ｇｙでの放射線後２４時間のγＨ２ＡＸフォーカス分析。パネルＡは、対照ＭＲＣ５細胞を示し、パネルＢは、標的指向した金ＮＰで予め処理されたＭＲＣ５細胞を示す。リン酸化ヒストン変異型Ｈ２ＡＸの増加したレベルは、ＤＮＡ損傷性薬（例えば、電離放射線）によって引き起こされたＤＮＡ二本鎖切断の増加したレベルの代理的測定値である。この結果は、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復（repaid）阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルが、放射線によって引き起こされた未修復／修復不能ＤＮＡ損傷の比率を増加させることによって細胞死滅を増大させるということを示している。
【図６】図６：５Ｇｙでの放射線後２４時間の無動原体型染色体フラグメント（微小核）分析。パネルＡは、対照ＭＲＣ５細胞を示し、パネルＢは、標的指向した金ＮＰで予め処理されたＭＲＣ５細胞を示し、４個の微小核がはっきり見えている。パネルＣは、各々のデータセットについて計数された１００個の細胞に基づく定量的分析を要約している。微小核の形成は、修復不能ＤＮＡ二本鎖切断のより高いレベルを示すものである。この結果は、更に、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルが、放射線によって引き起こされた未修復／修復不能ＤＮＡ損傷の比率を増加させることによって細胞死滅を増大させるということを示している。
【図７】図７：ヒト細胞への放射線との共力的作用と比較される標的指向したＮＰのナノ毒性（Nanotoxocity）分析。パネルＡ：標的指向した金及び白金ＮＰに暴露されたＫ５６２ヒト慢性骨髄性白血病細胞のクローン産生生存分析。パネルＢ：標的指向した金及び白金ＮＰに暴露後、２Ｇｙの電離放射線を施されたＫ５６２ヒト慢性骨髄性白血病細胞における２Ｇｙ生存画分分析。これら結果は、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルが、ＤＮＡ損傷性薬の不存在下において、標的細胞それ自体には毒性でないということを示している。
【図８】図８：中枢神経系軸索成長アッセイの阻害を用いた、標的指向したＮＰのナノ神経毒性（nano-neurotoxocity）分析。パネルＡ：対照 ex vivo 培養における軸索成長（全てのパネルにおいて緑色ＦＩＴＣ標識によって識別される軸索成長）の免疫蛍光分析。パネルＢ及びＣ：標的指向した金（パネルＢ）及び白金（パネルＣ）ＮＰに暴露された ex vivo ニューロン培養。標的指向したナノパーティクルを用いるのに臨床的に最も関係のある標的の一つは、脳腫瘍であるが、その場合、腫瘍組織の周囲の健康なニューロン組織への処置の毒性が、しばしば、主要な問題である。これら結果は、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルが、ＤＮＡ損傷性薬の不存在下において、標的ニューロンそれ自体には毒性でないということを示している。
【図９ａ】図９：標的指向した金及び白金ナノパーティクル（ＮＰ）で前処理されたＭＲＣ５ヒト細胞における、３０Ｇｙのγ線で照射後のＤＳＢ修復速度論のパルスフィールドゲル電気泳動（Pulse field gel electrophoresis）（ＰＦＧＥ）分析。パネルＡ：ＮＰ不含の被照射対照細胞のＰＦＧＥ。パネルＢ：標的指向した金ＮＰで前処理された被照射ＭＲＣ５細胞のＰＦＧＥ。パネルＣ：ＰＦＧＥによるＤＳＢ再連結の定量的分析。２４時間の修復時間後、放射線後の対照と比較したところ、ＮＰで処理された細胞における未修復ＤＳＢの百分率には、極めて有意の増加した状態が存在する（対照：１２．０３±３．１１；標的指向した金Ａ１：３７．０６±１０．９９，ｐ≦０．０１；標的指向した金Ａ３：３７．１０±１１．５３，ｐ≦０．０１；標的指向した白金Ａ１：２４．１３±４．０３，ｐ≦０．０１；標的指向した白金Ａ３：２１．８３±１．５８，ｐ≦０．０１）。「切断されたＤＮＡ」を直接的に測定するアッセイを用いると、これら結果は、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルが、電離放射線への暴露後にＤＳＢ修復への甚大な作用を有し、多くの切断が、長い修復時間後に未修復状態のままであるということを示している。
【図９ｂ】図９：標的指向した金及び白金ナノパーティクル（ＮＰ）で前処理されたＭＲＣ５ヒト細胞における、３０Ｇｙのγ線で照射後のＤＳＢ修復速度論のパルスフィールドゲル電気泳動（Pulse field gel electrophoresis）（ＰＦＧＥ）分析。パネルＡ：ＮＰ不含の被照射対照細胞のＰＦＧＥ。パネルＢ：標的指向した金ＮＰで前処理された被照射ＭＲＣ５細胞のＰＦＧＥ。パネルＣ：ＰＦＧＥによるＤＳＢ再連結の定量的分析。２４時間の修復時間後、放射線後の対照と比較したところ、ＮＰで処理された細胞における未修復ＤＳＢの百分率には、極めて有意の増加した状態が存在する（対照：１２．０３±３．１１；標的指向した金Ａ１：３７．０６±１０．９９，ｐ≦０．０１；標的指向した金Ａ３：３７．１０±１１．５３，ｐ≦０．０１；標的指向した白金Ａ１：２４．１３±４．０３，ｐ≦０．０１；標的指向した白金Ａ３：２１．８３±１．５８，ｐ≦０．０１）。「切断されたＤＮＡ」を直接的に測定するアッセイを用いると、これら結果は、タンデム立体配置での金付着ドメイン、核ターゲッティングドメイン及びＤＮＡ修復阻害ドメインから成る新規な合成ペプチドによって細胞核へ標的指向したナノパーティクルが、電離放射線への暴露後にＤＳＢ修復への甚大な作用を有し、多くの切断が、長い修復時間後に未修復状態のままであるということを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
材料及び方法
ナノパーティクルの製造
１３ｎｍの金及び白金のシトレート被覆ナノパーティクル（それぞれ、１３ｎｍＡｕＮＰ及び６ｎｍＰｔＮＰ）を、既知の手順にしたがって製造した［J. Phys. Chem. 90, 4765-4767 (1986)、及び Anal. Chem. 67, 735-743 (1995)］。次に、ナノパーティクルを、新規な三部分ペプチドで機能性付加した［Chem. Commun, 47, 6431-6433 (2011)］。生成された試料を、下の表に挙げる。
【００３０】
【表１】
2015521198.tif 000002
【００３１】
【表２】
2015521198.tif 000003
【００３２】
クローン産生生存アッセイ
正常ヒト線維芽細胞の細胞ＭＲＣ５ＶＡを、４．５ｇ／ＬのＤ−グルコース、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％ｖ／ｖのペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（PAA labs）及び１％ｖ／ｖの非必須アミノ酸（Invitrogen, Life Technologies）を含有する完全ダルベッコ変法イーグル培地（Dulbecco’s Modified Eagle Medium）（ＤＭＥＭ）中で維持し且つ継代培養した。アッセイ用に、細胞を、中間対数増殖中に（４０〜６０％密集）、１ｘトリプシン−ＥＤＴＡ（PAA labs）で採取した。トリプシン処理後、細胞を、１５００ｒｐｍでの遠心分離によって３分間洗浄し、培地中に再懸濁させ、そして血球計で計数した。次に、細胞を、６ウェルプレート中に必要な密度でプレーティングし、そしてインキュベーター中に、５％ＣＯ２を含む室内空気雰囲気中において３７℃で入れた。再付着を可能にする２４時間後、細胞に、ナノパーティクルを５ｘ１０７個ＮＰ／細胞で負荷した。未処理細胞を対照とした。２４時間後、被処理細胞を、トリプシン処理し、遠心分離によって洗浄し、培地中に再懸濁させ、そして計数した。各々の照射線量に必要な細胞数の原液を、新鮮培地中に小分けし、氷上に置いた。細胞は、１３７セシウムγ源を約２．５Ｇｙ／分の線量率で用いて、必要な線量に照射した。照射後、各々の線量に必要な細胞数を、６ウェルプレート中の予め加温した培地中に三重反復でプレーティングした。それらプレートは、インキュベーター中において静置して１４日間保持した。１４日のインキュベーション期間後、コロニーを固定し、そして水を含む５０％メタノール中の０．５％ｗ／ｖクリスタルバイオレット溶液を用いて染色し、コロニーを計数した。条件は全て、三重反復で行った；各々のコンストラクトの生存実験を、３回繰り返した。
【００３３】
ヒストンＨ２ＡＸリン酸化アッセイ及び微小核分析
ＭＲＣ５ＶＡ正常ヒト線維芽細胞を、２４ウェルプレート中の丸底カバーガラスに付着させた状態で、ほぼ密集するまで増殖させ、そして播種後に静置し且つ再付着させた。２４時間後、細胞を、ナノパーティクルで、５ｘ１０７個ＮＰ／細胞で処理した。未処理細胞を対照とした。２４時間後、各々のコンストラクトについて一つのカバーガラスを取り出して、未照射対照とした。残りのカバーガラスを氷上に置き、そして１３７セシウムγ源を約２．５Ｇｙ／分の線量率で用いて５Ｇｙに照射した。照射後、細胞を、インキュベーター中に戻し入れた。関係のある照射後時点で、細胞を、氷上において氷冷予備抽出用緩衝液（１０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．８、３００ｍＭスクロース、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び０．５％ Triton Ｘ−１００）中で７分間透過性にした。氷冷リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄後、細胞を、氷上において４％氷冷パラホルムアルデヒド中で１０分間固定した。固定した細胞は、ＰＢＳ中において４℃で、全ての時点が集められるまで貯蔵した。免疫染色の前に、細胞を、ＰＢＳ中で洗浄後、遮断用溶液（ＰＢＳ中の１０％ＦＢＳ）中において室温で１時間インキュベートした。遮断後、細胞を、ＰＢＳ中で３回洗浄後、ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ中１：１０００希釈のマウス抗γＨ２ＡＸモノクローナル（Millipore, UK）と一緒に室温で１時間インキュベーションを行った。細胞を、ＰＢＳ中で３回洗浄後、ＰＢＳ中の２％ＦＢＳ中１：１０００希釈の抗マウス Alex Fluor ４８８（Life Technologies）中、暗所において室温でインキュベートした。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（Vectorlabs, UK）で Vectashield 中に載せ、そして Zeiss 顕微鏡で調べた。γＨ２ＡＸフォーカスの数を、最低５０個の核の蓄積画像から三重反復で手動評点した。微小核を有する細胞を、γＨ２ＡＸフォーカス分析に用いられた同じ画像から、最低５０個の細胞において三重反復で手動評点した。
【００３４】
ブロモデオキシウリジン細胞増殖アッセイ
アッセイ用に、ＭＲＣ５ＶＡ細胞を採取し、計数し、そして２５ｃｍ２培養フラスコ（Corning, USA）中に必要な密度で播種した。細胞を２４時間回収させ且つ付着させた後、細胞に、ナノパーティクルを５ｘ１０７個ＮＰ／細胞で負荷した。負荷されていない細胞を対照とした。２４時間後、細胞に、ヌクレオチド類似体ブロモデオキシウリジン（Bromodeoxyuridine）（ＢｒＤＵ）で２０分間パルス標識した。ナノパーティクルを含有する古い培地を除去し、２０μＭのＢｒＤＵを含有する新鮮培地と交換し、そしてインキュベーター中に入れた。パルス標識後、細胞を、トリプシン処理によって採取し、そして遠心分離によって洗浄した。細胞ペレットを、完全ＤＭＥＭ中に再懸濁させ、氷上に置き、そして１３７セシウムγ源を約２．５Ｇｙ／分の線量率で用いて５Ｇｙに照射した。照射後、細胞を、必要な時点で採取するために２５ｃｍ２フラスコ中に再分布した。
【００３５】
必要な時点で、細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳ中において遠心分離によって２回洗浄した。最後の洗浄後、上澄みを捨て、そして細胞ペレットを、残りのＰＢＳ滴中に再懸濁させて、細胞が凝集するのを防いだ。次に、細胞を、２ｍｌの２０℃、１００％エタノールを滴加しながら渦巻かせた。固定した細胞を、−２０℃で、全ての試料が集められるまで貯蔵した。染色するには、細胞を、最初に、ＰＢＳ中において２０００ｒｐｍでの遠心分離によって５分間２回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を、０．１ｍｇ／ｍｌのペプシンを含有する２ｍｌの２Ｍ塩酸中に再懸濁させ、室温で２０分間インキュベートした。次に、細胞を、ＰＢＳ中において２０００ｒｐｍでの遠心分離によって５分間３回洗浄した。最後の洗浄後、できるだけ多くの上澄みを、細胞ペレットの妨げになることなく除去した。次に、細胞を、０．５％正常ヤギ血清、０．５％ Tween−２０（ＰＮＴ）、及び１：５０に希釈されたマウス抗ＢｒＤＵモノクローナル（Dako, UK）を含有する１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、そして室温で１時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中において遠心分離によって３回洗浄し、３回目の洗浄後、できるだけ多くの上澄みを、細胞ペレットから移動させた。次に、細胞を、１：５０に希釈された抗マウス Alexa Fluor ４８８（Life Technologies, UK）を含有する１００μｌのＰＮＴ中に再懸濁させ、そして暗所において室温で６０分間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ中において遠心分離によって１回洗浄し、１０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（propidium）を含有する０．５ｍｌのＰＢＳ中に再懸濁させ、そして暗所において４℃で一晩貯蔵した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳcalibur 計測器（Becton Dickson, USA）で行い、そして細胞周期分析は、FlowJo ソフトウェア（Tree Star, USA）を用いて行った。
【００３６】
パルスフィールドゲル電気泳動
ＭＲＣ５ＶＡ細胞を採取し、計数し、そして２５ｃｍ２培養フラスコ（Corning, USA）中に必要な密度で播種した。細胞を２４時間回収させ且つ付着させた後、指数的に増殖している細胞を、０．０２μＣｉ／ｍｌの１４Ｃ−チミジン（Perkin Elmer）を補足した新鮮な完全ＤＭＥＭでの古い培地の交換によって放射性標識した。２４時間後、培地を変化させることなく、細胞に、ナノパーティクルを５ｘ１０７個ＮＰ／細胞で負荷した。負荷されていない細胞を対照とした。更に２４時間後、定常期の細胞は、２時間のチェイス期間の間、新鮮な完全ＤＭＥＭと交換された培地を有した。次に、細胞をトリプシン処理し、そして予め加温したＰＢＳ中において１５００ｒｐｍでの遠心分離によって３分間洗浄した。上澄みを除去し、そして細胞を、１ｍｌの予め加温したＰＢＳ中に再懸濁させ、計数した。次に、必要な細胞数を、遠心分離によってペレットにし、必要な容量の予め加温したＰＢＳに再懸濁させ、そして等容量のＰＢＳ中の１％低融点アガロース溶液（ＬＭＰＡ）と一緒に、２．５〜３．０ｘ１０６個細胞／ｍｌの最終密度で静かに混合した。アガロース中の細胞懸濁液を、再使用可能プラグ型（Bio-Rad）中にピペッティングした。次に、その型を、４℃で１５分間置いて、アガロースプラグを凝固させた。凝固後、各々のプラグを、滅菌カバーガラスで切断して、３個のインサートとした。インサートを、２０ｘ容量の完全ＤＭＥＭに移し、氷上で３０分間インキュベートした。次に、非照射対照を除くインサートに、１３７セシウムγ源を約２．５Ｇｙ／分の線量率で用いて３０Ｇｙに照射した。照射後、インサートを、予め加温した完全ＤＭＥＭを含む６ウェルプレート中に注ぎ、そして５％ＣＯ２を含む室内空気雰囲気中において３７℃でインキュベートした。必要な時点で、細胞を、１５ｘ容量の溶解用溶液（０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、１％Ｎ−ラウロリサルコシン（laurolysarcosine）、１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ）と培地を交換し且つ５０℃で４８時間インキュベートすることによって溶解させた。溶解後、アガロースインサート中のＤＮＡ試料を、５００ｘ容量のＴＥ緩衝液、ｐＨ８．０（１０ｍＭ Tris−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で十分に５回洗浄して、残っているプロテイナーゼＫ及びデタージェントの混入を免れた。次に、洗浄済みプラグを、２０ｘ容量のＴＥ緩衝液中において４℃で、電気泳動を行うまで貯蔵した。
【００３７】
パルスフィールドゲル電気泳動は、０．５ｘＴＢＥ緩衝液（５０ｍＭ Tris、４５ｍＭホウ酸、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ）（BioRad）で流した０．８％超純粋アガロースゲル（BioRad）上で行った。試料を含有するアガロースインサートは、ゲルのウェル中に静かに入れ、そしてウェルの底部に押しつけて、気泡の形成を免れた。負荷後、インサートは、０．５％ＬＭＰＡと一緒にウェル中に密封した。次に、ゲルを、Bio-Rad ＣＨＥＦ−ＤＲIII装置中に入れた。ゲルは、１．５ボルト／ｃｍ、１８００秒のスイッチ時間、１２０°の角度で、０．５ＸのＴＡＥ中において１４℃で４８時間実験した。電気泳動後、ゲルは、適するゲル乾燥機を用いて、陽電荷の濾紙上に５０℃で約６時間乾燥させ、蓄積リン光スクリーンに４８時間暴露し、そして適するホスホルイメージャー（phosphorimager）を用いて分析した。
【００３８】
結果
図１は、標的指向したナノパーティクルが、細胞核に到達するということを示している。非標的指向粒子は、細胞核に到達しない。
【００３９】
図２は、標的指向したナノパーティクルが、いろいろな異なった細胞集団に用いることができるということを示している。それら粒子は、放射線を用いて細胞死滅を増大させる（図３）。
【００４０】
これは、図４に示されるように、ナノパーティクルによって減少したＤＮＡ修復及び増加した未修復ＤＮＡ損傷のためであると考えられる。これは、図５に示される増加したリン酸化ヒストン変異型Ｈ２ＡＸの知見によって確かめられる。より高いレベルのＤＮＡ二本鎖切断（ｄｓｂ）も、標的指向したナノパーティクルを用いて認められた（図６）。ｄｓｂは、修復するのが困難であり、しばしば、細胞において致死的である。
【００４１】
標的指向したナノパーティクル自体は、調べられた全ての細胞システムにおいて、ＤＮＡ損傷性薬の不存在下でそれ自体が毒性であるとは考えられない（図７）。これは、例えば、ナノパーティクルを投与することを可能にするし、しかも細胞の集中した区域に、例えば、電離放射線の集中したビームを、周囲の細胞への限られた作用で標的指向させることを可能にする。ナノパーティクルは、ニューロンに対して無毒性であると考えられる。
【００４２】
ＤＮＡｄｓｂの修復へのナノパーティクルの作用は、持続性で且つ長続きする。標的指向したナノパーティクルは、ｄｓｂを修復するのに要する時間を増加させ（図９）、したがって、標的細胞が死滅する可能性を増加させる。
【図１ａ】
2015521198.tif 000004
【図１ｂ】
2015521198.tif 000005
【図１ｃ】
2015521198.tif 000006
【図１ｄ】
2015521198.tif 000007
【図２ａ】
2015521198.tif 000008
【図２ｂ】
2015521198.tif 000009
【図２ｃ】
2015521198.tif 000010
【図２ｄ】
2015521198.tif 000011
【図４ａ】
2015521198.tif 000012
【図４ｂ】
2015521198.tif 000013
【図４ｃ】
2015521198.tif 000014
【図４ｄ】
2015521198.tif 000015
【図４ｅ】
2015521198.tif 000016
【図４ｆ】
2015521198.tif 000017
【図４ｇ】
2015521198.tif 000018
【図４ｈ】
2015521198.tif 000019
【図６ａ】
2015521198.tif 000020
【図６ｂ】
2015521198.tif 000021
【図８ａ】
2015521198.tif 000022
【図８ｂ】
2015521198.tif 000023
【図８ｃ】
2015521198.tif 000024
【図３】
2015521198.tif 000025
【図５ａ】
2015521198.tif 000026
【図５ｂ】
2015521198.tif 000027
【図６】
2015521198.tif 000028
【図７】
2015521198.tif 000029
【図９ａ】
2015521198.tif 000030
【図９ｂ】
2015521198.tif 000031
【配列表】
2015521198000001.app
【国際調査報告】
2015521198.tif 000032
2015521198.tif 000033
2015521198.tif 000034
2015521198.tif 000035