(57)【要約】  本発明は、植物プロフィリン(例えばPhl p 12、Bet v 2又はOle e 2)又はそのバリアントを用いての、プロフィリン含有植物性物質(例えば草又は樹木花粉)の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答のバイスタンダー抑制による治療に関する。また、本発明は、医薬的特性を増大するためにそのシステイン残基の２つが別のアミノ酸で置き換えられた特定のPhl p 12バリアントを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる個体における超過敏性免疫応答の治療に使用するための、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド。
【請求項２】
プロフィリン含有植物性物質のプロフィリンのアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を有する請求項１に記載の使用のための請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
植物界マツ綱、植物界単子葉植物綱及び植物界双子葉植物綱からなる群より選択される植物綱のプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンである請求項１に記載の使用のための請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
超過敏性免疫応答が、植物界マツ綱、植物界単子葉植物綱及び植物界双子葉植物綱からなる群より選択される植物綱のプロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる請求項１に記載の使用のための請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
マツ目, ヤシ目, クサスギカズラ目, イネ目, ショウガ目, セリ目, キク目, アブラナ目, ウリ目, ツツジ目, マメ目, ブナ目, リンドウ目, シソ目, クスノキ目, アオイ目, キントラノオ目, フトモモ目, ヤマモガシ目, バラ目, ムクロジ目, ナス目及びブドウ目からなる群より選択される植物目のプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンである請求項１に記載の使用のための請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
超過敏性免疫応答が、マツ目, ヤシ目, クサスギカズラ目, イネ目, ショウガ目, セリ目, キク目, アブラナ目, ウリ目, ツツジ目, マメ目, ブナ目, リンドウ目, シソ目, クスノキ目, アオイ目, キントラノオ目, フトモモ目, ヤマモガシ目, バラ目, ムクロジ目, ナス目及びブドウ目からなる群より選択される植物目のプロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる請求項１に記載の使用のための請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
配列番号2〜42からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するプロフィリンである請求項１に記載の使用のための請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項８】
Cry jプロフィリン, Pho d 2, Ana c 1, Cyn d 12, Tri a 12, Mus a 1, Api g 4, Dau c 4, Amb a 8, Art v 4, Hel a 2, Ara t 8, Sin a 4, Ama r 2, Beta v 2, Che e 2, Sal k 4, Act d 9, Cuc m 2, Ara h 5, Gly m 3, Bet v 2, Cor a 2, Ole e 2, Hev b 8, Mer a 12, Pla a 3, Fra a 4, Mal d 4, Par j 3, Pru av 4, Pru du 4, Pru p 4, Pyr c 4, Cit s 2, Lit c 1, Cap a 2及びLyc e 1からなる群より選択されるプロフィリン又は前記プロフィリンのバリアントである請求項１に記載の使用のための請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項９】
超過敏性免疫応答が、Cha o 1, Cha o 2, Cry j 1, Cry j 2, Cup a 1, Cup s 1, Cup s 3, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun s 1, Jun v 1, Jun v 3, Ana c 2, Ant o 1, Aspa o 1, Cro s 1, Cro s 2, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24, Dac g 1, Dac g 2, Dac g 3, Dac g 4, Dac g 5, Fes p 4, Hol l 1, Hol l 5, Hor v 1, Hor v 5, Hor v 12, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 4, Lol p 5, Lol p 11, Mus a 2, Mus a 3, Mus a 4, Mus a 5, Ory s 1, Ory s 12, Pas n 1, Pha a 1, Pha a 5, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 13, Pho d 2, Poa p 1, Poa p 5, Sec c 1, Sec c 5, Sec c 20, Sor h 1, Tri a 14, Tri a 15, Tri a 18, Tri a 19, Tri a 21, Tri a 25, Tri a 26, Tri a 27, Tri a 28, Tri a 29, Tri a 30, Tri a 31, Tri a 32, Tri a 33, Tri a 34, Tri a 35, Tri a 36, Tri a 37, Zea m 1, Zea m 12, Zea m 14, Zea m 25, Act c 5, Act c 8, Act c 10, Act d 1, Act d 2, Act d 3, Act d 4, Act d 5, Act d 6, Act d 7, Act d 8, Act d 10, Act d 11, Aln g 1, Aln g 4, Amb a 1, Amb a 2, Amb a 3, Amb a 4, Amb a 5, Amb a 6, Amb a 7, Amb a 9, Amb a 10, Amb p 5, Amb t 5, Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3, Api g 1, Api g 2, Api g 3, Api g 5, Api g 6, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 9, Ara h 10, Ara h 11, Art v 1, Art v 2, Art v 3, Art v 5, Art v 6, Ber e 1, Ber e 2, Beta v 1, Bet v 1, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7, Bra j 1, Bra n 1, Bra o 3, Bra r 1, Bra r 2, Cap a 1w, Car b 1, Car i 1, Car i 4, Cas s 1, Cas s 5, Cas s 8, Cas s 9, Cat r 1, Che a 1,Che a 3, Cit l 3, Cit r 3, Cit s 1, Cit s 3, Cof a 1, Cor a 1, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 10, Cor a 11, Cor a 12, Cor a 13, Cor a 14, Cuc m 1, Cuc m 3, Dau c 1, Fag e 2, Fag t 2, Fag s 1, Fra a 1, Fra a 3, Fra e 1, Gly m 1, Gly m 2, Gly  m 4, Gly m 5, Gly m 6, Hel a 1, Hel a 3, Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13, Hev b 14, Hum j 1, Jug n 1, Jug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Jug r 4, Lac s 1, Len c 1, Len c 2, Len c 3,Lig v 1, Lup an 1, Lyc e 2, Lyc e 3, Lyc e 4, Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3, Man e 5, Mer a 1, Mor n 3, Ole e 1, Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10, Ole e 11, Ost c 1, Par j 1, Par j 2, Par j 4, Par o 1, Pers a 1, Pha v 3, Pis v 1, Pis v 2, Pis v 3, Pis v 4, Pis v 5, Pis s 1, Pis s 2, Pla l 1, Pla a 1, Pla a 2, Pla or 1, Pla or 2, Pla or 3, Pru ar 1, Pru ar 3, Pru av 1, Pru av 2, Pru av 3, Pru d 3, Pru du 3, Pru du 5, Pru du 6, Pru p 1, Pru p 2, Pru p 3, Pyr c 1, Pyr c 3, Pyr c 5, Que a 1, Ric c 1, Rub i 1, Rub i 3, Sal k 1, Sal k 2, Sal k 3, Sal k 5, Ses i 1, Ses i 2, Ses i 3, Ses i 4, Ses i 5, Ses i 6, Ses i 7, Sin a 1, Sin a 2, Sin a 3, Sola t 1, Sola t 2, Sola t 3, Sola t 4, Syr v 1, Syr v 3, Vig r 1, Vit v 1及びZiz m 1からなる群より選択される非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる請求項１に記載の使用のための請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号1〜42からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するプロフィリン又は前記プロフィリンのバリアントである請求項１に記載の使用のための請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
Cry jプロフィリン, Pho d 2, Ana c 1, Cyn d 12, Tri a 12, Mus a 1, Api g 4, Dau c 4, Amb a 8, Art v 4, Hel a 2, Ara t 8, Sin a 4, Ama r 2, Beta v 2, Che e 2, Sal k 4, Act d 9, Cuc m 2, Ara h 5, Gly m 3, Bet v 2, Cor a 2, Ole e 2, Hev b 8, Mer a 12, Pla a 3, Fra a 4, Mal d 4, Par j 3, Pru av 4,  Pru du 4, Pru p 4, Pyr c 4, Cit s 2, Lit c 1, Cap a 2及びLyc e 1からなる群より選択されるプロフィリン又は前記プロフィリンのバリアントのバリアントである請求項１に記載の使用のための請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１０又は１１において言及されるプロフィリンの1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45又は50アミノ酸が、置換, 欠失, 重複, 挿入-欠失, フレームシフト, トランスバージョン, トランケーション及び/又は逆位に供されている請求項１０又は１１に記載の使用のための請求項１０及び１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記プロフィリンのバリアントが、配列番号1と少なくとも60％の配列同一性を有し、及び/又は配列番号1の13位及び/又は115位に対応する位置にA, G又はSから選択されるアミノ酸を含み、任意にアミノ酸配列は1位メチオニンを含まない請求項８〜１２のいずれか１つに記載の使用のための請求項８〜１２のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、プロフィリン含有植物性物質を6〜8の範囲のpHを有する水溶液に1〜30分間抽出するとき、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンと共抽出可能であり、また、前記抽出物が前記プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンを含む請求項１〜１３のいずれか１つに記載の使用のための請求項１〜１３のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドが、前記プロフィリン含有植物性物質からプロフィリンを単離するか又は前記プロフィリンを組換えにより製造することを含む方法によって得ることができ、前記プロフィリンが、プロフィリン含有植物性物質を6〜8の範囲のpHを有する水溶液に1〜30分間懸濁することによって作製された抽出物において同定されており、また、前記抽出物が前記プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンも含む請求項１〜１４のいずれか１つに記載の使用のための請求項１〜１４のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、プロフィリン含有植物性物質に対する自然曝露に供される標的臓器に前記プロフィリン含有植物性物質に対する個体の自然曝露と少なくとも部分的に又は完全に一致する期間内に追加的に投与され、前記標的臓器が呼吸器、胃腸管及び皮膚からなる群より選択される請求項１〜１５のいずれか１つに記載の使用のための請求項１〜１５のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項１７】
超過敏性免疫応答が前記プロフィリン含有植物性物質のプロフィリンによって引き起こされない請求項１〜１６のいずれか１つに記載の使用のための請求項１〜１６のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記個体が、少なくとも前記ポリペプチドの初回投与前に、前記プロフィリン含有植物性物質のプロフィリン及び/又は前記ポリペプチドに感作されていない請求項１〜１７のいずれか１つに記載の使用のための請求項１〜１７のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項１９】
非プロフィリンアレルゲンと共投与されない請求項１〜１８のいずれか１つに記載の使用のための請求項１〜１８のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項２０】
舌下経路によって投与される請求項１〜１９のいずれか１つに記載の使用のための請求項１〜１９のいずれか１つに記載のポリペプチド。
【請求項２１】
1又は2つのシステイン残基がA, G及び/又はSから選択されるアミノ酸によって置換されており、任意にアミノ酸配列が1位メチオニンを含まない配列番号1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9又は10のアミノ酸配列を有するポリペプチド。
【請求項２２】
13位及び/又は115位アミノ酸であるシステインが、A (アラニン)、G (グリシン)及びS (セリン)を含む群より選択されるアミノ酸によって置換されている請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
配列番号44又は45のアミノ酸配列を有し、任意にアミノ酸配列が1位メチオニンを含まない請求項２２に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号44又は45のタンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項２５】
配列番号46又は47を有する請求項２４に記載の単離された核酸。
【請求項２６】
プロフィリン含有植物性物質から免疫原性ポリペプチドを単離すること又は前記免疫原性ポリペプチドを組換えにより製造することを含み、前記免疫原性ポリペプチドがプロフィリン含有植物性物質を6〜8のpHを有する水溶液に1〜30分間懸濁することによって作製された抽出物において同定されており、任意に当該抽出物から単離されていてもよく、また、前記抽出物が前記プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンも含む、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答をバイスタンダー免疫寛容によって治療するために使用するのに適したポリペプチドを得る方法。
【請求項２７】
プロフィリン含有植物性物質から免疫原性ポリペプチドを単離すること又は前記免疫原性ポリペプチドを組換えにより製造することを含む方法によって得ることができ、前記免疫原性ポリペプチドがプロフィリン含有植物性物質を6〜8のpHを有する水溶液に1〜30分間懸濁することによって作製された抽出物において同定されており、任意に当該抽出物から単離されていてもよく、また、前記抽出物が前記プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンも含む、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答をバイスタンダー免疫寛容によって治療するために使用するのに適したポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの治療有効量を投与することを含む、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンに対する超過敏性免疫応答の個体における治療又は予防方法。
【請求項２９】
プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンに対する超過敏性免疫応答の個体における治療又は予防用医薬の製造のための、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を有する/含むポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療科学及び免疫学の分野、より具体的にはアレルギー、免疫療法及びバイスタンダー免疫寛容の分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
アレルゲン-特異的免疫療法(SIT)は、1型超過敏性免疫応答の治療のためにほぼ１世紀前に臨床医学において導入された減感作免疫療法である。減感作免疫療法は、通常皮下投与又は舌下投与のいずれかによって、当該特異的アレルゲンに感作された個体に対して特異的アレルゲンを繰り返し投与すること又はその交差反応性アレルゲンを投与することにある。繰り返しの投与は、特異的アレルゲンに対するある種の免疫寛容とその後のアレルギー症状の消失が得られるように、通常毎日、毎週又は毎月、長期間にわたって、通常１年以上行われる(Allergens and Allergen Immunotherapy 第4版, 2008, R Lockey及びD Ledford編, Informa healthcare)。減感作免疫療法は、典型的には、特異的IgG4抗体の生成及び特異的IgEレベルの低減に関連付けられる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
しかしながら、SITが直面する１つの課題は、特異的アレルゲンを同定する必要があること及び深刻な副作用を誘発するリスクが超過敏性免疫応答の治療におけるSITの一般的適用を制限し得ることである。
【０００４】
したがって、超過敏性免疫応答の治療を改善する必要がある。
１つの抗原を用いて、別の非関連抗原によって引き起こされる超過敏性免疫応答を抑制して個体を治療するという概念は、20年以上前に実証された。Millerら(1991)は、OVAの胃内投与によって繰り返し処置したナイーブラットにおいて抗原(MBP) (ミエリン塩基性タンパク質)に対する末梢寛容を得ることができることを示した。しかしながら、MBPに対する寛容は、ラットをMBPでチャレンジするときに当該ラットがMPB及びOVAの両方に共曝露されてEAEを発症する場合にのみ得られた。この概念はDahlman-Hoglundら(1995)及びMillingtonら(2004)によって更に研究されており、第１抗原を与えられたナイーブラットは、第２抗原でチャレンジするときに第１抗原及び第２抗原の両方に曝露される場合、第２抗原によって惹起される超過敏性免疫応答の発生を妨げることができることが示された。Oliveira CRら(2005)は、バイスタンダー効果が、１つのアレルゲンに既に感作された個体において新たなアレルゲンに対する感作を制御するという興味深いメカニズムであり得ることを示唆している。
【０００５】
プロフィリンは、典型的には125〜135アミノ酸からなり、酵母から人間まで、生物において普遍的に見られる自然に発生するポリペプチドである(Santos及びVan Ree 2011)。それらは、脊椎動物、植物等からの細胞の細胞質に高濃度で存在し、アクチン、ポリ-L-プロリン(PLP)及びホスファチジルイノシトール-4.5-ビホスフェート(PIP2)に特異的に結合する。プロフィリンは、その供給源たるa)植物、b)哺乳動物、c)ウイルス、d)その他の真核生物に依存して、４つの異なるクラスに分けることができる。これら異なるクラス間同士ではアミノ酸配列の相同性は低いが(〜30％)、クラス内同士の相同性はより高く、例えば約50〜90％である(Thornら, 1997)。
【０００６】
いくつかの植物プロフィリンがアレルゲンとして同定されているが(Martinez Aら, 2002)、植物プロフィリンに感受性のアレルギー患者の有病率は低いが、ものにより変動する。例えば、草花粉アレルゲンに対してアレルギー性の患者の約5〜15％は、草花粉のプロフィリンに対してアレルギー性である一方、オリーブの樹木花粉にアレルギー性の患者の約24％はオリーブ花粉のプロフィリン(Ole e 2)を認識するIgEを有することが見出された。
【０００７】
特異的アレルゲン免疫療法とは対照的に、本発明は、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答の治療/予防のための非特異的免疫療法に関する。
【０００８】
本発明者らは、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンに対する曝露によって惹起される(喘息のような)超過敏性免疫応答が、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリンの舌下投与によって処置されたナイーブマウス及び感作マウスにおいて、バイスタンダー免疫寛容によって抑制され得ることについての証拠を提供する。更に、同一の処置が別のプロフィリン含有植物性物質によって引き起こされる超過敏性免疫応答も抑制し得ることが実証されており、このことにより１つのプロフィリンポリペプチドに対するバイスタンダー免疫寛容の創成が、別のプロフィリンポリペプチドによって再活性化され、超過敏性免疫応答が下方制御される免疫学的事象を生じ得ることが示された。バイスタンダー免疫寛容の以前の研究によれば、抑制は、非プロフィリンアレルゲンに対する曝露時のマウスがポリペプチド/プロフィリンにも共曝露された場合にのみ実証され得た。
【０００９】
よって、ここで提供されるデータは、個体が「疾患惹起性の」第１抗原に曝露されるときに当該個体が第１抗原及び第２抗原又は第２抗原代替物の両方に曝露されることを前提として、第１抗原によって引き起こされる超過敏性免疫応答を、第２の(異なる)抗原で個体を治療することによって抑制することができることを示している。
【００１０】
個体に対する寛容誘導性抗原の繰り返し投与は、個体が攻撃的な(offensive)抗原に曝露されるときに寛容誘導性抗原と攻撃的な抗原の２つの抗原が両方存在することを前提として、アレルゲンのような攻撃的な異なる抗原によって引き起こされる免疫応答の減衰をもたらすと認識されている。花粉等のアレルゲン供給源物質が当該個体の気道粘膜と接触し、アレルゲン及び寛容誘導性抗原が同時にかつ同じ位置に放出されるようになるときに、個体が寛容誘導性抗原に対して寛容となること及び寛容誘導性抗原が以前に誘導された免疫寛容応答を活性化し、次いで近傍で放出されたアレルゲンに対する超過敏性免疫応答を下方制御することが想定される。
【００１１】
よって、本治療法は、個体が寛容となる第１抗原を投与することを含み、超過敏性免疫応答を惹起するアレルゲン及び寛容誘導性抗原の両方を含むアレルゲン供給源物質に曝露されたときに、そうしなければ生じると予想された超過敏性免疫応答を完全に又は部分的に抑制する。
【００１２】
Treg細胞等のT細胞及びTh-2細胞等がこのバイスタンダー免疫寛容を得るのに重要であると考えられる。例えば、流入領域リンパ節における抗原提示細胞(APC)、Treg細胞及びTh-2細胞の共局在が重要であり得る。寛容原性APC及び上皮組織における調節性サイトカインの産生もまた寛容誘導に寄与し得る。
【００１３】
プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答の抑制のための免疫療法において、植物種フレウム  プラテンス(Phleum pratense)のプロフィリンと少なくとも60％の同一性及び/又は類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを用い得ることが現在認識されている。
【００１４】
したがって、本発明の第１の側面は、例えば免疫療法による、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンに対する超過敏性免疫応答の個体における治療又は予防に使用するための、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を有する/からなる/から本質的になる/含むポリペプチドに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
好ましくは、治療される個体は、少なくともポリペプチドを初回投与されるときに、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリン及び/又はポリペプチドに対してアレルギー性でも感作されてもいない。よって、超過敏性免疫応答は、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリンによって引き起こされなくてもよい。また、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリンのアミノ酸配列及び投与されるポリペプチドのアミノ酸配列は、少なくとも60％の同一性及び/又は類似性を有することも考えられる。
【００１６】
したがって、１つの副次的側面では、本発明は、例えば免疫療法による、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンに対する超過敏性免疫応答の個体における治療又は予防に使用するためのポリペプチドであって、
ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を有し/からなり/から本質的になり/含み；
個体は、少なくともポリペプチドの初回投与されるときに、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリンに感作されておらず、好ましくはポリペプチドにも感作されておらず；
好ましくは、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリンのアミノ酸配列は、ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性及び/又は類似性を有する、ポリペプチドに関する。
【００１７】
言い換えれば、本発明の第１の側面は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を有する/からなる/から本質的になる/含むポリペプチドの治療有効量を投与することを含む、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンに対する超過敏性免疫応答の例えば免疫療法による個体における治療又は予防方法であって；好ましくは、
個体は、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリン及び/又はポリペプチドに感作されておらず；好ましくは、ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリンのアミノ酸配列と少なくとも60％の類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有する、治療又は予防方法に関する。
【００１８】
更に別の言い方をすれば、本発明の第１の側面は、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンに対する超過敏性免疫応答の例えば免疫療法による個体における治療又は予防用医薬の製造のためのポリペプチドの使用であって、
ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を有し/からなり/から本質的になり/含み；好ましくは
個体は、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリン及び/又はポリペプチドに感作されておらず；好ましくは、ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリンのアミノ酸配列と少なくとも60％の類似性又は同一性を有するアミノ酸配列を有する、使用に関する。
【００１９】
配列番号1のアミノ酸配列は、フレウム  プラテンス種の草花粉において見出されるプロフィリンPhl p 12の生物学的異性体(biological isomer)の１つである。配列番号1と少なくとも95％、例えば約98％の同一性又は類似性を有するアミノ酸配列を有するその他の生物学的異性体は、配列番号2〜10としてここで報告される。
【００２０】
本発明の第２の側面は、本発明のポリペプチドのシステイン置換バリアント、例えば1又は2つのシステイン残基がA、G及び/又はSから選択されるアミノ酸によって置換されている配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10のアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば13位及び/又は115位アミノ酸であるシステインがA (アラニン)、G (グリシン)及びS (セリン)を含む群より選択されるアミノ酸によって置換されている配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10のアミノ酸配列を有するポリペプチド、例えば配列番号44又は45のアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。とりわけ、配列番号1〜10、44及び45は、組換え技術により当該配列を産生する宿主細胞における酵素分解によって除去され得るN末端(1位)の最初のアミノ酸としてメチオニンを有する。したがって、システイン置換バリアントは配列番号44及び45のアミノ酸配列を有するが、1位のメチオニン基は存在しない場合があることは理解されるべきである。よって、いくつかの実施態様において、配列番号44及び/又は45のアミノ酸配列は、1位メチオニンを含まない。更に、この第２の側面は、配列番号44又は45のタンパク質をコードする単離された核酸、例えば配列番号46又は47の核酸配列を有する上記の単離された核酸にも関する。
【００２１】
本発明の第３の側面は、プロフィリン含有植物性物質から免疫原性ポリペプチドを単離すること又は免疫原性ポリペプチドを組換えにより製造することを含む、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答をバイスタンダー免疫寛容によって治療するために使用するのに適したポリペプチドを得る方法であって、免疫原性ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質を6〜8の範囲のpHを有する水溶液に1〜30分間懸濁することによって作製された抽出物において同定されており、任意に当該抽出物から単離されていてもよい、方法に関する。好ましくは、抽出物は、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲン、すなわち免疫原性ポリペプチドと共抽出された非プロフィリンアレルゲンも含む。
【００２２】
本発明の第４の側面は、プロフィリン含有植物性物質から免疫原性ポリペプチドを単離すること又は免疫原性ポリペプチドを組換えにより製造することを含む方法によって得ることができ、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答をバイスタンダー免疫寛容によって治療するために使用するのに適したポリペプチドであって、免疫原性ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質を6〜8の範囲のpHを有する水溶液に1〜30分間懸濁することによって作製された抽出物において同定されており、任意に当該抽出物から単離されていてもよい、ポリペプチドに関する。好ましくは、抽出物は、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲン、すなわち免疫原性ポリペプチドと共抽出された非プロフィリンアレルゲンも含む。
【００２３】
本発明の更なる側面及び本発明の別の表現を以下に示す：
・  プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる個体における超過敏性免疫応答の治療又は予防に使用するためのポリペプチドであって、当該ポリペプチドがマツ目(Pinales), ヤシ目(Arecales), クサスギカズラ目(Asparagales), イネ目(Poales), ショウガ目(Zingiberales), セリ目(Apiales), キク目(Asterales), アブラナ目(Brassicalis), ウリ目(Curcurbitales), ツツジ目(Ericales), マメ目(Fabales), ブナ目(Fagales), リンドウ目(Gentianales), シソ目(Lamiales), クスノキ目(Laurales), アオイ目(Malvales), キントラノオ目(Malpighiales), フトモモ目(Myrtales), ヤマモガシ目(Proteales), バラ目(Rosales), ムクロジ目(Sapindales), ナス目(Solanales)及びブドウ目(Vitales)からなる群より選択される植物目のプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンであるか又はプロフィリンのバリアントであり；
超過敏性免疫応答は、マツ目, ヤシ目, クサスギカズラ目, イネ目, ショウガ目, セリ目, キク目, アブラナ目, ウリ目, ツツジ目, マメ目, ブナ目, リンドウ目, シソ目, クスノキ目, アオイ目, キントラノオ目, フトモモ目, ヤマモガシ目, バラ目, ムクロジ目, ナス目及びブドウ目からなる群より選択される植物目からのプロフィリン含有植物の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる、ポリペプチド。
・  プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる個体における超過敏性免疫応答の治療又は予防に使用するためのポリペプチドであって、当該ポリペプチドがヒノキ科(Cupressaceae), ヤシ科(Arecaceae), クサスギカズラ科(Asparagaceae), アヤメ科(Iridaceae), パイナップル科(Bromeliaceae), イネ科(Poaceae), バショウ科(Musaceae), ショウガ科(Zingiberaceae), セリ科(Apiaceae), ウコギ科(Araliaceae), キク科(Asteraceae), アブラナ科(Brassicaceae), ヒユ科(Amaranthaceae), ナデシコ科(Caryophyllaceae), タデ科(Polygonaceae), ウリ科(Cucurbitaceae), マタタビ科(Actinidiaceae), サガリバナ科(Lecythidaceae), ツバキ科(Theaceae), マメ科(Fabaceae), カバノキ科(Betulaceae), ブナ科(Fagaceae), クルミ科(Juglandaceae), ヤマモモ科(Myricaceae), ナンキョクブナ科(Nothofagaceae), ティコデンドロン科(Ticodendraceae), キョウチクトウ科(Apocynaceae), アカネ科(Rubiaceae), モクセイ科(Oleaceae), ゴマ科(Pedaliacae), オオバコ科(Plantaginaceae), クスノキ科(Lauraceae), アオイ科(Malvaceae), トウダイグサ科(Euphorbiaceae), ミソハギ科(Lythraceae), スズカケノキ科(Platanaceae), アサ科(Cannabaceae), バラ科(Rosaceae), ニレ科(Ulmaceae), イラクサ科(Urticaceae), ウルシ科(Anacardiaceae), ミカン科(Rutaceae), ムクロジ科(Sapindales), ナス科(Solanaceae)及びブドウ科(Vitaceae)からなる群より選択される植物科のプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンであるか又は当該プロフィリンのバリアントであり；
超過敏性免疫応答は、ヒノキ科, ヤシ科, クサスギカズラ科, アヤメ科, パイナップル科, イネ科, バショウ科, ショウガ科, セリ科, ウコギ科, キク科, アブラナ科, ヒユ科, ナデシコ科, タデ科, ウリ科, マタタビ科, サガリバナ科, ツバキ科, マメ科, カバノキ科, ブナ科, クルミ科, ヤマモモ科, ナンキョクブナ科, ティコデンドロン科, キョウチクトウ科, アカネ科, モクセイ科, ゴマ科, オオバコ科, クスノキ科, アオイ科, トウダイグサ科, ミソハギ科, スズカケノキ科, アサ科, バラ科, ニレ科, イラクサ科, ウルシ科, ミカン科, ムクロジ科, ナス科及びブドウ科からなる群より選択される植物科からのプロフィリン含有植物の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる、ポリペプチド。
・  プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる個体における超過敏性免疫応答の治療又は予防に使用するためのポリペプチドであって、当該ポリペプチドがカメシパリス(Chamaecyparis), クリプトメリア(Cryptomeria), キュプレサス(Cupressus), ジュニペルス(Juniperus), フォエニクス(Phoenix), アスパラガス(Asparagus), クロクス(Crocus), アナナス(Ananas), アントキサンタム(Anthoxanthum), シノドン(Cynodon), ダクチリス(Dactylis), フェスツカ(Festuca), ホルクス(Holcus), ホルデウム(Hordeum), ロリウム(Lolium), オライザ(Oryza), パスパルム(Paspalum), ファラリス(Phalaris), フレウム(Phleum), ポア(Poa), セカレ(Secale), ソルガム(Sorghum), トリティカム(Triticum), ゼア(Zea), ムサ(Musa), アピウム(Apium), ダウクス(Daucus), アンブロシア(Ambrosia), アルテミシア(Artemisia), ヘリアンタス(Helianthus), ラクツカ(Lactuca), アラビドプシス(Arabidopsis), ブラシカ(Brassica), シナピス(Sinapis), アマランタス(Amaranthus), ベタ(Beta), ケノポディウム(Chenopodium), ファゴピラム(Fagopyrum), サルソラ(Salsola), ククミス(Cucumis), アクチニディア(Actinidia), ベルトレティア(Bertholletia), アラキス, グリシン(Glycine), レンス(Lens), ルピヌス(Lupinus), ファセオラス(Phaseolus), ピサム(Pisum), ヴィグナ(Vigna), アルヌス(Alnus), ベトゥラ(Betula), カルピヌス(Carpinus), カリア(Carya), カスタネア(Castanea), コリラス(Corylus), ファガス(Fagus), ジャグランス(Juglans), オストリア(Ostrya), ケルクス(Quercus), カタランタス(Catharanthus), コフィア(Coffea), フラクシヌス(Fraxinus), リグストラム(Ligustrum), オレア(Olea), プランタゴ(Plantago), セサマム(Sesamum), シリンガ(Syringa), ペルセア(Persea), ゴシピウム(Gossypium), ヘヴェア(Hevea), マニホット(Manihot), メルキュリアリス(Mercurialis), ポポラス(Popolus), リシヌス(Ricinus), ソネラティア(Sonneratia), プラタヌス(Platanus), フラガリア(Fragaria), フムラス(Humulus), マルス(Malus), モラス(Morus), パリエタリア(Parietaria), プラヌス(Prunus), ピルス(Pyrus), ルバス(Rubus), ジジファス(Ziziphus), アナカーディウム(Anacardium), シトラス(Citrus), リチ(Litchi), マンギフェラ(Mangifera), ピスタシア(Pistacia), カプシカム(Capsicum), リコパーシコン(Lycopersicon), ソラナム(Solanum)及びヴィティス(Vitis)からなる群より選択される属からのプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンであるか又は当該プロフィリンのバリアントであり；
超過敏性免疫応答は、カメシパリス, クリプトメリア, キュプレサス, ジュニペルス, フォエニクス, アスパラガス, クロクス, アナナス, アントキサンタム, シノドン, ダクチリス, フェスツカ, ホルクス, ホルデウム, ロリウム, オライザ, パスパルム, ファラリス, フレウム, ポア, セカレ, ソルガム, トリティカム, ゼア, ムサ, アピウム, ダウクス, アンブロシア, アルテミシア, ヘリアンタス, ラクツカ, アラビドプシス, ブラシカ, シナピス, アマランタス, ベタ, ケノポディウム, ファゴピラム, サルソラ, ククミス, アクチニディア, ベルトレティア, アラキス, グリシン, レンス, ルピヌス, ファセオラス, ピサム, ヴィグナ, アルヌス, ベトゥラ, カルピヌス, カリア, カスタネア, コリラス, ファガス, ジャグランス, オストリア, ケルクス, カタランタス, コフィア, フラクシヌス, リグストラム, オレア, プランタゴ, セサマム, シリンガ, ペルセア, ゴシピウム, ヘヴェア, マニホット, メルキュリアリス, ポポラス, リシヌス, ソネラティア, プラタヌス, フラガリア, フムラス, マルス, モラス, パリエタリア,  プラヌス, ピルス, ルバス, ジジファス, アナカーディウム, シトラス, リチ, マンギフェラ, ピスタシア, カプシカム, リコパーシコン, ソラナム及びヴィティスからなる群より選択される属からのプロフィリン含有植物の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる、ポリペプチド。
・  プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる個体における超過敏性免疫応答の治療又は予防に使用するためのポリペプチドであって、当該ポリペプチドがカメシパリス, クリプトメリア, キュプレサス, ジュニペルス, フォエニクス, アスパラガス, クロクス, アナナス, アントキサンタム, シノドン, ダクチリス, フェスツカ, ホルクス, ホルデウム, ロリウム, オライザ, パスパルム, ファラリス, フレウム, ポア, セカレ, ソルガム, トリティカム, ゼア, ムサ, アピウム, ダウクス, アンブロシア, アルテミシア, ヘリアンタス, ラクツカ, アラビドプシス, ブラシカ, シナピス, アマランタス, ベタ, ケノポディウム, ファゴピラム, サルソラ, ククミス, アクチニディア, ベルトレティア, アラキス, グリシン, レンス, ルピヌス, ファセオラス, ピサム, ヴィグナ, アルヌス, ベトゥラ, カルピヌス, カリア, カスタネア, コリラス, ファガス, ジャグランス, オストリア, ケルクス, カタランタス, コフィア, フラクシヌス, リグストラム, オレア, プランタゴ, セサマム, シリンガ, ペルセア, ゴシピウム, ヘヴェア, マニホット, メルキュリアリス, ポポラス, リシヌス, ソネラティア, プラタヌス, フラガリア, フムラス, マルス, モラス, パリエタリア, プラヌス, ピルス, ルバス, ジジファス, アナカーディウム, シトラス, リチ, マンギフェラ, ピスタシア, カプシカム, リコパーシコン, ソラナム及びヴィティスからなる群より選択される属からのプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンであるか又は当該プロフィリンのバリアントであり；
非プロフィリンアレルゲンは、Cha o 1, Cha o 2, Cry j 1, Cry j 2, Cup a 1, Cup s 1, Cup s 3, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun s 1, Jun v 1,Jun v 3, Ana c 2, Ant o 1, Aspa o 1, Cro s 1, Cro s 2, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24, Dac g 1, Dac g 2, Dac g 3, Dac g 4, Dac g 5, Fes p 4, Hol l 1, Hol l 5, Hor v 1, Hor v 5,Hor v 12, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 4, Lol p 5, Lol p 11, Mus a 2, Mus a 3, Mus a 4, Mus a 5, Ory s 1, Ory s 12, Pas n 1, Pha a 1, Pha a 5, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 12, Phl p 13,Pho d 2, Poa p 1, Poa p 5, Sec c 1, Sec c 5, Sec c 20, Sor h 1, Tri a 14, Tri a 15, Tri a 18, Tri a 19, Tri a 21, Tri a 25, Tri a 26, Tri a 27, Tri a 28, Tri a 29, Tri a 30, Tri a 31, Tri a 32, Tri a 33, Tri a 34, Tri a 35, Tri a 36, Tri a 37, Zea m 1, Zea m 12, Zea m 14, Zea m 25, Act c 5, Act c 8, Act c 10, Act d 1, Act d 2, Act d 3, Act d 4, Act d 5, Act d 6, Act d 7, Act d 8, Act d 10, Act d 11, Aln g 1, Aln g 4, Amb a 1, Amb a 2, Amb a 3, Amb a 4, Amb a 5, Amb a 6, Amb a 7, Amb a 9, Amb a 10, Amb p 5, Amb t 5, Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3, Api g 1, Api g 2, Api g 3, Api g 5, Api g 6, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 9, Ara h 10, Ara h 11, Art v 1, Art v 2, Art v 3, Art v 5, Art v 6, Ber e 1, Ber e 2, Beta v 1, Bet v 1, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7, Bra j 1, Bra n 1, Bra o 3, Bra r 1, Bra r 2, Cap a 1w, Car b 1, Car i 1, Car i 4, Cas s 1, Cas s 5, Cas s 8, Cas s 9, Cat r 1, Che a 1, Che a 3, Cit l 3, Cit r 3, Cit s 1, Cit s 3, Cof a 1, Cor a 1, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 10, Cor a 11, Cor a 12, Cor a 13, Cor a 14, Cuc m 1, Cuc m 3, Dau c 1, Fag e 2, Fag t 2, Fag s 1, Fra a 1, Fra a 3, Fra e 1, Gly m 1, Gly m 2, Gly  m 4, Gly m 5, Gly m 6, Hel a 1, Hel a 3, Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13, Hev b 14, Hum j 1, Jug n 1, Jug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Jug r 4, Lac s 1, Len c 1, Len c 2, Len c 3, Lig v 1, Lup an 1, Lyc e 2, Lyc e 3, Lyc e 4, Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3, Man e 5, Mer a 1, Mor n 3, Ole e 1, Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10, Ole e 11, Ost c 1, Par j 1, Par j 2, Par j 4, Par o 1, Pers a 1, Pha v 3, Pis v 1, Pis v 2, Pis v 3, Pis v 4, Pis v 5, Pis s 1, Pis s 2, Pla l 1, Pla a 1, Pla a 2,  Pla or 1, Pla or 2, Pla or 3, Pru ar 1, Pru ar 3, Pru av 1, Pru av 2, Pru av 3, Pru d 3, Pru du 3, Pru du 5, Pru du 6, Pru p 1, Pru p 2, Pru p 3, Pyr c 1, Pyr c 3, Pyr c 5, Que a 1, Ric c 1, Rub i 1, Rub i 3, Sal k 1, Sal k 2, Sal k 3, Sal k 5, Ses i 1, Ses i 2, Ses i 3, Ses i 4, Ses i 5, Ses i 6, Ses i 7, Sin a 1, Sin a 2, Sin a 3, Sola t 1, Sola t 2, Sola t 3, Sola t 4, Syr v 1, Syr v 3, Vig r 1, Vit v 1及びZiz m 1からなる群より選択される、ポリペプチド。
・  プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる個体における超過敏性免疫応答の治療又は予防に使用するためのポリペプチドであって、当該ポリペプチドがCry jプロフィリン, Pho d 2, Ana c 1, Cyn d 12, Tri a 12, Mus a 1, Api g 4, Dau c 4, Amb a 8, Art v 4, Hel a 2, Ara t 8, Sin a 4, Ama r 2, Beta v 2, Che e 2, Sal k 4, Act d 9, Cuc m 2, Ara h 5, Gly m 3, Bet v 2, Cor a 2, Ole e 2, Hev b 8, Mer a 12, Pla a 3, Fra a 4, Mal d 4, Par j 3, Pru av 4, Pru du 4, Pru p 4, Pyr c 4, Cit s 2, Lit c 1, Cap a 2及びLyc e 1からなる群より選択される植物プロフィリンであるか又はプロフィリンのバリアントであり；
超過敏性免疫応答は、カメシパリス, クリプトメリア, キュプレサス, ジュニペルス, フォエニクス, アスパラガス, クロクス, アナナス, アントキサンタム, シノドン, ダクチリス, フェスツカ, ホルクス, ホルデウム, ロリウム, オライザ, パスパルム, ファラリス, フレウム, ポア, セカレ, ソルガム, トリティカム, ゼア, ムサ, アピウム, ダウクス, アンブロシア, アルテミシア, ヘリアンタス, ラクツカ, アラビドプシス, ブラシカ, シナピス, アマランタス, ベタ, ケノポディウム, ファゴピラム, サルソラ, ククミス, アクチニディア, ベルトレティア, アラキス, グリシン, レンス, ルピヌス, ファセオラス, ピサム, ヴィグナ, アルヌス, ベトゥラ, カルピヌス, カリア, カスタネア, コリラス, ファガス, ジャグランス, オストリア, ケルクス, カタランタス, コフィア, フラクシヌス, リグストラム, オレア, プランタゴ, セサマム, シリンガ, ペルセア, ゴシピウム, ヘヴェア, マニホット, メルキュリアリス, ポポラス, リシヌス, ソネラティア, プラタヌス, フラガリア, フムラス, マルス, モラス, パリエタリア, プラヌス, ピルス, ルバス, ジジファス, アナカーディウム, シトラス, リチ, マンギフェラ, ピスタシア, カプシカム, リコパーシコン, ソラナム及びヴィティスからなる群より選択される属からのプロフィリン含有植物の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる、ポリペプチド。
・  プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる個体における超過敏性免疫応答の治療又は予防に使用するためのポリペプチドであって、当該ポリペプチドがCry jプロフィリン, Pho d 2, Ana c 1, Cyn d 12, Tri a 12, Mus a 1, Api g 4, Dau c 4, Amb a 8, Art v 4, Hel a 2, Ara t 8, Sin a 4, Ama r 2, Beta v 2, Che e 2, Sal k 4, Act d 9, Cuc m 2, Ara h 5, Gly m 3, Bet v 2, Cor a 2, Ole e 2, Hev b 8, Mer a 12, Pla a 3, Fra a 4, Mal d 4, Par j 3, Pru av 4, Pru du 4, Pru p 4, Pyr c 4, Cit s 2, Lit c 1, Cap a 2及びLyc e 1からなる群より選択される植物プロフィリンであるか又はプロフィリンのバリアントであり；
超過敏性免疫応答は、Cha o 1, Cha o 2, Cry j 1, Cry j 2, Cup a 1, Cup s 1, Cup s 3, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun s 1, Jun v 1, Jun v 3, Ana c 2, Ant o 1,  Aspa o 1, Cro s 1, Cro s 2, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24, Dac g 1, Dac g 2, Dac g 3, Dac g 4, Dac g 5, Fes p 4, Hol l 1, Hol l 5, Hor v 1, Hor v 5, Hor v 12, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 4, Lol p 5, Lol p 11, Mus a 2, Mus a 3, Mus a 4, Mus a 5, Ory s 1, Ory s 12, Pas n 1, Pha a 1, Pha a 5, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 12, Phl p 13, Pho d 2, Poa p 1, Poa p 5, Sec c 1,Sec c 5,Sec c 20,Sor h 1, Tri a 14, Tri a 15, Tri a 18, Tri a 19, Tri a 21, Tri a 25, Tri a 26, 27, Tri a 28, Tri a 29, Tri a 30, Tri a 31, Tri a 32, Tri a 33, Tri a 34, Tri a 35, Tri a 36, Tri a 37, Zea m 1, Zea m 12, Zea m 14, Zea m 25, Act c 5, Act c 8, Act c 10, Act d 1, Act d 2, Act d 3, Act d 4, Act d 5, Act d 6, Act d 7, Act d 8, Act d 10, Act d 11, Aln g 1, Aln g 4, Amb a 1, Amb a 2, Amb a 3, Amb a 4, Amb a 5, Amb a 6, Amb a 7, Amb a 9, Amb a 10, Amb p 5, Amb t 5, Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3, Api g 1, Api g 2, Api g 3, Api g 5, Api g 6, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 9, Ara h 10, Ara h 11, Art v 1, Art v 2, Art v 3, Art v 5, Art v 6, Ber e 1, Ber e 2, Beta v 1, Bet v 1, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7, Bra j 1, Bra n 1, Bra o 3, Bra r 1, Bra r 2, Cap a 1w, Car b 1, Car i 1, Car i 4, Cas s 1, Cas s 5, Cas s 8, Cas s 9, Cat r 1, Che a 1, Che a 3, Cit l 3, Cit r 3, Cit s 1, Cit s 3, Cof a 1, Cor a 1, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 10, Cor a 11, Cor a 12, Cor a 13, Cor a 14, Cuc m 1, Cuc m 3, Dau c 1, Fag e 2, Fag t 2, Fag s 1, Fra a 1, Fra a 3, Fra e 1, Gly m 1, Gly m 2, Gly  m 4, Gly m 5, Gly m 6, Hel a 1, Hel a 3, Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13, Hev b 14, Hum j 1, Jug n 1, Jug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Jug r 4, Lac s 1, Len c 1,Len c 2, Len c 3, Lig v 1, Lup an 1, Lyc e 2, Lyc e 3, Lyc e 4, Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3, Man e 5, Mer a 1, Mor n 3, Ole e 1, Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10, Ole e 11, Ost c 1, Par j 1, Par j 2, Par j 4, Par o 1, Pers a 1, Pha v 3, Pis v 1, Pis v 2, Pis v 3, Pis v 4, Pis v 5, Pis s 1, Pis s 2, Pla l 1, Pla a 1, Pla a 2, Pla or 1, Pla or 2, Pla or 3, Pru ar 1, Pru ar 3, Pru av 1, Pru av 2, Pru av 3, Pru d 3, Pru du 3, Pru du 5, Pru du 6, Pru p 1, Pru p 2, Pru p 3, Pyr c 1, Pyr c 3, Pyr c 5, Que a 1, Ric c 1, Rub i 1, Rub i 3, Sal k 1, Sal k 2, Sal k 3, Sal k 5, Ses i 1, Ses i 2, Ses i 3, Ses i 4, Ses i 5, Ses i 6, Ses i 7, Sin a 1, Sin a 2, Sin a 3, Sola t 1, Sola t 2, Sola t 3, Sola t 4, Syr v 1, Syr v 3, Vig r 1, Vit v 1及び Ziz m 1からなる群より選択される非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる、ポリペプチド。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】Phl p 12で処置し、OVA + Phl p 12又はOVA単独でチャレンジしたマウスのBAL液から単離された好酸球のパーセンテージを示す。
【図２】OVA添加時のインビトロ脾臓細胞増殖についての結果が示されること以外は図１と同じ実験である。
【図３】Phl p 12で処置し、Phl p 12含有Phl p抽出物又はPhl p 12欠失Phl p抽出物でチャレンジしたマウスのBAL液から単離した好酸球のパーセンテージを示す。
【図４】Phl p抽出物添加時の頸部リンパ節細胞のインビトロ刺激についての結果が示されること以外は図３と同じ実験である。
【図５】Phl p 抽出物添加時の頸部リンパ節細胞中のIL-5サイトカインレベルについての結果が示されること以外は図３と同じ実験である。
【図６】OVAに感作させ、次いでPhl p 12で処置し、その後OVA + Phl p 12又はOVA単独でチャレンジしたマウスのBAL液から単離した好酸球のパーセンテージを示す。
【図７】OVA添加時のインビトロ脾臓細胞増殖についての結果が示されること以外は図６と同じ実験である。
【図８】Phl p 12で処置し、OVAに感作させ、OVA + Bet v 2に共曝露したマウスから単離された脾臓細胞培養物中のIL-5サイトカインレベルを示す。
【図９】IL-13サイトカインレベルについての結果が示されること以外は図８と同じ実験である。
【図１０】フレウム  プラテンスの生花粉の20秒 (A)、60秒 (B)及び2分 (C)抽出で得られた抽出物のCIEダイアグラムである。
【図１１】フレウム  プラテンスの生花粉の5分 (A)、10分 (B)及び20分 (C)抽出で得られた抽出物のCIEダイアグラムである。
【図１２】フレウム  プラテンスの生花粉: A) Phl p 12、B) Phl p 5)、C) Phl p 1の20秒, 60秒, 2分, 5分, 10分及び20分抽出で得られた抽出物のRIEダイアグラムである。
【図１３】ELISAを用いて分析した、フレウム  プラテンスの生花粉の20秒, 60秒, 2分, 5分, 10分及び20分抽出後に遊離されたPhl p 12、Phl p 1及びPhl p 5量である。
【図１４】フレウム  プラテンスの脱脂花粉の20秒 (A)、60秒 (B)及び2分 (C)抽出で得られた抽出物のCIEダイアグラムである。
【図１５】フレウム  プラテンスの脱脂花粉の5分 (A)、10分 (B)及び20分 (C)抽出で得られた抽出物のCIEである。
【図１６】脱脂花粉(フレウム  プラテンス) A) Phl p 12、B) Phl p 5)、C) Phl p 1の20秒、60秒、2分、5分、10分及び20分抽出で得られた抽出物のRIEである。
【図１７】ELISAによって分析した、フレウム  プラテンスの脱脂花粉の20秒, 60秒, 2分, 5分, 10分及び20分抽出で遊離されたPhl p 12, Phl p 1及びPhl p 5量である。
【図１８】フレウム  プラテンスのA) 生花粉及びB) 脱脂花粉をそれぞれ 20秒, 40秒, 60秒, 2分, 5分, 10分及び20分抽出して得られた抽出物のSDS PAGEである。
【図１９】ベトゥラ  ベルコサ(Betula verrucosa)の脱脂花粉の20 秒, 60 秒及び2 分抽出で得られた抽出物のCIEである。
【図２０】ベトゥラ  ベルコサの脱脂花粉の5分(A), 10分(B)及び20分(B)抽出で得られた抽出物のCIEである。
【図２１】ベトゥラ  ベルコサの脱脂花粉A) Bet v 2 (プロフィリン)及びB) Bet v 1 (主要アレルゲン)の20秒, 60秒, 2分, 5分, 10分及び20分抽出で得られた抽出物のRIEである。
【図２２】アンブロシア  アルテミシイフォリア(Ambrosia artemisiifolia)の脱脂花粉A) Amb a 8 (プロフィリン)及びB) Amb a 1 (主要アレルゲン)の20秒, 60秒, 2分, 5分, 10分及び20分抽出で得られた抽出物のRIEである。
【図２３】アンブロシア  アルテミシイフォリア (A), ベトゥラ  ベルコサ (B), コリラス  アヴェラナ(Corylus avellana) (C)及びフレウム  プラテンス (E) アルテミシア  ブルガリス(Artemisia vulgaris) (F), クリプトメリア  ジャポニカ (Cryptomeria japonica) (G), フムラス  ジャポニカス (Humulus japonicas) (I)の花粉抽出物及びダーマトファゴイデス  プテロニシヌス(Dermatophagoides pteronyssinus)のダニの体の抽出物 (D), ネコの鱗屑の抽出物(H)及びマルス  ドメスティクス(Malus domesticus) (リンゴ) (作り立て)の抽出物(J)のRIE (ここで、プレートは、プロフィリンBet v 2を指向するポリクローナルIgG抗体で処理した)である。
【図２４】プロフィリンPhl p 2を指向するポリクローナルIgG抗体を用いて行RIEを行ったこと以外は図２３と同一の抽出物のRIEである。
【図２５】Phl p 12でSLIT処置し、その後bet v 抽出物に感作させたナイーブマウスから単離した脾臓細胞の、Bet v 抽出物を用いる刺激時のインビトロ脾臓細胞増殖を示す。
【図２６】Bet v 抽出物を用いる刺激時の頸部リンパ節細胞のインビトロ刺激の結果が示されること以外は図２５において言及したものと同じ実験である。
【図２７】bet v 抽出物に感作させ、その後Phl p 12を用いてSLIT処置したマウスから単離した脾臓細胞の、Bet v 抽出物を用いての刺激時のインビトロ脾臓細胞増殖を示す。
【図２８】Bet v 抽出物刺激時の頸部リンパ節細胞のインビトロ刺激の結果が示されること以外は図２７において言及したものと同じ実験である。
【図２９】Ole e 2でSLIT処置し、その後Phl p 抽出物に感作させたナイーブマウスから単離した脾臓細胞の、Phl p 抽出物を用いての刺激時にインビトロ脾臓細胞増殖から放出されたIL-5サイトカインレベルを示す。
【図３０】頸部リンパ節細胞のインビトロ刺激からのIL-5サイトカイン放出の結果が示されること以外は図２９において言及したものと同じ実験である。
【図３１】Phl p 12でSLIT処置し、その後OVAに感作させたナイーブマウスから単離した脾臓細胞のOVAを用いる刺激時のインビトロ脾臓細胞増殖を示す。
【図３２】H3-チミジン取り込み(カウント毎分, CPM, X軸)によって評価されたプロフィリン分子によって誘導されたT細胞活性化を示す。A及びBは、２名の草アレルギー患者から樹立したT細胞株である。a: rPhl p 12, b: nPhl p 12, g: rOle e 2, d: 培地コントロール。エラーバーは４回の実験の標準偏差を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
定義
以下の用語及びフレーズは、以下の意味を有するものとする；
用語「ある」は不確定の数について言及するものであり、「１つ」と解釈されるだけでなく、「いくつか」の意味にも解釈されるものとする。
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「アミノ酸配列」は本明細書中互換可能に用いられる。アミノ酸残基については、慣用の一字及び三字コードが本明細書中で用いられる。アミノ酸の三字コードは、生化学命名法に関する国際純正応用化学連合・国際生化学分子生物学連合合同委員会(IUPAC-IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature; JCBN)に従って定義される。
用語「バリアント」は、「親配列」と比較して改変/変異を含むポリペプチドをいう。用語「バリアント」は、用語「変異体」と互換可能に用いられ得る。
【００２６】
用語「親配列」又は「親ポリペプチド」は、バリアントが基礎とするポリペプチドを定義する意味である。そうでないと記載しない限り、配列番号1又は配列番号2〜42、あるいは表1〜4において言及したプロフィリンは親配列として考えられる。配列番号1〜42には、いくつかの実施態様において組換え製造のための宿主細胞により自然に又はエクスビボのいずれかによって酵素的に除去され得るものとして存在していなくてもよい1位メチオニンが示されていることを理解すべきである。また、メチオニンは完全に除去されていなくてもよく、約2％〜10％の組換えにより製造されたポリペプチドは1位メチオニンを含むことも理解すべきである。「親核酸」は、親ポリペプチドをコードする核酸配列を意味する。
【００２７】
用語「配列同一性」は、配列アライメント時に配列の対同士が同じであるアミノ酸の割合を定義する意味である。配列アライメント及び比較は目視によって行ってもよいが、通常容易に入手可能な配列比較コンピュータプログラムを用いて行われ、出力は当該コンピュータプログラムによって算出された同一性パーセンテージである。
【００２８】
用語「配列類似性」は、配列アライメント時に配列の対同士が同じ又は相同であるアミノ酸の割合を定義する意味である。非常に多くの場合、算出にはコンピュータプログラムが用いられ、出力は当該コンピュータプログラムのいくつかの類似性マトリクス形成部分を用いて算出されたスコアである。
【００２９】
フレーズ「アレルゲン」は、１又はそれより多いアレルゲンと解釈するものとする。
用語「アレルゲン」は、個体における、例えば動物における、例えばヒトにおける超過敏性免疫応答を誘発することができるタンパク質性の物質を指す意味である。アレルゲンは、感作アレルゲン又は交差反応性アレルゲンであり得る。
用語「感作アレルゲン」は、個体においてIgE 抗体を産生する免疫系を惹起することができるタンパク質性の物質を指す意味である。
【００３０】
用語「交差反応性アレルゲン」は、元々感作アレルゲンに対して創成されたIgE抗体によって認識され得るタンパク質性の物質を定義する。つまり、交差反応性アレルゲンは、感作アレルゲンによって誘導された交差反応性IgE抗体が認識し結合すると、超過敏性免疫応答を誘発することができるアレルゲンである。例えば、リンゴに見られるアレルゲンMal d 1は、カバノキ樹木花粉に見られるBet v 1に相同なタンパク質であり、交差的結合を惹起し、IgE抗-Bet v 1を負荷したマスト細胞でマスト細胞顆粒形成を誘導するその能力に起因して、Bet v 1アレルゲンに感作された個体において超過敏性免疫応答を誘発することができる。
【００３１】
用語「主要アレルゲン」は、当該アレルゲンを含むアレルゲン供給源物質に対する曝露によって惹起された超過敏性免疫応答を有する患者の(無作為に選択された)平均的集団の50％以上において感作を引き起こすアレルゲンを意味するものとする。
用語「マイナーアレルゲン(minor allergen)」は、当該アレルゲンを含むアレルゲン供給源物質に対する曝露によって惹起された超過敏性免疫応答を有する患者の(無作為に選択された)平均的集団の50％未満において感作を引き起こすアレルゲンを意味するものとする。
【００３２】
用語「バイスタンダー抑制」又は「バイスタンダー免疫寛容」は、一般に、個体におけるある抗原(A)に対する免疫応答を、別の非関連抗原(B)を用いる当該個体の治療によって抑制できることを包含する意味である。
用語「免疫療法」は、治療活性物質(ここではポリペプチド)が抗原(抗原性タンパク質)又は免疫原性ペプチドである療法を包含する意味である。通常、免疫療法は、十分な量、通常マイクログラム量の抗原を長期間、通常数カ月又は数年にわたって繰り返し投与すること(ここで、抗原又は免疫原性ペプチドは毎日、週数回、毎週、隔週又は毎月投与される)を包含する。
【００３３】
用語「個体」は、適応免疫系を有する哺乳動物、例えばヒト、家畜(例えばイヌ、ネコ、ウマ又はウシ)を指す意味である。
フレーズ「その必要がある個体」は、超過敏性免疫応答を有する個体、アレルゲンに感作された個体並びにアレルゲンに感作されるリスクのある個体及び超過敏性免疫応答を生じるリスクのある個体を包含する意味である。個体は、超過敏性免疫応答の臨床的症状を示していてもよいし、又は、アレルゲンに感作されているのみで超過敏性免疫応答の臨床的症状をまだ示していなくてもよい。アレルゲンに感作されるリスクのある個体は、家族のアトピー性疾患によって特定され得る。
【００３４】
フレーズ「予防治療」は、個体において超過敏性免疫応答が生じることを部分的に又は完全に妨害する応答を誘導することを目的とした例えば免疫療法による個体の治療を包含する意味である。したがって、予防治療、例えば予防免疫治療は、個体がアレルゲンに感作される前に開始する。これは、個体が感作アレルゲンに特異的に結合することができる検出可能な血清IgE抗体を生じる前又は超過敏性免疫応答の指標となるその他の生化学マーカーが個体から単離された生体試料において検出可能となる前に免疫療法を開始することによって達成され得る。さらに、予防免疫治療は、進行した疾患の臨床的症状、例えばアレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息又はアトピー性皮膚炎の症状を示す前に開始される免疫療法も指すものとする。
【００３５】
用語「治療」は、対象の状態(例えば１又はそれより多い症状)を改善すること、症状の開始を遅らせること、症状の進行を遅くすること又は疾患の改変(modification)を誘導すること等を含む、興味あるアレルゲンに対する超過敏性免疫応答を患っているか又は超過敏性免疫応答を生じるリスクのある対象に有益な全てのタイプの治療又は予防をいう。ここで用いられるように、「治療」は、必ずしも症状の治癒又は根治を暗示する意味ではないが、患者に有益な全てのタイプの治療をいう。
【００３６】
フレーズ「治療有効量」は、治療に効果的な量、例えば所望の効果を得るために十分な量を指す意味である。例えば、治療有効量は、意図した効果を得るために免疫療法の過程で投与される非関連抗原の蓄積投与量又は所与の期間内に寛容された最大投与量である。総投与量は、投与経路に依存して毎日、週２回以上、毎週、隔週又は４週毎若しくは毎月投与される単回投与量に分けてもよい。総投与量は、異なった濃度で投与してもよい。単回投与量は、抗原に依存して、マイクログラムの範囲、例えば5〜500マイクログラムの範囲にあることが期待される。
【００３７】
フレーズ「アレルゲンに感作されている」は、一般に、個体の適応免疫系が当該アレルゲンに対する記憶を示すように、例えば当該アレルゲンを指向する検出可能なIgE抗体を生じるように、又はインビトロで刺激されたT細胞が感作アレルゲンの存在下で増殖することができるように、個体がアレルゲンに曝露されていることを包含する意味である。
用語「アジュバント」は、抗原に対する免疫応答を亢進させる物質をいう。アジュバントの性質に依存して、それは細胞媒介性免疫応答、液性免疫応答又はこれら２つの混合のいずれかによって促進することができる。
【００３８】
超過敏性免疫応答の治療/予防
本発明のポリペプチドは、超過敏性免疫応答の治療/予防に使用するためであることが理解されるべきである。本発明の超過敏性免疫応答は、アレルギー性疾患/アレルギー性免疫応答、例えば典型的には1型又は4型超過敏性免疫応答又はその混合、例えば典型的には通常IgE抗体産生に関連付けられる免疫応答、例えばIgE媒介性アレルギーに関連付けられると考えられる。超過敏性免疫応答に媒介される疾患の典型例は、限定されないが、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、接触性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、アナフィラキシー、食物アレルギー及び薬物アレルギー等のアレルギー性疾患である。1型超過敏性免疫反応によって媒介される疾患の典型例は、限定されないが、アトピー性皮膚炎、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息、アナフィラキシー、食物アレルギー及び花粉症等のアレルギー性疾患である。4型超過敏性免疫反応によって媒介される疾患の例は、接触性皮膚炎である。
【００３９】
ポリペプチドは、如何なる投与経路によって投与してもよいが、好ましくは粘膜又は上皮に投与され、例えば呼吸器、胃腸管及び/又は口腔の粘膜及び/又は上皮に投与される。原則的に、皮膚への投与、例えば皮下投与、皮上投与(epicutaneous administration)又は経皮投与は本発明のポリペプチド投与の範囲内であり、いくつかの実施態様において用いられ得る。しかしながら、本発明の他の実施態様において、好ましくは、ポリペプチドは、経皮的手段又は注入(例えば皮下及び皮上)によって、皮膚に局所的に投与されない。
【００４０】
上皮及び/又は粘膜に対するポリペプチド投与後、ポリペプチドは抗原提示細胞によって取り込まれ得、アレルゲンで見られるような「危険シグナル」の不存在下に、生理的条件下で粘膜表面において起こる既定の免疫学的事象は、粘膜免疫系の正常な特徴である「口腔寛容(oral tolerance)」と称される現象をもたらす。なぜならば、それは抗原の口腔(経口を含む)、鼻内、気道及び舌下投与によって生じ得るからである。
【００４１】
口腔寛容誘導のメカニズムは、経口投与された抗原が胃に関連付けられるAPCによる抗原の提示後に抗原-特異的制御性T細胞の生成をもたらすこと以外、未だ完全には理解されていない。このような提示は、TGF-β及びIL-10のような制御性サイトカインを分泌するT細胞を選択的に誘導するであろう。これらの抗原-特異的制御性細胞は、エフェクター細胞の生成を阻害することによって免疫応答を抑制するリンパ器官、及び抗原-非特異的サイトカインを放出することによって疾患を抑制する標的臓器に移動し得る。近年、粘膜の免疫系における制御性細胞の生成が表面マーカーCD103を発現する特化した樹状細胞のサブセットによって媒介されることが示唆されている。また、抗原の口腔への投与が主にアネルギー又は欠失によってT細胞機能の応答なしを誘導することも示唆されている。Treg細胞の誘導、アネルギー及び欠失を誘導するメカニズムは互いに排除され得ず、かなり重複していると考えられる。
【００４２】
よって、好ましくは当該抗原に予め感作されていない個体の口腔粘膜に対する抗原の投与は、その後の当該抗原に対する曝露時に活性化され、非特異的制御性サイトカインの産生を開始するようになる抗原-特異的Treg細胞を誘導し得、抗原がアレルゲンに共曝露される場合には、非特異的制御性サイトカインは、ミクロ環境において進行しているその他の特異性に対する免疫応答、例えば超過敏性免疫応答を抑制し得ることが理解されるべきである。
【００４３】
よって、口腔寛容を誘導するために、本発明のポリペプチドは、好ましくは気道、口腔及び胃腸管の粘膜に投与されることが理解されるべきである。よって、本発明の好ましい実施態様において、ポリペプチドは、吸入、鼻内投与、バッカル投与(頬又は口腔への投与)、経口投与(胃腸管への投与)、例えば好ましくは舌下投与によって投与される。口腔粘膜への投与は、口腔(ここから抗原が粘膜及び粘膜下層に吸収される)の上皮表面に抗原を局所的に送達することによって行われ得ることが予見される。例えば、抗原は、口腔底を含む舌下部(ここから抗原が粘膜及び粘膜下層に吸収される)の上皮に投与される。バッカル投与によって、ポリペプチドが粘膜及び粘膜下層に吸収されるように好適なポリペプチド医薬製剤を口腔上皮、例えば舌の下側又は上側表面、歯茎又は頬に位置する上皮に適用することを意図するが、胃腸管にポリペプチドを送達することは意図されない。よって、より好ましい本発明の実施態様において、抗原は口腔の上皮及び/又は粘膜に、例えば舌下投与によって投与され、好ましくは、個体は、投与後少なくとも1分間、例えばより好ましくはポリペプチド投与後2分、3分、4分又は5分よりも前に飲み込まないように指示されている。
【００４４】
ポリペプチドは、十分な投与量、通常マイクログラム量の単回投与量で長期間、通常数週間、数カ月又は数年、効果が得られるまで繰り返し投与されてもよい。通常、ポリペプチドは、投与経路、剤形及び/又は特異的ポリペプチドに依存して、毎日、毎週、隔週又は毎月投与される。ポリペプチドは、少なくとも4週間から約4〜6カ月間継続的に又は１若しくはそれより多い無投与期間で隔てられて投与されるが、この投与は数カ月又は数年継続しなければならないことが期待される。
【００４５】
とりわけ、バイスタンダー免疫寛容の獲得が口腔寛容及び/又は特異的Treg細胞が創成されることを要する蓋然性が非常に高いことが理解されるべきである。口腔寛容は、少なくとも、口腔粘膜にポリペプチドを投与することによって創成される。しかしながら、口腔寛容(T細胞寛容)が得られたことを示すバイオマーカーを同定することは容易ではない。感作アレルギー患者における寛容は、通常IgG4産生及びIL-10及びIL-4サイトカイン産生に関連している。しかし、寛容原性抗原に対するT細胞応答の直接的な試験は、IL-10及び/又はTGF-bを産生するTreg細胞をもたらし得る一方で、完全な応答なし又はTh1/Th2応答は、プラセボ群において観察されるはずであると考えられる。このことを更に立証するためには、寛容原性ポリペプチド及び試験抗原、例えばアレルゲンを用いるTreg細胞の同時刺激のインビトロ研究が、試験抗原に特異的なT細胞応答の抑制をもたらすべきである。あるいは、寛容原性ポリペプチド及び破傷風トキソイド(TT)等の試験抗原を用いてのインビボの状況下におけるすべての免疫的要素を含む皮膚の同時チャレンジがインビトロ刺激を模倣してもよい。この状況において、寛容原性抗原の存在下では、TTに対する遅延型超過敏性応答の欠如が、能動的に治療された群において予想されるが、寛容原性抗原を用いないTT刺激は皮膚の応答をもたらすはずである。
【００４６】
更に、バイスタンダー免疫寛容の獲得は、同一のポリペプチドあるいは当該ポリペプチドの改変体が、プロフィリン含有植物性物質の曝露に供される標的臓器(例えば呼吸器)において非プロフィリンアレルゲンと共に存在することも要する。したがって、口腔寛容を得る目的でポリペプチドを投与することに加えて、ポリペプチド又はその改変ポリペプチド及び非プロフィリンアレルゲンの共曝露を提供する手段もまた、バイスタンダー免疫寛容を得るために必須である。
【００４７】
用語「共曝露」は、ポリペプチドが、非プロフィリン含有植物性物質に対する自然曝露中に当該非プロフィリンアレルゲンによって標的化されるものと同一の臓器に提示されている/供給されていること、例えば非プロフィリンアレルゲンに対する個体の自然曝露と少なくとも部分的に又は完全に一致する期間内に同一の標的臓器に提示されている/供給されていることを意味する。典型的には、空気アレルゲンの標的臓器は呼吸器であり、食物アレルゲンの標的臓器は胃腸管又は口腔であり、空気アレルゲン、食物アレルゲン及び接触アレルゲンは皮膚を標的とする。
【００４８】
よって、(口腔寛容/Treg細胞誘導を得るために)ポリペプチドを呼吸器、胃腸管及び/又は口腔に繰り返し投与することに加えて、アレルゲン曝露期間と部分的に又は完全に一致する期間内の標的臓器におけるポリペプチド及び非プロフィリンアレルゲンの共存/共曝露を確実にする手段が提供されるべきである。
【００４９】
本発明者らは、今回、共曝露が、超過敏性免疫応答を惹起するアレルゲンと同一の標的臓器に自然曝露される抗原を「寛容誘導性抗原」として選択することによって提供され得ることを見出した。よって、「寛容誘導性抗原」は、本来的に、プロフィリン含有植物性物質に対する曝露時に「惹起性」非プロフィリンアレルゲンと同一の標的臓器に到達する。有利には、惹起性アレルゲン(非プロフィリンアレルゲン)及び「寛容誘導性抗原」(ポリペプチド)に対する共曝露を確実にする更なる手段を提供する必要はない。
【００５０】
本発明によれば、バイスタンダー免疫寛容は、ポリペプチド、例えばプロフィリンPhl p 12を、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答を治療する必要がある個体に投与することによって得られる。バイスタンダー免疫寛容は、少なくとも、ポリペプチドが、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリンのアミノ酸配列と少なくとも60％、例えば少なくとも65％、70％、75％、80％、85％、90％又は95％の類似性及び/又は同一性を有するアミノ酸配列を有する場合に得られると考えられる。つまり、投与されるポリペプチドと自然曝露されるプロフィリンとの間に一定の同一性及び/又は類似性がある限り、ポリペプチドがプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンと同一である必要はない。
【００５１】
しかしながら、いくつかの理由のために本発明のポリペプチドが超過敏性免疫応答の十分なバイスタンダー免疫寛容を提供しない場合には、ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質に対する個体の自然曝露と少なくとも部分的に又は完全に一致する期間内に、プロフィリン含有植物性物質に対して自然曝露される標的臓器、例えば呼吸器、胃腸管又は皮膚にも投与され得る。
【００５２】
フレーズ「ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質に対する個体の自然曝露と少なくとも部分的に又は完全に一致する期間内に、プロフィリン含有植物性物質に対して自然曝露される標的臓器にも投与される」とは、少なくともアレルゲン曝露の全期間中ポリペプチドが標的臓器に投与されることを指す意味であってもよいし、又は自然曝露開始前を含む上記期間の一部の間に投与されてもよい。
【００５３】
本発明のいくつかの実施態様において、ポリペプチドは、当該ポリペプチドに対する口腔寛容を得る目的で呼吸器の上皮/粘膜(好ましくは鼻内投与)、口腔(好ましくは舌下投与)又は胃腸管に投与されることが想定される。更に、好ましくはポリペプチドに対する口腔寛容が得られた後に、同一のポリペプチド又はその改変ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質に対する自然曝露期間中、同時に、同時期に、別々に又は逐次的に、任意の順序でプロフィリン含有植物性物質に対する自然曝露に供される標的臓器に投与される。
【００５４】
例えば、標的臓器が空気アレルゲン(花粉)との関連性が最も高い呼吸器である場合、ポリペプチドは、(口腔寛容/Treg細胞を得るために)4週間〜12カ月又はそれ以上の期間中、毎日又は毎週口腔に(例えば舌下に)繰り返し投与され、同一のポリペプチド又はその改変ポリペプチドは、自然曝露期間と完全に又は部分的に重複する期間内に、例えば鼻内投与又は吸入によって呼吸器に投与される。
【００５５】
同様に、標的臓器が食物アレルゲンとの関連性が最も高い胃腸管である場合、ポリペプチドは、例えば4週間〜12カ月又はそれ以上の期間、毎日又は毎週(例えば舌下に)繰り返し投与され、同一のポリペプチド又はその改変ポリペプチド(そのバリアント)は、自然曝露期間と完全に又は部分的に重複する期間内に、例えば摂取又は経口投与によって胃腸管に投与される。
【００５６】
個体
口腔寛容誘導はポリペプチドに対するアレルギー感作の欠如によって促進されると期待されるので、本治療の必要がある個体は、好ましくは、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリンに感作されていない。つまり、超過敏性免疫応答は、好ましくはプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンによって引き起こされるものではない。更に、ポリペプチドがプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンと同一でない場合、個体は、好ましくは、当該ポリペプチドに感作されていない。
【００５７】
よって、本発明の好ましい実施態様において、個体は、少なくとも初回投与前に、プロフィリン含有植物性物質及び/又はポリペプチドのプロフィリンに感作されておらず、例えば少なくとも初回投与前に、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリンにもポリペプチドにも感作されていない。
【００５８】
よって、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリン及び/又はポリペプチドが、治療される個体から得られたIgE抗体(例えば血清IgE抗体)に結合するか又は会合するか否かを測定してもよい。いくつかのアッセイ(各々は測定及び定量化に様々な制限を有する)をこの目的のために使用することができる。したがって、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリン及び/又はポリペプチドは、検出可能なレベルで及び/又は定量可能なレベルでIgE抗体(例えば血清IgE抗体)に結合しないか又は会合しないことが理解され得る。
【００５９】
個体におけるプロフィリン及び/又はポリペプチドを指向する特異的IgE抗体の存在は、当該技術において周知の方法によって、例えば疑わしいアレルゲン又は既知のアレルゲンを指向する特異的IgE抗体を検出するためのラジオイムノアッセイ試験であるRAST試験を用いて検査することができる。これらの試験において、疑わしいアレルゲンは不溶性の物質に結合されており、患者の血清又はIgEを含むその他の体液(例えば唾液)が添加される。血清/体液がアレルゲンを指向する抗体を含む場合、これらの抗体は、当該アレルゲンに結合するか又は会合する。放射能標識された抗-ヒトIgE抗体が添加され、そこで不溶性の物質に既に結合したこれらのIgE抗体に結合するか又は会合する。結合していない抗-ヒトIgE抗体は洗い流される。放射活性量は、当該アレルゲンを指向する血清IgEに比例する。近年、「ImmunoCAP特異的IgE血液検査」と呼ばれるより優れた試験が同一の目的で使用されている(これは、文献上CAP RAST、CAP FEIA (蛍光酵素イムノアッセイ)及びPharmacia CAPとしても記載され得る)。このような検査の定量的検出限界は約0.1 kU/l程度と低いものであり得る。本発明との関連における使用について、ImmunoCAP(登録商標)特異的IgE血液検査又は比較試験が用いられる場合、定量的検出限界は、1 kU/l未満、例えば0.5 kU/l未満、例えば0.3 kU/l未満であり得る。
【００６０】
自明なことに、プロフィリン及び/又はポリペプチドは、治療の必要がある個体において超過敏性免疫反応を誘導し得ない。例えば、プロフィリン及び/又はポリペプチドは、少なくともポリペプチドの初回投与前には、治療の必要がある個体において、様々な濃度のプロフィリン/ポリペプチドを用いる皮膚プリックテストを実施した際には、即時型皮膚応答及び/又は遅延型皮膚応答を開始しない。
【００６１】
または、治療される個体からの血液を用いるインビトロ好塩基球/マスト細胞アッセイにおいてプロフィリン及び/又はポリペプチドがヒスタミン放出を誘導するか否かを確認することができる。
あるいは、プロフィリン及び/又はポリペプチドが、プロフィリン含有物質の１又はそれより多い非プロフィリンアレルゲンを用いるか又はプロフィリン含有物質の水性抽出物を用いる動物、例えばウサギの免疫後に生じたIgG 抗体、例えばウサギ抗IgG抗体に、少なくとも検出可能なレベルでは結合しないか又は会合しないことを確認してもよい。
【００６２】
本治療の必要がある個体は、プロフィリン含有物質の非プロフィリンアレルゲンに既に感作された個体であってもよいことが理解されるべきである。このような個体は超過敏性免疫応答の臨床的症状を示していてもよいし、又は非プロフィリンアレルゲンに感作されているのみで超過敏性免疫応答の臨床的症状をまだ示していなくてもよい。更に、非プロフィリンアレルゲンに感作されていないときであっても、個体はこの治療を受けてよいことが理解されるべきである。このような個体は、非プロフィリンアレルゲンに感作されるリスクがある個体、例えば非プロフィリンアレルゲンに対する超過敏性免疫応答を生じるリスクがある個体であってもよい。アレルゲンに感作されるリスクがある個体は、家族のアトピー性疾患の病歴によって特定され得る。
【００６３】
よって、本発明は、個体がプロフィリン含有物質の非プロフィリンアレルゲンを指向する検出可能な血清IgE抗体を生じる前に開始されるか又は超過敏性免疫応答の指標となるその他の生化学マーカーが、個体から単離された生体試料において検出可能となる前に開始される「予防治療」にも関する。更に、予防免疫治療は、個体が疾患の臨床的症状、例えばアレルギー性鼻炎又はアレルギー性喘息の症状を発症する前に開始される治療も含み得る。
【００６４】
上述のとおり、本発明のポリペプチドは、超過敏性免疫応答の治療に用いてもよい。関連ある投与レジメンは、例えば投与量、一日当たりの投与回数、治療期間及び投与頻度を選択するという観点から、通常アレルゲン特異的免疫療法の分野で使用されるものであり得る。よって、ポリペプチドは、所望の効果が得られるまで長期間頻繁に投与されること、例えば少なくとも2〜6カ月間口腔粘膜(例えば舌下粘膜)に毎日投与されることが想定され得る。また、超過敏性免疫応答が季節性アレルゲンによって引き起こされる場合、初回投与は当該アレルゲンの季節より前に行われ得ることも想定される。また、ポリペプチドが維持量に達するまで一日の間に又は数日若しくは数週間間隔で漸増量で投与される投与量増大期によって治療が開始されることも想定される。
【００６５】
ポリペプチドは、好ましくは、唯一の投与される治療活性成分であることが理解されるべきである。特に、ポリペプチドは、免疫機構の競合、危険シグナルの産生及び/又は炎症を避けるために、アレルゲンの非存在下で投与すべきであることが強調される。よって、非プロフィリンアレルゲン(個体はこのアレルゲンを指向する特異的IgE抗体を有する)は、少なくともポリペプチドに対する口腔寛容が確立される期間内に、ポリペプチドと共曝露されてはならない。また、ポリペプチドは、特許出願WO 2004/082710に記載されるような、免疫系の改変のために同時に、同時期に、別々に又は逐次的に使用する複合製剤としてのNotchシグナル伝達経路のモジュレータと共に投与されないことが理解されるべきある。
【００６６】
ポリペプチド、非プロフィリンアレルゲン及びプロフィリン含有植物性物質
本発明において使用するためのポリペプチドは、任意に1位メチオニンが存在しない配列番号1〜10のアミノ酸配列を有するもののような様々な異性体として存在する植物種フレウム  プラテンスのプロフィリン(Phl p 12)であり得る。とりわけ、このプロフィリンは、本来的には、個体が草花粉の季節中に植物目であるイネ目の草花粉に曝露されるとき、非プロフィリンアレルゲン、例えばPhl p 1、5又は6と付随的に提示される。
【００６７】
ポリペプチドは、プロフィリンPhl p 12のアミノ酸配列とは異なっていても、草花粉の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答を抑制するのに使用可能なバイスタンダー抗原としてPhl p 12に置き換わり得ると理解すべきである。例えば、Phl p 12に相同なプロフィリン、例えばカバノキ樹木花粉のプロフィリンBet v 2又はオリーブ樹木花粉のプロフィリンOle e 2は、植物目であるイネ目の草花粉の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答の抑制において用いられ得る。また、高い分子の類似性、例えばPhl p 12とBet v 2又はOle e 2とのアミノ酸配列の少なくとも60％の同一性に起因して、Phl p 12とBet v 2又はOle e 2との間の十分な免疫的交差反応性が確立されているので、Phl p 12を用いる治療は、カバノキ樹木花粉又はオリーブ樹木花粉への曝露後に、相同なポリペプチドであるBet v 2又はOle e 2によって活性化され得る寛容応答をもたらし、カバノキ及び/又は草花粉の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答の付随的な下方調節をもたらすことが想定される。同様に、プロフィリンBet v 2を用いる個体の治療は、草花粉又はオリーブ樹木花粉のそれぞれへの曝露後に、相同なポリペプチドであるPhl p 12又はOle e 2に対する曝露によって活性化され得る寛容応答をもたらし、カバノキ樹木花粉及び/又は草花粉及び/又はオリーブ樹木花粉の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答の付随的な下方調節をもたらし得る。
【００６８】
したがって、本発明において使用するためのポリペプチドは、任意に1位(N末端)メチオニンを有しない配列番号1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9又は10に示されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性及び/又は類似性、例えば少なくとも70%, 75, 80, 85, 90, 95及び98%の同一性及び/又は類似性を有するアミノ酸配列を有するか、当該アミノ酸配列からなるか、当該アミノ酸配列から本質的になるか、当該アミノ酸配列を含む。
配列番号1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9又は10に示されるアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性及び/又は類似性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの典型例は、その他のプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンである。
【００６９】
表1〜4は、例示的なプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンを示す(http:uniprot.orgから抜粋されたそれらのUniProt Number及びそれらのPhl p 12 (配列番号1)との同一性パーセンテージ(ここで、アミノ酸配列における同一性のパーセントはBLASTアライメント(データベース = UniProtKB, 閾値 = 10, マトリクス = オート, フィルタリング = なし, ギャップ = 500, ヒット数 = 500)を用いて測定された)によって特定される)。様々な植物種のプロフィリン同士では、とりわけ高度の同一性、例えば配列番号1のアミノ酸配列と表4に示されるプロフィリンとの間の少なくとも60%の同一性がある。特に、植物綱である単子葉植物綱に属する草及び穀類の群(イネ目、例えばシノドン属(ギョウギシバ), ホルデウム属(オオムギ), オライザ属(イネ), フレウム  プラテンス(オオアワガエリ), ソルガム属(草), トリティカム属(デュラムコムギ又はコムギ)及びゼア属(トウモロコシ))間の同一性パーセンテージは高く、例えば80%を超える。更に、樹木のプロフィリン(樹木花粉)は、プロフィリンPhl p 12と高い同一性を有し、例えば70%〜82%の範囲内である(ブナ目、例えばベトゥラ属(カバノキ),コリラス属(ハシバミ)；ヤシ目、例えばエレイス属(Elaeis；ヤシノキ)；アオイ目、例えばゴシピウム属(ワタノキ)；キントラノオ目、例えばヘヴェア属(ゴムノキ)、ヤマアイ目、例えばリシヌス属；シソ目、例えばオレア属(オリーブの木)、ポプラス属(Populus；ポプラの木)；フトモモ目、例えばソネラティア属)。雑草花粉のプロフィリンは、75〜81%の範囲内の同一性パーセンテージを有する(キク目、例えばアンブロシア属(ブタクサ)、アルテミシア属、ヘリアンタス属(ヒマワリ))。
【００７０】
セリ目, マメ目, バラ目, ナス目及びブドウ目の果実、ナッツ及び豆もまた、Phl p 12との高い同一性パーセンテージ、例えば70%〜82%の範囲内の同一性パーセンテージを有する(セリ目、例えばアピウム属(セロリ)、ダウクス属(ニンジン)、ペトロセリナム属(Petroselinum；パセリ)；マメ目、例えばアラキス属(ピーナッツ)；バラ目、例えばグリシン属(ダイズ)、フラガリア属(イチゴ)、フムラス属、マルス属(リンゴ)、パリエタリア属、プラヌス属(モモ、アプリコット、チェリー、アーモンド)、ピルス属(西洋ナシ)；ナス目、例えばカプシカム属(チリペッパー)、ニコチアナ属(Nicotiana；タバコ)、リコパーシコン属(トマト)、ソラナム属(ポテト)、ブドウ目、例えばヴィティス属(ブドウ))。
【００７１】
その他の興味深いプロフィリンは、アブラナ目、例えばアラビドプシス属、ブラシカ属(セイヨウアブラナ)、ナデシコ目(Caryoplyllales)、例えばケノポディウム属、ムクロジ目、例えばシトラス属(オレンジ)、リチ属；ウリ目、例えばククミス属(キュウリ、メロン)のものである。
【００７２】
よって、配列番号1と少なくとも80%の同一性を有するプロフィリン含有植物性物質の典型例は、アマランタス, アンブロシア, ブラシカ, ケノポディウム, コリラス, シノドン, エレイス, ヘリアンタス, ヘヴェア, ホルデウム, リチ, メルキュリアリス, ニコチアナ, オレア, オライザ, フレウム, フォエニクス, ソラナム, ソネラティア, ソルガム, トリティカム及びゼアから選択される植物属からのものである。
【００７３】
配列番号1と少なくとも70%の同一性を有するプロフィリン含有植物性物質の典型例は、アマランタス, アンブロシア, アナナス, アピウム, アラビドプシス, アラキス, アルテミシア, ベトゥラ, ブラシカ, カプシカム, カリオタ, ケノポディウム, シトラス, コリラス, ククミス, シノドン, エレイス, フラガリア, グリシン, ヘリアンタス, ヘヴェア, ホルデウム, フムラス, リチ, マルス, メルキュリアリス, ムサ, ニコチアナ, オレア, オライザ, パリエタリア, ペトロセリナム, ファセオラス, フレウム, フォエニクス, ピセア, ピヌス, プランタゴ, ポプラス, プラヌス, ピルス, リシヌス, サルソラ, ソラナム, ソネラティア, ソルガム, トリティカム, ヴィティス及びゼアから選択される植物属からのものである。
【００７４】
よって、(以前球果植物綱(Coniferopsida)として知られていた)植物界マツ綱、(単子葉植物(monocotyledon)として公知でありユリ綱(Liliopsida)と命名された)植物界単子葉植物綱及び植物界双子葉植物綱の植物綱の植物種のプロフィリンのアミノ酸配列において高度に保存されているようである。
【００７５】
したがって、本発明において使用するためのポリペプチドは、植物界マツ綱、植物界単子葉植物綱及び植物界双子葉植物綱を含む群より選択される植物綱、例えば表1、2及び3に示される植物目、植物科、植物属又は植物種のプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンであり得る。以下に更に記載するとおり、本発明のポリペプチドは、自然に生じるものに加えて、自然に生じるプロフィリンのバリアントであってもよい。
【００７６】
本発明のバイスタンダー免疫寛容の概念によれば、超過敏性免疫応答は、当該プロフィリン分子が由来するプロフィリン含有植物性物質と同一の植物種又は別の植物種、植物属、植物目又は植物綱のいずれかのものであるプロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって惹起されることになる。したがって、超過敏性免疫応答は、植物界マツ綱、植物界単子葉植物綱及び植物界双子葉植物綱を含む群より選択される植物綱、例えば表1、2及び3に示される植物目、植物科、植物属又は植物種のプロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって惹起される。
【００７７】
プロフィリン含有植物性物質の興味深い典型例は、マツ目, ヤシ目, クサスギカズラ目, イネ目, ショウガ目、セリ目, キク目, アブラナ目, ウリ目, ツツジ目, マメ目, ブナ目, リンドウ目, シソ目, クスノキ目, アオイ目, キントラノオ目, フトモモ目, ヤマモガシ目, バラ目, ムクロジ目, ナス目及びブドウ目を含む群より選択される植物目のもの、好ましくはマツ目, イネ目, ヤシ目, セリ目, キク目, アブラナ目, ナデシコ目, マメ目, ブナ目, シソ目, キントラノオ目, ヤマモガシ目, バラ目, ムクロジ目及びナス目のもの、より好ましくはマツ目, ヤシ目, イネ目, キク目, アブラナ目, ナデシコ目, ブナ目, シソ目, バラ目及びナス目のもの、最も好ましくはイネ目, キク目, ブナ目及びシソ目のもの、より一層好ましくはイネ目のものである。
【００７８】
より具体的には、プロフィリン含有植物性物質は、ヒノキ科, ヤシ科, クサスギカズラ科, アヤメ科, パイナップル科, イネ科, バショウ科, ショウガ科, セリ科, ウコギ科, キク科, アブラナ科, ヒユ科, ナデシコ科, タデ科, ウリ科, マタタビ科, サガリバナ科, ツバキ科, マメ科, カバノキ科, ブナ科, クルミ科, ヤマモモ科, ナンキョクブナ科, ティコデンドロン科, キョウチクトウ科, アカネ科, モクセイ科, ゴマ科, オオバコ科, クスノキ科, アオイ科, トウダイグサ科, ミソハギ科, スズカケノキ科, アサ科, バラ科, ニレ科, イラクサ科, ウルシ科, ミカン科, ムクロジ科, ナス科, ブドウ科を含む群より選択される植物科のもの、好ましくはヒノキ科, ヤシ科, パイナップル科, イネ科, セリ科, キク科, アブラナ科, ヒユ科, ナデシコ科, マメ科, カバノキ科, ブナ科, モクセイ科, トウダイグサ科, スズカケノキ科, アサ科, バラ科及びナス科を含む群より選択される植物科のもの、最も好ましくはイネ科, キク科, カバノキ科及びモクセイ科を含む群より選択される植物科のものである。
【００７９】
より一層具体的には、プロフィリン含有植物性物質は、カメシパリス, クリプトメリア, キュプレサス, ジュニペルス, フォエニクス, アスパラガス, クロクス, アナナス, アントキサンタム, シノドン, ダクチリス, フェスツカ, ホルクス, ホルデウム, ロリウム, オライザ, パスパルム, ファラリス, フレウム, ポア, セカレ, ソルガム, トリティカム, ゼア, ムサ, アピウム, ダウクス, アンブロシア, アルテミシア, ヘリアンタス, ラクツカ, アラビドプシス, ブラシカ, シナピス, アマランタス, ベタ, ケノポディウム, ファゴピラム, サルソラ, ククミス, アクチニディア, ベルトレティア, アラキス, グリシン, レンス, ルピヌス, ファセオラス, ピサム, ヴィグナ, アルヌス, ベトゥラ, カルピヌス, カリア, カスタネア, コリラス, ファガス, ジャグランス, オストリア, ケルクス, カタランタス, コフィア, フラクシヌス, リグストラム, オレア, プランタゴ, セサマム, シリンガ, ペルセア, ゴシピウム, ヘヴェア, マニホット, メルキュリアリス, ポポラス, リシヌス, ソネラティア, プラタヌス, フラガリア, フムラス, マルス, モラス, パリエタリア,  プラヌス, ピルス, ルバス, ジジファス, アナカーディウム, シトラス, リチ, マンギフェラ, ピスタシア, カプシカム, リコパーシコン, ソラナム及びヴィティスを含む群より選択される植物属のもの、より好ましくはクリプトメリア, アナナス, アントキサンタム, シノドン, ダクチリス, フェスツカ, ホルクス, ホルデウム, ロリウム, オライザ, パスパルム, ファラリス, フレウム, ポア, セカレ, ソルガム, トリティカム, ゼア, アピウム, ダウクス, アンブロシア, アルテミシア, ヘリアンタス, ケノポディウム, サルソラ, アラキス, グリシン, アルヌス, ベトゥラ, カルピヌス, カリア, カスタネア, コリラス, ファガス, ジャグランス, オストリア, ケルクス, フラクシヌス, オレア, プランタゴ, ヘヴェア, メルキュリアリス, プラタヌス, フムラス, マルス, パリエタリア, プラヌス, ピルス, ルバス, カプシカム, リコパーシコン及びソラナムを含む群より選択される植物属のもの、より一層好ましくはクリプトメリア, アントキサンタム, シノドン, ダクチリス, フェスツカ, ホルクス, ホルデウム, ロリウム, オライザ, フレウム, ポア, セカレ, ソルガム, トリティカム, ゼア, アンブロシア, アルテミシア, ヘリアンタス, ケノポディウム, サルソラ, ベトゥラ, コリラス, オレア, パリエタリア及びソラナムを含む群より選択される植物属のものである。
【００８０】
より更に具体的には、プロフィリン含有植物性物質は、Cha o 1, Cha o 2, Cry j 1, Cry j 2, Cup a 1, Cup s 1, Cup s 3, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun s 1, Jun v 1, Jun v 3, Ana c 2, Ant o 1, Aspa o 1, Cro s 1, Cro s 2, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24, Dac g 1, Dac g 2, Dac g 3, Dac g 4, Dac g 5, Fes p 4, Hol l 1, Hol l 5, Hor v 1, Hor v 5, Hor v 12, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 4, Lol p 5, Lol p 11, Mus a 2, Mus a 3, Mus a 4, Mus a 5, Ory s 1, Ory s 12, Pas n 1, Pha a 1, Pha a 5, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 13, Pho d 2, Poa p 1, Poa p 5, Sec c 1, Sec c 5, Sec c 20, Sor h 1, Tri a 14, Tri a 15, Tri a 18, Tri a 19, Tri a 21, Tri a 25, Tri a 26, Tri a 27, Tri a 28, Tri a 29, Tri a 30, Tri a 31, Tri a 32, Tri a 33, Tri a 34, Tri a 35, Tri a 36, Tri a 37, Zea m 1, Zea m 12, Zea m 14, Zea m 25, Act c 5, Act c 8, Act c 10, Act d 1, Act d 2, Act d 3, Act d 4, Act d 5, Act d 6, Act d 7, Act d 8, Act d 10, Act d 11, Aln g 1, Aln g 4, Amb a 1, Amb a 2, Amb a 3, Amb a 4, Amb a 5, Amb a 6, Amb a 7, Amb a 9, Amb a 10, Amb p 5, Amb t 5, Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3, Api g 1, Api g 2, Api g 3, Api g 5, Api g 6, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 9, Ara h 10, Ara h 11, Art v 1, Art v 2, Art v 3, Art v 5, Art v 6, Ber e 1, Ber e 2, Beta v 1, Bet v 1, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7, Bra j 1, Bra n 1, Bra o 3, Bra r 1, Bra r 2, Cap a 1 w, Car b 1, Car i 1, Car i 4, Cas s 1, Cas s 5, Cas s 8, Cas s 9, Cat r 1, Che a 1, Che a 3, Cit l 3, Cit r 3, Cit s 1, Cit s 3, Cof a 1, Cor a 1, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 10, Cor a 11, Cor a 12, Cor a 13, Cor a 14, Cuc m 1, Cuc m 3, Dau c 1, Fag e 2, Fag t 2, Fag s 1, Fra a 1, Fra a 3, Fra e 1, Gly m 1, Gly m 2, Gly  m 4, Gly m 5, Gly m 6, Hel a 1, Hel a 3, Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13, Hev b 14, Hum j 1, Jug n 1, Jug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Jug r 4, Lac s 1, Len c 1, Len c 2, Len c 3, Lig v 1, Lup an 1, Lyc e 2, Lyc e 3, Lyc e 4, Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3, Man e 5, Mer a 1, Mor n 3, Ole e 1, Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10, Ole e 11, Ost c 1, Par j 1, Par j 2, Par j 4, Par o 1, Pers a 1, Pha v 3, Pis v 1, Pis v 2, Pis v 3,Pis v 4, Pis v 5, Pis s 1, Pis s 2, Pla l 1, Pla a 1, Pla a 2, Pla or 1, Pla or 2, Pla or 3, Pru ar 1, Pru ar 3, Pru av 1, Pru av 2, Pru av 3, Pru d 3, Pru du 3, Pru du 5, Pru du 6, Pru p 1, Pru p 2, Pru p 3, Pyr c 1, Pyr c 3, Pyr c 5, Que a 1, Ric c 1, Rub i 1, Rub i 3, Sal k 1, Sal k 2, Sal k 3, Sal k 5, Ses i 1, Ses i 2, Ses i 3, Ses i 4, Ses i 5, Ses i 6, Ses i 7, Sin a 1, Sin a 2, Sin a 3, Sola t 1, Sola t 2, Sola t 3, Sola t 4, Syr v 1, Syr v 3, Vig r 1, Vit v 1及び Ziz m 1を含む群より選択される非プロフィリンアレルゲンを含む。
【００８１】
非プロフィリンアレルゲンは、好ましくは主要アレルゲンであり、例えばCha o 1, Cry j 1, Cry j 2, Cup a 1, Cup s 1, Jun a 1, Jun s 1, Jun v 1, Ana c 1, Ant o 1, Aspa o 1, Cro s 1, Cyn d 1, Dac g 1, Dac g 5, Fes p 4, Hol l 1, Hol l 5, Hor v 1, Hor v 5, Hor v 12, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21, Lol p 1, Lol p 5, Mus a 1, Ory s 1, Pas n 1, Pha a 1, Pha a 5, Phl p 1, Phl p 5, Phl p 6, Pho d 2, Poa p 1, Poa p 5, Sec c 1, Sec c 5, Sor h 1, Tri a 12, Zea m 1, Zea m 12, Zea m 14, Zea m 25, Act c 5, Act d 1, Act d 2, Aln g 1, Aln g 4, Ama r 2, Amb a 1, Amb a 2, Amb p 5, Amb t 5, Ana o 1, Ana o 2, Api g 1, Api g 5, Ara h 1, Art v 1, Ber e 1, Beta v 1, Bet v 1, Bra j 1, Bra n 1, Bra o 3, Bra r 1, Cap a 1w, Cap a 2, Car b 1, Car i 1, Cas s 1, Cat r 1, Che a 1, Cit l 3, Cit r 3, Cit s 1, Cof a 1, Cor a 1, Cor a 2, Cuc m 1, Dau c 1, Fag e 2, Fag t 2, Fag s 1, Fra a 1, Fra e 1, Gly m 1, Gly m 2, Hel a 1, Hel a 3, Hev b 1, Hum j 1, Jug n 1, Jug r 1, Lac s 1, Len c 1, Lig v 1, Lit c 1, Lup an 1, Lyc e 1, Lyc e 2, Mal d 1, Ole e 1, Ole e 2, Ost c 1, Par j 1, Par o 1, Pers a 1, Pha v 3, Pis v 1, Pis s 1, Pla l 1, Pla a 1, Pla a 2, Pla or 1, Pla or 2, Pru ar 1, Pru av 1, Pru p 1, Pyr c 1, Que a 1, Ric c 1, Rub i 1, Sal k 1, Ses i 1, Sin a 1, Sola t 1, Syr v 1, Vig r 1, Vit v 1及びZiz m 1を含む群より選択され、例えば好ましくはCry j 1, Cry j 2, Cyn d 1, Dac g 1, Dac g 5,Fes p 4, Hol l 1, Hol l 5, Hor v 1, Hor v 5, Hor v 12, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21, Lol p 1, Lol p 5, Ory s 1, Pas n 1, Pha a 1, Pha a 5, Phl p 1, Phl p 5, Phl p 6, Poa p 1, Poa p 5, Sec c 1, Sec c 5, Sor h 1, Tri a 12, Zea m 1, Zea m 12, Zea m 14, Zea m 25, Aln g 1, Aln g 4, Amb a 1, Amb a 2, Amb p 5, Amb t 5, Api g 1, Api g 5, Ara h 1, Art v 1, Bet v 1, Bra j 1, Bra n 1, Bra o 3, Bra r 1, Cap a 1w, Cap a 2, Car b 1, Car i 1, Cas s 1, Cat r 1, Che a 1, Cor a 1, Cor a 2, Cuc m 1, Dau c 1, Gly m 1, Gly m 2, Hel a 1, Hel a 3, Hev b 1, Hum j 1, Lit c 1, Lyc e 1, Lyc e 2, Mal d 1, Ole e 1, Ole e 2, Par j 1, Par o 1, Pla l 1, Pla a 1, Pla a 2, Pla or 1, Pla or 2, Pru ar 1, Pru av 1, Pru p 1, Pyr c 1, Que a 1, Ric c 1, Rub i 1, Sal k 1, Sin a 1及びSola t 1を含む群より選択される。
【００８２】
典型的には、プロフィリン含有植物性物質は花粉、例えば草、穀類、樹木又は雑草の花粉であるが、穀物、ナッツ、果実又は野菜等の食物又は食物成分であってもよい。
【００８３】
いくつかの好ましい本発明の実施態様において、非プロフィリンアレルゲンは、クリプトメリア, アントキサンタム, シノドン, ダクチリス, フェスツカ, ホルクス, ホルデウム, ロリウム, オライザ, パスパルム, ファラリス, フレウム, ポア, セカレ, ソルガム, トリティカム, ゼア, アンブロシア, アルテミシア, アルヌス, ベトゥラ, カルピヌス, カリア, カスタネア, コリラス, ファガス, ジャグランス, オストリア, ケルクス, フラクシヌス, リグストラム, オレア, サルソラ, プランタゴ, プラタヌス, フムラス及びパリエタリアを含む群より選択される植物属の花粉からのものであり、例えばCry j 1, Cry j 2, Ant o 1,Cyn d 1, Cyn d 7,Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 2, Dac g 1, Dac g 2, Dac g 3, Dac g 4, Dac g 5, Fes p 4; Hol l 1, Hol l 5, Hor v 1, Hor v 5, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 4, Lol p 5, Lol p 11, Ory s 1, Pas n 1, Pha a 1, Pha a 5, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 13, Poa p 1, Poa p 5, Sec c 1, Sec c 5, Sor h 1, Tri a 15, Tri a 21, Tri a 27, Tri a 28, Tri a 29, Tri a 30, Tri a 31, Tri a 32, Tri a 33, Tri a 34, Tri a 35, Zea m 1, Zea m 12, Amb a 1, Amb a 2, Amb a 3, Amb a 4, Amb a 5, Amb a 6, Amb a 7, Amb a 9, Amb a 10, Amb p 5, Amb t 5, Art v 1, Art v 2, Art v 3, Art v 5, Art v 6, Sal k 1, Sal k 2, Sal k 3, Sal k 5, Aln g 1, Aln g 4, Bet v 1, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7, Car b 1, Car i 1, Car i 4, Cas s 1, Cas s 5, Cas s 8, Cas s 9, Cor a 10, Fag e 2, Fag t 2, Fag s 1, Jug n 1, Jug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Jug r 4, Ost c 1, Que a 1, Fra e 1, Lig v 1, Ole e 1, Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10 and Ole e 11, Pla l 1, Pla a 1, Pla a 2, Pla a 3, Pla or 1, Pla or 2, Hum j 1; Par j 1, Par j 2, Par j 4及びPar o 1を含む群より選択される非プロフィリンアレルゲンである。
【００８４】
その他の好ましい本発明の実施態様においては、非プロフィリンアレルゲンは、ホルデウム, オライザ,  セカレ, トリティカム, ゼア, アピウム, ダウクス, ペトロセリナム, ヘリアンタス, ラクツカ, アラビドプシス, ブラシカ, シナピス, ククミス, ファゴピラム, アクチニディア, ベルトレティア(Betholletim), グリシン, レンス, ルピヌス, ファセオラス, ジャグランス, フラガリア, マルス, モラス, ピルス, ルバス, ジジファス, アナカーディウム, シトラス, マンギフェラ, リチ, ピスタシア, カプシカム リコパーシコン, ニコチアナ, ソラナム及びヴィティスを含む群より選択される植物属の食物又は食物成分からのものである。より具体的には、プロフィリン含有植物性物質は、Hor v 12, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17,Hor v 21, Ory s 12, Sec c 20, Tri a 12, Tri a 14, Tri a 18, Tri a 19, Tri a 21, Tri a 25, Tri a 26, Tri a 36, Zea m 14, Zea m 25, Api g 1, Api g 2, Api g 3, Api g 4, Api g 5, Api g 6, Dau c 1, Dau c 4, Hel a 3, Lac s 1, Bra j 1, Bra n 1, Bra o 3, Bra r 1, Bra r 2, Sin a 1, Sin a 2, Sin a 3, Sin a 4, Cuc m 1, Cuc m 2, Cuc m 3, Fag e 2, Act c 5, Act c 8, Act c 10, Act d 1, Act d 2, Act d 3, Act d 4, Act d 5, Act d 6, Act d 7, Act d 8, Act d 9, Act d 10, Act d 11, Ber e 1, Ber e 2, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 5, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 8, Ara h 9, Ara h 10, Ara h 11, Gly m 1, Gly m 2, Gly m 3, Gly  m 4, Gly m 5, Gly m 6s Len c 1, Len c 2, Len c 3s Lup an 1 Pha v 3, Pis v 1, Pis v 2, Pis v 3, Pis v 4, Pis v 5, Pis s 1, Pis s 2, Vig r 1, Vig r 6, Cor a 1, Cor a 2, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 11, Cor a 12, Cor a 13及びCor a 14, Jug n 1及びJug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Jug r 4, Pru du 3, Pru du 4, Pru du 5, Pru du 6, Fra a 1, Fra a 3, Fra a 4, Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3, Mal d 4, Mor n 3, Pru ar 1, Pru ar 3, Pru av 1, Pru av 2, Pru av 3, Pru av 4, Pru d 3, Pru p 1, Pru p 2, Pru p 3, Pru p 4, Pyr c 1, Pyr c 3, Pyr c 4, Pyr c 5, Rub i 1, Rub i 3, Ziz m 1, Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3, Cit l 3, Cit r 3, Cit s 1, Cit s 2, Cit s 3, Lit c 1, Man e 5, Pis v 1, Pis v 2, Pis v 3, Pis v 4, Pis v 5, Cap a 1w, Cap a 2, Lyc e 1, Lyc e 2, Lyc e 3, Lyc e 4, Sola t 1, Sola t 2, Sola t 3, Sola t 4及びVit v 1を含む群より選択される非プロフィリンアレルゲンを含む。
【００８５】
草花粉の典型例は、イネ目からのものであり、具体的には例えば植物科であるイネ科からのものであり、具体的には例えばアントキサンタム, シノドン, ダクチリス, フェスツカ, ホルクス, ホルデウム, ロリウム, オライザ, パスパルム, ファラリス, フレウム, ポア, セカレ, ソルガム, トリティカム及びゼアの植物属からのものである。典型的には、雑草花粉は、植物目であるキク目からのものであり、例えばキク科のもの、例えばアンブロシア属及びアルテミシア属のものである。典型的には、樹木花粉は、植物目であるブナ目(例えばカバノキ科(ベトゥラ, アルヌス, カルピヌス, コリラス, オストリア), ブナ科(ファガス, ケルクス, カスタネア)及びクルミ科(ジャグランス及びカリア)からのもの；植物目であるシソ目からのもの(例えばモクセイ科、例えばオレア属からのもの)；植物目であるマツ目からのもの(例えばヒノキ科、例えばジュニペルス属からのもの)である。
【００８６】
食物又は食物成分は、典型的には、植物目であるセリ目(例えばセリ科由来、例えばアピウム属及びダウクス由来)；とりわけグリシン  マックス(glycine max；ダイズ)及びアラキス  ヒポガエア(Arachis hypogaea；ピーナッツ)を含むマメ目(例えば豆類の科として一般に公知のマメ科)；バラ目(例えばとりわけリンゴ、アプリコット、プラム、チェリー、モモ、西洋ナシ、ラズベリー及びイチゴを含むバラ科)；イネ目(例えばとりわけオオムギ, トウモロコシ, アワ(キビ), イネ及びコムギを含むイネ科)に由来する。
【００８７】
さらに、プロフィリン含有植物性物質は、植物属であるヘヴェア属(ゴムの科)(ゴム又はゴム含有物質の非プロフィリンアレルゲンに対する超過敏性免疫応答の治療に関連する)に由来し得る。
理解されるであろうが、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性及び/又は類似性、例えば少なくとも65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%又は95%の同一性及び/又は類似性を有するアミノ酸配列を有する如何なるポリペプチドも、表1、2又は3において言及されるプロフィリン含有物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答の治療に用いることができると考えられる。しかしながら、プロフィリン含有植物性物質への曝露時における免疫的交差反応を確実にするために、治療段階で(寛容誘導性抗原として)用いられるポリペプチドは、個体が曝露されるプロフィリン含有物質(これは、超過敏性免疫応答を引き起こす非プロフィリンアレルゲンを含む)中に存在するプロフィリンのアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を有することが望ましい。よって、本発明のポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンでチャレンジする時に個体が曝露されるプロフィリンのアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性及び/又は類似性、例えば少なくとも65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%の同一性及び/又は類似性を有するアミノ酸配列を有していてもよい。
【００８８】
よって、本発明の好ましい実施態様においては、プロフィリン含有植物性物質は、イネ科, キク科, カバノキ科, ブナ科, クルミ科, モクセイ科, セリ科, バラ科及びトウダイグサ科を含む群より選択される植物科からのもの又はそのバリアントであり、好ましくはバリアント及びプロフィリンはプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンのアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００８９】
よって、ポリペプチドは、イネ科, キク科, カバノキ科, ブナ科, クルミ科, モクセイ科, セリ科, バラ科及びトウダイグサ科を含む群より選択される植物科の植物種のプロフィリン又はそのバリアントであり、好ましくはバリアント及びプロフィリンはプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンのアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、好ましくは超過敏性免疫応答はイネ科, キク科, カバノキ科, ブナ科, クルミ科, モクセイ科, セリ科, バラ科及びトウダイグサ科を含む群より選択される植物科の植物種のプロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる。
【００９０】
より具体的には、本発明の好ましい実施態様においては、ポリペプチドは、アントキサンタム, シノドン, ダクチリス, フェスツカ, ホルクス, ホルデウム, ロリウム, オライザ, パスパルム, ファラリス, フレウム, ポア, セカレ, ソルガム, トリティカム, ゼア, アピウム, ダウクス, アンブロシア, アルテミシア, アラキス, グリシン, アルヌス, ベトゥラ, コリラス, ファガス, ケルクス, オレア, プランタゴ, マルス, パリエタリア, プラヌス, リコパーシコン及びソラナムを含む群より選択される植物属の植物種のプロフィリン又はそのバリアントであり、好ましくはバリアント及びプロフィリンはプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンのアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、好ましくは超過敏性免疫応答はアントキサンタム, シノドン, ダクチリス, フェスツカ, ホルクス, ホルデウム, ロリウム, オライザ, パスパルム, ファラリス, フレウム, ポア, セカレ, ソルガム, トリティカム, ゼア, アピウム, ダウクス, アンブロシア, アルテミシア, アラキス, グリシン, アルヌス, ベトゥラ, コリラス, ファガス, ケルクス, オレア, プランタゴ, マルス, パリエタリア, プラヌス, リコパーシコン及びソラナムを含む群より選択される植物属の植物種のプロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる。
【００９１】
より一層具体的には、本発明の好ましい実施態様において、ポリペプチドは、イネ目(配列番号11〜15、40)、シソ目(配列番号16)、ブナ目(配列番号17及び18)、マメ目(配列番号19及び20)、キク目(配列番号21〜23)、キントラノオ目(配列番号24)、バラ目(配列番号25〜23)、キク目(配列番号24〜31)、ヤシ目(配列番号32)、ナデシコ目(配列番号33〜35)、セリ目(配列番号36及び37)、ウリ目(配列番号38)、ナス目(配列番号39)、クサスギカズラ目(配列番号41)、ショウガ目(配列番号42)のプロフィリンのアミノ酸配列によって例示される配列番号11〜43を含む群より選択されるアミノ酸配列を有するか、又は下記で更に定義されるような当該プロフィリンのバリアントである。
【００９２】
とりわけ、配列番号1〜42は、組換え技術によって配列を産生する宿主細胞における酵素の分解によって除去されていてもよいN末端(1位)の最初のアミノ酸としてメチオニンを有する。したがって、ここで言及されるアミノ酸配列(配列番号1〜42)のすべてにおいて、1位のメチオニン基が存在しない場合があることが理解されるべきである。よって、いくつかの実施態様において、配列番号1〜42のアミノ酸配列は1位メチオニンを含まない。
【００９３】
また、ポリペプチドは、公知のプロフィリン、例えばCry jプロフィリン, Pho d 2, Ana c 1 ,Cyn d 12, Tri a 12, Mus a 1, Api g 4, Dau c 4, Amb a 8, Art v 4, Hel a 2, Ara t 8, Sin a 4, Ama r 2, Beta v 2, Che e 2, Sal k 4, Act d 9, Cuc m 2, Ara h 5, Gly m 3, Bet v 2, Cor a 2, Ole e 2, Hev b 8, Mer a 12, Pla a 3, Fra a 4, Mal d 4, Par j 3, Pru av 4,  Pru du 4, Pru p 4, Pyr c 4, Cit s 2, Lit c 1, Cap a 2, Lyc e 1を含む群より選択されるか又はそのバリアントであってもよい。
【００９４】
更に、本発明の好ましい実施態様において、ポリペプチドは、配列番号1〜42に示されるプロフィリンと高い類似性を有し、アミノ酸配列の少なくとも60%、例えば少なくとも65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%及び95%が配列番号1〜42の群より選択されるプロフィリンのアミノ酸配列と重複する。
【００９５】
ポリペプチドは、様々な異性体を含むか又は含まない自然に生じる形態で用いてもよいし、プロフィリン含有植物性物質から抽出/単離されてもよいし、又は当該技術において周知の生物学的方法(例えば組換え技術)又は合成方法を用いて再現されてもよい。
したがって、いくつかの実施態様において、本発明において用いられるポリペプチドは精製された形態及び/又は単離された形態にある一方、その他の実施態様においては、本発明のポリペプチドは、ここで言及されるプロフィリン含有植物性物質から自然に生じるプロフィリンのバリアントであってもよい。例えば、親ポリペプチド(自然に生じるポリペプチド)は、不適切な可溶性、バイオアベイラビリティ、安全性、毒性又は安定性を理由として、例えば化学的及び/又は生物学的方法によって改変してもよい。
【００９６】
化学的改変の典型例は、N-又はO-結合型グリコシル化又はN-末端又はチオール基の誘導体化である。生物学的改変の典型例は、翻訳後修飾、例えばグリコシル化, アセチル化, アルキル化(メチル化, エチル化), ビオチニル化, グルタミル化, グリシル化, イソプレニル化, リポイル化, ホスホパンテテイニル化, リン酸化, 硫酸化, セレン化及びC-末端アミド化である。ポリペプチドは、ホルムアルデヒド又はグルタルアルデヒドを用いる処理によって改変されていてもよい。
【００９７】
一般的に、用語「バリアント」は、ここで言及されるプロフィリン含有植物性物質から自然に生じるプロフィリンであると考えられる「親ポリペプチド」のアミノ酸配列と比較して改変/変異を含むポリペプチド又は少なくとも配列番号1又は配列番号2〜42のアミノ酸配列を有する/含むポリペプチドをいうと理解すべきである。
よって、本発明は、ここで定義されるポリペプチドのアミノ酸配列のいずれかのポリペプチドバリアント及び誘導体、特に以下で定義される配列番号1〜10のもの又は配列番号11〜42のものの使用を包含する。
【００９８】
本発明のバリアントポリペプチドは、改変/変異、例えば親ポリペプチドの１又はそれ以上の位置における挿入, 置換, 欠失, 重複, 挿入-欠失, フレームシフト, トランスバージョン, トランケーション及び/又は逆位(inversion)を有していてもよく、例えば親ポリペプチドの１個のアミノ酸又は数個のアミノ酸、例えば2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45又は50アミノ酸が置換, 欠失, 重複, 挿入-欠失, フレームシフト, トランスバージョン, トランケーション及び/又は逆位しており、好ましくは、バリアントポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸数が、親ポリペプチドのアミノ酸数の50%〜150%の範囲、例えば75%〜125%の範囲にある。
【００９９】
天然プロフィリンは、通常、約120〜170アミノ酸、典型的には約130〜135アミノ酸の長さのアミノ酸鎖を含む。分子量は、典型的には、約14〜16 kDaである。ポリペプチド(親及びそのバリアント)が65〜195アミノ酸、例えば70〜190; 75〜185; 80〜180; 85〜175; 90〜170; 95〜165; 100〜160; 105〜155; 110〜150; 115〜145; 120〜140アミノ酸の長さのアミノ酸鎖を有すると考えられる。
【０１００】
よって、例示的なバリアントポリペプチドは、置換バリアント、欠失バリアント、重複バリアント、挿入バリアント、挿入-欠失バリアント、フレームシフトバリアント、トランスバージョンバリアント、トランケーションバリアント及び/又は逆位バリアント又はその他の適切なバリアントであり得、好ましくは、バリアントポリペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸数は、親ポリペプチドのアミノ酸数と比較して、50%〜150%、例えば55%〜145%, 60%〜140%, 65%〜135%, 70%〜130%, 75%〜125%, 80%〜120%, 85%〜115%、90%〜110%又は95%〜105%である。
【０１０１】
バリアントポリペプチドは、配列番号1又は配列番号2〜42との一定の同一性及び/又は類似性パーセント、例えば60%, 65%, 66%, 68%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%又は99%のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドであり得る。
【０１０２】
配列アライメントは、それによって配列同士を比較することができるDNA, RNA又はタンパク質の配列を整列する方法の１つである。よって、同一、類似又は相同領域を特定することが可能である。同一性、類似性又は相同性は、配列間の機能、構造又は進化上の関係性の結果であり得るし、偶然でもあり得る。
【０１０３】
商業的に入手可能な配列同一性を決定するためのコンピュータプログラムは、複雑な比較アルゴリズムを用いて、当該２又はそれより多い配列間の差異をもたらしたかもしれない進化上の事象を最も反映するように２又はそれより多い配列をアライメントする。したがって、これらのアルゴリズムは、同一又は類似のアミノ酸アライメントに加点し、ギャップ挿入、ギャップ延長及び非類似のアミノ酸アライメントに減点する評点システムで操作する。比較アルゴリズムの評点システムは、i)  ギャップが挿入される毎に常に減点すること(ギャップ減点)、ii)  存在するギャップが余剰の位置で延長される毎に常に減点すること(延長減点)、iii)  同一のアミノ酸のアライメント時に高得点を付与すること、及びiv)  同一でないアミノ酸のアライメント時に相応の得点を付与することを含む。
【０１０４】
殆どのアライメントプログラムでは、ギャップ減点の改変が可能である。しかしながら、このような配列比較ソフトウェアを用いるときには、既定値を用いることが好ましい。同一でないアミノ酸のアライメントの得点は、置換マトリクスとも呼ばれる評点マトリクスに従って付与される。このような置換マトリクスで提供される得点は、進化の間に１つのアミノ酸が別のアミノ酸で置換された蓋然性が変化し、置換されるアミノ酸の物理的/化学的性質に依存するという事実を反映する。例えば、極性アミノ酸が別の極性アミノ酸で置換されている蓋然性は、疎水性アミノ酸で置換されている蓋然性よりも高い。したがって、評点マトリクスは、同一のアミノ酸に最高得点を付与し、同一でないが類似のアミノ酸により低い得点を付与し、同一でなく非類似のアミノ酸により一層低い得点を付与する。プログラムは、hhttp:ncbi.nlm.nih.govで見つけることができる。
【０１０５】
ソフトウェアがアライメントを生成したら、配列類似性及び配列同一性を算出することが可能である。典型的には、ソフトウェアは、これを配列比較の一部として実行し、数値で表される結果を生じる。目視によって配列を比較するとき、ベン図を用いてもよい。この図は、どのアミノ酸が１又はそれより多い類似した(構造的又は化学的)特性を有するどの集合又は部分集合に属するかを説明する。好ましくは、アミノ酸の同一性及び類似性は、全長アミノ酸配列について算出されるか、又は核酸についてはそれぞれの全長アミノ酸配列をコードする対応するポリヌクレオチドに対して算出される。
【０１０６】
例えば、配列同一性及び類似性は、２つのアライメントされたアミノ酸配列を比較ウィンドウを用いて比較することによって、好ましくは全長アミノ酸配列を比較することによって決定することができ、ここで、バリアントポリペプチドは、２つの配列の最適アライメントに関して、親ポリペプチドと比較して付加又は欠失(例えばギャップ又はオーバーハング)を含み得る。同一性パーセンテージは、両方の配列中に同一のアミノ酸がある位置の数を測定して一致した位置の数を割り出し、一致した位置の数を比較ウィンドウの総アミノ酸数で除し、100を乗ずることによって配列同一性パーセンテージを割り出すことによって算出される。比較に最適な配列アライメントは、コンピュータ化されたアルゴリズム(GAP, BESTFIT, BLAST, PASTA及びTFASTA)の実行によって又は目視観察によって行われ得る。好ましくは、比較のための２つの配列が特定されていることを前提として、GAP及びBESTFITを用いてそれらの最適アライメントを決定する。典型的には、ギャップウェイト(gap weight)について5.00及びギャップウェイトレングス(gap weight length)について0.30の既定値が用いられる。
【０１０７】
改変/変異が置換(置換バリアント)であるとき、当該置換は、(同一の集合又は部分集合内で)保存的であってもよいし、(集合又は部分集合間で)非保存的であってもよい。置換は、サイレントな変異を生じ、機能的に等価なポリペプチドをもたらし得る。意図的なアミノ酸置換は、類似性に基づいて作製することができる(すなわち、似たもの同士の(like-for-like)置換、例えば塩基性-塩基性、酸性-酸性、極性-極性等)。
【０１０８】
また、非保存的置換、すなわち１つの集合又は部分集合の残基から別の集合又は部分集合の残基又はオルニチン(以下、Zと称する)、ジアミノブチル酸オルニチン(以下Bと称する)、ノルロイシンオルニチン(以下、0と称する)、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン及びフェニルグリシンのような関連のあるものへの置換も起こり得る。
【０１０９】
保存的及び類似の置換に関して、ベン図に基づく表は、構造的及び機能的特徴におけるそれらの類似性に従ってアミノ酸を集合(極性/疎水性/小さい)及び部分集合(芳香族/脂肪族/荷電/極小か否か)にグループ分けする表6において見られる。表7において特定されるように、置換は、同一の集合のアミノ酸同士の変異がある場合に保存的であると考えられ、(同一の集合ではないが)同一の部分集合のアミノ酸間の変異がある場合に類似であると考えられる。保存的又は類似の置換であるために置換が集合内又は部分集合内のみであることを必要とするか否かは、タンパク質構造中の位置に依存する。例えばフォールディング、結合部位、活性部位は、特定のアミノ酸が特定の重要な領域又は位置にあるか否かに依存する。当業者は、第１の選択肢として表7に示されるような置換ガイダンスを用いること、更なる試みとして表8に提供されるガイダンスを用いることを考えるであろう。
【０１１０】
以下、そうでないと記載されない限り、位置及び置換は配列番号1を参照して列挙される。別の配列中の等価な位置は、この配列と配列番号1とをアライメントして同一性パーセントが最も高いアライメントを見出した後にどのアミノ酸が配列番号1の特定の位置のアミノ酸とアライメントされるか及び/又は対応するかを決定することによって見出すことができる。このようなアライメント及び第１の参照としての１つの配列の使用は、当業者にとって単なるルーチンの事項であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１１】
我々は、公知の植物プロフィリンが配列番号1の71〜127位に対応する位置内で高度の配列同一性を有することを見出した。参照を容易にするために、この部分的配列を配列番号43という。したがって、本発明のポリペプチドは、配列番号1と少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%, 70%, 75%の配列同一性及び配列番号43と少なくとも80%、好ましくは85%, 90%、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を有する。
【０１１２】
１つの実施態様において、本発明のバリアントポリペプチドは、配列番号1に対して１及び最大25アミノ酸が付加されたか又は欠失されたバリアントを含む。
いくつかの実施態様において、本発明のバリアントポリペプチドは、1〜25個のアミノ酸が置換された配列番号1のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施態様において、本発明のバリアントポリペプチドは、1〜12個のアミノ酸が置換された配列番号1のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施態様において、本発明のバリアントポリペプチドは、3〜9個のアミノ酸が置換された配列番号1のアミノ酸配列を有する。
その更なる実施態様においては、配列番号1の少なくとも２つ、例えば少なくとも３つ、例えば少なくとも５つのアミノ酸が置換されている。
【０１１３】
３つの区別可能な供給源(植物、哺乳動物、下等真核生物)からのプロフィリンが分析され、Thornら(1997)による記事「植物からの主要アレルゲンの結晶構造(the crystal structure of a major allergen from plants)」において比較されている。分析された35個のプロフィリン配列の80%において保存されている18アミノ酸が同定された。配列番号1を参照して、アミノ酸K87及びG113はアクチン結合に関与し、アミノ酸W3, Y6, I25, G27, W33, A34, Y125及びL126はポリ-L-プロリン(PLP)結合に関与し、アミノ酸A23, A24, E46, G64, G69及びT97はフォールディングの保存に関与する。
【０１１４】
したがって、本発明の１つの実施態様において、本発明のバリアントポリペプチドは、配列番号1と少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%又は70%、より好ましくは少なくとも75%, 80%, 85%及び90%の配列同一性を有し、配列番号1のK87及びG113に対応するアミノ酸を含む。このようなバリアントの利点は、アクチン結合部位をバリアントポリペプチドの精製に用いることができることである。
【０１１５】
別の実施態様において、本発明のバリアントポリペプチドは、配列番号1と少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%又は70%、より好ましくは少なくとも75%, 80%, 85%及び90%の配列同一性を有し、配列番号1のW3, Y6, I25, G27, W33, A34, Y125及びL126に対応するアミノ酸を含む。このようなバリアントの利点は、PLP結合部位をバリアントポリペプチドの精製に用いることができることである。
【０１１６】
さらに別の実施態様において、本発明のバリアントポリペプチドは、配列番号1と少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%又は70%、より好ましくは少なくとも75%, 80%, 85%及び90%の配列同一性を有し、配列番号1のA23, A24, E46, G64, G69及びT97に対応するアミノ酸を含む。このようなバリアントの利点は、フォールディングが保存されていることである。
【０１１７】
本発明の１つの実施態様において、本発明のバリアントポリペプチドは、配列番号1と少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%又は70%、より好ましくは少なくとも75%, 80%, 85%及び90%の配列同一性を有し、配列番号1の13位及び/又は115位に対応する位置にあるA, G又はS (極小アミノ酸)から選択されるアミノ酸を含む。好ましい本発明のバリアントポリペプチドは、配列番号1の13位及び/又は115位に対応する位置にAを含む。別の好ましい本発明のバリアントポリペプチドは、配列番号1の13位及び/又は115位に対応する位置にSを含む。
【０１１８】
本発明の別の実施態様において、本発明のバリアントポリペプチドは、配列番号1と少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%又は70%、より好ましくは少なくとも75%, 80%, 85%及び90%の配列同一性を有し、親ポリペプチドの全てのシステイン残基がその他の極小アミノ酸であるA、G又はSの１つで置換されている。
【０１１９】
トリプトファン(W)の置換がタンパク質に対してしばしば多大な影響を有することが知られている。よって、好ましい本発明のバリアントポリペプチドは、配列番号1と少なくとも60%、好ましくは少なくとも65%又は70%、より好ましくは少なくとも75%, 80%, 85%及び90%の配列同一性を有し、配列番号1のW3及びW33に対応するアミノ酸を含む。とりわけ、トリプトファンの存在は、このようなポリペプチドが分析作業を容易にする蛍光を有し得るので重要である。
【０１２０】
例えばBLASTプログラムを用いて本発明の配列番号1〜42の配列をアライメントするとき、様々なプロフィリンのなかでいくつかの特定の保存的置換を観察することができる。アミノ酸の変異に供され得る配列番号1の位置の典型例を表5に示す。よって、カラム「アミノ酸の変異」において言及されるアミノ酸は、そのバリアントを作製するための、親ポリペプチド(配列番号1)のアミノ酸を置換し得るアミノ酸の典型例を構成する。
【０１２１】
本発明の第２の側面は、1又は2つのシステイン残基がA、G又はSから選択されるアミノ酸によって置換されている配列番号1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9又は10のアミノ酸配列を有するポリペプチド(同一のアミノ酸が両方のシステインを置換しているか又は異なるアミノ酸が置換しているかのいずれかである)に関する。このようなバリアントは、酸化に対してより低感受性であり得、よって二量体化、重合又は凝集塊形成しにくい傾向であり得る。このようなポリペプチドは、組換えにより製造されるか又は合成されてもよい。
【０１２２】
具体的に、少なくとも1、2又は全てのシステイン残基がA、G又はSから選択されるアミノ酸によって置換されている配列番号1又は配列番号2〜10のポリペプチドのバリアントが提供される。具体的に、このバリアントポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列を有するが、ここで、13位及び/又は115位アミノ酸であるシステインは、バリアントC13A, C115A, C13G, C115G, C13S, C115S及びその混合物、例えばC13A及びC115Sが産生されるように、A (アラニン)、G (グリシン)及びS (セリン) を含む群より選択されるアミノ酸によって置換されている。このようなバリアントの典型例は、配列番号44 (２つのシステインのセリンによる置換、すなわちC13S, C115S)又は45 (２つのシステインのアラニンによる置換、すなわちC13A, C115A)のアミノ酸配列を有し、ここで、好ましくはメチオニンは1位に存在しないか又は少なくとも組換えにより製造されたポリペプチドの5%に存在するのみである。
【０１２３】
有利には、このような配列番号44及び45のポリペプチドは、特に自己的な酸化及び凝集について安定である。さらに、このようなポリペプチドは、天然のPhl p 12よりも少ない程度でヒトアクチンに結合し得る。
さらに、配列番号45を有するポリペプチドの三次元構造は、配列番号44を有するポリペプチドよりも安定であった。よって、システインのアラニンによる置換は、セリンによる置換よりも分子の構造を安定化する。
【０１２４】
非特異的免疫療法(バイスタンダー免疫寛容)に用いられることに加えて、配列番号44及び45のシステイン-置換バリアントは、超過敏性免疫応答がプロフィリン含有植物性物質のアレルゲン性プロフィリン又は前記プロフィリンに特異的なIgE抗体とのアレルゲン交差反応によって引き起こされる特異的アレルゲン免疫療法においても用いられ得ることが想定される。とりわけ、このような実施態様において、個体は通常プロフィリンに感作されている。
【０１２５】
タンパク質性抗原として、ポリペプチドは免疫原性を有し得、個体の免疫系によって外来として認識され得る。よって、本発明のポリペプチドは免疫原性ポリペプチドである。それは、当該ポリペプチドに結合するか、複合体化するか又は会合することができる特異的IgG抗体、IgM又はIgA抗体を誘導し得る。
【０１２６】
プロフィリンは、通常ポリ-L-プロリンに結合する能力によって特徴付けられる。例えば、この特性は、有利には、プロフィリン含有物質からのプロフィリンの精製/単離に用いられ、そこではプロフィリン含有物質の抽出物、例えば水性抽出物をポリ-L-プロ親和性クロマトグラフィビーズ、例えばアガロースビーズに固定されたポリ-L-プロリンに添加する。会合は強力であり、典型的には、少なくとも6 Mの尿素が結合したプロフィリンをカラムから溶出するのに必要とされる。典型的には、プロフィリンは、6〜8 Mの尿素を用いてカラムから溶出され、尿素を含まない低イオン強度のバッファーに透析することにより復元され、任意にカチオン/アニオン交換クロマトグラフィ及び/又はゲル濾過により抽出物のその他の成分から更に分離される(Amnuaycheewa及びGonzalez de Mejia, 2010及びVidaliら, 1995)。同一の方法を、組換え技術により製造された本発明のポリペプチドの精製において用いることができる。
【０１２７】
プロフィリンは、アクチンに結合する能力によって更に特徴付けしてもよい。プロフィリンは、アクチン単量体(G-アクチン)に結合することによってアクチン-アクチン接触部位を占拠する。その効果はアクチン単量体プールからG-アクチンを隔離すること及びその後のアクチン重合(してF-アクチン形成)を予防することである。よって、アクチン、プロフィリン及びヌクレオチド(ADP及びATP)の混合物中で、アクチンはある程度重合するであろう(このことは質量作用の法則によって推定することができる)。ポリペプチドのアクチン、例えばヒト又は植物のアクチンと会合する能力は、F-アクチン(F-アクチンプール及びG-アクチンプールは遠心分離によって分離することができる)の存在下でポリペプチドへの(好ましくは蛍光標識された)G-アクチンの組込みを調べることによって試験することができる。アクチン結合を試験するための商業用キットは、Cytoskeleton Inc.から入手可能である。あるいは、ポリペプチドをポリ-L-プロリンセファロースビーズに結合させ、G-アクチンと共にインキュベートし、上清中の結合していないG-アクチンの濃度を測定することができる。アクチン結合アッセイの更なる詳細は、Lu及びPollard (2001)及びFechheimer及びZigmond (1993)の科学論文に見出すことができる。本発明のポリペプチドは、好ましくは、植物のアクチンに結合するか又は会合するが、ヒトアクチンとは会合しない。
【０１２８】
本発明において使用するためのポリペプチド(バリアントポリペプチドを含む)は、当該技術において公知の方法による組換えDNA技術によって製造することができる。宿主細胞としては、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列又は発現ベクターのいずれかを含む遺伝子改変細胞、例えば遺伝子改変真核細胞(例えば酵母ピキア属(Pichia))又は非真核細胞(例えばE.コリ(E. coli))を用いることができる。宿主細胞が細菌の細胞である１つの実施態様においては、好ましくはE.コリである。細菌の細胞を用いることの利点は、細菌細胞がプロフィリンを天然に産生しないことである。よって、プロフィリンは細菌細胞にとって異種である。特に、E.コリにとって異種である。よって、天然タンパク質の妨害による組換えポリペプチド精製/単離の複雑化がない。
【０１２９】
本発明のポリペプチドの製造に適したE.コリ株の例は、BL21(DE3), BL21(DE3)plysS又はRosetta(DE3)plysS (すべてNOVAGENから商業的に入手可能)又はBL21(DE3)gold (Agilent Technologiesから商業的に入手可能)である。
【０１３０】
適切なプラスミド及びcDNAを用いて宿主細胞内でポリペプチドを製造する場合、ポリペプチドは、発酵中又は発酵後に培地から細胞を分離することによって単離され、培地中に残る。ポリペプチドは、培養培地のその他の成分を実質的に含まないように、ポリペプチドが製造された培地から、適切な方法、好ましくはクロマトグラフィ(例えばアフィニティクロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、任意に透析と組み合わせられたアニオン又はカチオン交換クロマトグラフィ)によって更に精製してもよい。
【０１３１】
本発明のポリペプチドを検出する/提供する方法
本発明の興味深い側面によれば、本発明のポリペプチドを検出及び提供する方法が提供される。目的は、標的臓器において非プロフィリンアレルゲンに付随的に存在する蓋然性が非常に高いポリペプチドを検出することである。
【０１３２】
この側面は、
i)  プロフィリン含有植物性物質を6〜8のpHを有する水溶液で1〜30分間抽出すること；ii)  非プロフィリンアレルゲン及びプロフィリンの含有について抽出物をスクリーニングすること；iii)  任意にプロフィリンを単離すること；及びiv)  任意にプロフィリンを同定することを含み；抽出物が非プロフィリンアレルゲン及びプロフィリンの両方を含むとき、プロフィリンは、本発明に従って使用するためのポリペプチドとして選択され得る、本発明において使用するのに適したポリペプチド(例えばプロフィリン)をスクリーニングする方法に関する。
【０１３３】
プロフィリンを同定する場合、ここで定義されるプロフィリン又はバリアントは、当該技術において周知の組換え技術によって製造してもよい。
よって、本発明の更なる側面は、
i)   プロフィリン含有植物性物質を6〜8のpHを有する水溶液で1〜30分間抽出すること；ii)  非プロフィリンアレルゲン及びプロフィリンの含有について抽出物をスクリーニングすること；iii)  プロフィリンを同定する(任意に単離されてもよい)こと；及びvi)  任意にポリペプチド又はそのバリアントを組換え技術によって製造することを含み；抽出物が非プロフィリンアレルゲン及びプロフィリンの両方を含むとき、プロフィリンは本発明に従って使用するためのポリペプチドとして選択され得、プロフィリンはそのバリアントを得るために更に改変され得る、本発明において使用可能なポリペプチド(例えばプロフィリン)を得る方法に関する。
【０１３４】
その更なる側面において、本発明は、プロフィリン含有植物性物質から免疫原性ポリペプチドを単離すること又は免疫原性ポリペプチドを組換えにより製造することを含む、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答をバイスタンダー免疫寛容によって治療するために使用するのに適したポリペプチド(例えばプロフィリン)を得る方法であって、ここで、
免疫原性ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質を6〜8のpHを有する水溶液に1〜30分間懸濁することによって作製された抽出物において同定され、任意に当該抽出物から単離されてもよい方法を特徴とする。好ましくは、抽出物は、前記プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲン、すなわち免疫原性ポリペプチドで共抽出された非プロフィリンアレルゲンも含む。
【０１３５】
そのより更なる側面は、プロフィリン含有植物性物質から免疫原性ポリペプチドを単離すること又は免疫原性ポリペプチドを組換えにより製造することを含む方法によって得ることができ、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答をバイスタンダー免疫寛容によって治療するために使用するのに適したポリペプチド(例えばプロフィリン)であって、ここで、
免疫原性ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質を6〜8のpHを有する水溶液に1〜30分間懸濁することによって作製された抽出物において同定され、任意に当該抽出物から単離されていてもよいポリペプチドに関する。好ましくは、抽出物は、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲン、すなわち免疫原性ポリペプチドと共抽出された非プロフィリンアレルゲンも含む。
【０１３６】
つまり、本発明のポリペプチド(例えばプロフィリン)は、プロフィリン含有植物性物質を6〜8のpHを有する水溶液で1〜30分間抽出するとき、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンと共抽出可能である。さらに、本発明のポリペプチド(例えばプロフィリン)は、プロフィリン含有植物性物質からプロフィリンを単離すること又はプロフィリンを組換えにより製造することを含む方法によって得ることができ、ここで、プロフィリンは、プロフィリン含有植物性物質を6〜8のpHを有する水溶液に1〜30分間懸濁することによって作製された抽出物において同定されていることが強調される。
【０１３７】
抽出は、標的臓器の生理的条件をシミュレートする条件、例えば鼻汁に存在する生理的条件下で行われ得る。よって、抽出液は、実質的には、5.5〜8.5、例えば6〜8のpH、好ましくは約pH 7を有し、好ましくは約300 mOsm/Lの0.90% w/v NaCl溶液のそれに対応する浸透圧を有する水溶液である。抽出温度は、好ましくは2℃〜40℃の範囲内である。水溶液は、好ましくは、少なくとも60%の水、例えば好ましくは少なくとも70, 75, 80, 85, 90及び95%の水を含む。加えて、水溶液は、水と混合可能な非水性の液体、例えば低級アルカノール類(例えば1〜6炭素原子を有するもの；例えばエタノール、プロパノール)、アリールアルカノール類(例えば環中に5〜10炭素原子を有するもの；例えばベンジルアルコール)、ポリオール類(例えば2〜6炭素原子を有するもの；例えばグリセロール、プロピレングリコール又はソルビトール)、n-メチルピロリドン、ポリアルキレングリコール類(例えばポリエチレングリコール、プロピレングリコール等)、ポリグリセリン、トリアセチン、ジメチルアセチミド及びジメチルスルホキシドを含み得る。
【０１３８】
pHを制御するために、例えばアスコルビン酸、クエン酸、リン酸緩衝ビヒクル系、TRIS (トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン)、炭酸アンモニウム等の緩衝剤/系の添加によって水溶液を緩衝化してもよい(ここで、任意に、所望のpHはHCl又はNaOHを数滴添加することによって得られる)。よって、水溶液は、緩衝剤、例えばアスコルビン酸、クエン酸、リン酸緩衝液ビヒクル系、TRIS、炭酸アンモニウム/炭酸水素アンモニウム緩衝系を含んでいてもよい。
【０１３９】
浸透圧/イオン強度を制御するために、等張性のビヒクルを水溶液に添加して、標的臓器の生理的条件のそれに対応する浸透圧を得てもよい。よって、水溶液は、浸透圧を付与する物質、例えばホウ酸、塩化ナトリウム、塩化カリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム等を更に含んでいてもよい。典型的には、イオン強度は、10 mM〜1000 mM、例えば好ましくは20〜800 mM、例えば20 mM〜500 mM、例えば50 mM〜500 mM、例えば20 mM〜400 mM、例えば50 mM〜400 mM、例えば20 mM〜300 mM、例えば50 mM〜300 mMである。より好ましくは、イオン強度は、150〜180 mM、例えば約160〜170 mMである。好ましくは、浸透圧は、50〜600 mOsm/L、例えば50〜500 mOsm/L、例えば100〜400 mOsm/L、例えば約300 mOsm/Lである。
【０１４０】
さらに、ゲル化剤、例えばアルキルセルロース物質(例えばカルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルエチルセルロース等)、カーボポール(登録商標)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン及びイソプロピルミリステートを添加することによって粘性を調節してもよい。
【０１４１】
緩衝化水溶液の典型例は、7.2のpH及び165.8 mM (約0.17 M)のイオン強度(μ)を有し、8 g/L (137 mM)の塩化ナトリウム(NaCl)、0.2 g/L (2.7 mM)の塩化カリウム(KCl)、1.44 g/L (8.2 mM)のリン酸水素二ナトリウム(Na2HPO4, 2H2O)、0.2 g/L (1.5 mM)のリン酸二水素カリウムからなり、得られたpHは7.2であり、得られた全イオン強度(μ)は165.8 mM (約0.17 M)であるPBS緩衝液である。
【０１４２】
短時間の抽出で非プロフィリンアレルゲンと共抽出することができるプロフィリンは、このことがポリペプチドが標的臓器において非プロフィリンアレルゲンと共溶出され得ることを示唆しているので、本発明のポリペプチドとして使用可能である蓋然性が高いと考えられる。プロフィリン含有植物性物質は生理的プロセスによって除去される前の短時間で標的臓器の上皮/粘膜中に少しの間存在し得るのみであるから、30分よりも短い、例えば20分未満、より好ましくは15, 10, 8, 7, 6, 5, 3及び2分未満の抽出時間を用いることがより一層予測的であると考えられる。また、抽出は、15〜45℃、より好ましくは18〜37℃、例えば生理的温度又はそれ未満の温度、例えば室温で行われ得る。しかしながら、安定性の問題がある場合、抽出は、より低温度、例えば10℃、例えば約3〜5℃で行われ得る。
【０１４３】
抽出が完了したら、当該技術において周知の方法により非プロフィリンアレルゲン及びプロフィリンの含有について抽出物をスクリーニングする。典型的には、異なる抽出時間(例えば2, 5, 10及び20分)を有するいくつかの抽出物が産生されるか又はいくつかの試料が異なる時点(例えば2, 5, 10及び20分) において同一の抽出液から取り出され、これらの試料はCIE (交差免疫電気泳動), RIE (ロケット免疫電気泳動), SDS Page (ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動), ELISA (酵素結合免疫吸着測定法) 及び/又は MS (質量分析)等の免疫化学的方法に供される。
【０１４４】
さらに、プロフィリンは、アクチン及び/又はPLPに結合する能力により認識され得る。免疫原性プロフィリンは、ウサギにおいて生じるプロフィリン含有植物性物質の抽出精製物を指向するポリクローナル抗体とのCIEを行うことによって見出され得る。また、CIEは、公知のプロフィリンに特異的な抗体と反応する免疫原性ポリペプチド(よって、公知のプロフィリンとの免疫的交差反応性を有するポリペプチドとして適格な免疫原性ポリペプチド)が同定されるように、ここで言及される公知のプロフィリン、例えばPhl p 12 (配列番号1〜10)を指向するポリクローナル抗体を用いて行ってもよい。アレルゲンは、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンにアレルギー性の/感作された個体からの血清とのCIEを行うことによって検出され得る。CIE法の詳細な説明及びプロトコル並びにその他の免疫化学的方法は、Penny Lympanyによる書籍「アレルギーの方法及びプロトコル(分子医療における方法) (Allergy Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine))」 (2008); ISBN: 9780896038967の13章「アレルゲン抽出物の特徴決定のための免疫電気泳動(Immuno-electrophoresis for the characterisation of allergen extracts)」、著者Gitte Nordskov Hansen及びJorgen Nedergaard Larsen)に見出すことができる。
【０１４５】
よって、本発明のポリペプチドは、Cry jプロフィリン, Pho d 2, Ana c 1 ,Cyn d 12, Tri a 12, Mus a 1, Api g 4, Dau c 4, Amb a 8, Art v 4, Hel a 2, Ara t 8, Sin a 4, Ama r 2, Beta v 2, Che e 2, Sal k 4, Act d 9, Cuc m 2, Ara h 5, Gly m 3, Bet v 2, Cor a 2, Ole e 2, Hev b 8, Mer a 12, Pla a 3, Fra a 4, Mal d 4, Par j 3, Pru av 4,  Pru du 4, Pru p 4, Pyr c 4, Cit s 2, Lit c 1, Cap a 2及びLyc e 1から選択されるプロフィリンを指向する抗体、例えば配列番号1又は配列番号2〜42を有するポリペプチドを指向する抗体に結合することができる。抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり得、典型的にはウサギにおいて生じる。
【０１４６】
非プロフィリンアレルゲンと共抽出可能なプロフィリン、例えば好ましくはプロフィリンではない主要アレルゲンを同定したら、同一の抽出物中で直接又は単離後のいずれかにおいてプロフィリンを更に特徴決定してもよく、任意に当該技術において周知の方法に従って精製してもよい。
【０１４７】
例えば、プロフィリンは、ポリ-L-プロリン、例えばポリ-L-プロアフィニティカラムクロマトグラフィビーズ、例えばアガロースビーズに固定されたポリ-L-プロリンを用いて、又は当該技術において公知のその他のクロマトグラフィ方法、とりわけサイズ排除クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ、アニオン/カチオン交換クロマトグラフィ又はそれらの組合せによって単離されてもよい。
【０１４８】
プロフィリンを単離したら、当該技術において公知の方法、例えば任意にトリプシン等のタンパク質分解酵素によってポリペプチドを消化後のアミノ酸シーケンシング及び/又は質量分析によりアミノ酸配列を明らかにするために更に分析してもよい。
【０１４９】
最後に、自然に生じるプロフィリンを同定したら、アミノ酸配列を改変し、当該技術において周知の組換え技術によってバリアント又は元のプロフィリン(天然のもの)を製造して、そのバリアント(上記のようなポリペプチドバリアント)、例えばそのシステイン置換バリアントを得てもよい。
【０１５０】
製剤
ポリペプチドの胃液に対する安定性が乏しい場合、ポリペプチドは、好ましくは胃液との接触を避ける剤形、例えば胃液において非関連抗原の分解を妨げる剤形で投与される。これは、胃液に耐性の医薬製剤に非関連抗原を組み込むことにより、又は胃液におけるタンパク質の分解を避けることができるその他の医薬送達技術を導入することにより達成することができる。
【０１５１】
本発明のポリペプチドは、治療上不活性な成分及び/又はアジュバント等の免疫補助剤と共に製剤化されてもよい。典型的には、製剤は固体剤形、例えば速崩壊性錠剤又は溶液、懸濁液、分散液、ゲル化液を含む液剤である。あるいは、製剤は、エマルジョン又は投与前に溶解して液剤に製剤化することができる再溶解可能な粉末、顆粒又は凍結乾燥物である。
【０１５２】
製剤において用いる賦形剤は、当業者に周知であり、溶剤、乳化剤、湿潤剤、可塑化剤、着色物質、濾剤、防腐剤、粘性調整剤、緩衝剤、pH調整剤、等張性調整剤、粘膜吸着物質等を含む。製剤化ストラテジの例は、当業者に周知である。
【０１５３】
アジュバントは、酸素含有金属塩、例えば水酸化アルミニウム、キトサン、易熱性エンテロトキシン(LT), コレラ毒素(CT), コレラ毒素Bサブユニット(CTB),リポソーム重合体,毒素変異体、例えばLTK63及びLTR72, マイクロカプセル, インターロイキン(例えばIL-1 BETA, IL-2, IL-7, IL-12, INFGAMMA), GM-CSF, MDF誘導体, CpGオリゴヌクレオチド, LPS, MPL, ホスファゼン(phosphophazene), Adju-Phos(R), グルカン, 抗原製剤, リポソーム, DDE, DHEA, DMPC, DMPG, DOC/Alum複合体, フロイント不完全アジュバント, ISCOM(R), LT経口アジュバント, ムラミルジペプチド, モノホスホリルリピドA, ムラミルトリペプチド(muramyl thpeptide)及びホスファチジルエタノールアミンを含む慣用のアジュバントであり得る。
【０１５４】
本発明の実施態様は、以下のうち１以上を任意の順序で組み合わせてもよい：
・  プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる個体における超過敏性免疫応答の治療に使用するためのポリペプチドであって、
・  ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を有し/からなり/本質的になり/含み、任意にメチオニンはアミノ酸配列のN末端に存在せず、
・  あるいは、ポリペプチドは、配列番号2〜10のアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性(例えば少なくとも65% ,70%, 75%, 80%, 85%, 90%又は95%の同一性)を有するアミノ酸配列を有し/からなり/から本質的になり/含み、
・  ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリンのアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性(例えば少なくとも65% ,70%, 75%, 80%, 85%, 90%又は95%の同一性)を有するアミノ酸配列を有し、
【０１５５】
・  ポリペプチドは、植物界マツ綱、植物界単子葉植物綱及び植物界双子葉植物綱からなる群より選択される植物綱のプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンであるか又は当該プロフィリンのバリアントであり、
・  超過敏性免疫応答は、植物界マツ綱、植物界単子葉植物綱及び植物界双子葉植物綱からなる群より選択される植物綱のプロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされ、
・  ポリペプチドは、マツ目, ヤシ目, クサスギカズラ目, イネ目, ショウガ目 セリ目, キク目, アブラナ目, ウリ目, ツツジ目, マメ目, ブナ目, リンドウ目, シソ目, クスノキ目, アオイ目, キントラノオ目, フトモモ目, ヤマモガシ目, バラ目, ムクロジ目, ナス目及びブドウ目からなる群より選択される植物目のプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンであるか又は当該プロフィリンのバリアントであり、
・  超過敏性免疫応答は、マツ目, ヤシ目, クサスギカズラ目, イネ目, ショウガ目, セリ目, キク目, アブラナ目, ウリ目, ツツジ目, マメ目, ブナ目, リンドウ目, シソ目, クスノキ目, アオイ目, キントラノオ目, フトモモ目, ヤマモガシ目, バラ目, ムクロジ目, ナス目及びブドウ目からなる群より選択される植物目のプロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされ、
【０１５６】
・  ポリペプチドは、ヒノキ科, ヤシ科, クサスギカズラ科, アヤメ科, パイナップル科, イネ科, バショウ科,  ショウガ科, セリ科, ウコギ科, キク科, アブラナ科, ヒユ科, ナデシコ科, タデ科, ウリ科, マタタビ科, サガリバナ科, ツバキ科, マメ科, カバノキ科, ブナ科, クルミ科, ヤマモモ科, ナンキョクブナ科, ティコデンドロン科, キョウチクトウ科, アカネ科, モクセイ科, ゴマ科, オオバコ科, クスノキ科, アオイ科, トウダイグサ科, ミソハギ科, スズカケノキ科, アサ科, バラ科, ニレ科, イラクサ科, ウルシ科, ミカン科, ムクロジ科, ナス科及びブドウ科からなる群より選択される植物科のプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンであるか又は当該プロフィリンのバリアントであり、
・  超過敏性免疫応答は、ヒノキ科, ヤシ科, クサスギカズラ科, アヤメ科, パイナップル科, イネ科, バショウ科, ショウガ科, セリ科, ウコギ科, キク科, アブラナ科, ヒユ科, ナデシコ科, タデ科, ウリ科, マタタビ科, サガリバナ科, ツバキ科, マメ科, カバノキ科, ブナ科, クルミ科, ヤマモモ科, ナンキョクブナ科, ティコデンドロン科, キョウチクトウ科, アカネ科, モクセイ科, ゴマ科, オオバコ科, クスノキ科, アオイ科, トウダイグサ科, ミソハギ科, スズカケノキ科, アサ科, バラ科, ニレ科, イラクサ科, ウルシ科, ミカン科, ムクロジ科, ナス科及びブドウ科からなる群より選択される植物科のプロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされ、
【０１５７】
・  ポリペプチドは、カメシパリス, クリプトメリア, キュプレサス, ジュニペルス, フォエニクス, アスパラガス, クロクス, アナナス, アントキサンタム, シノドン, ダクチリス, フェスツカ, ホルクス, ホルデウム, ロリウム, オライザ, パスパルム, ファラリス, フレウム, ポア, セカレ, ソルガム, トリティカム, ゼア, ムサ, アピウム, ダウクス, アンブロシア, アルテミシア, ヘリアンタス, ラクツカ, アラビドプシス, ブラシカ, シナピス, アマランタス, ベタ, ケノポディウム, ファゴピラム, サルソラ, ククミス, アクチニディア, ベルトレティア, アラキス, グリシン, レンス, ルピヌス, ファセオラス, ピサム, ヴィグナ, アルヌス, ベトゥラ, カルピヌス, カリア, カスタネア, コリラス, ファガス, ジャグランス, オストリア, ケルクス, カタランタス, コフィア, フラクシヌス, リグストラム, オレア, プランタゴ, セサマム, シリンガ, ペルセア, ゴシピウム, ヘヴェア, マニホット, メルキュリアリス, ポポラス, リシヌス, ソネラティア, プラタヌス, フラガリア, フムラス, マルス, モラス, パリエタリア, プラヌス, ピルス, ルバス, ジジファス, アナカーディウム, シトラス, リチ, マンギフェラ, ピスタシア, カプシカム, リコパーシコン, ソラナム及びヴィティスからなる群より選択される植物属のプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンであるか又は当該プロフィリンのバリアントであり、
・  超過敏性免疫応答は、カメシパリス, クリプトメリア, キュプレサス, ジュニペルス, フォエニクス, アスパラガス, クロクス, アナナス, アントキサンタム, シノドン, ダクチリス, フェスツカ, ホルクス, ホルデウム, ロリウム, オライザ, パスパルム, ファラリス, フレウム, ポア, セカレ, ソルガム, トリティカム, ゼア, ムサ, アピウム, ダウクス, アンブロシア, アルテミシア, ヘリアンタス, ラクツカ, アラビドプシス, ブラシカ, シナピス, アマランタス, ベタ, ケノポディウム, ファゴピラム, サルソラ, ククミス, アクチニディア, ベルトレティア, アラキス, グリシン, レンス, ルピヌス, ファセオラス, ピサム, ヴィグナ, アルヌス, ベトゥラ, カルピヌス, カリア, カスタネア, コリラス, ファガス, ジャグランス, オストリア, ケルクス, カタランタス, コフィア, フラクシヌス, リグストラム, オレア, プランタゴ, セサマム, シリンガ, ペルセア, ゴシピウム, ヘヴェア, マニホット, メルキュリアリス, ポポラス, リシヌス, ソネラティア, プラタヌス, フラガリア, フムラス, マルス, モラス, パリエタリア,  プラヌス, ピルス, ルバス, ジジファス, アナカーディウム, シトラス, リチ, マンギフェラ, ピスタシア, カプシカム, リコパーシコン, ソラナム及びヴィティスからなる群より選択される植物属のプロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされ、ここで、ポリペプチドは、配列番号1〜42 からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するプロフィリンであるか又は当該プロフィリンのバリアントであり、
【０１５８】
・  配列番号1〜42のアミノ酸配列は、N末端に1位メチオニンを含まず、
・  ポリペプチドは、Cry jプロフィリン, Pho d 2, Ana c 1, Cyn d 12, Tri a 12, Mus a 1, Api g 4, Dau c 4, Amb a 8, Art v 4, Hel a 2, Ara t 8, Sin a 4, Ama r 2, Beta v 2, Che e 2, Sal k 4, Act d 9, Cuc m 2, Ara h 5, Gly m 3, Bet v 2, Cor a 2, Ole e 2 , Hev b 8, Mer a 12, Pla a 3, Fra a 4, Mal d 4, Par j 3, Pru av 4,  Pru du 4, Pru p 4, Pyr c 4, Cit s 2, Lit c 1, Cap a 2及びLyc e 1からなる群より選択されるプロフィリンであるか又は当該プロフィリンのバリアントであり、
・  超過敏性免疫応答は、Cha o 1, Cha o 2, Cry j 1, Cry j 2, Cup a 1, Cup s 1, Cup s 3, Jun a 1, Jun a 2, Jun a 3, Jun o 4, Jun s 1, Jun v 1, Jun v 3, Ana c 2, Ant o 1, Aspa o 1, Cro s 1, Cro s 2, Cyn d 1, Cyn d 7, Cyn d 15, Cyn d 22w, Cyn d 23, Cyn d 24, Dac g 1, Dac g 2, Dac g 3, Dac g 4, Dac g 5, Fes p 4, Hol l 1, Hol l 5, Hor v 1, Hor v 5, Hor v 12, Hor v 15, Hor v 16, Hor v 17, Hor v 21, Lol p 1, Lol p 2, Lol p 3, Lol p 4, Lol p 5, Lol p 11, Mus a 2, Mus a 3, Mus a 4, Mus a 5, Ory s 1, Ory s 12, Pas n 1, Pha a 1, Pha a 5, Phl p 1, Phl p 2, Phl p 4, Phl p 5, Phl p 6, Phl p 7, Phl p 11, Phl p 13, Pho d 2, Poa p 1, Poa p 5, Sec c 1, Sec c 5, Sec c 20, Sor h 1, Tri a 14, Tri a 15, Tri a 18, Tri a 19, Tri a 21, Tri a 25, Tri a 26, Tri a 27, Tri a 28, Tri a 29, Tri a 30, Tri a 31, Tri a 32, Tri a 33, Tri a 34, Tri a 35, Tri a 36, Tri a 37, Zea m 1, Zea m 12, Zea m 14, Zea m 25, Act c 5, Act c 8, Act c 10, Act d 1, Act d 2, Act d 3, Act d 4, Act d 5, Act d 6, Act d 7, Act d 8, Act d 10, Act d 11, Aln g 1, Aln g 4, Amb a 1, Amb a 2, Amb a 3, Amb a 4, Amb a 5, Amb a 6, Amb a 7, Amb a 9, Amb a 10, Amb p 5, Amb t 5, Ana o 1, Ana o 2, Ana o 3, Api g 1, Api g 2, Api g 3, Api g 5, Api g 6, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3, Ara h 4, Ara h 6, Ara h 7, Ara h 9, Ara h 10, Ara h 11, Art v 1, Art v 2, Art v 3, Art v 5, Art v 6, Ber e 1, Ber e 2, Beta v 1, Bet v 1, Bet v 3, Bet v 4, Bet v 6, Bet v 7, Bra j 1, Bra n 1, Bra o 3, Bra r 1, Bra r 2, Cap a 1w, Car b 1, Car i 1, Car i 4, Cas s 1, Cas s 5, Cas s 8, Cas s 9, Cat r 1, Che a 1, Che a 3, Cit l 3, Cit r 3, Cit s 1, Cit s 3, Cof a 1, Cor a 1, Cor a 8, Cor a 9, Cor a 10, Cor a 11, Cor a 12, Cor a 13, Cor a 14, Cuc m 1, Cuc m 3, Dau c 1, Fag e 2, Fag t 2, Fag s 1, Fra a 1, Fra a 3, Fra e 1, Gly m 1, Gly m 2, Gly  m 4, Gly m 5, Gly m 6, Hel a 1, Hel a 3, Hev b 1, Hev b 2, Hev b 3, Hev b 4, Hev b 5, Hev b 6, Hev b 7, Hev b 9, Hev b 10, Hev b 11, Hev b 12, Hev b 13, Hev b 14, Hum j 1, Jug n 1, Jug n 2, Jug r 1, Jug r 2, Jug r 3, Jug r 4, Lac s 1, Len c 1, Len c 2, Len c 3, Lig v 1, Lup an 1, Lyc e 2, Lyc e 3, Lyc e 4, Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3, Man e 5, Mer a 1, Mor n 3, Ole e 1, Ole e 3, Ole e 4, Ole e 5, Ole e 6, Ole e 7, Ole e 8, Ole e 9, Ole e 10, Ole e 11, Ost c 1, Par j 1, Par j 2, Par j 4, Par o 1, Pers a 1, Pha v 3, Pis v 1, Pis v 2, Pis v 3, Pis v 4, Pis v 5, Pis s 1,Pis s 2, Pla l 1, Pla a 1, Pla a 2, Pla or 1, Pla or 2, Pla or 3, Pru ar 1, Pru ar 3,Pru av 1, Pru av 2, Pru av 3, Pru d 3, Pru du 3, Pru du 5, Pru du 6, Pru p 1, Pru p 2, Pru p 3, Pyr c 1, Pyr c 3, Pyr c 5, Que a 1, Ric c 1, Rub i 1, Rub i 3, Sal k 1, Sal k 2, Sal k 3, Sal k 5, Ses i 1, Ses i 2, Ses i 3, Ses i 4, Ses i 5, Ses i 6, Ses i 7, Sin a 1, Sin a 2, Sin a 3, Sola t 1, Sola t 2, Sola t 3, Sola t 4, Syr v 1, Syr v 3, Vig r 1, Vit v 1及び Ziz m 1からなる群より選択される非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされ、
【０１５９】
・  プロフィリンバリアントは、上記の実施態様のいずれか１つの自然に生じるプロフィリンと比較して、１又はそれより多くの位置に挿入, 置換, 欠失, 重複, 挿入-欠失, フレームシフト, トランスバージョン, トランケーション及び/又は逆位を有し、
・  プロフィリンバリアントは、上記の実施態様のいずれか１つの自然に生じるプロフィリンの1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45又は50アミノ酸を置換, 欠失, 重複, 挿入-欠失, フレームシフト, トランスバージョン, トランケーション及び/又は逆位させることによって、上記の自然に生じるプロフィリンから作製され、
・  ここで言及される実施態様のいずれか１つのプロフィリンバリアントは、配列番号1又は配列番号2〜42と少なくとも60%の配列同一性、例えば少なくとも70%, 75%, 80% ,85%, 90%又は95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、
・  ポリペプチド又はそのバリアント(プロフィリンバリアント)は、配列番号43のアミノ酸配列を含み、
・  ポリペプチド又はそのバリアント(プロフィリンバリアント)は、配列番号43のアミノ酸配列を含み、配列番号1と少なくとも60%の配列同一性、例えば少なくとも70%, 75%, 80% ,85%, 90%又は95%の配列同一性を有し、
【０１６０】
・  バリアントは、配列番号1〜42のバリアント又は配列番号1〜42の親アミノ酸配列又は上記の自然に生じるプロフィリンと比較して1及び最大25アミノ酸が付加しているか又は欠失している、ここで言及されるその他の自然に生じるプロフィリンであり、
・  バリアントは、配列番号1〜42のバリアント又は配列番号1〜42の親アミノ酸配列又は上記の自然に生じるプロフィリンと比較して1及び最大25アミノ酸が別のアミノ酸で置換されている、ここで言及されるその他の自然に生じるプロフィリンであり、
・  バリアントは、配列番号1と少なくとも60%の配列同一性、例えば少なくとも70%, 75%, 80% ,85%, 90%又は95%の配列同一性を有し、配列番号1のK87及びG113に対応するアミノ酸を含み、
・  バリアントは、配列番号1と少なくとも60%の配列同一性、例えば少なくとも70%, 75%, 80%, 85%, 90%又は95%の配列同一性を有し、配列番号1のW3, Y6, I25, G27, W33, A34, Y125及びL126に対応するアミノ酸を含み、
・  バリアントポリペプチドは、配列番号1と少なくとも60%の配列同一性、例えば少なくとも70%, 75%, 80%, 85%, 90%又は95%の配列同一性を有し、配列番号1のA23, A24, E46, G64, G69及びT97に対応するアミノ酸を含み、
・  バリアントポリペプチドは、配列番号1と少なくとも60%の配列同一性、例えば少なくとも70%, 75%, 80%, 85%, 90%又は95%の配列同一性を有し、配列番号1の13位及び/又は115位に対応する位置にA, G又はSから選択されるアミノ酸を含み、
・  バリアントポリペプチドは、配列番号1と少なくとも60%の配列同一性、例えば少なくとも70%, 75%, 80%, 85%, 90%又は95%の配列同一性を有し、親ポリペプチドのすべてのシステイン残基がA, G及び/又はSから選択されるアミノ酸で置換されており、
【０１６１】
・  ポリペプチド又はそのバリアントは、65〜195アミノ酸の長さのアミノ酸鎖を有し、
・  バリアントのアミノ酸配列におけるアミノ酸数は、ここで言及される配列番号1〜42の親アミノ酸配列又は自然に生じるプロフィリンのアミノ酸数と比較して50%〜150%の範囲にあり、
・  ポリペプチド又はそのバリアントは、グリコシル化, アセチル化, アルキル化, ビオチニル化, グルタミル化, グリシル化, イソプレニル化, リポイル化, ホスホパンテテイニル化, リン酸化, 硫酸化, セレン化, C-末端アミド化及びチオール基の誘導体化によって改変されており、
【０１６２】
・  ポリペプチド又はそのバリアントは、免疫原性ポリペプチドであり、
・  ポリペプチド又はそのバリアントは、ポリ-L-プロリンと結合するか又は複合体化し、
・  ポリペプチド又はそのバリアントは、アクチンと結合するか又は複合体化し、
・  ポリペプチド又はそのバリアントは、ヒトアクチンと結合しないか又は複合体化せず、
・  ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質を6〜8のpHを有する水溶液で1〜30分間抽出するとき、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンと共抽出可能であり、
・  ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質からプロフィリンを単離すること又はプロフィリンを組換えにより製造することを含み、ここで、プロフィリンは、プロフィリン含有植物性物質を6〜8のpHを有する水溶液で1〜30分間懸濁することによって作製された抽出物において同定されている方法によって得ることができ、
【０１６３】
・  超過敏性免疫応答は、1型超過敏性免疫応答であり、
・  超過敏性免疫応答は、アトピー性皮膚炎, 蕁麻疹, 接触性皮膚炎, アレルギー性結膜炎, アレルギー性鼻炎, アレルギー性喘息, アナフィラキシー及び食物アレルギーからなる群より選択され、
・  ポリペプチドは、呼吸器, 胃腸管及び口腔の粘膜又は上皮からなる群より選択される粘膜又は上皮に投与され、
・  ポリペプチドは、吸入, 鼻内投与, バッカル投与, 経口投与, 舌下投与によって投与され、
・  ポリペプチドの初回投与は、吸入, 鼻内投与, バッカル投与, 経口投与, 舌下投与によって行われ、
・  ポリペプチドは、当該ポリペプチドに対する口腔寛容を確立するのに十分な期間内に吸入, 鼻内投与, バッカル投与, 経口投与, 舌下投与によって投与され、
【０１６４】
・  ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質に対する個体の自然曝露と少なくとも部分的に又は完全に一致する期間内に、プロフィリン含有植物性物質に対する自然曝露に供された標的臓器に更に投与され、ここで、標的臓器は、呼吸器、胃腸管及び皮膚からなる群より選択され、
・  ポリペプチドは、当該ポリペプチドに対する口腔寛容を確立するのに十分な期間内に舌下投与によって投与され、ここで、ポリペプチド又はそのバリアントは、その後プロフィリン含有植物性物質に対する曝露期間中、同時に、同時期に、別々に又は逐次的に、任意の順序で鼻腔、胃腸管及び/又は皮膚に投与され、
【０１６５】
・  超過敏性免疫応答は、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリンによって引き起こされず、
・  個体は、少なくともポリペプチドの初回投与前に、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリン及び/又はポリペプチドに感作されておらず、
・  個体は、少なくともポリペプチドの初回投与前に、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリンにもポリペプチドにも感作されておらず、
・  ポリペプチド又はプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンは、少なくともポリペプチドの初回投与前に、個体において超過敏性免疫応答を誘導しておらず、
【０１６６】
・  プロフィリン含有植物性物質のポリペプチド又はプロフィリンは、少なくともポリペプチドの初回投与前に、様々な濃度のプロフィリン含有植物性物質のプロフィリン及び/又はポリペプチドを用いる皮膚プリックテスト実行時に個体において即時型皮膚反応及び/又は遅延型皮膚反応を誘導しておらず、
・  ポリペプチド又はプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンは、少なくともポリペプチドの初回投与前に、治療される個体からの血液を用いるインビトロ塩基球/マスト細胞アッセイにおいてヒスタミン放出を誘導しておらず、
【０１６７】
・  個体は、ポリペプチドの初回投与前に、プロフィリン含有植物性物質に対して曝露されており、
・  個体は、少なくともポリペプチドの初回投与前に、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンに感作されておらず、
・  個体は、少なくともポリペプチドの初回投与前に、プロフィリン含有物質の非プロフィリンアレルゲンと結合することができるか又は会合することができる検出可能な血清IgE抗体を有さず、
・  個体は、少なくともポリペプチドの初回投与前に、プロフィリン含有植物性物質に対する曝露時に超過敏性免疫応答の臨床的症状を有さず、
【０１６８】
・  ポリペプチドは、投与されるポリペプチドのみであり、
・  ポリペプチドは、非プロフィリンアレルゲンと共投与されず、
・  ポリペプチドは、1又は2つのシステイン残基がA (アラニン), G (グリシン)及びS (セリン)から選択されるアミノ酸によって置換されている配列番号1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9又は10のアミノ酸配列を有し、
・  ポリペプチドは、13位及び/又は115位アミノ酸であるシステインがA、G及び/又はSを含む群より選択されるアミノ酸によって置換されている配列番号1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9又は10のアミノ酸配列を有し、
【０１６９】
・  ポリペプチドは、任意にアミノ酸配列が1位メチオニンを含まない配列番号44又は45のアミノ酸配列を有し、
・  単離された核酸は、配列番号44又は45のタンパク質をコードし、
・  ここで、単離された核酸は、配列番号46又は47を有し、
・  プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答をバイスタンダー免疫寛容によって治療するために使用するのに適したポリペプチドを得る方法は、プロフィリン含有植物性物質から免疫原性ポリペプチドを単離すること又は免疫原性ポリペプチドを組換えにより製造することを含み、ここで、免疫原性ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質を6〜8のpHを有する水溶液に1〜30分間懸濁することによって作製された抽出物において同定されており、任意に当該抽出物から単離されていてもよく、
・  プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答をバイスタンダー免疫寛容によって治療するために使用するのに適したポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質から免疫原性ポリペプチドを単離すること又は免疫原性ポリペプチドを組換えにより製造することを含む方法によって得ることができ、ここで、免疫原性ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質を6〜8のpHを有する水溶液に1〜30分間懸濁することによって作製された抽出物において同定されており、任意に当該抽出物から単離されていてもよく、
【０１７０】
・  ここで、抽出物は、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンも含み、
・  免疫原性ポリペプチドは、プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンと共抽出可能であり、
・  プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンに対する個体における超過敏性免疫応答の治療又は予防方法は、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも60%の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドの治療有効量を投与することを含み、
・  プロフィリン含有植物性物質の非プロフィリンアレルゲンに対する個体における超過敏性免疫応答の治療又は予防用医薬の製造のためのポリペプチドの使用(ここで、ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸配列と少なくとも60％の同一性を有するアミノ酸配列を有する/含む)。
【０１７１】
表のリスト
【表１】
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【０１７２】
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１７３】
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【０１７４】
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【表４−５】
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【表４−６】
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【表４−７】
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【表４−８】
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【表４−９】
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【表４−１０】
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【表４−１１】
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【表４−１２】
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【表４−１３】
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【表４−１４】
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【表４−１５】
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【表４−１６】
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【表４−１７】
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【表４−１８】
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【表４−１９】
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【表４−２０】
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【表４−２１】
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【表４−２２】
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【表４−２３】
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【表４−２４】
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【表４−２５】
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【表４−２６】
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【０１７５】
【表５】
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【０１７６】
【表６】
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【０１７７】
【表７】
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【０１７８】
【表８】
2015514126.tif 000042
【０１７９】
配列リスト
配列番号1:
>sp|O24650|PROF2_PHLPR プロフィリン-2/4 OS=フレウム  プラテンス GN=PRO2 PE=1 SV=1
MSWQTYVDEHLMCEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEITGIMKDFDEPGHLAPTGMFVAGAKYMVIQGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQALVVGIYDEPMTPGQCNMVVERLGDYLVEQGM
配列番号2:
>sp|O24282|PROF3_PHLPR プロフィリン-3 OS=フレウム  プラテンス GN=PRO3 PE=1 SV=1
MSWQTYVDEHLMCEIEGHHLASAAIFGHDGTVWAQSADFPQFKPEEITGIMKDLDEPGHLAPTGMFVAAAKYMVIQGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQALVVGIYDEPMTPGQCNMVVERLGDYLVEQGM
配列番号3:
>sp|P35079|PROF1_PHLPR プロフィリン-1 OS=フレウム  プラテンス GN=PRO1 PE=1 SV=1
MSWQTYVDEHLMCEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEITGIMKDFDEPGHLAPTGMFVAGAKYMVIQGEPGRVIRGKKGAGGITIKKTGQALVVGIYDEPMTPGQCNMVVERLGDYLVEQGM
【０１８０】
配列番号4:
>tr|A4KA31|A4KA31_PHLPR プロフィリン OS=フレウム  プラテンス PE=2 SV=1
MSWQAYVDEHLMCEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEITGIMKDFDEPGHLAPTGMFVATAKYMVIQGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQALVVGIYDEPMTPGQCNMVVERLGDYLLKQGL
配列番号5:
>tr|A4KA32|A4KA32_PHLPR プロフィリン OS=フレウム  プラテンス PE=2 SV=1
MSWQAYVDEHLMCEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEITGIMKDFDEPGHLAPTGMFVAAAKYMVIQGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQALVVGIYDEPMTPGQCNMVVERLGDYLVKQGL
配列番号6:
>tr|A4KA33|A4KA33_PHLPR プロフィリン OS=フレウム  プラテンス PE=2 SV=1
MSWQTYVDEHLMCEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEITGIMKDFDEPGHLAPTGMFVAAAKYMVIQGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQALVVGIYDEPMTPGQCNMVVERLGDYLLKQGL.
【０１８１】
配列番号7:
>tr|A4KA34|A4KA34_PHLPR プロフィリン OS=フレウム  プラテンス PE=2 SV=1
MSWQTYVDEHLMCEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEITGIMKDFDEPGHLAPTGMFVATAKYMVIQGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQALVVGIYDEPMTPGQCNMVVERLGDYLLKQGL
配列番号8:
>tr|A4KA36|A4KA36_PHLPR プロフィリン OS=フレウム  プラテンス PE=2 SV=1
MSWQAYVDEHLMCEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEITGIMKDFDEPGHLAPTGMFVAAAKYMVIQGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQALVVGIYDEPMTPGQCNMVVERLGDYLLKQGL
配列番号9:
>tr|A4KA37|A4KA37_PHLPR プロフィリン OS=フレウム  プラテンス PE=2 SV=1
MSWQAYVDEHLMCEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEITGIMKDFDEPGHLAPTGMFVAAAKYMVIQGEPGAVTRGKKGAGGITIKKTGQALVVGIYDEPMTPGQCNMVVERLGDYLVKQGL
【０１８２】
配列番号10:
>tr|A4KA38|A4KA38_PHLPR プロフィリン OS=フレウム  プラテンス PE=2 SV=1
MSWQAYVDEHLMCEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEITGIMKDFDEPGHLAPTGMFVATAKYMVIQGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQALVVGIYDEPMTPGQCSMVVERLGDYLVKQGL
配列番号11: Tri a 12.0101  (allergen.orgの4つの異性体) (コムギ, (イネ目)
>sp|P49232|PROF1_WHEAT プロフィリン-1 (フラグメント) OS=トリティカム  エスティバム GN=PRO1 PE=2 SV=1
MSWQTYVDDHLCCEIDGQHLTSAAILGHDGSVWTESPNFPKFKPEEIAGIVKDFEEPGHLAPTGLFLGGTKYMVIQGEPGVVIRGKKGTGGITIKKTGMALILGIYDEPMTPGQCNLVVERLGDYLIDQGYWVPSSNS
配列番号12: Hor v 12.0101 (オオムギ (イネ目))
>sp|P52184|PROF1_HORVU プロフィリン-1 OS=ホルデウム ヴルガレ GN=PRO1 PE=2 SV=1
MSWQTYVDDHLCCEIDGQHLTSAAILGHDGRVWVQSPNFPQFKPEEIAGIIKDFDEPGHLAPTGLFLGGTKYMVIQGEPGVVIRGKKGTGGITIKKTGMPLILGIYDEPMTPGQCNLVVERLGDYLVEQGF
【０１８３】
配列番号13: Ory s 12.0101 (イネ(イネ目))
>sp|Q9FUD1|PROFA_ORYSJ プロフィリン-A OS=オライザ  サティバ亜種ジャポニカ GN=Os10g0323600 PE=2 SV=1
MSWQTYVDEHLMCEIEGHHLTSAAIVGHDGTVWAQSAAFPQFKPEEMTNIMKDFDEPGFLAPTGLFLGPTKYMVIQGEPGAVIRGKKGSGGITVKKTGQALVVGIYDEPMTPGQCNMVVERLGDYLVEQGL
配列番号14: Zea m 12.0101 (トウモロコシ(イネ目))) 
>sp|P35081|PROF1_MAIZE プロフィリン-1 OS=ゼア  メイズ GN=PRO1 PE=1 SV=1
MSWQTYVDEHLMCEIEGHHLTSAAIVGHDGATWAQSTAFPEFKPEEMAAIMKDFDEPGHLAPTGLILGGTKYMVIQGEPGAVIRGKKGSGGITVKKTGQSLIIGIYDEPMTPGQCNLVVERLGDYLLEQGM
配列番号15: Cyn d 12.0101 (ギョウギシバ(イネ目))
>sp|O04725|PROF_CYNDA プロフィリン OS=シノドン ダクチロン GN=PRO1 PE=1 SV=1
MSWQAYVDDHLMCEIEGHHLTSAAIIGHDGTVWAQSAAFPAFKPEEMANIMKDFDEPGFLAPTGLFLGPTKYMVIQGEPGAVIRGKKGSGGVTVKKTGQALVIGIYDEPMTPGQCNMVIEKLGDYLIEQGM
【０１８４】
配列番号16: Ole e 2.0101 (オリーブ(シソ目) 
>sp|O24169|PROF1_OLEEU プロフィリン-1 OS=オレア  ユーロピア GN=PRO1 PE=1 SV=1
MSWQAYVDDHLMCDIEGHEDHRLTAAAIVGHDGSVWAQSATFPQFKPEEMNGIMTDFNEPGHLAPTGLHLGGTKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGGITIKKTGQALVFGIYEEPVTPGQCNMVVERLGDYLVEQGM
配列番号17: Cor a 2.0101 (セイヨウハシバミ (ブナ目))
>tr|Q9AXH5|Q9AXH5_CORAV プロフィリン OS=コリラス  アヴェラナ PE=2 SV=1
MSWQTYGDEHLMCEIEGNRLAAAAIIGHDGSVWAQSSTFPQLKPEEITGVMNDFNEPGSLAPTGLYLGGTKYMVIQGEPGAVIRRKKGPGGVTVKKTSQALIIGIYDEPMTPGQCNMIVERLGDYLIDQGL
配列番号18: Bet v 2.0101 (ブナ目) 
>sp|P25816|PROF_BETPN プロフィリン OS=ベトゥラ  ペンドゥラGN=BETVII PE=1 SV=1
MSWQTYVDEHLMCDIDGQASNSLASAIVGHDGSVWAQSSSFPQFKPQEITGIMKDFEEPGHLAPTGLHLGGIKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGGITIKKTGQALVFGIYEEPVTPGQCNMVVERLGDYLIDQGL
【０１８５】
配列番号19: Ara h 5.0101(ピーナッツ (マメ目)
>sp|Q9SQI9|PROF_ARAHY プロフィリン OS=アラキス  ハイポゲア PE=1 SV=1
MSWQTYVDNHLLCEIEGDHLSSAAILGQDGGVWAQSSHFPQFKPEEITAIMNDFAEPGSLAPTGLYLGGTKYMVIQGEPGAIIPGKKGPGGVTIEKTNQALIIGIYDKPMTPGQCNMIVERLGDYLIDTGL
配列番号20: Gly m 3.0101 (ダイズ(マメ目) 
>sp|O65809|PROF1_SOYBN プロフィリン-1 OS=グリシン  マクス GN=PRO1 PE=1 SV=1
MSWQAYVDDHLLCDIEGNHLTHAAIIGQDGSVWAQSTDFPQFKPEEITAIMNDFNEPGSLAPTGLYLGGTKYMVIQGEPGAVIRGKKGPGGVTVKKTGAALIIGIYDEPMTPGQCNMVVERPGDYLIDQGY
配列番号21: Amb a 8.0101 (ブタクサ (キク目))
>tr|Q2KN24|Q2KN24_AMBAR プロフィリン OS=アンブロシア  アルテミシイフォリア PE=2 SV=1
MSWQTYVDEHLMCDIEGTGQHLASAAIFGTDGNVWAKSSSFPEFKPDEINAIIKEFSEPGALAPTGLFLAGAKYMVIQGEPGAVIRGKKGAGGICIKKTGQAMVFGIYEEPVNPGQCNMVVERLGDYLVDQGM
【０１８６】
配列番号22: Hel a 2.0101 (ヒマワリ(キク目))
>sp|O81982|PROF_HELAN プロフィリン OS=ヘリアンタス  アヌウス PE=1 SV=1
MSWQAYVDEHLMCDIEGTGQHLTSAAILGLDGTVWAQSAKFPQFKPEEMKGIIKEFDEAGTLAPTGMFIAGAKYMVLQGEPGAVIRGKKGAGGICIKKTGQAMIMGIYDEPVAPGQCNMVVERLGDYLLEQGM
配列番号23: Art v 4.0101 (キク目))
>sp|Q8H2C9|PROF1_ARTVU プロフィリン-1 OS=アルテミシア  ヴルガリス PE=1 SV=3
MSWQTYVDDHLMCDIEGTGQHLTSAAIFGTDGTVWAKSASFPEFKPNEIDAIIKEFNEAGQLAPTGLFLGGAKYMVIQGEAGAVIRGKKGAGGICIKKTGQAMVFGIYDEPVAPGQCNMVVERLGDYLLDQGM
配列番号24: Hev b 8.0101 (キントラノオ目) 
>sp|O65812|PROF1_HEVBR プロフィリン-1 OS=ヘヴェア  ブラシリエンシス PE=1 SV=1
MSWQTYVDERLMCEIEGNHLTAAAIIGQDGSVWAQSSNFPQFKSEEITAIMSDFDEPGTLAPTGLHLGGTKYMVIQGEAGAVIRGKKGPGGVTVRKTNQALIIGIYDEPMTPGQCNMIVERLGDYLLEQGM
【０１８７】
配列番号25: Fra a 4  (バラ目))
>sp|P0C0Y3|PROF_FRAAN プロフィリン OS=フラガリア アナナサ PE=1 SV=1
MSWQTYVDDHLMCEIEGNHLSAAAIIGQDGSVWAQSATFPQLKPEEVTGIVRDFDEPGTLAPTGLYLGGTKYMVIQGEPGAVIRGKKGPGGVTVKKTTLALLIGIYDEPMTPGQCNMIVERLGDYLVEQGL
配列番号26: Mal d 4.0101 (バラ目))
>sp|Q9XF42|PROF3_MALDO プロフィリン-3 OS=マルス  ドメスティカ PE=1 SV=1
MSWQAYVDDHLMCDIDGNRLTAAAILGQDGSVWSQSASFPAFKPEEIAAILKDFDQPGTLAPTGLFLGGTKYMVIQGEPGAVIRGKKGSGGITIKKTSQALLIGIYDEPVTPGQCNIVVERLGDYLIEQGL
配列番号27: Pru av 4.0101 (チェリー (バラ目))
>sp|Q9XF39|PROF_PRUAV プロフィリン OS=プラヌス  アビウム PE=1 SV=1
MSWQAYVDDHLMCDIDGNRLTAAAILGQDGSVWSQSATFPAFKPEEIAAILKDLDQPGTLAPTGLFLGGTKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGGITVKKTNQALIIGIYDEPLTPGQCNMIVERLGDYLIEQGL
【０１８８】
配列番号28: Pru du 4.0101 (アーモンド (バラ目))
>sp|Q8GSL5|PROF_PRUDU プロフィリン OS=プラヌス  ダルシス PE=1 SV=1
MSWQQYVDDHLMCDIDGNRLTAAAILGQDGSVWSQSATFPAFKPEEIAAILKDFDQPGTLAPTGLFLGGTKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGGITVKKTNQALIIGIYDEPLTPGQCNMIVERLGDYLIEQGL
配列番号29: Pru p 4.0101 (モモ, (バラ目))
>tr|Q8GT40|Q8GT40_PRUPE プロフィリン OS=プラヌス  ペルシカ PE=2 SV=1
MSWQAYVDDHLMCDIDGNRLTAAAILGQDGSVWSQSATFPAFKPEEIAAILKDFDQPGTLAPTGLFLGGTKYMVIQGEAGAVIRGKKGSGGITVKKTNQALIIGIYDEPLTPGQCNMIVERLGDYLIEQGL 
配列番号30: Pyr c 4.0101 (西洋ナシ (バラ目))
>sp|Q9XF38|PROF_PYRCO プロフィリン OS=ピルス  コミュニス PE=1 SV=1
MSWQAYVDDHLMCDIDGHHLTAAAILGHDGSVWAQSSTFPKFKPEEITAIMKDFDEPGSLAPTGLHLGGTKYMVIQGEGGAVIRGKKGSGGVTVKKTSQALVFGIYEEPLTPGQCNMIVERLGDYLIDQGL
【０１８９】
配列番号31: Par j 3.0101)
>sp|Q9XG85|PROF1_PARJU プロフィリン-1 OS=パリエタリア  ジュダイカ GN=PRO1 PE=1 SV=1
MSWQAYVDDHLMCDVGDGNTPASAAIIGHDGSVWAQSANFPQLKPEEVTGIMNDFNEAGFLAPTGLFLGGTKYMVIQGESGAVIRGKKGSGGATLKKTGQAIVIGIYDEPMTPGQCNLVVERLGDYLLEQGL
配列番号32: Pho d 2.0101 (ナツメヤシ (ヤシ目))
>tr|Q8L5D8|Q8L5D8_PHODC プロフィリン OS=フォエニクス  ダクチリフェラ GN=pro PE=2 SV=1
MSWQAYVDEHLMCEIDGHHLTAAAILGHDGSVWAQSSSFPQFKSEEITNIMNDFNEPGSLAPTGLYLGSTKYMVIQGEPGAVIRGKKGSGGVTVKKTNQALIFGIYEEPMTPGQCNMVVERLGDYLIEQGM
配列番号33: Che a 2.0101 (ナデシコ目)
>sp|Q84V37|PROF_CHEAL プロフィリン OS=ケノポディウム  アルバム PE=1 SV=1
MSWQTYVDDHLMCDIEGNHLSSAAILGHDGTVWAQSPSFPQLKPEEVSAIMKDFNEPGSLAPTGLHLGGTKYMVIQGEPGDVIRGKKGPGGVTIKKTNQALIIGIYGEPMTPGQCNMVVERIGDYLVEQGM
【０１９０】
配列番号34: Sal k 4.0101 (ナデシコ目) 
>tr|C6JWH0|C6JWH0_SALKA プロフィリン (フラグメント) OS=サルソラ  カリ PE=2 SV=1
MSWQTYVDDHLMCEIEGTNNHLTAAAILGVDGSVWAQSANFPQFKPDEISAVVKEFDEAGTLAPTGLHLGGTKYMVIQGEAGQVIRGKKGPGGICVKKTGQALIFGIYDEPVTPGQCNMIVERLGDYLVEQGM
配列番号35: Ama r 2.0101 (アオゲイトウ (ナデシコ目))
>tr|C3W2Q7|C3W2Q7_AMARE プロフィリン (フラグメント) OS=アマランタス  レトロフレキサス PE=2 SV=1
MSWQAYVDDHLMCEIEGTTNHLTGAAILGLDGSVWAQSADFPQFKPDEIAAIVEDFDEPGTLAPTGLHLGGTKYMVIQGEPGAVIRGKKGAGGICVKKTGQALVMGIYDEPVTPGQCNMIVERLGDYLIEQGY
配列番号36: Dau c 4.0101 (ニンジン (セリ目)
>sp|Q8SAE6|PROF_DAUCA プロフィリン OS=ダウクス  カロタ PE=1 SV=1
MSWQTYVDDHLMCEVDGNPGQQLSAAAIIGHDGSVWAQSSTFPKFKPEEITGIMKNFDEPGHLAPTGLYLGGTKYMVIQGEPIAVIRGKKGSGGVTIKKTGQALVFGVYDEPVTPGQCNLIVERLGDYLIEQGL
【０１９１】
配列番号37: Api g 4.0101 (セロリ(セリ目))
>sp|Q9XF37|PROF_APIGR プロフィリン OS=アピウム  グラヴェオレンス PE=1 SV=1
MSWQAYVDDHLMCEVEGNPGQTLTAAAIIGHDGSVWAQSSTFPQIKPEEIAGIMKDFDEPGHLAPTGLYLGGAKYMVIQGEPNAVIRGKKGSGGVTIKKTGQALVFGVYDEPVTPGQCNVIVERLGDYLIDQGL
配列番号38: Cuc m 2.0101 (マスクメロン、ウリ目
>sp|Q5FX67|PROF_CUCME プロフィリン OS=ククミス  メロ PE=1 SV=1
MSWQVYVDEHLMCEIEGNHLTSAAIIGQDGSVWAQSQNFPQLKPEEVAGIVGDFADPGTLAPTGLYIGGTKYMVIQGEPGAVIRGKKGPGGATVKKTGMALVIGIYDEPMTPGQCNMIVERLGDYLIDQGL
配列番号39: Cap a 2.0101 (トウガラシ, ナス目)
>sp|Q93YI9|PROF_CAPAN プロフィリン OS=カプシカム  アヌウム PE=1 SV=1
MSWQTYVDDHLMCEIEGNRLTSAAIIGQDGSVWAQSATFPQFKPEEITAIMNDFAEPGTLAPTGLYLGGTKYMVIQGEAGAVIRGKKGPGGITVKKTNQALIIGIYDEPMTPGQCNMIVERLGDYLIEQSL
【０１９２】
配列番号40: Ana c 1.0101 (パイナップル, イネ目)
>sp|Q94JN2|PROF_ANACO プロフィリン OS=アナナス  コモサス PE=1 SV=1
MSWQAYVDDHLMCEIDGQHLSSAAILGHDSTVWAQSPNFPQFKPEEISAILNDFENPGSLAPTGLYLGGTKYMVIQGEPGVVIRGKKGTGGITVKKTNLALIIGVYDEPMTPGQCNMVVERLGDYLLEQGF
配列番号41: Cro s 2. (クサスギカズラ目))
>sp|Q5EF31|PROF_CROSA プロフィリン OS=クロクス  サティバス PE=1 SV=1
MSWQTYVDEHLMCDMDGHVLTSAAILGHDGSVWAQSAGFPELKPAEITAILNDFNEPGSLAPTGMYINGAKYMVIQGEPGVVIRGKKGSGGVTIKKSNMALIFGLYDEPMTPGQCNLVVERLGDYLIEQGY
配列番号42: Mus a 1.0101 (バナナ (ショウガ目))
>sp|Q94JN3|PROF_MUSAC プロフィリン OS=ムサ  アクミナタ PE=1 SV=1
MSWQAYVDDHLLCDIDGQCLTAAAIVGHDGSVWAQSDAFPQCKPEEIAAIMKDFDEPGSLAPTGLYLGGTKYMVIQGEPGAVIRGKKGSGGVTIKKTNLALIIGIYNEPMTPGQCNMVVERLGDYLFDQGF
【０１９３】
配列番号43: 組換え(配列番号1の71〜127位)
YMVIQGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQALVVGIYDEPMTPGQCNMVVERLGDYLV
配列番号44: 組換え(置換C13S及びC115Sを有する配列番号1)
MSWQTYVDEHLMSEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEITGIMKDFDEPGHLAPTGMFVAGAKYMVIQGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQALVVGIYDEPMTPGQSNMVVERLGDYLVEQGM
配列番号45: 組換え(置換C13A及びC115Aの配列番号1)
MSWQTYVDEHLMAEIEGHHLASAAILGHDGTVWAQSADFPQFKPEEITGIMKDFDEPGHLAPTGMFVAGAKYMVIQGEPGAVIRGKKGAGGITIKKTGQALVVGIYDEPMTPGQANMVVERLGDYLVEQGM
【０１９４】
配列番号46: 配列番号44を産生するためのヌクレオチド配列
> V1rPhl p 12_ALK_IP1002
atgagctggcaaacgtatgtcgatgaacacctgatgagcgaaattgaaggtcaccacctggcgtcggcggctattctgggtcacgatggcaccgtttgggcacagagcgctgattttccgcaattcaaaccggaagaaattaccggcatcatgaaggattttgacgaaccgggtcatctggcaccgacgggcatgttcgtcgcaggtgccaaatatatggtgattcagggtgaaccgggtgcagtcatccgtggcaaaaagggtgccggcggtattaccatcaaaaagacgggccaagccctggtggttggtatttacgacgaaccgatgacgccgggtcaaagcaacatggtggtggaacgtctgggcgactatctggtggaacagggtatgTAG
配列番号47: 配列番号45を産生するためのヌクレオチド配列
> V2rPhl p 12_ALK_IP1003
AtgtcctggcaaacgtatgtcgatgaacacctgatggcggaaattgaaggtcaccacctggcgtcggcagcgattctgggtcacgatggcaccgtttgggcacagagcgctgattttccgcaattcaaaccggaagaaattaccggcatcatgaaggattttgacgaaccgggtcatctggcaccgacgggcatgttcgtcgcaggtgccaaatatatggtgattcagggtgaaccgggtgcagtcatccgtggcaaaaagggtgccggcggtattaccatcaaaaagacgggccaagccctggtggttggtatttacgacgaaccgatgacgccgggtcaagcaaacatggtggtggaacgtctgggtgattatctggtggaacagggtatgTAG
【０１９５】
参考文献のリスト
Amnuaycheewa P and Gonzalez de Mejia E. Purification, characterisation, and quantification of the soy allergen profilin (Gly m 3) in soy products, Food Chemistry 119, 1671-1680, 2010.
Dahlmann-Hoglund et al. Bystander suppression of the immune response to human serum albumin in rats, Immunology 86, 128-133, 1995.
Fechheimer M and Zigmond S. H., Focusing on Unpolymerized Actin, The Journal of Cell Biology, Volume 123, No 1, 1-5, 1993
Lockey R and Ledford D. Allergens and Allergen Immunotherapy 4th Ed, 2008, Ed by R Lockey and D Ledford, Informa healthcare). 
Lu J and Pollard T, Profilin Binding to Poly-L-prolin and Actin Monomers along with Ability to Catalyze actin Nucleotide Exchange Is Required for Viability of Fission Yeast,  Molecular Biology of the Cell, Vol. 12, 1161-1175, 2001.
Martinez A et al, The Allegenic relevance of Profilin (Ole e 2) from Olea Europea pollen, Allergy, 57, suppl. 71, 17-23, 2002.
Miller et al. Antigen-driven Bystander Suppression after Oral Administration of Allegens, J. Exp. Med. 174, 791-798, 1991.
Millington et al. Induction of Bystander Suppression by Feeding Antigen Occurs despite Normal Clonal Expansion of the Bystander T Cell Population. Immunology, 173: 6059-6064, 2004.
Oliveira CR et al. Bystander effect in synergi to anergy in oral tolerance of Blomia Tropcalis/Ovalbumin Murine Co-Immunization model. J Clin Immunol, 25, 153-161, 2005.
Santos A and Van Ree R, Profilins: Mimickers of Allergy or Relevant Allergens?, Int Arch Allergy Immunol, 155, 191？204, 2011.
Thorn et al, Crystal structure of a major allergen from plants, Structure, vol 5, no 1, 1997.
Vidali L, H. E. Perez, V. V. Lopez, R. Noguez, F. Zamudio and F. Sanchez, Purification, Characterization, and cDNA Cloning of Profilin from Phaseolus vulgaris, Plant Physiology, vol. 108, no. 1, 115-123, 1995.
【実施例】
【０１９６】
実施例1 (図1及び2)、2 (図3, 4及び5)、4 (図8及び9)、8 (図25及び26)、10 (図29及び30)及び11 (図31)は、未感作マウスを用いる予防治療モデルにおけるバイスタンダー抑制の研究に言及する。簡潔には、当該ポリペプチドに対する寛容が誘導されるように、一定期間(典型的には２週間)本発明のポリペプチドを毎日舌下投与することによりマウスを治療する。その後、腹腔内投与によりマウスを抗原に感作させ、超過敏性免疫応答を誘導し、場合によっては鼻内投与により感作抗原でマウスをチャレンジし、呼吸器におけるアレルギー炎症を誘導する。最後に、マウスを犠牲にし、分析のために血液、気管支肺胞洗浄(BAL)液及び脾臓を回収する。次いで、寛容誘導性抗原及び感作抗原の両方に曝露されたマウスのBAL液中の好酸球の割合と、感作抗原だけに曝露されたマウスの好酸球の割合とを比較することにより、バイスタンダー抑制を測定する。択一的に、又は、追加的に、脾臓及び/又は頸部リンパ節細胞を単離し、培養し、感作アレルゲンで刺激する。細胞増殖又はサイトカイン産生量(IL-5, IL-13)を測定し、寛容誘導性抗原及び感作抗原の両方に曝露されたマウスから採取した試料中の細胞増殖又はサイトカイン産生量と、感作抗原だけに曝露されたマウスの試料中の細胞増殖又はサイトカイン産生量とを比較することによりバイスタンダー抑制を測定する。
【０１９７】
実施例3 (図6及び7)及び9 (図27及び28)は、感作マウスを用いる治療モデルにおけるバイスタンダー抑制の研究に言及する。簡潔には、実験の構成が感作アレルゲンの腹腔内投与により初めにマウスを感作させ、その後寛容誘導性抗原(SLIT用ポリペプチド)を用いてマウスを治療する点で予防モデルとはわずかに異なる。その後の全ての工程は予防モデルと類似である。
【０１９８】
以下に、マウスのバイスタンダー抑制に関するデータに言及する実施例の概略を示す。(P)は予防モデルを指し、(T)は治療モデルを指す。
【表９】
2015514126.tif 000043
【０１９９】
実施例1
Phl p 12で処置したナイーブマウスにおけるOVA抗原によって引き起こされる超過敏性免疫応答(喘息)のバイスタンダー抑制
方法: Phl p 12は、PLPアガロースを用いてフレウム  プラテンスの花粉の水性抽出物から単離したか、又は配列番号1のアミノ酸配列に基づいて組換えにより製造した。
動物: 6〜10週齢の雌性BALB/cJマウスを社内で育成し、フレウム  プラテンス (Phl p)に対するウサギ抗血清と交差反応する成分を含まない規定食で維持した。各実験群は動物7〜8体とした。
動物実験: 舌下免疫療法(SLIT)により50又は200μgのPhl p 12を用いて2週間、週に５日ナイーブマウスを処置し(処置段階)、水酸化アルミニウムに吸着させた10μg OVA及び10μg Phl p 12の混合物又は10μg OVA単独のいずれかを２週間毎に腹腔内注入した(マウスを感作させるための曝露段階)。その後、50μgのOVAを用いて４日間マウスの鼻内をチャレンジした(超過敏性免疫応答、例えば喘息の誘導)。最後のチャレンジの１日後マウスを犠牲にし、分析のために血液、気管支肺胞洗浄(BAL)液及び脾臓を回収した。
【０２００】
BAL液の差分計数: BAL液を遠心分離し、上清を除去した。ペレットをPBS中に再懸濁し、自動細胞計数機(Sysmex)によって好酸球の割合を測定した。
T細胞増殖アッセイ: 脾臓を単一細胞懸濁液となるように破砕し、培地中で３回洗浄した。細胞を計数し、96ウェル平底培養プレートの各ウェルに3 x 105細胞を添加し、0, 5, 25及び125μg/mLのOVAにより刺激した。37℃及び5% CO2で6日間細胞を培養した。0.5μCiの3H-チミジンを各ウェルに添加することにより、培養時間の最後の18時間増殖を測定し、細胞を回収し、取り込まれた放射能標識を計数した。
【０２０１】
結果:
この実験では、本発明のポリペプチド(例えばプロフィリンPhl p 12)で処置した未感作マウスが非プロフィリンアレルゲン(OVA)により誘導される超過敏性免疫応答の発生を妨害することができるか否か、又は少なくとも非プロフィリンアレルゲン(OVA)により誘導される超過敏性免疫応答(例えば喘息)を抑制することができるか否か、例えば非関連抗原(プロフィリンPhl p 12)を投与することによって得られるバイスタンダー抑制によってOVAにより誘導される超過敏性免疫応答を抑制/妨害することができるか否かを検証した。図1は、Phl p 12で処置したマウスは、バッファー処置マウスと比較してBAL液中の好酸球の割合の低減を示したが、これはマウスがOVA及びPhl p 12の両方に曝露/感作されたときのみであり、OVAだけではみられないことを示す。図2は、脾臓細胞のインビトロ増殖に関して図1と同じ発見を示す；脾臓細胞のOVA特異的インビトロ増殖は、Phl p 12で処置したマウスにおいて下方制御されるが、これはPhl p 12及びOVAの両方に共曝露/共感作されたマウスにおいてのみであり、OVAだけではみられない。
【０２０２】
実施例2
Phl p 12を用いるナイーブマウスの処置によるフレウム  プラテンスの花粉の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答(喘息)のバイスタンダー抑制
動物実験: 実施例1と同様にしてPhl p 12を得、類似の動物を用いた。舌下免疫療法(SLIT)により50又は100μgのPhl p 12を用いて２週間ナイーブマウスを処置し(処置段階)、いずれも水酸化アルミニウムに吸着された8μgのPhl p 抽出物又は8μgのPhl p 12欠失Phl p抽出物のいずれかを３週間毎に腹腔内注入した(マウスに感作させるための曝露段階)。その後、80μgのPhl p抽出物又は同じ量のPhl p 12欠失抽出物のいずれかを用いてマウスの鼻内をチャレンジした(超過敏性免疫応答、例えば喘息の誘導)。最後のチャレンジの１日後マウスを犠牲にし、分析のために血液、気管支肺胞洗浄(BAL)液及び頸部リンパ節を回収した。
【０２０３】
BAL液の差分計数: 実施例1に示したものと同一の手順である。
T細胞増殖アッセイ: 細胞を計数し、1.67 x 106細胞/mLに調整し、96ウェル平底培養プレートの各ウェルに3 x 105細胞を添加し、0, 5及び40μg/mLのPhl p 抽出物により細胞を刺激したこと以外は実施例1に示したものと同一の手順である。サイトカイン分析用の細胞培養上清を5日目に回収した。
【０２０４】
結果:
この実験では、本発明のポリペプチド(例えばプロフィリンPhl p 12)で処置した未感作マウスがフレウム  プラテンス(例えばアレルゲンPhl p 1, Phl p 5, Phl p 6)の花粉の非プロフィリンアレルゲンによって誘導される超過敏性免疫応答の発生を妨害することができるか否か、又は少なくともこれらの非プロフィリンアレルゲンによって誘導される超過敏性免疫応答(例えば喘息)を抑制することができるか否か、例えば非関連抗原(プロフィリンPhl p 12)を投与することにより得られるバイスタンダー免疫寛容によってフレウム  プラテンスの花粉の非プロフィリンアレルゲンによって誘導される超過敏性免疫応答を抑制/妨害することができるか否かを検証した。これは、Phl p 12又はバッファーを用いるナイーブマウスのSLIT処置により行った。SLIT処置後、(Phl p 12を含むか又は含まないPhl p 抽出物)IP感作によりアレルギー性喘息を誘導し、フレウム  プラテンスの草花粉抽出物(少なくともアレルゲンPhl p 1, 5及び6及びプロフィリンPhl p 12を含むPhl p 抽出物)又はプロフィリンを欠失している草花粉抽出物(Phl p 12欠失Phl p 抽出物)を用いて鼻内をチャレンジした。図3にみられるように、Phl p 12で処置したマウスは、バッファー処置マウスと比較してBAL液中の好酸球数が低減されており、この効果はマウスが非プロフィリンアレルゲン及びPhl p 12 (Phl p 12含有Phl p 抽出物)の両方に曝露されるときに得られるのみであり、マウスがPhl p 12欠失Phl p 抽出物に曝露されたときにはみられない。これらの結果は、頸部リンパ節細胞のインビトロ刺激によって確認された。違いは顕著ではないが、図4及び5は、Th2関連サイトカインであるIL-5の増殖及び産生が、それぞれ、上記と同様にしてPhl p 12で処置したマウスにおいて下方制御されることを示す。
【０２０５】
実施例3
Phl p 12で治療したOVA感作マウスにおける超過敏性免疫応答(喘息)のバイスタンダー抑制
動物実験: 実施例1と同様にしてPhl p 12を得、類似の動物を用いた。水酸化アルミニウムに吸着された10μgのOVAを２週間毎に腹腔内注入することによりマウスを感作させた(感作段階)。この後、0, 50又は150μgのPhl p 12を用いて6週間マウスをSLIT治療し(治療段階)、その後40μg OVA及び40μg Phl pを用いて、又はOVA単独を用いて、4日間マウスの鼻内をチャレンジした(曝露段階)。最後のチャレンジの１日後マウスを犠牲にし、分析のために血液、気管支肺胞洗浄(BAL)液、脾臓及び頸部リンパ節を回収した。
BAL液の差分計数: 実施例1に示したものと同一の手順である。
T細胞増殖アッセイ: 実施例1に示したものと同一の手順である。
【０２０６】
結果:
この一連の実験では、Phl p 12で治療したOVA感作マウスが「惹起性」アレルゲンOVAに対する曝露時にアレルギー性喘息の臨床的及び免疫的兆候の発生又は抑制を妨害することができるか否かを検証した。図6に示されるように、Phl p 12で治療したOVA感作マウスにおけるBAL液中の好酸球の割合は、非プロフィリンアレルゲン(OVA)に対する鼻内曝露(気道の曝露)時に、バッファー処置OVA感作マウスと比較して著しく低減された。とりわけ、この好酸球の下方制御は、マウスがOVAだけに曝露された場合、すなわちPhl p 12の共曝露が行われない場合には観察することができなかった。さらに、図7にみられるように、脾臓細胞のOVA特異的インビトロ増殖は、Phl p 12で治療したマウスにおいて下方制御されるが、これはマウスがPhl p 12及びOVAの両方に共曝露/共感作されたときのみであり、OVAだけではみられない。
【０２０７】
実施例4
Phl p 12を用いてナイーブマウスを処置し、OVA及び異なるプロフィリンBet v 2にマウスを曝露することによって非プロフィリンアレルゲン(OVA) によって引き起こされる超過敏性免疫応答(喘息)のバイスタンダー抑制
方法: Phl p 12は上記のとおりにして得、Bet v 2はベトゥラ  ベルコサの花粉抽出物から単離した。
動物実験: 75μgのPhl p 12を用いて2週間、舌下免疫療法(SLIT)により週に５日ナイーブマウス(実施例1と同じタイプ)を処置し(処置段階)、水酸化アルミニウムに吸着された10μg OVA及び10μg Bet v 2の混合物又は10μg OVA単独のいずれかを２週間毎に腹腔内注入した(マウスに感作させるための曝露段階)。その後、40μgのOVAを用いて4日間マウスの鼻内をチャレンジした(超過敏性免疫応答、例えば喘息の誘導)。最後のチャレンジの１日後マウスを犠牲にし、分析のために血液、気管支肺胞洗浄(BAL)液及び脾臓を回収した。
T細胞活性化アッセイ: 脾臓を単一細胞懸濁液となるように破砕し、培地中で３回洗浄した。細胞を計数し、96ウェル平底培養プレートの各ウェルに3 x 105細胞を添加し、0, 5, 25及び125μg/mL OVAにより刺激した。37℃及び5% CO2で5日間細胞を培養した。サイトカイン分析用の細胞培養上清を5日目に回収した。
【０２０８】
結果:
この実験では、本発明のポリペプチド(例えばプロフィリンPhl p 12)によって処置した未感作マウスにおいて非プロフィリンアレルゲン(OVA)により誘導される超過敏性免疫応答の発生を妨害することができるか否か、又は少なくとも非プロフィリンアレルゲン(OVA)により誘導される超過敏性免疫応答(例えば喘息)を抑制することができるか否かを検証した。さらに、実施例1に加えて、OVA及びPhl p 12に対する共曝露に代えてOVA及びBet v 2 (Phl p 12と約78%のアミノ酸配列同一性を有するプロフィリン)に対する共曝露が行われる場合に、別のプロフィリン含有植物性物質のプロフィリンがPhl p 12に特異的なTreg細胞を再活性化して非特異的制御性サイトカインを産生し、OVAによって引き起こされるアレルギー応答を抑制することができるか否かを検証するための試験を行った。
【０２０９】
図8及び9に示されるように、Phl p 12を用いる処置は、バッファー処置マウスと比較して、Th2関連サイトカインであるIL-5及びIL-13の産生をそれぞれ下方制御することができる。しかしながら、この下方制御は、マウスが感作及び鼻内チャレンジ時にBet v 2及びOVAに共曝露されるときにのみ観察された。よって、データは、Phl p 12で処置したマウスにおいて、惹起性アレルゲン(OVA)及びBet v 2の両方に対する当該マウスの曝露時に、(Phl p 12含有Phl p)以外の別のプロフィリン含有植物性物質のアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答を妨害することができたことを示す。
【０２１０】
実施例5 
プロフィリン含有植物性物質において共抽出されたポリペプチド及び非プロフィリンアレルゲンのスクリーニング
抽出のための材料:
・  (収穫直後に凍結された)フレウム  プラテンス種の生の草花粉、フレウム  プラテンス種, ベトゥラ  ベルコサ種, アンブロシア  アルテミシイフォリア種, コリラス  アヴェラナ種, アルテミシア  ヴルガリス種, クリプトメリア  ジャポニカ種, フムラス  ジャポニカ種の脱脂花粉, ネコの鱗屑, ダーマトファゴイデス  プテロニシヌス(Dermatophagoides pteronyssinus)のダニの体及び糞並びにリンゴ
・  抽出用のガラス瓶(100 ml)
・  シリコンチューブを有する10 mlのシリンジと組み合わせたPEベッド支持体を有するPD-10カラム
・  フィルターユニット(Millex 5μm + Millex 0.8μm)
・  テストチューブ
・  氷浴、ピペット、試料回転機、測定用シリンダ、ストップウォッチ
・  以下の塩を含むpH 7.2のPBSバッファー:
【０２１１】
【表１０】
2015514126.tif 000044
【０２１２】
(室温、21〜24℃での)抽出手順:
5.0 gの花粉/ダニの体/ダニの糞/ネコの鱗屑をガラス瓶に秤量し、50 mlのPBSを添加し、最初の5分間手で瓶を速やかに回転させ、その後全抽出中試料回転機中で回転させた。
20秒後に5 mlのスラリーを取り、ベッドフィルターを有するカラムに移し、シリンジでフィルターを通して引き取った。シリンジを速やかにフィルターユニットに移し、複合フィルターを通して標識したテストチューブに抽出物を押し出した。試料は、更なる分析のためのアリコートにピペッティングし凍結させるまでチューブを氷浴中で保存した。40秒、60秒、2分、5分、10分及び20分の時点で5.2 mlの懸濁液を採取する。リンゴを搾り、得られた液体をCIE/RIEにより速やかに分析した。
【０２１３】
共溶出/共抽出した非プロフィリンアレルゲン及びプロフィリンの測定
CIE (交差免疫電気泳動), RIE (ロケット免疫電気泳動), SDS Page (ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動), ELISA (酵素結合免疫吸着測定法)及び/又はMS (質量分析)の１又はそれより多い方法を用いて非プロフィリンアレルゲン及びプロフィリンの含有について試料を分析する。
【０２１４】
CIE (交差免疫電気泳動)
CIE/RIE用の材料
・  電気泳動装置(2つのバッファー容器, 2つの電極, 冷却された表面, チャンバ)
・  ガラス製プレート(標準サイズ、例えば5x5, 5x7, 10x7 cm)
・  電極容器及びアガロースゲル用バッファー(イオン強度0.02, pH 8.6) 5.5-ジエチルバルビツール酸(Veronal) 112.1 g; Tris (Sigma 7-9) 221.5 g; カルシウムラクテート(purum) 2.7 g; 5 Lになるまで精製水。使用前に1+4希釈。
・  アガロースプレート:「アガロースゲル用バッファー」を用いて1% (w/v) LitexアガロースタイプHSA (Mr = -0.13)を作製し、撹拌下にアガロースを熱し、2分間煮沸し、56℃の水浴中で液体を保持する。次いで、ゲルをプレートに置く(約5 ml)。
・  染色液: クマシーブリリアントブルーR-250 5 g, エタノール96% 450 ml, 精製水500 ml, 氷酢酸50 ml。一晩の撹拌により溶解させ、濾液を得る。
・  脱色液: エタノール96% 450 ml, 精製水500 ml, 氷酢酸50 ml。
・  ポリクローナルウサギ抗体; 0, 2, 4, 6, 10, 14及び18日目にポリペプチド、例えばプロフィリン含有植物性物質のプロフィリン、例えば天然Phl p 12を含む水性抽出物を用いてウサギを繰り返し免疫し、8, 12, 16, 20及び24日目に血液を回収する。硫酸アンモニウム(約1.75 M (NH4)2SO4)を用いる沈殿後にIgGフラクションを得、1.75Mの(NH4)2SO4を用いて洗浄する。精製水及び酢酸バッファーpH 5.0に透析することにより更に精製する。0.09% NaN3及び保存用のプロテアーゼインヒビター(トラシロール(登録商標))を含む0.9% NaCl中で+5℃で保存する。
【０２１５】
手順: アガロースゲルプレートにウェルを作製し、抽出試料を添加する。15℃及び10 V/cmで作動させた装置中で25〜30分間電気泳動を行う。ゲルを取り出し、ポリクローナル抗体と十分に混合されたアガロースゲルをカソード側及びアノード側に注ぐ。電圧2 V/cmで一晩電気泳動を行う。次いで、蒸留水及び0.1 M NaClで15〜30分間ウェルを洗浄し、次いでプレートを熱気流中で乾燥させる。クマシーブリリアントブルー染色液中でおよそ5分間プレートを染色し、次いで数秒間蒸留水中で洗浄し、脱色し、最後に熱気中で乾燥させる。
抗体によって認識されるポリペプチドは、CIEプレート上の青色のシャープなバンドとして見られる。ポリペプチドを更に同定するために、CIEプレートからバンドを切り出し、質量分析及び/又はその他の免疫化学的方法及び/又はアミノ酸分析によって分析することができる。
【０２１６】
RIE
関連あるポリクローナル抗体を含むアガロースゲルプレートは、ガラス製プレート上で作製する。プレートの下端から約1.5 cmにウェルを作製し、プレートを電気泳動装置中に置き、抽出試料を添加し、電圧2 V/cmで一晩電気泳動を継続する。プレートを洗浄/加圧し、CIEについて上記したようにしてクマシーブリリアントブルー染色液で染色する。
【０２１７】
SDS PAGE
材料: 試料バッファー(4X) NuPage(登録商標); invitrogen NP0007, NuPAGE(登録商標) 10% Bis-Tris SDS-PAGE; invitrogen NP0302, NuPAGE(登録商標) MES SDSランニングバッファー(20X); invitrogen NP0002-02, マーカー: SeeBlue(登録商標) Plus2Prestained Standard; invitrogen LC5925
SDS PAGE (還元又は非還元条件)は、NuPAGE(登録商標)電気泳動システム(改定日: 2010年10月29日 マニュアルパート番号IM-1001)を用いて、NuPAGE(登録商標)のテクニカルガイドの一般情報及びプロトコルに従って行った。
あるいは、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動は、当該技術において公知の方法に従って用いてもよい。
【０２１８】
電気泳動後、ゲルを染色し(最も一般的にはクマシーブリリアントブルーR-250又は銀染色を用いる)、分離したタンパク質を可視化するか又は更に処理(例えばウェスタンブロット)してもよい。染色後、異なるタンパク質は、ゲル中に区別可能なバンドとして表れる。ゲルをカリブレートし、マーカーが移動した距離を比較して未知のタンパク質のおよその分子量を測定するために、既知の分子量の分子量サイズマーカーをゲル中の別のレーンに添加してもよい。
【０２１９】
ELISA
材料: モノクローナル抗体(mAb)は、0, 2, 4, 6, 10, 14及び18日目に異性体を含まない単一のポリペプチドを用いてウサギを繰り返し免疫することによって得、血液は8, 12, 16, 20及び24日目に採取する。IgGフラクションは、硫酸アンモニウム(( 1.75 M (NH4)2SO4)を用いて沈殿し、1.75M (NH4)2SO4中で洗浄して得る。精製水及び酢酸バッファーpH 5.0に透析することによって更に精製する。0.09% NaN3及び保存用のプロテアーゼインヒビター(トラシロール(登録商標))を含む0.9% NaCl中に+5℃で保存する。
【０２２０】
Phl p 12単一抗原の測定: Pho d 2 (ナツメヤシのプロフィリン)のモノクローナル抗体(mAb) 2.5μg/mlを用いて一晩4℃でプレートをコーティングした。室温で30分間飽和後、nPhl p 12 (参照標準)を精製し、完全なシグモイド曲線を得るために抽出試料を希釈し(段階希釈1/3, 8点)、1時間室温でインキュベートした。洗浄後、1/4,000の希釈率でウサギポリクローナル抗-Pho d 2と共に1時間室温でインキュベートすることによって結合したPhl p 12を検出した。 洗浄後、ペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギポリクローナル抗ウサギIgG抗体を1時間RTで添加し、次いでH2O2と共にOPDを添加することによってシグナルを顕示した。30分後、2N HClで反応を停止し、490 nmでプレートを読み取った。
【０２２１】
Phl p 5単一抗原の測定: Phl p 5を指向するmAb及びLol p 5を指向するmAbでプレートを4℃で一晩コーティングし、飽和させ、乾燥させた。定量の日に、プレートを再水和し、完全なシグモイド曲線を得るために抽出試料を適宜希釈し(段階希釈1/3)、プレート中でRTで1hインキュベートした。洗浄後、草花粉の混合物を指向するウサギポリクローナル(混合物に対して1/10,000)と共に1時間RTでインキュベーション後に、結合したPhl p 5を測定した。洗浄後、ペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギポリクローナル抗ウサギIgG抗体を1時間RTで添加し、その後H2O2と共にOPDを添加することによってシグナルを顕示した。30分後、2N HClで反応を停止し、490 nmでプレートを読み取った。
【０２２２】
Phl p 1単一抗原の測定: 2.5μg/ml mAb Phl p 1, 5μg/ml mAb Phl p 1及び5μg/ml mAb Phl p 1を用いて一晩4℃でプレートをコーティングした。RTで30分間飽和後、完全なシグモイド曲線を得るために抽出試料を適宜希釈し(段階希釈1/3)、プレート中で1時間RTでインキュベートした。洗浄後、1/10,000のウサギポリクローナル抗-P.プラテンス抗体と共に、1時間RTでのインキュベーションによって、結合したPhl p 1を検出した。洗浄後、ペルオキシダーゼ-コンジュゲートヤギポリクローナル抗ウサギIg抗体を1時間RTで添加し、次いでH2O2と共にOPDを添加することによってシグナルを顕示した。30分後、2N HClで反応を停止し、490 nmでプレートを読み取った。
【０２２３】
質量分析
試料の還元、アルキル化及び消化用バッファー/溶液:
試料バッファー:     0.4 M NH4HCO3中8 Mの尿素
DTT (45 mM):        1.0 Mの凍結ストックから新たに作製する: 45μlの1 M DTT + 
955μlの水
ヨードアセトアミド(IAA): 溶液を新たに作製する、ヨードアセトアミド100 mM,       
トリプシン:         Sigma T6567, 20μlの1 mM HCl中に１バイアルを溶解する。
これは1μg/μlのトリプシンを含む溶液をもたらす。1 mM
HCl中で再構成後、凍結アリコートは最大4週間保存すること
ができる。
【０２２４】
質量分析用溶液中におけるトリプシンを用いる酵素的消化: 5μlの水に乾燥サンプルを希釈し、15μlの試料バッファー(0.4 M NH4HCO3中8 Mの尿素)を添加し、5 μlの45 mM DTTを添加し、56℃で15分間インキュベートし、室温に冷却し、5μlの100 mMヨードアセトアミドを添加し、室温で15分間暗中でインキュベートし、90μlの水を添加して尿素濃度を<1〜2 Mに低減し、1μgのトリプシンを添加し、37℃で一晩インキュベートする。
【０２２５】
クロマトグラフィ: 分取用及び分析用C18カラムを用いて逆相クロマトグラフィ(Ultimate 3000 HPLC, Dionex)を行った。溶出したペプチドをESI-QTOF質量分析器(MaXis, Bruker)に直接噴霧した。30μl/分の流速で5分間0.05% v/vのギ酸を用いてトラップカラムを洗浄後、溶媒A: 0.05% v/vのギ酸及び溶媒B: 80% v/vのアセトニトリル/0.04% v/vのギ酸及び勾配: 4〜50% B、200分; 50〜80% B、10分; 100% B、10分；4% B、5分を用いる流速2μl/分のアセトニトリル勾配でペプチドを溶出した。
【０２２６】
マスレンジ50-2599 m/z及びスペクトルレート(spectra rate) 1.5 Hzでスペクトルを得た。Agilent TechnologyからのESI-L低濃度チューニングミックスを用いて装置をチューニングし、カリブレートした。
データ取得及び装置制御は、Bruker Compass HyStar 3.2を用いて行った。データ処理はDataAnalysis 4.0 (Bruker)を用いて行った。タンパク質の同定は、プログラムBiotools3.2 (Bruker)及び２つの異なるデータベース、すなわちSwiss prot及びNCBInrを用いて行った。トリプシン消化についてのMS/MSデータセットは、以下のパラメータ; ペプチド寛容 10 ppm及びフラグメント寛容 0.05 Daを用いて分析した。
手順: 抽出試料を全て(50μl)蒸発させ、5μlの水に再懸濁した。次いで、試料を還元し、アルキル化し、トリプシンで消化する。得られたペプチドを分離し、逆相クロマトグラフィ、その後のMS/MSによって同定する。
【０２２７】
結果:
フレウム  プラテンスの生花粉の抽出に関する結果を：
・  図10 (フレウム  プラテンスの花粉抽出物を指向するポリクローナル抗体を用いる20秒, 60秒及び2分抽出物のCIE)
・  図11 (フレウム  プラテンスの花粉抽出物を指向するポリクローナル抗体を用いる5分, 10分及び20分抽出物のCIE)
・  図12 (精製Phl p 12 (A), Phl p 5 (B)及びPhl p 1 (C)を指向するポリクローナル抗体を用いる20秒, 60秒, 2分, 5分, 10分及び20分抽出物のRIE)
・  図13 (20秒, 60秒, 2分, 5分, 10分及び20分の抽出時間後に遊離されたPhl p 12, Phl p 1及びPhl p 5のELISAを用いて分析された量)
に示す。
【０２２８】
全ての結果は、プロフィリンPhl p 12が、同じ時間枠内で、及び最初の10分間の抽出の間でさえ、実際にフレウム  プラテンスの主要アレルゲン(Phl p 1及びPhl p 5)と共抽出されていることを示しており、このことは、プロフィリン含有植物性物質に対する個体の曝露時に超過敏性免疫応答を引き起こす主要アレルゲンと同じ時間枠内でプロフィリンが標的臓器に提供されることを示している。また、抽出物は質量分析によっても分析され、Phl p 12が数多くのタンパク質、とりわけアレルゲンPhl p 1, 5及び6と共抽出されたことを示すことができた。
【０２２９】
フレウム  プラテンスの脱脂花粉の抽出に関する結果は：
・  図14 (フレウム  プラテンスの花粉抽出物を指向するポリクローナル抗体を用いる20秒, 60秒及び2分抽出物のCIE)
・  図15 (フレウム  プラテンスの花粉抽出物を指向するポリクローナル抗体を用いる5分, 10分及び20分抽出物のCIE)
・  図16 (精製Phl p 12 (A), Phl p 5 (B)及びPhl p 1 (C)を指向するポリクローナル抗体を用いる20秒, 60秒, 2分, 5分, 10分及び20分抽出物のRIE)
・  図17 (20 秒, 60 秒, 2 分, 5 分, 10 分及び20 分の抽出時間後に遊離されたPhl p 12, Phl p 1及びPhl p 5の、精製Phl p 12, Phl p 1及びPhl p 5に対してウサギで惹起されたモノクローナル抗体を用いるELISAによって分析された量)
・  図18 (A) 生花粉及びB) 脱脂花粉の抽出物のSDS page、20秒, 40秒, 60秒, 2分, 5分, 10分及び20分抽出によって得られた抽出物は、左から右へと順に示されている)
に示す。
【０２３０】
全ての結果は、プロフィリン含有植物性物質のプロフィリン及び非プロフィリンアレルゲンを用いる共抽出のためのスクリーニングにおいて、生花粉に代えて、脱脂花粉を用いてもよいことを示す。
【０２３１】
ベトゥラ  ベルコサの脱脂花粉の抽出に関する結果は：
・  図19 (ベトゥラ  ベルコサの花粉抽出物を指向するポリクローナル抗体を用いる20秒, 60秒及び2分抽出物のCIE);
・  図20 (ベトゥラ  ベルコサの花粉抽出物を指向するポリクローナル抗体を用いる5分, 10分及び20分抽出物のCIE)
・  図21 (精製Bet v 2 (プロフィリン) (A)及びBet v 1 (主要アレルゲン)(B)を指向するポリクローナル抗体を用いる20秒, 60秒, 2分, 5分, 10分及び20分抽出物のRIE)
に示す。
【０２３２】
結果は、抽出開始後1分と早々にカバノキ花粉からBet v 2 (プロフィリン)が主要アレルゲン(Bet v 1)と共抽出されることを示す。
【０２３３】
アンブロシア  アルテミシイフォリアの脱脂花粉の抽出に関する結果を、精製Amb a 8 (プロフィリン) (A)及びAmb a 1 (主要アレルゲン) (B)を指向するポリクローナル抗体を用いる20秒, 60秒, 2分, 5分, 10分及び20分抽出物のRIEを示す図22に示す。結果は、抽出開始後1分と早々にAmb a 8が主要アレルゲンAmb a 1と共抽出されることを示す。
【０２３４】
プロフィリンBet v 2及びPhl p 12を指向する抗体を認識する様々な植物プロフィリンの能力は、アンブロシア  アルテミシイフォリア, ベトゥラ  ベルコサ, コリラス  アヴェラナ, フレウム  プラテンス, アルテミシア  ヴルガリス, クリプトメリア  ジャポニカ, フムラス  ジャポニカの花粉抽出物, ネコの鱗屑, ダニの体及び作り立てのリンゴジュース、及び精製Phl p 12及びBet v 2をそれぞれ指向するポリクローナルウサギ抗体を用いるRIEにより研究した。
【０２３５】
結果(図23及び24)は、フレウム  プラテンス及びベトゥラ  ベルコサ以外の種の植物プロフィリンがPhl p 12及びBet v 2に特異的なIgG 抗体に結合することができることを示し、このことは、Phl p 12又はBet v 2を用いる個体の治療がPhl p 12又はBet v 1を含まないプロフィリン(少なくともアンブロシア, コリラス, クリプトメリア, フムラス及びマルス属のプロフィリン以外)含有物質の非プロフィリンアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答を抑制し得ることを示す。
【０２３６】
実施例6
本発明のポリペプチドの組換え製造
本実施例では、配列番号1と比較してC13A及びC115Aの変異を有するバリアントポリペプチドを製造した。配列番号44に全配列を示す。
【０２３７】
材料: プラスミド: p-RSETB (Invitrogenから商業的に入手可能 - Life Technologies); E.コリ株: BL21(DE3), NOVAGENから商業的に入手可能; 溶解バッファー:  10 mMリン酸緩衝液, 30 mM NaCl, 10 mM EDTA, 1 mMベンズアミジン, 10 μg/ml SBTI (ダイズトリプシンインヒビター), 3 mM PMSF (フェニルメタンスルホニルフルオライド)及び0.02 w/w %アジ化ナトリウム; LB培地: 1% トリプトン, 0.5% 酵母抽出物, 0.5% NaCl, pH 7.0; カラム平衡化バッファー: PBS pH 7.2; PLP-セファロースカラム: CNBr-活性化セファロース4B (GE-Healthcare, 参照番号17-0430-01)の製造業者の取扱説明書に従って、ポリ-L-プロリン(Sigma, 参照番号P2129)をリガンドとして用いてカラムを調製した; Superdex75カラム: GE-Healthcareからの充填済みカラム; 透析用メンブレン: 3,500 Da MWCOメンブレン。
【０２３８】
手順: 配列番号44のポリペプチドをコードする配列番号46のcDNAを合成し、E.コリ選好(E.コリに最も通例かつ豊富に存在するtRNAに対応するヌクレオチドの選択)に基づいてコドンを最適化した；NdeI/PstI-切断プラスミドp-RSETB(これはIPTG (イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド)-誘導性である)にcDNAを導入した；BL21 (DE3) E.コリ株にプラスミドを導入した；250 rpmで振盪した培養フラスコ中のアンピシリン含有LB培地1 L中で37℃で、OD600が0.6に達するまで新たに形質転換した細胞を成長させ、次いで18℃で誘導した；0.3 mMの濃度になるようにIPTGを添加することによって細胞培養物を誘導し、約16時間18℃で放置した(あるいは、誘導は、より高温で、例えば37℃で行い、3〜4時間誘導し、0.4のOD600で開始してもよい)；E.コリ培養物を氷水浴中で少なくとも5分間維持し、遠心分離(例えば4℃で20分間12,000 rpm)によって回収した；このようにしてペレット化し、誘導された細胞を50 mlの溶解バッファーに再懸濁し、次いで超音波処理によって破砕した；可溶性の細胞質性の生成物を含む可溶性フラクションを遠心分離(4℃で20分間12,000 rpm)によって回収し、上清を清澄化し、次いでPBS (pH 7.2)に透析した。
【０２３９】
組換えポリペプチドを２つのクロマトグラフィ工程(カラム平衡化バッファーを用いて平衡化されたPLP-セファロースカラムでのアフィニティクロマトグラフィ; 6Mの尿素(これは、透析用メンブレンを通してPBS (カラム平衡化バッファー)に透析することによって速やかに排除されなければならない)を用いる溶出、及びその後の約99％(乾燥物の重量/重量)のタンパク質からなる組換えポリペプチド産物の単量体を得るための、カラム平衡化バッファーを用いて平衡化されたSuperdex75カラムでのサイズ排除クロマトグラフィ)を用いて精製した。
【０２４０】
組換えポリペプチドの同一性は、SDS-PAGE (還元及び非還元；銀染色及びクマシー染色)、N-末端シークケング及びアミノ酸分析並びに(不純物を分析し、フィンガープリントによってその同一性を確認するための)MS分析によって測定した。
【０２４１】
製造された組換えポリペプチドが配列番号44のアミノ酸配列を有することを確認した。N-末端メチオニンは、製造されたポリペプチド産物の約95%において除去されているようであった。製造されたポリペプチドのわずか約5%がN-末端メチオニンをなお保有しているようであった。
【０２４２】
次いで、組換えタンパク質のフォールディングを探索するためにポリペプチドを円偏光二色性(CD)分析に供した。この方法により、タンパク質の大半が正確にフォールディングされていることを確認することができる。0.1 cm四方の光路長を有するキュベットを用いて15℃でOLIS DSM-10分光偏光計でCDスペクトル(260〜184 nm)を測定した。全てのスペクトルは10 mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.2中で得、各試料は５回スキャニングした。生データのスペクトルはバッファー吸収に関して補正されており、すべてのスペクトルをCD_シグナル_λ260 = 0に対して規格化した。以下の等式(mDeg = 32980*ΔA; Δε = ΔA/(c*l)、ここで、「c」は試料のモル濃度であり、「l」は光路長(cm)である)を用いて生データ(mDeg)をΔε (楕円率)値に変換した。
【０２４３】
15℃での実験に加えて、15から90℃まで5℃間隔の異なる温度で試料をスキャンして加熱実験も行った。この分析は、タンパク質の安定性/アンフォールディングを検証するために行った。
【０２４４】
驚くべきことに、置換C13A及びC115Aを有するポリペプチドは、親ポリペプチドよりも高いフォールディング安定性を示した(配列番号44のポリペプチドの50%は約61℃でアンフォールディングされた一方、配列番号1のポリペプチドの50%は約51℃でアンフォールディングされた)。
【０２４５】
実施例7
本実施例では、配列番号1と比較してC13S及びC115S変異を有するバリアントポリペプチドを製造した。全配列を配列番号45に示す。
このポリペプチドバリアントは、用いられるcDNAが配列番号45のポリペプチドをコードする配列番号47を有すること以外は、実施例Aに記載されるようにして製造した。
【０２４６】
製造された組換えポリペプチドは配列番号45のアミノ酸配列を有することが確認された。N-末端メチオニンは、製造されたポリペプチド産物の約95%において除去されているようであった。製造されたポリペプチドのわずか約5%がN-末端メチオニンをなお保有しているようであった。
C13S置換及びC115S置換を有するポリペプチドは、親ペプチドとほぼ同じフォールディング安定性を示した(配列番号45のポリペプチドの50%が約51℃でアンフォールディングされた)。
【０２４７】
また、nPhl 12, rPhlp 12及び２つのバリアントV1 (C13S及びC115S)及びV2 (C13A及びC115A)の融点をそれぞれ測定した。アラニンバリアント(V2)の融点は、それぞれnPhl 12 (54℃), rPhlp 12 (58℃)及びバリアントV1 (51℃)の融点よりも著しく高い(61℃)ことが見出された。
【０２４８】
実施例8
Phl p 12により処置されたナイーブマウスにおいてBet v 抽出物(ベトゥラ  ベルコサの花粉抽出物) によって引き起こされる超過敏性免疫応答(喘息)のバイスタンダー抑制
方法及び材料は、Phl p抽出物がBet v 抽出物に置き換えられていること以外は実施例1と同じである。さらに、Phl p 12の欠失は本研究に含めていない。
結果(図25及び26)は、カバノキアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答がプロフィリンPhl p 12を用いて舌下処置されたナイーブマウスにおいて抑制されていることを示す。
【０２４９】
実施例9
Phl p 12により治療した感作マウスにおいてBet v 抽出物(ベトゥラ  ベルコサの花粉抽出物)によって引き起こされる超過敏性免疫応答(喘息)のバイスタンダー抑制
方法及び材料は、実施例3及び8と同じである。マウスは、OVAに代えてプロフィリンBet v 2を欠失したBet v 抽出物(カバノキアレルゲン)に感作させ、その後Phl p 12で治療する。
結果(図27及び28)は、プロフィリンPhl p 12で舌下治療された感作マウスにおいて、カバノキアレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答を抑制することができることを示す。
【０２５０】
実施例10
組換えにより産生されたOle e 2 (オリーブ樹木花粉のプロフィリン)によって処置したナイーブマウスにおいてPhl p 抽出物(フレウム  プラテンスの花粉抽出物)によって引き起こされる超過敏性免疫応答のバイスタンダー抑制
方法及び材料は実施例2と類似である。Ole e 2でマウスを舌下処置し、その後草花粉アレルゲン(Phl p 12抽出物)にマウスを感作させる。結果(図29及び30)は、プロフィリンOle e 2を用いて舌下処置されたナイーブマウスにおいて、草アレルゲンによって引き起こされる超過敏性免疫応答を抑制することができることを示す。
【０２５１】
実施例11
Phl p 12で処置したナイーブマウスにおいてOVA (Phl p 12又はBet v 2のいずれかと共曝露) によって引き起こされる超過敏性免疫応答のバイスタンダー抑制
方法及び材料は実施例1と類似である。Phl p 12でマウスを舌下処置し、その後OVA、Phl p 12と共曝露下のOVA又はBet v 2と共曝露下のOVAにマウスを感作させる。
【０２５２】
結果(図31)は、マウスがPhl p 12又はBet v 2と共曝露されるときに、プロフィリンPhl p 12で舌下処置したナイーブマウスにおいて、OVAによって引き起こされる超過敏性免疫応答が抑制されることを示す。また、結果は、共曝露がPhl p 12以外の別のプロフィリン分子(ここではBet v 2)により提供される場合であっても、１つのプロフィリン(Phl p 12)に対する寛容が非関連抗原(OVA)に対する免疫応答を抑制するのに十分であることを示す。
【０２５３】
実施例12
草アレルギー性個体のPBMCから樹立されたPhl p 12-特異的T細胞株における様々なプロフィリンのT細胞認識の研究
PBMCは、フレウム  プラテンスの草花粉アレルゲンにアレルギー性の個体(フレウム  プラテンスの花粉抽出物に対するIgE反応性を有する個体)から単離した。
【０２５４】
次いで、２週間インキュベートし、新たに単離されたPBMCを野生型(wt) Phl p 12 (配列番号1)の組換え体で再刺激することによって、Phl p 12応答性T細胞株を樹立した。その後、(a) wt Phlp 12組換え体, (b) 天然の精製Phl p 12, (c) オリーブ樹木花粉においてみられるOle e 2組換え体(Phl p 12のプロフィリンホモログ) (配列番号16)及び(d) コントロールとしての生育培地を用いて、樹立されたT細胞株を刺激した。草及びオリーブのプロフィリンを用いる刺激に応答してのT細胞活性化の大きさは、H3の取込みによって測定した。図A及びBは、２つの異なる個体からのPBMCからそれぞれ樹立されたT細胞株を表す。
【０２５５】
データ(図32)は、草アレルギー性個体からのヒトT細胞が、期待された通り同族の抗原(Phl p 12)に対する曝露後に活性化され、また相同タンパク質Ole e 2に対する曝露後にも活性化されることを示す。このことは、系統発生的に離れた種からの相同だが同一でないタンパク質同士のT細胞レベルにおける広範な免疫的交差反応の可能性をはっきりと実証している。さらに、この知見は、様々な離れた種に対して免疫調節能を有するタンパク質及びタンパク質バリアント選抜の基礎を形成し、このことによってアレルギー及び喘息を含むアトピー性疾患のより広く種の制限が少ない新規な治療法の開発が可能となる。
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１３】
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【図１７】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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