(57)【要約】  本開示は、ABDに対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失がABDのその標的との結合を妨げることなく既存抗体とABDとの相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含むC末端修飾、N末端修飾、またはC＋N末端修飾を含む抗原結合ドメイン(ABD)に関する。
2015531350.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
C末端修飾を含む単離された単一ドメイン抗体であって、該C末端修飾が、単一ドメイン抗体に対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含む抗体。
【請求項２】
該単一ドメイン抗体のC末端が露出したC末端が少なくとも1の既存抗体との相互作用に利用可能であるように露出し、該C末端修飾が該C末端の該既存抗体に対する暴露を減少させる、請求項１記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項３】
該C末端修飾が、既存抗体が該単一ドメイン抗体を認識しないようにC末端単一ドメイン抗体の3次元構造を変化させることにより少なくとも１の既存抗体の相互作用を排除することからなる群から選ばれる機序により該単一ドメイン抗体のC末端を修飾し、C末端単一ドメイン抗体の少なくとも1の既存抗体に対する暴露を変化させ、単一ドメイン抗体と少なくとも1の既存抗体の立体障害を変化させ、該C末端中の少なくとも1のコンフォメーションネオエピトープを破壊し、該単一ドメイン抗体のフレームワーク中の少なくとも1のネオエピトープを保護するものである請求項１記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項４】
配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、および配列番号13からなる群から選ばれるヒトVHフレームワーク足場を含む請求項4記載の単一ドメイン抗体。
【請求項５】
該アミノ酸残基が天然アミノ酸または非天然アミノ酸からなる群から選ばれる請求項4記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項６】
該C末端修飾が少なくとも1のアミノ酸残基の欠失を含む請求項記4載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項７】
該C末端修飾が、さらに単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも1のさらなるアミノ酸残基の欠失を含む請求項6記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項８】
該C末端修飾が、さらに該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも2のさらなるアミノ酸残基の欠失を含む請求項6記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項９】
該C末端修飾が該単一ドメイン抗体のC末端からの1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む請求項6記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項１０】
該C末端修飾がArg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Gly-Gln、およびGly-Gln-Proからなる群から選ばれるアミノ酸配列の欠失である請求項6記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項１１】
該単一ドメイン抗体がヒトVLフレームワーク足場であり、該C末端修飾が少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含み、該ヒトVLκ軽鎖、および該κ軽鎖のC末端がKabatの番号付けに基づいて107位のLysアミノ酸残基で終わる、請求項1記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項１２】
配列番号2および配列番号3からなる群から選ばれるヒトVLフレームワーク足場である請求項11記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項１３】
該アミノ酸残基が天然アミノ酸または非天然アミノ酸からなる群から選ばれる請求項11記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項１４】
該C末端修飾がさらに該単一ドメイン抗体のC末端に少なくとも1のさらなるアミノ酸残基の付加または欠失を含む請求項12記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項１５】
該C末端修飾が、さらに該単一ドメイン抗体のC末端に少なくとも2のさらなるアミノ酸残基の付加または欠失を含む請求項12記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項１６】
該C末端修飾が該VL配列VEIKからの1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む請求項12記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項１７】
該C末端修飾がVL配列VEIKに1アミノ酸〜3アミノ酸の付加を含み、該さらなるアミノ酸が天然または非天然アミノ酸残基からなる群から選ばれる請求項12記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項１８】
該C末端修飾がArg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Arg-Thr-Val-Ala、およびArg-Thr-Val-Ala-Alaからなる群から選ばれるアミノ酸配列の付加である請求項17記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項１９】
該C末端修飾が、少なくとも1の既存抗体反応を該C末端修飾を含まない単一ドメイン抗体に比べて少なくとも約10％排除する請求項1記載の単離された単一ドメイン抗体。
【請求項２０】
請求項1〜19のいずれかに記載の組成物をコードする核酸。
【請求項２１】
請求項20記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項２２】
請求項21の発現ベクターを含む宿主細胞または生物。
【請求項２３】
請求項1記載の単一ドメイン抗体を含む医薬組成物。
【請求項２４】
請求項1記載の単一ドメインを含む医薬組成物。
【請求項２５】
C末端修飾を含む単一ドメイン抗体を投与することを含む対象の既存免疫反応を排除する方法であって、該C末端修飾が、単一ドメイン抗体に対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含む方法。
【請求項２６】
C末端修飾を含む単一ドメイン抗体を投与することを含む単一ドメイン抗体に対する既存抗体を有する対象の単一ドメイン抗体に対する反応を改善する方法であって、該C末端修飾が、単一ドメイン抗体に対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含む方法。
【請求項２７】
以下の工程を含む、既存抗体が単一ドメイン抗体との既存免疫反応を生じるか否かを予測する方法であって、
単一ドメイン抗体をヒト試料と接触させ、
少なくとも1の既存抗体がヒト試料中に存在する場合に該単一ドメイン足場と結合するか否かを決定し、
単一ドメイン抗体のC末端領域を、C末端修飾が少なくとも１の既存抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の欠失により修飾する。
【請求項２８】
ヒト試料が血液および血清からなる群から選ばれる請求項27記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮出願No.61/700,529（2012年9月13日出願）および61/789,856（2013年3月15日出願）の優先権を主張する(これらの内容は本明細書の一部を構成する)。
【背景技術】
【０００２】
循環既存抗体は、異種タンパク質への偶発的または職業的暴露、感染後の治療薬としての抗体の使用、ワクチン接種、または未知の理由により生じうる。
【０００３】
該既存抗体は、患者の臨床像と矛盾する間違った結果を生じさせる。その干渉は、種々の内因性抗体間の広範囲の親和性と結合力またはその両方のため、変化しやすく、複雑で予測不能である。既存抗体は、認識するのが困難であるだけでなく、排除するのも不確実である。既存抗体による干渉の正確な機序の定義は、該抗体により生じる現象が変動するため難しい。既存抗体は、あるアッセイでは値が増加し、他のアッセイでは結果が低下することがある。既存抗体は、あるアッセイでは非線形性により同定され、他のアッセイでは段階希釈で完全な線形性を示しうる。ある抗体からの干渉は、市販の「ブロッキング試薬」によりブロックすることができるが、他の抗体からの干渉はブロックされない。
【０００４】
さらに、目的とする望ましい標的と結合し、既存抗体との相互作用がないかまたは減少した結合分子を製造する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、健康ヒトボランティアの血清中に存在する既存抗体により認識され、既存免疫反応を生じる種々のヒトVHおよびVLκ単一ドメイン足場のC末端のネオエピトープまたはネオエピトープ様構造の驚くべき発見に基づく。これらのヒトVHおよびVL単一ドメイン足場に対する既存免疫反応の同定は、これらの足場が合成ライブラリーではなくヒト起源であるので驚くべき予期しない発見であった。したがって、これらヒト由来足場に基づく既存免疫反応は予期または予測されないだろう。さらに、アミノ酸の付加または欠失によるVHまたはVLκ単一ドメイン足場のC末端の修飾は既存免疫反応を排除した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
さらに、本開示は、C末端修飾、N末端修飾またはC＋N末端修飾を含む抗原結合ドメイン(ABD)であって、該C末端修飾、N末端修飾、またはC＋N末端修飾が、ABDに対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失が、ABDとその標的の結合を妨げることなく既存免疫反応、例えばABDとその標的の結合を妨げることなくABDと少なくとも１の既存の抗体の相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含むABDに関する。
【０００７】
ある態様において、本開示は、C末端修飾を含む抗原結合ドメイン(ABD)であって、該C末端修飾が、ABDに対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失が、ABDとその標的との結合を妨げることなく既存免疫反応、例えばABDとその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存抗体の相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含むABDに関する。
【０００８】
ある態様において、ABDのC末端は、露出したC末端が既存抗体との相互作用に利用可能であるように露出し、該C末端修飾は、該C末端の該既存抗体に対する暴露を減少させる。
【０００９】
ある態様において、該C末端修飾は、既存抗体がABDをもはや認識しないようにC末端ABDの三次元配置を変化させることにより既存抗体の相互作用を排除することからなる群から選ばれる機序によりABDのC末端を修飾し、C末端ABDの既存抗体に対する暴露を変化させ、ABDと既存抗体との立体障害を変化させ、該C末端の少なくとも1のコンフォメーションネオエピトープを破壊し、ABDのネットワーク中の少なくとも1のネオエピトープを保護する。
【００１０】
ある態様において、ABDは、一本鎖抗体、ナノボディ、IgGまたはHSAと他のABD's、例えば、一本鎖Fv's、ナノボディ、または他の小ABD'sとの融合物を含む多ドメイン抗体；一本鎖、scFv、sdAb、Fab、ディアボディ、scFab、またはあらゆる他のABDを含む二特異的抗体；または通常露出していないNまたはC末端配列を露出するFc融合タンパク質からなる群から選ばれる。別の局面において、本開示は、C末端修飾を含む抗原結合ドメイン (ABD)であって、該C末端修飾が、ABDからの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失がABDとその標的の結合を妨げることなくABDと既存抗体の相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の欠失を含む、ABDに関する。
【００１１】
ある態様において、本開示は、C末端修飾を含む単離された単一ドメイン抗体であって、該C末端修飾が、単一ドメイン抗体に対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含む、単一ドメイン抗体に関する。
【００１２】
ある態様において、該単一ドメイン抗体のC末端は、露出したC末端が既存抗体と相互作用するために利用可能であるように露出し、該C末端修飾は、該C末端の該既存抗体に対する暴露を減少させる。
【００１３】
ある態様において、該C末端修飾は、既存抗体が単一ドメイン抗体をもはや認識しないようにC末端単一ドメイン抗体の三次元配置を変化させることにより既存抗体の相互作用を排除することからなる群から選ばれる機序により単一ドメイン抗体のC末端を修飾し、C末端単一ドメイン抗体の既存抗体に対する暴露を変化させ、単一ドメイン抗体と既存抗体との立体障害を変化させ、該C末端の少なくとも1のコンフォメーションネオエピトープを破壊し、単一ドメイン抗体のネットワーク中の少なくとも1のネオエピトープを保護する。
【００１４】
ある態様において、該単一ドメイン抗体は、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、および配列番号13からなる群から選ばれるヒトVHフレームワーク足場を含む。ある態様において、該アミノ酸残基は天然アミノ酸または非天然アミノ酸からなる群から選ばれる。ある態様において、該C末端修飾は、少なくとも1のアミノ酸残基の欠失を含む。ある態様において、C末端修飾が、さらに単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも1のさらなるアミノ酸残基の欠失を含む。ある態様において、該C末端修飾は、さらに該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも2のさらなるアミノ酸残基の欠失を含む。ある態様において、該C末端修飾は、該単一ドメイン抗体のC末端からの1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む。ある態様において、該C末端修飾は、Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Gly-Gln、およびGly-Gln-Proからなる群から選ばれるアミノ酸配列の欠失を含む。
【００１５】
ある態様において、該単一ドメイン抗体はヒトVLフレームワーク足場であり、該C末端修飾は少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含み、ヒトVLκ軽鎖、および該κ軽鎖のC末端は、Kabatの番号付けに基づいて107位のLysアミノ酸残基で終わる。ある態様において、該単一ドメイン抗体は、配列番号2および配列番号3からなる群から選ばれるヒトVLフレームワーク足場である。ある態様において、該アミノ酸残基は天然アミノ酸または非天然アミノ酸からなる群から選ばれる。ある態様において、該C末端修飾は、さらに該単一ドメイン抗体のC末端に少なくとも1のさらなるアミノ酸残基の付加または欠失を含む。ある態様において、該C末端修飾は、さらに、該単一ドメイン抗体のC末端に少なくとも2のさらなるアミノ酸残基の付加または欠失を含む。ある態様において、該C末端修飾は、VL VEIK C末端配列からの1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む。ある態様において、該C末端修飾は、VL配列VEIKに1アミノ酸〜3アミノ酸の付加を含み、該さらなるアミノ酸が、天然または非天然アミノ酸残基からなる群から選ばれる。ある態様において、該C末端修飾は、Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Arg-Thr-Val-Ala、およびArg-Thr-Val-Ala-Alaからなる群から選ばれるアミノ酸配列の付加を含む。
【００１６】
ある態様において、該C末端修飾は、既存抗体反応をC末端修飾を含まない単一ドメイン抗体に比べて約10％排除する。
【００１７】
ある態様において、本開示は、該単一ドメイン抗体からの少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含むC末端修飾を含むVH単一ドメイン抗体組成物をコードする核酸；該核酸を含む発現ベクター；および該発現ベクターを含む宿主細胞または生物に関する。
【００１８】
ある態様において、本開示は、単一ドメイン抗体に対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含むC末端修飾を含む単離されたVL単一ドメイン抗体をコードする核酸、該VLκ軽鎖（ここで、VLκ軽鎖のC末端はKabatの番号付けに基づいて107位のLysアミノ酸残基で終わる）；該核酸を含む発現ベクター；および該発現ベクターを含む宿主細胞または生物に関する。
【００１９】
別の局面において、本開示は、単一ドメイン抗体に対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含むC末端修飾を含む単一ドメイン抗体を含む医薬組成物に関する。
【００２０】
別の局面において、本開示は、単一ドメイン抗体に対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含むC末端修飾を含む単一ドメイン抗体を投与することを含む対象の既存免疫反応を排除する方法に関する。
【００２１】
別の局面において、該開示は、単一ドメイン抗体に対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含むC末端修飾を含む単一ドメイン抗体を投与することを含む該単一ドメイン抗体に対する既存抗体を有する対象の単一ドメイン抗体に対する反応を改善する方法に関する。
【００２２】
別の局面において、本開示は、単一ドメイン抗体をヒト試料と接触させて既存抗体がヒト試料中に存在する場合に単一ドメイン足場と結合するか否かを決定し、次いでC末端修飾が既存抗体と単一ドメイン抗体の相互作用を排除するように単一ドメイン抗体のC末端領域を少なくとも1のアミノ酸残基の欠失により修飾することを含む、既存抗体が単一ドメイン抗体との既存免疫反応を生じるか否かを予測する方法に関する。ある態様において、ヒト試料は、血液および血清からなる群から選ばれる。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】既存抗体との反応をもたらす露出したC末端を生じることができる抗体の開裂位置(位置A、B、C)を示す。
【図２】露出したC末端を含みうる抗体の例を示す。2Aは、モノクローナル抗体およびFab-(Fab)およびFv-断片(Fv)および一本鎖抗体 (scFv)であり、2Bは単一ドメイン抗体 (VHおよびVL)である；
【図３】3つのヒト単一ドメインVH足場および3つのヒトVL足場に対する既存反応を示す。
【図４】種々のC末端アミノ酸付加を有するVH-HVHP426単一ドメイン足場のヒト化血清における既存反応を示す。
【図５】種々のC末端アミノ酸付加を有するVH-HVHP420単一ドメイン足場のヒト血清における既存反応を示す。
【図６】種々のC末端アミノ酸付加を有するVH-HVHM81単一ドメイン足場のヒト血清における既存反応を示す。
【図７】種々のC末端アミノ酸付加を有するVH安定化S-S VH-HVHP421S単一ドメイン足場のヒト血清における既存反応を示す。
【図８】種々のC末端アミノ酸付加を有するVH安定化S-S VH-HVHP430S単一ドメイン足場のヒト血清における既存反応を示す。
【図９】種々のC末端アミノ酸付加を有するVH安定化S-S VH-HVHP426S単一ドメイン足場のヒト血清における既存反応を示す。
【図１０】種々のC末端アミノ酸付加を有するVL-HVLP335単一ドメイン足場のヒト血清における該反応を示す。
【図１１】種々のC末端アミノ酸付加を有するVL-HVLP325単一ドメイン足場のヒト血清における該反応を示す。
【図１２】種々のC末端アミノ酸付加を有するVL-HVLP351単一ドメイン足場のヒト血清における該反応を示す。
【図１３】種々のC末端アミノ酸付加を有するVL安定化S-S HVLP3103S単一ドメイン足場のヒト血清における該反応を示す。
【図１４】種々のC末端アミノ酸付加を有するVL安定化S-S HVLP325S単一ドメイン足場のヒト血清における該反応を示す。
【図１５】種々のC末端アミノ酸付加を有するVL安定化S-S HVLP351S単一ドメイン足場のヒト血清における該反応を示す。
【図１６】C末端アミノ酸欠失を有するVL−VL安定化S-S単一ドメイン足場 HVLP335、HVLP3103S、およびHVLP325のヒト血清における該反応を示す。
【図１７】C末端アミノ酸欠失を有するVL−VL安定化S-S単一ドメイン足場 HVLP325S、およびHVLP351およびHVLP351Sのヒト血清における該反応を示す。
【図１８】C末端アミノ酸欠失を有するVH−VH安定化S-S単一ドメイン足場 HVHP426、HVHP426SおよびHVHP420のヒト血清における該反応を示す。
【図１９】C末端アミノ酸欠失を有するVH−VH安定化S-S単一ドメイン足場 HVHM81、およびHVHP421SおよびHVHP430Sのヒト血清における該反応を示す。
【図２０】C末端アミノ酸付加または欠失を有するVL単一ドメイン足場のヒト血清における該反応を示す。
【図２１】単一ドメイン抗体のリボンダイヤグラムを示す。
【００２４】
本明細書および特許請求の範囲の明確な理解をもたらすために下記定義を便宜的に示す。
【００２５】
本明細書で用いている用語「抗原結合ドメイン」または「ABD」は、抗原と結合する露出したC末端を有するタンパク質またはタンパク質断片を表す。ABDの例には、限定されるものではないが、抗体、露出したC末端を有する単一ドメイン抗体、露出したC末端を有する抗体可変領域(例えば、VHまたはVL)、露出したC末端を有する一本鎖抗体断片 (scFv)、露出したC末端を有する一本鎖ディアボディ、少なくとも1の露出したC末端を有するFab断片、少なくとも1の露出したC末端を有するF(ab)2断片、少なくとも1の露出したC末端を有するヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合した2つのFab断片を含む二価断片、少なくとも1の露出したC末端を有する抗体の一腕のVLおよびVHドメインからなるFv断片、および少なくとも1の露出したC末端を有するdAb断片が含まれる。ABDは、限定されるものではないが、一本鎖抗体、ナノボディ、IgGまたはHSAと他のABD's、例えば、一本鎖Fv's、ナノボディ、または他の小ABD'sの融合物を含む多ドメイン抗体；一本鎖、scFv、sdAb、Fab、ディアボディ、scFabを含む二特異的抗体；または通常露出していないNまたはC末端配列を露出するあらゆる他のABDもしくはFc融合タンパク質を含む。本明細書で用いている用語「C末端修飾」は、既存抗体がABD (例えば、単一ドメイン抗体)の修飾されたC末端ともはや相互作用しないようにC末端の構造が変化する露出したC末端に修飾を有するABD (例えば、単一ドメイン抗体)を表す。変更は、ABD (例えば、単一ドメイン抗体)のC末端に対する少なくとも1のアミノ酸残基の付加、またはABD (例えば、単一ドメイン抗体)のC末端からの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失でありうる。ABDのC末端に対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加は、ネオエピトープがもはや既存抗体と相互作用するためには利用できないようにネオエピトープをマスクすることにより既存抗体がもはやマスクまたはキャップされたC末端と相互作用しないように露出したC末端をマスクまたはキャップするのに役立つ。ABDのC末端からの少なくとも１のアミノ酸残基の欠失は、既存抗体による相互作用に利用可能なネオエピトープを変化させることによりC末端を修飾するのに役立つ。少なくとも1のアミノ酸残基の欠失に関連する用語「C末端修飾」は、非修飾VH足場からの少なくとも1のアミノ酸の欠失に明確に関連し、特にABDの定常領域からあらゆるアミノ酸を除去する。
【００２６】
本明細書で用いている用語「N末端修飾」は、既存抗体がABD(例えば、単一ドメイン抗体)の修飾N末端ともはや相互作用しないようにN末端の構造を変化させる露出したN末端の修飾を有するABD (例えば、単一ドメイン抗体)を表す。該変化は、ABD (例えば、単一ドメイン抗体)のN末端に対する少なくとも1のアミノ酸残基の付加またはABD (例えば、単一ドメイン抗体)のN末端からの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失でありうる。ABDのN末端に対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加は、ネオエピトープが既存抗体との相互作用にもはや利用できないようにネオエピトープをマスクすることにより既存抗体がもはやマスクまたはキャップされたN末端と相互作用しないように露出したN末端をマスクまたはキャップするのに役立つ。ABDのN末端からの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失は、既存抗体による相互作用に利用可能なネオエピトープを変化させることによりN末端を修飾するのに役立つ。
【００２７】
本明細書で用いている用語「C＋N末端修飾」は、既存抗体がABD (例えば、単一ドメイン抗体)の修飾C＋N末端ともはや相互作用しないようにC＋N末端の構造を変化させる露出したC＋N末端に修飾を有するABD (例えば、単一ドメイン抗体)を表す。該変化は、ABD (例えば、単一ドメイン抗体)のC＋N末端両方に対する少なくとも1のアミノ酸残基の付加、またはABD (例えば、単一ドメイン抗体)のC＋N末端両方からの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失でありうる。ABDのC＋N末端両方に対する少なくとも1のアミノ酸残基の付加は、ネオエピトープがもはや既存抗体との相互作用に利用できないようにネオエピトープをマスクすることにより既存抗体がマスクまたはキャップされたC＋N末端ともはや相互作用しないように露出したC＋N末端をマスクまたはキャップするのに役立つ。ABDのC＋N末端両方からの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失は、既存抗体による相互作用に利用可能なネオエピトープを変化させることによりN末端を修飾するのに役立つ。また、種々の修飾をABDの各末端に施すことができる。例えば、ABDのC末端は少なくとも１のアミノ酸残基を付加するように修飾することができ、ABDのN末端は少なくとも１のアミノ酸残基が欠失するように修飾することができる。あるいはまた、ABDのN末端はは少なくとも１のアミノ酸残基を付加するように修飾することができ、ABDのC末端は少なくとも１のアミノ酸残基が欠失するように修飾することができる。
【００２８】
本明細書で用いている用語「免疫原性」は、ABD (例えば、単一ドメイン抗体)の投与前に存在している既存抗体から生じる免疫原性を表す。既存抗体から生じる免疫原性は、ABD (例えば、単一ドメイン抗体)の治療効果を低下させる。そのような免疫原性の程度は、ELISAアッセイにより測定することができ、測定可能な量の既存抗体を含むヒト血清のパーセンテージとして表すことができる。ABD (例えば、単一ドメイン抗体)と修飾（例えばC末端修飾）を有する対応するABD (例えば、単一ドメイン抗体)の間の免疫原性の低下は、該ABD (例えば、単一ドメイン抗体)に対する既存抗体を含む血清試料のパーセンテージと元のABD (例えば、単一ドメイン抗体)に対する既存抗体を含む血清試料のパーセンテージを比較することにより測定することができる。C末端修飾を有するABD (例えば、単一ドメイン抗体)に対する陽性血清試料の数またはパーセンテージが低いことは、C末端修飾を有するABD (例えば、単一ドメイン抗体)に対する免疫原性の低下を示す。単一血清試料に基づいて適用することができるより高感度の測定法を競合ELISAに用いる。該競合ELISAにおいて、C末端修飾を有するABD (例えば、単一ドメイン抗体)は、試験血清中の既存抗体の結合について元のABD (例えば、単一ドメイン抗体)と競合する。C末端修飾を有するABD (例えば、単一ドメイン抗体)の元のABD (例えば、単一ドメイン抗体)との競合能がより低いと、より効果的に免疫原性が低下した。
【００２９】
本明細書で用いている用語「単一ドメイン抗体」または「sdAb」は、ヒト抗体の重鎖の可変領域 (VHH)を含む一本鎖抗体の一種を表す。SdAbは、単一単量体可変抗体ドメインからなる抗体断片である。SdAbは、例えば、軽鎖を含まず2つの抗体重鎖のみからなるヒト由来の重鎖抗体から誘導される。分子量わずか12〜15kDaのsdAbは、2つの重鎖タンパク質鎖と2つの軽鎖を有するIgG抗体(150〜160 kDa)などのモノクローナル抗体 (mAbs)よりはるかに小さい。
【００３０】
sdAbは、限定されるものではないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシを含むあらゆる種由来でありうる。sdAbは、軽鎖を各重鎖抗体として知られる天然免疫グロブリンの修飾型でありうる。そのような免疫グロブリンはWO2006/099747、WO2009/079793、およびWO2012/100343に記載されている。明確にするために、天然に軽鎖を欠く重鎖抗体由来の可変ドメインは本明細書ではVHHまたはsdAbとして知られ、4鎖免疫グロブリンの従来のVHと区別される。
【００３１】
本明細書で用いている用語「既存抗体」は、ABD (例えば、単一ドメイン抗体)投与の結果として誘導されるのではなく、ABD (例えば、単一ドメイン抗体)投与前に対象中に存在する対象の血清中の干渉抗体を表す。既存抗体は、異種タンパク質に対する偶発的または職業的暴露により生じうる。該既存抗体は、露出したABD (例えば、単一ドメイン抗体)のC末端と相互作用し、ABD (例えば、単一ドメイン抗体)の治療効果を低下させる。
【００３２】
本明細書で用いている用語「既存免疫反応」は、ABD (例えば、単一ドメイン抗体)投与の結果として誘導されるのではなく、ABD (例えば、単一ドメイン抗体)投与前に対象中に存在する対象の血清（serumまたはsera）中の干渉免疫反応分子を表す。既存免疫反応は、異種タンパク質に対する偶発的または職業的暴露により生じ得、免疫反応分子、例えば、炎症分子 (例えば、IgG、IgM、IgA、IgE、TNF、リウマチ因子など)を含む。該既存免疫反応分子は、露出したABD (例えば、単一ドメイン抗体)のC末端と相互作用し、ABD (例えば、単一ドメイン抗体)の治療効果を低下させる。
【００３３】
本開示の種々の局面を以下のセクションおよびサブセクションにより詳細に記載する。
抗原結合ドメイン
【００３４】
ある態様において、本開示は、C末端修飾がABDに対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失が、ABDとその標的の結合を妨げることなくABDと少なくとも１の既存の抗体の相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含む、該C末端修飾を含む単離された抗原結合ドメイン(ABD)に関する。別の局面において、本開示は、C末端修飾が、ABDからの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失がABDとその標的の結合を妨げることなく既存抗体とABDの相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の欠失を含む、該C末端修飾を含む抗原結合ドメイン(ABD)に関する。別の局面において、本発明は、C末端修飾が、ABDからの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失がABDとその標的の結合を妨げることなく既存抗体とABDとの相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基〜少なくとも3アミノ酸残基の欠失を含む、該C末端修飾を含む抗原結合ドメイン(ABD)に関する。別の局面において、本開示は、N末端修飾が、ABDに対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失がABDとその標的の結合を妨げることなく既存抗体とABDとの相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含む、該N末端修飾を含む単離された抗原結合ドメイン(ABD)に関する。別の局面において、本開示は、C＋N末端修飾が、ABDに対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失がABDとその標的の結合を妨げることなく既存抗体とABDとの相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含む、C＋N末端修飾を含む単離された抗原結合ドメイン(ABD)に関する。
【００３５】
ABDの例には、限定されるものではないが、抗体、露出したC末端、N末端、またはC＋N末端を有する単一ドメイン抗体；露出したC末端、N末端、またはC＋N末端を有する抗体可変領域；(例えば、VHまたはVL)、露出したC末端、N末端、またはC＋N末端を有する一本鎖抗体断片(scFv)；露出したC末端、N末端、またはC＋N末端を有する一本鎖ディアボディ；少なくとも1の露出したC末端、N末端、またはC＋N末端を有するFab断片；少なくとも1の露出したC末端、N末端、またはC＋N末端を有するF(ab)2断片；少なくとも1の露出したC末端、N末端、またはC＋N末端を有する、ヒンジ領域でジスルフィド結合により結合した2のFab断片を含む二価断片；少なくとも1の露出したC末端、N末端、またはC＋N末端を有する抗体の１腕のVLおよびVHドメインからなるFv断片；少なくとも1の露出したC末端 N末端、またはC＋N末端を含むdAb断片が含まれる。ABDには、限定されるものではないが、一本鎖抗体、ナノボディ、IgGまたはHSAと他のABD's、例えば、一本鎖Fv's、ナノボディまたは他の小ABD'sとの融合体を含む多ドメイン抗体；一本鎖、scFv、sdAb、Fab、ディアボディ、scFabを含む二特異的抗体、または通常露出していないNまたはC末端配列が露出しているあらゆる他のABDまたはFc融合タンパク質が含まれる。
【００３６】
ABDは、抗原結合部位を形成する4以下のフレームワーク領域(FR)に加えて相補性決定領域(CDR)を有する。VHまたはVL可変ドメインのCDRは、本明細書ではCDR1、CDR2、およびCDR3という。VHまたはVL可変ドメインのFRは、本明細書ではFR1、FR2、FR3およびFR4という。該FRは、可変ドメインに構造的完全性をもたらし、免疫グロブリンホールドの保持を確実にする。相補性決定領域の同定には種々のスキームが存在し、最も一般的な2つは、VHおよび/またはVLドメインの抗原結合領域の配列変動性に基づいて「相補性決定領域」(CDR)を定義するKabat et al (1991)のものである(Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest. US Department of Health and Human Services、US Public Health Service、Bethesda、MD参照)。可変ドメイン (VHまたはVL)における大多数の配列可変性はCDR/ループに生じ、CDR/ループの外側の領域はフレームワーク領域(FR)という。ABDのFRおよびCDR領域は、IMGT国際データベースを用いて決定することができる(例えば、www.imgt.org；Lefranc、et al.、(1999) Nucleic Acids Research、27、209-212 (1999)；Ruiz、et al.、(2000) Nucleic Acids Research、28、219-221；Lefranc、(2001) Nucleic Acids Research、29、207-209；Lefranc、(2003) Nucleic Acids Res.、31、307-310；Lefranc、et al.、(2004) In Silico Biol.、5、0006  [Epub]、5、45-60 (2005)；Lefranc、et al.、(2005) Nucleic Acids Res.、33、D593-D597参照)。
【００３７】
ヒトVHまたはVLドメインは、ヒトIg重または軽鎖配列から得ることができる (Holliger、およびHudson、(2005) Nat. Biotechnol. 23、1126-1136；Holt et al.、(2003) Trends Biotechnol. 21、484-490；Jespers et al、(2004) Nat. Biotechnol. 22、1161-1165；To et al、(2005) J. Biol. Chem. 280、41395-41403)。非ヒト種からVHまたはVLドメインを得るための同様の技術は当該分野で知られている。さらに、VHおよびVLドメインは、組換えにより製造したVHまたはVL、および親和性熟成、安定化、可溶化または他の抗体工学方法によるそのようなVHまたはVLのさらなる修飾により得られる該VHまたはVLを含む。該VHまたはVLの安定性および非凝集特性を保持または改善する相同体、誘導体、または変異体も含まれる。
【００３８】
単に実例として、以下の項で単一ドメイン抗体に関する開示を用いて説明するが、該開示は、既存抗体に対する免疫反応を引き起こす少なくとも1の露出したC末端、N末端、またはC＋N末端を有し、該露出したC末端、N末端、またはC＋N末端へのアミノ酸の付加または欠失による該C末端、N末端、またはC＋N末端の修飾が該反応を排除する多くの抗体、抗体断片、またはその組み合わせに適用することができると理解すべきである。同様に、該開示は、既存抗体に対する免疫反応を引き起こす少なくとも1の露出したC末端、N末端、またはC＋N末端を有する、露出したC末端、N末端、またはC＋N末端へのアミノ酸の付加または欠失による該C末端、N末端、またはC＋N末端の修飾が該反応を排除する、抗体代替足場(例えば、フィブロネクチン)にも適用される。
ヒト単一ドメイン抗体
【００３９】
本発明は、ヒト血清中の既存抗体が、ヒト起源のヒト単一ドメイン抗体と結合し、既存免疫反応をもたらすという驚くべき発見に基づく。該単一ドメイン抗体は、ヒト起源であり、他の種由来の単一ドメイン抗体の誘導または修飾型または合成ライブラリー由来ではないので、出願人は、驚くべきことに、ヒトボランティア由来血清中に存在する既存抗体が本明細書に記載の種々の単一ドメイン抗体と結合し、既存免疫反応を生じることを発見した。ヒトVH またはVLκ単一ドメイン抗体のC末端領域の修飾（単一アミノ酸残基の付加または欠失）が該既存免疫反応を排除するという知見はさらにより驚くべき予期しないことであった。しかしながら、本明細書に記載のデータに基づき、ヒトVLλ単一ドメイン抗体のC末端に対する既存免疫反応があるという証拠はない（例えば、Lefranc、et al.、(1999) 上記；Ruiz、et al.、(2000) 上記；Lefranc、(2001) 上記；Lefranc、(2003) 上記；Lefranc、et al.、(2004) 上記；Lefranc、et al.、(2005) 上記参照)。
【００４０】
ラクダ類重鎖(VHH)由来の単一ドメイン抗体はヒト化突然変異ともいくらか既存免疫反応を示すが(例えば、WO2012/175741)、ラクダ類重鎖と反応することができる既存抗体が存在しうることは驚くべきことではない。ラクダ類重鎖では、C末端にアミノ酸残基を付加するC末端に対する修飾は既存免疫反応を低下させた。そのようなアミノ酸付加は、WO2013/024059にも既存免疫反応を低下させることが示された。
【００４１】
しかしながら、既存抗体がヒト単一ドメイン抗体と結合し、この結合を、本明細書に記載の非修飾ヒト単一ドメイン抗体足場のC末端領域からの少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失により排除することができるという証拠はほとんどない。これらヒトVH およびVL単一ドメイン足場に対する既存免疫反応の確認は、該足場が完全なヒトレパートリーにみられない配列（すなわち、ヒト配列にみられない突然変異）を含みうる合成ライブラリーではなくヒト起源であるため、驚くべき予期しない発見であった。ある者は、該突然変異の存在に基づく合成ライブラリー由来の抗体に対するある種の既存免疫反応を予期するかもしれない。しかしながら、本明細書に記載の該ヒト由来足場に基づく既存免疫反応は予期または予想しなかっただろう。本出願人は、非修飾VHまたはVLκヒト単一ドメイン抗体足場のC末端領域からの単一アミノ酸の欠失または付加が既存免疫反応を排除するのに充分であることを初めて開示する。該既存免疫反応の排除がVH単一ドメイン抗体足場およびVLκ単一ドメイン抗体足場でのみみられ、VLλではみられなかったことはさらに驚くべきことである。
【００４２】
さらに、ある態様において、本開示は、C末端修飾を含む単離されたVH単一ドメイン抗体であって、該C末端修飾が、該単一ドメイン抗体に対するに対する少なくとも1のアミノ酸残基の欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の欠失を含む抗体に関する。
【００４３】
さらに、ある態様において、本開示は、C末端修飾を含む単離されたVH単一ドメイン抗体であって、該C末端修飾が、該単一ドメイン抗体に対する少なくとも1のアミノ酸残基の付加が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の付加を含む抗体に関する。
【００４４】
さらに、ある態様において、本開示は、C末端修飾を含む単離されたVLκ 単一ドメイン抗体であって、該C末端修飾が、該単一ドメイン抗体に対する少なくとも1のアミノ酸残基の欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の欠失を含む抗体に関する。
【００４５】
さらに、ある態様において、本開示は、C末端修飾を含む単離されたVLκ 単一ドメイン抗体であって、該C末端修飾が、該単一ドメイン抗体に対する少なくとも1のアミノ酸残基の付加が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の付加を含む抗体に関する。
【００４６】
ある態様において、該単一ドメイン抗体は、VH領域またはVL領域由来でありうる。該単一ドメイン抗体 VHおよびVL足場は、該タンパク質の精製に用いるPhoAリーダー配列MKQSTIALALLPLLFTPVTKA (配列番号1)を用いて実施例の項に記載のごとく製造される。しかしながら、発現させ、精製したら、PhoAリーダー配列を除去し、以下に示す単一ドメイン抗体VHおよびVL配列を保持する(配列番号2〜13)。
【００４７】
ある態様において、該ヒト単一ドメイン抗体は、WO2006/099747およびWO2009/079793およびWO2012/100343に記載の重または軽鎖配列を含む(これらの内容は本明細書の一部を構成する)。ある態様において、該ヒト単一ドメイン抗体は、WO2012/100343に記載の足場領域内にジスルフィド結合を有する重または軽鎖配列を含む。今まで、ヒトの系では検出可能な量の遊離循環ヒト単一ドメイン抗体は同定されていない。
【００４８】
ある態様において、該ヒト単一ドメイン抗体は以下からなる群から選ばれる重または軽鎖配列を含む。
軽鎖ドメインフレームワーク足場
HVLP335 (κ)
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSSLAWYQQKPGQAPRLLIYGTSNRATGIPDRFSGSGSGTHFTLTINRLEPGDFAVYYCQQYGSSPRTFGQGTKVEIK (配列番号2)
HVLP3103S (κ)
ETTLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVRN-NLAWYQQRPGQAPRLLCYGASTRATGIPARFSCSGSGTDFTLTISSLQVEDVAVYYCQQYYTTPKTFGQGTKVEIK  (配列番号3)
HVLP325 (λ)
EIVLTQSPTTLSLSPGERATLSCRASQSVGR-YLAWYQQRPGQAPRLLVFDTSNRAPGVPARFSGRGSGTLFTLTISSLEPEDSAVYFCQQRSSGLTFGGGTKVTVL (配列番号4)
HVLP325S (λ)
EIVLTQSPTTLSLSPGERATLSCRASQSVGR-YLAWYQQRPGQAPRLLCFDTSNRAPGVPARFSCRGSGTLFTLTISSLEPEDSAVYFCQQRSSGLTFGGGTKVTVL (配列番号5)
HVLP351 (λ)
EIVMTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVGTSLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGISARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRYNWPR-TFGGGTKVTVL (配列番号6)
HVLP351S (λ)
EIVMTQSPVTLSLSPGERATLSCRASQSVGTSLAWYQQKPGQAPRLLCYDASNRATGISARFSCSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRYNWPR-TFGGGTKVTVL (配列番号7)
【００４９】
重鎖ドメインフレームワーク足場
HVHP426
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIVDGYAMHWVRQAPGQGLEWVSVTNNGGSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARQSITGPTGAFDIWGQGTMVTVSS (配列番号8)
HVHP426S
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFIVDGYAMHWVRQAPGQGLEWVCVTNNGGSTSYADSVKGRFTCSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCARQSITGPTGAFDIWGQGTMVTVSS (配列番号9)
HVHP420
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSNAWMTWVRQAPGKGLEWVGRIKTKTDGGTTDYAAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTDRDHSSGSWGQGTLVTVSS (配列番号10)
HVHM81
EVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISGSGASTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAGDTALYYCARQSITGPTGAFDVWGQGTMVTVSS (配列番号11)
HVHP421S
QLQLQESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVCAISGSGGSTYYADSVKGRFTCSRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDGKGGSSGYDHPDYWGQGTLVTVSS (配列番号12)
HVHP430S
QVQLVESGGGLIKPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVCAISSSGGSTYYADSVKGRFTCSRDNSKNTVYLQMNSLRAEDTAVYYCVREEYRCSGTSCPGAFDIWGQGTMVTVSS (配列番号13)
【００５０】
ある態様において、該単一ドメイン抗体は、WO2012/100343に記載の1またはそれ以上の非標準的Cys残基(この内容は本明細書の一部を構成する)、およびあらゆる天然（標準的）ジスルフィド結合を含む。ある態様において、少なくとも2の非標準的Cys残基は、該単一ドメイン抗体のフレームワーク領域内に導入される。ある態様において、該２つのCys残基は、抗体可変領域のFR2およびFR3中の残基を置換する。ある態様において、1つのCys残基はVH FR2領域の残基47〜49から選ばれる位置に導入され、1つのCys残基はVH sdAbドメインのVH FR3 領域の残基69〜71から選ばれる位置に導入される。ある態様において、Cys残基は、VL FR2 領域の残基46〜49から選ばれる位置に導入され、1つのCys残基は、VL sdAbドメインのVL FR3 領域の残基62〜66から選ばれる位置に導入される。ある態様において、少なくとも1の非標準的Cys残基は49位に導入され、少なくとも1の非標準的Cys残基はVHドメインの69位に導入される。ある態様において、少なくとも1の非標準的Cys残基は48位に導入され、少なくとも1の非標準的Cys残基はVLドメインの64位に導入される。
【００５１】
ある態様において、該単一ドメイン抗体は、「ヒト化」（humaneered、あるいは「humanized」ともいう)されている（すなわち、ヒト対象に投与されたsdAbに関して免疫原性でないかまたは免疫原性が低いアミノ酸で置換された免疫原性または潜在的に免疫原性アミノ酸残基を有するヒト以外の種由来のsdAb）。限定されるものではないがKalobiosのヒト化技術を含むヒト化抗体を製造するための当該分野で知られたあらゆる方法が開示されていると予期される。単一ドメイン抗体がヒト化されると、免疫原性アミノ酸残基は、これが保存されたアミノ酸変化を構成するか否かに関わらずあらゆる他の免疫原性が低いアミノ酸残基により置換することができることに留意する。
【００５２】
ある態様において、本開示は、C末端修飾を有する露出したC末端を含む単離されたscFvであって、該C末端修飾がscFvの露出したC末端に対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失がscFvとその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体とscFvとの相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含み、scFvのVHが少なくとも1のアミノ酸残基の欠失を含み、該VLがKabatの番号付けに基づいてLysアミノ酸残基で終わり、少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含むヒトκ軽鎖であるscFvに関する。scFvのVHおよびVLは、リンカー（例えばGSリンカー）を用いて一緒に結合することができる。
【００５３】
ある態様において、Lysは、Kabatの番号付けに基づいてアミノ酸位107である。ある態様において、該scFvは、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、および配列番号13からなる群から選ばれるヒトVHフレームワーク足場、および配列番号2および配列番号3からなる群から選ばれるヒトVLフレームワーク足場、およびVHおよびVLフレームワーク足場を結合するリンカーを含む。
【００５４】
ある態様において、該C末端修飾は、さらにscFvのC末端からの少なくとも1のさらなるアミノ酸残基の欠失を含む。ある態様において、該C末端修飾は、さらにscFvのC末端からの少なくとも2のさらなるアミノ酸残基の欠失を含む。ある態様において、該C末端修飾は、さらに、scFvのC末端からの少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5のさらなるアミノ酸残基の欠失を含む。
【００５５】
ある態様において、該C末端修飾は、さらに、scFvのC末端への少なくとも1のさらなるアミノ酸残基の付加を含む。ある態様において、該C末端修飾は、さらにscFvのC末端に対する少なくとも2のさらなるアミノ酸残基の付加を含む。ある態様において、該C末端修飾は、さらにscFvのC末端に対する少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5のさらなるアミノ酸残基の付加を含む。
【００５６】
ある態様において、ヒトVHフレームワーク足場中の該C末端修飾は、Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Gly-Gln、およびGly-Gln-Proからなる群から選ばれるアミノ酸配列の欠失である。
【００５７】
ある態様において、該C末端修飾は、VLフレームワーク足場VEIKからの1アミノ酸残基〜3アミノ酸残基の欠失を含む。ある態様において、該C末端修飾は、VL配列VEIKに対する1アミノ酸残基〜3アミノ酸残基の付加を含み、該さらなるアミノ酸は、天然または非天然アミノ酸残基からなる群から選ばれる。ある態様において、該C末端修飾は、Arg、Arg-Thr、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Arg-Thr-Val-Ala、およびArg-Thr-Val-Ala-Alaからなる群から選ばれるアミノ酸配列の付加である。
【００５８】
ある態様において、該C末端修飾は、既存抗体反応をC末端修飾を含まない単一ドメイン抗体に比べて少なくとも約10％除去する。
【００５９】
ある態様において、該開示は、C末端修飾を含む露出したC末端を有する単離されたscFvに関するものであり、該scFvは、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、および配列番号13からなる群から選ばれるVH、および配列番号2および配列番号3からなる群から選ばれるVLを含み、該露出したC末端は、VH上にあり、該C末端修飾は、C末端の少なくとも1のアミノ酸残基の欠失が、scFvとその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体と該scFvとの相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の欠失を含む。
【００６０】
ある態様において、本開示は、C末端修飾を有する露出したC末端を含む単離されたscFvであって、該scFvが、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、および配列番号13からなる群から選ばれるVH、および配列番号2および配列番号3からなる群から選ばれるVLを含み、該露出したC末端がVLにあり、該C末端修飾がscFvの露出したC末端の少なくとも1のアミノ酸残基の付加がscFvとその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体とscFvとの相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の付加を含むscFvに関する。
既存抗体
【００６１】
既存免疫反応および既存抗体は生存中の初期に形成することができ、対象依存性である。新規治療薬としてのモノクローナル抗体および抗体断片の開発において、既存抗体の存在は、治療的抗体の使用を制限し、複雑にする。図1は、既存抗体に対する反応を引き起こす露出したC末端をもたらしうる抗体の開裂位置(位置A、B、C)を示す。図2A〜2Bは、露出したC末端を含みうる抗体の例を示す。2Aは、モノクローナル抗体およびFab-(Fab)およびFv-断片(Fv)および一本鎖抗体(scFv)であり、2Bは単一ドメイン抗体(VHおよびVL)である。
【００６２】
既存抗体の相互作用メカニズムは、その有害作用が臨床の場で重大な結果をもたらすことが明らかであるにも関わらずあまり解っていない。既存抗体からの干渉の潜在的内在メカニズムは、既存抗体を検出するのに用いるイムノアッセイ、アッセイデザインまたは形式に関わらず潜行性の変動する予測不能な問題であるようである。既存抗体は一般的にポリクローナルである。抗原のモノクローナル抗体に対する結合親和性(すなわち、二つの速度、結合速度と解離速度の比である結合定数またはKa)は均一な傾向があるが、ポリクローナル抗体 (試薬または干渉抗体)を含む免疫反応において、Kaまたは結合力は各抗体ポピュレーションの結合定数の平均値である。したがって、ポリクローナル抗体を含む免疫反応はより変動的で複雑である。さらに、既存抗体は、例えば、イディオタイプネットワーク免疫反応において、その抗原、試薬抗体またはその両方と良く似ていることがある(Pan et al. (1995) Exp Biol Med J；9:43-49；Weir et al. Immunology 1997:69 Churchill Livingstone Edinburgh；Fields et al. (1995) Nature；374:739-742)。ある種の既存抗体は、該抗原または試薬抗体を相互作用の実体として認識しないが、「抗原抗体結合複合体」(すなわちメタトープ)を認識し、それと結合しうる(Voss EW (1993) Mol Immunol；30:949-951)、すなわち、イムノアッセイの反応速度論が変化する。したがって、正常な結合反応は、該抗原および/または抗体上に1より多い結合部位を含みうる。既存抗体の存在はこの結合反応を妨害し、妨害の程度は既存抗体の力価、その結合力と反応時間、および抗体結合部位の位置などの要因に依存しうる。捕捉抗体上の既存抗体の結合部位は、抗原に対する（部分的または完全な）結合阻害をもたらし、不当に低い成績をもたらしうる。あるいはまた、それはシグナル伝達抗体と反応するが捕捉抗体の遠位部位に結合することによりシグナル伝達抗体との結合を増加させ、後者は不当に高い成績をもたらしうる。
【００６３】
クラス(IgG、IgM、またはIgA)、サブクラス(例えば、IgG1、−2、または−3)、力価および親和性/結合力、およびエピトープ/パラトープの多様性に関する既存抗体の性質の変動は、単に、抗体が既存する可能性がある場合の結合反応の複雑さと予測不能性を強調し、干渉の多くの状況および変更を生じる免疫的相互作用を示す例である。
【００６４】
少なくとも1の既存抗体による単一ドメイン抗体の結合は、単一ドメイン抗体の薬物動態的および薬力学的挙動を変化させ、新たな複合体と機能をもたらし、組織分布にも影響を及ぼしうる複合体の大きさを変化させる。したがって、この現象は、避けるべき安全性と効果に対する重大なリスクである。
【００６５】
本出願人は、該既存免疫反応は通常露出していないNまたはC末端配列を露出させるあらゆるタンパク質により誘発されると考える。本開示は、既存抗体がABDのC末端、N末端、またはC＋N末端と相互作用しないようにABDのC末端、N末端、またはC＋N末端を修飾することにより既存抗体の干渉作用を排除しようとするものである。そのような反応を修飾するのに用いることができる多くの変更がある。ある態様において、該C末端は、ABDのC末端への少なくとも1のアミノ酸残基の付加により修飾される。別の態様において、該C末端は、ABDのC末端からの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失により修飾される。ある態様において、該N末端は、ABDのN末端への少なくとも1のアミノ酸残基の付加により修飾される。別の態様において、該N末端は、ABDのN末端からの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失により修飾される。ある態様において、該C末端は、ABDのC末端への少なくとも1のアミノ酸残基の付加により修飾され、該N末端は、ABDのN末端からの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失により修飾される。ある態様において、該N末端は、ABDのN末端への少なくとも1のアミノ酸残基の付加により修飾され、該C末端は、ABDのC末端からの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失により修飾される。
【００６６】
理論に縛られるものではないが、ABDのC末端、N末端、またはC＋N末端両方の修飾は、(i)既存抗体がもはやABDを認識しないようにABDのC末端、N末端、またはC＋N末端両方の三次元配置を変更することによる少なくとも1の既存抗体の相互作用の排除、(ii)ABDのC末端、N末端、またはC＋N末端両方の既存抗体への暴露の変化、(iii)ABDと既存抗体との立体障害の変更、(iv)C末端、N末端の少なくとも1のコンフォメーションネオエピトープ、またはC＋N末端両方の分離したネオエピトープの破壊、および/または(v)ABDの足場中の少なくとも1のネオエピトープの保護をもたらすかもしれない。
【００６７】
少なくとも1のアミノ酸の付加によるABDの露出したC末端、N末端、またはC＋N末端両方のマスクまたはキャップにより、該末端のコンフォメーションが変化するかまたは該ネオエピトープはもはや既存抗体と相互作用するために利用できないかもしれない。同様に、ABDのC末端、N末端、またはC＋N末端両方からの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失は、該末端または該ネオエピトープをもはや既存抗体と相互作用するために利用できなくするように該末端または該ネオエピトープのコンフォメーションを変化させることにより該末端を修飾するのに役立つ。
【００６８】
ある態様において、本開示は、既存抗体がもはや該単一ドメイン抗体のC末端と相互作用しないように単離された単一ドメイン抗体のC末端を修飾することにより既存抗体の相互作用効果を排除しようとするものである。ある態様において、該C末端は、該単一ドメイン抗体のC末端への少なくとも1のアミノ酸残基の付加により修飾される。別の態様において、該C末端は、該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失により修飾される。
【００６９】
理論に縛られるものではないが、該単一ドメイン抗体(例えば、ヒトVHまたはVL)のC末端の修飾は、(i)既存抗体がもはや該単一ドメイン抗体を認識しないようにC末端単一ドメイン抗体の三次元配置を変化させることによる少なくとも１の既存の抗体の相互作用の排除、(ii)該C末端単一ドメイン抗体の少なくとも1の既存抗体への暴露の変化、(iii)該単一ドメイン抗体と既存抗体との立体障害の変化、(iv)該C末端の少なくとも1のコンフォメーションネオエピトープの破壊、および/または(v)該単一ドメイン抗体の足場中の少なくとも1のネオエピトープの保護をもたらすかもしれない。
【００７０】
ある態様において、該単一ドメイン抗体はネオエピトープを含む露出したC末端ペプチドを含み、該既存抗体は、C末端ネオエピトープと特異的に相互作用する。該単一ドメイン抗体のC末端への少なくとも1のアミノ酸残基の付加、または該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも1のアミノ酸の欠失は、既存抗体がもはやネオエピトープを認識せず、該単一ドメイン抗体のC末端と相互作用しないように該ネオエピトープの構造を変化させる。
【００７１】
本明細書に記載のデータは、単離された単一ドメイン抗体の露出したC末端は既存抗体と相互作用するための好ましいネオエピトープであることを示す。ある態様において、既存抗体により認識される単離された単一ドメイン抗体の露出したC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端への少なくとも1のアミノ酸残基の付加によりマスクすることができる。
【００７２】
ある態様において、該単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単離された単一ドメイン抗体のC末端への少なくとも1のアミノ酸残基の付加によりマスクされる。別の態様において、該単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単離された単一ドメイン抗体のC末端への2の1アミノ酸残基の付加によりマスクされる。別の態様において、該単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端への少なくとも3のアミノ酸残基の付加によりマスクされる。別の態様において、該単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単離された単一ドメイン抗体のC末端への少なくとも4のアミノ酸残基の付加によりマスクされる。ある別の態様において、該単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単離された単一ドメイン抗体のC末端への少なくとも5のアミノ酸残基の付加によりマスクされる。別の態様において、該単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単離された単一ドメイン抗体のC末端への少なくとも6のアミノ酸残基の付加によりマスクされる。別の態様において、該単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単離された単一ドメイン抗体のC末端への少なくとも7のアミノ酸残基の付加によりマスクされる。別の態様において、該単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単離された単一ドメイン抗体のC末端への少なくとも8のアミノ酸残基の付加によりマスクされる。別の態様において、該単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単離された単一ドメイン抗体のC末端への少なくとも9のアミノ酸残基の付加によりマスクされる。別の態様において、該単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単離された単一ドメイン抗体のC末端への少なくとも10のアミノ酸残基の付加によりマスクされる。別の態様において、該単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単離された単一ドメイン抗体のC末端への少なくとも1〜10のアミノ酸残基の付加によりマスクされる。
【００７３】
ある態様において、既存抗体により認識される該単一ドメイン抗体の露出したC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失により排除することができる。さらに、ある態様において、本発明は、C末端修飾を含む単離されたVH 単一ドメイン抗体であって、該該C末端修飾が、該単一ドメイン抗体中の少なくとも1のアミノ酸残基の欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく既存抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の欠失を含む抗体に関する。
【００７４】
ある態様において、既存抗体により認識される該単一ドメイン抗体の露出したC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失により排除される。別の態様において、既存抗体により認識される該単一ドメイン抗体の露出したC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端からの2の1アミノ酸残基の欠失により排除される。別の態様において、既存抗体により認識される該単一ドメイン抗体の露出したC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも3のアミノ酸残基の欠失により排除される。
別の態様において、既存抗体により認識される該単一ドメイン抗体の露出したC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも4のアミノ酸残基の欠失により排除される。ある態様において、既存抗体により認識される該単一ドメイン抗体の露出したC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも5のアミノ酸残基の欠失により排除される。別の態様において、既存抗体により認識される該単一ドメイン抗体の露出したC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端からの6のアミノ酸残基の欠失により排除される。別の態様において、既存抗体により認識される該単一ドメイン抗体の露出したC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも7のアミノ酸残基の欠失により排除される。別の態様において、既存抗体により認識される該単一ドメイン抗体の露出したC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも8のアミノ酸残基の欠失により排除される。別の態様において、既存抗体により認識される該単一ドメイン抗体の露出したC末端のネオエピトープは、該C末端からの9のアミノ酸残基の欠失により排除される。別の態様において、既存抗体により認識される該単一ドメイン抗体の露出したC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも10のアミノ酸残基の欠失により排除される。別の態様において、既存抗体により認識される該単一ドメイン抗体の露出したC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも1〜10のアミノ酸残基の欠失により排除される。
【００７５】
ある態様において、ABD、例えば単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、表１に記載のアミノ酸残基の付加または欠失により変化する。
表１：C末端修飾
2015531350.tif 000003
C末端に付加を有するヒトVH
【００７６】
ある態様において、該C末端修飾は、VH鎖のC末端への1〜5アミノ酸の付加である。ある態様において、単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端へのAlaの付加によりマスクされる。ある態様において、単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端へのAla-Alaの付加によりマスクされる。ある態様において、単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端へのAla-Serの付加によりマスクされる。ある態様において、単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端へのAla-Ser-Thrの付加によりマスクされる。ある態様において、単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端へのAla-Ser-Thr-Lys-Pro (配列番号14)の付加によりマスクされる。ある態様において、単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端へのGly-Gly-Gly-Gly-Ser (配列番号15)の付加によりマスクされる。ある態様において、単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端へのAla-Ser-Thr-Lys-Pro (配列番号14)の付加によりマスクされる。ある態様において、単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端へのGly-Glyの付加によりマスクされる。ある態様において、単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端へのGly-Serの付加によりマスクされる。
【００７７】
さらに、ある態様において、本発明は、C末端修飾を含む単離されたVH単一ドメイン抗体であって、該C末端修飾が、該単一ドメイン抗体における少なくとも1のアミノ酸残基の付加が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の付加を含む抗体に関する。
【００７８】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号8を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は1アミノ酸〜3アミノ酸の付加を含む。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は、配列番号9を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は1アミノ酸〜3アミノ酸の付加を含む。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号10を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は1アミノ酸〜3アミノ酸の付加を含む。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号11を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は1アミノ酸〜3アミノ酸の付加を含む。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号12を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は1アミノ酸〜3アミノ酸の付加を含む。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号13を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は1アミノ酸〜3アミノ酸の付加を含む。
【００７９】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号8を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は、Ala、Ala-Ala、Ala-Ser、Ala-Ser-Thr、Ala-Ser-Thr-Lys-Pro (配列番号14)およびGly-Gly-Gly-Gly-Ser (配列番号15) からなる群から選ばれるアミノ酸残基の付加を含む。
【００８０】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は、配列番号9を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は、Ala、Ala-Ala、Ala-Ser、Ala-Ser-Thr、Ala-Ser-Thr-Lys-Pro (配列番号14)およびGly-Gly-Gly-Gly-Ser (配列番号15)からなる群から選ばれるアミノ酸残基の付加を含む。
【００８１】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号10を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は、Ala、Ala-Ala、Ala-Ser、Ala-Ser-Thr、Ala-Ser-Thr-Lys-Pro (配列番号14)およびGly-Gly-Gly-Gly-Ser (配列番号15)からなる群から選ばれるアミノ酸残基の付加を含む。
【００８２】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は、配列番号11を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は、Ala、Ala-Ala、Ala-Ser、Ala-Ser-Thr、Ala-Ser-Thr-Lys-Pro (配列番号14)およびGly-Gly-Gly-Gly-Ser (配列番号15)からなる群から選ばれるアミノ酸残基の付加を含む。
【００８３】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号12を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は、Ala、Ala-Ala、Ala-Ser、Ala-Ser-Thr、Ala-Ser-Thr-Lys-Pro (配列番号14)およびGly-Gly-Gly-Gly-Ser (配列番号15)からなる群から選ばれるアミノ酸残基の付加を含む。
【００８４】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号13を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は、Ala、Ala-Ala、Ala-Ser、Ala-Ser-Thr、Ala-Ser-Thr-Lys-Pro (配列番号14)およびGly-Gly-Gly-Gly-Ser (配列番号15) からなる群から選ばれるアミノ酸残基の付加を含む。
【００８５】
図4〜9は、多くの野生型VH単一ドメイン足場に対する既存抗体反応の存在を示す。これらの図は、各該足場を用いて各VH単一ドメイン足場のC末端への１またはそれ以上のアミノ酸残基の付加による既存抗体反応の完全な排除または顕著な低下がみられることを明確に示す。該データは、Ala-Ser-Thr アミノ酸付加で他の付加に比べて反応が増加する傾向があることも示す。該データは、VH足場で安定化VH S-S足場より反応が高いことも示す。興味深いことに、多くの野生型VL単一ドメイン足場を用いた現在のアッセイでは既存抗体反応は検出されなかった。
C末端に付加を有するヒトVL
【００８６】
別の局面において、本発明は、C末端修飾を含む単離されたVL単一ドメイン抗体であって、該C末端修飾が、単一ドメイン抗体に対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく既存抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失を含む、VLがκ軽鎖であり、該κ軽鎖のC末端がLysアミノ酸残基で終わる抗体に関する。ある態様において、Lysが、Kabatの番号付けに基づいて107位のアミノ酸である。
【００８７】
ある態様において、該単一ドメイン抗体は、配列番号2および配列番号3からなる群から選ばれるヒトVLフレームワーク足場を含む。ある態様において、該単一ドメイン抗体は、配列番号2を含むヒトVLフレームワーク足場および1アミノ酸〜3アミノ酸残基の付加を含むC末端修飾を含む。ある態様において、該単一ドメイン抗体は、配列番号3を含むヒトVLフレームワーク足場および1アミノ酸〜3アミノ酸残基の付加を含むC末端修飾を含む。ある態様において、該単一ドメイン抗体は、配列番号2を含むヒトVLフレームワーク足場およびArg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Arg-Thr-Val-Ala、およびArg-Thr-Val-Ala-Alaからなる群から選ばれるアミノ酸残基の付加を含むC末端修飾を含む。ある態様において、該単一ドメイン抗体は、配列番号3を含むヒトVLフレームワーク足場およびArg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Arg-Thr-Val-Ala、およびArg-Thr-Val-Ala-Alaからなる群から選ばれる1アミノ酸〜3アミノ酸残基の付加を含むC末端修飾を含む。
【００８８】
ある態様において、該単一ドメイン抗体は配列番号2を含むヒトVLフレームワーク足場を含み、該C末端修飾はArg-Thr-Valの付加を含む。ある態様において、該単一ドメイン抗体は配列番号2を含むヒトVLフレームワーク足場を含み、該C末端修飾はArg-Thr-Val-Alaの付加を含む。
【００８９】
ある態様において、該単一ドメイン抗体は配列番号3を含むヒトVLフレームワーク足場を含み、該C末端修飾はArg-Thr-Valの付加を含む。ある態様において、該単一ドメイン抗体は配列番号3を含むヒトVLフレームワーク足場を含み、該C末端修飾はArg-Thr-Val-Alaの付加を含む。
【００９０】
ある態様において、該単一ドメイン抗体は、配列番号2および配列番号3からなる群から選ばれるヒトVLであり、1アミノ酸〜5アミノ酸残基のC末端欠失を含む。
【００９１】
ある態様において、該C末端修飾は、VL鎖のC末端への1〜5アミノ酸の付加である。ある態様において、該VL鎖はκ軽鎖である。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端へのArg-Thr-Valの付加でマスクされる。ある態様において、該単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単離された単一ドメイン抗体のC末端へのArg-Thr-Val-Alaの付加でマスクされる。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端へのArg-Thr-Val-Ala-Ala (配列番号183)の付加でマスクされる。特定の態様において、該単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端へのArg-Thr-Valの付加でマスクされる。λ軽鎖 (配列番号4〜7)ではなくκ軽鎖 (配列番号2および3)における1〜3アミノ酸残基の付加は既存免疫反応を低下させる。図20において、107位 (Kabatにより決定した)がLysで終わるHVHLP335 κ単一ドメイン(配列番号2)は既存免疫反応を示さない。しかしながら、単一ドメイン抗体のC末端への単一アミノ酸 (例えばArg)の付加は、既存抗体に対する免疫反応の増加をもたらす。これは、該単一ドメイン抗体のC末端への2アミノ酸(例えば、Arg-Thr)の付加により観察される。しかしながら、3(例えば、Arg-Thr-Val)またはそれ以上のアミノ酸 (例えば、Arg-Thr-Val-AlaまたはArg-Thr-Val-Ala-Ala)を該単一ドメイン抗体のC末端に付加すると、該既存免疫反応は消失する。このデータは、VEIKで終わる単一ドメイン抗体のC末端のArg-Thr-Val-Ala-Ala配列の周辺にネオエピトープがあるらしいことを示す。
C末端に欠失を有するヒトVH
【００９２】
ある態様において、既存抗体により認識される該単一ドメイン抗体の露出したC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも1のアミノ酸残基の欠失により排除することができる。さらに、ある態様において、本発明は、C末端修飾を含む単離されたVH単一ドメイン抗体であって、該C末端修飾が、該単一ドメイン抗体における少なくとも1のアミノ酸残基の欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の欠失を含む抗体に関する。
【００９３】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端のArgの欠失により排除される。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端のArg-Thrの欠失により排除される。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端のArg-Thr-Valの欠失により排除される。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端のGly-Glnの欠失により排除される。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体のC末端のネオエピトープは、該単一ドメイン抗体のC末端のGly-Gln-Proの欠失により排除される。
【００９４】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号8を含むVHフレームワーク足場および1アミノ酸〜3アミノ酸残基の欠失を含むC末端修飾を含む。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号9を含むVHフレームワーク足場および1アミノ酸〜3アミノ酸残基の欠失を含むC末端修飾を含む。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号10を含むVHフレームワーク足場および1アミノ酸〜3アミノ酸残基の欠失を含むC末端修飾を含む。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号11を含むVHフレームワーク足場および1アミノ酸〜3アミノ酸残基の欠失を含むC末端修飾を含む。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号12を含むVHフレームワーク足場および1アミノ酸〜3アミノ酸残基の欠失を含むC末端修飾を含む。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号13を含むVHフレームワーク足場および1アミノ酸〜3アミノ酸残基の欠失を含むC末端修飾を含む。
【００９５】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号8を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾はArg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Gly-Gln、およびGly-Gln-Proからなる群から選ばれる1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む。
【００９６】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号9を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は、Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Gly-Gln、およびGly-Gln-Proからなる群から選ばれる1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む。
【００９７】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号10を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は、Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Gly-Gln、およびGly-Gln-Proからなる群から選ばれる1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む。
【００９８】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号11を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は、Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Gly-Gln、およびGly-Gln-Proからなる群から選ばれる1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む。
【００９９】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号12を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は、Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Gly-Gln、およびGly-Gln-Proからなる群から選ばれる1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む。
【０１００】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号13を含むVHフレームワーク足場を含み、該C末端修飾は、Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Gly-Gln、およびGly-Gln-Proからなる群から選ばれる1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む。
C末端に欠失を含むヒトVL
【０１０１】
ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は、配列番号2を含むVLフレームワーク足場および1アミノ酸〜3アミノ酸残基の欠失を含むC末端修飾を含む。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は、配列番号3を含むVLフレームワーク足場および1アミノ酸〜3アミノ酸残基の欠失を含むC末端修飾を含む。ある態様において、該単離された単一ドメイン抗体は配列番号2を含むVLフレームワーク足場を含み、該C末端修飾はC末端からの1アミノ酸(例えば、Arg)の欠失を含む。
【０１０２】
該データは、VLλ軽鎖でなく、107位(Kabatにより決定した)がLysで終わるVLκ軽鎖のみが既存免疫反応しやすいことを示す。理論に縛られるものではないが、本出願人は、VEIK配列からの少なくとも1のアミノ酸の欠失（VEIを生じる）が既存免疫反応を消失させることから、VLκ軽鎖のC末端VEIK配列周辺のネオエピトープが既存免疫反応に関与する考える。VEIKでは免疫反応はみられなかったが、C末端VEIK配列に対する1アミノ酸残基 (例えば、Arg)または2アミノ酸残基 (例えば、Arg-Thr)の付加（VEIKRまたはVEIKRTをもたらす）は既存免疫反応を増加させる。しかしながら、C末端VEIK配列への3アミノ酸残基(例えば、Arg-Thr-Val)〜4アミノ酸残基(例えば、Arg-Thr-Val-Ala)のさらなる付加（それぞれVEIKRTVまたはVEIKRTVAをもたらす）は、再度既存免疫反応を消失させる。したがって、既存抗体または既存免疫分子の相互作用に関与すると思われるC末端VEIK配列周辺の3〜4アミノ酸残基に限られるようである。
【０１０３】
ある態様において、本開示は、C末端修飾を含む単離されたVH単一ドメイン抗体であって、該C末端修飾が、該単一ドメイン抗体における少なくとも1のアミノ酸残基の欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の欠失を含む抗体に関する。
【０１０４】
ある態様において、該単一ドメイン抗体のC末端は、露出したC末端が既存抗体と相互作用するのに利用できるように露出しており、C末端修飾は該C末端の該既存抗体に対する暴露を減少させる。
【０１０５】
ある態様において、該C末端修飾は、既存抗体がもはや該単一ドメイン抗体を認識しないようにC末端単一ドメイン抗体の三次元配置を変化させることにより既存抗体の相互作用を排除することからなる群から選ばれるメカニズムにより該単一ドメイン抗体のC末端を修飾し、該C末端単一ドメイン抗体の既存抗体への暴露を変化させ、単一ドメイン抗体と既存抗体との立体障害を変化させ、該C末端の少なくとも1のコンフォメーションネオエピトープを破壊し、および該単一ドメイン抗体の足場中の少なくとも1のネオエピトープを保護する。
【０１０６】
ある態様において、該単一ドメイン抗体はヒトVHである。
【０１０７】
ある態様において、ヒトVHは、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、および配列番号13からなる群から選ばれる。
【０１０８】
ある態様において、該アミノ酸残基は、天然アミノ酸または非天然アミノ酸からなる群から選ばれる。ある態様において、該C末端修飾は、さらに単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも1のさらなるアミノ酸残基の欠失を含む。
【０１０９】
ある態様において、該C末端修飾は、さらに該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも2のさらなるアミノ酸残基の欠失を含むC末端修飾をさらに含む。
【０１１０】
ある態様において、該C末端修飾は、該単一ドメイン抗体のC末端からの少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9のさらなるアミノ酸残基の欠失をさらに含む。
【０１１１】
ある態様において、該C末端修飾は、Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Gly-Gln、およびGly-Gln-Proからなる群から選ばれるアミノ酸配列の欠失である。
【０１１２】
ある態様において、該C末端修飾は、既存抗体反応をC末端修飾を含まない該単一ドメイン抗体に比べて少なくとも約10％排除する。
【０１１３】
ある態様において、該VHは配列番号8を含み、該C末端修飾は1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む。ある態様において、該VHは配列番号9を含み、該C末端修飾は1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む。ある態様において、該VHは配列番号10を含み、該C末端修飾は、1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む。ある態様において、該VHは配列番号11を含み、該C末端修飾は1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む。ある態様において、該VHは配列番号12を含み、該C末端修飾は1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む。ある態様において、該VHは配列番号13を含み、該C末端修飾は1アミノ酸〜3アミノ酸の欠失を含む。ある態様において、本発明は、該単一ドメイン抗体の組成物をコードする核酸、該核酸を含む発現ベクター、および該発現ベクターを含む宿主細胞または生物に関する。
【０１１４】
ある態様において、本開示は、C末端修飾を含む単一ドメイン抗体を投与することを含む対象の既存免疫反応を排除する方法であって、該C末端修飾が、該単一ドメイン抗体に対する少なくとも1のアミノ酸残基の欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく既存抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の欠失を含む方法に関する。
【０１１５】
ある態様において、本開示は、C末端修飾を含む単一ドメイン抗体を投与することを含む単一ドメイン抗体に対する既存抗体を有する対象の単一ドメイン抗体に対する反応を改善する方法であって、該C末端修飾が、該単一ドメイン抗体に対する少なくとも1のアミノ酸残基の欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存の抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の欠失を含む方法に関する。
【０１１６】
ある態様において、本開示は、既存抗体が単一ドメイン抗体との既存免疫反応を生じるか否かを予測する方法であって、単一ドメイン抗体をヒト試料と接触させ、既存抗体がヒト試料中に存在する場合は、既存抗体が該単一ドメイン足場と結合するか否かを決定し、C末端修飾が該単一ドメイン抗体と既存抗体の相互作用を排除するように少なくとも1のアミノ酸残基の欠失により該単一ドメイン抗体のC末端領域を修飾することを含む方法に関する。ある態様において、ヒト試料は血液および血清からなる群から選ばれる。
ホモローガスな単一ドメイン抗体
【０１１７】
別の局面において、本開示は、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、および配列番号13、および配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、および配列番号7からなる群から選ばれるアミノ酸配列とホモローガスなVHまたはVLを含む露出したC末端を有する単離された単一ドメイン抗体であって、該単一ドメイン抗体のC末端が、少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく既存抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失によって修飾されている抗体に関する。
【０１１８】
ある態様において、本開示は、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、および配列番号13からなる群から選ばれるアミノ酸配列とホモローガスな露出したC末端を有するVH 単一ドメイン抗体であって、該単一ドメイン抗体のC末端が、少なくとも１のアミノ酸残基の欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく既存抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の欠失によって修飾されている抗体に関する。
【０１１９】
ある態様において、本開示は、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、および配列番号7からなる群から選ばれるアミノ酸残基とホモローガスな露出したC末端を有するVL単一ドメイン抗体であって、該単一ドメイン抗体のC末端が、少なくとも１のアミノ酸残基の欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく既存抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の欠失によって修飾されている抗体に関する。
【０１２０】
ある態様において、本開示は、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、および配列番号13からなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一なアミノ酸配列を含む単離されたVHを提供する。別の態様において、本開示は、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、および配列番号7からなる群から選ばれるアミノ酸配列と少なくとも50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一な単離されたVLを提供する。哺乳動物細胞中で発現するように最適化されたVHおよびVL親ヌクレオチド配列も本開示の範囲内に含まれる。突然変異してもまだ上記配列と少なくとも60％、70％、80％、90％、95％、98％、または99％の同一性を有するアミノ酸または核酸も本開示の範囲内である。ある態様において、それらは、上記配列と比べて、わずか1、2、3、4、または5アミノ酸がVHまたはVL中のアミノ酸の欠失、挿入、または置換により突然変異している突然変異アミノ酸配列を含む。
【０１２１】
保存的修飾を有する露出したC末端を有する単離された単一ドメイン抗体であって、該単一ドメイン抗体のC末端が、単一ドメイン抗体に対する少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失が該単一ドメイン抗体とその標的との結合を妨げることなく少なくとも１の既存抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように少なくとも１のアミノ酸残基の付加または欠失により修飾されている抗体も本開示の範囲内である。
【０１２２】
ポリペプチド配列に関して「保存的配列修飾」には、アミノ酸の化学的に同様なアミノ酸による置換を生じるポリペプチド配列に対する個々の置換、欠失、または付加も含まれる。機能的に同様なアミノ酸をもたらす保存的置換表は当該分野で良く知られている。そのような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間同族体、および対立遺伝子に加えて、それらを除外しない。下記8グループは、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：1) アラニン(A)、グリシン(G)；2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；4) アルギニン(R)、リジン(K)；5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；7) セリン(S)、トレオニン(T)；および8) システイン(C)、メチオニン(M)(例えば、Creighton、Proteins(1984)参照)。ある態様において、用語「保存的配列修飾」は、該アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に顕著な影響を及ぼさないかまたはそれを変化させないアミノ酸修飾を表すのに用いる。
【０１２３】
2またはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において用語「パーセント同一」または「パーセント同一性」は、同じである2またはそれ以上の配列またはサブ配列を表す。2つの配列を、下記配列比較アルゴリズムの１つを用いるか、またはマニュアルアラインメントおよび目視検査により測定した指定領域または比較ウインドウで比較し、最大に対応するようにアラインメントした時に同じ(すなわち、特定領域、または特定していない場合は全配列について60％同一、所望により65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、または99％同一)であるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定パーセンテージを有する時に2つの配列は「実質的に同一」という。所望により、該同一性は、長さが少なくとも約50ヌクレオチド（または10アミノ酸）である領域、またはより好ましくは長さが100〜500または1000またはそれ以上のヌクレオチド(または20、50、200またはそれ以上のアミノ酸)である領域にわたり存在する。
【０１２４】
配列比較では、典型的には１つの配列が試験配列と比較する基準配列の役割を果たす。配列比較アルゴリズムを用いるときは、試験配列および基準配列をコンピューターに入力し、必要であればサブ配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを用いるか、別のパラメーター指定することができる。次に、配列比較アルゴリズムにより、プログラムパラメーターに基づき基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【０１２５】
本明細書で用いている「比較ウインドウ」には、配列を、2つの配列を最適にアラインメントした後の隣接位置の同じ番号の基準配列と比較することができる20〜600、通常約50〜約200、より通常約100〜約150からなる群から選ばれる隣接位置数のいずれかの断片に対する言及を含む。比較のための配列のアラインメント方法は当該分野でよく知られている。比較のための配列の最適アラインメントは、例えば以下の方法により行うことができる：SmithおよびWaterman、(1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの部分相同性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch、(1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズム、PearsonおよびLipman、(1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索法、これらアルゴリズムのコンピューターによる実施(GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA（Wisconsin Geneticsソフトウエアパッケージ、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、Madison、WI)、またはマニュアルアラインメントおよび目視検査(例えば、Brent et al.、(2003) Current Protocols in Molecular Biology参照)。
【０１２６】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの2つの例には、それぞれAltschul et al.、(1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402；およびAltschul et al.、(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載のBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムがある。BLAST分析を行うためのソフトウエアは、National Center for Biotechnology Informationから公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントするといくつかの正の値の閾値スコアTとマッチするかまたはそれを満たすクエリー配列中の長さWの短いワードを同定することにより高スコア配列ペア(HSPs)を最初に同定することを含む。Tは、隣接ワードスコア閾値を表す(Altschul et al.、上記)。これらの初期隣接ワードヒットは、それを含むより長いHSPをみいだすための検索を開始するためのシードとして働く。該ワードヒットは、累積アラインメントスコアを増加させることができる限り各配列に沿って両方向に伸張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてパラメーターM(マッチする残基のペアに対するリワードスコア；常に＞0)およびN（ミスマッチする残基に対するペナルティスコア；常に＜0)を用いて計算する。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。各方向の該ワードヒットの伸張は、累積アラインメントスコアがその最大到達値から量Xだけ低下するか、該累積スコアが1またはそれ以上の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積により0またはそれ以下になるか、またはいずれかの配列の末端に達すると停止する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T、およびXは、アラインメントの感度と速度を決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列について)は、デフォルトとしてワード長(W)11、期待(E)10、M=5、N=−4、両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列について、BLASTPプログラムは、デフォルトとしてワード長3、および期待(E)10、およびBLOSUM62スコアリングマトリックス(HenikoffおよびHenikoff、(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915参照)、アラインメント(B)50、期待(E)10、M=5、N=−4、および両鎖の比較を用いる。
【０１２７】
BLASTアルゴリズムは、2配列間の類似性の統計分析も行う(例えば、KarlinおよびAltschul、(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787参照)。BLASTアルゴリズムにより得られる類似性の1尺度は、最小和確率(P(N))、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然起きる確率の指標となる。例えば、核酸は、基準核酸と試験核酸を比較した最小和確率が約0.2以下、より好ましくは約0.01以下、および最も好ましくは約0.001以下であれば基準配列と類似していると考えられる。
【０１２８】
2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、PAM120ウエイト残基表、ギャップ長ペナルティ12およびギャップペナルティ4を用いてALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれているE. MeyersおよびW. Millerのアルゴリズム（(1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17)を用いて決定することもできる。さらに、2アミノ酸配列間のパーセント同一性は、Blossom 62マトリックスまたはPAM250マトリックス、およびギャップウエイト16、14、12、10、8、6、または4および長さウエイト1、2、3、4、5、または6を用いるGCGソフトウエアパッケージのGAPプログラム(www.gcg.comで利用可能)に組み込まれているNeedlemanおよびWunsch（(1970) J. Mol. Biol. 48:444-453) アルゴリズムを用いて決定することができる。
【０１２９】
上記配列同一性パーセンテージ以外の2つの核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一であることの別の指標は、第1核酸がコードするポリペプチドが下記のごとく第2核酸がコードするポリペプチドに対して生じる抗体と免疫学的に交差反応することである。すなわち、ポリペプチドは、典型的には、例えば2つのペプチドが保存的置換されていることだけが異なる第2ポリペプチドと実質的に同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であることの別の指標は、2分子またはその相補物と下記のごとくストリンジェント条件下で互いにハイブリダイズすることである。2つの核酸配列が実質的に同一であるさらにべつの指標は、該配列の増幅に同じプライマーを用いることができることである。
操作および修飾単一ドメイン抗体
【０１３０】
別の局面において、既存抗体との相互作用を排除するように修飾された露出したC末端を有する単離された単一ドメイン抗体は、さらに、出発単一ドメイン抗体と毒性が変化している修飾単一ドメイン抗体を操作するための出発物質として単一ドメイン抗体のVHおよび/またはVL配列の1またはそれ以上を用いて操作することができる。該露出したC末端を有する単離された単一ドメイン抗体は、VHおよび/またはVL配列の１または両方内、例えば1またはそれ以上のCDR領域内および/または1またはそれ以上の足場領域内の1またはそれ以上の残基を修飾することにより操作することができる。
【０１３１】
行うことができる可変領域操作の1つはCDRグラフティングである。単一ドメイン抗体は、主としてCDRに位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、CDR内のアミノ酸配列は、CDRの外側の配列より個々の単一ドメイン抗体間の多様性が大きい。CDR配列はほとんどの抗体抗原相互作用に関与するため、特性が異なる種々の抗体由来のフレームワーク足場にグラフトされた野生型一本鎖抗体由来のCDR配列を含む発現ベクターを構築することにより特異的野生型一本鎖抗体の特性と良く似た組換え一本鎖抗体を発現させることができる(例えば、Riechmann et al.、(1998) Nature 332:323-327；Jones et al.、(1986) Nature 321:522-525；Queen et al.、(1989) Proc. Natl. Acad.、U.S.A. 86:10029-10033；Winterの米国特許No. 5,225,539、およびQueen et al.らの米国特許No. 5,530,101；5,585,089；5,693,762および6,180,370 to参照)。
【０１３２】
別の態様において、該単離された単一ドメイン抗体は、例えば、1またはそれ以上のCys残基の付加によりその足場領域を修飾することができる。例えば、単一ドメイン抗体は、抗体可変領域のフレームワーク領域FR2およびFR3内に導入された少なくとも2の非標準的Cys残基を含むポリペプチド配列を含み得る。ある態様において、該ポリペプチドは、VH sdAbドメインのVH FR2領域の残基47〜49から選ばれる位置にCys残基、およびVH FR3領域の残基69〜71から選ばれる位置にCys残基を含む。ある態様において、該ポリペプチドは、上記のVL sdAbドメインのVL FR2領域の残基46〜49から選ばれる位置にCys残基、およびVL FR3 領域の残基62〜66から選ばれる位置にCys残基を含む(WO2012/100343参照(この内容は本明細書の一部を構成する))。
二特異的および多価抗体
【０１３３】
別の局面において、既存抗体との相互作用を排除するように修飾された露出したC末端を有する単離された単一ドメイン抗体は、二特異的または多価抗体でありうる。修飾C末端を有する該単離された単一ドメイン抗体を、別の機能的分子、例えば別のペプチドまたはタンパク質（例えば別の抗体またはレセプターに対するリガンド）と結合させるかまたは誘導体化し、少なくとも2の異なる結合部位または標的分子と結合する二特異的分子を生成することができる。
【０１３４】
さらなる臨床的利点は、ある抗体内の2またはそれ以上の抗原の結合により得ることができる(Morrison et al.、(1997) Nature Biotech. 15:159-163；Alt et al.(1999) FEBS Letters 454:90-94；Zuo et al.、(2000) Protein Engineering 13:361-367；Lu et al.、(2004) JBC 279:2856-2865；Lu et al.、(2005) JBC 280:19665-19672；Marvin et al.、(2005) Acta Pharmacologica Sinica 26:649-658；Marvin et al.、(2006) Curr Opin Drug Disc Develop 9:184-193；Shen et al.、(2007) J Immun Methods 218:65-74；Wu et al.、(2007) Nat Biotechnol. 11:1290-1297；Dimasi et al.、(2009) J Mol Biol. 393:672-692；およびMichaelson et al.、(2009) mAbs 1:128-141参照)。
【０１３５】
二特異的分子は、1の一本鎖抗体および結合決定基を含む一本鎖分子、または2の結合決定基を含む一本鎖二特異的分子でありうる。二機能的分子は、少なくとも2の一本鎖分子を含みうる。二機能的分子の製造方法は、例えば米国特許No.5,260,203；米国特許No.5,455,030；米国特許No.4,881,175；米国特許No.5,132,405；米国特許No.5,091,513；米国特許No.5,476,786；米国特許No.5,013,653；米国特許No.5,258,498；および米国特許No.5,482,858に記載されている。
【０１３６】
二特異的分子を作製するには、修飾C末端を有するVHまたはVLは、二特異的分子を生じるように1またはそれ以上の他の結合分子、例えば、別の単一ドメイン抗体、抗体、抗体断片、ペプチド、または結合模倣物と機能的に（例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合その他により）結合させることができる。該二機能的分子は、当該分野で知られた方法を用いて構成結合特異性を結合することにより作製することができる。例えば、二特異的分子の各結合特性は独立して生成し、次いで互いに結合することができ、例えば、種々のカップリング剤または架橋剤を共有結合に用いることができる。架橋剤の例には以下のものが含まれる：プロテインA、カルボジイミド、N-スクシンイミジル-S-アセチル-チオアセテート(SATA)、5,5'-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)(DTNB)、o-フェニレンジマレイミド(oPDM)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)、およびスルホスクシンイミジル 4-(N-マレイミドメチル) シクロヘキサン-l-カルボキシレート(スルホ-SMCC)(例えば、Karpovsky et al.、(1984) J. Exp. Med. 160:1686；Liu et al.、(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648参照)。他の方法には、Paulus(1985) Behring Ins. Mitt. No. 78:118-132；Brennan et al.、(1985) Science 229:81-83)、およびGlennie et al.、(1987) J. Immunol. 139：2367-2375に記載のものが含まれる。結合剤にはSATAおよびスルホ-SMCCがあり、どちらもPierce Chemical Co.(Rockford、IL)から利用可能である。
【０１３７】
二機能的分子のその特異標的との結合は、例えば、酵素免疫測定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(REA)、FACS分析、バイオアッセイ(例えば成長阻害)、またはウエスタンブロットアッセイにより確認することができる。これらの各アッセイは、一般的に、興味深い複合体に特異的な標識試薬(例えば、抗体)を用いて特に興味深いタンパク質抗体複合体の存在を検出する。
単一ドメイン抗体の製造方法
【０１３８】
ある態様において、既存抗体との相互作用を排除するように修飾された露出したC末端を有する単離された単一ドメイン抗体は、望ましい抗原に対するVHHドメインを得、(i)抗原に対する配列について重鎖抗体配列および/またはVHH配列を含むライブラリーをスクリーニングし、(ii)該ライブラリーから該重鎖および/またはVHH配列を得、次いで(iii)該露出したC末端に存在する少なくとも1のアミノ酸の欠失または付加により該重鎖由来のVHH配列および/またはVHH配列を修飾することにより得ることができる。
【０１３９】
ある態様において、既存抗体との相互作用を排除するように修飾された露出したC末端を有する単離された単一ドメイン抗体は、さらに以下の工程を含みうる：(iv)該重鎖抗体配列および/またはVHH配列を突然変異誘発(例えば、ランダム突然変異誘発または部位指向性突然変異誘発)にかけて抗原に対する親和性および/または特異性を増加させ、(v)重鎖および/またはVHH配列から突然変異単一ドメイン抗体を得る。
ヌクレオチドおよびアミノ酸置換を用いる単一ドメイン抗体の生成
【０１４０】
既存抗体との相互作用を排除するように修飾された露出したC末端を有する単離された単一ドメイン抗体は、さらに種々の既知の方法により生じさせることができる1またはそれ以上のアミノ酸またはヌクレオチド修飾(例えば変更)を含みうる。典型的には、露出したC末端を有する単離された単一ドメイン抗体は組換え法により生成される。さらに、遺伝子コードの縮重により種々の核酸配列を用いて各目的分子をコードすることができる。
【０１４１】
出発分子のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子を製造するための当該分野で認められた典型的な方法には、限定されるものではないが、該分子をコードする先に製造したDNAの部位指向性(またはオリゴヌクレオチド介在)突然変異誘発、PCR突然変異誘発、およびカセット突然変異誘発による製造が含まれる。
【０１４２】
部位指向性突然変異誘発は置換変異体の好ましい製造方法である。この技術は当該分野でよく知られている(例えば、Carter et al. Nucleic Acids Res. 13:4431-4443(1985)およびKunkel et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 82:488(1987))。簡単には、DNAの部位指向性突然変異誘発を行うには、親DNAを望ましい突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを最初に該親DNAの一本鎖とハイブリダイズすることにより変化させる。ハイブリダイゼーション後、DNAポリメラーゼを用い、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドをプライマーに、親DNAの一本鎖をテンプレートに用いて完全な第2鎖を合成する。すなわち、望む突然変異をコードするオリゴヌクレオチドが、得られる二本鎖DNAに組み込まれる。
【０１４３】
PCR突然変異誘発は、出発分子のアミノ酸配列変異体を製造するのにも適している。Higuchi、PCR Protocols中、pp.177-183(Academic Press、1990)；およびVallette et al.、Nuc. Acids Res. 17:723-733(1989)を参照のこと。簡単には、少量のテンプレートDNAをPCRの出発物質として用いる場合は、テンプレートDNA中の対応領域と配列がわずかに異なるプライマーを用い、プライマーがテンプレートと異なる位置でのみテンプレート配列と異なる比較的大量の特異的DNA断片を生じさせることができる。
【０１４４】
変異体を製造するための別の方法であるカセット突然変異誘発は、Wells et al.、Gene 34:315-323(1985)に記載の技術に基づく。該出発物質は、突然変異させる出発ポリペプチドDNAを含むプラスミド（または他のベクター）である。突然変異させる親DNA中のコドンを同定する。同定された突然変異部位の各部位上に特有の制限エンドヌクレアーゼ部位がなければならない。そのような制限部位が存在しなければ、出発ポリペプチドDNAの適切な位置に制限部位を導入するための上記オリゴヌクレオチド介在突然変異誘発法を用いて該制限部位を作ることができる。プラスミドDNAをこれらの部位で切断て線状化する。該制限部位間のDNAの配列をコードするが望ましい突然変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを標準的方法を用いて合成する（ここで、該オリゴヌクレオチドの二本鎖は独立して合成され、次いで標準的技術を用いて互いにハイブリダイズされる）。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットという。このカセットは、該カセットがプラスミドと直接結合することができるように線状化プラスミドの末端と適合する5'および3'末端を有するように設計される。このプラスミドは今や突然変異DNA配列を含む。
【０１４５】
あるいはまたはさらに、該分子のポリペプチド変異体をコードする望ましいアミノ酸配列を決定し、そのようなアミノ酸配列変異体をコードする核酸配列を合成的に作製することができる。ある態様において、種々の種のコドン使用表を組み込み、タンパク質発現を最適化するためにヌクレオチド配列を修飾する。当業者は、露出したC末端を有する単一ドメイン抗体を発現させる細胞の種に応じて種々のコドン最適化チャートを参照するだろう。
【０１４６】
当業者は、本開示の単離された単一ドメイン抗体を、アミノ酸配列(例えば野生型変異体由来)は異なるが望ましい活性は変化しないようにさらに修飾することができると理解するだろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基にアミノ酸置換を生じるさらなるヌクレオチド置換を該タンパク質にもたらすことができる。例えば、分子中の非必須アミノ酸残基は同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基で置換することができる。別の態様において、アミノ酸のストリングは、側鎖ファミリーメンバーの順番および/または組成が異なる構造的に同様のストリングで置換することができる。すなわち、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている保存的置換を行うことができる。
【０１４７】
同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該分野で定義されており、塩基性側鎖(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分岐側鎖(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。
【０１４８】
アミノ酸置換の他に、本開示では、既存抗体と単離された単一ドメイン抗体のC末端との相互作用を減少させる分子を生成するための出発分子アミノ酸配列の他の修飾が予期される。ある態様において、該C末端に対する修飾が既存抗体と該単一ドメイン抗体のC末端との相互作用をマスクするように該単離された単一ドメイン抗体のC末端に1またはそれ以上のアミノ酸残基を付加することができる。別の態様において、該C末端の修飾が既存抗体と該単離された単一ドメイン抗体のC末端の相互作用を排除するように単離された単一ドメイン抗体のC末端から1またはそれ以上のアミノ酸残基を欠失させることができる。1またはそれ以上のアミノ酸付加または欠失を含むC末端修飾を有する該単離された単一ドメイン抗体は、既存抗体反応を、C末端修飾のない単一ドメイン抗体に比べて少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、または少なくとも約100％除去することが好ましい。
【０１４９】
ある態様において、本開示は、1またはそれ以上の天然アミノ酸残基を該単一ドメイン抗体のC末端に付加するC末端修飾を有する単離された単一ドメイン抗体に関する。ある態様において、本開示は、1またはそれ以上の非天然アミノ酸残基が単一ドメイン抗体のC末端に付加されたC末端修飾を有する単離された単一ドメイン抗体に関する。ある態様において、本開示は、1またはそれ以上の天然アミノ酸残基が該単一ドメイン抗体のC末端から欠失しているC末端修飾を有する単離された単一ドメイン抗体に関する。
ライブラリー構築およびスクリーニング
【０１５０】
該単一ドメイン抗体のライブラリーを作製するのに用いるWO2006/09974に記載の方法は本明細書の一部を構成する。ランダム化コドンを有するオリゴヌクレオチドを作製し、VH配列に組み込む。各固有のオリゴヌクレオチドは、VH遺伝子内に組み込まれ、修飾VH遺伝子はわずかな変化を有する配列のライブラリーを構成する。典型的には、該オリゴヌクレオチドは、VHのCDRまたはループがランダム化されるように設計される。例えば、VH CDRの1、2、または3すべてがランダム化されうる。次に、該VHライブラリーを、用いるライブラリーの種類に応じて適切なベクター中にクローニングし、該核酸配列をポリペプチドとして発現させる。該ライブラリーを、典型的にはパンニングにより該ライブラリーのポリペプチドと結合する分子についてスクリーニングする。該ライブラリーはファージディスプレイライブラリーまたは他のディスプレイライブラリー、例えばリボソームディスプレイおよび酵母ディスプレイでありうる。
【０１５１】
該選択方法により同定したVHまたはVLを単離したら、それをさらに操作して改善された生物物理学的特性、例えば可溶性、安定性、単量体性、結合特性、ヒト起源または高発現性を選択することができる。これは、in vitro組換え技術、例えばDNAシャッフリングまたはスタッガード伸張法により達成することができる。DNAシャッフリングは、第1（ドナー）および第2（アクセプター）ポリペプチド、例えば抗体断片のランダム断片への切断、次いでPCR用反応によるランダム断片の再構築を含む。次に、再構築断片をスクリーニングして望ましい特性を選択する。
【０１５２】
例えば、1またはそれ以上の高安定性VH（ドナー）を1またはそれ以上の充分な安定性を欠くVH（アクセプター）と混合し、DNAシャッフリングにかけることができる。これは、ドナーVH由来の安定残基が組み込まれたアクセプターVHの突然変異体を生じる。該新たな安定な突然変異体は、本明細書に記載の方法、または他の進化したタンパク質スクリーニング系、例えばリボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌細胞ディスプレイ、およびファージディスプレイにより同定することができる。同様に、この技術を用いて望ましい特性、例えば、可溶性、単量体性、および高発現性を伝達することができる。
【０１５３】
両ドナーおよびアクセプターVHが共に望ましい特性を有するこの技術を用いて両特性を有するVHを生成することができる。新たに生成した安定なVHも該リガンドと結合する安定性を有するのを確実にするため、該スクリーニング系はリガンド結合工程を含みうる。
【０１５４】
DNAシャッフリングは、非ヒトVH、例えば、ラクダ類重鎖抗体可変ドメインおよびコモリザメ（nurse shark）およびテンジクザメ（wobbegong shark）可変ドメイン、または治療的標的と結合する非ヒトVLをヒト化するのにも有用でありうる。望ましい特性、例えば可溶性、安定性、単量体性、および高発現性を有するヒトVHおよびVLをドナーとして用いうる。例えば、1またはそれ以上の安定性が良いヒトVH（ドナー）を、1またはそれ以上の非ヒト治療的VH(アクセプター)と混合し、DNAシャッフリングにかけることができる。これは、安定でヒト化されているアクセプターVHの突然変異体を生じる。新たに生じた安定なヒト化突然変異体は、本明細書に記載の方法、または他の進化したタンパク質スクリーニング系、例えばリボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌細胞ディスプレイ、およびファージディスプレイにより同定することができる。さらなる例では該アクセプターVHは治療的VHH(ラクダ類重鎖抗体可変ドメイン)でありうる。
【０１５５】
さらに、この技術は、VHおよびVL以外のポリペプチドの望ましい特性を選択するのにも有用である。上記のごとく、該ドナーポリペプチドおよび該アクセプターポリペプチドは共にヒトでありうるか、または該ドナーがヒトで該アクセプターが非ヒトでありうる。
【０１５６】
VHおよびVLに可溶性、単量体性、高発現性、または安定性をもたらす考えられるアプローチは、アクセプターVHおよびVLへのCDRのグラフトを介してでありうる。CDRは、単一ドメイン抗体の可溶性および安定性、したがってこれら領域のグラフティングに関与することが知られており、例えば本明細書に記載の方法により単離されたVHおよびVL由来のCDRはアクセプターVHおよびVLに対する可溶性および/または安定性をもたらしうる。
【０１５７】
種々の生殖細胞系および全体配列を含む単量体ヒトVHを、ファージプラークサイズに基づく選択法を用いるナイーブヒトVHファージディスプレイライブラリーから同定することができる（例えばWO2006099747参照)。VHは、37℃でトリプシン処理、37℃で数週間インキュベーション、または4℃で数カ月間保存後に機能的および単量体のままであり、E. coli中で良好な収量で産生され、プロテインA結合活性を有する。さらに、種々の単量体ヒトVLを同定することができる。
【０１５８】
そのような特性は、上記VHを足場として利用することができる合成ライブラリー由来のVHによっても操作されるだろう。同様に、VLを足場として利用するライブラリーを作製することができる。好ましい生物物理学的特性を有する先に報告された完全ヒトVHは単一V生殖細胞系配列：DP-47に基づく(Jespers et al.(2004)、Nat. Biotechnol；22、1161-1165；およびJespers、et al.(2004) J. Mol. Biol. 337：893-903)。この試験の単量体ヒトVHがDP-47を含む6種の異なる生殖細胞系配列から生じるという観察結果は、安定なVHが生殖細胞系遺伝子の使用に関して制限されないことを示す。実際に、該選択はプロテインA結合活性を有するVH3ファミリーVHのサブセットに制限されず、本発明者らは、本明細書に記載のものと異なるファミリーおよび生殖細胞系起源の単量体VHを単離している可能性が高い。
【０１５９】
合成VHライブラリーは単一足場上に構築された。レパートリー生成に対するそのようなアプローチは、複数の足場を利用する天然のin vivo「アプローチ」とはきわめて対照的である。本明細書に記載の配列に基づいてVHおよびVLの多様なセットを利用可能であるという利点があり、複数のVHおよびVL足場に基づくライブラリーを生成することができる。そのようなライブラリーは、in vivo レパートリーのよりよいエミュレーションであり、より最適な複雑さを有するだろう。そのようなライブラリーは、好ましくは、親のCDR3長を壊すことなく単一VHまたはVL足場のCDR3ランダム化(および所望によりCDR1および/またはCDR2ランダム化)によりそれぞれ作製されるサブライブラリーからなる。
【０１６０】
本VHおよびVLの多様性は、治療的標的と特異的なVHH、VHおよびVLをヒト化するための最適なVHまたはVL足場を選択するのにも好都合である。治療標的に対する高親和性ラクダ類VHHは、比較的容易に免疫、非免疫、または合成VHHライブラリーから得られ、次いでヒト化（CDRグラフティング、リサーフェイシング、再免疫）して考えられるVHH免疫原性を除去することができ、したがって、治療的VHを製造するためのヒトVHライブラリーアプローチに対する選択肢を提供する。後者のアプローチによる高親和性治療的VHの生成は、一次合成ヒトVHライブラリーから選ばれるリードバインダーのさらなる長々と時間のかかるin vitro親和性熟成を必要とすることが多いかもしれない。
【０１６１】
治療標的に対する非ヒトVHは、比較的容易に免疫、非免疫、または合成VHライブラリーから得られ、次いでヒト化（CDRグラフティング、リサ−フェイシング、再免疫）して非ヒトVH免疫原性を除去することができ、したがって、治療的VHを製造するためのヒトVHライブラリーアプローチに対する選択肢を提供する。
【０１６２】
治療標的に対する非ヒトVLは、比較的容易に免疫、非免疫、または合成VHHライブラリーから得られ、次いでヒト化（CDRグラフティング、リサーフェイシング、再免疫）してVHH免疫原性を除去することができ、したがって、治療的VLを製造するためのヒトVLライブラリーアプローチに対する選択肢を提供する。
【０１６３】
典型的には、安定性圧（stability pressure）は、ライブラリーポピュレーションから不安定または安定性の低いものより安定な変異体を優先的に選択するのを保証するために改善された生物物理学的特性を有するタンパク質を選択するのに必要である(Forrer et al.(1999) Curr. Opin. Struct. Biol. 9：514-520；Waldo(2003) Curr. Opin. Chem. Biol. 7：33-38；Jung et al.(1999). J. Mol. Biol. 294：163-180；およびMatsuura et al.(2003) FEBS Lett. 539：24-28)。例えば、関連研究において、VHファージディスプレイライブラリーの加熱処理は、凝集抵抗性VHを選択するのに必要であった。ファージディスプレイを含む進化した選択アプローチの例には、常套的ファージディスプレイ、選択的感染ファージ、およびタンパク質分解アプローチが含まれる。最初の2つのアプローチでは、親和性選択を用い、安定なタンパク質が不安定なものよりそのリガンドに対する結合特性がよいという仮定に基づいてライブラリーから安定な種を選択する。しかしながら、安定性選択工程をさらに含めても、これらのアプローチは、主として安定性がより高いものより親和性がより高いものを豊富化することができる。また、結合工程の必要性は、これらアプローチの既知リガンドを有するタンパク質への応用性を制限する。第3のタンパク質分解アプローチは、安定なタンパク質は一般的にコンパクトで、タンパク質分解に抵抗性であり、不安定なものはそうではないという事実に基づく。ファージディスプレイフォーマットは、ディスプレイされたタンパク質のタンパク質分解安定性がファージ感染性に翻訳されるように操作される。したがって、変異体ファージディスプレイライブラリーをプロテアーゼで処理すると、安定なタンパク質をディスプレイするファージのみが感染性を保持し、次いでE. coli宿主に感染させることにより選択することができる。このアプローチは、リガンド結合とは無関係であるので一般的な有用性がある。しかしながら、より安定で良くフォールドしたタンパク質はプロテアーゼ感受性部位、例えばループおよびリンカーを有し、これは、タンパク質分解アプローチにおいて安定な種の選択を妨げることがある(Bai et al(2004). Eur. J. Biochem. 271：1609-1614)。
【０１６４】
WO2006099747に記載の本明細書で用いている進化したアプローチを用いて、優れた生物物理学的特性を有するタンパク質は肉眼で簡単に同定される。該アプローチは、リガンド結合、タンパク質分解、または不安定化工程を必要とせず、報告した選択アプローチにおいて遭遇しうる混乱を避ける。結合工程が不要であることは、本アプローチが一般的有用性を有することも意味する。選択肢として、選択したタンパク質が機能的であることを保証するために結合工程を含めることができる。
【０１６５】
ライブラリー構築および標準的抗体および抗体断片のスクリーニングは、当該分野でよく知られた技術、例えば、WO2011/138391、WO2011/138392、およびWO2012/022814に記載のものを用いることもできる。例えば、WO2012/016245；WO2009/133208；WO2009/083804；US20110038866；およびUS20110275535に記載のライブラリー構築および抗体様足場（例えば、フィブロネクチン）のスクリーニングも本開示の精神内である。
製造方法
【０１６６】
既存抗体との相互作用を排除するように修飾された露出したC末端を有する単離された単一ドメイン抗体は、典型的には組換え発現により製造される。該分子をコードする核酸を発現ベクターに挿入する。該分子をコードするDNA断片を、所望により発現を保証する発現ベクター中の調節配列と結合させる。発現調節配列には、限定されるものではないが、プロモーター(例えば、天然関連またはヘテロローガスなプロモーター)、シグナル配列、エンハンサーエレメント、および転写終止配列が含まれる。好ましくは、発現調節配列は、真核宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクター中の真核プロモーター系である。該ベクターが適切な宿主内に取り込まれると、該宿主は、ヌクレオチド配列の高レベルの発現、および該単一ドメイン抗体の収集および精製に適した条件下に維持される。
【０１６７】
これら発現ベクターは、典型的には、エピソームまたは宿主染色体DNAの必須部分として宿主生物中で複製することができる。一般に、発現ベクターは、望ましいDNA配列で形質転換された細胞の検出を可能にする選択マーカー（例えば、アンピシリン耐性、ヒグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、またはネオマイシン耐性）を含む(例えば、Itakura et al.、米国特許4,704,362参照)。
【０１６８】
E. coliは、本開示のポリヌクレオチド(例えばDNA配列)をクローニングするのに特に有用な原核宿主である。使用に適した他の微生物宿主には、桿菌、例えばBacillus subtilis、および他の腸内細菌科、例えば、Salmonella、Serratia、および種々のPseudomonas種が含まれる。
【０１６９】
他の微生物、例えば酵母も発現に有用である。SaccharomycesおよびPichiaは、望ましい発現調節配列(例えばプロモーター)、複製起点、終止配列などを有する適切なベクターを有する典型的な酵母宿主である。典型的なプロモーターには、3-ホスホグリセレートキナーゼおよび他の解糖酵素が含まれる。誘導性酵母プロモーターには、とりわけアルコール脱水素酵素、イソチトクロームC、およびメタノール、マルトース、およびガラクトースの利用に関与する酵素が含まれる。
【０１７０】
微生物に加えて、哺乳動物組織培養を用いて本開示の修飾単一ドメイン抗体（例えば単一ドメイン抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチド)を発現および生成することもできる。Winnacker、From Genes to Clones、VCH Publishers、N.Y.、N.Y.(1987)参照。CHO細胞株、種々のCOS細胞株、HeLa細胞、293細胞、メラノーマ細胞株、形質転換B細胞、およびハイブリドーマを含む、ヘテロローガスなタンパク質（例えば完全な免疫グロブリン）を分泌することができる多くの適切な宿主細胞株が当該分野で開発されているので真核細胞が実際に好ましい。これら細胞の発現ベクターは、発現調節配列、例えば複製起点、プロモーター、およびエンハンサー(Queen et al.、(1986) Immunol. Rev. 89:49)、および必要なプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終止配列を含むことができる。好ましい発現調節配列には、免疫グロブリン遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、サイトメガロウイルスなど由来のプロモーターがある(Co et al.、(1992) J. Immunol. 148:1149参照)。
【０１７１】
あるいはまた、コーディング配列を導入遺伝子に組み込み、トランスジェニック動物のゲノムに導入し、次いでトランスジェニック動物のミルク中で発現させることができる(例えば、Deboer et al.、U.S.5,741,957、Rosen、U.S.5,304,489、およびMeade et al.、U.S.5,849,992参照)。適切な導入遺伝子は、カゼインまたはβラクトグロブリンなどの乳腺特異的遺伝子由来のプロモーターおよびエンハンサーと操作可能に連結した軽鎖および/または重鎖のコーディング配列を含む。
【０１７２】
目的とするポリヌクレオチド配列および発現調節配列を含むベクターを、細胞宿主の種類に応じて異なるよく知られた方法により宿主細胞に移入することができる。例えば、化学的にコンピテントな原核細胞は一時的に熱ショックにかけることができるが、他の細胞宿主にはリン酸カルシウム処理、エレクトロポーレイション、リポフェクション、遺伝子銃、またはウイルスベースのトランスフェクションを用いることができる。（一般的には、Sambrook et al.、Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press、第2版、1989参照)。哺乳動物細胞を形質転換するのに用いる他の方法には、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポーレイション、およびマイクロインジェクションが含まれる(一般的には、Sambrook et al. 上記参照)。トランジェニック動物を製造するには、導入遺伝子を受精卵母細胞中にマイクロインジェクションし、胚性幹細胞のゲノム中に組み込み、次いで該細胞の核を除核卵母細胞中に移入することができる。
【０１７３】
発現したら本開示の修飾単一ドメイン抗体を、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィ、HPLC精製、ゲルエレクトロポーレイションなどを含む当該分野の標準的手順に従って精製することができる(一般的には、Scopes、Protein Purification(Springer-Verlag、N.Y.、(1982)参照)。医薬用途には、少なくとも約90〜95％の均一性の実質的に純粋な分子が好ましく、98〜99％またはそれ以上の均一性が最も好ましい。
組成物
【０１７４】
既存抗体との相互作用を排除するように修飾された露出したC末端を有する単一ドメイン抗体は、in vivo治療的有用性を有する。さらに、本開示は、組成物、例えば、医薬的に許容される担体とともに製剤化された修飾単一ドメイン抗体（またはその変異体、融合物、およびコンジュゲート）の１または組み合わせを含む医薬組成物も提供する。本開示の医薬的組成物は、併用療法で（すなわち他の薬剤と組み合わせて）投与することができる。例えば、該併用療法は、本開示の組成物と少なくとも1またはそれ以上のさらなる治療剤、例えば、抗炎症剤、抗癌剤、および化学療法剤の組み合わせを含むことができる。
【０１７５】
本開示の医薬組成物は、放射線療法と併せて投与することもできる。他の修飾単一ドメイン抗体との同時投与も本開示に含まれる。
【０１７６】
本明細書で用いている「医薬的に許容される担体」には、医薬的に適合性のあらゆるすべての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。好ましくは、該担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄、または表皮投与（例えば注射または注入による）が適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち、抗体、二機能的および多特異的分子を、酸および化合物を不活性化する他の天然条件の作用から該化合物を保護する物質でコートすることができる。
【０１７７】
修飾単一ドメイン抗体は当該分野で知られた種々の方法で投与することができる。当業者が認識するように、投与経路および/または投与方法は目的とする結果に応じて変化する。活性化合物は、化合物を急速放出から保護する担体を用いて製造することができる（例えば、インプラント、経皮パッチ、およびミクロカプセル化デリバリーシステムを含む制御放出製剤）。生物分解性の生物的適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルソエステル、およびポリ乳酸を用いることができる。そのような製剤を製造するための多くの方法が特許され、当業者に一般に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems、J.R. Robinson、ed.、Marcel Dekker、Inc.、New York、1978参照。
【０１７８】
ある投与経路により修飾単一ドメイン抗体を投与するには、その不活性化を防ぐ物質で該化合物をコートするか、または該化合物を同時投与する必要があるかもしれない。例えば、該化合物は、適切な担体、例えばリポソーム、または希釈剤を用いて対象に投与することができる。医薬的に許容される希釈剤には、生理食塩水および水性緩衝溶液が含まれる。リポソームには、水中油中水CGFエマルジョンおよび常套的リポソーム(Strejan et al.(1984) J. Neuroimmunol. 7:27)が含まれる。
【０１７９】
医薬的に許容される担体には、無菌水性溶液または分散剤、および無菌注射可能溶液または分散剤をすぐに調製するための無菌粉末が含まれる。医薬活性物質のためのそのような媒質および物質の使用は当該分野で知られている。あらゆる常套的媒質または物質が該活性化合物と不適合性である場合を除き、その本開示の医薬組成物への使用が予期される。補助活性化合物も該組成物に組み込むことができる。
【０１８０】
医薬組成物は、典型的には、無菌、および製造および保存条件下で安定でなければならない。該組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬剤濃度に適した他の整然とした構造として製剤化することができる。該担体は、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、ポリプロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）を含む溶媒または分散媒質、およびそれらの適切な混合物でありうる。適切な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを用い、分散剤の場合は必要な粒度を維持し、界面活性剤を用いることにより維持することができる。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含むことが好ましいだろう。注射可能組成物の持続吸収は、組成物中に吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含ませることによりもたらすことができる。
【０１８１】
無菌注射可能溶液は、必要に応じて上記成分の1または組み合わせを含む適切な溶媒中に所要量の活性化合物を組み込み、次いで精密ろ過滅菌により製造することができる。一般的には、分散液は、活性化合物を基礎分散媒質および上記の必要な他の成分を含む無菌ビークル中に組み込むことにより製造する。無菌注射可能溶液を製造するための無菌粉末の好ましい製造方法は、予め滅菌ろ過したその溶液から活性成分とあらゆるさらなる望ましい成分の粉末を産生する真空乾燥および凍結乾燥である。
【０１８２】
用法は、最適な望ましい反応(例えば治療反応)を得るために調整される。例えば、単回ボーラスを投与するか、数分割用量を時間をかけて投与するか、または用量を治療状況の緊急性に応じて比例的に減少または増加させることができる。例えば、修飾単一ドメイン抗体は、皮下注射により1週間に1または2回、または皮下注射により1月間に1または2回投与することができる。
【０１８３】
投与し易さおよび用量の均一性のために単位剤形の非経口用組成物を製剤化することが特に好都合である。本明細書で用いている単位剤形は、各単位が必要な医薬担体と共に望ましい治療効果をもたらすように計算された活性化合物の予め決定された量を含む、治療する対象に対する単位用量として適した物理的に分離した単位を表す。本開示の単位剤形の仕様は、(a)活性化合物の独特な特性および達成すべき特定の治療効果、および(b)個体の感受性を治療するためのそのような活性化合物の調剤における当該分野の限界により規定され、直接それらに依存する。
【０１８４】
医薬的に許容される抗酸化剤の例には、(1)水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸塩、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど；(2)油溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビルパルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、プロピルガレート、アルファ-トコフェロールなど；および(3)金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などが含まれる。
【０１８５】
治療用組成物のための本開示の製剤には、経口、経鼻、局所（バッカルおよび舌下を含む）、直腸、膣、および/または非経口投与が含まれる。該製剤は、好都合には単位剤形で存在し、薬学の分野で知られたあらゆる方法により製造することができる。単回剤形を製造するために担体物質と混合することができる活性成分の量は、治療する対象および特定の投与方法に応じて変化する。単回剤形を製造するために担体物質と混合することができる活性成分の量は、一般的には治療効果をもたらす組成物の量である。一般的には、この量は、100％のうち、活性成分が約0.001％〜約90％、好ましくは約0.005％〜約70％、最も好ましくは約0.01％〜約30％であろう。
【０１８６】
膣投与に適した本開示の製剤には、適切であることが知られている該担体を含む、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー製剤が含まれる。修飾単一ドメイン抗体組成物の局所または経皮投与用の剤形には、粉末剤、スプレー、軟膏、ペースト、ローション、ゲル、溶液剤、パッチ、および吸入剤が含まれる。該活性化合物は無菌条件下で医薬的に許容される担体および必要なあらゆる保存料、緩衝剤、またはプロペラントと混合することができる。
【０１８７】
本明細書で用いている用語「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、腸および局所投与以外の通常、注射による投与方法を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外、および胸骨内注射および注入が含まれる。
【０１８８】
本開示の医薬組成物に用いることができる適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、植物油（例えばオリーブ油）、および注射可能な有機エステル（例えばオレイン酸エチル）が含まれる。適切な流動性は、例えばコーティング物質（例えばレシチン）を用い、分散剤の場合は必要な粒度を維持し、界面活性剤を用いることにより維持することができる。
【０１８９】
これら組成物は、アジュバント、例えば、保存料、湿潤剤、乳化剤、および分散剤も含むことができる。微生物の存在の予防は、上記滅菌方法、および種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸など）を含むことにより保証することができる。該組成物中に等張化剤、例えば糖、塩化ナトリウムなどを含むことも望ましいかもしれない。さらに、注射可能医薬剤形の持続吸収は、吸収を遅延させる物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含むことによりもたらすことができる。
【０１９０】
本開示の化合物をヒトおよび動物に医薬品として投与する場合、該化合物は単独で、または例えば、0.001〜90％(より好ましくは0.005〜70％、例えば、0.01〜30％)の活性成分を医薬的に許容される担体と組み合わせて含む医薬組成物として投与することができる。
【０１９１】
選択した投与経路に関わらず、本開示の医薬組成物および/または適切な水和型で用いることができる本開示の修飾単一ドメイン抗体は、当業者に知られた常套的方法により医薬的に許容される剤形に製剤化される。
【０１９２】
本開示の医薬組成物中の活性成分の実際の用量レベルは、特定の患者に対する望ましい治療反応、患者に対する毒性がない投与方法および組成を達成するのに有効な活性成分の量を得るために変更することができる。選択した用量レベルは、用いた本開示の組成物の活性、投与経路、投与の時、用いる特定化合物の排泄速度、治療の持続期間、用いる特定の組成物と組み合わせて用いる他の薬剤、化合物、および/または物質、治療する患者の年齢、性別、体重、状態、全般的健康、および病歴、および医学の分野でよく知られた同様の因子を含む種々の薬物動態因子に依存する。当該分野の通常の技能を有する医師または獣医師は、必要な医薬組成物の有効量を容易に決定および処方することができる。例えば、該医師または獣医師は、望ましい治療効果を達成するのに必要とされるより低いレベルの医薬組成物中の用いる本開示の化合物の用量で出発し、望ましい効果を達成するまで用量を徐々に増加させることができる。一般的には、本開示の組成物の適切な1日用量は、治療効果をもたらすのに有効な最低用量である該化合物の量であろう。そのような有効用量は、一般的に上記因子に依存する。該投与は、好ましくは標的部位の近くに静脈内、筋肉内、腹腔内、または皮下投与するのが好ましい。所望により、治療用組成物の有効一日用量を、所望により単位剤形でその日を通して適切な間隔で別個に投与する2、3、4、5、6またはそれ以上のサブ用量として投与することができる。本開示の化合物を単独で投与することもできるが、該化合物を医薬製剤（組成物）として投与するのが好ましい。
【０１９３】
治療用組成物は、当該分野で知られた医療用具を用いて投与することができる。例えば、好ましい態様において、本開示の治療的組成物は、無針皮下注射用具、例えば米国特許No. 5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824、または4,596,556に記載の用具を用いて投与することができる。本開示に有用なよく知られたインプラントおよびモジュールの例には以下のものが含まれる：米国特許No. 4,487,603（制御された速度で医薬を分配するための埋込可能微量注入ポンプを開示する）、米国特許No. 4.,486,194（皮膚を介して医薬を投与するための医療用具を開示する）、米国特許No. 4,447,233（正確な注入速度で医薬を送達するための医薬注入ポンプを開示する）、米国特許No. 4,447,224（連続医薬送達のための流量可変埋込可能注入装置を開示する）、米国特許No. 4,439,196（多チャンバーコンパートメントを有する浸透性薬物送達系を開示する）、および米国特許No. 4,475,196（浸透性薬物送達系を開示する）。多くの他のそのようなインプラント、送達系、およびモジュールが当業者に知られている。
【０１９４】
ある態様において、本開示の分子は適切なin vivo分散を保証するように製剤化することができる。例えば、血液脳関門(BBB)は、多くの高親水性化合物を排除する。(所望により)本開示の治療的化合物がBBBを横切るのを保証するため、該化合物を例えばリポソームに製剤化することができる。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許4,522,811；5,374,548；および5,399,331を参照のこと。該リポソームは、特定細胞または器官内に選択的に輸送される、標的とする薬物送達を増強する1またはそれ以上の部分を含みうる(例えば、V.V. Ranade(1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685参照)。典型的標的化部分には、葉酸塩またはビオチン(例えば、Low et al.の米国特許5,416,016参照)；マンノシド(Umezawa et al.、(1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038)；抗体(P.G. Bloeman et al.(1995) FEBS Lett. 357:140；M. Owais et al.(1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180)；サーファクタントプロテインAレセプター(Briscoe et al.(1995) Am. J. Physiol. 1233:134)（種々の種が本開示の製剤および本発明の分子の成分を含みうる）、p120(Schreier et al.(1994) J. Biol. Chem. 269:9090)が含まれる。K. Keinanen(1994) FEBS Lett. 346:123；J.J. Killion(1994) Immunomethods 4:273も参照のこと。ある態様において、本開示の治療的化合物は、リポソームに製剤化され、より好ましい態様において、該リポソームは、標的化部分を含む。ある態様において、リポソーム中の治療的化合物は、腫瘍または感染近くの部位にボーラス注射により送達される。該組成物は、注射針通過性が容易な程度に液体でなければならない。該組成物は、製造および保存条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用から保護されなければならない。
【０１９５】
該組成物は、無菌で、シリンジにより送達可能な程度に液体でなければならない。水に加えて、該担体は、等張緩衝生理食塩水溶液、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、ポリプロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、およびそれらの適切な混合物でありうる。適切な流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチン）を用い、分散剤の場合は必要な粒径に維持し、界面活性剤を用いることにより維持することができる。多くの場合、該組成物中に等張化剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトールまたはソルビトール、および塩化ナトリウムを含ませることが好ましい。注射可能組成物の長期間の吸収は、該組成物中に吸収を遅延する物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムまたはゼラチンを含ませることによりもたらすことができる。
【０１９６】
該活性化合物が上記のごとく適切に保護されると、該化合物は例えば不活性希釈剤または吸収可能な食用担体とともに経口投与することができる。
治療的および診断的応用
【０１９７】
本明細書に記載の既存抗体との相互作用を排除するように修飾された露出したC末端を有する単一ドメイン抗体は、目的とするあらゆる抗原または標的と結合するように構築することができる。そのような標的には、限定されるものではないが、クラスタードメイン、細胞レセプター、細胞レセプターリガンド、成長因子、インターロイキン、タンパク質アレルゲン、細菌、またはウイルスが含まれる。本明細書に記載の修飾単一ドメイン抗体は、安定性および半減期を増加し、さらなる機能的部分を有するように修飾することもできる。さらに、該分子を、研究、治療、および診断分野を含む抗体を用いるすべての領域において抗体の代わりに用いることができる。さらに、該分子は抗体より優れた可溶性および安定性特性を有するので、本開示の該修飾単一ドメイン抗体を、抗体分子を破壊または不活化する条件下で用いることができる。
【０１９８】
例えば、修飾単一ドメイン抗体は、種々の疾患を治療、予防、または診断するために培養中（例えばin vitroまたはex vivo）または対象中（例えばin vivo）の細胞に投与することができる。本明細書で用いている用語「対象」は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。非ヒト動物には、すべての脊椎動物、例えば哺乳動物および非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類、および爬虫類が含まれる。該修飾単一ドメイン抗体を別の物質と一緒に投与するときは、その2つを順番にまたは同時に投与することができる。
【０１９９】
本開示の該組成物(例えば、該修飾単一ドメイン抗体、変異体、融合物、およびそのコンジュゲート)および仕様説明書を含むキットも本開示の範囲内である。該キットは、さらに本開示の1またはそれ以上のさらなる修飾単一ドメイン抗体または少なくとも1のさらなる試薬を含むことができる。キットは、典型的には該キットの内容物の意図する用途を示すラベルを含む。用語「ラベル」には、キット上またはキットとともに供給されるかまたはキットに添付したあらゆる文書または記録物が含まれる。
【０２００】
上記のごとく本開示の分子は、研究、治療、および診断分野のすべての領域で用いることができる。本開示の修飾単一ドメイン抗体(およびその変異体、融合物、およびコンジュゲート)を用いて治療することができる典型的疾患/障害には、自己免疫障害、癌、感染症、および他の病的兆候が含まれる。
【０２０１】
本開示の修飾単一ドメイン抗体を用いることができる自己免疫病状の具体例には、限定されるものではないが以下のものが含まれる：多発性硬化症および他の脱髄疾患、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス、I型糖尿病、炎症性皮膚障害、シェーグレン症候群、および移植拒絶反応。
【０２０２】
該修飾単一ドメイン抗体を用いることができる癌の具体例には、限定されるものではないが以下のものが含まれる：肺、乳房、前立腺、膀胱、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、結腸および直腸、膵臓、子宮内膜、腎臓、皮膚（非メラノーマ）、白血病、および甲状腺。
【０２０３】
該修飾単一ドメイン抗体は、過剰増殖疾患または癌、および癌の転移拡散の治療または予防に用いることができる。癌の非限定的例には以下のものが含まれる：膀胱、血液、骨、脳、乳房、軟骨、結腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、、尿道、子宮、または膣の癌。本明細書に記載の血管新生関連疾患には、限定されるものではないが例えば以下のものを含む血管新生依存性癌が含まれる：固形癌、血液由来腫瘍（例えば白血病）、および腫瘍転移；良性腫瘍、例えば血管腫、聴神経腫瘍、神経線維腫、トラコーマおよび化膿性肉芽腫；炎症性障害、例えば、免疫および非免疫的炎症；慢性関節リウマチおよび乾癬；眼の血管新生疾患、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、ｈ黄斑変性、角膜移植拒絶反応、血管新生緑内障、後水晶体繊維増殖症、ルベオーシス；Osler-Webber症候群；心筋血管新生；プラーク血管新生；毛細血管拡張症；血友病関節；血管線維腫；創傷部の肉芽形成および創傷治癒；毛細血管拡張症  乾癬  強皮症、化膿性肉芽腫、冠側副循環、虚血肢血管新生、角膜疾患、ルベオーシス、関節炎、糖尿病血管新生、骨折、脈管形成、造血(例えばWO2005056764参照)。本開示の修飾単一ドメイン抗体を用いることができる感染症の具体例には、限定されるものではないが、細胞性、真菌性、細菌性、およびウイルス性が含まれる。
【０２０４】
単一ドメイン抗体とヒト試料を接触させ；既存抗体がヒト試料中に存在する場合はそれが単一ドメイン足場と結合するか否かを決定し；該C末端修飾が既存抗体と該単一ドメイン抗体との相互作用を排除するように単一ドメイン抗体のC末端領域を少なくとも1のアミノ酸残基の欠失により修飾することを含む、単一ドメイン抗体との既存免疫反応を生じるか否かを予測するための方法も本開示に含まれる。ヒト試料は血液および血清からなる群から選ばれる。
【０２０５】
特記しない限り、詳細に具体的に記載していないすべての方法、工程、技術、および操作は、当業者に明確なそれ自体知られた方法で実施される。例えば標準的ハンドブック、本明細書に記載の一般的背景技術、およびそこに記載のさらなる参考文献に再度言及する。
【実施例】
【０２０６】
実施例1：sdAb足場に対するヒト血清試料中の既存抗体の存在の分析
本アッセイの目的は、単一ドメイン抗体(sdAb)に対する異なるドナー由来のヒト血液試料中の既存IgGの反応、および種々のC末端アミノ酸の伸張によるこの反応の変動を検出することである。この伸張はアミノ酸組成および長さが異なった。いかなる伸張もないヒト由来sdAb(重鎖および軽鎖ベース)の種々の足場のヒト血清との免疫原性反応を試験した。全体の目的は、既存抗体に対する反応が無いかまたは低い構築物を見出すことである。
試料：
【０２０７】
いかなる伸張もない(Kabatにより定義した)3ヒト由来重鎖sdAb足場(HVHP、配列番号8〜13)および3ヒト由来軽鎖sdAb足場(LVHP、配列番号2〜7)を下記アッセイにおいて試験した。これらの足場を用いて、C末端の伸張およびトランケーションの効果も比較することができるベースラインを作成した。第2組の試験では、C末端修飾および既存抗体反応に対するその効果を試験した。試験したC末端修飾は、VHまたはVL足場のC末端からのアミノ酸残基の欠失または付加（伸張）を含んだ。
【０２０８】
限定されるものではないが、Ala、Ala-Ala、Ala-Ser、Ala-Ser-Thr、Arg、Arg-Thr、Arg-Thr-Val、Gly-Gln、Gly-Gln-Pro、Ala-Ser-Thr-Lys-Pro(配列番号14)を含む可変ドメインと定常ドメインの間のリンカー領域中の天然アミノ酸を表すC末端伸張を有する足場を製造した。列挙した最後の変異体には、C末端リジンの既知のクリッピングを防ぐために非天然プロリンを付加した。さらに通常単一ドメイン間のリンカーとして用いるAla-AlaおよびGly-Gly-Gly-Gly-Ser(配列番号15)を用いる伸張、ストレッチについても試験した。試験したさらなる伸張は、Gly、Gly-Gly、およびGly-Serであった。
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血清血液試料
【０２０９】
男性ドナーから得た20血清試料および女性ドナーから得た20試料を用いた。これにより、既知試料を各群の反応または無反応の陽性および陰性コントロールとして用いた。
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【０２１０】
緩衝液：
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検出：
ヤギ抗−hIgG-HRP（Fc）コンジュゲート、10.3mg/mL（Sigma）
手順：
【０２１１】
サンドイッチELISA技術を用いた。SdAb構築物をマイクロタイタープレート上に直接固定した。次に、ヒト血清試料を該プレートの各ウェルに加えた。血清試料をsdAb構築物により捕捉する場合はホースラディッシュパーオキシダーゼ(HRP)と結合した抗ヒトIgGにより検出した。
【０２１２】
第1日に、100μLコーティング溶液(sdAbs)/ウェルをプレートに加え、4℃で一夜インキュベーションした。次の日に、プレートを300μL洗浄緩衝液/ウェルで3回洗浄した。300μL/ウェルのブロッキング緩衝液で室温で2時間ブロックした後、プレートを300μL洗浄緩衝液で3回洗浄した。ヒト血清試料をアッセイ緩衝液で1:40に希釈し、次に、100μL/ウェルの希釈した試料をウェルに加え、300rpmのマイクロタイターシェーカー上で室温で2時間インキュベーションした。次に、プレートを300μL洗浄緩衝液で3回洗浄した。次いで、100μL/ウェル検出抗体(1:100.000希釈)をウェルに加え、プレートを300rpmにて室温で1時間インキュベーションした。プレートを300μL/ウェル洗浄緩衝液で3回洗浄後、100μL/ウェルのTMB基質溶液をプレートに加え、300rpmにて室温で少なくとも10分間インキュベーションし、次いで100μL/ウェルのTMB停止溶液を加えた。個々のウェルの吸光度を450で読んだ。
【０２１３】
個々のウェルの値をプレートバックグラウンド(NCの平均)に正規化した。次に、正規化試料（デュプリケート）値の平均を計算した。正規化OD値の平均が2に等しいかそれより大きければ陽性免疫原性反応(カットオフ点)とする。
結果：
【０２１４】
6の単一ドメイン抗体足場のヒト血清との免疫原性反応を試験した:−6ヒトsdAb足場(3VHおよび3VL)。
表2：既存抗体に対するsdAb重鎖および軽鎖足場反応
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【０２１５】
表2に示すように、天然リンカー位置−VSSで終止するすべての3VH足場(HVHP430S、HVHP426S、HVHP421Sという)のデータは、顕著な既存免疫反応を示した。対照的に、TKVTVL(HVLP3103S−λ配列)でなく天然リンカー位置−TKVEIK(HVLP325S、HVLP351S−κ配列)で終止するVL足場のみ(HVLP325S、HVLP351SおよびHVLP3103Sという)が既存免疫反応を示した。このことから、VHまたはVL足場の終止（開裂）位置が観察された既存免疫反応にとって重要であると結論される。この反応は該リンカーの異なるアミノ酸位置で終止する（開裂する）か、または天然リンカーの露出したアミノ酸残基を可変ドメインと定常ドメイン間のリンカー配列の天然でない部分のさらなるアミノ酸でマスキングすることにより変化させることができるというのが本出願人の見解である。本出願人の見解を評価するため、VHまたはVL足場のC末端のみが異なり、残りのVHまたはVL足場配列が同じに保たれたVHおよびVL足場の第2のセットを作製した。天然リンカー配列に従ったアミノ酸の維持およびアミノ酸のトランケーション（欠失）を試験した。さらに、露出したリンカーの天然リンカー配列の部分でない異なるアミノ酸によるマスキングもVHまたはVL足場のC末端に対するアミノ酸残基の付加により試験された。健康なドナーの血清中の単離されたVHまたはVLドメインに対する既存免疫反応は、循環から分解した抗体を除去する天然の除去メカニズムの一部であると仮定される。これら既存抗体により認識される抗体エピトープは、VH-CH1(図1 開裂位置A)またはVL-CL(図1 開裂位置B)間の通常隠されたリンカー領域のC末端が開裂すると露出する。この反応は、選択的アミノ酸をそれぞれVHまたはVL足場のC末端に付加または該末端から除去することにより変化するようである。さらに、該C末端の通常存在しないさらなるアミノ酸によるマスキングにより、該リンカー配列も既存抗体に対する反応を減少させるだろう。該メカニズムは、他の抗体断片、例えばFab'sまたはscFv's中の露出したC末端に対する既存免疫反応を生じるようである。また、単離されたVHのみまたはVLのみの抗体断片の場合のように、この反応は、天然リンカー領域内の選択的アミノ酸(例えば、Fab断片ではCH1-CH2間(図1、開裂位置C)、またはscFvのC末端)で終わる（開裂する）か、または天然リンカー配列を通常存在しないさらなるアミノ酸でマスクすることによりマスクされるようである。表3は、既存抗体反応に対するC末端修飾の効果を検討するためのGeneartから生成した多くのVHおよびVL単一ドメイン抗体配列を示す。該VHおよびVL単一ドメイン抗体配列は、PhoAリーダー配列(配列番号1)を含み、発現および精製後にこれを除去して上記のごとくVHおよびVL単一ドメイン抗体配列のみ(配列番号2〜13)を得る。
【０２１６】
表3：既存免疫反応に対するC末端修飾の効果を検討するために生成したPhoAリーダー配列(配列番号1)を含むVHおよびVL単一ドメイン抗体配列
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【０２１７】
図3〜9のデータは、多くの野生型VH単一ドメイン足場に対する既存抗体反応の存在を明確に示す。さらに、該データは、驚くべきことに、異なるヒトVH単一ドメイン足場のそれぞれのC末端に対する1またはそれ以上のアミノ酸残基の付加のみが既存抗体反応の完全な排除または顕著な減少を示す。同じ反応パターンが各VH足場で繰り返し見られるが、Ala-Ser-Thrアミノ酸付加では他の付加に比べて反応低下が増加する傾向がある。このことは、VH単一ドメイン足場のC末端の修飾が、既存抗体がもはや該単一ドメイン抗体を認識しないようにC末端単一ドメイン抗体の三次元配置を変化させることにより少なくとも１の既存の抗体の該足場との相互作用を排除するか、C末端単一ドメイン抗体が反応しないように少なくとも1の既存抗体に対するC末端単一ドメイン抗体の暴露を変化させるか、少なくとも1の単一ドメイン抗体と既存抗体間の立体障害を変化させるか、該C末端の少なくとも1の構造ネオエピトープを破壊するか、または該単一ドメイン抗体のフレームワーク中の少なくとも1のネオエピトープを保護することを証明する。
【０２１８】
図20のデータは、VLλ軽鎖ではなく107位のLys(Kabatにより決定)で終わるVLκ軽鎖のみが既存免疫反応をもたらす傾向があることを示す。理論に縛られるものではないが、本出願人は、VEIをもたらすVEIK配列からの少なくとも1のアミノ酸の欠失が既存免疫反応を消滅させるので、VLκ軽鎖のC末端VEIK配列周辺のネオエピトープが既存免疫反応をもたらすと考える。VEIKでは免疫反応はみられないが、1アミノ酸残基(例えばArg)または2アミノ酸残基(例えば、Arg-Thr)のVEIKRまたはVEIKRTをもたらすC末端VEIK配列への付加は既存免疫反応を増加させる。しかしながら、3アミノ酸残基(例えば、Arg-Thr-Val)〜4アミノ酸残基(例えば、Arg-Thr-Val-Ala)のC末端VEIK配列へのそれぞれVEIKRTVまたはVEIKRTVAを生じるさらなる付加は、再度、既存免疫反応を消滅させる。したがって、既存抗体または既存免疫分子の相互作用に関与すると思われるC末端VEIK配列周囲の3〜4アミノ酸残基の狭いウインドウがあるようである。
【０２１９】
まとめると、このデータは、種々のヒトVH およびVL κ単一ドメイン足場のC末端に健康ヒトボランティアの血清中に存在する既存抗体により認識されるネオエピトープがあることを初めて示す。これらヒトVH およびVL κ単一ドメイン足場に対する既存免疫反応の同定は、これら単一ドメイン足場が合成ライブラリーではなくヒト起源またはヒトライブラリー由来であるため予期し得ない驚くべき知見であった。したがって、これらヒト単一ドメイン足場に対する既存免疫反応または既存抗体の存在は予期も予想もされなかっただろう。さらに、アミノ酸の付加または欠失によるVHまたはVL κのC末端に対する修飾は、既存免疫反応を排除した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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