(57)【要約】  ３−ＨＰを生成するアクティブな発酵経路を含む遺伝的に改変されたサッカロマイセス・セレビシエは、マロン酸セミアルデヒドを生成するβ−アラニンとピルビン酸の間の転移反応を触媒するセレウス菌ＡＨ１２７２株由来のアミノトランスフェラーゼＹｈｘＡ外因性遺伝子を発現する。当該酵母はまた、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＢＡＤＨ）、３−ヒドロキシプロパン酸デヒドロゲナーゼ（３−ＨＰＤＨ）およびアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼを発現し得る。さらに、当該酵母はピルビン酸カルボキシラーゼおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを発現することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
３−ＨＰを生産する活発な発酵経路を含む遺伝子改変酵母細胞であって、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有し、かつマロン酸セミアルデヒドを生産するためのβ−アラニンとピルビン酸の間のアミノ基転移反応を触媒する、酵素の生産をコードする外来遺伝子を含み、かつ当該外来遺伝子を発現する、遺伝子改変酵母細胞。
【請求項２】
前記酵素がバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＡＨ１２７２由来のアミノトランスフェラーゼＹｈｘＡである、請求項１に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項３】
３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＢＡＤＨ）を発現する、請求項１または請求項２に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項４】
前記ＨＩＢＡＤＨが、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）、バチルス・セレウス、またはカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）由来である、請求項３に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項５】
３−ヒドロキシプロパン酸デヒドロゲナーゼ（３−ＨＰＤＨ）を発現する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項６】
前記３−ＨＰＤＨが、メタロスフェラ・セデュラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ）、スルホロバス・トカダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋａｄａｉｉ）または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来である、請求項５に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項７】
アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１１）を生産する外来遺伝子を発現し、及び／又はグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１５）を発現する外来遺伝子を発現する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項８】
コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ（配列番号５２）または配列番号５２と少なくとも８０％相同であるアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有する酵素を発現する、請求項７に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項９】
トリボリウム・カスタニュウム（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ）由来のアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ（配列番号６８）または配列番号６８と少なくとも８０％相同であるアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ活性を有する酵素を発現する、請求項７に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項１０】
ピルビン酸カルボキシラーゼ及び／又はアスパラギン酸トランスアミナーゼの活性が増加された、請求項７に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項１１】
ネイティブなピルビン酸カルボキシラーゼＰＹＣ１若しくはＰＹＣ２及び／又はネイティブなアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡＡＴ２を過剰発現する、請求項１０に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項１２】
前記酵母がＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子改変酵母細胞。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の酵母細胞を培養すること、および前記培養から３ＨＰを回収することを含む、３ＨＰの生産方法。
【請求項１４】
前記培養にβ−アラニン及び／又はＬ−アスパラギン酸を供給することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
培養培地１リットルあたり少なくとも１００ｍｇの３ＨＰが生産されるか、又は前記培養培地から回収される、請求項１３又は請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は遺伝子組換え酵母および３−ヒドロキシプロピオン酸（３ＨＰ）の生産方法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
３ＨＰは、アクリル酸、１，３−プロパンジオール、マロン酸、および他の有用品に変換することができるプラットフォーム化学物質である。アクリル酸由来の製品には、幼児用おむつおよび失禁用製品に使用される高吸水性ポリマー、さまざまなプラスチック、コーティング、接着剤、エラストマー、および塗料が挙げられる。現在、アクリル酸は、エチレンおよびガソリン生産の副産物であるプロピレンから誘導されている。グルコースまたは他の再生可能炭素源からの３ＨＰ生産が確立されれば、それは、化石資源からのアクリル酸生産に代わる生物学的に持続可能（ｂｉｏｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ）な代替方法になるであろう。グルコースから３ＨＰを生産する方法については、いくつか記載がある。しかしその具体的教示では、主に、細菌である大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）を宿主として使用する。本発明では、３ＨＰ生産のための宿主として酵母を使用する。これにより、低いｐＨでプロセスを遂行することが可能となり、したがって全体としてその経済性が増す。
【０００３】
米国特許出願公開第２０１０／０１３６６３８号明細書には、β−アラニンから、生体触媒作用により、酵母を含む微生物において３−ＨＰを生産することが、一般論として記載されている。β−アラニンはアラニン２，３−アミノムターゼ活性を有する酵素によりα−アラニンから細胞内で合成することができるとされており、関連酵素について配列が与えられている。
【０００４】
β−アラニン／ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＰＡＴ）配列を使って、β−アラニンから３−ＨＰを生産する方法も開示されている。細胞がβ−アラニンをマロン酸セミアルデヒド中間体経由で３−ＨＰに変換することを可能にする、ＢＡＰＡＴ活性を有する形質転換細胞が開示されている。
【０００５】
酵母においてそのような作業を実行することの可能性は言及されているが、その実証はない。本発明者らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では有効なこの経路の酵素が、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では有効でないことを見出した。具体的に述べると、米国特許出願公開第２０１０／０１３６６３８号明細書によれば、ＢＡＰＡＴ活性を有する酵素はシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）または緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）から取得することができる。しかし、これらの酵素をコードする遺伝子がＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では有効でないことを、本発明者らは見出した。
【０００６】
マロン酸セミアルデヒド（別名マロニックセミアルデヒドまたは３−オキソプロパン酸）は、３ＨＰをもたらす一つの経路におけるキー中間体であるが、その生産に至る経路は他にも数多く考えられる。
【０００７】
米国特許出願公開第２０１２１３５４８１号明細書には、ｇａｂＴ、３−ＨＰＤＨおよびＨＩＢＡＤＨ並びにその他をコードする遺伝子を含む、酵母における３ＨＰ生産経路が記載されている。しかし、それ以外の、より良い３ＨＰ生産酵母が、必要とされている。
本発明者らは、ここに、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）ＡＨ１２７２株由来の未同定のアミノトランスフェラーゼｙｈｘＡを異種発現させると、酵母Ｓ．セレビシエにおいて、β−アラニンから３ＨＰが生産されることを見出した。前記ｙｈｘＡがコードするアミノトランスフェラーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示し、ＤＮＡ配列を配列番号２に示す。配列番号２はＳ．セレビシエ用にコドン最適化されている。
【０００８】
バチルス・セレウスＡＨ１２７２株由来の前記アミノトランスフェラーゼＹｈｘＡは、β−アラニンとピルビン酸の間のアミノ基転移反応を触媒して、Ｌ−アラニンとマロニックセミアルデヒドをもたらすと本発明者らは考えており、この場合、この酵素はｇａｂＴ（Ｅ．Ｃ．２．６．１．１９）ではなくβ−アラニン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼＥ．Ｃ．２．６．１．１８（ＢＡＰＡＴ）ということになる。
【０００９】
米国特許出願公開第２０１２／０１３５４８１号明細書には、［β］−アラニンからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒するＢＡＡＴ遺伝子（βアラニンアミノトランスフェラーゼ−ＥＣ２．６．１．１９）を包含する活発な３−ＨＰ発酵経路を含む遺伝子改変酵母細胞が開示されている。したがって、ここでのＢＡＡＴは、天然ｇａｂＴまたは遺伝子改変ｇａｂＴと同義である。しかしこの方法による３−ＨＰ生産の成功は示されていない。
【００１０】
国際公開第２００５／１１８７１９号には、酵母細胞において、任意の生物に由来するβ−アラニン／ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ＢＡＰＡＴ）配列を使って、β−アラニンから３−ＨＰを生産する方法が開示されているが、その有効性は実証されていない。ここでＢＡＰＡＴの供給源として特定されているものには、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ラット、およびゼノパス（Ｘｅｎｏｐｕｓ）が挙げられる。上述のように、本発明者らは、シュードモナス由来のＢＡＰＡＴ遺伝子がＳ．セレビシエでは有効でないことを確認している。
ｙｈｘＡとの見出しでＵｎｉｐｒｏｔは、配列情報を提供しているものの、この酵素がＢＡＰＡＴであるとは同定していない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０１３６６３８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１２／０１３５４８１号明細書
【特許文献３】国際公開第２００５／１１８７１９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって本発明はここに、３−ＨＰを生産する活発な発酵経路を含む遺伝子改変酵母細胞であって、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有し、かつマロン酸セミアルデヒドを生産するためのβ−アラニンとピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）の間のアミノ基転移反応を触媒する、酵素の生産をコードする外来遺伝子を含み、かつ同外来遺伝子を発現する細胞を提供する。
【００１３】
好ましくは、前記酵母は、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＢＡＤＨ）（好適には緑膿菌、Ｐ．プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）、バチルス・セレウス、またはカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）に由来するもの）、および／または３−ヒドロキシプロパン酸デヒドロゲナーゼ（３−ＨＰＤＨ）（場合によっては、メタロスフェラ・セデュラ（Ｍｅｔａｌｌｏｓｐｈａｅｒａ  ｓｅｄｕｌａ）、スルフォロブス・トウコダイ（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｔｏｋｏｄａｉｉ）または大腸菌に由来するもの）も発現する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
グルコースからの直接的な３−ヒドロキシプロピオン酸の合成を可能にするには、β−アラニンから３−ヒドロキシプロピオン酸への経路を再構築することに加えて、異種アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ、好ましくは昆虫由来のもの、好ましくはコクヌストモドキ（トリボリウム・カスタニュウム（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ））由来のものを発現させることが好ましい。３−ヒドロキシプロピオン酸へのフラックスをさらに増加させるには、ピルビン酸カルボキシラーゼおよび／またはＰＥＰカルボキシラーゼならびにアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼを過剰発現させることが好ましい。さらに、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性（ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６）またはアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）活性を欠失させれば、副産物としてのエタノールの生成を伴わない嫌気発酵が可能になるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の菌株は、グルコース耐性を改良し、酢酸依存性を取り除き、３ＨＰ生産量を増加させるために、適応実験室進化法を使って進化させることができる。
酵母は好ましくはＳ．セレビシエであるが、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、デバリオミセス・ハンセニイ（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ）、シベルリンドネラ・ジャディニイ（Ｃｙｂｅｒｌｉｎｄｎｅｒａ  ｊａｄｉｎｉｉ）、ロドトルラ・ミヌタ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｍｉｎｕｔａ）、ロドトルラ・グルチニス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｉｓ）、トルラスポラ・デルブリュッキ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、または他の酵母であってもよい。
【００１６】
本発明の改変に適した酵母株は、３ＨＰの存在下での増殖に対するそれらの耐性をもって選択することができる。
Ｂ．セレウス（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）ＡＨ１２７２株のネイティブなｙｈｘＡ遺伝子発現産物のアミノ酸配列とそれをコードするＤＮＡ配列は、本発明において使用するために、さまざまな形で改変することができる。第１に、適当な酵母における発現のために、ＤＮＡ配列をコドン最適化することができる。第２に、酵素活性を妨げずに、あるいはむしろ酵素活性を増加させつつ、アミノ酸の欠損、付加、または置換によってアミノ酸配列を改変することもできる。そのような改変酵素は、ネイティブなアミノ酸配列と少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、または９０％、または９５％の相同性を有し得る。
【００１７】
本発明は、３ＨＰの生産方法であって、本発明の酵母細胞を培養すること、および場合によっては培養物から３ＨＰを回収することを含む方法を包含する。培養は、β−アラニンを含むか、または前記酵母以外のβ−アラニン供給源を含む培養基で、実行することができる。前記供給源は別の微生物であってもよい。ただし、βアラニンを、例えばＬ−アスパラギン酸から生産するために、好適にはアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１１）またはグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＥＣ４．１．１．１５）を生産する外来遺伝子を組み込むことによって、あるいはβ−アラニンをＬ−アラニンから２，３−アラニンアミノムターゼによって生産するために、本発明の酵母を工学的に操作してもよい。パントテン酸（ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅ）の合成におけるその役割ゆえに、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼはＰａｎＤとしても知られている。この酵素の遺伝子は野生型Ｓ．セレビシエのゲノムには存在しない。
【００１８】
本発明者らは、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼをコードする一定の外来ＰａｎＤ遺伝子を使用することで、他のものと比較して、優れた結果が得られることを見出した。具体的に述べると、本発明者らは、昆虫、とりわけゴミムシダマシ類（ｆｌｏｕｒ  ｂｅｅｔｌｅ）、より具体的にはコクヌストモドキ（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ）由来のＰａｎＤ遺伝子が、細菌ＰａｎＤ遺伝子と比較して、３−ＨＰの生産力価を向上させ、かつ収率を向上させることを見出した。
好ましくは、前記酵母による３ＨＰの生産は、培養基１リットルあたり少なくとも１００ｍｇの３ＨＰが、より好ましくは少なくとも２００、または３００、または４００または５００または１０００または２０００または１４０００ｍｇ／Ｌの３ＨＰが、生産され、または前記培養基から回収されるようなものである。
【００１９】
以下に非限定的実施例を挙げて本発明をさらに記述し、説明するが、それらの実施例では、以下の表に言及する。
【００２０】
【表１】
2015531237.tif 000002
【００２１】
【表２】
2015531237.tif 000003
【００２２】
【表３−１】
2015531237.tif 000004
【００２３】
【表３−２】
2015531237.tif 000005
【００２４】
【表３−３】
2015531237.tif 000006
【００２５】
【表４】
2015531237.tif 000007
＊ｐＴＹ、ＴＹリピート領域をターゲットとすることによる多重染色体組込み用に設計されたベクター。このベクターは、表４に列挙する他の親プラスミドと同じＵＳＥＲクローニングカセットを含有する。
【００２６】
【表５】
2015531237.tif 000008
【００２７】
【表６】
2015531237.tif 000009
【００２８】
【表７】
2015531237.tif 000010
【００２９】
【表８】
2015531237.tif 000011
【００３０】
以下の実施例において得られた結果の一部は、添付の図面に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）からアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）およびβ−アラニンおよびマロニックセミアルデヒドを経由して３−ＨＰに至る代謝経路を示す図である。
【図２】実施例２で得られたＮＭＲの結果を示す図である。
【図３】複数コピーの遺伝子の組込みおよび前駆体供給遺伝子の過剰発現が３ＨＰ力価に及ぼす影響を示す図である。培養液中の３ＨＰの濃度をＨＰＬＣ法によって測定した。それをｇＬ−１の単位で記載する。↑−単一コピーの遺伝子がゲノムに組み込まれている。↑↑−複数コピーの遺伝子がゲノムに組み込まれている（実施例６）。
【図４】ｐＨ５におけるＳＣＥ−Ｒ２−２００のグルコース制限流加培養での増殖および代謝産物濃度を示す図である。３つの培養のうちの１つの代表的グラフ（実施例７）。  図１に図解するように、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔａｔｅ）は、酵素ＰａｎＤ、すなわちアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼによって、β−アラニンに変換され得る。β−アラニンは、ＢＡＰＡＴまたはＧａｂＴのどちらかによって、マロニックセミアルデヒドに変換可能であり、マロニックセミアルデヒドはＨＩＢＡＤＨ／ＨＰＤＨによって３−ＨＰに変換され得る。本発明ではＢＡＰＡＴを経由する経路を使用する。
【実施例１】
【００３２】
＜異種β−アラニン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ、および３−ヒドロキシプロパン酸デヒドロゲナーゼのクローニング、ならびにＳ．セレビシエにおける異種およびネイティブγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼの過剰発現＞
【００３３】
Ｂ．セレウスの推定アミノトランスフェラーゼｙｈｘＡ（配列番号１）、シュードモナス・プチダのβ−アラニン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（配列番号３）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（配列番号５）、カンジダ・アルビカンスの３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（配列番号７）、Ｐ．プチダの３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（配列番号９）、バチルス・セレウスの３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（配列番号１１）、メタロスフェラ・セデュラの３−ヒドロキシプロパン酸デヒドロゲナーゼ（配列番号１３）、スルホロバス・トカダイの３−ヒドロキシプロパン酸デヒドロゲナーゼ（配列番号１５）、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ（配列番号１７）をコードする遺伝子は、酵母Ｓ．セレビシエ用にコドン最適化されたバージョン（配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８に対応）で、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって合成された。
【００３４】
注文した遺伝子構成は、次の一般構造を有していた：
ＧＧＴＡＣＣＡＡＡＡＣＡＡＴＧＮＮ・・・ＮＮＴＧＡＧＴＣＧＡＣ（配列番号６７）
（ここで、ＧＧＴＡＣＣはＫｐｎＩ制限部位であり、ＡＡＡＡＣＡはコザック配列であり、ＡＴＧは開始コドンであり、ＮＮ・・・ＮＮは開始コドンおよび停止コドンのないタンパク質コード配列を表し、ＴＧＡは停止コドンであり、ＧＴＣＧＡＣはＳａｌＩ制限部位である）。
【００３５】
合成遺伝子を、ＫｐｎＩおよびＳａｌＩでプラスミドから切り出し、ゲル精製し、同じ一対の酵素で消化しておいたプラスミドｐＥ１（配列番号８１）またはｐＥ２（配列番号８２）にライゲーションした。その結果得られたライゲーション混合物をケミカルコンピテント大腸菌ＤＨ５αにヒートショックを使って形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリン（ａｍｐｌｉｃｉｌｌｉｎ）を含むルリア−ベルターニ（ＬＢ）寒天培地で、細胞を選択した。
【００３６】
正しいインサートを持つクローンをコロニーＰＣＲによって同定し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ液体培地に接種し、プラスミドを単離した（表２）。その結果得られたプラスミドを配列決定によって確認した。
【００３７】
遺伝子とＵＳＥＲクローニング用の正しいオーバーハングとを保持している遺伝子フラグメントを、表３−１から表３−３に示すプライマーおよびテンプレートを使って、ＰＣＲ増幅によって生成させた。ＰＣＲ混合物は、２８μＬの水、１０μＬの高フィデリティＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼ緩衝液（５×）、５μＬの２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬのＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼ、２．５μＬのフォワードプライマー（濃度１０μＭ）、２．５μＬのリバースプライマー（濃度１０μＭ）、および１μＬのＤＮＡテンプレートを含有した。サイクリングプログラムは、９５℃で２分間、［９５℃で１０秒間、５０℃で２０秒間、６８℃で２分間］を３０サイクル、６８℃で５分間、１０℃で停止とした。遺伝子フラグメントを、ＳＹＢＲ（登録商標）−ＳＡＦＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する１％アガロースゲル上で分離し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使って精製した。プロモーターフラグメントもＰＣＲとそれに続く遺伝子精製によって生成させた（表３−２）。ターミネーターは発現プラスミド上に既に存在していた。
【００３８】
親プラスミドｐＥＳＣ−Ｕｒａ−ＵＳＥＲ（配列番号８５）、ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ−ＵＳＥＲ（配列番号８３）およびｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ＵＳＥＲ（配列番号８４）を、３７℃で１時間のＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）ＡｓｉＳＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）処理によって線状化し、３７℃で１時間のＮｂ．ＢｓｍＩ処理によってニックを入れた。その結果得られる線状化したニック入りＤＮＡを溶液から精製し、５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶出させた。
【００３９】
発現プラスミドは、以下のプロトコールを用いるＵＳＥＲクローニングによって作出した。線状化しニックを入れた親プラスミド１μＬを１μＬのプロモーターフラグメント、２μＬの遺伝子フラグメント、０．５μＬのＴａｑポリメラーゼ緩衝液、０．５μＬのＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）と混合した。その混合物を３７℃で２５分間、および２５℃で２５分間インキュベートし、ケミカルコンピテント大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。正しいインサートを持つクローンをコロニーＰＣＲによって同定し、プラスミドを大腸菌の終夜培養物から単離し、配列決定によって確認した。これらの発現プラスミドを表４に列挙する。
これらの発現プラスミドを、Ｓ．セレビシエ細胞に、酢酸リチウム形質転換プロトコールを使って形質転換した。これらの細胞を、ウラシル、ヒスチジンおよびロイシンを含まない合成完全（ＳＣ）寒天培地で選択した。その結果得られた株を表５に列挙する。
【実施例２】
【００４０】
＜β−アラニンで培養したＳ．セレビシエにおける３−ヒドロキシプロピオン酸の生産＞
【００４１】
少なくとも４つの独立した酵母形質転換体を、ＳＣ  ｕｒａ−ｈｉｓ−ｌｅｕ−寒天プレートで画線培養することによって分離した。独立した形質転換体から派生した４つの単一コロニーを、通気性の蓋が付いている９６ディープウェルマイクロタイタープレート（ＥｎｚｙＳｃｒｅｅｎ）中の、０．５ｍＬのＳＣ  ｕｒａ−ｈｉｓ−ｌｅｕ−に接種した。プレートを、軌道振幅５ｃｍ、２５０ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃で終夜インキュベートした。５０μＬの終夜培養物を使って、９６ディープウェルプレート中の、１０ｇ／Ｌβ−アラニンを含む０．５ｍＬの最少ミネラル（デルフト（Ｄｅｌｆｔ））培地に接種した。
【００４２】
デルフト培地の組成は次のとおりであった：７．５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１４．４ｇのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２２ｇのデキストロース、２ｍＬの微量金属溶液、および１ｍＬのビタミン類。培地のｐＨを６に調節した。微量金属溶液は１リットルあたり４．５ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、４．５ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３ｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇのＨ３ＢＯ３、１ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、０．４ｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、０．３ｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．１ｇのＫＩ、１５ｇのＥＤＴＡを含有した。微量金属溶液は、ＥＤＴＡを除く全ての構成成分をｐＨ６で９００ｍＬの超純水に溶解した後、穏やかに加熱し、ＥＤＴＡを添加することによって調製した。最後に微量金属溶液のｐＨを４に調節し、液量を１Ｌに調節して、オートクレーブにかけた（２０分で１２１℃）。微量金属溶液は＋４℃で保存した。ビタミン類溶液は１リットルあたり５０ｍｇのビオチン、２００ｍｇのｐ−アミノ安息香酸、１ｇのニコチン酸、１ｇのパントテン酸Ｃａ、１ｇのピリドキシン−ＨＣｌ、１ｇのチアミン−ＨＣｌ、２５ｇのｍｙｏ−イノシトールを含有した。ビオチンを２０ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。これに９００ｍＬの水を加える。ｐＨをＨＣｌで６．５に調節し、残りのビタミン類を加えた。ｍ−イノシトール添加の直前と直後にｐＨを６．５に再調節した。ビタミン溶液の最終体積を１Ｌに調節し、滅菌濾過してから、＋４℃で保存した。
【００４３】
発酵は上記と同じ条件下で７２時間行った。
培養の終了時にＯＤ６００を測定した。１０μＬの試料を１９０μＬの水と混合し、分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ）で波長６００ｎｍにおける吸光度を測定した。
【００４４】
培養液を遠沈し、酵素アッセイを使って上清を３−ヒドロキシプロピオン酸濃度について分析した（表５）。Ｐ．プチダのβ−アラニン−ピルビン酸アミノトランスフェラーゼまたはＣ．アセトブチリカム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）のγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼを３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼまたは３−ヒドロキシプロパン酸デヒドロゲナーゼと組み合わせた場合、３ＨＰ生産は達成されなかった。しかし、Ｂ．セレウスの推定アミノトランスフェラーゼＹｈｘＡまたはＳ．セレビシエのγ−アミノ酪酸トランスアミナーゼを３−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼまたは３−ヒドロキシプロパン酸デヒドロゲナーゼと組み合わせた場合は、β−アラニンからの３ＨＰ生産が観察された（表５：株１３３〜１４７）。試験した条件下で最も良い酵素の組み合わせは、Ｂ．セレウスのアミノトランスフェラーゼＹｈｘＡと大腸菌の３−ヒドロキシプロパン酸デヒドロゲナーゼＹｄｆＧとを発現する株１４７であり、この株では２，１４５±８９ｍｇ／Ｌの３ＨＰが得られた。
【００４５】
酵素アッセイは次のように行った。２０μＬの標品（デルフト培地中の濃度０．０３〜１ｇ／Ｌの３ＨＰ）および試料を９６ウェル平底透明プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に加えた。マルチチャンネルピペットを使って、１ウェルあたり、１８０μＬの混合液（１４．８ｍｌの水、２ｍｌの緩衝液（１ｍＭトリス、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ８．８）、１ｍｌのＮＡＤＰ＋溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）、およびＰＢＳ緩衝液中の精製ＹｄｆＧ酵素０．２ｍｌ（１５００μｇ／ｍｌ））を加えた。３４０ｎｍにおける開始時吸光度を測定し、プレートを密封し、３０℃で１．５時間インキュベートした。その後、３４０ｎｍにおける終了時吸光度を再び測定した。バックグラウンドについて補正した終値と開始値の間の差は、３ＨＰ濃度と線形相関関係にあった。試料中の３ＨＰの濃度を標準曲線から算出した。
【００４６】
最も良い試料中の３−ヒドロキシプロピオン酸の実体を、ＮＭＲ分析によって確認した（図２）。ＮＭＲによって測定された濃度は、酵素アッセイによって見出された値とよく相関した。
【実施例３】
【００４７】
＜Ｓ．セレビシエにおけるアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼまたはグルタミン酸デカルボキシラーゼのクローニング＞
【００４８】
大腸菌のアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ（配列番号５０）およびＣ．グルタミカム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）のアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ（配列番号５２）をコードする遺伝子は、ｇＢＬＯＣＫとして、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓにより、（配列番号５１および配列番号５３に対応する、酵母Ｓ．セレビシエ用にコドン最適化されたバージョンで）合成された。
【００４９】
ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（配列番号５８）由来のグルタミン酸デカルボキシラーゼをコードする遺伝子は、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により、酵母Ｓ．セレビシエ用にコドン最適化されたバージョン（配列番号５９）で合成された。
【００５０】
注文した遺伝子構成は、次の一般構造を有していた：
ＧＧＴＡＣＣＡＡＡＡＣＡＡＴＧＮＮ・・・ＮＮＴＧＡＧＴＣＧＡＣ（配列番号６７）
（ここで、ＧＧＴＡＣＣはＫｐｎＩ制限部位であり、ＡＡＡＡＣＡはコザック配列であり、ＡＴＧは開始コドンであり、ＮＮ・・・ＮＮは開始コドンおよび停止コドンのないタンパク質コード配列を表し、ＴＧＡは停止コドンであり、ＧＴＣＧＡＣはＳａｌＩ制限部位である）。
【００５１】
遺伝子とＵＳＥＲクローニング用の正しいオーバーハングとを保持している遺伝子フラグメントを、表３−１から表３−３に示すプライマーおよびテンプレートを使って、ＰＣＲ増幅によって生成させた。ＰＣＲ混合物は、２８μＬの水、１０μＬの高フィデリティＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼ緩衝液（５×）、５μＬの２ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬのＰｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ポリメラーゼ、２．５μＬのフォワードプライマー（濃度１０μＭ）、２．５μＬのリバースプライマー（濃度１０μＭ）、および１μＬのＤＮＡテンプレートを含有した。サイクリングプログラムは、９５℃で２分間、［９５℃で１０秒間、５０℃で２０秒間、６８℃で２分間］を３０サイクル、６８℃で５分間、１０℃で停止とした。遺伝子フラグメントを、ＳＹＢＲ（登録商標）−ＳＡＦＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する１％アガロースゲル上で分離し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｇｅｌ  ａｎｄ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使って精製した。プロモーターフラグメントも、ＰＣＲとそれに続く遺伝子精製によって生成させた（表３−２）。ターミネーターは発現プラスミド上に既に存在していた。
【００５２】
親プラスミドｐＥＳＣ−Ｕｒａ−ＵＳＥＲ、ｐＥＳＣ−Ｈｉｓ−ＵＳＥＲおよびｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ＵＳＥＲを、３７℃で１時間のＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ（登録商標）ＡｓｉＳＩ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）処理によって線状化し、３７℃で１時間のＮｂ．ＢｓｍＩ処理によってニックを入れた。その結果得られる線状化したニック入りＤＮＡを溶液から精製し、５ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶出させた。
【００５３】
発現プラスミドは、以下のプロトコールを用いるＵＳＥＲクローニングによって作出した。線状化しニックを入れた親プラスミド１μＬを、１μＬのプロモーターフラグメント、２μＬの遺伝子フラグメント、０．５μＬのＴａｑポリメラーゼ緩衝液、０．５μｌのＵＳＥＲ酵素（ＮＥＢ）と混合した。その混合物を３７℃で２５分間、および２５℃で２５分間インキュベートし、化学コンピテント大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。正しいインサートを持つクローンをコロニーＰＣＲによって同定し、プラスミドを大腸菌の終夜培養物から単離し、配列決定によって確認した。これらの発現プラスミドを表４に列挙する。
【００５４】
これらの発現プラスミドを、Ｓ．セレビシエ細胞に、酢酸リチウム形質転換プロトコールを使って形質転換した。これらの細胞を、ウラシル、ヒスチジンおよびロイシンを含まない合成完全（ＳＣ）寒天培地で選択した。その結果得られた株を表６に列挙する。
【実施例４】
【００５５】
＜Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）で培養したＳ．セレビシエにおける３−ヒドロキシプロピオン酸の生産＞
【００５６】
少なくとも４つの独立した酵母形質転換体を、ＳＣ  ｕｒａ−ｈｉｓ−ｌｅｕ−寒天プレートで画線培養することによって分離した。独立した形質転換体から派生した４つの単一コロニーを、通気性の蓋が付いている９６ディープウェルマイクロタイタープレート（ＥｎｚｙＳｃｒｅｅｎ）中の、０．５ｍｌのＳＣ  ｕｒａ−ｈｉｓ−ｌｅｕ−に接種した。プレートを、軌道振幅５ｃｍ、２５０ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃で終夜インキュベートした。５０μｌの終夜培養物を使って、９６ディープウェルプレート中の、１０ｇ／Ｌ  Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）を含む０．５ｍｌのデルフト培地に接種した。発酵は上記と同じ条件下で７２時間行った。
【００５７】
培養ブロスを遠沈し、実施例２で説明した酵素アッセイを使って、上清を３−ヒドロキシプロピオン酸濃度について分析した（表６）。
Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）からの３ＨＰ生産は、Ｃ．グルタミカム由来のアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼを、β−アラニンを３ＨＰに変換する酵素（Ｂ．セレウスの推定アミノトランスフェラーゼＹｈｘＡおよび大腸菌の３−ヒドロキシプロパン酸デヒドロゲナーゼＹｄｆＧまたはメタロスフェラ・セデュラの３−ヒドロキシプロパン酸デヒドロゲナーゼ）と組み合わせて発現させた場合にのみ観察された。最も良い組み合わせは、Ｃ．グルタミカム由来のアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ、Ｂ．セレウスの推定アミノトランスフェラーゼＹｈｘＡおよび大腸菌の３−ヒドロキシプロパン酸デヒドロゲナーゼＹｄｆＧであり、これは２６９±５３ｍｇ／Ｌの３ＨＰをもたらした。
【００５８】
この明細書では、別段の明示がある場合を除き、単語「または」（ｏｒ）は、条件のうちの一つだけが満たされることを要求する演算子「排他的論理和」（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ  ｏｒ）とは異なり、明記した条件の一方または両方が満たされる場合に真という値を返す演算子という意味で使用されている。「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という単語は、「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）を意味するのではなく、「包含する」（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）という意味で使用されている。上に明記した先行の教示は全て、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における先行公開文書の明記は、いずれも、その教示が、その日において、オーストラリアまたはその他の地域における共通一般知識であったことの承認または表現であると解釈すべきでない。
【実施例５】
【００５９】
＜Ｓ．セレビシエにおけるコクヌストモドキ由来のアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼの発現とグルコースからの３ＨＰの生産＞
【００６０】
トリボリウム・カスタニュウムのアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼＴｃＰａｎＤ（配列番号６８）をコードする遺伝子は、Ｓ．セレビシエ用にコドン最適化されたバージョン（配列番号６９）で、ＧｅｎｅＡｒｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって合成された。
【００６１】
プライマーＴｃＰａｎＤ＿Ｕ１＿ｆｗおよびＴｃ＿ＰａｎＤ＿ｒｖ（表３−３）を使って、実施例１で述べたように、ＵＳＥＲクローニングに適合するオーバーハングを生成させるために、ＴｃＰａｎＤ遺伝子をＰＣＲで増幅した。その結果得られたＤＮＡフラグメントＴｃＰａｎＤ＜−を、発現プラスミドｐＥＳＣ−ＨＩＳ−ＵＳＥＲに、ＴＥＦ１プロモーターと共にクローニングすることにより、プラスミドｐＥＳＣ−ＨＩＳ−ＴｃＰａｎＤ（表４）を得た。ＴｃＰａｎＤ遺伝子とプロモーターとの正しい挿入を配列決定によって確認した。
【００６２】
これらのプラスミドを、Ｓ．セレビシエ株に、酢酸リチウム形質転換プロトコールを使って形質転換した。その結果得られた株を表７に示す。
【００６３】
少なくとも３つの独立した酵母形質転換体を、通気性の蓋が付いている９６ディープウェルマイクロタイタープレート（ＥｎｚｙＳｃｒｅｅｎ）中の、０．５ｍＬのＳＣ  ｕｒａ−ｈｉｓ−ｌｅｕ−に接種した。プレートを、軌道振幅５ｃｍ、２５０ｒｐｍで撹拌しながら、３０℃で終夜インキュベートした。５０μＬの終夜培養物を使って、９６ディープウェルプレート中の、０．５ｍＬの最少ミネラル（デルフト）培地または０．５ｍＬのＳ．セレビシエ用Ｆｅｅｄ−ｉｎ−ｔｉｍｅ（ＦＩＴ）培地（Ｍ２Ｐ  Ｌａｂｓ、ドイツ）に接種した。
【００６４】
発酵は接種物調製と同じ条件で７２時間行った。培養ブロスを遠沈し、ＨＰＬＣを使って上清を３−ヒドロキシプロピオン酸濃度について分析した（表７）。
ＨＰＬＣ分析は、６０℃で作動するＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｈカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）により、Ｄｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で行った。注入液量は２０μＬとした。移動相は１ｍＭ  Ｈ２ＳＯ４で、流速は０．６ｍＬ／分とした。３ＨＰは、ＤＡＤ−３０００ダイオードアレイ検出器（Ｄｉｏｎｅｘ）で、２１０ｎｍにおける読み取り値を使って検出した。ＴＣＩから購入した３−ヒドロキシプロピオン酸を使って検量線を作成した。３−ヒドロキシプロピオン酸の実体を、標品とのスペクトルの比較によって、さらに検証した。
【００６５】
Ｔ．カスタニュウム（Ｔ．ｃａｓｔａｎｅｕｍ）由来のアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼは、Ｃ．グルタミカム由来のアスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼより、デルフト培地ではほぼ３倍高い３ＨＰ力価を、またＦＩＴ培地では２倍高い３ＨＰ力価をもたらした。こうして、本発明者らは、β−アラニンから３ＨＰを生産する能力を有する株に、Ｃ．グルタミカム由来の、より望ましくはＴ．カスタニュウム由来の、アスパラギン酸−１−デカルボキシラーゼ酵素を追加すれば、その株はグルコースから直接３ＨＰを生産できることを、確認した。
【実施例６】
【００６６】
＜前駆体の過剰発現による３ＨＰ生産の改良＞
【００６７】
グルコースからβ−アラニンを経由しての３ＨＰの生合成が酵母において確立されたら、次の目標は、生合成遺伝子の発現を改良し、Ｌ−アスパラギン酸（Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）へのフラックスを増加させることであった。これにはいくつかの遺伝子の安定な同時過剰発現が必要になるだろうから、本発明者らは、酵母用のＥａｓｙＣｌｏｎｅ組込みベクターを使用した。本発明者らは、ネイティブな細胞質アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡａｔ２ｐ、ピルビン酸カルボキシラーゼＰｙｃ１ｐおよびＰｙｃ２ｐ、ならびにそれらの組み合わせを過剰発現させた場合の効果を試験した。本発明者らは、アスパラギン酸（Ｌ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）から３ＨＰに至るキー生合成遺伝子の多重染色体組込みの効果も調べた。
【００６８】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼＡＡＴ２ならびにピルビン酸カルボキシラーゼＰＹＣ１およびＰＹＣ２をコードする遺伝子を、Ｓ．セレビシエＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ株のｇＤＮＡから、表３−３に示すプライマーおよび実施例１に示すＰＣＲ条件を使って増幅した。その結果得られるＤＮＡフラグメントを精製し、実施例１で述べたように、ＥａｓｙＣｌｏｎｅ発現ベクターにクローニングした（表４参照）。
【００６９】
Ｓ．セレビシエＣＥＮ．ＰＫ１０２−５Ｂ（ｕｒａ−ｈｉｓ−ｌｅｕ−）をプラスミドｐＸＩ−１−ＬｏｘＰ−ＫｌＬＥＵ２−ＰＹＣ１＜−ＰＴＥＦ１−ＰＰＧＫ１−＞ＰＹＣ２で形質転換し、ロイシンを含まないＳＣドロップアウト培地で形質転換体を選択し、形質転換体のゲノムＤＮＡ上でのプラスミドの正しい組込みをＰＣＲによって確認することにより、ＳＴ７２４株（ＰＹＣ１＾，ＰＹＣ２＾，ｕｒａ−ｈｉｓ−）を作出した。ＳＴ７２４株を使用し、ＬｏｘＰ−Ｃｒｅによる組換えを使ってＫｌＬＥＵ２選択マーカーをループアウトさせることにより、ＳＴ７３８株（ＰＹＣ１＾，ＰＹＣ２＾，ｕｒａ−ｈｉｓ−ｌｅｕ−）を作出した。
【００７０】
酵母株を表８の発現プラスミドで形質転換し、ウラシル、ヒスチジンおよびロイシンを含まないＳＣドロップアウト培地で形質転換体を選択した。それらの株を培養し、実施例５で述べたように３ＨＰ濃度を分析した。結果を図３に示す。
【００７１】
ＢｃＢＡＰＡＴ／ＥｃＹｄｆＧまたはＴｃＰａｎＤのコピー数を増加させると、試験した４つのバックグラウンド株（リファレンス、ＡＡＴ２を過剰発現、ＰＹＣ１およびＰＹＣ２を過剰発現、ならびにＡＡＴ２およびＰＹＣ１およびＰＹＣ２を過剰発現）の全てで、３ＨＰ力価の向上が起こる。ＴｃＰａｎＤの多重組込みの効果は、多コピーのＢｃＢＡＰＡＴ／ＥｃＹｄｆＧの効果より大きかった。
【００７２】
前駆体供給量の増加（ＰＹＣ１／ＰＹＣ２および／またはＡＡＴ２の過剰発現によるもの）は、多コピーのＴｃＰａｎＤ遺伝子またはＢｃＢＡＰＡＴ／ＥｃＹｄｆＧ遺伝子を持つ株における３ＨＰ生産に、正の効果を有したが、後者の遺伝子を１コピーしか持たない株では、正の効果を有さなかった。ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を過剰発現させることの正の効果は、流加条件をシミュレートするｆｅｅｄ−ｉｎ−ｔｉｍｅ培地でのみ観察された。最も高い力価はＳＣＥ−Ｒ２−２００株（ＡＡＴ２↑ＰＹＣ１↑ＰＹＣ２↑ＢｃＢＡＰＡＴ↑ＥｃＹｄｆＧ↑ＴｃＰａｎＤ↑↑）で得られた：無機培地とｆｅｅｄ−ｉｎ−ｔｉｍｅ培地でそれぞれ１．２７±０．２８ｇ／Ｌおよび８．５１±１．０５ｇ／Ｌ。
【実施例７】
【００７３】
＜ｐＨ５における流加培養中の酵母による３ＨＰの生産＞
【００７４】
最も良い分離株である上述のＳＣＥ−Ｒ２−２００株を、グルコース供給を制限したｐＨ５での好気的流加培養で、３つ一組にして培養した。
【００７５】
ＳＣＥ−Ｒ２−２００グリセロール保存液（０．３ｍｌ）を５００ｍＬバッフル付き振とうフラスコ中の１５０ｍＬのデルフト培地に接種し、２５０ｒｐｍで撹拌しながら約２４時間にわたって３０℃で増殖させた。培養物を４，０００×ｇで２分間の遠心分離によって５０ｍＬに濃縮し、それを使って、１Ｌ−Ｓａｒｔｏｒｉｕｓリアクター中の０．５Ｌの培地に接種した。リアクター中の最終培地は、１リットルあたり、１５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、６ｇのＫＨ２ＰＯ４、１ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ｍＬの微量金属溶液、２ｍＬのビタミン類溶液、０．４ｍＬの消泡剤Ａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および４４ｇのデキストロースを含有した。デキストロースは別途オートクレーブし、ビタミン類溶液は滅菌濾過して、オートクレーブ後の培地に加えた。微量金属溶液とビタミン類溶液は実施例２で述べたものと同じである。撹拌速度は８００ｒｐｍであり、温度は３０℃であり、給気は１Ｌ・ｍｉｎ−１の空気であり、ｐＨは２Ｎ  ＮａＯＨの自動添加によって５．０に維持した。オフガス中の二酸化炭素濃度を音響ガス分析計（モデル番号１３１１、Ｂｒｕｅｌ  ＆  Ｋｊａｅｒ）でモニターした。グルコースが消費されたら（これは、ＣＯ２生産量の減少によって観察され、また、グルコース試験片Ｇｌｕｃｏｓｅ  ＭＱｕａｎｔ（商標）（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使った残存グルコース検出によっても確認される）、５ｇ・ｈ−１の速度で供給を開始した。供給液は、１リットルあたり、４５ｇの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１８ｇのＫＨ２ＰＯ４、３ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１２ｍＬの微量金属溶液、６ｍＬのビタミン類溶液、０．６ｍＬの消泡剤Ａ、および１７６ｇのデキストロースを含有した。デキストロースは別途オートクレーブし、ビタミン類溶液は滅菌濾過し、オートクレーブ後の供給液に加えた。
【００７６】
供給開始の２４時間後に、供給速度を１０ｇ・ｈ−１まで漸増し、供給開始の４８時間後に、それをさらに１５ｇ・ｈ−１まで増加させた。リアクターから、１日に２回、試料を採取して、バイオマス乾燥重量および代謝産物を測定した。代謝産物分析のために、試料を直ちに遠心分離し、上清をＨＰＬＣ分析まで−２０℃で保存した。グルコース、コハク酸（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、酢酸（ａｃｅｔａｔｅ）、３ＨＰ、グリセロール、エタノール、およびピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）のＨＰＬＣ分析は、実施例５で述べたように行った。グルコース、グリセロールおよびエタノールは、ＲＩ−１０１屈折率検出器（Ｄｉｏｎｅｘ）を使って検出した。３ＨＰ、ピルビン酸（ｐｙｒｕｖａｔｅ）、コハク酸（ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）および酢酸（ａｃｅｔａｔｅ）は、ＤＡＤ−３０００ダイオードアレイ検出器（Ｄｉｏｎｅｘ）により、２１０ｎｍで検出した。
【００７７】
この株は３−ヒドロキシプロピオン酸を１３．７±０．３ｇ・Ｌ−１の力価で生産し、グルコースに基づく収率は１４±０％Ｃ−ｍｏｌ・Ｃ−ｍｏｌ−１、生産能は０．２４±０．０ｇ・Ｌ−１・ｈ−１であった。発酵の終了時に、有意な量の副産物、例えば酢酸（ａｃｅｔａｔｅ）、エタノールまたはグリセロールは検出されなかった。結果を図４に示す。
【００７８】
この明細書では、別段の明示がある場合を除き、単語「または」（ｏｒ）は、条件のうちの一つだけが満たされることを要求する演算子「排他的論理和」とは異なり、明記した条件の一方または両方が満たされる場合に真という値を返す演算子という意味で使用されている。「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という単語は、「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）を意味するのではなく、「包含する」（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）という意味で使用されている。上に明記した先行の教示は全て、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における先行公開文書の明記は、いずれも、その教示が、その日において、オーストラリアまたはその他の地域における共通一般知識であったことの承認または表現であると解釈すべきでない。本願と共に提出される配列表は、本発明の説明の一部を形成する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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