(57)【要約】  本発明は、安定化されたクルクミン組成物を含む。組成物は、クルクミン組成物及びホスフェート組成物を含み、ホスフェート組成物は非緩衝性であり、かつ、生物学的試料中のクルクミン及び／又はクルクミノイドを安定化し、及び／又は分解を防ぐのに十分な量で提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
クルクミノイド組成物を含む生物学的試料を準備するステップと、
非緩衝性の強酸を前記生物学的試料に加えるステップと、
前記試料中のクルクミノイドの量を検出するステップであって、前記非緩衝性の強酸が前記試料中のクルクミノイドの分解を低減する、ステップと
を含む、生物学的試料中のクルクミンレベルを決定する方法。
【請求項２】
生物学的試料がインビトロ試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的試料が、水性試料、上清試料、涙液試料、痰試料、血液試料、又は胆汁試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
クルクミノイド組成物が、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミノール、クルクミングルクロニド、及びクルクミン硫酸塩から選択される、クルクミン若しくはそのアナログ、又はその誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
強酸が、リン酸、オルトリン酸、リン酸塩、又はＮａ−ホスフェートの少なくとも１つから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
クルクミノイド組成物が、カプセル化クルクミノイド組成物を形成するための、リポソーム、リン脂質、又はポリマー組成物をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
リポソーム、リン脂質、又はポリマー組成物が、ホスファチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ホスファチジルコリン、及びジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシル−アミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレート（glycerol ricinoleate）、ヘキサデシルステアレート(hexadecyl sterate)、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、及びジアシルグリセロールスクシネート（diacylglycerolsuccinate）からなる群から選択され、或いは
ポリマー組成物が、ポリエステル、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリジオキサノン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカーボネート、ポリオルトカーボネート、ポリオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ吉草酸、ポリアルキレンオキサレート、ポリアルキレンスクシネート、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（アミノ酸）、共重合体、ターポリマー、及びこれらの組合せ又は混合物からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
カプセル化クルクミノイド組成物が１０〜９００ｎｍのサイズを有する、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
クルクミン組成物を含む試料を準備するステップと、
非緩衝性のホスフェート組成物を前記試料に加えるステップと、
前記試料中のクルクミノイドの量を検出するステップであって、前記非緩衝性のホスフェート組成物が前記試料中のクルクミノイドの分解を低減する、ステップと
を含む、生物学的試料を分析する方法。
【請求項１０】
試料の少なくとも１つの性質を分析するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
試料が血液試料又は胆汁試料である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
クルクミン組成物が、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミノール、クルクミングルクロニド、及びクルクミン硫酸塩から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ホスフェート組成物がリン酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
ホスフェート組成物がオルトリン酸である、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
ホスフェート組成物がリン酸塩である、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
ホスフェート組成物がＮａ−ホスフェートである、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
生物学的試料に対するクルクミン組成物の効果を測定するステップをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
生物学的試料に対するクルクミン組成物の効果を測定するステップと、前記効果を標準値と比較するステップとをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
クルクミノイド組成物を含む試料を準備するステップと、
非緩衝性であり、かつ、前記試料中のクルクミンを安定化するか、或いは分解を低減するかの少なくとも一方であるホスフェート組成物を前記試料に加えるステップと
を含む、クルクミン又はテトラヒドロクルクミンの試料を安定化する方法。
【請求項２０】
クルクミン組成物が、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミノール、クルクミングルクロニド、及びクルクミン硫酸塩から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ホスフェート組成物が、リン酸、オルトリン酸、リン酸塩、又はＮａ−ホスフェートを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
生物学的試料中のクルクミノイドを安定化させるのに十分な量の非緩衝性ホスフェート組成物と、
クルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミノール、クルクミングルクロニド、及びクルクミン硫酸塩を安定化させるためのリン酸、オルトリン酸、リン酸塩、又はＮａ−ホスフェートを含む前記非緩衝性ホスフェート組成物を用いてクルクミン試料を安定化させるための使用説明書一式と
を含むクルクミン診断キット。
【請求項２３】
クルクミン組成物を含む胆汁試料又は血液試料である試料を準備するステップであって、前記クルクミン組成物が、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミノール、クルクミングルクロニド、及びクルクミン硫酸塩から選択される、ステップと、
リン酸、オルトリン酸、リン酸塩、又はＮａ−ホスフェートから選択される、非緩衝性のホスフェート組成物を前記試料に加えるステップと、
前記試料中のクルクミノイドの量を検出するステップであって、前記非緩衝性のホスフェート組成物が前記試料中のクルクミノイドの分解を低減する、ステップと
を含む、血漿試料又は胆汁試料中のクルクミン組成物を、分析プロセスの間の分解に対して安定化させる方法。
【請求項２４】
クルクミン組成物と、非緩衝性であり、かつ試料中のクルクミンの分解の低減又は安定化の少なくとも一方に十分な量で提供されるホスフェート組成物と
を含む、安定化されたクルクミン組成物。
【請求項２５】
クルクミン組成物が、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミノール、クルクミングルクロニド、及びクルクミン硫酸塩から選択される、請求項２４に記載の安定化されたクルクミン組成物。
【請求項２６】
ホスフェート組成物が、リン酸、オルトリン酸、リン酸塩、又はＮａ−ホスフェートの少なくとも１つから選択される、請求項２４に記載の安定化されたクルクミン組成物。
【請求項２７】
リポソームのクルクミン組成物を形成するためのリポソームをさらに含む、請求項２４に記載の安定化されたクルクミン組成物。
【請求項２８】
溶液剤形を含む、請求項２４に記載の安定化されたクルクミン組成物。
【請求項２９】
（ａ）候補物質を準備する前に、１セットの患者由来の疑わしい組織から第１の組織試料を得るステップと、
（ｂ）候補薬物を第１のサブセットの前記患者に投与し、プラセボを第２のサブセットの前記患者に投与するステップと、
（ｃ）前記候補薬物又は前記プラセボを投与した後にステップ（ａ）を繰り返すステップと、
（ｄ）前記第１及び第２のセットの患者から第２の組織試料を得、有効量の非緩衝性ホスフェートを加えることにより前記第２の組織試料中のクルクミン又はクルクミノイドを安定化するステップと、
（ｅ）前記第１と第２のサブセットの患者間で、前記第２の組織試料中のクルクミン又はクルクミノイドの量に統計学的有意差があることを決定するステップであって、統計学的に有意な低減が、前記候補薬物が疾患状態を処置するのに有用であることを示す、ステップと、
を含む、医学的状態を処置するのに有用であると思われるクルクミン又はクルクミノイドを含む候補薬物を評価するために臨床試験を行う方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概ね、クルクミン及びテトラヒドロクルクミン（ＴＨＣ）を安定化させるための組成物及び方法に関し、特に、リン酸でｐＨを低下させることにより分析プロセス間に生じる分解に対して、血漿及び胆汁中のクルクミン及びＴＨＣを安定化させるための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の範囲を限定することなく、本発明の背景を、分析プロセス間に生じる分解に対して、血漿及び胆汁中のクルクミン及びＴＨＣを安定化させる方法に関して記載する。クルクミンは、ターメリックの主な黄色色素であり、薬草のクルクマロンガ（Curcuma longa Linn）の根茎に由来し、炎症、皮膚創傷、及び腫瘍に対する処置として伝統的に用いられている。加えて、前臨床動物モデルにおいて、クルクミンは、がんの化学防御、抗腫瘍、及び抗炎症の性質を示している。クルクミン［１，７−ビス（４−ヒドロキシ−３−メトキシフェニル）−１，６−ヘプタジエン−３，５−ジオン］は、以下の構造を有する：
【０００３】
【化１】
2015522810.tif 000003
【０００４】
クルクミンは、ヒドロキシルラジカル、スーパーオキシド陰イオン、並びに一重項酸素及び他の酸素種のスカベンジャーとして働く。クルクミンは、プロテインキナーゼの阻害、ｃ−Ｊｕｎ／ＡＰ−１活性化、プロスタグランジンの生合成を含めた、成長、分化、及び悪性転換に関係する、細胞のシグナル誘導（signal induction）経路において役割を果たし、転写因子ＮＦ−κＢの活性化において役割を果たし得る。しかし、動物におけるクルクミンのバイオアベイラビリティは依然として低いと考えられており、バイオアベイラビリティが劣るのはクルクミンの吸収が不十分であり、代謝が速いことに関連し得る。間接的な証拠により、クルクミンが腸管において代謝され、腸管で、クルクミンはクルクミングルクロニド及びクルクミン硫酸塩への代謝的Ｏ−コンジュゲーションを受け、ＴＨＣ、ヘキサヒドロクルクミン、及びヘキサヒドロクルクミノールへの生体内還元を受けることが示唆される。この多くは、処置の前及び後に試料（例えば、組織抽出物）中に存在するクルクミンを試験及び分析することにより確認される。研究では、経口投与したクルクミンのバイオアベイラビリティは非常に低いことが示され、低い又は測定不可能な血中レベルしか観察されなかった。クルクミンのバイオアベイラビリティを増強するためにクルクミンと一緒にピペリンを投与した研究もあったが、増強のレベルは中程度にすぎず、ピペリンを補った場合でも３時間後にクルクミンを検出することはできなかった。
【０００５】
「クルクミンのバイオアベイラビリティを増強するための組成物」と題する、米国特許第８，１５３，１７２号明細書は、クルクミノイド及びターメリックの精油を有する組成物を開示している。組成物をヒトに投与した場合に、クルクミノイドに精油を加えずに調製した組成物を投与した場合に得られるクルクミンのバイオアベイラビリティに比べて、クルクミンのバイオアベイラビリティの増強を引き起こすのに十分な量の精油が存在する、クルクミノイド及びターメリックの精油を有する組成物。クルクミノイド及びターメリックの精油を有する組成物を調製するための方法。
【０００６】
「薬草組成物で前立腺がんを処置するための方法」と題する、米国特許第７，０６７，１５９号明細書は、ローズマリー、ターメリック、オレガノ、及びショウガの治療有効量の超臨界抽出物、並びにホーリーバジル、ショウガ、ターメリック、コガネバナ（Scutellaria baicalensis）、ローズマリー、リョクチャ、イタドリ（huzhang）、中国オウレン（Chinese goldthread）、及びメギの治療有効量の水アルコール抽出物を含む組成物を投与することを含む、前立腺がんを処置するための方法を開示している。
【０００７】
「クルクミン化合物及び活性酸素種の阻害物質で膵炎を処置するための方法」と題する、米国特許第７，０６０，７３３号明細書は、対象に少なくとも１つのクルクミン化合物を投与することを含む、対象におけるＮＦ−κＢ活性化に関連する炎症に付随する疾患又は障害を処置、予防、変調、減弱、又は阻害する方法を開示している。少なくとも１つのクルクミン化合物及び少なくとも１つのＲＯＳ阻害物質を投与することを含む、併用療法も開示されている。医薬組成物及びキットも開示されている。
【０００８】
「クルクミン関連化合物を合成するためのプロセス」と題する、米国特許第５，６７９，８６４号明細書は、エノール型の２，４−ジケトンを、有機アミン触媒の存在下で一炭素環式（monocarbocyclic）アルデヒドと反応させることにより、クルクミン及びクルクミン関連化合物を合成するためのプロセスを開示している。反応物を高度に極性の非プロトン有機溶媒に溶解する。クルクミン関連生成物を、反応塊及び溶媒再結晶からの沈殿により結晶型において回収する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第８，１５３，１７２号明細書
【特許文献２】米国特許第７，０６７，１５９号明細書
【特許文献３】米国特許第７，０６０，７３３号明細書
【特許文献４】米国特許第５，６７９，８６４号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、リン酸でｐＨを低下させることにより分析プロセス間に生じる分解に対して、血漿及び胆汁中のクルクミン及びテトラヒドロクルクミンを安定化させるための方法を提供する。本発明の一実施形態は、クルクミノイド組成物を含む生物学的試料を準備し、非緩衝性のホスフェート組成物などの強酸を試料に加え、非緩衝性強酸が試料中のクルクミノイドの分解を低減する、試料中のクルクミノイドの量を検出することによる、生物学的試料中のクルクミンレベルを決定する方法を提供する。生物学的試料はインビトロ試料であってよく、水性試料、上清試料、涙液試料、痰試料、血液試料、又は胆汁試料を含むことができる。クルクミノイド組成物は、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミノール、クルクミングルクロニド、及びクルクミン硫酸塩から選択される、クルクミン若しくはそのアナログ、又はその誘導体を含むことができ、ホスフェート組成物はリン酸、オルトリン酸、リン酸塩、又はＮａ−ホスフェートを含むことができる。クルクミノイド組成物は、カプセル化クルクミノイド組成物を形成するための、リポソーム、リン脂質、又はポリマー組成物を含むことができ、リポソーム、リン脂質、又はポリマー組成物は、ホスファチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノール−アミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ホスファチジルコリン、及びジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシル−アミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレート（glycerol ricinoleate）、ヘキサデシルステアレート(hexadecyl sterate)、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー（acrylic polymers）、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、及びジアシルグリセロスクシネート（diacylglycerolsuccinate）からなる群から選択され、或いは、ポリマー組成物は、ポリエステル、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリジオキサノン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカーボネート、ポリオルトカーボネート、ポリオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ吉草酸、ポリアルキレンオキサレート、ポリアルキレンスクシネート、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（アミノ酸）、共重合体、ターポリマー、並びにこれらの組合せ又は混合物からなる群から選択され、約１０〜９００ｎｍのサイズを有する。
【００１１】
本発明の一実施形態は、安定化されたクルクミン組成物を提供する。組成物は、クルクミン組成物及びホスフェート組成物を含み、ホスフェート組成物は非緩衝性であり、非緩衝性の強酸は試料中のクルクミノイドの分解を低減する。その結果、ホスフェート組成物は、弱酸及び弱酸のコンジュゲート塩基の混合物、又は弱塩基及び弱塩基のコンジュゲート酸の混合物からなる水溶液を含まない。クルクミン組成物は、クルクミン組成物、修飾クルクミン組成物、又はクルクミン分解の生成物であってもよく、例えば、クルクミン組成物は、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミノール、クルクミングルクロニド、クルクミン硫酸塩、又は他の関連生成物から選択することができる。加えて、クルクミン組成物は修飾クルクミン組成物、クルクミン分解の生成物、修飾クルクミン又は合成クルクミン組成物の２又は３以上の混合物であってもよい。ホスフェート組成物は、非緩衝性であるホスフェート含有組成物であり、その結果、弱酸及び弱酸のコンジュゲート塩基の混合物、又は弱塩基及び弱塩基のコンジュゲート酸の混合物ではなく、例えば、ＰＢＳではない。本発明の一実施形態において、ホスフェート組成物はリン酸である。他の実施形態において、ホスフェート組成物はオルトリン酸、リン酸塩、Ｎａ−ホスフェート、Ｋ−ホスフェート、又は他の対イオンホスフェートであってもよい。他の実施形態において、ホスフェート組成物は、最終組成物がバッファーではない限り、すなわち、弱酸及び弱酸のコンジュゲート塩基の混合物、又は弱塩基及び弱塩基のコンジュゲート酸の混合物ではない限り、ホスフェート組成物の混合物であってもよい。安定化されたクルクミンは、リポソームのクルクミン組成物を形成するためにリポソームをさらに含むことができ、注入ナノ粒子、錠剤、カプセル剤、液剤などを含む、当業者に知られているあらゆる一般的な剤形であってもよい。
【００１２】
本発明の一実施形態は、クルクミン組成物を含む試料を準備し、ホスフェート組成物は非緩衝性であり、及び試料中のクルクミンを安定化し、又は分解を低減する、の少なくとも１つである、ホスフェート組成物を試料に加えることによりクルクミン試料を分析する方法を含む。方法は、次いで、試料の少なくとも１つの性質を分析するステップを含むことができ、ある場合には試料は水性試料、血液試料、又は胆汁試料である。その結果、ホスフェート組成物は、弱酸及び弱酸のコンジュゲート塩基の混合物、又は弱塩基及び弱塩基のコンジュゲート酸の混合物からなる水溶液を含まない。クルクミン組成物は、クルクミン組成物、修飾クルクミン組成物、又はクルクミン分解の生成物であってもよく、例えば、クルクミン組成物は、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミノール、クルクミングルクロニド、クルクミン硫酸塩、又は他の関連生成物から選択することができる。加えて、クルクミン組成物は、修飾クルクミン組成物、クルクミン分解の生成物、修飾クルクミン又は合成クルクミン組成物の２又は３以上の混合物であってもよい。ホスフェート組成物は、非緩衝性であり、その結果、弱酸及び弱酸のコンジュゲート塩基の混合物、又は弱塩基及び弱塩基のコンジュゲート酸の混合物ではなく、例えば、ＰＢＳではない、ホスフェート含有組成物である。本発明の一実施形態において、ホスフェート組成物はリン酸である。他の実施形態において、ホスフェート組成物は、オルトリン酸、リン酸塩、又はＮａ−ホスフェート、Ｋ−ホスフェート、又は他の対イオンホスフェートであってもよい。他の実施形態において、ホスフェート組成物は、最終組成物がバッファーではない限り、すなわち、弱酸及び弱酸のコンジュゲート塩基の混合物、又は弱塩基及び弱酸基のコンジュゲート酸の混合物ではない限り、ホスフェート組成物の混合物であってもよい。
【００１３】
本発明の一実施形態は、クルクミノイド組成物を含む試料を準備するステップと、ホスフェート組成物が非緩衝性であり、かつ、試料中のクルクミンを安定化するか、或いは分解を低減するかの少なくとも一方であるホスフェート組成物を試料に加えるステップとを含む、クルクミン又はテトラヒドロクルクミンの試料を安定化する方法を提供する。その結果、ホスフェート組成物は、弱酸及び弱酸のコンジュゲート塩基の混合物、又は弱塩基及び弱酸基のコンジュゲート酸の混合物からなる水溶液を含まない。クルクミン組成物は、クルクミン組成物、修飾クルクミン組成物、又はクルクミン分解の生成物であってよく、例えば、クルクミン組成物は、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミノール、クルクミングルクロニド、クルクミン硫酸塩、又は他の関連の生成物から選択することができる。加えて、クルクミン組成物は、修飾クルクミン組成物、クルクミン分解の生成物、修飾クルクミン又は合成クルクミン組成物の２又は３以上の混合物であってもよい。ホスフェート組成物は、非緩衝性であり、その結果、弱酸及び弱酸のコンジュゲート塩基の混合物、又は弱塩基及び弱酸基のコンジュゲート酸の混合物ではなく、例えば、ＰＢＳではない、ホスフェート含有組成物である。本発明の一実施形態において、ホスフェート組成物はリン酸である。他の実施形態において、ホスフェート組成物は、オルトリン酸、リン酸塩、Ｎａ−ホスフェート、Ｋ−ホスフェート、又は他の対イオンホスフェートであってもよい。他の実施形態において、ホスフェート組成物は、最終組成物がバッファーではない限り、すなわち、弱酸及び弱酸のコンジュゲート塩基の混合物、又は弱塩基及び弱塩基のコンジュゲート酸ではない限り、ホスフェート組成物の混合物であってもよい。
【００１４】
本発明の一実施形態は、非緩衝性ホスフェート組成物、及び非緩衝性ホスフェート組成物を用いてクルクミン試料を安定化させるための使用説明書一式を含むクルクミン診断キットを提供し、非緩衝性ホスフェート組成物の量は生物学的試料中のクルクミノイドを安定化させるのに十分であり、非緩衝性ホスフェート組成物は、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミノール、クルクミングルクロニド、及びクルクミン硫酸塩を安定化させるためのリン酸、オルトリン酸、リン酸塩、又はＮａ−ホスフェートを含む。その結果、ホスフェート組成物は、弱酸及び弱酸のコンジュゲート塩基の混合物、又は弱塩基及び弱塩基のコンジュゲート酸の混合物からなる水溶液を含まない。
【００１５】
本発明の別の一実施形態は、試料が胆汁試料又は血液試料であり、クルクミン組成物が、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミノール、クルクミングルクロニド、及びクルクミン硫酸塩から選択される、クルクミン組成物を含む試料を準備し、非緩衝性ホスフェート組成物の量が生物学的試料中のクルクミノイドを安定化させるのに十分である、ホスフェート組成物を試料に加えることによる、血漿試料又は胆汁試料中のクルクミン組成物を、分析プロセスの間の分解に対して安定化する方法を提供する。その結果、ホスフェート組成物は、弱酸及び弱酸のコンジュゲート塩基の混合物、又は弱塩基及び弱塩基のコンジュゲート酸の混合物からなる水溶液を含まない。クルクミン組成物は、クルクミン組成物、修飾クルクミン組成物、又はクルクミン分解の生成物であってもよく、例えば、クルクミン組成物は、クルクミン、テトラヒドロクルクミン、ヘキサヒドロクルクミノール、クルクミングルクロニド、クルクミン硫酸塩、又は他の関連生成物から選択することができる。加えて、クルクミン組成物は修飾クルクミン組成物、クルクミン分解の生成物、修飾クルクミン又は合成クルクミン組成物の２又は３以上の混合物であってもよい。ホスフェート組成物は、非緩衝性であるホスフェート含有組成物であり、その結果、弱酸及び弱酸のコンジュゲート塩基の混合物、又は弱塩基及び弱塩基のコンジュゲート酸の混合物ではなく、例えば、ＰＢＳではない。本発明の一実施形態において、ホスフェート組成物はリン酸である。他の実施形態において、ホスフェート組成物はオルトリン酸、リン酸塩、Ｎａ−ホスフェート、Ｋ−ホスフェート、又は他の対イオンホスフェートであってもよい。他の実施形態において、ホスフェート組成物は、最終組成物がバッファーではない限り、すなわち、弱酸及び弱酸のコンジュゲート塩基の混合物、又は弱塩基及び弱塩基のコンジュゲート酸の混合物ではない限り、ホスフェート組成物の混合物であってもよい。安定化されたクルクミンは、リポソームのクルクミン組成物を形成するためにリポソームをさらに含むことができ、注入ナノ粒子、錠剤、カプセル剤、液剤などを含む、当業者に知られているあらゆる一般的な剤形であってもよい。
【００１６】
本発明の別の一実施形態は、（ａ）候補物質を準備する前に、１セットの患者由来の疑わしい組織から第１の組織試料を得ること、（ｂ）候補薬物を第１のサブセットの患者に投与し、プラセボを第２のサブセットの患者に投与すること、（ｃ）候補薬物又はプラセボを投与した後にステップ（ａ）を繰り返すこと、（ｄ）第１及び第２のセットの患者から第２の組織試料を得、有効量の非緩衝性ホスフェートを加えることにより第２の組織試料中のクルクミン又はクルクミノイドを安定化すること、（ｅ）統計学的に有意な低減が候補薬物が前記疾患状態を処置するのに有用であることを示す、第１と第２のサブセットの患者間で、第２の組織試料中のクルクミン又はクルクミノイドの量における統計学的有意差があることを決定することを含む、医学的状態を処置するのに有用であると思われるクルクミン又はクルクミノイドを含む候補薬物を評価するために臨床試験を行う方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
本発明の特徴及び利点をより完全に理解するために、次に、添付の図と一緒に、発明を実施するための形態に言及する。
【図１Ａ−１Ｄ】注入後の時間の関数としてクルクミン及びＴＨＣの血漿レベルを示すグラフである。
【図２Ａ−２Ｄ】注入後の時間の関数として血漿、胆汁、及び尿中クルクミンレベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の様々な実施形態の作成及び使用を以下に詳しく論じるが、本発明は、広範囲の具体的な状況において具体化され得る多くの適用可能な発明上の概念を提供することを理解されたい。本明細書で論じる具体的な実施形態は、本発明を作成及び使用する具体的な方法を説明するにすぎず、本発明の範囲の限界を定めるものではない。
【００１９】
本発明の理解を促すために、いくつかの語を以下に規定する。本明細書に規定する語は、本発明に関連する分野の通常の技術者により通常理解される意味を有する。「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その（the）」などの語は、単数の実体のみに言及することを意図するものでなく、説明のために具体的な例を用いることができる一般的なクラスを含む。本明細書における専門用語は本発明の具体的な実施形態を記載するために用いるものであり、これらの用法は、特許請求の範囲において概略する以外、本発明の範囲を定めるものではない。
【００２０】
「リポソーム」という用語は、その壁又は膜が、脂質、特にリン脂質で形成されているカプセルを指し、ステロール、特にコレステロールがそれに任意に加えられる。
【００２１】
本明細書で用いられる、「インビボ」という用語は、身体の内側であることを指す。本出願において用いられる、「インビトロ」という用語は、非生物系において行われる操作を示すと理解されたい。
【００２２】
本明細書に記載する、「有効量」又は「治療有効量」という用語は、研究者、獣医師、医師、又は他の臨床家により探求される、組織、系、動物、又はヒトの、生物学的応答又は医学的応答を誘発する対象の化合物の量を意味する。
【００２３】
本明細書で用いられる、「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤、又は賦形剤が、製剤の他の構成成分と適合性でなければならず、そのレシピエントに有害であってはならないことを記載するものである。
【００２４】
本明細書で用いられる、「クルクミン」という用語は、（ｉ）溶媒中に溶解、分散、又は懸濁された１又は２以上の任意選択の関連の補助因子、タンパク質、抗体、鎮痛剤、及び他の薬学上の有効物質と、水性又は非水性溶媒中に溶解又は分散されるクルクミン誘導体又はその組合せ、（ii）１又は２以上の球状のリポソームが分散媒体中に分散される、適切な水性又は非水性の分散媒体、並びに（iii）１又は２以上の任意選択の賦形剤、希釈剤、持続放出若しくは徐放の薬剤、滑沢剤、保存剤、又はこれらの任意の組合せを記載するものである。
【００２５】
本発明は、血漿中のクルクミン及び／又はＴＨＣの安定化を提供するものであるが、安定化は血漿をＨ３ＰＯ４で酸性化するよりも複雑である。例えば、フェーズ１において、ヒト血漿試料をＮａ−ホスフェートを加えて安定化したが、クルクミン及びＴＨＣ両方のベンチ安定性（bench stability）は最小であり、試料を室温のベンチ上に２、３時間置いた後、クルクミン及び／又はＴＨＣは検出されなかった。Ｎａ−ホスフェートを加えると血漿は安定化したが、Ｈ３ＰＯ４ほど効率的ではなかった。その結果、本発明の一実施形態は、Ｎａ−ホスフェートを加えることによる、血漿中のクルクミン及びＴＨＣの安定性を提供する。本発明の別の一実施形態は、Ｏ−リン酸を加えることによる血漿中のクルクミン及びＴＨＣの安定性を提供する。本発明の別の一実施形態は、Ｎａ−ホスフェート及びＯ−リン酸を加えることによる血漿中のクルクミン及びＴＨＣの安定性を提供する。Ｏ−リン酸は、血漿又は体液中に、より容易に組み入れられ得る。ホスフェート分子はクルクミン及びＴＨＣを安定化するのに不可欠であり、リン酸ナトリウム及びリン酸の両方を用いることができる。それとは対照的に、リン酸バッファーは血漿中のクルクミン及びＴＨＣを安定化しない。リン酸バッファーは、それが作成される塩に特有ではなく、リン酸ナトリウム又はリン酸カリウム（一塩基性若しくは二塩基性）のいずれかで作成され得、一塩基性のリン酸ナトリウムはオルトリン酸同様に特有である。ホスフェート／リン酸を加える主な目的は、血漿中のクルクミン及びＴＨＣを安定化することである。本発明者らが認めたように、血漿中にリン酸が存在すれば、分析物がより高濃度であることを示す。この安定化のプロセスは、当業者に知られている他のリン酸塩の使用によっても実現され得る。Ｈ３ＰＯ４を加えることで、ｐＨの移行が確認されるため、より高濃度のクルクミンがもたらされる。例えば、ＥＤＴＡ血漿のｐＨは７．９５であり、ＥＤＴＡを含まない血漿のｐＨより少々高い。血漿９５０ｍｌに５％Ｈ３ＰＯ４５０μｌを加えた後、ｐＨは４．４であった。クルクミンは５．５未満のｐＨ値では安定なので、Ｈ３ＰＯ４を加えると血漿試料中のクルクミンは安定化する。他の実施形態は、他の酸性化剤（例えば、ＡＣＤ、酸性クエン酸塩など）を用いることができ、抗凝固剤も用いることができる。加えて、尿は５〜７の間のｐＨではより酸性である傾向があるが、Ｈ３ＰＯ４では安定化は観察されなかった。
【００２６】
本発明は、リン酸でｐＨを下げることにより、分析プロセスの間に生じる分解に対して、血漿及び胆汁中のクルクミン及びＴＨＣを安定化する方法を提供する。４頭のイヌの一試験において、オス２頭及びメス２頭に、２時間かけてリポソームのクルクミン（LIPOCURC（商標））１０ｍｇ／ｋｇを注入し、別のオス２頭及びメス２頭の４頭のイヌに、８時間かけてリポソームのクルクミン（LIPOCURC（商標））１０ｍｇ／ｋｇを注入した。クルクミン及びＴＨＣの血漿レベルを、注入後１５分に剖検して得た。ＴＨＣレベルは、両方の注入速度で、クルクミンより６．３〜９．６倍高く、クルクミンの酵素代謝が高速であり、血中ＴＨＣクリアランスが比較的低速である組合せが示唆された。８時間注入に比べて、クルクミン及びその代謝産物であるＴＨＣの両方の２時間注入のレベルは有意に高かった。両方の化合物の２時間注入後の血漿半減期は、０．４〜０．７時間の範囲であり、肝クリアランス及び腎クリアランス両方の帰結であった。しかし、血漿濃度が高ければ、腎排泄は特にＴＨＣで優勢である。８時間注入の間にクリアランス速度の増強が認められ、定常状態の達成が妨げられた。これらの観察は、白血病、リンパ腫、及び骨髄転移を含めた造血器悪性腫瘍に対して、２時間の注入が、より高濃度のプロファイル及び非刺激のクリアランス速度に基づき有利であり得ることを示唆するものである。
【００２７】
治療を意図するリポソームのクルクミン（LIPOCURC（商標））の非経口投与は、新生物疾患を有する患者に対する最適速度の投与の判定に関していくつかの問題を提起する。ボーラス静脈注射から持続注入までの範囲の選択肢は、酵素の代謝、ｐＨ依存的分解、腎臓及び肝臓の胆汁排泄メカニズムによる影響を受ける。イヌにおける前臨床の毒性学的評価の間、クルクミン含量２０ｍｇ／ｋｇ以上の短時間の注入後に、投与量依存性の溶血が認められた。２時間かけた投与量１０ｍｇ／ｋｇの注入は非毒性であった。正常ヒト対象における上昇性の投与量のフェーズ１臨床試験において、この同じ２時間注入のスケジュールを用い、最高の静脈内投与量の投与（５ｍｇ／ｋｇ）に有害反応はなかった。非常に高いＣｍａｘからの毒性を避けるために、本発明者らは２時間注入を用いたが、イヌにおける代謝因子及び排出因子が不明であることに鑑みて、本発明者らは、任意の利点を決定するために、２時間注入と４倍長い（８時間）注入とを比較した。
【００２８】
ビーグル品種８頭（メス４頭及びオス４頭）におけるリポソームのクルクミン（LIPOCURC（商標））の注入に起因する血漿濃度データを用いた。２時間又は８時間のいずれかの期間にわたって注入した全投与量１０ｍｇ／ｋｇの静脈内注入投薬に対する、試験に対する結果及び分析を示す。クルクミン及びその代謝産物であるＴＨＣの血漿レベルを、投薬後、決められた間隔で測定した。動物を全て安楽死させ、注入１５分後に剖検に供し、組織、血漿、胆汁、及び尿の試料を採取して、異なる２つの速度で注入した後のクルクミン及びＴＨＣの組織分布及び薬物動態、並びに異なる２つの分析物の保存／安定化方法（例えば、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）あり及び／又はなし）を決定し、クルクミン及びＴＨＣの血漿の薬物動態、尿及び胆汁のレベルを見直した。処置群の概要を、以下の表１に示す。
【００２９】
【表１】
2015522810.tif 000004
【００３０】
リポソームのクルクミン（LIPOCURC（商標））をビーグル犬８頭に、２時間（パートＡ）又は８時間（パートＢ）かけて静脈内注入することにより投与した。２時間注入に対して、血液試料を、投与前、並びに注入の間０．２５、０．５、１．５、及び２時間、並びに注入１５分後に採取した。８時間注入に対して、血液試料を、投与前、並びに注入の間０．２５、０．５、１．５、４、４、６、及び８時間、並びに注入１５分後に採取した。
【００３１】
全ての群に対して、血漿クルクミン及びＴＨＣを、Nucro-TechnicsのBioanalytical Departmentにより開発された方法を用いて決定した［１］。２セットの試料に対して生物分析を行い、１セットはリン酸で処置し、１セットはリン酸で処理しなかった。リン酸を用いて予備試験に基づく１セットの試料を処置し、ホスフェートは組織マトリクス中のクルクミン及びＴＨＣの安定性を増大することが示された。定量限界未満の値を、値０と割り当てた。
【００３２】
オスイヌ又はメスイヌにおけるクルクミンの血漿レベル間に一定の差が存在しなかったことから、オスイヌ及びメスイヌからの平均血漿濃度を用いてＰＫ分析を行った。イヌ４頭からのデータを用いて（別段の指示がなければ）、血漿濃度対時間のプロファイルを分析した。試験物品に対する血漿のプロファイルを、イヌ４頭の平均データ±ＳＥとして表す。平均血漿濃度を用いてＰＫ分析を行った。血漿濃度対時間のプロファイルを分析し、ＰＫパラメータを、WinNonlin Version 5.2.1を用い、一次を排除した静脈内注入モデルを用いて推定した。別段の指示がなければ、試験物品に対する血漿濃度−時間のプロファイルを、イヌ４頭の平均データ±ＳＥとして表す。
【００３３】
図１Ａ〜１Ｄは、注入後の時間の関数としてのクルクミンの血漿レベルのグラフである。図１Ａは、クルクミン５ｍｇ／ｋｇ／時間の注入２時間後のクルクミンの血漿レベルのグラフである。図１Ｂは、クルクミン１．２５ｍｇ／ｋｇの注入８時間後のクルクミンの血漿レベルのグラフである。図１Ｃは、クルクミン５ｍｇ／ｋｇ／時間の注入２時間後のＴＨＣの血漿レベルのグラフである。図１Ｄは、クルクミン１．２５ｍｇ／ｋｇ／時間の注入８時間後のＴＨＣの血漿レベルのグラフである。値は、イヌ４頭の平均値±標準誤差として表したものである。
【００３４】
２時間（高速）注入後又は８時間（低速）注入後いずれかのクルクミン及びＴＨＣの血漿レベル及びＡＵＣは、リン酸存在下で明らかに高く（表２及び３）、リン酸は血漿試料中のクルクミン及びＴＨＣの安定性を増大することが示唆された。
【００３５】
以下の表２は、リン酸の存在下及び非存在下で生物分析した時の、クルクミン及びＴＨＣに対する血漿濃度のＡＵＣ対時間の表である。リン酸を、リン酸の形態において血漿試料に加え、Ｃｍａｘは観察された値を表し、ＡＵＣは、線形の台形法則を用いて注入１５分後に計算した曲線下面積である。
【００３６】
【表２】
2015522810.tif 000005
【００３７】
以下の表３は、リン酸の存在下及び非存在下で生物分析した時の、クルクミン及びＴＨＣに対する血漿濃度対時間の表である。
【００３８】
【表３】
2015522810.tif 000006
【００３９】
値は、４つの値の平均値±ＳＥとして表したものである。
これは、胆汁も同様であり、しかしいっそう低く、尿ではリン酸を加えた影響は変動的であった。
【００４０】
図２Ａ〜２Ｄは、血漿、胆汁、及び尿注入後のレベルの時間の関数としての、血漿、胆汁、及び尿のクルクミン注入後レベルのグラフである。図２Ａは、クルクミン５ｍｇ／ｋｇ／時間の注入２時間後のクルクミンレベルのグラフである。図２Ｂは、クルクミン１．２５ｍｇ／ｋｇの注入８時間後のクルクミンレベルのグラフである。図２Ｃは、クルクミン５ｍｇ／ｋｇ／時間の注入２時間後のＴＨＣレベルのグラフである。図２Ｄは、クルクミン１．２５ｍｇ／ｋｇ／時間の注入８時間後のＴＨＣレベルのグラフである。表３は、リン酸非存在下のＴＨＣを示し、値は、３回決定の平均値±ＳＥとして表し、それ以外の値は全て、イヌ４頭の平均値±標準誤差として表したものである。
【００４１】
ラットの血漿中クルクミンの生物分析に対する疑わしいデータが、文献において、高投与量を経口投与した後に観察されている［２］。血漿安定性よりむしろ検出方法が、矛盾の理由として推測されたが、血漿／組織の安定性も、クルクミンの生物分析における問題であると思われる。本発明の一実施形態は、血漿、胆汁、及び尿の試料中のリン酸により安定化されたクルクミン及びＴＨＣの定量を提供するものである。
【００４２】
５ｍｇ／ｋｇ／時間のクルクミンを２時間注入すると（合計投与量１０ｍｇ／ｋｇ）、クルクミンの血漿レベルは上昇して１．５時間までに最大濃度３２０ｎｇ／ｍＬを達成し、次いで、注入の間に安定化／低下を始める。注入を停止すると、１５分でクルクミンの血漿濃度が２５７ｎｇ／ｍＬから６５ｎｇ／ｍＬに速やかに低下した。ＴＨＣの濃度−時間プロファイルも同様であった。クルクミンを１．２５ｍｇ／ｋｇ／時間の速度で８時間注入すると（合計投与量１０ｍｇ／ｋｇ）、１．５時間までに１８７ｎｇ／ｍＬのピーク血漿濃度にやはり到達し、注入期間の間に低下を始め、したがって定常状態のレベルは実現せず、同様の濃度−時間プロファイルがＴＨＣにも観察された。ＡＵＣに基づくＴＨＣ対クルクミン比は、２時間注入では９．６であり、８時間注入では６．３であった。８時間注入時のクルクミン及びその代謝産物であるＴＨＣ両方の血漿レベルにおける低下は、クルクミンの注入はそれ自体の排除を活性化又は増強し得ることを示唆するものである。
【００４３】
血漿濃度データのコンピュータ支援薬物動態分析は、２時間注入に対して示されたにすぎない。クルクミン及びＴＨＣに対する推定ＰＫパラメータを表４に示し、Ｃｍａｘ観察及び計算されたＡＵＣを表２に示す。
【００４４】
以下の表４は、クルクミン及びＴＨＣの推定ＰＫパラメータを表す。投薬速度２ｍｇ／ｋｇ／時間での２時間静脈内注入に対して、合計投与量１０ｍｇ／ｋｇ。推定ＰＫパラメータを、一次排除持続静脈内注入モデル（first-order elimination continuous intravenous infusion model）にデータを適合させることにより決定した。
【００４５】
【表４】
2015522810.tif 000007
【００４６】
クルクミンの血漿濃度の速やかな低下は、分布容積１２．７Ｌ／ｋｇからの２０．６Ｌ／ｋｇ／時間という高いクリアランスの結果として、０．４時間及び０．６時間というそれぞれ短いｔ１／２（ｅ）及びＭＲＴ値と一致する。２３３ｎｇ／ｍＬ及び４８５ｎｇ＊時間／ｍＬという適合されたＣｍａｘ及びＡＵＣ値は、観察されたＣｍａｘ３２０ｎｇ／ｍＬ及び計算されたＡＵＣ３９４ｎｇ＊時間／ｍＬに近似する。ＴＨＣは、クルクミンに近い推定ｔ１／２（ｅ）及びＭＲＴ値を有し、推定値はそれぞれ０．５時間及び０．７時間であり、Ｃｍａｘ及びＡＵＣ値は２４２９ｎｇ／ｍＬ及び５１８５ｎｇ＊時間／ｍＬであり、それに対して観察された値は２９８３ｎｇ／ｍＬ及び３７９７ｎｇ＊時間／ｍＬであった。注入投与速度１．２５ｍｇ／ｋｇ／時間及び５．０ｍｇ／ｋｇ／時間でクルクミンに観察されたＣｍａｘ値は投与速度に対して投与量比例的であるのに近く、２時間及び８時間の注入に対して観察され、投与速度により標準化されたＣｍａｘ値は６４ｎｇ／ｍＬ及び５３ｎｇ／ｍＬであった（ｍｇ／ｋｇ／時間でのＣｍａｘ／投与速度）。高速及び低速の注入速度に対してＡＵＤ及び注入投与速度により標準化された最高２時間のＡＵＤは、投与量比例的に一致する、それぞれ３５４＊時間／ｍＬ及び８２ｎｇ＊時間／ｍＬ、並びに５９＊時間／ｍＬ及び６６ｎｇ＊時間／ｍＬであった。
【００４７】
血漿、尿、及び胆汁中のクルクミン及びＴＨＣのレベルの測定により、クルクミンの処分に関する付加的な情報が提供される（図２Ａ〜２Ｄ、以下の表５）。胆汁に関して、クルクミン及びＴＨＣのレベルは、オスイヌに比べてメスイヌで幾分高かった。１．２５ｍｇ／ｋｇ／時間の高速及び低速両方の注入速度の両方で、クルクミンは、血漿に比べて尿及び胆汁中で濃度が高いことが見出された。低速の注入速度では、尿及び胆汁の血漿に対する濃度比はそれぞれ１０及び３２であり、高速の注入速度では、観察された値はそれぞれ４４及び１６であった。
【００４８】
表５は、注入後１５分、２時間、及び８時間の、血漿、尿、及び胆汁のクルクミン及びＴＨＣのレベルを示す。
【００４９】
【表５】
2015522810.tif 000008
【００５０】
別段の指示がなければ、値は、４回決定の平均値±ＳＥである。３つの値が０であり、１つの値が５８ｎｇ／ｍＬであった。３回決定の平均値±ＳＥ。
【００５１】
肝臓及び腎臓はクルクミンを血漿から排除することができ、腎臓はより高い血漿濃度でより多くのクルクミンを排泄することができるが、胆汁の排泄は飽和に到達しつつある。これは、ラットにおける試験と一致し、試験では、静脈内投与したクルクミンの組織内分布（tissue disposition）試験により肝臓及び腎臓において最高の曝露が実証された［３］。腎トランスポーターの変調は、先に言及したクルクミンの排除の増強において重要な役割を果たし得る。ＴＨＣに対して、尿対血漿の濃度比は、低速及び高速両方の注入速度で、胆汁対血漿の濃度比より高く、値はそれぞれ０．３及び１．２に比べて３．１及び４．４であった。これは、肝臓及び肝臓外の組織によるクルクミンからＴＨＣへの代謝、血漿中ＴＨＣの蓄積、及び尿による排泄に一致する。
【００５２】
これらのデータは、薬物の安定性、投与量、及び投与スケジュールが、クルクミンの臨床的治療の重要及び融通の利く（malleable）構成要素を表すことを実証するものである。組織の表現型、代謝、排泄経路、輸送のメカニズム、及び分布は重要であるが、修飾をあまり受けない。これらのパラメータのうち、分析手順前及び分析手順間のクルクミン分解は、決定的に重要であり、クルクミンの経口及び非経口投与の動物試験において報告された血漿レベルの可変性（variences）及び正当性に寄与する。環境の光線及びｐＨに対してクルクミンの感受性（succeptibility）が高いことは、分析処理の前にリン酸を加えてクルクミンを安定化させることにより解決された。
【００５３】
動物モデルにおけるクルクミン血中レベルに関する誤報に寄与する別の一因子は、代謝活性の効果である。クルクミンは、遊離クルクミンとしてあらゆる送達ビヒクルから放出され得、水溶性が低いため主に循環脂質及び組織の脂質に分布し、又はグルクロニド若しくは硫酸塩とのコンジュゲーションによりいくつかの二次化合物に代謝され、又はジヒドロクルクミン、ＴＨＣ、及びオクタヒドロクルクミンに還元される。しかし、動物モデルにおけるこれら代謝産物の特有及び集合的な生物学的活性については刊行されていない。優勢の還元された代謝産物はＴＨＣであり、クルクミンと同様の生物学的活性を有し、腸内の大腸菌（E.Coli）によりＮＡＤＨ−依存的ジヒドロクルクミンにより変換され得る。ＴＨＣはまた、特異的な酵素であるレダクターゼによりクルクミンから変換され得、レダクターゼは分子量８２ＫＤａを有し、クルクミンに対して優先的に作用する基質スペクトルの限定された２つの同一のサブユニットからなる。レダクターゼのクルクミンに対する作用機序は２ステップで行われる（すなわち、２つの酵素反応）。第１は中間体であるジヒドロクルクミンへのＮＡＤＰＨ−依存的還元であり、第２はＴＨＣへのＮＡＤＰＨ−依存的クルクミン／ジヒドロクルクミンレダクターゼである。この酵素は、中間鎖のデヒドロゲナーゼ−レダクターゼスーパーファミリーの一部であり、この酵素の存在は、酵素の起源及び分布の興味深い問題を提起する。この酵素は、クルクミンを腹腔内投与した後のマウスの血中に見出され、この酵素はヒトの血液及び組織中に、特にヒトの肝臓にも存在すると想定される。この酵素は、特定の系統のヒト起源の腸内大腸菌：Ｋ−１２亜系ＭＧ１６５５バージョン１５．１にも見出されている。動物モデルにおけるこの還元酵素のレベルに対して報告する刊行された研究は存在しないが、イヌの血漿中にＴＨＣが著しく存在することは、組織中及び血中の酵素の存在を強力に示唆するものである。
【００５４】
イヌにおける血漿及び胆汁の試料にリン酸を加えるとクルクミン及びＴＨＣの分解が妨げられ、このことはクルクミンの分布及び排泄に対して公開されているデータの正当性の問題を提起する。イヌにリポソームのクルクミン（LIPOCURC（商標））を２つの異なる注入速度で注入すると、２時間注入では８時間注入に比べて、クルクミン及びＴＨＣの血漿レベルはより高くなった。注入投与速度に対して標準化されたＣｍａｘ及びＡＵＣ２時間は比例した。ＴＨＣの血漿レベルはクルクミンより高く、血漿ＴＨＣ対クルクミンの比は６．３〜９．６の範囲であった。これらのデータは、血液又は組織中のクルクミン還元酵素の推定上の存在を強調するものである。
【００５５】
クルクミン２時間注入のデータを分析することで、０．４〜０．７時間の範囲の、短い血漿ｔ１／２（ｅ）及び平均滞留時間（ＭＲＴ、mean residence times）の推定値が提供された。短い血漿ｔ１／２（ｅ）及びＭＲＴは、肝臓及び腎臓両方の経路によるクルクミンのクリアランスの結果である可能性がある。８時間注入にわたるクルクミン及びＴＨＣのクリアランスは増大し、定常状態の達成が妨げられる。このメカニズムは、潜在的な腎トランスポーターの調節による可能性がある。本発明はクルクミンの２時間注入を提供するものであり、ＴＨＣ又はクルクミン及びＴＨＣは液体の悪性腫瘍に好ましいが、クルクミン、ＴＨＣ、又はクルクミン及びＴＨＣの８時間注入は、腫瘍細胞／組織のデータの非存在の固形腫瘍に対するものである。
【００５６】
加えて、本発明は、適切な水性媒体中又は非水性媒体中に溶解又は分散した、治療有効量の医薬組成物のクルクミン、クルクミンアナログ、クルクミン誘導体、又はこれらの組合せを静脈内投与することができ、クルクミンは１若しくは２以上の球状のリポソーム中に封入され、又は１つ若しくは２以上の生分解性のポリマーにコンジュゲートされている。別の一態様において、リポソームは脂質又はリン脂質の壁を含み、脂質又はリン脂質は、ホスファチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノール−アミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ホスファチジルコリン、及びジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシル−アミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレート、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、及びジアシルグリセロールスクシネートからなる群から選択される。具体的な一態様において、１又は２以上のリポソームのサイズは約１００ｎｍである。別の一態様において、治療有効量は、対象の体重１ｋｇあたり５０ｎＭを含む。さらに別の一態様において、医薬組成物は、関連の補助因子、タンパク質、抗体、鎮痛剤、及び他の薬学上の有効物質と一緒に投与されてもよい。本明細書上記に開示する方法の別の一態様において、１又は２以上の薬学上の有効物質は、Ｌ−ドーパ、カルビドパ、ベンセラジド、トルカポン、ドーパミンアゴニストブロモクリプチン、ペルゴリド、プラミペキソール、ロピニロール、ピリベジル、カベルゴリン、アポモルフィン、リスリド、ＭＡＯ阻害薬、セレギリン、及びラサギリンからなる群から選択される。
【００５７】
上記に開示する組成物の一態様において、１又は２以上の球状のリポソーム又はポリマーコンジュゲートは分散媒体中に分散されてもよく、分散媒体は水性又は非水性の分散媒体である。関連の態様において、脂質又はリン脂質は、ホスファチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ホスファチジルコリン、及びジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシル−アミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレート、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、及びジアシルグリセロールスクシネートからなる群から選択され、１又は２以上の生分解性ポリマーは、ポリエステル、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリジオキサノン、ポリアセタール、ポリケタール、ポリカーボネート、ポリオルトカーボネート、ポリオルトエステル、ポリホスホエステル、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシ吉草酸、ポリアルキレンオキサレート、ポリアルキレンスクシネート、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（アミノ酸）、共重合体、ターポリマー、並びにこれらの組合せ又は混合物からなる群から選択される。
【００５８】
別の一態様において、組成物は、静脈内に、皮下に、筋肉内に、又は腹腔内に投与される。具体的な一態様において、１又は２以上のリポソームのサイズは約１００ｎｍである。さらに別の一態様において、組成物は静脈内投与される。
【００５９】
別の一態様において、本発明は、ホスファチジルコリン（レシチン）、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノール−アミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、ホスファチジルエタノールアミン（セファリン）、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、ジセチルホスフェート、ホスファチジルコリン、及びジパルミトイル−ホスファチジルグリセロール、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシル−アミン、アセチルパルミテート、グリセロールリシノレート、ヘキサデシルステアレート、イソプロピルミリステート、両性アクリルポリマー、脂肪酸、脂肪酸アミド、コレステロール、コレステロールエステル、ジアシルグリセロール、及びジアシルグリセロールスクシネートからなる群から選択される脂質又はリン脂質を含むことができる。さらに別の一態様において、組成物は、静脈内に、皮下に、筋肉内に、又は腹腔内に投与される。別の一態様において、１又は２以上のリポソームのサイズは約１００ｎｍである。具体的な一態様において、組成物は静脈内投与される。
【００６０】
本明細書上記に記載した方法の具体的な態様において、１又は２以上のリポソームのサイズは約１００ｎｍであり、治療有効量は対象の体重１ｋｇあたり５０ｎＭを含む。関連の一態様において、医薬組成物は、関連の補助因子、タンパク質、抗体、鎮痛剤、及び他の薬学上の有効物質と一緒に投与されてもよく、薬学上の有効物質はセロトニン再取込み阻害薬であるセルトラリン及びパロキセチンを含む。
【００６１】
ビーグル犬８頭（メス４頭及びオス４頭）におけるリポソームのクルクミンの注入に起因する組織濃度データを用いてこの報告を構築した。２時間又は８時間いずれかの期間にわたって合計投与量１０ｍｇ／ｋｇを注入した静脈内注入の終了後の結果及び分析を、１２の組織試料（大脳皮質、海馬、線条体、脳幹、心臓、肺、筋肉、肝臓、腎臓、膵臓、腸壁、及び膀胱）に対して示す。クルクミン及びその代謝産物であるテトラヒドロクルクミン（ＴＨＣ）の組織レベルを、注入１５分後に屠殺し、剖検に供した動物で測定して、２つの異なる注入速度、並びに２つの異なる分析物の保存／安定化方法（Ｈ３ＰＯ４あり及びなし）後のクルクミン及びＴＨＣの組織分布及び薬物動態を決定した。
【００６２】
表６に示す通り、試験物品を、ビーグル犬８頭に２時間（パートＡ）又は８時間（パートＢ）かけて静脈内注入により投与する。
【００６３】
【表６】
2015522810.tif 000009
【００６４】
２時間注入又は８時間注入いずれかの１５分後に血液、尿、及び胆汁の試料を採取した後、イヌを剖検し、組織を単離するために臓器を取り除いた。およそ１グラムの重さの組織の複数の試料を取り除き、リン酸（Ｈ３ＰＯ４）の存在下又は非存在下で急速に冷凍した。全ての組織試料に対して、クルクミン及びＴＨＣのレベルを、Nucro-TechnicsのBioanalytical Departmentにより開発された方法を用いて決定した。ホスフェートが組織マトリクスにおけるクルクミン及びＴＨＣの安定性を増大することを示す予備試験に基づき、リン酸を用いて１セットの試料を処置した。定量限界未満の値を、値０と割り当てた。オスイヌとメスイヌとの間のクルクミンの組織レベルに一貫した差が存在しなかったので、オスイヌ及びメスイヌからの平均血漿濃度を用いて、組織分布の結果を評価した。組織分布データを、記載がなければ、イヌ４頭からのデータを用いて分析し、平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）として表す。
【００６５】
組織におけるクルクミン及びＴＨＣの分布を表７〜１１に示す。全般的に、クルクミン及びＴＨＣは、評価した１２の組織間に広く分布していた。血漿では、リン酸の添加はクルクミン及びＴＨＣの両方のレベルに対する明らかな安定化効果があったが、組織における効果は明らかではなく、幾分組織依存的であり、ＴＨＣに対してより明白であった。このように、いくつかの組織に対しては変動性が高度であるものの、脳組織に対してリン酸は明らかな安定化効果があり、ＴＨＣに対してやはりより顕著であるが、他の組織では、リン酸の安定化効果は微弱又は非存在であった（すなわち、心臓及び腎臓）。これらの違いは、各組織に対して様々な代謝上の能力の結果として生じ得る。
【００６６】
【表７】
2015522810.tif 000010
【００６７】
【表８】
2015522810.tif 000011
【００６８】
【表９】
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【００６９】
【表１０】
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【００７０】
【表１１】
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【００７１】
クルクミン及びＴＨＣの血漿、胆汁、及び尿のＰＫの考察と一貫させる目的で、組織分布の結果を、リン酸の存在下で決定した組織レベルに対して論じる。クルクミン及びＴＨＣは、調査した組織の全てに様々な程度に分布していた。２時間注入後、クルクミンに対する組織分布は、他の組織に比べて、肺において（２２．８６ｎｇ／ｇ）高かった（１３〜２５４倍）。次に高い組織は肝臓（１．８２ｎｇ／ｇ）であり、他の組織における分布は０．０９〜１．１４ｎｇ／ｇの範囲であった。クルクミンの肺中への分布が高いのは、クルクミンが非常に親油性の化合物であるという事実に関連するためである可能性がある。同様のパターンが２時間注入後のＴＨＣに観察され、クルクミンに匹敵するＴＨＣの組織レベルが観察された。
【００７２】
注入８時間では、注入濃度が低くても、クルクミン及びＴＨＣの程度は変化した。肺及び肝臓もやはり、最高及び２番目に高いレベルのクルクミンを有したが、肝臓及び肺におけるクルクミン及びＴＨＣの濃度は明らかに上昇し、２時間対８時間のレベルはそれぞれ２２．８６ｎｇ／ｇ対２５０．７５ｎｇ／ｇ及び１．８２ｎｇ／ｍＬ対２８．３８ｎｇ／ｍＬであった。観察された肺中最高レベルであるクルクミン２５０．７５ｎ／ｇは、組織１グラムが体積１ｍＬに等しいことを受け入れると、組織濃度０．６８μＭに解釈される。他の組織では、クルクミンレベルは０．０１〜２．８４ｎｇ／ｇの範囲であった。膵臓、腎臓、及び膀胱中のＴＨＣのレベルも注入８時間後に上昇したが、他の組織は注入２時間で観察されたものに匹敵した。ＴＨＣのレベルも、２時間注入に比べて８時間注入後に上昇した。８時間注入での肺及び肝臓におけるクルクミンの組織取込みの増大は、以前に報告された８時間注入の間にクルクミンが定常状態の血漿レベルを達成することができなかったことに一致し、注入の経過の間に組織取込みが増強されることをさらに支持している。組織分配係数（Ｋｐ）の比較はこの点をさらに支持し、短時間対長時間のクルクミン注入の、イヌにおける組織分布に対する影響にさらなる解明の光を投じている（表１０〜１１）。第１に、２時間注入後及び８時間注入後の両方で、クルクミン及びＴＨＣに対するＫｐ値の大多数が１未満であり、クルクミノイドの組織中への組織分布が乏しいことが示唆され、クルクミンの経口バイオアベイラビリティが低いことと一致する。低いＫｐ値は齧歯動物試験においてやはり観察されており、ラットでは０．０６〜０．２５の範囲であった。これに対する例外は肝臓及び肺であり、８時間注入でそれぞれ１．９及び１６．８という１を超える値であった。第２に、Ｋｐ値はＴＨＣに対するよりクルクミンに対して高く、これはＴＨＣの親油性が低いこととある程度つじつまが合う。第３に、Ｋｐ値は、クルクミン及びＴＨＣの両方に対して全ての組織間で、２時間注入に比べて８時間注入後に高かった。この後者の点は、長時間注入でのクルクミノイドの組織分配の増強を高度に支持するものである。文献において、クルクミンは、薬物の細胞からのトランスポーター媒介性の流出を阻害すると報告されている。機構的なレベルでは、これは実際、長時間の注入でのクルクミンの組織中への取込みの増大、及び定常状態の血漿レベルを達成できないことを実際に説明し得る。本質的に、注入が進行するにつれ、クルクミンレベルは組織中で増大し、流出を進行性に阻害し始め、経時的により大きな組織の隔絶をもたらし、あらゆる１つの組織におけるこの隔絶の程度は取込みと流出との間のトランスポーター活性のバランスに依存的である。８時間の組織中ＴＨＣレベルがより高いのは、より高い組織レベルのクルクミンの代謝の結果であり得る。したがって、クルクミンの血漿レベルの分析から到達した結果に加えて、循環からのクルクミンの速やかなクリアランスは、肝臓及び腎臓の影響に加えて、いくつかの組織にも関与し得、トランスポーター媒介性の取込みと流出とのバランスに依存し得る。クルクミン及びＴＨＣは、調査した全ての組織間に、肺に観察さ���た他の組織に比べて極めて高レベルで分布した。肝臓は２番目に高いレベルを有した。８時間注入では、肺及び肝臓中のクルクミンの組織レベルは、２時間注入に比べて実質的に上昇し、膵臓、腎臓、及び膀胱も高い組織レベルを示した。クルクミン及びＴＨＣに対する組織分配係数は、２時間注入に比べて８時間注入で高く、クルクミンを長時間注入するとトランスポーター依存的なメカニズムにより組織分布を促進し得ることが示唆された。
【００７３】
【表１２】
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【００７４】
上記の表１２に認められる通り、Ａ列では、ＴＨＣ濃度は、試験した１３の臓器全てにおいて、リポソームのクルクミン８時間注入に比べてリポソームのクルクミン２時間注入後に高かった。Ｂ列では、リポソームのクルクミンを静脈内注入した後のクルクミン濃度は、両方の組織に特有であり、時間依存的であると思われる。長時間注入（８時間）は、６つの組織に好ましく分布する。Ｃ列では、クルクミン濃度は、他の７組織において、２時間注入と８時間注入において大幅に違わない。組織間（intertissue）変動。注入後の変動はいくつかの原因によることがある：血管の供給、透過、局所組織クリアランス／排泄、クルクミンからＴＨＣへの酵素的還元。
【００７５】
【表１３】
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【００７６】
解釈。静脈内のリポソームのクルクミンの様々な身体組織への分布は均一ではなく、肺、肝臓、及び脾臓は残りの組織よりも大幅に多くのクルクミンを収集又は保持いずれかをすると思われる。これらのデータは、仮説上、ＴＨＣへの酵素的還元の低下又はクリアランスの低下により、８時間注入が、肺、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、及び筋肉中のクルクミンの大幅な高レベルをもたらすことを示すものである。筋肉、膀胱、心臓、腸壁といった他の組織では、大幅な違いはない。ＴＨＣのレベルは、８時間注入を受けた全ての組織において大幅に低下する。これらのデータは、還元酵素の組織依存的な存在の正味の結果を反映するものであり、クルクミンの組織への送達は、より少量のＴＨＣ及びＴＨＣの薬物動態学的プロファイルをもたらす。脳組織は、クルクミンを超えるＴＨＣの存在を支持することが顕著に明らかであり、この場合、長時間の注入によりクリアランスは増大し、濃度は低下する。注入持続期間はクルクミン及びＴＨＣの代謝を引き起こし、様々な組織の病態を処置する場合に考慮に入れる必要があり得る。例えば、大脳の障害は短時間の注入で処置して高レベルのＴＨＣを実現したほうがよいことがあり、ＴＨＣは脳をベースとする障害に対してクルクミンと同等に、又はクルクミンより効果的であることが想定される。
【００７７】
【表１４】
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【００７８】
【表１５】
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【００７９】
２時間注入後、クルクミンに関して、リン酸添加の非存在下、以下の組織：肺、脾臓、肝臓、膵臓中でより高レベルが達成され、リン酸を添加すると、検査した全ての脳組織中でより高いレベルが観察された。ＴＨＣに関して、リン酸を添加すると、全ての脳、脾臓、及び肝臓のレベルは高かったが、肺及び膵臓組織は低かった。８時間注入におけるパターン（表１５）は以下の通りであった：リン酸の非存在下で以下の組織：肺、脾臓、肝臓中でより高レベルのクルクミンが達成され、リン酸の添加は膵臓において高レベルを誘発した。全ての脳組織中のクルクミンレベルに対するリン酸の影響に有意差はなかった。ＴＨＣレベルに関して、リン酸を添加すると、全ての脳、及び膵臓の組織中のＴＨＣレベルを増大した。リン酸添加の非存在は、肺組織におけるより高いＴＨＣレベルに関連したが、他の組織においては増加させる影響はなかった。
【００８０】
ヒトに外挿することにより、及びＴＨＣ形成における変動、並びに安定化のためのリン酸の添加の存在又は非存在を含めたリポソームのクルクミンの８時間注入後及び２時間注入後のクルクミン及びＴＨＣの特有の組織レベルに基づき、投与スケジュールのデザインは、最適の治療結果を実現するために、特有の組織の病理に適応させるのが最良であり得る。６０ｋｇの成人では、３７０ｍｇ／Ｍ２は１０ｍｇ／ｋｇ投与量に等しい。イヌにおける１０ｍｇ／ｋｇ投与量のヒトへの変換：×０．５＝５．０ｍｇ／ｋｇ／投与量。臨床適用：リポソームのクルクミンの２時間又は８時間又はそれより長時間のいずれかの注入に対する判定の示唆。
【００８１】
肺障害：肺中のクルクミン濃度は、２時間注入におけるより８時間注入において高く、リン酸の存在下で分析した場合、レベルはさらに上昇する。クルクミンは、様々な薬剤により誘発した肺線維症からラットを保護することが既に示されているように、強皮症の処置において治療的価値があり得る。肺中のＴＨＣ濃度は、８時間注入におけるより２時間注入後に高く、レベルはリン酸の存在下で分析した場合により低い。テトラヒドロクルクミンは、３つのバイオアッセイモデル、すなわち、リノール酸自動酸化モデル、ウサギ赤血球膜ゴースト系、及びラット肝ミクロソーム系において抗酸化活性の効力が高く、クルクミノイドの水素付加は抗酸化能力を増大することをほのめかしている。
【００８２】
肝障害：肝臓中のクルクミン濃度は、２時間注入におけるより８時間注入において高く、リン酸の存在下でさらに上昇する。肝臓中のＴＨＣ濃度は、８時間注入より２時間注入後に高く、リン酸の存在下で増大する。８時間注入では、リン酸の添加に利点はなかった。脾臓障害：脾臓中のクルクミン濃度は、２時間注入におけるより８時間注入において高く、リン酸の存在下でさらに上昇する。クルクミンは、強力なアポトーシス誘発活性で、ｓｕｂＧ１細胞集団を増大する。脾臓中のＴＨＣ濃度は、２時間注入後により高い。ＴＨＣでの処置は、自己貪食マーカーである酸性血管オルガネラ（acidic vascular organelle）形成を増大することにより、ヒトＨＬ−６０前骨髄球性白血病細胞における自己貪食性細胞死を誘発した。フローサイトメトリーにより、ＴＨＣ処置はｓｕｂ−Ｇ１細胞集団を増大しないことも確認された。ウエスタンブロット分析は、ＴＨＣが、ラパマイシンの哺乳動物標的である、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３Ｉ２及びｐ７０リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼのリン酸化の低下を含め、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ／プロテインキナーゼＢ、及びマイトジェン活性化タンパク質キナーゼシグナリングを大幅に下方制御することを示した。結論：これらのデータは、自己貪食を誘発することによるＴＨＣの抗がん有効性を実証し、ヒト白血病の予防を提供するものである。骨髄線維症（ＭＦ、myelofibrosis）は重大な疾患の重荷であり、骨髄線維症患者の８５％は脾臓肥大を示し、ＭＦ患者の６０％〜８０％は脾臓関連の症状を報告する。ＭＦでは、あらゆる程度の脾臓肥大が臨床的に関連があり、ＭＦを有する大多数の患者が消耗性の症状を経験することから、好適な処置を考えなければならない。筋肉疾患：筋肉組織中のクルクミン濃度は、２時間注入におけるより８時間注入において高い。膵臓障害：膵臓障害におけるクルクミン濃度は、２時間注入におけるより８時間注入において高い。ＴＨＣ濃度は、８時間注入後より２時間注入後に高い。腎障害：クルクミン濃度は、腎障害では、２時間注入におけるより８時間注入において高い。腎臓中のＴＨＣ濃度は、８時間注入後より２時間注入後に高い。神経障害：脳幹、皮質、線条体、及び海馬中のクルクミン：２時間注入又は８時間注入いずれかにより同様の濃度が生成され、これはリン酸の添加によって変わらない。クルクミンは、不溶性のベータ−アミロイドペプチドであるアミロイドプラークの重荷の低減において効果的であった。
【００８３】
パーキンソン病モデルにおいて、ドーパミン（ＤＡ）及びＤＯＰＡＣ（３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸）の枯渇が、モノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ−Ｂ）活性の増大とともに生じる。クルクミン投与（８０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）及びテトラヒドロクルクミン投与（６０ｍｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）は、ＭＰＴＰ−誘導性のＤＡ及びＤＯＰＡＣの枯渇を大幅に逆転した。ＭＡＯ−Ｂ活性もこれらの化合物により大幅に阻害された。クルクミン及びＴＨＣの両方ともＭＰＴＰ誘発性神経毒性に対する神経保護を発揮する。クルクミン胃管栄養法に比べてＴＨＣは、劇的に高い薬物血漿レベルをもたらすが、得られた親化合物の脳レベルは同様であった。脳幹、皮質、線条体、及び海馬中のレベルは２時間注入において増大し、２時間注入及び８時間注入の両方においてリン酸によりさらに増大した。
【００８４】
本明細書において論じたあらゆる実施形態は、本発明のあらゆる方法、キット、試薬、又は組成物に関して実行することができ、逆もまた同じである。さらに、本発明の組成物を用いて、本発明の方法を実現することができる。
【００８５】
本発明に記載する特定の実施形態は例示として示すものであり、本発明を限定するものではないことが理解されよう。本発明の主要な特徴は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な実施形態において用いることができる。当業者であれば、ルーチンの実験のみを用いて、本明細書に記載する特定の手順の多くの同等物を認め、又は確認することができよう。このような同等物は本発明の範囲内であると考えられ、特許請求の範囲により網羅される。
【００８６】
本明細書において言及する刊行物及び特許出願は全て、本発明が関与する当業者の技術のレベルを示すものである。刊行物及び特許出願は全て、個々の刊行物又は特許出願が各々、参照により援用されることが具体的及び個々に示される如く、同程度に参照により本明細書に援用される。
【００８７】
「１つの（a）」又は「１つの（an）」の語の使用は、特許請求の範囲及び／又は本明細書において「含む（comprising）」という用語と組み合わせて用いられる場合、「１（one）」を意味し得るが、「１又は２以上」、「少なくとも１つ」、及び「１又は２以上」の意味とも一致する。特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物のみを言及し、又は代替物が相互に排他的であることを明確に示していなければ、「及び／又は」を意味するのに用いられるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持するものである。本出願を通して、「約」という用語は、値が、装置に対する誤差の固有の変動、値を決定するのに用いられる方法、又は試験対象間に存在する変動を含むことを示すのに用いられる。
【００８８】
本明細書及び請求項（複数可）において用いられる、単語の「含む（comprising）」（並びに、「含む（comprise）」及び「含む（comprises）」などの含むのあらゆる形態）、「有する（having）」（並びに、「有する（have）」及び「有する（has）」などの有するのあらゆる形態）、「含む（including）」（並びに、「含む（includes）」及び「含む（include）」などの含むのあらゆる形態）、又は「含む（containing）」（並びに、「含む（contains）」及び「含む（contain）」などの含むのあらゆる形態）は、包括的であり、又は限定的ではなく、付加的な、非列挙の要素又は方法ステップを除外するものではない。
【００８９】
本明細書で用いられる、「又はこれらの組合せ」という用語は、この語に先行する列挙されたアイテムの全ての順列及び組合せを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はこれらの組合せ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、又はＡＢＣの少なくとも１つを含み、特定の状況において順序が重要である場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＡＣＢ、ＢＡＣ、又はＣＡＢも含むことを意図する。この例に続き、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの１又は２以上のアイテム又は用語の反復を含む組合せも明らかに含まれる。当業者であれば、文脈から別段に明らかでなければ、典型的に、あらゆる組合せにおけるアイテム又は用語の数に制限がないことが理解されよう。
【００９０】
本明細書に開示し、特許請求される組成物及び／又は方法は全て、本開示に鑑みて過度の実験なしに作成及び遂行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して記載してきたが、当業者であれば、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱することなく、組成物及び／又は方法に、及び本明細書に記載する方法のステップ又はステップの連続において、変動を適用することができることが明らかであろう。当業者には明らかである、このような類似の代替及び修飾は全て、添付の特許請求の範囲により規定される、本発明の精神、範囲、及び概念内であるとみなされる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【国際調査報告】
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