(57)【要約】  本明細書では、アルツハイマー病を治療するための候補治療薬剤についてアッセイするための構築体、モデル、及び方法について記載する。ある態様では、（ａ）シャペロンタンパク質又は単糖トランスフェラーゼ（ＭＳＴ）と（ｂ）蛍光タンパク質の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが構築体に含まれる。ある態様において、その融合は、シャペロンタンパク質又はＭＳＴをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つのエクソンに、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドが続くところで生じる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）シャペロンタンパク質又は単糖トランスフェラーゼ（ＭＳＴ）と（ｂ）蛍光タンパク質との融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる構築体であって、ここでシャペロンタンパク質又はＭＳＴをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つのエクソンは、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドへ融合している、前記構築体。
【請求項２】
前記シャペロンタンパク質がＥＲｐ５７である、請求項１の構築体。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドが緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項１の構築体。
【請求項４】
（ａ）前記シャペロンタンパク質がＥＲｐ５７であって、（ｉｉ）前記ポリヌクレオチドが緑色蛍光タンパク質をコードする、請求項１の構築体。
【請求項５】
前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、又はｍＣｈｅｒｒｙからなる群より選択される、請求項１又は請求項２の構築体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項の構築体を含んでなる細胞。
【請求項７】
哺乳動物細胞である、請求項６の細胞。
【請求項８】
ヒト細胞である、請求項７の哺乳動物細胞。
【請求項９】
幹細胞である、請求項７又は８の哺乳動物細胞。
【請求項１０】
胚性幹細胞である、請求項９の幹細胞。
【請求項１１】
神経細胞である、請求項６の哺乳動物細胞。
【請求項１２】
ヒト神経細胞である、請求項１１の神経細胞。
【請求項１３】
請求項６〜１２のいずれか１項の細胞を含んでなる動物モデル。
【請求項１４】
請求項６〜１２のいずれか１項に記載される複数の細胞を含んでなる細胞モデル。
【請求項１５】
ａ）少なくとも１つの候補治療薬剤を請求項１４の細胞モデルへ投与する工程；及びｂ）蛍光を定量する工程を含んでなる、ハイスループットスクリーニングの方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
アルツハイマー病は、高齢者における罹病及び死亡の主因である。それは、大脳皮質の細胞外空間における、４２個のアミノ酸ペプチドであるβ−アミロイドの沈着物に関連した認知症を特徴とする。認知症の原因についての最有力モデルは、斑と呼ばれる沈着物又は可溶性凝集物のいずれかの形態をしたこのペプチドの神経毒性にそれが起因するというものである。このパラダイムに基づいて、プラーク沈着物と加齢に伴う認知機能の低下をともに明示するトランスジェニックマウスモデルが数多くの研究者によって開発されてきた。これらのモデルは、潜在的な治療薬剤の効力をスクリーニングするために利用されてきた。
【０００２】
これらのマウスモデルにおいて有効であった少なくとも７種の薬剤は、十分にデザインされた第ＩＩＩ相臨床試験で試験されたときに無効であることが証明された（表１）。これらの薬剤は、いずれも、上記のマウスモデルで見られた、アミロイド斑を除去して認知低下を抑制するその能力の結果として同定されたものである。
【０００３】
【表１】
2015521863.tif 000002
【０００４】
翌年には、いずれも斑を除去することが示された、ヒト化抗体のバピネオズマブ（bapineuzumab，ジョンソン・アンド・ジョンソン／ファイザー社）とソラネズマブ（solanezumab，イーライ・リリー社）の現在進行中の第ＩＩＩ相臨床試験の結果は、β−アミロイドが認知低下において何らかの役割を有するのかどうかを判定するのに役立つはずである。ワクチンの試験と同様に、このヒト化抗体が何らかの利益を示すことに失敗すれば、アルツハイマー病に関連した認知症の病因においてβ−アミロイドが重大な役割を有することを受容し続けるのは困難になろう。上記の試験が統計学的に有意な何らかの利益を示したとしても、いずれの抗体も第ＩＩ相臨床試験において何の傾向も示さなかったので、臨床的に大きな影響を及ぼす可能性は低い。
【０００５】
β−アミロイドモデルには、諸問題がある。これらには、斑負荷と認知症発現の間に関連性が乏しいこと；β−アミロイドが神経毒であるかどうか；アミロイドの沈着物又は可溶性凝集物が有毒物質であるかどうか；トランスジェニックマウスがこの疾患の真正のモデルであるかどうかという課題；及び、上記の試験が失敗したのは、患者の疾患がもはや治療より利益を享け得ないところまですでに進行していたからではないか、が含まれる（Gandy, 2005; Seabrook et al. 2005; Robakis, 2010）。
【０００６】
上述のことを考慮すれば、アルツハイマー病を治療するための薬物についてスクリーニングするのに適した細胞及び／又は動物モデルへのニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書では、アルツハイマー病を治療するための候補治療薬剤についてアッセイするための構築体、モデル、及び方法について記載する。ある態様では、構築体に（ａ）シャペロンタンパク質又は単糖トランスフェラーゼ（ＭＳＴ）と（ｂ）蛍光タンパク質の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。ある態様において、その融合は、シャペロンタンパク質又はＭＳＴをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つのエクソンに、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドが続くところで生じる。ある態様において、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’端は、シャペロンタンパク質又はＭＳＴの最終エクソンの５’端より始まる。ある態様では、構築体が、ＥＲｐ５７をコードするポリヌクレオチドと蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。ある態様では、構築体が、ＥＲｐ５７をコードするポリヌクレオチドと緑色蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０００８】
ある態様では、本明細書に開示されるような構築体を含んでなる複数の細胞が細胞モデルに含まれる。ある態様では、本明細書に開示されるような構築体を含んでなる細胞が動物モデルに含まれる。細胞モデルにおいて候補治療薬剤を投与して蛍光を測定する方法を開示する。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義
「正常シャペロンレベル」という用語は、対照集団由来の脳脊髄液に典型的に見出し得る、シャペロン群の平均濃度を意味する。好適な対照集団には、例えば、若年者、アルツハイマー病のない高齢者、等が含まれる。正常シャペロンレベルは、約２７±０．２ｎｇ／ｍｌであり得る。
【００１０】
「シャペロン」又は「シャペロンタンパク質」又は「シャペロニン」という用語は、活性タンパク質を作製するためのフォールディング、三次構造の形成、四次構造の形成、及び／又は他のプロセシングを触媒するタンパク質を意味する。本明細書に記載するように、いくつかのシャペロンは、加齢に伴ってレベルが低下し得て、加齢に関連した疾患及び障害に相関する可能性がある。特に、シャペロンのＢｉＰ、カルレチクリン、カルネキシン、Ｅｒｐ７２、Ｑ２、及びＱ５の１又はこれ以上の組織レベルは、齧歯動物又はヒトのような哺乳動物の加齢に伴って減少し得て、疾患に相関する可能性がある。シャペロンには、チオール：タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ（ＴＰＤＯ）として知られるファミリーが含まれる。ＴＰＤＯは、本発明の好ましいシャペロンを代表する。好ましいＴＰＤＯは、ＴＰＤＯ−Ｑ２である。ＴＰＤＯ−Ｑ２はまた、ＥＲｐ５７及びＧＲｐ５８と呼ばれてきた。本明細書に使用するように、シャペロンは、上記タンパク質の一般名のいずれも、そしてこのタンパク質の天然に存在するすべての変異型（グリコシル化型と非グリコシル化型が含まれる）を意味する。
【００１１】
「エクソン」という用語は、介在配列（イントロン）を有する遺伝子の領域に関連して、ここではエクソンＤＮＡが実際に翻訳又は発現される。対照的に、イントロンは、翻訳も発現もされないというより、ｍＲＮＡよりスプライシングで切り出される。
【００１２】
「治療薬剤」という用語には、生物（ヒト又は非ヒト動物）へ投与されるときに、局所及び／又は全身作用によって望ましい薬理効果、免疫原性効果、及び／又は生理効果を引き起こす、合成の又は天然に存在する、あらゆる生体活性化合物又は物質の組成物が含まれる。故に、この用語には、タンパク質（例、抗体又は抗体断片）、ペプチド、ホルモン、核酸、遺伝子構築体、等のような分子を含めて、従来より薬物、ワクチン、及び生物製剤とみなされてきた化合物又は化学品が含まれる。
【００１３】
「候補治療薬剤」又は「候補治療薬」という用語は、シャペロンタンパク質又はＭＳＴの発現に対するその効果を判定する、本明細書に開示するような細胞又は動物モデルにおいて検定される、及び／又は特性決定される場合の上記に定義されるような治療薬剤を意味する。
【００１４】
「哺乳動物」という用語は、治療又は療法の目的では、ヒト、家畜及び酪農動物、並びに動物園、競技用、又はペットの動物（イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、等のような）が含まれる、哺乳動物として分類されるあらゆる動物を意味する。
【００１５】
「対照」は、比較目的のための分析手順において使用される二者択一の被験者又は試料である。対照は、「陽性」又は「陰性」であり得る。例えば、分析手順の目的が関心対象の疾患によって影響を受ける、細胞又は組織において差示的に発現される転写物又はポリペプチドを検出することである場合、一般的には、所望される発現、及び／又はその所望される発現に特徴的な臨床症候群を明示する被験者又は被験者由来の試料といった陽性対照と、所望される発現、及び／又はその所望される発現の臨床症候群が欠落している被験者又は被験者由来の試料といった陰性対照を含めることが好ましい。
【００１６】
「治療」又は「治療すること」という用語は、有益であるか又は望まれる臨床結果を入手するためのアプローチである。本発明の目的では、有益であるか又は望まれる臨床結果には、限定されないが、検出可能又は検出不能にかかわらず、症状の軽減、疾患の程度の減衰、疾患の安定化（即ち、非悪化）状態、疾患進行の遅延又は鈍化、疾患状態の改善又は緩和、並びに寛解（部分又は全体のいずれかの）が含まれる。「治療」はまた、治療を受けない場合の予測寿命に比較した、寿命の延長を意味し得る。本発明の目的では、「治療」に「予防すること」又は「予防（prevention）」又は「防止（prophylaxis）」を含めない。
【００１７】
「ラベル」という用語は、本明細書において使用される場合、タンパク質へ融合している、検出可能な化合物又は組成物を意味する。ラベルは、それ自体が検出可能であっても（例、放射性同位体ラベル又は蛍光ラベル）、酵素ラベルの場合は、検出可能である基質化合物又は組成物（例、アビジン−ビオチン）の化学変化を触媒してもよい。
【００１８】
「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、本明細書において可換的に使用されるように、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーを意味して、ＤＮＡとＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾（された）ヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼによるか又は合成反応によってポリマーの中へ取り込まれ得るあらゆる基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドのような修飾ヌクレオチドとそれらの類似体を含んでよい。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、そのポリマーの組立ての前又は後に付与してよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてよい。ポリヌクレオチドは、合成の後で、ラベルとのコンジュゲーション等により、さらに修飾されてよい。
【００１９】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結した２個以上のアミノ酸を含有するペプチド又はタンパク質を意味して、ペプチド、オリゴマー、タンパク質、等が含まれる。ポリペプチドは、天然アミノ酸、修飾アミノ酸、又は合成アミノ酸を含有し得る。ポリペプチドはまた、翻訳後プロセシングによるように天然的に、又はアミド化、アシル化、架橋連結、等のように化学的に修飾される可能性がある。
【００２０】
「アンチセンス分子」又は「アンチセンスＲＮＡ」又は「アンチセンス試薬」という用語は、ＲＮＡのメッセージ（又は「センス」）鎖に対して相補的であるポリヌクレオチドを意味する。アンチセンス分子は、ＲＮＡのセンス鎖（ｍＲＮＡ）と二重鎖を形成することができる。この二重鎖は、ｍＲＮＡに対するリボソームのアクセスを妨害することによってｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を妨害することができるか又はＲＮＡ二重鎖は、リボヌクレアーゼによって分解される可能性がある。
【００２１】
「生体試料」という用語は、所与の被験者より単離された、すべての生体液及び排出物を意味する。本発明の文脈において、そのような試料には、限定されないが、血液とその分画、血清、血漿、尿、排泄物、精液（semen）、精液（seminal fluid）、精漿、前立腺液、射精前液（カウパー腺液）、胸膜浸出液、涙液、唾液、痰、汗、生検試料、腹水、脳脊髄液、羊水、リンパ液、骨髄、子宮頚管分泌液、膣分泌液、子宮内膜分泌液、胃腸分泌液、気管支分泌液、乳分泌液、卵巣嚢腫分泌液、又は毛髪、並びに均質化組織のような組織抽出物と細胞抽出物が含まれる。
【００２２】
「検出すること」という用語は、最も広義に使用されて、特定分子の定性的かつ定量的な測定（例えば、シャペロンタンパク質のような特定分子の測定）が含まれる。
シャペロンタンパク質
シャペロンは、活性タンパク質を作製するためのフォールディング、三次構造の形成、四次構造の形成、及び／又は他のプロセシングを触媒する。先に記載したように、いくつかのシャペロンは、加齢に伴ってレベルが低下し得て、加齢に関連した疾患及び障害に相関する可能性がある。シャペロンには、チオール：タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ（ＴＰＤＯ）として知られるファミリーが含まれる。ＴＰＤＯは、好ましいシャペロンを代表する。好ましいＴＰＤＯは、ＴＰＤＯ−Ｑ２である。ＴＰＤＯ−Ｑ２はまた、ＥＲｐ５７及びＧＲｐ５８と呼ばれてきた。ある態様では、シャペロンタンパク質がＥＲシャペロンタンパク質である。ある態様では、ＥＲシャペロンタンパク質が、ＥＲｐ５７、ＧＲｐ７８、ＧＲｐ９４、ＧＲｐ１０４、ＰＤＩ、カルネキシン、カルレチクリン、又はＥＲｐ７２と、グリコシル化型と非グリコシル化型が含まれる、すべての天然に存在する変異型である。
【００２３】
シャペロンは、一般に、十分に研究されている、及び／又は特性決定されているタンパク質である。数多くのシャペロンの十分に特性決定された特徴には、細菌からヒトに及ぶ生物においてそれらをコードしている遺伝子、これらのタンパク質の組換え発現系（例、ベクター、プラスミド、等）、これらのタンパク質を産生するための方法、タンパク質の配列及び構造、特定のタンパク質基質、及び特定の生物学的機能が含まれる。
【００２４】
動物モデルと細胞モデル
トランスジェニックマウスモデルにおける成功後の第ＩＩＩ相臨床試験において薬物がアルツハイマー病を治療することに成功しないために、アルツハイマー病を治療する薬物についてスクリーニングするための新たな細胞及び動物モデルが求められている。本明細書で開示するのは、β−アミロイドと複合したシャペロンに基づいた、小胞体（ＥＲ）におけるタンパク質の正常な翻訳後プロセシングについての動物及び細胞モデルである。本明細書で開示する態様では、種々の方法により細胞及び全身のシャペロンレベルを検出する。ある老化モデルでは、シャペロンレベルが低下する。本明細書で開示する細胞及び動物モデルへ候補治療薬剤を投与する。成功する治療薬剤は、シャペロンレベルを上昇させて、シャペロン／β−アミロイド複合体を増加させ、それによってその複合体は、ＥＲにおけるβ−アミロイドの正常な翻訳後プロセシングを可能にする。
【００２５】
細胞モデル
ある態様では、（ａ）シャペロンタンパク質又は単糖トランスフェラーゼ（ＭＳＴ）と（ｂ）蛍光タンパク質のような検出可能ラベルの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが構築体に含まれる。ある態様において、その融合は、シャペロンタンパク質又はＭＳＴをコードするポリヌクレオチドの少なくとも１つのエクソンに、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドが続くところで生じる。ある態様において、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３’端は、シャペロンタンパク質又はＭＳＴの最終エクソンの５’端より始まる。それによって、その融合は、シャペロン又はＭＳＴのエクソンによってコードされる５’端と蛍光タンパク質の間で生じる。ある態様では、構築体が、ＥＲｐ５７をコードするポリヌクレオチドと蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。ある態様では、構築体が、少なくとも１つのシャペロンタンパク質又は単糖トランスフェラーゼ（ＭＳＴ）をコードするポリヌクレオチドと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチドを含む。ある態様では、構築体が、ＥＲｐ５７をコードするポリヌクレオチドと緑色蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。ある態様では、構築体が、単糖トランスフェラーゼ（ＭＳＴ）をコードするポリヌクレオチドと緑色蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。ある態様では、構築体が、少なくとも１つのシャペロンタンパク質又は単糖トランスフェラーゼ（ＭＳＴ）をコードするポリヌクレオチドと緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードするポリヌクレオチドを含み、ここでＧＦＰは、あるエクソンによってコードされる部分に続いてＥＲｐ５７へ融合している。
【００２６】
ある態様では、本明細書に記載するような構築体を細胞が含む。
ある態様では、細胞モデルに、少なくとも１つのシャペロンタンパク質又は単糖トランスフェラーゼ（ＭＳＴ）をコードするポリヌクレオチドと蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含んでなる構築体を含んでなる、複数の細胞が含まれる。ある態様において、融合タンパク質は、シャペロンタンパク質又はＭＳＴへ融合した蛍光タンパク質を含み、ここで蛍光タンパク質は、シャペロンタンパク質（例、ＥＲｐ５７）又はＭＳＴへ融合する。それによって、細胞モデルには、シャペロンと蛍光タンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築体が含まれる。細胞モデルにはまた、ＭＳＴと蛍光タンパク質を含んでなる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築体が含まれる。ある態様では、細胞モデルが、ＥＲｐ５７：：ＧＦＰ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築体を含み、ここでＧＦＰをコードするポリヌクレオチドは、ＥＲｐ５７のエクソンへ融合する。ある態様では、細胞モデルに、本明細書で開示する構築体のいずれも含んでなる細胞が含まれる。
【００２７】
細胞モデルには、本明細書で開示するような構築体を含んでなる、複数の細胞が含まれる。細胞モデルは、アッセイに使用される細胞の試験管内の（in vitro）集合体であり得る。ある実施例では、細胞モデルに、本明細書で開示するような構築体を含んでなる複数の細胞がマルチウェル細胞培養プレートに含まれる。マルチウェル細胞培養プレート（又はマイクロタイタープレート）の各ウェルへ候補治療薬剤を適用し得て、インキュベーション時間又は時間帯に続いて蛍光を検出することができる。細胞モデルは、ハイスループットの薬物スクリーニングを可能にして、蛍光タンパク質と融合したシャペロン（例、ＥＲｐ５７）のエクソンを含んでなる哺乳動物細胞が含まれる。ある態様では、細胞を候補治療薬剤とともにインキュベートして、陰性対照と比較した蛍光の増加をスクリーニングする。ある態様では、陰性対照が担体単独（即ち、候補治療薬剤を含まずに細胞へ適用した溶液）である。ある態様では、細胞をマイクロタイタープレートにおいてインキュベートしてから、マイクロタイタープレートリーダー（例、ＢｉｏＴｅｋ（登録商標）マイクロプレートリーダー、バーモント州ウィヌースキー）によって蛍光を測定する。蛍光を測定するための他の化学的及び物理的技術は、公知である。
【００２８】
限定されないが、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ＹＦＰ、及びｍＣｈｅｒｒｙのような、よく使用される蛍光タンパク質は、適正なエクソン中へ挿入し得るか又は適正なエクソンへ融合し得るコンパクトなタンパク質であって、細胞代謝におけるタンパク質の正常機能に干渉しない。蛍光タンパク質には、限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及びｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質が含まれる。典型的には、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、第一エクソンの上流又は最終エクソンの下流で挿入される。これにより、機能に干渉せずに細胞の生存を可能にする融合タンパク質（例、ＥＲｐ５７：：ＧＦＰ）が産生される。
【００２９】
ある態様では、細胞モデルに、蛍光タンパク質へ融合した少なくとも１つのシャペロンタンパク質又は単糖トランスフェラーゼ（ＭＳＴ）を含んでなる哺乳動物細胞が含まれる。ある態様では、細胞モデルに、シャペロン又はＭＳＴ遺伝子へ隣接して挿入される、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。ある態様において、この遺伝子には、イントロン及び／又は様々な制御領域（第一エクソンに先行するプロモーター領域と最終エクソンに続く領域、３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）が含まれる）が含まれる。ある態様では、細胞モデルに、ａ）シャペロンタンパク質、ｂ）ＭＳＴ、又はｃ）シャペロンタンパク質と蛍光タンパク質へ融合したＭＳＴの両方の２以上を含んでなる哺乳動物細胞が含まれる。
【００３０】
哺乳動物細胞には、限定されないが、心臓前駆細胞、骨格筋細胞、膵島細胞、腎臓細胞、幹細胞、神経細胞、又は何か他の細胞が含まれる。幹細胞は、胚性幹細胞であり得る。幹細胞は、神経幹細胞であり得る。哺乳動物細胞は、ニューロン細胞であり、より特別には、胚性幹細胞由来のニューロン細胞であり得る。哺乳動物細胞は、ミクログリアであり得る。好適な哺乳動物細胞には、限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ヒトヒーラ（HeLa）細胞、ＰＣ１２細胞、ヒトニューロン（ＨＮ）細胞、サルＣＯＳ−１細胞、及びヒト胚性腎臓２９３細胞が含まれる。
【００３１】
この構築体が候補治療薬剤によって活性化されると、検出可能ラベルへ融合したシャペロンタンパク質又はＭＳＴを細胞が合成する。例えば、刺激されたルシフェラーゼの合成は、ルシフェリンとＡＴＰの添加後の生物発光によって検出することができる。同様に、増加したガラクトシダーゼの産生は、Ｘ−ｇａｌの培地への添加によって、次いでこれが加水分解されて標準的な分光光度法の技術によって定量し得る青色をもたらすので、判定することができる。最後に、蛍光タンパク質の増加は、標準的なフルオロメトリーによって判定することができる。上記アッセイは、いずれもマイクロタイタープレートリーダーにおいて実施し得て、それによって医薬探索についてのハイスループットスクリーニングが促進される。
【００３２】
迅速な薬物ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）試験では、トランスフェクトされた細胞をマイクロタイタープレート上で増殖させることができる。細胞は、プレートへ付着すべきである。マイクロタイタープレートは、むき出しのプラスチックであっても、コラーゲン、フィブロネクチン、ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（BD Biosciences, カリフォルニア州サンホセ）、３次元の基質、又は特別な細胞系に適した他のあらゆるコーティング剤でコートされてもよい。非蛍光性のサポート間葉細胞をフィーダー細胞として含めることは、しばしば有益である。ＤＳＭＯのような適正な溶媒において様々なレベルの候補治療薬剤を加えて、蛍光を０時点で測定して、蛍光のクエンチングが有るかどうかを判定する。光学密度を定量して、候補治療薬剤が励起波長又は発光波長のいずれを吸収するかを確かめることもできる。上記２種の検査法を使用して、細胞をインキュベートした後の蛍光測定を修正することができる。そこで、本明細書で開示するような細胞を適正な時間間隔の間インキュベートして、蛍光を定量する。候補治療薬剤が投与された細胞の蛍光を、担体のみで処理した細胞と比較することができる。この差を、標的タンパク質の産生を誘導する候補治療薬剤の能力の尺度として使用することができる。蛍光スクリーニングアッセイの結果は、上記に注目した免疫学的手順によって検証することができる。次いで、標的タンパク質（複数）の合成の刺激を示す候補治療薬剤を動物モデルにおいて試験することができる。初期の試験では、メトキシクロル（methoxychlor）を陽性対照として使用し得ることが示唆されている（Morrell et al., 2000）。
【００３３】
動物モデル
蛍光モデル。態様には、本明細書で開示する細胞モデルと同じパラダイムに基づいた非ヒト動物モデルも含まれる。ある態様では、コンディショナルプロモーターとシャペロン及び／又はＭＳＴのｍＲＮＡへ指向される小型ＲＮＡの配列を含有するプラスミドで非ヒト動物（例、マウス又はラット）をトランスフェクトする。シャペロンノックアウトとＭＳＴノックアウトは、いずれも致死突然変異体であるので、成熟動物では、認知検査のために、薬剤（例、ドキシサイクリン）の投与によって転写物を活性化させなければならないだろう。別の態様では、シャペロン又はＭＳＴに標的指向するアンチセンス試薬を投与する。小型ＲＮＡと異なり、アンチセンス試薬にはさらなるプロセシングが必要とされないので、候補治療薬剤が標的タンパク質の転写を高めるのではなく小型ＲＮＡの成熟化を妨害しているとする可能性が回避される。
【００３４】
ある態様では、動物モデルに、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドへ融合した、シャペロンタンパク質又はＭＳＴの少なくとも１つの遺伝子を含んでなる、哺乳動物の実験動物（例、マウス又はラット）が含まれる。ある態様では、その遺伝子に、イントロン及び／又は、第一エクソンに先行するプロモーター領域と最終エクソンの３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）に続く領域が含まれる様々な制御領域が含まれる。ある態様では、動物モデルに、蛍光タンパク質をコードするポリヌクレオチドへ縮合した、シャペロンタンパク質又はＭＳＴの少なくとも１つのエクソンを含んでなる哺乳動物の実験動物（例、マウス又はラット）が含まれる。
【００３５】
ある態様では、１以上の候補治療薬剤（複数）についてスクリーニングする方法に、本明細書に記載する非ヒト動物モデルへ候補治療薬剤を投与する工程と、非ヒト動物モデル由来の生体試料において、シャペロン、ＭＳＴ、ＯＳＴ、又は両方の量を定量する工程が含まれる。シャペロンは、ヒトＥＲｐ５７の相同体であり得る。生体試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）であり得る。生体試料は、組織抽出物であり得る。組織抽出物は、生きた動物に由来しても、剖検時のものであってもよい。蛍光は、公知の方法によって測定することができる。
【００３６】
ノックアウト。ＥＲシャペロンタンパク質又はＭＳＴについての完全なノックアウトモデルを開発することは、そのようなノックアウトが胚性致死であるので、可能ではない。さらに、ある特定の薬剤が標的タンパク質の転写と翻訳を高めるかどうかを判定することも、完全なノックアウトではその標的遺伝子が欠落するので、可能ではないだろう。ある態様では、動物モデルに、シャペロン又はＭＳＴのヘテロ接合体ノックアウトを含んでなる実験室系統の非ヒト動物（例、マウス又はラット）が含まれる。ある態様では、動物モデルに、ヒトＥＲｐ５７の相同体のヘテロ接合体ノックアウトを含んでなる実験室系統の非ヒト動物（例、マウス又はラット）が含まれる。これらの動物は、若年動物に見出される、シャペロン、ＭＳＴ、及びオリゴ糖トランスフェラーゼ（ＯＳＴ）の約半分の含量しか有さない場合がある。シャペロン含量の場合、このことは、若年動物と高齢動物の間のＥＲシャペロンのレベルで観測される低下に相当する（Erickson et al. 2006）。
【００３７】
標的遺伝子を胚性的にノックアウトすることに代えて、ｃｒｅ−ｌｏｘシステムとコンディショナルプロモーター（これは、テトラサイクリン、タモキシフェン、昆虫幼弱ホルモン、等のような薬剤によって活性化される）を使用して、成体動物において標的遺伝子をノックアウトすることが好ましい。Ｃｒｅ／ｌｏｘ技術の概説についての Orban, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 8: 6861-6865 と、Brand and Dymecki, Dev. Cell (2004) 6(1): 7-28 を参照のこと。本態様では、一組のエクソンを包含する５’及び３’領域において、標的遺伝子をｌｏｘ配列でトランスフェクトする。この動物は、コンディショナルプロモーターへ付いたｃｒｅ遺伝子でもトランスフェクトされる。ｃｒｅを産生するようにプロモーターを活性化する薬剤（例えば、テトラサイクリン、等）で処理した時に、ｌｏｘ配列の間の標的遺伝子のＤＮＡ配列を切り出す。ｌｏｘ遺伝子が適正に配置されれば、その遺伝子は、活性ｍＲＮＡを産生するように転写され得ない。このアプローチの主たる利点は、ニューロン、心筋細胞、腎細胞、膵臓β−細胞、様々なリンパ球の亜集合のすべて、及び内皮細胞、並びに他の組織種由来の他の細胞といった単一の細胞種においてのみ活性化されるようにｃｒｅプロモーターを構築することが可能であることである。これらの動物構築体は、重要なモデル系の証明としても役立つだろう。例えば、「認知機能の消失は、ＥＲにおけるタンパク質の翻訳後プロセシングの低下による」という仮説を検証する場合には、ｃｒｅ遺伝子が活性化されてヘテロ接合体の突然変異体が形成される前と後の両方での標準的な精神運動手法によって、動物の認知能力と運動技能について検査することができる。同様に、それはまた、加齢に伴って見られる、免疫学的機能、心機能、腎機能、及びインスリン産生の損失と他の組織機能の減少において被験タンパク質が何らかの役割を担うかどうかを判定するのに使用し得る。
【００３８】
小型ＲＮＡアンチセンスでの治療。細胞は、小型の調節ＲＮＡ分子をコードする遺伝子のセットを含有する。小型ＲＮＡの合成構築体の細胞及び動物中へのトランスフェクションは、標的タンパク質の合成をノックダウンさせるために広く使用されてきた。成体細胞において、ノックダウン研究においてごく一般的に利用されている構築体は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とショートヘアピンＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。これらのＲＮＡは、標的タンパク質の転写と翻訳をともに制御する。翻訳を制御する場合、その一次標的は、それらが結合して沈静化させるｍＲＮＡである。小型ＲＮＡのその活性型への合成は、多数の工程と複数の代替経路が関与する複雑なプロセスである（Czech and Hannon 2011）。小型ＲＮＡは、標的遺伝子を活性化するプロセスの一環として、ＤＮＡ−ヒストン複合体のアンパッキング（unpacking）を調節することができる（Djupedal and Ekewall, 2009）。
【００３９】
小型ＲＮＡの配列は、そのＲＮＡについてのＤＮＡ構築体とガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子を含有するプラスミドとしてトランスフェクトすることができる。レポーターを使用して、プラスミドがトランスフェクトされたことを確認することができる。プラスミドには、テトラサイクリン、タモキシフェン、昆虫幼弱ホルモンのような薬剤、又は（そのために利用可能なコンディショナルプロモーターがある）他のあらゆる薬剤によって活性化されるコンディショナルプロモーターも含め得る。
【００４０】
特定の遺伝子をノックダウンさせるための別の一般的な手順は、小型ＲＮＡの適正な配列を含有するアデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）へ細胞又はインタクトな動物を曝露することである（Camero et al. 2011）。レンチウイルスもベクターとしてよく利用されてきた。ウイルストランスフェクションシステムに伴う欠点は、これらウイルス構築体の大部分が肝臓によって頻繁に取り込まれることである。上記アプローチに伴うさらなる欠点は、どの候補治療薬剤も細胞スクリーニング試験において有効であるように見えても、活性のあるブロッキング小型ＲＮＡを形成する構築体のプロセシングに必要な諸工程の１つを阻害することによって主に作用し得ることである。このことは、あり得る偽陽性の結果をもたらす可能性がある。
【００４１】
合成アンチセンス試薬。特定のタンパク質の合成をノックダウンさせる別のアプローチは、合成アンチセンス試薬を投与することである。ごく一般的に使用されている２つの市販薬剤は、２’−Ｏ−メトキシエチルホスホロチオエートとモルホリノアンチセンス構築体である。これらの試薬は、細胞膜を容易には透過しないので、それらは、定型的には、細胞培養において透過処理剤と組み合わせて使用される。しかしながら、マウスとヒトの両方の生体内試験では、高用量の上記試薬が単独で細胞中へ透過して、活性を示すことが見出された。これらの試験において、上記試薬のほとんどは、悪性腫瘍の治療用に使用されてきたが、より最近になって、それらがマウス（Wu et al., 2011）とヒト（Cirak et al., 2011）の両方で、デュシェンヌ型（Duchenne）筋ジストロフィーの治療に有用であることが見出されてきた。これら薬剤の投与は、特定のシャペロン、ＭＳＴ、及びＯＳＴをノックダウンさせるための最も簡単なアプローチであるように見えるだろう。欠点は、組織特異性の不足である。従って、広範囲の組織で標的タンパク質がノックダウンされることだろう。このことは、認知機能の損失よりも骨格筋機能の減少により鈍い応答が生じる可能性があるので、精神運動試験に伴う問題を引き起こす可能性がある。例えば、水迷路は、プラットフォームを見つける動物の能力を記憶の変化の尺度として判定するためによく使用されている手技である。その試薬が骨格筋量の損失により動物の水泳能力の低下を引き起こすとすれば、その動物は、プラットフォームを見つけるほど十分に長く泳ぐことが可能でないだろう。
【国際調査報告】
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