(57)【要約】本発明は、R1、R2およびnが詳細な説明および特許請求の範囲において定義されている式Iの化合物に関する。特に、本発明は、LFA-1インテグリンアンタゴニストに連結された小分子、ペプチド、核酸、蛍光部分およびポリマーなどの結合体化された部分の製造と、LFA-1を発現する標的細胞への当該部分の送達とにおいて使用される、式Iの化合物に関する。2015508055.tif 000138
2015508055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式I：
2015508055.tif 000118
の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくはエステル：
式中、nは1〜24であり、かつ
R1は、
(1) 式：
2015508055.tif 000119
の化合物；
(2) 式：
2015508055.tif 000120
の化合物；および
(3) 式：
2015508055.tif 000121
の化合物であって、式中、QはHまたはOHである、化合物
からなる群より選択され、
R2は、
(1) 式：
2015508055.tif 000122
の化合物；
(2) 式：
2015508055.tif 000123
の化合物；
(3) 式：
2015508055.tif 000124
の化合物；および
(4) 式：
2015508055.tif 000125
の化合物であって、式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015508055.tif 000126
の化合物のいずれかを表す、化合物
からなる群より選択される。
【請求項２】
R1が式：
2015508055.tif 000127
の化合物である、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
R1が式：
2015508055.tif 000128
の化合物である、請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
R1が式：
2015508055.tif 000129
の化合物であって、式中、QはHまたはOHである、請求項1に記載の化合物。
【請求項５】
QがHである、請求項4に記載の化合物。
【請求項６】
QがOHである、請求項4に記載の化合物。
【請求項７】
R2が式：
2015508055.tif 000130
の化合物である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
R2が式：
2015508055.tif 000131
の化合物である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
R2が式：
2015508055.tif 000132
の化合物である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
R2が式：
2015508055.tif 000133
の化合物であって、式中、R3は一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、かつXは硫黄または式：
2015508055.tif 000134
の化合物のいずれかを表す、請求項1〜6のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
Xが硫黄を表す、請求項10に記載の化合物。
【請求項１２】
R3がsiRNA分子である、請求項10または11のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
R1が式：
2015508055.tif 000135
の化合物である、請求項7〜12のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
R1が式：
2015508055.tif 000136
の化合物である、請求項7〜12のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
R1が式：
2015508055.tif 000137
の化合物であって、式中、QはHまたはOHである、請求項7〜12のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
以下からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物：
(S)-3-{3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸; および
(S)-3-{3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸。
【請求項１７】
以下からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物：
(S)-3-{3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸; および
(S)-3-{4-[4-(3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸-PEG8。
【請求項１８】
以下からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物：
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸; および
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸。
【請求項１９】
以下からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物：
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸; および
(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニルアミノ]-プロピル-オキシ}-フェニル)-カルボニル]-アミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸。
【請求項２０】
以下からなる群より選択される、請求項1に記載の化合物：
(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニルアミノ]-プロピル-オキシ}-5-ヒドロキシ-フェニル)-カルボニル]-アミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸; および
(S)-3-[({3-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロピル-オキシ]-5-ヒドロキシ-フェニル}-カルボニル)-アミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸。
【請求項２１】
請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項２２】
炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療のための方法であって、それを必要とする患者に治療有効量の請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物を投与する段階を含む、方法。
【請求項２３】
炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防のための、請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２４】
炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防用の医薬の調製のための、請求項1〜20のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２５】
以上に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合体化される部分と標的化実体との間に共有結合が形成されるような、チオールなどの反応性求核剤を含有する他の分子との化学反応に適したリンカーおよび官能基を含有する、強力かつ選択的な小分子インテグリンアンタゴニストの合成および反応に関する。LFA-1アンタゴニストおよび/またはLFA-1/MAC-1デュアルアンタゴニストがICAM-1受容体に結合するように、当該小分子標的化アンタゴニストは同族受容体系に結合する。共有結合により連結された部分としては、小分子治療薬、ポリマー、ペプチドおよびオリゴヌクレオチドが挙げられる。5'-チオ-siRNAの標的化送達を可能にする手段としての5'-チオ-siRNA誘導体を形成するための5'-チオ含有オリゴヌクレオチドが含まれる。そのような誘導体化siRNAと適切なトランスフェクション剤との組み合わせは、そのようなインテグリン受容体を発現する細胞へのsiRNAの選択的送達を促進することで、RNA干渉(RNAi)を通じて標的遺伝子の発現を防止する。
【背景技術】
【０００２】
LFA-1としても知られるリンパ球機能関連抗原1は、すべてのT細胞上、ならびにB細胞、マクロファージおよび好中球上に見られかつ感染部位への動員に関与する、インテグリンである。それは抗原提示細胞上のICAM-1に結合し、接着分子として機能する。CD54(表面抗原分類54)としても知られるICAM-1(細胞間接着分子1)は細胞表面糖タンパク質である。異常なレベルのLFA-1/ICAM-1相互作用が炎症性疾患および炎症性障害において機能すると考えられ、したがって、そのような系への拮抗作用が治療手段であると考えられる。したがって、これらの系への高親和性小分子の標的化は、ICAM-1受容体を発現する細胞系にsiRNAなどの治療薬を選択的に送達する手段を与えることができる。
【０００３】
RNA干渉は周知のプロセスであり、このプロセスでは、メッセンジャーRNA(mRNA)のタンパク質への翻訳が、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)またはアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの相補的もしくは部分相補的オリゴヌクレオチドとの会合または結合によって干渉される。siRNAは、通常は長さが19〜25ヌクレオチドの範囲である二本鎖RNA分子であり、RISC(RNA誘導サイレンシング複合体)として知られる細胞質中の一組のタンパク質と会合する。RISCが最終的に二本鎖siRNAを分離することで、1本の鎖がmRNA分子の相補的もしくは部分相補的部分と結合または会合し、その後mRNAはRISCによって破壊されるかまたは翻訳を妨げられ、結果的に、コードされたタンパク質または遺伝子産物の発現が抑制される。
【０００４】
治療用途で(特にヒトにおける全身投与に)siRNAなどの核酸を使用する上での問題の1つは、(1) 特定の標的細胞または標的細胞型、および(2) それらの細胞の細胞質(すなわち、mRNAが存在しかつタンパク質に翻訳される場所)に核酸を送達することにあった。送達上の問題の一部は、核酸が負に帯電しており、容易に分解され(特に無修飾の場合)、腎臓によって効率的に濾過され、それ自体では細胞の細胞質に容易に輸送することができないという事実に基づく。したがって、著しい量の研究が、リポソーム、ミセル、ペプチド、ポリマー、結合体およびアプタマーを含む様々な担体および製剤に関する送達上の問題を解決することに重点を置いた。Ling et al, Advances in Systemic siRNA Delivery, Drugs Future 34(9): 721 (September 2009)（非特許文献1）を参照。一部の比較的有望な送達媒体は、脂質ナノ粒子を含む脂質系の使用を包含している。Wu et al., Lipidic Systems for In Vivo siRNA Delivery, AAPS J. 11(4): 639-652 (December 2009)（非特許文献2）；Hopeらによる国際特許出願公開第WO 2010/042877号（特許文献1）(「Improved Amino Lipids And Methods For the Delivery of Nucleic Acids」)を参照。しかし、特定の標的細胞およびそのような細胞の細胞質へのsiRNA、ならびに小分子、ペプチド、他の核酸、蛍光部分およびポリマーなどの他の物質の標的化について、さらなる改善が依然として必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際特許出願公開第WO 2010/042877号
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ling et al, Advances in Systemic siRNA Delivery, Drugs Future 34(9): 721 (September 2009)
【非特許文献２】Wu et al., Lipidic Systems for In Vivo siRNA Delivery, AAPS J. 11(4): 639-652 (December 2009)
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、式I：
2015508055.tif 000003
の化合物であって、式中、R1、R2およびnは詳細な説明および特許請求の範囲に定義されている、化合物に関する。特に、本発明は、様々な治療用途および他の用途のための、小分子、ペプチド、核酸、蛍光部分およびポリマーなどの結合体化された部分の、インテグリンα4β1(最晩期抗原4)二量体、αVβ3二量体、またはリンパ球機能関連抗原1（LFA-1）を発現する標的細胞への改善された送達のための、式Iの化合物に関する。本発明はまた、そのような化合物を製造および使用する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１ａ】表1は、特定の5'-誘導体化siRNA一本鎖および二本鎖の組成を示す。
【図１ｂ】表2は、小分子siRNA結合体の分析データを示す。
【図１ｃ】表3は、アンチセンス鎖の5'がNu547で誘導体化されたsiRNA配列を示す。
【図１ｄ】表4は、インテグリンアンタゴニストアッセイにおける小分子-siRNA結合体の効力、およびsiRNAのKDデータを示す。
【図１ｅ】表5は、FITC異性体標識試薬の同一性、特徴づけおよび結合能を示す。
【図１ｆ】ヒストグラフを示す(「B」: 二本鎖-27 500nMおよび例140 10μM；「A」: 二本鎖-27)。
【図２】代表的siRNA取り込み画像(二本鎖-27(500nM))を示す。
【図３】例FITC-5(LFA-1アンタゴニスト標識FITC)を10μMで有する、FITCが結合体化されたJurkat細胞の画像を示す。
【図４】例FITC-14(VLA-4アンタゴニスト標識FITC)を10μMで有する、FITCが結合体化されたJurkat細胞の画像を示す。ヒストグラフは、VLA-4標的化要素を伴うsiRNA二本鎖の存在の変化を示す。VLA-4アンタゴニスト例140の存在下では、この変化は扁平状である。
【図５】5'-センス鎖においてインテグリン標的化小分子によって誘導体化されたsiRNA二本鎖で処理された際のH1299細胞におけるAHA1発現の減少を示す。y軸はAHA1の実測発現レベルを示す。比較的低い棒は比較的高度のノックダウン(比較的高度のsiRNAトランスフェクション)を示し、高い棒は比較的低度のノックダウン(すなわち比較的低度のsiRNAトランスフェクション)を示す。青色の二本鎖はセンス鎖の5'-末端における標的化修飾を有し、桃色の二本鎖はセンス鎖の5'-末端における標的化修飾、およびアンチセンス鎖の5'-末端に結合したNu547フルオロフォアを有する。
【図６】細胞の健康状態のマーカーであるGAPDH mRNA発現のレベルを示す。誘導体化siRNAで処理された細胞とモック細胞および未処理細胞とで発現レベルが類似していることは、当該処理の濃度および期間で細胞毒性が存在しないことを示している。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
別途指定がない限り、明細書および特許請求の範囲において使用される以下の特定の用語および語句は以下のように定義される。
【００１０】
「部分」という用語は、1つもしくは複数の化学結合によって別の原子または分子に結合することで分子の一部を形成する、原子または化学結合した原子の群を意味する。例えば、式Iの可変要素R1およびR2は、式Iに示す構造に対して、示された位置で共有結合によって結合している、部分を意味する。
【００１１】
「結合体化された部分」という用語は、治療用のまたは有用な化合物、ペプチド、ポリマー、小分子、蛍光部分、オリゴヌクレオチドまたは核酸である、部分を意味する。例としては、薬物、治療用ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNAおよびフルオレセインイソチオシアネート(FITC)が挙げられる。
【００１２】
別途指定がない限り、「水素」または「ヒドロ」という用語は水素原子部分(-H)を意味し、H2を意味しない。
【００１３】
「ハロゲン」という用語はフッ素部分、塩素部分、臭素部分またはヨウ素部分を意味する。
【００１４】
「アルキル」という用語は、1〜25個の炭素原子を有する脂肪族直鎖または分岐鎖飽和炭化水素部分を意味する。
【００１５】
「TFA」という用語はトリフルオロ酢酸を意味する。
【００１６】
別途指定がない限り、「下記式の化合物(a compound of the formula)」または「下記式の化合物(a compound of formula)」または「下記式の化合物(compounds of the formula)」または「下記式の化合物(compounds of formula)」という用語は、その式によって定義される化合物の部類より選択される任意の化合物(別途記載がなければそのような任意の化合物の薬学的に許容される任意の塩またはエステルを含む)を意味する。
【００１７】
「薬学的に許容される塩」という用語は、遊離塩基または遊離酸の生物学的な有効性および特性を保持し、生物学的にまたは他の理由で望ましくないということがない塩を意味する。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、好ましくは塩酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、サリチル酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、N-アセチルシステインなどの有機酸によって形成することができる。さらに、塩は、無機塩基または有機塩基を遊離酸に加えることで調製することができる。無機塩基から誘導される塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩などが挙げられるが、それらに限定されない。有機塩基から誘導される塩としては、一級、二級および三級アミン、天然置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、ならびに塩基性イオン交換樹脂（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、N-エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂など）の塩が挙げられるが、それらに限定されない。置換パターンに応じて、本発明の化合物は双性イオンとして存在してもよい。
【００１８】
本発明の化合物は薬学的に許容される塩の形態で存在し得る。本発明の化合物は薬学的に許容されるエステル(すなわち、プロドラッグとして使用される式Iの酸のメチルおよびエチルエステル)の形態で存在してもよい。本発明の化合物は溶媒和、すなわち水和していてもよい。溶媒和は製造プロセスの途中で行われてもよく、例えば当初は無水である式Iの化合物の吸湿性の結果(水和)として行われてもよい。
【００１９】
同一の分子式を有するが原子の性質もしくは結合順序または原子の空間配置が異なる化合物を「異性体」と呼ぶ。原子の空間配置が異なる異性体を「立体異性体」と呼ぶ。ジアステレオマーとは、鏡像異性体ではない、1つまたは複数のキラル中心において相対する立体配置を有する立体異性体のことである。重ね合わせられない互いの鏡像である、1つまたは複数の不斉中心を有する立体異性体を「鏡像異性体」と呼ぶ。ある化合物が不斉中心を1つ有する場合、例えば炭素原子が4つの異なる基に結合している場合、一対の鏡像異性体が可能である。鏡像異性体は、不斉中心の絶対配置によって特徴づけることができ、Cahn、IngoldおよびPrelogのR-およびS-順位則によって、または分子が偏光面を回転させる様式によって記述され、右旋性または左旋性(すなわちそれぞれ(+)または(-)-異性体)と命名される。キラル化合物は個々の鏡像異性体またはその混合物として存在し得る。等しい割合の鏡像異性体を含有する混合物を「ラセミ混合物」と呼ぶ。
【００２０】
「治療有効量」という用語は、疾患の症状を予防し、緩和しもしくは寛解させるか、または治療される対象の生存を延長するために有効な化合物の量を意味する。治療有効量の決定は当技術分野における技能の範囲内である。本発明の化合物の治療上有効な量または投薬量は、広い範囲内で変動し得るし、当技術分野において公知の様式で決定することができる。そのような投薬量は、投与される特定の化合物、投与経路、治療される状態および治療される患者を含む、特定の各症例における個々の要件に対して調整される。1日の投薬量は、単一用量または分割用量で投与してもよく、非経口投与では持続注入として投与してもよい。
【００２１】
「薬学的に許容される担体」という用語は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、ならびに薬学的投与に適合性のある他の材料および化合物を含む、薬学的投与に適合性のあるあらゆる材料を含むように意図される。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と適合しない場合を除いて、本発明の組成物におけるその使用が企図される。補足的な活性化合物も本組成物に組み入れることができる。
【００２２】
詳しくは、本発明は、式I：
2015508055.tif 000004
の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は、
(1) 式：
2015508055.tif 000005
の化合物；
(2) 式：
2015508055.tif 000006
の化合物；および
(3) 式：
2015508055.tif 000007
の化合物（式中、QはHまたはOHである）
からなる群より選択され、
R2は、
(1) 式：
2015508055.tif 000008
の化合物；
(2) 式：
2015508055.tif 000009
の化合物；
(3) 式：
2015508055.tif 000010
の化合物；および
(4) 式：
2015508055.tif 000011
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015508055.tif 000012
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される、
前記式Iの化合物または薬学的に許容されるその塩もしくはエステルに関する。
【００２３】
上記構造中で使用されている
2015508055.tif 000013
という記号は、構造または部分が共有結合によってベース分子（base molecule）に結合する場所を示すために使用される。さらに、上記の記号との組み合わせで使用される「PEGへ」もしくは「Sへ」という語句または同様の文言は、複数の結合点が存在する場合に構造または部分がベース分子に結合する場所または方法を示す。例えば、R2が式：
2015508055.tif 000014
（式中、Xは式：
2015508055.tif 000015
の化合物である）の化合物である場合、
式Iに基づく構造は、式：
2015508055.tif 000016
（式中、R1、R3およびnは式Iに定義の通りである）である。
【００２４】
本発明はまた、式Iの化合物、およびそのような化合物を含有する薬学的組成物を製造および使用する方法に関する。式Iの化合物は、ICAM-1受容体を発現する標的細胞への小分子、タンパク質、核酸、ポリマー、蛍光マーカーおよび他の物質の送達を改善する上で有用である。特定の態様では、本発明は、RNA干渉を通じて特定の標的タンパク質の発現を阻害するために、ICAM-1受容体を発現する標的細胞の細胞質にsiRNAを送達する上で有用である、式Iの化合物を含有する組成物および製剤に関する。
【００２５】
より特定の態様では、本発明は、ICAM-1受容体を発現する腫瘍細胞および他の細胞型へのsiRNAなどの核酸の送達を促進する製剤のための、式Iの化合物の使用に関する。さらに、炎症、およびがんのような増殖性障害を治療する送達用製剤を合成するための式Iの化合物の使用が、本発明の一部である。
【００２６】
R1は、式Iの化合物をLFA-1インテグリンに標的化することで、そのような受容体を発現する細胞への該化合物の送達を促進する、小分子インテグリンアンタゴニストを表す。
【００２７】
特定の態様では、R1の小分子インテグリンアンタゴニスト標的化部分は、インテグリンに対する小分子の結合親和性が遊離小分子インテグリンアンタゴニストに比べて実質的に減少しない位置で結合する。式IのR1部分は（ICAM-1受容体に対するLFA-1アンタゴニストまたはLFA-1/MAC-1デュアルアンタゴニストを介して）ICAM-1受容体を標的化する。
【００２８】
特定の態様では、R1は、式：
2015508055.tif 000017
のLFA-1アンタゴニストおよび/もしくはLFA-1/MAC-1デュアルアンタゴニストまたはICAM-1受容体標的化部分、あるいは薬学的に許容されるその塩もしくはエステルである。
【００２９】
他の態様では、R1は、式：
2015508055.tif 000018
のLFA-1アンタゴニストおよび/もしくはLFA-1/MAC-1デュアルアンタゴニストまたはICAM-1受容体標的化部分、あるいは薬学的に許容されるその塩またはエステルである。
【００３０】
他の態様では、R1は式：
2015508055.tif 000019
（式中、QはHまたはOHである）のLFA-1アンタゴニストおよび/もしくはLFA-1/MAC-1デュアルアンタゴニストまたはICAM-1受容体標的化部分、あるいは薬学的に許容されるその塩またはエステルである。
【００３１】
R2は、チオール含有分子などの強力な求核剤を有する、治療用のまたは他の有用な化合物または結合体化される部分との共有結合を形成可能な、反応性部分を表し得る。そのような反応性部分の例としては、
2015508055.tif 000020
からなる群より選択される部分が挙げられる。
【００３２】
あるいは、R2は、治療用のまたは他の有用な化合物、タンパク質またはオリゴヌクレオチドなどの結合体化された部分(R3)に既に結合した部分を表し得る。より具体的には、R2は、式：
2015508055.tif 000021
部分を表し得、
式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015508055.tif 000022
の化合物のいずれかを表す。
【００３３】
特定の態様では、R3はオリゴヌクレオチドを表す。より特定の態様では、R3は、一本鎖または二本鎖で存在し得るRNA分子、例えばsiRNA分子のセンス鎖の5'-末端を表す。RNAi剤としても知られるそのようなsiRNA分子は、細胞中の標的遺伝子の発現を阻害する。特定の態様では、R3は、長さが15〜30ヌクレオチドのオリゴリボヌクレオチド鎖から本質的になるsiRNA分子であり、センスオリゴリボヌクレオチド鎖の5'末端は、上記構造に示すようにR2に結合しており、標的遺伝子に対応するmRNAの少なくとも一部に相補的である。他の態様では、R3は、5'-末端において結合したDNAのオリゴヌクレオチドである。そのような誘導体化DNAは、一本鎖として、または別のオリゴヌクレオチドの相補鎖とハイブリダイズした1本の鎖として存在し得る。オリゴヌクレオチド鎖は無修飾でもよく、代謝安定性のために修飾されていてもよい。そのような修飾としては、ホスフェート上の特定位置における置換(例えばホスホロチオエート)ならびに2'-ヒドロキシ上の特定位置における置換(例えば2'-O-メチルおよび2'-フルオロ)が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３４】
特定の態様では、式IのR2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は、（式Iをベースとする）式5：
2015508055.tif 000023
（式中、R1、nおよびXは式Iに定義の通りである）中に示すRNAのセンス鎖を含む。
【００３５】
他の特定の態様では、センス鎖はアンチセンス鎖に結合し得る。
【００３６】
他の特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3（式中、R3は小分子またはタンパク質を表す）を表し、それによって、共有結合により連結された、式Iの特異的標的化実体が形成される。
【００３７】
より特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は治療用の小分子またはタンパク質を表す。
【００３８】
他の特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は、細胞顕微鏡観察技術を使用するこれらのインテグリン受容体結合の可視化に有用な蛍光部分を表す。
【００３９】
他の特定の態様では、R2は-X-S-CH2-R3を表し、式中、R3は、一級反応性スルフィドを有するポリマーを表す。より具体的には、R3は、細胞表面および細胞の細胞質ドメインに対するsiRNAの複合体形成および送達に有用なカチオン性ポリマーを表し得る。
【００４０】
より特定の態様では、本発明は、R3が、
2015508055.tif 000024
に示すフルオレセインイソチオシアネート(FITC)の構造異性体の1つである、式Iの化合物に関する。
【００４１】
より特定の他の態様では、本発明は、R3が、
2015508055.tif 000025
に示すFITC-14の構造異性体の1つである、式Iの化合物に関する。
【００４２】
他の態様では、本発明は、nが9〜13、好ましくは12である、式Iの化合物に関する。
【００４３】
より特定の態様では、本発明は、以下の化合物（または薬学的に許容されるその塩もしくはエステル）のうちの1つからなる群より選択される式Iの化合物に関する：
LFA-1リガンド試薬1
(S)-3-{3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬2
(S)-3-{3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬3
(S)-3-{3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬4
(S)-3-{4-[4-(3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸-PEG8；
LFA-1リガンド試薬5
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬6
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬7
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬8
(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニルアミノ]-プロピル-オキシ}-フェニル)-カルボニル]-アミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬9
(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニルアミノ]-プロピル-オキシ}-5-ヒドロキシ-フェニル)-カルボニル]-アミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸；
LFA-1リガンド試薬10
(S)-3-[({3-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロピル-オキシ]-5-ヒドロキシ-フェニル}-カルボニル)-アミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸。
【００４４】
さらに、本発明は、LFA-1/ICAM-1複合体を発現する標的細胞の細胞質へのsiRNAなどの核酸の改善された送達をもたらす、siRNAと組み合わせた際にナノ粒子を創製するための、式Iの化合物を含有する新規組成物および製剤に関する。特定の態様では、本発明は、(1) R2が5'-siRNAオリゴヌクレオチドを含む、式Iの化合物と、(2) ポリカチオン性トランスフェクション剤とを含む、siRNA製剤に関する。
【００４５】
本発明はまた、そのような化合物および組成物を製造および使用する方法に関する。式Iの化合物は、LFA-1/ICAM-1複合体を発現する組織または細胞への薬物、核酸または他の治療用化合物の送達を改善する組成物または製剤の成分として有用である。特定の態様では、本発明は、RNA干渉を通じて特定のタンパク質の発現を阻害するために、LFA-1/ICAM-1複合体を発現する標的細胞の細胞質にsiRNAを送達する上で有用である、式Iの化合物を含有する製剤に関する。より特定の態様では、本発明は、がんまたは炎症性疾患の治療のための、ICAM-1受容体を発現する腫瘍細胞および他の細胞型にsiRNAを有効に送達可能な、式Iの化合物およびそのような化合物を含有する組成物に関する。そのような化合物および組成物は、式Iの化合物を欠く同様の製剤に比べて、より有効であるし、改善されたノックダウン能力を示す。
【００４６】
本発明の一態様では、式I：
2015508055.tif 000026
の化合物または薬学的に許容されるその塩もしくはエステルであって、
式中、nは1〜24であり、
R1は、
(1) 式：
2015508055.tif 000027
の化合物；
(2) 式：
2015508055.tif 000028
の化合物；および
(3) 式：
2015508055.tif 000029
の化合物（式中、QはHまたはOHである）
からなる群より選択され、
R2は、
(1) 式：
2015508055.tif 000030
の化合物；
(2) 式：
2015508055.tif 000031
の化合物；
(3) 式：
2015508055.tif 000032
の化合物；および
(4) 式：
2015508055.tif 000033
の化合物（式中、R3は結合体化された部分であり、かつXは硫黄または式：
2015508055.tif 000034
の化合物のいずれかを表す）
からなる群より選択される、
前記式Iの化合物または薬学的に許容されるその塩もしくはエステルが提供される。
【００４７】
本発明の一態様では、R1が式：
2015508055.tif 000035
の化合物である、式Iの化合物が提供される。
【００４８】
本発明の一態様では、R1が式：
2015508055.tif 000036
の化合物である、式Iの化合物が提供される。
【００４９】
本発明の一態様では、R1が式：
2015508055.tif 000037
（式中、QはHまたはOHである）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
【００５０】
本発明の一態様では、R1が式：
2015508055.tif 000038
（式中、QはHである）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
【００５１】
本発明の一態様では、R1が式：
2015508055.tif 000039
（式中、QはOHである）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
【００５２】
本発明の一態様では、R2が式：
2015508055.tif 000040
の化合物である、式Iの化合物が提供される。
【００５３】
本発明の一態様では、R2が式：
2015508055.tif 000041
の化合物である、式Iの化合物が提供される。
【００５４】
本発明の一態様では、R2が式：
2015508055.tif 000042
の化合物である、式Iの化合物が提供される。
【００５５】
本発明の一態様では、R2が式：
2015508055.tif 000043
（式中、R3は一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、Xは硫黄または式：
2015508055.tif 000044
の化合物のいずれかを表す）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
【００５６】
本発明の一態様では、R2が式：
2015508055.tif 000045
（式中、R3は一本鎖もしくは二本鎖オリゴヌクレオチドであり、Xは硫黄を表す）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
【００５７】
本発明の一態様では、R2が式：
2015508055.tif 000046
（式中、R3はsiRNA分子であり、Xは硫黄または式：
2015508055.tif 000047
の化合物のいずれかを表す）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
【００５８】
本発明の一態様では、R1が式：
2015508055.tif 000048
の化合物であり、
R2が式：
2015508055.tif 000049
（式中、R3はsiRNA分子であり、Xは硫黄または式：
2015508055.tif 000050
の化合物のいずれかを表す）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
【００５９】
本発明の一態様では、R1が式：
2015508055.tif 000051
の化合物であり、
R2が式：
2015508055.tif 000052
（式中、R3はsiRNA分子であり、Xは硫黄または式：
2015508055.tif 000053
の化合物のいずれかを表す）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
【００６０】
本発明の一態様では、R1が式：
2015508055.tif 000054
（式中、QはHまたはOHである）の化合物であり；
R2が式：
2015508055.tif 000055
（式中、R3はsiRNA分子であり、Xは硫黄または式：
2015508055.tif 000056
の化合物のいずれかを表す）の化合物である、式Iの化合物が提供される。
【００６１】
本発明の一態様では、以下からなる群より選択される式Iの化合物が提供される：
(S)-3-{3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸; および
(S)-3-{3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸。
【００６２】
本発明の一態様では、以下からなる群より選択される式Iの化合物が提供される：
(S)-3-{3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオニルアミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}アミノ)プロピオン酸; および
(S)-3-{4-[4-(3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸-PEG8。
【００６３】
本発明の一態様では、以下からなる群より選択される式Iの化合物が提供される：
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸; および
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸。
【００６４】
本発明の一態様では、以下からなる群より選択される式Iの化合物が提供される：
S)-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-3-(4-{2,6-ジクロロ-4-[3-(3-{2-[2-(2-{2-2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロポキシ]-ベンゾイルアミノ}-フェニル)-プロピオン酸; および
(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニルアミノ]-プロピル-オキシ}-フェニル)-カルボニル]-アミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸。
【００６５】
本発明の一態様では、以下からなる群より選択される式Iの化合物が提供される：
(S)-3-{[(3-{3-[3-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-プロピオニルアミノ]-プロピル-オキシ}-5-ヒドロキシ-フェニル)-カルボニル]-アミノ}-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸; および
(S)-3-[({3-[3-(3-{2-[2-(2-{2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-プロピオニルアミノ)-プロピル-オキシ]-5-ヒドロキシ-フェニル}-カルボニル)-アミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸。
【００６６】
本発明の別の態様では、式Iの化合物と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物が提供される。
【００６７】
本発明の化合物の一般的合成
式Iの化合物を合成するための好適な方法を実施例に示す。一般に、式Iの化合物は、以下に示すスキームに従って調製することができる。別途指定がない限り、以下のスキーム中の変数nならびにR1およびR2は、式Iの部類に関する以前の定義と同様に定義される。
【００６８】
マレイミド-(PEG)n-インテグリンアンタゴニスト結合剤の一般的合成
様々な長さのPEGのスキーム1の26などの化合物は市販されている(例えばPierce BioScienceから)。そのような化合物は、PEGアミノ酸のアミノ末端をアミド結合形成条件下で3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオン酸によってアシル化した後、エステル形成条件下でのN-ヒドロキシコハク酸との反応によって反応性N-ヒドロキシコハク酸エステルを形成することで作製することもできる。スキーム1に示すように、化合物26と27などの一級または二級アミンを含有する化合物との反応を、非プロトン性またはプロトン性溶媒中、DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)などの塩基性アミンの存在下、室温で行うことで、PEG化中間体28を生成させる。
2015508055.tif 000057
【００６９】
R4がチオアセチルまたは2-ジチオピリジルであって、様々な長さのPEG部分を有する、スキーム2の29などの化合物も市販されている(例えばPierce BioScienceから)。構造29を有する化合物と27などの一級または二級アミンを含有する化合物との反応を、非プロトン性またはプロトン性溶媒中、DIEA(ジイソプロピルエチルアミン)などの塩基性アミンの存在下、室温で行うことで、PEG化中間体30を生成させる。
2015508055.tif 000058
【００７０】
本発明の特定の非限定的な例として、スキーム3に示すように、中間体26と31とを反応させることでマレイミド中間体32を生成する。
2015508055.tif 000059
【００７１】
同様に、スキーム4に示すように、中間体26と33とを反応させることでマレイミド中間体34を生成することができる。
2015508055.tif 000060
【００７２】
同様に、スキーム5に示すように、中間体29と35とを反応させることで中間体36を生成することができ、R4はチオアセチルまたは2-ジチオピリジルを表す。
2015508055.tif 000061
【００７３】
同様に、スキーム6に示すように、中間体29と37とを反応させることで中間体38を生成することができ、R4はチオアセチルまたは2-ジチオピリジルを表す。
2015508055.tif 000062
【００７４】
一般構造26または29の化合物では、異なるPEGの長さが利用であるかまたは当業者によって容易に作製され、好ましくはn = 8〜24である。このトピックは徹底的に報告および考察されてきた(例えばChemistry for peptide and protein PEGylation, Advanced Drug Delivery Reviews Volume 54, Issue 4, 17 June 2002, Pages 459-476)。
【００７５】
スキーム7に示すように、中間体31は既報(例えばSidduri, A. et al. Bioorganic &amp；Medicinal Chemistry Letters, 2002, 12, 2475-2478)と同様に合成することができる。
2015508055.tif 000063
【００７６】
具体的には、スキーム7に示すように、中間体41を市販の(S)-3-[4-ニトロフェニル]-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸40から作り出した。メタノール溶液中の市販の出発原料40のニトロ基を塩化アンモニウムの存在下、亜鉛末によって室温で数時間かけて還元してアニリン41を得た。ニトロ還元の他の方法は当業者に公知である。アニリン41をジクロロメタンなどの非プロトン性溶媒中、ジ-イソプロピル-エチルアミンなどの塩基の存在下、室温で、塩化2,6-ジクロロベンゾイル42などのハロゲン化ベンゾイル誘導体によってアシル化した。こうしてアミド43を形成した。t-ブチルカルボニル(Boc)アミン保護基を、当業者に公知の標準的方法に従って、例えば室温でのジオキサン中HCl溶液による処理によって除去し、これにより塩酸塩44を得た。塩酸塩44を公知の1-(2-アジド-エチル)-シクロペンタンカルボン酸45の存在下、アミド結合形成条件(やはり当業者に周知)で処理することで、ジ-アミド46を生成した。中間体46のアジド基をテトラヒドロフランなどの非プロトン性溶媒中、室温でのトリ-アルキルホスフィンによる処理によって還元した。さらに、メチルエステルをエタノールおよびテトラヒドロフランなどの溶媒混合物中、50℃などの高温で15時間の水酸化ナトリウムによる処理によって鹸化した。この方法によって、双性イオンとして提示されることもある中間体31を形成した。
【００７７】
PEG部分の結合は、スキーム8に示すように合成される中間体39によっても可能である。具体的には、3,5-ジクロロフェノール47をDMFなどの極性非プロトン性溶媒中、イミダゾールなどの塩基の存在下で塩化トリ-イソプロピルシリルによって保護した後、無水テトラヒドロフラン中、-78℃などの低温でブチルリチウムなどの強塩基と反応させる。得られたリチウム錯体を、ドライアイスの形態で加えられる二酸化炭素で反応停止させることで、安息香酸誘導体である中間体48を得る。次に中間体48をトルエンなどの非プロトン性溶媒中での塩化スルホニル(SOCl2)による処理によって塩素化することで塩化アシルを形成する。この時点で、塩化アシルとアミン塩酸塩49とをジクロロメタン(DCM)などの非プロトン性溶媒中、ジ-イソプロピルエチルアミン(DIPEA)などの塩基の存在下で反応させることで中間体50を形成する。中間体50のシリル保護基をテトラヒドロフランなどのプロトン性溶媒中、室温でのフッ化テトラブチルアンモニウム(TBAF)による処理によって除去する。このフェノール中間体と3-N-t-ブチル-カーボネート-1-ブロモプロパンとをジメチルホルムアミド(DMF)などの非プロトン性溶媒中、炭酸カリウム(K2CO3)などの塩基の存在下で反応させる。こうして中間体52を形成し、これをトリフルオロ酢酸(TFA)で脱保護し、続いてエタノールなどのプロトン性溶媒中で水酸化ナトリウムなどの塩基によって加水分解することで中間体39を形成する。
2015508055.tif 000064
【００７８】
LFA-1アンタゴニスト誘導体化剤の合成
LFA-1/ICAM相互作用を標的化することで、ICAM系を発現する細胞を標的化する手段を与える小分子を、以下のスキーム11、12、13および14に示す。スキーム11に示すように、3-(3-メトキシ)-プロパン酸エステル70の一級アミドを当業者に公知の標準的条件下で形成し、還元する。これとは別に、尿素、アセトアルデヒドおよび3-オキソ-ブタン酸エチルエステルとのBignelli反応を使用してジヒドロピリミジンを形成する。50%硝酸でのジヒドロピリミジンの処理によってこの生成物のピリミジンを形成することで、4,6-ジメチル-2-ヒドロキシ-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステルを得る。
【００７９】
POCl3(オキシ塩化リン)との反応によってこの物質の塩化物を形成することで72を形成する。アミン71と塩化物72とを反応させることで二級アミンエステル73を形成する。この時点で、非プロトン性溶媒中での三臭化ホウ素などのルイス酸での処理によってメトキシ基を除去することでフェノール74を形成する。このフェノール74を塩基水溶液の存在下で鹸化した後、S-3-N-t-ブチル-カルバメート-2-カルボキシ-ジアミノプロパン塩酸塩(H-DAP(Boc)OMe塩酸塩)の存在下でアミドカップリング条件を適用することで、中間体77を形成する。Boc保護基を標準的条件下で除去した後、メチルエステルを鹸化することでICAM-1標的化小分子21を形成する。
【００８０】
例としてのLFA-1リガンド試薬1、LFA-1リガンド試薬2、LFA-1リガンド試薬3のための反応スキーム11：
2015508055.tif 000065
【００８１】
LFA-1/ICAM相互作用を標的化することで、ICAM系を発現する細胞を標的化する手段を与える他の小分子を、以下のスキーム12に示す。具体的には、トルエンなどの非プロトン性溶媒中の2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-安息香酸79を塩素化試薬である塩化チオニルによって還流条件下で処理する。次に、ワークアップ時に塩化アシルをジ-イソプロピルエチルアミンなどの塩基、および(S)-3-(4-アミノ-フェニル)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステル80で処理することでアミド81を作り出す。Bocアミノ保護基を標準的条件下で除去し、得られた一級アミン83を標準的アミド結合形成反応条件下でカップリングする。メチルエステル84はWO 01/58853号に報告されており、メチルエステル84のシリル保護を当業者に周知の標準的条件によって行った。カップリングおよび脱保護後、アミド88を(3-ブロモ-プロピル)-カルバミン酸tert-ブチルエステルで処理した。Boc保護基を標準的条件下で除去した後、メチルエステルを鹸化することでICAM-1標的化小分子22を形成する。
【００８２】
例としてのLFA-1リガンド試薬4、LFA-1リガンド試薬5、LFA-1リガンド試薬6、LFA-1リガンド試薬7のための反応スキーム12：
2015508055.tif 000066
【００８３】
同様に、LFA-1/ICAM相互作用を標的化することで、ICAM系を発現する細胞を標的化する手段を与える他の小分子の生成を、以下のスキーム13に示す。具体的には、アセトンおよびDMFなどの溶媒混合物中、炭酸カリウムの存在下などの塩基性条件下で、安息香酸3-ヒドロキシメチルを(3-ブロモ-プロピル)-カルバミン酸tert-ブチルエステルでアルキル化することで、中間体91を作り出す。メチルエステル91を鹸化し、得られた遊離酸92を標準的アミド結合形成条件下で中間体93(スキーム11)とカップリングすることで中間体94を得る。Boc保護基を標準的条件下で除去した後、メチルエステルを鹸化することでICAM-1標的化小分子96を形成する。
【００８４】
例としてのLFA-1リガンド試薬8のための反応スキーム13：
2015508055.tif 000067
【００８５】
LFA-1/ICAM相互作用を標的化することで、ICAM系を発現する細胞を標的化する手段を与える、以下のスキーム14に示す化合物102を作り出すために、同様の反応順序を使用する。安息香酸3-ヒドロキシメチルで出発する代わりに、出発原料の安息香酸3,5-ジヒドロキシメチル97を同様の順序において使用して、やはりスキーム14に示す中間体103を作り出す。
【００８６】
例としてのLFA-1リガンド試薬9、LFA-1リガンド試薬10のための反応スキーム14：
2015508055.tif 000068
【００８７】
有用性
式Iの化合物は、様々な治療用途および他の用途で、LFA-1インテグリン受容体複合体を発現する標的細胞に治療薬、小分子、ペプチド、核酸、蛍光部分およびポリマーなどの結合体化された部分を送達する上で有用である。したがって、式Iの化合物は、LFA-1の発現または過剰発現に関連する様々な疾患および状態を治療するために使用することができる。そのような疾患および状態としては炎症、がん、および代謝関連疾患を挙げることができる。
【００８８】
特定の態様では、本発明は、がんの治療または予防を、そのような治療を必要とする哺乳動物(好ましくはヒト)において行う方法であって、治療有効量の式Iの化合物を投与する段階を含む方法を含む。さらなる態様では、炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防のための、式Iの化合物の使用が提供される。さらなる態様では、炎症、がん、または代謝疾患もしくは代謝状態の治療または予防用の医薬の調製のための、式Iの化合物の使用が提供される。
【００８９】
そのような組成物は良質の医療のための原則(good medical practice)に一致する様式で投与することができる。この文脈で考慮される要素としては、治療される特定の障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および開業医に公知の他の要因が挙げられる。投与すべき化合物の「有効量」は、疾患または状態を治療もしくは予防し(例えば標的タンパク質の発現を阻害し)かつ許容されない毒性を回避するために必要な最小量などの考慮事項によって左右される。例えば、そのような量は正常細胞、または哺乳動物全体に毒性のある量を下回ることができる。本発明の式Iの化合物を含有する組成物は非経口投与、腹腔内投与および肺内投与によって投与することができる。非経口注入としては筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与または皮下投与が挙げられる。
【実施例】
【００９０】
本発明は、以下の実施例を参照することでさらに完全に理解されよう。しかし、それらを本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。
【００９１】
試薬をAldrich、SigmaおよびPierce BioScience、または以下に示す他の供給業者から購入し、さらに精製せずに使用した。マルチミリグラム〜マルチグラムのスケールの精製を当業者に公知の方法、例えばシリカゲルフラッシュカラムの溶離により行った。また、いくつかの場合では、分取フラッシュカラム精製を、CombiFlashシステムで溶離される使い捨て予備充填マルチグラムシリカゲルカラム(RediSep)の使用により行った。また、Biotage(商標)およびISCO(商標)は、中間体の精製に本発明で使用可能なフラッシュカラム機器である。
【００９２】
化合物の同一性および純度を判定する目的で、以下のシステムを使用してLC/MS(液体クロマトグラフィー/質量分析)スペクトルを記録した。質量スペクトルの測定では、システムはMicromass Platform II分光計: ポジティブモードのESイオン化(質量範囲: 150〜1200amu)からなる。同時クロマトグラフィー分離を以下のHPLCシステムで実現した: ES Industries Chromegabond WR C-18 3u 120Å(3.2x30mm)カラムカートリッジ；移動相A: 水(0.02% TFA)および相B: アセトニトリル(0.02% TFA)；勾配10% B〜90% B、3分；平衡化時間1分；流量2mL/分。いくつかの場合では、分取HPLC中に20ミリモル濃度の酢酸アンモニウムを有効イオン化用調節剤として使用した。そのような場合ではアンモニウム塩を単離した。
【００９３】
いくつかの分離では、超臨界流体クロマトグラフィーの使用も有用であり得る。超臨界流体クロマトグラフィー分離は以下の典型的条件でMettler-Toledo Minigramシステムを使用して行った: 12mm ADカラムを超臨界流体CO2中40% MeOHによって100bar、30℃、2.0mL/分で溶離。塩基性アミノ基を有する分析物の場合、0.2%イソプロピルアミンをメタノール調節剤に加えた。
【００９４】
化合物を、Varian Inova 400 MHz NMR分光計またはVarian Mercury 300 MHz NMR分光計を使用する1H-NMR、およびBruker Apex-II高分解能4.7T FT-質量分析計を使用する高分解能質量分析によって特徴づけた。また、最終化合物を、Thermo Electronが販売するLTQ CL Orbitrapを使用する高分解能質量分析によって特徴づけた。
【００９５】
本明細書において使用される略語は以下の通りである。
AIBN         2,2'-アゾビスイソブチロニトリル
Bu           ブチル
DCE          1,2-ジクロロエタン
DCM          ジクロロメタン
DBU          1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデカ-7-エン
DIAD         ジイソプロピルアゾジカルボキシレート
DIEA         ジエチルアミン
DIPEA        ジイソプロピルエチルアミン
DMF          N,N-ジメチルホルムアミド
DMSO         ジメチルスルホキシド
EDC-HCl      1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩
EtOAc        酢酸エチル
EtOH         エチルアルコール
FCC          フラッシュカラムクロマトグラフィー
h            時間
HBTU         O-(ベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウム
ヘキサフルオロホスフェート
HOBt         ヒドロキシベンゾトリアゾール
HPLC         高圧液体クロマトグラフィー
HRMS         高分解能質量スペクトル
LRMS         低分解能質量スペクトル
LC           液体クロマトグラフィー
L-Pro        L-プロリン
MCPBA        メタ-クロロ過安息香酸
MeOH         メチルアルコール
MW           マイクロ波
NIS          N-ヨードスクシンイミド
NBS          N-ブロモスクシンイミド
NMP          1-メチル-2-ピロリジノン
PdCl2(dppf)  [1,1'-ビス(ジフェニルホスフィノ)フェロセン]ジクロロパラジウム(II)
PEGn         ポリエチレングリコールのn回繰り返し(例えばPEG2 = -OCH2CH2OCH2CH2-)
PG           保護基
PyBroP       ブロモ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
rt           室温
TBAF         フッ化テトラブチルアンモニウム
TBDMS        tert-ブチル-ジメチルシリル
TBTU         2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム
テトラフルオロボレート
TMS          トリメチルシリル
TEA          トリエチルアミン
TFA          トリフルオロ酢酸
THF          テトラヒドロフラン
TLC          薄層クロマトグラフィー
TPP          トリフェニルホスフィン
【００９６】
標的化剤として使用される、ICAM-1受容体に対する小分子LFA-1アンタゴニストおよび/またはLFA-1/MAC-1デュアルアンタゴニストの合成
【００９７】
パート1: 好ましい中間体
3-(3-メトキシ-フェニル)-プロピオンアミドの調製
2015508055.tif 000069
3-(3-メトキシ-フェニル)-プロピオン酸(15g、83.2mmol)および4-メチル-モルホリン(10.1ml、91.56mmol)のTHF(150ml)溶液を0℃に冷却し(氷水浴)、クロロギ酸イソプロピル(トルエン中1M、91.6ml、91.56mmol)を20分かけて加えた。混合物を0℃でさらに30分間攪拌した後、7N NH3/MeOH(24ml、168mmol)を滴下した。混合物を室温に昇温させ、2時間攪拌した。それを10% K2CO3水溶液で反応停止させ、EtOAcで抽出した。有機抽出物を一緒にし、水およびブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて所望のアミド(11.15g、収率75%)を得た。MS m/e 179.9 (M+H+)。
【００９８】
3-(3-メトキシ-フェニル)-プロピルアミンの調製
2015508055.tif 000070
3-(3-メトキシ-フェニル)-プロピオンアミド(11.15g、62.26mmol)のTHF(100ml)溶液にTHF中BH3(2.2g、188mmol)を室温で加えた。溶液を還流温度に4時間加熱し、室温に冷却し、MeOH(50ml)で反応停止させた。溶液を還流温度に30分間加熱し、濃縮し、水で処理し、EtOAcで抽出した。抽出物を10% K2CO3水溶液、水およびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、蒸発させて標記化合物(9.26g、収率90%)を得た。MS m/e 165.9 (M+H+)。
【００９９】
4,6-ジメチル-2-ヒドロキシ-1,6-ジヒドロ-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステルの調製
2015508055.tif 000071
350ml加圧フラスコ中で3-オキソ-ブタン酸エチルエステル(16.27g、125mmol)、アセトアルデヒド(5.51g、125mmol)、尿素(7.51g、125mmol)および氷酢酸(20滴)のエタノール(35ml)中混合物を90℃に終夜加熱した。混合物を水で希釈した。析出物を濾取し、水で洗浄し、風乾させて所望の生成物(17.68g、収率71%)を得た。MS m/e 198.8 (M+H+)。
【０１００】
4,6-ジメチル-2-ヒドロキシ-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステルの調製
2015508055.tif 000072
50%硝酸の氷冷溶液(120ml)に4,6-ジメチル-2-ヒドロキシ-1,6-ジヒドロ-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステル(34.63g、174.7mmol)を数回に分けて5分かけて加えた。溶液を0℃で10分間攪拌し、氷水(500ml)に注ぎ、固体K2CO3で中和し、クロロホルムで抽出した。一緒にした有機層を水およびブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して標記化合物(21.9g、収率71%)を得た。MS m/e 197.1 (M+H+)。
【０１０１】
2-クロロ-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステルの調製
2015508055.tif 000073
POCl3(106ml)およびDIEA(65ml)の溶液に4,6-ジメチル-2-ヒドロキシ-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステル(21.9mg、111.6mmol)を加えた。混合物を110℃に2時間加熱した。過剰のPOCl3およびDIEAを減圧蒸発により除去した。残渣をEtOAc(1.2l)に溶解させ、脱色炭で処理した。濾過後、溶液を1N NaOH、水およびブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗残渣をヘキサン中0〜30% EtOAc勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物(9.33g、収率39%)を得た。
【０１０２】
2-[3-(3-メトキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステルの調製
2015508055.tif 000074
3-(3-メトキシ-フェニル)-プロピルアミン(2.31g、13.98mmol)、2-クロロ-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステル(2g、9.32mmol)のEtOH(12ml)中混合物を160℃で1.5時間マイクロ波処理した。反応混合物を室温に冷却し、10% K2CO3で反応停止させ、EtOAcで抽出した。有機層をブラインで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をヘキサン中30% EtOACを用いるフラッシュクロマトグラフィーで精製して所望の生成物(2.42g、収率76%)を得た。MS m/e 344.1 (M+H+)。
【０１０３】
2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ)-4,-ジメチル-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステルの調製
2015508055.tif 000075
2-[3-(3-メトキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステル(2.42g、7.05mmol)のDCM(50ml)溶液を氷水浴中で冷却し、BBr3/DCM(1M、14.1ml、14.1mmol)を滴下した。得られた溶液を室温に昇温させ、室温で2時間攪拌した。溶液を氷水で反応停止させ、DCMで抽出した。有機層を一緒にし、水およびブラインで洗浄し、MgSO4で乾燥させ、濾過し、濃縮して所望の生成物(2g、収率86%)を得た。MS m/e 330.1 (M+H+)。
【０１０４】
(S)-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステルの調製
2015508055.tif 000076
2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,5-ジメチル-ピリミジン-5-カルボン酸エチルエステル(2.0g、6.0mmol)のジオキサン(30ml)溶液を水酸化リチウム一水和物(6.3g、150mmol)の水(30ml)溶液で処理した。混合物を90℃で12時間攪拌した後、室温に冷却し、硫酸水素カリウム水溶液で反応停止させてpHを約2〜4に調整した。得られた溶液をEtOAcで抽出した。有機抽出物を一緒にし、ブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、濃縮して酸(1.76g)を得て、これを精製せずに次の工程に直接供した。2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボン酸(1.76g、5.84mmol)の無水DMF(60ml)溶液にEt3N(2.5ml、7.0mmol)、HBTU(2.66g、7.01mmol)、HOBT(0.95g、7.01mmol)およびH-DAP(Boc)OMe塩酸塩(1.79g、7.01mmol)を加えた。混合物を室温で3時間攪拌し、ブライン(200ml)で希釈し、酢酸エチルで抽出した。一緒にした有機層を1:1飽和炭酸水素ナトリウム/ブラインおよびブラインで洗浄した後、Na2SO4で乾燥させ、濾過し、減圧濃縮した。粗残渣をヘキサン中40〜100% EtOAc勾配を用いるフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物(2.66g、収率91%)を得た。MS m/e 501.9 (M+H+)。
【０１０５】
(S)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩の調製
2015508055.tif 000077
(S)-3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル(2.66g, 5.30mmol)のMeOH(10ml)溶液にジオキサン中4.0M HCl(20mL)を加えた。1時間後、混合物を濃縮し、MeOHと共沸した。生成物をエーテルでトリチュレートし、濾過し、エーテルで洗浄して標記化合物(2.16g、収率93%)を得た。MS m/e 401.9 (M+H+)。
【０１０６】
(S)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸塩酸塩; LFA-1リガンド1の調製
2015508055.tif 000078
LiOH水溶液(水2mL中13mg、0.57mmol)にS)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(50mg、0.114mmol)を加え、得られた懸濁液を室温で終夜攪拌した。次に反応混合物を1N塩酸で中和し、凍結乾燥させた。この材料をさらに精製せず次の工程に使用した。
【０１０７】
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-安息香酸メチルエステルの調製
2015508055.tif 000079
アセトン(10mL)とDMF(10mL)との混合物中で安息香酸3-ヒドロキシメチル(500mg、3.29mmol)、(3-ブロモ-プロピル)-カルバミン酸tert-ブチルエステル(861mg、1.1当量)および炭酸カリウム(2.3g、5当量)を一緒にした。反応混合物を75℃で終夜攪拌した。不溶性材料を濾過し、廃棄し、濾液を減圧濃縮し、酢酸エチルで希釈し、水およびブラインで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。酢酸エチルおよびヘキサンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより標記化合物900mgを得た。HRMS m/e 332.1466 (M+Na)+
【０１０８】
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-安息香酸の調製
2015508055.tif 000080
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-安息香酸メチルエステル(900mg)のメタノール(3mL)溶液にLiOH(334mg、5当量)の水(3mL)溶液を加え、得られた反応混合物を45℃で終夜攪拌した。次に反応混合物を1N HClでpH 3に酸性化し、直ちに酢酸エチルで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。次にそれを減圧濃縮し、酢酸エチルから結晶化させて標記化合物600mgを得た。
HRMS m/e 318.1311 (M+Na)+
【０１０９】
(S)-3-[3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステルの調製
2015508055.tif 000081
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-安息香酸(57mg、0.193mmol)のDMF(1mL)溶液にHBTU(78mg、1.05当量)、DIEA(172μL、5当量)および(S)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(100mg、0.194mmol)を加えた。得られた反応混合物を室温で4時間攪拌した。次にそれを酢酸エチルで希釈し、水およびブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。メタノール/塩化メチレンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより標記化合物97mgを得た。
HRMS m/e 679.3447 (M+H)+
【０１１０】
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩の調製
2015508055.tif 000082
塩化トリメチルシリル(177μL)をメタノール(2mL)に加え、得られた混合物を室温で5分間攪拌した。次にそれを(S)-3-[3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル(94.6mg、0.139mmol)に加え、得られた反応混合物を室温で週末にかけて攪拌した。次にそれを減圧濃縮し、ジエチルエーテルでトリチュレートして標記化合物84.8mgを得た。HRMS m/e 579.2925 (M+H)+
【０１１１】
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸LAF-1リガンド2の調製
2015508055.tif 000083
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(82.6mg、0.134mmol)をメタノール(1mL)および2M NaOH(336μL、5当量)に溶解させ、得られた反応混合物を室温で終夜攪拌した。次にそれを1N HClで中和し、凍結乾燥させ、さらに精製せずに次の工程に使用した。MS m/e 565.5 (M+H)+
【０１１２】
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-安息香酸メチルエステルの調製
2015508055.tif 000084
アセトン(50mL)とDMF(50mL)との混合物中で安息香酸3,5-ジヒドロキシメチル(1.8g、10.7mmol)、(3-ブロモ-プロピル)-カルバミン酸tert-ブチルエステル(1.3g、5.46mmol)および炭酸カリウム(1.5g、10.8mmol)を一緒にした。反応混合物を75℃で終夜攪拌した。粗反応混合物を減圧濃縮し、酢酸エチルで希釈し、水およびブラインで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。酢酸エチルおよびヘキサンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーにより標記化合物462mgを得た。HRMS m/e 348.1417 (M+Na)+
【０１１３】
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-安息香酸の調製
2015508055.tif 000085
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-安息香酸メチルエステル(1.2g、3.69mmol)の2M NaOH(9.2mL、5当量)溶液に水(20mL)を加え、得られた反応混合物を室温で終夜攪拌した。次に反応混合物を1N HClで中和し、直ちに酢酸エチルで抽出した。有機相をブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。次にそれを減圧濃縮して標記化合物1.0gを得た。MS m/e 211.8 (M+H-Boc)+
【０１１４】
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-安息香酸2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステルの調製
2015508055.tif 000086
3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-安息香酸(500mg、1.606mmol)およびN-ヒドロキシスクシンイミド(185mg、1当量)のTHF(20mL)中冷却溶液にDCC(332mg、1当量)を加えた。1時間後、冷却浴を取り外した。不溶性材料を濾過し、廃棄した。濾液を減圧濃縮し、粗材料を酢酸エチルおよびヘキサンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物602mgを得た。HRMS m/e 431.1426 (M+Na)+
【０１１５】
(S)-3-[3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステルの調製
2015508055.tif 000087
(S)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(476.4mg、0.924mmol)のDMF(5mL)溶液にDIEA(321μL、3当量)および3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-安息香酸2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(377mg、1当量)を加えた。得られた反応混合物を室温で2時間攪拌した。次にそれを酢酸エチルで希釈し、水およびブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗材料をメタノール/塩化メチレンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物301mgを得た。
HRMS m/e 695.3395 (M+H)+
【０１１６】
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩の調製
2015508055.tif 000088
塩化トリメチルシリル(548μL)をメタノール(5mL)に加え、得られた溶液を室温で1分間攪拌した。次に(S)-3-[3-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル(299.6mg、0.431mmol)を加え、室温での攪拌を終夜続けた。メタノールを減圧除去し、残渣をジエチルエーテルでトリチュレートして標記化合物272mgを得た。HRMS m/e 595.2875 (M+H)+
【０１１７】
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸; LFA-1リガンド3の調製
2015508055.tif 000089
水(1mL)とメタノール(1mL)との混合物に(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(100mg、0.158mmol)を溶解させた後、2N NaOHを加えた(400μL、5当量)。反応混合物を室温で3時間攪拌した。次にそれを1N HClで中和し、凍結乾燥させ、さらに精製せずに次の工程に使用した。MS m/e 581.1 (M+H)+
【０１１８】
(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸メチルエステルの調製
2015508055.tif 000090
2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-安息香酸(50mg、0.138mmol)のトルエン(2mL)溶液に塩化チオニル(50μL、0.69mmol)を加えた。得られた溶液を2時間還流させた。次に塩化チオニルおよびトルエンを減圧除去した。油状残渣を塩化メチレン(3mL)に再溶解させ、0℃に冷却した。次にDIEA(72μL、0.414mmol)および(S)-3-(4-アミノ-フェニル)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピオン酸メチルエステル(43mg、0.145mmol)を加え、得られた反応混合物を室温で週末にかけて攪拌した。粗材料を酢酸エチルおよびヘキサンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物87mgを得た。HRMS m/e 661.2237 (M+Na)+
【０１１９】
(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸メチルエステルの調製
2015508055.tif 000091
(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-トリイソプロピルシラニルオキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸メチルエステル(84.7mg、0.132mmol)のTHF(1mL)溶液にTBAF(THF中1M溶液199μL)を加え、得られた混合物を室温で終夜攪拌した。溶媒を減圧除去し、酢酸エチルに再溶解後に残渣を水およびブラインで洗浄し、次に無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗材料を酢酸エチルおよびヘキサンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物50.3mgを得た。HRMS m/e 505.0903 (M+Na)+
【０１２０】
(S)-2-アミノ-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]プロピオン酸メチルエステル塩酸塩の調製
2015508055.tif 000092
TMSCl(1.4mL、11.3mmol)のMeOH(15mL)溶液に(S)-2-tert-ブトキシカルボニルアミノ-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸メチルエステル(548mg、1.13mmol)を加え、得られた混合物を室温で終夜攪拌した。粗混合物を減圧濃縮し、残渣をジエチルエーテルでトリチュレートして標記化合物379mgを得た。HRMS m/e 383.0561 (M+H)+
【０１２１】
N-[3-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-ベンジル]-2-クロロ-テレフタルアミド酸メチルエステルの調製
2015508055.tif 000093
2-クロロ-N-(3-ヒドロキシ-ベンジル)-テレフタルアミド酸メチルエステルの調製は特許WO 01/58853号に記載されている。2-クロロ-N-(3-ヒドロキシ-ベンジル)-テレフタルアミド酸メチルエステル(4.0g、12.54mmol)、TBDMSCl(2.3g、15.0mmol)およびイミダゾール(1.9g、27.6mmol)をDMF(80mL)に溶解させ、室温で終夜攪拌した。次に反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水およびブラインで洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗材料を酢酸エチルおよびヘキサンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物5.0gを得た。MS m/e 433.9 (M+H)+
【０１２２】
N-[3-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-ベンジル]-2-クロロ-テレフタルアミド酸の調製
2015508055.tif 000094
N-[3-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-ベンジル]-2-クロロ-テレフタルアミド酸メチルエステル(4.9g、11.29mmol)の1,2-ジクロロエタン(80mL)溶液に水酸化トリメチルスズ(20.4g、112.9mmol)を加え、得られた反応混合物を80℃で8時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を酢酸エチルに溶解させた。次にそれをKHSO4水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、シリカパッドを通じて濾過した。濾液を減圧濃縮して標記化合物4.0gを得た。HRMS m/e 420.1393 (M+H)+
【０１２３】
(S)-2-{4-[3-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-ベンジルカルバモイル]-2-クロロ-ベンゾイルアミノ}-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸メチルエステルの調製
2015508055.tif 000095
N-[3-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-ベンジル]-2-クロロ-テレフタルアミド酸(103mg、0.246mmol)のDMF(2mL)溶液にHBTU(103mg、0.271mmol)、DIEA(128μL、0.738mmol)および(S)-2-アミノ-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(103mg、0.246mmol)を加えた。得られた反応混合物を室温で週末にかけて攪拌した。次にそれを酢酸エチルで希釈し、水およびブラインで洗浄した。粗材料をメタノール/塩化メチレンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物100mgを得た。HRMS m/e 784.1776 (M+H)+
【０１２４】
(S)-3-{4-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸メチルエステルの調製
2015508055.tif 000096
(S)-2-{4-[3-(tert-ブチル-ジメチル-シラニルオキシ)-ベンジルカルバモイル]-2-クロロ-ベンゾイルアミノ}-3-[4-(2,6-ジクロロ-4-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ)-フェニル]-プロピオン酸メチルエステル(91.5mg、0.116mmol)のアセトン(1mL)とDMF(1mL)との混合物中溶液に炭酸カリウム(48mg、3当量)および(3-ブロモ-プロピル)-カルバミン酸tert-ブチルエステル(33mg、1.2当量)を加えた。得られた反応混合物を75℃で終夜攪拌した。次にそれを酢酸エチルで希釈し、水およびブラインで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。粗材料をメタノール/塩化メチレンを使用するシリカゲル上でのフラッシュクロマトグラフィーで精製して標記化合物76.5mgを得た。HRMS m/e 827.2016 (M+H)+
【０１２５】
(S)-3-{4-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}--[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩の調製
2015508055.tif 000097
塩化トリメチルシリル(100μL、10当量)をメタノール(2mL)に加えた。5分後、得られた溶液を(S)-3-{4-[4-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸メチルエステル(65.6mg、0.079mmol)に加え、温度で終夜攪拌した。粗反応混合物を濃縮し、ジエチルエーテルでトリチュレートして標記化合物60.4mgを得た。HRMS m/e 727.1492 (M+H)+
【０１２６】
(S)-3-{4-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸; LFA-1リガンド4の調製
2015508055.tif 000098
(S)-3-{4-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}--[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸メチルエステル塩酸塩(55mg、0.072mmol)のメタノール(1mL)溶液に2M NaOH水溶液(178μL、5当量)を加えた。得られた反応混合物を室温で終夜攪拌した。次にそれを1N HClで中和し、凍結乾燥させ、さらに精製せずに次の工程に使用した。MS m/e 713.0 (M+H)+
【０１２７】
実施例1
LFA-1リガンド試薬1の調製
2015508055.tif 000099
(S)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸塩酸塩(0.114mmol)のアセトニトリル(1mL)溶液、ならびにスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-テトラエチレングリコール]エステル(58mg、0.114mmol)のDMSO 1mLおよびジイソプロピルエチルアミン(40μL、0.228mmol)溶液。両溶液を一緒にし、室温で30分間攪拌した。粗反応混合物を減圧濃縮し、SFCで精製して標記生成物51mgを得た。HRMS m/e 786.3665 (M+H)+
【０１２８】
実施例2
LFA-1リガンド試薬2の調製
2015508055.tif 000100
(S)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸塩酸塩およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-オクタエチレングリコール]エステルを用いて、実施例1に示すのと同様にして標記化合物を調製した。
HRMS m/e 984.4530 (M+Na)+
【０１２９】
実施例3
LFA-1リガンド試薬3の調製
2015508055.tif 000101
(S)-3-アミノ-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸塩酸塩およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-ドデカエチレングリコール]エステルを用いて、実施例1に示すのと同様にして標記化合物を調製した。
HRMS m/e 1138.5761 (M+H)+
【０１３０】
実施例4
LFA-1リガンド試薬4の調製
2015508055.tif 000102
(S)-3-{4-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸(0.196mmol)のDMSO(2mL)溶液にDIEA(102μL、3当量)およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-オクタエチレングリコール]エステル(135mg、1当量)を加えた。得られた混合物を室温で1時間攪拌した。粗材料をHPLCで精製して標記化合物105mgを得た。
HRMS m/e 1287.4077 (M+H)+
【０１３１】
実施例5
LFA-1リガンド試薬5の調製
2015508055.tif 000103
(S)-3-{4-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-テトラエチレングリコール]エステルを用いて、実施例4に示すのと同様にして標記化合物を調製した。
HRMS m/e 1111.3021 (M+H)+
【０１３２】
実施例6
LFA-1リガンド試薬6の調製
2015508055.tif 000104
(S)-3-{4-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-ドデカエチレングリコール]エステルを用いて、実施例4に示すのと同様にして標記化合物を調製した。
HRMS m/e 732.2595 (M+2H)2+
【０１３３】
実施例7
LFA-1リガンド試薬7の調製
2015508055.tif 000105
(S)-3-{4-[4-(3-アミノ-プロポキシ)-2,6-ジクロロ-ベンゾイルアミノ]-フェニル}-2-[2-クロロ-4-(3-ヒドロキシ-ベンジルカルバモイル)-ベンゾイルアミノ]-プロピオン酸(0.131mmol)のDMSO(2mL)溶液にDIEA(46μL、2当量)および3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-アセチルスルファニル-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-エトキシ}-エトキシ)-エトキシ]-プロピオン酸2,5-ジオキソ-ピロリジン-1-イルエステル(78mg、1当量)を加えた。得られた混合物を室温で1時間攪拌した。粗材料をHPLCで精製して標記化合物114mgを得た。
HRMS m/e 1195.3511 (M+H)+
【０１３４】
実施例8
LFA-1リガンド試薬8の調製
2015508055.tif 000106
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-オクタエチレングリコール]エステルを用いて、実施例1に示すのと同様にして標記化合物を調製した。
HRMS m/e 1139.5511 (M+H)+
【０１３５】
実施例9
LFA-1リガンド試薬9の調製
2015508055.tif 000107
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-オクタエチレングリコール]エステルを用いて、実施例1に示すのと同様にして標記化合物を調製した。
HRMS m/e 1155.5448 (M+H)+
【０１３６】
実施例10
LFA-1リガンド試薬10の調製
2015508055.tif 000108
(S)-3-[3-(3-アミノ-プロポキシ)-5-ヒドロキシ-ベンゾイルアミノ]-2-({2-[3-(3-ヒドロキシ-フェニル)-プロピルアミノ]-4,6-ジメチル-ピリミジン-5-カルボニル}-アミノ)-プロピオン酸およびスクシンイミジル-[(N-マレイミドプロピオンアミド)-テトラエチレングリコール]エステルを用いて、実施例1に示すのと同様にして標記化合物を調製した。
HRMS m/e 979.4403 (M+H)+
【０１３７】
フルオレセイン(FITC)標識標的化試薬の調製
標的化試薬は、標的化小分子に対する受容体を発現する細胞へのそれらの結合の追跡を試験するために有用であり得るフルオロフォアで誘導体化することができる。そのような分子は2つの方法の一方または両方で作製することができる。第一に、標的化マレイミドと2-[(5-フルオレセイニル)アミノカルボニル]エチルメルカプタンとの反応を行うことが可能である。あるいは、インテグリンアンタゴニスト小分子標的化リガンドのワンポット反応を行うことが可能であり、2-[(5-フルオレセイニル)アミノカルボニル]エチルメルカプタン、ならびにスキーム17および18に示す二官能性PEG試薬を用いる。
【０１３８】
方法a)の例
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸-FITCの調製
2015508055.tif 000109
(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸(37.5mg、0.03mmol)および2-[(5-フルオレセイニル)アミノカルボニル]エチルメルカプタン(FITC試薬)(15.6mg、0.036mml)のメタノール(5mL)中黄色懸濁液に過剰のDIPEA(38.7mg、52uL、0.3mmol)を窒素雰囲気下、室温で加えた。得られた明黄色懸濁液を2時間攪拌し、その時点でLCMS分析は出発原料の非存在を示した。次に、過剰のDIPEAを減圧除去し、所望の生成物をHPLCを使用する精製によって単離して(S)-N-[4-[3-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-ピロール-1-イル)-プロピオニルアミノ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]エトキシ]-プロピオニルアミノ]プロポキシ]-フェニル]-3-[2-[3-(グアニジノ)-ベンゾイルアミノ]-アセチルアミノ]-スクシンアミド酸-FITC誘導体25mg(収率50%)を褐色固体として得た。
2015508055.tif 000110
【０１３９】
方法b)の例
2015508055.tif 000111
【０１４０】
工程1. シスタミン二塩酸塩(68mg、0.301mmol)およびDIEA(110μL、2.1当量)をDMF(10mL)に溶解させた後、5-および6-カルボキシフルオレセインの混合物であるNHS-フルオレセイン(300mg、0.634mmol)を加え、得られた反応混合物を室温で終夜攪拌した。次にそれを酢酸エチルで希釈し、水で3回、ブラインで1回洗浄した。抽出物を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧濃縮し、少量のメタノールおよび酢酸エチルに再溶解させた後、ジエチルエーテルでトリチュレートしてフルオレセイン-シスタミン付加体140mgを明橙色固体として得た。
【０１４１】
工程2. フルオレセイン-シスタミン付加体(80mg、0.092mmol)をメタノールおよび水の3:1混合物(4mL)に溶解させ、TCEP塩酸塩(80mg、3当量)を加えた。得られた反応混合物を室温で2時間攪拌した。生成物をHPLCで精製して生成物78mgを得た。LRMS (ESI) 435.0
【０１４２】
フルオレセイン標識小分子-PEG結合体の調製
2015508055.tif 000112
【０１４３】
一般的手順
リガンド(1当量)のDMSO溶液にDIEA(2当量)およびSM(PEG)4n(1当量)を加えた。得られた反応混合物を室温で1時間攪拌した。次に、チオールハンドルを有するフルオレセイン(1当量)を加え、反応混合物をさらに10分間攪拌した。生成物をHPLCで精製した。
【０１４４】
5'-チオール-siRNAオリゴヌクレオチドへの小分子インテグリン標的化リガンドの共有結合の手順
siRNAの調製
オリゴリボヌクレオチド合成
ABI 394合成機(Applied Biosystems)を10μmolスケールで使用する固相上でのホスホラミダイト技術に従ってオリゴリボヌクレオチドを合成した。配列：
センス鎖
2015508055.tif 000113
アンチセンス鎖
2015508055.tif 000114
【０１４５】
対応するsiRNAはハウスキーピング遺伝子AHA1に対するものである。細孔制御ガラスでできた固体支持体(CPG、520Å、負荷75μmol/g、米国ペンシルベニア州アストンのPrime Synthesisから得た)上で合成を行った。定型的RNAホスホラミダイトである2'-O-メチルホスホラミダイト、および補助試薬をProligo(ドイツ・ハンブルク)から購入した。具体的には、以下のアミダイトを使用した: (5'-O-ジメトキシトリチル-N6-(ベンゾイル)-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-アデノシン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト、5'-O-ジメトキシトリチル-N4-(アセチル)-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-シチジン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト、(5'-O-ジメトキシトリチル-N2-(イソブチリル)-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-グアノシン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイトおよび5'-O-ジメトキシトリチル-2'-O-t-ブチルジメチルシリル-ウリジン-3'-O-(2-シアノエチル-N,N-ジイソプロピルアミノ)ホスホラミダイト。2'-O-メチルホスホラミダイトは定型的RNAアミダイトと同一の保護基を有していた。すべてのアミダイトを無水アセトニトリル(100mM)に溶解させ、モレキュラーシーブ(3Å)を加えた。オリゴマーの5'-末端においてスルフヒドリルリンカーを生成させるために、Glen Research(米国バージニア州スターリング)からの1'-[(2-シアノエチル)-(N,N-ジイソプロピル)]-ホスホラミダイトリンカーである1-O-ジメトキシトリチル-ヘキシル-ジスルフィドを使用した。小分子の結合体化の前に、トリス-(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP、以下参照)を使用してジスルフィドリンカーを還元した。Nu547フルオロフォアによる5'-末端標識のために、Thermo Fisher(ウィスコンシン州ミルウォーキー)から得た対応するホスホラミダイトを使用した。5-エチルチオテトラゾール(ETT、アセトニトリル中500mM)をアクチベーター溶液として使用した。カップリング時間は6分とした。ホスホロチオエート結合を導入するために、3-エトキシ-1,2,4-ジチアゾリン-5-オン(EDITH、スコットランド・ラナークシャーのLink Technologiesから得た)の無水アセトニトリル中100mM溶液を使用した。
【０１４６】
支持体結合オリゴマーの開裂および脱保護
固相合成の完了後、乾燥固体支持体を15mL管に移し、メタノール中メチルアミン(2M、Aldrich)によって45℃で180分間処理した。遠心分離後、上澄み液を新たな15mL管に移し、CPGをN-メチルピロリジン-2-オン(NMP、スイス・ブックス、Fluka)1200μLで洗浄した。洗浄液をメチルアミンのメタノール溶液と一緒にし、トリエチルアミン三フッ化水素酸塩(TEA・3HF、ドイツ・カールスルーエ、Alfa Aesar)450μLを加えた。この混合物を65℃に150分間到達させた。室温に冷却後、NMP 0.75mLおよびエトキシトリメチルシラン(スイス・ブックス、Fluka)1.5mLを加えた。10分後、析出したオリゴリボヌクレオチドを遠心分離により収集し、上澄み液を廃棄し、固体を緩衝液A(以下参照)1mL中で再構成した。
【０１４７】
オリゴリボヌクレオチドの精製
粗オリゴリボヌクレオチドを、AKTA Explorerシステム(GE Healthcare)上で分取22x250mm DNA Pac 100カラム(ドイツ・イトシュタイン、Dionex)を使用する強アニオン交換(SAX)HPLCにより精製した。緩衝液Aは10mM NaClO4、1mM EDTA、10mMトリス(pH 7.4)、6M尿素および20%アセトニトリルからなっていた。緩衝液Bは緩衝液A中に500mM NaClO4を有していた。流量4.5mL/分を使用した。260および280nmでのUVトレースを記録した。55分以内の20%B〜45%Bの勾配を使用した。適切な画分をプールし、3M NaOAc(pH=5.2)および70%エタノールで析出させた。
【０１４８】
粗Nu547標識オリゴマーを、AKTA Explorerシステム(GE Healthcare)上でXTerra Prep MS C8 10x50mmカラム(ドイツ・エシュボルン、Waters)を使用するRP HPLCにより精製した。緩衝液Aは100mM酢酸トリエチルアンモニウム(オランダ・ファルケンスワールト、Biosolve)であり、緩衝液Bは緩衝液A中に50%アセトニトリルを含有していた。流量5mL/分を使用した。260、280および547nm(Nu547標識オリゴリボヌクレオチドの場合)でのUVトレースを記録した。58個のカラム体積(CV)以内の5%B〜60%Bの勾配を使用した。適切な画分をプールし、3M NaOAc(pH=5.2)および70%エタノールで析出させた。
【０１４９】
最後に、精製オリゴマーを、Sephadex G-25(GE Healthcare)を含むカラム上でのサイズ排除クロマトグラフィーにより脱塩した。溶液の濃度を、UV光度計(ドイツ・クレーフェルト、Beckman Coulter)中、260nmでの吸光度測定により決定した。アニーリングまで、個々の鎖を-20℃で凍結溶液として貯蔵した。
【０１５０】
小分子RNA結合体の調製
マレイミド官能基を備えた小分子を、チオエーテル結合を通じた共有結合により、RNAと結合体化させた。この化学反応を可能にするために、5'-ジスルフィドリンカーを含有するRNA約60mgを、TCEP(水中0.5M、Sigma Aldrichから得た)1mLを使用して水(5mL)中で対応するチオールに還元した。分析用アニオン交換HPLCが反応の完了を示した時点で(室温で約2時間)、RNAをエタノール/3M NaOAc(pH 5.4)32:1(v/v)30mLによって-20℃で終夜析出させた。ペレットを遠心分離により収集し、引き続く小分子の結合体化に使用した。
【０１５１】
典型的な結合体化反応において、RNA 10mgをリン酸ナトリウム緩衝液(0.1M、pH 7.0)2mLに溶解させた。この溶液にACN/NMP 1:1(v/v)中小分子(0.12mM)を5分かけて加えた。RP LC-ESI MSが入力RNAの消費を示した時点で、混合物を水(約10mL)で希釈し、エタノール/3M NaOAc(pH 5.4)32:1(v/v)約40mLを-20℃で終夜加えて、結合体化されたRNAを析出させた。ペレットを遠心分離により収集し、水に溶解させ、必要であれば上記に示す手順に従ってアニオン交換HPLCで精製した。結合体が十分に純粋である場合、反応混合物をサイズ排除カラム(Sephadex G-25、GE Healthcare)を通じて濾過した。
【０１５２】
siRNAを生成させるためのオリゴリボヌクレオチドのアニーリング
等モルのRNA溶液を組み合わせることで相補鎖をアニールした。混合物を凍結乾燥させ、適切な量のアニーリング緩衝液(100mM NaCl、20mMリン酸ナトリウム、pH 6.8)で再構成することで所望の濃度を実現した。この溶液を95℃の水浴に入れ、3時間以内に室温に冷却した。表3: siRNA配列情報；小文字: 2'-OMeヌクレオチド；s: ホスホロチオエート結合；dT: デオキシチミジン；(C6SSC6): C-6ジスルフィドリンカー；(Cy5): シアニン5色素。
【０１５３】
sLFA-1/ICAM-1 ELISA相互作用およびMac-1/ICAM-1相互作用に対する標的化分子の効果を評価するために以下のアッセイを行った。
【０１５４】
二価カチオン緩衝液(1mM MnCI2、0.14M NaCl、20mM HEPES pH 7.2)中2.0ug/mlのsLFA-1またはMac-1受容体溶液50μl/ウェルによって、プレートを4℃で終夜コーティングした。各ウェルにブロッキング緩衝液(二価カチオン緩衝液中1% BSA)250μlを加え、37℃で1時間置いた。プレートを洗浄緩衝液(TBS/0.05% Tween-20/1mM MnCl2)で3回洗浄した。試験化合物をDMSOに可溶化した。一連の1:3希釈を行って濃度範囲0.45nM〜3uMとした。結合緩衝液(二価カチオン緩衝液中0.5% BSA)/1% DMSO 50μlおよび試験溶液50μlを適切なウェルに加え、1時間インキュベートした。5dICAM-Fc(27ng/ml)50μlを適切なウェルに加え、結合緩衝液50μlを非特異的結合ウェルに加え、2時間インキュベートし、洗浄した。1:4000 HRP-ヤギ抗huIgG 100μlを各ウェルに加え、1時間インキュベートし、洗浄した。1:1 TMB溶液100μlを各ウェルに加え、室温で20分間発色させた。H3PO4 100μlを各ウェルに加えることで発色を停止させた。吸光度を450nmで測定した。これらの結果を以下の表4および表5に示す。
【０１５５】
対照化合物(142および143)のIC50はそれぞれ約37nMおよび11nMであると決定された。おそらく、細胞のLFA-1受容体は対照化合物に結合または会合した。
2015508055.tif 000115
【０１５６】
標的化送達のための、FITCフルオロフォアおよびsiRNAに共有結合により連結されたインテグリンアンタゴニストの小分子誘導体の細胞透過性および局在の証拠
手順
成長培地(10% FBSを有するRPMI 1640)中で、AML MV4-11細胞を二本鎖-27(500nM)と共に37℃で1時間インキュベートした。VLA-4非依存性結合を決定するために、VLA-4依存性結合をブロッキングする1つの条件に140(10μM)を含めた。インキュベーション後、細胞をD-PBSで2回洗浄し、1%パラホルムアルデヒド中で10分間固定した。ImageStreamx(シアトル、Aminis Corporation)を使用するイメージングフローサイトメトリーによってsiRNAの取り込みを分析した。結果を表Aおよび図1〜4に示す。
【０１５７】
（表Ａ）
2015508055.tif 000116
【０１５８】
細胞系におけるAHA1 mRNAをノックダウンするための、5'-センス鎖を修飾したsiRNAのアッセイ
材料および方法
2015508055.tif 000117
【０１５９】
リバーストランスフェクション: DharmaFect-1トランスフェクション試薬を0.15μl/ウェルで使用して、明記されたsiRNAを最終濃度50nMでH1299細胞にトランスフェクションした。次に、細胞を96ウェルプレートに5000細胞/ウェルでプレーティングし、37℃で48時間インキュベートした。
【０１６０】
siRNAによるノックダウンの有効性を、ベンダーが報告した通りに分岐DNAアッセイによって測定した。そのようなノックダウンの結果を図5に示す。相対的な細胞生存率を、同一ウェルにおけるGAPDHの絶対発現量によって評価した(図6)。
【０１６１】
反対の記述がない限り、実施例中のすべての化合物は上記のように調製し、特徴づけた。本明細書において引用されるすべての特許および刊行物は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【図１ａ−１】
2015508055.tif 000139
【図１ａ−２】
2015508055.tif 000140
【図１ｂ】
2015508055.tif 000141
【図１ｃ−１】
2015508055.tif 000142
【図１ｃ−２】
2015508055.tif 000143
【図１ｄ−１】
2015508055.tif 000144
【図１ｄ−２】
2015508055.tif 000145
【図１ｄ−３】
2015508055.tif 000146
【図１ｄ−４】
2015508055.tif 000147
【図１ｄ−５】
2015508055.tif 000148
【図１ｅ−１】
2015508055.tif 000149
【図１ｅ−２】
2015508055.tif 000150
【図１ｅ−３】
2015508055.tif 000151
【図１ｅ−４】
2015508055.tif 000152
【図１ｆ】
2015508055.tif 000153
【図２】
2015508055.tif 000154
【図３】
2015508055.tif 000155
【図４】
2015508055.tif 000156
【図５】
2015508055.tif 000157
【図６】
2015508055.tif 000158
【配列表】
2015508055000001.app
【国際調査報告】
2015508055.tif 000159
2015508055.tif 000160
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