(57)【要約】 【課題】  結核予防のために経口投与される医薬品を製造するための不活化マイコバクテリアの使用。【解決手段】  マルチ服用療法を用いて、かつ、各投与間の間隔を短縮して不活化マイコバクテリアを経口投与することにより、結核菌による感染に対する耐性構築を誘発させる。不活化マイコバクテリアの経口投与耐性構築療法は、潜伏状態から活動性結核症への感染の進行を制御するために使用できる。【選択図】  図１
2015523351.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結核予防用医薬品を製造するための不活化マイコバクテリアの使用であって、
(a)不活化マイコバクテリアを定期的に経口投与する；
(b)投与間隔は５日以下である；及び
(c)与薬される投与回数は５回以上である、
ことを特徴とする不活化マイコバクテリアの使用。
【請求項２】
不活化マイコバクテリアは、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium bovis、Mycobacterium africanum、Mycobacterium microti、Mycobacterium bovis BCG、
Mycobacterium fortuitum及びMycobacterium kansasiiからなる群から選択される、
ことを特徴とする請求項１に記載の不活化マイコバクテリアの使用。
【請求項３】
不活化マイコバクテリアは、Mycobacterium tuberculosis、Mycobacterium bovis、Mycobacterium bovis BCG、Mycobacterium fortuitum及びMycobacterium kansasiiからなる群から選択される、
ことを特徴とする請求項２に記載の不活化マイコバクテリアの使用。
【請求項４】
マイコバクテリアは加熱プロセスにより不活化される、
ことを特徴とする請求項１−３の何れかに記載の不活化マイコバクテリアの使用。
【請求項５】
投与間隔が３日以下である、
ことを特徴とする請求項１−４の何れかに記載の不活化マイコバクテリアの使用。
【請求項６】
投与間隔が２日以下である、
ことを特徴とする請求項５に記載の不活化マイコバクテリアの使用。
【請求項７】
与薬される投与回数が７回以上である、
ことを特徴とする請求項１−６の何れかに記載の不活化マイコバクテリアの使用。
【請求項８】
与薬される投与回数が９回以上である、
ことを特徴とする請求項７に記載の不活化マイコバクテリアの使用。
【請求項９】
各投与は１０３から１０９個の不活化マイコバクテリアからなる、
ことを特徴とする請求項１−８の何れかに記載の不活化マイコバクテリアの使用。
【請求項１０】
マイコバクテリアは、不活化マイコバクテリアと、少なくとも１種類の薬剤的に使用可能な賦形剤とからなる医薬組成物の剤形で投与される、
ことを特徴とする請求項１−９の何れかに記載の不活化マイコバクテリアの使用。
【請求項１１】
医薬組成物の剤形はカプセル剤である、
ことを特徴とする請求項１０に記載の不活化マイコバクテリアの使用。
【請求項１２】
医薬組成物の剤形は錠剤である、
ことを特徴とする請求項１０に記載の不活化マイコバクテリアの使用。
【請求項１３】
不活化マイコバクテリアは、結核菌に感染しているが、その感染が潜伏状態である個体に投与される、
ことを特徴とする請求項１−１２の何れかに記載の不活化マイコバクテリアの使用。
【請求項１４】
個体は以前に活動性結核症を発症したことがある、
ことを特徴とする請求項１３に記載の不活化マイコバクテリアの使用。
【請求項１５】
不活化マイコバクテリアは、結核菌に感染していない個体に投与される、
ことを特徴とする請求項１−１２の何れかに記載の不活化マイコバクテリアの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核を予防するために経口投与される医薬品に関し、特に、結核の潜伏感染（無症状感染）が活動感染（有症状感染）に転化することを制御するための医薬品に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核は、マイコバクテリウム・ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)（結核菌）複合体(MTB-C)群に属するバクテリアにより引き起こされる慢性感染症である。現在、MTB-C群には桿菌マイコバクテリウム・ツベルクローシス(bacilli M. tuberculosis)(結核菌)、マイコバクテリウム・マイクロシ(M. microti)及びマイコバクテリウム・アフリカヌム(M. africanum)などが含まれる。これらのうち、結核菌(bacilli M. tuberculosis)が最も重要であり、また、ヒトの結核に関する最も普遍的作用菌である。この疾患は基本的に肺臓に発症するが、或る場合には、その他の臓器にも蔓延する。適切に治療しない場合、結核は致命的である。
【０００３】
２０１１年度世界保健機関(WHO)レポートによれば、世界中で毎年９００万人が新たに結核を発症し、そして、約１７０万人が結核により死亡している。また、世界中で約２５億人超の感染者が存在し、かつ、約１億人の新たな感染者が毎年発生していると思われる。
【０００４】
結核は空気により伝染する。肺に結核空洞を有する患者は結核の主要な伝染源である。これらの事実は例えば、非特許文献１及び非特許文献２に記載されている。
【０００５】
非特許文献１及び非特許文献２に記載されているように、患者は咳又はくしゃみにより、結核菌を移動拡散させることができる大量の微少液滴を排出する。患者から排出された結核菌含有微少液滴はヒトにより吸入され、ヒトの胚胞腔に侵入することができる。
【０００６】
吸入後、結核菌は肺胞マクロファージにより食菌され、この細胞内部で結核菌は細胞破壊を起こす程度にまで成長できる。結核菌は新たなマクロファージにより細胞外空間内で再び食菌され、そして、一旦、結核菌が排出され、肺門リンパ節内で感染が発生すれば、細胞免疫に基づく免疫反応が生じるまでこのプロセスが繰り返される。
【０００７】
感染後約６週間で結核菌の成長は止まり、宿主（ホスト）は、遅延型過敏症(DTH)応答により特徴付けられる皮膚ツベルクリンテストで陽性を示す。また、感染時に所謂、乾酪壊死(caseous necrosis)が生じている。
【０００８】
結核感染の主要な特徴の一つは、結核菌が、結核症を発症すること無く、“潜伏”結核症の形で、しかし、活動性結核症を発症させる能力を維持したまま、長年に渡り宿主組織内に留まることができることである。
【０００９】
感染の潜伏状態は、初期の肺胞性障害及び周囲の肺組織で生じる所謂乾酪壊死の発症に関連し、増殖する結核菌を含有するマクロファージの破壊を生じ、固形状壊死病斑(solid necrotic lesion))を起こす。
【００１０】
この壊死性反応の起源は正確には知られていないが、DTH型の反応に関連している。本質的に、桿菌群数を制御できる免疫応答はTh1 CD4により導かれる細胞型免疫応答である。すなわち、DTH型応答を生じることができ、かつ、感染マクロファージを同定し、そして、マクロファージ内の桿菌を死滅させるために当該感染マクロファージを活性化させることができる。
【００１１】
感染マクロファージのうち約１０％において、前記固形状壊死病斑は軟化する。これは、結核感染における最も重要なエピソードのうちの一つである。なぜなら、感染が進行すると、これはその後、活動性結核症、すなわち、肺結核疾患を発症するからである。
【００１２】
大抵の場合、この軟化は、気管支樹に向かう軟化組織の排出、結核性空洞の形成及び気管支の開放により酸素が取り込まれることによる桿菌の爆発的細胞外成長を伴う。咳をすると、桿菌でいっぱいの軟化カゼインが気管支の他の部位、肺及び体外に拡散される。
【００１３】
結核の薬理学的治療の特徴は治療が長期間に及ぶことであり、治療アドヒアランスを複雑化させるばかりか、同時に、薬物耐性細菌の攻撃も助長する。
【００１４】
結核を阻止する最良の戦略は予防的アプローチに基づくものと思料されている。
【００１５】
結核に対する予防処置で使用されている非経口的に投与される現在のワクチンは、BCG(bacilllus Calmette-Guerin)と呼ばれる細菌株（M. bovisの弱毒変異株）に基づいている。しかし、その効力は時間の経過につれて低下し、そして、成人の結核の予防には無効であることが判明している。実際、これは致死的結核疾患（粟粒結核症又は結核性髄膜炎）の発生の極僅かなニッチしか保護しないものと考えられている。
【００１６】
その他の弱毒化マイコバクテリアの生菌株又は細菌サブユニットに基本的に基づくその他の結核の予防処置も開発されている。
【００１７】
更に、弱毒化マイコバクテリア（すなわち、インターフェロン−γ生成Th1）に基づくワクチンにより得られる免疫応答に類似する免疫応答を得る目的に関する従来技術において、不活化マイコバクテリアに基づく結核の予防処置も研究された。
【００１８】
従って、例えば、非特許文献３には、結核に対する保護を生じさせる目的のために、加熱により不活化された結核菌を皮内に５回投与することからなる臨床研究結果が報告されている。
【００１９】
更に、非特許文献４には、加熱により不活化された結核菌１０００μｇを各回毎に２週間の間隔で３回皮下注射したワクチン化マウスによる実験研究が報告されており、この研究によれば、特異的Ｔ細胞系免疫の獲得が示された。
【００２０】
その他の不活化マイコバクテリアについても通常の非経口的投与による結核に対する保護の獲得についてテストした。
【００２１】
例えば、非特許文献５には、生菌のＭ．ｗマイコバクテリア又は加熱により不活化されたＭ．ｗマイコバクテリアを投与することからなる研究結果が報告されている。加熱により不活化されたＭ．ｗマイコバクテリアは１回量で皮下注射され、そして、インターフェロン生成Ｔｈ１細胞の誘発に基づく免疫応答が観察された。
【００２２】
経口投与による効果的な予防処置が特に望ましい。なぜなら、経口投与は薬物の投与及び治療アドヒアランスをかなり容易にするからである。
【００２３】
この意味で、通常の化学療法剤と併用される投与計画（レジメン）に従って活動性結核症の治療効果を達成するために、マイコバクテリア(マイコバクテリウム・バッカエ, Mycobacterium vaccae)の加熱不活化細菌を経口投与することに関する従来技術文献が存在する。
【００２４】
実験レベルにおいて、非特許文献６には、加熱により不活化されたマイコバクテリウム・バッカエ０．１μｇを各投与毎に２８日間の間隔でマウスに５回経口投与することからなるアッセイの結果が報告されている。このアッセイによれば、最初の投与後２３時間で気管内に結核菌(M. Tuberculosis)の感染が誘発された。この研究において、細胞免疫応答が発生され、Ｔｈ１細胞分泌が増大し、一方、Ｔｈ２型細胞及びTGF-β成長因子の低下により例証されるように、体液性免疫が低下した。
【００２５】
一般的に、従来技術は、Ｔｈ１誘発と、これに続くインターフェロン-γ生成は望ましいが、Ｔｈ２応答とこれに続くＩＬ−４生成又はＴｈ３応答（調節性Ｔ細胞(Treg）生成を伴う）は活動性結核誘発効果を有することを示唆している。
【００２６】
この事実は非特許文献７に記載されている。この文献によれば、調節性Ｔ細胞(Treg）の生成は、乾酪性病斑(caseous lesion)を無菌化し、実験的結核症のマウスモデルにおける潜伏感染を防止するＣＤ４Ｔ細胞の能力を無効化させる。非特許文献７は、Treg応答のためにTh1応答とTreg応答との間の不均衡を可能にする規制緩和は活動性結核誘発の原因であり得ることを示唆している。
【００２７】
従来文献に記載されている内容から見て、活動性結核の発生を防止し、更に、疾患の病理学的状態の事後的発症を防止するために、非感染のヒト又は個体（予防効果）及び結核菌に感染しているヒト又は個体（この場合、感染は潜伏状態である）（治療効果）の両方において経口投与可能な有効的結核治療法の提供の必要性は続いている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２８】
【非特許文献１】J. Grosset, "Studies in short-course chemotherapy for tuberculosis. Basis for short-course chemotherapy", Chest, 1981, 80, 719-720
【非特許文献２】J. Grosset, "Mycrobacterium tuberculosis in the Extracellular Compartment: an Underestimated Adversary", Antimicro. Agent Chemother., 2003, 47, 833-836
【非特許文献３】Opie et al., "Protective inoculation against human tuberculosis with heat-killed tubercle bacilli", Am. J. Hyg., 1939, 29, 155-164
【非特許文献４】Agger et al., "Specific acquired resistance in mice immunized with killed mycobacteria", Scand. J. Immunol., 2002, 56, 443-447
【非特許文献５】Gupta et al., "Immunogenicity and orotective efficacy of "Mycobactrium w" against Mycobacterium tuberculosis in mice Immunized with live versus heat-killed M. w by the aerosol or parenteral route", Infect. Immun., 2009, 77(1), 223-231
【非特許文献６】Hernandez-Pando et al., "Orally administered Mycobacterium vaccae modulates expression of immunoregulatory molecules in BALB/c mice with pulmonary tuberculosis", Clin. Vaccine Immunol., 2008, 15(11), 1730-1736
【非特許文献７】Kursar et al., "Cutting Edge: Regulatory T Cell Prevent Efficient Clearance of Mycobacterium tuberculosis", J. Immunol., 2007, 178, 2661-2665
【非特許文献８】George et al., "Suppression of early atherosclerosis in LDL-receptor deficient mice by oral tolerance with h2-glycoprotein I", Cardiovasc. Res., 2004, 62, 603-609
【非特許文献９】Haras et al., "Oral Tolerance With Heat Shock Protein 65 Attenuates Mycobaterium Tuberculosis-Induced and High-Fat-Diet-Driven Atherosclerotic Lesions",  J. Am. Coll. Cardiol., 2002, 40, 1333-1338
【非特許文献１０】Stanford et al., "Mycobacteria and their world", Int. J. Mycobacteriol., 2012, 3-12
【非特許文献１１】Harper et al., "Mouse model of necrotic tuberculosis granulomas deverop hypoxic lesions", J. Infect. Dis., 2012, 205, 595-601
【非特許文献１２】Sissons et al., "Multigenic control of tuberculosis resistance: analysis of QTL on mouse chromosome 7 and its synergism with sstl", Genes Immun., 2009, 10, 37-46
【非特許文献１３】Faria et al., "Oral tolerance", Immunol. Rev., 2005, 206(1), 232-259
【非特許文献１４】Hori et al., "Conrol of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3", Science, 2003, 299(5609), 1057-61
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
本発明の目的は、結核予防のために経口投与される医薬品を製造するための不活化マイコバクテリアの使用である。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
結核予防のために経口投与される医薬品を製造するための不活化マイコバクテリアの使用であって、当該使用は、
(a)不活化マイコバクテリアを定期的に経口投与する；
(b)投与間隔は５日以下である；及び
(c)与薬される投与回数は５回以上である、
ことを特徴とする。
【００３１】
別法として、結核を予防するために使用される不活化マイコバクテリアとして処方することができ、当該処方は、
(a)不活化マイコバクテリアを定期的に経口投与する；
(b)投与間隔は５日以下である；及び
(c)与薬される投与回数は５回以上である、
ことを特徴とする。
【００３２】
本発明者は結核に対する新規な予防治療法を発明した。この予防治療法は、各投与間の時間間隔が短縮されたマルチ服用療法を使用する不活化マイコバクテリアの投与に基づく。
【００３３】
本発明者は、結核菌による感染前（予防効果）又は感染後（治療効果）に投与される前記予防処置は、潜伏状態から活動性結核への感染の進行を制御することにより活動性結核の発症を防止できることを発見した。
【００３４】
前記処置によれば、好ましくは低投与量で、かつ、各投与間の短い時間間隔で、死滅桿菌の周期的投与を行うと耐性構築(tolerance-building)又は耐性構築応答が誘発される。この耐性構築は結核菌による感染を制御する。すなわち、潜伏感染の活動性感染への転化を制御することについて劇的な効果を有する。
【００３５】
実際、本発明者は、結核菌により感染前及び感染後の双方に投与することからなる前記処置は、調節性Ｔ細胞(Treg）の割合の増大により特徴付けられる耐性構築応答の誘発を確認した。
【００３６】
本発明の使用は、非感染のヒト及び結核菌に感染したヒト（この場合、感染は潜伏状態である）に焦点を合わせる。非感染のヒトの場合、予防処置は予防効果を有すると思料され、結核菌に感染しているヒトの場合は治療効果を有すると思料される。
【００３７】
この第２のケース、すなわち、治療効果による予防処置（「結核菌に感染しているが、感染は潜伏状態であるヒト」と呼ぶ）の特別なアスペクトは、以前に活動性結核を発症したが、例えば、常用の抗結核治療により当該疾患がその後緩解した（すなわち、結核が潜伏感染状態に立ち返った）ようなヒトからなる。この予防処置の特別なケースは、治療的抗再発効果(therapeutic anti-relapse effect)を有するものと思料される。
【００３８】
従って、抗結核薬による予防処置の場合、ヒトは通常、抗結核薬による薬理学的処置を事前に受ける。これらの抗結核薬は当業者に周知である。一次抗結核薬は例えば、イソニアジド(isoniazid)、エタンブトール(ethanbutol)、ピラジナミド(pyrazinamide)、リファンピシン(rifampicin)及びストレプトマイシン(streptomycin)などである。耐性が発生した場合に投与される二次的抗結核薬は例えば、チオアミド類(thioamides)（特に、プロチオンアミド(prothionamide)及びエチオンアミド(ethionamide)）、アミノグリコシド類(aminoglycosides)（特に、アミカシン(amikachin)及びカナマイシン(kanamycin)）、シクロセリン(cycloserine)、リファブチン(rifabutin)、リファペンチン(rifapentine)、フルオロキノロン類(fluoroquinolons)（特に、モキシフロキサシン(moxifloxacin)、レボフロキサシン(levofloxacin)及びオフロキサシ(ofloxacin）、PAS、クラリスロマイシン(clarithromycin)、クロファジミド(clofazimide)、リネゾリド(linezolid)又はチオリダジン(thioridazine)若しくはこれらの混合物類などである。
【００３９】
「予防処置」とは一般的に、ヒトを疾患(病気)から保護することができる処置を意味する。
【００４０】
この意味において、本発明のコンテキスト(文脈)における「予防処置」とは、潜伏感染から活動性感染への転化を制御することにより活動性結核の発症を防止することができる処置のことである。
【００４１】
「耐性構築」とは一般的に、生物学的薬剤又は化学的薬剤による耐性の意図的誘発を意味する。また、「耐性」とは、生物学的薬剤又は化学的薬剤に対して特異的な低反応の状態を意味する。
【００４２】
従って、本発明のコンテキスト(文脈)において、「耐性構築応答の誘発」とは、特異抗原に対する応答の欠如状態を宿主(ホスト)の免疫系内に誘発させ、失調（病気）の減衰を生じさせる方法を意味する。
【００４３】
耐性構築療法は例えば、アテローム性動脈硬化症などのような他の疾患に関連して非特許文献８に記載されている。非特許文献８には、経口耐性の誘発及び早期アテローム性動脈硬化症の抑制のためのβ２−グリコプロテイン(glycoprotein)の使用が記載されている。また、非特許文献９には、動脈硬化病変に対する経口耐性を誘発するための熱ショックタンパク質６５の使用が記載されている。
【００４４】
不活化マイコバクテリア
マイコバクテリア属(genus of the mycobacteria)はマイコバクテリウム科(family of Mycobacteriaceae)に属し、好気性桿菌により生成される。
【００４５】
マイコバクテリア属に属する全ての桿菌は本発明の目的の一部である。これらの菌種は例えば、M. abscessus, M. africanum, M. asiaticum, M. aurum, M. avium, M. avium paratuberculosis, M. avium silvaticum, M. avium hominissuis, M. bovis, M. bovis BCG, M. chelonae, M. fortuitum, M. gastri, M. goodi, M. gordonae, M. immunogenum, M. haemophilum, M. habana, M. kansaii, M. lentiflavum, M. leprae, M. lepromatosis, M. lufu, M. mageritense, M. malmoense, M. marinum, M. massiliense, M. microti, M. manacense, M. mucogenicum, M. neoaurum, M. peregrinum, M. phlei, M. scrofulaceum, M. smegmatis, M. terrae, M. triviale, M. tuberculosis, M. microti, M. ulcerans, M. vaccae 及びM. xenopiなどである。
【００４６】
マイコバクテリアは結核菌(M. tuberculosis)と同様に多くの抗原を有する。従って、本発明の使用にとって好適である。非特許文献１０には、マイコバクテリアにおける異なる抗原群の分類及びその分布方法とマイコバクテリア科の異なる種の共有方法が記載されている。                                     
【００４７】
本発明の一部を為す不活化マイコバクテリアは好ましくは、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)複合体(MTB-C)，マイコバクテリウム・フォーチュイタム(Mycobacterium fortuitum)及びカンサシ菌(Mycobacterium kansasii)と呼ばれる群のマイコバクテリアである。換言すれば、不活化マイコバクテリアは、M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M. bovis BCG, M. fortuitum及びM. kansasiiからなる群から選択することが好ましい。不活化マイコバクテリアは、M. tuberculosis, M. bovis, M. bovis BCG, M. fortuitum及びM. kansasiiからなる群から選択することが一層好ましい。
【００４８】
不活化マイコバクテリア（別名、死滅マイコバクテリア）は、生菌のマイコバクテリアを複製不可能な形に転化させるための物理的又は化学的処理を施すことにより得られたマイコバクテリアである。
【００４９】
本発明において、マイコバクテリアを不活化させる好適な方法は例えば、ホルムアルデヒドによる処理、放射線処理又は加熱処理などである。
【００５０】
本発明の不活化マイコバクテリア対象物は、加熱処理により不活化されていることが好ましい。
【００５１】
加熱処理によりマイコバクテリアを不活化させる好適な方法は例えば、Middlebrook 7H10又は7H11寒天、Sauton培地又はProskauer-Beck培地などのような当業者に周知の適当な培養培地中でマイコバクテリア菌株を培養することからなる。培養は、１ｍｌ当たり約１ｘ１０５から１ｘ１０９コロニー生成単位(CFUs)の範囲内の濃度が得られるまで維持することが好ましい。
【００５２】
次いで、培地を加熱することにより不活化させる。培地は７０℃から９０℃の範囲内の温度で加熱することが好ましい。加熱時間は３０分間から３時間の範囲内であることが好ましい。更に、オートクレーブを使用することにより、培地を１２１℃で２０分間加熱することが好ましい。
【００５３】
結核の予防
「結核の予防」という表現は、潜伏状態から活動性結核へ感染が進行することを制御することにより活動性結核の症状発現を防止することを意味する。
【００５４】
前記防止は非感染のヒトにおいて実施することができるし、また、結核菌に感染しているが感染が未だ潜伏状態にあるヒトにおいても実施することができる。なぜなら、疾患（病気）は未だ発現していないか又は活動性疾患が既に発現しているが例えば、抗結核薬による処置により活動性疾患が緩解しているからである。
【００５５】
本発明らは、潜伏感染の進行を阻止する結核に対する予防処置を発明した。本発明によれば、固形状壊死病斑が液状病斑に進行することが阻止され、従って、活動性結核の症状発現が阻止される。
【００５６】
本発明らは、C3HeB/FeJマウスの使用に基づく実験モデルを使用した。この実験モデルでは、ヒトにおける発症に相当する結核菌に感染した後の肺病理学をシミュレーションできる。
【００５７】
壊死病斑が発症しないその他の動物モデルで生じるものと異なり、結核菌への感染に応答して液状化することができる壊死病斑の生成がC3HeB/FeJマウスで観察された。このC3HeB/FeJマウスモデルは非特許文献１１に記載されている。
【００５８】
高投与量で経静脈的に感染させた場合、前記動物におけるネクローシス（壊死）の成長及び病斑の成長は、感染後約４週間で１００％の死亡率を生じさせることができる。これらのことは非特許文献１２に記載されている。
【００５９】
理論に拘る訳ではないが、本発明者は次のように考えている。すなわち、本発明の処置目的の予防効果は、死滅桿菌を好ましくは低投与量で高頻度で経口投与することが、対象物（ヒト）において耐性を誘発し、好ましくは調節性Ｔ細胞(Tregs)が誘発される応答を生じることができる療法（レジメン）だからである。前記細胞は形質転換成長因子ベータ(TGF-beta)に関連する。すなわち、基本的にＴｈ１免疫応答がトリガーされる常用のワクチン系と異なり、耐性構築又はＴｈ３免疫応答が最初に発生する。
【００６０】
本発明者は驚くべきことに、耐性の誘発は結核菌による感染の進行、すなわち、潜伏感染の活動性感染への転化を阻止するのに効果的であることを発見した。
【００６１】
耐性構築応答をトリガーするためには、不活化マイコバクテリアを繰り返し投与しなければならない。しかも、各投与間の間隔は短くなければならない。すなわち、不活化マイコバクテリアを５日以下の時間間隔で複数回投与しなければならない。投与間隔は３日以下であることが好ましい。投与間隔は２日以下であることが一層好ましい。
【００６２】
耐性構築処置はまた、不活化マイコバクテリアの繰り返し投与を必要とする。投与回数は５回以上である。好ましい投与回数は７回以上である。一層好ましい投与回数は９回以上である。更に一層好ましい投与回数は１４回以上である。
【００６３】
本発明の使用において、不活化マイコバクテリアは免疫学的に有効な量で投与される。
【００６４】
公知のように、使用される投与量は、不活化マイコバクテリアが投与されるヒト（又は個体）の年齢及び体重に応じて変化する。
【００６５】
好適な投与量は一般的に、不活化マイコバクテリアが１０３から１０９個の範囲内、好ましくは、１０３から１０９個の範囲内、一層好ましくは、１０４から１０８個の範囲内である。
【００６６】
本発明の一部である耐性構築投与療法の乾酪性病斑の液状化に対する予防治療効果を例証するために、前記のモデルで使用されたC3HeB/FeJマウスに対して次のプロトコルを実施した。すなわち、不活化マイコバクテリアを５回から１４回、各回の投与間隔を１日から３日間の範囲内として、経口投与した。
【００６７】
使用したネズミモデルは次の何れのケースにおいても予防結核療法をシミュレートする。すなわち、(1)下記の実施例１及び３−６に記載されるように感染前に不活化マイコバクテリアを投与するケース、又は(2)下記の実施例1、２及び４−６に記載されるように結核菌感染後に不活化マイコバクテリアの投与を開始するケースである。ケース(2)の場合、早期の段階（マウスに既に病斑が発生しているが、前記病斑は未だ液状化状態までには進行しておらず、その後、疾患の徴候を示す場合は感染後１５日以内に）で治療薬が投与される。又は、別法として、(3)実施例７に記載されるようなケースもある。このケース(3)では、マウスが病斑を発症し、かつ、病斑が液状化しているが、前記病斑は潜伏感染の微少病斑特徴の生成に戻っているような場合、感染後に不活化マイコバクテリアが投与される。
【００６８】
実施例で得られた結果に基づいて次のように結論される。すなわち、感染前及び結核菌による感染後の双方における経口投与耐性構築療法はマウスの生存率を高める。その理由は、疾患（病気）の誘発、すなわち潜伏感染の活動性感染への転化が遅延されるからである。
【００６９】
従って、本発明による不活化マイコバクテリアの使用は結核を予防するのに好適であると思料される。
【００７０】
組成物
本発明の目的によれば、不活化マイコバクテリアは経口投与される。
【００７１】
前記マイコバクテリアは当業者に周知なように、経口投与するのに好適な医薬組成物の剤形で投与することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、懸濁剤、分散剤、散剤、顆粒剤又は噴霧剤などの剤形が経口投与に好適である。
【００７２】
マイコバクテリアはカプセル剤又は錠剤で投与することが好ましい。
【００７３】
本発明の医薬組成物は一般的に、不活化マイコバクテリアと、少なくとも１個の薬剤的に使用可能な賦形剤とからなる。
【００７４】
前記組成物は、医薬製剤技術マニュアルに記載されているような当業者に周知の常用方法により製造される。このような医薬製剤技術マニュアルは例えば、Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, Lippincott, Willams & Wilkins, Philadelphia, 2000[ISBN: 0-683-306472]などである。
【００７５】
本発明の医薬組成物に配合することができる薬剤的に使用可能な賦形剤は例えば、(1)固結防止剤（例えば、コロイダルシリカ、第三リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、ケイ酸マグネシウム又はタルク等）、
(2)希釈剤（例えば、無水ラクトース、ラクトース一水和物、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム無水物、リン酸水素カルシウム二水和物、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、結晶セルロース、セルロース粉末、酢酸ルロース、デキストラン、デキストリン、デキストロース、フルクトース、グリセリルパルミトステアレート、カオリン、ラクチロール、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マルチトール、マルトデキストリン、マルトース、ポリメタクリレート、α化デンプン、塩化ナトリウム、デンプン、蔗糖など）、
(3)滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、グリセリンパルミトステアレート、ポロキサマ、酸化マグネシウム、安息香酸ナトリウム、コロイドシリカ、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリルフマル酸ナトリウム、ステアリン酸、タルク又はベヘン酸グリセリル等）、
(4)懸濁化剤（沈殿防止剤）（例えば、キサンタンガム、グアガム、アルギン酸、ベントナイト、カルボマー、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ヒドロキシプロピル、結晶セルロース、セルロース粉末、コロイド状無水二酸化ケイ素、デキストリン、ゼラチン、カオリン、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、マルチトール、ポリビニルピロリドン、ソルビタンエステル又はトラガントなど）、
(5)結合剤（例えば、三ケイ酸マグネシウム、セルロース、デンプン、デキストリン、デキストロース、ポリデキストロース、マルトース、マルトデキストリン、エチルセルロース、メチルセルロース、ポリメチルアクリレート、タルク、ポリビニルピロリドン、ステアリン酸又は蔗糖など）、
(6)脱凝集剤（例えば、低置換ヒドロキシプロピルセルロース、第三リン酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、クロスポリビニルピロリドン又はマチルセルロースなど）、(7)塗工剤（例えば、キトサン、フタル酸ジブチル、セバシン酸ジブチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジメチル、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒプロメロース、マルトデキストリン、ポリメタクリレート、ポリビニルアセテートフタレート(PVAP)又はクエン酸トリエチルなど）、
(8)分散剤（例えば、ポロキサマ又はソルビタンエステルなど）、
(9)甘味剤（例えば、アスパルテーム、マンニトール、ソルビトール、サッカリンナトリウム、サイクラミン酸ナトリウム、蔗糖、デキストロース、グルコース、イヌリン、イソマルトース、ラクチトール、マルトース、マルトール、スクラロース、トレハロース、キシリトール又はタウマチンなど）、
(10)矯味矯臭剤及び
(11)調味料などである。
これらは単独でも使用できるし、あるいは適宜組み合わせて併用することもできる。 
【００７６】
賦形剤のより完全なリスト及びその物理化学的特性並びに市販されている商品の商品名はR.C. Rowe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipient, 4th edition, Pharmaceutical Press, London, 2003 [ISBN: 0-85369-472-9]などの文献に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１はｘ軸上に示される生存期間（日数）と、ｙ軸上に示されるマウスの生存率を示す。対照群は実線で示され、グループ１は破線で示されている。グループ１は、感染前に結核菌(Mycobacteriumu tuberculosis)の不活化マイコバクテリアの経口投与処置を受けている。前記不活化マイコバクテリアの投与は感染前の１０日目から開始され、各４８時間毎に５回行われた。グループ１、２、３及び４はグループ１ａ、１ｂ、１ｃ及び１ｄのマウスにそれぞれ対応し、これらのマウスには、１：１、１：１０、１：１００及び１：１０００の希釈度に応じた異なる量の不活化マイコバクテリアが投与された。（実施例１）
【図２】図２はｘ軸上に示される生存期間（日数）と、ｙ軸上に示されるマウスの生存率を示す。この図では、対照群（実線）はグループ２（破線）と比較されている。グループ２のマウスは、感染後に結核菌の不活化マイコバクテリアの経口投与処置を受けている。前記不活化マイコバクテリアの投与は感染後の１１日目から開始され、各４８時間毎に５回行われた。グループ５、６、７及び８はグループ２ａ、２ｂ、２ｃ及び２ｄのマウスにそれぞれ対応し、これらのマウスには、１：１、１：１０、１：１００及び１：１０００の希釈度に応じた異なる量の不活化マイコバクテリアが投与された。（実施例１）
【図３】図３はｘ軸上に示される生存期間（日数）と、ｙ軸上に示されるマウスの生存率を示す。この図では、対照群（実線）はグループ１（破線）と比較されている。グループ１のマウスは感染後にM. bovis BCGの不活化マイコバクテリアによる経口投与処置を受けている。（実施例２）
【図４】図４はｘ軸上に示される生存期間（日数）と、ｙ軸上に示されるマウスの生存率を示す。この図では、対照群（実線）はグループ１（破線）と比較されている。グループ１のマウスは感染前にM. bovis BCGの不活化マイコバクテリアによる経口投与処置を受けている。（実施例３）
【図５】図５はｘ軸上に示される生存期間（日数）と、ｙ軸上に示されるマウスの生存率を示す。グラフ１では、対照群（実線）はグループ１（破線）と比較されている。グループ１のマウスは感染前に開始された結核菌の不活化マイコバクテリアによる経口投与処置を受けている。グラフ２では、対照群（実線）はグループ２（破線）と比較されている。グループ２のマウスは感染後に開始された結核菌の不活化マイコバクテリアによる経口投与処置を受けている。（実施例４）
【図６】図６は、感染後の第３週目（グラフ１）及び第４週目（グラフ２）における、結核菌の不活化マイコバクテリアによる処置群と対照群のそれぞれの、CD4+T細胞の総数に対する、CD4+CD25+Foxp3+表現型を有する調節性Ｔ細胞の割合を示す。前記調節性Ｔ細胞の割合はｙ軸上に示されている。異なるグループのマウスはｘ軸上に示されている。図中の四角形印は非処置マウス（対象群）を示し、三角形印は感染前に処置されたグループ１のマウスを示し、円形印は感染後に処置されたグループ２のマウスをそれぞれ示す。実線の水平線は各グループの算術平均値を示す。（実施例４）
【図７】図７はｘ軸上に示される生存期間（日数）と、ｙ軸上に示されるマウスの生存率を示す。グラフ１では、対照群（実線）はグループ１（破線）と比較されている。グループ１のマウスは感染前に開始されたカンサシ菌(M. kansasii)の不活化マイコバクテリアによる経口投与処置を受けている（予防効果）。グラフ２では、対照群（実線）はグループ２（破線）と比較されている。グループ２のマウスは感染後に開始されたカンサシ菌の不活化マイコバクテリアによる経口投与処置を受けている（治療効果）。（実施例５）
【図８】図８は、ｘ軸上に示される生存期間（日数）と、ｙ軸上に示されるマウスの生存率を示す。グラフ１では、対照群（実線）はグループ１（破線）と比較されている。グループ１のマウスは感染前に開始されたフォーチュイタム菌(M. fortuitum)の不活化マイコバクテリアによる経口投与処置を受けている（予防効果）。グラフ２では、対照群（実線）はグループ２（破線）と比較されている。グループ２のマウスは感染後に開始されたフォーチュイタム菌の不活化マイコバクテリアによる経口投与処置を受けている（治療効果）。（実施例６）
【図９】図９は、ｘ軸上に示される生存期間（日数）と、ｙ軸上に示されるマウスの生存率を示す。マウスは感染され、その後、抗結核薬RIMSTARによる治療を受けていた。RIMSTARによる治療後、グループ１は引き続き、フォーチュイタム菌の不活化マイコバクテリアによる経口投与耐性構築処置を受けている（抗再発効果）。対照群(実線）はグループ１（破線、耐性構築処置を受けたグループ）と比較されている。RIMSTARによる治療期間（黒色矩形部分）と、引き続く耐性構築処置期間（白抜き矩形部分）はｘ軸上に示されている。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
以下、本発明の実施の形態について、実施例により詳述する。
【実施例１】
【００７９】
感染前又は感染後に結核菌の不活化菌を投与することによる経口耐性構築治療（予防効果又は治療効果）
Institut German Traias i PujolのUnitat de Tuberculosi Experimental菌寄託機関から入手した結核菌(M. tuberculosis)の臨床株(TOL-3)をProskauer Beck液体培地中で指数関数増殖 が起こり、１ｍｌ当たり１．７ｘ１０７コロニー形成単位(CFUs)濃度に達するまで培養し、得られた培養物を用いて不活化マイコバクテリアを作成した。
【００８０】
培養物を７５℃で２時間加熱して不活化させ、続いて、−８０℃で冷凍した。その後、１０％蔗糖溶液で５０：５０に希釈し、容量０．５ｍｌのバイアル中に充填し、凍結乾燥させた。その後、これらのバイアルを希釈水３ｍｌで元に戻した。希釈倍率は１：１であり、４．２５ｘ１０６CFUsに相当する。
【００８１】
アッセイにおいて、生成物０．３ｍｌを、生成物：希釈液が１：１、１：１０、１：１００及び１：１０００の比率で投与した。これらの投与は、４．２５ｘ１０５CFUs、４．２５ｘ１０４CFUs、４．２５ｘ１０３CFUs及び４．２５ｘ１０２CFUsの各投与量に対応する。
【００８２】
特異的病原体を有しない６−８週齢の雌マウスを使用し、これらの不活化マイコバクテリアの有効性をテストした。
【００８３】
これらのマウスを、各６匹毎の３群に分け、各群のマウスに対して下記の耐性構築プロトコルを実施した。
1)対照群：非処置
2)グループ１（感染前処置群）：ゾンデにより経口的に不活化マイコバクテリア含有生成物を強制摂取させた。感染前１０日目から投与を開始し、各４８時間毎に投与し、不活化マイコバクテリア含有生成物５回投与した。各投与毎に、容量０．３ｍｌを投与した。全体で４種類の希釈度、すなわち、１：１、１：１０、１：１００及び１：１０００（それぞれグループ１ａ、１ｂ、１ｃ及び１ｄに対応する）の希釈度をテストした。
3）グループ２（感染後処置群）：ゾンデにより経口的に不活化マイコバクテリア含有生成物を強制摂取させた。感染後１１日目から投与を開始し、各４８時間毎に投与し、不活化マイコバクテリア含有生成物５回投与した。各投与毎に、容量０．３ｍｌを投与した。全体で４種類の希釈度、すなわち、１：１、１：１０、１：１００及び１：１０００（それぞれグループ２ａ、２ｂ、２ｃ及び２ｄに対応する）の希釈度をテストした。
【００８４】
結核菌の毒性株(H37Rv Pasteur) を中期対数期になるまでProskauer-Beck培地中で培養し、使用するまで−７０℃の温度で１ｍｌ毎のアリコートで保存した。その後、これを感染源として使用した。
【００８５】
約２ｘ１０４の生菌を接種源として静脈内に投与することによりマウスを感染させた。
【００８６】
下記の表１に示す方法に従って、マウスが屠殺を必要する状態になるまで毎日、マウスの状態を観察し、そして体重を測定した。
【００８７】
表１
マウスの観察  スコア
体重 
正常（体重減少無し。マウスは正常通りに成長する）                 ０
体重減少＜１０％                                                 １
体重減少１０−１５％（糞便の外観及び量に有り得べき変化）         ２
体重減少＞１５％（マウスは水を飲まないか又は餌を食べない）       ３
外観
正常                                                             ０
外皮が劣化した状態                                               １
外皮が劣化した状態又は目或いは鼻分泌物の存在                     ２
異常な姿勢                                                       ３
苦痛の徴候の観察 
徴候無し（自傷行為又は異音が観察されない）                       ０
自傷行為又は異音が観察される                                     ３
刺激に対する反応
正常（攻撃又は昏睡状態の何れも無し）                             ０
非常に攻撃的又は昏睡状態                                         ３
脚注：
スコア０−２：正常
スコア３    ：管理プロトコルの適用頻度を２回／日まで増大する。
２個以上のコンセプトでスコア３が得られた場合、全てのスコア３はスコア４になる。
１個以上のスコアが４の値に達した場合、マウスを屠殺する。
【００８８】
得られた結果を図１及び図２に示す。図１及び図２から明らかなように、異なる実験群について感染後のマウスの生存率が上昇する。日数で示された生存期間はｘ軸に、一方、生存率はｙ軸にそれぞれ示されている。
【００８９】
図１において、対照群（実線）は感染前に処置されたグループ１（破線）のマウスと比較されている。グラフ１、２、３及び４はグループ１ａ、１ｂ、１ｃ及び１ｄにそれぞれ対応している。すなわち、異なる量の生成物を１：１、１：１０、１：１００及び１：１０００の希釈度に従って投与した。
【００９０】
図２において、対照群（実線）は感染後に処置されたグループ２（破線）のマウスと比較されている。グラフ５、６、７及び８はグループ２ａ、２ｂ、２ｃ及び２ｄにそれぞれ対応している。すなわち、異なる量の生成物を１：１、１：１０、１：１００及び１：１０００の希釈度に従って投与した。
【００９１】
マウスの生存性に対する処置の効果を評価するために、生存曲線を２種類の方法により比較した。一つの方法は、Mantel-Cox検定(又は対数順位検定、LRt)であり、もう一つの方法はGehan-Breslow-Wilcoxon検定(CBWt)である。最初の方法ではリスク（死亡数／単位時間）は実験全体を通じて一定であるが、第２の方法では最初の数日中の死亡数（早期死亡数）を一層考慮する。リスクが一定である場合、Mantel-Cox検定は一層高い検出力を有するが、そうでない場合又は他方よりもリスクが高いグループが存在する場合、Gehan-Breslow-Wilcoxon検定の方が一層好適である。
【００９２】
対照群に関して、全てのケースにおいて統計的有意差(p<0.05、CBWt)が認められた。また、グラフ４、５、６及び７に対応する処置におけるLRtについて統計学的有意性(p<0.05)も存在する。
【００９３】
図示された結果は、最低希釈度（１：１０００、図１、グラフ４）で感染前療法を使用した場合の保護的応答を反映している。これに対して、希釈度１：１、１：１０及び１：１００（それぞれ、図２のグラフ５、６及び７に対応する）で、感染後療法による保護効果が認められた。これらのうち、１：１０希釈療法が特に重要である。
【００９４】
対照群に対する剖検は、２６日目から３０日目の間の非常に急速な進行を示した。この期間中に、病斑のサイズが増大し、そして、最後には収束し、内部がクリーム状の粘稠性を有するネクローシス（壊死）の大きな病斑を形成した。
【００９５】
従って、次のように結論することができる。すなわち、結核菌の感染前（予防効果）及び結核菌の感染後（治療効果）の双方について、耐性構築療法による経口投与は、潜伏感染の活動性感染への転化を遅延させることによりマウスの生存性を増大させる。従って、本発明により不活化マイコバクテリアを使用することは結核症に対する予防処置として好適であると思料される。
【実施例２】
【００９６】
感染後にM. bovis BCGの不活化菌を投与することによる経口耐性構築治療（治療効果）
この実施例で使用した治療薬はM. bovis BCG(SSI)の市販菌株から作成した。この菌株をProskauer Beck液体培地中で指数関数増殖 が起こり、１ｍｌ当たり１．０３ｘ１０８コロニー形成単位(CFUs)濃度に達するまで培養した。得られた培養物を実施例１に述べた方法と同じ方法を用いて不活化させた。
【００９７】
特異的病原体を有しない６−８週齢のC3HeB/FeJ雌マウスを使用し、これらの不活化マイコバクテリアの有効性をテストした。各投与において、１：１０希釈度に対応する容量０．３ｍｌ（２．５７５ｘ１０５CFUsに相当)を投与した。
【００９８】
これらのマウスを、各１２匹毎の２群に分け、各群のマウスに対して下記の耐性構築プロトコルを実施した。
1)対照群：非処置
2)グループ１（感染後処置群）：ゾンデにより経口的に不活化マイコバクテリア含有生成物を強制摂取させた。感染後１２日目から投与を開始し、各４８時間毎に投与し、不活化マイコバクテリア含有生成物５回投与した。引き続き、各マウスの生存時間に応じて、実験の終了まで１週間に３回（月曜日、水曜日及び金曜日）投与した。
【００９９】
結核菌の毒性株(H37Rv Pasteur) を中期対数期になるまでProskauer-Beck培地中で培養し、使用するまで−７０℃の温度で１ｍｌ毎のアリコートで保存した。その後、これを感染源として使用した。
【０１００】
約２ｘ１０４の生菌を接種源として静脈内に投与することによりマウスを感染させた。
【０１０１】
上記実施例１の表１に記載した方法と同じ方法に従って、マウスが屠殺を必要する状態になるまで毎日、マウスの状態を観察し、そして体重を測定した。
【０１０２】
得られた結果を図３に示す。日数で示された生存期間はｘ軸に、一方、生存率はｙ軸にそれぞれ示されている。
【０１０３】
対照群（実線）は処置されたグループ１（破線）よりも低い生存率を有することが認められた。有意差(対数準位検定, Log-rank test, p=0.0147;  Gehan-Breslow-Wilcoxon test, p=0.0052)が認められた。
【０１０４】
これらの結果は、感染マウスの連続的処置後の保護応答を反映している。従って、次のように結論することができる。すなわち、結核菌により感染された後に、不活化M. bovis BCGの耐性構築療法による経口投与は、疾患（結核症）の誘発を遅延させることによりマウスの生存率を高める。従って、本発明により不活化マイコバクテリアを使用することは、潜伏感染の活動性感染への転化を遅延させることにより結核に対する予防処置として好適であると思料される。
【実施例３】
【０１０５】
感染前にM. bovis BCGの不活化菌を投与することによる経口耐性構築治療（予防効果）
M. bovis BCGの不活化菌を実施例２に述べた方法と同じ方法で作成した。
【０１０６】
不活化マイコバクテリアの効力を特異的病原体を有しない６−８週齢のC3HeB/FeJ雌マウスでテストした。
【０１０７】
これらのマウスを、各１２匹毎の２群に分け、各群のマウスに対して下記の処置を施した。
1)対照群：非処置
2)グループ１（感染前処置群）：ゾンデにより経口的に不活化マイコバクテリア含有生成物を１３回強制摂取させた。感染前２９日目から投与を開始し、１週間に３回（月曜日、水曜日及び金曜日）投与した。各投与において、１：１０００希釈度に対応する容量０．３ｍｌ（２．５７５ｘ１０３CFUsに相当)を投与した。
【０１０８】
前記実施例と同様に、結核菌の毒性株(H37Rv Pasteur) を中期対数期になるまでProskauer-Beck培地中で培養し、使用するまで−７０℃の温度で１ｍｌ毎のアリコートで保存した。その後、これを感染源として使用した。
【０１０９】
約２ｘ１０４の生菌を接種源として静脈内に投与することによりマウスを感染させた。
【０１１０】
上記実施例１の表１に記載した方法と同じ方法に従って、マウスが屠殺を必要する状態になるまで毎日、マウスの状態を観察し、そして体重を測定した。
【０１１１】
得られた結果を図４に示す。日数で示された生存期間はｘ軸に、一方、生存率はｙ軸にそれぞれ示されている。
【０１１２】
対照群（実線）は処置されたグループ１（破線）よりも低い生存率を有することが認められた。対数準位検定(Log-rank test)による有意差はp=0.0020であり、  Gehan-Breslow-Wilcoxon testによる有意差はp=0.0019であった。
【０１１３】
これらの結果は、結核菌による感染前に不活化マイコバクテリアM. bovis BCGを経口投与することによる耐性誘発後の保護応答の存在を示している。従って、前記処置は高い確率で疾患(結核)の誘発を阻止することが認められる。
【実施例４】
【０１１４】
感染前又は感染後に結核菌の不活化菌を投与することによる経口耐性構築処置の有効性（予防効果又は治療効果）及び脾臓中の調節性T細胞 の分析による被誘発耐性のモニタリング
結核菌(TOL-3)の不活化菌を実施例１に述べた方法と同じ方法で作成した。
【０１１５】
不活化マイコバクテリアの効力を特異的病原体を有しない６−８週齢のC3HeB/FeJ雌マウスでテストした。
【０１１６】
これらのマウスを、各２４匹毎の３群に分け、各群のマウスに対して下記の処置を施した。
1)対照群：非処置
2)グループ１（感染前処置）：ゾンデにより経口的に不活化マイコバクテリア含有生成物を５回強制摂取させた。感染前１０日目から投与を開始し、各４８時間毎に投与し、続いて、実験が終わるまで１週間に３回（月曜日、水曜日及び金曜日）投与した。各投与において、１：１０００希釈度の溶液を０．３ｍｌ投与した。
3）グループ２（感染後処置群）：ゾンデにより経口的に不活化マイコバクテリア含有生成物を５回強制摂取させた。感染後１１日目から投与を開始し、各４８時間毎に投与し、続いて、実験が終わるまで１週間に３回（月曜日、水曜日及び金曜日）投与した。各投与において、１：１０希釈度の溶液を０．３ｍｌ投与した。
【０１１７】
前記実施例と同様に、結核菌の毒性株(H37Rv Pasteur) を中期対数期になるまでProskauer-Beck培地中で培養し、使用するまで−７０℃の温度で１ｍｌ毎のアリコートで保存した。その後、これを感染源として使用した。
【０１１８】
約１ｘ１０５の生菌を接種源として静脈内に投与することによりマウスを感染させた。
【０１１９】
各グループのマウスのうち半数のマウス（１２匹）を生存性研究用に割り当てた。実施例１の表１に記載した方法と同じ方法に従って、マウスが屠殺を必要する状態になるまで毎日、マウスの状態を観察し、そして体重を測定した。
【０１２０】
図５において、グラフ１及び２は異なる実験グループの生存結果を示す。日数で示された生存期間はｘ軸に、一方、マウスの生存率はｙ軸にそれぞれ示されている。
【０１２１】
グラフ１において、対照群（実線）は、感染前に開始された処置を受けたグループ１（破線）と比較されている。対照群は処置されたグループよりも低い生存率を有することが認められた。対数準位検定(Log-rank test)による有意差はp=0.0011であり、  Gehan-Breslow-Wilcoxon testによる有意差はp=0.0014であった。
【０１２２】
グラフ２において、対照群（実線）は、感染後に開始された処置を受けたグループ２（破線）と比較されている。対照群は処置されたグループよりも低い生存率を有することが認められた。対数準位検定(Log-rank test)による有意差はp=0.04541であるが、  Gehan-Breslow-Wilcoxon testでは統計学的有意差は認められなかった。
【０１２３】
双方のケースにおいて、次のような結論が得られる。すなわち、不活化マイコバクテリアによる耐性構築療法の処置を受けたマウスは、処置を受けなかったマウスよりも、結核菌感染後、長期間にわたって生存することができる。
【０１２４】
各グループの残りのマウス（１２匹）に関して、脾臓細胞間に存在する調節性T細胞を研究するために、半数のマウス（各グループ６匹）は第３週目に屠殺し、他の半数のマウス（各グループ６匹）は第４週目に屠殺した。
【０１２５】
非特許文献１３に記載されているように、調節性T細胞は経口耐性の誘発における鍵となるべきＴ細胞群であり、免疫応答の調節に関係される個数として定義される。調節性T細胞はCD4及びCD25膜マーカーを発現する。
【０１２６】
非特許文献１４には、転写因子Foxp3は調節性T細胞発生の鍵であると記載されている。このため、CD4+CD25+Foxp3+表現型を有するＴ細胞は調節機能を有すると思料される。
【０１２７】
イソフルラン麻酔薬を吸入させた後、頚椎脱臼によりマウスを屠殺した。脾臓を摘出し、機械的離解、細胞ストレイナー（ＢＤファルコン細胞濾過ストレイナー、ナイロン製、４０μｍ）及び赤血球溶解により脾臓細胞を収集した。CD4及びCD25膜脾臓細胞及び細胞間Foxp3は調節性Ｔ細胞標識キット(eBioscience社製）により標識を付け、フローサイトメトリー（流動細胞計測法）(BD LSR-Fortessa細胞分析計)により分析した。測定結果はBD FACSdiva分析ソフトウエアにより処理した。
【０１２８】
図６は、感染後第３週目（グラフ１）及び第４週目（グラフ２）における異なる処置グループと対象群の、CD4＋Ｔ細胞の総数に対する調節性Ｔ細胞（すなわち、CD4+CD25+Foxp3+表現型を有するＴ細胞）の割合を示す。調節性Ｔ細胞の割合はｙ軸に示される。異なる処置タイプ及び対象群はｘ軸に示される。
【０１２９】
図中の四角形印は非処置マウス（対象群）を示し、三角形印は感染前に処置されたグループ１のマウスを示し、円形印は感染後に処置されたグループ２のマウスをそれぞれ示す。実線の水平線は各グループの算術平均値を示す。
【０１３０】
実際、結核菌による感染前又は感染後に処置が開始されたか否かに拘わらず、耐性構築療法により処置されたグループ内のマウスにのみ、第３週目と第４週目の間に調節性Ｔ細胞の割合が増大することが認められた。
【実施例５】
【０１３１】
感染前又は感染後にカンサシ菌(M. kansasii)の不活化菌を投与することによる経口耐性構築処置（予防効果又は治療効果）
カンサシ菌(Mycobacteriumu kansasii)は晩生（遅生育）の非結核性抗酸菌である。Institut German Traias i PujolのUnitat de Tuberculosi Experimental菌寄託機関から入手したカンサシ菌の臨床株(TOL)をProskauer Beck液体培地中で指数関数増殖 が起こり、１ｍｌ当たり８．０７ｘ１０４コロニー形成単位(CFUs)濃度に達するまで培養し、得られた培養物を用いて不活化マイコバクテリアを作成した。
【０１３２】
培養物を１２１℃で２０分間オートクレーブ処理して不活化させ、続いて、−８０℃で冷凍した。その後、１０％蔗糖溶液で５０：５０に希釈し、容量２ｍｌのバイアル中に充填し、−８０℃で保存した。
【０１３３】
特異的病原体を有しない６−８週齢のC3HeB/FeJ雌のマウスを使用し、これらの不活化マイコバクテリアの有効性をテストした。
【０１３４】
各投与において、１：１０希釈度の溶液を０．３ｍｌ（２．４２ｘ１０４CFUsに相当)投与した。
【０１３５】
これらのマウスを、各１２匹毎の３群に分け、各群のマウスに対して下記の耐性構築プロトコルを実施した。
1)対照群：非処置
2)グループ１（感染前処置）：ゾンデにより経口的に不活化マイコバクテリア含有生成物を１３回強制摂取させた。１週間に３回（月曜日、水曜日及び金曜日）投与した。このグループは最後の投与後、２４時間目に感染させた。
3)グループ２（感染後処置群）：感染後、１５日目から、ゾンデにより経口的に不活化マイコバクテリア含有生成物を１３回強制摂取させた。１週間に３回（月曜日、水曜日及び金曜日）投与した。
【０１３６】
結核菌の毒性株(H37Rv Pasteur) を中期対数期になるまでProskauer-Beck培地中で培養し、使用するまで−７０℃の温度で１ｍｌ毎のアリコートで保存した。その後、これを感染源として使用した。
【０１３７】
約２ｘ１０４の生菌を接種源として静脈内に投与することによりマウスを感染させた。
【０１３８】
実施例１の表１に記載した方法と同じ方法に従って、マウスが屠殺を必要する状態になるまで毎日、マウスの状態を観察し、そして体重を測定した。
【０１３９】
図７のグラフ１及びグラフ２は異なるグループの生存結果を示す。日数で示された生存期間はｘ軸に、一方、マウスの生存率はｙ軸にそれぞれ示されている。
【０１４０】
グラフ１は予防処置を示すグラフであり、非処置の対照群と、感染前から開始された処置を受けたグループ１とを比較している。対照群（実線）はグループ１（破線）よりも低い生存率を有することが認められた。また、有意差も認められた。対数準位検定(Log-rank test)による有意差はp<0.0001であり、Gehan-Breslow-Wilcoxon testによる有意差はp<0.0001であった。
【０１４１】
グラフ２は治療処置を示すグラフであり、非処置の対照群と、感染後から開始された処置を受けたグループ２とを比較している。対照群（実線）はグループ２（破線）よりも低い生存率を有することが認められた。また、有意差も認められた。対数準位検定(Log-rank test)による有意差はp<0.0001であり、Gehan-Breslow-Wilcoxon testによる有意差はp<0.0001であった。
【０１４２】
双方のケースとも、これらの結果は保護応答を反映している。従って、次のように結論することができる。すなわち、結核菌により感染される前又は感染された後に、晩生（遅生育）非結核性不活化マイコバクテリア（カンサシ菌）の耐性構築療法による経口投与は、疾患（結核症）の誘発を遅延させることによりマウスの生存率を高める。従って、本発明により不活化マイコバクテリアを使用することは、潜伏感染の活動性感染への転化を遅延させるので、結核症に対する予防処置として好適であると思料される。
【実施例６】
【０１４３】
感染前又は感染後にマイコバクテリウム・フォーチュイタム(M. fortuitum)の不活化菌を投与することによる経口耐性構築処置（予防効果又は治療効果）
マイコバクテリウム・フォーチュイタムは速生育非結核性抗酸菌である。Institut German Traias i PujolのUnitat de Tuberculosi Experimental菌寄託機関から入手したフォーチュイタム菌の環境株(environmental strain)(マンレサ(Manresa)株)をMiddlebrook 7H9固体培地中で、１ｍｌ当たり２ｘ１０９コロニー形成単位(CFUs)濃度に達するまで培養し、得られた培養物を用いて不活化マイコバクテリアを作成した。
【０１４４】
培養物を１２１℃で２０分間オートクレーブ処理して不活化させ、続いて、−８０℃で冷凍した。その後、１０％滅菌蔗糖溶液で５０：５０に希釈し、容量２ｍｌのバイアル中に充填し、−８０℃で保存した。
【０１４５】
特異的病原体を有しない６−８週齢のC3HeB/FeJ雌のマウスを使用し、これらの不活化マイコバクテリアの有効性をテストした。
【０１４６】
各投与において、１：１０００希釈度の溶液を０．３ｍｌ（６ｘ１０５CFUsに相当)投与した。
【０１４７】
これらのマウスを、各１２匹毎の３群に分け、各群のマウスに対して下記の耐性構築プロトコルを実施した。
1)対照群：非処置
2)グループ１（感染前処置）：ゾンデにより経口的に不活化マイコバクテリア含有生成物を１０回強制摂取させた。１週間に５回（月曜日から金曜日）投与した。このグループは最後の投与後、２４時間目に感染させた。
3)グループ２（感染後処置群）：感染後、５日目から処置を開始し、ゾンデにより経口的に不活化マイコバクテリア含有生成物を１０回強制摂取させた。１週間に５回（月曜日から金曜日）投与した。
【０１４８】
結核菌の毒性株(H37Rv Pasteur) を中期対数期になるまでProskauer-Beck培地中で培養し、使用するまで−７０℃の温度で１ｍｌ毎のアリコートで保存した。その後、これを感染源として使用した。
【０１４９】
約２ｘ１０５の生菌を接種源として静脈内に投与することによりマウスを感染させた。
【０１５０】
実施例１の表１に記載した方法と同じ方法に従って、マウスが屠殺を必要する状態になるまで毎日、マウスの状態を観察し、そして体重を測定した。
【０１５１】
図８のグラフ１及びグラフ２は異なるグループの生存結果を示す。日数で示された生存期間はｘ軸に、一方、マウスの生存率はｙ軸にそれぞれ示されている。
【０１５２】
予防処置に関して得られた結果はグラフ１に示されている。対照群（実線）はグループ１（破線）よりも低い生存率を有することが認められた。また、有意差も認められた。対数準位検定(Log-rank test)による有意差はp<0.0001であり、Gehan-Breslow-Wilcoxon testによる有意差はp<0.0001であった。
【０１５３】
治療処置に関して得られた結果はグラフ２に示されている。対照群（実線）はグループ２（破線）よりも低い生存率を有することが認められた。また、有意差も認められた。対数準位検定(Log-rank test)による有意差はp<0.0001であり、Gehan-Breslow-Wilcoxon testによる有意差はp<0.0001であった。
【０１５４】
双方のケースとも、これらの結果は保護応答を反映している。従って、次のように結論することができる。すなわち、結核菌により感染される前又は感染された後に、速生育非結核性抗酸菌不活化マイコバクテリア(M. fortuitum)の耐性構築療法による経口投与は、疾患（結核症）の誘発を遅延させることによりマウスの生存率を高める。従って、本発明により不活化マイコバクテリアを使用することは、潜伏感染の活動性感染への転化を遅延させるので、結核症に対する予防処置として好適であると思料される。
【実施例７】
【０１５５】
実験的活動性結核症の処置後にマイコバクテリウム・フォーチュイタム(M. fortuitum)の不活化菌を投与することによる経口耐性構築処置（再発に対する効果）
マイコバクテリウム・フォーチュイタム(マンレサ株)の不活化菌を実施例６に述べた方法と同じ方法で生成した。
【０１５６】
特異的病原体を有しない６−８週齢のC3HeB/FeJ雌マウスを使用し、これらの不活化マイコバクテリアの有効性をテストした。
【０１５７】
各投与において、１：１００希釈度の溶液を０．３ｍｌ（６ｘ１０６CFUsに相当)投与した。
【０１５８】
このケースでは、本発明による予防的耐性構築処置の効果を抗再発効果に関して研究した。すなわち、マウスが活動性結核症を発症した後で、かつ、当該マウスが抗結核薬で治療された後の再発防止効果について研究した。
【０１５９】
従って、実験の開始時点で、約２ｘ１０５の生菌を接種源として静脈内に投与することによりマウスを感染させた。
【０１６０】
前記実施例と同様に、結核菌の毒性株(H37Rv Pasteur) を中期対数期になるまでProskauer-Beck培地中で培養し、使用するまで−７０℃の温度で１ｍｌ毎のアリコートで保存した。その後、これを感染源として使用した。
【０１６１】
実施例１の表１に記載した方法と同じ方法に従って、マウスが屠殺を必要する状態になるまで毎日、マウスの状態を観察し、そして体重を測定した。
【０１６２】
２１日目の時点で、商品名RIMSTARと呼ばれる市販製剤に含まれる抗生物質混合物（イソニアジド、エタンブトール、ピラジナミド及びリファンピシン）を用いて治療を開始した。製剤の投与量はマウスの体重に合わせて調整した。１週間に５日間投与した。
【０１６３】
これらのマウスを、各１２匹毎の２群に分け、各群のマウスに対して下記の耐性構築プロトコルを実施した。
1)対照群：耐性構築処置無し
2)グループ１：ゾンデを用いて経口的に不活化マイコバクテリア含有生成物を１４回強制摂取させることにより処置した。１週間に７回（月曜日から日曜日）投与した。RIMSTARによる活動性結核症の治療終了後（６３日目）、７２時間目に前記耐性構築処置を開始し、７６日目に最後の投与を行った。
【０１６４】
再発に対する処置に関して得られた結果を図９に示す。日数で示された生存期間はｘ軸に、一方、マウスの生存率はｙ軸にそれぞれ示されている。また、時相ｘ軸(temporal x-axis)上に、RIMSTARによる治療期間が黒色の矩形で、更に、グループ１の耐性構築処置期間が白抜きの矩形で示されている。
【０１６５】
対照群（実線）は処置されたグループ１（破線）よりも生存期間が短いことが認められる。
【０１６６】
これらの結果は保護応答を反映している。従って、次のように結論することができる。すなわち、不活化マイコバクテリアの経口投与耐性構築療法は、活動性結核症の治療を受けた後の結核症再発を防止する。
【０１６７】
以上の説明は、本発明の一実施例に関するもので、この技術分野の当業者であれば、本発明の種々の変形例を考え得るが、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。特許請求の範囲の構成要素の後に記載した括弧内の番号は、図面の部品番号に対応し、発明の容易なる理解の為に付したものであり、発明を限定的に解釈するために用いてはならない。また、同一番号でも明細書と特許請求の範囲の部品名は必ずしも同一ではない。これは上記した理由による。用語「又は」に関して、例えば「Ａ又はＢ」は、「Ａのみ」、「Ｂのみ」ならず、「ＡとＢの両方」を選択することも含む。特に記載のない限り、装置又は手段の数は、単数か複数かを問わない。
【図１】
2015523351.tif 000003
【図２】
2015523351.tif 000004
【図３】
2015523351.tif 000005
【図４】
2015523351.tif 000006
【図５】
2015523351.tif 000007
【図６】
2015523351.tif 000008
【図７】
2015523351.tif 000009
【図８】
2015523351.tif 000010
【図９】
2015523351.tif 000011
【国際調査報告】
2015523351.tif 000012
2015523351.tif 000013
2015523351.tif 000014
2015523351.tif 000015