(57)【要約】一部の態様において、本開示はＤＮＡ配列の標的化された変更のための組成物およびその組成物を用いて標的ＤＮＡ配列を変更する方法を提供する。一部の態様において、そのような組成物はインビボまたはインビトロにおける細胞内での標的とされるＤＮＡ配列の相同性に方向付けられる修復、変更、または置き換えのための核酸配列鋳型を含むＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒを含み、ここでそのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは細菌の複製起点および抗生物質選択遺伝子の両方を欠いており、ここでそのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは約２，５００塩基対までの大きさを有する。【選択図】図１
2015523860.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下：
インビボまたはインビトロにおける細胞内での標的とされるＤＮＡ配列の相同性に方向付けられる修復、変更、または置き換えのための核酸配列鋳型を含むＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ、ここで該ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは細菌の複製起点および抗生物質選択遺伝子の両方を欠いており、かつここで該ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは約２，５００塩基対までの大きさを有する；
を含む、標的化されたＤＮＡ配列の変更のための組成物。
【請求項２】
標的とされるＤＮＡ配列の相同性に方向付けられる修復、変更、または置き換えのための核酸配列鋳型が以下：
変更されるべき標的とされるＤＮＡ配列の付近の核酸配列に相補的な該鋳型の少なくとも１つの部分；および
変更されるべき標的とされるＤＮＡ配列に相補的ではない該鋳型の少なくとも１つの部分；
を含み、該核酸鋳型の非相補的部分が該標的とされるＤＮＡ配列中で所望される変更を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
変更されるべき標的とされるＤＮＡ配列が細胞内のゲノム、ミトコンドリア、またはプラスチドＤＮＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
さらに少なくとも１種類の部位特異的ヌクレアーゼを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
部位特異的ヌクレアーゼがＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒの核酸配列鋳型の一部によりコードされる、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
部位特異的ヌクレアーゼが別々のＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ、プラスミド、メッセンジャーＲＮＡ、もしくはウイルスによりコードされているか、またはタンパク質として送達される、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
部位特異的ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文状の反復）／ＣＡＳ（ＣＲＩＳＰＲ会合）系からなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
部位特異的ヌクレアーゼが標的ＤＮＡ配列中の１以上の一本鎖破断を誘導する、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
部位特異的ヌクレアーゼが標的ＤＮＡ配列中の１以上の二本鎖破断を誘導する、請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
相同性に方向付けられる修復、変更、または置き換えがｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系が含まれるがそれに限定されないトランスポザーゼまたはリコンビナーゼにより媒介される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒがさらに化学的部分、修飾オリゴヌクレオチド、および／または修飾主鎖を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
細胞が哺乳類細胞、原核細胞、真核細胞、古細菌、または植物細胞である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の組成物を含む細胞。
【請求項１４】
細胞が哺乳類細胞、原核細胞、真核細胞、古細菌、または植物細胞である、請求項１３に記載の細胞。
【請求項１５】
請求項１に記載の組成物を含むキット。
【請求項１６】
請求項４に記載の組成物を含むキット。
【請求項１７】
以下の工程：
ａ）核酸配列鋳型を含むＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒのトランスフェクション、ここで該核酸配列鋳型は、標的ＤＮＡ配列付近の核酸配列に相補的な少なくとも１つの部分；および該標的ＤＮＡ配列に相補的ではない少なくとも１つの部分を含み、ここで該核酸鋳型の非相補的部分は所望される変更を含有する；
ｂ）該核酸配列鋳型の相補的領域の、該非相補的部分を除いた標的ＤＮＡ配列付近の核酸配列との塩基対合；ならびに
ｃ）該所望の変更の該標的ＤＮＡ配列中への配列特異的様式での組み込み；
を含む、細胞中の標的ＤＮＡ配列を変更する方法であって、該ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒが細菌の複製起点および抗生物質選択遺伝子の両方を欠いており、かつ該ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒが約２，５００塩基対までの大きさを有する、前記方法。
【請求項１８】
方法がさらに少なくとも１種類の部位特異的ヌクレアーゼを提供することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
部位特異的ヌクレアーゼがＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒの核酸鋳型の一部によりコードされる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
部位特異的ヌクレアーゼの提供が部位特異的ヌクレアーゼをコードする別個のＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ、プラスミド、メッセンジャーＲＮＡ、もしくはウイルス、またはタンパク質を同時トランスフェクションすることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
部位特異的ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文状の反復）／ＣＡＳ（ＣＲＩＳＰＲ会合）系からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
部位特異的ヌクレアーゼが標的ＤＮＡ配列中の１以上の一本鎖破断を誘導する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
部位特異的ヌクレアーゼが標的ＤＮＡ配列中の１以上の二本鎖破断を誘導する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
標的ＤＮＡの変更がｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系が含まれるがそれに限定されないトランスポザーゼまたはリコンビナーゼにより媒介される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２５】
ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒがさらに化学的部分、修飾オリゴヌクレオチド、および／または修飾主鎖を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２６】
それを必要とする対象において標的ＤＮＡ配列の変更が所望される遺伝性障害または他の病気を処置する方法であって、以下の工程：
ａ）対象への療法上有効量の核酸配列鋳型を含むＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒの投与、ここで該核酸配列鋳型は、標的ＤＮＡ配列付近の核酸配列に相補的な少なくとも１つの部分；および該標的ＤＮＡに相補的ではない少なくとも１つの部分を含み、ここで該核酸鋳型の非相補的部分は所望される変更を含有する；
ｂ）該核酸配列鋳型の相補的領域の、該非相補的部分を除いた標的ＤＮＡ配列付近の核酸配列との塩基対合；ならびに
ｃ）該所望の変更の該標的ＤＮＡ配列中への配列特異的様式での組み込み；
を含み、該ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒが細菌の複製起点および抗生物質選択遺伝子の両方を欠いており、かつ該ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒが約２，５００塩基対までの大きさを有する、前記方法。
【請求項２７】
さらに少なくとも１種類の部位特異的ヌクレアーゼを同時投与することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
部位特異的ヌクレアーゼがＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒの核酸鋳型の一部によりコードされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
同時投与が部位特異的ヌクレアーゼをコードする別個のＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ、プラスミド、メッセンジャーＲＮＡ、もしくはウイルス、またはタンパク質を提供することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
部位特異的ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文状の反復）／ＣＡＳ（ＣＲＩＳＰＲ会合）系からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
部位特異的ヌクレアーゼが標的ＤＮＡ配列中の１以上の一本鎖破断を誘導する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
部位特異的ヌクレアーゼが標的ＤＮＡ配列中の１以上の二本鎖破断を誘導する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
標的ＤＮＡの変更がｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系が含まれるがそれに限定されないトランスポザーゼまたはリコンビナーゼにより媒介される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒがさらに化学的部分、修飾オリゴヌクレオチド、および／または修飾主鎖を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
対象が哺乳類または植物である、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
[0001]  この出願は、２０１２年５月３０日に出願された米国仮出願第61/653,279号に対する優先権を主張する。前記の出願の全体を本明細書に援用する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する記載
[0002]  本発明は、全部または部分的に、国立衛生研究所からの助成金番号R01-AI054830およびRL1-GM084434により支援された。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
[0003]  この発明は、ＤＮＡの修復、変更、または置き換えのための道具としての核酸配列を含むＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ（商標）を用いる遺伝子療法の組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
[0004]  標的化ゲノム工学は、内在性ＤＮＡを細胞内のＤＮＡに沿った特定の部位において方向付けられた様式で編集または変更することを含む。遺伝子修復および相同性に方向付けられた遺伝子変更の莫大な可能性にもかかわらず、現在のゲノム工学のアプローチは非常に低い修復または編集の効率を提供し、そして有害な、または望ましくないＤＮＡ配列および結果を導入する可能性を有する。従って、生物学的環境において安定であり、より大きい細胞トランスフェクションおよび導入遺伝子発現を可能にする、より有効な標的化ゲノム工学の方法を開発する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]  一部の態様において、本開示は標的とされるＤＮＡ配列の変更のための組成物を提供する。例えば、限定的でない態様において、そのような組成物はインビボまたはインビトロにおける細胞内での標的とされるＤＮＡ配列の相同性に方向付けられる修復、変更、または置き換えのための核酸配列鋳型を含むＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒを含み、ここでそのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは細菌の複製起点および抗生物質選択遺伝子の両方を欠いており、ここでそのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは約２，５００塩基対までの大きさを有する。本開示のさらなる態様において、標的とされるＤＮＡ配列の相同性に方向付けられる修復、変更、または置き換えのための核酸配列鋳型はその標的とされるＤＮＡ配列付近の核酸配列に相補的な鋳型の少なくとも１つの部分；およびその標的とされるＤＮＡに相補的ではない鋳型の少なくとも１つの部分を含み、ここでその核酸鋳型の非相補的部分はその標的とされるＤＮＡ配列において所望される変更を含有する。一部の態様において、その組成物はさらに、少なくとも１種類の部位特異的ヌクレアーゼを含む。
【０００６】
[0006]  別の態様において、本開示は細胞中の標的ＤＮＡ配列を変更する方法に関する。一部の態様において、そのような方法は核酸配列鋳型を含むＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒをトランスフェクションすることを含む。一部の態様において、その核酸配列鋳型はその標的ＤＮＡ配列付近の核酸配列に相補的な少なくとも１つの部分；およびその標的ＤＮＡ配列に相補的ではない少なくとも１つの部分を含む。本開示の関連する態様において、その核酸鋳型の非相補的部分は所望の変更を含有する。さらなる態様において、その方法は、その核酸配列鋳型の相補的領域の、非相補的部分を除いたその標的ＤＮＡ配列付近の核酸配列との塩基対合を含む。さらなる態様において、その方法は所望の変更をその標的ＤＮＡ配列中に配列特異的様式で組み込むことを含む。その方法の関連する態様において、そのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは細菌の複製起点および抗生物質選択遺伝子の両方を欠いている。一部の態様において、そのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは約２，５００塩基対までの大きさを有する。
【０００７】
[0007]  一部の態様において、本開示はそれを必要とする対象において標的ＤＮＡ配列の変更が所望される遺伝性障害または他の病気を処置する方法に関する。一部の態様において、そのような方法は、対象に療法上有効量の核酸配列鋳型を含むＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒを投与することを含む。関連する態様において、その核酸配列鋳型はその標的ＤＮＡ配列付近の核酸配列に相補的な少なくとも１つの部分；およびその標的ＤＮＡ配列に相補的ではない少なくとも１つの部分を含み、ここでその核酸鋳型の非相補的領域はその所望の変更を含有する。追加の態様において、その方法は、その核酸配列鋳型の相補的領域の、非相補的部分を除いたその標的ＤＮＡ配列付近の核酸配列との塩基対合を含む。その方法のさらなる態様は、所望の変更をその標的ＤＮＡ配列中に配列特異的様式で組み込むことを含む。その方法の関連する態様において、そのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは細菌の複製起点および抗生物質選択遺伝子の両方を欠いている。一部の態様において、そのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは約２，５００塩基対までの大きさを有する。
【０００８】
[0008]  本開示の上記の目的および他の目的、特徴、および利点は、添付の図面と合わせて受け取られた場合、本発明を実施するための最高の方式の以下の詳細な記載から容易に明らかである。
【０００９】
[0009]  本発明の上記で列挙された、および他の利点および目的が得られる方法のため、上記で簡潔に記載された本発明のより詳細な記載はその具体的な態様への参照により与えられると考えられ、それは添付された図において図説されている。これらの図は本発明の典型的な態様のみを示しており、従ってその範囲を限定するものと考えられるべきではないことを理解し、本発明は添付の図の使用によりさらに具体的かつ詳細に記載されると考えられ、ここで：
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】[0010]  図１はＤＮＡ変更のための鋳型をコードするＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒの調製を示し；
【図２】[0011]  図２はＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ鋳型を用いた標的化されたゲノム編集を示し；
【図３】[0012]  図３はＩＬ２Ｒγ遺伝子の改変のための修復鋳型としてのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒを用いたジンクフィンガーに媒介される遺伝子編集の典型的な態様を示す。野生型の内在性ＩＬ２Ｒγ遺伝子の初期配列を、コザック配列および開始コドンの位置を示すために標識する（ｌａｂｅｌｅｄ）。その修復鋳型の非相補的部位は、制限部位のＩＬ２Ｒγ遺伝子中への挿入に関する付加された配列を示す。示したように、このＸｈｏ部位はその遺伝子に関する開始コドンの直前にコードされている。供与鋳型上で、挿入されるべきＸｈｏＩ部位を有する配列は２個の相同性の腕により隣接されている。これらの相同性の腕は、編集に関して標的とされてきた細胞のゲノム中の部位の左側および右側のＤＮＡ配列に相補的である。ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒはその供与鋳型の完全長を含めて生成される。
【図４】[0013]  図４Ａ〜４Ｂは、ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）分析の結果を示す。左の３つのレーンは、３種類の供与鋳型（等質量でのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ、プラスミド、または等モルでのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒのいずれか）のそれぞれをＺＦＮ一切なしで細胞に送達した対照である（図４Ａ）。次のレーンは、ＺＦＮをプラスミドに基づく供与鋳型または等質量もしくは等モル量のどちらかでのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒに基づく供与鋳型と共に送達した際の、送達されたプラスミドの量と比較した実験結果を示す（図４Ａ）。上部の未切断のバンドの密度に対する２つのより低い位置のバンドの密度の決定は、うまく修復されたアレル全体の百分率の尺度を提供する。ゲルの分析は、ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒがアレルの標的化および制限部位の挿入に成功したことを示し（図４Ｂ）；そして
【図５】[0014]  図５Ａ〜５Ｃは、ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ供与体による標的化された遺伝子修正を示す。ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ供与鋳型は、ＧＦＰ遺伝子の完全な３’領域を、上流の機能するＰＰＧＫプロモーター（図５Ａ）（左）または同じプロモーターの切り詰められた形態（図５Ａ）（右）と共に有する。修復に関する染色体上の標的は、Ｉ−Ａｎｉｌ部位（黄色の三角形）およびＧＦＰの発現を妨げるための２個のインフレームＮ末端停止コドン（赤線）を有する転写されるＧＦＰ遺伝子であった（図５Ｂ）（上）。このＤＮＡ標的はＨＥＫ２９３Ｔ細胞の染色体中に組み込まれている。相同性に方向付けられる修復の成功はＧＦＰ遺伝子を修正し、それらの染色体中にＧＦＰ遺伝子の機能するコピーを含有するＧＦＰ＋細胞を生成する（図５Ｂ）（下）。フローサイトメトリー分析をそのＨＥＫ２９３細胞においてトランスフェクションの３日後に実施した。ＢＦＰ＋細胞（図５Ｃ）（上の横列）および同定されたＢＦＰ＋細胞集団の中のＧＦＰ＋細胞（図５Ｃ）（下の横列）を定量化するデータを示す。トランスフェクションされたＢＦＰ＋細胞の百分率を上に示す（ＢＦＰ＋細胞、Ｉ−Ａｎｉｌを発現している）。ＧＦＰ＋（ＨＤＲによりうまく修正された）としても同定されたＢＦＰ＋細胞の百分率を示す（図５Ｃ）（下）。Ｉ−Ａｎｉｌを形質導入されなかった対照からのデータは、ここでＢＦＰ発現が予想されることを示している（図５Ｃ）（左）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
[0015]  前記の一般的な記述および以下の詳細な記述は両方とも典型的かつ説明的なものでしかなく、特許請求されるような本発明を制限するものではないことは理解されるべきである。この出願において、別途明確に記載しない限り、単数形の使用には複数形が含まれ、用語“ａ”または“ａｎ”は“少なくとも１”を意味し、“または”の使用は“および／または”を意味する。さらに、用語“含まれること”ならびに他の形態、例えば“含まれる”および“含まれた”の使用は限定的ではない。また、“要素”または“構成要素”のような用語は、別途明確に記載しない限り、１つの単位を含む要素または構成要素および１より多くの単位を含む要素または構成要素の両方を包含する。
【００１２】
[0016]  本明細書で用いられる節の見出しは組織化の目的のためだけのものであり、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。特許、特許出願、論文、書籍、および専門書が含まれるがそれらに限定されないこの出願において引用される全ての文書または文書の一部は、あらゆる目的に関して本明細書により明確にそのまま本明細書に援用される。援用される文献および類似の資料の１以上が用語をこの出願におけるその用語の定義と矛盾する様式で定義している場合、この出願が統制する。
【００１３】
[0017]  本開示は、内在性の細胞ＤＮＡ修復機序を用いてＤＮＡを編集または変更するための標的化されたＤＮＡ工学に関する方法および組成物を提供する。本明細書で開示される方法は、標的ＤＮＡ配列の相同性に方向付けられる修復、変更、または置き換えのための鋳型としてＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒを利用する。本明細書で開示される方法および組成物を用いて、インビボまたはインビトロにおいて、あらゆる植物または動物細胞、例えば哺乳類細胞が含まれるがそれらに限定されないあらゆる細胞中のあらゆるＤＮＡ配列を標的とすることができる。本明細書で開示される方法および組成物は、体細胞および幹細胞が含まれるがそれらに限定されないあらゆる細胞型で用いることができる。
【００１４】
[0018]  標的化されたＤＮＡ工学は、細胞内のＤＮＡに沿った特定の部位において方向付けられた様式で細胞内の内在性ＤＮＡを編集または改変することを含む。ゲノムの編集または標的化されたＤＮＡの編集は、少数を例に挙げると、酵母、昆虫、無脊椎動物、哺乳類、魚、齧歯類、ヒト、植物、細菌、および昆虫が含まれるあらゆる生物または細胞において実施することができる１，２，８，１２。さらに、標的化されたＤＮＡ編集は、幹細胞および体細胞が含まれるがそれらに限定されないあらゆる細胞型において実施することができる。編集されるべき内在性ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、またはプラスチドＤＮＡであることができる１３。
【００１５】
[0019]  ゲノム編集または標的化されたＤＮＡ工学は、療法目的のために、例えば遺伝子変異を修復するために用いることができ、または基礎研究において、例えば特定の遺伝子の機能を研究するために用いることができる９−１１。加えて、植物、藻類、細菌、および古細菌のゲノム編集は、食品およびバイオ燃料の開発のための新規のアプローチとして探求されている。標的化されたＤＮＡ編集または変更によるゲノム改変は、通常はそれらの作物において見られない特徴、例えば除草剤もしくは害虫に対する耐性、または栄養的にバランスの取れた食物もしくは飼料製品が含まれる、１種類以上の所望の特徴を有する植物を生成するための効率的かつ制御された方法を提供する。
【００１６】
[0020]  遺伝子療法は、疾患に関わっていることが示されている欠陥遺伝子または他のＤＮＡ配列を修正する、修復する、置き換える、または変更するためのＤＮＡまたはＲＮＡの所望の器官または細胞への送達を含む。これはいくつかの異なるアプローチにより達成することができる。その疾患状態が、欠損した、または機能しない遺伝子または他のＤＮＡ配列の結果である場合、その遺伝子の機能するコピーをその疾患座位に送達することができる。遺伝子発現は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）およびＲＮＡ活性化技術、例えば低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を用いて制御することができる。一部の態様において、本開示は対象の配列を修復する、変更する、置き換える、付加する、削除する、重複させる、または反転させるための標的化されたＤＮＡ工学のためのＤＮＡ  ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒを用いる方法に関する。
【００１７】
ＤＮＡ修復機序
[0021]  細胞はあらゆる二本鎖または一本鎖ＤＮＡの損傷を修復することを試みるための内在性の機序を有する。その細胞性修復機序は、天然の原因の結果であるあらゆるＤＮＡ損傷を修復するために進化した。ゲノム、ミトコンドリア、葉緑体、または過剰染色体のＤＮＡ配列を、変更する、修復する、置き換える、付加する、削除する、重複させる、および反転させるためのいくつかの方法が存在する。全てのこれらの方法はＤＮＡの相同性に依存している。
【００１８】
[0022]  １つの方法は、細胞にＤＮＡ相同組み換えにおいて用いられ得る鋳型を供給することを含む。このタイプの組み換えは、相同性を有するＤＮＡの区間に依存する。その事象の頻度はその欠陥配列付近のＤＮＡ損傷（典型的には二本鎖の破断またはニック）の誘導により増大し、従ってその鋳型はその欠陥配列において組み替えて、そうしてそれを直して、または変更して、その鋳型によりコードされる所望の配列にするために用いられるであろう。二本鎖の破断は配列特異的エンドヌクレアーゼ、例えばメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはＴＡＬヌクレアーゼにより誘発され得る。ニックは配列特異的ニッキングエンドヌクレアーゼにより生成され得る。
【００１９】
[0023]  ＤＮＡ配列を修復または変更するための別の方法は、その鋳型に関するゲノム、ミトコンドリア、葉緑体、または過剰染色体配列をその鋳型と交換するであろう酵素を用いることである。第１の方法のように鋳型をコピーするのではなく、この方法では、酵素、例えばＤＲＡＰはその鋳型を用いてゲノム、ミトコンドリア、葉緑体、または過剰染色体（単数または複数）を相同性領域に関して検索するであろう。相同性領域がマッチした場合、ＤＲＡＰは２セットの二本鎖破断を鋳型および標的配列の両方において生成し、その鋳型に関するそのゲノム、ミトコンドリア、葉緑体、または過剰染色体の配列を“フリップイン（ｆｌｉｐ−ｉｎ）”機序で取り替える（ｓｗａｐ  ｏｕｔ）であろう。
【００２０】
[0024]  他のＤＮＡ修復系には、トランスポザーゼ、リコンビナーゼまたはインテグラーゼが含まれる。トランスポゾン系、例えばＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼもカットアンドペースト機序により相同組み換えを成し遂げることができる。インテグラーゼ系、例えばＨＩＶインテグラーゼは、配列を相同組み換えにより付加する、削除する、重複させる、または反転させることができる。これらの細胞性修復機序を利用して、反転、挿入、削除、点変異、重複、または転座が含まれるがそれらに限定されない内在性ＤＮＡ配列の標的化された所望のＤＮＡ変更を方向付けることができる。
【００２１】
修復鋳型の送達
[0025]  遺伝子療法の莫大な療法的可能性および遺伝子療法に関する良好な候補として同定された多数の疾患にもかかわらず、その分野は今のところほとんどうまくいっていない。これらの失敗はＤＮＡ送達と関係する厄介な問題の結果である。修復鋳型を導入するためのいくつかのアプローチが評価されてきた。修復鋳型は、一本鎖線状ＤＮＡ、二本鎖線状ＤＮＡ、二本鎖プラスミド、または一本鎖プラスミドとして導入することができる。さらに、その修復鋳型は裸のＤＮＡまたはウイルス送達媒体内にパッケージングされたＤＮＡとして送達することができる。１，４
[0026]  ほとんどの一般的なＤＮＡ送達法はウイルスベクターを利用する。送達効率はウイルスベクターに関して高い。しかし、ウイルスベクターは、毒性、免疫および炎症反応ならびに標的化および用量の制御における困難が含まれる、臨床試験において観察された問題のため、限られた療法的可能性を有する。加えて、そのベクターはゲノム中に組み込まれて未知の長期の作用を有するであろうというもっともな懸念およびそのウイルスが疾患を引き起こすその能力を回復し得る可能性が存在する。
【００２２】
[0027]  従って、多くの努力が非ウイルスベクター系、例えばプラスミドＤＮＡに向けられてきた。線状ＤＮＡ鋳型はプラスミドを用いて送達することができる。これらのベクターは、それらは生成および保管が簡単であり、それらは細胞において安定して存続し得るため、魅力的である。しかし、相同性の腕または供与修復鋳型の構成要素ではないそのプラスミドベクターのかなりの部分が存在する。これは、プラスミドは細菌株中で増殖し、従って細菌のＤＮＡ配列、特にプラスミドの維持のための原核生物の複製起点および抗生物質耐性マーカーを含有する必要があるためである。これらの細菌の配列の存在は、いくつかの非常に深刻かつ有害な結果を有する。最も顕著であるのは、それがどれだけそのプラスミドを小さく作ることができるかを制限することである。数千塩基対の大きいプラスミドは非常に低い効率でトランスフェクションされる。それらの大きい大きさはまた、それらを送達（例えばエアロゾル化）と関係する、または静脈内送達により導入した場合血流中での水力学的剪断力の影響を受けやすくする。剪断に誘導される分解は生物学的活性の喪失をもたらし、それは少なくとも部分的に現在の遺伝子療法に関する非ウイルスベクターの使用における成功の欠如の原因である。トランスフェクションに関するこれらの問題に挑戦し、それを緩和するために、様々な陽イオン性およびリポソーム性トランスフェクション試薬がデザインされてきたが、これらは細胞毒性に関する問題に悩まされている。加えて、樹状細胞およびＴ細胞が含まれる多くのヒト細胞は、現行のプラスミドベクターでは効率的にトランスフェクションすることができない。
【００２３】
[0028]  ＤＮＡベクターの大きさの低減は、細胞トランスフェクション効率を増大させるための合理的なアプローチであるようである。そのプラスミド上の細菌の配列を物理的に除去することができ、結果として得られた療法的配列のみを含有する短い線状ＤＮＡ断片は従来のプラスミドベクターよりも容易に細胞中に導入され得るであろうと想像するかもしれない。しかし、線状ＤＮＡ鋳型は不安定であり、細胞により急速に分解される。さらに、線状ＤＮＡの末端は高度に反応性であり、制御されないＤＮＡ修復および組み替えプロセスを誘発し、加えて内因性免疫応答および細胞毒性またはアポトーシスを誘発する。
【００２４】
[0029]  従って、遺伝子修復および相同性に方向付けられた遺伝子変更の莫大な可能性にもかかわらず、現行のアプローチは修復または編集事象の非常に低い効率を提供し、有害な、または望まれないＤＮＡ配列および結果を導入する可能性を有する。従って、生物学的環境中で安定であり、より大きな細胞トランスフェクションおよび導入遺伝子発現を可能にする遺伝子標的化療法に関する必要性が存在する。
【００２５】
[0030]  ミニベクター
[0031]  本開示は、相同性に方向付けられる修復、変更、または置き換えのための鋳型としての使用のためのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒに関する。ＤＮＡ  ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ（約２５０ｂｐほどの小ささ）は、典型的にはプラスミドを用いたトランスフェクションに抵抗する懸濁細胞、Ｔ細胞、樹状細胞のような細胞型が含まれる試験した全ての細胞型において、注目に値するトランスフェクション効率を示す。遺伝子置き換え療法におけるこの発明の使用に関する、そしてヒトの疾患細胞の遺伝子再プログラミングに関する大きな可能性が存在する。変異した、修復を必要とする、変更される、または置き換えられる必要がある、付加される、削除される、重複させる、または反転させる必要があるゲノム、ミトコンドリア、葉緑体、または過剰染色体配列を、ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒをＤＮＡ修正のための鋳型として、または遺伝子置換として知られるプロセスの間に挿入される（“フリップインされる（ｆｌｉｐｐｅｄ  ｉｎ）”）、もしくは組み込まれるＤＮＡの部品として用いてインビボで直すことができる。
【００２６】
[0032]  スーパーコイル状ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒおよびそのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒを生成するための方法は、Zechiedrichらによる米国出願一連番号11/448,590（米国公開番号：US 20070020659 A1）；表題：“Generation of Minicircle DNA with Physiological Supercoiling”において記載されており、それを本明細書にそのまま援用する。さらに、本明細書で用いられる際、“ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ”またはスーパーコイル状ＤＮＡベクター系は以前にZechiedrichらによる米国出願一連番号12/905,612（米国公開番号：US 20110160284 A1）；表題：“Supercoiled MiniVectors for Gene Therapy Applications”においても記載されており、それも本明細書にそのまま援用する。
【００２７】
[0033]  本開示の態様は、相同性に方向付けられる修復、変更、または置き換えのための鋳型としての使用のための、非ウイルス性遺伝子療法ベクターであり細菌の配列をほぼ完全に欠いている小さいスーパーコイル状ＤＮＡ  ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒを提供する。それらの小さい大きさのため、これらのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは高い効率でトランスフェクションされる。細菌の配列の欠如は、二本鎖のスーパーコイル状の生理活性形態の所望のＤＮＡ配列のみを含有する最適な供与鋳型デザインを可能にする。
【００２８】
[0034]  １態様において、本開示はインビボまたはインビトロでの細胞内の標的とされるＤＮＡ配列の相同性に方向付けられる修復、変更、または置き換えのための核酸配列鋳型を含むＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒに関する。本開示の一部の態様において、上記で記載された組成物の核酸配列鋳型は、標的とされるＤＮＡ配列付近の核酸配列に相補的な鋳型の少なくとも１つの部分；およびその標的とされるＤＮＡ配列に相補的ではない鋳型の少なくとも１つの部分を含んでいてよい。関連する態様において、その核酸鋳型の非相補的部分はその標的とされるＤＮＡ配列において所望される変更を含有していてよい。本明細書で記載される発見は、そのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒが標的化されたゲノム編集または修復のための利点を有することを実証している。
【００２９】
[0035]  ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは大腸菌においてインビボでのインテグラーゼに媒介される部位特異的組み換えにより得ることができる。それは例えば導入遺伝子発現カセットのみを有する核酸分子を含有する（プロモーターおよび核酸配列のみが含まれ、ここでその核酸配列は例えば相同性に方向付けられる標的とされるＤＮＡ配列の修復、変更、または置き換えのための鋳型であることができ、そして重要なことだが、細菌由来の配列であってはならない(Mali et al., 2013; Alexander BL et al., 2007; Alton et al., 2007)。
【００３０】
[0036]  標的化されたＤＮＡ変更のために用いられるＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは、約１００塩基対（ｂｐ）から約２．５キロ塩基（ｋｂ）まで、例えば約２００ｂｐから約２．２ｋｂまで、例えば約３００ｂｐから約２．０ｋｂまで、例えば約４００ｂｐから約１．９ｋｂまで、例えば約５００ｂｐから約１．８ｋｂまで、例えば約６００ｂｐから約１．７ｋｂまで、例えば約７００ｂｐから約１．６ｋｂまで、例えば約８００ｂｐから約１．５ｋｂまで、例えば約９００ｂｐから約１．４ｋｂまで、例えば約１ｋｂから約１．３ｋｂまで、例えば約１．１ｋｂから約１．２ｋｂまでの大きさの二本鎖の環状ＤＮＡ分子であることができる。ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは約１００ｂｐ以下の大きさの増分で作製することができる。
【００３１】
[0037]  本開示の１態様において、上記で記載した組成物のＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは、細菌の複製起点および抗生物質選択遺伝子の両方を欠いていてよい。関連する態様において、そのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは約２，５００塩基対までの大きさのものであることができる。一部の態様において、そのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒはさらに、化学的部分、修飾オリゴヌクレオチド、および／または修飾主鎖を含んでいてよい。
【００３２】
[0038]  そのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは、所望される場合、例えば化学的部分を用いて標識することができる。代表的な標識には、フルオレセイン、ビオチン、コレステロール、色素、修飾塩基および修飾主鎖が含まれる。代表的な色素には以下の色素が含まれる：６−カルボキシフルオレセイン、５−／６−カルボキシローダミン、５−／６−カルボキシテトラメチルローダミン、６−カルボキシ−２’−，４−，４’−，５’−，７−，７’−ヘキサクロロフルオレセイン）、６−カルボキシ−２’−，４−，７−，７’−テトラクロロフルオレセイン）、６−カルボキシ−４’−，５’−ジクロロ−２’−，７’−ジメトキシフルオレセイン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５、ＩＲＤｙｅ７００、ＩＲＤｙｅ８００、ＢＯＤＩＰＹ色素、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ。追加の修飾には、修飾塩基（例えば２−アミノプリン、メチル化塩基）、または修飾主鎖（例えば、ホスホロチオエート類、ここでその非架橋酸素の１つが硫黄で置換されている；２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ−オリゴヌクレオチド類；メチル−ホスフェートオリゴヌクレオチド類）も含まれ得る。所望であれば、化学的部分および／または修飾塩基および／または修飾主鎖が含まれる多数の標識を同時に用いることができる。ヌクレオチドを標識する方法は、例えばRobert E. Farrellによる“Nucleic Acid Probe Technology”；RNA Methodologies (第３版), 2005, pp. 285-316”；ならびにCurrent Protocols in Immunology 2001 May中のStanley TaborおよびAnn Boyleによる“Enzymatic Labeling of Nucleic Acids”；第１０章：単位１０．１０において記載されている。これらの参考文献の教示を本明細書にそのまま援用する。
【００３３】
ヌクレアーゼ類
[0039]  上記で言及したように、標的化されたＤＮＡ工学は、いくつかの異なる意図された結果、例えば変異を修復すること、変異を導入すること、新しい遺伝子を導入すること、細胞を再プログラミングすること、ＤＮＡ配列の一部を削除すること、遺伝子の発現パターンを変更すること等に関して望ましい可能性がある(Perez-Pinera et al., 2012)。このプロセスは典型的には操作された部位特異的ヌクレアーゼの使用を含むことができる。本開示の典型的な態様において、その部位特異的ヌクレアーゼは上記で記載したＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒの核酸配列鋳型の一部によりコードされていてよい。
【００３４】
[0040]  これらの操作されたヌクレアーゼは、それぞれが別個の機能を有する２個の融合したドメインを含有することができる。第１ドメインであるＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ配列を認識して結合するように操作することができる。第２ドメインはヌクレアーゼまたはＤＮＡ中に二本鎖もしくは一本鎖の破断を作ることができる酵素からなることができる。細胞中に導入された際、その操作されたヌクレアーゼは、標的化された配列が存在する場合、細胞のＤＮＡに結合することができる。結合すると、そのヌクレアーゼはそのＤＮＡの主鎖において切断または破断を引き起こすことができる。従って、その切断は、そのヌクレアーゼドメインの操作された活性に基づいて、その二重らせんの両方の鎖に影響を及ぼすようにデザインすることができ（二本鎖破断、ＤＳＢ）、またはそれは１本の鎖のみに影響を及ぼすようにデザインすることができる（一本鎖破断、ＳＳＢ）。そのヌクレアーゼ自体はＤＮＡを非特異的に切断するであろうが、ＤＮＡ結合ドメインに融合させた場合、そのヌクレアーゼ活性は特定の部位に向けられるであろう。従って、これらの操作されたヌクレアーゼは、部位特異的ヌクレアーゼとも呼ばれる(Jensen et al., 2011; Joung and Sander, 2013; Perez-Pinera et al., 2012)。組み換えによる相同性修復は操作されたヌクレアーゼが一切存在しないでも起こる可能性もあり、または非特異的ヌクレアーゼを用いて実施することができ得ることは特筆すべきである(Jensen et al., 2011)。しかし、部位特異的ヌクレアーゼを用いない相同組み換えに媒介される遺伝子編集の速度は非常に低い(Mali & Cheng, 2012; Parekh-Olmedo et al., 2005; Perez-Pinera et al., 2012)。
【００３５】
[0041]  多数のタイプの操作されたヌクレアーゼが開発されてきた。例えば、最初の、そして最も研究されたものはヌクレアーゼに融合したジンクフィンガー結合ドメインに基づいており、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）と呼ばれる(Carrol, 2008; Jensen et al., 2011; Joung & Sander, 2013; Perez-Pinera., 2012)。別のアプローチは、ヌクレアーゼを転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）に由来するＤＮＡ結合ドメインに融合させてＴＡＬＥＮまたは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼをもたらしたものを利用する(Joung & Sander, 2013; Perez-Pinera., 2012)。追加のアプローチは、哺乳類および他の非細菌生物におけるゲノム編集を改めて目的とした（ｒｅｐｕｒｐｏｓｅｄ）細菌系を利用する。この系では、クラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文状の反復（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）（ＣＲＩＰＳＲ）ＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ会合（Ｃａｓ）タンパク質との複合体で、そのＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ配列とマッチするＤＮＡ配列の切断を方向付けるように作用する。１つの例において、そのＣａｓ９タンパク質を切断されるべき所望のＤＮＡ配列を標的とするＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡに融合させる(Mali et al., 2013)。これらの部位特異的ヌクレアーゼ系のいずれか１つまたは組み合わせを、供与体またはＤＮＡ鋳型と組み合わせて、所望されるようなそれに続く修復を方向付けることができる。
【００３６】
[0042]  人為的な破断が操作されたヌクレアーゼにより引き起こされる場合、これらの細胞性修復機序を利用して、反転、挿入、削除、点変異、重複、または転座が含まれるがそれらに限定されない、内在性ＤＮＡ配列に対するあらゆる数の変更を引き起こすためにその修復プロセスを方向付けることができる(Joung and Sander, 2013; Perez-Pinera et al., 2012; Parekh-Olmedo, Ferrara, Brachman, & Kmiex, 2005)。修復事象を所望の結果へと方向付けるため、鋳型ＤＮＡ鎖を操作されたヌクレアーゼと共に細胞中に導入することもできる。この鋳型鎖は一本鎖または二本鎖であることができ、部位特異的ヌクレアーゼにより媒介される誘導されたＤＮＡ切断事象の部位の、またはその付近の細胞ＤＮＡに相補的または相同性である部分を有するであろう。１つの例において、その鋳型鎖は、二本鎖破断の両側のＤＮＡ配列に相補的である２つの相同性の領域を有することができる。これらの相同性の腕の間に、修復後の細胞ＤＮＡの所望の最終的な配列に対応する鋳型領域が存在することができる。その鋳型領域は、１つの例において、その内在性ＤＮＡ中に挿入されるべき核酸配列をコードすることができる。それは、あるいは核酸配列に対する単一の点変異またはあらゆる数の他の変更をコードすることができるであろう(Joung and Sander, 2013; Perez-Pinera et al., 2012; Jensen et al., 2011)。
【００３７】
[0043]  操作されたヌクレアーゼに加えて、ＤＮＡ結合ドメインをあるいは修復鋳型との部位特異的組み換えを方向付けるためにインテグラーゼまたはリコンビナーゼドメインに融合させることができる(Perez-Pinera et al., 2012)。別の態様において、トランスポザーゼまたはリコンビナーゼに媒介される遺伝子変更を、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾンのような系を用いることにより、修復鋳型を用いて実施することができるであろう(Richardson et al., 2002)。
【００３８】
[0044]  １態様において、この開示は、インビボまたはインビトロでの細胞内の標的とされるＤＮＡ配列の相同性に方向付けられる修復、変更、または置き換えのための核酸配列鋳型を含むＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒを含むＤＮＡ配列の標的化された変更のための組成物を提供する。典型的な態様において、変更されるべき標的とされるＤＮＡ配列は、細胞内のゲノム、ミトコンドリア、またはプラスチドＤＮＡであってよい。一部の態様において、その細胞は哺乳類細胞、原核細胞、真核細胞、古細菌、または植物細胞であることができる。別の態様において、その細胞は体細胞、生殖細胞、または幹細胞であることができる。
【００３９】
[0045]  本開示の一部の態様において、上記で記載した組成物の核酸配列鋳型は、その標的とされるＤＮＡ配列付近の核酸配列に相補的な鋳型の少なくとも１つの部分；およびその標的とされるＤＮＡ配列に相補的でない鋳型の少なくとも１つの部分を含むことができる。関連する態様において、その核酸鋳型の非相補的部分は、その標的とされるＤＮＡ配列において所望される変更を含有することができる。
【００４０】
[0046]  一部の態様において、本開示は、インビボまたはインビトロでの細胞内の標的とされるＤＮＡ配列の相同性に方向付けられる修復、変更、または置き換えのための核酸配列鋳型を含むＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒを含むキットに関する。
【００４１】
[0047]  さらなる態様において、上記で記載される組成物はさらに少なくとも１種類の部位特異的ヌクレアーゼを含む。一部の態様において、本開示は前記の組成物を含むキットに関する。本開示の典型的な態様において、その部位特異的ヌクレアーゼはそのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒの核酸配列鋳型の一部によりコードされていてよい。別の態様において、その部位特異的ヌクレアーゼは別々のＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ、プラスミド、メッセンジャーＲＮＡ、もしくはウイルスによりコードされていてよく、またはタンパク質として送達されてよい。その部位特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文状の反復）／ＣＡＳ（ＣＲＩＳＰＲ会合）系からなる群から選択することができる。
【００４２】
[0048]  １態様において、その部位特異的ヌクレアーゼはその標的ＤＮＡ配列中の１つ以上の一本鎖破断を誘導することができる。別の態様において、その部位特異的ヌクレアーゼはその標的ＤＮＡ配列中の１つ以上の二本鎖破断を誘導することができる。本開示の１態様において、その相同性に方向付けられる修復、変更、または置き換えは、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系が含まれるがそれに限定されないトランスポザーゼまたはリコンビナーゼにより媒介されてよい。
【００４３】
[0049]  本開示の別の態様は、上記で記載した組成物（単数または複数）を用いて細胞中の標的ＤＮＡ配列を変更する方法に関する。そのような方法は、核酸配列鋳型を含むＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒをトランスフェクションすることを含んでいてよい。一部の態様において、その核酸配列鋳型はその標的ＤＮＡ配列付近の核酸配列に相補的な少なくとも１つの部分；およびその標的ＤＮＡ配列に相補的でない少なくとも１つの部分を含んでいてよい。関連する態様において、その核酸鋳型の非相補的部分は所望の変更を含有する。そのような方法はさらに、その核酸配列鋳型の相補的領域の、非相補的部分を除いたその標的ＤＮＡ配列付近の核酸配列との塩基対合；およびその所望の変更のその標的ＤＮＡ配列中への配列特異的様式での組み込みを含む。
【００４４】
[0050]  追加の態様において、そのような方法はさらに、少なくとも１種類の部位特異的ヌクレアーゼを提供する工程を含むことができる。その部位特異的ヌクレアーゼは、ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒの核酸鋳型の一部によりコードされていてよい。典型的な態様において、部位特異的ヌクレアーゼを提供する工程は、部位特異的ヌクレアーゼをコードする別個のＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ、プラスミド、メッセンジャーＲＮＡ、もしくはウイルス、またはタンパク質を同時トランスフェクションすることを含むことができる。その部位特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文状の反復）／ＣＡＳ（ＣＲＩＳＰＲ会合）系からなる群から選択することができる。１態様において、その部位特異的ヌクレアーゼはその標的ＤＮＡ配列中の１個以上の一本鎖破断を誘導することができる。別の態様において、その部位特異的ヌクレアーゼはその標的ＤＮＡ配列中の１個以上の二本鎖破断を誘導することができる。一部の態様において、その標的ＤＮＡの変更は、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系が含まれるがそれに限定されないトランスポザーゼまたはリコンビナーゼにより媒介される。
【００４５】
[0051]  さらに別の態様において、本開示はそれを必要とする対象において標的ＤＮＡ配列の変更が望まれる遺伝子障害または他の病気を処置する方法に関する。１態様において、その対象は哺乳類または植物であることができる。一部の態様において、そのような方法は、対象に療法上有効量の上記で記載した組成物（単数または複数）を投与することを含む。別の態様において、その方法は、さらに少なくとも１種類の部位特異的ヌクレアーゼを同時投与することを含むことができる。一部の態様において、その部位特異的ヌクレアーゼはＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒの核酸鋳型の一部によりコードされている。別の態様において、その同時投与はその部位特異的ヌクレアーゼをコードする別個のＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ、プラスミド、メッセンジャーＲＮＡ、もしくはウイルスを提供する、またはタンパク質を提供することを含むことができる。
【００４６】
[0052]  その部位特異的ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、およびＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的に間隔が空いた短い回文状の反復）／ＣＡＳ（ＣＲＩＳＰＲ会合）系からなる群から選択することができる。１態様において、その部位特異的ヌクレアーゼはその標的ＤＮＡ配列中の１個以上の一本鎖破断を誘導することができる。別の態様において、その部位特異的ヌクレアーゼはその標的ＤＮＡ配列中の１個以上の二本鎖破断を誘導することができる。一部の態様において、その標的ＤＮＡの変更は、ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾン系が含まれるがそれに限定されないトランスポザーゼまたはリコンビナーゼにより媒介される。
【００４７】
[0053]  本明細書で開示される方法および組成物に対する可能な変更および改変が想像されてよい。例えば、細胞での位置（例えば核に対してミトコンドリア、葉緑体、または過剰染色体）を制御するため、そのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒを“タグ付けする”、または所望の細胞での位置に方向付ける特別なＤＮＡ配列が含まれていてよい。細胞の混合集団（例えば生きたマウスにおける肺の線維芽細胞）中の特定の細胞を標的化するため、様々な部分（エピトープ、脂肪酸、特別なタンパク質配列等）をＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒに付けてそれらを例えばその部分に結合する受容体を有する細胞に標的化することができ、またはそれはＤＮＡをその部分に結合させた際にＤＮＡ取り込みをより受けやすい。ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは、送達ビヒクル、例えばトランスフェクション剤または標的化部分、例えばポリマーもしくはタンパク質と非共有結合的に複合体形成させることもできる。
【００４８】
適用および利点
[0054]  現行のプラスミドベクターはかなり大きく（＞５ｋｂ）、従って以下の理由のため、新規の適用には適していない：（ｉ）大きさ：そのベクターは対象の配列を含むとさらに大きくなる；（ｉｉ）トランスフェクション効率：プラスミドは、鋳型ＤＮＡが修復のために細胞の内部にほとんど〜全く送達されない不十分なトランスフェクションを有する；そして（ｉｉｉ）非特異的ＤＮＡ：細菌配列は問題があり、その導入遺伝子のサイレンシングを引き起こし得る。ＤＮＡ  ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは遥かに小さく、サイレンシングされる可能性がより低いＤＮＡ修復鋳型のより高いトランスフェクション、増大した安定性、および向上した送達の利点を与える。
【００４９】
[0055]  療法的適用に加えて、遺伝子またはＤＮＡの置き換え、修復、および変更を非療法的適用において適用することもできる。例えば、それを用いてトランスジェニック生物、例えばノックアウトマウスを生成することができ、またはそれを用いて例えば細胞株の不死化のために細胞を変化させることができる。これらのトランスジェニック細胞および生物は疾患モデルとしての、そしてＤＮＡ機能の研究における有用性を有する可能性がある。さらに、トランスジェニック生物は、例えば、遺伝子の変更、修復、挿入、削除、重複、または反転が新規の有益な特徴、例えば疾患または害虫耐性を提供し得る農業において商業的有用性を有する可能性がある。これらの適用の全てに関して、ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは、それらの向上したトランスフェクションの効率および合成の容易さのため、伝統的なプラスミドまたはウイルスベクターを超える向上したプラットフォームを提供する。さらに、ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは、全ての関連のない配列（細菌の起点および抗生物質耐性）が除去されていると考えられ、従って宿主のＤＮＡへの相同性結合に干渉することができないため、より優れた修復鋳型を提供するであろうと予想することができる。
【００５０】
追加の態様
[0056]  ここで、本開示の様々な態様およびそのような態様に関する支持を提供する実験結果に対して参照を行うであろう。出願者らは、本明細書における開示は説明的な目的のためだけのものであり、特許請求される主題の範囲を限定することを決して意図していないことを特筆する。
【実施例】
【００５１】
実施例１
ミニベクターを用いたＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎおよび標的化された遺伝子編集
[0057]  ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒがＺＦＮに媒介される標的化された遺伝子編集のための供与鋳型の役目を果たすことができることを実証するため、細胞のゲノムＤＮＡにおいて容易に検出されて定量化可能な変化をもたらすような改変がデザインされた実験を実施した。その供与鋳型は、ＩＬ２Ｒγ遺伝子の第１部分に相補的な２個の相同性領域を有するようにデザインされている。その２個の相同性領域の間に、ＸｈｏＩ制限酵素により認識され得る部位を含有する鋳型配列がある。最初の概念実証実験は、ＤＮＡを送達するためにＬｏｎｚａ、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）トランスフェクションシステムを用いて、Ｋ５６２細胞（非接着性の白血病細胞株）を用いて実施された。しかし、あらゆるアプローチ（トランスフェクション剤、電気穿孔法等）を細胞へのＤＮＡ送達のために用いることができるであろうことは特筆すべきである。ＤＮＡおよびＺＦＮのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎの後、その細胞のゲノムＤＮＡを回収し、分析した。ＸｈｏＩ部位の挿入を検出するため、適切なプライマーをＰＣＲで用いて編集に関して標的化されたＤＮＡ配列を含有するゲノムＤＮＡの区間を増幅した。次いでこの増幅されたＰＣＲ産物に対してＸｈｏＩ酵素を用いた制限消化を行った（図３）。ゲル上で泳動した際、そのＰＣＲ産物は単一のより大きいバンド（未切断、従って未編集）として残るか、または２個のより小さいバンド（切断、従ってその供与鋳型によりうまく編集された）として泳動するかのどちらかであろう。その大きいバンドのその２個のより小さいバンドに対する比率は、遺伝子標的化の成功の定量的評価を可能にした。その実験において、その供与鋳型は伝統的なプラスミド上またはＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ上のどちらかで送達された。そのはるかに小さいＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは、より大きいプラスミドに対して等しい質量の量で用いられた場合、遥かに多くの鋳型分子を提供するであろう。従って、２種類の用量のＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ：等しい質量の量のＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒおよび等しいモル量のＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒを送達すると計算されたより低い用量をプラスミド鋳型に対して比較した。
【００５２】
細胞培養の方法
[0058]  Ｋ５６２細胞（ヒト不死化骨髄性白血病細胞株、ＡＴＣＣ）を３７℃および５％ＣＯ２において保温されるＲＰＭＩ培地中で維持した。培地を２〜３日ごとに交換し、細胞濃度が１×１０６細胞／ｍＬに達した際に継代培養を実施した。その実験に備えるため、細胞を２００，０００細胞／ｍＬに分割し、２００，０００〜５００，０００細胞／ｍｌで３日間、細胞がその期間の間対数増殖期にあるように維持した。
【００５３】
ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒおよびプラスミドＤＮＡのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎのための方法
[0059]  ６ウェルプレート中で、ウェルあたり３ｍｌのＰＲＭＩ培地を３７℃に予め温めた。それぞれの試料に関して、１×１０６個の細胞を８００ＲＰＭおよび５℃で遠心沈殿させた。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ溶液を、１ｍｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ溶液ＩＩ（Ｌｏｎｚａ）を１分割量のＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ溶液Ｉ（Ｌｏｎｚａ）と組み合わせることにより調製した。細胞のペレットを１×１０６個の細胞あたり１００μｌのｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ溶液中で再懸濁した。その再懸濁した細胞に、ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒまたはプラスミドＤＮＡのどちらかの試料を添加し、十分に混合した。細胞およびＤＮＡの最終的な混合物（約１００〜１１０μｌの量）を、ｂｌｕｅ−ｔｏｐトランスフェクションキュベット（Ｌｏｎｚａ）に入れた。Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎを、２Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）（Ｌｏｎｚａ）により、プログラム２〜１６を用いて実施した。そのキュベットを、開始前にその試料が完全にそのキュベットの底部にあるように作業台の上で軽く叩いたことを特筆する。ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎが完了した直後に、５００μｌの温かい培地をそのキュベットに添加した。最終的に試料をそのキュベットから予め温めた６ウェルプレートに移した。また、キュベットを５００μｌの培地ですすぎ、それをそのウェルに添加した。プレートをインキュベーター中で３７℃および５％ＣＯ２において３から１４日間まで培養した。
【００５４】
[0060]  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ後３日目に、細胞をＦＡＣＳにより分析してトランスフェクション効率を測定した。ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ後１４日目に、ｇＤＮＡをその細胞から公開された方法を用いて回収した（Urnov et al., 2005; Zou et al., 2009）。対象のゲノム座位を適切にデザインされたプライマーを用いたＰＣＲにより標的とし、増幅した。次いでそのＰＣＲ産物を、ゲノム編集が成功である場合その挿入された制限部位を切断するであろう制限酵素ＸｈｏＩ（ＮＥＢ）により消化した。それぞれの試料に関する消化されたＰＣＲ産物を最終的にＰＡＧＥにより分析して標的化されたアレルの百分率を決定した。標的化されたアレルの百分率を、その切断されたバンドの密度対未切断のバンドの密度を比較することにより計算した。
【００５５】
ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒおよびプラスミドを用いた標的化された遺伝子編集の結果
[0061]  ＰＡＧＥを用いてその細胞集団内の標的化されたアレルの百分率を決定した。標的化されたゲノム編集が成功した場合、ＸｈｏＩ制限酵素に関する制限部位が標的とされるＩＬ２Ｒγ遺伝子のＤＮＡ内に作り出された。このＤＮＡの標的とされた領域を適切なプライマーを用いたＰＣＲにより増幅し、次いでそれに対してＸｈｏＩ酵素による制限消化を行った。ゲル上で泳動した際、改変されなかったそれらのアレルのＰＣＲ産物は、それらはその制限部位を含有せず、その酵素により切断されないため、単一のより大きいバンドとして泳動した。対照的に、供与鋳型により標的とされ修復されたあらゆるアレルは、そのＰＣＲ産物はその酵素により認識されて切断されたため、２個のより短いバンドとして泳動した。そのＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒはそのドナー鋳型を提供するのに成功し、アレルの６％〜７％がその制限部位を有するように改変されることを可能にした（図４）。
【００５６】
実施例２
ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒに基づく供与鋳型およびメガヌクレアーゼを用いた標的化された遺伝子修正
[0062]  標準的なアッセイを用いて、ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒの標的化された遺伝子修正（ＴＧＣ）に関してホーミングエンドヌクレアーゼ（レアカットメガヌクレアーゼ）との組み合わせで供与鋳型の役目を果たす能力を実証した(Humbert and Maizels, 2012)。遺伝子修正は、ＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーターの制御下の高感度緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）遺伝子の安定して組み込まれているが変異型を有するように操作してあったＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ヒト胎児性腎臓細胞）を用いた細胞培養系において達成された。このｅＧＦＰ遺伝子の変異型は、その細胞株中での蛍光レポータータンパク質（ＧＦＰ）の発現を妨げるように２個のインフレームのＮ末端停止コドンを有する。完全に機能するｅＧＦＰ発現カセット（ＰＧＫプロモーターおよびその停止コドンを欠いたｅＧＦＰ遺伝子の両方）のための鋳型を提供するＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒを生成した。従って、このＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは、細胞のゲノム中のその発現カセットに相補的なＤＮＡの領域、およびそれがその２個の停止コドンを含有しないため相補的ではない細胞中の標的とされたＤＮＡ配列に対応するより小さい領域を含有していた。その供与鋳型ＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒの２つの形態をここで試験し、１つはＰＧＫプロモーターの完全長（より長い左側の相同性の腕）を有し、１つは切り詰められたＰＧＫプロモーター配列（より短い左側の相同性の腕）を有していた。両方の形態をＨＥＫ２９３細胞の培養物中に別々にトランスフェクションした。同時に、その細胞に、そのｅＧＦＰ遺伝子中の２個の停止コドンの部位付近の２０ｂｐの標的部位において二本鎖破断を生成するレアカットヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼファミリーのＩ−Ａｎｉｌ）を送達するための組み込み欠陥レンチウイルスベクターを用いて形質導入した。うまく相同性に方向付けられる修復（ＨＤＲ）が起こると、そのｅＧＦＰ遺伝子が修正され、その細胞はＧＦＰレポーターを発現し始める（ＧＦＰ＋）。
【００５７】
[0063]  別個の蛍光タンパク質レポーター系を用いて、そのウイルスによりうまく形質導入された細胞およびＩ−Ａｎｉｌヌクレアーゼを生成している細胞を同定した。この系に関して、そのＩ−ＡｎｉｌヌクレアーゼはＴ２Ａペプチド翻訳リンカーを介してｍＴａｇＢＦＰ（単量体性青色蛍光タンパク質）に連結されていた。これは、Ｉ−Ａｎｉｌタンパク質およびｍＴａｇＢＦＰレポータータンパク質の両方が同じオープンリーディングフレームから同時に発現することを可能にした。その２種類のタンパク質は翻訳後にＴ２Ａペプチドにおける切断事象により分離され、正しいタンパク質の折り畳みおよび機能性を可能にした。従って、青色蛍光タンパク質を発現している細胞（ＢＦＰ＋）はＩ−Ａｎｉｌヌクレアーゼも発現していることを確証することができた。全ての実験に関して、その細胞集団はフローサイトメトリーにより分析された。プロトコルは以前に記載された通りに従った(Humbert and Maizels, 2012)。
【００５８】
方法
[0064]  ＨＥＫ２９３細胞を、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を１０％で補ったイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）中で接着集団として培養し、３７℃および５％ＣＯ２で保温した。培地を２〜３日ごとに補充し、培養密度が８０％近くなった際に細胞を継代した。細胞にＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ供与鋳型をトランスフェクションし、同時にＩ−ＡｎｉｌメガヌクレアーゼおよびｍＴａｇＢＦＰレポーターをコードする組み込み欠陥レンチウイルスベクターを用いて形質導入した。トランスフェクションの３日後において細胞を収集し、フローサイトメトリーにより分析してどの集団がその蛍光レポータータンパク質に関して陽性であるか決定した。
【００５９】
結果
[0065]  予想されたように、Ｉ−Ａｎｉｌ発現の非存在下では修復は存在しないことが示された（図５Ｃ、左上）。Ｉ−Ａｎｉｌを発現している細胞（ＢＦＰ＋）において、完全なＰＧＫプロモーターを有するＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒは、トランスフェクションされた細胞の３．９％において標的化された遺伝子修正を支持した。これは、伝統的なプラスミド供与体による修復の頻度に匹敵する。標的化された遺伝子修正の頻度は、ＰＧＫプロモーターの切り詰められた形態を有するＭｉｎｉＶｅｃｔｏｒ供与体を用いると１０倍低く（０．４％）；伝統的なベクターは完全長プロモーターへの類似の依存を示す（図５Ｃ）。
【００６０】
[0066]  本明細書で記載される態様は説明的なものとして解釈されるべきであり、決して何であれその開示の残りの部分を限定するものとして解釈されるべきではない。その態様を示し、記載してきたが、当業者は本発明の精神および教示から逸脱することなくその多くの変動および修正を行うことができる。従って、保護の範囲は上記で述べた記載によっては限定されず、特許請求の範囲の主題の全ての均等物を含め、特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書で引用される全ての特許、特許出願および刊行物の開示を、それらが本明細書で述べた手順または他の詳細と一致する、およびそれを補う手順または他の詳細を提供する程度まで、本明細書により本明細書に援用する。
【００６１】
参考文献
【００６２】
【化１】
2015523860.tif 000003
【００６３】
【化２】
2015523860.tif 000004
【００６４】
【化３】
2015523860.tif 000005
【図１】
2015523860.tif 000006
【図２】
2015523860.tif 000007
【図３】
2015523860.tif 000008
【図４】
2015523860.tif 000009
【図５】
2015523860.tif 000010
【国際調査報告】
2015523860.tif 000011
2015523860.tif 000012