(57)【要約】  例示の実施形態において本明細書で開示されているのは、必要とする患者の欠損した角膜を修復する、もしくは、治療するための方法及び組成物である。例えば、この方法及び組成物は、患者に対して適用量の組成物を投与することを含む。また、この組成物は、眼の送達のための噴出口を有する容器を経由して患者の眼内のエリアへ投与されてもよい。この方法及び組成物は、始原細胞遊走を促進し、患者の角膜における細胞増殖を増加させる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
角膜欠損により特徴づけられる状態を治療する方法であって、該方法は、
必要とする対象の角膜に、ＭＳ−８１８（２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロール［３，４−ｄ］ピリミジン  マレイン酸塩を含有する組成物、又は、マレイン酸塩を含まない、該ピリミジン化合物の他の薬学的に許容される塩を含有する組成物を送達すること
を備える方法。
【請求項２】
該欠損は、角膜のひっかき傷又は他のけが、フックスのジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、円錐角膜、角膜の瘢痕化、スティーブンス・ジョンソン症候群、翼状片、もしくは、角膜炎を含み、送達することは、該角膜欠損の角膜細胞との該組成物の故意の接触を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該組成物は、必要とする該対象の眼内のエリアに適用されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該対象に該組成物を適用することは、
組成物を備える容器であって、前記組成物は、ＭＳ−８１８を含有し、前記容器は、注出口を持った収納容器を備える、組成物を備える容器を得ること、
必要とする該対象の眼の位置に該容器の前記注出口を調整すること、
該容器の該注出口を経由して、必要とする該対象の眼内のエリアに該組成物を放出すること、
を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
必要とする患者の角膜又はその一部を修復する方法であって、
該患者に対して適用量の組成物、該組成物は、ＭＳ−８１８（２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロール［３，４−ｄ］ピリミジン  マレイン酸塩を含有する組成物、又は、マレイン酸塩を含まない、当該基礎をなすピリミジン化合物の他の薬学的に許容される塩を含有する組成物である、を投与すること、
を備える方法。
【請求項６】
該組成物は、該患者の眼内のエリアに投与されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
必要とする該患者は、角膜外傷を示すことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
該組成物は、液体又は半固体であることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
該方法は、
ＭＳ−８１８を含有する組成物を備える容器を得ること、
必要とする該患者の眼の位置に該容器の注出口を調整すること、
該容器の該注出口を経由して、必要とする該患者の眼内のエリアに該組成物を放出すること、
を含むこと特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
組成物を備える容器であって、前記組成物はＭＳ−８１８を含有し、前記容器は、眼の送達のための注出口を備えることを特徴とする容器。
【請求項１１】
該組成物は、液体又は半固体であることを特徴とする請求項１０に記載の容器。
【請求項１２】
該注出口は、噴出口を備えることを特徴とする請求項１０に記載の容器。
【請求項１３】
該容器は、スプレー又はミストの形での眼の送達のためのノンエアゾールで非電気的な送達機構をさらに備えることを特徴とする請求項１０に記載の容器。
【請求項１４】
眼の送達のために構成された機構を備える容器と、前記容器内に配置された、角膜欠損の治療に役立つ医薬品組成物を備え、前記医薬品組成物は、ＭＳ−８１８、又は、当該基礎をなすピリミジン化合物で形成されたマレイン酸塩以外の他の塩を含有することを特徴とする製品。
【請求項１５】
該組成物は、液体又は半固体であることを特徴とする請求項１４に記載の製品。
【請求項１６】
該組成物は、対象の眼の眼内のエリアに投与されることを特徴とする請求項１４に記載の製品。
【請求項１７】
該組成物は、眼の送達のために溶液を含むことを特徴とする請求項１４に記載の製品。
【請求項１８】
眼の上に載置するための接触を備える製品であって、前記接触は、ＭＳ−８１８、又は、当該基礎をなすピリミジン化合物で形成されたマレイン酸塩以外の他の薬学的に許容される塩で充填されることを特徴とする製品。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
角膜は、眼の前方にある透明な層の組織であり、眼の中の内容物を保護し、眼の主要な光学素子として役立つ器官である。角膜は、そのほとんどすべてが特別の種類のコラーゲンからできている。通常、角膜では血管は見られないが、神経終末を含んでいるため、角膜損傷は非常に苦痛を伴うことがある。目の屈折力の７５パーセントは、角膜と大気の境界に依存する。けが、病気、あるいは、細胞の機能不全は、後に機能障害及び角膜性失明となり得る角膜の混濁化を引き起こす場合がある。角膜混濁は、世界的に１０００万人を超える患者が発症し、死亡したドナー組織の移植、あるいは、ここ最近なって高度に発展した幹細胞生体組織検査及び移植法によってしばしば治療される。これらの移植術は、一部の問題（ドナー組織の拒絶、移植術の複雑さ、提供された眼の保存期間がたった数日しか持たず短いことによる角膜のドナーへの要求の増大）により、しばしば成功率が低い。移植を含む角膜の治療及び修復の既知の方法は、侵襲性の手順を含むため、病院又は医院において行なわなければならないとともに、提供された組織が必ずしも、すぐ利用可能だとは限らないため、さらに大きな費用がかかる。
【０００２】
米国アイバンク協会によれば、毎年４０，０００件を超える角膜移植が米国で行われる。また、角膜の被移植者は、生後９日から１０３歳までの年齢に及ぶ。典型的な角膜移植では、ディスク状の組織を眼の中心から除去し、ドナーの眼からの対応するディスクと交換する。円形の切り込みは、トレパンと呼ばれる、クッキーの抜き型に似た道具を使用して、加えられる。角膜移植（全層角膜移植（ＰＫ））の１つの形態では、除去されたディスクは角膜の全層である。また、交換ディスクもそうである。（次を参照のこと。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｕｒｇｅｒｙｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ．ｃｏｍ／Ｃｅ−Ｆｉ／Ｃｏｒｎｅａｌ−Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ＃ｉｘｚｚ１ｒ５ＩｘＣｔＴｂ）。ドナー角膜は、移植において非常に素晴らしい縫合で取り付けられる。手術は、患者の目は覚めていながら身体の１エリアに制限される麻酔（局所麻酔）、又は、患者の全身を意識消失の状態にする麻酔（全身麻酔）の下で行なうことができる。角膜移植の外科手術は、通常は３０〜９０分を要する。米国の全角膜移植の９０％以上は、ＰＫである。表層角膜移植術（ＬＫ）では、角膜の外側層だけを除去して交換する。ＬＫは、早期の抜糸や感染症の危険の減少を含む多くの長所を持つ。しかしながら、ＬＫは、より多くの時間がかかり、外科医によるはるかに大きな技術能力を要するため、ＰＫほど広く使用されない。
【０００３】
角膜移植術は、最も一般的なヒト移植手術で、最も高い成功率を誇る。患者が病気又はけがの結果、角膜損傷により視力を失った場合、しばしば角膜移植は必要となる。また、他の実行可能な選択肢は存在しない。角膜性失明は、開発途上国では、失明の８〜２５％の原因である（Ｇａｒｇら、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ，Ｅｙｅ  （２００５）  １９，  １１０６−１１１４．  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｊ．ｅｙｅ．６７０１９６８  “Ｔｈｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｃｏｒｎｅａｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ”「失明の軽減における角膜移植の価値」）。角膜の混濁を引き起こす、又は、器官の自然な曲率を変更する、及び、視力質を低下させ得る様々な角膜の状態は、円錐角膜（角膜の外部の膨大）、フックスのジストロフィー（角膜内皮の不調）、偽水晶体性水疱性角膜症（痛みを伴う角膜の膨潤）、翼状片（角膜上の組織の増殖）、及び、スティーブンス・ジョンソン症候群（眼に影響を与える皮膚病）を特に含む。これらの各種疾患は、角膜移植を要し得る。化学的熱傷、物理的損傷、あるいは、ウィルス、バクテリア、菌類又は原虫類による感染症により角膜へのけがが生じる場合にも、角膜移植が必要とされ得る。
【０００４】
結局、問題（ドナー組織の拒絶、移植術の複雑さ、提供された眼の保存期間がたった数日しか持たず短いことによる角膜のドナーへの要求の増大、提供された組織への信頼のために必要なだけでなく、専門外科医又は医療施設の使用に必要とされる増加費用）を含む角膜移植術に関連した危険及び費用が、低侵襲性で、より多くの費用対効果の大きい治療方法の必要を実証する。
【発明の概要】
【０００５】
角膜の細胞増殖の増大を提供する方法及び組成物が本明細書で見いだされる。死亡したドナーからの移植、並びに、幹細胞生体組織検査法、及び移植法を含む、角膜の修復又は交換のための高価で複雑な現在の治療法とは対照的に、対象の方法及び組成物は法外に高くはない。さらに、対象の実施形態の侵襲性のレベルは、診療及び治療の現在の標準よりはるかに低い。本明細書に開示した実施形態は、本明細書に見いだされた方法及び組成物により治療された患者において、迅速で大幅な角膜再生を提供する。指数関数的な角膜細胞増殖は、本明細書に記述された方法及び組成物により達成された。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１Ａ】図１Ａは、０ｍｇ／ｍｌのＭＳ−８１８を含有する点眼薬の投与を受けた対照動物の角膜の２０ミクロンの厚さの矢状切片の１００倍拡大図を提供する。赤いドットは、増殖細胞を示すＢｒｄＵ免疫反応性を表わす。青は、細胞核の対比染色法である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、１ｍｇ／ｍｌのＭＳ−８１８を含有する点眼薬の投与を受けた高投与量動物の角膜の２０ミクロンの厚さ矢状切片の１００倍拡大図を提供する。赤いドットは、増殖細胞を示すＢｒｄＵ免疫反応性を表わす。青は、細胞核の対比染色法である。
【図２】図２は、眼の矢状断面の模型を提供する。ここで、図１及び図４Ａ〜図４Ｄの画像の視野を、ブルーボックスで強調した。画像は、国立眼病研究所のウェブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｅａｌｔｈ／ｃｏｒｎｅａｌｄｉｓｅａｓｅ／＃６の  Ｆａｃｔｓ  Ａｂｏｕｔ  ｔｈｅ  Ｃｏｒｎｅａ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ（角膜及び角膜疾患に関する事実）のページ上から得られた。
【図３】図３は、目薬を投薬するために構成された容器の一例の図である。この容器は、眼の送達ために一定の容積の組成物を保持するための収納容器（ｈｏｕｓｉｎｇ）、及び、注出口（ｏｕｔｌｅｔ  ｐｏｒｔ）を含む。
【図４Ａ】ラットの眼の矢状切片の一連の写真が、増加した細胞増殖に相互に関連するＢｒｄＵ（赤）の存在を示すことを示す図であり、図４Ａは、対照動物に関する。
【図４Ｂ】ラットの眼の矢状切片の一連の写真が、増加した細胞増殖に相互に関連するＢｒｄＵ（赤）の存在を示すことを示す図であり、図４Ｂは、１００μｇ／ｍｌで処理された動物に関する。
【図４Ｃ】ラットの眼の矢状切片の一連の写真が、増加した細胞増殖に相互に関連するＢｒｄＵ（赤）の存在を示すことを示す図であり、図４Ｃは、３００μｇ／ｍｌで処理された動物に関する。
【図４Ｄ】ラットの眼の矢状切片の一連の写真が、増加した細胞増殖に相互に関連するＢｒｄＵ（赤）の存在を示すことを示す図であり、図４Ｄは、１０００μｇ／ｍｌで処理された動物に関する。
【図５】図５は、図４Ａ〜図４Ｄに示される視野と同様のいくつかの異なる動物（ｎ＝６）の角膜においてカウントされた、ＢｒｄＵに対する陽性の核の数を表す。垂直のカラムは、対照、低用量、中用量、及び、高用量のＭＳ−８１８の平均を表し、各カラム上の垂線の直線は、各グループの標準偏差を表す。処理されたグループにおけるＢｒｄＵ陽性の核は、対照より著しく高い（ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本発明の原理及び作用についての理解を促進する目的のために、図面の中で説明された実施形態を本明細書では参照する。また、同じことについて記載するために特定の言語を使用する。しかしながら、これにより発明の範囲の制限が意図されないことは理解されるだろう。本発明の属する分野の当業者であれば、説明したような方法及び装置の変更及び更なる変形、並びに、本明細書で説明したような発明の原理の更なる応用を通常は思いつくであろう。
【０００８】
角膜における細胞増殖を増加させる独自の点眼剤の能力が、初めて本明細書にて実証される。失明に関係する状態を含めて、健康な角膜組織の再生のための臨床的適応は多数ある。これらの状態のための現在の既知の治療法は、死亡したドナーからの角膜移植、並びに、ここ最近になって高度に発展した幹細胞生体組織検査法及び移植法を含む。両者は、多くの人々にこれらの治療を使用するには法外に高く、法外に複雑である。本明細書で開示した技術は、はるかに低侵襲性で、投与することがはるかに容易で、よりコスト効率の良い、これらの治療の代替案を提供する。以下により詳しく議論されるように、この溶液の投与を受ける動物は、迅速で実質的な角膜再生の達成に関して臨床的有効性を表わして、対照動物よりも指数関数的な角膜細胞増殖を実証した。
【０００９】
本明細書での実施形態は、角膜外傷又は病気に利用可能なより侵襲性でより高価な治療に取って代わる新規の発明を提供する。現在、角膜の状態の種々のグループは、角膜移植又は輪部移植（角鞏膜の輪部からの組織での幹細胞の移植）のための適用である。国立眼病研究所によれば、これらの状態は、フックスジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、円錐角膜及び角膜の瘢痕化を特に含む（ｗｗｗ．ｎｅｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖを参照）。角膜移植及びアロ輪部移植は、両方とも、ドナー組織の使用を要する。これらの治療に続いて、移植片拒絶を回避するために、一生涯、免疫抑制治療が必要となる。一例において、点眼薬によるＭＳ−８１８の投与は、これらの治療に対して、治療の利用可能性を増し、移植片拒絶陽性を含む代替治療の副作用を減少させる、簡単でコスト効率の良い代替案を提供する。
【００１０】
一実施形態では、角膜欠損により特徴づけられる状態を治療する方法が提供される。この方法は、ＭＳ−８１８（２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロール［３，４−ｄ］ピリミジン  マレイン酸塩）を含有する組成物、又は、マレイン酸塩以外のピリミジン化合物の薬学的に許容される塩を適用することを含む。治療される状態は、フックスジストロフィー、虹彩角膜内皮症候群、円錐角膜、角膜の瘢痕化、スティーブンス・ジョンソン症候群、翼状片、及び／又は、角膜炎を含んでもよい。一実施形態では、この方法は、必要とする対象の眼内のエリアに組成物が適用されるように提供される。
【００１１】
この化合物の他の薬学的に許容される塩の例は、第四級アンモニウム（又はアミン）塩と及びその水和物と同様に、陰イオン（塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、亜硫酸水素塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸エステル、コハク酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、安息香酸塩、クエン酸塩、グルコン酸塩、グルカル酸塩、メタンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸及びナフタレンスルホン酸塩）及びそれらの水和物を含む薬学的に許容される無毒な酸付加塩を形成することができる酸から形成された塩を含む。
【００１２】
別の実施形態では、この方法は、対象に組成物を適用することが、ＭＳ−８１８を含有する組成物を含む容器を提供すること、必要とする対象の眼の位置に容器の注出口（ｏｕｔｌｅｔ  ｐｏｒｔ）を調整すること、及び、容器の注出口を経由して、必要とする対象の眼内のエリアへ組成物を放出すること、を含むように提供される。
【００１３】
別の実施形態では、必要とする患者において、角膜又はその一部を修復する方法が提供される。この方法は、ＭＳ−８１８（２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロール［３，４−ｄ］ピリミジン  マレイン酸塩）を含有する組成物を患者へ投与することを含む。この方法は、組成物が患者の眼内のエリアに投与されることをさらに含む。更なる実施形態では、必要とする患者は角膜外傷を示す。また更なる実施形態では、組成物は、液体又は半固体である。
【００１４】
また別の実施形態では、必要とする患者において、角膜又はその一部を修復する方法は、ＭＳ−８１８を含有する組成物を備える容器を提供すること、必要とする患者の眼の位置に容器の注出口を調整すること、及び、容器の注出口を経由して、必要とする患者の眼内のエリアに組成物を投与すること、を含むように提供される。
【００１５】
また別の実施形態では、ＭＳ−８１８を含有する組成物を備える容器が提供される。ここで、容器は、眼の送達のための注出口を含む。容器は、組成物が液体又は半固体であるように、さらに提供される。更なる実施形態では、容器は、注出口が噴出口（ｓｐｏｕｔ）を含むように提供される。また更なる実施形態、容器は、スプレー又はミストの形で眼に送達するためのノンエアゾールで非電気的な送達機構を含む。眼の送達装置の例は、米国特許出願公開第２００４／００５２８７７号、第２００５／０１６５３６８号、第２００８／０２３３０５２号、米国特許第４，４８４，９２２号（ＭＳ−８１８又は関連する塩で浸すことができ、かつ、その化合物を角膜の細胞と接触する角膜上に置くことができる膜組織）、第４，７３３，８０２号、第６，７３６，８０２号、第６，７４０，０６５号、第６，５０６，１８３号、第５，０５９，１８８号、第４，８３４，７２８号、第４，９６０，４０７号、及び、第３，７５６，４７８号で教示されたものを含むが、これに限定されない。
【００１６】
更なる実施形態では、必要とする対象における角膜欠損の治療のための医薬品組成物が提供される。医薬品組成物は、治療薬を含み、この治療薬は、ＭＳ−８１８を含有する。
ＭＳ−８１８は、医薬品組成物が対象の眼域へ投与される場合、対象の角膜における始原細胞の遊走を促進し、かつ、細胞増殖を増大させる。医薬品組成物は、一実施形態においては、液体又は半固体として提供される。更なる実施形態では、組成物は対象の眼の眼内のエリアへ投与される。また、更なる実施形態では、組成物は、眼の送達のための溶液を含む。
【００１７】
実施例
角膜再生におけるＭＳ−８１８の効果
ＭＳ−８１８（２−ピペラジノ−６−メチル−５−オキソ−５，６−ジヒドロ（７Ｈ）ピロール［３，４−ｄ］ピリミジン  マレイン酸塩）は、宿主生物における内在性の幹細胞の増殖を促進するその能力のために、本明細書で発見された。多様な組織タイプの中で、広い増殖促進効果が本明細書で同定された。さらに、角膜における組織再生に対するＭＳ−８１８の効果は、これまでに発見されていない。一連の対照実験では、ＭＳ−８１８は、３つの投薬グループ及び１つの対照グループに分けられた動物に対して点眼薬によって投与された。ＭＳ−８１８について、けががある状態及びない状態の両方での角膜再生に対する効果のための試験を行った。予備実験の結果は、けがをしていない目において、薬の投与を受けていない対照グループにおけるものに対して、薬に暴露された動物での増殖において著しい増加を示す。したがって、この非侵襲性の角膜の治療の使用から、広範囲の角膜疾患又は外傷を持った対象が利益を得ることが本明細書で同定された。
【００１８】
実験１−材料及び方法
手術は１６匹のラットから左の涙腺を取り除くために行われた。その後、ＭＳ−８１８は、３つの投薬グループ（１ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、及び、１０ｍｇ／ｍｌ）に分けられた１２匹のラットの両眼に対して点眼薬によって投与された。対照グループとして役立つ残りの４匹のラットは、リン酸緩衝生理食塩水の点眼投与を受けた。化合物は、３日の期間にわたって３回投与された。ＢｒｄＵは、腹腔内注射によってこの間に投与された。ラットは、最初の化合物の投与の７日後に安楽死させられ、潅流を行った。眼は、クライオスタットを使用して、２０ミクロンの切片の中でスライスされた。切片はスライドガラスに乗せられた。その後、スライドは、核の中へのＢｒｄＵの組み込みのための試験を行うために、モノクローナルのマウスａｎｔｉ  ＢｒｄＵ一次抗体で染色された。ＴＲＩＴＣ結合ロバａｎｔｉマウス二次抗体は、一次抗体を検知するために使用された。スライドは、核を視覚化するためにＤＡＰＩで染色された。画像は、ＴＲＩＴＣ、ＤＡＰＩ及びＦＩＴＣ蛍光の下の１００倍拡大での切片を撮ったものである。
【００１９】
結果
ＢｒｄＵのための抗体染色は、対照の動物及び薬の投与を受ける動物の手術を行っていない（左）眼の間の有意差を明らかにした。図に戻って、図１Ａ及び１Ｂは、対照動物（図１Ａ）及び高投与量（１ｍｇ／ｍｌ）の投与を受ける動物（図１Ｂ）の角膜の２０ミクロンの厚さの矢状切片の１００倍拡大である。各図における構成は、角膜の中央の一部である。青いシグナルは、核の対比染色法である。赤い蛍光は、陽性のＢｒｄＵ染色を示し、結果として細胞増殖のための陽性の結果を示す。図１Ａは、角膜内にＢｒｄＵ陽性のシグナル（赤）をほとんど示さないが、図１Ｂは、顕著に増加したＢｒｄＵの陽性のシグナルを示す。これらの所見により、ＭＳ−８１８がラット角膜における細胞増殖を引き起こすことが実証される。
【００２０】
図２は、眼の矢状断面の概略図を提供する。図１及び図４の画像の視野は、ブルーボックスで強調される。画像は、国立眼病研究所のウェブサイト、Ｆａｃｔｓ  Ａｂｏｕｔ  ｔｈｅ  Ｃｏｒｎｅａ  ａｎｄ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ（角膜及び角膜疾患に関する事実）から得られた（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｅａｌｔｈ／ｃｏｒｎｅａｌｄｉｓｅａｓｅ／＃６を参照）。
【００２１】
実験２−材料及び方法
実験１に同様の別の実施例によれば、手術は１６匹のラットから左の涙腺を取り除くために行われた。その後、ＭＳ−８１８は、３つの投薬グループ（１００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ）に分けられた１２匹のラットの両眼に対して点眼薬によって投与された。対照グループとして役立つ残りの４匹のラットは、リン酸緩衝生理食塩水の点眼投与を受けた。化合物は、３日の期間にわたって３回投与された。ＢｒｄＵは、腹腔内注射によってこの間に投与された。ラットは、最初の化合物の投与の７日後に安楽死させられ、潅流を行った。眼は、クライオスタットを使用して、２０ミクロンの切片の中でスライスされた。切片はスライドガラスに乗せられた。その後、スライドは、核の中へのＢｒｄＵの組み込みのための試験を行うために、モノクローナルのマウスａｎｔｉ  ＢｒｄＵ一次抗体で染色された。ＴＲＩＴＣ結合ロバａｎｔｉマウス二次抗体は、一次抗体を検知するために使用された。スライドは、核を視覚化するためにＤＡＰＩで染色された。画像は、ＴＲＩＴＣ、ＤＡＰＩ及びＦＩＴＣ蛍光の下の１００倍拡大での切片を撮ったものである。
【００２２】
結果
ＢｒｄＵのための抗体染色は、対照の動物及び薬の投与を受ける動物の手術を行っていない（左）眼の間の有意差を明らかにした。図に戻って、図４Ａは、対照動物の矢状方向の眼の切片である。図４Ｂは、ＭＳ−８１８の点眼薬の１００μｇ／ｍｌの投与量を与えられた動物の矢状切片である。図４Ｃは、３００μｇ／ｍｌの投与量を与えられた動物の矢状切片である。そして、図４Ｄは、１ｍｇ／ｍｌの投与量を与えられた動物の矢状切片である。各図における構成は、角膜の中央の一部である。赤い蛍光は、陽性のＢｒｄＵ染色を示し、結果として細胞増殖のための陽性の結果を示す。青は、核の対比染色法である。図に示すように、治療された動物は、対照動物よりも細胞増殖において著しい増加を有する。これらの所見により、ＭＳ−８１８がラット角膜における細胞増殖を引き起こすことが実証される。
【００２３】
図５は、単位視野当たりのＢｒｄＵに対して陽性の核の結果の統計的分析を示す。図に示すように、顕著かつ投与量依存的な増加が、ＭＳ−８１８点眼薬に治療された動物で得られ、高投与量動物でＢｒｄＵの陽性の核の数が最高となる。
【００２４】
投与量
本発明に従って、対象（特に人間）に投与された投与量は、合理的な期間（タイムフレーム）をかけて、対象において所望の反応を達成するのに十分であるべきである。当業者であれば、投与量が、使用された特定の組成物の強さ、対象の年齢、種、状態及び体重を含む様々な要因に依存するだろうということを認識するだろう。また、投与量の大きさは、投与のルート、タイミング及び頻度だけでなく、特定の組成物の投与に伴う有害な副作用の存在、性質及び範囲、並びに、所望の生理的影響により決定されるだろう。当業者であれば、様々な状態又は所望の結果のために、複数回投与を伴う長期の治療を要することがあることが分かるであろう。
【００２５】
適切な投与量及び投与計画は当業者にとって既知の従来の範囲発見技法により決定することができる。一般に、必然的にではないが、治療は、低投与量から始められ、化合物の至適投与量未満である。その後、投与量は、現状で最適の結果に到達するまで、小さな増分で増加される。
【００２６】
１回投与当たりに投与された本発明の化合物又は組成物の量、もしくは、１日当たりに投与された総量は、予め決められてもよい。あるいは、それは、患者の状態の性質及び重症度、治療されている状態、患者の年齢、体重及び健康状態、化合物に対する患者の耐性、投与ルート、化合物及びの投与されている任意の二次的治療薬（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｇｅｎｔ）の活性、有効性、薬物動態及び毒性プロファイルのような薬理学的な考察等を含む多数の要因を考慮に入れることにより、個々の患者基準で決定されてもよい。このような治療を受ける患者は、治療の有効性を決定するために、通常は日常的にモニターされるだろう。医師による継続的なモニターにより、本発明の最適な量の化合物が所定の時間に投与されるであろうことが保証されるだけでなく、治療の持続時間の決定も促進されるであろう。二次的治療薬（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ａｇｅｎｔ）は、それらの選択、投与量及び治療の持続時間も調節する必要があるため、投与されている場合は、特定の値となる。このように、所望の有効性を示す最低の量の化合物又は組成物が投与され、さらに、最適な結果を無事達成するのに必要な長さでその投与が継続されるように、治療計画及び服薬スケジュールは、治療経過にわたって調節することができる。
【００２７】
医薬品組成物
本発明の様々な実施形態には、一般に病理として定義された様々な状態を治療するための製剤の組成として価値のある応用があることを予見される。従って、発明の実施形態は、また、薬学的に許容される担体と関連づけられた本発明の１つ以上の化合物を含む医薬品組成物を含有する。好ましくは、これらの組成物は、眼科用液剤のような単位剤形である。しかし、また、これらは、タブレット、錠剤、カプセル、パウダー、果粒剤、無菌の非経口液又は懸濁液、定量エアゾール又は液体スプレー、滴剤、アンプル又は眼への投与のための自動インジェクタ装置を含んでもよい。最も好ましくは、これらの組成物は、眼科用液剤のための単位剤形である。液体又は半固体溶液、及び、本明細書で同定される組成物のような組成物の調製のために、本明細書で同定した、主要な有効成分は、医薬キャリア、及び／又は、水のような賦形剤と混合されて、本発明の化合物／組成物の均一混合物、又は、薬学的に許容される均等物を含む前処方の組成物を形成する。これらの前処方の組成物を均一として言及する場合、有効成分が組成物の全体にわたって均一に分散され、組成物が等しく有効な単位剤形へとすぐ細分されることを意味する。その後、この液体又は半固体前処方組成物は、上記のタイプの単位剤形へ細分される。組成物は、バイアル、スポンジ、シリンジ、チューブ又は他の適切な容器に入れられてもよい。
【００２８】
眼への送達に具体的に適した組成物の例（これらは、治療効果のある化合物としてＭＳ−８１８又は関連する塩を含むのに適しているかもしれない）は、米国特許第５，１４１，９２８号、第５，７７６，４４５号、第５，２００，１８０号、第５，４２２，１１６号、第５，８８８，４９２号、第４，４７４，７５１号、第４，００３，９９１号、第３，４５０，８１４号、及び／又は、第３，４１５，９２９号に教示されるものを含むが、これらに限定されない。組成物は、油性又は水性の媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）中で、懸濁液、溶液、又は、乳液の形をとり、懸濁剤、安定剤、及び／又は、分散剤のような調合剤を含み得る。あるいは、組成物は、使用の前に（例えば、滅菌発熱性物質除去蒸留水のような適切な媒体（ｖｅｈｉｃｌｅ）と共に構成するために粉末形態（例えば、凍結乾燥）であってもよい。また、他の投与ルートが使用されてもよい。
【００２９】
本明細書で使用されるように、用語「共投与」又は「共投与すること」は、生物学的効果が相乗的にオーバーラップするように、ある物質の投与を別の物質の投与よりも前に、同時に、又は、後に行うことを言う。
【００３０】
本明細書で使用されるように、用語「エリア」又は「領域」は、溶液に直接接触する部分を含むが、これに制限されない。また、前頭骨及び上顎骨及び頬骨によって前方及び後方を取り囲まれた眼窩全体を含む、周辺エリアも含むが、これに限定されない。
【００３１】
本明細書で使用されるような「容器」（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）は、化合物又は組成物のための収納容器（ｈｏｕｓｉｎｇ）を指し、アンプル、エアゾール缶、スポンジ、シリンジ、バイアル、チューブ、ボトル、パウチ、薬剤が注がれた眼のコンタクト、及び、細片含むが、これらに限定されない。
【００３２】
本明細書で使用されるように、「対象」、「患者」という用語は、交換可能に使用される。本明細書で使用されるように、用語「対象」は、動物、好ましくは非霊長動物（例えばウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットｅｔｃ．）、及び、霊長動物（例えばサル及びヒト）のような哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
【００３３】
特定の化合物を投与するために１つ以上のルートを使用することができるが、特定のルートは別のルートより多くの即時で、より有効な反応を提供することができる。従って、記載された投与ルートは単なる例示であり、全く限定的ではない。
【００３４】
本明細書中で言及される全ての特許、特許出願、特許公報、技術刊行物、科学出版物、及び、他の参考文献は、本発明が属する技術分野をより完全に記載するために本出願で参考として本明細書で援用されることに留意すべきである。
【００３５】
特定の緩衝液、培地、試薬、細胞、培養条件など、又はそのあるサブクラスに関する言及は、限定することを意図せず、その議論が行われる特定の文脈で関心があり価値があると当業者が認めるそのような関連する材料全てを包含すると解釈されるべきである。例えば、１つの緩衝液系又は培養培地を別のものと置換して、異なるが公知の方法を使用して、示唆される方法、材料又は組成物の使用が目指すものと同じ目標を達成することが多くの場合可能である。
【００３６】
本明細書中で用いられる全ての技術用語及び科学用語は、当然のことながら本明細書中で特に別段の規定がない限り、当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有することが意図されるということが本発明の理解にとって重要である。本明細書中で用いられる技術も、特に記載しない限り、当業者に公知のものである。本明細書中で開示され、請求される発明をさらに明確な理解を促進するために、以下の定義を記載する。
【００３７】
多くの本発明の実施形態を本発明に関連して本明細書中で示し、記載してきたが、そのような実施形態は例示のみのために提供され、限定するものではない。本明細書中の発明から実質的に逸脱することなく、多くの変形、変更、及び、置換が当業者には思い当たるであろう。例えば、本発明は本明細書中で開示されるベストモードに限定される必要はない。なぜなら、他の応用が本発明の教示から等しく恩恵を受け得るからである。さらに、請求項において、ミーンズプラスファンクション及びステッププラスファンクション条項は、列挙される機能及び構造的等価物又は作動的等価物だけでなく、等価な構造又は等価な作動もそれぞれ実施すると記載されるようにそれぞれ本明細書中で記載される構成及び作動を網羅することが意図される。したがって、そのような修飾はすべて、それらの解釈に関して関連する規則にしたがって、以下の特許請求の範囲で定義される本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【００３８】
さまざまな本発明の実施形態を本明細書中で示し、記載してきたが、そのような実施形態は例示のみのために提供されていることは明らかであろう。本明細書中の本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更、及び、置換を行うことができる。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲の精神及び範囲によってのみ限定されることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【国際調査報告】
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