(57)【要約】本開示は、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒する酵素を発現するように操作された組換え微生物に関する。本開示はさらに、当該組換え微生物を炭素源の存在下で培養することによって脂肪酸アミドを生産する方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列を含み、炭素源の存在下で培養される、組換え微生物。
【請求項２】
前記ポリペプチドがパルミトイルプトレシン合成酵素 (PPS) ポリペプチドである、請求項1に記載の組換え微生物。
【請求項３】
前記PPSポリペプチドが、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項2に記載の組換え微生物。
【請求項４】
前記PPSポリペプチドが、SEQ ID NO: 1を含むアミノ酸配列を有する、請求項2に記載の組換え微生物。
【請求項５】
前記PPSポリペプチドが、SEQ ID NO: 2を含む核酸配列によってコードされる、請求項2に記載の組換え微生物。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、N-(4-アミノ-2-ヒドロキシブチル)テトラデカンアミド合成酵素 (AhtS) ポリペプチドである、請求項1に記載の組換え微生物。
【請求項７】
前記AhtSポリペプチドが、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項6に記載の組換え微生物。
【請求項８】
前記AhtSポリペプチドが、SEQ ID NO: 3を含むアミノ酸配列を有する、請求項6に記載の組換え微生物。
【請求項９】
前記AhtSポリペプチドが、SEQ ID NO: 22を含む核酸配列によってコードされる、請求項6に記載の組換え微生物。
【請求項１０】
前記炭素源が炭水化物である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１１】
前記一級アミンが、3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミン、(±)-1-アミノ-2-プロパノール、2-メトキシエチルアミン、3-アミノ-1-プロパノール、2-アミノ-1,3プロパンジオール、3-メトキシプロピルアミン、N-(2-ヒドロキシエチル)エチレンジアミン、ブチルアミン、および1,4-ジアミノブタン、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１２】
前記アシルチオエステルが脂肪酸アシル-ACPまたは脂肪酸アシル-CoAである、請求項1〜11のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１３】
前記脂肪酸アシル-ACPまたは前記脂肪酸アシル-CoAが、前記微生物によって産生される、請求項12に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
脂肪酸生合成ポリペプチド、チオエステラーゼポリペプチド（EC 3.1. 2.14またはEC 3.1.1.5）、およびアシル-CoA合成酵素ポリペプチド (EC 2.3.1.86) のうちの1つまたは複数をコードする核酸配列を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
チオエステラーゼポリペプチドおよびアシル-CoA合成酵素ポリペプチドをコードする核酸配列を含む、請求項14に記載の組換え微生物。
【請求項１６】
前記チオエステラーゼポリペプチドをコードする核酸配列が、‘tesAの核酸配列を含む、請求項14または15に記載の組換え微生物。
【請求項１７】
前記アシルCoA合成酵素ポリペプチドをコードする核酸配列がfadDである、請求項14〜16のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１８】
前記脂肪酸生合成ポリペプチドが、accABCD、FabD、FabH、FabG、FabB、FabA、FabZ、FabF、FabI、またはFadRをコードする核酸配列より選択される、請求項14〜17のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項１９】
細菌、ラン藻、藻類、または真菌である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２０】
真菌である、請求項19に記載の組換え微生物。
【請求項２１】
前記真菌が酵母または糸状菌である、請求項20に記載の組換え微生物。
【請求項２２】
サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・リポリティカ (Candida lipolytica)、大腸菌 (Escherichia coli)、アルスロバクター (Arthrobacter)、ロドトルラ・グルチニス (Rhodotorula glutinins)、アシネトバクター (Acinetobacter)、カンジダ・リポリティカ、ボツリオコッカス・ブラウニー (Botryococcus braunii)、ビブリオ・ファーニシイ (Vibrio furnissii)、ミクロコッカス・ルテウス (Micrococcus leuteus)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア (Stenotrophomonas maltophilia)、枯草菌 (Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス (Bacillus lichenoformis)、シュードモナス・プチダ (Pseudomonus putida)、シュードモナス・フルオレッセンス (Pseudomonas florescens)、ストレプトマイセス・セリカラー (Streptomyces coelicolor)、シネココッカス・エスピー (Synechococcus sp.) PCC7002、サーモシネココッカス・エロンガタス (Thermosynechococcus elongatus) BP-1、プロトテカ・モリフォルミス (Prototheca moriformis)、プロトテカ・クルガニ (Prototheca krugani)、プロトテカ・スタグノラ (Prototheca stagnora)、プロトテカ・ゾフィ (Prototheca zopfii)、またはクロレラ・プロトセコイデス (Chorella protothecoide) 細胞である、請求項1〜19のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２３】
アルスロバクター AK 19、アシネトバクター・エスピー M-1株、大腸菌B、大腸菌C、大腸菌K、または大腸菌W細胞である、請求項22に記載の組換え微生物。
【請求項２４】
前記一級アミンおよび前記アシルチオエステルの前記脂肪酸アミドへの変換を触媒する前記ポリペプチドが、前記微生物にとって内因性である、請求項1〜23のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２５】
前記一級アミンおよび前記アシルチオエステルの前記脂肪酸アミドへの変換を触媒する前記ポリペプチドが、前記微生物にとって外因性である、請求項1〜23のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２６】
前記脂肪酸アミドが脂肪酸アルカノールアミドまたは脂肪酸アミドアミンである、請求項1〜25のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２７】
セリンデカルボキシラーゼポリペプチドを発現する、請求項1〜26のいずれか一項に記載の組換え微生物。
【請求項２８】
以下の段階を含む、脂肪酸アミドを生産する方法：
(a) 請求項1〜27のいずれか一項に記載の組換え微生物を提供する段階；および
(b) 一級アミンおよびアシルチオエステルの該脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列の発現に適した条件下において、該ポリペプチドに対する少なくとも1つの基質の存在下で、該組換え微生物を培地中で培養する段階。
【請求項２９】
前記培地から前記脂肪酸アミドを単離する段階をさらに含む、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
前記脂肪酸アミドが、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20脂肪酸アルカノールアミドである、請求項28または29に記載の方法。
【請求項３１】
前記脂肪酸アミドが、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20脂肪酸アミドアミンである、請求項28または29に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は2012年4月13日に出願された米国仮特許出願第61/623,711号の恩典を主張し、その開示全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表
本出願は、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出され、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含む。2013年3月11日に作成された前記ASCIIコピーは、LS00041PCT_SL.txtと命名され、69,769バイトの大きさである。
【０００３】
分野
本開示は、炭素源の存在下で培養された場合に脂肪酸アミドを産生するために酵素を発現するよう操作された微生物に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
脂肪酸アミドは、多種多様な生化学的機能および生理学的機能を有する動物脂質および植物脂質の内因性成分である (Bachur et al. (1965) J. Biol. Chem. 240:1019-1024（非特許文献1）)。N-パルミトイルエタノールアミン (PEA)、N-アラキドノイルエタノールアミド（アナンダミド）、N-オレオイルエタノールアミド (OEA)、およびN-アラキドノイルドーパミン (NADA) などの内因性脂肪酸アミドは、中枢神経系および末梢神経系においてシグナル伝達分子として機能する（例えば、Tan et al. (2006) AAPSJ. 8(3): E461-E465（非特許文献2）；およびLo Verme et al. (2004) Mol. Pharmacol. 67(1):15-19（非特許文献3）を参照されたい）。PEAは抗炎症活性および抗侵害受容活性を発揮することが実証されており、疼痛治療のためのPEAの薬学的製剤がNORMASTという商品名でヨーロッパで入手可能である（Petrosino et al. (2010) Biochimie 92(6):724-7（非特許文献4）；およびBacci et al. (2011) ISRN Surgery, Volume 2011, Article ID 917350, 6 pages; doi:10.5402/2011/917350（非特許文献5））。
【０００５】
脂肪酸アルカノールアミドおよび脂肪酸アミノアミドなどの脂肪酸アミドはまた、多種多様な非薬学的商業用途を有する。脂肪酸アルカノールアミドおよび脂肪酸アミノアミドは、パーソナルケア製品（例えば、シャンプー、ボディソープ、および洗顔クレンザー）、化粧品処方物（例えば、頬紅、マスカラ、および口紅）、および家庭用洗浄製品（例えば、洗濯洗剤、食器用洗剤、および表面洗浄組成物）の製造における発泡剤、界面活性剤、またはその中間体として有用である。脂肪酸アルカノールアミドおよび脂肪酸アミノアミドはまた、燃料添加剤として有用である。毎年100,000トンのアルカノールアミドが世界市場で消費されていると推定されている (Adiercreutz et al. (2010) Industrial Biotechnology 6(4):204-211（非特許文献6）)。
【０００６】
商業用途のための脂肪酸アルカノールアミドは、古典的には、天然の油または脂肪および原油などの原料に由来する脂肪酸または脂肪酸メチルエステルとアルカノールアミンとの間のコストのかかる有機合成反応によって生産されている（Adiercreutz et al、前記（非特許文献6）、およびFrost & Sullivan, 「Nonionic Surfactants in the Industrial Triad」 (2002)（非特許文献7）)。例えば、PEAは、以下のように、ヤシ油由来のパルミトイル脂肪酸をモノエタノールアミンとショッテン・バウマン反応にて反応させることによって生産することができる：
2015516808.tif 000002
。
【０００７】
脂肪酸アルカノールアミドはまた、生合成によって生産されている。例えば、OEAは、2つの酵素過程によりホスファチジルエタノールアミン (PE) およびsn-1-オレオイル-ホスファチジルコリン (PC) 前駆体から生産することができ、この場合、N-アシルトランスフェラーゼを用いてPEとsn-1-オレオイル-PCを反応させてN-アセチルホスファチジルエタノールアミン (NAPE) を形成させ、次にこれをリゾ-PCと混合し、NAPE特異的ホスホリパーゼDを用いて反応させてOEAおよびホスファチジン酸を形成させる（Astarita et al. (2006) Am. J. Physiol. Regal. Integr. Comp. Physiol 290:R1407-R1412（非特許文献8）を参照されたい）。
【０００８】
これらの方法、および脂肪酸アミドを合成するための当技術分野で公知の他の方法は、非効率的な反応段階を含む場合が多く、そのため経済的観点および環境的観点の両方からコストがかかる。したがって、脂肪鎖の長さおよび飽和度、ならびにアミド頭部基の種類を効率的に制御することができる、脂肪酸アミドを生産するための改善された方法および試薬の必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Bachur et al. (1965) J. Biol. Chem. 240:1019-1024
【非特許文献２】Tan et al. (2006) AAPSJ. 8(3): E461-E465
【非特許文献３】Lo Verme et al. (2004) Mol. Pharmacol. 67(1):15-19
【非特許文献４】Petrosino et al. (2010) Biochimie 92(6):724-7
【非特許文献５】Bacci et al. (2011) ISRN Surgery, Volume 2011, Article ID 917350, 6 pages; doi:10.5402/2011/917350
【非特許文献６】Adiercreutz et al. (2010) Industrial Biotechnology 6(4):204-211
【非特許文献７】Frost & Sullivan, 「Nonionic Surfactants in the Industrial Triad」 (2002)
【非特許文献８】Astarita et al. (2006) Am. J. Physiol. Regal. Integr. Comp. Physiol 290:R1407-R1412
【発明の概要】
【００１０】
概要
本開示の1つの局面は、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え微生物を提供し、この場合、該微生物は炭素源の存在下で培養される。本明細書において、微生物は、炭素源の存在下で培養された場合に、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列を発現するように操作される。1つの態様において、炭素源は炭水化物である。別の態様において、ポリペプチドは、パルミトイルプトレシン合成酵素 (PPS) ポリペプチドである。さらに別の態様において、ポリペプチドは、N-(4-アミノ-2-ヒドロキシブチル)テトラデカンアミド合成酵素 (AhtS) ポリペプチドである。
【００１１】
本開示の別の局面は、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列を有するパルミトイルプトレシン合成酵素 (PPS) ポリペプチドを提供する。1つの態様において、PPSポリペプチドは、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の態様において、PPSポリペプチドは、SEQ ID NO: 2の核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００１２】
本開示の別の局面は、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を有するN-(4-アミノ-2-ヒドロキシブチル)テトラデカンアミド合成酵素 (AhtS) ポリペプチドを提供する。1つの態様において、AhtSポリペプチドは、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の態様において、AhtSポリペプチドは、SEQ ID NO: 22の核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００１３】
その上、本開示の別の局面は組換え微生物を提供し、この場合の一級アミンには、3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミン、(±)-1-アミノ-2-プロパノール、2-メトキシエチルアミン、3-アミノ-1-プロパノール、2-アミノ-1,3プロパンジオール、3-メトキシプロピルアミン、N-(2-ヒドロキシエチル)エチレンジアミン、およびブチルアミン、1,4-ジアミノブタン、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００１４】
さらに、本開示の別の局面は組換え微生物を提供し、この場合のアシルチオエステルは脂肪酸アシル-ACPまたは脂肪酸アシル-CoAである。脂肪酸アシル-ACPまたは脂肪酸アシル-CoAは、該微生物によって産生される。
【００１５】
本開示はさらに、脂肪酸生合成ポリペプチド、チオエステラーゼポリペプチド（EC 3.1. 2.14またはEC 3.1.1.5）、およびアシル-CoA合成酵素ポリペプチド (EC 2.3.1.86) のうちの1つまたは複数をコードする核酸配列を含む組換え微生物を包含する。1つの態様において、チオエステラーゼポリペプチドをコードする核酸配列はtesAである。別の態様において、アシルCoA合成酵素ポリペプチドをコードする核酸配列はfadDである。さらに別の提要において、微生物は、accABCD、FabD、FabH、FabG、FabB、FabA、FabZ、FabF、FabI、および／またはFadRを含むがこれらに限定されない脂肪酸生合成ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００１６】
本開示はさらに、細菌、ラン藻、藻類、および真菌を含むがこれらに限定されない微生物を企図する。1つの態様において、細菌は大腸菌 (E. coli) である。別の態様において、真菌は酵母または糸状菌である。さらに別の態様において、微生物には、サッカロマイセス・セレビシエ (Saccharomyces cerevisiae)、カンジダ・リポリティカ (Candida lipolytica)、大腸菌、アルスロバクター (Arthrobacter)、ロドトルラ・グルチニス (Rhodotorula glutinins)、アシネトバクター (Acinetobacter)、カンジダ・リポリティカ、ボツリオコッカス・ブラウニー (Botryococcus braunii)、ビブリオ・ファーニシイ (Vibrio furnissii)、ミクロコッカス・ルテウス (Micrococcus leuteus)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア (Stenotrophomonas maltophilia)、枯草菌 (Bacillus subtilis)、バチルス・リケニフォルミス (Bacillus lichenoformis)、シュードモナス・プチダ (Pseudomonus putida)、シュードモナス・フルオレッセンス (Pseudomonas florescens)、ストレプトマイセス・セリカラー (Streptomyces coelicolor)、シネココッカス・エスピー (Synechococcus sp.) PCC7002、サーモシネココッカス・エロンガタス (Thermosynechococcus elongatus) BP-1、プロトテカ・モリフォルミス (Prototheca moriformis)、プロトテカ・クルガニ (Prototheca krugani)、プロトテカ・スタグノラ (Prototheca stagnora)、プロトテカ・ゾフィ (Prototheca zopfii)、またはクロレラ・プロトセコイデス (Chorella protothecoide) 細胞が含まれるが、これらに限定されない。さらに別の態様において、微生物には、アルスロバクター AK 19、アシネトバクター・エスピー M-1株、大腸菌B、大腸菌C、大腸菌K、または大腸菌W細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【００１７】
本開示の別の局面は、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え微生物を提供し、この場合、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドは、該微生物にとって内因性である。
【００１８】
本開示の別の局面は、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え微生物を提供し、この場合、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドは、該微生物にとって外因性である。
【００１９】
さらに、本開示の別の局面は、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒する酵素をコードする核酸配列を含む組換え微生物を提供する。1つの態様において、脂肪酸アミドは、脂肪酸アルカノールアミドおよび／または脂肪酸アミドアミンである。別の態様において、脂肪酸アミドは、C14、C16、および／もしくはC18脂肪酸アルカノールアミド、ならびに／またはC14、C16、もしくはC18脂肪酸アミドアミンである。さらに別の態様において、脂肪酸アミドは、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、もしくはC20脂肪酸アルカノールアミド、および／またはC8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、もしくはC20脂肪酸アミドアミンである。
【００２０】
その上、本開示の別の局面は、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え微生物を提供し、この場合、該微生物はセリンデカルボキシラーゼポリペプチドを発現する。
【００２１】
本開示は、以下を含む、脂肪酸アミドを生産する方法をさらに包含する：(a) 一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列を含む組換え微生物を提供すること；および (b) 一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列の発現に適した条件下において、該ポリペプチドに対する少なくとも1つの基質の存在下で、該組換え微生物を培地中で培養すること。本方法は、培地から脂肪酸アミドを単離することをさらに含み得る。本方法を用いて脂肪酸アミドを生産することができる。1つの態様において、脂肪酸アミドは、脂肪酸アルカノールアミドおよび／または脂肪酸アミドアミンである。別の態様において、脂肪酸アミドはC8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、もしくはC20脂肪酸アルカノールアミド、および／またはC8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、もしくはC20脂肪酸アミドアミンである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
本開示は、好ましい態様を説明するのに役立つ添付の図面と併せて読む場合に、最良に理解される。しかしながら、本開示は、図面中に開示される特定の態様に限定されないことが理解される。
【図１】エタノールアミンの存在下で培養した、パルミトイルプトレシン合成酵素 (PPS) をコードする発現ベクターで形質転換された大腸菌MG1655株DG5によって産生された脂肪種の代表的なガスクロマトグラフィー‐質量分析 (GC-MS) クロマトグラムである。上部パネルは、GC保持時間13.1分を有するピークを示し、これは下部パネルにおいて示されるMS解析により、N-パルミトイルエタノールアミドと同定された。
【図２】図2A〜2Dは、N,O-ビス(トリメチルシリル)-トリフルオロアセトアミド (BSTFA) による誘導体化後のN-パルミトイルエタノールアミド産物のGC-MSクロマトグラムである。図2Aは、GC保持時間13.3分を有するピークを示し、これは図2Eにおいて示されるMS解析により、トリメチルシリル (TMS) 保護N-パルミトイルエタノールアミドと同定された。図2B〜2Dはそれぞれ、BSTFA単独、BSTFA誘導体化していないN-パルミトイルエタノールアミド、およびブランク反応の対照クロマトグラムである。
【図３】3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミンの存在下で培養した、PPSをコードする発現ベクターで形質転換された大腸菌MG1655株DG5によって産生された脂肪N-(3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミン)アミドのGC-MSクロマトグラムである。
【図４】表示の一級アミン供給物の存在下で培養した、PPSをコードする発現ベクターで形質転換された大腸菌MG1655細胞から得られた脂肪酸アミド産物を示す。
【図５】3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミンの存在下で培養した、N-(4-アミノ-2-ヒドロキシブチル)テトラデカンアミド合成酵素 (AhtS) をコードする発現ベクターで形質転換された大腸菌MG1655株によって産生された脂肪種の代表的なGC-MSクロマトグラムである。上部パネルは、GC保持時間11.4分を有するピークを示し、これは下部パネルにおいて示されるMS解析により、C14:0脂肪N-(3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミド）と同定された。
【図６】本開示の方法に従って遺伝子改変され得る代謝経路の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
詳細な説明
天然抗生物質パルミトイルプトレシンは、GenBankアクセッション番号AY632377.1（以下、「AY632377」）(SEQ ID NO: 2) の核酸配列によってコードされるパルミトイルプトレシン合成酵素 (PPS)（GenBankアクセッション番号AAV33349.1（以下、「AAV33349」））(SEQ ID NO: 1) を発現する細菌によって産生され得る (Brady et al. (2004) J. Nat. Prod. 67:1283-1286)。大腸菌で過剰発現された場合、AY632377によってコードされるPPSは、プトレシンの1つの主要なN-アシル誘導体（1,4-ジアミノブタン）、すなわちパルミトイルプトレシンンのみを生成することが実証された（Brady et al、前記）。酵素、N-(4-アミノ-2_ヒドロキシブチル)テトラデカンアミド合成酵素 (AhtS) をコードする相同体（GeneBankアクセッション番号ACX33975.1）(SEQ ID NO: 3) は、PPSのアミノ酸配列と38%同一であるアミノ酸配列を有する。非培養細菌RM44由来のN-(4-アミノ-2-ヒドロキシブチル)テトラデカンアミド合成酵素 (AhtS) 遺伝子 (GenBank GQ869386) は、(SEQ ID NO: 22) に示される。
【００２４】
本開示は、少なくとも一部には、PPSまたはAhtSを発現する微生物（例えば、細菌）が、炭素源の存在下で培養された場合に、アシルチオエステル前駆体から脂肪酸アミドを産生し得るという発見に基づいている。理論によって縛られることは望まないが、PPSは、アシルチオエステルと一級アミンとの間のアミド化を直接触媒すると考えられる。微生物が、脂肪酸アミドを産生するために、PPSまたはAhtSなどの酵素を発現するように特異的に操作されたことは初めてである。このことは有益である、というのも、微生物はこれにより、分岐型または非分岐型を含む所望の鎖長の脂肪酸アミドを生成する簡便な生物工場として役立つからである。加えて、様々な異なる原料（例えば、トウモロコシ、サトウキビ、グリセロール、スイッチグラス）を互換的に用いて、微生物に必要な炭素源を供給することができ、柔軟性が可能になる。したがって、微生物を用いて、発酵を介して回収され得る脂肪酸アミドを要求に応じて生産することができ、それによって、依然として高価な天然油および複雑な合成化学に依存している厄介でかつコストのかかる以前の技術システムが回避される。脂肪酸アミドは、シャンプーおよび浴用製品として使用するための発泡剤、陽イオン性界面活性剤、中間体、化粧品および医薬品中の乳化剤、燃料添加剤などを含むがこれらに限定されない、多くの製品の製造のために必要とされる。
【００２５】
本開示は、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列を発現するように操作された組換え微生物を提供し、この場合、該微生物は炭素源の存在下で培養される。1つの態様において、炭素源は炭水化物である。より詳細には、微生物は、アルカノールアミドおよびアミドアミンなどの脂肪酸アミドを産生するために、一級アミン（例えば、エタノールアミン、アミン3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミン）とアシルチオエステル（例えば、アシル-CoAまたはアシル-ACP）との間のアミド化を触媒するために、PPSまたはAhtSのような酵素が発現されるように操作された。このことは新規な過程である、というのも、脂肪酸アルカノールアミド（例えば、コカミドプロピルベタインの合成において使用される中間体）およびアミドアミンは、これまで天然油（または脂肪）および原油などの原料から合成によって生産されており、これは、所望の材料が得られるまで原材料を精製することに依存するという理由で非効率的な過程であるからである。これと比較して、本開示は、微生物が、例えばアルカノールアミドおよび脂肪酸N-(3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミン)アミドが生化学的に合成されるように酵素を発現するよう操作される生産方法であって、脂肪酸アミドを生産するためのはるかにより効率的な過程である生産方法を提供する。アミノ酸または炭水化物を微生物の発酵培地に添加して、必要な炭素源を供給することができる（実施例3〜7を参照されたい）。あるいは、インビボでそれ自身の一級アミンを生成するように、微生物を操作することもできる。例えば、エタノールアミンの生合成は、セリン生合成経路およびセリン脱炭酸経路を遺伝的に増加させることによって達成することができる（実施例8を参照されたい）。酵素的に、AhtSはPPSと同じアミド化合物を生成するが、C14:0脂肪酸チオエステル基質を好む。いずれの酵素もECファミリー2.3.1.X.Xに属する。
【００２６】
本開示はさらに、組換え微生物において脂肪酸アミドを生産する方法を提供する。本方法によって生産される脂肪酸アミドには、脂肪酸アルカノールアミドおよび脂肪酸アミドアミンが含まれるが、これらに限定されない。1つの態様において、脂肪酸アミドは、C14、C16、および／またはC18脂肪酸アルカノールアミドである。別の態様において、脂肪酸アミドは、C14、C16、および／またはC18脂肪酸アミドアミンである。本方法は、(a) 一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒する、PPSまたはAhtSなどのポリペプチドをコードする核酸配列を発現するように操作された組換え微生物を提供する段階；および (b) 該ポリペプチドに対する少なくとも1つの基質の存在下で、該ポリペプチドの発現に適した条件下で該組換え微生物を培養し、それによって脂肪酸アミドを生産する段階を含む。微生物は、炭素源の存在下で培養される。炭素源は、アミノ酸、炭水化物、および脂質を含むがこれらに限定されない多種多様な異なる供給源から選択され得る。1つの態様において、炭素源は炭水化物である。微生物によって産生される脂肪酸アミドは、培養ブロス（例えば、発酵ブロス）から単離することができる。1つの態様において、脂肪酸アミドは、微生物の細胞外環境から単離される。別の態様において、脂肪酸アミドは、微生物から部分的にまたは完全に自発的に分泌される。別の態様において、脂肪酸アミドは、任意に1つまたは複数の適切な輸送タンパク質の助けを借りて、細胞外環境に輸送される。さらに別の態様において、脂肪酸アミドは細胞外環境に受動的に輸送される。
【００２７】
「脂肪酸アミド」および「アルキルアミド」という用語は、式R1CONHR2を有する化合物を指し、式中、R1は脂肪酸に由来する脂肪族基を表し、R2は、一級アミンに由来する置換もしくは非置換アルキル基、置換もしくは非置換ヘテロアルキル基、置換もしくは非置換アルケニル基、または置換もしくは非置換ヘテロアルケニル基を表す。
【００２８】
「アシルチオエステル」とは、生産宿主微生物の脂肪酸生合成経路によって「活性化」された脂肪酸を指す。アシルチオエステルは、微生物にとって内因性の脂肪酸から生成されてもよいし、またはアシルチオエステルは、微生物に外因的に提供された脂肪酸から生成されてもよい。アシルチオエステルの非限定的な例は、アシル-補酵素A (CoA) およびアシル-アシルキャリアータンパク質 (ACP) である。
【００２９】
「アシル-CoA」という用語は、アルキル鎖のカルボニル炭素とCoAの4'-ホスホパンテテイン成分のスルフヒドリル基との間で形成された、式R1-C(O)S-CoA（式中、R1は脂肪族基である）を有するアシルチオエステルを指す。「アシル-ACP」という用語は、アルキル鎖のカルボニル炭素と、ACPに付着した4'-ホスホパンテテイン成分のスルフヒドリル基との間で形成された、式R1-C(O)S-ACP（式中、R1は脂肪族基である）を有するアシルチオエステルを指す。
【００３０】
「脂肪酸」という用語は、式R1COOHを有するカルボン酸を意味する。R1は、脂肪族基、好ましくはアルキル基を表す。R1は、4〜26個の炭素原子を含み得る。ある種の態様において、R1は、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9、少なくとも10、少なくとも11、少なくとも12、少なくとも13、少なくとも14、少なくとも15、少なくとも16、少なくとも17、少なくとも18、少なくとも19、少なくとも20、または少なくとも21炭素長である。あるいは、または加えて、R1基は、22もしくはそれ未満、21もしくはそれ未満、20もしくはそれ未満、19もしくはそれ未満、18もしくはそれ未満、17もしくはそれ未満、16もしくはそれ未満、15もしくはそれ未満、14もしくはそれ未満、13もしくはそれ未満、12もしくはそれ未満、11もしくはそれ未満、10もしくはそれ未満、9もしくはそれ未満、8もしくはそれ未満、7もしくはそれ未満、または6もしくはそれ未満の炭素長である。したがって、R1基は、上記端点のいずれか2つによって制限されるR1基を有し得る。例えば、R1基は、6〜16炭素長、10〜14炭素長、または12〜18炭素長であってよい。いくつかの態様において、脂肪酸は、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、またはC26脂肪酸である。ある種の態様において、脂肪酸は、C6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17、またはC18脂肪酸である。1つの好ましい態様において、脂肪酸アミドは、C14、C16、またはC18脂肪酸アルカノールアミドである。別の好ましい態様において、脂肪酸アミドは、C14、C16、またはC18脂肪酸アミドアミンである。さらに別の好ましい態様において、脂肪酸アミドは、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20アルカノールアミドである。さらに別の好ましい態様において、脂肪酸アミドは、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、またはC20アミドアミンである。
【００３１】
脂肪酸のR1基は、直鎖または分岐鎖であってよい。分岐鎖は、複数の分岐点を有してよく、また環状分岐を含み得る。いくつかの態様において、分岐脂肪酸は、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、またはC26分岐脂肪酸である。特定の態様において、分岐脂肪酸は、C6、C8、C10、C12、C13、C14、C15、C16、C17、またはC18分岐脂肪酸である。ある種の態様において、分岐脂肪酸のヒドロキシル基は第1 (C1) 位にある。
【００３２】
ある種の態様において、分岐脂肪酸はイソ脂肪酸またはアンテイソ脂肪酸である。例示的な態様において、分岐脂肪酸は、イソC7:0、イソC8:0、イソC9:0、イソC10:0、イソC11:0、イソC12:0、イソC13:0、イソC14:0、イソC15:0、イソC16:0、イソC17:0、イソC18:0、イソC19:0、アンテイソC7:0、アンテイソC8:0、アンテイソC9:0、アンテイソC10:0、アンテイソC11:0、アンテイソC12:0、アンテイソC13:0、アンテイソC14:0、アンテイソC15:0、アンテイソC16:0、アンテイソC17:0、アンテイソC18:0、およびアンテイソC19:0分岐脂肪酸より選択される。
【００３３】
分岐または非分岐脂肪酸のR1基は、飽和または不飽和であってよい。不飽和である場合、R1基は、1つまたは複数の不飽和点を有し得る。いくつかの態様において、不飽和脂肪酸は一不飽和脂肪酸である。ある種の態様において、不飽和脂肪酸は、C6:1、C7:1、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1、C20:1、C21:1、C22:1、C23:1、C24:1、C25:1、またはC26:1不飽和脂肪酸である。他の態様において、不飽和脂肪酸は、C10:1、C12:1、C14:1、C16:1、またはC18:1不飽和脂肪酸である。さらに他の態様において、不飽和脂肪酸はω7位において不飽和である。ある種の態様において、不飽和脂肪酸はシス二重結合を含む。
【００３４】
一級アミンは、式R2NH2（式中、R2は、置換もしくは非置換アルキル鎖、置換もしくは非置換ヘテロアルキル鎖、置換もしくは非置換アルケニル鎖、または置換もしくは非置換ヘテロアルケニル鎖を表す）を有する、PPSに対する基質として役立ち得る任意の一級アミンであり得る。ある種の態様において、R2はヒドロキシル基で置換されており、脂肪酸アミドは「アルカノールアミド」または「脂肪酸アルカノールアミド」と称され得る。他の態様において、R2はアミノ基を含み、脂肪酸アミドは「アミドアミン」または「脂肪酸アミドアミン」と称され得る。
【００３５】
R2は、1〜12個の炭素原子を含み得る。ある種の態様において、R2は、少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、または少なくとも7個の炭素を含む。あるいは、または加えて、R2は、12個もしくはそれ未満、11個もしくはそれ未満、10個もしくはそれ未満、9個もしくはそれ未満、8個もしくはそれ未満、7個もしくはそれ未満、6個もしくはそれ未満、5個もしくはそれ未満、または4個もしくはそれ未満の炭素を含む。したがって、R2基は、上記端点のいずれか2つによって制限される炭素を含み得る。例えば、R2基は、2〜8個の炭素、4〜10個の炭素、または3〜6個の炭素を含み得る。いくつかの態様において、R2基は、3、4、5、または6個の炭素原子を含む。
【００３６】
一級アミンのR2基は、直鎖または分岐鎖であってよい。分岐鎖は、複数の分岐点を有してよく、また環状分岐を含み得る。
【００３７】
それ自体または別の置換基の一部としての「アルキル」という用語は、特に記載のない限り、直鎖もしくは分岐鎖、または環状炭化水素基、またはそれらの組み合わせを意味する。この定義はまた、「アルキル」が、例えば、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アミノアルキル、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ等のような基の一部として存在しても、適用される。
【００３８】
それ自体または別の置換基の一部としての「アルケニル」という用語は、特に記載のない限り、例えば約2〜約12個の炭素原子を含み、かつ炭素‐炭素二重結合を少なくとも1つ含む、直鎖もしくは分岐鎖、または環状炭化水素基、またはそれらの組み合わせを意味する。
【００３９】
「ヘテロアルキル」または「ヘテロアルケニル」という用語は、特に記載のない限り、記載された数の炭素原子、ならびにO、N、Si、およびSからなる群より選択される少なくとも1個のヘテロ原子からなり、ここで窒素原子および硫黄原子は任意に酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は任意に四級化されていてもよい、直鎖もしくは分岐鎖、または環状炭化水素基、またはそれらの組み合わせを指す。ヘテロ原子O、N、Si、およびSは、ヘテロアルキル基またはヘテロアルケニル基の任意の内部位置に位置し得る。R2基の例示的なヘテロアルキル基には、-CH2-CH2-OH、-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CHOH-CH3、-CH2-CH2-CH2-O-CH3、-CH2-CH2-CH2-N(CH3)2、CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH3、-CH2-CH2-CH2-NH-CH2-CH2-OH、-CH-(CH2-OH)2、および-Si(CH3)3が含まれるが、これらに限定されない。例えば、-CH2-CH2-O-Si(CH3)3のように、2個までのヘテロ原子が連続していてもよい。
【００４０】
アルキル、ヘテロアルキル、アルケニル、およびヘテロアルケニルという用語は、示された基の置換型および非置換型の両方を含むよう意図される。R2基のアルキル基、ヘテロアルキル基、アルケニル基、およびヘテロアルケニル基に対する例示的な置換基は、0〜(2m'+1) 個（式中、m'はそのような基中の炭素原子の総数である）の範囲の数の、これらに限定されないが、-OR'、=0、=NR'、=N-OR'、-NR'R''、-SR'、-ハロゲン、-SiR'R''R'''、-OC(0)R'、-C(0)R'、-C02R'、-CN、および-N02より選択される様々な基のうちの1つまたは複数であってよい。R'、R''、およびR'''はそれぞれ独立して、水素、非置換もしくは置換アルキル基、非置換もしくは置換ヘテロアルキル基、非置換もしくは置換アルケニル基、非置換もしくは置換ヘテロアルケニル基、アルコキシ基もしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。
【００４１】
いくつかの態様において、R2基に対する置換基は-OHである。ある種の態様において、R2基は、2、3、または4個のヒドロキシル基を含むポリヒドロキシアルキル部分またはポリヒドロキシヘテロアルキル部分である。
【００４２】
R2基のアルキル鎖、ヘテロアルキル鎖、アルケニル鎖、またはヘテロアルケニル鎖はまた、ポリエチレンオキシド部分によって中断され得る。ある種の態様において、R2基は、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、または6個以上、または7個以上のエチレンオキシド部分を含むポリエチレンオキシド部分を含む。他の態様において、R2基は、12個もしくはそれ未満、11個もしくはそれ未満、10個もしくはそれ未満、9個もしくはそれ未満、8もしくはそれ未満、7個もしくはそれ未満、6個もしくはそれ未満、または5個もしくはそれ未満のエチレンオキシド部分を含むポリエチレンオキシド部分を含む。したがって、R2基は、上記端点のいずれか2つによって制限される数のエチレンオキシド部分を有するポリエチレンオキシド部分を含み得る。例えば、R2基は、2〜10個、4〜8個、または3〜5個のエチレンオキシド部分を有するポリエチレンオキシド部分を含み得る。
【００４３】
一級アミンは、微生物において発酵性炭素源から生成され得る。例えば、モノエタノールアミンは、インビボにおいてセリンデカルボキシラーゼ (SDC) の作用によってセリンから生成され得る (Rontein et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(38):35523-35529)。いくつかの態様において、微生物は内因性SDCポリペプチドを発現する。他の態様において、微生物はSDCポリペプチドを過剰発現するように操作される。
【００４４】
プトレシン（1,4-ジアミノブタン）は、インビボにおいて、それぞれアルギニンをアグマチンへおよびアグマチンをプトレシンに変換するアルギニンデカルボキシラーゼ (ADC) およびアグマチンウレオヒドロラーゼ (AUH) の作用によってアルギニンから生成され得る (Moore et al. (1990) J. Bacteriol 172(8): 4631-4640)。いくつかの態様において、微生物は内因性のADCポリペプチドおよびAUHポリペプチドを発現する。他の態様において、微生物は、ADCポリペプチド、AUHポリペプチド、またはADCポリペプチドおよびをAUHポリペプチド過剰発現するように操作される。ある種の態様において、ADCは大腸菌MG1655由来のspeA遺伝子（GenBankアクセッション番号NC_000913）によってコードされる。
【００４５】
一級アミンはまた、微生物に外因的に提供され得る。
【００４６】
本開示における使用に適した例示的な一級アミンには、エタノールアミン（モノエタノールアミン）、3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミン、(±)-1-アミノ-2-プロパノール、2-メトキシエチルアミン、3-アミノ-1-プロパノール、2-アミノ-1,3プロパンジオール、3-メトキシプロピルアミン、N-(2-ヒドロキシエチル)エチレンジアミン、ブチルアミン、1,4-ジアミノブタン、およびそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ある種の態様において、一級アミンは3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミンである。
【００４７】
本開示の組換え微生物および方法における使用に適した核酸は、炭素源の存在下で該核酸が発現され、かつ該微生物が培養された場合に、一級アミンとアシルチオエステルを脂肪酸アミドに変換し得るポリペプチドをコードする配列を有する任意の核酸であってよい。
【００４８】
1つの態様において、ポリペプチドはPPSポリペプチドである。ある種の態様において、PPSポリペプチドは、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列、すなわちAAV33349のアミノ酸配列を含むか、本質的にそのアミノ酸配列からなるか、またはそのアミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、PPSポリペプチドは、SEQ ID NO: 2の核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。他の態様において、PPSポリペプチドは、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列を有するPPSポリペプチドの相同体である。PPSポリペプチドは、好ましくは、SEQ ID NO: 1のアミノ酸配列と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそのアミノ酸配列からなるか、またはそのアミノ酸配列からなる。
【００４９】
他の態様において、ポリペプチドはN-(4-アミノ-2-ヒドロキシブチル)テトラデカンアミド合成酵素 (AhtS) ポリペプチドである。ある種の態様において、AhtSポリペプチドは、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列、すなわちGenbankアクセッション番号ACX33975のアミノ酸配列を含むか、本質的にそのアミノ酸配列からなるか、またはそのアミノ酸配列からなる。いくつかの態様において、AhtSポリペプチドは、SEQ ID NO: 22の核酸配列を含む核酸配列によってコードされる。他の態様において、AhtSポリペプチドは、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列を有するAhtSポリペプチドの相同体である。AhtSポリペプチドは、好ましくは、SEQ ID NO: 3のアミノ酸配列と少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそのアミノ酸配列からなるか、またはそのアミノ酸配列からなる。
【００５０】
ある種の態様において、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドは、微生物にとって内因性である。そのような態様において、組換え微生物は、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒する内因性ポリペプチドを過剰発現するように操作される。
【００５１】
他の態様において、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドは、微生物にとって外因性である。そのような態様において、組換え微生物は、外因性ポリペプチドが一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するように、外因性ポリペプチドを発現するよう操作される。例えば、標準的な分子生物学手順により、外因性ポリペプチドをコードする外因性核酸を微生物中に組み込むことができる。微生物を炭素源と共に提供することにより、該微生物が脂肪酸アミド産生を増加させることが可能になる。
【００５２】
本明細書で用いられる「相同体 (homolog)」、「相同体 (homologue)」、および「相同的な」という用語は、対応するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と少なくとも約70%相同的な配列を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。当業者は、2つ以上の配列間の相同性を決定する方法を十分理解している。例えば、2つの配列間の配列の比較およびパーセント相同性の決定は、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215(3): 403-410) などの数学アルゴリズムを用いて達成することができる。
【００５３】
「ポリヌクレオチド」という用語は、DNAまたはRNAのポリマーを指し、これは一本鎖または二本鎖であってよく、また非天然ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドを含み得る。「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、本明細書において互換的に用いられて、リボヌクレオチド (RNA) またはデオキシリボヌクレオチド (DNA) のいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー型を指す。
【００５４】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指す。「組換えポリペプチド」という用語は、組換えDNA技法によって生成されるポリペプチドを指し、この技法では一般的に、発現させるタンパク質またはRNAをコードするDNAを適切な発現ベクターに挿入し、次にこれを用いて宿主細胞を形質転換して、該ポリペプチドまたは該RNAを産生させる。
【００５５】
本開示の組成物および方法において、所望の脂肪酸またはそのアシルチオエステル誘導体の生成は、組換え微生物において、脂肪酸の産生、分解、および／または分泌の調節に関与する1つまたは複数の遺伝子の発現を変更することによって増強され得る。
【００５６】
いくつかの態様において、組換え微生物は、脂肪酸生合成ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。本明細書で用いられる場合、「脂肪酸生合成ポリペプチド」という用語は、脂肪酸生合成に関与する任意のポリペプチドを指す。宿主細胞における脂肪酸生合成経路は、前駆体アセチル-CoAおよびマロニル-CoAを使用する。この経路における段階は、脂肪酸生合成 (fab) 遺伝子ファミリーおよびアセチル-CoAカルボキシラーゼ (acc) 遺伝子ファミリーの酵素によって触媒される（例えば、Heath et al. (2001) Prog. Lipid Res. 40(6):467-497を参照されたい）。アセチル-CoAは、アセチル-CoAカルボキシラーゼ (EC 6.4.1.2) によってカルボキシル化されて、マロニル-CoAを形成する。アセチル-CoAカルボキシラーゼ (EC 6.4.1.2) は、大部分の原核生物において、4つの別々の遺伝子（accA、accB、accC、およびaccD）によってコードされる多サブユニット酵素である。コリネバクテリウム・グルタミカス (Corynebacterium glutamicus) などのいくつかの細菌では、アセチル-CoAカルボキシラーゼは、それぞれaccDAおよびaccBCによってコードされる2つのサブユニット、AccDA [YP_225123.1] およびAccBC [YP_224991] を含む。所望の脂肪酸または脂肪酸誘導体産物に応じて、操作された宿主細胞において、特定のfab遺伝子および／またはacc遺伝子（またはそれらの組み合わせ）を過剰発現させる、修飾する、減弱させる、または欠失させることができる。
【００５７】
いくつかの態様において、脂肪酸生合成ポリペプチドをコードする核酸配列はaccABCDをコードする。他の態様において、脂肪酸生合成ポリペプチドをコードする核酸配列は、FabD、FabH、FabG、FabB、FabA、FabZ、FabF、FabI、または例えばFabVなどの、別の生物に由来するFabの機能的相同体をコードする。本開示の組成物および方法における使用に適した脂肪酸生合成ポリペプチドの例示的なGenBankアクセッション番号には、FabD (AAC74176)、FabH (AAC74175)、FabG (AAC74177)、FabB (P0A953)、FabA (ACY27485.1)、FabZ (ACY27493.1)、FabF (AAC74179)、およびFabI (NP_415804) が含まれる。
【００５８】
いくつかの態様において、組換え微生物は、2つ以上（例えば、3つ以上、4つ以上）の生合成ポリペプチド（例えば、accABCDおよびFabD；FabD、FabH、およびFabG；またはFabI、FabG、H、D、FabA、B、およびFabZ）をコードする核酸配列を含む。
【００５９】
FadRは、脂肪酸分解経路および脂肪酸生合成経路に関与する転写因子である (Cronan et al. (1998) Mol. Microbiol. 29(4):937-943)。FadRは、fabA、fabB、iclR、fadA、fadB、fadD、fadE、fadI、fadJ、fadL、fadM、uspA、aceA、aceB、およびaceKを含む多くの遺伝子の発現および／または活性を調節することが知られている。FadR標的遺伝子によってコードされるポリペプチドの例示的なGenBankアクセッション番号には、fabA (NP_415474)、fabB (BAA16180)、(NP_418442)、fadA (YP_026272.1)、fadB (NP_418288.1)、fadD (AP_002424)、fadE (NP_414756.2)、fadI (NP_416844.1)、fadJ (NP_416843.1)、fadL (AAC75404)、fadM (NP_414977.1)、uspA (AAC76520)、aceA (AAC76985.1)、aceB (AAC76984.1)、およびaceK (AAC76986.1) が含まれる。
【００６０】
いくつかの態様において、組換え微生物は、脂肪酸生合成ポリペプチドをコードする核酸配列、およびFadRをコードする核酸配列を含む。ある種の態様において、核酸配列は大腸菌MG1655由来のFadR (NP_415705) をコードする。
【００６１】
チオエステラーゼ（EC 3.1. 2.14またはEC 3.1.1.5）は、アシル-ACPチオエステルから脂肪酸を加水分解する。アシルチオエステル基質の鎖長は、選択されたチオエステラーゼの発現を改変することによって選択され得る。ある種の態様において、宿主細胞は、好ましい脂肪酸誘導体基質の生成を増加させるために、1つまたは複数の選択されたチオエステラーゼを発現する、過剰発現する、弱く発現する、または発現しないように操作される。例えば、C10脂肪酸は、C10脂肪酸の生成を好むチオエステラーゼを発現させ、かつC10脂肪酸以外の脂肪酸の生成を好むチオエステラーゼ（例えば、C14脂肪酸の生成の方を好むチオエステラーゼ）を減弱させることによって生成され得る。これにより、炭素10個を含む脂肪酸の比較的均一な集団が得られる。他の例では、C14脂肪酸は、非C14脂肪酸を生成する内因性チオエステラーゼを減弱させ、かつC14-ACPを好むチオエステラーゼを発現させることによって生成され得る。場合によっては、C12脂肪酸は、C12-ACPを好むチオエステラーゼを発現させ、かつ非C12脂肪酸を優先的に生成するチオエステラーゼを減弱させることによって生成され得る。アセチル-CoA、マロニル-CoA、および脂肪酸の過剰生成は、当技術分野で公知の方法を用いて、例えば、放射性前駆体、HPLC、またはGC-MSを使用することにより、検証することができる。
【００６２】
本開示の組成物および方法においてその発現が変更され得るチオエステラーゼ遺伝子（および対応するGenBankアクセッション番号）の非限定的な例には、大腸菌由来のリーダー配列を含まないtesA (‘tesA) (AAC73596)、大腸菌由来のtesB (AAC73555)、ウンベルラリア・カリフォルニア (Umbellularia California) 由来のfatB（Q41635、AAA34215)、クフェア・フーケリアナ (Cuphea hookeriana) 由来のfatB2 (AAC49269)、クフェア・フーケリアナ由来のfatB3（Q39513；AAC72881）、クスノキ (Cinnamonum camphorum) 由来のfatB（Q39473、AAC49151）、シロイヌナズナ (Arabidopsis thaliana) 由来のfatB [M141T] (CAA85388) (Mayer et al. (2007) BMC Plant Biology 7:1-11)、シロイヌナズナ由来のfatA（NP 189147；NP 193041）、ブラディリゾビウム・ジャポニカム (Bradyrhiizobium japonicum) 由来のfatA (CAC 39106)、クフェア・フーケリアナ由来のfatA (AAC72883)、およびヒマワリ (Helianthus annus) 由来のfatA1 (AAL79361) が含まれる。
【００６３】
ある種の態様において、組換え微生物はチオエステラーゼをコードする核酸を含み、該核酸配列は大腸菌MG1655由来の‘tesA (AAC73596)である。
【００６４】
アシル-CoA合成酵素 (EC 2.3.1.86) は、アシル-CoAチオエステルの形成を触媒することによって脂肪酸を活性化する。本開示の組成物および方法においてその発現が変更され得るアシル-CoA合成酵素遺伝子の非限定的な例には、fadD、fadK、BH3103、yhfL、Pfl-4354、EAV15023、fadD1、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa3p、またはタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子が含まれる。アシル-CoA合成酵素遺伝子の具体例には、結核菌 (M. tuberculosis) H37Rv由来のfadDD35 [NP_217021]、結核菌H37Rv由来のfadDD22 [NP_217464]、大腸菌由来のfadD [NP_416319]、大腸菌由来のfadK [YP_416216]、アシネトバクター・エスピー ADP1由来のfadD [YP_045024]、インフルエンザ菌 (Haemophilus influenza) RdkW20由来のfadD [NP_438551]、ロドシュードモナス・パルストリス (Rhodopseudomonas palustris) Bis B18由来のfadD [YP_533919]、バチルス・ハロデュランス (Bacillus halodurans) C-125由来BH3101 [NP_243969]、シュードモナス・フルオレッセンス (Pseudomonas fluorescens) Pfo-1由来のPfl-4354 [YP_350082]、コマモナス・テストステロニ (Comamonas testosterone) KF-1由来のEAV15023 [ZP_01520072]、枯草菌由来のyhfL [NP_388908]、緑膿菌 (P. aeruginosa) PAO1由来のfadD1 [NP_251989]、青枯病菌 (Ralstonia solanacearum) GM1 1000由来のfadD1 [NP_520978]、緑膿菌PAO1由来のfadD2 [NP_251990]、ステノトロフォモナス・マルトフィリアR551-3由来のタンパク質ZP_01644857をコードする遺伝子、サッカロマイセス・セレビシエ由来のfaa3p [NP_012257]、サッカロマイセス・セレビシエ由来のfaa1p [NP_014962]、枯草菌由来のlcfA [CAA99571]、ならびにShockey et al. (2002) Plant. Physiol. 129:1710-1722)；Caviglia et al. (2004) J. Biol. Chem. 279:1163-1169)；Knoll et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(23):16348-56)；Johnson et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:18037-18046)；およびBlack et al. (1992) J. Biol Chem. 267:25513-25520) に記載されているものが含まれる。
【００６５】
いくつかの態様において、組換え微生物はアシル-CoA合成酵素ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、該アシル-CoA合成酵素ポリペプチドは大腸菌MG1655由来のFadD [NP_416319] である。
【００６６】
組換え微生物は、脂肪酸生合成ポリペプチド、チオエステラーゼポリペプチド、およびアシル-CoA合成酵素ポリペプチドの任意の組み合わせをコードする核酸を含み得る。ある種の態様において、微生物は、チオエステラーゼポリペプチドをコードする核酸、およびアシル-CoA合成酵素ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。
【００６７】
当業者は、目的（例えば、所望の脂肪酸またはそのアシルチオエステル誘導体）に応じて、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒し得るポリペプチドをコードする核酸配列を含むように操作された組換え微生物において、脂肪酸代謝に関与する特定の遺伝子（または遺伝子の組み合わせ）を過剰発現させる、改変する、減弱させる、または欠失させることができることを理解するであろう。本開示における使用に適した脂肪酸代謝に関与する遺伝子の付加的な例は、例えば米国特許出願公開第2011/0162259号に記載されており、これは全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【００６８】
いくつかの態様において、ポリペプチドは、本明細書に記載されるポリペプチドのいずれかの断片である。「断片」という用語は、4個のアミノ酸残基から全アミノ酸配列マイナス1アミノ酸残基までのサイズの範囲の、全長ポリペプチドまたはタンパク質のより短い部分を指す。本発明のある種の態様において、断片とは、ポリペプチドまたはタンパク質のドメイン（例えば、基質結合ドメインまたは触媒ドメイン）の全アミノ酸配列を指す。
【００６９】
いくつかの態様において、ポリペプチドは本明細書に記載されるポリペプチドのいずれかの変異体または変種である。本明細書で用いられる「変異体」および「変種」という用語は、野生型ポリペプチドと少なくとも1アミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。例えば、変異体は、以下の保存的アミノ酸置換のうちの1つまたは複数を含み得る：アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンなどの脂肪族アミノ酸の別の脂肪族アミノ酸との置換；セリンのスレオニンとの置換；スレオニンのセリンとの置換；アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性残基の別の酸性残基との置換；アスパラギンおよびグルタミンなどのアミド基を有する残基の、アミド基を有する別の残基との置換；リジンおよびアルギニンなどの塩基性残基の別の塩基性残基との交換；ならびにフェニルアラニンおよびチロシンなどの芳香族残基の別の芳香族残基との置換。いくつかの態様において、変異体ポリペプリドは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100個、またはそれより多いアミノ酸の置換、付加、挿入、または欠失を有する。
【００７０】
ポリペプチドの好ましい断片または変異体は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能（例えば、酵素活性）の一部またはすべてを保持する。いくつかの態様において、断片または変異体は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能の少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、または少なくとも約98%、またはそれより多くを保持する。他の態様において、断片または変異体は、対応する野生型ポリペプチドの生物学的機能の約100%を保持する。生物学的活性に影響を及ぼすことなく、どのアミノ酸残基を置換する、挿入する、または欠失させることができるかを判定する上での指針は、当技術分野で周知のコンピュータプログラム、例えばLASERGENE（商標）ソフトウェア（DNASTAR, Inc.、Madison, WI）を用いて見出すことができる。
【００７１】
さらなる他の態様において、断片または変異体は「増加したレベルの活性」を有する。「増加したレベルの活性」とは、ポリペプチドが、同じ条件下で、対応する野生型宿主細胞における生化学的機能および／または生物学的機能（例えば、DNA結合活性または酵素活性）のそのレベルと比較して、操作された細胞においてより高いレベルの生化学的機能または生物学的機能を有することを意味する。増強された活性の程度は、約10%以上、約20%以上、約50%以上、約75%以上、約100%以上、約200%以上、約500%以上、約1000%以上、またはそれらの中の任意の範囲であってよい。
【００７２】
いくつかの態様において、変更または改変されたレベルの発現を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、「過剰発現される」、または「増加したレベルの発現」を有する。本明細書で用いられる場合、「過剰発現する」および「発現レベルを増加させること」とは、同じ条件下で、操作された細胞において、対応する野生型細胞において通常発現される濃度よりも高い濃度でポリヌクレオチドまたはポリペプチドを発現するまたは発現させることを意味する。例えば、ポリペプチドが、同じ条件下で、同じ種の操作されていない宿主細胞におけるその濃度と比較して、操作された細胞においてより高い濃度で存在する場合に、そのポリペプチドは操作された細胞において「過剰発現」され得る。
【００７３】
他の態様において、変更されたレベルの発現を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、「減弱される」、または「低下したレベルの発現」を有する。本明細書で用いられる場合、「減弱させる」および「発現レベルを低下させること」とは、同じ条件下で、操作された細胞において、対応する野生型細胞において通常発現される濃度よりも低い濃度でポリヌクレオチドまたはポリペプチドを発現するまたは発現させることを意味する。
【００７４】
過剰発現または減弱の程度は、1.5倍以上、例えば、2倍以上、3倍以上、5倍以上、10倍以上、または15倍以上であってよい。あるいは、または加えて、過剰発現または減弱の程度は、500倍またはそれ未満、例えば、100倍もしくはそれ未満、50倍もしくはそれ未満、25倍もしくはそれ未満、または20倍もしくはそれ未満であってよい。したがって、過剰発現または減弱の程度は、上記端点のいずれか2つによって制限され得る。例えば、過剰発現または減弱の程度は、1.5〜500倍、2〜50倍、10〜25倍、または15〜20倍であってよい。
【００７５】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、当技術分野で公知の方法を用いて減弱させることができる。いくつかの態様において、遺伝子または該遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現は、該遺伝子の発現を制御する調節性ポリヌクレオチド配列を変異させることによって減弱される。他の態様において、遺伝子または該遺伝子によってコードされるポリペプチドの発現は、リプレッサータンパク質を過剰発現させることによって、またはリプレッサータンパク質を活性化する外因性調節エレメントを提供することによって減弱される。なおさらなる他の態様では、遺伝子またはポリヌクレオチドの発現を減弱させるために、DNAベースまたはRNAベースの遺伝子サイレンシング方法が用いられる。いくつかの態様において、遺伝子またはポリペプチドの発現は、例えばその遺伝子のポリヌクレオチド配列のすべてまたは一部を欠失させることにより、完全に減弱される。
【００７６】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、当技術分野で公知の方法を用いて過剰発現させることができる。いくつかの態様において、ポリペプチドの過剰発現は、外因性調節エレメントを使用して達成される。「外因性調節エレメント」という用語は、一般に、宿主細胞の外部に由来する調節エレメントを指す。しかしながら、ある種の態様において、「外因性調節エレメント」という用語は、内因性ポリペプチドの発現を調節する目的でその機能が複製されるかまたは奪われる、宿主細胞由来の調節エレメントを指し得る。例えば、組換え微生物が、脂肪酸生合成ポリペプチドをコードする核酸配列を含む大腸菌細胞であり、該脂肪酸生合成ポリペプチドが、内因性fadR遺伝子によってコードされるFadRである場合、内因性fadRの発現は別の大腸菌遺伝子に由来するプロモーターによって制御され得る。
【００７７】
いくつかの態様において、外因性調節エレメントは、小分子などの化学化合物である。本明細書で用いられる場合、「小分子」という用語は、約1,000 g/モル未満の分子量を有する物質または化合物を指す。
【００７８】
いくつかの態様において、核酸配列の発現を制御する外因性調節エレメントは、該核酸配列に機能的に連結されている発現制御配列である。発現制御配列は当技術分野で公知であり、これには例えば、宿主細胞において核酸配列の発現をもたらすプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、内部リボソーム進入部位 (IRES)、リボソーム結合部位 (RBS) などが含まれる。発現制御配列は、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する (Maniatis et al. (1987) Science 236:1237-1245)。例示的な発現制御配列は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) に記載されている。
【００７９】
「機能的に連結された」とは、適切な分子（例えば、転写活性化因子タンパク質）が発現制御配列に結合した場合に、遺伝子発現を可能にするように、核酸配列と発現制御配列が結合されていることを意味する。機能的に連結されたプロモーターは、転写および翻訳の方向に関して、選択された核酸配列の上流に位置する。機能的に連結されたエンハンサーは、選択された核酸配列の上流、内部、または下流に位置し得る。
【００８０】
いくつかの態様において、核酸配列は、ポリヌクレオチド配列に機能的に連結されたプロモーターを含む組換えベクターによって宿主細胞に提供される。ある種の態様において、プロモーターは、誘導性、構成的、または細胞小器官特異的プロモーターである。ある種の態様において、発現制御配列は、当技術分野で公知の方法を用いて相同的組換えにより宿主細胞のゲノム中に発現制御配列を組み込むことによって、内因性核酸配列に機能的に連結される（例えば、Datsenko et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97(12): 6640-6645）。
【００８１】
本明細書で用いられる場合、「ベクター」という用語は、核酸分子に連結されている別の核酸配列を輸送することができる核酸分子を指す。有用なベクターの1つの種類はエピソーム（すなわち、染色体外複製を行うことができる核酸）である。有用なベクターは、ベクターに連結されている核酸の自律的複製および／または発現を行うことができるベクターである。ベクターに機能的に連結されている遺伝子の発現を指示することができるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。一般的に、組み換えDNA技法において有用な発現ベクターは、「プラスミド」の形態である場合が多く、プラスミドとは一般的に、それらのベクター形態において、染色体に結合されていない環状二本鎖DNAループを指す。しかしながら、同等の機能を提供し、かつ後に当技術分野において公知となる他の形態の発現ベクターもまた含まれる。
【００８２】
いくつかの態様において、組換えベクターは、(a) 核酸配列に機能的に連結された発現制御配列；(b) 核酸配列に機能的に連結された選択マーカー：および (c) 核酸配列に機能的に連結された標的化配列からなる群より選択される少なくとも1つの配列を含む。
【００８３】
発現ベクターの設計が、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現レベル等の要因に依存し得ることは、当業者によって認識されよう。本明細書に記載される発現ベクターを宿主細胞に導入して、本明細書に記載されるポリヌクレオチド配列によってコードされる、融合ポリペプチドを含むポリペプチドを生成することができる。
【００８４】
原核細胞および真核細胞の両方に適した発現系は、当技術分野で周知である；例えば、Sambrook et al., 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual,」 second edition, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) を参照されたい。誘導性の非融合大腸菌発現ベクターの例には、pTrc (Amann et al. (1988) Gene 69:301-315) およびPET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, pp. 60-89 (1990)) が含まれる。ある種の態様において、本開示のポリヌクレオチド配列は、バクテリオファージT5由来のプロモーターに機能的に連結される。酵母における発現のためのベクターの例には、pYepSec1 (Baldari et al. (1987) EMBO J. 6:229-234)、pMFa (Kurjan et al. (1982) Cell 30:933-943)、pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123)、pYES2（Invitrogen Corp.、San Diego, CA）、およびpicZ（Invitrogen Corp.、San Diego, CA）が含まれる。
【００８５】
ベクターは、従来の形質転換技法またはトランスフェクション技法により、原核細胞または真核細胞中に導入することができる。本明細書で用いられる場合、「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムもしくは塩化カルシウム共沈澱、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む、宿主細胞に外来核酸（例えば、DNA）を導入するための当技術分野で認識されている種々の技法を指す。宿主細胞を形質転換するまたは宿主細胞にトランスフェクトするための適切な方法、およびベクターを取り込んだ細胞を選択する方法は、例えばSambrook et al.（前記）において見出すことができる。
【００８６】
「組換え微生物」とは、本明細書に記載される産物（例えば、脂肪酸アミド）を生産するために用いられる宿主細胞である。本明細書において「組換え宿主細胞」、「操作された微生物」、または「操作された宿主細胞」とも称される組換え微生物は、1つまたは複数の核酸またはポリペプチドの発現が、同じ条件下における、対応する野生型宿主細胞におけるそれらの発現と比較して変更または改変されている宿主細胞である。本明細書に記載される開示の局面のいずれかにおいて、宿主細胞には、細菌細胞、ラン藻細胞、藻類細胞、および真菌細胞（例えば、糸状菌細胞または酵母細胞）が含まれ得るが、これらに限定されない。
【００８７】
いくつかの態様において、宿主細胞はグラム陽性細菌細胞である。他の態様において、宿主細胞はグラム陰性細菌細胞である。
【００８８】
いくつかの態様において、宿主細胞は、エシェリキア (Escherichia) 属、バチルス属、ラクトバチルス (Lactobacillus) 属、ロドコッカス (Rhodococcus) 属、シュードモナス (Pseudomonas) 属、アスペルギルス (Aspergillus) 属、トリコデルマ (Trichoderma) 属、ニューロスポラ (Neurospora) 属、フサリウム (Fusarium) 属、フミコラ (Humicola) 属、リゾムコール (Rhizomucor) 属、クリベロマイセス (Kluyveromyces) 属、ピキア (Pichia) 属、ムコール (Mucor) 属、ミセリオフトラ (Myceliophtora) 属、ペニシリウム (Penicillium) 属、ファネロカエテ (Phanerochaete) 属、ヒラタケ (Pleurotus) 属、ホウロクタケ (Trametes) 属、クリソスポリウム (Chrysosporium) 属、サッカロマイセス属、ステノトロフォモナス (Stenotrophamonas) 属、シゾサッカロミセス (Schizosaccharomyces) 属、シネココッカス属、ヤロウイア (Yarrowia) 属、またはストレプトマイセス属より選択される。
【００８９】
ある種の態様において、宿主細胞は、サッカロマイセス・セレビシエ、カンジダ・リポリティカ、大腸菌、アルスロバクター、ロドトルラ・グルチニス、アシネトバクター、カンジダ・リポリティカ、ボツリオコッカス・ブラウニー、ビブリオ・ファーニシイ、ミクロコッカス・ルテウス、ステノトロフォモナス・マルトフィリア、枯草菌、バチルス・リケニフォルミス、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・フルオレッセンス、ストレプトマイセス・セリカラー、プロトテカ・モリフォルミス、プロトテカ・クルガニ、プロトテカ・スタグノラ、プロトテカ・ゾフィ、またはクロレラ・プロトセコイデス細胞である。
【００９０】
いくつかの態様において、宿主細胞は、アルスロバクター AK 19、アシネトバクター・エスピー M-1株、大腸菌B、大腸菌C、大腸菌K、または大腸菌W細胞である。
【００９１】
他の態様において、宿主細胞は、バチルス・レンタス (Bacillus lentus) 細胞、バチルス・ブレビス (Bacillus brevis) 細胞、バチルス・ステアロサーモフィルス (Bacillus stearothermophilus) 細胞、バチルス・リケニフォルミス (Bacillus lichen formis) 細胞、バチルス・アルカロフィルス (Bacillus alkalophilus) 細胞、バチルス・コアグランス (Bacillus coagulans) 細胞、バチルス・サーキュランス (Bacillus circulans) 細胞、バチルス・プミリス (Bacillus pumilis) 細胞、バチルス・チューリンゲンシス (Bacillus thuringiensis) 細胞、バチルス・クラウジイ (Bacillus clausii) 細胞、バチルス・メガテリウム (Bacillus megaterium) 細胞、またはバチルス・アミロリケファシエンス (Bacillus amyloliquefaciens) 細胞である。
【００９２】
他の態様において、宿主細胞は、トリコデルマ・コニンギ (Trichoderma koningii) 細胞、トリコデルマ・ビリデ (Trichoderma viride) 細胞、トリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reesei) 細胞、トリコデルマ・ロンギブラキアタム (Trichoderma longibrachiatum) 細胞、アスペルギルス・アワモリ (Aspergillus awamori) 細胞、アスペルギルス・フミガタス (Aspergillus fumigates) 細胞、アスペルギルス・フォエティダス (Aspergillus foetidus) 細胞、アスペルギルス・ニデュランス (Aspergillus nidulans) 細胞、クロコウジカビ (Aspergillus niger) 細胞、コウジカビ (Aspergillus oryzae) 細胞、フミコラ・インソレンス (Humicola insolens) 細胞、フミコラ・ラヌギノセ (Humicola lanuginose) 細胞、ロドコッカス・オパカス (Rhodococcus opacus) 細胞、リゾムコール・ミエヘイ (Rhizomucor miehei) 細胞、またはムコール・ミエヘイ (Mucor michei) 細胞である。
【００９３】
さらなる他の態様において、宿主細胞はストレプトマイセス・リビダンス (Streptomyces lividans) 細胞またはストレプトマイセス・ムリナス (Streptomyces murinus) 細胞である。
【００９４】
さらなる他の態様において、宿主細胞は放線菌細胞である。
【００９５】
他の態様において、宿主細胞は、真核生物の植物、藻類、ラン藻、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、極限性微生物、酵母、真菌、それらの操作された生物、または合成生物に由来する細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は光依存性であるかまたは炭素を固定する。いくつかの態様において、宿主細胞は光依存性であるかまたは炭素を固定する。いくつかの態様において、宿主細胞は独立栄養活性を有する。いくつかの態様において、宿主細胞は、光の存在下などで光独立栄養活性を有する。いくつかの態様において、宿主細胞は、光の非存在下で従属栄養性または混合栄養性である。ある種の態態様において、宿主細胞は、シロイヌナズナ (Avabidopsis thaliana)、パニクム・ウィルガツム (Panicum virgatum)、ミスカンサス ギガンテウス (Miscanthus giganteus)、トウモロコシ (Zea mays)、コナミドリムシ (Chlamydomonas reinhardtii)、ドナリエラ・サリナ (Dunaliela salina)、シネココッカス・エスピー PCC 7002、シネココッカス・エスピー PCC 7942、シネコシスティス・エスピー PCC 6803、サーモシネココッカス・エロンガタス (Thermosynechococcus elongates) BP-1、クロロビウム・テピダム (Chlorobium tepidum)、クロロフレクサス・オーランティアカス (Chlorojlexus auranticus)、クロマチウム・ビノサム (Chromatiumm vinosum)、ロドスピリラム・ラブラム (Rhodospirillum rubrum)、ロドバクター・カプスラタス (Rhodobacter capsulatus)、ロドシュードモナス・パルストリス (Rhodopseudomonas palusris)、クロストリジウム・リュングダリイ (Clostridium ljungdahlii)、クロストリジウム・サーモセラム (Clostridiuthermocellum)、ペニシリウム・クリソゲナム (Penicillium chrysogenum)、ピキア・パストリス (Pichia pastoris)、シゾサッカロミセス・ポンベ (Schizosaccharomyces pombe)、シュードモナス・フルオレッセンス (Pseudomonasjluorescens)、またはザイモモナス・モビリス (Zymomonas mobilis) に由来する細胞である。
【００９６】
本明細書で用いられる場合、「産生に許容的な条件」という用語は、宿主細胞が脂肪酸アミドなどの所望の産物を産生することを可能にする任意の条件を意味する。同様に、「発現に適した条件」という用語は、宿主細胞がポリペプチドを合成することを可能にする任意の条件を意味する。適切な条件には、例えば発酵条件が含まれる。発酵条件は、温度範囲、通気レベル、および培地組成などの多くのパラメータを含み得る。これらの条件はそれぞれ、個々におよび組み合わせて、宿主細胞が増殖することを可能にする。例示的な培地には、ブロスまたはゲルが含まれる。一般に、培地は、宿主細胞によって直接代謝され得る炭素源を含む。加えて、酵素を培地中で使用して、炭素源の動員（例えば、デンプンまたはセルロースの発酵性糖への脱重合）およびその後の代謝を促進することができる。
【００９７】
本明細書で用いられる場合、「炭素源」という語句は、原核細胞または単純な真核細胞の増殖のための炭素源として用いられるのに適した基質または化合物を指す。炭素源は、これらに限定されないが、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチド、およびガス（例えば、COおよびCO2）を含む様々な形態であってよい。例示的な炭素源には、単糖類、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、およびアラビノースなど；オリゴ糖、例えばフルクトオリゴ糖およびガラクトオリゴ糖など；多糖類、例えば、デンプン、セルロース、ペクチン、およびキシランなど；二糖類、例えば、スクロース、マルトース、およびツラノースなど；セルロース系材料および変種、例えばメチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースナトリウムなど；飽和または不飽和脂肪酸エステル、コハク酸、乳酸、および酢酸；アルコール、例えば、エタノール、メタノール、およびグリセロールなど、またはそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。炭素源はまた、グルコースなどの光合成の産物であってもよい。ある種の好ましい多用において、炭素源はバイオマスである。他の好ましい態様において、炭素源はグルコースである。
【００９８】
「バイオマス」という用語は、炭素源の元になる任意の生物材料を指す。いくつかの態様において、バイオマスは、生物変換に適している炭素源に加工される。他の態様において、バイオマスは、炭素源へのさらなる加工を必要としない。炭素源はバイオ燃料に変換され得る。バイオマスの例示的な供給源は、トウモロコシ、サトウキビ、またはスイッチグラスなどの植物質または草木である。バイオマスの別の例示的な供給源は、動物質（例えば、牛糞肥料）などの代謝廃棄物である。バイオマスのさらなる例示的な供給源には、藻類および他の海藻が含まれる。バイオマスにはまた、工業、農業、林業、および家庭からの廃棄物が含まれ、これには、発酵廃液、貯蔵牧草、わら、木材、汚水、生ごみ、セルロース性一般廃棄物、食品廃棄物、およびグリセロールが含まれるが、これらに限定されない。「バイオマス」という用語はまた、炭水化物（例えば、単糖類、二糖類、または多糖類）などの炭素源を指し得る。
【００９９】
条件が、産物の生産またはポリペプチドの発現を可能にするのに十分であるかどうかを判定するために、宿主細胞を、例えば、約4、8、12、24、36、48、72時間、またはそれより長く培養することができる。培養の間および／または後に、試料を採取し、解析して、その条件が生産または発現を可能にするかどうかを判定することができる。例えば、宿主細胞を増殖させた試料または培地中の宿主細胞を、所望の産物の存在について試験することができる。脂肪酸アミドの存在について試験する場合には、これらに限定されないが、MS、薄層クロマトグラフィー (TLC)、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)、液体クロマトグラフィー (LC)、水素炎イオン化検出器 (FID) に連結されたGC、GC-MS、およびLC-MSなどのアッセイを使用することができる。ポリペプチドの発現について試験する場合には、これらに限定されないが、ウェスタンブロッティングおよびドットブロッティングなどの技法を使用することができる。
【０１００】
本発明の方法において、脂肪酸アミドの生産および単離は、発酵条件を最適化することによって増強することができる。いくつかの態様において、発酵条件は、炭化水素産物に変換される炭素源の割合を高めるように最適化される。通常の細胞生活環において、炭素は、脂質、糖類、タンパク質、有機酸、および核酸の生成などの細胞機能に用いられる。増殖に関連する活性に必要な炭素の量を減少させることによって、炭素源の産物への変換の効率を高めることができる。これは、例えば、最初に宿主細胞を所望の密度（例えば、増殖の対数期のピークに達する密度）まで増殖させることにより達成することができる。このような時点で、細胞の増殖を停止させるために、複製チェックポイント遺伝子を利用することができる。具体的には、クオラムセンシング機構（Camilli et al. (2006) Science 311:1113；Venturi (2006) FEMS Microbiol. Rev. 30:274-291；およびReading et al. (2006) FEMS Microbiol. Lett. 254:1-11において概説される）を用いて、p53、p21、または他のチェックポイント遺伝子などのチェックポイント遺伝子を活性化することができる。
【０１０１】
大腸菌の細胞複製および増殖を停止させるために活性化することができる遺伝子には、umuDC遺伝子が含まれる。umuDC遺伝子の過剰発現により、定常期から対数増殖への進行が停止する (Murli et al. (2000) J. Bacteriol. 182:1127-1135)。UmuCは、通常、紫外線 (UV) および化学変異誘発によって起こる非コード損傷にわたる損傷乗り越え合成を行うことができるDNAポリメラーゼである。umuDC遺伝子産物は、損傷乗り越え合成の過程に関与し、DNA配列損傷チェックポイントとしても機能する。umuDC遺伝子産物には、UmuC、UmuD、umuD'、UmuD'2C、UmuD'2、およびUmuD2が含まれる。同時に、産物生成遺伝子を活性化することができ、それにより、使用される複製経路および維持経路の必要性が最小限になる一方で、脂肪酸アミドまたはその中間体が生成される。宿主細胞はまた、prpBCDEプロモーター系下にあるpBAD24中の大腸菌由来のumuCおよびumuDを、この遺伝子のデノボ合成により、適切な最終産物生成遺伝子と共に発現するように操作することもできる。
【０１０２】
加えて、組換えセルロソームを発現するように宿主細胞を操作することもでき、セルロソームは宿主細胞がセルロース系材料を炭素源として使用することを可能にし得る。本開示の方法における使用に適した例示的なセルロソームには、例えば、国際特許出願公開第WO 2008/100251号に記載されているセルロソームが含まれる。宿主細胞はまた、米国特許第5,000,000号；第5,028,539号；第5,424,202号；第5,482,846号；および第5,602,030号に記載されている方法に従って、炭素を効率的に同化し、炭素源としてセルロース系材料を用いるように操作することもできる。
【０１０３】
本開示の発酵方法のいくつかの態様において、発酵チャンバーは持続的還元を起こしている発酵物を封入し、これによって安定した還元環境が作り出される。電子バランスは、二酸化炭素（ガス形態）の放出によって維持され得る。NAD/HおよびNADP/Hバランスを高める取り組みもまた、電子バランスの安定化を促進し得る。NADH:NADPHトランスヒドロゲナーゼを発現するように宿主細胞を操作することによって、細胞内NADPHの利用能を高めることもできる。1つまたは複数のNADH:NADPHトランスヒドロゲナーゼの発現は、解糖系で生成されるNADHをNADPHに変換し、これによって脂肪酸アミドおよびその中間体の生成が強化され得る。
【０１０４】
小規模生産の場合には、操作された宿主細胞を、例えば、約100 mL、500 mL、1 L、2 L、5 L、または10 Lのバッチで増殖させ；発酵させ；PPSをコードする核酸配列などの所望の核酸配列を発現するように誘導することができる。大規模生産の場合には、操作された宿主細胞を、約10 L、100 L、1000 L、10,000 L、100,000 L、1,000,000 L、またはそれより大きなバッチで増殖させ；発酵させ；所望の核酸配列を発現するように誘導することができる。
【０１０５】
本開示の方法によって生産された脂肪酸アミドは、一般的に宿主細胞から単離される。脂肪酸アミドなどの産物に関して本明細書で用いられる「単離された」という用語は、細胞成分、細胞培養液、または化学前駆体もしくは合成前駆体から分離された産物を指す。本明細書に記載される方法によって生産された脂肪酸アミドは、発酵ブロス中および細胞質中で比較的非混和性であり得る。したがって、脂肪酸アミドおよびその誘導体は、細胞内または細胞外のいずれかにおいて有機相中に集まり得る。有機相中に産物が集まることで、脂肪酸アミドが細胞機能に及ぼす影響が弱くなり得、宿主細胞がより多くの産物を産生することが可能になり得る。
【０１０６】
いくつかの態様において、本開示の方法によって生産された脂肪酸は精製される。本明細書において用いられる場合、「精製する」、「精製された」、または「精製」という用語は、例えば単離または分離による、分子のその環境からの除去または単離を意味する。「実質的に精製された」分子は、それらに付随する他の成分を少なくとも約60%含まない（例えば、少なくとも約70%含まない、少なくとも約75%含まない、少なくとも約85%含まない、少なくとも約90%含まない、少なくとも約95%含まない、少なくとも約97%含まない、少なくとも約99%含まない）。本明細書で用いられる場合、これらの用語はまた、試料からの混入物の除去を指す。例えば、混入物の除去は、試料中の脂肪酸アミドの割合の増加をもたらし得る。例えば、脂肪酸アミドが宿主細胞において産生される場合、その脂肪酸アミドは、宿主細胞タンパク質の除去によって精製することができる。精製後は、試料中の脂肪酸アミドの割合が増加する。
【０１０７】
本明細書で用いられる場合、「精製する」、「精製された」、および「精製」という用語は、絶対的純度を必要としない相対的用語である。したがって、例えば、脂肪酸アミドが宿主細胞において産生される場合、精製脂肪酸アミドとは、他の細胞成分（例えば、核酸、ポリペプチド、脂質、炭水化物、または他の炭化水素）から実質的に分離された脂肪酸アミドである。
【０１０８】
加えて、精製脂肪酸アミド調製物は、脂肪酸アミドが、発酵後に存在するかもしれない混入物などの混入物を実質的に含まない脂肪酸アミド調製物である。いくつかの態様において、試料の少なくとも約50重量%が脂肪酸アミドから構成される場合、その脂肪酸アミドは精製されている。他の態様において、試料の少なくとも約60重量%、例えば、少なくとも約70重量%、少なくとも約80重量%、少なくとも約85重量%、少なくとも約90重量%、少なくとも約92重量%が脂肪酸アミドから構成される場合、その脂肪酸アミドは精製されている。あるいは、または加えて、試料の約100重量%未満、例えば、約99重量%未満、約98重量%未満、約95重量%未満、約90重量%未満、または約80重量%未満が脂肪酸アミドから構成される場合、その脂肪酸アミドは精製されている。したがって、精製脂肪酸アミドは、上記端点のいずれか2つによって制限される純度レベルを有し得る。例えば、試料の少なくとも約80%〜95%、少なくとも約85%〜99%、または少なくとも約90%〜98%が脂肪酸アミドから構成される場合、その脂肪酸アミドは精製されていてよい。
【０１０９】
脂肪酸アミドは細胞外環境に存在してよく、または脂肪酸アミドを宿主細胞の細胞外環境から単離することもできる。ある種の態様において、脂肪酸アミドは宿主細胞から分泌される。他の態様において、脂肪酸アミドは細胞外環境に輸送される。さらなる他の態様において、脂肪酸アミドは細胞外環境に受動的に輸送される。脂肪酸アミドは、国際特許出願公開第WO 2010/042664号および第WO 2010/062480号に開示されているような当技術分野で公知の方法を用いて、宿主細胞から単離することができる。
【０１１０】
本明細書に記載される方法は均一な化合物の生産をもたらすことができ、生産された脂肪酸アミドの少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%は、炭素6個未満、炭素5個未満、炭素4個未満、炭素3個未満、または炭素約2個未満だけが異なる脂肪鎖を有する。あるいは、または加えて、本明細書に記載される方法は均一な化合物の生産をもたらすことができ、生産された脂肪酸アミドの約98%未満、約95%未満、約90%未満、約80%未満、または約70%未満は、炭素6個未満、炭素5個未満、炭素4個未満、炭素3個未満、または炭素約2個未満だけが異なる脂肪鎖を有する。したがって、脂肪酸アミドは、上記端点のいずれか2つによって制限される均一度を有し得る。例えば、脂肪酸アミドは、生産された脂肪酸アミドの約70%〜95%、約80%〜98%、または約90%〜95%が、炭素6個未満、炭素5個未満、炭素4個未満、炭素3個未満、または炭素約2個未満だけが異なる脂肪鎖を有する均一度を有し得る。これらの化合物はまた、比較的均一な飽和度を有して生産され得る。
【０１１１】
本発明の方法の結果として、一級アミンおよびアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒するポリペプチドをコードする核酸配列を含むように操作された組換え微生物によって産生される脂肪酸アミドの力価、収率、または生産性のうちの1つまたは複数は、対応する野生型微生物のものと比較して増加する。
【０１１２】
「力価」という用語は、宿主細胞培養物の単位量当たりに生産される脂肪酸アミドの量を指す。本明細書に記載される組成物および方法の任意の局面において、脂肪酸アミドは、25 mg/L以上、50 mg/L以上、75 mg/L以上、100 mg/L以上、125 mg/L以上、150 mg/L以上、175 mg/L以上、200 mg/L以上、250 mg/L以上、300 mg/L以上、350 mg/L以上、400 mg/L以上、450 mg/L以上、500 mg/L以上、600 mg/L以上、700 mg/L以上、800 mg/L以上、900 mg/L以上、または1000 mg/L以上の力価で生産される。あるいは、または加えて、脂肪酸アミドは、2000 mg/Lもしくはそれ未満、1900 mg/Lもしくはそれ未満、1800 mg/Lもしくはそれ未満、1700 mg/Lもしくはそれ未満、1600 mg/Lもしくはそれ未満、1500 mg/Lもしくはそれ未満、1400 mg/Lもしくはそれ未満、1300 mg/Lもしくはそれ未満、1200 mg/Lもしくはそれ未満、1100 mg/Lもしくはそれ未満、1000 mg/Lもしくはそれ未満、900 mg/Lもしくはそれ未満、800 mg/Lもしくはそれ未満、700 mg/Lもしくはそれ未満、600 mg/Lもしくはそれ未満、500 mg/Lもしくはそれ未満、400 mg/Lもしくはそれ未満、300 mg/Lもしくはそれ未満、または200 mg/Lもしくはそれ未満の力価で生産される。したがって、脂肪酸アミドは、上記端点のいずれか2つによって制限される力価で生産される。例えば、脂肪酸アミドは、150〜1000 mg/L、200〜500 mg/L、500〜1500 mg/L、または300〜1300 mg/Lの力価で生産され得る。他の態様において、脂肪酸アミドは、2000 mg/L超、5000 mg/L超、10,000 mg/L超、またはそれより大きい、例えば、50 g/L、70 g/L、100 g/L、120 g/L、150 g/L、または200 g/Lなどの力価で生産される。
【０１１３】
「収率」という用語は、宿主細胞において投入炭素源が産物（すなわち、脂肪酸アミド）に変換される効率を指す。酸素含有炭素源（例えば、グルコースおよび他の炭水化物ベースの供給源）に関して、酸素は二酸化炭素の形態で放出されなければならない。したがって、酸素原子2個が放出される度に、炭素原子1個もまた放出され、最大理論的代謝効率はおよそ34% (w/w)（脂肪酸由来産物に関して）となる。しかしながら、この数値は、その他の有機化合物および炭素源については変化する。文献で報告されている典型的な効率は、およそ5%未満である。本開示の方法に従って脂肪酸アミドを産生するように操作された宿主細胞は、約3%以上、約5%以上、約10%以上、約15%以上、約18%以上、または約20%以上の収率を有し得る。あるいは、または加えて、収率は、約30%もしくはそれ未満、約27%もしくはそれ未満、約25%もしくはそれ未満、約22%もしくはそれ未満、約20%もしくはそれ未満、約17%もしくはそれ未満、約13%もしくはそれ未満、または約10%もしくはそれ未満である。したがって、収率は上記端点のいずれか2つによって制限され得る。例えば、本開示の組換え微生物によって産生される脂肪酸アミドの収率は、約5%〜約25%、約10%〜約25%、約10%〜約22%、約15%〜約27%、または約18%〜約22%であってよい。他の態様において、収率は30%を超える。
【０１１４】
「生産性」という用語は、宿主細胞培養物の単位密度当たりの宿主細胞培養物の単位量当たりに生産される脂肪酸アミドの量を指す。本明細書に記載される組成物および方法の任意の局面において、組換え微生物によって産生される脂肪酸アミドの生産性は、約3 mg/L/OD600以上、約6 mg/L/OD600以上、約9 mg/L/OD600以上、約12 mg/L/OD600以上、約15 mg/L/OD600以上、約18 mg/L/OD600以上、または約20 mg/L/OD600以上である。あるいは、または加えて、生産性は、約50 mg/L/OD600もしくはそれ未満、約40 mg/L/OD600もしくはそれ未満、約30 mg/L/OD600もしくはそれ未満、約25 mg/L/OD600もしくはそれ未満、約20 mg/L/OD600もしくはそれ未満、約17 mg/L/OD600もしくはそれ未満、または約10 mg/L/OD600もしくはそれ未満である。したがって、生産性は上記端点のいずれか2つによって制限され得る。例えば、生産性は、約3〜約30 mg/L/OD600、約6〜約20 mg/L/OD600、または約15〜約30 mg/L/OD600であってよい。
【０１１５】
本開示はまた、本明細書に記載される組換え微生物および方法によって生産された脂肪酸アミドを提供する。本開示の組換え微生物および方法によって生産された生物産物（例えば、脂肪酸アミド）は、二重炭素同位体フィンガープリント法または14C年代測定に基づいて、石油化学炭素由来の有機化合物と区別することができる。加えて、生物起源炭素の特定の供給源（例えば、グルコース対グリセロール）も、二重炭素同位体フィンガープリント法により決定することができる（例えば米国特許第7,169,588号を参照されたい）。
【０１１６】
生物産物と石油ベースの有機化合物とを区別する能力は、商業においてこれらの材料を追跡する上で有益である。例えば、生物ベースの炭素同位体プロファイルと石油ベースの炭素同位体プロファイルを両方含む有機化合物または化学物質を、石油ベースの材料のみから作られた有機化合物および化学物質と区別することができる。よって、本発明の方法に従って調製された脂肪酸アミドは、商業において、それら特有の炭素同位体プロファイルに基づいて追跡することができる。
【０１１７】
生物産物は、各燃料中の安定した炭素同位体比 (13C/12C) を比較することにより、石油ベースの有機化合物と区別することができる。所与の生物産物における13C/12C比は、二酸化炭素が固定された時点の大気中二酸化炭素における13C/12C比の結果である。これはまた正確な代謝経路を反映する。地域的な変動も生じる。石油、C3植物（広葉植物）、C4植物（草本植物）、および海洋炭酸塩はいずれも、13C/12Cおよび対応するδ13C値の有意な差を示す。さらに、C3植物およびC4植物の脂質は、代謝経路の結果として、同じ植物の炭水化物成分から誘導される材料とは異なる分析を示す。
【０１１８】
13C測定尺度は元々ピー・ディー・ベレムナイト (Pee Dee Belemnite) (PDB) 石灰石によって設定されたゼロ点により定義されたものであり、この場合、値はこの材料からの千分率偏差で示される。「δ13C」値は千分率（パーミル）で表され、%oと略記され、以下のように計算される：
δ13C (%o) = [(13C/12C)試料 - (13C/12C)標準物質] / (13C/12C)標準物質 x 1000
【０１１９】
いくつかの態様において、本開示の方法に従って生産される脂肪酸アミドは、約-30以上、約-28以上、-約27以上、約-20以上、約-18以上、約-15以上、約-13以上、または約-10以上のδ13Cを有する。あるいは、または加えて、脂肪酸アミドは、約-4もしくはそれ未満、約-5もしくはそれ未満、約-8もしくはそれ未満、約-10もしくはそれ未満、約-13もしくはそれ未満、約-15もしくはそれ未満、約-18もしくはそれ未満、または約-20もしくはそれ未満のδ13Cを有する。したがって、脂肪酸アミドは、上記端点のいずれか2つによって制限されるδ13Cを有し得る。例えば、脂肪酸アミドは、約-30〜約-15、約-27〜約-19、約-25〜約-21、約-15〜約-5、約-13〜約-7、または約-13〜約-10のδ13Cを有し得る。いくつかの態様において、脂肪酸アミドは、-10、-11、-12、または-12.3のδ13Cを有し得る。他の態様において、脂肪酸アミドは約-15.4以上のδ13Cを有する。さらなる他の態様において、脂肪酸アミドは、約-15.4〜約-10.9のδ13Cまたは約-13.92〜約-13.84のδ13Cを有する。
【０１２０】
生物産物はまた、各化合物中の14Cの量を比較することによって、石油ベースの有機化合物と区別することもできる。14Cは核半減期が5730年であるため、「より古い」炭素を含む石油ベースの燃料と「より新しい」炭素を含む生物産物とを区別することができる（例えば、Currie, 「Source Apportionment of Atmospheric Particles」, Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and H. P. van Leeuwen, Eds., Vol. I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series, Lewis Publishers, Inc., pp. 3-74 (1992)を参照されたい）。
【０１２１】
14Cは加速器質量分析 (AMS) によって測定することができ、その結果は「現代炭素の割合」という単位 (fM) で示される。fMは、米国立標準技術研究所 (National Institute of Standards and Technology) (NIST) の標準参照物質 (SRM) 4990Bおよび4990Cによって定義される。本明細書で用いられる場合、「現代炭素の割合」またはfMは、米国立標準技術研究所 (NIST) の、それぞれシュウ酸標準物質HOxIおよびHOxIIとして知られる標準参照物質 (SRM) 4990Bおよび4990Cによって定義されるものと同じ意味を有する。この基本定義は、0.95 × 14C/12C同位体比HOxI（AD1950を基準とする）に関連する。これは、減衰補正された産業革命前の木材にほぼ等しい。現在ある生物圏（植物材料）については、fMはおよそ1.1である。
【０１２２】
いくつかの態様において、本開示の方法に従って生産される脂肪酸アミドは、少なくとも約1、例えば、少なくとも約1.003、少なくとも約1.01、少なくとも約1.04、少なくとも約1.111、少なくとも約1.18、または少なくとも約1.124のfM14Cを有する。あるいは、または加えて、脂肪酸アミドは、約1.130またはそれ未満、例えば、約1.124もしくはそれ未満、約1.18もしくはそれ未満、約1.111もしくはそれ未満、または約1.04もしくはそれ未満のfM14Cを有する。したがって、脂肪酸アミドは、上記端点のいずれか2つによって制限されるfM14Cを有し得る。例えば、脂肪酸アミドは、約1.003〜約1.124のfM14C、約1.04〜約1.18のfM14C、または約1.111〜約1.124のfM14Cを有し得る。
【０１２３】
14Cの別の測定は、現代炭素のパーセント、すなわちpMCとして知られている。14C年代を使用する考古学者または地質学者にとって、AD 1950は「ゼロ年」に等しい。これはまた100 pMCを表す。熱核兵器実験のピークであった1963年に、大気中の「爆弾炭素」は通常レベルのほぼ2倍に達した。その出現以降、大気中のその分布は近似されて、AD 1950以降に生きる植物および動物では、100 pMCを上回る値を示す。これは時間と共に徐々に減少しており、現在の値は107.5 pMC付近である。これは、トウモロコシなどの新鮮なバイオマス材料が107.5 pMCに近い14C特性を示すことを意味する。石油ベースの化合物はpMC値がゼロであると考えられる。化石炭素を現代炭素と混合すると、現代pMC含量の希釈が生じることになる。107.5 pMCが現代バイオマス材料の14C含量を表し、0 pMCが石油ベースの生成物の14C含量を表すと仮定すると、この材料の測定pMC値はそれら2種類の成分の比率を反映することになる。例えば、現代のダイズに100%由来する材料は、107.5 pMCに近い放射性炭素特性を有する。この材料を石油ベースの生成物で50%希釈した場合、得られる混合物はおよそ54 pMCの放射性炭素特性を有する。
【０１２４】
生物ベース炭素含量は、「100%」を107.5 pMCに割り当て、「0％」を0 pMCに割り当てることによって導き出される。例えば、99 pMCと測定される試料は、93%に相当する生物ベース炭素含量を示す。この値は、平均生物ベース炭素結果と称され、分析した材料中の成分のすべてが現代生物材料または石油ベース材料のいずれかに由来すると仮定している。
【０１２５】
いくつかの態様において、本開示の方法に従って生産される脂肪酸アミドは、少なくとも約50、少なくとも約60、少なくとも約70、少なくとも約75、少なくとも約80、少なくとも約85、少なくとも約90、少なくとも約95、少なくとも約96、少なくとも約97、または少なくとも約98のpMCを有する。あるいは、または加えて、脂肪酸アミドは、約108もしくはそれ未満、約105もしくはそれ未満、約102もしくはそれ未満、約99もしくはそれ未満、約96もしくはそれ未満、約93もしくはそれ未満、約90もしくはそれ未満、約85もしくはそれ未満、または約80もしくはそれ未満のpMCを有する。したがって、脂肪酸アミドは、上記端点のいずれか2つによって制限されるpMCを有し得る。例えば、脂肪酸アミドは、約50〜約100；約60〜約105；約70〜約100；約80〜約105；約85〜約100；約87〜約98；または約90〜約95のpMCを有し得る。他の態様において、本明細書に記載される脂肪酸アミドは、約90、約91、約92、約93、約94、または約94.2のpMCを有する。
【０１２６】
本明細書に記載される組換え微生物および方法のいずれかによって生産される脂肪酸アミドは、それ自体を界面活性剤もしくは洗浄剤として直接使用することができ、または脂肪酸アミドは、パーソナル用、ペット用、もしくは家庭用洗浄組成物に製剤化することもできる。界面活性剤、洗浄剤、および洗浄組成物、ならびにそれらを製造するための方法は当技術分野で周知であり、例えば米国特許出願公開第2011/0206630号に詳細に記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２７】
したがって、本開示は、本明細書に記載される方法のいずれかによって生産された脂肪酸アミドを含む界面活性剤、洗浄剤、および洗浄組成物を提供する。当業者は、界面活性剤、洗浄剤、または洗浄組成物の意図された目的に応じて、異なる脂肪酸アミドを生産し、使用することができることを認識するであろう。例えば、本明細書に記載される脂肪酸アミドが界面活性剤または洗浄剤製品の原料として用いられる場合、当業者は、脂肪酸アミド原料の特徴が、製造される界面活性剤または洗浄剤組成物の特徴に影響することを認識するであろう。よって、界面活性剤または洗浄剤組成物の特徴は、原料として使用するための特定の脂肪酸アミドを生産することによって選択され得る。
【０１２８】
本開示の脂肪酸アミドベースの界面活性剤または洗浄剤は、当技術分野で周知の他の界面活性剤および／または洗浄剤と混合することができる、脂肪酸アミドは、混合物の総重量に基づいて、10重量パーセント (wt.%) 以上、15 wt.%以上、20 wt.%以上、30 wt.%以上、40 wt.%以上、50 wt.%以上、60 wt.%以上、または70 wt.%以上の量で混合物中に存在し得る。あるいは、または加えて、脂肪酸アミドは、混合物の総重量に基づいて、95 wt.%もしくはそれ未満、90 wt.%もしくはそれ未満、80 wt.%もしくはそれ未満、70 wt.%もしくはそれ未満、60 wt.%もしくはそれ未満、50 wt.%もしくはそれ未満、または40 wt.%もしくはそれ未満の量で混合物中に存在し得る。したがって、脂肪酸アミドは、上記端点のいずれか2つによって制限される量で混合物中に存在し得る。例えば、脂肪酸アミドは、15〜40%、30〜90%、50〜95%、または40〜50%の量で混合物中に存在し得る。
【０１２９】
脂肪酸アミドベースの界面活性剤を洗浄組成物に製剤化して、洗浄力および清浄力を該洗浄組成物に付与することができる。脂肪酸アミドは、洗浄組成物の総重量に基づいて、0.001 wt.%以上、0.1 wt.%以上、1 wt.%以上、10 wt.%以上、20 wt.%以上、または40 wt.%以上の量で洗浄組成物中に存在し得る。あるいは、または加えて、脂肪酸アミドは、洗浄組成物の総重量に基づいて、60 wt.%もしくはそれ未満、50 wt.%もしくはそれ未満、40 wt.%もしくはそれ未満、30 wt.%もしくはそれ未満、15 wt.%もしくはそれ未満、または5 wt.%もしくはそれ未満の量で洗浄組成物中に存在し得る。したがって、脂肪酸アミドは、上記端点のいずれか2つによって制限される量で洗浄組成物中に存在し得る。例えば、脂肪酸アミドは、0.1〜10 wt.%、10〜15 wt.%、20〜40 wt.%、または0.001〜5 wt.%の量で、洗浄組成物に製剤化することができる。
【０１３０】
本開示の洗浄組成物は、錠剤、顆粒、粉末、またはコンパクトなどの固体形態であってよい。洗浄組成物はまた、液体、ゲル、ペースト、乳濁液、または濃縮液などの液体形態であってよい。
【０１３１】
ある種の態様において、本開示の洗浄組成物は、液体または固体の洗濯洗剤組成物である。いくつかの態様において、洗浄組成物は硬質表面洗浄組成物であり、この場合、この硬質表面洗浄組成物は不織布基材に含浸させることが好ましい。本明細書で用いられる場合、「含浸させる」とは、不織布基材の少なくとも一部に硬質表面洗浄組成物が浸透するように、硬質表面洗浄組成物を不織布基材と接触させることを意味する。例えば、硬質表面洗浄組成物を不織布基材に染み込ませることが好ましい。他の態様において、本開示の洗浄組成物はカーケア組成物であり、これは、堅木、タイル、セラミック、プラスチック、革、金属、および／またはガラスなどの様々な表面を洗浄するのに有用である。いくつかの態様において、洗浄組成物は、例えば、液体食器手洗い用組成物、固体自動食器洗い用組成物、液体自動食器洗い用組成物、および錠剤／単位用量形態の自動食器洗い用組成物などの食器洗浄組成物である。
【０１３２】
他の態様において、洗浄組成物は、様々な機器および機械を洗浄するため、ならびに石油掘削作業において使用するために、工業環境で使用することができる。例えば、本開示の洗浄組成物は、特に、これが遊離硬度に接触する環境において、および石油掘削を支援するために用いられる場合などの、硬度耐性界面活性剤系を必要とする組成物において適している。
【０１３３】
いくつかの態様において、本開示の組換え微生物および方法のいずれかによって生産される脂肪酸アミドは、シャンプー、ボディソープ、洗顔料、または液体もしくは固体の石鹸などのパーソナルケア組成物およびペットケア組成物に製剤化される。
【０１３４】
本開示の組換え微生物および方法のいずれかによって生産された脂肪酸アミドを含む洗浄組成物は、当業者に周知の他の洗浄補助剤を含み得る。家庭用洗浄組成物、パーソナルケア組成物などを含む大部分の洗浄組成物に適用可能な一般的な洗浄補助剤には、溶媒、可溶化剤、担体、ビルダー、酵素、ポリマー、起泡剤、抑泡剤（消泡剤）、染料、フィラー、殺菌剤、ヒドロトロープ、抗酸化剤、香料、プロ香料、酵素安定化剤、色素などが含まれる。いくつかの態様において、洗浄組成物は液体洗浄組成物であり、この場合、この組成物は、溶媒、キレート剤、分散剤、および水より選択される1つまたは複数を含む。他の態様において、洗浄組成物は固体であり、この場合、この組成物は例えば無機フィラー塩をさらに含む。無機フィラー塩は、固体洗浄組成物の慣習的な成分であり、例えば約10 wt.%から約35 wt.%まで異なるかなりの量で存在する。適切なフィラー塩には、例えば、硫酸および塩化物のアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩が含まれる。例示的なフィラー塩は硫酸ナトリウムである。
【０１３５】
家庭用洗浄組成物（例えば、洗濯洗剤、家庭用表面クリーナー）は、漂白剤、漂白活性化剤、触媒物質、分散剤ポリマー、シルバーケア (silvercare)、変色防止剤および／または防食剤、アルカリ源、加工助剤、移染阻害剤、増白剤、構造弾性化剤、衣料柔軟剤、摩耗防止剤、および他の衣類ケア剤より選択される1つまたは複数の付加的な成分を含み得る。家庭用洗浄組成物に特に有用な洗浄補助剤および使用のレベルは、例えば、米国特許第5,576,282号、第6,306,812号、および第6,326,348号に記載されている。適切な洗濯洗浄補助剤または他の家庭用洗浄補助剤のリストは、例えば、国際特許出願公開第WO 99/05245号に記載されている。
【０１３６】
パーソナルケア組成物、ペットケア組成物、または化粧品組成物（例えば、シャンプー、洗顔クレンザー、手指消毒剤、頬紅、ブロンザー (bronzer) など）は、調整剤（例えば、ビタミン、シリコーン、シリコーン乳化安定化成分）、陽イオン性セルロース、またはポリマー（例えば、グアーポリマー）、フケ防止剤、抗菌剤、ゲル形成剤、懸濁剤、粘度調整剤、染料、不揮発性溶媒または希釈剤（水溶性または非水溶性）、起泡剤、シラミ駆除剤、pH調整剤、香料、保存剤、キレート剤、タンパク質、皮膚活性剤、日焼け止め剤、UV吸収剤、ミネラル、ハーブ／果実／食品抽出物、スフィンゴ脂質誘導体、および粘土より選択される1つまたは複数の付加的な成分を含み得る。
【０１３７】
本開示はまた、本明細書に記載される組換え微生物および方法のいずれかによって生産された脂肪酸アミドを含む燃料添加剤を提供する。ある種の態様において、燃料添加剤は、エンジン性能添加剤、洗浄剤、分散剤、摩耗防止剤、粘度指数調整剤、摩擦調整剤、抗酸化剤、さび止め剤、消泡剤、シール固定剤、潤滑添加剤、流動点降下剤、曇点低下剤、煙抑制剤、抵抗減少剤、金属不活性化剤、殺生物剤、および抗乳化剤より選択される。燃料添加剤は、米国特許出願公開第2010/0257777号に詳細に記載されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。
【０１３８】
ある種の態様において、本組換え微生物および本方法のいずれかによって生産された脂肪酸アミドを含む燃料添加剤は、脂肪酸アミドおよび該脂肪酸アミドの溶媒として用いられる1種または複数種の基油を含むパッケージ中に混合される。等級および／または種類に応じて、基油は、例えば、極端温度利点、抗酸化利点、または適切な流動点を含む、様々な程度の性能利点を添加剤パッケージに提供し得る。
【０１３９】
本開示はまた、本明細書に記載される組換え微生物および方法のいずれかによって生産された脂肪酸アミドならびに薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物は、例えば、希釈剤、補助剤、賦形剤、保存剤、pH調整剤などの付加的な成分、および例えば特定の適応症（例えば、疼痛または炎症）の治療に有用な治療薬などの付加的な治療薬を含み得る。
【０１４０】
薬学的組成物は、固体（例えば、錠剤、カプセル、舌下錠、粉末、小袋）組成物であってよい。薬学的組成物はまた、液体（例えば、水性液体、ゲル、ローション、クリーム）組成物であってよい。薬学的組成物は、例えば、経口、局所、静脈内、筋肉内、腹腔内、くも膜下腔内、硬膜外、経皮、皮下、経粘膜、および鼻腔内経路からなる群より選択される投与経路などの任意の適切な経路による投与のために製剤化され得る。
【０１４１】
本開示はまた、本明細書に記載される組換え微生物および方法のいずれかによって生産された脂肪酸アミドの有効量を対象に投与し、それによって該対象における疾患または状態を予防または治療することを含む、それを必要とする対象において疾患または状態を予防または治療する方法を提供する。
【０１４２】
「有効量」または「治療有効量」とは、ヒトまたは動物対象における疾患または状態の1つまたは複数の症状を軽減する（熟練した医療従事者が判断して、ある程度まで）量を意味する。加えて、「有効量」または「治療有効量」とは、疾患または状態と関連するかまたはその原因となる生理学的または生化学的パラメータを、部分的にまたは完全に正常に戻す量を意味する。当技術分野における熟練した臨床医は、組成物が投与された場合に特定の疾患状態または障害を治療または予防するための、その治療有効量を決定することができる。治療上有効であるために必要とされる組成物の正確な量は、多くの患者特有の考慮事項に加えて、例えば、活性物質の比活性、使用する送達装置、物質の物理学的特徴、投与の目的などの多くの因子に依存する。有効量または治療有効量となるために投与しなければならない組成物の量の決定は、当技術分野において慣例的であり、通常の技術を有する臨床医の技術の範囲内である。
【０１４３】
いくつかの態様において、有効量は、投薬単位当たり、本開示の脂肪酸アミドの1 ng以上、例えば、10 ng以上、100 ng以上、1μg以上、10μg以上、100μg以上、1 mg以上、10 mg以上、50 mg以上、または100 mg以上であってよい。あるいは、または加えて、有効量は、投薬単位当たり、本開示の脂肪酸アミドの5 gもしくはそれ未満、1 gもしくはそれ未満、500 mgもしくはそれ未満、250 mgもしくはそれ未満、100 mgもしくはそれ未満、75 mgもしくはそれ未満、25 mgもしくはそれ未満、10 mgもしくはそれ未満、または1 mgもしくはそれ未満であってよい。したがって、脂肪酸アミドは、上記端点のいずれか2つによって制限される量で投薬単位中に存在し得る。例えば、脂肪酸アミドは、100 ng〜10 mg、50 mg〜250 mg、1μg〜1 mg、または100 mg〜500 mgの量で投薬単位中に存在し得る。本開示の脂肪酸アミドの有効量を含む投薬単位を、単回の1日用量として投与することができ、または全1日投与量を、必要に応じて1日に2回、3回、4回、またはそれより多い分割用量として投与することもできる。
【０１４４】
疾患または状態は、本発明の脂肪酸アミドによる治療に反応する1つまたは複数の症状および／または生理学的もしくは生化学的パラメータを有する任意の疾患または状態であってよい。いくつかの態様において、疾患は炎症性疾患であり、本開示の脂肪酸アミドは、炎症を軽減するのに十分な量で投与される。ある種の態様において、炎症性障害は、自己免疫疾患、関節リウマチ、多発性硬化症、またはクローン病である。
【０１４５】
ある種の態様において、状態は疼痛であり、本開示の脂肪酸アミドは、鎮痛を提供するのに十分な量で投与される。
【０１４６】
他の態様において、状態は高血圧であり、本開示の脂肪酸アミドは、血圧の低下を引き起こすのに十分な量で投与される。
【０１４７】
アナンダミドは、カンナビノイド (CB) 1受容体、ならびにより少ない程度にCB2受容体およびバニロイド1受容体の内因性アゴニストである（Tan et al.、前記）。ヒトおよび動物対象へのアナンダミドの投与は、食物摂取および体重の調節、血圧の低下、心拍数の減少、心筋再灌流傷害の保護、化学的刺激、機械的刺激、または熱刺激によって誘発される急性疼痛の軽減、神経障害または炎症起源の慢性疼痛の軽減、炎症の軽減、急性ニューロン損傷（例えば、外傷性脳損傷、脳卒中、および癲癇）および慢性神経変性障害（例えば、多発性硬化症、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、およびアルツハイマー病）における神経保護の提供、気管支拡張の促進、眼圧の低下（例えば、緑内障患者における）、ならびに腫瘍細胞アポトーシスの促進を含む無数の生理学的効果を有することが実証されている（例えば、Pacher et al. (2006) Pharmacol. Rev. 58(3):389-462を参照されたい）。
【０１４８】
いくつかの態様において、脂肪酸アミドは、本明細書に記載される組換え微生物および方法によって生産されるアナンダミドであり、疾患または状態は、有効量のアナンダミドの投与によって治療または予防され得る上述の疾患または状態のうちの1つである。
【０１４９】
PEAおよびOEAは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体-α (PPAR-α) の内因性アゴニストである（Fu et al. (2003) Nature 425(6953): 90-93；およびLo Verme et al.、前記）。ヒトおよび動物対象へのPEAまたはOEAの投与は、食物摂取および体重の調節、疼痛および炎症の軽減、神経保護の提供、ならびに眼圧の低下を含む、アナンダミドによって誘発されるのと同じ反応の多くを誘起することが実証されている（例えば、Fu et al.、前記、Tan et al.、前記、Lo Verme et al.、前記、ならびに米国特許第6,348,498号および第6,656,972号を参照されたい）。
【０１５０】
いくつかの態様において、脂肪酸アミドは、本明細書に記載される組換え微生物および方法によって生産されるPEAであり、疾患または状態は、有効量のPEAの投与によって治療または予防され得る上述の疾患または状態のうちの1つである。他の態様において、脂肪酸アミドは、本明細書に記載される組換え微生物および方法によって生産されるOEAであり、疾患または状態は、有効量のOEAの投与によって治療または予防され得る上述の疾患または状態のうちの1つである。
【実施例】
【０１５１】
以下の具体的な実施例は本開示を説明することを意図するものであり、特許請求の範囲の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【０１５２】
実施例1
本実施例は、アシル-CoAデヒドロゲナーゼ、外膜タンパク質受容体、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、および転写リプレッサーの発現が減弱された、遺伝子操作された微生物の構築を説明する。
【０１５３】
大腸菌MG1655 DV4は、fadE（アシル-CoAデヒドロゲナーゼ）、fhuA（外膜タンパク質受容体）、pflB（ピルビン酸ギ酸リアーゼ）、およびldhA（乳酸デヒドロゲナーゼ）の遺伝子欠失を含む、遺伝子操作された大腸菌K株である（参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2011/0072714号および第2011/0162259号を参照されたい）。本明細書に記載される以下の修正と共に、Datsenko et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645によるラムダレッドシステム (Lambda Red System) を用いて、転写リプレッサーをコードする大腸菌MG1655のfabR遺伝子（GenBankアクセッション番号AAC76945）を大腸菌MG1655 DV4から欠失させた。 
【０１５４】
欠失株を作製するために使用した2つのプライマーは、以下のものであった：
fabR_del_F：
2015516808.tif 000003
；および
fabR_del_R：
2015516808.tif 000004
。
【０１５５】
Datsenko et al.、前記に記載される通りに、fabR_del_FプライマーおよびfabR_del_Rプライマーを用いて、PCRによりプラスミドpKD13からカナマイシン耐性 (KmR) カセットを増幅した。次に、得られたPCR産物を用いて、Datsenko et al.、前記に記載される通りに、予めアラビノースで3〜4時間誘導した、プラスミドpKD46を含むエレクトロコンピテント大腸菌MG1655 DV4細胞を形質転換した。SOC培地中で37℃で3時間増殖させた後、この細胞を、50μg/mLのカナマイシンを含むルリア寒天プレート上にプレーティングした。37℃で一晩インキュベートした後、カナマイシンに対して耐性であるコロニーを同定し、単離した。fabR遺伝子の破壊は、大腸菌fabR遺伝子に隣接するプライマーを用いて確認した。
【０１５６】
fabRの欠失の確認は、以下のプライマーを用いて行った：
2015516808.tif 000005
。
【０１５７】
欠失が確認された後、単一コロニーを用いて、Datsenko et al.、前記に記載される方法に従って、KmRマーカーを除去した。fadE、fhuA、pflB、ldhA、およびfabRの遺伝子欠失を有する、得られたMG1655大腸菌株を、大腸菌MG1655 ΔfadE_ΔfhuA_ΔpflB_ΔldhAE_ΔfabRまたは大腸菌MG1655 DG5と命名した。
【０１５８】
本実施例は、アシル-CoAデヒドロゲナーゼ、外膜タンパク質受容体、ピルビン酸ギ酸リアーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、および転写リプレッサーの発現が減弱された、遺伝子操作された微生物である大腸菌MG1655 DG5の構築を説明する。
【０１５９】
実施例2
本実施例は、チオエステラーゼ (‘tesA) およびアシル-CoA合成酵素 (fadD) をコードするヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下において微生物の染色体に組み込まれた、遺伝子操作された微生物の構築を説明する。
【０１６０】
‘tesAは、リーダーなしの大腸菌tesA遺伝子を含むヌクレオチド配列である（GenBankエントリーAAC73596、アクセッションU00096.2）。‘tesAは、最初の25アミノ酸が欠失し、26位のアミノ酸であるアラニンがメチオニンと置き換えられた大腸菌チオエステラーゼ (EC 3.1.1.5, 3.1.2.-) をコードする。その結果、そのメチオニンが‘tesAの第1アミノ酸となった (Cho et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:4216-4219)。大腸菌fadD（GenBankエントリーAAC74875；アクセッションU00096.2）は、アシル-CoA合成酵素をコードする。
【０１６１】
‘tesAまたは‘tesA-fadDを含むpACYC-Ptrcプラスミドの構築
‘tesA遺伝子は、以前に記載された通りに、NdeI/AvrII消化したpETDuet-1プラスミド（Novagen、Madison, WI）に‘tesA遺伝子をクローニングすることによって構築された、pETDuet-1-‘tesAプラスミドから得た（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2010/0242345号および国際特許出願公開第WO 2007/136762号を参照されたい）。fadD遺伝子は、以前に記載された通りに、pCDFDuet-1プラスミド（Novagen、Madison, WI）にfadD遺伝子をクローニングすることによって構築された、pHZ1.61プラスミド (SEQ ID NO: 8) から得た（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2010/0257777号もまた参照されたい）。‘tesA遺伝子およびfadD遺伝子は、高忠実度PHUSION（商標）ポリメラーゼ（New England Biolabs, Inc.、Ipswich, MA）および以下のプライマーを用いて、それぞれpETDuet-1-‘tesAおよびpHZ1.61から増幅した：
2015516808.tif 000006
。
【０１６２】
pACYC-‘tesAプラスミドを構築するため、‘tesA PCR産物およびpACYC-Ptrcベクター (SEQ ID NO: 13) をNcoIおよびEcoRIで消化した。T4 DNAリガーゼ（New England Biolabs、Ipswich, MA）による一晩のライゲーション後、このDNA産物をTOP10（登録商標）ONE SHOT（登録商標）細胞（Invitrogen、Carlsbad, CA）に形質転換した。pACYC-Ptrcベクターへの‘tesAの挿入は、制限消化により確認した。IN-FUSION（商標）クローニング（Clontech、Mountain View, CA）のためのSwaI制限部位および重複断片もまた、‘tesA挿入物の3'末端において作出した。
【０１６３】
pACYC-Ptrc-‘tesA-fadDプラスミドを構築するため、pACYC-Ptrc-‘tesAプラスミドをSwaIによる一晩の制限消化に供した。pHZ1.61から増幅されたfadD PCR産物を、IN-FUSION（商標）PCRクローニングシステム（Clontech、Mountain View, CA）を用いて‘tesA遺伝子の下流にクローニングした。fadDの挿入は、制限消化で検証した。fadDの挿入によって、‘tesA遺伝子の後のSwaI部位は破壊されるが、fadDの3'末端において新たなSwaI部位が再度作出される。
【０１６４】
Tn7tesプラスミドおよびTn7tesfadプラスミドの構築
pACYC-Ptrc-‘tesAプラスミドおよびpACYC-Ptrc-‘tesA-fadDプラスミドを鋳型として用いて、それぞれPtrc-‘tesAカセットおよびPtrc-‘tesA-fadDカセットを生成した。以下のプライマーを用いて、そのようなカセットを得た：
2015516808.tif 000007
。
【０１６５】
プラスミドpGRG25（GenBankアクセッション番号DQ460223）を精製し、NotIおよびAvrII（New England Biolabs, Inc.、Ipswich, MA）による制限消化に供した。IN-FUSION（商標）PCRクローニングシステム（Clontech、Mountain View, CA）を用いて、Ptrc-‘tesAカセットをpGRG25のNotIおよびAvrII制限部位にクローニングして、左側および右側のTn7末端がlacIqおよびPtrc-‘tesA遺伝子に隣接しているTn7tesプラスミド (SEQ ID NO: 16) を作出した。同様に、Ptrc-‘tesA-fadDカセットをpGRG25のNotIおよびAvrII制限部位にクローニングし、それによって左側および右側のTn7末端がlacIqおよびPtrc-‘tesA-fadD遺伝子に隣接しているTn7tesfadプラスミド (SEQ ID NO: 17) を作出した。
【０１６６】
大腸菌MG1655 DG5 Tn7-‘tesAおよび大腸菌MG1655 DG5 Tn7-‘tesA-fadDの作製
McKenzie et al., BMC Microbiology, 6:39 (2006) によって記載されるプロトコールを用いて、プラスミドTn7tesおよびTn7tesfadをそれぞれ別々に大腸菌株MG1655 DG5（実施例1に記載）にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、0.1%グルコースおよび100μg/mLカルベニシリンを含むLB培地中で32℃で一晩増殖させることにより、アンピシリン耐性細胞を選択し、次に0.1%アラビノースを含むLBプレート上で32℃で一晩増殖させることにより、Tn7転位部分を含む細胞を選択した。単一コロニーを、アンピシリンを含むまたは含まないLB培地プレート上に画線し、42℃で一晩増殖させて、Tn7tesプラスミドまたはTn7tesfadプラスミドをキュアリングした。このようにして、lacIqおよびPtrc-‘tesA遺伝子またはlacIqおよびPtrc-‘tesA-fadD遺伝子を、大腸菌MG1655染色体上のpstS遺伝子とglmS遺伝子との間に位置するattTn7部位に組み込んだ。これらの遺伝子の組込みは、以下のプライマーを用いてPCRおよび配列決定により確認した：
2015516808.tif 000008
。
【０１６７】
得られた株を、それらに応じて大腸菌MG1655 DG5 Tn7-‘tesAおよび大腸菌MG1655 DG5 Tn7-‘tesA-fadDと命名した。
【０１６８】
本実施例の結果は、チオエステラーゼをコードするヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下において宿主細胞の染色体に組み込まれた、遺伝子操作された微生物（すなわち、大腸菌MG1655 DG5 Tn7-‘tesA）、またはチオエステラーゼおよびアシル-CoA合成酵素をコードするヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下において宿主細胞の染色体に組み込まれた、遺伝子操作された微生物（すなわち、大腸菌MG1655 DG5 Tn7-‘tesA-fadD）の作製を説明する。
【０１６９】
実施例3
本実施例は、遺伝子操作された微生物において、パルミトイルプトレシン合成酵素をコードする遺伝子を発現させることにより、N-パルミトイルエタノールアミドを生産する方法を説明する。
【０１７０】
GenBankアクセッション番号AY632377 (Brady, S.F., et al. (2004) J. Nat. Prod., 67:1283-1286) (SEQ ID NO: 2) として同定される細菌パルミトイルプトレシン合成酵素 (PPS) をコードする遺伝子は、DNA2.0 (Menlo Park, CA) によって合成された。pJ201:30127と命名されたDNA2.0プラスミドは、開始コドンに隣接するNcoI部位および終止コドンに隣接するPmeI部位を含むように設計された。pJ201:30127中のPPSコード遺伝子は、コドン最適化されなかった。PPSコード遺伝子を、以前に記載された発現ベクターOP80にサブクローニングした（その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2010/0154293号を参照されたい）。OP80ベクターは、IPTG誘導性trcプロモーターの制御下に機能的に連結された遺伝子を発現する低コピープラスミドであるpCL1920に基づいている。PPS遺伝子を発現するOP80ベクターを構築するため、プラスミドOP80およびpJ201:30127を精製し、NcoI/PmeI（New England Biolabs, Inc.、Ipswich, MA）による制限消化に供した。PPSコード遺伝子を、T4 DNAリガーゼを用いて、NcoI/PmeI消化したOP80プラスミドに連結した。ライゲーション反応物をTOP10（登録商標）大腸菌細胞に形質転換し、その細胞をスペクチノマイシンを含むLB寒天上にプレーティングした。コロニー10個を選択し、そのコロニーを培養し、プラスミドDNAを単離し、プラスミドDNAをNcoI/PmeIで消化することにより、PPSコード挿入物について試験した。1個のコロニーが、制限消化により、PPSコード挿入物を含むプラスミドについて陽性であった。このプラスミドは、配列解析によりPPSコード遺伝子を含むことが確認され、「OP80-PPS」と命名された。次にOP80-PPSプラスミドを、大腸菌MG1655株DG5（実施例1に記載）、DG5 Tn7-‘tesA（実施例2に記載）、およびDG5 Tn7-‘tesA-fadD（実施例2に記載）に形質転換した。対照として、OP80空ベクターを大腸菌MG1655株DG5、DG5 Tn7-‘tesA、およびDG5 Tn7-‘tesA-fadDに形質転換した。全6つの株を、グルコースを追加せずにLBブロス中で培養した。各培養物がOD600 1.2に達した時点で、エタノールアミン (0.1% (v/v))と共に、IPTGを1 mMの最終濃度まで添加した。24時間後、培養物を回収し、酢酸エチルで抽出し（2倍量の培養物 対 1倍量の酢酸エチル）、有機画分を収集し、GC-MSによる脂肪種の解析に使用した。
【０１７１】
分離用の30 m x 0.25 mm 0.25μmフィルムAgilent HP-5-MSカラムを備えたGC-MS（Agilent 6850 GCおよび5975B VL MSD）により、質量検出器の電子イオン化 (EI) をフルスキャンモード（50〜500 m/z）にして、全試料を解析した。1μLの酢酸エチル抽出物を、300℃に設定したAgilentスプリットレス注入口に注入した。カラムは、以下のように温度プログラミングした：100℃で5分間、20℃／分で320℃まで上昇、および320℃で5分間保持。担体ガスヘリウムは、流速1.2 mL／分に設定した。OP80-PPSで形質転換された大腸菌MG1655株DG5の、質量スペクトルの解釈を加えた代表的なクロマトグラムを図1に示す。OP80-PPSで形質転換されたすべての大腸菌MG1655株DG5、DG5 Tn7-‘tesA、およびDG5 Tn7-‘tesA-fadDのGC-MSトレースにおいて、保持時間13.1分を有するピークが同定された。このピークは、N-パルミトイルエタノールアミドと同定された。N-パルミトイルエタノールアミドと同定されたこのピークは、空ベクターで形質転換された対照株のいずれにおいても存在しなかった。
【０１７２】
OP80-PPSで形質転換された大腸菌MG1655株DG5において、およそ200 mg/LのN-パルミトイルエタノールアミドが産生されたと推定された。大腸菌MG1655株DG5は脂肪酸アシル-ACPを産生するように操作されているのに対して、DG5 Tn7-‘tesAは遊離脂肪酸を産生するように操作されており、およびDG5 Tn7-‘tesA-fadDは脂肪酸アシル-CoAを産生するように操作されている。これらの結果から、3つの株すべてがN-パルミトイルエタノールアミドを産生することが実証されたため、親DG5株におけるN-パルミトイルエタノールアミドの産生により、遺伝子AY632377によってコードされるPPS酵素が、一級エタノールアミノンの存在下で、C16:0アシル-ACPを基質として使用することが示唆される。図1で同定されたN-パルミトイルエタノールアミドを、ヒドロキシル基がトリメチルシリル保護されるN,O-ビス(トリメチルシリル)-トリフルオロアセトアミド (BSTFA) による誘導体化により、さらに特徴づけた。図2Aに示されるように、保持時間13.3分を有するGC-MSトレースにおけるピークは、トリメチルシリル (TMS) 保護産物と同定された。
【０１７３】
本実施例の結果は、脂肪酸アシル-ACPを産生するように操作された細菌株において、遺伝子AY632377によってコードされるPPS酵素を発現させることにより、N-パルミトイルエタノールアミドを生産する方法を説明する。加えて、これらの結果から、単一の酵素（すなわち、PPS）が、インビボにおいてアシル-ACPおよび一級アミン頭部基から直接、二次的アミド化を行うことができることが示唆される。
【０１７４】
実施例4
本実施例は、遺伝子操作された微生物において、パルミトイルプトレシン合成酵素をコードする遺伝子を発現させることにより、N-パルミトイルエタノールアミドを生産する方法を示す。
【０１７５】
実施例3に記載されるように、OP80空ベクターまたはOP80-PPSプラスミドを、大腸菌MG1655株DG5、DG5 Tn7-‘tesA、およびDG5 Tn7-‘tesA-fadDに形質転換した。6つの株をそれぞれ、グルコースを追加せずにLBブロス中で一晩培養した。次いで、一晩培養物の各々を、グルコースを含む栄養分豊富な培地中に接種した。より具体的には、一晩培養物の各々の1 mLを、1 mM IPTG、抗生物質、および1%エタノールアミンを含む栄養分豊富な2N-BT（2%グルコース、窒素制限培地、0.2 M Bis-Tris、pH 7.0、0.1% Triton）：LB培地 (1:10) 中に3つ組で接種し、pH調整されたインキュベーター内で培養した。48時間後、各培養物のOD600を記録し、細胞を回収し、酢酸エチルで抽出した（2倍量の培養物 対 1倍量の酢酸エチル）。有機画分を収集し、実施例3に記載されるように、GC-MS解析に使用した。OP80-PPSで形質転換された大腸菌MG1655株DG5 Tn7-‘tesA-fadDのGC-MSトレースにおいて、保持時間13.1分を有するピークが最も多いことが見出された。保持時間13.1分を有するピークは、OP80-PPSで形質転換された株DG5において2番目に最も多く、およびOP80-PPSで形質転換された株DG5 Tn7-‘tesAにおいて3番目に最も多かった。すべての株から、13.1分のピークはN-パルミトイルエタノールアミドと同定された。N-パルミトイルエタノールアミドと同定されたこのピークは、空ベクターで形質転換された対照DG5株のいずれにおいても存在しなかった。
【０１７６】
上記の通り、大腸菌MG1655株DG5 Tn7-‘tesA-fadDは、脂肪酸アシル-CoAを産生するように操作されている。したがって、DG5 Tn7-‘tesA-fadD株におけるN-パルミトイルエタノールアミドの産生により、遺伝子AY632377によってコードされるPPS酵素が、エタノールアミノンの存在下で、脂肪酸アシル-CoAも基質として使用することができることが示唆される。
【０１７７】
本実施例の結果は、脂肪酸アシル-CoAを産生するように操作された細菌株において、遺伝子AY632377によってコードされるPPS酵素を発現させることにより、N-パルミトイルエタノールアミドを生産する方法を示す。加えて、これらの結果から、単一の酵素（すなわち、PPS）が、インビボにおいて脂肪酸チオエステルおよび一級アミン頭部基から直接、二次的アミド化を行うことができることが示唆される。
【０１７８】
実施例5
本実施例は、遺伝子操作された微生物において、PPSをコードする遺伝子を発現させることにより、飽和脂肪酸アミドおよび不飽和脂肪酸アミドを生産する方法を示す。
【０１７９】
脂肪酸3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミドは、両性洗剤コカミドプロピルベタイン (CAPB) の合成における前駆体である。PPSを発現するように遺伝子操作された微生物において、脂肪酸N-(3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミン)アミドが産生され得るかどうかを判定するために、大腸菌MG1655株DG5細胞をOP80空ベクターまたはOP80-PPSプラスミドで形質転換し、グルコースを追加せずにLBブロス中で一晩培養した。次いで、一晩培養物の各々を、グルコースを含む栄養分豊富な培地中に接種した。より具体的には、一晩培養物の各々の1 mLを、1 mM IPTG、抗生物質、および1%一級アミン3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミンを含む栄養分豊富な2N-BT（2%グルコース、窒素制限培地、0.2 M Bis-Tris、pH 7.0、0.1% Triton）：LB (1:10) 培地中に3つ組で接種し、pH調整されたインキュベーター内で培養した。60時間後、各培養物のOD600を記録し、細胞を回収し、酢酸エチルで抽出した（2倍量の培養物 対 1倍量の酢酸エチル）。有機画分を収集し、実施例3に記載されるように、GC-MS解析に使用した。このクロマトグラムを、脂肪酸N-(3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミン)アミドの共通イオンであるイオン58に関する抽出イオンクロマトグラムにより解析した。GC-MSトレースにおいて、C12:0（12.8分）、C14:0（13.2分）、C16:1（13.5分）、C16:0（13.6分）、およびC18:1（14.3分）脂肪鎖を含むN-(3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミン)アミドが同定された（図3）。GC-MSトレースにおいて、C16:0脂肪鎖を含む脂肪酸アミドが最も多いと見なされた（図3）。
【０１８０】
本実施例の結果は、3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミンを含む培地中で、アシル-ACPを産生するように操作され、かつ遺伝子AY632377によってコードされるPPS酵素をさらに発現する大腸菌株を培養することにより、0個または1個の不飽和を有する様々な脂肪鎖長を有する脂肪酸アミドを生産する方法を示す。
【０１８１】
実施例6
本実施例は、遺伝子操作された微生物に種々の一級アミンを供給することにより、様々な脂肪酸アミドを生産するための方法を説明する。
【０１８２】
実施例3に記載されるように、OP80空ベクターまたはOP80-PPSプラスミドを、大腸菌MG1655株DG5、DG5 Tn7-‘tesA、およびDG5 Tn7-‘tesA-fadDに形質転換した。6つの株をそれぞれ、グルコースを追加せずにLBブロス中で一晩培養した。次いで、一晩培養物の各々を、グルコースを含む栄養分豊富な培地中に接種した。より具体的には、一晩培養物の各々の1 mLを、1 mM IPTG、抗生物質、ならびに1%の、以下の一級アミン：(±)-1-アミノ-2-プロパノール、2-メトキシエチルアミン、3-アミノ-1-プロパノール、2-アミノ-1,3プロパンジオール、3-メトキシプロピルアミン、N-(2-ヒドロキシエチル)エチレンジアミン、またはブチルアミンのうちの1つを含む栄養分豊富な2N-BT（2%グルコース、窒素制限培地、0.2 M Bis-Tris、pH 7.0、0.1% Triton）：LB (1:10) 培地中に接種した。この培養物を、pH調整された環境において60時間インキュベートした。各培養物のOD600を記録し、細胞を回収し、酢酸エチルで抽出した（2倍量の培養物 対 1倍量の酢酸エチル）。有機画分を収集し、実施例3に記載されるように、GC-MS解析に使用した。一級アミンを供給したPPS発現大腸菌株のそれぞれから、脂肪酸アミドが得られた。各供給物基質から得られた脂肪酸アミド産物を図4に示す。空ベクターで形質転換された大腸菌株では、脂肪酸アミド産物は検出されなかった。
【０１８３】
本実施例の結果から、一級アミン供給物の種類を変化させることにより、脂肪酸チオエステルを産生するように遺伝子操作され、かつ遺伝子AY632377によってコードされるPPS酵素をさらに発現する大腸菌株において、異なる種の脂肪酸アミドを生産する方法が実証される。
【０１８４】
実施例7
本実施例は、遺伝子操作された微生物におけるPPSの相同体の発現により、PPSが発現された場合に産生されるものと同じ脂肪酸アミド化合物が産生されたことを示す。
【０１８５】
遺伝子AY632377 (SEQ ID NO: 2) によってコードされるPPSは、BLAST解析により、任意の他の公知の配列と20%を超える配列同一性を有さないと以前に判定された（Brady et al (2004) J. Not. Prod., 67: 1283-1286を参照されたい）。遺伝子AY632377によってコードされるPPS酵素のアミノ酸配列、すなわちGenBankアクセッション番号AAV33349 (SEQ ID NO: 1) を、米国立バイオテクノロジー情報センター (National Center for Biotechnology Information) (NCBI) データベースのBLAST検索に供した。酵素、N-(4-アミノ-2-ヒドロキシブチル)テトラデカンアミド合成酵素 (AhtS) をコードする相同体（GenBankアクセッション番号ACX33975.1）(SEQ ID NO: 3)は、AY632377によってコードされるPPSのアミノ酸配列と38%同一であるアミノ酸配列を有すると同定された。AhtSをコードする遺伝子はGENEART（商標）（Life Technologies、Grand Island, NY）によって合成され、この遺伝子を以下のように発現ベクターOP80にクローニングした。プラスミドOP80を精製し、NcoI/PmeI（New England Biolabs, Inc.、Ipswich, MA）による制限消化に供した。以下のプライマーと共にIN-FUSION（商標）PCRクローニングシステム（Clontech、Mountain View, CA）を用いて、AhtS遺伝子をOP80にクローニングした：
2015516808.tif 000009
。2個のコロニーが、制限消化により、AhtSコード挿入物を含むプラスミドについて陽性であった。このプラスミドは、配列解析によりAhtSコード遺伝子を含むことが確認され、「OP80-AhtS」と命名された。OP80-AhtSプラスミドを、大腸菌MG1655株DG5、DG5 Tn7-‘tesA、およびDG5 Tn7-‘tesA-fadDに形質転換した。3つの株を、実施例4に記載されるように培養して誘導し、各培養物に、3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミン、(±)-1-アミノ-2-プロパノール、またはエタノールアミンのいずれかを1%の最終濃度になるまで供給した。pH調整されたインキュベーター内で60時間培養した後、培養物を回収し、酢酸エチルで抽出した（2倍量の培養物 対 1倍量の酢酸エチル）。有機画分を収集し、実施例3に記載されるように、GC-MS解析に使用した。
【０１８６】
一級アミンの各々を供給したAhtS発現大腸菌株の各々から、脂肪酸アミドが得られた。3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミンを供給した、OP80-AhtSで形質転換された大腸菌MG1655株DG5 Tn7-‘tesA-fadDによって産生された産物の代表的なGC-MSトレースを図5に示す。MS解析により、GC保持時間11.4分を有するピークは、C14:0脂肪酸N-(3-ジメチルアミノ-1-プロピルアミド）と確認された（図5）。空ベクターで形質転換された大腸菌株では、脂肪酸アミド産物は検出されなかった。大腸菌MG1655株DG5 Tn7-‘tesA-fadDにおいて最も多量のアミドが産生されたのに対して、大腸菌MG1655株DG5 Tn7-‘tesAにおいて最も少量のアミドが産生された。DG5 Tn7-‘tesA-fadD株におけるアミドの産生増加により、AhtS酵素がC14:0脂肪酸チオエステル基質を好むことが示唆される。これらのデータから、AhtSおよびPPSがいずれも、大腸菌において2つの脂肪酸チオエステル基質（すなわち、脂肪酸-ACPおよび脂肪酸-CoA）の各々を使用して、脂肪酸アミドを生成することができることもまた示唆される。
【０１８７】
本実施例の結果から、AhtS酵素が、PPS酵素と同じ種類の、一級アミンと脂肪酸チオエステル基質との間の反応を触媒することができることが実証される。加えて、本実施例で示されるデータから、AhtS酵素がC14:0脂肪酸チオエステル基質を好むことが示される。
【０１８８】
実施例8
本実施例は、本開示による脂肪酸アミドの生成において、出発材料として有用な一級アミンを生成するためのインビボ方法を提供する。
【０１８９】
エタノールアミンのインビボ生成は、セリン生合成経路およびセリン脱炭酸経路を遺伝的に増加させることによって達成することができる。そのようにするために、ホスホグリセリン酸ムターゼ (gpm AB) を過剰発現するように大腸菌株MG1655を操作することによって、解糖系中間体3-ホスホグリセリン酸を増加させる。セリン生成経路は、ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ (serA)、3-ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ (serC)、および3-ホスホセリンホスファターゼ (serB) を過剰発現させることによって操作される。セリンを脱炭酸してエタノールアミンにする異種セリンデカルボキシラーゼ (SDC) を宿主細胞において発現させる。その株がエタノールアミンおよびセリンを代謝するのを防ぐために、分解酵素エタノールアミンアンモニアリアーゼ (eutABC) およびセリンデアミナーゼ (sdaAB) をコードする遺伝子を欠失させる（図6）。次に、エタノールアミンとアシルチオエステルの脂肪酸アミドへの変換を触媒する、PPSまたはAhtSなどのポリペプチド過剰発現させることにより、エタノールアミンを産生する組換え微生物において脂肪酸アミドを生産することができる。
【０１９０】
本開示の様々な修正および変更は、本開示の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかであろう。本開示を特定の好ましい態様に関して説明したが、特許請求の範囲がそのような特定の態様に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、当業者によって理解される、本開示を実施するための記載様式の様々な修正は、特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図１】
2015516808.tif 000010
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
2015516808.tif 000015
【図３】
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【図４】
2015516808.tif 000017
【図５】
2015516808.tif 000018
【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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