(57)【要約】  脂質ナノ粒子製剤と、それを作製する方法、及びそれを使用する方法を開示する。
2015523969.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの脂質と少なくとも１つのアルブミン−ポリマーコンジュゲート（ＡＰＣ）を含んでなる脂質ナノ粒子であって、ここで該ポリマーは、少なくとも１つの陽荷電ポリマーを含む、前記脂質ナノ粒子。
【請求項２】
ＡＰＣが超カチオン化アルブミン−ポリカチオンコンジュゲートを含む、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項３】
約０〜約＋４０ｍＶのゼータ電位を有する、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項４】
ＡＰＣが少なくとも１つのオリゴヌクレオチドへ結合することが可能である、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項５】
陽荷電ポリマーが、スペルミン、ジスペルミン、トリスペルミン、テトラスペルミン、オリゴスペルミン、テルミン、スペルミジン、ジスペルミジン、トリスペルミジン、オリゴスペルミジン、プトレシン、ポリリジン、ポリアルギニン、分岐鎖又は直鎖型のポリエチレンイミン、及びポリアリルアミンからなる群より選択されるポリアミンを含む、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項６】
少なくとも１つの陽荷電ポリマーがポリエチレンイミンを含む、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項７】
ポリエチレンイミンが５０ｋＤａ以下の分子量を有するか又は約２００〜約２０００Ｄａの分子量を有する、請求項６の脂質ナノ粒子。
【請求項８】
ポリエチレンイミンがヒト血清アルブミンへコンジュゲートする、請求項６の脂質ナノ粒子。
【請求項９】
少なくとも１つの陽荷電ポリマーがテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）を含む、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項１０】
陽荷電ポリマーが２以上の低分子量ポリマーの混合物を含む、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項１１】
アルブミンが少なくとも１つの陽荷電ポリマーへ１以上の架橋剤を介してコンジュゲートする、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項１２】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）へコンジュゲートしたペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）を含む、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項１３】
それぞれのＨＳＡ分子へ平均して約１１個のＰＥＨＡ分子が連結している、請求項１２の脂質ナノ粒子。
【請求項１４】
少なくとも１つの脂質が、カチオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ化脂質、及びコレステロールの１以上を含む、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項１５】
少なくとも１つの脂質が、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｌ−α−ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、及びｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコール１０００スクシネート（ＴＰＧＳ）を含む、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項１６】
脂質が２５：７０：５のモル比のＤＯＴＡＰ：ＳＰＣ：ＴＰＧＳである、請求項１５の脂質ナノ粒子。
【請求項１７】
核酸、化学療法剤、及びこれらの組合せより選択される少なくとも１つの分子を被包する、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項１８】
被包化分子が、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲ、抗ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、及びこれらの組合せより選択される核酸を含む、請求項１７の脂質ナノ粒子。
【請求項１９】
被包化分子が、抗新生物剤、抗感染症薬、局所麻酔薬、抗アレルギー薬、抗貧血薬、血管新生阻害剤、β−アドレナリン作動性遮断薬、カルシウムチャネル拮抗薬、降圧剤、抗うつ薬、抗痙攣薬、抗細菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗リウマチ薬、駆虫薬、抗寄生虫薬、コルチコステロイド、ホルモン、ホルモン拮抗薬、免疫調節剤、神経伝達物質拮抗薬、抗糖尿病剤、抗てんかん薬、止血薬、抗過緊張薬、抗緑内障剤、免疫調節性サイトカイン、鎮静剤、ケモカイン、ビタミン、毒素、麻薬、造影剤、及びこれらの組合せより選択される治療薬剤を含む、請求項１７の脂質ナノ粒子。
【請求項２０】
被包化分子が核酸治療薬剤を含む、請求項１７の脂質ナノ粒子。
【請求項２１】
核酸治療薬剤が、ｐＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲＮＡ、ＡＳＯ、及びこれらの組合せより選択される、請求項２０の脂質ナノ粒子。
【請求項２２】
核酸治療薬剤が、置換基ＮＡ塩基単位への修飾によって、ホスホジエステルリンカーのホスホロチオエート置換によって、及び／又はリボース単位の２’−Ｏ−メチル化によって安定化される、請求項２０の脂質ナノ粒子。
【請求項２３】
約３００ｎｍ未満の直径を有する、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項２４】
約２００ｎｍ未満の直径を有する、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項２５】
ポリマーがその脂質の外部表面へ直結合を介するか又はリンカーを介して結合する、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項２６】
少なくとも約４０％の分子の被包化効率を有する、請求項１６の脂質ナノ粒子。
【請求項２７】
ポリエチレングリコール−コンジュゲート（conjugated）脂質がさらに含まれる、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項２８】
ポリエチレングリコール−コンジュゲート脂質が、ポリソルベート８０、ＴＰＧＳ、及びｍＰＥＧ−ＤＳＰＥの１以上を含む、請求項２７の脂質ナノ粒子。
【請求項２９】
ポリエチレングリコール−コンジュゲート脂質が約１５．０モルパーセント未満の濃度で存在する、請求項２７の脂質ナノ粒子。
【請求項３０】
標的細胞又は細胞表面上の標的分子へ結合することが可能なリガンドをさらに含んでなる、請求項１の脂質ナノ粒子。
【請求項３１】
リガンドが抗体又は抗体断片である、請求項３０の脂質ナノ粒子。
【請求項３２】
リガンドが、ｃＲＧＤ、ガラトース含有部分、トランスフェリン、葉酸塩、低密度リポタンパク質、又は表皮増殖因子より選択される、請求項３０の脂質ナノ粒子。
【請求項３３】
請求項１の脂質ナノ粒子と医薬的に許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物。
【請求項３４】
経口的に、静脈内に、腹腔内に、皮下に、又は経皮的に投与される、請求項３３の医薬組成物。
【請求項３５】
経口投与錠剤、吸入剤、又は坐剤として調製される、請求項３３の医薬組成物。
【請求項３６】
無菌溶液剤、無菌懸濁液剤、又は凍結乾燥散剤として調製される、請求項３３の医薬組成物。
【請求項３７】
脂質ナノ粒子を作製する方法であって：
少なくとも１つの脂質をヒト血清アルブミン−ペンタエチレンヘキサミン（ＨＳＡ−ＰＥＨＡ）コンジュゲートへ加えて、混合物を生成する工程；
該混合物へ少なくとも１つの治療分子を加える工程；及び
該混合物を透析又は透析濾過工程へ処して、脂質ナノ粒子を作製する工程を含んでなる、前記方法。
【請求項３８】
少なくとも１つの脂質がＤＯＴＡＰ、ＳＰＣ、及びＴＰＧＳを２５：７０：５の比で含む、請求項３７の方法。
【請求項３９】
治療分子が、ｐＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲ、抗ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はこれらの組合せより選択される、請求項３７の方法。
【請求項４０】
請求項３９の方法より作製される産物。
【請求項４１】
障害を治療する方法であって、請求項３３の医薬組成物の有効量をその必要な被験者へ投与することを含んでなる、前記方法。
【請求項４２】
送達系であって：
ａ．少なくとも１つの脂質；及び
ｂ．ポリマーへコンジュゲートした高分子を含んでなり、
ｃ．ここで該高分子は、核酸を被包する、前記送達系。
【請求項４３】
脂質ナノ粒子を使用する方法であって：
ａ．ポリマーへコンジュゲートしたアルブミンを含む脂質ナノ粒子に核酸を被包する工程；
ｂ．該脂質ナノ粒子を医薬組成物へ取り込む工程；及び
ｃ．該医薬組成物をその必要な患者へ投与する工程を含んでなる、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
[0001]  本出願は、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国仮特許出願６１／６５０，７２９（２０１２年５月２３日出願）及び米国仮特許出願６１／７８４，８９２（２０１３年３月１４日出願）に対する優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府支援研究に関する陳述
[0002]  本発明は、アメリカ国立衛生研究所によって授与された認可番号：Ｒ０１ＣＡ１３５２４３、ＤＫ０８８０７６、及びＣＡ１５２９６９の下での政府支援でなされた。連邦政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
[0003]  本出願は、ＥＦＳ−ウェブより提出されて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含有する。２０１３年５月２２日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、604_55043_SEQ_LIST_OSU-2013-246(2).txt と名付けられて、大きさは１，４７６バイトである。
【０００４】
技術分野
[0004]  本開示は、限定されないが、核酸（ＮＡ）が含まれる、治療用組成物の送達に使用可能な脂質ナノ粒子（ＬＮ）に関する。
【背景技術】
【０００５】
[0005]  リポソームは、親水性分子を水性コアの内側で運ぶか又は疎水性分子をその脂質二重層（複数）の内側で運ぶことが可能な、１以上の脂質二重層より構成される小胞である。本明細書に使用するように、「脂質ナノ粒子」（ＬＮ）は、サブミクロン範囲の脂質ベースの粒子について記載するための一般的な用語である。ＬＮは、リポソームの構造特性を有すること、及び／又は代わりの非二重層タイプの構造を有することが可能である。ＬＮによる全身経路を介した薬物送達には、いくつかの生理学的障壁を克服することが求められる。ＬＮの循環からのクリアランスは、細網内皮系（ＲＥＳ）が原因である。この血管構造から逃れて標的細胞に達すると、ＬＮは、典型的にはエンドサイトーシスによって取り込まれて、酸性エンドソーム状況内での分解に先立って、薬物を細胞質へ放出しなければならない。
【０００６】
[0006]  特に、ｓｉＲＮＡや他の治療用オリゴヌクレオチドが含まれるような核酸（ＮＡ）の送達は、重大な技術課題であって、その臨床転用（clinical translation）の潜在可能性を制限してきた。
【０００７】
[0007]  効率的な送達担体の開発は、オリゴヌクレオチド（ＯＮ）治療薬の臨床転用の鍵である。ＬＮ製剤には、（１）薬物を酵素分解より防護する；（２）毛細血管内皮を横断する；（３）過度の免疫活性化も標的外の細胞毒性も引き起こさずに標的細胞型へ特異的に到達する；（４）エンドサイトーシスとエンドソーム放出を促進する；及び（５）高いコロイド安定性と長い貯蔵寿命がある安定した製剤を生成することが可能であるべきことが望まれている。
【発明の概要】
【０００８】
[0008]  本発明で提供するのは、治療用オリゴヌクレオチドを高い効率で被包して、有効な送達の物理学的及び生物学的な判定基準を満たすＬＮである。ある態様において、ＬＮは、超カチオン化及び／又はｐＨ応答性のＨＳＡ−ポリマーコンジュゲートを含む。ある態様において、ＨＳＡ−ポリマーコンジュゲートは、ＨＳＡ−ＰＥＩ又はＨＳＡ−ＰＥＨＡを含む。超カチオン化アルブミン−ポリマーコンジュゲート（ＡＰＣ）の取込みは、ＬＮ製剤のトランスフェクション効率を高める。これらのＬＮ粒子は、本明細書において、脂質コートされたアルブミンナノ粒子（ＬＣＡＮ）とも記載される。
【０００９】
[0009]  第一の側面において、本発明で提供するのは、少なくとも１つの脂質と陽荷電ポリマーへコンジュゲートしたアルブミンを含んでなる脂質ナノ粒子（ＬＮ）である。
【００１０】
[0010]  ある態様において、ＬＮは、超カチオン化アルブミン−ポリカチオンコンジュゲート（ＡＰＣ）を含む。ある態様において、このポリカチオンは、スペルミン、ジスペルミン、トリスペルミン、テトラスペルミン、オリゴスペルミン、テルミン、スペルミジン、ジスペルミジン、トリスペルミジン、オリゴスペルミジン、プトレシン、ポリリジン、ポリアルギニン、分岐鎖又は直鎖型のポリエチレンイミン、及びポリアリルアミンからなる群より選択されるポリアミンを含む。
【００１１】
[0011]  ある態様において、この陽荷電ポリマーは、本質的にポリエチレンイミンからなる。
【００１２】
[0012]  ある態様において、このポリエチレンイミンは、５０ｋＤａ以下、又は約２００Ｄａ〜約２０００Ｄａの分子量を有する。ある態様において、この陽荷電ポリマーは、ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）又はテトラエチレンペンタミン（ＴＥＰＡ）を含む。
【００１３】
[0013]  ある態様において、ＬＮは、ヒト血清アルブミンへコンジュゲートしたポリエチレンイミンを含む。
【００１４】
[0014]  ある態様において、このコンジュゲーションは、１以上の架橋剤を介する。ある態様において、ＬＮは、ＨＳＡへコンジュゲートしたＰＥＨＡを含む。
【００１５】
[0015]  ある態様では、それぞれのＨＳＡ分子へ多数のＰＥＨＡ分子が連結している。例えば、ある態様では、それぞれのＨＳＡ分子へ約２個と約２０個の間のＰＥＨＡ分子を連結することができる。ある態様では、それぞれのＨＳＡ分子へ１１個のＰＥＨＡ分子が連結している。
【００１６】
[0016]  ある態様において、ＬＮは、２以上の低分子量ポリマーの混合物を含む。
【００１７】
[0017]  ある態様において、少なくとも１つの脂質は、カチオン性脂質、中性脂質、及びＰＥＧ化脂質をコレステロール有り又は無しで含む。
【００１８】
[0018]  ある態様では、少なくとも１つの脂質が、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）、Ｌ−α−ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、及びｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコール１０００スクシネート（ＴＰＧＳ）を含む。特別な態様において、この脂質は、２５：７０：５のモル比のＤＯＴＡＰ：ＳＰＣ：ＴＰＧＳである。
【００１９】
[0019]  ある態様において、ＬＮは、核酸、化学療法剤、又はこれらの組合せより選択される分子を被包する。ある態様において、この被包化分子は、プラスミドＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲ、抗ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はこれらの組合せより選択される核酸を含む。ある態様において、治療薬剤又はヌクレオチドの被包化率は、４０％以上である。
【００２０】
[0020]  ある態様において、ＬＮは、３００ｎｍ未満、又は２００ｎｍ未満、又は約９８ｎｍの直径を有する。
【００２１】
[0021]  ある態様において、該ポリマーは、直結合を介するか又は架橋剤を介してその脂質粒子の外部表面へのみ結合する、
[0022]  ある態様において、ＬＮは、ポリエチレングリコール−コンジュゲート（conjugated）脂質をさらに含む。ある態様において、このポリエチレングリコール−コンジュゲート脂質は、ポリソルベート８０、ＴＰＧＳ、及びｍＰＥＧ−ＤＳＰＥからなる群より選択される。特別な態様において、このポリエチレングリコール−コンジュゲート脂質は、約１５．０モルパーセント未満の濃度で存在する。
【００２２】
[0023]  ある態様において、ＬＮは、標的細胞又は標的分子へ結合することが可能なリガンドをさらに含む。ある態様において、このリガンドは、抗体又は抗体断片である。ある態様において、このリガンドは、ｃＲＧＤ、ガラトース含有部分、トランスフェリン、葉酸塩、低密度リポタンパク質、又は表皮増殖因子より選択される。
【００２３】
[0024]  別の広い側面において、本発明で提供するのは、少なくとも１つの脂質と陽荷電ポリマーへコンジュゲートしたアルブミンを有する脂質ナノ粒子と医薬的に許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物である。
【００２４】
[0025]  ある態様において、該医薬組成物は、経口的に、静脈内に、腹腔内に、皮下に、又は経皮的に投与される。特別な態様において、該医薬組成物は、経口投与錠剤、無菌溶液剤、無菌懸濁液剤、凍結乾燥散剤、又は坐剤として調製される。
【００２５】
[0026]  別の広い側面において、本発明で提供するのは、脂質コートされたアルブミンナノ粒子（ＬＣＡＮ）を作製する方法である。この方法は、ヒト血清アルブミン−ペンタエチレンヘキサミン（ＨＳＡ−ＰＥＨＡ）コンジュゲートを合成する工程；このＨＳＡ−ＰＥＨＡコンジュゲートへ少なくとも１つの脂質を加える工程；この脂質とＨＳＡ−ＰＥＨＡコンジュゲートの混合物へ核酸を加えて、ＬＣＡＮ前駆体を入手する工程；及びこのＬＣＡＮ前駆体を透析又は透析濾過工程へ処して、脂質コートされたアルブミンナノ粒子を作製する工程を含む。
【００２６】
[0027]  ある態様において、少なくとも１つの脂質は、ＤＯＴＡＰ、ＳＰＣ、及びＴＰＧＳを２５：７０：５の比で含む。ある態様において、核酸は、ｐＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲ、抗ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はこれらの組合せより選択される。本発明でさらに提供するのは、記載の方法より作製される産物である。
【００２７】
[0028]  別の広い側面において、本発明で提供するのは、癌又は感染症を診断するか又は治療する方法である。該方法は、少なくとも１つの脂質、陽荷電ポリマーへコンジュゲートしたアルブミン、及び医薬的に許容される賦形剤を含んでなる医薬組成物の有効量をその必要な患者へ投与することを含む。
【００２８】
[0029]  別の広い側面において、本発明で提供するのは、少なくとも１つの脂質とポリマーへコンジュゲートした高分子を含んでなる送達系であり、ここでこの高分子は、核酸と静電複合体を生成する。
【００２９】
[0030]  別の広い側面において、本発明で提供するのは、脂質ナノ粒子を使用する方法である。該方法は、脂質ナノ粒子に核酸を被包する工程（ここで脂質ナノ粒子は、ポリマーへコンジュゲートしたアルブミンを含む）；該脂質ナノ粒子を医薬組成物へ取り込む工程；及び該医薬組成物をその必要な患者へ投与する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】[0031]  図１：ＨＳＡ−ＰＥＩ（６００）（ＡＰＣ）−オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）複合体の様々なＯＤＮ対ＨＳＡ−ＰＥＩ（６００）（ｗ／ｗ）比でのゲル移動度シフト分析。リボヌクレアーゼレダクターゼＲ１（ＲＮＲ  Ｒ１）サブユニットに対するＡＳＯである、ＬＯＲ−２５０１（Alpha DNA より購入）を使用した。
【図２】[0032]  図２：ＬＮ（ＬＮ）−ＨＳＡ−ＰＥＩ（６００）−ＬＯＲ−２５０１（ＡＰＣ−ＯＤＮ）複合体のゼータ電位。
【図３】[0033]  図３Ａ〜Ｂ：ＬＣＡＮ中のＬＯＲ−２５０１によるＲＮＲ  Ｒ１  ｍＲＮＡ発現の下方調節。ＬＣＡＮは、異なる培地条件下に様々なＡＰＣ濃度で調製した。図３Ａは、無血清培地を表示し；図３Ｂは、１０％  ＦＢＳを含有する培地を表示する。アクチンに対するＲＮＲ  Ｒ１  ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって定量して、ここでは、未処理ＫＢ細胞をｍＲＮＡ発現のベースラインとして役立てた。
【図４】[0034]  図４：ＬＣＡＮ−ＨＳＡ−ＰＥＩ（６００）−ＬＯＲ−２５０１（ＡＰＣ）複合体で処理したＫＢ細胞の細胞生存度試験。無血清培地においてトランスフェクションを実施した。細胞生存度は、未処理ＫＢ細胞の平均生存度に対する百分率として表される。
【図５】[0035]  図５：ＨＳＡ−ＰＥＨＡ−ＬＯＲ−２５０１（ＡＰＣ−ＯＤＮ）複合体の様々なＯＤＮ対ＡＰＣ（ｗ／ｗ）比でのゲル移動度シフト分析。本試験では、ＯＤＮとしてＬＯＲ−２５０１を使用した。
【図６】[0036]  図６：ＬＣＡＮ中のＬＯＲ−２５０１によるＲＮＲ  Ｒ１  ｍＲＮＡ発現の下方調節。ＬＣＡＮは、無血清条件下に様々なＡＰＣ濃度で調製した。アクチンに対するＲＮＲ  Ｒ１  ｍＲＮＡ発現をＲＴ−ＰＣＲによって定量して、ここでは、未処理ＫＢ細胞をｍＲＮＡ発現のベースラインとして役立てた。
【図７】[0037]  図７：ＫＢ細胞における、ＬＮ−Ｇ３１３９と比較した、脂質コートされたアルブミンナノ粒子（ＬＣＡＮ）−Ｇ３１３９によるＢｃｌ−２の下方調節。
【図８】[0038]  図８：ＡＰＣを合成するスキームの例。
【図９】[0039]  図９：超カチオン化ｐＨ応答性ＡＰＣの作用機序。
【図１０】[0040]  図１０：ＣＡＬ−５１乳癌細胞における、抗ｍｉＲ−２２１をロードしたＬＣＡＮによるｐ２７／ｋｉｐ１  ｍＲＮＡの上方調節。
【図１１】[0041]  図１１：ＣＡＬ−５１細胞における、抗ｍｉＲ−２２１をロードしたＬＣＡＮによるエストロゲンｍＲＮＡの上方調節。エストロゲン受容体は、ｍｉＲ−２２１の標的である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
[0042]  当業者は、以下の詳細な態様の記載が例示に他ならず、限定的であることを決して意図しないことを理解されよう。本開示の利益を享けるような当業者には、他の態様が自ずと容易に示唆されよう。本明細書での「態様」、「側面」又は「実施例」への言及は、そのように記載される本発明の態様に特別な特徴、構造、又は特性が含まれる場合があっても、その特別な特徴、構造、又は特性がどの態様にも必ず含まれるわけではないことを示す。さらに、「１つの態様において」という句の反復使用は、同じ態様へ言及する場合があるとしても、必ずしも同じ態様へ言及するわけでない。
【００３２】
[0043]  本明細書に記載する実行又は方法の定番の特徴をすべて示して記載するわけではない。当然ながら、そのような実際の実行の開発においては、応用及び事業に関連した制約の遵守といった、開発者の具体的な目標を達成するために数多くの実行特異的な決定がなされて、これらの具体的な目標は、実行ごとに、そして開発者ごとに異なると理解されよう。さらに、そのような開発努力は複雑で時間がかかるかもしれないが、それでも本開示の利益を享ける当業者にとっては、定番の作業になると理解されよう。
【００３３】
[0044]  一般的な記載
[0045]  遺伝子発現を促進するか又は阻害するために核酸（ＮＡ）ベース治療薬が開発されている。遺伝子中の突然変異とｍｉＲＮＡプロフィール中の変化が癌や他の疾患の根本原因であると考えられているので、ＮＡベースの薬剤は、根本的な病因に直接作用して、治療ポテンシャルを最大にする可能性がある。ＮＡベース治療薬の非限定的な例には、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、ミミック（模倣体）、抗ｍｉＲ／アンタゴｍｉＲ／ｍｉＲ阻害剤、及びアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が含まれる。本明細書に記載するナノ粒子組成物の開発まで、ＮＡベース治療薬の臨床転用は、ＮＡをその細胞内標的へ輸送することが特に難題であること、そしてＮＡが相対的に不安定で血清や細胞ヌクレアーゼによる分解を受けやすいことから、その実行においていくつかの障害（obstacles）に直面した。さらに、ＮＡの高い陰電荷は細胞膜を通過するその輸送を不可能にして、さらに有用性を制限した。
【００３４】
[0046]  本明細書に記載するＬＮは、慣用の治療用化合物とＮＡベース治療薬の両方の送達に有用な基盤を提供する。ＬＮを使用して製剤化される薬物は、亢進された透過性及び保持（ＥＰＲ）効果により、増加した血液循環時間や固形腫瘍の部位での増加した蓄積といった、望ましい生体内薬物動態（ＰＫ）特性を提供する。さらに、ある態様において、ＬＮは、血清タンパク質によるＬＮのオプソニン化と生じるＲＥＳ媒介性の取込みを抑制するためにポリエチレングリコールで表面被覆してよい、及び／又は標的指向性の薬物送達を提供するために細胞特異的リガンドで被覆してよい。
【００３５】
[0047]  全身性の送達のために、ＬＮのゼータ電位は、過度に陽性でも陰性でもないことが望ましい。高い陽電荷があるＬＮは、非標的の細胞、組織、及び循環血漿タンパク質と非特異的に相互作用する傾向があって、細胞毒性を引き起こす場合がある。あるいは、高い陰電荷があるＬＮは、それ自体が陰電荷であるＮＡを有効に取り込むことができないので、迅速なＲＥＳ媒介性のクリアランスを誘発して、治療効力を低下させる場合がある。生体内の薬物及び遺伝子送達には、中性〜中位の電荷があるＬＮが最も適している。
【００３６】
[0048]  ある態様において、本明細書に記載するＬＮは、超カチオン化アルブミン−ポリマーコンジュゲート（ＡＰＣ）を含む。本明細書に使用するように、「超カチオン化」という用語は、それぞれのポリカチオンが多数の陽電荷を担うことを意味する。特別な態様では、それぞれのアルブミン分子へ２０個までのポリカチオンを連結することができる。これらの要因により、ＡＰＣには、従来のカチオン化アルブミン（これは、典型的には、カルボキシル基が単一陽電荷のアミン官能基で置換されているアルブミンコンジュゲートを含む）と比較して、ずっと高い全電荷量がもたらされる。その高い電荷密度の故に、ＡＰＣは、多数のカチオン又は陽電荷を有する、オリゴヌクレオチド粒子、分子、化合物、又は製剤のようなポリアニオンときわめて効率的に相互作用することができる。
【００３７】
[0049]  本明細書に使用する「脂質ナノ粒子」（ＬＮ）という用語は、１以上の脂質成分によって形成される小胞を意味する。本明細書に記載する脂質成分には、カチオン性脂質を含めてよい。カチオン性脂質とは、どの生理学的ｐＨでも正味の陽電荷を担う脂質である。ある態様において、この陽電荷は、ＡＳＯのような陰電荷の治療薬との静電相互作用を介した会合に使用される。
【００３８】
[0050]  好適なカチオン性脂質には、限定されないが、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール塩酸塩（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）；１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）；１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＤＡＰ）；ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド塩（ＤＤＡＢ）；１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリンクロリド（ＤＬ−ＥＰＣ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ−Ｎ−Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ−Ｎ−Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）；１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）；ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）；カチオン性修飾基へコンジュゲートした中性脂質；並びにこれらの組合せが含まれる。加えて、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（販売元：ギブコ／ＢＲＬ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（販売元：ギブコ／ＭＲＬ）、ｓｉＰＯＲＴ  ＮＥＯＦＸ（登録商標）（販売元：アプライド・バイオシステムズ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（登録商標）（販売元：プロメガ）、及びＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（登録商標）（販売元：Bio-Rad Laboratories 社）といった、入手可能な製品中の多くのカチオン性脂質も使用し得る。当業者は、さらに多くのカチオン性脂質が当該ＬＮ製剤における包含に適していることを認められよう。ある態様において、カチオン性脂質は、製剤中の全脂質の約８０．０モルパーセントまでの濃度で、又は製剤の約５．０〜約５０．０モルパーセントの濃度で存在してよい。
【００３９】
[0051]  ある態様において、今回開示されるＬＮ製剤には、アニオン性脂質も含まれてよい。アニオン性脂質とは、生理学的なｐＨで正味の陰電荷を担う脂質である。これらのアニオン性脂質は、カチオン性脂質と組み合わされるとき、ＬＮの全体の表面電荷を低下させて、ＬＮ二重層構造のｐＨ依存性の破壊を導き、酸性ｐＨで非ラメラ相を誘発することによってヌクレオチド放出を促進するか又は細胞膜との融合を誘発するのに有用である。
【００４０】
[0052]  好適なアニオン性脂質の例には、限定されないが、オレイン酸、リノール酸、及びリノレン酸のような脂肪酸；コレステリルヘミスクシネート；１，２−ジ−Ｏ−テトラデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ジエーテルＰＧ）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）（ナトリウム塩）；１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ナトリウム塩）；１−ヘキサデカノイル，２−（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカジジエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスフェート；１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−［ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）］（ＤＯＰＧ）；ジオレオイルホスファチジン酸（ＤＯＰＡ）；及び１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−Ｌ−セリン（ＤＯＰＳ）；中性脂質へコンジュゲートしたアニオン性修飾基；並びにこれらの組合せが含まれる。本開示のアニオン性脂質は、製剤の約６０．０モルパーセントまでの濃度で、又は製剤の約５．０〜約２５．０モルパーセントの濃度で存在する。
【００４１】
[0053]  ある態様では、帯電したＬＮがトランスフェクションに有利であるが、細胞毒性やＲＥＳ媒介性の取込みといった標的外の効果が起こり得る。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような親水性分子を脂質アンカーへコンジュゲートさせて、本明細書に記載するＬＮに含めて、ＬＮ凝集や膜との相互作用を防ぐことができる。親水性ポリマーは、脂質成分へ共有結合させても、架橋剤を使用してアミンのような官能基へコンジュゲートさせてもよい。
【００４２】
[0054]  親水性ポリマーの好適なコンジュゲートには、限定されないが、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）；ポリソルベート８０；１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−ＰＥＧ２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）；Ｄ−α−トコフェリルポリエチレングリコール１０００スクシネート（ＴＰＧＳ）；ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ２０００（ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２０００）；及びジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ２０００（ＤＰＰＥ−ＰＥＧ２０００）が含まれる。ある態様において、親水性ポリマーは、製剤の約０〜約１５．０モルパーセントに及ぶ濃度で、又は製剤の約５．０〜約１０．０モルパーセントに及ぶ濃度で存在してよい。また、ある態様において、使用するＰＥＧの分子量は、約１００Ｄａと約１０，０００Ｄａの間であるか、又は約１００Ｄａ〜約２，０００Ｄａである。
【００４３】
[0055]  本明細書に記載するＬＮは、中性及び／又はコレステロールの脂質をヘルパー脂質としてさらに含んでよい。これらの脂質は、製剤を安定にする、生体内での消失を抑える、又はトランスフェクション効率を高めるのに有用である。ＬＮは、溶解安定性（lyostability）及び低温安定性（cryostability）を促進するために、限定されないが、グルコース、ソルビトール、スクロース、マルトース、トレハロース、ラクトース、セルビオース、ラフィノース、マルトトリオース、デキストラン、又はこれらの組合せのような糖類の溶液中で製剤化してよい。
【００４４】
[0056]  中性脂質は、生理学的なｐＨで０の正味電荷を有する。本明細書に開示するどのＬＮ製剤にも、数種の中性脂質の１つ又は組合せを含めてよい。
【００４５】
[0057]  好適な中性脂質には、限定されないが、ホスファチジルコリン（ＰＣ、例えば、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、ＤＭＰＣ、大豆ＰＣ、卵ＰＣ、ＨＳＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ、例えば、ＤＯＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＰＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＭＰＥ）、セラミド、セレブロシド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、ジアシルグリセロール、グリコシル化ジアシルグリセロール、プレノール、リソソーム型ＰＬＡ２基質、Ｎ−アシルグリシン、並びにこれらの組合せが含まれる。
【００４６】
[0058]  他の好適な脂質には、限定されないが、ホスファチジン酸、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ、例えば、ＤＳＰＧ、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ）、及びリソホスファチジルエタノールアミン；コレステロール、デモステロール、シトステロール、チモステロール、ジオスゲニン、ラノステノール、スチグマステロール、ラソステロール、及びデヒドロエピアンドロステロンのようなステロール類；及びスフィンゴシン、セラミド、スフィンゴミエリン、ガングリオシド、グリコスフィンゴ脂質、ホスホスフィンゴ脂質、フィトスフィンゴシンのようなスフィンゴ脂質；並びにこれらの組合せが含まれる。
【００４７】
[0059]  本明細書に記載するＬＮ製剤は、膜融合を促進するために、膜融合性脂質又は膜融合性コーティング剤をさらに含んでよい。好適な膜融合性脂質の例には、限定されないが、グリセリルモノオレエート、オレイン酸、パルミトレイン酸、ホスファチジン酸、ホスホイノシトール４，５−ビスホスフェート（ＰＩＰ２）、並びにこれらの組合せが含まれる。
【００４８】
[0060]  本明細書に記載するＬＮ製剤は、カチオン性ポリマー又はカチオン性ポリマーのコンジュゲートをさらに含んでよい。カチオン性ポリマー又はそのコンジュゲートは、単独で使用しても、脂質ナノ担体と組み合わせて使用してもよい。好適なカチオン性ポリマーには、限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）；スペルミン；スペルミジン；ポリ（Ｌ−リジン）；ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）デンドリマー；ポリプロピレンイミンデンドリマー；ポリ（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）；キトサン；トリス（２−アミノエチル）アミンとそのメチル化誘導体；並びにこれらの組合せが含まれる。ある態様において、ポリマー送達系の実行には、鎖の長さと枝分かれが重要な考慮事項である。ＰＥＩ（分子量２５，０００）のような高分子量ポリマーは、トランスフェクション剤として有用であるが、細胞毒性に悩まされる。低分子量ＰＥＩ（分子量６００）は、細胞毒性を引き起こさないが、ＮＡとの安定した縮合を促進する能力が無いことにより限界がある。従って、本明細書に記載するように、アルブミンのようなより大きい分子への低分子量ポリマーのコンジュゲーションは、ＬＮ製剤の細胞毒性を低下させる一方で、ＮＡとの静電複合化縮合の活性を高めるのに有用な方法である。
【００４９】
[0061]  今回開示したＬＮ製剤の中へアニオン性ポリマーも取り込んでよい。好適なアニオン性ポリマーには、限定されないが、ポリ（プロピルアクリル酸）（ＰＰＡＡ）；ポリ（グルタミン酸）（ＰＧＡ）；アルギン酸塩；デキストラン誘導体；キサンタン；誘導化ポリマー；並びにこれらの組合せが含まれる。
【００５０】
[0062]  ある態様において、ＬＮ製剤には、ポリマーのコンジュゲートが含まれる。このコンジュゲートは、標的化剤、親油性部分、タンパク質、又は全体の治療効力を高める他の分子へ架橋連結してよい。好適な架橋剤には、限定されないが、３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオン酸Ｎ−スクシンイミジル（ＳＰＤＰ）；３，３’−ジチオビスプロピオンイミド酸ジメチル（ＤＴＢＰ）；ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）；ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）；１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ）；Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）；Ｎ’−Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）；Ｎ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム−３’スルホネート（ウッドワード［Woodward's］試薬Ｋ）；並びにこれらの組合せが含まれる。
【００５１】
[0063]  ＬＮへ標的化剤を加えると、受動的な標的化アプローチに優って高められる効力が提供される。標的化には、限定されないが、細胞表面受容体に対するリガンド又は抗体、ペプチド、リポタンパク質、糖タンパク質、ホルモン、ビタミン、抗体、抗体断片、並びにこれらの部分のコンジュゲート又は組合せといった特定の標的化部分の取込みが関与する。
【００５２】
[0064]  ある態様において、標的化効率の最大化には、標的化リガンドの他の成分とのプレ混合（これは、標的化剤の一部被包化をもたらして、それを細胞標的へ接近不能にする）よりむしろ、適正な標的化部分でＬＮを表面コーティングすることが含まれる。この方法により、細胞表面受容体との相互作用が最適化される。
【００５３】
[0065]  標的化剤は、合成の間にＬＮ中へ直接取り込んでも、後続の工程で加えてもよいと理解されたい。ＬＮ中への取込みの適正な手段を決定するのは、治療応用の仕様（specifications）（例、分解可能な連結）だけでなく、標的化部分上の官能基である。例えば、親油性領域を有さない標的化部分は、ＬＮの脂質二重層の中へ直に挿入し得ないので、挿入の前に脂質アンカーへの事前コンジュゲーションを必要とするか又はＬＮとの静電複合体を生成しなければならない。
【００５４】
[0066]  また、ある状況下では、標的化リガンドが親油性アンカーへ直接結合することができない。これらの状況では、その相互作用を促進するために、架橋剤の形態をした分子ブリッジを利用してよい。ある態様では、アンカーとなる標的化部分の立体障害により企図される生理学的な標的との十分な相互作用が妨げられるならば、架橋剤を使用することが有利である。加えて、標的化部分がある配向下でのみ機能的である（例、モノクローナル抗体）ならば、架橋剤を介した脂質アンカーへの連結が有益である。標的化剤をＬＮへ連結するには、慣用のバイオコンジュゲーションの方法を使用してよい。製剤の生体内での蓄積と後続の細胞毒性を防ぐには、還元可能又は加水分解可能な連結を適用してよい。
【００５５】
[0067]  本開示のＬＮを合成するには、様々なＬＮ調製法が適している。例えば、エタノール希釈、凍結融解、薄膜水和、音波処理、押し出し、高圧均質化、界面活性剤透析、顕微溶液化、タンジェンシャルフロー透析濾過、濾過滅菌、及び／又は凍結乾燥を利用してよい。加えて、ＬＮのサイズを減少させるには、いくつかの方法を利用し得る。例えば、Avestin Emulsiflex Ｃ５（登録商標）のような脂質均質化に適したどのデバイスでも均質化を実行してよい。適正な孔径（０．０５〜０．２μｍ）のポリカーボネート膜を使用する Lipex Biomembrane押出機で押出しを実行してよい。試料内のサイズ変動を最小にするには、多数の粒径縮小サイクルを実行し得る。次いで、生じるＬＮを Sepharose CL4B のようなサイズ排除カラムに通過させるか又はタンジェンシャルフロー透析濾過によって処理して、ＬＮを精製し得る。
【００５６】
[0068]  本明細書に記載するＬＮのどの態様にも、その調製法においてエタノールをさらに含めてよい。ＬＮ製剤における約３０〜５０％のエタノールの取込みは、脂質二重層を不安定にして、カチオン性脂質のような帯電部分とアニオン性のＡＳＯ及びｓｉＲＮＡとの間の静電相互作用を促進する。高濃度エタノール溶液において調製されたＬＮは、投与前に希釈される。あるいは、透析又は透析濾過によってエタノールを除去してよく、これにより非被包化ＮＡも除去される。
【００５７】
[0069]  ある態様では、ＬＮを滅菌することが望ましい。このことは、プレ濾過の有無でＬＮを０．２又は０．２２μｍの滅菌フィルターに通過させることによって達成し得る。
【００５８】
[0070]  ＬＮの物理学的な特性決定は、多くの方法を介して行うことができる。例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ）又は原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用して、平均直径とその標準偏差を定量することができる。ある態様では、ＬＮが約２００ｎｍ以下の直径を有することが特に望ましい。ゼータ電位計を介したゼータ電位の測定は、粒子の相対安定性を決定するのに有用である。動的光散乱分析もゼータ電位分析も、脱イオン水又は適正な緩衝溶液に希釈した試料で実行し得る。低温透過型電子顕微鏡法（クライオ−ＴＥＭ）と走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）を使用して、ＬＮの詳細な形態を決定することができる。
【００５９】
[0071]  本明細書に記載するＬＮは、冷却下で数ヶ月間安定である。合成と投与の間で延長された期間が求められるＬＮは、標準手順を使用して凍結乾燥させてよい。凍結乾燥の間に製剤の完全性を維持するには、凍結に先立って、ＬＮ懸濁液へ１０％スクロースのような凍結防止物質を加えてよい。長期安定性には、ＬＮ製剤の凍結乾燥が推奨される。
【００６０】
[0072]  ある態様において、本明細書に記載するＬＣＡＮは、３００ｎｍ未満の直径を有して、特別な態様では、約５０ｎｍと約２００ｎｍの間で平均直径を有する。これらのＬＮは、特に全身投与の間に見出される高血清条件の下で、高められたトランスフェクションと低下した細胞毒性を示す。このＬＮは、広範囲の現行の治療薬剤及びシステムにおいて有用であり、高い血清安定性を有して、トランスフェクション効率が高い標的指向性の送達のために設計することができる。
【００６１】
[0073]  アルブミン−ポリマーコンジュゲート（ＡＰＣ）
[0074]  カチオン性ポリマーをトランスフェクション剤として単独で、及び脂質と組み合わせてＬＮ中で利用することは、しばしば、トランスフェクション効率のためになる。１つのポリマー性トランスフェクション剤は、分子量約２５ｋＤａの大型ポリマーである、高分子量ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。ＰＥＩ２５Ｋは、ｐＤＮＡを細胞へ送達するのに使用されてきたが、細胞毒性により生体内での使用が制限されてきた。より無害の、低分子量ＰＥＩ（分子量：約６００ｋＤａ）も検討されてきたが、これは、ＮＡと相互作用してそれを送達するのに減衰した能力を示した。
【００６２】
[0075]  本発明で提供するのは、上述したポリマーの欠点をいずれも有さない、超カチオン化アルブミン−ポリマーコンジュゲート（ＡＰＣ）である。ＡＰＣは、ｐＤＮＡのような薬剤を送達するのに単独で使用しても、ＡＳＯ及びｓｉＲＮＡのような薬剤を送達するのに脂質ベースの製剤と組み合わせて使用してもよい。アルブミンは、その疎水性コアによりエンドソーム溶解活性も保有し、これは、コンホメーション変化時に曝露され得て、二重層破壊又は膜融合を誘発することができる。ＨＳＡ−ＰＥＩ６００コンジュゲートのようないくつかの態様において、ＡＰＣは、ｐＨ変化へ応答するイオン化プロフィールを有する。電荷密度は、酸性であるエンドソームのｐＨで増加する。
【００６３】
[0076]  １つの態様では、ＡＰＣをカチオン性脂質の組合せと組み合わせて、カチオン性脂質−ＡＰＣ−ＮＡナノ粒子（本明細書では、ＬＣＡＮと呼ぶ場合もある）を組み立てる。別の態様では、ＡＰＣをアニオン性脂質の組合せと組み合わせて、脂質−ＡＰＣ−ＮＡナノ粒子を組み立てる。ある態様において、ＬＮは、超カチオン化ＡＰＣを含む。これらのＬＮは、追加の細胞毒性を伴わずに、高いトランスフェクション効率を有する。ＡＰＣを合成するスキームの例を図８に示す。超カチオン化ｐＨ応答性ＡＰＣの作用機序は、図９に示す。
【００６４】
[0077]  本発明でまた提供するのは、陽荷電ポリマーのようなポリマーへコンジュゲートした高分子である。１つの態様では、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）へ架橋剤を介して低分子量ｐＨ感受性ポリマー（ポリエチレンイミンＭＷ６００、ＰＥＩ６００）をコンジュゲートして、超カチオン化ｐＨ応答性ＡＰＣを得る。ＨＳＡ−ＰＥＩ６００コンジュゲートのＬＮへの付加は、ＫＢ細胞（ヒーラの亜系）において、血清の存在下に有意な細胞毒性を伴わずに、ＲＲＭ１（別名、ＲＮＲ  Ｒ１）のＡＳＯ  ＬＯＲ−２５０１（Alpha DNA より購入）での下方調節を有意に増加させる。
【００６５】
[0078]  別の態様では、ＨＳＡへ架橋剤を介して低分子量ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）をコンジュゲートして、超カチオン化ｐＨ応答性ＡＰＣを得る。脂質コートされたアルブミンナノ粒子（ＬＣＡＮ）と言及される、この特別な製剤は、アンチセンスＯＤＮ、ｐＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲ、及び抗ｍｉＲのようなオリゴヌクレオチドの送達に特に有用である。理論によって束縛されることを望まずに言えば、ＨＳＡ−ＰＥＨＡは、ナノ粒子の安定性と生物学的活性を向上させると考えられている。ある態様において、この製剤中の脂質は、２５：７０：５（モル／モル）の比である、ＤＯＴＡＰ、ＳＰＣ、及びＴＰＧＳである。
【００６６】
[0079]  応用例
[0080]  応用に依存して、本明細書に開示するＬＮは、ＮＡのローディングの増加、血清安定性の増加、ＲＥＳ媒介性の取込みの低下、標的指向性の送達、又はエンドソーム内部でのｐＨ感受性の放出といった特性に有利になるように設計してよい。ＬＮ製剤の多様な性質の故に、特別な治療目標を達成するには、本発明で提供するいくつかの方法のいずれも使用してよい。具体的な目標に応じるために、カチオン性脂質、アニオン性脂質、ポリアルケン、中性脂質、膜融合性脂質、カチオン性ポリマー、アニオン性ポリマー、ポリマーコンジュゲート、ペプチド、標的化部分、並びにこれらの組合せを利用してよい。
【００６７】
[0081]  本明細書に記載するＬＮは、ｃＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲ、及びアンチセンスＯＤＮのようなオリゴヌクレオチド（ＯＮ）治療薬の治療用送達の基盤として使用することができる。これらの治療薬は、様々な種類の癌、白血病、ウイルス感染症、及び他の疾患といった多種多様な疾患を管理するのに有用である。例えば、環状ＲＧＤ、葉酸塩、トランスフェリン、又は抗体といった標的化部分は、標的指向性の薬物送達を可能にすることによって、活性を大いに高める。数多くの腫瘍は、その細胞表面に受容体を過剰発現する。好適な標的化部分の非限定的な例には、トランスフェリン（Ｔｆ）、葉酸塩、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、及び表皮増殖因子が含まれる。加えて、α−ｖ−β−３インテグリン及び前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）のような腫瘍血管内皮マーカーは、ＬＮの標的として貴重である。ある態様では、約３００ｎｍ以下の直径を測定してゼータ電位が５０ｍＶ未満である粒子を有して、被包化効率が２０．０％より高いＬＮ製剤がＮＡ送達に有用である。
【００６８】
[0082]  本明細書に記載するＬＮ製剤の単独での態様又は互いと組み合わせた態様の実行は、ＬＮ設計の現行のパラダイムとの相乗効果がある。
【００６９】
[0083]  本明細書に記載するＬＮと併用して、広範囲の治療薬剤を使用し得る。そのような治療薬剤の非限定的な例には、抗新生物剤、抗感染症薬、局所麻酔薬、抗アレルギー薬、抗貧血薬、血管新生阻害剤、β−アドレナリン作動性遮断薬、カルシウムチャネル拮抗薬、降圧剤、抗うつ薬、抗痙攣薬、抗細菌薬、抗真菌薬、抗ウイルス薬、抗リウマチ薬、駆虫薬、抗寄生虫薬、コルチコステロイド、ホルモン、ホルモン拮抗薬、免疫調節剤、神経伝達物質拮抗薬、抗糖尿病剤、抗てんかん薬、止血薬、抗過緊張薬、抗緑内障剤、免疫調節性サイトカイン、鎮静剤、ケモカイン、ビタミン、毒素、麻薬、造影剤、及びこれらの組合せが含まれる。
【００７０】
[0084]  本開示のＬＮ製剤には、ＮＡベース治療薬剤がきわめて適用可能である。そのようなＮＡベース治療薬剤の例には、限定されないが、ｐＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、抗ｍｉＲＮＡ、ＡＳＯ、及びこれらの組合せが含まれる。血清ヌクレアーゼから防護して治療薬剤を安定化させるために、置換基のＮＡ塩基単位及び／又はホスホジエステルリンカーに対する修飾をなすことができる。そのような修飾には、限定されないが、骨格修飾（例、ホスホチオエート連結）；２’修飾（例、２’−Ｏ−メチル置換塩基）；双性イオン修飾（６’−アミノヘキシ修飾ＯＤＮ）；末端の親油性部分（例、脂肪酸、コレステロール、又はコレステロール誘導体）の付加；並びにこれらの組合せが含まれる。この修飾された配列には、本明細書に開示するＬＮ製剤との相乗効果がある。例えば、ＯＤＮへの３’−コレステロールの付加は、それがなければ主に静電相互作用によって結合している系の合成の間に親油性の相互作用を加えることによって、ＬＮ複合体へ安定性を供給する。加えて、この親油性の付加は、ＯＤＮを細胞膜の外葉へ局在化させることによって細胞透過を促進する。
【００７１】
[0085]  治療上の適用に依拠して、本明細書に記載するＬＮは、以下の方法によって投与され得る：経口、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、経皮、腫瘍内、動脈内、全身、又は対流強化送達。特別な態様において、ＬＮは、静脈内、筋肉内、皮下、又は腫瘍内で送達される。異なるか又は類似のＬＮでの後続の投薬には、代わりの投与経路を使用してよい。
【００７２】
[0086]  本開示の医薬組成物は、本明細書に開示するＮＡ製剤及び／又は追加薬剤の有効量を、医薬的に許容される担体に溶解又は分散されて含む。「医薬的」又は「薬理学的に許容される」という句は、例えば、ヒトのような動物へ投与されるときに、有害反応、アレルギー反応、又は他の不都合な反応をもたらさない分子実体及び組成物に関連する。少なくとも１つの化合物又は追加の有効成分を含有する医薬組成物の調製法（preparation）は、当業者には、本開示に照らして、参照により本明細書に組み込まれる「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」2003 に例示されるように、公知であろう。さらに、動物（例、ヒト）への投与では、ＦＤＡ生物製剤基準局（FDA Office of Biological Standards）によって要求されるような無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準をＬＮ製剤が満たすべきであることが理解されよう。
【００７３】
[0087]  本明細書に開示する組成物は、それが固体、液体、又はエアゾールの形態で投与されるか、そしてそれが注射のような投与経路のために無菌性である必要があるかどうかに依拠して、異なるタイプの担体を含む場合がある。本明細書に開示する組成物は、静脈内に、皮内に、経皮的に、髄腔内に、動脈内に、腹腔内に、鼻腔内に、膣内に、直腸内に、局所的に、筋肉内に、皮下に、粘膜より、子宮内に、経口的に、局所的に、局部的に、吸入により（例、エアゾール吸入）、注射によって、注入によって、持続点滴によって、標的細胞を浸す局所灌流によって直接的に、カテーテルにより、洗浄液により、クリーム剤において、脂質組成物（例、リポソーム剤）において、又は当業者に公知であるような他の方法又は上記のあらゆる組合せによって、投与することができる（例えば、参照により本明細書に組み込まれる「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」2003 を参照のこと）。
【００７４】
[0088]  動物又はヒト患者へ投与される、本明細書に開示する組成物の実際の投与量は、体重又は体表面積、病態の重症度、治療される疾患の種類、過去又は現行の治療介入、患者の突発性疾患、及び投与経路といった身体的因子及び生理学的因子によって決定することができる。投与量と投与経路に依拠して、好ましい投与量及び／又は有効量の投与回数は、被験者の応答に従って変動してよい。投与の任に当たる医療実施者は、ともかくも、組成物中の有効成分（複数）の濃度と個別の被験者に適した用量（複数）を決定するものである。
【００７５】
[0089]  ある態様において、医薬組成物は、例えば、少なくとも約０．１％の活性化合物を含み得る。当然ながら、それぞれの治療上有用な組成物中の活性化合物（複数）の量は、該化合物のどの所与の単位用量においても好適な投与量が得られるようなやり方で調製してよい。このような医薬製剤を調製する当業者には、溶解度、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与経路、製品の貯蔵寿命といった因子、並びに他の薬理学的な考慮事項が熟慮されるものであり、それ故に、多様な投与量と治療レジメンが望ましい場合がある。
【００７６】
[0090]  他の非限定的な例において、用量はまた、各投与につき約１マイクログラム／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重、約１０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約１００マイクログラム／ｋｇ／体重、約２００マイクログラム／ｋｇ／体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ／体重、約５００マイクログラム／ｋｇ／体重、約１ミリグラム／ｋｇ／体重、約５ミリグラム／ｋｇ／体重、約１０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約１００ミリグラム／ｋｇ／体重、約２００ミリグラム／ｋｇ／体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ／体重、約５００ミリグラム／ｋｇ／体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重又はそれ以上までと、その中の導き得るあらゆる範囲を含み得る。本明細書に収載した数字から導き得る範囲の非限定的な例では、上記に記載した数字に基づいて、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重、等の範囲の医薬有効成分（ＡＰＩ）を投与することができる。
【００７７】
[0091]  ある態様では、本明細書の組成物及び／又は追加薬剤を製剤化して、消化経路より投与する。消化経路には、組成物が消化管と直接接触する、すべての可能な投与経路が含まれる。具体的には、本明細書に開示する医薬組成物は、経口的に、頬内に、直腸に、又は舌下に投与してよい。従って、これらの組成物は、不活性希釈剤とともに、又は吸収可能な食用の担体とともに製剤化してよい。
【００７８】
[0092]  さらなる態様では、本明細書に記載する組成物を非経口経路より投与してよい。本明細書に使用するように、「非経口」という用語には、消化管を迂回する経路が含まれる。具体的には、本明細書に開示する医薬組成物は、例えば、限定されないが、静脈内に、皮内に、筋肉内に、動脈内に、髄腔内に、皮下に、又は腹腔内に投与してよい（米国特許第６，７５３，５１４号、６，６１３，３０８号、５，４６６，４６８号、５，５４３，１５８号；５，６４１，５１５号；及び５，３９９，３６３号は、その全体において参照により本明細書にそれぞれ具体的に組み込まれる）。
【００７９】
[0093]  遊離塩基又は薬理学的に許容される塩として本明細書に開示される組成物の溶液剤は、好適にもヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と混合して、水中で調製され得る。分散液剤も、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物において、そして油剤において調製され得る。通常の保存及び使用の条件の下で、これらの製剤は、微生物の増殖を防ぐために保存剤を含有する。注射可能な使用に適した医薬形態には、無菌水溶液剤又は分散液剤と、注射可能な無菌水溶液剤又は分散液剤の即時調製用の無菌散剤が含まれる（米国特許第５，４６６，４６８号、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）。すべての事例において、この形態は、無菌でなければならず、容易に注射し得る程度に流動的でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の汚染作用に抗して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（即ち、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール、等）、これらの好適な混合物、及び／又は植物油剤を含有する、溶媒又は分散媒体であり得る。例えば、レシチンのようなコーティング剤の使用によって、分散の場合に求められる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって、適正な流動性を維持してよい。微生物の作用の予防は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、等）によってもたらすことができる。多くの事例では、等張性を達成するための薬剤、例えば、糖類又は塩化ナトリウムクロリドを含めることが好ましいであろう。例えば、アルミニウムモノステアレート又はゼラチンのような吸収遅延剤の組成物における使用によって、注射可能な組成物の延長吸収をもたらすことができる。
【００８０】
[0094]  水溶液剤における非経口投与では、例えば、その溶液剤は、必要であれば好適に緩衝化すべきであって、液体希釈剤は、十分な生理食塩水又はブドウ糖で最初に等張にすべきである。この特別な水溶液剤は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内の投与に特に適している。これに関連して、当業者には、本開示に照らして、利用し得る無菌水性媒体が公知であろう。例えば、１回の投与量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液剤に溶かして、１０００ｍｌの皮下注入液剤へ加えても、提案された注入部位に注射してもよい（例えば、「レミントン製薬科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）」15版、1035-1038頁と 1570-1580頁を参照のこと）。投与量のいくらかの変動は、治療される被験者の状態に依存して、必然的に生じるものである。投与の責任者は、ともかくも、個々の被験者に適した用量を決定するものである。さらに、ヒトへの投与では、ＦＤＡ生物製剤基準局によって要求されるような無菌性、発熱性、一般的安全性、及び純度の基準を製剤が満たすべきである。
【００８１】
[0095]  無菌注射溶液剤は、所要量の組成物を上記に列挙した様々な他の成分を含む適正な溶媒に取り込んで、必要に応じて濾過滅菌を続けることによって調製する。一般に、分散液剤は、様々な無菌組成物を、基本の分散媒体と上記に列挙したものより求められる他の成分を含有する無菌担体の中へ取り込むことによって調製する。無菌注射溶液剤の調製用の無菌散剤の場合、いくつかの調製法は、真空乾燥及び凍結乾燥の技術であって、これにより、すでに滅菌濾過したその溶液より、有効成分＋所望の追加成分の散剤が入手される。粉末化した組成物は、安定化剤を伴うか又は伴わずに、例えば、水又は無菌溶液剤のような液体担体と組み合わせる。
【００８２】
[0096]  他の態様において、組成物は、様々なその他の経路による投与、例えば、局所（即ち、経皮）投与、粘膜投与（鼻腔内、膣内、等）及び／又は吸入による投与のために製剤化され得る。
【００８３】
[0097]  ある態様において、組成物は、点眼剤、鼻腔スプレー剤、吸入、及び／又は他のエアゾール送達担体によって送達してよい。米国特許第５，７５６，３５３号及び５，８０４，２１２号（その全体が参照により本明細書にそれぞれ具体的に組み込まれる）には、組成物を点鼻エアゾールスプレー剤より肺へ直接的に送達するための方法が記載されている。同様に、鼻腔微粒子樹脂（Takenaga et al., 1998）とリソホスファチジル−グリセロール化合物（米国特許第５，７２５，８７１号、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）を使用する薬物の送達も製薬技術の分野でよく知られていて、本明細書に記載する組成物を送達するのに利用し得る。同様に、米国特許第５，７８０，０４５号（その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）には、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックス剤の形態での経粘膜薬物送達が記載されていて、本明細書に記載する組成物を送達するのに利用し得る。
【００８４】
[0098]  本明細書に開示する組成物は、エアゾール剤により送達し得ることがさらに想定される。「エアゾール剤」という用語は、微細化した固体又は液体粒子が液化又は加圧された気体推進薬に分散しているコロイド系を意味する。典型的な吸入用エアゾール剤は、液体推進薬又は液体推進薬と好適な溶媒の混合物中の有効成分の懸濁液剤からなる。好適な推進薬には、炭化水素類と炭化水素エーテル類が含まれる。好適な容器は、推進薬の圧力要件に従って変わるものである。エアゾール剤の投与は、被験者の年齢、体重、並びに症状の重症度及び応答に従って変わるものである。
【実施例】
【００８５】
[0099]  実施例
[00100]  本発明のいくつかの態様を本明細書の「実施例」において明確にする。これらの実施例は、本発明の好ましい態様を示すが、例解のためにのみ示されると理解されたい。上記の考察とこれらの実施例より、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができて、その精神及び範囲より逸脱することなく、本発明の様々な変更及び修飾を行って、それを様々な使用法及び状況へ適用することができる。
【００８６】
[00101]  実施例１
[00102]  ＨＳＡ（２５％）を Octapharma より購入した。ＰＥＨＡをシグマ・アルドリッチより購入した。ｐＨを  Ｍ  ＨＣｌで８．０へ調整したＰＥＨＡのストック溶液を調製した。ＨＳＡを５００倍のＰＥＨＡと合わせた。次いで、この溶液へ８０倍の１−エチル−３−［３ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（購入先：Fisher Scientific）を撹拌しながら加えた。反応を室温で４時間以上進行させた。生成したＨＳＡ−ＰＥＨＡをＰＤ−１０脱塩カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーによるか又はＭＷＣＯ１０，０００膜を使用する透析によって精製して、未反応のＰＥＨＡと副生成物を除去した。この生成物のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質アッセイによって定量した。ＨＳＡ−ＰＥＨＡコンジュゲートの分子量は、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＤＬＩ  ＴＯＦ  ＭＳ）によって決定した。６６４０５．７５６のｍ／ｚを示す結果に基づけば、平均して、それぞれのＨＳＡに１１個のＰＥＨＡが連結していた。この生成物は、４℃で保存する、凍らせる、又は凍結乾燥させることができる。
【００８７】
[00103]  実施例２
[00104]  脂質の１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）（Avanti Polar Lipids）、ダイズ由来Ｌ−α−ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）（Avanti Polar Lipids）、及びｄ−α−トコフェリルエチレングリコール１０００スクシネート（ＴＰＧＳ）（Eastman Chemical）をエタノールに溶かした。２５：７０：５（モル／モル）で脂質を合わせた。簡潔には、それぞれ３．１５、８．８３、及び０．６３マイクロモルのＤＯＴＡＰ、ＳＰＣ、及びＴＰＧＳを４ｍＬのエタノール中で合わせた。次いで、これを４ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に溶かした３ｍｇのＨＳＡ−ＰＥＨＡに続いて、２ｍＬの２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液中１ｍｇのＧ３１３９（ｂｃｌ−２に対するＡＳＯ、Alpha DNA より購入）へ加えて、４０％エタノールを含有する混合物を生成した。次いでこれを、MWCO 10K Slide-A-Lyzer カセットを使用して、ＨＥＰＥＳ緩衝液に対して透析して、エタノールとフリーのＧ３１３９を除去した。この生成物、脂質コートされたアルブミンナノ粒子（ＬＣＡＮ）−Ｇ３１３９を透析濾過によって２ｍｇ／ｍＬ  ＯＤＮ濃度へ濃縮し、この生成物へ１０％スクロースを加えて、この生成物を０．２μｍフィルターに通して滅菌濾過した。ＬＣＡＮ−Ｇ３１３９は４℃で安定であって、長期保存用には凍らせるか又は凍結乾燥させた。ＬＣＡＮの粒径は、NICOMP 370 粒径アナライザーによって決定した。ゼータ電位は、ゼータＰＡＬＳ機器で決定した。Oligreen ｓｓＤＮＡ定量試薬によって薬物ローディング効率を決定した。ＬＣＡＮ粒子は、直径が２００ｎｍ未満であることが見いだされ、＋２０〜＋４０ｍＶのゼータ電位と６０％より高い３１３９被包化効率を有した。同じ方法を使用して、ナノ粒子合成の間に脂質誘導化リガンドを脂質成分の中へ取り込むことによって、リガンド−コンジュゲートＬＣＡＮを合成した。可能なリガンドには、トランスフェリン、葉酸塩、ｃＲＧＤ、又は抗体が含まれる。
【００８８】
[00105]  実施例３
[00106]  ＨＳＡ−ＰＥＨＡコンジュゲートを以下のように合成した。ＨＳＡ（２５％）を Octapharma より購入した。ＰＥＨＡを水に溶かして、ｐＨは、ＨＣｌで８．０へ調整した。このＨＳＡ溶液へ５００倍過剰のＰＥＨＡに続いて８０倍過剰のＥＤＣを撹拌下に加えた。この反応を室温で４時間進行させた。この生成物は、分子量１０，０００の MicroKros カートリッジでの水に対するタンジェンシャルフロー透析濾過によって精製して濃縮した。生成物のタンパク質濃度はＢＣＡタンパク質アッセイによって定量して、生成物中のＰＥＨＡ含量は、ＰＥＨＡベースの標準曲線を使用するＴＮＢＳアミン含量アッセイによって決定した。ＰＥＨＡ−ＨＳＡ比は、未修飾ＨＳＡに対するアミン含量の超過に基づいて計算して、１０．５：１であることがわかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、このコンジュゲートが単一のバンドとして移動することを示し、ＨＳＡ−ＰＥＨＡ生成物において分子間架橋連結がほとんど無いことを示唆した。
【００８９】
[00107]  Ｇ３１３９は、ｂｃｌ−２に対する１８マーのホスホロチオエートＡＳＯである。Alpha DNA より購入したＧ３１３９を  ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）に溶かした。２５：７０：５（ｍ／ｍ）のＤＯＴＡＰ／ＳＰＣ／ＴＰＧＳをエタノールに溶かして、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳに希釈したＨＳＡ−ＰＥＨＡに続いてＧ３１３９溶液へ加えて、４０％の最終エタノール濃度と１：３：１０（重量／重量）のＯＤＮ：ＨＳＡ−ＰＥＨＡ：全脂質の比を得た。これにより、ＬＣＡＮにとって前駆体であるコロイド複合体の形成をもたらした。次いで、これを水によって４倍希釈して、ＭＷＣＯ（分子量カットオフ）が３０，０００の MicroKros カートリッジでの５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）に対するタンジェンシャルフロー透析濾過へ処した。次いで、この生成物へスクロースを加えた（１０％の最終濃度）。次いで、０．２μｍフィルターを使用してこのＬＣＡＮ−Ｇ３１３９を滅菌濾過して、−２０℃で凍結保存した。この生成物について OliGreen アッセイによって定量すると、Ｇ３１３９濃度が２ｍｇ／ｍＬであった。この生成物中のＧ３１３９の回収パーセントは、６７％であった。ＬＣＡＮの粒径について、NICOMP Particle Sizer Model 370（Particle Sizing Systems, カリフォルニア州サンタバーバラ）で分析した。体積加重ガウス分布分析を使用して、平均粒径とサイズ分布を決定した。ゼータ電位（ξ）は、ZetaPALS（Brookhaven Instruments 社、ニューヨーク州ウスターシャー）で決定した。いずれの測定も、同一３検体で行った。粒径は９８±４０ｎｍであって、ゼータ電位は＋２３ｍＶであった。
【００９０】
[00108]  生成物のＬＣＡＮ−Ｇ３１３９について、ＫＢ（ヒト癌）細胞におけるｂｃｌ−２の下方調節を分析した。ＫＢ細胞を、トランスフェクションに先立つ２４時間前に、６ウェルプレートにおいて、１０％  ＦＢＳと１％抗生物質を含有するＲＰＭＩ  １６４０（Life Technologies）培地中２ｘ１０４個／ｃｍ２の細胞密度で蒔いた。この培地を取り出して、Ｇ３１３９濃度が１μＭである、ＲＰＭＩ  １６４０培養基中の様々なＧ３１３９  ＯＤＮ製剤と交換した。対照のＬＮ−Ｇ３１３９は、ＨＳＡ−ＰＥＨＡを加えずに、他の点ではＬＣＡＮと同じ方法によって調製した、ＤＯＴＡＰ／ＳＰＣ／ＴＰＧＳの組成が２５：７０：５（ｍ／ｍ）であるＬＮ製剤である。３７℃で４時間後、このトランスフェクション培地を取り出して、細胞をＰＢＳで３回洗浄した。次いで、この細胞へ新鮮な培地を加えた。トランスフェクション後４８時間の時点で、この細胞を採取した。簡潔には、Trizol 試薬（Invitrogen）を使用して全ＲＮＡを抽出して、ランダムヘキサマーのプライマー（パーキンエルマー、マサチューセッツ州ボストン）とともに、次いで逆転写酵素（Invitrogen）、反応緩衝液、ジチオスレイトール、ｄＮＴＰ、及びＲＮＡｓｉｎとともにＲＮＡをインキュベートして、４２℃で６０分と９４℃で５分のサーマルサイクラー（アプライド・バイオシステムズ, カリフォルニア州フォスターシティ）中でのインキュベーションを続けることによってｃＤＮＡを合成した。生じるｃＤＮＡを、ｂｃｌ−２プライマーと以下のプローブを使用する、リアルタイムＰＣＲ（ABI Prism 7700 Sequence Detection System, アプライド・バイオシステムズ）によって増幅した：
[00109]  フォワードプライマー：ＣＣＣＴＧＴＧＧＡＴＧＡＣＴＧＡＧＴＡＣＣＴＧ［配列番号１］；
[00110]  リバースプライマー：ＣＣＡＧＣＣＴＣＣＧＴＴＡＴＣＣＴＧＧ［配列番号２］；及び、
[00111]  プローブ：ＣＣＧＧＣＡＣＣＴＧＣＡＣＡＣＣＴＧＧＡ［配列番号３］）。
【００９１】
[00112]  ハウスキーピング遺伝子のＡＢＬ  ｍＲＮＡも同時に増幅して、Ｂｃｌ−２
ｍＲＮＡをＡＢＬ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化した。
【００９２】
[00113]  この結果を図７に図示する。これらの結果は、ＬＣＡＮ−Ｇ３１３９が、Ｂｃｌ−２の下方調節において、ＬＮ−Ｇ３１３９（ＨＳＡ−ＰＥＨＡを含有しない、Ｇ３１３９の典型的なＬＮ製剤）よりもずっと有効であることを示した。上記のデータは、ＬＣＡＮ−Ｇ３１３９がほとんどのＬＮに優る組成物であって、アンチセンスＡＳＯと、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲミミック、及び抗ｍｉＲオリゴのような他のオリゴヌクレオチド薬を送達するのに使用し得ることを示した。
【００９３】
[00114]  実施例４
[00115]  この実施例では、低分子量ＰＥＩ（６００）を使用した。同様の技術を使用して、ペンタエチレンヘキサミン（ＰＥＨＡ）のような代わりの低分子量ポリマーもコンジュゲートさせてよい。
【００９４】
[00116]  ＥＤＣを使用して、ＨＳＡ−ＰＥＩコンジュゲートを生成した。小バイアルにおいて、４２ｍｇのＨＳＡと１８８ｍｇのＰＥＩ（分子量＝６００）（ＨＳＡ：ＰＥＩのモル比＝１：５００）をＨＢＳ中で合わせて全量２．０ｍＬとして、ｐＨ８．０へ調整した。ＰＥＩの高アルカリ性により、混合に先立ってＰＥＩストック溶液をｐＨ８．０へ滴定した。ＥＤＣをそのまま室温へ平衡化した後で、９．６０ｍｇのＥＤＣ（ＨＳＡに対して８０倍のモル過剰量）をＨＳＡ及びＰＥＩの撹拌溶液へゆっくり加えた。この混合物を撹拌しながら室温で１時間反応させた。反応の経過にわたって、ｐＨを約９．０に維持した。生成物をＰＤ−１０カラムに通過させて未反応試薬を除去した。ゲル移動度シフト分析を行って、ＨＳＡ−ＰＥＩコンジュゲートのＤＮＡ濃縮効率を決定した。
【００９５】
[00117]  還元可能なライナー（a reducible liner）を導入する代わりのコンジュゲート法では、トラウト試薬を使用して、ＨＳＡ−ＰＥＩコンジュゲートを生成した。小バイアルにおいて、４２ｍｇのＨＳＡと１８８ｍｇのＰＥＩ（分子量＝６００）（ＨＳＡ：ＰＥＩのモル比＝１：５００）をＨＢＳ中で合わせて全量２．０ｍＬとし、ｐＨ８．０へ調整した。ＰＥＩの高アルカリ性により、混合に先立ってＰＥＩストック溶液をｐＨ８．０へ滴定した。３．５ｍｇのトラウト試薬（ＨＳＡに対して４０倍のモル過剰量）を１０μＬのＤＭＳＯに溶かして、ＨＳＡ及びＰＥＩの撹拌溶液へゆっくり加えた。この混合物を撹拌しながら室温で２時間反応させた。反応の経過にわたって、８．０のｐＨを維持した。スルフヒドリルの酸化を生じるジスルフィド架橋連結により、ＨＳＡ−ＰＥＩコンジュゲートの形成がもたらされた。この生成物をＰＤ−１０カラムに通過させることによって精製して、未反応試薬を除去した。ゲル移動度シフト分析を行って、このコンジュゲートのＤＮＡ濃縮効率を決定した。
【００９６】
[00118]  なお別の合成法では、ＳＰＤＰを使用してＨＳＡ−ＰＥＩコンジュゲートを生成した。小バイアルにおいて、トラウト試薬によって活性化した４２ｍｇのＨＳＡとＳＰＤＰによって活性化した１８８ｍｇのＰＥＩ（分子量＝６００）（ＨＳＡ：ＰＥＩのモル比＝１：５００）をＨＢＳ中で合わせて全量２．０ｍＬとし、ｐＨ８．０へ調整した。これにより、ジスルフィド連結によるアルブミン−ＰＥＩコンジュゲートの形成を生じた。ゲル移動度シフト分析を行って、このコンジュゲートの濃縮効率を決定した。
【００９７】
[00119]  ＤＴＢＰを使用して、アルブミン−ＰＥＩコンジュゲートを生成した。小バイアルにおいて、４２ｍｇのＨＳＡと１８８ｍｇのＰＥＩ（分子量＝６００）（ＨＳＡ：ＰＥＩのモル比＝１：５００）をＨＢＳ中で合わせて全量２．０ｍＬとし、ｐＨ８．０へ調整した。ＰＥＩの高アルカリ性により、混合に先立ってＰＥＩストック溶液をｐＨ８．０へ滴定した。３．９ｍｇのＤＴＢＰ（ＨＳＡに対して２０倍のモル過剰量）を１０μＬのＤＭＳＯに溶かして、ＨＳＡ及びＰＥＩの撹拌溶液へゆっくり加えた。この混合物を撹拌しながら室温で一晩反応させた。反応の経過にわたって、８．０のｐＨを維持して、この生成物をＰＤ−１０カラムに通過させて、未反応試薬を除去した。ゲル移動度シフト分析を行って、このコンジュゲートの濃縮効率を決定した。
【００９８】
[00120]  実施例５
[00121]  ＨＳＡ−ＰＥＩコンジュゲートを含有するＬＮを生成した。ゲル移動度分析を使用して最適の遅延比を見出すために、様々なｗ／ｗ比（０、０．５、１、３、６：１のＨＳＡ：ＯＤＮ  ｗ／ｗ）でのＨＳＡ−ＰＥＩをＯＤＮ  ＬＯＲ−２５０１（０．２μＭ）（Alpha DNA より購入）と合わせた。遅延が生じたのは３：１（ＨＳＡ：ＯＤＮ  ｗ／ｗ）である（図１）。１００％エタノールに溶かした、ＤＤＡＢ、ＣＨＯＬ、及びＴＰＧＳの脂質ストックを６０：３５：５のモル比で合わせた。エタノール中１００μＬの脂質混合物を９００μＬの１ＸＰＢＳ緩衝液へ加えて、１０％エタノール中のエンプティ（empty）ＬＮを生成した。次いで、このＨＳＡ−ＰＥＩ／ＯＤＮ複合体をエンプティＬＮと合わせて、ＬＣＡＮを生成した。この製剤を少しの間激しく撹拌して、ＫＢ細胞へのトランスフェクションの前に、そのまま室温で１５分間放置した。ＨＳＡ−ＰＥＩとＯＤＮ  ＬＯＲ−２５０１（Alpha DNA より購入）を含有するＬＣＡＮについて、ＬＮ：ＨＳＡ：ＯＤＮ＝１０：１、２、３：１の比で、ゼータ電位分析を完了した。使用するＯＤＮの濃度は、０．２μＭであった（図２）。ＨＳＡ−ＰＥＩを含有するＬＣＡＮは、いずれも５ｍＶと２５ｍＶの間に及ぶ陽電荷を明示した。ＨＳＡ−ＰＥＩの無いＬＣＡＮは、中性に帯電していた。図３は、ＬＣＡＮ中のＬＯＲ−２５０１による、ＲＮＲ  Ｒ１  ｍＲＮＡ発現の下方調節を表示する。
【００９９】
[00122]  ＲＰＭＩ  １６４０培地において５％  ＣＯ２雰囲気下に３７℃で増殖させたＫＢ細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、６ウェルプレートにおいてウェルに付き３．０ｘ１０５個の細胞密度で蒔いた。細胞をほぼ８０％の集密度まで増殖させて、この血清含有培地を取り出した。細胞を１０００μＬのトランスフェクション培地でトランスフェクトして、４時間処理した。０％と１０％の血清含有ＲＰＭＩ  １６４０培地の存在下でトランスフェクションが起きた。実験は同一３検体で実施した。処理が完了した後で、細胞を１ＸＰＢＳで洗浄して、血清含有ＲＰＭＩ  １６４０を戻した。処理が完了してから４８時間後に、細胞について、アクチンをハウスキーピング遺伝子とするＲＴ−ＰＣＲによってＲＮＲ  Ｒ１発現レベルを分析した。結果を図２に示す。無血清条件下では、１：３のＯＤＮ：ＨＳＡのＬＣＡＮ製剤が最大のトランスフェクション効力を示した。逆に、１０％血清では、１：１のＯＤＮ：ＨＳＡのＬＣＡＮ製剤が最も有効であった。処理後４８時間での細胞生存度をＭＴＴアッセイによって評価した（図４）。ＰＥＨＡのアルブミンへのコンジュゲーションを伴う同様の実験を完了したところ、同様のトランスフェクション活性を示した（図７及び８）。
【０１００】
[00123]  実施例６
[00124]  ＬＣＡＮについて、ＣＡＬ−５１乳癌細胞中への抗ｍｉＲ−２２１の送達を試験した。
【０１０１】
[00125]  ＬＣＡＮ（ＨＳＡ−ＰＥＩベースのＡＰＣを使用する）を上記のように調製した。ＣＡＬ−５１（トリプルネガティブ乳癌）細胞を、トランスフェクションに先立つ２４時間前に、６ウェルプレートにおいて、１％ペニシリン／ストレプトマイシンと１０％  ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中２ｘ１０４個／ｃｍ２の細胞密度で蒔いた。ＬＣＡＮを抗ｍｉＲ−２２１（１００ｎＭ）と合わせて、ｍｉＲ−２２１の下流標的であるｐ２７／Ｋｉｐ１とエストロゲン受容体α（ＥＲα）を上方調節するその能力を評価した。２０％血清の存在下にＣＡＬ−５１細胞をトランスフェクトした。処理をそのまま４時間進行させて、この時点でトランスフェクション培地を取り出して、新鮮な培地（１０％  ＦＢＳを補充した）と交換した。細胞をそのままさらに４４時間増殖させた後で、ＲＴ−ＰＣＲを開始した。細胞由来のＲＮＡを TRIzol 試薬（Life Technologies）によって抽出して、製造業者の説明書に従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III First-Strang Synthesis System（Life Technologies）によって、ｃＤＮＡを産生した。次いで、ＳＹＢＲグリーン（Life Technologies）と、ｐ２７／ｋｉｐ１及びＥＲαのプライマー（Alpha DNA）を使用して、ＲＴ−ＰＣＲを実施した：
[00126]  フォワード：５’ＣＧＧＡＧＣＡＣＧＧＧＧＡＣＧＧＧＴＡＴＣ−３’［配列番号４］、
[00127]  リバース：５’−ＡＡＧＡＣＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＡＣＧＣＡＣＡＴＣ−３’［配列番号５］）。
【０１０２】
[00128]  対照としてβ−アクチンを使用した。図１０と図１１に明示されるように、ＬＣＡＮ／抗ｍｉＲ−２２１は、ｐ２７／Ｋｉｐ１の発現における中等度の増加と、ＥＲαの発現における軽度の増加をもたらした。
【０１０３】
[00129]  実施例７
[00130]  比較的大きなスケールでＨＳＡ−ＰＥＨＡコンジュゲートを合成した。合成の間に使用したＨＳＡ：ＰＥＨＡ：ＥＤＣのモル比は、１：１５００：２００（モル／モル）であった。５ｇのＰＥＨＡ（分子量２３２．３７、工業級）を８０ｍＬのｄｄＨ２Ｏに溶かしてから、１Ｍ  ＨＣｌを使用してｐＨ８．０へ調整した。このＰＥＨＡ溶液へ１ｇ（４ｍＬ）のＨＳＡ（２５％，Octapharma）に次いで５６２．５ｍｇの１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド（ＥＤＣ，ＤＭＳＯに溶かす）を撹拌下に加えた。この反応を室温で３時間続けた。次いで、この混合物を、ＭＷＣＯ  １０，０００ Spectrum 膜を使用してｄｄＨ２Ｏに対して４℃で透析した。この緩衝液は、透析サイクルの最後の３時間の時点での外部緩衝液における標準ニンヒドリン又はＴＮＢＳアミンアッセイによってＰＥＨＡからのアミンが検出不能になるまで、３〜４時間ごとに交換した。さらなるスケールアップ合成のために、この透析手順は、例えば、Millipore Pellicon カセットシステム又は Spectropor 中空糸膜システムを使用する、タンジェンシャルフロー透析濾過に換えることができる。この方法を使用して、生成物を望まれる濃度まで濃縮することもできる。生成物は、０．２２μｍ滅菌フィルターから無菌容器中へ通過させて、４℃で保存することができる。長期保存のためには、生成物を−２０℃で保存することができる。この生成物は、凍結乾燥させてもよい。
【０１０４】
[00131]  ＢＣＡタンパク質アッセイを使用して、生成物のタンパク質濃度を定量した。ＨＳＡ−ＰＥＨＡコンジュゲートのアミン含量は、ＨＳＡに対する分子量の変化に基づいた、ＴＮＢＳアッセイ又はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって定量した。ゲル浸透クロマトグラフィーをアミンＴＮＢＳアッセイと組み合わせて使用して、生成物における架橋連結性ＨＳＡの欠乏と遊離ＰＥＨＡの非存在を実証する。使用する試薬の低廉性により、反応の収率はさして重要ではない。生成物の純度はきわめて高いと予測される。最終生成物におけるＰＥＨＡ対ＨＳＡ比と架橋連結性ＨＳＡと遊離ＰＥＨＡの上限に基づいて、正確な製品仕様を規定することができる。
【０１０５】
[00132]  本明細書に開示した製剤及び方法のいくつかの態様を上記の実施例において明確化した。これらの実施例は、本発明の特別な態様を示すものではあるが、例解のためにのみ示されることを理解されたい。上記の考察とこれらの実施例より、当業者は、本開示の本質的な特徴を確認することができて、その精神及び範囲より逸脱することなく、様々な変更及び修飾を加えて、本明細書に記載される組成物及び方法を様々な使用法及び状況へ適用することができる。本開示の本質的な範囲より逸脱することなく、様々な変更をなし得て、その要素に均等物を代用し得る。加えて、本開示の教示内容に対して、その本質的な範囲より逸脱することなく、特別な状況又は材料を適用するために、多くの修飾を行うことができる。
【図１】
2015523969.tif 000003
【図２】
2015523969.tif 000004
【図３】
2015523969.tif 000005
【図４】
2015523969.tif 000006
【図５】
2015523969.tif 000007
【図６】
2015523969.tif 000008
【図７】
2015523969.tif 000009
【図８】
2015523969.tif 000010
【図９】
2015523969.tif 000011
【図１０】
2015523969.tif 000012
【図１１】
2015523969.tif 000013
【配列表】
2015523969000001.app
【国際調査報告】
2015523969.tif 000014