(57)【要約】  本発明は、抗毒素剤の組合せに関する。本発明は、クロストリジウム属の種もしくはコクシジウム類の種を主体とする疾患もしくは他の腸疾患の影響を軽減するのに有用となりうる、または胃腸の健康もしくは機能を一般に向上させることにより有用となりうる、抗毒素剤、免疫調節剤、および粘膜細胞にエネルギーを提供する成分の組合せに関する。
2015532302.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その必要のある動物において腸疾患を処置する方法であって、クレイと、酵母、酵母産物、または酵母様産物とを含む混合物を動物に投与し、それによって腸疾患を処置する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記腸疾患が、クロストリジウム属の細菌またはアイメリア属の原性動物を原因とするものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腸疾患が、壊疽性腸炎、コクシジウム症、クロストリジウム・ディフィシレ感染、慢性または出血性腸疾患、腸性毒血症、細菌性赤痢、細菌性または食品もしくは水媒介性の内毒素および／または外毒素が原因となる下痢または疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記動物が、家禽種、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、またはヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記動物が水棲種である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記水棲種が、エビまたは養殖魚である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記混合物を食餌補助剤として投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記補助剤が、飼料の約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約０．３５％（ｗ／ｗ）、飼料の約０．１５％（ｗ／ｗ）〜約０．２５％（ｗ／ｗ）、または飼料の約０．２５％（ｗ／ｗ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記混合物が、約５０〜９０％（ｗ／ｗ）のクレイおよび約５〜５０％（ｗ／ｗ）の酵母産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記混合物が、約８０％（ｗ／ｗ）のクレイ、および約１０％（ｗ／ｗ）の酵母、酵母産物、または酵母様産物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記クレイがカルシウムモンモリロナイトクレイである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記クレイがＣａｌｉｂｒｉｎ（登録商標）−Ｚである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記クレイが、吸着剤鉱物、珪藻土、ケイ酸塩、ゼオライト、アタパルジャイト、スメクタイト（ベントナイトクレイ）、またはこれらの組合せである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記スメクタイト（ベントナイトクレイ）が、サポナイト、ヘクトライト、スチブンサイト、サウコナイト（ｓａｕｃｏｎｉｔｅ）、モンモリロナイトもしくはその塩、バイデライト、またはノントロナイトである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記クレイを、約１００℃〜約８００℃の間に加熱する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記クレイを、約２０〜５０ミクロンの粒径に粉砕する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記酵母産物が、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記酵母産物がクエン酸プレスケーキである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵母産物が酵母発酵産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記酵母産物が酵母成分である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記酵母成分が、酵母マンナン、酵母細胞壁、マンナンオリゴ糖、βグルカン、繊維、炭水化物源、プレバイオティック、またはこれらの組合せである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記酵母産物が酵母発酵産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
その必要のある動物において腸疾患を処置する方法であって、クレイと、酵母、酵母産物、または酵母様産物と、グルタメートとを含む混合物を動物に投与し、それによって腸疾患を処置する工程を含む、方法。
【請求項２４】
前記腸疾患が、クロストリジウム属の細菌またはアイメリア属の原性動物を原因とするものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記腸疾患が、壊疽性腸炎、コクシジウム症、クロストリジウム・ディフィシレ感染、慢性または出血性腸疾患、腸性毒血症、細菌性赤痢、細菌性または食品もしくは水媒介性の内毒素および／または外毒素が原因となる下痢または疾患である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記動物が、家禽種、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、またはヒトである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記動物が水棲種である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記水棲種が、エビまたは養殖魚である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記混合物を食餌補助剤として投与する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記補助剤が、飼料の約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約０．３５％（ｗ／ｗ）、飼料の約０．１５％（ｗ／ｗ）〜約０．２５％（ｗ／ｗ）、または飼料の約０．２５％（ｗ／ｗ）である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記混合物が、約５０〜９０％（ｗ／ｗ）のクレイ、約５〜５０％（ｗ／ｗ）の酵母産物、および約０．０１〜１５％（ｗ／ｗ）のグルタメートである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３２】
前記混合物が、約８０％（ｗ／ｗ）のクレイ、約１０％（ｗ／ｗ）の酵母、酵母産物、または酵母様産物、および約１０％（ｗ／ｗ）のグルタメートである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記クレイがカルシウムモンモリロナイトクレイである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３４】
前記クレイがＣａｌｉｂｒｉｎ（登録商標）−Ｚである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記クレイが、吸着剤鉱物、珪藻土、ケイ酸塩、ゼオライト、アタパルジャイト、スメクタイト（ベントナイトクレイ）、またはこれらの組合せである、請求項２３に記載の方法。
【請求項３６】
前記スメクタイト（ベントナイトクレイ）が、サポナイト、ヘクトライト、スチブンサイト、サウコナイト、モンモリロナイトもしくはその塩、バイデライト、またはノントロナイトである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記クレイを、約１００℃〜約８００℃の間に加熱する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３８】
前記クレイを、約２０〜５０ミクロンの粒径に粉砕する、請求項２３に記載の方法。
【請求項３９】
前記酵母産物が、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母産物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項４０】
前記酵母産物がクエン酸プレスケーキである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記酵母産物が酵母発酵産物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項４２】
前記酵母産物が酵母成分である、請求項２３に記載の方法。
【請求項４３】
前記酵母成分が、酵母マンナン、酵母細胞壁、マンナンオリゴ糖、βグルカン、繊維、炭水化物源、プレバイオティック、またはこれらの組合せである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記酵母産物が酵母発酵産物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項４５】
前記グルタメートがグルタミン酸一ナトリウムである、請求項２３に記載の方法。
【請求項４６】
前記グルタメートが、グルタミン酸、α−ケトグルタレート、グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、もしくはＬ−グルタミン、またはこれらの誘導体である、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願および参照による援用］
本出願は、それぞれ「ＣＬＡＹ−ＣＯＮＴＡＩＮＩＮＧ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮ  ＴＨＡＴ  ＡＬＬＥＶＩＡＴＥＳ  ＥＦＦＥＣＴＳ  ＯＦ  ＢＡＣＴＥＲＩＡＬ  ＥＸＯＴＯＸＩＮ−ＡＳＳＯＣＩＡＴＥＤ  ＤＩＳＥＡＳＥ」および「ＣＬＡＹ，  Ａ  ＹＥＡＳＴ  ＰＲＯＤＵＣＴ  ＡＮＤ  ＧＬＵＴＡＭＡＴＥ  ＢＬＥＮＤＥＤ  ＰＲＯＤＵＣＴ  ＡＮＤ  ＵＳＥＳ  ＴＨＥＲＥＯＦ」と題された、それぞれ２０１２年１０月２日および２０１３年３月１５日出願の米国仮特許出願通し番号第６１／７０８，７６３号および第６１／７９２，３８２号の権益およびこれらに対する優先権を主張する。
【０００２】
前述の出願、および本明細書で引用する、または審査中であるすべての文書（「出願引用文書」）；出願引用文書において引用され、または参照文献とされているすべての文書；本明細書で引用し、または参照文献とするすべての文書（「本明細書引用文書」）；本明細書引用文書において引用され、または参照文献とされているすべての文書；ならびに本明細書、または参照により本明細書に援用される文書において言及される製品についての、製造業者による使用説明書、解説書、製品明細書、および製品仕様書は、参照により本明細書に援用され、本発明を実践する際に用いることができる。より詳細には、参照文献とされる文書はすべて、個々の各文書が参照により援用されると詳細かつ個別に示されたかのごとく、参照により援用される。
【０００３】
［発明の分野］
本出願は、詳細には腸疾患の影響を軽減するための、クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートからなる混合物、ならびにこれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
クロストリジウムは、家禽、動物、およびヒトにおいて疾患の原因となる毒素を分泌する細菌属である。嫌気性細菌病原体は、農産業への深刻な経済的負担である。クロストリジウム科の細菌は、家禽および他の経済的価値のある家畜において重篤な疾患の原因となるので、特別な負担となる。こうした生物をコントロールするための以前からの取り組みは、衛生上の手段、および動物飼料に入れた抗生物質の投与を頼みとしている。
【０００５】
壊疽性腸炎（ＮＥ）は、現代のブロイラー集団における、最も一般的で、財政上手痛い細菌性疾患である。この疾患は、土壌、敷料、塵埃中に、また低レベルで健康な鳥の腸において見出すことのできるグラム陽性嫌気性細菌である、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）が原因となる感染性疾患である。クロストリジウム・パーフリンジェンスは、毒素非産生型から毒素産生型に変換するときにだけ、ＮＥの原因となる。
【０００６】
幾種類かの毒素（α、β、ε、ι、およびＣＰＥ）を産生する５つの型のＣ．パーフリンジェンス（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、およびＥ）が存在する。酵素（ホスホリパーゼＣ）であるα−毒素は、ＮＥの発生の鍵であると考えられている。しかし、最近の研究で、α−毒素を産生しない分離株が、依然として疾患の原因となる場合があることが示されている。加えて、疾患の原因となるＣ．パーフリンジェンス分離株において、ＮｅｔＢと呼ばれる新たな毒素が最近になって確認されている。感染した鳥の腸は、脆く、毒素がもたらすガスおよび肉眼的病変によって膨張している。急性型のＮＥでは、鳥は、多くの場合、臨床徴候を示す前に死亡する。しかし、その準臨床的な型では、疾患は、生産者にとって財政上はるかに損害を与えるものである。疾患の一般に認められる症状は、鳥の齢数によって様々である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｒ．  Ｂ．  ２００５  Ｉｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ：  ｒａｔｉｏｎａｌ，  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｇｕｔ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．  Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈ．  ３４：１５９〜１８０
【非特許文献２】「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＬｅｅ、１９８７）
【非特許文献３】Ｐａｒｋ  ＳＳ、Ｌｉｌｌｅｈｏｊ  ＨＳら、Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｂｒｏｉｌｅｒ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ  ｃｏｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ  ａｎｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ．  Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２００８、５２：１４〜２２
【非特許文献４】Ｊａｎｇ  ＳＩ、Ｌｉｌｌｅｈｏｊ  ＨＳら、Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＭｏｎｔａｎｉｄｅＴＭ  ＩＳＡ  ７１  ＶＧ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｂｒｏｉｌｅｒ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１２、３０：５４０１〜５４０６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ニワトリなどの鳥類を含めた、集約的に飼養されている家畜を、クロストリジウム属の種による感染から防御する、安全で、経済的で、有効な方法が当業界で求められている。クロストリジウム類が原因となる疾患は、ヒトの罹患および家畜の経済的損失の両方を引き起こす。こうした疾患に介入する費用効果の高い方法があれば、疾患管理システムが促進されることになる。
【０００９】
本出願における文書の引用または認定は、そうした文書が本発明の先行技術として有効であることの容認ではない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、クロストリジウム類もしくはコクシジウム類を主体とする疾患もしくは他の腸疾患の影響を軽減するのに有用となりうる、または胃腸の健康もしくは機能を一般に向上させることにより有用となりうる、抗毒素剤、免疫調節剤、粘膜細胞にエネルギーを提供する成分、またはこれらの組合せに関する。
【００１１】
出願人らは、ある特定のクレイによって、クロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）およびクロストリジウム・パーフリンジェンスからの毒素を吸着できることをｉｎ  ｖｉｔｒｏで示した。出願人らは、ある特定のクレイまたはクレイ製剤によって、クロストリジウム・パーフリンジェンスと関連する疾患である、ニワトリにおける壊疽性腸炎を緩和できることをｉｎ  ｖｉｖｏで示した。出願人らは、クレイまたはクレイ製剤がｉｎ  ｖｉｔｒｏでクロストリジウム毒素を結合しうること、ならびにクレイまたはクレイ製剤が、クロストリジウム・パーフリンジェンスが原因となる疾患、およびおそらく他のクロストリジウム類が原因となる疾患を軽減しうることを見出した。
【００１２】
出願人らは、クレイによって、クロストリジウム・ディフィシレおよびクロストリジウム・パーフリンジェンスが産生する外毒素を吸着できることも見出した。クレイ、酵母産物、一形態の機能性アミノ酸の組合せである配合物が、Ｃ．パーフリンジェンスおよびコクシジウム（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ）を含んだ負荷モデル（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｍｏｄｅｌ）を使用したとき、ブロイラーにおける壊疽性腸炎の影響の軽減を助けることがわかった。
【００１３】
本発明は、抗毒素剤、免疫調節剤、および粘膜細胞にエネルギーを提供する成分、またはこれらの組合せに関する。有利な場合では、抗毒素剤は、クレイでよく、免疫調節剤は、酵母産物でよく、細胞にエネルギーを提供する成分は、グルタメートなどの機能性アミノ酸でよい。特定の有利な実施形態では、クレイは、カルシウムモンモリロナイトクレイでよく、酵母産物は、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ酵母産物でよく、機能性アミノ酸は、グルタミン酸一ナトリウム（「ＭＳＧ」）でよい。別の有利な実施形態では、混合物は、約５０〜９０％（ｗ／ｗ）の抗毒素剤、約１０〜５０％（ｗ／ｗ）の、酵母産物でよい免疫調節剤、および約０．０１〜１５％（ｗ／ｗ）のグルタメートを含んでよい。
【００１４】
特に好ましい実施形態では、組成物または混合物は、約８０％（ｗ／ｗ）のクレイ、約１０％（ｗ／ｗ）の酵母産物、および約１０％（ｗ／ｗ）のグルタメート、または６０％（ｗ／ｗ）のクレイ、約３５％（ｗ／ｗ）の酵母産物、および約５％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）のグルタメートでよい。
【００１５】
本発明はまた、食餌補助剤として利用される、本明細書で開示する組成物および／または混合物も包含する。一実施形態では、補助剤は、飼料の約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約０．３５％（ｗ／ｗ）、飼料の約０．１５％（ｗ／ｗ）〜約０．２５％（ｗ／ｗ）、または飼料の約０．２５％（ｗ／ｗ）でよい。
【００１６】
これに応じて、本発明の目的は、以前から知られている、いかなる製品、製品の作製プロセス、または製品の使用方法も、本発明の範囲内に含めないことであるため、出願人らは、以前から知られている、いかなる製品、プロセス、または方法の権利も留保し、これによってその放棄を開示する。さらに、本発明は、ＵＳＰＴＯ（３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．  §１１２、第１パラグラフ）またはＥＰＯ（ＥＰＣ第８３条）の明細書記載要件および実施可能要件を満たさない、いかなる製品、製品の作製プロセス、または製品の使用方法も、本発明の範囲内に含めないものとするため、出願人らは、以前に記載されている、いかなる製品、製品の作製プロセス、または製品の使用方法の権利も留保し、これによってその放棄を開示することを指摘する。
【００１７】
本開示、特に請求項および／または段落において、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの用語は、米国特許法においてそれによるとされる意味を有してよく、たとえば、こうした用語は、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ」、「ｉｎｃｌｕｄｅｄ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」などを意味してよく、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」や「ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ」などの用語は、米国特許法においてそれによるとされる意味を有し、たとえば、こうした用語は、明確に列挙されない要素を見込んでいるが、先行技術において見出されるまたは本発明の根本的もしくは新奇な特徴に影響を及ぼす要素は除外する。
【００１８】
これらおよび他の実施形態は、以下の詳細な説明から開示され、または明らかとなり、それによって実現される。
【００１９】
例として示すが、本発明を、記載する特定の実施形態に専ら限定するものでない、以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて、最良に理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】実験計画の概要を示す概略図である。
【図２】Ｏｉｌ−Ｄｒｉ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡｍｅｒｉｃａのＡｍｌａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社のブランドである（「Ａｍｌａｎ」）製品、たとえば、１００％クレイ製品（Ｂ）、有機酸および植物抽出物を配合したクレイ製品（Ｙ）、クレイと酵母産物の配合物（Ｃ）、クレイ、酵母産物、およびグルタミン酸一ナトリウムの配合物（Ｄ）を給餌し、クロストリジウム・パーフリンジェンス（ＣＰ）で負荷して壊疽性腸炎を誘発したブロイラー鶏の体重増加を、抗生物質ヴァージニアマイシン（ＶＭ）と比べた比較を示すグラフである。体重は、Ｅ．ｍａｘｉｍａ感染の日からＣＰ感染後の２日にかけて求めた。鳥は、孵化後１４日の時点で、Ｅ．ｍａｘｉｍａの胞子形成接合子嚢１０，０００個で感染させた。Ｅ．ｍａｘｉｍａ感染から４日後、対照処置のものを除く鳥に、１×１０９ＣＦＵのＣＰを接種した。
【図３】Ｂ、Ｙ、Ｃ、ＤなどのＡｍｌａｎ製品を給餌し、抗生物質ＶＭと比べた、ブロイラー鶏の体重増加の比較を示すグラフである。体重増加は、ＣＰ感染の日からＣＰ感染後７日にかけて求めた。鳥は、孵化後１４日の時点で、Ｅ．ｍａｘｉｍａの胞子形成接合子嚢１０，０００個で感染させた。Ｅ．ｍａｘｉｍａ感染から４日後、鳥に１×１０９ＣＦＵのＣＰを接種した。
【図４】腸病変スコアに対する食餌用Ａｍｌａｎ製品の効果を示すグラフである。
【図５Ａ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後７日でのα−毒素抗原に対する血清抗体応答を示すグラフである。
【図５Ｂ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後１４日でのα−毒素抗原に対する血清抗体応答を示すグラフである。
【図６Ａ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後７日でのＮｅｔＢ毒素抗原に対する血清抗体応答を示すグラフである。
【図６Ｂ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後１４日でのＮｅｔＢ毒素抗原に対する血清抗体応答を示すグラフである。
【図７Ａ】Ａｍｌａｎ製品による食餌補助が血清毒素に与える効果を示すグラフである。血清は、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点で収集し、ＥＬＩＳＡによるα−毒素レベルの測定に使用した。
【図７Ｂ】Ａｍｌａｎ製品による食餌補助が血清毒素に与える効果を示すグラフである。血清は、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点で収集し、ＥＬＩＳＡによるＮｅｔＢ毒素レベルの測定に使用した。
【図８Ａ】第２のｉｎ  ｖｉｖｏ実験における、０〜２１日目にかけての飼料要求量の比較を示すグラフである。この実験では、負荷されないもの（ＮＥなし）を除くブロイラー鶏に負荷をかけて壊疽性腸炎を誘発し、製品なし（ＮＥ）、以前の実験のとおりの、クレイ、酵母産物、およびグルタミン酸一ナトリウムの配合物（Ｄ）、異なる混入率の、クレイ、酵母産物、およびグルタミン酸一ナトリウム（Ｄ８）、および異なる酵母産物を使用したこれら２種の製剤（ＤＸおよびＤ８Ｘ）を給餌し、これらの製品を抗生物質ヴァージニアマイシン（ＶＭ）と比較した。この実験では、ブロイラーに、１４日目に、Ｅ．ｍａｘｉｍａ（コクシジウム類の一系統）の接合子嚢およそ５，０００個を経口負荷し、１９、２０、および２１日目に、壊疽性腸炎の臨床事例から単離された、αおよびＮｅｔＢ両方の毒素を産生する、Ｃ．パーフリンジェンス１０８ｃｆｕ／ｍｌのブロス培養物を与えた（負荷されない対照処置（ＮＥなし）を除く）。実験は２８日続いた。一般に、種々のＡｍｌａｎ製品を給餌された鳥についての飼料要求量は、０〜２１日目にかけて、ＮＥ処置とＶＭ処置の中間であった。しかし、Ｄ８Ｘ製品を給餌された鳥は、このパターンに従わず、飼料要求量は、この期間、統計的および数値的に、ＮＥ処置と同程度に不良であった。
【図８Ｂ】１４〜２１日目の飼料要求量を示すグラフである。負荷をかけ、ＤＸ処置を与えた鳥についての飼料要求量は、１４〜２１日の期間、（負荷したが、製品を給餌しなかった）ＮＥ処置の鳥より有意に良好であり、ＶＭを加えた食餌と統計的に同等であった。
【図８Ｃ】０〜２８日目の飼料要求量を示すグラフである。Ｄ８Ｘを除くすべての製品が、製品なしのＮＥより有意に良好であった。ＤおよびＤＸ製品は、ＶＭ処置の鳥と同様に、試験した製品の中で最良であり、ＮＥ負荷を受けなかった鳥と統計的に差がなかった。
【図９Ａ】０〜２８日目の体重増加を示すグラフである。増加は、ＶＭによって、どの製品もなしのＮＥ対照に比べて向上した。Ｄ８は、ＶＭと比べたとき、統計的に同等であり、数値的により良好であった。他のすべての製品は、製品なしのＮＥとＶＭの中間であった。
【図９Ｂ】１４〜２８日目の体重増加を示すグラフである。１４〜２８日目について、増加は、Ｄ８がＶＭと数値的に同等であったことを除き、０〜２８日目と同様のパターンに従った。
【図１０】病変スコアを示すグラフである。Ｄ８およびＤ８Ｘを給餌した鳥の病変スコアは、ＶＭを給餌した鳥より低く、ＮＥ負荷しなかった鳥と統計学的に差がなかったとしてもよい。
【図１１】ＮＥ死亡率を示すグラフである。Ｄを除くすべての製品で、製品なしでＮＥ負荷された鳥に比べて死亡率が低下し、ＶＭを給餌した鳥と同等であった。
【図１２Ａ】Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ感染の日からＣ．パーフリンジェンス感染後の２日にかけて求めた、第３のｉｎ  ｖｉｖｏ研究におけるブロイラー鶏の体重増加の比較を示すグラフである。鳥は、孵化後１４日の時点で、Ｅ．ｍａｘｉｍａの胞子形成接合子嚢１０，０００個で感染させた。Ｅｉｍｅｒｉａｍａｘｉｍａ感染から４日後、鳥に１×１０９ＣＦＵのＣ．パーフリンジェンスを接種した。この実験では、負荷されない対照（Ｃｏｎｔ）、負荷をかけて壊疽性腸炎を誘発したが製品を給餌されない群（ＮＥ）、０．３５、０．２５、０．１５、および０．０５％の混入率のＤ製品製剤（Ｄ３５、Ｄ２５、Ｄ１５、およびＤ０５）が存在し、原材料を異なる率で合わせた製品（ＤＳ、ＤＳＦ、Ｄ８、Ｄ８Ｆ）も含まれ、最後の群には、食餌において２０ｇ／トンのヴァージニアマイシンを与えた（ＶＭ）。
【図１２Ｂ】製品なしの壊疽性腸炎負荷対照の鳥に対する、体重増加の増大パーセントの比較を示すグラフである。ＮＥは、負荷をかけて壊疽性腸炎を誘発したが製品を給餌されない群であり、ＶＭは、食餌において２０ｇ／トンのヴァージニアマイシンを与えられる群である。
【図１３Ａ】ブロイラー鶏の体重増加の比較を示すグラフである。体重増加は、Ｃ．パーフリンジェンス感染の日から始め、Ｃ．パーフリンジェンス感染後７日で終えて求めた。
【図１３Ｂ】製品なしの壊疽性腸炎負荷対照に対する、体重増加の増大パーセントの比較を示すグラフである。
【図１４】腸病変スコアに対する製品の効果を示すグラフであり、スコアは、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日目に調べた、１群あたり５羽の鳥の平均である。
【図１５Ａ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点のα−毒素抗原に対する血清抗体応答を示すグラフである。
【図１５Ｂ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後７日の時点のα−毒素抗原に対する血清抗体応答を示すグラフである。
【図１６Ａ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点のＮｅｔＢ毒素抗原に対する血清抗体応答を示すグラフである。
【図１６Ｂ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後７日の時点のＮｅｔＢ毒素抗原に対する血清抗体応答を示すグラフである。
【図１７Ａ】血清α−毒素レベルに対する食餌補助の効果を示すグラフである。血清は、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点で収集し、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ＥＬＩＳＡ）によるα−毒素レベルの測定に使用した。
【図１７Ｂ】血清ＮｅｔＢ毒素レベルに対する食餌補助の効果を示すグラフである。血清は、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点で収集し、ＥＬＩＳＡによるＮｅｔＢ毒素レベルの測定に使用した。
【図１８Ａ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の空腸上皮内リンパ球におけるサイトカイン産生を示すグラフである。
【図１８Ｂ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の空腸上皮内リンパ球におけるサイトカイン産生を示すグラフである。
【図１８Ｃ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の鳥の空腸上皮内リンパ球におけるサイトカイン産生を示すグラフである。
【図１８Ｄ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の鳥の空腸上皮内リンパ球におけるサイトカイン産生を示すグラフである。
【図１９Ａ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の鳥の脾臓におけるサイトカイン産生を示すグラフである。
【図１９Ｂ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の鳥の脾臓におけるサイトカイン産生を示すグラフである。
【図１９Ｃ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の鳥の脾臓におけるサイトカイン産生を示すグラフである。
【図１９Ｄ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の鳥の脾臓におけるサイトカイン産生を示すグラフである。
【図１９Ｅ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の鳥の脾臓におけるサイトカイン産生を示すグラフである。
【図１９Ｆ】Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の鳥の脾臓におけるサイトカイン産生を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、クロストリジウム疾患の影響を軽減するのに有用となりうる、抗毒素剤、免疫調節剤、および粘膜細胞にエネルギーを提供する成分、またはこれらの組合せに関する。
【００２２】
クロストリジウムは、家禽、動物、およびヒトにおいて疾患の原因となる毒素を分泌する細菌属である。出願人らは、クロストリジウム属の２つの種、クロストリジウム・ディフィシレおよびクロストリジウム・パーフリンジェンスを調べ、クレイによって、両方が産生する外毒素を吸着できることを見出した。Ｃ．ディフィシレからの疾患は、ヒトおよびブタにおいて一般的であり、Ｃ．パーフリンジェンスからの疾患は、ウシにおいて一般的であり、ニワトリでは特に顕著であり、壊疽性腸炎（ＮＥ）として知られる。クレイ、酵母産物、および一形態の機能性アミノ酸の組合せである配合物を調べ、Ｃ．パーフリンジェンスおよびコクシジウム症（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ）を含んだ負荷モデルを使用したとき、ブロイラーにおける壊疽性腸炎の影響の軽減を助けることを見出した。
【００２３】
高濃度の食物繊維もしくは全粒小麦食、特に高濃度の動物タンパク質もしくは魚粉からの、粗タンパク質の多い食餌、または高濃度のアミノ酸グリシンもしくはメチオニンによって、Ｃ．パーフリンジェンス細菌が高レベルになるリスクが増大し、したがって、壊疽性腸炎になる見込みが増大したことが、以前に報告されている（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｒ．  Ｂ．、２００５年、Ｉｎｔｅｒｃｕｒｒｅｎｔ  ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ：  ｒａｔｉｏｎａｌ，  ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｂｙ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｇｕｔ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．  Ａｖｉａｎ  Ｐａｔｈ．  ３４：１５９〜１８０）。出願人らの調査では、負荷をかけて壊疽性腸炎を誘発したとき、クレイ、複雑還元炭素源、および有機酸の配合物である製品、または有機クレイである製品によって、ブロイラー生産力は、クレイ単独より向上しなかった。
【００２４】
出願人らは、いくつかのｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行って、壊疽性腸炎の緩和を助けるかどうか製品を調べた。出願人らは、製品なしまたはヴァージニアマイシンと比べた、異なる６種の製品の効果に注目した。ある実験では、鳥にＣ．パーフリンジェンスで負荷をかけたとき、すべての製品で、Ｃ．パーフリンジェンスで負荷され、いかなる製品でも処置しなかった鳥と比べて、病変スコアが低下した。１種類の製品（Ｙ）は、ヴァージニアマイシンと同等であり、２種類の製品（ＣＣ、Ｂ）は、ヴァージニアマイシンと比べて有意差がなかった。Ｃ．パーフリンジェンスで負荷された鳥において死亡率を比較したとき、製品なしより有意に良好であったのは、ヴァージニアマイシンだけであったが、ＣＣ製品は、ヴァージニアマイシンと有意差がなかった。１４〜２８日目（Ｃ．パーフリンジェンス負荷による影響を主に受ける期間）にかけての飼料要求量（飼料：増加）に注目すると、評価した２種類の製品（ＢＦＡ、ＢＴ）は、飼料要求量が、製品なしで負荷された鳥より数値的に不良であり、残りの製品は、ヴァージニアマイシンより、数値的には不良であるが有意には不良でなかった。１４〜２８日目にかけての体重増加について、Ｂを給餌された鳥だけは、体重増加が、製品を給餌されない鳥より有意に大きかった。この実験における応答判定基準全体にわたって一貫して最良であった製品はなかったので、製品は、主要な応答判定基準全体にわたってどのように機能するかによって順位付けした（表Ａ）。これは、４つの応答判定基準：１）１４〜２８日目にかけての体重増加、２）１４〜２８日目にかけての飼料要求量、３）病変スコア、および４）壊疽性腸炎からの死亡率のそれぞれにおける製品の順位付けに基づく順位付けであった。この順位付けにおいて、ある応答判定基準に別のものより重きを置く試みはなく、または統計的分析の試みもない。
【００２５】
【表１】
2015532302.tif 000003
【００２６】
このおよび以前のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ研究の結果に基づき、出願人らは、クレイを主体とした製品が、家禽における壊疽性腸炎の影響を軽減する助けとなりうるであろうと考えたが、他のものより明らかに良好であった特定の製品はなかった。したがって、別のｉｎ  ｖｉｖｏ研究を行った。この研究では、ＣＡ、ＢＴ、およびＢＦＡ製品は、その順位付けのために、もはや使用しなかった。Ｂは、ＣＡより高く順位付けされたので、次の実験のために、ＣＣの配合を改めてＢを使用し、配合の比率を変えた（新たなＣ製品）。
【００２７】
Ｃ．パーフリンジェンスまたはＣ．パーフリンジェンス＋アフラトキシンで負荷した鳥に注目した追跡実験を行った。３種の試験製品は、Ｂ、Ｙ、またはＣとした。３種の試験製品によって、疾患は軽減した。これは、Ｂ、Ｙ、またはヴァージニアマイシン製品によって、製品なしの食餌に比べて増加が向上し、Ｙが、ヴァージニアマイシンの給餌と統計的に同等であったように、Ｃ．パーフリンジェンスで負荷された鳥における１０〜２４日目にかけての負荷期間の間の増加において主に示された。この負荷では、飼料：増加比については、ヴァージニアマイシンを除く製品間に有意差はなかった。壊疽性腸炎負荷をアフラトキシン（１ｐｐｍ）負荷と合わせたとき、製品の効果はより大きかった。負荷期間（１４〜２４日目）の間の体重増加について、いずれかの製品を給餌された鳥は、製品を給餌されない鳥より、体重増加が大きかった。Ｂの給餌は、増加に対して、ヴァージニアマイシンを含めた他の製品より有意に高い、最も大きい効果をもたらした。飼料：増加比も、ＢまたはＣ製品を給餌された鳥では、製品を給餌されない鳥より良好であった（表Ｂ）。
【００２８】
本発明は、本明細書で開示する好ましい実施形態に加えて、抗毒素剤、酵母、酵母産物、または酵母様産物、およびＭＳＧ様材料も包含する。抗毒素剤であると考えられている他の材料として、他のクレイもしくは鉱物、酵母、酵母産物、もしくは酵母成分、または繊維、βグルカン、もしくは酵素の他の供給源などの酵母様産物も挙げることができる。
【００２９】
本明細書で使用するとき、クレイは、ケイ酸塩など、任意のタイプのクレイを指す場合もある。ケイ酸塩には、フィロケイ酸塩、ネソケイ酸塩、シクロケイ酸塩、ソロケイ酸塩、イノケイ酸塩、およびテクトケイ酸塩を含めることができる。フィロケイ酸塩としては、マイカ、クロライト、カオリナイト、スメクタイト（ベントナイトクレイ）、ホルマイト、タルク、および蛇紋岩を挙げることができる。テクトケイ酸塩としては、石英、ゼオライト、および長石を挙げることができる。
【００３０】
有利な実施形態では、クレイは、スメクタイト（ベントナイトクレイ）である。スメクタイト類には、限定はしないが、三八面体スメクタイトおよび二八面体スメクタイトが含まれる。三八面体スメクタイトとしては、限定はしないが、サポナイト、ヘクトライト、スチブンサイト（ｓｔｅｖｅｎｓｉｔｅ）、およびソーコナイト（ｓａｕｃｏｎｉｔｅ）が挙げられる。二八面体スメクタイトとしては、限定はしないが、モンモリロナイト、バイデライト、およびノントロナイトが挙げられる。モンモリロナイトには、限定はしないが、ナトリウムモンモリロナイトおよびカルシウムモンモリロナイトが含まれる。
【００３１】
本明細書で使用するとき、酵母は、酵母（子嚢菌や担子菌など）、酵母断片、酵母産物、または酵母様産物を指す場合がある。詳細には、酵母という用語は、酵母（子嚢菌や担子菌など）、酵母断片、酵母産物、または酵母様産物だけでなく、酵母のように作用しうる、いかなるものも包含する。本明細書で使用するとき、酵母は、酵母産物源、酵母発酵産物、酵母マンナン、全酵母もしくは酵母細胞の成分（限定はしないが、酵母細胞壁など）もしくはその混合物、または他の種の酵母からの酵母もしくは酵母成分も指す場合がある。
【００３２】
有利な実施形態では、βグルカンは、β１，３グルカンでよい。別の有利な実施形態では、βグルカンは、細菌βグルカンまたは細菌β１，３グルカンでよい。
【００３３】
他の免疫調節剤として、酵母、酵母産物、酵母成分もしくは他の繊維、免疫グロブリンもしくは免疫グロブリンの供給源、キチン、またはコルチコステロイドも挙げることができる。腸粘膜への他のエネルギー供給源としては、機能性タンパク質、グルタミン酸、トレオニン、機能性タンパク質の供給源、たとえば血漿、または機能性ペプチドも挙げることができる。本明細書で使用するとき、ペプチドは、短鎖のアミノ酸、たとえば、２〜４分子のグルタメート、またはグルタメートを含むもしくは含まない、異なるアミノ酸の組合せでよい。
【００３４】
本発明は、クレイに、３００℃〜８００℃の間の熱を最高で１時間加えることも含む。
【００３５】
本発明は、クレイの有効性に影響を与えうるように、クレイを加熱することも含む。これは、マッフル炉を使用して静的に、またはロータリーキルンもしくは気流乾燥器において動的に行うことができる。
【００３６】
本製品の好ましい実施形態は、約５０〜９０％（ｗ／ｗ）の、クレイなどの抗毒素剤、約５〜５０％（ｗ／ｗ）の、酵母産物でよい免疫調節剤、および約０．０１〜１５％（ｗ／ｗ）のグルタメートでよい。特に好ましい実施形態では、製品は、約８０％（ｗ／ｗ）の、クレイなどの抗毒素剤、約１０％（ｗ／ｗ）の、酵母産物でよい免疫調節剤、および約１０％（ｗ／ｗ）のグルタメートでよい。
【００３７】
抗毒素剤は、有利な場合では、１００℃〜８００℃の間、有利な場合では４００℃〜８００℃の間の温度に加熱して水分を減らし、微細な粒径に粉砕した、カルシウムモンモリロナイトクレイでよい。この加工処理、すなわち、１００℃〜８００℃の間への加熱および／または（平均粒径をおよそ２０〜５０ミクロンの間とする）微粉砕は、多種類の毒素にわたってクレイの毒素結合能を増大させることが示されている。酵母産物は、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉもしくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母産物または別の種の酵母からの産物でよい。グルタミン酸一ナトリウムは、アミノ酸グルタミン酸塩の一形態である。
【００３８】
有利な実施形態では、混合物は、約８０％（ｗ／ｗ）のクレイ、約３０％（ｗ／ｗ）〜約３５％（ｗ／ｗ）の酵母産物、および約５％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）のグルタメートでよい。
【００３９】
特に有利な実施形態では、クレイは、モンモリロナイトクレイ、好ましくは、高度精製モンモリロナイト吸着剤クレイ、より詳細には、Ｃａｌｉｂｒｉｎ（登録商標）−Ｚでよい。別の特に有利な実施形態では、酵母産物は、好ましくは酵母マンナン産物でよい。別の特に有利な実施形態では、グルタメートは、グルタミン酸一ナトリウムである。
【００４０】
特に好ましい実施形態では、混合物は、約６０％（ｗ／ｗ）のクレイ、約３０％（ｗ／ｗ）の酵母産物、および約１０％（ｗ／ｗ）のグルタメート、または６０％（ｗ／ｗ）のクレイ、約３５％（ｗ／ｗ）の酵母産物、および約５％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）のグルタメートでよい。
【００４１】
特に有利な実施形態では、クレイは、モンモリロナイトクレイ、好ましくは、高度精製モンモリロナイト吸着剤クレイ、より好ましくは、Ｃａｌｉｂｒｉｎ（登録商標）−Ｚでよい。別の特に有利な実施形態では、酵母産物は、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉマンナン産物を含めた酵母マンナン産物、またはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ酵母産物でよい。別の特に有利な実施形態では、グルタメートは、グルタミン酸一ナトリウムである。
【００４２】
本発明は、食餌補助剤として利用される、本明細書で開示する混合物も包含する。一実施形態では、補助剤は、飼料の約０．０５％（ｗ／ｗ）〜約０．３５％（ｗ／ｗ）、飼料の約０．１５％（ｗ／ｗ）〜約０．２５％（ｗ／ｗ）、または飼料の約０．２５％（ｗ／ｗ）でよい。
【００４３】
好ましい実施形態に加えて、Ａｍｌａｎ製品の代わりに、他のクレイもしくは吸着剤鉱物、珪藻土、ケイ酸塩、ゼオライト、アタパルジャイト、ホルマイトなどの、毒素を結合しうる他の材料を用いてもよいし、または（乾燥温度もしくは時間または最終含水量の増減、焼成材料、またはより大きいもしくは小さい粒径に粉砕した材料を含めた）他の工程で製造した、こうした鉱物もしくはこうした鉱物の組合せ（Ａｍｌａｎ製品の基礎材料を含める）を使用してもよいが、但し、非Ａｍｌａｎ製品は、いっそう多くの量が必要となる場合もあり、かつ／または非Ａｍｌａｎ製品では、効率がより落ちる場合もある。
【００４４】
クレイは、約１００℃、約１２５℃、約１５０℃、約１７５℃、約２００℃、約２２５℃、約２５０℃、約２７５℃、約３００℃、約３２５℃、約３５０℃、約３７５℃、約４００℃、約４２５℃、約４５０℃、約４７５℃、約５００℃、約５２５℃、約５５０℃、約５７５℃、約６００℃、約６２５℃、約６５０℃、約６７５℃、約７００℃、約７２５℃、約７５０℃、約７７５℃、約８００℃、約８２５℃、約８５０℃、約８７５℃、約９００℃、約９２５℃、約９５０℃、または約１０００℃に加熱してよい。クレイは、１分間から４時間まで加熱してよい。
【００４５】
クレイの平均粒径は、１ミクロン程度の小さい粒径から、５００ミクロン程度の大きい粒径でよい。平均粒径は、有利な場合では、２０ミクロン〜５０ミクロンの間でよい。
【００４６】
他の酵母産物源、酵母発酵産物、酵母マンナン、全酵母もしくは酵母細胞の成分（限定はしないが、酵母細胞壁など）もしくはその混合物、または他の種の酵母からの酵母もしくは酵母成分も使用してよい。マンナンオリゴ糖の供給源、および／またはβグルカン、または、限定はしないが、他の繊維または炭水化物源を含めて、酵母の他の主要成分も、使用できることになる。プレバイオティクスの他の供給源またはプレバイオティクスの配合物も、本発明のために使用してよい。
【００４７】
グルタメート、グルタミン酸、もしくはそのいずれかの塩の他の供給源、他のエネルギー生成アミノ酸（限定はしないが、α−ケトグルタレート、グルタミン、アスパルテート、分枝鎖アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、またはＬ−グルタミンを含める）、他の機能性アミノ酸、機能性ペプチド、もしくは機能性タンパク質、またはヌクレオチドも、本発明のために企図される。
【００４８】
材料の混入パーセントは、好ましい実施形態における混入パーセントから増減してよい。
【００４９】
好ましい実施形態が、コクシジウム症（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ）およびクロストリジウム・パーフリンジェンスを食道接種することによって誘発した壊疽性腸炎に対して価値があることを示してきたが、他のクロストリジウム属の種もしくはコクシジウム類の種を主因とする疾患もしくは他の腸疾患に対して、またはいずれかの家禽種、もしくは他の種、たとえば、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ヒト、および水棲種、たとえば、エビや養殖魚における胃腸管の健康もしくは機能を全般に改善することにより、同様の効果を示しうることになる。助けが得られる他の考えられる疾患は、ヒトおよび動物のクロストリジウム・ディフィシレ感染、ヒトの慢性腸疾患、乳牛の出血性腸疾患、仔ウシ、ブタ、およびヒツジの腸性毒血症、ヒトおよび動物の細菌性赤痢、旅行者下痢症、または細菌性もしくは食品およびもしくは水媒介性の内毒素もしくは外毒素が原因となる、動物もしくはヒトの他の疾患としてよいことになる。
【００５０】
いくつかの製品が、ブロイラー鶏における壊疽性腸炎の臨床徴候に与える効果を調べるために、研究を行った。製品には、出願人らが以前に試験したいくつかと、出願人らが動物において以前に使用していない新たな組合せ製品とを含めた。以前に試験した製品は、１）１００％クレイ製品（Ｂ）、２）有機酸および植物抽出物を配合したクレイ製品（Ｙ）、３）クレイと酵母産物の配合物（Ｃ）であった。以前に試験していない製品は、クレイ、酵母産物、およびグルタミン酸一ナトリウムの配合物（Ｄ）であった。これらの製品は、すべて、食餌の０．２５％および０．５％という２つの濃度で試験した。家禽における壊疽性腸炎の予防に一般的に使用される抗生物質であるヴァージニアマイシン（２２ｐｐｍ）も、比較のための処置として含めた。
【００５１】
クレイ、酵母産物、およびグルタミン酸一ナトリウムの組合せで補充した食餌を給餌し、Ｅ．ｍａｘｉｍａおよびＣ．パーフリンジェンスを同時感染させて壊疽性腸炎が誘発されたニワトリは、体重増加の有意な増進、病変スコアの低下、α−毒素またはＮｅｔＢ毒素に対する血清抗体レベルの向上、および血清α−毒素レベルの低下を示した。これは、製品なしに比べて有意に良好であったばかりでなく、試験した他の製品に比べても、往々にして良好であった。
【００５２】
一般に、食餌の０．２５％でＤを加えると、食餌の０．５％のＤよりも良好な生産力が示されたが、このことから、こうした原材料のバランスをとって、最適な応答を得る必要があることが示唆される。
【００５３】
本発明の、クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートの混合物の、動物飼料または水への混和は、当業者に知られているようにして行ってよい。好ましい実施形態では、本発明の、クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートの混合物は、プレミックスに混和する。プレミックスは、クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートの混合物と、生理学的に許容される担体と、場合により飼料素材とを含むことが好ましい。プレミックスは、一般に、比較的濃縮された形態であり、他の担体、ビタミンおよびミネラル補助剤、飼料素材の１種または複数などの他の材料で希釈されて、最終動物飼料になるように適合させてある。プレミックスは、クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートの混合物を、０．１〜７０質量％、好ましくは０．５〜５０質量％、より好ましくは約０．２５質量％の範囲にある濃度で含むことが好ましい。最適な濃度は、処置が予防的、コントロールのため、治癒的のいずれであるのか、本発明の、クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートの混合物だけが活性であるのか、または併用療法において他の材料と共に使用されるのか、さらにレシピエントの種および齢数または生活段階に応じて決まる。
【００５４】
好ましい実施形態では、クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートの混合物の濃縮された組成物は、徐放形態である。徐放形態は、クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートの混合物と、クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートの混合物の、徐放系からの徐放を実現するためのポリマー材料とを含み、固体飼料材料に加える組成物において特に有用である。徐放製剤の結果として、クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートの混合物の放出を、主に十二指腸で起こるように遅らせることができる。徐放性ポリマーは、組成物が味のせいで拒絶されるのを最小限に抑えることもでき、または肛門坐剤に使用することもできる。
【００５５】
本発明において、用語「徐放系」は、「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」（ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＬｅｅ、１９８７）においての文脈と同じ文脈で使用され、そこで引き合いに出されているのと同じ範囲の例を包含する。当業界で知られている他の多くのｐＨ感受性徐放系（ＲｏｂｉｎｓｏｎおよびＬｅｅ、１９８７）を、アクリル酸のポリマーまたはアクリルアミドとアクリル酸のコポリマーの代わりに用いることができる。たとえば、可溶性でアニオン性、もしくは不溶性架橋型でアニオン性のセルロース系、または一般的ないずれかのアクリル酸ポリマーおよび／もしくはその誘導体から導かれる可溶性でアニオン性、もしくは不溶性架橋型でアニオン性のポリマー。このような架橋型で不溶性のポリマーは、膨張し、代謝される見込みがより低いので、好ましい。
【００５６】
本発明は、本発明の、クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートの混合物と、飼料素材とを含む動物飼料組成物も提供する。クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートの混合物は、総飼料組成物の０．０００１〜２５％、好ましくは総飼料組成物の０．０００１〜５％、より好ましくは総飼料組成物の約０．２５％の量で存在することが好ましい。
【００５７】
別の好ましい実施形態では、本発明の、クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートの混合物は、動物の飲料水に加えられるように製剤してもよい。
【００５８】
本発明の、クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートの混合物は、０．０５〜５０００ｍｇ／体重ｋｇ／日、好ましくは１００〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日の量で与えることが好ましい。
【００５９】
本発明の、クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートの混合物の投与のために組成物中に使用するのに適する不活性担体の例としては、限定はしないが、水、オリーブ油、ラッカセイ油、ゴマ油、ヒマワリ油、ベニバナ油、ラッカセイ油、ヤシ油、流動パラフィン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、グリセロール、脂肪族アルコール、トリグリセリド、ポリビニルアルコール、部分的に水和したポリ酢酸ビニル、およびこれらの混合物が挙げられる。
【００６０】
経口または直腸投与用の固体形態は、薬学的または獣医学的に許容される結合剤、甘味剤、崩壊剤、希釈剤、着香剤、コーティング剤、保存剤、滑沢剤、および／または時間遅延剤（ｔｉｍｅ  ｄｅｌａｙ  ａｇｅｎｔ）を含有してよい。適切な結合剤としては、アカシアゴム、ゼラチン、コーンスターチ、トラガカントゴム、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、またはポリエチレングリコールが挙げられる。適切な甘味剤としては、スクロース、ラクトース、グルコース、またはネオヘスペリジンジヒドロカルコンなどのフラボノイド配糖体が挙げられる。適切な崩壊剤としては、コーンスターチ、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、キサンタンガム、ベントナイト、アルギン酸、または寒天を挙げることができる。適切な希釈剤としては、ラクトース、ソルビトール、マンニトール、デキストロース、カオリン、セルロース、炭酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、またはリン酸二カルシウムが挙げられる。適切な着香剤としては、ハッカ油、冬緑油、チェリー、オレンジ、またはラズベリー着香料が挙げられる。適切なコーティング剤としては、アクリル酸および／もしくはメタクリル酸および／またはそのエステルおよび／またはそのアミドのポリマーまたはコポリマー、ろう、脂肪族アルコール、ゼイン、セラック、またはグルテンが挙げられる。適切な保存剤としては、安息香酸ナトリウム、ビタミンＥ、α−トコフェロール、アスコルビン酸、メチルパラベン、プロピルパラベン、または硫酸水素ナトリウムが挙げられる。適切な滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、またはタルクが挙げられる。適切な時間遅延剤としては、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルが挙げられる。
【００６１】
経口または直腸投与用の懸濁液は、分散剤および／または懸濁化剤をさらに含んでもよい。適切な懸濁化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、アルギン酸ナトリウム、またはセチルアルコールが挙げられる。適切な分散剤としては、レシチン、ポリオキシエチレンエステルまたはステアリン酸などの脂肪酸、ポリオキシエチレンソルビトールモノもしくはジオレエート、ステアレート、またはラウレート、ポリオキシエチレンソルビタンモノもしくはジオレエート、ステアレート、またはラウレートなどが挙げられる。
【００６２】
クレイ、酵母産物、および場合によりグルタメートの混合物の組成物は、１種または複数の乳化剤をさらに含んでもよい。適切な乳化剤としては、上で例示したとおりの分散剤、またはアカシアゴムやトラガカントゴムなどの天然ゴムが挙げられる。
【００６３】
本発明の方法において投与する組成物は、活性成分、ならびに選択された賦形剤、希釈剤、担体、および佐剤の、配合、粉砕、均質化、懸濁化、溶解、乳化、分散、および適切な場合では混合を含めて、（獣医学的および薬学的組成物の業界など）組成物を調製する業界で知られている手段によって調製することができる。
【００６４】
経口投与については、薬学的または獣医学的組成物は、錠剤、口中錠、丸剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、凍結乾燥粉末を含めた粉末、溶液、顆粒、懸濁液、乳濁液、シロップ、およびチンキ剤の形でよい。たとえば、コーティングされた粒子、多層錠、または微粒剤の形の緩効性または遅効性形態も調製することができる。
【００６５】
【表２】
2015532302.tif 000004
【００６６】
本発明およびその利点を詳細に述べてきたが、添付の請求項において定めるとおりの本発明の真意および範囲から逸脱することなく、本発明において種々の変更、代用、および改変を行ってもよいことを理解されたい。
【００６７】
本発明について、以下の実施例においてさらに例示するが、実施例は、例示目的で示すにすぎず、本発明を一切限定するものでない。
【００６８】
［実施例１：クロストリジウム毒素／疾患、基本型製品効力の概要］
クロストリジウム属の２種に対していくつかの毒素吸着剤をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。
【００６９】
α−トキシンを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ吸着アッセイを、微粉砕したクレイの３種のサンプル：カルシウムベントナイト（ＣＢＥＮ）、アタパルジャイト型のフラー土（ＡＦＥ）、および熱処理したフラー土（ＨＴＦ）で行った。α−トキシンは、ストレス状態にある間家禽の腸において、Ｃ．パーフリンジェンスによって産生される結果、壊疽性腸炎を生じる。５つのレベルの毒素（０、５、１０、５０、および１００μｇ／ｍｌ）および３つのレベルの各クレイ（０、０．５％、および１．０％）を、５０μｌのリン酸緩衝液中で一斉に試験し、インキュベートし、遠心分離し、未結合のα−トキシンの結果として生じる卵黄レシチン寒天の加水分解を測定することにより、結合を定量した。すべての製品が多少のレベルで毒素を結合した。表１に、要約した結果を示す。毒素に対する結合剤の比率を下げることで、結果としてクレイの結合効率が分別され、ＣＢＥＮが、他の２種のクレイより高い結合効率を示した（およそ２倍効率がよい）。全体として、α−トキシンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合は、ＣＢＥＮで最良であり、ＡＦＥおよびＨＴＦと続いた。
【００７０】
【表３】
2015532302.tif 000005
【００７１】
いくつかのクレイを、２種のＣ．ディフィシレ毒素ＡおよびＢに対する活性について試験した（ＡＦＥ、酸処理したアタパルジャイト（ＡＴＡ）、ＣＢＥＮ、および熱処理したカルシウムベントナイト（ＨＣＢＮ）。（微細な粉末としての）クレイおよび毒素（精製された毒素を毒素Ａについては１ｍｌあたり２０００細胞毒性単位、毒素Ｂについては１ｍｌあたり１０，０００細胞毒性単位の最終濃度に希釈した）の両方を、異なるいくつかの濃度で加えた。クレイを毒素と共に懸濁液の状態にし、インキュベートした。次いで、固体を遠心分離によって除去した。上清（依然として活性毒素が残ることになる、液状残余物）を細胞培養物（チャイニーズハムスター卵巣細胞）に加え、損傷を記録した。細胞損傷が多いほど、クレイ活性が低いことを意味した。細胞損傷が少ないほど、毒素に対する活性が高いことを意味した。
【００７２】
結果：いずれの製品も（毒素Ａの比率の１０倍で使用した）毒素Ｂを吸着しなかった。表２に、実施例データを示す。ＡＦＥおよびＡＴＡは、多少の毒素Ａを吸着した。以下の表に、結果の一例を示す。１００は、毒素吸着の減が測定されなかったことを意味する。０は、毒素活性がなかったことを意味する。
【００７３】
【表４】
2015532302.tif 000006
【００７４】
２％クレイを使用し、毒素を（細胞毒性単位でなく）質量で定量化した、毒素Ｂだけを使用しての追跡回の試験では、試験したすべての製品が、ある程度活性を伴ったことが示された表３）。この表において、活性の定義は、表２の定義と反対になる。１００は、毒素活性がなかったことを意味する。０は、多くの毒素活性（すなわち、細胞毒性）があったことを意味する。
【００７５】
【表５】
2015532302.tif 000007
【００７６】
ｉｎ  ｖｉｖｏ研究については、有毒ＮＥ域菌株であるＪＧＳ４１４３菌株を負荷に使用した。新たに孵化したＣｏｒｎｉｓｈ  ｘ  Ｒｏｃｋニワトリひなに、１６％のタンパク質を含む抗生物質不使用のニワトリひな幼動物飼料食を７日間給餌した。８日目に、食餌を、６０％の魚粉および４００ｐｐｍの亜鉛を含有する、小麦を主体とした高タンパク質（２８％）飼料に変更した。クレイＨＣＢＥＮ、ＣＢＥＮ、およびＣＢＥＮ＋プロバイオティックを、個々の群の飼料に１％または２％で加えた。負荷の前（１４日目）に、飼料を２０時間撤収した。１５日目から、鳥に、１．２５：１の、飼料：培養物混合物を給餌した（１２時間毎３．５日間）。１８日目および１９日目に、生存している鳥を剖検した。肉眼的病変をカウントし、スコア付けし、二通りの検体を、細菌培養用に新鮮な状態で採取し、病理組織学用に１０％リン酸緩衝ホルマリン固定した。パラフィン包埋組織を切片化し（５μｍ）、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、光学顕微鏡によって調べ、壊死の度合いに基づいて病変スコアを割り当てた。半定量的な細菌学的結果については、剖検したニワトリひなから採取した空腸の分節を、滅菌ホイル上で無菌的に開き、滅菌顕微鏡スライドでこすることにより粘膜を除去した。肉眼的病変を伴う領域からの擦過物を、トリプトース血液寒天上に画線塗抹した。典型的な形態および溶血パターンを有するすべてのコロニーを、単離のために血液寒天上に画線し、Ｃ．パーフリンジェンス（二重溶血環を有するグラム陽性嫌気性桿菌）であることを確認した。Ｃ．パーフリンジェンス濃度の推定を、一連の画線からのコロニーを査定することによって行った（たとえば、ａ４は、画線４上のコロニーを表す）。
【００７７】
結果：プロバイオティックなしの両方のクレイが、病変スコアまたはプレートスコアいずれかの有意な低下を示した。ニワトリは、すべて相当に病んでいたが、使用した過重な接種および飼料のせいではないかと思われた。
【００７８】
【表６】
2015532302.tif 000008
【００７９】
発病の際にコクシジウム類を使用しなかったので（壊疽性腸炎は、コクシジウム感染と関連付けられている）、コクシジウムモデルを使用して研究を実施した。
【００８０】
方法：８羽の鳥で８通りとした１２の処置（ＴＲＴ）を実験で使用して、ニワトリにおいて、異なる製品が腸の健康、成長能力に与える効果、および壊疽性腸炎（ＮＥ）の影響を評価した。６種の製品を、クロストリジウム・パーフリンジェンス負荷で評価し、これらの製品のうち２種は、クロストリジウム・パーフリンジェンス（ＣＰ）負荷なしでも評価した。ニワトリに、０〜２８日齢にかけて処置食餌を給餌し、１４日目には、すべての鳥に、混合コクシジウム接種物（１羽あたり約５０００個のＥ．ｍａｘｉｍａ接合子嚢）での経口コクシジウム負荷を与えた。負荷をかけた鳥には、１９、２０、および２１日目に、ＣＰのブロス培養物（１０８ｃｆｕ／ｍｌ）も与えて、ＮＥを誘発した。
【００８１】
処置を表５に列挙する。
【００８２】
【表７】
2015532302.tif 000009
【００８３】
結果：すべての製品で、測定法に応じて、何らかの形で疾患が減少した。表６に、性能の順位付けによる順序を示す。ヴァージニアマイシン（壊疽性腸炎のコントロールに使用される薬物）が数値的に最良であったものの、クレイ製品は、一般に、それと有意差がなかった。
【００８４】
【表８】
2015532302.tif 000010
【００８５】
測定したパラメータおよび結果の件数が若干込み入っているので、以下の表に、単にそれらを列挙する。
【００８６】
【表９】
2015532302.tif 000011
【００８７】
【表１０】
2015532302.tif 000012
【００８８】
［実施例２：壊疽性腸炎およびアフラトキシンが、若いブロイラーにおける成長能力、病変スコア、および死亡率に及ぼす影響、ならびにそれを緩和する製品の効果］
起こりうる壊疽性腸炎／アフラトキシン相互作用については、ほとんど知られていない。起こりうる相互作用、ならびにいくつかの基本型製品の疾患軽減能を調査する研究を行った。製品記号Ｂ＝ＬＶＭクレイ、Ｙ＝Ｂ＋有機酸＋植物抽出物、Ｃ＝Ｂ＋酵母産物。３種の試験材料によって、疾患が軽減した。
【００８９】
Ｃｏｂｂ  ５００ニワトリひな（２６４０羽、雄）を使用して、疾患負荷の影響、および製品がこうした影響を減少させる効果を明らかにした。１）負荷なし、２）壊疽性腸炎（ＣＰＰ）負荷、および３）ＣＰＰ＋１ｐｐｍアフラトキシンＢ１の３つの負荷レベルを使用した。疾患負荷を軽減するかの試験をした製品は、１）製品なし（ＮＰ）、２）登録商標をもつクレイ系製品（Ｂ）、３）（Ｙ）、４）（Ｃ）、および５）ヴァージニアマイシン（ＶＭ）とした。２４日間の研究において、畜舎あたり２２羽のニワトリひな（７日目に等しく２０羽とした）を、８通り（実験単位＝畜舎）に、１５の処置（３×５要因配置）に割り当てた。有意差は、Ｐ＜．０５に設定した。飼料摂取、増加、および飼料：増加を算出するために、０、１０、および２４日目に体重を量った。鳥は、飼料および水を自由に消費した。この研究において、負荷レベルが、負荷なしから、ＣＰＰ負荷、ＣＰＰ＋ＡＦＬ負荷へと進むにつれて、ＦＩ（０〜１０日目）、増加（１０〜２４日目、０〜２４日目）、およびＦ：Ｇ（１０〜２４日目）がますます不良になったとおり、ＮＥとＡＦＬの組合せに対する不利な応答の増加が認められた（Ｐ＜．０５）。他の成長応答は、ＣＰＰ＋ＡＦＬ両方を適用したとき、非負荷またはＣＰＰ負荷より悪くなった（Ｐ＜．０５）。病変スコアは、ＡＦＬありまたはなしでＣＰＰ負荷された鳥においてより高かった（Ｐ＜．０５）。ＶＭを与えることで、負荷されていない鳥において生産力が向上した（Ｐ＜．０５）。ＣＰＰ負荷された鳥では、ＢまたはＹを加えることで、ＮＰに比べて、ＦＩおよび増加が向上し、Ｙは、負荷期間の間、ＶＭを与えたものと同等であった（Ｐ＜．０５）。Ｂを与えた鳥は、ＣＰＰおよびＡＦＬの両方で負荷したとき、増加および飼料要求量が最高であり、Ｙ、Ｃ、およびＶＭの給餌は、ＮＰを加えるより増加が大きかった（Ｐ＜．０５）。結論として、負荷レベルを上げることで、鳥の生産力は低下した。壊疽性腸炎を有し、Ｙを給餌された鳥は、増加が、負荷期間中ＶＭを与えたものと同等であった。クレイ系製品を給餌することで、ＣＰＰ＋ＡＦＬ負荷の間の生産力が向上した。
【００９０】
【表１１】
2015532302.tif 000013
【００９１】
【表１２】
2015532302.tif 000014
【００９２】
［実施例３：壊疽性腸炎およびアフラトキシンが、若いブロイラーにおける成長能力、病変スコア、および死亡率に及ぼす影響、ならびにそれを軽減する製品の効果］
Ｃｏｂｂ  ５００ニワトリひな（２６４０羽、雄）を使用して、疾患負荷の影響、および製品がこうした影響を減少させる効果を明らかにした。１）負荷なし、２）壊疽性腸炎（ＣＰＰ）負荷、および３）ＣＰＰ＋１ｐｐｍアフラトキシンＢ１の３つの負荷レベルを使用した。疾患負荷を軽減するか試験した製品は、１）製品なし（ＮＰ）、２）登録商標をもつクレイ系製品（Ｂ）、３）第２の登録商標をもつクレイ系製品（Ｙ）、４）第３の登録商標をもつクレイ系製品（Ｃ）、および５）ヴァージニアマイシン（ＶＭ）とした。２４日間の研究において、畜舎あたり２２羽のニワトリひな（７日目に等しく２０羽とした）を、８通り（実験単位＝畜舎）に、１５の処置（３×５要因配置）に割り当てた。有意差は、Ｐ＜．０５に設定した。飼料摂取、増加、および飼料：増加を算出するために、０、１０、および２４日目に体重を量った。鳥は、飼料および水を自由に摂取した。この研究において、負荷レベルが、負荷なしから、ＣＰＰ負荷、ＣＰＰ＋ＡＦＬ負荷へと進むにつれて、ＦＩ（０〜１０日目）、増加（１０〜２４日目、０〜２４日目）、およびＦ：Ｇ（１０〜２４日目）がますます不良になったとおり、ＮＥとＡＦＬの組合せに対する不利な応答の増加が認められた（Ｐ＜．０５）。他の成長応答は、ＣＰＰ＋ＡＦＬ両方を適用したとき、非負荷またはＣＰＰ負荷より悪くなった（Ｐ＜．０５）。病変スコアは、ＡＦＬありまたはなしでＣＰＰ負荷された鳥においてより高かった（Ｐ＜．０５）。ＶＭを与えることで、負荷されていない鳥において生産力が向上した（Ｐ＜．０５）。ＣＰＰ負荷された鳥では、ＢまたはＹを加えることで、ＮＰに比べて、ＦＩおよび増加が向上し、Ｙは、負荷期間の間、ＶＭを与えたものと同等であった（Ｐ＜．０５）。Ｂを与えた鳥は、ＣＰＰおよびＡＦＬで負荷したとき、増加および飼料要求量が最高であり、Ｙ、ＣＬ３、およびＶＭの給餌は、ＮＰを加えるより増加が大きかった（Ｐ＜．０５）。結論として、負荷レベルを上げることで、鳥の生産力は低下した。壊疽性腸炎を有し、Ｙを給餌された鳥は、増加が、負荷期間中ＶＭを与えたものと同等であった。クレイ系製品を給餌することで、ＣＰＰ＋ＡＦＬ負荷の間の生産力が向上した。
【００９３】
［実施例４：壊疽性腸炎、アフラトキシン、およびヴァージニアマイシンが、若いブロイラーにおける成長能力、病変スコア、および死亡率に及ぼす影響］
合計２１１２羽の雄Ｃｏｂｂ  ５００ニワトリひなを使用して、漸増するアフラトキシン濃度（ＡＦＬ；０、０．７５、１．５ｐｐｍ）が、壊疽性腸炎またはヴァージニアマイシン（ＶＭ）ありまたはなしのブロイラーに及ぼす影響を明らかにした。２３日間の研究において、畜舎あたり２２羽のニワトリひな（７日目に等しく２０羽とした）を、完全乱塊法において８通りに１２の処置（３×２×２要因配置）に割り当て、畜舎を実験単位とした。有意差は、Ｐ＜．０５に設定した。飼料摂取、増加、および飼料：増加を算出するために、０、１６、および２３日目に体重を量った。鳥は、飼料および水を自由に摂取した。アフラトキシンによって、増加および飼料摂取が減少し、飼料：増加、死亡率、および病変スコアはより不良になった（Ｐ＜．０５）。クロストリジウム・パーフリンジェンスで汚染された敷料および１０日目に投与する１０倍用量のコクシジウム症ワクチンを使用して壊疽性腸炎（ＣＰＰ）を誘発することで、病変スコアが増大し、飼料摂取および増加が低減した（Ｐ＜．０５）。食餌にＶＭを加えることで、増加、飼料摂取、および飼料要求量が改善され、死亡率が低下した（Ｐ＜．０５）。しかし、第２期間において鳥にＣＰＰで負荷をかけ、０．７５ｐｐｍのＡＦＬを与えると、増加に不利な相乗効果がもたらされ、鳥に１．５ｐｐｍのＡＦＬを与えたときには、相加効果さえ認められなかった一方で、相互作用が存在した。１．５ｐｐｍのＡＦＬでは、ＣＰＰを負荷されず、ＶＭを与えられた鳥は、ＶＭを与えられない鳥より大きい増加を示し、ＶＭありまたはなしの負荷された鳥の増加と同等であった。０．７５ｐｐｍでは、ＶＭによって、ＣＰＰ負荷された鳥が全般に助けられたが、同様の相互作用（Ｐ＜．０５）が給餌期間全体で認められた。ヴァージニアマイシンによって、飼料要求量は改善され、１．５ｐｐｍで最も大きく改善された。アフラトキシンによって、負荷されない鳥では病変スコアが増大するが、負荷された鳥では増大しなかった。ＶＭによって、負荷された鳥では病変スコアが増大するが、負荷されない鳥では増大しなかった（Ｐ＜．０５）。アフラトキシンおよび壊疽性腸炎は、ブロイラー生産力を低下させ、相互に作用して、体重増加を低減し、ＶＭは、０．７５ｐｐｍのＡＦＬでは、負荷された鳥において増加の向上を助けたが、１．５ｐｐｍのＡＦＬではそうでなかった。
【００９４】
［実施例５：ブロイラー鳥における壊疽性腸炎の影響に対するＡｍｌａｎ製品の効果］
この実施例の目的は、壊疽性腸炎（ＮＥ）疾患モデルにおいて、Ａｍｌａｎ製品が、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａとクロストリジウム・パーフリンジェンスに同時感染したブロイラー鶏のＮＥ臨床徴候、免疫病理学、およびサイトカイン応答に与える効果を評価することである。この実験に使用したＮＥ疾患モデル（Ｐａｒｋ  ＳＳ、Ｌｉｌｌｅｈｏｊ  ＨＳら、Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｂｒｏｉｌｅｒ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ  ｃｏｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ  ａｎｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ．  Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２００８、５２：１４〜２２；Ｊａｎｇ  ＳＩ、Ｌｉｌｌｅｈｏｊ  ＨＳら、Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＭｏｎｔａｎｉｄｅＴＭ  ＩＳＡ  ７１  ＶＧ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｂｒｏｉｌｅｒ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１２、３０：５４０１〜５４０６）。
【００９５】
材料および方法。Ａｍｌａｎ製品は、１００％クレイ製品（Ｂ）、有機酸および植物抽出物を配合したクレイ製品（Ｙ）、クレイと酵母産物の配合物（Ｃ）、クレイ、酵母産物、およびグルタミン酸一ナトリウムの配合物（Ｄ）、および抗生物質ヴァージニアマイシン（ＶＭ）とした。ニワトリは、Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒｓ孵化場（ペンシルヴェニア州Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｔｏｗｎ）で孵化され、郵便車で輸送され、育雛ユニットに収容された、１日齢のブロイラー鳥（Ｒｏｓｓ／Ｒｏｓｓ）とした。鳥は、育雛畜舎において無Ｅｉｍｅｒｉａ設備で飼養し、離れた場所にある大型の吊り下げ式ケージに移し、そこで感染させ、生存負荷感染研究（ｌｉｖｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ）の実験期間の終わりまで飼養した。輸送、体重測定、感染、ならびに血液および脾臓の採取に関するすべての手順は、動物実験についての確立された指針に従った。
【００９６】
すべての鳥に、１〜１８日齢にかけて、粗タンパク質１７％の市販の非薬剤添加基礎飼料を給餌した。飼料は、それぞれ、製品Ｂ、Ｙ、Ｃ、Ｄ、およびＶＭと混合した。１８日齢の時点で、飼料を、粗タンパク質２４％幼動物飼料を含有する市販の非薬剤添加飼料に差し替えた。
【００９７】
アイメリア属の種の菌株を、確立された手順に従って維持し、増殖させた。Ｅ．ｍａｘｉｍａ（４１Ａ）を５％次亜塩素酸ナトリウムに浮かせて浄化し、ＰＢＳで３回洗浄し、血球計数器を使用して、生存能をトリパンブルーによって数え上げた。接合子嚢数は、胞子形成接合子嚢だけに基づく。１４日目に、接種針を使用して、ニワトリに、１０，０００個のＥ．ｍａｘｉｍａを食道接種した。
【００９８】
Ｅｉｍｅｒｉａ感染から４日後、ＮＥ群の鳥に、接種針を使用して、それぞれ１×１０９ＣＦＵのクロストリジウム・パーフリンジェンスを食道接種した。
【００９９】
Ｅ．ｍａｘｉｍａ（ＥＭ）での負荷の直前、Ｃ．パーフリンジェンス負荷後０日および２日目に、鳥を秤量して、体重増加を算出した。
【０１００】
病変スコアを求めるために、鳥（５羽／群）を、Ｃ．パーフリンジェンス（ＣＰ）感染後２日の時点で屠殺した。憩室の前後１０ｃｍにわたるおよそ２０ｃｍの腸の分節を取得し、縦方向に切断した。病変スコアは、３人の独立した観察者が、病変の重症度の低い順に０〜４で評価した。
【０１０１】
ＣＰ感染後０、２、７、および１４日のそれぞれにおいて、合計１２羽（５／群）から、抗体力価用の血清をサンプル採取した（個々に集める）。血清については、血液サンプルを個々の鳥から取得し（３ｍｌ／鳥）、４℃で終夜凝固させ、血清を集めた。
【０１０２】
血清サンプルを、確立されたＥＬＩＳＡを使用して、クロストリジウムに対する抗体について試験した。簡潔に述べると、マイクロタイタープレートを、２００ｎｇ／ウェルの組換えクロストリジウム抗原で終夜コートし、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡでブロックした。血清希釈物を加え、絶えず穏やかに振盪しながらインキュベートし、洗浄し、結合したＡｂを、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ニワトリＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）およびペルオキシダーゼ特異的基質で検出した。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州リッチモンド）を使用して、４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を求めた。
【０１０３】
血清サンプルを、確立されたＥＬＩＳＡを使用して、α−毒素またはＮｅｔＢに対する抗原について試験した。簡潔に述べると、マイクロタイタープレートを、０．５μｇ／ウェルの、α−毒素またはＮｅｔＢ毒素に対するｍＡｂで終夜コートし、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡでブロックした。ニワトリ血清希釈物を加え、絶えず穏やかに振盪しながらインキュベートし、洗浄し、結合したＡｂを、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗α−毒素またはＮｅｔＢ毒素およびペルオキシダーゼ特異的基質で検出した。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州リッチモンド）を使用して、４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を求めた。
【０１０４】
統計的分析については、すべての値を平均±ＳＥＭとして示す。体重増加および病変スコアの平均値は、ＳＰＳＳ  １５．０  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、イリノイ州シカゴ）を使用して、ＡＮＯＶＡに従うＤｕｎｃａｎの多重範囲検定によってグループ間で比較した。平均値の差は、ｐ＜０．０５で有意であるとみなした。
【０１０５】
【表１３】
2015532302.tif 000015
【０１０６】
２２０羽のブロイラー鳥（２０／群）を使用し、１単位あたり２つの育雛Ｐｅｔｅｒｓｉｍｅを用いて育雛畜舎に収容した。仕上げ単位は、吊り下げ式８０ケージユニットとし、そこに１８日齢の時点で鳥を移した。
【０１０７】
ニワトリは、０日目に到着し、同じ日にＰｅｔｅｒｓｉｍｅユニットに移した。１８日目に、ニワトリを大きいケージに移した。鳥は、１４日目に、Ｅ．ｍａｘｉｍａの胞子形成接合子嚢１０，０００個で感染させ、１８日目に、１×１０９ＣＦＵのＣ．パーフリンジェンスで感染させた。１４、１８、２０、２５、および３２日目に血液を採取した。２０日目に病変をスコア付けした。１４、２０、および２５日目に体重を求めた（たとえば、図１を参照のこと）。
【０１０８】
図２に示すとおり、０．２５％のＤおよび０．５％のＤで補充した食餌を給餌し、Ｅ．ｍａｘｉｍａとＣ．パーフリンジェンスで同時感染させたニワトリは、補充なしの食餌を与えられた感染動物に比べて、体重の増加を示した。
【０１０９】
図３に示すとおり、０．２５％のＤで補充した食餌を給餌し、Ｅ．ｍａｘｉｍａとＣ．パーフリンジェンスで同時感染させた鶏は、補充なしの食餌を与えられた感染動物（対照ＮＥ群）に比べて、体重の増加を示した。
【０１１０】
図４に示すとおり、Ｄ（０．２５％）、Ｄ（０．５％）、およびＹ（０．５％）を給餌した鳥の群は、対照ＮＥ群に比べて、病変スコアの有意な低下を示した。
【０１１１】
図５Ａに示すとおり、α−毒素に対する血清抗体レベル（Ｃ．パーフリンジェンス感染後７日）は、Ｄ（０．２５％）群では、感染ＮＥ対照群に比べて、有意に高かった。しかし、他の食餌群と感染ＮＥ対照群との間に抗体レベルの有意差はなかった。
【０１１２】
図５Ｂに示すとおり、Ｄ（０．２５％）およびＤ（０．５％）で補充した食餌を給餌した鳥では、α−毒素に対する血清抗体応答（Ｃ．パーフリンジェンス感染後１４日）が、ＮＥ対照群に比べて、顕著な増加を示した。
【０１１３】
図６Ａに示すとおり、Ｄ（０．２５％）を給餌した鳥では、ＮｅｔＢ毒素に対する血清抗体（Ｃ．パーフリンジェンス感染後７日）が、ＮＥ対照群に比べて増加を示した。
【０１１４】
図６Ｂに示すとおり、Ｄ（０．２５％）を給餌した鳥では、ＮｅｔＢ毒素に対する血清抗体レベル（Ｃ．パーフリンジェンス感染後１４日）が、ＮＥ対照群に比べて、顕著な増加を示した。
【０１１５】
図７Ａに示すとおり、血清α−毒素レベルは、Ｄ（０．２５％）およびＢ（０．５％）の感染群において、補充なしの感染ＮＥ対照に比べて、有意に低かった。
【０１１６】
図７Ｂに示すとおり、血清ＮｅｔＢ毒素レベルは、Ｄ（０．２５％、０．５％）およびＢ（０．２５％、０．５％）の感染群において、補充なしの感染ＮＥ対照に比べて低かった。しかし、群の間に有意差はない。
【０１１７】
この実施例を要約するために、ニワトリに、通常食餌またはＡｍｌａｎ製品（Ｃ、Ｙ、Ｂ、Ｄ、および抗生物質ＶＭと比較）で補充した食餌を、孵化以来給餌し、ＮＥに対する免疫を実験群とＮＥ対照群間で比較した。Ｄで補充した食餌を給餌し、Ｅ．ｍａｘｉｍａとＣ．パーフリンジェンスで同時感染させたニワトリは、体重増加の有意な増大、病変スコアの低下、α−毒素またはＮｅｔＢ毒素に対する血清抗体レベルの向上、および血清α−毒素レベルの低下を示した。
【０１１８】
［実施例６：ブロイラー鶏においてクロストリジウム・パーフリンジェンスが原因となる壊疽性腸炎をコントロールするための飼料にして投与した、製品のヴァージニアマイシンとの比較上の効果］
【０１１９】
【表１４】
2015532302.tif 000016
【０１２０】
【表１５】
2015532302.tif 000017
【０１２１】
研究継続期間は、２８日とし、ターゲット動物は、ブロイラー鶏とした。
【０１２２】
【表１６】
2015532302.tif 000018
【０１２３】
材料および方法：
実験飼料：市販のタイプの非薬剤添加ニワトリ幼動物飼料に、米国で一般的に使用される飼料素材を混ぜ合わせたものを、調合した。この（粉餌形態の）飼料は、ニワトリひなの到着日から試験２８日目まで自由に給餌された。この食餌配合比を原始データに含めた。実験処置飼料は、この基礎幼動物飼料から調製した。処置バッチの調製に使用したすべての基礎飼料および試験品の量を記録に残した。処置飼料を混合して、それぞれの試験品が確実に均等に分布するようにした。飼料を、同じ処置のケージに分配した。
【０１２４】
処置食餌のバッチの序盤、中盤、および終盤からそれぞれ１回の３つのサンプルを集め、混合して、混成サンプルとした。各処置の混成品から、１つの混成サンプルを採取した。
【０１２５】
動物：１日齢の雄ブロイラーひな鶏を、Ｃｏｂｂ−Ｖａｎｔｒｅｓｓ孵化場、ジョージア州Ｃｌｅｖｅｌａｎｄから購入した。系統は、Ｃｏｂｂ  Ｘ  Ｃｏｂｂであった。繁殖鶏集団の情報を記録した。孵化場において、鳥は、性別を鑑別され、型通りのワクチン接種を受けた。健康に見えるひな鶏だけを研究に使用した。割当てに使用しないすべての鳥の数および処分を記録に残した。
【０１２６】
収容：到着後、ひな鶏は、Ｐｅｔｅｒｓｉｍｅバタリーケージで飼育した。配置時に、鳥に、処置飼料を給餌した。動物あたりの床面積は、０．６３平方フィート／鳥とした。１羽あたりの給餌器スペースは、８羽／４３ｃｍ×６．８ｃｍ給餌器とした。サーモスタット制御されたガス炉／エアコンによって、均等な温度を維持した。一様な照明を用意した。ケージの線図を記録に残した。
【０１２７】
鳥の割当ておよびケージの無作為化：バタリー中の位置によってケージをブロック分けし、ブロックサイズは処置と同等にした（ブロックあたり７ケージ）。研究は、鳥が配置されたとき（孵化日）（試験０日目）に始まり、その時点で、鳥は、実験ケージに割り当てられた。健康な鳥だけを選択した。試験０日目に、ケージ単位で群体重を記録した。研究の過程で、入れ替えられた鳥はいなかった。
【０１２８】
疾患の誘発：飼料および水は、試験の間、自由に利用可能であった。試験１４日目に、すべての鳥に、１羽あたりおよそ５，０００個のＥ．ｍａｘｉｍａ接合子嚢を含有するコクシジウム接種物を経口的に接種した。コクシジウム接合子嚢接種手順は、ＳＰＲ  ＳＯＰに記載されている。試験１９日目から、処置１を除くすべての鳥に、Ｃ．パーフリンジェンス１０８ｃｆｕ／ｍｌのブロス培養物を与えた。鳥には、新鮮なブロス培養物を１日１回３日間（試験１９、２０、および２１日目）投与した。
【０１２９】
試験０、１４、２１、および２８日目の体重：試験０、１４、２１、および２８日目に、すべての鳥を、ケージ単位で秤量した。試験０日目に飼料を秤量し、試験１４、２１、および２８日目に、残存する飼料を秤量した。試験は、試験２８日目に終了した。
【０１３０】
壊疽性腸炎腸病変スコア付け：試験２１日目に、各ケージから３羽を選択し、屠殺し、秤量し、壊疽性腸炎病変が存在する度合いについて調べた。スコア付けは、０を正常とし、３を最も重篤とする、０〜３のスコアに基づくものであった。
【０１３１】
管理：設備は、綿密に点検して、すべてのケージが水を備えていたこと、およびどのケージにおいてもみな飼料が入手可能であったことを確実なものとした。建物の温度範囲は、鳥の齢数に適した温度に維持した。壁に沿って垂直に吊り下げられた蛍光ランプによって、一様な絶え間のない照明を提供した。飼料および水は、自由に与えた。
【０１３２】
標準作業手順（ＳＯＰ）に従って、ケージは１日２回点検した。観察記録には、飼料および水の利用可能度、温度制御、ならびに何かしらの変わった状況を含めた。異常な反応がないか、鳥をしっかりと注視した。
【０１３３】
死亡したときは、鳥をケージから取り出し、ケージ番号、日付、鳥の体重、性別、および考えられる死因を記録した。
【０１３４】
データ分析：ケージ重量増加、飼料摂取、飼料要求量、病変スコア、および死亡率の平均値を算出した。
【０１３５】
図８Ａに、０〜２１日目の飼料要求量を示す。一般に、異なる処置を与えた鳥の飼料要求量は、０〜２１日目にかけて、ＮＥ（負荷をかけて壊疽性腸炎を誘発されたが製品を与えられない鳥）とＶＭ（負荷をかけて壊疽性腸炎を誘発され、ヴァージニアマイシンを与えられた鳥）処置の中間であった。しかし、Ｄ８Ｘ製品を与えられた鳥は、このパターンに従わず、飼料要求量は、この期間、統計的および数値的に、製品なしのＮＥ処置の飼料要求量と同程度に不良であった。
【０１３６】
図８Ｂに、１４〜２１日目の飼料要求量を示す。負荷をかけ、ＤＸ処置を与えた鳥の飼料要求量は、１４〜２１日目にかけて、（負荷をかけたが製品を与えられない）ＮＥ処置の鳥より有意に良好であり、ＶＭを加えた食餌と統計的に同等であった。
【０１３７】
図８Ｃに、０〜２８日目の飼料要求量を示す。Ｄ８Ｘを除くすべての製品が、製品なしのＮＥより有意に良好であった。ＤおよびＤＸ製品は、ＶＭ処置の鳥と同様に、試験した製品の中で最良であり、ＮＥ負荷を与えなかった鳥と統計的に差がなかった。
【０１３８】
図９Ａに、０〜２８日目の体重増加を示す。増加は、ＶＭによって、どの製品もなしのＮＥ対照に比べて向上した。Ｄ８は、ＶＭと比べたとき、統計的に同等であり、数値的により良好であった。他のすべての製品は、製品なしのＮＥとＶＭの中間であった。
【０１３９】
図９Ｂに、１４〜２８日目の体重増加を示す。１４〜２８日目について、増加は、Ｄ８がＶＭと数値的に同等であったことを除き、０〜２８日目が従ったのと同様のパターンに従った。
【０１４０】
図１０に、病変スコアを示す。Ｄ８およびＤ８Ｘを給餌した鳥の病変スコアは、ＶＭを給餌した鳥より低く、ＮＥ負荷のない鳥と統計的に差がなかったとしてもよい。
【０１４１】
図１１に、ＮＥ死亡率を示す。Ｄを除くすべての製品で、製品なしでＮＥ負荷された鳥に比べて死亡率が低下し、ＶＭを給餌した鳥と統計的に同等であった。
【０１４２】
［実施例７：ブロイラー鳥における壊疽性腸炎の影響に対する製品の効果］
この実施例の目的は、壊疽性腸炎（ＮＥ）疾患モデルにおいて、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａとクロストリジウム・パーフリンジェンスで同時感染させたブロイラー鶏における壊疽性腸炎（ＮＥ）臨床徴候、免疫病理学、およびサイトカイン応答について、異なる処方および投与量の、以前に発見された製品を評価することであった。この実験に使用したＮＥ疾患モデル（Ｐａｒｋ  ＳＳ、Ｌｉｌｌｅｈｏｊ  ＨＳら、Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｂｒｏｉｌｅｒ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ  ｃｏｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ  ａｎｄ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ．  Ａｖｉａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ２００８、５２：１４〜２２；Ｊａｎｇ  ＳＩ、Ｌｉｌｌｅｈｏｊ  ＨＳら、Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＭｏｎｔａｎｉｄｅＴＭ  ＩＳＡ  ７１  ＶＧ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｎｅｃｒｏｔｉｃ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｓ  ｉｎ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｂｒｏｉｌｅｒ  ｃｈｉｃｋｅｎｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１２、３０：５４０１〜５４０６）。
【０１４３】
材料および方法。製品は、以前に有効であることが判明した処方での、クレイ、酵母産物、およびグルタミン酸一ナトリウムの配合物（Ｄ）とし、目下の実験において、これを異なる４つの混入率（０．３５、０．２５、０．１５、および０．０５％）で含め、また、以前の製品と同じ原材料を含有するが、製品の処方における原材料の配合比を異なる４通りとした製品（ＤＳ、ＤＳＦ、Ｄ８、およびＤ８Ｆ５と示す）も含めた。抗生物質ヴァージニアマイシン（ＶＭ）も、処置として含めた。ニワトリは、Ｌｏｎｇｅｎｅｃｋｅｒｓ孵化場（ペンシルヴェニア州Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｔｏｗｎ）で孵化され、郵便車で輸送され、育雛ユニットに収容された、１日齢のブロイラー鳥（Ｒｏｓｓ／Ｒｏｓｓ）とした。鳥は、育雛畜舎において無Ｅｉｍｅｒｉａ設備で飼養し、離れた場所にある大型の吊り下げ式ケージに移し、そこで感染させ、生存負荷感染研究の実験期間の終わりまで飼養した。輸送、体重測定、感染、ならびに血液および脾臓の採取に関するすべての手順は、動物実験についての確立された指針に従った。
【０１４４】
すべての鳥に、１〜１８日齢にかけて、粗タンパク質１７％の市販の非薬剤添加基礎飼料を給餌した。飼料は、異なる混入率（飼料の０．３５、０．２５、０．１５、および０．０５％）のＤ、または食餌の０．２５％で含められ異なる配合比の製品（ＤＳ、ＤＳＦ、Ｄ８、Ｄ８Ｆ）と混合した。抗生物質ＶＭ（２２ｐｐｍ）も、処置として含めた。１８日の時点で、飼料を、１７％ＣＰ飼料のように処置製品を加えた、粗タンパク質２４％幼動物飼料を含有する市販の非薬剤添加飼料に差し替えた。
【０１４５】
アイメリア属の種の菌株を、確立された手順に従って維持し、増殖させた。Ｅ．ｍａｘｉｍａ（４１Ａ）を５％次亜塩素酸ナトリウムに浮かせて浄化し、ＰＢＳで３回洗浄し、血球計数器を使用して、生存能をトリパンブルーによって数え上げた。接合子嚢数は、胞子形成接合子嚢だけに基づく。１４日目に、接種針を使用して、ニワトリに、１０，０００個のＥ．ｍａｘｉｍａを食道接種した。
【０１４６】
Ｅｉｍｅｒｉａ感染から４日後、ＮＥ群の鳥に、接種針を使用して、それぞれ１×１０９ＣＦＵのクロストリジウム・パーフリンジェンスを食道接種した。
【０１４７】
Ｅ．ｍａｘｉｍａ（ＥＭ）での負荷の直前、Ｃ．パーフリンジェンス負荷後０日および２日目に、鳥を秤量して、体重増加を算出した。
【０１４８】
病変スコアを求めるために、鳥（５羽／群）を、Ｃ．パーフリンジェンス（ＣＰ）感染後２日の時点で屠殺した。憩室の前後１０ｃｍにわたるおよそ２０ｃｍの腸の分節を取得し、縦方向に切断した。病変スコアは、３人の独立した観察者が、病変の重症度の低い順に０〜４で評価した。
【０１４９】
ＣＰ感染後０、２、７、および１４日のそれぞれにおいて、合計１２羽（５／群）から、抗体力価用の血清をサンプル採取した（個々に集める）。血清については、血液サンプルを個々の鳥から取得し（３ｍｌ／鳥）、４℃で終夜凝固させ、血清を集めた。
【０１５０】
血清サンプルを、確立されたＥＬＩＳＡを使用して、クロストリジウムに対する抗体について試験した。簡潔に述べると、マイクロタイタープレートを、２００ｎｇ／ウェルの組換えクロストリジウム抗原で終夜コートし、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡでブロックした。血清希釈物を加え、絶えず穏やかに振盪しながらインキュベートし、洗浄し、結合したＡｂを、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗ニワトリＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）およびペルオキシダーゼ特異的基質で検出した。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州リッチモンド）を使用して、４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を求めた。
【０１５１】
血清サンプルを、確立されたＥＬＩＳＡを使用して、α−毒素またはＮｅｔＢに対する抗原について試験した。簡潔に述べると、マイクロタイタープレートを、０．５μｇ／ウェルの、α−毒素またはＮｅｔＢ毒素に対するｍＡｂで終夜コートし、ＰＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡでブロックした。ニワトリ血清希釈物を加え、絶えず穏やかに振盪しながらインキュベートし、洗浄し、結合したＡｂを、ペルオキシダーゼ結合ウサギ抗α−毒素またはＮｅｔＢ毒素およびペルオキシダーゼ特異的基質で検出した。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州リッチモンド）を使用して、４５０ｎｍで光学密度（ＯＤ）を求めた。
【０１５２】
統計的分析については、すべての値を平均±ＳＥＭとして示す。体重増加および病変スコアの平均値は、ＳＰＳＳ  １５．０  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、イリノイ州シカゴ）を使用して、ＡＮＯＶＡに従うＤｕｎｃａｎの多重範囲検定によってグループ間で比較した。平均値の差は、ｐ＜０．０５で有意であるとみなした。
【０１５３】
【表１７】
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【０１５４】
２２０羽のブロイラー鳥（２０／群）を使用し、Ｐｅｔｅｒｓｉｍｅ育雛畜舎に収容した。仕上げ単位は、吊り下げ式８０ケージユニットとし、そこに１８日齢の時点で鳥を移した。
【０１５５】
ニワトリは、０日目に到着し、同じ日にＰｅｔｅｒｓｉｍｅユニットに移した。１８日目に、ニワトリを大きいケージに移した。鳥は、１４日目に、Ｅ．ｍａｘｉｍａの胞子形成接合子嚢１０，０００個で感染させ、１８日目に、１×１０９ＣＦＵのＣ．パーフリンジェンスで感染させた。１４、１８、２０、２５、および３２日目に血液を採取した。２０日目に病変をスコア付けした。１４、２０、および２５日目に体重を求めた（たとえば、図１を参照のこと）。
【０１５６】
図１２Ａ〜Ｂに示すとおり、０．２５％の製品Ｄまたは０．２５％のＤ８を含有する食餌を給餌されたニワトリは、Ｅｉｍｅｒｉａ負荷の日からＣＰ感染後２日にかけて、補充なしの食餌を与えられた感染した鳥（ＮＥ対照群）に比べて、それぞれ２５．４％または２９．３％の体重増加の増大を示した。
【０１５７】
図１３Ａ〜Ｂに示すとおり、０．２５％のＤ８またはＤ８Ｆで補充した食餌を給餌されたニワトリは、補充なしの食餌を与えられた感染した鳥（ＮＥ対照群）に比べて、それぞれ２０．１８％および１８．２９％の体重増加の増大を示した。
【０１５８】
図１４に示すとおり、０．２５、０．１５、もしくは０．０５％の混入レベルでＤを給餌された鳥、またはＤＳＦ、Ｄ８、およびＤ８Ｆ群は、補充なしの食餌を与えられた感染した鳥に比べて、病変スコアの有意な低下を示した。
【０１５９】
図１５Ａに示すとおり、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日目において、α−毒素に対する血清抗体レベルは、０．０５もしくは０．２５％の混入率でＤ、または０．２５％の混入率でＤＳＦ、Ｄ８、もしくはＤ８Ｆを給餌した鳥、またはＶＭ群では、補充なしの食餌を与えられた感染した鳥（ＮＥ対照群）に比べて、有意に高かった。
【０１６０】
図１５Ｂに示すとおり、Ｃ．パーフリンジェンス感染後７日目において、０．２５もしくは０．０５％の混入率のＤ処方、または０．２５％の混入率のＤ８もしくはＤ８Ｆ、またはＶＭで補充した食餌を給餌された鳥では、光学密度によって、ＮＥ対照群に比べて、α−毒素に対する抗体の顕著な増加が示された。
【０１６１】
図１６Ａに示すとおり、ＮｅｔＢ毒素抗原に対する血清抗体レベルは、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点で、０．０５もしくは０．２５％の混入率で製品Ｄを、または０．２５％の混入率でＤ８もしくはＤ８Ｆを、またはＶＭを給餌された鳥において、光学密度によって、ＮＥ対照群に比べて増加が示されたとおり、有意に高かった。
【０１６２】
図１６Ｂに示すとおり、０．０５および０．２５％の混入率のＤ処方、またはＤＳ、ＤＳＦ、Ｄ８、およびＶＭを給餌された鳥は、Ｃ．パーフリンジェンス感染後７日目に、すべてが、ＮｅｔＢ毒素抗原に対する血清抗体応答の増大を示した。
【０１６３】
図１７Ａに示すとおり、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日目の血清α−毒素レベルは、Ｄ（０．２５％）を給餌された感染した鳥において、補充なしのＮＥ感染対照に比べて、有意に低かった。血清α毒素のレベルは、クロストリジウム感染の重症度を示す。この結果は、製品によって直接または間接的作用によりＣ．パーフリンジェンスα毒素レベルが低下したことを示唆しているといえる。
【０１６４】
図１７Ｂに示すとおり、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日目の血清ＮｅｔＢ毒素レベルは、Ｄ（０．２５％）およびＤ８（０．２５％）を給餌されたＮＥ感染鳥において、補充なしの感染ＮＥ対照に比べて、（統計的に有意ではないものの）実質的に低かった。ＮｅｔＢ毒素のレベルは、クロストリジウム感染の重症度を示す。この結果は、製品によって直接または間接的作用によりＣ．パーフリンジェンスＮｅｔＢ毒素レベルが低下したことを示唆しているといえる。
【０１６５】
図１８Ａ〜Ｂに示すとおり、上皮内リンパ球ＩＬ８発現は、全製品Ｄ、ＤＳ、ＤＳＦ、Ｄ８、またはＶＭで補充された群において、ＮＥ対照の鳥に比べて減少した。上皮内リンパ球（ＬＩＴＡＦ）発現は、０．３５、０．２５、もしくは０．１５％の混入レベルの製品Ｄ、または製品ＤＳＦ、Ｄ８、Ｄ８Ｆ、または抗生物質ＶＭで補充された群において減少した。食餌の０．２５％のＤＳを加えることで、ＬＩＴＡＦレベルの低下が示された。
【０１６６】
図１８Ｃ〜Ｄに示すとおり、ＩＬ−６およびｉＮＯＳ発現は、全製品Ｄ、ＤＳ、ＤＳＦ、Ｄ８、または抗生物質ＶＭで補充された群において、ＮＥ対照の鳥に比べて、一般に減少した。一般に、これらの結果は、若いブロイラー鶏にこうした製品を給餌することの有益な効果を示している。
【０１６７】
図１９Ａ〜Ｃに示すとおり、脾臓において、ＩＬ８発現は、Ｄ８Ｆを補充した群で増加した。ＬＩＴＡＦ発現は、Ａｍｌａｎ製品Ｄ８（０．２５％）およびＤ８Ｆで補充された群では減少したが、しかし、ＤＳＦ群は、ＬＩＴＡＦレベルの増大を示した。ＴＮＦＳＦ１５発現は、すべての混入レベルのＡｍｌａｎ製品Ｄ、またはＤ８もしくはＤ８Ｆ製品、または抗生物質ＶＭを補充された群において、減少した。
【０１６８】
図１９Ｄ〜Ｆに示すとおり、脾臓において、ＩＬ−６サイトカイン発現に、群の間の有意差はなかった。一方、ｉＮＯＳ発現は、０．２５％もしくは０．０５％の混入率の製品Ｄ、または製品Ｄ８Ｆ、または抗生物質ＶＭで補充された群で減少した。加えて、ＩＬ−１β発現は、０．３５もしくは０．１５％の混入率の製品Ｄ、または製品ＤＳもしくはＤ８で補充された群で減少した。
【０１６９】
この実施例を要約するために、ニワトリに、通常食餌、または製品Ｄ、ＤＳ、ＤＳＦ、Ｄ８、Ｄ８Ｆ、もしくはＶＭが加えられた食餌を、孵化以来給餌し、ＮＥに対する免疫を実験群とＮＥ対照群間で比較した。０．２５％のＤまたは０．２５％のＤ８を補充した食餌を給餌し、Ｅ．ｍａｘｉｍａとＣ．パーフリンジェンスで同時感染させたニワトリは、体重増加の有意な増大、病変スコアの低下、α−毒素またはＮｅｔＢ毒素に対する血清抗体レベルの向上、および血清α−毒素レベルの低下を示した。腸における、ＩＬ−６、ＩＬ８、ｉＮＯＳ、およびＴＮＦＳＦ１５についての遺伝子転写レベルは、０．２５％の製品Ｄ、ＤＳ、ＤＳＦ、Ｄ８、およびＤ８Ｆでそれぞれ補充された群において低下した。食餌に０．２５％の製品Ｄを加えたとき、鳥は、脾臓におけるＴＮＦＳＦ１５やｉＮＯＳなどのサイトカイン発現について、レベルの減少を示した。こうした結果は、ブロイラー鶏におけるＮＥ疾患の有害な影響を軽減することに対する、０．２５％の製品Ｄを加えること、またはＤ８を０．２５％補充することの有益な効果を示唆している。
【０１７０】
図１２Ａに、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ感染の日からＣ．パーフリンジェンス感染後の２日にかけて求めたブロイラー鶏の体重増加の比較を示す。鳥は、孵化後１４日の時点で、Ｅ．ｍａｘｉｍａの胞子形成接合子嚢１０，０００個で感染させた。Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ感染から４日後、鳥に、１×１０９ＣＦＵのＣ．ＰＣＰを接種した（Ｃｏｎｔは、負荷されない対照群であり、ＮＥは、負荷をかけて壊疽性腸炎を誘発したが製品を給餌されない群であり、ＶＭは、食餌において２０ｇ／トンのヴァージニアマイシンを与えた群である）。
【０１７１】
図１２Ｂに、１に基づく、製品なしの壊疽性腸炎負荷対照の鳥に対する体重増加の増大パーセンテージの比較を示す。
【０１７２】
図１３Ａに、ブロイラー鶏における体重増加の比較を示す。体重増加は、Ｃ．パーフリンジェンス感染の日から始め、Ｃ．パーフリンジェンス感染後７日で終えて求めた。
【０１７３】
図１３Ｂに、図１〜３に基づく、製品なしの壊疽性腸炎負荷対照に対する体重増加の増大パーセンテージの比較を示す。
【０１７４】
図１４に、製品が腸病変スコアに与える効果を示し、スコアは、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日目に調べた、１群あたり５羽の平均である。
【０１７５】
図１５Ａに、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の、α−毒素抗原に対する血清抗体応答を示す。
【０１７６】
図１５Ｂに、Ｃ．パーフリンジェンス感染後７日の時点の、α−毒素抗原に対する血清抗体応答を示す。
【０１７７】
図１６Ａに、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の、ＮｅｔＢ毒素抗原に対する血清抗体応答を示す。
【０１７８】
図１６Ｂに、Ｃ．パーフリンジェンス感染後７日の時点の、ＮｅｔＢ毒素抗原に対する血清抗体応答を示す。
【０１７９】
図１７Ａに、血清α−毒素レベルに対する食餌補助の効果を示す。Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点で血清を採取し、ＥＬＩＳＡによるα−毒素のレベルの測定に使用した。
【０１８０】
図１７Ｂに、血清ＮｅｔＢ毒素レベルに対する食餌補助の効果を示す。Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点で血清を採取し、ＥＬＩＳＡによるＮｅｔＢ毒素のレベルの測定に使用した。
【０１８１】
図１８Ａ〜Ｂに、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の、空腸上皮内リンパ球におけるサイトカイン産生を示す。
【０１８２】
図１８Ｃ〜Ｄに、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の鳥の空腸上皮内リンパ球におけるサイトカイン産生を示す。
【０１８３】
図１９Ａ〜Ｃに、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の鳥の脾臓におけるサイトカイン産生を示す。
【０１８４】
図１９Ｄ〜Ｆに、Ｃ．パーフリンジェンス感染後２日の時点の鳥の脾臓におけるサイトカイン産生を示す。
【０１８５】
以下の番号付きの段落によって、本発明についてさらに記載する。
【０１８６】
１．その必要のある動物において腸疾患を処置する方法であって、クレイ、酵母産物、およびグルタメートを含む混合物を動物に投与し、それによって腸疾患を処置する工程を含む、方法。
【０１８７】
２．腸疾患が、クロストリジウム属の細菌またはアイメリア属の原性動物を原因とするものである、段落１の方法。
【０１８８】
３．腸疾患が、壊疽性腸炎、コクシジウム症、クロストリジウム・ディフィシレ感染、慢性または出血性腸疾患、腸性毒血症、細菌性赤痢、細菌性または食品もしくは水媒介性の内毒素および／または外毒素が原因となる下痢または疾患である、段落１または２の方法。
【０１８９】
４．動物が、家禽種、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、またはヒトである、段落１〜３のいずれか１つの方法。
【０１９０】
５．動物が水棲種である、段落１〜３のいずれか１つの方法。
【０１９１】
６．水棲種が、エビまたは養殖魚である、段落５の方法。
【０１９２】
７．混合物を食餌補助剤として投与する、段落１〜６のいずれか１つの方法。
【０１９３】
８．混合物が、約５０〜９０％（ｗ／ｗ）のクレイ、約１０〜５０％（ｗ／ｗ）の酵母産物、および約０．０１〜１５％（ｗ／ｗ）のグルタメートである、段落１〜７のいずれか１つの方法。
【０１９４】
９．クレイがカルシウムモンモリロナイトクレイである、段落１〜８のいずれか１つの方法。
【０１９５】
１０．クレイが、吸着剤鉱物、珪藻土、ケイ酸塩、ゼオライト、アタパルジャイト、またはこれらの組合せである、段落１〜８のいずれか１つの方法。
【０１９６】
１１．クレイを、約１００℃〜約８００℃の間に加熱する、段落１〜１０のいずれか１つの方法。
【０１９７】
１２．クレイを、約２０〜５０ミクロンの粒径に粉砕する、段落１〜１１のいずれか１つの方法。
【０１９８】
１３．酵母産物がＰｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ酵母産物である、段落１〜１２のいずれか１つの方法。
【０１９９】
１４．酵母産物がクエン酸プレスケーキである、段落１３の方法。
【０２００】
１５．酵母産物が酵母発酵産物である、段落１〜１２のいずれか１つの方法。
【０２０１】
１６．酵母産物が酵母成分である、段落１〜１５のいずれか１つの方法。
【０２０２】
１７．酵母成分が、酵母マンナン、酵母細胞壁、マンナンオリゴ糖、βグルカン、繊維、炭水化物源、プレバイオティック、またはこれらの組合せである、段落１６の方法。
【０２０３】
１８．酵母産物が酵母発酵産物である、段落１〜１７のいずれか１つの方法。
【０２０４】
１９．グルタメートがグルタミン酸一ナトリウムである、段落１〜１８のいずれか１つの方法。
【０２０５】
２０．グルタメートが、グルタミン酸、α−ケトグルタレート、グルタミン、Ｌ−グルタミン酸、もしくはＬ−グルタミン、またはこれらの誘導体である、段落１〜１８のいずれか１つの方法。
【０２０６】
このように本発明の好ましい実施形態について詳細に述べてきたが、上記段落によって定められる本発明は、本発明の真意または範囲から逸脱することなく、その多くの明白な変形形態が考えられるように、上記説明において述べた特定の細目に限定されないことを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【国際調査報告】
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