(57)【要約】ｓｉＲＮＡ分子などの核酸を効率的にインビボおよびインビトロ送達するための、脂質化グリコサミノグリカン粒子を含む組成物、その調製および使用法が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
粒子状脂質組成物を形成する複数の脂質を含む水不溶性脂質化グリコサミノグリカン粒子と、前記粒子内に封入された核酸とを含む組成物であって、前記核酸と脂質の重量比が１：１未満である組成物。
【請求項２】
前記複数の脂質が、カチオン性脂質、および一級アミノ基を有する脂質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記カチオン性脂質が、モノカチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ＢＣＡＴ（Ｏ−（２Ｒ−１  ２−ジ−Ｏ−（１’Ｚ，９’Ｚ−オクタデカジエニル）−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート）、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール）、ＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−トレン−コレステロール）、ＣＤＡＮ（Ｎ’−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン）、ＣＨＤＴＡＥＡ（コレステリルヘミジチオジグリコリルトリス（アミノ（エチル）アミン）、ＤＣＡＴ（Ｏ−（１，２−ジ−Ｏ−（９’Ｚ−オクタデセニル）−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアニリン（エチル）カルバモイルコレステロール）、ＤＬＫＤ（Ｏ，Ｏ’−ジラウリルＮ−リジルアスパルテート）、ＤＭＫＤ（Ｏ，Ｏ’−ジミリスチルＮ−リジルアスパルテート）、ＤＯＧ（ジオレイルグリセロール）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＧＳＤＳＯ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−スクシニル−２−ヒドロキシエチルジスルフィドオルニチン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＳＮ（ジオレイルスクシニルエチルチオネオマイシン）、ＤＯＳＰ（ジオレイルスクシニルパロモマイシン）、ＤＯＳＴ（ジオレイルスクシニルトブラマイシン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ’［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＰＰＥＳ（ジ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン）、ＤＤＡＢおよびＤＯＤＡＰから選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記一級アミノ基を有する脂質が、１，２−ジラウロイル−Ｌ−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）、１，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＤＰＰＥ）、１−パルミトイル−３−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＰＯＰＥ）、ビオチン−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）およびジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
前記複数の脂質が、膜安定化脂質をさらに含む、請求項２に記載の組成物。
【請求項６】
前記膜安定化脂質が、コレステロール、リン脂質、セファリン、スフィンゴ脂質およびグリセロ糖脂質から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、これらの塩および混合物から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ヒアルロン酸が、高分子量ヒアルロン酸を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記粒子状脂質組成物が、１０〜２００ｎｍの粒径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの修飾型、およびこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびこれらの組み合わせから選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記複数の脂質と前記核酸との間の重量比が、１０：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
標的化部分をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記粒子が、前記核酸を標的部位に送達するよう適合される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記標的部位が、細胞、組織、器官および微生物から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
モノカチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）を含むカチオン性脂質と；１，２−ジラウロイル−Ｌ−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＬＰＥ）を含む一級アミノ基を有する脂質と；コレステロールを含む膜安定化脂質とを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
凍結乾燥粒子の形態の請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
経口、非経口および局所から選択される経路を介する投与に適した剤形の請求項１から１７のいずれか一項に記載の粒子を含む医薬組成物。
【請求項１９】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物、または請求項１８に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、がんを治療する方法。
【請求項２０】
核酸を封入した脂質化グリコサミノグリカン組成物を調製する方法であって、
ａ）
ｉ）１種または複数の脂質を有機溶媒に所望の比で混合し、均質な脂質混合物を形成するステップと、
ｉｉ）前記脂質混合物を水性緩衝液に懸濁し、加熱脂質押出機中での前記脂質懸濁液の順次濾過により所望の粒径を得るステップと
を含む粒子状脂質組成物を形成するステップと、
ｂ）
ｉ）グリコサミノグリカンを酸性緩衝液に溶解し、架橋剤を添加して活性化グリコサミノグリカンを形成するステップ
を含むグリコサミノグリカンを活性化するステップと、
ｃ）
ｉ）ステップａ）の前記脂質組成物を前記核酸とインキュベートするステップと、
ｉｉ）ステップｂ）の前記活性化グリコサミノグリカンを前記混合物に添加するステップと
により前記脂質化グリコサミノグリカン組成物を形成するステップと
を含む方法。
【請求項２１】
前記脂質粒子が、約１０〜２００ｎｍの粒径を有する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記有機溶媒を前記脂質混合物から蒸発させて脂質膜を形成する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記脂質粒子を凍結乾燥するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記脂質が、カチオン性脂質、および一級アミノ基を有する脂質を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記カチオン性脂質が、モノカチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ＢＣＡＴ（Ｏ−（２Ｒ−１  ２−ジ−Ｏ−（１’Ｚ，９’Ｚ−オクタデカジエニル）−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート）、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール）、ＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−トレン−コレステロール）、ＣＤＡＮ（Ｎ’−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン）、ＣＨＤＴＡＥＡ（コレステリルヘミジチオジグリコリルトリス（アミノ（エチル）アミン）、ＤＣＡＴ（Ｏ−（１，２−ジ−Ｏ−（９’Ｚ−オクタデセニル）−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアニリン（エチル）カルバモイルコレステロール）、ＤＬＫＤ（Ｏ，Ｏ’−ジラウリルＮ−リジルアスパルテート）、ＤＭＫＤ（Ｏ，Ｏ’−ジミリスチルＮ−リジルアスパルテート）、ＤＯＧ（ジオレイルグリセロール）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＧＳＤＳＯ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−スクシニル−２−ヒドロキシエチルジスルフィドオルニチン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＳＮ（ジオレイルスクシニルエチルチオネオマイシン）、ＤＯＳＰ（ジオレイルスクシニルパロモマイシン）、ＤＯＳＴ（ジオレイルスクシニルトブラマイシン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ’［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＰＰＥＳ（ジ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン）、ＤＤＡＢおよびＤＯＤＡＰから選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記一級アミノ基を有する脂質が、１，２−ジラウロイル−Ｌ−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）、１，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＤＰＰＥ）、１−パルミトイル−３−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＰＯＰＥ）、ビオチン−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記脂質が、膜安定化脂質をさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記膜安定化脂質が、コレステロール、リン脂質、セファリン、スフィンゴ脂質およびグリセロ糖脂質から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、これらの塩および混合物から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヒアルロン酸が、高分子量ヒアルロン酸を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸と前記脂質粒子の重量比が、１：１未満である、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの修飾型、およびこれらの組み合わせを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡが、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡおよびこれらの組み合わせから選択される、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｓｉＲＮＡ分子などの核酸を効率的にインビボおよびインビトロ送達するための、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー（ｇａｇｏｍｅｒ）としても知られている）を含む組成物、その調製および使用法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸を所望の標的部位に効率的に送達することが、多くの熱心な研究の焦点となっている。核酸は、いったん標的部位に導入されると、標的部位で生物学的効果を直接的または間接的に及ぼすことができる。いくつかの例では、核酸の送達は、核酸を標的部位に送達するよう設計された担体を使用する場合がある。標的部位に送達され得る代表的な核酸には、デオキシリボヌクレオチド核酸（ＤＮＡ）ならびに例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ（ＡＳ−ＲＮＡ）などのリボヌクレオチド核酸（ＲＮＡ）が含まれる。
【０００３】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、遺伝子サイレンシングの内因性細胞機構である。ＲＮＡｉは、特異的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を分解するまたはｍＲＮＡ翻訳を遮断することにより、相補ヌクレオチド配列を有する特異的遺伝子の発現を抑制する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により行われる。ＲＮＡｉはまた、ウイルスベクターを用いて低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現することにより、または合成低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を細胞質に直接組み込むことにより、内因的に活性化することもできる。ｓｉＲＮＡは、５’−リン酸化末端および非リン酸化３’−末端において対になっていない２個のヌクレオチドを有する１９〜２３塩基対の化学合成二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。細胞質の内側で、ｓｉＲＮＡはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）、ＲＮＡ二本鎖の鎖を分離し、センス鎖を処分する複合体に組み込まれる。次いで、アンチセンスＲＮＡ鎖がＲＩＳＣを導いて標的ｍＲＮＡをアニールおよび切断する、またはその翻訳を遮断する。標的ｍＲＮＡを再利用することにより、アンチセンス鎖を組み込んだＲＩＳＣ複合体は、最大で数日間分裂細胞でおよび数週間非分裂細胞で治療効果を示すことができる。さらに、ｓｉＲＮＡの反復投与は、その標的の安定したサイレンシングをもたらすことができる。しかしながら、この見込みにもかかわらず、ｓｉＲＮＡを治療法として利用することは、簡単な課題ではない。例えば、大きな分子量（約１３ｋＤａ）および正味の負電荷のために、裸のｓｉＲＮＡ分子が形質膜を横切り、細胞質に入る効率は通常極めて低い。静脈内注射されると、急速な腎クリアランスおよびＲＮＡ分解酵素による分解に対する感受性に加えて、修飾されていない裸のｓｉＲＮＡはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）に認識される。これが通常は免疫系を刺激し、インターフェロン応答、補体活性化、サイトカイン誘導および凝固カスケードを誘発する（Ｐｅｅｒ  Ｄ．により概説）。望ましくない免疫活性化に加えて、これらの効果は遺伝子発現を全体的に抑制し、オフターゲットのおよび誤解された結果をもたらすおそれがある。
【０００４】
ｓｉＲＮＡを細胞にインビトロまたはエキソビボ送達するために、従来のトランスフェクション法が一般的に使用される（ＷｅｉｎｓｔｅｉｎおよびＰｅｅｒにより概説）。ｓｉＲＮＡのインビトロ送達は、２つのグループ：局所または全身に分類され得る。ｓｉＲＮＡの局所送達は、種々の動物モデルで証明されており、いくつかの進行中の臨床試験に使用されている。裸のまたはカチオン性脂質／ポリマー製剤化ｓｉＲＮＡの局所注射に基づいて、この送達方法は、粘膜疾患、皮下組織、目の硝子体への眼内注射などに主に適している。ｓｉＲＮＡの全身送達は、追加の合併症をもたらす。細胞および局所送達がｓｉＲＮＡの細胞質への内部移行、放出および蓄積の必要性に対処する一方で、動物全体における全身送達は、例えば、ｓｉＲＮＡの血液成分との相互作用（これはリポソームの正の電荷と血清タンパク質の一般的に負の電荷との静電相互作用による、カチオン性リポソームを使用する場合に一般的な合併症である）、毛細血管中への捕捉、網内系細胞による取り込み、ＲＮＡ分解酵素による分解、解剖学的障壁（肝臓、脾臓および腎臓による濾過など）、免疫刺激、血管から標的組織への溢出、組織内への浸透などの追加の障害を強いる。
【０００５】
長年にわたって、ｓｉＲＮＡ分子を全身送達するために種々の方法および担体が示唆されてきた。この方法および担体には、ｓｉＲＮＡの受動的送達またはｓｉＲＮＡの標的化送達が含まれる。当技術分野で記載されている代表的な担体には、安定核酸−脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）、中性リポソーム、リピドイド（ｌｉｐｉｄｏｉｄ）含有リポソーム、アテロコラーゲン、コレステロール−ｓｉＲＮＡ、動的ポリ抱合体（ｄｙｎａｍｉｃ  ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ）、ＰＥＩナノプレックス（ｎａｎｏｐｌｅｘ）、抗体−プロタミン融合タンパク質、アプタマー−ｓｉＲＮＡ、標的化カチオン性リポソームおよびシクロデキストリン含有ポリカチオン（ＣＤＰ）が含まれる（ＭａｎｊｕｎａｔｈおよびＤｙｋｘｈｏｏｒｎ；ならびにＷｅｉｎｓｔｅｉｎおよびＰｅｅｒにより概説）。
【０００６】
当技術分野で記載されるｓｉＲＮＡ担体のいくつかは、粒子の構成要素および／または標的化部分として使用され得るヒアルロン酸を使用する。例えば、Ｔａｅｔｚらによる刊行物は、抗テロメラーゼｓｉＲＮＡをＣＤ４４発現肺がん細胞に標的化送達するためのヒアルロン酸修飾ＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥリポソームに関する。Ｌｅｅ．らによる刊行物は、分解性ヒアルロン酸ナノゲルを使用したｓｉＲＮＡの標的特異的細胞内送達に関する。Ｃｈｏｉらによる刊行物は、活性腫瘍標的化のための自己組織化ヒアルロン酸ナノ粒子に関する。Ｐｅｅｒらによる刊行物は、抗炎症標的としてサイクリンＤ１を明らかにする全身白血球指向ｓｉＲＮＡ送達に関する。例えば、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１１／０１３１３０号は、ポリヌクレオチド剤を含む細胞標的化ナノ粒子およびその使用に関する。さらに、米国特許第７５４４３７４号は、診断および治療のための脂質化グリコサミノグリカン粒子ならびに薬物および遺伝子送達へのその使用に関する。
【０００７】
それにもかかわらず、ヒアルロン酸を使用する担体を含む、当技術分野で記載される担体は、ｓｉＲＮＡの標的細胞へのうまい送達、特に、インビボ送達に関連する全ての障害に対処しているわけではない。
【０００８】
したがって、ｓｉＲＮＡを所望の標的部位に効率的かつ特異的に送達するための改善した担体組成物であって、ｓｉＲＮＡが所望の効果を効率的に及ぼすことができるように、安定であり、長い貯蔵寿命を有し、生分解性で、工業的製造法に修正可能で、高い封入容量を有し、非毒性で、免疫応答の誘導を回避し、中に封入されたｓｉＲＮＡに強化された保護（安定性および完全性）をもたらし、インビトロおよびインビボでｓｉＲＮＡをその標的部位に効率的に送達することができる担体組成物が当技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
いくつかの実施形態によると、例えば、ｓｉＲＮＡ分子などの核酸分子の有効かつ効率的なインビボおよびインビトロ送達システムとして使用される改善した脂質化グリコサミノグリカン組成物（ガゴマー）が提供される。
【００１０】
いくつかの実施形態によると、本発明は、少なくとも一部は、脂質化グリコサミノグリカン粒子の調製に使用される脂質の組成の修正、その調製法の修正、ガゴマーの種々の構成要素間の比の修正ならびにガゴマー粒子の種々の構成要素とその中に封入される核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ分子など）との間の会合が、インビトロとインビボ用途の両方にとって、一般的に核酸分子、特にｓｉＲＮＡ分子のための送達システムとして極めて有用な強化されたガゴマー組成物を予想外に提供するという驚くべきおよび予想外の知見に基づく。本発明の強化されたガゴマー組成物は、以前記載されたガゴマー組成物に対して種々の改善を示す。例えば、本発明の強化されたガゴマー組成物は、改善した安定性（貯蔵寿命）、所定の構造ならびに均一なサイズ分布および電荷を示す。さらに、本発明の強化されたガゴマー組成物は、費用対効果が高い工業的製造法に修正可能であり、従来の滅菌法によりさらに滅菌され得る。さらに、本発明の強化されたガゴマー組成物は、高効率の核酸分子の封入ならびに高い負荷能力（すなわち、ガゴマーが有効に担持することができる核酸の数／量）を示す。さらに、本発明の強化されたガゴマー組成物は、ガゴマー粒子内に封入された核酸分子に強化された保護をもたらすことができる。さらに、本発明の強化されたガゴマー組成物は、細胞にとって免疫毒性でなく、単離ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）中でおよびインビボ投与時に免疫応答を誘発もしない。本発明のガゴマー組成物の強化された特性は、核酸の有効で、非毒性の、かつ有用な送達システムにとっての臨界パラメータである。
【００１１】
さらに、別の予想外の知見では、本発明の強化されたガゴマー組成物が、ガゴマー粒子の脂質成分と、その中に封入された核酸（例えば、ｓｉＲＮＡなど）との間の予想外の重量比を示す。例えば、高い脂質とｓｉＲＮＡの重量比は、ｓｉＲＮＡの標的に対する改善した生物学的効果を提供する。さらに、本明細書で示されるように、ｓｉＲＮＡのレベルと、それによって及ぼされる生物学的効果との間に直接の相関はない。
【００１２】
いくつかの実施形態によると、粒子状脂質組成物を形成する複数の脂質を含む水不溶性脂質化グリコサミノグリカン粒子と、粒子内に封入された核酸とを含む組成物であって、核酸と脂質の重量比が１：１未満である組成物が提供される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、複数の脂質は、カチオン性脂質、および一級アミノ基を有する脂質から選択され得る。カチオン性脂質は、それだけに限らないが、モノカチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ＢＣＡＴ（Ｏ−（２Ｒ−１  ２−ジ−Ｏ−（１’Ｚ，９’Ｚ−オクタデカジエニル）−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート）、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール）、ＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−トレン−コレステロール）、ＣＤＡＮ（Ｎ’−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン）、ＣＨＤＴＡＥＡ（コレステリルヘミジチオジグリコリルトリス（アミノ（エチル）アミン）、ＤＣＡＴ（Ｏ−（１，２−ジ−Ｏ−（９’Ｚ−オクタデセニル）−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアニリン（エチル）カルバモイルコレステロール）、ＤＬＫＤ（Ｏ，Ｏ’−ジラウリルＮ−リジルアスパルテート）、ＤＭＫＤ（Ｏ，Ｏ’−ジミリスチルＮ−リジルアスパルテート）、ＤＯＧ（ジオレイルグリセロール）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＧＳＤＳＯ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−スクシニル−２−ヒドロキシエチルジスルフィドオルニチン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＳＮ（ジオレイルスクシニルエチルチオネオマイシン）、ＤＯＳＰ（ジオレイルスクシニルパロモマイシン）、ＤＯＳＴ（ジオレイルスクシニルトブラマイシン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ’［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＰＰＥＳ（ジ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン）、ＤＤＡＢおよびＤＯＤＡＰから選択され得る。各可能性は別々の実施形態である。
【００１４】
一級アミノ基を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン）は、それだけに限らないが、１，２−ジラウロイル−Ｌ−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）、１，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＤＰＰＥ）、１−パルミトイル−３−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＰＯＰＥ）、ビオチン−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）から選択され得る。各可能性は別々の実施形態である。
【００１５】
さらなる実施形態では、複数の脂質には、（カチオン性脂質および一級アミノ基を有する脂質に加えて）それだけに限らないが、コレステロール、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロールなど）、セファリン、スフィンゴ脂質（スフィンゴミエリンおよびスフィンゴ糖脂質）およびグリセロ糖脂質から選択され得る膜安定化脂質がさらに含まれ得る。各可能性は別々の実施形態である。
【００１６】
さらなる実施形態によると、グリコサミノグリカンは、それだけに限らないが、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸ならびにこれらの断片、塩および混合物から選択され得る。いくつかの実施形態では、ヒアルロン酸は、それだけに限らないが、高分子量ヒアルロン酸（例えば、約ＭＷ＝３．１×１０５〜１．５×１０６ｋＤａの範囲）から選択され得る。
【００１７】
いくつかの実施形態によると、粒子状脂質組成物は、約１０〜２００ｎｍの範囲の粒径を有し得る。
【００１８】
さらなる実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの修飾型、およびこれらの組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはこれらの組み合わせから選択され得る。
【００１９】
追加の実施形態では、複数の脂質と核酸との間の重量比は２：１である。いくつかの実施形態では、複数の脂質と核酸との間の重量比は５：１である。いくつかの実施形態では、複数の脂質と核酸との間の重量比は１０：１である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡ（Ｎ’［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）ではない。
【００２１】
いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約５０ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約１００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約２００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約５００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約７５０ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約１０００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約１５００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約２０００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約２５００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約３０００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約３５００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約４０００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約４５００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約５０００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約５００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約５０ｎｍ〜１２ミクロンの範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約５００ｎｍ〜５ミクロンの範囲の粒径を有する。
【００２２】
さらなる実施形態では、組成物は標的化部分をさらに含んでもよい。
【００２３】
追加の実施形態では、粒子は、核酸を標的部位に送達するよう適合され得る。標的部位は、細胞、組織、器官および微生物から選択され得る。
【００２４】
いくつかの実施形態によると、経口、非経口および局所から選択される経路を介する投与に適した剤形の脂質化グリコサミノグリカン粒子を含む医薬組成物が提供される。
【００２５】
追加の実施形態によると、組成物は、凍結乾燥粒子の形態であり得る。
【００２６】
代表的な実施形態によると、組成物は、ＤＯＴＡＰ、ＤＬＰＥおよびコレステロールを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態によると、それを必要とする対象のがんを治療する方法であって、粒子状脂質組成物を形成する複数の脂質を含む水不溶性脂質化グリコサミノグリカン粒子と、粒子内に封入された核酸とを含む組成物（核酸と脂質の重量比は１：１未満である）、または同組成物を含む医薬組成物を対象に投与するステップを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、核酸。さらなる実施形態では、核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの修飾型、およびこれらの組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはこれらの組み合わせから選択され得る。
【００２８】
いくつかの実施形態によると、核酸を封入した脂質化グリコサミノグリカン組成物を調製する方法であって、
ａ）
ｉ）１種または複数の脂質を有機溶媒に所望の比で混合し、均質な脂質混合物を形成するステップと、
ｉｉ）脂質混合物を水性緩衝液に懸濁し、加熱脂質押出機中での脂質懸濁液の順次濾過により所望の粒径を得るステップと
を含む粒子状脂質組成物を形成するステップと、
ｂ）
ｉ）グリコサミノグリカンを酸性緩衝液に溶解し、架橋剤を添加して活性化グリコサミノグリカンを形成するステップ
を含むグリコサミノグリカンを活性化するステップと、
ｃ）
ｉ）ステップａ）の脂質組成物を核酸とインキュベートするステップと、
ｉｉ）ステップｂ）の活性化グリコサミノグリカンを混合物に添加するステップと
により脂質化グリコサミノグリカン組成物を形成するステップと
を含む方法が提供される。
【００２９】
いくつかの実施形態によると、脂質粒子は約５０〜２００ｎｍの粒径を有する。
【００３０】
さらなる実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン組成物を調製する方法のステップａ）で、有機溶媒を脂質混合物から蒸発させて脂質膜を形成してもよい。
【００３１】
追加の実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン組成物を調製する方法は、脂質粒子を凍結乾燥するステップをさらに含んでもよい。
【００３２】
いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン組成物を調製する方法に使用される複数の脂質は、カチオン性脂質、および一級アミノ基を有する脂質から選択され得る。カチオン性脂質は、それだけに限らないが、モノカチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ＢＣＡＴ（Ｏ−（２Ｒ−１  ２−ジ−Ｏ−（１’Ｚ，９’Ｚ−オクタデカジエニル）−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート）、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール）、ＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−トレン−コレステロール）、ＣＤＡＮ（Ｎ’−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン）、ＣＨＤＴＡＥＡ（コレステリルヘミジチオジグリコリルトリス（アミノ（エチル）アミン）、ＤＣＡＴ（Ｏ−（１，２−ジ−Ｏ−（９’Ｚ−オクタデセニル）−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアニリン（エチル）カルバモイルコレステロール）、ＤＬＫＤ（Ｏ，Ｏ’−ジラウリルＮ−リジルアスパルテート）、ＤＭＫＤ（Ｏ，Ｏ’−ジミリスチルＮ−リジルアスパルテート）、ＤＯＧ（ジオレイルグリセロール）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＧＳＤＳＯ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−スクシニル−２−ヒドロキシエチルジスルフィドオルニチン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＳＮ（ジオレイルスクシニルエチルチオネオマイシン）、ＤＯＳＰ（ジオレイルスクシニルパロモマイシン）、ＤＯＳＴ（ジオレイルスクシニルトブラマイシン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ’［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＰＰＥＳ（ジ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン）、ＤＤＡＢ、ＤＯＤＡＰおよびこれらの組み合わせから選択され得る。各可能性は別々の実施形態である。
【００３３】
いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＯＴＭＡ（Ｎ’［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）ではない。
【００３４】
いくつかの実施形態では、一級アミノ基を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン）は、それだけに限らないが、１，２−ジラウロイル−Ｌ−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）、１，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＤＰＰＥ）、１−パルミトイル−３−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＰＯＰＥ）、ビオチン−ホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）およびこれらの組み合わせから選択され得る。各可能性は別々の実施形態である。
【００３５】
さらなる実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン組成物を調製する方法に使用される脂質には、（カチオン性脂質および一級アミノ基を有する脂質に加えて）それだけに限らないが、コレステロール、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロールなど）、セファリン、スフィンゴ脂質（スフィンゴミエリンおよびスフィンゴ糖脂質）、グリセロ糖脂質およびこれらの組み合わせから選択され得る膜安定化脂質がさらに含まれ得る。各可能性は別々の実施形態である。
【００３６】
さらなる実施形態によると、本方法に使用されるグリコサミノグリカンは、それだけに限らないが、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸ならびにこれらの断片、塩および混合物から選択され得る。ヒアルロン酸は、それだけに限らないが、高分子量ヒアルロン酸（例えば、約ＭＷ＝３．１×１０５〜１．５×１０６ｋＤａの範囲）から選択され得る。
【００３７】
さらなる実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン組成物内に封入される核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、これらの修飾型、およびこれらの組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはこれらの組み合わせから選択され得る。
【００３８】
上記代表的な態様および実施形態に加えて、さらなる態様および実施形態は、図面を参照し、以下の詳細な説明を研究することにより明らかになるだろう。
【００３９】
代表的な実施形態を参照図面で説明する。図面に示される構成要素および特徴の寸法は、提示の便宜および明快さのために一般的に選択されており、必ずしも一定の縮尺で示されていない。図面を以下に列挙する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】いくつかの実施形態によるガゴマー構造の概略図である。
【図２Ａ】粒子状脂質組成物の粒径分布を示すゼータサイザー分析データを示す図である。
【図２Ｂ】粒子状脂質組成物の粒径分布を示すゼータサイザー分析データを示す図である。
【図２Ｃ】粒子状脂質組成物の粒径分布を示すゼータサイザー分析データを示す図である。
【図３】（Ａ）カチオン性粒子状脂質組成物；（Ｂ）ｓｉＲＮＡを添加した後；（Ｃ）活性化ＨＡをカチオン性脂質組成物に添加した後のゼータ電位の変化を示すグラフである。
【図４Ａ】改善したガゴマー組成物内に封入されたｓｉＲＮＡの安定性を示すピクトグラムである。非化学修飾ｓｉＲＮＡを使用した実験を示している。
【図４Ｂ】改善したガゴマー組成物内に封入されたｓｉＲＮＡの安定性を示すピクトグラムである。非化学修飾ｓｉＲＮＡを使用した実験を示している
【図４Ｃ】改善したガゴマー組成物内に封入されたｓｉＲＮＡの安定性を示すピクトグラムである。化学修飾ｓｉＲＮＡを使用した（交互の２−Ｏ−メチル化を使用した）実験を示している。
【図５】種々のｓｉＲＮＡと脂質の比でｐＧＰに向けたｓｉＲＮＡを含むガゴマー組成物とのインキュベーション後のｐＧＰタンパク質発現の低下のＦＡＣＳ分析を示す図である。上のパネル−１：１０のｓｉＲＮＡと脂質の重量比、中央パネル−１：５のｓｉＲＮＡと脂質の重量比、下のパネル−１：２のｓｉＲＮＡと脂質の重量比。
【図６Ａ】改善したガゴマー組成物内に封入された１００ｎｍのｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ（ＮＡＲ）細胞系におけるＡｈａ１およびＫｉｆ１１（それぞれ、図６Ａおよび図７Ｂ）の発現の相対的低下を示すグラフである。
【図６Ｂ】改善したガゴマー組成物内に封入された１００ｎｍのｓｉＲＮＡでトランスフェクトされたＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ（ＮＡＲ）細胞系におけるＡｈａ１およびＫｉｆ１１（それぞれ、図６Ａおよび図７Ｂ）の発現の相対的低下を示すグラフである。
【図７Ａ】改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物との１８時間のインキュベーション後の、ＮＡＲ細胞（図８Ａ〜図８Ｂ）またはＢ１６Ｆ１０細胞（図７Ｃ）にトランスフェクトしたｓｉＲＮＡの量と細胞における特異的遺伝子発現の低下との間の用量反応を示すグラフである。相対的Ａｈａ発現。
【図７Ｂ】改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物との１８時間のインキュベーション後の、ＮＡＲ細胞（図８Ａ〜図８Ｂ）またはＢ１６Ｆ１０細胞（図７Ｃ）にトランスフェクトしたｓｉＲＮＡの量と細胞における特異的遺伝子発現の低下との間の用量反応を示すグラフである。相対的Ｋｉｆ１１発現。
【図７Ｃ】改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物との１８時間のインキュベーション後の、ＮＡＲ細胞（図８Ａ〜図８Ｂ）またはＢ１６Ｆ１０細胞（図７Ｃ）にトランスフェクトしたｓｉＲＮＡの量と細胞における特異的遺伝子発現の低下との間の用量反応を示すグラフである。相対的Ａｈａ１遺伝子発現。
【図８Ａ】改善したガゴマー組成物内に封入された１００ｎｍのｓｉＲＮＡで、またはリポフェクタミンによりトランスフェクトされた種々の細胞系におけるＡｈａ１の発現の相対的低下を示すグラフである。マウスメラノーマＢ１６−Ｆ１０細胞系。
【図８Ｂ】改善したガゴマー組成物内に封入された１００ｎｍのｓｉＲＮＡで、またはリポフェクタミンによりトランスフェクトされた種々の細胞系におけるＡｈａ１の発現の相対的低下を示すグラフである。ヒトＬＬＣ−Ｄ１２２細胞系。
【図９Ａ】改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物によるＰＢＭＣ細胞のトランスフェクション後の、サイトカインまたはインターフェロンの経時的（時間）発現レベル（濃度、ｐｇ／ｍＬ）の変化を示す棒グラフである。結果は、改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物が有意な免疫応答を誘導しないことを示している。ＩＬ−６の濃度。
【図９Ｂ】改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物によるＰＢＭＣ細胞のトランスフェクション後の、サイトカインまたはインターフェロンの経時的（時間）発現レベル（濃度、ｐｇ／ｍＬ）の変化を示す棒グラフである。結果は、改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物が有意な免疫応答を誘導しないことを示している。ＩＬ−１０の濃度。
【図９Ｃ】改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物によるＰＢＭＣ細胞のトランスフェクション後の、サイトカインまたはインターフェロンの経時的（時間）発現レベル（濃度、ｐｇ／ｍＬ）の変化を示す棒グラフである。結果は、改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物が有意な免疫応答を誘導しないことを示している。ＩＮＦγの濃度。
【図９Ｄ】改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物によるＰＢＭＣ細胞のトランスフェクション後の、サイトカインまたはインターフェロンの経時的（時間）発現レベル（濃度、ｐｇ／ｍＬ）の変化を示す棒グラフである。結果は、改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物が有意な免疫応答を誘導しないことを示している。ＴＮＦαの濃度。
【図１０Ａ】カチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを含むガゴマー粒子（「ＤＯＴＡＰ」）またはカチオン性脂質としてＤＯＴＭＡを含むガゴマー粒子（「ＤＯＴＭＡ」）によるＰＢＭＣ細胞のトランスフェクション後の、サイトカインまたはインターフェロンの経時的（時間）発現レベル（濃度、ｐｇ／ｍＬ）の変化を示す棒グラフである。結果は、驚くべきことに、ＤＯＴＡＰを含むガゴマーは有意な免疫応答を誘導しないが、ＤＯＴＭＡを含むガゴマーは種々の炎症マーカー（ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ）の濃度の強い急性の増加を誘導することを示している。ＩＬ−６の濃度（ｐｇ／ｍＬ）。
【図１０Ｂ】カチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを含むガゴマー粒子（「ＤＯＴＡＰ」）またはカチオン性脂質としてＤＯＴＭＡを含むガゴマー粒子（「ＤＯＴＭＡ」）によるＰＢＭＣ細胞のトランスフェクション後の、サイトカインまたはインターフェロンの経時的（時間）発現レベル（濃度、ｐｇ／ｍＬ）の変化を示す棒グラフである。結果は、驚くべきことに、ＤＯＴＡＰを含むガゴマーは有意な免疫応答を誘導しないが、ＤＯＴＭＡを含むガゴマーは種々の炎症マーカー（ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ）の濃度の強い急性の増加を誘導することを示している。ＴＮＦ−αの濃度（ｐｇ／ｍＬ）。
【図１０Ｃ】カチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを含むガゴマー粒子（「ＤＯＴＡＰ」）またはカチオン性脂質としてＤＯＴＭＡを含むガゴマー粒子（「ＤＯＴＭＡ」）によるＰＢＭＣ細胞のトランスフェクション後の、サイトカインまたはインターフェロンの経時的（時間）発現レベル（濃度、ｐｇ／ｍＬ）の変化を示す棒グラフである。結果は、驚くべきことに、ＤＯＴＡＰを含むガゴマーは有意な免疫応答を誘導しないが、ＤＯＴＭＡを含むガゴマーは種々の炎症マーカー（ＩＬ−６、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γ）の濃度の強い急性の増加を誘導することを示している。ＩＮＦγの濃度（ｐｇ／ｍＬ）。
【図１１Ａ】改善したガゴマー組成物内に封入されたＣｙ５標識ｓｉＲＮＡを注射された無処理または担腫瘍マウスから得た種々の組織の凍結切片標本の顕微鏡ピクトグラムである。肝臓。
【図１１Ｂ】改善したガゴマー組成物内に封入されたＣｙ５標識ｓｉＲＮＡを注射された無処理または担腫瘍マウスから得た種々の組織の凍結切片標本の顕微鏡ピクトグラムである。肝臓。
【図１１Ｃ】改善したガゴマー組成物内に封入されたＣｙ５標識ｓｉＲＮＡを注射された無処理または担腫瘍マウスから得た種々の組織の凍結切片標本の顕微鏡ピクトグラムである。脾臓。
【図１１Ｄ】改善したガゴマー組成物内に封入されたＣｙ５標識ｓｉＲＮＡを注射された無処理または担腫瘍マウスから得た種々の組織の凍結切片標本の顕微鏡ピクトグラムである。脾臓。
【図１１Ｅ】改善したガゴマー組成物内に封入されたＣｙ５標識ｓｉＲＮＡを注射された無処理または担腫瘍マウスから得た種々の組織の凍結切片標本の顕微鏡ピクトグラムである。腎臓。
【図１１Ｆ】改善したガゴマー組成物内に封入されたＣｙ５標識ｓｉＲＮＡを注射された無処理または担腫瘍マウスから得た種々の組織の凍結切片標本の顕微鏡ピクトグラムである。腎臓。
【図１１Ｇ】改善したガゴマー組成物内に封入されたＣｙ５標識ｓｉＲＮＡを注射された無処理または担腫瘍マウスから得た種々の組織の凍結切片標本の顕微鏡ピクトグラムである。肺。
【図１１Ｈ】改善したガゴマー組成物内に封入されたＣｙ５標識ｓｉＲＮＡを注射された無処理または担腫瘍マウスから得た種々の組織の凍結切片標本の顕微鏡ピクトグラムである。肺。
【図１２Ａ】異なる時点の担腫瘍マウスから得た腫瘍の凍結切片の画像である。共焦点顕微鏡画像。
【図１２Ｂ】異なる時点の担腫瘍マウスから得た腫瘍の凍結切片の画像である。Ｈ＆Ｅ組織学的染色。
【図１２Ｃ】異なる時点の担腫瘍マウスから得た腫瘍の凍結切片の画像である。高分解能分光蛍光顕微鏡画像。
【図１３】ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物を投与したマウス（処理）および無処理マウスの経時的（時間）体重（ｇ）の変化を示す折れ線グラフである。
【図１４Ａ】ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間／日）でマウスから得た種々の肝臓酵素および血清中の脂質のレベルの棒グラフである（各時点／群についてｎ＝５）。ＳＧＯＴ／ＡＳＴのレベル（ＩＵ／Ｌ）。
【図１４Ｂ】ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間／日）でマウスから得た種々の肝臓酵素および血清中の脂質のレベルの棒グラフである（各時点／群についてｎ＝５）。ＳＧＰＴ／ＡＳＴのレベル（ＩＵ／Ｌ）。
【図１４Ｃ】ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間／日）でマウスから得た種々の肝臓酵素および血清中の脂質のレベルの棒グラフである（各時点／群についてｎ＝５）。コレステロール（ｍｇ／ｄＬ）。
【図１４Ｄ】ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間／日）でマウスから得た種々の肝臓酵素および血清中の脂質のレベルの棒グラフである（各時点／群についてｎ＝５）。トリグリセリドのレベル（ｍｇ／ｄＬ）。
【図１５Ａ】ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間）でマウスから得た血液中の種々のサイトカインの濃度の棒グラフである（各時点／群についてｎ＝５）。ＩＬ−６の濃度（ｐｇ／ｍｌ）。
【図１５Ｂ】ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間）でマウスから得た血液中の種々のサイトカインの濃度の棒グラフである（各時点／群についてｎ＝５）。ＩＬ−１０の濃度（ｐｇ／ｍｌ）。
【図１５Ｃ】ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間）でマウスから得た血液中の種々のサイトカインの濃度の棒グラフである（各時点／群についてｎ＝５）。ＩＦＮγ（ｐｇ／ｍｌ）。
【図１５Ｄ】ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間）でマウスから得た血液中の種々のサイトカインの濃度の棒グラフである（各時点／群についてｎ＝５）。ＴＮＦαの濃度（ｐｇ／ｍｌ）。
【図１６Ａ】ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与の最大で数時間後に試験マウスから得た組織の組織学的切片のピクトグラムである。肺。
【図１６Ｂ】ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与の最大で数時間後に試験マウスから得た組織の組織学的切片のピクトグラムである。肝臓。
【図１６Ｃ】ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与の最大で数時間後に試験マウスから得た組織の組織学的切片のピクトグラムである。腎臓。
【図１６Ｄ】ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与の最大で数時間後に試験マウスから得た組織の組織学的切片のピクトグラムである。脾臓。
【図１７Ａ】Ｂ１６−Ｆ１０細胞を接種され、５日後に指示したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物を全身投与されたマウスから得た種々の組織におけるＡｈａ１発現の相対的ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与２４時間後に、マウスを屠殺し、示した組織を抽出し、Ａｈａ１の発現について分析した。ガゴマー組成物には、１．ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを含む対照ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物（「ｓｉＬｕｃ」）、２．Ａｈａ１に対するｓｉＲＮＡを含む試験ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物（ｓｉＡｈａ１）が含まれる。「無処理」は、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物を投与されなかったマウスを示している。示したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物（０．４ｍｇ／ｋｇ）で処理された、または処理されていない、肝臓、肺および腫瘍組織におけるＡｈａ１  ｍＲＮＡの相対的発現レベルを示す棒グラフ。試験した時点は、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与の２４時間後および４８時間後とした。試験したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の用量は、０．４ｍｇ／ｋｇおよび２．０ｍｇ／ｋｇとした。
【図１７Ｂ】Ｂ１６−Ｆ１０細胞を接種され、５日後に指示したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物を全身投与されたマウスから得た種々の組織におけるＡｈａ１発現の相対的ｍＲＮＡ発現を示す棒グラフである。ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与２４時間後に、マウスを屠殺し、示した組織を抽出し、Ａｈａ１の発現について分析した。ガゴマー組成物には、１．ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを含む対照ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物（「ｓｉＬｕｃ」）、２．Ａｈａ１に対するｓｉＲＮＡを含む試験ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物（ｓｉＡｈａ１）が含まれる。「無処理」は、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物を投与されなかったマウスを示している。腫瘍抽出物におけるＡｈａ１  ｍＲＮＡの相対的発現レベルに対するガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の用量および時間の影響を示す棒グラフ。試験した時点は、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与の２４時間後および４８時間後とした。試験したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の用量は、０．４ｍｇ／ｋｇおよび２．０ｍｇ／ｋｇとした。
【図１８Ａ】Ｂ１６−Ｆ１０細胞を投与され（ＩＶ）、肺転移を誘導したＣ５７ＢＬマウスから得た肺のピクトグラムである。Ｂ１６−Ｆ１０細胞のＩＶ投与の１０日後に肺を回収した。回収した肺の腹側図の肉眼ピクトグラムである。
【図１８Ｂ】Ｂ１６−Ｆ１０細胞を投与され（ＩＶ）、肺転移を誘導したＣ５７ＢＬマウスから得た肺のピクトグラムである。Ｂ１６−Ｆ１０細胞のＩＶ投与の１０日後に肺を回収した。背側図の肉眼ピクトグラムである。矢印は、同定した転移コロニー形成を示している（黒丸として同定される）。
【図１８Ｃ】Ｂ１６−Ｆ１０細胞を投与され（ＩＶ）、肺転移を誘導したＣ５７ＢＬマウスから得た肺のピクトグラムである。Ｂ１６−Ｆ１０細胞のＩＶ投与の１０日後に肺を回収した。Ｂ１６−Ｆ１０細胞接種１０日後に屠殺した動物の肺の組織学的標本のピクトグラムを示しており、付随する実質侵潤による胸膜下凝集の徴候を示している。
【図１９Ａ】肺転移を誘導するＢ１６−Ｆ１０細胞を投与された（ＩＶ）Ｃ５７ＢＬマウスから得た肺転移の凍結切片標本の顕微鏡ピクトグラムである。マウスに、ＦＩＴＣで標識されたＨＡ部分を有する改善したガゴマー組成物内に封入されたＣｙ５標識ｓｉＲＮＡを注射した。マウスをガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の種々の時点で屠殺し、肺転移の凍結切片をＣｙ５標識（当初赤色として示されている）およびＦＩＴＣ（当初緑色として示されている）で蛍光標識した。対照マウス（ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物を投与されていない）の肺転移凍結切片。
【図１９Ｂ】肺転移を誘導するＢ１６−Ｆ１０細胞を投与された（ＩＶ）Ｃ５７ＢＬマウスから得た肺転移の凍結切片標本の顕微鏡ピクトグラムである。マウスに、ＦＩＴＣで標識されたＨＡ部分を有する改善したガゴマー組成物内に封入されたＣｙ５標識ｓｉＲＮＡを注射した。マウスをガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の種々の時点で屠殺し、肺転移の凍結切片をＣｙ５標識（当初赤色として示されている）およびＦＩＴＣ（当初緑色として示されている）で蛍光標識した。ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与１時間後に屠殺されたマウスの肺転移凍結切片。
【図１９Ｃ】肺転移を誘導するＢ１６−Ｆ１０細胞を投与された（ＩＶ）Ｃ５７ＢＬマウスから得た肺転移の凍結切片標本の顕微鏡ピクトグラムである。マウスに、ＦＩＴＣで標識されたＨＡ部分を有する改善したガゴマー組成物内に封入されたＣｙ５標識ｓｉＲＮＡを注射した。マウスをガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の種々の時点で屠殺し、肺転移の凍結切片をＣｙ５標識（当初赤色として示されている）およびＦＩＴＣ（当初緑色として示されている）で蛍光標識した。ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与３時間後に屠殺されたマウスの肺転移凍結切片。
【図１９Ｄ】肺転移を誘導するＢ１６−Ｆ１０細胞を投与された（ＩＶ）Ｃ５７ＢＬマウスから得た肺転移の凍結切片標本の顕微鏡ピクトグラムである。マウスに、ＦＩＴＣで標識されたＨＡ部分を有する改善したガゴマー組成物内に封入されたＣｙ５標識ｓｉＲＮＡを注射した。マウスをガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の種々の時点で屠殺し、肺転移の凍結切片をＣｙ５標識（当初赤色として示されている）およびＦＩＴＣ（当初緑色として示されている）で蛍光標識した。ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与７時間後に屠殺されたマウスの肺転移凍結切片。全ての図に関して−右側のパネル（ＢＦ）−明視野像、右から２番目のパネル（Ｃｙ５−ｓｉＲＮＡ）−Ｃｙ５標識（当初赤色）、左から２番目のパネル（ＦＩＴＣ−ＨＡ）−ＦＩＴＣ標識（当初緑色）、左側のパネル（合併）−Ｃｙ５およびＦＩＴＣ標識の合併像を示す像（当初黄色）。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および句を以下に定義する。これらの用語および句は、説明を目的とするものであって、限定を目的としていないことを理解すべきであり、結果として本明細書の用語法および表現法は、当業者の知識と組み合わせて本明細書に提示される教示および手引きに照らして当業者が解釈するはずである。
【００４２】
本明細書で言及される場合、「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」および「ヌクレオチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され得る。これらの用語は、別個の断片またはより大きな構築物の構成要素、直鎖または分岐、一本鎖、二本鎖、三本鎖あるいはこれらのハイブリッドの形態のデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボクヌレオチド（ＲＮＡ）およびこれらの修飾型のポリマーに関する。これらの用語はまた、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドも包含する。ポリヌクレオチドには、ＤＮＡもしくはＲＮＡのセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が含まれ得る。ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、例えば、それだけに限らないが、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、組換えＤＮＡもしくはこれらのハイブリッドまたは例えば、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどのＲＮＡ分子であり得る。各可能性は別々の実施形態である。これらの用語は、天然塩基、糖および共有結合性ヌクレオシド間結合ならびにそれぞれの天然部分と同様に機能する非天然部分を有するオリゴヌクレオチドで構成されるオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００４３】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書においてアミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。これらの用語は、１個または複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的化学類似体であるアミノ酸ポリマーならびに天然アミノ酸ポリマーに準用する。
【００４４】
本明細書で使用される「複数」という用語は、２つ以上の構成要素を含むことに関する。
【００４５】
「グリコサミノグリカン」（）ＧＡＧｓ）または「ムコ多糖」という用語は、反復二糖単位からなる長鎖非分岐多糖に関する。反復単位には、ヘキソサミンに結合したヘキソース（六炭糖）またはヘキスロン酸が含まれ得る。グリコサミノグリカンファミリーの構成員は、含有するヘキソサミン、ヘキソースまたはヘキスロン酸単位（例えば、グルクロン酸、イズロン酸、ガラクトース、ガラクトサミン、グルコサミン）の型およびグリコシド結合の幾何学が異なり得る。グリコサミノグリカンという用語は、天然、合成または半合成グリコサミノグリカン分子を含む。代表的なグリコサミノグリカンには、それだけに限らないが、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ヒアルロナン（ヒアルロン酸、ヒアルロン酸塩、ＨＡとしても知られている）ならびにこれらの断片、塩および混合物といったグリコサミノグリカンが含まれる。グリコサミノグリカンという用語は、それだけに限らないが、エステル化、硫酸化、ポリ硫酸化およびメチル化などの修飾により化学修飾されたグリコサミノグリカンをさらに含む。グリコサミノグリカンは、ヒアルロン酸を除いて、本来、多糖部分と共有結合したタンパク質部分の形態である。タンパク質−糖結合を加水分解する方法は、化学的および酵素的の両方が当業者に周知である。
【００４６】
「ＨＡ」および「ヒアルロナン」という用語は、遊離型、および細胞外基質成分などの付着型であり得るヒアルロン酸を指す。ＨＡという用語はさらに、例えば、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウムおよびヒアルロン酸カルシウムを含むヒアルロン酸塩のいずれかに関する。ＨＡ多糖は、交互のβ−１，３−グルクロン酸およびβ−１，４−グルコサミニド結合により連結された交互のＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびＤ−グルクロン酸残基からなる。ＨＡは、低分子量（例えば、ＭＷ＝１０４〜７．２×１０４の範囲）および／または高分子量（例えば、約ＭＷ＝３．１×１０５〜１．５×１０６ｋＤａの範囲）のものであり得る。ＨＡは、様々な鎖長のものであり得る。ヒアルロン酸は、細胞外基質および種々の腫瘍（乳房、脳、肺、皮膚ならびに他の器官および組織のものを含む）に対する高い親和性を有する。ＨＡは、ＣＤ４４細胞受容体の高い親和性を有する。
【００４７】
「ガゴマー」および「ガゴマー組成物」という用語は、互換的に使用され、脂質化グリコサミノグリカンの粒子に関する。一般に、ガゴマーは、脂質とカルボン酸含有グリコサミノグリカンを架橋することにより製造される生体付着性バイオポリマーである。「改善したガゴマー」、「強化したガゴマー」、「改善したガゴマー組成物」および「強化したガゴマー組成物」という用語は、互換的に使用され、本明細書に開示される、本発明のガゴマー組成物を含むことに関する。
【００４８】
「ｓｉＲＮＡ−ガゴマー」および「ガゴマー−ｓｉＲＮＡ」という用語は、互換的に使用され、ｓｉＲＮＡを封入した本発明の改善したガゴマーに関する。ｓｉＲＮＡ分子には、例えば、それだけに限らないが、短二本鎖ｓｉＲＮＡ（例えば、１８〜２５ヌクレオチド長である）が含まれ得る。ｓｉＲＮＡ分子は修飾されていても修飾されていなくてもよい。いくつかの実施形態では、ガゴマー中の全てのｓｉＲＮＡ分子が同一である。
【００４９】
本明細書で使用される「構築物」という用語は、１つまたは複数の核酸配列を含んでもよい人工的に構築したまたは単離した核酸分子を指し、核酸配列にはコード配列（すなわち、最終産物をコードする配列）、制御配列、非コード配列またはこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。構築物という用語は、例えば、ベクターを含むが、これに限定されるとみなされるべきではない。
【００５０】
「発現ベクター」は、異種核酸断片（例えば、ＤＮＡなど）を外来細胞に組み込むおよび発現する能力を有する構築物を指す。換言すれば、発現ベクターは、転写することができる核酸配列／断片（ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなど）を含む。多くの原核生物および真核生物発現ベクターが知られている、および／または商業的に入手可能である。適当な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内にある。いくつかの代表的な実施形態では、発現ベクターは、標的部位で二本鎖ＲＮＡ分子をコードすることができる。
【００５１】
本明細書で使用される「発現」という用語は、標的細胞中で所望の最終産物分子を産生することを指す。最終産物分子には、例えば、ＲＮＡ分子、ペプチドもしくはタンパク質など、またはこれらの組み合わせが含まれ得る。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「導入する」および「トランスフェクション」という用語は、互換的に使用され、例えば、核酸、ポリヌクレオチド分子、ベクターなどの分子を標的細胞（複数可）、より具体的には標的細胞（複数可）の膜に囲まれた空間の内部へ運ぶことを指す。分子は、例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（２０１１）により教示される、当業者に知られている任意の手段により標的細胞（複数可）に「導入する」ことができる。分子を細胞に「導入する」手段には、例えば、それだけに限らないが、ヒートショック、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＰＥＩトランスフェクション、電気穿孔、リポフェクション、トランスフェクション試薬（複数可）、ウイルス媒介導入など、またはこれらの組み合わせが含まれる。細胞のトランスフェクションは、例えば、ヒト細胞、動物細胞、植物細胞、ウイルス細胞などの任意の起源の任意の細胞型に行うことができる。細胞は、単離細胞、組織培養細胞、細胞系、生物体内に存在する細胞などから選択され得る。
【００５３】
本明細書で言及される場合、「標的部位」という用語は、核酸が向けられる位置および／または核酸が生物学的効果を及ぼす予定の部位を指す。いくつかの代表的な実施形態では、標的部位は、それだけに限らないが、培養細胞（初代細胞または細胞系由来細胞）、および生物体内の細胞；組織、器官、微生物（例えば、ウイルス、細菌、寄生生物など）などから選択されうる細胞である。生物は、それだけに限らないが、ヒトまたは動物などの哺乳動物、哺乳動物ではない動物（例えば、鳥類、魚類など）などの任意の生物でありうる。いくつかの代表的な実施形態では、標的部位は、細胞内位置または細胞小器官（例えば、核、細胞質など）である。
【００５４】
本明細書で使用される「治療する」および「治療」という用語は、疾患または状態の進行を抑止する、阻害する、遅くするまたは逆戻りさせる、疾患または状態の臨床症状を寛解させる、あるいは疾患または状態の臨床症状の出現を予防することを指す。「予防する」という用語は、本明細書において対象が障害または疾患または状態を獲得するのを防ぐこととして定義される。
【００５５】
「がんの治療」という用語は、以下の１つまたは複数を含むことに関する：がんの成長速度の低下（すなわち、がんは遅い速度であるがまだ成長している）；がん腫の成長の休止、すなわち、腫瘍成長の静止、および腫瘍が縮小するまたはサイズが減少する。この用語はまた、転移の数の減少、新たに形成される転移の数の減少、ある期から別の期へのがんの進行の緩徐化、およびがんにより誘導される血管新生の減少を含む。最も好ましい場合では、腫瘍が完全に排除される。治療を受けている対象の生存期間の延長、疾患進行時間の延長、腫瘍退縮などがこの用語にさらに含まれる。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は＋／−１０％を指す。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態によると、活性化グリコサミノグリカンと、そこに結合した脂質の組み合わせとを含む改善したガゴマー組成物であって、ガゴマー粒子が核酸分子を封入しており、ガゴマー粒子が核酸分子を所望の標的部位に送達するための送達システムとして使用される組成物が提供される。標的部位には、それだけに限らないが、細胞、組織、器官、微生物などの任意の標的部位が含まれ得る。標的部位はインビボ標的部位であってもインビトロ標的部位であってもよい。
【００５８】
いくつかの代表的な実施形態によると、改善したガゴマー組成物は、１種または複数の脂質の組み合わせを含む。組成物中の複数の脂質は天然源のものであっても合成源のものであってもよく、それだけに限らないが、カチオン性脂質、一級アミノ基を有する脂質および膜安定化脂質（膜安定剤）から選択され得る。例えば、カチオン性脂質は、それだけに限らないが、モノカチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、ＢＣＡＴ（Ｏ−（２Ｒ−１  ２−ジ−Ｏ−（１’Ｚ，９’Ｚ−オクタデカジエニル）−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート）、ＢＧＳＣ（ビス−グアニジニウム−スペルミジン−コレステロール）、ＢＧＴＣ（ビス−グアニジニウム−トレン−コレステロール）、ＣＤＡＮ（Ｎ’−コレステリルオキシカルボニル−３，７−ジアザノナン−１，９−ジアミン）、ＣＨＤＴＡＥＡ（コレステリルヘミジチオジグリコリルトリス（アミノ（エチル）アミン）、ＤＣＡＴ（Ｏ−（１，２−ジ−Ｏ−（９’Ｚ−オクタデセニル）−グリセロール）−３−Ｎ−（ビス−２−アミノエチル）−カルバメート）、ＤＣ−Ｃｈｏｌ（３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアニリン（エチル）カルバモイルコレステロール）、ＤＬＫＤ（Ｏ，Ｏ’−ジラウリルＮ−リジルアスパルテート）、ＤＭＫＤ（Ｏ，Ｏ’−ジミリスチルＮ−リジルアスパルテート）、ＤＯＧ（ジオレイルグリセロール）、ＤＯＧＳ（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン）、ＤＯＧＳＤＳＯ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−スクシニル−２−ヒドロキシエチルジスルフィドオルニチン）、ＤＯＰＣ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ＤＯＰＥ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン）、ＤＯＳＮ（ジオレイルスクシニルエチルチオネオマイシン）、ＤＯＳＰ（ジオレイルスクシニルパロモマイシン）、ＤＯＳＴ（ジオレイルスクシニルトブラマイシン）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（Ｎ’［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）、ＤＰＰＥＳ（ジ−パルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン）、ＤＤＡＢ（ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド）およびＤＯＤＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン）ならびにこれらの任意の塩およびこれらの任意の組み合わせから選択され得る。例えば、一級アミノ基を有する脂質（ホスファチジルエタノールアミン）は、それだけに限らないが、１，２−ジラウロイル−Ｌ−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈＰＥ）、１，３−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＤＰＰＥ）、１−パルミトイル−３−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−２−ホスホエタノールアミン（１，３−ＰＯＰＥ）、ビオチン−ホスファチジルエタノ��ルアミン、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）およびこれらの組み合わせから選択され得る。例えば、膜安定化脂質は、それだけに限らないが、コレステロール、リン脂質（例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、ジホスファチジルグリセロールなど）、セファリン、スフィンゴ脂質（スフィンゴミエリンおよびスフィンゴ糖脂質）、グリセロ糖脂質およびこれらの組み合わせから選択され得る。各可能性は別々の実施形態である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、脂質は、ＤＯＴＭＡ（Ｎ’［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）ではない。
【００６０】
いくつかの実施形態によると、ガゴマーの脂質組み合わせ（粒子状脂質組成物）中の種々の脂質間の比は変化し得る。いくつかの実施形態では、比はモル比である。いくつかの実施形態では、比は重量比である。いくつかの実施形態では、脂質群の各々は、約１％〜９９％のモル比／重量比であり得る。
【００６１】
いくつかの代表的な実施形態によると、種々の脂質間の比は、ガゴマー内に封入された核酸に関して最大有効性をもたらすように決定され得る。最大有効性には、それだけに限らないが、ガゴマーの安定性、ガゴマー内に封入された核酸の保護、核酸の所望の標的部位への標的化送達、標的部位で核酸により及ぼされる最大の生物学的効果；ガゴマー内の核酸の最高有効負荷能力などおよびこれらの組み合わせといった代表的なパラメータが含まれ得る。
【００６２】
いくつかの代表的な実施形態によると、脂質組成物がカチオン性脂質、膜安定化脂質および／または一級アミノ基を有する脂質を含む場合、脂質群の各々は約１％〜９９％のモル比または重量比となり得る。例えば、カチオン性脂質は脂質組成物の１０〜９０％となり得る；一級アミノ基を有する脂質は脂質組成物の１〜５０％となり得る；および膜安定化脂質は脂質組成物の１０〜９０％となり得る。以下は代表的な脂質組成物である：１．カチオン性脂質：３０〜８０％、一級アミノ基を有する脂質：５〜２５％、膜安定化脂質：１０〜５０％；２．カチオン性脂質：５０〜７０％、一級アミノ基を有する脂質：８〜１２％、膜安定化脂質：２０〜４０％；３．カチオン性脂質：５５〜６５％、一級アミノ基を有する脂質：９〜１１％、膜安定化脂質：２５〜３５〜５０％。
【００６３】
いくつかの実施形態によると、ガゴマーの核酸と脂質との間の重量比も、核酸による標的部位に対する最大の生物学的効果を達成するよう調整することができる。本明細書で例示されるように、ｓｉＲＮＡ分子に関して、高い脂質とｓｉＲＮＡの重量比が改善した生物学的効果をもたらすことが驚くべきことに、また予想外に分かった。ｓｉＲＮＡのレベルと生物学的効果との間に直接の相関はないことが予想外に分かった。理論または機構に拘束されることを望むものではないが、ｓｉＲＮＡのレベルと生物学的効果との間の直接の相関の欠如は、少なくとも一部は、標的部位の負荷能力に起因し得る、すなわち、ｓｉＲＮＡを利用して標的部位内の標的の発現を阻害する生物学的効果を及ぼす細胞内ＲＮＡｉ機構の過負荷が、ＲＮＡｉ機構の減少した活性をもたらし得る。したがって、最大応答を達成するために、標的部位に向けられるｓｉＲＮＡの量が、ＲＮＡｉ機構に過負荷をかけるべきである。したがって、ｓｉＲＮＡと脂質の重量比は１：１未満である。例えば、ｓｉＲＮＡと脂質組成物との間の重量比は１：１となり得る。例えば、ｓｉＲＮＡと脂質組成物との間の重量比は１：２となり得る。例えば、ｓｉＲＮＡと脂質組成物との間の重量比は１：５となり得る。例えば、ｓｉＲＮＡと脂質組成物との間の重量比は１：１０となり得る。例えば、ｓｉＲＮＡと脂質組成物との間の重量比は１：２０となり得る。
【００６４】
いくつかの実施形態によると、改善したガゴマーを調製するために使用されるグリコサミノグリカンには、任意の未修飾および／または修飾グリコサミノグリカンならびに修飾グリコサミノグリカンが含まれ得る。いくつかの実施形態では、グリコサミノグリカンは、それだけに限らないが、ＨＡ、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸およびこれらの塩から選択され得る。グリコサミノグリカンは、種々の長さのものであってよい。いくつかの代表的な実施形態では、グリコサミノグリカンは高分子量（ＨＭＷ）ＨＡである。いくつかの代表的な実施形態では、グリコサミノグリカンは低分子量（ＬＭＷ）ＨＡである。他の代表的な実施形態では、グリコサミノグリカンは種々の分子量を有するＨＡの組み合わせである。いくつかの実施形態によると、グリコサミノグリカンは、ガゴマーの他の構成要素と反応させる前に活性化され得る。例えば、活性化には、それだけに限らないが、グリコサミノグリカンを酸性化すること、架橋剤をグリコサミノグリカンに添加することなどが含まれ得る。代表的な実施形態では、架橋剤は、それだけに限らないが、ＥＤＣ（ＥＤＡＣ、ＥＤＣＩ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド）およびＤＩＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）から選択されるカルボジイミドであり得る。
【００６５】
さらなる実施形態によると、脂質組成物と反応させる前に、追加の分子／部分を最初にグリコサミノグリカンに付着させてもよい。追加の分子は、例えば、抗体、葉酸、ポルフィリンまたはレクチンであってよく、特異的標的部位への改善したガゴマーの標的化に使用することができる。追加の実施形態では、追加の分子／部分をガゴマーに付着させてもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約５０ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約１００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約２００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約５００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約７５０ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約１０００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約１５００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約２０００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約２５００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約３０００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約３５００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約４０００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約４５００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約５０００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約５００ｎｍを超える範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約５０ｎｍ〜１２ミクロンの範囲の粒径を有する。いくつかの実施形態では、脂質化グリコサミノグリカン粒子（ガゴマー）は、約５００ｎｍ〜５ミクロンの範囲の粒径を有する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、改善したガゴマー組成物は、ＤＯＴＭＡ（Ｎ’［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）を含まない。いくつかの実施形態では、改善したガゴマー組成物は、ＤＯＴＭＡ（Ｎ’［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド）を持たない。
【００６８】
いくつかの実施形態によると、核酸を送達するための改善したガゴマー組成物を調製する方法であって、以下のステップ：
ａ）粒子状脂質組成物を形成する：１種または複数の脂質を有機溶媒に所望の比で混合し；蒸発により均質な脂質混合物を形成し（例えば、液体膜の形態）；液体膜を適当な緩衝液に分散させ（懸濁し）；加熱脂質押出機中での順次脂質分散液濾過により所望の粒径（例えば、１０〜２００ｎｍのサイズ）を得るステップ；
ｂ）グリコサミノグリカンを活性化する：グリコサミノグリカンを酸性緩衝液に溶解し；架橋剤を添加して活性化グリコサミノグリカンを形成するステップ；
ｃ）ガゴマー組成物を形成する：ステップａ）の粒子状脂質組成物を核酸と所望の重量比で一定時間インキュベートし、その後活性化グリコサミノグリカンを添加して改善したガゴマー組成物を形成するステップ
の１つまたは複数を含む方法が提供される。
【００６９】
いくつかの実施形態によると、最も有効なガゴマー組成物を得るために、改善したガゴマー組成物を調製する方法は、ガゴマーの構成要素ならびに構成要素間の比を細かく調整する種々の修正を含んでもよい。修正には、例えば、それだけに限らないが、脂質組成物を形成するために使用される具体的な脂質、脂質組成物の脂質間の比、ガゴマー内に封入される核酸の素性、核酸と脂質組成物との間の比、使用される具体的なグリコサミノグリカン、グリコサミノグリカンと脂質組成物との間の比、反応が行われるｐＨ、反応が行われる温度、反応が形成される条件（攪拌の有／無）、種々のステップの時間長など、またはこれらの任意の組み合わせといったパラメータが含まれ得る。
【００７０】
代表的な実施形態によると、ｓｉＲＮＡ分子を封入した改善したガゴマー組成物を調製するために、本方法のステップは、ｓｉＲＮＡを送達するための最も強力なガゴマーを提供するための少なくとも以下の具体的に調整されたパラメータを含むことができる：粒子状脂質組成物が６０％のカチオン性脂質（例えば、ＤＯＴＡＰを含んでもよい）と、３０％の膜安定化脂質（例えば、コレステロールを含んでもよい）と、１０％の一級アミノ基を有する脂質（例えば、ＤＬＰＥを含んでもよい）とを含むことができる；脂質膜をｐＨ９．０でホウ酸緩衝液に溶解することができる；ｓｉＲＮＡと脂質組成物との間の重量比は１：１０となり得る；脂質組成物−ｓｉＲＮＡと活性化ＨＡとの間のインキュベーションの最終ステップを、攪拌なしで、３７℃で一晩中行うことができる。
【００７１】
いくつかの実施形態によると、本発明の改善したガゴマーを調製する方法は、本明細書においてさらに例示されるように（実施例１）、均一に分布した脂質組成物粒径を有利にもたらすことができる。
【００７２】
追加の実施形態では、ガゴマー構造の形成で、リポソームの形成はなく、むしろ、脂質組成物をグリコサミノグリカンに共有結合的に付着させる。
【００７３】
いくつかの実施形態によると、本発明の方法により形成される改善したガゴマーを、形成の種々の段階で凍結乾燥または脱水することができる。例えば、溶媒を除去した後および核酸を添加する前に脂質膜を凍結乾燥することができる。例えば、脂質−核酸組成物を凍結乾燥および容易に脱水することができる。例えば、ガゴマー（核酸を封入した脂質化グリコサミノグリカン）を凍結乾燥および容易に脱水することができる。
【００７４】
いくつかの実施形態によると、本発明の改善したガゴマー組成物は、高効率の封入を示す。いくつかの代表的な実施形態では、単一ガゴマーは、約７５００個のｓｉＲＮＡ分子を封入することができ、これは当技術分野で知られている他のｓｉＲＮＡ担体の封入能力よりも高い。
【００７５】
ここで、いくつかの実施形態による、核酸分子を封入した改善したガゴマーの構造の概略図である図１を参照する。図１に示されるように、例えば、ガゴマー１０などのガゴマーは、例えば、カチオン性脂質（例えば、図１でカチオン性脂質１６Ａ〜１６Ｃとして示されている）、一級アミノ基を有する脂質（例えば、図１で脂質１４Ａ〜１４Ｃとして示されている）および膜安定化脂質（例えば、図１で膜安定化脂質１８Ａ〜１８Ｃとして示されている）などの脂質の組み合わせで構成されており、これらの脂質が結びつく／付着して粒子状脂質組成物を形成し、これがさらにサイズを所望のサイズに減少させるためにフィルタ押出され得る。粒子状脂質組成物に、核酸分子（例えば、図１で核酸分子２０Ａ〜２０Ｃとして示されている）を添加する。負に帯電した核酸分子が、脂質組成物中の正に帯電したカチオン性脂質に結合することができる。カルボン酸残基を有する種々の長さの活性化グリコサミノグリカン分子（例えば、図１でグリコサミノグリカン分子１２Ａ〜１２Ｃとして示されている）が一級アミノ基を有する脂質の一級アミノ基と共有結合的に架橋して、脂質−核酸複合体を包んで保護外面を形成および改善したガゴマー構造を形成する。活性化グリコサミノグリカンと一級アミノ基を有する脂質との間に形成する共有結合に加えて、静電相互作用がガゴマーの種々の構成要素間で形成し、それによって、その構造をさらに安定化し、封入されている核酸に強化された保護をもたらす。いくつかの実施形態では、ガゴマー構造は球状である。ガゴマー構造は必ずしも球形を形成しない。
【００７６】
いくつかの代表的な実施形態では、図１に提示される改善したガゴマーは、以下の構成要素を含むことができる：カチオン性脂質はＤＯＴＡＰを含み、一級アミノ基を有する脂質はＤＬＰＥを含み、膜安定化脂質はコレステロールを含み、核酸分子は二本鎖ｓｉＲＮＡ分子を含み、グリコサミノグリカン分子は高分子量ヒアルロン酸（ＨＡ）を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態によると、また理論または機構に拘束されることを望むものではないが、図１に示される改善したガゴマー構造の形成により、封入された核酸を周囲環境から保護し、核酸を、核酸が放出されその生物学的効果を及ぼすことができる標的部位に送達するための有効な送達手段を提供する再現性のある制御された構造がもたらされる。形成された構造が各ガゴマー当たりの高い核酸の負荷能力を提供する。いくつかの代表的な実施形態では、単一ガゴマーが約７５００個のｓｉＲＮＡ分子を封入することができる。さらに、以下に示されるように、核酸およびグリコサミノグリカンを脂質組成物に添加し、ガゴマーを形成すると、ガゴマーは負電荷を獲得する。これはインビボ送達にとって特に重要であり、それによって核酸粒子を封入したガゴマーが正に帯電される生物体により認知されず、それによってガゴマー粒子に「ステルス」様相が与えられる。したがって、露出したカチオン性脂質を有さない核酸−ガゴマー粒子は、例えば、凝集体を形成するおそれがある血清タンパク質との望まれない相互作用を防ぐので粒子に追加の利益をもたらし、粒子は免疫応答を誘導せず、外部ＨＡが、粒子が外来粒子として識別されることを防ぎ、したがって、粒子が核酸の改善したインビボ送達手段となることを可能にする。特に、改善したガゴマー組成物は、インビボ投与時にカチオン性脂質により及ぼされる既知の毒性効果を防ぐ。
【００７８】
いくつかの実施形態によると、改善したガゴマー組成物を、それを必要とする生物の種々の病的状態の治療に使用することができる。
【００７９】
いくつかの実施形態によると、改善したガゴマー組成物は、そのままで投与され得る。いくつかの実施形態では、改善したガゴマー組成物は、溶液で投与され得る。いくつかの実施形態では、ガゴマー組成物は、任意の所望の投与経路によって投与するのに適した医薬組成物に製剤化され得る。代表的な投与経路には、それだけに限らないが、局所、経口または非経口といった経路が含まれる。意図した投与様式に応じて、使用される組成物は、例えば、錠剤、坐剤、丸剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤などの固体、半固体または液体剤形の形態、好ましくは正確な用量の単独投与に適した単位剤形とすることができる。医薬組成物は、改善したガゴマー、薬学的に許容される賦形剤を含むことができ、場合により、他の薬用剤、医薬品、担体、アジュバントなどを含むことができる。薬学的に許容される担体が、ガゴマー内に封入された核酸に対して不活性であり、使用条件下で有害な副作用も毒性も有さないものであることが好ましい。
【００８０】
いくつかの実施形態では、非経口投与用の注射用製剤を、液体溶液または懸濁液、注射前の液体への溶解もしくは懸濁に適した固体形態、または乳濁液として調製することができる。適当な賦形剤には、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどがある。さらに、所望であれば、投与される医薬組成物は、微量の、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどの、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤などの非毒性補助剤を含有してもよい。水性注射懸濁液は、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよび／またはデキストランを含む懸濁液の粘度を増加させる物質を含有してもよい。非経口製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数回用量密閉容器中に存在することができ、使用直前に、注射のために例えば、水などの滅菌液体担体を添加することのみを要するフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保管することができる。
【００８１】
他の実施形態では、経口投与のために、薬学的に許容される非毒性組成物を、例えば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、クロスカルメロースナトリウム、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤のいずれかを組み込むことにより形成することができる。このような組成物には、液剤、懸濁剤、錠剤、分散性錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放製剤などが含まれる。経口投与に適した製剤は、水、食塩水またはオレンジジュースなどの希釈剤に溶解した有効量の化合物（複数可）などの液剤；それぞれ所定量の有効成分を固体または顆粒として含有するサシェ、ロゼンジおよびトローチ剤；散剤、適当な液体中の懸濁剤；ならびに適当な乳剤からなることができる。液体製剤は、薬学的に許容される界面活性剤、懸濁化剤または乳化剤を添加してもしなくてもよい、水およびアルコール（例えば、エタノール、ベンジルアルコールおよびポリエチレンアルコールなど）などの希釈剤を含んでもよい。
【００８２】
投与される改善したガゴマー組成物の用量を決定することにおいて、投与の用量および頻度は、ガゴマー内に封入される具体的な核酸分子の薬理学的特性に関連して選択される。
【００８３】
いくつかの代表的な実施形態では、ガゴマー−ｓｉＲＮＡを、ｓｉＲＮＡの素性、標的部位などに応じて、種々の病的状態の治療に使用することができる。代表的な病的状態は、それだけに限らないが、種々の型のがん、種々の感染症（例えば、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症など）、自己免疫疾患、神経変性疾患、炎症（例えば、クローン病、大腸炎などの炎症性腸疾患）、目に関連する症候群および疾患、肺に関連する疾患、胃腸に関連する症候群および疾患などから選択され得る。
【００８４】
いくつかの代表的な実施形態では、空のまたは核酸を封入した（ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物など）、改善したガゴマーを、がんの治療に使用することができる。がんは、細胞の集団が、様々な程度で、増殖および分化を正常に支配する制御機構に反応しなくなった障害である。がんは、異なる部位への転移を含む、種々の型の悪性新生物および腫瘍を指す。改善したガゴマーおよび／または改善したガゴマー−核酸（ガゴマー−ｓｉＲＮＡなど）組成物によって治療することができるがんの非限定的例には、卵巣がん、前立腺がん、乳がん、皮膚がん、黒色腫、結腸がん、肺がん、膵がん、胃がん、膀胱がん、ユーイング肉腫、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、頭頸部がん、腎がん、骨がん、肝がんおよび甲状腺がんがある。がんの具体的な例としては、それだけに限らないが、腺癌、副腎腫瘍、エナメル上皮腫、未分化腫瘍、甲状腺細胞の未分化癌、血管線維腫、血管腫、血管肉腫、アプドーマ、銀親和性細胞腫、男性化細胞腫、腹水腫瘍細胞、腹水腫瘍、星状芽細胞腫、星状細胞腫、毛細血管拡張性運動失調、心房粘液腫、基底細胞癌、骨がん、骨腫瘍、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳がん、バーキットリンパ腫、癌腫、小脳性星状細胞腫、子宮頸がん、老人性血管腫、胆管癌、胆管腫、軟骨芽細胞腫、軟骨腫、軟骨肉腫、絨毛芽腫、絨毛癌、結腸がん、コモン急性リンパ芽急性白血病、頭蓋咽頭腫、嚢胞癌、嚢胞線維腫、嚢腫、細胞腫、Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌、導管乳頭腫、未分化肺細胞腫、脳腫瘤、子宮内膜癌、内皮腫、上衣腫、上皮腫、赤白血病、ユーイング肉腫、節外性リンパ腫、ネコ肉腫、線維腺腫、線維肉腫、甲状腺の濾胞がん、神経節膠腫、ガストリノーマ、多形性膠芽腫、膠腫、性腺芽細胞腫、血管芽腫、血管内皮芽細胞腫、血管内皮腫、血管周囲細胞腫、血管リンパ管腫、血球芽細胞腫、血液細胞腫（ｈａｅｍｏｃｙｔｏｍａ）、有毛細胞白血病、過誤腫、肝臓癌腫、肝細胞癌、ヘパトーマ、組織腫、ホジキン病、副腎腫、浸潤がん、浸潤性乳管細胞癌、インスリノーマ、若年性血管線維腫、カポジ肉腫、腎腫瘍、大細胞型リンパ腫、白血病、慢性白血病、急性白血病、脂肪腫、肝がん、肝転移、リュッケー癌（Ｌｕｃｋｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、リンパ節腫、リンパ管腫、リンパ球性白血病、リンパ球性リンパ腫、リンパ細胞腫、リンパ浮腫、リンパ腫、肺がん、悪性中皮腫、悪性奇形腫、肥満細胞腫、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、中皮腫、転移がん、モートン神経腫、多発性骨髄腫、骨髄芽球腫、骨髄性白血病、骨髄脂肪腫、骨髄腫、筋芽細胞腫、粘液腫、鼻咽頭癌、腎芽腫、神経芽細胞腫、神経線維腫、神経線維腫症、神経膠腫、神経腫、非ホジキンリンパ腫、乏突起膠腫、視神経膠腫、骨軟骨腫、骨原性肉腫、骨肉腫、卵巣がん、乳房ページェット病、パンコースト腫瘍、膵がん、褐色細胞腫、褐色細胞腫、形質細胞腫、原発性脳腫瘍、胎児転位腫、プロラクチノーマ、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、横紋肉腫、固形腫瘍、肉腫、続発性腫瘍、精上皮腫、皮膚がん、小細胞癌、扁平上皮癌、ストロベリー血管腫、Ｔ細胞リンパ腫、奇形腫、精巣がん、胸腺腫、絨毛性腫瘍、腫瘍化、前庭神経鞘腫、ウィルムス腫瘍、またはこれらの組み合わせといった型が挙げられる。
【００８５】
したがって、いくつかの実施形態によると、がんを治療する方法であって、ガゴマーまたはガゴマー−ｓｉＲＮＡまたはこれを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、それを必要とする対象のがんを治療する方法であって、ガゴマー−ｓｉＲＮＡまたはガゴマー−ｓｉＲＮＡを含む医薬組成物を対象に投与し、それによって対象のがんを治療するステップを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、がんを治療するための、ガゴマー−ｓｉＲＮＡまたはこれを含む医薬組成物の使用が提供される。
【００８６】
いくつかの代表的な態様および実施形態を上で論じてきたが、当業者であれば、一定の修正、並べ替え、付加およびこれらの部分的組み合わせを認識するだろう。そのため、以下の添付する特許請求の範囲および今後導入される特許請求の範囲は、その真の精神および範囲内にあるように、全てのこのような修正、並べ替え、付加および部分的組み合わせを含むものと解釈されることが意図されている。
【００８７】
以下の実施例は、本発明の一定の実施形態をより完全に説明するために提示される。しかしながら、これらの例は、何ら本発明の広範な範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。当業者であれば本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書において開示される原則の多くの変形および修正を容易に考案することができる。
【００８８】
実施例
実施例１−ｓｉＲＮＡを封入した改善したガゴマー組成物の調製
ａ）脂質組成物の調製：
以下の脂質（表１）を、９５％エタノールを含むガラス煮沸フラスコに秤量し、攪拌しながら６５℃の水浴に溶解した。
【表１】
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【００８９】
透明懸濁液を含むフラスコを、Ｂｕｃｈｉ２１０エバポレーターに入れ、液体膜を形成する（完全な真空、６０℃）。エタノール蒸発を確認するために、フラスコをＮ２流下に２０〜３０秒間置いた。６０℃水浴中で１５〜３０秒間のフラスコの回転により、１０ｍｌ  １００ｍＭ  ｐＨ９．０ホウ酸緩衝液に液体膜を分散させる。次いで、フラスコをフル旋回回転で２分間ボルテックスし、オービタルシェーカーにおいて３７℃で２時間インキュベートする。加熱（６０℃）脂質押出（サーモバレル脂質押出、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ）において、種々のフィルタ（２００ｎｍ（×５）、１００（×５）、２００（×１））を通した順次脂質分散濾過により、所望の脂質粒径（８０〜２００ｎｍ）を得る。
【００９０】
ｂ）ヒアルロン酸の活性化
透明溶液が得られるまで攪拌しながら、３７℃で１時間、ヒアルロン酸を酢酸緩衝液（１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、カタログ番号１２７−０９−３）、１１１ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０）に溶解して２ｍｇ／ｍｌの最終濃度にする。
【００９１】
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ架橋剤）を２０×ＨＡ（ｗ／ｗ）で添加し、攪拌／振とうしながら３７℃で１時間インキュベートする。
【００９２】
ｃ）ガゴマー組成物形成
ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ緩衝液中ストック１００μＭ、Ｄａｒｍａｃｏｎ）２μｌ（２．６６μｇ）をＯｐｔｉＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２．６８μｌに添加し、脂質担体（１０ｍｇ／ｍｌ）２．６６μｌ（２６．６μｇ）とともに室温で１５分間インキュベートする。ＨＡ−ＥＤＣ（５．３２μｇ  ＨＡ）２．６６μｌを添加し、攪拌せずに３７℃で一晩インキュベートする。
【００９３】
実施例２−ガゴマーの粒子状脂質組成物の粒径分布
図２Ａ〜図２Ｃに示される結果は、脂質組成物の粒径分布を示すＺｅｔａＳｉｚｅｒを使用した分析からのものである。
【００９４】
図２Ａに示される結果は、４００ｎｍ（×４）、２００ｎｍ（×４）、１００ｎｍ（×４）および５０ｎｍ（×４）ｎｍのフィルタと通した押出後に調製された粒子状脂質組成物のものである。結果は、粒径が均一ではないことを示している。主ピーク（６２．７％）は、４００ｎｍ粒径を超えるものであり、約３０％のみが所望の１００〜１５０ｎｍ粒径のものである。
【００９５】
図２Ｂおよび図２Ｃに示される結果は、２００ｎｍ（×７）および２００ｎｍ（×５）フィルタを通した脂質組成物の押出後の、本発明の方法により調製（実施例１に詳述のように調製）された粒子状脂質組成物のものである。結果は、単一の固有のピークが、１００％分布で得られ、これは約１３５ｎｍの平均粒径で極めて再現性があることを示している。
【００９６】
したがって、結果は、本発明の方法により調製された本発明の脂質組成物が、所望のナノメートルサイズで均一なサイズの粒子を提供することを示している。
【００９７】
実施例３−ｓｉＲＮＡ−ガゴマー構造の形成時の脂質組成物の特性変化
図３、パネルＡ〜Ｃに示される結果は、ゼータ電位（ｍＶ）の変化を示している：パネル（Ａ）：脂質組成物単独（ｓｉＲＮＡも活性化ＨＡも添加しない）−約＋６１．２ｍＶの正電荷。パネル（Ｂ）：ｓｉＲＮＡを添加すると、電荷が−６．０５ｍＶに減少する。パネル（Ｃ）：活性化ＨＡを脂質組成物−ｓｉＲＮＡに添加し、ガゴマー組成物を形成すると、電荷が平均約−２８．５ｍＶの負電荷に変化する。したがって、結果は、活性化ＨＡおよびｓｉＲＮＡを添加することにより、カチオン性脂質の正味の電荷が負にされることを示している。これはインビボ送達にとって特に重要であり、それによって粒子が正に帯電される体により認知されず、それによって粒子に「ステルス」様相が与えられる。ｓｉＲＮＡ−ガゴマー粒子が露出したカチオン性脂質を有さないという知見は、この粒子が凝集体を形成するおそれがある血清タンパク質との望まれない相互作用を防ぐので粒子に追加の利益をもたらす：粒子は、免疫応答を誘導せず、外部ＨＡが、粒子が外来粒子として識別されることを防ぐ。
【００９８】
実施例４−中に封入されたｓｉＲＮＡを保護する改善したガゴマー構造
改善したガゴマー内に封入された非修飾ｓｉＲＮＡは、３７℃で少なくとも３時間のインキュベーションに対してヒト血清中で安定であることが示されている。図４Ａに示される結果は、封入されたｓｉＲＮＡが安定で、分解されていない一方で、対照の非封入ｓｉＲＮＡが１時間のインキュベーション後に完全に分解されていることを示している。同様に、図４Ｂでは、対照ｓｉＲＮＡが６０分のインキュベーションで分解産物を示す一方で、ガゴマー内に封入されたｓｉＲＮＡが１８０分後でさえ保護されている。
【００９９】
図４Ｃに示される結果は、ガゴマー内に封入されたｓｉＲＮＡ（交互の２−Ｏ−メチル化を使用して化学修飾されたｓｉＲＮＡ）が、４８時間のインキュベーション後でさえヒト血清中で保護されていることをさらに示している。結果は、完全なガゴマー粒子構造（すなわち、脂質組成物およびＨＡを含むガゴマー構造）が最良の保護をもたらす一方で、脂質組成物のみを含みＨＡを含まない粒子がｓｉＲＮＡの保護においてそれほど有効でないことをさらに示している。
【０１００】
実施例５−改善したガゴマー組成物中のｓｉＲＮＡと脂質の重量比の決定
ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞に種々のガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物を導入し、ｐＧＰ（ＭＤＲ１）タンパク質の発現レベルを決定した。図５に示される結果は、種々の実験条件下でのＦＡＣＳ分析を示している。
【０１０１】
それぞれ異なる脂質とｓｉＲＮＡの重量比を有するいくつかのガゴマー組成物を試験した。驚くべきことに、結果は、高い脂質とｓｉＲＮＡの比で、標的部位に対するｓｉＲＮＡの改善した効果が観察されることを示している。図５に示されるように、１：１０のｓｉＲＮＡと脂質の比を有するガゴマー組成物でｐＧＰタンパク質の発現の最高の低下が見られる（上のパネル）一方で、１：２のｓｉＲＮＡと脂質の比を有するガゴマー組成物でｐＧＰの発現の最低の低下が観察される（下のパネル）。
【０１０２】
実施例６−改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物により媒介される種々の遺伝子の発現の低下
ＮＣＩ／ＡＤＲ−ＲＥＳ細胞系（ＮＡＲ）に、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物をトランスフェクトした（ｓｉＲＮＡ分子はＡｈａ１またはＫｉｆ１１に向けられたものである）。１００個の当該ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした２４時間後、細胞を回収し、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を使用してＡｈａ１およびＫｉｆ１１  ｍＲＮＡの発現レベルを測定した。試料をＰＩＰ（シクロフィリンＢ）遺伝子発現レベルに正規化した。図６Ａ〜図６Ｂに提示される結果は、２つの独立した実験からのものである。結果は、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ（それぞれ、ｓｉＡｈａ１およびｓｉＫｉｆ１１）により及ぼされたＡｈａ１（図６Ａ）およびＫｉｆ１１（図６Ｂ）の発現の相対的低下を示している。陰性対照は、ホタル細胞中でのみ内因的に発現するルシフェラーゼ遺伝子を標的化することができるルシフェラーゼ遺伝子に対して向けられたｓｉＲＮＡを封入したガゴマー（ｓｉＬｕｃ）による細胞のトランスフェクションとする。陽性対照として、試験ｓｉＲＮＡが活性であることを示すために、商業的に入手可能なｓｉＲＮＡトランスフェクション剤（リポフェクタミン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手）を使用してＡｈａ１およびＫｉｆ１１に対するｓｉＲＮＡ（それぞれ、Ｌｕｃ＋ｓｉＡｈａ１およびＬｕｃ＋ｓｉＫｉｆ１１）をトランスフェクトした。
【０１０３】
実施例７−改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物により媒介される種々の遺伝子の発現の低下−ｓｉＲＮＡの用量反応効果
実験を本質的に実施例６に記載されるように行った。種々の量の当該ｓｉＲＮＡ組成物を封入した当該ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物を細胞にトランスフェクトし、Ａｈａ１（図８Ａ）およびＫｉｆ１１（図８Ｂ）の発現の低下に対する効果を測定した。図８Ａ〜図８Ｂに提示される結果は、細胞にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡの量とｓｉＲＮＡにより及ぼされる生物学的効果との間に直接の相関がないことを示している。図７Ａに示されるように、１０ｎＭのＡｈａ１  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションがＡｈａ１の発現の最高の低下をもたらした一方で、同じｓｉＲＮＡの量を増加させても、Ａｈａ１の発現の低下に少ない効果しか及ぼさなかった。興味深いことに、最大量のｓｉＲＮＡ（２００ｎＭ）がＡｈａ１の発現に対する最低のｓｉＲＮＡ効果を示した。図７Ｂに示されるように、１００ｎＭのＫｉｆ１１  ｓｉＲＮＡのトランスフェクションがＫｉｆ１１の発現の最高の低下をもたらした一方で、同じｓｉＲＮＡの量を２００ｎＭに増加させると、Ｋｉｆ１の発現に対するｓｉＲＮＡの効果は著しく減少した。
【０１０４】
図７Ｃにさらに示されるように、Ｂ１６Ｆ１０細胞におけるガゴマー組成物により送達された遺伝子Ａ  ｓｉＲＮＡの用量反応効果。結果は、最大で１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡまでの有効濃度範囲を示している。
【０１０５】
実施例８−種々の細胞系における改善したガゴマー−Ａｈａ１−ｓｉＲＮＡ組成物により媒介されるＡｈａ１の発現の低下
実験を本質的に実施例６に記載されるように行った。Ｂ１６Ｆ１０マウスメラノーマ細胞系に以下をトランスフェクトした：ガゴマー−Ａｈａ１  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｈａｓａ１）、リポフェクタミン＋Ａｈａ１  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｈｓａ１＋リポフェクタミン）およびガゴマー−Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ（ｓｉルシフェラーゼ）。Ａｈａ１の相対的発現を測定した。結果は図８Ａの棒グラフに提示されている。ＬＬＣ−Ｄ１２２ヒト細胞系に以下をトランスフェクトした：ガゴマー−Ａｈａ１  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｈａｓａ１）およびリポフェクタミン＋Ａｈａ１  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｈｓａ１＋リポフェクタミン）。Ａｈａ１の相対的発現を測定した。結果は図８Ｂの棒グラフに提示されている。図８Ａ〜図８Ｂに提示されている結果は、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物が、マウスおよびヒト細胞系において当該ｍＲＮＡの発現を有効に低下させることを示している。
【０１０６】
実施例９−改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の細胞に対する免疫毒性効果の欠如
ＰＢＭＣ細胞を試験して改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の細胞に対する免疫毒性効果を検出した。免疫毒性効果の陽性対照として、１ｍｇ／ｍｌの濃度のＬＰＳを使用した。ＰＢＭＣ細胞を種々の濃度のＡｈａ１  ｓｉＲＮＡ−ガゴマー組成物とともにインキュベートし、免疫応答（サイトカインまたはインターフェロン応答により試験される）を測定した。３人の異なるドナーから単離したＰＢＭＣを使用して、アッセイ（ＥＬＩＳＡベースの市販のキット９−ＰＬＥＸヒトサイトカインキット、Ｑｕａｎｓｙｓ）を反復した。Ｍａｇｅｎ  Ｄａｖｉｄ  Ａｄｏｍ  Ｂｌｏｏｄ  ＢａｎｋからＰＢＭＣ  Ｆｉｃｏｌｌ系単離用の血液を得た。使用した種々の濃度のｓｉＲＮＡ−ガゴマーは、有効量（ＥＤ）（インビトロノックダウン）、ＥＤ×１０およびＥＤ×５０を表す１０、５０、５００ｎＭであった。
【０１０７】
図９Ａ〜図９Ｄに棒グラフとして示される結果は、全ての場合で、ＰＢＭＣのｓｉＲＮＡ−ＧＡＧとのインキュベーションが有意な免疫応答を誘導しなかった（サイトカインもインターフェロン応答も観察されなかった）ことを示している。結果は、ヒトドナーの固有変動性に由来する試験サイトカインの異なるベースラインレベルを有する各ドナーで同じ傾向を示している。図９ＡはＩＬ６発現の変化を示している；図９ＢはＩＬ１０発現の変化を示している；図９ＣはＩＮＦγ発現の変化を示している；そして図９ＤはＴＮＦα発現の変化を示している。各時点で、図９Ａ〜図９Ｄの各々の棒グラフは、以下の処理を表している（左から右へ）：１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ−ガゴマー、５００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ−ガゴマー；１０００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ−ガゴマー；１ｍｇ／ｍｌ  ＬＰＳ；対照、未処理細胞（ＰＢＭＣ）。
【０１０８】
実施例１０−カチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを含むガゴマー粒子とカチオン性脂質としてＤＯＴＭＡを含むガゴマー粒子の比較
カチオン性脂質としてＤＯＴＡＰを含むガゴマー粒子（「ＤＯＴＡＰ粒子」）またはカチオン性脂質としてＤＯＴＭＡを含むガゴマー粒子（「ＤＯＴＭＡ粒子」）のいずれかによるヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）のサイトカイン誘導を試験した。各組成物は、１：１０のｓｉＲＮＡ：脂質の一定比の同量の脂質（計：１μＭ）および同量のｓｉＲＮＡ（１００ｎＭ）からなる。ＨＡコーティングシェルを６０μｇのＨＡ／脂質１マイクロモルとなるよう定量化した。
【０１０９】
ＰＢＭＣを６人の健常志願者から単離し、細胞（２４ウェルプレートにおいて２０００００個の細胞／ウェル）を３連でインキュベートした。ＤＯＴＡＰ粒子（１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ、１μｇ脂質）、ＤＯＴＭＡ粒子（１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡおよび１μｇ脂質）を細胞に添加した。陰性対照は培地中の無処理ＰＢＭＣとする。ＬＰＳ（１μｇ／ｍＬ）が陽性対照として働いた。インキュベーションの２時間および６時間後で、細胞をＩＬ−６（炎症の包括的マーカー）、ＴＮＦ−αおよびＩＦＮ−γのＥＬＩＳＡに供した。結果はそれぞれ図１０Ａ〜図１０Ｃに提示される。
【０１１０】
図１０Ａに示されるように、ＤＯＴＭＡ粒子とのインキュベーションの早くも２時間後に強いＩＬ−６誘導を確認することができる。その４時間後にＩＬ−６濃度のさらなる増加が観察された。対照的に、ＤＯＴＡＰ粒子とのインキュベーションは、ＩＬ−６発現（濃度）のこのような誘導を誘導しなかった。
【０１１１】
同様に、図１０Ｂに示されるように、細胞をＤＯＴＭＡ粒子で処理すると、インキュベーションの２時間後でさえ高レベルのＴＮＦ−αが誘導された一方で、ＤＯＴＰＡ粒子による処理はこのような応答を誘導しなかった。図１０Ｃにさらに示されるように、細胞をＤＯＴＭＡ粒子で処理すると、２時間後でさえ高レベルのＩＦＮ−γが誘導された一方で、ＤＯＴＡＰ粒子による処理はこのような応答を誘導しなかった。
【０１１２】
要するに、結果は、驚くべきことに、ＤＯＴＭＡをカチオン性脂質としてガゴマー粒子組成物に使用すると、免疫毒性を誘導する一方で、カチオン性脂質ＤＯＴＡＰはこのような応答を誘導しないことを示している。
【０１１３】
実施例１１−ｓｉＲＮＡを担持した改善したガゴマー組成物のインビボでの時間依存性生体分布
無処理または担黒色腫マウスにおけるｓｉＲＮＡ−ガゴマーの時間依存性生体分布研究を試験するために、Ｃｙ５蛍光標識ｓｉＲＮＡを使用した。改善したガゴマー組成物内に封入されたＣｙ５標識ｓｉＲＮＡを無処理および担腫瘍マウスに注射し、器官（肝臓、腎臓、脾臓、肺および当該群の腫瘍）を１、６、２４、４８および７２時間後の異なる時点で回収した。凍結切片標本への共焦点顕微鏡を使用して蛍光を観察した。
【０１１４】
モデル誘導（皮下Ｂ１６Ｆ１０接種）：マウスに、１０５個の細胞／マウスのＢ１６Ｆ１０細胞を右歯面に、０．２ｍｌ／マウス（２９Ｇ針を備える０．３ｍｌインスリン注射器を使用）で皮下注射した（注射の約４８時間前にクリッピング）。
【０１１５】
ＩＶ注射：ｓｉＲＮＡガゴマー複合体（１０２．５μｌ／２５ｇマウス）を標準的手順にしたがって尾静脈を介してＩＶ注射した。手短に言えば、マウスを加熱灯の下に５分間置き、保定器に入れ、Ｇ３０針を備えた１ｍｌインスリン注射器を使用して、ガゴマーを尾静脈にゆっくり注射した。
【０１１６】
回収した器官の蛍光顕微鏡評価：回収した器官（腫瘍、肝臓、肺、脾臓および腎臓）を、室温で一晩、１０％中性緩衝ホルマリンで後固定し、次いで、４℃で一晩、３０％スクロース（ＩＣＮ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、カタログ番号１９０２７１）で凍結保護した。次いで、器官をＯ．Ｃ．Ｔ．Ｃｏｍｐｏｕｎｄ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ、カタログ番号４５８３）に移し、光から保護して４℃で一晩包埋した。新鮮なＯＣＴ中でＣｒｙｏｓｔａｔ（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ３０５０）を使用して５μｍ厚さの凍結組織切片を切断し、ＤＡＰＩ含有水性マウント媒体Ｆｌｕｏｒｏｓｈｉｅｌｄ（Ｓｉｇｍａ）を用いてＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓスライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｊ１８００ＡＭＮＺ）上にマウントした。共焦点顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  ３００およびＬＳＭ  Ｚｅｉｓｓ  ７１０）を使用して切片を評価し、ＺＥＮ２００９ソフトウェアを使用して画像を取得した。組織学的（顕微鏡）検査が特異的細胞または構造内に明確な蛍光シグナルを示した場合にのみ、組織断片を陽性（すなわち、ＧＡＧ−Ｃｙ５  Ｌｕｃ  ｓｉＲＮＡ導入成功／細胞内組み込みが起こった）とみなした。背景ＤＡＰＩ染色により、組織構造の同定を補助した。対照（未処理）組織を使用してＣｙ５自己蛍光シグナルを定義し、この閾値を使用して画像を正規化した。
【０１１７】
ここで、Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡを封入したガゴマー投与後の示した時点で回収した無処理または担腫瘍マウスの肝臓切片の共焦点顕微鏡ピクトグラムを示す図１１Ａを参照する。図１１Ａに示される結果は、全ての観察されたＣｙ５−ｓｉＲＮＡが血管内に見られ、隣接細胞中に蛍光が見られないことを示している。無処理マウスと担腫瘍マウスとの間の蛍光レベルの著しい差がさらに注目に値する。
【０１１８】
ここで、肝臓切片の高分解能分光顕微鏡画像を示す図１１Ｂを参照する。結果は、全ての観察されたＣｙ５−ｓｉＲＮＡが血管および類洞内に見られ、隣接細胞中に蛍光が見られないことを示している。写真は、Ｃｙ５−ｓｉＲＮＡ投与の６時間後に撮影した。上のパネルは形態学的に関連する領域を示す肝臓のＨ＆Ｅ染色切片を表している。下のパネルは細胞核（ＤＡＰＩ染色した（点線矢印））および蛍光ｓｉＲＮＡ（実線矢印）を示している。
【０１１９】
ここで、Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡを封入したガゴマー投与後の示した時点で回収した無処理または担腫瘍マウスの脾臓切片の共焦点顕微鏡ピクトグラムを示す図１１Ｃを参照する。図１１Ｃに示される結果は、全ての観察されたＣｙ５−ｓｉＲＮＡが赤色物質中、血管内に見られ、細胞または白色物質中に蛍光が見られないことを示している。無処理マウスと担腫瘍マウスとの間の蛍光レベルの著しい差がさらに注目に値する。
【０１２０】
ここで、脾臓切片の高分解能分光顕微鏡画像を示す図１１Ｄを参照する。結果は、全ての観察されたＣｙ５−ｓｉＲＮＡが赤脾髄内に見られ、隣接細胞中に蛍光が見られないことを示している。写真は、Ｃｙ５−ｓｉＲＮＡ投与の６時間後に撮影した。上のパネルは形態学的に関連する領域を示す脾臓のＨ＆Ｅ染色切片を表している。下のパネルは細胞核（ＤＡＰＩ染色した（点線矢印））および蛍光ｓｉＲＮＡ（実線矢印）を示している。
【０１２１】
ここで、Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡを封入したガゴマー投与後の示した時点で回収した無処理または担腫瘍マウスの腎臓切片の共焦点顕微鏡ピクトグラムを示す図１１Ｅを参照する。図１１Ｅに示される結果は、蛍光が観察されないことを示している。
【０１２２】
ここで、腎臓切片の高分解能分光顕微鏡画像を示す図１１Ｆを参照する。結果は、蛍光が検出されないことを示している。写真は、Ｃｙ５−ｓｉＲＮＡ投与の６時間後に撮影した。左側のパネルは形態学的に関連する領域を示す腎臓のＨ＆Ｅ染色切片を表している。右側のパネルは細胞核（ＤＡＰＩ染色した（点線矢印））を示している。
【０１２３】
ここで、Ｃｙ５標識ｓｉＲＮＡを封入したガゴマー投与後の示した時点で回収した無処理または担腫瘍マウスの肺切片の共焦点顕微鏡ピクトグラムを示す図１１Ｇを参照する。図１１Ｇに示される結果は、全ての観察されたＣｙ５−ｓｉＲＮＡが赤色物質中、血管内に見られ、隣接細胞中に蛍光が見られないことを示している。無処理マウスと担腫瘍マウスとの間の蛍光レベルの著しい差がさらに注目に値する。
【０１２４】
ここで、肺切片の高分解能分光顕微鏡画像を示す図１１Ｈを参照する。結果は、全ての観察されたＣｙ５−ｓｉＲＮＡが血管内に見られ、隣接細胞中に蛍光が見られないことを示している。写真は、Ｃｙ５−ｓｉＲＮＡ投与の６時間後に撮影した。上のパネルは形態学的に関連する領域を示す肺のＨ＆Ｅ染色切片を表している。下のパネルは細胞核（ＤＡＰＩ染色した（点線矢印））および蛍光ｓｉＲＮＡ（実線矢印）を示している。
【０１２５】
ここで、Ｃｙ５−標識ｓｉＲＮＡを含むガゴマー組成物の注射後の異なる時点（１時間、６時間および２４時間）の担腫瘍マウスから得た種々の腫瘍／腫瘍領域の凍結切片の共焦点顕微鏡画像を示す図１２Ａを参照する。図１２Ａに示される結果は、Ｃｙ５−ｓｉＲＮＡが腫瘍の血管および細胞に見られ、約１時間後にピーク送達があることを示している。
【０１２６】
ここで、担腫瘍マウスから得た腫瘍の切片のＨ＆Ｅ組織学的染色を示す図１２Ｂを参照する。単離した腫瘍をＨ＆Ｅ染色して形態学的に関連する領域を観察した。腫瘍内に壊死の徴候は観察されなかったので、それによってＥＰＲ効果が最小化された。
【０１２７】
ここで、担腫瘍マウスから得た腫瘍の切片の高分解能分光蛍光顕微鏡画像を示す図１２Ｃを参照する。Ｃｙ５−ｓｉＲＮＡの蛍光は、投与６時間後に、腫瘍脈管構造内ならびに隣接メラニン形成細胞中の両方で観察された。図は、細胞核（ＤＡＰＩ、点線矢印）および蛍光ｓｉＲＮＡ（実線矢印）を示している。
【０１２８】
実施例１２−ｓｉＲＮＡを封入した改善したガゴマー組成物のインビボ投与の毒性効果の測定
ｓｉＲＮＡ分子を封入した改善したガゴマー組成物のインビボ投与（静脈内（ＩＶ）投与による）の毒性効果を測定するために、８〜１０週齢の４０匹のＣ５７ＢＬマウスを、表２に記載されるように、各々５匹のマウスの６つの実験群および１０匹のマウスの対照群に分けた。実験群Ｉ〜ＶＩに対して、０日に単回ボーラスＩＶ注射で尾静脈に投与する。投与は、個々の体重に基づいて一定の体積用量で行う。実験群ＶＩＩの動物を無処理正常対照として使用する。
【０１２９】
試験材料の説明：Ａｈａ１に対する二本鎖化学修飾ｓｉＲＮＡ。滅菌条件下で、ｓｉＲＮＡ粉末２０ｍｇを滅菌再蒸留水１ｍｌに溶解して透明な２０ｍｇ／ｍｌ溶液を得る。溶液を使用するまで−８０℃で保管する。２０ｍｇ／ｍｌ  ｓｉＲＮＡストック溶液（５０μｇ）２．５μｌを、１０ｍｇ／ｍｌストックからの１００μｌ脂質組成物溶液（５０μｌ（５００μｇ）および活性化（２ｍｇＥＤＣ）ヒアルロン酸５０μｌ（１００μｇ）と混合して、１００μｌ  ＷＦＩ中５０μｇ  ｓｉＲＮＡの最終濃度を得る。
【０１３０】
試験したパラメータ：屠殺動物の末梢血を一方は血漿用、一方は血清用の２本のチューブに分ける。血漿を使用して、１６−ｐｌｅｘサイトカインキット（Ｑｕａｎｓｙｓ）を用いてサイトカインレベル誘導を試験した。血清を使用して、肝臓酵素レベル（ＳＧＰＴ／ＡＬＴ、ＳＧＯＴ／ＡＳＴ）ならびにコレステロール、トリグリセリドおよびＨＤＬレベルを検出した。器官（肝臓、脾臓、肺および腎臓）を回収し、パラホルムアルデヒドでの固定およびパラフィンブロックでのブロッキング後に組織学的分析に供し、ＨＥで染色し、スライド上にマウントした。さらに、処置対無処理動物の体重の変化を測定した。
【表２】
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【０１３１】
処理および無処理動物の経時的（時間）体重（ｇ）の変化の折れ線グラフを示す図１３に示されるように、ガゴマー−ｓｉＲＮＡの投与は、試験動物の体重に影響を及ぼさなかった。実験全体を通じて体重を測定した。終末出血前に動物を加重した。
【０１３２】
図１４Ａ〜図１４Ｄは、試験マウスの血清中の種々の肝臓酵素および他の脂質のレベルを示す棒グラフを提示している（各時点でｎ＝５）。
【０１３３】
図１４Ａは、試験マウスから得た血清中の、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間／日）のＳＧＯＴ／ＡＳＴのレベル（ＩＵ／Ｌ）の棒グラフを示している。
【０１３４】
図１４Ｂは、試験マウスから得た血清中の、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間／日）のＳＧＰＴ／ＡＳＴのレベル（ＩＵ／Ｌ）の棒グラフを示している。
【０１３５】
図１４Ｃは、試験マウスから得た血清中の、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間／日）のコレステロールのレベル（ｍｇ／ｄＬ）の棒グラフを示している。
【０１３６】
図１４Ｄは、試験マウスから得た血清中の、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間／日）のトリグリセリドのレベル（ｍｇ／ｄＬ）の棒グラフを示している。
【０１３７】
図１４Ａ〜図１４Ｄに提示される結果は、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の試験動物への投与が、肝臓酵素ＡＬＴおよびＡＳＴの上昇に有意には影響を及ぼさなかったことを示している。同様に、コレステロール、トリグリセリドまたはＨＤＬレベルの有意な影響も観察されない。
【０１３８】
図１５Ａ〜図１５Ｄは、試験マウスの血液中の種々のサイトカインのレベルの棒グラフを提示している（各時点でｎ＝５）。
【０１３９】
図１５Ａは、試験マウスの血清中の、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間）のＩＬ−６の濃度（ｐｇ／ｍｌ）の棒グラフを示している。
【０１４０】
図１５Ｂは、試験マウスの血清中の、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間）のＩＬ−１０の濃度（ｐｇ／ｍｌ）の棒グラフを示している。
【０１４１】
図１５Ｃは、試験マウスの血清中の、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間）のＩＦＮγの濃度（ｐｇ／ｍｌ）の棒グラフを示している。
【０１４２】
図１５Ｄは、試験マウスの血清中の、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与後の異なる時点（時間）のＴＮＦαの濃度（ｐｇ／ｍｌ）の棒グラフを示している。
【０１４３】
図１５Ａ〜図１５Ｄに提示される結果は、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の試験動物への投与が、サイトカインの免疫応答を誘導しなかったことを示している。
【０１４４】
（ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物の投与７時間後に）試験マウスから得た組織の種々の組織学的切片の分析は、肺、肝臓、腎臓および脾臓においていかなる病理学的所見も異常な組織学的所見も示していない（それぞれ、図１６Ａ〜図１６Ｄ）。
【０１４５】
実施例１３−ガゴマー−ｓｉＲＮＡの全身送達は、腫瘍特異的遺伝子ノックダウンを示す
ガゴマーｓｉＲＮＡ組成物を、Ｂ１６−Ｆ１０接種５日後に、尾静脈を介してＩＶ投与し（０．４ｍｇ／ｋｇ）、動物を２４時間後に屠殺した。ガゴマーｓｉＲＮＡ組成物は、１．Ａｈａ１に対するｓｉＲＮＡを含むガゴマー組成物（「ｓｉＡｈａ１」、実施例１２に記載されるように調製）、および２．ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡを含むガゴマー組成物（「ｓｉＬｕｃ」、上記のように調製、Ｆ−Ｌｕｃに対するｓｉＲＮＡ、Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号ＲＤ−０１００３Ｋ７４）とした。製造指示書にしたがって、ＥＺ−ＲＮＡ（全ＲＮＡ単離キット、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カタログ番号２０−４００−１００）を使用して、全ＲＮＡを凍結試料（肝臓、肺および腫瘍組織）から抽出し、ＥｃｏＴＭ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムで、製造業者指示書にしたがって、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＶｅｒｓｏＴＭ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＢ−１４５３／Ｂ）を使用してｃＤＮＡを合成した。ＥｃｏＴＭ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲシステムで、製造業者指示書にしたがって、ＡＢｓｏｌｕｔｅ  ＴＭ  Ｂｌｕｅ  ＱＰＣＲ  ＲＯＸ  Ｍｉｘ（２Ｘ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＡＢ−４１３９／Ａ）を使用して、全組織試料におけるＡｈａ１遺伝子レベル発現の相対量を測定した。
【０１４６】
図１７Ａに提示される棒グラフに示される結果は、Ａｈａ１遺伝子の相対ｍＲＮＡ量（発現）が、いかなる処理下でも（対照ｓｉＲＮＡ−ガゴマー組成物でもＡｈａ１−ｓｉＲＮＡ−ガゴマー組成物でも）、非腫瘍組織では変化しなかった一方で、腫瘍組織では、Ａｈａ１遺伝子の発現が、ｓｉＡｈａ１−ガゴマーで処理したマウスでのみ特異的に低下した（最大で８５％の低下）が、対照（無処理マウス）でも対照ｓｉＬｕｃ−ガゴマー組成物で処理したマウスでも低下しなかったことを示している。
【０１４７】
次に、用量依存性実験を行い、それによって、マウスに種々の用量の種々のｓｉＲＮＡ−ガゴマー組成物を投与し、マウスを投与後の種々の時点で屠殺した。図１７Ｂに提示される棒グラフに示される結果は、腫瘍のＡｈａ１遺伝子の発現に対して特異的ガゴマー−ｓｉＲＮＡ（ｓｉＡｈａ）の用量依存性効果があることを示している。
【０１４８】
要するに、本明細書において提示される結果は、改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物がインビボで有用に機能し得ることを示している。さらに、これらの組成物は腫瘍部位を標的にし、用量依存的様式で遺伝子サイレンシング効果を特異的に及ぼすことができる。
【０１４９】
実施例１４−改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物は、全身投与後、インビボで転移肺の転移コロニーを特異的に標的にすることができる
前の実施例において本明細書の上で示されるように、皮下腫瘍モデルを使用して、改善したガゴマー組成物に製剤化された蛍光標識ｓｉＲＮＡの単回ＩＶ投与後の腫瘍特異的標的化が示された。血流中に蛍光が確認され、その後、皮下腫瘍への腫瘍細胞特異的送達が確認された。
【０１５０】
しかしながら、一般的には高度に発達した血管を伴わず、固形腫瘍と形態が異なる転移性増殖と対照的に、インビボ転移モデルを確立して、改善したガゴマー組成物が全身静脈内（ＩＶ）投与後に転移コロニーを特異的に標的にすることもできることを示した。使用したインビボ転移モデルは転移性肺癌とした。５×１０５個のＢ１６−Ｆ１０細胞をＣ５７ＢＬマウスに静脈内（ＩＶ）投与することによって、この転移モデルを確立した。注入マウスの肺を７、１０および１４日（ｎ＝５）に回収し、肉眼および組織学的分析に使用した。Ｂ１６−Ｆ１０細胞のＩＶ投与後の肺での転移の確立を示した。１０日に屠殺した動物は、実質侵入の初期化による胸膜下凝集を示す増殖によって、肺における転移コロニー形成の明確な徴候を既に示していた。結果は、Ｂ１６−Ｆ１０細胞の投与１０日後にマウスから得た肺の肉眼および組織学的分析を示す図１７Ａ〜図１７Ｃに示されている。図１７Ａ〜図１７Ｂに示されるように、転移コロニー形成を容易に確認（黒丸、および代表的なコロニーを示す矢印として確認）することができる。図１７Ｃの組織学的標本に示されるように、付随する実質侵入による胸膜下凝集の徴候を肺で確認することができる。
【０１５１】
確立した転移モデルを使用して、改善したガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物（蛍光標識により二重標識）を、Ｂ１６−Ｆ１０細胞を前に接種したマウスに全身投与した。二重蛍光標識を、Ｃｙ５標識（赤色）を使用した封入ｓｉＲＮＡおよびＦＩＴＣで標識したグリコサミノグリカン部分（この例ではヒアルロン酸（ＨＡ））に行った。ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物を投与した（ＩＶ、２ｍｇ／ｋｇ）マウスを投与後の種々の時点で屠殺し、明視野顕微鏡および蛍光画像化下で調査した。図１９Ａ〜図１９Ｄに提示される結果に示されるように、蛍光シグナル（ｓｉＲＮＡおよびガゴマー自体に起因する）が、肺転移に優先的に蓄積し、核酸、特にｓｉＲＮＡのための特異的標的化ビヒクルとしてのガゴマー組成物をさらに示している。より具体的には、蛍光シグナルを投与１時間後でさえ確認することができ、このシグナルは時間と共に増加する（投与３時間および７時間後）。Ｃｙ５蛍光標識およびＦＩＴＣ標識の共局在は、ガゴマー−ｓｉＲＮＡ組成物が全部腫瘍細胞に局在することを示している。
【０１５２】
転移モデルにおける蛍光標識の動態学は、固形皮下腫瘍（上に提示）で観察されるものとは異なる。固形皮下腫瘍に関しては、蛍光が早い時点でピークに達した一方で、転移性腫瘍に関しては、蛍光ピークが遅い時点でピークに達する。これは、２つの型の腫瘍（固形対転移性）の間の異なる血管新生に起因し得る。
【０１５３】
参考文献
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【図１】
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【図２Ａ】
2015514746.tif 000005
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
2015514746.tif 000011
【図５】
2015514746.tif 000012
【図６Ａ】
2015514746.tif 000013
【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
2015514746.tif 000015
【図７Ｂ】
2015514746.tif 000016
【図７Ｃ】
2015514746.tif 000017
【図８Ａ】
2015514746.tif 000018
【図８Ｂ】
2015514746.tif 000019
【図９Ａ】
2015514746.tif 000020
【図９Ｂ】
2015514746.tif 000021
2015514746.tif 000022
【図９Ｃ】
2015514746.tif 000023
【図９Ｄ】
2015514746.tif 000024
【図１０Ａ】
2015514746.tif 000025
【図１０Ｂ】
2015514746.tif 000026
【図１０Ｃ】
2015514746.tif 000027
【図１１Ａ】
2015514746.tif 000028
【図１１Ｂ】
2015514746.tif 000029
【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
2015514746.tif 000031
【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【国際調査報告】
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