(57)【要約】流体の存在を検出するためのＤＮＡトレーサーの使用についてのシステム、方法およびキットが提供され、さらに供給源特異的トレーサーの作成方法が含まれる。
2015523073.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体の汚染を判定するための方法であって、
流体のサンプルを準備する工程；
サンプルを洗浄する工程；
ＤＮＡトレーサーの存在または不在を検出するための第１のセットの試験を行う工程であって、ＤＮＡトレーサーはヘアピン構成およびダングリング末端のセットを含み、それによって、試験する流体中にＤＮＡトレーサーが存在することを検出することにより流体の汚染を判定するための試験段階を準備する工程を含む、方法。
【請求項２】
ＤＮＡトレーサーの存在を検出する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において複数のプライマーの混合物を使用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡトレーサーの存在を検出する工程が、ＤＮＡトレーサーと相互作用するユニバーサルトレーサーを使用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１のセットの試験から肯定的な結果が得られる場合に実行される第２のセットの試験を行う工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第１のセットの試験から不確実な結果が得られる場合に実施される第２のセットの試験を行う工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＰＣＲにおける各々のプライマーの対の単離試験をさらに含むダングリング末端のセットを識別する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
特定の流体供給源と一致するように、第２のセットの試験の結果を減少させる工程をさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
サンプルが配列増幅のためにエタノールリンスまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）阻害剤除去で洗浄される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
検出方法がゲル電気泳動を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
流体の汚染を判定するためのトレーサーであって、トレーサーがヘアピンおよびダングリング末端を含むＤＮＡ構造を含み、構造が耐久性であり、および構造が供給源の検出のために提供されるものである、トレーサー。
【請求項１１】
ヘアピンが、およそ半分に折り畳まれた一本鎖のＤＮＡを含み、一本鎖の一部分が一本鎖の別の部分とともに二本鎖化され、その折り畳まりにおいてループを有し、ループがヘアピンを形成するものである、請求項１０に記載のトレーサー。
【請求項１２】
ダングリング末端がＤＮＡ構造の一本鎖の他端と対形成しない、請求項１０に記載のトレーサー。
【請求項１３】
ダングリング末端が自由に浮遊した一本鎖ＤＮＡ構造を有する、請求項１０に記載のトレーサー。
【請求項１４】
トレーサーの配列が、天然に見出される現存のＤＮＡ配列から区別可能であり、終止コドン配列を含むものである、請求項１０に記載のトレーサー。
【請求項１５】
少なくとも１つのトレーサーを含む、流体の汚染を判定するためのシステムであって、少なくとも１つのトレーサーがヘアピンおよびダングリング末端を含むＤＮＡ構造を含み、構造が耐久性であり、および構造が供給源の検出のために提供されるものである、システム。
【請求項１６】
ヘアピンが、およそ半分に折り畳まれた一本鎖のＤＮＡを含み、一本鎖の一部分が一本鎖の別の部分とともに二本鎖化され、その折り畳まりにおいてループを有し、ループがヘアピンを形成するものである、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
ダングリング末端がＤＮＡ構造の一本鎖の他端と対形成しない、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
ダングリング末端が自由に浮遊した一本鎖ＤＮＡ構造を有する、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１９】
少なくとも１つのトレーサーが、１つの流体供給源特異的トレーサーをさらに含む、請求項１５に記載のシステム。
【請求項２０】
少なくとも１つの流体供給源特異的トレーサーが、地下水供給源、地表水供給源、流体汚染の潜在的な供給源、閉ループ工業活動システム、または閉ループエネルギー生成システムと関連している、請求項１９に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年６月３０日に出願された米国出願第６１／６６６，８４３号の利益を主張する２０１２年１１月２６日に出願された一部継続米国出願第１３／６８４，６７９号であり、その両者は参照によりその全体が組み込まれる。
【０００２】
本発明は、目的の流体の存在を判定することに関するものであり、より具体的には、そのような判定はＤＮＡトレーサーの使用を介して行われる。
【背景技術】
【０００３】
一例として、および本発明の背景として、地下水中の汚染物質の存在は、水圧破砕能力の上昇のために注目すべき関心事となっている。水圧破砕は、長年、活用されており、天然ガス、石油、シェールガス、および他の地下からのそのような物質を放出するために使用される。特に、従来の掘削方法のみを用いる生産が経済的に実現可能であるためには十分な伝導度がない領域における天然ガスまたは石油生産を刺激するために、坑井に地下注入された流体を使用する水圧破砕。通常、これらの流体は、砂および掘削会社間で異なる種々の化学混合物と混合した水または他の溶媒からなる。この混合物は、地下水および飲料水の供給を汚染すると疑われている。これらのケースについての汚染供給源を解決しようとする試みはあったが、ベースライン水質検査の不備または欠如および汚染の可能性のある他の供給源の存在のために多大な不確実性があるままである。
【０００４】
この水圧破砕プロセスは、そのような物質を抽出するための良い方法であるが、なお議論の余地がある。その議論は、地下水の汚染の可能性だけでなく、空気の汚染や他の様々な健康リスクを中心に展開している。現在、この水圧破砕プロセスで使用される方法および化合物の多くは、営業秘密の保護の下であり、したがって、汚染の可能性を評価するために利用可能な最小限の試験がある。
【０００５】
一般に、掘削会社がトレーサーサービスを利用することが知られているが、現在は、掘削の探索フェーズの間においては破砕診断の目的のみであり、水圧破砕フェーズの間においては水の汚染を判定する目的のためではない。
【０００６】
トレーサー技術は、水圧破砕からの逆流の試験から流体の出力に至るまでの、多くの機能を有している。剪断力に耐えるのに十分なほど安定であり、特に水圧破砕を目的とした、無毒性である、地下水を試験するためのＤＮＡトレーサー技術を具体化すると思われる特許のアイデアが、現在、欠如している。水圧破砕に関連するほとんどの特許および特許出願は、油回収および逆流の測定を扱っている。
【０００７】
技術分野内の関連文献の例としては、下記のものが含まれる：
【０００８】
２００８年４月１８日に出願され、２０１２年３月２７日に発行された、Ｓｏｄｅｒｂｕｎｄらによる、「混合物中のポリヌクレオチドの定量のための方法および試験キット、」についての、米国特許第８，１４３，３８８号は、混合物中のポリヌクレオチドの量または相対比率の定量のための方法および試験キットを記載している。試験キットは、１つ以上のプローブプールを含み、各々のプールは：複数の可溶性トレーサータグ付きポリヌクレオチドプローブであって、各々の単一のトレーサータグ付きポリヌクレオチドプローブはサンプル中の個々の標的ポリヌクレオチド配列に相補的であり；各々のポリヌクレオチドプローブのプールがその容器内に配置されている複数の容器であって、複数の容器が準備されるときは、それらは別々であってもまたは一緒に接合されていてもよく；前記トレーサータグ付きポリヌクレオチドプローブを分離する装置、を含む。また、ポリヌクレオチドプローブは、ＤＮＡフラグメント、合成ペプチド核酸（ＰＮＡ）、およびロックト核酸（ＬＮＡ）からなる群から選択される。試験キットは、細胞または組織サンプル中に存在する複数の分析ポリヌクレオチドの量を定量するための方法においても使用される。
【０００９】
「カプセル化されたトレーサーの使用」として、２００９年６月３日に出願され、２０１０年１２月９日に公開された、Ｌａｆｉｔｔｅらによる米国特許出願公開番号第２０１００３０７７４５号は、水脈内および／または単一の領域から延びる異なる水脈の異なる場所での識別可能な粒子のセットを配置することにより、水圧破砕で使用される地下貯水池におけるトレーサー粒子の識別可能なセットを使用する際のプロセスを記載しており、各々のトレーサーのセット内の粒子がトレーサーの１セットを互いに区別するユニークな物質を含有している。また、トレーサー粒子はカプセル化され、トレーサーは１０ミクロンから１００ミクロンの範囲のサイズである異なる粒子サイズと重量であり、そしてトレーサーは、坑井を経由して水圧破砕中に放出される。
【００１０】
２０００年１１月２９日に出願され、２００３年１１月１１日に発行された「貯水池のモニタリング」についてのＴａｙｅｂｉらによる米国特許第６，６４５，７６９号には、ゾーン／領域特有のものであり、その領域に固有であるトレーサーを使用することによる、ｐＨ、組成、塩分、微生物の変化を検出するための、領域およびゾーンからの炭化水素と水の生産をモニタリングするための方法が記載されている。この方法は、水のブレークスルーのための、または水平生産および注入井において改善された石油およびガス回収（ＩＯＲ）のための、ローカル警報システムにおける応用のために教示されている。様々な現象を検出するための特定の領域／ゾーンのために使用される監視システムであって、その領域またはゾーンに固有の特定のトレーサーを注入することを含み、トレーサーは固定化されており、化学的にインテリジェントであり、油またはガスと接触するときに放出され、そしてＤＮＡ、蛍光、微生物、燐光、または磁性粒子もしくは流体から構成されているものである、監視システムも開示されている。この方法は、蛍光や燐光などによる特定の刺激に反応するゾーンまたは領域における微生物の検出に焦点を当てて、検出は下流で測定される。
【００１１】
２００５年６月３０日に出願され、２００９年７月１４日に発行された、「流体輸送システムにおけるトレーサーの送達のためのシステムおよびその使用」についての、Ｓｔｒａｙらによる米国特許第７，５６０，６９０号には、液体系にトレーサー化合物をゆっくり放出するために使用される様々なトレーサー材料でドープしたメラミンホルムアルデヒド樹脂（ＭＦＲ）で構成される、特定のトレーサーの送達システムが記載されている。ＭＦＲは、様々なタイプのトレーサーでドープすることができ、それによって上流のいくつかの異なる位置で異なるトレーサーの配置を可能にし、様々な標識されたゾーンからの生産は、下流の１つのサンプルを分析することにより検証することができる。放射性および非放射性の両方であり得るトレーサー材料と組み合わせたＭＦＲは、上流で測定され、後に下流で測定される。放射性トレーサーは、充填剤、可塑剤、安定剤、および着色剤で充填させることができる一方で、非放射性トレーサーは、ナフタレンスルホン酸、アミノナフタレンスルホン酸、フッ素化安息香酸またはその塩を含んでいてもよく、さらに充填剤、可塑剤、安定剤および／または着色剤で構成され得る。ポリマートレーサーは、最大１年間、上流と下流の両方のシステムで活性である。
【００１２】
２００３年１１月１９日に出願され、２００８年３月４日に発行された「坑内水の化学的性質を分析するための装置および方法」についての、Ｒａｇｈｕｒａｍａｎらによる米国特許第７，３３９，１６０号は、水の化学的性質を分析するための地下で使用される装置が記載されており、水サンプルの化学的性質を示す水サンプルへの着色剤を提供する。さらに、装置は、フローラインに導入されるインジェクタを有し、フローラインには、その後、色素を注入するものであり、その後に比色分析器によって水の化学的性質を決定するために、二重らせんの混合物と混合される。また、上記のように水の化学的性質を決定するために、汚染された水にトレーサーを添加し、さらに着色剤を添加することによる、「坑内」水汚染の監視システムが開示されている。
【００１３】
さらに、核酸の検出は特定の遺伝子と既知の配列の存在およびコピー数を決定するために、広く用いられる。核酸の重要な特徴は、相補的な塩基配列を有する核酸との配列特異的水素結合を形成する能力である。核酸の相補鎖にハイブリダイズする核酸のこの能力は、ハイブリダイゼーションアッセイとして知られているものであり、ＤＮＡ精製技術において有利に使用されてきた。ハイブリダイゼーションアッセイにおいては、既知の配列を有する核酸は、相補的な核酸配列を有する標的核酸にハイブリダイズするプローブとして使用される。プローブを標識することは、ハイブリッドの検出と、それに対応して、標的核酸の検出を可能にする。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第８，１４３，３８８号
【特許文献２】米国特許出願公開番号第２０１００３０７７４５号
【特許文献３】米国特許第６，６４５，７６９号
【特許文献４】米国特許第７，５６０，６９０号
【特許文献５】米国特許第７，３３９，１６０号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明のように、サンプリングされた液体自体を汚染することなく、サンプリング液体中の供給源特異的な目的の流体の存在を検出するためのＤＮＡトレーサーを提供する先行技術は知られていない。したがって、当該技術分野において、安全かつ効果的な方法で液体サンプル中の目的の流体の存在を検出するための方法およびシステムを提供する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
バイオポリマーを使用して、汚染の疑いのある領域における目的の流体を検出するためのトレーサーを使用するための方法およびシステムを提供することが本発明の主要な目的である。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、トレーサーのバリエーションが発生供給源と互いに区別されることを可能にする、目的の流体を検出するためのトレーサーを使用するための方法およびシステムを提供することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、流体の毒性または放射能を増大させることなく、検出のために目的の流体に生体高分子を添加する方法を提供することである。
【００１９】
本発明の別の目的は、ＤＮＡ配列を生成するための方法、システム、およびキットを提供することである。
【００２０】
本発明のさらに他の目的は、高い塩分、高い温度（約７０℃超）、高い圧力、剪断力、またはそれらの組み合わせに耐えることができるトレーサーを提供することである。
【００２１】
本発明のこれらおよび他の目的および態様は、それらが特許請求される本発明をサポートするように、図面と共に考慮されるとき、好ましい実施形態の以下の説明を読む後に当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、ｍｆｏｌｄソフトウェアを使用したトレーサーの二次構造の描写を示す、本発明の一実施形態の図である。
【図２】図２は、図１に示された構造のエネルギードットプロットの図であり、トレーサー構造の自由エネルギーを示すものである。
【図３】図３は、ＤＮＡトレーサー構造を示す、ソフトウェア生成された本発明の一実施形態の別の図である。
【図４】図４は、終止コドンの配置構成オプションの概略図を示す図である。
【図５】図５は、天然に存在する配列との重複を最小化させたヌクレオチド配列およびシーケンス内の１つまたは複数の位置に配置された終止コドンを選択するための段階的な手順を含むフローチャートの図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
一般に図面を参照する際には、図は本発明の好ましい実施形態を説明するためのものであり、本発明をそれに限定することを意図するものではない。
【００２４】
本発明は、安全かつ効果的な方法で、液体サンプル中の目的の流体の検出に使用するためのシステム、方法、およびキットを提供する。本発明の一実施形態では、トレーサーと地下水または飲料水のモニタリングに関連する水圧破砕と共に使用するためのシステム、方法、およびキットを含む。先行技術は、液体を試験および測定する際に使用するＤＮＡトレーサーの改善について提供するが、いずれも水を汚染しないままに飲料水の安全性レベルを測定することに適用可能であるものは知られていない。
【００２５】
本発明は、目的の流体を検出するためのＤＮＡトレーサーを使用するためのシステム、方法、およびキットを提供し、供給源特異的トレーサーを生成する方法を含み、さらに供給源流体へのトレーサーの適用後のトレーサーを含んでもよい液体サンプルを適用し、解釈する方法を含む。本発明のいくつかの例示的実施形態は、水利権を分析し、地質学的または環境的修復を研究し、工業化学物質、廃棄物または流出物を追跡し、液化炭酸ガスの漏洩を検知し、生体試料により液体の流れを追跡し、その起源を決定するために燃料をマーキングし、エネルギー発生供給源を追跡するための、トレーサーの使用を含む。
【００２６】
トレーサーは、糖、リン酸基および核酸塩基または核酸塩基類似体からなる生体高分子であるヌクレオチド鎖からなる。好ましい実施形態では、ヌクレオチドがヌクレオチド類似体の代わりに用いられる。核酸塩基は、ＤＮＡにおいては、２つのヌクレオチド鎖間の架橋を形成する水素結合対を形成する、窒素系分子である。核酸塩基類似体はお互いに結合しない場合、非窒素系塩基が含まれるが、それでもヌクレオチド鎖の長さに沿った配列を形成することができる。ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体はまた、五炭糖、リボースまたは２−デオキシリボースのいずれか、およびリン酸基、Ｐ０４３−を含む。このように得られたヌクレオチド鎖は、特定の供給源用に設計された個々のトレーサーの各々にユニークなタグとしてカスタマイズすることができる配列を含有する。得られた鎖はまた、配列から形成された特定の水素結合を介して三次元（３−Ｄ）構造を形成することができ、コンパクトさを増加させる。
【００２７】
ヘアピン構造、ループ、またはスキャフォールディング構成を含むことができ、３−Ｄ構造は、高い剪断力への露出度を減少させ、温度または化学的分解に対する耐性を増加させる。好ましくは、単一のヘアピン構造は、耐久性と弾力性を付与する塩基ステップのループ部と、識別のために使用されるダングリング（ｄａｎｇｌｉｎｇ）末端の一対を含むように設けられている。鎖の長さおよび核酸塩基の特定の種類への分布も鎖の強度を高める。本発明の一実施形態の方法によれば、発生供給源の液体またはシステムに注入される前に、トレーサーは、水と混合し、目的の流体に添加される。他の実施形態においては、トレーサーは目的の流体と混合するためにより適切な他の液体と混合してもよい。一実施形態では、水圧破砕流体によって汚染されることが疑われるサンプルからの材料は、後にトレーサーについて分析される。このような実施形態では、個々のトレーサー配列は、個々の坑井にマッチングされ、汚染供給源である正確な坑井を同定し、したがって、水圧破砕流体による汚染を識別するための坑井特異的トレーサーを提供する。
【００２８】
本発明の一実施形態では、水圧破砕に使用される炭化水素貯留層に関連付けられた流体の存在を判定するための方法であって、下記の段階：ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体鎖を含むトレーサーを合成する段階であって、トレーサーは、水圧破砕条件を生存できる能力がある段階；トレーサーの配列を特定の坑井にマッチさせる段階；水でトレーサーを希釈し、そのようにして得られた混合物を水圧破砕流体中に挿入する段階；トレーサーが存在するかどうかを判定するために、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはアレイベースの電気検出のような方法によって、地下水などのような環境サンプルを分析する段階、を含む。
【００２９】
また、トレーサーは本質的に、各々の供給源について独自のトレーサーを有するように十分な多様なバリエーションを可能にするヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体配列からなる。好ましくは、トレーサーを水で希釈してもよく、水よりも毒性の任意の他の追加の材料を必要とせずに、目的の流体に直接添加してもよい。トレーサー自体は、生物学的に不活性であり、生物学的システムに重大な害をもたらすものではない材料からなる。本発明の一実施形態においては、そのようなトレーサーは、それが追加される水圧破砕流体よりも環境への毒性がないであろう。また、本発明のトレーサーは、それが添加された発生供給源流体内に見出される可能性がある高塩分、酸性ｐＨ、および高金属イオン含有量に耐えることができる。さらに、トレーサーは約７０℃超の検出温度を可能にするために十分な長さと、したがって、十分な耐久性がある。別の実施形態では、トレーサーは、約７０℃から１００℃の間の検出温度を可能にするために十分な長さと十分な耐久性がある。また、好ましくは、トレーサーは、糖およびリン酸鎖をアンフォールディングさせた長さに引き離すことが可能な剪断力に耐えることを可能とする三次元構成を形成することができる。
【００３０】
図１は、ｍｆｏｌｄソフトウェアを使用して、トレーサーの二次構造の描写を示す、本発明の一実施形態の図である。図２は、トレーサー構造の自由エネルギー（ΔＧ）を示す、図１に示す本発明の実施形態の図である。図２に示す例において、３７℃でのトレーサー１の折り目、下部三角は最適エネルギーを示し、プロットされた上部三角の塩基対は２２であり、最適エネルギーは−３５．６であり、プロットファイルにおけるデルタＧは０．０ｋｃａｌ／ｍｏｌである。図３は、ＤＮＡトレーサー構造を示す、本発明の一実施形態の三次元図を示す図である。特に、示されるように、本発明は、サンプル中の目的の流体の存在を検出するために使用されるＤＮＡトレーサーの方法、システム、およびキットを独自に提供するが、ここでトレーサーは、少なくとも６０％のＧ−Ｃ塩基対含量を含む。また、トレーサーは、配列の中央での極めて強い「ループ」と剪断力に耐えるのに十分なほど構造をコンパクトにしつつも、耐久性を付与する二本鎖ステムによって特徴付けられる。トレーサーは、供給源特異的トレーサーを提供するために様々な供給源について切り替えることができるユニークな識別子ダングリング末端を有している。特に、１００℃近辺でアンフォールディングするトレーサーのヘアピン構造がある；また、それは、より高い温度で分解しない。
【００３１】
本発明による分子特定するための方法において、トレーサーがＤＮＡ配列、核酸からなる、少なくとも１つのＤＮＡトレーサーが提供される。このような配列は、人工的に合成され、国立衛生研究所の簡易局所的アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）に基づくと、自然には見られない。ＤＮＡトレーサーは、図１、２および３に示すように、その一部が鎖の他の一部との二重鎖であって、折り畳み部分がループである約半分に折られた一本鎖であり、「ヘアピン」構造を形成し、他の末端とは対形成しない末端部分がダングリングし、浮遊している一本鎖ＤＮＡである。
【００３２】
本発明の一実施形態では、方法段階はさらに、例えば、限定ではなく一例として、水圧破砕作業の混合プロセスのような、特定の工業用途の正規プロセス中に目的の流体にトレーサーを加えることを含む。工業システム内に、混合から注入へ、連続的な流れがある場合には、注入の初期近くの流体にトレーサーを混合する。本発明の一実施形態では、フローバックまたは水圧破砕システムの生成水を、サンプリングのためおよびトレーサーが水中に存在することを確認するために提供する。
【００３３】
トレーサーを使用する方法の一実施形態においては、試験流体のためのシステムおよびキットが提供される。本発明の別の実施形態では、水サンプルはＰＣＲ阻害物質を除去するためにエタノールリンスで洗浄され、配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅され、その結果は、例えば、ゲル電気泳動などの検出方法を用いて検出される。２つのセットの試験が提供される：ＰＣＲにおける複数のプライマーの組み合わせを介するかまたはそのＤＮＡトレーサーと相互作用するユニバーサルトレーサーのいずれかを介して、本明細書に上述のように、本発明に記載のＤＮＡトレーサーの存在または不在を検出するための第１のセットの試験；ならびに、陽性結果または第１のセットの試験が不確実な結果であった場合のみに実施される第２のセットの試験。第２のセットの試験は、どのダングリング末端のセットが、検出されたＤＮＡトレーサーとともに使用されたかを識別する。ダングリング末端のセットを識別する段階は、ＰＣＲにおける各々の対のプライマーの試験を分離し、特定の坑井に一致する結果を絞り込むか減少させる（すなわち、坑井特異的トレーサーを検出する）ことを含む。
【００３４】
シーケンス生成。ＤＮＡ配列は、生物学的環境でのトレーサー成分として安全に使用するために設計された。生物学的環境のいくつかの例は、生体試料、注射可能な医薬品のような注射のために意図された製品、および生命の生態系に入ることができる物質を含む。
【００３５】
ＤＮＡ配列設計の第１の方法は、天然のＤＮＡでまれあるいは全く出現しない配列の選択を伴うものであった。ＤＮＡは、生物学的分子を生成するために生体によって使用される情報をコードしているため、自然界に見出される配列類似性を最小化しているＤＮＡトレーサー配列は比較的に生物学的に不活性であり、したがって、天然に存在する配列よりも安全であると期待される。
【００３６】
ＤＮＡ配列設計の第２の方法は、１つまたは複数の終止コドンをＤＮＡ配列に組み込まれることを追加要件として組み込んだ。終止コドンはＤＮＡ配列からのタンパク質翻訳を終結させ、したがって、それらの存在は、生物学的に不活性と、それゆえそれらの安全性を高めることが期待される。実証の目的のために、以下に同定された配列は、配列に対していくつかの異なる位置における終止コドンを含む。
【００３７】
配列セット番号１：天然に存在するＤＮＡ配列に対する最小類似性について設計されたＤＮＡ配列。Ｒ言語で書かれたソフトウェアを使用して、大気雑音に基づいたランダムな整数を生成するために乱数サーバ（ｒａｎｄｏｍ．ｏｒｇ）を使用した。１と４の間の整数である、これらの数値は、その後、核酸塩基（「Ａ、」「Ｔ、」「Ｇ、」「Ｃ」）に翻訳され、ユーザーが指定した長さ（この場合、３５ヌクレオチド長）に連結された。配列はユニークであって自然界には存在してなかったことを確認するために、配列は、既知の生物学的配列の国立衛生研究所ＢＬＡＳＴデータベースに対してバッチ−スクリーニングし、これらの配列から最も少ないアラインメントを持つ４つを保持した。
【００３８】
配列セット番号２：天然のＤＮＡ配列に対する最小類似性と、全体に分散した終止コドンを有することの両方について設計されたＤＮＡ配列。Ｒ言語を用いて、ユーザー指定の長さ（この場合、５１ヌクレオチド長）のランダムなＤＮＡ配列を生成するために、ソフトウェアが開発された。３つのランダムＤＮＡ終止コドン（「ＴＡＧ」、「ＴＡＡ」または「ＴＧＡ」）の１つがその後、指定された点において配列に意図的に挿入された。そのソフトウェアは６つの方法の１つを使用して終止コドンを挿入するように設計され（図４参照）、各々のカテゴリーに名前が与えられた。
【００３９】
第１（４００）：終止コドン（４０１）は配列の最前部３分の１内のランダムな点において挿入される。
【００４０】
第３（４０２）：終止コドン（４０３）は配列の後方部３分の１内のランダムな点において挿入される。
【００４１】
第２（４０４）：終止コドン（４０５）は配列の中央部３分の１内のランダムな点において挿入される。
【００４２】
第１第３（４０６）：終止コドンは配列の最前部（４０７）および後方部（４０８）３分の１内のランダムな点において挿入される。
【００４３】
相補配列（４０９）：終止コドン相補配列（「ＡＴＣ、」「ＡＴＴ、」または「ＡＣＴ」）は配列の最前部および後方部３分の１内のランダムな点（４１０）において挿入される。
【００４４】
３フレーム（４１１）：ランダムな終止コドンは各々の３つのリーディングフレーム（−１、０、および＋１）中に挿入される（４１２）。
【００４５】
非類似性要件および終止コドン要件のいずれかの両方を満たす配列は、追加の望ましい特性についてスクリーニングされ、次のセクションで説明され、図５に示したフローチャートによりまとめられた。
【００４６】
配列スクリーニング。
ステップ１（５００−ランダム）：１２０ランダム配列はＲソフトウェアのコードを使用して３回を超える実行を施して生成した。配列は、その後、４つのフィルタに通過させた：ＮＩＨのＢＬＡＳＴアラインメントアルゴリズムツール、挿入および付加的なバックグラウンドの終止コドンについての手動チェック、連続したモノヌクレオチド（塩基反復配列）、および二次構造の一般的な分析。
【００４７】
ステップ２（５０１−挿入終止コドン）：Ｒによって生成されたすべてのランダムな配列は、その後、６つの終止コドンの位置構成のいずれかにおいて終止コドンを含むように変更された。
【００４８】
ステップ３（５０２−非重複）：ステップ２からの配列は、国立衛生研究所の簡易局所的アラインメント検索ツール（ＢＬＡＳＴ）に入力した。既知の生物学的配列について１つまたは少数のアラインメントを有する配列のみを、ステップ４に渡した。
【００４９】
ステップ４（５０３−手動終止コドン検索）：アラインメントを１つだけ持つ配列について、そのアラインメントの長さをヌクレオチド塩基換算カウントについて決定した。次に、各々の終止コドン位置カテゴリーについて標的コドンを手動検索し、全コドン数についてカウントした。このカウントは、後で参照するために記録した。
【００５０】
ステップ５（５０４−連続塩基対検索およびスコア）：長いヌクレオチドの並び（ｒｕｎ；ラン）を含有する配列をスクリーニングした。Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧ塩基対の各々の並びの数を数えた。各塩基対について、最長の並びの長さを記録した；単一の候補配列のための並びの長さの合計は、予備非加重スコアを作成するために使用された。低いスコアを持つ候補配列は、我々の目的について、より高い適合性を有するとみなした。適格な配列は、その後、次のフィルタに渡された。
【００５１】
ステップ６（５０５−二次構造スコア）：標準状態（３７℃、１Ｍ  Ｎａ＋）での二次構造について候補配列を分析した。より少ない二次構造（ループ、擬似ノット）を示す配列がより好ましいと考えられ、これらの構造の数を、各々の配列について記録した。最終スコアは、各々の候補配列について、全塩基対のスコアおよび二次構造のスコアを合計することによって計算した。最も低いスコアを有する各々のカテゴリーからの代表的な配列が、承認された配列として選択された。
【００５２】
一実施形態では、１つまたは複数のトレーサーオリゴヌクレオチドは、試料採取時の生体試料に関連している。別の実施形態において、１つまたは複数のトレーサーオリゴヌクレオチドは、試料採取時の生物学的薬剤と関連している。トレーサーオリゴヌクレオチドは、特定のアイデンティティと関連している。採取後の時点では、試料は、既知の生物学的配列と重複が最小であるトレーサー配列からの干渉無しに、臨床的に関連する分析アッセイを受けることができる。さらに、試料のアイデンティティは、限定することなく一例として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）検出方法を用いて、生体試料の分析を行うことによって決定することができる。
【００５３】
別の実施形態では、少なくとも１つのトレーサーオリゴヌクレオチドは、識別のための採取時の試料と関連している。一例として、ＰＣＲ増幅プロセスの任意の時点において、試料の一部を採取してもよく、２つ以上のヌクレオチド配列：トレーサーオリゴヌクレオチドおよびＰＣＲ産物内の天然に存在するヌクレオチド配列、について試験してもよい。トレーサーおよびＰＣＲ産物オリゴヌクレオチドの検出は、いくつかの方法を用いて同時に行うことができる；そのような方法の１つは、相補的なオリゴヌクレオチド配列の使用である。
【００５４】
一実施形態では、認証で使用するための核酸配列を構築する方法は、以下の段階が含まれる：（１）ユーザーが指定した長さの複数の核酸配列をランダムに生成する段階；（２）複数の核酸配列を既知の生物学的配列と比較する段階；および（３）比較に基づいて、既知の生物学的配列について１つまたは０個のアラインメントを有する核酸配列を選択する段階。さらに、本実施形態は、複数の核酸配列のそれぞれに少なくとも１つの終止コドンを組み込む付加的な段階を含んでもよい。それとは別に、付加的な段階は、複数の核酸配列のそれぞれに少なくとも１つの終止コドンの相補配列を組み込むことを含んでもよい。それとは別に、付加的な段階は、核酸配列と既知の生物学的配列との間のアラインメントの長さを決定すること、および既知の生物学的配列とのアラインメントのうち、所定の長さを超えたアラインメントを有する核酸配列を除くことを、含んでもよい。それとは別に、付加的な段階は、核酸配列中の各ヌクレオチドについて連続したモノヌクレオチドの並びの長さを決定すること、および所定の長さを超えた、少なくとも１つの連続したモノヌクレオチドの並びを有する核酸配列を除くことを、含んでもよい。それとは別に、付加的な段階は、複数の核酸配列の各々の二次構造を決定すること、および所定の数を超えた、二次構造の数を有する核酸配列を除くことを、含んでもよい。以前の代替例において、二次構造は、一実施形態においては、ループおよび擬似ノットからなる群から選択され得る。
【００５５】
ある種の修飾および改良は、前述の記載を読む際に当業者に想起される。本発明に記載の方法、システム、およびキットは、特定の用途について記載されている一方で、限定ではなく一例として、水権を検出および追跡すること、科学的分析のために地下水や地表水システムをトレースすること、および例えば、環境修復のための地質学の研究のためにトレースすること、他の分野での説明責任のために化学物質、廃棄物または他の流体をトレースすること、炭素隔離、液化炭酸ガスの漏洩を検出すること、燃料をトレースすること、生命の生態系や生体試料を通る流体を追跡すること、またはエネルギー発生システムにトレーサーを埋め込むこと、に適用されてもよい。上記の実施例は、本発明の態様を明確にする目的に供するために提供されるものであり、それらは本発明の範囲を限定するものではないことは、当業者には明らかであろう。すべての修飾および改良は、簡潔性と可読性のために本明細書から削除されているが、適切に本発明の範囲内である。
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図１】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年3月3日(2015.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流体の汚染を判定するための方法であって、
流体のサンプルを準備する工程；
サンプルを洗浄する工程；
ＤＮＡトレーサーの存在または不在を検出するための第１のセットの試験を行う工程であって、ＤＮＡトレーサーはヘアピン構成およびダングリング末端のセットを含み、およびヘアピンが天然に存在しない配列を含み；
それによって、試験する流体中にＤＮＡトレーサーが存在することを検出することにより流体の汚染を判定するための試験工程を準備する工程を含む、方法。
【請求項２】
ＤＮＡトレーサーの存在を検出する工程が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において複数のプライマーの混合物を使用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＤＮＡトレーサーの存在を検出する工程が、ＤＮＡトレーサーと相互作用するユニバーサルトレーサーを使用することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第１のセットの試験から肯定的な結果が得られる場合に実行される第２のセットの試験を行う工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第１のセットの試験から不確実な結果が得られる場合に実施される第２のセットの試験を行う工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＰＣＲにおける各々のプライマーの対の単離試験をさらに含むダングリング末端のセットを識別する工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
サンプルが配列増幅のためにエタノールリンスまたはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）阻害剤除去で洗浄される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
検出方法がゲル電気泳動を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
流体の汚染を判定するためのトレーサーであって、トレーサーがヘアピンおよびダングリング末端を含むＤＮＡ構造を含み、ヘアピンおよび／またはダングリング末端が天然に存在しない少なくとも１つの配列を含む、トレーサー。
【請求項１０】
ヘアピンが、一本鎖の一部分が一本鎖の別の部分とともに二本鎖化されてステムを形成するように、およそ半分に折り畳まれた一本鎖のＤＮＡを含み、ステムが少なくとも２２塩基対を含む、請求項９に記載のトレーサー。
【請求項１１】
少なくとも１つのトレーサーおよび流体サンプルを含む組成物であって、少なくとも１つのトレーサーがヘアピンおよびダングリング末端を含むＤＮＡ構造を含み、およびヘアピンおよび／またはダングリング末端が天然に存在しない配列を含む、組成物。
【請求項１２】
ヘアピンが、一本鎖の一部分が一本鎖の別の部分と結合し、その折り畳まり部でループを持つ二本鎖ステムを形成するように、およそ半分に折り畳まれた一本鎖のＤＮＡを含み；およびステムが少なくとも２２塩基対を含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ヘアピン構造が、塩分、酸性ｐＨ、および金属イオン含有量を含む流体条件においてインタクトなままである、請求項９に記載のトレーサーまたは請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
ヘアピン構造が、摂氏約７０度以上の温度でインタクトのままである、請求項９に記載のトレーサー。
【請求項１５】
ヘアピン構造が、摂氏約７０度から摂氏約１００度の間の温度でインタクトのままである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
流体が、地下水、飲料水、地表水および水圧破砕流体による汚染が疑われる供給源からなる群から選択される環境サンプルを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
流体が、地下水、飲料水、地表水および水圧破砕流体による汚染が疑われる供給源からなる群から選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１８】
流体の汚染を判定するためのトレーサーであって、トレーサーがヘアピンおよびダングリング末端を含むＤＮＡ構造を含み、ダングリング末端が、天然に存在しない配列を含む、トレーサー。
【国際調査報告】
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