(57)【要約】  本発明は、有毛細胞における発現を誘導するための組成物、および該組成物を使用して蝸牛における発現を調節するための方法を提供する。さらに、そのような組成物は、感音難聴の治療、たとえば、機械受容器である有毛細胞の増殖の促進またはその生存期間の延長に有用である。
2015534818.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された核酸であって、
エストロゲン受容体（ＥＲ）またはそのフラグメントに作動可能に連結されたＡｔｏｎａｌホモログ１（Ａｔｏｈ１）またはそのフラグメントを含むポリペプチドをコードする配列を含み、Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントが核酸と結合して転写を活性化できること、およびＥＲまたはそのフラグメントがＥＲリガンドと結合できることを特徴とする核酸。
【請求項２】
前記Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントと前記ＥＲまたはそのフラグメントとがリンカーによって連結されている、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記ＥＲまたはそのフラグメントが、前記Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントのＣ末端に作動可能に連結されている、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、ＤｓＲｅｄ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰおよびＹＦＰからなる群から選択されるレポーターをさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項５】
前記レポーターが、前記Ａｔｏｈ１もしくはそのフラグメントまたは前記ＥＲもしくはそのフラグメントにリンカーで連結されている、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項６】
前記レポーターが、前記ＥＲまたはそのフラグメントのＣ末端に作動可能に連結されている、請求項５に記載の単離された核酸。
【請求項７】
前記ＥＲまたはそのフラグメントが、生理学的濃度の生体内１７β−エストラジオールに結合しないように修飾されている、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項８】
前記ＥＲリガンドが、４−ヒドロキシタモキシフェン、タモキシフェンおよびエストロゲンからなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、ＥＲリガンドとの接触により核に局在化される、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
請求項１のいずれかに記載の核酸を含むベクター。
【請求項１１】
哺乳動物細胞における発現に適した発現ベクターである、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２（Ｓｏｘ２）、Ｐｒｏｓｐｅｒｏホメオボックスタンパク質１（ｐｒｏｘ１）およびトランスフォーミング増殖因子β−活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）からなる群から選択される遺伝子のエンハンサーまたはプロモーターをさらに含む、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１０に記載のベクターを含むウイルス。
【請求項１４】
サイトメガロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびポリオーマウイルスからなる群から選択される、請求項１３に記載のウイルス。
【請求項１５】
請求項１０に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
インビトロ細胞、インビボ細胞またはエクスビボ細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
哺乳動物細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１８】
ヒト細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項１９】
腫瘍細胞株または不死化細胞株に由来する、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
有毛細胞または蝸牛細胞である、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
請求項１５に記載の細胞を含む異種移植片。
【請求項２２】
個体において難聴を治療または予防する方法であって、
難聴の治療または予防を必要とする個体に薬理学的有効量の医薬組成物を投与することを含み、該医薬組成物が、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはそのフラグメントに作動可能に連結されたＡｔｏｎａｌホモログ１（Ａｔｏｈ１）またはそのフラグメントを含む単離されたポリペプチドをコードする配列を含む核酸を含み、Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントが核酸と結合して転写を活性化できること、およびＥＲまたはそのフラグメントがＥＲリガンドと結合できることを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記難聴が感音難聴である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
個体において新形成を治療または予防する方法であって、
新形成の治療または予防を必要とする個体に薬理学的有効量の医薬組成物を投与することを含み、該医薬組成物が、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはそのフラグメントに作動可能に連結されたＡｔｏｎａｌホモログ１（Ａｔｏｈ１）またはそのフラグメントを含むポリペプチドをコードする配列を含む核酸を含み、Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントが核酸と結合して転写を活性化できること、およびＥＲまたはそのフラグメントがＥＲリガンドと結合できることを特徴とする方法。
【請求項２５】
前記新形成が、腸がん、結腸直腸がん、皮膚がん、脳がん（神経膠腫、髄芽腫など）および神経内分泌がんからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントと前記ＥＲまたはそのフラグメントとがリンカーによって連結されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＥＲまたはそのフラグメントが、前記Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントのＣ末端に作動可能に連結されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＥＲまたはそのフラグメントが、生理学的濃度の生体内１７β−エストラジオールに結合しないように修飾されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＥＲリガンドが、４−ヒドロキシタモキシフェン、タモキシフェンおよびエストロゲンからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリペプチドが、ＥＲリガンドとの接触により核に局在化される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３１】
ＤｓＲｅｄ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰおよびＹＦＰからなる群から選択されるレポーターをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３２】
前記レポーターが、前記Ａｔｏｈ１もしくはそのフラグメントまたは前記ＥＲもしくはそのフラグメントにポリペプチドリンカーで連結されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記レポーターが、前記ＥＲまたはそのフラグメントのＣ末端に作動可能に連結されている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、対象に投与されたベクターから発現されること、または前記ポリペプチドが、エレクトロポレーションによって前記個体の細胞に直接導入されることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ベクターが、哺乳動物細胞における発現に適した発現ベクターである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞が有毛細胞または蝸牛細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ベクターが、前記対象に投与されるウイルスに含まれている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記ウイルスが、サイトメガロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびポリオーマウイルスからなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが、前記対象に投与された宿主細胞において発現される、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記宿主細胞が、前記対象に投与される異種移植片に含まれている、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１２年１１月２日に出願された米国仮出願６１／７２２,０９４号に基づく優先権を主張するものであり、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
米国政府援助を受けた研究によりなされた発明に関する権利
本発明は、米国国立衛生研究所による助成Ｒ０３ＤＣ０１００６５号を受けてなされたものである。米国政府は本発明に関し一定の権利を保有する。
【背景技術】
【０００３】
失聴や難聴を持って生まれてくる子供の数は米国人１,０００人当たり３人（ＮＩＤＣＤ、２００８）であるが、一般に加齢とともに難聴を発症する可能性は高くなる。米国人成人の１７％がある程度の難聴を持っていると推定されている（ＮＩＤＣＤ、２００３）。６５歳以上では３０％が難聴を持ち、７５歳以上では難聴の割合は４７％にまで上昇する（ＮＩＤＣＤ、２００８）。病因に関係なく、蝸牛のコルチ器内に存在し機械受容能を有する有毛細胞の死滅や機能不全が感音難聴の主な原因となっている。たとえば、騒音やアミノグリコシド系抗生物質に過剰に曝露されることにより、有毛細胞が失われ、ひいては感音難聴（ＳＮＨＬ）を発症する。
【０００４】
現在のＳＮＨＬ治療は電子技術に基づいたものであり、たとえば、補聴器を用いて音声信号を増幅したり、残存しているラセン神経節細胞に人工内耳で電気刺激を与える処置がなされている。老人性難聴などの言語獲得後のＳＮＨＬの多くは、補聴器による増幅を利用して治療されている。弱度〜中程度の難聴を持つ人や高い語音弁別能を持つ人にとって補聴器は有益であるが、高度〜重度のＳＮＨＬを持つ相当数の人にとっては、補聴器の使用によるコミュニケーションの改善はわずかである。
【０００５】
高度〜重度のＳＮＨＬは一般に人工内耳を使用して治療され、残存している聴神経線維が人工内耳によって直接刺激される。高度〜重度のＳＮＨＬを持つ人が静かな環境下で音声認識を行うには、補聴器よりも人工内耳が効果的であることが分かっている。しかしながら、人工内耳を使用しても正常な聴力までには回復しない。また、人工内耳装用者は一般に暗騒音の存在下での聞き取りが困難であり、様々な音声刺激が入り混じった騒音がある場合には聞き取りはさらに困難となる。さらに、人工内耳装用者は、音の方向を特定することが比較的難しく、片側装用の患者においてこれは特に顕著である。また、人工内耳装用者は音の高さ（ピッチ）を認識することが難しいため、音楽を認識できず、インドのパンジャブ語や、標準中国語、広東語、台湾語などの中国語などの声調言語を発音することが困難である。それゆえ、声調言語を使用してコミュニケーションを取っている耳の不自由な多くの人々にとって、現在の人工内耳技術は不十分である。したがって、ＳＮＨＬの新たな治療法が早急に必要とされている。
【０００６】
塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子であるａｔｏｎａｌ−１（Ａｔｏｈ１、あるいはＭａｔｈ１とも呼ばれる）は、哺乳動物の有毛細胞の発達に関与している。蝸牛細胞におけるＡｔｏｈ１の発現は内耳有毛細胞の発生に重要かつ必要十分である。Ａｔｏｈ１を強制発現させることによって、失われた有毛細胞を再生できることが実験により示されているが、Ａｔｏｈ１で誘導した有毛細胞再生のメカニズムは完全には解明されていない。強制発現の欠点の１つはトランスフェクト細胞の遺伝子発現を制御できないことである。異常に高いレベルのＡｔｏｈ１が持続的に発現される構成的発現システムを使用するよりも、蝸牛環境などでＡｔｏｈ１の発現を調節できる誘導システムを使用する方が有利であるとともに、望ましいと考えられる。Ａｔｏｈ１を調節できないことが、現在進行中の有毛細胞に関する研究や有毛細胞再生用治療薬の開発において障害となっている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
以下に説明するように、本発明は、蝸牛における発現を調節または誘導するための組成物および方法であって、エストロゲン受容体リガンド（たとえば４−ヒドロキシタモキシフェン硫酸塩）との接触により核に局在化されるエストロゲン受容体に融合された修飾Ａｔｏｈ１転写因子を使用することによって、Ａｔｏｈ１応答性プロモーターを有する遺伝子の発現を活性化する組成物および方法を特徴とする。
【０００８】
一態様において、本発明は、単離された核酸であって、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはそのフラグメントに作動可能に連結されたＡｔｏｎａｌホモログ１（Ａｔｏｈ１）またはそのフラグメントを有するポリペプチドをコードする配列を持ち、Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントが核酸と結合して転写を活性化できること、およびＥＲまたはそのフラグメントがＥＲリガンドと結合できることを特徴とする核酸を提供する。
【０００９】
別の一態様において、本発明は、個体において難聴（たとえば感音難聴）を治療または予防する方法であって、難聴の治療または予防を必要とする個体に薬理学的有効量の医薬組成物を投与することを含み、該医薬組成物が、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはそのフラグメントに作動可能に連結されたＡｔｏｎａｌホモログ１（Ａｔｏｈ１）またはそのフラグメントを有するポリペプチドをコードする配列を持つ核酸を含み、Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントが核酸と結合して転写を活性化できること、およびＥＲまたはそのフラグメントがＥＲリガンドと結合できることを特徴とする方法を提供する。
【００１０】
さらに別の一態様において、本発明は、有毛細胞の成長、維持、生存または増殖を促進する方法であって、有毛細胞に核酸を投与することを含み、該核酸が、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはそのフラグメントに作動可能に連結されたＡｔｏｎａｌホモログ１（Ａｔｏｈ１）またはそのフラグメントを有するポリペプチドをコードする配列を持ち、Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントが核酸と結合して転写を活性化できること、およびＥＲまたはそのフラグメントがＥＲリガンドと結合できることを特徴とする方法を提供する。
【００１１】
さらに別の一態様において、本発明は、有毛細胞の死滅またはアポトーシスを抑制する方法であって、有毛細胞に核酸を投与することを含み、該核酸が、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはそのフラグメントに作動可能に連結されたＡｔｏｎａｌホモログ１（Ａｔｏｈ１）またはそのフラグメントを有するポリペプチドをコードする配列を持ち、Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントが核酸と結合して転写を活性化できること、およびＥＲまたはそのフラグメントがＥＲリガンドと結合できることを特徴とする方法を提供する。
【００１２】
別の一態様において、本発明は、個体において新形成を治療または予防する方法であって、新形成の治療または予防を必要とする個体に薬理学的有効量の医薬組成物を投与することを含み、該医薬組成物が、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはそのフラグメントに作動可能に連結されたＡｔｏｎａｌホモログ１（Ａｔｏｈ１）またはそのフラグメントを有するポリペプチドをコードする配列を持つ核酸を含み、Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントが核酸と結合して転写を活性化できること、およびＥＲまたはそのフラグメントがＥＲリガンドと結合できることを特徴とする方法を提供する。
【００１３】
さらに別の一態様において、本発明は、新生物細胞の成長、維持、生存または増殖を抑制する方法であって、新生物細胞に核酸を投与することを含み、該核酸が、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはそのフラグメントに作動可能に連結されたＡｔｏｎａｌホモログ１（Ａｔｏｈ１）またはそのフラグメントを有するポリペプチドをコードする配列を持ち、Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントが核酸と結合して転写を活性化できること、およびＥＲまたはそのフラグメントがＥＲリガンドと結合できることを特徴とする方法を提供する。
【００１４】
さらに別の一態様において、本発明は、新生物細胞の死滅またはアポトーシスを促進する方法であって、新生物細胞に核酸を投与することを含み、該核酸が、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはそのフラグメントに作動可能に連結されたＡｔｏｎａｌホモログ１（Ａｔｏｈ１）またはそのフラグメントを有するポリペプチドをコードする配列を持ち、Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントが核酸と結合して転写を活性化できること、およびＥＲまたはそのフラグメントがＥＲリガンドと結合できることを特徴とする方法を提供する。
【００１５】
関連する一態様において、本発明は、ポリペプチドであって、エストロゲン受容体（ＥＲ）またはそのフラグメントに作動可能に連結されたＡｔｏｎａｌホモログ１（Ａｔｏｈ１）またはそのフラグメントを有し、Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントが核酸と結合して転写を活性化できること、およびＥＲまたはそのフラグメントがＥＲリガンドと結合できることを特徴とするポリペプチドを提供する。さらなる一態様では、本発明は、本明細書に記載の態様のいずれかによるポリペプチドを含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
関連する別の一態様において、本発明は、本明細書に記載の態様のいずれかによる核酸を有するベクターを提供する。さらなる一態様では、本発明は、本明細書に記載の態様のいずれかによるベクターを含むウイルスを提供する。
【００１７】
関連するさらに別の一態様において、本発明は、本明細書に記載の態様のいずれかによるベクターを含む宿主細胞を提供する。さらなる一態様では、本発明は、本明細書に記載の態様のいずれかによる細胞を含む異種移植片を提供する。
【００１８】
本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントと上記ＥＲまたはそのフラグメントとはリンカーによって連結されている。本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記ＥＲまたはそのフラグメントは、上記Ａｔｏｈ１またはそのフラグメントのＣ末端に作動可能に連結されている。場合によっては、上記ポリペプチドはレポーターコンストラクトを含んでいない。別の場合には、上記ポリペプチドは、ＤｓＲｅｄ、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ＢＦＰ、ＣＦＰおよびＹＦＰからなる群から選択されるレポーターをさらに含んでいる。様々な実施形態において、上記レポーターは、上記Ａｔｏｈ１もしくはそのフラグメントまたは上記ＥＲもしくはそのフラグメントにリンカーで連結されている。特定の実施形態では、上記レポーターは、上記ＥＲまたはそのフラグメントのＣ末端に作動可能に連結されている。本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記ポリペプチドは、対象に投与されたベクターから発現される。様々な実施形態において、上記ポリペプチドは、上記対象に投与された宿主細胞において発現される。
【００１９】
本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記ＥＲまたはそのフラグメントは、生理学的濃度の生体内１７β−エストラジオールに結合しないように修飾されている。本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記ＥＲリガンドは、４−ヒドロキシタモキシフェン、タモキシフェンおよびエストロゲンからなる群から選択される。本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記ポリペプチドは、ＥＲリガンドとの接触により核に局在化される。
【００２０】
本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記ベクターは、哺乳動物細胞における発現に適した発現ベクターである。様々な実施形態において、上記ベクターはエンハンサーまたはプロモーターを含む。このコンストラクトは、容易に様々なプロモーターの制御下に置くことができ、それによって細胞特異的発現を誘導することができる。たとえば、治療用タンパク質、レポータータンパク質、バリアントまたはこれらのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、レトロウイルスベクターにクローニングすることができ、内在性プロモーター、レトロウイルスのロングターミナルリピート、または標的とする細胞種に特異的なプロモーターから発現を開始することができる。場合によっては、上記ベクターは、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２（Ｓｏｘ２）、Ｐｒｏｓｐｅｒｏホメオボックスタンパク質１（ｐｒｏｘ１）およびトランスフォーミング増殖因子β−活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１）からなる群から選択される遺伝子のエンハンサーまたはプロモーターを含んでいる。
【００２１】
本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記ベクターは、ウイルス（たとえば上記対象に投与されるウイルス）に含まれている。本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記ウイルスは、サイトメガロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびポリオーマウイルスの１以上である。
【００２２】
本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記ベクターは宿主細胞（たとえば上記対象に投与される宿主細胞）に含まれている。本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記宿主細胞は、インビトロ細胞、インビボ細胞またはエクスビボ細胞である。本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記宿主細胞は哺乳動物細胞またはヒト細胞である。本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記宿主細胞は腫瘍細胞株または不死化細胞株に由来する。本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記宿主細胞は有毛細胞または蝸牛細胞である。本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記宿主細胞は、上記対象に投与される異種移植片に含まれている。
【００２３】
本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記難聴は感音難聴である。本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記有毛細胞は蝸牛細胞である。本明細書に記載された態様の様々な実施形態において、上記新形成または上記新生物細胞の種類は、腸がん、結腸直腸がん、皮膚がん、脳がん（神経膠腫、髄芽腫など）および神経内分泌がんからなる群から選択される。
【００２４】
本発明は、Ａｔｏｈ１を核に局在化させてＡｔｏｈ１転写因子による制御下で遺伝子を発現することができる組成物および方法を提供する。本発明によって定義される組成物などは、後述する実施例を参照して単離または他の方法により製造された。本発明の他の特徴および利点は本発明の詳細な説明および請求項から明らかになるであろう。
【００２５】
定義
別途定義する場合を除き、本明細書で使用されている技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。当業者であれば、本発明で使用されている用語の一般的な定義の多くを以下の文献から理解できるであろう：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書において、以下の用語は、別途定義する場合を除き、以下に用語別に記載された意味を有する。
【００２６】
「薬物」は、任意の小分子化合物、抗体、核酸分子もしくはポリペプチド、またはこれらのフラグメントを意味する。
【００２７】
「改善する」は、疾患の発症または進行の低減、抑制、減弱、軽減、阻止または安定化を意味する。
【００２８】
「変化」は、本明細書に記載されているような標準的な公知の方法によって検出された、遺伝子またはポリペプチド（たとえばレポーター）の発現レベルまたは活性の変化（増加または減少）を意味する。本明細書において、変化は、発現レベルの１０％の変化、好ましくは発現レベルの２５％の変化、より好ましくは発現レベルの４０％の変化、最も好ましくは発現レベルの５０％以上の変化を包含する。
【００２９】
「類似体」は、元の分子と同一ではないが、類似した機能または類似した構造上の特徴を有している分子を意味する。たとえば、ポリペプチド類似体は、対応する天然のポリペプチドの生物学的活性を保持しながら、天然のポリペプチドよりも機能が増強されるような特定の生化学的修飾を有している。そのような生化学的修飾によって、類似体のリガンド結合性などを変えることなく、プロテアーゼ耐性や膜透過性を増強したり、半減期を延長したりすることができる。類似体は非天然アミノ酸を包含してもよい。
【００３０】
本明細書において「Ａｔｏｎａｌホモログ１」、「Ａｔｏｈ１」、「Ａｔｏｈ１タンパク質」または「Ａｔｏｈ１」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿００５１６３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドを指す。Ａｔｏｈ１は本発明での使用に適しており、エンハンサー配列／プロモーター配列に結合して転写を活性化するＡｔｏｈ１およびそのフラグメントを包含する。本発明において使用される代表的なＡｔｏｈ１はヒトＡｔｏｈ１である。
【００３１】
分子「に結合する」は、その分子に対して物理化学的親和性を持つことを意味する。
【００３２】
本明細書において「カセット」または「レポーターカセット」は、細胞におけるヌクレオチド配列の発現を指令することができるＤＮＡ配列を意味する。一実施形態において、カセットは、終止シグナルおよび／または他の調節エレメントに作動可能に連結されていてもよい目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。また、カセットは、ヌクレオチド配列の正しい翻訳に必要とされる配列を含んでいてもよい。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットはキメラ型であってもよく、これは、その成分のうち少なくとも１つが、他の成分のうち少なくとも１つに対して異種であることを意味する。たとえば、本発明の特定の実施形態では、Ａｔｏｈ１転写因子は、エストロゲン受容体ポリペプチドおよび検出可能なレポーター（たとえばＤｓＲｅｄ）に作動可能に連結され、融合ポリペプチドを形成する。発現カセットは、（たとえば組換えクローン技術によって）細胞外で完全な形に組み立てられてもよい。発現カセット中のヌクレオチド配列の発現は、構成型プロモーターまたは宿主細胞がある特定の刺激にさらされた場合にのみ転写を開始する誘導型プロモーターによって制御されてもよい。多細胞生物の場合、発現カセット中のレポーターの発現は、特定の微小環境、組織、器官または発達段階に特異的であってもよい。
【００３３】
「化合物」は、任意の小分子化合物、抗体、核酸分子もしくはポリペプチド、またはこれらのフラグメントを意味する。
【００３４】
本開示において「含む（comprises, comprising, containing）」、「有する、持つ（having）」などは、米国特許法に記載の意味を有していてもよく、「包含する（including）」などの意味であってもよい。「から実質的になる（consisting essentially of, consists essentially）」も同様に米国特許法に記載の意味を有し、記載されている要素以外の存在によって、記載されている要素の基本的かつ新規な特徴が変更されない限り、記載されている要素以外の存在を認めるオープンエンド形式の用語であるが、先行技術による実施形態を除外する。
【００３５】
「検出する」は、検出される分析物の存在、非存在またはその量を確認することを指す。
【００３６】
「検出可能な標識」は、目的の分子と結合した場合に、分光学的方法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法または化学的方法により目的の分子を検出可能とする組成物を意味する。有用な標識としては、たとえば、放射性同位体、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（たとえばＥＬＩＳＡで一般的に使用される酵素）、ビオチン、ジゴキシゲニンおよびハプテンが挙げられる。
【００３７】
「疾患」は、細胞（たとえば有毛細胞）、組織（たとえば蝸牛）または器官（たとえば耳）の正常な機能が損なわれたり阻害されたりしている何らかの状態または障害を意味する。
【００３８】
本明細書において「エンハンサー」は、制御性核酸配列を指し、プロモーターの上流または下流の任意の位置に存在し、プロモーターの作用を調節（たとえば増強）することができる（たとえば転写レベルを上昇させることができる）。
【００３９】
本明細書において「エストロゲン受容体」、「ＥＲ」、「ＥＲタンパク質」または「ＥＲ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０００１１６［エストロゲン受容体α］またはＮＰ＿００１０３５３６５［エストロゲン受容体β］と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を持つポリペプチドを指す。本発明での使用に適したエストロゲン受容体ポリペプチドとしては、リガンド結合ドメインを含むエストロゲン受容体およびそのフラグメントが挙げられる。本発明において使用される代表的なエストロゲン受容体は、生理学的濃度の生体内１７β−エストラジオールに結合しないように修飾されたヒトエストロゲン受容体バリアントである（Danielianら、1998；Danielianら、1993）。ヒトエストロゲン受容体の５２５番目のグリシンと、５２１番目のメチオニンおよび／または５２２番目のセリンとを変異させることによって、エストラジオールに結合して転写を刺激する能力をほぼ欠失させることができた（Danielianら、1993）。
【００４０】
「フラグメント」は、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。フラグメントは、対応する核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を含んでいることが好ましい。フラグメントは、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個または１０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含んでいてもよい。
【００４１】
本明細書において「融合ポリペプチド」または「融合タンパク質」は、天然のポリペプチドには同時に含まれない２種以上のポリペプチドまたはその活性フラグメントを含むポリペプチドを意味する。通常、この２種以上のポリペプチドは共有結合されており、たとえば、化学的に結合されているか、あるいはペプチド結合によってインフレームに融合されている。
【００４２】
「単離されたポリヌクレオチド」は、本発明の核酸分子が由来する生物の天然ゲノムにおいて該核酸分子に隣接していた遺伝子を含んでいない核酸（たとえばＤＮＡ）を意味する。したがって、この用語は、たとえば、ベクターに組み込まれる組換えＤＮＡ；自己複製プラスミドまたはウイルスに組み込まれる組換えＤＮＡ；原核生物または真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれる組換えＤＮＡ；および他の配列から独立した別個の分子（たとえば、ＰＣＲや制限エンドヌクレアーゼによる消化によって作製されたｃＤＮＡ、ゲノムフラグメントまたはｃＤＮＡフラグメント）として存在する組換えＤＮＡを包含する。さらに、この用語は、ＤＮＡ分子から転写されたＲＮＡ分子、およびさらなるポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを包含する。
【００４３】
「単離されたポリペプチド」は、自然界において付随する様々な成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。通常、自然界において付随するタンパク質や天然の有機分子を含まないポリペプチドが全体の少なくとも６０重量％を占める場合、単離されたポリペプチドという。該調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％の本発明のポリペプチドで構成されていることが好ましい。本発明の単離されたポリペプチドは、たとえば、天然のタンパク質源から抽出することによって得てもよく、本発明のポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって得てもよく、本発明のタンパク質を化学的に合成することによって得てもよい。純度は任意の適切な方法、たとえばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析などによって測定することができる。
【００４４】
「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」は、天然状態において通常付随する様々な成分が様々な程度で除去された物質を指す。「単離」は、由来源または由来環境から分離されたことを示す。「精製」は、単離よりも高い精度で分離されたことを示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質とは、なんらかの不純物がタンパク質の生物学的特性に実質的な影響を与えたり、他の有害な影響を実質的に引き起こしたりすることのない程度まで十分に他の物質が除去されたタンパク質をいう。すなわち、本発明の核酸またはペプチドを組換えＤＮＡ技術を用いて製造した場合において、得られた核酸またはペプチドに細胞物質、ウイルス物質、培地がいずれも実質的に含まれておらず、また本発明の核酸またはペプチドを化学的に合成した場合において、得られた核酸またはペプチドに化学前駆物質などの他の化学物質が実質的に含まれていなければ、精製された核酸またはペプチドといえる。純度および均質性は、通常、たとえばポリアクリルアミドゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を使用して測定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルにおいて実質的に１本のバンドとして現れることを意味してもよい。たとえばリン酸化、グリコシル化などの修飾を行うことが可能なタンパク質の場合、様々な修飾を行うことによって種々の単離されたタンパク質を得てもよく、このようなタンパク質は別々に精製することができる。
【００４５】
本明細書において「リンカー」は、２つ以上のポリペプチドまたは核酸に共有結合して、これらを互いに連結する官能基（たとえば化学物質またはポリペプチド）を意味する。本明細書において「ペプチドリンカー」は、２つのタンパク質を互いに連結するために（たとえばＥＲリガンド結合ドメインにＡｔｏｈ１を連結するために）使用される１つ以上のアミノ酸を指す。本発明の融合ポリペプチドでは、複数のアミノ酸配列に翻訳されるようにリンカー配列を設計し、融合タンパク質のサブユニットの自由度を高めた。代表的なリンカー配列としては、CTCGAGCCATCTGCTGGAGACATG（配列番号１、Ａｔｏｈ１のＣ末端とエストロゲン受容体結合ドメインのＮ末端とを連結するために使用した）およびTCAGGATCTGGTTCAGGA（配列番号２、エストロゲン受容体結合ドメインのＣ末端とＤｓＲｅｄのＮ末端とを連結するために使用した）が挙げられる。
【００４６】
「マーカー」は、疾患または障害に関連して発現レベルまたは活性が変化する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。
【００４７】
本明細書において「作動可能に連結される」は、連結される生体分子に関連した生物学的機能、活性および／または構造が少なくとも保持されるように２つ以上の生体分子を連結することを意味する。ポリペプチドの場合、この用語は、２つ以上のポリペプチドを連結することによって、各ポリペプチド成分が持つ活性の少なくともいくつかが保持されている融合ポリペプチドを得ることを意味する。２つ以上のポリペプチドは直接連結されていてもよく、リンカーを介して連結されていてもよい。核酸の場合、この用語は、第１のポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドに隣接して位置し、適切な分子（たとえば転写活性化因子タンパク質）が第２のポリヌクレオチドに結合した場合に第１のポリヌクレオチドの転写が指令されることを意味する。
【００４８】
「新形成」は、過剰な増殖またはアポトーシスの低下を特徴とする疾患または障害を意味する。本発明を使用することができる新生物としては、白血病（たとえば急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、および肉腫、癌などの充実性腫瘍（たとえば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、睾丸癌、肺癌、肺小細胞癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、多形膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、乏突起膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、悪性黒色腫、神経芽腫および網膜芽細胞腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
本明細書において「薬物を得る」などにおける「得る」は、合成すること、購入すること、他の方法により薬物を入手することを包含する。
【００５０】
「プロモーター」は、転写の指令に十分なポリヌクレオチドを意味する。
【００５１】
「タンパク質」、「ポリペプチド」または「ペプチド」は、本明細書に記載されているように、翻訳後修飾（たとえばグリコシル化またはリン酸化）の有無によらず、天然または非天然のポリペプチドまたはペプチドの全体またはその一部を構成する、３つ以上の天然または非天然アミノ酸からなる任意の鎖を意味する。
【００５２】
「作動可能に連結された」は、第１のポリヌクレオチドが第２のポリヌクレオチドに隣接して位置し、適切な分子（たとえば転写活性化因子タンパク質）が第２のポリヌクレオチドに結合した場合に第１のポリヌクレオチドの転写が指令されることを意味する。
【００５３】
「低減させる」または「増強させる」は、負または正に少なくとも５％変化させることを意味する。この変化は、５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％、１００％のいずれであってもよい。
【００５４】
「参照」は、標準条件または対照条件を意味する。一実施形態では、ある細胞に対する薬物の作用は、対照細胞に対する同じ薬物の作用と比較される。
【００５５】
「参照配列」は、配列比較の基準として使用される定義された配列である。参照配列は、特定の配列のサブセットであってもよく、特定の配列全体であってもよく、たとえば、完全長ｃＤＮＡまたは完全長遺伝子配列のセグメントであってもよく、完全長ｃＤＮＡ配列または完全長遺伝子配列であってもよい。ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の長さは、通常少なくとも約１６アミノ酸長、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸長、さらにより好ましくは約３５アミノ酸長、約５０アミノ酸長、または約１００アミノ酸長である。核酸の場合、参照核酸配列の長さは、通常少なくとも約５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド長、さらにより好ましくは約１００ヌクレオチド長、約３００ヌクレオチド長、これらの長さ付近の任意の整数値、またはこれらの長さの間の任意の整数値である。
【００５６】
「レポーター」は、自体が検出可能な分子（たとえばポリペプチド）、または検出可能な特性（たとえば蛍光）を有する分子（たとえばポリペプチド）を意味する。本発明のレポーターカセットにおいては、コード領域はレポーターをコードする。「検出可能なレポーター」は、特定の部分を含むポリペプチドであって、この特定の部分が、分光学的方法、光化学的方法（たとえばルシフェラーゼ、ＧＦＰなど）、生化学的方法、免疫化学的方法、化学的方法などの任意の方法を介して該ポリペプチドを検出可能とするポリペプチドを指す。本発明における検出可能なレポーターとしては、たとえば、ＧＦＰ、ｅｖｏｇｌｏｗ、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＲＦＰが挙げられる。
【００５７】
「調節エレメント」または「調節配列」は、ポリヌクレオチドに作動可能に連結された場合、細胞におけるこのポリヌクレオチドの転写レベルおよび／または発現レベルを調節する核酸を意味する。本発明における遺伝子調節エレメントには、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、これらの組み合わせ、および転写因子の結合に関与する他のシス作用配列が包含されていてもよい。調節エレメントは、正の転写調節因子および負の転写調節因子をいずれも包含する。
【００５８】
本明細書において「選択マーカー」または「選択マーカー遺伝子」は、細胞に特定の表現型を付与する核酸配列を意味する。一実施形態において、選択マーカーは、抗生物質または薬物に対する耐性を付与する。別の一実施形態では、選択マーカーは、特定の栄養素を欠く培地での増殖を可能にする酵素活性を付与する。本発明のベクターにおいて使用される抗生物質選択マーカーとしては、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子およびネオマイシン耐性遺伝子が挙げられる。選択培地での増殖のために宿主細胞が選択マーカーを発現しなければならない場合、この選択マーカーは正の選択マーカーと呼ばれる（たとえば、適切な抗生物質の存在下での増殖を可能にする抗生物質耐性遺伝子）。また、選択マーカーは、特定の遺伝子を含む宿主細胞に致死的に働くことによって選択を行うこともでき、このような用途で使用される選択マーカーは負の選択マーカーと呼ばれる。
【００５９】
「低減する」は、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％または１００％の負の変化を意味する。
【００６０】
「参照」は、標準条件または対照条件を意味する。
【００６１】
「参照配列」は、配列比較の基準として使用される定義された配列である。参照配列は、特定の配列のサブセットであってもよく、特定の配列全体であってもよく、たとえば、完全長ｃＤＮＡまたは完全長遺伝子配列のセグメントであってもよく、完全長ｃＤＮＡ配列または完全長遺伝子配列であってもよい。ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の長さは、通常少なくとも約１６アミノ酸長、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸長、さらにより好ましくは約３５アミノ酸長、約５０アミノ酸長、または約１００アミノ酸長である。核酸の場合、参照核酸配列の長さは、通常少なくとも約５０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド長、より好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド長、さらにより好ましくは約１００ヌクレオチド長、約３００ヌクレオチド長、これらの長さ付近の任意の整数値、またはこれらの長さの間の任意の整数値である。
【００６２】
本発明の方法に使用可能な核酸分子としては、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするあらゆる核酸分子が挙げられる。そのような核酸分子は生体内の核酸配列と１００％の同一性を有している必要はなく、通常、実質的同一性を示すものである。生体配列と「実質的同一性」を示すポリヌクレオチドは、通常、二本鎖核酸分子のうちの少なくとも一本鎖とハイブリダイズすることができる。本発明の方法に使用可能な核酸分子としては、本発明のポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするあらゆる核酸分子が挙げられる。そのような核酸分子は生体内の核酸配列と１００％の同一性を有している必要はなく、通常、実質的同一性を示すものである。生体配列と「実質的同一性」を示すポリヌクレオチドは、通常、二本鎖核酸分子のうちの少なくとも一本鎖とハイブリダイズすることができる。
【００６３】
「ハイブリダイズする」は、様々なストリンジェント条件において相補的なポリヌクレオチド配列同士（たとえば本明細書に記載されている遺伝子）またはその一部同士が対になって二本鎖分子を形成することを意味する（たとえば、Wahl, G. M. and S. L. Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, A. R. (1987) Methods Enzymol. 152:507を参照されたい）。
【００６４】
たとえば、ストリンジェントな塩濃度とは、通常、約７５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約７５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムであり、約５００ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約５０ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムが好ましく、約２５０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約２５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムがより好ましい。低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、有機溶媒（たとえばホルムアミド）を使用しないことによって達成でき、これに対して、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、少なくとも約３５％のホルムアミド、より好ましくは少なくとも約５０％のホルムアミドを使用することによって達成することができる。ストリンジェントな温度条件としては、通常約３０℃以上、好ましくは約３７℃以上、最も好ましくは約４２℃以上が挙げられる。変更可能な他のパラメータ、たとえば、ハイブリダイゼーション時間、洗浄剤（たとえばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））の濃度、担体ＤＮＡの添加や除去などは、当業者によく知られている。必要に応じてこれらの様々な条件を組み合わせることによって、様々なレベルのストリンジェンシーを達成することができる。好ましい一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび１％ＳＤＳ中、３０℃で実施される。より好ましい一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミドおよび１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で実施される。最も好ましい一実施形態では、ハイブリダイゼーションは、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミドおよび２００μｇ／ｍＬ ｓｓＤＮＡ中、４２℃で実施される。当業者であれば、これらの条件を有利なものに変更することは容易であろう。
【００６５】
さらに、多くの場合、ハイブリダイゼーション後の洗浄工程もストリンジェンシーに影響を及ぼす。ストリンジェントな洗浄条件は、塩濃度と温度とによって定義される。上述したように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を低下させることによって、あるいは温度を上昇させることによって高めることができる。たとえば、洗浄工程におけるストリンジェントな塩濃度としては、約３０ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約３ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムが好ましく、約１５ｍＭ未満のＮａＣｌおよび約１．５ｍＭ未満のクエン酸三ナトリウムが最も好ましい。洗浄工程におけるストリンジェントな温度条件としては、通常約２５℃以上、より好ましくは約４２℃以上、さらに好ましくは約６８℃以上が挙げられる。好ましい一実施形態では、洗浄工程は、３０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ中、２５℃で実施される。より好ましい一実施形態では、洗浄工程は、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ中、４２℃で実施される。より好ましい別の一実施形態では、洗浄工程は、１５ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウムおよび０．１％ＳＤＳ中、６８℃で実施される。これらの条件のさらなる変更は当業者であれば容易に理解できるであろう。ハイブリダイゼーション技術は当業者によく知られており、たとえば、BentonおよびDavis（Science 196:180, 1977）；GrunsteinおよびHogness（Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975）；Ausubelら（Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001）；BergerおよびKimmel（Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York）；およびSambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York）に記載されている。
【００６６】
「感音難聴」すなわち「ＳＮＨＬ」は、機械受容器である有毛細胞などの蝸牛細胞の死滅または機能不全によって引き起こされる難聴を意味する。
【００６７】
「特異的に結合する」は、ある化合物または抗体が本発明のポリペプチドを認識して結合するが、試料中の他の分子を実質的に認識せず結合しないことを意味する。
【００６８】
「実質的に同一」は、参照アミノ酸配列（たとえば本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれか）または参照核酸配列（たとえば本明細書に記載の核酸配列のいずれか）と少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチドまたは核酸分子を意味する。そのような配列は、比較用配列とアミノ酸レベルまたは核酸レベルで少なくとも６０％の同一性を示すことが好ましく、８０％または８５％の同一性を示すことがより好ましく、９０％、９５％または９９％の同一性を示すことがさらに好ましい。
【００６９】
配列同一性は、通常、配列分析ソフトウェア（たとえば、Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、 1710 University Avenue、 Madison、 Wis. 53705、ＢＬＡＳＴプログラム、ＢＥＳＴＦＩＴプログラム、ＧＡＰプログラムまたはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失および／または他の修飾に対して相同性の程度を決定することによって、同一配列同士また類似した配列同士のマッチングを行う。通常、保存的置換には、以下の各グループ内における置換が包含される：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度は、代表的な方法ではＢＬＡＳＴプログラムを使用して測定してもよく、ｅ−３〜ｅ−１００の期待値であれば配列同士が密接な関連性を有していることが示される。
【００７０】
「対象」は、哺乳動物を意味し、ヒトおよび非ヒト哺乳動物、たとえば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、ネコ、げっ歯類などを包含するが、これらに限定されない。
【００７１】
本明細書に記載の特定の範囲は、その範囲内に含まれるすべての値を簡潔に示したものであると見なされる。たとえば、１〜５０という範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９および５０からなる群に含まれる任意の数字、数字の組み合わせ、または部分範囲を包含すると見なされる。
【００７２】
本明細書において「治療する」、「治療」などは、疾患および／またはそれに関連する症状の低減または改善を意味する。疾患または状態の治療には、疾患、状態またはそれに関連する症状を完全に取り除くことも包含されるが、そのような完全な除去が必須ではないことは明らかであろう。
【００７３】
特に記載がない限り、あるいは文脈から明らかである場合を除き、本明細書において「または」は包括的な用語であると見なされる。また、特に記載がない限り、あるいは文脈から明らかである場合を除き、本明細書において「a」、「an」および「the」は単数とも複数とも理解される。
【００７４】
特に記載がない限り、あるいは文脈から明らかである場合を除き、本明細書において「約」は、当技術分野において一般的な許容差の範囲内であることを指し、たとえば平均値±２ＳＤ（標準偏差）の範囲内である。また、「約」は、記載された数値から±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±０．５％、±０．１％、±０．０５％または±０．０１％の範囲内にあるものと見なすことができる。文脈から明らかである場合を除き、本明細書に記載の数値はすべて「約」という用語で修飾されていると見なされる。
【００７５】
本明細書において可変部分に関する任意の定義において列挙された化学基は、任意の単一基または列挙された基の組み合わせとしての当該可変部分の定義を包含する。本明細書において可変部分または態様を示した実施形態は、任意の単一の実施形態としての当該実施形態、および他の実施形態またはその一部と組み合わせられた当該実施形態を包含する。
【００７６】
本明細書に記載の組成物および方法はいずれも、本明細書に記載の他の組成物および方法のいずれか１以上と組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１Ａ〜図１Ｅは、誘導型Ａｔｏｈ１融合タンパク質の作製に使用したコンストラクトを示した概略図である。図１Ａは、Ｆｌａｇ−Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄと名付けたコンストラクトを示す。細胞質と細胞質ゾルとの間における融合タンパク質の移行を測定するため、ＤｓＲｅｄ遺伝子を導入したコンストラクトを作製した。Ａｔｏｈ１（Ａｔｏｎａｌホモログ１）の検出を容易とするため、１つのまたは連続した２つのｆｌａｇタグ配列を導入していくつかの実験コンストラクトを作製した（Vallier、Mancipら、2001）。タモキシフェンに感受性を示すＡｔｏｈ１コンストラクトを得るため、ＰＣＲクローニングプライマーを設計し、１）５’末端にＥｃｏＲＩ部位を配置し、Ａｔｏｈ１の開始コドンの上流にＫｏｚａｃ配列（CACC）を配置し；２）Ａｔｏｈ１の終止コドン（TAG）を欠失させ；３）ポリペプチドリンカーをコードする配列CTCGAGCCATCTGCTGGAGACATG（配列番号１）を介して、ｆｌａｇタグ付加Ａｔｏｈ１配列をエストロゲン受容体（ＥＲ）配列に連結し；４）ＥＲの終止コドン（TAG）を欠失させ；５）ポリペプチドリンカーをコードする配列TCAGGATCTGGTTCAGGA（配列番号２）を介して、ＥＲ配列をＤｓＲｅｄ配列に連結し；６）３’末端にＮｏｔ Ｉ部位を配置した。上記リンカーは、複数のプロリン配列に翻訳されるように設計し、それによって融合タンパク質のサブユニットの自由度を高めた。上記ＥＲコンストラクトの作製に用いたインサートは、生理学的濃度の生体内１７β−エストラジオールに結合しないように変異させた鋳型ＤＮＡ（Danielian、Whiteら、1993；Danielian、Muccinoら、1998）をA.McMahon（Harvard Medical School）より入手し、この鋳型ＤＮＡから２ステップＰＣＲにより増幅することによって得た。ＤｓＲｅｄ ＤＮＡは市販ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）から得た。上記コンストラクトは、ｐｃＤＮＡ（登録商標）３．１（＋）ベクターにサブクローニングすることによって作製した。Ｆｌａｇ−Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄをコードするベクターの核酸配列は後掲する。図１Ｂは、陰性対照として使用した、ＤｓＲｅｄ−ＥＲと名付けたコンストラクトを示す。陰性対照ＤｓＲｅｄ−ＥＲコンストラクトを得るため、ＰＣＲクローニングプライマーを設計し、１）５’末端にＥｃｏＲＩ部位を配置し、ＤｓＲｅｄの開始コドンの上流にＫｏｚａｃ配列（CACC）を配置し；２）ＤｓＲｅｄの終止コドン（TAG）を欠失させ；３）ポリペプチドリンカーをコードする配列TCAGGATCTGGTTCAGGATCCATG（配列番号３）を介して、ＤｓＲｅｄをＥＲに連結し；４）３’末端にＮｏｔ Ｉ部位をクローニングした。図１Ｃは、Ｆｌａｇ−Ａｔｏｈ１−ＥＲと名付けたコンストラクトを示す。このコンストラクトは、Ａｔｏｈ１のプロモーター／エンハンサーに結合して該プロモーター／エンハンサーを活性化する融合タンパク質をコードする。Ｆｌａｇ−Ａｔｏｈ１−ＥＲをコードするベクターの核酸配列は後掲する。Ａｔｏｈ１プロモーター／エンハンサーへの結合性、Ａｔｏｈ１ ｍＲＮＡの転写効率、およびＡｔｏｈ１タンパク質の翻訳効率は、概してｆｌａｇ−Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトよりも高いが、大きな差はない。図１Ｄは、Ａｔｏｈ１−ＥＲと名付けたコンストラクトを示す。このコンスト��クトは、ｆｌａｇタグ配列を持たないことを除いてはＦｌａｇ−Ａｔｏｈ１−ＥＲコンストラクトと同一である。このコンストラクトは、Ｆｌａｇ−Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトやＦｌａｇ−Ａｔｏｈ１−ＥＲコンストラクトとほぼ同様の活性を示す。図１Ｅは、ＴＡＫ１ｐ−Ａｔｏｈ１−ＥＲと名付けたコンストラクトを示す。このコンストラクトは、その発現がＴＡＫ１プロモーター／エンハンサーの制御下に置かれることを除いてはＡｔｏｈ１−ＥＲコンストラクトと同一である。したがって、この導入遺伝子の発現は、内因性ＴＡＫ１を発現する細胞種において起こる。上述した導入遺伝子はそれぞれ、このプロモーターの制御下に置いてもよく、コンストラクトの発現量に有意な差は出ない。
【図２】Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄの核局在化が４−ヒドロキシタモキシフェン硫酸塩（４ＯＨＴ）によって用量依存的に誘導されたことを示す。Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞を、段階的に用量を増加させた４ＯＨＴとともにインキュベートした。４ＯＨＴの非存在下では、Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質は細胞質に隔離される。Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄを発現する細胞をタモキシフェンと接触させると、核内のＤｓＲｅｄの蛍光が増強した（左図：０ｎＭタモキシフェン；中央図：１ｎＭタモキシフェン；１μＭタモキシフェン）。４ＯＨＴの濃度を上昇させると、Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質が核に局在化された。核分画抽出では、分離された核内におけるＤｓＲｅｄの蛍光が４ＯＨＴによって用量依存的に増強することが明らかとなった。また、最小有効量は、１ｎＭタモキシフェンの２〜７日間投与であることが経験的に分かった。タモキシフェンの濃度上昇に対してＤｓＲｅｄの蛍光をプロットしたグラフでは、高用量（１００μＭ）および低用量（１ｎＭ）と比較して、１μＭの用量で蛍光がさらに増強することが示された。最も高い用量（１００ｍＭ）では、培養２日後に細胞傷害作用が生じた。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂは、核局在化に最適な４−ヒドロキシタモキシフェン硫酸塩（４ＯＨＴ）の濃度およびインキュベーション時間の決定を示す。ＲＯＳＡ２６−ＧＦＰマウス（緑色）から作製した球状蝸牛細胞塊にＡｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄをエレクトロポレーションによって導入し、段階的に用量を増加させた４ＯＨＴとともにインキュベートした。図３Ａは、４ＯＨＴの非存在下では、Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質（赤色）が細胞質においてのみ発現されることを示す。図３Ｂは、４ＯＨＴ（１ｎＭ）を添加した４８時間後には、該融合タンパク質が核内に斑点状に局在化されたことを示す（ＤＡＰＩ＝青色；ＤｓＲｅｄの蛍光＝赤色）。下の表は、核局在化に対する４ＯＨＴの用量および一時的な効果を示す。黄色の囲み枠は最適条件を強調して示したものである（＋＝９０％を超える細胞が核に局在；−／＋＝約５０％の細胞が核に局在；−＝１０％未満の細胞が核に局在）。
【図４】ｃｍｖ．Ａｔｏｈ１エンハンサー−ルシフェラーゼコンストラクトを安定にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞において、４−ヒドロキシタモキシフェン硫酸塩（４ＯＨＴ）によりＡｔｏｈ１のエンハンサー領域の活性化が誘導されたことを示す。安定にトランスフェクトされた該ＨＥＫ細胞に、ｃｍｖ．Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトまたはｃｍｖ．ＤｓＲｅｄ−ＥＲ対照コンストラクトを一時的にトランスフェクトした。段階的に用量を増加させた４ＯＨＴとともに細胞を７２時間インキュベートし、溶解し、ルシフェラーゼアッセイ（インビトロジェン）を行った。さらに、ウミシイタケトランスフェクションコントロールをすべての細胞にコトランスフェクトした。
【図５】Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトを一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞において、４−ヒドロキシタモキシフェン硫酸塩（４ＯＨＴ）によりＡｔｏｈ１ ｍＲＮＡの発現が誘導されたことを示す。一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞を様々な用量の４ＯＨＴとともにインキュベートした。ＲＴ−ＰＣＲの結果から、４ＯＨＴを増加させるとＡｔｏｈ１ ｍＲＮＡレベルが上昇することが示唆された（上図）。定量ＰＣＲでは、４ＯＨＴの用量を段階的に増加させるとＡｔｏｈ１ ｍＲＮＡの発現量が増加することが示された（下図）。
【図６】Ａｔｏｈ１−ＥＲ（ＦＭＥＲ）コンストラクトを一時的にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞において、４−ヒドロキシタモキシフェン硫酸塩（４ＯＨＴ）によりＡｔｏｈ１タンパク質の発現が誘導されたことを示す。一時的にトランスフェクトされたＨＥＫ細胞を様々な用量の４ＯＨＴとともに７２時間インキュベートした。全細胞タンパク質を回収し、ウエスタンブロット分析を行った。陽性対照試料には、ｃｍｖプロモーター制御下のｆｌａｇタグ付加Ａｔｏｈ１コンストラクト（ｆｌａｇＡｔｏｈ１）をトランスフェクトし、陰性対照試料にはＤｓＲｅｄＥＲコンストラクトをトランスフェクトした。４ＯＨＴレベルを上昇させると、Ａｔｏｈ１−ＥＲをトランスフェクトした細胞のＡｔｏｈ１タンパク質レベルが上昇した。
【図７】タモキシフェンによるＡｔｏｈ１の発現の誘導を示す。ｃｍｖプロモーターの指令によってＡｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質が構成的に発現されるが、発現されたタンパク質はＨＳＰ９０の作用によって細胞質ゾル内に隔離される（左図）。特定の理論に拘束されるものではないが、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）はＨＳＰ９０と競合して、Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質を核へと移行させ（右図）、核内において４−ＯＨＴが内因性Ａｔｏｈ１エンハンサー／プロモーター領域に結合し、フィードフォワード機構によって内因性Ａｔｏｈ１を発現させると考えられる。Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトは、様々なプロモーターの制御下に容易に置くことができ、それによって細胞特異的発現を付与することができる。
【図８】培養されたコルチ器において４ＯＨＴによりＡｔｏｈ１の発現が誘導されたことを示す。Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトをＯＣ１細胞にトランスフェクトし、増殖条件（３３℃）で３日間浮遊凝集塊培養し、４ＯＨＴの存在下または非存在下において分化条件（３９℃）で３日間培養した。これら２群においてトランスフェクション効率に有意差はなかった（ＤｓＲｅｄの棒グラフ参照）。これに対して、タモキシフェンとともに球状細胞塊を培養すると、球状細胞塊中のミオシン７ａ陽性細胞が有意に増加した。
【図９】蝸牛における一時的、定量的かつ細胞特異的なＡｔｏｈ１のアップレギュレーションを示す。ＴＡＫ１ｐ−Ａｔｏｈ１−ＥＲコンストラクトは、ウイルスなどの任意のベクターに導入することができ（上図）、このベクターは中央階に注入することができる（中央図）。有毛細胞が損傷を受けた後、４ＯＨＴを全身投与することによって支持細胞を有毛細胞に分化転換させることができる（下図）。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
本発明は、Ａｔｏｈ１の核局在化を誘導してＡｔｏｈ１媒介性発現を制御するための組成物を特徴とし、該組成物を使用して有毛細胞を増殖および／または再生させるための方法を提供する。さらに、そのような組成物は、感音難聴および新形成（たとえば結腸がん、乳がんおよび皮膚がん）の治療方法に有用である。
【００７９】
詳細については後述するが、本願は、Ａｔｏｈ１とＥＲリガンド結合ドメインとを含む融合ポリペプチドをコードする発現ベクターを提供する。実施形態のいくつかでは、該融合ポリペプチドはレポーター（たとえばＤｓＲｅｄ）をさらに含む。さらに本発明は、該融合ポリペプチドを核に局在化させる方法を提供する。Ａｔｏｈ１を核に局在化させることによって、Ａｔｏｈ１応答性エンハンサー／プロモーターにより制御される遺伝子が発現され、これにはＡｔｏｈ１自体も包含される。
【００８０】
コルチ器においてＡｔｏｈ１の条件付き発現が可能な誘導モデルを開発した。Ｃ末端にエストロゲン受容体（ＥＲ）とレポータータンパク質（ＤＳ−Ｒｅｄ）とを融合させたＡｔｏｈ１遺伝子を作製し、培養細胞または蝸牛環境にタモキシフェンを加えることによって用量依存的にＡｔｏｈ１の発現を増加させた。このコンストラクトをトランスフェクトしたＨＥＫ細胞は、細胞質においてＡｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質を構成的に発現し、静止状態となった。しかし、このトランスフェクト細胞にタモキシフェンを加えると、用量依存的にＡｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質が核に移行した。培地からタモキシフェンを除去すると、２週間以内に該融合タンパク質が細胞質に移行した。Ａｔｏｈ１は、自体の転写を正に制御する自己制御性転写因子として作用するため、ルシフェラーゼアッセイによる測定においてタモキシフェンの濃度を増加させると、Ａｔｏｈ１遺伝子のエンハンサー／プロモーター領域に対する結合が用量依存的に増加し、さらに、ＲＴ−ＰＣＲおよびｑＰＣＲのいずれによる測定でもタモキシフェンによってＡｔｏｈ１の発現が用量依存的に増加した。エレクトロポレーションによってこのコンストラクトを導入したコルチ器は、１μＭタモキシフェンと接触させると、有毛細胞を過剰発現した。これらのデータから、Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質は、時間依存的かつ用量依存的なＡｔｏｈ１発現の制御に使用できることが示された。したがって、本発明は、４−ヒドロキシタモキシフェンとの接触によりＡｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合ポリペプチドが核に局在化されるという観察に少なくとも部分的に基づく。Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合ポリペプチドが核に局在化した場合、Ａｔｏｈ１およびミオシン７ａの転写を活性化することができた。Ａｔｏｈ１−ＥＲ融合タンパク質の核局在化は、蝸牛特異的発現の活性化およびＡｔｏｈ１の腫瘍抑制因子活性の調節に有用である。
【００８１】
Ａｔｏｎａｌホモログ１（Ａｔｏｈ１）
塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス転写因子であるａｔｏｎａｌ−１（Ａｔｏｈ１）の哺乳動物相同体は、有毛細胞の発達を決定付ける遺伝子のうちの１つである。さらに、Ａｔｏｈ１は抗腫瘍作用または腫瘍抑制作用を示す（Bossuytら、2009）。蝸牛細胞におけるＡｔｏｈ１の発現は、有毛細胞の発生に必要かつ十分である（Bermingham、Hassanら、1999）。コルチ器の発達過程においてＡｔｏｈ１を発現する細胞は有毛細胞へと分化し（Helms、Abneyら、2000）、このことからＡｔｏｈ１は有毛細胞分化の最も早期のマーカーのうちの１つとなっている。また、Ａｔｏｈ１ノックアウトマウスは有毛細胞を形成しない（Isaka、Ishibashiら、1999；Helms、Abneyら、2000）。有毛細胞前駆遺伝子Ａｔｏｈ１を過剰発現するコルチ器支持細胞は、有毛細胞に特有の性質を呈する能力を保持しており、このような特有の性質として、繊毛形成（ZhengおよびGao、2000；Kawamoto、Ishimotoら、2003；Izumikawa、Minodaら、2005）、ミオシン７ａの標識による検出（ZhengおよびGao、2000）および有毛細胞の固有機能（Kawamoto、Ishimotoら、2003）が挙げられる。胎仔耳胞（Gubbels、Woessnerら、2008）またはコルチ器外植片（ZhengおよびGao、2000）にＡｔｏｈ１をエレクトロポレーションにより導入すると、有毛細胞が発生した。
【００８２】
ヒトＡｔｏｈ１のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００５１６３より参照することができ、以下に示す通りである（配列番号４）。
2015534818.tif 000003
【００８３】
アデノウイルスを介してＡｔｏｈ１を蝸牛に送達すると、このウイルスに感染した細胞において有毛細胞が発生した（Bermingham、Hassanら、1999；ZhengおよびGao、2000；Kawamoto、Ishimotoら、2003）。興味深いことに、これらの細胞のいくつかはキメラ型有毛細胞／支持細胞形態を示し、成体の支持細胞が分化転換能力を維持している可能性が示唆された。このデータから、成体哺乳動物のコルチ器において有毛細胞を発生させることができる可能性が示されたことは重要である。後の実験により、成体モルモットの蝸牛にＡｔｏｈ１を導入すると機能が回復することも示唆されている（Izumikawa、Minodaら、2005）。
【００８４】
エストロゲン受容体
エストロゲン受容体は、細胞内に見られるタンパク質の一群であり、エストロゲン（１７β−エストラジオール）というホルモンによって活性化される受容体である。エストロゲン受容体は２種類存在し、細胞内受容体に属する核内ホルモンファミリーのメンバーであるＥＲと、Ｇタンパク質共役受容体の一つであるＧタンパク質共役エストロゲン受容体ＧＰＲ３０（ＧＰＥＲ）とがある。細胞内エストロゲン受容体に属する核内ホルモンファミリーは本発明の方法に有用である。細胞内エストロゲン受容体は、エストロゲンによって活性化されると核に移行し、ＤＮＡと結合して様々な遺伝子の活性を制御することができる（すなわちＤＮＡ結合性転写因子として機能する）。しかしながら、細胞内エストロゲン受容体は、ＤＮＡへの結合に依存しない別の機能も有する。
【００８５】
細胞内エストロゲン受容体には２種の形態があり、それらは一般にαおよびβと呼ばれ、それぞれ別々の遺伝子（ＥＳＲ１およびＥＳＲ２）によってコードされている。ホルモンによって活性化されると、エストロゲン受容体は二量体を形成する。多種類の細胞において上記２種の形態が共発現していることから、エストロゲン受容体はＥＲα（αα）もしくはＥＲβ（ββ）のホモ二量体、またはＥＲαβ（αβ）のヘテロ二量体を形成している可能性がある。エストロゲン受容体αとβは全体的に配列相同性が高く、いずれも５つのドメインから構成されている（Ａ〜Ｆドメイン）（以下、Ｎ末端からＣ末端の方向に記載；アミノ酸配列の番号はヒトＥＲに基づく）。Ｎ末端のＡ／Ｂドメインは、リガンド（たとえばエストロゲンホルモン）の結合がない状態で遺伝子の転写を促進することができる。この領域はリガンドなしで遺伝子の転写を活性化することができるものの、この活性化は、Ｅドメインによって引き起こされる活性化と比較して、より弱く、より選択的である。ＤＮＡ結合ドメインとしても知られているＣドメインは、ＤＮＡ中のエストロゲン応答性エレメントに結合する。Ｄドメインは、ＣドメインとＥドメインとを連結するヒンジ領域である。Ｅドメインは、リガンドが結合する窪みと、コアクチベータータンパク質やコリプレッサータンパク質が結合する部位とを含んでいる。Ｅドメインは、リガンドの結合によって遺伝子の転写を活性化することができる。Ｃ末端にあるＦドメインの機能は完全には解明されておらず、長さは様々である。
【００８６】
ヒトエストロゲン受容体αのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０００１１６より参照することができ、以下に示す通りである（配列番号５）。
2015534818.tif 000004
【００８７】
ヒトエストロゲン受容体βのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１０３５３６５より参照することができ、以下に示す通りである（配列番号６）。
2015534818.tif 000005
【００８８】
典型的なヒトエストロゲン受容体をコードする典型的な核酸配列を以下に示す（配列番号７）。
2015534818.tif 000006
【００８９】
リガンドの種類によって、エストロゲン受容体のαアイソフォームおよびβアイソフォームに対する親和性が異なりうる。１７β−エストラジオールは、どちらの受容体にも同じように高い結合性を示し、エストロンおよびラロキシフェンはα受容体に選択的に結合し、エストリオールおよびゲニステインはβ受容体に選択的に結合する。サブタイプ選択的エストロゲン受容体調整薬は、α受容体サブタイプとβ受容体サブタイプのいずれかに選択的に結合する。さらに、エストロゲン受容体の組み合わせが異なれば、様々なリガンドに対する応答性が異なる可能性があり、それによって組織選択的なアゴニスト作用やアンタゴニスト作用が発揮されることも考えられる。αサブタイプとβサブタイプの濃度の比率は、特定の疾患において何らかの影響を及ぼしている可能性が報告されている。いずれのＥＲも様々な組織において広く発現されているが、その発現パターンにはいくつかの顕著な差異がある。ＥＲαは、子宮内膜、乳がん細胞、卵巣支質細胞および視床下部に見られる。男性では、ＥＲαタンパク質は精巣輸出管上皮に見られる。ＥＲβタンパク質は、腎臓、脳、骨、心臓、肺、腸管粘膜、前立腺および内皮細胞において発現されていることが報告されている。ＥＲは、リガンドが結合していない状態では細胞質受容体であるとされているが、可視化研究からは、ＥＲの一部は核内に存在することが示されている。
【００９０】
選択的エストロゲン受容体調整薬の創薬概念は、転写コアクチベーターや転写コリプレッサーなどの様々なタンパク質とＥＲとの相互作用を促進する能力に基づいている。さらに、コリプレッサータンパク質とコアクチベータータンパク質の比率は組織によって様々である。したがって、同一のリガンドが、（コアクチベーターが大部分を占める）ある組織ではアゴニスト性を示し、（コリプレッサーが大部分を占める）別の組織ではアンタゴニスト性を示すこともありうる。たとえば、タモキシフェンは乳房においてはアンタゴニストとして作用するため、乳がんの治療に使用されるが、骨ではＥＲアゴニストとして作用し（それによって骨粗鬆症を予防し）、子宮内膜では部分的アゴニストとして作用する（それによって子宮がんのリスクが上昇する）。
【００９１】
エストロゲン受容体とがん
エストロゲン受容体は、乳がん症例の約７０％で過剰発現されており、このような状態を「ＥＲ陽性」と呼ぶ。そのような組織におけるエストロゲン受容体の過剰発現は、免疫組織化学を利用して調べることができる。エストロゲン受容体の過剰発現によって腫瘍が発生する理由として以下の２つの仮説がこれまでに提案されており、入手可能な証拠によるといずれのメカニズムも腫瘍発生に関与していることが示唆される。
（１）エストロゲンがＥＲに結合することによって乳房細胞の増殖が刺激され、細胞分裂およびＤＮＡ複写が増加し、その結果変異が生じる。
（２）エストロゲンの代謝によって遺伝毒性の老廃物が生じる。
【００９２】
これらのプロセスはいずれも、細胞周期の異常、アポトーシス異常およびＤＮＡ修復異常を引き起こし、結果として腫瘍が形成される。ＥＲαが分化度の高い腫瘍に関連していることは確かであるが、ＥＲβの関与については議論の余地がある。ＥＳＲ１遺伝子の（一塩基多型による）様々な型が同定されており、型によって乳がん発症のリスクが異なることが分かっている。
【００９３】
乳がんのための内分泌療法としては、乳房組織においてＥＲアンタゴニストとして作用する選択的エストロゲン受容体調整薬（ＳＥＲＭＳ）（タモキシフェンなど）、アロマターゼ阻害薬（アナストロゾールなど）などがある。ＥＲの状態によって、タモキシフェンやアロマターゼ阻害薬に対する乳がん病変の感受性を測ることができる。別のＳＥＲＭであるラロキシフェンは、乳がんを発症するリスクが高いと判断された女性に対する予防的化学療法として使用されている。完全アンタゴニストとして作用する別の抗エストロゲン化学療法薬であるＩＣＩ １８２,７８０（Ｆａｓｌｏｄｅｘ）は、エストロゲン受容体の分解を促進するという作用も有する。
【００９４】
また、エストロゲンおよびＥＲは、乳がん、卵巣がん、結腸がん、前立腺がんおよび子宮内膜がんとも関連付けられている。進行結腸がんでは、結腸組織においてＥＲの大部分を占めるＥＲβが消失しており、したがって結腸がんはＥＲβ特異的アゴニストで治療される。
【００９５】
ケルセチンなどの植物エストロゲンは、エストロゲン受容体の活性を調節し、アポトーシスを促進することによって、乳がん、前立腺がん、結腸がんなどのがんを予防することができる。ケルセチンは、エストロゲン受容体β（ＥＲβ）に選択的に結合する。ＥＲβは、エストラジオールの結合によって転写を誘導するリガンド活性化転写因子であり、エストラジオールによって活性化されると、ＥＲβは標的遺伝子のプロモーター領域に存在するエストロゲン応答性エレメントに結合する。この結合機構についての検証を、純粋なエストロゲン受容体アンタゴニストで処理したＨｅＬａ細胞を使用して行ったところ、このエストロゲン受容体アンタゴニストによって、エストラジオールおよびケルセチンのカスパーゼ−３活性化誘導作用が阻害された。ＥＲβはヒト結腸において発現されており、結腸においてアポトーシスを制御する特定のシグナル伝達経路を活性化する。ＥＲβは、エストラジオールにより活性化されることによってその機能を発揮するが、最近になって、ケルセチンによっても活性化されると考えられることが分かった。ｐ３８キナーゼがリン酸化されたことによってカスパーゼ−３が存在する場合、ケルセチンはアポトーシスカスケードを活性化するとともにＥＲβを活性化する。結腸がんや結腸腫瘍では、ＥＲβおよびその経路が顕著に低下しており、それによって腫瘍増殖が可能となっていることが証明されている。
【００９６】
感音難聴（ＳＮＨＬ）
「感音難聴」は、機械受容器である有毛細胞などの様々な種類の蝸牛細胞の死滅または機能不全によって引き起こされる。幹細胞療法や遺伝子療法は、有毛細胞を再生し、聴力を回復させる目的で難聴の治療に使用されている（ParkerおよびCotanche、2004；Raphael、Kimら、2007；Parker、2011）。本願は、これらの論文の主題を拡大して、支持細胞の生態に再生医療を適用し、聴力を回復させることを目的としたものである。様々な細胞が混在する支持細胞は、下等脊椎動物において有毛細胞の前駆細胞として機能し、哺乳動物においては有毛細胞に分化する能力を示し、さらに、外因性導入遺伝子を容易に発現することから、興味深いものである。また、本願は、新規な遺伝子コンストラクトを使用して、正常蝸牛の解剖学的構造が再現されるように聴覚有毛細胞を再生することを全体的な目的としている。この目的は、蝸牛支持細胞の特定の亜集団において有毛細胞前駆遺伝子Ａｔｏｈ１を一時的かつ定量的に発現することが可能な本願の導入遺伝子を使用することによって達成される。
【００９７】
蝸牛の有毛細胞は感覚機能に関係しない支持細胞に取り囲まれており、支持細胞は、有毛細胞に栄養を補給し（Santos-SacchiおよびDallos、1983）、有毛細胞の構造（RaphaelおよびAltschuler、2003）および神経節細胞の構造（Montcouquiol、Valatら、1998；Stankovic、Rioら、2004）を支持し、ギャップ結合による細胞間コミュニケーションを介した、コルチ器における適切なイオン濃度の維持に必須である（Wangemann、2006；Zdebik、Wangemannら、2009）。また、支持細胞は有毛細胞の再生に重要な役割を果たしている。発達段階では、有毛細胞と支持細胞とは共通の前駆細胞から発生し（DriverおよびKelley、2009）、有毛細胞の発生によって周囲の細胞にシグナルが伝達され、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路を介した接触阻止が生じ、それによって周囲の細胞が支持細胞へと発達する（Kelley、2006）。損傷した有毛細胞が自然に再生する鳥類などの動物では、有毛細胞が死ぬと、隣接した支持細胞が刺激され、この支持細胞自体が有毛細胞へと直接分化転換して有毛細胞が再生されるか、あるいは刺激された支持細胞が有糸分裂を起こして新しい支持細胞と有毛細胞とを発生し有毛細胞が再生される（図２）（StoneおよびCotanche、2007；Parker、2011）。
【００９８】
支持細胞が有毛細胞に分化する能力を有していること、および有毛細胞と支持細胞の発生経路が共通であることから、支持細胞は有毛細胞の前駆細胞として機能すると仮定されている（ParkerおよびCotanche、2004）。発達段階において、哺乳動物のコルチ器は鳥類の雛のものと同等の柔軟性を有し、有系分裂薬のいくつか（すなわちレチノイン酸（Kelley、Xuら、1993）やＩＧＦ（Malgrange、Rigoら、1999））は、Ｅ１３．５前後で有毛細胞が正常に発生した後の発達過程にある哺乳動物のコルチ器において過剰な数の有毛細胞を誘導することができる（Parker、2011）。また、支持細胞においてｐ２７（Ｋｉｐ１）による細胞周期阻害を回避すると、哺乳動物の有毛細胞を再生できることがいくつかの研究で報告されている（Lowenheim、Furnessら、1999；Torchinsky、Messanaら、1999；Minoda、Izumikawaら、2007）。したがって、雛鳥の蝸牛の場合と同様に、成体哺乳動物の支持細胞も、自由に細胞周期に入ることができれば有毛細胞に分化できる能力を維持していると言える。しかしながら、蝸牛が老化すると、新たに有毛細胞を発生する能力が低下することを示唆する研究も存在する（Kelley、Xuら、1993；Kwan、Whiteら、2009）。
【００９９】
ポリヌクレオチド療法
本発明の治療用ポリペプチドをコードする核酸分子は、細胞（たとえば有毛細胞、幹細胞）に送達することができる。本発明の核酸分子は、体内に入った際に治療有効レベルのレポータータンパク質が生成されるような形態で対象の細胞に送達されなければならない。特に、感染効率が高く、安定に統合および発現されることから、ウイルスベクター（たとえば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター）を使用して形質導入することもできる（たとえば、Cayouette et al., Human Gene Therapy 8:423-430, 1997; Kido et al., Current Eye Research 15:833-844, 1996; Bloomer et al., Journal of Virology 71:6641-6649, 1997; Naldini et al., Science 272:263-267, 1996;およびMiyoshi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997を参照されたい）。たとえば、治療用タンパク質、レポータータンパク質、バリアントまたはこれらのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、レトロウイルスベクターにクローニングすることができ、発現は、内在性プロモーター、レトロウイルスのロングターミナルリピート、または標的とする細胞種に特異的なプロモーターから開始することができる。使用可能な他のウイルスベクターとしては、たとえば、ワクシニアウイルス、ウシパピローマウイルス、ヘルペスウイルス（エプスタイン−バーウイルスなど）などが挙げられる（たとえば、the vectors of Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244:1275-1281, 1989; Eglitis et al., BioTechniques 6:608-614, 1988; Tolstoshev et al., Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991; Cornetta et al., Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987; Anderson, Science 226:401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Miller et al., Biotechnology 7:980-990, 1989; Le Gal La Salle et al., Science 259:988-990, 1993;およびJohnson, Chest 107:77S-83S, 1995を参照されたい）。特にレトロウイルスベクターは開発が進んでおり、臨床において使用されている（Rosenberg et al., N. Engl. J. Med 323:370, 1990；Andersonら、米国特許第５,３９９,３４６号）。ウイルスベクターを使用して本発明の発現ベクターを標的細胞、腫瘍組織、または全身に投与することが最も好ましい。
【０１００】
ウイルスを使用しない方法で治療薬を細胞（たとえば腫瘍細胞または新生物細胞）に導入することもできる。たとえば、細胞への核酸分子の導入は、リポフェクチンの存在下における核酸分子の投与（Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413, 1987; Ono et al., Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham et al., Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger et al., Methods in Enzymology 101:512, 1983）、アシアロオロソムコイド−ポリリジンとの結合（Wu et al., Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu et al., Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989）、外科的条件下でのマイクロインジェクション（Wolff et al., Science 247:1465, 1990）などによって行うことができる。本発明の核酸は、リポソームおよびプロタミンと組み合わせて投与することが好ましい。
【０１０１】
遺伝子移入は、インビトロにおけるトランスフェクションを使用した、ウイルスを用いない方法によって行うこともできる。そのような方法として、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、プロトプラスト融合法などが挙げられる。リポソームの使用も細胞へのＤＮＡの送達に有利であると考えられる。
【０１０２】
本発明の治療用コンストラクトまたはレポーターコンストラクトは、任意の適切なプロモーターから発現を開始してもよく、任意の適切な哺乳動物調節エレメントの制御下で発現させてもよい。所望に応じ、特定の細胞種において遺伝子発現を選択的に制御することが知られているエンハンサー（たとえば、ＴＡＫ１、ＧＦＡＰ、ＳＲＹ、ｐｒｏｘ１）を用いて核酸の発現を制御することもできる。ＴＡＫ１遺伝子に隣接する核酸配列は遺伝子発現の調節に関連している（ＧｅｎｅＬｏｃロケーション：ＧＣ０６Ｍ０９１２８２、開始：９１,２２３,２９２ｂｐ、終了：９１,２９６,９０７ｂｐ；たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｋｂ上流、および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０ｋｂ下流）。典型的なＴＡＫ１プロモーターは以下の配列（配列番号８）を含む。
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【０１０３】
別法として、コグネイト調節配列を介して制御してもよく、あるいは、所望に応じて、上述のプロモーターおよび調節エレメントなどの異種由来調節配列を介して制御してもよい。本発明によれば、検出可能なレポーターを含む発現ベクターを発現させることによって、細胞内の局在を示すことができる。
【０１０４】
レポーターの発現
本発明はさらに、レポーターをコードする核酸分子を包含する。本発明の方法に特に有用なものは、ＤｓＲｅｄポリペプチド配列、ＧＦＰポリペプチド配列、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）配列、ヒトインフルエンザヘマグルチニンタグ（ＨＡタグ）配列、ｆｌａｇタグ（DYKDDDDK（配列番号９））配列、ルシフェラーゼ配列、またはこれらのフラグメントをコードする核酸分子である。典型的な核酸分子の配列は本明細書に記載されている。
【０１０５】
通常、本発明の検出可能なＡｔｏｈ１−ＥＲ融合ポリペプチドは、本発明の発現コンストラクト全体またはその一部を用いて適切な宿主細胞を形質転換することにより製造してもよい。様々な発現系のいずれを使用してもよいことは、分子生物学に精通した当業者であれば理解できるであろう。使用する宿主細胞が厳密にどのようなものであるのかは本発明において重要視されない。宿主細胞は発現ベクターを含んでいればどのような細胞（たとえば真核細胞）であってもよい。
【０１０６】
本発明のポリペプチドは、真核生物の宿主細胞（たとえば、哺乳動物細胞、たとえば、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞、ＨｅＬａ細胞など、好ましくはＣＯＳ細胞）において製造してもよい。そのような細胞は様々な提供元から入手可能である（たとえば、American Type Culture Collection（メリーランド州ロックランド）；たとえばAusubel et al., Current Protocol in Molecular Biology, New York: John Wiley and Sons, 1997を参照されたい）。形質転換およびトランスフェクションの方法は、たとえばＡｕｓｕｂｅｌらによる文献（上掲）に記載されており、発現ビヒクルは、たとえばCloning Vectors: A Laboratory Manual（P. H. Pouwels et al., 1985, Supp. 1987）に記載されているものから選択してもよい。
【０１０７】
様々な発現系を使用して本発明のポリペプチドを製造することができる。本発明のポリペプチドの製造に有用な発現ベクターとしては、染色体ベクター、エピソームベクターおよびウイルス由来ベクターが挙げられ、たとえば、細菌プラスミド由来ベクター、バクテリオファージ由来ベクター、トランスポゾン由来ベクター、酵母エピソーム由来ベクター、挿入エレメント由来ベクター、酵母染色体エレメント由来ベクター、ウイルス由来ベクター、たとえば、バキュロウイルス、パポバウイルス（たとえばＳＶ４０）、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルスなどに由来するベクター、およびこれらの組み合わせに由来するベクターが挙げられるが、これらに限定されない。特定の一実施形態において、本発明は、本明細書に記載のレポーターコンストラクトをコードする１以上のポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターバックボーンを提供する。発現ベクターは、宿主細胞において特定の遺伝子を転写することが可能な一連の特定の核酸エレメントを持つ、組換え技術または合成により作製された核酸コンストラクトである。通常、遺伝子発現は、特定の調節エレメント（たとえば４ＯＨ−タモキシフェン、タモキシフェン、エストロゲン）の制御下に置かれる。他の調節エレメントとしては、構成型プロモーター、誘導型プロモーター、組織選択的調節エレメント、およびエンハンサー（たとえばＴＡＫ１、ＧＦＡＰ、ＳＲＹ、ｐｒｏｘ１）が挙げられる。本発明によれば、発現ベクターを介して本明細書に記載の検出可能なポリペプチドのいずれをも発現することができる。典型的な発現ベクターの配列は本明細書に記載されている。さらに、本発明は、本明細書に記載のレポーターのいずれかをコードする核酸配列を含む宿主細胞（たとえば、哺乳動物細胞、げっ歯類細胞、ヒト細胞）を特徴とする。
【０１０８】
別の方法では、本発明の発現ベクターをトランスジェニック動物などのトランスジェニック生物において発現させる。「トランスジェニック」は、細胞に人工的に挿入されたＤＮＡ配列が、その細胞から発生する生物のゲノムの一部、または追加された遺伝性染色体アレイの一部となるような任意の細胞を意味する。本明細書において、トランスジェニック生物は、任意のトランスジェニック脊椎動物であってよく、たとえばトランスジェニックな家畜哺乳動物（たとえば、ヒツジ、ウシ、ヤギ、ウマなど）、トランスジェニックマウス、トランスジェニックラットなどが挙げられる。一実施形態では、本発明のレポーターコンストラクトは、げっ歯類（たとえばラットまたはマウス）などのトランスジェニック動物において発現される。さらに、当技術分野の標準的な方法によって、このようなマウスから細胞株を樹立してもよい。導入遺伝子は、Ａｕｓｕｂｅｌら（Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 2000）に記載されているような任意の適切な遺伝子工学的手法を使用して構築することができる。導入遺伝子を構築するための一般的な技術、および発現コンストラクトを使用してトランスフェクションまたは形質転換を行うための一般的な技術は多く知られており、本明細書で開示したコンストラクトに使用することができる。
【０１０９】
トランスジェニック実験に適した動物は、Ｔａｃｏｎｉｃ社（ニューヨーク州ジャーマンタウン）などの一般的な販売会社から入手することができる。様々な株が適しているが、Ｓｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ（Ｔａｃｏｎｉｃ）雌性マウスが胚の取得および移入には望ましい。Ｂ６Ｄ２Ｆ（Ｔａｃｏｎｉｃ）雄性マウスを交配に使用することができ、また、精管切除したＳｗｉｓｓ Ｗｅｂｓｔｅｒ雄性マウスは偽妊娠を誘発するために使用することができる。精管切除したマウスおよびラットは上記の供給業者から公的に入手することができる。しかしながら、当業者であれば、トランスジェニックマウスまたはトランスジェニックラットの作製方法（たとえばHelmsら、2000を参照されたい）を熟知しているであろう。
【０１１０】
医薬組成物の製剤化
本発明の化合物または本発明の化合物の組み合わせの投与は、他の成分と組み合わせたこれらの治療薬の濃度が、感音難聴または新形成の治療に効果的な濃度となるような任意の適切な方法によって行ってもよい。本発明の化合物は、任意の適切な担体物質中に任意の適切な量で含まれていてもよく、通常、組成物の総重量に対して１〜９５重量％含まれている。本発明の組成物は、非経口（たとえば、皮下、静脈内、筋肉内または腹腔内）投与経路に適した剤形で提供されてもよい。本発明の医薬組成物は薬学上の慣例に従って製剤化されてもよい（たとえば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A. R. Gennaro, Lippincott Williams & Wilkins, 2000およびEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New Yorkを参照されたい）。
【０１１１】
当技術分野においては、通常、動物モデルと比較することによってヒトに対する用量を調整することが当業者によって行われているように、最初に、たとえばマウスにおける化合物の使用量からヒトでの使用量を推定することによって、ヒトに対する用量を決定してもよい。特定の実施形態では、本発明の化合物の用量は、約１μｇ／ｋｇ体重〜約５０００ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約４０００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重〜約３０００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、約１５０ｍｇ／ｋｇ体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重のいずれの範囲であってもよい。別の実施形態では、本発明の化合物の用量は、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約２５ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約７５ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１５０ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約２５０ｍｇ／ｋｇ体重、約３００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約４００ｍｇ／ｋｇ体重、約４５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重、約５５０ｍｇ／ｋｇ体重、約６００ｍｇ／ｋｇ体重、約６５０ｍｇ／ｋｇ体重、約７００ｍｇ／ｋｇ体重、約７５０ｍｇ／ｋｇ体重、約８００ｍｇ／ｋｇ体重、約８５０ｍｇ／ｋｇ体重、約９００ｍｇ／ｋｇ体重、約９５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１１５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１２００ｍｇ／ｋｇ体重、約１２５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１３００ｍｇ／ｋｇ体重、約１３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１４００ｍｇ／ｋｇ体重、約１４５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１５００ｍｇ／ｋｇ体重、約１６００ｍｇ／ｋｇ体重、約１７００ｍｇ／ｋｇ体重、約１８００ｍｇ／ｋｇ体重、約１９００ｍｇ／ｋｇ体重、約２０００ｍｇ／ｋｇ体重、約２５００ｍｇ／ｋｇ体重、約３０００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５００ｍｇ／ｋｇ体重、約４０００ｍｇ／ｋｇ体重、約４５００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０００ｍｇ／ｋｇ体重のいずれであってもよい。別の実施形態では、本発明の化合物の用量は、約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよい。別の実施形態では、本発明の化合物の用量は、約８ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１２ｍｇ／ｋｇ体重、約１４ｍｇ／ｋｇ体重、約１６ｍｇ／ｋｇ体重、約１８ｍｇ／ｋｇ体重のいずれであってもよい。言うまでもないが、このような治療プロトコルにおいて通常行われているように、初期の臨床試験の結果および個別の患者の必要性に応じて、これらの用量は増加させても減少させてもよい。
【０１１２】
治療薬（たとえば４ＯＨＴ）の有効量は、単回用量、２回用量または複数回用量として投与することができる。このような用量の投与はどのようなタイミングで行ってもよいが、一実施形態では、損傷発生後０．５時間以内、１時間以内、２時間以内、３時間以内、４時間以内、５時間以内、６時間以内、７時間以内、８時間以内、９時間以内、１０時間以内、１１時間以内もしくは１２時間以内、または損傷発生後できるだけ早期に投与する。別の一実施形態では、損傷を発生した哺乳動物に単回用量、２回用量または複数回用量として投与するが、投与量は損傷の重症度に依存するであろう。複数回用量として投与する場合、毎日投与、週１回投与、隔週投与のいずれであってもよい。また、上記用量はカテーテルまたは注射器を用いて投与してもよい。別の方法においては、耳道に直接適用できるように、外科手術中に投与することができる。
【０１１３】
本発明による医薬組成物は、実質的に投与直後、または投与後の所定の時点もしくは所定の期間において本発明の活性化合物を放出するように製剤化してもよい。後者のタイプの組成物は、放出制御製剤として一般に知られており、放出制御製剤には、
（ｉ）生体内において長期間にわたり実質的に一定の薬物濃度を維持できる製剤；
（ii）所定の遅延時間が経過した後、生体内において長期間にわたり実質的に一定の薬物濃度を維持できる製剤；
（iii）生体内において比較的安定した有効レベルを維持することによって所定期間にわたり作用を維持するとともに、血漿中の有効成分濃度の変動（鋸歯状動態パターン）による有害な副作用が最小化されている製剤；
（iv）たとえば、胸腺に隣接または接触する位置に放出制御組成物を配置することなどによって、局所で作用を発揮する製剤；
（ｖ）たとえば週１回または２週に１回投与するような簡便な投薬が可能な製剤；および
（vi）特定の細胞種（たとえばニューロン）に治療薬を送達することができる担体または化学的誘導体を使用することによって中枢神経系損傷または中枢神経系外傷を標的とする製剤
が包含される。放出制御製剤を使用することにより、場合によっては、治療レベルの血漿中濃度を維持するために日中に頻繁な投薬を行う必要がなくなる。
【０１１４】
投与する化合物の代謝速度よりも放出速度が重要視される放出制御は、様々な方法によって行うことができる。一例においては、様々な処方パラメータおよび様々な成分、たとえば様々な種類の放出制御組成物やコーティングなどを適切に選択することによって放出制御を行うことができる。したがって、本発明の治療薬は、適切な添加剤を使用することによって、投与後に治療薬を制御放出する医薬組成物に製剤化される。このような医薬組成物の具体例としては、シングルユニット型またはマルチプルユニット型の錠剤組成物およびカプセル組成物、油液、懸濁液、乳液、マイクロカプセル、マイクロスフェア、分子複合体、ナノ粒子、パッチならびにリポソームが挙げられる。
【０１１５】
本発明の化合物は、たとえばアジュバント、プロテアーゼ阻害薬、または適合性を有するこれら以外の薬物もしくは化合物などの、他の有効成分と組み合わせて投与することもでき、このような組み合わせは、本明細書に記載の方法の所望の効果を達成するにあたって望ましいあるいは有利であると考えられる。
【０１１６】
非経口組成物
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される慣用の無毒な担体およびアジュバントを含んだ投与剤形、製剤、適切な送達装置、または移植片の形態で、（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内などの）注射、点滴または移植によって非経口的に投与してもよい。本発明の組成物は、損傷部位または損傷部位近傍に局所投与することが好ましい。このような組成物の処方および調製は、医薬製剤化に精通した当業者によく知られている。このような処方は、上掲のRemington: The Science and Practice of Pharmacyに記載されている。
【０１１７】
非経口投与される本発明の組成物は、単位投与剤形（たとえば単回用量アンプル）の形態または複数回用量を含むバイアルの形態で提供されてもよく、適切な保存剤が添加されていてもよい（後述）。該組成物は、溶液、懸濁液、乳液、点滴装置、移植用送達装置のいずれの形態であってもよく、使用前に水または別の適切なビヒクルで再構成される乾燥粉末として提供されてもよい。該組成物は、神経系損傷または神経系外傷を回復または改善する有効成分に加えて、非経口的に許容される適切な担体および／または添加剤を含んでいてもよい。本発明の治療有効成分は、放出制御を行うため、マイクロスフェア、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソームなどに組み込まれていてもよい。さらに、上記組成物は、懸濁化剤、可溶化剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、等張化剤および／または分散剤を含んでいてもよい。
【０１１８】
上述したように、本発明による医薬組成物は滅菌注射に適した形態であってもよい。このような組成物を調製するためには、適切な治療有効成分を非経口的に許容される液体ビヒクル中に溶解または懸濁する。許容されるビヒクルおよび溶媒として使用可能なものとしては、水；塩酸、水酸化ナトリウムまたは適切な緩衝液を適量加えて適切なｐＨに調整した水；１，３−ブタンジオール；リンゲル液；生理食塩液；および等張デキストロース溶液が挙げられる。このような水性製剤は、１以上の保存剤（たとえばｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル）をさらに含んでいてもよい。本発明の化合物のうちの１つが難水溶性または低水溶性である場合、溶解促進剤または可溶化剤を加えてもよく、あるいは、溶媒がプロピレングリコールなどを１０〜６０％ｗ／ｗ含んでいてもよい。
【０１１９】
放出制御非経口組成物
放出制御非経口組成物は、水性懸濁液、マイクロスフェア、マイクロカプセル、磁気マイクロスフェア、油液、油中懸濁液または乳液の形態であってもよい。別法として、本発明の有効成分を、生体適合性担体、リポソーム、ナノ粒子、移植片または点滴装置に組み込んでもよい。
【０１２０】
マイクロスフェアおよび／またはマイクロカプセルの調製に使用される材料としては、たとえば、ポリグラクチン、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−Ｌ−グルタミン）、ポリ乳酸などの生分解性ポリマーが挙げられる。放出制御非経口製剤の調製に使用してもよい生体適合性担体としては、炭水化物（たとえばデキストラン）、タンパク質（たとえばアルブミン）、リポタンパク質および抗体が挙げられる。移植片に使用される材料としては、非生物分解性材料（たとえばポリジメチルシロキサン）および生分解性材料（たとえばポリカプロラクトン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル、またはこれらの組み合わせ）が挙げられる。
【０１２１】
本発明は、蝸牛の損傷、疾患および／もしくは障害、またはその症状を治療する方法であって、本明細書に記載の薬物を含む治療有効量の医薬組成物を対象（たとえばヒトなどの哺乳動物）に投与することを含む方法を提供する。したがって、一実施形態は、蝸牛の損傷、疾患もしくは障害またはその症状を有する対象、または蝸牛の損傷、疾患もしくは障害またはその症状を発症する傾向がある対象を治療する方法である。この方法は、蝸牛の疾患または障害が治療される条件下において、本明細書に記載の薬物を、蝸牛の疾患もしくは障害またはその症状を治療するのに十分な治療量で哺乳動物に投与する工程を含む。
【０１２２】
上記方法は、本明細書に記載の化合物または組成物の有効量を対象（上記治療を必要とすると判定された対象を含む）に投与して、上記の効果を達成することを含む。対象が上記治療を必要とするかどうかの判定は、対象自身の判断または医療従事者の判断に基づくものであってもよく、主観的判定（たとえば見解）でも客観的判定（たとえば検査法または診断法によって測定できるのもの）でもよい。
【０１２３】
本発明の治療方法（予防療法も包含する）は、通常、哺乳動物（特にヒト）を包含する上記治療を必要とする対象（たとえば動物、ヒト）に、本明細書に記載の式の化合物を包含する本明細書に記載の化合物を治療有効量で投与することを含む。このような治療は、蝸牛の損傷、疾患、障害またはその症状を有していたり、そのような傾向があったり、あるいはこれらのリスクを抱えている対象（特にヒト）に適切に適用される。「リスクを抱えている」対象は、診断検査または対象自身もしくは医療従事者の見解（たとえば、遺伝子検査、酵素マーカーまたはタンパク質マーカー、（本明細書に記載の）マーカー、家族歴など）に基づいた、客観的判定または主観的判定により決定することができる。さらに、本明細書に記載の化合物は新形成の治療に使用してもよい。
【０１２４】
一実施形態では、本発明は、治療の進展をモニタリングする方法を提供する。この方法は、脳卒中または心筋梗塞に関連した障害またはその症状を有していたり、そのような傾向を示しており、このような状態またはその症状の治療に十分な治療量の本明細書に記載の化合物を投与された対象において、診断マーカー（本明細書に記載のマーカー）（たとえば本明細書に記載の化合物、そのタンパク質または指標などによって調節される本明細書に記載の任意のターゲット）のレベルまたは（たとえばスクリーニング、アッセイの）診断検査値を測定する工程を含む。この方法において測定されたマーカーのレベルを、健常対照または他の疾患を有する患者におけるマーカーの既知レベルと比較することによって、対象における疾患の状態を確認することができる。好ましい実施形態では、対象において特定のマーカーの第１のレベルを測定した後のある時点において第２のレベルを測定し、これら２つのレベルを比較して、疾患の経過または治療の有効性をモニタリングする。特定の好ましい実施形態では、本発明による治療を開始する前に対象におけるマーカーの治療前レベルを測定する。この治療前レベルを治療開始後の対象における該マーカーのレベルと比較することにより、治療の有効性を確認することができる。
【０１２５】
経口投与用固形製剤
経口投与用製剤としては、薬学的に許容される無毒な添加剤と混合された有効成分（たとえばタモキシフェン）を含む錠剤が挙げられる。そのような製剤は当業者に知られている。添加剤としては、たとえば、不活性な希釈剤および充填剤（たとえば、スクロース、ソルビトール、糖類、マンニトール、微結晶性セルロース、デンプン（バレイショデンプンなど）、炭酸カルシウム、塩化ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、硫酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム）；造粒剤および崩壊剤（たとえば、セルロース誘導体（微結晶性セルロースなど）、デンプン（バレイショデンプンなど）、クロスカルメロースナトリウム、アルギン酸塩またはアルギン酸）；結合剤（たとえば、スクロース、グルコース、ソルビトール、アラビアゴム、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、デンプン、α化デンプン、微結晶性セルロース、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、エチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはポリエチレングリコール）；ならびに滑沢剤、流動促進剤および接着防止剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸亜鉛、ステアリン酸、シリカ、硬化植物油またはタルク）が挙げられる。薬学的に許容される他の添加剤としては、着色剤、香料、可塑剤、湿潤剤、緩衝剤などが挙げられる。
【０１２６】
上記錠剤は、コーティングされていなくてもよく、胃腸管における崩壊および吸収を遅延させ、より長い時間にわたって作用を持続できるように公知の技術によってコーティングされていてもよい。コーティングは、（たとえば放出制御を行うことを目的として）所定パターンで有効成分を放出できるように調整されていてもよく、胃を通過するまで有効成分を放出しないように調整されていてもよい（腸溶コーティング）。コーティングは、糖衣、フィルムコーティング（たとえば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アクリレートコポリマー、ポリエチレングリコールおよび／またはポリビニルピロリドンを使用したもの）、腸溶コーティング（たとえば、メタクリル酸コポリマー、酢酸フタル酸セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ポリビニルアセテートフタレート、セラックおよび／またはエチルセルロースを使用したもの）のいずれであってもよい。さらに、たとえばモノステアリン酸グリセリン、ジステアリン酸グリセリンなどの放出遅延剤を使用してもよい。
【０１２７】
固形錠剤組成物は、望ましくない化学変化（たとえば治療有効成分放出前の化学分解）を起こさないよう組成物を保護するのに適したコーティングを含んでいてもよい。コーティングは、上掲のEncyclopedia of Pharmaceutical Technologyに記載された方法と同様にして固形製剤に施してもよい。
【０１２８】
経口投与製剤は、チュアブル錠、不活性な固形希釈剤（たとえばバレイショデンプン、ラクトース、微結晶性セルロース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と有効成分とが混合された硬質ゼラチンカプセル、または水もしくは油性基剤（たとえばラッカセイ油、流動パラフィンまたはオリーブ油）と有効成分とが混合された軟質ゼラチンカプセルの形態で提供されてもよい。散剤および顆粒剤は、たとえば、ミキサー、流動層装置またはスプレー乾燥器を使用した慣用の方法で、上記錠剤およびカプセル剤について記載した成分を使用して調製してもよい。
【０１２９】
放出制御経口製剤
経口投与用放出制御組成物は、たとえば、治療有効成分の溶解および／または拡散の制御により該有効成分の放出が制御されるように構築されていてもよい。溶解または拡散を制御した放出は、化合物を含む錠剤、カプセル剤、ペレット剤または顆粒剤を適切にコーティングすることによって行うことができ、あるいは適切なマトリックスに化合物を混合することによっても行うことができる。放出制御コーティングは、上記コーティング材料の１以上を含んでいてもよく、かつ／または、たとえば、セラック、ミツロウ、ｇｌｙｃｏｗａｘ、ヒマシ油、カルナウバロウ、ステアリルアルコール、モノステアリン酸グリセリン、ジステアリン酸グリセリン、パルミトステアリン酸グリセリン、エチルセルロース、アクリル樹脂、ｄｌ−ポリ乳酸、酢酸酪酸セルロース、ポリ塩化ビニル、ポリ酢酸ビニル、ビニルピロリドン、ポリエチレン、ポリメタクリレート、メチルメタクリレート、２−ヒドロキシメタクリレート、メタクリレートヒドロゲル、１，３−ブチレングリコール、エチレングリコールメタクリレートおよび／もしくはポリエチレングリコールを含んでいてもよい。放出制御マトリックス製剤において、マトリックス材料は、たとえば、メチルセルロース水和物、カルナウバロウ、ステアリルアルコール、カーボポール９３４、シリコーン、トリステアリン酸グリセリン、メチルアクリレート−メチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリエチレン、および／またはハロゲン化フルオロカーボンをさらに含んでいてもよい。
【０１３０】
また、１以上の治療化合物を含む放出制御組成物は、浮遊錠剤または浮遊カプセル剤（すなわち、経口投与された後、胃内容物上に一定時間浮遊できる錠剤またはカプセル剤）の形態であってもよい。本発明の化合物の浮遊錠剤は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどの親水コロイド２０〜７５％ｗ／ｗと添加剤と本発明の化合物との混合物を造粒することによって調製することができる。次いで、得られた造粒物を圧縮して錠剤を成形することができる。浮遊錠剤は、胃液と接触すると、その表面に実質的に水不透過性のゲルバリアを形成する。このゲルバリアによって１未満の密度が維持されることから、錠剤を胃液中に浮遊させることが可能となる。
【０１３１】
治療法
一実施形態において、本発明は、感音難聴または他のタイプの難聴を治療する方法を提供する。有利なことに、本発明は、蝸牛細胞または有毛細胞の成長、増殖、または生存を促進する方法を提供するものであり、この方法を難聴の治療に使用してもよい。本発明の別の一態様は、対象において蝸牛細胞または有毛細胞の成長、増殖または生存を促進するための薬剤の製造における本発明の化合物の使用である。感音難聴の治療に加えて、本発明は、新形成（たとえば結腸がん、乳がんおよび皮膚がん）の治療に使用してもよい。Ａｔｏｈ１は腫瘍抑制因子として作用することが示されている。特定の理論に拘束されるものではないが、Ａｔｏｈ１を核に局在化させるとその腫瘍抑制活性が有利に作用すると考えられる。上記方法は、治療を必要とする対象に本発明の治療薬（たとえばＡｔｏｈ１−ＥＲ融合タンパク質を含むポリペプチドを発現するベクター）の有効量を投与することを含む。そのような薬物は薬学的に許容される担体を含むウイルスベクターにより投与することが好ましい。当業者によく知られているように、治療薬（たとえば、ウイルスもしくはリポソームにより送達される核酸、またはポリペプチド）は、損傷部位へ局所投与してもよく、あるいは全身投与してもよく、このような投与によって効果を発揮する。さらに、Ａｔｏｈ１−ＥＲ融合タンパク質の発現による治療効果を発揮するために、エストロゲン受容体リガンド（たとえば４ＯＨ−タモキシフェン、タモキシフェン、エストロゲンなど）を対象に投与する。上記方法は、難聴に罹患した対象または難聴を発症する傾向のある対象を治療するために使用することが好ましい。さらに、本発明の治療法は、利用可能な他の難聴治療法と組み合わせて使用することができる。別の実施形態は、本明細書に記載の治療を必要とすると判断された対象に対して施される本明細書に記載の任意の方法を包含する。対象が感音難聴または他のタイプの難聴損傷を有していると診断された後に治療法を選択する。上記薬剤は、対象における上記の疾患、障害または症状を治療または予防するために使用することが好ましい。したがって、本発明は、対象に対して治療法を選択する方法であって、対象における難聴（たとえば感音難聴など）または新形成（たとえば結腸がん、乳がん、皮膚がんなど）の罹患を確認すること、および対象に本発明の治療用組成物を投与することを含む方法を提供する。
【０１３２】
治療効果の評価方法
一方法では、治療の有効性は、たとえば治療した器官の生物学的機能（たとえば、聴覚機能、聴力）を測定することによって評価する。そのような方法は当技術分野において一般的に行われており、たとえば、Textbook of Medical Physiology, Tenth edition, （Guyton et al., W.B. Saunders Co., 2000）に記載されている。具体的には、本発明の方法は、組織または器官の生物学的機能を少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％または２００％高め、さらには３００％、４００％または５００％もの向上を誘導する。上記組織は蝸牛組織であることが好ましく、上記器官は耳であることが好ましい。機能回復を検出する行動試験を治療効果の評価に使用してもよく、このような行動試験として、たとえば、聴覚刺激に対する応答などが挙げられる。
【０１３３】
別の一方法では、本発明の方法の治療効果は、対応する対照組織または器官（たとえば治療を施していない組織または器官）と比較した、治療または移植した組織または器官中の細胞数の増加を測定することによって分析する。組織または器官中の細胞数は、対応する組織または器官と比較して、少なくとも５％、１０％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１５０％または２００％増加していることが好ましい。細胞増殖を分析する方法は当業者に知られており、たとえば、Bonifacinoら（Current Protocols in Cell Biology Loose-leaf, John Wiley and Sons, Inc., San Francisco, Calif.）に記載されている。たとえば、細胞増殖を検出するアッセイにおいては、細胞複製過程におけるＤＮＡ合成を測定してもよい。一実施形態では、ＤＮＡ合成の検出は、［３Ｈ］−チミジン、５−ブロモ−２’−デオキシウリジン［ＢｒｄＵ］などの標識されたＤＮＡ前駆物質を細胞（または動物）に投与し、細胞周期のＳ期（複製期）にゲノムＤＮＡに取り込まれたこれらの前駆物質を検出することによって行われる（Ruefli-Brasse et al., Science 302(5650):1581-4, 2003； Gu et al., Science 302 (5644):445-9, 2003）。
【０１３４】
別の一方法では、治療効果は、治療を施していない対照組織もしくは器官中の生細胞数または治療前に存在していた生細胞数と比較した、組織または器官中の生細胞数の増加を検出することによって測定する。細胞生存率を測定するためのアッセイは当技術分野で知られており、たとえば、Crouchら（J. Immunol. Meth. 160, 81-8）；Kangasら（Med. Biol.62, 338-43, 1984）；Lundinら（Meth. Enzymol.133, 27-42, 1986）；Pettyら（Comparison of J. Biolum. Chemilum.10, 29-34, 1995）；およびCreeら（AntiCancer Drugs 6: 398-404, 1995）に記載されている。細胞生存率は様々な方法を使用して分析することができ、このような方法として、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）法（Barltrop, Bioorg. & Med. Chem. Lett.1: 611, 1991; Cory et al., Cancer Comm. 3, 207-12, 1991; Paull J. Heterocyclic Chem. 25, 911, 1988）が挙げられる。さらに、細胞生存率アッセイは市販品を用いて行うこともできる。このようなアッセイとして、ルシフェラーゼ技術を使用してＡＴＰを検出することにより培養物中の細胞の健常性または細胞数を定量するCELLTITER-GLO（登録商標）Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ）や、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を使用した細胞毒性アッセイであるCellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay（プロメガ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３５】
別法としてあるいは上記に加えて、アポトーシスの減少を測定することによって治療効果を評価する。アポトーシスを起こした細胞には、クロマチンの凝集、細胞の萎縮、細胞膜表面のブレブ形成などの特徴的な形態変化が見られ、これらは、光学顕微鏡下で容易に観察することができる。アポトーシスの生化学的特徴としては、ＤＮＡの断片化、特定の位置でのタンパク質切断、ミトコンドリア膜の透過性の増加、および細胞膜表面上におけるホスファチジルセリンの露出が挙げられる。アポトーシスを検出するアッセイは当技術分野で知られている。典型的なアッセイとしては、ＴＵＮＥＬ（ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼビオチン−ｄＵＴＰニック末端標識）アッセイ、カスパーゼ活性（特にカスパーゼ−３）アッセイ、およびｆａｓ−リガンドおよびアネキシンＶを検出するアッセイが挙げられる。アポトーシスを検出するための市販品としては、たとえば、Apo-ONE（登録商標）Homogeneous Caspase-3/7 Assay, FragEL TUNELキット（ONCOGENE RESEARCH PRODUCTS、カリフォルニア州サンディエゴ）、ApoBrdU DNA Fragmentation Assay（BIOVISION、カリフォルニア州マウンテンビュー）、およびQuick Apoptotic DNA Ladder Detection Kit（BIOVISION、カリフォルニア州マウンテンビュー）が挙げられる。
【０１３６】
キットまたは製剤システム
本発明の組成物は、蝸牛細胞および有毛細胞の成長、増殖または生存において使用するためのキットまたは製剤システムとして構成されてもよい。キットまたは製剤システムに含まれる組成物は、感音難聴または難聴に関連する他の損傷の治療に使用してもよい。別の実施形態では、キットまたは製剤システムに含まれる組成物は、新形成（たとえば、結腸がん、乳がん、皮膚がんなど）に使用してもよい。本発明によるキットまたは製剤システムは、バイアル、チューブ、アンプル、ボトルなどの容器を１つ以上含む、箱、紙箱、チューブなどの密閉可能な運搬手段を含む。本発明のキットまたは製剤システムは、本発明の薬物の使用説明書をさらに含んでいてもよい。本発明のキットは、少なくとも、エストロゲン受容体のリガンド結合ドメインに融合されたＡｔｏｈ１をコードするポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、Ａｔｏｈ１−ＥＲ融合タンパク質はレポーター（たとえばＤｓＲｅｄ）をさらに含んでいてもよい。実施形態のいくつかでは、本発明のキットは、４−ヒドロキシタモキシフェン、タモキシフェン、エストロゲンなどのエストロゲンリガンドの１以上を含んでいてもよい。本発明のキットは、エストロゲン受容体のリガンド結合ドメインと結合する１以上の薬物と組み合わせてＡｔｏｈ１−ＥＲ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを投与するための説明書を含んでいてもよい。４−スルファターゼ活性を有する薬物の有効性を測定する方法は、当技術分野で知られており、本明細書に記載されている。
【実施例】
【０１３７】
特に記載がない限り、本発明は、当業者によく知られている分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学における慣用の技術を使用して実施される。そのような技術は、「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, second edition（Sambrook、1989）；「Oligonucleotide Synthesis」（Gait、1984）；「Animal Cell Culture」（Freshney、1987）；「Methods in Enzymology」「Handbook of Experimental Immunology」（Weir、1996）；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」（MillerおよびCalos、1987）；「Current Protocols in Molecular Biology」（Ausubel、1987）；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」（Mullis、1994）；「Current Protocols in Immunology」（Coligan、1991）などの文献に詳しく説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製造に使用することができ、また、本発明による製造や本発明の実施において、このような技術の使用を考慮してもよい。特定の実施形態に特に有用な技術は後の節で説明する。
【０１３８】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニングおよび治療方法をどのように実施するのかを当業者に完全に開示し説明することを目的として記載されたものであり、本発明者らが発明品であると見なしているものの範囲を限定するものではない。
【０１３９】
実施例１  Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質のタモキシフェン依存性核局在化
誘導型Ａｔｏｈ１−ＥＲ融合タンパク質を発現するコンストラクトを作製した（図１）。ＤｓＲｅｄ部分の蛍光によって容易に検出可能なＡｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質を構成的に発現するこのＡｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトをＨＥＫ細胞にトランスフェクトした。このＡｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトにおいて、Ａｔｏｈ１は、生理学的濃度の生体内１７β−エストラジオールへの結合を制限するエストロゲン受容体リガンド結合ドメインバリアントに融合されている（Danielianら、1998；Danielianら、1993）。蛍光顕微鏡を使用した観察から分かるように、４ＯＨＴの非存在下では、Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質はトランスフェクト細胞の細胞質ゾル内に隔離されたままである（図２）。Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質の核への移行を定量するため、上記コンストラクトをＨＥＫ細胞にトランスフェクトし、段階的に用量を増加させた４ＯＨＴとともに７２時間インキュベートし、核分画抽出し、単離した核をプールしてカバースリップ上に載せ、ＤｓＲｅｄの蛍光を分析した。
【０１４０】
蛍光分析の結果、ＣＭＶ−Ａｔｏｈ１−Ｉｒｅｓ−ＤｓＲｅｄをトランスフェクトした対照群は５６８ｎｍにおいて低レベルの蛍光バックグラウンド（平均１９４．７±０．２７任意単位［ａｕ］）を示した。ＣＭＶ−Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄをトランスフェクトし、タモキシフェンとは接触させなかった細胞群では、５８８ｎｍの蛍光のわずかな増加（３９２．０±６８．３５ａｕ；ｐ＝０．１６）を示し、タモキシフェンの非存在下ではＡｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質の核内への移行はわずかであることが示唆された。１ｎＭ ４ＯＨＴ（８４８．０±２９．３３ａｕ；ｐ＜０．０５）または１ｍＭ ４ＯＨＴ（３,２００．９±１５６．９５ａｕ；ｐ＜０．０５）とともに培養物を７２時間インキュベートすると、核分画において５６８ｎｍの蛍光が有意に増加し、４ＯＨＴの用量に依存的してＡｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄの核への移行が増加することが示された。また、培地から４ＯＨＴを除去すると、２週間以内に該融合タンパク質が細胞質に完全に移行した（データ示さず）。しかしながら、１００ｍＭ ４ＯＨＴとともに３日間インキュベートすると細胞への毒性が示され、残存した核が示した５６８ｎｍの蛍光は、４ＯＨＴの添加を行わなかった群と統計的に同等であった（５９７．８±４０、５９７．８±４６；ｐ＝０．０７）。また、最小有効量は、１ｎＭ ４ＯＨＴの２〜７日間投与であることが経験的に分かった（図３）。
【０１４１】
実施例２  Ａｔｏｈ１の５’末端エンハンサー／プロモーターに対するＡｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質のタモキシフェン依存性結合
Ａｔｏｈ１は自体を正に制御するフィードフォワード型の自己制御性転写因子として作用することから、Ａｔｏｈ１遺伝子の発現に対する４ＯＨＴの効果を試験した。ルシフェラーゼ結合アッセイによる測定において４ＯＨＴの濃度を増加させると、Ａｔｏｈ１遺伝子のエンハンサー／プロモーター領域（Helmsら、2000）に対する結合が用量依存的に増加した（図４）。さらに、ＲＴ−ＰＣＲおよびｑＰＣＲのいずれにおいても、４ＯＨＴによってＡｔｏｈ１の発現が用量依存的にアップレギュレートされることが確認された（図５）。ウエスタンブロット分析では、４ＯＨＴによって細胞質ゾル中のＡｔｏｈ１タンパク質濃度が用量依存的に増加することが分かった（図６）。特定の理論に拘束されるものではないが、４−ＯＨＴは、ＨＳＰ９０と競合してＡｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質を核へと移行させ、核内において内因性Ａｔｏｈ１エンハンサー／プロモーター領域に結合し、フィードフォワード機構によって内因性Ａｔｏｈ１を発現させると考えられる（図７）。
【０１４２】
４ＯＨＴにより誘導されたＡｔｏｈ１の発現が、下流のシグナル伝達経路の活性化にとって十分であるかどうかを確認した。これを評価するため、Ａｔｏｈ１シグナル伝達の下流に位置するミオシン７ａの発現を、Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトをトランスフェクトしたＨＥＩ ＯＣ１細胞において測定した。増殖させたＨＥＩ ＯＣ１細胞にＡｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトをトランスフェクトし、１ｍＭ ４ＯＨＴの存在下または非存在下において、細胞を分化条件（３９℃）で３日間浮遊凝集塊培養し、細胞を固定し、ミオシン７ａを免疫標識してその強度を測定した（図８）。４ＯＨＴを投与した群と４ＯＨＴを投与しなかった群との間で、ＤｓＲｅｄ陽性細胞の数に有意差は見られず（ｐ＝０．０７）、これら２つの群におけるトランスフェクション効率は同等であることが示唆された。しかしながら、ビヒクルのみでインキュベートしたトランスフェクト細胞（２６％；±６％）と比較して、４ＯＨＴとともにインキュベートしたトランスフェクト細胞ではミオシン７ａの標識が有意に増加した（７９％；±５％）（ｐ＜０．００１）。
【０１４３】
Ａｔｏｈ１の５’末端エンハンサー／プロモーターの制御下でＧＦＰを発現するトランスジェニック仔マウスから単離した新生仔コルチ器に上記コンストラクトをエレクトロポレーションによって導入した。この結果、Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質によって、培養されたコルチ器外植片におけるＡｔｏｈ１の発現がアップレギュレートされた。以上の結果から、Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ融合タンパク質を使用し、４ＯＨＴを投与することによって、Ａｔｏｈ１発現の用量依存的なアップレギュレーションもダウンレギュレーションも可能であることが示された。
【０１４４】
４ＯＨＴの投与によってＡｔｏｈ１を調節できる遺伝学的コンストラクトは、制御下のＡｔｏｈ１発現をインビトロまたはインビボで分析する目的で組織に直接トランスフェクトしてもよい。構成的発現システムと比較すると、Ａｔｏｈ１の一時的かつ定量的な発現を制御できるという利点がある。Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトは、ウイルス粒子に封入して、聴力障害を生じた蝸牛に感染させることができる。レポーターコンストラクトを使用することによって、複数の世代にわたるトランスジェニック生物を作製する必要なく、翻訳モデルにおいてＡｔｏｈ１の一時的かつ定量的な発現を分析することができる。細胞特異的プロモーターの制御下にＡｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトを置いたＡｔｏｈ１の細胞特異的発現を翻訳送達システムにおいて利用することによって、コルチ器内でのＡｔｏｈ１の発現を一時的発現、定量的発現および細胞特異的局在に関して分析することができ、細胞特異的プロモーターとしては、たとえば、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；Rioら、2002）、ＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２（Ｓｏｘ２；Humeら、2007）、Ｐｒｏｓｐｅｒｏホメオボックスタンパク質１（ｐｒｏｘ１；Bermingham-McDonoghら、2007）、成体の蝸牛内支持細胞の特異的マーカーであるトランスフォーミング増殖因子β−活性化キナーゼ１（ＴＡＫ１；Parkerら、2011）などが挙げられる。
【０１４５】
特に記載がない限り、本明細書で報告した結果は以下の方法および材料を使用して得られた。
【０１４６】
Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトおよび対照コンストラクトの作製
実験を行うために設計したコンストラクトを図１Ａ〜１Ｅ、図１０および図１１に示す。開始コドンのすぐ後ろに２つの連続したｆｌａｇタグ配列（GATTACAAGGATGACGATGACAAG（配列番号１０））が含まれるようにＡｔｏｈ１配列をＰＣＲクローニングにより修飾し、このＡｔｏｈ１配列を含む構成発現型陽性対照コンストラクトを作製した。次いで、誘導型Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ導入遺伝子をコードするコンストラクトを得るため、ＰＣＲクローニングプライマーを設計し、１）５’末端にＥｃｏＲＩ部位を配置し、Ａｔｏｈ１の開始コドンの上流にＫｏｚａｃ配列（CACC）を導入し；２）Ａｔｏｈ１の終止コドン（TAG）を欠失させ；３）ポリペプチドリンカーをコードする配列CTCGAGCCATCTGCTGGAGACATG（配列番号１）を介して、上記ｆｌａｇタグ付加Ａｔｏｈ１配列をＥＲ ＬＢＤ配列に連結し；４）ＥＲ ＬＢＤの終止コドン（TAG）を欠失させ；５）ポリペプチドリンカーをコードする配列TCAGGATCTGGTTCAGGA（配列番号２）を介して、ＥＲ ＬＢＤ配列をＤｓＲｅｄ配列に連結し；６）３’末端にＮｏｔ Ｉ部位を配置した。上記リンカーは、複数のプロリン配列に翻訳されるように設計し、それによって融合タンパク質のサブユニットの自由度を高めた。上記ＥＲコンストラクトの作製に用いたインサートは、生理学的濃度の生体内１７β−エストラジオールに結合しないように変異させた（Danielian, P.S., et al., Curr Biol, 1998. 8(24): p. 1323-6；Danielian et al., Mol Endocrinol, 1993. 7(2): p. 232-40）鋳型ＤＮＡ（A. McMahon、Harvard Medical Schoolより供与）から２ステップＰＣＲにより増幅することによって得た。ＤｓＲｅｄ ＤＮＡは市販ベクター（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）から得た。さらに、陰性対照（ＤｓＲｅｄ−ＥＲ）コンストラクトを得るため、ＰＣＲクローニングプライマーを設計し、１）５’末端にＥｃｏＲＩ部位を配置し、ＤｓＲｅｄの開始コドンの上流にＫｏｚａｃ配列（CACC）を配置し；２）ＤｓＲｅｄの終止コドン（TAG）を欠失させ；３）ポリペプチドリンカーをコードする配列TCAGGATCTGGTTCAGGATCCATG（配列番号３）を介して、ＤｓＲｅｄをＥＲ ＬＢＤ配列に連結し；４）３’末端にＮｏｔ Ｉ部位をクローニングした。
【０１４７】
ｃｍｖプロモーターを使用したｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターのマルチクローニングサイトに上記コンストラクトをサブクローニングし、遺伝子を発現させた。また、蝸牛特異的発現を行うため、ＣＭＶプロモーターの代わりにＴＡＫ１プロモーターを使用した。このサブクローニングを行うため、Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトを作製するためのインサートおよびＤｓＲｅｄ−ＥＲコンストラクトを作製するためのインサートを鋳型ＤＮＡから２ステップＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ増幅は、AccuPrime（登録商標）Pfx SuperMix（インビトロジェン）を使用して行った。得られたＰＣＲ産物をゲル精製し、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔ Ｉで消化し、PureLink PCR精製キット（インビトロジェン）で精製してそれぞれのインサートを得た。次いで、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）１０μｇをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔ Ｉにより３７℃で２時間消化した。消化した溶液に仔ウシ小腸由来アルカリホスファターゼ（１μＬ）（インビトロジェン）を加え、３７℃で１０分間インキュベートした。消化溶液をフェノール抽出し、エタノール沈殿し、８０％エタノールで洗浄し、滅菌水に再懸濁した。インサートとしての融合フラグメントとベクターとしてのｐｃＤＮＡ３．１（＋）とを３：１（インサート：ベクター）の比率で使用して、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（インビトロジェン）によりライゲートした。ライゲーション産物をＴＯＰ１０細胞に形質導入し、等量をＬＢ／Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）平板培地に播種した。所望のコンストラクトそれぞれにつき１６個のコロニーを採取し、Ｔ７プライマーおよびＢＧＨリバースプライマーからなるベクタープライマー対を用いてコロニーＰＣＲを行った。陽性のコロニーは、PureLink HQ Mini Plasmid DNA Purification Kit（インビトロジェン）を使用してミニプレップし、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔ Ｉで制限消化することによって確認した。陽性のクローンは、Ｔ７プライマーおよびＢＧＨリバースプライマーからなるベクタープライマー対と、Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ遺伝子特異的シークエンシングプライマー対（TTGTGTGCCTCAAATCCATC（配列番号１１）、CCTTACAAACCTACTACATACC（配列番号１２））、またはＤｓＲｅｄ−ＥＲ遺伝子特異的シークエンシングプライマー対（CCCGTAATGCAGAAGAAGAC（配列番号１３）、GGTCAGTGCCTTGTTGGATG（配列番号１４））とを用いてシークエンシングし、クローニング接合点およびクローニング方向を確認した。次いで、陽性クローンのグリセロールストックを調製し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１４８】
Ａｔｏｈ１をＥＲ部分および／またはＤｓＲｅｄ部分に直接融合させた発現コンストラクトならびにＡｔｏｈ１の上流にＥＲおよび／またはＤｓＲｅｄを融合させた発現コンストラクトの中には、生体内Ａｔｏｈ１のアップレギュレーションにあまり効果を示さないものもあった。Ａｔｏｈ１−ＥＲ融合コンストラクトとＤｓＲｅｄ融合コンストラクトとの間に連結配列を付加すると、Ａｔｏｈ１の発現量が増加した。特定の理論に拘束されるものではないが、連結配列が立体障害を低減し、これらのコンストラクト間の自由度を高めていると考えられる。
【０１４９】
球状蝸牛細胞塊の作製およびエレクトロポレーション
蝸牛由来の前駆細胞を作製し、以前に報告された方法（Oshima et al., Journal of the Association for Research in Otolaryngology, 2007. 8(1): 18-31）に準じ、以下の変更を加えて浮遊凝集塊（球状蝸牛細胞塊）を増殖させた。Ｐ０〜Ｐ３の同腹ＲＯＳＡ２６−ＧＦＰマウスから蝸牛を単離し、コルチ器を切り離し、プールし、トリプシン処理し、バラバラにした後、遠心分離した。ペレットをＳＦＭに再懸濁し、７０μｍのセルストレーナーで濾過し、増殖因子（１０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ、ＩＧＦ、ＥＧＦ、ヘパリン硫酸塩）を添加した同じ培地で５日間培養した。浮遊凝集塊を回収し、遠心分離し、１００μＬピペットを使用して塊を崩し、Ｏｐｔｉｍｅｍ３００μＬに再懸濁し、エレクトロポレーションによってプラスミドＤＮＡ５０μｇを導入した（２５Ｖ；持続期間５０ｍｓ、間隔１００ｍｓの設定で水中２ｍｇ／ｍＬ ＤＮＡを８回パルスし、３：１ Ｆｕｇｅｎｅ ６中で一晩インキュベートした）。実験群（Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄ）および対照群（ｃｍｖ．ｆｌａｇＡｔｏｈ１およびＤｓＲｅｄ−ＥＲ）から得られた球状細胞塊を６ウェルプレートの上記と同じ培地中において３７℃でさらに５日間培養することにより増殖させ、段階的に用量を増加させた１ｎＭ ４−ヒドロキシタモキシフェン硫酸塩（４ＯＨＴ）とともに７２時間インキュベートした（各用量ともにＮ＝１０）。次いで、これらの各群から得た球状細胞塊を遠心分離し、１：１ポリリジン／ポリオルニチンでコーティングしたガラス製カバースリップ上に載せ、３７℃で２〜４時間インキュベートすることによってガラス製カバースリップに接着させ、４％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄し、分析するまで４℃で保存した。
【０１５０】
核局在化アッセイ
６ウェル培養皿（タイプ）においてＨＥＫ細胞を５０％コンフルエントまで培養し、Ｆｕｇｅｎｅ ６トランスフェクション試薬（ロシュ）とターゲットＤＮＡとを３：１の比率で用いてトランスフェクションを行った。細胞を２４時間インキュベートし、次いで、段階的に用量を増加させた４ＯＨＴとともに５〜７日間インキュベートした。次いで、細胞を細胞質と核に分画（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ）した。１条件につき５つ用意したウェルのそれぞれから回収し分離した核分画をカバースリップ上に載せ、Ｃｙ３（５５０ｎｍ）フィルターを備えたツァイス製落射蛍光顕微鏡で観察した５つの関心領域（２０倍率において２０６．５×１６５．２画素）の平均画素密度をＭｅｔａＭｏｒｐｈソフトウェアを使用して測定した。
【０１５１】
ルシフェラーゼアッセイ
Ａｔｏｈ１の５’末端エンハンサー／プロモーター領域（Helms、Abneyら、2000）を、ｐＧＬ３−プロモータールシフェラーゼレポーターベクター（プロメガ）のＭＣＳにクローニングし、ＨＥＫ細胞株において安定に発現させ、アンピシリンにより選択した。この細胞を６ウェルプレートにおいて８０％コンフルエントまで増殖させ、Ｆｕｇｅｎｅ ６トランスフェクション試薬とターゲットＤＮＡとを３：１の比率で用いて、ｃｍｖ．Ａｔｏｈ１対照ベクター、ｃｍｖ．Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクト、ｃｍｖ．ＤｓＲｅｄ−ＥＲ陰性対照コンストラクトのいずれかを一時的に細胞にトランスフェクトした。さらに、ウミシイタケトランスフェクションコントロールをすべての細胞にコトランスフェクトした。段階的に用量を増加させた４ＯＨＴとともに細胞を７２時間インキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、溶解し、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ（プロメガ）を行った。マニュアルＴＤ−２０／２０ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ）でホタルルシフェラーゼ活性を測定した。
【０１５２】
ＲＮＡ分析
６ウェルプレートにおいてＨＥＫ細胞を８０％コンフルエンまで増殖させ、上記と同様にしてｃｍｖ．Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトまたはｃｍｖ．Ａｔｏｈ１コンストラクトを細胞に一時的にトランスフェクトし、様々な用量の４ＯＨＴとともに７２時間インキュベートした。次いで、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（インビトロジェン）１ｍＬを各ウェルに加えて５分間インキュベートし、細胞からトータルＲＮＡを抽出した。細胞を掻き取って１．５ｍＬのチューブ（１本のチューブ／ウェル）に移し、（フード内で）クロロホルム２００ｍＬとともに２分間インキュベートし、４℃、１２,０００ｇで２０分間遠心分離した。新しい１．５ｍＬチューブに上清を回収し、上清と２−プロパノールとを１：１の等量でインキュベートし、RNeasy mini kitカラムを使用して８０００ｇで１５秒間遠心分離した。次いで、以下のようにしてＲＮＡをカラムから溶出した。ＲＷ１を７００ｍＬ加え、カラムを８０００ｇで１５秒間遠心分離した。ＲＰＥ２洗浄液５００ｍＬを加えて８０００ｇで１５秒間再度遠心分離し、もう一度この操作を行った。再度遠心分離（１０,０００ｇ、１分間）してメンブレンを乾燥させ、ＲＮＡｓｅフリー水４５ｍＬを加えて新しい１．５ｍＬチューブにＲＮＡを溶出し、最後に８０００ｇで１５秒間遠心分離を行った。
【０１５３】
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を行うため、鋳型ＲＮＡ４５μＬをＰＣＲチューブに加え、5x first strand buffer２０μＬ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２ １１μＬ、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）５μＬ、ランダムプライマー（インビトロジェン）５μＬ、ならびにＡｔｏｈ１ ｃＤＮＡの４４９塩基対セグメントを増幅するために設計されたフォワードプライマー（aga tct aca tca acg ctc tgt c）およびリバースプライマー（act ggc ctc atc aga gtc act g）各１．１μＬと混合し、ｄＨ２Ｏ １３μＬを加えて全反応量を１００μＬとした。上記ヘキサマーを２５℃で１０分間インキュベートし、ＲＴ反応を３７℃で６０分間行い、ＲＴインキュベーションを９５℃で５分間行い、４℃で保持し、１％アガロースゲル分析を行うまで氷上で保存した。
【０１５４】
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を行うため、ｄＨ２Ｏ ３００μＬを入れたＰＣＲチューブにｑＰＣＲマスターミックス（インビトロジェン）３００μＬを加え、５本のチューブに分けた（それぞれ１２０μＬ）。各チューブに鋳型ｃＤＮＡ６μＬを加えた。９６ウェルプレート（TempPlateIII PCRプレート、ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にプローブ３μＬを入れ、各チューブの内容物をそれぞれ２つのウェルに分けた（１列目に１８ｓ内部標準を入れ、４列目にＡｔｏｈ１を入れた）。上下にピペッティングすることにより混合し、１列目から２列目と３列目とに２０μＬずつ小分けし、４列目から５列目と６列目とに２０μＬずつ小分けした。９６ウェルプレートを透明のフィルムでシールし、ウェルの底の気泡を揺すって取り除いた。定量ＰＣＲを行い、ＲＮＡの量を測定した。ΔΔＣｔ値を各処置群に対して算出し、タモキシフェンを添加せずにインキュベートした群の発現比（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）に対して正規化した。実験条件ごとの平均発現比（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）を平均し、有意差を求めるためスチューデントのｔ検定を行った。
【０１５５】
ウエスタンブロット分析
１０ｍｍ培養プレート（タイプ）においてＨＥＫ細胞を８０％コンフルエントまで増殖させ、Ｆｕｇｅｎｅ ６トランスフェクション試薬とターゲットＤＮＡとを３：１の比率で使用して、Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄコンストラクトを一時的にトランスフェクトし、段階的に用量を増加させた４ＯＨＴとともに３７℃で７２時間インキュベートした。対照試料も同様にしてＤｓＲｅｄ−ＥＲ（陰性対照）または陽性対照ベクター（ｃｍｖ．ｆｌａｇＡｔｏｈ１）をトランスフェクトした。細胞を溶解し、全細胞タンパク質を回収し、抗Ａｔｏｈ１ポリクローナル抗体（Developmental Studies Hybridoma Bank）または抗β−アクチンポリクローナル抗体（シグマ）を使用してウエスタンブロット分析を行った。
【０１５６】
コルチ器の切除、培養およびエレクトロポレーション
これらの操作の詳細なプロトコルは文献に記載されている（Parker et al., Journal of Visualized Experiments, 2010(36)）。簡単に述べると、Ａｔｏｈ１のエンハンサー／プロモーターの制御下で核標的化ＧＦＰを発現するＰ０〜Ｐ３の仔マウス（Jane Johnsonより供与）（Helms et al., Development, 2000. 127(6): p. 1185-96）からコルチ器を切り離し、１０％血清中１：１ポリリジン／オルニチンでコートしたガラス製カバースリップ上で一晩培養し、エレクトロポレーションによって２ｍｇ／ｍＬのターゲットＤＮＡを導入した。コルチ器をインキュベーターに戻し、４ＯＨＴの存在下または非存在下で４８時間インキュベートした。次いで、血清を添加した培地２ｍＬをウェルに加え、コルチ器を３７℃で５日間インキュベートした。４％パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、ＨＢＳＳで３回洗浄し、ミオシン７ａを免疫蛍光標識した。
【０１５７】
ｐｃＤＮＡ３．１−Ｆｌａｇ−Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ｄｓＲｅｄおよびＦｌａｇ−Ａｔｏｈ１−ＥＲ融合タンパク質の配列を以下に示す。
【０１５８】
Ｆｌａｇ−Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ＤｓＲｅｄをコードするベクター（ｐｃＤＮＡ３．１Ｆｌａｇ−Ａｔｏｈ１−ＥＲ−ｄｓＲｅｄ（配列番号１５））の核酸配列を以下に示す。
2015534818.tif 000008
2015534818.tif 000009
2015534818.tif 000010
【０１５９】
Ｆｌａｇ−Ａｔｏｈ１−ＥＲ融合タンパク質をコードするベクターの核酸配列（配列番号１６）を以下に示す。
2015534818.tif 000011
2015534818.tif 000012
【０１６０】
他の実施形態
上記の説明から、本明細書に記載の本発明を様々な用途や条件に適応させるため本発明に変更や修正を加えてもよいことは明らかであろう。そのような実施形態も下記の請求項の範囲内に含まれる。
【０１６１】
本明細書において可変部分に関する任意の定義において列挙された要素は、任意の単一の要素または列挙された要素のコンビネーション（もしくはサブコンビネーション）としての当該可変部分の定義を包含する。本明細書に記載の実施形態は、任意の単一の実施形態としての当該実施形態、および他の実施形態またはその一部と組み合わせられた当該実施形態を包含する。
【０１６２】
本明細書にて言及した特許文献および出版物は、それらの個々に独立した特許文献および出版物が参照により組み込まれることを意図してそれぞれ具体的に記載されているかのように、すべて参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６３】
参考文献
本明細書中で引用した文献を以下に示す。
1.  Bermingham, N.A., et al., Math1: An Essential Gene for the Generation of Inner Ear Hair Cells. Science, 1999. 284(5421): p. 1837-1841.
2.  Helms, A.W., et al., Autoregulation and multiple enhancers control Math1 expression in the developing nervous system. Development, 2000. 127(6): p. 1185-96.
3.  Isaka, F., et al., Ectopic expression of the bHLH gene Math1 disturbs neural development. European Journal of Neuroscience, 1999. 11(7): p. 2582-2588.
4.  Jeon, S.-J., et al., Bone marrow mesenchymal stem cells are progenitors in vitro for inner ear hair cells. Molecular and Cellular Neuroscience 2007. 34(1): p. 59-68
5.  Zheng, J.L. and W.Q. Gao, Overexpression of Math1 induces robust production of extra hair cells in postnatal rat inner ears. Nature Neuroscience, 2000. 3(6): p. 580-6.
6.  Kawamoto, K., et al., Math1 Gene Transfer Generates New Cochlear Hair Cells in Mature Guinea Pigs In Vivo. J. Neurosci., 2003. 23(11): p. 4395-4400.
7.  Danielian, P.S., et al., Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Curr Biol, 1998. 8(24): p. 1323-6.
8.  Danielian, P.S., et al., Identification of residues in the estrogen receptor that confer differential sensitivity to estrogen and hydroxytamoxifen. Mol Endocrinol, 1993. 7(2): p. 232-40.
9.  Oshima, K., et al., Differential Distribution of Stem Cells in the Auditory and Vestibular Organs of the Inner Ear. Journal of the Association for Research in Otolaryngology, 2007. 8(1): p. 18-31.
10.  Parker, M.A., A. Brugeaud, and A.S. Edge, Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments, 2010(36).
11.  Rio, C., et al., Glial fibrillary acidic protein expression and promoter activity in the inner ear of developing and adult mice. Journal of Comparitive Neurology, 2002. 442(2): p. 156-62.
12.  Hume, C.R., D.L. Bratt, and E.C. Oesterle, Expression of LHX3 and SOX2 during mouse inner ear development. Gene Expr Patterns, 2007. 7(7): p. 798-807.
13.  Bermingham-McDonogh, O., et al., Expression of Prox1 during mouse cochlear development. Journal of Comparitive Neurology, 2006 496(2): p. 172-86.
14.  Parker, M.A., et al., TAK1 expression in the cochlea: a specific marker for adult supporting cells. J Assoc Res Otolaryngol, 2011. 12(4): p. 471-83.
15.  Parker, M.A., et al., The Potential Use of Stem Cells for Cochlear Repair. Audiol Neurotol, 2004. 9: p. 72-80.
16.  Bossuyt et al., Atonal homolog 1 is a tumor suppressor gene. PLoS Biol. 2009. 7(2):e39.
【図８】
2015534818.tif 000013
【図１】
2015534818.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【配列表】
2015534818000001.app
【国際調査報告】
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2015534818.tif 000023
2015534818.tif 000024
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