(57)【要約】  本発明は、免疫アジュバントとしての少なくとも１つのグリコシル化四官能性両親媒性ブロックコポリマーの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫アジュバントとしての少なくとも１つのグリコシル化四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの使用。
【請求項２】
前記免疫アジュバントがクラスＩ拘束性細胞性免疫応答を誘発する請求項１記載の使用。
【請求項３】
前記免疫アジュバントが体液性免疫応答を誘発する請求項１または２記載の使用。
【請求項４】
前記免疫アジュバントが粘膜免疫を刺激する請求項１〜３のいずれか一項記載の使用。
【請求項５】
前記免疫アジュバントがサブユニットワクチン組成物に存する請求項１〜３のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
前記の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが、親水性ブロックと疎水性ブロックとを、０．７〜１．５の範囲の親水性ブロック／疎水性ブロックの比で含む、請求項１〜５のいずれか一項記載の使用。
【請求項７】
前記の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが少なくとも１つの末端親水性ブロックを含む、請求項１〜６のいずれか一項記載の使用。
【請求項８】
前記の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが、ポリエチレンオキシド単位を含む親水性ブロック、およびポリプロピレンオキシド単位を含む疎水性ブロックを含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の使用。
【請求項９】
前記の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが、式（ＩＩ）：
【化４】
2015508811.tif 000006
（式中、
−  ｉは、約５から約１２５、特に約１０から約１００、より特定すると約１０から約６０までの数値を有し、そして
−  ｊは、５から約８５、特に約１０から約５０、特に約１０から約２０、より特定すると１３以上である数値を有し、
−  各々のＲ１、Ｒ２対について、一方が水素であれば、他方はメチル基である）
で示される、請求項１〜８のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
少なくとも１つのグリコシル部分が、グリコシル部分の１つの官能基と、ブロックコポリマーの１つの官能基とを共有結合的に連結するスペーサーを用いて、前記の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーにコンジュゲーションしている、請求項１〜９のいずれか一項記載の使用。
【請求項１１】
前記の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが、グリコシル部分とコンジュゲーションした少なくとも１つの末端親水性ブロックを含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の使用。
【請求項１２】
前記の非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの末端親水性ブロックの少なくとも２５％、特に少なくとも５０％、特に少なくとも７５％、より特定すると少なくとも１００％が、グリコシル部分とコンジュゲーションしている、請求項１〜１１のいずれか一項記載の使用。
【請求項１３】
前記の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが、四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー７０４、四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー９０４、およびそれらの混合物からなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか一項記載の使用。
【請求項１４】
前記のグリコシル部分が、好ましくはマンノースまたはガラクトースから選択される、少なくとも１つのグリコシル単位を含む、請求項１〜１３のいずれか一項記載の使用。
【請求項１５】
前記抗原がペプチド抗原またはタンパク質抗原である、請求項１〜１４のいずれか一項記載の使用。
【請求項１６】
少なくとも１つのグリコシル化四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを含む、抗原に対する防御性クラスＩ拘束性細胞性免疫応答を付与するための免疫アジュバント。
【請求項１７】
少なくとも１つの抗原と、免疫アジュバントとしての少なくとも１つのグリコシル化四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーとを含む、ワクチン組成物。
【請求項１８】
グリコシル化四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーが請求項７〜１４のいずれか一項により定義された通りである、請求項１６記載の免疫アジュバントまたは請求項１７記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン接種の分野、より特定すると新規な免疫アジュバントに関する。特に、本発明は、免疫アジュバントとしての、グリコシル化四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの使用に関する。
【０００２】
開発された最初のアジュバントは、１９１６年にLe Moignicによって記載されているような油中水滴型エマルションに基づいていた。以来、数多くの強力なアジュバントが開発されたが、毒性副作用に因る有害反応が、ヒトワクチンへのその使用を制限してきた。１９３７年には、Freundが、不活化細菌Mycobacterium tuberculosisと混合させた鉱油を含むフロイントアジュバントを開発した。このアジュバントは、重篤な有害作用に因りヒトへの使用が禁止されているが、動物用のワクチンには依然として使用されている（Broderson, Lab Anim Sci, 1989, 39, 400-5）。別の方法では、Glenny et al.が、アルミニウム塩（ミョウバン）を使用した第一人者であり、これは米国食品医薬品局によって承認されている唯一のアジュバントである（Gupta, R.K., Adv Drug Deliv Rev, 1998, 32, 155-172）。ミョウバンは、弱い細胞性免疫を伴うが粘膜免疫は全く伴わない体液性免疫応答を誘発し、そしてこれはアレルギー反応の原因となり得る。より最近では、スクアレン水中油滴型エマルション（ＭＦ５９）が開発され、そしてインフルエンザワクチン用に欧州で承認された（Ott, G., G.L. BarchfeldおよびG. Van Nest, Vaccine, 1995, 13, 1557-62; Cataldo, D.M.およびG. Van Nest, Vaccine, 1997, 15, 1710-5）。これらのアジュバントは、強力な体液性免疫応答を誘発することができるが、僅か１週間の細胞性応答しか観察されず、そして高い毒性が一般的に観察される。
【０００３】
リポソームをベースとしたアジュバントまたは免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）などの、様々な種類のアジュバントがその作用機序に基づいて開発された。しかしながら、それらは溶血活性および局所的な炎症応答を伴い、そして動物用のワクチンにのみ使用されている。あるいは、強力な体液性応答を誘起するために、リポ多糖、モノホスホリルＡまたはＣｐＧ ＤＮＡなどの病原体に通常由来する免疫刺激成分が、アジュバントとして、特にサブユニットワクチン用に、ミョウバンなどの他のアジュバントと組み合わせて提案された。しかしながら、それらは同様に、炎症誘発性サイトカインの産生を誘発する傾向があり、ヒトへのその使用が除外された（Gustafson, G.L.およびM.J. Rhodes, Res Immunol, 1992, 143, 483-8）。また、これらのアジュバントは強力な体液性免疫応答を与えるが、弱い細胞性応答および安全性の欠如も一般的に観察された。
【０００４】
サブユニットワクチンは、免疫系を刺激するのに必要とされる抗原のみを含むように設計されている。サブユニットワクチンは、詳細に明らかにされ、精製され、そして良好な安全性プロファイルで大量に生産され得る。しかしながら、それらは一般的に、従来のワクチンと比べて低下した免疫原性を提示し、それ故、免疫系を刺激するアジュバント分子の使用が必要とされる。
【０００５】
結果的に、強力な免疫細胞性応答を誘起することのできる新規な免疫アジュバントが必要である。
【０００６】
また、サブユニットワクチンの効力を向上させることのできる新規な免疫アジュバントが必要である。
【０００７】
また、強力な免疫細胞性応答と体液性応答の複合した応答を誘起することのできる新規な免疫アジュバントが必要である。
【０００８】
また、ヒトへの使用に適した良好な安全性プロファイルを有する新規な免疫アジュバントが必要である。
【０００９】
また、容易に生産され得る新規な免疫アジュバントが必要である。
【００１０】
また、低いコストで生産され得る新規な免疫アジュバントが必要である。
【００１１】
本発明は、それらの必要性を満たす目的を有する。
【００１２】
本発明は、免疫アジュバントとしての、少なくとも１つのグリコシル化四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの使用に関する。
【００１３】
意外なことに、本発明らは、以下の実施例において詳述したように、７０４および９０４四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーのマンノシル化は、抗体力価（Ｔｈ２応答）を劇的に改善させるだけでなく、種々の組換え抗原に対するクラスＩ拘束性細胞性応答（Ｔｈ１応答）も改善させることを観察した。７０４および９０４は、優れた安全性プロファイルを含む独特で効率的かつ工業的な特徴を提示する。
【００１４】
「免疫アジュバント」という用語は、本発明において、免疫系を刺激し、そしてそれ自体では特異的な抗原性作用を全く及ぼすことなくワクチンに対する応答を増加させるのに適した物質を意味するものである。本発明の免疫アジュバントは、強力な免疫細胞性応答を誘発することができる。
【００１５】
１つの態様によると、本発明による免疫アジュバントは、クラスＩ拘束性細胞性免疫応答（またはＴｈ１応答）を誘発することができる。
【００１６】
本発明では、「クラスＩ拘束性細胞性免疫応答」という用語は、主にＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞によって媒介される免疫応答を意味するものである。細胞障害性Ｔ細胞（また、Ｔｃ、細胞障害性Ｔリンパ球、ＣＴＬ、キラーＴ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはキラーＴ細胞としても知られる）は、感染した体細胞または腫瘍細胞の死滅を誘発することのできるＴリンパ球の亜群である。細胞障害性Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子に結合した特異的な抗原性ペプチドを認識することができるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）、およびＭＨＣクラスＩ分子の変異していない部分に誘引されるＣＤ８と呼ばれる糖タンパク質を発現する。別の言葉で言えば、本発明の免疫アジュバントは、主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩ拘束性免疫応答またはＴｈ１応答を誘発することができる。
【００１７】
「防御性」クラスＩ拘束性細胞性免疫応答は、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞によって媒介される免疫応答であり、その強度またはレベルは、病原性細菌、ウイルス、真菌などの病原体によってまたは癌細胞によってトリガーされる疾病の発生の可能性を抑えるまたは減少させることができるか、あるいは、疾病の症状を処置または軽減または低減させることができる。
【００１８】
本発明の免疫アジュバントは、クラスＩ拘束性細胞性免疫応答を刺激することに限定されず、また、同時に強力な体液性応答または主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ拘束性免疫（またはＴｈ２応答）を誘発することができる。Ｔｈ２応答は、Ｂ細胞の活性化により中和抗体が作られ、これにより「体液性免疫」がもたらされることによって特徴付けられる免疫応答である。
【００１９】
１つの態様によると、本発明による免疫アジュバントは、体液性免疫応答を誘発することができる。
【００２０】
別の態様によると、本発明による免疫アジュバントは、粘膜免疫を刺激することができる。
【００２１】
本発明において、「粘膜免疫」という用語は、生物の様々な粘膜に対する防御を与える免疫系の一部を指すことを意図する。
【００２２】
その別の目的によると、本発明は、サブユニットワクチン組成物における本発明による免疫アジュバントの使用に関する。
【００２３】
その別の目的によると、本発明は、少なくとも１つのグリコシル化四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーを含む、抗原に対する防御性クラスＩ拘束性細胞性免疫応答を付与するための免疫アジュバントに関する。
【００２４】
その別の目的によると、本発明は、少なくとも１つの抗原と、免疫アジュバントとしての少なくとも１つのグリコシル化四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーとを含む、ワクチン組成物に関する。
【００２５】
１つの利点によると、本発明は、強力で防御性のクラスＩ拘束性細胞性免疫応答を誘発することのできる新規な免疫アジュバントを提供する。
【００２６】
別の利点によると、本発明は、ヒトへの使用に適した良好な安全性プロファイルを有する新規な免疫アジュバントを提供する。
【００２７】
別の利点によると、本発明は、生産が簡単で低コストで得ることのできる新規な免疫アジュバントを提供する。
【００２８】
四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー
本発明において、「ブロックコポリマー」という特色は、少なくとも２つのセットの重合化モノマー単位または重合化モノマー単位のブロックを含むポリマーを指すことを意図する。「ブロック」は、モノマーの重合によって得られ、そしてポリマー内で反復され得る、モチーフを指す。ブロックコポリマーは、必然的に、少なくとも２つの別個の種類の重合化モノマーのブロックを含む。
【００２９】
本発明において、「非イオン性両親媒性ブロックコポリマー」という特色は、少なくとも１つの親水性ブロックと少なくとも１つの疎水性ブロックとを含むブロックコポリマーを指すことを意図するが、前記ブロックは非イオン性であり、すなわち、それらはイオンを形成している部分を含まない。
【００３０】
本発明において、「ブロックコポリマー」に関する「四官能性」という特色は、四官能性連結部分によって生じた４つの反応性官能基に結合した４つのブロックコポリマーを含む化合物を指す。別の言葉で言えば、「四官能性ブロックコポリマー」は、中心の四官能性連結部分に結合したブロックコポリマーの４つの分岐を含む。
【００３１】
４つのブロックコポリマーは互いに独立して、同一であってもまたは異なっていてもよく、そして好ましくは同一である。
【００３２】
本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、各々、少なくとも１つの親水性ブロックおよび少なくとも１つの疎水性ブロックを含む、ブロックコポリマーの４つの分岐を含む。
【００３３】
本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、モノホスホリルリピドＡ、またはJiang et al., Carbohydrate Res, 2007, 342:784に記載されているようなその類似体ではない。
【００３４】
本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、米国特許第５，９７７，０８１号に記載されているようなトリテルペン−サポニン親油性コンジュゲートではない。
【００３５】
本発明にとって有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーにおいては、親水性ブロックは、ポリオキシアルキレン、ポリビニルアルコール、ポリビニル−ピロリドン、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）、またはサッカライドからなる群より選択され得、そして疎水性ブロックは、ポリオキシアルキレン、脂肪族鎖、アルキリデンポリエステル、ベンジルポリエーテルヘッドを有するポリエチレングリコール、およびコレステロールからなる群より選択され得る。
【００３６】
特に、親水性ブロックは、ポリオキシエチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニル−ピロリドン、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）からなる群より選択され得、そして疎水性ブロックは、ポリオキシアルキレン、脂肪族鎖、アルキリデンポリエステル、ベンジルポリエーテルヘッドを有するポリエチレングリコール、およびコレステロールからなる群より選択され得る。
【００３７】
より特定すると、親水性ブロックは、ポリオキシエチレン、ポリビニルアルコール、ポリビニル−ピロリドン、ポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）からなる群より選択され得、そして疎水性ブロックは、ポリオキシプロピレン、脂肪族鎖、アルキリデンポリエステル、ベンジルポリエーテルヘッドを有するポリエチレングリコール、およびコレステロールからなる群より選択され得る。
【００３８】
１つの態様によると、本発明のブロックコポリマーの親水性ブロックは、ポリエチレンオキシド単位を含み、そして好ましくはそれからなる。
【００３９】
１つの態様によると、本発明のブロックコポリマーの疎水性ブロックは、ポリプロピレンオキシド単位を含み、そして好ましくはそれからなる。
【００４０】
好ましい態様によると、本発明のブロックコポリマーは、ポリエチレンオキシド単位を含み、そして好ましくはそれからなる親水性ブロック、および、ポリプロピレンオキシド単位を含み、そして好ましくはそれからなる疎水性ブロックを含む。
【００４１】
好ましい態様において、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、少なくとも１つの末端親水性ブロックを含む。「末端親水性ブロック」は、コポリマーの１つの末端に、特に、本発明の四官能性ポリマーの分岐の遠位末端に位置するブロックである。好ましくは、四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、少なくとも２つ、好ましくは３つ、より好ましくは４つの末端親水性ブロックを含む。
【００４２】
好ましい態様によると、本発明のブロックコポリマーは、少なくとも１つ、好ましくは２つ、さらに好ましくは３つ、より好ましくは４つの末端オキシエチレン単位を、各々、ポリマーの各分岐の１つの末端に含む。
【００４３】
好ましくは、本発明の四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、親水性ブロックと疎水性ブロックとを、０．７〜１．５、好ましくは０．８〜１．３、より好ましくは０．８〜１．２の範囲の親水性ブロック／疎水性ブロックの比で含む。
【００４４】
本発明にとって有用な四官能性非イオン性両親媒性四官能性ブロックコポリマーは、（Ａ−Ｂ）ｎ−Ｃ分岐ブロックコポリマーであり得、Ａは親水性ブロックを示し、Ｂは疎水性ブロックを示し、Ｃは連結部分を示し、そしてｎは４であり、そしてこれはＣに連結した（Ａ−Ｂ）基の数を数字で表記している。
【００４５】
好ましくは、親水性ブロックＡはポリオキシエチレンブロックであり、疎水性ブロックＢはポリオキシプロピレンブロックである。
【００４６】
連結部分Ｃはアルキレンジアミン部分であり得、そして好ましくはエチレンジアミン部分である。
【００４７】
本発明にとって有用な四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、式（Ｉ）：
【化１】
2015508811.tif 000002
（式中、
ＲＡ、ＲＢ、ＲＣ、ＲＤは、互いに独立して、
【化２】
2015508811.tif 000003
を示し、
ここで、
−  ｉは、約５から約１２５、特に約１０から約１００、より特定すると約１０から約６０までの数値を有し、そして
−  ｊは、５から約８５、特に約１０から約５０、特に約１０から約２０、より特定すると１３以上である数値を有し、
−  Ｒ＊は、炭素数２〜６個のアルキレン、炭素数５〜８個のシクロアルキレン、またはフェニレンであり、そして好ましくはエチレンであり、
−  Ｒ１およびＲ２について、（ａ）両方が水素であるか、または（ｂ）一方が水素であり、そして他方がメチルであるかのいずれかであり、
−  Ｒ３およびＲ４について、（ａ）両方が水素であるか、または（ｂ）一方が水素であり、そして他方がメチルであるかのいずれかであり、そして
−  Ｒ３およびＲ４の両方が水素である場合、Ｒ５およびＲ６の一方が水素であり、そして他方がメチルであるか、または、Ｒ３およびＲ４の一方がメチルである場合、Ｒ５およびＲ６の両方が水素である）
で示され得る。
【００４８】
より好ましくは、本発明にとって有用な非イオン性両親媒性四官能性ブロックコポリマーは、式（ＩＩ）：
【化３】
2015508811.tif 000004
（式中、
−  ｉは、約５から約１２５、特に約１０から約１００、より特定すると約１０から約６０までの数値を有し、そして
−  ｊは、約５から約８５、特に約１０から約５０、特に約１０から約２０、より特定すると１３以上である数値を有し、
−  そして、各々のＲ１、Ｒ２対について、一方が水素であれば、他方はメチル基である）
で示され得る。
【００４９】
好ましくは、ｉは、約５から約１２５、特に約１０から約１００、より特定すると約１０から約６０までの範囲であり得、そしてｊは、約５から約５０、特に約１０から約２５、特に約１０から約２０の範囲、より特定すると１３以上であり得る。
【００５０】
本発明のブロックコポリマーは、４０００〜３５０００の範囲、特に４５００〜３００００の範囲、より特定すると５０００〜２５０００の範囲の分子量を有し得る。
【００５１】
本発明のブロックコポリマーは、約４０％、特に約４５％、特に約４５〜約８０％、特に約４５〜７０％、より特定すると約４５〜約６０％の範囲、より好ましくは約５０％のエチレンオキシド単位含量を含み得、そして好ましくはそれらからなり得る。
【００５２】
本発明の多くの四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー、特に非イオン性両親媒性四官能性ブロックコポリマーは、一般的な商標名「ポロキサミン」として市販されている。
【００５３】
特に、本発明の非イオン性両親媒性四官能性ブロックコポリマーはＢＡＳＦ（Wyandotte, Mich.）から商標名Tetronic（商標）で入手できる。
【００５４】
本発明の適切なポロキサミンのさらなる詳細は、Surfactant Systems, Eds. Attwood and Florence, Chapman and Hall, London 1983,p 356-361; in The Condensed Encyclopaedia of Surfactants, Ed. Ash and Ash, Edward Arnold, London, 1989, in Non-ionic Surfactants, pp. 300-371, Ed. Nace, Dekker, New York, 1996, in Santon, Am. Perfumer Cosmet. 72(4):54-58 (1958); (Dekker, N.Y., 1967)または米国特許第６，３５３，０５５号に見い出すことができる。
【００５５】
１つの態様によると、本発明に適した非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー３０４、四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー７０４、四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー９０４、四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー９０８、および四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマー１１０７、およびその混合物からなる群より選択され得る。
【００５６】
好ましくは、本発明の非イオン性ブロックコポリマーは、３０４、７０４、９０４、１１０７およびその混合物からなる群より、より好ましくは３０４、７０４、９０４およびその混合物からなる群より、より好ましくは７０４、９０４およびその混合物からなる群より選択され得る。
【００５７】
本発明のブロックコポリマーの少なくとも１つのブロック、好ましくは親水性ブロックが、グリコシル部分とコンジュゲーションしている。
【００５８】
本発明のグリコシル化四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、少なくとも１つのグリコシル部分とコンジュゲーションした、少なくとも１つの末端ブロック、好ましくは１つの末端親水性ブロックを含む。
【００５９】
より好ましくは、本発明のブロックコポリマーの末端ブロックの少なくとも２５％、特に少なくとも５０％、特に少なくとも７５％、より特定すると少なくとも１００％が、グリコシル部分とコンジュゲーションしている。
【００６０】
本発明の免疫アジュバントとして使用され得るグリコシル化四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの量は、抗原の量および性質、ワクチン接種しようとする個体の種、性別、体重、年齢、食事、容態、追加の治療などの、様々なパラメーターに従って適応させる。考慮されるべきパラメーターは当業者には周知であり、そしてパラメーターに対する免疫アジュバントの適切な量の適応は、日常的な仕事に属する。
【００６１】
グリコシル化四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーは、それを含む組成物の全重量の０．０１〜１０重量％の範囲、特に、それを含む組成物の全重量の０．０２〜５重量％、より特定すると０．０５〜２重量％、より好ましくは０．１〜１重量％、より好ましくは０．１〜０．５重量％の範囲、より好ましくは約０．２５重量％の量で使用され得る。
【００６２】
グリコシル部分およびグラフト法
本発明にとって有用なグリコシル部分は、少なくとも１つのグリコシル単位を含み得る。グリコシル部分は、単一のグリコシル単位であり得るか、または鎖状もしくは分岐状のグリコシル単位のポリマーであり得る。グリコシル部分は、１〜５つのグリコシル単位を含み得、これには１、２、３、４および５つのグリコシル単位が含まれる。グリコシル部分は、好ましくは、１つまたは２つのグリコシル単位を含み得、そして好ましくは１つのグリコシル単位を含み得る。
【００６３】
本発明にとって有用なグリコシル部分は、マンノース部分またはガラクトース部分から選択され得、そして好ましくはマンノース部分である。マンノース部分は、１〜５つのマンノース単位を含み得（これには１、２、３、４、および５つのマンノース単位が含まれる）、そして好ましくは１つまたは２つのマンノース単位を含み得、そして好ましくは１つのマンノース単位を含み得る。
【００６４】
グリコシル部分は、グリコシル部分の１つの官能基とブロックコポリマーの１つの官能基との間に確立された共有結合を用いて、本発明のブロックコポリマーにコンジュゲーションされ得る。共有結合は、それ自体が反応性であるかまたは反応性であるように改変された２つの官能基の間の反応から生じ得る。グリコシル部分は、直接、ブロックコポリマーにコンジュゲーションされ得る。あるいは、グリコシル部分は、スペーサーを用いて、ブロックコポリマーにコンジュゲーションされ得る。
【００６５】
１つの態様によると、グリコシル部分は、エーテル官能基を用いて、ブロックコポリマーにコンジュゲーションされ得る。
【００６６】
別の態様によると、グリコシル部分は、グリコシル部分の１つの官能基とブロックコポリマーの１つの官能基とを共有結合的に連結するスペーサーを用いて、本発明のブロックコポリマーにコンジュゲーションされ得る。
【００６７】
スペーサーは、ＮまたはＯから好ましくは選択されたヘテロ原子を場合により含み、そしてグリコシル部分とブロックコポリマーなどの少なくとも２つの分子を一緒に連結する、炭化水素をベースとした基である。
【００６８】
本発明にとって有用なスペーサーは、１つのブロックコポリマーを、少なくとも１つ、または２つ、３つ、４つ、または５つ、好ましくは３つのグリコシル部分と連結し得る。
【００６９】
複数のグリコシル部分がスペーサーに結合する場合、グリコシル部分は互いに同一であっても異なっていてもよく、そして好ましくは同一であり得る。
【００７０】
スペーサーは、アミノ官能基を用いてブロックコポリマーに共有結合的に連結され得る。
【００７１】
スペーサーは、エーテル官能基を用いて、グリコシル部分に共有結合的に連結され得る。
【００７２】
スペーサーは鎖状または分岐状であり得る。
【００７３】
１つのブロックコポリマーと単一のグリコシル単位を連結するスペーサーは鎖状スペーサーである。
【００７４】
鎖状スペーサーは、アミノ官能基を用いてブロックコポリマーに共有結合的に連結され得、そしてエーテル官能基を用いてグリコシル部分に共有結合的に連結され得る。
【００７５】
鎖状スペーサーは（ヒドロキシメチル）−４トリアゾールであり得る。
【００７６】
１つのブロックコポリマーと少なくとも２つ、３つ、４つまたは５つのグリコシル部分を連結するスペーサーは、分岐状スペーサーである。
【００７７】
分岐は単一の原子によって生じ得るか、またはスペーサーの主要骨格に沿って分布し得る。言うまでもなく、単一の原子上の分岐の数は、この原子の原子価に依存する。例えば、スペーサーの主要骨格内の窒素原子は１つの分岐を有することができるが、炭素原子は、１または２つの分岐を有することができる。あるいは、スペーサーの主要骨格の１つの末端における窒素原子は、１または２つの分岐を有することができるが、スペーサーの主要骨格の１つの末端における炭素原子は、１、２、または３つの分岐を有することができる。
【００７８】
好ましくは、分岐状スペーサーは、少なくとも２つ、好ましくは３つの分岐を有する、主要な骨格の１つの末端における少なくとも１つの炭素原子を含み得る。
【００７９】
本発明にとって有用なスペーサーは、ブロックコポリマーの１つの官能基に共有結合的に連結し得、そして、少なくとも１つ、好ましくは２つ、３つ、４つまたは５つ、より好ましくは３つの分岐を含み得、各々は、グリコシル部分の１つの官能基に共有結合的に連結している。
【００８０】
分岐状スペーサーは、アミノ官能基を用いてブロックコポリマーに共有結合的に連結され得、そして、エーテル官能基を用いてグリコシル部分に共有結合的に連結され得る。
【００８１】
グリコシル部分は、グリコシル部分とコポリマーブロックの両方の性質に従って、および化学的特性に従って適応させる当技術分野において公知の任意の技術に従って、本発明の非イオン性両親媒性ブロックコポリマーにコンジュゲーションさせ得る。
【００８２】
グリコシル部分は、親水性ブロック、特に末端親水性ブロックに化学反応によってコンジュゲーションさせ得る。
【００８３】
本発明に適した化学反応は、特に本明細書で後に実施例に詳述したような、直接的なカップリングまたはクリックケミストリーによって実施され得る。
【００８４】
直接的なカップリングまたはクリックケミストリーに適したブロックコポリマーの例として、特に、１つの末端エチレンオキシド単位からの、少なくとも１つのヒドロキシル基を有するブロックコポリマーを挙げることができる。
【００８５】
少なくとも１つのグリコシル部分と、少なくとも１つのヒドロキシル基を有するブロックコポリマーとの直接的なカップリングによるコンジュゲーションの例として、テトラ−Ｏ−アセチル−グリコシド部分とポリマーとの、三フッ化ホウ素エチルエーテレートの存在下における反応、およびメタン酸ナトリウムによる糖の脱保護による、Ｏ結合を介した、前記ヒドロキシル基とグリコシル部分（例えばマンノース）との間の直接的なカップリングを挙げることができる。
【００８６】
テトラ−Ｏ−アセチル−グリコシドは、当技術分野において公知の任意の方法に従って得ることができる。例えば、酢酸ヒドラジンをペンタ−Ｏ−アセチル−グリコシドとＴＨＦなどの無水溶媒中で反応させ得る。その後、テトラ−Ｏ−アセチル−グリコシドを、炭酸カリウムおよびトリクロロアセトニトリルの存在下、およびジクロロメタンなどの無水溶媒の存在下で反応性のテトラ−Ｏ−アセチル−１−トリクロロアセトイミドイル−グリコシドへと、変換し得る。その後、この化合物を、少なくとも１つのヒドロキシル基を有するブロックコポリマーと、例えば三フッ化ホウ素エチルエーテレートの存在下、ジクロロメタンなどの無水溶媒中で反応させると、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−Ｏ−ブロックコポリマー−グリコシドを得ることができる。前記生成物をメタン酸ナトリウム溶液に加えると、ブロックコポリマー−グリコシドがもたらされ得る。
【００８７】
好ましい態様において、グリコシル部分と本発明のブロックコポリマーとのコンジュゲーションは、クリックケミストリーによって実施され得る。
【００８８】
クリックケミストリー反応は、炭素原子とヘテロ原子との間の少なくとも１つの共有結合の形成をもたらす、２つの官能基部分の間の反応である。
【００８９】
本発明において使用され得るクリックケミストリー反応は、例えば、Sharpless et al. (Angew Chem Int, 2001, 40, 2004-2021)によって定義されている。
【００９０】
好ましい態様によると、本発明に使用され得る官能基部分の対は、ニトリルまたはアルキン／アジドの対であり得る。
【００９１】
クリックケミストリー反応は、触媒の存在下で実施され得る。有用な触媒として、Ｃｕなどの遷移金属を挙げることができる。
【００９２】
本発明によるクリックケミストリーに有用な好ましい化学反応の例としては、銅（Ｃｕ）の存在下におけるアジド官能基を有する化合物とアルキン官能基を有する化合物との間の化学反応を挙げることができる。
【００９３】
例えば、本発明のブロックコポリマーを、アジド部分を用いて、特に、例えばエチレン−オキシド単位からの末端ヒドロキシル基上で官能基化し得、一方、この改変されたブロックコポリマーにコンジュゲートしようとするグリコシル部分を、アルキン部分を用いて官能基化し得る。
【００９４】
少なくとも１つのグリコシル部分を、少なくとも１つのヒドロキシル基を有するブロックコポリマーとクリックケミストリーによってコンジュゲーションする例として、アジド末端ポリマーと、アルキン基を含むように改変されたマンノース部分との間の銅により触媒されるヒュスゲン１，３−双極子環化付加を挙げることができる。
【００９５】
Ｏ−アルキニル炭水化物、例えばプロパルギル−β−Ｄ−グリコシドは、乾燥ジクロロメタン中、三フッ化ホウ素エチルエーテレートの存在下、β−Ｄ−炭水化物五酢酸塩（例えばβ−Ｄ−マンノース五酢酸塩）とアルキニルアルコール（例えばプロパルギルアルコール）と反応させ、その後、ナトリウムメトキシドにより媒介されるアセチル保護基の除去によって調製され得る。
【００９６】
例えば末端エチレンオキシド単位として少なくとも１つのヒドロキシル基を有するブロックコポリマーは、Mereyala et al., Carbohydrate Research, 1998, 307, 351; Muthana et al., J Am Chem Soc, 2007, 129, 11918; Bonger et al., Bioorg Med Chem, 2007, 15, 4841; Goncalves et al., Pharm Res, 2005, 22, 1411-1421; Li et al., Biomacromol, 2003, 4, 1055; Iyer et al., Tetrahedron Lett, 2004, 45, 4285から導かれた手順に従って少なくとも１つのアジド基の導入によって改変され得る。末端ヒドロキシル基をまず、無水ジクロロメタン中、過剰のｐ−トルエンスルホニルクロリドおよび水酸化カリウムを使用して、ビス−トシル化誘導体ブロックコポリマー−ＯＴｓへと変換し得る。その後、スルホン酸エステルを、無水エタノール中、アジドイオンを用いて誘導体ブロックコポリマー−ＯＴｓから除去して、ビス−アジドブロックコポリマーを生成し得る。
【００９７】
アジドブロックコポリマーとプロパルギルグリコシドとの１，３−双極子環化付加は、ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ中、硫酸銅／アスコルビン酸ナトリウムを使用して行なわれ、これにより、ブロックコポリマー−トリアゾロ−マンノースを得ることができる。
【００９８】
抗原
１つの態様によると、本発明の免疫アジュバントと組み合わせようとする抗原は、細菌、ウイルス、真菌、または癌細胞に由来する抗原であり得る。
【００９９】
「抗原」という用語は、動物において防御的免疫応答を刺激するペプチド型またはヌクレオチド型の生物学的材料（天然、組換えまたは合成）を意味する。本発明に適した抗原は、ペプチドまたはタンパク質などのアミノ酸配列であり得るか、または、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、小分子干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）ハイブリッド配列、または、改変されていても改変されていなくてもよい合成もしくは半合成オリゴヌクレオチドの配列などの、核酸配列であり得る。
【０１００】
本発明に適した抗原は、細菌、ウイルス、寄生虫、リケッチア、原虫および癌細胞からなる群より選択される生物から得ることができる。
【０１０１】
細菌の例は、Bordetella spp.、Streptococcus spp.、Staphylococcus spp.、Clostridium spp.、Leptospira spp.、Escherichia spp.、Salmonella spp.、Pasteurella spp.、Mycobacteria spp.、Mycoplasma spp.、Moraxella spp.、Haemophilus spp.、Borrelia spp.、Fusobacteria spp.、Bacteriodes spp.およびRhodococcus spp.からなる群より選択され得る。
【０１０２】
ウイルスの例は、ヘルペスウイルス、パラインフルエンザウイルス、レオウイルス、ロタウイルス、モルビリウイルス、レトロウイルス、コロナウイルス、アデノウイルス、トガウイルス、パルボウイルス、パラポックスウイルス、パラミクソウイルス、サイトメガロウイルス、アルボウイルスおよびハンタウイルスからなる群より選択され得る。
【０１０３】
寄生虫および原虫の例は、Neospora spp.、Toxoplasma spp.、Dirofilaria spp.、Cryptosporidium spp.、Giardia spp.、Babesia spp.およびCoccidia spp.からなる群より選択され得る。
【０１０４】
リケッチアの例は、Chlamydia spp.、ポトマック馬熱、Ehrlichia canisおよび他のEhrlichia spp.からなる群より選択され得る。
【０１０５】
癌細胞から得られる抗原の例は、αフェトプロテイン、Ｍｅｌａ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、抗原ＢＡＧＥ、抗原ＭＡＧＥ、抗原ＧＡＧＥ、ＭＡＲＴ１、ＭＵＣ１およびＣＡ−１２５からなる群より選択され得る。
【０１０６】
抗原は、生物の全培養液、例えば全培養収集液、部分的に精製された全培養収集液、収集液から抽出された精製サブユニット、組換え技術を介して得られそして同質もしくは異質な生物で発現されたサブユニット、完全生物の欠失突然変異体（従来のまたはｒＤＮＡ遺伝子の欠失した突然変異体）、ペプチド、裸ＤＮＡ、化学合成された抗原、逆転写裸ｃＤＮＡ、またはそれらの組合せから得ることができる。
【０１０７】
一般的には、抗原は、生物を培養および収集し、このような生物の抗原を濃縮および／または慣用的に精製する当技術分野において公知の技術によって産生され得る。例えば、抗原は、増殖培地を有する培養液中で選択された生物を増殖させることによって産生することができる。より具体的には、生物は、哺乳動物または植物細胞から調製された組織培養液中で増殖させることができる。生物はまた発酵培地中で増殖させることができ、生物は組織培養液の非存在下で増殖するが、そこには増殖培地が添加されている。
【０１０８】
本発明のワクチンは、例えば以下のような多種多様な疾病および疾患の治療または予防に使用され得る：
−  ウイルスの関与する疾病および疾患：レトロウイルス科（例えばヒト免疫不全ウイルス、ＨＩＶ−１を含む）；ピコルナウイルス科（例えばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス；エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（Calciviridae）（例えば胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（例えばウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（Flaviridae）（例えばデングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（Coronoviridae）（例えばコロナウイルス）；ラブドウイルス科（例えば水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（例えばエボラウイルス）；パラミクソウイルス科（例えばパラインフルエンザウイルス、ムンプスウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルトミクソウイルス科（例えばインフルエンザウイルス）；ブニヤウイルス科（Bungaviridae）（例えばハンタンウイルス、ブンガ（bunga）ウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（例えばレオウイルス、オルビウイルス（orbiviurses）およびロタウイルス）；ビルナウイルス科；ヘパドナウイルス科（Ｂ型肝炎ウイルス）；パン／ウイルス科（Pan/oviridae）（パルボウイルス）；パポバウイルス科（パピローマウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（殆どのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１型および２型）、水痘帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポックスウイルス科（Poxyiridae）（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（例えばアフリカブタ熱ウイルス）；および未分類のウイルス（例えば、海綿状脳症の病因、デルタ肝炎の原因物質（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライトウイルスであると考えられている）、ＨＣＶウイルス（非Ａ型、非Ｂ型肝炎を引き起こす）；ノーウォークおよび関連ウイルス、およびアストロウイルス）。前記の中で、特に好ましいのは、ＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、狂犬病ウイルス、ポリオウイルス、インフルエンザウイルス、髄膜炎ウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、風疹ウイルス、百日咳、脳炎ウイルス、パピローマウイルス、黄色熱ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パルボウイルス、チクングニアウイルス、出血熱ウイルスおよびヘルペスウイルス、特に水痘、サイトメガロウイルスおよびエプシュタインバーウイルスである。このような態様において、ワクチンに使用するために選択される抗原は、天然のウイルスに存在する（または感染中に発現される／それにより誘導される）抗原に由来する（またはそれを参照にして設計される）。
【０１０９】
−  グラム陰性細菌およびグラム陽性細菌の関与する疾病および疾患：Helicobacter pylori、Borelia burgdorferi、Legionella pneumophilia、Mycobacterium spp（例えば、M. tuberculosis、M. leprae、M. avium、M. intracellular、M. kansaiiおよびM. gordonae）、Staphylococcus aureus, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes（Ａ群のStreptococcus）、Streptococcus agalactiae (Ｂ群のStreptococcus)、Streptococcus viridans、Streptococcus faecalis、Streptococcus bovis、Streptococcus属の任意の嫌気的な種、Streptococcus pneumoniae、Campylobacter spp.、Enterococcus spp.、Haemophilus influenzae、Bacillus anthracis、Corynebacterium spp.(C. diphtheriaeを含む)、Erysipelothrix rhusiopathiae、Clostridium perfringens、Clostridium tetani、Enterobacter aerogenes、Klebsiella spp(K. pneumoniaeを含む)、Pasturella multocida、Bacteroides spp.、Fusobacterium nucleatum、Streptobacillus monilijormis、Treponema pallidium、Treponema pertenue、Leptospira spp.、Rickettsia spp.およびActinomyces spp.(A. israeliiを含む)。このような態様において、ワクチンに使用するために選択される抗原は、天然の細菌に存在する（または感染中に発現される／それにより誘導される）抗原に由来する（またはそれを参照にして設計される）。
【０１１０】
−  真菌の関与する疾病および疾患：Cryptococcus neoformans、Histoplasma capsulatum、Coccidioides immitis、Blastomyces dermatitidis、Chlamydia trachomatisおよびCandida albicans、このような態様において、ワクチンに使用するために選択される抗原は、天然の真菌に存在する（または感染中に発現される／それにより誘導される）抗原に由来する（またはそれを参照にして設計される）。
【０１１１】
−  原虫の関与する疾病および疾患：Plasmodium spp. (Plasmodium falciparum、Plasmodium malariae、Plasmodium ovaleおよびPlasmodium vivaxを含む)、Toxoplasma spp. (T. gondiiおよびT. cruziiを含む)およびLeishmania spp.。
【０１１２】
−  癌細胞の関与する疾病および疾患：血液系およびリンパ系の癌（ホジキン病、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫およびワルデンストレーム病を含む）、黒色腫（眼の黒色腫を含む）、腺腫、肉腫、固形組織の癌、黒色腫、肺癌、甲状腺癌、唾液腺癌、下肢の癌、舌癌、口唇癌、胆管癌、骨盤癌、縦隔癌、尿道癌、カポジ肉腫（例えばＡＩＤＳと併発した場合）；皮膚癌（悪性黒色腫を含む）、消化管癌（頭頸部癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、結腸直腸癌、肛門癌を含む）、泌尿生殖器系の癌（腎臓癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌を含む）、女性の癌（乳癌、子宮頸癌、卵巣癌、婦人科系の癌、および絨毛癌を含む）、並びに、脳癌、骨カルチノイド、上咽頭腫瘍、後腹膜腫瘍、甲状腺腫瘍、軟組織腫瘍、および未知の原発性部位の癌。このような態様において、ワクチンに使用するために選択される抗原は、悪性細胞および／または組織に存在する同族の新生抗原または腫瘍関連抗原である。
【０１１３】
−  蠕虫（例えばSchistosoma spp.）などの後生動物寄生体の関与する疾病および疾患。
【０１１４】
好ましい態様において、本発明に有用な抗原は、ペプチド抗原またはタンパク質抗原である。
【０１１５】
抗原を、免疫学的に有効な量の本発明の免疫アジュバントと自然に組み合わせる。「免疫学的に有効な量」は、本発明の免疫アジュバントを含有しそして抗原を含有するワクチンを個体に投与した場合に、抗原が、標的疾病から動物を防御するのに十分な濃度で防御成分を含むことを意味する。抗原の免疫学的に有効な量の例としては、０．０１〜１００μgの範囲の量を挙げることができる。
【０１１６】
ワクチン組成物
本発明に適したワクチン組成物は、生ワクチン、死菌または不活化ワクチン、およびサブユニットワクチンであり得る。
【０１１７】
生ワクチンは、それらに通常は伴う疾病を発生させることなく、その抗原に対する長い免疫応答を開始することのできるように一般的に減弱されている。
【０１１８】
死菌ワクチンは、宿主免疫系に提示する抗原性因子を不活化しない化学的または他の手段によって不活化される。
【０１１９】
いくつかの疾病ベクターについては、生物を殺滅しても、レシピエントにおいて望ましくない作用を引き起こすことが妨げられない。このような場合、前記因子を、それ自体は病原性ではないサブユニットまたは細画分へと断片化しなければならない。
【０１２０】
好ましくは、本発明のワクチンはサブユニットワクチンである。
【０１２１】
本発明のワクチンは、使用される特定のワクチンについて処方される任意の方法で、好ましくは非経口的に、すなわち皮下、静脈内、筋肉内または腹腔内に投与され得る。
【０１２２】
本発明のワクチンは、動物またはヒトの療法のいずれかに使用され得る。
【０１２３】
本発明のワクチンは、本発明の免疫アジュバントを抗原希釈液に溶解または懸濁し、そしてその後、適切な容量の免疫アジュバント溶液および抗原溶液を適切な抗原希釈度で合わせることによって調製され得る。抗原希釈液は当技術分野において慣用的なものであり、例えばリン酸緩衝食塩水、最少必須培地、ペプトンなどである。
【０１２４】
例えば不活性な希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤および保存剤を含む、当技術分野における任意の適切な賦形剤を使用し得る。適切な不活性な希釈剤としては、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、並びにラクトースが挙げられ、コーンスターチおよびアルギン酸が適切な崩壊剤である。結合剤としては、スターチおよびゼラチンが挙げられ得るが、潤滑剤は（存在する場合）、一般的にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクである。
【０１２５】
本発明の免疫アジュバントの他に、本発明によるワクチンは、別個の免疫アジュバントを含んでもよい。当技術分野において公知でありそして本発明の免疫アジュバントとは別個の任意の免疫アジュバントを使用し得る。追加の別個の免疫アジュバントの例として、完全および不完全フロイントアジュバント、アルミニウム塩、スクアレン、またはToll様レセプターアゴニスト、例えばポリ（I:C）、リポ多糖またはCpGオリゴデオキシヌクレオチドを挙げることができる。
【０１２６】
本発明のワクチンは、任意の適切な形状をとり得、そしてこれには例えば錠剤、エリキシル剤、カプセル剤、液剤、懸濁剤、散剤、顆粒剤およびエアゾール剤が含まれる。
【０１２７】
筋肉内、腹腔内、皮下および静脈内への使用のために、本発明の化合物は、一般的に、適切なｐＨおよび等張性へと緩衝化された無菌水溶液または懸濁液で提供される。
【０１２８】
適切な水性ビヒクルとしては、リンガー液および等張塩化ナトリウムが挙げられる。本発明による水性懸濁液は、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよびトラガカントガムなどの懸濁化剤、並びにレシチンなどの湿潤剤が挙げられ得る。水性懸濁液のための適切な保存剤としては、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルおよびｎ−プロピルが挙げられる。
【０１２９】
本発明のワクチンにおけるグリコシル化四官能性非イオン性両親媒性ブロックコポリマーの量は、ワクチンの性質、使用される特定の投与量単位、処置期間、処置される患者の年齢、体重および併用処置の種類（ある場合）、および性別、処置される疾患の性質および程度、並びに投与される抗原の性質に従って幅広く変化し得る。
【０１３０】
本発明は、以下の実施例および図面を用いてより完全に説明され、これらは単なる例示であり制限するものと考えるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】図１は、クリックケミストリー（ａ）および直接的なカップリング（ｂ）によってマンノシル化−７０４を得るために使用された化学合成経路を示す。
【図２】図２は、サブユニットワクチン接種後の免疫応答に対する、マンノースを四官能性ポリマーにカップリングする仕方の効果を示す。マウスの群に、０日目および２１日目に、クリックケミストリー（白いバー、７０４−Ｍおよび９０４−Ｍ）および直接的なカップリング（灰色のバー、７０４−Ｏ−Ｍおよび９０４−Ｏ−Ｍ）によってそれぞれ合成された０．２５％の７０４−Ｍ、９０４−Ｍおよび７０４−Ｏ−Ｍ、９０４−Ｏ−Ｍを用いて製剤化されたβ−ガラクトシダーゼを皮下注射した。図２（ａ）および２（ｃ）は、７０４−Ｍ、７０４−Ｏ−Ｍ、９０４−Ｍおよび９０４−Ｏ−Ｍを用いて製剤化された２５μgのβ−ガラクトシダーゼの注射されたマウスの２１日目（縦の斜線の入ったバー）および４２日目（横の斜線の入ったバー）の体液性応答を示す。図２（ｂ）および２（ｄ）は、７０４−Ｍ、７０４−Ｏ−Ｍ、９０４−Ｍおよび９０４−Ｏ−Ｍのいずれかを用いて製剤化されたβ−ガラクトシダーゼの注射されたマウスの４２日目のクラスＩ拘束性細胞性応答を示す。体液性応答および細胞性応答について、各群についてのｎ＝６匹の注射されたマウスについての力価の平均＋／−標準偏差が示されている。
【図３】図３は、サブユニットワクチン接種後の免疫応答に対する７０４−Ｍ標的化ベクターの効果を示す。マウスの群に、０日目および２１日目に、７０４および７０４−Ｍを用いて製剤化されたβ−ガラクトシダーゼを皮下注射した。図３（ａ）は、０．０５〜２％の範囲の様々な濃度の７０４−Ｍを用いて複合媒体中で製剤化された２５μgのβ−ガラクトシダーゼの注射されたマウスの４２日目の体液性応答を示す。図３（ｂ）は、７０４（白いバー）または７０４−Ｍ（灰色のバー）のいずれかを用いて製剤化されたβ−ガラクトシダーゼの注射されたマウスの２１日目（縦の斜線の入ったバー）および４２日目（横の斜線の入ったバー）における体液性応答を示す。図３（ｃ）は、７０４（白いバー）または７０４−Ｍ（灰色のバー）のいずれかを用いて製剤化されたβ−ガラクトシダーゼの注射されたマウスの４２日目のクラスＩ拘束性細胞性応答を示す。図３（ｄ）は、０．２５％という一定の７０４−Ｍを用いて製剤化された様々な量のβ−ガラクトシダーゼの注射されたマウスの体液性応答を示す。図３（ｅ）は、０．２５％の７０４（白いバー）または７０４−Ｍ（灰色のバー）を用いて製剤化された２５μgの注射されたＢａｌｂ／ｃマウスの２１日目（縦の斜線の入ったバー）および４２日目（横の斜線の入ったバー）における体液性応答を示す。体液性応答および細胞性応答について、各群についてのｎ＝６匹の注射されたマウスについての力価の平均＋／−標準偏差が示されている。
【図４】図４は、７０４ベクターを用いてのサブユニットワクチン接種に対する製剤媒体の効果を示す。マウスの群に、食塩水または複合媒体中の０．２５％の７０４（白いバー）または７０４−Ｍ（灰色のバー）のいずれかを用いて製剤化された２５μgのβ−ガラクトシダーゼを皮下注射した。体液性応答を、初回の注射（横の斜線の入ったバー）および２１日目のブースト（縦の斜線の入ったバー）から４２日後に測定した。体液性応答について、各群についてのｎ＝６匹の注射されたマウスについての力価の平均＋／−標準偏差が示されている。
【図５】図５は、イヌ試験におけるβ−ガラクトシダーゼを用いての７０４−Ｍワクチン接種の効力を示す。イヌに、７０４−Ｍを用いて製剤化された１５０μgのβ−ガラクトシダーゼを皮下注射した。β−ガラクトシダーゼ特異的抗体を、１回の注射後から種々の時点において測定した。
【０１３２】
実施例
材料および方法
製剤
７０４、９０４、７０４−Ｍおよび９０４−Ｍは、親切にもIn-Cell-Art (Nantes, France)によって提供された。β−ガラクトシダーゼはRoche (Rosny-Sous-Bois, France)によって提供された。β−ガラクトシダーゼまたはオボアルブミンは、皮下（s.c.）注射直前に製剤化された。不完全および完全フロイントアジュバントを用いての製剤化は、製造業者のプロトコール（Sigma, St Quentin Fallavier, France）に従って実施された。
【０１３３】
クリックケミストリーによる７０４および９０４のマンノシル化（７０４−Ｍおよび９０４−Ｍ）
２−プロピニル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド
窒素雰囲気下、三フッ化ホウ素エチルエーテレート（７．９０mL、６４mmol、５当量）を０℃で、α−Ｄ−マンノピラノース五酢酸塩（５g、１２．８mmol）およびプロパルギルアルコール（２．９８mL、５１．２mmol、４当量）の無水ジクロロメタン（１５０mL）溶液に滴下して加え、そして前記溶液を０℃で４日間撹拌した。無水炭酸カリウム（８g）を加え、そして反応混合物をさらに１時間かけて撹拌し、そしてろ過した。ろ液をジクロロメタン（２００mL）で希釈し、水（３×２００mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、そして濃縮すると、２−プロピニル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（４．９５ｇ、定量的な収率）が褐色油状物として得られ、これはさらに精製することなく使用した。１H NMR (400 MHz, CDCl3): δ = 5.38-5.20 (m, 3H, H2,3,4), 5.02 (d, J= 1.6 Hz, 1H, H1), 4.27 (dd, J= 5.2, 12.2 Hz, 1H, H6), 4.26 (d, J = 2.4 Hz, 2H, OCH2C≡CH), 4.10 (dd, J = 2.5, 12.2 Hz, 1H, H6), 4.45-3.72 (m, 1H, H5), 2.46 (t, J = 2.4 Hz, 1H, C≡CH), 2.15, 2.09, 2.03, 1.98 (4s, 4 × 3H, OCOCH3) ; 13C NMR (100.6 MHz, CDCl3) :δ＝170.7, 170.0, 169.9および169.8 (OCOCH3), 96.4 (C1), 78.0 (C≡C-H), 75.7 (C≡C-H), 69.5 (C5), 69.1 (C4), 69.0 (C3), 66.2 (C2), 62.5 (C6), 55.1 (OCH2C≡C-H), 20.9, 20.8 × 2 および20.7 (OCOCH3) ; MS (ESI) : m/z = 409.0 [M+Na]+。
【０１３４】
プロパルギル−α−Ｄ−マンノピラノシド
２−プロピニル２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（９９０mg、２．５６mmol）を、ナトリウムメトキシド（６９mg、１．２８mmol、０．５当量）の乾燥メタノール（１５mL）溶液に室温で溶解した。混合物を２４時間撹拌し、ＤＯＷＥＸ（Ｈ＋）樹脂で中和し、ろ過し、そして濃縮すると、プロパルギル−α−Ｄ−マンノピラノシド（５５９mg、定量的な収率）が油状物として得られ、これはさらに精製することなく使用した。1H NMR (400 MHz, D2O) : δ = 5.02 (d, J= 1.6 Hz, 1H, H1), 4.38-4.22 (m, 2H, OCH2C≡CH), 3.98-3.56 (m, 6H, H2,3,4,5,6), 2.90 (t, J = 2.4 Hz, 1H, C≡CH) ; 13CNMR (100.6 MHz, D2O) :δ = 99.1 (C1), 79.1 (C≡CH), 76.5 (C≡CH), 73.4 (C2), 70.8 (C5), 70.2 (C3), 66.9 (C4), 61.1 (C6), 54.9 (OCH2C≡CH) ; MS (ESI) : m/z = 240.8 [M+Na]+, 218.9 [M+H]+。
【０１３５】
テトラトシル化７０４ブロックコポリマー：７０４−ＯＴｓ
窒素雰囲気下、ｐ−トルエンスルホニルクロリド（４１６mg、２．１８mmol、１２当量）を、７０４（１g、１８２μmol）の無水ジクロロメタン（１６mL）溶液に４Åのモレキュラーシーブの存在下で加えた。混合物を氷浴を用いて０℃まで冷却し、そして粉末化水酸化カリウム（１６３mg、２．９０mmol、１６当量）を少しずつ５℃を下回る温度で注意深く加えた。混合物を６日間、室温で激しく撹拌し、そしてジクロロメタン（１５０mL）で希釈した。有機層を水（３×１００mL）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、そして濃縮すると７０４−ＯＴｓ（９４８mg、９１％トシル化官能基）が油状物として得られ、これはさらに精製することなく使用した。1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ = 7.79 (d, J = 8.3 Hz, Har), 7.33 (d, J = 8.3 Hz, Har), 4.15 (t, J = 4.9 Hz, CH2OTs), 3.70-3.30 (m, [CH2CH2O]n, [CH2CH(CH3)O]n, CH2N), 2.44 (s, CH3), 1.17-1.08 (m, [CH2CH(CH3)O]n)。
【０１３６】
テトラ−アジド７０４ブロックコポリマー：７０４−Ｎ３
アジ化ナトリウム（２８０mg、４．３１mmol、２５当量）を、７０４−ＯＴｓ（９４８mg、１７２μmol）の無水エタノール（８mL）溶液に加え、そして混合物を８０℃で６日間激しく撹拌した。その後、溶液を濃縮し、そして残渣を水（１５mL）に溶解し、そしてＭｉｌｌｉＱ脱イオン水（６×１．５L）に対する４℃での透析（ＭＣＷＯ＝２０００）によって精製し、続いて凍結乾燥すると、７０４−Ｎ３（５８３mg、定量的な変換、９１％アジド官能基）が黄色の油状物として得られた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ = 3.70-3.30 (m, CH2N3, [CH2CH2O]n, [CH2CH(CH3)O]n, CH2N), 1.17-1.07 (m, [CH2CH(CH3)O]n) ; 13C NMR (100.6 MHz, CDCl3) :δ = 75.6, 75.5, 75.3, 73.5, 73.1, 73.0, 71.0, 70.9, 70.8, 70.7および70.2 ([CH2CH2O]n, [CH2CH(CH3)O]n, CH2N, CH2CH2N3), 50.8 (CH2N3), 17.6および17.5 ([CH2CH(CH3)O]n)。704-N3についての元素分析、計算値: C, 57.70 ; H, 9.68 ; N, 3.44。実測値: C, 57.25 ; H, 9.75 ; N, 2.85。
【０１３７】
マンノシル化７０４：７０４−トリアゾロ−Ｍａｎ（７０４−Ｍ）
新しく調製した硫酸銅（ＩＩ）五水和物（９０．７mg、３６４μmol、２当量）およびアスコルビン酸ナトリウム（２８８mg、１．４５mmol、８当量）の水（６mL）溶液を、室温で、プロパルギル−α−Ｄ−マンノピラノシド（４７６mg、２１８mmol、１２当量）の水（６mL）溶液に加えた。得られた混合物を７０４−Ｎ３（１g、１８２μmol）のｔｅｒｔ−ブタノール（１２mL）の溶液に加えた。５５℃で４８時間撹拌した後、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム塩二水和物（ＥＤＴＡ、６７７mg、１．８２mmol、１０当量）の水（１５mL）溶液を加え、そして室温で３０分間撹拌し続けた。粗反応混合物をＭｉｌｌｉＱ脱イオン水（６×１．５L）に対する４℃での透析（Cellu・Sep （登録商標）H1透析膜1,000 MCWO）によって精製し、続いて凍結乾燥すると、褐色油状物として７０４−トリアゾロ−Ｍａｎ（２２１mg、８５％以下のマンノース取り込み）が得られた。1H NMR (400 MHz, D2O) : δ = 8.11 (s, 4H, H トリアゾール), 4.95 (s, 4H, H1マンノース), 4.83 (d, J= 12.4 Hz, 4H, OCH2-トリアゾール), 4.70 (d, J = 12.4 Hz, 4H, OCH2-トリアゾール), 4.63 (t, J = 4.8 Hz, 8H, OCH2CH2N), 3.97 (t, J = 4.8 Hz, 8H, OCH2CH2N), 3.92-3.25 (m, H2,3,4,5,6 ガラクトース, CH2N, [CH2CH2O]n, [CH2CH(CH3)O]n), 1.42-0.89 (m, [CH2CH(CH3)O]n) ; 13C NMR (100.6 MHz, D2O) : δ = 143.8 (NCH=C), 126.0 (NCH=C), 99.7 (C1 マンノース), 75.8, 75.7, 75.6, 74.8, 73.3, 72.6, 72.3, 70.8, 70.3, 69.9, 69.8, 69.1, 67.9, 67.0, 61.2, 60.0, 50.4, 17.5, 16.4。
【０１３８】
前記したのと同じ手順を適用して、クリックケミストリーによってマンノシル化９０４（９０４−Ｍ）を調製した。
【０１３９】
Ｏ結合による７０４および９０４のマンノシル化（７０４−Ｏ−Ｍおよび９０４−Ｏ−Ｍ）
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−マンノピラノシド
不活性な雰囲気下、酢酸ヒドラジン（１９０mg、２．０６mmol、１．３５当量）を、ペンタ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（５９６mg、１．５３mmol）の無水ＴＨＦ（６mL）溶液に４Åのモレキュラーシーブの存在下で加える。混合物を室温で４時間３０分撹拌し、減圧下で濃縮し、そしてシリカゲルクロマトグラフィー（ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ；２５：１）によって精製すると、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−マンノピラノシド（３８３．３mg、７８％）が黄色の油状物として得られた。RMN 1H (CDCl3) : δ = 5.41 (m, 0.5H, H1α), 5.40 (m, 0.5H, H1β), 5.31-5.19 (m, 3H, H4,3,2), 4.30-4.06 (m, 3H, H5,6a,6b), 2.21-1.98 (m, 12H, CH3CO)。RMN 13C (100.6 MHz, CDCl3) : δ = 176.2, 171.2, 170.5および170.2 (C=O), 92.6 (C1), 71.5 (C4) 69.2 (C3), 68.9 (C2), 66.6 (C5), 62.9 (C6), 21.3, 21.2, 21.1および20.9 (4 × CH3CO)。
【０１４０】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−Ｏ−トリクロロアセトイミドイル-α−Ｄ−マンノピラノシド
不活性な雰囲気下、炭酸カリウム（８３６mg、６．０５mmol、６．７当量）およびトリクロロアセトニトリル（０．７８mL、７．８mmol、８．８当量）を、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−Ｄ−マンノピラノシド（３１０mg、０．８９mmol）の無水ジクロロメタン（２０mL）溶液に、４Åのモレキュラーシーブの存在下、連続的に加える。混合物を室温で１２時間撹拌し、その後、ろ過し蒸発すると、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−Ｏ−トリクロロアセトイミドイル−α−Ｄ−マンノピラノシド（４５７mg、９６％）が無色の油状物として得られた。
【０１４１】
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−Ｏ−７０４−α−Ｄ−マンノピラノシド（７０４−ｍａｎＡｃ４）：
窒素雰囲気下、三フッ化ホウ素エチルエーテレート（２００μL、１．６２mmol、２５当量）を室温で、７０４（３７７．６mg、６９μmol）および２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシドトリクロロアセトアミデート（５０９．４mg、１．０３μmol、１５当量）の無水ジクロロメタン（２０mL）溶液に加え、そして反応混合物を室温で２時間撹拌した。溶液を減圧下で濃縮し、リン酸緩衝液（ｐＨ７、４mL）で希釈し、そしてＭｉｌｌｉＱ脱イオン水（６×１．５L）に対する４℃での透析（Cellu・Sep （登録商標）H1透析膜2,000 MCWO）によって精製し、続いて凍結乾燥すると、黄色の油状物として７０４−ＭａｎＡｃ４（２９０mg、３５％以下のアセチル化マンノース取り込み）が得られた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ =  5.36 (dd, J = 3.4, 10.1 Hz, 1H, H4), 5.30-5.25 (m, 2H, H2, H3), 4.86 (d, J = 3.3 Hz, 1H, H1), 4.34-4.13 (m, 4H, CH2OgalAc4, H5, H6), 3.80-3.21 (m, [CH2CH2O]n, [CH2CH(CH3)O]n, CH2N), 2.15, 2.10, 2.03および1.98 (4 × s, 4 × 3H, CH3CO), 1.15-1.05 (m, [CH2CH(CH3)O]n) ; RMN 13C (100.6 MHz, CDCl3) : δ 97.9 (C1), 77.5, 77.2, 76.8, 75.7, 75.5, 73.5, 73.0, 72.7, 71.0, 70.7, 70.5, 70.1, 69.2 (C2), 68.7(C4), 66.3, 62.6, 61.9 (C6), 29.8, 21.0 × 2 および20.8 (4 × CH3CO), 17.6, 17.4。
【０１４２】
１−Ｏ−７０４−α−Ｄ−マンノピラノシド７０４ブロックコポリマー：７０４−Ｏ−Ｍ
生成物７０４−ｍａｎＡｃ４（２９６mg、４３μmol）を、新しく調製したメタン酸ナトリウム（２００mM、１．７mmol、２９当量）溶液に加え、室温で２時間撹拌し、その後、減圧下で濃縮し、リン酸緩衝液（ｐＨ７、４mL）で希釈し、そしてＭｉｌｌｉＱ脱イオン水（６×１．５L）に対する４℃での透析（Cellu・Sep （登録商標）H1透析膜2,000 MCWO）によって精製し、続いて凍結乾燥すると、黄色の油状物として７０４−Ｍａｎ（２４６mg、３５％以下のアセチル化マンノース取り込み）が得られた。1H NMR (400 MHz, CDCl3) : δ =4.87 (d, J = 3.4 Hz, 1H, H1), 3.85-3.75 (m, 2H, CH2OGal), 3.70-3.25 (m, H2,3,4,5,6 [CH2CH2O]n, [CH2CH(CH3)O]n, CH2N), 1.22-1.02 (m, [CH2CH(CH3)O]n) ; RMN 13C(100.6 MHz, CDCl3) : δ =100.5 (C1), 77.7, 77.4, 77.1, 76.2, 75.9, 75.7 (C5), 74.9 (C3), 74.2, 74.0, 73.7, 73.3 (C2), 73.0, 72.3 (C4), 72.1, 71.2, 70.9 70.6, 68.9, 67.1, 62.1 (C6), 18.9, 18.6, 17.8, 17.7。
【０１４３】
前記したのと同じ手順を適用して、直接的なカップリングによってマンノシル化９０４（９０４−Ｏ−Ｍ）を調製した。
【０１４４】
動物の処理
８週令のＣ５７ｂｌ／６雌マウス（Janvier, Le Genest Saint Isle, France）を実験に使用した。動物をマウスを飼うための標準的な寸法のプラスチックの箱で飼育した。動物をエアコンの効いた（１５〜２１℃）環境に入れた。人工的な昼／夜の光サイクルには１２時間の明かりと１２時間の暗闇が含まれ、午前８：００に点灯する。各注射前に、マウスにイソフルランによって麻酔した。組換えタンパク質合成製剤を、Ｕ１００マイクロファインシリンジ（BD Medical Rungis, France）を使用して注射した。各動物に、初回／ブーストスキームに従って１００μlを０日目および２１日目に皮下（s.c.）注射した。全てのマウスについて後方の眼窩洞から血液試料をガラス製のピペットを使用して０日目、２１日目および４２日目に回収した。血液試料を３７℃で３０分間温め、そしてその後５０００rpmで５分間遠心分離にかけた。血清を回収し、そして−８０℃で保存した。４２日目にマウスを屠殺し、血液試料を回収し、そして脾臓をＥＬＩＳＰＯＴ分析のために使用した。
【０１４５】
ビーグル雄イヌ（ENV, Nantes, France）の肩甲骨間領域に、タイロード媒体（CaCl2 3 mM、MgCl22 mM、KCl 6 mM、NaCl 140 mM、グルコース10 mM、およびHepes 10 mM、pH 7.4；Tyrode Pharmacology. Philadelphia, 1908, 第２版 1912）中０．２５％の７０４−Ｍを用いて製剤化された１５０μgのβ−ガラクトシダーゼ組換えタンパク質を皮下注射した。１mlの製剤を、２１Ｇ針と２．５mlのシリンジを使用して注射した。
【０１４６】
免疫応答の測定
β−ガラクトシダーゼに特異的なマウス抗体（全ＩｇＧ）の力価を、ＥＬＩＳＡによって測定した。β−ガラクトシダーゼタンパク質を使用して、一晩かけて４℃でウェルをコーティングした。周囲温度でＢＳＡを用いて１時間かけて飽和させた後、血清希釈液を３７℃で１時間半かけてインキュベーションした。その後、１／５０００に希釈したペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたヤギ抗マウスＩｇＧを、周囲温度で１時間インキュベーションし、そしてペルオキシダーゼ基質の添加後、プレートを４９０nmにおいて分光測定により解読した。各マウスにおいて、免疫前、１回目のブースト前、および最終の血清を４つの希釈度で試験した：１／２０、１／２００、１／２０００、１／２００００。標準の力価を５０００に任意に固定し、そして１／１０００から１／６４０００まで希釈して、検量線を構築した。検量線の線形部分に含まれるＯＤを有する各試験希釈試料を、抗体力価の決定のために保存した。他の希釈度は除外した。β−ガラクトシダーゼに特異的なイヌ抗体（全ＩｇＧ）の力価を、いくらか小さな改変を加えて前記のようにＥＬＩＳＡによって測定した。簡潔に言えば、ペルオキシダーゼにコンジュゲーションさせたヤギ抗イヌＩｇＧを１／５０００の希釈度で使用した。標準の力価を５０００で任意に固定した。オボアルブミンに特異的なマウス抗体（全ＩｇＧ）の力価をマウス抗β−ガラクトシダーゼ力価の決定について記載されたプロトコールを適応させることによってＥＬＩＳＡによって測定した。
【０１４７】
βＧａｌ ＣＴＬの存在についてのマーカーとしての、クラスＩ拘束性ＩＦＮγ分泌を、ＥＬＩＳＰＯＴ（Diaclone, Besancon, France）によって決定した。Ｈ２−Ｋｂ拘束性ＩＣＰＭＹＡＲＶペプチドを代表的なβＧａｌエピトープとして使用した。陰性対照はKRWIILGLNKペプチド（ＨＩＶ ｇａｇ２６３〜２７２）であった。肝脾細胞を、トリパンブルー排除によって血球計算盤スライド上で計測し、１×１０６／mlで完全培地（１０％ウシ胎児血清、２mmol/lのｌ−グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンの補充されたＲＰＭＩ１６４０、全てInvitrogen, Paisley, UK）に再懸濁し、その後、１×１０５個の細胞／ウェルで３回分配した。細胞を３７℃および５％ＣＯ２で５μg/mlのコンカナバリンＡまたは４μg/mlのペプチドの存在下で一晩インキュベーションした。ＳＦＣを製造業者のプロトコールに従って検出し、ＡＩＤ ＥＬＩＳＰＯＴ解読機（Autoimmun Diagnostika, Strassberg, Germany）で自動的に計数し、そして結果をＳＦＣ／１０６個の脾細胞として表現した。細胞計測誤差を修正するために、ｎ番目のマウスのペプチド特異的ＳＦＣ計数を、全てのウェルにおける平均のＣｏｎＡ刺激ＳＦＣを乗じ、これをｎ番目のマウスのＣｏｎＡ刺激ＳＦＣによって割ることによって標準化した。標準化は、一貫して、群内のばらつきを減少させることが判明した。クラスＩ拘束性ＩＦＮγ分泌もまた、オボアルブミンＣＤ８特異的細胞の定量について上記したようなＥＬＩＳＰＯＴによって決定した。Ｈ２−Ｋｂ拘束性ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを代表的なオボアルブミンエピトープとして使用した。
【０１４８】
実施例１
マンノシル化ブロックコポリマーの合成および特徴付け
サブユニットワクチン接種のためのアジュバントとしての標的化ベクターの可能性を試験するために、両親媒性四官能性ブロックコポリマーを、マンノース標的化リガンドを導入することによって化学的に改変させた。その後、体液性応答および細胞性応答を誘発するその能力を、組換え抗原を用いての製剤化および皮下注射後に分析した。
【０１４９】
四官能性両親媒性ブロックコポリマー７０４の遠位末端におけるマンノシル残基の取り込みを、２つの化学的戦略に従って実施した（図１）；（ａ）アジド末端ポリマーと、アルキン基を含むマンノース部分との間の銅により触媒されるヒュスゲン１，３−双極子環化付加に依拠したクリックケミストリーによって（図１ａ）、および（ｂ）三フッ化ホウ素エチルエーテレートの存在下、２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−１−Ｏ−α−Ｄ−マンノピラノシドとポリマーとの反応、およびメタン酸ナトリウムによる糖の脱保護による、Ｏ結合を介した、四官能性ポリマーのヒドロキシル基とマンノースとの間の直接的なカップリング（図１ｂ）。クリックケミストリーおよび直接的なカップリングによって得られたマンノシル化７０４はそれぞれ７０４−Ｍおよび７０４−Ｏ−Ｍと命名された。クリックケミストリーアプローチでは、必要とされるＯ−アルキニル炭水化物は、乾燥ジクロロメタン中、三フッ化ホウ素エチルエーテレートの存在下、β−Ｄ−マンノース五酢酸塩とプロパルギルアルコールと反応させ、その後、アセチル保護基をナトリウムメトキシドにより除去することによって容易に調製された。プロパルギル−β−Ｄ−マンノピラノシドは、望ましくないα−アノマーを形成することなく定量的な収率で得られた。
【０１５０】
四官能性７０４のＰＥＯ末端へのアジド基の導入は、以前にポリエチレングリコールに適用された改変された２ステップの手順を使用して行なわれた（Mereyala et al., Carbohydrate Research, 1998, 307, 351; Muthana et al., J Am Chem Soc, 2007, 129, 11918; Bonger et al., Bioorg Med Chem, 2007, 15, 4841; Goncalves et al., Pharm Res, 2005, 22, 1411-1421; Li et al., Biomacromol, 2003, 4, 1055; Iyer et al., Tetrahedron Lett, 2004, 45, 4285）。ヒドロキシ遠位末端７０４を、過剰のｐ−トルエンスルホニルクロリド（１つのヒドロキシル基につき３当量）および水酸化カリウムを無水ジクロロメタン中で使用して、ビス−トシル化誘導体ブロックコポリマー−ＯＴｓへと変換した。ヒドロキシル基の変換は、δ＝１．１８〜１．０３ppm（多重線、１５０Ｈ）のＰＰＯ ＣＨ３シグナルおよびδ＝４．１４ppmの末端ＰＥＯメチレンＣＨ２ＯＴｓシグナルまたはδ＝７．７８および７．３３ppmのトシル芳香族シグナルの比較積分を使用して４００ＭＨｚの１Ｈ ＮＭＲ実験によって決定された。この方法は、７０４の９１％以下の末端が官能基化されたことを示した。７０４−ＯＴｓのスルホン酸エステルのアジドイオンによる完全な置換は、無水エタノール中８０℃で実施され、そしてビス−アジド７０４−Ｎ３が得られた。１Ｈ ＮＭＲ分析は、トシル芳香族シグナルの全消失、および、末端ＰＥＯメチレンプロトンシグナルのブロードな−ＯＣＨ２ＣＨ２−シグナルへのダウンシフトを示した。１３Ｃ ＮＭＲ実験もまた、スルホン酸エステルから、−ＣＨ２Ｎ３シグナルに対応するδ＝５０．８ppmの末端ＰＥＯメチレン炭素の独特なシグナルを有するアジドへの定量的な変換を確認した。
【０１５１】
アジド７０４−Ｎ３とプロパルギル−β−Ｄ−マンノースピラノシドとの最適化１，３−双極子環化付加を、ｔ−ＢｕＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１、ｖ／ｖ）中の硫酸銅／アスコルビン酸ナトリウムを使用して５５℃で２日間実施すると、７０４−Ｍ遠位末端に８５％以下のマンノース残基を含むブロックコポリマー７０４トリアゾロ−マンノースが得られた。１，４−トリアゾール環の位置特異的形成は１Ｈおよび１３Ｃ ＮＭＲによって確認され、そしてマンノースの取り込みは、ＰＰＯ ＣＨ３シグナルおよびトリアゾールまたはピラノシドシグナルの比較積分を使用して計算された。直接的なカップリングによる第２の化学合成を使用して１−Ｏ−ポリマー−α−Ｄ−マンノースを形成する、７０４へのマンノースの取り込みの定量により、７０４−Ｏ−Ｍ遠位末端にはマンノース残基の８０％が存在していた。クリックケミストリーまたは直接的なＯ結合のいずれかによるマンノシル化７０４の記載の合成をまた、四官能性ブロックコポリマー９０４のマンノシル化に適用した。
【０１５２】
マンノシル化されているまたはマンノシル化されていない７０４および９０４の分子的配分のＭａｌｄｉ−Ｔｏｆによる分析は差異を示さなかった（データは示さず）。
【０１５３】
実施例２
２つの異なる化学戦略によるマンノシル化７０４および９０４により、皮下サブユニットワクチン接種に対する免疫応答がもたらされた
ワクチン接種効力に対する７０４および９０４四官能性ポリマーへのマンノースのカップリングの仕方の影響を調べた。この目的を達成するために、マウスに、０日目および２１日目に、クリックケミストリー（７０４−Ｍおよび９０４−Ｍ）または直接的なＯ−結合（７０４−Ｏ−Ｍおよび９０４−Ｏ−Ｍ）のいずれかによりマンノシル化された７０４および９０４を用いて製剤化された組換えβ−ガラクトシダーゼを皮下注射した。結果（図２）は、４２日目にβ−ガラクトシダーゼに対する細胞性応答および体液性応答の両方が、試験した２つの四官能性ポリマーへのマンノースのカップリングの仕方に関係なく同じであったことを示す。
【０１５４】
実施例３
高い体液性応答および細胞性応答のための７０４−Ｍについての製剤化パラメーターの最適化
マウスに、０日目および２１日目に、様々な量の７０４−Ｍを用いて製剤化された組換えβ−ガラクトシダーゼを皮下注射した。マウスを、最初のβ−ガラクトシダーゼ注射後４２日目に屠殺し、種々の群における抗β−ガラクトシダーゼ力価のレベルを比較した。体液性応答の有意な増強が観察され、そして０．２５％の７０４−Ｍを含む製剤ではピークに達した（図３ａ）。
【０１５５】
次に、親ベクターと比較した標的化ベクターの効果を調べた。この目的を達成するために、マウスに、０日目および２１日目に、７０４−Ｍおよび親７０４のいずれかを用いて製剤化された２５μgのβ−ガラクトシダーゼを皮下注射した。各ベクターは、抗β−ガラクトシダーゼ抗体力価の最大の増強を与える０．２５％の濃度で使用された。４２日目における抗β−ガラクトシダーゼ力価の有意な増強が、親７０４ベクターと比べて７０４−Ｍで観察された（図３ｂ）。最も重要なことには、クラスＩ拘束性細胞性免疫応答はまた、７０４−Ｍの注射されたマウスの群においても増加を示した（図３ｃ）。
【０１５６】
０．２５％の７０４−Ｍを用いて製剤化されたβ−ガラクトシダーゼを使用した用量反応実験は、最大の体液性応答が１０μgのβ−ガラクトシダーゼで得られたことを示した（図３ｄ）。７０４および７０４−Ｍワクチン接種効力に対するマウス株の影響も調べた。図３ｅは、抗β−ガラクトシダーゼ抗体力価の増加がまた、７０４親で得られたものと比較して７０４−Ｍを用いてもＢａｌ／ｃマウスで観察されたことを示す。
【０１５７】
実施例４
製剤化媒体は、マンノシル化７０４のワクチン接種効力に影響を及ぼさない
その後、７０４および７０４−Ｍの効力を、様々な製剤化媒体で試験した。マウスに、０日目および２１日目に、食塩水中またはタイロード媒体中のいずれかの７０４および７０４−Ｍを用いて製剤化されたβ−ガラクトシダーゼを皮下注射した。結果は、製剤化に使用される媒体の組成は、７０４または７０４−Ｍのいずれかで免疫化されたマウスの群において抗β−ガラクトシダーゼ抗体力価を改変しなかったことを示す（図４）。結果はまた、７０４をマンノース標的化部分を用いて化学的に改変した場合に、４２日目に得られた体液性応答の劇的な増加を確認する。
【０１５８】
実施例５
７０４−Ｍは、大型動物における組換えワクチン接種を誘起する
大型動物へと本発明者らの所見を拡張するために、イヌに０日目に、７０４−Ｍを用いて製剤化された１５０μgのβ−ガラクトシダーゼを１回皮下注射した。結果は、体液性応答が、１回の注射から１０日間検出可能であり、そして長い時間かけて連続的に増加したことを示す（図５）。
【０１５９】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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