(57)【要約】【課題】本発明は、２以上のチオール官能基を有する修飾オリゴヌクレオチドに関する。【解決手段】この修飾オリゴヌクレオチドは、金表面またはグラフト化表面、特に、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基を含む表面に固定することができる。本発明はまた、修飾オリゴヌクレオチドと生体試料から増幅された標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検出するステップを含む、生体試料中の核酸を検出する方法を含む。本発明は、より詳細には、病原体生物、好ましくはウイルスを、検出、遺伝子型決定またはシーケンシングするための方法を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＸＩＩｂ）：
(XIIb)N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’b)y-(M1-…-Mm-1-Mm)p-(I’b)y’
または式（ＸＩＩＩｂ）：
(XIIIb)(Ic’)-(I’b)y-1-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’b)y’-(M1-M2-…-Mm-1-Mm)p-(I’b)y”
［式中、
Ｎ１、…、Ｎｎは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ１、…、Ｍｍは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
（Ｉ’ｂ）は、式：
【化１】
2015514402.tif 000051
の化合物を表し、
（Ｉｃ’）は、式：
【化２】
2015514402.tif 000052
の化合物を表し、
ｎは、４から１００の範囲の整数であり、
ｍは、４から１００の範囲の整数であり、
ｙは、２から１２の範囲の整数であり、
ｐは、０または１を表し、
ｙ’は、ｐが値１を有する場合、０から１２の範囲の整数であり、ｐが値０を有する場合、ｙ’は０に等しく、
ｙ”は、ｐが値１を有する場合、０から１２の範囲の整数であり、ｐが値０を有する場合、その際は、ｙ”は０の値を有し、
整数（ｙ＋ｙ’）または（ｙ＋ｙ’＋ｙ”）の合計は、１２を超えることがなく
Ｘは、直鎖または分岐鎖のＣ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基から選択され、
Ｙは、直鎖または分岐鎖のＣ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基から選択され、
Ｚは、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２ＮＣＯ−アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２ＣＯＮ−アルキル基から選択され、
Ｗは、Ｃ１−Ｃ１２アルカントリイル基、Ｃ６−Ｃ１８アリールトリイル基およびＣ６−Ｃ１８アラルカン（ａｒａｌｋａｎｅ）トリイル基から選択され、
Ｒは、Ｈであるか、またはＣ１−Ｃ１２アシル、Ｃ１−Ｃ１２Ｓ−アルキル、Ｃ６−Ｃ１２Ｓ−アリール、Ｓ−２−ピリジン、酸素含有または窒素含有Ｃ１−Ｃ１２Ｓ−ヘテロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２Ｓ−シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２Ｓ−シクロヘテロアルキル基から選択され、ならびに、
Ｒ１は、２−シアノエチルまたはＲ’１Ｒ’２Ｒ’３ＳｉＣＨ２ＣＨ２基（式中Ｒ’１、Ｒ’２およびＲ’３は、同一であっても、または異なっていてもよく、１から１２の炭素原子を含む直鎖もしくは分岐鎖のアルキルおよびＣ６−Ｃ１２アリールから選択される基を表す）から選択される］
に対応する修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
式：
【化３】
2015514402.tif 000053
（式中、ｎ、ｙ、Ｎ１、…、Ｎｎ−１、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＷおよびＲは、請求項１と同じ定義を有し、
Ｂｎは、ｎ番目のヌクレオチドの塩基を表す）
に対応する、請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項３】
式：
【化４】
2015514402.tif 000054
（式中、ｎ、ｙ、Ｎ２、…、Ｎｎ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＷおよびＲは、請求項１と同じ定義を有し、
Ｂ１は、第１番目のヌクレオチドの塩基を表す。）
に対応する、請求項１に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項４】
ヌクレオチド配列（Ｎ１−Ｎ２−…−Ｎｎ−１−Ｎｎ）および場合により、ヌクレオチド配列（Ｍ１−Ｍ２−…−Ｍｍ−１−Ｍｍ）が、疾患の原因である、または疾患に関与する、ウイルス、細菌または遺伝子に対して特異的である、請求項１から３のいずれか一項に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項５】
ヌクレオチド配列（Ｎ１−Ｎ２−…−Ｎｎ−１−Ｎｎ）および場合によりヌクレオチド配列（Ｍ１−Ｍ２−…−Ｍｍ−１−Ｍｍ）が、
−Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に特異的な配列番号１、配列番号４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３５もしくは配列番号３６の配列、
−フラビウイルスに特異的な配列番号１６、配列番号１７もしくは配列番号４０の配列、
−デングウイルスに特異的な配列番号１８もしくは配列番号４１の配列、または
−西ナイルウイルス（ＷＮＶ）に特異的な配列番号１９の配列、
から選択される、請求項４に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項６】
ヌクレオチド配列（Ｎ１−Ｎ２−…−Ｎｎ−１−Ｎｎ）および場合によりヌクレオチド配列（Ｍ１−Ｍ２−…−Ｍｍ−１−Ｍｍ）は、アルファアノマー、ベータアノマー、直鎖もしくはスネイルタイプの構造を有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の修飾オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記修飾オリゴヌクレオチドのグラフティングに耐える物質によりコーティングされた少なくとも１つのレシービングゾーンを含む、少なくとも１つの請求項１から６に記載の修飾オリゴヌクレオチドによるグラフト化基材。
【請求項８】
−前記レシービングゾーンが金またはプラチナのフィルムによりコーティングされ、前記基材が金属、好ましくは銅もしくはチタン製である、または
−前記レシービングゾーンがその表面に、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基を含み、および前記基材がプラスチック、好ましくはポリスチレン製である、
請求項７に記載のグラフト化基材。
【請求項９】
前記基材が非平面であり、好ましくはマイクロ粒子またはナノ粒子である、請求項７または８に記載のグラフト化基材。
【請求項１０】
−前記標的核酸を、請求項１から６のいずれか一項に記載の修飾オリゴヌクレオチドにより形成される少なくとも１つの検出プローブにより検出するステップを含む、生体試料中の少なくとも１つの標的核酸を検出する方法。
【請求項１１】
−前記生体試料から少なくとも１つ供給源核酸を得るステップ、
−供給源核酸から前記標的核酸の増幅によりアンプリコンを作製するステップ、および
−前記アンプリコンと、請求項１から６のいずれか一項に記載の修飾オリゴヌクレオチドにより形成される少なくとも１つの検出プローブとのハイブリダイゼーションを検出するステップ、
を含む、請求項１０に記載の検出方法。
【請求項１２】
−アンプリコンが、ウイルスの遺伝子型および／または亜型に関する情報を保有するウイルスのゲノム領域に対応す標的ヌクレオチド配列の増幅により作製され、ならびに
−検出が、ウイルスの遺伝子型および／または亜型に特異的なプローブにより実施される、
生体試料中に存在するウイルスの遺伝子型および／または亜型を決定するための、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
アンプリコンの作製するステップが、ウイルスの遺伝子型および／または亜型に関する情報を保有するウイルスのゲノム領域に対応する標的ヌクレオチド配列の増幅により、好ましくはプライマーペア：
−配列番号８および配列番号９、アンプリコンがＨＣＶの任意の遺伝子型から出発して作製される場合；
−配列番号１０および配列番号９、アンプリコンが遺伝子型１ａ／１ｂのＨＣＶから出発して作製される場合；
−配列番号２９および配列番号９、アンプリコンが遺伝子型２のＨＣＶから出発して作製される場合；
−配列番号８および配列番号１１、アンプリコンが遺伝子型３ａのＨＣＶから出発して作製される場合；
−配列番号８および配列番号３０、アンプリコンが遺伝子型４ａ／４ｄのＨＣＶから出発して作製される場合；
−配列番号２０および配列番号２１、または配列番号２２および配列番号２１、アンプリコンがフラビウイルスから作製される場合、
から選択されるヌクレオチドプライマーの混合物により実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
−少なくとも１つの請求項１から６のいずれか一項に記載の修飾オリゴヌクレチド、および前記修飾オリゴヌクレオチドのグラフティングに耐える物質によりコーティングされた少なくとも１つのレシービングゾーンを含み、前記レシービングゾーンが、好ましくは金、プラチナによりコーティングされるか、または少なくとも１つの炭素−炭素二重結合もしくは炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基ををその表面に含む少なくとも１つの基材、または
−請求項７から９のいずれか一項に記載の少なくとも１つのグラフト化基材、
を含む、生体試料中の少なくとも１つの標的核酸を検出するためのキット
【請求項１５】
配列番号１、配列番号４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４０および配列番号４１の配列から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１から６のいずれか一項に記載の修飾オリゴヌクレオチド、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項７から９のいずれか一項に記載のグラフト化基材の、生体試料中の少なくとも１つの標的核酸を検出するための使用。
【請求項１７】
ウイルス株、好ましくは肝炎ウイルス、アルボウイルス、好ましくはフラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）またはブニヤウイルス科（Ｂｕｎｈｙａｖｉｒｉｄａｅ）の、診断、遺伝子型決定またはシーケンシングのための、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
ＨＣＶ、ＨＢＶ、デングウイルスまたは西ナイルウイルスの、診断、遺伝子型決定またはシーケンシングのための、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２以上のチオール官能基を有する修飾オリゴヌクレオチドに関し、この修飾オリゴヌクレオチドは、金表面またはグラフト化表面、特に、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基を含む表面に固定することができる。本発明はまた、修飾オリゴヌクレオチドと生体試料から増幅された標的核酸との間のハイブリダイゼーションを検出するステップを含む、生体試料中の核酸を検出する方法に関する。本発明は、より詳細には、病原体生物（好ましくはウイルス）を、検出し(detecting)、遺伝子型決定し(genotyping)またはシーケンシングする(sequencing)ための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸は、それらを構成する異なるヌクレオチドの連続配置によりもたらされるそれらの物理化学的安定性および特異性のため、ヒト、動物、植物、細菌またはウイルス性生物の特異的検出および同定のための方法における使用に、非常に良く適した分子である。
【０００３】
これらの特性は、信頼性があり、感度の高いバイオセンサーの開発につながり、このバイオセンサーは、従来通り、分子認識要素およびトランスデュサーから構成される。「プローブ」と呼ばれる分子認識要素は、一般的にトランスデュサーの表面に固定されており、「標的」核酸分子に対して高い特異性および感度を表す。トランスデュサーの役割は、分子認識事象を変換することである。すなわちプローブのヌクレオチド配列と標的との間のハイブリダイゼーションを、容易に測定可能なシグナルに変換する。したがって、バイオセンサーは、プローブおよび標的中に含有される２つの相補的ヌクレオチド配列の対合に関する能力を活用し、２つの配列のハイブリダイゼーションが起こった時にシグナルを発生する。
【０００４】
バイオセンサーは、プローブと標的配列のハイブリダイゼーションを明らかにするために使用される、変換の方法により特徴付けられる。
【０００５】
直接変換によるバイオセンサーは、特殊な標識化を用いずに、配列のハイブリダイゼーションを検出可能にする。これらは、例えば、変換が電子移動反応により起こる電気化学系、例えば定電位における電流変化の検出に基づく電流測定、２つの電極間の導電率変化の検出に基づく導電率測定または定電流における電位変化の検出に基づく電位差測定を含む。直接変換によるバイオセンサーはまた、圧電技術に基づき、例えば、表面において起こる変化に応じて振動数が変動する水晶の特性を活用する重量測定系も含む。直接変換によるバイオセンサーは、一般的に迅速で特異的であるが、感度が限られている（１０−９から１０−１２Ｍ）。直接変換によるバイオセンサーは、安価で、使い捨ての持ち運びのできる診断系の作製に非常に適している。
【０００６】
一方で、間接的変換によるバイオセンサーは、標的核酸配列の標識化を必要とし、検出前に洗浄ステップの実施が必要である。間接的変換によるバイオセンサーは、一般的に、光学系の形態である。そこでは、検出が共焦点顕微鏡に連結されたリーダーにおいて実施され、レーザーで誘起される励起に応じた、１以上の蛍光マーカーによる光の放射に基づく光学系の形態である。したがって、間接的変換によるバイオセンサーは、一般的に操作が複雑な重い機器を必要とし、有資格者を必要とするが、高い検出感度（１０−１２から１０−１５Ｍ）を有する。間接的変換によるバイオセンサーは、核酸に基づく診断分野において最も多く使用される技術を構成する。
【０００７】
直接または間接的な変換によるバイオセンサーは、何千または何万もの核酸配列のハイブリダイゼーションの検出を同時に可能にする。これらのバイオセンサーは、一般的に、固体支持体上のドットの形態で固定されたプローブの秩序だった形態で配置される。各ドットは、同じヌクレオチド配列を有する約１０６の同一プローブを含有し、プローブのヌクレオチド配列は、１つのドットと次のドットとで異なる。
【０００８】
「マイクロアレイ」は、約２０から５０μｍのサイズの１０００から１０６のドットを含む、非常に複雑なバイオセンサーである。マイクロアレイは、非常に洗練されており、高価であり、主にＤＮＡシーケンシング、遺伝的疾患の調査および多型の分析を意図している。このタイプのバイオセンサーは、特に、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社およびＡｇｉｌｅｎｔ社により開発されている。一方で、「マクロアレイ」は、２００μｍ以上のサイズの１０００から１００００のドットを含むあまり複雑ではないバイオセンサーである。
【０００９】
プローブは、共有結合または非共有結合によりバイオセンサーに固定され得る。プローブとトランスデュサーとの共有結合は、例えば、フォトリソグラフィーにより得ることもできる。またはアミノ化オリゴヌクレオチドと、官能化シランによりコーティングされた表面との反応により得ることができる。プローブは、金属表面、特に金表面にも、例えば金原子とイオウ原子との間の結合を用いて固定することができる。しかし、Ａｕ−Ｓ結合は中程度の強度の結合であり、単一の金−イオウ結合は、プローブを金表面に非常に安定な様式で固定するには十分でない。実際に、検出方法は特に洗浄ステップを含み、洗浄ステップは、Ａｕ−Ｓ結合を不安定化させ得る強力な機械的ストレスを生じる。
【００１０】
プローブはまた、トランスデュサーに非共有的に、例えば静電吸着により結合させることができる。非共有結合は、例えば、プローブのＤＮＡの負に帯電したリン酸塩と、γ−アミノプロピルシランまたはポリ−Ｌ−リジンの層によりコーティングされたトランスデュサーの表面との間の相互作用からもたらされ得る。プローブとトランスデュサーとの間の非共有結合の相互作用は、検出手順の間に実施される洗浄ステップに対して、特に、検出が間接的変換により実施される場合、ほとんど抵抗性が無い。それは、ハイブリダイゼーションの検出は、ハイブリダイゼーションステップそれ自体の後に、プローブのヌクレオチド配列に結合しなかった標識標的ヌクレオチド配列を除去する必要があるためである。さらに、非共有結合は、ハイブリダイゼーションまたは洗浄のステップのストリンジェンシーの強化のための操作条件を有意に変化させることができず、したがってそれらをより特異的にしている。
【００１１】
文献EP 0 523 978は、チオール−修飾オリゴヌクレオチドを作製するために使用可能なホスホラミダイトまたはホスホネート化合物を開示している。しかし、これらの化合物は、１回だけ、オリゴヌクレオチドの５’末端にだけ導入可能である。
【００１２】
文献US 7,601,848は、少なくとも２つの金−イオウ結合を生じさせ、それ故、金表面のオリゴヌクレオチドを安定化させるために、オリゴマー中への組み込みが意図される２つのイオウ原子を含む、多官能性化合物を開示している。これらの化合物のいくつかは、ホスホラミダイト官能基を含む。しかし、この文献において使用される化合物は、非常に高価な化合物から製造され、多官能性化合物のオリゴヌクレオチドのカップリングは、この化合物の立体障害のため、満足の行く収率を有さない。この文献において、チオール化合物を互いに結合させるため、結合剤が必要であり、それによって、チオール化合物がオリゴヌクレオチド内へ複数導入される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】ＥＰ  ０  ５２３  ９７８
【特許文献２】ＵＳ  ７，６０１，８４８
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Chattopadhyaya and Reese, Chem. Soc. Chem. Comm., 1978年, 639-640頁
【非特許文献２】Pourceau, G., Meyer, A., Vasseur, J. J., and Morvan, F., Journal of Organic Chemistry 74, 2009年, 1218-1222
【非特許文献３】Tamalet C.ら、 2003年、Journal of Medical Virology 71: 391-39頁
【非特許文献４】Scaramozzino N. ら、Comparison of Flavivirus universal primer pairs and development of a rapid, highly sensitive heminested reverse transcription-PCR assay for detection of flaviviruses targeted to a conserved region of the NS5 gene sequences. 2001年. Journal of Clinical Microbiology 39: 1922-1927頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の目的は、少なくとも２つのチオール官能基を有するオリゴヌクレオチドから形成されるプローブを、開発することである。前記プローブは、さまざまな支持体に、単純かつ効率的にグラフト可能であり、前記支持体は、両面が金属（例えば金）によりコーティングされた表面を有していてもよく、両面が、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基（好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基）を有するグラフト化表面を有してもよい。本発明のプローブは、前述の欠点を少なくとも部分的に克服し、検出の間に用いられる変換のタイプ（直接的変換または間接的変換）に関わらず、標的ヌクレオチド配列の検出の特異性および感度を増強可能にする。
【００１６】
本発明はまた、病原体生物もしくは感染性生物の核酸、または疾患の原因または疾患に関与する遺伝子の核酸を検出する方法、シーケンシングする方法および／または遺伝子型を決定する方法を提供することを目的とし、該方法は、経済的、迅速、高感度、より柔軟性であり、既存の方法より自動化が容易である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明は、まず第１に、式（ＸＩＩｂ）：
N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’b)y-(M1-…-Mm-1-Mm)p-(I’b)y’（ＸＩＩｂ）
または式（ＸＩＩＩｂ）：
(Ic’)-(I’b)y-1-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’b)y’-(M1-M2-…-Mm-1-Mm)p-(I’b)y”（ＸＩＩＩｂ）
［式中、
Ｎ１、…、Ｎｎは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ１、…、Ｍｍは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
（Ｉ’ｂ）は、式：
【００１８】
【化１】
2015514402.tif 000002
【００１９】
の化合物を表し、
（Ｉｃ’）は、式：
【００２０】
【化２】
2015514402.tif 000003
【００２１】
の化合物を表し、
ｎは、４から１００の範囲の整数であり、
ｍは、４から１００の範囲の整数であり、
ｙは、２から１２の範囲の整数であり、
ｐは、０または１を表し、
ｐが値１を有する場合、ｙ’は０から１２の範囲の整数であり、ｐが値０を有する場合、ｙ’は０に等しく、
ｐが値１を有する場合、ｙ”は０から１２の範囲の整数であり、ｐが値０を有する場合、ｙ”は０の値を有し、
整数（ｙ＋ｙ’）または（ｙ＋ｙ’＋ｙ”）の合計は、２から１２の間に含まれ、
Ｘは、直鎖または分岐鎖の、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基から選択され、
Ｙは、直鎖または分岐鎖の、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基から選択され、
Ｚは、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２ＮＣＯ−アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２ＣＯＮ−アルキル基から選択され、
Ｗは、Ｃ１−Ｃ１２アルカントリイル基、Ｃ６−Ｃ１８アリールトリイル基およびＣ６−Ｃ１８アラルカン（ａｒａｌｋａｎｅ）トリイル基から選択され、好ましくは、ＣＨ、ＣＣＨ３、ＣＣＨ２ＣＨ３、シクロヘキサントリイルおよびベンゼントリイルから選択される基であり、
Ｒは、ＨまたはＣ１−Ｃ１２アシル、Ｃ１−Ｃ１２Ｓ−アルキル、Ｃ６−Ｃ１２Ｓ−アリール、Ｓ−２−ピリジン、酸素含有または窒素含有Ｃ１−Ｃ１２Ｓ−ヘテロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２Ｓ−シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２Ｓ−シクロヘテロアルキル基から選択され、ならびに、
Ｒ１は、２−シアノエチルまたはＲ’１Ｒ’２Ｒ’３ＳｉＣＨ２ＣＨ２基（式中Ｒ’１、Ｒ’２およびＲ’３は、同一であっても、または異なっていてもよく、直鎖もしくは分岐鎖の、Ｃ１−１２アルキルおよびＣ６−Ｃ１２アリールから選択される基を表す）から選択される］
に対応する修飾オリゴヌクレオチドに関する。
【００２２】
本発明の一実施形態に従って、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、式：
【００２３】
【化３】
2015514402.tif 000004
【００２４】
（式中、ｎ、ｙ、Ｎ１、…、Ｎｎ−１、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＷおよびＲは、上記と同じ定義を有し、Ｂｎは、ｎ番目のヌクレオチドの塩基を表す。）
に対応する。
【００２５】
本発明の別の実施形態に従って、修飾オリゴヌクレオチドは、式：
【００２６】
【化４】
2015514402.tif 000005
【００２７】
（式中、ｎ、ｙ、Ｎ２、…、Ｎｎ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＷおよびＲは、上記と同じ定義を有し、Ｂ１は、第１番目のヌクレオチドの塩基を表す。）
に対応する。
【００２８】
本発明の一実施形態に従って、上記の修飾オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列（Ｎ１−Ｎ２−…−Ｎｎ−１−Ｎｎ）および、場合により、ヌクレオチド配列（Ｍ１−Ｍ２−…−Ｍｍ−１−Ｍｍ）を含み、これらは、疾患の原因ないしは疾患に関与する、ウイルス、細菌、または遺伝子に対して特異的である。
【００２９】
本発明の一実施形態に従って、ヌクレオチド配列（Ｎ１−Ｎ２−…−Ｎｎ−１−Ｎｎ）および場合によりヌクレオチド配列（Ｍ１−Ｍ２−…−Ｍｍ−１−Ｍｍ）は、
−Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に特異的な配列番号１、配列番号４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３５もしくは配列番号３６の配列、
−フラビウイルスに特異的な配列番号１６、配列番号１７もしくは配列番号４０の配列
−デングウイルスに特異的な配列番号１８もしくは配列番号４１の配列、または
−西ナイルウイルス（ＷＮＶ）に特異的な配列番号１９の配列、
から選択される。
【００３０】
本発明の一実施形態に従って、ヌクレオチド配列（Ｎ１−Ｎ２−…−Ｎｎ−１−Ｎｎ）および場合によりヌクレオチド配列（Ｍ１−Ｍ２−…−Ｍｍ−１−Ｍｍ）は、アルファアノマー、ベータアノマー、直鎖もしくはステムループ（スネイル「ｓｎａｉｌ」）タイプの構造を有する。
【００３１】
本発明はさらに、少なくとも１つの上記の修飾オリゴヌクレオチドによるグラフト化基材に関し、前記基材は、前記修飾オリゴヌクレオチドのグラフティングを許容する物質によりコーティングされた少なくとも１つのレシービングゾーンを含む。
【００３２】
本発明の一実施形態に従って、前記グラフト化基材の前記レシービングゾーンは、金またはプラチナフィルムによりコーティングされ、前記基材は、金属、好ましくは銅製であるか、または前記レシービングゾーンは、その表面に少なくとも１つの炭素−炭素二重結合（アルケニル官能基）または炭素−炭素三重結合（アルキニル官能基）またはハロアセトアミド官能基（好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基）を含み、前記基材はプラスチック、好ましくはポリスチレン製である。本発明の一実施形態に従って、使用する基材は、非導電ポリマーである。本発明の別の実施形態に従って、本発明の実施に使用される基材は導電性である。
【００３３】
本発明の一実施形態に従って、グラフト化基材は、（部分的または全体に）平坦または曲面であり、球状であることが有利であり得る。一実施形態に従って、基材は非平面、例えば、マイクロ粒子またはナノ粒子の形態であり、好ましくは磁性である。
【００３４】
本発明はさらに、生体試料中の少なくとも１つの標的核酸を検出する方法に関する。この方法は、前記標的核酸を、上記の修飾オリゴヌクレオチドにより形成される少なくとも１つの検出プローブにより検出するステップを含む。
【００３５】
本発明の一実施形態に従って、本発明の検出方法は、
−生体試料から少なくとも１つ供給源核酸を得るステップ、
−前記供給源核酸からの標的核酸の増幅によりアンプリコンを作製するステップ、および
−前記アンプリコンと、上記の修飾オリゴヌクレオチドにより形成される少なくとも１つの検出プローブとのハイブリダイゼーションを検出するステップ、
を含む。
【００３６】
本発明の一実施形態に従って、本発明の検出方法は、生体試料中に存在するウイルスの遺伝子型および／または亜型の決定を可能にする。前記検出方法は、
−標的ヌクレオチド配列の増幅によりアンプリコンを作製するステップであって、前記標的ヌクレオチド配列は、ウイルスの遺伝子型および／または亜型に関する情報を保有するウイルスのゲノム領域に対応するステップと、
−少なくとも１つの検出プローブを有する前記アンプリコンと、ウイルスの遺伝子型および／または亜型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションを検出するステップであって、前記検出プローブは、上述した修飾オリゴヌクレオチドより形成されている検出プローブであるステップと、
を含む。
【００３７】
本発明の一実施形態に従って、本発明の検出方法のアンプリコンを作製するステップはヌクレオチドプライマーの混合物により実施される。好ましくは、下記のプライマーペア：
−配列番号８および配列番号９、どのようなウイルス遺伝子型が関与していても、アンプリコンがＨＣＶから作製され、このプライマーペアは包括的であり、ＨＣＶの任意の遺伝子型から出発する４０１ｎｔの「長鎖」アンプリコンの増幅を可能にするペア；
−配列番号１０および配列番号９、遺伝子型１ａ／１ｂに特異的な１９１ｎｔの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア；
−配列番号２９および配列番号９、遺伝子型２に特異的な１０８ｎｔの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア；
−配列番号８および配列番号１１、遺伝子型３ａに特異的な１４３ｎｔの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア；
−配列番号８および配列番号３０、遺伝子型４ａ／４ｄに特異的な１７５ｎｔの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア；ならびに
−配列番号２０および配列番号２１、および／または配列番号２２および配列番号２１アンプリコンが、フラビウイルスから作製される場合のペア、
から選択されるヌクレオチドプライマーの混合物により実施される。
【００３８】
本発明はさらに、生体試料中の少なくとも１つの標的核酸を検出するためのキットに関する。前記キットは、
−上記の少なくとも１つの修飾オリゴヌクレチド、および少なくとも１つの基材と、
−上記の少なくとも１つのグラフト化基材、を含み、
前記少なくとも１つの基材は、前記修飾オリゴヌクレオチドのグラフトに耐える物質によりコーティングされた少なくとも１つのレシービングゾーンを含み、
前記レシービングゾーンが、好ましくは金、プラチナによりコーティングされるか、または少なくとも１つの炭素−炭素二重結合もしくは炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基を含む少なくとも１つの基材である、
生体試料中の少なくとも１つの標的核酸を検出するためのキットに関する。
【００３９】
本発明はさらに、配列番号１、配列番号４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４０および配列番号４１の配列から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。
【００４０】
本発明はさらに、生体試料中の少なくとも１つの標的核酸を検出するための、上記のオリゴヌクレオチドの使用もしくは修飾オリゴヌクレオチドの使用、または上記のグラフト化基材の使用に関する。
【００４１】
本発明の一実施形態に従って、前記使用は、ウイルス株（好ましくは、ＨＣＶ、デングまたは西ナイルウイルス）の診断または遺伝子型決定を可能にする。
【００４２】
本発明の有利性は、
−チオール官能基を保有する本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、作製に要するコストが高価ではない、
−本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、金表面に、または少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基を含む表面に安定に固定できる、
−核酸の検出、シーケンシングおよび／または遺伝子型決定のための方法における本発明の修飾オリゴヌクレオチドの使用は、数百のヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列を特異的に検出可能にする、
−本発明の修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、検出のより優れた感度および特異性を有しながら、公知の検出方法および／または遺伝子型決定において使用されるプローブより有利に短い、
である。
【００４３】
本発明の他の特長および有利性は、下記の本発明の好ましい実施形態の説明、所与の実施例を読み、添付の図面を参照することにより明らかになると思われる。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、化合物（Ｉ）の合成方法を説明する概略図を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、化合物（Ｉａ）から出発する、本発明の化合物のオリゴマーの合成方法を説明する概略図を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、化合物（Ｉｂ）から出発する、本発明の化合物のオリゴマーの合成方法を説明する概略図を示す。
【図３】図３は、その５’末端において（Ｉ）のオリゴマーによりグラフト化されたオリゴヌクレオチド化合物（ＸＩＩｃ）の合成方法を説明する概略図を示す。
【図４】図４は、その３’末端において（Ｉ）のオリゴマーによりグラフト化されたオリゴヌクレオチド化合物（ＸＩＩＩｃ）の合成方法を表す概略図を示す。
【図５】図５は、修飾オリゴヌクレオチドの金表面におけるグラフト率のヒストグラムを示す。
【図６】図６は、修飾オリゴヌクレオチドの金表面へのグラフティングの安定性を、６０℃における時間の関数として表すグラフを示す。
【図７】図７は、修飾オリゴヌクレオチドの金表面へのグラフティングの安定性を、８０℃における時間の関数として表すグラフを示す。
【図８】図８は、タイプ３ａのテトラチオールプローブにより実施された、蛍光検出によるＥＬＯＳＡ試験の結果のグラフを示す。
【図９】図９は、タイプ３ａのテトラチオールプローブにより実施された、蛍光検出によるＥＬＯＳＡ試験の結果のグラフを示す。
【図１０】図１０は、タイプ１ａ／１ｂのテトラチオールプローブにより実施された、蛍光検出によるＥＬＯＳＡ試験の結果のグラフを示す。
【図１１】図１１は、１、２、４、６または８つのチオール基を保有するタイプ１ａ／１ｂのプローブにより実施された、蛍光検出によるＥＬＯＳＡ試験の結果のグラフを示す。
【図１２】図１２は、異なるグラフト密度においてタイプ１ａ／１ｂのモノチオールプローブにより実施された、蛍光検出によるＥＬＯＳＡ試験の結果のグラフを示す。
【図１３】図１３は、異なるグラフト密度においてタイプ１ａ／１ｂのジチオールプローブにより実施された、蛍光検出によるＥＬＯＳＡ試験の結果のグラフを示す。
【図１４】図１４は、異なるグラフト密度においてタイプ１ａ／１ｂのテトラチオールプローブにより実施された、蛍光検出によるＥＬＯＳＡ試験の結果のグラフを示す。
【図１５】図１５は、金表面にグラフトされたテトラチオールプローブによる、プローブ／標的のハイブリダイゼーション試験の結果のグラフを示す。
【図１６ａ】図１６ａは、本発明に係る修飾オリゴヌクレオチドと、活性化されたアルケニルまたはアルキニル基によるグラフト化表面との間の反応式を示す。
【図１６ｂ】図１６ｂは、本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドと、光（λ＝２６５ｎｍ）により活性化されたアルケニルまたはアルキニル基によるグラフト化表面との間の反応式を示す。
【図１７】図１７は、タイプ１ａ／１ｂのテトラチオールＨＣＶプローブにより実施された、蛍光検出によるＥＬＯＳＡ試験の結果のグラフを示す。
【図１８】図１８は、タイプ２ａ／２ｃおよび／２ｂの２つのテトラチオールＨＣＶプローブの混合物により実施された、蛍光検出によるＥＬＯＳＡ試験の結果のグラフを示す。
【図１９】図１９は、タイプ３ａのテトラチオールＨＣＶプローブにより実施された、蛍光検出によるＥＬＯＳＡ試験の結果のグラフを示す。
【図２０】図２０は、タイプ４ａ／４ｄのテトラチオールＨＣＶプローブにより実施された、蛍光検出によるＥＬＯＳＡ試験の結果のグラフを示す。
【図２１】図２１は、フラビウイルスに包括的なテトラチオールプローブにより実施された、蛍光検出によるＥＬＯＳＡ試験の結果のグラフを示す。
【図２２】図２２は、デングの血清型４に特異的なテトラチオールプローブにより実施された、蛍光検出によるＥＬＯＳＡ試験の結果のグラフを示す。
【図２３】図２３は、西ナイルウイルスに包括的なテトラチオールプローブにより実施された、蛍光検出によるＥＬＯＳＡ試験の結果のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
本出願は、ホスホラミダイト、Ｈ−ホスホネート構造の化合物、または固体支持体に結合された化合物であって、保護されたチオール官能基を有する化合物の調製を記載する。これらのチオール化合物は、本発明に係る修飾オリゴヌクレオチドを形成するために、オリゴヌクレオチド内への導入が意図される。このようにして得られた修飾オリゴヌクレオチドは、いくつかのチオール官能基を有し得る。
【００４６】
したがって、本発明は、下記の方法によって得られ、２から１２のチオール官能基を含む修飾オリゴヌクレオチドに関する。本発明はさらに、生体試料中の少なくとも１つの標的核酸を検出するための、これらの修飾オリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００４７】
［チオール化合物］
チオール化合物は、本発明の修飾オリゴヌクレオチド内への導入が意図され、下記の式（Ｉ）：
【００４８】
【化５】
2015514402.tif 000006
【００４９】
（式中、
Ｔは、−Ｏ−Ｐ（ＯＲ１）Ｎ（Ｒ２）２、−Ｏ−ＰＨ（Ｏ）Ｏ−、−ＯＣ（Ｏ）ＪＣ（Ｏ）ＮＨ−□から選択される基であり、
・Ｒ１は、２−シアノエチル、Ｒ’１Ｒ’２Ｒ’３ＳｉＣＨ２ＣＨ２および基Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３から選択され、Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３は、同一であっても、または異なっていてもよく、直鎖もしくは分岐鎖の、１から１２の炭素原子を有するアルキル基およびＣ６−Ｃ１２アリール基から選択され、
・Ｒ２は、直鎖もしくは分岐鎖の、１から１２の炭素原子を含むアルキル基、ピロリジンから選択され、
・Ｊは、単結合、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＯＣＨ２−、Ｐｈがベンジルである−ＣＨ２ＯＰｈＯＣＨ２−の基から選択され、
・□は、固体支持体を表し、
Ｄは、アルコールの保護基であり、
Ｗは、Ｃ１−Ｃ１２アルカントリイル基、Ｃ６−Ｃ１８アリールトリイル基およびＣ６−Ｃ１８アラルカン（ａｒａｌｋａｎｅ）トリイル基から選択され、
Ｚは、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ１２ＮＣＯ−アルキル、Ｃ１−Ｃ１２ＣＯＮ−アルキルから選択され、
Ｙは、直鎖または分岐鎖の、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基から選択され、
Ｘは、直鎖または分岐鎖の、Ｃ１−Ｃ１２アルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル基、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ基、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル基、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル基から選択され、
Ｒは、Ｃ１−Ｃ１２アシル、Ｃ１−Ｃ１２Ｓ−アルキル、Ｃ６−Ｃ１２Ｓ−アリール、Ｓ−２−ピリジン、酸素含有または窒素含有Ｃ１−Ｃ１２Ｓ−ヘテロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２Ｓ−シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２Ｓ−シクロヘテロアルキル基から選択される。）
に対応する。
【００５０】
本発明の意味の範囲内で、「アルカントリイル」は、１以上のアルキル基により場合により置換されている直鎖、分岐鎖または環状の、アルカントリイルを意味する。本発明に従った化合物中に存在できるアリールトリイル基としては、ベンゼントリイルおよびナフタレントリイルを挙げることができる。アラルカン（ａｒａｌｋａｎｅ）基としては、１，３，５−トリメチルベンゼントリイルおよびトリメチルナフタレントリイルを挙げることができる。
【００５１】
化合物（Ｉ）は、下記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（Ｉｃ）に対応する亜化合物（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（Ｉｃ）に分けることができ、式中、パラメーターＸ、Ｙ、Ｚ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＤは、上記の式（Ｉ）と同じ定義を有する：
【００５２】
【化６】
2015514402.tif 000007
【００５３】
好ましくは、Ｒ１は、２−シアノエチルおよびＲ’１Ｒ’２Ｒ’３ＳｉＣＨ２ＣＨ２基から選択され、
Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３は同一であっても、または異なっていてもよく、直鎖または分岐鎖の、１から６の炭素原子を含むアルキル基およびフェニルから選択される基を表し、
好ましくはＲ１は、２−シアノエチルおよびＲ’１Ｒ’２Ｒ’３ＳｉＣＨ２ＣＨ２基から選択され、
Ｒ’１、Ｒ’２、Ｒ’３は同一であっても、または異なっていてもよく、直鎖または分岐鎖の、１から３の炭素原子を含むアルキル基およびフェニルから選択される基を表し、
さらにより好ましくは、Ｒ１は、２−シアノエチル、２−（トリメチルシリル）エチル、２−（トリフェニルシリル）エチル、２−（ジフェニルメチルシリル）エチル基から選択される。
【００５４】
好ましくは、Ｒ２は、直鎖または分岐鎖の、１から６の炭素原子を含むアルキル基から選択される。好ましくは、Ｒ２は、イソプロピル基（ｉＰｒ）を表す。
【００５５】
好ましくは、固体支持体は、樹脂、特にポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、セルロース、ポリエチレン、ポリエステル、ラテックス、ポリアミド、ポリジメチルアクリルアミドで構成される樹脂、合成または天然の親水性ポリマー、ガラスビーズ、シリカゲルから選択される。
【００５６】
好ましくは、Ｗは、Ｃ１−Ｃ６アルカントリイル基、Ｃ６−Ｃ１２アリールトリイル基、Ｃ６−Ｃ１２アラルカン（ａｒａｌｋａｎｅ）トリイル基から選択され、より好ましくは、ＣＨ、ＣＣＨ３、ＣＣＨ２ＣＨ３、シクロヘキサントリイルおよびベンゼントリイル基から選択される。
【００５７】
好ましくは、Ｄは、化合物（Ｉ）の他の基に対して直交脱保護（orthogonal deprotection）が可能なアルコールの保護基から選択される。より詳細には、Ｄは、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、９−フェニルキサンテン−９−イル（ピキシル（ｐｉｘｙｌ））またはフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）から選択される。ピキシル保護基は、特に、文献Chattopadhyaya and Reese, Chem. Soc. Chem. Comm., 1978年, 639-640頁に記載されている。アルコールの別の保護基候補は、ｔｅｒｔ−ブチル−ジメチルシリル基であり、およびこの場合ポリスチレン支持体が特に好ましいと思われる。
【００５８】
好ましくは、Ｚは、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ６ＮＣＯ−アルキル、Ｃ１−Ｃ６ＣＯＮ−アルキル基から選択される。
【００５９】
好ましくは、Ｙは、直鎖または分岐鎖の、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基から選択される。
【００６０】
好ましくは、Ｘは、直鎖または分岐鎖の、Ｃ１−Ｃ６アルキル基、Ｃ１−Ｃ６アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ６シクロヘテロアルキル基から選択される。
【００６１】
好ましくは、Ｒは、Ｃ１−Ｃ１２アシル、Ｃ１−Ｃ６Ｓ−アルキル、Ｃ６Ｓ−アリール、酸素含有または窒素含有Ｃ６Ｓ−ヘテロアルキル、Ｃ６Ｓ−シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ６Ｓ−シクロヘテロアルキル基から選択される。
【００６２】
一実施形態に従って、直鎖または分岐鎖のアルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、イソプロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルの基から選択される。
【００６３】
一実施形態に従って、アミノアルキルは、１以上の窒素原子を含む、アミノメチル、アミノエチル、アミノプロピル、アミノブチル、アミノペンチル、アミノヘキシル、アミノヘプチル、アミノオクチル、アミノノニル、アミノデシル、アミノウンデシル、アミノドデシル、アミノイソプロピル、アミノイソブチル、アミノ−ｔｅｒｔ−ブチルの基から選択される。
【００６４】
一実施形態に従って、アルコキシは、１以上の酸素原子を含む、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、オキシブチルオキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、ヘプチルオキシ、オクチルオキシ、ノニルオキシ、デシルオキシ、ウンデシルオキシ、ドデシルオキシ、イソプロピルオキシ、イソブチルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシの基から選択される。
【００６５】
一実施形態に従って、シクロアルキルは、場合により１以上の不飽和を含み、３から１２の間の炭素原子、好ましくは６の炭素原子を含む環から選択される。
【００６６】
一実施形態に従って、シクロヘテロアルキルは、１以上の窒素原子および／または酸素原子により置換され、場合により、１以上の不飽和を含み、３から１２の間の炭素原子、好ましくは５の炭素原子および１個の窒素原子または酸素原子を含む環から選択される。
【００６７】
一実施形態に従って、ＮＣＯ−アルキルおよびＣＯＮ−アルキルは、アルキルが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、イソプロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルの基から選択される直鎖または分岐鎖のアルキル基であってよい基である。
【００６８】
一実施形態に従って、Ｒ２は、イソプロピル基（ｉＰｒ）である、および／またはＲ１はシアノエチル基である。
【００６９】
好ましい実施形態に従って、チオール化合物（Ｉａ）は、下記の式：
【００７０】
【化７】
2015514402.tif 000008
【００７１】
（式中、
ｎは、１から１２の間、好ましくは１から６の間の整数であり、
Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＤは、上記の（Ｉａ）と同じ定義を有する）
に対応する化合物（ＶＩ）である。
【００７２】
好ましくは、Ｒ２はイソプロピル基（ｉＰｒ）であり、Ｒ１はシアノエチル基である。
【００７３】
好ましくは、Ｒはアセチル基である。
【００７４】
好ましくは、Ｄは４，４’−ジメトキシトリチルである。
【００７５】
別の実施形態に従って、チオール化合物（Ｉａ）は、下記の式：
【００７６】
【化８】
2015514402.tif 000009
【００７７】
（式中、
ｎは、１から１２の間、好ましくは１から６の間の整数であり、
Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＤは、上記の式（Ｉａ）と同じ定義を有する）
に対応する化合物（ＶＩＩ）である。
【００７８】
好ましくは、Ｒ２はイソプロピル基（ｉＰｒ）であり、Ｒ１はシアノエチル基である。
【００７９】
好ましくは、Ｒはアセチル基である。
【００８０】
好ましくは、Ｄは４，４’−ジメトキシトリチルである。
【００８１】
一実施形態に従って、チオール化合物（Ｉｃ）は、下記の式：
【００８２】
【化９】
2015514402.tif 000010
【００８３】
（式中、
ｎは、１から１２の間、好ましくは１から６の間の整数であり、
Ｒおよび□は、上記の式（Ｉｃ）と同じ定義を有する）
に対応する化合物（ＶＩＩＩ）である。
【００８４】
好ましくは、Ｒはアセチル基である。好ましくは、Ｊはエチル基である。好ましくは、Ｄは４，４’−ジメトキシトリチルである。
【００８５】
一実施形態に従って、チオール化合物（Ｉａ）は、式：
【００８６】
【化１０】
2015514402.tif 000011
【００８７】
（式中、
ｎは、１から１２の間、好ましくは１から６の間の整数であり、
Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＤは、上記の式（Ｉａ）と同じ定義を有する）
の化合物（ＩＸ）である。
【００８８】
好ましくは、Ｒ２はイソプロピル基（ｉＰｒ）であり、Ｒ１はシアノエチル基である。
【００８９】
好ましくは、Ｒはアセチル基である。
【００９０】
好ましくは、Ｄは４，４’−ジメトキシトリチルである。
【００９１】
一実施形態に従って、チオール化合物（Ｉａ）は、式：
【００９２】
【化１１】
2015514402.tif 000012
【００９３】
（式中、
ｎは、１から１２の間、好ましくは１から６の間の整数であり、
Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＤは、上記の（Ｉａ）と同じ定義を有する）
の化合物（Ｘ）である。
【００９４】
好ましくは、Ｒ２はイソプロピル基（ｉＰｒ）であり、Ｒ１はシアノエチル基である。
【００９５】
好ましくは、Ｒはアセチル基である。
【００９６】
好ましくは、Ｄは４，４’−ジメトキシトリチルである。
【００９７】
好ましくは、Ｒ２はイソプロピル基（ｉＰｒ）であり、Ｒ１はシアノエチル基である。
【００９８】
一実施形態に従って、チオール化合物（Ｉａ）は、式：
【００９９】
【化１２】
2015514402.tif 000013
【０１００】
（式中、
ｎは、１から１２の間、好ましくは１から６の間の整数であり、
Ｒ、Ｒ１、Ｒ２およびＤは、上記の式（Ｉａ）と同じ定義を有する）
の化合物（ＸＩ）である。
【０１０１】
好ましくは、Ｒ２はイソプロピル基（ｉＰｒ）であり、Ｒ１はシアノエチル基である。
【０１０２】
好ましくは、Ｒはアセチル基である。
【０１０３】
好ましくは、Ｄは４，４’−ジメトキシトリチルである。
【０１０４】
［製造方法］
化合物（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（Ｉｃ）の製造方法を、図１の概略図に表す。
【０１０５】
化合物（Ｉａ）、（Ｉｂ）および（Ｉｃ）は、下記の式：
【０１０６】
【化１３】
2015514402.tif 000014
【０１０７】
（式中、Ｄ、Ｘ、Ｗ、Ｙ、ＺおよびＲは、チオール化合物（Ｉ）と同じ定義を有する）
を有する同じ化合物（ＩＩ）から得られる。
【０１０８】
式（Ｉａ）の化合物は、下記の式：
【０１０９】
【化１４】
2015514402.tif 000015
【０１１０】
に表された反応により、
または、好ましくはジイソプロピルアミンテトラゾリドの塩の存在下で、下記の式：
【０１１１】
【化１５】
2015514402.tif 000016
【０１１２】
に表された反応によって得ることができる。
【０１１３】
式（Ｉｂ）の化合物は、下記の式：
【０１１４】
【化１６】
2015514402.tif 000017
【０１１５】
（式中、ＱおよびＱ’は互いに独立して、置換または非置換のベンゼン基を表す）
に表された反応によって得ることができる。
【０１１６】
化合物（Ｉａ）または（Ｉｂ）を得るための前述の反応は、化合物（ＩＩ）から出発して、好ましくは塩基、例えばジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の存在下で、無水溶媒、例えば無水ジクロロメタン中で実施される。
【０１１７】
式（Ｉｃ）の化合物もまた、化合物（ＩＩ）から出発するが、好ましくは下記の式：
【０１１８】
【化１７】
2015514402.tif 000018
【０１１９】
に表される反応ステップに従う。
【０１２０】
化合物（Ｉｃ）を得るための前述の反応は、好ましくは無水溶媒、例えばピリジン中で、塩基、例えばトリエチルアミンの存在下で実施される。
【０１２１】
化合物（Ｉｃ）を、下記の反応式：
【０１２２】
【化１８】
2015514402.tif 000019
【０１２３】
に従って得ることもまた可能である。
【０１２４】
上記の式の化合物（ＩＩ）（式中、Ｘ、Ｗ、Ｚ、ＹおよびＲ基は、化合物（Ｉ）と同じ定義を有する）は、一実施形態に対応する。
【０１２５】
式（ＩＩ）の化合物は、化合物（ＩＩＩ）から下記の反応ステップ：
【０１２６】
【化１９】
2015514402.tif 000020
【０１２７】
（式中、Ｇはハロゲン、好ましくは臭素またはヨウ素である）
に従って得ることができる。
【０１２８】
上記の反応は、好ましくは、無水溶媒、例えば無水トルエン中で、クラウンエーテルの存在下で実施される。
【０１２９】
化合物（ＩＩＩ）は、化合物（ＩＶ）から、下記の反応ステップ：
【０１３０】
【化２０】
2015514402.tif 000021
【０１３１】
（式中、
ＧおよびＧ’はハロゲン原子であり、同一であっても、または異なっていてもよく、好ましくはＧおよびＧ’は臭素またはヨウ素原子であり、
Ｚ’は、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ１２ＮＣＯ−アルキル、Ｃ１−Ｃ１２ＣＯＮ−アルキル基であり、
Ｚ”は、Ｃ１−Ｃ１２の直鎖または分岐鎖アルキル、Ｃ１−Ｃ１２アミノアルキル、Ｃ１−Ｃ１２アルコキシ、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル、酸素含有または窒素含有Ｃ３−Ｃ１２シクロヘテロアルキル、Ｃ１−Ｃ１２ＮＣＯ−アルキル、Ｃ１−Ｃ１２ＣＯＮ−アルキル基であり、
ジハロゲン化化合物Ｇ−Ｚ”−Ｇ’は、化合物（ＩＶ）のＺ’基と反応して、化合物（ＩＩＩ）のＺ−Ｇ基の形成をもたらすことが意図される）
に従って得ることができる。
【０１３２】
化合物（ＩＩＩ）を得るステップは、好ましくはアルカリ金属水素化物、例えばＮａＨの存在下で実施される。
【０１３３】
化合物（ＩＶ）は、市販の化合物（Ｖ）から、下記の反応ステップ：
【０１３４】
【化２１】
2015514402.tif 000022
【０１３５】
に従ってアルコール官能基の保護によって得ることができる。
【０１３６】
アルコール官能基の保護のこのステップは、当業者に周知の条件下で、Ｄの選択に依存して実施される。
【０１３７】
一実施形態に従って、化合物（ＩＶ）は、化合物（Ｖ）からアルコール官能基を保護するために好ましくは溶媒、例えばピリジン中で、４，４’−ジメトキシトリチル塩化物（ＤＭＴｒ−Ｃｌ）との反応により、得られる。
【０１３８】
別の実施形態に従って、化合物（ＩＶ）は、化合物（ｖ）から、９−フェニルキサンテン−９−イル塩化物（ピキシル−Ｃｌ）から出発して、文献Chattopadhyaya and Reese, Chem. Soc. Chem. Comm., 1978年, 639-640頁に記載の条件下で得られる。
【０１３９】
別の実施形態に従って、化合物（ＩＶ）は、化合物（Ｖ）から、当業者に周知の条件下でフルオレニルメトキシカルボニル塩化物（Ｆｍｏｃ−Ｃｌ）との反応により得られる。
【０１４０】
上記の式（ＩＩ）から（Ｖ）において、Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚ、Ｄ、Ｒ、Ｒ１、Ｒ２は、上記の化合物（Ｉ）の定義と同じ定義を有する。
【０１４１】
好ましくは、出発化合物（Ｖ）は、１，１，１−トリス（ヒドロキシメチル）エタンまたは２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオン酸または１，３，５−トリス（ヒドロキシエトキシ）ベンゼンまたは１，３，５−トリス（ヒドロキシメチル）シクロヘキサンまたは２−アミノ−１，３−プロパンジオールである。
【０１４２】
［チオール化合物のオリゴマー］
オリゴマーは、上記の式（Ｉ）のチオール化合物から形成することができる。これらのオリゴマーの合成方法は、式（Ｉａ）の化合物のオリゴマー化に関しては図２Ａの略図に、式（Ｉｂ）の化合物のオリゴマー化に関しては図２Ｂの略図に記載する。
【０１４３】
第１のステップにおいて、化合物（Ｉｃ）のアルコール官能基を、化合物（Ｉｃ．１）を得るために脱保護させる。この脱保護ステップは、当業者に周知の手段により、好ましくは、ＤＭＴｒおよびＰｉｘｙｌ基に関してはジ−またはトリクロロ酢酸の存在下で、およびＦｍｏｃ基に関してはピペリジンの存在下で実施される。
【０１４４】
【化２２】
2015514402.tif 000023
【０１４５】
次いで、化合物（Ｉｃ．１）を化合物（Ｉａ）または（Ｉｂ）と反応させ、それぞれ、化合物亜リン酸トリエステル（ＸＩＶ’）１またはＨ−ホスホネートジエステル（ＸＶ’）１を得る。
【０１４６】
【化２３】
2015514402.tif 000024
【０１４７】
次いで、化合物（ＸＩＶ’）１を、好ましくは２ヨウ素（diiodine）の存在下で酸化させ、この２ヨウ素をその後、亜リン酸トリエステル結合の酸素原子を供給する水により置き換え、リン酸トリエステル化合物（ＸＩＶ）１を得る。この酸化ステップは、化合物（ＸＩＶ）ｉと化合物（Ｉａ）との間の各カップリングステップ後に実施される。
【０１４８】
【化２４】
2015514402.tif 000025
【０１４９】
次いで、同じ方法において、化合物（ＸＩＶ）１を（ｋ−１）の化合物（Ｉａ）と反応させ、（ｋ−１）の酸化後、化合物（ＸＩＶ）ｋを得：
【０１５０】
【化２５】
2015514402.tif 000026
【０１５１】
化合物（ＸＶ’）１を、そのアルコール官能基において脱保護し、（ＸＶ”）１を得、これを（ｋ−１）の化合物（Ｉｂ）と反応させ、化合物（ＸＶ’）ｋを得る：
【０１５２】
【化２６】
2015514402.tif 000027
【０１５３】
次いで、化合物（ＸＶ’）ｋを、好ましくは２ヨウ素および水の存在下で酸化させ、リン酸ジエステル化合物（ＸＶ）ｋを得る。
【０１５４】
【化２７】
2015514402.tif 000028
【０１５５】
最終的に、任意選択の最終ステップは、化合物（ＸＩＶ）ｋまたは（ＸＶ）ｋの脱保護から成り、同じ化合物（Ｉ）ｋを得る。
【０１５６】
【化２８】
2015514402.tif 000029
【０１５７】
好ましくは、オリゴマーは、２から１２の化合物（Ｉ）、特に２から８の間の化合物（Ｉ）のオリゴマー化からもたらされる、すなわち、このオリゴマーは、２、３、４、５、６、７または８の化合物（Ｉ）を含み得る。好ましくは、金表面へのグラフトが意図されるチオールオリゴマーは、３から８、有利には４から８の化合物（Ｉ）を含み、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基を含む表面への連結が意図されるチオールオリゴマーは、有利には、２から６の化合物（Ｉ）を含む。
【０１５８】
一実施形態に従って、オリゴマーは、式（Ｉａ）の化合物または式（Ｉｂ）化合物から単独で作製可能である。オリゴマー化は、第１の化合物（Ｉ）の脱保護されたアルコール官能基と、第２の化合物（Ｉ）のホスホラミダイトまたはＨ−ホスホネート官能基との間の反応により実施される。
【０１５９】
化合物（Ｉａ）および化合物（Ｉｂ）の混合物から出発するオリゴマーの作製を想定することも可能であるが、この実施形態はあまり興味深くない。
【０１６０】
好ましくは、オリゴマーは、ホスホラミダイトの化学的性質を利用して、すなわち、タイプ（Ｉａ）の化合物のオリゴマー化により作製される。
【０１６１】
オリゴマー化は、固体支持体上、または溶液中で実施可能である。好ましくは、オリゴマー化は、固体支持体上で実施される。実際に、溶液中のオリゴマー化は、特に、診断応用に必要な少量のために経済的には採算の合わないクロマトグラフィーによる精製ステップを伴う。
【０１６２】
化合物（Ｉａ）のオリゴマーまたは化合物（Ｉｂ）のオリゴマーによるグラフト化固体支持体は、下記の式（ＸＶＩ）ｋ：
(Ic)-(I’)k        （ＸＶＩ）ｋ
（式中、
ｋは、１から１１の整数を表し、
（Ｉｃ）は、上記と同じ意味を有し、
（Ｉ’）は、（Ｉ’ａ）または（Ｉ’ｂ）：
【０１６３】
【化２９】
2015514402.tif 000030
【０１６４】
を表す）
に対応する。
【０１６５】
化合物（Ｉｃ）および式（Ｉａ）の化合物から形成された固体支持体上のオリゴマーは、下記の式（ＸＩＶ）ｋ：
【０１６６】
【化３０】
2015514402.tif 000031
【０１６７】
（式中、Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚ、Ｊ、ＲおよびＲ１は、上記と同じ定義を有し、ＲはさらにＨを表してもよく、ｋは、１から１１の間の整数である）
に対応する。
【０１６８】
化合物（Ｉｃ）および式（Ｉｂ）の化合物から形成された固体支持体上のオリゴマーは、下記の式（ＸＶ）ｋ：
【０１６９】
【化３１】
2015514402.tif 000032
【０１７０】
（式中、Ｄ、Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚ、ＪおよびＲは、上記と同じ定義を有し、ＲはさらにＨを表してもよく、ｋは、１から１１の間の整数である）
に対応する。
【０１７１】
オリゴマーが、化合物（Ｉｃ）および化合物（Ｉｂ）から出発して、固体支持体上に形成される場合、得られた化合物（ＸＶ）ｋは、化合物（ＸＩＶ）ｋと同じ式に対応するが、Ｈ−ホスホネートジエステル結合の酸化後、Ｒ１は水素原子である。
【０１７２】
オリゴマー化反応の終わりに、既存の方法によるチオール官能基の脱保護が想定され、その後ＲはＨを表す。
【０１７３】
［修飾オリゴヌクレオチド］
本発明の対象は、上記のような、少なくとも１０のヌクレオチドおよび少なくとも２のチオール化合物（Ｉ）を含む修飾オリゴヌクレオチドに関する。
【０１７４】
本出願において、オリゴヌクレオチドという用語は、４から１００のヌクレオチドを含む鎖を表す。
【０１７５】
本発明に従ったチオール化合物は、鎖の３’位、またはオリゴヌクレオチドの５’位にグラフトされる。
【０１７６】
前記修飾オリゴヌクレオチドの調製方法は、少なくとも：
−化合物（Ｉ）をオリゴヌクレオチド上にグラフトして、５’−チオールオリゴヌクレオチドを得るステップ、または
−化合物（Ｉ）のオリゴマー上にヌクレオチドをグラフトして、３’−チオールオリゴヌクレオチドを得るステップ、
を含む。
【０１７７】
一実施形態に従って、グラフト化オリゴヌクレオチドは、下記の式（ＸＩＩａ）：
□-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’)y-(M1-…-Mm-1-Mm)p-(I’)y’      （ＸＩＩａ）
（式中、
Ｎ１、…Ｎｎは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ１、…Ｍｍは、互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
（Ｉ’）は、式（Ｉ’ａ）または（Ｉ’ｂ）の化合物を表し、
ｎは、４から１００の範囲の整数であり、
ｍは、４から１００の範囲の整数であり、
ｙは、２から１２の範囲の整数であり、
ｐは、０または１を表し、
ｙ’は、ｐが値１を有する場合、０から１２の範囲の整数であり、ｐが値０を有する場合、ｙ’は０に等しく、
整数（ｙ＋ｙ’）の合計は１２を超えることがなく、
□は固体支持体をあらわす）
に対応する。
【０１７８】
修飾オリゴヌクレオチド（ＸＩＩａ）は、オリゴヌクレオチドＮの５’位またはヌクレオチド鎖に、２以上のチオール化合物を有する。修飾オリゴヌクレオチド（ＸＩＩａ）は、化合物（Ｉ）をグラフトし、その後、オリゴヌクレオチドの５’位における（Ｉ）から得られたオリゴマーを伸長することによって得られる。次いで、ｐ＝１の場合、ヌクレオチド鎖の伸長を継続する。次いで、同じ方法で、１以上の追加の化合物（Ｉ）を、オリゴヌクレオチドＭの５’位へのグラフティングを、想定することができる。
【０１７９】
化合物（ＸＩＩａ）を得るための略図を、図３に記載するが、ここでチオール化合物はタイプ（Ｉａ）であり、ｐは０に等しい。化合物（ＸＩＩａ）の調製の最初の３ステップにより、オリゴヌクレオチドの合成が可能である。オリゴヌクレオチドは、固体支持体上に、当業者に周知の方法により合成される。第１のステップにおいて、第１のヌクレオチドを固体支持体にグラフトし、次いで、他のヌクレオチドを、当業者に周知の合成方法によりグラフトさせる。下記の化合物が得られる：
【０１８０】
【化３２】
2015514402.tif 000033
【０１８１】
その後、別のヌクレオチドを、同じ方法によりグラフトし、式（ＸＩＩａ．２）の化合物を得る。
【０１８２】
次のステップにおいて、上記のチオール化合物タイプ（Ｉａ）を、オリゴヌクレオチド（ＸＩＩａ．２）の５’位にグラフトし、化合物（ＸＩＩａ．３）を得る：
-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’a)        （ＸＩＩａ．３）
【０１８３】
このステップにおいて、グラフティングは、化合物（Ｉａ）のホスホラミダイト官能基と、化合物（ＸＩＩａ．２）の末端ヌクレオチドの５’位のアルコール官能基との反応により、従来通りに実施される。
【０１８４】
図３の概略図において、合成例は、タイプ（Ｉａ）のチオール化合物のオリゴマー化により記載しているが、同様の合成方法は、タイプ（Ｉｂ）のチオール化合物により修飾されたオリゴヌクレオチドの合成にも使用される。
【０１８５】
その後、前記のオリゴマー化、特に図２Ａおよび図２Ｂに記載のオリゴマー化を、上記の化合物（ＸＩＩａ．３）から出発して実施し、１以上の化合物（Ｉａ）または（Ｉｂ）との反応により、式：
□-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’a)y
の化合物（ＸＩＩａ．４）
または構造式（ｐ＝０の場合）：
【０１８６】
【化３３】
2015514402.tif 000034
【０１８７】
（式中、
Ｄ、Ｒ、Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚ、Ｒ１は、化合物（Ｉ）と同じ定義を有し、Ｒ１はさらにＨを表してもよく、
ｎ、ｙおよびＮ１、Ｎ２、…Ｎｎ−１は、化合物（ＸＩＩａ）と同じ定義を有し、
Ｂｎは、ヌクレオチド鎖に従来通り使用される塩基を表す）
を得る。
【０１８８】
オリゴマーの伸長がタイプ（Ｉｂ）の化合物により実施される場合、修飾オリゴヌクレオチドは、修飾オリゴヌクレオチド（ＸＩＩａ．４）と類似の構造を有するが、Ｒ１はＨを表す。
【０１８９】
その後、ヌクレオチド化合物Ｍ１、Ｍ２、…Ｍｍを続けてグラフティングすることが可能であり、ｐ＝１の生成物（ＸＩＩａ）が得られる。これらの場合も、固体支持体上においてさらに伸長が起こる。
【０１９０】
このグラフトステップは、当業者に周知の方法により、従来通り実施される。
【０１９１】
別の実施形態では、グラフト化オリゴヌクレオチドは、下記の式（ＸＩＩＩａ）：
(Ic)-(I’)y-1-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’)y’-[M1-M2-…-Mm-1-Mm]p-(I’)y”  （ＸＩＩＩａ）
（式中、
Ｎ１、…Ｎｎは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ１、…Ｍｍは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
（Ｉ’）は、式（Ｉ’ａ）または（Ｉ’ｂ）の化合物を表し、
ｎは、４から１００の範囲の整数であり、
ｍは、４から１００の範囲の整数であり、
ｙは、２から１２の範囲の整数であり、
ｙ’は、２から１２の範囲の整数であり、
ｐは、ｙ’が０でなければ値０または１を有し、ｙ’が値０を有する場合、その時ｐは値０を有し、
ｙ”は、ｐが値１を有する場合０から１２の範囲の整数であり、ｐが値０を有する場合、その時ｙ”は０を有し、
整数（ｙ＋ｙ’＋ｙ”）の合計は１２を超えることはない）
に対応する。
【０１９２】
Ｊがエチル基であるタイプ（Ｉｃ）の化合物およびタイプ（Ｉｂ）の化合物から形成されるオリゴマーを使用する、化合物（ＸＩＩＩｃ）の合成方法を表す略図を図４に記載する。
【０１９３】
式（ＸＩＩＩｃ）の化合物の合成は、式（Ｉ）の本発明に従ったチオール化合物のオリゴマー化からなる第１のステップを含み、そのための方法は上に記載しており、式（ＸＩＩＩａ．１）：
(Ic)-(I’)y-1          （ＸＩＩＩａ．１）
（式中、
（Ｉｃ）は、前述と同じ定義を有し、
（Ｉ’）は、タイプ（Ｉ’ａ）または（Ｉ”ｂ）の基を表し、
【０１９４】
【化３４】
2015514402.tif 000035
【０１９５】
である）
または
（Ｉ’）が（Ｉ”ｂ）を表す場合の構造式として、
【０１９６】
【化３５】
2015514402.tif 000036
【０１９７】
の化合物をもたらす。
【０１９８】
第２のステップにおいて、第１のヌクレオチドＮ１を式（ＸＩＩＩａ．１）のオリゴマーにグラフトし、下記の式（ＸＩＩＩａ．２）：
(Ic)-(I’)y-1-N1          （ＸＩＩＩａ．２）
の化合物を得る。
【０１９９】
このグラフトステップは、化合物（ＸＩＩＩａ．１）のオリゴマー鎖の末端の脱保護されたアルコール官能基と、第１のヌクレオチドＮ１のホスホラミダイトまたはＨ−ホスホネート官能基との間の反応により実施される。
【０２００】
修飾オリゴヌクレオチドは、次いで、当業者に公知の任意の方法、特に、チオール化合物のオリゴマー上に存在する第１のヌクレオチドの５’のアルコール官能基と、第２のヌクレオチドの３’位のホスホラミダイトまたはＨ−ホスホネート官能基との間の反応による、当業者に周知の従来どおりの方法により合成される。合成を、当業者に周知のヌクレオチド鎖の伸長の同様の連続ステップにより継続し、式（ＸＩＩＩａ）の化合物を得る。      
【０２０１】
したがって、本発明の主題は、修飾オリゴヌクレオチドを固体支持体に結び付ける結合の切断後の、上記の式（ＸＩＩａ）および（ＸＩＩＩａ）の化合物から得られる化合物に関する。結合の切断は、エステル官能基のレベルにおいて起こる。
【０２０２】
したがって、本発明の一実施形態に従って、本発明の支持されていない修飾オリゴヌクレオチドは、下記の構造（ＸＩＩｂ）：
N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’b)y-(M1-…-Mm-1-Mm)p-(I’b)y’      （ＸＩＩｂ）
（式中、
Ｎ１、…Ｎｎは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ１、…Ｍｍは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
（Ｉ’ｂ）は、上で定義された式の化合物を表し、
ｎは、４から１００の範囲の整数であり、
ｍは、４から１００の範囲の整数であり、
ｙは、２から１２の範囲の整数であり、
ｐは、０または１を表し、
ｙ’は、ｐが値１を有する場合、０から１２の範囲の整数であり、ｐが値０を有する場合、ｙ’は０に等しく、
整数（ｙ＋ｙ’）の合計は１２を超えることはない）
を有する。
【０２０３】
支持体の離脱は２ステップで実施される。まず、シアノエチル基が存在する場合（ホスホラミダイトの場合）その除去が非求核性強塩基（ピペリジンまたはＤＢＵ）により行われ、第２に、当業者に公知の従来の方法、好ましくは化合物（ＸＩＩａ）を水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）により処理することによって実施される。シアノエチル基はその除去の間にアクリロニトリルを形成し、アクリロニトリルはチオール官能基と強力に反応するので、チオール基の脱保護の前にシアノエチル基を除去することが必要である。
【０２０４】
本発明の別の実施形態に従って、支持されていない本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、下記の構造（ＸＩＩＩｂ）：
(Ic’)-(I’b)y-1-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I’b)y’-[M1-M2-…-Mm-1-Mm]p-(I’b)y”
（ＸＩＩＩｂ）
（式中、
Ｎ１、…Ｎｎは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ１、…Ｍｍは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
（Ｉｃ’）は、（Ｉｃ）から、固体支持体とのエステル結合を切断することによって得られる化合物を表し、好ましくは構造
（Ｉｃ’）
【０２０５】
【化３６】
2015514402.tif 000037
【０２０６】
を有し、
（Ｉ’ｂ）は上で定義された式の化合物を表し、
ｎは、４から１００の範囲の整数であり、
ｍは、４から１００の範囲の整数であり、
ｙは、２から１２の範囲の整数であり、
ｙ’は、０から１２の範囲の整数であり、
ｐは、ｙ’が０でなければ値０または１を有し、ｙ’が値０を有する場合、その時ｐは値０を有し、
ｙ”は、ｐが値１を有する場合０から１２の範囲の整数であり、ｐが値０を有する場合、その時ｙ”は値０を有し、
整数（ｙ＋ｙ’＋ｙ”）の合計は１２を超えることはない）
を有する。
【０２０７】
支持体の離脱は、当業者に公知の従来の方法、好ましくは化合物（ＸＩＩＩａ）を水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）により処理することによって実施される。
【０２０８】
本発明の一実施形態に従って、ｐ＝０の場合、修飾オリゴヌクレオチドは構造式（ＸＩＩｂ）：
【０２０９】
【化３７】
2015514402.tif 000038
【０２１０】
（式中、ｙ、Ｎ１、…、Ｎｎ−１、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＷおよびＲは上記と同じ定義を有し、Ｂｎは、ｎ番目のヌクレオチドの塩基を表す）
に対応する。
【０２１１】
本発明の別の実施形態に従って、ｐ＝０の場合、修飾オリゴヌクレオチドは、構造式（ＸＩＩＩｂ）：
【０２１２】
【化３８】
2015514402.tif 000039
【０２１３】
（式中、ｎ、ｙ、Ｎ２，…、Ｎｎ、Ｘ、Ｙ、Ｚ、ＷおよびＲは上記と同じ定義を有し、Ｂ１は、第１のヌクレオチドの塩基を表す。
に対応する。
【０２１４】
本発明はさらに、修飾オリゴヌクレオチド（ＸＩＩｃ）および（ＸＩＩＩｃ）に関し、それぞれ、化合物（ＸＩＩａ）および（ＸＩＩＩａ）から出発して、チオール官能基の脱保護および化合物と支持体とを結ぶ結合の切断により得られる（それぞれ、図３および４）。
【０２１５】
オリゴヌクレオチドが、１以上のタイプ（Ｉａ）のチオール化合物により修飾される場合、当業者に公知の処理によるチオール官能基および化合物（ＸＩＩａ）のホスホラミダイトの脱保護後、式（ＸＩＩｃ）：
N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I”)y-(M1-…-Mm-1-Mm)p-(I”)y’      （ＸＩＩｃ）
（式中、
Ｎ１、…Ｎｎは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ１、…Ｍｍは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
【０２１６】
【化３９】
2015514402.tif 000040
【０２１７】
であり、
ｎは、４から１００の範囲の整数であり、
ｍは、４から１００の範囲の整数であり、
ｙは、２から１２の範囲の整数であり、
ｐは、０または１を表し、
ｙ’は、ｐが値１を有する場合、０から１２の範囲の整数であり、ｐが値０を有する場合、ｙ’は０に等しく、
整数（ｙ＋ｙ’）の合計は１２を超えることはない）
の化合物
またはｐ＝０の場合、構造式：
【０２１８】
【化４０】
2015514402.tif 000041
【０２１９】
（式中、
Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚ、Ｒ１は化合物（Ｉ）と同じ定義を有し、
Ｎ１、…Ｎｎ、ｎ、ｙは、化合物（ＸＩＩａ）と同じ定義を有し、
Ｂｎは、ヌクレオチド鎖中に従来通り使用される塩基を表す）
の化合物を得る。
【０２２０】
オリゴヌクレオチドが、１以上のタイプ（Ｉｂ）のチオール化合物により修飾される場合、当業者に公知の処理による化合物（ＸＩＩＩａ）のチオール官能基の脱保護後、式（ＸＩＩＩｃ）：
(Ic’)-(I’)y-1-N1-N2-…-Nn-1-Nn-(I”)y’-[M1-M2-…-Mm-1-Mm]p-(I”)y”  （ＸＩＩＩｃ）
（式中、
Ｎ１、…Ｎｎは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
Ｍ１、…Ｍｍは互いに独立して、ヌクレオチドを表し、
（Ｉｃ’）は、（Ｉｃ）から、固体支持体とのエステル結合を切断することによって得られる化合物を表し、
【０２２１】
【化４１】
2015514402.tif 000042
【０２２２】
であり、
ｎは、４から１００の範囲の整数であり、
ｍは、４から１００の範囲の整数であり、
ｙは、２から１２の範囲の整数であり、
ｙ’は、２から１２の範囲の整数であり、
ｐは、ｙ’が０でなければ値０または１を有し、ｙ’が値０を有する場合、その時ｐは値０を有し、
ｙ”は、ｐが値１を有する場合０から１２の範囲の整数であり、ｐが値０を有する場合、その時ｙ”は値０を有し、
整数（ｙ＋ｙ’＋ｙ”）の合計は１２を超えることはない）
の化合物；
またはｙ’＝ｐ＝０の場合、構造式：
【０２２３】
【化４２】
2015514402.tif 000043
【０２２４】
（式中、
Ｘ、Ｙ、Ｗ、Ｚは、化合物（Ｉ）と同じ定義を有し、
Ｎ２、…Ｎｎ、ｎおよびｙは、化合物（ＸＩＩａ）と同じ定義を有し、
Ｂｎは、ヌクレオチド鎖中に従来通り使用される塩基に対応する）
の化合物を得る。
【０２２５】
オリゴヌクレオチドの合成の間に、チオール官能基は保護されることが好ましい。実際に、チオール官能基は、入ってくるホスホラミダイト官能基と反応可能である。
【０２２６】
チオール官能基の脱保護および固体支持体の除去のステップは、修飾オリゴヌクレオチド（ＸＩＩａ）または（ＸＩＩＩａ）の単一ステップ処理で実施することができる。
【０２２７】
さらに、固体支持体の除去、第１のステップにおいて実施することができ、チオール官能基の脱保護は、その後第２のステップにおいて実施することができる。
【０２２８】
最終オリゴヌクレオチド（ＸＩＩｃ）（それぞれ、最終オリゴヌクレオチド（ＸＩＩＩｃ））は、出発チオール化合物とは独立して、化合物（Ｉａ）から出発しても、または化合物（Ｉｂ）から出発しても得られる。実際、モノマー（Ｉａ）または（Ｉｂ）のいずれを使用するかに関わりなく、オリゴマー化反応から得られるチオールモノマー単位は、上記の化合物（Ｉ”）に対応する。
【０２２９】
上記の式（ＸＶＩ）ｋのグラフト化支持体は、オリゴヌクレオチドの合成開始を可能にする。オリゴヌクレオチドの３’位において、ポリチオール配列として使用されるオリゴマーの配列によりグラフト化された固体支持体の工業的または半工業的調製が、特に想定可能である。
【０２３０】
本発明の一実施形態に従って、上記のような本発明の修飾オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列（Ｎ１−Ｎ２−…−Ｎｎ−１−Ｎｎ）および、場合によりヌクレオチド配列（Ｍ１−Ｍ２−…−Ｍｍ−１−Ｍｍ）は、疾患の原因である、または疾患に関与する、ウイルス、細菌または遺伝子に特異的である。
【０２３１】
本出願の意味の範囲内で、「特異的」は、配列（Ｎ１−Ｎ２−…−Ｎｎ−１−Ｎｎ）および場合により配列（Ｍ１−Ｍ２−…−Ｍｍ−１−Ｍｍ）が、ウイルスまたは細菌の遺伝子またはゲノムに含まれる少なくとも１つの標的核酸配列の全体もしくは一部に相補的であり、後者に特徴的であることを意味する。したがって、配列（Ｎ１−Ｎ２−…−Ｎｎ−１−Ｎｎ）および場合により配列（Ｍ１−Ｍ２−…−Ｍｍ−１−Ｍｍ）と、それに対応する標的配列の一部またはすべてとのハイブリダイゼーションが、多くても２の誤対合を有する核酸の二本鎖の形成をもたらすことが理解される。本発明の一実施形態において、「特異的」という用語は、形成された二本鎖がわずか１または２の誤対合を含むだけであることを表す。有利には、形成された二本鎖は、いずれの誤対合も含有しない。「ウイルスまたは細菌の遺伝子またはゲノムに特徴的な配列」は、固有の遺伝的変異のため、他の生物には見出されないヌクレオチドの配置を有する、生物、ウイルスまたは細菌のゲノム、染色体またはプラスミドの領域を意味する。
【０２３２】
本発明の文脈において、「修飾オリゴヌクレオチド」および「プローブ」という用語は同義的に使用され、４から１００ヌクレオチドを有し、上記のように少なくとも２つのチオール官能基を有するオリゴヌクレオチドを表す。有利には、遺伝子型決定に使用する場合、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、１３から２０のヌクレオチド、有利には１４または１５のヌクレオチドを含む。従って、プローブは、適切な表面、例えば金またはマレイミド基によりコーティングされた表面にグラフトすることができ、さらにそのヌクレオチド部分によって、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる。
【０２３３】
好ましくは、本発明の修飾オリゴヌクレオチドは、２から１２のチオール官能基、特に２から８の官能基を含み、すなわち、修飾オリゴヌクレオチドは、２、３、４、５、６、７または８の官能基を含むことができる。好ましくは、金表面へのグラフトが意図される修飾オリゴヌクレオチドは、３から８、有利には４から８のチオール官能基を含む。少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基を含む表面への連結が意図される修飾オリゴヌクレオチドは、有利には２から８のチオール官能基、好ましくは４つのチオール官能基を含む。
【０２３４】
本発明の文脈において使用される「標的配列」という用語は、本発明のプローブに相補的または部分的に相補的であり、ウイルスまたは細菌の、遺伝子またはゲノム、好ましくは後者に特徴的な領域から増幅される配列を表す。
【０２３５】
「ウイルス」という用語は、複製のために宿主細胞を必要とし、最低限核酸およびタンパク質を含み、さらに該核酸が一本鎖または二本鎖のＤＮＡおよび／またはＲＮＡであってよい生物学的実体を表す。ウイルスは、原核生物に寄生可能なウイルス（例えば、ミオウイルス科（Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ）、シホウイルス科（Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ）、ポドウイルス科（Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、ミクロウイルス科（Ｍｉｃｒｏｖｉｒｉｄａｅ）およびイノウイルス科（Ｉｎｏｖｉｒｉｄａｅ））、植物に寄生可能なウイルス（植物ウイルス、例えばタバモウイルス）、昆虫に寄生可能なウイルス（例えば、バキュロウイルス）、真菌およびヒトに寄生可能なウイルスを含む。本発明の文脈において、ウイルスはアルボウイルスをさらに含む。アルボウイルス群は、形態学的に異種のウイルスと一緒に、いくつかの異なる属、より詳細にはフラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）（フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ））、アルファウイルス（Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ）（トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ））、コルティウイルス（Ｃｏｌｔｉｖｉｒｕｓ）（レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ））、フレボウイルス（Ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）（ブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ  ｆａｍｉｌｙ））を含む属に属する。より広範囲には、フラビウイルス科は、特に、フラビウイルス属（黄熱病ウイルス、西ナイルウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス（ＴＢＥ）、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ウスツウイルスおよびデングウイルス）、へパシウイルス属（Ｈｅｐａｃｉｖｉｒｕｓ）（Ｃ型肝炎ウイルス）およびペスチウイルス属（Ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）（ウシウイルス性下痢症ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ  ｖｉｒａｌ  ｄｉａｒｒｈｏｅａ  ｖｉｒｕｓ）（ＢＶＤ）、ブタ熱ウイルス）を含む。トガウイルス科は、特に、アルファウイルス属（シンドビウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ）、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、オニョンニョンウイルス（Ｏ’ｎｙｏｎｇ’ｎｙｏｎｇ  ｖｉｒｕｓ）、チクングニヤウイルス（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ））およびルビウイルス属（Ｒｕｂｉｖｉｒｕｓ）（風疹ウイルス（Ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ））を含む。レオウイルス科は、特に、消化器系を侵すウイルス（例えばロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ））または呼吸器系を侵すウイルスを含む。ブニヤウイルス科は、特に、ハンタウイルス属（Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ）（ハンタウイルス肺症候群（Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、韓国型出血熱（Ｋｏｒｅａｎ  ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ））、ナイロウイルス属（Ｎａｉｒｏｖｉｒｕｓ）（ジュグベウイルス（Ｄｕｇｂｅ  ｖｉｒｕｓ））、オルソブニヤウイルス属（Ｏｒｔｈｏｂｕｎｙａｖｉｒｕｓ）（ブニヤムウェラウイルス（Ｂｕｎｙａｍｗｅｒａ  ｖｉｒｕｓ））、フレボウイルス（Ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）（リフトバレー熱（Ｒｉｆｔ  Ｖａｌｌｅｙ  ｆｅｖｅｒ））およびトスポウイルス（Ｔｏｓｐｏｖｉｒｕｓ）を含む。本発明の文脈において、ヒトに感染可能なウイルスは、ベシクロウイルス（Ｖｅｓｉｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）（水疱性口内炎ウイルス（ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｖｉｒｕｓ）など）、リッサウイルス属（Ｌｙｓｓａｖｉｒｕｓｅｓ）（狂犬病ウイルス（Ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、オーストラリアコウモリリッサウイルス（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  ｂａｔ  ｖｉｒｕｓ））；ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓｅｓ）（ライノウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）、ポリオウイルス（Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）、Ａ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）など）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ）（水痘（ｃｈｉｃｋｅｎｐｏｘ）、帯状疱疹（ｓｈｉｎｇｌｅｓ）、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）ＣＭＶ、エプスタイン・バー・ウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）ＥＢＶなど）、オルソミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ）（インフルエンザウイルスなど）、パラミクソウイルス（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ）（麻疹ウイルス、ムンプウイルスなど）、ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）（天然痘ウイルスなど）、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ）（ＳＡＲＳなど）、フィロウイルス（Ｆｉｌｏｖｉｒｕｓｅｓ）（エボラ（Ｅｂｏｌａ）など）、ヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓｅｓ）（ＨＢＶ）およびレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）（ＨＩＶ、ＨＴＬＶなど）を含む。
【０２３６】
「細菌」という用語は、核およびオルガネラの不在並びに細胞壁を備えることにより特徴付けられる任意の原核生物を表す。この用語は特に、病原性であり、ヒトにおいて疾患および／または感染症を引き起こし得る細菌、例えば、コリネバクテリウム・ジフテリエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）（ジフテリア）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）（梅毒）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（結核）、マイコバクテリウム・レプレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）（らい病）、ナイセリア・ゴノレエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（淋病）、リッケチア（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）（発疹チフス）、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）（破傷風）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）（コレラ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）およびブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）（日和見病原体）を含む。この用語は、輸血による危険性および院内感染に関係する細菌、例えば、グラム陰性細菌の大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、エルシニア・エンテロコリチカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、アシネトバクター・バウマンニ（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｂａｕｍａｎｎｉｉ）およびシュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）またはグラム陽性細菌のスタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、プロピオニバクテリウム・アクネス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｃｎｅｓ）およびクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）をさらに含む。
【０２３７】
本発明の一実施形態に従って、ヌクレオチド配列（Ｎ１−Ｎ２−…−Ｎｎ−１−Ｎｎ）および場合によりヌクレオチド配列（Ｍ１−Ｍ２−…−Ｍｍ−１−Ｍｍ）は、
−Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）に特異的な、配列番号１、配列番号４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号３５もしくは配列番号３６の配列、
−フラビウイルスに特異的な、配列番号１６、配列番号１７もしくは配列番号４０の配列、
−デングウイルスに特異的な、配列番号１８もしくは配列番号４１の配列、または
−西ナイルウイルス（ＷＮＶ）に特異的な、配列番号１９の配列、
から選択される。
【０２３８】
本発明の一実施形態に従って、ヌクレオチド配列（Ｎ１−Ｎ２−…−Ｎｎ−１−Ｎｎ）および場合によりヌクレオチド配列（Ｍ１−Ｍ２−…−Ｍｍ−１−Ｍｍ）は、アルファアノマー、ベータアノマー、直鎖もしくは「スネイル（ｓｎａｉｌ）」タイプの構造を有する。ヌクレオチド配列がベータアノマータイプの構造を有する場合、本発明の修飾オリゴマー（このチオールは５’に位置する）は、逆平行様式で標的配列とハイブリダイズする。ヌクレオチド配列がアルファアノマータイプの構造を有する場合、本発明の修飾オリゴマー（このチオールは３’末端に位置する）は、平行様式で標的配列とハイブリダイズする。
【０２３９】
［表面の官能化］
本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドは、基材の表面を官能化するために、この基材上に付着させることができる。基材は、金属またはポリマー製、導電性または非導電性であってよい。基材は、平坦（部分的または全体に）または曲面であってよく、有利には球状であってよい。
【０２４０】
一実施形態に従って、基材は非平面、例えば、マイクロ粒子またはナノ粒子である。本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドは、これらのマイクロ粒子またはナノ粒子にグラフト可能である。好ましくは、これらの粒子は磁性的である。実際、検出、遺伝子型決定またはシーケンシングのための試験のため、これらの磁性粒子は、磁石を利用して、電極の表面に、またはマイクロプレートのウェルの底に容易に運ぶことが可能である。本発明の検出方法に関連して、マイクロ粒子またはナノ粒子のタイプの非平面支持体の使用は、本発明の修飾オリゴヌクレオチドをグラフトできる表面積の増加を有利に可能にし、したがって、プローブと標的配列との間のハイブリダイゼーションの割合の増加を可能にする。
【０２４１】
一実施形態に従って、基材は、金属、例えば銅またはチタン製であり、その表面は、金またはプラチナ膜により、好ましくは金により、部分的または完全にコーティングされる。
【０２４２】
一実施形態に従って、基材は、ポリマー、好ましくは導電性ポリマーである。
【０２４３】
一実施形態に従って、基材は、金またはプラチナの膜により被覆された、またはアルケニル、アルキニルもしくはハロアセトアミド官能基、例えばマレイミドまたはアクリルアミド官能基により被覆された、修飾オリゴヌクレオチドが付着されるレシービングゾーンを含み得る。
【０２４４】
本発明の一実施形態に従って、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合を含む基は、アルファ位のカルボニル官能基により活性化されたアルケンから選択され、このアルケンは、好ましくはマレイミドおよびアクリルアミド基から選択される。
【０２４５】
本発明の一実施形態に従って、ハロアセトアミド基は、ブロモアセトアミドおよびヨードアセトアミド基から選択される。
【０２４６】
本発明の一実施形態に従って、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む基は、アルファ位のカルボニル官能基により活性化されたアルキンから選択され、このアルキンは、好ましくは２−プロピンアミド基から選択される。
【０２４７】
化合物ｇｐｔ−ＳＨが本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドを表す図１６ａに例示するように、チオール官能基は、アルファ位のカルボニル官能基により活性化された炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合と反応する。図１６ａの上から下に示すように、いずれも、本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドが２つのチオール化合物を含む場合に調製される。第１の官能化反応はマレイミドによるグラフト化表面に対応し、第２の反応はアクリルアミドによるグラフト化表面に対応し、第３の反応はヨードアセトアミドまたはブロモアセトアミドによるグラフト化表面に対応し、第４の反応は２−プロピンアミドによるグラフト化表面に対応する。
【０２４８】
図１６ｂの場合、表面は、活性化されていないアルケニル基（第１の反応）およびアルキニル基（第２の反応）によりグラフト化される。修飾オリゴヌクレオチドのチオール官能基と、表面基との間の反応は、光（λ＝２６５ｎｍ）による活性化を使用して実施される。第１の官能化反応は、ｇｐｔ−ＳＨにより模式的に表されるモノチオール修飾オリゴヌクレオチドを使用して実施され、第２の反応は、ジチオール修飾オリゴヌクレオチドを使用して実施される。
【０２４９】
支持体がアルキニル官能基によりグラフト化される場合、ポリチオール修飾オリゴヌクレオチドによる表面官能化は非常に興味深い（図１６ａおよび１６ｂ）。なぜなら第１ステップにおける第１のチオール官能基と、−イン官能基との間およびその後の第２ステップにおける第２のチオール官能基と得られた−エン官能基との間の、２つの連続反応により環状構造がもたらされるためである。
【０２５０】
好ましい実施形態に従って、基材は、マレイミドまたはアクリルアミド基によりグラフト化される。
【０２５１】
したがって、本発明は、例えば、基材の表面と修飾オリゴヌクレオチドとの間に金−イオウ結合を作製することによる、金表面の官能化を可能にしてもよいし、またはチオエーテル結合の作製による、マレイミドまたはアクリルアミド官能基によるグラフト化表面の官能化を可能にする。
【０２５２】
修飾オリゴヌクレオチドの基材表面への固定化は、処理される表面を、上記の本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドを含む溶液に浸漬することによって実施される。洗浄および乾燥の１以上のさらなるステップが、一般的に提供される。概して、修飾オリゴヌクレオチドの溶液は、基材表面が金製である場合、０．１０μＭから５００μＭ、好ましくは０．５μＭから１００μＭの間が含まれる濃度であり、基材表面がマレイミドから形成される場合、５０ｎＭから２００ｎＭの間、好ましくは７５ｎＭから１５０ｎＭの間が含まれる濃度である。浸漬の次に、洗浄を行い、反応しなかったものをすべて除去する。
【０２５３】
オリゴヌクレオチド上のいくつかのイオウ原子の存在は、いくつかの金−イオウ結合、またはいくつかのチオエーテル結合の作製を可能にし、これにより、オリゴヌクレオチドを表面に安定化させることができる。
【０２５４】
したがって、本発明の主題は、少なくとも１つの上記の修飾オリゴヌクレオチドによるグラフト化基材を含み、前記基材は、前記修飾オリゴヌクレオチドのグラフティングに耐える物質によりコーティングされた少なくとも１つのレシービングゾーンを含む。本発明の一実施形態に従って、基材は、電極の形態である。本発明の別の実施形態に従って、基材は、９６ウェル以上を有するマイクロプレートの形態である。
【０２５５】
本発明の一実施形態に従って、本発明に従ったグラフト化基材は金属、好ましくは銅またはチタン製であり、金またはプラチナの膜によりコーティングされた少なくとも１つのレシービングゾーンを含む。本発明の別の実施形態に従って、グラフト化基材は、プラスチック、好ましくはポリスチレン製であり、レシービングゾーンは、マレイミド基によりコーティングされるか、および／またはその表面に少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基を含む。
【０２５６】
本発明の一実施形態に従って、レシービングゾーン上に得られる本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドのグラフト密度は、９６ウェルプレートを基材として使用する場合、１０ｎＭ／ウェルから５００ｎＭ／ウェルのグラフティング溶液からもたらされる。有利には、基材のレシービングゾーン上の本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドグラフト密度は、９６ウェルプレートを基材として使用する場合、１００ｎＭ／ウェルのグラフティング溶液を使用して得られる。
【０２５７】
［マーカーまたはリガンドへの固定］
本発明の修飾オリゴマーは、１以上の結合点によりマーカーまたはリガンドに結合させることができ、このマーカーまたはリガンドは、例えば、酵素性、発色性、蛍光発生的、放射性、または化学発光のマーカー、金属、金属イオン、ホルモン、タンパク質、ペプチド、糖類、オリゴ糖、核酸分解剤もしくはタンパク質分解剤、ビオチンなどの結合剤、抗原、ハプテン、抗体または受容体であってよい。有利には、このマーカーまたはリガンドは、本発明の修飾オリゴヌクレオチドと、ウイルスまたは細菌の遺伝子の代表的標的配列との間のハイブリダイゼーション事象の検出を可能にする。
【０２５８】
本発明の別の実施形態に従って、マーカーまたはリガンドは、遺伝子の、ウイルスの、または細菌の代表的標的ヌクレオチド配列と結合し、本発明の修飾オリゴヌクレオチドと標的配列との間のハイブリダイゼーション事象の検出を可能にする。
【０２５９】
［検出方法］
本発明はさらに、生体試料中の少なくとも１つの標的核酸を検出する方法に関し、この方法は、前記標的核酸を、上記の修飾オリゴヌクレオチドにより形成された少なくとも１つの検出プローブにより検出するステップを含む。
【０２６０】
本発明の一実施形態に従って、検出方法は、
−生体試料から少なくとも１つの「供給源」核酸を得るステップ、
−供給源核酸から標的核酸の増幅によりアンプリコンを作製するステップ、および
−アンプリコンと、上記の修飾オリゴヌクレオチドにより形成された少なくとも１つの検出プローブとの間のハイブリダイゼーションを検出するステップ、
を含む。
【０２６１】
「生体試料」は、核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを含有する、または含有する疑いのあるあらゆる物質であり、ヒト、動物、植物から、または任意の液体もしくは固体組成物から得られる物質を意味する。生体試料は、例えば個体（単数または複数）から単離された組織または液体の試料を含み、限定するものではないが、皮膚、血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、滑液、尿、涙、血液細胞、骨髄、器官、腫瘍ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞培養の構成成分の試料を含む。生体試料は、それらの細胞内成分を溶液に移すために、組織または細胞の構造を破壊するように、有利に処理されてよい
【０２６２】
「アンプリコン」は、生体試料に含有される遺伝子、ウイルスまたは細菌の特徴的標的核酸配列の増幅のための手順の間に作製される核酸分子を意味する。本発明の一実施形態に従って、アンプリコンは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術により作製される。本発明の検出方法に使用されるアンプリコンは、有利には、７５ｂｐから約５００ｂｐの範囲のサイズを有する。特に、本発明の方法の有利性の１つは、百以上のヌクレオチド長を有するアンプリコンを使用する可能性であると思われ、これは、先行技術において公知の検出方法では不可能であることが証明されている。本発明の検出方法は、したがって、遺伝子、ウイルスまたは細菌中のより大きな標的配列を選択および増幅可能にする。
【０２６３】
本発明の一実施形態に従って、検出方法は、生体試料中に存在するウイルスの遺伝子型および／または亜型の決定を可能にする。アンプリコンは、より詳細には、標的ヌクレオチド配列の増幅により作製され、ウイルスの遺伝子型および／または亜型に関する情報を保有するウイルスのゲノム領域に対応する。検出は、特定のウイルスの遺伝子型および／または亜型に特異的なプローブにより実施される。本発明の方法は、したがって、ウイルスまたは細菌の型または亜型についてのより多くの情報を含有する標的配列に基づく検出をもたらすことを可能にする。この有利性は、本発明に従った修飾オリゴヌクレオチド、基材の固定ゾーンに固定するための、その方法および能力から直接もたらされる。したがって有利には、ウイルスまたは細菌のゲノムから可能な限り短い標的配列を増幅するためのプライマーを規定することはもはや必須ではない。本発明の方法は、代わりに、問題となるウイルスまたは細菌の科における保存領域に局在するプライマーを選択し、より長い標的配列を増幅することを可能にする。このことは、同じプライマーを、いくつかのウイルスまたは細菌の型および／または亜型において遭遇するゲノムゾーンの増幅に使用でき、使用するアンプリコンのサイズにより歪められたハイブリダイゼーション結果を見る恐れがないという点で、有意な省力および使用の容易さの増加をもたらす。
【０２６４】
本発明の一実施形態に従って、本発明の検出方法のアンプリコンを作製するステップはヌクレオチドプライマーの混合物により実施され、好ましくはプライマーペア
−配列番号８および配列番号９、どのようなウイルス遺伝子型が関与していても、アンプリコンがＨＣＶから作製される場合。このプライマーペアは包括的であり、ＨＣＶの任意の遺伝子型から出発する４０１ｎｔの「長鎖」アンプリコンの増幅を可能にする；
−配列番号１０および配列番号９、遺伝子型１ａ／１ｂに特異的な、１９１ｎｔの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア；
−配列番号２９および配列番号９、遺伝子型２に特異的な１０８ｎｔの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア；
−配列番号８および配列番号１１、遺伝子型３ａに特異的な１４３ｎｔの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア；
−配列番号８および配列番号３０、遺伝子型４ａ／４ｄに特異的な１７５ｎｔの「短鎖」アンプリコンの作製を可能にするペア；ならびに
−配列番号２０および配列番号２１、および／または配列番号２２および配列番号２１、アンプリコンが、フラビウイルスから作製される場合；
から選択されるヌクレオチドプライマーの混合物により実施される。
【０２６５】
一実施形態に従って、本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドは、９６ウェルプレートを基材として使用した場合、１０ｎＭから５００ｎＭの範囲のグラフティング溶液とウェルを接触させることからもたらされる密度で検出方法に使用される。有利には、９６ウェルプレートを基材として使用した場合、本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドのグラフティング溶液は１００ｎＭの溶液である。本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドが２つのチオール官能基を含む場合、使用するグラフティング溶液は、少なくとも１０ｎＭ（９６ウェルプレートを基材として使用した場合）の修飾オリゴヌクレオチド濃度を有し、検出方法に使用するアンプリコンの濃度は、少なくとも１００ｐＭである。本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドが、４つのチオール官能基を含む場合、使用するグラフティング溶液は、９６ウェルプレートを基材として使用した場合、少なくとも１０ｎＭ／ウェルの修飾オリゴヌクレオチド濃度を有し、検出方法に使用するアンプリコンの濃度は、少なくとも１０ｐＭ／ウェルである。
【０２６６】
本発明に従った検出方法は、特に、ＨＣＶのさまざまな公知の遺伝子型および亜型を、単純な分子検出試験を使用して識別可能にするという点で、ＨＣＶの遺伝子型決定に特定の有利性を提示する。
【０２６７】
Ｃ型肝炎ウイルスに関連する感染症は、極めて重要な健康問題を表す。なぜなら、感染個体が、肝臓疾患、肝硬変および原発性肝臓癌を発症する危険性があり、また、感染個体は感染症の保菌者を構成する。疫学的研究は、新しい診断系および治療系が開発されない場合、今後１０年間の期間にわたるＨＣＶによりもたらされる年間死亡数が３倍になることを予見する。
【０２６８】
かなりの数の遺伝的変異性により特徴付けられて、ＨＣＶは、６種の主要な遺伝子型に分類され、これらは、８０を超える亜型を含む。感染性の遺伝子型および／または亜型の正確な決定は、治療戦略には極めて重大であり、抗ウイルス応答の有効性の予測および療法の期間の規定、治療タイプおよび投薬量の予測を可能にする。感染個体に見出されるＨＣＶの詳細な分類の同定もまた、ウイルス株の分布のモニタリングおよび伝染要因の同定の目的で、疫学的モニタリングにとって重要である。
【０２６９】
ＨＣＶのＲＮＡの検出および／または定量のための上市されている試験の多くは、５’非コーディング領域（５’ＮＣＲ）に見出される配列に基づき、５’非コーディング領域は、ＨＣＶの領域のうち、最も多く保存され、最もよく特徴付けられた領域の１つを構成する。５’ＮＣＲ領域は、したがって、市販品として流通している遺伝子型決定のさまざまな公知の方法において、標的として選択される。そのような方法としては、例えば、配列解析および二本鎖運動性試験に基づくＩＮＮＯ  ＬｉＰＡ  ＨＣＶ  ＩＩ試験（Ｂａｙｅｒ社）、Ｔｒｕｇｅｎｅ  ＨＣＶ  ５’ＮＣＲキット（Ｂａｙｅｒ／Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社（WO2007/076493））が挙げられ、またはＲｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓにより開発された、５’ＮＣＲ領域またはＮＳ５領域において設計された複数のＨＣＶのタイプ決定を含むハイブリダイゼーションの検出系（US 2007/014160）が挙げられる。
【０２７０】
しかし、５’ＮＣＲ領域における突然変異の存在は、５から８％の事例においてＨＣＶ遺伝子型の分類不良をもたらし、治療の結果にとって深刻な結果につながる。５’ＮＣＲ領域はもはや、ウイルスの遺伝子型２および４を同定するために十分な程度の信頼性を表すとは思われない。
【０２７１】
ＨＣＶの遺伝子型決定を実施するための参照方法は、さらに、ＨＣＶの特異的領域に存在し、特に、ＲＮＡ−依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする、ウイルスのＮＳ５ｂ領域のシーケンシングに存在する。しかし、シーケンシングは、高価であり、時間がかかり、特殊な設備および熟練した操作者を必要とする。したがって、シーケンシングは、大規模臨床研究には適切ではない。
【０２７２】
したがって、ＨＣＶのさまざまな公知の遺伝子型および亜型を、単純な分子試験、例えば本発明の試験を使用して識別するための、ＨＣＶを検出および／または遺伝子型決定するための改良された方法の必要性が存在する。
【０２７３】
本発明はさらに、配列番号１、配列番号４、配列番号２７、配列番号２８、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号３５、配列番号３６、配列番号４０および配列番号４１の配列から選択されるヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドに関する。有利には、配列番号１の配列のオリゴヌクレオチドは、タイプ１ａ／１ｂのＨＣＶに特異的に見出されるヌクレオチド配列に対応し、上記の検出方法との関連において、後者の特異的検出を可能にする。有利には、配列番号２７の配列のオリゴヌクレオチドは、タイプ２のＨＣＶに特異的に見出されるヌクレオチド配列に対応し、上記の検出方法との関連において、後者の特異的検出を可能にする。有利には、配列番号３５の配列のオリゴヌクレオチドは、タイプ２ａ／２ｃのＨＣＶに特異的に見出されるヌクレオチド配列に対応し、上記の検出方法との関連において、後者の特異的検出を可能にする。有利には、配列番号３６の配列のオリゴヌクレオチドは、タイプ２ｂのＨＣＶに特異的に見出されるヌクレオチド配列に対応し、上記の検出方法との関連において、後者の特異的検出を可能にする。有利には、配列番号４の配列のオリゴヌクレオチドは、タイプ３ａのＨＣＶに特異的に見出されるヌクレオチド配列に対応し、上記の検出方法との関連において、後者の特異的検出を可能にする。有利には、配列番号２８の配列のオリゴヌクレオチドは、タイプ４ａ／４ｄのＨＣＶに特異的に見出されるヌクレオチド配列に対応し、上記の検出方法との関連において、後者の特異的検出を可能にする。有利には、配列番号１６、配列番号１７または配列番号４０の配列のオリゴヌクレオチドは、フラビウイルスに特異的に見出されるヌクレオチド配列に対応し、上記の検出方法との関連において、後者の特異的検出を可能にする。有利には、配列番号１８の配列のオリゴヌクレオチドは、デングウイルスに特異的に見出されるヌクレオチド配列に対応し、上記の検出方法との関連において、後者の特異的検出を可能にする。有利には、配列番号４１の配列のオリゴヌクレオチドは、血清型４のデングウイルスに特異的に見出されるヌクレオチド配列に対応し、上記の検出方法との関連において、後者の特異的検出を可能にする。有利には、配列番号１９の配列のオリゴヌクレオチドは、西ナイルウイルスに特異的に見出されるヌクレオチド配列に対応し、上記の検出方法との関連において、後者の特異的検出を可能にする。
【０２７４】
［検出キット］
本発明の別の主題は、少なくとも１つのレシービングゾーンを含み、その上に少なくとも１つの本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドを配置した少なくとも１つの支持体を含む、検出および／または診断キットからなる。
【０２７５】
したがって、検出キットは、生物学的活性分子のスクリーニングまたは診断もしくはシーケンシング試験のために使用することができる。診断キットが、いくつかの別個のレシービングゾーンを含み、その上に、同一もしくは異なるオリゴヌクレオチドによるグラフト化固体支持体が付着されることが想定可能である。例えば、同一または異なる修飾オリゴヌクレオチドによるグラフト化固体支持体は、基材の別個のレシービングゾーンに、試験および／または診断用支持体を形成するように配置することができ、ここで前記基材は、金フィルムにより被覆された基材であってもよく、または少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基を含む官能基によるグラフト化基材であってもよい。
【０２７６】
支持体は、特に金電極であってよい。試験キットは、有利には、作用電極、対電極および基準電極を含む、電気化学セルを含んでもよい。作用電極は金製、対電極はプラチナ製および基準電極は銀製であってよい。修飾オリゴヌクレオチドと被験分子との間の相互作用の調査は、サイクリックボルタンメトリーのステップを含むことができる。
【０２７７】
少なくとも１つの炭素−炭素二重結合（アルケニル官能基）または炭素−炭素三重結合（アルキニル官能基）またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基を含む表面へのグラフティングは、例えば、マイクロプレートフォーマットにおける診断分野への応用のため、および／またはＥＬＯＳＡタイプ（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＯｌｉｇｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）の試験を実施するために使用することができる。このタイプの試験の過程において、ウェルの表面は、アルケニル、アルキニルまたはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基１によりグラフト化される。その後、この表面を、本発明に従った修飾オリゴヌクレオチドと接触させる。したがって、本発明に従ったオリゴヌクレオチド上の１以上のチオール官能基の存在のため、１以上のチオエーテル結合が形成される。次いで、試験は、標的ヌクレオチド配列を含む試験試料と、このように官能化されたウェルとを接触させるステップからなる。特に、試験は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを測定するために行われる。測定は、例えば、オリゴヌクレオチド鎖を標識化することによって、蛍光に基づくことができる。
【０２７８】
本発明はさらに、上記の修飾オリゴヌクレオチドの使用に関し、上記の修飾オリゴヌクレオチドは、表面グラフトのための少なくとも２つのチオール官能基を含み、前記表面は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結または炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基を含む。一実施形態に従って、化合物は、３または４のチオール官能基を含んでもよい。少なくとも１つの炭素−炭素二重結合または炭素−炭素三重結合またはハロアセトアミド官能基、好ましくはマレイミドもしくはアクリルアミド官能基を含む表面に固定された修飾オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのチオール官能基を介して、診断試験、例えばＥＬＯＳＡタイプの試験における使用に対する非常に優れた安定性を示すとともに、標的に関するより優れた利用可能性を示す。化合物中のチオール官能基の数が増加する場合、検出試験の間にグラフト化される支持体全体のハイブリダイゼーションの数が増加する。したがって、４つのチオール官能基を有する修飾オリゴヌクレオチドは、標的のより効率的なハイブリダイゼーションの獲得を可能にする。
【実施例】
【０２７９】
実施例において、「プローブ」は、表面への固定が意図される、少なくとも１つの本発明に従ったチオール化合物を含むオリゴヌクレオチド鎖を意味する。
【０２８０】
「標的」は、例えば診断試験の間に、プローブとのハイブリダイズが意図されるオリゴヌクレオチド鎖を意味する。
【実施例１】
【０２８１】
［オリゴマーの合成］
［化合物１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−（６−Ｓ−アセチルチオヘキシルオキシメチル）−２−メチルプロパン−１，３−ジオール４の合成］
【０２８２】
【化４３】
2015514402.tif 000044
【０２８３】
化合物３を、Pourceau, G., Meyer, A., Vasseur, J. J., and Morvan, F., Journal of Organic Chemistry 74, 2009, 1218-1222に記載のプロトコルに従って、化合物１から得る。
【０２８４】
クラウンエーテル１８−６（７０ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）を、無水トルエン（１０ｍＬ）中１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−（６−ブロモヘキシルオキシメチル）−２−メチル−１，３−プロパンジオール３（５５６ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ）およびチオ酢酸カリウム（１６２ｍｇ、１．４２ｍｍｏｌ）の溶液に加える。この混合物を、２時間、５０℃において磁気撹拌に供する。ジクロロメタン（１５０ｍＬ）による希釈後、混合物をろ過し、有機相を水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いで、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥する。蒸発後、粗反応生成物をシリカクロマトグラフィー（シクロヘキサン中０から３０％のエチルアセテート）により精製し、所望の生成物を、無色の油状物質の形態で得る（４１３ｍｇ、７５％）。
【０２８５】
［１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−（６−Ｓ−アセチルチオヘキシルオキシメチル）−２−メチル−３−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルホスホラミダイト）−プロパン−１，３−ジオール５の合成］
【０２８６】
【化４４】
2015514402.tif 000045
【０２８７】
２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（１９０μＬ、０．８５ｍｍｏｌ）を、無水ジクロロメタン（１０ｍＬ）中１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−（６−Ｓ−アセチルチオヘキシルオキシメチル）−２−メチルプロパン−１，３−ジオール４（４１３ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（１８６μＬ、１．０６ｍｍｏｌ）の溶液に加える。混合物を、１時間、周囲温度において磁気撹拌に供する。過剰な試薬を、５００μＬの水を加えることによって中和し、次いで混合物を、ジクロロメタン（１５０ｍＬ）で希釈する。有機相を飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１００ｍＬ）で洗浄し、次いでＮａ２ＳＯ４で乾燥する。蒸発後、粗反応生成物を、シリカクロマトグラフィー（４％のトリエチルアミン含有シクロヘキサン中０から３０％の酢酸エチル）により精製し、所望の化合物５を、無色の油状物の形態で得る（４００ｍｇ、７２％）。
【０２８８】
［チオール固体支持体６の合成］
【０２８９】
【化４５】
2015514402.tif 000046
【０２９０】
すりガラス管において、１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−（６−Ｓ−アセチルチオヘキシルオキシメチル）−２−メチル−１，３−プロパンジオール４（１７８ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）およびジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ  ３６ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を３ｍＬの無水ピリジンと一緒に同時蒸発させる。次いで、スクシニル−長鎖アルキルアミン-ＣＰＧ（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐｏｒｅ  Ｇｌａｓｓ）（１ｇ）、無水ピリジン（５ｍＬ）、無水トリエチルアミン（１６０ｍＬ、１．２ｍｍｏｌ）およびエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド（ＥＤＣ、２８０ｍｇ、２．０ｍｍｏｌ）を加える。次いで、１ｍＬの無水ピリジンによりすすぐ。混合物を一晩撹拌する。
【０２９１】
混合物をろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）で洗浄し、その後デシケーター中で乾燥させる。支持体上のチオール化合物を、ＴＨＦ中無水酢酸、Ｎ−メチルイミダゾール、２，６−ルチジンの溶液により、３時間、撹拌しながら処理する。混合物をろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）で洗浄し、その後デシケーター中で乾燥させ、２９μｍｏｌ／ｇで官能化されたチオール固体支持体６（９４０ｍｇ）を得る。
【実施例２】
【０２９２】
［修飾オリゴヌクレオチドの調製］
フェロセン基を５’位に含み、本発明に従ったタイプ（Ｉａ）の漸増数のチオール化合物（１、２および４チオールの化合物）を含む３種のオリゴヌクレオチドを、ＤＮＡ合成装置で合成した。金表面へのオリゴヌクレオチドの固定化をサイクリックボルタンメトリーにより可視化するために、フェロセン基を使用した。１、２または４つのチオール基を、プロパンジオールタイプの固体支持体に導入し、配列番号７のＤＮＡ配列をグラフトした。最終的に、フェロセン基を保有するアルファ−チミジンホスホラミダイトを、修飾オリゴヌクレオチドの５’位に導入した。その後の脱保護は、２ステップで実施する。第１に、ベータ−除去によりシアノエチル基を除去するために、媒体を、アセトニトリル中１０％のピペリジンにより１０分間処理し、得られたアクリロニトリルを、アセトニトリルによる洗浄によって媒体から除去する。次いで、濃水酸化アンモニウムによる処理で、核酸塩基上およびチオール官能基上のアシル保護基の除去を可能にし、スクシニル連結（固体支持体）の加水分解を可能にする。このプロトコルは、脱保護されたチオール官能基とアクリロニトリルとの間のＭｉｃｈａｅｌ付加の回避を可能にする。蒸発後、支持されていない修飾オリゴヌクレオチドを、Ｃ１８カラムによる逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製する。
【０２９３】
【化４６】
2015514402.tif 000047
【０２９４】
［修飾オリゴヌクレオチド（テトラチオール、ジチオールおよびモノチオール）のグラフティングおよび安定性調査］
この研究のために、ＶＭＰ３  Ｂｉｏｌｏｇｉｃマルチチャンネル・ポテンショスタット(Biologic Science Instruments、Pont de Claix)を使用した。結果を、ＥＣ−Ｌａｂソフトウェア、Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社製を使用して記録した。
【０２９５】
電気化学セルは、表面積０．２８ｃｍ2の金電極、プラチナの対電極およびＡｇ／ＡｇＣｌ基準電極からなる。
【０２９６】
ステップ１：チオール基の還元
４ｎｍｏｌのＯＤＮ−チオール（１以上のチオール化合物により修飾されたオリゴヌクレオチド）を、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ−ＨＣＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（１６０ｍＭ）、すなわち、溶液中、濃度２０ｍＭのＴＣＥＰ−ＨＣＬで、２０℃において２時間アルゴン下で還元する。
【０２９７】
ＯＤＮを、ＴＣＥＰ−ＨＣｌの２０ｍＭ溶液による２回連続の希釈／遠心分離により精製し、アミコンＹＭ３０００フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）において１５分間１４０００ｒｃｆ（ｒｃｆ＝相対遠心力（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｏｒｃｅ））でガス抜きする。４５０μＬのガス抜きした１００ｍＭのリン酸バッファーで希釈後、媒体を、アミコンＹＭ３０００フィルターにおいて３０分、１４０００ｒｃｆで、再度遠心分離する。
【０２９８】
４ｎｍｏｌのＯＤＮ、９０ｍＭのリン酸ナトリウム、２ｍＭのＴＣＥＰ−ＨＣｌを含有するグラフティング溶液を得る。
【０２９９】
ステップ２：金電極の活性化
金の作用電極を、アセトン中で１０分間、超音波による１回目の洗浄により、浄化する。一度乾燥させ、すべての有機残留物を表面から除去するために、表面を「ピラニア」溶液（０．７ｍＬのＨ２ＳＯ４、０．３ｍＬのＨ２Ｏ２）に１分間浸漬する。
【０３００】
電極の最終基本活性化は、０．５Ｍのソーダ中で負電位（−１．４Ｖ対Ａｇ／ＡｇＣｌ）において数サイクル、水の加水分解により電極において水素を発生させることによる金の表面浄化からなる。
【０３０１】
ステップ３：プローブのグラフティング
すすぎ後、チオールオリゴヌクレオチドを含有するグラフティング溶液を、活性化された金電極と、不活性雰囲気下で３日間接触させる。
【０３０２】
すすぎ後、電気化学セルに分析電解質（１０ｍＭの二塩基性のリン酸ナトリウム、１０ｍＭの一塩基性のリン酸カリウム、２５０ｍＭの過塩素酸ナトリウム、ｐＨ６．５）を満たす。
【０３０３】
表面を、１ｍＭのメルカプトプロパノール溶液により３０分間不動態化し、すすぎ後、グラフト層を安定化させるために、セルを分析電解質に２時間入れる。
【０３０４】
ステップ４：表面にグラフトされた化合物の安定性分析
分析は、５０ｍＶ／秒において−０．１Ｖから０．４５Ｖの間で、サイクリックボルタンメトリー（ＣＶ）により実施される。グラフト層の安定性の研究は、３０分ごとのサイクルで２時間、電気化学シグナルの安定化後、実施される。
【０３０５】
セルを、６０℃または８０℃で１または５分ガス抜きした蒸留水で満たし、すすぎ後、セルを、１．５ｍＬの分析電解質のリン酸塩（２０ｍＭ）過塩素酸塩（２５０ｍＭ）で満たす。３０分間安定化後、ＣＶを実施する。
【０３０６】
操作を必要な回数繰り返す。
【０３０７】
結果
チオール化合物（テトラチオール、ジチオールおよびモノチオール）により修飾された３種のオリゴヌクレオチドのグラフト率の比較を実施した。グラフト率は、フェロセンの酸化ピークの積分により決定した。実際、移動した電子電荷は、電極の表面に存在するフェロセンの数に直接関係し、したがって、金にグラフトされたプローブの数に直接関係する。
【０３０８】
下記の得られた結果は、各プローブに関する３種の異なるグラフティングのグラフト率の平均値に対応する。
【０３０９】
【表１】
2015514402.tif 000048
【０３１０】
結果のヒストグラムを図５に示す。
【０３１１】
モノチオールおよびジチオールに関するグラフト率は極めて同等であり、テトラチオールのグラフティングは、チオール連結の数との調和においておそらく障害の大きさのため、低レベルであることが観察されている。この差にもかかわらず、テトラチオールのグラフト率はそれでもかなりの量であり、非常に再現性がある。
【０３１２】
チオール化合物により修飾された３種のオリゴヌクレオチドの、温度に対する安定性試験を、ガス抜きした蒸留水中で実施した。電気化学応答の進展を、サイクリックボルタンメトリーによりモニターした。フェロセンの酸化強度の百分率低下を、安定化後に得られたシグナルに関して計算する。
【０３１３】
時間の関数としてのこれらの低下を、図６および７に提示する。
【０３１４】
テトラチオール分子は、６０℃の水中における連続処理に対し非常に安定である（図６）。実際に、１分のこの処置を５回後、モノチオール（出発シグナルの７０％）およびジチオール（出発シグナルの６２％）とは対照的に、９７％の出発シグナルが残存する。
【０３１５】
８０℃において、シグナルの喪失はより多い（図７）。１分間の５回連続処理後、８３％の出発シグナルがテトラチオールに関して再度定量可能である。したがって、テトラチオールの安定性は、モノチオール（残留シグナルの４５％）の安定性およびジチオール（残留シグナルの１８％）の安定性を超えて十分上である。
【０３１６】
この研究は、４チオール化合物（テトラチオール）により修飾されたオリゴヌクレオチドの使用により、金へのチオールのグラフティングの安定性が、モノチオールまたはジチオールのグラフティングと比較して著しく増加することを示す。この最後に述べたジチオールの安定性の欠如は、金へのグラフティングと、分子内ジスルフィド結合の再形成のための閉環との間の競合による可能性があり得る。したがって、グラフティング連結における４つのチオールの数を維持し、温度に対する優れた安定性を確実にすることが好ましいと思われる。
【実施例３】
【０３１７】
［Ｃ型肝炎ウイルスの検出への応用］
被験標的試料
１）天然標的：「ＨＣＶ（＋）」アンプリコン
国家規模でＨＣＶの存在に関する検査で陽性と出た血液ドナー由来の血漿試料を、シーケンシングにより解析する。各ドナーに感染しているＨＣＶのウイルスの遺伝子型および亜型を決定する。
【０３１８】
４０１ｂｐの「ＨＣＶ（＋）」アンプリコンを、ＲＴ−ＰＣＲにより、上記の血漿試料それぞれに由来するＨＣＶのＮＳ５ｂウイルス領域から作製する。ＲＮＡを、２００μＬのヒト血漿からＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、製造業者の推奨に従って抽出する。ＲＮＡを、５０μＬの滅菌水（ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ非含有）に溶出させる。逆転写（ＡＴ）ステップのために、１１μＬのＲＮＡを７２℃で１０分間変性させ、４μＬの５Ｘ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μＬの１０Ｘ  ＨｅｘａＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）、２μＬの１０ｍＭのｄＮＴＰ  ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で逆転写する。逆転写条件は、下記のとおりである：１０分２３℃、４５分３７℃、および１０分９５℃。
【０３１９】
５マイクロリットルのｃＤＮＡをその後、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により、プライマー：
−「ビオチン化ＨＣＶセンス」（配列：［Ｂｔｎ］−ＴＧＧ  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＧＴ  ＡＴＧ  ＡＴＡ  ＣＣＣ  ＧＣＴ  ＧＣＴ  ＴＴＧ  Ａ（または［Ｂｔｎ］−配列番号８））および
−「ＨＣＶアンチセンス」（配列  ＧＧＣ  ＧＧＡ  ＡＴＴ  ＣＣＴ  ＧＧＴ  ＣＡＴ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＣＧＴ  ＧＡＡ  （配列番号９））（Tamalet C.ら、 2003年、Journal of Medical Virology 71: 391-398頁を参照されたい）
を使用して増幅する。
【０３２０】
増幅反応を、ＭｇＣｌ２非含有１Ｘ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２μＭの各プライマー、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰミックス（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１．３ＵのＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む５０μＬの反応混合物中で実施する。ＰＣＲ条件は以下のとおりである：５分９５℃、４０サイクル（変性：４０秒９５℃；ハイブリダイゼーション：４０秒５６℃；伸長：５０秒７２℃）および最終伸長が１０分７２℃。
【０３２１】
得られたＨＣＶアンプリコンを、アガロースゲル電気泳動により解析し、アリコートを採取し、−２０℃において使用まで保存する。
【０３２２】
元々のウイルス遺伝子型が公知であるこれらのアンプリコンを、ライブラリの形態で保存する。
【０３２３】
参照番号ＰＴＲ６７１９の、ウイルス株１ａ／１ｂから得られた４０１ｂｐの長さのアンプリコンの例は、配列：
５’−
ＴＧＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＡＴＧＡＴＡＣＣＣＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＣＴＣＡＡＣＧＧＴＣＡＣＴＧＡＧＡＡＴＧＡＣＡＴＣＣＧＴＧＴＴＧＡＧＧＡＧＴＣＡＡＴＴＴＡＣＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＡＣＣＴＡＧＣＣＣＣＣＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＡＧＧＣＣＡＴＡＡＧＧＴＣＧＣＴＣＡＣＡＧＡＧＣＧＧＣＴＴＴＡＣＡＴＣＧＧＧＧＧＴＣＣＣＣＴＧＡＣＴＡＡＴＴＣＡＡＡＡＧＧＧＣＡＧＡＡＣＴＧＣＧＧＣＴＡＴＣＧＣＣＧＧＴＧＣＣＧＣＧＣＧＡＧＣＧＧＴＧＴＧＣＴＧＡＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＣＣＴＣＡＣＡＴＧＴＴＡＣＴＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＴＣＧＴＧＴＧＣＧＧＡＧＡＣＧＡＣＣＴＴＧＴＣＧＴＴＡＴＣＴＧＴＧＡＡＡＧＣＧＣＧＧＧＡＡＣＣＣＡＲＧＡＧＧＡＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＴＡＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣ−３’（配列番号１２）
を有する。
【０３２４】
参照番号ＰＴＲ７７６１の、ウイルス株２から得られた４０１ｂｐの長さのアンプリコンの例は、配列：
５’−
ＴＧＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＡＴＧＡＴＡＣＣＣＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＣＴＣＡＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＡＧＡＧＡＣＡＴＣＡＧＡＡＣＣＧＡＧＧＡＧＴＣＣＡＴＡＴＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＴＣＣＣＴＡＡＣＣＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＧＣＡＣＣＧＣＣＡＴＡＣＡＣＴＣＧＣＴＧＡＣＴＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＡＣＧＴＧＧＧＡＧＧＧＣＣＣＡＴＧＣＴＣＡＡＴＡＧＣＡＡＡＧＧＣＣＡＧＡＣＣＴＧＣＧＧＧＴＡＣＡＧＧＣＧＴＴＧＣＣＧＣＧＣＣＡＧＣＧＧＧＧＴＧＣＴＣＡＣＣＡＣＴＡＧＣＡＴＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴＡＣＧＴＧＣＴＡＴＧＴＧＡＡＡＧＣＴＣＴＡＧＣＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＧＣＣＧＣＡＧＧＧＡＴＡＧＴＡＧＣＧＣＣＣＡＣＧＡＴＧＣＴＧＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＧＴＣＧＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＣＴＴＣＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣ−３’（配列番号３１）
を有する。
【０３２５】
参照番号ＰＴＲ９０５８の、ウイルス株３ａから得られた４０１ｂｐの長さのアンプリコンの例は、配列：
５’−
ＴＧＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＡＴＧＡＴＡＣＣＣＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＣＴＣＧＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＧＴＡＡＴＣＴＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＧＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣＧＧＧＧＧＴＣＣＴＡＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡＧＧＧＧＣＣＣＡＧＴＧＴＧＧＴＴＡＴＣＧＣＣＧＴＴＧＣＣＧＴＧＣＴＡＧＴＧＧＡＧＴＴＣＴＡＣＣＴＡＣＣＡＧＣＴＴＣＧＧＣＡＡＴＡＣＡＡＴＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＡＴＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＧＣＧＧＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＣＧＣＡＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＡＣＣＣＧＧＡＣＴＴＴＣＴＴＧＴＣＴＧＣＧＧＡＧＡＣＧＡＴＣＴＡＧＴＣＧＴＧＧＴＧＧＣＴＧＡＧＡＧＴＧＡＣＧＧＣＧＴＣＧＡＣＧＡＧＧＡＴＧＧＧＧＣＧＧＣＣＣＴＧＡＧＡＧＣＣＴＴＣＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣ−３’（配列番号：１４）
を有する。
【０３２６】
参照番号ＰＴＲ４１６２の、ウイルス株４ａ／４ｄから得られた４０１ｂｐの長さのアンプリコンの例は、配列：
５’−
ＴＧＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＡＴＧＡＴＡＣＣＣＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＡＣＴＧＴＡＡＣＣＧＡＡＡＧＡＧＡＣＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＣＡＧＴＧＴＴＧＴＧＡＣＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＡＡＧＣＣＣＧＣＡＡＧＧＴＡＡＴＡＴＣＣＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴＡＣＧＴＧＧＧＣＧＧＴＣＣＣＡＴＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＡＣＣＴＴＴＧＣＧＧＡＡＣＴＣＧＡＣＧＧＴＧＣＣＧＴＧＣＡＡＧＣＧＧＣＧＴＡＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＴＴＴＧＧＧＡＡＣＡＣＡＣＴＧＡＣＧＴＧＣＴＡＴＣＴＴＡＡＧＧＣＣＡＧＣＧＣＧＧＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＣＴＡＡＡＧＧＡＣＴＧＣＡＣＣＡＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＴＧＧＣＧＡＣＧＡＣＴＴＡＧＴＣＧＴＴＡＴＣＧＣＴＧＡＡＡＧＣＧＡＴＧＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＣＣＧＴＧＣＧＣＴＣＡＧＡＧＣＣＴＴＣＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣ−３’（配列番号３２）
を有する。
【０３２７】
これらの長鎖アンプリコンを補完するために、上記の各血漿試料から出発して、より短いアンプリコンを作製するために、他のプライマーを設計した。同じ全プロトコルを辿り、プライマーを変更しただけで「短鎖」アンプリコンを作製した。使用するプライマーは、患者を感染させたＨＣＶの遺伝子型および／または亜型に従って選択する。
【０３２８】
サイズ１９１ヌクレオチドの、亜型１ａ／１ｂのＨＣＶの特異的アンプリコンを、下記のプライマー：
−ビオチン化センスプライマー「１ａ／１ｂセンス」、配列５’−［Ｂｔｎ］−ＴＧＡ−ＣＲＡ−ＣＹＡ−ＧＣＴ−ＧＹＧ−ＧＴＡ−ＡＹＡ−ＣＣＣ−Ｔ−３’（または［Ｂｔｎ］−配列番号１０）および
−アンチセンスプライマー「ＨＣＶアンチセンス」、配列番号９（上記を参照されたい）
により増幅させる。
【０３２９】
参照番号ＰＴＲ６７１９の、ウイルス株１ａ／１ｂから得られた１９１ヌクレオチドの短鎖アンプリコンの例は、配列：
５’−
ＴＧＡＣＧＡＣＣＡＧＣＴＧＣＧＧＴＡＡＴＡＣＣＣＴＣＡＣＡＴＧＴＴＡＣＴＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＧＴＣＧＡＧＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＣＴＧＣＡＣＡＡＴＧＣＴＣＧＴＧＴＧＣＧＧＡＧＡＣＧＡＣＣＴＴＧＴＣＧＴＴＡＴＣＴＧＴＧＡＡＡＧＣＧＣＧＧＧＡＡＣＣＣＡＲＧＡＧＧＡＴＧＣＧＧＣＧＡＧＣＣＴＡＣＧＡＧＴＣＴＴＣＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣ−３’（配列番号１３）
を有する。
【０３３０】
サイズ１０８ヌクレオチドの、亜型２のＨＣＶの特異的アンプリコンを、下記のプライマー：
−ビオチン化センスプライマー「ビオチン化ＨＣＶ２センス」、配列５’−［Ｂｔｎ］−ＡＴＧ−ＹＴＧ−ＧＴＲ−ＴＧＣ−ＧＧＣ−ＧＡＣ−ＧＡＣ−３’（または［Ｂｔｎ］−配列番号２９）、および
−アンチセンスプライマー「ＨＣＶアンチセンス」、配列番号９（上記を参照されたい）
により増幅させる。
【０３３１】
参照番号ＰＴＲ７７６１の、ウイルス株２から得られた１０８ヌクレオチドの短鎖アンプリコンの例は、配列：
５’−ＡＴＧＣＴＧＧＴＡＴＧＣＧＧＣＧＡＣＧＡＣＣＴＧＧＴＣＧＴＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＴＧＡＧＧＡＧＧＡＣＧＡＧＣＧＧＡＡＣＣＴＧＡＧＡＧＴＣＴＴＣＡＣＧＧＡＧＧＣＴＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＧＣＣ−３’（配列番号３３）
を有する。
【０３３２】
サイズ１４３ヌクレオチドの、亜型３ａのＨＣＶの特異的アンプリコンを、下記のプライマー：
−ビオチン化センスプライマー「ＨＣＶセンス」、配列番号８（上記を参照されたい）、および
−アンチセンスプライマー「３ａ  ｒｅｖ」、配列：５’−ＧＣＡ−ＧＴＡ−ＡＡＧ−ＣＣＧ−ＹＴＣ−ＣＧＴ−ＧＡＧ−３’（配列番号１１）
により増幅させる。
【０３３３】
参照番号ＰＴＲ９０５８の、ウイルス株３ａから得られた１４３ヌクレオチドの短鎖アンプリコンの例は、配列：
５’−
ＴＧＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＡＴＧＡＴＡＣＣＣＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＣＴＣＧＡＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＡＣＡＧＧＡＴＡＴＣＡＧＧＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＧＴＡＡＴＣＴＴＧＡＡＣＣＧＧＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＧＧＴＧＡＴＣＴＣＣＴＣＣＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＧＧＣＴＴＴＡＣＴＧＣ−３’（配列番号１５）
を有する。
【０３３４】
サイズ１７５ヌクレオチドの、亜型４ａ／４ｄのＨＣＶの特異的アンプリコンを、下記のプライマー：
−ビオチン化センスプライマー「ＨＣＶセンス」、配列番号８（上記を参照されたい）、および
−アンチセンスプライマー「ＨＣＶアンチセンス４  ｒｅｖ」、配列：５’−ＡＧＧ−ＴＣＴ−ＣＣＣ−ＹＴＧ−ＣＴＧ−ＴＴＧ−ＴＲＣ−ＡＴ−３’（配列番号３０）
により増幅させる。
【０３３５】
参照番号ＰＴＲ４１６２の、ウイルス株４ａ／４ｄから得られた１７５ヌクレオチドの短鎖アンプリコンの例は、配列：
５’−ＴＧＧＧＧＡＴＣＣＣＧＴＡＴＧＡＴＡＣＣＣＧＣＴＧＣＴＴＴＧＡＣＴＣＣＡＣＴＧＴＡＡＣＣＧＡＡＡＧＡＧＡＣＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＴＣＴＡＴＣＡＧＴＧＴＴＧＴＧＡＣＣＴＡＧＡＧＣＣＣＧＡＡＧＣＣＣＧＣＡＡＧＧＴＡＡＴＡＴＣＣＧＣＣＣＴＣＡＣＡＧＡＧＡＧＡＣＴＣＴＡＣＧＴＧＧＧＣＧＧＴＣＣＣＡＴＧＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＡＣＣＴ−３’（配列番号３４）
を有する。
【０３３６】
前述のように、１９１、１０８、１７５および１４３ヌクレオチドの得られた「短鎖」ＨＣＶアンプリコンを、アガロースゲル電気泳動により解析し、アリコートを採取し、使用まで−２０℃において保存する。
【０３３７】
元々のウイルス遺伝子型が公知であるこれらのアンプリコンを、ライブラリの形態で保存する。
【０３３８】
２）合成標的：１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒのビオチン化オリゴヌクレオチド
５’末端がビオチン化された、１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドを合成した。
【０３３９】
１５−ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドは、選択されたＨＣＶプローブ（下記を参照されたい）に厳密に相補的であり、下記の配列：
−亜型１ａ／１ｂに特異的な１５−ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドは、配列：５’［Ｂｔｎ］−ＧＣＴ  ＣＣＲ  ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＧＣＡ  Ｃ−３’（または［Ｂｔｎ］−配列番号２）を有し；
−亜型３ａに特異的な１５−ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドは、配列：［Ｂｔｎ］−ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＧＣＣ−３’（または［Ｂｔｎ］−配列番号５）を有し、および
−亜型４ａ／４ｄに特異的な１５−ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドは、配列：５’［Ｂｔｎ］−ＣＴＡ  ＹＧＴ  ＧＧＧ  ＣＧＧ  ＹＣＣ−３’（または［Ｂｔｎ］−配列番号３９）を有する。
【０３４０】
下記のＨＣＶプローブの相補配列を含む長鎖オリゴヌクレオチドであって、４５ヌクレオチドの配列により両側を構成されるか、または全体で１０５ヌクレオチドの配列で構成され、５’末端がビオチン化された長鎖オリゴヌクレオチドについても、プローブ／標的ハイブリダイゼーション試験の開発のために合成した。
【０３４１】
使用した１０５−ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドは下記の配列：
−亜型  １ａ／１ｂに特異的な１０５−ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドは、配列：５’［Ｂｔｎ］−ＣＣＴ  ＣＡＣ  ＴＴＧ  ＣＴＡ  ＣＡＴ  ＣＡＡ  ＧＧＣ  ＣＣＡ  ＧＧＣ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＴＣＧ  ＡＧＣ  ＣＧＣ  ＡＧＧ  −  ＧＣＴ  ＣＣＲ  ＧＧＡ  ＡＣＴ  ＧＣＡ  Ｃ  −  ＣＡＴ  ＧＣＴ  ＣＧＴ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＣＧＡ  ＣＧＡ  ＣＴＴ  ＡＧＴ  ＣＧＴ  ＴＡＴ  ＣＴＧ  ＴＧＡ  ＡＡＧ  ＴＧＣ−３’（または［Ｂｔｎ］−配列番号３）を有し、および
−亜型３ａに特異的な１０５−ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドは、配列：５’［Ｂｔｎ］−ＧＡＡ  ＣＡＧ  ＧＡＣ  ＡＴＣ  ＡＧＧ  ＧＴＧ  ＧＡＡ  ＧＡＧ  ＧＡＧ  ＡＴＡ  ＴＡＣ  ＣＡＡ  ＴＧＣ  ＴＧＴ  ＡＡＣ  −  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＣＣＧ  ＧＡＧ  ＧＣＣ  -  ＡＧＧ  ＡＡＡ  ＧＴＧ  ＡＴＣ  ＴＣＣ  ＴＣＣ  ＣＴＣ  ＡＣＧ  ＧＡＧ  ＣＧＧ  ＣＴＴ  ＴＡＣ  ＴＧＣ  ＧＧＧ  ＧＧＣ−３’（または［Ｂｔｎ］−配列番号６）
を有する。
【０３４２】
［ＨＣＶ配列の認識のためのオリゴヌクレオチドプローブの設計］
ＨＣＶのＲＮＡポリメラーゼをコードするＮＳ５ｂ領域を、本発明のオリゴヌクレオチドプローブの設計のための標的とした。
【０３４３】
ＨＣＶの各遺伝子型および／または亜型の最も保存されたゾーンを同定するために、ＮＳ５ｂ領域において増幅されたＨＣＶゲノム配列（８００試料の代表的バンク）を決定し、クラスタルＷ２アライメントソフトウェアおよびＭｅｇａ５系統樹解析ソフトウェアを使用して解析した。遺伝子型（および場合により所与の亜型）のウイルスの配列の包括的認識が可能な個別の領域を選択した。したがって、ウイルスの遺伝子型１ａ／１ｂのすべてのＨＣＶの特異的検出を可能にする高度に保存された領域を同定し、選択した。同じ方法で、ウイルスの遺伝子型２、２ａ／２ｃ、２ｂ、３ａおよび４ａ／４ｄのＨＣＶの特異的検出を可能にする領域を同定し、選択した。選択された各領域の相補的な１５−ｍｅｒのオリゴヌクレオチドを設計し、次いで、マルチ−チオールオリゴヌクレオチドを、亜型１ａ／１ｂ、２、２ａ／２ｃ、２ｂ、３ａおよび４ａ／４ｄの特異的認識のために選択された配列に基づき合成した。
【０３４４】
プローブ１ａ／１ｂの作製のために保持されたオリゴヌクレオチド配列は、５’−ＧＴＧ−ＣＡＧ−ＴＣＣ−ＹＧＧ−ＡＧＣ（配列番号１）である。このプローブは、亜型１ａおよび１ｂの株に特異的である。
【０３４５】
プローブ２の作製のために保持されたオリゴヌクレオチド配列は、５’−ＴＧＧ−ＣＴＹ−ＴＣＴ−ＧＡＧ−ＡＴＧ（配列番号２７）である。このプローブは、亜型２の株に特異的である。
【０３４６】
プローブ２ａ／２ｃの作製のために保持されたオリゴヌクレオチド配列は、５’−ＧＧＡ−ＣＴＣ−ＣＴＣ−ＲＧＴ−ＴＣＴ（配列番号３５）である。このプローブは、亜型２ａおよび２ｃの株に特異的である。
【０３４７】
プローブ２ｂの作製のために保持されたオリゴヌクレオチド配列は、５’−ＴＡＴ−ＧＧＡ−ＴＴＣ−ＴＴＣ−ＴＧＴ（配列番号３６）である。このプローブは、亜型２ｂの株に特異的である。
【０３４８】
プローブ３ａの作製のために保持されたオリゴヌクレオチド配列は、５’−ＧＧＣ−ＣＴＣ−ＣＧＧ−ＴＴＣ−ＡＡＧ（配列番号４）である。このプローブは、亜型３ａの株に特異的である。
【０３４９】
プローブ４ａ／４ｄの作製のために保持されたオリゴヌクレオチド配列は、５’−ＧＧＲ−ＣＣＧ−ＣＣＣ−ＡＣＲ−ＴＡＧ（配列番号２８）である。このプローブは、亜型４ａおよび４ｄの株に特異的である。
【０３５０】
［ＥＬＯＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｏｌｉｇｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）によるプローブ／標的のハイブリダイゼーションの評価］
任意のタイプのチオールプローブ（アルファ−アノマーまたはベータ−アノマーのオリゴヌクレオチド、線形またはステム−ループのプローブ（スネイル「ｓｎａｉｌ」）など）のグラフティングは、下記の最適化されたプロトコルに従って実施することができる。マレイミド活性化マイクロプレートウェル（Ｐｉｅｒｃｅ）を、ＷＢ１バッファー（０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０（ｗ／ｖ）、ｐＨ７．２）により洗浄する。ウェルの官能化を、ＢＢバッファー（０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．２）中１００ｎＭのマルチチオールプローブ（上記）により、２時間、周囲温度（ＡＴ）において実施する。次いでウェルをＷＢ１により３回洗浄し、ＢＢ中１０μｇ．ｍＬ−１のシステイン−ＨＣｌ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）で１時間ＡＴにおいて満たし、ＷＢ１により再度３回洗浄する。
【０３５１】
ハイブリダイゼーション試験を、短鎖の１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒの合成標的により、または実際のＨＣＶアンプリコン：長鎖（４０１ｎｔ）または短鎖（１９１ｎｔまたは１４３ｎｔ）により実施する。合成標的およびアンプリコンを、１５０μＬのハイブリダイゼーションバッファー（ＨＢ：０．９ＭのＮａＣｌ、６０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、６ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、Ｄｅｎｈａｒｄｔ  ５Ｘ）で希釈し、その後ウェルに付着させた。１０分、９５℃の追加の変性ステップをアンプリコンに実施し、その後マイクロウェルに移す。ハイブリダイゼーションを、一晩、３７℃において実施する。ウェルを、ＷＢ２バッファー（０．７５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４、ＳＤＳ  ０．１％）により、２分間ＡＴにおいて３回、および３０分間５０℃において１回洗浄する。
【０３５２】
検出ステップを、３０分間ＡＴにおけるウェルのインキュベーション後に、１００μＬのアッセイバッファー（「Ａｓｓａｙ  Ｂｕｆｆｅｒ」、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で希釈された１００μＬ／ウェルのストレプトアビジン−ユーロピウム（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の存在下で実施する。ウェルを最終的にＷＢ３バッファー（ＷＢ１Ｘ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）により６回洗浄し、２００μＬのシグナル発生バッファー（「Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  Ｂｕｆｆｅｒ」、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を、各ウェルに５分間ＡＴにおいて加える。時間分解蛍光(time-resolved fluorescence)を、Ｖｉｃｔｏｒ３（商標）１４２０マルチ標識検出器（「マルチカウンター（ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ  ｃｏｕｎｔｅｒ）」、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）において、製造業者のプロトコル（３４０ｎｍにおいて励起および６１５ｎｍにおいて放射）に従って測定する。
【０３５３】
[結果１：４つのチオール官能基を有するベータ−アノマーの線形プローブに関するハイブリダイゼーション試験]
４つのチオール官能基を有するベータ−アノマーの線形３ａプローブを、１００ｎＭの密度で、マレイミド基により被覆された支持体に上記のプロトコルに従ってグラフトする。３ａプローブにより得られた結果を、図８および９に提示する。
【０３５４】
保持されたプローブの特異性を検証するために、ＥＬＯＳＡ試験を、使用する標的の性質および濃度を変化させて（短鎖の１５−ｍｅｒおよび１０５−ｍｅｒ合成標的、１４３ｎｔまたは１９１ｎｔの短鎖アンプリコン、４０１ｎｔの長鎖アンプリコン）実施する。
【０３５５】
図８に提示した結果は、１／１０、１／１００および１／１０００希釈の、ＨＣＶ３ａ遺伝子型に特異的な長鎖アンプリコンおよび非特異的長鎖アンプリコン（ＨＣＶ１ａ／１ｂ遺伝子型に対応する）により実施したＥＬＯＳＡ試験に対応する。ハイブリダイゼーションの陽性対照は、３ａ遺伝子型に特異的な合成標的（１５−ｍｅｒ）により、１０００ｐＭおよび５ｐＭの濃度で実施する。ハイブリダイゼーションの陰性対照は、非特異的合成標的（１５−ｍｅｒ）（１ａ／１ｂの標的配列に対応する）により１０００ｐＭの濃度で、または標的を含まないＨＢ（ハイブリダイゼーションバッファー）単独により実施する。
【０３５６】
３ａ亜型に「特異的」としてみなされる３ａプローブに関して、「３ａ」標的により得られる結果は、プローブ／標的ハイブリダイゼーションが定量化可能なように、陰性対照により得られるバックグラウンドノイズを超えている必要がある。
【０３５７】
図９に提示した結果は、下記の標的：
−１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒの３ａ特異的合成標的、濃度１０ｐＭ、１００ｐＭまたは１０００ｐＭ、
−１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒの１ａ／１ｂ非特異的合成標的（陰性対照）、濃度１０ｐＭ、１００ｐＭまたは１０００ｐＭ、
−３ａ特異的長鎖アンプリコン、１／１００希釈、
−１ａ／１ｂ非特異的長鎖アンプリコン、１／１００希釈、
−３ａ特異的短鎖アンプリコン（１４３ｎｔ）、１／１００および１／１０００希釈、
−１ａ／１ｂ非特異的短鎖アンプリコン（１９１ｎｔ）、１／１００および１／１０００希釈、
−ＨＢ単独、標的非含有、
により実施されたＥＬＯＳＡ試験に対応する。
【０３５８】
図８および９において得られた結果は、本発明に従った「３ａ」プローブが、３ａ特異的合成標的の１５−ｍｅｒ（５ｐＭの濃度を有する標的）または１０５−ｍｅｒ（１０ｐＭの濃度を有する標的）とハイブリダイズ可能であるだけでなく、遺伝子型３ａの血漿から得られた４０１ｎｔの長鎖アンプリコンまたは１４３ｎｔの短鎖アンプリコンともハイブリダイズ可能であり、したがって３ａ遺伝子型（１／１０００希釈）に特異的であることを示している。これらの結果は、３ａプローブに特異的ではない１ａ／１ｂ標的が、それらの形態（１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒの合成標的、短鎖アンプリコン１９１ｎｔまたは長鎖アンプリコン４０１ｎｔ）またはそれらの濃度（合成標的に関しては１０００ｐＭまたはアンプリコンに関しては１／１０希釈）に関わらず、検出可能な程度に後者とハイブリダイズしないこともさらに示している。
【０３５９】
図１０に提示した結果は、ベータ−アノマーの、４つのチオール官能基を有する１ａ／１ｂの線形プローブ（上記を参照されたい）により実施されたＥＬＯＳＡ試験に対応し、この線形プローブは、１００ｎＭの密度で、上記のプロトコルに従ってマレイミド基により被覆された支持体にグラフトされる。
【０３６０】
図１０の結果は、下記の標的：
−１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒの１ａ／１ｂ特異的合成標的、濃度１０ｐＭ、１００ｐＭまたは１０００ｐＭ，
−１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒの３ａ非特異的合成標的（陰性対照）、濃度１０ｐＭ、１００ｐＭまたは１０００ｐＭ、
−１ａ／１ｂＨＣＶ遺伝子型に特異的な長鎖アンプリコン、１／１００希釈、
−３ａ非特異的長鎖アンプリコン、１／１００希釈、
−１ａ／１ｂ特異的短鎖アンプリコン（１９１ｎｔ）、１／１００および１／１０００希釈、
−３ａ非特異的短鎖アンプリコン（１４３ｎｔ）、１／１００および１／１０００希釈、
−ＨＢ単独、標的非含有、
から得られる。
【０３６１】
図１０から得られた結果は、本発明に従った１ａ／１ｂプローブが、１ａ／１ｂに特異的な１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒの合成標的（１０ｐＭの濃度を有する標的）とハイブリダイズ可能であるだけでなく、遺伝子型１ａ／１ｂの血漿から得られた１９１ｎｔの短鎖アンプリコンともハイブリダイズ可能であり、したがって、遺伝子型１ａ／１ｂ（１／１０００希釈）および遺伝子型１ａ／１ｂに特異的な４０１ｎｔの長鎖アンプリコン（１／１００希釈）に特異的であることを示している。
【０３６２】
これらの結果は、１ａ／１ｂプローブに非特異的な３ａ標的が、それらの形態（１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒの合成標的、短鎖アンプリコン１４３ｎｔまたは長鎖アンプリコン４０１ｎｔ）またはそれらの濃度（合成標的に関しては１０００ｐＭまたはアンプリコンに関しては１／１０希釈）に関わらず、検出可能な程度に後者とハイブリダイズしないこともさらに示している。
【０３６３】
図１７に提示した結果は、４つのチオール官能基を有する、ベータ−アノマーの線形１ａ／１ｂプローブにより実施されたＥＬＯＳＡ試験に対応し、この線形プローブは、１００ｎＭの密度で、上記のプロトコルに従ってマレイミド基により被覆された支持体にグラフトされる。
【０３６４】
図１７の結果は、下記の標的：
−１５−ｍｅｒの１ａ／１ｂ特異的合成標的、濃度１０ｐＭまたは１０００ｐＭ、
−１５−ｍｅｒの２ａ／２ｃ、２ｂ、３ａまたは４ａ／４ｄ非特異的合成標的（陰性対照）、濃度１０ｐＭまたは１０００ｐＭ、
−１ａ／１ｂＨＣＶ遺伝子型に特異的な長鎖アンプリコン、１／１００希釈、
−２ａ／２ｃ、２ｂ、３ａまたは４ａ／４ｄ非特異的長鎖アンプリコン、１／１００希釈、
−ＨＢ単独、標的非含有、
から得られる。
【０３６５】
図１８に提示した結果は、４つのチオール官能基を有する２種のベータ−アノマーの線形プローブ（配列番号３５の２ａ／２ｃおよび配列番号３６の２ｂ）の混合物により実施されたＥＬＯＳＡ試験に対応し、これらの線形プローブは、それぞれ５０ｎＭの密度で、上記のプロトコルに従ってマレイミド基により被覆された支持体にグラフトされる。
【０３６６】
図１８の結果は、下記の標的：
−１５−ｍｅｒの２ａ／２ｃおよび２ｂ特異的合成標的、濃度１０ｐＭまたは１０００ｐＭ、
−１５−ｍｅｒの１ａ／１ｂ、３ａまたは４ａ／４ｄ非特異的合成標的（陰性対照）、濃度１０ｐＭまたは１０００ｐＭ、
−２ａ／２ｂ／２ｃＨＣＶ遺伝子型に特異的な長鎖アンプリコン、１／１００希釈、
−１ａ／１ｂ、３ａまたは４ａ／４ｄ非特異的長鎖アンプリコン、１／１００希釈、
−ＨＢ単独、標的非含有、
から得られる。
【０３６７】
図１９に提示した結果は、４つのチオール官能基を有する、ベータ−アノマーの線形３ａプローブにより実施されたＥＬＯＳＡ試験に対応し、この線形プローブは、１００ｎＭの密度で、上記のプロトコルに従ってマレイミド基により被覆された支持体にグラフトされる。
【０３６８】
図１９の結果は、下記の標的：
−１５−ｍｅｒの３ａ特異的合成標的、濃度１０ｐＭまたは１０００ｐＭ、
−１５−ｍｅｒの１ａ／１ｂ、２ａ／２ｂ／２ｃまたは４ａ／４ｄ非特異的合成標的（陰性対照）、濃度１０ｐＭまたは１０００ｐＭ、
−３ａＨＣＶ遺伝子型に特異的な長鎖アンプリコン、１／１００希釈、
−１ａ／１ｂ、２ａ／２ｂ／２ｃまたは４ａ／４ｄ非特異的長鎖アンプリコン、１／１００希釈、
−ＨＢ単独、標的非含有、
から得られる。
【０３６９】
図２０に提示した結果は、４つのチオール官能基を有する、ベータ−アノマーの線形４ａ／４ｄプローブにより実施されたＥＬＯＳＡ試験に対応し、この線形プローブは、１００ｎＭの密度で、上記のプロトコルに従ってマレイミド基により被覆された支持体にグラフトされる。
【０３７０】
図２０の結果は、下記の標的：
−１５−ｍｅｒの４ａ／４ｄ特異的合成標的、濃度１０ｐＭまたは１０００ｐＭ、
−１５−ｍｅｒの１ａ／１ｂ、２ａ／２ｂ／２ｃまたは３ａ非特異的合成標的（陰性対照）、濃度１０ｐＭまたは１０００ｐＭ、
−４ａ／４ｄＨＣＶ遺伝子型に特異的な長鎖アンプリコン、１／１００希釈、
−１ａ／１ｂ、２ａ／２ｂ／２ｃまたは３ａ非特異的長鎖アンプリコン、１／１００希釈、
−ＨＢ（ハイブリダイゼーションバッファー）単独、標的非含有、
から得られる。
【０３７１】
アンプリコンを使用して実施した試験に関して、起源が異なるが同じ亜型のウイルス株から出発して実施した、３つの独立した検査の結果を、図１７から２０に提示する。
【０３７２】
図１７から２０に提示した結果は、本発明に従ったそれぞれのプローブ１ａ／１ｂ、２ａ／／２ｃ、２ｂ、３ａまたは４ａ／４ｄが、それに特異的な１５−ｍｅｒの合成標的（１０ｐＭの濃度を有する標的）とハイブリダイズ可能であるだけでなく、同じ遺伝子型の特異的アンプリコン（１／１００希釈）ともハイブリダイズ可能であることを示している。
これらの結果もまた、非特異的標的が検出可能な程度にハイブリダイズしないことを示している。
【０３７３】
[結果２：チオール官能基の数の効果の調査]
ＥＬＯＳＡ試験を、使用するプローブ中のチオール官能基の数を変化させ、異なるタイプおよび濃度の標的（１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒの短鎖合成標的、１４３ｎｔまたは１９１ｎｔの短鎖アンプリコン、４０１ｎｔの長鎖アンプリコン）を試験して、実施した。図１１に提示した結果は、１、２、４、６または８のチオール官能基を有する、ベータ−アノマーの線形１ａ／１ｂプローブ（上記）により実施したＥＬＯＳＡ試験に対応し、この線形プローブは、１００ｎＭの密度で、上記のプロトコルに従ってマレイミド基により被覆された支持体にグラフトされる。図１１の結果は、下記の標的：
−１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒの１ａ／１ｂ特異的合成標的、濃度１０ｐＭ、１００ｐＭまたは１０００ｐＭ、
−１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒの３ａ非特異的合成標的（陰性対照）、濃度１０ｐＭ、１００ｐＭまたは１０００ｐＭ、
−ＨＢ単独、標的非含有、
から得られる。
【０３７４】
各プローブ／標的のハイブリダイゼーション条件は、マイクロプレートにおいて三連に試験する。試験は、３回、プローブのグラフティングからハイブリダイゼーションの検出までのステップを、完全に３回（３つの異なるマイクロプレートにおいて）再現する。したがって、本出願に提示する結果は、９回の測定の平均値に対応する。
【０３７５】
図１１に得られた結果は、１５−ｍｅｒの１ａ／１ｂ特異的合成標的と、１ａ／１ｂプローブとのハイブリダイゼーションが、ひとたびチオールが存在すると、１０ｐＭの標的から検出可能であることを示す。１０５−ｍｅｒの１ａ／１ｂ特異的合成標的の検出は、今度は、プローブが２つのチオール官能基を含む場合１００ｐＭの標的濃度を必要とし、プローブが４、６または８つのチオール官能基を含む場合、１０ｐＭの標的濃度を必要とする。検出可能なハイブリダイゼーションは、１ａ／１ｂプローブに非特異的な３ａ標的の存在下で、それらのサイズ（１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒ）またはそれらの濃度（最大被験濃度：１０００ｐＭ）に関わらず、観察されない。したがってこの結果は、チオール官能基をグラフト化オリゴヌクレオチドプローブに加えることによって、問題となる標的の検出性能が改善されることを示している。使用するプローブ中の４つのチオール官能基の存在は、すべての合成標的（１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒ）を、１０ｐＭの濃度で検出可能にする。
【０３７６】
[結果３：グラフト密度の効果の調査]
図１２、１３および１４に提示した結果は、１、２または４つのチオール官能基を有する、ベータ−アノマーの線形１ａ／１ｂプローブ（上記を参照されたい）により実施されたＥＬＯＳＡ試験に対応し、このプローブは、１、１０、２５、５０または１００ｎＭの密度で、上記のプロトコルに従って、マレイミド基により被覆された支持体にグラフトされる。図１２は、モノチオールプローブ、すなわち、本発明に従った単一のチオール化合物を含むプローブに関して得られた結果を示す。図１３は、ジチオールプローブ、すなわち、本発明に従った２つのチオール化合物を含むプローブに関して得られた結果を示し、図１４は、テトラチオールプローブ、すなわち、本発明に従った４つのチオール化合物を含むプローブに関して得られた結果例示す。
【０３７７】
それぞれの事例において、ハイブリダイゼーション試験を、下記の標的： 
−１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒの１ａ／１ｂ特異的合成標的、濃度１０００ｐＭ、１００ｐＭまたは１０ｐＭ、
−１５−ｍｅｒまたは１０５−ｍｅｒの３ａ非特異的合成標的（陰性対照）、濃度、１０００ｐＭ、１００ｐＭまたは１０ｐＭ、
−ＨＢ単独、標的非含有、
により実施する。
【０３７８】
図１２、１３および１４に提示した結果は、検出可能なハイブリダイゼーションが、３ａ標的の存在下で後者の濃度とは独立して、観察されないという点で、１ａ／１ｂプローブと１ａ／１ｂ標的とのハイブリダイゼーションの特異性を確認している。
【０３７９】
これらの結果は、（１）使用するプローブ中の単一のチオールの存在は、１０５ｎｔのサイズを有する標的を検出可能にしないこと、（２）２つのチオール官能基から出発して、プローブと１０５ｎｔの標的との（特に、１００ｐＭの標的から出発して）との間のハイブリダイゼーションが検出可能になること、（３）テトラチオールプローブにより最もよい結果が得られること、を確認している。
【０３８０】
他方で、モノチオールプローブのグラフティングの密度は、どのような標的（１５−ｍｅｒおよび１０５−ｍｅｒ）であっても、ハイブリダイゼーションシグナルにあまり影響を与えず、一方で、ジチオールおよびテトラチオールプローブの場合、ハイブリダイゼーションは、グラフティング密度に用量依存性であると思われる。最も優れたプローブ／標的ハイブリダイゼーションシグナル（１５−ｍｅｒおよび１０５−ｍｅｒ）は、１００ｎＭでグラフトされたテトラチオールプローブにより得られる。
【０３８１】
[金表面を有する電極におけるプローブ／標的のハイブリダイゼーションの評価]
ハイブリダイゼーション試験を、１ａ／１ｂ特異的プローブ配列を、金表面を有する電極にグラフトすることによって実施した。
【０３８２】
配列番号１の配列のオリゴヌクレオチドを保有するテトラチオールプローブを、セルの金表面を有する作用電極にグラフトした。１０５−ｍｅｒの１ａ／１ｂ特異的標的（配列番号３）のハイブリダイゼーションを、３種の異なる標的濃度：１ｐＭ、１０ｐＭおよび１００ｐＭに関して評価した。陰性対照を、配列番号６（陰性対照）の１０５−ｍｅｒの３ａ特異的標的により実施する。
【０３８３】
ハイブリダイゼーション反応を、差次的パルスボルタンメトリーによりモニターする。得られた結果を図１５に提示する。
【０３８４】
ｙ軸の値は、電流変化の正規化された値に対応する。
【０３８５】
得られた結果は、電気化学によるハイブリダイゼーション試験が、１ｐＭの標的濃度において感度が高く、特異的であることを示している。シグナルの変動もまた、試験を１００ｐＭにおいて実施する場合よりも、１ｐＭにおいて大きくなると思われる。より高い標的濃度において、電極表面における標的の非特異的吸着の効果は、認識反応の有効性を低下させる。電気化学的方法では、ハイブリダイゼーション反応の定量的モニタリングは不可能である。にもかかわらず、電気化学的方法は、非常に高い感度で特異的応答の有無を供給する。
【実施例４】
【０３８６】
[フラビウイルス、例えばデングおよび西ナイルウイルスの検出への応用]
デングウイルス（血清型１、２、３および４）および西ナイルウイルスの公知の配列を、ＧｅｎＢａｎｋデータベースから抽出し解析した。表１は、アライメントの実施に使用したデングおよび西ナイルウイルスの配列のＧｅｎＢａｎｋ受託番号を載せている。
【０３８７】
【表２】
2015514402.tif 000049
【０３８８】
[デングまたは西ナイルの配列の認識のためのオリゴヌクレオチドプローブの設計]
アライメントおよび配列比較を、クラスタルＷ２およびＭｅｇａ５のソフトウェアを使用して実施し、４つの領域を規定し、そのうち、
−２つは、デングおよび西ナイルウイルスのすべて並びに他のフラビウイルス、例えば日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、黄熱病ウイルスおよびウスツウイルス（非限定的リスト）に保存されており、
−１つは、デングウイルスに保存されており、
−１つは、西ナイルウイルスに保存されている。
【０３８９】
これらの領域を、生体試料中のフラビウイルスの包括的検出またはデングウイルス、デング亜型４もしくは西ナイルウイルスの特異的検出を可能にする目的で、本発明に従ったプローブの設計に使用した。
【０３９０】
下記の表２に提示したプローブ１から３は、したがって、包括的に（デングおよび西ナイルフラビウイルスを含む）フラビウイルスの検出を可能にする。プローブ４は、血清型に関わらずデングウイルスに特異的である。プローブ５は、デングウイルスの血清型４に特異的である。プローブ６は、西ナイルウイルスに特異的である。
【０３９１】
【表３】
2015514402.tif 000050
【０３９２】
[プローブ１から６の認識特異性を試験するための標的の設計]
同定された６つの領域を含むそれぞれのアンプリコンを、表１に述べた配列から出発して、Scaramozzinoらにより記載されたプライマーおよびプロトコル(Scaramozzino N. ら、Comparison of Flavivirus universal primer pairs and development of a rapid, highly sensitive heminested reverse transcription-PCR assay for detection of flaviviruses targeted to a conserved region of the NS5 gene sequences. 2001. Journal of Clinical Microbiology 39: 1922-1927)を使用して、単純ＰＣＲを実施することによって調製する。
【０３９３】
ＰＣＲによる一次増幅は、
−ＭＡＭＤセンスプライマー：［Ｂｔｎ］−５’−ＡＡＣ−ＡＴＧ−ＡＴＧ−ＧＧＲ−ＡＡＲ−ＡＧＲ−ＧＡＲ−ＡＡ−３’（または［Ｂｔｎ］−配列番号２０）、および
−ｃＦＤ２アンチセンスプライマー（配列番号２１）：５’−ＧＴＧ−ＴＣＣ−ＣＡＧ−ＣＣＧ−ＧＣＧ−ＧＴＧ−ＴＣＡ−ＴＣＡ−ＧＣ−３’、
により実施される。
【０３９４】
この増幅は、２６３ｂｐの一次アンプリコンを得ることにつながる。
【０３９５】
ウイルス負荷が非常に低い場合、二次ＰＣＲを、初回のＰＣＲから得られた増幅産物をマトリックスとして使用して実施する。この「セミネスティッド（semi-nichee）」ＰＣＲは、有利な感度の上昇をもたらす。
【０３９６】
参照番号ＦＪ８８２５１７の、デングウイルスの株から出発する増幅後に得られた２６３ｂｐのアンプリコンの例は、配列：５’−ＡＡＣＡＴＧＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＡＣＴＡＧＧＡＧＡＧＴＴＣＧＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＡＧＧＡＡＧＴＣＧＴＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴＡＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＧＣＴＴＴＣＴＡＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴＣＡＴＧＡＡＣＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＡＡＡＣＴＴＧＧＡＴＡＴＡＴＡＣＴＣＡＧＡＧＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＡＣＡＴＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＧＡＴＧＧＧＡＣＡＣ−３’（配列番号２３）
を有する。
【０３９７】
参照番号ＥＦ４２９２００／Ｈ４４２の、西ナイルウイルスの株から出発する増幅後に得られた２６３ｂｐのアンプリコンの例は、配列：５’−ＡＡＣＡＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＧＴＴＣＧＧＣＡＡＧＧＣＴＡＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＧＧＡＴＴＣＣＴＣＡＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＧＴＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＧＣＴＴＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＡＣＡＴＣＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧＴＴＧＧＧＡＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＧＡＴＴＴＡＣＧＣＣＧＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＧＧＡＣＡＣ−３’（配列番号２５）
を有する。
【０３９８】
その後、必要に応じてＰＣＲによる二次増幅を、Scaramozzinoらにより公開されたプロトコルに従って、上記の一次アンプリコンをマトリックスとして使用して、：
−ＦＳ７７８センスプライマー：［Ｂｔｎ］５’−ＡＡＲ−ＧＧＨ−ＡＧＹ−ＭＣＤ−ＧＣＨ−ＡＴＨ−ＴＧＧ−Ｔ−３’（または［Ｂｔｎ］−配列番号２２）、および
−ｃＦＤ２アンチセンスプライマー（配列番号２１）：５’−ＧＴＧ−ＴＣＣ−ＣＡＧ−ＣＣＧ−ＧＣＧ−ＧＴＧ−ＴＣＡ−ＴＣＡ−ＧＣ−３’、
により場合により実施してもよい。
この増幅は、２１５ｂｐの二次アンプリコンを得ることにつながる。
【０３９９】
参照番号ＦＪ８８２５１７の、デングウイルスの株から出発する増幅後に得られた２１５ｂｐのアンプリコンの例は、配列：５’−ＡＡＡＧＧＡＡＧＴＣＧＴＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴＡＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＡＧＣＡＣＧＣＴＴＴＣＴＡＧＡＧＴＴＣＧＡＡＧＣＴＣＴＴＧＧＴＴＴＣＡＴＧＡＡＣＧＡＡＧＡＴＣＡＣＴＧＧＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＡＧＣＧＧＡＧＴＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＣＴＣＣＡＣＡＡＡＣＴＴＧＧＡＴＡＴＡＴＡＣＴＣＡＧＡＧＡＣＡＴＡＴＣＡＡＡＧＡＴＴＣＣＡＧＧＧＧＧＡＡＡＣＡＴＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧＣＣＧＧＡＴＧＧＧＡＣＡＣ−３’（配列番号２４）
を有する。
【０４００】
参照番号ＥＦ４２９２００／Ｈ４４２の、西ナイルウイルスの株から出発する増幅後に得られた２１５ｂｐのアンプリコンの例は、配列：５’−ＡＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＴＧＴＧＧＣＴＧＧＧＧＧＣＴＣＧＴＴＴＣＣＴＧＧＡＧＴＴＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＧＧＡＴＴＣＣＴＣＡＡＴＧＡＡＧＡＣＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧＧＴＡＧＧＡＡＧＡＡＣＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＴＴＧＡＡＧＧＣＴＴＡＧＧＡＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＴＴＧＧＧＴＡＣＡＴＣＴＴＧＡＡＧＧＡＡＧＴＴＧＧＧＡＣＡＡＡＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＧＡＴＴＴＡＣＧＣＣＧＡＴＧＡＴＡＣＣＧＣＡＧＧＣＴＧＧＧＡＣＡＣ−３’（配列番号２６）
を有する。
【０４０１】
別の実施形態において、アンプリコンは、フラビウイルス、デングまたは西ナイルウイルスのＲＮＡから、非対称ＲＴ−ＰＣＲにより調製される。ウイルスのＲＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製されたデングウイルス（１−４）および西ナイルウイルス（アメリカ起源のＮＹまたはアフリカのＡｆ）から抽出する。２６３ｂｐのアンプリコンを、フラビウイルスのＮＳ５ウイルス領域から、上記の各ＲＮＡ試料から出発してＲＴ−ＰＣＲにより作製する。逆転写ステップ（ＡＴ）を実施するために、５μＬのＲＮＡを７２℃で１０分間変性させ、全量２０μＬ中４μＬの５Ｘ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、２μＬの１０Ｘ  Ｈｅｘａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｍｉｘ（Ｒｏｃｈｅ）、２μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および２００ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で逆転写させる。逆転写条件は、下記：１０分２５℃、６０分４２℃および１０分９５℃のとおりである。その後、５マイクロリットルのｃＤＮＡを、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）により、プライマー：
−ビオチン化「ＭＡＭＤ」センスフラビウイルス（配列：［Ｂｔｎ］−ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＧＧＲ  ＡＡＲ  ＡＧＲ  ＧＡＲ  ＡＡ（または［Ｂｔｎ］−配列番号２０））および
−「ｃＦＤ２」アンチセンスフラビウイルス（配列ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＣＡＧ  ＣＣＧ  ＧＣＧ  ＧＴＧ  ＴＣＡ  ＴＣＡ  ＧＣ（配列番号２１））（Scaramozzino N.ら、2001年、Journal of Clinical Microbiology 39: 1922-1927頁を参照されたい）
を使用して増幅させる。
【０４０２】
非対称増幅反応を、ＭｇＣｌ２非含有１Ｘ  ＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２μＭのＭＡＭＤ、０．０２μＭのｃＦＤ２、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ  ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および１．５ＵのＴａｑ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む５０μＬの反応混合物において実施する。ＰＣＲ条件は、下記：５分９５℃、４０サイクル（変性：４０秒、９４℃；ハイブリダイゼーション：４０秒、５３℃；伸長：５０秒、７２℃）、および最終伸長の１０分７２℃、のとおりである。得られたアンプリコンを、アガロースゲル電気泳動により解析し、アリコートを採取し、使用まで−２０℃において保存する。元々のウイルス遺伝子型が公知であるこれらのアンプリコンを、ライブラリの形態で保存する。
【０４０３】
５’末端においてビオチン化された１５−ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドは、上で選択されたプローブ、すなわち、フラビウイルス検出用の包括的プローブ３、西ナイルウイルス検出用の包括的プローブおよびデングウイルスの血清型４に特異的なプローブに、厳密に相補的である。これらの合成オリゴヌクレオチドは、下記の配列：
−フラビウイルスに特異的な１４−ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドは、配列：５’［Ｂｔｎ］−ＴＧＧ  ＴＷＣ  ＡＴＧ  ＴＧＧ  ＣＴ−３’（または［Ｂｔｎ］−配列番号４３）を有し；
−西ナイルウイルスに特異的な１５−ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドは、配列：５’［Ｂｔｎ］−ＡＧＡ  ＡＹＴ  ＣＡＧ  ＧＡＧ  ＧＭＧ−３’（または［Ｂｔｎ］−配列番号４２）および
−デングウイルスの血清型４に特異的な１５−ｍｅｒの合成オリゴヌクレオチドは、配列：５’［Ｂｔｎ］−ＴＣＡ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＧＧＡ  ＧＴＧ−３’（または［Ｂｔｎ］−配列番号４４）を有する。
【０４０４】
ハイブリダイゼーション試験を、フラビウイルスを一般的に認識するプローブ３（図２１を参照されたい）、デングの血清型４を特異的に認識するプローブ５（図２２を参照されたい）および西ナイルウイルスを認識するプローブ６（図２３を参照されたい）により実施する。４つのチオール官能基を有するプローブを、２００ｎＭの密度で、上記のプロトコルに従ってマレイミド基により被覆された支持体にグラフトする。次いで、保持されたプローブの特異性を検証するために、ＥＬＯＳＡ試験を、デングの血清型１、２、３または４、アメリカ起源（ＮＹ）もしくはアフリカ（Ａｆ）の西ナイルウイルスまたはＣ型肝炎ウイルス（長鎖３ａアンプリコン）から調製したアンプリコンを、プローブ３に関しては１／１０希釈およびプローブ５および６に関しては１／５０で使用して実施する。図２１、２２および２３のダイアグラムにおいて、「試料／バックグラウンドノイズ」の値を、各試料に関して測定されたカウント数対、標的を含まないハイブリダイゼーションバッファー単独に対応する対照（ＨＢ）に関して測定されたカウント数の比を計算することによって得る。これら試験に使用されたデングウイルスおよび西ナイルウイルスのアンプリコンは、上記の非対称ＲＴ−ＰＣＲの方法により得た。
【０４０５】
図２１、２２および２３に提示した結果は、フラビウイルス包括的プローブ、デング特異的プローブ４および西ナイルウイルス包括的プローブが、問題となるウイルスに対応するアンプリコンとだけ有意にハイブリダイズすることを示している。
【図１】
2015514402.tif 000055
【図２Ａ】
2015514402.tif 000056
【図２Ｂ】
2015514402.tif 000057
【図３】
2015514402.tif 000058
【図４】
2015514402.tif 000059
【図５】
2015514402.tif 000060
【図６】
2015514402.tif 000061
【図７】
2015514402.tif 000062
【図８】
2015514402.tif 000063
【図９】
2015514402.tif 000064
【図１０】
2015514402.tif 000065
【図１１】
2015514402.tif 000066
【図１２】
2015514402.tif 000067
【図１３】
2015514402.tif 000068
【図１４】
2015514402.tif 000069
【図１５】
2015514402.tif 000070
【図１６ａ】
2015514402.tif 000071
【図１６ｂ】
2015514402.tif 000072
【図１７】
2015514402.tif 000073
【図１８】
2015514402.tif 000074
【図１９】
2015514402.tif 000075
【図２０】
2015514402.tif 000076
【図２１】
2015514402.tif 000077
【図２２】
2015514402.tif 000078
【図２３】
2015514402.tif 000079
【配列表】
2015514402000001.app
【国際調査報告】
2015514402.tif 000080
2015514402.tif 000081
2015514402.tif 000082
2015514402.tif 000083