(57)【要約】本発明は、末梢血管疾患（ＰＶＤ）の処置のための組成物および方法に関する。特に、本発明は、アンジオテンシン−（１−７）ペプチドまたは機能的同等物、類似体もしくは誘導体、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト、ＡＣＥ２および／またはＡＣＥ２アクチベーターの使用に基づく、重症虚血肢、および関連する疾患、障害または状態の処置のための組成物および方法を提供する。一局面において、末梢血管疾患を処置するための方法が提供され、この方法は、アンジオテンシン（１−７）ペプチドを含む医薬組成物を、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織への血流の部分的または完全な閉塞によって特徴付けられる末梢血管疾患を患っている個体に投与するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血管疾患を処置するための方法であって、アンジオテンシン（１−７）ペプチドを含む医薬組成物を、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織への血流の部分的または完全な閉塞によって特徴付けられる末梢血管疾患を患っている個体に投与するステップを含み、前記アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、前記末梢血管疾患の少なくとも１つの症状または特徴が強度、重症度、もしくは頻度において低減し、または発症が遅延するように、治療有効量で投与される、方法。
【請求項２】
前記アンジオテンシン（１−７）ペプチドが、Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｔｙｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｐｒｏ７（配列番号１）の天然に存在するアンジオテンシン（１−７）アミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アンジオテンシン（１−７）ペプチドが、天然に存在するアンジオテンシン（１−７）の機能的同等物である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記機能的同等物が、直鎖状ペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記直鎖状ペプチドが、前記天然に存在するアンジオテンシン（１−７）において出現する７個のアミノ酸からの少なくとも４個のアミノ酸を含む配列を含み、
前記少なくとも４個のアミノ酸は、これらが前記天然に存在するアンジオテンシン（１−７）において出現する相対的位置を維持し、
さらに、前記直鎖状ペプチドは、血管形成促進活性を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記直鎖状ペプチドが、前記天然に存在するアンジオテンシン（１−７）において出現する７個のアミノ酸からの少なくとも５個のアミノ酸を含む配列を含み、
前記少なくとも５個のアミノ酸は、これらが前記天然に存在するアンジオテンシン（１−７）において出現する相対的位置を維持し、
さらに、前記直鎖状ペプチドは、血管形成促進活性を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記直鎖状ペプチドが、前記天然に存在するアンジオテンシン（１−７）において出現する７個のアミノ酸からの少なくとも６個のアミノ酸を含む配列を含み、
前記少なくとも６個のアミノ酸は、これらが前記天然に存在するアンジオテンシン（１−７）において出現する相対的位置を維持し、
さらに、前記直鎖状ペプチドは、血管形成促進活性を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
それぞれ、前記少なくとも４個、５個または６個のアミノ酸が、これらが前記天然に存在するアンジオテンシン（１−７）において出現する相対的な間隔をさらに維持する、請求項５から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記直鎖状ペプチドが、４〜２５個のアミノ酸を含有する、請求項４から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記直鎖状ペプチドが、前記天然に存在するアンジオテンシン（１−７）のフラグメントである、請求項４から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記直鎖状ペプチドが、前記天然に存在するアンジオテンシン（１−７）においてアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含有する、請求項４から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記直鎖状ペプチドが、Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｎｌｅ３−Ｔｙｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｐｒｏ７（配列番号４）のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記直鎖状ペプチドが、Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｓｅｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｃｙｓ７（配列番号５）のアミノ酸配列を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記機能的同等物が、環状ペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記環状ペプチドが、アミノ酸の間に連結を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記連結が、天然に存在するアンジオテンシン（１−７）におけるＴｙｒ４位およびＰｒｏ７位に対応する残基に位置している、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記連結が、チオエーテル架橋である、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記環状ペプチドが、Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｔｙｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｐｒｏ７（配列番号１）の前記天然に存在するアンジオテンシン（１−７）アミノ酸配列とその他の点で同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記環状ペプチドが、天然に存在するアンジオテンシン（１−７）におけるＶａｌ３位を置き換えるノルロイシン（Ｎｌｅ）を含む、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記環状ペプチドが、下記の式：
【化１０】
2015508759.tif 000020
を有する４，７−環化アンジオテンシン（１−７）である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アンジオテンシン（１−７）ペプチドが、プロテアーゼ耐性、血清安定性および／またはバイオアベイラビリティーを増加させる１つまたは複数の化学修飾を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つまたは複数の化学修飾が、ペグ化を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記心臓および脳の外側の前記１つまたは複数の組織が、前記個体の１つまたは複数の肢を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記末梢血管疾患が、末梢動脈疾患である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記末梢動脈疾患が、重症虚血肢である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記末梢血管疾患が、急性虚血である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記末梢血管疾患が、慢性虚血である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記末梢血管疾患が、糖尿病性血管疾患である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記糖尿病性血管疾患が、ネフロパシーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記糖尿病性血管疾患が、ニューロパシーである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記アンジオテンシン（１−７）が、前記心臓および脳の外側の前記１つまたは複数の組織における血管形成および／または血管新生を誘発および／または増加させる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記アンジオテンシン（１−７）が、前記心臓および脳の外側の前記１つまたは複数の組織における細胞死を減少および／または遅延させる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞死が、アポトーシスである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞死が、ネクローシスである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記アンジオテンシン（１−７）が、前記心臓および脳の外側の前記１つまたは複数の組織における細胞生存を増加および／または増強させる、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記治療有効量の前記アンジオテンシン（１−７）が、前記心臓および脳の外側の前記１つまたは複数の組織への血流の部分的または全面的な閉塞を減少させるのに十分である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記治療有効量の前記アンジオテンシン（１−７）が、前記心臓および脳の外側の前記１つまたは複数の組織における組織の損傷を減少または遅延させるのに十分である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記治療有効量の前記アンジオテンシンが、前記心臓および脳の外側の前記１つまたは複数の組織の機能を改善させるのに十分である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記アンジオテンシン（１−７）が、非経口的に投与される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記非経口投与が、静脈内、皮内、吸入、経皮的（局所的）、皮下および／または経粘膜投与から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記アンジオテンシン（１−７）が、経口的に投与される、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記組成物が、シクロデキストリンをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記アンジオテンシン（１−７）が、隔月、毎月、３週間に１回、隔週、毎週、毎日、または可変間隔で投与される、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記アンジオテンシン（１−７）と組み合わせて血管形成促進剤を投与することをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記心臓および脳の外側の前記１つまたは複数の組織に対する血管手順または血管内手順を行うことをさらに含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
末梢血管疾患を処置するための方法であって、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を含む医薬組成物を、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織への血流の部分的または完全な閉塞によって特徴付けられる末梢血管疾患を患っている個体に投与するステップを含む、方法。
【請求項４７】
末梢血管疾患を処置するための方法であって、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）のアクチベーターを含む医薬組成物を、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織への血流の部分的または完全な閉塞によって特徴付けられる末梢血管疾患を患っている個体に投与するステップを含み、
ＡＣＥ２の前記アクチベーターは、ジミナゼンアセチュレート（ＤＩＺＥ）および／または１−［（２−ジメチルアミノ）エチルアミノ］−４−（ヒドロキシメチル）−７−［（４−メチルフェニル）スルホニルオキシ］−９Ｈ−キサンテン−９−オン（ＸＮＴ）である、方法。
【請求項４８】
末梢血管疾患を処置するための方法であって、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストを含む医薬組成物を、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織への血流の部分的または完全な閉塞によって特徴付けられる末梢血管疾患を患っている個体に投与するステップを含み、
前記アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストは、以下の式：
【化１１】
2015508759.tif 000021
を有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１２年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／５９７，２２３号および２０１２年１０月３０日に出願された米国仮特許出願第６１／７２０，３０１号（これらの開示は、それらの全体が参考として本明細書に援用される）からの優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本明細書は、２０１３年２月７日の「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ」という名称のＡＳＣＩＩテキストファイルとして電子的に提出した配列一覧を参照する。テキストファイルは２０１３年１月３１日に作製し、サイズは３９ＫＢである。配列一覧の全内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
末梢血管疾患（ＰＶＤ）は一般に、心臓または脳の外側の血管系の部分的または完全な閉塞によって特徴付けられ、とりわけ、アテローム性動脈硬化、狭窄をもたらす炎症過程、塞栓形成、または血栓形成に起因し得る。末梢動脈疾患（ＰＡＤ）は、様々な内部器官および／または肢への動脈血供給の部分的または全面的な閉塞が存在するＰＶＤの一形態である。ＰＡＤについての危険因子には、血中コレステロールの上昇、糖尿病、喫煙、高血圧、不活動、および肥満が含まれる。５０歳を超えた人の約５％は、ＰＡＤを患っていると考えられる。ＰＡＤの症状は、閉塞された動脈の位置および程度によって決まる。ＰＡＤの最も一般の症状は、歩行の間に起こり、安静時に消失する疼痛（通常、ふくらはぎにおける）によって顕在化する間欠性跛行である。経時的にＰＡＤの重症度が上昇すると、症状はより短い期間の運動の後に現れる。ＰＡＤがより重度となるとき、症状は、夜間の疼痛およびけいれん、足またはつま先における疼痛または刺痛、脚を上げているときに悪化し、（例えば、ベッドの側面上に）脚をぶら下げているときに消失する疼痛、および治癒しない潰瘍を含み得る。ＰＡＤは、四肢における治癒しない皮膚のただれ、潰瘍、壊疽、および／または感染によって一般に特徴付けられる重症虚血肢（ＣＬＩ）の段階に最終的に達し得る。多くの場合、切断が必要となり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
ＰＶＤ（例えば、ＰＡＤ）は、生活習慣の変更、医薬品、血管形成術および関連する処置、または手術によって処置することができる。これらの治療は症状を軽減し、生存期間を延長さえし得るが、何も疾病過程を逆行させ、長く続く損傷を直接修復することはできない。損なわれた血管形成は、虚血性疾患の特徴の１つである。治療的血管形成のための最も確立された標的はＶＥＧＦおよびその受容体であった。しかし、虚血を軽減する臨床治験は期待に背くものであった。このように、ＰＶＤ（例えば、ＣＬＩなどのＰＡＤ）または損なわれた血管形成と関連する他の疾患、障害または状態の処置は、未だ対処されていない主要な医療的必要性であり続けている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、とりわけ、アンジオテンシン−（１−７）ペプチドまたは機能的同等物、類似体もしくは誘導体、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト、ＡＣＥ２および／またはＡＣＥ２アクチベーターに基づく、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、例えば、重症虚血肢（ＣＬＩ）、および損なわれた血管形成と関連する他の疾患、障害または状態の、改善されおよびより有効な処置を提供する。本発明は、部分的に、アンジオテンシン（１−７）として公知の短い７個のアミノ酸ペプチドの投与が、後肢虚血の動物モデルにおいて血流を効果的に回復させ、肢機能を改善させ、虚血による切断を減少させることができるという予期せぬ発見に基づいている。本発明の前に、アンジオテンシン（１−７）は、主要な血管形成促進タンパク質である血管内皮増殖因子−Ａを低減させることによって有意な血管形成抑制活性を有することが報告されていたため、この発見は特に驚くべきことである（Ｓｏｔｏ−Ｐａｎｔｏｊａ  Ｄ．  Ｒ．ら、「Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−（１−７）  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ」、Ｍｏｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．、２００９年；８巻（６号）：１６７６〜８３頁）を参照されたい）。しかし、下の実施例のセクションに詳細に記載されているように、動物後肢虚血モデルにおける天然に存在するアンジオテンシン（１−７）と同一の７個のアミノ酸を有するアンジオテンシンペプチドの投与は、血流を効果的に回復させ、改善された肢機能、組織の壊死および虚血による切断の低減をもたらすことを本発明者らは首尾よく示した。このように、先の報告に反して、本発明は、治療的血管形成を刺激するために使用することができるアンジオテンシンに基づく治療法、ならびに重症虚血肢、および損なわれた血管形成と関連する他の疾患、障害または状態の処置を提供する。
【０００６】
このように、一態様において、本発明は、アンジオテンシン（１−７）ペプチドを含有する医薬組成物を、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織への血流の部分的または完全な閉塞によって特徴付けられる末梢血管疾患を患っている個体に投与するステップを含む、末梢血管疾患を処置するための方法を提供し、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、末梢血管疾患の少なくとも１つの症状または特徴が強度、重症度、もしくは頻度において低減し、または発症が遅延するように、治療有効量で投与される。本明細書において使用する場合、「アンジオテンシン（１−７）ペプチド」という用語は、天然に存在するアンジオテンシン（１−７）、および天然に存在するアンジオテンシン（１−７）の任意の機能的同等物、類似体または誘導体の両方を指す。本明細書において使用する場合、「ペプチド」および「ポリペプチド」は互換的な用語であり、ペプチド結合によって一緒に結合している２個以上のアミノ酸を指す。本明細書において使用する場合、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、直鎖状および環状ペプチドの両方を含む。
【０００７】
様々な実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｔｙｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｐｒｏ７（配列番号１）の天然に存在するアンジオテンシン（１−７）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、天然に存在するアンジオテンシン（１−７）の機能的同等物である。特定の実施形態において、機能的同等物は、直鎖状ペプチドである。
【０００８】
いくつかの実施形態において、直鎖状ペプチドは、天然に存在するアンジオテンシン（１−７）において出現する７個のアミノ酸からの、それぞれ、少なくとも４個、５個または６個のアミノ酸を含む配列を含有し、それぞれ、少なくとも４個、５個または６個のアミノ酸は、これらが天然に存在するアンジオテンシン（１−７）において出現する相対的位置を維持し、各直鎖状ペプチドは、血管形成促進（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）活性をさらに有する。様々な実施形態において、それぞれ、少なくとも４個、５個または６個のアミノ酸は、これらが天然に存在するアンジオテンシン（１−７）において出現するようなそれらの相対的な間隔をさらに維持する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、直鎖状ペプチドは、４〜２５個のアミノ酸（例えば、４〜２０個、４〜１５個、４〜１４個、４〜１３個、４〜１２個、４〜１１個、４〜１０個、４〜９個、４〜８個、４〜７個のアミノ酸）を含有する。
【００１０】
特定の実施形態において、直鎖状ペプチドは、天然に存在するアンジオテンシン（１−７）のフラグメントである。様々な実施形態において、直鎖状ペプチドは、天然に存在するアンジオテンシン（Ａａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）（１−７）におけるアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含有する。特定の実施形態において、直鎖状ペプチドは、Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｎｌｅ３−Ｔｙｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｐｒｏ７（配列番号４）のアミノ酸配列またはＡｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｓｅｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｃｙｓ７（配列番号５）のアミノ酸配列を有する。
【００１１】
様々な実施形態において、機能的同等物は、環状ペプチドである。特定の実施形態において、環状ペプチドは、アミノ酸の間に連結を含む。いくつかの実施形態において、連結は、天然に存在するアンジオテンシン（１−７）におけるＴｙｒ４位およびＰｒｏ７位に対応する残基に位置している。特定の実施形態において、連結は、チオエーテル架橋である。様々な実施形態において、環状ペプチドは、Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｔｙｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｐｒｏ７（配列番号１）の天然に存在するアンジオテンシン（１−７）アミノ酸配列とその他の点で同一であるアミノ酸配列を含有し、または環状ペプチドは、天然に存在するアンジオテンシン（１−７）におけるＶａｌ３位を置き換えるノルロイシン（Ｎｌｅ）を含む。いくつかの実施形態において、環状ペプチドは、下記の式：
【００１２】
【化１】
2015508759.tif 000002
【００１３】
を有する４，７−環化アンジオテンシン（１−７）である。
【００１４】
様々な実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、プロテアーゼ耐性、血清安定性および／またはバイオアベイラビリティーを増加させる１つまたは複数の化学修飾を含有する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の化学修飾は、ペグ化を含む。
【００１５】
特定の実施形態において、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織は、個体の１つまたは複数の肢を含む。
【００１６】
様々な実施形態において、末梢血管疾患は、末梢動脈疾患である。いくつかの実施形態において、末梢動脈疾患は、重症虚血肢である。特定の実施形態において、末梢血管疾患は、急性虚血、慢性虚血であり、または糖尿病性血管疾患である。いくつかの実施形態において、糖尿病性血管疾患は、ネフロパシーおよび／またはニューロパシーである。
【００１７】
様々な実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織における血管形成および／または血管新生を誘発および／または増加させる。特定の実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織において細胞死を減少および／または遅延させる。いくつかの実施形態において、細胞死は、アポトーシスまたはネクローシスである。特定の実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織において細胞生存を増加および／または増強させる。
【００１８】
様々な実施形態において、治療有効量のアンジオテンシン（１−７）ペプチドは、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織への血流の部分的または全面的な閉塞を減少させるのに十分である。いくつかの実施形態において、治療有効量のアンジオテンシン（１−７）ペプチドは、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織における組織の損傷を減少または遅延させるのに十分である。特定の実施形態において、治療有効量のアンジオテンシンは、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織の機能を改善するのに十分である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、非経口的に投与される。特定の実施形態において、非経口投与は、静脈内、皮内、吸入、経皮的（局所的）、皮下、および／または経粘膜投与から選択される。様々な実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、経口的に投与される。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、シクロデキストリンと併せて投与される。特定の実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、隔月、毎月、３週間に１回、隔週、毎週、毎日、または可変間隔で投与される。
【００２０】
様々な実施形態は、異なる量のアンジオテンシン（１−７）ペプチドを使用し得ることが意図される。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、約１〜１，０００μｇ／ｋｇ／日の範囲（例えば、約１〜９００μｇ／ｋｇ／日、約１〜８００μｇ／ｋｇ／日、約１〜７００μｇ／ｋｇ／日、約１〜６００μｇ／ｋｇ／日、約１〜５００μｇ／ｋｇ／日、約１〜４００μｇ／ｋｇ／日、約１〜３００μｇ／ｋｇ／日、約１〜２００μｇ／ｋｇ／日、約１〜１００μｇ／ｋｇ／日、約１〜９０μｇ／ｋｇ／日、約１〜８０μｇ／ｋｇ／日、約１〜７０μｇ／ｋｇ／日、約１〜６０μｇ／ｋｇ／日、約１〜５０μｇ／ｋｇ／日、約１〜４０μｇ／ｋｇ／日、約１〜３０μｇ／ｋｇ／日、約１〜２０μｇ／ｋｇ／日、約１〜１０μｇ／ｋｇ／日の範囲）の有効用量で投与される。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、約１〜５００μｇ／ｋｇ／日の範囲の有効用量で投与される。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、約１〜１００μｇ／ｋｇ／日の範囲の有効用量で投与される。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、約１〜６０μｇ／ｋｇ／日の範囲の有効用量で投与される。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、約１ｕｇ／ｋｇ／日、約２ｕｇ／ｋｇ／日、約４ｕｇ／ｋｇ／日、約６ｕｇ／ｋｇ／日、約８ｕｇ／ｋｇ／日、約１０ｕｇ／ｋｇ／日、約１５ｕｇ／ｋｇ／日、約２０ｕｇ／ｋｇ／日、約２５ｕｇ／ｋｇ／日、約３０ｕｇ／ｋｇ／日、約３５ｕｇ／ｋｇ／日、約４０ｕｇ／ｋｇ／日、約４５ｕｇ／ｋｇ／日、約５０ｕｇ／ｋｇ／日、約７５ｕｇ／ｋｇ／日、約１００ｕｇ／ｋｇ／日、約１５０ｕｇ／ｋｇ／日、約２００ｕｇ／ｋｇ／日、約２５０ｕｇ／ｋｇ／日、約３００ｕｇ／ｋｇ／日、約３５０ｕｇ／ｋｇ／日、約４００ｕｇ／ｋｇ／日、約４５０ｕｇ／ｋｇ／日、約５００ｕｇ／ｋｇ／日、約５５０ｕｇ／ｋｇ／日、約６００ｕｇ／ｋｇ／日、約６５０ｕｇ／ｋｇ／日、約７００ｕｇ／ｋｇ／日、約７５０ｕｇ／ｋｇ／日、約８００ｕｇ／ｋｇ／日、約８５０ｕｇ／ｋｇ／日、約９００ｕｇ／ｋｇ／日、約９５０ｕｇ／ｋｇ／日、または約１，０００ｕｇ／ｋｇ／日から選択される有効用量で投与される。
【００２１】
特定の実施形態において、血管形成促進剤は、アンジオテンシン（１−７）ペプチドと組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、血管手順または血管内手順は、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織において行われる。
【００２２】
別の態様において、本発明は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を使用した末梢血管疾患を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を含む医薬組成物を、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織への血流の部分的または完全な閉塞によって特徴付けられる末梢血管疾患を患っている個体に投与するステップを含む、末梢血管疾患を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＡＣＥ２は、末梢血管疾患の少なくとも１つの症状または特徴が強度、重症度、もしくは頻度において低減し、または発症が遅延するように、治療有効量で投与される。
【００２３】
また別の態様において、本発明は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）のアクチベーターを使用した末梢血管疾患を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）のアクチベーターを含む医薬組成物を、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織への血流の部分的または完全な閉塞によって特徴付けられる末梢血管疾患を患っている個体に投与するステップを含む、末梢血管疾患を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、ＡＣＥ２の適切なアクチベーターは、ジミナゼンアセチュレート（ＤＩＺＥ）および／または１−［（２−ジメチルアミノ）エチルアミノ］−４−（ヒドロキシメチル）−７−［（４−メチルフェニル）スルホニルオキシ］−９Ｈ−キサンテン−９−オン（ＸＮＴ）である。いくつかの実施形態において、ＡＣＥ２のアクチベーターは、末梢血管疾患の少なくとも１つの症状または特徴が強度、重症度、もしくは頻度において低減し、または発症が遅延するように、治療有効量で投与される。
【００２４】
さらに別の態様において、本発明は、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストを使用した末梢血管疾患を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本発明は、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストを含む医薬組成物を、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織への血流の部分的または完全な閉塞によって特徴付けられる末梢血管疾患を患っている個体に投与するステップを含む、末梢血管疾患を処置するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、適切なアンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストは、
【００２５】
【化２】
2015508759.tif 000003
【００２６】
の式を有する。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストは、末梢血管疾患の少なくとも１つの症状または特徴が強度、重症度、もしくは頻度において低減し、または発症が遅延するように、治療有効量で投与される。
【００２７】
本出願において、「または」の使用は、特に断りのない限り、「および／または」を意味する。本出願において使用されるように、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語およびこの用語のバリエーション、例えば、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、他の添加物、成分、整数またはステップを除外することを意図しない。本出願において使用されるように、「約」および「概ね」という用語は、同等物として使用される。約／概ねの有無に関わらず、本出願において使用される任意の数字は、関連性のある技術分野における当業者が認識する任意の通常の変動をカバーすることを意味する。特定の実施形態において、「概ね」または「約」という用語は、特に明記しない限り、または文脈からその他の点で明らかでない限り（このような数が可能な値の１００％を超える場合を除いて）、記述された参照値のいずれかの方向（これを超えるまたはこれ未満）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはこれ未満の範囲に入る値の範囲を指す。
【００２８】
本発明の他の特徴、目的、および利点は、下記の詳細な記載、図面および特許請求の範囲において明らかである。しかし、詳細な記載、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示す一方、限定ではなく例示としてのみ示されることを理解すべきである。本発明の範囲内で様々な変更および修正は当業者には明らかであろう。
【００２９】
図面は、例示をする目的のみのためであり、限定のためではない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、ＴＸＡ１２７またはＤＰＢＳビヒクルを受けたマウスにおける後肢虚血の誘発の４９日後までの例示的な体重測定を示す。
【図２】図２は、ＴＸＡ１２７またはＤＰＢＳビヒクルを受けたマウスにおける後肢虚血の誘発の４９日後までの例示的な血流測定を示す。
【図３】図３は、ＴＸＡ１２７またはＤＰＢＳビヒクルを受けたマウスにおける後肢虚血の誘発の４９日後までの例示的な肢壊死スコアを示す。
【図４】図４は、ＴＸＡ１２７またはＤＰＢＳビヒクルを受けたマウスにおける後肢虚血の誘発の４９日後までの例示的な手足の切断の動態を示す。
【図５】図５は、ＴＸＡ１２７またはＤＰＢＳビヒクルを受けたマウスにおける後肢虚血の誘発の４９日後までの例示的な肢機能スコアを示す。
【図６】図６は、分析の「最終観察繰越」法を使用することによる、ＴＸＡ１２７またはＤＰＢＳビヒクルを受けたマウスにおける後肢虚血の誘発の４９日後までの例示的な肢機能スコアを示す。
【図７】図７は、ＰａｎＣｙｔｅまたはＤＰＢＳビヒクルを受けたマウスにおける後肢虚血の誘発の４９日後までの例示的な体重測定を示す。
【図８】図８は、ＰａｎＣｙｔｅまたはＤＰＢＳビヒクルを受けたマウスにおける後肢虚血の誘発の４９日後までの例示的な血流測定を示す。
【図９】図９は、ＰａｎＣｙｔｅまたはＤＰＢＳビヒクルを受けたマウスにおける後肢虚血の誘発の４９日後までの例示的な肢機能スコアを示す。
【図１０】図１０は、ＰａｎＣｙｔｅまたはＤＰＢＳビヒクルを受けたマウスにおける後肢虚血の誘発の４９日後の例示的な毛細血管密度の測定を示す。
【図１１】図１１は、ＰａｎＣｙｔｅまたはＤＰＢＳビヒクルを受けたマウスにおける後肢虚血の誘発の４９日後までの例示的な体重測定を示す。
【図１２】図１２は、ＰａｎＣｙｔｅまたはＤＰＢＳビヒクルを受けたマウスにおける後肢虚血の誘発の４９日後までの例示的な血流測定を示す。
【図１３】図１３は、ＰａｎＣｙｔｅまたはＤＰＢＳビヒクルを受けたマウスにおける後肢虚血の誘発の４９日後までの例示的な肢機能スコアを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
定義
本発明がより容易に理解されるように、特定の用語を最初に下に定義する。下記の用語および他の用語についてのさらなる定義を、明細書を通して記載する。
【００３２】
急性：本明細書において使用する場合、「急性」という用語は、組織の損傷および関連する疾患、障害、または状態に関連して使用されるとき、医学の技術分野における当業者によって理解される意味を有する。例えば、この用語は典型的には、症状の急激または重度の発症が存在する疾患、障害、または状態を指す。いくつかの実施形態において、急性損傷は、虚血性または外傷性事象による。典型的には、「急性」という用語は、「慢性」という用語と対照的に使用される。
【００３３】
アゴニスト：本明細書において使用する場合、「アゴニスト」という用語は、対象とするタンパク質の機能においてプラスの影響を有する任意の分子を指す。いくつかの実施形態において、アゴニストは、対象とするタンパク質の活性を直接的もしくは間接的に増強し、強化し、活性化し、かつ／または増加させる。特定の実施形態において、アゴニストは、対象とするタンパク質と直接的に相互作用する。このようなアゴニストは、例えば、タンパク質、化合物、小分子、核酸、抗体、薬物、リガンド、または他の薬剤でよい。
【００３４】
動物：本明細書において使用する場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、発達の任意の段階におけるヒトを指す。いくつかの実施形態において、「動物」は、発達の任意の段階におけるヒトではない動物を指す。特定の実施形態において、ヒトではない動物は、哺乳動物（例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。いくつかの実施形態において、動物には、これらに限定されないが、哺乳動物、鳥、爬虫類、両生類、魚、昆虫、および／または蠕虫が含まれる。いくつかの実施形態において、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子改変動物、および／またはクローンであり得る。
【００３５】
概ねまたは約：本明細書において使用する場合、「概ね」または「約」という用語は、１つまたは複数の対象とする値に適用するとき、記述された参照値と同様の値を指す。特定の実施形態において、「概ね」または「約」という用語は、特に明記しない限り、または文脈からその他の点で明らかでない限り（このような数が可能な値の１００％を超える場合を除いて）、記述された参照値のいずれかの方向（これを超えるまたはこれ未満）において、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはこれ未満の範囲に入る値の範囲を指す。
【００３６】
生物活性がある：本明細書において使用する場合、「生物活性がある」という句は、生物系、特に生物において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生物に投与したとき、その生物に対して生物学的効果を有する薬剤は、生物活性があると考えられる。特定の実施形態において、ペプチドが生物活性がある場合、ペプチドの少なくとも１つの生物活性を共有するそのペプチドのポーションは典型的には、「生物活性がある」ポーションと称される。特定の実施形態において、ペプチドは内在性の生物活性を有さないが、１種または複数種の天然に存在するアンジオテンシン化合物の効果を阻害するペプチドは、生物活性があると考えられる。
【００３７】
担体または賦形剤：本明細書において使用する場合、「担体」および「賦形剤」という用語は、医薬製剤の調製のために有用な薬学的に許容される（例えば、ヒトへの投与のために安全および無毒性の）担体または希釈物質を指す。例示的な賦形剤には、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝化溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、無菌の食塩水、リンゲル液またはデキストロース溶液が含まれる。例示的な担体は、下でより詳細に考察するような、錠剤もしくはカプセル剤製剤のための、または吸入用製剤のための調製物を含む。
【００３８】
慢性：本明細書において使用する場合、「慢性」という用語は、組織の損傷、または関連する疾患、障害、もしくは状態に関連して使用されるとき、医学の技術分野における当業者が理解するような意味を有する。典型的には、「慢性」という用語は、持続性および／または再発性の症状が関与する疾患、障害、または状態を指す。慢性疾患、障害、または状態は典型的には、長期間に亘って発生する。「慢性」という用語は、「急性」という用語と対照的に使用される。いくつかの実施形態において、慢性疾患、障害、または状態は、細胞変性からもたらされる。いくつかの実施形態において、慢性疾患、障害、または状態は、年齢に関連する細胞変性からもたらされる。
【００３９】
対照：本明細書において使用する場合、「対照」という用語は、それに対して結果が比較される標準であるというその当技術分野で理解される意味を有する。典型的には、対照を使用して、可変部分についての結論を出すために、このような可変部分を分離することによって、実験における完全性を増大させる。いくつかの実施形態において、対照は、比較物を提供するために、試験反応またはアッセイと同時に行われる反応またはアッセイである。１つの実験において、「試験」（すなわち、試験される可変部分）を適用する。第２の実験である「対照」において、試験される可変部分を適用しない。いくつかの実施形態において、対照は、歴史的対照である（すなわち、先に行われた試験もしくはアッセイ、または既知である量もしくは結果のもの）。いくつかの実施形態において、対照は、印刷されたもしくはその他の点で保存された記録であり、または印刷されたもしくはその他の点で保存された記録を含む。対照は、陽性対照または陰性対照であり得る。いくつかの実施形態において、対照はまた、参照と称される。
【００４０】
重症虚血肢：本明細書において使用する場合、「重症虚血肢」または「ＣＬＩ」という用語は一般に、四肢における組織の損傷または機能障害をもたらし得る、個体の四肢（例えば、手、足、脚）への血液または酸素供給の制限によって特徴付けられる状態を指す。重症虚血肢は、種々の要因のいずれか、例えば、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）に起因し得、他の症状の中でも重度の疼痛、皮膚潰瘍、またはただれをもたらし得、場合によって切断を引き起こす。重症虚血肢は、１つまたは複数の四肢における血管収縮、血栓症、または塞栓形成によって特徴付け得る。血液供給を通常受ける四肢における任意の組織は、重症虚血肢を経験することがある。
【００４１】
粗製物：本明細書において使用する場合、「粗製物」という用語は、生体試料に関連して使用されるとき、実質的に粗製の状況にある試料を指す。例えば、粗試料は、細胞ライセートまたは生検用組織試料でよい。粗試料は、溶液中にまたは乾燥調製物として存在し得る。
【００４２】
糖尿病性血管疾患：本明細書において使用する場合、「糖尿病性血管疾患」という用語は、糖尿病による、血管、特に、動脈における閉塞の発生と関連する疾患、障害または状態を指す。糖尿病性血管疾患は、体全体で発生することがある。いくつかの実施形態において、糖尿病性血管疾患は、本明細書において使用する場合、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織において発生する。いくつかの実施形態において、糖尿病性血管疾患はまた、ネフロパシー（腎臓疾患）、ニューロパシー（つま先または足における保護的感覚の喪失をもたらす神経自体の状態）を含み得る。糖尿病性血管疾患の例示的な症状には、これらに限定されないが、かすんだ視界、顔もしくは肢の膨れまたは予想外の重量増加、靴ずれ、手または足における感触の喪失または燃えるような感触、歩行するときの脚の疼痛、および高血圧が含まれてもよい。糖尿病性血管疾患を患っている患者は、壊疽として公知である死んだ組織を最終的に発生し得る。これは感染および最終的に切断をもたらし得る。
【００４３】
剤形：本明細書において使用する場合、「剤形」および「単位剤形」という用語は、処置される患者のための治療剤の物理的な個別単位を指す。各単位は、所望の治療効果を生じさせるように計算した所定の量の活性材料を含有する。しかし、組成物の総投与量は、正しい医学的判断の範囲内で主治医が決定することが理解される。
【００４４】
機能障害：本明細書において使用する場合、「機能障害」という用語は、異常な機能を指す。分子（例えば、タンパク質）の機能障害は、このような分子と関連する活性の増加または減少によってもたらされ得る。分子の機能障害は、分子自体、あるいはこの分子と直接的もしくは間接的に相互作用する、またはこの分子をレギュレートする他の分子と関連する欠陥によってもたらされることがある。
【００４５】
機能的同等物または誘導体：本明細書において使用する場合、「機能的同等物」または「機能的誘導体」という用語は、アミノ酸配列の機能的誘導体との関連において、本来の配列の生物活性（機能的または構造的）と実質的に同様である生物活性（機能的または構造的）を保持する分子を意味する。機能的誘導体または同等物は、天然誘導体であり得、または合成的に調製される。例示的な機能的誘導体は、１個または複数個のアミノ酸の置換、欠失、または付加を有するアミノ酸配列を含むが、ただし、タンパク質の生物活性は保存される（例えば、これは、Ｍａｓ受容体のアゴニストとして作用する）。置換するアミノ酸は望ましくは、置換されるアミノ酸の物理化学的特性と同様の物理化学的特性を有する。望ましい同様の物理化学的特性は、電荷、かさ高性、疎水性、親水性などにおける類似性を含む。
【００４６】
改善する、増加させる、または低減させる：本明細書において使用する場合、「改善する」、「増加させる」もしくは「低減させる」という用語または文法的同等物は、ベースライン測定、例えば、本明細書に記載されている処置の開始の前の同じ個体における測定、または本明細書に記載されている処置の非存在下での対照個体（もしくは複数の対照個体）における測定と比較した値を示す。「対照個体」は、処置される個体とほぼ同じ年齢の、処置される個体と同じ形態の疾患に悩んでいる個体である（処置される個体および対照個体（複数可）における疾患の段階が比較可能であることを確実にする）。
【００４７】
インビトロ：本明細書において使用する場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内で起こるよりもむしろ、人工環境中、例えば、試験管または反応槽中、細胞培養物中などで起こる事象を指す。
【００４８】
インビボ：本明細書において使用する場合、「インビボ」という用語は、多細胞生物、例えば、ヒトおよびヒトではない動物内で起こる事象を指す。細胞ベース系との関連において、この用語は、生細胞内で起こる事象を指すために使用し得る（例えば、インビトロ系とは対照的に）。
【００４９】
虚血：本明細書において使用する場合、「虚血（ｉｓｃｈｅｍｉａ）」（また「虚血（ｉｓｃｈａｅｍｉａ）」ともつづられる）という用語は典型的には、組織の損傷または機能障害をもたらし得る血液または酸素供給の制限を指す。虚血は、種々の要因のいずれか、例えば、血管における要因、血餅、血圧の重度の低下、コンパートメント圧の増加、および／または外傷によってもたらされ得る。「虚血」という用語はまた、本明細書において使用する場合、例えば、血管収縮、血栓症、または塞栓形成からもたらされ得る体または組織の所与の一部における局所的貧血を指す。血液供給を通常受ける任意の組織は、虚血を形成することがある。
【００５０】
単離された：本明細書において使用する場合、「単離された」という用語は、（１）最初に生成されたとき（自然においてであろうと、および／または実験の設定においてであろうと）、物質および／または実体が関連していた成分の少なくともいくつかから分離されており、かつ／あるいは（２）人の手によって生成され、調製され、かつ／または製造されてきた、物質および／または実体を指す。単離された物質および／または実体は、単離された物質および／または実体が最初に関連していた他の成分の少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％、実質的に１００％、または１００％から分離し得る。いくつかの実施形態において、単離された薬剤は、約８０％超、約８５％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、約９５％超、約９６％超、約９７％超、約９８％超、約９９％超、実質的に１００％、または１００％純粋である。本明細書において使用する場合、物質は、他の成分が実質的にない場合、「純粋」である。本明細書において使用する場合、「単離された細胞」という用語は、多細胞生物中に含有されていない細胞を指す。
【００５１】
末梢血管疾患：本明細書において使用する場合、「末梢血管疾患」または「ＰＶＤ」という用語は、心臓および脳の外側（例えば、冠血管、大動脈弓血管系、または脳内ではない）に位置する血管（例えば、動脈）の部分的または完全な閉塞によってもたらされる疾患、障害または状態を指す。本明細書において使用する場合、「末梢動脈疾患」または「ＰＡＤ」という用語は、心臓および脳の外側（例えば、冠血管、大動脈弓血管系、または脳内ではない）に位置する１つまたは複数の組織、例えば、内部器官および／または肢への血液供給を実現する動脈の部分的または全面的な閉塞が存在するＰＶＤの一形態を指す。本明細書において使用する場合、末梢血管疾患は、糖尿病性血管疾患を包含する。「糖尿病性血管疾患」の定義を参照されたい。
【００５２】
安定性：本明細書において使用する場合、「安定的」という用語は、長期間に亘るその治療有効性（例えば、その意図される生物活性および／または生理化学的完全性の全てまたは大部分）を維持する治療剤の能力を指す。治療剤の安定性、およびこのような治療剤の安定性を維持するための医薬組成物の性能は、長期間に亘って（例えば、少なくとも１カ月、３カ月、６カ月、１２カ月、１８カ月、２４カ月、３０カ月、３６カ月またはそれを超える期間）アセスメントし得る。特定の実施形態において、本明細書に記載されている医薬組成物は、医薬組成物がそれと共に製剤された１種または複数種の治療剤を安定化させ、または代わりにこれらの分解を遅延もしくは防止することができるように製剤されている。製剤との関連において、安定的な製剤は、その中の治療剤が本質的に、貯蔵によって、ならびにプロセス（例えば、冷凍／解凍、機械的混合および凍結乾燥）の間にその物理的および／または化学的完全性ならびに生物活性を保持する製剤である。
【００５３】
対象：本明細書において使用する場合、「対象」という用語は、ヒトまたは任意のヒトではない動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマもしくは霊長類）を指す。ヒトは、出生前および出生後の形態を含む。多くの実施形態において、対象は、人間である。対象は、疾患の診断または処置のために医療提供者に提示されるヒトを指す患者であり得る。「対象」という用語は、本明細書において「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患もしくは障害に悩んでいることがあり、または疾患もしくは障害の影響を受けやすいが、疾患もしくは障害の症状を示してもよく、または示さなくてもよい。
【００５４】
実質的に：本明細書において使用する場合、「実質的に」という用語は、全面的もしくはほぼ全面的な程度または度合いの、対象とする特徴または特性を示す定性的状態を指す。生物学的および化学的現象が、あるとしても、めったに完結せず、かつ／または完全性に向かわず、または絶対的な結果を達成もしくは回避しないことを生物学の技術分野における当業者は理解する。したがって、「実質的に」という用語は、本明細書において使用され、多くの生物学的および化学的現象において固有である完全性の潜在的な欠如を捉える。
【００５５】
患っている：疾患、障害、および／または状態を「患っている」個体は、疾患、障害、および／または状態であると診断されてきており、あるいは疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の症状を示す。
【００５６】
影響を受けやすい：疾患、障害、および／または状態に「影響を受けやすい」個体は、疾患、障害、および／または状態であると診断されていない。いくつかの実施形態において、疾患、障害、および／または状態の影響を受けやすい個体は、疾患、障害、および／または状態の症状を示し得ない。いくつかの実施形態において、疾患、障害、状態、または事象（例えば、虚血性脳卒中）の影響を受けやすい個体は、下記の１つまたは複数によって特徴付けられ得る。（１）疾患、障害、および／または状態の発生と関連する遺伝子変異；（２）疾患、障害、および／または状態の発生と関連する遺伝子多型；（３）疾患、障害、および／または状態と関連するタンパク質の増加および／または減少した発現ならびに／または活性；（４）疾患、障害、状態、および／または事象の発生と関連する習慣および／またはライフスタイル；（５）移植を受けており、受けることを計画しており、または必要とする。いくつかの実施形態において、疾患、障害、および／または状態の影響を受けやすい個体は、疾患、障害、および／または状態を発生する。いくつかの実施形態において、疾患、障害、および／または状態の影響を受けやすい個体は、疾患、障害、および／または状態を発生しない。
【００５７】
治療有効量：本明細書において使用する場合、治療剤の「治療有効量」という用語は、疾患、障害、および／または状態を患っている、あるいは疾患、障害、および／または状態の影響を受けやすい対象に投与するとき、疾患、障害、および／または状態の症状（複数可）を処置し、診断し、予防し、かつ／または発症を遅延させるのに十分な量を意味する。治療有効量は典型的には、少なくとも１つの単位用量を含む投薬レジメンによって投与されることを当業者は認識する。
【００５８】
治療剤：本明細書において使用する場合、「治療剤」という句は、対象に投与したときに、治療効果を有し、かつ／または所望の生物学的および／もしくは薬理効果を引き出す任意の薬剤を指す。いくつかの実施形態において、本発明の治療剤は、本発明によるペプチド阻害剤またはその誘導体を指す。
【００５９】
処置すること：本明細書において使用する場合、「処置する」、「処置」または「処置すること」という用語は、特定の疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の症状または特徴を部分的にまたは完全に軽減し、寛解し、緩和し、阻害し、予防し、発症を遅延させ、重症度を低減させ、かつ／または発生率を低減させるために使用する任意の方法を指す。処置は、疾患と関連する病態を発生する危険性を減少させる目的のために、疾患の徴候を示さず、かつ／または疾患の早期の徴候のみを示す対象に投与し得る。
【００６０】
特定の実施形態の詳細な説明
本発明は、とりわけ、アンジオテンシン−（１−７）ペプチドまたは機能的同等物、類似体もしくは誘導体、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト、ＡＣＥ２および／またはＡＣＥ２アクチベーターの使用に基づく、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、例えば、重症虚血肢、および関連する疾患、障害または状態の処置のための改善された組成物および方法を提供する。
【００６１】
本発明の様々な態様を、下記のセクションにおいて詳細に記載する。セクションの使用は、本発明を限定することを意味しない。各セクションは、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、「または」の使用は、特に断りのない限り、「および／または」を意味する。
【００６２】
アンジオテンシン（１−７）ペプチド
本明細書において使用する場合、「アンジオテンシン（１−７）ペプチド」という用語は、天然に存在するアンジオテンシン（１−７）、および天然に存在するアンジオテンシン（１−７）の任意の機能的同等物、類似体または誘導体の両方を指す。本明細書において使用する場合、「ペプチド」および「ポリペプチド」は互換的用語であり、ペプチド結合によって一緒に結合している２個以上のアミノ酸を指す。本明細書において使用する場合、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、直鎖状および環状ペプチドの両方を含む。「アンジオテンシン（ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）−（１−７）」、「アンジオテンシン（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ）−（１−７）」、および「Ａｎｇ−（１−７）」という用語は、互換的に使用される。
【００６３】
天然に存在するアンジオテンシン（１−７）
天然に存在するアンジオテンシン（１−７）（Ａｎｇ−（１−７）とまた称される）は、下に示す７個のアミノ酸のペプチドである：
Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｔｙｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｐｒｏ７（配列番号１）
これは、レニン−アンジオテンシン系の一部であり、かつ主に肝臓によって恒常的に産生され、循環中に放出されるα−２−グロブリンであるアンジオテンシノーゲンとしてまた公知である前駆体から変換される。アンジオテンシノーゲンは、セルピンファミリーのメンバーであり、レニン基質としてまた公知である。ヒトアンジオテンシノーゲンは４５２個のアミノ酸の長さであるが、他の種は変動するサイズのアンジオテンシノーゲンを有する。典型的には、最初の１２個のアミノ酸は、アンジオテンシン活性のために最も重要である。
Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｔｙｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｐｒｏ７−Ｐｈｅ８−Ｈｉｓ９−Ｌｅｕ１０−Ｖａｌ１１−Ｉｌｅ１２（配列番号２）  。
【００６４】
異なるタイプのアンジオテンシンは、様々な酵素の作用によって形成し得る。例えば、アンジオテンシン（１−７）は、アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）の作用によって生じる。下の「アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）」セクションを参照されたい。
【００６５】
Ａｎｇ−（１−７）は、Ｍａｓ受容体のための内因性リガンドである。Ｍａｓ受容体は、７回膜貫通領域を含有するＧタンパク質共役受容体である。本明細書において使用する場合、「アンジオテンシン−（１−７）受容体」という用語は、Ｇタンパク質共役Ｍａｓ受容体を包含する。
【００６６】
本明細書において使用する場合、「天然に存在するアンジオテンシン（１−７）」という用語は、自然源から精製された任意のアンジオテンシン（１−７）ペプチド、および天然に存在するアンジオテンシン（１−７）のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する、任意の組換え技術によって産生され、または化学的に合成されたペプチドを含む。
【００６７】
Ａｎｇ−（１−７）の機能的同等物、類似体または誘導体
いくつかの実施形態において、本発明に適したアンジオテンシン（１−７）ペプチドは、天然に存在するＡｎｇ−（１−７）の機能的同等物である。本明細書において使用する場合、天然に存在するＡｎｇ−（１−７）の機能的同等物は、天然に存在するＡｎｇ−（１−７）とアミノ酸配列の同一性を共有し、かつ天然に存在するＡｎｇ−（１−７）と実質的に同じまたは同様の活性を保持する任意のペプチドを指す。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている天然に存在するＡｎｇ−（１−７）の機能的同等物は、本明細書に記載されている方法もしくは当技術分野において公知の方法を使用して決定するような血管形成促進活性、または活性、例えば、一酸化窒素放出、血管拡張、改善された内皮機能、抗利尿、もしくは血管形成にプラスの影響を与える本明細書において考察されている他の特性の１つを有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されているまたは当技術分野において公知の様々なアッセイを使用して決定するように、本明細書に記載されている天然に存在するＡｎｇ−（１−７）の機能的同等物は、アンジオテンシン−（１−７）受容体（例えば、Ｇタンパク質共役Ｍａｓ受容体）に結合し、またはこれを活性化することができる。いくつかの実施形態において、Ａｎｇ−（１−７）の機能的同等物はまた、アンジオテンシン（１−７）類似体もしくは誘導体、または機能的誘導体と称される。
【００６８】
典型的には、アンジオテンシン（１−７）の機能的同等物は、天然に存在するＡｎｇ−（１−７）とのアミノ酸配列の類似性を共有する。いくつかの実施形態において、本発明によるＡｎｇ−（１−７）の機能的同等物は、天然に存在するＡｎｇ−（１−７）において出現する７個のアミノ酸からの少なくとも３個（例えば、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個）のアミノ酸を含む配列を含有し、少なくとも３個（例えば、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、または少なくとも７個）のアミノ酸は、これらが天然に存在するＡｎｇ−（１−７）において出現する相対的な位置および／または間隔を維持する。
【００６９】
いくつかの実施形態において、Ａｎｇ−（１−７）の機能的同等物はまた、天然に存在するＡｎｇ−（１−７）のアミノ酸配列と少なくとも５０％（例えば、少なくとも５０％、６０、７０％、８０％、または９０％）同一の配列を含有する任意のペプチドを包含する。アミノ酸配列の同一性の百分率は、アミノ酸配列のアラインメントによって決定することができる。アミノ酸配列のアラインメントは、例えば、公的に利用可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、当技術分野の範囲内である様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長に亘り最大アラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含めた、アラインメントを測定するための適当なパラメーターを決定することができる。好ましくは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２ソフトウェアを使用して、アミノ酸配列の同一性を決定する（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６巻、４６０〜４８０頁（１９９６年）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌ）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの探索パラメーターを使用し、これらの大部分はデフォルト値に設定する。調節可能なパラメーターは、下記の値で設定する。オーバーラップスパン＝１、オーバーラップフラクション＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰスコア（Ｓ）およびＨＳＰ  Ｓ２パラメーターは動的な値であり、特定の配列の組成によってプログラム自体によって確立されるが、しかし、最小値は調節してもよく、上で示したように設定する。
【００７０】
いくつかの実施形態において、Ａｎｇ−（１−７）の機能的同等物、類似体または誘導体は、天然に存在するＡｎｇ−（１−７）のフラグメントである。いくつかの実施形態において、Ａｎｇ−（１−７）の機能的同等物、類似体または誘導体は、天然に存在するＡｎｇ−（１−７）においてアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含有する。Ａｎｇ−（１−７）の機能的同等物、類似体または誘導体は、置換、付加、および／または欠失によってアミノ酸配列を改変することによって作製することができる。例えば、天然に存在するＡｎｇ−（１−７）の配列（配列番号１）内の１個または複数個のアミノ酸残基は、機能的同等物として作用する同様の極性の別のアミノ酸で置換することができ、サイレント改変がもたらされる。配列内のアミノ酸についての置換は、アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択し得る。例えば、正に帯電している（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれる。非極性（疎水性）アミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。非荷電極性アミノ酸には、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれる。負に帯電している（酸）アミノ酸には、グルタミン酸およびアスパラギン酸が含まれる。アミノ酸グリシンは、非極性アミノ酸ファミリーまたは非荷電（中性）極性アミノ酸ファミリー中に含まれてもよい。アミノ酸のファミリー内で行われる置換は一般に、保存的置換であると理解される。例えば、ペプチド阻害剤のアミノ酸配列は、修飾または置換することができる。
【００７１】
Ａｎｇ−（１−７）の機能的同等物、類似体および誘導体の例は、下の「例示的なアンジオテンシン（１−７）ペプチド」という表題のセクションに記載されている。
【００７２】
アンジオテンシン−（１−７）ペプチドは、任意の長さのものでよい。いくつかの実施形態において、本発明によるアンジオテンシン−（１−７）ペプチドは、例えば、４〜２５個のアミノ酸（例えば、４〜２０個、４〜１５個、４〜１４個、４〜１３個、４〜１２個、４〜１１個、４〜１０個、４〜９個、４〜８個、４〜７個のアミノ酸）を含有することができる。いくつかの実施形態において、本発明によるアンジオテンシン−（１−７）ペプチドは、５〜２５個のアミノ酸残基、例えば、５〜２０個、５〜１５個または５〜１０個のアミノ酸残基を含有することができる。いくつかの実施形態において、本発明によるＡｎｇ（１−７）ペプチドは、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個の残基を含有する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、アンジオテンシン−（１−７）ペプチドは、プロテアーゼ耐性、血清安定性および／またはバイオアベイラビリティーを増加させる１つまたは複数の修飾を含有する。いくつかの実施形態において、適切な修飾は、ペグ化、アセチル化、グリコシル化、ビオチン化、Ｄ−アミノ酸および／もしくは非天然アミノ酸による置換、ならびに／またはペプチドの環化から選択される。
【００７４】
本明細書において使用する場合、その最も広い意味での「アミノ酸」という用語は、ポリペプチド鎖中に組み込むことができる任意の化合物および／または物質を指す。特定の実施形態において、アミノ酸は、一般構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。特定の実施形態において、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。特定の実施形態において、アミノ酸は、合成または非天然アミノ酸（例えば、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸）である。いくつかの実施形態において、アミノ酸は、Ｄ−アミノ酸である。特定の実施形態において、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。「標準的アミノ酸」とは、両方とも天然でペプチド中に組み込まれているＬ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の両方を含めた天然に存在するペプチドにおいて一般に見出される２０種の標準的アミノ酸のいずれかを指す。「非標準的」または「通常ではないアミノ酸」とは、これが合成的に調製されるか、または自然源から得られるかに関わらず、標準的なアミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書において使用する場合、「合成または非天然アミノ酸」は、これらに限定されないが、塩、アミノ酸誘導体（例えば、アミド）、および／または置換を含めた、化学修飾されたアミノ酸を包含する。ペプチド中のカルボキシ末端アミノ酸および／またはアミノ末端アミノ酸を含めたアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、および／またはその活性に悪影響を与えることなくペプチドの循環半減期を変化させることができる他の化学基による置換によって修飾することができる。通常ではないまたは非天然アミノ酸の例には、これらに限定されないが、シトルリン、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、４−（Ｅ）−ブテニル−４（Ｒ）−メチル−Ｎ−メチルトレオニン（ＭｅＢｍｔ）、Ｎ−メチル−ロイシン（ＭｅＬｅｕ）、アミノイソ酪酸、スタチン（ｓｔａｔｉｎｅ）、およびＮ−メチル−アラニン（ＭｅＡｌａ）が含まれる。アミノ酸は、ジスルフィド結合に関与し得る。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸および／またはペプチドのアミノ酸残基を指し得る。これが遊離アミノ酸、またはペプチドの残基を指すかは、用語が使用されている文脈から明らかである。
【００７５】
特定の実施形態において、アンジオテンシン−（１−７）ペプチドは、１種または複数種のＬ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、および／または非天然アミノ酸を含有する。
【００７６】
天然に存在するアミノ酸のみを含有するペプチドに加えて、ペプチド模倣物またはペプチド類似体はまた、本発明によって包含される。ペプチド類似体は、テンプレートペプチドの特性と類似の特性を有する、医薬品産業における非ペプチド薬物として一般に使用される。非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物」またはペプチド模倣物と称される（Ｆａｕｃｈｅｒｅら、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．５４巻：２８３〜２８７頁（１９８６年）；Ｅｖａｎｓら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．３０巻：１２２９〜１２３９頁（１９８７年））。治療的に有用なペプチドと構造的に関連するペプチド模倣物を使用して、同等なまたは増強された治療効果または予防効果を生成し得る。一般に、ペプチド模倣物は、パラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的活性または薬理活性を有するポリペプチド）、例えば、天然に存在する受容体結合ポリペプチドと構造的に同様であるが、当技術分野で周知の方法によって、連結、例えば、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（ｃｉｓおよびｔｒａｎｓ）、−ＣＨ２ＳＯ−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、−ＣＯＣＨ２−などによって任意選択で置き換えられている１つまたは複数のペプチド連結を有する（Ｓｐａｔｏｌａ、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ、１巻（３号）：２６７頁（１９８３年）；Ｓｐａｔｏｌａら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．３８巻：１２４３〜１２４９頁（１９８６年）；Ｈｕｄｓｏｎら、Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｐｅｐｔ．  Ｒｅｓ．１４巻：１７７〜１８５頁（１９７９年）；およびＷｅｉｎｓｔｅｉｎ．  Ｂ．、１９８３年、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ、Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ）。このようなペプチド模倣物は、より経済的な生成、より大きな化学的安定性、増強された薬理学的特性（例えば、半減期、吸収、効力、効率など）、抗原性の低減およびその他を含めた、天然に存在するポリペプチドを上回る有意な利点を有し得る。
【００７７】
Ａｎｇ−（１−７）ペプチドはまた、通常ペプチドの一部ではないさらなる化学的部分を含有する他のタイプのペプチド誘導体を含むが、ただし、誘導体は、ペプチドの所望の機能的活性を保持する。このような誘導体の例には、（１）アミノ末端の、または別の遊離アミノ基のＮ−アシル誘導体であって、アシル基は、アルカノイル基（例えば、アセチル、ヘキサノイル、オクタノイル）、アロイル基（例えば、ベンゾイル）またはブロック基、例えば、Ｆ−ｍｏｃ（フルオレニルメチル−Ｏ−ＣＯ−）であり得る；（２）カルボキシ末端の、または別の遊離カルボキシもしくはヒドロキシル基のエステル；（３）アンモニアまたは適切なアミンとの反応によって生成される、カルボキシ末端の、または別の遊離カルボキシル基のアミド；（４）リン酸化誘導体；（５）抗体または他の生物学的リガンドにコンジュゲートした誘導体、および他のタイプの誘導体；ならびに（６）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖とコンジュゲートした誘導体が含まれる。
【００７８】
Ａｎｇ−（１−７）ペプチドは、合成（例えば、独占的固相合成、部分的固相合成、フラグメント縮合、古典的な溶液合成、ネイティブ化学的ライゲーション）および組換え技術を含めた、当業者には公知のペプチド合成の任意の方法によって得てもよい。例えば、ペプチドまたはペプチド誘導体は、手短に言えば、Ｃ末端アミノ酸のカルボキシル基を樹脂（例えば、ベンズヒドリルアミン樹脂、クロロメチル化樹脂、ヒドロキシメチル樹脂）にカップリングし、Ｎ−α保護されたアミノ酸を連続的に加えることからなる固相ペプチド合成によって得ることができる。保護基は、当技術分野において公知の任意のこのような基であり得る。それぞれの新規なアミノ酸を成長している鎖に加える前に、鎖に加えられた先のアミノ酸の保護基を除去する。このような固相合成は、開示されてきた。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．８５巻：２１４９頁（１９６４年）；Ｖａｌｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２１３巻：１３９４〜１３９７頁（１９８１年）、米国特許第４，３０５，８７２号および同第４，３１６，８９１号、Ｂｏｄｏｎｓｋｙら、Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｄ．（Ｌｏｎｄｏｎ）、３８巻：１５９７頁（１９６６年）；ならびにＰｉｅｔｔａおよびＭａｒｓｈａｌｌ、Ｃｈｅｍ．  Ｃｏｍｍ．６５０頁（１９７０年）、Ｌｕｂｅｌｌら、「Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、２１．１１巻、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｄｅｓ．、Ｔｈｉｅｍｅ、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ、７１３〜８０９頁（２００５年）において概説されている技術による。適当な樹脂へのアミノ酸のカップリングはまた当技術分野で周知であり、米国特許第４，２４４，９４６号において開示されてきた（Ｈｏｕｖｅｒ−Ｗｅｙｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．、第Ｅ２２ａ巻、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ、Ｍｕｒｒａｙ  Ｇｏｏｄｍａｎ、編集長、Ｔｈｉｅｍｅ．  Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ．  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００２年において概説されている）。
【００７９】
他に定義しない限り、本明細書において使用される科学および技術用語ならびに命名法は、本発明が属する当業者が一般に理解するような同じ意味を有する。一般に、細胞培養、感染、分子生物学の方法などの手順は、当技術分野で使用される一般の方法である。このような標準的な技術は、参照マニュアル、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２００１年；およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．、２００１年において見出すことができる。
【００８０】
Ａｎｇ（１−７）ペプチドの調製の任意のプロセスの間に、関与している分子のいずれか上の感受性反応性基を保護することが望ましくてもよい。これは、通常の保護基の手段、例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  Ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｔ．Ｗ．  ＧｒｅｅｎｅおよびＰ．Ｇ．Ｍ．  Ｗｕｔｓ、１９９１年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ−Ｙｏｒｋ；およびＰｅｐｔｉｄｅｓ：  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ＳｅｗａｌｄおよびＪａｋｕｂｋｅ、２００２年、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、Ｗｈｅｉｎｈｅｉｍ、１４２頁に記載されているものなどによって達成し得る。例えば、αアミノ保護基には、アシルタイプの保護基（例えば、トリフルオロアセチル、ホルミル、アセチル）、脂肪族ウレタン保護基（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、シクロヘキシルオキシカルボニル）、芳香族ウレタンタイプの保護基（例えば、フルオレニル−９−メトキシ−カルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル（Ｃｂｚ）、Ｃｂｚ誘導体）およびアルキルタイプの保護基（例えば、トリフェニルメチル、ベンジル）が含まれる。アミノ酸側鎖保護基には、ベンジル（ＴｈｒおよびＳｅｒ）、Ｃｂｚ（Ｔｙｒ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、メチルエチル、シクロヘキシル（Ａｓｐ、Ｈｉｓ）、Ｂｏｃ（Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｃｙｓ）などが含まれる。保護基は、当技術分野において公知の方法を使用して好都合なそれに続く段階において除去し得る。
【００８１】
さらに、Ａｎｇ−（１−７）ペプチドは、ＦＭＯＣプロトコルによって有機相中で保護基によって合成し得る。望ましくは、ペプチドは、Ｃ１８クロマトグラフィーカラム上の高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）で７０％の収率で精製され、１０〜６０％のアセトニトリル勾配で溶出される。ペプチドの分子量は、質量分析法によって検証することができる（Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．「Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ．、第２８９巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７年において概説されている）。
【００８２】
代わりに、Ａｎｇ−（１−７）ペプチドは、例えば、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を使用して、組換え系において調製し得る。ポリペプチドは、同じポリペプチド内の複数の上記の修飾を含有し得ることが理解される。
【００８３】
ペプチドは生物活性をインビトロで引き出すことにおいて有効であり得る一方で、インビボでのこれらの有効性は、プロテアーゼの存在によって低減し得る。血清プロテアーゼは、特定の基質に対する必要性を有する。基質は、切断のためにＬ−アミノ酸およびペプチド結合の両方を伴わなければならない。さらに、血清中のプロテアーゼ活性の最も顕著な成分を表すエキソペプチダーゼは通常、ペプチドの最初のペプチド結合上に作用し、遊離Ｎ末端を必要とする（Ｐｏｗｅｌｌら、Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．１０巻：１２６８〜１２７３頁（１９９３年））。これに照らして、ペプチドの修飾されたバージョンを使用することが有利であることが多い。修飾されたペプチドは、Ａｎｇ−（１−７）の所望の生物活性を与えるが、有利にプロテアーゼおよび／またはエキソペプチダーゼによる切断の影響を容易に受けやすくない、本来のＬ−アミノ酸ペプチドの構造的特徴を保持する。
【００８４】
同じタイプのＤ−アミノ酸によるコンセンサス配列の１個または複数個のアミノ酸の系統的置換（例えば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）を使用して、より安定的なペプチドを生じ得る。このように、本発明のペプチド誘導体またはペプチド模倣物は、順方向または逆方向の順序の全てＬ、全てＤまたは混合Ｄ、Ｌペプチドであり得る。Ｎ末端またはＣ末端Ｄ−アミノ酸が存在することは、ペプチダーゼがＤ−アミノ酸を基質として利用することができないため、ペプチドのインビボでの安定性を増加させる（Ｐｏｗｅｌｌら、Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．１０巻：１２６８〜１２７３頁（１９９３年））。逆方向−Ｄペプチドは、Ｌ−アミノ酸を含有するペプチドに対して逆方向配列で配置されているＤ−アミノ酸を含有するペプチドである。このように、Ｌ−アミノ酸ペプチドのＣ末端残基は、Ｄ−アミノ酸ペプチドなどについてＮ末端となる。逆方向Ｄ−ペプチドは、Ｌ−アミノ酸ペプチドと同じ二次的立体構造、したがって同様の活性を保持するが、インビトロおよびインビボでの酵素分解に対してより耐性であり、このように本来のペプチドに比べてより大きな治療有効性を有することができる（ＢｒａｄｙおよびＤｏｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻：６９２〜６９３頁（１９９４年）；Ｊａｍｅｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３６８巻：７４４〜７４６頁（１９９４年））。同様に、逆方向−Ｌペプチドは標準的な方法を用いて生じさせてもよく、親ペプチドのＣ末端は逆方向−ＬペプチドのＮ末端に取って代わるようになる。有意な二次構造（例えば、短いペプチド）を有さないＬ−アミノ酸ペプチドの逆方向Ｌ−ペプチドは、Ｌ−アミノ酸ペプチドの側鎖の同じ間隔および立体構造を保持し、したがって本来のＬ−アミノ酸ペプチドと同様の活性を有することが多いことが意図される。さらに、逆方向ペプチドは、Ｌ−アミノ酸およびＤ−アミノ酸の組合せを含有し得る。アミノ酸の間の間隔、および側鎖の立体構造は保持され、本来のＬ−アミノ酸ペプチドと同様の活性をもたらし得る。
【００８５】
修飾されたペプチドはもはやペプチダーゼのための基質ではないため、ペプチドのＮ末端またはＣ末端残基上に作用するペプチダーゼに対する耐性を与える別の有効なアプローチは、ペプチド末端において化学基を加えることである。１つのこのような化学修飾は、いずれかまたは両方の末端におけるペプチドのグリコシル化である。特定の化学修飾、特に、Ｎ末端グリコシル化は、ヒト血清中のペプチドの安定性を増加させることが示された（Ｐｏｗｅｌｌら、Ｐｈａｒｍ．  Ｒｅｓ．１０巻：１２６８〜１２７３頁（１９９３年））。血清安定性を増強させる他の化学修飾には、これらに限定されないが、１〜２０個の炭素の低級アルキルからなるＮ末端アルキル基、例えば、アセチル基の添加、および／またはＣ末端アミドもしくは置換アミド基の添加が含まれる。特に、本発明は、Ｎ末端アセチル基および／またはＣ末端アミド基を担持するペプチドからなる修飾されたペプチドを含む。
【００８６】
ペプチドのサブ配列において天然アミノ酸を天然に存在しないアミノ酸で置換することはまた、タンパク質分解に対する耐性を与えることができる。このような置換は、例えば、生物活性に影響を与えることなく、Ｎ末端上に作用するエキソペプチダーゼによるタンパク質分解に対する耐性を与えることができる。天然に存在しないアミノ酸の例には、α，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、Ｃ−α−メチルアミノ酸、β−アミノ酸、およびβ−メチルアミノ酸が含まれる。本発明において有用なアミノ酸類似体には、これらに限定されないが、β−アラニン、ノルバリン、ノルロイシン、４−アミノ酪酸、オルニチン（ｏｒｉｔｈｉｎｅ）、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、シクロヘキシルアラニン、２−アミノイソ酪酸、６−アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、フェニルグリシン、ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジンおよび他の通常ではないアミノ酸が含まれてもよい。さらに、天然に存在しないアミノ酸を有するペプチドの合成は、当技術分野で通例である。
【００８７】
さらに、コンセンサス配列または実質的に同一なコンセンサス配列のバリエーションを含む拘束されたペプチドは、当技術分野で周知の方法によって生じさせ得る（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１巻：３８７〜４１８頁（１９９２年））。例えば、拘束されたペプチドは、ジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基を加え、それによって、環状ペプチドをもたらすことによって生じさせ得る。環状ペプチドは、遊離Ｎ末端またはＣ末端を有さないように構成することができる。したがって、環状ペプチドは、ペプチド末端において切断しないエンドペプチダーゼの影響を受けやすくてもよいが、環状ペプチドはエキソペプチダーゼによるタンパク質分解の影響を受けやすくない。Ｎ末端またはＣ末端Ｄ−アミノ酸を有するペプチドの、および環状ペプチドのアミノ酸配列は通常、それぞれ、Ｎ末端もしくはＣ末端Ｄ−アミノ酸残基、またはこれらの環状構造の存在を除いて、これらが対応するペプチドの配列と同一である。
【００８８】
環状ペプチド
いくつかの実施形態において、天然に存在するＡｎｇ−（１−７）の機能的同等物、類似体または誘導体は、環状ペプチドである。本明細書において使用する場合、環状ペプチドは、２個の隣接していない残基の間に分子内共有結合を有する。分子内結合は、骨格と骨格、側鎖と骨格または側鎖と側鎖の結合であり得る（すなわち、直鎖状ペプチドの末端官能基および／または末端もしくは内部残基の側鎖官能基は連結され、環化を達成し得る）。典型的な分子内結合には、ジスルフィド、アミドおよびチオエーテル結合が含まれる。ポリペプチドを環化するための種々の手段は、このようなペプチドに対して行うことができる多くの他の修飾のように当技術分野で周知である。一般的考察のために、これらの内容が参照により本明細書中に組み込まれている国際公開第ＷＯ０１／５３３３１号および同第ＷＯ９８／０２４５２号を参照されたい。このような環状結合および他の修飾はまた、本発明の環状ペプチドおよび誘導体化合物に適用することができる。
【００８９】
本明細書に記載のような環状ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、または任意のこれらの組合せの残基を含み得る。アミノ酸は、自然源または非自然源由来であってよいが、ただし、少なくとも１個のアミノ基および少なくとも１個のカルボキシル基が分子中に存在する。α−アミノ酸およびβ−アミノ酸が一般に好ましい。環状ペプチドはまた、多種多様の側鎖修飾および／または置換（例えば、メチル化、ベンジル化、ｔ−ブチル化、トシル化、アルコキシカルボニル化など）のいずれかの有無に関わらず、１個もしくは複数個の希少アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリンもしくはヒドロキシリシン）、有機酸もしくはアミド、および／または一般のアミノ酸の誘導体、例えば、エステル化（例えば、ベンジル、メチルもしくはエチルエステル）またはアミド化されたＣ末端カルボキシレートを有し、かつ／またはＮ末端アミノ基の修飾（例えば、アセチル化もしくはアルコキシカルボニル化）を有するアミノ酸を含有し得る。適切な誘導体は、Ｎ−アセチル基（環化前の直鎖状ペプチドのＮ末端を表すアミノ基がアセチル化されているような）および／またはＣ末端アミド基（すなわち、環化の前の直鎖状ペプチドのカルボキシ末端はアミド化される）を有するアミノ酸を含む。環状ペプチドと共に存在し得る一般のアミノ酸以外の残基には、これらに限定されないが、ペニシラミン、β，β−テトラメチレンシステイン、β，β−ペンタメチレンシステイン、β−メルカプトプロピオン酸、β，β−ペンタメチレン−β−メルカプトプロピオン酸、２−メルカプトベンゼン、２−メルカプトアニリン、２−メルカプトプロリン、オルニチン、ジアミノ酪酸、α−アミノアジピン酸、ｍ−アミノメチル安息香酸およびα，β−ジアミノプロピオン酸が含まれる。
【００９０】
Ｎ−アセチル化および／またはＣ−アミド化の有無に関わらず、直鎖状ペプチドの合成に続いて、環化は、当技術分野で周知の種々の技術のいずれかによって達成し得る。一実施形態において、結合は、反応性アミノ酸側鎖の間で生じ得る。例えば、ジスルフィド架橋は、種々の方法のいずれかを使用して、ペプチドを酸化することによって、２個のチオール含有残基を含む直鎖状ペプチドから形成し得る。１つのこのような方法において、チオールの空気酸化は、塩基性または中性の水性媒体を使用して、数日の期間に亘りジスルフィド連結を生じさせることができる。ペプチドを高希釈度で使用し、凝集および分子間の副反応を最小化する。代わりに、強力な酸化剤、例えば、Ｉ２およびＫ３Ｆｅ（ＣＮ）６を使用して、ジスルフィド連結を形成することができる。Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＨｉｓの感受性側鎖が酸化しないように慎重さが必要であることを当業者は認識する。さらなる実施形態において、環化は、アミド結合形成によって達成し得る。例えば、ペプチド結合は、末端官能基（すなわち、環化の前の直鎖状ペプチドのアミノおよびカルボキシ末端）の間で形成し得る。別のこのような実施形態において、直鎖状ペプチドは、Ｄ−アミノ酸を含む。代わりに、環化は、Ｎ末端アセチル基および／またはＣ末端アミドの有無に関わらず、１個の末端および残基側鎖を連結することによって、または２個の側鎖を使用して達成し得る。ラクタム結合を形成することができる残基には、リシン、オルニチン（Ｏｒｎ）、α−アミノアジピン酸、ｍ−アミノメチル安息香酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、グルタメートまたはアスパルテートが含まれる。アミド結合を形成するための方法は一般に、当技術分野で周知である。１つのこのような方法において、カルボジイミドが媒介するラクタム形成は、カルボン酸とＤＣＣ、ＤＩＣ、ＥＤ  ＡＣまたはＤＣＣＩとを反応させることによって達成することができ、Ｏ−アシル尿素の形成がもたらされ、これは遊離アミノ基と直ちに反応して、環化を完了することができる。代わりに、環化は、アジド法を使用して行うことができ、ここでは反応性アジド中間体は、ヒドラジドを介してアルキルエステルから生じる。代わりに、活性化エステルを使用して、環化を達成することができる。エステルのアルコキシ炭素上の電子求引性置換基の存在は、アミノリシスに対するエステルの影響の受けやすさを増加させる。ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシ化合物およびポリハロゲン化フェノールのエステルの高い反応性は、これらの「活性エステル」を、アミド結合の合成において有用なものとしてきた。さらなる実施形態において、チオエーテル連結は、チオール含有残基の側鎖および適当に誘導体化されたα−アミノ酸の間に形成し得る。例として、リシン側鎖は、カルボジイミドカップリング方法（ＤＣＣ、ＥＤＡＣ）によってブロモ酢酸にカップリングすることができ、次いで、上記のチオール含有残基のいずれかの側鎖と反応させて、チオエーテル連結を形成させる。ジチオエーテルを形成するために、任意の２個のチオール含有側鎖は、ＤＭＦ中のジブロモエタンおよびジイソプロピルアミンと反応させることができる。
【００９１】
例示的なアンジオテンシン−（１−７）ペプチド
直鎖状アンジオテンシン（１−７）ペプチド
特定の態様において、本発明は、直鎖状アンジオテンシン−（１−７）ペプチドを提供する。上記で考察するように、天然に存在するＡｎｇ−（１−７）の構造は、下記の通りである：
Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｔｙｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｐｒｏ７（配列番号１）  。
【００９２】
本発明のペプチドおよびペプチド類似体は一般に、式（Ｉ）によって表すことができ、
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｘａａ７（配列番号３）
または薬学的に許容されるその塩である。
【００９３】
Ｘａａ１は、任意のアミノ酸またはジカルボン酸である。特定の実施形態において、Ｘａａ１は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｃｐｃ（１−アミノシクロペンタンカルボン酸）、Ａｌａ、Ｍｅ２Ｇｌｙ（Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン）、Ｐｒｏ、Ｂｅｔ（ベタイン、１−カルボキシ−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルメタンアミニウム水酸化物）、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｓａｒ（サルコシン）またはＳｕｃ（コハク酸）である。特定のこのような実施形態において、Ｘａａ１は、負に帯電しているアミノ酸、例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕ、典型的にはＡｓｐである。
【００９４】
Ｘａａ２は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｃｉｔ（シトルリン）、Ｏｒｎ（オルニチン）、アセチル化Ｓｅｒ、Ｓａｒ、Ｄ−ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓである。特定の実施形態において、Ｘａａ２は、正に帯電しているアミノ酸、例えば、ＡｒｇまたはＬｙｓ、典型的にはＡｒｇである。
【００９５】
Ｘａａ３は、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ（ノルロイシン）、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、ＨｙｄｒｏｘｙＰｒｏ（ヒドロキシプロリン）、Ａｉｂ（２−アミノイソ酪酸）、ＡｃｐｃまたはＴｙｒである。特定の実施形態において、Ｘａａ３は、脂肪族アミノ酸、例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＮｌｅ、典型的にはＶａｌまたはＮｌｅである。
【００９６】
Ｘａａ４は、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ３）、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ホモＳｅｒ（ホモセリン）、アザＴｙｒ（アザ−α１−ホモ−Ｌ−チロシン）またはＡｌａである。特定の実施形態において、Ｘａａ４は、ヒドロキシル−置換アミノ酸、例えば、Ｔｙｒ、ＳｅｒまたはＴｈｒ、典型的にはＴｙｒである。
【００９７】
Ｘａａ５は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、ＶａｌまたはＧｌｙである。特定の実施形態において、Ｘａａ５は、脂肪族アミノ酸、例えば、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＮｌｅ、典型的にはＩｌｅである。
【００９８】
Ｘａａ６は、Ｈｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ２−Ｐｈｅ（６−アミノフェニルアラニン（ａｍｉｎｏｐｈｅｎｙｌａｌａｉｎｅ））である。特定の実施形態において、Ｘａａ６は、完全または部分的に正に帯電しているアミノ酸、例えば、ＡｒｇまたはＨｉｓである。
【００９９】
Ｘａａ７は、Ｃｙｓ、ＰｒｏまたはＡｌａである。
【０１００】
特定の実施形態において、Ｘａａ１〜Ｘａａ７の１つまたは複数は、天然に存在するＡｎｇ（１−７）における対応するアミノ酸と同一である。特定のこのような実施形態において、Ｘａａ１〜Ｘａａ７の１個または２個を除いて全ては、天然に存在するＡｎｇ（１−７）における対応するアミノ酸と同一である。他の実施形態において、Ｘａａ１〜Ｘａａ６の全ては、天然に存在するＡｎｇ（１−７）における対応するアミノ酸と同一である。
【０１０１】
特定の実施形態において、Ｘａａ３は、Ｎｌｅである。Ｘａａ３がＮｌｅであるとき、Ｘａａ１〜Ｘａａ２およびＸａａ４〜７の１つまたは複数は、天然に存在するＡｎｇ（１−７）における対応するアミノ酸と任意選択で同一である。特定のこのような実施形態において、Ｘａａ１〜Ｘａａ２およびＸａａ４〜７の１個または２個を除いて全ては、天然に存在するＡｎｇ（１−７）における対応するアミノ酸と同一である。他の実施形態において、Ｘａａ１〜Ｘａａ２およびＸａａ４〜７の全ては、天然に存在するＡｎｇ（１−７）における対応するアミノ酸と同一であり、アミノ酸配列：Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｎｌｅ３−Ｔｙｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｐｒｏ７（配列番号４）をもたらす。
【０１０２】
特定の実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｎｌｅ３−Ｔｙｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｐｒｏ７（配列番号４）を有する。
【０１０３】
特定の実施形態において、ペプチドは、アミノ酸配列Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｓｅｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｃｙｓ（配列番号５）またはＡｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−ｓｅｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｃｙｓ７（配列番号６）を有する。
【０１０４】
例示的な環状アンジオテンシン（１−７）ペプチド
特定の態様において、本発明は、ＡｎｇにおけるＴｙｒ４位およびＰｒｏ７位に対応するアミノ酸の側鎖の間などの連結を含む、環状アンジオテンシン−（１−７）（Ａｎｇ（１−７））ペプチド類似体を提供する。これらのペプチド類似体は典型的には、７個のアミノ酸残基を含むが、また切断可能な配列を含むことができる。下でさらに詳細に考察するように、本発明は、フラグメントおよび類似体を含み、１個または複数個のアミノ酸は、別のアミノ酸（フラグメントを含めた）で置換されている。このようなフラグメントまたは類似体の一例は、Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｓｅｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｃｙｓ７（配列番号２２）であり、連結は、Ｓｅｒ４およびＣｙｓ７の間で形成される。
【０１０５】
下記のセクションは、４位および７位の残基を連結するチオエーテル結合に関して本発明の態様を記載するが、（上記のような）他の連結は、チオエーテル架橋を置き換えることができ、他の残基を環化することができることを理解すべきである。チオエーテル架橋はまた、モノスルフィド架橋と、または、Ａｌａ−Ｓ−Ａｌａの場合、ランチオニン架橋と称される。チオエーテル架橋含有ペプチドは、下記の式：
【０１０６】
【化３】
2015508759.tif 000004
【０１０７】
の１つを有する２個のアミノ酸によって形成することができる。
【０１０８】
これらの式において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、独立に、−Ｈ、アルキル（例えば、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ４アルキル）またはアラルキル基であり、アルキルおよびアラルキル基は、１個または複数個のハロゲン、−ＯＨまたは−ＮＲＲ’基（ＲおよびＲ’は、独立に、−ＨまたはＣ１〜Ｃ４アルキルである）で任意選択で置換されている。特定の実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は、それぞれ独立に、−Ｈまたは−ＣＨ３であり、例えば、全ては−Ｈである。
【０１０９】
特定の実施形態において、本発明は、式（Ｉ）によるチオエーテル架橋を含むＡｎｇ類似体または誘導体を提供する。典型的には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、−Ｈおよび−ＣＨ３から独立に選択される。式（Ｉ）によるチオエーテル架橋を含むペプチドは、例えば、ランチビオティック酵素によって、またはジスルフィドの硫黄の脱離によって生成することができる。一例において、そこから硫黄が脱離されるジスルフィドは、４位におけるＤ−システインおよび７位におけるＬ−システインによって、または４位におけるＤ−システインおよび７位におけるＬ−ペニシラミンによって形成することができる（例えば、Ｇａｌａｎｄｅ、ＴｒｅｎｔおよびＳｐａｔｏｌａ、（２００３年）Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、７１巻、５３４〜５５１頁を参照されたい）。
【０１１０】
他の実施形態において、２個のアミノ酸の連結は、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）において示す架橋でよい。式（ＩＩ）によるチオエーテル架橋を含むペプチドは、例えば、４位におけるＤ−ホモシステインおよび７位におけるＬ−システインによって形成されるジスルフィドの硫黄の脱離によって作製することができる。同様に、式（ＩＩＩ）におけるようにチオエーテル架橋を含むペプチドは、例えば、４位におけるＤ−システインおよび７位におけるＬ−ホモシステインによって形成されるジスルフィドの硫黄の脱離によって作製することができる。
【０１１１】
上記で考察するように、本発明のＡｎｇ類似体および誘導体は、長さおよびアミノ酸組成が変動する。本発明のＡｎｇ類似体および誘導体は好ましくは生物活性を有し、またはタンパク分解性に活性化することができる不活性な前駆体分子である（例えば、１０個のアミノ酸を有するアンジオテンシン（Ｉ）が、２個のアミノ酸の切断によって活性フラグメントにどのように変換されるか）。Ａｎｇ類似体または誘導体のサイズは変動することができるが、３〜７Ｎｌｅ−チオエーテル環状構造を含む「コア」五量体セグメントが包含される限り、典型的には約５〜１０個のアミノ酸である。本発明の類似体または誘導体のアミノ酸配列は、変動することができるが、典型的にはただし、本発明の類似体または誘導体は生物活性があり、またはタンパク分解性に活性化されることができる。類似体または誘導体の生物活性は、放射性リガンド結合研究、インビトロでの細胞活性化アッセイおよびインビボでの実験を含めた当技術分野において公知の方法を使用して決定することができる。例えば、ＧｏｄｅｎｙおよびＳａｙｅｓｋｉ、（２００６年）Ａｍ．  Ｊ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２９１巻：Ｃ１２９７〜１３０７頁；Ｓａｒｒら、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．  Ｒｅｓ．（２００６年）７１巻：７９４〜８０２頁；およびＫｏｚｉａｒｚら、（１９３３年）Ｇｅｎ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２４巻：７０５〜７１３頁を参照されたい。
【０１１２】
ペプチドの長さのみが変動するＡｎｇ類似体および誘導体には、下記が含まれる。
［Ｃｙｃ４−７］Ａｎｇ（１−７）と称される４，７−環化類似体、天然Ａｎｇ（１−７）（Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｃｙｃ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｃｙｃ７、配列番号７）に由来する。
［Ｎｌｅ３、Ｃｙｃ４−７］Ａｎｇ（１−１０）と称される４，７−環化類似体、天然アンジオテンシンＩ（Ａｎｇ（１−１０））（Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｎｌｅ３−Ｃｙｃ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｃｙｃ７−Ｐｈｅ８−Ｈｉｓ９−Ｌｅｕ１０、配列番号８）に由来する；
［Ｎｌｅ３、Ｃｙｃ４−７］Ａｎｇ（１−８）と称される４，７−環化類似体、天然アンジオテンシンＩＩ（Ａｎｇ（１−８））（Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｎｌｅ３−Ｃｙｃ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｃｙｃ７−Ｐｈｅ８、配列番号９）に由来する；
［Ｎｌｅ３、Ｃｙｃ４−７］Ａｎｇ（２−８）と称される４，７−環化類似体、天然アンジオテンシンＩＩＩ（Ａｎｇ（２−８））（Ａｒｇ２−Ｎｌｅ３−Ｃｙｃ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｃｙｃ７−Ｐｈｅ８、配列番号１０）に由来する；
［Ｎｌｅ３、Ｃｙｃ４−７］Ａｎｇ（３−８）と称される４，７−環化類似体、天然アンジオテンシンＩＶ（Ａｎｇ（３−８））（Ｎｌｅ３−Ｃｙｃ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｃｙｃ７−Ｐｈｅ８、配列番号１１）に由来する；
［Ｎｌｅ３、Ｃｙｃ４−７］Ａｎｇ（１−７）と称される４，７−環化類似体、天然Ａｎｇ（１−７）（Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｎｌｅ３−Ｃｙｃ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｃｙｃ７、配列番号１２）に由来する；および
［Ｎｌｅ３、Ｃｙｃ４−７］Ａｎｇ（１−９）と称される４，７−環化類似体、天然Ａｎｇ（１−９）（Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｎｌｅ３−Ｃｙｃ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｃｙｃ７−Ｐｈｅ８−Ｈｉｓ９、配列番号１３）に由来する。
これらの類似体は、Ｃｙｃ４−７部分として式（Ｉ）〜（ＩＩＩ）において示すチオエーテル架橋の１つを有することができ、例えば、Ｃｙｃ４およびＣｙｃ７は、式（Ｉ）によって表され、例えば、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ、−Ｈまたは−ＣＨ３、典型的には−Ｈである。
【０１１３】
天然アンジオテンシンペプチドのアミノ酸配列と比較して、Ｃｙｃ４−７類似体の４位および７位におけるアミノ酸は修飾され、上に示すチオエーテル環状構造の導入が可能となる。Ａｎｇ類似体の長さに加えて、３位、４位および７位以外の位置におけるアミノ酸は、天然に存在するペプチドと同じまたは異なってもよいが、典型的にはただし、類似体は、生物学的機能を保持する。不活性な前駆体の類似体、例えば、［Ｃｙｃ４−７］Ａｎｇ（１−１０）について、生物学的機能とは、類似体を生物活性があるフラグメント（例えば、Ａｎｇ（１−８）もしくはＡｎｇ（１−７））に切断することができるアンジオテンシン変換酵素に対する類似体の影響の受けやすさ、またはフラグメント自体の生物活性の、一方または両方を指す。特定の実施形態において、本発明のＡｎｇ類似体または誘導体は内在性の機能を有さないが、１種または複数種の天然に存在するアンジオテンシン化合物の効果を阻害する。
【０１１４】
特定の実施形態において、本発明のＡｎｇ類似体は、式（ＩＶ）によって表される。
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｃｙｃ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｃｙｃ７（Ｖ、配列番号１４）
Ｘａａ１は、任意のアミノ酸であるが、典型的には負に帯電しているアミノ酸、例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ、より典型的にはＡｓｐである。
【０１１５】
Ｘａａ２は、正に帯電しているアミノ酸、例えば、ＡｒｇまたはＬｙｓ、典型的にはＡｒｇである。
【０１１６】
Ｘａａ３は、脂肪族アミノ酸、例えば、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＶａｌ、典型的にはＶａｌである。
【０１１７】
Ｃｙｃ４は、Ｃｙｃ７と併せてチオエーテル架橋を形成する。Ｃｙｃ４は、Ｄ−立体異性体および／またはＬ−立体異性体、典型的にはＤ−立体異性体でよい。（Ｃｙｃ７と一緒の）Ｃｙｃ４の例を、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）において示す。典型的には、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）におけるＲ基は、−Ｈまたは−ＣＨ３、特に、−Ｈである。
【０１１８】
Ｘａａ５は、脂肪族アミノ酸、例えば、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＶａｌ、典型的にはＩｌｅである。
【０１１９】
Ｘａａ６は、Ｈｉｓである。
【０１２０】
例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）において、Ｃｙｃ７は、Ｃｙｃ４と併せてチオエーテル架橋を形成する。Ｃｙｃ７は、Ｄ−立体異性体および／またはＬ−立体異性体、典型的にはＬ−立体異性体でよい。（Ｃｙｃ４と一緒の）Ｃｙｃ７の例を、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）において示す。典型的には、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）および（ＩＶ）におけるＲ基は、−Ｈまたは−ＣＨ３、特に、−Ｈである。
【０１２１】
特定の実施形態において、Ｘａａ１〜Ｘａａ６の１つまたは複数（Ｃｙｃ４およびＣｙｃ７を除いて）は、天然に存在するＡｎｇ−（１−７）中の対応するアミノ酸と同一である。特定のこのような実施形態において、Ｘａａ１〜Ｘａａ６の１個または２個を除いて全ては、天然に存在するＡｎｇ−（１−７）中の対応するアミノ酸と同一である。他の実施形態において、Ｘａａ１〜Ｘａａ６の全ては、天然に存在するＡｎｇ−（１−７）中の対応するアミノ酸と同一である。
【０１２２】
特定の実施形態において、Ｃｙｃ４およびＣｙｃ７は、Ａｂｕ（２−アミノ酪酸）およびＡｌａ（アラニン）から独立に選択され、Ａｌａは、少なくとも１つの位置において存在する。このように、環状類似体は、−Ａｌａ４−Ｓ−Ａｌａ７−（式（Ｉ）、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ−Ｈである）；−Ａｌａ４−Ｓ−Ａｂｕ７−（式（Ｉ）：Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈであり、Ｒ４は、−ＣＨ３である）または−Ａｂｕ４−Ｓ−Ａｌａ７−（式（Ｉ）：Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は、−Ｈであり、Ｒ２は、−ＣＨ３である）によって形成されるチオエーテル連結を有することができる。環状類似体の具体例は、−Ａｂｕ４−Ｓ−Ａｌａ７−連結または−Ａｌａ４−Ｓ−Ａｌａ７−連結を含む。
【０１２３】
特定の実施形態において、本発明は、下記の構造的ダイアグラム：
【０１２４】
【化４】
2015508759.tif 000005
【０１２５】
によって表されるアミノ酸配列Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ａｂｕ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ａｌａ７（配列番号１５）またはアミノ酸配列Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ａｌａ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ａｌａ７（配列番号１６）を有する、４位および７位の間にチオエーテル−架橋を伴うＡｎｇ−（１−７）類似体を提供する。
【０１２６】
特定の実施形態において、本発明のＡｎｇ類似体または誘導体は、式（ＩＶ）：
Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｎｌｅ３−Ｃｙｃ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−Ｃｙｃ７−Ｘａａ８−Ｘａａ９−Ｘａａ１０（ＩＶ、配列番号１７）
によって表される。上記で考察するように、Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ８、Ｘａａ９およびＸａａ１０の１つまたは複数は、特定の実施形態において存在しない。例えば、（１）Ｘａａ１０は存在せず、（２）Ｘａａ９およびＸａａ１０は存在せず、（３）Ｘａａ８、Ｘａａ９およびＸａａ１０は存在せず、（４）Ｘａａ１は存在せず、（５）Ｘａａ１およびＸａａ１０は存在せず、（６）Ｘａａ１、Ｘａａ９およびＸａａ１０は存在せず、（７）Ｘａａ１、Ｘａａ８、Ｘａａ９およびＸａａ１０は存在せず、（８）Ｘａａ１およびＸａａ２は存在せず、（９）Ｘａａ１、Ｘａａ２およびＸａａ１０は存在せず、（１０）Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ９およびＸａａ１０は存在せず、または（１１）Ｘａａ１、Ｘａａ２、Ｘａａ８、Ｘａａ９およびＸａａ１０は存在しない。これらの実施形態のそれぞれについて、残りのアミノ酸は、下記の値を有する。
【０１２７】
Ｘａａ１は、存在するとき、任意のアミノ酸であるが、典型的には負に帯電しているアミノ酸、例えば、ＧｌｕまたはＡｓｐ、より典型的にはＡｓｐである。
【０１２８】
Ｘａａ２は、存在するとき、正に帯電しているアミノ酸、例えば、ＡｒｇまたはＬｙｓ、典型的にはＡｒｇである。
【０１２９】
Ｎｌｅ３は、ノルロイシンである。
【０１３０】
Ｃｙｃ４は、Ｃｙｃ７と併せてチオエーテル架橋を形成する。Ｃｙｃ４は、Ｄ−立体異性体および／またはＬ−立体異性体、典型的にはＤ−立体異性体でよい。（Ｃｙｃ７と一緒の）Ｃｙｃ４の例を、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）において示す。典型的には、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）におけるＲ基は、−Ｈまたは−ＣＨ３、特に、−Ｈである。
【０１３１】
Ｘａａ５は、脂肪族アミノ酸、例えば、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、ＩｌｅまたはＶａｌ、典型的にはＩｌｅである。
【０１３２】
Ｘａａ６は、Ｈｉｓである。
【０１３３】
例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）において、Ｃｙｃ７は、Ｃｙｃ４と併せてチオエーテル架橋を形成する。Ｃｙｃ７は、Ｄ−立体異性体および／またはＬ−立体異性体、典型的にはＬ−立体異性体でよい。（Ｃｙｃ４と一緒の）Ｃｙｃ７の例を、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）において示す。典型的には、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）におけるＲ基は、−Ｈまたは−ＣＨ３、特に、−Ｈである。
【０１３４】
Ｘａａ８は、存在するとき、Ｐｒｏ以外のアミノ酸、典型的にはＰｈｅまたはＩｌｅである。特定の実施形態において、Ｉｌｅは、Ａｎｇ（１−８）の阻害剤をもたらす。特定の実施形態において、Ｐｈｅは、Ａｎｇ（１−８）またはＡｎｇ（１−１０）の生物活性を維持する。
【０１３５】
Ｘａａ９は、存在するとき、Ｈｉｓである。
【０１３６】
Ｘａａ１０は、存在するとき、脂肪族残基、例えば、Ｉｌｅ、ＶａｌまたはＬｅｕ、典型的にはＬｅｕである。
【０１３７】
特定の実施形態において、Ｘａａ１〜Ｘａａ１０の１つまたは複数（Ｎｌｅ３、Ｃｙｃ４およびＣｙｃ７を除いて）は、天然に存在するＡｎｇ（Ａｎｇ（１−７）、Ａｎｇ（１−８）、Ａｎｇ（１−９）、Ａｎｇ（１−１０）、Ａｎｇ（２−７）、Ａｎｇ（２−８）、Ａｎｇ（２−９）、Ａｎｇ（２−１０）、Ａｎｇ（３−８）、Ａｎｇ（３−９）およびＡｎｇ（３−１０）を含めた）における対応するアミノ酸と同一である。特定のこのような実施形態において、Ｘａａ１〜Ｘａａ１０の１個または２個を除いて全て（存在するものについて）は、天然に存在するＡｎｇにおける対応するアミノ酸と同一である。他の実施形態において、Ｘａａ１〜Ｘａａ１０の全て（存在するものについて）は、天然に存在するＡｎｇにおける対応するアミノ酸と同一である。
【０１３８】
特定の実施形態において、Ｃｙｃ４およびＣｙｃ７は、Ａｂｕ（２−アミノ酪酸）およびＡｌａ（アラニン）から独立に選択され、Ａｌａは、少なくとも１つの位置において存在する。このように、包含されるのは、−Ａｌａ４−Ｓ−Ａｌａ７−（式（Ｉ）、Ｒ１〜Ｒ４は、それぞれ−Ｈである）；−Ａｌａ４−Ｓ−Ａｂｕ７−（式（Ｉ）：Ｒ１〜Ｒ３は、−Ｈであり、Ｒ４は、−ＣＨ３である）または−Ａｂｕ４−Ｓ−Ａｌａ７−（式（Ｉ）：Ｒ１、Ｒ３およびＲ４は、−Ｈであり、Ｒ２は、−ＣＨ３である）によって形成されるチオエーテル連結を含む環状類似体である。特定の環状類似体は、−Ａｂｕ４−Ｓ−Ａｌａ７−または−Ａｌａ４−Ｓ−Ａｌａ７−連結を含む。
【０１３９】
特に、本発明は、アミノ酸配列Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｎｌｅ３−Ａｂｕ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ａｌａ７（配列番号１８）またはアミノ酸配列Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｎｌｅ３−Ａｌａ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ａｌａ７（配列番号１９）を有する、４位および７位の間にチオエーテル−架橋を伴うＡｎｇ（１−７）類似体または誘導体を提供する。
【０１４０】
別の態様において、本発明は、Ａｎｇ（１−８）アンタゴニスト活性を有する、４位および７位の間にチオエーテル−架橋を伴うＡｎｇ（１−８）類似体または誘導体、特に、アミノ酸配列Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｎｌｅ３−Ａｂｕ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ａｌａ７−Ｉｌｅ８（配列番号２０）またはアミノ酸配列Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｎｌｅ３−Ａｌａ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ａｌａ７−Ｉｌｅ８（配列番号２１）を有するＡｎｇ（１−８）類似体または誘導体を提供する。
【０１４１】
アルキル基は、完全に飽和している直鎖状または分岐状の非芳香族炭化水素である。典型的には、直鎖状または分岐状のアルキル基は、１個〜約２０個の炭素原子、好ましくは１個〜約１０個の炭素原子を含む。直鎖状および分岐状のアルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ペンチルおよびオクチルが含まれる。Ｃ１〜Ｃ４直鎖状または分岐状のアルキル基はまた、「低級アルキル」基と称される。
【０１４２】
アラルキル基は、アリール基で置換されているアルキル基である。芳香族（アリール）基には、炭素環式芳香族基、例えば、フェニル、ナフチル、およびアントラシル、ならびにヘテロアリール基、例えば、イミダゾリル、チエニル、フリル、ピリジル、ピリミジル、ピラニル、ピラゾリル、ピロリル、ピラジニル、チアゾリル、オキサゾリル、およびテトラゾリルが含まれる。芳香族基はまた、縮合多環芳香族環系を含み、炭素環式芳香族環またはヘテロアリール環は、１つまたは複数の他のヘテロアリール環に縮合している。例には、ベンゾチエニル、ベンゾフリル、インドリル、キノリニル、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイミダゾール、キノリニル、イソキノリニルおよびイソインドリルが含まれる。
【０１４３】
アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト
本発明はまた、末梢血管疾患の処置におけるアンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストの使用を意図する。本明細書において使用する場合、「アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト」という用語は、アンジオテンシン−（１−７）受容体、特に、Ｇタンパク質共役Ｍａｓ受容体の機能においてプラスの影響を有する任意の分子を包含する。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストは、アンジオテンシン−（１−７）受容体（すなわち、Ｍａｓ受容体）活性を直接的または間接的に増強し、強化し、活性化させ、かつ／または増加させる。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストは、アンジオテンシン−（１−７）受容体（すなわち、Ｍａｓ受容体）と直接的に相互作用する。このようなアゴニストは、例えば、タンパク質、化合物、小分子、核酸、抗体、薬物、リガンド、または他の薬剤を含めて、ペプチドまたは非ペプチドでよい。
【０１４４】
例示的なクラスのアンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストは、１−（ｐ−チエニルベンジル）イミダゾールである。これらの非ペプチドのアンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストの例は、構造式（ＩＶ）によって表され、
【０１４５】
【化５】
2015508759.tif 000006
【０１４６】
または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
Ｒ１は、ハロゲン、ヒドロキシル、（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシ、（Ｃ１〜Ｃ８）−アルコキシ（１〜６個の炭素原子は、ヘテロ原子Ｏ、Ｓ、またはＮＨ（好ましくは、Ｏ）で置き換えられている）、（Ｃ１〜Ｃ４）−アルコキシ（飽和環状エーテル、例えば、テトラヒドロピランまたはテトラヒドロフランで置換されている）、Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ４）−アルケニル、Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキルアリール、またはアリールオキシ（非置換もしくはハロゲン、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルコキシおよびトリフルオロメチルから選択される置換基で置換されている）であり、
Ｒ２は、ＣＨＯ、ＣＯＯＨ、または（３）ＣＯ−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキルであり、
Ｒ３は、（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキルまたはアリールであり、
Ｒ４は、水素、ハロゲン（クロロ、ブロモ、フルオロ）、または（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキルであり、
Ｘは、酸素または硫黄であり、
Ｙは、酸素または−ＮＨ−であり、
Ｒ５は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキル；または（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキルアリールであり、Ｙが−ＮＨ−であるとき、Ｒ５は、水素であり、
Ｒ６は、（Ｃ１〜Ｃ５）−アルキルである。
【０１４７】
特定の実施形態において、Ｒ２がＣＯＯＨまたはＣＯ−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキルであるとき、Ｒ１は、ハロゲンではない。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストは、下記の構造によって表されるＡＶＥ０９９１、５−ホルミル−４−メトキシ−２−フェニル−１［［４−［２−（エチルアミノカルボニルスルホンアミド）−５−イソブチル−３−チエニル］−フェニル］−メチル］−イミダゾールである。
【０１４９】
【化６】
2015508759.tif 000007
【０１５０】
別の例示的なクラスのアンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストは、ｐ−チエニルベンジルアミドである。これらの非ペプチドアンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストの例は、構造式（Ｖ）によって表され、
【０１５１】
【化７】
2015508759.tif 000008
【０１５２】
または薬学的に許容されるその塩であり、式中、
Ｒ１は、（Ｃ１〜Ｃ５）−アルキル（非置換もしくはＮＨ２、ハロゲン、Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル、ＣＯ−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルおよびＣＯ２Ｈから選択されるラジカルで置換されている）、（Ｃ３〜Ｃ８）−シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル−（Ｃ３〜Ｃ８）−シクロアルキル、（Ｃ６〜Ｃ１０）−アリール（非置換もしくはハロゲンおよびＯ−（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルから選択されるラジカルで置換されている）、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０）−アリール（アリールラジカルは、非置換またはハロゲンおよびＯ−（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルから選択されるラジカルで置換されている）、（Ｃ１〜Ｃ５）−ヘテロアリール、または（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル−（Ｃ１〜Ｃ５）−ヘテロアリールであり、
Ｒ２は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキル（非置換もしくはハロゲンおよびＯ−（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルから選択されるラジカルで置換されている）、（Ｃ３〜Ｃ８）−シクロアルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル−（Ｃ３〜Ｃ８）−シクロアルキル、（Ｃ６〜Ｃ１０）−アリール（非置換もしくはハロゲン、Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルおよびＣＯ−Ｏ−（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルから選択されるラジカルで置換されている）、または（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル−（Ｃ６〜Ｃ１０）−アリール（非置換もしくはハロゲンおよびＯ−（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキルから選択されるラジカルで置換されている）であり、
Ｒ３は、水素、ＣＯＯＨ、またはＣＯＯ−（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキルであり、
Ｒ４は、水素、ハロゲン；または（Ｃ１〜Ｃ４）−アルキルであり、
Ｒ５は、水素または（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルであり、
Ｒ６は、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキル、（Ｃ１〜Ｃ３）−アルキル−（Ｃ３〜Ｃ８）−シクロアルキル、または（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルであり、
Ｘは、酸素またはＮＨである。
【０１５３】
アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストのさらなる例は、その内容が本明細書において参照により組み込まれている米国特許第６，２３５，７６６号および同第６，５３８，１４４号に記載されている。
【０１５４】
上記の様々なアンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニストは、薬学的に許容される塩として存在することができる。本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される塩」は、ペプチドまたは同等な化合物の所望の活性を保持するが、好ましくはペプチド、またはペプチドを使用する系の他の成分の活性に有害な影響を与えない塩を指す。このような塩の例は、無機酸、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などと形成される酸付加塩である。塩はまた、有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモ酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸などと共に形成し得る。カチオン性材料から形成される塩は、これらの無機酸および有機酸の共役塩基を利用し得る。塩はまた、多価金属カチオン、例えば、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケルなどと共に、またはＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンもしくはエチレンジアミンから形成された有機カチオンと共に形成し得、またはこれらの組合せ（例えば、タンニン酸亜鉛塩（ｚｉｎｃ  ｔａｎｎａｔｅ  ｓａｌｔ））である。無毒性の生理学的に許容される塩が好ましい。
【０１５５】
塩は、通常の手段、例えば、生成物の遊離酸または遊離塩基の形態と、１当量もしくは複数当量の適当な酸または塩基とを、その中で塩が不溶性である溶媒もしくは媒体中で、またはその後に真空中もしくは凍結乾燥によって除去される水などの溶媒中で反応させることによって、あるいは存在する塩のカチオンを適切なイオン交換樹脂上の別のカチオンと交換することによって形成させることができる。
【０１５６】
アルキル基は、完全に飽和した、直鎖状または分岐状の非芳香族炭化水素である。典型的には、直鎖状または分岐状のアルキル基は、１個〜約２０個の炭素原子、好ましくは１個〜約１０個の炭素原子を有する。直鎖状および分岐状のアルキル基の例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ペンチルおよびオクチルが含まれる。Ｃ１〜Ｃ４の直鎖状または分岐状のアルキル基はまた、「低級アルキル」基と称される。
【０１５７】
アルケニル基は、１つまたは複数の二重結合を含む直鎖状または分岐状の非芳香族炭化水素である。典型的には、直鎖状または分岐状のアルケニル基は、２個〜約２０個の炭素原子、好ましくは２個〜約１０個の炭素原子を有する。直鎖状および分岐状のアルケニル基の例には、エテニル、ｎ−プロペニル、およびｎ−ブテニルが含まれる。
【０１５８】
芳香族（アリール）基には、炭素環式芳香族基、例えば、フェニル、ナフチル、およびアントラシル、ならびにヘテロアリール基、例えば、イミダゾリル、チエニル、フリル、ピリジル、ピリミジル、ピラニル、ピラゾリル、ピロリル、ピラジニル、チアゾリル、オキサゾリル、およびテトラゾリルが含まれる。芳香族基はまた、縮合多環芳香族環系を含み、炭素環式芳香族環またはヘテロアリール環は、１つまたは複数の他のヘテロアリール環に縮合している。例には、ベンゾチエニル、ベンゾフリル、インドリル、キノリニル、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイミダゾール、キノリニル、イソキノリニルおよびイソインドリルが含まれる。
【０１５９】
アラルキル基は、アリール基で置換されているアルキル基である。芳香族（アリール）基には、炭素環式芳香族基、例えば、フェニル、ナフチル、およびアントラシル、ならびにヘテロアリール基、例えば、イミダゾリル、チエニル、フリル、ピリジル、ピリミジル、ピラニル、ピラゾリル、ピロリル、ピラジニル、チアゾリル、オキサゾリル、およびテトラゾリルが含まれる。芳香族基はまた、縮合多環芳香族環系を含み、炭素環式芳香族環またはヘテロアリール環は、１つまたは複数の他のヘテロアリール環に縮合している。例には、ベンゾチエニル、ベンゾフリル、インドリル、キノリニル、ベンゾチアゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイミダゾール、キノリニル、イソキノリニルおよびイソインドリルが含まれる。
【０１６０】
アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）
本発明はまた、末梢血管疾患の処置におけるアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）の使用を意図する。ＡＣＥ２は、レニン−アンジオテンシン−アルドステロン（ａｌｄｏｔｅｒｏｎｅ）系に関与する酵素である。ＡＣＥ２は一般に、様々な器官、例えば、心臓、腎臓、肝臓および肺、ならびに血管において膜アンカー型糖タンパク質として発現する。ＡＣＥ２は、アペリン、ブラジキニン、アンジオテンシン１−９に切断されるアンジオテンシンＩ、およびＡｎｇ１−７に切断されるＡｎｇ  ＩＩを含めた多数のペプチド基質を切断するカルボキシペプチダーゼである。本明細書において使用する場合、「ＡＣＥ２活性」という用語は、Ａｎｇ  ＩＩをＡｎｇ１−７に変換することができるＡＣＥ２酵素またはポリペプチドを指す。
【０１６１】
典型的には、ヒト野生型ＡＣＥ２は、シグナル配列（アミノ酸１〜１７、下の表１において下線を引く）および膜アンカーに関与するＣ末端疎水性端（下の表１においてボールド体である）を含めた８０５個のアミノ酸残基を有する。いくつかの実施形態において、Ｃ末端疎水性残基の除去は、タンパク質の溶解性の増加をもたらす。ヒト野生型ＡＣＥ２のｍＲＮＡおよびアミノ酸配列は、それぞれ、アクセッション番号ＡＢ０４６５６９およびＢＡＢ４０３７０において示され、下で表１において示される。
【０１６２】
【表１−１】
2015508759.tif 000009
【０１６３】
【表１−２】
2015508759.tif 000010
【０１６４】
このように、いくつかの実施形態において、本発明に適したＡＣＥ２酵素は、完全長成熟ヒトＡＣＥ２タンパク質（配列番号２５）である。いくつかの実施形態において、本発明に適したＡＣＥ２酵素は、完全長前駆体ＡＣＥ２におけるアミノ酸７４０に対応する残基までを含めた成熟ＡＣＥ２酵素である（配列番号２６）。いくつかの実施形態において、本発明に適したＡＣＥ２酵素は、完全長前駆体におけるアミノ酸６１５に対応する残基までを含めた成熟ＡＣＥ２酵素である（配列番号２７）。いくつかの実施形態において、適切なＡＣＥ２酵素は、成熟ヒトＡＣＥ２酵素のホモログまたは類似体であり得る。例えば、成熟ＡＣＥ２酵素のホモログまたは類似体は、実質的なＡＣＥ２酵素活性を保持する一方で、野生型または天然に存在するＡＣＥ２タンパク質（例えば、配列番号２５）と比較して、１個または複数個のアミノ酸置換、欠失、および／または挿入を含有する修飾された成熟ヒトＡＣＥ２酵素であり得る。このように、いくつかの実施形態において、本発明に適したＡＣＥ２酵素は、成熟ヒトＡＣＥ２タンパク質（配列番号２５）、またはタンパク質フラグメント（配列番号２６もしくは配列番号２７）と実質的に相同である。いくつかの実施形態において、本発明に適したＡＣＥ２酵素は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える、配列番号２５と相同なアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明に適したＡＣＥ２酵素は、成熟ヒトＡＣＥ２タンパク質（配列番号２５）、またはタンパク質フラグメント（配列番号２６もしくは配列番号２７）と実質的に同一である。いくつかの実施形態において、本発明に適したＡＣＥ２酵素は、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える、配列番号２５、またはタンパク質フラグメント（配列番号２６もしくは配列番号２７）と同一なアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明に適したＡＣＥ２酵素は、成熟ヒトＡＣＥ２タンパク質のフラグメントまたはポーションを含有する。
【０１６５】
ＡＣＥ２ヌクレオチドおよびアミノ酸配列のさらなる例は、これらのそれぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれている米国特許出願公開第２０１１／００２０３１５号、米国特許出願公開第２０１１／０３３５２４号、および米国特許出願公開第２０１０／０３１６６２４号において提供されている。
【０１６６】
いくつかの実施形態において、本発明に適したＡＣＥ２は、有意なＡＣＥ２活性を保持する、すなわち、Ａｎｇ  ＩＩをＡｎｇ１−７に変換することができる、天然に存在するＡＣＥ２酵素のフラグメントである。いくつかの実施形態において、本発明に適したＡＣＥ２酵素は、野生型ヒトＡＣＥ２酵素活性と比較して、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、１００％またはそれを超える活性を保持する。
【０１６７】
いくつかの実施形態において、ＡＣＥ２は、ＡＣＥ２酵素の可溶性形態である。例えば、いくつかの実施形態において、ＡＣＥ２は、Ｃ末端疎水性領域の一部または全てを欠如しているＡＣＥ２酵素のフラグメントである。タンパク質の溶解性はまた、グリコシル化によって影響を与えられてもよい。ヒト野生型ＡＣＥ２の可溶性ポーションは、７つのＮ−グリコシル化部位を有し、その部位におけるグリコシル化は、タンパク質の溶解性を増加し得る。いくつかの実施形態において、本発明に適したＡＣＥ２は、タンパク質の溶解性が対照と比較して増加するように、グリコシル化パターンを有する。いくつかの実施形態において、ＡＣＥ２のＮ−グリコシル化部位の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つは、グリコシル化されている。様々な実施形態において、ＡＣＥ２酵素は、総ＡＣＥ２の１０％重量パーセント超、１５％重量パーセント超、２０％重量パーセント超、または２５％重量パーセント超の糖組成を有する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のグリコシル化部位は、シアル酸付加されている。例えば、いくつかの実施形態において、５３位、９０位、１０３位、３２２位、４３２位、５４６位および／または６９０位に対応する１個または複数個のアスパラギン残基は、モノ−、ジ−、トリ−またはテトラ−シアル酸付加されている。いくつかの実施形態において、アミノ酸の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％は、モノ−、ジ−、トリ−またはテトラ−シアル酸付加されている。
【０１６８】
ＡＣＥ２は、基質としてＡｎｇ  ＩＩを有する全ての哺乳動物において見出される。適切なＡＣＥ２は、とりわけ、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ブタ、霊長類、またはウシを含めた任意の生物由来であり得ることを理解されたい。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、ＡＣＥ２酵素は、組換え技術によって産生される。酵素が組換え技術によって産生される場合、任意の発現系を使用することができる。ほんの数例を挙げると、公知の発現系には、例えば、卵、バキュロウイルス、植物、酵母、または哺乳動物細胞が含まれる。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、本発明に適した酵素は、哺乳動物細胞において生成される。本発明によって使用し得る哺乳動物細胞の非限定的例には、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫ライン（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ番号：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６、ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；ＳＶ４０によって形質転換したサル腎臓ＣＶ１ライン（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胎児腎ライン（２９３細胞、または懸濁培養液における増殖のためにサブクローニングした２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．、３６巻：５９頁、１９７７年）；ヒト線維肉腫細胞ライン（例えば、ＨＴ１０８０）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、７７巻：４２１６頁、１９８０年）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．、２３巻：２４３〜２５１頁、１９８０年）；サル腎細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．、３８３巻：４４〜６８頁、１９８２年）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫ライン（Ｈｅｐ  Ｇ２）が含まれる。
【０１７１】
ＡＣＥ２アクチベーター
本発明はさらに、末梢血管疾患の処置におけるＡＣＥ２アクチベーターの使用を意図する。本明細書において使用する場合、「ＡＣＥ２アクチベーター」という用語は、ＡＣＥ２の機能においてプラスの影響を有する任意の分子を包含する。いくつかの実施形態において、ＡＣＥ２アクチベーターは、ＡＣＥ２活性を直接的または間接的に増強し、強化し、活性化し、かつ／または増加させる。いくつかの実施形態において、ＡＣＥ２アクチベーターは、ＡＣＥ２と直接的に相互作用する。このようなＡＣＥ２アクチベーターは、ペプチドまたは非ペプチドでよい。いくつかの実施形態において、ＡＣＥ２アクチベーターは、小分子である。様々なＡＣＥ２アクチベーターは当技術分野において公知であり、本発明によって使用し得る。例えば、ジミナゼンアセチュレート（ＤＩＺＥ）：
【０１７２】
【化８】
2015508759.tif 000011
【０１７３】
および１−［（２−ジメチルアミノ）エチルアミノ］−４−（ヒドロキシメチル）−７−［（４−メチルフェニル）スルホニルオキシ］−９Ｈ−キサンテン−９−オン（ＸＮＴ）：
【０１７４】
【化９】
2015508759.tif 000012
【０１７５】
は、ＡＣＥ２アクチベーターとして機能することが示されてきた。例えば、これらのそれぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれている、Ｇｊｙｍｉｓｈｋａら、「Ｄｉｍｉｎａｚｅｎｅ  Ａｃｅｔｕｒａｔｅ  ｉｓ  ａｎ  ＡＣＥ２  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ａｎｄ  ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅ  Ｄｒｕｇ」ＦＡＳＥＢ  Ｊ．、２４  １０３２．３（２０１０年）およびＦｅｒｒｅｉｒａら、「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ  ２  ａｓ  ａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ」Ａｍ．  Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．  Ｃｒｉｔ．  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１７９巻：１０４８頁（２００９年）を参照されたい。適切なＡＣＥ２アクチベーターまたはＡＣＥ２アゴニストのさらなる例は、例えば、これらのそれぞれの内容が参照により本明細書中に組み込まれている、ＷＯ２００４／０００３６５および米国特許第６，１９４，５５６号において開示されている。
【０１７６】
治療への適用
いくつかの実施形態において、本発明は、末梢血管疾患（ＰＶＤ）ならびに関連する疾患、障害および状態の処置のための、アンジオテンシン−（１−７）ペプチドまたは機能的同等物、類似体もしくは誘導体、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト、ＡＣＥ２および／またはＡＣＥ２アクチベーターを使用する方法を提供する。任意の特定な理論または仮説に束縛されるものではないが、アンジオテンシン−（１−７）ペプチドまたは機能的同等物、類似体もしくは誘導体、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト、ＡＣＥ２および／またはＡＣＥ２アクチベーターは、治療的血管形成を刺激することによって、標的組織内の血流および機能的回復を改善し得ることが意図されている。
【０１７７】
特定の実施形態において、本発明の方法および組成物を使用して、末梢血管性の疾患、障害または状態からもたらされた虚血によって損傷された組織および／または細胞の修復を刺激する。いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物を使用して、虚血からもたらされる急性状態、例えば、虚血性脳卒中における損傷された組織の修復を刺激する。非限定的例として、本発明の方法および組成物を使用して、末梢血管疾患、例えば、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、特に、重症虚血肢（ＣＬＩ）を処置し得る。本明細書において使用する場合、「重症虚血肢」または「ＣＬＩ」という用語は一般に、四肢における組織の損傷または機能障害をもたらし得る、個体の四肢（例えば、手、足、脚）への血液または酸素供給の制限によって特徴付けられる状態を指す。重症虚血肢は、種々の要因のいずれか、例えば、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）に起因し得、他の症状の中でも重度の疼痛、皮膚潰瘍、またはただれをもたらし得、場合によって切断処置を引き起こす。重症虚血肢は、１つまたは複数の四肢における血管収縮、血栓症、または塞栓形成によって特徴付け得る。血液供給を通常受ける四肢における任意の組織は、重症虚血肢を経験することがある。
【０１７８】
いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物を使用して、糖尿病性血管疾患を処置する。本明細書において使用する場合、「糖尿病性血管疾患」という用語は、糖尿病による、血管、特に、動脈における閉塞の発生と関連する疾患、障害または状態を指す。糖尿病性血管疾患は、体全体で発生することがある。いくつかの実施形態において、糖尿病性血管疾患は、本明細書において使用する場合、心臓および脳の外側の１つまたは複数の組織において発生する。いくつかの実施形態において、本発明の方法および組成物を使用して、特定のタイプの糖尿病性血管疾患、例えば、ネフロパシー（腎臓疾患）、および／またはニューロパシー（つま先または足における保護的感覚の喪失をもたらす神経自体の状態）を処置する。糖尿病性血管疾患の例示的な症状には、これらに限定されないが、かすんだ視界、顔もしくは肢の膨れまたは予想外の重量増加、靴ずれ、手または足における感触の喪失または燃えるような感触、歩行するときの脚の疼痛、および高血圧が含まれてもよい。糖尿病性血管疾患を患っている患者は、壊疽として公知である死んだ組織を最終的に発生し得る。これは感染および最終的に切断処置をもたらし得る。
【０１７９】
末梢血管疾患
とりわけ、本発明の方法および組成物を使用して、末梢血管疾患を処置または寛解する。本明細書において使用する場合、「末梢血管疾患」または「ＰＶＤ」という用語は、心臓および脳の外側に位置している血管の疾患を指す。
【０１８０】
いくつかの実施形態において、処置は、対象における末梢動脈疾患の部分的もしくは完全な軽減、寛解、緩和、阻害、発症の遅延、重症度および／または発生率の低減を指す。本明細書において使用する場合、「末梢動脈疾患」または「ＰＡＤ」という用語は、内部器官および／または肢への血液供給を実現する動脈の部分的または全面的な閉塞が存在するＰＶＤの一形態を指す。いくつかの実施形態において、処置は、対象における重症虚血肢（ｃｒｉｔｃｉｃａｌ  ｌｉｍｂ  ｉｓｃｈｅｍｉａ）の部分的もしくは完全な軽減、寛解、緩和、阻害、発症の遅延、重症度および／または発生率の低減を指す。本明細書において使用する場合、「重症虚血肢」または「ＣＬＩ」という用語は一般に、四肢における組織の損傷または機能障害をもたらし得る、個体の四肢（例えば、手、腕、足、脚）への血液または酸素供給の制限によって特徴付けられる状態を指す。重症虚血肢は、種々の要因のいずれか、例えば、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）に起因し得、重度の疼痛、皮膚潰瘍、またはただれをもたらし得、場合によって切断処置を引き起こす。重症虚血肢は、１つまたは複数の四肢における血管収縮、血栓症、または塞栓形成によって特徴付け得る。血液供給を通常受ける四肢における任意の組織は、重症虚血肢を経験することがある。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、処置は、末梢血管性の疾患、障害または状態を患っている対象における改善された血流を指す。血流は、任意の利用可能な方法および／または計器類を使用して測定することができることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態において、血流は、レーザードプラを使用して測定される。血流は、処置の前および／または後の任意の適当な時間に測定することができることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態において、血流は、処置の０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、２１日目、２８日目、３５日目、４２日目、または４９日目の１つまたは複数において測定される。いくつかの実施形態において、血流測定は、正常組織における血流と比較した、病んでいるおよび／または損傷された組織における血流の比として表される。いくつかの実施形態において、病んでいるおよび／または損傷された組織における血流は、同じ個体における正常組織と比較して、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、または６５％超である。いくつかの実施形態において、病んでいるおよび／または損傷された組織における血流は、１週間当たり平均して、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、またはそれを超えて増加する。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、処置は、病んでいるおよび／または損傷された組織における壊死の低減または予防（例えば、虚血スコアの増加）を指す。例えば、いくつかの実施形態において、壊死は、病んでいるおよび／または損傷された組織における虚血の重症度の肉眼的評価によって決定される。壊死は、任意の適当な方法によって決定することができることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態において、Ｇｏｔｏら（Ｔｏｋａｉ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ、３１巻（３号）：１２８頁、２００６年）において開示されているように、壊死エリアについての形態学的グレードを割り当てる。マウスにおける壊死エリアについての例示的な形態学的グレードを、下の表２に示す。
【０１８３】
【表２】
2015508759.tif 000013
【０１８４】
いくつかの実施形態において、壊死エリアについての形態学的グレードは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０またはそれを超えるグレードだけ減少する。いくつかの実施形態において、壊死エリアについての形態学的グレードは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、またはそれを超えて減少する。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、処置は、改善された肢機能を指す。任意の適当な方法および／または計器類を使用して、肢機能は、測定することができることを理解されたい。例えば、いくつかの実施形態において、肢機能は、虚血肢の損なわれた使用の半定量的アセスメントによって決定される（例えば、Ｓｔａｂｉｌｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０８巻（２号）：２０５頁、２００３年を参照されたい）。マウスにおける肢機能の例示的なアセスメントスケールを、下の表３に提供する。ヒトにおける肢機能のアセスメントは、マウスのそれと相関することを理解されたい。
【０１８６】
【表３】
2015508759.tif 000014
【０１８７】
いくつかの実施形態において、肢機能壊死エリアについてのグレードは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０またはそれを超えるグレードだけ減少する。いくつかの実施形態において、肢機能についてのグレードは、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約１００％、またはそれを超えて減少する。
【０１８８】
医薬組成物
医薬組成物は、経口剤形、局所的クリーム剤、局所パッチ、イオン泳動形態、坐剤、鼻用スプレーおよび吸入器、点眼薬、眼球内注射形態、デポー形態、ならびに注射剤および点滴液を含めた種々の形態でよい。医薬組成物を調製するための方法は、当技術分野で周知である。
【０１８９】
医薬組成物は典型的には、本明細書に記載されている活性剤（例えば、アンジオテンシン−（１−７）ペプチドまたは機能的同等物、類似体もしくは誘導体、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト、ＡＣＥ２および／またはＡＣＥ２アクチベーター）を、不利な副作用を回避または最小化する一方で所望の治療効果を達成するに有効な量で含有する。活性剤の薬学的に許容される調製物および塩は本明細書において提供され、当技術分野で周知である。ポリペプチドなどの投与のために、治療的に有効であり、不利な副作用を殆どから全く伴わないように、投与される量は望ましくは選択される。特定の疾患、障害または状態の処置において有効な治療組成物または医薬組成物の量は、疾患の性質および重症度、作用の標的部位、対象の体重、対象が従っている特別な食事、使用される併用医薬品、投与経路、ならびに当業者が認識する他の要因によって決まる。投与量は、通常の要因、例えば、疾患の程度、および対象からの異なるパラメーターに従って臨床医が適応させることができる。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から外挿し得る（例えば、これらの全内容が参照により本明細書中に組み込まれている「Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：  Ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓａｆｅ  Ｓｔａｒｔｉｎｇ  Ｄｏｓｅ  ｉｎ  Ｉｎｉｔｉａｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｎ  Ａｄｕｌｔ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ」、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、２００５年７月）において米国保健社会福祉省、米国食品医薬品局、および医薬品評価研究センターによって記載されているように）。
【０１９０】
様々な送達系が公知であり、本明細書に記載されている活性剤（例えば、アンジオテンシン−（１−７）ペプチドまたは機能的同等物、類似体もしくは誘導体、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト、ＡＣＥ２および／またはＡＣＥ２アクチベーター）またはこれらを含む医薬組成物を投与するために使用することができる。本明細書に記載されている医薬組成物は、静脈内または筋肉内注射、脳室内またはくも膜下腔内注射（中枢神経系投与のための）、経口的、局所的、皮下、肺内（例えば、吸入）、結膜下、眼球内、または鼻腔内、皮内、舌下、膣、直腸または硬膜外の経路を含めた任意の適切な経路によって投与することができる。
【０１９１】
当技術分野で周知の他の送達系は、例えば、水溶液、微粒子（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌｅｓ）、またはマイクロカプセルにおけるカプセル化による、本明細書に記載されている医薬組成物の送達のために使用し得る。本発明の医薬組成物はまた、制御放出系において送達することができる。例えば、ポリマー材料を使用することができる（例えば、ＳｍｏｌｅｎおよびＢａｌｌ、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，  Ｄｒｕｇ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、１９８４年、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；ＲａｎａｄｅおよびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ、Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ｓｅｒｉｅｓ、２００３年、第２版、ＣＲＲＣ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい）。代わりに、ポンプを使用し得る（Ｓａｕｄｅｋら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．３２１巻：５７４頁（１９８９年））。本明細書に記載されている組成物はまた、薬物の制御放出の達成において有用な一群の生分解性ポリマー、例えば、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、架橋両親媒性ブロックコポリマーおよびヒドロゲル、ポリヒドロキシ酪酸、ならびにポリジヒドロピランにカップリングし得る。
【０１９２】
上記のように、医薬組成物は望ましくは、薬学的に許容される担体を含む。担体という用語は、それと共にペプチド、ペプチド誘導体またはペプチド模倣物が投与される、賦形剤、アジュバント、添加剤またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、無菌の液体、例えば、水、および鉱油、植物性油（例えば、ダイズ油またはトウモロコシ油）、動物油または合成由来の油を含めた油を含む。水性グリセロールおよびデキストロース溶液ならびに食塩水はまた、本発明の医薬組成物の液体担体として用い得る。担体の選択は、当技術分野でよく認識されている要因、例えば、ペプチド、ペプチド誘導体またはペプチド模倣物の性質、その溶解性および他の生理学的特性、ならびに送達および適用の標的部位によって決まる。適切な医薬担体の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ、２００３年、第２１版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。さらに、経口投与のための適切な担体は当技術分野において公知であり、例えば、これらの開示が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第６，０８６，９１８号、同第６，６７３，５７４号、同第６，９６０，３５５号、および同第７，３５１，７４１号ならびにＷＯ２００７／１３１２８６に記載されている。
【０１９３】
医薬調製物中に組み込み得るさらなる薬学的に適切な材料には、傍細胞吸収を増加させることを意図するものを含めた吸収増強剤、ｐＨ調節剤および緩衝液、容量オスモル濃度調節剤、保存剤、安定剤、抗酸化剤、界面活性剤、増粘剤、軟化剤、分散化剤、香味剤、着色剤、および湿潤剤が含まれる。
【０１９４】
適切な医薬添加剤の例には、水、グルコース、スクロース、ラクトース、グリコール、エタノール、モノステアリン酸グリセロール、ゼラチン、デンプン粉（例えば、米粉）、チョーク、ステアリン酸ナトリウム、麦芽、塩化ナトリウムなどが含まれる。アンジオテンシンポリペプチドを含む医薬組成物は、溶液剤、カプセル剤、錠剤、クリーム剤、ゲル剤、散剤の持続放出製剤などの形態を取ることができる。組成物は、伝統的な結合剤および担体、例えば、トリグリセリドと共に坐剤として製剤することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ、２００３年、第２１版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい）。このような組成物は、対象への適切な投与のための形態を実現するために、適切な量の担体と一緒に、治療有効量の治療組成物を含有する。製剤は、投与のモードおよび作用の標的部位（例えば、特定の器官または細胞型）に合うように設計される。
【０１９５】
本明細書に記載されている活性剤（例えば、アンジオテンシン−（１−７）ペプチドまたは機能的同等物、類似体もしくは誘導体、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト、ＡＣＥ２および／またはＡＣＥ２アクチベーター）を含む医薬組成物はまた、中性または塩の形態として製剤された組成物を含む。薬学的に許容される塩は、遊離アミノ基と共に形成されるもの、および遊離カルボキシル基と反応するものを含む。医薬品産業において一般に使用される無毒性のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、およびアンモニウム塩には、当技術分野で周知の方法によって調製されるナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、バリウム塩、アンモニウム塩、およびプロタミン亜鉛塩が含まれる。また含まれるのは、本発明の化合物と適切な有機酸または無機酸とを反応させることによって一般に調製される無毒性の酸付加塩である。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、吉草酸塩、シュウ酸塩、オレイン酸塩、ラウリン酸塩（ｌａｕｒｅａｔｅ）、ホウ酸塩、安息香酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、リン酸塩、チソレート（ｔｙｓｏｌａｔｅ）、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、コハク酸塩、ナプシル酸塩などが含まれる。
【０１９６】
本発明によって使用し得る充填剤または結合剤の例には、アカシア、アルギン酸、（第二）リン酸カルシウム、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、デキストリン、デキストレート（ｄｅｘｔｒａｔｅｓ）、スクロース、チロース、アルファ化デンプン、硫酸カルシウム、アミロース、グリシン、ベントナイト、マルトース、ソルビトール、エチルセルロース、リン酸水素二ナトリウム、リン酸二ナトリウム、ピロ亜硫酸二ナトリウム、ポリビニルアルコール、ゼラチン、グルコース、グアーガム、液状グルコース、圧縮性糖、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、マルトデキストリン、ポリエチレンオキシド、ポリメタクリレート、ポビドン、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、微結晶性セルロース、デンプン、およびゼインが含まれる。特定の実施形態において、充填剤または結合剤は、微結晶性セルロースである。
【０１９７】
使用し得る崩壊剤の例には、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース（低置換度）、微結晶性セルロース、粉末セルロース、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、メチルセルロース、ポラクリリンカリウム、ポビドン、アルギン酸ナトリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デンプン、二亜硫酸二ナトリウム、エダサミル二ナトリウム、エデト酸二ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、架橋ポリビニルピロリドン、アルファ化デンプン、カルボキシメチルデンプン、カルボキシメチルデンプンナトリウム、微結晶性セルロースが含まれる。
【０１９８】
滑沢剤の例には、ステアリン酸カルシウム、キャノーラ油、グリセリルパルミトステアレート、水添植物性油（タイプＩ）、酸化マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、鉱油、ポロキサマー、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウムフマレート（ｓｏｄｉｕｍ  ｓｔｅａｒａｔｅ  ｆｕｍａｒａｔｅ）、ステアリン酸、タルクおよび、ステアリン酸亜鉛、グリセリルベハペート（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｂｅｈａｐａｔｅ）、ラウリル硫酸マグネシウム、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム／酢酸ナトリウム（組み合わせた）、ＤＬ−ロイシンが含まれる。
【０１９９】
シリカ流動調整剤の例には、コロイド状二酸化ケイ素、ケイ酸アルミニウムマグネシウムおよびグアーガムが含まれる。別の最も好ましいシリカ流動調整剤は、二酸化ケイ素からなる。
【０２００】
安定化剤の例には、アカシア、アルブミン、ポリビニルアルコール、アルギン酸、ベントナイト、第二リン酸カルシウム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、コロイド状二酸化ケイ素、シクロデキストリン、モノステアリン酸グリセリル、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、三ケイ酸マグネシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、プロピレングリコール、アルギン酸プロピレングリコール、アルギン酸ナトリウム、カルナウバワックス、キサンタンガム、デンプン、ステアレート（複数可）、ステアリン酸、ステアリン酸モノグリセリドおよびステアリルアルコールが含まれる。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている活性剤（例えば、アンジオテンシン−（１−７）ペプチドまたは機能的同等物、類似体もしくは誘導体、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト、ＡＣＥ２および／またはＡＣＥ２アクチベーター）を含有する経口製剤を意図する。例えば、本明細書に記載されている医薬組成物は、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体を含み得る。シクロデキストリンは一般に、１→４連結している５個以上のα−Ｄ−グリコピラノシド単位で構成されている。典型的には、シクロデキストリンは、環中に６〜８単位の範囲のいくつかのグルコースモノマーを含有し、錐形状を生じさせる（α−シクロデキストリン：６員の糖環分子、β−シクロデキストリン：７個の糖環分子、γ−シクロデキストリン：８個の糖環分子）。例示的なシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体は、これらのそれぞれの全内容が参照により本明細書中に組み込まれている米国特許第７，７２３，３０４号、米国特許出願公開第２０１０／０１９６４５２号、および米国特許出願公開第２０１０／０１４４６２４号に開示されている。例えば、いくつかの実施形態において、本発明によるシクロデキストリンは、アルキル化シクロデキストリン、ヒドロキシアルキル化シクロデキストリン、またはアシル化シクロデキストリンである。いくつかの実施形態において、シクロデキストリンは、ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンである。例示的なシクロデキストリン誘導体は、これらのそれぞれの全内容が参照により本明細書に組み込まれているＳｚｅｊｔｌｉ，  Ｊ．、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ（１９９８年）９８巻、１７４３〜１７５３頁；およびＳｚｅｎｔｅ，  ＬおよびＳｚｅｊｔｌｉ，  Ｊ．、Ａｄｖａｎｃｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、３６巻（１９９９年）１７〜２８頁に記載されている。シクロデキストリン（ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｉｎ）誘導体の例には、メチル化シクロデキストリン（例えば、ＲＡＭＥＢ；ランダムにメチル化されたβ−シクロデキストリン）；ヒドロキシアルキル化シクロデキストリン（ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンおよびヒドロキシプロピルγ−シクロデキストリン）；アセチル化シクロデキストリン（アセチル−γ−シクロデキストリン）；反応性シクロデキストリン（クロロトリアジニルβ−シクロデキストリン）；分岐状シクロデキストリン（グルコシル−およびマルトシルβ−シクロデキストリン）；アセチル−γ−シクロデキストリン；アセチル−β−シクロデキストリン、スルホブチル−βシクロデキストリン、硫酸化α−、β−およびγ−シクロデキストリン；スルホアルキル化シクロデキストリン；ならびにヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリンが含まれる。
【０２０２】
投薬
典型的には、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の量の本明細書に記載されている活性剤（例えば、アンジオテンシン−（１−７）ペプチドまたは機能的同等物、類似体もしくは誘導体、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト、ＡＣＥ２および／またはＡＣＥ２アクチベーター）を、対象に投与する。例えば、いくつかの実施形態において、約０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２５ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日、０．２ｍｇ／ｋｇ／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．０２ｍｇ／ｋｇ／日〜約０．１ｍｇ／ｋｇ／日、または約１ｍｇ／ｋｇ／日〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日を、対象に投与する。いくつかの実施形態において、約１０μｇ／ｋｇ／日、５０μｇ／ｋｇ／日、１００μｇ／ｋｇ／日、２００μｇ／ｋｇ／日、３００μｇ／ｋｇ／日、４００μｇ／ｋｇ／日、５００μｇ／ｋｇ／日、６００μｇ／ｋｇ／日、７００μｇ／ｋｇ／日、８００μｇ／ｋｇ／日、９００μｇ／ｋｇ／日、または１０００μｇ／ｋｇ／日の量の本明細書に記載されている活性剤（例えば、アンジオテンシン−（１−７）ペプチドまたは機能的同等物、類似体もしくは誘導体、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト、ＡＣＥ２および／またはＡＣＥ２アクチベーター）を、対象に投与する。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、約１〜１，０００μｇ／ｋｇ／日の範囲（例えば、約１〜９００μｇ／ｋｇ／日、１〜８００μｇ／ｋｇ／日、１〜７００μｇ／ｋｇ／日、１〜６００μｇ／ｋｇ／日、１〜５００μｇ／ｋｇ／日、１〜４００μｇ／ｋｇ／日、１〜３００μｇ／ｋｇ／日、１〜２００μｇ／ｋｇ／日、１〜１００μｇ／ｋｇ／日、１〜９０μｇ／ｋｇ／日、１〜８０μｇ／ｋｇ／日、１〜７０μｇ／ｋｇ／日、１〜６０μｇ／ｋｇ／日、１〜５０μｇ／ｋｇ／日、１〜４０μｇ／ｋｇ／日、１〜３０μｇ／ｋｇ／日、１〜２０μｇ／ｋｇ／日、１〜１０μｇ／ｋｇ／日の範囲）の有効用量で投与される。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、約１〜５００μｇ／ｋｇ／日の範囲の有効用量で投与される。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、約１〜１００μｇ／ｋｇ／日の範囲の有効用量で投与される。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、約１〜６０μｇ／ｋｇ／日の範囲の有効用量で投与される。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドは、約１ｕｇ／ｋｇ／日、約２ｕｇ／ｋｇ／日、約４ｕｇ／ｋｇ／日、約６ｕｇ／ｋｇ／日、約８ｕｇ／ｋｇ／日、約１０ｕｇ／ｋｇ／日、約１５ｕｇ／ｋｇ／日、約２０ｕｇ／ｋｇ／日、約２５ｕｇ／ｋｇ／日、約３０ｕｇ／ｋｇ／日、約３５ｕｇ／ｋｇ／日、約４０ｕｇ／ｋｇ／日、約４５ｕｇ／ｋｇ／日、約５０ｕｇ／ｋｇ／日、約７５ｕｇ／ｋｇ／日、約１００ｕｇ／ｋｇ／日、約１５０ｕｇ／ｋｇ／日、約２００ｕｇ／ｋｇ／日、約２５０ｕｇ／ｋｇ／日、約３００ｕｇ／ｋｇ／日、約３５０ｕｇ／ｋｇ／日、約４００ｕｇ／ｋｇ／日、約４５０ｕｇ／ｋｇ／日、約５００ｕｇ／ｋｇ／日、約５５０ｕｇ／ｋｇ／日、約６００ｕｇ／ｋｇ／日、約６５０ｕｇ／ｋｇ／日、約７００ｕｇ／ｋｇ／日、約７５０ｕｇ／ｋｇ／日、約８００ｕｇ／ｋｇ／日、約８５０ｕｇ／ｋｇ／日、約９００ｕｇ／ｋｇ／日、約９５０ｕｇ／ｋｇ／日、または約１，０００ｕｇ／ｋｇ／日から選択される有効用量で投与される。
【０２０４】
いくつかの実施形態において、治療有効量のアンジオテンシン−（１−７）ペプチドまたは機能的同等物、類似体もしくは誘導体、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト、ＡＣＥ２および／またはＡＣＥ２アクチベーター）は、約１０〜１，０００ｍｇ（例えば、約２０ｍｇ〜１，０００ｍｇ、３０ｍｇ〜１，０００ｍｇ、４０ｍｇ〜１，０００ｍｇ、５０ｍｇ〜１，０００ｍｇ、６０ｍｇ〜１，０００ｍｇ、７０ｍｇ〜１，０００ｍｇ、８０ｍｇ〜１，０００ｍｇ、９０ｍｇ〜１，０００ｍｇ、約１０〜９００ｍｇ、１０〜８００ｍｇ、１０〜７００ｍｇ、１０〜６００ｍｇ、１０〜５００ｍｇ、１００〜１０００ｍｇ、１００〜９００ｍｇ、１００〜８００ｍｇ、１００〜７００ｍｇ、１００〜６００ｍｇ、１００〜５００ｍｇ、１００〜４００ｍｇ、１００〜３００ｍｇ、２００〜１０００ｍｇ、２００〜９００ｍｇ、２００〜８００ｍｇ、２００〜７００ｍｇ、２００〜６００ｍｇ、２００〜５００ｍｇ、２００〜４００ｍｇ、３００〜１０００ｍｇ、３００〜９００ｍｇ、３００〜８００ｍｇ、３００〜７００ｍｇ、３００〜６００ｍｇ、３００〜５００ｍｇ、４００ｍｇ〜１，０００ｍｇ、５００ｍｇ〜１，０００ｍｇ、１００ｍｇ〜９００ｍｇ、２００ｍｇ〜８００ｍｇ、３００ｍｇ〜７００ｍｇ、４００ｍｇ〜７００ｍｇ、および５００ｍｇ〜６００ｍｇ）の範囲の量であり得る。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドまたはアンジオテンシン（１−７）受容体アゴニストは、約１０ｍｇ以上、５０ｍｇ以上、１００ｍｇ以上、１５０ｍｇ以上、２００ｍｇ以上、２５０ｍｇ以上、３００ｍｇ以上、３５０ｍｇ以上、４００ｍｇ以上、４５０ｍｇ以上、５００ｍｇ以上、５５０ｍｇ以上、６００ｍｇ以上、６５０ｍｇ以上、７００ｍｇ以上、７５０ｍｇ以上、８００ｍｇ以上の量で存在する。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン（１−７）ペプチドまたはアンジオテンシン（１−７）受容体アゴニストは、約１０００ｍｇ以下、９５０ｍｇ以下、９００ｍｇ以下、８５０ｍｇ以下、８００ｍｇ以下、７５０ｍｇ以下、７００ｍｇ以下、６５０ｍｇ以下、６００ｍｇ以下、５５０ｍｇ以下、５００ｍｇ以下、４５０ｍｇ以下、４００ｍｇ以下、３５０ｍｇ以下、３００ｍｇ以下、２５０ｍｇ以下、２００ｍｇ以下、１５０ｍｇ以下、または１００ｍｇ以下の量で存在する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている治療有効量は、１用量で提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている治療有効量は、１日で提供される。
【０２０５】
他の実施形態において、治療有効量は、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜４００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜３００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜９０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜８０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜７０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜６０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜４０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜１５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている治療有効量は、１用量で提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている治療有効量は、１日で提供される。
【０２０６】
また他の実施形態において、治療有効量は、例えば、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．１ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．０４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０１９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０１８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０１７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０１６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０１５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０１４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０１３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０１２ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０１１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．００９ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．００８ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．００７ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．００６ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．００５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．００４ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．００３ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．００２ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。いくつかの実施形態において、治療有効用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００２ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００３ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００４ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００５ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００６ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００７ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００８ｍｇ／ｋｇ体重、０．０００９ｍｇ／ｋｇ体重、０．００１ｍｇ／ｋｇ体重、０．００２ｍｇ／ｋｇ体重、０．００３ｍｇ／ｋｇ体重、０．００４ｍｇ／ｋｇ体重、０．００５ｍｇ／ｋｇ体重、０．００６ｍｇ／ｋｇ体重、０．００７ｍｇ／ｋｇ体重、０．００８ｍｇ／ｋｇ体重、０．００９ｍｇ／ｋｇ体重、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２ｍｇ／ｋｇ体重、０．０３ｍｇ／ｋｇ体重、０．０４ｍｇ／ｋｇ体重、０．０５ｍｇ／ｋｇ体重、０．０６ｍｇ／ｋｇ体重、０．０７ｍｇ／ｋｇ体重、０．０８ｍｇ／ｋｇ体重、０．０９ｍｇ／ｋｇ体重、または０．１ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。特定の個体についての有効用量は、個体の必要性に応じて、経時的に変動（例えば、増加または減少）することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている治療有効量は、１用量で提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されている治療有効量は、１日で提供される。
【０２０７】
Ｖ、キット
特定の実施形態において、本明細書に記載されている活性剤（例えば、アンジオテンシン−（１−７）ペプチドまたは機能的同等物、類似体もしくは誘導体、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト、ＡＣＥ２および／またはＡＣＥ２アクチベーター）、投与のためのツール、ならびに／あるいは使用説明書を含む、キットまたは他の製造品を提供する。例えば、キットまたは他の製造品は、投与において有用な容器、カテーテルおよび任意の他の物品、装置または設備を含み得る。適切な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ（例えば、事前充填したシリンジ）、アンプル、カートリッジ、レザバー、またはｌｙｏ−ｊｅｃｔが含まれる。容器は、種々の材料、例えば、ガラスまたはプラスチックから形成し得る。特定の実施形態において、容器は、事前充填したシリンジである。適切な事前充填したシリンジには、これらに限定されないが、焼いたシリコーンコーティングを伴うホウケイ酸ガラスシリンジ、噴霧されたシリコーンを伴うホウケイ酸ガラスシリンジ、またはシリコーンを伴わないプラスチック用樹脂シリンジが含まれる。
【０２０８】
典型的には、容器は、本明細書に記載されている活性剤（例えば、アンジオテンシン−（１−７）ペプチドまたは機能的同等物、類似体もしくは誘導体、アンジオテンシン−（１−７）受容体アゴニスト、ＡＣＥ２および／またはＡＣＥ２アクチベーター）、ならびに本明細書に記載のような再構成および／もしくは使用のための指示を示し得る容器上のラベル、またはこれらと関連するラベルを含有する製剤を保持する。
【実施例】
【０２０９】
実施例１．  慢性後肢虚血の動物モデルにおけるアンジオテンシン（１−７）処置は、血流および肢機能を改善した
アンジオテンシン（１−７）を使用して、虚血性疾患を効果的に処置することができることを本実施例は示す。この実施例において、Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｔｙｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｐｒｏ７（配列番号１）のアミノ酸配列を有する直鎖状アンジオテンシンペプチドであるＴＸＡ１２７を一例として使用して、マウス後肢虚血モデルにおけるアンジオテンシン（１−７）の治療効果をアセスメントした。
【０２１０】
後肢虚血モデル
安定的な後肢虚血モデルは先に記載されており、一般に様々な治療の効果を検査するのに有用な均一な虚血性損傷によって特徴付けられる（Ｇｏｔｏら、Ｔｏｋａｉ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ、３１巻（３号）：１２８頁、２００６年；Ｋａｎｇ  Ｙ，ら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．、２００９年；４巻（１号）：ｅ４２７５頁））。この実施例において使用されるマウスの後肢虚血モデルは、大腿動脈の近位端の２回の結紮、および２つの結紮間の切開が関与する。手術によって血流の閉塞を引き起こし、それに続いて重度の虚血性損傷がもたらされる（Ｇｏｔｏら；Ｋａｎｇら）。この実験において、健康な成体雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用した。先に記載したプロトコルを使用して、マウスにおいて後肢虚血を誘発した。手短に言えば、Ｂａｌｂ／ｃ雌性マウスは標準的な食餌を持続させ、水は自由に利用可能とした。マウスを麻酔し、鼡径部の皮膚の切り込みを行った。大腿動脈を６−０絹糸で２回結紮し、結紮間で切除し、この後、創傷を４−０絹糸で閉じ、マウスを回復させた。
【０２１１】
ＴＸＡ１２７の投与
アンジオテンシン（１−７）ポリペプチド組成物（ＴＸＡ１２７）およびビヒクル対照（ＤＰＢＳ）を、すぐ使用できる溶液として供給し、使用するまで４℃で貯蔵した。ＴＸＡ１２７を、１日目に虚血を誘発した２４時間後に開始して毎日研究の終わりまで皮下注射した（５００μｇ／ｋｇ）。陰性対照マウスにビヒクルを皮下注射した。表４は、動物群の割当てを提供する。
【０２１２】
【表４】
2015508759.tif 000015
【０２１３】
虚血の評価
体重
動物の体重を、手術の前およびその後週１回測定した。
【０２１４】
血流
動物の両側の脚における血流を、手術の前、ならびに手術後の１日目、７日目、１５日目、２１日目、２８日目、３５日目、４２日目および４９日目に非接触レーザードプラによって測定した。血流測定は、虚血肢における流れと正常な肢における流れの比として表した。
【０２１５】
虚血の重症度の肉眼的アセスメント
表５に示すように、虚血肢の肉眼的評価を、壊死エリアについての形態学的グレードを使用することによって手術後に１週間に１回行った（Ｇｏｔｏら、Ｔｏｋａｉ  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｃｌｉｎ  Ｍｅｄ、３１巻（３号）：１２８頁、２００６年）。
【０２１６】
【表５】
2015508759.tif 000016
【０２１７】
肢機能および虚血性損傷のインビボでのアセスメント
虚血肢の損なわれた使用の半定量的アセスメントを、表６において示すスケールを使用して、手術後週１回行った（Ｓｔａｂｉｌｅら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０８巻（２号）：２０５頁、２００３年）。
【０２１８】
【表６】
2015508759.tif 000017
【０２１９】
部分的または完全な四肢切断術の場合、肢機能は「適用せず」としてグレード付けする。このような場合、血流測定は、統計解析に含めない。
【０２２０】
組織固定
動物を屠殺した日に、虚血性脚および対照脚の四頭筋筋肉を取り除き、分析のために４％緩衝ホルマリン中に固定した。
【０２２１】
結果
本明細書に記載されている方法を使用して生じさせた安定的な重度虚血モデルを使用して、反復皮下投与後のＴＸＡ１２７の血管形成の有効性をアセスメントした。
【０２２２】
体重
例示的な体重分布を、図１において要約する。研究を通して、動物の体重において統計的有意差は観察されなかった。
【０２２３】
血流
３５日目から４９日目の研究の終了まで、ビヒクル（対照）処置動物群（１Ｆ）と比較して、血流の統計的に有意な改善が、ＴＸＡ１２７処置動物群（２Ｆ）において観察された。例示的な結果を、図２において要約する。
【０２２４】
図２についての統計解析を、反復測定のための二元配置ＡＮＯＶＡ、それに続いてボンフェローニ事後検定を使用して行った。対照群１ＦとＴＸＡ１２７処置群２Ｆとの比較は、３５日目に統計的有意差を示した（ｐ＜０．００１）。
【０２２５】
インビボでの虚血の重症度のアセスメント
壊死エリアについてのグレード付けした形態学的スケールを使用して、虚血肢を７日目および４９日目に評価した。四肢切断術が、両方の群の動物において見出された。対照群１Ｆにおいて、これは６０％であり、ＴＸＡ１２７処置群２Ｆにおいて、これは４８％であった。虚血の重症度はまた、対照群およびＴＸＡ１２７処置群において異なった。重症度の減少が明らかな傾向は、対照処置群と比較してＴＸＡ１２７処置群において見られた。これらの結果を、図３において要約する。さらに、ＴＸＡ１２７処置群における大部分の四肢切断術は、図４に示されているように後肢虚血の誘発３５日目後にのみ起こる（研究を通して、０％は切断処置なしを表し、減少は切断処置の増加を反映する）。
【０２２６】
インビボでの肢機能のアセスメント
虚血肢の損なわれた使用の半定量的アセスメントを、グレード付けした機能スケールを使用することによって７日目から４９日目まで行った。肢機能における改善は、ビヒクルまたは対照処置群（１Ｆ）の動物と比較して、後肢虚血の誘発の後４９日目までＴＸＡ１２７処置群（２ｆ）において見出された。しかし、差異は統計的に有意でなかった。これらの結果を、図５において要約する。図６に示されているように、分析の「最終観察繰越」法が用いられたとき、この傾向は統計的有意性に達した。
【０２２７】
反復測定のための二元配置ＡＮＯＶＡ、それに続いてボンフェローニ事後検定を使用して用いた「最終観察繰越」法を使用した図６についての統計解析。対照群１ＦとＴＸＡ１２７処置群２Ｆの比較は、４９日目に統計的有意差を示した（ｐ＜０．０１）。
【０２２８】
まとめると、ＴＸＡ１２７は、血流および組織修復を刺激することによって虚血性疾患を効果的に処置することができることをこれらの結果は示す。例えば、ＴＸＡ１２７の皮下投与は、血流をその正常値の７１％に復活させたことが見出された。血流灌流の復活は、ＴＸＡ１２７処置が肢機能を改善させ、虚血による切断処理を減少させることを示す他の知見と一貫している。さらに、ＴＸＡ１２７処置はまた、虚血性ストレスを受けた肢への損傷を軽減する。これらの知見は、アンジオテンシン（１−７）が、様々な虚血性疾患（ｉｓｃｈｍｅｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ）、例えば、重症虚血肢（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｌｉｍｂ  ｉｕｓｃｈｅｍｉａ）および他の末梢血管疾患を処置するための治療的血管形成のために使用することができることを示す。
【０２２９】
実施例２．  慢性後肢虚血の動物モデルにおけるＰａｎＣｙｔｅ処置は、血流および肢機能を改善した
ＰａｎＣｙｔｅを使用して、虚血性疾患を効果的に処置することができることを本実施例は示す。この実施例において、Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｓｅｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｃｙｓ７（配列番号２２）のアミノ酸配列を有する環状アンジオテンシンペプチドを一例として使用して、マウス後肢虚血モデルにおけるＰａｎＣｙｔｅの治療効果をアセスメントした。
【０２３０】
３つの群に分割した全部で４９匹の雌性マウスを利用した。群１Ｆにおいて１６匹、群２Ｆにおいて１７匹および群３Ｆにおいて１６匹。群の数および動物の総数は、これが指示的／有意な情報を得るのに十分な群毎の動物の最小数であったことを示す先の研究に基づいた。表７は、各群の設計を示す。
【０２３１】
【表７】
2015508759.tif 000018
【０２３２】
後肢虚血モデル
この実施例において使用されるモデルは、実施例１と同じである。手短に言えば、この実施例において使用したマウスの後肢虚血モデルは、大腿動脈の近位端の２回の結紮、および２つの結紮間の切開が関与する。手術によって血流の閉塞を引き起こし、それに続いて重度の虚血性損傷がもたらされる（Ｇｏｔｏら；Ｋａｎｇら）。この実験において、健康な成体雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを使用した。先に記載したプロトコルを使用して、マウスにおいて後肢虚血を誘発した。手短に言えば、Ｂａｌｂ／ｃ雌性マウスは標準的な食餌を持続させ、水は自由に利用可能とした。マウスを麻酔し、鼡径部の皮膚の切り込みを行った。大腿動脈を６−０絹糸で２回結紮し、結紮間で切除し、この後、創傷を４−０絹糸で閉じ、マウスを回復させた。
【０２３３】
ＰａｎＣｙｔｅの投与
アンジオテンシン（１−７）ポリペプチド組成物（ＰａｎＣｙｔｅ）およびビヒクル対照（ＤＰＢＳ）を、すぐ使用できる溶液として供給し、使用するまで４℃で貯蔵した。ＰａｎＣｙｔｅを、１日目に虚血を誘発した２４時間後に開始して毎日研究の終わりまで皮下注射した（５００μｇ／ｋｇまたは５０μｇ／ｋｇ）。陰性対照マウスにビヒクルを皮下注射した。
【０２３４】
虚血の評価
体重
動物の体重を、手術の前およびその後週１回測定した。
【０２３５】
血流
動物の両側の脚における血流を、手術の前、ならびに手術後の１日目、７日目、１５日目、２１日目、２８日目、３５日目、４２日目および４９日目に非接触レーザードプラによって測定した。血流測定は、虚血肢における流れと正常な肢における流れの比として表した。
【０２３６】
虚血の重症度の肉眼的アセスメント
虚血肢の肉眼的評価は、上の表５において示す壊死エリアについての形態学的グレードを使用することによって、手術後週１回行った。
【０２３７】
肢機能および虚血性損傷のインビボでのアセスメント
虚血肢の損なわれた使用の半定量的アセスメントを、上の表６において示すスケールを使用して、手術後週１回行った。
【０２３８】
部分的または完全な四肢切断術の場合、肢機能は「適用せず」としてグレード付けした。このような場合、血流測定は、統計解析に含めない。
【０２３９】
組織固定
動物を屠殺した日に、虚血性脚および対照脚の四頭筋筋肉を取り出し、２．５％緩衝パラホルムアルデヒドまたは亜鉛固定剤中で分析のために固定した。
【０２４０】
結果
本明細書に記載されている方法を使用して生じさせた安定的な重度の虚血モデルを使用して、反復皮下投与の後にＰａｎＣｙｔｅの血管形成の有効性をアセスメントした。
【０２４１】
体重
例示的な体重を、図７において示す。研究を通して、動物の体重の統計的有意差は観察されなかった。
【０２４２】
血流
２１日目から４９日目の研究終了まで、ビヒクル処置対照（１Ｆ）と比較して、ＰａｎＣｙｔｅ（２Ｆおよび３Ｆ）で処置された動物群において血流の統計的に有意な改善が観察された（図８）。
【０２４３】
図８において示すデータの統計解析を、反復測定のための二元配置ＡＮＯＶＡ、それに続いてボンフェローニ事後検定を使用して行った。対照群１ＦとＰａｎＣｙｔｅ処置群２Ｆおよび３Ｆとの比較は、２１日目から４９日目まで統計的有意差を示した（ｐ＜０．０５〜０．００１）。
【０２４４】
肢機能のアセスメント
虚血肢の損なわれた使用の半定量的アセスメントを、グレード付けした機能スケールを使用することによって、７日目から４９日目まで行った。肢機能における改善は、後肢虚血の２８日目後に、対照群１Ｆの動物に対して５００μｇ／ｋｇのＰａｎＣｙｔｅで処置した群２Ｆの動物において観察された（図９を参照されたい）。
【０２４５】
毛細血管密度
筋肉試料のセクションを、各群からの６〜７匹の動物における同じエリアから採取した。異なるセクションからの全部で１２のランダムな領域において、毛細血管を顕微鏡下で計数した。密度は視野当たりの毛細血管の平均数として表した。ＰａｎＣｙｌｅによる処置は、処置の始まりの４９日後に毛細血管の数を有意に増加させた。この効果は、動物の両方の処置群において見出された（図１０）。
【０２４６】
この実施例は、５０μｇ／ｋｇまたは５００μｇ／ｋｇでのＰａｎＣｙｔｅのＳＣ投与が、虚血性事象の後に血流をその正常値の８５％まで復活させ得ることを示す。さらに、組織分析は、対照群と比較したＰａｎＣｙｔｅで処置した動物群の両方において毛細血管密度の増加を明らかにした。まとめると、ＰａｎＣｙｔｅは、血流および組織修復を刺激することによって、虚血性疾患を効果的に処置することができることをこれらの結果は示す。ＰａｎＣｙｔｅは、様々な虚血性疾患、例えば、重症虚血肢および他の末梢血管疾患を処置する治療的血管形成のために使用することができることをこれらの知見は示す。
【０２４７】
実施例３．  慢性後肢虚血の動物モデルにおけるより低用量のＰａｎＣｙｔｅおよび連続注入処置は、血流および肢機能を改善した
１μｇ／ｋｇ〜５０μｇ／ｋｇのＰａｎＣｙｔｅの用量を使用して、虚血性疾患を効果的に処置することができることを本実施例は示す。この実施例において、Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｓｅｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｃｙｓ（配列番号２２）のアミノ酸配列を有する環状アンジオテンシンペプチドを使用して、マウス後肢虚血モデルにおいてＰａｎＣｙｔｅの治療効果をアセスメントした。
【０２４８】
３つの群に分割した全部で９８匹の雌性マウスを利用した。群１Ｆにおいて１５匹、群２Ｆにおいて１７匹、群３Ｆにおいて１７匹、群４Ｆにおいて１６匹、群５Ｆにおいて１７匹、および群６Ｆにおいて１６匹。群の数および動物の総数は、これが指示的／有意な情報を得るのに十分な群毎の動物の最小数であったことを示す先の研究に基づいた。表８は、各群の設計を示す。
【０２４９】
【表８】
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【０２５０】
後肢虚血モデル
この実施例のために使用したモデルおよび手順は、他に特定しない限り、実施例１および２におけるものと同じである。
ＰａｎＣｙｔｅの投与
アンジオテンシン（１−７）ポリペプチド組成物（ＰａｎＣｙｔｅ、環化Ａｓｐ１−Ａｒｇ２−Ｖａｌ３−Ｓｅｒ４−Ｉｌｅ５−Ｈｉｓ６−Ｃｙｓ（配列番号２２））およびビヒクル対照（ＤＰＢＳ）をすぐ使用できる溶液として供給し、使用するまで４℃で貯蔵した。群２Ｆ〜５Ｆにおいて、ＰａｎＣｙｔｅを、１日目に虚血を誘発した２４時間後に開始して毎日研究の終わりまで皮下注射した（１μｇ／ｋｇ、５μｇ／ｋｇ、２５μｇ／ｋｇ、５０μｇ／ｋｇ）。群６Ｆにおいて、浸透圧Ａｌｚｅｔポンプを皮下にインプラントし、研究の期間に亘ってＰａｎＣｙｔｅの連続放出を実現した。陰性対照マウスに、ビヒクル（ＤＰＢＳ）を皮下注射した。
【０２５１】
結果
本明細書に記載されている方法を使用して生じさせた安定的な重度虚血モデルを使用して、反復皮下投与の後にＰａｎＣｙｔｅの血管形成の有効性をアセスメントした。
【０２５２】
体重
例示的な体重を、図１１において示す。研究を通して、体重における統計的有意差は観察されなかった。
【０２５３】
血流
ビヒクル処置対照（１Ｆ）と比較して、研究の１４日目に開始して４９日目の研究終了までの、Ａｌｚｅｔポンプを使用した連続ＰａｎＣｙｔｅ投与で処置された動物群（６Ｆ）において血流の統計的に有意な改善が観察された（図１２を参照されたい）。毎日の注射によって与えられる同様の用量のＰａｎＣｙｔｅで処置した群５Ｆにおいて、対照と比較して血流における有意な改善が３５日目から４９日目まで観察された。他の処置群において、血流改善は、４２日目および４９日目に統計的有意性に達した（群２Ｆ、３Ｆおよび４Ｆ）。
【０２５４】
肢機能のアセスメント
虚血肢の損なわれた使用の半定量的アセスメントを、グレード付けした機能スケールを使用することによって７日目から４９日目に行った。肢機能の改善は、対照群（１Ｆ）の動物に対して１μｇ／ｋｇのＰａｎＣｙｔｅで処置された群（２Ｆ）および連続注入群（６Ｆ）において後肢虚血の後１４日目および２１日目に見出された（図１３を参照されたい）。
【０２５５】
ＰａｎＣｙｔｅは、治療的血管形成のための有効な処置であり得ることをこの実施例は示す。虚血組織におけるＰａｎＣｙｔｅの用量依存的な治療活性をアセスメントするために、認められているマウス後肢虚血モデルを使用した。この実施例は、ＰａｎＣｙｔｅの皮下投与が血流を用量依存的な様式でその正常値の８４％まで復活させたことを示す。この実施例において試験した群の内、特に良好で早期の血液灌流の復活は、Ａｌｚｅｔポンプを使用して連続ＰａｎＣｙｔｅ投与で処置された動物において観察された。
【０２５６】
同等物および範囲
単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載されている特定の実施形態に対する多くの同等物を当業者は理解し、または確認することができる。本発明の範囲は上記の説明に限定されることを意図しないが、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されている。
【０２５７】
単に通例の実験法を使用して、本明細書に記載されている本発明による特定の実施形態に対する多くの同等物を当業者は理解し、または確認することができる。本発明の範囲は上記の説明に限定されることを意図しないが、むしろ添付の特許請求の範囲に記載されている。
【０２５８】
特許請求の範囲において、冠詞、例えば、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、それとは反対に示され、または文脈からその他の点で明らかでない限り、１つまたは複数を意味し得る。群の１つまたは複数のメンバーの間に「または」を含む特許請求の範囲または記載は、それとは反対に示され、または文脈からその他の点で明らかでない限り、群メンバーの１つ、複数、または全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在し、所与の生成物またはプロセスにおいて用いられ、または所与の生成物またはプロセスとその他の点で関連性のある場合、満たされていると考えられる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在し、所与の生成物またはプロセスにおいて用いられ、または所与の生成物またはプロセスとその他の点で関連性のある実施形態を含む。本発明は、群メンバーの複数、または全てが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在し、所与の生成物またはプロセスにおいて用いられ、または所与の生成物またはプロセスとその他の点で関連性のある実施形態を含む。さらに、本発明は、全てのバリエーション、組合せ、および順列を包含し、リストされた請求項の１つまたは複数からの１つまたは複数の限定、要素、節、記述用語などは、別の請求項中に導入されることを理解すべきである。例えば、同じ基礎請求項に従属する任意の他の請求項において見出される１つまたは複数の限定を含ませるために、別の請求項に従属する任意の請求項を修正し得る。さらに、請求項が組成物を記載する場合、他に示さない限り、または矛盾もしくは不一致が生じることが当業者には明らかでない限り、本明細書において開示されている目的のいずれかのために組成物を使用する方法が含まれ、本明細書において開示されている作製方法または当技術分野において公知の他の方法のいずれかによる組成物の作製方法が含まれることを理解すべきである。
【０２５９】
要素が一覧として提示される場合、例えば、マーカッシュ群形式において、要素の各部分群がまた開示され、任意の要素（複数可）を群から除去できることを理解すべきである。一般に、本発明、または本発明の態様が、特定の要素、特徴などを含むことが言及される場合、特定の本発明の実施形態または本発明の態様は、このような要素、特徴などからなり、またはこのような要素、特徴などから本質的になることを理解すべきである。簡潔さの目的のために、これらの実施形態は、本明細書においてこれらの言葉で特に記載していない。「含むこと」という用語は、開放型であることを意図し、さらなる要素またはステップを含むことを許容することがまた留意される。
【０２６０】
範囲が示される場合、端点が含まれる。さらに、他に示さない限り、または文脈および当業者の理解からその他の点で明らかでない限り、範囲として表される値は、本発明の異なる実施形態において、文脈によって明らかにそれ以外のことの指示がない限り、範囲の下限の単位の１０分の１まで、記述された範囲内の任意の特定の値または部分範囲を想定することができることを理解すべきである。
【０２６１】
さらに、従来技術の範囲に入る本発明の任意の特定の実施形態は、特許請求の範囲の任意の１つまたは複数から明確に除外し得ることを理解すべきである。このような実施形態は当業者に公知であると見なされるため、たとえ除外が本明細書において明確に記載されなくても、このような実施形態は除外し得る。本発明の組成物の任意の特定の実施形態（例えば、任意の細胞型；任意の神経細胞系；シナプス小胞サイクリングの任意のレポーター；任意の電気刺激系；任意のイメージング系；任意のシナプス小胞サイクリングアッセイ；任意のシナプス小胞サイクルモジュレーター；任意の使用方法など）は、従来技術の存在に関連するかしないかに関わらず、任意の理由のために任意の１つまたは複数の特許請求の範囲から除外することができる。
参考文献の組込み
本出願において引用された全ての公開資料および特許文献は、それぞれの個々の公開資料または特許文献の内容が本明細書において組み込まれているのと同じ程度までその全体が参照により組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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