(57)【要約】  本明細書は、二酸化チタンスキャフォールド形態の医療用インプラントに関する。二酸化チタンスキャフォールドを低粘度二酸化チタンスラリーで真空浸透プロセスにおいて再被覆し、続いてこのスキャフォールドを焼結することにより、向上した機械強度を有する二酸化チタンスキャフォールドを調製する方法が開示される。本明細書は、また、調製された再被覆二酸化チタンスキャフォールド及びこれらの医療用インプラントとしての使用にも関する。
2015531270.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 二酸化チタンを含む第１スラリーを可燃性多孔質構造体に塗布する工程； 
b) 前記第１スラリーを前記可燃性多孔質構造体上で固化させる工程；
c) 約４００〜５５０℃の第１焼結により固化させた前記二酸化チタンスラリーから前記可燃性多孔質構造体を除去して、二酸化チタンスキャフォールド構造体を生成する工程；
d) 工程c)の二酸化チタンスキャフォールド構造を少なくとも１３００℃の温度の第２焼結に少なくとも１０時間供して、一重被覆二酸化チタンスキャフォールドを提供する工程を含む、再被覆二酸化チタンスキャフォールドを調製する方法であって、
e) 真空浸透により二酸化チタンを含む第２スラリーを前記一重被覆二酸化チタンスキャフォールドに塗布し、その後に任意選択で該一重被覆二酸化チタンスキャフォールドを遠心分離に供する工程；
f) 工程e)の第２スラリーを前記一重被覆二酸化チタンスキャフォールド上で固化させる工程；及び
g) 少なくとも１１００℃の温度での第３焼結を行い、再被覆二酸化チタンスキャフォールドを提供する工程、
を含む真空浸透手順をさらに含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記真空浸透手順を、
i) 二酸化チタンを含む第３スラリーを工程d)の一重被覆二酸化チタンスキャフォールド又は工程g)の再被覆二酸化チタンスキャフォールドに塗布し、任意選択で該スキャフォールドを遠心分離に供する工程；
ii) 工程i)の第３スラリーを前記スキャフォールド上で固化させる工程；及び
iii) 少なくとも１１００℃の温度での焼結をさらに行う工程
を含む二重被覆手順の前又は後で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程iii)のさらなる焼結を少なくとも１０時間、例えば２０〜５０時間行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程g)の第３焼結を約２〜１５時間、例えば３時間行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２スラリー中の二酸化チタン濃度が、３００〜９００ｍｇ／ｍｌ、例えば４００〜８００ｍｇ／ｍｌである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第３スラリー中の二酸化チタン濃度が、約１３００〜１７００ｍｇ／ｍｌ、例えば１５００〜１７００ｍｇ／ｍｌである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記真空浸透を少なくとも０．１ｍｂａｒ、例えば０．１〜０．３ｍｂａｒで行う、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
二酸化チタンスキャフォールドの機械強度を向上させるための方法であって、
二酸化チタンスキャフォールドを準備する工程と、該二酸化チタンスキャフォールドを請求項１及び２でそれぞれ定義した真空浸透工程e)〜f)又は二重被覆工程i)〜iii)の少なくとも１つに供する工程とを含む、方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載した方法により得られる、再被覆二酸化チタンスキャフォールド。
【請求項１０】
請求項９に記載の再被覆二酸化チタンスキャフォールドを含む、医療補綴デバイス。
【請求項１１】
医療補綴デバイスとして使用するための、請求項９に記載の再被覆二酸化チタンスキャフォールド。
【請求項１２】
組織の再生、修復、置換、及び／又は回復のために使用するための、請求項９に記載の再被覆二酸化チタンスキャフォールド又は請求項１０に記載の医療補綴デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、医療用途において医療補綴デバイスとして使用され得るスキャフォールド構造体に関する。本明細書は、再被覆手順により向上した機械強度を有する二酸化チタンスキャフォールドを製造する方法、及びこの方法により製造されたスキャフォールドに関する。本発明のスキャフォールドは、その強度を高める方法により、基本的に影響されずに必要な細孔構造を維持し、高い機械強度を有する。
【背景技術】
【０００２】
外傷、腫瘍、癌、歯周炎、及び骨粗しょう症等の状態は、骨量の減少、骨の成長及び体積の減少を引き起こし得る。これらの理由及び他の理由のために、骨成長を向上させ、骨組織を回復させる方法を発見することはとても重要である。スキャフォールドは、骨再生プロセスに関与する細胞の足場として用いられ得るが、損失した骨構造の代わりの足場としても用いることができる。骨細胞を刺激して成長させる表面構造を有し、治癒プロセスの後で移植された構造の骨による被覆を可能にする、対象中に移植され得るスキャフォールドを提供することも興味深い。
【０００３】
整形外科用インプラントは、筋骨格系、特に関節及び骨における、これらの組織における痛みの緩和を含む、機能の保存及び回復のために利用される。整形外科用インプラントは、通常、生体環境中で安定であり、最小限の変形で物理的ストレスに耐える材料から構成される。こうした材料は、強度及び耐腐食性を有し、良好な生体適合性及び良好な耐摩耗性を有する必要がある。これらの要求を満たす材料としては、チタン及びコバルト‐クロム合金等の生体適合性の材料が挙げられる。
【０００４】
組織工学（又は生体組織工学、再生医学とも言う）の目的のために、細胞の成長をサポートするためのスキャフォールドの使用が以前より知られている。スキャフォールドの細孔径（細孔直径）、空隙率、及び相互接続性（インテーコネクティビティ）は、重要な要素であり、これらは細胞の挙動及び再生される組織の品質に影響を与える。従来技術のスキャフォールドは、典型的には、リン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイト、及び種々のポリマーで作られる。
【０００５】
組織工学の１つの原則は、細胞を採取し、必要ならばin vivoで細胞集団を拡大させ、これらを、支持用３次元スキャフォールド上に播種することであり、ここで細胞は完全な組織又は器官に成長できる。多くの臨床用途のための、スキャフォールド材料及び構造の選択は重要である。スキャフォールド中の高い細胞密度の達成のために、この材料は容積に対する高い表面積の比を有することが必要とされる。細孔は、スキャフォールド中に細胞が移動できるように、十分に広く大きくなくてはならない。材料表面に細胞が付着した場合、そこには栄養送達、老廃物の除去、材料又は細胞の排除、及びタンパク質輸送を可能にする十分なスペース及び経路がなくてはならず、これは細孔の相互接続ネットワークでのみ得られ得る。移植されたスキャフォールドに対する生物学的応答もまた、３次元ミクロ構造等のスキャフォールドのデザイン要素により影響され得る。材料の構造特性に加えて、細胞接着のための材料表面の物理特性も必須である。
【０００６】
骨の内方成長（または「内殖」、「内部成長」とも言う（in-growth））は、骨梁（又は小柱骨）のサイズ（約０．２５〜０．５ｍｍ）とほぼ同じセルサイズで、直径が約１００μｍ（０．１ｍｍ）の支柱を有する、高多孔質のオープンセル構造（連続気泡構造とも言う）で優先的に生じることが知られている。そのため、高多孔質で制御された微細構造を有する材料は、筋骨格系及び歯科用インプラント製造の両方において興味深い。筋骨格系の市場のために、現在、骨の内方成長及び表面成長(on-grouth)の選択肢としては、以下が挙げられる： (a) DePuy社は、インプラント表面に金属ビーズを焼結させている。これは、制御された骨の内部成長に好適な細孔径の微細構造をもたらすが、骨の内部成長のための最適な空隙率よりかは低い空隙率を示す; (b) Zimmer社は、拡散して接合している緩んだ繊維で製造された繊維状金属パッドを用いている。このパッドはその後、インプラント又は複合体構造中に成形された射出インサートに拡散結合されるが、骨の内部成長のための最適な密度よりかは低い密度を示す; (c) Biomet社は、プラズマ照射された表面を用いている。これは、粗面化表面をもたらし、表面成長を可能にするが、内方成長は可能ではない; 及び(d) Implex社は、化学蒸着プロセスを用いて、金属発泡体（金属フォーム）とも呼ばれるタンタル被覆炭素微細構造を製造している。研究結果は、この「小柱金属（又は「骨梁金属」、「トラベキュラメタル」とも言う）」が高品質の内殖骨をもたらすことを示唆している。小柱金属は、高空隙率、オープンセル構造、及び骨の内部成長に資するセルサイズの点で有利である。しかしながら、小柱金属は、制御するのが難しい化学的性質及び被覆厚さを有している。小柱金属は、材料、プロセスコスト、及び主に化学蒸着（ＣＶＤ）に起因する長い加工時間のために非常に高価である。
【０００７】
さらに、ＣＶＤにおいては毒性の高い化学薬品の使用が必要であり、これは製造及び生体用途において好ましくない。
【０００８】
成長可能なセル付着、栄養及び老廃物輸送、血管新生、及びスキャフォールド体積全体にわたる新しく形成された骨組織の通路を確かなものにするために、骨用スキャフォールドは、大きな細孔容積を有する十分に相互接続された細孔ネットワーク及び好ましくは100μmを超える平均細孔接続径を有することが要求される。網目状細孔スペースに加えて、非再吸収性スキャフォールド構造体中での成長可能な骨形成のための十分なスペース及び浸透性を提供するために適切な細孔形態及び300μｍを超える平均細孔径が必要である。しかしながら、スキャフォールド構造体のために最も重要な必要条件の１つは、スキャフォールド材料自体が完全に生体適合性であり、好適な骨細胞接着性を有し、且つ、その表面での好適な分化作用を有し、骨とスキャフォールドとの直接接合の形成を促進することである。
【０００９】
セラミックTiO2は、スキャフォールドに基づく骨組織の修復のための有望材料として認識されており、高多孔質のTiO2スキャフォールドは、従来から、in vivo中での周囲の骨組織からの実行可能な骨の内部成長のための好適な微細環境を提供してきた。これらのTiO2スキャフォールドの優れた骨誘導活性能力は、TiO2フォーム構造の大きくて高度に相互接続した細孔容積に起因する。しかしながら、スキャフォールドの機械特性は、スキャフォールド材料だけではなく、スキャフォールド構造体の細孔構造によっても左右され、細孔径及び空隙率の増加は、セル固形物の機械特性に不利な影響を与え、結果的にスキャフォールド構造体の構造の完全性を劣化させる。骨用スキャフォールドの重要な特性の１つは、骨組織の再生の間に欠陥部位を機械的に支持することであり、十分な機械的強度の不足は、TiO2スキャフォールド構造体の使用を中程度の生理的負荷がかかる骨格部位のみでの使用に制限する。そのため、そうしたセラミックTiO2フォームの機械特性は、高多孔質のTiO2骨用スキャフォールドの所望の細孔構造特性を維持しつつ、整形外科用途のための十分な耐負荷能力を有する骨用スキャフォールドを製造するために、最適化された処理により向上されるべきである
【００１０】
網目状セラミックフォーム、例えば特許文献１に記載されたものは、近年、非治癒性の又は危機的なサイズの骨の欠陥の修正において、天然の骨の再生を刺激し、誘導する多孔質性スキャフォールドとして注目を集めている。こうした骨用スキャフォールドの目的は、組織再生のための最適条件を提供することであるので、フォーム構造体は骨細胞のその表面への付着を可能にすると同時に、細胞増殖及び遮るものがない組織の内方成長のために十分なスペースを提供しなければならない。そのため、３Ｄ骨用スキャフォールド構造体の空隙率及び形態（モルフォロジー）等の構造特性は、スキャフォールドに基づく骨再生の成功に決定的な役割を果たす。網目状セラミックフォームは、いわゆる複製法又はポリマースポンジ法により調製され得る。この方法は、Somers及びSchwartzwalderにより、１９６３年に最初に開示された。簡単に言うと、こうした方法は、多孔性で可燃性の構造体を金属酸化物で被覆する工程と、多孔性構造体の除去及び金属酸化物粒子の融合を引き起こす高温での加熱により、多孔性構造体を取り除く工程とを含む。
【００１１】
複製法により調製された網目状セラミックフォームの機械特性は、フォーム構造中のクラック及び割れ目のサイズ及び分布に強く影響され、これらは典型的にはフォーム支柱の強度を決定する（非特許文献１）。しかしながら、複製法に含まれる種々の処理工程を最適化することにより機械強度を高めようとすることは、多くの研究における目的となっている。
【００１２】
非特許文献２には、複製フォームの支柱における中空内部がセラミックスラリーで充填され、そのためセラミックフォームの圧縮強度を向上させる真空浸透法が記載されている。しかしながら、セラミック支柱内部の中空スペースは、実質的に密閉された（閉口した）多孔性とみなすことができ、この中空スペース中へのセラミックスラリーの浸透は、特に支柱内部のより狭い三角形状のボイドを有するより小さい支柱径のフォームの場合、たとえ真空下であっても制限される可能性がある。そのため、非特許文献２の方法により達成される向上した機械強度は、スキャフォールドのより内部の強化を伴わずに、主にスキャフォールドの外側の表面部分を強化する作用に依存していると考えられる。また、非特許文献２の方法は、細孔をより狭くすることによって細孔構造に影響を与えることが懸念される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】WO08078164
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Breznyら(1989年)
【非特許文献２】Vogtら(2010年)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記から明らかなように、医療補綴デバイスの分野において、高い機械強度及び十分に形成された多孔質ネットワークを有するスキャフォールド構造体の必要性は依然として存在している。本文献の目的は、従来技術に関連する問題を解消するか、少なくとも緩和することである。
【００１６】
本文献は、医療補綴デバイスとして使用するために好適な機械強度を有する二酸化チタン（TiO2）スキャフォールドに関する。そのため、本文献の１つの目的は、良好な生体適合性を有し、対象中に移植された際に有害反応（拒絶反応）を引き起こさず、３次元スキャフォールド内部への細胞成長を可能にし、構造体を安定化するのに実用的に有用なものにする機械的安定性をさらに有する、対象中への移植のための医療補綴デバイスとして使用される二酸化チタンスキャフォールドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
一態様において、本文献は、
a) 二酸化チタンを含む第１スラリーを可燃性多孔質構造体に塗布する工程； 
b) 前記した第１スラリーを可燃性多孔質構造体上で固化させる工程；
c) 約４００〜５５０℃の第１焼結により、前記した可燃性多孔質構造体を固化させた二酸化チタンスラリーから除去して二酸化チタンスキャフォールド構造体を生成する工程；
d) 工程c)の二酸化チタンスキャフォールド構造体を少なくとも１３００℃の温度の第２焼結に少なくとも１０時間供して、一重被覆二酸化チタンスキャフォールドを提供する工程を含む、再被覆二酸化チタンスキャフォールドを調製する方法であって、この方法は、
e) 真空浸透により二酸化チタンを含む第２スラリーを一重被覆二酸化チタンスキャフォールドに塗布し、その後に任意選択でこの一重被覆二酸化チタンスキャフォールドを遠心分離に供する工程；
f) 工程e)の第２スラリーを前記した一重被覆二酸化チタンスキャフォールド上で固化させる工程；及び
g) 少なくとも１１００℃の温度での第３焼結を行い、再被覆二酸化チタンスキャフォールドを提供する工程、
を含む真空浸透手順をさらに含むことを特徴とする、再被覆二酸化チタンスキャフォールドを調製する方法を提供する。
【００１８】
上述した方法における工程e)~g)の真空浸透手順は、
i) 二酸化チタンを含む第３スラリーを工程d)の一重被覆二酸化チタンスキャフォールド又は工程g)の再被覆二酸化チタンスキャフォールドに塗布し、任意選択でこのスキャフォールドを遠心分離に供する工程；
ii) 工程i)の第３スラリーを前記したスキャフォールド上で固化させる工程；及び
iii) 少なくとも１１００℃の温度でさらに焼結を行う工程
を含む二重被覆手順の前又は後で行われてもよい。
【００１９】
そのため、再被覆二酸化チタンスキャフォールドを調製するための方法は、それぞれの選択番号においてこれらが行われる順番で表された、以下の工程：
1. 工程 a)-g)
2. 工程 a)-d), 工程 i)-iii), 工程 e)-g) 
3. 工程 a)-g), 工程 i)-iii)
を含むことができ、またはこれらから成り得る。
【００２０】
上記した選択番号１、２、又は３による方法を行うことにより、再被覆二酸化チタンスキャフォールドが調製される。選択肢１、２、又は３による方法により調製された二酸化チタンスキャフォールドは、本明細書において、一括して再被覆二酸化チタンスキャフォールドと示す。本文献はまた、上記した選択番号１、２、又は３による方法を行うことにより得られた、又は得られる再被覆二酸化チタンスキャフォールドにも関する。
【００２１】
そのため、本文献はまた、
a) 二酸化チタンを含む第１スラリーを可燃性多孔質構造体に塗布する工程；
b) 前記したスラリーを可燃性多孔質構造体上で固化させる工程；
c) 約４００〜５５０℃での第１焼結により、固化させた二酸化チタンスラリーから前記した可燃性多孔質構造体を除去して二酸化チタンスキャフォールド構造体を生成する工程；
d) 工程c)の二酸化チタンスキャフォールド構造体を少なくとも１３００℃の温度の第２焼結に少なくとも１０時間供して、一重被覆二酸化チタンスキャフォールドを提供する工程を含む方法であって、この方法は、
e) 真空浸透により二酸化チタンを含む第２スラリーを一重被覆二酸化チタンスキャフォールドに塗布し、その後に任意選択でこの一重被覆二酸化チタンスキャフォールドを遠心分離に供する工程；
f) 工程e)の第２スラリーを前記した一重被覆二酸化チタンスキャフォールド上で固化させる工程；及び
g) 少なくとも１１００℃の温度での第３焼結を行い、再被覆二酸化チタンスキャフォールドを提供する工程、
を含む真空浸透手順をさらに含むことを特徴とする方法により得られる、再被覆二酸化チタンスキャフォールドにも関し、
ここで、工程e)~g)の真空浸透手順は、場合により、
i) 二酸化チタンを含む第３スラリーを工程d)の一重被覆二酸化チタンスキャフォールド又は工程g)の再被覆二酸化チタンスキャフォールドに塗布し、任意選択でこのスキャフォールドを遠心分離に供する工程；
ii) 工程i)の第３スラリーを前記したスキャフォールド上で固化させる工程；及び
iii) 少なくとも１１００℃の温度でさらに焼結を行う工程
を含む二重被覆手順の前又は後で行われる。
【００２２】
本文献はまた、上記した方法により得られる再被覆二酸化チタンスキャフォールドを含む医療補綴デバイスにも関する。本文献はまた、医療補綴デバイスに使用するためのこの再被覆二酸化チタンスキャフォールドにも関する。
【００２３】
さらに、本文献は、本明細書に記載した再被覆二酸化チタンスキャフォールド若しくはこれを含む医療補綴デバイスを、これら必要とする対象中に移植することを含む、組織の再生、修復、置換、及び／又は回復のための方法、並びに、組織の再生、修復、置換、及び／又は回復のための再被覆二酸化チタンスキャフォールド又はこれを含む医療補綴デバイスの使用に関する。また、本文献は、組織の再生、修復、置換、及び／又は回復に使用するための再被覆二酸化チタンスキャフォールド又はこれを含む医療補綴デバイス、並びに、組織の再生、修復、置換、及び／又は回復のための医療補綴デバイスの調製のための再被覆二酸化チタンスキャフォールドの使用も開示する。
【００２４】
本文献の再被覆二酸化チタンスキャフォールドは、良好な生体適合性を有する二酸化チタンでできているため、対象にスキャフォールドが移植される際のアレルギー反応等の拒絶反応のリスクが低減される。再被覆二酸化チタンスキャフォールドはまた、それらを形成する材料及びそれらの表面構造により、組織の再生に有利な効果を有する。再被覆手順における真空浸透の使用により、再被覆二酸化チタンスキャフォールドは安定性をさらに有し、特に、硬すぎることなく、安定化作用をもたらすのに十分な安定性を有する医療インプラントでの使用のための安定性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１ａ】図１ａは、TiO2スキャフォールドの微細な外観に対する1500℃の焼結時間の影響を示す図である。
【図１ｂ】図１ｂは、1500℃の焼結時間の圧縮強度に対する影響を示す図である。(*、**)は、２時間焼結させたフォームに対する比較の統計的有意差を示し、(#、##)は、１０時間焼結させたフォームに対する比較の統計的有意差を示す。*p < 0.05であり、**、##p < 0.01であり、n = 10である。
【図２ａ】図２は、スキャフォールド製造に用いたTiO2スラリーのせん断速度の関数としての粘度を示す。図２ａは、異なる被覆手順に用いられるスラリーの間の粘度の違いを示す図である。
【図２ｂ】図２ｂは、TiO2スラリーのレオロジー特性に対する固形分の影響を示す図である。
【図２ｃ】図２ｃは、TiO2スラリーのレオロジー特性に対する固形分の影響を示す図である。
【図３】図３は、二重被覆手順が、複製法後のTiO2フォーム支柱中に残っている微細孔及び折れ目を埋めることにより、割れ目（ひび）のサイズ及び数を減らすことが見いだされたことを示す図である。低粘度スラリーを用いる真空浸透は、微細孔窓を閉口（遮断）させずに、支柱構造の均一性をさらに向上した。（Ａ）一重被覆、（Ｂ）焼結前の二重被覆、（Ｃ）焼結後の二重被覆、及び（Ｄ）１５００℃での焼結後に二重被覆及び真空浸透させたTiO2フォームを示す。
【図４】図４は、二重被覆に用いられる第３スラリーの固形分がどのようにTiO2フォーム構造の均一性に影響を与えるかを示す図である。低固形分のスラリーは、低粘度を有し、これは35〜40gのTiO2粉末を含むスラリーと比べて低い再現性を示した。より高い固形分（45gのTiO2粉末）は、スラリーの粘度が高すぎるので、スキャフォールド内部全体わたって均一に浸透しなかった。40gのTiO2粉末写真中の円は、3D解析のためのVOI選択を描いている。
【図５ａ】図５ａは、再被覆手順が、調製したセラミックTiO2スキャフォールドの圧縮強度の顕著な増加をもたらしたことを示す図である。(*、**)は、SCと比較した統計的有意差を示し、(##)はDCと比較した統計的有意差を示している。*p < 0.05で、**、##p < 0.01で、n = 10である。
【図５ｂ】図５ｂは、細孔ネットワークの相互接続性に対するDC及びVI手順の影響を示す図である。SCは一重被覆を示し、DCは二重被覆を示し、VIは真空浸透を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の他の特徴及び有利な点は、以下の詳細な説明、図面、実施例、及び特許請求の範囲から明らかになるだろう。
【００２７】
本明細書で用いられる「スキャフォールド」は、開口多孔質構造に関する。用語「二酸化チタンスキャフォールド」は、スキャフォールド構造体の構造材料として二酸化チタンを主に含む（すなわち、50 wt%を超える二酸化チタン、例えば、少なくとも約51 wt%、60 wt%、70 wt%、80 wt%、90 wt%、95 wt%、96 wt%、97 wt%、98 wt%、99 wt%、又は100 wt%の二酸化チタン、例えば約51-100 wt%、60-100 wt%、60-90 wt%、70-100 wt%、70-90 wt%、80-90 wt%、又は80-95 wt%の二酸化チタンを含む）スキャフォールドを意味する。そのため、二酸化チタンスキャフォールドは、スキャフォールドのための構造材料として二酸化チタンを含み得るか、又はこれのみから成り得る。さらに、スキャフォールドは他の物質、例えば表面被覆又は生体活性分子等を含み得る。
【００２８】
本明細書で用いられる「細孔径」は、細孔を囲んでいる壁を除いた、細孔の水力直径を意図する。水力直径は、当業者によく知られており、細孔の円周長さによって割った細孔の４×領域として定義される。
【００２９】
「フラクタル次元支柱」は、だんだん微細なスケールにズームダウンするように、スペース（空間）を満たすのにどの程度完全にフラクタルが現れるかの指標を与える統計量である。フラクタル次元の多くの具体的な定義が存在するが、それらのどれも普遍的なものであると扱われるべきではない。１の値は、直線に関連付けられる。表面構造は、より大きい数で、より不雑なものである。フラクタル次元は、本明細書においてコルモゴロフまたは「ボックスカウント」法を用いて計算される（Larry S.ら、1989年)。Skyscan CTAn, Kontich（ベルギー）において、２次元及び３次元の両方が計算される。表面又は体積は、同じ正方形又は立方体の配列に分けられ、対象表面の部分を含む正方形の数をカウントする。この操作を３〜１００ピクセル等の四角形のサイズの範囲にわたって繰り返す。表面を含む四角形の数を四角形の長さに対して両対数グラフ中でプロットし、両対数回帰の傾きからフラクタル次元が求められる。
【００３０】
「全空隙率」又は「空隙率（又は多孔率、気孔率とも言う）」は、本明細書において、物体内の材料ではないすべての区画、すなわち、材料により占められていない空間と定義される。全空隙率は、閉口細孔及び開口細孔のどちらも含む。
【００３１】
「内部支柱容積」は、支柱の内腔の容積を意味する。
【００３２】
本明細書で用いられる「真空浸透（又は真空湿潤とも言う）」は、液体を対象物中に１００ｋＰａ以下の圧力により強制的に浸透させるプロセスを意味する。
【００３３】
「焼結」及び「シンタリング」等は、（材料の融点未満の温度で）材料を粒子が相互に接着（融合）するまで加熱することにより、粉体から対象物を調製する方法を意味する。焼結は、セラミック物質を製造するのに伝統的に使用され、また、粉末冶金等の分野においても使用されている。
【００３４】
「網目状フォーム（網目状発泡体）」は、本明細書において、多孔質で開口固体発泡体を意味する。「網目状セラミックフォーム」は、二酸化チタン等のセラミック材料で形成された開口多孔質構造体を意味する。網目状セラミックフォームは、多孔性で可燃性の構造体を金属酸化物スラリーで被覆する工程と、多孔性で可燃性の構造体の除去及び金属酸化物粒子の融合を引き起こし、セラミック多孔質構造体を形成する、多孔性で可燃性の構造体を高温で加熱することにより除去する工程を含む複製法により調製され得る。
【００３５】
「医療補綴デバイス」、「医療用インプラント」、及び「インプラント」等は、本明細書において、脊椎動物、例えば哺乳類、例えばヒト哺乳類の体内に移植することを目的とするデバイスを意味する。本明細書におけるインプラントは、生体構造と置き換える及び／又は身体の機能を回復するのに使用され得る。そうしたデバイスの例としては、これらに限定されないが、歯科用インプラント及び整形外科用インプラントが挙げられる。本明細書において、整形外科用インプラントとしては、筋骨格系、特に関節及び骨の機能の維持又は回復、例えばこれらの組織における痛みの緩和のための、脊椎動物、特にヒト等の哺乳類の体内に移植することが意図される、本明細書の範囲内のあらゆるデバイスを挙げることができる。本明細書において、歯科用インプラントとしては、歯の修復手順において、脊椎動物、特にヒト等の哺乳類の口腔に移植されることが意図される、本明細書の範囲内のあらゆるデバイスが挙げられる。一般的に、歯科用インプラントは、１つ又はいくつかのインプラント部分で構成される。例えば、歯科用インプラントは、第２インプラント部分に連結された歯科用固定具、例えばアバットメント、及び／又は歯科修復、例えばクラウン、ブリッジ、又は義歯等を通常含む。しかしながら、移植のために意図される歯科用固定具等のデバイスは、たとえ他の部分が連結していたとしても、単独でインプラントとして参照され得る。整形外科用及び歯科用のインプラントは、上記から明らかなように、整形外科用及び歯科用補綴デバイスとして示され得る。
【００３６】
本明細書において、「対象」はあらゆる脊椎動物を意味し、例えば、鳥類、爬虫類、哺乳類、霊長類及びヒトを意味する。
【００３７】
「セラミック」は、本明細書において、熱で処理されて固化構造体を形成する無機粉末材料の物質を意味する。
【００３８】
「軟組織」は、本明細書において、骨ではない体内の他の構造及び／又は器官を接続し、支持し、又は囲む組織を意味する。軟組織としては、靱帯、腱、筋膜、皮膚、線維組織、脂肪、滑膜、上皮、筋肉、神経、及び血管が挙げられる。
【００３９】
「硬組織」は、本明細書において、骨及び歯、並びに軟骨組織等の鉱質化組織を意味する。鉱質化組織は、ソフトマトリックス中にミネラルを組み込む生体組織である。
【００４０】
本明細書は、高い生体適合性、及び医療用インプラントにおいて有用なものにする機械的安定性を有する再被覆二酸化チタンスキャフォールドに関する。本明細書はまた、そうした再被覆二酸化チタンスキャフォールドを調製するための方法及びその使用にも関する。
【００４１】
本明細書の二酸化チタンスキャフォールドは、細胞の接着及び内部成長のための３次元空間を形成することにより、組織形成を可能にする構造的支持体として機能し得る網目状スキャフォールドである。二酸化チタンのスキャフォールドは、生体適合性であり、種々の形態に加工することができ、細胞成長のための機械的サポート及び足場となるスキャフォールドを提供する。そのため、二酸化チタンスキャフォールドは、組織工学、例えば骨の再生のために使用される好適な構造を提供する。
【００４２】
支柱構造における割れ目（又は「傷」とも言う）及び凹凸は、網目状セラミックフォームの機械特性に強い影響を与えることが知られており、そのため支柱強度は処理方法を改善することにより最適化され得る。本明細書において、二酸化チタンスキャフォールドの機械特性を向上するために処理パラメーターを最適化させた。高温での長い焼結は、複製法を用いて調製されたフォームの支柱内部で典型的に見出される三角形状の空隙（「ボイド」又は「空洞」とも言う）の壁の１つの内部崩壊をもたらすことが実証された。この支柱の折り畳み構造は、細孔構造の特徴に有意な影響を与えずに、増強した圧縮強度をもたらした。
【００４３】
さらに、フォーム支柱の内部多孔質の大部分が部分的に取り除かれ、TiO2スラリーでの浸透のために利用可能なものになる。本明細書に記載する再被覆手順は、TiO2フォーム支柱中の割れ目のサイズ及び数を明らかに減らすことが見いだされ、これは向上した構造的均一性によるセラミック構造の顕著な増強をもたらし、且つ、わずかに増加した支柱径をもたらした。
【００４４】
そのため、一態様において、本明細書は再被覆二酸化チタンスキャフォールドを調製する方法に関し、この方法は、
a) 二酸化チタンを含む第１スラリーを可燃性多孔質構造体に塗布する工程；
b) 前記した第１スラリーを可燃性多孔質構造体上で固化させる工程；
c) 約４００〜５５０℃の第１焼結により、前記した可燃性多孔質構造体を固化させた二酸化チタンスラリーから除去して二酸化チタンスキャフォールド構造体を生成する工程；
d) 工程c)の二酸化チタンスキャフォールド構造体を少なくとも１３００℃の温度の第２焼結に少なくとも１０時間供して、一重被覆二酸化チタンスキャフォールドを提供する工程を含む方法であって、この方法はさらに真空浸透手順を含み、この真空浸透手順は、
e) 真空浸透により二酸化チタンを含む第２スラリーを一重被覆二酸化チタンスキャフォールドに塗布し、その後に任意選択でこの一重被覆二酸化チタンスキャフォールドを遠心分離に供する工程；
f) 工程e)の第２スラリーを前記した一重被覆二酸化チタンスキャフォールド上で固化させる工程；及び
g) 少なくとも１１００℃の温度の第３焼結を行い、再被覆二酸化チタンスキャフォールドを提供する工程、
を含む。
【００４５】
工程e)~g)の真空浸透手順は、
i) 二酸化チタンを含む第３スラリーを工程d)の一重被覆二酸化チタンスキャフォールド又は工程g)の再被覆二酸化チタンスキャフォールドに塗布し、任意選択でスキャフォールドを遠心分離に供する工程；
ii) 工程i)の第３スラリーを前記したスキャフォールド上で固化させる工程；及び
iii) 少なくとも１１００℃の温度でさらなる焼結を行う工程
を含む二重被覆手順の前又は後で行われてもよい。
【００４６】
上記した方法において工程a)〜c)を行うことにより得られる構造体（又は単に「構造」とも言う）は、本明細書において二酸化チタンスキャフォールド構造体（又は「二酸化チタンスキャフォールド構造」とも言う）と示され得る。工程a)〜d)の後で生成されるスキャフォールドは、本明細書において「一重被覆（single-coated、SC）」スキャフォールド又は焼結二酸化チタンスキャフォールドと示され得る。工程i)〜iii)は、本明細書において二重被覆（二重コーティング、double coating (DC)）と示され、少なくとも工程a)〜d)が前もって行われた場合、二重被覆（ＤＣ）スキャフォールドをもたらす。工程e)〜g)のプロセスは、本明細書において真空浸透(vacuum infiltration、VI)プロセスと示される。そのため、工程e)〜g)に供されたスキャフォールドは、真空浸透(VI)スキャフォールドと示され得る。工程a)〜d)を行い、続いて工程e)〜g)を行うことにより、SC+VIスキャフォールド又は再被覆二酸化チタンスキャフォールドが生成される。工程a)〜d）を行い、続いて工程i)〜iii)の前に工程e)〜g)を行うことにより、VI+DCスキャフォールド又は再被覆二酸化チタンスキャフォールドが生成される。工程i)〜iii)の前に工程a)〜d)を行い、続いて工程e)〜g)を行うことにより、DC+VIスキャフォールド又は再被覆二酸化チタンスキャフォールドが生成される。上記した異なる種類のスキャフォールド及びこれらがどのように調製されたかを示す略称は、本明細書の他の部分においても用いられ得る。しかしながら、本明細書で用いられる用語「再被覆(recoated)二酸化チタンスキャフォールド」又は「再被覆スキャフォールド」は、工程a)〜d)の直後に工程e)〜g)を行うことにより生成された二酸化チタンスキャフォールド、及び工程a)~d)の後で、工程e)〜g)の前に工程i)〜iii)を行うことにより生成された二酸化チタンスキャフォールド、及び工程i)〜iii)の前に工程a)〜g)を行うことにより生成された二酸化チタンスキャフォールドをまとめて示す。そのため、本明細書はまた、工程a)〜d)の直後に工程e)〜g)を行うこと、工程a)~d)の後であって、工程e)〜g)の前に工程i)〜iii)を行うこと、及び工程i)〜iii)の前に工程a)〜g)を行うことによってそれぞれ得られる又は得られた再被覆二酸化チタンスキャフォールドにも関する。
【００４７】
驚くべきことに、DC+VI又はVI+DCスキャフォールドを形成する二重被覆(工程i)〜iii))及び真空浸透(工程e)〜g))の順番が、得られる再被覆スキャフォールドの細孔構造特性又は圧縮強度のどちらにもいても有意な変化を引き起こさないことが分かった。
【００４８】
再被覆二酸化チタンスキャフォールドを調製する方法の第１段階は、二酸化チタンスキャフォールドの準備を含む。これは、例えば工程a)〜d)の方法を行うこと、又はWO 08/078164に記載されている方法、例えばホットプレート成形プロセス又はポリマースポンジ法（ポリマースポンジ複製法とも示される）を行うことにより提供され得る。そのため、たとえ好ましくても、DC(工程i)〜iii))及び／又はVI(工程e)〜g))に供される二酸化チタンスキャフォールドが、工程a)~d)の方法により供されることは必ずしも必要ではなく、二酸化チタンスキャフォールドをもたらす他の方法を使用してもよい。したがって、本明細書は二酸化チタンスキャフォールドの機械強度を増強するための方法にも関し、この方法は二酸化チタンスキャフォールド(例えば、工程a)〜d)により供される一重被覆スキャフォールド）を準備する工程と、この二酸化チタンスキャフォールドを少なくとも１つの真空浸透工程e)〜f)又は二重被覆工程i)〜iii)とを含む。本明細書は、その結果として、二酸化チタンスキャフォールドを準備する工程と、この二酸化チタンスキャフォールドを少なくとも１つの真空浸透工程e)〜f)又は工程i)〜iii)の二重被覆工程i)〜iii)との方法により得られる又は得られた再被覆又は二重被覆二酸化チタンスキャフォールドにも関する。
【００４９】
上述した通り、二酸化チタンスキャフォールドは、典型的には工程a)〜d)を行うことにより準備される。これらの工程において、二酸化チタンを含む第１スラリーが可燃性多孔質構造（可燃性多孔質構造体）に塗布され、約４００〜５５０℃で少なくとも３０分の第１焼結及び少なくとも１２００℃、例えば１２００〜１６００℃で少なくとも１０時間の第２焼結を行う前に、可燃性多孔質構造で固化され、一重被覆二酸化チタンスキャフォールド（焼結二酸化チタンスキャフォールド）を生成する。こうした工程a)〜d)は、WO 08/078164に記載されているとおりに行うことができる。工程a)及びb)は、工程c)の前に１〜５回、例えば１、２、３、４、又は５回繰り返してもよい。工程a)及びb)の繰り返しは、得られるスキャフォールドの細孔径を小さくし得る。
【００５０】
可燃性多孔質構造は、例えば、合成スポンジ等のスポンジ構造であり得る。可燃性多孔質構造材料は、燃焼によりスキャフォールドから可燃性多孔質構造の除去を容易にするために、好ましくは有機材料である。そのため、可燃性多孔質構造は、有機スポンジ構造、例えば、有機多孔質ポリマースポンジ、例えばポリエチレン、シリコーン、セルロース、又はポリビニルクロリドスポンジであり得る。可燃性多孔質構造の一例は、45又は60ppi Bulbrenポリウレタンフォーム（Bulbren S, Eurofoam GmbH, Wiesbaden, ドイツ）である。可燃性多孔質構造は、これに二酸化チタンを含む第１スラリー（本明細書において第１二酸化チタンスラリー又は第１スラリーとも示される）を供する前に、水で洗浄して残留物及び／又はコンタミネーションを除去してもよい。第１スラリーは、可燃性多孔質構造を第１スラリー中に浸漬することにより、可燃性多孔質構造に供される。浸漬の後、第１スラリー中に浸漬した可燃性多孔質構造を圧搾及び／又は遠心分離することにより、過剰なスラリーを除去してもよい。その後、例えば第１スラリー中に浸漬した可燃性多孔質構造少なくとも５時間、例えば５〜２４時間、例えば１０〜２４又は１５〜２４時間、例えば役５時間、１０時間、１５時間、１６時間、２０時間、又は２４時間乾燥させることにより、他可燃性多孔質構造上で第１スラリーを固化させる。
【００５１】
再被覆二酸化チタンスキャフォールドのサイズ及び形状は、用いられる可燃性多孔質構造のサイズ及び形状を調整することにより調整できる。そのため、特定の対象の具体的な目的の移植部位のためのテーラーメードのスキャフォールドを調製することを可能にする。さらに、例えば、ＣＡＤ（コンピュータ支援設計）カメラ技術等の技術を使用して、例えば所定の欠陥に合わせて特定して作成されたインプラント等の特定の用途のための再被覆二酸化チタンスキャフォールドを特別に調製することを可能にする。ＣＡＤは、可燃性多孔質構造及び／又は再被覆手順の前若しくは後の二酸化チタンスキャフォールドのどちらでも利用することができ、所望の形状のスキャフォールドを提供できる。少なくとも１つの焼結工程に供された二酸化チタンスキャフォールドのＣＡＤは、可燃性多孔質構造にＣＡＤを用いるよりもより高い精度をもたらし得る。ＣＡＤは、例えば、Nd:YAGレーザー(J Pascual-Cospら)又はミリングにより行われ得る。
【００５２】
可燃性多孔質構造上で第１スラリーを固化させた後、可燃性多孔質構造をこの上で固化したスラリーから除去し、二酸化チタンスキャフォールドを得る。この工程は、WO 08/078164に記載されている通りに行うことができる。
【００５３】
可燃性多孔質構造は多孔質ポリマー構造であることができ、そのため加熱により固化した第１スラリーから除去され得る。そのため、上述した方法の工程c)は、例えば、時間を要する焼結工程において固化した第１スラリーから可燃性多孔質構造を焼き切ることにより行われ得る。このプロセを行うのに必要な温度及び時間は、当業者ならば容易に理解できるように、可燃性多孔質構造の材料に応じて変化する。重要なことに、この温度及び時間は、多かれ少なかれ可燃性多孔質構造の除去が完結されるように選択されるべきである。当業者は、これを達成するために、具体的な可燃性多孔質構造及びスキャフォールドのために必要な時間及び温度をどのように選択するか知っているだろう。温度を所望の温度までゆっくり昇温し、例えば0.2〜0.8 °C/分、例えば0.4〜0.6 °C/分又は約0.5 °C/分で昇温する。 典型的には、約400〜550 °Cの温度、例えば約440〜510 °C、490〜510 °C又は440-460 °C、例えば約400 °C、450 °C, 500 °C又は550 °Cを用いる。 この温度を、少なくとも３０分、例えば３０〜９０分又は４５〜７５分、例えば約４５分、６０分、７５分、又は９０分維持する。
【００５４】
その後、第１焼結における所望の保持時間後に温度を昇温することにより、この二酸化チタンスキャフォールド構造を第２焼結工程(工程d))に供する。この工程において、二酸化チタンスキャフォールド構造はより高い温度の速い焼結に供される。これは、典型的には、少なくとも１２００℃又は少なくとも１３００℃、例えば約１２００〜１８００℃又は１７００〜１８００℃、例えば約１７５０℃の温度で行われる。典型的には、この第２焼結工程における温度は、第１焼結工程よりも速く昇温され、例えば約2-5 °C/分、例えば約3 °C/分で昇温される。その後、所望の温度を少なくとも２時間、例えば２〜４５時間、５〜４０時間、１０〜４０時間、２０〜４０時間、又は１０〜３０時間保持する。その後、得られた一重被覆二酸化チタンスキャフォールドを室温まで冷却させる。この冷却は、約2-8°C/分、例えば約2〜5 °C/分、例えば約5 °C/分で行われ得る。
【００５５】
例えば工程a)〜d)を行うことにより二酸化チタンスキャフォールドを準備した後、この二酸化チタンスキャフォールドを、直接工程e)〜ｇ)の真空浸透に供いてもよく、又は工程i)〜iii)の方法を行うことにより二重被覆してもよい。
【００５６】
工程e)〜g)は、工程a)〜d)又は別のやり方により得られた一重被覆二酸化チタンスキャフォールドに二酸化チタンを含む第２スラリー（第２二酸化チタンスラリー又は第２スラリーとも示される）を塗布することにより行われる。その後、第２二酸化チタンスラリーを真空を用いることによりスキャフォールド内に入れ、第２スラリーを固化するように乾燥させ、第３焼結工程に供する。第２スラリーは、第２スラリー中への浸漬により、二酸化チタンスキャフォールドに塗布され得る。第２スラリー塗布されたスキャフォールドを、その後真空に供し、スラリーをスキャフォールド構造中に押し込む。この工程は、スキャフォールドを真空の密閉ガラス容器内に入れ、少なくとも0.1 mbar、例えば約0.1〜0.5 mbar、例えば約0.1〜0.3 mbar、例えば0.1 mbar、0.2 mbar、0.3 mbar、0.4 mbar、又は0.5 mbarの真空を、少なくとも約1分、例えば約1〜10分、1〜7分、3〜6分、4〜6分又は5分間適用することにより行われ得る。その後、過剰な第２スラリーは、例えば数分間、例えば約0.5〜5分、1〜5又は1〜3分間で、約500〜1500 rpmの速度（Biofuge 22R, Heraeus Sepatec遠心分離機に好適なローターサイズに基づく）での慎重な遠心分離により除去され得る。浸漬後の遠心分離は、細孔窓（開口部）を閉口させずに支柱のより均一な被覆をもたらすという、最終結果の改善をもたらし得る。その後、第２スラリーをスキャフォールド上で、少なくとも５時間、例えば約5-24時間、例えば約10〜24又は15〜24時間、例えば約5時間、10時間、15時間、16時間、20時間、又は24時間かけて固化させる。その後、スキャフォールドを少なくとも1100°C、例えば約1100〜1800 °C、1200〜1600 °C、1400〜1600 °C、例えば1400 °C、1500 °C、又は1600 °Cの温度の第３焼結に供する。第３焼結の時間は、典型的には少なくとも約２時間であり、例えば約2〜15時間、2〜10時間、2〜8時間、3〜5時間、又は約3時間若しくは4時間である。温度は、約2〜5 °C/分、例えば約3 °C/分で昇温され、室温までの冷却のための冷却速度は、約2〜8°C/分、例えば約2〜5 °C/分、例えば約5 °C/分である。
【００５７】
上述したとおり、二重被覆工程i)〜iii)は、工程e)＝g)の前又はその後に行われ得る。二重被覆のために、二酸化チタンを含む第３スラリー（第３二酸化チタンスラリー又は第３スラリーとも示される）は、例えば第３スラリー中に浸漬することによりスキャフォールドに塗布される。その後、過剰な第３スラリーを、数分間、例えば約0.5〜5分、1〜5又は1〜3分間で、約500〜1500 rpmの速度（Biofuge 22R, Heraeus Sepatec遠心分離機に好適なローターサイズに基づく）での慎重な遠心分離により除去され得る。浸漬後の遠心分離は、細孔窓（開口部）を閉口させずに支柱のより均一な被覆をもたらすという、最終結果の改善をもたらし得る。その後、第３スラリーをスキャフォールド上で、少なくとも５時間、例えば約5-24時間、例えば約10〜24又は15〜24時間、例えば約5時間、10時間、15時間、16時間、20時間、又は24時間かけて固化させる。その後、スキャフォールドを少なくとも1100°C、例えば約1100〜1800 °C、1200〜1600 °C、1400〜1600 °C、例えば1400 °C、1500 °C、又は1600 °Cの温度のさらなる焼結に供する。このさらなる焼結の時間は、典型的には少なくとも2時間又は少なくとも10時間、例えば2-50時間、5-40時間、10-50時間、10-30時間、20-50時間、又は20-40時間、例えば10時間、20時間、25時間、30時間、35時間、40時間、又は45時間である。温度は、約2〜5 °C/分、例えば約3 °C/分で昇温され、室温までの冷却のための冷却速度は、約2〜8°C/分、例えば約2〜5 °C/分、例えば約5 °C/分である。
【００５８】
第１、第２、及び第３二酸化チタンスラリーを調製するために用いられる酸化チタン粉末は、アモルファス、アナターゼ、ブルッカイト、又はルチル結晶相形態であり得る。二酸化チタン粉末を、NaOH（例えば、1M NaOH）を用いて前もって洗浄し、第２及び第３リン酸塩のコンタミネーションを除去してもよい。代わりに、第２及び／又は第３リン酸塩のコンタミネーションを含まない二酸化チタン粉末が必要な場合、そうしたコンタミネーションを含まない二酸化チタン粉末は市販されている（例えば、Sachtleben製の二酸化チタン）。最大でも10ppmの第２及び第３リン酸塩のコンタミネーションを含む二酸化チタンの使用が有利であり得る。スラリーを調製する際に約10ppm未満の第２及び／又は第３リン酸塩のコンタミネーションを含む二酸化チタンを使用することにより、二酸化チタン粒子が十分に小さいので、抗凝集化合物及び／又は界面活性剤の追加せずに適当な焼結を可能にし得る。典型的には、二酸化チタンスラリーは、凝集を回避し、粘度を制御するために約1.0〜4.0、好ましくは約1.5〜2.0のpH値を有する。スラリーのpHは、少量のHCl(例えば1M HCl)の追加により、溶媒中での二酸化チタン粉末の分散の全期間にわたって、好ましくはこのpHに維持される。二酸化チタン粒子のサイズを、二酸化チタンの理論上の等電点を示すpH値のできるだけ近くまで、小さくすることが好ましい。TiO2にとって、このpHは1.7である。二酸化チタン粒子の平均粒子径は、10μm以下、例えば1.4μm以下であり得る。二酸化チタン粒子は、単分散であり得る。典型的には、二酸化チタン粒子を、撹拌し、HCl等の酸の追加によりpHを調整しながら水中に分散させ、二酸化チタンスラリーを調製する。すべての二酸化チタン粉末が分散するまで、例えば２〜８時間の間、撹拌は続けられ得る。このスラリーは、例えば、金属ブレード、好ましくはチタンブレードを備える回転分散機を用いて分散される。例えば、撹拌は少なくとも4000 rpmのスピードで少なくとも４時間、例えば5000 rpmで5時間以上行われ得る。スラリーのｐＨは、通常は、懸濁液の適当なゼータ電位のために選択されたpH値まで調整される。
【００５９】
二酸化チタンスラリーは、典型的には、種々の濃度の二酸化チタンを有し、異なる粘度を示す。第１スラリーは、典型的には約2000〜5000 mg/ml、例えば約2500〜4000 mg/ml、3000〜3500 mg/ml又は約3250 mg/mlの二酸化チタン濃度を有する。第２スラリー中の二酸化チタンの濃度は、典型的には、約200〜1000 mg/ml、例えば約300〜900 mg/ml、400〜800 mg/ml、500〜600 mg/ml、例えば約400 mg/ml、500 mg/ml、600 mg/ml、700 mg/ml、又は800 mg/mlである。第３スラリー中の二酸化チタン濃度は、典型的には、約200〜1800 mg/ml、例えば約1300〜1700 mg/ml、1500〜1700 mg/ml、例えば1400 mg/ml、1500 mg/ml、1600 mg/ml、又は1700 mg/mlである。
【００６０】
実施例１で実証されたように、工程d)における焼結時間は、スキャフォールド構造及び圧縮強度に大きな影響を与える。焼結時間の増加により、支柱及び三角形のボイド（「空洞」とも言う）の部分的消去に起因して支柱の中空の外観が変化した。この内部の支柱の多孔性の消去は、３つの二酸化チタン支柱壁の１つの内部破壊により生じているように考えられた。この破壊は、３以上の支柱が互いに連結している部分でのクラック及びボイドの形成をもたらした。さらなる焼結時間の延長は、割れ目サイズ及び数の減少をもたらし、そのため支柱は角が丸く、中身の詰まった（中空でない）三角形形状を形成した。延長した焼結時間の間に生じたスキャフォールドの細孔構造パラメーターに本質的な差異はない。しかしながら、より長い焼結時間の適用により、圧縮強度が著しく向上した。そのため、第１焼結(工程d))の焼結時間の延長は、スキャフォールドの強度を増強できる。
【００６１】
また、実施例１で実証されたように、二重被覆及び真空浸透は、スキャフォールドの圧縮強度をさらに増強させた。真空浸透は、例えば、二重被覆スキャフォールドの圧縮強度をほぼ２倍にすることが実証された。
【００６２】
理論に縛られることなく、この圧縮強度の向上は、支柱のボイド及びフォールド（節目、溝）中の第２及び第３スラリーの堆積により支柱の均一性を向上する、二重被覆及び／又は真空浸透の結果であると考えられる。
【００６３】
興味深いことに、二重被覆及び真空浸透手順の順番を入れ替えることは、再被覆二酸化チタンスキャフォールドの細孔構造特性又はこれらの圧縮強度の有意な変化を引き起こさなかった。真空浸透プロセスで用いられる低粘度の第２二酸化チタンスラリーは、主に支柱の微小孔及び微小ボイド中に堆積されると考えられ、任意選択の遠心分離プロセスは、スキャフォールドから過剰なスラリーを効率的に除去し、支柱構造上に非常に薄い被覆をもたらし得る。第２スラリーの低い粘度により、真空の補助によって支柱構造中に残っている微小な割れ目中に侵入することを可能し、一方、二重被覆工程で用いられるより粘度の高い第３スラリーが支柱のより大きい溝に堆積する。真空浸透被覆による無視できる支柱サイズの増加は、いくつかの最小の細孔窓の閉口及び支柱の接合点での第２スラリーの凝集を引き起こす可能性があり、これはまたフォーム構造の相互接続性の僅かな低下も引き起こし得る（Fig. 5bを参照）。この細孔ネットワークの相互接続性における低下は、真空浸透されたスキャフォールドがより粘度の高い第３スラリーで二重被覆された場合により顕著であり、DC+VIプロセスが、反対の順番（VI+DC）で同じ手順が適用される場合よりも、より少ない細孔開口部の閉口をもたらすことを示唆している。それにもかかわらず、追加の真空浸透された低粘度被覆（第２スラリー）は、二酸化チタンスキャフォールドの構造の均一性をもたらすための効果的な方法であり、これにより適切な細孔構造特性を維持したまま、スキャフォールドの機械強度の大幅に強化させる。
【００６４】
工程e)〜g)における真空浸透のために使用される低粘度の第２スラリーがスキャフォールドを構造に無視できるほどの作用をしか有さないと考えられるので、細孔構造特性は、主に工程i)〜iii)で用いられるより高い粘度の第３スラリーによって影響される。細孔容積の相互接続性は、骨用スキャフォールドのための最も重要な特性の１つであると確認されたので、閉口した細孔窓の数は、手順の最適化により、スキャフォールドにおいて好ましくは最小化される。スキャフォールドを二重被覆（ＤＣ）するために用いられる第３スラリーの粘度は、低固形分（30 g）及び高固形分(45 g)の両方で、TiO2フォーム構造の均一性に顕著な影響を与え、細孔窓の閉口を引き起こし（Fig. 4）、これにより細孔ネットワークの相互接続性に影響を与える（Fig. 5b）。より高い粘性の第３スラリーの低い浸透性が、主にTiO2フォームの外側端部で細孔開口部の閉口をもたらしたので、この閉口の作用は、スキャフォールドシリンダーの最外部領域を除く選択されたＶＯＩとしての３Ｄ相互接続性解析において明らかにされなかった。しかしながら、外側の細孔窓の閉口は、スキャフォールド内部への細胞及び組織の浸透を大幅に阻害する可能性が高いので、特に望ましくない。そのため、第３スラリーの粘度の制御は、再被覆手順による二酸化チタンスキャフォールドの機械的完全性を向上する場合に、細孔ネットワークの均一性及び相互接続性を左右する最も重要な処理パラメーターの一つとして認識された。
【００６５】
本明細書によって調製される再被覆二酸化チタンスキャフォールドの機械強度（圧縮強度）は、典型的には、約1〜5 Pa、例えば3〜5 MPaである。しかしながら、当業者には明らかなように、再被覆二酸化チタンスキャフォールドの圧縮強度はその空隙率に応じて変化する。上述した圧縮強度値は、約９０％の空隙率を有する再被覆二酸化チタンスキャフォールドにおいて求められる。二酸化チタンスキャフォールドの空隙率とは無関係に、スキャフォールドを本明細書に記載した再被覆手順に供することにより、圧縮強度は大幅に向上する。スキャフォールドの圧縮強度は、DIN EN ISO 3386（例えば、実施例１に記載している）に基づく圧縮試験を行うことにより求めることができる。
【００６６】
再被覆二酸化チタンスキャフォールドは、対象中への移植のために用いることができ、すなわち、医療用インプラントとして用いることができる。再被覆二酸化チタンスキャフォールドは、その生体適合性を高め、細胞の成長及びインプラントへの付着を促進する、向上した表面特性を有する多孔質構造を含む。多孔質構造は、スキャフォールドの中への細胞の内方成長を可能にし、これにより組織の再生を可能にする。再被覆二酸化チタンスキャフォールドの大きな表面積はまた、構造中への細胞の成長を促進させ、これによりスキャフォールドの付着及び組織の再生を促進する。再被覆二酸化チタンスキャフォールドが、良好な再体適合性を有する材料でできているので、対象中に移植された場合のスキャフォールドに対する拒絶反応は低い。
【００６７】
再被覆二酸化チタンスキャフォールドは、マクロ多孔性であり、マクロ孔及び相互接続を含む。マクロ孔は、約10〜3000μm、例えば約20〜2000μm、30〜1500μm、又は30〜700μmの範囲の細孔径を有する。マクロ孔径は、約100μm又は約30〜700μmであり得る。骨において、細孔径は最適には約30〜100μmである。しかしながら、スキャフォールドはまた、より大きい構造体、例えば血管や骨梁の内方成長を可能にするために、約100μm以上の最古を有することも重要である。スキャフォールドの少なくともいくつかの細孔が相互接続していることは重要である。
【００６８】
細孔径（細孔サイズ）は、スキャフォールドを生成するために用いられる構造の選択、例えばスポンジの選択、及びこの構造が二酸化チタンを含む第１スラリー中に浸漬される回数の選択によって調整され得る。細孔径を変更することにより、再被覆二酸化チタンスキャフォールド中への細胞の成長の速度及び程度に作用し、そのため得られる組織の性質にも影響を与え得る。
【００６９】
細孔は、相互接続性(interconnective)であるか、部分的に相互接続性であることが好ましい。これは、細孔が「行き止まり(dead end)」の、又は閉口した細孔ではなく、１以上の方向に栄養及び老廃物の経路を提供する少なくとも２つの開口末端を有することを意味する。これにより、壊死組織が形成するリスクが低減される。好ましくは、マクロ多孔系は、スキャフォールドの少なくとも５０％堆積を占める。再被覆二酸化チタンスキャフォールド中のマクロ孔及び微細孔の容積は、スキャフォールドの機能に応じて変化し得る。処置による目的が多くの骨構造を置換することであり、再被覆二酸化チタンスキャフォールドが治癒期間中に負荷の無い状態で保持できる場合、再被覆二酸化チタンスキャフォールドは全スキャフォールド容積の９０％までを占めているマクロ多孔質システムで調製され得る。
【００７０】
再被覆二酸化チタンスキャフォールドは、約40〜99%、好ましくは70〜90%又は80〜90%の全空隙率を有する。
【００７１】
再被覆二酸化チタンスキャフォールドのフラクタル次元支柱は、典型的には約2.0〜3.0であり、例えば約2.2〜2.3である。支柱厚さは、スキャフォールドの強度に影響を与え、スキャフォールド中の支柱がより厚いと、スキャフォールドはより強くなる。
【００７２】
再被覆二酸化チタンスキャフォールドは、本質的に支柱内部容積が欠けており、これはSEMにおいて、埋め込まれた断面によって確認できる。
【００７３】
再被覆二酸化チタンスキャフォールドの表面がミクロレベルとナノレベルの構造を有することも、当業者には理解されるであろう。このミクロ及びナノ構造は、製造条件によって調整され得る。製造工程によって形成される細孔は、約1〜10μmの範囲内のミクロレベルである。ナノレベルの細孔径は1μｍ未満である。
【００７４】
再被覆二酸化チタンスキャフォールドは、典型的には、約10〜3000μm、例えば20〜2000μm、30〜1500μm又は30〜700μmのミクロ及びマクロ細孔径を合せた細孔を有する。細孔径は、少なくとも20μmの相互接続性細孔により、40μmを超え得る。
【００７５】
再被覆二酸化チタンスキャフォールドは、中空細管の構造を有し、この中空細管中で、骨は成長し、相互接続する骨梁を形成し得る。これらの細管の内側及び外側の両方で細胞は成長し得る。
【００７６】
また、生体分子も、再被覆二酸化チタンスキャフォールドの表面に供され得る。生体分子が再被覆二酸化チタンスキャフォールドに供された場合、これらはすべての再被覆工程が終了した後に供され得る。生体分子の存在は、再被覆二酸化チタンスキャフォールドの生体適合性、細胞の成長速度及び付着率をさらに向上させ得る。本明細書において、生体分子は、天然の生体分子（すなわち、天然資源に由来する天然に存在する分子）、合成生体分子（すなわち、合成により調製される天然に存在する分子、及び合成により調製される天然に存在しない分子若しくは分子の形態）、又は組換え技術の使用によって調製される組換え生体分子等の多種多様の生物的に活性な分子を含む。意図される生体分子の例としては、これらに限定されないが、US 2006/0155384に記載された生体高分子、例えば、生体接着剤、細胞接着因子、バイオポリマー、血液タンパク質、酵素、細胞外マトリックスタンパク質及び生体分子、増殖因子及びホルモン、核酸（DNA及びRNA）、受容体、合成生体分子、ビタミン、薬剤、生理活性イオン、マーカー生体分子等が挙げられ、また、バイオミネラリゼーション及び骨形成を促進するスタチン及びタンパク質又はペプチド等のタンパク質及びペプチドが挙げられる。生体分子の他の例としては、無機の生理活性イオン、例えば、カルシウム、クロム、フッ化物、金、ヨウ素、鉄、カリウム、マグネシウム、マンガン、セレン、硫黄、スズ、銀、ナトリウム、亜鉛、ストロンチウム、硝酸塩、亜硝酸塩、リン酸塩、塩化物、硫酸塩、炭酸塩、カルボキシル又は酸化物が挙げられる。生体分子は、例えば、生体分子を含む溶液中への浸漬、又は当業者によく知られており、例えばWO02/45764又はWO03/086495に開示されている電気化学プロセスにより、二酸化チタンスキャフォールドの表面に付着し得る。
【００７７】
本明細書はまた、本明細書に記載する再被覆二酸化チタンスキャフォールドを含む医療補綴デバイスにも関する。医療補綴デバイスは、その中に再被覆二酸化チタンスキャフォールドが存在し得る。代わりに、医療補綴デバイスは、他の構造、例えば整形外科、歯科、又は他の固定用デバイス又はインプラントと、再被覆二酸化チタンスキャフォールドを含み得る。そのため、本明細書は、組織、特に骨組織の再生、修復、置換、及び／又は回復のための再被覆二酸化チタンスキャフォールド又は再被覆二酸化チタンスキャフォールドを含む医療補綴デバイスにも関する。
【００７８】
再被覆二酸化チタンスキャフォールドは、対象中に移植することができ、細胞はスキャフォールド構造内部へ成長し得る。移植の前にスキャフォールド上で細胞を播種し、成長させることも可能である。再被覆二酸化チタンスキャフォールドの相互接続マクロ細孔構造は、特に組織工学、とりわけ骨組織工学に好適であり、現在利用可能な骨修復治療に対する魅力的な代替である。この点において、再被覆二酸化チタンスキャフォールドの骨髄由来細胞の播種は、当業者に公知の従来の方法（Maniatopoulosら(1988年)を参照）を用いて行なわれる。細胞は再被覆二酸化チタンスキャフォールド上に播種され、成長に好適な条件下で培養される。培養物は、その成長をもたらす適当な媒体で培養される。
【００７９】
上記の通り、様々なタイプの細胞を、本再被覆二酸化チタンスキャフォールドを通じて成長させることができる。より正確には、細胞の種類としては、造血又は間葉系幹細胞が挙げられ、また、心臓血管、筋肉、または任意の結合組織を生成する細胞も挙げられる。細胞は、ヒト又は他の動物起源であり得る。しかしながら、再被覆二酸化チタンスキャフォールドは、骨形成原細胞、特に骨基質を産生する細胞の成長に特に好適である。組織工学において、細胞は任意の起源であり得る。ヒト起源の細胞は有利である。３次元再被覆二酸化チタンスキャフォールドでの細胞を成長させる方法は、播種された骨形成原細胞を、例えば、in vitro段階の間に金属酸化物スキャフォールドに、再被覆二酸化チタンスキャフォールドの構造中に広範囲に分布しながら浸透して骨基質を形成させることを可能にする。骨形成原細胞の浸透、及び結果として骨基質の産生は、機械的手段、超音波手段、電場的手段、又は電子的手段により向上され得る。
【００８０】
再被覆二酸化チタンスキャフォールドは、例えば、組織の再生、修復、置換及び／又は回復のために、細胞の成長のための足場として機能する構造が必要ないかなる場合でも有用である。再被覆二酸化チタンスキャフォールドは、骨及び／又は軟骨構造の再生、修復、置換及び／又は回復のために特に有用である。そうした構造の再生が必要とされる場合の状況の例としては、外傷、骨又は歯の外科的除去、又は癌治療に関する外科的除去が挙げられる。
【００８１】
全体的に又は部分的に置換され得る対象における構造の例としては、これらに限定されないが、頬骨弓等の頭蓋顔面骨、内耳の骨（特に、ツチ骨、アブミ骨及びキヌタ骨）、上顎と下顎の歯槽隆起、眼窩の側面及び底面の骨、洞の側面及び底面の骨、頭蓋骨及び頭蓋骨の欠陥、例えば、股関節形成異常の場合の股関節の凹み（窩寛骨臼）、曲骨（Song bone）の複雑骨折、例えば（これらに限定されないが）、上腕骨、橈骨、尺骨、大腿骨、脛骨と腓骨、脊椎、手及び足の骨、指及び足指の骨、（抜歯からの）抜歯窩の充填、歯周欠陥の修復及びインプラント周辺の欠陥が挙げられる。
【００８２】
加えて、再被覆二酸化チタンスキャフォールドは、腫瘍、癌、感染症、外傷、手術、先天性奇形、遺伝性疾患、代謝性疾患（例えば、骨粗しょう症及び糖尿病）に由来する、又はこれらの除去に由来する、すべての種類の骨の欠陥の充填のために有用である。
【００８３】
そのため、本明細書は、医療補綴デバイスとして使用するための、本明細書で定義される再被覆二酸化チタンスキャフォールドにも関する。
【００８４】
本明細書はさらに、再被覆二酸化チタンスキャフォールド又は再被覆二酸化チタンスキャフォールドを含む医療補綴デバイスの、これらを必要としている対象への移植を含む、例えば骨等の組織の再生、修復、置換及び／又は回復のための方法にも関する。
【００８５】
再被覆二酸化チタンスキャフォールドは、組織の再生、修復、置換及び／又は回復のためにも使用され得る。そのため、本明細書はまた、再被覆二酸化チタンスキャフォールド又は再被覆二酸化チタンスキャフォールドを含む医療補綴デバイスの組織の再生、修復、置換及び／又は回復のための使用にも関する。さらに、組織の再生、修復、置換及び／又は回復に使用するための再被覆二酸化チタンスキャフォールド又は再被覆二酸化チタンスキャフォールドを含む医療補綴デバイスも開示される。また、本明細書は、組織の再生、修復、置換及び／又は回復のための医療補綴デバイスの調製のための再被覆二酸化チタンスキャフォールドの使用にも関する。
【００８６】
再被覆二酸化チタンスキャフォールドの高い圧縮強度は、負荷が掛る骨構造におけるスキャフォールドの新規な用途も可能にする。従来から利用可能なスキャフォールドは、一般的に、そうした用途に利用するには強度が弱すぎる。しかしながら、本明細書に記載した再被覆二酸化チタンスキャフォールドのより高い圧縮強度により、脊椎、大腿骨、脛骨等の高い負荷の掛る骨構造中にスキャフォールドを移植することが可能である。現在の骨移植代替物よりもより大きな欠陥において代替することも可能である。また、外科的手術の回数も減らすことができ、また、骨の治癒も向上し得る。
【００８７】
本発明はこの発明の詳細な説明とともに記載されたが、前述の記載は本発明を説明するためのものであり、本件の特許請求の範囲に定義された本発明の範囲を制限するものではないことが理解されよう。他の態様、有利な効果、及び変更は、本件の特許の範囲内である。
【００８８】
反対の記載がない限り、本明細書に記載した好ましい特徴のそれぞれは、本明細書に記載した他の好ましい特徴のいずれか又はすべてと組み合わせて用いることができる。
【００８９】
本発明は、以下の実施例によりさらに詳細に説明される。この実施例は、特許請求の範囲に記載した発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００９０】
実施例１
材料及び方法
サンプルの調製
ポリマースポンジ複製法を用いて網目状セラミックフォームスキャフォールドを調製した。合計で65gのセラミックTiO2粉末(Kronos 1171、Kronos Titan GmbH, Leverkusen, Germany; 1 M NaOHで前もって洗浄された)を25mlの滅菌水に徐々に添加することにより、セラミックスラリーを準備した。凝集を避けて粘度を制御するために、1M HClの少量の追加により、撹拌するすべての間でスラリーのpHを1.5に保った。水中でのTiO2粉末の分散後、5000 rpmで2.5時間撹拌を続けた(Dispermat Ca-40, VMA-Getzmann GmbH, Reichshof, Germany)。スポンジ複製法のより詳細は、Tiatnen Hら(2010年)を参照できる。
【００９１】
円筒形ポリウレタンフォームのテンプレート (60 ppi, Bulbren S, Eurofoam GmbH, Wiesbaden, Germany、直径及び高さ共に10mm)を調製したスラリーで被覆した。過剰なスラリーを、２つのポリマーフォームシートの間のフォームテンプレートを圧搾して除去した。このサンプルを多孔性セラミックプレート上に置き、焼結前に室温で少なくとも１６時間乾燥させた。ポリマーの焼却のために、スキャフォールドを0.5 °C/分の昇温速度で450℃までゆっくり加熱した。450℃で1時間保持した後、温度を3 °C/分の昇温速度で1500 °Cまであげ、焼結時間をこの温度で2〜40時間に設定した(HTC-08/16, Nabertherm GmbH, Liiienthai, Germany)。その後、焼結したスキャフォールドを5 °C/分の降温速度で室温まで冷却し、一重被覆二酸化チタンスキャフォールド（ＳＣスキャフォールド）を調製した。
【００９２】
上述した複製法（４０時間焼結）により調製された一重被覆二酸化チタンスキャフォールドのいくつかは、25 mlの滅菌水中に分散させた40 gの粉末を含み、上述した方法で調製されたTiO2スラリーで二重被覆(DC)を行った。pHを撹拌しているすべての期間で1.5に調整した。SCスキャフォールドを調製したスラリー中に浸漬させ、過剰なスラリーを遠心分離(1000 rpmで1分; Biofuge 22R Heraeus Sepatech, Osterode, Germany)してフォーム構造から除去し、TiO2スラリーが細孔窓を封鎖させずに均一にフォーム支柱の表面を被覆することを確保した。16時間の乾燥後、温度を1500℃まで3 °C/分の速度で昇温させ、焼結時間をこの温度で４０時間に設定してフォームの焼結を行った。その後、焼結させたスキャフォールドを5 °C/分の降温速度で室温まで冷却した。
【００９３】
その後、いくつかの二重被覆スキャフォールドサンプルを、25 mlの滅菌水中に分散させた10〜20gの洗浄したTiO2スラリーを含む、上述した方法で調製された低粘度スラリーでさらに被覆させた。スキャフォールドサンプルをスラリー中に浸漬させ、真空浸透(VI)プロセスに供した。このスラリー浸透スキャフォールドを真空密閉ガラス容器中に置き、0.2 mbarの真空を5分間適用した。真空浸透に続いて、上記した遠心分離を行って過剰なスラリーを除去した。16時間の室温での乾燥後、この被覆スキャフォールドを3 °C/分の昇温速度で1500℃まで昇温させてから、この温度で4時間焼結させ、続いて室温まで5 °C/分の降温速度で冷却させた。２つの手順の順番（DC及びVI）を、いくつかのスキャフォールドサンプルにおいて逆にした。
【００９４】
スラリーのレオロジー
調製したTiO2スラリーのレオロジー特性を、20℃で、カップ及び垂球形状(C25)を用いるBohlin Visco 88粘度計（Malvern Instruments Ltd, Malvern, UK)を用いて評価した。TiO2スラリーの粘度を、せん断速度間隔2.5〜100 s-1で、増加及び減少せん断速度の両方で測定した。
【００９５】
細孔構造特性
調製したスキャフォールドのミクロ構造の初期の可視化及び光学観察を、走査型電子顕微鏡（TM-1000, Hitachi High-Technologies, Japan）を用いて行った。サンプルを導電性カーボンテープでアルミニウムスタブ上に取り付け、15 kvの加速電圧で、後方散乱電子で観測した。
【００９６】
マイクロ−コンピュータ断層撮影（CT）を、スキャフォールドの３次元微細構造を測定するのに用いた。サンプルをプラスチック製のサンプルホルダーに取り付け、デスクトップ1172 マイクロ-CTイメージングシステム (SkyScan, Aartselaar, Belgium)を用いて、6μmのボクセル解像度で、100kvの電源電圧及び100μAの電流で、アルミニウムフィルターを用いてスキャンした。サンプルを縦軸の回りに180°回転させ、0.4°の回転ごとに３つの吸収画像を記録した。これらのサンプルの原画像を、スタンダードSkyScan再構成ソフトウェア(NRecon)を用いて、3Dコーンビーム再構成アルゴリズムを用いて一連のコロナル方向断層像を再構成した。再構成のために、ビームハードニング（線質硬化）を20%に設定し、リング状アーチファクトの低減を12に設定した。再構成されたアキシャルビトマップ画像の画像解析を、可能性があるエッジ効果を消去するために閾値及び斑点除去（500ボクセルよりも小さい対象を除去し3D本体に結合させない）を設定したスタンダードSkyScanソフトウェア（CTan及びCTvol）を用い、8mmの直径及び3mmの高さの目的の円柱容積(VOI)をスキャフォールドの中央に選択した。その後、VOI中の2値化された対象の100%−容積％として計算した。
【００９７】
続いて、3D解析を行ったすべての画像を、所定の最小サイズの開口部を通して外部から到達できるスキャフォールド中の細孔容積の割合を測定できる「収縮ラップ(shrink-wrap)」機能(function、関数又は写像) (Mooreら、2004)を用いて相互接続性の定量化を行った。収縮ラップ法は、2つの3D測定の間で行い、閾値（この試験では0~160μmを用いた）以上の径を有する開口部を通してVOIの外部の境界をスキャフォールド中に収縮させた。相互接続性を以下のとおりに計算した。
【００９８】
【数１】
2015531270.tif 000003
【００９９】
ここで、VはVOIの全容積であり、Vshrink-wrapは収縮ラップ処理後のVOI容積であり、Vmはスキャフォールド材料の容積である。
【０１００】
各スキャフォールドサンプルに分布している平均支柱及び細孔径を、再構成された２値化データセットに基づく材料厚さ及び材料分離のそれぞれを測定することにより求めた。追加のノイズを、500ボクセルよりも小さい対象を除去し3D本体に結合させない斑点除去機能を用いて再度除去した。
【０１０１】
圧縮強度
機械強度を圧縮試験(Zwicki, ZwickRoell, Ulm, Germany)で評価した。圧縮試験は、DIN EN ISO 3386に基づいて、室温で、事前に0.5Nの負荷でセットされた1kNのロードセルを用いて行った。スキャフォールドを長軸にそって100mm/分の圧縮速度で、破壊するまで圧縮した。力及び変位を圧縮の間記録し、初期のスキャフォールドの寸法に基づく応力及びひずみに変換した。
【０１０２】
統計的解析
正規及び等分散試験をさらなる統計試験の前に行った。異なるデータ群の統計的比較は、スチューデントのｔ−検定又は一元配置分散分析（ANOVA）試験を行い、続いて、一対比較のための事後テストをHolm-Sidak（ホルム-シダック）法を用いて行った。別の特定がない限り、統計的有意性を、n=10で確率p値 < 0.05のときに認めた。相関試験を、２変量相関解析、Spearman Rank Order相関（スピアマンの順位相関）を用いて行った。結果を以下のとおりに解釈した：0.1 < |p| < 0.3の場合、小さな相関；0.3 < |p| < 0.5の場合、中程度の相関；0.5 < |p| < 1 且つ p < 0.05 [22]の場合、強い相関。負のp値は負の相関を示し、正のp値は正の相関を示す（p値は、スピアマンの相関係数を表す)。すべての統計的な解析は、SigmaPlot 12 (Systat Software Inc, San Jose, USA)を用いて行った。
【０１０３】
［結果］
スキャフォールドの構造及び圧縮強度に対する焼結時間の影響
様々な焼結時間後のSC TiO2スキャフォールドの顕微鏡での典型的な外観及び圧縮強度を図１に示す。1500 °Cで２時間の焼結時間の後、TiO2フォーム支柱は、副製法を用いて調製されたフォームの典型的な中空の外観を有した。より細かい寸法のミクロ多孔質はまた、いくつかの支柱壁に小さな長手方向の裂け目が見られ、また、支柱端部の所々に横断亀裂が見られた。焼結温度を５時間まで増やすと、フォーム支柱の約５０％からセラミック支柱内の三角形状のボイドが部分的に消失した。この内部多孔質の消失は、３つのTiO2支柱壁のうちの１つの内部崩壊により生じ、薄いTiO2の端部のV形の断面を有する折り畳まれた支柱の外観をもたらした（図１：５時間〜１０時間）。中空支柱構造の崩壊は、３以上の支柱が互いに接続しているフォームの幹で大きなクラック及びボイドを生じさせた。そうした大きな割れ目は、１０時間焼結させたTiO2フォームに存在する、崩壊した支柱で主に確認された。１５００℃での１０時間の加熱後、ほぼすべての支柱が折り畳まれ、また、この温度でのさらなる焼結時間の延長は裂け目のサイズ及び数の著しい減少をもたらした。４０時間と４０時間のグループの両方で、折り畳まれた支柱の大部分が丸い角を有する中空でない三角形状の構造になり、その前のはっきりとしたV形構造の折り畳まれた支柱は消失した（図１；４０時間）。TiO2支柱の接合部の大きなボイド及び支柱端部に沿った長手方向のクラックは、２０時間以上連続して焼結させたTiO2スキャフォールドにおいて、これよりも短い時間の焼結で調製したスキャフォールドに比べて、著しく少ない頻度で観測された。
【０１０４】
図１で示されたとおり、最も小さい粒子の量は焼結時間の増加につれて大幅に減少し、より均一な粒径をもたらすことが確認されたが、TiO2の表面全体の粒径は長い焼結時間の間で大きく変わらなかった。TiO2粒子は一様な粒子境界を介して良好に一体化され、全体の粒径はすべてのサンプルにおいて比較的大きかった。いくつかの大きな粒子の優先的な粒子成長もまた、すべてのサンプル群、特に支柱接続部に近いサンプル群における証拠であり、一方、支柱の平均粒径は顕著により小さくなった。折り畳まれたTiO2支柱の特徴は、焼結時間が５時間から２０時間に延長されるにつれてより丸くなるのが確認され、表面のTiO2粒子の外側端部はより立体的になり、1500 °Cでより短い焼結手順に供したより平面的な支柱ミクロ構造に比べて、表面粒子の境界領域で増加した高さの差をもたらした。焼結時間をさらに４０時間まで延長した場合、スキャフォールドのミクロ構造に外見上の変化は生じなかった。
【０１０５】
焼結時間の延長は、SC TiO2スキャフォールドの細孔構造パラメーターには有意な影響を与えなかった。しかしながら、1500 °Cでのより長い焼結時間により、より長い平均支柱径値への変化が確認され、一方、４０時間の焼結の後でいくらかの空隙率の低下が確認された。しかしながら、TiO2スキャフォールド群の細孔構造パラメーターにおける有意差は確認されなかった。一方、TiO2スキャフォールドの圧縮強度は、増加した焼結時間に大きく関連していることが確認された(p = 0.592、p < 0.01 )。加えて、TiO2スキャフォールド円筒物の全体の直径は、延長した焼結時間に応じて僅かに縮小したことが確認された。
【０１０６】
DC及び／又はVI手順のスキャフォールド構造及び圧縮強度に対する影響
焼結TiO2フォームの被覆に用いたTiO2スラリーの粘度を図に２おいてせん断速度に対してプロットする。調製したすべてのスラリーは、擬塑レオロジー挙動を示した。異なる被覆手順において用いたスラリー粘度、及び二重被覆（DC）又は真空浸透（VI）のために調製した低粘度スラリーの粘度は、固形分が向上するにつれて低いせん断速度において大幅に増加した。一方、せん断速度の増加により、粘度の差異はかなり小さくなった。
【０１０７】
二重被覆（DC）は、図３に示されるように、一重被覆スキャフォールド（SC）の微細孔、ボイド、及び折り畳まれた支柱構造中の残りの折り目を部分的に充填することにより、TiO2フォーム支柱における割れ目サイズ及び数の減少をもたらすことが確認された。DCスラリーは始終のボイド及び折れ目に堆積し、また、TiO2粒子の薄い層のみが支柱構造の残りを覆い（図3b）、支柱厚さにおける僅かな増加のみをもたらし、結果として、いくらか低下した細孔サイズ（細孔径）及び全体の空隙率をもたらした（表１）。
【０１０８】
【表１】
2015531270.tif 000004
【０１０９】
低粘度スラリーを用いたDCスキャフォールドの真空浸透は、大部分のTiO2スラリーがフォーム支柱の残りの微細孔中に堆積するので、支柱厚さを有意に変化させずに支柱均一性のさらなる向上をもたらした。異なる群（DC、DC+VI、又はVI+DC）の間で測定した細孔構造パラメーターのいずれにおいても、有意な差は確認されなかった。しかしながら、図４に示したとおり、二重被覆スラリーの粘度は、全体のフォーム構造の均一性に影響を与えることが確認された。35〜40gのTiO2粉末を含むスラリーで被覆したフォームが、僅かな数の閉口した細孔窓のみを含んで、スキャフォールド容積を通じて均一な構造を有したのに対し、より高い(45g)及びより低い(30g)固形分のどちらも、構造均一性の低減をもたらした。低固形分のスラリー、それにより低粘度のスラリーは、閉口した細孔窓の数の増加をもたらし、45gのTiO2を含む高粘度のスラリーは、スキャフォールド構造の内部領域へのスラリーの乏しい浸透をもたらし、スキャフォールドの外縁部の多くの細孔は、遠心分離による過剰なスラリーの除去後に閉口されたままであった。
【０１１０】
多孔質TiO2スキャフォールドの圧縮強度は、異なる手順によって有意に増加することがわかった（図5a）。真空浸透プロセスにより塗布された二酸化チタンスラリーは、真空浸透TiO2被覆が適用された場合、二重被覆スキャフォールドにおいて平均強度値が1.78 ± 0.52 MPaから3.39 ± 0.77 MPaまで向上したように、スキャフォールドの圧縮強度のさらなる強化をもたらした。しかしながら、細孔ネットワークの相互接続性は、低粘度のスラリーによってわずかに減少した。しかしながらこの減少は、100μmを超えるサイズの相互接続においてのみ注目に値するだけである（図5b）。さらに、セラミックフォームを二重被覆するのに用いたスラリーの固形分もまた、最も低い固形分で、細孔ネットワークの相互接続性に影響を与え、相互接続性の低減をもたらしたが、３つの別のDC群の間で僅かな差異のみが確認された。
【０１１１】
［考察］
セラミックフォーム構造中に前もって存在する割れ目の存在は、支柱強度に悪影響を有する場合があり、そのため、機械的荷重が想定される用途において、それらの使用は厳しく制限され得る。ポリマースポンジ複製法を用いて調製された網目状セラミックフォームの圧縮強度を限定する重大な要素の１つは、セラミックフォーム骨格中の三角形状のボイドの存在である。このフォーム支柱内の中空スペースは、この方法により調製せれたフォームにおいて共通の特徴であり、元々はスポンジテンプレートにより占められていたスペースに相当する。加えて、典型的には、複製法は、フォーム支柱の大きく湾曲した端部の乏しいスラリー被覆、及び、ポリマーテンプレートとセラミック被覆の熱膨張の不一致によって引き起こされる応力に対するこれらの狭い支柱端部の低い抵抗性により、フォーム支柱の大きく湾曲した端部と並んだいくつかの横割れをもたらす。
【０１１２】
長い焼結時間は、以前から、高多孔性のセラミックTiO2スキャフォールド構造の支柱内部の三角形状の細孔の部分的な除去をもたらすことが示されていた(Fostadら(2009年)及びTiainenら(2010年))。Fostadら(2009年)には、45 ppiポリマーフォームテンプレートを用いて調製したTiO2スキャフォールドの支柱の折り畳みと、これに続く1500℃で30時間の焼結が記載されているが、しかしながら、この文献では、強度と焼結時間の増加との間の僅かな相関しか確認されていない。それにもかかわらず、彼らは、30時間を超える加熱を推奨しており、そうした加熱スケジュールが、400〜600μmの間の細孔径を有するTiO2フォームにおける、支柱の折り畳をもたらすとしている。しかしながら、焼結プロセスの間に支柱折り畳み及びこれに続く支柱構造の固化のメカニズム及び漸進的変化は、この関連した文献において詳細には記載されていなかった。
【０１１３】
典型的には、複製されたセラミックフォームの支柱壁は、3次元のラス用セグメントで構成されていると思われており、しばしば、焼結された支柱も、３つの支柱セグメントを互いに分離する長手方向のクラックを有していると思われている。しかしながら、1500 °Cで２時間の焼結の後でさえ、調製されたTiO2フォームの支柱の３つの壁は、均一な構造を形成し、これらの端部での典型的な長手方向のクラックは、比較的まれであった。これは、1500℃で適用された焼結温度において、より短い保持時間(2〜5時間)の後でさえ確認された、支柱壁の大きく、全体的な粒子径によって証明された、TiO2粒子の速い焼結速度による。TiO2の高い易焼結性によりもたらされた緻密化は、支柱壁の角部が共に焼結された時に、中空支柱の内部の初期容積の減少をもたらし、３つの壁のうちの１つが内側に曲がることを引き起こす。
【０１１４】
焼結時間が増加するに連れて、支柱の折り畳みは、３つの支柱壁のうちの１つの内部破壊として発展し、これは、典型的には、薄い凹形の支柱壁の縦の破壊が先に起こる（図１；２〜５時間）。１０時間の保持時間により、実質的にファーム支柱の全てがすでに完全な支柱折り畳みを起こしており、そのため支柱カラム(strut column)内の中空は実際には消滅し、３以上の支柱カラムが互いに接続している接合点に大きなボイドを形成する。薄いV形の支柱形状との組み合わせにおいて、支柱の幹でのこれらの大きな折れ目及びボイドは、５時間しか焼結していないものに比べて、これらのフォームは僅かな強度の値の低下を引き起こした可能性がある。長い焼結時間（２０〜４０時間）の間の支柱構造のさらなる固化は、中空でなく、折り畳まれたV形の支柱の外縁部が互いに合体して、角の丸い三角形の支柱を形成し（図１）、低減した割れ目サイズ及び向上した構造の均一性により、圧縮強度の増強をもたらした。興味深いことに、支柱の折り畳み及びその後のセラミック支柱の固化は、想定された平均支柱厚さの低下をもたらさなかった。その代り、焼結時間が長くなると、僅かだが統計的に有意な増加が確認され、一方、全体の空隙度はいくらか低下したことが確認された（表２）。
【０１１５】
【表２】
2015531270.tif 000005
【０１１６】
この明らかな支柱径の増加は、焼結温度の増加による全体の微細構造の固化に関連していると考えられ、また、TiO2フォームシリンダーの空隙率及び全体の径僅かな減少をもたらす。表面粒子の全体のサイズは、延長した焼結の間に顕著に成長していないように見られるが、最小粒子の部分がより大きい粒子により消費されたので、TiO2粒子の体積は顕著に増加し、そのため、支柱構造の固化を促進した。それにもかかわらず、焼結の２０時間後に生じた微細構造におけるさらなる緻密化は、TiO2スキャフォールドフォームの機械特性に影響を有さいようであった。
【０１１７】
初期ボイド容積の大部分がTiO2フォームの延長した焼結の間に生じる支柱の折り畳みにより消滅したにもかかわらず、いくつかの利用できない閉口した多孔質が依然として支柱構造内に残っており、特に、初期中空ボイド容積が最も大きかった部分のフォーム支柱の接合部で残っている。しかしながら、この残留している内部多孔質の角部での増加した湾曲半径は、割れ目部での局部応力の増幅をより低くし、このことがまた、スキャフォールド構造の圧縮強度の増強に寄与する。加えて、セラミック被覆の厚さは、典型的には、支柱カラムに比べて支柱の幹でより大きく、そのため内部ボイドスペースのとがっていない縁部で囲まれたセラミック壁は、１０時間未満で焼結されたサンプルの中空支柱の薄い壁よりも破壊に対してより耐性を有し、これはまた２０〜４０時間焼結されたサンプルの向上した強度に寄与する。そのため、約２０〜４０時間の焼結時間の使用は、本明細書の再被覆二酸化チタンスキャフォールドを提供する方法において好ましく用いられ得る。さらに、ポリマーテンプレート上のより厚いセラミック被覆の塗布は、より厚く、それにより、より強い折り畳まれた支柱をもたらすと考えられる。
【０１１８】
それにもかかわらず、中空支柱の壁の内部破壊の主な有利な点が、セラミックフォーム骨格内の元々はほとんど利用不可能な細孔容積が、ほとんどの部分が除去され、又は再被覆手順のために利用可能になるという事実であることが、驚くべきことに見いだされた。支柱の折り畳みそれ自体は、調製されたTiO2スキャフォールドの圧縮強度の大幅な強化をもたらし、これらの一重被覆スキャフォールドの強度は、健康な骨梁の強度の下限値（2 MPa）を十分に維持した。しかしながら、折り畳まれた支柱構造を有するスキャフォールドはTiO2スラリーで被覆されたので、割れ目の数及びサイズは、支柱表面に存在する大きなボイド及び折れ目にスラリーが堆積したので、効果的に減少した（図３）。支柱構造の微細構造の均一性における向上は、調製されたTiO2フォームの圧縮強度の確認された顕著な向上を引き起こすと考えられる（図5a）。
【０１１９】
以前の研究は、多重被覆が網目状セラミックフォームの強度のさらなる向上をもたらし得ることを示した。しかしながら、この改良は、細孔ネットワークの空隙率及び相互接続性を犠牲にすれば、通常達成され、これは最終的にそうしたフォームの意図される用途における使用を制限する。対照的に、本明細書の再被覆法の使用により、セラミック支柱中に残っている欠陥の数を、支柱厚さの増加を避けるための真空条件での非常に低粘度なTiO2スラリーを用いる二重被覆TiO2フォームを再被覆することにより、低減されるそうした真空浸透プロセスは、より均一なセラミック構造のさらに向上した支柱強度により、TiO2フォームの機械的完全性における顕著な改善をもたらすことが見いだされた(図3及び5a)。Vogtrら（2010年）は、以前に、複製ファーム支柱の中空内部がセラミックスラリーで充填され、そのためこのセラミックフォームの圧縮強度の増強をもたらす真空浸透プロセスを開示している。しかしながら、セラミック支柱内部の中空スペースは、実質的に閉じた多孔性であり、この中空スペース中へのセラミックスラリーの浸透は、特に支柱内のより狭い三角形状のボイドを有するより小さい支柱径のフォームにおいて、真空下でも制限されると考えられ、加えて、真空浸透手順で用いられるスラリー粘度は、わずかな利用可能な開口、例えば割れた支柱及び支柱端部の狭いクラック等を通してセラミック支柱ネットワーク内部の曲がりくねった細孔スペースの大部分に達するために、低い粘度を維持しなければならない。
【０１２０】
興味深いことに、２つの塗布プロセス（ＤＣ及びＶＩ）の順番の入れ換えは、調製したTiO2フォームの細孔構造特性又はこれらの圧縮強度において、有意な変化を生じなかった。ＶＩプロセスで用いられる低粘度スラリーが支柱の微細孔（ミクロ孔）及び小さなボイド中に主に堆積することが考えられ、遠心分離プロセスがフォーム構造から過剰なスラリーを効率的に取り除き、支柱表面上に非常に薄いコーティングのみをもたらす。使用されるTiO2スラリーの低い粘度により、たとえ低いせん断応力であっても、このスラリーは、真空の助けにより支柱構造中に残っている小さな欠陥（割れ目、傷、ひび）中に浸透させることができ、一方、より粘度の高いＤＣスラリーは支柱のより大きい折れ目中に堆積される。真空浸透コーティングによる無視できる支柱径の増加は、最小の細孔窓のいくつかの閉口及び支柱接合点でのTiO2スラリーの蓄積に起因すると考えられ、これはまた、フォーム構造の相互接続性の僅かな低下を引き起こした（図５ｂ）。細孔ネットワークの相互接続性の低下は、真空浸透したスキャフォールドが粘度の高いスラリーで二重被覆された場合により顕著であり、これはDC+VIプロセスが、逆の順番(VI+DC)の同じ手順を適用するよりも閉口した細孔開口部がより少なくなる。それにもかかわらず、追加の真空浸透された低粘度コーティングは、TiO2フォーム構造の構造均一性を向上するために効果的であると考えられ、そのため、TiO2スキャフォールドの機械強度を顕著に向上させ、TiO2スキャフォールド構造の好適な細孔構造特性を維持する。
【０１２１】
VIプロセスで用いられる低粘度コーティングがスキャフォールド構造に無視できる影響しか有さないと考えられるので、細孔構造特性は、より高い粘度の二重被覆手順に主に左右される。細孔容積の相互接続性は、骨スキャフォールドのための最も重要な特性の１つであると特定されているので、二重被覆手順の最適化により、スキャフォールド構造中において閉口した細孔窓の数は最小化されるべきである。スキャフォールド（ＤＣ）を二重コーティングするために用いられるスラリーの粘度は、低固形分（30 g）及び高固形分(45g)の両方でTiO2フォーム構造の均一性に顕著な影響を与え、細孔窓の閉口を引き起こし（図４）、これにより細孔ネットワークの相互接続性に影響を与える（図５ｂ）。より高粘度のスラリーの乏しい浸透がTiO2フォームの外縁部で主に細孔開口部の閉口をもたらすので、この閉口の影響は、選択されたVOI(volume of interest、目的の容積)がスキャフォールドシリンダーの最外領域を除かなかったので、３Ｄ相互接続性解析では明らかにされなかった。しかしながら、外側の細孔窓の閉口は、スキャフォールド内部への細胞及び組織の浸透を相当阻害すると考えられるので、特に望ましくない。そのため、セラミックフォームの機械的完全性が再被覆手順により向上される場合、第３スラリーの粘度の制御が、細孔ネットワークの均一性及び相互接続性に影響を与える最も重要な処理パラメーターの１つであると特定された。
【０１２２】
そのため、本明細書に記載した再被覆二酸化チタンスキャフォールドを提供する方法は、向上した機械強度を有するスキャフォールドをもたらし、細孔ネットワークの細孔構造及び相互接続性に悪影響を与えない。
【０１２３】
本発明はその詳細な説明と併せて説明されたが、この前述の記載は本発明を説明するためのものであり、本願の特許請求の範囲に規定した本発明の範囲を制限するものではないことが理解されよう。他の態様、有利な点、変更、及び改良は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
【０１２４】
反対の記載がない限り、本明細書に記載した好ましい特徴のそれぞれは、他の本明細書に記載した好ましい特徴のいずれか又は全てと組み合わせて用いることができる。
【０１２５】
参照文献
【表３】
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【図１ａ】
2015531270.tif 000007
【図１ｂ】
2015531270.tif 000008
【図２ａ】
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【図２ｂ】
2015531270.tif 000010
【図２ｃ】
2015531270.tif 000011
【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2015531270.tif 000015
【図４】
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【図５ａ】
2015531270.tif 000017
【図５ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年12月2日(2014.12.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
a) 二酸化チタンを含む第１スラリーを可燃性多孔質構造体に塗布する工程； 
b) 前記第１スラリーを前記可燃性多孔質構造体上で固化させる工程；
c) 約４００〜５５０℃の第１焼結により前記固化させた二酸化チタンスラリーから前記可燃性多孔質構造体を除去して、二酸化チタンスキャフォールド構造体を生成する工程；
d) 工程c)の二酸化チタンスキャフォールド構造体を少なくとも１３００℃の温度の第２焼結に少なくとも１０時間供して、一重被覆二酸化チタンスキャフォールドを提供する工程を含む、再被覆二酸化チタンスキャフォールドを調製する方法であって、
e) 真空浸透により二酸化チタンを含む第２スラリーを前記一重被覆二酸化チタンスキャフォールドに塗布し、その後に任意選択で該一重被覆二酸化チタンスキャフォールドを遠心分離に供する工程；
f) 工程e)の第２スラリーを前記一重被覆二酸化チタンスキャフォールド上で固化させる工程；及び
g) 少なくとも１１００℃の温度での第３焼結を行い、再被覆二酸化チタンスキャフォールドを提供する工程
を含む真空浸透手順をさらに含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記真空浸透手順を、
i) 二酸化チタンを含む第３スラリーを工程d)の一重被覆二酸化チタンスキャフォールド又は工程g)の再被覆二酸化チタンスキャフォールドに塗布し、任意選択で該スキャフォールドを遠心分離に供する工程；
ii) 工程i)の第３スラリーを前記スキャフォールド上で固化させる工程；及び
iii) 少なくとも１１００℃の温度でのさらなる焼結を行う工程
を含む二重被覆手順の前又は後で行う、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程iii)のさらなる焼結を少なくとも１０時間、例えば２０〜５０時間行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程g)の第３焼結を約２〜１５時間、例えば３時間行う、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２スラリー中の二酸化チタン濃度が、３００〜９００ｍｇ／ｍｌ、例えば４００〜８００ｍｇ／ｍｌである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第３スラリー中の二酸化チタン濃度が、約１３００〜１７００ｍｇ／ｍｌ、例えば１５００〜１７００ｍｇ／ｍｌである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記真空浸透を、少なくとも０．１ｍｂａｒ、例えば０．１〜０．３ｍｂａｒで行う、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
二酸化チタンスキャフォールドの機械強度を向上させるための方法であって、
二酸化チタンスキャフォールドを準備する工程と、該二酸化チタンスキャフォールドを請求項１に規定する真空浸透工程e)〜f)に供する工程とを含む、方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項に記載した方法により得られる、再被覆二酸化チタンスキャフォールド。
【請求項１０】
請求項９に記載の再被覆二酸化チタンスキャフォールドを含む、医療補綴デバイス。
【請求項１１】
医療補綴デバイスとして使用するための、請求項９に記載の再被覆二酸化チタンスキャフォールド。
【請求項１２】
組織の再生、修復、置換、及び／又は回復のために使用するための、請求項９に記載の再被覆二酸化チタンスキャフォールド又は請求項１０に記載の医療補綴デバイス。
【国際調査報告】
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