(57)【要約】【解決手段】  少なくとも１つの態様において、本願明細書に開示された実施形態は、生物組織の形態を観察するための方法に関する。本方法は、パテントブルーＶ、イソスルファンブルー、トルイジンブルー、ヒペリシン、インドシアニングリーン、ＭＶＡＣ、またはドキソルビシンから選択される蛍光色素を、生物組織に対して用いるステップと、顕微鏡的な線形イメージングシステムまたは非線形イメージングシステムを用いて生物組織の画像を形成させるステップと、を含む。蛍光色素の蛍光は、生物組織の形態を細胞スケールにて明らかにする。【解決手段】【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物組織の形態を観察するための方法であって、
パテントブルーＶ、イソスルファンブルー、トルイジンブルー、ヒペリシン、インドシアニングリーン、ＭＶＡＣ、またはドキソルビシンから選択される蛍光色素を、前記生物組織に対して用いるステップと、
顕微鏡イメージングシステムを用いて前記生物組織の画像を形成させるステップと、を含み、
前記蛍光色素の蛍光は、前記生物組織の形態を細胞スケールにて明らかにすることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記蛍光色素がパテントブルーであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記パテントブルーを前記生物組織の中に導入するステップをさらに含み、
前記パテントブルーの濃度は、０．００５％〜２．５％にて選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記蛍光色素は、トルイジンブルーであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記トルイジンブルーを前記生物組織の中に導入するステップをさらに含み、
前記トルイジンブルーの濃度は、０．１％〜２％にて選択されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記蛍光色素は、ヒペリシンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒペリシンを前記生物組織の中に導入するステップをさらに含み、
前記ヒペリシンの濃度は、０．５μＭ〜１０μＭにて選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記蛍光色素は、インドシアニングリーンであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記インドシアニングリーンを前記生物組織の中に導入するステップをさらに含み、
前記インドシアニングリーンの濃度は、投与経路に応じて０．０５ｍｇ／ｍｌ〜２．５ｍｇ／ｍｌにて選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
蛍光は、生体外の顕微鏡検査を用いて観察されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
蛍光は、生体内の顕微鏡検査を用いて観察されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
顕微鏡検査は、ファイバー型の内視鏡を用いて行われることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
顕微鏡検査は、非線形顕微鏡検査を用いて行われることを特徴とする請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記蛍光色素を前記生物組織の中に導入するステップをさらに含み、
前記蛍光色素は、インドシアニングリーンであって、当該蛍光色素の投与は静脈内に行われることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記蛍光色素を前記生物組織の中に導入するステップをさらに含み、
前記蛍光色素は、パテントブルーまたはインドシアニングリーンから選択され、当該蛍光色素の投与は皮下に行われることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記蛍光色素を前記生物組織の中に導入するステップをさらに含み、
前記蛍光色素は、パテントブルーまたはインドシアニングリーンから選択され、当該蛍光色素の投与は粘膜下に行われることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記蛍光色素は、局所的に投与されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
口唇、舌、咽頭、および口腔を含む口腔がんは、すべてのがんの形態の中で１２番目に位置される。原発性悪性腫瘍は、一般に診断が遅いため、近年の治療の進歩にもかかわらず予後の悪いがんのままである。白色光検査および触診は、生検部位を特定するために一般に使用される。放射性コロイドと青色色素の間質注入に続く術中のリンパ節マッピングは、正当性が立証され、乳がん、皮膚黒色腫、およびそれらより頻度は低いが頭頸部がんに対して主に使用されるルーティンな外科的処置として、広く受け入れられてきた。
【背景技術】
【０００２】
前がん病変、がん病変、正常組織の間の区別を改善するため、およびセンチネルリンパ節を検出するために、視覚的な診断方法が導入された（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ  Ｊ．Ｃ．ら、「近赤外蛍光を用いたヒトにおけるリンパイメージング」、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ  ２００９年；第２０巻：７４−８２２００９およびＶａｒｇｈｅｓｅ  Ｐ．ら、「メチレンブルー色素−センチネルリンパ節局在に対する安全で有効な代替手段」、Ｔｈｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｊ  ２００８年；第１４巻：第６１頁〜第６７頁）。内因的もしくは外因的に誘導された蛍光色素分子による肉眼的蛍光イメージングを用いて、またはラマン分光法、蛍光分光法および弾性散乱分光法などの分光法を用いて、臨床研究が行われてきた。共焦点顕微鏡検査はずっと基礎研究に限定して使用されてきた。しかし、最近生体内における疑わしい組織の細胞レベルでのイメージングに適用されてきた（Ｋｉｅｓｓｌｉｃｈ  Ｒ．ら、「生体内における上皮内がんと大腸がんの診断用の共焦点レーザー内視鏡検査」、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００４年；第１２７巻第７０６頁〜第７１３頁）。プローブ型共焦点レーザー内視鏡（内視鏡検査）（ｐＣＬＥ）は、高解像度画像の要求を満たすために、過去数年間に広く使われるようになってきた。「光学的生検」と呼ばれるそのような非侵襲的な方法は、今や蛍光色素を用いて様々な臓器におけるがんや他の疾患に接近して監視することを可能とする。
【０００３】
水酸化フェナントロペリレンキノンであるヒペリシンは、蛍光診断用であると考えられてきた。正常でない特にがん細胞においてこの色素の取り込みがより高いことは、膀胱がん（Ｄ’Ｈａｌｌｅｗｉｎ  Ｍ−Ａ．ら、「ヒペリシンに基づく膀胱上皮性悪性腫瘍の蛍光診断」、ＢＪＵ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２００２年；第８９巻第７６０頁〜第７６３頁）および悪性口腔の病変（Ｔｈｏｎｇ  Ｐ．Ｓ．Ｐ．ら、「ヒトの口腔病変に対してヒペリシンを用いた蛍光内視鏡的イメージングの臨床応用」、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００９年；第１０１巻第１５８０頁〜第１５８４頁）の検出率を高めるという潜在能力があると評価されてきた。後者の研究では、診断基準は赤色と青色の強度比に基づいていた。この強度比は、悪性病変よりも非悪性病変の方が高い。
【０００４】
チアジン族のよく知られた異染性色素であるトルイジンブルーもまた、局所的な適用を用いて、染色悪性と前悪性病変によって口腔の広い分野の試験において潜在能力が調べられてきた。つまり、Ｅｐｓｔｅｉｎによると、がんへの進行の高リスクを伴う前悪性病変は、この方法を用いて選択的に染色される。この死を招く（ｖｉｔａｌ）色素を用いて肉眼検査中に観察された主な偽陽性の結果は、一般に炎症性領域または外傷性領域に関連する。そのため、これらの原因を除去するために、２週間後に反復検査が強く推奨される（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｊ．Ｂ．ら、２００９年）。口腔がんスクリーニングにおけるトルイジンブルーの有効性を評価するために、事前のメタ解析が好適であった。この方法は、高リスク集団において感度が９３．５％〜９７．５％の範囲であること、および特異性が７３．３％〜９２．９％の範囲であることが示された。
【０００５】
トルイジンブルーに密接に関連するチアジン色素であるメチレンブルーは、接触内視鏡検査によって細胞構造を明確に示すために、口腔および喉頭の上皮の表層の染色用であるとみなされてきた。核／細胞質の比と核の色、大きさおよび形状は、生体内において解析しうる。しかし、診断ツールとしてのそれらの潜在価値にもかかわらず、近年においてこの技術の使用を記載した研究はほんの少ししか存在しなかった。
【０００６】
口腔における局所的な適用のあと、前がん病変とがん病変を選択的に染色するというメチレンブルーの能力の使用は、Ｒｉａｚによって提案された（Ｒｉａｚら、「口腔前がん状態およびがんに対する初期診断マーカーとしてのメチレンブルー」、ＳｐｒｉｎｇｅｒＰｌｕｓ  ２０１３年、第２巻：第９５頁）。１２０人の患者における予備的研究によって、陽性予測値９７．７％、陰性予測値３３％とともに、この肉眼的方法の感度が９１．４％であること、および特性が６６．６％であることが示された。偽陽性性は、炎症病変および不規則性病変が原因でありうる。この方法は、高リスク集団の大規模な口腔スクリーニングに対して提案された。
【０００７】
最後に、トリアリルメタン族に由来する致死的な（ｖｉｔａｌ）青色色素であるパテントブルーＶは、臨床診療においてマッピングされるセンチネルリンパ節に対して主に用いられる。パテントブルーは、主にヨーロッパにおいて使用される。パテントブルーと対をなす異性体であるイソスルファンブルーは、米国において食品医薬品局によって承認されてきた。低濃度の両色素は、間質注入に続いて青色に着色されたリンパ節を求心性のリンパ本幹とともに肉眼的に可視化するために十分である。センチネルリンパ節の検出に対する肉眼的蛍光もまた、様々な臨床研究においてフルオレセインナトリウムとインドシアニングリーンを用いて記載されてきた（Ｄａｎ  Ａ．Ｇ．ら、「大腸腫瘍におけるセンチネルリンパ節をマッピングするための１％リンファズリン（Ｌｙｍｐｈａｚｕｒｉｎ）対１０％フルオレセイン」、Ａｒｃｈ  Ｓｕｒｇ  ２００４年；第１３９巻：第１１８０頁〜第１１８４頁）。
【０００８】
トルイジンブルー、メチレンブルー、パテントブルー、インドシアニングリーンおよびヒペリシンは、診断法の肉眼的誘導用に臨床診療または臨床試験において現在使用されている色素である。患者に対するこれらの色素の副作用は非常に限られている（Ｎａｒｕｉ  Ｋ．ら、「初期乳がんにおける腋窩の病期分類に対する青色色素介在型の４節サンプリングの観察研究」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  ２０１０年；第３６巻：第７３１頁〜第７３６頁）。
【０００９】
本願開示では、我々は赤色蛍光色素であるヒペリシン、遠赤外（ｆａｒ−ｒｅｄ）トルイジンブルー（ＴＢ）、パテントブルー（ＰＢ）染色剤、赤外線インドシアニングリーン（ＩＣＧ）染色剤の単独または組み合わせの蛍光特性を、正常およびがん性頭頸部組織の特性に対して、および細胞レベルにおけるリンパ節のイメージングに対して初めて評価した。ラップトップ型共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ）、非線形（多光子）顕微鏡、およびプローブ型共焦点レーザー内視鏡（ｐＣＬＥ）を用いて、ヒトの外科標本およびラットのリンパ節の高解像度蛍光イメージングが実現された。我々は次に対応する共焦点および非線形画像と、標準的な組織病理学を用いて得られた結果とを比較した。生検およびセンチネルリンパ節部位の改善された位置に対する共焦点顕微鏡検査、反射率および蛍光情報を組み合わせた潜在的な多面的方法もまた議論される。
【発明の概要】
【００１０】
少なくとも１つの局面において、本願明細書で開示される実施形態は、生物組織の形態を観察するための方法であって、
パテントブルーＶ、イソスルファンブルー、トルイジンブルー、ヒペリシン、インドシアニングリーン、ＭＶＡＣ、またはドキソルビシンから選択される蛍光色素を、生物組織に対して用いるステップと、
顕微鏡イメージングシステムを用いて生物組織の画像を形成させるステップと、を含み、
顕微鏡的線形または非線形イメージングシステムを用いることによって、生物組織の画像を形成させるステップと、を含み、
蛍光色素の蛍光は、生物組織の形態を細胞スケールにて明らかにすることを特徴とする。
【００１１】
出願人らは、本願開示において上述した色素の未知の特性、つまり未知の蛍光特性（例：パテントブルーＶ、イソスルファンブルー）または細胞スケールにてコントラストのついた画像を明らかにするための未知の機能（例：ヒペリシン、ＭＶＡＣ、ドキソルビシン、インドシアニングリーン）を示す。
【００１２】
より具体的には、センチネルリンパ節の細胞構造を生体内にて強調するためのパテントブルーＶ、インドシアニングリーンの蛍光特性、より広くは局所的な適用に続いて悪性頭頸部病変に関する形態の情報を提供するすべての蛍光色素、つまりヒペリシン、トルイジンブルー、パテントブルーＶ、インドシアニングリーンが、本願開示では示される。
【００１３】
ＭＶＡＣとドキソルビシンが細胞レベルの「治療イメージング」に使用されることにより、正確な投与と薬剤の生体内分布のモニタリング、および本手法による生体内の分子治療効果のよりよい理解が可能になる。
【００１４】
ある実施形態によると、本方法は蛍光色素を現在の臨床用途に伝統的に使用されている濃度よりも著しく低い色素濃度にて導入することによって、特定の細胞試験条件を満たすことを含む。これらの新たな条件下にて、許容できるコントラストが得られることによって、病理学者が組織の形態の判断を細胞スケールにて行うことができるようになる。この判断によって、診断を補助するキーとなるパラメータおよび細胞構造の同定が可能となる。
【００１５】
ある実施形態によると、本方法はパテントブルーを生物組織の中に導入するステップを含む。パテントブルーの濃度は、投与経路に応じて０．０５ｍｇ／ｍＬ（０．００５％）〜２５ｍｇ／ｍＬ（２．５％）にて選択される。
【００１６】
ある実施形態によると、本方法はトルイジンブルーを生物組織の中に導入するステップを含む。トルイジンブルーの濃度は、０．１ｍｇ／ｍＬ（０．０１％）〜２０ｍｇ／ｍＬ（２％）にて選択される。
【００１７】
ある実施形態によると、本方法はヒペリシンを生物組織の中に導入するステップを含む。ヒペリシンの濃度は、０．２５２μｇ／ｍＬ（０．５μＭ）〜５．０２μｇ／ｍＬ（１０μＭ）にて選択される。
【００１８】
ある実施形態によると、本方法はインドシアニングリーンを生物組織の中に導入するステップを含む。インドシアニングリーンの濃度は、投与経路に応じて０．０５ｍｇ／ｍＬ〜５ｍｇ／ｍＬにて選択される。
【００１９】
ある実施形態によると、蛍光は、生体外の線形または非線形顕微鏡検査を用いて観察される。
【００２０】
ある実施形態によると、蛍光は、生体内の線形または非線形顕微鏡検査を用いて観察される。
【００２１】
別の実施形態によると、蛍光色素の導入は、静脈内もしくは皮下に、または粘膜下もしくは局所的な投与による。
【００２２】
別の実施形態によると、生物組織は腹腔−骨盤腔、胸腔、頭頸部領域、リンパ系から選択される。
【００２３】
ある実施形態によると、顕微鏡検査はファイバー型の内視鏡を用いて行われる。
【００２４】
以下の表は、内視鏡におけるこれらの色素の可能性のある使用を非制限的に要約する。
【００２５】
【表１】
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【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】柔軟なミニプローブｇａｓｔｒｏｆｌｅｘ  ＵＨＤの先端を示す図である。本研究の典型的なサンプル（Ａ）、Ｃｅｌｌｖｉｚｉｏにより取得されたあるスナップショットから生成された腫瘍サンプル由来の２４０μｍの視野画像（Ｂ）、興味のある領域のより完全な表現をもたらすために、ビデオモザイク技術を用いて作られた再構築画像（Ｃ）。
【図２】トルイジンブルー染色後の腫瘍組織および非腫瘍組織の典型的な蛍光イメージング、ならびにそれぞれの場合に対応する組織学的画像である。ＣＬＳＭ（Ａ）、ｐＣＬＥ（Ｂ）、およびＨＥＳ（Ｃ）を用いて観察された仮声帯からの高度異形成である。ＣＬＳＭ（Ｄ）、ｐＣＬＥ（Ｅ）およびＨＥＳ（Ｆ）を用いてイメージングされた生体内の乳頭状上皮性悪性腫瘍である。核の詳細（白い矢印）および有糸分裂の形態（黄色の矢印）を示す。これらはいくつかの細胞で識別可能である。ＣＬＳＭ（Ｇ）、ｐＣＬＥ（Ｈ）およびＨＥＳ（Ｉ）を用いてイメージングされた高分化型ＨＮＳＣＣである。腫瘍細胞を取り囲む間質線維芽細胞（黄色の星印）に留意する。
【図３】ＭＢ染色後における腫瘍組織および非腫瘍組織の典型的な蛍光イメージング、および各例に対して対応する組織病理学的画像を示す図である。ＣＬＳＭ（Ａ）、ｐＣＬＥ（Ｂ）およびＨＥＳ（Ｃ）を用いて解析された下の外側縁に由来する扁平上皮；小円形核（白色の楕円）によって特徴づけられる炎症性細胞とともに、ＣＬＳＭ（Ｄ）、ｐＣＬＥ（Ｅ）およびＨＥＳ（Ｆ）を用いて観察された喉頭に由来する低分化非角化ＨＮＳＣＣ。最後に、ＣＬＳＭ（Ｇ）、ｐＣＬＥ（Ｈ）およびＨＥＳ（Ｉ）を用いて観察された筋肉を襲う侵襲的で中程度に分化した非角化ＨＮＳＣＣ。ＨＥＳによって明らかにされた対応する形態と比較して、蛍光モードにおける典型的な正常筋細胞（白色の矢印）の形態に留意する。
【図４】ＰＢ染色後における腫瘍組織および非腫瘍組織の典型的な蛍光イメージング、およびそれぞれの場合に対して対応する組織病理学的画像を示す図である。ＣＬＳＭ（Ａ）、ｐＣＬＥ（Ｂ）およびＨＥＳ（Ｃ）を伴う扁平上皮；ＣＬＳＭ（Ｄ）、ｐＣＬＥ（Ｅ）およびＨＥＳ（Ｆ）を用いて観察された咽頭の副唾液腺管後壁上皮の部分的な扁平上皮化生；ＣＬＳＭ（Ｇ）、ｐＣＬＥ（Ｈ）およびＨＥＳ（Ｉ）を用いて観察された低分化型ＨＮＳＣＣ。
【図５】ヒペリシン染色後における腫瘍の典型的な蛍光イメージングおよび対応する組織病理学的画像を示す図である：ＣＬＳＭ（Ａ）、ｐＣＬＥ（Ｂ）およびＨＥＳ（Ｃ）を用いて観察された中程度に分化した扁平上皮がん。
【図６】インドシアニングリーン染色後における喉頭ＨＮＳＳＣの典型的な蛍光イメージングを示す図である。０．２５ｍｇ／ｍｌインドシアニングリーン溶液を１０秒間局所投与することにより染色された生体外の扁平上皮がん。サンプルは次に、線形共焦点顕微鏡ＣＬＳＭ（λｅｘ＝６３５ｎｍ）（Ａ）およびファイバー型共焦点顕微鏡（λｅｘ＝７８５ｎｍ）（Ｂ）を用いてイメージングされた。
【図７】ＣＬＳＭにより取得された腫瘍標本の多重パラメータ型蛍光モードイメージングを示す図である。（Ａ）ＴＢ染色後のＨＮＳＣＣである（緑色および差し込み図）。上皮性悪性腫瘍小柱は緑色に見え、自己蛍光（λｅｘ＝４０５ｎｍおよびλｅｍ＝４２０〜５００  ｎｍ）により検出された主要な繊維性基質（青色）に関連している。（Ｂ）コラーゲンおよびエラスチンの間質性ネットワーク（青色）とともに、自己蛍光（λｅｘ＝４０５ｎｍおよびλｅｍ＝４２０〜５００ｎｍ）を用いて検出されたＭＢ染色後の高分化型ＨＮＳＣＣである（緑色および差し込み図）。黄色の矢印はケラチン真珠を示す。いぼ状の扁平上皮がんはＴＢ染色後に識別される（緑色信号および差し込み図）。しかし錯角化細胞核（白い楕円）はＡＣＦ染色後にのみ検出された（赤色信号）。（Ｄ）ＭＢ染色後に検出された細胞境界の一部（白い矢印）を有する高分化型ＨＮＳＣＣである（緑色信号および差し込み図）。しかし、ＭＢが充填されていない領域（黄色の矢印）において核が強調されたＡＣＦを用いた二重染色（赤色信号）が存在する。
【図８】４０×対物レンズを用いてＣＬＳＭによって取得された蛍光および反射モードにおける腫瘍標本の多重パラメータイメージングを示す図である。（Ａ）ＭＢ染色後における低分化〜中程度に分化したＨＮＳＣＣ；（Ｂ）自己蛍光信号（青色）：コラーゲン繊維およびエラスチン繊維をより明瞭に見ることができる（λｅｘ＝４０５ｎｍおよびλｅｍｉ＝４２０〜５００ｎｍ）；（Ｃ）間質細胞および上皮性悪性腫瘍細胞が存在する反射（ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ）信号（赤色、λ＝４８８ｎｍ）；（Ｄ）サンプルに由来する緑色、赤色および青色信号の重ね合わせ。黄色の領域は、ＭＢと反射信号の共局在を示す。ピンク色の領域は、自己蛍光と反射信号の共局在を示す。マクロファージも見ることができる（黄色の矢印）。スケールバーは５０μｍである。
【図９】青色色素を皮膚下に注入した後における非病原性のラットのリンパ節における典型的な蛍光イメージングを示す図である：ＣＬＳＭ（Ａ）、ｐＣＬＥ（Ｂ）および対応するＨＥＳ（Ｃ）で観察された典型的なＴＢ染色；ＣＬＳＭ（Ｄ）、ｐＣＬＥ（Ｅ）および対応するＨＥＳ（Ｆ）で観察された典型的なＭＢ染色；ＣＬＳＭ（Ｇ）、ｐＣＬＥ（Ｈ）および対応するＨＥＳ（Ｉ）で観察された典型的なＰＢ染色。黄色の矢印はリンパ濾胞、緑色の矢印は濾胞間領域、赤色の矢印は生理的な洞の（ｓｉｎｕｓａｌ）組織球増殖症、および青色の矢印は節の周囲の含脂肪細胞を示す。
【図１０】インドシアニングリーンを用いて染色されたリンパ節の非線形イメージングを示す図である。０．２５ｍｇ／ｍｌのインドシアニングリーン溶液を１０秒間局所的に適用することによって染色された生体外のリンパ節である。サンプルは次に多光子顕微鏡を用いて８３０ｎｍにてイメージングされた。  含脂肪細胞層のいくらかが付着した節の被膜は、枠の左側に見える。また神経節内部の皮質領域が右側に見える。  皮膚領域では、ＩＣＧの蛍光が核周囲に存在することによって、細胞核を陰性にしている。しかし、蛍光は細胞周囲の空間にも存在することに留意する。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
（略語）
ＣＬＳＭ：共焦点レーザー走査顕微鏡
ｐＣＬＥ：プローブ型共焦点レーザー内視鏡
ＨＥＳ：ヘマトキシリンとエオシン―サフランを用いて染色された組織学的スライド
ＨＮＳＳＣ：頭頸部扁平上皮がん
【００２８】
（詳細な説明）
本願開示では、すべての百分率濃度は、他に明記しない限り質量／体積（ｗ／ｖ）をいう。溶液は、他に明記しない限り水溶液である。
【００２９】
［材料と方法］
（材料）
ヒペリシンはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社（フランス国Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ）から、ＭＢはＡｇｕｅｔｔａｎｔ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社（ＭＢ１％注入、フランス国Ｌｙｏｎ）から、トルイジンブルー（ＴＢ）はＦｌｕｋａ社（シグマアルドリッチ社、フランス国Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ）から、パテントブルー（ＰＢ）はＧｕｅｒｂｅｔ社（パテントブルーＶナトリウム２．５％注入、フランス国Ｖｉｌｌｅｐｉｎｔｅ）から、アクリフラビン塩酸塩（ＡＣＦ）はシグマアルドリッチ社（フランス国Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ）から、インフラシアニン（Ｉｎｆｒａｃｙａｎｉｎｅ）２５ｍｇ（ＩＣＧ）はＳＥＲＢ  Ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅｓ社（フランス国パリ）から購入された。また酢酸はＧｙｎｅａｓ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（酢酸５％、フランス国Ｇｏｕｓｓａｉｎｖｉｌｌｅ）から提供された。
【００３０】
（ヒトの標本）
Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｇｕｓｔａｖｅ  Ｒｏｕｓｓｙ（フランス国Ｖｉｌｌｅｊｕｉｆ）にて扁平上皮がん（ＨＮＳＣＣ）に対する全（咽頭）喉頭切除または口腔および顎顔面外科手術を経験した合計２５人の患者が前向きプロトコルに含められた（２００９年１月〜２０１１年４月）。施設内倫理委員会はこの研究を承認した。またインフォームド・コンセントが全患者から得られた。最大表面積が１ｃｍ３である３０個の新鮮に収集された組織が、蛍光イメージングの前に病理学者によって臨床的に非腫瘍性粘膜および腫瘍組織として鑑別された。
【００３１】
（動物のリンパ節）
１０匹のオスのウィスター系ラット（体重３５０ｇ）がＪａｎｖｉｅｒ社から購入された。ラットの世話および研究は、実験や他の科学目的に使用される脊椎動物の保護に対する欧州の慣習、ＥＵの指示および動物実験法に関するフランス国の法律に従って実行された。すべての実験プロトコルは、保護委員会およびＩｎｓｔｉｔｕｔ  Ｇｕｓｔａｖｅ  Ｒｏｕｓｓｙでの実験における動物の使用によって承認された。アイソレータ中の標準的なケージ中で維持されたラットは、１２時間の光／暗サイクルで２２〜２４℃および５０％湿度にて飼育された。また自由に（ａｄ  ｌｉｂｉｔｕｍ）餌と水が与えられた。
【００３２】
（ヒトの外科標本の調整）
（一般的なサンプル調整）
頭頸部粘膜は、角質化していることが多い。これらのケラチンの層は、色素と光が組織に拡散する際の障壁であるため、サンプルの管腔表面にてテープ剥離（３Ｍ外科手術用テープ）によって除去されてもよい。
【００３３】
（ヒペリシン染色）
新鮮な外科サンプルが１０％アセチルシステインを用いて２分間処理された後、新鮮な８μＭヒペリシン溶液を用いて３７℃にて３０分間インキュベートされた。
【００３４】
（トルイジンブルー染色）
新鮮なサンプルが１％酢酸を用いてリンスされた後、１％ＴＢ（ｗ／ｖ）を用いて短時間染色された。蛍光色素の組織への拡散を最適化するために必要な待ち時間（最大５分間）の後、サンプルは１％酢酸にてリンスされた。
【００３５】
（メチレンブルー染色）
外科標本は、１０％アセチルシステインを用いて２分間処理された後、０．２５％ＭＢにより短時間充填された。待ち時間（最大５分間）の後、サンプルは０．９％塩化ナトリウム溶液にてリンスされた。
【００３６】
（パテントブルー染色）
外科標本は、１０％アセチルシステインによって２分間処理された。その後、０．０２５％パテントブルー溶液中に１０秒間浸された。最後に０．９％塩化ナトリウム溶液中にてリンスされた。
【００３７】
（インドシアニングリーン染色）
外科標本は、１０％アセチルシステインによって２分間処理された。次に０．２５ｍｇ／ｍｌのＩＣＧによって２分間、局所的に染色された。最後に０．９％塩化ナトリウム溶液中にてリンスされた。
【００３８】
（組織の多重染色）
少数の場合には、サンプルは０．０１％（ｗ／ｖ）アクリフラビン塩酸塩によって４５秒間、追加的に染色された。次に０．９％塩化ナトリウム溶液中にて１分間リンスされた。これにより、追加的な形態の情報を得るために、トルイジンブルー−アクリフラビンおよびメチレンブルー−アクリフラビンの潜在的な組み合わせに関する議論が可能となった。
【００３９】
（リンパ節の調整）
ラットにはイソフルラン（誘導用に２．５％、維持用に１．５％）の吸入によって短時間で麻酔がかけられた。次に、１．２５％パテントブルー、１％トルイジンブルー、または０．２５％メチレンブルーのいずれか１００μＬがラットの後ろ足（ｈｉｎｄｐａｗ）の肉球（ｆｏｏｔｐａｄ）に皮下注射されることによって、リンパ節に向かって５分間拡散された。ラットは静脈内のペントバルビタール注入によって安楽死させられた。また肉眼的に青色の外観を呈する膝窩および／または鼠径部のリンパ節が解剖された。次に、生体外のリンパ節は、共焦点レーザー走査顕微鏡およびプローブ型共焦点レーザー内視鏡（ｐＣＬＥ）を用いてイメージングされた。
【００４０】
（共焦点レーザー走査顕微鏡（ＣＬＳＭ））
ＤＭＩ４００逆転顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰＥ社、ドイツ国Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて蛍光イメージングを行った。頭頸部組織とリンパ節は３５ｍｍマイクロディッシュに配置された（Ｉｂｉｄｉ社、フランス国Ｂｉｏｖａｌｌｅｙ）。組織の形態と構造は、以下のレーザー線を用いて評価された：アクリフラビン塩酸塩（励起波長λｅｘ＝４８８ｎｍ；発光波長λｅｍ＝５００〜６００ｎｍ）；ヒペリシン（励起波長λｅｘ＝５３２ｎｍ；発光波長λｅｍ＝５５０〜６５０ｎｍ）；ＴＢ、ＭＢおよびＰＢ（λｅｘ＝６３５ｎｍ；λｅｍ＝６５０〜８００ｎｍ）。１．１ｍｍ×１．１ｍｍの視野に対応する１０×対物レンズ（乾燥／  ＮＡ０．３）、５５０μｍ×５５０μｍの視野を有する２０×対物レンズ（乾燥／ＮＡ０．７）、または２７５μｍ×２７５μｍの視野を有する４０×対物レンズ（オイル／ＮＡ１．２５）のいずれかを用いて画像が形成された。異なる組織層の細胞分布および形態をイメージングするために、５μｍごとにＺ系列が生成された。
【００４１】
（非線形レーザー走査顕微鏡（多光子））
ＳＰ８逆転多光子顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰＥ社、ドイツ国Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて蛍光イメージングを行った。頭頸部組織とリンパ節は３５ｍｍマイクロディッシュに配置された（Ｉｂｉｄｉ社、フランス国Ｂｉｏｖａｌｌｅｙ）。組織の形態と構造は、８３０ｎｍにおけるパルス幅が１００ｆｓ、繰り返し率（ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｒａｔｅ）が８０Ｍｈｚである８３０ｎｍレーザー線を用いて評価された。蛍光は５８０〜６８０ｎｍの帯域通過フィルタを通じて集められた。画像は５５０μｍ×５５０μｍの視野に対応する２０×対物レンズ（乾燥／ＮＡ０．７５）を用いて取得された。異なる組織層の細胞分布および形態をイメージングするために、５μｍごとにＺ系列が生成された。
【００４２】
（プローブ型共焦点レーザー内視鏡（ｐＣＬＥ））
ＣＬＳＭと多光子顕微鏡は、生体内の診断には適していないベンチトップ型（ｂｅｎｃｈｔｏｐ）装置である。そのため、蛍光画像が次に、マウナケアテクノロジーズ社（フランス国パリ）のご好意によって提供された繊維型イメージングシステムであるＣｅｌｌｖｉｚｉｏ（登録商標）を用いて追加的に記録された。Ｃｅｌｌｖｉｚｉｏ（登録商標）は、胃腸、尿および肺の管に対してこれまで試験がうまくいっている。ｐＣＬＥは、レーザー装置に接続された柔軟で繊維型のミニプローブを含む。レーザー装置には、６６０ｎｍ（ＴＢ、ＭＢおよびＰＢ励起用）または５６８ｎｍ（ヒペリシン励起用）にて作動する半導体レーザー、高速スキャニングレーザー（１秒あたり８〜１２画像のフレーム率）、および蛍光信号を検出するための光ダイオードが備え付けられている。従来の組織病理学とは逆に、標本から得られた「最適な切片」は、横断型ではなく、組織の表面領域に対して正面を向いている（ｅｎ  ｆａｃｅ）。直径２４０μｍの視野を有する共焦点ミニプローブｇａｓｔｒｏｆｌｅｘ  ＵＨＤ（マウナケアテクノロジーズ社、フランス国パリ）を用いて、データが取得された。３０，０００本の光ファイバーから構成されるこの繊維束は、横方向の分解能が１μｍであって、軸方向の分解能が１０μｍである。皮膚の表面下５５μｍ〜６５μｍの異なる深さにて画像が取得された。興味のある所望の領域のより完全な表現を実現するために、より大きな静的な画像を生成することによって、画像の再構築はビデオモザイクソフトウェアを用いて実行された（図１）。様々な解剖学的部位に由来する上皮性悪性腫瘍および非腫瘍性粘膜において、組織の自己蛍光コントロール画像もまた記録された。
【００４３】
（組織病理学）
以前ｐＣＬＥおよびＣＬＳＭを用いて解析されたサンプルは、頭頸部組織の場合はホルモル（ｆｏｒｍｏｌ）中に、リンパ節の場合はファインフィックス（Ｆｉｎｅｆｉｘ）中に固定された後、パラフィン中に包埋され、表面粘膜に垂直となるように３μｍ厚にて切片化され、ヘマトキシリンとエオシン−サフラン（ＨＥＳ）を用いて染色された。頭頸部組織から得られた組織学的試験および蛍光画像は、頭頸部の病理学を専門とする病理学者によって読解および解釈がなされた。
【００４４】
［結果］
（トルイジンブルーを用いた頭頸部組織イメージング）
標本の効率的な蛍光イメージングがＴＢ染色の後に直接行われた。表面から６０μｍ下（ガストロフレックス（ｇａｓｔｒｏｆｌｅｘ）ＵＨＤの焦点面）の至適な拡散が色素充填の１５分後に観察された。
【００４５】
化生性の扁平上皮仮声帯標本から得られた異形成において、核の明るい蛍光および細胞の細胞質内における拡散性の染色がいずれのシステムでも観察された（図２（ａ）および図２（ｂ））。核の大きさおよび形状におけるわずかな不均一性が観察された可能性があった。この不均一性は、不規則な細胞分布に関係があった。色素拡散の範囲が限られていたためおよびｐＣＬＥ焦点面が５５μｍ〜６５μｍの範囲に制限されているために、画像は上皮表面下０〜６５μｍの深さでのみ収集された。異形性の高悪性度は、ＨＥＳスライド試験を用いて病理学者によって確認された。高度に角化したサンプルでは、おそらく制限された色素拡散のため、粘膜面に残存したケラチンおよびそれによる上皮厚の増大によって、より深い領域が見えない場合がある。
【００４６】
生体内の乳頭状上皮性悪性腫瘍が図２（ｄ）および図２（ｅ）に示されている。いずれのシステムにおいても、典型的な顕微鏡的乳頭状構造が見られる。異常な細胞分布および異型が識別可能であった。乳頭状構造は、軸に垂直にイメージングされるため、正面から見ると（ｅｎ  ｆａｃｅ）円状である。細胞の末端における強力な円状の染色は、乳頭状構造の表面にてケラチンの薄い層に貢献しうる。興味深いことに、有糸分裂とともにクロマチン（図２（ｄ）の白い矢印）は、腫瘍細胞によっては核においてＣＬＳＭを用いて判別しうる（図２（ｄ）の黄色の矢印）。
【００４７】
高分化型ＨＮＳＣＣの画像は、方向性を有する間質性細胞（黄色の矢印）により取り囲まれた高い細胞密度にて、不均一な細胞分布を明らかにする（図２（ｇ）および図２（ｈ））。がん細胞の場合、高い核／細胞質比によって、分化していない核および細胞質染色が検出された。基質において取り囲む方向性を有する細胞（線維芽細胞および筋線維芽細胞）は、がん細胞から識別しうる（図２（ｄ）および図２（ｅ））。トルイジンブルーの局所的な適用によっては、毛細血管網は特定できなかった。両方の共焦点イメージングシステムにより得られた全ＴＢ画像は、病理学者によって解釈されうる。ＣＬＳＭが一連の画像を異なる深さで生成する能力のおかげで、細胞および細胞下の詳細が表層の平面（ｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌ  ｐｌａｎｅｓ）中にてより容易に区別できた。これは、組織の表面と深部との間に存在するＴＢ蛍光勾配の結果である。
【００４８】
（メチレンブルーを用いた頭頸部組織イメージング）
標本はＭＢ染色の後即座にイメージングされた。色素が組織から漏れることによって、２時間の期間に蛍光強度とコントラストイメージングがしだいに減少した。
【００４９】
下の外側縁に由来する扁平上皮などの非腫瘍性のサンプルでは（図３（ａ）および図３（ｂ））、いずれのイメージングシステムにおいても、細胞質では拡散性の染色、核ではより高い蛍光強度を観察した。予想されるように、規則的な核分布が明瞭に観察される。また核／細胞質比が低い細胞は、従来の組織学に基づく表層解析にて確認された（図３（ｃ））。
【００５０】
ＨＮＳＣＣ標本では、小柱状（図３（ｄ）および図３（ｅ）：ここでは中程度に分化したＨＮＳＣＣ）または小葉状に不均一に配置されたがん細胞は、ＭＢ充填の後、基質から容易に見分けられる。細胞密度の増大も認識される。細胞学的異型が認識される。しかし、ｐＣＬＥを用いて実現されるコントラストの欠如が悔やまれる。ＣＬＳＭを用いると、小円形核を有する炎症性細胞（図３（ｄ）、白色の楕円）を紡錘状の核を呈する線維芽細胞から識別することも可能であった。さらに、浸潤がんから得られた外科標本においては、いずれのシステムにおいても、筋肉に浸潤する高密度がん細胞（白い矢印）を明瞭に観察することができた（図３（ｇ）および図３（ｈ））。
【００５１】
（パテントブルーを用いた頭頸部組織イメージング）
標本はＰＢ染色の後、即座にイメージングされた。青色色素の漏出によって、コントラストイメージングの質の急速な低下（１〜２時間の期間にわたる）が観察された。図４は扁平上皮（図４（ａ）、図４（ｂ））、導管化生（図４（ｄ）、図４（ｅ））およびＨＮＳＣＣ（図４（ｇ）、図４（ｈ））の高品質な蛍光画像を示す。またこれらの画像は、対応する従来の組織病理学的画像と比較しうる（図４（ｃ）、図４（ｆ）、図４（ｉ））。非病理組織の画像は、細胞質全体でＰＢ色素の分布を示す。がん性のサンプルでは、不均一な細胞形態が容易に識別できた。またこの形態は、核が強く染色される多数の小柱と関連していた。増大した細胞密度もまた、容易に認識された。
【００５２】
（ヒペリシンを用いた頭頸部組織イメージング）
サンプルはヒペリシン溶液に３７℃にて３０分間浸けられた後にイメージングされた。細胞膜および核膜は区別できた。またこれらは細胞質における拡散性の蛍光色素分子染色に関連していた。中程度に分化した扁平上皮がんなどの腫瘍組織の場合（図５）、不均一な細胞分布が蛍光下で観察できた。
【００５３】
（インドシアニングリーンを用いた頭頸部組織イメージング）
標本はＩＣＧ染色の後に直ちにイメージングされた。
励起光下におけるＩＣＧの引き上げ（ｂｅａｃｈｉｎｇ）によって、蛍光のわずかな減衰が見られた。しかし、イメージング工程を通じて色素の漏出は観察されなかった。図１０は、ＩＣＧの蛍光が細胞質の全体に分布したＨＮＳＣＣの高精度蛍光画像を示す。ＣＬＳＭ（Ａ）およびｐＣＬＥ（Ｂ）の両方の画像に対して、細胞の形態は容易に区別できた。また、高度に分化した上皮性悪性腫瘍において、組織構造の破壊はよく観察された。
【００５４】
（頭頸部組織における多重胸部（Ｍｕｌｔｉｐｅｃｔｒａｌ）および多面的共焦点イメージング）
多重パラメータ（ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｒｉｃ）解析がＨＮＳＣＣ標本の画像の質を改善する潜在能力が評価された。上述した色素の１つを用いるだけでは、完全に詳細な組織構造は染色できないからである。まず４０５ｎｍにおけるレーザー励起に続いて、組織標本の自己蛍光がＴＢ染色またはＭＢ染色と組み合わせられた。ＨＮＳＣＣサンプルがまずＴＢに充填されることによって、弱い蛍光の組織が境界となる不規則な小柱が強調された（図７（ａ））。追加的に自己蛍光信号が記録された際に、病理学者は対応するＨ＆Ｅ領域に相関する主要な線維症を十分に認識することができた。第２の場合には、ＭＢにより染色された高分化型ＨＮＳＣＣの上皮性悪性腫瘍の小葉が容易に認識された。基質特性は、自己蛍光信号に基づいてエラスチンに富む基質の画像によって補足された（図７（ｂ））。このサンプルでは、ＭＢによってケラチン真珠もまた染色された（黄色の矢印）。すべての画像で、自己蛍光によってもたらされた追加的な情報によって、Ｈ＆Ｅ切片を用いた腫瘍組織の従来の表現に近づくことが可能となった。
【００５５】
第２の方法では、外科標本はトルイジンブルー−アクリフラビンまたはメチレンブルー−アクリフラビンを用いて二重染色された。アクリフラビン（ＡＣＦ）はＤＮＡ塩基の間に入り込む蛍光色素であって、細胞核を強く染色する。図６（ｃ）は、主要な角質化と渦（ｗｈｉｒｌｐｏｏｌ）の傾向を有する扁平細胞に向かう無秩序な構造におけるがん細胞と小細胞の間に進行性の分化を伴うトルイジンブルー−アクリフラビン充填後のいぼ状の扁平上皮がんを示す。両方の単一の蛍光色素を用いて角化症の過程が明確に確認できる。しかし、この領域ではＴＢ単独では核およびケラチンは区別できなかったため、錯角化はＡＣＦによってのみ明らかとなった（白色の楕円）。図７（ｄ）は、ＡＣＦとＭＢを用いて染色された高分化型ＨＮＳＣＣの例を示す。加えて、ＭＢを用いて核、細胞質染色、細胞境界の一部（白色の矢印）が識別された。腫瘍組織のほとんどの領域において、ＡＣＦとＭＢの共局在が観察された。しかし、ＡＣＦを用いて一部の核が見えるＭＢを充填していない領域が認識された。
【００５６】
最後に、病理学者の解釈を改善するために、ＭＢが充填された高分化型ＨＮＳＣＣもまた、自己蛍光と追加的なパラメータとして反射率（ｒｅｆｌｅｃｔａｎｃｅ）を用いてイメージングされた。反射イメージングは、組織の構造に関連した屈折性の指標とともに、組織に由来する後方散乱光を利用する。得られる多色画像によって、妨害された構造から追加的なデータが得られた。つまり、ＭＢ画像は識別可能な腫瘍細胞と炎症性細胞を示す（図８（ａ））。図８（ｄ）では、炎症性細胞は丸い核を有する小型細胞として見えるリンパ球と、小型の核を含み形状が様々である大型細胞の形態であるマクロファージとから構成される（黄色の矢印）。
【００５７】
（ラットの顕微鏡的リンパ節イメージング）
我々の予備試験では、健康なリンパ節のみがイメージングされた。
【００５８】
ＰＢ、ＴＢまたはＭＢの皮膚下の注入に続いて、膝窩および／または鼠径部のリンパ節への青色色素の拡散がわずか５分後に肉眼的に確認できた。リンパ節はＣＬＳＭおよびｐＣＬＥを用いて生体外でイメージングされた（図９（ａ）、図９（ｄ）、図９（ｇ）、図９（ｂ）図９（ｅ）、図９（ｈ））。リンパ節はＭＢ、ＴＢおよびＰＢを用いて均一に染色された。リンパ性細胞の均一な分布は、節の被膜（ｎｏｄｅ  ｃａｐｓｕｌｅ）下にて容易に区別できた。
【００５９】
ＩＣＧにより染色されたサンプルの多光子顕微鏡検査では、モード（ｍｏｄｅｓ）の皮質領域の細胞質において局所的な染色が見られた。ＩＣＧ色素の局所的な投与の後、核の蛍光の欠如を示す画像において、細胞核は黒色に見えた。サンプルが非病原性であって非炎症性リンパ節であったため、極めて均一な細胞分布が観察できた（図１０）。
【００６０】
パテントブルーＶとＩＣＧが生体内でセンチネルリンパ節の細胞構造を強調するという蛍光特性は、以前に報告されたことがなかった。この新たな方法によって、組織に対して色素を局所的に投与しただけで、悪性病変に関する形態の情報を提供することができた。
【００６１】
（考察）
本願開示では、我々は細胞レベルにおける蛍光イメージング、より具体的には、頭頸部組織のイメージングおよびリンパ節、特にセンチネルリンパ節の試験に対する新たな方法を提唱した。
【００６２】
ＴＢ、ＭＢ、ＰＢ、ＩＣＧおよびヒペリシンの蛍光特性は、細胞レベルおよび組織レベルにおける高精度な画像を生成するために使用された。これにより、これらの「光学的生検」に基づいて、病理学者が診断をすることが可能となった。これらの色素によってもたらされた組織の形態および構造に関する情報は、ヒトの腫瘍性および非腫瘍性頭頸部標本、ならびに動物のリンパ節において評価された。
【００６３】
臨床診療では、前がん病変とがん病変はＴＢおよびＭＢに対して肉眼レベルにて優先的な色素測定用の（ｃｈｒｏｍｏｓｃｏｐｉｃ）色素の取り込みを示す（Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｊ．Ｂ．ら、２００９年）。予想されにくい結果は、本願開示の両方の色素に対して、著しい蛍光信号も扁平上皮中に見られることである。ＨＮＳＣＣ標本では、腫瘍細胞は両方の色素を用いて周囲の基質とともに顕微鏡的に扁平上皮の均一で規則的な染色からよく区別できる。がん病変は、核の大きさや形状の変化（核の大小不同）などの細胞学的異常、増大した核／細胞質比によって細胞レベルにて、さらに細胞や不規則な細胞構造のクラスター化によって組織レベルにて、正確に区別することができる。共焦点ＣＬＳＭ画像もまた、従来の生検を用いて得られたレベルと類似する詳細なレベルにて、有糸分裂のパターンを明らかにする。興味深いことに、これらの赤色および遠赤外蛍光造影剤の局所的な投与もまた、ケラチン真珠などの角質化異常の有用な染色をもたらす。
【００６４】
ほとんど局所的に使用されるＭＢおよびＴＢとは対照的に、ＰＢは臨床ルーティンでは間質投与（ほぼ腫瘍周囲の注入）によって蛍光イメージングが顕微鏡スケールにて適用可能となる濃度にてすでに日常的に使用されている。組織におけるこれらの色素の局所的な搬送はもまた、病理学者が解釈可能な画像を取得することに関連する。ＭＢおよびＴＢを用いて観察されるように表面下約６０μｍにイメージング深さが制限されるため、局所的な搬送様式を使用する場合、色素の組織中への拡散が限られていることも考慮されなければならない。さらに、表面粘膜を機械的に剥離してＨＮＳＣＣ標本中のほとんどのケラチン層を除去することによって、顕微鏡スケールにて解読可能な画像の生成を改善してもよい。両方の青色色素（ＴＢ、ＰＢ）を用いた組織の標識化はほぼ即座に（１分以内に）起こる。また生体外の標本におけるこれらの青色色素の除去率は、外科的処置の時期に対応しうる（１５分以内）。青色色素およびＩＣＧと比較した場合、解読可能な顕微鏡的画像を提供するためには、ヒペリシンを用いる細胞イメージングは、染色後により長い時間間隔を要する（少なくとも３０分）。しかしながら、この継続時間は従来の臨床プロトコルに対応する。
【００６５】
局所的な適用に続くＭＢ、ＴＢおよびヒペリシンを用いた肉眼的偽陽性は、炎症または再生組織と関連することが多い。これらの赤色および遠赤外蛍光色素を用いて生成された共焦点顕微鏡検査または内視鏡画像のすべては、病理学者によって解釈されるのに十分な質を有する。しかし、これらの蛍光マーカーが単独で使用された場合には、腫瘍間質性疾患の同定に制限が生じうる。線維症の網状構造がほんのわずかにしか蛍光を出さない可能性があるためである。本願発明者らは、多面的顕微鏡イメージングが画像中で追加的な有用な情報を得ることに貢献しうることにより、繊維の網状構造および炎症性細胞の同定を改善できることを示した。共焦点顕微鏡検査による反射率の潜在的な使用によって、喉頭の病変を診断することの研究および生体内の口腔病変の検出が成功した。染色されていない組織を反射モードにてイメージングすることができるが、誘導された蛍光モードにより、ＳＮ比の高い改善された構造のイメージングが可能となる。また誘導された蛍光モードは、組織病理学によって観察された特徴に近い特徴を明らかにする。
【００６６】
本願開示では、本願発明者らはまた、遠赤外造影剤によって誘導された蛍光により得られた画像と自己蛍光または反射信号とを組み合わせることによって、従来の組織学によって実現できるのと同程度の正確性にて、すべての細胞構造または細胞外構造を特定することができる。本願開示によって説明された多重スペクトル型イメージングは、二重蛍光染色（ＡＣＦ色素および近赤外蛍光色素）の使用と組み合わせることによってこそ、病理学者の診断能力を改善する補足的な組織学的を提供する。
【００６７】
ＰＢはセンチネルリンパ節を検出するために日常的に使用される。センチネルリンパ節は青色色素注入の後、肉眼的に青色になる（Ｇｉｌｌ  Ｊ．ら、「乳がんにおけるセンチネルリンパ節生検：切除に必要となる最大節数の解析」、Ｔｈｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｊ  ２０１１年；第１７巻：第３頁〜第８頁）。臨床研究はまた、センチネルリンパ節局在に対するＭＢの間質注入を記載してきた（Ｖａｒｇｈｅｓｅ  Ｐ．ら、「メチレンブルー色素−センチネルリンパ節局在に対する安全で効率的な代替手段」、Ｔｈｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｊ  ２００８年；第１４巻：第６１頁〜第６７頁）。しかし、動物の研究はＭＢ注入後のリンパ節から得られた肉眼的赤色蛍光信号に基づく結果を示した。本願開示では、本願発明者らは、まず初めに健康なラットにおいて、青色色素とインドシアニングリーンの注入に続いて、色素測定による（ｃｈｒｏｍｏｓｃｏｐｉｃ）リンパ節検出を顕微鏡レベルの蛍光イメージングと関連付ける潜在能力を試験した。リンパ節の正常組織は、病理学者によって識別された。この結果は、センチネルリンパ節の切除に先立って、ｐＣＬＥがリンパ節のｉｎ  ｓｉｔｕイメージングをする潜在能力を浮き立たせる。本願発明者らはまた、非線形励起を用いてＩＣＧの予期せぬ目立った蛍光を示した。この結果によって、ラットのリンパ節において、皮質細胞構造の詳細な記述を可能とする。
【００６８】
本願開示において使用されたすべての造影剤は、ヒトでの使用および形態の染色能力が承認されている。本願開示において提案された新たなイメージング技術は、保健機関によって既に承認された臨床プロトコルが変化しないことを含む。このイメージング技術は、青色色素を乳がん研究または黒色腫においてセンチネルリンパ節プロトコルに対して、ヒペリシンを光力学治療に対して、ＩＣＧを網膜の血管造影に対して使用する。
【００６９】
本願発明者らが使用を提案したマーカーの濃度は、患者に投与される最大臨床用量に等しいか、またはより多くの場合には承認された臨床用量よりも５〜１０倍低いかである。
【００７０】
本願発明者らが使用を提案した蛍光マーカーの投与経路は、臨床ルーティンにおいて既に使用されている投与経路と同一である。この投与経路では、数年後の臨床診療において、非常にわずかな悪影響が観察されているだけか、または観察されていない（Ｕｈａｒａら、「放射性コロイド、青色色素および蛍光インドシアニングリーンの黒色腫におけるセンチネルリンパ節生検への適用性」、Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１２年９月２０日、ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３４６−８１３８．２０１１．０１３４０．ｘ．を参照）。さらに、本願発明者らは、イメージングされるほとんどの組織に対して、主な経路は局所的な適用となりうることを実証した。
【００７１】
初期診断およびをより安全でより効率的な治療の発展を改善する機能的または分子的イメージングのこれらの新たな方法は、共焦点内視鏡において示されてきた。同じ文脈において、細胞レベルにおける「治療イメージング」に対して、ドキソルビシンまたはＭＶＡＣなどの本質的に蛍光特性を有する治療分子もまた考慮されうる。これらの治療分子は、正確な投与および薬剤の生体内分布のモニタリング、およびこの方法における生体内の分子治療効果のよりよい理解を可能にする。
【００７２】
繊維型顕微鏡イメージングと組み合わせられた場合、本研究で評価された色素は、メゾスコピックレベルで把握された際にはあまり理解できない領域の内容に関する改善された分類を通じて、外科医に相当な手助けとなる。ｐＣＬＥは、色素の局所的な適用に続いて、視覚的な検査とともに実行しうる。医師は初回の検査時に疑わしい領域の性質を特定しうる。その結果、炎症および外傷性病変を確認するための反復検査が不要となりうる。さらに、ｐＣＬＥはリアルタイムの生体内の組織病理学検査に適しているため、このイメージング技術は、生検を行う必要性を明らかにすること、または外科的切除の程度を決定することを可能にすることによって、臨床医を補助しうる。肉眼的および顕微鏡的蛍光試験は、組織異常の診断を埋め合わせ、医用画像に対する迅速で新たな非侵襲性かつ多重スケールの方法を医師に提供することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図８】
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【国際調査報告】
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