(57)【要約】  本発明は、非環式脂肪族アルケン、又はテルペンのエポキシ化のための酵素法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エポキシドを生成する方法であって、非環式脂肪族アルケン又はテルペンを過酸化水素及びペルオキシゲナーゼと接触させることを含み；前記ペルオキシゲナーゼは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が、モチーフ：Ｅ−Ｈ−Ｄ−［Ｇ，Ａ］−Ｓ−［Ｌ，Ｉ］−Ｓ−Ｒ（配列番号２１）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペルオキシゲナーゼが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の同一性、より好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、極めて好ましくは少なくとも９０％の同一性、とりわけ少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれから構成される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ペルオキシゲナーゼが、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性、より好ましくは少なくとも７０％の同一性、より好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、極めて好ましくは少なくとも９０％の同一性、とりわけ少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれから構成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ペルオキシゲナーゼが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０のアミノ酸配列；又はペルオキシゲナーゼ活性を有するその断片を含むか、又はそれから構成される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ペルオキシゲナーゼが、配列番号１のアミノ酸配列；又はペルオキシゲナーゼ活性を有するその断片を含むか、又はそれから構成される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記脂肪族アルケンが、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、ニトロ、シアノ、チオール、スルホニル、ホルミル、アセチル、メトキシ、エトキシ、カルバモイル及びスルファモイルからなる群から選択される１つ又は複数の置換基を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記置換基が、クロロ、ヒドロキシル、カルボキシル及びスルホニル；特に、クロロ及びカルボキシルからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記脂肪族アルケンが、少なくとも３つの炭素からなり、一方の末端に炭素−炭素二重結合を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記脂肪族アルケンが、プロペン、ブテン、ペンテン、ヘキセン、ヘプテン、オクテン、ノネン、デセン、ウンデセン、ドデセン、トリデセン、テトラデセン、ペンタデセン若しくはヘキサデセン、又はこれらの異性体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記脂肪族アルケンが、プロペン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン、２−ヘキセン、３−ヘキセン、１−ヘプテン、１−オクテン、２−メチル−２−ブテン、２，３−ジメチル−２−ブテン、シス／トランス−２−ブテン、イソブテン、１，３−ブタジエン、及びイソプレン；又はこれらの異性体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記脂肪族アルケンが、置換されていない、請求項１〜６又は９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記脂肪族アルケンが、直鎖状である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記テルペンが、イソプレン又はモノテルペンであり；好ましくは前記テルペンが、環状テルペン、例えば、リモネンなどの単環式モノテルペンである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
非環式脂肪族アルケン、又はテルペンのエポキシ化のためのペルオキシゲナーゼの使用であって、前記ペルオキシゲナーゼが、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、コンピュータで読み取り可能な書式での配列表を含む。このコンピュータで読み取り可能な書式は、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
本発明は、非環式脂肪族アルケン、又はテルペンのエポキシ化のためのペルオキシゲナーゼの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ハラタケ類担子菌（ａｇａｒｉｃ ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅ）株アグロキベ・アエゲリタ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ  ａｅｇｅｒｉｔａ）（ＴＭ−Ａ１株）由来のＡａＰと称するペルオキシゲナーゼは、アリールアルコール及びアルデヒドを酸化することが判明した。ＡａＰペルオキシゲナーゼは、アグロキベ・アエゲリタ（Ａ．ａｅｇｅｒｉｔａ）ＴＭ  Ａ１から、数ステップのイオンクロマトグラフィーにより精製され、分子量がＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定され、二次元電気泳動の後、Ｎ末端の１４アミノ酸配列が決定されたが、コード遺伝子は単離されなかった（Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０（８）：４５７５−４５８１)。
【０００４】
国際公開第２００６／０３４７０２号パンフレットは、アグロキベ・アエゲリタ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ  ａｅｇｅｒｉｔａ）ＴＭ  Ａ１のＡａＰペルオキシゲナーゼ酵素を用いた、ナフタレン、トルオール及びシクロヘキサンなどの不活性化炭化水素の酵素加水分解の方法を開示している。これは、Ｕｌｌｒｉｃｈ及びＨｏｆｒｉｃｈｔｅｒ，２００５，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５７９：６２４７−６２５０にも記載されている。
【０００５】
国際公開第２００８／１１９７８０号パンフレットは、アグロキベ・アエゲリタ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ  ａｅｇｅｒｉｔａ）、ウシグソヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ  ｃｉｎｅｒｅａ）、オオキツネタケ（Ｌａｃｃａｒｉａ ｂｉｃｏｌｏｒ）及びコキララタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ ｒａｄｉａｎｓ）由来の８つの異なるペルオキシゲナーゼを開示している。
【０００６】
独国特許出願公開第１０３  ３２  ０６５Ａ１号明細書は、アグロキベ・アエゲリタ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ  ａｅｇｅｒｉｔａ）ＴＭ  Ａ１のＡａＰペルオキシゲナーゼ酵素を用いたアルデヒドの中間形成による、アルコールからの酸の酵素調製の方法を開示している。
【０００７】
ＡａＰペルオキシゲナーゼによる迅速かつ選択的分光光度直接検出の方法が報告されている（Ｋｌｕｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７５：１４７３−１４７８）。
【０００８】
有機分子への酸素機能の直接位置選択的導入（酸素処理）が、化学合成において問題となることはよく知られている。生成物は、極めて多様な各種合成に重要な中間体として用いることができる。
【０００９】
細胞内酵素、メタンモノオキシゲナーゼ（ＭＭＯ、ＥＣ１４．１３．２５）は、ある炭化水素の末端炭素を酸化／ヒドロキシル化することが知られている。ＭＭＯ酵素は、数個のタンパク質成分からなり、唯一メチロトローフ細菌（例えば、メチロコッカス・カプスラタス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ））により形成され；これは、ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨなどの複合電子供与体、補助タンパク質（フラビンレダクターゼ、調節タンパク質）及び分子状酸素（Ｏ2）を必要とする。ＭＭＯの天然基質はメタンであり、これは酸化されてメタノールになる。特に非特異的な生体触媒として、ＭＭＯは、メタンと同様に、さらに別の一連の基質、例えば、ｎ−アルカン及びその誘導体、シクロアルカン、芳香族化合物、一酸化炭素並びに複素環も酸化／ヒドロキシル化する。ほとんどの細胞内酵素と同様に単離するのが難しく、低安定性で、しかも、必要な補基質が比較的高価であることから、生物工学でのこの酵素の使用は現在不可能である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
第１の態様において、本発明の発明者らは、エポキシドを生成する酵素法を提供し、これは、非環式脂肪族アルケン、又はテルペンを過酸化水素及びペルオキシゲナーゼと接触させることを含み；ここで、ペルオキシゲナーゼは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、上記アミノ酸配列は、モチーフ：Ｅ−Ｈ−Ｄ−［Ｇ，Ａ］−Ｓ−［Ｌ，Ｉ］−Ｓ−Ｒを含む。
【００１１】
定義
ペルオキシゲナーゼ活性：「ペルオキシゲナーゼ活性」という用語は、ＥＣ１．１１．２．１に拠る、「非特異的ペルオキシゲナーゼ」活性を意味し、Ｈ2Ｏ2から様々な基質（例えば、ニトロベンゾジオキソール）への酸素原子の挿入を触媒する。本発明の目的のために、ペルオキシゲナーゼ活性は、Ｍ．Ｐｏｒａｊ−Ｋｏｂｉｅｌｓｋａ，Ｍ．Ｋｉｎｎｅ，Ｒ．Ｕｌｌｒｉｃｈ，Ｋ．Ｓｃｈｅｉｂｎｅｒ，Ｍ．Ｈｏｆｒｉｃｈｔｅｒ，“Ａ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｇａｌ  ｐｅｒｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ”，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１２），ｖｏｌ．４２１，ｉｓｓｕｅ  １，ｐｐ．３２７−３２９に記載されている手順に従い決定する。
【００１２】
本発明のペルオキシゲナーゼは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０の成熟ポリペプチドのペルオキシゲナーゼ活性の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、またさらに好ましくは少なくとも１００％を有する。
【００１３】
成熟ポリペプチド：「成熟ポリペプチド」という用語は、本明細書において、翻訳、及びＮ末端処理、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化などの任意の翻訳後修飾後のその最終形態である、ペルオキシゲナーゼ活性を有するポリペプチドとして定義される。好ましい態様では、成熟ポリペプチドは、ＡａＰペルオキシゲナーゼ酵素の成熟タンパク質の開始を明らかにする、Ｎ末端ペプチドシーケンシングデータ（Ｕｌｌｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７０（８）：４５７５−４５８１）に基づき、配列番号１の１〜３２８位に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１４】
同一性：２つのアミノ酸配列又は２つのヌクレオチド配列同士の関連性をパラメータ「同一性」によって表す。
【００１５】
本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列同士の同一性度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ(ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６：２７６−２７７；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ)のＮｅｅｄｌｅプログラムに組み込まれた、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３)を用いて決定する。使用する任意選択のパラメータは、ギャップ開始ペナルティ：１０、ギャップ伸長ペナルティ：０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）のアウトプットを同一性（％）として用い、以下のように計算する。
（同一残基×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）
【００１６】
本発明の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列同士の同一性度は、好ましくはバージョン３．０．０以降のＥＭＢＯＳＳパッケージ(ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，前掲；ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｏｒｇ)のＮｅｅｄｌｅプログラムに組み込まれた、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，１９７０，前掲)を用いて決定する。使用する任意選択のパラメータは、ギャップ開始ペナルティ：１０、ギャップ伸長ペナルティ：０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換行列である。Ｎｅｅｄｌｅ標識「最長同一性」（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）のアウトプットを同一性（％）として用い、以下のように計算する。
（同一デオキシリボヌクレオチド×１００）／（アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）
【００１７】
修飾：「修飾」という用語は、本明細書において、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０；又はその相同性配列の成熟ポリペプチドからなるポリペプチドのあらゆる化学的改変；並びにこのようなポリペプチドをコードするＤＮＡの遺伝子操作を意味する。修飾は、１つ若しくは複数（数個）のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入、並びに１つ又は複数（数個）のアミノ酸側鎖の置換であってよい。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ペルオキシゲナーゼ
本発明は、ペルオキシゲナーゼ活性を有する、好ましくは組換えにより生成されるポリペプチド（「ペルオキシゲナーゼ」と呼ぶ）を用いたエポキシ化の方法に関し、上記ペルオキシゲナーゼは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０；好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも６０％の同一性、好ましくは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれから構成される。
【００１９】
好ましい実施形態では、ペルオキシゲナーゼは、モチーフ：Ｅ−Ｈ−Ｄ−［Ｇ，Ａ］−Ｓ−［Ｌ，Ｉ］−Ｓ−Ｒによって表されるアミノ酸配列（配列番号２１）を含む。
【００２０】
また別の実施形態において、第１態様のポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０；好ましくは配列番号１のアミノ酸配列；又はペルオキシゲナーゼ活性を有するその断片を含むか、又はそれから構成され；好ましくは、ポリペプチドは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０；好ましくは配列番号１の成熟ポリペプチドを含むか、又はそれから構成される。
【００２１】
好ましくは、アミノ酸変化は軽度の性質のもの、すなわち、タンパク質のフォールディング及び／若しくは活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換又は挿入；典型的には１〜約３０個のアミノ酸の微小な欠失；アミノ末端メチオニン残基などの微細なアミノ末端若しくはカルボキシル末端延伸；約２０〜２５残基までの微細なリンカーペプチド；又は、正味電荷若しくは別の機能を変化させることにより精製を容易にする、例えば、ポリヒスチジン配列、抗原エピトープ若しくは結合ドメインなどの微細な延伸である。
【００２２】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、並びに微小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）からなる群に含まれる。一般に比活性を変化させないアミノ酸置換は、当分野において公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ及びＲ．Ｌ．Ｈｉｌｌにより、１９７９年、Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。最も一般的に起こる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００２３】
２０の標準的なアミノ酸に加えて、非標準的アミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、６−Ｎ−メチルリシン、２−アミノイソ酪酸、イソバリン、及びα−メチルセリン）を野生型ポリペプチドのアミノ酸残基と置換してもよい。遺伝子コードによってコード化されていない限定数の非保守的なアミノ酸、及び非天然アミノ酸をアミノ酸残基と置換してもよい。「非天然アミノ酸」は、タンパク質合成後に修飾されている、及び／又は標準アミノ酸の化学構造と異なる化学構造をそれらの側鎖に有している。非天然アミノ酸は化学的に合成することが可能であり、好ましくは市販されているもので、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、３−及び４−メチルプロリン、並びに３，３−ジメチルプロリンが挙げられる。
【００２４】
あるいは、アミノ酸変化は、ポリペプチドの物理−化学的特性を改変するような性質のものである。例えば、アミノ酸変化により、ポリペプチドの熱的安定性の改善、基質特異性の改変、最適ｐＨの変更などが可能である。
【００２５】
親ポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発（ａｌａｎｉｎｅ−ｓｃａｎｎｉｎｇ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ及びＷｅｌｌｓ、１９８９、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４４：１０８１−１０８５）などの当分野において公知の手順に従い同定することができる。後者の技術においては、単一アラニン突然変異が分子のあらゆる残基で導入され、その結果得られた突然変異分子の生物活性（即ち、ペルオキシゲナーゼ活性）を試験して分子の活性に不可欠なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８もまた参照のこと。酵素又はその他の生物相互作用の活性部位は、推定接触部位のアミノ酸の突然変異と併せて、核磁気共鳴、結晶学、電子線回折、又は光親和性標識などの技術によって決定されるように、構造の物理分析によっても決定することが可能である。例えば、ｄｅ Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９２、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。本発明によるポリペプチドに関連するポリペプチドとの同一性の分析から、必須アミノ酸の同一性を推定することもまた可能である。
【００２６】
単一若しくは複数のアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入は、突然変異誘発、組換え、及び／又はシャッフリングなどの既知の方法に続いて、関連するスクリーニング方法、例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ及びＳａｕｅｒ，１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ及びＳａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；又は国際公開第９５／２２６２５号パンフレットに開示されているものを用いて実施し、試験することできる。用いることのできるその他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージディスプレイ法（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、及び位置指定突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，ＤＮＡ７：１２７）が挙げられる。
【００２７】
突然変異誘発／シャッフリング方法を、ハイスループット、自動化スクリーニング方法と組み合わせて、宿主細胞によって発現される、クローン化し、突然変異したポリペプチドの活性を検出することができる（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコード化する活性突然変異したＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、当分野で標準的方法を用いて迅速に配列決定することができる。これらの方法により、対象とするポリペプチドにおける個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定することが可能となり、未知構造のポリペプチドに適用することができる。
【００２８】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０；好ましくは配列番号１の成熟ポリペプチドのアミノ酸の置換、欠失、及び／又は挿入の総数は、１０、好ましくは９、より好ましくは８、より好ましくは７、より好ましくは最大でも６、より好ましくは５、より好ましくは４、さらにより好ましくは３、非常に好ましくは２、さらに極めて好ましくは１である。
【００２９】
過酸化水素
ペルオキシゲナーゼに必要な過酸化水素は、過酸化水素の水溶液又は過酸化水素のｉｎ  ｓｉｔｕ生成のための過酸化水素前駆体として用意してよい。溶解時に、ペルオキシゲナーゼによる使用が可能な過酸化物を遊離する任意の固体の実体を、過酸化水素の供給源として使用することができる。水又は適切な水性媒質中への溶解時に過酸化水素をもたらす化合物としては、限定するものではないが、過酸化金属、過炭酸塩、過硫酸塩、過リン酸塩、過酸、アルキルペルオキシド、アシルペルオキシド、ペルオキシエステル、過酸化尿素、過ホウ酸塩及びペルオキシカルボン酸又はこれらの塩が挙げられる。
【００３０】
別の過酸化水素の供給源としては、オキシダーゼとオキシダーゼの基質の組合せなどの、過酸化水素生成酵素系がある。オキシダーゼと基質の組合せの例としては、限定するものではないが、アミノ酸オキシダーゼ（例えば、米国特許第６，２４８，５７２５号明細書など）と好適なアミノ酸、グルコースオキシダーゼ（例えば、国際公開第９５／２９９９６号パンフレットを参照）とグルコース、乳酸オキシダーゼと乳酸塩、ガラクトースオキシダーゼ（例えば、国際公開第００／５０６０６号パンフレットを参照）とガラクトース、並びにアルドースオキシダーゼ（例えば、国際公開第９９／３１９９０号パンフレットを参照）と好適なアルドースが挙げられる。
【００３１】
当業者であれば、ＥＣ１．１．３．＿、ＥＣ１．２．３．＿、ＥＣ１．４．３．＿、ＥＣ１．５．３．＿又は類似のクラス（国際生化学連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の下で）を調べることによって、このようなオキシダーゼと基質の組合せの他の例を容易に認識されよう。
【００３２】
ペルオキシゲナーゼ取得のために使用することのできる別の酸化体は、アスコルビン酸、デヒドロアスコルビン酸、ジヒドロキシフマル酸又はシステインなどの好適な水素供与体と組み合わせた酸素であってよい。このような酸素水素供与体系の１例が、Ｐａｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，（１９９９）ｖｏｌ．６２，ｉｓｓｕｅ  ４，ｐｐ．４８９−４９３に記載されている。
【００３３】
過酸化水素又は過酸化水素源は、本発明の方法の開始時、又はその最中に、例えば、過酸化水素の１回又は複数回の個別の添加として；あるいは、フェドバッチ添加として連続的に、添加してよい。過酸化水素の典型的量は、０．００１ｍＭ〜２５ｍＭのレベル、好ましくは０．００５ｍＭ〜５ｍＭのレベル、特に０．０１〜１ｍＭ又は０．０２〜２ｍＭ過酸化水素のレベルに相当する。過酸化水素はまた、０．１ｍＭ〜２５ｍＭのレベル、好ましくは０．５ｍＭ〜１５ｍＭのレベル、より好ましくは１ｍＭ〜１０ｍＭのレベル、最も好ましくは２ｍＭ〜８ｍＭ過酸化水素のレベルに相当する量で用いてもよい。
【００３４】
界面活性剤
本発明の方法は、界面活性剤（例えば、洗浄剤又は湿潤剤の一部として）の使用を含んでもよい。使用するのに好適な界面活性剤は、ノニオン（半極性を含む）、アニオン、カチオン及び／又は双性イオン性であってよく；好ましくは、界面活性剤は、アニオン性（例えば、直鎖アルキルベンゼンスルホネート、α−オレフィンスルホネート、アルキル硫酸（高級アルコール硫酸エステル塩）、アルコールエトキシ硫酸塩、第２アルカンスルホネート、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−若しくはアルケニルコハク酸又はセッケン）又はノニオン性（例えば、アルコールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、ポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド、又はグルコサミンのＮ−アシルＮ−アルキル誘導体（「グルコサミド」）など）、あるいはこれらの混合物である。
【００３５】
本発明の方法に含まれる場合、界面活性剤の濃度は、通常、約０．０１重量％〜約１０重量％、好ましくは約０．０５重量％〜約５重量％、より好ましくは約０．１重量％〜約１重量％である。
【００３６】
脂肪族アルケン
本発明の方法でエポキシ化される脂肪族アルケン（不飽和脂肪族炭化水素）は、非環式脂肪族アルケンで、これは直鎖又は分枝状であり；置換されているか、又は置換されていない。好ましくは、脂肪族アルケンは置換されていない。分枝状アルケンは、直鎖状アルケンの異性体に相当する。
【００３７】
一実施形態において、非環式脂肪族アルケンは、少なくとも３個の炭素を有する。別の実施形態では、脂肪族アルケンは、一方の末端で、炭素−炭素二重結合（不飽和炭素）を有する。
【００３８】
好ましくは、脂肪族アルケンは、プロペン、ブテン、ペンテン、ヘキセン、ヘプテン、オクテン、ノネン、デセン、ウンデセン、ドデセン、トリデセン、テトラデセン、ペンタデセン若しくはヘキサデセン、又はこれらの異性体である。より好ましくは、脂肪族アケン（ａｋｅｎｅ）は、プロペン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン、２−ヘキセン、３−ヘキセン、１−ヘプテン、１−オクテン、２−メチル−２−ブテン、２，３−ジメチル−２−ブテン、シス／トランス−２−ブテン、イソブテン、１，３−ブタジエン、及びイソプレン；又はこれらの異性体である。
【００３９】
脂肪族アルケンを置換する（官能基を結合する）場合、好ましい置換基は、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、ニトロ、シアノ、チオール、スルホニル、ホルミル、アセチル、メトキシ、エトキシ、カルバモイル及びスルファモイルであり；より好ましい置換基は、クロロ、ヒドロキシル、カルボキシル、及びスルホニルであり；最も好ましい置換基は、クロロ及びカルボキシルである。
【００４０】
脂肪族アルケンは、最大１０個置換基、最大８つの置換基、最大６つの置換基、最大４つの置換基、最大２つの置換基、又は最大１つの置換基で置換してよい。
【００４１】
テルペン
本発明の方法でエポキシ化されるテルペンとしては、イソプレン、及び多数のイソプレン構造を有する化合物が挙げられる。また、本発明のテルペンには、テルペノイドも含まれる。
【００４２】
テルペンは、モノテルペン（２つのイソプレン単位）、セスキテルペン（３つのイソプレン単位）、ジテルペン（４つのイソプレン単位）、トリテルペン（６つのイソプレン単位）、テトラテルペン（８つのイソプレン単位）等々に細分することができる。テルペンは、単環式、二環式、三環式等々であってよい。
【００４３】
モノテルペンの例としては、ゲラニオール（バラ油）及び単環式モノテルペン、例えば、（−）−メントール（ペパーミント油）、Ｒ−（＋）−カルボン（キャロウェイ（ｃａｒｏｗａｙ）油）、Ｓ−（−）−カルボン（スペアミント油）、Ｒ−（＋）−リモネン（オレンジ油）、及びＳ−（−）−リモネン（パイン油の香り）が挙げられる。
【００４４】
本発明のテルペンは、イソプレン又はモノテルペンであるのが好ましく；より好ましくは、テルペンは、環式テルペンであり、例えば、リモネンなどの単環式モノテルペンである。
【００４５】
テルペン及びリモネンなどの環式テルペンは、広く天然に存在する。リモネンは、最も豊富に天然に存在する一般的テルペンであり、３００種を超える植物によって産生され、柑橘類果皮油の主成分である。リモネンのエポキシ化は、それが芳香剤及び薬剤の合成の基礎となることから、特に有意である。ペルオキシゲナーゼは、環位置及び側鎖の両方でリモネンをエポキシ化するが、主として環位置の方が好ましい（実施例１）。
【００４６】
方法及び使用
本発明は、非環式脂肪族アルケン、又はテルペンからエポキシドを生成する方法（非環式脂肪族アルケン又はテルペンのエポキシ化の方法）を提供し、これは、脂肪族アルケン、又はテルペンをペルオキシゲナーゼ及び過酸化水素と接触させることを含む。従って、本発明は、炭素−炭素二重結合での脂肪族アルケン又はテルペンの酸化により、非環式脂肪族アルケン、又はテルペンをエポキシドに変換する方法を提供する。
【００４７】
脂肪族アルケンは、少なくとも３個の炭素を含む。好ましくは、脂肪族アルケンは、一方の末端に炭素−炭素二重結合（不飽和炭素）を有する。
【００４８】
従って、第１の態様では、本発明は、非環式脂肪族アルケン、又はテルペンを過酸化水素及びペルオキシゲナーゼと接触させることを含む、エポキシドの生成方法を提供し、前記ペルオキシゲナーゼは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。脂肪族アルケンは、置換されていても、置換されていなくてもよく、直鎖又は分枝状のいずれであってもよい。
【００４９】
一実施形態において、上記アミノ酸配列は、モチーフ：Ｅ−Ｈ−Ｄ−［Ｇ，Ａ］−Ｓ−［Ｌ，Ｉ］−Ｓ−Ｒを含む。
【００５０】
一実施形態において、ペルオキシゲナーゼは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０；好ましくは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性、好ましくは少なくとも７０％の同一性、より好ましくは少なくとも７５％の同一性、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、より好ましくは少なくとも８５％の同一性、極めて好ましくは少なくとも９０％の同一性、特に少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、又はそれから構成される。好ましい実施形態において、ペルオキシゲナーゼは、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０；好ましくは配列番号１のアミノ酸配列；又はペルオキシゲナーゼ活性を有するその断片を含むか、又はそれから構成される。
【００５１】
一実施形態において、テルペンは、イソプレン又はモノテルペンであり；好ましくは、テルペンは、環状テルペン、例えば、リモネンなどの単環式モノテルペンである。
【００５２】
別の実施形態において、脂肪族アルケンは、ハロゲン、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、ニトロ、シアノ、チオール、スルホニル、ホルミル、アセチル、メトキシ、エトキシ、カルバモイル及びスルファモイルからなる群から選択される１つ又は複数の置換基を有する。好ましくは、上記の置換基は、クロロ、ヒドロキシル、カルボキシル、及びスルホニルであり；とりわけ、クロロ及びカルボキシルからなる群から選択される。
【００５３】
別の実施形態において、脂肪族アルケンは、少なくとも３つの炭素からなり、一方の末端に炭素−炭素二重結合を有する。
【００５４】
別の実施形態において、脂肪族アルケンは、プロペン、ブテン、ペンテン、ヘキセン、ヘプテン、オクテン、ノネン、デセン、ウンデセン、ドデセン、トリデセン、テトラデセン、ペンタデセン若しくはヘキサデセン、又はこれらの異性体である。より好ましい実施形態において、脂肪族アルケンは、プロペン、１−ブテン、１−ペンテン、１−ヘキセン、２−ヘキセン、３−ヘキセン、１−ヘプテン、１−オクテン、２−メチル−２−ブテン、２，３−ジメチル−２−ブテン、シス／トランス−２−ブテン、イソブテン、１，３−ブタジエン、及びイソプレン；又はこれらの異性体である。
【００５５】
別の実施形態において、脂肪族アルケンは置換されていない。
【００５６】
別の実施形態において、脂肪族アルケンは直鎖状である。
【００５７】
本発明の方法により生成することができる、好ましいエポキシドとしては、限定しないが、以下のものが挙げられる：プロピレンオキシド（１，２−エポキシプロパン）及びエポキシテルペン（エポキシテルペノイドを含む）、例えばリモネンオキシド；並びに２−メチルオキシラン、２−エチルオキシラン、２−プロピルオキシラン、２−ブチルオキシラン、２−ペンチルオキシラン、２−ヘキシルオキシラン、２，２，３−トリメチルオキシラン、２，２，３，３−テトラメチルオキシラン、（２Ｓ，３Ｓ）−２，３−ジメチルオキシラン、（２Ｒ，３Ｓ）−２，３−ジメチルオキシラン、２，２−ジメチルオキシラン、２−メチル−２−（４−メチルシクロヘキス−３−エン−１−イル）オキシラン、２−メチル−２−（４−メチルシクロヘキス−３−エン−１−イル）オキシラン、２−エテニルオキシラン、２−エテニル−２−メチルオキシラン、２−メチル−３−プロピルオキシラン、及び２，３−ジエチルオキシラン。
【００５８】
本発明の方法は、バルク化学合成（生物触媒作用）など、様々な目的のために用いることができる。アルケンは、ペルオキシゲナーゼにより効率的にエポキシ化される。プロピレンオキシドは、高度に反応性の物質であり、最も重要な化学的中間体の１つである。これは、ポリマー（ポリウレタン、ポリエステル）、酸化溶媒（プロピレングリコールエーテル）及び工業用流体（モノプロピレングリコール及びポリグリコール）など、多様な物質のための出発材料である。年間６，５００，０００ＭＴが生産される。分枝状アルケンなど、他のより長い鎖のアルケン（ブテン及びイソブテンなど）も同様にエポキシ化される。
【００５９】
エポキシドの重合によりポリエーテルが得られ、例えば、エチレンオキシドが重合すると、ポリエチレングリコール（ポリエチレンオキシドとしても知られる）が得られる。
【００６０】
本発明の方法は、固定化ペルオキシゲナーゼを用いて実施してもよい。
【００６１】
本発明の方法は、水性溶媒（反応媒体）、各種アルコール、エーテル、その他の極性若しくは非極性溶媒、又はこれらの混合物中で実施することができる。当業者であれば、本発明の方法に用いる脂肪族炭化水素の特徴を調べることにより、好適な溶媒例を容易に認識する。酸化を実施する圧力を増加又は減少させることにより、溶媒（反応媒体）及び脂肪族炭化水素を反応温度で液相に維持することができる。
【００６２】
本発明の方法は、０〜９０℃、好ましくは５〜８０℃、より好ましくは１０〜７０℃、さらに好ましくは１５〜６０℃、極めて好ましくは２０〜５０℃、とりわけ２０〜４０℃の温度で実施してよい。
【００６３】
本発明の方法は、１０秒〜（少なくとも）２４時間、好ましくは１分〜（少なくとも）１２時間、より好ましくは５分〜（少なくとも）６時間、極めて好ましくは５分〜（少なくとも）３時間、とりわけ５分〜（少なくとも）１時間の処理時間を使用してよい。
【００６４】
以下の実施例により、本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例】
【００６５】
アグロキベ・アエゲリタ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ  ａｅｇｅｒｉｔａ）由来のペルオキシゲナーゼのアミノ酸配列を配列番号１に示す。
【００６６】
実施例１
真菌類ペルオキシゲナーゼにより触媒されるアルケンエポキシ化
試薬
市販の化学薬品は、Ａｃｒｏｓ  Ｏｒｇａｎｉｃｓから購買した２，３−エポキシ−２−メチルブタンを除いて、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＴＣｌ  Ｅｕｒｏｐｅ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｓ  ＧｍｂＨから購入した。アグロキベ・アエゲリタ（Ａｇｒｏｃｙｂｅ  ａｅｇｅｒｉｔａ）（野生型、イソ型ＩＩ、４４ｋＤａ）の細胞外ペルオキシゲナーゼを生成し、以前記載されているように精製した。酵素調製物は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により均質であり、Ａ418／Ａ280比１．８６を呈示した。ペルオキシゲナーゼの比活性は、６３Ｕ／ｍｇであり、ここで、１Ｕは、２３℃で１分にわたる１μモルの３，４−ジメトキシベンジルアルコールの３，４−ジメトキシベンズアルデヒドへの酸化を表す。
【００６７】
反応条件
典型的反応混合物（総量：０．２ｍｌ；気体状アルケンの場合は１．２ｍｌ）は、以下を含んだ：リン酸カリウムバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）中に溶解させた精製ペルオキシゲナーゼ（１〜２Ｕｍｌ-1、０．３８〜０．７６μＭ）、アセトン（６０％、ｐＨ５．３）、及びアルケン基質（５％ｖｏｌ／ｖｏｌ；但し、＋／−リモネンの場合には、５ｍＭの基質を用いた）。シリンジポンプ（４ｍＭ／時、但し、２−メチル−２−ブテン及び２，３−ジメチル−２−ブテンの場合には、２ｍＭ／時を用いた）を用いたＨ2Ｏ2の添加により、反応を開始し、室温で３０分撹拌した後、クロマトグラフィー分析が、生成物の形成が完了したことを示した時点で停止した。気体状プロペン及びｎ−ブテンを同じ条件下で処理したが、反応バイアル中に純ガスを連続的にバブリングする（約１ｌ／時）ことにより実施した。激しく振盪することにより、反応混合物をヘキサン（０．１ｍｌ）で抽出した。
【００６８】
生成物同定
Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ５９７３質量分析計とＺＢ−Ｗａｘプラスキャピラリーカラム（直径２５０μｍ、長さ３０ｍ、膜厚０．２５μｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を取り付けたＨｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ６８９０クロマトグラフを用いたＧＣにより、反応生成物を分析した。分析のために、１μｌのヘキサン抽出物をＧＣ装置に注入した。分析対象物に応じた様々な温度プロフィールを用いて、ＧＣを実施した。プロペン：３０℃を２分保持；１−ブテン：３５℃を３．５分保持し、３０℃／分で１００℃まで；１−ペンテン：５０℃を３．５分保持し、４０℃／分で１１５℃まで；１−ヘキセン、２−ヘキセン及び３−ヘキセン：７０℃を３．５分保持し、４０℃／分で１３５℃まで；１−ヘプテン：９０℃を３．５分保持し、４０℃／分で１４５℃まで；１−オクテン：１１０℃を３．５分保持し、２０℃／分で１２０℃まで；＋／−リモネン：７０℃、５℃／分で１２５℃まで、次に３０℃／分で２３０℃まで；シス／トランス−２−ブテン、イソブテン及び１，３−ブタジエン：３５℃を１０分保持；シクロペンテン及びシクロヘプテン：４５℃を３分保持し、２０℃／分で２５０℃まで；イソプレン：４５℃を５分保持し、１０℃／分で１００℃まで。いずれの場合も、ヘリウムがキャリアガスであり、カラム流量：１．５ｍｌ／分とした。生成物は、その保持時間及び／又は７０ｅＶでの電子衝撃ＭＳにより、真正標準に対して同定した。
【００６９】
キラル分離
前述と同じであるが、Ｂｅｔａ  ＤＥＸ（商標）１２０キャピラリーカラム（直径２５０μｍ、長さ３０ｍ、膜厚０．２５μｍ、Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｂｅｌｌｅｆｒｏｎｔｅ，ＰＡ，ＵＳＡ）を取り付けた装置を用いて、ＧＣ／ＭＳによりエポキシドのキラル分離を実施した。ＧＣは、様々な温度プロフィールを用いて実施した。１−ヘキセン：４５℃を２０分保持；１−ヘプテン：４５℃を３７分保持；１−オクテン：５５℃を４６分保持；１−オクチン：４５℃を２分保持し、１０℃／分で１５５℃まで。生成物は、その保持時間及び７０ｅＶでの電子衝撃ＭＳにより、真正標準に対して同定した。
【００７０】
生成物の定量
それぞれの真正標準の外標準曲線を用いて、前述のようなＧＣ／ＭＳにより、反応生成物の定量分析を実施した。全ての標準曲線が、Ｒ2＞０．９８の線形回帰値を有していた。
【００７１】
結果
【００７２】
【表１】
2015516804.tif 000002
【００７３】
【表２】
2015516804.tif 000003
【００７４】
【表３】
2015516804.tif 000004
【００７５】
実施例２
様々な真菌類ペルオキシゲナーゼを用いた１−オクテンのエポキシ化
表２に示すペルオキシゲナーゼを実施例２で用いた。
【００７６】
【表４】
2015516804.tif 000005
【００７７】
蓋をした２ｍＬＨＰＬＣガラスバイアルにおいて、次の条件で反応を実施した：８００μＬの総反応容量中、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．５、２０％ｖ／ｖアセトニトリル、１ｍＭ１−オクテン、０．０１ｍｇ／ｍＬペルオキシゲナーゼ（表３を参照）、１ｍＬ過酸化水素。室温（約２５℃）で反応混合物をマグネットにより３０分撹拌した後、５μＬのカタラーゼ（Ｔｅｒｍｉｎｏｘ  Ｕｌｔｒａ  ５０Ｌ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）を添加することにより反応を停止した。
【００７８】
０．０１％ｗ／ｖＢＨＴ（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール）を含有する７６０μＬの酢酸エチルと混合することにより、サンプルを抽出した。Ａｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ  ＣＡ，ＵＳＡ）製のオートサンプラー（モデル７６９３Ａ）及び質量選択検出器（モデル５９７５Ｃ）を備えたガスクロマトグラフ（モデル７８９０Ａ）でのＧＣ−ＭＳにより、酢酸エチル抽出物を次のように分析した：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｔｏｒｒａｎｃｅ  ＣＡ，ＵＳＡ）製のＺｅｂｒｏｎ  ＤＢ−５ＨＴ  Ｉｎｆｅｒｎｏカラム（１５ｍ、２５０μｍ、０．２５μｍ）にスプリットモード（１０：１）でサンプルを注入し、下記の温度プログラムを用いて、１．１ｍＬ／分のヘリウムで溶出した：４５℃（１分）、１０℃／分で４５〜７５℃、４０℃／分で７５〜２７５℃、及び２７５℃（１分）。質量検出器を走査モードで操作し、Ｔｏｔａｌ  Ｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔ（ＴＩＣ）クロマトグラムを用いて、基質及び生成物ピークの面積を決定した。ピークは、マススペクトルを、ＧＣソフトウエア（ＮＩＳＴ  ＭＳ検索バージョン２．０）で入手可能なマススペクトルライブラリーからのスペクトルと比較することにより同定した。内標準としてＢＨＴ（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール）を用いた真正化合物での外部校正により、基質及び生成物濃度を決定した。
【００７９】
１−オクテン（基質）の１，２−エポキシオクタン（生成物）への酵素変換を表３に示す。１−オクテンの揮発性のために、基質のかなりの部分が、反応工程で蒸発により消失した。
【００８０】
【表５】
2015516804.tif 000006
【００８１】
実施例３
フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属ペルオキシゲナーゼを用いた様々なアルケンのエポキシ化
蓋をした２ｍＬＨＰＬＣガラスバイアルにおいて、次の条件で反応を実施した：総反応容量８００μＬ中、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．５、２０％ｖ／ｖアセトニトリル、１ｍＭ基質（表４参照）、０．０１ｍｇ／ｍＬのペルオキシゲナーゼ３（実施例２を参照）、１ｍＬ過酸化水素。室温（約２５℃）で反応混合物をマグネットにより３０分撹拌した後、５μＬのカタラーゼ（Ｔｅｒｍｉｎｏｘ  Ｕｌｔｒａ  ５０Ｌ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）を添加することにより反応を停止した。
【００８２】
内標準として０．０１％ｗ／ｖＢＨＴ（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール）を含有する７６０μＬの酢酸エチルと混合することにより、サンプルを抽出した。実施例２に記載したＧＣ−ＭＳにより、酢酸エチル抽出物を分析した。真正標準の不足と一部の基質の高い揮発性のために、生成物収率は、基質及び生成物について同じ応答係数を想定して、０．０１％ｗ／ｖＢＨＴ含有の酢酸エチルに溶解した１ｍＭ基質を含む標準サンプルのＡｒｅａ／Ａｉｓｔｄと比較したサンプル中の生成物のＡｒｅａ／Ａｉｓｔｄとして計算した。
【００８３】
【表６】
2015516804.tif 000007
【００８４】
実施例４
フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属ペルオキシゲナーゼを用いたトランス−２−オクテンのエポキシ化
蓋をした２ｍＬＨＰＬＣガラスバイアルにおいて、次の条件下で反応を実施した：最終反応容量８００μＬ中、１０ｍＭリン酸バッファーｐＨ６．５、２０％ｖ／ｖアセトニトリル、２０ｇ／Ｌトランス−２−オクテン、０．１又は０．５ｍｇ／ｍＬのペルオキシゲナーゼ３（実施例２を参照）、１ｍＬ気密ガラスシリンジ（ＳＧＥ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｒｉｎｇｗｏｏｄ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いたマルチチャネルシリンジポンプ（モデル２２０−ＣＥ、Ｗｏｒｌｄ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｉｎｓｔｕｍｅｎｔｓ，Ａｓｔｏｎ，Ｓｔｅｖｅｎａｇｅ，ＵＫ）で、反応工程（２時間）中に添加した１６０μＬの１Ｍ過酸化水素。室温（約２５℃）で反応混合物をマグネットにより２時間撹拌した後、５μＬのカタラーゼ（Ｔｅｒｍｉｎｏｘ  Ｕｌｔｒａ  ５０Ｌ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）を添加することにより反応を停止した。
【００８５】
内標準として０．１％ｗ／ｖＢＨＴ（２，６−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−メチルフェノール）を含有する７８０μＬの酢酸エチルと混合することにより、サンプルを抽出した。酢酸エチル抽出物を、内標準を含まない酢酸エチルで１００倍希釈した後、実施例２に記載したＧＣ−ＭＳにより、この酢酸エチル抽出物を分析した。基質及び生成物について同じ応答係数を想定し、エポキシドの形成を、基質と生成物の面積の和と比較したエポキシドの面積の割合（％）として測定した。
【００８６】
【表７】
2015516804.tif 000008
【配列表】
2015516804000001.app
【国際調査報告】
2015516804.tif 000009
2015516804.tif 000010
2015516804.tif 000011
2015516804.tif 000012
2015516804.tif 000013