(57)【要約】  本発明は、新生児の低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）等の神経障害におけるエステトロール等の或る特定のエストロゲン成分の予防適用及び治療適用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経障害の処置における使用のための、
式（Ｉ）：
【化１】
2015514731.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、各々独立して、水素原子、ヒドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基であり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７の各々はヒドロキシル基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のうちの３つ以下は水素原子である）を有するエストロゲン物質、
前記エストロゲン物質の前駆体であって、該前駆体が、少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が炭素数１〜２５の炭化水素カルボン酸、スルホン酸若しくはスルファミン酸のアシルラジカル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、又は１残基あたり１個〜２０個のグリコシド単位を含有する直鎖若しくは分岐鎖のグリコシド残基によって置換されている、エストロゲン物質の誘導体及び、
１以上の前記エストロゲン物質及び／又は前記前駆体の混合物、
からなる群から選択されるエストロゲン成分。
【請求項２】
Ｒ３がヒドロキシル基又は炭素数１〜５のアルコキシ基を表す、請求項１に記載の使用のためのエストロゲン成分。
【請求項３】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のうちの３つが水素原子を表す、請求項１又は２に記載の使用のためのエストロゲン成分。
【請求項４】
１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１５α，１６α，１７β−テトロール（エステトロール）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのエストロゲン成分。
【請求項５】
前記神経障害の処置が治療的である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のためのエストロゲン成分。
【請求項６】
前記神経障害が、脳損傷、脊髄損傷、及び神経変性疾患を含む群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのエストロゲン成分。
【請求項７】
前記神経障害が、低酸素性脳損傷、無酸素性脳損傷、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、及びパーキンソン病を含む群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のためのエストロゲン成分。
【請求項８】
低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の処置における使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載される使用のためのエストロゲン成分。
【請求項９】
新生児の低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の処置における使用のための、請求項１〜８のいずれか一項に記載される使用のためのエストロゲン成分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学分野に属する。より具体的には、本発明は、エステトロール（１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１５α，１６α，１７β−テトロール）等の或る特定のエストロゲン成分の新たな医学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
神経障害、特に中枢神経系（ＣＮＳ）障害は、とりわけ急性ＣＮＳ損傷（例えば、低酸素性虚血性脳症、脳卒中、外傷性脳損傷、脊髄損傷、脳性麻痺）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭型認知症）、及び多数の中枢神経系機能不全（例えば、鬱、てんかん、及び統合失調症）を含む多くの病気を包含する。
【０００３】
新生児の低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ：Hypoxic-Ischemic Encephalopathy）は、不十分な酸素供給に起因する新生児の脳の細胞に傷害を引き起こす神経障害である。全身性の低酸素症及び脳血流（ＣＢＦ）の低下に起因する脳の低酸素症及び虚血は、新生児において生じる灰白質及び白質の損傷を伴う新生児ＨＩＥをもたらす主要な原因である。新生児ＨＩＥは、新生児期の死亡を引き起こすか、又は発達遅延、精神遅滞、若しくは脳性麻痺（ＣＰ）として後に認められるものを結果的に生じる可能性がある。近年、種々の治療戦略が開発されてきているにもかかわらず、新生児ＨＩＥは、依然として新生児に近い時期又は新生児期における著しい死亡率及び罹患率を引き起こす深刻な状態であり、したがって、今もなお周産期医療に対する挑戦となっている。
【０００４】
過去数年に亘り、ラットの低酸素性虚血性脳傷害モデルは、周産期医学において最も用いられるモデルとなった。産後７日目（Ｐ７；誕生した日をＰ１とする）において、ラットの脳は妊娠３２週目〜３４週目のヒト胎児又は新生児の脳に組織学的に類似する。すなわち、大脳皮質神経層の形成が完了し、胚芽層が退行しており、白質はまだわずかしかミエリン形成をしていない。７日齢の仔ラットにおいて低酸素性虚血性脳傷害を生じるため、一定温度（３７℃）において、ラットを、片方の総頸動脈結紮の後、８％酸素／残部窒素の吸入によりもたらされる全身性の低酸素症に供した（非特許文献１）。
【０００５】
ラットモデルは、周産期低酸素性虚血性脳傷害の根底にある機構、及び治療的介入によりどのようにして組織損傷を予防又は最小化し得るかに関する重要な情報を提供することを証明した。特に、低体温法、キセノン処置及びエリスロポエチン投与を含む可能性のある処置を評価するため、生理的及び治療的な手技が未熟なラットの周産期低酸素性虚血性脳傷害モデルに対して適用されてきた。
【０００６】
有望な神経保護剤としては、抗てんかん薬、エリスロポエチン、メラトニン及びキセノンが挙げられる。仮死の動物モデルによるデータは、低体温法に対して発作後数時間から数日以内に開始するアジュバント療法を追加することによってＨＩＥ後の神経学的予後が改善され得ることを更に示唆する。これらの有望な処置は、直ちに臨床試験で判断される必要がある。例えば、バイオマーカーの結果、例えばリン磁気共鳴分光法を用い、少数の幼児を用いる第Ｉ〜ＩＩ相臨床研究は、実際的な試験に対して新たな処置が行われる以前に安全性及び潜在的な有効性を評価するための鍵である。キセノン及びエリスロポエチンの第Ｉ〜ＩＩ相試験は、既に計画されているか、又は進行中である。
【０００７】
神経障害、特にＣＮＳ損傷又は神経変性疾患の治療法は、脳若しくは脊髄の傷害から保護すること、又は、例えば神経栄養因子を介して神経細胞の活動を回復することに重点をおく場合がある。例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）及びトランスフォーミング成長因子−アルファ（ＴＧＦ−α）等の神経栄養因子は、神経細胞の生存、増殖、分化、大きさ及び機能を多様に支持するポリペプチドである。また、神経障害の処置は、自然な細胞死、損傷又は疾患によるそれらの神経系細胞の脱落を置き換えるための幹細胞の投与も含む場合がある。
【０００８】
かかる神経栄養因子又は幹細胞の投与に見られる問題は、血流からＣＮＳ中への移行を妨げ得る血液脳関門である。したがって、処置は、かかる処置を必要とする被験体のＣＮＳの損傷又は傷害部位への直接的な神経栄養因子の適用又は幹細胞の注入をしばしば必要とする。
【０００９】
一般に神経障害の処置の成功が少ないことを考慮すると、好ましくは侵襲的な頭蓋内の処理又は血液脳関門の通過が改善された物質に頼らない、更なる治療剤及び方法が依然として必要である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Vanucci et al. 2005. Dev Neurosci, vol. 27, 81-86
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、当該技術分野における１又は複数の上述の要求に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
実験の欄に示されるように、本発明者らは、エステトロールにより例証されるように、或る特定のエストロゲン成分が神経保護効果を有することを見出した。例えば、本発明者らは、驚くべきことに、エステトロールを用いて仔ラットを処置することにより低酸素虚血に起因する脳傷害から仔ラットが保護されることを示した。また、とりわけ、低酸素虚血に続いて（すなわち、その後に）エステトロールによって例証される或る特定のエストロゲン成分を用いて仔ラットを処置することによって結果的に脳損傷が少なくなることを示し、これらの化合物が有利な治療効果を呈することを裏付けた。さらに、エステトロールによって例証される或る特定のエストロゲン化合物を用いた仔ラットの処置は、神経発生及び血管新生を促進することが示された。
【００１３】
エステトロール（Ｅ４）は、ヒトの妊娠期間中に胎児肝臓のみにより合成され、胎盤を通して母体循環に到達するエストロゲン様ステロイド物質である。Ｅ４は妊娠９週目と早期から母親の尿中に見出され、妊娠が進むにつれて実質的に増加する（Holinka et al. 2008. J Steroid Biochem Mol Biol, vol. 110, 138-143）。また、非抱合型Ｅ４は、羊水にも見出される。エステトロールは、ヒドロキシル化を介してその前駆体から形成されるエストラジオール（Ｅ２）の主要な代謝産物である。
【００１４】
Ｅ４は、Ｅ２と比較するとエストロゲン受容体結合親和性が低いことから、Ｅ２と比べて効能が弱いとされている。競合的受容体結合の研究は、Ｅ２の親和性結合と比較して核及び細胞質のエストロゲン受容体に対するＥ４の低い親和性結合を明らかにし、それぞれＥ２について１．０及びＥ４について０．０１５の細胞質エストロゲン受容体結合の値を示した（上記Holinka et al.）。Ｅ４は、Ｅ２と比べて培養エストロゲン反応性ＭＣＦ−７細胞の増殖促進において弱いエストロゲンとして作用し、Ｅ２の効能はＥ４よりも５０倍高いことが示された。
【００１５】
Warmerdam et al. 2008（Climacteric, vol. 11 (suppl. 1), 59-63）は、実験の設定に依存する、エステトロールのＰｏｗの対数又は「Ｐｏｗ  Ｌｏｇ」（Ｐｏｗ  Ｌｏｇ＝１．４７又は１．６９５）として表される、化合物の親油性又は親水性特性の尺度であるオクタノール／水分配（Ｐｏｗ）係数を報告した。Ｐｏｗ  Ｌｏｇ  ２．０が化合物を、血液脳関門を通過させるのに最適とされていることから（上記Warmerdam et al. 2008）、新生児ＨＩＥのラットモデルにおけるエステトロールの強い神経保護作用は驚くべきものである。
【００１６】
最近の薬理学的データ及び臨床データは、ホルモン療法、避妊、骨粗しょう症及び更年期の顔面潮紅の予防、がんの治療法、並びに心血管症状の処置又は予防等の用途へのＥ４の臨床的使用の可能性を支持する。我々の知る限り、中枢神経系においてＥ４により例証されるエストロゲン成分の効果は、これまで説明されていない。
【００１７】
したがって一態様では、本発明は、神経障害の処置に使用される、
式（Ｉ）：
【００１８】
【化１】
2015514731.tif 000002
【００１９】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、各々独立して、水素原子、ヒドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基であり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７の各々はヒドロキシル基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のうちの３つ以下は水素原子である）を有するエストロゲン物質、
エストロゲン物質の前駆体、及び、１以上のエストロゲン物質及び／又は前駆体の混合物、
からなる群から選択されるエストロゲン成分を提供する。
【００２０】
好ましくは本発明は、神経障害の処置における使用のための、
式（Ｉ）：
【００２１】
【化２】
2015514731.tif 000003
【００２２】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、各々独立して、水素原子、キドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基であり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７の各々はヒドロキシル基であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４のうちの３つ以下は水素原子である）を有するエストロゲン物質、
エストロゲン物質の前駆体であって、該前駆体が、少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が炭素数１〜２５の炭化水素カルボン酸、スルホン酸若しくはスルファミン酸のアシルラジカル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、又は１残基あたり１個〜２０個のグリコシド単位を含有する直鎖若しくは分岐鎖のグリコシド残基によって置換されている、エストロゲン物質の誘導体、及び、
１以上のエストロゲン物質及び／又は前駆体の混合物、
からなる群から選択されるエストロゲン成分を提供する。
【００２３】
また、本発明は、かかる処置を必要とする患者における神経障害を処置する方法であって、治療的有効量の本明細書に教示されるエストロゲン成分を上記患者に投与することを含む、方法を提供する。
【００２４】
また、本発明は、神経障害の処置用医薬の製造への本明細書に教示されるエストロゲン成分の使用を提供する。
【００２５】
好ましい実施の形態では、Ｒ３は、ヒドロキシル基又は炭素数１〜５のアルコキシ基を表し、より好ましくはＲ３はヒドロキシル基を表す。
【００２６】
好ましい実施の形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうちの少なくとも２つ、より好ましくは３つが水素原子を表す。特に好ましい実施の形態では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ４は、水素原子を表す。
【００２７】
或る特定の実施の形態では、Ｒ３は、ヒドロキシル基又は炭素数１〜５のアルコキシ基を表し、より好ましくはＲ３はヒドロキシル基を表し、基Ｒ１、Ｒ２及びＲ４のうちの少なくとも１つ、より好ましくは少なくとも２つ、更に好ましくは３つ全てが水素原子を表す。
【００２８】
更に好ましい実施の形態では、Ｒ１、Ｒ２及びＲ４は水素原子を表し、Ｒ３、Ｒ５及びＲ６及びＲ７はヒドロキシル基を表し、よって、エストロゲン物質又はエストロゲン成分は１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１５，１６，１７−テトロールである。特に好ましい実施の形態では、エストロゲン物質又はエストロゲン成分は、１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１５α，１６α，１７β−テトロール（エステトロール）である。
【００２９】
好ましい実施の形態では、前駆体は、少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が炭素数１〜２５の炭化水素カルボン酸、スルホン酸若しくはスルファミン酸のアシルラジカル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、又は１残基あたり１〜２０のグリコシド単位を含有する直鎖若しくは分岐鎖のグリコシド残基によって置換されているエストロゲン物質の誘導体である。
【００３０】
上述のとおり、本発明は、神経障害の処置に使用される本明細書に教示されるエストロゲン成分を提供する。
【００３１】
好ましい実施の形態では、本発明は、神経障害の治療的処置、すなわちエストロゲン成分を神経障害と診断された被験体に投与する神経障害の処置に使用される、本明細書に教示されるエストロゲン成分を提供する。
【００３２】
「神経障害」という用語は、一般的に、中枢神経系及び末梢神経系を含む神経系に影響を与える障害を意味する。
【００３３】
好ましい実施の形態では、神経障害は損傷であり、好ましくは中枢神経系の損傷、より好ましくは脳損傷、又は神経変性疾患である。よって、神経障害は、脳損傷、脊髄損傷、及び神経変性疾患を含む又はからなる群から選択されるのが好ましい。神経障害は、脳損傷及び神経変性疾患を含む又はからなる群から選択されるのがより好ましい。
【００３４】
好ましい実施の形態では、神経障害は、低酸素性脳損傷、無酸素性脳損傷、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、及びパーキンソン病を含む又はからなる群から選択される。
【００３５】
或る特定の実施の形態では、アルツハイマー病は、初期アルツハイマー病、すなわち前臨床段階又は最も初期の臨床段階のアルツハイマー病である。
【００３６】
或る特定の実施の形態では、パーキンソン病は、初期の認知症を伴わないパーキンソン病又は軽度認知障害を伴うパーキンソン病である。
【００３７】
「低酸素性損傷」又は「無酸素性損傷」という用語は、本明細書において、それぞれ低酸素性（すなわち、脳への酸素供給の低下）又は無酸素性（すなわち、脳に対する完全な酸素の欠如）の機構のいずれかに起因する酸素欠乏の結果としての脳損傷を意味する。低酸素性／無酸素性損傷は、脳の局所領域（複数の場合もあり）又は脳全体に影響を与え得る。或る特定の好ましい実施の形態では、低酸素性／無酸素性／外傷性脳損傷は、少なくとも海馬又は大脳皮質、例えば、少なくとも海馬及び大脳皮質、好ましくは少なくとも海馬に影響を与える。
【００３８】
好ましい実施の形態では、神経障害は、低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）である。
【００３９】
「低酸素性虚血性脳症」又は「ＨＩＥ」という用語は、本明細書において具体的には、脳全体の十分な酸素供給が絶たれているが、完全には欠乏していない場合に生じる状態を意味する。不十分な酸素供給は、低酸素（すなわち酸素利用率の低下）が原因であり、及び／又は虚血（すなわち血流の途絶に起因する酸素欠乏）が原因であり得る。或る特定の好ましい実施の形態では、ＨＩＥは、少なくとも海馬又は大脳皮質、例えば少なくとも海馬及び大脳皮質、好ましくは少なくとも海馬に影響を与える。
【００４０】
特に好ましい実施の形態では、本明細書に教示されるエストロゲン成分は、新生児の低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の処置に使用される。
【００４１】
本明細書で使用される「新生児ＨＩＥの処置」という表現は、脳傷害から保護することを包含し得て、例えば、発達遅延、精神遅滞又は脳性麻痺（ＣＰ）（ＣＰの改善は、例えば、運動、行動、及び／又は認知機能の向上を含む）等の新生児ＨＩＥ関連障害の予防、それに関連する症状の緩和、又はその程度の減弱を更に包含し得る。本明細書で使用される「脳性麻痺」という用語は、慢性的な運動又は姿勢の障害を特徴とする一連の状態を指す。脳性麻痺は、発作性傷害、感覚機能障害及び／又は認知的限界を伴う場合がある。
【００４２】
上記及び更なる態様、本発明の好ましい実施形態及び特徴は、以下の項及び添付の特許請求の範囲に記載される。本明細書に記載される各々の態様、実施形態又は特徴は、特に明らかに矛盾しない限り、任意の他の態様（複数の場合もあり）、実施形態（複数の場合もあり）又は特徴（複数の場合もあり）と組み合わされてもよい。特に、本明細書に詳述される任意の特徴、とりわけ好ましい又は有利であることが示された任意の特徴は、本明細書に詳述される任意の他の特徴（複数の場合もあり）、とりわけ好ましい又は有利であることが示された任意の他の特徴（複数の場合もあり）と組み合わされてもよい。添付の特許請求の範囲の主題は、これにより具体的に引用することにより本明細書の一部をなす。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】手術後の仔ラットの体重。出産後を含む４日〜７日に、ビヒクル（生理食塩溶液）（ビヒクル）、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（Ｅ４  ５ｍｇ／ｋｇ）若しくは５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（Ｅ４  ５０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを腹腔内注射するか、又は注射しなかった（シャム）仔ラットの手術後の体重。シャム群の仔ラット７匹、ビヒクル群の仔ラット１１匹、Ｅ４  ５ｍｇ／ｋｇ群の仔ラット７匹、及びＥ４  ５０ｍｇ／ｋｇ群の仔ラット５匹の体重の平均±ＳＥＭを示す。
【図２】仔ラットの脳重量。出産後を含む４日〜７日に、ビヒクル（生理食塩溶液）（ビヒクル）、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（５ｍｇ／ｋｇ）、若しくは５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（５０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを腹腔内注射するか、又は注射しなかった（シャム）仔ラットの脳重量。シャム群の仔ラット７匹、ビヒクル群の仔ラット１１匹、Ｅ４  ５ｍｇ／ｋｇ群の仔ラット７匹、及びＥ４  ５０ｍｇ／ｋｇ群の仔ラット５匹の出産後１４日目の屠殺の際の脳重量の平均±ＳＥＭを示す。スケールバー：２ｍｍ。
【図３】仔ラットの海馬領域の脳切片のヘマトキシリン−エオシン染色。出産後１４日目の屠殺の際に仔ラットの脳を摘出し、パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した試料の海馬領域の切片作成及びヘマトキシリン−エオシン染色のために加工した。出産後を含む４日〜７日に、ビヒクル（生理食塩溶液）（ビヒクル）、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（Ｅ４  ５ｍｇ／ｋｇ）、若しくは５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（Ｅ４  ５０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを仔ラットに腹腔内注射するか、又は注射しないかの（シャム）いずれかであった。
【図４】仔ラットのヘマトキシリン−エオシン染色脳切片における無傷細胞の計測。仔ラットのヘマトキシリン−エオシン染色脳切片の海馬の歯状回帯（ＤＧ）、顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）、及びアンモン角（ＣＡ１、ＣＡ２／ＣＡ３）、及び皮質において無傷細胞を計測した。無傷細胞を各々の脳領域の３視野において倍率４００倍で計測し、平均を１視野あたりの無傷細胞数として表す。シャム群の仔ラット７匹、ビヒクル群の仔ラット１１匹、Ｅ４  ５ｍｇ／ｋｇ群の仔ラット７匹、及びＥ４  ５０ｍｇ／ｋｇ群の仔ラット５匹の無傷細胞数／１視野重量（weights）の平均±ＳＥＭを示す。
【図５】エステトロールで予め処置した仔ラットの手術後の体重。指示される各々の出生後日数（Ｘ軸）において、６本の棒グラフは左から右に、それぞれ、ビヒクル又はＥ４を注射していない仔ラット（シャム群、ｎ＝２４）、出生後４日〜７日を含めてビヒクルを腹腔内注射した仔ラット（ビヒクル群、ｎ＝１４）、出生後４日〜７日を含めて１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４を腹腔内注射した仔ラット（ｎ＝１１）、出生後４日〜７日を含めて５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４を腹腔内注射した仔ラット（ｎ＝１４）、出生後４日〜７日を含めて１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４を腹腔内注射した仔ラット（ｎ＝１４）、又は出生後４日〜７日を含めて５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４を腹腔内注射した仔ラット（ｎ＝１９）の手術後の体重（単位ｇ）を表す。出生後７日目の最後の注射から３０分後に、仔ラットを低酸素性虚血性傷害に供した。シャム動物を、低酸素性虚血性傷害を含まない同様の処理に供した。測定を平均±ＳＥＭとして表す。
【図６】エステトロールで予め処置した仔ラットの脳重量。ビヒクル若しくはＥ４を注射しなかった仔ラット（シャム群、ｎ＝２４）、又は出生後４日〜７日を含めてビヒクル（ビヒクル群、ｎ＝１４）、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１１）、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１４）、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１４）、若しくは５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１９）を腹腔内注射した仔ラットの脳重量（単位ｇ）。出生後７日目の最後の注射から３０分後、仔ラットを低酸素性虚血性傷害に供した。シャム動物を、低酸素性虚血性傷害を含まない同様の処理に供した。測定を平均±ＳＥＭとして表す。
【図７Ａ】エステトロールで予め処置した仔ラットの冠状脳切片のヘマトキシリン−エオシン染色及び無傷細胞の計測。仔ラットに、（ａ）ビヒクル若しくはＥ４を注射しなかった（シャム群、ｎ＝２４）、又は出生後４日〜７日を含めて（ｂ）ビヒクル（ビヒクル群、ｎ＝１６）、（ｃ）１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１０）、（ｄ）５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１３）、（ｅ）１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１０）、若しくは（ｆ）５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１４）を腹腔内注射した。出生後７日目の最後の注射から３０分後、仔ラットを低酸素性虚血性傷害に供した。シャム動物を、低酸素性虚血性傷害を含まない同様の処理に供した。出生後１４日目の屠殺に際して脳を摘出し、パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した脳試料を海馬領域において冠状切片にした。試験群の（Ａ）脳冠状切片（スケールバー：２ｍｍ）、（Ｂ）海馬領域（スケールバー：５００μｍ）、及び（Ｃ）皮質（スケールバー：１００μｍ）のヘマトキシリン−エオシン染色を示す。
【図７Ｂ】（Ｄ）ヘマトキシリン−エオシン染色された仔ラットの冠状脳切片の海馬の種々の領域：歯状回（ＤＧ）、顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）、及びアンモン角（ＣＡ１、ＣＡ２／ＣＡ３）、ならびに皮質で無傷細胞を計測した。無傷細胞を各々の脳領域の３視野において倍率４００倍で計測し、平均を１視野あたりの無傷細胞数として表す。示される各脳領域（Ｘ軸上のＤＧ、ＳＧＺ、ＣＡ１、ＣＡ２／３、皮質）について、６本の棒グラフは左から右に、それぞれ、シャム群の仔ラット、ビヒクル群の仔ラット、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４で処置した仔ラット、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４で処置した仔ラット、１０ｍｇ/ｋｇ  Ｅ４で処置した仔ラット、又は５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４で処置した仔ラットの１視野あたりの無傷細胞数を表す。全ての測定を平均±ＳＥＭとして表す。
【図８Ａ】エステトロールで予め処置した仔ラットの脳冠状切片の微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）染色。仔ラットに、（ａ）ビヒクル若しくはＥ４を注射しなかった（シャム群）、又は出生後４日〜７日を含めて（ｂ）ビヒクル（ビヒクル群）、（ｃ）１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４、（ｄ）５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４、（ｅ）１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４、若しくは（ｆ）５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４を腹腔内注射した。出生後７日目の最後の注射から３０分後、仔ラットを低酸素性虚血性傷害に供した。シャム動物を、低酸素性虚血性傷害を含まない同様の処理に供した。出生後１４日目の屠殺に際して脳を摘出し、パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した脳試料を海馬領域において冠状切片にした。抗ＭＡＰ２抗体による免疫組織学的染色を介して神経細胞骨格の破壊を検出するため切片を加工した。（Ａ）脳冠状切片のＭＡＰ２染色（スケールバー：２ｍｍ）を示す。
【図８Ｂ】（Ｂ）ＭＡＰ２陽性領域の比率を、同側半球のＭＡＰ２陽性領域を対側半球のＭＡＰ２陽性領域で除算して算出した。各試験群に由来する１０個の試料を分析した。シャム群のＭＡＰ２陽性領域の比率をデフォルトで１とした。
【図９】エステトロールで予め処置した仔ラットの海馬及び皮質のダブルコルチン（ＤＣＸ）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）染色。仔ラットに、ビヒクル若しくはＥ４を注射しなかった（シャム群）、又は出生後４日〜７日を含めてビヒクル（ビヒクル群）、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４、若しくは５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４を腹腔内注射した。出生後７日目の最後の注射から３０分後、仔ラットを低酸素性虚血性傷害に供した。シャム動物を、低酸素性虚血性傷害を含まない同様の処理に供した。出生後１４日目の屠殺に際して脳を摘出し、パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した脳試料を海馬領域において冠状切片にした。切片を抗ＤＣＸ抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体で二重染色した。ＤＣＸ（Ａ）及びＶＥＧＦ（Ｂ）陽性細胞の割合を、ＤＣＸ又はＶＥＧＦ陽性染色細胞のいずれかの合計をＤＡＰＩ陽性細胞の総数で除算して定量化した。海馬の種々の領域（歯状回（ＤＧ）、アンモン角１（ＣＡ１）、アンモン角２／３（ＣＡ２／ＣＡ３））及び皮質において定量化を行った。シャム群、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群、１０ｍｇ/ｋｇ  Ｅ４群、又は５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群において１０個の試料を解析し、ビヒクル群に由来する１２個の試料と比較した。示される各脳領域（Ｘ軸上のＤＧ、ＣＡ１、ＣＡ２／３、皮質）について、６本の棒グラフは左から右に、それぞれ、シャム群、ビヒクル群、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群、１０ｍｇ/ｋｇ  Ｅ４群、又は５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群のＤＣＸ（Ａ）又はＶＥＧＦ（Ｂ）陽性細胞の割合を表す。全ての測定を平均±ＳＥＭとして表す。
【図１０】エステトロールで予め処置した仔ラット血清中のＳ１００Ｂ及びグリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ：Glial Fibrillary Acidic Protein）の発現。仔ラットに、ビヒクル若しくはＥ４を注射しなかった（シャム群、それぞれＳ１００Ｂについてｎ＝２０及びＧＦＡＰについてｎ＝２１）、又は出生後４日〜７日を含めてビヒクル（ビヒクル群、それぞれＳ１００Ｂについてｎ＝１３及びＧＦＡＰについてｎ＝１５）、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（それぞれＳ１００Ｂについてｎ＝１０及びＧＦＡＰについてｎ＝１１）、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（それぞれＳ１００Ｂについてｎ＝１１及びＧＦＡＰについてｎ＝１１）、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（それぞれＳ１００Ｂについてｎ＝１３及びＧＦＡＰについてｎ＝１０）、若しくは５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（それぞれＳ１００Ｂについてｎ＝１９及びＧＦＡＰについてｎ＝１８）を腹腔内注射した。出生後７日目の最後の注射から３０分後に、仔ラットを低酸素性虚血性傷害に供した。シャム動物を、低酸素性虚血性傷害を含まない同様の処理に供した。出生後１４日目の屠殺に際して血液試料を採取した。血清中のＳ１００Ｂ（Ａ）、ＧＦＡＰ（Ｂ）の濃度を検査するためＳ１００Ｂ及びＧＦＡＰについてＥＬＩＳＡを行った。全ての測定を平均±ＳＥＭとして示す。
【図１１】エステトロールで処置した仔ラットの手術後の体重。出生後７日目に仔ラットを低酸素性虚血性傷害に供した。低酸素状態からの回復に際し、仔ラットに単回用量のビヒクル（ビヒクル群、ｎ＝２０）、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１６）、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１９）、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１７）、又は５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１５）を腹腔内注射した。シャム動物を、低酸素性虚血性傷害を含まない同様の処理に供し、ビヒクル又はＥ４のいずれも注射しなかった（シャム群、ｎ＝２９）。示される各出生後の日数において（Ｘ軸）、６本の棒グラフは左から右に、それぞれ、シャム群、ビヒクル群、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群、１０ｍｇ/ｋｇ  Ｅ４群、又は５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群に由来する仔ラットの手術後の体重（単位ｇ）を表す。測定を平均±ＳＥＭとして表す。
【図１２】エステトロールで処置した仔ラットの脳重量。出生後７日目に仔ラットを低酸素性虚血性傷害に供した。低酸素状態からの回復に際し、仔ラットに単回用量のビヒクル（ビヒクル群、ｎ＝２０）、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１６）、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１９）、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１７）、又は５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１５）を腹腔内注射した。シャム動物を、低酸素性虚血性傷害を含まない同様の処理に供し、ビヒクル又はＥ４のいずれも注射しなかった（シャム群、ｎ＝２９）。仔ラットの脳重量（単位ｇ）を示す。測定を平均±ＳＥＭとして表す。
【図１３Ａ】エステトロールで処置した仔ラットの冠状脳切片のヘマトキシリン−エオシン染色及び無傷細胞の計測。出生後７日目に、仔ラットを低酸素性虚血性傷害に供した。低酸素状態からの回復に際し、仔ラットに単回用量の（ｂ）ビヒクル（ビヒクル群、ｎ＝１０）、（ｃ）１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１０）、（ｄ）５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１０）、（ｅ）１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１０）、又は（ｆ）５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１０）を腹腔内注射した。シャム動物（ａ）を、低酸素性虚血性傷害を含まない同様の処理に供し、ビヒクル又はＥ４のいずれも注射しなかった（シャム群、ｎ＝１０）。出生後１４日目の屠殺に際して脳を摘出し、パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した試料を海馬領域において冠状切片を作製するために加工した後、ヘマトキシリン−エオシン染色を行った。（Ａ）脳冠状切片（スケールバー：２ｍｍ）、（Ｂ）海馬領域（スケールバー：５００μｍ）、及び（Ｃ）皮質（スケールバー：１００μｍ）のヘマトキシリン−エオシン染色を示す。
【図１３Ｂ】（Ｄ）ヘマトキシリン−エオシン染色された冠状脳切片の海馬の種々の領域：歯状回（ＤＧ）、顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）、及びアンモン角（ＣＡ１、ＣＡ２／ＣＡ３）、ならびに皮質で無傷細胞を計測した。無傷細胞を各脳領域の３視野において倍率４００倍で計測し、平均を１視野あたりの無傷細胞数として表す。示される各脳領域（Ｘ軸上のＤＧ、ＳＧＺ、ＣＡ１、ＣＡ２／３、皮質）について、６本の棒グラフは左から右に、それぞれ、シャム群の仔ラット、ビヒクル群の仔ラット、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４で処置した仔ラット、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４で処置した仔ラット、１０ｍｇ/ｋｇ  Ｅ４で処置した仔ラット、又は５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４で処置した仔ラットの１視野あたりの無傷細胞数を表す。全ての測定を平均±ＳＥＭとして表す。
【図１４Ａ】エステトロールで処置した仔ラットの脳冠状切片の微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）染色。出生後７日目に、仔ラットを低酸素性虚血性傷害に供した。低酸素状態からの回復に際し、仔ラットに単回用量の（ｂ）ビヒクル（ビヒクル群、ｎ＝１０）、（ｃ）１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１０）、（ｄ）５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１０）、（ｅ）１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１０）、又は（ｆ）５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１０）を腹腔内注射した。シャム動物（ａ）を、低酸素性虚血性傷害を含まない同様の処理に供し、ビヒクル又はＥ４のいずれも注射しなかった（シャム群、ｎ＝１０）。出生後１４日目の屠殺に際して脳を摘出し、パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した試料を海馬領域において冠状切片にした。抗ＭＡＰ２抗体による免疫組織学的染色を介して神経細胞骨格の破壊を検出するため切片を加工した。（Ａ）脳冠状切片のＭＡＰ２染色を示す（スケールバー：２ｍｍ）。
【図１４Ｂ】（Ｂ）ＭＡＰ２陽性領域の比率を、同側半球のＭＡＰ２陽性領域を対側半球のＭＡＰ２陽性領域で除算して算出した。各群に由来する１０個の試料を解析した。シャム群のＭＡＰ２陽性領域の比率をデフォルトで１．０とした。
【図１５】エステトロールで処置した仔ラットの海馬及び皮質におけるダブルコルチン（ＤＣＸ）及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）染色。出生後７日目に、仔ラットを低酸素性虚血性傷害に供した。低酸素状態からの回復に際し、仔ラットに単回用量のビヒクル（ビヒクル群、ｎ＝１０）、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１０）、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１０）、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１０）、又は５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（ｎ＝１０）を腹腔内注射した。シャム動物（ａ）を、低酸素性虚血性傷害を含まない同様の処理に供し、ビヒクル又はＥ４のいずれも注射しなかった（シャム群、ｎ＝１０）。出生後１４日目の屠殺に際して脳を摘出し、パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した試料を海馬領域において冠状切片にした。切片を抗ＤＣＸ抗体及び抗ＶＥＧＦ抗体で二重染色した。ＤＣＸ（Ａ）及びＶＥＧＦ（Ｂ）陽性細胞の割合を、ＤＣＸ又はＶＥＧＦ陽性染色細胞のいずれかの合計をＤＡＰＩ陽性細胞の総数で除算して定量化した。海馬の種々の領域（歯状回（ＤＧ）、アンモン角１（ＣＡ１）、アンモン角２／３（ＣＡ２／ＣＡ３））及び皮質において定量化を行った。各研究群に由来する１０個の試料を分析した。指示される各脳領域（Ｘ軸上のＤＧ、ＣＡ１、ＣＡ２／３、皮質）について、６本の棒グラフは左から右に、それぞれ、シャム群、ビヒクル群、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群、又は５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群のＤＣＸ（Ａ）又はＶＥＧＦ（Ｂ）陽性細胞の割合を表す。全ての測定を平均±ＳＥＭとして示す。
【図１６】エステトロールで処置した仔ラットの血清中のＳ１００Ｂ及びグリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現。出生後７日目に仔ラットを、低酸素性虚血性傷害に供した。低酸素状態からの回復に際し、仔ラットに単回用量のビヒクル（ビヒクル群、それぞれＳ１００Ｂについてｎ＝１４及びＧＦＡＰについてｎ＝１６）、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（それぞれＳ１００Ｂについてｎ＝１３及びＧＦＡＰについてｎ＝１５）、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（それぞれＳ１００Ｂについてｎ＝１６及びＧＦＡＰについてｎ＝１５）、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（それぞれＳ１００Ｂについてｎ＝１３及びＧＦＡＰについてｎ＝１３）、又は５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（それぞれＳ１００Ｂについてｎ＝１５及びＧＦＡＰについてｎ＝１４）を腹腔内注射した。シャム動物（ａ）を、低酸素性虚血性傷害を含まない同様の処理に供し、ビヒクル又はＥ４のいずれも注射しなかった（シャム群、それぞれＳ１００Ｂについてｎ＝２０及びＧＦＡＰについてｎ＝２１）。出生後１４日目の屠殺に際して血液試料を採取した。血清中のＳ１００Ｂ（Ａ）、ＧＦＡＰ（Ｂ）の濃度を検査するためＳ１００Ｂタンパク質及びＧＦＡＰタンパク質についてＥＬＩＳＡを行った。全ての測定を平均±ＳＥＭとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本明細書で使用される数量を特定していない単数形（"a", "an", and "the"）は、文脈により明確に指示されない限り、単数及び複数の両方の指示物を含む。
【００４５】
本明細書で使用される「含んでいる（comprising）」、「含む（comprises）」及び「含まれる（comprised of）」という用語は、「含んでいる、挙げられている（including）」、「含む、挙げられる（includes）」又は「含有している（containing）」、「含有する（contains）」と同義であり、包括的又はオープンエンド（open-ended）であり、追加的な、列挙されていないメンバー、要素又は方法工程を除外するものではない。また、この用語は、「からなる（consisting of）」及び「から本質的になる（consisting essentially of）」を包含する。
【００４６】
端点（endpoints）による数値範囲の列挙は、各範囲内に包含される全ての数字及び端数、また列挙される端点を含む。
【００４７】
本明細書で使用される「約」という用語は、パラメーター、量、時間的期間等の測定可能な値を指す場合、具体的な値の及びその値からの変量を包含し、具体的には、かかる変量が開示される発明を実施するのに適切である限り、具体的な値の及びその値から±１０％以下、好ましくは±５％以下、より好ましくは±１％以下、更に好ましくは±０．１％以下の変量を包含することを意味する。修飾語「約」が指す値は、その値自体も具体的に、また好ましくは、開示される。
【００４８】
一群のメンバーの１以上のメンバーといった「１以上」という用語が、更なる例示によりそれ自体明確であるが、とりわけこの用語は、例えば、上記メンバーの任意の１つ、又は上記メンバーの任意の３以上、４以上、５以上、６以上、若しくは７以上等、また上記メンバーの全てに及ぶ上記メンバーの任意の２以上に対する言及を包含する。
【００４９】
本明細書に引用される全ての文献は、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【００５０】
別段の定めがない限り、技術用語及び科学用語を含む本発明の開示に使用される全ての用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味を有する。更なる指示により、用語の定義は、本発明の教示をよりよく理解するために含まれ得る。或る特定の用語が具体的な態様又は実施形態と組合せて説明又は定義される場合、別段の定めがない限り又は文脈による明確な規定がない限り、かかる含意は本明細書を、全体を通して、すなわち他の態様又は実施形態に適用されることが意図される。
【００５１】
本発明者らは、エステトロール及び関連するエストロゲン成分が、仔ラットにおける新生児の低酸素性虚血性脳症の確立されたモデルで説明されるように神経保護効果を有することを見出した。また、本発明者らは、エステトロール及び関連するエストロゲン成分が、同じ新生児の低酸素性虚血性脳症のラットモデルにおいて示されるように治療効果を呈することを明らかにした。さらに、本発明者らはエステトロール及び関連するエストロゲン成分は、仔ラットの脳で神経発生及び血管新生を誘導又は促進することを見出した。
【００５２】
本明細書で使用される「エストロゲン成分」という用語は、本明細書に教示されるエストロゲン物質、その前駆体、又は１以上の上記エストロゲン物質及び／又は前駆体の混合物を指す。
【００５３】
或る特定の実施形態では、エストロゲン成分は、
式（Ｉ）（式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基であり、Ｒ２は水素原子、ヒドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基であり、Ｒ３は水素原子、ヒドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基であり、Ｒ４は水素原子、ヒドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基であり、Ｒ５はヒドロキシル基であり、Ｒ６はヒドロキシル基であり、Ｒ７はヒドロキシル基であり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうちの３つ以下が水素原子である）を有するエストロゲン物質、
上記エストロゲン物質の前駆体、及び、
１以上のエストロゲン物質及び／又は前駆体の混合物、
からなる群から選択される。
【００５４】
或る特定の実施形態では、エストロゲン成分は、
式（Ｉ）（式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基であり、Ｒ２は水素原子、ヒドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基であり、Ｒ３は水素原子、ヒドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基であり、Ｒ４は水素原子、ヒドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基であり、Ｒ５はヒドロキシル基であり、Ｒ６はヒドロキシル基であり、Ｒ７はヒドロキシル基であり、かつＲ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４のうちの１つが水素原子、又は炭素数１〜５のアルコキシ基である）を有するエストロゲン物質、
上記エストロゲン物質の前駆体、及び、
１以上のエストロゲン物質及び／又は前駆体の混合物、
からなる群から選択される。
【００５５】
実施形態では、エストロゲン成分は、
式（ＩＩＩ）：
【００５６】
【化３】
2015514731.tif 000004
【００５７】
（式中、Ｒ１は水素原子、ヒドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基であり、Ｒ２は水素原子、ヒドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基であり、Ｒ３は水素原子、ヒドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基であり、Ｒ４は水素原子、ヒドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基であり、
かつＲ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４の少なくとも１つがヒドロキシル基、又は炭素数１〜５のアルコキシ基である）を有するエストロゲン物質、
上記エストロゲン物質の前駆体、及び、
１以上のエストロゲン物質及び／又は前駆体の混合物、
からなる群から選択される。
【００５８】
「炭素数１〜５のアルコキシ基」という表現は、「Ｃ１〜５アルコキシ」又は「Ｃ１〜５アルキルオキシ」も意味し得て、式：−ＯＲａ（式中、Ｒａが本明細書で定義されるＣ１〜５アルキルである）を有するラジカルを指す。好適なＣ１〜５アルキルオキシの非限定的な例として、メチルオキシ、エチルオキシ、プロピルオキシ、イソプロピルオキシ、ブチルオキシ、イソブチルオキシ、ｓｅｃ−ブチルオキシ、ｔｅｒｔ−ブチルオキシ、及びペンチルオキシが挙げられる。
【００５９】
本明細書に教示されるエストロゲン物質は、ステロイド骨格中の五員環が０〜２ではなく少なくとも３つのヒドロキシル置換基を含む点で、医薬製剤に一般的に適用される生物起源及び合成エストロゲンのいずれとも異なる。
【００６０】
また、該エストロゲン物質は、それらの立体異性体、それらの薬学的に許容可能な付加塩、水和物及び溶媒和物も包含する。
【００６１】
式（Ｉ）及び式（ＩＩＩ）により表されるエストロゲン物質は、ヒドロキシル置換基を保有する炭素原子、具体的にはＲ５、Ｒ６及びＲ７がキラルに活性（chirally active）であることから、様々なエナンチオマーを包含する。好ましい実施形態では、エストロゲン物質は、１５α−ヒドロキシ置換されている。他の好ましい実施形態では、上記物質は１６α−ヒドロキシ置換されている。更に他の好ましい実施形態では、上記物質は１７β−ヒドロキシ置換されている。エストロゲン物質は、１５α，１６α，１７β−トリヒドロキシ置換されているのが最も好ましい。本明細書に教示されるエストロゲン物質のステロイド骨格中の他のキラルに活性な炭素原子は、１７β−エストラジオール及び他の生物起源エストロゲン中の対応する炭素原子と同じ立体配置を有するのが好ましい。
【００６２】
好ましくは、本明細書で使用されるエストロゲン物質は、いわゆる生物起源エストロゲン、すなわち、人体で自然発生するエストロゲンである。生物起源エストロゲンが胎児及び女性の体内に天然に存在することから、特にかかるエストロゲンの外部からの投与により生じる血清レベルが自然発生的な濃度を実質的に超えない限り、副作用が生じないと予想される。
【００６３】
好ましい実施形態では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４の少なくとも１つ、より好ましくは厳密に１つがヒドロキシル基を表し、エストロゲン物質が少なくとも４つ、好ましくは厳密に４つのヒドロキシル基を含有することを意味する。エストロゲン物質が４つのヒドロキシル基を含有する場合、テトラヒドロキシル化エストロゲンとも称され得る。
【００６４】
少なくとも４つのヒドロキシル基を含有する商業的に入手可能なエストロゲン及びそれらの前駆体の非限定的な例は、１，３，５（１０）−エストラトリエン−２，３，１５α，１６α，１７β−ペントール２−メチルエーテル、１，３，５（１０）−エストラトリエン−２，３，１５β，１６α，１７β−ペントール２−メチルエーテル、１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１５α，１６α，１７β−テトロール、１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１５α，１６α，１７β−テトロールテトラアセテート、又は１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１５β，１６β，１７β−テトロールテトラアセテートである。
【００６５】
特に好ましい実施形態では、エストロゲン物質は、１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１５，１６，１７−テトロールである。
【００６６】
更に特に好ましい実施形態では、エストロゲン物質はエステトロールである。
【００６７】
「エステトロール」、「１，３，５（１０）−エストラトリエン−３，１５α，１６α，１７β−テトロール」及び「Ｅ４」は同義語であり、妊娠期間にのみヒト胎児肝臓により自然に産生されることが知られているエストロゲン化合物を指すため、本明細書では互換的に使用される。それは、４つのヒドロキシル基の存在を特徴とするテトラヒドロキシル化エストロゲンであり、そのため頭字語はＥ４である。その一般式は、式（ＩＩ）により表される：
【００６８】
【化４】
2015514731.tif 000005
【００６９】
また、本発明は、本明細書に教示されるエストロゲン物質の前駆体の使用も包含する。これらの前駆体は、特に本発明に従って使用される場合、例えば、代謝転換の結果、エストロゲン物質を遊離することが可能である。
【００７０】
好ましくは、これらの前駆体は、エストロゲン物質の誘導体であり、少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が、炭素数１〜２５の炭化水素カルボン酸、スルホン酸若しくはスルファミン酸のアシルラジカル；テトラヒドロフラニル；テトラヒドロピラニル；又は１残基あたり１個〜２０個のグリコシド単位を含有する直鎖若しくは分岐鎖のグリコシド残基により置換されている。
【００７１】
本発明に従って好適に使用することができる前駆体の非限定的な例は、エストロゲン物質のヒドロキシル基と１以上のカルボキシ（Ｍ＋−ＯＯＣ−）基（ここで、Ｍ＋は水素又は（アルカリ）金属カチオンを表す）を含有する物質とを反応させることにより得ることができるエステルである。それゆえ、前駆体の特に好ましい例は、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）又は式（ＩＩＩ）の少なくとも１つのヒドロキシル基の水素原子が−ＣＯ−Ｒ（ここで、Ｒは１個〜２５個の炭素原子を含む炭化水素ラジカルであり、好ましくはＲは、水素、又は１個〜２０個の炭素原子を含むアルキル、アルケニル、シクロアルキル、若しくはアリールラジカルである）で置換されているエストロゲン物質の誘導体である。
【００７２】
基として又は基の一部としての「アルキル」という用語は、本明細書では、式ＣｎＨ２ｎ＋１（式中、ｎは１〜約２５の数字である）のヒドロカルビルラジカルを指す。好ましくは、本明細書で意図されるアルキル基は、１個〜２０個の炭素原子、例えば１個〜１０個の炭素原子、１個〜５個の炭素原子、１個〜４個の炭素原子、又は１個〜３個の炭素原子、より好ましくは１個〜２個の炭素原子を含む。アルキル基は、直鎖であっても分岐鎖であってもよく、本明細書で示されるように置換されてもよい。本明細書において炭素原子の後に下付き文字が使用される場合、下付き文字は、指定された基が含有し得る炭素原子の数を指す。よって、例えば、Ｃ１〜５アルキルは、炭素数１〜５のアルキルを意味する。アルキル基、特にＣ１〜５アルキルの例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、２−メチルブチル、ペンチル、イソアミル及びその異性体である。
【００７３】
基としての又は基の一部としての「アルケニル」という用語は、直鎖であっても分岐鎖であってもよい、１以上の炭素−炭素二重結合を含む不飽和ヒドロカルビル基を指す。アルケニル基は、少なくとも２個、例えば２個〜約２５個の炭素原子の炭素原子を含み、本明細書で使用されるように、好ましくは２個〜約２０個の炭素原子、例えば２個〜１０個の炭素原子、２個〜５個の炭素原子、２個〜４個の炭素原子、又は２個〜３個の炭素原子を含み得る。アルケニル基の例は、エテニル、２−プロペニル、２−ブテニル、３−ブテニル、２−ペンテニル及びその異性体、２−ヘキセニル及びその異性体、２，４−ペンタジエニル等である。
【００７４】
基としての又は基の一部としての「シクロアルキル」という用語は、１個（すなわち、単環式）若しくは複数、例えば、２個（すなわち、二環式）の環状構造を有する飽和又は一部不飽和のヒドロカルビルラジカルを指す。多環式シクロアルキルラジカルの更なる環は、１以上のスピロ原子により縮合、架橋及び／又は結合されてもよい。シクロアルキル基は、独立して、１つの環に３個以上の炭素原子、例えば３個〜２５個の炭素原子、好ましくは３個〜２０個の炭素原子、より好ましくは３個〜８個の炭素原子、例えば５個、６個若しくは７個の炭素原子を含み得る。好ましくは、本明細書で意図されるシクロアルキル基は、単環式シクロアルキル基を指し、３個〜２０個の炭素原子を含む。単環式シクロアルキルラジカルの例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロへキシル等が挙げられる。
【００７５】
基としての又は基の一部としての「アリール」という用語は、単一の芳香環（例えば、フェニル）又は互いに縮合するか（例えば、ナフチル）若しくは共有結合した（例えば、ビフェニル）複数（例えば、２個、３個、又は４個）の芳香環を含む、多価不飽和芳香族ヒドロカルビル基を指す。アリール基は、１つの環に少なくとも６個の炭素原子、好ましくは６個〜約２０個の炭素原子、より好ましくは６個〜１０個の炭素原子を含む。アリール基中の芳香環は、それと縮合した１個又は２個の付加的な環（シクロアルキル、ヘテロシクリル、及び／又はヘテロアリール）を任意に含み得る。アリールの非限定的な例は、フェニル、ビフェニリル、５−又は６−テトラリニル、１−、２−、３−、４−、５−、６−、７−又は８−アズレニル、ナフタレン−１−又は−２−イル、４−、５−、６−又は７−インデニル、１−、２−、３−、４−又は５−アセナフチレニル、３−、４−又は５−アセナフテニル、１−、２−、３−、４−又は１０−フェナントリル、１−又は２−ペンタレニル、４−又は５−インダニル、５−、６−、７−又は８−テトラヒドロナフチル、１，２，３，４−テトラヒドロナフチル、１，４−ジヒドロナフチル、１−、２−、３−、４−又は５−ピレニルを含む。
【００７６】
上述のとおり、本明細書で教示されるエストロゲン成分は、被験体における神経障害の処置に有用である。
【００７７】
本明細書で使用される「処置する」又は「処置」という用語は、治療的処置及び予防又は防止手段の両方を指し、その目的は、神経障害の発症等の望ましくない生理学的変化又は障害を防止又は減速（軽減）することである。有利な又は望ましい臨床結果としては、検出可能であるか又は検出不可能であるかに関わらず、障害の防止、障害の発生の減少、障害と関連する症状の緩和、障害の程度の減弱、安定化された（すなわち、悪化していない）障害の状態、障害の進行の遅延若しくは減速、障害状態の改善若しくは一時的な緩和、寛解（部分的又は全体的に関わらず）、又はこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けていない場合に予測される生存と比較して、生存の延長を意味し得る。
【００７８】
或る特定の実施形態では、本明細書に教示されるエストロゲン成分は、神経障害の予防的処置又は防止的処置に使用することができる。すなわち、神経障害と診断されていない間（例えば、診断される前）にエストロゲン成分を被験体に投与する。例えば、被験体は、神経障害に罹患する／神経障害を発生するリスクにあると考えられ得る。それゆえ、かかる処置は、神経障害の防止に焦点が当てられる。
【００７９】
好ましい実施形態では、本明細書に教示されるエストロゲン成分は、神経障害の治療的処置に使用することができる。したがって、好ましい実施形態では、本発明は、神経障害の処置に使用される本明細書で教示されるエストロゲン成分に関し、ここで、エストロゲン成分は神経障害と診断された患者に投与される。それゆえ、かかる処置は、存在する神経障害の治療法に焦点が当てられる。
【００８０】
本明細書で使用される「治療的処置」又は「治療法」等の用語は、被験体の身体又はその要素を、神経障害等の望ましくない生理学的変化若しくは障害から、より重症度の低い状態若しくは不快感が和らいだ状態等の望ましい状態とすること（例えば、改善又は一時的な緩和）、又は正常な健康状態へと戻すこと（例えば、健康、生理学的完全性及び被験体の身体の健康の回復）、上記望ましくない生理学的変化若しくは障害を保持すること（すなわち、悪化させない）（例えば、安定化）、又は上記望ましくない生理学的変化若しくは障害と比較してより重症度の高い状態若しくはより悪化した状態へと進行するのを防止する若しくは減速することを目的とする処置を指す。
【００８１】
特に言及される場合を除き、「被験体」又は「患者」は、互換的に使用され、動物、好ましくは温血動物、より好ましくは脊椎動物、更に好ましくは哺乳動物、より一層好ましくは霊長類を指し、具体的にはヒト患者ならびに非ヒト哺乳動物及び霊長類が挙げられる。「哺乳動物の」被験体は、そのように分類される任意の動物を指し、ヒト、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、畜牛、乳牛等の飼育動物、商業用動物、家畜、動物園の動物、スポーツ動物、ペット及び実験動物；類人猿、サル、オランウータン及びチンパンジー等の霊長類；イヌ及びオオカミ等のイヌ科動物；ネコ、ライオン及びトラ等のネコ科動物；ウマ、ロバ及びシマウマ等のウマ科動物；ウシ、ブタ及びヒツジ等の食用動物；シカ及びキリン等の有蹄動物；マウス、ラット、ハムスター、及びモルモット等の齧歯類等が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい患者はヒト被験体である。
【００８２】
本明細書で使用される「処置を必要とする被験体」等の文言は、列挙される障害、具体的には神経障害の処置、好ましくは治療的処置からの利益を得るであろう被験体を含む。かかる被験体としては、上記障害と診断されたもの、上記障害に罹患する若しくは発症する傾向のあるもの、及び／又は上記障害を防止すべきものが挙げることができるが、これらに限定されない。特に意図されるのは、神経障害と診断された患者、又は神経障害を防止すべき患者である。
【００８３】
本明細書で使用される「診断」という用語は、被験体が列挙される障害、具体的には神経障害に影響されていることを確立すること及び結論付けることを指す。診断は、列挙される障害に関連する症状の検査に基づいて行われ得る（例えば、臨床的診断等）。代替的には又は追加的に、診断は、症状が検査可能である前（すなわち、前臨床的診断）か、又は症状が軽度であるか若しくは列挙される障害に限定されるため、例えば列挙される障害及び／又は画像化技術の指標であるバイオマーカーを検出することにより行われ得る。
【００８４】
本明細書で使用される「治療的有効量」という用語は、被験体の神経障害を処置する、すなわち、望ましい局所又は全身の効果及び成績を得るのに有効な本明細書に教示されるエストロゲン成分又は医薬組成物の量を指す。よって、この用語は、研究者、獣医、医師又は他の臨床医に求められる、組織、全身、動物、又はヒトにおける生物学的又は医学的反応を引き出すエストロゲン成分又は医薬組成物の分量を指す。特に、この用語は、神経障害と関連する臨床的な機能障害、症状、又は合併症を予防、治癒、改善、又は少なくとも最小化するのに必要な、単回用量又は複数回用量のいずれかの本明細書に教示されるエストロゲン成分又は医薬組成物の分量を指す。
【００８５】
本明細書で使用される、神経障害の治療的処置等の「神経障害の処置」の表現は、脳細胞の完全性の破壊及び／又は脳細胞の構造若しくは機能の喪失を含む脳傷害に対する保護又は予防、脳傷害の程度の減弱、脳傷害の悪化の防止又は脳傷害の回復を包含し、また神経発生及び／又は血管新生の誘導又は促進を更に包含し得る。
【００８６】
或る特定の実施形態では、神経障害の治療的処置等の神経障害の処置は、脳傷害に対する保護、脳障害の程度の減弱、脳傷害を悪化の防止又は脳傷害の回復を含む。特定の実施形態では、神経障害の治療的処置は、脳傷害を悪化の防止又は脳傷害の回復を含む。
【００８７】
実施形態では、神経障害の治療的処置等の神経障害の処置は、神経発生、血管新生、又は神経発生及び血管新生を促進することを含む。
【００８８】
脳傷害、神経発生及び血管新生を検査する非限定的な例として、画像化技法、特に神経画像化技法、ならびに、例えば血清又は脳脊髄液中の好適な生物学的マーカーの検出及び測定が挙げられる。好適な神経画像化技法として、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）及びポジトロン放射断層撮影法（ＰＥＴ）が挙げられる。脳傷害の好適な生物学的マーカーとして、例えばＳ１００Ｂ及びグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）が挙げられる。体液中の生物学的マーカーの検出及び測定の技法はよく知られており、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。
【００８９】
本明細書で使用される「神経障害」という用語は、中枢神経系及び／又は末梢神経系に影響を与える、任意の神経疾患、神経状態、神経行動、及び／又はそれらに関連する任意の症状を指す。
【００９０】
好ましくは、神経障害は、脳及び脊髄を含む中枢神経系に影響を与える可能性があり、より好ましくは少なくとも脳に影響を与える可能性があり、更に好ましくは少なくとも海馬及び皮質等の少なくとも海馬に影響を与える可能性がある。
【００９１】
「海馬」及び「海馬構造」という用語は本明細書において同義語として使用され、記憶、ならびに空間記憶及びナビゲーションに関与する脳の内側側頭葉に位置する脳領域を指す。哺乳動物は脳の両側に２つの海馬を有し、上記用語は両方の海馬を包含する。本明細書で使用されるように、海馬は、歯状回（ＤＧ：Dentate Gyrus）、アンモン角（ＣＡ：Cornu Ammonis）及び鉤状回を指す。歯状回は、歯状回（fascia dentata）、門部、顆粒細胞下帯（ＳＧＺ：SubGranular Zone）、顆粒細胞層、及び分子層を包含する。顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）は、顆粒細胞層とＤＧ門部との間に位置する狭い細胞層である。アンモン角（ＣＡ）は、アンモン角１（ＣＡ１）、アンモン角２（ＣＡ２）、アンモン角３（ＣＡ３）、及びアンモン角４（ＣＡ４）の分野へと分化される。神経障害は、特に、歯状回、アンモン角１、アンモン角２、アンモン角３、又は顆粒細胞下帯の少なくとも１つ、２つ以上、又は全てといった、これらの領域の少なくとも１つ、２つ以上又は全てに影響を与え得る。
【００９２】
「皮質」及び「大脳皮質」という用語は、本明細書では同義語として使用され、通常、大脳の最も外側の神経組織シートを意味する。皮質は、通常、感覚野、運動野、及び連合野から構成されて見られる。
【００９３】
神経障害は、皮質、例えば皮質の任意の領域に影響を与え、特に一次体性感覚皮質、より具体的には一次運動皮質に接する一次体性感覚皮質の一次体幹領域（primary trunk region）に影響を与え得る。
【００９４】
本明細書に教示されるエストロゲン成分又は医薬組成物を使用して処置される神経障害は、神経機能不全及び／又は神経変性、神経傷害若しくは神経脱落を含み得る。処置される神経障害は、限定されないが、例えば脳損傷、脊髄損傷、又は神経変性疾患等の神経変性、神経傷害又は神経脱落を含むのが好ましい。
【００９５】
例示的な脳損傷として、好ましくは新生児ＨＩＥ等の低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）を含む低酸素性／無酸素性脳損傷、更に脳虚血若しくは脳卒中、又は外傷性脳損傷が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
好ましくは、低酸素性脳損傷、無酸素性脳損傷、又は外傷性脳損傷等の脳損傷は、少なくとも海馬に影響を与え、より好ましくは、脳損傷は少なくとも海馬における脳細胞の完全性を破壊する。
【００９７】
脊髄及び関連する神経節に対する例示的な損傷として、ポリオ後症候群、外傷性損傷、外科的損傷、又は麻痺性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
「神経変性疾患又は障害」という用語により、一般的に、ニューロンの死を含むニューロンの構造又は機能の進行性の喪失を特徴とする神経障害が意味される。
【００９９】
好ましい例示的な神経変性疾患として、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＤ）（ピック病、前頭葉変性を含む様々な状態に及ぶ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の海馬及び／又は皮質のニューロンの構造又は機能の進行性の喪失を特徴とする疾患；進行性核上性麻痺、線条体黒質変性症、大脳皮質基底核変性症、オリーブ橋小脳萎縮症等の基底核（具体的には、視床下核、黒質、及び淡蒼球）、脳幹（具体的には、核上性眼球運動が存在する中脳部分）、小脳の歯状核におけるニューロン死を含むニューロンの構造又は機能の進行性の喪失を特徴とする疾患が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１００】
神経変性疾患の他の例としては、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、ハンチントン病（ＨＤ）及び他のポリグルタミン伸長病、ピック病、進行性核上性麻痺、線条体黒質変性症、大脳皮質基底核変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、リー病、小児壊死性脳脊髄障害、ハンター病（Hunter's disease）、ムコ多糖症、様々な白質萎縮症（例えばクラッベ病、ペリツェウス−メルツバッハー病等）、黒内障（家族性）白痴、クーフス病、シュピールマイアー−フォークト病、テイ−サックス病、バッテン病、ヤンスキー−ビールショースキー病、ライ病、大脳性運動失調症、慢性アルコール依存症、脚気、ハレルフォルデン−スパッツ症候群、小脳変性症等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０１】
神経変性疾患はアルツハイマー病（ＡＤ）又はパーキンソン病（ＰＤ）であるのが好ましい。
【０１０２】
アルツハイマー病では、海馬は最初に傷害を負う脳領域の１つである（Hampel et al. 2008. Alzheimer & Dementia 4: 38-48）。本明細書に教示されるエストロゲン成分又は医薬組成物は、したがって、或る特定の実施形態では、前臨床段階又は最も初期の臨床段階のＡＤ等の最も初期段階のＡＤにある被験体の処置、特に治療的処置に特に好適であり得る。したがって、或る特定の好ましい実施形態では、処置される神経障害は初期段階のＡＤ（すなわち、前臨床段階又は最も初期の臨床段階のＡＤ）である。
【０１０３】
また、パーキンソン病は、海馬の傷害と関連する。特に、記憶障害を呈する初期段階の認知症を伴わないＰＤ患者（Brueck et al. 2004. J Neurol Neurosurg Psychiatry 75: 1467-1469）、及び軽度の認知障害又は認知症を有するＰＤ患者（Camicioli et al. 2003. Mov Disorder 18: 784-790）に海馬の委縮が観察された。したがって、或る特定の好ましい実施形態では、処置される神経障害は、初期段階の認知症を伴わないＰＤ又は軽度認知障害（ＭＣＩ）を伴うＰＤである。
【０１０４】
本明細書に教示されるエストロゲン成分又は医薬組成物を用いて処置することができる神経障害の更に好ましい例としては、脱髄性自己免疫障害、例えば多発性硬化症；中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性疾患又は感染性ウイルス疾患、例えばＡＩＤＳ脳症、脳炎後パーキンソニズム、ウイルス性脳炎、細菌性髄膜炎の感染又は感染性疾患の他のＣＮＳへの影響によって引き起こされる神経学的欠損；神経疾患の症状としての皮質性知覚認知障害、例えば前庭機能障害、バランス調整障害（balance and coordination disorders）、目眩、歩行問題、失読症、手指巧緻障害（clumsiness）、聴覚識別変調障害（audition discrimination and modulation disorders）、視覚問題、眼球運動調整障害又は知覚障害（sensory disturbance）；腸機能障害、例えば便秘又は失禁；並びにＣＮＳ疾患の症状としての膀胱制御障害、例えば尿失禁；脳性麻痺後の呼吸機能不全；皮膚への血流異常、異常な性的応答、勃起機能不全、頭痛、頸部痛、背部痛、外傷の状況下での脳脊髄障害、体位性起立性頻拍、起立耐性失調、起立性低血圧、卒倒、神経因性腸及び神経因性膀胱を引き起こす自律神経性機能障害が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１０５】
本明細書に教示されるエストロゲン成分又は医薬組成物を用いて処置することができる神経障害の例としては、脱髄性自己免疫障害、例えば多発性硬化症；中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症性疾患、例えばクロイツフェルト−ヤコブ病又は他の遅発感染性ウイルス疾患、ＡＩＤＳ脳症、脳炎後パーキンソニズム、ウイルス性脳炎、細菌性髄膜炎の感染又は感染性疾患の他のＣＮＳへの影響によって引き起こされる神経学的欠損；皮質性運動機能障害、例えば痙縮、不全麻痺、クローン（clones）又は反射亢進；皮質性知覚認知障害、例えば前庭機能障害、バランス調整障害、目眩、歩行問題、失読症、手指巧緻障害、発育遅延、聴覚識別変調障害、遅滞及び機械的発話障害（delayed and mechanical speech disorders）、視覚問題、眼球運動調整障害又は知覚障害；脳神経機能の低下（lower cranial nerve dysfunctions）、例えば発話間の調整、嚥下又は流暢な発音の喪失；腸機能障害、例えば胃食道の括約筋制御問題；異常な尿機能、例えば遺尿症、夜尿症又は膀胱制御障害；呼吸機能不全、例えば過度のいびき、閉塞性若しくは中枢性の無呼吸、又は酸素及び二酸化炭素レベルに対する異常な呼吸応答；睡眠時呼吸障害、例えば睡眠時無呼吸、筋肉機能不全又は乳児突然死；発育障害、例えばキアリ奇形；又は先天性疾患、例えばダウン症候群、モルキオ症候群、脊椎骨端異形成症、軟骨形成不全症又は骨形成（osteogenesis）；神経学的行動障害、例えば注意欠陥多動性障害、不安症、双極性障害、統合失調症又はうつ病を含む精神的問題、自閉症、アスペルガー症候群及び特定不能の広汎性行動障害を含む自閉症スペクトラム障害；解剖学的状態、例えば扁平頭蓋底、歯状突起（retroflexed odontoid）、頭蓋底陥入及び大後頭孔狭窄；後天性骨軟化状態、例えばくる病、パジェット病又は副甲状腺機能亢進症；代謝性骨障害；過可動性結合組織障害、例えばエーラース−ダンロス症候群を含む結合組織障害；頸延髄部症候群；腎臓の代謝性又は内分泌性症候群；皮膚への血流異常、異常な性的応答、ＧＥＲＤＳ、統合運動障害、特発性脊柱側彎、頭痛、頸部痛、背部痛、頭部痛、外傷の状況下での脳脊髄障害、新生物、体位性起立性頻拍及び延髄（bulbar）所見を引き起こす自律神経性機能障害が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
実験の項に示されるように、本明細書で教示されるエストロゲン成分は、脳傷害に対して治療効果を呈し、低酸素性虚血後の神経発生及び血管新生を促す。したがって、本明細書で教示されるエストロゲン成分又は医薬組成物は、低酸素性脳損傷、無酸素性脳損傷及び／又は外傷性脳損傷の処置に好適であり、エストロゲン成分又は医薬組成物は低酸素症、虚血及び／又は外傷の後に投与される。特に、本明細書で教示されるエストロゲン成分又は医薬組成物は、好ましくは新生児の低酸素性虚血性脳症等の低酸素性虚血性脳症の処置に好適であり、エストロゲン成分又は医薬組成物は低酸素性虚血の後に投与される（すなわち、ＨＩＥの治療的処置）。好ましくは、エストロゲン成分又は医薬組成物は、ヒト被験体等の被験体の低酸素症、虚血、外傷又は低酸素性虚血の後１２時間以内、９時間以内、又は６時間以内、より好ましくは低酸素症、虚血、外傷又は低酸素性虚血の後６時間以内、例えば５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、１時間以内、３０分以内、又は１５分以内といった低酸素症、虚血、外傷又は低酸素性虚血の後できる限り早期に投与される。
【０１０７】
上述のとおり、本明細書に教示されるエストロゲン成分又は医薬組成物は、特にＡＤの処置にも好適であり得る。例えば、本明細書に教示されるエストロゲン成分又は医薬組成物は、ＡＤの予防処置又は防止処置に好適であり、エストロゲン成分又は医薬組成物は、ＡＤの家族歴の或る閉経女性に投与される。本明細書に教示されるエストロゲン成分又は医薬組成物は、初期段階のＡＤの治療的処置にも好適であり、エストロゲン成分又は医薬組成物は初期段階のＡＤと診断された患者に投与される。
【０１０８】
初期段階のＡＤの診断は、例えば、ＭＲＩ等の神経画像化により達成することができ、これにより初期段階のＡＤ患者は海馬構造の委縮を特徴とする（上記Hampel et al. 2008.）。代替的には又は追加的に、初期段階のＡＤの診断は、例えばアミロイドベータ４２（Ａβ４２）、アミロイドベータ４０比率（Ａβ４０）、総タウタンパク質、過剰リン酸化タウタンパク質、β−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）、又はこれらの任意の組合せ等の脳脊髄液中のバイオマーカーの評価に基づいて確立することができ得る（上記Hampel et al. 2008.）。
【０１０９】
上述のとおり、本明細書に教示されるエストロゲン成分又は医薬組成物は、特に、初期段階の認知症を伴わないＰＤ又は軽度の認知障害（ＭＣＩ）を伴うＰＤの処置、より好ましくは初期段階の認知症を伴わないＰＤ又は軽度の認知障害を伴うＰＤの治療的処置にも好適であり、エストロゲン成分又は医薬組成物は、初期段階の認知症を伴わないＰＤと診断された患者、具体的には記憶障害を呈する初期段階の認知症を伴わないＰＤと診断された患者、又はＭＣＩを有するＰＤと診断された患者に投与される。
【０１１０】
患者を初期段階の認知症を伴わないＰＤと診断することは、ＰＤの臨床症状の検査に基づいて行うことができ、初期段階の認知症を伴わないＰＤ患者は、任意に、例えばＭＲＩ等の神経画像化技法と組合せて、振戦、硬直及び運動減少からなる群から選択される少なくとも２つのＰＤ症状を有する。容積測定ＭＲＩ画像診断は、ＰＤの認知症に関する初期マーカーを提供する可能性があり、初期段階の認知症を伴わないＰＤ患者、及び軽度の認知障害を有するＰＤ患者は海馬の委縮を特徴とする。例えば、言語記憶（ＶＥＭ）に関するウェクスラー記憶検査改訂版等の神経心理学的試験により記憶障害を評価することができる。
【０１１１】
本明細書で教示されるエストロゲン成分は、単独で使用されてもよく、又は任意の既知の神経障害の治療法と組合せて使用されてもよい（「併用療法」）。
【０１１２】
本明細書で熟考される併用療法は、本明細書で教示される少なくとも１つのエストロゲン成分と少なくとも１つの他の薬学的又は生物学的な有効成分との投与を含み得る。上記エストロゲン成分及び上記薬学的又は生物学的な有効成分は、同一又は別々の医薬組成物（複数の場合もあり）のいずれかで同時に、別々に又は任意の順序で順次に投与され得る。
【０１１３】
少なくとも１つの「他の薬学的又は生物学的な有効成分」は、特に、神経障害を処置するのに有効で、エストロゲン成分との相乗効果をもたらしても又はもたらさなくてもよい、本明細書に記載されるエストロゲン成分以外の物質を指す。特に、好ましくは新生児ＨＩＥ等のＨＩＥの処置における使用のための本明細書に教示されるエストロゲン成分と組合せて投与されるのに好適な薬学的又は生物学的な有効成分の非限定的な例として、抗てんかん薬、エリスロポエチン、メラトニン及びキセノンが挙げられる。
【０１１４】
また、本明細書で熟考されるのは、中等度の低体温法（すなわち、３３℃〜３４℃までの体温の低下）と本明細書に教示される少なくとも１つのエストロゲン成分の投与との組合せである。かかる併用療法は、好ましくは新生児ＨＩＥ等の低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の処置、好ましくは治療的処置に特に好適であり得る。
【０１１５】
本明細書に開示されるエストロゲン成分は、１以上の薬学的に許容可能な担体／賦形剤と共に医薬組成物又は医薬製剤に製剤化され得る。医薬組成物は、本明細書に開示される１以上のエストロゲン成分を含み得る。また、医薬組成物は、上記に定義される１以上の他の薬学的又は生物学的な有効成分を更に含み得る。したがって、本明細書に開示されるエストロゲン成分を含む医薬組成物もまた、本明細書に開示される。
【０１１６】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な」という用語は、当該技術分野と矛盾することがなく、医薬組成物の他の成分と適合性であって、その受容者に有害でないことを意味する。
【０１１７】
本明細書で使用される「担体（carrier）」又は「賦形剤（excipient）」は、ありとあらゆる溶媒、希釈剤、バッファー（例えば中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、又は任意でＴｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸若しくはリン酸バッファー等）、可溶化剤（例えばＴｗｅｅｎ  ８０、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０等）、コロイド、分散媒、ビヒクル、充填剤、キレート剤（例えばＥＤＴＡ又はグルタチオン等）、アミノ酸（例えばグリシン等）、タンパク質、崩壊剤、結合剤、滑剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、甘味料、着色料、香料、着香料（aromatisers）、増粘剤、デポ効果を達成するための作用剤、コーティング剤、抗真菌剤、保存剤（例えばＴｈｉｍｅｒｏｓａｌ（商標）、ベンジルアルコール等）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム等）、張性制御剤、吸収遅延剤、アジュバント、増量剤（例えばラクトース、マンニトール等）等を含む。医薬組成物を製剤化するためのかかる媒質及び薬剤の使用は、当該技術分野においてよく知られている。任意の従来の媒質及び薬剤が有効成分（復数の場合もあり）と適合性でない場合を除き、治療用組成物におけるその使用が熟慮され得る。好適な薬学的担体は、とりわけRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)に記載される。
【０１１８】
医薬組成物は、それ自体当業者に既知の様式で調製することができる。この目的のため、本明細書に開示される少なくとも１つのエストロゲン成分、１以上の固体又は液体の薬学的賦形剤を、所望であれば、上記に定義される１以上の他の薬学的又は生物学的な有効成分と組合せて、ヒト医学又は獣医学の医薬として使用され得る好適な投与形態又は剤形とする。担体若しくは賦形剤又は他の原料の正確な特徴は、投与経路に依存する。投与様式に応じて固体、半固体、又は液体であってもよい、かかる好適な投与形態、更にその調製に使用される方法及び担体もまた当業者に明らかであり、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences（上記）等の標準的なハンドブックを参照する。
【０１１９】
例えば、本明細書で教示される医薬組成物は、発熱物質を含まず、好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する、非経口的に許容可能な水溶液の形態で非経口的に（静脈内注射、脳内注射、脳室内注射、筋肉内注射、若しくは皮下注射、又は静脈内点滴等により）投与することができる。代替的には、本明細書に教示される医薬組成物は、経口的、例えば、丸剤、錠剤、ラッカー被覆錠（lacquered tablets）、糖衣錠、顆粒、ハードゼラチンカプセル及びソフトゼラチンカプセル、水溶液、アルコール溶液若しくは油性溶液、シロップ、乳剤若しくは懸濁剤の形態で、又は経直腸的に、例えば坐剤の形態で、経皮的に若しくは局所的に（点眼を含む）、例えば軟膏、チンキ、スプレー若しくは経皮治療システム（例えば、皮膚パッチ等）の形態で、又は鼻腔用スプレー若しくはエアロゾル混合物の形態の吸入により、又は、例えばマイクロカプセル、インプラント若しくはロッドの形態で投与することができる。
【０１２０】
丸剤、錠剤、糖衣錠及びハードゼラチンカプセルの製造のため、例えば、乳糖、デンプン、例えばトウモロコシデンプン又はデンプン誘導体、タルク、ステアリン酸又はその塩等を使用することができる。ソフトゼラチンカプセル及び坐剤用の担体は、例えば、脂質、ワックス、半固形及び液体のポリオール、天然油又は硬化油等である。溶液、例えば注射溶液、又は乳剤若しくはシロップの調製用の好適な担体は、例えば、水、生理学的塩化ナトリウム溶液、エタノール、グリセロール、ポリオール等のアルコール、ショ糖、転化糖、ブドウ糖、マンニトール、植物油等である。また、有効成分（復数の場合もあり）を凍結乾燥し、得られた凍結乾燥物を、例えば、注射用又は点滴用の調製剤を調製するために使用することもできる。マイクロカプセル、インプラント又はロッドに好適な担体は、例えば、グリコール酸と乳酸との共重合体である。
【０１２１】
経口投与形態のため、本発明の組成物を、賦形剤、安定化剤、又は不活性な希釈剤等の好適な添加剤と共に混合し、通例の方法を用いて、錠剤、被覆剤、ハードカプセル、水溶液、アルコール溶液又は油性溶液等の好適な投与形態とすることができる。好適な不活性な担体の例は、アラビアゴム、酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、リン酸カリウム、乳糖、ブドウ糖、又はデンプン、特にコーンスターチである。この場合、乾燥顆粒及び湿顆粒の両方で調製を行うことができる。好適な油性賦形剤又は溶媒は、ヒマワリ油又はタラ肝油等の植物性油又は動物性油である。水溶液又はアルコール溶液用の好適な溶媒は、水、エタノール、糖溶液、又はこれらの混合物である。ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールもまた、他の投与形態に対する更なる助剤として有用である。即時放出錠として、これらの組成物は微結晶セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、及び乳糖及び／又は当該技術分野で既知の他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤及び滑剤を含有し得る。
【０１２２】
本明細書に開示される少なくとも１つのエストロゲン成分を含む医薬組成物の経口投与は、任意には細かく分割された固形担体をも含む、好適な量の粉末形態の上記成分を共に均一に十分にブレンドし、例えばハードゼラチンカプセルに上記ブレンドをカプセル化することにより好適に達成される。固形担体は、結合剤、滑剤、崩壊剤、着色剤等として作用する１つ以上の物質を含み得る。好適な固形担体としては、例えばリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖類、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン、低融点ワックス及びイオン交換樹脂が挙げられる。
【０１２３】
本明細書に記載される医薬組成物を含有する圧縮剤は、有効成分（復数の場合もあり）を上述のような固形担体と均一に十分に混合して必要な圧縮特性を有する混合物を与え、その後、この混合物を好適な機械で所望の形状及び大きさに圧縮することにより調製され得る。湿製錠剤は、不活性な液体希釈剤で加湿した粉末化有効成分（復数の場合もあり）の混合物を好適な機械で成形することにより作製され得る。
【０１２４】
鼻エアロゾル又は吸入により投与される場合、これらの組成物は、医薬製剤の分野でよく知られている技法に従って調製することができ、ベンジルアルコール又は他の好適な保存剤、バイオアベイラビリティを高めるための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は当該技術分野で既知の他の可溶化剤若しくは分散剤を利用して生理食塩水溶液として調製することができる。エアロゾル又はスプレーの形態で投与されるのに好適な医薬製剤は、例えば、エタノール若しくは水、又はかかる溶媒の混合物等の薬学的に許容可能な溶媒中の本発明の化合物又は生理学的に忍容性のあるそれらの塩の溶液、懸濁液、又は乳剤である。必要であれば、製剤は、界面活性剤、乳化剤及び安定化剤、また噴射剤等の他の薬学的な助剤を追加的に含有することも可能である。
【０１２５】
皮下又は静脈内投与のため、本明細書に記載されるエストロゲン成分（復数の場合もあり）を、所望であれば、可溶化剤、乳化剤、又は更なる助剤等の慣用の物質と共に溶液、懸濁液、又は乳剤とする。また、有効成分（復数の場合もあり）は凍結乾燥されてもよく、得られた凍結乾燥物は、例えば注射調製剤又は点滴調製剤の製造に使用され得る。好適な溶媒は、例えば、水、生理学的食塩水、又はアルコール（例えば、エタノール、プロパノール、グリセロール）、また更にはブドウ糖液若しくはマンニトール液等の糖溶液、又は代替的には言及された様々な溶媒の混合物である。注射可能な溶液又は懸濁液は、マンニトール、１，３−ブタンジオール、水、リンゲル溶液、若しくは等張な塩化ナトリウム溶液等の好適な非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤若しくは溶媒、又は合成モノグリセリド若しくはジグリセリドを含む滅菌した無刺激の不揮発性油、及びオレイン酸を含む脂肪酸等の好適な分散剤若しくは湿潤剤及び懸濁剤を使用して当該技術分野に従って製剤化され得る。
【０１２６】
坐剤の形態で経直腸的に投与される場合、これらの製剤は、本明細書に記載されるエストロゲン成分と、常温で固形であるが直腸腔で液化及び／又は溶解して薬物を放出する、カカオバター、合成グリセリドエステル、又はポリエチレングリコール等の好適な非刺激性の賦形剤とを混合することにより調製され得る。
【０１２７】
かかる調製剤の或る好ましい非限定的な例として、ボーラス投与用及び／又は継続投与用の錠剤、丸剤、粉末、トローチ、サシェ、オブラート、エリキシル、懸濁液、乳剤、溶液、シロップ、エアロゾル、軟膏、クリーム、ローション、ソフトゼラチンカプセル及びハードゼラチンカプセル、坐剤、点眼剤、滅菌注射溶液ならびに滅菌包装粉末（通常、使用前に再構成される）が挙げられ、これらは乳糖、デキストロース、ショ糖、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルギネート、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、セルロース、（滅菌）水、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート及びプロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、食用油、植物油及び鉱物油、又はこれらの好適な混合物等のそれ自体かかる製剤に好適である担体、賦形剤及び希釈剤と共に製剤化され得る。製剤は、他の薬学的に有効な物質（本発明の化合物との相乗効果をもたらしてもよく、又はそうでなくてもよい）、並びに滑剤、湿潤剤、乳化剤及び懸濁剤、分散剤、崩壊剤、充填剤、フィラー、保存剤、甘味剤、風味剤、粘度調節剤（flow regulators）、放出剤等の医薬製剤で一般的に使用される他の物質を任意に含有することができる。
【０１２８】
医薬組成物は、例えば、リポソーム又は天然のゲル若しくは合成高分子に基づく親水性高分子マトリクスを使用して、そこに含有される有効成分（復数の場合もあり）の即時放出、持続放出、又は遅延放出を提供するように製剤化され得る。
【０１２９】
上記に定義される１以上の他の薬学的又は生物学的な有効成分と任意に組合せて使用される本明細書に開示されるエストロゲンの投与量又は量は、個々の場合に依存し、慣習的に、最適な効果を達成するために個々の状況に適合される。よってその投与量又は量は、処置される障害の特徴及び重症度、また処置されるヒト若しくは動物の性別、年齢、体重、食事、一般的な健康状態、個々の反応性、使用される成分の有効性、代謝安定性及び作用期間、投与の様式及び時間、排出速度、治療法が急性的若しくは慢性的、若しくは予防的であるかどうか、又はエストロゲン成分に加えて上記に定義される他の薬学的若しくは生物学的な有効成分が投与されるか、若しくは他の治療法が適用されるかどうかに依存する。
【０１３０】
限定されないが、障害の種類及び重症度に応じて、典型的な１日当たりの投与量は上述の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ体重〜約２５０ｍｇ／ｋｇ体重以上、例えば約１μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ／ｋｇ体重〜約０．４ｍｇ／ｋｇ体重、又は約５μｇ／ｋｇ体重〜約０．４ｍｇ／ｋｇ体重の範囲内である場合がある。好ましくは、１日当たりの投与量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、更に好ましくは約２ｍｇ／ｋｇ体重〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、例えば約５ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。
【０１３１】
数日又はそれ以上に亘る反復投与については、状態に応じて、病徴の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。エストロゲン成分の好ましい投与量は、約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、更に好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。よって、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇ（又はその任意の組合せ）の１以上の用量を患者に投与し得る。
【０１３２】
他の利用可能な投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。よって、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はその任意の組合せ）の１以上の用量を患者に投与し得る。かかる用量は、１日あたりの単回用量、１日あたりの１回以上の分割用量として投与されてもよく、又は例えば点滴を使用して原則として継続的に投与されてもよく、又は例えば１週間若しくは３週間ごとに断続的に投与されてもよい。
【０１３３】
本明細書に開示される医薬調製剤は、好ましくは単位投与量形態であり、好適には、例えば箱、ブリスター、バイアル、瓶、サシェ、アンプル、又は任意の他の好適な単回投与若しくは複数回投与の入れ物若しくは容器（適切にラベルが貼られていてもよい）に包装されてもよく、任意に、製品情報及び／又は使用のための指示を含有する１以上の説明書を含んでもよい。通常、かかる単位投与量は、１ｍｇ〜１０００ｍｇ、例えば５ｍｇ〜５００ｍｇの本発明の少なくとも１つのエストロゲン成分を含有し、例えば、1単位投与量あたり約１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、７００ｍｇ、８００ｍｇ、９００ｍｇ又は１０００ｍｇを含有する。
【０１３４】
投与様式に応じて、医薬組成物は、好ましくは０．０５重量％〜９９重量％、より好ましくは０．１重量％〜７０重量％、更に好ましくは０．１重量％〜５０重量％の本明細書に記載されるエストロゲン成分、及び１重量％〜９９．９５重量％、より好ましくは３０重量％〜９９．９重量％、更に好ましくは５０重量％〜９９．９重量％の薬学的に許容可能な担体を含み、全てのパーセンテージは組成物の総重量に基づく。
【０１３５】
医薬組成物を一連の治療法の間の異なる時間に別々に投与するか、又は分割形態若しくは単回の配合形態で同時に投与することができる。本開示は、全てのかかる同時又は交互の処置の投与計画を包含し、「投与」という用語はそれに応じて解釈される。
【０１３６】
投与は、食品、例えば高脂肪食と共に行われてもよい。「食品と共に」という用語は、本明細書に記載される医薬組成物の投与の間、又はその前若しくは後約１時間以内の食事の摂取を意味する。
【実施例】
【０１３７】
実施例１：実験手順
試験動物：
Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ妊娠ラットをJanvier（フランス）から入手した。出産後、新生仔ラットをそれらの雌親と共に収容し、１２時間の明暗サイクルのもと、室温（２５℃）にて通常通り飼育した。全ての実験プロトコルは、リエージュ大学倫理委員会による承認を受けた。動物の苦痛を最小限にするためのあらゆる努力がなされた。
【０１３８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ操作：
新生仔ラットをシャム群、ビヒクル群、又はＥ４群に割り当てた。
【０１３９】
エステトロール（Ｅ４）を種々の濃度で生理食塩溶液に溶解し、等容量（５μｌ／ｇ）の溶液をＥ４群（復数の場合もあり）の仔ラットに腹腔内注射した。ビヒクル群の仔ラットに生理食塩溶液を腹腔内注射した。シャム群の仔ラットには注射を全く行わなかった。
【０１４０】
左総頸動脈の二重結紮及び切断を含む手術により虚血を生じさせ、１１％〜８％が酸素で残部が窒素の酸素濃度が減少された状態で２０分間吸入させた後、８％酸素及び９２％窒素の一定の濃度で３５分間吸入させることによって低酸素状態を生じさせた。シャム群は低酸素性虚血性傷害に供されなかった。
【０１４１】
全ての操作を３７℃で行った。
【０１４２】
仔ラット直腸温度の測定：
低酸素性傷害への暴露から０時間、２時間及び４時間後に直腸プローブ（ＲＥＴ−４、BioMedical Instruments、ドイツ、ツェルニッツ）を備えた多目的体温計（ＢＡＴ−１０Ｒ、Physitemp Instruments Inc.、米国、ニュージャージー州、クリフトン）を用いて仔ラットの直腸温度を測定した。温度の変動を低く維持するため、巣から仔ラットを移動してから１５分後に２５℃室にて直腸温度の測定を行った（すぐに測定が行われた最初の低酸素後測定を除く）。直腸温度は、脳深部温度に非常によく対応することが示されている（Thoresen et al. 1996. Arch Dis Child Fetal Neonatal 74: F3-F9、Yager et al. 1993. Pediatr Res 34: 525-529）。
【０１４３】
血液試料及び脳試料の調製：
出生後１４日目に仔ラットを屠殺した。動物を過剰量のペントバルビタールナトリウム（１００ｍｇ／ｋｇ、ｉｐ）で深く麻酔した。
【０１４４】
血液を採取し、遠心分離し、血清試料を−８０℃で保存した。
【０１４５】
その後、動物を経心的に４℃の０．９％生理食塩溶液で灌流した後、４℃のリン酸緩衝生理食塩溶液０．１ｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒドで灌流した。脳を素早く分離し、計量し、同じ固定溶液中に４℃にて２４時間浸漬し、段階的なエタノール及びキシレン系で脱水し、パラフィンに包埋した。
【０１４６】
ヘマトキシリン−エオシン染色（組織化学）：
摘出した脳のパラホルムアルデヒド固定パラフィン包埋試料を、Ｐａｘｉｎｏｓラット脳アトラス（Paxinos and Watson 2007. In: The rat brain in stereotaxic coordinates, 6th edition）に従い海馬領域の同じレベルで冠状切片にした。切片の厚さは５μｍであった。ヘマトキシリン−エオシン染色を行った。簡潔には、染色前に切片をキシレン中で脱パラフィンし、段階的なエタノール濃度中で再水和した。スライドをヘマトキシリンで染色し、数秒間水ですすぎ、その後１％エオシン中に置き、洗浄し、脱水し、カバーガラスで覆った。
【０１４７】
無傷細胞の計測：
各脳領域の３視野において倍率４００倍で仔ラット脳のヘマトキシリン−エオシン染色切片に対して無傷細胞の計測を行った。皮質及び海馬（領域：歯状回（ＤＧ）、顆粒細胞下帯（ＳＧＺ）、アンモン角（ＣＡ１、ＣＡ２／ＣＡ３））で計測を行った。顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１、Olympus、日本、東京）、画像スキャナ（ＤｏｔＳｌｉｄｅ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、Olympus、ドイツ）及びＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、米国）を用いて切片を解析した。
【０１４８】
無傷細胞は損傷を受けていない。損傷細胞は、萎縮した、濃縮された、又は青白く肥大した非均一な核密度を伴う青白いエオシン好性の染色を特徴とする。
【０１４９】
微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）染色：
神経細胞骨格の破壊の免疫組織化学的検出のため脳切片を加工した。抗原の回復のため、切片を１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０）中で１００℃にて１０分間加熱した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、３％過酸化水素を用いて１０分間阻害し、５％正常ヤギ血清を用いた２度目の阻害の後、１：１０００に希釈した抗微小管結合タンパク質２（ＭＡＰ２）抗体（マウスモノクローナル抗体；Sigma、米国、ミズーリ州、セントルイス）と共に室温にて１時間、切片をインキュベートした。すすいだ後、ビオチン化ヤギ抗マウス免疫グロブリンＧ（Vector Laboratories、カリフォルニア州、バーリンガム）を添加し、色素原として３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を用いてアビジン−ビオチン複合体法（Vector Laboratories）により抗体検出を行った。ＤＡＢとの反応後、スライドを洗浄し、脱水し、カバーガラスで覆った。
【０１５０】
画像スキャナ（Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒ  Ｖｉｒｔｕａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、日本、東京、浜松）及びＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ、米国）を用いて試料を解析した。同側半球及び対側半球のＭＡＰ２陽性領域を測定した。同側半球のＭＡＰ２陽性領域を対側半球のＭＡＰ２陽性領域で除算して、ＭＡＰ２陽性領域の比率を算出した。シャム群のＭＡＰ２陽性領域の比率をデフォルトで１．０とした。
【０１５１】
ダブルコルチン−血管内皮成長因子二重染色：
切片を１０ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸緩衝溶液（ｐＨ６．０）中で１００℃にて１０分間加熱した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、３％過酸化水素を用いて１０分間阻害し、５％正常ヤギ血清を用いた２度目の阻害の後、１：１０００に希釈した抗ダブルコルチン（ＤＣＸ）抗体（ウサギポリクローナル抗体；Abcam、英国、ケンブリッジ）及び１：１００に希釈した抗血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）抗体（マウスモノクローナル抗体；Abcam、英国、ケンブリッジ）と共に、切片を４℃にて終夜インキュベートした。すすいだ後、１：１０００で希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）ヤギ抗ウサギ抗体、及び１：１０００で希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）ヤギ抗マウス抗体（Invitrogen Inc.、ベルギー、ヘント）を添加し、切片を室温にて１時間インキュベートした。蛍光試験用の４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）を含有する封入剤を使用した（Vector Laboratories）。顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｖａｎｏｘ  ＡＨＢＴ３、Olympus）及びＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いて試料を解析した。ＤＣＸ又はＶＥＧＦのいずれかの陽性染色細胞の合計をＤＡＰＩ陽性細胞の総数で除算して陽性染色細胞の割合を定量化し、パーセンテージで表した。
【０１５２】
血清試料中のＳ１００Ｂ及びグリア細胞線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の検出：
血清試料において脳傷害マーカーであるＳ１００Ｂタンパク質（カタログ番号ＣＳＢ−Ｅ０８０６６ｒ、Cusabio Biotech Co., LTD、中国）、及びグリア細胞線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（カタログ番号Ｅ９００６８Ｒａ、Uscn Life sciences Inc.、中国）を検出するためのＥＬＩＳＡを、製造業者の推奨に従って行った。
【０１５３】
統計学的解析：
ＳｔａｔＶｉｅｗソフトウェア（Abacus Concepts, Inc.、米国、カリフォルニア州、バークレー）を使用して解析を行った。ＡＮＯＶＡの後、Ｐ＜０．０５により有意性を示す、ＦｉｓｈｅｒのＰＬＳＤ、Ｓｃｈｅｆｆｅの検定及びＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ事後検定を使用して統計学的比較を行った。全ての値を平均±ＳＥＭとして表す。
【０１５４】
実施例２：新生児の低酸素性虚血性脳症の動物モデルにおけるエステトロールの神経保護効果
出産後、新生仔ラットを以下の４群のうちの１つに割り当てた：シャム群、ビヒクル群、Ｅ４  ５ｍｇ／ｋｇ／日群及びＥ４  ５０ｍｇ／ｋｇ／日群。４日目〜７日目を含めて、仔ラットにビヒクル（ビヒクル群）若しくはＥ４（割り当てられた群に従い５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射するか、又は注射を全く行わなかった（シャム群）。７日目の最後の注射から３０分後に、ビヒクル群及びＥ４（５ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇ）群の動物を、左総頚動脈二重結紮及び切断を含む手術に供し、その後、１１％〜８％が酸素で残部が窒素の酸素濃度が減少された状態で２０分間吸入させた後、８％酸素及び９２％窒素の一定の濃度で３５分間吸入させることによって低酸素状態を生じさせた。シャム群は、左総頚動脈の結紮及び低酸素状態を含まない同様の処理に供した。全ての操作を３７℃にて行った。出生後１４日目に屠殺されるまで仔ラットを雌親と共に回復させた。
【０１５５】
仔ラットの重量
注射に必要なビヒクル及びＥ４の量を決定するため、４日目〜７日目に仔ラットの重量測定を行い、仔ラットの手術後の健康状態をモニターするために７日目から１４日目までの間重量測定を行った。
【０１５６】
手術後１３日目及び１４日目において、Ｅ４  ５ｍｇ／ｋｇで処置した仔ラットは、ビヒクルで処置した動物よりも有意に体重が重かったのに対し、他の手術後の日において偽手術群は他の群よりも有意に体重が重かった：８日目（シャム対ビヒクル及びＥ４  ５ｍｇ／ｋｇ）、１０日目（シャム対Ｅ４  ５０ｍｇ／ｋｇ）、１２日目（シャム対ビヒクル）、１３日目（シャム対ビヒクル）及び１４日目（シャム対ビヒクル）（図１）。
【０１５７】
脳重量
脳重量の測定より、ビヒクル処置群よりもＥ４  ５ｍｇ／ｋｇ群及び偽手術群で有意に重いことが明らかとなった（図２）。
【０１５８】
ヘマトキシリン−エオシン染色（組織化学）：
ビヒクルで処置した群に由来する切片のみが、傷害と対側（右側）の海馬領域に伸びる梗塞領域で囲まれた、傷害と同側（左側）の海馬領域の可視的な組織破壊を示した（図３）。これらの結果は、いずれの用量でもＥ４が神経保護効果を有することを示している。
【０１５９】
無傷細胞の計測：
海馬のＤＧ領域では、１視野あたりの無傷細胞数は、ビヒクル群よりもＥ４  ５ｍｇ／ｋｇ群及び偽手術動物群において有意に多かった（図４）。ＳＧＺでは、Ｅ４  ５ｍｇ／ｋｇ群のみがシャム群及びビヒクル群と比較して無傷細胞数が有意に多かったのに対し、ＣＡ１では、試験群間で有意差は検出されなかった。海馬のＣＡ２／ＣＡ３領域では、Ｅ４  ５０ｍｇ／ｋｇ処置群のみが、ビヒクル処置群及びＥ４  ５ｍｇ／ｋｇ群よりも無傷細胞数が有意に多かったのに対し、皮質では、Ｅ４  ５０ｍｇ／ｋｇ群はビヒクル群と比べた場合のみ無傷細胞の数が有意に多かった。これらの結果は、エステトロールが神経保護効果を有することを示している。
【０１６０】
実施例３：新生児の低酸素性虚血性脳症の動物モデルにおけるエステトロールの神経保護効果
新生仔ラットを出生後４日目から以下の６群のうちの１つに割り当てた：シャム群（ｎ＝２４）、ビヒクル群（ｎ＝１４）、Ｅ４  １ｍｇ／ｋｇ／日群（ｎ＝１１）、Ｅ４  ５ｍｇ／ｋｇ／日群（ｎ＝１４）、Ｅ４  １０ｍｇ／ｋｇ／日群（ｎ＝１４）、又はＥ４  ５０ｍｇ／ｋｇ／日群（ｎ＝１９）。出生後４日目から、仔ラットにビヒクル（ビヒクル群）若しくはＥ４（Ｅ４群の割り当てに従って１ｍｇ／ｋｇ／日、５ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日又は５０ｍｇ／ｋｇ／日）のいずれかを腹腔内注射するか、又はビヒクル若しくはＥ４のいずれも注射しなかった（シャム群）。７日目の最後の注射から３０分後に、動物をイソフルラン（導入：３．０％；維持、１．５％）で麻酔し、ビヒクル群及びＥ４群の仔ラットを左総頚動脈二重結紮及び切断を含む手術に供した。処置の後、仔ラットを雌親に返し、１時間回復させた。その後、仔ラットを加湿した低酸素ｉｎ  ｖｉｖｏキャビネット（CoyLab、米国、ミシガン州、グラスレイク）に置いた。１１％〜８％が酸素で残部が窒素の酸素濃度が減少された状態で２０分間吸入させた後、８％酸素及び９２％窒素の一定の濃度で３５分間吸入させることによって低酸素状態を生じさせた。全ての操作を３７℃にて行った。シャム群を、左総頚動脈結紮後の低酸素状態及び注射を含まない同様の処理に供した。仔ラットを雌親と共に回復させ、出生後１４日目に屠殺するまで通常通り飼育した。
【０１６１】
直腸温度：
試験群間で直腸温度の有意差はなく、エステトロールによる前処置は体温に影響しないことを示していた（データは示されていない）。
【０１６２】
体重
行われた操作及びエステトロールの前処置による仔ラットの手術後の健康状態をモニターするため、出生後７日目〜１４日目を含めて体重をモニターした。図５は、出生後８日目及び１３日目の偽手術仔ラット及びエステトロールで前処置した仔ラットの手術後体重がビヒクルで前処置した動物よりも有意に重かったことを示す。さらに、出生後９日目の偽手術動物及び１０ｍｇ／ｋｇのエステトロールで前処置した動物はビヒクル群よりも体重が有意に重かったのに対し、出生後１０日目、１１日目及び１２日目の偽手術仔ラット、１ｍｇ／ｋｇで前処置した仔ラット及び１０ｍｇ／ｋｇで前処置した仔ラットはビヒクル群よりも有意に体重が重いことを示した。出生後１４日目の偽手術動物、ならびに１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇのエステトロールで前処置した動物は、ビヒクル群のみに対して体重が有意に重かった。しかしながら、出生後８日目、９日目、１０日目、１２日目の偽手術動物の体重は５ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇのエステトロール前処置群よりも有意に重かったのに対し、出生後１１日目、１３日目、１４日目の偽手術動物は５０ｍｇ／ｋｇのエステトロール前処置群のみに対して体重が有意に重かった。
【０１６３】
脳重量
可能性のある脳傷害を評価するため、仔ラット脳の測定を行った。図６は、ビヒクル群（１．０１６±０．０４２ｇ）よりもシャム群（１．２２５±０．００６ｇ）、ならびに１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（１．１５５±０．０２２ｇ）、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（１．１８１±０．０２３ｇ）、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（１．１７９±０．０１２ｇ）、及び５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（１．１６３±０．０１６ｇ）による前処置群で脳重量が有意に重かったことを示している。
【０１６４】
ヘマトキシリン−エオシン染色及び無傷細胞の計測：
ビヒクルで前処置した仔ラットの脳切片は、皮質まで及ぶ、傷害と同側の（左側の）海馬領域の可視的な組織破壊及び傷害を示した（図７ＡのＡ〜Ｃ）。
【０１６５】
海馬のＤＧ領域では、１視野あたりの無傷細胞数は、ビヒクル群（８４．５６３±５．９５４）（図７ＡのＢ（ｂ））よりも偽手術動物（１５４．５±７．９４２）（図７ＡのＢ（ａ））及び５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４を注射した動物（１２１．０±８．０９８）（図７ＡのＢ（ｄ））で有意に多かった（図７ＢのＤ）。さらに、ＳＧＺの無傷細胞数は、ビヒクル群（２３．８７５±３．３６３）（図７ＡのＢ（ｂ））よりも、シャム群（５８．３５７±３．６５３）（図７ＡのＢ（ａ））、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（４２．８４６±３．８８４）（図７ＡのＢ（ｄ））及び１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（４７．６±４．６７２）（図７Ｂ（ｅ））で有意に多かった（図７ＢのＤ）のに対し、同じ領域でシャム群は、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３５．６±２．７５）（図７ＡのＢ（ｃ））及び５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３０．７１４±３．６１５）（図７ＡのＢ（ｆ））よりも有意に多い無傷細胞数を示した（図７ＢのＤ）。ＣＡ１領域では、シャム群（７０．７１４±４．８１９）（図７ＡのＢ（ａ））と、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（４３．２±２．４３５）（図７ＡのＢ（ｃ））及び１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（５７．４±４．５６６）（図７ＡのＢ（ｅ））との間で有意差が検出されたのに対し、他の群は有意差を示さなかった（図７ＢのＤ）。海馬のＣＡ２／ＣＡ３領域では、シャム群（５６．９２９±４．８５９）（図７ＡのＢ（ａ））及び５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（５３．０±４．７）（図７ＡのＢ（ｆ））は、ビヒクル群（２９±３．５４３）（図７ＡのＢ（ｂ））よりも無傷細胞数が有意に多かったのに対し、シャム群のみが１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３２．８±２．８０８）（図７ＡのＢ（ｃ））よりも無傷細胞数が有意に多かった（図７ＢのＤ）。皮質では、５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（７６．２８６±３．９６２）（図７ＡのＣ（ｆ））は、ビヒクル群のみ（５１．９３８±５．３０４）（図７ＡのＣ（ｂ））に対して有意に多い無傷細胞数を示した（図７ＢのＤ）。
【０１６６】
ＭＡＰ２染色：
出生後１４日目の低酸素虚血（ＨＩ）後に特定された同側のＭＡＰ２染色の喪失を、初期の灰白質領域脱落のマーカーとして使用した。無傷ニューロンを含む領域はＭＡＰ２による染色を呈したのに対し、梗塞領域はＭＡＰ２染色の喪失を示した。特に、ビヒクル群では、皮質にまで及ぶ、傷害半球と同側の海馬領域におけるＭＡＰ２染色の喪失があった（図８Ａ（ｂ））。ＭＡＰ２陽性領域の比率の定量化により、エステトロールによる前処置後（図８Ｂ）、ＭＡＰ２陽性領域の比率は、ビヒクル群（０．６７５±０．０４６）（図８Ａ（ｂ））よりも、偽手術動物（デフォルト１．０）（図８Ａ（ａ））、及びエステトロール前処置群（１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（０．９２９±０．０１９）（図８Ａ（ｃ））、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（０．８８９±０．０６３）（図８Ａ（ｄ））、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（０．８９８±０．０２２）（図８Ａ（ｅ））、５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（０．９２２±０．０３１）（図８Ａ（ｆ）））で有意に高かったことが明らかとなった。
【０１６７】
ダブルコルチン−血管内皮成長因子二重染色：
出生後１４日目のＤＣＸ及びＶＥＧＦの発現を、それぞれ神経発生及び血管新生のマーカーとして使用した。エステトロール前処置により、ビヒクル群（３２．８３３±２．６２５％）よりも１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４で前処置した動物（５５．８±５．６５８％）の海馬ＤＧ領域におけるＤＣＸ陽性染色細胞の割合が有意に高くなった（図９Ａ）のに対し、同じ領域のＶＥＧＦ陽性染色細胞の割合は、ビヒクル群（２５．３３３±２．２７１％）よりも１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（４３．５±２．０８３％）、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（４６．０±４．３６１％）、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（４７．０±５．３６２％）、及び５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（４６．０±４．４６５％）で前処置した群で有意に高かった（図９Ｂ）。さらに、ＣＡ１領域では、ＤＣＸ陽性染色細胞の割合は、ビヒクル群（１１±１．５１８％）よりも５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３５．２±３．３０９％）、及び１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３４．１±６．６６４％）で有意に高かった（図９Ａ）のに対し、ＶＥＧＦ陽性染色細胞の割合は、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３７．４±７．６４５％）のみで有意に高かった（図９Ｂ）。ＣＡ２／ＣＡ３領域では、ＤＣＸ陽性染色細胞の割合は、ビヒクル群（６．４１７±１．０３３％）よりも５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３０．３±３．７％）で有意に高かったのに対し、ＶＥＧＦ陽性染色細胞の割合は、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３４．１±６．８５５％）においてのみ有意差に達した（図９Ｂ）。皮質では、ＤＣＸ及びＶＥＧＦ陽性染色細胞の割合は、ビヒクル群（それぞれ、２６．０±４．１５６％及び２０．５±２．４１４％）のみに対して１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（それぞれ、５２．１±７．７６２％及び４６．２±７．６４６％）で有意に高かった（それぞれ図９Ａ〜図９Ｂ）。
【０１６８】
血清Ｓ１００Ｂ及びグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）：
Ｓ１００Ｂ及びグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）を脳傷害のマーカーとして使用した。Ｓ１００Ｂタンパク質及びＧＦＡＰタンパク質に関するＥＬＩＳＡにより血清中のそれらの濃度を測定した。図１０Ａに示されるように、エステトロールによる前処置の後、Ｓ１００Ｂの濃度は、ビヒクルで前処置した動物（６９８．９２５±５７．３４２ｐｇ／ｍｌ）よりも偽手術動物（３４４．６１４±５０．３２８ｐｇ／ｍｌ）、及び５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３６１±３２．９１４ｐｇ／ｍｌ）で有意に低かったが、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群ではＳ１００Ｂ濃度はシャム群、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群、及び５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群よりも有意に高かった。
【０１６９】
図１０Ｂは、ビヒクル群（１００３．９２６±２８８．３４５ｐｇ／ｍｌ）よりも偽手術動物（４０７．５６７±４９．２５８ｐｇ／ｍｌ）、及び５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４で前処置した動物（３００．３８８±３１．２３２ｐｇ／ｍｌ）でＧＦＡＰ濃度の有意な減少が観察されたことを示す。
【０１７０】
結論：
本結果は、エステトロールが、ＨＩＥの動物モデルの海馬構造及び皮質において用量依存的な神経保護効果を有することを示している。また、本結果によれば、エステトロールによる前処置は、初期の灰白質の脱落を減少し、神経発生及び血管新生を促す。さらに、エステトロールによる前処置は、体重、脳重量又は体温に何らの有害効果も有していない。
【０１７１】
実施例４：新生児の低酸素性虚血性脳症の動物モデルにおけるエステトロールの治療効果
エステトロールの治療効果を試験するため、新生仔ラットを出生後７日目に以下の６群のうちの１つに割り当てた：シャム群（ｎ＝２９）、ビヒクル群（ｎ＝２０）、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（ｎ＝１６）、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（ｎ＝１９）、１０ｍｇ／ｋｇ／日  Ｅ４（ｎ＝１７）及び５０ｍｇ／ｋｇ／日  Ｅ４群（ｎ＝１５）。出生後７日目に動物をイソフルラン（導入、３．０％；維持、１．５％）で麻酔し、ビヒクル群及びＥ４群の仔ラットを左総頚動脈二重結紮及び切断を含む手術に供した。手術後、仔ラットを雌親に返し、１時間回復させた。その後、仔ラットを加湿した低酸素ｉｎ  ｖｉｖｏキャビネット（CoyLab）に置いた。１１％〜８％が酸素で残部が窒素の酸素濃度が減少された状態で２０分間吸入させた後、８％酸素及び９２％窒素の一定の濃度で３５分間吸入させることによって低酸素状態を生じさせた。全ての操作を３７℃で行った。
【０１７２】
低酸素チャンバーからの回復に際し、仔ラットにビヒクル（ビヒクル群）又は割り当てた群に従ってＥ４（１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は５０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかを腹腔内注射した。シャム群の動物を、左総頚動脈結紮及び切断後の低酸素状態、又はビヒクル若しくはエステトロール投与のいずれも行わない同様の処置に供した。仔ラットを出生後１４日目に屠殺するまで雌親と共に回復させた。
【０１７３】
直腸温度：
試験群間で直腸温度に有意差はなく、エステトロール処置は体温に影響しないことを示していた（データは示されていない）。
【０１７４】
体重
行われた操作及びエステトロールの処置による仔ラットの手術後の健康状態を評価するため、出生後７日目〜１４日目に手術後の体重を測定した。図１１は、出生後１４日目の偽手術動物、及び１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群、及び５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群の動物は、ビヒクル群よりも体重が有意に重かったことを示す。偽手術動物は、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４処置群よりも有意に重い体重を示した。
【０１７５】
脳重量
図１２は、ビヒクル群（０．９３７±０．０２２ｇ）よりも偽手術動物（１．２１４±０．００７ｇ）、ならびに１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（１．０９９±０．０３７ｇ）、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（１．０６±０．０３５ｇ）、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（１．１２±０．３３ｇ）及び５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（１．１６３±０．０２５ｇ）において、脳重量が有意に重かったことを示す。偽手術動物は、５ｍｇ/ｋｇ  Ｅ４群よりも有意に重い脳重量を示した。この結果パターンは、実施例３と同じである。
【０１７６】
ヘマトキシリン−エオシン染色及び無傷細胞の計測：
海馬のＤＧ及びＳＧＺ領域では、１視野あたりの無傷細胞数は、ビヒクル群の動物（図１３ＡのＢ（ｂ））よりも偽手術動物（図１３ＡのＢ（ａ））で有意に高かった（それぞれ、１６０．８±７．０７４対８８．２±１９．４７７、及び６０．８±４．６３５対２８．３±６．７３）（図１３ＢのＤ）。ＣＡ１領域では、無傷細胞数は、ビヒクル群（２８．４±６．９９７）（図１３ＡのＢ（ｂ））よりもシャム群（６９．４±５．２５６）（図１３ＡのＢ（ａ））、及び１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（５１．５±２．５）（図１３ＡのＢ（ｃ））で有意に高く、シャム群では、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（４５．３±２．９８９）（図１３Ｂ（ｄ））、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（４６．０±３．１９）（図１３ＡのＢ（ｅ））、及び５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（４６．６±５．３３６）（図１３ＡのＢ（ｆ））よりも有意に高かった（図１３ＢのＤ）。海馬のＣＡ２／ＣＡ３領域では、偽手術動物（５７．１±６．１９２）（図１３ＡのＢ（ａ））及び１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４で処置した動物（３５．２±３．１６９）（図１３ＡのＢ（ｅ））は、ビヒクル群（１３．８±３．０１８）よりも無傷細胞数が有意に多かったのに対し、シャム群は、１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３３．９±４．３０６）、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３３．８±４．７０４）、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３５．２±３．１６９）、及び５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３０．５±２．５２７）よりも無傷細胞数が有意に多かった（図１３ＢのＤ）。皮質では、偽手術動物（７０．１±６．１６５）（図１３ＡのＣ（ａ））及び５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（５７．１±７．０１２）（図１３ＡのＣ（ｄ））、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（５６．９±５．９５８）（図１３ＡのＣ（ｅ））及び５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（５４．５±３．４０３）（図１３ＡのＣ（ｆ））で処置した動物は、ビヒクル群（２３．２±３．８７２）（図１３ＡのＣ（ｂ））よりも有意に多い無傷細胞数を示したのに対し、シャム群は１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（４２．４±４．８６５）（図１３ＡのＣ（ｃ））よりも無傷細胞数が有意に多かった（図１３ＢのＤ）。
【０１７７】
ＭＡＰ２染色：
実施例３で観察されたものと同じＭＡＰ２染色パターンが観察された。ＭＡＰ２陽性領域の比率の定量化により（図１４Ｂ）、ＭＡＰ２陽性領域の比率は、ビヒクル群（０．６５６±０．０９１）（図１４Ａ（ｂ））よりも偽手術動物（デフォルトで１．０）（図１４Ａ（ａ））、及びエステトロール処置群（１ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（０．９４３±０．０２８）（図１４Ａ（ｃ））、５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（０．８９±０．０３７）（図１４Ａ（ｄ））、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（０．９３８±０．０４４）（図１４Ａ（ｅ））、５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４（０．９６６±０．０３６）（図１４Ａ（ｆ）））において有意に高いことが明らかとなった。
【０１７８】
ダブルコルチン−血管内皮成長因子二重染色：
海馬のＤＧ領域では、ＤＣＸ又はＶＥＧＦのいずれの染色も試験群間に有意差はなかった（図１５）。ＣＡ１領域では、ＤＣＸ陽性染色細胞の割合は、ビヒクル群（１２．８±２．９４７％）よりも１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３７．１±３．８４）及び５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３７．３±４．７８４％）で有意に高かった（図１５Ａ）のに対し、ＶＥＧＦ陽性染色細胞の割合は、ビヒクル処置動物（１５．７±４．９２４％）よりも５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３７．４±４．８３３％）、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（３７．１±３．８４％）、及び５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（４５．１±４．７５３％）で有意に高かった（図１５Ｂ）。ＣＡ２／ＣＡ３領域では、ＤＣＸ陽性染色細胞の割合は、ビヒクル処置した動物（１０．４±２．８６８％）よりも１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（４２．５±５．９８６％）で有意に高かった（図１５Ａ）のに対し、ＶＥＧＦ陽性染色細胞の割合は試験群間に有意差はなかった（図１５Ｂ）。皮質では、ＤＣＸ陽性染色細胞の割合は、ビヒクル群（２３．３±４．７４％）よりも５ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（４５．２±３．３３９％）、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（４９．４±４．９４９％）、及び５０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４群（４９．６±３．１１％）で有意に高かった（図１５Ａ）のに対し、ＶＥＧＦ陽性染色細胞の割合は、１０ｍｇ／ｋｇ  Ｅ４処置群（４９．４±４．９４９％）よりも偽手術動物（２４．６±３．７％）で有意に低かった（図１５Ｂ）。
【０１７９】
血清Ｓ１００Ｂ及びグリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）：
図１６に示されるように、ビヒクル群の動物よりも偽手術動物及びエステトロール処置動物において、Ｓ１００Ｂタンパク質及びＧＦＡＰタンパク質の有意に低い発現が観察された。
【０１８０】
結論：
本発明の結果は、エステトロールがＨＩＥの動物モデルの海馬構造及び皮質において用量依存性の治療効果を有することを示す。また、本発明の結果によれば、エステトロール処置は、初期の灰白質の脱落を低減し、神経発生及び血管新生を促す。さらに、エステトロール処置は、体重、脳重量又は体温に対して何らの有害効果も有していない。
【０１８１】
実施例５：周産期又は新生児仮死後の新生児におけるエステトロールの治療効果
出生時仮死を経て、少なくとも１つの以下の症状：意識低下及びアシドーシス（ｐＨ＜７．００又は１２以上の塩基欠乏）、５以下の１０分アプガールスコア、又は１０分の進行中の蘇生を呈する新生児をエステトロールで処置した。
【０１８２】
エステトロールを５ｍｇ／ｋｇ体重若しくは１０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で出生後６時間以内に単回注射として腹腔内投与するか、又は点滴により投与した。投薬は繰り返し行われてもよい。
【０１８３】
任意に、新生児は、出産後６時間以内から開始して７２時間に亘り低体温法(hypothermia)を同時に経験している場合がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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