(57)【要約】タンパク質が直接的にＤＮＡまたはＲＮＡに結合する部位、ヒストンを含む他のタンパク質を修飾する部位、または他のタンパク質に結合する部位を決定するため、およびＤＮＡまたはＲＮＡが修飾された部位を決定するためのプロトコルおよびシステムが本明細書中に記載される。ナノ検出器システムを用いてＤＮＡまたはＲＮＡとのタンパク質相互作用およびＤＮＡまたはＲＮＡ修飾の部位を研究するための単純で高度に正確な方法が提供される。
2015534063.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡまたはＲＮＡへのタンパク質結合部位あるいはＤＮＡまたはＲＮＡの修飾部位を決定するための方法であって、
ａ）解析されるべきＤＮＡ／タンパク質複合体、ＲＮＡ／タンパク質複合体、修飾ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡを含む試料を提供するステップと、
ｂ）検出領域を有するナノ検出器を通して該試料を移動させるステップと、
ｃ）該検出領域において電気的性質を検出し、モニタリングするステップと、
ｄ）該電気的性質を解析して、タンパク質が結合されたかまたは該試料が修飾された該試料における少なくとも一つの部位を決定するステップと
を含み、該電気的性質における変化は、ｉ）該検出領域における該試料の非存在、ｉｉ）該検出領域における、結合されたタンパク質または修飾を欠く該試料の一部の存在、およびｉｉｉ）該検出領域における結合されたタンパク質または修飾を含む該試料の一部の存在、の識別を可能とする、方法。
【請求項２】
前記試料が生物学的試料から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料がインビトロで作成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＮＡ／タンパク質複合体またはＲＮＡ／タンパク質複合体の該タンパク質が、該ＤＮＡまたはＲＮＡに架橋される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記修飾が、前記ＤＮＡまたはＲＮＡのメチル化、ヒドロキシル化またはグルコシル化を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記移動させるステップの前に、前記タンパク質または修飾に特異的な抗体または他の試薬に前記試料を曝露するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＮＡ／タンパク質複合体またはＲＮＡ／タンパク質複合体を提供するステップが、複合体形成の前に該タンパク質をラベルすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ナノ検出器がナノ孔を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記電気的性質が前記ナノ孔を横切る電流を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ナノ検出器が流体チャネルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記流体チャネルがナノチャネルまたはマイクロチャネルを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記検出領域が、該流体チャネルにおいて、前記チャネルの長さに沿って側方に隔たりを有する少なくとも一対の検出器電極によって規定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記電気的性質が、少なくとも一対の検出器電極間の電位を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記移動させるステップの前に、前記ＤＮＡ／タンパク質複合体、前記ＲＮＡ／タンパク質複合体、前記修飾ＤＮＡまたは前記修飾ＲＮＡの近位領域に追加のタンパク質を結合させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記追加のタンパク質が架橋によって結合される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記移動させるステップの前に、前記ＤＮＡ／タンパク質複合体、前記ＲＮＡ／タンパク質複合体、前記修飾ＤＮＡまたは前記修飾ＲＮＡにタグを結合させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記追加のタンパク質が、前記ＤＮＡ／タンパク質またはＲＮＡ／タンパク質複合体における該タンパク質と異なる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記移動させるステップの前に、前記ＤＮＡ／タンパク質複合体、前記ＲＮＡ／タンパク質複合体、前記修飾ＤＮＡまたは前記修飾ＲＮＡの特定の領域に対して検知可能なプローブを提供するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記プローブが、オリゴヌクレオチドプローブ、ロックド核酸プローブ、ペプチド核酸プローブ、配列特異的なタンパク質またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも一つを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記移動させるステップの前に、前記ＤＮＡ／タンパク質複合体、前記ＲＮＡ／タンパク質複合体、前記修飾ＤＮＡまたは前記修飾ＲＮＡの特定の領域に対して検知可能な特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ結合剤を提供するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記電気的性質を解析するステップが、前記試料上に前記タンパク質の結合部位または修飾部位のマップを提供するために、前記検出領域において結合されたタンパク質または修飾を欠く該試料の一部の存在を示すデータ、および該検出領域において結合されたタンパク質または修飾を含む該試料の一部の存在を示すデータを解析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
移動の前に、前記ＤＮＡ／タンパク質複合体、前記ＲＮＡ／タンパク質複合体、前記修飾ＤＮＡまたは前記修飾ＲＮＡの少なくとも一部をコーティングするステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記コーティングが、前記ＤＮＡ／タンパク質複合体、前記ＲＮＡ／タンパク質複合体、前記修飾ＤＮＡまたは前記修飾ＲＮＡの少なくとも一部に結合するタンパク質を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質がＲｅｃＡを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記移動させるステップの前に、前記ＤＮＡ／タンパク質複合体、前記ＲＮＡ／タンパク質複合体、前記修飾ＤＮＡまたは前記修飾ＲＮＡの特定の領域に対して検知可能なタグを提供するステップをさらに含み、このような領域が、ニッキング酵素または他のＤＮＡもしくはＲＮＡ修飾酵素あるいは結合成分によって作製される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ＤＮＡまたはＲＮＡへのタンパク質結合の部位あるいはＤＮＡまたはＲＮＡの修飾の部位を決定するための方法であって、
ａ）解析されるべきＤＮＡ／タンパク質複合体、ＲＮＡ／タンパク質複合体、修飾ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡを含む試料を提供するステップと、
ｂ）ナノ検出器装置を提供するステップであって、該ナノ検出器装置は、第１の流体チャンバーと、第２の流体チャンバーと、該第１のチャンバーと第２のチャンバーとの間に配置された膜と、該第１のチャンバーおよび第２のチャンバーがナノ孔によって流体連結されるように該膜を通って延びる該ナノ孔とを有する、ステップと、
ｃ）該試料を該第１のチャンバーに導入するステップと、
ｄ）該ナノ孔を通って該第１のチャンバーから該第２のチャンバーへ該試料を移動させるステップと、
ｅ）該ナノ孔を横切る電気的性質を検出しモニタリングするステップと、
ｆ）時間の関数として該電気的性質における変化を記録するステップと、
ｇ）該電気的性質における該変化を解析して、タンパク質が結合されたまたは該試料が修飾された該試料の少なくとも一つの部位を決定するステップと
を含み、該電気的性質における変化は、ｉ）該ナノ孔における該試料の非存在、ｉｉ）該ナノ孔における、結合されたタンパク質または修飾を欠く該試料の一部の存在、およびｉｉｉ）該ナノ孔における、結合されたタンパク質または修飾を含む該試料の一部の存在、の識別を可能とする、方法。
【請求項２７】
前記電気的性質における前記変化を解析することが、前記試料上に前記タンパク質の結合部位または修飾の部位のマップを作成する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＤＮＡまたはＲＮＡへのタンパク質結合の部位あるいはＤＮＡまたはＲＮＡの修飾の部位を決定するための方法であり、
ａ）解析されるべきＤＮＡ／タンパク質複合体、ＲＮＡ／タンパク質複合体、修飾ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡを含む試料を提供するステップと、
ｂ）流体ナノチャネルまたはマイクロチャネルを有するナノ検出器に該試料を配置するステップであって、該流体ナノチャネルまたはマイクロチャネルは、該流体ナノチャネルまたはマイクロチャネルの長さに沿って側方に隔たりを有する少なくとも一対の電極によって規定される少なくとも一つの検出容積を含む、ステップと、
ｃ）該検出容積を通って該試料を移動させるステップと、
ｄ）該試料が該検出容積を通って移動するときの、該検出容積における電気的性質を検出するステップと、
ｅ）時間の関数として該電気的性質における変化を記録するステップと、
ｆ）該電気的性質における該変化を解析し、タンパク質が結合されたまたは該試料が修飾された該試料の少なくとも一つの部位を決定するステップと
を含み、該電気的性質における変化は、ｉ）該検出領域における該試料の非存在、ｉｉ）該検出領域における、結合されたタンパク質または修飾を欠く該試料の一部の存在、およびｉｉｉ）該検出領域における、結合されたタンパク質または修飾を含む該試料の一部の存在、の識別を可能とする、方法。
【請求項２９】
前記試料を移動させるステップが、前記流体ナノチャネルまたはマイクロチャネルにおいて配置される少なくとも第１および第２の起電性電極によって電気泳動力を提供することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料を移動させるステップが、電位勾配、圧力勾配、化学的勾配またはこれらの組み合わせの少なくとも一つを用いることをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記電気的性質が、前記検出容積を横切って測定される電位である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記電気的性質における変化を解析することが、前記試料上に前記タンパク質の結合部位または修飾の部位のマップを作成する、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願との相互参照）
本出願は、２０１２年９月２６日に出願された米国仮特許出願番号第６１／７０５，９８３号、および２０１３年３月７日に出願された米国仮特許出願番号第６１／７７４，２１６号に対して、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権の利益を主張する；これらの出願の両方の全体が、参照によって本明細書中に援用される。
本発明の実施形態は、一般的に、目的のタンパク質が結合するＤＮＡまたはＲＮＡ試料上の一つまたはそれより多くの領域、および／あるいはメチル化によってまたは別の化学成分によって修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡ試料上の一つまたはそれ以上の領域を決定するための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子発現、分化および発生は、ＤＮＡ修飾によって、およびＤＮＡに直接結合することによって、ヒストンを含む他のタンパク質を修飾することによって、または他のタンパク質に結合することのいずれかによって働く様々なタンパク質によって、調節および制御される。これらの相互作用がどのように生じるのかということ、およびそれらが重要な生物学的プロセスをどのように調整するのかということを理解することは医療上のおよびその他の成果を改良するための基礎を提供し得る。そのようなＤＮＡ修飾およびタンパク質相互作用は、最初期には、化学的および酵素的フットプリンティング技術を用いて個別に特徴付けられた。マイクロアレイ技術が進歩するのにしたがって、さらにより多くの遺伝子領域が同時に研究され得るように、ＤＮＡ修飾およびタンパク質相互作用は、高度に並列化された方法で研究されるようになった。
【０００３】
ＤＮＡ修飾およびＤＮＡへのタンパク質結合に関する情報を取得するための一つの方法はクロマチン免疫沈降（本明細書中において”ＣｈＩＰ”と言う）である。ＣｈＩＰは、プロモーターまたは他のＤＮＡ結合部位上の転写因子のように、ＤＮＡ修飾および特定のタンパク質が、特定のゲノム領域に関連するかどうかを決定するために利用される。ＣｈＩＰはまた、様々なヒストン修飾に関連するゲノムにおける特定の位置を決定するために使用され、それによってヒストン修飾因子の標的を示唆する
【０００４】
簡単に述べると、ＣｈＩＰの方法は以下のようなものである：細胞溶解物中のタンパク質および関連クロマチンは、一時的に結合させられるかまたは架橋され、ＤＮＡ（クロマチン）／タンパク質複合体を形成する。この複合体は、その後分離され、そして目的のタンパク質と関連するＤＮＡ断片は選択的に免疫沈降される。この関連するＤＮＡ断片はその後、インビボで目的のタンパク質と関連すると推定される結果として生じたＤＮＡ断片とともに精製される。ＣｈＩＰを利用した方法は、例えば、その全体が参照によって本明細書中に援用されるＷｙｒｉｃｋ、ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，４１０，２４３号において記載されている。ＤＮＡ修飾を検出するための方法論はいくらか異なる。修飾はすでにＤＮＡの一部であるので、結合または架橋は必要でない。そのかわり、ＤＮＡは、目的のソースから調製され、望ましい修飾に対する特異性を有するタンパク質または他の分子に結合させられ、そしてその後、その結合に基づいて大量のＤＮＡから分離される。典型的には、ＤＮＡは、修飾ＤＮＡと非修飾ＤＮＡとの分離の前に切断される。
【０００５】
次世代シークエンシングの開発は、ＣｈＩＰシークエンシング（本明細書中で”ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ”と言う）の導入によってさらなる発展をもたらした。ＣｈＩＰ−Ｓｅｑは、ゲノムのより広範なカバレッジを提供し、タンパク質結合およびヒストン修飾のさらにより優れた理解を可能とする。同様に、修飾において濃縮されたＤＮＡのシークエンシングが遂行され、時としてメチル化ＤＮＡ沈降（ＭｅＤＩＰ）（Ｓａｌｐａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１２  Ａｕｇ；４０（１４）：６４７７−９４）またはＧＬＩＢ（グルコシル化、過ヨウ素酸酸化、ビオチン化）またはＣＭＳ（５ｈｍＣのシトシン５−メチレンスルホン酸への変換）（Ｐａｓｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１  Ｍａｙ  １９；４７３（７３４７）：３９４−７）のような異なる名称によって呼ばれる；両参照は本明細書中にその全体が援用される。これらおよび関連の技術は、本明細書中で”Ｍｏｄ−Ｓｅｑ”と言う。メチル化特異的な酵素、またはシークエンシング反応によって異なって認識されるように化学的に塩基を変換する化学物質によるＤＮＡの処理（重亜硫酸塩処理など）を利用する、修飾を検出するための追加の技術論が存在する。そのようなタンパク質結合およびタンパク質修飾およびＤＮＡ修飾の広範な特徴付けが、ＥＮＣＯＤＥプロジェクトによって様々な細胞株および条件にわたって収集されてきた。
【０００６】
ＣｈＩＰ−ＳｅｑおよびＭｏｄ−Ｓｅｑに関連するワークフロー全体は作業量が多い。ひとたびクロマチン標的が単離され断片化されると、ＣｈＩＰのプロセス（上記）が遂行される。結果として生じたＤＮＡ断片は、タンパク質を取り除くために脱架橋され（ＣｈＩＰ−Ｓｅｑについて）、そしてその後二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）断片からの一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）伸長が、修復され修飾される（ＣｈＩＰ−ＳｅｑおよびＭｏｄ−Ｓｅｑ両方について）。断片をサイズによって分離するために、アダプターが、その後ゲル上で単離されるｄｓＤＮＡ断片に結合させられる。選択された断片は、その後ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅される。たいていのシークエンシングシステムは動かすのがとても高価なので、最適でない試料をシークエンシングしないことが重要である。したがって、ＰＣＲの結果生じた断片は、一般的に、適切なサイズの断片が生成されており、そして実質的な割合が、結合された望ましいリンカー両方を有することを確実にするためにゲル電気泳動または他のサイズ決定方法によって解析される。試料は、その後一般的に、シークエンシングのために適切な試料量が使用され得るためにリアルタイムＰＣＲを用いて定量される。最終的に、次世代シークエンシングは、選択された断片それぞれの配列を決定し、そしてそれによって目的のタンパク質について標的結合または修飾部位を決定するために利用され得る。
ＣｈＩＰ−ＳｅｑおよびＭｏｄ−Ｓｅｑのデータが価値あるものである一方、この技術には限界がある。第一に、この方法論は、高いレベルの専門的技術を要求する多くのステップを有し冗漫である。冗長なプロトコルは、多くのタンパク質および修飾のための十分な材料を生成するのに困難をもたらし得る。第二に、ＣｈＩＰ−ＳｅｑおよびＭｏｄ−Ｓｅｑにおいて用いられる短いリードは、タンパク質および修飾の間の長い範囲の相互作用、ならびにタンパク質が、同一のまたは異なるＤＮＡ分子のいずれに結合しているかということを評価するのに困難をもたらし得る。さらに、ＣｈＩＰ−ＳｅｑおよびＭｏｄ−Ｓｅｑを用いて複数のタンパク質または修飾を区別することは困難または不可能であり、そのためより複雑な相互作用の観測を制限する。したがって、ＣｈＩＰ−ＳｅｑおよびＭｏｄ−Ｓｅｑは生物学的制御の多くの局面の理解を大いに促進したが、この技術はいくつかの点においては限定されたままである。したがって、ゲノム全体基準でタンパク質結合およびＤＮＡ修飾を検出するための改良されたプロトコルは価値ある利点を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６，４１０，２４３号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｓａｌｐａｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１２  Ａｕｇ；４０（１４）：６４７７−９４
【非特許文献２】Ｐａｓｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１  Ｍａｙ  １９；４７３（７３４７）：３９４−７
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
単純化のために、本明細書中の記載は、主に、ＤＮＡまたはＤＮＡ／タンパク質複合体に対するタンパク質結合およびＤＮＡに対する修飾について言及するが、特に明示されない限り、これらの用語は、ＲＮＡおよびＲＮＡ／タンパク質複合体に対するタンパク質結合およびＲＮＡに対する修飾についても同様に言及することを意図されることが理解されるべきである。
【００１０】
一つの局面において、本発明の実施形態は、ＤＮＡまたはＲＮＡに対するタンパク質結合あるいはＤＮＡまたはＲＮＡにおいて修飾された部位に対するタンパク質結合の部位を決定するための方法に関連する。概括的に、本発明の実施形態は、解析されるべきＤＮＡ／タンパク質複合体、ＲＮＡ／タンパク質複合体、修飾ＤＮＡまたは修飾ＲＮＡの試料を提供するステップと、検出領域を有するナノ検出器を通って試料を移動させるステップと、検出領域において電気的性質を検出しモニタリングするステップと、この電気的性質を解析し、タンパク質が結合されたかあるいは修飾が存在する試料の少なくとも一つの部位を決定するステップとを含む。電気的性質における変化は、ｉ）検出領域における試料の非存在、ｉｉ）検出領域における、結合されたタンパク質または修飾を欠いた試料の一部の存在、およびｉｉｉ）検出領域における、結合されたタンパク質または修飾を含む試料の一部の存在、の識別を可能にする。
【００１１】
試料は、生物学的試料から単離され得るか、あるいはインビトロで作成され得、そしてタンパク質は、ＤＮＡまたはＲＮＡに架橋され得るか、またはその他の方法によって結合させられ得る。ＤＮＡまたはＲＮＡに対する修飾は、メチル化、ヒドロキシル化またはグルコシル化を含み得る。
【００１２】
タンパク質または修飾を含む複合体形成されたかまたは修飾された試料の部分の検出は、タンパク質または修飾に特異的な抗体または他の試薬に試料をさらに曝露し、それによってより大きなタンパク質標的を提供することによって向上させられ得る。タンパク質結合部位を検出する場合、タンパク質は、ＤＮＡまたはＲＮＡとの結合の前にラベルされ得る。タンパク質単数、タンパク質複数についての結合部位複数、あるいはタンパク質複数または修飾複数もしくはタンパク質複合体の混合物についての結合部位複数、およびＤＮＡまたはＲＮＡ修飾は、全て一つの試料において検出され得る。
【００１３】
ナノ検出器はナノ孔であっても、ナノ孔を含んでもよいし、またはその代わり、流体ナノチャネルもしくはマイクロチャネルであっても、流体ナノチャネルもしくはマイクロチャネルを含んでもよい。ナノ孔の場合、一つの実施形態は、ナノ孔を横切る電流変動の検出およびモニタリングを含み、一方流体チャネルの場合、実施形態は、チャネルの長さに沿った側方に隔たりを有する少なくとも一対の検出器電極によって規定される検出領域を横切る電気的性質（例えば、電位変動など）の検出およびモニタリングを含む。
【００１４】
様々なアッセイ準備方法が本明細書において提供される。ひとつの実施形態において、移動の前に、追加のタンパク質（第一のタンパク質と異なってもよい）は、最初のタンパク質／ＤＮＡもしくはＲＮＡ複合体または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡに近位の領域において、ＤＮＡまたはＲＮＡに架橋され得るか、またはその他の方法によって結合させられ得る。タンパク質および／または抗体に結合する追加の抗体またはタグが、検出を向上させるために利用され得る。さらに、移動の前に、複合体の全体または一部が、検出を向上させるために結合成分によってコーティングされ得る。代表的な結合成分はＲｅｃＡのようなタンパク質を含む。
【００１５】
なお別の実施形態において、参照ゲノム位置マップが、ＤＮＡもしくはＲＮＡ／タンパク質複合体または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡに重ねられ得る。このようなステップは、より高い解像度の位置測定を提供すると同時に、目的のタンパク質が結合するかまたは修飾が存在する領域が検出され得るプロセスを単純化する。この場合、試料の複合体形成した部分から区別可能な検知可能なプローブが、移動ステップの前にＤＮＡもしくはＲＮＡ／タンパク質複合体または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡにハイブリダイズされるか、もしくは他の方法で結合させられるかまたは反応させられ得る。代表的なプローブとして、ゲノムの特定の領域に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ、ロックド核酸（ＬＮＡ）プローブおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブが挙げられる。公知の特異性または触媒活性を有するタンパク質のようなマーカーが、参照ゲノムと関連した目的の領域を検出するために使用されてもよい。
【００１６】
なお別の実施形態において、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を解析するときに、ニッキング酵素が、例えば、以下に記載される米国特許出願公開２０１２／００７４９２５  Ａ１（参照によって本明細書中でその全体が援用される）の方法を用いて参照ゲノムと関連する目的の領域を検出するために使用され得る。同様に、ｄｓＤＮＡの場合、特異性を有する主溝または副溝結合物体を含む特異的なＤＮＡ結合物体が使用され得る。ニッキング、特異的なＤＮＡまたはＲＮＡ結合などの場合、ＤＮＡまたはＲＮＡに対するハイブリダイゼーションは解析されず、むしろ別の結合の活性または共有結合の活性が解析される。参照ゲノムが標識された部位とタンパク質結合部位または修飾との相対的位置は、タンパク質結合部位または修飾が、参照ゲノムにより正確に位置付けられることを可能にする。
【００１７】
移動ステップの前に、検知可能な特異的ＤＮＡまたはＲＮＡ結合剤が、ＤＮＡもしくはＲＮＡ／タンパク質複合体または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡの特定の領域に提供され得る。
【００１８】
複合体形成された試料の検出領域を通った移動の際に、結合されたタンパク質または修飾を欠くＤＮＡもしくはＲＮＡ／タンパク質複合体または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡの一部の存在を示すデータ、および結合されたタンパク質または修飾を含むＤＮＡもしくはＲＮＡ／タンパク質複合体または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡの一部の存在を示すデータが取得される。このデータは組み合わされ、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料に対するタンパク質の結合部位または修飾のマップを提供する。
【００１９】
別の局面において、本発明の実施形態は、ナノ検出器を用いてＤＮＡまたはＲＮＡに対するタンパク質結合または修飾の部位を決定するための方法を含む。解析されるべきＤＮＡもしくはＲＮＡ／タンパク質複合体または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡが提供され、第１の流体チャンバーと、第２の流体チャンバーと、第１のチャンバーと第２のチャンバーの間に位置付けられる膜と、第１のチャンバーと第２のチャンバーがナノ孔によって流体連結されるように膜を通って延びるこのナノ孔とを有するナノ検出器の中へと導入される。ＤＮＡもしくはＲＮＡ／タンパク質複合体または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡは、第１のチャンバーに導入され、検出器を通って第２のチャンバーへ移動させられる。移動の間、ナノ検出器を横切る電気的性質が検出およびモニタリングされ、電気的性質における変化が時間の関数として記録される。電気的性質における変化は、タンパク質が結合されたかまたはある位置が修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一つの部位を決定するために解析される。電気的性質における変化は、ｉ）ナノ検出器におけるＤＮＡもしくはＲＮＡ／タンパク質複合体または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡの非存在、ｉｉ）ナノ検出器における、結合されたタンパク質または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡを欠くＤＮＡまたはＲＮＡ／タンパク質複合体の一部の存在、およびｉｉｉ）ナノ検出器における、結合されたタンパク質または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡを含むＤＮＡまたはＲＮＡ／タンパク質複合体の一部の存在、の識別を可能にする。このデータは、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料上にタンパク質の結合部位またはＤＮＡ／ＲＮＡ修飾のマップを提供するため利用され得る。
【００２０】
なお別の局面において、本発明の実施形態は、ナノチャネルまたはマイクロチャネル検出器のような流体チャネルを利用するナノ検出器を用いてＤＮＡもしくはＲＮＡに対するタンパク質結合またはＤＮＡ／ＲＮＡ上の修飾の部位を決定するための方法を含む。この実施形態において、解析されるべきＤＮＡもしくはＲＮＡ／タンパク質複合体または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡは、チャネルの長さに沿った側方に隔たりを有する少なくとも一対の電極によって流体チャネルにおいて規定される少なくとも一つの検出容積を有する流体ナノチャネルまたはマイクロチャネルへ導入される。ＤＮＡもしくはＲＮＡ／タンパク質複合体または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡは検出容積を通して移動させられ、そして移動中、検出容積における電気的性質が検出される。時間の関数として電気的性質における変化が記録される。電気的性質における変化は、タンパク質が結合されたかまたは修飾が存在するＤＮＡまたはＲＮＡの少なくとも一つの部位を決定するために解析される。
【００２１】
時間の関数として検出容積を横切って測定された電位のような電気的性質における変化を記録することによって、ｉ）検出容積におけるＤＮＡもしくはＲＮＡ／タンパク質複合体または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡの存在、ｉｉ）検出容積における、結合されたタンパク質または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡを欠くＤＮＡまたはＲＮＡ／タンパク質複合体の一部の存在、およびｉｉｉ）検出容積における、結合されたタンパク質または修飾ＤＮＡ／ＲＮＡを含むＤＮＡまたはＲＮＡ／タンパク質複合体の一部の存在、を識別することが可能である。このデータは、ＤＮＡまたはＲＮＡ試料上にタンパク質の結合部位または修飾のマップを提供するため利用され得る。
【００２２】
移動は、少なくとも部分的には、流体チャネルにおいて配置された起電性電極によって提供される電気泳動力によって達成され得る。圧力勾配、化学的勾配またはその両方が同様に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】図１Ａは、ナノ検出器装置における結合されたタンパク質を有するＤＮＡ分子を示す、本発明の実施形態に従うアッセイ方法の模式図である。
【００２４】
【図１Ｂ】図１Ｂは、結合されたタンパク質を有するＤＮＡ分子が、図１Ａのナノ検出器装置を通って移動するときの電流測定波形を示す、本発明の実施形態に従うアッセイ方法の模式図である。
【００２５】
【図２】図２は、アッセイを実行するのに有用な流体ナノチャネルまたはマイクロチャネル装置を示す、本発明の実施形態に従うアッセイ方法の模式図である。
【００２６】
【図３Ａ】図３Ａは、結合されたタンパク質を有するＤＮＡ分子が、図２の装置において検出容積に進入するときの電位測定を示す、本発明の実施形態に従うアッセイ方法の模式図である。
【００２７】
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＤＮＡ分子上に結合されたタンパク質が、図２の装置において検出容積に進入するときの電位測定を示す、本発明の実施形態に従うアッセイ方法の模式図である。
【００２８】
【図３Ｃ】図３Ｃは、ＤＮＡ分子上の結合されたタンパク質が、図２の装置において検出容積を出るときの電位測定を示す、本発明の実施形態に従うアッセイ方法の模式図である。
【００２９】
【図３Ｄ】図３Ｄは、結合されたタンパク質を有するＤＮＡ分子が、図２の装置において検出容積を出るときの電位測定を示す、本発明の実施形態に従うアッセイ方法の模式図である。
【００３０】
【図４】図４は、複数の検出容積を有する流体ナノチャネルまたはマイクロチャネル装置を示す、本発明の実施形態に従うアッセイ方法の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
（詳細な説明）
タンパク質がＤＮＡまたはＲＮＡと直接結合している部位、タンパク質がヒストンを含む他のタンパク質を修飾している部位、タンパク質が他のタンパク質と結合している部位、およびＤＮＡまたはＲＮＡが修飾されている部位を決定するためのプロトコルおよびシステムが、本明細書中に記載される。ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ法またはＭｏｄ−Ｓｅｑ法において要求される厳密な作業量の多い方法論を必要とするよりも、本発明の実施形態は、ＤＮＡまたはＲＮＡとのタンパク質の相互作用、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡの修飾部位に関して研究するための、単純で高度に正確な手段を提供する。該プロトコルは、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ（Ｐａｒｋ、ＰＪ（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  １０：６６９−６８０、ＣｈＩＰ−Ｓｅｑ：Ａｄｖａｎｔａｇｅｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｏｆ  ａ  ｍａｔｕｒｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにおいて総説されている。本明細書中にその全体が参照によって援用される。）と同様の利点の少なくともいくつかを有すると同時に、長い範囲の相互作用、および複数のタンパク質または標識またはＤＮＡ／ＲＮＡ修飾の同時マッピングの可能性を提供することによって追加の利点を提供する。
【００３２】
上記の通り、標準的なＣｈＩＰ−Ｓｅｑ実験において、ホルムアルデヒドまたは類似の化学物質を使用して、細胞または生物学的システム内でタンパク質はＤＮＡと架橋される。ＣｈＩＰ−Ｓｅｑの方法論において、ＤＮＡはその後断片化される。本発明の実施形態は、このステップを排除しインタクトなＤＮＡを維持し、それによってより長い範囲の情報の生成を可能にする。特に、架橋されたタンパク質またはその他の方法によりＤＮＡと結合したタンパク質を有するＤＮＡ／タンパク質複合体あるいはＤＮＡ／ＲＮＡ修飾が提供された後、目的のタンパク質または修飾と特異的に結合する抗体またはその他のタンパク質／試薬が、ＤＮＡ／タンパク質複合体または修飾されたＤＮＡ／ＲＮＡと接触させられる。相互作用がどのくらい強いかおよびＤＮＡ／タンパク質複合体とどのように架橋されているかに依存して、この物質は、以下に記述するタイプのナノ検出器システムに直接流され得るか、あるいはより良好な成果のためさらに処理され得る。例えば、当該分野において公知の任意の様々な方法を用いてもＤＮＡまたは修飾されたＤＮＡとの結合の前または後のいずれかに、タンパク質は適切なタグを付されて提供されてもよい。
【００３３】
本発明の、なお別の実施形態において、最初のＤＮＡ／タンパク質複合体または修飾されたＤＮＡ／ＲＮＡが提供された後、ナノ検出器システムによって検出可能な他の物体を目的のタンパク質または修飾と特異的に結合する抗体またはその他のタンパク質／試薬の代わりに使用することができる。したがって、タンパク質または修飾に結合し得るデンドリマーあるいは銀または金粒子が、ナノ検出器システムにおけるタンパク質または修飾されたＤＮＡ／ＲＮＡの検出を向上するために使用され得る。この実施形態は、デンドリマーあるいは銀または金粒子の使用に限定されることを意図されているものではなく、むしろ、検出を向上させるためにタンパク質または修飾されたＤＮＡ／ＲＮＡと結合され得る任意の公知の物体が、本明細書中で企図されることを意図されていることが理解されるべきである。
【００３４】
なお別の実施形態において、同一の試料中の複数のタンパク質またはＤＮＡ／ＲＮＡ修飾の試験は、有用な情報を提供することができる。現在のＣｈＩＰ  ｓｅｑのプロトコルでは、複数の免疫沈降または共免疫沈降が遂行され、その後、得られる情報は全体のストーリーのために組み合わされる（例えば、本明細書中に参照によってその全体が援用されているＡｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  １２２：１９０７−１９１９，”Ｎｋｘ３．１  ａｎｄ  Ｍｙｃ  ｃｒｏｓｓｒｅｇｕｌａｔｅ  ｓｈａｒｅｄ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ”において遂行されている複数アッセイを参照のこと。）。免疫沈降によって間接的というよりはむしろ直接的に結合しているまたは修飾された部位を試験することによって、タンパク質結合およびＤＮＡ／ＲＮＡ修飾のより直接的な全体像が、本発明のプロトコルを用いて取得され得る。
【００３５】
なお別の実施形態において、ＤＮＡ／タンパク質複合体およびＤＮＡ／ＲＮＡ修飾に、参照ゲノム位置マップを重ねることが、有益であり得る。本発明の実施形態は、研究者が参照ゲノム上の特定の配列を標識することを可能とし、それによってより高い解像度の位置測定を提供する一方、目的のタンパク質が結合しているかまたはＤＮＡ／ＲＮＡ修飾が位置している部分を検出し得るプロセスを単純化する。この場合、ゲノムの公知の領域に特異的なオリゴヌクレオチドプローブ、ロックド核酸（ＬＮＡ）プローブ、およびペプチド核酸プローブ（ＰＮＡ）を含むプローブは、ゲノムＤＮＡとハイブリダイズさせられまたは他の方法で結合もしくは反応させられ、そして本明細書中に記載されるように処理され得る。そのような配列特異的なプローブは、試料の複合体形成されたかまたは修飾された部分と区別可能なように構築され得る。しかし、もしこの試料が以前にマッピングされている場合は、そのような標識は区別可能である必要がない。公知の特異性を有するタンパク質のような標識が、参照ゲノムと比較して目的の部位を検出するため使用されてもよい。なお別の実施形態において、２本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を解析するとき、例えば以前に言及した米国特許出願公開２０１２／００７４９２５  Ａ１の方法を用いて、参照ゲノムと比較して目的の部位を検出するためにニッキング酵素が使用され得る。同様に、ｄｓＤＮＡの場合、特異性を有する主溝または副溝結合物体を含む特異的なＤＮＡ結合物体が使用され得る。ニッキング、特異的なＤＮＡ結合などの場合、ＤＮＡまたはＲＮＡへのハイブリダイゼーションは解析されず、むしろ別の結合または共有結合の活性が解析される。参照ゲノムが標識された部位とタンパク質結合部位との相対位置は、タンパク質結合部位およびＤＮＡ／ＲＮＡ修飾が、参照ゲノムへより正確に位置付けられることを可能にする。
【００３６】
特に、ａ）それぞれが５’末端および３’末端を有する第１および第２のＤＮＡ鎖を有する２本鎖ＤＮＡテンプレートを提供すること、ｂ）その二本鎖ＤＮＡテンプレートをニッキングエンドヌクレアーゼと接触させ第１のＤＮＡ鎖上の配列特異的ニッキング位置にニックを形成させること、およびｃ）第２のＤＮＡ鎖の対応する部位に沿って第１のＤＮＡ鎖上で塩基伸長反応を行うこと、というステップを遂行することによりニッキング酵素が利用され得、反応はニックから開始し、第１のＤＮＡ鎖の３’末端に向かって進行し、それによってニック形成部位に隣接したテンプレート上に一本鎖フラップを形成する。必要に応じて、以下のような追加のステップを実行してもよい：ｄ）二本鎖ＤＮＡテンプレートを、テンプレートおよび一本鎖フラップの電子的検出を向上させる結合成分でコーティングすること。
【００３７】
本発明の実施形態において有用なニッキングエンドヌクレアーゼとしては、単独または様々な組み合わせのいずれかで使用される、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＮｂＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、およびＮｔ．ＣｖｉＰＩＩが挙げられる。上記の通り、ニッカーゼは、認識部位で二本鎖ＤＮＡのうち一方の鎖のみを切断することで特徴付けられる配列特異的なエンドヌクレアーゼである。
【００３８】
ニッカーゼＮｂ．ＢｂｖＣＩは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ由来のＢｂｖＣＩ制限遺伝子［Ｒａ＋：Ｒｂ（Ｅ１７７Ｇ）］の改変型を発現するＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。これは以下の認識部位にニックを導入する
【化１】
2015534063.tif 000003
【００３９】
ニッカーゼＮｂ．ＢｓｍＩは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＮＵＢ  ３６由来のクローニングされたＢｓｍＩ遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。これは以下の認識部位にニックを導入する：
【化２】
2015534063.tif 000004
【００４０】
ニッカーゼＮｂ．ＢｓｒＤＩは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ｄ７０由来のＢｓｒＤＩ制限遺伝子の大サブユニットのみを発現するＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。これは以下の認識部位にニックを導入する：
【化３】
2015534063.tif 000005
【００４１】
ニッカーゼＮｂ．ＢｔｓＩは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ由来のＢｔｓＩ制限遺伝子の大サブユニットのみを発現するＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。これは以下の認識部位にニックを導入する：
【化４】
2015534063.tif 000006
【００４２】
ニッカーゼＮｔ．ＡｌｗＩは、ｔｏｐ鎖の認識配列の３’末端を４塩基越えたところの一本鎖切断を触媒するＡｌｗＩの操作による誘導体である。これは、ＡｌｗＩのＤＮＡ認識ドメインおよびＮｔ．ＢｓｔＮＢＩの切断／二量化ドメインをコードするキメラ遺伝子を有するＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。これは以下の認識部位にニックを導入する：
【化５】
2015534063.tif 000007
【００４３】
ニッカーゼＮｔ．ＢｂｖＣＩは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ由来のＢｂｖＣＩ制限遺伝子［Ｒａ（Ｋ１６９Ｅ）：Ｒｂ＋］の改変型を発現するＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。これは以下の認識部位にニックを導入する：
【化６】
2015534063.tif 000008
【００４４】
ニッカーゼＮｔ．ＢｓｍＡＩは、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  Ａ６６４由来のＢｓｍＡＩ制限遺伝子の改変型を発現するＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。これは以下の認識部位にニックを導入する：
【化７】
2015534063.tif 000009
【００４５】
ニッカーゼＮｔ．ＢｓｐＱＩは、ＢｓｐＱＩ制限酵素に由来する遺伝子操作されたＢｓｐＱＩ変異型を発現するＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。これは以下の認識部位にニックを導入する：
【化８】
2015534063.tif 000010
【００４６】
ニッカーゼＮｔ．ＢｓｔＮＢＩは、認識配列の３’末端を４塩基越えたところの一本鎖切断を触媒する。これはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅｒｅｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ３３Ｍ由来のクローニングされたＮｔ．ＢｓｔＮＢＩ遺伝子を保持するＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。これは以下の認識部位にニックを導入する：
【化９】
2015534063.tif 000011
【００４７】
ニッカーゼＮｔ．ＣｖｉＰＩＩは、二本鎖ＤＮＡ基質の一方のＤＮＡ鎖を切断する。ｐＵＣ１９（プラスミドクローニングベクター）における最終産物は２５から２００塩基対の一連のバンドである。ＣＣＴは、ＣＣＧおよびＣＣＡよりは効果的に切断されず、そして、いくつかのＣＣＴ部位は切断されずに残る。これは、Ｍｘｅ  ＧｙｒＡのインテイン、キチン結合ドメインおよびクロレラウイルスＮＹｓ−１由来のＮｔ．ＣｖｉＰＩＩニッキングエンドヌクレアーゼ遺伝子の切断型の融合物を発現するＥ．ｃｏｌｉ株に由来する。これは以下の認識部位にニックを導入する：
【化１０】
2015534063.tif 000012
【００４８】
上記の制限エンドヌクレアーゼはいずれもＩｐｓｗｉｃｈ、ＭＡのＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから入手できる。
【００４９】
本発明は上記のニッキングエンドヌクレアーゼに限定されることを意図しているのではないことが理解されるべきである；むしろ、二本鎖ＤＮＡ分子にニックを提供することができる任意のエンドヌクレアーゼが、本発明の方法に従って使用され得ることが予期されている。
【００５０】
ナノ検出器はタンパク質結合部位および修飾部位を決定するのに有用な手段を提供する。本発明の実施形態において、免疫沈降ステップを要求する代わりに、ＤＮＡ／タンパク質複合体または修飾されたＤＮＡ／ＲＮＡが検出器を通って移動するときの検出器内の電気的性質における変化を測定することによって、抗体結合部位が直接的に決定され得る。
【００５１】
本発明の広範な実施形態において、一つのアッセイの準備の方法論は以下のステップを含む。
【００５２】
最初のステップとして、ＤＮＡ／タンパク質複合体または修飾ヌクレオチドを有するＤＮＡが提供される。この分析物は、細胞または細胞溶解物のような生物学的な試料から、結合タンパク質または修飾ヌクレオチドを有するＤＮＡ断片を分離することによって、あるいはそのような複合体をインビトロで生成することによって取得され得る。後者の例において、研究されるべきＤＮＡ断片単数または複数が分離され、その後、研究室で目的のタンパク質単数または複数と接触させられ得る。目的のタンパク質、修飾タンパク質または他の分子は、ＤＮＡ／タンパク質複合体または修飾ＤＮＡを提供するために、ホルムアルデヒドまたはＵＶ光への暴露を含む当該分野で公知の広範に種々の任意の方法を用いてＤＮＡに架橋またはその他の方法によって結合されて、ＤＮＡ／タンパク質複合体または修飾ＤＮＡを提供し得る。ＤＮＡのヌクレオチドは化学的ラベルまたは他のタグを用いて標識され得る。
【００５３】
この複合体または修飾ＤＮＡは、その後、目的のタンパク質もしくはＤＮＡ修飾に特異的な抗体または他の試薬で処理され得る。
【００５４】
本発明の実施形態は、目的のタンパク質、修飾タンパク質、ＲＮＡおよび他の分子に適用することが意図されているが、本明細書中でアッセイ準備のプロトコルの記述はタンパク質にのみ言及することに留意されたい。この用語法は単純化という目的のみが意図されており、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
【００５５】
ひとたびＤＮＡ／タンパク質複合体またはＤＮＡ修飾が、目的のタンパク質／修飾に特異的な抗体または試薬で処理されると、これは、その後、以下に記載する型のナノ検出器を通って移動させられ得る。ナノ検出器の電気的性質における変化は経時的に記録され得、そしてタンパク質結合部位または修飾のマップを作成するために解析され得る。
【００５６】
アッセイ準備方法の様々な変更が、単独でまたは様々な組み合わせで、さらなる成果の向上を提供するために使用され得る。例えば、上述されるように、タンパク質が十分に大きな場合、抗体または他のタンパク質結合試薬の使用は省略され得る。あるいは、他の検出可能な物体（金粒子または銀粒子が挙げられるが、これらに限定されない）が、検出される能力を向上させるためにタンパク質またはＤＮＡ修飾に結合され得る。
【００５７】
別の実施形態において、抗体または他の試薬が、タンパク質結合部位に近接したＤＮＡに架橋またはその他の方法によって結合され得、または上述のように、ＤＮＡ／タンパク質複合体またはＤＮＡ修飾の特異的な領域が、タンパク質結合部位および／または修飾部位の改良された局在を提供するために公知の配列特異的なプローブとともに提供され得る。
【００５８】
本発明のなお別の実施形態において、ＤＮＡ／タンパク質複合体は、生体分子のナノ孔または流体チャネル移動におけるシグナル対ノイズ比を増加させることによって検出される能力を向上させるためにコーティングされ得る。ＤＮＡまたはＲＮＡ／タンパク質複合体あるいは修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡは、生体分子と結合し、そして生体分子に沿って少なくとも部分的なコーティングを形成するタンパク質または酵素とともにインキュベートされ得る。コーティング方法は同時係属中の米国特許出願公開第２０１００２４３４４９号（本明細書中にその全体が参照により援用される）の中で詳細に説明され、そして以下で論じられる。
【００５９】
概括的に、コーティングされた生体分子は、典型的に移動率においてより優れた均一性を有し、それによって位置の誤差が減少し、そして、そのためにより正確な同定が可能となる。増加した粘性抗力のため、コーティングされた生体分子は、概してコーティングされていない生体分子より遅い速度でシークエンシングシステムを通って移動する。好ましくは、第一のチャンバーから第二のチャンバーまでのその通過の間、シグナルが検出され得るほど十分に、この移動は遅い。
【００６０】
代表的な結合成分としては、例えば、ＲｅｃＡ、Ｔ４遺伝子３２タンパク質、ｆ１遺伝子Ｖタンパク質、ヒト複製タンパク質Ａ、Ｐｆ３一本鎖結合タンパク質、アデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質、およびＥ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質のようなタンパク質が挙げられる。特に、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＲｅｃＡタンパク質は、典型的に協調的な様式で一本鎖または二本鎖ＤＮＡと結合し、コアにおけるＤＮＡ、およびタンパク質の外殻を含むフィラメントを形成する（ＭｃＥｎｔｅｅ，Ｋ．；Ｗｅｉｎｓｔｏｃｋ，Ｇ．Ｍ．；Ｌｅｈｍａｎ，Ｉ．Ｒ．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲｅｃＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｔｏ  Ｓｉｎｇｌｅ−  ａｎｄ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８１，２５６，８８３５）。ＤＮＡは約２ｎｍの直径を有するが、一方、ＲｅｃＡにコーティングされたＤＮＡは約１０ｎｍの直径を有する。一本鎖ＤＮＡが０．７５ｎｍまたは二本鎖ＤＮＡが５０ｎｍであるのに対して、ＤＮＡの持続長は９５０ｎｍほどまで増加する。Ｔ４遺伝子３２タンパク質は協調的に一本鎖ＤＮＡと結合することが公知である（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．Ｍ．；Ｆｒｅｙ，Ｌ．Ｔ４  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｇｅｎｅ  ３２：Ａ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＮＡ．Ｎａｔｕｒｅ，１９７０，２２７，１３１３−１３１８）。Ｅ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質は、塩およびマグネシウム濃度に依存して、いくつかの方式で一本鎖ＤＮＡに結合する（Ｌｏｈｍａｎ，Ｔ．Ｍ．；Ｆｅｒｒａｒｉ，Ｍ．Ｅ．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＤＮＡ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｍｏｄｅｓ  ａｎｄ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｉｅｓ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９４，６３，５２７−５７０）。Ｅ．ｃｏｌｉ一本鎖結合タンパク質は生体分子上で様々なコーティングを形成し得る。ｆ１遺伝子Ｖタンパク質は一本鎖ＤＮＡをコーティングすることが公知であり（Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，Ｔ．Ｃ．Ｇｅｎｅ  Ｖ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（ｄＡ）．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９６，３５，１６６５２）、ヒト複製タンパク質Ａ（Ｋｉｍ，Ｃ．；Ｓｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｏ．；Ｗｏｌｄ，Ｍ．Ｓ．Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９２，１２，３０５０）、Ｐｆ３一本鎖結合タンパク質（Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｄ．；Ｇｒａｙ，Ｄ．Ｍ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐｆ３  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９３，３２，１２５３８）、およびアデノウイルスＤＮＡ結合タンパク質も同様である（Ｔｕｃｋｅｒ，Ｐ．Ａ．；Ｔｓｅｒｎｏ��ｌｏｕ，Ｄ．；Ｔｕｃｋｅｒ，Ａ．Ｄ．；Ｃｏｅｎｊａｅｒｔｓ，Ｆ．Ｅ．Ｊ．；Ｌｅｅｎｄｅｒｓ，Ｈ．；Ｖｌｉｅｔ，Ｐ．Ｃ．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｈｏｏｋ−ｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｆｏｒ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９４，１３，２９９４）。タンパク質でコーティングされたＤＮＡのナノ孔を通る移動は、二本鎖ＤＮＡと結合したＲｅｃＡによって実証されている（Ｓｍｅｅｔｓ，Ｒ．Ｍ．Ｋ．；Ｋｏｗａｌｃｚｙｋ，Ｓ．Ｗ．；Ｈａｌｌ，Ａ．Ｒ．；Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｈ．；Ｄｅｋｋｅｒ，Ｃ．Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲｅｃＡ−Ｃｏａｔｅｄ  Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓｏｌｉｄ−Ｓｔａｔｅ  Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２００９）。タンパク質コーティングは、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡに対して同様に機能する。
【００６１】
本発明の方法は、特定の解析に限定されることが意図されるのではないと同時に、様々な公知のタンパク質アッセイが、本明細書中で説明される方法によく適合することが理解されるべきである。一つの非限定例において、ＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼ特定（ＤａｍＩＤ）（ｖａｎ  Ｓｔｅｅｎｓｅｌ，Ｂ，ｅｔ  ａｌ．，（Ａｐｒｉｌ  ２０００），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１８（４）：４２４−８）（本明細書中にその全体が参照により援用される）は、真核生物においてＤＮＡおよびクロマチン結合タンパク質の結合部位をマッピングするために使用されるプロトコルである。ＤａｍＩＤにおいて、融合タンパク質は、ＤＮＡアデニンメチルトランスフェラーゼ（Ｄａｍ）および目的のＤＮＡ結合タンパク質から形成される。ＤＮＡに結合された融合タンパク質は、メチルトランスフェラーゼを結合部位の領域に局在させる。これは結果としてタンパク質結合部位付近のＧＡＴＣ配列におけるアデニンのメチル化を生じる。アデノシンメチル化は、真核生物においては自然には生じないので、標的分析物上のアデニンメチル化の検出は、融合タンパク質が、その標的に結合されているまたはされていたことを示唆し、そしてさらに結合部位が近い位置にあったことを示唆する。したがって、メチル化部位は、本発明の方法を用いて検出され得る持続性のマーカーとして役立つ。経時的にタンパク質結合部位を決定したいと希望しうることが予期される。こうして、標的分析物上の全てのメチル化部位を検出し得、それによって、経時的にタンパク質が結合していた様々な位置を決定できる。
【００６２】
別の非限定例において、本発明の方法は、近接利用ビオチン化およびネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）クロマチン免疫沈降（ＰＵＢ−ＮＣｈＩＰ）（Ｓｈｏａｉｂ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２０１３  Ｆｅｂ；２３（２）：３３１−４０）（本明細書中にその全体が参照として援用される）と関連して使用され得る。そのプロトコルにおいて、転写因子または他の核タンパク質のような目的のタンパク質は、細菌ビオチンＢｉｒＡと融合される。この融合タンパク質は、ヒストンとＢｉｒＡによって特異的にビオチン化されるビオチン受容ペプチド（ＢＡＰ）との融合産物と共発現される。ＢＡＰ／ヒストンのクロマチンへの組み込み時に、目的のＢｉｒＡ／タンパク質複合体の近くに位置するクロマチン領域は優先的にビオチン化される。ストレプトアビジンまたは他のビオチン結合タンパク質の適用後に、これらの部位は、その後、本発明の方法を用いて検出可能である。この方法は、ヒストンに結合するタンパク質に対しては特に有用であるが、ＤＮＡに結合するタンパク質に対してはそうでない。なぜなら、ＤＮＡに結合するタンパク質は、架橋研究においては検出可能でないのと同時に、このプロトコルがヒストンまたは他のタンパク質に持続性の検出可能なマーカーを残し得るからである。
【００６３】
上で詳細に記述された二つの方法は単なる例であるが、本発明の方法は、天然に存在するか否かにかかわらず、ＤＮＡおよびＲＮＡ上のタンパク質またはその他の修飾を検出する広範な能力を提供することを意図されていることが理解されるべきである。したがって、本発明の方法は、修飾（メチル化、ヒドロキシル化およびグルコシル化が挙げられるが、これらに限定されない）の検出を含むことを意図されている。
【００６４】
ナノ検出器を通る移動率または頻度は、チャンバー間の圧力勾配または化学的（塩）勾配のうちいずれか一方または両方を導入することによってさらに制御され得る。チャンバーのトランス側に対するシス側の代表的な塩濃度比率として１：２、１：４、１：６および１：８が挙げられるが、これに限定されない。例えば、塩濃度は、シス側で約０．５Ｍ  ＫＣｌから約１Ｍ  ＫＣｌ、そしてトランス側で約１Ｍ  ＫＣｌから約４Ｍ  ＫＣｌの範囲に及び得る。好ましくは、シグナルは、公知の方法または本明細書中に記載される方法を用いて検出されるのに十分に強い。代表的なシグナル対ノイズ比として、２：１、５：１、１０：１、１５：１、２０：１、５０：１、１００：１および２００：１が挙げられるが、これに限定されない。シグナル対ノイズ比が高くなるほど、より低い電位が、移動をもたらすために使用され得る。
【００６５】
移動率および頻度はまた、流体セルのシスまたはトランス側のいずれかに圧力を適用することによってさらに制御され得る。
【００６６】
本明細書中に記載される分析物は、ナノ孔および／または流体チャネル、すなわち流体マイクロチャネルまたはナノチャネルシステムを使用するナノ検出器における位置情報の検出のために構成され得る。分析物のマッピングは、米国特許公開第２０１０−０３１０４２１号（本明細書中にその全体が参照により援用される）に記載された方法を用いて、ナノ孔、ナノチャネルまたはマイクロチャネルを利用する電気的検出方法を用いて遂行され得る。
【００６７】
ひとつの実施形態において、ナノ孔を横切る電流は、図１Ａに示されるように、ナノ検出器を通るＤＮＡ複合体の移動の間に測定される。このナノ孔は、約１ｎｍから約１μｍの範囲から選択される直径を有する。より好ましくは、このナノ孔は、約２．３ｎｍと１００ｎｍとの間の直径を有する。なおより好ましくは、このナノ孔は、２．３ｎｍと５０ｎｍとの間の直径を有する。ナノ孔を横切る電気的性質における変化は、ＤＮＡがそこを通って移動する間、モニターされ得、電気的性質における変化は、結合されたタンパク質を含む分析物の領域とそのようなタンパク質を欠いた分析物の領域とを区別するために使用される。
【００６８】
具体的には、ナノ孔１０５について、電極１２０、１２２によって生成された測定可能な電流１１５は、標的分析物１５、すなわち結合タンパク質１００を有するＤＮＡ断片２０の移動と並行して流れる。タンパク質はまた、タンパク質１００またはＤＮＡ断片２０と相互作用し、検出される能力を向上させる抗体またはその他のタンパク質／試薬（図示せず）を含んでもよいし含まなくてもよい。同様に、標的分析物１５の少なくとも一部が、検出される能力を向上させるためにＲｅｃＡコーティングのようなコーティングを含み得る。
【００６９】
電流の変動は、ナノ孔１０５を通過するときの標的分析物１５の相対的な直径の結果である。ナノ孔１０５を通過する標的分析物１５の体積におけるこの相対的増加は、ナノ孔を通る電流における一時的な中断または減少を引き起こし、結果として測定可能な電流の変動を生じる。結合タンパク質１００および必要に応じて抗体を含む標的分析物１５の部分は、そのタンパク質を含まない標的分析物の部分より直径において大きい。結果的に、結合されたタンパク質１００を有する標的分析物の一部がナノ孔１０５を通り過ぎるとき、電極１２０、１２２間の電流におけるさらなる中断または減少が生じる。これらの電流における変化は図１Ｂの波形２００に描写される。
【００７０】
波形２００の解析は、検出された電気的性質における変化に、少なくとも部分的にもとづいて、タンパク質を含む分析物の領域とタンパク質を有さない領域の区別を可能にし、それによってＤＮＡテンプレートの少なくとも一部におけるタンパク質結合位置を決定する。図１Ｂにおいて、波形２００は、分析物１５がナノ検出器を通過するときに検出された電気的性質における変化を描写しており、以下のように解釈され得る。電流測定２１０は、測定されたバックグランド電流、すなわちシス側からトランス側へのナノ孔１０５を通る、ＤＮＡ分子２０およびタンパク質１００の通過の前のベースライン電流を表す。分析物１５が、ナノ孔のシス側からナノ孔１０５に入るとき、電流は部分的に中断され、記録された電流において第１のくぼみ２２０を形成する。ひとたび結合されたタンパク質１００および必要に応じて抗体を有する分析物の部分がナノ孔１０５に入ると、電流におけるさらなる減少が生じ、電流測定におけるより深い、第２のくぼみ２３０を引き起こす。タンパク質および抗体１００のナノ孔１０５の完全な通過の際、ＤＮＡテンプレート２０の遠位部分はナノ孔内に留まり得る。これは、およそ第１のくぼみ２２０のレベルまで上昇する測定された電流２４０を引き起こす。最終的に、ひとたび分析物１５が、ナノ孔１０５を通りトランス側に完全に通過すると、測定電流２５０は、最初期レベル２１０のレベルに近いバックグランドベースラインレベルに戻る。電流変動測定は時間の関数として記録される。
【００７１】
結果的に、電流における周期的な変動は、相対的または絶対的位置の関数として、タンパク質１００がどこでＤＮＡテンプレート２０上の領域に結合していたのかを示す。このタンパク質は特定の部位に結合されているので、利用された特定のタンパク質またはＤＮＡ修飾に対するタンパク質結合に関連する部位の相対的または絶対的位置が決定され得る。これは、それらの特定のタンパク質結合部位およびＤＮＡ修飾部位を分析物上にマッピングすることを可能とする。複数のタンパク質またはＤＮＡ修飾を用いて生成された複数のマップが作成され得る。
【００７２】
上記の通り、結合成分またはコーティング（例えば、タンパク質Ａ）の使用は、分析物の、および分析物上の複合体形成されたタンパク質領域の検出を、さらに向上させ得る。なぜなら、追加容量の結合成分コーティングは、より大きな電流偏向を引き起こすからである。
【００７３】
別の実施形態において、図２から４に示されるように、電位または電流のような電気的性質が、ナノチャネルまたはマイクロチャネルを含むナノ検出器を通るタンパク質／ＤＮＡ複合体の移動の間に測定される。流体チャネル装置の一つの実施形態が図２に模式的に示される。図２において、装置３００は、流体マイクロチャネルまたはナノチャネル３０２を含む。この流体チャネルは、約１μｍから約２５μｍの範囲から選択される幅を有するマイクロチャネル、または約１０ｎｍから約１０００ｎｍの範囲から選択される幅を有するナノチャネルであり得る。マイクロチャネルの場合、その深さは、約２００ｎｍから約５μｍの範囲から選択され得、一方、ナノチャネルの場合、その深さは、約１０ｎｍから約１０００ｎｍの範囲から選択され得る。いずれの場合においても、チャネルは、約２００ｎｍから約１０ｃｍの範囲から選択される長さを有し得る。ナノチャネルまたはマイクロチャネルは、当該分野において公知の任意の数のナノおよびマイクロ作成方法によって形成され得る。一つの実施形態において、チャネルは、基材の中でトレンチとして作成され得、その後キャップされる。
【００７４】
第１の起電性電極対３０４、３０４’は、電圧源３０６と接続され、チャネルの長さの少なくとも一部に沿って電位を提供する様式で配置される。したがって、電位がこの起電性電極に印加されたとき、これらの電極は、チャネルに沿って電流を提供し、そしてチャネルにおける分析物１５に対する駆動力３０８を提供または向上させるために用いられ得る。前記の通り、分析物１５は、結合されたタンパク質またはＤＮＡ修飾１００を一つまたはそれより多く有するＤＮＡテンプレート２０を含む。また前記の通り、このタンパク質は、このタンパク質もしくはＤＮＡ修飾１００またはＤＮＡ断片２０と相互作用し、検出される能力を向上させる抗体または他のタンパク質／試薬（図示せず）を含んでもよいし含まなくともよい。圧力勾配または化学的勾配のような他の駆動力が同様に企図される。第２の電極対３１２，３１２’（すなわち検出器電極）は、好ましくは、検出容積３１４を規定するための間隔を空けた（すなわち側方に隔たりを有する）関係でチャネルに対して実質的に垂直に配置される。第２の検出器電極対３１２、３１２’は、検出容積３１４における電気的性質をモニタリングする検出器３１６（例えば、電圧計）に接続される。検出器３１６が電圧計である実施形態において、検出器電極対３１２、３１２’の間の電位は、検出容積３１４を横切って測定される。
【００７５】
この装置のオペレーションは、図３Ａ−３Ｄの中で模式的に描写され、そこでは、分析物１５が流体チャネルを通って移動するときの、流体チャネルを横切る電気的性質における変化がモニタリングされる。電気的性質における変化は、分析物の有無と、タンパク質が結合された領域およびタンパク質の無い領域とを示している。図３Ａ−３Ｄにおいて、起電性電極３０４、３０４’および電流源３０６は明瞭さのために省略されている。図３Ａにおいて、流体チャネル３０２は、そこを通って移動する分析物１５を含む。電気的性質（この場合は電位）は、検出器電極３１２、３１２’および検出器３１６によって検出容積３１４を横切って測定され、記録される。分析物１５は、タンパク質またはＤＮＡ修飾１００ならびに必要に応じて抗体または他の物体が、以前に記載された方法を用いて結合されたＤＮＡテンプレート２０である。ＤＮＡテンプレートならびに／またはタンパク質および抗体は、検出を向上させるために結合成分（例えば、タンパク質ＲｅｃＡ）でコーティングされ得る。
【００７６】
分析物１５の検出容積３１４への進入の前に、実質的に一定なベースラインバックグランド電圧３２２が、検出容積を横切って測定される。この電圧は、図３Ａの波形３２０において示される。この例は、検出容積を横切る電圧における変化をモニタリングしているが、単に説明の単純化のために電圧が使用されているに過ぎないことが留意されるべきである。本発明の実施形態が、電圧測定だけに限定されることは意図されていない；むしろ、広範に種々の任意の電気的性質がモニタリングされ、解析され得る。分析物１５が検出容積３１４に進入するとき、検出容積中で測定された電気的性質における中断または減少を引き起こし得る。この中断または減少は、波形３２０において示される第１のくぼみ３２４を引き起こす。
【００７７】
図３Ｂは、ひとたびタンパク質１００を含む分析物１５の一部が検出容積３１４に進入したときの装置と波形３２０を示す。タンパク質の検出容積３１４への進入は、検出容積中で測定された電気的性質におけるさらなる中断または減少を引き起こす。このさらなる中断または減少は、波形３２０において示される第２のくぼみ３２６を引き起こす。
【００７８】
図３Ｃにおいて、分析物１５のタンパク質１００を含む部分は、検出容積３１４を出たところである；しかし、分析物１５の遠位部分はまだ検出容積の中にある。結果として、波形３２０は、分析物１５の最初の部分が、初めて検出容積に進入したときに検出されたレベルに近いレベル３２８まで戻った。
【００７９】
最終的に、図３Ｄに示されるように、分析物１５は検出容積３１４を完全に出る。結果的に、波形３２０は、分析物１５の検出容積３１４への最初期の進入の前に検出されたレベルに近いバックグランドレベル３３０に戻る。波形３２０の解析は、少なくとも部分的には電気的性質において検出された変化に基づいて、分析物のタンパク質コーティング領域とタンパク質の無い領域との間の区別を可能とする。このようにして、分析物の少なくとも一部に、タンパク質結合位置および修飾されたＤＮＡの位置を決定すること、ならびにこれらをマッピングすることが可能である。
【００８０】
流体チャネル装置の別の実施形態が図４に示される。図４において、装置４００は流体マイクロチャネルまたはナノチャネル４０２を含む。前記の通り、この流体チャネルは、約１μｍから約２５μｍの範囲から選択される幅を有するマイクロチャネルまたは約１０ｎｍから約１０００ｎｍの範囲から選択される幅を有するナノチャネルであり得る。マイクロチャネルの場合、その深さは約２００ｎｍから約５μｍの範囲から選択され得、一方、ナノチャネルの場合、その深さは約１０ｎｍから約１０００ｎｍの範囲から選択され得る。いずれの場合においても、チャネルは約２００ｎｍから約１０ｃｍの範囲から選択される長さを有し得る。
【００８１】
第１の起電性電極対４０４、４０４’は、電圧源４０６と接続され、チャネルの少なくとも一部分に沿って電位を提供する様式で配置される。電位が起電性電極に印加されたとき、これらの電極は、チャネルに沿って電流を提供し、チャネル中の分析物１５に対する駆動力４０８を提供または向上させるために使用され得る。前記の通り、分析物１５は、結合されたタンパク質またはＤＮＡ修飾１００を一つまたはそれ以上有するＤＮＡテンプレート２０を含む。また前記の通り、このタンパク質は、タンパク質１００またはＤＮＡ断片２０と相互作用し、検出される能力を向上させる抗体または他のタンパク質／試薬（図示せず）を含んでもよいし含まなくともよい。圧力勾配または化学的勾配のような他の駆動力が同様に企図される。
【００８２】
複数の検出器電極４１２、４１４、４１６、４１８が、好ましくは、隣接する検出器電極間の複数の検出容積を規定する側方に隔たりを有し、間隔を空けた関係でチャネルに対して垂直に配置される。したがって、図４において見られるように、検出器電極４１２と４１４は検出容積４２０を規定し、検出器電極４１４と４１６は検出容積４２２を規定し、そして検出器電極４１６と４１８は検出容積４２４を規定する。検出器電極は、それぞれの検出容積において電気的性質をモニタリングする検出器４２６，４２８，４３０（例えば、電圧計）にそれぞれ接続される。検出器が電圧計である実施形態において、電気的性質における落差は、それぞれの検出容積を横切って測定される。装置のオペレーションは、追加の検出容積の存在に起因して追加の波形が生成されるということ以外は、図３Ａ−３Ｄのシステムと類似する。追加の波形は、この装置によって生成されるデータの質をさらに改良するために組み合わされ得る。
【００８３】
検出器電極および検出容積の数は、図４で示される数に限定されることを意図されていないことが理解されるべきである。むしろ、任意の数の検出容積が、流体チャネルの長さに沿って含まれ得る。さらに、検出器電極および検出容積は、均等に間隔を空ける必要も、均等のサイズを有する必要も、お互いに直接隣接される必要もない。様々な検出容積のサイズ、間隔および構成が企図される。
【００８４】
上で以前に記されたように、上記の方法およびシステムは、ＤＮＡ修飾の特定の部位、または特定のタンパク質がＤＮＡに直接結合する、ヒストンを含む他のタンパク質を修飾する、もしくは他のタンパク質に結合する特定の部位を決定する能力を提供する。これは、治療法および治療標的の開発、治療の安全性および有効性の評価、ならびに疾患の診断および予後のための価値ある情報を提供する。例えば、エピゲノムに変異を導入するのにかかわるタンパク質ファミリーおよび変化を引き起こすのに有効な様々な治療法が、本明細書中にその全体が参照によって援用されるＡｒｒｏｗｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  １１：３８４−４００，”Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ：ａ  ｎｅｗ  ｆｒｏｎｔｉｅｒ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ”で総括されている。全ゲノムレベルでそのような治療法の効果をモニタリングすることが可能となることが、そのような薬を改良するため、ならびに効能および潜在的な副作用の両方のためにその薬物をモニタリングするために有利である。さらに、エピジェネティックな標識の位置または頻度は、健康および疾患の有用な予測因子であり得る（Ｇｒｅｅｒ  ａｎｄ  Ｓｈｉ（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３：３４３−３５７，”Ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：ａ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｍａｒｋ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ，ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ”）（本明細書中で参照としてその全体が援用される）。ＣｈＩＰ  ｓｅｑによって検出される特定の遺伝子に対する差示的なタンパク質結合はまた、ガンおよび他の疾患の臨床結果を予想するために使用され得る（Ｒｏｓｓ−Ｉｎｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ，（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  ４８１：３８９−３９３，”Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｏｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ”）。そのような変化をより迅速かつより再現性よく検出することができることは、よりよい治療判断を可能とするだろう。同様に、ＤＮＡメチル化の様々な病態との関連が説明され、そしてそのますます高まる重要性が示唆されている（Ｈｅｙｎ  ａｎｄ  Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１３：６７９−６９２），”ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ”）（本明細書中で参照としてその全体が援用される）。したがって、現在の技術をもってしてもなお、エピジェネティックの位置および転写因子結合部位の位置およびＤＮＡ修飾の位置を知ることは多くの利益を提供する。複数のタンパク質およびＤＮＡ修飾のための、ならびにより長い距離範囲にわたるマップを生成することができることは、それらの利益を向上させるばかりだろう。
（均等論）
【００８５】
当業者は、本明細書中に列挙される全てのパラメータは例示的なものであり、実際のパラメータは、本発明の実施形態の方法および物質が使用される特定の実用例に依存することを容易に認識するであろう。したがって、前記の実施形態は単に例として示されていること、ならびに添付の特許請求の範囲およびその均等の範囲において、本発明は、具体的に記載された方法とは別の方法で実施され得ることが理解されるべきである。
【００８６】
本発明の記載された実施形態は、単に例示的ものであることが意図され、多くのバリエーションおよび変更が、当業者に明らかであろう。このようなバリエーションおよび変更は全て、添付の特許請求の範囲において規定されるような本発明の範囲内であることが意図される。
【図１Ａ】
2015534063.tif 000013
【図１Ｂ】
2015534063.tif 000014
【図２】
2015534063.tif 000015
【図３Ａ】
2015534063.tif 000016
【図３Ｂ】
2015534063.tif 000017
【図３Ｃ】
2015534063.tif 000018
【図３Ｄ】
2015534063.tif 000019
【図４】
2015534063.tif 000020
【配列表】
2015534063000001.app
【国際調査報告】
2015534063.tif 000021
2015534063.tif 000022
2015534063.tif 000023
2015534063.tif 000024
2015534063.tif 000025