(57)【要約】  本発明は、活性型の特定のマトリックスメタロプロテアーゼの検出を可能にする方法及び診断方法におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプル中の対象となるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の活性型だけを特異的に検出するin vitroの方法であって、
a)生体サンプルを、MMPの遊離活性部位に結合できる、対象となるMMPのリガンドと接触させる工程と;
b)工程a)の後又は工程a)と同時に、工程a)の産物を、対象となるMMPに特異的な抗体と接触させる工程と;
c)対象となるMMP、対象となるMMPのリガンド、及び対象となるMMPに特異的な抗体の三成分複合体を検出する工程と
を含み、リガンドがホスフィン偽ペプチド阻害物質を含む方法。
【請求項２】
リガンド又は抗体のいずれかが、固体支持体に固定されており、検出が、リガンドが支持体に固定されている場合は抗体を検出することによって又は抗体が支持体に固定されている場合はリガンドを検出することによって達成される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
a)対象となるMMPのリガンドが固定されている固体支持体を準備する工程と;
b)固体支持体をサンプルと接触させて、リガンドと対象となるMMPとの結合によりサンプル中に存在する対象となるMMPを固体支持体に付着させる工程と;
c)任意選択で、付着していないMMPを除去する工程と;
d)対象となるMMPに特異的な抗体を添加して、対象となるMMP、対象となるMMPのリガンド、及び対象となるMMPに特異的な抗体の三成分複合体を形成させる工程と;
e)任意選択で、遊離の抗体を除去する工程と;
f)三成分複合体中の抗体を検出する工程と
を含み、この検出により、サンプル中に対象となるMMPの活性型が存在することが示される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
a)対象となるMMPに特異的な抗体が固定化されている固体支持体を準備する工程と;
b)対象となるMMPのリガンドと事前に接触させた又は同時に接触させるサンプルと固体支持体を接触させて、サンプル中に存在する対象となるMMPをリガンドに付着させ、抗体と対象となるMMPとの結合により対象となるMMPを固体支持体に固定する工程と;
c)任意選択で、遊離のMMP及びリガンドを除去する工程と;
d)対象となるMMP、対象となるMMPのリガンド、及び対象となるMMPに特異的な抗体の三成分複合体中のリガンドを検出する工程と
を含み、この検出により、サンプル中に対象となるMMPの活性型が存在することが示される、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項５】
免疫クロマトグラフィー試験(ICT)又は固相免疫測定法を使用し、固相が場合によって膜(フロースルー)、マイクロタイタープレートのウェル(例えばEIA)又はストリップ(SPT)である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
リガンド又は抗体の検出が、検出可能なマーカーとの共有結合又は非共有結合によって得られる、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
検出可能なマーカーが、コロイド金属、非金属コロイド、炭素、可視、蛍光、発光又は化学発光トレーサー、磁気粒子、放射性元素及び酵素からなる群から選択され、好ましくはコロイド金又は酵素である、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
リガンドが、好ましくはリンカー又はスペーサー、特にポリエチレングリコールリンカーを介して担体タンパク質に結合している、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
担体タンパク質が、対象となるMMPのリガンドで単官能化又は多官能化されている、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
担体タンパク質が、血清アルブミン、好ましくはヒト又はウシである、請求項8から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
生体サンプルが、生体液若しくは体液、又は組織若しくは細胞抽出物である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
対象となるMMPが、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-21、MMP-23A、MMP-23B、MMP-24、MMP-25、MMP-26、MMP-27及びMMP-28の中から、好ましくはMMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-12、MMP-13及びMMP-14の中から選択され、好ましくはMMP-12である、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
リガンドが、式(I)の部分を含み:
【化１】
2015532417.tif 000027
式中、
Yaa'が、Asp、Pro、Gly、Cys及びGln以外の天然アミノ酸、特にAla、Arg、Asn、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Val、Trp及びTyrからなる群から選択され;
Zaa'が、Pro及びCys以外の天然アミノ酸、特にAla、Arg、Asp、Asn、Gly、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Val、Trp及びTyrからなる群から選択され;
Rが、
【化２】
2015532417.tif 000028
からなる群から選択される、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
リガンドが、式(III)の部分
【化３】
2015532417.tif 000029
を含む、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
MMP12、MMP2又はMMP9、好ましくはMMP12の検出のための、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
対象となるMMPの活性型だけを特異的に検出するためのキットであって、
-  対象となるMMPに特異的な抗体;
-  ホスフィン偽ペプチド阻害物質を含み、好ましくは担体タンパク質を官能化する、対象となるMMPのリガンド;
-  任意選択で、抗体又はリガンドのいずれかが固定されている固体支持体;及び
-  任意選択で、抗体又はリガンドの検出を可能にする試薬
を含むキット。
【請求項１７】
特に、癌、ウイルス感染、変形性関節症、関節リウマチ、デュピュイトラン拘縮、アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患、気腫及び喘息などの炎症性成分を伴う呼吸器疾患、又は多発性硬化症、重症筋無力症、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症若しくはアルツハイマー病などの神経変性疾患を診断するための診断方法における、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法の使用又は請求項16に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)を特異的に検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
MMPは、細胞外マトリックス(ECM)のすべての構成成分を全体的に分解することができる。ECMの分解は、細胞の移動を可能にするだけでなく、ケモカイン、サイトカイン又は増殖因子など本来ECMに結合しているシグナル伝達分子の放出を引き起こす。MMPは、シグナル伝達分子の活性化にも寄与する。
【０００３】
組織再形成におけるMMPの活性は、TIMP(メタロプロテイナーゼの組織阻害物質)として公知の天然の阻害物質によって又はMMPのプロフォーム(proform)である潜在的な型によってin vivoで厳格に制御されている。実際に、活性部位が結合しておらず、したがって天然の基質と相互作用できる活性型のMMPと活性部位がプロペプチドで塞がれている不活性プロフォームのMMPと活性部位が天然の阻害物質によって塞がれている阻害された型のMMPのすべては、共存することができる。
【０００４】
疾患の発症及び進行は、タンパク質分解能を有する活性型の存在と関連するこの活性の脱制御を伴う。関係する疾患は、癌(いくつかのバイオマーカーMMP、特にMMP-2及びMMP-9)、ウイルス感染症(MMP-9、MMP-2)、変形性関節症及び関節リウマチ(MMP-13)、デュピュイトラン拘縮(MMP-2、MMP-14)、アテローム性動脈硬化症(MMP-12)、又は慢性閉塞性肺疾患(COPD)(MMP-12)、気腫及び喘息(MMP8)などの炎症性成分を伴う呼吸器疾患である。MMPは、神経変性疾患にも関与する:多発性硬化症(MMP-3、MMP-8、MMP-9)、重症筋無力症(MMP-2、MMP-3、MMP-9)、脳卒中(MMP-9、MMP-3)、筋萎縮性側索硬化症(MMP-1及びMMP-2)、アルツハイマー病(MMP-3、MMP-9及びMMP-10)。
【０００５】
したがって、活性型のMMPはこれらの疾患のマーカーを表し、その検出は、この特許に記載される本発明が解決しようとする真の診断課題を提起する。
【０００６】
実際に、多くのMMP検出方法が記載されてきたが、不活性型(プロフォーム及び阻害された型)を除外することを意味する、特定のMMP、特に活性型を検出する満足できる方法は存在しない。
【０００７】
メッセンジャーRNAの測定によるトランスクリプトーム分析は、最後に様々な型で液中に存在するタンパク質をコードしているmRNAの量についてしか分からない。mRNA転写産物の測定では、活性型の割合に関する情報を得られない。
【０００８】
MMPの合成基質に基づく方法は、他の問題を提起する。MMPを検出するために基質を使用する市販のキットのほとんどは、水銀塩を添加することによって酵素自体を活性化する工程を含み、この工程により最初に存在する活性型のいずれの特異的な測定も不可能になる。最も重要なことには、異なるMMP間で合成基質の高い特異性が無いので、基質を使用しても、基質の切断に関与するMMPの同一性に関してどんな情報も得られない。したがって、これらの方法は特定のMMPに対して特異的でない。
【０００９】
電気泳動に基づく技術はすべて、活性酵素型と活性部位を遮断する天然の阻害物質の存在によって活性が最初に制御されている酵素型との区別を妨げる部分的な又は完全な変性工程を使用する。実際のところ、これらの技術において必要な変性工程は、その後に活性型として分析される不活性MMPの存在を排除する。加えて、ウェスタンブロット技術における抗体の使用は、サンプル中に極めて低濃度で存在するタンパク質に対してほとんど感度がないままである。したがって、これらの技術は、不活性化された及び活性化された型の両方を検出してしまい、あまり高感度でない。
【００１０】
MMP2及びMMP9(ゼラチナーゼとしても公知)の検出に非常に特異的な酵素電気泳動技術も、サンプルの部分変性の工程という短所があり、その工程は実施に必須である。加えて、分析において対象となる分析物の量を制限する移動方法の制約のため、日常的に使用する電気泳動は、分析するサンプルの総量を制限する。
【００１１】
MMP12の検出用として幾つか市販されているELISA試験は、活性型、プロフォーム及び不活性型を区別できない相補的な抗体の組を使用しており、そのためタンパク質の機能情報の入手が妨げられる。
【００１２】
これらすべての要素により、研究は、タンパク質分解活性を介して疾患に関係する活性型のMMPの特異的検出について行われた。活性ベースのプローブを含めて、この目的でこれまでに開発された方法は、特に複合生体サンプル又は組織標本を考えると、感度又は特異性の不足に関連する短所がある。ここで再び、制限は、サンプルの取り扱いにおける方法論的な制約によるものである。
【００１３】
活性型のMMPの検出に必要な要件を満たすとして記載されている文献の唯一の例は、ヒトMMP12の検出に関し、抗体及び蛍光基質の使用を併用する系を使用する(LaPanら、BMC Pulmonary Medicine 2010、10:40頁)。しかし、阻害物質によって最初は不活性化されているMMP12の検出を除外するそのような系の能力に関するデータは、得られていない。しかし、この方法は、抗体へのタンパク質の結合と基質の添加との間に、MMP12に結合している天然の阻害物質(TIMP)を除去する可能性がある工程である予備洗浄工程を含む。したがって、この方法は、生体サンプル中のプロフォームと活性型とを区別することはできるが、活性部位が結合していない活性型と最初は活性部位が阻害物質によって塞がれているものとを区別することはできない。更に、そのような手法は、EIA(酵素免疫測定法)形式においてしか使用できない。
【００１４】
上記の主な短所は、活性型のMMPと不活性型との区別ができないこと、及び/又は検出されたMMPの確認に曖昧性があることを意味する。これらの制限は、サンプルの取り扱いにおける方法論的な制約から生まれる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】WO00/43404
【特許文献２】WO01/25264
【特許文献３】WO07/062376
【特許文献４】WO08/057254
【特許文献５】WO2011/023864
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】LaPanら、BMC Pulmonary Medicine 2010、10:40頁
【非特許文献２】Diveら(2004、Cell Mol Life Sci、61、2010〜2019頁)
【非特許文献３】Fisher及びMobashery(2006、Cancer Metastasis Rev. 25、115〜136頁)
【非特許文献４】Develら(2006、J Biol Chem、281、11152〜11160頁)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
したがって、特に、低発現量の当該MMPと一緒に高濃度のタンパク質を含有し得る複合生体サンプルから活性型の特定のMMPを特異的に検出する方法の差し迫った必要性がなお存在している。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
特に試験に使用される合成基質に対して強い配列/構造相同性及び低い基質特異性を呈するMMPに関連して、本発明は、特定のMMPの活性型だけを特異的に検出する方法を提供し、複合生体媒体中でそれを速やかに、優れた感度で行う。
【００１９】
本発明は、生体サンプル中の対象となるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の活性型だけを特異的に検出するin vitroの方法であって、
a)生体サンプルを、MMPの遊離活性部位に結合できる対象となるMMPのリガンドと接触させる工程と;
b)工程a)の後又は工程a)と同時に、工程a)の産物を、対象となるMMPに特異的な抗体と接触させる工程と;
c)対象となるMMP、対象となるMMPのリガンド、及び対象となるMMPに特異的な抗体の三成分複合体を検出する工程と
を含み、リガンドがホスフィン偽ペプチド阻害物質を含む方法に関する。
【００２０】
好ましくは、対象となるMMPのリガンド又は対象となるMMPに特異的な抗体のいずれかが、固体支持体に固定されており、検出は、リガンドが支持体に固定されている場合は抗体を検出することによって又は抗体が支持体に固定されている場合はリガンドを検出することによって達成される。
【００２１】
第1の好ましい実施形態において、本方法は、
a)対象となるMMPのリガンドが固定されている固体支持体を準備する工程と;
b)固体支持体をサンプルと接触させて、リガンドと対象となるMMPとの結合によりサンプル中に存在する対象となるMMPを固体支持体に付着させる工程と;
c)任意選択で、付着していないMMP及びサンプルの他のタンパク質を除去する工程と;
d)対象となるMMPに特異的な抗体を添加して、対象となるMMP、対象となるMMPのリガンド、及び対象となるMMPに特異的な抗体の三成分複合体を形成させる工程と;
e)遊離抗体を除去する工程と;
f)三成分複合体中の抗体を検出する工程と
を含み、この検出により、サンプル中に対象となるMMPの活性型が存在することが示される。
【００２２】
第2の他の実施形態において、本方法は、
a)対象となるMMPに特異的な抗体が固定されている固体支持体を準備する工程と;
b)対象となるMMPのリガンドと事前に接触させた又は同時に接触させるサンプルと固体支持体を接触させて、抗体と対象となるMMPとの結合によりサンプル中に存在する対象となるMMPをリガンドに付着させ、対象となるMMPを固体支持体に固定する工程と;
c)遊離MMP及びリガンドを除去する工程と;
d)対象となるMMP、対象となるMMPのリガンド、及び対象となるMMPに特異的な抗体の三成分複合体中のリガンドを検出する工程と
を含み、この検出により、サンプル中に対象となるMMPの活性型が存在することが示される。
【００２３】
好ましくは、本方法は、固相免疫測定法又は免疫クロマトグラフィー試験(ICT)を使用する。固相は、膜(フロースルー)、マイクロタイタープレートのウェル(例えばEIA)又はストリップ(ディップスティック)でもよい。リガンド又は抗体は、検出可能なマーカーとの共有結合又は非共有結合によって検出される。検出可能なマーカーは、コロイド金属、非金属コロイド、炭素、可視、蛍光、発光又は化学発光トレーサー、磁気粒子、放射性元素、可視又は蛍光トレーサーを有するラテックスビーズ及び酵素からなる群から選択されてもよく;好ましくはコロイド金又は酵素である。
【００２４】
特定の一実施形態において、リガンドは、好ましくはリンカー又はスペーサー、特にポリエチレングリコールリンカーを介して担体タンパク質に結合される。担体タンパク質は、対象となるMMPのリガンドで単官能化又は多官能化されてもよい。それは、血清アルブミン、好ましくはヒト又はウシでもよい。また、それはアセチルコリンエステラーゼなどの酵素でもよい。
【００２５】
生体サンプルは、生体液若しくは体液、又は組織若しくは細胞抽出物でもよい。
【００２６】
対象となるMMPは、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-21、MMP-23A、MMP-23B、MMP-24、MMP-25、MMP-26、MMP-27及びMMP-28の中から、好ましくはMMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-12、MMP-13及びMMP-14の中から選択されてもよく、好ましくはMMP-12である。
【００２７】
好ましくは、リガンドは式(I)の部分を含み:
【００２８】
【化１】
2015532417.tif 000002
【００２９】
式中、
Yaa'は、Asp、Pro、Gly、Cys及びGln以外の天然アミノ酸、特にAla、Arg、Asn、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Val、Trp及びTyrからなる群から選択され;
Zaa'は、Pro及びCys以外の天然アミノ酸、特にAla、Arg、Asp、Asn、Gly、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Val、Trp及びTyrからなる群から選択され;
Rは、
【００３０】
【化２】
2015532417.tif 000003
【００３１】
からなる群から選択される。
【００３２】
好ましい実施形態において、リガンドは式(III)の部分:
【００３３】
【化３】
2015532417.tif 000004
【００３４】
を含む。
【００３５】
本発明は、対象となるMMPの活性型だけを特異的に検出するためのキットであって、
a)対象となるMMPに特異的な抗体;
b)ホスフィン偽ペプチド阻害物質を含み、好ましくは担体タンパク質を官能化する対象となるMMPのリガンド;
c)任意選択で、抗体又はリガンドのいずれかが固定されている固体支持体;及び
d)任意選択で、抗体又はリガンドの検出を可能にする試薬
を含むキットにも関する。
【００３６】
最終的に、本発明は、特に、癌、ウイルス感染、変形性関節症、関節リウマチ、デュピュイトラン拘縮、アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患、気腫及び喘息などの炎症性成分を伴う呼吸器疾患、又は多発性硬化症、重症筋無力症、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症若しくはアルツハイマー病などの神経変性疾患を診断するための診断方法における、本発明による方法又は本発明によるキットの使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、対象となるMMPの活性型だけを検出する方法に関し、この方法は、複合サンプルの場合を含めて、非常に高感度で実行が容易である。より具体的には、この方法は、対象となるMMPに特異的な抗体を使用し、それによってサンプル中に存在する対象となるMMPと他のMMPとの識別を可能にする第一の方法と、MMPの活性部位に結合し、ホスフィン偽ペプチド阻害物質を含むリガンドを使用し、このリガンドが、サンプル中に存在する可能性がある対象となるMMPの活性型と対象となるMMPの他の型(プロフォーム及び天然の阻害物質によって不活性化された型)との識別を可能にする第二の方法とを併用する。プロフォーム又は不活性型の中で活性型を特異的に検出できるように、洗浄、活性化、若しくは変性など、MMPと天然の阻害物質又はプロペプチドとの結合を修飾する可能性がある前工程無しにこのリガンドをサンプルと接触させる。リガンド、対象となるMMP、及び特異的抗体の三成分複合体の検出は、対象となるMMPの活性型の特異的検出を可能にする。
【００３８】
以前に記載された方法はすべて、MMPを固体支持体に付着させる工程と基質と接触させる工程の間に洗浄工程、又は変性工程を含むように設計されているので、この方法は新規である。しかしそのような工程は、MMPと天然の阻害物質との結合を排除する。
【００３９】
したがって、本発明は、サンプル中の対象となるマトリックスメタロプロテアーゼ(MMP)の活性型だけを特異的に検出する方法であって、
a)生体サンプルを、MMPの遊離活性部位に結合できる対象となるMMPのリガンドと接触させる工程と;
b)工程a)の後又は工程a)と同時に、工程a)の産物を、対象となるMMPに特異的な抗体と接触させる工程と;
c)対象となるMMP、対象となるMMPのリガンド、及び対象となるMMPに特異的な抗体の三成分複合体を検出する工程と
を含み、リガンドがホスフィン偽ペプチド阻害物質を含む方法に関する。
【００４０】
好ましくは、対象となるMMPのリガンド又は対象となるMMPに特異的な抗体のいずれかが、固体支持体に固定されており、検出は、リガンドが支持体に固定されている場合は抗体を検出することによって又は抗体が支持体に固定されている場合はリガンドを検出することによって実施される。
【００４１】
対象となるMMPは、好ましくはMMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-21、MMP-23A、MMP-23B、MMP-24、MMP-25、MMP-26、MMP-27及びMMP-28からなる群から選択される。特定の一実施形態において、対象となるMMPはMMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-16、MMP-17、MMP-19、MMP-20、MMP-21、MMP-23A、MMP-23B、MMP-24、MMP-25、MMP-26、MMP-27及びMMP-28からなる群から選択される。好ましい実施形態において、対象となるMMPはMMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-10、MMP-12、MMP-13及びMMP-14からなる群から選択される。他の好ましい実施形態において、対象となるMMPはMMP-2、MMP-3、MMP-8、MMP-9、MMP-12、MMP-13及びMMP-14からなる群から選択される。特に好ましい実施形態において、対象となるMMPは、MMP-12である。好ましくは、対象となるMMPは、ヒトMMPである。しかし、対象となるMMPは、活性型の検出が、家畜(例えばイヌ、ネコ又はウマ)など、診断的価値を、又は実験動物(例えばマウス又はラット)など、実験的価値を持つ他の種由来であってもよい。
【００４２】
好ましくは、試験サンプルは生体サンプルである。このサンプルは、例えばそれだけには限らないが、血液サンプル、リンパサンプル、痰、特に気管気管支洗浄物、唾液、尿、胆汁、膵液、精液、羊水、粘液、胃液、汗、脳脊髄液、滑液、胸膜液、腹水又は心膜液を含めた体液又は生体液のサンプルでもよい。また、このサンプルは、組織抽出物、特に細胞抽出物でもよい。好ましくは、試験サンプルは、採取したサンプルから又は細胞若しくは組織抽出物から、特に希釈によって調製される。希釈は、2、5、10、20、50又は100倍であってもよい。しかしながら、通常MMPは少量しか存在しないので、サンプルが試験に使用される方法に適合するように、好ましくは希釈はできるだけ低い。サンプルは、腫瘍由来でもよい。サンプルは新鮮でも凍結されていてもよい。
【００４３】
定義により、サンプルが、生体サンプルである又はそのようなサンプルから調製される場合、それを複合であると言う。サンプルの複雑さは、サンプル中に様々な濃度比で存在する多数の異なるタンパク質に起因する。これらのタンパク質の濃度は、MMP(その濃度は、ナノモル以下:≦1nMであると推定できる)など対象となる生物学的標的と比較して、非常に高い場合がある(×1000、×10,000)。
【００４４】
第1の工程は、生体サンプルを、対象となるMMPのリガンドと接触させる工程を含む。
【００４５】
本方法の重要な点は、生体サンプルが、MMPの状態を変化させ得る工程無しに、対象となるMMPのリガンドの存在下に置かれるということである。上で説明されるように、MMPは3つの状態:1)プロフォーム、プロペプチドの切断前を意味し、プロペプチドは活性部位に結合する;2)活性型、プロペプチドがないことを意味する;及び3)不活性型、プロペプチドを含まないが活性部位に結合している天然のMMP阻害物質を含むことを意味する、で存在してもよい。天然のMMP阻害物質には、TIMP(メタロプロテイナーゼの組織阻害物質)、特にTIMP-1、TIMP-2、TIMP-3及びTIMP-4がある。
【００４６】
しかし、サンプル中のMMPの状態に影響を及ぼさない限り、サンプルは、希釈又は抽出工程に供することができる。実験データは、本発明の方法が、生体サンプルを希釈する又は組織若しくは細胞抽出物を調製するために使用する媒体に適合することを示した。しかしながら、本方法は、MMP固定化と、それに続く洗浄工程を含まず、洗浄工程はサンプルをリガンドと接触させる前にMMPの状態を変化させる恐れがある。
【００４７】
MMPリガンドは、対象となるMMPの遊離活性部位に結合できるリガンドである。阻害物質を、MMPの活性部位に対する基質の結合を永続的に妨げ、MMPによって切断されないものと考えることもできる。それは、極めて高い親和性で結合し、洗浄工程の間中この相互作用を維持できなければならない。しかし、それは、MMPに結合している天然の阻害物質を置き換えるべきでない。好ましくは、リガンドは、MMP対象に対する阻害定数Kiが2ナノモル以下、特に1ナノモル以下のKi(1nM以下、特に1、0.5又は0.1nM未満のKi)であるべきである。試験サンプル中に存在する他のプロテアーゼと比較して、MMPに対して特異性を有する阻害物質を選ぶことが好ましい。最終的に、阻害物質の選択における他の重要なパラメータは、化学的安定性である。実際に、阻害物質は代謝されるべきではなく、体液又は細胞抽出物を意味するサンプル中でその構造は変質するべきでない。
【００４８】
本発明者らは、阻害物質選択ための様々なパラメータを定義し、ホスフィン偽ペプチド阻害物質を選んだ。
【００４９】
多くのMMP阻害物質が記載されている。いくつかは、MMPに対して優れた親和性を有する。しかし、これらの阻害物質は、この親和性にも関わらず不適当だった。例えば、1つの周知のクラスの阻害物質であるヒドロオキサメート阻害物質は、MMP阻害物質の開発において最も研究されてきた。しかし、このクラスは選ばれなかった。実際に、それらはMMPに対する特異性が極めて低く、ADAM、ADAM-TSなど他のメタロプロテアーゼ族、又はネプリライシンなど豊富なメタロプロテアーゼと相互作用し、そのため複合サンプルにおける使用が困難になる。ヒドロオキサメート官能基が加水分解されて、カルボン酸エステル及び親和性が低い化合物を生成するので、それらは化学的に極めて不安定でもあり;これにより、複合媒体、特に細胞抽出物を調製する場合に使用される媒体における使用が困難になる。
【００５０】
ホスフィン偽ペプチドのクラスは当業者に公知であり、例えば、Diveら(2004、Cell Mol Life Sci、61、2010〜2019頁); Fisher及びMobashery(2006、Cancer Metastasis Rev. 25、115〜136頁);WO00/43404、WO01/25264、WO07/062376、WO08/057254及びWO2011/023864に記載されており、これらの説明を参照により本明細書に組み込む。
【００５１】
任意選択で、MMPリガンドは、他のMMPに対してではなく対象となるMMPに対して特異性を有するように選ぶことができる。しかし、この態様は本発明において重要ではなく、重要な因子は、対象となるMMPに対する優れた親和性だけである。MMP12リガンドの好ましい実施形態において、阻害物質は、WO08/057254、WO2011/023864又はDevelら(2006、J Biol Chem、281、11152〜11160頁)に記載されている中から選ばれ、これらの説明を参照により本明細書に組み込む。
【００５２】
したがって、リガンドはホスフィン偽ペプチド阻害物質を含む又はそれである。
【００５３】
好ましい実施形態において、リガンドは式(I)の部分:
【００５４】
【化４】
2015532417.tif 000005
【００５５】
を含み、式中、
Yaa'は、Asp、Pro、Gly、Cys及びGln以外の天然アミノ酸、特にAla、Arg、Asn、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Val、Trp及びTyrからなる群から選択され;
Zaa'は、Pro及びCys以外の天然アミノ酸、特にAla、Arg、Asp、Asn、Gly、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Ser、Thr、Val、Trp及びTyrからなる群から選択され;
Rは、
【００５６】
【化５】
2015532417.tif 000006
【００５７】
からなる群から選択される。
【００５８】
本文書で定義されるアミノ酸は、下に表示する3文字記号を使用して表される:
【００５９】
【表１】
2015532417.tif 000007
【００６０】
より具体的には、リガンドは式(II)の部分:
【００６１】
【化６】
2015532417.tif 000008
【００６２】
を含み、式中、
R、Yaa'及びZaa'は式(I)中において定義される通りであり;
R'は、R3がH又はBrである
【００６３】
【化７】
2015532417.tif 000009
【００６４】
;又は
【００６５】
【化８】
2015532417.tif 000010
【００６６】
のいずれかであり、
Xは、Gly、Phe、Ala、Val、Leu及びIleからなる群から選択されるアミノ酸の側鎖であり;
R2は、
【００６７】
【化９】
2015532417.tif 000011
【００６８】
;-C(=O)-Waa'-Xaa'-;及び-C(=O)-Vaa'-Waa'-Xaa'-からなる群から選択され;
Vaa'、Waa'及びXaa'は、Cys以外の任意の天然アミノ酸であり、特にAla、Arg、Asp、Asn、Gly、Gln、Glu、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Val、Trp及びTyrからなる群から選択される。
【００６９】
極めて具体的な実施形態において、リガンドは、式IIの部分を含むようなものであり、
Yaa'は、Tyrであり、Zaa'は、Alaであり;
Rは、
【００７０】
【化１０】
2015532417.tif 000012
【００７１】
であり;
R'は、Xが、Pheの側鎖であり、R2が、-C(=O)-Waa'-Xaa-である
【００７２】
【化１１】
2015532417.tif 000013
【００７３】
であり;Xaa'は、AlaでありWaa'はProである。
【００７４】
したがって、リガンドは式(III)の部分:
【００７５】
【化１２】
2015532417.tif 000014
【００７６】
を含む。
【００７７】
他の極めて具体的な実施形態において、リガンドは、式IIの部分を含むようなものであり、
Yaa'は、Tyrであり、Zaa'は、Alaであり;
Rは、
【００７８】
【化１３】
2015532417.tif 000015
【００７９】
であり;
R'は、Xが、Pheの側鎖であり、R2が、-C(=O)-Waa'-Xaa-である
【００８０】
【化１４】
2015532417.tif 000016
【００８１】
であり;Xaa'は、AlaでありWaa'はProである。
【００８２】
他の極めて具体的な実施形態において、リガンドは、式IIの部分を含むようなものであり、
Yaa'は、Tyrであり、Zaa'は、Alaであり;
Rは、
【００８３】
【化１５】
2015532417.tif 000017
【００８４】
であり;
R'は、Xが、Pheの側鎖であり、R2が-C(=O)-Vaa'-Waa'-Xaa-であり、Vaa'が、Pheであり、Xaa'が、Alaであり、Waa'が、Proである
【００８５】
【化１６】
2015532417.tif 000018
【００８６】
である。
【００８７】
好ましくは、リガンドは、部分の1端及び/又は他の末端、特にZaa'でスペーサーを更に含む。任意選択で、スペーサーは-CH2-C(=O)-NH-(CH2)3-O-(CH2)2-O-(CH2)2-O-(CH2)3-NH-であることができる。
【００８８】
したがって、リガンドは式(III')の部分:
【００８９】
【化１７】
2015532417.tif 000019
【００９０】
を含むことができる。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態において、リガンドは担体タンパク質と結合している。担体タンパク質とリガンドの間の結合は、共有結合又は非共有結合であり得る。
【００９２】
結合が非共有結合である場合、リガンドは、互いに親和性を有する一対の分子、例えばビオチン-ストレプトアビジン又はビオチン-アビジン対によって担体タンパク質上に固定されてもよい。したがって、リガンドは、好ましくはポリエチレングリコールなどのリンカー又はスペーサーによってビオチンに共有結合しており、担体タンパク質はストレプトアビジンに結合しているか又はそれである。リガンドP3は、ビオチンに結合しているリガンドの具体例である。
【００９３】
結合が共有結合である場合、対象となるMMPのリガンドで官能化される担体タンパク質は、官能化可能なアミノ酸、例えばリシン、ヒスチジン、チロシン又はシステインを有する任意のタンパク質であることができる。実施例で示すように、担体タンパク質としてBSA、HSA及びアセチルコリンエステラーゼを使用して類似の結果が得られたので、この担体タンパク質の性質は検出試験に影響がない。
【００９４】
担体タンパク質は、単官能化(単一のMMPリガンドを有する)又は多官能化(いくつかのMMPリガンドを有する)できる。好ましい実施形態において、固体支持体へのMMPリガンドの固定に免疫クロマトグラフィー技術を使用する場合、多官能化された担体タンパク質が好ましい。
【００９５】
好ましくは、MMPリガンドは、リンカー又はスペーサーを介して担体タンパク質に結合している。この結合の主要な機能は、リガンドがMMPの活性部位との相互作用に確実に利用可能になることである。好ましくは、結合は、少なくとも約30オングストロームの長さを有する。例えば、結合は、100〜200オングストロームの長さを有することができる。リガンドが著しく疎水性である場合、相補的な機能がリガンドの可溶性を促進することになる。一例は、ポリエチレングリコール(PEG)リンカー/スペーサーであり、特に少なくとも10個の繰り返しのPEG、特に20〜40個の繰り返し、例えば約30個の繰り返しがある。他のスペーサーが当業者に周知であり、使用することができる。
【００９６】
好ましくは、担体タンパク質、又は多重結合している場合の担体タンパク質のモノマーの分子量は、あまり大きくなく、好ましくは100kDa未満である。
【００９７】
担体タンパク質は、MMPの活性に干渉してはならない。
【００９８】
一実施形態において、担体タンパク質は酵素活性を示さない。担体タンパク質の非限定的な例には、血清アルブミン(ヒト又はウシを含める)、卵白アルブミン、サイログロブリン(tyrogloblin)、破傷風トキソイド又はジフテリアトキソイド、スカシガイヘモシアニン(KLH)、マルトース結合タンパク質(MBP)及びフラジェリンがある。好ましい実施形態において、担体タンパク質は、血清アルブミン、好ましくはヒト又はウシである。
【００９９】
他の実施形態において、担体タンパク質も検出可能であり、検出可能な酵素活性を有してもよい。したがって、それは検出可能なマーカーに直接又は間接的にコンジュゲートされる。
【０１００】
「間接的にコンジュゲートされる」とは、特に、ビオチン-ストレプトアビジン対など互いに親和性を有する一対の分子を介して、タンパク質が検出可能なマーカーに付着できることを意味すると理解される。したがって、担体タンパク質には、その表面に1つ以上ビオチンが付着することができ、ストレプトアビジンは、検出可能なマーカーにコンジュゲートされることになる。
【０１０１】
「直接コンジュゲートされる」とは、タンパク質が表面に検出可能なマーカーを有することを意味すると理解される。これらの検出可能なマーカーは、例えば、コロイド金属、非金属コロイド、炭素、可視、蛍光、発光又は化学発光トレーサー、磁気粒子、放射性元素、可視又は蛍光トレーサーを有するラテックスビーズ及び活性を検出できる酵素からなる群から選択されてもよい。好ましくは、検出可能なマーカーは、コロイド金又は酵素である。この型の用途に使用できる酵素は、当技術分野で周知であり、アセチルコリンエステラーゼ又はペルオキシダーゼを具体例として挙げることができる。
【０１０２】
具体的な実施形態において、担体タンパク質は、検出可能なマーカーとして使用される酵素である。酵素免疫測定法(EIA)若しくはELISAにおいて使用される又は使用可能な酵素は、当業者に周知であり、担体タンパク質として本発明において使用できる。EIA試験において、MMPリガンドで官能化された担体タンパク質を、支持体に固定された対象となるMMPの検出に使用する場合、この実施形態は特に興味深いものになる。
【０１０３】
担体タンパク質にMMPリガンドを結合(又は官能化)させる方法は、当業者に周知である。例には、カルボジイミド、グルタルアルデヒド、ビスジアゾ化ベンジジン又はマレイミドによる結合がある。
【０１０４】
次の工程は、工程a)の後又は工程a)と同時でもよく、工程a)の産物を、対象となるMMPに特異的な抗体と接触させる工程である。
【０１０５】
抗体は、対象となるMMPを場合によっては試験サンプル中に存在する他のMMPと識別できなければならない。それが、対象となるMMPを特異的に検出する方法を可能にする抗体の特異性である。
【０１０６】
対象となるMMPに特異的な抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよい。それは、IgG、IgM又はIgAでもよく、好ましくはIgGである。抗体は、リガンドに対するMMPの結合に干渉しない方法でMMPに連結されなければならず、換言すれば、MMPの触媒ドメインの活性部位に結合しない。しかしながら、それは触媒ドメインに結合することができるが、活性部位の外側である。
【０１０７】
多くの抗MMP抗体が、例えばSigma-Aldrich社、R&D社、Millipore社、Aviva社、GeneTex社、MyBioSource.com社、Genway Biotech Inc.社、Thermo Scientific Pierce Antibodies社、Acris Antibodies GmbH社、コスモバイオ社及びLifeSpan BioSciences社から各MMPについて市販されている。
【０１０８】
最終的に、本方法は、対象となるMMP、対象となるMMPのリガンド、及び対象となるMMPに特異的な抗体の三成分複合体を検出する工程を含む。この三成分複合体の検出は、抗体の検出によって又はリガンドの検出によって実施することができる。
【０１０９】
第1の好ましい実施形態において、三成分複合体は抗体の検出によって検出される。この抗体は、直接又は間接的に標識されてもよく、好ましくは直接である。例えば、それは検出可能なマーカー、例えば酵素、金粒子又は着色、蛍光若しくは放射性マーカーにコンジュゲートされてもよい。別法として、抗体は、MMPに特異的な抗体に対する抗体など、検出可能なマーカーにコンジュゲートされている二次抗体によって検出されてもよい。例えば、MMPに特異的な抗体がマウス免疫グロブリンである場合、二次抗体はマウス免疫グロブリンに特異的である。加えて、抗体は、互いに親和性を有する一対の分子のメンバーにコンジュゲートされてもよく、例えばビオチンにコンジュゲートされる。他のメンバー、特にストレプトアビジンが、検出可能なマーカーにコンジュゲートされる。
【０１１０】
第1の他の実施形態において、三成分複合体は、リガンドの検出によって検出される。リガンドが検出可能なマーカーにコンジュゲートされている場合、又は担体タンパク質が検出可能な活性を有する酵素である場合、これは直接行うことができる。リガンド又は担体タンパク質が、互いに親和性を有する一対の分子のメンバーにコンジュゲートされ、例えばビオチンにコンジュゲートされている場合、それを間接的に行うこともできる。他のメンバー、特にストレプトアビジンが、検出可能なマーカーにコンジュゲートされる。標識に関する最終の選択肢は、担体タンパク質に対して作られた抗体を使用することである。
【０１１１】
本方法は、好ましくは固体支持体への三成分複合体の固定化を含む。固体支持体は、表面、ビーズ又はチューブでもよい。固体支持体は、免疫測定法に適合する任意の支持体でもよい。ニトロセルロース、ナイロン、酢酸セルロース、グラスファイバー又は他の多孔性ポリマーなど多くの材料が、支持体として使用できる。
【０１１２】
固定化は、リガンド又は抗体のいずれかによって達成される。MMPがリガンドによって固定される場合、その後三成分複合体の検出は抗体の検出によって起こる。逆に、MMPが抗体によって固定される場合、その後三成分複合体の検出はリガンドの検出によって起こる。
【０１１３】
したがって、三成分複合体の固定化が、リガンドによって達成される第1の特に好ましい実施形態において、本方法は、
a)対象となるMMPのリガンドが固定されている固体支持体を準備する工程と;
b)固体支持体をサンプルと接触させて、リガンドと対象となるMMPとの結合により、サンプル中に存在する対象となるMMPを固体支持体に付着させる工程と;
c)任意選択で、付着していないMMP及びサンプルの他のタンパク質を除去する工程と;
d)対象となるMMPに特異的な抗体を添加して、対象となるMMP、対象となるMMPのリガンド、及び対象となるMMPに特異的な抗体の三成分複合体を形成させる工程と;
e)遊離抗体を除去する工程と;
f)三成分複合体中の抗体を検出する工程と
を含み、その検出により、サンプル中に対象となるMMPの活性型が存在することが示される。
【０１１４】
工程c)及びe)は、洗浄工程を実行することによって達成されてもよい。
【０１１５】
任意選択で、工程b)及びd)は、逆にすることができる。したがって、サンプルを抗体と接触させ、次いでこの混合物を固体支持体と接触させる。あるいは、工程b)及びd)は、同時であり得る。したがって、サンプル及び抗体を固体支持体と接触させる。
【０１１６】
この実施形態において、リガンドは、固体支持体に直接固定されてもよく、任意選択でリンカー/スペーサーを介してもよい。好ましくは、リガンドは、固体支持体に固定されている担体タンパク質に結合している。担体タンパク質は、リガンドで単官能化又は多官能化されてもよい。具体的な一実施形態において、担体タンパク質は、血清アルブミン、特にヒト又はウシである。
【０１１７】
したがって本発明は、上で定義した通りリガンドが固定されている固体支持体に関する。好ましくは、リガンドは、固体支持体に固定された担体タンパク質に結合している。担体タンパク質は、リガンドで単官能化又は多官能化されてもよい。具体的な一実施形態において、担体タンパク質は、血清アルブミン、特にヒト又はウシである。固体支持体は、ストリップ(免疫クロマトグラフィーに適する)、マイクロタイタープレートのウェル、フィルター若しくは膜、又はディップスティックストリップでもよい。
【０１１８】
特に、本発明は、2つの型の試験に関する。
【０１１９】
第1の型は、免疫クロマトグラフィー試験である。この方法は、当業者に周知である。好ましくは、支持体は、クロマトグラフィーに適したストリップである。リガンドは、試験領域に固定される。好ましい実施形態において、リガンドで多官能化された担体タンパク質(いくつかのリガンドを有する)が固定される。別法として、リガンドで単官能化された担体タンパク質(1つのリガンドを有する)も固定できる。好ましくは、支持体は対照領域を更に含み、この領域には、抗MMP抗体、例えば抗MMP抗体に対する抗体を付着させる手段がある。例えば、抗MMP抗体がマウス抗体である場合、マウス抗体に特異的な抗体を使用することになる。同じことが、ウサギ、ラット又はヤギ抗体にも適用される。サンプルは、サンプル沈着領域の側にサンプルを沈着させることによってリガンドと接触させ、次いでサンプルの移動が起こる。任意選択で、1回以上の洗浄がその後実行される。最初に遊離活性部位を有する活性型MMPは、リガンドとの相互作用により試験領域に固定される。他の型は領域に付着しないので、試験領域から除去される。得られた実験データは、プロフォーム及び阻害物質によって不活性化された型は保持されず、したがって検出されないので、この系により活性型のMMPの選択的な固定化が可能になり;この系が様々な環境において複合サンプルを用いて固定できることを示している。次いで、対象となるMMPに特異的な抗体を添加することによって、試験領域に固定されたMMPが検出される。この抗体は、直接又は間接的に標識されてもよく、好ましくは直接である。この実施形態は、活性型に特異的であり、高感度(緩衝液中に約1.2ng/mL)であり、複合媒体(複合サンプル中に10〜20ng/mLの感度)に適合すると判明した。
【０１２０】
別法として、サンプルを沈着領域でストリップに置くことができる。サンプルはストリップに沿って移動し、移動可能な(固体支持体に固定化されていない)抗MMP抗体を有する領域と一緒になる。その後サンプルと抗体は、ストリップに沿って試験及び対照領域に移動する。
【０１２１】
対象となる異なるMMPを検出することも可能である。したがって、リガンドは、対象となるMMPに適合する(換言すれば、結合できる)ように選ばれ、各ストリップは、対象となる異なるMMPに特異的な抗体と共に使用される。例えば、2つのMMPを検出しようとする場合、第1のMMPに特異的な抗体と共に使用される1つのストリップ及び第2のMMPに特異的な抗体と共に使用される別のストリップがあることになる。
【０１２２】
本発明は、試験を行うためのキットにも関する。このキットは以下を含む、
-  対象となるMMPのリガンドが固定されている試験領域を含むストリップ。好ましくは、リガンドは、特にリンカー又はスペーサーを介して担体タンパク質と結合している。好ましくは担体タンパク質は、リガンドで多官能化されている。好ましくは、ストリップは、抗MMP抗体を付着させる手段を固定した対照領域を更に含む。ストリップは、サンプル沈着領域、及び任意選択でその下流であり試験領域の前に抗MMP抗体を支持する領域を更に含む。
-  好ましくは着色粒子(例えば金又はラテックス粒子)、発蛍光団又はラジオアイソトープで標識した対象となるMMPに特異的な抗体;
-  任意選択で、洗浄緩衝液、希釈又は抽出緩衝液などの試薬。
【０１２３】
対象となる異なるMMPがいくつか検出される場合、キットは対象となるMMP当たり少なくとも1つのストリップを含有し、対象となるMMP当たり1つの特異抗体を更に含む。例えば、2つのMMPを検出しようとする場合、少なくとも1つの、第1のMMPに特異的な抗体及び第2に特異的な別の抗体があることになる。キットは、単一の型のストリップ及び存在する対象となるMMPと同数の特異的抗体を含有してもよい。
【０１２４】
第2の型の試験は、固相免疫測定法、好ましくは酵素免疫測定法である。固体支持体は、膜若しくはフィルター(フロースルー)、マイクロタイタープレートのウェル(例えばEIA)、又はストリップ(ディップスティック)でもよい。リガンドは、固体支持体に固定される。好ましい実施形態において、リガンドで単官能化された担体タンパク質(1つのリガンドを有する)が固定される。別法として、また、リガンドで多官能化された担体タンパク質(いくつかのリガンドを有する)が固定されてもよい。その後サンプルを、固定化したリガンドと接触させる。インキュベーション後に、1回以上の洗浄を、場合により実行する。得られた実験データは、プロフォーム及び阻害物質によって不活性化された型は保持されず、したがって検出されないので、この系により活性型のMMPの選択的な固定化が可能になり;この系が様々な環境において複合サンプルを用いて固定できることを示している。対象となるMMPに特異的な抗体が、その後添加され、任意選択で抗体を検出する前に1回以上の洗浄を実行する。その後に抗体を検出する。
【０１２５】
固体支持体が膜又はフィルター(フロースルー)である場合、リガンドは、膜若しくはフィルターに固定され、好ましくは制御手段(抗体付着手段)も、別の部位に固定される。次に、サンプルを膜又はフィルターにアプライし、特に毛細管現象によって膜又はフィルターを通過させる。次いで抗体を利用して、リガンド-MMP複合体の存在を明らかにする。また、抗体添加の前後に洗浄ステップを加えてもよい。
【０１２６】
固体支持体がマイクロタイタープレートのウェルである場合、抗体検出には酵素免疫測定法が好ましい。この抗体は、検出可能なマーカー、好ましくは酵素と直接結合していてもよく、又はビオチン-ストレプトアビジン対、若しくはマーカーと結合している二次抗体を介して間接的に結合してもよい。これらの技術は、当業者に周知である。酵素は、例えば、ペルオキシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼでもよい。この実施形態は、活性型に特異的であり、高感度(緩衝液中に約20pg/ml)であり、複合媒体(複合サンプル中に200pg/mlの感度)に適合することが示された。
【０１２７】
最終的に、固体支持体がディップスティックである場合、固体支持体は、好ましくは無孔の支持体である。リガンドは、別の部位で支持体に固定される。好ましくは、対照手段(抗体付着手段)も別の部位に固定される。ディップスティックは、サンプルに、次いで検出しようとするMMPに特異的な抗体の溶液に浸漬される。好ましくは、ディップスティックはこれらの工程の間に洗浄溶液に浸漬される。最後に、抗体の存在を検出する。
【０１２８】
この実施形態において、対象となる異なるMMPを複数検出することも可能である。したがって、リガンドは、対象となるMMPに適合する(換言すれば、結合できる)ように選ばれ、対象となる異なるMMPそれぞれに特異的ないくつかの抗体が使用される。例えば、2つのMMPを検出しようとする場合、第1のMMPに特異的な抗体と共に使用される1つの固体支持体及び第2に特異的な抗体と共に使用される別のそれがある。固体支持体がマイクロタイタープレートウェルである場合、2つ別々のウェルが使用される。固体支持体が膜、フィルター又はストリップである場合、同型の2つの固体支持体が使用されることになる。
【０１２９】
本発明は、試験を行うためのキットにも関する。キットは、以下を含む:
-  対象となるMMPのリガンドが固定されている固体支持体。好ましくは、リガンドは、特にリンカー又はスペーサーを介して担体タンパク質と結合している。任意選択で、それは、対照を取るために、リガンドが固定されている部位から離れた部位への抗体付着手段の固定化を更に含む。
-  対象となるMMPに特異的な抗体。抗体は、検出可能なマーカー、例えば酵素に直接結合されてもよい。別法として、抗体は、検出可能なマーカーとの非共有結合を可能にする分子、例えばビオチンと結合されてもよく;
-  任意選択で、二次抗体又はストレプトアビジンなど抗体との結合が可能な分子と結合している検出可能なマーカー、例えば酵素などの試薬、酵素の作用の後に有色若しくは蛍光産物を形成する基質、及び/又は洗浄緩衝液、希釈若しくは抽出緩衝液。
【０１３０】
対象となる異なるMMPがいくつか検出される場合、キットは対象となるMMP当たり1つの特異的な抗体を含む。例えば、2つのMMPを検出しようとする場合、キットは、第1のMMPに特異的な抗体及び第2に特異的な抗体を含む。
【０１３１】
三成分複合体の固定化が、抗体によって起こる第2の他の特定の一実施形態において、本方法は、
a)対象となるMMPに特異的な抗体が固定されている固体支持体を準備する工程と;
b)対象となるMMPのリガンドと事前に接触させた又は同時に接触させるサンプルと固体支持体を接触させて、抗体と対象となるMMPとの結合によりサンプル中に存在する対象となるMMPをリガンドに結合させ、対象となるMMPを固体支持体に固定する工程と;
c)任意選択で、リガンド及び遊離MMP及びサンプルの他のタンパク質を除去する工程と;
d)対象となるMMP、対象となるMMPのリガンド、及び対象となるMMPに特異的な抗体の三成分複合体中のリガンドを検出する工程と
を含み、この検出により、サンプル中に対象となるMMPの活性型が存在することが示される。
【０１３２】
この実施形態において、上で説明した通り、固体支持体にMMPを固定化し洗浄するいずれかの工程の前に又は同時にサンプルをリガンドと接触させることが重要である。
【０１３３】
したがって本発明は、上記の通り検出可能なマーカーに結合しているMMPのリガンドにも関する。好ましくは、それは、リガンドで官能化された担体タンパク質に関する。一実施形態において、担体タンパク質は、活性が検出可能な酵素である。別法として、担体タンパク質は、検出可能なマーカーに結合している。具体的な一実施形態において、担体タンパク質は、血清アルブミン、特にヒト又はウシである。
【０１３４】
特に、本発明は、2つの型の試験に関する。
【０１３５】
第1の型は、免疫クロマトグラフィー試験である。この実施形態において、対象となるMMPに特異的な抗体が試験領域に固定される。サンプルをリガンドとインキュベートする。好ましくは、リガンドは担体タンパク質に結合している。担体タンパク質は、リガンドで単官能化又は多官能化されてもよい。次に、リガンドと接触させたサンプルが、サンプル沈着領域側に沈着し、移動が起こる。任意選択で、1回以上の洗浄が、その後行われる。
【０１３６】
別法として、サンプルを沈着領域でストリップに沈着させることができる。サンプルが、下流だが試験領域の前であるリガンドを含有する領域に移動した後で、それをリガンドと接触させる。次いで2つを一緒に試験領域に移動させ、固体支持体に固定された抗MMP抗体と接触させる。
【０１３７】
抗体-MMP-リガンド三成分複合体は、リガンドの検出によって検出される。実際、この構成において、対象となるMMPのすべての型が試験領域内に保持される。しかしながら、検出には、活性型にしか結合しないリガンドを用い、その型は利用可能な活性部位を含む唯一の型なので、活性型だけが検出される。リガンドの検出を可能にするために、MMPは検出可能なマーカーに直接又は間接的に結合している。リガンドで官能化された担体タンパク質を使用する場合、検出のために担体タンパク質に特異的な標識抗体を使用することも可能である。
【０１３８】
好ましくは、固体支持体は、リガンドを結合できる対照領域も含む。例えば、リガンドに結合できるMMPが、固体支持体に固定されてもよい。
【０１３９】
この実施形態において、対象となる異なるMMPをいくつか検出することも可能である。したがって、リガンドは、対象となるMMPに適合する(換言すれば、結合できる)ように選ばれる。各ストリップは、試験領域に固定されている、対象となる異なるMMPのうち1つに特異的な抗体と一緒に使用できる。例えば、2つのMMPを検出しようとする場合、第1のMMPに特異的な抗体が固定されている試験領域を有する1つのストリップ及び第2に特異的な抗体が固定されている試験領域を有する別のものが存在することになる。別法として、ストリップは、異なる特異性を有する抗体が固定された別々の試験領域を含む。したがって、2つのMMPを検出しようとする場合、2つの試験領域、つまり第1のMMPに特異的な抗体が固定されている第1の領域、及び第2に特異的な抗体が固定されている試験領域を提供する他の領域を含む1枚のストリップがあることになる。
【０１４０】
本発明は、試験を行うためのキットにも関する。このキットは、以下を含む:
-  対象となるMMPに特異的な抗体が固定されている試験領域を含むストリップ、好ましくは、リガンド付着手段、例えばMMPが固定されている対照領域;
-  好ましくは着色粒子(例えば金又はラテックス粒子)、発蛍光団又はラジオアイソトープで標識した対象となるMMPのリガンド;好ましくは、リガンドは、特にリンカー又はスペーサーを介して担体タンパク質と結合している。
-  任意選択で、洗浄緩衝液、希釈又は抽出緩衝液などの試薬。
【０１４１】
対象となる異なるMMPをいくつか検出しようとする場合、キットは対象となるMMPのうち1つに特異的な抗体が固定されているストリップを、対象となるMMP当たり1枚含有してもよい。例えば、2つのMMPを検出しようとする場合、キットは、第1のMMPに特異的な抗体が固定されている試験領域を有するストリップ及び第2に特異的な抗体が固定されている試験領域を有する別のストリップを含む。別法として、キットは、対象となるMMPのうち1つに特異的な抗体が固定されている複数の試験領域を含むストリップを含有してもよい。例えば、2つのMMPを検出しようとする場合、キットは2つの試験領域、つまり第1のMMPに特異的な抗体が固定されている第1の、及び第2に特異的な抗体が固定されている別の試験領域を有するストリップを含む。
【０１４２】
第2の型の試験は、固相免疫測定法、好ましくは酵素免疫測定法である。固相は、膜若しくはフィルター(フロースルー)、マイクロタイタープレートのウェル(例えばEIA)、又はストリップ(ディップスティック)でもよい。抗体は、固体支持体に固定される。サンプルは、リガンドとプレインキュベートした後に固体支持体に固定された抗体と接触させるか又はサンプルは、リガンドと同時に固体支持体に固定された抗体と接触させるかのいずれかである。好ましい実施形態において、サンプルを、リガンドとプレインキュベートした後に固定された抗体と接触させる。好ましくは、リガンドは担体タンパク質に結合している。担体タンパク質は、リガンドで単官能化又は多官能化されてもよい。次に、1回以上の洗浄を実行することができる。最後に、固体支持体上のリガンドの存在を検出する。前述の如く、対象となるMMPのすべての型が固体支持体に保持され、検出は活性型だけに結合するリガンドによって行われるので、活性型だけが検出される。具体的な一実施形態において、官能化された担体タンパク質は、検出可能なマーカー、例えば基質の加水分解に応じて着色又は蛍光シグナルを生成することができる酵素である。別の実施形態において、リガンドは、担体タンパク質を介して互いに親和性を有する一対の分子メンバー、特にビオチン-ストレプトアビジン又はビオチン-アビジン対のメンバー、特にビオチンに直接又は間接的に結合される。対の他のメンバーは、検出可能なマーカーに結合している。
【０１４３】
固体支持体が膜又はフィルター(フロースルー)である場合、抗体は、膜若しくはフィルターに固定され、好ましくは制御手段(MMPなどリガンド付着手段段)も、別の部位に固定される。事前にリガンドと接触させたサンプルを、次いで膜又はフィルターにアプライし、特に毛細管現象によって膜又はフィルターを通過させる。膜又はフィルターに固定されたリガンドをその後検出する。また、サンプル添加の前後に洗浄ステップを加えてもよい。
【０１４４】
固体支持体がマイクロタイタープレートのウェルである場合、リガンド検出には酵素免疫測定法が好ましい。リガンド若しくは担体タンパク質は、マーカー、好ましくは酵素と直接結合していてもよく、又はビオチン-ストレプトアビジン対若しくは検出可能なマーカーと結合している二次抗体を介して間接的に結合していてもよい。これらの技術は、当業者に周知である。酵素は、例えば、ペルオキシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼでもよい。
【０１４５】
最終的に、固体支持体がディップスティックである場合、固体支持体は、好ましくは無孔の支持体である。抗体は、別の部位で支持体に固定される。好ましくは、対照手段(MMPなどリガンド付着手段)も別の部位に固定される。次いで、ディップスティックは、リガンドの存在下でサンプルに浸漬される又は事前にサンプルと一緒にプレインキュベートされ、その後支持体に固定化されたリガンドを検出する。好ましくは、これらの工程の間にディップスティックを洗浄溶液に浸す。
【０１４６】
この実施形態において、対象となる異なるMMPを複数検出することも可能である。この場合、リガンドは、対象となるMMPに適合する(換言すれば、結合できる)ように選ばれ、ウェルの組又は別々の試験領域は、検出しようとする対象となる様々なMMPのうち1つに特異的な固定されている抗体を有する。例えば、2つのMMPを検出しようとする場合、第1のMMPに特異的な抗体を含む1つの試験領域及び第2に特異的な抗体を含む別のものがある。別法として、別々の固体支持体を、検出しようとする各MMPに使用することができる。
【０１４７】
本発明は、試験を行うことを可能にするキットにも関する。このキットは、以下を含む:
-  対象となるMMPに特異的な抗体が固定された試験領域を含む固体支持体。好ましくは、固体支持体は、リガンド付着手段、例えばMMPが固定された対照領域を更に含む。
-  対象となるMMPのリガンド。好ましくは、リガンドは、特にリンカー又はスペーサーを介して担体タンパク質と結合している。担体タンパク質は、検出可能なマーカー、好ましくは酵素でもよい。別法として、リガンドは、マーカーとの非共有結合を可能にする分子、例えばビオチンと結合されてもよく;
-  任意選択で、担体タンパク質又はストレプトアビジンに特異的な抗体などリガンドとの結合を可能にする分子と結合している酵素などの試薬、酵素の作用の後に有色若しくは蛍光産物を形成する基質、及び/又は洗浄緩衝液、希釈若しくは抽出緩衝液。
【０１４８】
対象となる異なるMMPがいくつか検出される場合、キットは、固定されている検出しようとする対象となる異なるMMPのうち1つに特異的な抗体をそれぞれ有する試験領域の組を含む。例えば、2つのMMPを検出しようとする場合、第1のMMPに特異的な抗体を含む試験領域及び第2に特異的な抗体を含む別のものがある。
【０１４９】
本方法及びキットの特に好ましい一実施形態において、対象となるMMPは、MMP12、好ましくはヒトMMP12である。
【０１５０】
いくつかの具体的な実施形態において、本方法は、活性型の特定のMMPを定量化することを更に可能にする。
【０１５１】
MMP活性の脱制御が、多くの疾患に関連する発病機序のかなりの部分を構成するので、本発明の方法及びキットは診断に使用できる。そのような疾患には、例えば、関節リウマチ及び変形性関節症における軟骨及び骨の破壊、浸潤性腫瘍の増殖又は腫瘍血管新生の間の組織再形成、神経炎症性疾患におけるミエリン塩基性タンパク質の分解、脳損傷後の血液脳関門完全性消失、狭窄病変におけるマトリックス代謝回転の増大、動脈瘤における大動脈壁の弾性の消失、胃潰瘍における組織の分解、肝線維症、歯周病における結合組織の脆弱化、急性肺損傷並びに急性呼吸促迫症候群がある。
【０１５２】
したがって、本発明は、特に、癌、ウイルス感染、変形性関節症、関節リウマチ、デュピュイトラン拘縮、アテローム性動脈硬化症、慢性閉塞性肺疾患、気腫及び喘息などの炎症性成分を伴う呼吸器疾患、又は多発性硬化症、重症筋無力症、脳卒中、筋萎縮性側索硬化症若しくはアルツハイマー病などの神経変性疾患を診断するための診断方法における、本発明による方法又は本発明によるキットの使用に関する。
【０１５３】
例えば、MMP-1は、筋萎縮性側索硬化症に; MMP-2は、癌、デュピュイトラン拘縮、重症筋無力症又は筋萎縮性側索硬化症に;MP-3は、多発性硬化症、脳卒中又はアルツハイマー病に; MMP-8は、喘息又は多発性硬化症に;MMP-9は、癌、多発性硬化症、脳卒中又はアルツハイマー病に; MMP-10は、アルツハイマー病に; MMP-12は、アテローム性動脈硬化症又はCOPDなどの炎症性成分を伴う呼吸器疾患に; MMP-13は、変形性関節症又は関節リウマチに;MMP-14は、デュピュイトラン拘縮に使用されることになる。
【０１５４】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の実施例を読み込むことにより明らかになるが、それらは例示的なものであり制限的でないと考えられる。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】OR-mAb12hトレーサーの使用と併用したストリップにおけるMMP12hの検出を示す図である。MMP12hの存在下(1)又は非存在(2)にP1で多官能化したBSAストリップ、又はMMP12hの存在下にP1で官能化していないBSAストリップ(3)、MMP12hのプロフォームの存在下にP1で多官能化したBSAストリップ(4)、濃度100nM(°)(5)又は1μM(°°)(6)でMMP12hの競合阻害物質と事前にインキュベートし、MMP12hの存在下にP1で多官能化したBSAストリップ。
【図２】サンプル中の様々な濃度のMMP12hを用いて、及び試験した2種類の緩衝液:(7)〜(11):50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brij緩衝液;(12)〜(14):50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brij緩衝液と100mM Tris-HCl pH7.4、0.5% Tween 20、1% Chaps、0.1% NaN3緩衝液との50/50の混合物を用いて、OR-mAb12hトレーサーの使用と組み合わせた、P1で多官能化したBSAストリップにおけるMMP12hの検出を示す図である。
【図３】サンプル中の様々な型のMMPを用いる、OR-mAb12hトレーサーの使用と組み合わせた、P1で多官能化したBSAストリップにおけるMMP12hの検出を示す図である。
【図４】OR-mAb12hトレーサーの使用と組み合わせた、P1で多官能化したBSAストリップ上の混合MMPにおけるMMP12hの検出を示す図である。
【図５】OR-mAb12hトレーサーの使用と組み合わせた、P1で多官能化したBSAストリップ上の細胞質性のタンパク質のホモジネートにおけるMMP12hの検出を示す図である。
【図６】OR-mAb12hトレーサーの使用と組み合わせた、P1で多官能化したBSAストリップ上の気管支肺胞洗浄物(BAL)におけるMMP12hの検出を示す図である。
【図７】OR-mAb13hトレーサーの使用と組み合わせた、P1で多官能化したBSAストリップ上のMMP13hの検出を示す図である。
【図８】OR-polyAb12mトレーサーの使用と組み合わせた、P1で多官能化したBSAストリップ上のMMP12mの緩衝媒体又はタンパク質混合物における検出。
【図９】MMP12hの存在下(42)〜(44)、(46)及び(48)、又は非存在下(45)及び(47)における、BSA-P1(42)、HSA-P2(43)又はmAb12h(44)〜(48)ストリップ上のMMP12hの検出を示す図である。
【図１０】1μM MMP競合阻害物質とMMP12hとのプレインキュベーションが有り又は無しのいずれかの緩衝液において、又は細胞質性タンパク質の混合物の存在下で濃度を増加させたMMP12hを含むBSA-P1プレート上でのEIAによるMMP12hの検出を示す図である。
【図１１】1μM MMP競合阻害物質の存在又は非存在下で3種類の緩衝媒体の試験による、BSA-P1プレート上でのEIAによるMMP12hの検出を示す図である。
【図１２】1μM MMP競合阻害物質とサンプルとのプレインキュベーションの有り又は無しで濃度を増加させた細胞質性タンパク質の混合物由来MMP12hの存在下でBSA-P1、P2-HSA又はmAb12hプレート上でのEIAによるMMP12hの検出を示す図である。
【図１３】緩衝液、活性MMP12h、又は不活性MMP12h存在下でmAb12hプレート上でのEAIによるMMP12hの検出を示す図である、左:biot-HSA-P2の添加前にウェル中のサンプルのプレインキュベーション;右:ウェル中でのサンプル及びbiot-HSA-P2の同時インキュベーション。
【図１４】MMP12h又はProMMP12h存在下でHSA-P2又はmAb12hプレート上でのEIAによるMMP12hの検出を示す図である。mAb12hプレートの場合、Biot-P2-HSAトレーサーは、プレートにMMP12hを付着させた後又はプレートにMMP12hを付着させる前のいずれかにサンプルに添加された。
【図１５】MMPの競合阻害物質とサンプルとのプレインキュベーションの有り又は無しで、濃度を増加させたMMP12hを含有する気管支肺胞洗浄物(BAL)におけるHSA-プレートP2上でのEIAによるMMP12hの検出を示す図である。
【図１６】細胞質性タンパク質の混合物又は参照緩衝液を含むサンプルにおいて濃度を増加させたMMP12hの存在下でpolyAb12hプレート上でのEIAによるMMP12hの検出を示す図であり、トレーサーはビオチンを含むリガンドP3である。
【図１７】細胞質性タンパク質の混合物又は参照緩衝液を含むサンプルにおいて濃度を増加させたMMP12hの存在下でmAb12hプレート上でのEIAによるMMP12hの検出を示す図であり、トレーサーはビオチンを含むリガンドP3である。
【図１８】異なる緩衝液を含むサンプルにおいて濃度を増加させたMMP12hの存在下でmAb12hプレート上でのEIOによるMMP12hの検出を示す図であり、トレーサーはビオチンを含むリガンドP3である。
【図１９】BSA-P1及びHSA-P2プレート上でのサンプルのインキュベーション後に蛍光発生基質を使用する、上清に存在するヒトMMP-2、MMP-9、MMP-12、MMP-13及びMMP-14の定量を示す図である。
【図２０】濃度を増加させたMMP12h、トレーサーAchE(G4)-P1、及びモノクローナル抗体mAb12hの存在下でCASプレート上でのEIAによるMMP12hの検出を示す図である:活性MMP12hの濃度の関数として1時間で測定される吸光度。
【図２１】緩衝液、活性MMP12h又は不活性MMP12h存在下でmAb12hプレート上でのEIAによるMMP12hの検出を示す図である。ウェル中に、左:AChE(G4)-P1の存在下;右:biot-HSA-P2の存在下。
【図２２】緩衝液中に濃度を増加させたMMP2hを含む、BSA-P1プレート上でのEIAによるMMP2hの検出を示す図である。
【図２３】緩衝液中に濃度を増加させたMMP9hを含む、BSA-P1プレート上でのEIAによるMMP9hの検出を示す図である。
【実施例】
【０１５６】
材料及び方法
実験に使用した各種ストリップの形式は、以下の通りであった:
-  BSA-P1ストリップ:P1で多官能化したBSAが吸収されているストリップ。
-  HSA-P2ストリップ:P2で単官能化したHSAが吸収されているストリップ。
-  mAb12hストリップ:抗ヒトMMP12抗体が吸収されているストリップ。
【０１５７】
実験に使用した各種プレートの形式は、以下の通りであった:
-  BSA-P1プレート:P1で多官能化したBSAが吸収されているプレート。
-  HSA-P2プレート:P2で単官能化したHSAが吸収されているプレート。
-  mAb12hプレート:抗ヒトMMP12抗体が吸収されているプレート。
-  polyAb12プレート:抗ヒト又はマウスMMP12抗体が吸収されているプレート。
【０１５８】
使用したトレーサーは、以下である:
-  OR-mAb12h:BSA-P1及びBSA-P2ストリップで使用される、金ビーズと結合している抗ヒトMMP12抗体。
-  OR-BSA-P1:mAb12hストリップで使用される、金ビーズと結合しているP1で多官能化されたBSA。
-  OR-BSA-P2:mAb12hストリップで使用される、金ビーズと結合しているP2で単官能化されたBSA。
-  OR-HSA-P2:mAb12hストリップで使用される、金ビーズと結合しているP2で単官能化されたHSA。
-  ビオチン-HSA-P2又はbiot-HSA-P2:ビオチンと結合しているP2で単官能化されたHSA。
-  ビオチン-BSA-P2又はP2-biot-BSA:ビオチンと結合しているP2で単官能化されたBSA。
-  AChE(G4)-P1:P1で多官能化されたAChE(G4)。
【０１５９】
リガンドP1、P2及びP3
リガンドP1、P2及びP3の構造
【０１６０】
【化１８】
2015532417.tif 000020
【０１６１】
リガンドP1の合成戦略
【０１６２】
【化１９】
2015532417.tif 000021
【０１６３】
リガンドP2の合成戦略
【０１６４】
【化２０】
2015532417.tif 000022
【０１６５】
リガンドP3の合成戦略
【０１６６】
【化２１】
2015532417.tif 000023
【０１６７】
市販の試薬及び溶媒のすべてを、受け取ったまま追加の精製なしで使用した。固体支持体(pegNovaTagレジン)、Fmoc基で保護されている天然アミノ酸、スクシンイミド形態の活性化されたビオチン及びプローブ合成に使用されるCOMUカップリング剤は、Novabiochem社から入手した。付加的なポリエチレングリコールリンカーは、Iris bitotech社から得た。無水N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)は、Fluka社より入手した。ホスフィンブロックの組み込みに使用した6-クロロ-1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(ClHOBt)及びジイソプロピルカルボジイミド(DIC)は、それぞれMolekula社及びAldrich社から得た。トリフルオロ酢酸(TFA)及びトリイソプロピルシラン(TIS)は、Aldrich社から入手した。BSA(ウシ血清アルブミン)はMerck社から入手し、HSA(ヒト血清アルブミン)はAldrich社から得た。
【０１６８】
分析及び分取RP-HPLC分離を、それぞれShimadzu社製分離機器及びGilson社製機器で、Ascentis Express分析カラム(100×4.6mm、100Å)又はKromasil AIT C18半分取カラム(250×20mm、10μm、100Å)のいずれかを使用して、それぞれ1、2及び3mL/minの流速で実行した。検出は、230nm及び275nmで実行した。(A)90%水-10%アセトニトリル中に0.1%TFA及び(B)90%アセトニトリル-10%水中に0.09%TFAからなる溶媒系を使用した。分析モードで得られた保持時間(tR)(Ascentis Expressカラム)は、分で得られる。
【０１６９】
精製した化合物P1、P2及びP3の光学密度測定(OD)を、Beckman社DU640B分光光度計を使用して実行した。質量スペクトルの記録には、サンプルと多量の、水/アセトニトリル/TFAの1/1/0.01混合物中の10mg/mlマトリックス4-HCCA(シアノ-4-ヒドロキシ桂皮酸)との共沈を必要とする。化合物P1、P2及びP3の質量スペクトルを、陰イオンリフレクトロンモードで、m/z 800〜3000の範囲でMALDI-TOF 4800質量分析計(Applied Biosystems社、Foster City、USA)を使用して記録した。各スペクトルは、1000〜2000ショット(各スポット内に20箇所の異なる位置及びサブスペクトル当たり50ショット)及びApplied Biosystems社(MDS Sciex)より販売されている標準Calmixキットを使用する内部校正の結果である。
【０１７０】
化合物P1、P2及びP3の合成を、
-  トリチル基で保護されているPEG(ポリエチレングリコール)スペーサーを含有する汎用PegNova Tagレジン、
-  N末端Fmoc官能基で及びチロシンの場合には3級ブチル部分で保護されている天然アミノ酸、
-  末端アミン官能基がBoc部分で保護されている又はマレイミドで官能化されているPEGリンカー、を使用して固体支持体上でそれぞれ独立に手作業で実行した。
【０１７１】
これらの合成は、共通の合成ホスフィンブロック:カルボキシル基の官能性(COOH)、Fmoc部分(Fmoc)によって保護されているアミン官能基、アダマンチル部分(Ad)によって保護されているホスホリル官能基、並びにイソキサゾール複素環系及び一方が塩素原子を含有する2つのフェニル部分を組み入れている側鎖、を有するブロックAも使用する。
【０１７２】
【化２２】
2015532417.tif 000024
【０１７３】
DIC/Cl-HOBt混合物を使用したブロックA結合を除いて、これらの単位を組み立てるのに使用されるカップリング剤は、COMUであった。結合の間中、DMF中のDIEA(10当量)の存在下で、過剰量の天然アミノ酸(使用したレジンのアミン官能基の数に対して5当量)を使用した。ブロックAの結合は、DMF中に1.5当量の過剰のこのブロックを使用することを含む。PEGリンカーの結合は、DMF中に6当量のDIEA存在下にこれらのリンカー3当量を使用することを含む。各結合後に、アセチルイミダゾールの溶液を用いて、キャッピング工程(反応しなかった遊離アミンを捕捉する)を実行した。DMF/ピペリジン(1/1)の混合物を使用して、支持されているペプチド又は偽ペプチドからのN末端Fmoc部分の除去を実行し、その後DMF及びジクロロメタンで洗浄した。TFE/CH2Cl2の1/1混合物中の0.6M HOBt溶液を使用して、固体支持体上で、レジンを官能化しているPEGリンカーにあるトリチル部分の脱保護を実行した。レジンから偽ペプチドを分離する間に、TFA/TIS/H2Oの95/2.5/2.5混合物によるレジン処理を含む、PEGリンカーにあるBoc部分並びにチロシン及びブロックAの保護部分の除去を行った。次いで、得られた混合物をHPLCによって精製し、化合物P2並びに化合物P1及びP3の前駆体を得て、それぞれを高純度形態で単離した。DMF中でDIEAの存在下に、得られた化合物P1及びP3の前駆体をそれぞれアセチルチオアセテート及びプロパン酸のスクシンイミド誘導体と結合させ、HPLCによる過剰なスクシンイミド試薬の除去後に、それぞれ高純度の化合物P1及びP3を得た。
【０１７４】
化合物P1、P2及びP3の純度を、分析RP-HPLCから得られるスペクトルによって記録した。スペクトルは、単一のピークであり、保持時間は、10分間に0から100%Bへの勾配の場合、分でP1に対して6.65、P2に対して6.4及びP3に対して6.4を示した。
【０１７５】
陰イオンリフレクトロンモードを使用する質量分析法によって、化合物P1、P2及びP3を特徴づけた。
【０１７６】
化合物P1、P2及びP3の阻害定数Kiを、ヒトMMP2、3、8、9、12、13、14及びマウスMMP12と比較して決定した。組換えプロテアーゼを、100μLの容量にヒトMMP2、3、8、9、12、13、14に対してそれぞれ0.05、0.3、0.03、0.05、0.03、0.015及び0.5nMの濃度、並びにマウスMMP12に対して0.1nMの濃度で使用した。Develら(2006、J. Biol Chem、281[16]:11152〜60頁)に記述される手順と類似のものに従って、この試験におけるKiの決定には、市販の蛍光発生基質MCA-Matを15μMで使用した。化合物のKiが低い程、選ばれた標的を阻害する可能性が高いことを想起させる。Ki及び各阻害試験に使用した酵素の量を、下表(表1)に挙げる。
【０１７７】
【表２】
2015532417.tif 000025
【０１７８】
官能化したタンパク質
官能化した血清アルブミン
リガンドP1を使用してBSAを多官能化し、それによりBSA-P1を得る一方で、リガンドP2を使用してHSA又はBSAを単官能化して、それぞれHSA-P2又はBSA-P2を得た。
【０１７９】
リガンド-P1で多官能化されたBSA:BSA-P1の調製
BSA-P1は、SATA部分を有するリガンドP1とマレイミド部分で官能化されたBSAとを結合させることから得られた。BSA上のこれら部分の存在は、市販のBSAにヘテロ官能性リンカー(N-スクシンイミジル-4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシラート:SMCC)を結合させることによって得た。
【０１８０】
1Mヒドロキシルアミン溶液pH7を添加することにより室温で30分間、リガンドP1のチオール官能基を脱保護した後に、SATAを1つ含有するリガンドP1のBSA-SMCCへの結合を実行した(阻害物質/BSA-SMCCのモル比は10に等しい)。
【０１８１】
得られた溶液は、それ以上精製することなく:
-  ICT技術に使用するストリップへの又はEIA法に使用するプレートのウェルの底での吸収。
-  OR-BSA-P1トレーサーを準備する調製。
に使用した。
【０１８２】
リガンド-P2で単官能化されたHSA:HSA-P2の調製
HSA-P2は、マレイミド部分を含有するリガンドP2とHSAとを結合させることによって得られた。
【０１８３】
ヒト血漿から単離された市販のHSAを制御された還元的条件下に事前に置いて、最初は還元型(SH=遊離チオール)及び酸化型チオール(血漿由来の内在性システインを含む付加物)の混合物状であるHSAの64位のシステインの完全な還元を達成した。100mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6中に2モル当量のDTT存在下で2mg/ml HSA溶液を使用して実行したこの処理の後に、10kDa Filtronを使用して還元剤を除去した。得られた混合物を、等モルのリガンドP2と一緒に置いてHSA-P2を得た。得られた溶液は、それ以上精製することなく:
-  ICT技術に使用するストリップへの又はEIA法に使用するプレートのウェルの底での吸収。
-  ビオチン-HSA-P2又はOR-HSA-P2トレーサーを準備する調製。
に使用した。
【０１８４】
BSA-P2を調製するには同じプロトコルを用いる。
【０１８５】
官能化されたAChE(G4)
0.1nmol AChE(G4-SMCC)、アセチルコリンエステラーゼの四量体型(SPI-BIO社から入手可能)を、チオエーテル結合により2.7nmol P1と結合させて、リガンドP1で多官能化されたAChEであるAChE(G4)-P1を得た。1Mヒドロキシルアミン溶液10μLを、100mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6、5.10-3M EDTA 40μL中の2.7nmol P1に添加した。室温で30分間インキュベーションした後に、P1を含有する溶液を0.1nmol AChE(G4-SMCC)を含有する100mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6、5.10-3EDTA 62.5μLに添加した。全体を4℃で終夜撹拌し、次いでNaN3の存在下で100mMリン酸pH7.4、0.4M NaCl、0.5% BSAの緩衝液を使用するBiogel A015M(サイズ排除ゲル)を用いる精製工程により、368EU/min/mlの活性を有するAchE(G4)-P1トレーサーの保存溶液を単離できた。アセチルチオコリン及びDTNBを使用する採取した画分の定量によって、この精製工程をモニタリングした。
【０１８６】
ストリップを用いる免疫クロマトグラフィー試験(ICT)
ストリップ調製
ICTを実行することは、BSA-P1、HSA-P2又はmAb12で官能化されたストリップを調製することを含む。
【０１８７】
官能化されたストリップ(最終的な寸法:0.5cm×4.5cm)を、2つの構成成分を使用して調製した:ニトロセルロース膜(反応領域)及びニトロセルロースブロッティング(毛細管現象による移動を容易にする吸着領域)。
【０１８８】
反応領域を使用して、2本の線状に固定された2つの型の実体:
-  試験線又は試験領域、
-  PBS中に800〜100μG/mLの抗マウス免疫グロブリン(CAS)又は抗ウサギ免疫グロブリン(SAL)の固定化により得られる抗体移動対照線、を固定した。
【０１８９】
試験線又は試験領域は、
-  リガンドP1若しくはP2で官能化された血清アルブミン(BSA-P1又はHSA-P2)又は
-  対象となるモノクローナル若しくはポリクローナル抗MMP12h抗体、の固定化に対応した。
【０１９０】
Phastsystem(Pharmacia社)電気泳動システムの12x0.3μLコームアプリケーターを用いてサンプル沈着領域に2μL/cmの割合で、BSA-P1の場合200ng/cmの溶液及びHSA-P2又はモノクローナル若しくはポリクローナル抗体の場合2mg/cmを基準として、試験線を手で沈着させた。
【０１９１】
CSA又はSALの固定化によって得られた対照線は、自動分注器(BioDot社AirJet XYZ 3050)を使用して、PBS中の溶液を1μL/cmの割合でそれぞれ0.1mg/mL及び0.5mg/mLで沈着させた。
【０１９２】
これら沈着の後に、膜を40℃で1時間オーブン中で乾燥させた。次いでそれらを、NaN3の存在下で、0.15M NaCl及び0.5% BSAを含有する10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4から構成される飽和溶液中で、ゆっくりとした揺動の下で、室温(20℃)で30分間、2回インキュベートした。これらのインキュベーションは、残されたあらゆる結合部位をブロッキングすることを目的とした。次いで膜を超純水(Milli-Q H2O)で洗浄し、次に0.15M NaCl及び0.1% Tween 20を含有する10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4の溶液中で、室温で30分間インキュベートした。次いで膜を、吸湿紙タオルで水抜きし、40℃で15分間オーブン中で乾燥させ、次にサンプル沈着及び吸収用の膜を、ニトロセルロース膜の最下部及び最上部に接着し、その後にプログラム可能な自動切断機(Bio-Dot社CM-400 Guillotine)を使用して幅5mmのストリップに切断した。そのように得られたBSA-P1、HSA-P2、mAbストリップを、室温で光を避けてプラスチック容器に貯蔵した。
【０１９３】
OR-BSA-P1、OR-HSA-P2、OR-BSA-P2及びOR-mAbトレーサーの調製
OR-BSA-P1、OR-HSA-P2、OR-BSA-P2及びOR-mAb12トレーサーを得るには、コロイド金の保存溶液を調製する必要があった。この溶液は、1%クエン酸ナトリウム溶液1mLが予め添加されている超純水(40mL MilliQ H2O)沸騰溶液に0.2%塩化金(AuCl2)溶液4mLを絶えず撹拌しながら添加することによって得た。溶液が「ワインカラー」(後に黒色)なった後、得られた溶液を室温に戻した。保存溶液を、4℃で光を避けて貯蔵した。
【０１９４】
10mMリン酸ナトリウムpH7.4、0.15M NaCl、0.01% NaN3の緩衝溶液中の抗体25μg又は官能化された血清アルブミン(最大50μl)に、コロイド金保存溶液1mL及び20mMホウ砂緩衝液(クエン酸三ナトリウム)pH=9 100μlを添加した。機械的回転下で1時間のインキュベーション(4℃)後に、20mMホウ砂pH=9、1% BSAの緩衝液100μlを混合物に添加し、その後15000g、4℃で50分間遠心分離した。遠心分離の後に、上清を除去し、ペレットを2mMホウ酸、1% BSA、0.01%アジ化合物の緩衝液1mLに採取した。ペレットの再懸濁後に、得られた溶液を、15000g、室温で50分間遠心分離した。上清を除去した後に、ペレットを2mMホウ酸、1% BSA、0.01% NaN3緩衝液250μLに採取した。OR-BSA-P1、OR-HSA-P2、OR-BSA-P2及びOR-mAb12金トレーサーを、100μg/mLの最終濃度に保ち、4℃で光を避けて貯蔵した。
【０１９５】
ICTの実行
BSA-P1又はHSA-P2で官能化されたストリップの使用を、OR-mAb12トレーサー、OR-polyAb12による明視化と組み合わせた。抗体で官能化されたストリップの使用を、OR-BSA-P1、OR-HSA-P2又はOR-BSA-P2トレーサーによる明視化と組み合わせた。
【０１９６】
試験は、96ウェルマイクロタイタープレート中で室温で実行した。希釈又は再構成された天然のサンプル100μL又はサンプル50μLを、それぞれ空の若しくは100mM Tris-HCl、pH6.8、0.5% Tween-20、1% Chaps、0.1% NaN3緩衝液50μLを既にウェル内に含有するウェルに置いた。
【０１９７】
OR-mAb12、OR-polyAb12トレーサーによる明視化と組み合わせたBSA-P1又はHSA-P2で官能化されたストリップ
ウェルに含有される溶液の吸収後に、ストリップを100mM Tris-HCl pH7.4、0.5% Tween-20、1% Chaps、0.1% NaN3又は50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brij緩衝液を使用して洗浄した。これら洗浄の量及び繰り返しの回数は、処理したサンプルが生体媒体を含有するサンプルか否かによって異なった。生体媒体を含有するサンプルの分析の場合、50μL、次に30μL、その後20μLでの洗浄を実行し、一方で組換えタンパク質だけを含有するサンプルの場合、(競合剤の添加の有無に関わらず)30μLでの洗浄、その後に20μLでの洗浄を実行した。20μLの添加後に、トレーサーがモノクローナル抗体であった場合、5〜10μLの容量のトレーサーをウェルに添加した。沈着させた試験線に沿って肉眼で見えるシグナルを集束させることにより、トレーサーの移動は、BSA-P1又はHSA-P2のいずれかに捕捉されたタンパク質の明視化を可能にした。観察されたシグナルの強度を、肉眼によって定性的に推定した。
【０１９８】
OR-BSA-P1、OR-HSA-P2又はOR-BSA-P2トレーサーによる明視化と組み合わせた抗体で官能化されたストリップ。
この場合、トレーサーは、最初からサンプルとインキュベートしてもしなくてもよい。混合物を撹拌した後に、ストリップを、サンプル沈着領域の近くのウェルに垂直に挿入した。液体は、毛細管現象によってストリップ上方に動く。沈着させた試験線に沿って肉眼で見えるシグナルを集束させることにより、トレーサーの移動がモノクローナル抗体に捕捉されたタンパク質の明視化を可能にした。観察されたシグナルの強度を、肉眼によって定性的に推定した。
【０１９９】
酵素免疫測定法(EIA)
BSA-P1、HSA-P2、mAb12又はpolyAb12で官能化されたプレートの調製
免疫測定法用として一般に使用されるプレートを使用してBSA-P1、HSA-P2又はモノクローナル抗体を有するプレートを調製した。50mMリン酸ナトリウム緩衝液pH6中に2μg/mL(BSA-P1)、5μg/mL(HSA-P2)及び5μg/mL(モノクローナル抗体mAb、又はポリクローナル抗体polyAb)の溶液100μLを使用して、プレートのウェルを官能化した。4℃で終夜インキュベーションし、上清を除去した後に、0.15M NaCl及び0.1%BSA、0.1% NaN3を含有する10mMリン酸ナトリウム緩衝液pH7.4の300μLをウェルに添加して、残されたあらゆる結合部位をブロッキングした。プレートは、使用するまで4℃でこの緩衝液中に貯蔵した。
【０２００】
トレーサー調製: 1-Biot-mAb12及びbiot-HSA-P2トレーサー
Biot-mAb12及びBiot-HSA-P2を、100mMホウ酸緩衝液pH9中のmAb12又はHSA-P2溶液及び新たに調製したDMF中の5mg/mL N-ヒドロキシスクシンイミドエステルの形態の活性ビオチン(ビオチンNHS)溶液から調製した。
【０２０１】
Biot-mAb12:mAb12の250μg(PBS中に2mg/mLの溶液を125μL)を、100mMホウ酸緩衝液pH=9.0の200μLに入れ、その後5mg/mLでビオチン-NHSを20μLまで添加した。室温で45分間のインキュベーション後に、1M Tris緩衝液pH=8.0の115μLを混合物に添加した。10分間のインキュベーション後に、100mMリン酸pH7.4、0.1% BSA、0.15M NaCl、0.01% NaN3 EIA(0.1% BSA)の緩衝液の650μLを添加して、濃度200μg/mLのBiot-mAb12トレーサーを実現した。Biot-mAb12保存溶液を、4℃で貯蔵した。
【０２０２】
Biot-HSA-P2:HSA-P2 175μg(PBS中に2mg/mLの溶液を87μL)を、100mMホウ酸緩衝液pH=9.0の200μLに入れ、その後5mg/mlでビオチン-NHS 9μLを添加した。室温で45分間のインキュベーション後に、1M Tris緩衝液pH=8.0の100μLを混合物に添加した。10分間のインキュベーション後に、100mMリン酸pH7.4、0.1% BSA、0.15M NaCl、0.01% NaN3 EIAの緩衝液の475μLを添加して、保存濃度200μg/mLのBiot-HSA-P2トレーサーを実現した。Biot-HSA-P2保存溶液を、4℃で貯蔵した。
【０２０３】
2-P3トレーサー
精製後にDMSOに溶解した後に一度単離したままで、P3リガンドを使用した。
【０２０４】
3-AChE(G4)-P1トレーサー
精製後に一度単離したままで、AChE(G4)-P1トレーサーを使用した。
【０２０５】
EIAの実行
BSA-P1又はHSA-P2で官能化されたプレートの使用を、biot-mAb12hトレーサーによる明視化と組み合わせた。
【０２０６】
抗体(mAb12又はpolyAb12)で官能化されたプレートの使用を、biot-HSA-P2、P3又はAChE(G4)-P1トレーサーによる明視化と組み合わせた。
【０２０７】
官能化したプレートを室温に放置した後、ウェルを、5回洗浄のサイクルの自動プレート洗浄器で10mMリン酸、0.1% Tween、pH7.4の緩衝液を使用して300μL容量により洗浄した。
【０２０８】
Biot-mAb12hトレーサー又はbiot-HSA-P2トレーサーを使用するEIA分析の場合(経時的なバージョンの場合)、その後様々な緩衝液中のサンプル100μL容量を、4時間又は終夜インキュベーションするためにウェルに入れた。サンプル中の対象となる種を捕捉する工程に相当するこの工程の後に上清を除去し、100mM Tris HCl、10mM CaCl2、1M NaCl、0.5% Tweenの緩衝液を使用して、撹拌しながら2〜5分間浸すことで一連の洗浄を行った。この後に、biot-mAb12の場合はPBS pH7.4、0.15M NaCl、0.1%BSA、0.01% NaN3の緩衝液中で、biot-HSA-P2の場合は50mM Tris HCl、pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brijの緩衝液中で使用されるビオチン化トレーサーを1μg/mLの濃度で添加した。トレーサーとのインキュベーションを4℃で終夜行った後に上清を除去し、50mMリン酸、0.1% Tween 20の緩衝液で更に一連の洗浄を行った。1EU/min/mlのストレプトアビジンAchE(G4)(アセチルコリンエステラーゼ)を添加し、続けて2時間インキュベーションした後上清を除去し、洗浄し、アセチルチオコリン及びDTNB(10mMリン酸緩衝液にDTNB=5×10-4M、アセチルチオコリン1.4×10-5M)を添加した。DTNBの存在下で基質に対する作用が414nmの吸光度を生じるAChE(G4)の活性を測定することによって、対象となるタンパク質の検出を測定した。
【０２０９】
Biot-HSA-P2トレーサーを使用するEIA分析の場合(同時バージョンの場合)、サンプルを、biot-HSA-P2とプレインキュベートし、次いでプレートに入れた。グラフトされた抗体による対象となるタンパク質の捕捉及び洗浄の後に、1EU/min/mLのストレプトアビジンAChE(G4)をインキュベートし、次いで上清を除去した後にアセチルチオコリン及びDTNBを添加し、生成した吸光度を414nmで測定することにより、対象となるタンパク質の検出を実施した。
【０２１０】
P3トレーサーを使用するEIA分析の場合、サンプルを、濃度20又は100nMのP3とプレインキュベートし、次いでプレートに入れた。グラフトされた抗体(mAb12hプレート、polyAb12mプレート、polyAb12hプレート)による対象となるタンパク質の捕捉後に、1EU/min/mLのストレプトアビジンAChE(G4)をインキュベートし、次いで上清を除去した後にアセチルチオコリン及びDTNBを添加し、生成した吸光度を414nmで測定することにより、対象となるタンパク質の検出を実施した。
【０２１１】
AchE(G4)-P1トレーサーを使用するEIA分析の場合、サンプルを、プレート上で2EU/min/mlのAChE(G4)-P1とプレインキュベートした。グラフトされた抗体(例えばmAb12hプレート)による又はCAS若しくはSALプレートと一緒に使用した溶液中の抗体による対象となるタンパク質の捕捉後の、上清を除去した後にアセチルチオコリン及びDTNBを添加し、生成した吸光度を414nmで測定することにより、対象となるタンパク質の検出を実施した。
【０２１２】
結果
ストリップにおける免疫クロマトグラフィー試験(ICT)
BSA-P1ストリップ:結果
BSA-P1ストリップは、リガンドP1で多官能化されたBSA 100ngが固定化されたストリップに相当する。BSA-P1ストリップの使用を、OR-mAb12hトレーサー(モノクローナル抗ヒトMMP12抗体)の使用と組み合わせた。
【０２１３】
ヒトMMP12(MMP12h)の検出-[図1]
OR-mAb12hトレーサーの使用と組み合わせたBSA-P1ストリップは、ストリップ上のBSA-P1固定化領域の中心に肉眼で見えるシグナルの明視化により、MMP12hの陽性の検出(1)を可能にする。MMP12hの非存在下で(2)、ストリップに沿ったOR-mAb12hトレーサーの移動は、ストリップ上のBSA-P1固定化領域に観察可能なシグナルを全く生じなかったので、実験において、この検出はMMP12hの使用に特異的である。MMP12hの陽性の検出(1)は、MMP12hとBSA-P1にあるリガンドP1との相互作用に因るものである。実際に、ストリップ上部の移動対照がORトレーサーの有効な移動を確実にするが、固定された無修飾BSAを有するストリップに沿ったMMP12h及びOR-mAb12hトレーサーの移動により、陽性シグナルの観察は得られない(3)。MMP12hに対して0.2nMのKiを有するMMP12hに特異的なホスフィン阻害物質(競合剤)(「化合物1」又はRXP470.1と称され、Develら、2006、J Biol Chem、281、11152〜11160頁に記述されている)と予めインキュベートしたMMP12h溶液を濃度100nM(°)又は1μM(°°)で使用した結果(それぞれ5、6)、BSA-P1固定化領域にシグナルが観察されないとすると、MMP12hの陽性の検出(1)は、その活性部位におけるMMP12hの相互作用を意味する。同様に、MMP12hタンパク質前駆体によって阻害される、MMP12hに対応するproMMP12はこの系によって検出されない(4)。
【０２１４】
【化２３】
2015532417.tif 000026
【０２１５】
これらすべての実験から、OR-mAb12hトレーサーと組み合わせてBSA-P1ストリップを使用することにより、一方で、MMP12hの活性部位と、BSAを官能化しているリガンドとの分子相互作用、及び他方でMMP12hのドメインと、金トレーサーに結合している抗MMP12hモノクローナル抗体(OR-mAb12h)との分子相互作用を含む三成分複合体の形成を介して、BSA-P1固定化部位におけるMMP12hの検出が可能になると結論できた。MMP12hだけが遊離活性部位を生成し、したがって活性であり、検出できるので、MMP12hプロフォーム及びMMP12h阻害物質によって予め不活性化された型は検出されない。したがってこの系は、活性型のMMP12hを特異的に検出するのに適切である。
【０２１６】
緩衝媒体におけるMMP12h検出の感度-[図2]
50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brijの緩衝液中でのMMP12hの濃度範囲、及びOR-mAb12hの使用と組み合わせたBSA-P1ストリップの利用により、開発した系は、重量0.12ng又は濃度0.06nMに相当する6fmolまでのMMP12hを含有する緩衝サンプルを使用してMMP12hを検出できることが示された(10)。しかしながら、示された線の波状の様子に反映されているように、この緩衝液の使用は、不均一な移動効果を生じる。50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brijと100mM Tris-HCl pH7.4、0.5% Tween-20、1% Chaps、0.1% NaN3との50/50混合物において一連の濃度のMMP12hを使用することは、この効果の調整を可能にし、この場合検知閾値は、ストリップ(13)及び(14)に示すように6〜12.5fmol(0.12〜0.25ng、又は0.06nM〜0.12nMのモル濃度)の値に達した。
【０２１７】
他のMMPと対比したMMP12hを検出する系の特異性-[図3]
MMP-2、-3、-7、-8、-9、-12、-13及び-14の独立した溶液を使用する実験によって、他のMMPと対比したMMP12hを検出する系の選択性を検証した。ストリップに固定されたBSAを官能化するP1リガンドによって高い相同性を共有する使用したMMPは捕捉できたが、これらの実験はモノクローナル抗体の選択性を確認した。実際、MMP及びOR-mAbトレーサーの移動後に、陽性シグナルはMMP12h溶液(20)だけに観察され、一方で、他のMMP溶液はストリップ(15、16、17、18、19、21、22)に目に見えるシグナルを生成せず、MMP12hがない場合(23)も検出されなかった。
【０２１８】
他のMMPが存在する場合にMMP12hを検出する系の特異性-[図4]
MMP12を含む(24)又は含まない(25)、異なるMMP(2、9、13、14)を含有する溶液及びMMP12hだけを含有する溶液(26)を使用する実験を比較することにより、MMPの混合物中のMMP12だけを検出する系の能力も試験した。MMP12hを含む混合物(24)ではシグナルが検出されるが、MMP混合物(25)ではストリップのBSA-P1固定化部位にシグナルは全く見えない。このシグナルは、緩衝媒体中のMMP12h溶液(26)で得られた強度と同等である。
【０２１９】
複合環境における検出
細胞質性タンパク質のホモジネート-[図5]:
50fmolのMMP12hを、細胞質性タンパク質の複合混合物70、140又は280μgに添加した場合、MMP12hは、使用したMMP12hが緩衝液の存在下にある場合に観察されるもの(27)と同等のシグナル強度で(28、29、30)、OR-mAb12hと組み合わせたBSA-P1ストリップの系によって検出された。使用した様々なタンパク質のホモジネート280μgが、ストリップ(31)のBSA-P1固定化部位に観察可能なシグナルを生成しなかったとすると、添加したMMP12hを含有するタンパク質混合物で観察されるシグナルは、MMP12hから実際に生じていることになる。したがって、OR-mAb12hによる明視化と組み合わせたBSA-P1ストリップの使用が複合タンパク質混合物でも可能になり、細胞質性タンパク質の場合、MMP12hが0.0003%しか存在しなくても陽性の検出シグナルを得られる。
【０２２０】
気管支肺胞洗浄物(BAL)[図6]:
マウス気管支肺胞洗浄物にMMP12hを添加することによって、OR-mAb12hトレーサーと組み合わせたBSA-P1ストリップの系を使用して、MMP12hを検出する可能性についても試験した。これらの実験を行って、ヒトBAL中のMMP12hを検出するためのそのような系の適合性を特徴づけた。これを考慮して、2つの型の媒体を評価した:BAL M4及びBAL M5と命名した。マウスBALに対応する100% BAL M4をPBS中に得て、50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brijの緩衝液で半分に希釈した。マウスBALに対応する100% BAL M5をPBS中に得て、50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brijで半分に希釈し、次いで再び50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brij、1M NaCl、2M尿素中に半分に希釈した。示したパーセンテージが100%未満であるとき、以下の緩衝液100mM Tris-HCl pH7.4、0.5% Tween-20、1% Chaps、0.1% NaN3を用いて、100%のBAL M4及び100%のBAL M5を希釈した後に、マイクロタイタープレートのウェル中で移動させた。気管支肺胞洗浄物を使用して行った実験の結果は、これらの媒体においてMMP12hの検出が可能であることを示した。実際、BAL M4及びBAL M5媒体単独では、BSA-P1固定化部位(32、38)にシグナルを全く得られなかったが、BAL M4媒体がそのまま使用された(35)か又は100mM Tris-HCl pH7.4、0.5% Tween-20、1% Chaps、0.1% NaN3で50%に希釈されたか(33、34)に関わらず、シグナルの存在は、1ピコモル(33)、200fmol(34)及び100fmol(35)MMP12hの検出を可能にした。100fmol MMP12hの検出は、媒体中の尿素及びNaClの存在(それぞれ濃度1M及び500mM)と適合する。実際に、100% BAL M5 100μlに添加した100fmol MMP12hに対する検出シグナル(36)は、100% BAL M4 100μlに添加した100fmol MMP12hに対するもの(37)と同等である。100% BAL M5 100μlに添加した80fmol MMP12hに対する検出シグナル(39)は、50% BAL M5(40)及び66% BAL M5(41)100μlに添加した80fmol MMP12hに対するものと同等である。
【０２２１】
他のMMPの検出に対する系の適用性-[図7、図8]
本系を、活性ヒトMMP13の検出について試験した。使用したトレーサーは、BSA-P1でロードしたストリップを伴うモノクローナル抗ヒトMMP13抗体である。
【０２２２】
実験に活性MMP13hだけを使用した場合、陽性シグナルが観察された(図7)。本系を、活性マウスMMP12の検出について試験した(図8)。使用したトレーサーは、ポリクローナル抗マウスMMP12抗体であった。緩衝媒体中又は細胞質性タンパク質抽出物40μgの存在下で実験に活性MMP12mだけを使用した場合、陽性シグナルが観察される。これらの結果は、後に当該MMPに特異的な抗体を用いて検出可能である異なる型のMMPの捕捉に対する系の機能性を実証している。
【０２２３】
他のストリップ:結果
BSA-P1ストリップに加えて、生成した他の型のストリップは、HSA-P2ストリップ及びmAb12hストリップと呼ばれるストリップであった。これらのストリップは、リガンドP2及びモノクローナル抗体mAb12hで単官能化されたHSAがそれぞれ固定化されたストリップに対応する。BSA-P1ストリップと同様に、HSA-P2ストリップの使用をOR-mAb12hトレーサーの使用と組み合わせる。mAb12hストリップの使用をOR-BSA-P1若しくはOR-HSA-P2トレーサー又は更にOR-BSA-P2(リガンドP2で官能化されたBSAの金トレーサー)の使用と組み合わせる。
【０２２４】
BSA-P1、HSA-P2及びmAb12hストリップによるMMP12hの検出効率の比較-[図9]
同じ緩衝MMP12h溶液をそれぞれ異なるストリップと一緒に使用し、対応するトレーサーによって明視化した。MMP12hを実験(42、43、44、46及び48)に使用した場合、実験に含まれるストリップの型に関わらず陽性シグナルが観察され、これは、
-  ストリップに固定されたHSA-P2は、実験に使用したMMP12hを捕捉することが可能であり、OR-mAb12hトレーサー(43)によってストリップのHSA-P2固定化部位で明視化され;
-  OR-BSA-P1(44)、OR-HSA-P2(46)及びOR-BSA-P2(48)は、ストリップに固定されたmAb12hによって捕捉されたMMP12hを検出する能力があるトレーサーであることを示している。
【０２２５】
これらの結果は、血清アルブミンがストリップに固定されているか又はトレーサーを構成するかに関わらず、BSA又はHSAのリガンドP1若しくはP2からなる阻害部分が、リガンド/MMP/mAb三成分複合体におけるパートナーになり得るという証拠を提示している。mAb12hストリップでは、トレーサーを形成する血清アルブミンが多官能化されている(44)か又は単官能化されているか(46)に関わらず、また血清アルブミンがヒト(46)か又はウシ(48)かに関わらず、MMP12hの検出を示す観察されたシグナルは、同等の強度のものである。したがって血清アルブミンをトレーサーとして使用する場合、対象となるMMPのリガンドによる血清アルブミンの官能化の程度は、トレーサーの、ストリップに固定したmAb12hに捕捉されたMMP12hを検出する能力に対してわずかな効果しかない。他方、官能化のこの程度は、ストリップに固定された血清アルブミンの、実験に使用したMMP12hを捕捉する能力に対して効果があるように見える。実際、OR-mAb12hの使用と組み合わせたHSA-P2ストリップ(43)で観察されたシグナルの強度は、同じMMP12h溶液及びOR-mAb12hの使用と組み合わせたBSA-P1ストリップ(42)で観察されたものより有意に低い。両方の場合(42、43)に同じトレーサーを使用したこと並びにリガンドP1及びP2の同等の阻害能力を考えると、これらの結果は、単官能化した血清アルブミン溶液(HSA-P2)で調製したストリップと比較して、多官能化した血清アルブミン溶液(BSA-P1)で調製したストリップの捕捉能力が強いことを示している。加えて、使用したトレーサーがOR-BSA-P1(44)、OR-HSA-P2(46)又はOR-BSA-P2(48)に対応するかどうかに関わらず、OR-mAb12h(42)を用いる明視化によりBSA-P1ストリップにおいて観察されたシグナルは、mAb12hを含むストリップを使用して同じMMP12h溶液で観察されるものより強い。
【０２２６】
ストリップ形式に対する結果の概要
mAb12hトレーサーの使用と組み合わせた、固定されたBSA-P1を含有するストリップの系により、100μlサンプル当たり、1個の遊離活性部位(活性型のMMP12h)を有するMMP12h 6fmol(0.12ng)の緩衝媒体中で選択的且つ特異的な検出が可能になり、これは検出感度1.2ng/mLである。プロペプチドを含むプロフォーム又は阻害物質によって不活性化された型とは異なり、MMP12hが遊離活性部位を示す場合に限り、MMP12hの検出はこの系だけで機能する。実際、ProMMP12h及びMMP12h/阻害物質複合体を分析に使用する場合、本系は、陽性シグナルをもたらさない。試験したMMPの中で、MMP12hだけが陽性シグナルを生成し、MMP12hが最初に、高い相同性を有する他のMMPを含む混合物中の場合でも、このシグナルを観察できる。本系は、最初にタンパク質の豊富な媒体(240μg)中のMMP12h(1ng)の検出に適合しており、MMP12hが総タンパクの0.003%を表す場合に、MMP12hを検出する可能性を表している。加えて、開発した系は、マウス気管支肺胞洗浄物(BAL)中に入れたMMP12hの検出にも適合する。現在まで、これらの環境で実証された検出感度は、100μl BAL当たり80fmol又は16ng/mLである。したがって開発したストリップは、細胞抽出物又は気管支肺胞洗浄物などの複合媒体にも適合する。ストリップは経時的に安定であり、迅速な分析を可能にするので、ICT形式のストリップが、生体サンプル中の対象となる活性MMPを検出する方法としての利点を提供することに留意されたい。
【０２２７】
標的MMPを捕捉するためにストリップに固定されその後にモノクローナル抗体により明視化される実体として(42、43、図9)、又はストリップに固定されたモノクローナル抗体によって捕捉された対象となるMMPの存在を明らかにできるトレーサーとして(44、46、48、図9)の両方で、対象となるMMPのリガンドで官能化した血清アルブミンを、MMPの検出に使用できる。リガンドによる血清アルブミンの官能化の程度は、官能化された血清アルブミンの、捕捉されたMMP12hを検出する能力にほとんど影響がないが、官能化の程度は、その後の明視化のためにMMP12hを捕捉する血清アルブミンの能力に有意な影響を持つ。この効果は、官能化の程度の増加と順相関がある。最後に、最も高い検出感度が得られる形式は、固体支持体に固定された、標的MMPのリガンドで多官能化された血清アルブミンの使用と、金標識したモノクローナル抗体からなるトレーサーとを組み合わせることに基づく形式に相当する。
【０２２８】
ストリップ形式結論
対象となるMMPのリガンドで多官能化した血清アルブミンを、ストリップ上の対象となるMMPを捕捉し、濃縮し、集束させる薬剤として使用し、その後にその存在を標識したモノクローナル又はポリクローナル抗体、例えばコロイド金によって明視化する場合、ストリップ形式は活性MMPだけを検出するための最大感度を提供する。しかしながら、対象となるMMPのリガンドで単官能化した血清アルブミンも、対象となるMMPを捕捉するには効果的であるが、より低い感度である。加えて、対象となるMMPのリガンドで単官能化又は多官能化した血清アルブミンを特にコロイド金で標識し、標的MMPに特異的な抗体で官能化したストリップと使用する場合、それはトレーサーとしての価値を持ち得る。
【０２２９】
EIA試験
ICT形式(ストリップ)において探究した手法を移行する可能性を、対象となるMMPが活性型で存在する、言い換えれば塞がれていない活性部位を有する場合に陽性シグナルしか生じないEIA試験を設計することで評価した。この手法の場合、数種類のプレートを調製した:
-  リガンドP1で多官能化したBSAの固定化を含むBSA-P1プレート;
-  リガンドP2で単官能化したHSAの固定化を含むHSA-P2プレート;
-  それぞれモノクローナル抗ヒトMMP12抗体、ポリクローナル抗ヒトMMP12抗体及びポリクローナル抗マウスMMP12抗体を固定化したmAb12hプレート、polyAb12hプレート及びpolyAb12mプレート。
【０２３０】
BSA-P1プレート及びHSA-P2プレートの使用を、ビオチンで標識したモノクローナル抗体(Biot-mAb12h)を使用する検出、及び414nmに吸光度シグナルを生成するDTNBの存在下でアセチルチオコリンを切断できるストレプトアビジン-AChE(G4)による二次検出と組み合わせた。
【０２３１】
mAb12hプレート、polyAb12mプレート及びpolyAb12hプレートの使用を、
-  mAb12hプレートの場合Biot-HSA-P2、P3又はAChE(G4)-P1;
-  polyAb12hプレート及びpolyAb12mプレートの場合P3
を使用する検出と、それぞれ組み合わせた。
【０２３２】
すべての場合において、測定されるシグナルは、DTNBの存在下でアセチルチオコリンを切断するAchE(G4)によって生成される414nmの吸光度シグナルである。下で得られるデータは、各測定点に関して、少なくとも3回行った実験の結果である。
【０２３３】
BSA-プレートP1:結果
単純及び複合媒体における検出感度-[図10]
MMP12hが、50mM Tris-HCl 6.8、10mM CaCl2、Brij 0.01%の緩衝媒体中のか又は同じ緩衝液中で細胞質性タンパク質の混合物40μgの存在下にあるかに関わらず、Biot-mAb12を用いる検出と組み合わせてBSA-P1プレートを使用した結果、MMP12hが検出された。MMP12hの検出は、緩衝媒体中で1pMの初期濃度及び細胞質性タンパク質の混合物40μgからなる複合媒体中で1〜10pMまで陽性であり、それはそれぞれ、100μLの分析容量中に0.1fmol(2pgである)及び0.1〜1fmol(2〜20pgである)の初期量のMMP12hを表している。
【０２３４】
単純又は複合媒体において、分析したサンプルが、MMP阻害物質(競合剤)により溶液中で予め阻害されたMMP12を含有する場合、BSAにあるリガンドP1による、MMP12hの塞がれていない活性部位(したがって活性型のMMP12hだけ)を介する捕捉の特異性を吸光度の生成を排除することによって検証した。
【０２３５】
異なる緩衝液との適合性-[図11]
Biot-mAb12hを用いる検出と組み合わせたBSA-P1プレート系の適合性を、生体媒体又は組織抽出溶液に対する希釈剤として通常使用される様々な緩衝液に対して確立した。得られた吸光度を、
-  50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brijの緩衝液;
-  50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brij/メタロプロテアーゼ阻害物質以外のプロテアーゼ阻害物質の反応混液を含有するPBS:1/1の緩衝液混合物;
-  50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、2M尿素、1M NaClの緩衝液
中に20mM MMP12h 100μLの容量を有する溶液を分析することによって比較した。
【０２３６】
これらの異なる型の緩衝媒体を用いて、及びプロテアーゼ阻害物質反応混液を構成する有機分子の混合物の存在下でMM12h検出系の適合性を観察した。実験において、塞がれていない活性部位を持つMMP12h(活性型)だけが検出されるので、MMP12hを溶液中でMMP阻害物質(競合剤)によって予め阻害した場合に吸光度が生成しないことは、観察されたシグナルの特異性を示している。
【０２３７】
生成した吸光度は、同程度であるが同一でない強度を持つ。20pMのMMP12h初期濃度に対して測定したシグナルは、50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brijの緩衝液において観察されたそれと比較して、50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brij/プロテアーゼ阻害物質(メタロプロテアーゼ阻害物質以外)の反応混液を含有するPBS、の混合物(1/1)において一層大きく、前者は、50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、2M尿素、1M NaClの緩衝液において観察したものより高い。これらの強度の違いは、緩衝液に依存してMMP12hが三次元構造を維持する様々な能力及びBSAにあるリガンドP1が標的と効果的に相互作用する能力を反映している可能性がある。
【０２３８】
複合媒体中のMMP12hの検出に対するBSA-P1プレート、HSA-P2プレート及びmAb12hプレートの比較:結果-[図12]
これらの実験において、サンプルをプレート中でインキュベートし、次いで上清の除去に続いて洗浄し、トレーサーを添加した。BSA-P1、HSA-P2及びmAB12hプレートを使用するMMP12hの検出のために細胞質性タンパク質の混合物40μgの存在下に10又は50pMでMMP12hの同一溶液を使用することは、
-  MMP12hが、BSA-P1プレート//Biot-mAb12hトレーサー系とHSA-P2プレート//Biot-mAb12hトレーサー系の両方によって検出されることは、EIA形式の場合に、血清アルブミンの置換の程度はMMP12h検出の質に対して有意な効果がないことを示している。しかしながら、この実験において、サンプルは終夜インキュベートされ、それが対象となる種の量に関して最適な捕捉を助長できることに留意されたい。
-  HSA-P2//Biot-mAb12hトレーサー系は、複合媒体中で、100μLサンプル当たり1fmolのMMP12hを検出し、それはMMP12hの初期濃度10pMに相当する。
-  BSA-P1//Biot-mAb12hトレーサー系と同様に、活性部位への接近が、競合剤によって事前に遮断されている場合、HSA-P2//Biot-mAb12hトレーサー系は、MMP12hを検出せず、塞がれていない活性部位を有するMMP12h(活性型のMMP12h)の検出に特異的な系を与える。
-  複合タンパク質サンプルの場合にBSA-P1プレートによって生成したバックグラウンドノイズは、HSA-P2プレートによって観察されるものより大きい(領域5と6の比較)。サンプルを競合剤とプレインキュベートする実験(領域2及び4)においても、この一層大きなノイズを見ることができる。
ことを示している。
【０２３９】
他方で、mAb12hプレート//Biot-HSA-P1トレーサー系が連続して使用される場合:
-  検出感度がより低い。実際に、MMP12h溶液を、細胞質性タンパク質の混合物40μg中に10pMの濃度で使用する場合、mAb12hプレート//Biot-HSA-P1トレーサーで観察される吸光度は、シグナル強度がMMP12hの非存在下で観察されたものと同等なので、MMP12hの陽性の検出と結論できない。
-  MMP12hの活性部位への接近が競合剤によって予め妨げられている場合でも、MMP12hは、競合剤の非存在下にMMP12h溶液で得られるシグナル強度(領域3)と同等の強度でなお検出される(領域4)。予め不活化されたMMP12hのこの検出の理由は、恐らくMMP12hの捕捉後の洗浄によって競合剤が除去されたことにある。
という事実により他の2つの系より際立っている。
【０２４０】
プレート及びトレーサーとのインキュベーションだけが連続している場合、mAb12hプレート//Biot-HSA-P1トレーサー系は、したがって、MMP12hの検出を可能にするが、MMP12hの活性型(換言すれば塞がれていない活性部位を有する)に選択的ではない、
【０２４１】
MMP12hの検出にmAb12hプレートを使用するアッセイにおいてBiot-P2-HSAトレーサーを添加する場合の時間の比較:結果-[図13]
これらの実験において、サンプルをBiot-HSA-P2トレーサーの有り又は無しでプレート中でインキュベートし、次いで上清を除去し、その後洗浄し、サンプルインキュベーションの間にBiot-HSA-P2トレーサーが存在しなかった場合にはそれを添加した。
【０２４２】
結果は、プレートが抗体で官能化されている場合に、ワンステップ手順(検出しようとするMMPを含有するサンプル及びトレーサーを、検出しようとするMMPを認識することができる抗体で官能化したウェル中で初めから一緒にインキュベートした)だけが、MMP12hの活性型と最初に不活性化されている型(阻害物質と結合している)との存在の明瞭な区別を可能にすることを示している。ツーステップ手順(MMPを含有するサンプルのインキュベーション及び上清の除去後にbiot-HSA-P2トレーサーを添加する)では、MMPが最初に活性であるか又は阻害物質に結合しているかどうかに関わらず、陽性の検出シグナルが得られる。したがって、活性型のMMPだけを検出するには、すべての反応物を初めから一緒にインキュベートし、測定した吸光度によりbiot-HSA-P2//活性MMP複合体の量に比例するように活性MMPの定量を可能にする必要がある。
【０２４３】
この系を、mAb12hをロードしたプレートを使用するMMP12h(50pM)の検出及びpolyAb12mをロードしたプレートを使用するMMP12m(50pM)の検出について確認した。
【０２４４】
ProMMP12hと対比した、活性MMP12hの特異的検出に対するHSA-P2プレート及びmAb12hプレートの比較:結果[図14]
50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brijの緩衝液中に20pMのMMP12h及びProMMP12h(自身のタンパク質前駆体によって自己阻害されるMMP12hのプロフォーム)溶液をHSA-P2プレート//Biot-mAb12hトレーサー系及びmA12hプレート/Biot-HSA-P2トレーサー系に使用して、これらの系が、MMP12hの検出と対比してProMMP12hの検出を除外する能力を評価した。
【０２４５】
mAb12hプレートを使用する場合、2つの型のトレーサー添加時間について再評価した。上記のように、1つの場合は、捕捉工程後の、上清の除去及び洗浄後のトレーサーの添加を含み(mAb12hプレート、Biot-HSA-P2明視化)、一方で第2は、サンプルをBiot-HSA-P2トレーサー(mAb12hプレート、Biot-HSA-P2プレインキュベーション)と一緒に初めからインキュベートする結果である。結果は、以前観察された通り、いつトレーサーを添加するかに関係なく、MMP12hが、官能化したmAb12hプレートを使用する系よりもHSA-P2プレートを使用する系によってより良く検出されることを示している。
【０２４６】
他方で、トレーサーを初めからサンプルと一緒にインキュベートする場合(領域2、mAb12hプレート、Biot-HSA-P2プレインキュベーション)、MMP12hの検出は、mAb12hプレートの場合より効果的にみえる。加えて、このワンステップインキュベーション手順は、ProMMP12の検出を除外するにも優れており、mAb12hプレート上でのサンプルインキュベーションの間中Biot-HSA-P2トレーサーが存在する場合、ProMMP12に関連するシグナルは一層弱い。
【０２４７】
HSA-P2プレートによるProMMP12h溶液の分析に関しては、シグナル強度は、このサンプルからのMMP12hの検出を示す傾向がある。したがってProMMP12h溶液も、活性化されているMMP12hを一部含有すると推測できる。蛍光発生基質による、使用した溶液の活性の測定がこれらの結果を説明した。実際、これらの測定は、使用したProMMP12h溶液が、蛍光発生基質を分解することができるMMP12hを推定割合20%含有することを示した。したがって、実際にProMMP12hサンプルは、塞がれた活性部位を有するProMMP12hとMMP12hの混合物に相当し、遮断されていない活性部位は、基質を分解する又はHSA-P2プレートに固定されたHSAにあるP2阻害物質と相互作用する能力をこの種に付与する。HSA-P2//Biot-mAb12hトレーサー系は、ProMMP12hサンプル中の活性MMP12hのこの割合を検出することが可能である。したがって、HSA-P2プレート//Biot-mAb12hトレーサー系は、活性MMP12hを含有する溶液の場合だけ陽性の検出シグナルを生じることによって、MMP12h及びProMMP12hの存在を区別することが可能である。
【０２４８】
気管支肺胞洗浄物中のMMP12hの検出用のHSA-P2プレート:結果-[図15]
マウス気管支肺胞洗浄物に異なる量のMMP12hを添加することによって、HSA-P2プレートとBiot-Ab12hトレーサーの使用と組み合わせた系を用いてMMP12hを検出する可能性についても試験した。これらの実験を計画して、ヒトBALからMMP12hを検出するためのそのような系の適合性を特徴づけた。これを考慮して、100% BAL M5を使用した。この媒体は、50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brij中に半分に希釈し、次いで再び50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brij、1M NaCl、2M尿素中に半分に希釈したPBS中に得られるマウスBALである。
【０２４９】
結果は、タンパク質がBAL中に存在する場合の、MMP12h検出に対するHSA-P2//Biot-Ab12hトレーサー系の適合性を示す。サンプルを、対象となるMMP12hの活性部位を標的にしている競合阻害物質とプレインキュベーションする場合、観察されるシグナル(領域1)は、抑制される。
【０２５０】
使用したBAL媒体における検出感度は、サンプル100μLあたり1fmol MMP12hであり、10pMのモル濃度及び200pg/mLの質量濃度を表す。
【０２５１】
使用したプレートを、MMP12hの存在下で抗MMP12hポリクローナル抗体(polyAb12hプレート)で官能化した場合、同じプロファイル結果が得られる。トレーサーは、ビオチン部分を含有するリガンドP3であった。この戦略においてプレートに固定したmAb12hの使用は、polyAb12hを使用するのと同じ感度レベルを実現する。
【０２５２】
この系は、50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、0.01% Brij、又は50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2 0.01% Brij/メタロプロテアーゼ阻害物質以外のプロテアーゼ阻害物質の反応混液を含有するPBSの1/1混合物、又は50mM Tris-HCl pH6.8、10mM CaCl2、2M尿素、1M NaClなど、様々な緩衝液で実行するインキュベーションに適合する。したがって本系は、様々な緩衝媒体によって希釈したMM12hの検出に適合する。
【０２５３】
他のMMPの捕捉:結果[図19]
複数のMMPを捕捉する系のEIAバージョンの能力を、捕捉後上清の酵素アッセイによって実証した。このアッセイは、この形式(それはストリップ形式においては不可能である)においてだけ可能であり、緩衝媒体中でMMPにより切断されると蛍光シグナルを生成する市販の蛍光発生基質MCA-Matのインキュベーション後に、単離した上清を添加することによって機能する。MMPが、ウェル(この場合、MMPのリガンドで官能化した血清アルブミン中)にロードした実体によって捕捉された場合、蛍光測定はゼロになると期待される。これらの測定を、MMPリガンドを有しない血清アルブミン(対照)でロードした対照ウェルに由来する上清と比較して実施して、MMP捕捉が、MMPリガンドとの特異的相互作用を介して実際に機能することを確実にする。これらの実験は、試験したすべてのMMPについて、使用した蛍光測定器で測定可能な蛍光放射(ΔF)に適合する濃度である初期MMP濃度100pMで行われた。
【０２５４】
図19に示した結果は、系の捕捉工程が、試験したすべてのMMPに対して機能しており、モノクローナル抗体を使用する場合に、その工程がMMPの検出にとって必須の必要条件であることを明らかに示している。したがって、効果的であると実証された捕捉は、検出しようとする対象となるMMPに特異的なモノクローナル抗体を使用することによって、各MMPに対して更に増強される可能性がある。
【０２５５】
リガンドP1で官能化したAChE(G4)の使用:[図20]
AChE(G4-SMCC)、アセチルコリンエステラーゼ四量体型(SPI-BIO社から市販されている)をリガンドP1で官能化して、AChE(G4)-P1を得た。したがって、リガンドP1の結合は、AChEによって直接検出できる。
【０２５６】
第1の試験において、3つすべての相手、すなわちAChE-(G4)-P1、MMP12h及びmAb12hを、マウス抗ヒト抗体のすべてのセットを認識することが可能な実体であるCASで官能化したウェル中で一緒にインキュベートする。上清の除去、洗浄及びアセチルコリン基質類似体の添加後に、測定した吸光度は、AChE(G4)-P1//活性MMP12h//mAb12h複合体の量と比例しており、したがって活性MMP12hの定量が可能になる。一定量のmAb12h(50μL、10ng/mL)を用いる場合、この系が、濃度10pM(50μL、100pg/mL)までの活性MMP12hの検出に効果的であることが示された。同様に、この系を、一定量の抗MMP12mポリクローナル抗体(免疫精製した)を使用して、10pM活性MMP12m(50μL、100pg/mL)の濃度に下げてMMP12mの検出について確認した。この場合、プレートを、ウサギ抗マウス抗体のすべてのセットを認識することが可能な実体であるSALで官能化する。
【０２５７】
この系のバリアントは、(CAS又はSALではなく)検出しようとするMMPに特異的な抗体によって直接官能化したウェルを使用する。この系において、AChE(G4)-P1及びMMP12h若しくはMMP12mのいずれかであるMMPを含有するサンプルを、mAb又はpolyAbいずれかによって官能化したウェル中で初めから一緒にインキュベートする。上清の除去、洗浄及びアセチルコリン基質類似体(AChE[G4])の添加後に、測定した吸光度は、AChE(G4)-P1//活性MMP複合体の量に比例しており、したがって活性MMPの定量にしか対応しない。この系の原理を、mAb12hをロードしたプレートを使用するMMP12hの検出(50pM)及びpolyAb12mをロードしたプレートを使用するMMP12mの検出(50pM)について、並びにプロテアーゼ阻害物質反応混液を含有しない様々な緩衝液中で確認した。
【０２５８】
MMPを含有するサンプルのインキュベーション後にAchE(G4)-P1トレーサーをウェルに添加する場合、この系が機能することも示された。しかしながら、この場合、検出は活性型のMMPに特異的でない。
【０２５９】
複合媒体中のMMP12hの検出に関するAchE(G4)-P1とbiot-HSA-P2との比較[図21]
トレーサーとしてリガンドP2及びP1をそれぞれ有するビオチン標識した血清アルブミン又はAChE(G4)を含むmAb12hで官能化したプレートの使用について、サンプルとリガンドP1若しくはP2を有するトレーサーとの同時インキュベーションにより、細胞質性タンパク質抽出物によって例証した複合媒体の存在下でMMP12hについて評価した。両方の系から、活性MMP12hの陽性の検出だけが得られた。最初に競合阻害物質と相互作用しているMMP12hは、P1又はP2のいずれとも相互作用することができず、したがって検出されない。複合媒体(細胞質性タンパク質抽出物40μg)の存在及びインキュベーション時間は、系の検出能力に影響がない。AChE(G4)の触媒活性及びリガンドを有する血清アルブミンのストレプトアビジン-AChE(G4)による(対象となる標的との相互作用における)認識の可能性は、インキュベーション時間及びタンパク質分解活性を有する細胞抽出物の存在に影響を受けない。しかしながら、AChE(G4)を直接使用する系のシグナルは、ストレプトアビジン-AChE(G4)によって二次検出されるbiot-HSA-P2を使用する系より高い。
【０２６０】
EIA形式の結論
この形式において、MMPのリガンドで単官能化及び多官能化した血清アルブミンは、MMP対象の捕捉、濃縮に対する薬剤として有効であり、その存在は、対象となるMMPに特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体によってその後明らかになる。この場合、MMPリガンドで単官能化した血清アルブミンの使用により、系の費用及びバックグラウンドノイズを減少させることが可能になる。
【０２６１】
ロードした抗体を使用するEIA形式において、MMPリガンドで単官能化した血清アルブミン及びAChE(G4)を活性型のMMPを検出するためのトレーサーとして使用することができる。
【０２６２】
EIA形式における活性型のMMPの排他的な検出は、検出しようとするMMPを含有するサンプルが、最初からリガンドと接触していることを必要とし、その検出は、
-  P1又はP2を有する血清アルブミンで官能化したプレートを用いて、又は
-  ウェル内でのインキュベーションの前に又は同時にサンプルをMMPリガンド(例えばMMPリガンドを有する血清アルブミン又はAChE[G4])とインキュベートする場合には、対象となるMMPに特異的な抗体で官能化したプレートを用いて可能になる。
【０２６３】
これら3つの系がタンパク質の複合混合物の存在に適合することが示され、これは、標的したMMPが担体タンパク質にあるMMPリガンドと相互作用する能力に影響を及ぼさず、活性型のMMPだけを排他的に検出することを保証する。
【０２６４】
しかしながら、P1又はP2を有する血清アルブミンで官能化したプレートを使用する場合、抗体で官能化したプレートの使用と比較して、MMP12hの検出に対して得られるシグナルが系統的により高い強度のものになる点に注意することが重要である。
【０２６５】
MMP2h及びMMP9hの検出
MMP12のために開発した戦略の適合性を、他の活性型のMMP、特にヒトMMP2及びMMP9の検出に対して確立した。
【０２６６】
MMPの活性部位のリガンドで官能化したBSA-P1プレートを、捕捉相に使用し、適当な抗体を、検出工程に使用した。それらを、上記の通り調製した。
【０２６７】
Biot-mAb2及びBiot-mAb9抗体を使用した。これらは、ビオチン分子で官能化したモノクローナル抗体である。Biot-mAb9は、ヒトMMP9を認識する抗MMP9hモノクローナル抗体である。Biot-mAb2は、ヒトMMP2を認識する抗MMP2hモノクローナル抗体である。Biot-mAb2は、ヒトMMP2に対する市販のマウスモノクローナル抗体(抗MMP2[Ab-8]マウス[VB3];Calbiochem社[EMD Millipore社])のビオチン標識工程の後に得られた。Biot-mAb9は、すでにビオチン化されているヒトMMP9に対するマウスモノクローナル抗体(MMP9[7-11C]:sc-13520、Santa Cruz Biotechnology、Inc.社)に対応する。
【０２６８】
Biot-mAb2を、100mMホウ酸緩衝液pH9中のmAb2溶液及び新たに調製したDMF中の5mg/mL N-ヒドロキシスクシンイミドエステル形態の活性ビオチン(ビオチン-NHS)溶液から調製した。特に、mAb2 25μg(PBS中に1mg/mL含有する溶液25μL)を、100mMホウ酸緩衝液pH=9.0 125μLに入れ、その後に5mg/mL NHS-ビオチン10μLを添加した。室温で45分間のインキュベーション後に、1M Tris緩衝液pH=8.0 50μLを混合物に添加した。10分間インキュベーションし、その後100mMリン酸pH7.4、0.1% BSA、0.15M NaCl、0.01% NaN3緩衝液790μLを添加して、濃度25μg/mLのBiot-mAb2トレーサーを実現した。Biot-mAb2保存溶液を、4℃で貯蔵した。
【０２６９】
MMP2h及びMMP9hそれぞれの検出の場合に、BSA-P1で官能化したプレートの使用をbiot-mAb2hトレーサーによる明視化、またbiot-mAb9hトレーサーによる明視化と組み合わせた。
【０２７０】
官能化したプレートを室温に持ち込んだ後、ウェルを、5回洗浄のサイクルの自動プレート洗浄器で100mMリン酸、0.1% Tween、pH7.4緩衝液を使用して300μL容量で洗浄した。
【０２７１】
BSA-P1プレート及びbiot-mAb2hトレーサー又はbiot-mAb9hトレーサーを使用するEIA試験において、50mMリン酸又は50mM Tris.HCl pH7.4、0.1% BSA、0.15M NaCl、0.01% NaN3緩衝液の溶液中のMMP2h若しくは活性型のMMP9hを濃度を増加させて含有するサンプル100μLを、その後25℃で3時間、及び4℃で終夜インキュベーションするためにウェルに入れた。サンプル中の対象となる種を捕捉する工程に相当するこの工程の後に、上清を除去し、100mM Tris HCl、10mM CaCl2、1M NaCl、0.5% Tween緩衝液を使用して、撹拌しながら2〜5分間浸すことで一連の洗浄を行った。この後に、PBS又は50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、0.1% BSA、0.01% NaN3の緩衝液中で使用されるビオチン化トレーサーbiot-mAb2又はbiotm-Ab9を濃度1μg/mLで添加した。トレーサーとのインキュベーションを4℃で終夜行った後に、上清を除去し、50mMリン酸、0.1% Tween 20緩衝液で更に一連の洗浄を行った。1EU/min/mLのストレプトアビジンAchE(G4)(アセチルコリンエステラーゼ)を添加し、続けて2時間インキュベーションした後、上清を除去し、洗浄し、アセチルチオコリン及びDTNB(10mMリン酸緩衝液にDTNB = 5×10-4M、アセチルチオコリン1.4×10-5M)を添加した。DTNBの存在下で基質に対する作用が414nmの吸光度を生じるAChE(G4)の活性を測定することによって、対象となるタンパク質の検出を測定した。
【０２７２】
Biot_mAb2h又はBiot_mAb9hによる検出と組み合わせてBSA-P1プレートを使用することにより、50mM Tris.HCl pH7.4、0.1% BSA、0.15M NaCl、0.01% NaN3の緩衝媒体中でMMP2h(図22)及びMMP9h(図23)がそれぞれ検出される。MMP2h及びMMP9hの検出は、緩衝媒体中で初期濃度10pMの場合に陽性であることが実証され、これは分析容量100μLにそれぞれ1fmol(それぞれ66pg及び65pg)の初期量のMMP2h及びMMP9hを表す。
【０２７３】
これらの結果は、捕捉工程並びに活性型のMMPの陽性の検出が、MMPのサイズ及び分子量によって決まらないことを示している。検出は、使用される抗体の型及び活性型で存在するMMPだけで決まるにとどまる。
【０２７４】
サンプル中のMMP12、2又は9のpMレベル(10-12M)での同等の感度での検出に加えて、他の既存の、特に市販の抗MMPモノクローナル抗体の使用により、すべてのMMPに対する検出系を得ることができる。
【図１】
2015532417.tif 000030
【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図４】
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【図５】
2015532417.tif 000038
【図１０】
2015532417.tif 000039
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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