(57)【要約】本発明は、ｉｎ ｖｉｖｏで作成される、新規の腫瘍特異的完全ワクチンシステムを開示する。本ワクチンシステムは、照射により不活性化された分離腫瘍細胞の使用、およびＧＭ‐ＣＳＦのトランスジェニック発現を伴う腫瘍溶解性ウイルスベクターとのｉｎ ｖｉｖｏ相互作用により作成され、抗ＣＴＬＡ‐４抗体による共刺激シグナル確認などの免疫チェックポイントモジュレーター（「ＩＣＭ」）で完全となる。特に、患者への投与前に、２種または全３種の成分の事前培養または相互作用が不要である。そのような腫瘍溶解ウイルスベクターの一例が、ＣＧ００７０（ＧＭ‐ＣＳＦを発現する、条件付きで複製可能なアデノウイルス）である。腫瘍・ウイルス・ＩＣＭ成分の混合を投与直前に行うことで、腫瘍溶解過程およびその後の免疫療法反応の効果が保持され、まったくの最初から生でｉｎ ｖｉｖｏとなる。本発明は、完全な生のｉｎ ｖｉｖｏがんワクチンシステム（「ＣＬＩＶＳ」）である。【選択図】図１
2015523412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
照射により単離および不活性化された分離腫瘍細胞と、ＧＭ‐ＣＳＦをコードする異種核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスおよびがん特異的ベクターと、免疫チェックポイントモジュレーター（「ＩＣＭ」）との少なくとも２種または全３種の成分を含む腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムであって、前記２種または３種の成分が、前培養を行わずに、患者に投与する直前に混合される、腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項２】
ただし、前記免疫チェックポイントモジュレーターを省略した、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫チェックポイント分子が抗ＣＴＬＡ‐４抗体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗ＣＴＬＡ‐４抗体が、イピリムマブと、トレメリムマブと、単鎖抗ＣＴＬＡ‐４抗体とから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記免疫チェックポイント分子が、ＯＸ４０結合剤もしくはアゴニスト、またはＯＸ４０Ｌ分子である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記免疫チェックポイント分子が、ＰＤ１、ＴＩＭ３、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＬＡＧ‐３およびＫＩＲもしくはそのリガンドを標的とする、または調節する分子群もしくは抗体から選択される抗体もしくはモジュレーターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫チェックポイント分子が、請求項３から６の免疫チェックポイント分子の２つ以上の組み合わせである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記ＧＭ‐ＣＳＦを発現する腫瘍溶解性がん特異的ウイルスベクターが、例えばＣＧ００７０などのアデノウイルスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＧＭ？ＣＳＦを発現する腫瘍溶解性がん特異的ウイルスベクターが、例えば単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびレオウイルスなどの、アデノウイルス以外のウイルスから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
照射により単離および不活性化された分離腫瘍細胞と、ＧＭ−ＣＳＦをコードする異種核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスおよびがん特異的ベクターと、免疫チェックポイントモジュレーター（「ＩＣＭ」）との少なくとも２種または全３種と、使用法とが記載された添付文書を含むキット。
【請求項１１】
腫瘍の解離および調製を行う材料および方法と、酵素および／またはウイルスベクター形質導入剤と、低温保存バイアルなどと、使用法とが記載された添付文書とを含む、腫瘍細胞調製キット。
【請求項１２】
請求項１の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムの患者への投与を含む、がん治療のための局所および／または全身の特異的免疫反応を含む方法。
【請求項１３】
前記がん細胞の起源が自己である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記がん細胞の起源が同種である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記がん細胞の起源が細胞培養システムである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記がん細胞が、ウイルス形質導入および／または免疫修飾に有益であり得る作用物質または受容体を分泌または発現するよう修正されており、その一例が、ＧＭ−ＣＳＦを分泌するよう修正された自己または同種がん細胞であるＧＶＡＸであるがこれに限定されない、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記がん細胞の起源が、請求項１３から１６に定めるがん細胞由来の２つ以上の組み合わせであり得る、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１８】
前記腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムを患者に皮下投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムを患者に皮内投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムを患者に筋肉内投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムをリンパ系に投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムを、ヒトの１つまたは複数の器官に投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムを、１サイクルとして週１回、次いで治療過程ごとに２回以上の同様のサイクルで投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムを、１サイクルとして２週間以上ごとに１回、次いで治療過程ごとに２回以上の同様のサイクルで投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
前記腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムを、１サイクルとして１週間に２回以上、次いで治療過程ごとに２回以上の同様のサイクルで投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２６】
前記腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムを、１サイクルとして２週間以上ごとに週に２回以上、次いで治療過程ごとに２回以上の同様のサイクルで投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２７】
前記腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムを、投与の一部または全部について、治療過程において任意のサイクルで患者の同じ身体部位に投与する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２８】
前記腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムを、投与の一部または全部について、治療過程において任意のサイクルで患者の異なる身体部位に投与する、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規のがんワクチンの組み合わせに関する。具体的には、本発明は照射腫瘍細胞と、ＧＭ‐ＣＳＦを発現する腫瘍溶解性ウイルスと、免疫チェックポイント調節分子とを含む腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムと、腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムを含むキットと、それらの使用法とに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＭ‐ＣＳＦのトランスジェニック発現を伴う腫瘍溶解性ウイルス、例えばＣＧ００７０などは、膀胱がんにおいて膀胱内投与した際に［Ｖ００４６試験］、予備的に成功している。数年以上にわたって継続する長期完全奏効は、わずか６週間の治療を終えた後に報告されており、本剤がまさに膀胱がんに対する腫瘍特異的免疫療法となり得る可能性が高まっている。この理論をさらに確固たるものにするために、本明細書では、膀胱内部ほど到達が容易でない他のがんに対して、生ワクチンシステムによる相互作用の独自の方法を用いることが提案される。第１の成分は、生検または手術標本から採取した患者自身の腫瘍細胞である（ただし、同種腫瘍細胞も使用できる）。第２の成分はＧＭ‐ＣＳＦ発現を伴う腫瘍溶解性ウイルス、例えばＣＧ００７０である。第３の成分は免疫チェックポイントモジュレーターで、ここに挙げる例は、共刺激シグナル確認分子である抗ＣＴＬＡ‐４抗体である。がんワクチンのこれまでのあらゆる手法におけるような、ｉｎ ｖｉｔｒｏで抗原またはウイルスを付着、感染させた、または修正した腫瘍細胞を産生する前培養や相互作用の代わりに、本新規腫瘍・ウイルス・ＩＣＭワクチン、すなわちＣＬＩＶＳは、患者に投与する直前に３種の成分を混合することにより、生きたままｉｎ ｖｉｖｏで作られる。これにより、腫瘍溶解性および免疫原性の最大効果が、患者自身の免疫系のリアルタイム反応内にあることが可能となる。そのような新しい送達方法は、これまでに実現されたことのない腫瘍特異的腫瘍免疫療法の可能性を高めると考えられる。
【０００３】
さらに、他の免疫チェックポイントモジュレーター、抗サプレッサー細胞分子、または支持共確認シグナルモジュレーター刺激を同時投与し、長期にわたる強い腫瘍特異的免疫反応を増強することができる。別法として、特定種のがんでは、免疫チェックポイントモジュレーター確認を省略してもよい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の１つの実施態様では、腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムは：照射により単離および不活性化された分離腫瘍細胞と、ＧＭ‐ＣＳＦをコードする異種核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスおよびがん特異的ベクターと、免疫チェックポイントモジュレーター（「ＩＣＭ」）との少なくとも２種または全３種の成分を含み、前記３種の成分が、前培養を行わずに、患者に投与する直前に混合される。
【０００５】
本発明の別の実施態様では、ワクチンシステムから免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）が省略される。
【０００６】
特定の実施態様では、免疫チェックポイント分子（ＩＣＭ）は抗ＣＴＬＡ‐４抗体である。特定の好ましい実施形態では、抗ＣＴＬＡ‐４抗体は、イピリムマブと、トレメリムマブと、単鎖抗ＣＴＬＡ‐４抗体とから選択される。
【０００７】
他の実施態様では、ＩＣＭは、最初の数日以上にわたってＴ細胞の増殖を維持できるＯＸ４０結合剤もしくはアゴニスト、またはＯＸ４０Ｌ分子である。
【０００８】
別の実施形態では、ＩＣＭは、ＰＤ１、ＴＩＭ３、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＬＡＧ‐３およびＫＩＲまたはそのリガンドに対する抗体またはモジュレーターである。
【０００９】
別の実施形態では、ＩＣＭ成分は、先の実施形態に記載されるＩＣＭの２つ以上の組み合わせであってよい。
【００１０】
いくつかの実施形態では、分離腫瘍細胞は、自己細胞、同種細胞、または自己細胞と同種細胞との組み合わせから採取して調製する。特定の実施形態における自己細胞および同種細胞は、細胞培養から調製してもよい。他の実施形態では、腫瘍細胞は、免疫調節を増強する作用物質を分泌するよう修正されていてもよい。これらの例の１つが、ＧＶＡＸによる自己または同種がん細胞治療であり、ＧＶＡＸのがん細胞がＧＭ‐ＣＳＦを分泌する。
【００１１】
別の実施態様では、腫瘍溶解性ウイルス成分はアデノウイルス由来で、一例がＣＧ００７０、すなわちＥ２ＦプロモーターとＧＭ‐ＣＳＦの導入遺伝子発現とを含むアデノウイルスベクターである。
【００１２】
別の実施態様では、腫瘍溶解性ウイルス成分は、形質導入後にＧＭ‐ＣＳＦを発現できる他の腫瘍溶解性ウイルスのいずれか１つである。例として、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ムンプスウイルス、レオウイルス、およびニューカッスル病ウイルスがあるが、これらに限定されない。
【００１３】
本発明のある実施態様では、ＣＬＩＶＳは患者に皮下投与される。
【００１４】
本発明の別の実施態様では、ＣＬＩＶＳは、例えば表皮、筋肉内など他の経路で患者のリンパ節鎖、および当業者には既知の、免疫反応を増強するその他の部位または器官に投与することができる。
【００１５】
本発明の他の実施態様では、照射により単離および不活性化された分離腫瘍細胞と、ＧＭ‐ＣＳＦをコードする異種核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスおよびがん特異的ベクターと、免疫チェックポイントモジュレーター（「ＩＣＭ」）と、使用法が記載された添付文書とを含むキットが提供される。
【００１６】
本発明の他の実施態様では、腫瘍細胞調製キットは：腫瘍の解離および調製を行う材料および方法と、酵素ならびに／またはウイルスベクター形質導入剤と、低温保存バイアルなどと、使用法が記載された添付文書とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１はＣＧ００７０および野生型（ｗｔ）アデノウイルス５型の概略図である。ＣＧ００７０はアデノウイルス血清型５をベースとしており、内因性Ｅ１ＡプロモーターおよびＥ３ １９ｋＤコード領域は、それぞれヒトＥ２Ｆ‐１プロモーターおよびヒトＧＭ‐ＣＳＲＦのｃＤＮＡコード領域に置き換えられている。
【図２．２．１．１】図２．２．１．１の２つの棒グラフは、正常Ｗｉ３８線維芽細胞およびＷｉ３８‐ＶＡ１３細胞における選択的Ｅ１Ａ遺伝子転写およびＧＭ‐ＣＳＦ産生を示す。Ａ．選択的Ｅ１Ａ遺伝子転写。Ｗｉ３８（正常Ｒｂ経路）細胞およびＷｉ３８‐ＶＡ１３（欠損Ｒｂ経路）細胞は、１細胞あたり１００または１０００ウイルス粒子（ｖｐ）（ｐｐｃ）でｏｎ ｉｃｅで１時間モック感染、またはＣＧ００７０に感染させ、続いて３７℃で培養し、ウイルスの取り込みを同期化した。感染の２４時間後にＥ１Ａ ｍＲＮＡの定量的ＲＴ‐ＰＣＲを行った。Ｅ１Ａ ＲＮＡレベルは、感染の４時間後に測定したヘキソンＤＮＡコピー数に対して正規化した。＊ｐ＜０．０１、ｔ検定、同じベクターに感染させたＷｉ３８‐ＶＡ１３におけるＥ１Ａ ＲＮＡ対Ｗｉ３８におけるＥ１Ａ ＲＮＡ。Ｂ．選択的ＧＭ‐ＤＸＦ産生。ＣＧ００７０に感染させたＷｉ３８細胞およびＷｉ３８‐ＶＡ１３細胞（１００ｐｐｃ）の上清を、ヒトＧＭ‐ＣＳＦについてＥＬＩＳＡで１５から２４時間分析した。＊ｐ０＜０．０１、ｔ検定、Ｗｉ３８‐ＶＡ１３細胞におけるＧＭ‐ＤＳＦレベル対Ｗｉ３８細胞におけるＧＭ‐ＤＳＦレベル。
【図２．２．２．１】図２．２．２．１の棒グラフは、Ｒｂ経路欠損ヒト膀胱ＴＣＣ細胞および正常細胞におけるＣＧ００７０および野生型アデノウイルスの産生性を示す。２９３単層、ヒト膀胱ＴＣＣ細胞株（ＲＴ４、ＳＷ７８０、ＵＣ１４および２５３Ｊ Ｂ‐Ｖ細胞）ならびにヒト正常細胞（線維芽細胞ＭＲＣ５および大動脈内皮ｈＡＥＣ）を、２プラーク形成単位（ｐｆｕ）／細胞のＭＯＩでＣＧ００７０または野生型アデノウイルスのいずれかに感染させた。感染の７２時間後に細胞を採取し、ウイルス力価を２９３細胞でプラークアッセイで測定した。独立した２つの実験の重複力価の平均を、２９３細胞で測定して正規化した。
【図２】図２のグラフは、皮下２５３Ｊ Ｂ０Ｖ膀胱ＴＣＣ異種移植モデルにおけるＣＧ００７０の抗腫瘍効果を示す。皮下腫瘍を有するＮＣＲヌードマウスに、生理食塩水またはＣＧ００７０の腫瘍内投与を、矢印で示すとおり５回行った（試験１、３、５、８および１０日目［ＳＤ］）。生理食塩水または１回の注入あたり３×１０８ｖｐ、３×１０９ｖｐまたは３×１０１０ｖｐのＣＧ００７０を投与したマウスについて、群平均腫瘍容積±標準偏差（１群あたりｎ＝１０）を示している。試験期間中に３つの治療群において抗腫瘍効果に有意差は認められなかった。ＣＧ００７０治療群はすべて、ＳＤ ６０において生理食塩水治療群と統計的に差があった（ｐ＜０．００１、ｔ検定）。ＳＤ ４３からＳＤ ４７にＰＢＳ群の１０匹中４匹を腫瘍容積のために安楽死させたため、この群の平均腫瘍容積が低下した。
【図２．３．２Ａ】図２．３．２Ａは、試験したマウスの画像のコピーで、ＳＷ７８０‐Ｌｕｃ同所性膀胱腫瘍モデルにおけるＣＧ００７０の抗腫瘍効果を示す。同所性膀胱腫瘍作成後、マウスの膀胱内に、図に示す投与量でＰＢＳまたはＣＧ００７０のいずれかを５０μＬ投与した。マウスは毎週、ルシフェリンを腹腔内投与した後に撮影した。図に示す画像は、図中に記載があるものを除き、ＳＤ １に撮影したものである。
【図２．３．２Ｂ】図２．３．２Ｂは、試験したマウスの画像のコピーで、ＳＷ７８０‐Ｌｕｃ同所性膀胱腫瘍モデルにおけるＣＧ００７０の抗腫瘍効果を示す。同所性膀胱腫瘍作成後、マウスの膀胱内に、図に示す投与量でＰＢＳまたはＣＧ００７０のいずれかを５０μＬ投与した。マウスは毎週、ルシフェリンを腹腔内投与した後に撮影した。図に示す画像は、図中に記載があるものを除き、ＳＤ １およびＳＤ ４２に撮影したものである。
【図２．３．２Ｃ】図２．３．２Ｃは、試験したマウスの画像のコピーで、ＳＷ７８０‐Ｌｕｃ同所性膀胱腫瘍モデルにおけるＣＧ００７０の抗腫瘍効果を示す。同所性膀胱腫瘍作成後、マウスの膀胱内に、図に示す投与量でＰＢＳまたはＣＧ００７０のいずれかを５０μＬ投与した。マウスは毎週、ルシフェリンを腹腔内投与した後に撮影した。図に示す画像は、図中に記載があるものを除き、ＳＤ １およびＳＤ ３２に撮影したものである。
【図２．３．３】図２．３．３の２つのグラフは、血清ＧＭ‐ＣＳＦ発現を示す。ＣＧ００７０およびＡｒ２０‐１００４（２×１０１０ｖｐ／１投与）を、矢印に示すＳＤ １、３および５に腫瘍内投与した。グラフに示すＳＤにマウスの採血および腫瘍の除去を行い、血清（パネルＡ）および腫瘍抽出物（パネルＢ）を調製して、ヒトまたはマウス特化型のＥＬＩＳＡを用いてＧＭ‐ＣＳＦを測定した。生理食塩水を注入したマウスではＧＭ‐ＣＳＦは検出されなかった（図示せず）。各データポイントは、５匹のマウスの平均±標準偏差を示す。
【図２．３．４】図２．３．４の単一のグラフは、作成したＣＭＴ‐６４腫瘍における抗腫瘍効果を示す。ＣＭＴ‐６４腫瘍はＣ５７Ｂ１／６マウスの皮下に作成した。腫瘍が平均１２０ｍｍ３に達したら、矢印に示すように、生理食塩水またはアデノウイルス（２×１０１０ｖｐ）を１日１回または３日連続で投与した。治療はグラフの差し込み図に示す。データは平均腫瘍容積および標準誤差を示す（１群あたりｎ＝９）。アスタリスクは生理食塩水に対してｐ＜０．０５を示す。記号の下のアスタリスクは、記号の真上の治療群のみに対する有意性を示すのに対し、記号の上のアスタリスクは、生理食塩水投与と比較して、記号の下の全群に対する有意性を示す。
【図２．３．５】図２．３．５の棒グラフは、Ａｒ２０‐１００４で治療した後のＣＭＴ‐６４腫瘍モデルにおける腫瘍所属リンパ節のＣＤ１１ｃ＋細胞の増加を示す。ＣＭＴ‐６４腫瘍を有するＣ５７Ｂ１／６マウスに、ＨＢＳＳ（生理食塩水）または１×１０１０粒子／投与のＡｒ２０‐１００４もしくはＡｒ２０‐１０６１を４日間毎日投与した。最終投与の４日後、マウスを安楽死させ、各マウスから腫瘍所属リンパ節（右鼠径リンパ節）を採取した。単個細胞浮遊液を調製し、抗マウスＣＤ１１ｃモノクローナル抗体で染色した。各棒はｍａｎパーセント陽性細胞染色±ＳＤ（１群あたりｎ＝１０）を示す。実際の陽性細胞染色（背景減算）は棒の上に示している。アスタリスクは、一方向ＡＮＯＶＡを用いて、ＨＢＳＳまたはＡｒ２０‐１０６１と比較してｐ＜０．００１を示した。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
別途定義する場合を除き、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に引用される特許および文献はすべて、参照により援用される。
【００１９】
過去数十年の間、がん治療ワクチンはさまざまな組み合わせや手法で開発されてきたが、それほど大きな臨床的成功には至っていない。ヒト免疫系の自然免疫および適応免疫は極めて複雑なシステムであり、うまく利用してがんと闘うには至っていない。一説には、がんは通常人生の後期に発生するため、がんに対抗する免疫反応の進行は、進化の過程において適者生存の理論にとっては必須ではないとされる。恐らく、ヒト免疫系のさまざまな側面が、特にそれを目的として設計されていないのであろう。
【００２０】
本発明は、完全な生のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍・ウイルスワクチンシステムの調製、ならびに腫瘍治療および転移の免疫療法におけるその使用に関する。さらに、この完全な生のｉｎ ｖｉｖｏがんワクチンシステム（ＣＬＩＶＳ）は、特定のがん免疫療法効果を高めることができる。
【００２１】
原発腫瘍を広範に除去した後でも、手術時にすでに存在した微小転移の増殖に起因する転移の形成、または、完全に除去されていなかった、もしくは手術後に再付着した腫瘍細胞もしくは腫瘍幹細胞による新たな転移の形成を防ぐことがなおも問題となる。基本的に、後期がんでは、手術および／または放射線治療は肉眼的病変にしか対処できないが、大部分の患者は、がんが元の大きさに戻り、さらなる治療に適さなくなる。
【００２２】
ごく最近、ＦＤＡが、前立腺がんおよびメラノーマに対する２種類の免疫療法薬を承認した。１つめの薬剤、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ（プロベンジ）は、前立腺がん抗原とのＧＭ‐ＣＳＦ融合分子を利用し、後期がん患者の単核細胞または抗原提示細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで活性化して、患者の全生存期間を延長することができる。２つめの薬剤は抗ＣＴＬＡ‐４モノクローナル抗体で、メラノーマ患者において、Ｔエフェクター細胞産生における免疫チェックポイントモジュレーターシグナルに対する強い増強効果が示されている。腫瘍溶解性ウイルスＣＧ００７０も、連続する６週間の膀胱内投与を行った膀胱がん患者において、長期完全奏効を得ていることが示されている［Ｖ００４６治験総括報告書］。
【００２３】
本発明の目的は、腫瘍に対する患者の特異的免疫反応を選択的に誘発し、それにより、残存原発腫瘍に対する、または転移性病変における全身効果を可能にする、例えば抗ＣＴＬＡ‐４抗体による共刺激シグナル確認など、免疫チェックポイントモジュレーターを有する完全な腫瘍・ウイルス・ＩＣＭを、生きたまま（腫瘍とウイルスベクターの両方）ｉｎ ｖｉｖｏで（ワクチンが患者で作られる）ワクチンシステムを調製することである。
【００２４】
通常、がん患者における腫瘍特異的免疫Ｔリンパ球は、それらが存在するときでも、リンパ球の中で低い頻度でしか発生しない。理由としては、腫瘍抗原の抗原性および免疫原性が概して弱く、また、サイトカインやＴｒｅｇなどの制御性細胞によるサプレッサー活性の量が圧倒的であるということが考えられる。
【００２５】
現在、異なる特異的免疫原性成分を組み合わせることによって、免疫系の活性化が大きく改善されるかもしれないことがわかっている。ブースター特異的成分に対し非特異的成分を使用するというかつてのコンセプトは、自身の細胞に対して非常に特異的な免疫反応を起こす人体の能力が（たいていのがん細胞には、正常細胞と差が付くほど十分な免疫原性がない）生来限定的であるため、ほとんど成果がないことがわかっている。非特異的免疫成分から生じるそのような作用は、生じたとしても一時的である。
【００２６】
本発明は、これまでに組み合わせで試したことのない特異的免疫成分のネットワークを導入し、人体の自然で複雑な抑制活性を抑え、自身のがん細胞に対する特異的免疫療法効果をもたらす。
【００２７】
本発明の第１の特異的要素は、機械的方法および酵素的方法により切除腫瘍から単離した自己腫瘍細胞を用いることである。がん細胞は、特に転移部位では、細胞のさまざまなクローンの異種混合物であり、急速な複製と頻繁な変異が生じていることから、もっとも良いのは、これらの変化が起こるとき、または起こっている間にこれらの変化に適応できる特異成分を有することである。自己腫瘍細胞は、オリジナルの手術標本もしくは生検から、または後で転移性病変の除去物から調製することができる。このワクチンの利点の１つは、患者の反応および腫瘍標本の入手可能性に応じてこの成分を変えられることである。したがって、原発腫瘍段階で作られた腫瘍・ウイルスの生のｉｎ ｖｉｖｏがんワクチンシステム（ＣＬＩＶＳ）は、後で転移部位の腫瘍細胞を用いて作られたものと異なる可能性がある。最終目的は、当然ながら、支配的な腫瘍の種類に応じて免疫療法反応を適応させることであり、これは経路標的治療またはモノクローナル抗体特異的治療の最近の動きでは見られない利点である。
【００２８】
第２の特異的要素は、生の複製可能ながん特異的腫瘍溶解性ウイルスベクターである。そのような例の１つがＣＧ００７０であり、ＣＧ００７０は、転写タンパク質のがん特異的Ｅ２Ｆ群を用いるＥ１Ａ初期ウイルス遺伝子のプロモーターを有する。最近の試験で示されたように、Ｅ２Ｆタンパク質は大部分のがん細胞および前駆細胞において活性であり、Ｒｂ経路欠損とのみ関連していない。この成分は、これまでの他の腫瘍・ウイルスワクチンとは異なる。これまでのがんワクチンはすべて、非特異的、すなわち正常細胞の溶解を引き起こすか、または照射せずに生のウイルスワクチンシステムとして投与されることはない。
【００２９】
本腫瘍・ウイルスの生のｉｎ ｖｉｖｏワクチンシステムの第３の特異的要素は、腫瘍溶解性ウイルスがＧＭ‐ＣＳＦを産生できることである。ＧＭ‐ＣＳＦは、樹枝状細胞とその他の抗原提示細胞を成熟させ、両方を採取した後に腫瘍因子をＣＤ４細胞に対して交差提示できるようにする重要なサイトカインである。たとえ抗原提示細胞が非特異的免疫活性に関与していても、免疫原性の腫瘍抗原が十分に存在する場合には、ｉｎ ｓｉｔｕで適当かつ十分な量のＧＭ‐ＣＳＦを利用することにより、免疫反応の方向がより特異的に、つまり、Ｔｈ１およびＴｈ１７経路に向かう。これまでの腫瘍・ウイルスまたは腫瘍・感染症薬でＧＭ‐ＣＳＦトランスジェニック発現に基づいているものはほとんどなく、あったとしても、ワクチンはウイルスの複製可能な形態で送達されなかった。
【００３０】
本腫瘍・ウイルスの生のｉｎ ｖｉｖｏがんワクチンシステムの第４の、かつもっとも違いのある要素は、ワクチンの産生が、例えば抗ＣＴＬＡ‐４抗体による共刺激シグナル確認の使用など、免疫チェックポイントモジュレーターとともにｉｎ ｖｉｖｏで生じることである。そのため、本発明は、すでに製造されている、またはｉｎ ｖｉｔｒｏに定められているワクチンではなく、完全なワクチンシステムと名付けられている。これが、本ワクチンと、最近特許を取得した米国特許第５２７３７４５号明細書に記載される腫瘍・ウイルスワクチンとを区別している。同特許では、腫瘍・ウイルスワクチンはあらかじめ無血清培地で培養し、その後で再び照射してウイルスベクターが複製しないようにする必要がある。ウイルスが付着した腫瘍細胞のウイルス部分は、主にインターフェロンであるサイトカインを誘発でき（同特許に記載）、本免疫療法アプローチにおける非特異成分であり得るようなアジュバントと事実上見なされる。本発明の腫瘍・ウイルス・ＩＣＭシステムでは、ウイルスベクターは、がん細胞またはＲｂ欠損経路細胞のみに限定的かつ特異的ではあるものの、複製可能であり、また、この複製過程は、これまでに記述されていない生のｉｎ ｖｉｖｏシステムを誘発する。もっとも際立った特徴は、腫瘍溶解がｉｎ ｖｉｖｏで生じているときに、これらの成分（腫瘍および生ウイルス）の相互作用によりワクチンが形成され、これにより、特定の腫瘍反応の刺激に不可欠な腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原などの直接がん細胞死タンパク質の安定かつ十分な供給が可能になることである。最近の試験では、これらのがん抗原が重要であるだけでなく、がん細胞死によって放出されるタンパク質が、適切なサイトカイン環境またはケモカイン環境とともに、これを、ここでは上述のＧＭ‐ＣＳＦにより刺激された抗原提示細胞、主に樹枝状細胞にとって理想的な状態にし、成果のある持続的な特異的腫瘍反応を刺激することがわかっている。これらの事象のリアルタイム発生と、抗ＣＴＬＡ抗体による共刺激シグナル確認を有する免疫チェックポイントモジュレーターにより、この新たな発明における成功の可能性が高まるとみられる。
【００３１】
この完全な生のｉｎ ｖｉｖｏがんワクチンシステム、すなわちＣＬＩＶＳは、ＧＭ‐ＣＳＦ発現を伴う腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍内投与ととも明らかに異なる。腫瘍内経路による腫瘍溶解性ウイルスの送達は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ環境での腫瘍細胞の調製が不要であるという利点があるものの、ウイルスベクターの過剰で制御不可能な漏出といった明らかに不利な点もある。そのため、そうした損失を補うためにウイルスベクターの投与量を増やす必要があるものの、それでも、その投与量で腫瘍細胞に関連する感染率の理想的な多重度に達し得るという保証がない。また、曝露不足や予測不可能な受容体、または腫瘍細胞とウイルスベクターとの付着相互作用、腫瘍血液供給の阻害、多くの内臓腫瘍への到達の難しさ、注入中に生きた腫瘍細胞が体の他の部分に広がる可能性もあるだろう。既存の腫瘍が、サプレッサー細胞活性を高め、そうした治療にとって不利な環境を増していることも予測される。また、手順に特有の乱雑さや予測不可能な性質があるため、有効量を計算すること、または腫瘍内投与に、抗ＣＴＬＡ‐４抗体といった他の効果的かつ補助的な免疫療法薬を加えることも難しい。さらに、免疫療法が、再発を防ぐことにより予測可能な最高の有効性を有するようなアジュバント療法には、複製可能な腫瘍溶解性ウイルス治療の腫瘍内投与は適用できない。
【００３２】
最近の試験で示されるように、ＩＬ６およびＴＧＦβは、多数の実験動物モデルにおいて自己免疫過程の進展に主に関与している。この過程に関連するＴｈ１７経路ならびにＣＤ４細胞の活性化および増殖は、成熟抗原提示細胞の利用可能性と合わせて、免疫原性抗原が十分に存在することにより促される。我々の以前の試験［Ｖ００４６］において、腫瘍反応に関連する重要なサイトカインの１つがＩＬ６である（結果は示さず）。この新規ＣＬＩＶＳアプローチでは、ＧＭ‐ＣＳＦを発現するがん特異的腫瘍溶解性ウイルスベクター（例えばＣＧ００７０）は、仮説上は、純粋な免疫原性効果に関与し、アポトーシス性の腫瘍細胞、その関連抗原または特異的抗原、および成熟抗原提示細胞が存在すれば、ＧＭ‐ＣＳＦのその場での発現により、主にＴｈ１から主にＴｈ１７へのヘルパーＴ細胞の経路転換を可能にする。腫瘍細胞はすでに照射されており増殖できないため、腫瘍溶解効果は意味がないことから、すべての腫瘍溶解性ウイルスベクターがその免疫原性効果のためにのみ利用されるというのは初めてとなる。ＣＧ００７０の免疫原性効果の利用も新規であり、それは、この効果が、Ｔヘルパー細胞経路のＴｈ１からＴｈ１７への転換であり、先天的細胞致死のためのサイトカイン炎症反応を誘発するといった、事実上アジュバント抗原および腫瘍細胞抗原の産生を意味する、通常予測されるウイルス免疫学的効果ではないと仮定されるからである。実際に、そしてまさに、腫瘍溶解性ウイルスベクターの使い方の通常の理論とは対照的に、上記のＴヘルパー経路転換に用いられるウイルスベクターに対する中和抗体を作り出すことは、それにより免疫系が、Ｔｈ１７サイトカインを誘発する必要性、ならびに自己免疫がん治療に必要なＴエフェクター細胞および／または抗体の産生に集中することになるため、患者にとって有益である。
【００３３】
要約すると、本発明の生のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍特異的がんワクチンシステムの新規性は、以下の事実に基づく。
【００３４】
第一に、腫瘍成分とウイルス成分とが、患者に投与される瞬間まで完全に分離している。治療前にある程度の時間をかけてこれらの成分を事前培養または混合する必要がない。腫瘍細胞とウイルスベクターとから成るこれまでのがんワクチンはすべて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ操作が必要であった。
【００３５】
ウイルス成分は、がん特異的かつ複製可能である。
【００３６】
ＧＭ‐ＣＳＦのトランスジェニック発現は、戦略的に腫瘍溶解部で生じている。
【００３７】
ワクチンは、患者の体内において生きたままｉｎ ｖｉｖｏで生成されることで、ＧＭ‐ＣＳＦに刺激され成熟した抗原提示細胞または樹枝状細胞によって採取され交差提示されるべき、がん細胞死の間に必要な細胞成分、サイトカイン、ケモカイン、および抗原成分すべて、ならび抗ＣＴＬＡ‐４抗体による免疫チェックポイントモジュレーター信号確認を捕捉する。
【００３８】
多くのがん患者に対して提案されている完全な生のｉｎ ｖｉｖｏがんワクチンシステムにおいて腫瘍・ウイルス・ＩＣＭ相互作用を容易にかつ確実にもたらすことも、ウイルスベクターの腫瘍内投与の設定と大きく異なる。
【００３９】
ＣＬＩＶＳアプローチの投与も、がんワクチンを、その成分の一部または全部とともに、週に１回超のペースで同一の、または異なる注入部位に複数回投与できるのが初めてとなることから、新規である。ＣＬＩＶＳシステムの通常の投与スケジュールは、１サイクルとして週に１回ワクチン成分の全部または一部を皮内注射または皮下注射し、その後、１コースとして同じサイクルを２から３週間ごとに４から６サイクル繰り返すことになるとみられる。がん特異的免疫反応をさらに増強および持続させるために、１サイクルとして週に２回以上ＣＬＩＶＳシステムを投与してもよく、および／または、各サイクルの間に、同一の、もしくは異なる身体部位へのワクチンの注入を併用してもよい。その後、この週サイクルごとの「二段階」または２回投与を、治療の完全なコースとして２から３週間ごとに合計４から６サイクル繰り返すことになる。
【００４０】
最後に、システムの新規性のさらに別の実施態様、すなわちシステムを実施する理由と方法は、使用するがん特異的腫瘍溶解性ウイルスが、純粋に免疫原性因子として作用するためのものである（開発中の大半のもののようにその腫瘍溶解効果のためではない）という理論に基づいている。その免疫原性因子効果は、これまでのようにアジュバントまたは腫瘍抗原の産生ではなく、Ｔヘルパー細胞の種類の転換を目的としている点で新規である。
【００４１】
方法：
腫瘍細胞：
腫瘍細胞の調製：
通常の手術標本について、腫瘍の一片を病理学的分類のために除去し、次いで、主な腫瘍細胞塊をゲンタマイシン含有ＨＢＳＳの入った管に入れ、８℃で保管する。約８から１２時間以内に新鮮な腫瘍試料を検査室に運び、そこでさらに解離する。腫瘍試料を小さな切片、通常は１ｃｍ３にメスで切断する。次いで、この切片を酵素溶液中で３７℃で培養する。通常の酵素溶液でもっとも有効なのは、コラゲナーゼと、デオキシリボヌクレアーゼと、ヒアルロニダーゼとの混合である。培養後、得られた懸濁液を、目開きが４０μｍのナイロンメッシュでろ過する。これらの手順を、腫瘍標本の主な画分がすべて分解されるまで繰り返す。得られた細胞懸濁液をＨＢＳＳで３回洗浄して、低温保存の準備が完了する。
【００４２】
腫瘍細胞の低温保存と解凍：
このように単離した腫瘍細胞を、次いで１０％ヒト血清アルブミンおよび１０％ＤＭＳＯ内で凍らせ、１０７個の細胞のアリコートで液体窒素中で保存する。細胞の冷凍は、冷凍コンピューターＫｒｙｏ１０シリーズＩＩ（Ｍｅｓｓｅｒ‐Ｇｒｉｅｓｈｅｉｍ）で実施できる。計画ワクチン接種の日に、１０％ヒト血清アルブミンを加えた温かい媒体中で細胞を慎重に解凍し、次いで、この媒体で３回洗浄する。
【００４３】
腫瘍細胞の不活性化：
投与前に、コバルト遠隔照射源を用いて腫瘍細胞の増殖能を２００Ｇｙで不活性化する。
【００４４】
ウイルスベクター：
ＧＭ‐ＣＳＦのトランスジェニック発現を伴う腫瘍溶解およびがん特異的ウイルスベクターの調製：
がん特異的かつ条件付きで複製可能なウイルスベクターは数多くあるが、通常はプロモーターベース、弱毒化操作ベース、または遺伝子操作ベースのいずれかに分類される。ここに挙げる例は、プロモーターベースのＣＧ００７０、すなわち、Ｅ１Ａ遺伝子にＥ２Ｆプロモーターを有し、Ｅ３遺伝子にＧＭ‐ＣＳＦ発現を有するアデノウイルス血清型５型である。
【００４５】
１．物理的、科学的、薬剤学的性質および構造
１．１ ＣＧ００７０
ＣＧ００７０は、選択的にＲｂ経路欠損がん細胞内で複製し、これを死滅させるよう設計された、条件付きで複製する腫瘍溶解アデノウイルス（血清型５）である。すべてのがんの約８５％でこの経路が突然変異している。図１に腫瘍溶解アデノウイルスベクターＣＧ００７０のゲノム構造を概略的に示す。下流のすべての遺伝子産物に腫瘍特異性をもたらすヒトＥ２Ｆ‐１プロモーターが、ヒトＡｄ５主鎖において内因性Ｅ１Ａプロモーターの代わりにクローニングされている。Ｅ１Ａ発現を活性化する転写のリードスルーから守るために、ポリアデニル化信号（ＰＡ）をＥ２Ｆ‐１プロモーターの５'に挿入した。ＣＧ００７０は、１９ｋＤコード領域を除いて野生型Ｅ３領域全体を含む。腫瘍溶解アデノウイルスベクターをＥ３含有とＥ３欠損とで直接比較すると、腫瘍の広がりと有効性においてＥ３含有ベクターの優位性が示された。１９ｋＤ遺伝子の代わりに、ＣＧ００７０は、Ｅ３プロモーター（Ｅ３Ｐ）の制御下でヒトＧＭ‐ＣＳＦのｃＤＮＡを保持する。Ｅ２、Ｅ４、後期タンパク質領域および逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含むウイルスベクター主鎖の残りの部分は、野生型Ａｄ５ゲノムと同一である。
【００４６】
アデノウイルス初期Ｅ１Ａ遺伝子の産物は、アデノウイルスゲノムの他の領域の効率的な発現に必須である。ＣＧ００７０は、ヒトＥ２Ｆ‐１プロモーターの制御下でＥ１Ａ遺伝子を発現するよう操作されているのに対し、ＧＭ‐ＣＳＦの発現は、内因性ウイルスＥ３プロモーターによって制御される。一方、Ｅ３プロモーターはＥ１Ａによって活性化されるため、ウイルス複製とＧＭ‐ＣＳＦ発現の両方が、最終的にＥ２Ｆ‐１プロモーターの制御下にある。その腫瘍選択的Ｅ２Ｆ‐１プロモーターにより、ＣＧ００７０はＲｂ経路欠損を有する腫瘍細胞内で複製し、選択的にこれを死滅させるよう設計されている。
【００４７】
感染細胞はＧＭ‐ＣＳＦを産生する。ＧＭ‐ＣＳＦは、感染していない遠位の局所的な腫瘍病巣に対する免疫反応を刺激することが期待されている。
【００４８】
１．２ Ｃｏｌｄ Ｇｅｎｅｓｙｓ，Ｉｎｃ．によるＣＧ００７０の臨床での産生
ＣＧ００７０は、ＨｅＬａ‐Ｓ３細胞内で作られ、界面活性剤溶解により感染ＨｅＬａ‐Ｓ３細胞から放出される。ＣＧ００７０は、クロマトグラフィーによって溶解物から精製し、次いで、５％スクロース、１０ｍＭのＴｒｉｓ、０．０５％ポリソルベート８０、１％グリシン、１ｍＭの塩化マグネシウム（ｐＨ７．８）で調剤する。
【００４９】
ＣＧ００７０は、わずかに乳白色の無菌の冷凍液として共栓ガラスバイアルで供給される。１ｍＬあたりの粒子濃度（ｖｐ／ｍＬ）は、ＣＧ００７０のロットごとに分析証明書に記載する。
【００５０】
２．非臨床薬理学と中毒学：
２．１ 試験計画の理論的根拠
ＣＧ００７０はＲｂ経路欠損がん細胞内で複製し、選択的にこれを死滅させるよう設計された、条件付きで複製する腫瘍溶解アデノウイルスである。すべてのがんの約６０％で、腫瘍サプレッサーＲｂの遺伝子またはその調節経路の要素の１つが突然変異している。ＣＧ００７０は、長期的な抗腫瘍免疫を発生させる重要なサイトカインであるヒトＧＭ‐ＣＳＦのｃＤＮＡを保持する点で、追加的な潜在的抗腫瘍活性を有する。したがって、ＣＧ００７０は、２つのメカニズム：複製ベクターとしての直接細胞毒性と宿主の免疫反応の誘導とによって腫瘍を攻撃する可能性を有する、選択的に複製する腫瘍溶解ベクターである。以下のセクションに、ＣＧ００７０の腫瘍選択性および抗腫瘍活性ならびに安全性の特徴を明らかにするために実施したｉｎ ｖｉｔｒｏ試験とｉｎ ｖｉｖｏ試験について要約する。
【００５１】
２．２ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ腫瘍選択性と細胞毒性
一連の試験をｉｎ ｖｉｔｒｏで実施し、選択的遺伝子発現、細胞毒性を含む、正常細胞および腫瘍細胞におけるＣＧ００７０の選択性の特徴を明らかにし、Ｒｂ経路欠損細胞におけるウイルス複製について以下に要約する。
【００５２】
２．２．１ Ｅ１ＡおよびＧＭ‐ＣＳＦのＲｂ依存性発現
対応する細胞株、Ｗｉ３８とＷｉ３８‐ＶＡ１３を、Ｅ１ＡおよびＧＭ‐ＣＳＦの発現から明らかなように、ＣＧ００７０複製を支持する能力について比較した。Ｗｉ３８‐ＶＡ１３は、構成的ＳＶ４０ラージＴ抗原発現に起因するＲｂ経路脱調節細胞株である。以前に公表されたデータから、Ｅ２Ｆ‐１発現がＷｉ３８‐ＶＡ１３においてアップレギュレートされることが確認されている（Ｊａｋｕｂｃｚａｋ ｅｔ ａｌ．，２００３）。親Ｗｉ３８細胞株は、正常なヒト２倍体線維芽細胞細胞株であり、Ｒｂ経路が欠損していない（例えばＲｂ野生型）。図２．２．１．１の説明で述べたように、培養細胞を感染させ、接種４時間後に、定量的ＲＴ‐ＰＣＲ（ｑＲＴ‐ＰＣＲ）でＥ１Ａ発現を測定した。データは、ヘキソンｑＰＣＲで測定したＡｄゲノムコピー数について正規化した。Ｒｂ経路欠損Ｗｉ３８‐ＶＡ１３細胞におけるＥ１Ａ ｍＲＮＡのレベルは、正常Ｗｉ３８細胞と比べて有意に高かった（図２．２．１．１）。ＧＭ‐ＣＳＦ産生の欠損Ｒｂ経路への依存も示され、ＣＧ００７０のヒトＥ２Ｆ‐１プロモーターは、Ｒｂ経路欠損細胞において、アデノウイルスＥ１Ａ遺伝子転写および下流のＥ３プロモーターによって調節されたｈＧＭ‐ＣＳＦ発現を選択的に調節できるという証拠となった。
【００５３】
２．２．２ Ｒｂ経路欠損腫瘍細胞におけるＣＧ００７０の選択的産生と細胞毒性
Ｒｂ経路機能が正常または欠損している細胞におけるビリオン産生を測定することで、ＣＧ００７０複製の選択性および細胞毒性のさらなる証拠が示される。産生されるウイルスの量は、感染させる特定の細胞型の能力を含め多くのプロセスを反映することで、ウイルスプロモーターを転写活性化し、ウイルスの複製を可能にする。またそれにより、標的アデノウイルスの選択性の十分な指標を提供する。ＣＧ００７０は、Ｒｂ経路欠損ヒト膀胱ＴＣＣ細胞株ＲＴ‐４、ＳＷ７８０、ＵＣ‐１４、および２５３Ｊ Ｂ‐Ｖにおいて野生型アデノウイルスと同じくらい効果的に複製し、同様レベルの子孫ウイルスを産生した（図２．２．２．１）。しかしながら、正常Ｒｂ経路細胞ではＣＧ００７０の複製は非効率的であった。
【００５４】
ＣＧ００７０の細胞毒性も欠損Ｒｂ経路に依存する。ヒトＲｂ経路欠損腫瘍および正常（非腫瘍）細胞のパネルをＣＧ００７０に感染させた。定量的ＭＴＳ細胞毒性アッセイに基づいて、ＣＧ００７０はＲｂ経路欠損腫瘍細胞において選択的に細胞毒性を示し（表２．２．２．１）、Ｒｂ経路欠損腫瘍細胞のＥＣ５０値は、初代細胞におけるよりも常に低かった。
【００５５】
ヒト腫瘍細胞株および初代細胞におけるＣＧ００７０および野生型Ａｄ５のＭＴＳアッセイによる細胞毒性。ＥＣ５０値（細胞生存において５０％減少になるｖｐ／細胞）を、Ｓ字状の用量反応曲線適合を用いる線形回帰分析によって計算した。低いＥＣ５０値は、細胞毒性薬が強いことを示す。各細胞型の複製数は丸括弧内に記載している。データは複製の平均±標準偏差を示す。
【００５６】
【表２．２．２．１】
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【００５７】
２．２．３ 生物活性ＧＭ‐ＣＳＦの産生
ＣＧ００７０に感染させた後の生物活性ＧＭ‐ＣＳＦの産生は、Ｒｂ経路欠損腫瘍細胞では同様に選択的である（表２．２．３．１）。さまざまな感染多重度（ＭＯＩ、ｖｐ／細胞）でＣＧ００７０に感染させたヒト膀胱ＴＣＣ ２５３Ｊ Ｂ‐Ｖ、ＳＷ７８０、ＲＴ４およびＵＣ１４細胞に由来する上清におけるＧＭ‐ＣＳＦのレベルおよび活性を、それぞれＥＬＩＳＡおよびＧＭ‐ＣＳＦ依存ＴＦ‐１赤白血病細胞株を用いた細胞増殖アッセイにより測定した。１００ｖｐ／細胞以上のＭＯＩで、生物活性ＧＭ‐ＣＳＦの産生が、すべての細胞株で４０ｎｇ／ｍＬ／１０６細胞／２４時間、すなわちＤｒａｎｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．のレベルを超えた。［Ｄｒａｎｏｆｆ］は、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍ワクチンモデルにおいて強力で長く続く抗腫瘍免疫を十分に誘発すると報告されている。したがって、ＣＧ００７０は、治療的であると予想される量でＧＭ‐ＣＳＦを産生する可能性がある。
【００５８】
ＣＧ００７０感染膀胱ＴＣＣ細胞における生物活性ＧＭ‐ＣＳＦの産生。ヒト膀胱ＴＣＣ細胞株の二重ウェルを、支持した粒子／細胞の割合で２４時間感染させた。細胞上清を採取し、総ＧＭ‐ＣＳＦタンパク質についてＥＬＩＳＡ（２連）で、ＧＭ‐ＣＳＦ活性については増殖バイオアッセイを３連で用いてＴＦ‐１赤白血病細胞で試験した。ＥＬＩＳＡデータは複製ウェルの平均±標準偏差を示す。
【００５９】
【表２．２．３．１】
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【００６０】
２．２．４ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の概要
ＣＧ００７０は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、膀胱ＴＣＣを含むさまざまな溶解ヒト腫瘍細胞で効果的に複製し、非腫瘍細胞と比べて腫瘍細胞で際立った選択性を有する。生物活性ＧＭ‐ＣＳＦの産生は、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍モデルで抗腫瘍防御免疫を刺激することが知られているレベルで、用量依存的に誘発された。
【００６１】
２．３ 動物モデルにおけるＣＧ００７０の抗腫瘍活性
ウイルスはヒト細胞で複製するため、ＣＧ００７０のような腫瘍溶解ベクターの抗腫瘍効果は、ヒト腫瘍異種移植片を用いてマウスモデルで評価し、腫瘍増殖に対するウイルスの抑制作用を判断することができる。これらの動物において腫瘍増殖を阻止する主なメカニズムは、ウイルスの腫瘍溶解効果、および腫瘍に対する自然免疫系の直接細胞毒性（ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球など）である。これらのモデルの制限として、マウス組織においてアデノウイルスを複製できないため、マウスにおけるウイルスの複製効果の評価が制限され、また、免疫系のＴ細胞アームとＢ細胞アームもないため、腫瘍特異的Ｔ細胞免疫の誘導の評価が制限される。ＣＧ００７０のウイルス複製および抗腫瘍活性を、マウスの同所性膀胱がんモデルを含む、さまざまな異なる腫瘍異種移植モデルに単回または反復腫瘍内投与後に評価した。ＣＧ００７０に感染させることができ、かつ低レベルの子孫アデノウイルス粒子を生成できる免疫応答性マウス腫瘍モデルにおけるＣＧ００７０の抗腫瘍効果の評価についても以下に説明する。
【００６２】
ＣＧ００７０の抗腫瘍活性を、ＮＣＲヌードマウスの膀胱ＴＣＣ２５３Ｊ Ｂ‐Ｖ異種移植片腫瘍皮下移植モデルで評価した。ＣＧ００７０はマウスでは不活性なヒトＧＭ‐ＣＳＦを発現するため、本試験では、（いかなる状況においても免疫不全マウスでは容易に測定できない）免疫系のＧＭ‐ＣＳＦ関連刺激の効果でなく、ウイルス自体の細胞毒性抗腫瘍効果のみを効果的に測定した。ＣＧ００７０（１回の投与あたり３×１０８、３×１０９もしくは３×１０１０ｖｐ／投与）または生理食塩水を、雌マウスの皮下２５３Ｊ Ｂ‐Ｖ膀胱腫瘍異種移植片の腫瘍内に投与した（１群あたりｎ＝１０）。腫瘍の大きさが約１２５ｍｍ３に達したら投与を開始し、各マウスにおよそ１日おきのスケジュールで腫瘍内投与を５回行った。腫瘍容積は週に２回測定した。生理食塩水を投与した腫瘍と比べて、全投与量で抗腫瘍活性を観察した（図２の下側、ｐ＜０．００１）。ＳＤ ６０までに、生理食塩水を投与した腫瘍は大きさがほぼ１６倍に増大したのに対し、３×１０１０ｖｐ／投与でＣＧ００７０を投与した腫瘍の増殖は完全に抑制された。低用量群および中用量群の腫瘍の大きさも、ＳＤ ６０までに約３．５から４倍の増大と、生理食塩水を投与した群よりも有意に小さいままであった。
【００６３】
ＣＧ００７０の抗腫瘍活性も、ヌードマウスの同所性膀胱腫瘍モデルで調べた。膀胱がんの同所性動物モデルは、ヒトのそれらの腫瘍の部位と動態とに近似していると予想される。生きている動物における腫瘍増殖を可視化するために、構造的にルシフェラーゼを発現するヒト膀胱ＴＣＣ細胞株ＳＷ７８０‐ｌｕｃをモデル作成に用いた。ＳＷ７８０‐ｌｕｃ細胞をヌードマウスの膀胱内に注入し、形成された同所性腫瘍を、ルシフェリンの腹腔内注入後の発光画像によってｉｎ ｖｉｖｏで可視化し、腫瘍増殖をｉｎ ｓｉｔｕで観察した。ヒト抗サイトケラチン染色を行った同所性腫瘍のある膀胱の免疫組織化学的（ＩＨＣ）分析で、ヒト由来の腫瘍であることを確認した。組織学的に、ＳＷ７８０‐ｌｕｃ同所性腫瘍はヒトの表在性膀胱腫瘍に酷似しており［Ｒａｍｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００４ａ］、このモデルが臨床状況に近似する能力を確認した。以前の試験では、アデノウイルスの膀胱上皮への感染性を高めるためにＤＤＭで前処理する必要性が示されている［Ｒａｍｅｓｈ ｅｔ ａｌ．，２００４ｂ］（下記参照）。同様のＤＤＭ前処理計画が、アデノウイルスによる同所性腫瘍の効果的な形質導入に不可欠であることがわかっている。
【００６４】
有効性試験では、同所性ＳＷ７８０‐ｌｕｃ膀胱腫瘍を有する雌ＮＣＲヌードマウスに、３週連続で週に１回または２回、ＣＧ００７０（投与量５０μＬで３×１０１０ｖｐ／投与）を膀胱内に６回投与した。腫瘍細胞を注入した９日後、平均生物発光が光子数約３から８×１０６のときに治療を開始した；各ウイルス治療の前に、膀胱をＤＤＭで前処理した。Ｉｎ ｓｉｔｕでの膀胱画像（図２．３．２Ｃ）に基づくと、ＣＧ００７０治療群（週２回投与）の８匹のうち５匹は、治療開始後ＳＤ ３２までに腫瘍がなくなった。１匹は腫瘍が縮小し（光子数が１．４５×１０６から５．７１×１０５に減少）、１匹は不変で、１匹は全身腫瘍組織量が多いため安楽死させた。もう１つのＣＧ００７０治療群（週１回投与）では、ｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍画像から、９匹のうち４匹は、治療開始後ＳＤ ４２までに腫瘍がなくなった（図２．３．２Ｂ）。１匹は腫瘍が拡大し、３匹は全身腫瘍組織量が多いため安楽死させ、１匹は、先の画像データに記録されるように、恐らく腫瘍が大きいためケージ内で死んだ。これに対し、生理食塩水治療群（ｎ＝８）では、腫瘍が成長しなかった１匹を除いて、ベースラインと比べてすべての腫瘍が拡大した（図２．３．２Ａ）。Ｉｎ ｓｉｔｕ画像から腫瘍がないと判断されたＣＧ００７０治療マウス（週２回投与群で５／８、週１回投与群で４／９）において、膀胱の免疫組織化学的評価から腫瘍細胞が完全にないことが確認された。
【００６５】
アデノウイルスはマウスでは十分に複製しないため、複製アデノウイルスに感染させたマウス腫瘍モデルの細胞により発現されるＧＭ‐ＣＳＦの免疫増強効果の評価には制限がある。したがって、複製欠損アデノウイルスと複製選択的アデノウイルスとの抗腫瘍活性の差異、およびアデノウイルス複製に依存するＧＭ‐ＣＳＦ産生による免疫系刺激の可能性の実証は限定的である。免疫応答性マウスモデルは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＣＭＴ‐６４マウス肺腫瘍細胞株を用いて作成し、この短所をある程度回避した。この細胞株では、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、Ａｒ２０‐１００４（ＣＧ００７０と同一だが、マウスのＧＭ‐ＣＳＦをコードする）および野生型Ａｄ５の低いながらも測定可能な程度の複製が生じる。
【００６６】
皮下ＣＭＴ‐６４腫瘍をＣ５７ＢＬ／６マウスおよび対照の側腹部に作成し、試験ウイルスは、Ａｒ２０‐１００４、ＣＧ００７０または生理食塩水を５×１０１０から２×１０１０ｖｐの投与量で腫瘍内に３回または４回投与した。Ａｒ２０‐１００４またはＣＧ００７０を伴う腫瘍の腫瘍内投与後、血清および腫瘍において測定可能レベルのＧＭ‐ＣＳＦが認められた（図２．３．３）。高用量で、Ａｒ２０‐１００４は、ヒトＧＭ‐ＣＳＦを発現するＣＧ００７０と比べて抗腫瘍効果がより大きい傾向を示した（図２．３．４）。
【００６７】
免疫反応の増強におけるＧＭ‐ＣＳＦの効果は、図２．３．５に示すように、第２の試験でも明らかだった。抗原提示細胞は、マウスのＧＭ‐ＣＳＦ発現ウイルスＡｒ２０‐１００４投与後に、腫瘍を排出する所属リンパ節に多くみられた。フローサイトメトリ解析から、Ａｒ２０‐１００４と同一であるがＧＭ‐ＣＳＦをコードしないＡｒ２０‐１０６１と比べて、Ａｒ２０‐１００４投与マウスの腫瘍でＣＤ１１ｃ＋樹枝状細胞およびマクロファージの増加が示された。
【００６８】
要約すると、同所性膀胱ＴＣＣモデルを含む、皮下マウス異種移植片腫瘍モデルにおける試験では、ＣＧ００７０のウイルス複製、アデノウイルス細胞毒性および抗腫瘍効果が示された。免疫応答性マウスのＣＭＴ‐６４腫瘍モデルにＡｒ２０‐１００４（ＣＧ００７０と同一だがマウスのＧＭ‐ＣＳＦをコードする）を投与した試験では、Ａｒ２０‐１００４は腫瘍抑制を増強し、腫瘍所属リンパ節のＣＤ１１ｃ＋細胞を増加させる傾向を示し、予想どおりＧＭ‐ＣＳＦが免疫系を刺激していたことが示された。
【００６９】
免疫チェックポイントモジュレーター：
１．抗ＣＴＬＡ‐４抗体：
免疫チェックポイント分子およびそのような分子を使う方法は、当技術分野で周知であり、説明されている。免疫チェックポイント分子の一例が抗ＣＴＬＡ‐４抗体である。抗ＣＴＬＡ‐４抗体の例に、イピリムマブ（米国特許第６，９８４，７２０、７，４５２，５３５、７，６０５，２３８、８，０１７，１１４および８，１４２，７７８号明細書参照）、トレメリムマブ（米国特許第６，６８，７３６、７，１０９，００３、７，１３２，２８１、７，４１１，０５７、７，８０７，７９７、７，８２４，６７９および８，１４３，３７９号明細書参照）ならびに単鎖抗体を含むその他の抗ＣＴＬＡ‐４抗体（例えば、米国特許第５，８１１，０９７、６０５１，２２７および７，２２９，６２８号明細書、ならびに米国特許出願公開第２０１１００４４９５３号明細書参照）がある。
【００７０】
抗ＣＴＬＡ‐４抗体の１つは現在臨床現場で使用でき、後期メラノーマ患者での使用がＦＤＡによって承認されている。完全な処方情報は、Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｅｙｅｒｓ）の添付文書にすべて記載されている。Ｙｅｒｖｏｙ（イピリムマブ）は５０ｍｇの使い捨てバイアルで提供されている。
【００７１】
投与量：推奨用量は、前臨床データに基づいて、３０μｇから５００μｇを約２ｍＬの腫瘍・ウイルスベクター溶液に混合する。正確な推奨用量は、今後の第１相試験で決定される予定である。
【００７２】
２．抗ＰＤ‐１：
もう１つの重要な免疫チェックポイントモジュレーターがＰＤ‐１である。ＰＤ‐１はＢ７‐４の受容体と定義されている。Ｂ７‐４は、免疫細胞上で抑制受容体と結合すると、免疫細胞活性化を抑制することができる。免疫細胞において、ＰＤ‐１、Ｂ７‐４、およびＢ７‐４とＰＤ‐１との抑制信号の相互作用を抑制的に調節する薬剤は、免疫反応の増強をもたらし、また、ＣＬＩＶＳで使用することができる。
【００７３】
特許番号：７１０１５５０
出願日：２００２年２月６日
発行日：２００６年９月５日
出願番号：１０／０６８，２１５
2015523412.tif 000005
【００７４】
2015523412.tif 000006
３．ＯＸ４０
ＯＸ４０ＬとＯＸ４０との相互作用は、最初の２日以上、Ｔ細胞増殖と免疫反応ならびに記憶を維持する。抗原でＴ細胞を刺激している間に、または刺激直後に、ＯＸ４０受容体結合剤、ＯＸ４０ＬまたはＯＸ４０アゴニストを用いて免疫反応の表面にＯＸ４０受容体を連結させることにより腫瘍抗原に対する免疫反応を増強する方法を、免疫チェックポイントモジュレーターとしてＣＬＩＶＳに用いることができる。
【００７５】
米国特許第６３１２７００号明細書およびその他の引用・参照特許を以下に示す：
2015523412.tif 000007
【００７６】
2015523412.tif 000008
2015523412.tif 000009
2015523412.tif 000010
４．ＬＡＧ‐３  
抗原特異的免疫反応を高めるためのＬＡＧ‐３（リンパ球活性化遺伝子‐３）の使用、またより一般的には、ワクチンのアジュバントとしてＭＨＣクラスＩＩリガンドまたはＭＨＣクラスＩＩ様リガンドの使用は、前臨床モデルにおいては成功している。ＬＡＧ‐３遺伝子産物に対する、またはこれを調節する抗体または薬剤は本発明に役立つ可能性がある。
【００７７】
ＬＡＧ‐３関連特許および特許請求の範囲の詳細については、米国特許第５７７３５７８号明細書、引用および参照特許を参照されたい。
【実施例１】
【００７８】
筋肉浸潤性膀胱がん：
ＣＧ００７０は膀胱がんに活性があることが示されているため、実施例として筋肉浸潤性膀胱がんを選んだ。さらに、筋肉浸潤性膀胱がん患者はすべて、膀胱切除を受ける必要があるため、本ワクチンシステムのために必要な腫瘍細胞を用意するのに良い腫瘍検体が得られる。加えて、筋肉浸潤性膀胱がん患者（Ｔ３から４）の予後は、ネオアジュバント化学療法の使用にもかかわらず、かなり厳しい。こうした患者の大部分は６０歳を超えており、化学療法の重篤な副作用にほとんど耐えられない。この患者集団における再発のリスクを最小限に抑えることのできる効果的な薬剤に対する需要は満たされていない。
【００７９】
腫瘍・ウイルス・ＩＣＭの生のｉｎ ｖｉｖｏがんワクチンシステム投与：
ワクチンシステムの成分として筋肉浸潤性膀胱腫瘍細胞を前述の方法に従って調製した後、解凍し、生存率を試験し、照射して、さらなる細胞増殖を不活性化する。最初のワクチン接種は手術の１０日後に行うのが適切である。ワクチン接種の直前に、１投与あたり約１ｍＬのアリコート中の１×１０７腫瘍細胞を、ＣＧ００７０（１から１．２ｍＬに１×１０９ウイルス粒子のバイアル）の１０×ウイルス粒子（ウイルス粒子：腫瘍細胞＝１０：１）と混合する。混合用のＣＧ００７０の約１０×ｖｐ用量は、まずＣＧ００７０のバイアルを正常生理食塩水１００ｍＬに、それから生理食塩水バッグから引き出した計算用量（１ｍＬ）に希釈して得る。投与用の完全混合物における最終ステップで、約１００μｇの抗ＣＴＬＡ‐４抗体（例えばイピリムマブ）を添加する。次いで、１週間間隔でワクチン接種を６回繰り返す。この後に、臨床試験の一般的な経過観察ガイドラインに従って、患者の（検査と組み合わせた）臨床再評価を行う。
【００８０】
治療経過中に、一般的な臨床データと合わせて治療中および治療後の患者の免疫状態の変化を測定する。比較値として、手術前後および免疫療法開始前の検査を用いる。診断と検査には、細胞性免疫反応と体液性免疫反応を含む。
【００８１】
適用に関して要約すると、手術後１週間以降、かつ手術後４週間以内に実施すべきということになる。がんワクチンシステムは、１週間間隔で少なくとも３回、好ましくは６回以上投与する必要がある。また、検査、すなわちＤＴＨ反応の確認のために、低用量（０．１ｍＬ中に約１０５個の腫瘍細胞）のウイルスベクターを含む照射腫瘍細胞を、初回の６週間治療の後に２から４週間投与する。
【００８２】
最良の結果が得られるのは、自己材料、すなわち、患者の腫瘍に由来する材料を用いるときである。別法として、自己腫瘍細胞が入手できないときには、第三者、または膀胱腫瘍細胞株に由来する同種腫瘍細胞を、がんワクチンシステムの自己部分に置き換えてもよい。
【００８３】
治療を持続する場合、すなわち、より長い間隔で、例えば３ヵ月ごとに投与し、数年にわたって持続する必要がある場合、同種異系材料を使用し、投与前にＣＧ００７０および抗ＣＴＬＡ‐４抗体と混合することが推奨される。
【００８４】
投与：
腫瘍細胞、腫瘍溶解性ウイルス（ＣＧ００７０）および抗ＣＴＬＡ‐４抗体の混合物である生のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍・ウイルスがんワクチンシステム約２ｍＬを、鼠径部などリンパ液の排出が良好な領域に皮下投与する。
【実施例２】
【００８５】
去勢抵抗性前立腺がん：
Ｒｂ経路欠損原発性前立腺がんは少ないが、去勢抵抗性前立腺がんの最大６０％が、そのような欠損経路を有している可能性がある。これらの結果は、異種移植モデルの形質転換試験によって確認されている。Ｒｂ経路欠損前立腺がんは化学療法に対する感受性が高めであるが、それでも、化学療法が失敗した場合、または患者が化学療法に適していない場合、これらの患者にはほとんど選択肢が残されていない。これらの患者の大部分が高齢であるため、この患者集団で疾患進行を遅らせることのできる毒性の少ない有効な薬剤に対する需要は満たされていない。
【００８６】
腫瘍・ウイルスの生のｉｎ ｖｉｖｏがんワクチンシステムの投与：
ワクチンシステムの成分として生検標本から採取した前立腺がん腫瘍細胞を前述の方法に従って調製した後、解凍し、生存率を試験し、照射して、さらなる細胞増殖を不活性化する。最初のワクチン接種は、化学療法に失敗した後ならいつでも適切である。ワクチン接種の直前に、１投与あたり約１ｍＬのアリコート中の１×１０７腫瘍細胞を、ＣＧ００７０（１から１．２ｍＬに１×１０９ウイルス粒子のバイアル）の１０×ウイルス粒子（ウイルス粒子：腫瘍細胞＝１０：１）と混合する。混合用のＣＧ００７０の約１０×ｖｐ用量は、まずＣＧ００７０のバイアルを正常生理食塩水１００ｍＬに、それから生理食塩水バッグから引き出した計算用量（１ｍＬ）に希釈して得る。投与用の完全混合物における最終ステップで、約１００μｇの抗ＣＴＬＡ‐４抗体（例えばイピリムマブ）を添加する。次いで、１週間間隔でワクチン接種を６回繰り返す。この後に、臨床試験の一般的な経過観察ガイドラインに従って、患者の（検査と組み合わせた）臨床再評価を行う。
【００８７】
治療経過中に、一般的な臨床データと合わせて治療中および治療後の患者の免疫状態の変化を測定する。比較値として、手術前後および免疫療法開始前の検査を用いる。診断と検査には、細胞性免疫反応と体液性免疫反応を含む。
【００８８】
がんワクチンシステムは、１週間間隔で少なくとも６から８回投与する必要がある。また、検査、すなわちＤＴＨ反応の確認のために、低用量（０．１ｍＬ中に約１０５個の腫瘍細胞）のウイルスベクターを含む照射腫瘍細胞を、初回の６週間治療の後に２から４週間投与する。
【００８９】
最良の結果が得られるのは、自己材料、すなわち、患者の腫瘍に由来する材料を用いるときである。別法として、自己腫瘍細胞が入手できないときには、第三者、またはＲｂ欠損経路を有する前立腺がん細胞株に由来する同種腫瘍細胞を、がんワクチンシステムの自己部分に置き換えてもよい。
【００９０】
治療を持続する場合、すなわち、より長い間隔で、例えば３ヵ月ごとに投与し、数年にわたって持続する必要がある場合、同種異系材料を使用し、投与前にＣＧ００７０および抗ＣＴＬＡ‐４抗体と混合することが推奨される。
【００９１】
投与：
腫瘍細胞、腫瘍溶解性ウイルス（ＣＧ００７０）および抗ＣＴＬＡ‐４抗体の混合物である生のｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍・ウイルスがんワクチンシステム約２ｍＬを、鼠径部などリンパ液の排出が良好な領域に皮下投与する。
【００９２】
均等物
当業者は、単なる日常の実験を用いて、本明細書に記載する特定の方法および試薬について、その代替手段、変化形、追加、削除、修正、代用を含め、数多くの均等物を理解または確認できるであろう。そのような均等物は、本発明の範囲内にあるとみなされ、以下の請求項に属する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００９３】
2015523412.tif 000011
【非特許文献】
【００９４】
【非特許文献１】Ｖ００４６治験総括報告書：２０１２年にＦＤＡに提出済み。ＩＮＤ１２１５４シリアル番号５２。報告書全体は、非仮特許出願の付録とされる予定である。
【非特許文献２】Ｄｒａｎｏｆｆ ｅｔ ａｌ：Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｒｒａｄｉａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ＧＭ‐ＣＳＦ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １９９３ ９０（８）３５３９‐３５４３
【非特許文献３】Ｒａｍｅｓｈ：ＣＧ００７０ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＧＭ‐ＣＳＦ：Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００６；１２；３０５‐５１３
【図１】
2015523412.tif 000012
【図２．２．１．１】
2015523412.tif 000013
【図２．２．２．１】
2015523412.tif 000014
【図２】
2015523412.tif 000015
【図２．３．２Ａ】
2015523412.tif 000016
【図２．３．２Ｂ】
2015523412.tif 000017
【図２．３．２Ｃ】
2015523412.tif 000018
【図２．３．３】
2015523412.tif 000019
【図２．３．４】
2015523412.tif 000020
【図２．３．５】
2015523412.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】平成27年2月23日(2015.2.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムであって：
ａ．照射により単離および不活性化された分離腫瘍細胞と
ｂ．ＧＭ‐ＣＳＦをコードする異種核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスおよびがん特異的ベクターと
ｃ．免疫チェックポイントモジュレーター（「ＩＣＭ」）と
の３種の成分のうち少なくとも２種を含む装置である腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムにおいて、
前記２種または３種の成分が、前培養を行わずに、患者に投与する直前に混合される、腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項２】
前記免疫チェックポイントモジュレーターが省略された、請求項１に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項３】
前記免疫チェックポイントジュレーターが抗ＣＴＬＡ‐４抗体である、請求項１に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項４】
前記抗ＣＴＬＡ‐４抗体が、イピリムマブと、トレメリムマブと、単鎖抗ＣＴＬＡ‐４抗体とから選択される、請求項１に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項５】
前記免疫チェックポイントジュレーターが、ＯＸ４０結合剤もしくはアゴニスト、またはＯＸ４０Ｌ分子である、請求項１に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項６】
前記免疫チェックポイントジュレーターが、ＰＤ１、ＴＩＭ３、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＬＡＧ‐３およびＫＩＲもしくはそのリガンドを標的とする、または調節する分子群もしくは抗体から選択される抗体もしくはモジュレーターである、請求項１に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項７】
前記免疫チェックポイントジュレーターが：抗ＣＴＬＡ‐４抗体；イピリムマブ、トレメリムマブ、および単鎖抗ＣＴＬＡ‐４抗体；ＯＸ４０結合剤もしくはアゴニスト、もしくはＯＸ４０Ｌ分子；またはＰＤ１、ＴＩＭ３、Ｂ７‐Ｈ３、Ｂ７‐Ｈ４、ＬＡＧ‐３およびＫＩＲもしくはそのリガンドを標的とする、もしくは調節する分子群もしくは抗体：の群から選択される抗ＣＴＬＡ‐４抗体の２つ以上の組み合わせである、請求項１に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項８】
前記ＧＭ‐ＣＳＦを発現する腫瘍溶解性がん特異的ウイルスベクターが、例えばＣＧ００７０などのアデノウイルス由来である、請求項１に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項９】
前記ＧＭ‐ＣＳＦを発現する腫瘍溶解性がん特異的ウイルスベクターが、例えば単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ムンプスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびレオウイルスなどの、アデノウイルス以外のウイルスから選択される、請求項１に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項１０】
腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムであって：
ａ．照射により単離および不活性化された分離腫瘍細胞と
ｂ．ＧＭ‐ＣＳＦをコードする異種核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスおよびがん特異的ベクターと
ｃ．免疫チェックポイントモジュレーター（「ＩＣＭ」）と
の３種の成分のうち３種全て、あるいは少なくとも２種を含むキットをさらに含む、
請求項１に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項１１】
腫瘍の解離および調製を行う材料および方法と、酵素および／またはウイルスベクター形質導入剤と、低温保存バイアルなどと、使用法とが記載された添付文書とを含む、腫瘍細胞調製キットをさらに含む、
請求項１に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項１２】
前記腫瘍特異的免疫療法ワクチンの患者への投与を含む、がん治療のための局所および／または全身の特異的免疫反応をさらに含む、
請求項１に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項１３】
前記がん細胞の起源が自己であることをさらに含む、請求項１２に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項１４】
前記がん細胞の起源が同種であることをさらに含む、請求項１２に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項１５】
前記がん細胞の起源が細胞培養システムであることをさらに含む、請求項１２に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項１６】
前記がん細胞が、ウイルス形質導入および／または免疫修飾に有益であり得る作用物質または受容体を分泌または発現するよう修正されており、その一例が、ＧＭ‐ＣＳＦを分泌するよう修正された自己または同種がん細胞であるＧＶＡＸであるがこれに限定されないことをさらに含む、請求項１２に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項１７】
前記がん細胞の起源が、請求項１３から１６に定めるがん細胞由来の２つ以上の組み合わせであり得ることをさらに含む、請求項１２に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【請求項１８】
前記腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステムを患者に皮下投与することをさらに含む、請求項１２に記載の腫瘍特異的免疫療法ワクチンシステム。
【国際調査報告】
2015523412.tif 000022
2015523412.tif 000023
2015523412.tif 000024