(57)【要約】  本発明は、その野生型に対して低下したｐｐＧｐｐアーゼ活性を有し且つ好ましくは必須アミノ酸、更に一層好ましくはセリン由来の必須アミノ酸、最も好ましくはメチオニン又はトリプトファンを過剰生産するように、その野生型に対して遺伝的に改変された細胞に関し、かかる細胞を含む試料添加剤に関し、必須アミノ酸、更に好ましくはセリン由来の必須アミノ酸、最も好ましくはメチオニン又はトリプトファンを過剰生産する細胞の製造方法であって、ｐｐＧｐｐアーゼをコードするノックアウト遺伝子を有する細胞の製造を含む、前記製造方法に関し、且つ必須アミノ酸、更に好ましくはセリン由来の必須アミノ酸、最も好ましくはメチオニン又はトリプトファンの製造方法であって、ａ）本発明の第１の態様による又はその実施態様のいずれかによる細胞を培養する工程、及びｂ）任意にアミノ酸を精製する工程を含む、前記製造方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
その野生型に対して低下したｐｐＧｐｐアーゼ活性を有し且つ好ましくは必須アミノ酸、更に好ましくはセリン由来の必須アミノ酸、最も好ましくはメチオニン又はトリプトファンを過剰生産するように、その野生型に対して遺伝的に改変された細胞。
【請求項２】
細胞がその野生型に対して実質的に変化していない（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンテターゼ活性を有する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記細胞が、アミノ酸配列の配列番号２、配列番号４及び配列番号６を含む群から選択される少なくとも１つのｐｐＧｐｐアーゼ、さらにはその変異体、好ましくは配列番号２又はその変異体の、その野生型に対して、低下した活性を有するように、その野生型に対して遺伝的に改変された、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
アミノ酸配列の配列番号２、配列番号４及び配列番号６、さらにはその変異体、好ましくは配列番号２又はその変異体を含む群からの少なくとも１つのｐｐＧｐｐアーゼの活性が、以下の改変：
ａ）Ｇｌｙ１７４又はそれと相同のアミノ酸は、異なるアミノ酸によって、好ましくは非保存的に置換された、
ｂ）Ｌｅｕ５２９又はそれと相同のアミノ酸は、異なるアミノ酸によって、好ましくは非保存的に置換された、
ｃ）少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは少なくとも２つのアミノ酸、好ましくはＨｉｓ及びＡｓｎの挿入は、Ａｓｐ８４とＭｅｔ８５又はそれと相同のアミノ酸の間に存在する、
のうち少なくとも１つを有し、
好ましくは３つ全ての突然変異が存在する
前記ｐｐＧｐｐアーゼの結果として低下する、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
ｐｐＧｐｐアーゼがアミノ酸Ｇｌｎ９、Ｔｈｒ１３、Ｔｙｒ６３、Ａｒｇ１０９、Ｇｌｎ２２５、Ｃｙｓ２４５、Ｖａｌ２４８、Ａｓｎ２６８、Ｓｅｒ２７０、Ｍｅｔ２８０、Ｈｉｓ３４４、Ｐｒｏ４３６、Ａｓｎ５０１、Ｇｌｎ５０５、Ｈｉｓ５４３、Ａｌａ５４６、Ｓｅｒ５４７、Ｉｌｅ５４８、Ｈｉｓ５５５、Ｇｌｙ５５６、Ｈｉｓ５５７、Ｐｒｏ５５９、Ｌｙｓ６１９、Ｔｈｒ６２１、Ａｌａ６２２、Ｔｈｒ６２７、Ｔｈｒ６５１、Ａｌａ６６９、Ａｌａ６７５、Ｔｈｒ６９８での置換、好ましくは非保存性置換、並びにＧｌｕ３４３及びＨｉｓ３４４又はそれぞれの場合にそれと相同のアミノ酸の間の挿入を含む群からの少なくとも１つの改変を更に有する、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
ｐｐＧｐｐアーゼが以下の置換又はその置換されるアミノ酸と相同のアミノ酸の同じアミノ酸による置換：
１．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＬｅｕによるＧｌｎ９の置換、
２．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｒｇ又はＡｓｎによるＴｈｒ１３の置換、
３．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＨｉｓによるＴｙｒ６３の置換、
４．）Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＡｒｇ１０９の置換、
５．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＴｈｒによるＧｌｎ２２５の置換、
６．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＬｅｕによるＣｙｓ２４５の置換、
７．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＨｉｓによるＶａｌ２４８の置換、
８．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＬ−Ｈｉｓ又はＬｙｓによるＡｓｎ２６８の置換、
９．）Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａ又はＶａｌによるＳｅｒ２７０の置換、
１０．）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａによるＭｅｔ２８０の置換、
１１．）アミノ酸Ｇｌｕ３４３とＨｉｓ３４４との間のアミノ酸Ｌｙｓ及びＧｌｕの挿入、
１２．）Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＨｉｓ３４４の置換、
１３．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＳｅｒによるＰｒｏ４３６の置換、
１４．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＬ−アラニンによるＡｓｎ５０１の置換、
１５．）Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＰｒｏ又はＡｌａによるＧｌｎ５０５の置換、
１６．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＨｉｓ５４３の置換、
１７．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＡｌａ５４６の置換、
１８．）Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａ又はＶａｌによるＳｅｒ５４７の置換、
１９．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｓｎによるＩｌｅ５４８の置換、
２０．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＶａｌによるＨｉｓ５５５の置換、
２１．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓ、好ましくはＡｒｇによる位置５５６でのグリシンの置換、
２２．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＨｉｓ５５７の置換、
２３．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａによるＰｒｏ５５９の置換、
２４．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＬｙｓ６１９の置換、
２５．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＩｌｅによるＴｈｒ６２１の置換、
２６．）Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｓｐによるＡｌａ６２２の置換、
２７．）Ａｌａ及びＧｌｙからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａによるＴｈｒ６２７の置換、
２８．）Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｕによるＴｈｒ６５１の置換、
２９．）ＴｈｒによるＡｌａ６６９及び／又はＡｌａ６７５の置換、
３０．）Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｓｎによるＴｈｒ６９８の置換、
を有する群からの少なくとも１つの改変を有する、請求項４又は５に記載の細胞。
【請求項７】
細胞が、その野生型に対して、以下の酵素：
１．）チオ硫酸／硫酸トランスポートシステムＣｙｓＰＵＷＡ（ＥＣ３．６．３．２５）、
２．）３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸レダクターゼＣｙｓＨ（ＥＣ１．８．４．８）、
３．）亜硫酸レダクターゼＣｙｓＪＩ（ＥＣ１．８．１．２）、
４．）システインシンターゼＡ  ＣｙｓＫ（ＥＣ２．５．１．４７）、
５．）システインシンターゼＢ  ＣｙｓＭ（ＥＣ２．５．１．４７）、
６．）セリンアセチルトランスフェラーゼＣｙｓＥ（ＥＣ２．３．１．３０）、
７．）グリシン開裂系ＧｃｖＴＨＰ−Ｌｐｄ（ＥＣ２．１．２．１０、ＥＣ１．４．４．２、ＥＣ１．８．１．４）、
８．）リポイルシンターゼＬｉｐＡ（ＥＣ２．８．１．８）、
９．）リポイル−タンパク質リガーゼＬｉｐＢ（ＥＣ２．３．１．１８１）、
１０．）ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼＳｅｒＡ（ＥＣ１．１．１．９５）、
１１．）３−ホスホセリンホスファターゼＳｅｒＢ（ＥＣ３．１．３．３）、
１２．）３−ホスホセリン／ホスホヒドロキシトレオニンアミノトランスフェラーゼＳｅｒＣ（ＥＣ．２．６．１．５２）、
１３．）セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼＧｌｙＡ（ＥＣ２．１．２．１）、
１４．）アスパルトキナーゼＩ及びホモセリンデヒドロゲナーゼＩ  ＴｈｒＡ（ＥＣ２．７．２．４、ＥＣ１．１．１．３）、
１５．）アスパラギン酸キナーゼＬｙｓＣ（ＥＣ２．７．２．４）、
１６．）ホモセリンデヒドロゲナーゼＨｏｍ（ＥＣ１．１．１．３）、
１７．）ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼＭｅｔＸ（ＥＣ２．３．１．３１）、
１８．）ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼＭｅｔＡ（ＥＣ２．３．１．４６）、
１９．）シスタチオニンガンマ−シンターゼＭｅｔＢ（ＥＣ２．５．１．４８）、
２０．）βＣ−ＳリアーゼＡｅｃＤ（ＥＣ４．４．１．８、ベータ−リアーゼとも呼ばれる）、
２１．）シスタチオニンベータ−リアーゼＭｅｔＣ（ＥＣ４．４．１．８）、
２２．）Ｂ１２−非依存性ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼＭｅｔＥ（ＥＣ２．１．１．１４）、
２３．）Ｂ１２−依存性ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼＭｅｔＨ（ＥＣ２．１．１．１３）、
２４．）メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素ＭｅｔＦ（ＥＣ１．５．１．２０）、
２５．）コリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glutamicum）由来のＬ−メチオニンエキスポーターＢｒｎＦＥ、
２６．）大腸菌（Echerichia coli）由来のバリンエキスポーターＹｇａＺＨ（ｂ２６８２、ｂ２６８３）、
２７．）大腸菌由来の推定トランスポーターＹｊｅＨ（ｂ４１４１）、
２８．）ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼＰｎｔＡＢ（ＥＣ１．６．１．２）、
２９．）Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼＭｅｔＺ（ＥＣ２．５．１．４８）、
３０．）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキラーゼＰｙｃ（ＥＣ４．１．１．３１）、
３１．）チオ硫酸硫黄トランスフェラーゼＲＤＬ２ｐ（ＥＣ２．８．１．１）、
３２．）チオ硫酸−チオール硫黄トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．１．３）、
３３．）チオ硫酸−ジチオール硫黄トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．１．５）、
その構成要素又は前記酵素の変異体又はその構成要素のいずれかをコードする少なくとも１つの核酸配列又はその変異体を過剰発現するように、その野生型に対して遺伝的に改変された、請求項１から６までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８】
細胞が、以下の酵素：
１．）Ｌ−メチオニン生合成の転写調節因子（ＭｅｔＪ）（ｂ３９３８、ＥＣＫ３９３０）、
２．）グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（Ｐｇｉ、ＥＣ５．３．１．９）（ｂ４０２５、ＥＣＫ４０１７）、
３．）ホモセリンキナーゼ（ＴｈｒＢ、ＥＣ２．７．１．３９）（ｂ０００３、ＥＣＫ０００３）、
４．）Ｓ−アデノシルメチオニンシンターゼ（ＭｅｔＫ、ＥＣ２．５．１．６）（ｂ２９４２、ＥＣＫ２９３７）、
５．）ジヒドロジピコリネートシンターゼ（ＤａｐＡ、ＥＣ４．２．１．５２）（ｂ２４７８、ＥＣＫ２４７４）、
６．）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｃｋ、ＥＣ４．１．１．４９）（ｂ３４０３、ＥＣＫ３３９０）、
７．）ホルミルテトラヒドロフォレートヒドロラーゼ（ＰｕｒＵ、ＥＣ３．５．１．１０）（ｂ１２３２、ＥＣＫ１２２７）、
８．）ピルビン酸キナーゼＩＩ（ＰｙｋＡ、ＥＣ２．７．１．４０）（ｂ１８５４、ＥＣＫ１８５５）、
９．）ピルビン酸キナーゼＩ（ＰｙｋＦ、ＥＣ２．７．１．４０）（ｂ１６７６、ＥＣＫ１６７２）、
１０．）Ｌ−メチオニントランスポーター（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニット（ｂ０１９７、ＥＣＫ０１９７）、
１１．）Ｌ−メチオニントランスポーター（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニット（ｂ０１９８、ＥＣＫ０１９８）、
１２．）Ｌ−メチオニントランスポーター（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニット（ｂ０１９９、ＥＣＫ０１９９）、
１３．）デオキシシチジン５’−トリホスフェートデアミナーゼ（Ｄｃｄ，ＥＣ３．５．４．１３）（ｂ２０６５、ＥＣＫ２０５９）、
１４．）推定Ｎ−アシルトランスフェラーゼ（ＹｎｃＡ）、
１５．）調節ｓＲＮＡ  ＦｎｒＳ、
１６．）シグマ因子ＲｐｏＳ、
その構成要素又は前記酵素の変異体又はその構成要素のいずれかをコードする少なくとも１つの核酸配列又はその変異体を、その野生型に対して、低減された規模で発現するように、その野生型に対して遺伝的に改変された、請求項１から７までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
細胞が、以下の酵素：
１．）アントラニル酸シンターゼ（ｔｒｐＤＥ、ＥＣ４．１．３．２７）、アントラニル酸ホスホリボシル−トランスフェラーゼ（ｔｒｐＤ、ＥＣ２．４．２．１８）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ｔｒｐＣ、ＥＣ５．３．１．２４）、インドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼ（ｔｒｐＣ、ＥＣ４．１．１．４８）及びトリプトファンシンターゼ（ｔｒｐＡＢ、ＥＣ４．１．２．８及び４．２．１．１２２）、
２．）ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼＳｅｒＡ（ＥＣ１．１．１．９５）、
３．）３−ホスホセリンホスファターゼＳｅｒＢ（ＥＣ３．１．３．３）、
４．）３−ホスホセリン／ホスホヒドロキシトレオニンアミノトランスフェラーゼＳｅｒＣ（ＥＣ２．６．１．５２）、
５．）Ｌ−チロシン感受性ＤＨＡＰシンターゼ（ａｒｏＦ、ＥＣ２．５．１．５４）、
６．）Ｌ−フェニルアラニンフィードバック耐性ＤＨＡＰシンターゼ（ａｒｏＧ、ＥＣ２．５．１．５４）、
７．）Ｌ−トリプトファン感受性ＤＨＡＰシンターゼ（ａｒｏＨ、ＥＣ２．５．１．５４）、
８．）ホスホエノールピルビン酸シンターゼｐｐｓＡ（ＥＣ２．７．９．２）、
９．）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼｐｃｋ（ＥＣ４．１．１．４９）、
１０．）トランスケトラーゼＡ  ｔｋｔＡ（ＥＣ２．２．１．１）、
１１．）トランスケトラーゼＢ  ｔｋｔＢ（ＥＣ２．２．１．１）、
１２．）大腸菌のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ｙｄｄＧの遺伝子産物、
その構成要素又は前記酵素の変異体又はその構成要素のいずれかをコードする少なくとも１つの核酸配列又はその変異体を、その野生型に対して、過剰発現するように、その野生型に対して遺伝的に改変された、請求項１から６までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
細胞が、以下の酵素：
１．）トリプトファナーゼ（ｔｎａＡ、ＥＣ４．１．９９．１）、
２．）ｔｒｐオペロンのリプレッサー（ｔｒｐＲ）、
３．）コリスミ酸ムターゼＴ又はプレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ、ＥＣ１．３．１．１２）、
４．）コリスミ酸ムターゼＰ又はプレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｈｅＡ、ＥＣ４．２．１．５１）、
５．）トリプトファン特異的輸送タンパク質（ｍｔｒ）、
６．）トリプトファンパーミアーゼ（ｔｎａＢ）、
７．）芳香族アミノ酸のトランスポーター（ａｒｏＰ）、
８．）Ｌ−セリンデアミナーゼ（ｓｄａＡ、ＥＣ４．３．１．１７）、
９．）グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ｐｇｉ、ＥＣ５．３．１．９）、
１０．）チロシンアミノトランスフェラーゼ（ｔｈｒＢ）、
１１．）ｇｌｐレギュロンのリプレッサー（ｇｌｐＲ）、
１２．）シグマ因子ＲｐｏＳ（ｒｐｏＳ）、
その構成要素又は前記酵素の変異体又はその構成要素のいずれかをコードする少なくとも１つの核酸配列又はその変異体を、その野生型に対して、低減された規模で発現するように、その野生型に対して遺伝的に改変された、請求項１から６までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１１】
細胞が、必須アミノ酸、更に一層好ましくはセリン由来の必須アミノ酸、最も好ましくはメチオニン又はトリプトファンを過剰生産するための細胞である、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか１項に記載の細胞を含む飼料添加剤。
【請求項１３】
必須アミノ酸、更に好ましくはセリン由来の必須アミノ酸、最も好ましくはメチオニン又はトリプトファンを過剰生産する細胞の製造方法であって、ｐｐＧｐｐアーゼをコードするノックアウト遺伝子を有する細胞、好ましくはその野生型に対して低下した（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンテターゼ活性を有していない細胞を製造すること、その際、前記ｐｐＧｐｐアーゼが好ましくはアミノ酸配列番号２、配列番号４及び配列番号６、さらにはその変異体を含む群から選択され、更に一層好ましくは配列番号２である、及び前記細胞を培養すること、任意にアミノ酸を精製することを含む、前記製造方法。
【請求項１４】
セリン由来の必須アミノ酸の製造方法であって、
ａ．）請求項１から１１までのいずれか１項に記載の細胞を培養する工程、
ｂ．）任意にアミノ酸を精製する工程
を含む、前記製造方法。
【請求項１５】
請求項１から１１までのいずれか１項に記載の細胞を使用し且つメチオニンの製造方法である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から７までのいずれか１項又は請求項１０及び請求項１１に記載の細胞を使用し且つ芳香族アミノ酸、好ましくはトリプトファンの製造方法である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
微生物を回分プロセス、流加プロセス、反復流加プロセス又は連続プロセスで培養する、請求項１３から１６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の属由来の細菌細胞である、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の細胞／飼料添加剤又は請求項１３から１７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
細胞がエシェリキア（Escherichia）、エルウィニア（Erwinia）、プロビデンシア（Providencia）及びセラチア（Serratia）を含む属の群から選択され、細胞は好ましくはエシェリキア属由来の細胞、更に一層好ましくは大腸菌である、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の細胞／飼料添加剤又は請求項１３から１８までのいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、その野生型に対して低下したｐｐＧｐｐアーゼ活性を有し、好ましくは必須アミノ酸、更に好ましくはセリン由来の必須アミノ酸、最も好ましくはメチオニン又はトリプトファンを過剰生産するようにその野生型に対して遺伝的に改変された細胞に関し、かかる細胞を含む試料添加剤に関し、セリン由来の必須アミノ酸、好ましくはメチオニン、又は芳香族必須アミノ酸、特にトリプトファンを過剰生産する細胞の製造方法であって、ｐｐＧｐｐアーゼをコードするノックアウト遺伝子を有する細胞の製造を含む、前記製造方法に関し、且つセリン由来のその必須アミノ酸の製造方法であって、ａ）本発明の第１の態様による又はその実施態様のいずれかによる細胞を培養する工程、及びｂ）任意にアミノ酸を精製する工程を含む、前記製造方法に関する。
【０００２】
硫黄含有及び芳香族Ｌ−アミノ酸は、経済的に非常に重要である。Ｌ−システインは、薬理学的に活性な化合物（例えば、Ｎ−アセチルシステイン）及び化粧品のための出発物質として、食品添加物として使用されている。アミノ酸のＬ−メチオニン及びＬ−トリプトファンは動物栄養において非常に重要な役割を果たす。それらは脊椎動物の代謝の生合成によって製造することができない必須アミノ酸に属している。その結果として、動物の飼育では、十分な量の特定のアミノ酸が供給物中に取り込まれることが保証されなければならない。しかしながら、例えば、Ｌ−メチオニンは、特に豚及び家禽の場合、従来の飼料植物（例えば大豆又は穀類）中に最適な動物の栄養を保証するには少なすぎる量で存在することが多いため、メチオニンを添加剤として動物の飼料に添加することが有利である。Ｄ−メチオニンは、脊椎動物によって生物学的に活性なＬ−メチオニンに変換され得る。従って、Ｄ−及びＬ−メチオニンのラセミ体は、通常、動物用飼料に添加されている。動物では、Ｌ−ホモシステインは、メチル基移転によって変換され、これにより、Ｌ−メチオニンを置換することができる。
【０００３】
従来技術では、メチオニンなどのアミノ酸は、化学合成によって製造されている。これは、３−メチルチオプロピオンアルデヒドを得るために最初にアクロレインとメチルメルカプタンを反応させることを含み、次にシアニド、アンモニア及び一酸化炭素によってヒダントインが得られる。これは、最終的に加水分解されてラセミ化合物、即ち、２つの立体異性体のＤ−メチオニン及びＬ−メチオニンの等モル混合物が得られる。Ｌ体のみが生物学的に活性な形態の分子を構成するので、供給物中に存在するＤ体は最初に脱アミノ反応及びアミノ基転移反応によって活性なＬ体に代謝的に変換されなければならない。
【０００４】
メチオニンとは対照的に、例えば、トリプトファンなどの他の殆どの天然のタンパク質遺伝子のアミノ酸は、微生物が天然アミノ酸を合成するための適切な生合成経路を有する事実を利用して、主に微生物の発酵によって製造される。更に、多くの発酵方法は、グルコース及び鉱物塩などの安価な反応物により非常に有利な製造コストを実現し、更には特定のアミノ酸の生物学的に活性なＬ体を提供する。
【０００５】
この種のアミノ酸は、腸内細菌株、特に大腸菌（E. coli）及びセラチア・マルセッセンスの発酵によって産生されることで知られている。非常に重要なので、作業は常に製造プロセスを改善するために行われている。プロセスの改善は、例えば、撹拌及び酸素の供給、又は例えば、栄養培地の組成、例えば、使用される糖及び発酵中の糖濃度の選択などの発酵の目安に関係するか、又は例えば、イオン交換クロマトグラフィによる、製品形態への仕上げに関係するか、又は微生物自体の固有の生産性に関係し得る。
【０００６】
アミノ酸の生合成経路は、野生型株において厳格に代謝調節され、これによりアミノ酸は確実に細胞自身が要求する程度まで生産される。従って、効率的な生産プロセスのための重要な前提条件は、適切な微生物の利用可能性であり、これは野生型の微生物とは対照的に、所望のアミノ酸を製造するためのそれら自身の要求（過剰生産）を超える急激に増加した生産量を有する。
【０００７】
かかるアミノ酸過剰生産微生物は、従来の変異/選択プロセスによって、及び／又は近代的な、特定の、組換え技術（代謝工学）によって生成され得る。この場合は、まず、それらの変性、活性又は不活性化によるアミノ酸の過剰生産に影響を及ぼす遺伝子又は対立遺伝子の同定を含む。従って、分子生物学の技術は、過剰生産を最適化するように、これらの遺伝子／対立遺伝子を微生物株に導入するか又はそれらを不活性化するために使用されている。しかしながら、幾つかの異なる尺度の組み合わせによって初めて真に効率的な産生をもたらすことが多い。前記遺伝子又は対立遺伝子は、酵素、転写因子、輸送及び他のポリペプチド、補因子又は補因子合成ポリペプチド又は目的のアミノ酸の合成に影響を及ぼすことが可能な構成要素をコードし得る。好ましい実施態様では、「構成要素」との用語は、本願明細書で理解されるように、当該アミノ酸の合成に影響を及ぼすポリペプチドのサブユニットを意味し、このサブユニットは、遺伝子又はオペロンによってコードされるシステム全体よりも小さいが、例えば、ポリペプチドのサブユニット又はドメインは、システム全体のタスクに関して機能的である。
【０００８】
Ｌ−メチオニンは、アスパラギン酸及びセリンに由来する。大腸菌では、硫黄がＬ−システインを介して（中間体としてのシスタチオニンを介して）硫黄転移反応によってＬ−メチオニンに導入される。Ｌ−メチオニンのＣＨ３基はＣ１代謝に由来し且つＭｅｔＥ又はＭｅｔＨメチオニン合成によってＬ−ホモシステインに移動する（レビュー：Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ  ＦＣら（編）のグリーンＲＣ（１９９６年）、”Escherichia coli and Salmonella”、第２版、第５４２〜５６０頁）。株及びＬ−メチオニンの発酵生産プロセスは、大腸菌の場合、例えば、ＷＯ２００６／００１６１６号又はＷＯ２００９／０４３８０３号に記載されている。
【０００９】
とりわけコリスミ酸、腸内バクチン、メナキノン、テトラヒドロ葉酸、ユビキノン及び芳香族アミノ酸を合成するためのシキミ酸の代謝経路も同様に厳密に調節されている。大腸菌中の芳香族生合成は、遺伝子レベルでの減衰及び抑圧によって、及び酵素のフィードバック阻害によって調節されている（Frost and Draths, Annual review of microbiology, 49:557-79 (1995年); Pittard, Genes to Cells 1 (8):717-25 (1996年)）。この経路は、芳香族代謝物の生産は細胞の要求と厳密に一致する。シキミ酸経路は、３つの異なるイソ酵素の３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソン酸−７−リン酸シンターゼ（ａｒｏＦ、ａｒｏＧ及びａｒｏＨ遺伝子によってコードされた、ＤＡＨＰシンターゼ）によって触媒される初期反応を制御することによって調節される。ＡｒｏＧ遺伝子産物は、大腸菌における全てのＤＡＨＰシンターゼの全活性の８０％を構成し（Tribeら, Journal of Bacteriology 127(3): 1085-1097 (1976年); Pittard, Genes to Cells 1 (8):717-25 (1996年)）；ＡｒｏＧは芳香族アミノ酸Ｌ−フェニルアラニンによって９５％阻害される。遺伝子レベルでは、フェニルアラニン及びトリプトファンの存在化で、ＴｙｒＲ調節因子は、ａｒｏＧ転写を抑制し（Baseggioら, Journal of Bacteriology 172 (5): 2547-57 (1990年); Daviesら, Gene 33 (3) : 323-31 (1985年)）。出願ＥＰ１２７０７２１号及びＥＰ２１４７９７２号は、ａｒｏＧ対立遺伝子を利用することで、大腸菌属の菌株を用いる芳香族アミノ酸Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−トリプトファンの生産及び製造に有益な影響を及ぼすことを記載している。
【００１０】
このような背景の下で、本発明の根底にある目的は、従来技術に記載された細胞よりも改善された細胞、かかる細胞の製造方法並びにセリン、好ましくはメチオニン、又は芳香族必須アミノ酸、特にトリプトファンから誘導された必須アミノ酸を過剰生産するためのかかる細胞を使用する方法を提供することであり、前記改善は、過剰生産されたアミノ酸の達成された細胞内濃度、培養物の処理後の過剰生産されたアミノ酸の収量、細胞の成長特性及び前記アミノ酸の過剰生産及び処理に要求される方法工程の時間と数、並びにプロセスによって要求されるリソース、例えば、時間、エネルギー及び使用される菌株と反応物の量などの要因に関係している。
【００１１】
この課題及び更なる課題は、本出願の主題によって、特に一緒に含まれる独立請求項の主題によって達成され、その際、実施態様は従属請求項から生じている。
【００１２】
第１の態様では、本出願の根底となる課題は、その野生型よりも低下したｐｐＧｐｐアーゼ活性を有し、且つ好ましくは必須アミノ酸、更に一層好ましくはセリン由来の必須アミノ酸、最も好ましくはメチオニン又はトリプトファンを過剰生産するように、その野生型に対して遺伝的に改変された細胞によって達成される。
【００１３】
第１の態様の第１の実施態様では、この課題は、その野生型に対して実質的に変化していない（ｐ）ｐｐＧｐｐシンテターゼ活性を有する細胞によって解決される。
【００１４】
本発明の範囲内では、「その野生型に対して実質的に変化していない（ｐ）ｐｐＧｐｐシンテターゼ活性を有する細胞」とは、前記細胞が、同等の条件下で、時間当たりに合成された（ｐ）ｐｐＧｐｐ分子の数によって測定された、少なくとも９０％、９５％、９９％、１０１％、１０５％、１１０％の活性の野生型細胞を有することを意味する。
【００１５】
第１の実施態様の実施態様でもある、第１の態様の第２の実施態様では、この課題は、アミノ酸配列番号２、配列番号４及び配列番号６を含む群、さらにはその変異体、好ましくは配列番号２又はその変異体から選択された、その野生型よりも低下した活性の少なくとも１つのｐｐＧｐｐアーゼを有するように、その野生型に対して遺伝的に改変された細胞によって解決される。
【００１６】
第１〜第２の実施態様の実施態様でもある、第１の態様の第３の実施態様では、この課題は、アミノ酸配列番号２、配列番号４及び配列番号６を含む群、さらにはその変異体、好ましくは配列番号２又はその変異体からの少なくとも１つのｐｐＧｐｐアーゼ活性が、前記ｐｐＧｐｐアーゼが以下の改変：
ａ）Ｇｌｙ１７４又はそれと相同のアミノ酸が、好ましくは非保存的に、異なるアミノ酸によって置換された、
ｂ）Ｌｅｕ５２９又はそれと相同のアミノ酸が、好ましくは非保存的に、異なるアミノ酸によって置換された、
ｃ）少なくとも１種のアミノ酸、好ましくは少なくとも２種のアミノ酸、好ましくはＨｉｓ及びＡｓｎの挿入が、Ａｓｐ８４及びＭｅｔ８５又はそれと相同のアミノ酸の間に存在する、
その際、好ましくは全ての３つの変異が存在している、
のうち少なくとも１つを有する結果として低下する、細胞によって解決される。
【００１７】
第３の実施態様の実施態様でもある、第１の態様の第４の実施態様では、この課題は、ｐｐＧｐｐアーゼが、アミノ酸Ｇｌｎ９、Ｔｈｒ１３、Ｔｙｒ６３、Ａｒｇ１０９、Ｇｌｎ２２５、Ｃｙｓ２４５、Ｖａｌ２４８、Ａｓｎ２６８、Ｓｅｒ２７０、Ｍｅｔ２８０、Ｈｉｓ３４４、Ｐｒｏ４３６、Ａｓｎ５０１、Ｇｌｎ５０５、Ｈｉｓ５４３、Ａｌａ５４６、Ｓｅｒ５４７、Ｉｌｅ５４８、Ｈｉｓ５５５、Ｇｌｙ５５６、Ｈｉｓ５５７、Ｐｒｏ５５９、Ｌｙｓ６１９、Ｔｈｒ６２１、Ａｌａ６２２、Ｔｈｒ６２７、Ｔｈｒ６５１、Ａｌａ６６９、Ａｌａ６７５、Ｔｈｒ６９８での置換、好ましくは非保存性置換、並びにＧｌｕ３４３及びＨｉｓ３４４又はそれぞれの場合にそれと相同のアミノ酸の間の挿入を含む群からの少なくとも１つの改変を更に有する、細胞によって解決される。
【００１８】
第３及び第４の実施態様の実施態様でもある、第１の態様の第５の実施態様では、この課題は、ｐｐＧｐｐアーゼが以下の置換又はその置換されるアミノ酸と相同のアミノ酸の同じアミノ酸による置換：
１．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＬｅｕによるＧｌｎ９の置換、
２．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｒｇ又はＡｓｎによるＴｈｒ１３の置換、
３．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＨｉｓによるＴｙｒ６３の置換、
４．）Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＡｒｇ１０９の置換、
５．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＴｈｒによるＧｌｎ２２５の置換、
６．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＬｅｕによるＣｙｓ２４５の置換、
７．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＨｉｓによるＶａｌ２４８の置換、
８．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＬ−Ｈｉｓ又はＬｙｓによるＡｓｎ２６８の置換、
９．）Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａ又はＶａｌによるＳｅｒ２７０の置換、
１０．）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａによるＭｅｔ２８０の置換、
１１．）アミノ酸Ｇｌｕ３４３及びＨｉｓ３４４の間にアミノ酸Ｌｙｓ及びＧｌｕの挿入、
１２．）Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＨｉｓ３４４の置換、
１３．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＳｅｒによるＰｒｏ４３６の置換、
１４．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＬ−アラニンによるＡｓｎ５０１の置換、
１５．）Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＰｒｏ又はＡｌａによるＧｌｎ５０５の置換、
１６．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＨｉｓ５４３の置換、
１７．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＡｌａ５４６の置換、
１８．）Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａ又はＶａｌによるＳｅｒ５４７の置換、
１９．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｓｎによるＩｌｅ５４８の置換、
２０．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＶａｌによるＨｉｓ５５５の置換、
２１．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓ、好ましくはＡｒｇによるＧｌｙ５５６の置換、
２２．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＨｉｓ５５７の置換、
２３．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａによるＰｒｏ５５９の置換、
２４．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＬｙｓ６１９の置換、
２５．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＩｌｅによるＴｈｒ６２１の置換、
２６．）Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｓｐによるＡｌａ６２２の置換、
２７．）Ａｌａ及びＧｌｙからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａによるＴｈｒ６２７の置換、
２８．）Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｕによるＴｈｒ６５１の置換、
２９．）ＴｈｒによるＡｌａ６６９及び／又はＡｌａ６７５の置換、
３０．）Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｓｎによるＴｈｒ６９８の置換
を有する群からの少なくとも１つの改変を有する、細胞によって解決される。
【００１９】
第５〜第６の実施態様の実施態様でもある、第１の態様の第６の実施態様では、この課題は、その野生型に対して、過剰発現するように、その野生型に対して遺伝的に改変された細胞、以下の酵素：
１）チオ硫酸／硫酸トランスポートシステムＣｙｓＰＵＷＡ（ＥＣ３．６．３．２５）、
２）３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸レダクターゼＣｙｓＨ（ＥＣ１．８．４．８）、
３）亜硫酸レダクターゼＣｙｓＪＩ（ＥＣ１．８．１．２）、
４）システインシンターゼＡ  ＣｙｓＫ（ＥＣ２．５．１．４７）、
５）システインシンターゼＢ  ＣｙｓＭ（ＥＣ２．５．１．４７）、
６）セリンアセチルトランスフェラーゼＣｙｓＥ（ＥＣ２．３．１．３０）、
７）グリシン開裂系ＧｃｖＴＨＰ−Ｌｐｄ（ＥＣ２．１．２．１０、ＥＣ１．４．４．２、ＥＣ１．８．１．４）、
８）リポイルシンテターゼＬｉｐＡ（ＥＣ２．８．１．８）、
９）リポイル−タンパク質リガーゼＬｉｐＢ（ＥＣ２．３．１．１８１）、
１０）ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼＳｅｒＡ（ＥＣ１．１．１．９５）、
１１）３−ホスホセリンホスファターゼＳｅｒＢ（ＥＣ３．１．３．３）、
１２）３−ホスホセリン／ホスホヒドロキシトレオニンアミノトランスフェラーゼＳｅｒＣ（ＥＣ．６．１．５２）、
１３）セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼＧｌｙＡ（ＥＣ２．１．２．１）、
１４）アスパルトキナーゼＩ及びホモセリンデヒドロゲナーゼＩ  ＴｈｒＡ（ＥＣ２．７．２．４、ＥＣ１．１．１．３）、
１５）アスパラギン酸キナーゼＬｙｓＣ（ＥＣ２．７．２．４）、
１６）ホモセリンデヒドロゲナーゼＨｏｍ（ＥＣ１．１．１．３）、
１７）ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼＭｅｔＸ（ＥＣ２．３．１．３１）、
１８）ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼＭｅｔＡ（ＥＣ２．３．１．４６）、
１９）シスタチオニンガンマ−シンターゼＭｅｔＢ（ＥＣ２．５．１．４８）、
２０）βＣ−ＳリアーゼＡｅｃＤ（ＥＣ４．４．１．８、ベータ−リアーゼとも呼ばれる）、
２１）シスタチオニンベータ−リアーゼＭｅｔＣ（ＥＣ４．４．１．８）、
２２）Ｂ１２−非依存性ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼＭｅｔＥ（ＥＣ２．１．１．１４）、
２３）Ｂ１２−依存性ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼＭｅｔＨ（ＥＣ２．１．１．１３）、
２４）メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素ＭｅｔＦ（ＥＣ１．５．１．２０）、
２５）コリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glutamicum）由来のＬ−メチオニンエキスポーターＢｒｎＦＥ、
２６）大腸菌（Echerichia coli）由来のバリンエキスポーターＹｇａＺＨ、好ましくはデータベースコードｂ２６８２、ｂ２６８３又はその変異体によって表されるもの、
２７）大腸菌由来の推定トランスポーターＹｊｅＨ、好ましくはデータベースコードｂ４１４１又はその変異体によって表されるもの、
２８）ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼＰｎｔＡＢ（ＥＣ１．６．１．２）、
２９）Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼＭｅｔＺ（ＥＣ２．５．１．４８）、
３０）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキラーゼＰｙｃ（ＥＣ４．１．１．３１）、
３１）チオ硫酸硫黄トランスフェラーゼＲＤＬ２（ＥＣ２．８．１．１）、
３２）チオ硫酸−チオール硫黄トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．１．３）、
３３）チオ硫酸−ジチオール硫黄トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．１．５）、
その構成要素又は前記酵素の変異体又はその構成要素のいずれかをコードする少なくとも１つの核酸配列又はその変異体によって解決される。
【００２０】
第１〜第６の実施態様の実施態様でもある、第１の態様の第７の実施態様では、この課題は、その野生型に対して、低減された規模で発現するように、その野生型に対して遺伝的に改変された細胞、以下の酵素：
１）Ｌ−メチオニン生合成（ＭｅｔＪ）の転写調節因子、好ましくはデータベースコードｂ３９３８、ＥＣＫ３９３０又はその変異体によって表されるもの、
２）グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（Ｐｇｉ、ＥＣ５．３．１．９）、好ましくはデータベースコードｂ４０２５、ＥＣＫ４０１７又はその変異体によって表されるもの、
３）ホモセリンキナーゼ（ＴｈｒＢ，ＥＣ２．７．１．３９）、好ましくはデータベースコードｂ０００３、ＥＣＫ０００３又はその変異体によって表されるもの、
４）Ｓ−アデノシルメチオニンシンターゼ（ＭｅｔＫ、ＥＣ２．５．１．６）、好ましくはデータベースコードｂ２９４２、ＥＣＫ２９３７又はその変異体によって表されるもの、
５）ジヒドロジピコリネートシンターゼ（ＤａｐＡ、ＥＣ４．２．１．５２）、好ましくはデータベースコードｂ２４７９、ＥＣＫ２４７４又はその変異体によって表されるもの、
６）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｃｋ、ＥＣ４．１．１．４９）、好ましくはデータベースコードｂ３４０３、ＥＣＫ３３９０又はその変異体によって表されるもの、
７）ホルミルテトラヒドロフォレートヒドロラーゼ（ＰｕｒＵ、ＥＣ３．５．１．１０）、好ましくはデータベースコードｂ１２３２、ＥＣＫ１２２７又はその変異体によって表されるもの、
８）ピルビン酸キナーゼＩＩ（ＰｙｋＡ、ＥＣ２．７．１．４０）、好ましくはデータベースコードｂ１８５４、ＥＣＫ１８５５又はその変異体によって表されるもの、
９）ピルビン酸キナーゼＩ（ＰｙｋＦ、ＥＣ２．７．１．４０）、好ましくはデータベースコードｂ１６７６、ＥＣＫ１６７２又はその変異体によって表されるもの、
１０）Ｌ−メチオニントランスポーター（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニット、好ましくはデータベースコードｂ０１９７、ＥＣＫ０１９７又はその変異体によって表されるもの、
１１）Ｌ−メチオニントランスポーター（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニット、好ましくはデータベースコードｂ０１９８、ＥＣＫ０１９８又はその変異体によって表されるもの、
１２）Ｌ−メチオニントランスポーター（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニット、好ましくはデータベースコードｂ０１９９、ＥＣＫ０１９９又はその変異体によって表されるもの、
１３）デオキシシチジン５’−トリホスフェートデアミナーゼ（Ｄｃｄ，ＥＣ３．５．４．１３）、好ましくはデータベースコードｂ２０６５、ＥＣＫ２０５９又はその変異体によって表されるもの、
１４）推定Ｎ−アシルトランスフェラーゼ（ＹｎｃＡ）、好ましくはデータベースコードｂ１４４８、ＥＣＫ１４４２又はその変異体によって表されるもの、
１５）調節ｓＲＮＡ  ＦｎｒＳ、好ましくはデータベースコードｂ４６９９、ＥＣＫ４５１１又はその変異体によって表されるもの、
１６）シグマ因子ＲｐｏＳ、好ましくはデータベースコードｂ２７４１、ＥＣＫ２７３６又はその変異体によって表されるもの、
その構成要素又は前記酵素の変異体又はその構成要素のいずれかをコードする少なくとも１つの核酸配列又はその変異体によって解決される。
【００２１】
第１〜第５の実施態様の実施態様でもある、第１の態様の第８の実施態様では、この課題は、その野生型に対して過剰発現するように、その野生型に対して遺伝的に改変された細胞、以下の酵素：
１）アントラニル酸シンターゼ（ｔｒｐＤＥ、ＥＣ４．１．３．２７）、アントラニル酸ホスホリボシル−トランスフェラーゼ（ｔｒｐＤ、ＥＣ２．４．２．１８）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ｔｒｐＣ、ＥＣ５．３．１．２４）、インドール−３−グリセリンリン酸シンターゼ（ｔｒｐＣ、ＥＣ４．１．１．４８）及びトリプトファンシンターゼ（ｔｒｐＡＢ、ＥＣ４．１．２．８及び４．２．１．１２２）、
２）ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼＳｅｒＡ（ＥＣ１．１．１．９５）、
３）３−ホスホセリンホスファターゼＳｅｒＢ（ＥＣ３．１．３．３）、
４）３−ホスホセリン／ホスホヒドロキシトレオニンアミノトランスフェラーゼＳｅｒＣ（ＥＣ２．６．１．５２）、
５）Ｌ−チロシン感受性ＤＨＡＰシンターゼ（ａｒｏＦ、ＥＣ２．５．１．５４）、
６）Ｌ−フェニルアラニンフィードバック耐性ＤＨＡＰシンターゼ（ａｒｏＧ、ＥＣ２．５．１．５４）、
７）Ｌ−トリプトファン感受性ＤＨＡＰシンターゼ（ａｒｏＨ、ＥＣ２．５．１．５４）、
８）ホスホエノール／ピルビン酸シンターゼｐｐｓＡ（ＥＣ２．７．９．２）、
９）ホスホエノール／ピルビン酸カルボキシキナーゼｐｃｋ（ＥＣ４．１．１．４９）、
１０）トランスケトラーゼＡ  ｔｋｔＡ（ＥＣ２．２．１．１）、
１１）トランスケトラーゼＢ  ｔｋｔＢ（ＥＣ２．２．１．１）、
１２）大腸菌のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の遺伝子産物ｙｄｄＧ、好ましくはデータベースコードｂ１４７３、ＥＣＫ１４６７又はその変異体によって表されるもの、
その構成要素又は前記酵素の変異体又はその構成要素のいずれかをコードする少なくとも１つの核酸配列又はその変異体によって解決される。
【００２２】
第１〜第５の実施態様の実施態様でもある、第１の態様の第９の実施態様では、この課題は、その野生型に対して、低減された規模で発現するようにその野生型に対して遺伝的に改変された細胞、以下の酵素：
１）トリプトファナーゼ（ｔｎａＡ、ＥＣ４．１．９９．１）、
２）ｔｒｐオペロンのリプレッサー（ｔｒｐＲ）、好ましくはデータベースコードｂ４３９３によって表されるもの、ＥＣＫ４３８５又はその変異体、
３）コリスミ酸ムターゼＴ又はプレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ、ＥＣ１．３．１．１２）、
４）コリスミ酸ムターゼＰ又はプレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｈｅＡ、ＥＣ４．２．１．５１）、
５）トリプトファン特異的輸送タンパク質ｍｔｒ、好ましくはデータベースコードｂ３１６１によって表されるもの、ＥＣＫ３１４９又はその変異体、
６）トリプトファンパーミアーゼ（ｔｎａＢ）、好ましくはデータベースコードｂ３７０９によって表されるもの、ＥＣＫ３７０２又はその変異体、
７）芳香族アミノ酸（ａｒｏＰ）のトランスポーター、好ましくはデータベースコードｂ０１１２によって表されるもの、ＥＣＫ０１１１又はその変異体、
８）Ｌ−セリンデアミナーゼ（ｓｄａＡ、ＥＣ４．３．１．１７）、
９）グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ｐｇｉ、ＥＣ５．３．１．９）、
１０）チロシンアミノトランスフェラーゼ（ｔｈｒＢ）、好ましくは、データベースコードｂ４０５４、ＥＣＫ４０４６又はその変異体によって表されるもの、
１１）ｇｌｐレギュロンのリプレッサー（ｇｌｐＲ）、好ましくはデータベースコードｂ３４２３、ＥＣＫ３４０９又はその変異体によって表されるもの、
１２）シグマ因子ＲｐｏＳ（ｒｐｏＳ）、好ましくはデータベースコードｂ２７４１によって表されるもの、ＥＣＫ２７３６又はその変異体、
その構成要素又は前記酵素の変異体又はその構成要素のいずれかをコードする少なくとも１つの核酸配列又はその変異体によって解決される。
【００２３】
第１〜第９の実施態様の実施態様でもある、第１の態様の第１０の実施態様では、この課題は、セリン、好ましくはメチオニン由来の必須アミノ酸、又は特に、トリプトファン中の芳香族必須アミノ酸の過剰生産のための細胞によって解決される。
【００２４】
第２の態様では、本発明によって対処される課題は、本発明の第１の態様又はその実施態様による細胞を含む飼料添加剤によって解決される。
【００２５】
第３の態様では、本発明によって対処される課題は、必須アミノ酸、更に一層好ましくはセリン由来の必須アミノ酸、最も好ましくはメチオニン又はトリプトファンを過剰生産する細胞の製造方法であって、好ましくはその野生型に対して低下した（ｐ）ｐｐＧｐｐシンテターゼ活性を有していない、好ましくはアミノ酸配列番号２、配列番号４及び配列番号６を含む群、さらにはその変異体から選択され、更に一層好ましくは配列番号２である、ｐｐＧｐｐアーゼをコードするノックアウト遺伝子を有する細胞を準備する工程、及び前記細胞を、アミノ酸の任意の精製を用いて培養する工程を含む、前記製造方法によって解決される。
【００２６】
第４の態様では、本発明によって対処される課題は、セリン由来の必須アミノ酸の製造方法であって、
ａ）本発明の第１の態様又はその実施態様のいずれかによる細胞を培養する工程、
ｂ）任意にアミノ酸を精製する工程
を含む、前記方法によって解決される。
【００２７】
第４の態様の第１の実施態様では、この課題は、第１の態様又はその実施態様のいずれかによる細胞を用いて解決され、該方法はメチオニンの製造方法である。
【００２８】
第１の実施態様の実施態様でもある、第４の態様の第２の実施態様では、この課題は、第１の態様又はその第２〜第６の実施態様又は第９〜第１０の実施態様による細胞を使用し且つ芳香族必須アミノ酸、好ましくはトリプトファンの製造方法である、前記方法によって解決される。
【００２９】
第１〜第２の実施態様の実施態様でもある、第４の態様の第３の実施態様では、この課題は、微生物が回分プロセス、流加プロセス、反復流加プロセス又は連続プロセスで培養される方法によって解決される。
【００３０】
第１〜第４の態様の全ての実施態様の実施態様でもある、第１、第２、第３及び第４の態様の更なる実施態様では、この課題は、細胞／飼料添加剤によって又は細胞が腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の属由来の細菌細胞である方法によって解決される。
【００３１】
第１〜第４の態様の全ての実施態様の実施態様でもある、第１、第２、第３及び第４の態様の更なる実施態様では、この課題は、細胞／飼料添加剤によって又は細胞がエシェリキア（Escherichia）、エルウィニア（Erwinia）、プロビデンシア（Providencia）及びセラチア（Serratia）を含む属の群から選択され、且つ細胞が好ましくはエシェリキア属、更に一層好ましくは大腸菌由来の細胞である、前記方法によって解決される。
【００３２】
第５の態様では、本発明によって対処される課題は、その野生型に対して低下したｐｐＧｐｐアーゼ活性を有するようにその野生型に対して遺伝的に改変されたｐｐＧｐｐアーゼをコードする部分を含む単離又は組み換え核酸分子によって解決される。
【００３３】
第５の態様の第１の実施態様では、単離された又は組み換え核酸分子によってコードされたｐｐＧｐｐアーゼは、その野生型に対して実質的に変化していない（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンテターゼを有する。
【００３４】
第１の実施態様の実施態様でもある、第５の態様の第２の実施態様では、単離された又は組み換え核酸分子によってコードされたｐｐＧｐｐアーゼは、アミノ酸配列番号２、配列番号４及び配列番号６を含む群、さらにはその変異体から選択され、好ましくは配列番号２又はその変異体である。
【００３５】
第２の実施態様の実施態様でもある、第５の態様の第３の実施態様では、単離された又は組み換え核酸分子によってコードされたｐｐＧｐｐアーゼの活性は、対応する野生型配列に対する以下の改変のうち少なくとも１つを有するｐｐＧｐｐアーゼをコードする前記核酸分子の結果として低下する：
ａ）Ｇｌｙ１７４又はそれと相同のアミノ酸は、異なるアミノ酸によって、好ましくは非保存的に置換された、
ｂ）Ｌｅｕ５２９又はそれと相同のアミノ酸は、異なるアミノ酸によって、好ましくは非保存的に置換された、
ｃ）少なくとも１つのアミノ酸、好ましくは少なくとも２つのアミノ酸、好ましくはＨｉｓ及びＡｓｎの挿入は、Ａｓｐ８４とＭｅｔ８５又はそれと相同のアミノ酸の間に存在し、好ましくは全ての３つの変異が存在する。
【００３６】
第１〜第３の実施態様の実施態様でもある、第５の態様の第４の実施態様では、単離された又は組み換え核酸分子によってコードされたｐｐＧｐｐアーゼの活性は、ｐｐＧｐｐアーゼをコードする前記単離された又は組み換え核酸分子が、対応する野生型の配列に対して以下の改変：アミノ酸Ｇｌｎ９、Ｔｈｒ１３、Ｔｙｒ６３、Ａｒｇ１０９、Ｇｌｎ２２５、Ｃｙｓ２４５、Ｖａｌ２４８、Ａｓｎ２６８、Ｓｅｒ２７０、Ｍｅｔ２８０、Ｈｉｓ３４４、Ｐｒｏ４３６、Ａｓｎ５０１、Ｇｌｎ５０５、Ｈｉｓ５４３、Ａｌａ５４６、Ｓｅｒ５４７、Ｉｌｅ５４８、Ｈｉｓ５５５、Ｇｌｙ５５６、Ｈｉｓ５５７、Ｐｒｏ５５９、Ｌｙｓ６１９、Ｔｈｒ６２１、Ａｌａ６２２、Ｔｈｒ６２７、Ｔｈｒ６５１、Ａｌａ６６９、Ａｌａ６７５、Ｔｈｒ６９８での置換、好ましくは非保存性の置換並びにＧｌｕ３４３及びＨｉｓ３４４又はそれぞれの場合のそれと相同のアミノ酸の間の挿入を含む群からの改変のうち少なくとも１つを有する結果として低下する。
【００３７】
第１〜第４の実施態様の実施態様でもある、第５の態様の第５の実施態様では、単離された又は組み換え核酸分子によってコードされたｐｐＧｐｐｐａｓｅの活性は、対応する野生型配列に対して以下の置換のうち少なくとも１つを有するｐｐＧｐｐｐａｓｅをコードする前記単離された又は組み換え核酸分子の結果として低下する：
１．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＬｅｕによるＧｌｎ９の置換、
２．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｒｇ又はＡｓｎによるＴｈｒ１３の置換、
３．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＨｉｓによるＴｙｒ６３の置換。
４．）Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＡｒｇ１０９の置換、
５．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＴｈｒによるＧｌｎ２２５の置換、
６．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＬｅｕによるＣｙｓ２４５の置換、
７．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＨｉｓによるＶａｌ２４８の置換、
８．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＬ−Ｈｉｓ又はＬｙｓによるＡｓｎ２６８の置換、
９．）Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａ又はＶａｌによるＳｅｒ２７０の置換、
１０．）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａによるＭｅｔ２８０の置換、
１１．）アミノ酸Ｇｌｕ３４３とＨｉｓ３４４との間のアミノ酸Ｌｙｓ及びＧｌｕの挿入、
１２．）Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＨｉｓ３４４の置換、
１３．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＳｅｒによるＰｒｏ４３６の置換、
１４．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＬ−アラニンによるＡｓｎ５０１の置換、
１５．）Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＰｒｏ又はＡｌａによるＧｌｎ５０５の置換、
１６．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＨｉｓ５４３の置換、
１７．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＡｌａ５４６の置換、
１８．）Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａ又はＶａｌによるＳｅｒ５４７の置換、
１９．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｓｎによるＩｌｅ５４８の置換、
２０．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＶａｌによるＨｉｓ５５５の置換、
２１．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓ、好ましくはＡｒｇによる位置５５６でのグリシンの置換、
２２．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＨｉｓ５５７の置換、
２３．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒ、好ましくはＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸によるＰｒｏ５５９の置換、
２４．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｎによるＬｙｓ６１９の置換、
２５．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌ、好ましくはＩｌｅからなる群から選択されるアミノ酸によるＴｈｒ６２１の置換、
２６．）Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｓｐによるＡｌａ６２２の置換、
２７．）Ａｌａ及びＧｌｙからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｌａによるＴｈｒ６２７の置換、
２８．）Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＧｌｕによるＴｈｒ６５１の置換、
２９．）ＴｈｒによるＡｌａ６６９及び／又はＡｌａ６７５の置換、
３０．）Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸、好ましくはＡｓｎによるＴｈｒ６９８の置換。
【００３８】
第１〜第５の実施態様の実施態様でもある、第５の態様の第６の実施態様では、この課題は、配列番号８又はその変異体をコードする単離された又は組み換え核酸分子によって解決される。
【００３９】
第１〜第５の実施態様の実施態様でもある、第５の態様の第７の実施態様では、この課題は、配列番号７又はその変異体を含む単離された又は組み換え核酸分子によって解決される。
【００４０】
第６の態様では、本発明によって対処される課題は、第５の態様又はその実施態様のいずれかによる核酸分子を含むベクターによって解決される。
【００４１】
本発明の発明者らは、必須アミノ酸、好ましくはセリン由来の必須アミノ酸、最も好ましくはメチオニン又はトリプトファンが、驚くことに、前記細胞がその野生型よりも低下したｐｐＧｐｐアーゼ活性を有する状況によって増加することを見出した。驚くことに、これは、特に細胞の（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンテターゼ活性がその野生型に対して本質的に変化しない場合である。
【００４２】
本発明による細胞の本質的な性質は、その野生型よりも低下したｐｐＧｐｐアーゼ活性を有するように、野生型に対して遺伝的に改変されているものである。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「ｐｐＧｐｐアーゼ活性」との用語は、グアノシン−３’，５’−ビス（二リン酸）３’−ジホスファターゼ（ＥＣ３．１．７．２）の酵素活性、即ち、ＧＤＰ及びピロホスフェートを得るためにグアノシン−３’，５’−ビス（二リン酸）（＝ｐｐＧｐｐ）の分解を触媒する能力を意味する。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される用語「ｐｐＧｐｐアーゼ」は、ｐｐＧｐｐアーゼ活性を有する酵素を意味し、その酵素はｐｐＧｐｐアーゼ活性を含む、ｐｐＧｐｐアーゼ活性のみ又は複数の活性を有し得る。ｐｐＧｐｐは、グアノシン−５’−三リン酸、グアノシン３’−二リン酸５’−三リン酸（＝ｐｐｐＧｐｐ）からの３’−二リン酸ピロホスファターゼ（ＥＣ３．６．１．４０）、ＡＴＰ及びＧＴＰからのＧＴＰジホスホキナーゼ（ＥＣ２．７．６．５、しばしば文献にＰＳＩ及びＰＳＩＩと略される）によって次々に産生される化合物の作用によって産生される。好ましい実施態様では、「（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンテターゼ活性」との用語は、好ましくはＡＴＰの加水分解によって、２種の化合物ｐｐｐＧｐｐ及びｐｐＧｐｐのうちの少なくとも１つ、好ましくは両方を生成するために、本願明細書で使用されるような能力を含む。従来技術は、例えば、Ｂｌａｔｔｎｅｒら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２７７：１４５３〜１４６２頁（１９９７年））及び、データベース、例えば、ＮＣ＿００３１９７（ＲＥＧＩＯＮ：３９３４０７０−３９３６１８１）、ＮＣ＿００９８３２（ＲＥＧＩＯＮ：（５３９１４２１−５３９３５３２）、ＮＣ＿００７６１３、ＮＣ＿００４７４１、ＮＣ＿０１３９７１及びＮＣ＿００９６４８において多数のｐｐＧｐｐアーゼ及びｐｐＧｐｐアーゼをコードする遺伝子を記載している。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、その野生型に対して低下したｐｐＧｐｐアーゼ活性を有し且つ「好ましくは必須アミノ酸、更に一層好ましくはセリン由来の必須アミノ酸、最も好ましくはメチオニン又はトリプトファンを過剰生産する」ようにその野生型に対して遺伝的に改変された細胞との表現は、細胞のベースとなる出発菌株が、ｐｐＧｐｐアーゼ活性の低下の更に前に且つ無関係に、その元の野生型菌株と比較して増加した量の関連アミノ酸を既に産生していることを意味する。
【００４３】
当業者は、従来技術、例えば、Cornish-Bowden, Fundamentals of Enzym Kinetics, Portland Press Limited, 1995においてかかる測定で得られた動力学的パラメーターの専門家の評価及び解釈の方法と関連して説明されてきたもののように、活性アッセイに基づいて、酵素の活性、例えば、ｐｐＧｐｐアーゼ又は（ｐ）ｐｐＧｐｐシンテターゼの活性を決定し得る。従来技術は、更に（ｐ）ｐｐＧｐｐシンテターゼ（Mecholdら, 1996年, J. Bact. 178, 1401〜1411頁）及びｐｐＧｐｐアーゼ（Gallantら, 1970年, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 35, 397）の活性を決定するための特別なアッセイを記載している。簡単に言えば、これは放射性同位元素識別ヌクレオチドによって決定されるべき活性を有する細胞を標識すること、４００μｇ／ｍｌのバリンを添加することによってイソロイシンに関してこれらを飢餓にすること、その後に、０．６６Ｎのギ酸中での１５分のバリン阻害、続いて１．５Ｍのリン酸二水素カリウム中でＰＥＩセルロースプレートでの薄層クロマトグラフィによるｐｐｐＧｐｐ、ｐｐＧｐｐ、ｐｐｐＧ及びｐｐｐＡの分別後に細胞のヌクレオチドプールを抽出すること及びオートラジオグラフィを用いて可視化することを含む。好ましい実施態様では、「その野生型よりも低下したｐｐＧｐｐアーゼ活性を有するようにその野生型に対して遺伝的に改変された細胞」とは、かかる細胞が同等の条件下で、時間単位当たりに加水分解されたｐｐＧｐｐ分子の数によって測定された、野生型細胞よりも低いｐｐＧｐｐアーゼ活性、即ち、好ましさの高まる順に、７０％、６０％、４０％、２０％、１０％又は５％未満の野生型細胞の活性を有することを意味する。更に好ましい実施態様では、「その野生型に対して実質的に変化していない（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンテターゼ活性を有する細胞」とは、前記細胞が同等の条件下で、単位時間当たりに合成された（ｐ）ｐｐＧｐｐ分子の数によって測定された、少なくとも９０％、９５％、９９％、１０１％、１０５％、１１０％の活性の野生型細胞を有することを意味する。特に好ましい実施態様では、細胞は、その配列番号２又はその変異体のｐｐＧｐｐアーゼ活性が低下している大腸菌株であるが、前記細胞の（ｐ）ｐｐＧｐｐシンテターゼ活性は実質的に変化していない。
【００４４】
本発明の教示は、本願明細書で使用される生体高分子のアミノ酸又は核酸配列が本出願に記載された配列又は本願明細書で示された又は引用された従来技術の配列と同一であるが、本発明による教示は、１種以上のアミノ酸又は核酸の欠損、追加又は置換、さらにはかかる高分子又はその変異体を含む融合によって得られるかかる高分子の変異体も含む。好ましい実施態様では、「相同の」との用語と同義的に且つ交換可能に以下で使用されている、核酸配列又はアミノ酸配列の「変異体」との用語は、本願明細書で使用される通り、対応する元の野生型の核酸又はアミノ酸配列に対して、本願明細書では７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％又はそれ以上のパーセントの同一性と同義的に使用される、相同性を有する、異なる核酸配列又はアミノ酸配列を意味しており、好ましいのは、触媒活性部位を形成するもの以外のアミノ酸又は欠損若しくは置換される構造又は折りたたみにとって必須のアミノ酸又は単に保存的に置換されるアミノ酸である。先行技術は、保存的な及び非保存的なアミノ酸の置換の性質と、それらがどのように生成され得るかを教示しており（例えば、Berg, Jeremy M., Tymoczko, John L, and Stryer, Lubert. Biochemistry. 第6版. New York, N.Y.: W.H. Freeman and Company, 2007年を参照のこと）、また、２つの配列の相同の程度を計算するために使用され得るアルゴリズムを記載している（例えば、Arthur Lesk (2008年)、Introduction to bioinformatics, 第3版）。本発明の更に一層好ましい実施態様では、アミノ酸又は核酸配列の変異体は、好ましくは上記と相同の配列の他に、野生型分子又は元の分子と実質的に同じ酵素活性を有する。例えば、プロテアーゼとして酵素的に活性なポリペプチドの変異体は、ポリペプチド酵素と同じ又は実質的に同じタンパク分解活性、即ち、ペプチド結合の加水分解を触媒する能力を有する。更に好ましい実施態様では、核酸又はアミノ酸配列の「変異体」との用語は、前記核酸又はアミノ酸配列の少なくとも１つの活性部位及び／又は断片を含む。更に好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「活性部位」との用語は、アミノ酸配列又は核酸配列であって、その長さが完全な長さのアミノ酸配列よりも短く又は完全な長さのアミノ酸配列よりも短い前記アミノ酸配列又は野生型ポリペプチド又はその変異体、例えば、（ｐ）ｐｐＧｐｐシンテターゼと同じ酵素活性を実質的に有する野性型のアミノ酸配列よりも短い長さを有する前記アミノ酸配列又はコードされたアミノ酸配列をコードするアミノ酸配列又は核酸配列を意味する。特定の実施態様では、核酸の「変異体」との用語は、その相補鎖が好ましくは厳格な条件下で野生型の核酸に結合している核酸を含む。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーは、当業者によって容易に測定することができ、一般的にプローブの長さ、洗浄中の温度及び塩濃度に依存する。一般的に、より長いプローブは、ハイブリダイゼーションに対してより高い温度を要求するが、低い温度はより短いプローブにとって適切である。ハイブリダイゼーションが起こるかどうかは、一般的に、特に溶融温度よりも低い、その周囲で相補鎖にアニーリングする変性ＤＮＡの能力に依存する。ハイブリダイゼーショ��反応及び対応する条件のストリンジェンシーは、F. M. Ausubel (1995), Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons, Incに更に詳細に記載されている。ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ配列の同定のための指示は、とりわけ、ベーリンガーマンハイムＧｍｂＨのハンドブック「The DIG System Users Guide for Filter Hybridization（マンハイム、独国、1993年）」及びLieblらの（International Journal of Systematic Bacteriology 41 : 255-260 (1991年)）に当業者によって見出されている。好ましい実施態様では、ハイブリダイゼーションは厳格な条件下で実施される、即ち、プローブと標的配列、即ち、プローブで処理されたポリヌクレオチドが少なくとも７０％同一であるハイブリッドのみが形成される。洗浄工程を含むハイブリダイゼーションのストリンジェンシーが、緩衝組成物、温度及び塩濃度の変化によって影響を受けるか又は決定されることが知られている。ハイブリダイゼーション反応は一般に、洗浄工程と比較して比較的低いストリンジェンシーで実施される（Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996年）。ハイブリダイゼーション反応の場合、例えば、約５０℃〜６８℃の温度で５×ＳＳＣ緩衝液に相当する緩衝液を利用することが可能である。ここで、プローブも該プローブの配列と７０％未満の同一性を有するポリヌクレオチドでハイブリッド形成することができる。かかるハイブリッドはあまり安定ではなく、厳格な条件下で洗浄によって除去される。これは、例えば、塩濃度を２×ＳＳＣ、場合により続いて０．５×ＳＳＣ（The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany, 1995年）まで低下させることによって達成することができ、その際、好ましさの高まる順に、約５０℃〜６８℃、約５２℃〜６８℃、約５４℃〜６８℃、約５６℃〜６８℃、約５８℃〜６８℃、約６０℃〜６８℃、約６２℃〜６８℃、約６４℃〜６８℃、約６６℃〜６８℃の温度に調整される。約６４℃〜６８℃又は約６６℃〜６８℃の温度範囲が好ましい。任意に塩濃度を０．２×ＳＳＣ又は０．１×ＳＳＣに相当する濃度に低下させることが可能である。約１〜２℃から５０℃〜６８℃の段階で、ハイブリダイゼーション温度を段階的に高めることによって、利用されるプローブの配列と又は配列番号１、配列番号３又は配列番号５に記載されたヌクレオチド配列と、好ましさの高まる順に、少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチド断片が単離され得る。ハイブリダイゼーションの更なる説明は、「キット」（例えば、DIG Easy Hyb from Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、独国、カタログＮｏ．１６０３５５８）の形で市場で得られる。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、核酸の「変異体」との用語は、遺伝コードの縮重の結合内のこのアミノ酸配列の元の核酸又は変異体と同じアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を含む。
【００４５】
核酸及びアミノ酸レベルの両方で、生体高分子中への特定の変異の導入は、現在では、分子生物学、微生物学及び生化学の日常的に使用される標準方法の一部である。例えば、突然変異誘発性オリゴヌクレオチドを使用する部位特異的突然変異誘発の方法（T. A. Brown: Gentechnologie fur Einsteiger [Genetic engineering for beginners], Spektrum Akademischer Verlag, ハイデルベルグ、独国、1993年）が使用され得るか又はGaitによるマニュアル: Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, オックスフォード、英国、1984年)又はNewton及びGrahamによるマニュアル（PCR, Spektrum Akademischer Verlag, ハイデルベルグ、1994年）に記載されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が使用され得る。変異を操作するために、例えば、Stratagene社（アムステルダム、オランダ）製のクイックチェンジ部位特異的突然変異誘発キットが使用され得る。これらの方法の使用は、出発配列、例えば、従来技術に記載されたｐｐＧｐｐアーゼ−コード配列を、野生型菌株の単離された全ＤＮＡから出発するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅すること、前記配列を適したプラスミドベクター中でクローニングすること、その後にＤＮＡを突然変異誘発プロセスにかけることを含む。「GeneSOEing」（Gene Splicing by Overlap Extension, Horton, Molecular Biotechnology 3: 93-98 (1995年)）により、点突然変異が更にＰＣＲによって得られる。ヌクレオチド配列のデノボ遺伝子合成（例えば、GENEART AG, レーゼンブルグ、独国）もスポット遺伝子に突然変異を生じさせるために使用され得る。生じた突然変異を決定し、例えば、サンガーらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci. 74 (12): 5463-5467, 1977年）によるＤＮＡ配列決定によって確認することができる。生じた対立遺伝子は、例えば、形質転換及び遺伝子又は対立遺伝子交換の方法によって、適切な菌株の染色体に組み込まれ得る。
【００４６】
ハミルトンらによって記載された慣用の方法（Journal of Bacteriology 171, 4617 - 4622 (1989年)）は、条件的に複製するｐＳＣ１０１誘導体ｐＭＡＫ７０５による又はｐＫＯ３による遺伝子交換の方法(Linkら, Journal of Bacteriology 179: 6228-6237)である。従来技術に記載された他の方法、例えば、Martinez-Moralesらの方法（Journal of Bacteriology 1999, 7143-7148 (1999年)）又はBoydらの方法（Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000年)）も同様に使用され得る。
【００４７】
別の慣用法は、短い、相同の隣接配列を介してＰＣＲ又は遺伝子合成によって生じたＤＮＡ断片を、ラムダレッドリコンビナーゼ（Lambda Red recombinase）を用いて直接、染色体中に組み込むこと、又は置換を実施することからなる（Proc. Natl. Acad. Sci. 97(12), 6640-6645 (2000年); Nature Genetics 20, 123 - 128, 1998年）。
【００４８】
生じた対立遺伝子を、接合又は形質導入によって、様々な菌株中に移すことも可能である。
【００４９】
核酸又はアミノ酸配列中に自然に発生しない多数の人工ヌクレオチド又はアミノ酸を、例えば、完全な化学合成の過程で又は細胞の翻訳装置を変更することによって、生物学的高分子中に導入することは技術的に可能であるが、本発明は、好ましい実施態様において、特定のポリペプチド中に最初から存在する１種以上のアミノ酸を交換するための置換のためにタンパク質を構成するＬ−アミノ酸のみを提供する。好ましい実施態様において、「タンパク質を構成する」アミノ酸との用語は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリンの全てのＬ形のアミノ酸の中から任意のアミノ酸を意味する。好ましい実施態様において、本願明細書で使用される、ポリペプチドの野生型配列におけるアミノ酸の「相同の」アミノ酸との用語は、一次構造に関して野生型配列に関係する、異なるアミノ酸配列において同定されるアミノ酸を意味しているが、野生型配列中のアミノ酸に相当するアミノ酸である又は関連するアミノ酸配列中のそれらの対応する位置を占める２つの配列の配置に基づいている。２つ以上のアミノ酸配列のアラインメントを実施する方法は、従来技術、例えば、Arthur Lesk (2008年), Introduction to bioinformatics, 第３版に記載されており、Clustal W（Thompsonら, Nucleic Acids Research 22, 4637-4680, 1994年）又はＭＡＦＦＴ（Katohら, Genome Information, 16(1), 22-33, 2005年）などのソフトウェアパッケージの使用を含む。例えば、ヒトＰａ×６遺伝子によってコードされたポリペプチド中のＡｒｇ２６は、ショウジョウバエ遺伝子ｅｙｌｅｓｓのＡｒｇ５９と相同である（Lesk (2008)、第３６頁を参照のこと）。
【００５０】
本発明による変異体の遺伝学的な調製方法は、遺伝子工学的方法の他に、腸内細菌株の細胞集団及び変異原、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、５−ブロモウラシル又は紫外光を用いるｉｎ  ｖｉｖｏ突然変異誘発法などの従来の遺伝学的な方法も含む。突然変異誘発法は、例えば、一般的な細菌学のための方法のマニュアル（Gerhardら(編集)、American Society for Microbiology、ワシントン、DC、米国、1981年）又はTosakaら（Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978年)）又はKonicekら（Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988年)）に記載されている。ＭＮＮＧを使用する典型的な突然変異誘発反応は、５０〜５００ｍｇ／ｌの濃度又はせいぜい１ｇ／ｌまでの更に高い濃度、及びｐＨ５．５〜７．５で１〜３０分間にわたるインキュベーションを含む。これらの条件下で、生存細胞の数は、およそ５０％〜９０％又はおよそ５０％〜９９％又はおよそ５０％〜９９．９％以上の割合だけ減少する。
【００５１】
変異体又は細胞は、突然変異誘発された細胞集団から除去され且つ伝播される。更なる工程では、好ましくは、適した栄養培地を使用するバッチ培養において、アミノ酸、好ましくはメチオニン又はトリプトファンを分泌するそれらの能力が調査されている。適切なロボットシステムを使用する場合、例えば、ツィンマーマンら（VDI Berichte No.1841, VDI-Verlag、デュッセルドルフ、独国、２００４年、４３９〜４４３頁）又はツィンマーマン（Chemie Ingenenieur Technik 77 (4), ４２６〜４２８頁（２００５年））に記載される通り、多数の変異体を短時間で調査することができる。一般に、３０００個以下、１００００個以下、３００００個以下又は更に６００００個以下、適切であればそれより多くの変異体が調査されている。親株又は変異誘発されていない出発株と比較して、増加した栄養培地中への又は細胞内部へのアミノ酸の分泌を示す突然変異体は、このように同定されている。これらは、例えば、アミノ酸分泌が少なくとも０．５％増加する突然変異体を含んでいた。
【００５２】
次にＤＮＡが変異体から調製又は単離され、そして対応するポリヌクレオチドは、本発明によるスポット遺伝子又はスポット対立遺伝子の増幅又は本発明による突然変異体の増幅を可能にするプライマー対を用いるポリメラーゼ連鎖反応により合成される。ＤＮＡは好ましくは増加した程度までのアミノ酸を分泌する突然変異体から単離される。
【００５３】
好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「遺伝子」との用語は、最初にリボ核酸（ＲＮＡ）の産生（転写）に関する情報を含む、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の一区画を意味しており、その際、ポリペプチドが（ｐ）ｐｐＧｐｐシンテターゼＩＩの活性を有する場合に、これはタンパク質（ポリペプチド）の産生（翻訳）に関する情報を含む。遺伝子又はポリヌクレオチドがタンパク質を産生する情報を含む事実は、遺伝子による又はＲＮＡによるタンパク質又はポリペプチドのコードとも呼ばれる。遺伝子発現とは、ＤＮＡ及び遺伝子に含まれる遺伝情報からのＲＮＡ及びタンパク質の生合成を意味する。内因性遺伝子又はポリヌクレオチドは、種の集団中に存在するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、遺伝子又は対立遺伝子又はそれらのポリヌクレオチドを意味すると理解されている。「遺伝子」及び「ＯＲＦ」（オープンリーディングフレーム）との用語は、本発明において同義的に使用される。
【００５４】
好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「ポリヌクレオチド」との用語は、未修飾ＲＮＡ又はＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ又はＤＮＡであってよい、ポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドを意味しており、その際、ポリヌクレオチドとの用語は、「核酸」との用語と同義的に且つ交換可能に使用されている。
【００５５】
好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「ポリペプチド」との用語は、ペプチド結合を介して結合された２種以上のアミノ酸を含むペプチド又はタンパク質を意味する。ポリペプチド及びタンパク質との用語は同義的に使用されている。タンパク質は、全ての細胞の基本的なビルディングブロックの１つである。それらは細胞に構造を与えるだけでなく、物質を運び、化学反応を触媒し且つシグナル伝達物質を認識する分子「機械」でもある。
【００５６】
当業者は、ポリペプチド又はコード遺伝子の変異体又は突然変異体を設計する際に、あるアミノ酸を従来の方法で野生型の配列中のアミノ酸と交換する場合、類似の又は更に同一の特性を有するポリペプチドに至る可能性が非常に高いことを知っている。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「保存的な」置換との用語は、アミノ酸が類似の物理化学的性質を有するタンパク質を構成するアミノ酸によって置換されることを意味する。更に一層好ましい実施態様では、これは以下の群のいずれかのアミノ酸が同じ群からの別のアミノ酸によってのみ置換されることを意味し、前記群は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ及びＴｈｒを含む小さいアミノ酸の群を含み、Ｃｙｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ及びＬｅｕを含む中低度の大きさの非極性アミノ酸の群、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ及びＴｒｐを含む大きな非極性アミノ酸の群、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ及びＡｓｎを含む、側鎖に電荷のない極性アミノ酸の群、Ｌｙｓ及びＡｒｇを含む正の荷電のアミノ酸の群、及びＧｌｕ及びＡｓｐを含む負に荷電したアミノ酸の群を含む。
【００５７】
本発明による教示は、原則的にアミノ酸の製造のために利用され得る。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「アミノ酸」との用語は、少なくとも１つのアミノ基及び１つのカルボキシ基を含む有機酸、好ましくは同じ炭素原子によって共有結合された有機酸、最も好ましくはＬ型のアミノ酸を意味すると理解されている。好ましい実施態様では、本発明による細胞又は本発明による方法は、必須の及び／又はセリン由来の及び／又は芳香族のアミノ酸を調製するために利用されている。好ましい実施態様では、「必須」アミノ酸との用語は、高等真核生物、好ましくは温血動物高等真核生物、更に一層好ましくは鳥類又は哺乳動物によって独立して産生することができないアミノ酸を意味する。更に好ましい実施態様では、これはその生命体がそれ自体を産生できるアミノ酸も含むが、これは適切な前駆体、最も好ましくは別のアミノ酸において栄養物と一緒に取る場合のみである。好ましい実施態様において、本願明細書で使用される「セリン由来のアミノ酸」との用語は、セリンを反応物として消費する少なくとも１つの反応を含む生合成経路を介して産生されるアミノ酸を意味するが、前記生合成経路は好ましくは産生されるべきアミノ酸の構造のタスクに直接寄与する反応のみを含み、単に補助因子を再生する反応は含まない。
【００５８】
本発明による細胞又は本発明による方法で産生される又は利用される細胞は、生物工学で利用され得る多数の生命体の細胞であってよい。好ましい実施態様では、これは原核又は下等真核細胞である。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「下等真核細胞」との用語は、単細胞真核細胞、好ましくは酵母細胞を意味する。下等真核細胞の例としては、サッカロミセス属、シゾサッカロミケス属、カンジダ、ピキア及びヤロウィアの酵母が挙げられる。別の好ましい実施態様では、細胞は原核細胞、更に好ましくはグラム陰性細菌、更に一層好ましくはエシェリキア（Escherichia）、エルウィニア（Erwinia）、プロビデンシア（Providencia）及びセラチア（Serratia）を含む属の群から選択される細胞、更に一層好ましくはエシェリキア属由来の細胞、最も好ましくは大腸菌である。好ましい実施態様では、これは純粋な培地によって維持される単離された細胞である。更なる実施態様は培地の混合物を使用する。最も好ましい実施態様では、細胞は菌株ＥＭＣ１＿ｓｐｏＴ１８４９のバクテリアであり、実施例４を参照されたい。
【００５９】
少なくとも１種のアミノ酸を調製するための本発明による細胞は、好ましくは無傷であり、損なわれていない代謝活性を有する。しかしながら、本発明による教示はまた、その代謝が当該アミノ酸（単数又は複数）を未だ産生することが可能な、部分的に溶解し且つ部分的に精製された細胞を用いることによって実施され得る。本発明による細胞が飼料添加物の一部として使用される場合、任意の細胞の精製段階は、無傷の細胞〜部分的に又は完全に溶解した細胞から純粋なアミノ酸まで可能である。
【００６０】
本発明によれば、特に好ましいのは、セリン由来の必須アミノ酸、好ましくはメチオニン又はトリプトファン、又は芳香族アミノ酸、特にトリプトファン、低下したｐｐＧｐｐアーゼ活性に導く遺伝的な改変の前に既に天然から取られたその野生型よりも増加した量の特定のアミノ酸、即ち、対応する出発菌株の形のアミノ酸である。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される、「親菌株」との用語と交換可能に使用される、「出発菌株」との用語は、１種以上のアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の生産性を高める手段、又は１種以上の酵素の活性を高める手段、例えば、過剰発現をもたらす手段が実施される微生物菌株を意味する。出発菌株は野生型菌株であるだけでなく、予め改変された菌株、例えば、産生株として使用され得る、少なくとも１種のＬ−アミノ酸を過剰生産する菌株であってもよい。
【００６１】
従来技術は、関連アミノ酸を過剰生産する多数の菌株、さらにはかかる過剰生産が達成され得る手段及び改変を開示している。好ましい実施態様では、Ｌ−メチオニンを分泌又は産生する大腸菌株は、好ましくは強化されたアスパラギン酸キナーゼ（ＥＣ２．７．２．４）酵素活性を有し、その際、フィードバック耐性対立遺伝子が好ましい。大腸菌では、遺伝子ｔｈｒＡ、ｍｅｔＬ及びｌｙｓＣによってコードされる、３つの異なるアスパラギン酸キナーゼが存在する。別の好ましい実施態様では、Ｌ−メチオニン生合成は、ｍｅｔＪ遺伝子によってコードされた調節タンパク質ＭｅｔＪの減衰又は欠失によって増加する。ＭｅｔＪは大腸菌のＬ−メチオニン生合成の主要なリプレッサーである。
【００６２】
更に好ましい実施態様では、細胞の出発菌株は、大腸菌ＭＧ１６５５、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＤＨ１０Ｂ、大腸菌ＢＷ２９５２、大腸菌ＲＥＬ６０６を含む群からの菌株に由来する。
【００６３】
本出願における従来技術からの核酸及びアミノ酸配列を引用するために使用される全ての受託番号及び受託コードは、２０１１年１２月１日にオンラインで入手可能なバージョンの、ＩＳＲ、ＣＡ、ＵＳＡのＢｉｏＣｙｃデータベースからの受託番号及び受託コードである。
【００６４】
更に好ましい実施態様では、細胞は、メチオニン過剰生産大腸菌産生株ＭＧ１６５５Δ  ｍｅｔＪ  ｍｅｔＡ＊１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｕｒＵ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦに由来し、これらは産生プラスミドｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−Ｐｇａｐ−ｍｅｔＡ＊１１及びｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣを含む（ＷＯ２００９／０４３８０３号）。
【００６５】
更に好ましい実施態様では、細胞はメチオニン過剰生産大腸菌産生株ＭＧ１６５５ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰに由来し、これらは産生プラスミドｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−Ｐｇａｐ−ｍｅｔＡ＊１１を含む。この菌株は、出願ＷＯ２００９／０４３８０３号に記載されるように、多くのＰ１形質導入及び養生によってクローニングされ得る。この菌株は、野生型の菌株大腸菌Ｋ１２ＭＧ１６５５に基づく。以下の改変がこの株のゲノムに導入された：Ｌ−メチオニン生合成のリプレッサーのための遺伝子、ｍｅｔＪの欠失；コバラミン依存性メチオニンシンターゼをコードするｍｅｔＨ遺伝子の強力なｔｒｃプロモータ上流の挿入；５，１０−メチレンテトラヒドロフォレートレダクターゼをコードするｍｅｔＦ遺伝子の強力なｔｒｃプロモータ上流の挿入；サルフェート／チオサルフェート摂取トランスポータをコードするｃｙｃＰＵＷＡ及びシステインシンターゼＢをコードするｃｙｓＭによる、ｃｙｓＰＵＷＡＭオペロンの強力なｔｒｃプロモータ上流の挿入；亜硫酸レダクターゼをコードするｃｙｓＪＩ及び３’−ホスホ−アデニリル−サルフェートレダクターゼをコードするｃｙｓＨによる、ｃｙｓＪＩＨオペロンの強力なｔｒｃプロモータ上流の挿入；グリシン開裂系の３つの構成要素をコードするｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ及びｇｃｖ  Ｐによる、ｇｃｖＴＨＰオペロンの強力なｔｒｃ０９プロモータ上流の挿入。
【００６６】
大腸菌産生プラスミドｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ＊１−ｃｙｓＥ−Ｐｇａｐ−ｍｅｔＡ＊１１のクローニングは、出願ＷＯ２００７／０７７０４１号及びＷＯ２００９／０４３８０３号に記載されている。これはベクターｐＣＬ１９２０をベースとした低コピープラスミドである（Lerner, C.G.及びInouye, M., Nucl. Acids Res. (1990年) 18:4631 [PMID: 2201955]）。空のプラスミド、ｐＭＥ１０１は、ｌａｃリプレッサーの強力に発現した対立遺伝子をコードするｌａｃｌｑ遺伝子を保有している。ｔｈｒＡ＊１遺伝子は、Ｌａｃリプレッサーによって表され得る強力なｔｒｃプロモータの下流でクローニングされた。これは大腸菌ＴｈｒＡアスパラギン酸キナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼのフィードバック耐性変異体をコードする。その天然のプロモータを含むｃｙｓＥ遺伝子は、その下流に同じ方向で配置されている。これは大腸菌セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする。以下のｃｙｓＥの下流は、ｍｅｔＡ＊１１遺伝子の発現を制御する強力な大腸菌ｇａｐＡプロモータである。ｍｅｔＡ＊１１は大腸菌ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼのフィードバック耐性変異体をコードする。
【００６７】
記載され得る他のＬ−メチオニン−分泌及び産生微生物の例は以下の菌株である：大腸菌ＴＦ４０７６ＢＪＦ  ｍｅｔＡ＃１０＋ｍｅｔＹＸ（Ｌｍ）（ＷＯ２００８／１２７２４０号）；大腸菌Ｗ３１１０ΔＪ／ｐＫＰ４５１（ＥＰ１４４５３１０Ｂ１号、第７頁、実施例４）；大腸菌ＷΔｔｈｒＢＣΔｍｅｔＪｍｅｔＫ３２  ｐＭＷＰｔｈｒｍｅｔＡ４Δ５Δ９（Yoshihiro Usuda及びOsamu Kurahashi、２００５年、Applied and Environmental Microbiology、第７１巻、第６号、第３２２８〜３２３４頁）；及びＷ３１１０／ｐＨＣ３４（ＷＯ０１／２７３０７号第１３頁、実施例３）。様々な好適な微生物の更なる例は、Gomesら（Enzyme and Microbial Technology 37, 2005年, 3-18）に記載されている。
【００６８】
従来技術はまた、トリプトファン過剰生産菌株、さらにはこのアミノ酸の過剰生産が達成され得る手法及び改変、例えば、大腸菌ＪＰ４７３５／ｐＭＵ３０２８（ＵＳ５，７５６，３４５号）、大腸菌ＪＰ６０１５／ｐＭＵ９１（ＵＳ５，７５６，３４５号）、大腸菌ＳＶ１６４（ｐＧＨ５）（ＷＯ９４／０８０３１号）、大腸菌ＡＧＸ１７（ｐＧＸ４４）（ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６３）（ＵＳ４，３７１，６１４号）、大腸菌ＡＧＸ６（ｐＧＸ５０）ａｒｏＰ（ＮＲＲＬ  Ｂ−１２２６４）（ＵＳ４，３７１，６１４号）、大腸菌ＡＧＸ１７／ｐＧＸ５０、ｐＡＣＫＧ４−ｐｐｓ（ＷＯ９７／０８３３３号）、大腸菌ＡＴＣＣ３１７４３（ＣＡ１１８２４０９）、大腸菌Ｃ５３４／ｐＤ２３１０、ｐＤＭ１３６（ＡＴＣＣ３９７９５）（ＷＯ８７／０１１３０号）、大腸菌ＪＢ１０２／ｐ５ＬＲＰＳ２（ＵＳ５，９３９，２９５号）も記載している。
【００６９】
好ましい実施態様では、腸内細菌科のＬ−トリプトファン過剰生産株は、５−メチル−ＤＬ−トリプトファンへの耐性、５−フルオロトリプトファンへの耐性、４−メチル−ＤＬ−トリプトファンへの耐性、６−メチル−ＤＬ−トリプトファンへの耐性、４−フルオロトリプトファンへの耐性、６−フルオロトリプトファンへの耐性、アントラニレートへの耐性、トリプタザンへの耐性、インドールへの耐性、インドールアクリル酸への耐性、フェニルアラニンの必要性、チロシンの必要性、任意にスクロースを利用する能力、トリプトファンオペロンの強化、好ましくはアントラニル酸シンターゼの強化、好ましくはフィードバック耐性型の強化、部分的欠損のトリプトファニル−ｔＲＮＡシンターゼ、減衰トリプトファン摂取、欠損トリプトファナーゼ、不活性リプレッサータンパク質、セリン生合成の強化、ホスホエノールピルビン酸合成の強化、Ｄ−エリスロース−４−リン酸合成の強化、３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロソネート−７−ホスフェート（ＤＨＡＰ）合成の強化、及びコリスミ酸生合成の強化を含む群から選択される１つ以上の遺伝的表現型の特徴を有する。
【００７０】
ｐｐＧｐｐアーゼ活性の低下を引き起こす少なくとも１つの遺伝的改変の他に、本発明による細胞は、特に遺伝子の発現を変更することによって、当該アミノ酸の産生の増加に影響を及ぼす出発株に対して更なる改変を有し得る。好ましい実施態様では、細胞が、その野生型に対して、「少なくとも１つの核酸配列又はその変異体を低下した程度まで発現する又は過剰発現する」ように、その野生型に対して遺伝的に改変されているとの文言は、本願明細書で使用されるように、遺伝的に改変された細胞が、同等の条件下で、例えば、温度、栄養物の供給及び細胞密度の下で、遺伝的に改変されていない細胞が行うよりも少量の又は多量の転写及び／又は核酸配列の翻訳産物を産生することを意味する。
【００７１】
核酸の発現は、例えば、少なくとも１つのコピーによって、対応するポリヌクレオチドのコピー数を染色体で又は染色体外で増加させることによって増加され得る。コピー数を増大させる広く使用されている方法は、細菌によって複製されるベクター、好ましくはプラスミドに関連するポリヌクレオチドを挿入することから構成されている。腸内細菌に適したプラスミドベクターの例は、ｐＡＣＹＣ１８４由来のクローニングベクター（Bartolomeら; Gene 102: 75-78 (1991年)）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Amannら; Gene 69: 301-315, 1988年）、又はｐＳＣ１０１誘導体（Vocke及びBastia; Proc. Natl. Acad. Sci. 80 (21): 6557-6561, 1983年）である。また、ｐＣＬ１９２０由来のプラスミド（Lerner, C.G.及びInouye, M., Nucl. Acids Res., 1990年, 18:4631 [PMID: 2201955]）が特に適している。「細菌人工染色体」（ＢＡＣ）由来のプラスミドベクター、例えば、ｐＣＣＩ  ＢＡＣ（EPICENTRE Biotechnologies社、マディソン、米国）も同様に大腸菌内の関連するポリヌクレオチドのコピー数を増加させるのに適している。
【００７２】
さらに使用され得るベクターは、トランスポゾン、挿入エレメント（ＩＳエレメント）又はファージである。これらの遺伝系のタイプは、例えば、特許文献、ＵＳ４８２２７３８号、ＵＳ５８０４４１４号及びＵＳ５，８０４４１４号に例示されている。同様に、ＷＯ９２／０２６２７号に記載されたＩＳ要素ＩＳａＢＩ又はプラスミドｐＸＺ１０１４２のＴｎ４５トランスポゾン（”Handbook of Corynebacterium glutamicum”（編集者: L. Eggeling及びM. Bott）に引用）が使用され得る。
【００７３】
発現を増加させる別の一般的な方法は、染色体遺伝子増幅法である。この方法は、細胞の染色体に目的のポリヌクレオチドの少なくとも１つの追加のコピーを挿入することを含む。このタイプの増幅プロセスは、例えば、ＷＯ０３／０１４３３０号又はＷＯ０３／０４０３７３号に記載されている。
【００７４】
発現を増加させる別の方法は、プロモータ又は発現カセット（機能的に連結された）に関連する遺伝子又は対立遺伝子を機能的に連結することから構成されている。大腸菌に適したプロモータは、例えば、Amannら（Gene 69(2), 301 -315, 1988年）及びAmann及び Brosius（Gene 40(2-3), 183-190, 1985年）によって記載されたプロモータ、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６、Ｍ１３、ｌａｃ、ｔａｃ及びｔｒｃである。このタイプのプロモータは、例えば、典型的には、開始コドンから約１〜５００ヌクレオチド塩基の距離で、当該遺伝子の上流に挿入され得る。ＵＳ５，９３９，３０７号は、発現カセット又はプロモータ、例えば、ｔａｃプロモータ、ｔｒｐプロモータ、Ｉｐｐプロモータ又はＰＬプロモータ及びλファージのＰＲプロモータを、例えば、染色体スレオニンオペロンの上流に組み込むことによって、発現の増加を達成したことを報告している。Ｔ７−ファージプロモータ、ギアボックスプロモータ、ｎａｒプロモータ又は遺伝子ｒｒｓＧ、ｒｎｐＢ、ｃｓｒＡ、ｃｓｒＢ、ｏｍｐＡ、ｆｕｓＡ、ｐｅｐＱ、ｒｐｌＸ及びｒｐｓＧのプロモータは、同様の方法で使用され得る。ＥＰ０５９３７９２号に記載されているように、発現カセット又はプロモータのこれらのタイプもプラスミドに結合した遺伝子を過剰発現するために使用され得る。ｌａｃｌＱ対立遺伝子を使用することにより、遺伝子の発現を順番に制御することができる（Glascock及びWeickert、Gene 223, 221 -231, 1998年）。当業者は、挿入及び／又は欠失による１つ以上のヌクレオチド置換を用いてそれらの配列を改変することによって前記プロモータの活性を更に増加させ得る。
【００７５】
核酸又はその変異体の発現の程度は、遺伝子発現又はアンチセンスＲＮＡ技術によりシグナル構造の遺伝的改変（変異）によって、適切な培養管理によって低減され得る。遺伝子発現のシグナル構造は、例えば、リプレッサー遺伝子、アクチベーター遺伝子、オペレータ、プロモータ、減衰器、リボソーム結合部位、開始コドン及びターミネータである。当業者は、これらの情報を、とりわけ、例えば、ジェンセン及びハンマー（Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195, 1998年）、キャリア及びキースリング（Biotechnology Progress 15: 58-64, 1999年）、フランチ及びジェルド（Current Opinion in Microbiology 3: 159-164, 2000年）、Kawanoら（Nucleic Acids Research 33(19), 6268-6276, 2005年）、例えば、クニッペルスの教科書（”Molekulare Genetik” [Molecular Genetics], 第6版, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Germany, 1995年）又はウインナッカーの教科書（”Gene und Klone” [Genes and Clones], VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany, 1990年）などの遺伝子及び分子生物学の公知の教科書において見出している。好ましい実施態様では、本願明細書で使用される遺伝子の「ノックアウト」との用語は、遺伝子又は細胞機構が、その発現に要求されるか又は要求される核酸又はその一部、例えば、プロモータが、好ましい順に５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％発現が低減されるように、突然変異、欠失又は挿入により遺伝的に改変されたことを意味する。例えば、遺伝子の発現を、プロモータの制御下に置くことが可能であり、これは出発菌株と比較して、低減した本方法に使用される微生物における発現につながる。発現は、本方法に使用される微生物のその遺伝子又は一部を削除することによって更に低減され得る。また、ミスセンス突然変異又はナンセンス突然変異を導くトランジション、トランスバージョン又は挿入を用いることも可能である。発現は更に、出発菌株と比較して、本方法に使用される微生物における減少した翻訳をもたらすリボソーム結合部位を使用することによって低減され得る。当業者は更に、本方法に使用される微生物に関してコドンの使用頻度を少なくすることによって遺伝子の発現を低減させることができる。最後に、遺伝子発現は、適切なｔ−ＲＮＡサプレッサーによって、遺伝子のコード領域における終止コドン変異を抑制することによって低減され得る。
【００７６】
本発明による細胞又は本発明によって使用される細胞は、発酵プロセスにおいて所望のアミノ酸の分泌又は産生を、利用される出発菌株又は親株と比較して増加させ、その際、該アミノ酸は周りの培地中に放出されるか又は細胞内に蓄積される。
【００７７】
本発明による細胞の性能又は該細胞を用いる発酵プロセスの性能は、生成物濃度（体積当たりの生成物）、生成物収率（消費された炭素源当たりに形成された生成物）及び生成物形成（体積及び時間当たりに形成された生成物）又はその他のプロセスパラメータ及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上のパラメータに対して、出発株又は親株又はこれらを用いる発酵プロセスを基準として少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％又は少なくとも２％改善されている。
【００７８】
本発明による方法で培養され得る細胞は、Ｌ−アミノ酸を製造するために、例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００８８８２号に記載されるように連続的に培養され得るか、又は回分プロセス（バッチ培養）又は流加プロセス又は反復流加プロセスで不連続的に培養され得る。公知の培養方法の一般的な概要は、Chmielによる教科書（Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess Technology 1. Introduction to Bioprocess Technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991年)）又はStorhasによる教科書（Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and Peripheral Equipment] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994年)）で得られる。
【００７９】
使用されるべき培養培地又は発酵培地は、特定の菌株の要求を適切に満たさなければならない。異なる微生物を培養するための培地の説明は、例えば、米国微生物学協会（the American Society for Bacteriology）（米国、ワシントンＤ．Ｃ．１９８１年）によって刊行されたマニュアル”Manual of Methods for General Bacteriology”に示されている。培養培地、発酵培地及び培地との用語は相互に交換可能である。
【００８０】
利用される炭素源は、糖及び炭水化物、例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、テンサイ糖又はショ糖から誘導されるスクロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解物及びセルロース、油及び脂肪、例えば、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油及びココナッツ油、脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及びリノール酸、アルコール類、例えば、グリセロール、メタノール及びエタノール、有機酸、例えば、酢酸であってよい。これらの物質は、別個に又は混合物として使用され得る。
【００８１】
利用される窒素源は、有機窒素含有化合物、例えば、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、麦芽エキス、コーンスティープリカー、大豆粉及び尿素、又は無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、アンモニア及びチオ硫酸アンモニウムであってよい。窒素源は、単独で又は混合物として使用され得る。
【００８２】
利用されるリン源は、リン酸、リン酸二水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又は対応するナトリウム含有塩であってよい。
【００８３】
利用される硫黄源は、ジチオ硫酸の塩（チオ硫酸塩）単独で又は他の硫黄源、例えば、硫酸塩、亜硫酸塩、硫化物、硫化水素、メタンチオラート又は亜ジオチン酸塩と一緒であってよく、ＥＰ出願第１１１５１５２６．８号も参照されたい。
【００８４】
培養培地は更に、例えば、金属の塩化物の形で塩、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム及び鉄、例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有しなければならず、これらは成長のために必要とされている。最後に、アミノ酸などの成長物質、例えば、ホモセリン、及びビタミン、例えば、コバラミン、チアミン、ビオチン又はパントテン酸は、上記の物質に加えて使用され得る。
【００８５】
この他に、特定のアミノ酸の適切な前駆体が培地に添加されてもよい。
【００８６】
上記の利用される物質は、一回のみ混合物の形で培養物に添加されるか又は培養中に適切な方法で供給され得る。
【００８７】
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア又はアンモニア水などの塩基性化合物、又はリン酸又は硫酸などの酸性化合物が、培養物のｐＨを調節するために適切な方法で使用される。一般に、ｐＨは６．０〜９．０、好ましくは６．５〜８の値に調整される。泡の形成を制御するために、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用することが可能である。例えば、抗生物質、選択的に作用させる好適な物質が、プラスミドの安定性を維持するために培地に添加され得る。好気条件を維持するために、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば、空気が培養物中に通気される。また、過酸化水素で富化された液体を使用することも可能である。適切な場合、発酵は、０．０３〜０．２ＭＰａの圧力下にて正の圧力下で実施される。培養物の温度は、通常、２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃である。回分プロセスの場合、培養は、最大量の所望のアミノ酸が生成されるまで継続される。この目的は、通常１０時間〜１６０時間以内に達成される。より長い培養時間は、連続プロセスの場合に可能である。
【００８８】
好適な発酵培地は、とりわけ、米国特許第６，２２１，６３６号、同第５，８４０，５５１号、同第５，７７０，４０９号、同第５，６０５，８１８号、同第５，２７５，９４０号及び同第４，２２４，４０９号に記載されている。
【００８９】
この方法で調製された発酵ブロスは、次に、更なる処理が施されて固体又は液体生成物になる。
【００９０】
好ましい実施態様では、本願明細書で使用される「発酵ブロス」とは、微生物が、一定の温度で一定時間にわたり培養された発酵培地を意味すると理解されている。発酵培地、又は発酵中に用いられる培地は、微生物の増殖と所望のアミノ酸の形成に必要とされる全ての物質又は成分を含有する。
【００９１】
従って、発酵の終わりに、得られた発酵ブロスは、ａ）前記微生物の細胞の増殖によって生成された微生物のバイオマス、ｂ）発酵の間に形成された所望のアミノ酸、ｃ）発酵の間に形成された副生物、及びｄ）利用された発酵培地／発酵媒体の成分、又は利用される物質の成分、例えば、ビオチンなどのビタミン、ホモセリンなどのアミノ酸、又は硫酸マグネシウムなどの塩を含有し、これらの成分は発酵によって消費されなかった。
【００９２】
副生物は、特定の所望のＬ−アミノ酸の他に発酵で利用される微生物によって生成され、且つ分泌され得る物質を含む。それらは、所望のアミノ酸と比べて３０％、２０％又は１０％より少ない量のＬ−アミノ酸を含み、更に１個〜３個のカルボキシル基を有する有機酸、例えば、酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸又はフマル酸、さらには糖、例えば、トレハロースを含む。
【００９３】
工業用に適した典型的な発酵ブロスは、４０ｇ／ｋｇ〜１８０ｇ／ｋｇ又は５０ｇ／ｋｇ〜１５０ｇ／ｋｇのアミノ含有量を有する。一般に、バイオマス含有量（乾燥バイオマスによる）は２０〜５０ｇ／ｋｇである。
【００９４】
従来技術は、生成された培養ブロス又は発酵ブロスからアミノ酸を精製するための多数の方法を記載しており、これはイオン交換クロマトグラフィ、結晶化、抽出プロセス及び活性炭処理を含む。これは、９０質量％以上、９５質量％以上、９６質量％以上、９７質量％以上、９８質量％以上、９９質量％以上の含有率を有する大部分純粋なＬ−アミノ酸をもたらす。
【００９５】
同様に、発酵ブロス中に含有されるバクテリアのバイオマスを、完全に（１００％）又は殆ど完全に、即ち、９０％、９５％、９７％、９９％を超えて除去し、且つ発酵ブロスの他の成分を大部分、即ち、それらの３０％〜１００％、４０％〜１００％、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、又は９０％〜１００％、好ましくは５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は完全に（１００％）を生成物中に残すことによって生成される発酵ブロスからアミノ酸を精製することも可能である。
【００９６】
遠心分離、濾過、デカンテーション、凝集又はそれらの組み合わせなどの分離方法がバイオマスの除去又は分離のために使用されている。
【００９７】
得られたブロスは、次に、公知の方法を用いて、例えば、回転蒸発器、薄層蒸発器、流下膜式蒸発器を用いて、逆浸透、ナノ濾過又はそれらの組み合わせによって、増粘又は濃縮される。
【００９８】
この濃縮されたブロスは、次いで、凍結乾燥、噴霧乾燥、噴霧造粒の方法によって又は他のプロセスによって後処理されて、好ましくは注入可能な、微粉砕された粉末が得られる。この注入可能な、微細粉末は、その後、適切な締固め又は造粒法によって、容易に注入可能な、貯蔵可能な且つ殆ど無塵の製品に、順番に変換され得る。これは、製品中の水分含有率が１０質量％未満、５質量％未満、４質量％未満又は３質量％未満であるように、全体的に見て、９０％を上回る水を除去することを含む。
【００９９】
発酵の間の１つ以上の時間での濃度を測定するためのＬ−アミノ酸の分析は、Spackmanら（Analytical Chemistry 30: １１９０〜１２０６頁（１９５８年））に記載されるように、イオン交換クロマトグラフィ、好ましくはカチオン交換クロマトグラフィによってＬ−アミノ酸を分離し、その後にニンヒドリンを用いるポストカラム誘導体化によって実施され得る。また、ポストカラム誘導体化のためにニンヒドリンではなくオルト−フタルアルデヒドを利用することも可能である。イオン交換クロマトグラフィの概要の論文は、ピカリング（Pickering）（LC GC (Magazine of Chromatographic Science) 7(6), 484-487 (1989年)）に見出され得る。
【０１００】
同様に、例えば、オルト−フタルアルデヒド又はフェニルイソチオシアネートを使用することによって、プレカラム誘導体化を実施し、得られるアミノ酸誘導体を、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の形で、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ）によって分画することも可能である。この種の方法は、例えば、Lindrothら（Analytical Chemistry 51: 1167-1174 (1979年)）に記載されている。
【０１０１】
検出は、測光法（吸光度、蛍光）により行われる。
【０１０２】
アミノ酸分析に関する概要は、とりわけ、Lottspeich及びZorbasによる教科書”Bioanalytik”（Spektrum Akademischer Verlag、独国ハイデルベルグ、1998年）に見出され得る。
【０１０３】
本発明は、本発明の更なる特徴、実施態様、態様及び利点が引き出され得る、以下の図面及び非限定的な実施例によって更に例示される。
【０１０４】
図１はｌｉｇＢ遺伝子の断片を含有するプラスミドｐＭＡＫ−ｌｉｇＢのマップを示す。
図２はプラスミドｐＣＣ３のマップを示す。
図３はプラスミドｐＭＥ−ＲＤＬ２ａのマップを示す。
【０１０５】
長さ情報は近似値として解釈されるべきである。使用される略語及び参照名は以下の意味を有する：
・  ａａｄＡ１：ストレプトマイシン／スペクチノマイシン耐性遺伝子
・  ｌａｃｌｑ：ｔｒｃ−プロモーターリプレッサータンパク質の遺伝子
・  ｒｅｐＡｔｓ：プラスミド複製タンパク質（ｔｓ）；またｒｅｐＡ
・  ｏｒｉＶ：複製起点
・  ｏｒｉ２：複製起点
・  ｃａｍ／Ｃｍ：クロラムフェニコール耐性遺伝子
・  ｌｉｇＢインサート：ｌｉｇＢ遺伝子のコード領域の一部
・  ｓｅｒＣ：ｓｅｒＣ遺伝子のコード領域
・  ｓｅｒＡ：ｓｅｒＡ遺伝子のコード領域
・  ｇｌｙＡ：ｇｌｙＡ遺伝子のコード領域
・  ｓｅｒＢ：ｓｅｒＢ遺伝子のコード領域
・  ｔｈｒＡ＊１：ｔｈｒＡ遺伝子のコード領域（フィードバック耐性対立遺伝子）
・  ｃｙｓＥ：ｃｙｓＥ遺伝子のコード領域
・  ＰｇａｐＡ：ＧＡＰプロモーター
・  ｍｅｔＡ＊１１：ｍｅｔＡ遺伝子のコード領域（フィードバック耐性対立遺伝子）
・  ＲＤＬ２ａ：チオ硫酸硫黄トランスフェラーゼをコードするＲＤＬ２対立遺伝子のコード領域
【０１０６】
制限酵素の略語は以下のように定義されている：
・  Ａｇｅｌ：Ruegeria gelatinovora由来の制限エンドヌクレアーゼ
・  Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ：インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）由来の制限エンドヌクレアーゼ
・  Ｘｂａｌ：グラム陰性細菌（Xanthomonas campestris）由来の制限エンドヌクレアーゼ
・  Ｋｐｎｌ：肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）由来の制限エンドヌクレアーゼ
【０１０７】
本発明は、例示的な実施態様に基づいて以下に更に詳細に説明される。
【０１０８】
大腸菌に使用される最小培地（Ｍ９）及び完全な培地（ＬＢ）は、J.H. Miller（A Short Course in Bacteriol Genetics (1992年), Cold Spring Harbor Laboratory Press）によって記載されている。大腸菌由来のプラスミドＤＮＡの単離及び制限、連結、クレノー処理及びアルカリホスファターゼ処理に関する全ての技術は、特段記載されない限り、Sambrookら（Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989年) Cold Spring Harbor Laboratory Press）に従って実施されている。大腸菌の形質転換は、特段記載されない限り、Chungら（Proc. Natl. Acad. Sci. 86: 2172-2175, 1989年）に従って実施されている。
【０１０９】
特段記載されない限り、菌株及び形質転換株の生産のためのインキュベーション温度は３７℃である。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１はｌｉｇＢ遺伝子の断片を含有するプラスミドｐＭＡＫ−ｌｉｇＢのマップを示す。
【図２】図２はプラスミドｐＣＣ３のマップを示す。
【図３】図３はプラスミドｐＭＥ−ＲＤＬ２ａのマップを示す。
【０１１１】
実施例１
ｐＭＡＫ−ｌｉｇＢのクローニング
プラスミドｐＭＡＫ−ｌｉｇＢを、ｓｐｏＴ対立遺伝子の形質導入のための選択マーカーとしてクローニングし、これを大腸菌ＤＭ１８４９の染色体中のｌｉｇＢ遺伝子に挿入した。ｌｉｇＢ遺伝子をｓｐｏＴの約１．２ｋｂｐ上流の染色体に配置する。大腸菌ＤＭ１８４９菌株は本発明によるｓｐｏＴ対立遺伝子を有する。
【０１１２】
ＰＣＲプライマーｌｉｇＢ−アップ及びｌｉｇＢ−ダウンは、それらの５’末端に、それぞれの場合に、ランダムに選択されたヌクレオチドを有し、その後に、それぞれ、制限エンドヌクレアーゼＸｂａｌ（ｔｃｔａｇａ）及びＫｐｎｌ（ｇｇｔａｃｃ）についての認識配列が続く。ｌｉｇＢ−アップのヌクレオチド１３〜３２は、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムにおける位置３８１７４９６番目から３８１７５１６番目まで結合する。ｌｉｇＢ−ダウンのヌクレオチド１３〜３２は、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノムにおける位置３８１８５１９番目から３８１８４９８番目まで結合する。
2015508647.tif 000002
【０１１３】
これらの２つのプライマー及び大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡをテンプレートとしてＰＣＲを実施するために使用した。ＰＣＲ産物は、１０４５ｂｐの長さであり、ＭＧ１６５５ゲノム（配列番号１１）の３８１７４９６番目から３８１８５１９番目までの位置の配列を含んでいた。
【０１１４】
前記ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（キアゲン、ヒルデン、独国）を用いて精製し、ＸｂａＩ及びＫｐｎＩ制限酵素によって切断し、再び精製した。プラスミドｐＭＡＫ７０５（Hamilton CM, Aldea M, Washburn BK, Babitzke P, Kushner SR (1989); J Bacteriol.; 171 (9): 4617-4622）を、ＸｂａＩ及びＫｐｎＩ制限酵素によって切断し、アルカリホスファターゼ（アルカリホスファターゼ、仔ウシ腸管、New England Biolabs社、フランクフルトアムマイン、独国）によって脱リン酸化し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（キアゲン、ヒルデン）を用いて精製した。ＰＣＲ産物を、次いでｐＭＡＫ７０５で連結し、結合混合物を大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。正確なプラスミドクローンを、２０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールによって選択し、制限切断及びその後の挿入物の配列決定により同定した。この方法で得られたプラスミドをｐＭＡＫ−ｌｉｇＢと命名した。
【０１１５】
実施例２
ｐＭＡＫ−ｌｉｇＢのドナー株ＤＭ１８４９への導入
大腸菌株ＤＭ１８４９はｐｐＧｐｐアーゼコードｓｐｏＴ遺伝子中に３つの突然変異を有する：ヌクレオチド位置２５２の下流の６つのヌクレオチドＣＡＴＧＡＴの挿入（ＭＧ１６５５ゲノム中の位置３８２０６７４に対応）、置換ｇ５２０ｔ（ＭＧ１６５５ゲノム中の位置３８２０９４２に対応する野生型ｓｐｏＴ遺伝子に基づく）及び置換ｃ１５８５ｔ（ＭＧ１６５５ゲノム中の位置３８２２００７に対応する野生型ｓｐｏＴ遺伝子に基づく）。
【０１１６】
ＤＭ１８４９株を電気穿孔法によりプラスミドｐＭＡＫ−ｌｉｇＢで形質転換した。ｐＭＡＫ−ｌｉｇＢはクロラムフェニコール耐性遺伝子と複製の温度感受性起源を有する。温度感受性起源は４４℃ではなく３０℃で大腸菌によって複製される。形質転換混合物を２０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上にプレーティングし、３０℃で４０時間インキュベートした。次に細胞を、接種ループを用いてピックアップし、ＬＢ培地に再懸濁し且つＬＢ培地で１００００分の１に希釈した。１００μｌの希釈溶液を２０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上にプレーティングし、４４℃で更に２４時間インキュベートした。その結果、ｐＭＡＫ−ｌｉｇＢプラスミドがｌｉｇＢ遺伝子に染色体に組込まれたコロニーを選択した。これらのコロニーの１つを、２０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上で接種ループを用いて採取し、これを４４℃で２４時間インキュベートした。得られた菌株を、ＤＭ１８４９：：ｐＭＡＫ−ｌｉｇＢと命名した。
【０１１７】
実施例３
ＤＭ１８４９：：ｐＭＡＫ−ｌｉｇＢからのＰ１−ファージライブラリの生成
まず、１０ｍｌのＬＢ培地をＤＭ１８４９：：ｐＭＡＫ−ｌｉｇＢ株で接種し、これを４４℃で１８時間培養した。その後、１００μｌの培養物を、１０ｍｌのＬＢ培地に移し、これを４４℃で０．５の光学密度（６００ｎｍ）まで培養した。次に、５ｍＭの最終濃度までの塩化カルシウム、及び２ｇ／ｌの最終濃度までのグルコースを添加した。この後に、１００μｌのＰ１−ファージ懸濁液を添加し、３７℃で細胞をインキュベートした。４時間後に、培養物を遠心分離し、上清を２回滅菌濾過した。
【０１１８】
実施例４
ＤＭ１８４９の３つの突然変異を導入するためのＤＭ１８４９：：ｐＭＡＫ−ｌｉｇＢからのＰ１−ファージライブラリを用いるメチオニン生産大腸菌ＥＣＭ１の形質導入
Ｌ−メチオニン−生産大腸菌株ＥＣＭ１は、フィードバック耐性ｍｅｔＡ対立遺伝子、ｍｅｔＪ遺伝子の欠失及び遺伝子ｍｅｔＨ、ｍｅｔＦ、ｃｙｓＰ及びｃｙｓＪのそれぞれの上流に強力なｔｒｃプロモータのコピーを有する。これは野生型Ｋ１２株ＭＧ１６５５に基づいている。
【０１１９】
ＬＢ培地１０ｍｌをアクセプター株ＥＣＭ１で接種し、これを３７℃で１８時間培養した。この後に、２ｍｌの培養物を遠心分離によって除去し、１０ｍＭのＭｇＳＯ４と５ｍＭのＣａＣｌ２を含有する１ｍｌのＬＢ培地内で細胞ペレットを再懸濁した。細胞懸濁液３００μｌに、ＤＭ１８４９：：ｐＭＡＫ−ｌｉｇＢからのＰ１−ファージライブラリ１００μｌを添加し、混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。この後に、２００μｌの１Ｍクエン酸三ナトリウムを添加し、簡単に渦撹拌した。次に、１ｍｌのＬＢ培地を添加し、細胞を４４℃で１時間増殖させた。その後、細胞を、それぞれの場合に１００ｍＭのクエン酸三ナトリウムを含有する１ｍｌのＬＢで２回洗浄し、最後に１００ｍＭのクエン酸三ナトリウムを含有する１００μｌのＬＢに再懸濁した。それらを２０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上で画線し、これを４４℃で４８時間インキュベートした。１０個のコロニーを２０ｍｇ／Ｌのクロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天上で採取し、これを再び４４℃で４８時間インキュベートした。これらのクローンでは、組み込まれたｐＭＡＫ−ｌｉｇＢプラスミドを含むｌｉｇＢ領域を構成する、ゲノム断片が形質導入されていた。ｓｐｏＴ遺伝子の関連部分のその後のＤＮＡ配列決定により、ＤＭ１８４９からのｓｐｏＴ対立遺伝子が同時形質導入された５つのクローンが同定された。
【０１２０】
ｐＭＡＫ−ｌｉｇＢプラスミドの染色体からの切除及びキュアリングをHamiltonら（CM Hamilton, Aldea M, Washburn BK, Babitzke P, Kushner SR (1989); J Bacterid.; 171 (9): 4617〜4622頁）に記載される通りに実施した。この方法で得られたプラスミドのないクローンの１つをＥＣＭ１＿ｓｐｏＴ１８４９と命名した。
【０１２１】
菌株ＥＣＭ１及びＥＣＭ１＿ｓｐｏＴ１８４９を、ブダペスト条約に従って２０１１年８月３日にＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstsse 7B, 38124ブランズウィック、独国）によりＤＳＭ番号ＤＳＭ２５０６６（＝ＥＣＭ１）及びＤＳＭ２５０６７（＝ＥＭＣ１＿ｓｐｏＴ１８４９）の下で寄託した。
【０１２２】
実施例５
プラスミドｐＵＣ１８へのｓｅｒＣ遺伝子のクローニング
大腸菌ＭＧ１６５５  ｓｅｒＣ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅し、その後、ｐＵＣ１８プラスミド（Fermentas GmbH, St. Leon-Rot, 独国）にクローニングした。
【０１２３】
ＰＣＲプライマーｓｅｒＣＦ（ＸｂａＩ）及びｓｅｒＣＲ（ＨｉｎｄＩＩＩ）は、それぞれの場合に、それらの５’末端にランダムに選択されたヌクレオチドを有し、その後に、それぞれ、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）についての認識配列が続く。ｓｅｒＣＦ（ＸｂａＩ）のヌクレオチド１３〜３８は、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中の位置９５６６１９番目から９５６６４４番目に結合する。ｓｅｒＣＲ（ＨｉｎｄＩＩＩ）のヌクレオチド１３〜３７は、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中の位置９５８０２８番目から９５８００４番目に結合する。
2015508647.tif 000003
【０１２４】
ｓｅｒＣ遺伝子を、ｓｅｒＣＦ（ＸｂａＩ）及びｓｅｒＣＲ（ＨｉｎｄＩＩＩ）プライマー並びにＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes Oy, Espoo、フィンランド）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡは鋳型の役割を果たす。得られたＤＮＡ断片のサイズは１４３４ｂｐであった。これをＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼによって切断し、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン、ヒルデン、独国）を用いて精製した。非メチル化ｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡを、ＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼによって切断し、これをＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン、ヒルデン、独国）を用いて精製した。次に、切断されたプラスミドをＰＣＲ産物と連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。ｓｅｒＣ遺伝子を含むプラスミドクローンを制限酵素切断及びＤＮＡ配列決定により同定した。得られたプラスミドをｐＵＣ１８−ｓｅｒＣと命名した。
【０１２５】
実施例６
ｓｅｒＡ遺伝子のプラスミドｐＵＣ１８−ｓｅｒＣへのクローニング
大腸菌ＭＧ１６５５ｓｅｒＡ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅し、その後、ｐＵＣ１８−ｓｅｒＣプラスミドにクローニングした。
【０１２６】
ＰＣＲプライマーｓｅｒＡＦ（ＸｂａＩ）は、その５’末端に６つのランダムに選択されたヌクレオチドを有し、その後に制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）についての認識配列が続く。ヌクレオチド１２〜３３は、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中の位置３０５５１９９番目から３０５５２２０番目まで結合する。ＰＣＲプライマーｓｅｒＡＲ（ＳＨＳＳＮＢ）は、その５’末端に６つのランダムに選択されたヌクレオチドを有し、その後に制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳｍａＩ、ＮｏｔＩ及びＢｇＩＩＩについての認識配列が続く。ヌクレオチド４９〜５８は、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中の位置３０５６８８０番目から３０５６８６１番目まで結合する。
2015508647.tif 000004
【０１２７】
ｓｅｒＡ遺伝子を、ｓｅｒＡＦ（ＸｂａＩ）及びｓｅｒＡＲ（ＳＨＳＳＮＢ）プライマー並びにＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes Oy、エスポー、フィンランド）を用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡは鋳型としての役割を果たす。得られたＤＮＡ断片のサイズは１７３１ｂｐであった。
【０１２８】
これをＸｂａＩ及びＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼによって切断し、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン、ヒルデン、独国）を用いて精製した。ｐＵＣ１８−ｓｅｒＣプラスミドを、同様にＸｂａＩ及びＳａｃＩ制限エンドヌクレアーゼによって切断し、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いて精製した。切断したプラスミドを次いでＰＣＲ産物と連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。ｓｅｒＡ遺伝子を含むプラスミドクローンを制限酵素切断及びＤＮＡ配列決定により同定した。得られたプラスミドをｐＵＣ１８−ｓｅｒＡＣと命名した。
【０１２９】
実施例７
プラスミドｐＵＣ１８−ｓｅｒＡＣへのｓｅｒＢ遺伝子のクローニング
大腸菌ＭＧ１６５５ｓｅｒＢ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅し、その後、ｐＵＣ１８−ｓｅｒＡＣプラスミドにクローニングした。
【０１３０】
ＰＣＲプライマーｓｅｒＢ（ＳｐｈＩ）は、その５’末端に６つのランダムに選択されたヌクレオチドを有し、その後に制限エンドヌクレアーゼＳｐｈＩ（ＧＣＡＴＧＣ）の認識配列が続く。ヌクレオチド１３〜３４は、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中の位置４６２２８１６番目から４６２２８３７番目まで結合する。
【０１３１】
ＰＣＲプライマーｓｅｒＢ（ＳｍａＩ）は、その５’末端に６つのランダムに選択されたヌクレオチドを有し、その後に制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）及びＳｍａＩ（ＣＣＣＧＧＧ）の認識配列が続く。ヌクレオチド５４〜７５は、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中の位置４６２３８８７番目から４６２３８６６番目まで結合する。
2015508647.tif 000005
【０１３２】
ｓｅｒＢ遺伝子を、ｓｅｒＢ（ＳｐｈＩ）及びｓｅｒＢ（ＳｍａＩ）プライマー並びにＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes Oy、エスポー、フィンランド）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡは鋳型としての役割を果たす。得られたＤＮＡ断片のサイズは１１３７ｂｐであった。
【０１３３】
これをＳｐｈＩ及びＳｍａＩ制限エンドヌクレアーゼによって切断し、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン、ヒルデン、独国）を用いて精製した。ｐＵＣ１８−ｓｅｒＡＣプラスミドも同様にＳｐｈＩ及びＳｍａＩ制限エンドヌクレアーゼによって切断し、アルカリホスファターゼにより脱リン酸化し、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン、ヒルデン、独国）を用いて精製した。次に、切断されたプラスミドをＰＣＲ産物と連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。ｓｅｒＢ遺伝子を含むプラスミドクローンを制限酵素切断及びＤＮＡ配列決定により同定した。得られたプラスミドをｐＵＣ１８−ｓｅｒＢＡＣと命名した。
【０１３４】
実施例８
ｇｌｙＡ遺伝子のプラスミドｐＵＣ１８−ｓｅｒＢＡＣへのクローニング
大腸菌ＭＧ１６５５ｇｌｙＡ遺伝子を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅し、その後、ｐＵＣ１８−ｓｅｒＢＡＣプラスミドにクローニングした。
【０１３５】
ＰＣＲプライマーｇｌｙＡ−下流は、その５’末端に６つのランダムに選択されたヌクレオチドを有し、その後に制限エンドヌクレアーゼＢｇＩＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）の認識配列が続く。ヌクレオチド１３〜３５は、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中の位置２６８２０６３番目から２６８２０８５番目まで結合する。
【０１３６】
ＰＣＲプライマーｇｌｙＡ−上流は、その５’末端にランダムに選択されたヌクレオチドを有し、その後に制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）の認識配列が続く。ヌクレオチド１５〜３３は、大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中の位置２６８３７６２番目から２６８３７４４番目まで結合する。
2015508647.tif 000006
【０１３７】
ｇｌｙＡ遺伝子を、ｇｌｙＡ−下流及びｇｌｙＡ−上流プライマー並びにＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes Oy、エスポー、フィンランド）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡは鋳型としての役割を果たす。得られたＤＮＡ断片のサイズは１７２６ｂｐであった。
【０１３８】
これをＢｇＩＩＩ及びＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼによって切断し、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン、ヒルデン、独国）を用いて精製した。ｐＵＣ１８−ｓｅｒＢＡＣプラスミドも同様にＢｇＩＩＩ及びＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼによって切断し、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キット（キアゲン、ヒルデン、独国）を用いて精製した。次に、切断されたプラスミドをＰＣＲ産物と連結し、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。ｇｌｙＡ遺伝子を含むプラスミドクローンを制限酵素切断及びＤＮＡ配列決定により同定した。得られたプラスミドをｐＵＣ１８−ｓｅｒＢ-ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡＣと命名した。
【０１３９】
実施例９
遺伝子ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡＣのｐＵＣ１８−ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡＣからｐＣＣ１−ＢＡＣまでのクローニング
ｐＵＣ１８−ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡＣプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより切断し、ＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分画した。ｓｅｒＢ、ｇｌｙＡ、ｓｅｒＡ及びｓｅｒＣ遺伝子を含む５．９ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから単離した。断片を、予めＨｉｎｄＩＩＩによって切断された、Epicentre社（マディソン、米国）製のプラスミドｐＣＣ１  ＢＡＣ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ｒｅａｄｙベクター（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ）と連結し、大腸菌ＥＰＩ３００に形質転換した。ｓｅｒＢ、ｇｌｙＡ、ｓｅｒＡ及びｓｅｒＣのＤＮＡ断片を含むプラスミドクローンを制限酵素切断及びＤＮＡ配列決定により同定した。得られた産生プラスミドをｐＣＣ３と命名した。
【０１４０】
実施例１０
産生プラスミドｐＭＥ−ＲＤＬ２ａのクローニング
ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａ産生プラスミドのクローニングを、欧州特許出願第１１１５１５２６．８号に記載されるように行った。これは、大腸菌ｃｙｓＥ遺伝子、大腸菌ｔｈｒＡ及びｍｅｔＡ遺伝子のフィードバック耐性対立遺伝子並びにサッカロミセスセレビシエチオ硫酸硫黄トランスフェラーゼＲＤＬ２ｐをコードするＲＤＬ２ａ遺伝子を含む。また、ストレプトマイシン耐性遺伝子を含む。
【０１４１】
実施例１１
菌株ＥＣＭ１及びＥＣＭ１  ｓｐｏＴ１８４９の産生プラスミドによる形質転換
菌株ＥＣＭ１及びＥＣＭ１＿ｓｐｏＴ１８４９を、実施例９の産生ベクターｐＣＣ３により形質転換し、この形質転換株を２０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを用いて選択した。細胞を次いで実施例１０のプラスミドｐＭＥ−ＲＤＬ２ａで形質転換し、得られた形質転換株を２０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコール＋１００ｍｇ／ｌのストレプトマイシンを用いて選択した。得られた株をＥＣＭ１／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａ及びＥＣＭ１＿ｓｐｏＴ１８４９／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａと命名した。
【０１４２】
実施例１２
シェーカーフラスコ実験でのパフォーマンス分析
大腸菌Ｌ−メチオニン生産株の性能を１００ｍｌの三角フラスコで生産試験により評価した。１００μｌの細胞培養物で接種された１０ｍｌの前培養培地（２．５ｇ／ｌのグルコースを含有する１０％ＬＢ培地及び９０％ＰＣ１最小培地）の各場合における前培養物を、３７℃で１０時間増殖させた。次にこれらを使用して、それぞれの場合に１０ｍｌのＰＣ１最小培地（表１）を、０．２のＯＤ６００ｎｍ（エッペンドルフバイオ光度計；エッペンドルフＡＧ、ハンブルグ、独国）まで接種し、この培養物を３７℃で２４時間増殖させた。細胞外Ｌ−メチオニン濃度は、アミノ酸分析装置（Sykam社、Eresing、独国）を使用するニンヒドリン検出によるポストカラム誘導体化とイオン交換クロマトグラフィによって測定した。細胞外グルコース濃度を、ＹＳＩ２７００セレクトグルコースアナライザー（ＹＳＩライフサイエンス、イエロースプリングス、オハイオ州、米国）を用いて測定した。結果を表２に示す。２４時間後に、グルコースは両方の培養物中で完全に使い切られた。ＥＣＭ１＿ｓｐｏＴ１８４９／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａの培養物上清中のメチオニン濃度は、１．５６ｇ／ｌで、比較の菌株（１．０１ｇ／ｌ）よりも明らかに高かった。従って、変異Ｇｌｙ１７４、Ｌｅｕ５２９の導入及びＡｓｐ８４とＭｅｔ８５との間の挿入によるｐｐＧｐｐアーゼをコードする遺伝子の改変は、出発株を１０．１％（グルコース１グラム当たりのメチオニンのグラム）から１５．６％まで上回るメチオニンの収量の増加をもたらした。
【０１４３】
【表１】
2015508647.tif 000007
【０１４４】
【表２】
2015508647.tif 000008
【０１４５】
上記明細書及び特許請求の範囲内に開示された本発明の特徴は、両方とも個別に及び任意の組み合わせで、その様々な実施態様において本発明を実施するために必須である。
【図１】
2015508647.tif 000009
【図２】
2015508647.tif 000010
【図３】
2015508647.tif 000011
【配列表】
2015508647000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月19日(2014.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その野生型に対して低下したｐｐＧｐｐアーゼ活性を有するように、その野生型に対して遺伝的に改変された細胞。
【請求項２】
細胞がその野生型に対して変化していない（ｐ）ｐｐＧｐｐ−シンテターゼ活性を有する、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記細胞が、アミノ酸配列の配列番号２、配列番号４及び配列番号６を含む群から選択される少なくとも１つのｐｐＧｐｐアーゼ、さらにはその変異体の、その野生型に対して、低下した活性を有するように、その野生型に対して遺伝的に改変された、請求項１又は２に記載の細胞。
【請求項４】
アミノ酸配列の配列番号２、配列番号４及び配列番号６、さらにはその変異体を含む群からの少なくとも１つのｐｐＧｐｐアーゼの活性が、以下の改変：
ａ）Ｇｌｙ１７４又はそれと相同のアミノ酸は、異なるアミノ酸によって置換された、
ｂ）Ｌｅｕ５２９又はそれと相同のアミノ酸は、異なるアミノ酸によって置換された、
ｃ）少なくとも１つのアミノ酸の挿入は、Ａｓｐ８４とＭｅｔ８５又はそれと相同のアミノ酸の間に存在する、
のうち少なくとも１つを有する
前記ｐｐＧｐｐアーゼの結果として低下する、請求項３に記載の細胞。
【請求項５】
ｐｐＧｐｐアーゼがアミノ酸Ｇｌｎ９、Ｔｈｒ１３、Ｔｙｒ６３、Ａｒｇ１０９、Ｇｌｎ２２５、Ｃｙｓ２４５、Ｖａｌ２４８、Ａｓｎ２６８、Ｓｅｒ２７０、Ｍｅｔ２８０、Ｈｉｓ３４４、Ｐｒｏ４３６、Ａｓｎ５０１、Ｇｌｎ５０５、Ｈｉｓ５４３、Ａｌａ５４６、Ｓｅｒ５４７、Ｉｌｅ５４８、Ｈｉｓ５５５、Ｇｌｙ５５６、Ｈｉｓ５５７、Ｐｒｏ５５９、Ｌｙｓ６１９、Ｔｈｒ６２１、Ａｌａ６２２、Ｔｈｒ６２７、Ｔｈｒ６５１、Ａｌａ６６９、Ａｌａ６７５、Ｔｈｒ６９８での置換、並びにＧｌｕ３４３及びＨｉｓ３４４又はそれぞれの場合にそれと相同のアミノ酸の間の挿入を含む群からの少なくとも１つの改変を更に有する、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
ｐｐＧｐｐアーゼが以下の置換又はその置換されるアミノ酸と相同のアミノ酸の同じアミノ酸による置換：
１．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸によるＧｌｎ９の置換、
２．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸によるＴｈｒ１３の置換、
３．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸によるＴｙｒ６３の置換、
４．）Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸によるＡｒｇ１０９の置換、
５．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸によるＧｌｎ２２５の置換、
６．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸によるＣｙｓ２４５の置換、
７．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸によるＶａｌ２４８の置換、
８．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓからなる群から選択されるアミノ酸によるＡｓｎ２６８の置換、
９．）Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸によるＳｅｒ２７０の置換、
１０．）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＡｌａからなる群から選択されるアミノ酸によるＭｅｔ２８０の置換、
１１．）アミノ酸Ｇｌｕ３４３とＨｉｓ３４４との間のアミノ酸Ｌｙｓ及びＧｌｕの挿入、
１２．）Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸によるＨｉｓ３４４の置換、
１３．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸によるＰｒｏ４３６の置換、
１４．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸によるＡｓｎ５０１の置換、
１５．）Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸によるＧｌｎ５０５の置換、
１６．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸によるＨｉｓ５４３の置換、
１７．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸によるＡｌａ５４６の置換、
１８．）Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸によるＳｅｒ５４７の置換、
１９．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸によるＩｌｅ５４８の置換、
２０．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸によるＨｉｓ５５５の置換、
２１．）Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓによる位置５５６でのグリシンの置換、
２２．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸によるＨｉｓ５５７の置換、
２３．）Ｓｅｒ、Ａｌａ及びＴｈｒからなる群から選択されるアミノ酸によるＰｒｏ５５９の置換、
２４．）Ａｓｎ及びＧｌｎからなる群から選択されるアミノ酸によるＬｙｓ６１９の置換、
２５．）Ｌｅｕ、Ｉｌｅ及びＶａｌからなる群から選択されるアミノ酸によるＴｈｒ６２１の置換、
２６．）Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択されるアミノ酸によるＡｌａ６２２の置換、
２７．）Ａｌａ及びＧｌｙからなる群から選択されるアミノ酸によるＴｈｒ６２７の置換、
２８．）Ｇｌｕ及びＡｓｐからなる群から選択されるアミノ酸によるＴｈｒ６５１の置換、
２９．）ＴｈｒによるＡｌａ６６９及び／又はＡｌａ６７５の置換、
３０．）Ｇｌｎ及びＡｓｎからなる群から選択されるアミノ酸によるＴｈｒ６９８の置換、
を有する群からの少なくとも１つの改変を有する、請求項４又は５に記載の細胞。
【請求項７】
細胞が、その野生型に対して、以下の酵素：
１．）チオ硫酸／硫酸トランスポートシステムＣｙｓＰＵＷＡ（ＥＣ３．６．３．２５）、
２．）３’−ホスホアデノシン５’−ホスホ硫酸レダクターゼＣｙｓＨ（ＥＣ１．８．４．８）、
３．）亜硫酸レダクターゼＣｙｓＪＩ（ＥＣ１．８．１．２）、
４．）システインシンターゼＡ  ＣｙｓＫ（ＥＣ２．５．１．４７）、
５．）システインシンターゼＢ  ＣｙｓＭ（ＥＣ２．５．１．４７）、
６．）セリンアセチルトランスフェラーゼＣｙｓＥ（ＥＣ２．３．１．３０）、
７．）グリシン開裂系ＧｃｖＴＨＰ−Ｌｐｄ（ＥＣ２．１．２．１０、ＥＣ１．４．４．２、ＥＣ１．８．１．４）、
８．）リポイルシンターゼＬｉｐＡ（ＥＣ２．８．１．８）、
９．）リポイル−タンパク質リガーゼＬｉｐＢ（ＥＣ２．３．１．１８１）、
１０．）ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼＳｅｒＡ（ＥＣ１．１．１．９５）、
１１．）３−ホスホセリンホスファターゼＳｅｒＢ（ＥＣ３．１．３．３）、
１２．）３−ホスホセリン／ホスホヒドロキシトレオニンアミノトランスフェラーゼＳｅｒＣ（ＥＣ．２．６．１．５２）、
１３．）セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼＧｌｙＡ（ＥＣ２．１．２．１）、
１４．）アスパルトキナーゼＩ及びホモセリンデヒドロゲナーゼＩ  ＴｈｒＡ（ＥＣ２．７．２．４、ＥＣ１．１．１．３）、
１５．）アスパラギン酸キナーゼＬｙｓＣ（ＥＣ２．７．２．４）、
１６．）ホモセリンデヒドロゲナーゼＨｏｍ（ＥＣ１．１．１．３）、
１７．）ホモセリンＯ−アセチルトランスフェラーゼＭｅｔＸ（ＥＣ２．３．１．３１）、
１８．）ホモセリンＯ−スクシニルトランスフェラーゼＭｅｔＡ（ＥＣ２．３．１．４６）、
１９．）シスタチオニンガンマ−シンターゼＭｅｔＢ（ＥＣ２．５．１．４８）、
２０．）βＣ−ＳリアーゼＡｅｃＤ（ＥＣ４．４．１．８、ベータ−リアーゼとも呼ばれる）、
２１．）シスタチオニンベータ−リアーゼＭｅｔＣ（ＥＣ４．４．１．８）、
２２．）Ｂ１２−非依存性ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼＭｅｔＥ（ＥＣ２．１．１．１４）、
２３．）Ｂ１２−依存性ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼＭｅｔＨ（ＥＣ２．１．１．１３）、
２４．）メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素ＭｅｔＦ（ＥＣ１．５．１．２０）、
２５．）コリネバクテリウムグルタミクム（Corynebacterium glutamicum）由来のＬ−メチオニンエキスポーターＢｒｎＦＥ、
２６．）大腸菌（Echerichia coli）由来のバリンエキスポーターＹｇａＺＨ（ｂ２６８２、ｂ２６８３）、
２７．）大腸菌由来の推定トランスポーターＹｊｅＨ（ｂ４１４１）、
２８．）ピリジンヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼＰｎｔＡＢ（ＥＣ１．６．１．２）、
２９．）Ｏ−スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼＭｅｔＺ（ＥＣ２．５．１．４８）、
３０．）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキラーゼＰｙｃ（ＥＣ４．１．１．３１）、
３１．）チオ硫酸硫黄トランスフェラーゼＲＤＬ２ｐ（ＥＣ２．８．１．１）、
３２．）チオ硫酸−チオール硫黄トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．１．３）、
３３．）チオ硫酸−ジチオール硫黄トランスフェラーゼ（ＥＣ２．８．１．５）、
その構成要素又は前記酵素の変異体又はその構成要素のいずれかをコードする少なくとも１つの核酸配列又はその変異体を過剰発現するように、その野生型に対して遺伝的に改変された、請求項１から６までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項８】
細胞が、以下の酵素：
１．）Ｌ−メチオニン生合成の転写調節因子（ＭｅｔＪ）（ｂ３９３８、ＥＣＫ３９３０）、
２．）グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（Ｐｇｉ、ＥＣ５．３．１．９）（ｂ４０２５、ＥＣＫ４０１７）、
３．）ホモセリンキナーゼ（ＴｈｒＢ、ＥＣ２．７．１．３９）（ｂ０００３、ＥＣＫ０００３）、
４．）Ｓ−アデノシルメチオニンシンターゼ（ＭｅｔＫ、ＥＣ２．５．１．６）（ｂ２９４２、ＥＣＫ２９３７）、
５．）ジヒドロジピコリネートシンターゼ（ＤａｐＡ、ＥＣ４．２．１．５２）（ｂ２４７８、ＥＣＫ２４７４）、
６．）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（Ｐｃｋ、ＥＣ４．１．１．４９）（ｂ３４０３、ＥＣＫ３３９０）、
７．）ホルミルテトラヒドロフォレートヒドロラーゼ（ＰｕｒＵ、ＥＣ３．５．１．１０）（ｂ１２３２、ＥＣＫ１２２７）、
８．）ピルビン酸キナーゼＩＩ（ＰｙｋＡ、ＥＣ２．７．１．４０）（ｂ１８５４、ＥＣＫ１８５５）、
９．）ピルビン酸キナーゼＩ（ＰｙｋＦ、ＥＣ２．７．１．４０）（ｂ１６７６、ＥＣＫ１６７２）、
１０．）Ｌ−メチオニントランスポーター（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニット（ｂ０１９７、ＥＣＫ０１９７）、
１１．）Ｌ−メチオニントランスポーター（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニット（ｂ０１９８、ＥＣＫ０１９８）、
１２．）Ｌ−メチオニントランスポーター（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニット（ｂ０１９９、ＥＣＫ０１９９）、
１３．）デオキシシチジン５’−トリホスフェートデアミナーゼ（Ｄｃｄ，ＥＣ３．５．４．１３）（ｂ２０６５、ＥＣＫ２０５９）、
１４．）推定Ｎ−アシルトランスフェラーゼ（ＹｎｃＡ）、
１５．）調節ｓＲＮＡ  ＦｎｒＳ、
１６．）シグマ因子ＲｐｏＳ、
その構成要素又は前記酵素の変異体又はその構成要素のいずれかをコードする少なくとも１つの核酸配列又はその変異体を、その野生型に対して、低減された規模で発現するように、その野生型に対して遺伝的に改変された、請求項１から７までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項９】
細胞が、以下の酵素：
１．）アントラニル酸シンターゼ（ｔｒｐＤＥ、ＥＣ４．１．３．２７）、アントラニル酸ホスホリボシル−トランスフェラーゼ（ｔｒｐＤ、ＥＣ２．４．２．１８）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ｔｒｐＣ、ＥＣ５．３．１．２４）、インドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼ（ｔｒｐＣ、ＥＣ４．１．１．４８）及びトリプトファンシンターゼ（ｔｒｐＡＢ、ＥＣ４．１．２．８及び４．２．１．１２２）、
２．）ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼＳｅｒＡ（ＥＣ１．１．１．９５）、
３．）３−ホスホセリンホスファターゼＳｅｒＢ（ＥＣ３．１．３．３）、
４．）３−ホスホセリン／ホスホヒドロキシトレオニンアミノトランスフェラーゼＳｅｒＣ（ＥＣ２．６．１．５２）、
５．）Ｌ−チロシン感受性ＤＨＡＰシンターゼ（ａｒｏＦ、ＥＣ２．５．１．５４）、
６．）Ｌ−フェニルアラニンフィードバック耐性ＤＨＡＰシンターゼ（ａｒｏＧ、ＥＣ２．５．１．５４）、
７．）Ｌ−トリプトファン感受性ＤＨＡＰシンターゼ（ａｒｏＨ、ＥＣ２．５．１．５４）、
８．）ホスホエノールピルビン酸シンターゼｐｐｓＡ（ＥＣ２．７．９．２）、
９．）ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼｐｃｋ（ＥＣ４．１．１．４９）、
１０．）トランスケトラーゼＡ  ｔｋｔＡ（ＥＣ２．２．１．１）、
１１．）トランスケトラーゼＢ  ｔｋｔＢ（ＥＣ２．２．１．１）、
１２．）大腸菌のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ｙｄｄＧの遺伝子産物、
その構成要素又は前記酵素の変異体又はその構成要素のいずれかをコードする少なくとも１つの核酸配列又はその変異体を、その野生型に対して、過剰発現するように、その野生型に対して遺伝的に改変された、請求項１から６までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１０】
細胞が、以下の酵素：
１．）トリプトファナーゼ（ｔｎａＡ、ＥＣ４．１．９９．１）、
２．）ｔｒｐオペロンのリプレッサー（ｔｒｐＲ）、
３．）コリスミ酸ムターゼＴ又はプレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｔｙｒＡ、ＥＣ１．３．１．１２）、
４．）コリスミ酸ムターゼＰ又はプレフェン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｈｅＡ、ＥＣ４．２．１．５１）、
５．）トリプトファン特異的輸送タンパク質（ｍｔｒ）、
６．）トリプトファンパーミアーゼ（ｔｎａＢ）、
７．）芳香族アミノ酸のトランスポーター（ａｒｏＰ）、
８．）Ｌ−セリンデアミナーゼ（ｓｄａＡ、ＥＣ４．３．１．１７）、
９．）グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ（ｐｇｉ、ＥＣ５．３．１．９）、
１０．）チロシンアミノトランスフェラーゼ（ｔｈｒＢ）、
１１．）ｇｌｐレギュロンのリプレッサー（ｇｌｐＲ）、
１２．）シグマ因子ＲｐｏＳ（ｒｐｏＳ）、
その構成要素又は前記酵素の変異体又はその構成要素のいずれかをコードする少なくとも１つの核酸配列又はその変異体を、その野生型に対して、低減された規模で発現するように、その野生型に対して遺伝的に改変された、請求項１から６までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１１】
細胞が、必須アミノ酸を過剰生産するための細胞である、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１２】
請求項１から１１までのいずれか１項に記載の細胞を含む飼料添加剤。
【請求項１３】
必須アミノ酸を過剰生産する細胞の製造方法であって、ｐｐＧｐｐアーゼをコードするノックアウト遺伝子を有する細胞を製造すること、及び前記細胞を培養することを含む、前記製造方法。
【請求項１４】
セリン由来の必須アミノ酸の製造方法であって、
ａ．）請求項１から１１までのいずれか１項に記載の細胞を培養する工程、
を含む、前記製造方法。
【請求項１５】
請求項１から１１までのいずれか１項に記載の細胞を使用し且つメチオニンの製造方法である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１から７までのいずれか１項又は請求項１０又は請求項１１に記載の細胞を使用し且つ芳香族アミノ酸の製造方法である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
微生物を回分プロセス、流加プロセス、反復流加プロセス又は連続プロセスで培養する、請求項１３から１６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞が腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の属由来の細菌細胞である、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項１９】
細胞が腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の属由来の細菌細胞である、請求項１２に記載の飼料添加剤。
【請求項２０】
細胞が腸内細菌科（Enterobacteriaceae）の属由来の細菌細胞である、請求項１３から１７までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞がエシェリキア（Escherichia）、エルウィニア（Erwinia）、プロビデンシア（Providencia）及びセラチア（Serratia）を含む属の群から選択される、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の細胞。
【請求項２２】
細胞がエシェリキア（Escherichia）、エルウィニア（Erwinia）、プロビデンシア（Providencia）及びセラチア（Serratia）を含む属の群から選択される、請求項１２に記載の飼料添加剤。
【請求項２３】
細胞がエシェリキア（Escherichia）、エルウィニア（Erwinia）、プロビデンシア（Providencia）及びセラチア（Serratia）を含む属の群から選択される、請求項１３から１７までのいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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