(57)【要約】本明細書に記載される技術は、１つまたは複数の特異的核酸の存在を検出すること、例えば、１つまたは複数の対立遺伝子標的部位遺伝子座の遺伝子型を決定することに関する。例えば、１つの実施形態では、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法が提供される。他の実施形態では、各標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つのセットを含む、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するための組成物もまた提供される。
2015508661.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法であって、前記方法は；
鎖分離、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のサイクルを含むＰＣＲ増幅レジメンを、核酸試料と各標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットとを含む反応混合物に対して実施するステップであって、
オリゴヌクレオチドプライマーの各前記セットは、少なくとも１つの切断型二重ドメインフォワードプライマーの第１のサブセットおよび少なくとも１つのリバースプライマーの第２のサブセットを含み；
セットの各切断型二重ドメインプライマーは、前記セット中の他の二重ドメインプライマーの５’テイル領域とは異なる５’テイル領域および前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域を含み；
各切断型二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記切断型二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記切断型二重ドメインプライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；
プライマーセットの各切断型二重ドメインプライマーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーセットの任意の他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有し；
前記ＰＣＲ増幅レジメンは、第１の期および第２の期を含み、
前記第１の期は、第１のセットのサイクルのための前記第１のアニーリング温度においてアニーリングすることを含み、および；
前記第２の期は、第２のセットのサイクルのための前記第２のアニーリング温度においてアニーリングすることを含む、
ステップ；ならびに
各標的ポリヌクレオチドについての増幅産物を検出するステップであって、前記検出は、前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、ステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
リバースプライマーが増幅プライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
プライマーのセットが、少なくとも１つの二重ドメインフォワードプライマーを含み；
セットの各二重ドメインプライマーが、前記セット中の他の二重ドメインプライマーの５’テイル領域とは異なる５’テイル領域、前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域、および前記標的部位に存在するバリアントヌクレオチドの１つに対して相補的な末端ヌクレオチド、を含み；
各二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記二重ドメインプライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；かつ
プライマーセットの各切断型二重ドメインプライマーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーセットの任意の他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
複数の標的ポリヌクレオチドが単一の反応において検出される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチドおよびＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド；ならびに
以下：
タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つがＳＮＰを含み、前記方法が、前記ＳＮＰにおけるヌクレオチドを遺伝子型決定する、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
標的ＳＮＰの２つ以上の対立遺伝子の各々に対して特異的な二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、同じ反応中に存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、前記標的ＳＮＰの優勢対立遺伝子に対して特異的である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
標的ヌクレオチドの２つ以上の対立遺伝子または配列バリアントの各々に対して特異的な前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、同じ反応中に存在する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、前記標的ポリヌクレオチドの優勢対立遺伝子またはバリアント対立遺伝子に対して特異的である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が識別され得る、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が、別個のサイズであることによって識別される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が、異なる検出可能な標識で標識されていることによって識別される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、前記産物を配列決定することによって識別される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって識別される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、前記増幅産物の融解曲線分析によって識別される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記コア配列が１０〜４０ヌクレオチド長である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記コア配列が１１〜２０ヌクレオチド長である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の期が１〜１０サイクルを含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の期が３〜５サイクルを含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する３つ未満連続する相同塩基を有する、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する２つ未満連続する相同塩基を有する、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記５’テイル配列が１〜２００ヌクレオチド長である、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記５’テイル配列が４〜１５０ヌクレオチド長である、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記第２のアニーリング温度が、前記第１のアニーリング温度よりも少なくとも４℃高い、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
反応中に存在する前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、互いに８℃以下異なる、そのそれぞれの３’コア領域に対するＴｍ値を有する、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記５’テイル配列が、配列番号２１０〜２７０９のいずれかから選択される、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記５’テイル配列の各々が、配列番号２１０〜２７０９から選択される、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
プライマーの前記１つまたは複数のセットが、以下：
配列番号２９〜４４；配列番号５１〜５６；配列番号６２〜６６；配列番号６７〜８４；配列番号１６３〜１８６；および配列番号１８７〜２０９
からなる群から選択される２つ以上の配列を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
各標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つのセットを含む、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するための組成物であって、
オリゴヌクレオチドプライマーの各前記セットは、少なくとも１つの切断型二重ドメインフォワードプライマーの第１のサブセットおよび少なくとも１つのリバースプライマーの第２のサブセットを含み；
セットの各切断型二重ドメインプライマーは、前記セット中の他の切断型二重ドメインプライマー上の５’テイル領域とは異なる５’テイル領域および前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域を含み；
各切断型二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記切断型二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記プライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；
前記切断型二重ドメインプライマーセットの各メンバーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記切断型二重ドメインプライマーセットの他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、
組成物。
【請求項３３】
核酸試料をさらに含む、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
少なくとも１つのフォワードプライマーが二重ドメインプライマーを含み；
セットの各二重ドメインプライマーが、前記セット中の他の二重ドメインプライマー上の５’テイル領域とは異なる５’テイル領域、前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域、および前記標的部位に存在するバリアントヌクレオチドの１つに対して相補的な末端ヌクレオチド、を含み；
各二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記プライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；
前記二重ドメインプライマーセットの各メンバーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記二重ドメインプライマーセットの前記他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、
請求項３２〜３３のいずれかに記載の組成物。
【請求項３５】
リバースプライマーが二重ドメインプライマーを含む、請求項３２〜３４のいずれかに記載の組成物。
【請求項３６】
リバースプライマーが切断型二重ドメインプライマーを含む、請求項３２〜３４のいずれかに記載の組成物。
【請求項３７】
リバースプライマーが増幅プライマーを含む、請求項３２〜３６のいずれかに記載の組成物。
【請求項３８】
前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項３２〜３７のいずれかに記載の組成物。
【請求項３９】
前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む、請求項３２〜３８のいずれかに記載の組成物。
【請求項４０】
前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチドおよびＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド；ならびに
以下：
タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド
を含む、請求項３２〜３９のいずれかに記載の組成物。
【請求項４１】
二重ドメインフォワードプライマーのサブセットが、標的ＳＮＰの２つ以上の対立遺伝子の各々に対して特異的なプライマーを含む、請求項３２〜４０のいずれかに記載の組成物。
【請求項４２】
セットの１つの二重ドメインフォワードプライマーが、前記標的ＳＮＰの優勢対立遺伝子に対して特異的である、請求項３２〜４１のいずれかに記載の組成物。
【請求項４３】
二重ドメインまたは切断型二重ドメインフォワードプライマーの前記サブセットが、標的ヌクレオチドの２つ以上の対立遺伝子または配列バリアントの各々に対して特異的なプライマーを含む、請求項３２〜４２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４４】
セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインフォワードプライマーが、前記標的ポリヌクレオチドの優勢対立遺伝子またはバリアント対立遺伝子に対して特異的である、請求項３２〜４３のいずれかに記載の組成物。
【請求項４５】
前記コア配列が１０〜４０ヌクレオチド長である、請求項３２〜４４のいずれかに記載の組成物。
【請求項４６】
前記コア配列が１１〜２０ヌクレオチド長である、請求項３２〜４５のいずれかに記載の組成物。
【請求項４７】
セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する３つ未満連続する相同塩基を有する、請求項３２〜４６のいずれかに記載の組成物。
【請求項４８】
セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する２つ未満連続する相同塩基を有する、請求項３２〜４７のいずれかに記載の組成物。
【請求項４９】
前記５’テイル配列が１〜２００ヌクレオチド長である、請求項３２〜４８のいずれかに記載の組成物。
【請求項５０】
前記５’テイル配列が４〜１５０ヌクレオチド長である、請求項３２〜４９のいずれかに記載の組成物。
【請求項５１】
前記第２のアニーリング温度が、前記第１のアニーリング温度よりも少なくとも４℃高い、請求項３２〜５０のいずれかに記載の組成物。
【請求項５２】
反応中に存在する前記二重ドメインプライマーが、互いに８℃以下異なる、そのそれぞれの３’コア領域に対するＴｍ値を有する、請求項３２〜５１のいずれかに記載の組成物。
【請求項５３】
前記５’テイル配列が、配列番号２１０〜２７０９のいずれかから選択される、請求項３２〜５２のいずれかに記載の組成物。
【請求項５４】
前記５’テイル配列の各々が、配列番号２１０〜２７０９から選択される、請求項３２〜５３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５５】
プライマーの前記１つまたは複数のセットが、以下：
配列番号２９〜４４；配列番号５１〜５６；配列番号６２〜６６；配列番号６７〜８４；配列番号１６３〜１８６；および配列番号１８７〜２０９
からなる群から選択される２つ以上の配列を含む、請求項３２〜５４のいずれかに記載の組成物。
【請求項５６】
１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法であって、前記方法は；
鎖分離、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のサイクルを含むＰＣＲ増幅レジメンを、核酸試料と各標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットとを含む反応混合物に対して実施するステップであって、
オリゴヌクレオチドプライマーの各前記セットは、少なくとも１つの切断型二重ドメインフォワードプライマーの第１のサブセットおよび少なくとも１つのリバースプライマーの第２のサブセットを含み；
セットの各切断型二重ドメインプライマーは、前記セット中の他の二重ドメインプライマーの５’テイル領域とは異なる５’テイル領域および前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域を含み；
各切断型二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記切断型二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記切断型二重ドメインプライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；
プライマーセットの各切断型二重ドメインプライマーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーセットの任意の他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有し；
前記ＰＣＲ増幅レジメンは、第１の期および第２の期を含み、
前記第１の期は、第１のセットのサイクルのための前記第１のアニーリング温度においてアニーリングすることを含み、および；
前記第２の期は、第２のセットのサイクルのための前記第２のアニーリング温度においてアニーリングすることを含む、
ステップ；ならびに
各標的ポリヌクレオチドについての増幅産物を検出するステップであって、前記検出は、前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、ステップ、
を含む、方法。
【請求項５７】
リバースプライマーが増幅プライマーを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項５６〜５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
プライマーのセットが、少なくとも１つの二重ドメインフォワードプライマーを含み；
セットの各二重ドメインプライマーが、前記セット中の他の二重ドメインプライマーの５’テイル領域とは異なる５’テイル領域、前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域、および前記標的部位に存在するバリアントヌクレオチドの１つに対して相補的な末端ヌクレオチド、を含み；
各二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記二重ドメインプライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；かつ
プライマーセットの各切断型二重ドメインプライマーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーセットの任意の他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、
請求項５６〜５８のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
複数の標的ポリヌクレオチドが単一の反応において検出される、請求項５６〜５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチドおよびＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド；ならびに
以下：
タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド
を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記標的ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つがＳＮＰを含み、前記方法が、前記ＳＮＰにおけるヌクレオチドを遺伝子型決定する、請求項５６〜６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
標的ＳＮＰの２つ以上の対立遺伝子の各々に対して特異的な二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、同じ反応中に存在する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、前記標的ＳＮＰの優勢対立遺伝子に対して特異的である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
標的ヌクレオチドの２つ以上の対立遺伝子または配列バリアントの各々に対して特異的な前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、同じ反応中に存在する、請求項５６〜６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、前記標的ポリヌクレオチドの優勢対立遺伝子またはバリアント対立遺伝子に対して特異的である、請求項５６〜６６のいずれかに記載の方法。
【請求項６８】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が識別され得る、請求項５６〜６７のいずれかに記載の方法。
【請求項６９】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が、別個のサイズであることによって識別される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が、異なる検出可能な標識で標識されていることによって識別される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、前記産物を配列決定することによって識別される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって識別される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、前記増幅産物の融解曲線分析によって識別される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
前記コア配列が１０〜４０ヌクレオチド長である、請求項５６〜７３のいずれかに記載の方法。
【請求項７５】
前記コア配列が１１〜２０ヌクレオチド長である、請求項５６〜７４のいずれかに記載の方法。
【請求項７６】
前記第１の期が１〜１０サイクルを含む、請求項５６〜７５のいずれかに記載の方法。
【請求項７７】
前記第１の期が３〜５サイクルを含む、請求項５６〜７６のいずれかに記載の方法。
【請求項７８】
セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する３つ未満連続する相同塩基を有する、請求項５６〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する２つ未満連続する相同塩基を有する、請求項５６〜７８のいずれかに記載の方法。
【請求項８０】
前記５’テイル配列が１〜２００ヌクレオチド長である、請求項５６〜７９のいずれかに記載の方法。
【請求項８１】
前記５’テイル配列が４〜１５０ヌクレオチド長である、請求項５６〜８０のいずれかに記載の方法。
【請求項８２】
前記第２のアニーリング温度が、前記第１のアニーリング温度よりも少なくとも４℃高い、請求項５６〜８１のいずれかに記載の方法。
【請求項８３】
反応中に存在する前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、互いに８℃以下異なる、そのそれぞれの３’コア領域に対するＴｍ値を有する、請求項５６〜８２のいずれかに記載の方法。
【請求項８４】
前記５’テイル配列が、配列番号２１０〜２７０９のいずれかから選択される、請求項５６〜８３のいずれかに記載の方法。
【請求項８５】
前記５’テイル配列の各々が、配列番号２１０〜２７０９から選択される、請求項５６〜８４のいずれかに記載の方法。
【請求項８６】
プライマーの前記１つまたは複数のセットが、以下：
配列番号２９〜４４；配列番号５１〜５６；配列番号６２〜６６；配列番号６７〜８４；配列番号１６３〜１８６；および配列番号１８７〜２０９
からなる群から選択される２つ以上の配列を含む、請求項５６〜８５のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
各標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つのセットを含む、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するための組成物であって、
オリゴヌクレオチドプライマーの各前記セットは、少なくとも１つの切断型二重ドメインフォワードプライマーの第１のサブセットおよび少なくとも１つのリバースプライマーの第２のサブセットを含み；
セットの各切断型二重ドメインプライマーは、前記セット中の他の切断型二重ドメインプライマー上の５’テイル領域とは異なる５’テイル領域および前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域を含み；
各切断型二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記切断型二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記プライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；
前記切断型二重ドメインプライマーセットの各メンバーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記切断型二重ドメインプライマーセットの他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、
組成物。
【請求項８８】
核酸試料をさらに含む、請求項８７に記載の組成物。
【請求項８９】
少なくとも１つのフォワードプライマーが二重ドメインプライマーを含み；
セットの各二重ドメインプライマーが、前記セット中の他の二重ドメインプライマー上の５’テイル領域とは異なる５’テイル領域、前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域、および前記標的部位に存在するバリアントヌクレオチドの１つに対して相補的な末端ヌクレオチド、を含み；
各二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記プライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；
前記二重ドメインプライマーセットの各メンバーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記二重ドメインプライマーセットの前記他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、
請求項８７〜８８のいずれかに記載の組成物。
【請求項９０】
リバースプライマーが二重ドメインプライマーを含む、請求項８７〜８９のいずれかに記載の組成物。
【請求項９１】
リバースプライマーが切断型二重ドメインプライマーを含む、請求項８７〜９０のいずれかに記載の組成物。
【請求項９２】
リバースプライマーが増幅プライマーを含む、請求項８７〜９１のいずれかに記載の組成物。
【請求項９３】
前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項８７〜９２のいずれかに記載の組成物。
【請求項９４】
前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む、請求項８７〜９３のいずれかに記載の組成物。
【請求項９５】
前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチドおよびＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド；ならびに
以下：
タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド
を含む、請求項８７〜９４のいずれかに記載の組成物。
【請求項９６】
二重ドメインフォワードプライマーのサブセットが、標的ＳＮＰの２つ以上の対立遺伝子の各々に対して特異的なプライマーを含む、請求項８７〜９５のいずれかに記載の組成物。
【請求項９７】
セットの１つの二重ドメインフォワードプライマーが、前記標的ＳＮＰの優勢対立遺伝子に対して特異的である、請求項８７〜９６のいずれかに記載の組成物。
【請求項９８】
二重ドメインまたは切断型二重ドメインフォワードプライマーの前記サブセットが、標的ヌクレオチドの２つ以上の対立遺伝子または配列バリアントの各々に対して特異的なプライマーを含む、請求項８７〜９７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９９】
セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインフォワードプライマーが、前記標的ポリヌクレオチドの優勢対立遺伝子またはバリアント対立遺伝子に対して特異的である、請求項８７〜９８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１００】
前記コア配列が１０〜４０ヌクレオチド長である、請求項８７〜９９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０１】
前記コア配列が１１〜２０ヌクレオチド長である、請求項８７〜１００のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０２】
セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する３つ未満連続する相同塩基を有する、請求項８７〜１０１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０３】
セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する２つ未満連続する相同塩基を有する、請求項８７〜１０２のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０４】
前記５’テイル配列が１〜２００ヌクレオチド長である、請求項８７〜１０３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０５】
前記５’テイル配列が４〜１５０ヌクレオチド長である、請求項８７〜１０４のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０６】
前記第２のアニーリング温度が、前記第１のアニーリング温度よりも少なくとも４℃高い、請求項８７〜１０５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０７】
反応中に存在する前記二重ドメインプライマーが、互いに８℃以下異なる、そのそれぞれの３’コア領域に対するＴｍ値を有する、請求項８７〜１０６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０８】
前記５’テイル配列が、配列番号２１０〜２７０９のいずれかから選択される、請求項８７〜１０７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０９】
前記５’テイル配列の各々が、配列番号２１０〜２７０９から選択される、請求項８７〜１０８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１０】
プライマーの前記１つまたは複数のセットが、以下：
配列番号２９〜４４；配列番号５１〜５６；配列番号６２〜６６；配列番号６７〜８４；配列番号１６３〜１８６；および配列番号１８７〜２０９
からなる群から選択される２つ以上の配列を含む、請求項８７〜１０９のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本願は、その全体が本明細書中に参考として援用される、２０１２年２月２３日に出願した米国仮出願第６１／６０２，２４６号および同第６１／６０２，２４４号、ならびに２０１２年７月１３日に出願した米国仮出願第６１／６７１，３１５号および同第６１／６７１，３１４号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）項の下での優先権を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、その全体が本明細書で参照により組み込まれるＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩフォーマットで提出された配列表を含む。２０１３年２月２２日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、０４６２６４−０７２５５４−ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、サイズは１４，４７３，７２８バイトである。
【０００３】
本発明は、１つまたは複数の特異的核酸の存在を検出する方法に関する。いくつかの実施形態では、これらの方法は、１つまたは複数の対立遺伝子標的部位遺伝子座の遺伝子型を決定する。いくつかの実施形態では、これらの方法は、多重ＰＣＲに関する。
【背景技術】
【０００４】
試料中の一塩基多型（ＳＮＰ）および／または変異の存在を検出するための現在のＰＣＲベースの方法は、バックグラウンドシグナルに苦しんでいる。例えば、ＳＮＰの検出のための１つの一般的なアプローチは、Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＡＲＭＳ）である。ＡＲＭＳで利用される対立遺伝子特異的プライマーは、３’末端ヌクレオチドにおいてバリエーションを有する標的特異的配列のみを含むように設計され、その結果、その３’末端ヌクレオチドが所与の鋳型に対して相補的なプライマーのみが伸長され得、それにより、ＳＮＰ部位におけるヌクレオチドを同定する。かかるプライマーは、非標的配列との非特異的相互作用に起因してミスプライミングし得る、すなわち、このＡＲＭＳアプローチは、「漏れやすい」。さらに、ＡＲＭＳが多重化され、少なくとも１つのアンプリコンが高レベルまで蓄積する場合、プライマー相互作用または「クロストーク」が生じる。
【０００５】
ネステッドプライマーを利用する反応が試みられてきた。これらのアプローチでは、第１のセットの非対立遺伝子特異的プライマーが、第１のアニーリング温度を使用して、試料中に存在する標的遺伝子座の全ての対立遺伝子を増幅するために使用される。次いで、第２のセットの対立遺伝子特異的プライマーが、第２のより低いアニーリング温度において標的を増幅するために使用される。このアプローチは、ＡＲＭＳアプローチについて記載されたのと同じ漏れおよびクロストークの問題に苦しみ得る（Taboneら  BMC  Genomics  ２００９年、１０巻：５８０頁）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Taboneら  BMC  Genomics  ２００９年、１０巻：５８０頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書に記載される本発明の方法および組成物は、核酸試料中の１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在の決定を可能にする。本発明の種々の態様は、異なるアニーリング温度を有することによって鑑別される少なくとも２つの期を有するＰＣＲ増幅レジメンにおける、少なくとも１つの二重ドメインプライマー（または切断型二重ドメインプライマー）の使用に基づく。このＰＣＲ増幅レジメンの第１の期の間、二重ドメインプライマー（または切断型二重ドメインプライマー）の３’コア領域は、その標的に特異的にアニーリングし、プライマー伸長が生じ、標的ポリヌクレオチドおよび／またはその相補体を含む増幅産物を創出する。これらの増幅産物は、産物の少なくとも１つの末端において「タグ」配列を含み、このタグは、少なくとも１つの二重ドメインプライマー（または切断型二重ドメインプライマー）の５’テイル領域の配列を含む。このＰＣＲ増幅レジメンの第２の期では、アニーリング温度が上昇され、その結果、５’テイル領域および３’コア領域の両方に対して相補的な配列が、二重ドメインプライマー（または切断型二重ドメインプライマー）の標的へのアニーリングのために必要とされ、したがって、このプライマーがオフターゲットポリヌクレオチドに対してミスプライミングすることを防止する。
【０００８】
本明細書に記載される方法および組成物は、オフターゲットポリヌクレオチドの増幅を低減させるため、およびかかるパラメーターに関心が持たれる場合にはＰＣＲ増幅レジメンのシグナル対ノイズ比を改善させるために、使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、オフターゲットポリヌクレオチドの増幅を低減させるため、および１つまたは複数のＳＮＰの対立遺伝子を検出するために設計されたＰＣＲ増幅レジメンのシグナル対ノイズ比を改善させるために、使用され得る。
【０００９】
本明細書に記載される本発明の一態様は、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法に関し、この方法は；鎖分離、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のサイクルを含むＰＣＲ増幅レジメンを、核酸試料と各標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットとを含む反応混合物に対して実施するステップであって；オリゴヌクレオチドプライマーの各セットは、少なくとも１つの切断型二重ドメインフォワードプライマーの第１のサブセットおよび少なくとも１つのリバースプライマーの第２のサブセットを含み；セットの各切断型二重ドメインプライマーは、このセット中の他の切断型二重ドメインプライマー上の５’テイル領域とは異なる５’テイル領域およびこの標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域を含み；各切断型二重ドメインプライマーについて、この３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、この５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、この第２のアニーリング温度は、第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、この第２のアニーリング温度において、この切断型二重ドメインプライマーの３’コアは、この切断型二重ドメインプライマーの５’テイル配列の相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；プライマーセットの各切断型二重ドメインプライマーについて：この５’テイル配列は、標的配列に対する相同性を全く有さない；およびこの５’テイル配列は、この切断型二重ドメインプライマーセットの任意の他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有し；このＰＣＲ増幅レジメンは、第１の期および第２の期を含み、この第１の期は、第１のセットのサイクルのための第１のアニーリング温度においてアニーリングすることを含み、および；この第２の期は、第２のセットのサイクルのための第２のアニーリング温度においてアニーリングすることを含む、ステップ；ならびに各標的ポリヌクレオチドについての増幅産物を検出するステップであって、この検出は、この標的ポリヌクレオチドの存在を示す、ステップ、を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、リバースプライマーは二重ドメインプライマーを含む。いくつかの実施形態では、リバースプライマーは切断型二重ドメインプライマーを含む。いくつかの実施形態では、リバースプライマーは増幅プライマーを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、プライマーのこのセットは、少なくとも１つの二重ドメインフォワードプライマーを含み；セットの各二重ドメインプライマーは、このセット中の他の二重ドメインプライマーの５’テイル領域とは異なる５’テイル領域、前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域、および前記標的部位に存在するバリアントヌクレオチドの１つに対して相補的な末端ヌクレオチド、を含み；各二重ドメインプライマーについて、この３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、この５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、この第２のアニーリング温度は、第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記二重ドメインプライマーの前記３’コアは、この二重ドメインプライマーの５’テイル配列の相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；かつプライマーセットの各切断型二重ドメインプライマーについて：この５’テイル配列は、標的配列に対する相同性を全く有さない；およびこの５’テイル配列は、二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーセットの任意の他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、この標的ポリヌクレオチドは、以下：ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは単一の反応において検出される。いくつかの実施形態では、この標的ポリヌクレオチドは、以下：ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、この標的ポリヌクレオチドは、以下：ＳＮＰを含むポリヌクレオチドおよびＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド；ならびに以下：タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、この標的ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つがＳＮＰを含み、この方法は、このＳＮＰにおけるヌクレオチドを遺伝子型決定する。いくつかの実施形態では、標的ＳＮＰの２つ以上の対立遺伝子の各々に対して特異的な二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、同じ反応中に存在する。いくつかの実施形態では、セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、この標的ＳＮＰの優勢対立遺伝子に対して特異的である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチドの２つ以上の対立遺伝子または配列バリアントの各々に対して特異的なこの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーは、同じ反応中に存在する。いくつかの実施形態では、セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーは、この標的ポリヌクレオチドの優勢対立遺伝子またはバリアント対立遺伝子に対して特異的である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーのこの増幅産物は識別され得る。いくつかの実施形態では、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーのこの増幅産物は、別個のサイズであることによって識別される。いくつかの実施形態では、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーのこの増幅産物は、異なる検出可能な標識で標識されていることによって識別される。いくつかの実施形態では、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーのこの産物は、この産物を配列決定することによって識別される。いくつかの実施形態では、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーのこの産物は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって識別される。いくつかの実施形態では、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーのこの産物は、この増幅産物の融解曲線分析によって識別される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、このコア配列は１０〜４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、このコア配列は１１〜２０ヌクレオチド長である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、この第１の期は１〜１０サイクルを含む。いくつかの実施形態では、この第１の期は３〜５サイクルを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、セットの各５’テイル配列は、このセットのこの他の５’テイル配列に対する３つ未満連続する相同塩基を有する。いくつかの実施形態では、セットの各５’テイル配列は、このセットのこの他の５’テイル配列に対する２つ未満連続する相同塩基を有する。いくつかの実施形態では、この５’テイル配列は１〜１５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、この５’テイル配列は１〜５０ヌクレオチド長である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、この第２のアニーリング温度は、この第１のアニーリング温度よりも少なくとも４℃高い。いくつかの実施形態では、反応中に存在するこの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーは、互いに８℃以下異なる、そのそれぞれの３’コア領域に対するＴｍ値を有する。
【００２２】
一態様において、本明細書に記載される本発明は、各標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つのセットを含む、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するための組成物であって、オリゴヌクレオチドプライマーの各セットは、少なくとも１つの切断型二重ドメインフォワードプライマーの第１のサブセットおよび少なくとも１つのリバースプライマーの第２のサブセットを含み；セットの各切断型二重ドメインプライマーは、このセット中の他の切断型二重ドメインプライマー上の５’テイル領域とは異なる５’テイル領域およびこの標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域を含み；各切断型二重ドメインプライマーについて、この３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、この５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、この第２のアニーリング温度は、この第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、この第２のアニーリング温度において、この切断型二重ドメインプライマーのこの３’コアは、このプライマーの５’テイル配列のこの相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；この切断型二重ドメインプライマーセットの各メンバーについて：この５’テイル配列は、この標的配列に対する相同性を全く有さない；およびこの５’テイル配列は、この切断型二重ドメインプライマーセットのこの他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、組成物に関する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、この組成物は核酸試料をさらに含み得る。
【００２４】
いくつかの実施形態では、この組成物の少なくとも１つのフォワードプライマーは二重ドメインプライマーを含み；セットの各二重ドメインプライマーは、このセット中の他の二重ドメインプライマー上の５’テイル領域とは異なる５’テイル領域、前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域、および前記標的部位に存在するバリアントヌクレオチドの１つに対して相補的な末端ヌクレオチド、を含み；各二重ドメインプライマーについて、この３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、この５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、この第２のアニーリング温度は、この第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記二重ドメインプライマーの前記３’コアは、このプライマーの５’テイル配列のこの相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；前記二重ドメインプライマーセットの各メンバーについて：この５’テイル配列は、この標的配列に対する相同性を全く有さない；およびこの５’テイル配列は、この二重ドメインプライマーセットのこの他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、リバースプライマーは二重ドメインプライマーを含む。いくつかの実施形態では、リバースプライマーは切断型二重ドメインプライマーを含む。いくつかの実施形態では、リバースプライマーは増幅プライマーを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、この標的ポリヌクレオチドは、以下：ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、この標的ポリヌクレオチドは、以下：ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、この標的ポリヌクレオチドは、以下：ＳＮＰを含むポリヌクレオチドおよびＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド；ならびに以下：タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、二重ドメインフォワードプライマーのサブセットは、標的ＳＮＰの２つ以上の対立遺伝子の各々に対して特異的なプライマーを含む。いくつかの実施形態では、セットの１つの二重ドメインフォワードプライマーは、この標的ＳＮＰのこの優勢対立遺伝子に対して特異的である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、二重ドメインまたは切断型二重ドメインフォワードプライマーのこのサブセットは、標的ヌクレオチドの２つ以上の対立遺伝子または配列バリアントの各々に対して特異的なプライマーを含む。いくつかの実施形態では、セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインフォワードプライマーは、この標的ポリヌクレオチドの優勢対立遺伝子またはバリアント対立遺伝子に対して特異的である。
【００２９】
いくつかの実施形態では、このコア配列は１０〜４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、このコア配列は１１〜２０ヌクレオチド長である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、セットの各５’テイル配列は、このセットのこの他の５’テイル配列に対する３つ未満連続する相同塩基を有する。いくつかの実施形態では、セットの各５’テイル配列は、このセットのこの他の５’テイル配列に対する２つ未満連続する相同塩基を有する。いくつかの実施形態では、この５’テイル配列は１〜１５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、この５’テイル配列は１〜５０ヌクレオチド長である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、この第２のアニーリング温度は、この第１のアニーリング温度よりも少なくとも４℃高い。いくつかの実施形態では、反応中に存在するこの二重ドメインプライマーは、互いに８℃以下異なる、そのそれぞれの３’コア領域に対するＴｍ値を有する。
【００３２】
本明細書に記載される本発明の一態様は、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法に関し、この方法は；鎖分離、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のサイクルを含むＰＣＲ増幅レジメンを、核酸試料と各標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットとを含む反応混合物に対して実施するステップであって；オリゴヌクレオチドプライマーの各セットは、少なくとも１つの切断型二重ドメインフォワードプライマーの第１のサブセットおよび少なくとも１つのリバースプライマーの第２のサブセットを含み；セットの各切断型二重ドメインプライマーは、このセット中の他の切断型二重ドメインプライマー上の５’テイル領域とは異なる５’テイル領域およびこの標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域を含み；各切断型二重ドメインプライマーについて、この３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、この５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、この第２のアニーリング温度は、第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、この第２のアニーリング温度において、この切断型二重ドメインプライマーの３’コアは、この切断型二重ドメインプライマーの５’テイル配列の相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；プライマーセットの各切断型二重ドメインプライマーについて：この５’テイル配列は、標的配列に対する相同性を全く有さない；およびこの５’テイル配列は、この切断型二重ドメインプライマーセットの任意の他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有し；このＰＣＲ増幅レジメンは、第１の期および第２の期を含み、この第１の期は、第１のセットのサイクルのための第１のアニーリング温度においてアニーリングすることを含み、および；この第２の期は、第２のセットのサイクルのための第２のアニーリング温度においてアニーリングすることを含む、ステップ；ならびに各標的ポリヌクレオチドについての増幅産物を検出するステップであって、この検出は、この標的ポリヌクレオチドの存在を示す、ステップ、を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、リバースプライマーは二重ドメインプライマーを含む。いくつかの実施形態では、リバースプライマーは切断型二重ドメインプライマーを含む。いくつかの実施形態では、リバースプライマーは増幅プライマーを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、プライマーのこのセットは、少なくとも１つの二重ドメインフォワードプライマーを含み；セットの各二重ドメインプライマーは、このセット中の他の二重ドメインプライマーの５’テイル領域とは異なる５’テイル領域、前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域、および前記標的部位に存在するバリアントヌクレオチドの１つに対して相補的な末端ヌクレオチド、を含み；各二重ドメインプライマーについて、この３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、この５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、この第２のアニーリング温度は、第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記二重ドメインプライマーの前記３’コアは、この二重ドメインプライマーの５’テイル配列の相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；かつプライマーセットの各切断型二重ドメインプライマーについて：この５’テイル配列は、標的配列に対する相同性を全く有さない；およびこの５’テイル配列は、二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーセットの任意の他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、この標的ポリヌクレオチドは、以下：ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、複数の標的ポリヌクレオチドは単一の反応において検出される。いくつかの実施形態では、この標的ポリヌクレオチドは、以下：ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、この標的ポリヌクレオチドは、以下：ＳＮＰを含むポリヌクレオチドおよびＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド；ならびに以下：タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、この標的ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つはＳＮＰを含み、この方法は、このＳＮＰにおけるヌクレオチドを遺伝子型決定する。いくつかの実施形態では、標的ＳＮＰの２つ以上の対立遺伝子の各々に対して特異的な二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーは、同じ反応中に存在する。いくつかの実施形態では、セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーは、この標的ＳＮＰの優勢対立遺伝子に対して特異的である。
【００３９】
いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチドの２つ以上の対立遺伝子または配列バリアントの各々に対して特異的なこの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーは、同じ反応中に存在する。いくつかの実施形態では、セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーは、この標的ポリヌクレオチドの優勢対立遺伝子またはバリアント対立遺伝子に対して特異的である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーのこの増幅産物は識別され得る。いくつかの実施形態では、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーのこの増幅産物は、別個のサイズであることによって識別される。いくつかの実施形態では、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーのこの増幅産物は、異なる検出可能な標識で標識されていることによって識別される。いくつかの実施形態では、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーのこの産物は、この産物を配列決定することによって識別される。いくつかの実施形態では、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーのこの産物は、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって識別される。いくつかの実施形態では、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーのこの産物は、この増幅産物の融解曲線分析によって識別される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、このコア配列は１０〜４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、このコア配列は１１〜２０ヌクレオチド長である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、この第１の期は１〜１０サイクルを含む。いくつかの実施形態では、この第１の期は３〜５サイクルを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、セットの各５’テイル配列は、このセットのこの他の５’テイル配列に対する３つ未満連続する相同塩基を有する。いくつかの実施形態では、セットの各５’テイル配列は、このセットのこの他の５’テイル配列に対する２つ未満連続する相同塩基を有する。いくつかの実施形態では、この５’テイル配列は１〜１５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、この５’テイル配列は１〜５０ヌクレオチド長である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、この第２のアニーリング温度は、この第１のアニーリング温度よりも少なくとも４℃高い。いくつかの実施形態では、反応中に存在するこの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーは、互いに８℃以下異なる、そのそれぞれの３’コア領域に対するＴｍ値を有する。
【００４５】
一態様において、本明細書に記載される本発明は、各標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つのセットを含む、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するための組成物であって、オリゴヌクレオチドプライマーの各セットは、少なくとも１つの切断型二重ドメインフォワードプライマーの第１のサブセットおよび少なくとも１つのリバースプライマーの第２のサブセットを含み；セットの各切断型二重ドメインプライマーは、このセット中の他の切断型二重ドメインプライマー上の５’テイル領域とは異なる５’テイル領域およびこの標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域を含み；各切断型二重ドメインプライマーについて、この３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、この５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、この第２のアニーリング温度は、この第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、この第２のアニーリング温度において、この切断型二重ドメインプライマーのこの３’コアは、このプライマーの５’テイル配列のこの相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；この切断型二重ドメインプライマーセットの各メンバーについて：この５’テイル配列は、この標的配列に対する相同性を全く有さない；およびこの５’テイル配列は、この切断型二重ドメインプライマーセットのこの他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、組成物に関する。
【００４６】
いくつかの実施形態では、この組成物は核酸試料をさらに含み得る。
【００４７】
いくつかの実施形態では、この組成物の少なくとも１つのフォワードプライマーは二重ドメインプライマーを含み；セットの各二重ドメインプライマーは、このセット中の他の二重ドメインプライマー上の５’テイル領域とは異なる５’テイル領域、前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域、および前記標的部位に存在するバリアントヌクレオチドの１つに対して相補的な末端ヌクレオチド、を含み；各二重ドメインプライマーについて、この３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、この５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、この第２のアニーリング温度は、この第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記二重ドメインプライマーの前記３’コアは、このプライマーの５’テイル配列のこの相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；前記二重ドメインプライマーセットの各メンバーについて：この５’テイル配列は、この標的配列に対する相同性を全く有さない；およびこの５’テイル配列は、この二重ドメインプライマーセットのこの他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する。
【００４８】
いくつかの実施形態では、リバースプライマーは二重ドメインプライマーを含む。いくつかの実施形態では、リバースプライマーは切断型二重ドメインプライマーを含む。いくつかの実施形態では、リバースプライマーは増幅プライマーを含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、この標的ポリヌクレオチドは、以下：ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、この標的ポリヌクレオチドは、以下：ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、この標的ポリヌクレオチドは、以下：ＳＮＰを含むポリヌクレオチドおよびＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド；ならびに以下：タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、二重ドメインフォワードプライマーのサブセットは、標的ＳＮＰの２つ以上の対立遺伝子の各々に対して特異的なプライマーを含む。いくつかの実施形態では、セットの１つの二重ドメインフォワードプライマーは、この標的ＳＮＰのこの優勢対立遺伝子に対して特異的である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、二重ドメインまたは切断型二重ドメインフォワードプライマーのこのサブセットは、標的ヌクレオチドの２つ以上の対立遺伝子または配列バリアントの各々に対して特異的なプライマーを含む。いくつかの実施形態では、セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインフォワードプライマーは、この標的ポリヌクレオチドの優勢対立遺伝子またはバリアント対立遺伝子に対して特異的である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、このコア配列は１０〜４０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、このコア配列は１１〜２０ヌクレオチド長である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、セットの各５’テイル配列は、このセットのこの他の５’テイル配列に対する３つ未満連続する相同塩基を有する。いくつかの実施形態では、セットの各５’テイル配列は、このセットのこの他の５’テイル配列に対する２つ未満連続する相同塩基を有する。いくつかの実施形態では、この５’テイル配列は１〜１５０ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、この５’テイル配列は１〜５０ヌクレオチド長である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、この第２のアニーリング温度は、この第１のアニーリング温度よりも少なくとも４℃高い。いくつかの実施形態では、反応中に存在するこの二重ドメインプライマーは、互いに８℃以下異なる、そのそれぞれの３’コア領域に対するＴｍ値を有する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、伝統的なＰＣＲプライマーを使用するＰＣＲ増幅レジメンの概略描写である。
【００５６】
【図２】図２は、同一または高度に類似したテイル配列を有する短いプライマーを使用するＰＣＲ増幅レジメンの概略描写である。
【００５７】
【図３】図３は、高度に不均一なテイル配列を有する短いプライマーを使用するＰＣＲ増幅レジメンの概略描写である。
【００５８】
【図４】図４は、個々の変異体（１ｎｇ）およびＫ５６２野生型（５０ｎｇ）細胞株ＤＮＡを用いた多重ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ変異アッセイの結果を示す。
【００５９】
【図５】図５は、Ｋ５６２野生型細胞株ＤＮＡと混合した個々の変異体細胞株ＤＮＡ（１％）を用いた多重ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ変異アッセイの結果を示す。
【００６０】
【図６】図６は、合成ＤＮＡおよび精製されたヒトＤＮＡ試料を用いた多重ＩＬ−１０（−１０８２）／ＴＮＦ−α（−３０８）ＳＮＰアッセイの結果を示す。
【００６１】
【図７】図７は、オリゴヌクレオチドプライマーのセットおよび標的遺伝子座の２つの対立遺伝子に対するそれらの関係の１例の概略を示す。プライマーのセットは、２つのサブセットを含む。第１のサブセットは、標的遺伝子座の両方の対立遺伝子にアニーリングすることが可能であり、かつ第２のサブセットのプライマーのいずれかと組み合わせて標的を増幅することが可能な、単一の増幅プライマー（黒の破線）を含む。第２のサブセットは２つの二重ドメインプライマーを含む。３’コアは、黒のべた塗りブロックで示され、５’テイルは、縦線を伴ったブロックとして示される。第１の二重ドメインプライマーの３’ヌクレオチドは、標的遺伝子座の対立遺伝子番号１に対して相補的であるが、第２の二重ドメインプライマーの３’ヌクレオチドは、標的遺伝子座の対立遺伝子番号２に対して相補的である。
【００６２】
【図８】図８は、ＫＲＡＳ  ＳＮＰスパイクイン血漿試料アッセイの結果を示す。
【００６３】
【図９】図９は、ＫＲＡＳのコドン１２および１３中のＳＮＰを検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号８５）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、３’から５’へと黒で示され（配列番号８６）、複数の可能なリバースプライマーは、５’から３’で示される（配列番号８７〜９８）。
【００６４】
【図１０】図１０は、ＫＲＡＳのコドン６１中のＳＮＰを検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号９９）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、３’から５’へと黒で示され（配列番号１００）、複数の可能なリバースプライマーは、５’から３’で示される（配列番号１０１〜１０９）。
【００６５】
【図１１】図１１は、ＫＲＡＳのコドン１４６中のＳＮＰを検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号１１０）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、３’から５’へと黒で示され（配列番号１１１）、複数の可能なリバースプライマーは、５’から３’で示される（配列番号１１２〜１１９）。
【００６６】
【図１２】図１２は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００を検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号１２０）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、３’から５’へと黒で示され（配列番号１２１）、複数の可能なリバースプライマーは、５’から３’で示される（配列番号１２２〜１２９）。
【００６７】
【図１３】図１３は、図９に示される配列の相補鎖上の、ＫＲＡＳのコドン１２および１３中のＳＮＰを検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号１３０）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、５’から３’へと黒で示され（配列番号１３１）、複数の可能なリバースプライマーは、３’から５’で示される（配列番号１３２〜１３８）。
【００６８】
【図１４】図１４は、図１０に示される配列の相補鎖上の、ＫＲＡＳのコドン６１中のＳＮＰを検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号１３９）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、５’から３’へと黒で示され（配列番号１４０）、複数の可能なリバースプライマーは、３’から５’で示される（配列番号１４１〜１４６）。
【００６９】
【図１５】図１５は、図１１に示される配列の相補鎖上の、ＫＲＡＳのコドン１４６中のＳＮＰを検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号１４７）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、５’から３’へと黒で示され（配列番号１４８）、複数の可能なリバースプライマーは、３’から５’で示される（配列番号１４９〜１５４）。
【００７０】
【図１６】図１６は、図１２に示される配列の相補鎖上の、ＢＲＡＦ  Ｖ６００を検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号１５５）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、５’から３’へと黒で示され（配列番号１５６）、複数の可能なリバースプライマーは、３’から５’で示される（配列番号１５７〜１６２）。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
核酸試料中の１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定することに関する方法および組成物が、本明細書に記載される。本明細書に記載される方法および組成物は、二重ドメインプライマーの使用を介した、多重、マルチモーダルおよび／または遺伝子型決定ＰＣＲ増幅レジメンを実施するための改善された方法の、本発明者の発見に少なくとも一部基づく。
【００７２】
定義
簡便さのために、明細書、実施例および添付の特許請求の範囲においてここで使用される特定の用語を、ここに集める。特に示さない限り、または文脈から示されない限り、以下の用語および語句は、以下に提供される意味を含む。特に明示的に示さない限り、または文脈から明らかでない限り、以下の用語および語句は、その用語または語句が関係する分野においてその用語または語句が獲得した意味を排除しない。本発明の範囲は、特許請求の範囲によってのみ限定されるので、これらの定義は、特定の実施形態を記載する際の助けとして提供され、特許請求された発明を限定することを意図しない。特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００７３】
細胞生物学および分子生物学における一般的用語の定義は、Blackwell  Science  Ltd.によって１９９４年に出版されたThe  Encyclopedia  of  Molecular  Biology（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）中に見出すことができる；分子生物学における一般的用語の定義は、Jones  &  Bartlett  Publishingによって２００９年に出版されたBenjamin  Lewin,  Genes  X（ＩＳＢＮ−１０：０７６３７６６３２１）；VCH  Publishers,Inc.によって１９９５年に出版されたKendrewら（編）およびMolecular  Biology  and  Biotechnology:  a  Comprehensive  Desk  Reference（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）中にも見出すことができる。
【００７４】
特に示さない限り、本発明は、例えば、その全体が本明細書で参照により全て組み込まれる、Sambrookら、Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual（第３版）、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、Cold  Spring  Harbor、N.Y.、USA（２００１年）；Davisら、Basic  Methods  in  Molecular  Biology、Elsevier  Science  Publishing,  Inc.、New  York、USA（１９９５年）に記載されるような標準的な手順を使用して実施した。
【００７５】
用語「単離された」または「部分的に精製された」は、本明細書で使用する場合、核酸の場合には、その天然の供給源において見出されるようにその核酸と共に存在するおよび／または細胞によって発現された場合にその核酸と共に存在する少なくとも１つの他の構成成分（例えば、核酸またはポリペプチド）から分離された核酸を指す。化学合成された核酸またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳を使用して合成された核酸は、「単離された」とみなされる。
【００７６】
本明細書で使用する場合、用語「核酸」または「核酸配列」とは、リボ核酸、デオキシリボ核酸またはそれらのアナログの単位を組み込むポリマー性分子を指す。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る。一本鎖核酸は、変性された二本鎖ＤＮＡの一方の鎖であり得る。あるいは、核酸は、任意の二本鎖ＤＮＡから誘導されたものではない一本鎖核酸であり得る。一態様では、鋳型核酸はＤＮＡである。別の態様では、鋳型はＲＮＡである。適切な核酸分子には、ゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡを含むＤＮＡが含まれる。他の適切な核酸分子には、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡを含むＲＮＡが含まれる。この核酸分子は、ゲノムＤＮＡ中のように天然に存在し得、または合成であり得る、すなわちヒトの活動に基づいて調製され得る、あるいはこれら２つの組合せであり得る。この核酸分子は、２’−デオキシ、２’−デオキシ−２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）もしくは２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（2'-O--N-methylacetamido）（２’−Ｏ−ＮＭＡ）、コレステロール付加、および米国特許出願第２００７０２１３２９２号に記載されるようなホスホロチオエート骨格；ならびに米国特許第６，２６８，４９０号に記載されるような、メチレン単位によって２’−酸素原子と４’−炭素原子との間で連結された特定のリボヌクレオシドなどの特定の改変もまた有し得、両方の特許および特許出願は、その全体が本明細書で参照により組み込まれる。
【００７７】
用語「遺伝子」は、適切な調節配列に作動可能に連結した場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでＲＮＡへと転写される核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子は、コード領域の前および後の調節領域、例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）を含み得る。
【００７８】
本明細書で使用する場合、用語「相補的」とは、２つの所与のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列が互いにアニーリングする場合、ＤＮＡ中ではＡがＴと対合し、ＧがＣと対合し、ＲＮＡ中ではＧがＣと対合し、ＡがＵと対合するような、ヌクレオチド塩基Ｇ、Ａ、Ｔ、ＣおよびＵ間の水素結合した塩基対形成の嗜好性の階層を指す。本明細書で使用する場合、「実質的に相補的」とは、プライマーの配列全体にわたり、第２のヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の相補性を有するプライマーを指し、例えば、９０％相補的、９５％相補的、９８％相補的、９９％相補的または１００％相補的である。
【００７９】
本明細書で使用する場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、組成物、方法、およびその方法または組成物にとって本質的なそのそれぞれの構成成分（複数可）に関して使用されるが、本質的であってもなくても、特定されていない要素を含むことにもなお開かれている。
【００８０】
本明細書で使用する場合、用語「本質的に〜からなる」とは、所与の実施形態に必要とされる要素を指す。この用語は、その実施形態の基本的かつ新規または機能的特徴（複数可）に大きい影響を与えない要素の存在を許容する。
【００８１】
用語「からなる」とは、実施形態の説明において列挙されていない任意の要素を排除する、本明細書に記載されるような組成物、方法、およびそのそれぞれの構成成分を指す。
【００８２】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他を指示しない限り、複数形の言及を含む。したがって例えば、「この方法」に対する言及は、本明細書に記載される型の、および／または本開示などを読めば当業者に明らかになる、１つまたは複数の方法および／またはステップを含む。同様に、単語「または」は、文脈が明らかに他を示さない限り、「および」を含む意図である。本明細書に記載される方法および材料と類似または等価な方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料は以下に記載されている。省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａ（例えば）に由来し、非限定的な例を示すために本明細書で使用される。したがって、省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、用語「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）と同義である。
【００８３】
操作実施例中または特に示した場合を除き、本明細書で使用される成分の量または反応条件を表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」によって修飾されると理解すべきである。用語「約」は、百分率と関連して使用する場合、±１％を意味し得る。
【００８４】
他の用語は、本発明の種々の態様の説明において本明細書で定義される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、一般に適用される方法と比較して、低減したバックグラウンドおよび増加した特異性を有するＰＣＲ増幅レジメンに関する。標的配列のＰＣＲ増幅において特異性を増加させバックグラウンドレベルを減少させる１つの方法は、プライマーの長さを短縮することである。プライマーの長さが減少するにつれ、核酸プライマー−鋳型二重鎖の融点に対する、任意の１つの位置における誤対合の影響は増加する（表１を参照のこと）。しかし、短いプライマーを用いた場合でさえ、非標的配列の増幅（すなわち、バックグラウンドノイズ）の問題は、なおも些細ではない。本明細書に記載される規則に従って、二重ドメインプライマーを生成するために短い標的特異的プライマー配列に対して５’テイル領域をカップリングすることで、ＰＣＲ増幅レジメンの第２の期の間に、これらのプライマーが、核酸試料から配列を増幅していないが、ＰＣＲ増幅レジメンの第１の期の間に生成された増幅産物からのみ配列を増幅していることを確実にする。これは、バックグラウンド増幅の１つの継続中の供給源を回避する。ＰＣＲ増幅レジメンの第１の期中のサイクル数を最小に維持することによって、バックグラウンド増幅の量は、有意に低減される。好ましい実施形態では、バックグラウンド増幅の量は、検出可能なレベルを下回って低減される。ＰＣＲ増幅レジメンの第２の期におけるプライマー間のクロストークを回避するために、プライマーセット中の各二重ドメインプライマーおよび／または切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域は、このセット中の全ての他の二重ドメインプライマーおよび／または切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域とは異なることが好ましい。
【００８６】
核酸試料中の１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドを検出および／または分析するための方法および組成物が、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、異なるアニーリング温度を有することによって鑑別される少なくとも２つの期を有するＰＣＲ増幅レジメンにおける少なくとも１つの二重ドメインプライマー（または切断型二重ドメインプライマー）の使用に関する。ＰＣＲ増幅レジメンの第１の期の間、二重ドメインプライマー（または切断型二重ドメインプライマー）の３’コア領域がその標的に特異的にアニーリングし、プライマー伸長が起こり、標的ポリヌクレオチド配列および／またはその相補体を含む増幅産物が創出される。この増幅産物は、増幅されている標的配列およびこの産物の少なくとも１つの末端における「タグ」の両方を含み、このタグは、二重ドメイン（または切断型二重ドメインプライマー）の５’テイルの配列を含む。ＰＣＲ増幅レジメンの第２の期では、アニーリング温度が上昇され、その結果、５’テイル領域および３’コア領域の両方に対して相補的な配列が、二重ドメインプライマー（または切断型二重ドメインプライマー）の標的に対するアニーリングのために必要とされ、したがって、このプライマーがオフターゲットポリヌクレオチドに対してミスプライミングすることを防止する。
【００８７】
主題の方法を実施するための考慮事項は、本明細書の以下に記載される。簡潔に述べると、ＰＣＲ一般の態様、ならびに特許請求された方法に対してより特異的に適用可能な態様、例えば、二重ドメインプライマーの設計、アニーリング温度、増幅の各期のためのサイクリングパラメーター、ＳＮＰ検出のための考慮事項を含む標的特異的考慮事項、マルチモーダル増幅、多重化のための選択肢、および増幅産物の検出のための種々の考慮事項、を考慮することが重要である。
【００８８】
ＰＣＲ
本明細書に記載される方法および組成物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅レジメンを実施することに関する。本明細書で使用する場合、用語「増幅レジメン」とは、対象の核酸配列を特異的に増幅する、すなわち、対象の核酸配列の存在量を増加させるプロセスを指し、より具体的には、以前のポリメラーゼ伸長の産物が後に続くラウンドの伸長のための鋳型として機能する場合に生じる指数関数的増幅を指す。本発明に従うＰＣＲ増幅レジメンは、少なくとも２つの、および好ましくは少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５またはそれ以上の反復サイクルを含み、各サイクルは以下のステップを含む：１）鎖分離（例えば、熱変性）；２）鋳型分子へのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング；および３）アニーリングしたプライマーの核酸ポリメラーゼ伸長。これらのステップの各々に必要な条件および時間は、当業者によって考案され得る。本明細書に記載される方法に従う増幅レジメンは、サーマルサイクラーにおいて実施されることが好ましく、サーマルサイクラーの多くは市販されている。
【００８９】
ＰＣＲは、核酸ポリメラーゼの使用を必要とする。本明細書で使用する場合、語句「核酸ポリメラーゼ」とは、ヌクレオシド三リン酸の鋳型依存的重合を触媒して、鋳型核酸配列に対して相補的なプライマー伸長産物を形成する酵素を指す。核酸ポリメラーゼ酵素は、アニーリングしたプライマーの３’末端において合成を開始し、鋳型の５’末端に向かう方向で進行する。多数の核酸ポリメラーゼが当該分野で公知であり、市販されている。好ましい核酸ポリメラーゼの１つの群は、熱安定性である、すなわち、これらは、相補的核酸のアニーリングした鎖を変性させるのに十分な温度、例えば９４℃またはある場合にはそれより高い温度に供した後に、機能を保持する。
【００９０】
当該分野で理解されるように、ＰＣＲは、反応混合物の加熱を一般に含む鎖分離ステップを含むサイクルを必要とする。本明細書で使用する場合、用語「鎖分離」または「鎖を分離する」は、相補的二本鎖分子が、オリゴヌクレオチドプライマーへのアニーリングに利用可能な２本の単一の鎖へと分離されるような、核酸試料の処理を意味する。より具体的には、本明細書に記載される方法に従う鎖分離は、そのＴｍを上回って核酸試料を加熱することによって達成される。一般に、核酸ポリメラーゼに適した緩衝液中に核酸分子を含む試料について、９４℃まで加熱することが、鎖分離を達成するのに十分である。例示的な緩衝液は、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｃ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、０．５〜３ｍＭのＭｇＣｌ２および０．１％ＢＳＡを含む。
【００９１】
当該分野でまた理解されるように、ＰＣＲは、鋳型核酸に対してプライマーをアニーリングさせることを必要とする。本明細書で使用する場合、「アニーリング」とは、２つの相補的なまたは実質的に相補的な核酸鎖をハイブリダイズさせることを指し、より具体的には、ＰＣＲの文脈において使用する場合、鋳型依存的ポリメラーゼ酵素のためのプライマー伸長基質が形成されるようにハイブリダイズさせることを指す。プライマー−標的核酸アニーリングのための条件は、プライマーの長さおよび配列と共に変動し、プライマーについて計算されたＴｍに基づく。一般に、増幅レジメン中のアニーリングステップは、鎖分離ステップ後に、かかるアニーリングを可能にするのに十分な時間にわたって、プライマー配列について計算されたＴｍに基づく温度まで温度を低減させることを含む。
Ｔｍは、いくつかの広く入手可能なアルゴリズム（例えば、ＯＬＩＧＯ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  Ｉｎｃ．Ｃｏｌｏｒａｄｏ）プライマー設計ソフトウェアおよびＶＥＮＴＲＯ  ＮＴＩ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）プライマー設計ソフトウェア、ならびにＰｒｉｍｅｒ３およびＯｌｉｇｏ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒを含む、インターネット上で入手可能なプログラム）のいずれかを使用して、当業者によって容易に予測され得る。本明細書に提供される実施例に記載される方法について、Ｔｍは、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒソフトウェア（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ；Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ；およびｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｅｍｉｅｒｂｉｏｓｏｆｔ．ｃｏｍ／ｎｅｔｐｒｉｍｅｒ／ｎｅｔｐｒｌａｕｎｃｈ／Ｈｅｌｐ／ｘｎｅｔｐｒｌａｕｎｃｈ．ｈｔｍｌにおいてワールドワイドウェブ上で自由に利用可能である）を使用して計算した。プライマーのＴｍは、ＮｅｔＰｒｉｍｅｒソフトウェアによって使用され、その全体が本明細書で参照により組み込まれるFrieirら  PNAS  １９８６年、８３巻：９３７３〜９３７７頁においてより詳細に記載される、以下の式を使用して計算され得る。
Ｔｍ＝ΔＨ／（ΔＳ＋Ｒ×ｌｎ（Ｃ／４））＋１６．６ｌｏｇ（［Ｋ＋］／（１＋０．７［Ｋ＋］））−２７３．１５
式中、ΔＨは、らせん形成のエンタルピーであり；ΔＳは、らせん形成のエントロピーであり；Ｒはモル気体定数であり（１．９８７ｃａｌ／℃×ｍｏｌ）；Ｃは核酸濃度であり；［Ｋ＋］は塩濃度である。ほとんどの増幅レジメンについて、アニーリング温度は、予測されたＴｍを約５℃下回るように選択されるが、Ｔｍにより近いおよびＴｍを上回る温度（例えば、予測されたＴｍを１℃と５℃の間下回る温度、または予測されたＴｍを１℃と５℃の間上回る温度）が使用され得、例えば、予測されたＴｍを５℃よりも多く下回る温度（例えば、６℃下回る温度、８℃下回る温度、１０℃下回る温度またはそれより低い温度）も使用され得る。一般に、アニーリング温度がＴｍに近いほど、アニーリングはより特異的になる。ＰＣＲ増幅レジメンの間のプライマーアニーリングを可能にする時間は、反応の体積に主に依存し、より大きい体積はより長い時間を必要とするが、プライマーおよび鋳型の濃度にも依存し、鋳型に対するプライマーのより高い相対的濃度は、より低い相対的濃度よりも短い時間を必要とする。体積および相対的プライマー／鋳型濃度に依存して、増幅レジメン中のプライマーアニーリングステップは、１秒間〜５分間のオーダーであり得るが、一般には、１０秒間と２分間との間、好ましくは、３０秒間〜２分間のオーダーである。
【００９２】
本明細書で使用する場合、「実質的にアニーリングする」とは、検出可能なレベルの特異的増幅産物を産生するのに十分な、ＰＣＲ増幅レジメンの間のアニーリングの程度を指す。
【００９３】
ＰＣＲは、各サイクルにおけるアニーリングしたプライマーのポリメラーゼ伸長にも依存する。本明細書で使用する場合、用語「ポリメラーゼ伸長」は、アニーリングしたプライマーの３’末端への、核酸ポリメラーゼによる、少なくとも１つの相補的ヌクレオチドの鋳型依存的取り込みを意味する。ポリメラーゼ伸長は好ましくは、好ましくは鋳型の全長に対応するヌクレオチドを含むかそれ以下の長さまで、１つより多いヌクレオチドを付加する。ポリメラーゼ伸長のための条件は、ポリメラーゼの正体によって変動する。ポリメラーゼ伸長に使用される温度は一般に、その酵素の既知の活性特性に基づく。しかし、例えば酵素の至適温度を下回るアニーリング温度が必要とされる場合、より低い伸長温度を使用することが許容可能な場合が多い。一般に、この酵素は、その至適伸長温度よりも低い温度で少なくとも部分的に活性を保持するが、最も一般に使用される熱安定性ポリメラーゼ（例えば、Ｔａｑポリメラーゼおよびそのバリアント）によるポリメラーゼ伸長は、６５℃〜７５℃、好ましくは約６８〜７２℃で実施される。
【００９４】
プライマー伸長は、アニーリングしたオリゴヌクレオチドプライマーの伸長を可能にする条件下で実施される。本明細書で使用する場合、用語「伸長産物が生成されるような、アニーリングしたオリゴヌクレオチドの伸長を可能にする条件」とは、核酸ポリメラーゼがプライマー伸長を触媒する、例えば温度、塩濃度および補因子濃度、ｐＨならびに酵素濃度を含む条件のセットを指す。かかる条件は、使用されている核酸ポリメラーゼの正体によって変動するが、多数の有用なポリメラーゼ酵素のための条件が、当業者に周知である。条件の１つの例示的なセットは、Ｔａｑポリメラーゼがプライマー伸長を触媒する、７２℃で５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｃ−ＨＣｌ（２５℃でｐＨ８．８）、０．５〜３ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｕＭの各ｄＮＴＰおよび０．１％ＢＳＡである。
【００９５】
本明細書で使用する場合、「増幅産物」とは、ヌクレオチド配列中の鋳型ポリヌクレオチド配列および／またはその相補的配列に対応する、特定の標的ポリヌクレオチド配列および／またはその相補的配列の一部分のコピーである、ＰＣＲ反応から生じるポリヌクレオチドを指す。増幅産物は、プライマーに対して特異的であって、標的核酸および／またはその相補体の一部分である配列に隣接する配列を、さらに含み得る。本明細書に記載される増幅産物は一般に二本鎖ＤＮＡであるが、その個々の鎖が言及され得る。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、多重ＰＣＲに関する。本明細書で使用する場合、「多重ＰＣＲ」とは、１つの反応容器中の標的部位遺伝子座または標的核酸の１つより多い標的ポリヌクレオチドおよび／または１つより多い多型バリアントの同時増幅、ならびに複数の産物の次に続く検出または同時に起こる検出が、セット中の１つより多い対のプライマー（例えば、少なくとも１つより多いフォワードプライマーおよび／または１つより多いリバースプライマー）を使用することによって達成され得る、ＰＣＲの異形を指す。多重増幅は、複数の標的の存在を検出するためだけでなく、欠失、変異および多型の分析、検出および／または遺伝子型決定のため、あるいは定量的アッセイのためにも、有用であり得る。多重とは、単一の反応における、２〜１，０００の間の、標的部位遺伝子座または標的核酸の異なる標的配列および／または多型の検出を指し得る。本明細書で使用する場合、多重とは、単一の反応における、２〜１，０００の間の任意の範囲の、例えば、５〜５００の間、２５〜１０００の間もしくは１０〜１００の間の、標的部位遺伝子座または標的核酸の異なる標的配列および／または多型の検出などを指す。非限定的な例として、本明細書に記載される方法の一部としての多重ＰＣＲ反応は、単一の反応において、少なくとも２つの異なる対立遺伝子標的部位遺伝子座において、少なくとも２つのＳＮＰの２つ以上の可能な対立遺伝子の存在を、肯定的に検出し得る。用語「多重」は、ＰＣＲに適用される場合、同じＰＣＲ反応中に、少なくとも２つの異なる標的配列に対して特異的なプライマーが存在することを意味する。したがって、２つの異なる標的配列に対して特異的なプライマーセットが存在する反応は、少なくとも２つの標的配列のうち１つだけ（またはさらにはなし）が所与の試料中で実際に検出される場合であっても、多重増幅とみなされる。したがって、いくつかの実施形態では、多重ＰＣＲは、複数の対のプライマーを含む反応もまた指し得、この反応は、１つまたは複数の標的が反応中に存在する場合に、１つまたは複数の特異的増幅産物を生じ得る。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、マルチモーダルＰＣＲに関する。本明細書で使用する場合、「マルチモーダル」とは、１つより多い型またはクラスの標的配列の同時増幅が１つの反応容器中で生じる、多重ＰＣＲの異形を指す。マルチモーダル増幅は、いくつかの実施形態において、欠失、変異および多型の分析に有用であり得る。マルチモーダルとは、少なくとも２つの異なる型の標的、すなわち、２つの異なる型の標的、３つの異なる型の標的、４つの異なる型の標的または５つもしくはそれ以上の異なる型の標的の検出を指し得る。非限定的な例として、マルチモーダルＰＣＲ反応は、かかる標的の定量を含め、単一の反応中のｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの存在を検出し得、またはマルチモーダルＰＣＲは、同じ反応中のＳＮＰを遺伝子型決定し得るおよびｍｉＲＮＡを検出し得る。さらなる非限定的な例として、マルチモーダルＰＣＲ増幅は、単一の反応中の第２の標的部位遺伝子座においてＳＮＰを遺伝子型決定し得るおよび欠失を検出し得る。
【００９８】
したがって、マルチモーダル反応は、例えば、同じ反応中の発現されたＲＮＡおよびＤＮＡ遺伝子型の存在ならびに／または量を検出し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、標的ヌクレオチド、標的ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドの多型および／または対立遺伝子標的部位遺伝子座の定量的検出に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、標的ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、標的ポリヌクレオチドの多型および／または対立遺伝子標的部位遺伝子座の定量的多重検出に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、標的ヌクレオチド、標的ヌクレオチドの多型および／または対立遺伝子標的部位遺伝子座の定量的マルチモーダル検出に関する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡの存在下でＲＮＡまたはｃＤＮＡを特異的に検出するために、１つまたは複数のプライマーは、イントロンにまたがるプライマーであり得る。いくつかの実施形態では、短い標的ポリヌクレオチド（例えば、ｍｉＲＮＡまたは分解された標的ポリヌクレオチド）ならびにより長い標的ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡ中の標的部位遺伝子座）を検出するために、少なくともより短い標的ポリヌクレオチドに対するプライマーは、標的配列よりも大きい個別のサイズの増幅産物を生じるタグ配列を含み得る。これらのタグは、反応中の全ての増幅産物が別個のサイズであるように、設計され得る。
【００９９】
定量的態様は、例えば、増幅反応の間またはその後の任意の時点において反復して試料採取し、その後増幅産物の分離および検出を行うことによって、促進され得る。試料採取は、例えば、反応のアリコートを取り出すことを含み得る。試料採取は、例えば、サイクル毎の最後に、または数サイクル毎の最後に、例えば、２サイクル毎、３サイクル毎、４サイクル毎などの最後に、行われ得る。均一な試料間隔が最も頻繁に所望されるが、均一な間隔で試料採取が実施されるという要件はない。単に１例として、試料採取方法は、最初の５サイクルにわたってサイクル毎の後に試料採取し、次いで、１つおきのサイクルの後に試料採取することを含み得、逆もまた同様である。
【０１００】
増幅反応からのアリコートの試料採取または分配は、いくつかの異なる一般的形式のいずれかで実施され得る。試料採取または取り出しの方法は、利用可能な設備、分析される試料の数、および試料収集に対する検出のタイミング（例えば、同時発生的  対  連続的）が含まれるがこれらに限定されない、いくつかの因子のいずれかに依存し得る。試料の取り出しまたは押し出しの正確な方法は、本明細書に記載される方法の制限では必ずしもない。試料採取は、特にハイスループット適用のために、自動デバイスで実施することが好ましい。試料採取は、キャピラリー電気泳動デバイス中への、ＰＣＲ反応からの直接的な動電学的または水力学的注入を使用しても、実施され得る。これらの方法において使用される試料採取の方法は、好ましくは、例えば、単一のアリコートが引き出された後に廃棄されるピペッッティングチップもしくは針を使用することによって、または同じＰＣＲ反応容器から試料を分配するための同じチップもしくは針を使用することによって、サイクリング反応（複数可）の汚染を最小化するために適合される。同時試料採取および検出のための方法は、当業者に公知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開公報第２００４／０１６６５１３号を参照のこと）。
【０１０１】
試料採取ステップにおいて分配される核酸の量および／またはアリコートの体積は、例えば、増幅反応の総体積、産物検出の感度、および使用される分離の型に依存して変動し得る。増幅体積は、数マイクロリットルから数百マイクロリットルまで（例えば、５μｌ、１０μｌ、２０μｌ、４０μｌ、６０μｌ、８０μｌ、１００μｌ、１２０μｌ、１５０μｌまたは２００μｌもしくはそれ以上）、好ましくは１０〜１５０μｌの範囲で、より好ましくは１０〜１００μｌの範囲で、変動し得る。増幅反応の正確な体積は、本発明の制限ではない。アリコート体積は、反応混合物の０．０１％から３０％まで変動し得る。増幅レジメンは、任意選択でマルチウェルコンテナ中で、複数の独立した核酸増幅混合物に対して実施され得る。増幅反応（複数可）が実施されるコンテナ（複数可）は、本明細書に記載される方法の制限では必ずしもない。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、少なくとも２つの期を含むＰＣＲ増幅レジメンに関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、２つの期からなるＰＣＲ増幅レジメンに関する。本明細書で使用する場合、ＰＣＲ増幅レジメンの「期」は、異なるアニーリング温度を必然的に有しかつ異なる数のサイクルを一般に有するサイクルのセットによって、サイクルの第２のセットから鑑別され得るサイクルの第１のセットである。いくつかの実施形態では、全ての他の時間および温度パラメーターは同一である。いくつかの実施形態では、さらなる時間および温度パラメーターは変動し得る。いくつかの実施形態では、第１の期のアニーリング温度は、第２の期のアニーリング温度よりも低い。本明細書で使用する場合、「サイクルのセット」とは、同一の温度パラメーターを有する、ＰＣＲ増幅レジメンの１つまたは複数のサイクルを指す。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、この第１の期のアニーリング温度は、第２の期のアニーリング温度よりも低い。いくつかの実施形態では、この第１のアニーリング温度は、第２のアニーリング温度よりも、少なくとも２℃、すなわち、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、８℃、１０℃またはそれ以上低い。いくつかの実施形態では、この第１のアニーリング温度は、第２のアニーリング温度よりも、少なくとも４℃低い。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅レジメンの各期は、少なくとも１サイクル、例えば、１サイクル、２サイクル、３サイクル、４サイクル、５サイクル、１０サイクル、２０サイクルまたはそれ以上のサイクルを含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅レジメンの第１の期は、１０サイクルより少ないサイクル、例えば、１０サイクル、９サイクル、８サイクル、７サイクル、６サイクル、５サイクル、４サイクル、３サイクル、２サイクルまたは１サイクルを含む。上述のように、第１の期中のサイクル数を最小に維持することで、初期核酸試料中の非標的配列に対するミスプライミングの影響を回避または少なくとも軽減することができる。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅レジメンの第１の期は、３〜５サイクルを含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅レジメンの第１の期は、３サイクルを含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅レジメンの第１の期は、４サイクルを含む。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅レジメンの第１の期は、５サイクルを含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅レジメンの第２の期は、少なくとも５サイクル、例えば、５サイクル、１０サイクル、１５サイクル、２０サイクル、２５サイクル、３０サイクルまたはそれ以上のサイクルを含む。この第２の期では、より高いアニーリング温度は、初期核酸試料中の非標的配列からのプライミングを実質的に防止し、それにより、このレジメンの第１の期において増幅された標的ポリヌクレオチドのみの増幅を支持する。したがって、この第２の期は、バックグラウンドを増加させるリスクが実質的になしに、より多くのサイクルを含むことができる。このアプローチは、５’テイル配列中の差異に関する規則と合わせて、ＰＣＲ反応一般において、および特にＳＮＰ遺伝子型決定反応において、バックグラウンドを実質的に減少し得る。いくつかの実施形態では、ＰＣＲ増幅レジメン全体は、少なくとも合計１０サイクル、例えば、１０サイクル、１５サイクル、２０サイクル、２５サイクル、３０サイクル、３５サイクル、４０サイクルまたはそれ以上を含む。
【０１０６】
ＰＣＲ標的
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、標的核酸および／またはポリヌクレオチドの存在を検出することに関する。標的核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。標的核酸は、二本鎖（ｄｓ）核酸または一本鎖（ｓｓ）核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡであり得る。上述のように、本明細書に記載される方法は、同じ反応、すなわち、マルチモーダル増幅および検出において、これらの型の標的のうち１つより多くの検出および／または定量を可能にすることが、具体的に企図される。標的核酸の非限定的な例には、核酸配列、変異を含む核酸配列、欠失を含む核酸配列、挿入を含む核酸配列、配列バリアント、対立遺伝子、多型、ＳＮＰ、マイクロＲＮＡ、タンパク質コードＲＮＡ、非タンパク質コードＲＮＡ、ｍＲＮＡ、病原体（例えば、細菌、ウイルスまたは寄生生物）由来の核酸、疾患に関連するまたは疾患を有するもしくは疾患を発症する可能性に関連する核酸（例えば、マーカー遺伝子、疾患に関連するまたは疾患を有するもしくは疾患を発症する可能性に関連する多型、あるいはその発現が疾患に関連するまたは疾患を有するもしくは疾患を発症する可能性に関連するＲＮＡ）が含まれる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、標的核酸および／またはポリヌクレオチドの１つまたは複数の多型の存在を検出することに関する。本明細書で使用する場合、用語「多型」は、核酸配列バリエーションを指す。優勢に存在する天然配列と比較した場合、多型は、集団中の０．０１％、０．１％、１％より高い頻度またはそれ以上の頻度で存在し得る。本明細書で使用する場合、多型は、置換、挿入、欠失、重複または再編成であり得る。一塩基多型（ＳＮＰ）を含む多型は、表現型的に中立であり得るか、またはその遺伝子座において優勢配列によって示されるものからそれを識別する関連のバリアント表現型を有し得る。本明細書で使用する場合、「中立多型」とは、配列バリエーションが遺伝子機能を変更させない多型を指し、「変異」または「機能的多型」とは、遺伝子機能を変更させ、したがって関連の表現型を有する、配列バリエーションを指す。集団中に存在する遺伝子座の多型は、対立遺伝子と呼ばれる。２つ以上の対立遺伝子が集団内に存在する特定の遺伝子座に関して個体の遺伝子型に言及する場合、「優勢対立遺伝子」は、問題の集団中に最も高い頻度で存在する対立遺伝子である（すなわち、２つの対立遺伝子が存在する場合、その集団の５０％よりも多くにおいて存在する対立遺伝子が、優勢対立遺伝子である；２つより多い対立遺伝子が存在する場合、この「優勢対立遺伝子」は、その部位において他の対立遺伝子と比較して最高の頻度で、例えば、少なくとも５％より高い頻度で対象集団中に存在する対立遺伝子である）。用語「バリアント対立遺伝子」は、その集団において、優勢対立遺伝子よりも低い頻度で存在する対立遺伝子（単数または複数）を指すために使用される（例えば、２つの対立遺伝子が存在する場合、このバリアント対立遺伝子は、対象集団の５０％未満において存在する対立遺伝子である；２つより多い対立遺伝子が存在する場合、このバリアント対立遺伝子は、優勢対立遺伝子よりも低い頻度で、例えば、少なくとも５％低い頻度で存在する全ての対立遺伝子である）。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、「一塩基多型」または「ＳＮＰ」とは、単一ヌクレオチドの欠失、挿入、または塩基変化もしくは置換を含む、単一のヌクレオチド残基における核酸配列バリエーションを指す。ＳＮＰは対立遺伝子であり得る。いくつかのＳＮＰは、規定された表現型、例えば疾患表現型を有するが、他のＳＮＰは、既知の関連の表現型を有さない。本明細書に記載されるＳＮＰ検出方法は、表現型特徴の予測、例えば、薬物に対する応答性または感受性の予測のために使用され得る。これに関して、本明細書に記載され当該分野で公知のＳＮＰ遺伝子型決定は、疾患または疾患に対する易罹患性の診断では必ずしもない。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、１つまたは複数の対立遺伝子標的部位遺伝子座において核酸試料の遺伝子型を決定することに関する。本明細書で使用する場合、用語「標的部位遺伝子座」とは、遺伝子型決定される遺伝子座を指す。標的部位遺伝子座は一般に、野生型対立遺伝子および少なくとも１つのバリアント対立遺伝子を有する。標的部位遺伝子座は、標的部位遺伝子座の対立遺伝子間で変動するヌクレオチド位置（複数可）を含み得る。標的部位遺伝子座は、対立遺伝子間で変動する特定のヌクレオチド位置（複数可）のみに限定されないが、可変性のヌクレオチド位置に隣接する配列を含み得る。一般に、「標的部位遺伝子座」は少なくとも、本明細書に記載されるようなプライマーセットを使用してＰＣＲ増幅されるのに十分に大きい配列である。一般に、標的部位遺伝子座は、サイズが５ｋｂ未満であり得る。２つの標的部位遺伝子座は、例えば、１０ｂｐ（またはそれより少ないｂｐ）離れて位置付けられる２つのＳＮＰの場合などのように、重複し得る。この例では、各ＳＮＰは、他のＳＮＰに隣接する標的部位遺伝子座とのかなりの重複を有する標的部位遺伝子座によって隣接される。本明細書に記載される方法は、密接するＳＮＰを遺伝子型決定するために特に十分に適合される。ＳＮＰに関連して使用される場合、「標的部位」は、変動する実際のヌクレオチドである。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、同じ反応において、１つまたは複数の標的部位遺伝子座における核酸試料の遺伝子型を決定することに関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、各標的部位遺伝子座に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットに関する。オリゴヌクレオチドプライマーのセットは、その遺伝子座の１つまたは複数の対立遺伝子に対して、例えば、優勢対立遺伝子、野生型対立遺伝子、バリアント対立遺伝子（複数可）および／または変異体対立遺伝子（複数可）に対して特異的なプライマーを含み得る。オリゴヌクレオチドプライマーのセットは、２つ以上のプライマー、すなわち、２つのプライマー、３つのプライマー、４つのプライマー、５つのプライマー、６つのプライマー、７つのプライマーまたはそれ以上のプライマーを含み得る。
【０１１１】
留意されるように、いくつかの実施形態では、標的部位遺伝子座はＳＮＰを含む。ＳＮＰ遺伝子座の４つの対立遺伝子が可能であるが、標的部位における２つのヌクレオチド間でのみ変動するＳＮＰが一般的である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、ＳＮＰ遺伝子座の単一の対立遺伝子を検出できるプライマーのセットに関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、ＳＮＰ遺伝子座の２つの対立遺伝子を検出できるプライマーのセットに関する（すなわち、これらの方法および組成物は、２つのＳＮＰ対立遺伝子の肯定的検出を可能にするアッセイ、またはそのＳＮＰの「二相性」遺伝子型決定に関し得る）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、ＳＮＰ遺伝子座の３つの対立遺伝子を検出できるプライマーのセットに関する（すなわち、これらの方法および組成物は、３つのＳＮＰ対立遺伝子の肯定的検出を可能にするアッセイ、またはそのＳＮＰの「三相性」遺伝子型決定に関し得る）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、ＳＮＰ遺伝子座の４つの対立遺伝子の肯定的検出を可能にするアッセイに関する（すなわち、これらの方法および組成物は、４つのＳＮＰ対立遺伝子の多重検出、またはそのＳＮＰの「四相性」遺伝子型決定に関し得る）。いくつかの実施形態では、ＳＮＰの優勢および／または野生型対立遺伝子が検出される。いくつかの実施形態では、ＳＮＰの優勢および／または野生型対立遺伝子は検出されない。「肯定的に検出される」とは、そのアッセイが、その特異的対立遺伝子の増幅を可能にすることを意味する。例えば、ＳＮＰ部位に存在することが既知の２つの可能性のみが存在する場合、肯定的検出の代替法が使用され得る。この例では、アッセイは、２つのバリアントのうち一方が増幅され他方が増幅されないように設計され得る；このアッセイは、増幅されたバリアントを肯定的に検出でき、他方を受動的に検出できる、すなわち、産物の欠如は、他の対立遺伝子またはバリアントが存在することを意味する。
【０１１２】
分析のための試料
本明細書に記載される方法および組成物は、試料中の標的核酸の存在の検出に関する。本明細書で有用な試料は、核酸を含む。いくつかの実施形態では、試料は、タンパク質、細胞、流体、生物学的流体、保存剤および／または他の物質をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、試料は、対象から取得され得る。いくつかの実施形態では、試料は、対象から取得された生物学的試料であり得る。いくつかの実施形態では、試料は、対象から取得された診断試料であり得る。非限定的な例として、試料は、頬スワブ、血液、血清、血漿、痰、脳脊髄液、尿、涙、肺胞単離物、胸水、心膜液、嚢胞液、腫瘍組織、組織、生検、唾液、吸引物またはそれらの組合せであり得る。いくつかの実施形態では、試料は、切除または生検によって取得され得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、この試料は、分析の対象である微生物を含む。いくつかの実施形態では、この試料は、微生物の培養物の一部分またはアリコートを含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、この試料は、例えば遠心分離によって清澄化された流体試料である。いくつかの実施形態では、この試料は、低速遠心分離（例えば、３，０００×ｇ以下）および清澄化された流体試料を含む上清の収集によって清澄化される。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、この試料は新たに収集され得る。いくつかの実施形態では、この試料は、本明細書に記載される方法および組成物において使用される前に貯蔵され得る。いくつかの実施形態では、この試料は未処理の試料である。本明細書で使用する場合、「未処理の試料」とは、溶液中での希釈および／または懸濁以外の任意の先の試料事前処理を受けていない生物学的試料を指す。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、試料は、対象から取得され得、本明細書に記載される方法および組成物において利用される前に保存または加工され得る。非限定的な例として、試料は、パラフィンワックス中に包埋され得、冷蔵され得、または凍結され得る。凍結試料は、本明細書に記載される方法および組成物に従って核酸の存在を決定する前に解凍され得る。いくつかの実施形態では、この試料は、加工または処理された試料であり得る。試料を処理または加工するための例示的な方法には、遠心分離、濾過、超音波処理、ホモジナイズ化、加熱、凍結および解凍、保存剤（例えば、抗凝固剤またはヌクレアーゼインヒビター）との接触、ならびにそれらの任意の組合せが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、この試料は、化学的および／または生物学的試薬で処理され得る。化学的および／または生物学的試薬は、加工および／または貯蔵の間に、試料または試料によって含まれる核酸の安定性を保護および／または維持するために、使用され得る。さらに、またはあるいは、化学的および／または生物学的試薬は、試料の他の構成成分から核酸を遊離させるために使用され得る。非限定的な例として、血液試料は、本明細書に記載される方法および組成物において利用される前に抗凝固剤で処理され得る。当業者は、核酸分析のための試料の加工、保存または処理のための方法およびプロセスを十分承知している。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、試料中に存在する核酸は、本明細書に記載される方法および組成物において利用される前に、単離、富化または精製される。試料から核酸を単離、富化または精製する方法は、当業者に周知である。非限定的な例として、種々の試料型からのゲノムＤＮＡの単離のためのキットが市販されている（例えば、カタログ番号５１１０４、５１３０４、５６５０４および５６４０４；Ｑｉａｇｅｎ；Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ）。
【０１１８】
用語「対象」および「個体」は、本明細書で相互交換可能に使用され、試料が取得される生物を指す。対象は、生物またはその生物を構成するもしくはその生物内に含まれる１つもしくは複数の細胞における核酸の存在を決定することが望まれる、任意の生物であり得る。本明細書で使用する場合、「対象」は、生物、例えば、細菌、寄生生物、植物または動物を意味し得る。いくつかの実施形態では、対象はヒトまたは動物であり得る。通常、この動物は、霊長類、げっ歯類、家畜または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類には、チンパンジー、カニクイザル（cynomologous）、クモザルおよびマカク、例えば、アカゲザルが含まれる。げっ歯類には、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギおよびハムスターが含まれる。家畜および狩猟動物には、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、スイギュウ、ネコ種、例えば、イエネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、鳥類種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚類、例えば、マス、ナマズおよびサケが含まれる。個体または対象には、上記の任意のサブセット、例えば上記の全てが含まれる。
【０１１９】
プライマー
種々の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、各標的ポリヌクレオチド、標的多型および／または対立遺伝子標的部位遺伝子座に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つのセットを用いて、ＰＣＲ増幅レジメンを実施することに関する。本明細書で使用する場合、「プライマー」とは、ポリヌクレオチド鋳型に特異的にアニーリングすることが可能であり、かつポリヌクレオチド鋳型に対して相補的な伸長産物を産生するための鋳型依存的ポリメラーゼに対する基質として機能する３’末端を提供することが可能な、ＤＮＡもしくはＲＮＡポリヌクレオチド分子またはそれらのアナログを指す。開始および伸長のための条件は通常、適切な緩衝液（この文脈では、「緩衝液」は、溶媒（一般には水性）ならびにｐＨ、イオン強度などに影響を与える必要な補因子および試薬を含む）中で、適切な温度において、４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸のうち少なくとも１つであるがより好ましくは４つ全て、およびＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合誘導剤の存在を含む。本明細書に記載される方法において有用なプライマーは、一般に一本鎖であり、プライマーおよびその相補体は、アニーリングして二本鎖ポリヌクレオチドを形成し得る。本明細書に記載される方法および組成物に従うプライマーは、３００ヌクレオチド長以下、例えば、３００以下または２５０以下または２００以下または１５０以下または１００以下または９０以下または８０以下または７０以下または６０以下または５０以下または４０以下、好ましくは３０以下または２０以下または１５以下であるが、少なくとも１０ヌクレオチド長であり得る。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、用語「セット」は、核酸試料、プライマーまたは他の実体の群を意味する。セットは、公知の数の、および少なくとも２つのかかる実体を含む。プライマーのセットは、標的部位遺伝子座および／または標的ポリヌクレオチドヌクレオチドに対して特異的な、少なくとも１つのフォワードプライマーおよび少なくとも１つのリバースプライマーを含む。
【０１２１】
したがって、本明細書で使用する場合、「オリゴヌクレオチドプライマーのセット」とは、そのうち一方が標的核酸の第１の鎖にアニーリングし、そのうち他方が第１の鎖の相補体にアニーリングするフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、少なくとも２つのプライマーの群を指す。いくつかの実施形態では、プライマーの第１のサブセット（例えば、フォワードプライマー）は、標的核酸配列の第１の鎖にアニーリングし得、プライマーの第２のサブセット（例えば、リバースプライマー）は、この鎖の相補体にアニーリングし得る。標的および／またはその相補体にアニーリングされる場合のプライマーの配向は、１つのサブセットのプライマーのプライマー伸長から進行する核酸合成が、第２のサブセットのプライマーの少なくとも１つの領域に対して相補的な核酸配列を産生するような配向であり得る。核酸標的および／または配列の「第１の鎖」は、標的ヌクレオチドおよび／または標的部位遺伝子座の配列を含む二本鎖核酸のいずれかの鎖であり得るが、いったん選択されると、その相補体を第２の鎖として規定する。したがって、本明細書で使用する場合、「フォワードプライマー」は、核酸標的の第１の鎖にアニーリングするプライマーであり、同じセットの「リバースプライマー」は、その核酸標的の第１の鎖の相補体にアニーリングするプライマーである。
【０１２２】
本明細書で使用する場合、用語「サブセット」は、本明細書で定義されるセットによって含まれる群を意味し、このサブセット群は、そのセットの全てのメンバーよりも少ない。サブセットは、本明細書で使用する場合、セット内からの単一の実体からなり得る。標的核酸および／または多型標的部位遺伝子座に対して特異的な「プライマーのサブセット」とは、例えば、標的核酸の第１の鎖にはアニーリングするが標的核酸の第２の鎖にはアニーリングしない、同じ標的核酸および／または多型標的部位遺伝子座に対して特異的なプライマーの群を指す。プライマーのサブセットは、例えば、標的部位遺伝子座および／または標的ヌクレオチド配列に対して特異的な少なくとも１つのフォワードプライマー、例えば、標的部位遺伝子座および／または標的ヌクレオチド配列に対して特異的な１つのフォワードプライマー、２つのフォワードプライマー、３つのフォワードプライマーまたはそれ以上のフォワードプライマーを含む。あるいは、プライマーのサブセットは、例えば、標的部位遺伝子座および／または標的ヌクレオチド配列に対して特異的な少なくとも１つのリバースプライマー、例えば、標的部位遺伝子座および／または標的ヌクレオチド配列に対して特異的な１つのリバースプライマー、２つのリバースプライマー、３つのリバースプライマーまたはそれ以上のリバースプライマーを含む。
【０１２３】
本明細書で使用する場合、標的核酸に対して特異的なプライマーの文脈において使用する場合、「特異的」とは、プライマーが標的核酸にアニーリングして標的核酸の増幅を媒介し、かつ試料中に存在する非標的配列にアニーリングすることも非標的配列の増幅を媒介することもないアニーリング温度が存在するような、プライマーと標的との間の相補性のレベルを指す。
【０１２４】
プライマーを製造する方法は、当該分野で周知であり、多数の商業的供給源が、本明細書に記載される方法および組成物に従うプライマーを提供するのに適したオリゴヌクレオチド合成サービス、例えば、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）Ｃｕｓｔｏｍ  ＤＮＡ  Ｏｌｉｇｏｓ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹまたはＩＤＴ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡのカスタムＤＮＡ  Ｏｌｉｇｏｓ）を提供している。
【０１２５】
二重ドメインプライマー
種々の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、少なくとも１つの二重ドメインプライマーを含むオリゴヌクレオチドのセットに関する。上で議論したように、二重ドメインプライマーは、ＰＣＲ検出および定量におけるエラーの少なくとも２つの供給源を回避しつつ、特異的配列の増幅および検出を可能にする。本明細書で使用する場合、「二重ドメインプライマー」とは、５’テイル領域と、標的ポリヌクレオチドの第１の鎖または第２の鎖のいずれかに対して相補的な３’コア領域と、標的部位遺伝子座に存在するバリアントヌクレオチドの１つに対して相補的な１つまたは複数の３’末端ヌクレオチドとを有するプライマーを指す。「切断型」二重ドメインプライマーは、ＳＮＰの１つの対立遺伝子に対して特異的な３’末端ヌクレオチドを有さない。用語「切断型」は、この文脈で使用する場合、プライマーの長さに関して何も暗示しないが、例えば、１つのＳＮＰ対立遺伝子を特異的に検出するために設計されたのではないプライマーを識別することを意図する。いくつかの実施形態では、切断型二重ドメインプライマーは、ＳＮＰの少なくとも１つの対立遺伝子を検出および増幅するために、少なくとも１つの二重ドメインプライマーもまた含むプライマーのセットの一部であり得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の切断型二重ドメインプライマーは、ＳＮＰ対立遺伝子以外の標的ポリヌクレオチド、例えばｍＲＮＡを検出するために、プライマーセットにおいて使用され得る。これらの二重ドメインおよび切断型二重ドメインプライマーならびにそれらの役割および使用は、以下にさらに議論される。二重ドメインプライマーおよび／または切断型二重ドメインプライマーの５’テイルおよび３’コア領域の設計および機能に関する具体的な特徴または規則は、以下で議論される。
【０１２６】
５’テイル領域
二重ドメインプライマーおよび／または切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域は、必然的に、３’コア領域の５’側であり、通例、標的配列に対する相同性を全く有さない。これは、二重ドメインプライマーおよび／または切断型二重ドメインプライマーの３’コア領域を介して、核酸標的配列（またはプライマーの配向に依存してその相補体）に対するプライマーの配列のアラインメントを創出することによって決定され得る。５’テイル領域の各位置において、その位置に存在するヌクレオチド塩基は、対応する位置において核酸標的配列中に見出されるヌクレオチド塩基と同じであるべきではない、すなわち、相同であるべきではない。５’テイル配列に対する相同性の欠如を確認するために必要なアラインメントは、目で行ってもよい。しかし、必要に応じて、当業者は、核酸配列のアラインメントを創出するために利用可能なソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴまたはＣＬＵＳＴＡＬＷ２を承知している。デフォルトパラメーターは一般に、標的配列の相同性の欠如を確立するために必要なアラインメントに十分である。
【０１２７】
標的配列に対する相同性を欠くことに加えて、通例、二重ドメインプライマーの５’テイル領域の配列は、同じセット中の他の二重ドメインおよび／または切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域の配列とは異なる、すなわち、同じセット中の他の二重ドメインプライマーおよび／または切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域と同一ではない。いくつかの実施形態では、二重ドメインプライマーおよび／または切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域の配列は、同じセット中の他の二重ドメインプライマーおよび／または切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域の配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、すなわち、６以下連続する相同塩基を有する、５以下連続する相同塩基を有する、４以下連続する相同塩基を有する、３以下連続する相同塩基を有する、２以下連続する相同塩基を有する、１つだけの相同塩基を有する、または相同塩基を有さない。本明細書で使用する場合、「連続する塩基」とは、核酸内の塩基の中断されない配列を形成する塩基を指す。例えば、２つの塩基は、一方が核酸配列中で他方の直ぐ５’側または３’側に存在する場合、すなわち、それらの間に介在塩基が存在しない場合に、連続する。プライマーの同じセットまたはサブセットにおいて使用するのに適したテイル配列の例は、表２および６に示される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、その各々が異なるセットのオリゴヌクレオチド（例えば、異なる標的遺伝子座に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセット）によって含まれる２つの二重ドメインプライマーおよび／または切断型二重ドメインプライマーの場合、これら２つのプライマーは、１つまたはそれ以上の相同塩基を有する５’テイル領域を有し得る、すなわち、１つの相同塩基、２つの相同塩基、３つの相同塩基、４つの相同塩基、５つの相同塩基、６つの相同塩基またはそれ以上の相同塩基を有する。いくつかの実施形態では、その各々が異なるセットのオリゴヌクレオチドによって含まれる２つの二重ドメインプライマーおよび／または切断型二重ドメインプライマーの場合、これら２つのプライマーは、同一の５’テイル領域を有し得る。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二重ドメインプライマーまたは切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域は、１〜２００ヌクレオチドまたはそれ以上の長さであり得、例えば、１ヌクレオチド長、２ヌクレオチド長、３ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、６０ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、９０ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、またはこれらの値の間の任意の他の長さ、またはそれより長い長さであり得る。理論的には、５’テイルは、もっと長くてもよい。しかし、実用的に述べると、プライマーは一般に、３００ヌクレオチド長以下であり、好ましくはより短い。テイルが長くなるほど、多重反応において１つまたは複数の標的に対して相同性の領域を排除することがより困難になり得、別のプライマーがその標的にハイブリダイズできる可能性が高くなることを心に留めるべきである。このように、２００ヌクレオチド以下の５’テイル配列が好ましい。この５’テイルは、わずか１ヌクレオチド長であり得るが、これは、１ヌクレオチドの差異が、本明細書に記載されるように、５’テイルが機能的になるのに必要とされるようにＴｍを増加させるのに十分である場合にのみ、許容される。テイルの長さおよび組成における小さい差異は、３’コア領域が比較的短い場合には、Ｔｍに対して最大の影響を必然的に有するが、これは、Ｔｍに対する任意の単一ヌクレオチドの影響が、ポリヌクレオチドが長くなるほど減退するからである。上述のように、５’テイル領域の重要な態様は、標的領域単独にハイブリダイズするプライマー、すなわち３’コア配列単独を有するプライマーと比較して、二重ドメインプライマーまたは切断型二重ドメインプライマーについてのＴｍを増加させることである。したがって、５’テイル領域の長さおよび組成の選択は、この機能的要件によって実質的に駆動される。本明細書で使用する場合、用語「Ｔｍを増加させる」とは、変更されたプライマーが、元のプライマーがその標的配列にもはや実質的にアニーリングできない温度においてその標的配列に実質的にアニーリングできるように、プライマーへの変化、例えば５’テイル配列の付加が、ＰＣＲ反応混合物に適した塩および緩衝液条件下で、得られたプライマーのＴｍを上昇させるのに十分であることを意味する。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二重ドメインプライマーまたは切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域は、１〜２００ヌクレオチド長であり得る。好ましくは、この二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域は、１５０ヌクレオチド長以下であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二重ドメインプライマーまたは切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域は、４〜１５０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二重ドメインプライマーまたは切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域は、１〜１０ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二重ドメインプライマーまたは切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域は、少なくとも２ヌクレオチド長、例えば、少なくとも２ヌクレオチド長、少なくとも３ヌクレオチド長、少なくとも４ヌクレオチド長、少なくとも５ヌクレオチド長、少なくとも６ヌクレオチド長、少なくとも７ヌクレオチド長、少なくとも８ヌクレオチド長、少なくとも９ヌクレオチド長、またはそれより長い長さであり得る。
【０１３１】
５’テイル領域配列の例示的な例は、配列番号２１０〜２７０９として提供される。配列番号２１０〜４５９は、２０％のＧＣ含量を有する。配列番号４６０〜７０９は、３０％のＧＣ含量を有する。配列番号７０９〜９５９は、４０％のＧＣ含量を有する。配列番号９６０〜１２０９は、５０％のＧＣ含量を有する。配列番号１２１０〜１４５９は、６０％のＧＣ含量を有する。配列番号１４６０〜１７０９は、２５％のＧＣ含量を有する。配列番号１７１０〜１９５９は、３５％のＧＣ含量を有する。配列番号１９６０〜２２０９は、４５％のＧＣ含量を有する。配列番号２２１０〜２４５９は、５５％のＧＣ含量を有する。配列番号２４６０〜２７０９は、６５％のＧＣ含量を有する。配列番号２１０〜２７０９のいずれかの組合せは、本明細書の別の箇所に記載される単一のマルチモーダルアッセイにおいて使用され得、例えば、完全二重ドメインプライマーを形成するためにそれらが連結される３’コア領域に依存して、類似のＴｍを有する二重ドメインプライマーを提供するために、Ｔｍによって選択され得る。
【０１３２】
したがって、いくつかの実施形態では、各標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つのセットを含む、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するための組成物が本明細書に記載され；オリゴヌクレオチドプライマーの各前記セットは、少なくとも１つの切断型二重ドメインフォワードプライマーの第１のサブセットおよび少なくとも１つのリバースプライマーの第２のサブセットを含み；セットの各切断型二重ドメインプライマーは、このセット中の他の切断型二重ドメインプライマー上の５’テイル領域とは異なる５’テイル領域および前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域を含み；各切断型二重ドメインプライマーについて、この３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、この５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、この第２のアニーリング温度は、第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記切断型二重ドメインプライマーの前記３’コアは、このプライマーの５’テイル配列の相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；前記切断型二重ドメインプライマーセットの各メンバーについて：この５’テイル配列は、標的配列に対する相同性を全く有さない；およびこの５’テイル配列は、この切断型二重ドメインプライマーセットの他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有し、各５’テイル配列は、配列番号２１０〜２７０９から、あるいは配列番号２１０〜２７０９のうち１つに対して４つ以下の変異、挿入もしくは欠失（例えば、４つの変異、挿入もしくは欠失、３つの変異、挿入もしくは欠失、２つの変異、挿入もしくは欠失、または１つの変異、挿入もしくは欠失）を有する配列から選択される。この段落の文脈では、１つの挿入とは、１つだけのヌクレオチドの挿入を指し、例えば、２つの挿入とは、同じ部位においてであっても、２つだけのヌクレオチドの付加を指す。同様に、この段落の文脈では、１つの欠失とは、１つだけのヌクレオチドの欠失を指し、例えば、２つの欠失とは、同じ部位においてであっても、２つだけのヌクレオチドの欠失を指す。
【０１３３】
３’コア領域
本明細書で使用する場合、二重ドメインプライマーの「３’コア領域」とは、５’テイル領域の３’側に位置付けられる、標的ポリヌクレオチドの第１の鎖または第２の鎖のいずれかに対して相補的な、プライマーの領域を指す。いくつかの実施形態では、この二重ドメインプライマーは、標的部位遺伝子座の対立遺伝子および／またはバリアントの存在を遺伝子型決定または決定するために使用され；この場合、３’コア領域は、対立遺伝子および／またはバリアント間で変動する標的部位遺伝子座の一部分に隣接するように設計され得る。所与の可変部位を遺伝子型決定するための二重ドメインプライマーのセットは一般に、その可変部位に存在する各ヌクレオチドについて１つの二重ドメインプライマーを有し、異なるプライマーの各々は、その部位に存在するヌクレオチドのうち１つだけに対して相補的な３’末端ヌクレオチドを有する。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、少なくとも１つの切断型二重ドメインプライマーを含むオリゴヌクレオチドのセットに関する。本明細書で使用する場合、「切断型二重ドメインプライマー」とは、ａ）５’テイル領域およびｂ）標的ポリヌクレオチドの第１の鎖または第２の鎖のいずれかに対して相補的な３’コア領域、を有するプライマーを指す。切断型二重ドメインプライマーは、多型の特定の対立遺伝子に対して特異的な二重ドメインプライマーの３’末端ヌクレオチドを欠く。他の二重ドメインプライマーの場合と同様、切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域は、同じセット中の他の二重ドメインプライマーおよび／または切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域とは異なる。
【０１３５】
本明細書に記載される二重ドメインプライマーまたは切断型二重ドメインプライマーの３’コア領域は、１０〜４０ヌクレオチド長であり得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーのセットは、その各々が同じ標的遺伝子座の対立遺伝子に特異的にアニーリングし、それを増幅するように設計された２つ以上の二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーを含むフォワードプライマーのサブセットを含む。プライマーのセットは、単一のリバースプライマーをさらに含み得、このリバースプライマーは、オリゴヌクレオチドプライマーセットの各フォワードプライマーと呼応して、ＰＣＲ増幅レジメンの間に識別可能な増幅産物を産生するように作用する、切断型二重ドメインプライマーを含む（実施例について、表２のＫｒａｓプライマーセットを参照のこと）。あるいは、このサブセットは、その各々が同じ標的遺伝子座の対立遺伝子にアニーリングし、それを増幅するように設計された２つ以上の二重ドメインまたは切断型二重ドメインリバースプライマーと、単一のフォワードプライマーとを含み得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、少なくとも１つの増幅プライマーを含むオリゴヌクレオチドのセットに関する。本明細書で使用する場合、「増幅プライマー」とは、標的核酸の第１の鎖またはこの第１の鎖の相補体のいずれかに対して相補的な領域を有するプライマーを指す。二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーとは対照的に、増幅プライマーは、５’テイル領域を含まず、標的核酸の１つだけの対立遺伝子またはバリアントに対して相補的なヌクレオチドも含まない。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの各セットは、２つ以上のプライマー、例えば、２つのプライマー、３つのプライマー、４つのプライマー、５つのプライマー、６つのプライマーまたはそれ以上のプライマーを含み得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプライマーの各セットは、少なくともｎ＋１のプライマーを含み得、ここでｎは、検出される標的ポリヌクレオチドの多型およびまたは対立遺伝子の数である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、プライマーのセットの２つ以上のプライマーの３’コア領域についてのＴｍは、８℃以下、例えば、８℃以下、７℃以下、６℃以下、５℃以下、４℃以下、３℃以下、２℃以下、１℃以下変動し得るか、または同じであり得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、同じ反応中に存在する２つ以上のプライマーの３’コア領域についてのＴｍは、８℃以下、例えば、８℃以下、７℃以下、６℃以下、５℃以下、４℃以下、３℃以下、２℃以下、１℃以下変動し得るか、または同じであり得る。
【０１４１】
図９〜１６は、図面の簡単な説明に示したように、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ中のＳＮＰを検出するための例示的３’コア配列（例えば、配列番号８６、１００、１１１、１２１、１３１、１４０、１４８および１５６）を示す。その各々が、ＰＣＲ反応において、示された３’コア配列を含む二重ドメインプライマー（複数可）と共に使用され得る複数のリバースプライマーもまた、図９〜１６中に提供される。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二重ドメインプライマーは、３’コア配列として配列番号８６、１００、１１１、１２１、１３１、１４０、１４８および１５６のいずれかを含み得、５’テイル配列として配列番号２１０〜２７０９のいずれかを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二重ドメインプライマーは、１つまたは複数の置換、挿入または欠失（例えば、１つの置換、２つの置換、３つの置換、４つの置換またはそれ以上の置換）を有する配列番号８６、１００、１１１、１２１、１３１、１４０、１４８および１５６のいずれかの配列を有する３’コア、ならびに１つまたは複数の置換、挿入または欠失（例えば、１つの置換、２つの置換、３つの置換、４つの置換またはそれ以上の置換）を有する配列番号２１０〜２７０９のいずれかの配列を有する５’テイル、を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二重ドメインプライマーは、３つ以下の置換、挿入または欠失（例えば、１つの置換、２つの置換、３つの置換、４つの置換またはそれ以上の置換）を有する配列番号８６、１００、１１１、１２１、１３１、１４０、１４８および１５６のいずれかの配列を有する３’コア、ならびに１つまたは複数の置換、挿入または欠失（例えば、１つの置換、２つの置換、３つの置換、４つの置換またはそれ以上の置換）を有するが、配列番号２１０〜２７０９のうち１つに対して少なくとも９０％の同一性を有する、配列番号２１０〜２７０９のいずれかの配列を有する５’テイル、を含み得る。配列番号８６、１００、１１１、１２１、１３１、１４０、１４８および１５６のうち１つに対して置換、挿入または欠失を保有する３’コア配列は、本明細書に記載される初期反応期のアニーリング条件下で、配列番号８６、１００、１１１、１２１、１３１、１４０、１４８および１５６の相補体に特異的にハイブリダイズする能力を保持しなければならない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二重ドメインプライマーは、４つ以下の置換、挿入または欠失（例えば、１つの置換、２つの置換、３つの置換または４つの置換）を有する配列番号８６、１００、１１１、１２１、１３１、１４０、１４８のいずれかの配列を有する３’コア、ならびに４つ以下の置換、挿入または欠失（例えば、１つの置換、２つの置換、３つの置換または４つの置換）を有する配列番号２１０〜２７０９のいずれかの配列を有する５’テイル、を含み得る。この段落の文脈では、１つの挿入とは、１つだけのヌクレオチドの挿入を指し、例えば、２つの挿入とは、同じ部位においてであっても、２つだけのヌクレオチドの付加を指す。同様に、この段落の文脈では、１つの欠失とは、１つだけのヌクレオチドの欠失を指し、例えば、２つの欠失とは、同じ部位においてであっても、２つだけのヌクレオチドの欠失を指す。
【０１４３】
３’コア配列として使用するための配列は、例えば、標的配列（例えば、Ｋｒａｓ遺伝子）から１０〜４０ヌクレオチド長の配列を選択することによって、標的（例えば、二本鎖標的核酸分子のいずれかの鎖と同一または相補的な標的）に特異的にアニーリングし得る任意の配列の選択によって生成され得、二重ドメインプライマーについて本明細書に示される要件を満たす５’テイルを少なくとも付け足すことによって、二重ドメインプライマーにされ得る。いくつかの実施形態では、３’コア配列は、所与のサイズ（非限定的な例として４０ヌクレオチド）の「ウインドウ」または「マスク」が、標的配列として機能し得るサイズ範囲中の配列を同定するために標的配列上に文字通りにまたは比喩的に（例えばｉｎ  ｓｉｌｉｃｏを含む）配置される方法によって、同定され得る。初期標的配列の場所の１ヌクレオチド上流または下流に漸進的に配列「ウインドウ」を移動させることによって、可能な配列の完全なセットが選択された任意の所与の標的サイズについて同定されるまで、次の潜在的標的配列が同定され得る。このプロセスは、体系的合成と相まって、本明細書に記載されるまたは当該分野で公知のアッセイを使用して試験され得る配列を同定でき、それにより、所与の遺伝子標的にとって最適な配列が確立される。非限定的な例として、配列番号２７１０〜９３９８１は、かかる「ウインドウ」技術の使用によってＫ−ｒａｓのゲノム配列から取得された４０マー配列であり、本明細書に記載される方法および組成物において３’コア配列として使用され得る。当業者は、より短い３’コア配列（例えば、１０〜３９ヌクレオチド長）が、配列番号２７１０〜９３９８１のいずれかから取得され得ることを、即座に想定できる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される二重ドメインプライマーは、配列番号２７１０〜９３９８１（または１０〜３９ヌクレオチドのその断片）のいずれかの配列を有する３’コア配列と配列番号２１０〜２７０９のいずれかの配列を有する５’テイルとを含み得る。
【０１４４】
本明細書に示されるアプローチは、高い感度を必要とする、すなわち密接に関連したまたは高度に類似した標的配列間の信頼性のある分別が行われることを必要とする、任意の多重ＰＣＲのために有効であることが留意される。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術は、プライマーのセットが、配列番号２９〜８４および１６３〜２０９のうち１つの配列を有する少なくとも１つのプライマー（例えば、１つのプライマー、２つのプライマー、３つのプライマー、４つのプライマー、５つのプライマー、６つのプライマーまたはそれ以上のプライマー）を含む、本明細書に記載される態様のいずれかに従う組成物に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術は、プライマーのセットが、プライマーの全体の内に４つ以下の置換、欠失および／または挿入を有する配列番号２９〜８４および１６３〜２０９のうち１つの配列を有する少なくとも１つのプライマー（例えば、１つのプライマー、２つのプライマー、３つのプライマー、４つのプライマー、５つのプライマー、６つのプライマーまたはそれ以上のプライマー）を含む、本明細書に記載される態様のいずれかに従う組成物に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術は、プライマーのセットが、プライマーの５’テイル領域の内に４つ以下の置換、欠失および／または挿入を有する配列番号２９〜８４および１６３〜２０９のうち１つの配列を有する少なくとも１つのプライマー（例えば、１つのプライマー、２つのプライマー、３つのプライマー、４つのプライマー、５つのプライマー、６つのプライマーまたはそれ以上のプライマー）を含む、本明細書に記載される態様のいずれかに従う組成物に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術は、プライマーのセットが、配列番号２９〜４４、４５〜５６、５７〜６６、６７〜８４、１６３〜１８６または１８７〜２０９の配列を有するプライマーを含む、本明細書に記載される態様のいずれかに従う組成物に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術は、プライマーのセットが、プライマーの全体の内に４つ以下の置換、欠失および／または挿入を有する配列番号２９〜４４、４５〜５６、５７〜６６、６７〜８４、１６３〜１８６または１８７〜２０９の配列を有するプライマーを含む、本明細書に記載される態様のいずれかに従う組成物に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術は、プライマーのセットが、プライマーの５’テイル領域の内に４つ以下の置換、欠失および／または挿入を有する配列番号２９〜４４、４５〜５６、５７〜６６、６７〜８４、１６３〜１８６または１８７〜２０９の配列を有するプライマーを含む、本明細書に記載される態様のいずれかに従う組成物に関する。この段落の文脈では、１つの挿入とは、１つだけのヌクレオチドの挿入を指し、例えば、２つの挿入とは、同じ部位においてであっても、２つだけのヌクレオチドの付加を指す。同様に、この段落の文脈では、１つの欠失とは、１つだけのヌクレオチドの欠失を指し、例えば、２つの欠失とは、同じ部位においてであっても、２つだけのヌクレオチドの欠失を指す。配列番号２９〜４４、４５〜５６、５７〜６６、６７〜８４、１６３〜１８６または１８７〜２０９のうち１つに対して置換、挿入または欠失を保有するプライマーは、本明細書に記載される初期反応期のアニーリング条件下で、配列番号２９〜４４、４５〜５６、５７〜６６、６７〜８４、１６３〜１８６または１８７〜２０９の３’コア領域の相補体に特異的にハイブリダイズする能力を保持しなければならない。
【０１４６】
検出
種々の実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、各標的ポリヌクレオチド、標的多型および／または対立遺伝子標的部位遺伝子座についての増幅産物を検出することに関する。いくつかの実施形態では、各ポリヌクレオチドについての増幅産物の検出は、試料中のこのポリヌクレオチドの存在を肯定的に示す。いくつかの実施形態では、多型標的ポリヌクレオチドの増幅産物の検出は、試料中のこの多型標的ポリヌクレオチドの特定の対立遺伝子の存在を示す。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、各対立遺伝子標的部位遺伝子座についての増幅産物の検出は、その標的部位遺伝子座における遺伝子型を示す。非限定的な例として、遺伝子型Ａまたは遺伝子型Ｂのものであり得る標的部位遺伝子座の単一コピーを含む試料が提供される場合、本明細書に記載される方法に従うＰＣＲ増幅レジメンは、遺伝子型Ａを含む配列に対して特異的な３’末端ヌクレオチド（複数可）を有する二重ドメインプライマー、遺伝子型Ｂを含む配列に対して特異的な３’末端核酸（複数可）を有する二重ドメインプライマー、およびリバース増幅プライマーを含む、標的部位遺伝子座に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットを用いて実施され得る。ＰＣＲ増幅レジメンの最終サイクルの後に、増幅産物が検出され、２つの結末が可能である。遺伝子型Ａに対して特異的な二重ドメインプライマーの産物が検出される場合、この試料は遺伝子型Ａの試料であることが示される。遺伝子型Ｂに対して特異的な二重ドメインプライマーの産物が検出される場合、この試料は遺伝子型Ｂの試料であることが示される。当業者は、この原理が、試料中に存在する１つの標的部位遺伝子座の複数の可能な対立遺伝子または複数コピーの標的部位遺伝子座が存在するシナリオ（例えば、二倍体生物由来の試料の場合）に対して適用され得ることを理解する。また、２つだけの対立遺伝子が存在することが知られている場合、このアッセイは、遺伝子型Ａまたは遺伝子型Ｂに対して特異的な二重ドメインプライマーまたは切断型二重ドメインプライマーの一方または他方なしに実施され得ることが企図される。この例では、例えば、遺伝子型Ａに対して特異的なプライマーのみが使用される場合、遺伝子型Ａ特異的プライマーを用いた伸長／増幅産物の検出は、遺伝子型Ａを肯定的に示し、産物の欠如は、遺伝子型Ｂを受動的に示す。
【０１４８】
本明細書に記載される方法および組成物は、識別可能であるべき、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの増幅産物に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの増幅産物が、別個のサイズであることによって識別され得る、ＰＣＲ増幅レジメンに関する。本明細書で使用する場合、核酸は、異なるサイズの核酸から分解可能な場合、「別個のサイズ」の核酸である。「異なるサイズ」とは、長さが少なくとも１ヌクレオチド異なる核酸分子を指す。一般に、本明細書に記載される方法に従って有用な別個のサイズの増幅産物は、所与の分離または検出方法において使用される分離プロセスに関する分解能よりも大きいまたはそれと等しい数のヌクレオチド分、異なっている。例えば、分離の分解能が１塩基である場合、別個のサイズの増幅産物は、長さが少なくとも１塩基異なるが、２塩基、５塩基、１０塩基、２０塩基、５０塩基、１００塩基またはそれ以上の塩基分、異なり得る。分解能が例えば１０塩基である場合、別個のサイズの増幅産物は、少なくとも１０塩基異なるが、１１塩基、１５塩基、２０塩基、３０塩基、５０塩基、１００塩基またはそれ以上の塩基分、異なり得る。
【０１４９】
プライマーの２つ以上のメンバーの増幅産物は、例えば、このプライマーセットが１つのリバースプライマーおよび２つのフォワードプライマーを含み、フォワードプライマーの各々が異なる長さのものである場合、別個のサイズであるように設計され得る。いくつかの実施形態では、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの３’コア領域は、異なる長さのものであり得る。しかし、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの５’テイル領域が異なる長さのものであり得ることが好ましい。いくつかの実施形態では、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの全体の長さは変動し得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの増幅産物は、例えば、このプライマーセットが１つのリバースプライマーおよび２つのフォワードプライマーを含み、フォワードプライマーの各々が標的ポリヌクレオチドの異なるヌクレオチド配列を認識する３’コア領域を有する場合、別個のサイズであり得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、プライマーまたはその任意の一部分の長さおよびそれにアニーリングする標的ポリヌクレオチド配列のセグメントの長さの両方が、変動し得る。例えば、さらに離れたまたはより近い、フォワードプライマーおよびリバースプライマーの選択された位置付けによる、増幅される標的配列の長さにおけるバリエーションは、異なる標的遺伝子座由来の産物間の即座の分別を確実にするための、単刀直入なアプローチである。プライマー、特に二重ドメインプライマーの５’テイル領域の長さにおけるバリエーションは、例えば、アッセイにおいて所与の標的遺伝子座の特異的対立遺伝子の産物を識別するのに、特に有効である。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、これらの増幅産物は、異なる検出可能な標識で標識されていることによって識別される。いくつかの実施形態では、この標識は、二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマー中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、この標識は、二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーにコンジュゲートされる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、この標識は、ＰＣＲ増幅レジメンが完了した後に、プライマーに結合される。いくつかの実施形態では、この標識は、プライマーに特異的に結合するオリゴヌクレオチドもしくは抗体またはそれらの一部分、あるいはそれらに付着した部分に、コンジュゲートされる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、この標識は、ＰＣＲ増幅レジメンが完了した後に、二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーの３’コア領域に結合される。いくつかの実施形態では、この標識は、二重ドメインプライマーまたは切断型二重ドメインプライマーの３’コア領域に特異的に結合するオリゴヌクレオチドもしくは抗体またはそれらの一部分、あるいはそれらに付着した部分に、コンジュゲートされる。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、この標識は、ＰＣＲ増幅レジメンが完了した後に、二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域に結合される。いくつかの実施形態では、この標識は、二重ドメインプライマーまたは切断型二重ドメインプライマーの５’テイル領域に特異的に結合するオリゴヌクレオチドもしくは抗体またはそれらの一部分、あるいはそれらに付着した部分に、コンジュゲートされる。
【０１５６】
２つの検出可能な標識は、１つの標識からのシグナルが、他方の標識からのシグナルから識別できる場合に、異なるとみなされる。検出可能な標識は、例えば、光吸収色素、蛍光色素または放射性標識を含み得る。蛍光色素が好ましい。一般に、蛍光シグナルは、ピーク発光波長同士が少なくとも２０ｎｍ分離される場合に、別の蛍光シグナルから識別可能である。特に、所与の反応におけるフルオロフォアの発光ピークが広い場合には、狭いまたはより切り立ったピークとは対照的に、より大きいピーク分離が好ましい。
【０１５７】
検出可能な標識、それを検出する方法、ならびにそれを増幅産物中に組み込むまたはそれを増幅産物とカップリングさせるおよび／もしくはそれを増幅産物に結合させる方法は、当該分野で周知である。以下は、非限定的な例として提供される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識には、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電磁気的、放射化学的もしくは化学的手段、例えば、蛍光、ケミフルオレセンス（chemifluoresence）もしくは化学発光、または任意の他の適切な手段によって検出され得る標識が含まれ得る。
【０１５９】
本明細書に記載される方法において使用される検出可能な標識は、１次標識（標識が、直接的に検出可能である部分または直接的に検出可能な部分を産生する部分を含む場合）または２次標識（例えば、２次および３次抗体を使用する免疫学的標識において一般的なように、検出可能な標識が、検出可能なシグナルを生じる別の部分に結合する場合）であり得る。
【０１６０】
検出可能な標識は、共有結合または非共有結合的手段によって核酸に連結され得る。あるいは、検出可能な標識は、例えば、リガンド−受容体結合対配置または他のかかる特異的認識分子を介して別の核酸への結合を達成する分子を直接標識することによって、連結され得る。検出可能な標識には、放射性同位体、生物発光化合物、発色団、抗体、化学発光化合物、蛍光化合物、金属キレートおよび酵素が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、蛍光色素分子またはフルオロフォアであり得、これらには、フルオレセイン、フィコエリトリン（phycoerytl1rin）、Ｃｙ３ＴＭ、Ｃｙ５ＴＭ、アロフィコシアニン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ペリディニン（peridenin）クロロフィル、シアニン、直列コンジュゲート、例えばフィコエリトリン−Ｃｙ５ＴＭ、緑色蛍光タンパク質、ローダミン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）およびＯｒｅｇｏｎ  ＧｒｅｅｎＴＭ、ローダミンおよび誘導体（例えば、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄおよびテトラローダミンイソチオシアネート（tetrarhodimine  isothiocynate）（ＴＲＩＴＣ））、ビオチン、フィコエリトリン、ＡＭＣＡ、ＣｙＤｙｅｓＴＭ、６−カルボキシフルオレセイン（carboxyfhiorescein）（省略形ＦＡＭおよびＦとして一般に公知）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレセイン（6-carboxy-2’,4’,7’,4,7-hexachlorofiuorescein）（ＨＥＸ）、６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン（dimethoxyfiuorescein）（ＪＯＥまたはＪ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡまたはＴ）、６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸまたはＲ）、５−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ５またはＧ５）、６−カルボキシローダミン−６Ｇ（Ｒ６Ｇ６またはＧ６）およびローダミン１１０；シアニン色素、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５およびＣｙ７色素；クマリン、例えば、ウンベリフェロン；ベンズイミド色素、例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８；フェナントリジン色素、例えば、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ；エチジウム色素；アクリジン色素；カルバゾール色素；フェノキサジン色素；ポルフィリン色素；ポリメチン色素、例えば、シアニン色素、例えばＣｙ３、Ｃｙ５など；ＢＯＤＩＰＹ色素ならびにキノリン色素が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐおよび３３Ｐが含まれるがこれらに限定されない放射標識であり得る。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれるがこれらに限定されない酵素であり得る。酵素標識は、例えば、化学発光シグナル、色シグナルまたは蛍光シグナルを生じ得る。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、ルミノール、ルシフェリンまたはルシゲニンが含まれるがこれらに限定されない化学発光標識である。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、コロイド金または着色されたガラスもしくはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレンおよびラテックス）のビーズが含まれるがこれらに限定されないスペクトル比色標識であり得る。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの増幅産物が、配列決定されることによって識別され得る、ＰＣＲ増幅レジメンに関する。核酸を配列決定する方法は、当該分野で周知であり、商業的な配列決定サービスが広く利用可能である（例えば、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの増幅産物が、融解曲線分析によって識別され得る、ＰＣＲ増幅レジメンに関する。融解曲線分析の方法は、当該分野で周知である（例えば、その全体が本明細書で参照により組み込まれる、Ririeら  Analytical  Biochemistry  １９９７年、２４５巻：１５４〜１６０頁；Wittwerら  Clinical  Chemistry  ２００３年、４９巻：８５３〜８６０頁；およびLiewら  Clinical  Chemistry  ２００７年、５０巻：１１５６〜１１６４頁）。
【０１６８】
サイズ分離された増幅産物の直接的検出が好ましい。しかし、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法および組成物は、プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの増幅産物が、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって識別され得る、ＰＣＲ増幅レジメンに関する。当業者は、標的多型の配列情報を使用して、所与の標的部位遺伝子座または標的核酸の単一の多型に対して完全に相補的であるが、他の多型に対してはそうではないプローブを設計し得る。ハイブリダイゼーション条件は、完全に相補的ではないハイブリダイゼーションによるバックグラウンドシグナルを最小化するために、慣用的に最適化され得る。ハイブリダイゼーションプローブは、５’テイル領域、３’コア領域、テイル−コア接合部、またはプライマーによって含まれていない増幅産物の一部に対してハイブリダイズするように設計され得るが、ただし、プローブがハイブリダイズする配列は、この反応中に存在する少なくとも１つの他の増幅産物からそれを識別する。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＰＣＲ増幅レジメンは、多重および／またはマルチモーダルレジメンである。いくつかの実施形態では、二重ドメイン（または切断型二重ドメインプライマー）の増幅産物は、少なくとも２つのアプローチによって、他の二重ドメイン（または切断型二重ドメインプライマー）の増幅産物から識別され得る。非限定的な例として、オリゴヌクレオチドプライマーのセットの産物は全て、１つの共通の標識を用いて標識され得、各独自の増幅産物は、別個のサイズであることによって、プライマーの同じサブセットの他の増幅産物から識別され得る。
【０１７０】
本開示の実施形態の説明は、網羅的であることも、開示された正確な形態に本開示を限定することも意図しない。本開示の具体的実施形態および本開示の例は、例示目的のために本明細書に記載されているが、種々の等価な改変が、当業者が認識するように、本開示の範囲内で可能である。本明細書に提供される本開示の教示は、必要に応じて、他の手順または方法に適用され得る。本明細書に記載される種々の実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わされ得る。本開示の態様は、必要に応じて、本明細書に記載される方法および組成物のなおさらなる実施形態を提供するために本明細書に記載される組成物、機能および構想を使用するために、改変され得る。
【０１７１】
上記実施形態のいずれかの具体的な要素は、他の実施形態中の要素と組み合わされ得るまたは置換され得る。さらに、本開示の特定の実施形態に関する利点が、これらの実施形態の文脈において記載されてきたが、他の実施形態もまたかかる利点を示し得、全ての実施形態が本開示の範囲内に入るかかる利点を必ずしも示す必要はない。
【０１７２】
同定された全ての特許および他の刊行物は、例えば、本発明と関連して使用され得るかかる刊行物に記載される方法論などを説明および開示する目的のために、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示についてのみ提供される。これに関して何物も、本発明者らが以前の発明によってまたは任意の他の理由のためにかかる開示に先立つ権利がないことの自白として解釈すべきではない。これらの文献の内容に関する日付または表明に関する全ての主張は、出願人に入手可能な情報に基づいており、これらの文献の日付または内容の正確さに関する任意の自白を構成するわけではない。
【０１７３】
本発明は、限定として解釈すべきではない以下の実施例によってさらに説明される。
【０１７４】
本明細書に記載される技術のいくつかの実施形態は、以下の番号の段落のいずれかに従って規定され得る：
段落１。
１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法であって、前記方法は；
鎖分離、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のサイクルを含むＰＣＲ増幅レジメンを、核酸試料と各標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットとを含む反応混合物に対して実施するステップであって、
オリゴヌクレオチドプライマーの各前記セットは、少なくとも１つの切断型二重ドメインフォワードプライマーの第１のサブセットおよび少なくとも１つのリバースプライマーの第２のサブセットを含み；
セットの各切断型二重ドメインプライマーは、前記セット中の他の二重ドメインプライマーの５’テイル領域とは異なる５’テイル領域および前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域を含み；
各切断型二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記切断型二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記切断型二重ドメインプライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；
プライマーセットの各切断型二重ドメインプライマーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーセットの任意の他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有し；
前記ＰＣＲ増幅レジメンは、第１の期および第２の期を含み、
前記第１の期は、第１のセットのサイクルのための前記第１のアニーリング温度においてアニーリングすることを含み、および；
前記第２の期は、第２のセットのサイクルのための前記第２のアニーリング温度においてアニーリングすることを含む、
ステップ；ならびに
各標的ポリヌクレオチドについての増幅産物を検出するステップであって、前記検出は、前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、ステップ、
を含む、方法。
段落２。リバースプライマーが増幅プライマーを含む、段落１に記載の方法。
段落３。前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される、段落１に記載の方法。
段落４。プライマーのセットが、少なくとも１つの二重ドメインフォワードプライマーを含み；
セットの各二重ドメインプライマーが、前記セット中の他の二重ドメインプライマーの５’テイル領域とは異なる５’テイル領域、前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域、および前記標的部位に存在するバリアントヌクレオチドの１つに対して相補的な末端ヌクレオチド、を含み；
各二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記二重ドメインプライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；かつ
プライマーセットの各切断型二重ドメインプライマーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーセットの任意の他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、
段落１に記載の方法。
段落５。複数の標的ポリヌクレオチドが単一の反応において検出される、段落１〜４のいずれかに記載の方法。
段落６。前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む、段落５に記載の方法。
段落７。前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチドおよびＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド；ならびに
以下：
タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド
を含む、段落６に記載の方法。
段落８。前記標的ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つがＳＮＰを含み、前記方法が、前記ＳＮＰにおけるヌクレオチドを遺伝子型決定する、段落４〜７のいずれかに記載の方法。
段落９。標的ＳＮＰの２つ以上の対立遺伝子の各々に対して特異的な二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、同じ反応中に存在する、段落８に記載の方法。
段落１０。セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、前記標的ＳＮＰの優勢対立遺伝子に対して特異的である、段落９に記載の方法。
段落１１。標的ヌクレオチドの２つ以上の対立遺伝子または配列バリアントの各々に対して特異的な前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、同じ反応中に存在する、段落１〜１０のいずれかに記載の方法。
段落１２。セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、前記標的ポリヌクレオチドの優勢対立遺伝子またはバリアント対立遺伝子に対して特異的である、段落１〜１１のいずれかに記載の方法。
段落１３。プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が識別され得る、段落１〜１２のいずれかに記載の方法。
段落１４。プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が、別個のサイズであることによって識別される、段落１３に記載の方法。
段落１５。プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が、異なる検出可能な標識で標識されていることによって識別される、段落１３に記載の方法。
段落１６。プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、前記産物を配列決定することによって識別される、段落１３に記載の方法。
段落１７。プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって識別される、段落１３に記載の方法。
段落１８。プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、前記増幅産物の融解曲線分析によって識別される、段落１３に記載の方法。
段落１９。前記コア配列が１０〜４０ヌクレオチド長である、段落１〜１８のいずれかに記載の方法。
段落２０。前記コア配列が１１〜２０ヌクレオチド長である、段落１〜１９のいずれかに記載の方法。
段落２１。前記第１の期が１〜１０サイクルを含む、段落１〜２０のいずれかに記載の方法。
段落２２。前記第１の期が３〜５サイクルを含む、段落１〜２１のいずれかに記載の方法。
段落２３。セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する３つ未満連続する相同塩基を有する、段落１〜２２のいずれかに記載の方法。
段落２４。セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する２つ未満連続する相同塩基を有する、段落１〜２３のいずれかに記載の方法。
段落２５。前記５’テイル配列が１〜２００ヌクレオチド長である、段落１〜２４のいずれかに記載の方法。
段落２６。前記５’テイル配列が４〜１５０ヌクレオチド長である、段落１〜２５のいずれかに記載の方法。
段落２７。前記第２のアニーリング温度が、前記第１のアニーリング温度よりも少なくとも４℃高い、段落１〜２６のいずれかに記載の方法。
段落２８。反応中に存在する前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、互いに８℃以下異なる、そのそれぞれの３’コア領域に対するＴｍ値を有する、段落１〜２７のいずれかに記載の方法。
段落２９。前記５’テイル配列が、配列番号２１０〜２７０９のいずれかから選択される、段落１〜２８のいずれかに記載の方法。
段落３０。前記５’テイル配列の各々が、配列番号２１０〜２７０９から選択される、段落１〜２９のいずれかに記載の方法。
段落３１。プライマーの前記１つまたは複数のセットが、以下：
配列番号２９〜４４；配列番号５１〜５６；配列番号６２〜６６；配列番号６７〜８４；配列番号１６３〜１８６；および配列番号１８７〜２０９
からなる群から選択される２つ以上の配列を含む、段落１〜３０のいずれかに記載の方法。
段落３２。各標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つのセットを含む、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するための組成物であって、
オリゴヌクレオチドプライマーの各前記セットは、少なくとも１つの切断型二重ドメインフォワードプライマーの第１のサブセットおよび少なくとも１つのリバースプライマーの第２のサブセットを含み；
セットの各切断型二重ドメインプライマーは、前記セット中の他の切断型二重ドメインプライマー上の５’テイル領域とは異なる５’テイル領域および前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域を含み；
各切断型二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記切断型二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記プライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；
前記切断型二重ドメインプライマーセットの各メンバーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記切断型二重ドメインプライマーセットの他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、
組成物。
段落３３。核酸試料をさらに含む、段落３２に記載の組成物。
段落３４。少なくとも１つのフォワードプライマーが二重ドメインプライマーを含み；
セットの各二重ドメインプライマーが、前記セット中の他の二重ドメインプライマー上の５’テイル領域とは異なる５’テイル領域、前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域、および前記標的部位に存在するバリアントヌクレオチドの１つに対して相補的な末端ヌクレオチド、を含み；
各二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記プライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；
前記二重ドメインプライマーセットの各メンバーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記二重ドメインプライマーセットの前記他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、
段落３２〜３３のいずれかに記載の組成物。
段落３５。リバースプライマーが二重ドメインプライマーを含む、段落３２〜３４のいずれかに記載の組成物。
段落３６。リバースプライマーが切断型二重ドメインプライマーを含む、段落３２〜３４のいずれかに記載の組成物。
段落３７。リバースプライマーが増幅プライマーを含む、段落３２〜３６のいずれかに記載の組成物。
段落３８。前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される、段落３２〜３７のいずれかに記載の組成物。
段落３９。前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む、段落３２〜３８のいずれかに記載の組成物。
段落４０。前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチドおよびＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド；ならびに
以下：
タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド
を含む、段落３２〜３９のいずれかに記載の組成物。
段落４１。二重ドメインフォワードプライマーのサブセットが、標的ＳＮＰの２つ以上の対立遺伝子の各々に対して特異的なプライマーを含む、段落３２〜４０のいずれかに記載の組成物。
段落４２。セットの１つの二重ドメインフォワードプライマーが、前記標的ＳＮＰの優勢対立遺伝子に対して特異的である、段落３２〜４１のいずれかに記載の組成物。
段落４３。二重ドメインまたは切断型二重ドメインフォワードプライマーの前記サブセットが、標的ヌクレオチドの２つ以上の対立遺伝子または配列バリアントの各々に対して特異的なプライマーを含む、段落３２〜４２のいずれかに記載の組成物。
段落４４。セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインフォワードプライマーが、前記標的ポリヌクレオチドの優勢対立遺伝子またはバリアント対立遺伝子に対して特異的である、段落３２〜４３のいずれかに記載の組成物。
段落４５。前記コア配列が１０〜４０ヌクレオチド長である、段落３２〜４４のいずれかに記載の組成物。
段落４６。前記コア配列が１１〜２０ヌクレオチド長である、段落３２〜４５のいずれかに記載の組成物。
段落４７。セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する３つ未満連続する相同塩基を有する、段落３２〜４６のいずれかに記載の組成物。
段落４８。セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する２つ未満連続する相同塩基を有する、段落３２〜４７のいずれかに記載の組成物。
段落４９。前記５’テイル配列が１〜２００ヌクレオチド長である、段落３２〜４８のいずれかに記載の組成物。
段落５０。前記５’テイル配列が４〜１５０ヌクレオチド長である、段落３２〜４９のいずれかに記載の組成物。
段落５１。前記第２のアニーリング温度が、前記第１のアニーリング温度よりも少なくとも４℃高い、段落３２〜５０のいずれかに記載の組成物。
段落５２。反応中に存在する前記二重ドメインプライマーが、互いに８℃以下異なる、そのそれぞれの３’コア領域に対するＴｍ値を有する、段落３２〜５１のいずれかに記載の組成物。
段落５３。前記５’テイル配列が、配列番号２１０〜２７０９のいずれかから選択される、段落３２〜５２のいずれかに記載の組成物。
段落５４。前記５’テイル配列の各々が、配列番号２１０〜２７０９から選択される、段落３２〜５３のいずれかに記載の組成物。
段落５５。プライマーの前記１つまたは複数のセットが、以下：
配列番号２９〜４４；配列番号５１〜５６；配列番号６２〜６６；配列番号６７〜８４；配列番号１６３〜１８６；および配列番号１８７〜２０９
からなる群から選択される２つ以上の配列を含む、段落３２〜５４のいずれかに記載の組成物。
段落５６。１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法であって、前記方法は；
鎖分離、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のサイクルを含むＰＣＲ増幅レジメンを、核酸試料と各標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットとを含む反応混合物に対して実施するステップであって、
オリゴヌクレオチドプライマーの各前記セットは、少なくとも１つの切断型二重ドメインフォワードプライマーの第１のサブセットおよび少なくとも１つのリバースプライマーの第２のサブセットを含み；
セットの各切断型二重ドメインプライマーは、前記セット中の他の二重ドメインプライマーの５’テイル領域とは異なる５’テイル領域および前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域を含み；
各切断型二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記切断型二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記切断型二重ドメインプライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；
プライマーセットの各切断型二重ドメインプライマーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーセットの任意の他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有し；
前記ＰＣＲ増幅レジメンは、第１の期および第２の期を含み、
前記第１の期は、第１のセットのサイクルのための前記第１のアニーリング温度においてアニーリングすることを含み、および；
前記第２の期は、第２のセットのサイクルのための前記第２のアニーリング温度においてアニーリングすることを含む、
ステップ；ならびに
各標的ポリヌクレオチドについての増幅産物を検出するステップであって、前記検出は、前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、ステップ、
を含む、方法。
段落５７。リバースプライマーが増幅プライマーを含む、段落５６に記載の方法。
段落５８。前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される、段落５６〜５７のいずれかに記載の方法。
段落５９。プライマーのセットが、少なくとも１つの二重ドメインフォワードプライマーを含み；
セットの各二重ドメインプライマーが、前記セット中の他の二重ドメインプライマーの５’テイル領域とは異なる５’テイル領域、前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域、および前記標的部位に存在するバリアントヌクレオチドの１つに対して相補的な末端ヌクレオチド、を含み；
各二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記二重ドメインプライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；かつ
プライマーセットの各切断型二重ドメインプライマーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーセットの任意の他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、
段落５６〜５８のいずれかに記載の方法。
段落６０。複数の標的ポリヌクレオチドが単一の反応において検出される、段落５６〜５９のいずれかに記載の方法。
段落６１。前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む、段落６０に記載の方法。
段落６２。前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチドおよびＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド；ならびに
以下：
タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド
を含む、段落６１に記載の方法。
段落６３。前記標的ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つがＳＮＰを含み、前記方法が、前記ＳＮＰにおけるヌクレオチドを遺伝子型決定する、段落５６〜６２のいずれかに記載の方法。
段落６４。標的ＳＮＰの２つ以上の対立遺伝子の各々に対して特異的な二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、同じ反応中に存在する、段落６３に記載の方法。
段落６５。セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、前記標的ＳＮＰの優勢対立遺伝子に対して特異的である、段落６４に記載の方法。
段落６６。標的ヌクレオチドの２つ以上の対立遺伝子または配列バリアントの各々に対して特異的な前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、同じ反応中に存在する、段落５６〜６５のいずれかに記載の方法。
段落６７。セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、前記標的ポリヌクレオチドの優勢対立遺伝子またはバリアント対立遺伝子に対して特異的である、段落５６〜６６のいずれかに記載の方法。
段落６８。プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が識別され得る、段落５６〜６７のいずれかに記載の方法。
段落６９。プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が、別個のサイズであることによって識別される、段落６８に記載の方法。
段落７０。プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が、異なる検出可能な標識で標識されていることによって識別される、段落６８に記載の方法。
段落７１。プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、前記産物を配列決定することによって識別される、段落６８に記載の方法。
段落７２。プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって識別される、段落６８に記載の方法。
段落７３。プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、前記増幅産物の融解曲線分析によって識別される、段落６８に記載の方法。
段落７４。前記コア配列が１０〜４０ヌクレオチド長である、段落５６〜７３のいずれかに記載の方法。
段落７５。前記コア配列が１１〜２０ヌクレオチド長である、段落５６〜７４のいずれかに記載の方法。
段落７６。前記第１の期が１〜１０サイクルを含む、段落５６〜７５のいずれかに記載の方法。
段落７７。前記第１の期が３〜５サイクルを含む、段落５６〜７６のいずれかに記載の方法。
段落７８。セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する３つ未満連続する相同塩基を有する、段落５６〜７７のいずれかに記載の方法。
段落７９。セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する２つ未満連続する相同塩基を有する、段落５６〜７８のいずれかに記載の方法。
段落８０。前記５’テイル配列が１〜２００ヌクレオチド長である、段落５６〜７９のいずれかに記載の方法。
段落８１。前記５’テイル配列が４〜１５０ヌクレオチド長である、段落５６〜８０のいずれかに記載の方法。
段落８２。前記第２のアニーリング温度が、前記第１のアニーリング温度よりも少なくとも４℃高い、段落５６〜８１のいずれかに記載の方法。
段落８３。反応中に存在する前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、互いに８℃以下異なる、そのそれぞれの３’コア領域に対するＴｍ値を有する、段落５６〜８２のいずれかに記載の方法。
段落８４。前記５’テイル配列が、配列番号２１０〜２７０９のいずれかから選択される、段落５６〜８３のいずれかに記載の方法。
段落８５。前記５’テイル配列の各々が、配列番号２１０〜２７０９から選択される、段落５６〜８４のいずれかに記載の方法。
段落８６。プライマーの前記１つまたは複数のセットが、以下：
配列番号２９〜４４；配列番号５１〜５６；配列番号６２〜６６；配列番号６７〜８４；配列番号１６３〜１８６；および配列番号１８７〜２０９
からなる群から選択される２つ以上の配列を含む、段落５６〜８５のいずれかに記載の方法。
段落８７。各標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つのセットを含む、１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定するための組成物であって、
オリゴヌクレオチドプライマーの各前記セットは、少なくとも１つの切断型二重ドメインフォワードプライマーの第１のサブセットおよび少なくとも１つのリバースプライマーの第２のサブセットを含み；
セットの各切断型二重ドメインプライマーは、前記セット中の他の切断型二重ドメインプライマー上の５’テイル領域とは異なる５’テイル領域および前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域を含み；
各切断型二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記切断型二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記プライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；
前記切断型二重ドメインプライマーセットの各メンバーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記切断型二重ドメインプライマーセットの他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、
組成物。
段落８８。核酸試料をさらに含む、段落８７に記載の組成物。
段落８９。少なくとも１つのフォワードプライマーが二重ドメインプライマーを含み；
セットの各二重ドメインプライマーが、前記セット中の他の二重ドメインプライマー上の５’テイル領域とは異なる５’テイル領域、前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域、および前記標的部位に存在するバリアントヌクレオチドの１つに対して相補的な末端ヌクレオチド、を含み；
各二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記プライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；
前記二重ドメインプライマーセットの各メンバーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記二重ドメインプライマーセットの前記他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、
段落８７〜８８のいずれかに記載の組成物。
段落９０。リバースプライマーが二重ドメインプライマーを含む、段落８７〜８９のいずれかに記載の組成物。
段落９１。リバースプライマーが切断型二重ドメインプライマーを含む、段落８７〜９０のいずれかに記載の組成物。
段落９２。リバースプライマーが増幅プライマーを含む、段落８７〜９１のいずれかに記載の組成物。
段落９３。前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される、段落８７〜９２のいずれかに記載の組成物。
段落９４。前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む、段落８７〜９３のいずれかに記載の組成物。
段落９５。前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチドおよびＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド；ならびに
以下：
タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド
を含む、段落８７〜９４のいずれかに記載の組成物。
段落９６。二重ドメインフォワードプライマーのサブセットが、標的ＳＮＰの２つ以上の対立遺伝子の各々に対して特異的なプライマーを含む、段落８７〜９５のいずれかに記載の組成物。
段落９７。セットの１つの二重ドメインフォワードプライマーが、前記標的ＳＮＰの優勢対立遺伝子に対して特異的である、段落８７〜９６のいずれかに記載の組成物。
段落９８。
二重ドメインまたは切断型二重ドメインフォワードプライマーの前記サブセットが、標的ヌクレオチドの２つ以上の対立遺伝子または配列バリアントの各々に対して特異的なプライマーを含む、段落８７〜９７のいずれかに記載の組成物。
段落９９。セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインフォワードプライマーが、前記標的ポリヌクレオチドの優勢対立遺伝子またはバリアント対立遺伝子に対して特異的である、段落８７〜９８のいずれかに記載の組成物。
段落１００。前記コア配列が１０〜４０ヌクレオチド長である、段落８７〜９９のいずれかに記載の組成物。
段落１０１。前記コア配列が１１〜２０ヌクレオチド長である、段落８７〜１００のいずれかに記載の組成物。
段落１０２。セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する３つ未満連続する相同塩基を有する、段落８７〜１０１のいずれかに記載の組成物。
段落１０３。セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する２つ未満連続する相同塩基を有する、段落８７〜１０２のいずれかに記載の組成物。
段落１０４。前記５’テイル配列が１〜２００ヌクレオチド長である、段落８７〜１０３のいずれかに記載の組成物。
段落１０５。前記５’テイル配列が４〜１５０ヌクレオチド長である、段落８７〜１０４のいずれかに記載の組成物。
段落１０６。前記第２のアニーリング温度が、前記第１のアニーリング温度よりも少なくとも４℃高い、段落８７〜１０５のいずれかに記載の組成物。
段落１０７。反応中に存在する前記二重ドメインプライマーが、互いに８℃以下異なる、そのそれぞれの３’コア領域に対するＴｍ値を有する、段落８７〜１０６のいずれかに記載の組成物。
段落１０８。前記５’テイル配列が、配列番号２１０〜２７０９のいずれかから選択される、段落８７〜１０７のいずれかに記載の組成物。
段落１０９。前記５’テイル配列の各々が、配列番号２１０〜２７０９から選択される、段落８７〜１０８のいずれかに記載の組成物。
段落１１０。プライマーの前記１つまたは複数のセットが、以下：
配列番号２９〜４４；配列番号５１〜５６；配列番号６２〜６６；配列番号６７〜８４；配列番号１６３〜１８６；および配列番号１８７〜２０９
からなる群から選択される２つ以上の配列を含む、段落８７〜１０９のいずれかに記載の組成物。
【実施例】
【０１７５】
（実施例１）−ＫＲＡＳ／ＢＲＡＦ多重アッセイ
【０１７６】
多重アッセイを、ＢＲＡＦ遺伝子座のＶ６００Ｅ／Ｄ対立遺伝子ならびにＫＲＡＳの１２番目および１３番目のコドンにおいて野生型配列および変異体配列を含むＫＲＡＳの多数の対立遺伝子に対して特異的な二重ドメインプライマーを使用して実施した。プライマー配列は表２に示す。２つの期のＰＣＲ増幅レジメンのための条件は表３、４および５に示す。結果を図４および５に示す。図４は、本明細書に記載されるプライマーのセットが、オフターゲット配列を増幅せず、標的が存在する場合には標的対立遺伝子を特異的に増幅することを実証している。図５は、複数の標的が存在する場合、本明細書に記載される方法に従って実施される多重化ＰＣＲ反応が、任意の検出可能なバックグラウンドなしに標的対立遺伝子の存在を特異的に検出することを実証している。図４および５は共に、１つまたは１つより多い増幅された標的が高レベルまで蓄積される場合、検出可能なレベルまで生じる「クロストーク」増幅が存在しないこともまた、実証している。
【０１７７】
（実施例２）−ＩＬ−１０／ＴＮＦα多重アッセイ
【０１７８】
多重アッセイを、ＩＬ−１０遺伝子座の野生型または−１０２８Ａおよび−１０２８Ｇ対立遺伝子、ならびにＴＮＦα遺伝子座の野生型ならびに−３０８Ｇおよび−３０８Ａ対立遺伝子のいずれかに対して特異的な二重ドメインプライマーを使用して実施した。プライマー配列は表６に示す。２つの期のＰＣＲ増幅レジメンのための条件は表７、８および９に示す。結果を図６に示す。図６は、本明細書に記載される多重反応において使用されるプライマーのセットが、オフターゲット配列を増幅せず、標的が存在する場合には、検出可能なバックグラウンド増幅なしに標的対立遺伝子を特異的に増幅することを実証している。図６は、１つまたは１つより多い増幅された標的が高レベルまで蓄積される場合、検出可能なレベルまで生じる「クロストーク」増幅が存在しないこともまた、実証している。
【０１７９】
（実施例３）−マルチモーダルアッセイ
【０１８０】
ＴＮＦα遺伝子座の−３０８Ｇおよび−３０８Ａ対立遺伝子の存在ならびにＩＬ−１０の発現を、同じ反応において検出するために、マルチモーダルアッセイが実施され得る。最初に、試料を、オリゴｄＴプライマーを使用した逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）レジメンに供する。簡潔に述べると、試料を、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、緩衝液およびオリゴｄＴプライマーと共に混合する。この試料を、使用される特定のＲＴ酵素に適した温度（例えば、４２℃）でインキュベートし、ｃＤＮＡを合成する。ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ（商標）ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（カタログ番号１１７５４−０５０；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）などの、ＲＴ  ＰＣＲのための市販のキットが使用され得る。
【０１８１】
次いで、ＰＣＲ増幅レジメンが実施され得る。プライマー配列は表１０に示す。ＩＬ−１０プライマーは、エクソン−イントロン接合部にまたがっており、したがって、同じ試料中に存在するＤＮＡを増幅せず、ＩＬ−１０  ｍＲＮＡの特異的検出を可能にする。２つの期のＰＣＲ増幅レジメンのための条件は表１１および１２に示す。増幅産物の産生は、識別可能な産物のサイズを用いてキャピラリー電気泳動分離によって検出され得る；ＴＮＦ−α対立遺伝子（１７３ｂｐ産物＝３０８Ｇ対立遺伝子；１７８ｂｐ産物＝３０８Ａ対立遺伝子）、ならびに１０１ｂｐ産物によって証明されるＩＬ−１０  ｍＲＮＡの存在および量。上記アプローチのいずれかにおいて、定量が、ＰＣＲサイクリングの間の増幅反応の反復された試料採取によって生成された増幅曲線から導出され得ることに留意のこと。
【０１８２】
（実施例４）−血漿試料アッセイ
【０１８３】
血漿または血清標本が、種々の疾患または障害の診断のために調査されてきた。血漿および／または血清試料に基づく診断は、かかる方法が、がん試験における腫瘍試料などの生検組織を使用する方法よりも侵襲性が顕著に低いので、特に有益である。腫瘍核酸を同定した血液血清または血漿アッセイは、循環している核酸単独に基づいて、腫瘍を早期に潜在的に検出するという、さらなる利益を有する。しかし、血漿は、高いバックグラウンドレベルの核酸を有し、腫瘍細胞核酸が非常に稀であるので、困難を示す。したがって、血漿試料に関するアッセイは、過剰な無関係の核酸のバックグラウンドの中で腫瘍マーカーを検出するのに十分に高感度でなければならない。この実施例では、本明細書に記載される方法および組成物が、血漿試料において、ＳＮＰ遺伝子型の同定を含めて、所望の標的を首尾よく検出できることが、実証されている。
【０１８４】
ドナー血漿試料（各１ｍＬ）を、（ａ）１０ｎｇの変異体ＤＮＡ（ＫＲＡＳ  Ｇ１２ＶのためにＣＣＬ２２８またはＫＲＡＳ  Ｇ１３ＤのためにＨＣＴ１１６）（ｂ）２００ｎｇのＫ５６２野生型ＤＮＡおよび（ｃ）スパイクなしの対照としての水、を用いてスパイクした。試料を、製造業者の指示に従って、ＱｉａｇｅｎのＱＩＡＡＭＰ  ＣＩＲＣＵＬＡＴＩＮＧ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＫＩＴ（商標）を用いて抽出した。精製では担体ＲＮＡは使用しなかった。核酸を３５μＬ中に溶出させた。１０μＬをＰＣＲに使用した（５０μＬ／反応）。適切なプライマーは表１３に示し、サーモサイクリング条件は表１４に示す。標的ＳＮＰの検出が図８において実証されている。
【０１８５】
表１５および１６は、本明細書、例えば実施例１および４で上記したような、マルチモーダルアッセイにおけるＫＲＡＳおよびＢＲＡＦ  ＳＮＰの検出に適したプライマーのさらなるセットを含んでいる。
【０１８６】
【表１】
2015508661.tif 000003
【０１８７】
【表２−１】
2015508661.tif 000004
【表２−２】
2015508661.tif 000005
【０１８８】
【表３】
2015508661.tif 000006
【０１８９】
【表４】
2015508661.tif 000007
【０１９０】
【表５】
2015508661.tif 000008
【０１９１】
【表６】
2015508661.tif 000009
【０１９２】
【表７】
2015508661.tif 000010
【０１９３】
【表８】
2015508661.tif 000011
【０１９４】
【表９】
2015508661.tif 000012
【０１９５】
【表１０】
2015508661.tif 000013
【０１９６】
【表１１】
2015508661.tif 000014
【０１９７】
【表１２】
2015508661.tif 000015
【０１９８】
【表１３−１】
2015508661.tif 000016
【表１３−２】
2015508661.tif 000017
【０１９９】
【表１４】
2015508661.tif 000018
【０２００】
【表１５】
2015508661.tif 000019
【０２０１】
【表１６】
2015508661.tif 000020
【図１】
2015508661.tif 000021
【図２】
2015508661.tif 000022
【図３】
2015508661.tif 000023
【図７】
2015508661.tif 000024
【図９】
2015508661.tif 000025
【図１０】
2015508661.tif 000026
【図１１】
2015508661.tif 000027
【図１２】
2015508661.tif 000028
【図１３】
2015508661.tif 000029
【図１４】
2015508661.tif 000030
【図１５】
2015508661.tif 000031
【図１６】
2015508661.tif 000032
【図４】
2015508661.tif 000033
【図５】
2015508661.tif 000034
【図６】
2015508661.tif 000035
【図８】
2015508661.tif 000036
【配列表】
2015508661000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月23日(2014.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つまたは複数の標的ポリヌクレオチドの存在を決定する方法であって、前記方法は；
鎖分離、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のサイクルを含むＰＣＲ増幅レジメンを、核酸試料と各標的ポリヌクレオチドに対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットとを含む反応混合物に対して実施するステップであって、
オリゴヌクレオチドプライマーの各前記セットは、少なくとも１つの切断型二重ドメインフォワードプライマーの第１のサブセットおよび少なくとも１つのリバースプライマーの第２のサブセットを含み；
セットの各切断型二重ドメインプライマーは、前記セット中の他の二重ドメインプライマーの５’テイル領域とは異なる５’テイル領域および前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域を含み；
各切断型二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記切断型二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記切断型二重ドメインプライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；
プライマーセットの各切断型二重ドメインプライマーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーセットの任意の他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有し；
前記ＰＣＲ増幅レジメンは、第１の期および第２の期を含み、
前記第１の期は、第１のセットのサイクルのための前記第１のアニーリング温度においてアニーリングすることを含み、および；
前記第２の期は、第２のセットのサイクルのための前記第２のアニーリング温度においてアニーリングすることを含む、
ステップ；ならびに
各標的ポリヌクレオチドについての増幅産物を検出するステップであって、前記検出は、前記標的ポリヌクレオチドの存在を示す、ステップ、
を含む、方法。
【請求項２】
リバースプライマーが増幅プライマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
プライマーのセットが、少なくとも１つの二重ドメインフォワードプライマーを含み；
セットの各二重ドメインプライマーが、前記セット中の他の二重ドメインプライマーの５’テイル領域とは異なる５’テイル領域、前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域、および前記標的部位に存在するバリアントヌクレオチドの１つに対して相補的な末端ヌクレオチド、を含み；
各二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記二重ドメインプライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；かつ
プライマーセットの各切断型二重ドメインプライマーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーセットの任意の他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有する、
請求項１に記載の方法。
【請求項５】
複数の標的ポリヌクレオチドが単一の反応において検出される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチド；ＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド；タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも２つのポリヌクレオチドを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記標的ポリヌクレオチドが、以下：
ＳＮＰを含むポリヌクレオチドおよびＳＮＰの対立遺伝子を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド；ならびに
以下：
タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；非タンパク質コードＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチド；変異を含むポリヌクレオチド；欠失を含むポリヌクレオチド；および挿入を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択される少なくとも１つのポリヌクレオチド
を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的ポリヌクレオチドのうち少なくとも１つがＳＮＰを含み、前記方法が、前記ＳＮＰにおけるヌクレオチドを遺伝子型決定する、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
標的ＳＮＰの２つ以上の対立遺伝子の各々に対して特異的な二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、同じ反応中に存在する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、前記標的ＳＮＰの優勢対立遺伝子に対して特異的である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
標的ヌクレオチドの２つ以上の対立遺伝子または配列バリアントの各々に対して特異的な前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、同じ反応中に存在する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
セットの１つの二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、前記標的ポリヌクレオチドの優勢対立遺伝子またはバリアント対立遺伝子に対して特異的である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が識別され得る、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が、別個のサイズであることによって識別される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が、異なる検出可能な標識で標識されていることによって識別される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、前記産物を配列決定することによって識別される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって識別される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、前記増幅産物の融解曲線分析によって識別される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記コア配列が１０〜４０ヌクレオチド長である、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記コア配列が１１〜２０ヌクレオチド長である、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記第１の期が１〜１０サイクルを含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記第１の期が３〜５サイクルを含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する３つ未満連続する相同塩基を有する、請求項１〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する２つ未満連続する相同塩基を有する、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記５’テイル配列が１〜２００ヌクレオチド長である、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記５’テイル配列が４〜１５０ヌクレオチド長である、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記第２のアニーリング温度が、前記第１のアニーリング温度よりも少なくとも４℃高い、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
反応中に存在する前記二重ドメインまたは切断型二重ドメインプライマーが、互いに８℃以下異なる、そのそれぞれの３’コア領域に対するＴｍ値を有する、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記５’テイル配列が、配列番号２１０〜２７０９のいずれかから選択される、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記５’テイル配列の各々が、配列番号２１０〜２７０９から選択される、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
プライマーの前記１つまたは複数のセットが、以下：
配列番号２９〜４４；配列番号５１〜５６；配列番号６２〜６６；配列番号６７〜８４；配列番号１６３〜１８６；および配列番号１８７〜２０９
からなる群から選択される２つ以上の配列を含む、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
１つまたは複数の対立遺伝子標的部位遺伝子座における核酸試料の遺伝子型を決定する方法であって、前記方法は；
鎖分離、プライマーアニーリングおよびプライマー伸長のサイクルを含むＰＣＲ増幅レジメンを、遺伝子型決定する核酸試料と各標的部位遺伝子座に対して特異的なオリゴヌクレオチドプライマーのセットとを含む反応混合物に対して実施するステップであって、
オリゴヌクレオチドプライマーの各前記セットは、少なくとも１つの二重ドメインフォワードプライマーの第１のサブセットおよび少なくとも１つのリバースプライマーの第２のサブセットを含み；
セットの各二重ドメインプライマーは、前記セット中の他の二重ドメインプライマーにおける５’テイル領域とは異なる５’テイル領域、前記標的を含む二本鎖核酸の一方の鎖上の配列に対して相補的な３’コア領域、および前記標的部位において生じる前記バリアントヌクレオチドの一方に対して相補的な末端ヌクレオチドを含み；
各二重ドメインプライマーについて、前記３’コアは、第１のアニーリング温度においてその相補的標的部位配列に実質的にアニーリングし、前記５’テイルおよび３’コア領域によって含まれる配列は、第２のアニーリング温度においてその相補体に実質的にアニーリングし、前記第２のアニーリング温度は、前記第１のアニーリング温度よりも高く、その結果、前記第２のアニーリング温度において、前記二重ドメインプライマーの前記３’コアは、前記二重ドメインプライマーの５’テイル配列の前記相補体もまた有さない鋳型分子には実質的にアニーリングできず；
プライマーセットの各二重ドメインプライマーについて：
前記５’テイル配列は、前記標的配列に対する相同性を全く有さない；および
前記５’テイル配列は、前記二重ドメインプライマーセットの任意の他の５’テイル配列に対する６以下連続する相同塩基を有し；
前記ＰＣＲ増幅レジメンは、第１の期および第２の期を含み、
前記第１の期は、第１のセットのサイクルのための前記第１のアニーリング温度においてアニーリングすることを含み、および；
前記第２の期は、第２のセットのサイクルのための前記第２のアニーリング温度においてアニーリングすることを含む、
ステップ；ならびに
各標的部位遺伝子座についての増幅産物を検出するステップであって、前記検出は、前記標的部位遺伝子座における前記核酸試料の遺伝子型を示す、ステップ、
を含む、方法。
【請求項３３】
リバースプライマーが二重ドメインプライマーを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
リバースプライマーが切断型二重ドメインプライマーを含む、請求項３２〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
リバースプライマーが増幅プライマーを含む、請求項３２〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記１つまたは複数の標的部位遺伝子座が、ＳＮＰを含む、請求項３２〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
標的ＳＮＰの２つ以上の対立遺伝子の各々に対して特異的な二重ドメインプライマーが、同じ反応中に存在する、請求項３２〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
１つの二重ドメインプライマーが、標的ＳＮＰの優勢対立遺伝子に対して特異的である、請求項３２〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が識別され得る、請求項３２〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が、別個のサイズであることによって識別される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記増幅産物が、異なる検出可能な標識で標識されていることによって識別される、請求項３９〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、前記産物を配列決定することによって識別される、請求項３９〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって識別される、請求項３９〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
プライマーサブセットの２つ以上のメンバーの前記産物が、前記増幅産物の融解曲線分析によって識別される、請求項３９〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記コア配列が１０〜４０ヌクレオチド長である、請求項３２〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記コア配列が１１〜２０ヌクレオチド長である、請求項３２〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記第１の期が１〜１０サイクルを含む、請求項３２〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記第１の期が３〜５サイクルを含む、請求項３２〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する３つ未満連続する相同塩基を有する、請求項３２〜４８のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
セットの各５’テイル配列が、前記セットの前記他の５’テイル配列に対する２つ未満連続する相同塩基を有する、請求項３２〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記５’テイル配列が１〜２００ヌクレオチド長である、請求項３２〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記５’テイル配列が４〜１５０ヌクレオチド長である、請求項３２〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記第２のアニーリング温度が、前記第１のアニーリング温度よりも少なくとも４℃高い、請求項３２〜５２のいずれかに記載の方法。
【請求項５４】
反応中に存在する前記二重ドメインプライマーが、互いに８℃以下異なる、そのそれぞれの３’コア領域に対するＴｍ値を有する、請求項３２〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記５’テイル配列が、配列番号２１０〜２７０９のいずれかから選択される、請求項３２〜５４のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
前記５’テイル配列の各々が、配列番号２１０〜２７０９から選択される、請求項３２〜５５のいずれかに記載の方法。
【請求項５７】
プライマーの前記１つまたは複数のセットが、以下：
配列番号２９〜４４；配列番号５１〜５６；配列番号６２〜６６；配列番号６７〜８４；配列番号１６３〜１８６；および配列番号１８７〜２０９
からなる群から選択される２つ以上の配列を含む、請求項３２〜５６のいずれかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
【図９】図９は、ＫＲＡＳのコドン１２および１３中のＳＮＰを検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号８５）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、３’から５’へと示され（配列番号８６）、複数の可能なリバースプライマーは、５’から３’で四角で囲んで示される（配列番号８７〜９８）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６４】
【図１０】図１０は、ＫＲＡＳのコドン６１中のＳＮＰを検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号９９）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、３’から５’へと示され（配列番号１００）、複数の可能なリバースプライマーは、５’から３’で四角で囲んで示される（配列番号１０１〜１０９）。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
【図１１】図１１は、ＫＲＡＳのコドン１４６中のＳＮＰを検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号１１０）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、３’から５’へと示され（配列番号１１１）、複数の可能なリバースプライマーは、５’から３’で四角で囲んで示される（配列番号１１２〜１１９）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
【図１２】図１２は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００を検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号１２０）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、３’から５’へと示され（配列番号１２１）、複数の可能なリバースプライマーは、５’から３’で四角で囲んで示される（配列番号１２２〜１２９）。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
【図１３】図１３は、図９に示される配列の相補鎖上の、ＫＲＡＳのコドン１２および１３中のＳＮＰを検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号１３０）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、５’から３’へと示され（配列番号１３１）、複数の可能なリバースプライマーは、３’から５’で四角で囲んで示される（配列番号１３２〜１３８）。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
【図１４】図１４は、図１０に示される配列の相補鎖上の、ＫＲＡＳのコドン６１中のＳＮＰを検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号１３９）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、５’から３’へと示され（配列番号１４０）、複数の可能なリバースプライマーは、３’から５’で四角で囲んで示される（配列番号１４１〜１４６）。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
【図１５】図１５は、図１１に示される配列の相補鎖上の、ＫＲＡＳのコドン１４６中のＳＮＰを検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号１４７）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、５’から３’へと示され（配列番号１４８）、複数の可能なリバースプライマーは、３’から５’で四角で囲んで示される（配列番号１４９〜１５４）。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
【図１６】図１６は、図１２に示される配列の相補鎖上の、ＢＲＡＦ  Ｖ６００を検出する際に使用するためのプライマーの例示的実施形態の概略を示す。標的配列（配列番号１５５）はイタリックで示される。二重ドメインプライマーにおいて使用するための３’コア配列は、５’から３’へと示され（配列番号１５６）、複数の可能なリバースプライマーは、３’から５’で四角で囲んで示される（配列番号１５７〜１６２）。
【国際調査報告】
2015508661.tif 000037