(57)【要約】  C3a、C5a、C3b、C5bおよびC5b-9を産生する古典的経路の能力のいずれも阻害することなく、補体第2経路C3転換酵素の成分に結合し、補体第2経路によってのみ産生されるC3a、C5a、C3b、C5bおよびC5b-9を選択的に阻害する治療上有効量の抗体を、被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体における溶血性障害を治療する方法。【選択図】図１
2015532303.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
C3a、C5a、C3b、C5bおよびC5b-9を産生する古典的経路の能力のいずれも阻害することなく、補体第2経路C3転換酵素の成分に結合し、補体第2経路によってのみ産生されるC3a、C5a、C3b、C5bおよびC5b-9を選択的に阻害する治療上有効量の抗体を被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体における溶血性障害を治療する方法。
【請求項２】
抗体が、血管外溶血の原因となるC3b形成および血管内溶血の原因となるC5b-9を防止するのに有効な量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗体が補体第2経路機能の成分を中和する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
溶血性障害が、発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、溶血性尿毒症症候群(HUS)、播種性血管内凝固症候群(DIC)、抗リン脂質症候群(APS)、輸血後紫斑病、および新生児同種免疫性血小板減少症(NAITP)からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
抗体が、中和抗P抗体、中和抗C3b抗体、および中和抗Bb抗体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
溶血性障害が血液細胞のC3b誘導性活性化と関連し、抗体が血液細胞のC3b誘導性活性化を阻害するのに有効な量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
血液細胞の活性化が、好中球活性化、単球活性化、血小板活性化およびTリンパ球活性化を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
抗体が、
a. 被験体がC3bでオプソニン化された赤血球を有する；
b. 被験体がC3bでオプソニン化された白血球を有する；
c. 被験体がC3bでオプソニン化された血小板を有する；
d. 被験体が貧血を有する；
e. 被験体が正常より高いレベルのLDHを有する；
f. 被験体が正常より高いレベルの遊離ヘモグロビンを有する；
g. 被験体が正常より低いレベルの血小板を有する；
h. 被験体が正常より高いレベルの網状赤血球数を有する；および
i. 被験体が正常より高いレベルのビリルビンを有する
からなる群から選択される1つ以上の症状を有する被験体に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗体がa〜iに列挙された症状の全部または1つを正常レベルまで低下させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
被験体が血管外溶血について治療される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
抗体が、配列番号43〜75からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号1〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がP、BbまたはC3bの少なくとも1つに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
抗体が、配列番号43〜57からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号1〜27からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がPに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
抗体が、配列番号61〜72からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号28〜39からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がBbに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
抗体が、配列番号73〜75からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号40〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がC3bに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
C3a、C5a、C3b、C5bおよびC5b-9を産生する古典的経路の能力のいずれも阻害することなく、補体第2経路C3転換酵素の成分に結合し、補体第2経路によってのみ産生されるC3a、C5a、C3b、C5bおよびC5b-9を選択的に阻害する治療上有効量の抗体を、被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体における補体第2経路活性化と関連する異常な血球減少症を治療する方法。
【請求項１６】
異常な血球減少症が血管外溶血および/または血管内溶血と関連する、および/またはその結果生じるものであり、抗体が血管外溶血の原因となるC3b形成および血管内溶血の原因となるC5b-9を防止するのに有効な量で投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
異常な血球減少症が溶血性障害と関連する、および/またはその結果生じるものであり、該溶血性障害が、発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、溶血性尿毒症症候群(HUS)、播種性血管内凝固症候群(DIC)、抗リン脂質症候群(APS)、輸血後紫斑病、および新生児同種免疫性血小板減少症(NAITP)からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
抗体が中和抗P抗体、中和抗C3b抗体および中和抗Bb抗体からなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
血球減少症が白血球減少症、血小板減少症、赤血球減少症、白血球減少症、リンパ球減少症、および好中球減少症のうち少なくとも1つを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
抗体が、
a. 被験体がC3bでオプソニン化された赤血球を有する；
b. 被験体がC3bでオプソニン化された白血球を有する；
c. 被験体がC3bでオプソニン化された血小板を有する；
d. 被験体が貧血を有する；
e. 被験体が正常より高いレベルのLDHを有する；
f. 被験体が正常より高いレベルの遊離ヘモグロビンを有する；
g. 被験体が正常より低いレベルの血小板を有する；
h. 被験体が正常より高いレベルの網状赤血球数を有する；および
i. 被験体が正常より高いレベルのビリルビンを有する
からなる群から選択される1つ以上の症状を有する被験体に投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
抗体がa〜iに列挙された症状の全部または1つを正常レベルまで低下させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
抗体が、配列番号43〜75からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号1〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がP、BbまたはC3bの少なくとも1つに結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
抗体が、配列番号43〜57からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号1〜27からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がPに結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
抗体が、配列番号61〜72からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号28〜39からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がBbに結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
抗体が、配列番号73〜75からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号40〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がC3bに結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
C3a、C5a、C3b、C5bおよびC5b-9を産生する古典的経路の能力のいずれも阻害することなく、補体第2経路C3転換酵素の成分に結合し、補体第2経路によってのみ産生されるC3a、C5a、C3b、C5bおよびC5b-9を選択的に阻害する治療上有効量の抗体を、被験体に投与することを含む、被験体における補体第2経路誘導性炎症により引き起こされる細胞および/または組織損傷を治療する方法。
【請求項２７】
細胞および/または組織損傷が、補体第2経路誘導性溶血および炎症により引き起こされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗体が中和抗P抗体、中和抗C3b抗体および中和抗Bb抗体からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
抗体が血液細胞のC3b誘導性活性化を阻害するのに有効な量で投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
血液細胞の活性化が、好中球活性化、単球活性化、血小板活性化およびTリンパ球活性化を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
組織損傷が細胞損傷と関連する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
組織損傷が臓器損傷と関連する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
抗体が、配列番号43〜75からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号1〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がP、BbまたはC3bの少なくとも1つに結合する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
抗体が、配列番号43〜57からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号1〜27からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がPに結合する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
抗体が、配列番号61〜72からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号28〜39からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がBbに結合する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
抗体が、配列番号73〜75からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号40〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がC3bに結合する、請求項２６に記載の方法。
【請求項３７】
正常な宿主防御を維持するのに十分なレベルでC3a、C5a、C3b、C5bおよびC5b-9を産生する古典的経路の能力のいずれも阻害することなく、補体第2経路C3転換酵素の成分に結合し、補体第2経路によってのみ産生されるC3a、C5a、C3b、C5bおよびC5b-9を選択的に阻害する治療上有効量の抗体を、被験体に投与することを含む、被験体における好中球、単球、血小板、および/またはTリンパ球の溶解を阻害する方法。
【請求項３８】
抗体が血管外溶血の原因となるC3b形成および血管内溶血の原因となるC5b-9を防止するのに有効な量で投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
溶解が、溶血性障害と関連する、および/またはその結果生じるものであり、該溶血性障害が発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、溶血性尿毒症症候群(HUS)、播種性血管内凝固症候群(DIC)、抗リン脂質症候群(APS)、輸血後紫斑病、および新生児同種免疫性血小板減少症(NAITP)からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
抗体が中和抗P抗体、中和抗C3b抗体および中和抗Bb抗体からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
抗体が、配列番号43〜75からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号1〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がP、BbまたはC3bの少なくとも1つに結合する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
抗体が、配列番号43〜57からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号1〜27からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がPに結合する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
抗体が、配列番号61〜72からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号28〜39からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がBbに結合する、請求項３７に記載の方法。
【請求項４４】
抗体が、配列番号73〜75からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号40〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がC3bに結合する、請求項１に記載の方法、請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
C3a、C5a、C3b、C5bおよびC5b-9を産生する古典的経路の能力のいずれも阻害することなく、補体第2経路C3転換酵素の成分に結合し、補体第2経路によってのみ産生されるC3a、C5a、C3b、C5bおよびC5b-9を選択的に阻害する治療上有効量の抗体を、被験体に投与することを含む、それを必要とする被験体における補体第2経路血小板活性化および機能障害を阻害する方法。
【請求項４６】
抗体が、血小板活性化の原因となるC3b形成を防止するのに有効な量で投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４７】
溶解が、溶血性障害と関連する、および/またはその結果生じるものであり、該溶血性障害が発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、溶血性尿毒症症候群(HUS)、播種性血管内凝固症候群(DIC)、抗リン脂質症候群(APS)、輸血後紫斑病、および新生児同種免疫性血小板減少症(NAITP)からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
抗体が中和抗P抗体、中和抗C3b抗体および中和抗Bb抗体からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
抗体が、配列番号43〜75からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号1〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がP、BbまたはC3bの少なくとも1つに結合する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
抗体が、配列番号43〜57からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号1〜27からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がPに結合する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
抗体が、配列番号73〜75からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号40〜42からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がC3bに結合する、請求項４６に記載の方法、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
抗体が、配列番号61〜72からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む軽鎖可変ドメインと、配列番号28〜39からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのCDRを含む重鎖可変ドメインとを含み、抗体がBbに結合する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
ヒトにおいてin vivoで観察されるものと同等の方法でPNH赤血球の溶解が起こるように、動物にPNH細胞を導入することを含み、病理学的レベルのヘモグロビン、乳酸デヒドロゲナーゼ、網状赤血球数、およびビリルビンを生成する、溶血性障害の動物モデルを作成する方法。
【請求項５４】
請求項５３に記載の方法により形成された動物モデルを提供すること；
薬剤を該動物モデルに投与すること；
該薬剤の投与後にヘモグロビン、乳酸デヒドロゲナーゼ、網状赤血球数、ビリルビン、またはC5b-9のうち少なくとも1つのレベルを測定すること；
測定レベルと対照レベルとを比較すること
を含み、該薬剤の投与後のヘモグロビン、乳酸デヒドロゲナーゼ、網状赤血球数、ビリルビン、またはC5b-9のうち少なくとも1つの減少が、溶血性障害の治療における該薬剤の有効性を示す、溶血性障害の治療のための薬剤をスクリーニングするための方法。
【請求項５５】
溶血性障害がPNHである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
被験体から血液細胞を含む体試料を取得すること、
血液細胞に結合したC5b-9のレベルを測定すること
を含み、対照レベルと比較したC5b-9沈着の増加が、PNH進行の増加を示す、PNHを有する被験体におけるPNH進行を判定する方法。
【請求項５７】
血液細胞に結合したC5b-9のレベルがC5b-9に対する免疫アッセイを用いて測定される、請求項５２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本出願は、2012年10月4日に出願された米国特許仮出願第61/709,796号の優先権の利益を主張し、その内容は全体が参照により本明細書に組込まれるものとする。
背景技術
補体系は、「古典的経路」、「レクチン/MBL」および「補体第2経路(alternative pathway)」(それぞれ、CP、MBL、およびAP)と呼ばれる、3つの異なる酵素カスケードを介して活性化され得る。MBLはここでは議論されない。古典的経路は、細胞の感染を防止するために抗原に対する宿主防御を助けるのを担う。レクチン経路は古典的経路のバリエーションである。補体活性化の誘発因子が古典的経路である場合、補体第2経路は全補体活性の80〜95%を担うと現在考えられている(「AP増幅ループ」)。補体第2経路自体は、補体成分が上昇した状態で見出されたいくつかの疾患兆候において活性化される。
【０００２】
a)補体第2経路の開始および増殖と、b)補体第2経路増幅ループによる古典的経路増殖において主な役割を果たす、3つの「補体第2経路特異的タンパク質」であるB、D、およびP因子が存在する。補体系における中心的存在であるタンパク質C3およびC3bは、全ての古典的経路および補体第2経路に共通である。1つの型のC3が存在し得るが、産生されるC3bには3つの異なる型が存在し、これはそれぞれのC3転換酵素が異なるためである。APのC3転換酵素はPC3bBbから構成され、古典的C3転換酵素は異なるタンパク質から作られる。従って、類似するC3b分子を産生するために切断が全て同一であると考えることは難しい。結果として、補体第2経路により産生されるC3bは、古典的経路により産生されるC3bと比較して異なる。
【０００３】
古典的経路(CP)は、抗原-抗体複合体により開始される。CPの進行は、C1Q、C1r/C1s、C4およびC2などのタンパク質を伴う。CPのC3転換酵素は、C3bC4b2aからなる。この複合体はC3をC3bとC3aに切断することができる。このC3bは、古典的経路転換酵素に由来し、通常は様々な病原体および細菌のオプソニン作用にとって必要である。このC3bの阻害は望ましくない。C3b被覆細胞は様々な細胞上に存在する補体受容体により除去される。
【０００４】
両補体経路は、C3a、C3b、C5a、C5b、C5b-9、およびsC5b-9を補体活性化副産物として独立に産生する。
【０００５】
古典的経路が補体第2経路の活性化を誘発した際に、古典的経路C3転換酵素もまたC3をC3bに切断するが、これは、補体第2経路とは無関係にはたらき、Ca2+/Mg2+イオンの存在下、1%の正常ヒト血清中で古典的経路を完全に増幅させることができる。古典的経路C5転換酵素は、C5を切断してC5aおよびC5bを生成することができる。次いで、C5b分子は細胞の脂質二重層に挿入され、C5b-9またはsC5b-9の形成を開始する。
【０００６】
補体第2経路の活性化において、補体系により産生されるC3bはプロパージンおよびB因子に結合して、複合体「PC3bB」を形成することができる。次いで、D因子は、複合体内のB因子をBbとBaとに切断する。この切断は、複合体からのBaの遊離およびAP転換酵素PC3bBbの形成をもたらす。PC3bBbは、C3をC3aとC3bとに切断し、それによって、補体第2経路の利益のために補体第2経路の増幅ループを持続させる。次いで、PC3bBbは、C5を切断してC5bとC5aを作ることができる。次いで、C5b分子は、細胞の脂質二重層に挿入され、MAC沈着のための核を形成する。
【０００７】
古典的経路はまた、増幅ループとして知られる補体第2経路の一部の増殖を開始させることもできる。増幅ループ内で、C3bはプロパージンおよびB因子に結合して、複合体「PC3bB」を形成する。次いで、D因子は、複合体内のB因子をBbとBaとに切断する。この切断は、複合体からのBaの遊離およびAP転換酵素PC3bBbの形成をもたらす。PC3bBbは、C3をC3aとC3bとに切断し、それによって、増幅ループを持続させる。
【０００８】
従って、C3bは、補体経路活性化の型にかかわらず、補体系の成分と副産物との両方である。APの増幅の際、PC3bBb(APのC3転換酵素)は増加量のC3bを生成するため、補体第2経路の活性化が継続することができるように増幅ループが確立される。さらに、古典的経路もまたC3bを生成し、それがB因子に結合し、それによって、トリガーがCP媒介性であるが、補体第2経路に従事することができる。これにより、より多くのC3bを標的上に沈着させることができ、それがAP活性化の増幅の増強をもたらす。
【０００９】
既存のAPのC3転換酵素PC3bBbへの新しく形成されたC3bの付加が、APのC5転換酵素を生成する。既存のCPのC3転換酵素への新しく形成されたC3bの付加が、CPのC5転換酵素を生成する。両方のC5転換酵素は、C5を切断してC5bとC5aとを産生する能力を有する。補体活性化の結果として産生された終末複合体は、MAC複合体(C5b-9またはsC5b-9としても知られる)として知られ、被験体中の細胞の溶解の原因となる。C3aとC5aは両方とも、血小板、好中球、および単球を活性化することを担う強力なアナフィラトキシンである。結果として、エラスターゼ、TNF-α、IL-1、VEGF、および過酸化物などの炎症性分子が放出される。C5b-9/sC5b-9の形成は、「他の疾患」において見られる組織損傷および組織傷害/組織損傷の原因となる。
【００１０】
古典的補体経路活性化は、可能性のある病原体に対する有益な最前線防御を提供し、C3a/C3b、C5a/C5b、およびC5b-9/sC5b-9を生成することができる。従って、古典的経路の悪化は、大量の補体副産物を産生し得る。他の場所に記載のように、C3aとC5aは両方とも、強力なアナフィラトキシンであり、C3bはオプソニン作用を媒介し、C5bは病原体の望まれる殺傷を担う。ここで、C3aとC5aは両方とも、有益な応答を生成し、侵入者を殺傷するために産生される。この経路は、宿主防御にとって必要であり、従って、阻害してはならない。
【００１１】
カルシウムイオンなしの、Mg++イオンにおける補体第2経路活性化は、AP活性化のみを保証する。疾患状態においては、この経路は古典的経路とは無関係に活性化される。この経路は、宿主防御にとって必要ではなく、従って、その全体を阻害してもよい。
【発明の概要】
【００１２】
本明細書に記載の実施形態は、血管外溶血の原因となるC3b形成および血管内溶血の原因となるC5b-9を防止する抗体に関する。本発明はさらに、血管内および血管外経路による赤血球および血小板の溶解を含む障害に罹患している被験体の治療のための方法に関する。本発明はまた、補体攻撃に対する好中球、単球、血小板、およびTリンパ球の保護も包含する。これは、GPI結合タンパク質が欠損している細胞上でのC3bおよび細胞上でのC5b-9の形成および沈着をブロックする特許請求された属の抗体により達成される。
【００１３】
本出願は、補体第2経路由来C3bおよびC5b-9形成の形成を防止する補体阻害剤モノクローナル抗体の群をまとめたものである。これらの抗体は、この特定の出願において属として特許請求される。これらの抗体は補体第2経路内の異なる標的に結合するが、それらは全て、「C3b」と呼ばれるが古典的経路により生成されるC3bではない、補体第2経路により生成されるC3bを阻害することから、ユニークな特徴を有する。
【００１４】
それは、攻撃下にある細胞型に応じた血球減少症、すなわち、好中球減少症、単球減少症、血小板減少症、リンパ球減少症、および白血球減少症を引き起こす細胞の除去である。かくして、特許請求された属のモノクローナル抗体によるAP活性化の阻害は、被験体(ヒト)における血球減少症を防止することができる。血球減少症は、発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、溶血性尿毒症症候群(HUS)、播種性血管内凝固症候群(DIC)、抗リン脂質症候群(APS)、輸血後紫斑病、新生児同種免疫性血小板減少症(NAITP)などの血液障害において一般的に観察される。特許請求された属の抗体は、血球減少症、細胞活性化、細胞機能障害、炎症、血管外溶血、血管内溶血および組織傷害を防止することができる。
【００１５】
古典的経路と補体第2経路は両方とも、活性化に際して、C3b分子を産生する。この2つのC3bは同じに呼ばれるが、異なるものである。PNHにおいて古典的経路ではなく補体第2経路によって産生されるC3b分子は、赤血球、好中球、単球、血小板、およびTリンパ球に結合する。この結合は、細胞外溶血によるそのような細胞の消失をもたらす。細胞外溶血による除去は、血球減少症ならびにビリルビンおよびLDHのレベルの上昇を引き起こす。C5b-9(MACとしても知られる)は細胞膜上に沈着し、赤血球および血小板などの無核細胞の溶解をもたらす。C3b沈着およびC5b-9沈着の明確な証拠は、以前には報告されていなかった。赤血球溶解は、LDHレベルの上昇、網状赤血球数の増加および赤血球中のヘモグロビンレベルの低下をもたらす。
【００１６】
PNHにおいては、本発明者らは、C3bおよびC5b-9が無核細胞と有核細胞の両方と関連することを見出した。GPI結合タンパク質が欠損した様々な細胞へのC3bおよびC5b-9結合のこれらのパターンは、そのような細胞の破壊/部分的破壊、活性化、または機能障害を示す。本発明は、GPI結合タンパク質の非存在が病因と関連する疾患における病的転帰の原因となる様々な無核および有核細胞上でのそのような分子の形成および沈着を防止するためのものである。補体第2経路によるC3bおよびC5b-9の形成を防止する中和抗体が、本発明の下で包含される。
【００１７】
血球減少症が起こる血液障害の一例は、PNHである。血球減少症は、白血球減少症、好中球減少症、単球減少症、血小板減少症、リンパ球減少症を包含する。ほぼ全ての型の細胞が、PNHにおいてGPI結合タンパク質を欠損していると考えられる。そのような細胞は、C3b沈着および血管外除去による補体攻撃ならびに/または血管外経路による破壊を受ける。補体第2経路にのみ由来するC3bおよびC5b-9の選択的ブロッキング剤である全ての抗体が、本発明の下で包含される。そのような機能を実行するそのような抗体のセットが、本発明の下で包含される。
【００１８】
Tリンパ球、単球および好中球は全てGPI結合タンパク質を欠損しており、従って、補体攻撃ならびにC3bおよびC5b-9の沈着を受ける。C3b被覆細胞は、適切な機能を剥奪され、C5b-9沈着が細胞死を起こすことにより細胞の喪失をもたらす。例として、好中球は、体内で細菌および真菌感染と戦う重要な細胞である。PNH患者中のこれらの好中球は、病原菌を効率的に取り込むことができず、従って、あまり感染と戦うことができない。白血球が適切に働かないこれらの患者は、二次感染を生じる傾向がはるかに強くなっている。実験室試験におけるGM-CSFの添加により、細菌を取込み、感染と戦う白血球の能力を回復させることができることが、実験室試験により公知である。かくして、GM-CSFの添加は、好中球が正常に振舞う能力を増加させるための患者における使用可能性として提唱されている。GM-CSFの主な機能は公知である。このタンパク質は、一般に白血球増殖因子として機能するサイトカインである。GM-CSFは幹細胞を刺激して、顆粒球(好中球、好酸球および好塩基球)ならびに単球を産生する。かくして、PNH血液試料中に見られるGM-CSF量の増加は、PNH細胞が死んでいることを示す。かくして、特許請求された属の抗体と共に、およびそれなしにGM-CSFを添加することは、一般に細胞の品質を改善し、細胞が感染と戦う能力を増加させるのに役立ち得る。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図1は、古典的経路および補体第2経路の補体カスケードを示す図である。レクチン経路は本発明の一部ではないため、示さない。図1は、CPおよびAPの略図を示す。この図面において、本発明者らはCPとAPの双方が異なるものであり、つながっていないことを示す。この略図は、本発明の属の抗体がどのように動作するかを示すものに過ぎず、他の発明の抗体が動作する方法を示すものではない。AP増幅は、上右手側に示され、PC3b、PC3bB、PC3bBbからなる。略図に見られるように、PC3bBbは次いで、C3を、Pに結合するより多くのC3bに切断して、PC3bを再度形成することによりサイクルを持続させるように作用する。本発明の適用は、この増幅ループの成分を特異的に標的化することによって、古典的経路に影響を及ぼすことなく補体第2経路を完全に阻害する。これらの抗体は、古典的経路に影響を及ぼすことなく補体第2経路の増幅ループを阻止する(図1の略図の左側に示される)。C3が収束点であると説明する古い収束理論に基づいて、当業者であれば、補体第2経路活性化の効果を常に有する古典的経路の何らかの活性化を予想したであろう。これは、2つの経路がC3の出発点で「重複する」と考えられているためである。この理論によれば、古典的経路により産生されたC3bは、AP増幅ループに参画する。本特許の主題である発明は、その仮定に挑戦する、新しく、ユニークな属の補体阻害抗体の開発である。特許請求される発明、すなわちこの新しい属の抗体は、AP増幅ループがさもなければ古典的経路により誘発されたかどうかに関係なく補体第2経路を阻害するような方法で、補体第2経路増幅ループの成分を特異的に標的化する。かくして、本発明の抗C3b抗体は、CP増幅ループまたはCP増殖ではなく、APのみを阻害する。本発明の独自性は、これらの抗体がどの成分を標的とするかだけでなく、それらがどのようにこれらの成分を標的とするかである。同様に、本発明者らは、本発明のための抗Ba抗体、抗Bb抗体、および抗P抗体および抗C3b抗体について記載する。
【図２】図2は、代表的な図4として発明抗体の1つから作成された実際のデータからの3つのアッセイトレース図を示す。1つの線は未処理の試料を表すが、第2の線は抗体処理された試料を表す。パネルAはCPバッファー中の1%NHS中で行われたCPアッセイである。2番目のパネルは、CP増幅ループをAPに寄与させる10%NHS中のCPアッセイである。3番目のパネル(パネルC)は、CP(パネルB)に影響することなくAPを阻害する発明抗体の属による阻害を示す。このパターンを示す全ての抗体は、発明された属に属する。
【図３】図3(a〜e)はそのそれぞれの標的(C3b、Bb、およびP)に対する発明抗体の結合親和性を示すプロットである。
【図４】図4は、発明抗体がヒト血清(NHS)中のウサギ赤血球(rRBC)の補体第2経路依存的溶血を阻害することを示すグラフである。プロパージン(P因子)、Bb因子、およびC3bの活性を阻害する多数の抗体が存在する。そのような抗体は全て、補体第2経路を阻害し、CPを阻害しない(図7)。しかしながら、これらの抗体は、古典的経路を阻害することなく、補体第2経路を阻害するような方法でその標的に対して作用する。
【図５】図5は、発明抗体が抗体感作ヒツジ赤血球(sRBC)の古典的経路依存的溶解を阻害しないことを示すグラフである。現在の技術水準は、古典的経路の活性化が、CPにより産生されたC3転換酵素によるC3の切断から開始する、増幅ループでの補体第2経路の活性化を常にもたらすことを教示している。特許請求された発明は、古典的経路活性にもかかわらず、補体第2経路の治療的阻害を可能にする。示されているように、発明された属の抗C3b、抗Ba、抗Bb、および抗P抗体は、古典的経路を阻害せず、補体第2経路に特異的である(図2〜3)。従って、本発明は、補体第2経路の病的過剰活性化を特徴とするか、またはそれにより媒介される任意の疾患における適用可能性を有する。
【図６】図6(a〜c)は、発明抗体が、血管外溶血のマーカーである、血清中でのC3bの形成を阻害することを示すプロットを示す。
【図７】図7(a〜c)は、発明抗体が、血管内溶血のマーカーである、血清中でのC5b-9の形成を阻害することを示すプロットを示す。
【図８】図8は、発明抗体が、全血炎症におけるC3aの形成を阻害することを示すグラフである。C3a(C3から切断される)とC5a(C5から切断される)は両方とも、補体活性化の際に産生される強力なアナフィラトキシン(局所炎症の誘発因子)である。古典的経路と補体第2経路は両方ともこれらの分子を産生する。この図面は、補体第2経路に由来するC3aの阻害を示す。古典的経路誘発因子は、このモデルには存在しない。
【図９】図9は、発明抗体が、全血炎症におけるC5aの形成を阻害することを示すグラフである。特許請求された発明は、補体第2経路から産生されたC3a(図8)およびC5a(図9)を選択的に阻害する。
【図１０】図10は、発明抗体が全血中でのsC5b-9の形成を阻害することを示すグラフである。
【図１１】図11は、発明抗体が好中球活性化を阻害することを示すグラフである。好中球活性化は、CPまたはCPにより誘導されるAPではなく、APの活性化に起因して生じる。
【図１２】図12は、発明抗体が単球活性化を阻害することを示すグラフである。単球活性化は、CPまたはCPにより誘導されるAPではなく、APの活性化に起因して生じる。
【図１３】図13は、発明抗体が血小板活性化を阻害することを示すグラフである。血小板活性化は、CPまたはCPにより誘導されるAPではなく、APの活性化に起因して生じる。
【図１４】図14は、発明抗体が単球-血小板凝集体を阻害することを示すグラフである。単球-血小板凝集は、CPまたはCPにより誘導されるAPではなく、APの活性化に起因して生じる。
【図１５】図15は、発明抗体が好中球からのエラスターゼ放出を阻害することを示すグラフである。好中球エラスターゼは、補体第2経路から産生されたC3a/C5aにより活性化された好中球から産生される。
【図１６】図16は、本発明の抗体がPNHのin vivoモデルにおいてLDH放出を防止することを示すグラフである。
【図１７】図17は、本発明の抗体がPNHのin vivoモデルにおいてHgB放出を防止することを示すグラフである。
【図１８】図18は、PNH患者からの血液中の細胞を示すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
定義
本明細書で特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての用語は、本発明の当業者によって理解されるものと同じ意味を有する。以下の定義は、明確性のために、ならびに本発明を説明するために明細書および特許請求の範囲で用いられるその意図される意味を定義するために提供される。
【００２１】
定義-補体経路
「古典的経路」とは、活性化のために抗原-抗体複合体により誘発され、その増殖のために補体第2経路増幅ループをも誘発しても、または誘発しなくてもよい補体を指す。
【００２２】
「補体第2経路」とは、異物表面のように見える細胞表面(または細胞表面のような材料)により誘発される補体活性化を指す。GPI結合タンパク質の非存在は、PNH細胞の表面を、補体第2経路を活性化するのに十分に異物性にする。補体第2経路はまた、補体因子C3からのC3bの自発的タンパク質分解生成から始まってもよく、ここで、C3bはBとPの両方に結合する能力を有する。
【００２３】
「補体第2経路特異的タンパク質」とは、C3b、B因子、Bb因子、D因子、および/またはプロパージンを指す。ここで、C3bとは、CPではなくAPの一部としてのC3bを指す。
【００２４】
「AP増幅ループ」とは、形成されたC3bがAP C3転換酵素を作る、ループする一連の反応を指す。この転換酵素はC3を切断し、より多くのC3bを生成し、ループ中にフィードバックする。この自己持続的反応サイクルは、大量のC3bを生成する。
【００２５】
「C3b」は、APおよびCP経路に由来する両方のC3bについて用いられる用語である。
【００２６】
「補体第2経路依存的C5a」は、全血中の補体系の補体第2経路の活性から産生されるC5aの形成を記述する。例えば、「AP依存的C5a形成」とは、古典的経路とは無関係である、補体第2経路の活性化によるC5aの形成を指す。
【００２７】
「補体第2経路依存的sC5b-9」は、補体系の補体第2経路の活性から産生されたsC5b-9の形成を記述する。例えば、「AP依存的sC5b-9(可溶性MAC)形成」とは、古典的経路とは無関係である、補体第2経路の活性化によるsC5b-9の形成を指す。
【００２８】
「補体第2経路依存的C5b-9」は、補体系の補体第2経路の活性から産生されたC5b-9の形成を記述する。例えば、「AP依存的C5b-9形成(MAC沈着)」とは、古典的経路とは無関係である、補体第2経路の活性化によるC5b-9の形成を指す。
【００２９】
「C3a依存的細胞活性化」は、補体第2経路依存的C3aが、これらの細胞上に存在するC3a受容体に結合する場合に生じる好中球、単球、血小板、Tリンパ球、内皮細胞、肥満細胞、および血小板の活性化を記述する。これらの細胞は、様々な異なる疾患(「他の疾患」を参照されたい)において、そのC3a活性化状態で見出される。
【００３０】
「C5a依存的細胞活性化」は、補体第2経路依存的C5aが、これらの細胞上に存在するC5a受容体に結合する場合に生じる好中球、単球、血小板、Tリンパ球、内皮細胞、肥満細胞、および血小板の活性化を記述する。これらの細胞は、様々な異なる疾患(「他の疾患」を参照されたい)において、そのC5a活性化状態で見出される。
【００３１】
「C5b-9およびsC5b-9依存的組織傷害/細胞損傷」は、sC5b-9および/またはC5b-9の形成により引き起こされる細胞損傷を記述する。これらの分子は、細胞表面に結合する、および/または自身を細胞の細胞膜に挿入し、「組織傷害」としても記載される病理学的状態をもたらす。組織傷害は様々な疾患において生じ、様々な臓器に対する損傷をもたらし得る。
【００３２】
「膜攻撃複合体(MAC)」とは、細胞膜に挿入され、それを破壊する最終的に5つの補体成分(C5b-C9)の複合体を指す。この複合体は、C5b-9とも呼ばれる。MAC複合体は、補体第2経路と、古典的補体経路との両方によって産生される。「Sタンパク質」と会合する複合体は、sC5b-9と呼ばれ、MACの可溶性形態である。本発明抗体は補体第2経路と関連するC5b-9およびsC5b-9を阻害する。
【００３３】
「C3a、C5a、C5b-9、sC5b-9および炎症」は、AP活性化および活性の生成物、特に、AP活性から生成するAP生成物C3a、C5a、C5b-9、およびsC5b-9により引き起こされる炎症を記述する。これらの分子は、C3a依存的細胞活性化、C5a依存的細胞活性化、C5b-9およびsC5b-9依存的細胞損傷を引き起こし、サイトカイン活性化細胞、プロテアーゼ活性化細胞、および過酸化物活性化細胞の普及をもたらし、これらは全て様々な異なる疾患および疾患病理において実行され得る。
【００３４】
定義-全血および炎症
「全血」は、ヒトの血管中に見出される血液と同じ組成で細胞、化学物質、タンパク質などを含む完全な血液を記述する。単離された血液は、炎症応答を担う炎症細胞などの補体系の全ての成分を含有する。
【００３５】
「全血における炎症」は、全血中で補体第2経路活性化から始まる反応のカスケード、全血中のC3a、C5a、ならびにC5b-9およびsC5b-9の得られる産生、全血中での好中球、単球および血小板の得られる活性化、最終的には、全血中での炎症性サイトカインの産生(in vivoまたはin vitro)を記述する。いくつかの炎症メディエーターが血漿中に分泌されることがわかっている。これらの炎症メディエーターは、TNF、IL-1、IL-6、IL-8およびその他のいくつかである。一覧中には含まれない。
【００３６】
「溶血性疾患における補体第2経路(AP)依存的炎症」とは、PNHおよび他の溶血性疾患における、1種以上の下記成分：C3a、C3b、C5a、C5b-9、またはsC5b-9の形成、および/または放出の継続または増加、ならびにその全ての予測される結果により測定される、補体第2経路活性化の増加を指す。そのような予測される結果としては、細胞のAP依存的MAC媒介性沈着および/もしくは溶解の継続もしくは増加、血小板、単球、好中球、肥満細胞、もしくは好塩基球のAP依存的活性化の継続もしくは増加、ならびに/またはTNF-α、IL-1、もしくは好中球エラスターゼのAP依存的形成もしくは放出の継続もしくは増加が挙げられる。
【００３７】
「他のオーファンおよび非オーファン血液系および非血液系急性および慢性疾患」は、測定された増加した成分の1つが、補体第2経路系の活性化に由来する疾患の一覧を記述する。これらの成分としては、限定されるものではないが、C3a/C3b、P、Ba/Bb、C5a/C5aおよびC5b-9/sC5b-9が挙げられる。これらの成分のレベルの上昇は、1種以上の疾患と関連することがわかった。これらの成分は、細胞活性化および炎症メディエーターの放出を担う。ひいては、これらのものは、最終的には、血液系および非血液系疾患の両方において疾患を規定する組織損傷を引き起こす。
【００３８】
「PNHにおける補体第2経路(AP)依存的炎症」とは、C3a、C3b、C5a、C5b-9、および/またはsC5b-9の形成および/または放出の継続または増加、ならびにその全ての予測される結果により測定される、補体第2経路活性の増加を指す。そのような予測される結果としては、細胞のAP依存的C3bおよびMAC媒介性沈着もしくは溶解の継続もしくは増加、血小板、単球、好中球、肥満細胞、もしくは好塩基球のAP依存的活性化の継続もしくは増加、ならびに/またはTNF-α、IL-1、もしくは好中球エラスターゼのAP依存的形成もしくは放出の継続もしくは増加が挙げられる。
【００３９】
「自己免疫疾患」とは、被験体の免疫応答が体内に通常存在する物質および組織に不適切に向けられる状態を指す。
【００４０】
「細胞溶解」は、部分的には組織傷害を示す。細胞溶解は、細胞表面のC5b-9形成の結果として起こる。C5b-9のそのような沈着は、細胞傷害をもたらし、組織の場合、細胞傷害は組織傷害である。
【００４１】
定義-阻害抗体および薬剤
「薬剤」、「化合物」とは、任意の物質、分子、元素、化合物、実体、またはその任意の組合せを指す。薬剤は、特に、タンパク質、オリゴペプチド、低分子有機分子、多糖、ポリヌクレオチド、または他の生化学的物質であってもよい。それは天然の生成物、合成化合物、化学的化合物、または異なる起源の2つ以上の物質の組合せであってもよい。別途特定されない限り、用語「薬剤」、「物質」および「化合物」は互換的に用いることができる。
【００４２】
「補体第2経路特異的抗体」とは、被験体における補体第2経路の活性化および/または進行を阻害するために補体第2経路タンパク質に結合することができる抗体またはその断片を指す。
【００４３】
「APタンパク質に対する抗体」は、古典的経路を阻害することなく、補体第2経路の活性を中和する抗P、抗Ba、抗Bb、抗C3b抗体を記述する。
【００４４】
定義-薬理学
「薬物動態活性」または「薬物動態」とは、投与された薬物の吸収および分布の機序、薬物作用が開始する速度および効果の持続期間、体内での物質の化学的変化、ならびに薬物の代謝物の排出の効果および経路を指す。
【００４５】
「治療上有効量」は、in vivoでAP活性を完全に阻害するのに十分な量と定義される。
【００４６】
本明細書で用いられる場合、「予防上有効量」は、被験体における疾患または障害の開始を防止するのに十分な量と定義される。
【００４７】
本明細書で用いられる用語「投与すること」、「投与」などは、限定されるものではないが、経口投与、静脈内投与、腹腔内、筋肉内、皮下投与、耳内投与、または直腸投与などの、抗体またはその抗原結合断片を被験体に与えることができる方法を指す。
【００４８】
定義-抗体
最も広い意味で用いられる「抗体」は、マウス、ウサギまたはヒト種に由来する完全長または部分長モノクローナル抗体などのモノクローナル抗体、およびポリクローナル抗体を含む。抗体を、他の哺乳動物中で生成させることもできる。その最も広く認識される形態において、抗体は、ジスルフィド結合により相互連結された2つの重鎖(H)および2つの軽鎖(L)を含有する。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではVHと省略される)と、重鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2およびCH3から構成される。それぞれの軽鎖は、重鎖可変領域(本明細書ではVLと省略される)と、軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLから構成される。VHおよびVL領域は、フレームワーク領域(FR)と呼ばれるより保存された領域とともに散在する、相補性決定領域(CDR)と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分することができる。それぞれのVHおよびVLは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって以下の順序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4に配置された3つのCDRと4つのフレームワークとから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。用語「抗体」は、プロパージン、C3b、Ba、およびBbまたはその一部などのタンパク質に特異的に結合する、任意の抗体産生哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ウサギ、およびヒトなどの霊長類)に由来する、全抗体およびその抗体断片を包含する。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナルおよび組換え抗体；多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)；ヒト化抗体；ネズミ抗体；キメラ、マウス-ヒト、マウス-霊長類、霊長類-ヒトモノクローナル抗体；および抗イディオタイプ抗体が挙げられ、任意の無傷分子またはその断片であってもよい。
【００４９】
「他の抗体」とは、限定されるものではないが、ヒトおよび動物における治療的使用のための動物およびヒトなどの生きている生物で生じる抗体を指す。生きている生物で生じた任意の抗体は、CP媒介性溶解またはCP増幅ループではなく、AP媒介性溶解(アッセイ3)を阻害することができる。
【００５０】
「抗体断片」とは、一般に、その抗原結合領域または可変領域を含む、完全長抗体、特に、抗C3b、抗P、および抗Ba、または抗Bb抗体から誘導されるか、またはそれと関連する一部を指す(「抗原結合断片」を参照されたい)。用語「抗体断片」とは、一般に、その抗原結合領域および可変領域を含む、完全長補体第2経路阻害抗体から誘導される一部を指す。他の抗体は、抗体断片から形成されたナノボディ、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子および多重特異性抗体を含む。抗体断片の例としては、Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2およびFv断片、またはscFv断片(および前記のいずれかの任意のPEG化変異体)が挙げられる。
【００５１】
抗体の「抗原結合断片」とは、所与の抗原に特異的に結合する能力を保持する無傷抗体の1つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能を、相補性決定領域(CDR)を含有する無傷抗体の断片によって実行することができる。抗原結合断片の例は：
「Fab」断片(VHおよびVLを含む一本鎖可変領域；
「一価断片」(VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる抗体断片)；
「F(ab')2」断片(ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結された2つのFab断片を含む二価断片)；
「Fd」断片(抗体のVHおよびCH1ドメインからなる)；
「Fv」断片(抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなる)；
VHドメインまたはVLドメインからなる単一ドメイン抗体(「dAb」)；
単離された相補性決定領域(「CDR」)
である。
【００５２】
抗体の「機能的誘導体」は、抗体の機能的領域から取られた、またはそれ自身を中に含む任意の化合物である。抗体の機能的誘導体としては、限定されるものではないが、抗原結合断片、CDR、ヒト化抗体、「Fab」断片、「Fd」断片、キメラ抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、および一本鎖抗体が挙げられる。
【００５３】
抗原結合断片としてのCDRを、単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、v-NARおよびビス-scFvに組込むこともできる。抗体の抗原結合断片を、III型フィブロネクチン(Fn3)などのポリペプチドに基づく足場に移植することができる。抗原結合断片を、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に抗原結合領域の対を形成するタンデムFvセグメント(VH-CH1-VH-CH1)の対を含む一本鎖分子に組込むことができる。
【００５４】
本明細書で用いられる用語「Fc領域」とは、エフェクター機能を誘導する抗体の領域を指す。
【００５５】
「親和性」とは、単一の抗原性部位での抗体と抗原との間の相互作用の化学的強度を指す。
【００５６】
「結合特異性」とは、個々の抗体または抗原結合断片が特定の標的に結合する能力、例えば、抗体がその標的にのみ結合する結合特異性を指す。
【００５７】
「化合物」、「ブロッキング剤」、「阻害剤」または「アンタゴニスト」とは、化学的または生理学的反応または応答を遅延させるか、または防止する化学物質、または力を指す。一般的なブロッキング剤または阻害剤としては、限定されるものではないが、アンチセンス分子、抗体、アンタゴニストおよびその誘導体が挙げられる。例えば、抗体は、成分とAPの別の成分との間のAP特異的相互作用の成分に結合する。そのような抗体は、その相互作用の、および拡張すると、APの、阻害剤またはブロッキング剤である。
【００５８】
「キメラ抗体」は、非ヒト種の動物に由来する抗体から誘導される可変ドメインおよびCDRを含有するが、残りの抗体分子はヒト抗体から誘導される、組換えタンパク質である。抗体の非結合領域の、ヒト定常領域との置き換えにより、キメラ抗体は、ヒトにおける低下した抗原性を有しながら(元のマウス抗体と比較して)、標的抗原を認識し、それに結合する際にその特異性を保持することができる。
【００５９】
「ヒト化抗体」は、非ヒトCDRと、ヒト化フレームワーク領域とからなる抗体である。ヒト化抗体は、典型的には、抗体相補性決定領域のみが非ヒト起源のものである組換えタンパク質である。
【００６０】
本明細書で用いられる場合、「一本鎖Fv」または「scFv」抗体断片は、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖上に存在する。
【００６１】
本明細書で用いられる用語「免疫原性」とは、被験体における免疫応答を開始させる抗原の能力を指す。
【００６２】
「相補性決定領域(CDR)」は、抗体の鍵となる結合領域である。典型的には、2つの重鎖および軽鎖可変領域のそれぞれの可変領域内に見出される3つのCDRが存在する。CDRを、位置に関して、ごちゃ混ぜにして、特定の結合親和性を作出することができる。「抗原結合断片」も参照されたい。
【００６３】
「エフェクター機能」とは、抗体の天然のFc領域に帰する生物活性を指し、抗体アイソタイプに応じて変化する。抗体エフェクター機能の例としては、C1q結合および補体依存的細胞傷害性；Fc受容体結合；抗体依存的細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)；食作用；細胞表面受容体(例えば、B細胞受容体)の下方調節；Fc受容体を発現する血小板の活性化の欠如；ならびにB細胞活性化が挙げられる。治療抗体の副作用を最小化するか、または除去するためには、エフェクター機能を最小化するか、または除去することが好ましい。
【００６４】
本明細書で用いられる用語「Fcエフェクター機能の低下」とは、抗体が抗体のFc領域を認識する抗原に対して作用しない抗体の機能を指す。Fcエフェクター機能の低下の例としては、限定されるものではないが、抗原に対するFc結合の低下、抗原に対するFc活性化の欠如、正常なFcエフェクター機能を防止する突然変異を含有するFc領域、またはFc受容体を有する血小板および他の細胞の活性化の防止が挙げられる。
【００６５】
「ヒト抗体」は、フレームワーク、CDR、および定常領域を含む、抗体の全ての成分がヒト起源のものである抗体である。用語「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体の結合特異性を保持するが、ヒトにおける免疫原性が低い非ヒト起源の抗体である。「キメラ抗体」および「ヒト化抗体」を参照されたい。
【００６６】
「精製抗体」とは、夾雑物から単離された抗体を指す。好ましい実施形態においては、抗体は、(1)Lowry法により測定された場合、95重量%を超える、最も好ましくは、99重量%を超える抗体にまで、(2)スピニングカップシーケネーターの使用により少なくとも15残基のN末端もしくは内部アミノ酸配列を得るのに十分な程度にまで、または(3)クマシーブルー、もしくは好ましくは、銀染色を用いた還元的もしくは非還元的条件下でのSDS-PAGEにより均一になるまで精製される。
【００６７】
「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子により提供される抗体クラス(例えば、IgM、IgE、IgG1またはIgG4などのIgG)を指す。アイソタイプはまた、改変型のこれらのクラスの1つも含み、ここで改変は、Fc機能を変化させるため、例えば、エフェクター機能またはFc受容体への結合を増強または低下させるために行うことができる。
【００６８】
「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種の抗体の集団から得られた、すなわち、該集団を含む個々の抗体が同一である抗体を指す。モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を指向する。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体を、ハイブリドーマ法により調製するか、またはそれらを細菌もしくは真核動物細胞もしくは植物細胞中で組換えDNA法を用いて作製することができる。「モノクローナル抗体」を、ファージ抗体ライブラリーから単離するか、またはin vitro、in vivo、および細胞培養法を用いて生成することもできる。モノクローナル抗体は、アミノ酸のユニークな配列に結合し、その標的抗原上に単一の特異的エピトープを有するものを含む。
【００６９】
「ポリクローナル抗体調製物」は、モノクローナル抗体調製物と違って、異なる決定基(エピトープ)を指向する異なる抗体を含む。本明細書で用いられる用語「ポリクローナル」とは、単一の抗原上の複数のエピトープを認識する抗体を指す。
【００７０】
「組換え抗体」は、組換え手段および方法により調製、発現、作出または単離された全ての抗体を含む。
【００７１】
「一本鎖抗体」とは、Fv断片の2つのドメイン、VLおよびVHが別々の遺伝子によりコードされる抗体を指す。これらの遺伝子を、組換え法を用いて、人工ペプチドリンカーにより連結することができる。遺伝子の連結は、VLおよびVH領域が対形成して、一価分子(一本鎖Fv、「scFv」として知られる)を形成する単一タンパク質鎖の産生をもたらす。そのような一本鎖抗体は、抗体の1つ以上の「抗原結合断片」を含む。「抗原結合断片」を参照されたい。
【００７２】
「治療抗体」とは、目的の疾患または状態に関して治療的または予防的文脈で有効であると考えられる抗体を指す。
【００７３】
定義-アミノ酸およびアミノ酸配列
「アミノ酸」は、最も広い意味において、天然アミノ酸を指し、これはそれぞれのアミノ酸の側鎖の化学的特徴に基づいて群に分割することができる。「疎水性」アミノ酸は、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val、Ala、CysおよびProである。「親水性」アミノ酸は、Asn、Gln、Ser、Thr、Asp、Glu、Lys、ArgおよびHisである。「非荷電親水性」アミノ酸は、Ser、Thr、AsnおよびGlnである。「酸性」アミノ酸は、GluおよびAspである。「塩基性」アミノ酸は、Lys、ArgおよびHisである。本明細書で用いられる場合、アミノ酸残基は以下のように省略される：アラニン(Ala;A)、アスパラギン(Asn;N)、アスパラギン酸(Asp;D)、アルギニン(Arg;R)、システイン(Cys;C)、グルタミン酸(Glu;E)、グルタミン(Gln;Q)、グリシン(Gly;G)、ヒスチジン(His;H)、イソロイシン(Ile;I)、ロイシン(Leu;L)、リシン(Lys;K)、メチオニン(Met;M)、フェニルアラニン(Phe;F)、プロリン(Pro;P)、セリン(Ser;S)、トレオニン(Thr;T)、トリプトファン(Trp;W)、チロシン(Tyr;Y)、およびバリン(Val;V)。
【００７４】
「保存的アミノ酸置換」は、下記群のそれぞれに含まれるアミノ酸間の置換により説明される：(1)グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、(2)フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン、(3)セリンおよびトレオニン、(4)アスパラギン酸およびグルタミン酸、(5)グルタミンおよびアスパラギン、ならびに(6)リシン、アルギニンおよびヒスチジン。
【００７５】
2つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈における「同一」とは、2つ以上の配列または部分配列が同じであることを指す。2つの配列が、下記の配列比較アルゴリズムの1つを用いて、または手動のアラインメントおよび目視により測定するときに、比較ウィンドウ、または指定の領域にわたって、最大の一致のために比較およびアラインメントされた場合、同じであるアミノ酸残基またはヌクレオチドの特定のパーセンテージ(すなわち、特定の領域にわたって、または特定されない場合、配列全体にわたって、60%の同一性、場合により65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、または99%の同一性)を有する場合、2つの配列は「実質的に同一」である。場合により、同一性は、長さ少なくとも約50ヌクレオチド(または10アミノ酸)である領域にわたって、またはより好ましくは、長さ100〜500もしくは1000以上のヌクレオチド(または20、50、200以上のアミノ酸)である領域にわたって存在する。2つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を、MeyersおよびMillerのアルゴリズムを用いて決定することもできる。
【００７６】
定義-PNHおよび溶血性疾患
本明細書で用いられる用語「溶血性疾患」とは、細胞溶解、細胞損傷および炎症が疾患の病理において役割を果たす任意の障害または疾患を指す。溶血性疾患はまた、AP活性化が細胞溶解、細胞損傷および炎症を引き起こす炎症性障害または疾患でもある。溶血性疾患は、赤血球および/または血小板の病理学的溶解を特徴とする疾患を含む。赤血球や血小板などの無核細胞は完全溶解を受ける。赤血球の溶解はヘモグロビンを放出し、これは血液および臓器に関する病的転帰を示す。好中球、単球、Tリンパ球などの有核細胞はMACにより攻撃され得るが、完全な溶解は受けない。
【００７７】
「血管内溶血」とは、AP活性化ならびに細胞表面上でのC5b-9の関連する産生および沈着により引き起こされる無核および有核細胞の溶解を指す。
【００７８】
「血管外溶血」とは、補体受容体によるC3b沈着および除去に起因する細胞の溶解を指す。C3bは古典的経路および補体第2経路の活性化により産生される。本発明は、補体第2経路により産生されるC3bに焦点を当てたものである。
【００７９】
「捕捉アンタゴニスト」は、ヒトIgG1のFc部分に融合された抗体Fabからなる受容体-Fc融合タンパク質である。好ましい実施形態においては、標的タンパク質をコードする発現プラスミドを、捕捉アンタゴニストを培養培地中に分泌するCHO細胞中にトランスフェクトする。得られるアンタゴニスト捕捉体は、プロパージンに対する親和性がより高い、高親和性受容体の結合ドメインを用いてそのリガンドに結合する。
【００８０】
「皮下投与」とは、薬物容器からの比較的遅い、持続的送達による、動物またはヒト患者の皮膚の下、好ましくは、皮膚と下層組織との間のポケット内への薬物の導入を指す。ポケットを、下層組織から皮膚を上につまむか、または引き寄せることにより作出することができる。利用可能な様々な製剤が存在し、特に、当業者であればそのような製剤をよく知っている。
【００８１】
「組織傷害」とは、C5b-9(MAC)が組織を傷害することがわかっている組織を指す。組織傷害は、MACにより引き起こされ、MAC形成を防止する抗体により阻害することができる。本出願で示される1つの例は、生理学的レベルの補体成分を含有する正常ヒト血清の存在下、時間依存的方法での赤血球の定量可能な細胞死である。細胞溶解のこの証明は、OD700での散乱の喪失により定量可能である。組織中に存在する有核細胞も、赤血球と同様に補体により傷害される。赤血球溶解の阻害および従って組織傷害を、本発明の抗体の使用によって防止することができる。組織傷害は、身体/臓器の任意の部分で生じ、関節炎などの病理学的転帰をもたらし得る。GPIを欠く全ての細胞がMAC攻撃を受ける血液障害においては、組織傷害および損傷を、そのような抗体の使用によって防止することができる。この定義は、組織傷害がCP活性化ではなくAP活性化の結果として生じる多くの疾患にも拡張することができる。
【００８２】
本明細書に記載の実施形態は、古典的補体経路に影響することなく補体第2経路のみを媒介した血管内および血管外溶解を阻害する特定の属の阻害抗体の1つ(またはいくつか)の有効量を、罹患した被験体に投与することにより、溶血性疾患、溶血関連状態、またはPNH様状態に罹患する被験体を治療するための方法に関する。この属の抗体は、補体系を阻害する様々な抗体から、補体第2経路の特定の成分に対するその特異的でユニークな効果について同定および選択された。特許請求された属の阻害抗体は、補体第2経路に選択的である。選択基準のこの組合せから産生された抗体は、いくつもの溶血状態にとって有用である。
【００８３】
古典的経路と補体第2経路の双方は、独立している。レクチンまたはMBL経路は古典的経路の一部である。両経路とも、C3b、C3a、C5b、C5a、およびC5b-9を独立に生成する。本発明の抗体は、両経路により産生される分子であるC3bおよびC5b-9の形成を阻害する。これらのモノクローナルは、増幅ループがそのプロセスの一部であろうとなかろうと、古典的経路に由来するC3bおよびC5b-9を阻害しない。本発明は、オプソニン作用などの宿主防御のため、古典的経路により産生されたC3bを無傷のままにする。本発明は、宿主防御のため、古典的経路により産生されたC5b-9を無傷のままにする。
【００８４】
古典的経路は補体第2経路に流れ込み、また、補体第2経路と協調して動作するため、先行技術は、選択的ではないと考えられる阻害剤を用いている。古典的経路は、補体第2経路の増幅ループを使用する。そのような設定において開発されたAPの阻害剤は、古典的経路の増幅された活性を阻害したであろう。
【００８５】
独自に、補体攻撃は正常細胞を損傷せず、異常細胞はCD55およびCD59などの補体系の重要な調節因子を欠くものである。これらの異常細胞は、PNHにおいて見出される。PNH細胞はCD55およびCD59を欠き、我々の発明は、CD55とCD59の両方が、赤血球、血小板、Tリンパ球、好中球、および単球などのほぼ全ての型の細胞中に存在しないが、それぞれの細胞型の全集団は異なっていてもよく、例えば、異常細胞の%が1%〜10%未満または10%〜100%未満で変化してもよいことを示す。
【００８６】
PNHにおいて、異常な赤血球は、AP活性化の結果として溶解を受け、ヘモグロビンを放出する。放出されたヘモグロビンは、腎臓にとって損傷的であり得る。赤血球の溶解に起因する飛躍的進歩は重要であると考えられ、血管内溶血を制御するための薬物が発見され、現在用いられている。この薬物は、その下流の作用のため、血管外溶血を防止せず、従って、患者は依然として貧血であり続ける。
【００８７】
血管外溶血が起こるのを防ぐために、いくつかの主要なカテゴリーの補体阻害剤を開発することができる；a)細胞表面上での古典的経路により産生されるC3bの沈着を防止する古典的経路阻害剤、b)増幅ループにより産生されるC3bの形成を防止する古典的経路阻害剤、c)CPの形成に由来するC3bの形成を防止するAP阻害剤、およびd)古典的経路に影響することなく補体第2経路により産生されるC3bを防止するAP阻害剤。本出願の発明者は、古典的経路に由来するC3b形成に影響することなく、補体第2経路に由来するC3b形成を選択的に標的化する阻害剤を特許請求する。そのような手法の論拠は、そのような阻害剤が宿主防御のために古典的経路により産生されるC3bをそのままにするということである。本発明者らは、古典的経路に由来するC3bに影響することなく、補体第2経路によるC3bの形成のみを防止するモノクローナル抗体の属を特許請求する。
【００８８】
血管内溶血を防止するために、いくつかの主要なカテゴリーの補体阻害剤を開発することができる；a)細胞表面上での古典的経路により産生されるC3bの沈着を防止する古典的経路阻害剤、b)増幅ループにより産生されるC5b-9の形成を防止する古典的経路阻害剤、c)CPの形成に由来するC5b-9の形成を防止するAP阻害剤、およびd)古典的経路に影響することなく補体第2経路により産生されるC5b-9を防止するAP阻害剤。本出願の発明者は、古典的経路に由来するC5b-9形成に影響することなく、補体第2経路に由来するC5b-9形成を選択的に標的化するその阻害剤を特許請求する。そのような手法の論拠は、そのような阻害剤が宿主防御のため、古典的経路により産生されるC5b-9をそのままにするということである。本発明者らは、古典的経路に由来するC5b-9に影響することなく、補体第2経路によるC5b-9の形成のみを防止するモノクローナル抗体の属を特許請求する。
【００８９】
C3bおよびC5b-9は、古典的経路と補体第2経路の両方によって産生される。異なる分子構造を有する2つのC3転換酵素(CP C3転換酵素およびAP C3転換酵素)が同定されている；(C4b2a)および(PC3bBb)。これらのC3転換酵素はC3を切断し、2つの異なる型のC3b分子を生成する。両補体経路は独立しているため、本発明は、古典的経路により産生される、またはCP増幅ループから産生されるC3bに影響することなく補体第2経路によるC3b産生のみを標的化する。補体第2経路に由来するC3bを選択的に標的化するモノクローナル抗体の属は、本発明の焦点である。
【００９０】
本発明の抗体は、in vivoにおいて血管外溶血ならびに臨床試験において網状赤血球数、ヘモグロビン(HgB)およびLDHの増加などのその関連する臨床転帰を制御することができる。特定の実施形態において、本発明は、赤血球、好中球、単球、血小板およびTリンパ球がGPI結合タンパク質を欠損している血液障害を有する被験体を治療する方法であって、C3b、PC3b、PC3bBbおよびP(C3b)n(Bb)nの形成および沈着を防止するために補体第2経路を阻害する有効量の阻害剤を投与することを含む、前記方法を含む。そのような作用は、血管外および血管内溶血ならびに溶血クリーゼの発現を防止するのに重要である。他の実施形態において、本発明は、被験体が既に血管外溶血を示している場合にエクリズマブまたは同等の薬物ですでに処置された被験体を治療する方法を含み、本発明は転換酵素に分解し、血管外溶血の進行を停止させると期待される。
【００９１】
特定の実施形態において、本発明の方法は、被験体が、以下の特徴；a)被験体が進行中の、または間欠的な血管内溶血および/または血管外溶血による赤血球の継続的喪失の兆候または症状を示す；b)被験体がC3の断片によりオプソニン化された赤血球を有する；c)被験体が定期的な輸血を必要とする；d)被験体が正常低値の、または正常レベルより低いヘモグロビンを有する；e)被験体が正常低値の、または正常レベルより低い血小板を有する；f)被験体が正常高値の、または正常レベルより高い網状赤血球を有する；g)被験体が正常高値の、または正常レベルより高いビリルビンを有する；h)被験体が鉄過剰であるか、または鉄過剰の危険性がある、のうちの少なくとも1つを示す、血液細胞に影響する補体媒介性溶血性障害を有する被験体を処置することを含む。
【００９２】
上記方法を達成するのに有用な好ましい実施形態として、本発明は、補体第2経路の活性を阻害する薬剤および組成物を提供する。そのような薬剤および組成物は、特許請求された属に由来する抗体の結合領域を担持する融合タンパク質および/または抗体自体を含む。これらの薬剤は、C3転換酵素形成およびC3bの形成の開始を防止し、GPI結合タンパク質を欠く細胞上へのC3bの沈着を防止すると期待される。結果として、血管外溶血は下方調節され、輸血回数は減少し、血球減少症は減少し、血管内溶血は減少する。血球減少症の減少が特許請求される本発明の別の態様においては、血球減少症は、白血球減少症、血小板減少症、赤血球減少症、白血球減少症、リンパ球減少症、および好中球減少症を含む。これらのプロセスは、細胞凝集体の形成および被験体の循環からのそのような凝集体の除去の結果として起こり得る。また、細胞数の減少は、血管外溶血に起因して起こり得る。
【００９３】
好ましい実施形態においては、補体第2経路の阻害剤は、「Fab」、または抗体の少なくとも可変領域を含む断片もしくはその生物学的に活性な断片と、抗体のFc領域との融合物を含んでもよい。本発明の別の態様においては、補体第2経路の阻害剤は、ブロッキング性の抗C3b抗体、抗Bb因子抗体、抗プロパージン抗体、および抗D因子抗体、特に、C3bの形成とC5b-9の形成との両方をブロックするもののみを含んでもよい。そのような抗体がC3bの形成をブロックし、C5b-9の形成をブロックしない場合、そのような抗体は本発明から除外される。選択された属の抗体は、古典的経路ではなく、補体第2経路のみを阻害するべきである。
【００９４】
特定の好ましい実施形態においては、補体第2経路の阻害剤は、以下の特徴を有する中和モノクローナル抗体の属である。
【００９５】
補体第2経路に由来するC3bを阻害し、古典的経路に由来するC3bを阻害しない。古典的経路に由来するC3bは、オプソニン作用および宿主防御にとって必要である。かくして、選択された属の抗体は、特定の機能を実施する。
【００９６】
これらの抗体は、古典的経路を阻害せず、従って、古典的経路によるC3bの形成を阻害しない。
【００９７】
本発明は、一態様において、血液細胞に影響する補体媒介性溶血性障害を有する被験体を治療する方法であって、補体第2経路の活性化を阻害する有効量の抗体およびその抗原結合断片を投与することを含み、該抗体が、それぞれ血管外および血管内溶血の原因となるC3bとC5b-9の両方の形成を阻害する、前記方法を提供する。
【００９８】
本明細書に記載の方法のいずれかの特定の実施形態においては、被験体は以下の特徴：a)被験体が進行中の、もしくは間欠的な血管内溶血および/もしくは血管外溶血による血球減少症の兆候もしくは症状を示す；b)被験体が、白血球、リンパ球、赤血球、血小板、および単球、好塩基球を含む群から選択される細胞に結合したC3bを有する；c)被験体が定期的な輸血を必要とする；被験体が正常低値の、もしくは正常レベルより低いヘモグロビンを有する；被験体が正常低値の、もしくは正常レベルより低い血小板を有する；被験体が正常高値の、もしくは正常レベルより高い網状赤血球を有する；被験体が正常高値の、もしくは正常レベルより高いビリルビンを有する；または被験体が鉄過剰であるか、もしくは鉄過剰の危険性がある；または被験体が多数の死細胞を有する、のうちの1つ以上を有する。
【００９９】
いくつかの実施形態においては、前記方法は、本発明の抗体の収集物から選択された有効量のモノクローナル抗体を投与することを含み、ここでそれらは補体第2経路の活性を阻害し、従って、
細胞総数を正常レベルに増加させる、
生存赤血球増加の総数を正常レベルに増加させる、
好中球の総数を正常レベルに増加させる、
単球の総数を正常レベルに増加させる、
Tリンパ球の総数を正常レベルに増加させる、
血小板の総数を正常レベルに増加させる、
死細胞の総数を減少させ、健康な細胞の総数を増加させる、
細胞凝集体の総数を減少させる、
総LDHを正常レベルに低下させる、
ビリルビンを正常レベルに低下させる、
血漿中のヘモグロビンを減少させる、
C3a、C3b、C5a、C5b、C5b-9、およびsC5b-9レベルを低下させる、
活性化された細胞を減少させる、
炎症性サイトカインレベルを低下させる、
細胞活性化を低下させる、
抗体である。
【０１００】
いくつかの実施形態においては、本発明の抗体は、CPを阻害することなくAPの活性化を削ぐ、および/または阻害する。それらは、補体第2経路依存的溶解および炎症に関与する細胞の活性化を阻害し、炎症分子の産生を阻害し、最終的には、様々な溶血性疾患と関連する無数の病状を阻害する。これらの抗体はまた、C5b-9により媒介される血管外溶血および血管内溶血の原因となるC3bの形成を阻害する。
【０１０１】
補体第2経路のC3b(C3b)  -  この鍵となる分子は、補体第2経路の増幅において重要である。疾患状態と関連する場合、AP活性化は、血液細胞などの様々な細胞上でC3bを産生、沈着させる。これは、次いで、それぞれ、赤血球減少症および血小板減少症の根本的な原因である、赤血球および血小板の血管外溶解を引き起こす。この理由から、C3bの病的過剰産生は有害であり、阻害または制御しなければならない。C3bはまた、好中球、単球、およびTリンパ球上にも沈着する。これらの有核細胞上へのC3bの沈着は、これらの細胞の溶解を引き起こさないが、細胞損傷を引き起こし、それは組織傷害と同等である。C3b受容体は、これらの有核細胞上に見出され、そのような受容体の密度は、補体活性化および疾患の間に増加する。結果として、そのような細胞は機能不全に陥る。赤血球が溶解を受けるだけでなく、血小板も溶解を受けることを証明すしているのが本出願の発明である。赤血球と血小板は両方とも無核細胞である。好中球、単球、および血小板などの有核細胞は全て、C3bに結合し、血管外溶解により除去される。
【０１０２】
本発明者らは、C3b形成が補体第2経路によってのみ阻害される場合、補体第2経路により産生されるC3bは細胞上への沈着に利用可能ではなく、従って、血管外溶解による細胞喪失および/または宿主の肝臓もしくは脾臓による除去を阻害する。除去の阻害は、全ての細胞を含む血球減少症が阻害されることを意味する。PNHなどの血液障害においては、赤血球減少症が観察されるだけでなく、血小板減少症、好中球減少症、単球減少症、リンパ球減少症も観察される。これらのことは新しい知見であるため、白血球および血小板の除去に対処することが重要である。
【０１０３】
好中球および他の細胞はC3b受容体を担持し、従って、結合したC3bを抗C3b抗体を用いて検出することができる。C3bで被覆された好中球は感染と戦うことができず、従って、特許請求された発明の中和モノクローナルは感染を防止する。
【０１０４】
赤血球と同様、血小板も無核であり、従って、溶解する能力を有する。
【０１０５】
古典的経路により産生されるC3bは、補体第2経路により産生されるものと、このC3bとを区別するために(C3b)と呼ぶ。C3bはオプソニン作用および細菌の除去のために無傷のままであり、従って、阻害されてはならない。本発明の属の抗体は、古典的経路を阻害せず、従って、古典的経路により産生されるC3b、C3a、C5b、C5a、およびC5b-9などの関連する副産物を阻害しない。オプソニン食作用のプロセスは、細胞表面上へのC3bの沈着、および食細胞によるその後の取込みから始まる。C3bの不適切な、および/または未制御の産生は、不適切な、および/または非制御のオプソニン食作用をもたらす。
【０１０６】
C3a  -  C3a分子は9,000Daの分子量およびC3a受容体(C3aR)に対する高い親和性を有するペプチドである。C3aRは好中球、単球、血小板、肥満細胞、およびTリンパ球上に存在する。C3aのC3aRへの結合は、誘発/活性化された細胞からの炎症分子の放出を活性化する。活性化の際に、これらの細胞は、a)細胞内および細胞間凝集体を形成する、b)正常組織および宿主自体に侵入し、病状を引き起こす、ならびにc)TNF-α、IL-1、IL-18、IL-27、過酸化物、ならびにマトリックスを分解し、炎症および組織破壊を開始させることができるプロテアーゼなどの、炎症メディエーターを放出する。例えば、活性化/誘発された単球は、CD11bを発現し、腫瘍壊死因子アルファ(TNF-α)を放出する。活性化された単球は、血小板との凝集体を形成することができる。活性化された好中球もCD11bを発現し、過酸化物および好中球エラスターゼを放出する。活性化された血小板は、より高濃度のCD62Pを発現し、好中球および単球との凝集体を形成する。肥満細胞とTリンパ球は両方とも、C3aによっても活性化される。C3aは単球からのTNF-αの放出を開始させる。TNF-αは病理学的転帰および状態において鍵となる役割を果たすことが知られる。血小板もまたC3a受容体を担持する。C3aによる活性化の際に、血小板は活性化マーカーであるCD62Pを発現する。CD62Pは、細胞間凝集体形成の原因となる。これらの凝集体は、循環から除去され、最終的には血小板減少症をもたらす。
【０１０７】
C5aもまた、血小板の活性化において役割を果たす。血小板活性化の方法にかかわらず、活性化された血小板は、P-セレクチンとも呼ばれるCD62Pを発現する。P-セレクチンはまた、血小板-単球コンジュゲーションを媒介する。この結合は、単球からの組織因子の放出を誘発する。
【０１０８】
C5a/C5b  -  AP C5転換酵素(P(C3b)n(Bb)n)は、C5を切断し、C5aおよびC5bを生成する。C3aRおよびC5aR受容体は好中球および単球上に見出されていることから、C5aは、これらの細胞を活性化することが知られている。活性化の際に、好中球および単球は、細胞間および細胞内凝集体を生成し、好中球エラスターゼ、過酸化物、および、組織マトリックスを分解する様々なマトリックスプロテアーゼなどの炎症マーカーを放出する。C3aと同様、C5aもまた、いくつかの病状および関連する溶血性疾患と関連する炎症メディエーターの放出を引き起こす。
【０１０９】
C5b-9およびsC5b-9  -  これらの複合体は「MAC」とも呼ばれ、C5b-9は細胞表面上で形成し、組織傷害を引き起こす複合体である。図6に示されるように、ウサギ赤血球(rRBC)は、全血中でAPを活性化する。応答して、C5b-9は細胞膜に組込まれ、ヒト補体によるこれらの細胞の溶解を引き起こす。このアッセイは、赤血球溶血アッセイを用いて組織傷害を証明する方法である。sC5b-9は、プロテインSのC5bへの会合により形成されるMAC複合体である。C5bは、細胞表面上に沈着する代わりにSに結合する。プロテインSは、sC5b-9と省略される「可溶性MAC」の形成を可能にする。可溶性MACは、血小板および他の細胞型も活性化する。
【０１１０】
C3aおよびC5aは細胞を活性化し、活性化された細胞はCD62PおよびCD11bなどのマーカーを発現する。これらの活性化された細胞は、凝集体を形成する。凝集体は、循環から除去され、患者を血球減少症にする。
【０１１１】
本発明の抗体は、C3a、C3b、C5a、C5b、およびC5b-9のAPに由来する形成を防止することができる。結果として、細胞活性化は防止される。活性化がない場合、炎症マーカーの放出もない。かくして、本発明の抗体は、疾患の進行をブロック、防止することができる。
【０１１２】
溶血性疾患における補体第2経路の役割
利用可能な文献および関連するデータに基づけば、慢性溶血において、補体活性化は主に細胞表面上でのC5b-9の形成により媒介されると考えられる。それは、古典的経路由来または補体第2経路由来の間を区別しない。本発明は、古典的補体経路ではなく、補体第2経路により形成されるC5b-9を標的とする。本発明は、感染に対する宿主防御のために古典的経路を無傷のままにする。
【０１１３】
溶血性疾患は、赤血球の溶解がヘモグロビンの放出をもたらすものを含む。そのような作用は、血液中の赤血球の総濃度を減少させる。発作性夜間ヘモグロビン尿症(「PNH」)は、稀な溶血性疾患である。それは、赤血球が身体自身の補体経路の活性により破壊される、血液の自己免疫障害である。PNHは、細胞がグリコシル-ホスファチジルイノシトール(「GPI」)アンカーを合成することができなくする体細胞突然変異の結果生じる。GPIアンカーは、補体攻撃に対して細胞を保護する。PNH細胞は、崩壊促進因子(「DAF」)、またはCD55、および反応性溶解の膜阻害剤(「MIRL」)、またはCD59を含む補体調節表面タンパク質を欠損している。
【０１１４】
PNHにおいては、赤血球の溶解は、総赤血球数の病的減少(すなわち、溶血性貧血)を引き起こす。尿中のヘモグロビンの存在(ヘモグロビン尿症)は、睡眠後に特に明らかであり、通常、尿の色が黒く見える。PNHを有する被験体は、その血流中にも遊離ヘモグロビンを有する(ヘモグロビン血症)。溶血性貧血は、補体成分C5b-9(MAC)による赤血球の血管内溶解に起因するものである。赤血球および血小板の数が減少すると、嚥下障害、疲労、勃起障害、血栓症および反復性腹痛が引き起こされる。
【０１１５】
赤血球溶解  -  赤血球は無核細胞であり、ヘモグロビンの維持を担う。これらの細胞は、細胞表面由来のCD55およびCD59の非存在に起因してPNHにおいて補体攻撃を受けることが知られている。従って、これらの細胞は、血管外溶解によるC3bの沈着および除去を受ける。これらのCD59欠損細胞はまた、C5b-9の沈着および血管内溶解による赤血球除去も可能にする。溶解は、これらの赤血球からのヘモグロビンの放出をもたらし、溶血性貧血、従って、赤血球数の減少を引き起こし、それが一般には赤血球減少症を引き起こす。かくして、赤血球は、血管外溶解と血管内溶解の両方による除去を受ける。さらに、過剰の遊離ヘモグロビンは、腎臓損傷および鉄の全身喪失を引き起こし得る。ハプトグロビンは、遊離ヘモグロビンに結合し、結合したヘモグロビンの酵素的分解を容易にすることによってその状況を改善するのに役立つ。
【０１１６】
PNHおよび他の溶血性疾患と関連するものなどの病的な血管内溶血は、しばしば、ハプトグロビンを完全に枯渇させるのに十分に高い遊離ヘモグロビン濃度をもたらす。いったんハプトグロビンが枯渇したら、その後負荷が遊離ヘモグロビンを再吸収するように腎臓に課される。いったん腎臓がヘモグロビン再吸収に関するその限度容量に達したら、ヘモグロビン尿症が始まる。血管内溶血中の遊離ヘモグロビンの放出は、一酸化窒素(NO)の硝酸イオン(NO3-)への過剰の酸化をもたらす。NOの枯渇は、平滑筋収縮、血管収縮ならびに血小板の活性化および凝集の増強を引き起こす。また、血液中の過剰の遊離ヘモグロビンの全身的な結果は、腹痛、勃起障害、食道痙攣、および血栓症をもたらす。
【０１１７】
日常的な実験室試験として、一般に、血液塗抹標本を、RBC(赤血球)の形態学的異常性、網状赤血球数(RBC喪失に関する骨髄代償を決定するため)、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)、および遊離ヘモグロビンのレベル(溶血由来)を同定するように評価する。ビリルビン、ハプトグロビン、ヘモシデリン、および遊離ヘモグロビンの濃度は、溶血の程度を測定することができ、血管内溶血と血管外溶血とを区別するのに役立つ。RBC数、RBC(すなわち、細胞に結合した)ヘモグロビンのレベル、およびヘマトクリットが、任意の貧血および/または溶血性疾患の任意の他の関連する症状の程度を決定するためにしばしば評価される。乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)のレベルはまた、進行中の細胞死の程度に関するいくらかの情報を提供することができる。
【０１１８】
赤血球の溶解は、持続的な血管外および血管内溶血のため、誤った、一貫性のない結果を与えることがある。従って、溶解を受けない細胞が、PNH患者におけるクローンサイズを測定するためにより良好である。そのような例は、好中球および他の単核細胞である。
【０１１９】
転換酵素を積んだ赤血球  -  PNHにおいては、CD55を欠く赤血球はC3bを沈着する傾向がある。そのような細胞はC3bを有するだけでなく、C3転換酵素全体も有する。本発明の属の抗体は、C3b、C3bBb、PC3bBbの形成を防止し、従って、血管外および血管内溶血による赤血球の溶解を防止する。かくして、これらの抗体は、C3転換酵素とC5転換酵素の両方の形成を防止する。
【０１２０】
補体第2経路により産生されるC3bおよびC5b-9の形成を選択的に防止する本発明の抗体は、血管外および血管内溶血を阻害し、全ての貧血において利益が得られる。血小板溶解  -  血小板は無核であり、従って、補体第2経路による補体攻撃を受ける。赤血球と同様、血小板も同様の機序により破壊される。血小板の溶解は、血小板がその細胞表面上にCD55およびCD59を欠くPNH患者において起こる。血小板溶解は、血小板数の減少、従って、PNH患者における血液の血液凝固能力の低下を意味する。血小板数の減少は、限定されるものではないが、血小板因子4(PF4)、血小板由来増殖因子(PDGF)、ベータトロンボグロブリン、P-セレクチンなどの血小板内容物のレベルの増加をもたらす。これは、現在または将来報告される全ての内容が本発明の下に包含されることを含む。かくして、本発明の抗体は、血液障害を有する患者と関連する血小板減少症を減少させる。
【０１２１】
有核細胞の溶解  -  このカテゴリーに含まれるのは、好中球、単球、およびリンパ球などの細胞である。これらの細胞は、CD55/CD59陽性であることが知られており、近年ではPNHクローンを確立するための信頼性の高い細胞であると考えられてきた。しばしば、赤血球に関して示されたものよりも高いパーセンテージの白血球が、CD59を用いて検出される。赤血球は一般に、白血球と比較してより短い寿命を有する。有核細胞は溶解せず、従って、赤血球と比較してより長い持続期間にわたって血中に存在し、従って、PNHのより確立されたマーカーである。
【０１２２】
好中球はC3b受容体を担持し、従って、そのような分子に結合する。本発明者らは、好中球上でのC3b、プロパージン、およびBbの染色の増加を示し、これは、転換酵素がそのような細胞上で形成することを示す。本発明の抗体属の抗体は、古典的経路由来C3bではなく、補体第2経路由来C3転換酵素の形成を防止することができる。同様の知見は、全ての有核細胞上で認められた。ほぼ全ての有核細胞がC3bとC5b-9の両方で重度の染色を示すことに気付いたのは驚くべきことであった。これらの分子は両方とも、AP活性化の結果として細胞表面上に沈着する。
【０１２３】
有核および非有核細胞上でのC3bおよびC5b-9の形成および沈着を防止することが、提唱される本発明の意図するところである。AP特異的に選択された抗体は、経路の上流を阻害し、血管外および血管内での溶解および損傷を引き起こす両分子の沈着を防止する。C3bおよびC5b-9を積んだ場合、有核細胞は機能不全になり、認識され、それ自身の死に手を貸すことになる可能性が高い。死んだ細胞は、細胞死に特異的な染色により認識される。
【０１２４】
炎症におけるC3aおよびC5aの役割：赤血球の溶解をもたらす補体第2経路の連続的活性化のため、PNHにおいてはC3aおよびC5aのレベルの上昇が予測される。C3aおよびC5aは強力な炎症促進機能および免疫調節機能を有する。それらは血管透過性を増大させ、化学誘引物質として働き、軟組織の膨張を促進する。アナフィラトキシンは、好中球および単球を活性化し、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、およびIL-17[47〜50]などの炎症誘発性メディエーターの産生をもたらす。C5aは、好中球走化性、脱顆粒化、好中球エラスターゼ放出、およびスーパーオキシド生成を誘導する強力な走化性タンパク質である。好中球は、PNHなどの溶血性疾患における炎症および細胞溶解の多くの兆候を媒介するために産生される血管作動性、タンパク質分解性および細胞毒性物質の強力な宝庫を含有する。本発明の化合物は、有害な炎症、組織傷害、および細胞溶解を阻害する。
【０１２５】
輸血および抗補体抗体
-  患者の赤血球が少なすぎる場合(貧血)、血球輸血が与えられる。PNHにおける血液試験は、血管内溶血性貧血と一致する以下の変化を示す：低ヘモグロビン、乳酸デヒドロゲナーゼの上昇、網状赤血球(破壊された細胞を置き換えるために骨髄により放出される未熟な赤血球)の上昇、ビリルビン(ヘモグロビンの分解産物)の上昇、およびハプトグロビンレベルの低下。貧血は、虚弱および疲労を引き起こす。重篤な事例では、それは息切れまたは頻脈を引き起こし得る。輸血は通常、ヘモグロビンレベルが8グラム/デシリットル未満である場合に用いられる。時には、輸血の代わりに、体がより多くの赤血球を生産するのを助ける薬物である赤血球増殖因子を摂取してもよい。この増殖因子は、エリスロポエチン(Procrit(登録商標)、Epogen(登録商標)、Aransep(登録商標))と呼ばれる。別の無核細胞である血小板も、補体媒介性溶解に基づいて数が減少する。医師は血小板数を10,000〜20,000(立方ミリメートルあたり)より上に維持するために血小板輸血を処方する。輸血された血小板は、2〜3日しか持続しない。本発明の抗体は、添加された血小板を保持し、患者の身体により作られる血小板の破壊を防止することが見込まれる。
【０１２６】
白血球(顆粒球)輸血は稀である。これは、顆粒球が血流中では数時間しか持続しないためである。提供白血球は直ちに使用しなければならず、また長持ちしない。好中球/白血球の数を増加させるための一般的な例は、フィルグラスチム(Neupogen(登録商標))である。特許請求される属の抗体は、添加物により増加する細胞の損傷および溶解を防止するのに役立ち得る。
【０１２７】
一般に、血球減少症を防止するために、特許請求される属の抗体は、C3bの形成および沈着ならびにC5b-9の形成および沈着を防止することができ、AP由来部分の2つの主な機能は、それが添加物を含むか、または含まないかに拘らず、溶血性障害にとって重要である。
【０１２８】
PNHならびに他の溶血性疾患および状態における補体系活性化の役割
C3a、C5a、C3b、C5b、およびC5b-9のレベルの上昇は、疾患状態における活性化、炎症および溶血のレベルを正確に測定することができる。血液障害を含む補体関連障害の例としては、限定されるものではないが、劇症型抗リン脂質抗体症候群(CAPS)、c3bを増加させる寒冷凝集素症(CAD)、CD46、H因子、およびI因子を増加させる血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、C3およびC4が血小板上で検出される特発性血小板減少性紫斑病、異常なH因子が糸球体C3沈着の増加をもたらす血清病、内毒素血症、敗血症、c3bbb転換酵素の形成および補体調節因子に対する耐性が増強される非定型的溶血性尿毒素症候群(ahus)、C5抗体処置が血栓塞栓症の危険性を低下させることが示された発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)、敗血性ショック、c3bを上昇させる鎌状赤血球貧血、c5a、抗リン脂質を増加させる好酸球増加症候群、自己免疫性リンパ球増殖性症候群、c5b-9が活性化されるドゴー病、エバンス症候群、本態性混合型クリオグロブリン血症、ならびに赤芽球癆が挙げられる。「スクリーニング方法」(23頁を参照されたい)を用いて選択された本発明の抗体属の抗体は、局所損傷を防止することができ、疾患の全血モデルにおいて利益を示した。本発明の抗体は、血液炎症および細胞溶解および関連する疾病を防止する。
【０１２９】
古典的経路と補体第2経路のC3転換酵素とPNH
古典的経路と補体第2経路の両方のC3転換酵素は、中心的なC3の切断を担う。エクリズマブは、C5レベルでCPとAPの両方を阻害し、C3aとC3bの形成を阻害しない。いくつかの疾患状態においては過剰のC3aと過剰のC3bが両方とも実装されているため、これはエクリズマブの重大な欠点である。両方、またはいずれかの経路により産生されたC3bは、細胞を被覆し得る。次いで、これらの細胞は、オプソニン作用プロセスによって除去され得る。
【０１３０】
概念的には、CPではなく、APの阻害は、感染の場合、CPによるオプソニン作用にとって必要とされ得るC3bのCP依存的産生を可能にする。本発明の抗体属の抗体は、APのみを阻害する。それらはCPまたはCPの任意の増幅ループを阻害しない。C3bの阻害は、赤血球の血管外溶解(および有効な除去)を防止するために必須であるが、CP依存的C3bは宿主防御にとって必須である。PNHなどの疾患においては、問題となるのは古典的経路ではなく補体第2経路である。かくして、これらのタンパク質の過剰産生と闘うために、最良の処置は補体第2経路のみをブロックすることである。主題に関する現在の意見は、2つの経路が密接に接続されていること、およびCPを阻害することなくAPをブロックすることは不可能であり得るということである。本発明は、その現在の意見に対する挑戦を提示し、いかなる程度でもCPを阻害することなくAPをブロックするための方法を提供する。古典的経路をブロックするか、または有意に阻害する任意の処置は、感染と戦う身体の能力を脅かす。C3b産生は、感染性細菌などの望ましくない細胞の除去にとって必要である。従って、AP依存的C3bを阻害しながら、CP依存的C3bの産生を保持することが望ましく、また有利である。
【０１３１】
特許請求された属の抗体の選択および同定
古典的経路と補体第2経路の両方がC3aおよびC5aを産生するが、本発明は、APにより産生されたC3aおよびC5aを選択的に阻害する。等モル濃度のC3aおよびC3bがC3切断の結果として産生される。かくして、in vitroでのC3b形成の阻害を、本明細書に記載のアッセイにより証明することができる。C3bの形成は、C3aの同時的形成を証明する(逆も同様)。C3のC3bおよびC3aへの切断を阻害するように作用する、C3転換酵素複合体の成分を標的化する任意の抗体は、等しい尺度でC3bおよびC3aを阻害する。
【０１３２】
C3a産生の阻害はまた、C3aの活性の全てを阻害する。そのような活性としては、好中球、単球、血小板、好塩基球、およびTリンパ球のその後の活性化、ならびに炎症マーカーの産生が挙げられる(図13〜図18を参照されたい)。C3bはC3b受容体を介して細胞表面上に沈着する。C3bの沈着は、赤血球および他の溶血性疾患において病理学的転帰を引き起こす他の細胞のオプソニン作用/除去にとって必要である。
【０１３３】
米国特許第6,333,034号および第7,423,128号は、CPとAPの両方により媒介される補体活性化を阻害し、従って宿主防御が障害された抗体を特許請求している。これらの抗体は、抗体がプロパージンオリゴマーの形成を防止する方法において役割を果たす。プロパージンは、1型トロンボスポンジンリピートであり、1型トロンボスポンジンの6つのリピートからなる。これらの抗体は、プロパージンのC3bへの結合を阻害し、C3cの形成を防止する。C3bの切断は、C3cの形成をもたらす。かくして、これらの抗体は、C3bの切断を防止する。
【０１３４】
別の態様において、本発明の補体第2経路特異的抗体は、ヒトにおける補体第2経路タンパク質のレベルを低下させることなくそのタンパク質に結合することができる。
【０１３５】
治療抗体
図1を参照して、本発明者らは、CPとAPの両方が異なるものであり、接続されていないことを示す。CPは増幅ループを有し、CPとAPとを接続することが知られている。この略図は、本発明の属の抗体がどのように働くかのみを示すものであり、他の発明の抗体が働く方法を示すものではない。AP増幅は、上右手側に示され、PC3b、PC3bB、PC3bBbからなる。略図に見られるように、次いでPC3bBbは、C3を、Pに結合するより多くのC3bに切断して再びPC3bを形成することによってサイクルを持続させるように作用する。本明細書に記載のスクリーニング方法を用いて選択された抗体の適用は、この増幅ループの成分を特異的に標的化することによって古典的経路に影響することなく補体第2経路を完全に阻害する。これらの抗体は、古典的経路に影響することなく補体第2経路の増幅ループを防止する(図1の略図の左側に示される)。
【０１３６】
C3理論における経路の古い転換に基づいて、当業者であれば、古典的経路の任意の活性化が補体第2経路を誘発し、増殖させる効果を常に有することを予測したであろう。これは、2つの経路がC3の出発点で「重複」すると考えられているためである。この理論によれば、古典的経路により産生されたC3bは、AP増幅ループに参画する。本明細書に記載の方法を用いて選択された抗体の属は、AP増幅ループがさもなければ古典的経路により誘発されたかどうかに関係なく、補体第2経路を阻害するような方法で補体第2経路増幅ループの成分を特異的に標的化する。かくして、例えば、本明細書に記載の抗C3b抗体は、APのみを阻害し、CP増幅ループまたはCP増殖を阻害しない。
【０１３７】
「スクリーニング方法」：補体第2経路を阻害し、古典的補体経路を阻害せず、AP C3転換酵素の成分に特異的である抗体の選択
C3b、P、BaおよびBbなどの、補体第2経路(CP増幅ループの一部であろうと、補体第2経路自体であろうと)に属する補体タンパク質に特異的な抗体を、本明細書に記載の「スクリーニング方法」を用いてスクリーニングして、CPまたはCPの増幅ループに影響することなく補体第2経路を阻害する抗体を選択することができる。C3b、P、BaおよびBbは、それぞれ、210K、50K、33Kおよび66Kの分子量の大きなタンパク質である。当業者であれば、これらのタンパク質のそれぞれに対する何百万の抗体を生成することができる。ある標的に対する抗体の産生は、それ自体、特定の治療機能を有するものとしてこれらの抗体のさらなる選択を行わなければ無意味である。
【０１３８】
いくつかの実施形態においては、「スクリーニング方法」は、2段階のスクリーニングプロセスを含んでもよい。第1段階は、AP型抗体(APを特異的に阻害する抗体)を同定するための3つの連続的スクリーニングアッセイを用いる。選択プロセスは、機能において類似するが、様々な抗原に対して標的化される補体第2経路特異的抗体の同定をもたらす。これらの選択された抗体は、それらが結合する標的またはそれらが生じた動物の種に基づいて区別することはできない。配列決定の際に、そのような抗体は大きく異なるCDR群(抗原への結合に関与する領域)を有することが明らかである。これらの抗体の機能、および最終的な治療的価値を、その配列のみによって定義することはできない。本明細書に記載の「スクリーニング方法」は、所望の機能および効果を有する、プロパージン(P)、C3b因子(C3b)、および/またはB因子(Ba、またはBb)に対する抗体の属を同定および定義することができる。
【０１３９】
A1)ステップ1：機能に基づく選択
3つの異なる型の抗体を、特異的アッセイを用いて同定することができる。この抗体は、CP型、CP/AP型、およびAP型と呼ぶことができ、以下のように定義される。
【０１４０】
CP型：これらのものは補体第2経路ではなく、古典的経路を阻害する。
【０１４１】
CP/AP型：これらのものは古典的経路と補体第2経路の両方を阻害する。
【０１４２】
AP型：これらのものは古典的経路ではなく補体第2経路を阻害する。
【０１４３】
これらの3つの異なる型の補体阻害抗体の同定は、3つの異なるアッセイ；CPのみのアッセイ、CPアッセイとAPアッセイとの組合せ、およびAPのみのアッセイを用いて達成される。
【０１４４】
CP型
古典的経路活性化のために、抗体感作ヒツジ細胞を、Ca2+/Mg2+の存在下、1%正常ヒト血清中でアクチベーターとして用いる。カルシウムイオンは、C1q/C1r/s複合体の最初の誘発因子のための古典的経路の活性化にとって必要である。CPはカルシウムイオンの非存在下では起こらない。Mg2+は補体第2経路活性化にとって必要である。Ca2+/Mg2+を含有する1%正常ヒト血清中では、CPだけが完了まで進行する。10%である必要なレベルのNHSがなければ、補体第2経路は有意な存在を有さない。図2、アッセイ-1は、CP活性化が抗体感作ヒツジ赤血球の溶解をもたらすことを示す。抗体に結合したsRBCは、古典的経路のための誘発因子として作用する。観察されたCP活性は、Ca2+およびMg2+を含有する1%バッファー溶液を用いることによりAP活性から単離される。図6はまた、選択された抗体がいずれも、古典的経路状態では1%ヒト血清中のsRBCのCP媒介性溶血を実質的に阻害しないことを示す。
【０１４５】
CP/AP型
古典的経路活性化のために、補体第2経路の増幅ループと共に、抗体感作ヒツジ赤血球を、正常ヒト血清中、10%Ca2+/Mg2+中でアクチベーターとして用いる。CP型抗体を同定するために用いられるアッセイと、AP/CP型抗体を同定するために用いられるアッセイとの差異は、CP/AP型において10%である正常ヒト血清の濃度である。AP/CP型抗体の同定において用いられるCa2+/Mg2+の濃度は、AP活性化にとって必要とされるMg2+のレベルを提供することにより、CPとAPの両方を活性にすることができる。抗体感作sRBCのみが、CPを活性化する。それらは、それ自体では、補体第2経路を活性化しない。しかしながら、十分なNHSの存在下では、活性化されたCPはAPの増幅ループを利用する。かくして、アッセイ系は、両方の経路が活性である条件下で補体阻害剤の性能を評価するために設計される(図3、アッセイ2および図4、パネルB)。これらの条件下では、古典的経路により産生されるC3bは、補体第2経路に流入し、補体第2経路の「補体第2経路ループの増幅」を引き起こし、間接的に誘発因子として働くことができる。換言すれば、APは、CPにより活性化されている。APのCPにより開始した活性化を防止する抗体が、(R Gupta-Bansal, J B Parent, K R Brunden, Molecular immunology. 37(5):191-201)に記載されている。これらの抗体は、これらのアッセイにおいてヒツジ赤血球の溶血を減少させた。しかしながら、「スクリーニング方法」におけるこの段階で、抗体は、それらがプロセスをどのように(およびどこで)阻害するかに応じてまだ区別されていない。CPの任意の段階を阻害することによりAPの古典的経路の活性化を阻害する抗体は、選択された抗体の属に含まれない。従って、古典的経路により開始された補体第2経路の増幅を阻害する抗体は、選択された抗体の属から除外された。
【０１４６】
AP型
ウサギRBC(rRBC)を用いて、Mg2+の存在下およびCa2+の非存在下、10%正常ヒト血清中でAPを活性化する。CPはCa2+の存在を必要とするため、古典的経路はこれらの条件下で活性ではない。かくして、Mg2+中の10%NHS中では、APのみが完了まで進行する。図2、アッセイ-3に示されるように、AP活性化はrRBCの細胞溶解をもたらす。このアッセイは、補体第2経路が、活性な古典的経路機能の非存在下で、活性化され、完了まで進行できることを立証することに留意すべきである。APは進行するために古典的経路による開始を必要としない。図4は、本発明の属の抗体が10%正常ヒト血清中でのrRBCのAP依存的溶血を阻害することを明確に示すものである。
【０１４７】
AP活性化および進行に対する抗体の効果が、独立型プロセスとしてのAPと共に、単独で観察される場合、得られる情報は、CPとAPの両方が活性である状態での抗体の効果の観察から得られる情報と異なる。ここで得られる情報はまた、CPのみが活性である状態での抗体の効果の観察から得られる情報とも異なる。
【０１４８】
3つのアッセイの解析
これらの3つのアッセイの1つにおける特定の抗体の存在が溶血の割合を低下させることがわかった場合、その抗体はそのアッセイにおいて活性であった経路、または複数の経路を阻害すると結論付けられた。かくして、例えば、ある抗体が3つ全てのアッセイにおいて溶血を減少させることがわかった場合、その抗体はAPとCPの両方を阻害すると結論付けられた(CP/AP型)。ある抗体が1%ヒト血清(Ca2+/Mg2+バッファーを含む)を含有するアッセイにおいてのみ溶血を阻害することがわかった場合、その抗体はAPではなくCPを阻害すると結論付けられた(CP型)。ある抗体が10%ヒト血清およびMg2+(Ca2+ではなく)を含有するアッセイにおいてのみ溶血を阻害することがわかった場合、その抗体はCPではなくAPを阻害すると結論付けられた。
【０１４９】
これは、「スクリーニング方法」の第1段階である。これらの選択基準を通過する抗体は、1)補体第2経路が単独で活性である(すなわち、古典的経路の同時的活性化がない)条件下で補体第2経路を阻害する、および2)CP活性に対する効果がない(単独で、またはAP活性と同時の場合)ことが示された。
【０１５０】
本発明は、AP型抗体を第1に同定するためにこのアッセイの組合せを用いる。しかしながら、選択された属の抗体を同定するためには、さらなるスクリーニングステップが必要である。これらのアッセイはAPおよびCPの上流と下流の両方の部分において抗体を同定するため、さらなるスクリーニングが必要である。
【０１５１】
A2)ステップ2：C3転換酵素形成に対して作用するAP型抗体の選択
「スクリーニング方法」の第2のステップは、どのAP型抗体がAP C3転換酵素の機能的活性のみを阻害するかを同定することである。換言すれば、このステップは、APの増幅ループにおいて、「下流」よりもむしろ、補体第2経路系の「上流」で作用するAP型抗体を同定する。
【０１５２】
このステップは、固相ELISAに基づく結合アッセイを最初に確立することによって達成される。このアッセイにより、補体第2経路により産生されるC3bおよびC5b-9の直接的検出が可能になる。これらのタンパク質の検出は、補体第2経路の初期成分(C3b)および後期成分(C5b-9)を表す。抗体がC3bではなくC5b-9の産生を阻害する場合、それはAPのC5転換酵素に対して作用している可能性が高い。対照的に、C3b産生は、C3転換酵素の活性を阻害する抗体によって阻害される。C3b産生の阻害は、C5b-9の産生も阻害する(C5b-9はC3bの下流で産生されるため)。かくして、「スクリーニング方法」の第2段階は、C5転換酵素(下流)を阻害する抗体からC3転換酵素(上流)を阻害する抗体を分離する。
【０１５３】
「スクリーニング方法」により、AP C3転換酵素を選択的に阻害する抗体が同定された。この選択段階は、Mg++の存在下、10%でのヒト血清をLPSコーティング上でインキュベートさせるアッセイを利用する。LPSは、補体第2経路の特異的アクチベーターであり、AP由来C3転換酵素およびC5転換酵素の形成を可能にし得る。図6に示されるように、選択された属の抗体は、補体第2経路増幅ループの中心的な成分であるC3bの形成を防止する。図7は、それらがC5b-9の形成も阻害することを示す。
【０１５４】
この段階の選択プロセスの結論において、AP依存的細胞溶解およびC3b形成(図6)を防止する抗体は、選択された属の抗体のメンバーであるとして選択される。これらの抗体は、それらが全て、1)古典的経路を阻害することなく補体第2経路を選択的に阻害する(図2、4および5)、ならびに2)APの上流の成分であるC3転換酵素形成に対して作用することにより、補体第2経路依存的C3b形成を阻害する、という事実によって定義される。
【０１５５】
図10および図11は、選択された属の抗体が、それぞれ、補体タンパク質C3aおよびC5aの形成を阻害することを示す。
【０１５６】
選択された属の抗体
「スクリーニング方法」の適用は、これまで、選択された属の抗体からいくつかの抗体を産生してきた。
【０１５７】
標的タンパク質としてのC3b
マウス抗ヒトC3b(抗C3b)抗体
C3bは、大きなタンパク質であり、従って、このタンパク質の様々なセグメントに対して複数の抗体を産生することができる。抗体が任意の様々な方法でタンパク質に結合し、その活性を阻害し得る複数の部位が存在する。抗体がC3bに結合する方法および場所に応じて、その抗体の効果は取るに足りないものから完全な阻害までの範囲であり得る。マウスにヒトC3bを注射すると、ヒトC3bタンパク質に対する多数のマウス抗体の産生が得られる。
【０１５８】
選択された属の抗体は、C3bとB因子との相互作用を防止するような方法でC3bに結合するものを含む。そのような相互作用は古典的経路内には存在しないため、これらの抗体の効果は、補体第2経路に必然的に分離される。これらの抗体は、疾患の開始および進行を引き起こす病理学的転帰にとって重要なC3a/C3b、C5a/C5b、およびC5b-9/sC5b-9の形成を防止する。補体第2経路による、これらの分子のそれぞれの形成の阻害は、有意な生理学的結果を有する。補体第2経路により産生されたC3b(本明細書では「aC3b」と呼ばれる)の阻害は、赤血球の血管外溶血に影響する。古典的経路により産生されたC3bは、これらの抗体によって阻害されず、従って、CPにより産生されたC3b(本明細書で「cC3b」と呼ばれる)で被覆された外来粒子/細菌のオプソニン化にとって必要である。かくして、選択された属の抗体は、これを一般的な機能として有するそのような抗体によって、cC3bではなくaC3bの形成を防止する。C3a形成の阻害は、単球活性化および検証された炎症マーカーであるTNF-αの産生に対する直接的な影響を及ぼす。
【０１５９】
標的タンパク質としてのプロパージン
C3bと同様、プロパージンは抗体が結合することができる多くの潜在的な部位を有する大きなタンパク質である。プロパージンタンパク質に異なる方法で、および/またはその異なる部位に結合する様々な抗体は、古典的経路または補体第2経路のいずれかの増幅ループを阻害する。プロパージンは、古典的経路の増幅ループの一部であることが知られている。かくして、増幅ループを阻害する特異的抗プロパージン抗体の使用により、古典的経路活性化を弱めることができる(米国特許第6,333,034号)。いくつかの抗体は、古典的経路内での、プロパージンとC3bとの相互作用が古典的経路増幅にとって重要である古典的経路活性化を阻害することができる(米国特許第6,333,034号)。
【０１６０】
プロパージンは、それ自身に結合し、凝集体を生成する。凝集体の構成に応じて、プロパージンに結合する抗体は、モノマー、ダイマー、トリマーおよびテトラマーに結合し、それぞれ異なる応答を生成することができる。かくして、抗体とプロパージンの比は、1:1、1:2、1:3、および1:4であってもよい。これは、抗体が任意の構成で結合してもよいことを意味する。アッセイを用いて、それらがプロパージンに結合する比により、効力に応じた順序で抗体を分離することができる。換言すれば、1:1の比で結合する抗体を、1:2の比、1:3の比および1:4の比で結合する抗体から分離することができる。1:1の結合比は、抗体結合が1つのアームによるものであり、2つのアームによるものではないことを示す。そのような抗体は、抗体がFab(一価)またはIgG(二価)であるかどうかに関係なく1:1の結合比を示す。
【０１６１】
プロパージンは、AP活性化に直接関与するが、古典的経路活性化にはin vivoで増幅ループを介して間接的に関与する。また、プロパージンはC3bとC5bの両方に結合する。プロパージンとC3bとの相互作用を破壊する抗体は、プロパージンとC5bとの相互作用を遮断しても、またはしなくてもよい(逆も同様)。一方または両方を防止する抗体は、臨床有意性を識別することができる。
【０１６２】
かくして、プロパージンを標的とするいくつかの抗体は、a)古典的経路と補体第2経路の両方を阻害するか、またはb)補体第2経路のみを阻害する。選択された属の抗体は、特に、CPではなく、APのみを阻害するような方法でプロパージンに対して作用した、プロパージンを標的とする抗体のみを含む。
【０１６３】
マウス由来抗ヒトP(抗P)抗体
タンパク質プロパージン(P)は、約50,000の分子量を有する大きなタンパク質である。この大きなタンパク質の様々なタンパク質モチーフに対する複数の抗体を産生することができる。これらの抗体の全てが、または多くでさえ、治療的価値を有するとは限らない。最適な治療的価値を有する、適切な抗体、または複数の抗体の同定および選択が重要である。
【０１６４】
連続スクリーニング方法の特許で守られた組合せを用いて、2つのマウス抗ヒトP抗体が選択された。「スクリーニング方法」により、本発明者は、1)ヒトプロパージンに結合する、2)補体第2経路の活性のみを選択的に阻害する、および3)古典的経路の増幅ループを破壊しないような方法で補体第2経路を遮断する抗体を同定することができた。これらの抗体は、標的抗原としてプロパージンに結合する。そして、それらはP(C3b)n、PC3bBおよびPC3bBb、ならびに同じ方向でさらに進めると、(Bb)nおよびC3bBbの形成を阻害するような方法でそうする。これらの特定の複合体の阻害は、選択された属の全ての抗体の本質的かつ決定的な共通の特徴の1つである。これらの複合体の形成の防止において、これらの抗体は全て、C3b、C5a、C5b、およびC5b-9、ならびにTNF-α、IL-1の補体第2経路による産生を防止する。
【０１６５】
ウサギ由来抗ヒトP(抗P)抗体
「スクリーニング方法」(抗ヒトPマウス抗体を選択するために用いられたのと同じ)を用いて、3つのウサギ抗ヒトP抗体が選択された。図2に見られるように、これらの抗体は、カルシウムを欠くバッファー中の正常ヒト血清(NHS)中でのウサギ赤血球(rRBC)の補体第2経路依存的溶解を阻害し、従って、古典的補体経路からの寄与は存在しない。そうすることにおいて、これらの抗体の効果は、古典的経路と重複しない補体第2経路のセクションに標的化、分離される。これらの抗体は、C3a、C3b、C5a、C5b、およびC5b-9の形成を防止する。これらの特異的タンパク質の形成は、正常な免疫系のプロセスが病理学的状態の起源になり得る補体第2経路における重要なステップである。それは、しばしば関節炎状態を引き起こす補体第2経路からのこれらのタンパク質の過剰産生である。
【０１６６】
ウサギにおいて生成される選択された補体第2経路特異的抗ヒトP抗体は、マウスモデルに由来するものと効果において類似する。マウスおよびウサギ由来抗体は両方とも、「スクリーニング方法」を用いて選択されたため、それらは効果において類似する。それらはC3a、C3b、C5a、C5b、およびC5b-9の形成を阻害し；それにより、単球、好中球、血小板の活性化、およびTNF-α(炎症においても鍵となる役割を果たす)の形成を阻害する。
【０１６７】
これらの抗プロパージンウサギ抗体の配列は、以下に記載の表に示されるように、非常に異なっている。従って、タンパク質配列のみを見て、プロパージンに対するその効果の理解を得られるとは限らない。「スクリーニング方法」を用いて試験されない限り、所与の抗体が選択された属の抗体に属するかどうかを決定することは困難である。従って、選択された属の抗体を、特定のアミノ酸配列によって定義することはできない。むしろ、その属は、1)CPの任意の機能を破壊することなくAP活性化を選択的に阻害する、および2)CPから単離され、C3a、C3b、C5a、C5b、およびC5b-9のAPによる産生を担う、APの特定の部分に対して作用する、そのメンバー抗体の能力によって定義される。
【０１６８】
標的タンパク質としてのBa
マウス由来抗ヒトBa(抗Ba)抗体
タンパク質Ba(B因子から切断される)は、約33,000の分子量を有する大きなタンパク質である。かくして、プロパージンおよびC3bのように、このタンパク質の様々なモチーフ、およびタンパク質上の位置に対する任意の多数の抗体を産生することができる。このタンパク質に関して、APの他のタンパク質と同様、本発明は、疾患の病理学的進行にとって必要とされるC3a、C3b、C5a、C5b、およびC5b-9の形成を阻害するような方法で前記タンパク質に結合する選択された属の抗体である。
【０１６９】
図2に見られるように、これらの抗体は、カルシウムを欠くバッファー中の正常ヒト血清(NHS)中でのウサギ赤血球(rRBC)の補体第2経路依存的溶解を阻害する。古典的経路は、カルシウムを欠くバッファー中では機能することができない。かくして、これらの条件では、古典的補体経路からの寄与はない。そのような条件により、古典的経路の完全な非存在下、補体第2経路上に有するこれらの抗体の効果を観察することができる。これらの条件下での抗体の観察は、本発明の抗体を同定する「スクリーニング方法」の1ステップである。
【０１７０】
これらの抗補体第2経路抗体の配列決定は、非常に異なる。かくして、ここで再び、本発明者らは、選択された属の抗体を特定のアミノ酸配列によって定義することはできないことを観察する。むしろ、前記属は、「スクリーニング方法」により選択されたものによって定義される。
【０１７１】
標的タンパク質としてのBb
マウス由来抗ヒトBb(抗Bb)抗体
タンパク質Bb(B因子の切断産物)は、約64,000の分子量を有する大きなタンパク質である。かくして、再度、本発明者らは、いくつかの抗体をこのタンパク質の様々なタンパク質モチーフに対して産生することができることを見出す。再度、本発明者らは、所望の効果を有する抗体のみを産生するために「スクリーニング方法」を適用する。
【０１７２】
マウス抗ヒトBb抗体を、Bb因子に対して生じさせたが、従って、それらは抗体のBa断片には結合しない。これらのモノクローナル抗体もまた、「スクリーニング方法」を用いて選択した。それらは標的抗原としてBbおよびB因子には結合するが、Baには結合しない。選択された抗ヒトBb抗体は、選択された抗C3b、抗P、抗Ba抗体に特徴的な特徴を共有する。選択された属の抗体に由来する全ての抗体と同様、これらの抗ヒトBb抗体は、補体第2経路によりC3a、C3b、C5a、C5b、およびC5b-9の形成を防止する。そうすることにおいて、これらの抗体は、TNF-α、IL-1などの周知の炎症マーカーの形成も防止する。
【０１７３】
ウサギ由来抗ヒトBb(抗Bb)抗体
3つのウサギ抗ヒトBb抗体を、「スクリーニング方法」を用いて選択した。Bbに結合する選択された属の抗体のメンバーも、Baに結合しない。B因子は、古典的補体経路ではなく補体第2経路の不可欠な成分である。「スクリーニング方法」を生き残るヒトBbに結合する抗体は、補体第2経路の増殖にとって重要な複合体；C3bB、PC3bB、C3bBb、PC3bBb、P(C3)n(Bb)nの形成を防止する。本発明の全ての抗体と同様、それらはC3b、C3a、C5b、C5a、およびC5b-9のAPにより誘導される形成を防止し、古典的経路と共有されない連結点でAPを阻害する。これらの分子のそれぞれの形成の阻害は、生理学的結果を有する。C3b(aC3b)の阻害は、血管外溶血に影響する。C3aおよびC5aの阻害は、細胞活性化および炎症メディエーターのその後の放出に影響する。炎症メディエーターは、過剰産生された場合、ヒトにおいて任意数の疾患病理を引き起こし得る。
【０１７４】
選択された属の他の抗体と同様、これらのウサギ抗Bb抗体の配列は、非常に異なる。従って、タンパク質配列のみを見ても、そのような抗体が所望の効果を有するかどうかを予測することはできない。
【０１７５】
表1および表2は、本明細書に記載の「スクリーニング方法」を用いて選択された抗C3b、抗P、抗Ba、および抗Bb抗体の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を列挙する。これらの表は、抗体の重鎖および軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3ならびにそれぞれのフレームワークを特定する。従って、本明細書に記載の出願の態様は、(a)それぞれの抗体のCDR1、CDR2およびCDR3を含む重鎖可変領域；ならびに(b)それぞれの抗体のCDR1、CDR2およびCDR3を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分に関する。本明細書に記載の他の実施形態は、表1および表2に記載のVHおよびVL配列と同じエピトープに結合する抗体に関する。
【０１７６】
【表１】
2015532303.tif 000003
【０１７７】
【表２】
2015532303.tif 000004
【０１７８】
他の実施形態においては、本明細書に記載の抗体は、本明細書に記載の好ましい抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖可変領域を含んでもよく、ここで前記抗体は所望の機能的特性を保持する。例えば、本発明は、(a)重鎖可変領域が、それぞれの抗体について表1に列挙された重鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含む；(b)軽鎖可変領域が、それぞれの抗体について表2に列挙された軽鎖可変領域のアミノ酸配列と少なくとも80%相同であるアミノ酸配列を含む；および(c)抗体が、それぞれのタンパク質、C3b、P、Ba、またはBbに特異的に結合する、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【０１７９】
様々な態様において、抗体は、例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であってよい。他の態様において、VHおよび/またはVLアミノ酸配列は、上記の配列と85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%相同であってもよい。上記の配列のVHおよびVL領域に対する高い(すなわち、80%以上)相同性を有するVHおよびVL領域を有する抗体を、アミノ酸配列をコードする核酸分子の突然変異誘発(例えば、部位特異的またはPCR媒介性突然変異誘発)、次いで、本明細書に記載の機能的アッセイを用いた保持された機能についてコードされた変化した抗体の試験により取得することができる。
【０１８０】
本明細書で用いられる場合、2つのアミノ酸配列間の相同性パーセントは、2つの配列間の同一性パーセントと同等である。2つの配列間の同一性パーセントは、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数、およびそれぞれのギャップの長さを考慮に入れた、配列により共有される同一の位置の数の関数(すなわち、相同性% = 同一の位置数/位置の総数x100)である。配列の比較および2つの配列間の同一性パーセントの決定を、以下の非限定例に記載されるように、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。
【０１８１】
特定の態様においては、本発明の抗体は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域と、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域とを含んでもよく、これらのCDR配列の1つ以上は本明細書に記載の好ましい抗体に基づく特定のアミノ酸配列、またはその保存的改変を含み、前記抗体は所望の機能的特性を保持する。従って、本発明は、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む重鎖可変領域と、CDR1、CDR2およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域とを含む、単離されたモノクローナル抗体、またはその抗原結合部分を提供する。
【０１８２】
本明細書で用いられる用語「保存的配列改変」は、そのアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に有意に影響しない、またはそれを変化させないアミノ酸改変を指すことが意図される。そのような保存的改変は、アミノ酸置換、付加、および欠失を包含する。部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介性突然変異誘発などの、当業界で公知の標準的な技術により、本発明の抗体に改変を導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似する側鎖を有するアミノ酸残基と置き換えられるものである。類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当業界で定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン)、ベータ-分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン)および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が挙げられる。かくして、本発明の抗体のCDR領域内の1つ以上のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーに由来する他のアミノ酸残基と置き換え、本明細書に記載の機能的アッセイを用いて、保持された機能(すなわち、上記の(c)〜(j)に記載の機能)について変化した抗体を試験することができる。
【０１８３】
本発明の抗体を、出発抗体から変化した特性を有してもよい改変抗体を遺伝子操作するための出発材料として本明細書に開示される1つ以上のVHおよび/VL配列を有する抗体を用いてさらに調製することができる。一方または両方の可変領域(すなわち、VHおよび/またはVL)内、例えば、1つ以上のCDR領域内および/または1つ以上のフレームワーク領域内の1つ以上の残基を改変することにより、抗体を遺伝子操作することができる。さらに、またはあるいは、例えば、抗体のエフェクター機能を変化させるために、定常領域内の残基を改変することにより、抗体を遺伝子操作することができる。
【０１８４】
実施することができる1つの型の可変領域遺伝子操作は、CDR移植である。抗体は、主に6つの重鎖および軽鎖相補性決定領域(CDR)中に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。この理由から、CDR内のアミノ酸配列は、CDRの外側の配列よりも個々の抗体間でより多様である。CDR配列は大部分の抗体-抗原相互作用を担うため、異なる特性を有する異なる抗体からフレームワーク配列上に移植された特定の天然抗体に由来するCDR配列を含む発現ベクターを構築することにより、特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることができる。かくして、そのような抗体は、表に記載されたVHおよびVL CDR配列を含有し、さらにこれらの抗体に由来する異なるフレームワーク配列を含有してもよい。
【０１８５】
別の型の可変領域改変は、VHおよび/またはVKCDR1、CDR2および/またはCDR3領域内のアミノ酸残基を突然変異させることによって、目的の抗体の1つ以上の結合特性(例えば、親和性)を改善することである。部位特異的突然変異誘発またはPCR媒介性突然変異誘発を実施して、突然変異を導入し、抗体結合に対する効果、または目的の他の機能的特性を、本明細書に記載され、実施例に提供されるin vitroまたはin vivoアッセイにおいて評価することができる。保存的改変(上記で考察されたもの)が導入される。突然変異はアミノ酸置換、付加または欠失であってもよいが、好ましくは置換である。さらに、典型的には、CDR領域内の1、2、3、4または5個以下の残基を変化させる。
【０１８６】
一般に、一度選択されたら、治療抗体は、様々な異なる理由から様々な方法で操作する、変化させる、および遺伝子操作することができる。例えば、選択された抗体の不活性(非結合)部分を、抗体の決定的な機能を全く変化させない数え切れない方法で変化させ、操作することができる。事実、抗体の機能的(タンパク質結合部分)を、残りの抗体から完全に切断することができる。これらの変化は、抗体をより容易に、または低費用に製造することができるようにするための有用性を有してもよい。また、そのような変化は、抗体をヒト被験者においてより化学的に安定にしてもよい。選択された抗体のこれらの操作および誘導体化は、新規な、または別の発明ではない。従って、属自体の同じ決定的な特徴を利用する選択された属の抗体の任意のそのような操作、変更および誘導体化は、本発明の範囲内にある。
【０１８７】
本発明は、選択された属の抗体のいずれか1つまたはいくつかの機能的(標的タンパク質結合)成分を構成する化合物、ならびにそのような化合物の治療的使用を含む。これらの化合物としては、限定されるものではないが、選択された属の全抗体、選択された属の抗体の抗原結合断片、および選択された属の抗体から誘導される任意の抗体または抗体断片のキメラまたはヒト化発現(manifestation)が挙げられる。本発明のそのような誘導体化は、限定されるものではないが、選択された属の任意の抗体から発現させることができるトランケート型、線状、一本鎖、IgG断片、F(ab)断片、F(ab')断片、F(ab)2断片、F(ab')2断片、Fv断片またはscFv断片を含んでもよい。
【０１８８】
本発明は、抗体属の任意のメンバーのFc領域が297位で突然変異されて無グリコシル化抗体を生成する結果を含む。本発明は、選択された属の任意の抗体がFc媒介性エフェクター機能の低下を惹起するように遺伝子操作される結果を含む。遺伝子操作の方法は、限定されるものではないが、アミノ酸突然変異、アミノ酸付加もしくは欠失、グリカン改変もしくは除去、PEG化、および/またはトランケーションを含んでもよい。
【０１８９】
投与方法
本発明は、被験体に、有効量の本発明の属の抗体の実施形態を投与することを含む治療方法を提供する。被験体は動物(ウシ、ブタ、ラット、またはサルなどの哺乳動物)であってもよいが、好ましくはヒトである。様々な送達系が公知であり、本発明の実施形態(例えば、リポソーム中へのカプセル封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することができる組換え細胞、受容体媒介性エンドサイトーシス、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築など)を投与するために用いることができる。導入方法は、腸内または非経口であってもよく、限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、および経口経路が挙げられる。前記化合物を、任意の都合のよい経路により、例えば、輸注またはボーラス注射により、上皮または皮膚粘膜系列(例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など)を介する吸収により投与することができ、他の生物活性剤と一緒に投与してもよい。投与は、全身または局所であってもよい。投与は、急性的もしくは慢性的(例えば、毎日、毎週、毎月など)、または他の薬剤と一緒であってもよい。
【０１９０】
用量
本発明の属の抗体、および/またはその任意の機能的誘導体の投与は、当業界で公知の任意の方法によるものであってもよい。そのような投与は、皮下、関節内、筋肉内、皮内、腹腔内、静脈内、鼻内、または経口投与経路によるものであってもよい。1つの好ましい実施形態においては、抗体は皮下注射または静脈内注射により投与される。特定の実施形態においては、抗体は皮下注射により投与される。
【０１９１】
一実施形態においては、投与されるAP抗体の量は、0.3mg/kg〜30mg/kgの用量範囲にある。より特定の実施形態においては、AP抗体は、0.5mg/kg〜10mg/kgの範囲で1日1回投与される。別の実施形態においては、AP抗体は、週に少なくとも1回、0.3mg/kg〜30mg/kgの用量範囲で投与される。さらに別の実施形態においては、AP抗体は、少なくとも月に1回、0.3mg/kg〜30mg/kgの用量範囲で投与される。かくして、AP阻害プロファイルに応じて、投与レジメンを選択することができる。
【０１９２】
製剤
前記化合物を、製薬上許容し得る賦形剤を含む製剤中で個体に投与することができる。様々な製薬上許容し得る賦形剤が当業界で公知であり、本明細書で詳細に議論する必要はない。
【０１９３】
前記化合物を、治療的投与のための様々な製剤中に含有させることができる。一例においては、主題の化合物を、適切な製薬上許容し得る担体または希釈剤と組合わせることにより医薬組成物中に製剤化し、錠剤、カプセル剤、粉末剤、顆粒剤、軟膏、溶液、坐剤、注射、吸入剤およびエアロゾル剤などの、固体、半固体、液体または気体形態で調製物中に製剤化することができる。
【０１９４】
また、皮下、腹腔内、静脈内、および関節内投与のために製剤を開発することもできる。
【０１９５】
投薬スケジュール
本発明の化合物を、所望の治療効果を達成するために、特定の頻度で、一定の時間にわたって個体に投与することができる。例えば、本発明の抗体を、例えば、月に1回、月に2回、月に3回、1週間おきに(qow)、週に1回(qw)、週に2回(biw)、週に3回(tiw)、週に4回、週に5回、週に6回、1日おきに(qod)、毎日(qd)、1日2回(qid)、または1日3回(tid)、または実質的に連続的に、または連続的に、約1日〜約1週間、約2週間〜約4週間、約1ヶ月〜約2ヶ月、約2ヶ月〜約4ヶ月、約4ヶ月〜約6ヶ月、またはそれ以上の範囲の期間にわたって投与することができる。
【０１９６】
溶血性疾患における補体第2経路(AP)依存的炎症を阻害するAP特異的抗体
全血における補体第2経路  -  炎症モデル
好中球、単球、および血小板のC3a/C5a産生および活性化と、一連の炎症性サイトカイン、プロテアーゼ、および過酸化物の放出との間には直接的な関係がある。このモデルでは、健康なドナーからの全血を、刺激源として接触によるAP活性化にかける。アナフィラトキシン産生、細胞活性化および炎症性サイトカインの測定値を、本発明の抗体の存在下および非存在下で決定した。細胞の活性化は、凝集体形成、および血球減少症を引き起こす循環からの最終的な除去と関連する。本発明のAP抗体は、活性化および血球減少症の防止に対する調節効果を有することが示される。
【０１９７】
in vivoでの補体第2経路の活性化の効果を証明するために、ex vivoでの全血炎症モデルを用いた。このモデルは、炎症応答の開始および持続に関与する細胞によって示されるものと類似する効果をもたらす。全血系は、補体第2経路活性化の最終結果である最終的な炎症応答を実行するのを担う補体タンパク質および細胞の完全なアレイを含有する。補体第2経路は、血漿と、ポリプロピレン管の人工表面との接触により全血中で誘発される。血漿の空気への単純な曝露でさえ、AP活性化、ならびに得られる細胞活性化および炎症メディエーターの放出を誘発し得る。このモデルでは、人工系における血液循環は、補体アナフィラトキシン、活性化された細胞、ならびにTNF-αおよびIL-1などの炎症メディエーターを生成する。複数の分析により、VEGF、IL-1、IL-17、およびいくつかのマクロファージ由来サイトカインなどのサイトカインの産生がさらに示された。in vitroでのこれらの効果は、そのような成分のレベルの上昇が血中または局所組織レベルで見出される場合、疾患転帰を予測することができる。
【０１９８】
抗C3b、抗Ba、抗Bb、および抗P抗体は、TNF-αの形成を下方調節する能力を有し、従って、関節炎状態の発症および進行を防止する。TNF-αの減少の治療的価値は、当業者には公知の現象である。しかしながら、以前に考察された通り、当業者であっても、補体第2経路中の所与のタンパク質に対する任意の所与の抗体を用いる転帰を予測することはできない。全ての抗C3b抗体が治療効果を有するわけではない。2ステップのプロセスを用いて選択されない限り、同じことは、抗Ba、抗Bbおよび抗P抗体にも当てはまる。
【０１９９】
AP特異的抗体およびヒトにおける細胞溶解/炎症
本発明の属の抗体を開発するプロセス、ならびに得られた属の抗体に加えて、本発明はさらに、溶血性障害における細胞溶解、細胞損傷、および炎症を治療する方法からなる。この方法は、罹患した被験体に、本発明の属の抗体のいずれかのメンバーである、および/またはそのような抗体から誘導され、本発明の属の抗体に由来する任意の抗体と同じAP阻害特性を利用する治療上有効量の化合物を投与することを含む。そのような化合物、または複数の化合物は、補体により活性化された血管内および血管外溶血をもたらすAPプロセスを阻害する。特許請求された発明の抗体は、CP増幅ループを阻害せず、従って、それらが作製された標的に関係なくAP活性化のみを阻害する。古典的経路由来C3bではなく、補体第2経路由来C3bのみを阻害するこれらの抗体が特許請求される。
【０２００】
他の発明において、古典的経路は補体第2経路増幅ループの増幅を使用し、古典的経路により産生されるC3bを防止することができる。
【０２０１】
血管内溶血は、赤血球の細胞表面上へのC5b-9の沈着により引き起こされる。MACは細胞溶解を引き起こす。そのような溶解は、CD59を欠損する細胞上に存在する。特許請求された発明の抗体は、AP由来C5b-9形成のみを阻害し、古典的経路由来C3bを阻害しない。
【０２０２】
血管外溶血は、細胞表面上へのC3bの沈着により引き起こされる。C3bは、血管外経路による細胞の効率的な除去を担う。特許請求された発明の抗体は、C3b形成、従って、補体第2経路により媒介される細胞の除去の阻害を阻害する。
【０２０３】
発作性夜間ヘモグロビン尿症(「PNH」)および他の溶血性疾患は、古典的経路ではなく補体第2経路の1つ以上の補体成分に結合するか、またはさもなければその生成および/もしくは活性をブロックする特許請求された発明の抗体を用いて治療される。そのような化合物は、例えば、古典的経路ではなく補体第2経路の1つ以上の補体成分に結合するか、またはさもなければその生成および/もしくは活性をブロックする抗体および抗体断片、例えば、補体成分C3b、プロパージン、Ba、およびBbに特異的な抗体などを含む。前記化合物は、抗C3b抗体、抗プロパージン抗体、抗Ba抗体、および抗Bb抗体である。そのような抗体は、抗C3b抗体(マウス、キメラおよびヒト化)、抗P抗体(マウス、キメラおよびヒト化)、および抗Ba抗体(マウス、キメラおよびヒト化)、および抗Bb抗体(マウス、キメラ、ヒト化)ならびにそのような抗体の他の機能的断片からなる群からさらに選択される。これらの抗体は、2つの主要な機能：a)C3bおよびC5b-9形成を阻害する能力を有する必要がある。
【０２０４】
選択された抗体群が古典的経路の増幅ループを阻害せず、従って、10%NHS中で古典的経路を阻害しないことを見出したのは驚くべきことであった。これらの抗体は、補体第2経路に特異的である抗体を特異的に単離するアッセイセットから選択されたものであった。これらの化合物は、上流で経路を阻害し、従って、ヒト血液および血漿/血清中、in vitroおよびex vivoでのC3a、C3b、C5a、C5b、およびC5b-9形成の強力な阻害剤である。そのような抗体によるC3b形成の阻害は、血管外溶血を防止するのに重要である。本発明の抗体は、ヒト血清および全血中で用量依存的方法でCPではなくAPによってのみ産生されるC3b形成を防止する。本発明の抗体はまた、全血および/または血清中でAP由来C5b-9およびsC5b-9形成も阻害する。従って、これらの抗体が古典的経路のいかなる増幅も阻害しないのは驚くべきことである。
【０２０５】
AP阻害抗体を、症状の発現を防止するか、または防止を助けるために溶血性疾患を有することが知られる個体に予防的に投与することができる。あるいは、AP阻害抗体を、溶血性疾患の症状を経験している個体に治療レジメンとして投与することができる。
【０２０６】
別の態様においては、溶血性疾患に罹患した患者における損傷感受性III型赤血球の比率を増加させ、および従って、総赤血球数が増加する方法である。この方法は、特定のAPタンパク質に結合し、CPではなくAPをブロックする化合物を投与することを含む。赤血球の総数を増加させることにより、溶血性疾患に罹患した患者における疲労および貧血などの症状が軽減される。
【０２０７】
別の態様において、本発明は、化合物を被験体に投与することにより、溶血性疾患に罹患した被験体を輸血非依存性にする方法を提供する。抗C3b、抗P、抗Ba、および抗Bb抗体ならびにAP特異的タンパク質に結合するそれらの機能的に活性な抗原結合断片からなる群から選択され、C3bおよびC5b-9の形成をブロックする化合物は、1つ以上のAP特異的タンパク質の活性をブロックする。
【０２０８】
AP特異的抗体が赤血球の溶解を減少させることができるのは驚くべきことであり、患者は本発明の方法に従えば輸血非依存性になる。少ないC5b-9形成は少ない細胞損傷と直接関係し、そのことは、より多くの細胞および患者が輸血非依存性になり、輸血を必要としなくてもよいことを意味する。
【０２０９】
別の態様において、本発明は、赤血球の溶解を減少させる方法を企図し、本発明の方法は、血中の遊離ヘモグロビンの量を減少させることによって、一酸化窒素(NO)を増加させ、腎臓損傷を防止する。
【０２１０】
別の態様において、本発明は、血小板活性化、血小板溶解、血小板の除去、および血小板凝集体の形成を防止するために特許請求された発明の抗体を投与することにより、被験体における血栓形成を治療する/防止する方法を企図する。
【０２１１】
別の態様において、本発明は、好中球、単球、血小板、およびTリンパ球を含む群から選択される細胞の細胞損傷を防止する薬理学的効果を扱うする方法を企図する。
【０２１２】
さらに別の態様において、本発明は、1)造血を増加させることが知られる1つ以上の化合物を、2)被験体におけるC3b形成およびC5b-9形成を阻害することによりAP活性化を阻害する化合物からなる群から選択される化合物と併用して投与することにより、溶血性疾患に罹患した被験体を治療する方法を企図する。造血を増加させることが知られる好適な化合物としては、例えば、ステロイド、免疫抑制剤(シクロスポリンなど)、抗凝固剤(ワルファリンなど)、ギ酸、鉄など、エリスロポエチン(EPO)ならびに抗胸腺細胞グロブリン(ATG)および抗リンパ球グロブリン(ALG)が挙げられる。特に有用な実施形態においては、エリスロポエチン(EPO)を、抗C3b、抗P、抗Ba、および抗Bb抗体からなる群から選択される抗体と併用して投与する。
【０２１３】
別の態様において、本開示は、AP特異的補体成分に結合する化合物、C3a、C5a、C5b-9の形成をブロックする化合物、ならびにP、Ba、Bb、C3a、C5a、C5b、C6、C7、C8およびC9などの1つ以上の補体成分の活性をブロックする化合物からなる群から選択される化合物を投与することにより、赤血球が補体攻撃を受ける被験体における溶血性疾患の1つ以上の症状を治療する方法であって、前記化合物が単独で、または造血を増加させることが知られる1つ以上の化合物と併用して投与される、前記方法を提供する。
【０２１４】
別の態様において、本発明の方法は、ヒトにおける補体第2経路の活性化を選択的に阻害することができる。AP型抗体は、古典的経路の活性化またはCPの増幅ループに影響することなく補体第2経路の活性化を阻害することができる。
【０２１５】
別の態様において、補体第2経路特異的抗体を、限定されるものではないが、抗C3b抗体、および抗Ba因子抗体、抗Bb因子抗体、抗B因子抗体、抗D因子抗体、または抗プロパージン抗体を含む群から選択することができる。
【０２１６】
さらなる態様において、本発明の補体第2経路特異的抗体が結合することができる補体第2経路タンパク質を、限定されるものではないが、C3b、B因子、Ba因子、Bb因子、D因子、またはプロパージンを含む群から選択することができる。
【０２１７】
さらに別の態様において、本発明の方法を用いて、ヒトにおける補体第2経路の活性化の結果として形成し得る副産物の形成を防止することができる。一例において、本発明の方法は、アナフィラトキシンの形成を防止することができる。アナフィラトキシンとしては、C3aおよびC5aが挙げられる。別の例においては、本発明の方法は、C5b-9またはsC5b-9(さもなければMACとして知られる)の形成を防止することができる。さらなる例において、本発明の方法は、被験体における好中球、マクロファージ、および血小板の活性化を防止することができる。さらに別の例においては、本発明の方法は、サイトカインの形成を防止することができる。サイトカインとしては、限定されるものではないが、IL-1、TNF-α、VEGF、GM-CSFが挙げられる。
【０２１８】
一態様において、本発明の補体第2経路特異的抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、非グリコシル化抗体、または1つ以上の突然変異を有する抗体であってもよい。
【０２１９】
別の態様において、本発明の補体第2経路特異的抗体を、限定されるものではないが、ヒト、ヒト化、組換え、キメラ、脱免疫化、トランケート型、非グリコシル化、線状、一本鎖、IgG断片、F(ab)断片、F(ab')断片、F(ab)2断片、F(ab')2断片、Fv断片またはscFv断片を含む群から選択することができる。
【０２２０】
別の態様において、本発明の方法は、エフェクター機能が低下した補体第2経路特異的抗体を含んでもよい。エフェクター機能の低下としては、限定されるものではないが、Fc結合の減少、Fc活性化の欠如、Fcエフェクター機能を防止する突然変異を含有するFc領域、または血小板およびFc受容体を担持する細胞の活性化の防止が挙げられる。
【０２２１】
別の態様において、有効量の補体第2経路特異的抗体を被験体に投与することができる。一例においては、補体第2経路特異的抗体またはその抗原結合断片を、治療上有効量で被験体に投与することができる。別の例においては、補体第2経路特異的抗体またはその抗原結合断片を、予防上有効量で被験体に投与することができる。さらなる例においては、補体第2経路特異的抗体は、in vivoまたはex vivoでの治療設定において有効であってよい。さらに別の例においては、補体第2経路特異的抗体は、in vivoまたはex vivoでの予防設定において有効であってよい。
【０２２２】
さらに別の態様においては、本発明の補体第2経路特異的抗体は、相補性決定領域、またはCDRと呼ばれる抗原結合領域を含んでもよい。一例においては、補体第2経路特異的抗体のCDR群は、融合タンパク質中に存在してもよい。別の例においては、補体第2経路特異的抗体のCDR群は、ウサギ補体第2経路特異的モノクローナル抗体またはマウス補体第2経路特異的モノクローナル抗体に由来するものであってもよい。さらなる例においては、補体第2経路特異的抗体のCDR群は、補体第2経路特異的抗体の天然CDR群に対する50%を超える相同性を有してもよい。
【０２２３】
AP特異的抗体および他の疾患
本発明の属の抗体を用いて、補体第2経路の不適切な活性化、または過剰活性化と関連する任意の疾患、または疾患状態を治療することができる。補体第2経路関連障害の例は、多数ある。以下は、本発明の属の抗体の投与により改善することができる、全てではないが、いくつかの疾患、ならびに/または疾患症状および状態の一覧である。
【０２２４】
聴覚系の病理  -  補体因子HおよびBが過剰発現されるメニエール病。
【０２２５】
心血管系の病理  -  川崎病(動脈炎)、研究によりMACの生成が有意に多数の皮膚病変およびHSP腎炎における血管傷害の病因に関与し得ることが示される、心臓手術合併症ヘノッホ・シェーンライン紫斑病腎炎、血管漏出症候群(c3aの上昇と関連する)、経皮冠動脈インターベンション(PCI)/冠動脈血管形成術、急性心筋梗塞後の虚血再かん流、C3およびC4を上昇させる心筋梗塞、C5aがアテローム斑に存在するアテローム性動脈硬化症、MACが内皮細胞の膜完全性を変化させる免疫複合体血管炎、C3およびC4沈着を含有する動脈炎、C5阻害が腹部大動脈瘤モデルにおける傷害を弱めることが示された動脈瘤、c5b-9がTNF-αを活性化する心筋症、C5-/-マウスおよびB因子-/-マウスが疾患を発症しないことが示された血管炎、高安動脈炎、c5b-9がTNF-αを活性化する拡張型心筋症、静脈ガス塞栓(VGE)、ウェゲナー肉芽腫症、ベーチェット症候群、自己免疫性心筋症、高レベルのC5aが再狭窄と関連するバルーン血管形成術、C3aおよびTNF-αが存在する心筋炎、経皮経管冠動脈形成術(PTCA)、IL-2誘導性血管漏出症候群、高レベルのC3が存在する冠動脈疾患(CAD)、C3dレベルが上昇するドレスラー症候群(心筋梗塞後症候群)、巨細胞性動脈炎(側頭動脈炎または頭部動脈炎)、虚血性心疾患、C3aおよびc5aを生成する虚血再かん流傷害、c3d、gおよび終末補体複合体が存在する白血球破砕性血管炎、結合するC3bが傷害を弱めることが示された腸間膜動脈再かん流、顕微鏡的多発性血管炎、MAC、c3d、P因子およびB因子と関連する微量免疫型血管炎、肺血管炎、レイノー現象、虚血後再かん流状態、肺塞栓症および肺梗塞、ステント留置後の再狭窄、C3dが存在する亜急性細菌性心内膜炎、関節リウマチおよびC3沈着と関連する血管炎。
【０２２６】
結合組織の病理  -  C3およびC4が沈着する、混合性結合組織疾患およびリウマチ性多発性筋痛。
【０２２７】
皮膚の病理  -  類天疱瘡、B因子欠損マウスが疾患モデルにおいて遅延され、あまり重症でない水疱形成を示す表皮水疱症、自己免疫性水疱症、C3およびC5と関連する水疱性類天疱瘡、C5b-9およびC5a受容体が活性化される強皮症、血管性浮腫、遺伝性血管神経性浮腫(HAE)、多形性紅斑、妊娠性疱疹、c5b-9が活性化されたシェーグレン症候群、乾癬、円形脱毛症、C3およびC4のレベルが増加するアトピー性皮膚炎(湿疹)、瘢痕性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、びまん性全身性硬化症、円盤状紅斑性狼瘡、好酸球性海綿状態、結節性紅斑、扁平苔癬、線状IgA病、限局性全身性硬化症(限局性強皮症)、ムッハ・ハーベルマン病、眼部瘢痕性類天疱瘡、天疱瘡、尋常性天疱瘡、壊疽性膿皮症、白斑、蕁麻疹。
【０２２８】
内分泌系の病理  -  橋本甲状腺炎、C3、c3dおよびC4レベルが増加する1型糖尿病、ストレス性不安、膵炎、アジソン病、H因子を増加させるインスリン耐性、糖尿病性血管症、グレーブス病。
【０２２９】
体外手順と関連する状態  -  心肺バイパス後の炎症、C5aが増加するヘパリン誘導性体外LDL沈降(HELP)、かん流後症候群、術後肺機能不全、c5b-9を増加させる心肺バイパスもしくは腎臓バイパスにおけるポンプ後症候群、ならびに補体第2経路によりSC5b-9を活性化し得る、心肺バイパス術、血液透析、心肺バイパス、白血球除去療法、プラスマフェレーシス、血小板フェレーシス、および体外式膜型人工肺(ECMO)中の補体活性化。
【０２３０】
胃腸系の病理  -  クローン病、c3bと関連するセリアック病/グルテン感受性腸疾患、腸虚血、c5aと関連する炎症性腸疾患(IBD)、C5a抗体が大腸炎モデルにおける損傷を弱めることが示された潰瘍性大腸炎、好酸球性胃腸炎、c3b、ic3bおよびC3cのレベルが増加する胃炎、膵炎。
【０２３１】
血液障害  -  劇症型抗リン脂質抗体症候群(CAPS)[96]、c3bを増加させる寒冷凝集素症(CAD)、CD46、H因子およびI因子を増加させる血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)、検出されるC3およびC4が血小板上にある特発性血小板減少性紫斑病、異常なH因子が糸球体C3沈着の増加をもたらす血清病、内毒素血症、敗血症、c3bbb転換酵素の形成および補体調節因子に対する耐性が増強される非定型的溶血性尿毒素症候群(ahus)、C5抗体処置が血栓塞栓症の危険性を低下させることが示された発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)、敗血性ショック、c3bを上昇させる鎌状赤血球貧血、c5a、抗リン脂質を増加させる好酸球増加症候群、自己免疫性リンパ球増殖性症候群、c5b-9が活性化されるドゴー病、エバンス症候群、本態性混合型クリオグロブリン血症、ならびに赤芽球癆。
【０２３２】
肝臓系の病理  -  c3dを増加させる自己免疫性慢性活動性肝炎、感染性肝炎、より高いc1q、C3、B因子、およびプロパージンレベルと関連する原発性胆汁性肝硬変炎症(PBC)、C3が増加する原発性硬化性胆管炎、自己免疫性肝炎。
【０２３３】
過敏症の病理  -  C3aおよびC5aのブロッキングが有効な治療であることが示されたアナフィラキシーショック、X線撮影造影剤の使用、有害な薬物反応に由来するアナフィラキシー反応、アレルギー。
【０２３４】
骨格筋系の病理  -  変形性関節症、骨粗鬆症、C6およびMACが活性化される急性痛風関節炎、脊椎関節症、多発性筋炎、C3bおよびc5b-C9を増加させる皮膚筋炎、c3bの増加と関連する強直性脊椎炎、C5aレベルが上昇する関節炎、腱付着部炎関連関節炎、好酸球性筋膜炎、c1q、C4およびMACが増加した若年性リウマチ性(特発性)関節炎、抗C5a抗体が関節炎を防止することが示された乾癬性関節炎、ライター症候群(反応性関節炎)、再発性多発性軟骨炎。
【０２３５】
神経系の病理  -  重症筋無力症、多発性硬化症(MS)、C3aおよびc5aを活性化するギランバレー症候群、C4およびsC3b-5が上昇する脳卒中、髄膜炎における脳神経損傷、変異型クロイツフェルト・ヤコブ病(vcjd)、神経因性疼痛、C5a受容体アンタゴニストを用いる処置が病理を減少させることが示されたアルツハイマー病(AD)、多巣性運動ニューロパチー(MMN)、C3およびC9の沈着ならびにC5a受容体の上方調節が存在するハンチントン病(HD)、C5aおよびc5aを増加させる筋萎縮性側索硬化症(ALS)、パーキンソン病、変性円板疾患(DDD)、特発性多発ニューロパシー、C3沈着が少ない傷害をもたらし得るアレルギー性神経炎、急性播種性脳脊髄炎、急性出血性白質脳炎、自己免疫性末梢ニューロパシー、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、C3およびC4の減少が脱髄を防止することを示した脱髄、特発性炎症性脱髄疾患、ランバート・イートン筋無力症候群、C5aが予後と相関し、c5ar欠損マウスが脳損傷にあまり罹患しない髄膜炎、ミラー・フィッシャー症候群、視神経脊髄炎(NMO)、C6欠損マウスがMACを形成することができず、脱髄を示さないことが示された静脈周囲脳髄膜炎、進行性炎症性ニューロパシー、オプソクローヌス・ミオクローヌス症候群、ラスムッセン脳炎、連鎖球菌と関連する小児自己免疫性神経精神疾患、全身硬直症候群、スザック症候群、不安。
【０２３６】
視覚の病理  -  硝子体におけるより高レベルのC3aおよびC4aが存在する眼内炎、脈絡毛細管枝におけるC3dおよびc5b-9沈着が存在する糖尿病性網膜症、網膜中にC5b-9を含む糖尿病性網膜細小血管症、眼のヒストプラスマ症、プルチェル網膜症、加齢黄斑変性(AMD)、c3aが上昇したドライ型加齢黄斑変性(AMD)、脈絡膜神経血管新生(CNV)、ブドウ膜炎、糖尿病性黄斑浮腫、病的近視、網膜中心静脈閉塞症(CRVO)、網膜新生血管、網膜色素上皮(RPE)、脈絡膜血管新生(CNY)、C3aおよびC5aが脈絡膜血管新生を促進する優性ドルーゼン(drusen)、光受容体および/または網膜色素上皮(RPE)喪失、スタルガルト病、強膜炎。
【０２３７】
腫瘍病理  -  血管腫、腫瘍細胞転移。
【０２３８】
腎臓系の病理  -  糸球体腎炎、連鎖球菌感染後糸球体腎炎(PSGN)、グッドパスチャー病、膜性腎炎、バージャー病/IgA腎症、c5b-9が上昇するメサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎(高密度沈着物疾患)、膜性糸球体腎炎、腎皮質壊死(RCN)、C5阻害が腎臓傷害から保護することが示された腎臓再かん流傷害、クリオグロブリン血症性糸球体腎炎、ABO不適合腎移植、非定型的溶血性尿毒素症候群(ahus)、ループス(SLE)腎炎。
【０２３９】
呼吸系の病理  -  好酸球性肺炎、過敏性肺炎、気管支拡張症、C5およびc5ar欠損マウスが気道過敏性を示さないことが示された気道過敏症症候群、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)感染、パラインフルエンザウイルス感染、ライノウイルス感染、アデノウイルス感染、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症(ABPA)、結核、寄生虫肺疾患、血清中のより高いC3cおよびC4が汚染された地域で生活している子供において示された公害誘発性喘息、気道過敏性(AHR)、C3およびc3aを上昇させる成人呼吸窮迫症候群、運動誘発性喘息、咳型喘息、職業喘息、アレルギー性喘息、花粉誘発性喘息、重症喘息、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫、気管支炎、嚢胞性線維症、間質性肺炎、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、輸血関連急性肺外傷(TRALI)、急性肺外傷、綿肺、アスベスト誘発性炎症、気管支収縮、Ba因子を上昇させる線維化性肺胞炎(特発性肺線維症)、虚血/再かん流急性肺外傷、C3、c3d、およびB因子レベルが増加する有機塵疾患、肺炎、不活性粉じんおよび鉱物(例えば、シリコン、炭塵、ベリリウム、およびアスベスト)により引き起こされる病理。
【０２４０】
全身性障害  -  全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ、後天性免疫不全症候群(AIDS)、サルコイド、全身性炎症応答症候群(SIRS)、Bb因子およびSC5b-9を上昇させる全身性若年性関節リウマチ、キャッスルマン病、補体成分2欠損、多臓器不全、IL-2療法中のインターロイキン-2誘導性毒性、バラケル・ジーモンス症候群(後天性部分リポジストロフィー)。
【０２４１】
臓器および組織移植の合併症  -  抗C5抗体が移植片生存を改善することが示された移植拒絶、異種移植片拒絶、C5阻害が抗体媒介性拒絶を減少させることが示された臓器または移植片の同種移植、超急性拒絶、移植片対宿主疾患、超急性同種移植片拒絶、予備感作腎移植、生体ドナー、移植片および/または再移植片に対する再血管化。
【０２４２】
外傷との関連  -  C5a受容体アンタゴニストが多臓器傷害を弱めることが示された出血性ショック、血液量減少性ショック、脊髄損傷、脳外傷および/または脳出血、C5aブロッキングが熱傷誘発性心機能障害を改善することが示された重度の熱傷、凍傷、挫滅外傷、創傷治癒、脳外傷、C5を上昇させる脳虚血再かん流、煙傷害。
【０２４３】
泌尿生殖器系および/または生殖器系の病理  -  自然流産、感覚膀胱疾患、間質性膀胱炎(膀胱痛症候群)、母子間免疫寛容、子癇前症、副鼻腔炎、妊娠合併症、慢性無菌性膀胱炎、溶血、肝酵素上昇、および血小板数低下(HELLP)症候群、不妊症、胎盤機能不全および流産および子癇前症、習慣性流産。
【０２４４】
他の関連する疾患および状態  -  無ガンマグロブリン血症、抗合成酵素症候群、アトピー性アレルギー、自己免疫性腸疾患、自己免疫性内耳疾患、1型自己免疫性多内分泌症候群(ウィタカー症候群)、2型自己免疫性多内分泌症候群(シュミット症候群)、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、バロー病/バロー同心性硬化症、卵黄様黄斑ジストロフィー(ベスト病)、ビッカースタッフ型脳幹脳炎、ブラウ症候群、がん、化学傷害(刺激性ガスおよび化学物質、例えば、塩素、ホスゲン、二酸化硫黄、硫化水素、二酸化窒素、アンモニア、および塩酸に起因する)、慢性再発性多発性骨髄炎、チャーグ・ストラウス症候群、コーガン症候群、角膜血管形成、クッシング症候群、皮膚白血球破砕性血管炎、有痛脂肪症、進行性骨化性線維形成異常症、線維形成塵疾患、消化管類天疱瘡、橋本脳炎、溶血性尿毒症症候群(HUS)、喀血、低ガンマグロブリン血症、免疫複合体関連炎症、虚血関連網膜症、硬化性苔癬、ルポイド肝炎、若年性リンパ球性甲状腺炎、マジード症候群、常染色体優性放射状ドルーゼン(放射状ドルーゼン)、神経ミオトニー、ノースカロライナ黄斑ジストロフィー、オード甲状腺炎、回帰性リウマチ、傍腫瘍性小脳変性症、寄生虫疾患、パリー・ロンベルク症候群、扁平部炎、パーソナージュ・ターナー症候群、パターンジストロフィー、悪性貧血、POEMS症候群、結節性多発動脈炎、増殖性腎炎、むずむず脚症候群、後腹膜線維化症、リウマチ熱、回転性粥腫切除術、シュニッツラー症候群、ソースビー眼底変性症、スティル病、外科的外傷、シデナム舞踏病、交感性眼炎、トローザ・ハント症候群、横断性脊髄炎、未分化脊椎関節症、全身性エリテマトーデスと関連する血管炎、A型肝炎と関連する血管炎、フォン・ヒッペル・リンドウ病(VHL)、ウィップル病、自己免疫性好中球減少症、化学療法、血液透析、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、マラリア、エプスタイン・バーウイルス、ビタミン欠損症、脾機能亢進症、特発性血小板減少性紫斑病(ITP)、播種性血管内凝固症候群(DIC)、輸血後紫斑病、新生児同種免疫性血小板減少症、オニアライ病、周期性好中球減少症、ヘビ咬傷、インターフェロン投与、腫瘍壊死因子投与、放射線療法投与、およびコルチコステロイド塗布。
【０２４５】
ITP  -  ITPは、低血小板数、正常骨髄および血小板減少症の他の原因の非存在により定義される比較的一般的な血液障害である。標準的な臨床実験室試験を用いてITPを診断することができ、例えば、尿検査、血液分画CBC、血液学、凝固、血清化学(GM-CSFおよび可溶性GM-CSFの濃度の測定を含む)、サーファクタントD、赤血球沈降速度、およびC反応性タンパク質が用いられる。
【０２４６】
慢性ITPを有する患者は、血小板数が、コルチコステロイドを受けていない患者については30x109/L未満またはコルチコステロイドを受けている患者については50x109/L未満である場合、出血の危険性があると同定される。
【０２４７】
臓器移植における抗体媒介性拒絶、抗好中球細胞質抗体(ANCA)血管炎、劇症型抗リン脂質抗体症候群、高密度沈着物疾患またはC3腎症、溶血性寒冷凝集素症、視神経脊髄炎、非滲出性(ドライ型)黄斑変性、志賀毒素大腸菌関連溶血性尿毒症症候群(STEC-HUS)、全身性エリテマトーデス(SLE)、血栓性血小板減少性紫斑病(TTP)。
【実施例１】
【０２４８】
本発明の属の抗体の例示的化合物を用いて被験体におけるAP活性化の阻害を証明するための細胞アッセイ
in vivo様の系においてAP活性化を阻害する本発明の例示的化合物の能力を評価するために、赤血球溶血アッセイを用いた。ウサギ赤血球(rRBC)を、AP可能化バッファー中で正常ヒト血清(NHS)と共にインキュベートした。rRBC(「異物」)の存在は、APの活性化を選択的に誘導し、それが赤血球上へのC5b-9沈着をもたらし、最終的には細胞溶解を引き起こす。細胞溶解の程度を、700nmでの光学密度での光散乱に基づいて検出する。本発明の属の抗体の例示的化合物は、図2および図3に示されるように、用量依存的方法でrRBCの溶血を阻害した。
【０２４９】
10%ヒト血清(Mg2+/EGTAを含む)中へのウサギ赤血球(rRBC)の導入は、補体第2経路カスケードを開始させる外来細胞表面の導入を表す。APの活性化は、外来細胞(rRBC)の溶解を引き起こすMACの形成をもたらす。本発明の選択された抗体は、これらの赤血球の溶解を防止する。このプロセスを、無傷の赤血球により引き起こされた光散乱を試験した後に定量した。
【０２５０】
ウサギ赤血球は、C5b-9(MAC)複合体によるrRBCの溶解をもたらすと共に、APを特異的に活性化するとされている。光散乱の累進減少(無傷細胞の溶解に起因する)を、温度制御式ELISAプレートリーダー中で時間の関数として700nmで測定した。データを記録し、SpectraMax 190プレートリーダーおよびSoftMax Proソフトウェアを用いて分析した。
【０２５１】
図4に示されるように、本発明の抗C3b、抗Ba、抗Bb、および抗P抗体はAP活性化を阻害し、従って、補体第2経路依存的溶解を促進する条件下でのみヒト血清中のrRBCの溶解を阻害する。
【０２５２】
細胞の溶解は、溶血性疾患などのいくつかの疾患において生じる。溶解の阻害は、細胞死がC5b-9の産生の結果として生じる疾患状態において有意な利益を提供する(図4)。細胞の溶解はまた、組織傷害における補体の役割が確立されていると考えられる他の疾患において見られる組織傷害も示す。
【実施例２】
【０２５３】
本発明の抗体は古典的経路を阻害しない
CP阻害のための抗体の活性を試験するために、抗体感作ヒツジ赤血球(sRBC)を、CPバッファー(Ca2+/Mg2+)中の1%正常ヒト血清中でインキュベートした。これらのsRBCは、細胞膜の溶解を誘導するCPを活性化する。細胞膜の溶解は、細胞により散乱された光の漸減をもたらす。本発明の補体第2経路特異的抗体を、Ca2+およびMg2+を含有するバッファー(「CPバッファー」)を含む1%NHS中、37℃でsRBCと共にインキュベートした場合、溶血の開始で始まり、最大の溶血で終わる期間内に溶血に対する何の影響も観察されなかった。これは、本発明の補体第2経路特異的抗体がNHS中でCP溶血活性に影響せず(図5)、病原体に対する宿主防御へのCPの予想される寄与を損なわないと見込まれることを意味する。
【０２５４】
本発明のモノクローナル抗体は、それらを生じさせた標的抗原にかかわらず、古典的経路を阻害しない。典型的なアッセイにおいては、抗体感作ヒツジ赤血球を、Ca++を含有するCPバッファーを含む正常ヒト血清と共にインキュベートする。これらの条件により、古典的経路の選択的活性化が可能になる。機械論的には、ヒツジ細胞の表面上の抗原抗体複合体が、赤血球溶解を引き起こす古典的補体経路を活性化する。
【０２５５】
図5に示されるように、本発明の代表的な抗体は、CPまたはCPの増幅ループではなくAPを阻害する。本発明のモノクローナル抗体の開発は、感染に対する宿主防御のために古典的経路を無傷のままにする。
【０２５６】
本発明の属の抗体によるCP活性化の阻害の欠如は、古典的経路は宿主防御にとって必要であるため、宿主防御が損なわれないことを示す。古典的経路は、活性化の際に、AP活性化中の疾患状態においてオプソニン作用のために必要であるC3bを生成する。かくして、C3b媒介性オプソニン作用は、本発明の抗体によって阻害されない。
【実施例３】
【０２５７】
本発明の抗体は古典的経路の完全な能力にとって必要な増幅プロセスを阻害しない
古典的経路の完全な能力に影響し得る任意の増幅プロセスに対する何らかの阻害効果について候補抗体を試験するために特に設計されたアッセイを用いた。このアッセイでは、抗体感作ヒツジ赤血球(sRBC)を、CPバッファー(Ca2+/Mg2+)中の10%正常ヒト血清中でインキュベートした。これらのsRBCは細胞膜の溶解を誘導する抗体-抗原結合複合体によりCPを活性化する。細胞膜の溶解は、無傷の細胞により散乱される光の漸減をもたらす。本発明の補体第2経路特異的抗体を10%正常ヒト血清(NHS)中のCa2+およびMg2+含有バッファー(「CPバッファー」)中、37℃でsRBCと共にインキュベートした場合、溶血の開始で始まり、最大の溶血で終わる期間内に溶血に対する何の影響も観察されなかった(図2、パネルB)。これは、本発明の補体第2経路特異的抗体がNHS中でCP溶血活性に影響せず、病原体に対する宿主防御へのCPの予想される寄与を損なわないと見込まれることを意味する。それはまた、本発明の補体第2経路特異的抗体がCPの完全な能力にとって必要とされ得るいかなる増幅プロセスに影響しないことも意味する。従って、本発明の属の抗体は、病原体に対する正常な宿主防御に対するCPの完全な寄与を損なわないと見込まれる。
【０２５８】
本発明のモノクローナル抗体を、補体第2経路の増幅に対するその効果について評価した。これは、700nmで読取ることができる温度制御式ELISAプレートリーダー中、固定数のウサギ赤血球(Covance)を用いて、37℃で正常ヒト血清(AP単離用Mg2+単独バッファーを含む10%NHS)のアッセイを用いて行った。光散乱の累進減少(無傷細胞の溶解に起因する)を、時間の関数として700nmで測定した。データを記録し、SpectraMax 190プレートリーダーおよびSoftMax Proソフトウェアを用いて分析した。
【０２５９】
図2、パネルBに示されるように、本発明の補体第2経路特異的抗体は、AP増幅ループによって開始され得るCPの増幅を阻害しない。本発明の抗体は、CP(またはCP増幅ループ、図2、パネルA)のいかなる増幅も阻害せず、従って、APの特異的阻害剤である。宿主防御は依然として無傷である。
【実施例４】
【０２６０】
本発明の抗体はAPが活性化された場合にC3b形成を阻害する
補体第2経路活性化は、AP C3転換酵素によるC3の切断によりC3bを生成する。それによって、C3はC3bとC3aとに分割される。補体第2経路を活性化するLPSを用いてC3bの阻害について抗体を評価した。マイクロタイタープレートを、一晩、2μgのLPS(サルモネラ・ティフォーサ(Salmonella Typhosa)由来リポ多糖)を含む50μlのPBSで被覆した。そのウェルをPBS中の1%BSAと共にインキュベートして、プレート上の占有されていない部位をブロッキングした。37℃で2時間インキュベートした後、プレートをPBSで洗浄し、正常ヒト血清(APバッファー中の10%最終濃度)と共にインキュベートし、本発明の抗体と混合し、LPSで被覆されたウェルと共にインキュベートした。プレートを再度37℃で2時間インキュベートして、C3b形成を起こさせた。プレートをPBSで大規模に洗浄し、C3転換酵素の成分を、抗体を用いて適切に検出した。本発明者らは、ブロッキング溶液中、1:2000でウサギ抗ヒトC3cを用いてC3bを検出した。インキュベーション後、プレートをPBSで洗浄し、C3b検出のためにブロッキング溶液中1:2000のペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ウサギを用いて調製した。全てのプレートを、PBSで大規模に洗浄した後、TMBで発色させた。本発明のAP特異的抗体の存在下で、C3b形成の阻害が観察された。
【０２６１】
本発明の補体第2経路特異的抗体は、補体第2経路により過剰に産生されるC3bの形成を阻害する。C3b被覆細胞は一般に、PNH疾患において血管外溶血として知られるものによって破壊される。他の有核細胞を、同じ機構により同様に除去することができる。かくして、好中球減少症、白血球減少症および血小板減少症は、最終結果が細胞数の減少であるいくつかの例である。本出願において特許請求される抗体の属は、血管外経路による細胞の除去を担うC3bの形成を防止することが期待される。血管外溶解は、C3b被覆赤血球が望ましくない血管外経路により循環から除去される発作性夜間血色素尿症などの適応症において重要である。
【０２６２】
図18に示されるのは、PNH患者に由来する血液である。Tリンパ球は黄色で示され、単球は青色で示され、好中球は赤色で示される。これらの細胞を、全ての白血球を染色するためにFITC標識CD45で染色する。血小板は緑色で示される。示されるように、全ての細胞がC3bを担持し、そのことは、CD55が全ての細胞上で部分的に存在せず、C3b沈着を可能にしていることを示唆する。本発明の抗体は、図6に示されるように、C3b沈着を阻害する。
【実施例５】
【０２６３】
本発明の抗体は10%NHS中のAPバッファー中でのC5b-9形成を阻害する
補体第2経路活性化は、AP C3転換酵素によるC3の切断によりC3bを生成する。それによって、C3はC3bとC3aとに分割される。AP C5転換酵素はC5をC5aとC5bとに切断する。C5b分子はそれ自身を細胞膜に挿入し、細胞表面上でC5b-9分子を生成し、それが細胞溶解および細胞壁の損傷をもたらす。補体第2経路を活性化するLPSを用いてC5b-9の阻害について抗体を評価した。マイクロタイタープレートを、一晩、2μgのLPS(サルモネラ・ティフォーサ(Salmonella Typhosa)由来リポ多糖)を含む50μlのPBSで被覆した。室温で2時間インキュベートした後、プレートをPBSで洗浄し、正常ヒト血清(APバッファー中の10%最終濃度)と共にインキュベートし、本発明の抗体と混合し、LPSで被覆されたウェルと共にインキュベートした。プレートを再度37℃で2時間インキュベートして、C5b-9形成を起こさせた。プレートをPBSで大規模に洗浄し、C5b-9の成分を、C5b-9に対する新抗体を用いて適切に検出した。本発明者らは、ブロッキング溶液中、1:2000でマウス抗MACを用いてC5b-9を検出した。全てのプレートを、PBSで大規模に洗浄した後、TMBで発色させた。本発明のAP特異的抗体の存在下で、C5b-9形成の阻害が観察された。
【０２６４】
図7に示されるように、本発明の補体第2経路特異的抗体は、補体第2経路により過剰に産生されるC5b-9の形成を阻害する。C5b-9被覆細胞は、PNH疾患において血管内溶血により破壊される。他の有核細胞を、同じ機構により同様に除去することができる。かくして、好中球減少症、白血球減少症および血小板減少症は、最終結果が細胞数の減少であるいくつかの例である。本出願において特許請求される抗体の属は、血管外経路による細胞の除去を担うC5b-9の形成を防止することが期待される。血管外溶解は、C5b-9被覆赤血球が血管内経路により循環から除去される発作性夜間血色素尿症などの適応症において重要である。
【０２６５】
図10に示されるように、全ての血液細胞が、CD59およびC5b-9抗体で染色された。血小板、好中球、単球およびTリンパ球を含む細胞は、C5b-9により攻撃される。各細胞型について示しているのは、CD59およびMACに関するプロットである。このドナーにおいては、全細胞が類似するパターンを示し、従って、PNH検出および薬物モニタリングのためのこのアッセイの価値を証明するには、全て、または1つの細胞型で十分である。C5b-9を担持する細胞とCD59欠損細胞との比率は、類似すると考えられる。これらの細胞は攻撃され、死ぬことになろう。本発明の抗体は、C5b-9の形成を阻害する。
【実施例６】
【０２６６】
化合物(本発明の属の抗体)による全血炎症モデルにおける炎症メディエーターの形成の阻害
補体第2経路活性化は、AP C3転換酵素によりC3から切断される、C3bを生成する。C3は、C3bとC3aとに切断される。C3b形成の阻害は、実施例5で取り組まれた。C3aの形成を、ELISA(Quidel Corp)を用いて測定する。本発明の抗体は、C3aの形成を阻害する。C3aに結合するC3a受容体は、単球上に見出される。C3aは、強力な炎症性サイトカインおよび炎症メディエーターであるTNF-αを放出する単球を活性化することが知られる。TNF-αは、関節炎の発症および進行において役割を果たす。抗TNF-α療法のみが、関節リウマチおよび変形性関節症などの様々な関節炎状態および疾患を有する患者に顕著であるが不完全な利益を提供してきた。C3a形成の阻害は、単球活性化の阻害ならびにTNF-α形成および関節炎炎症の阻害と直接関連する。
【０２６７】
全血中のAP活性化は、疾患の誘導および進行にとって一次的な状態を再現する。血液炎症は、AP活性化および炎症性サイトカインの産生と関連する。ヒト全血が人工的誘発因子によりAP活性化を受ける場合、全血における炎症は完了まで進む。これは、アナフィラトキシン(例えば、C3a、C5a)、MAC複合体(C5b-9/sC5b-9)の形成、好中球、単球および血小板などの炎症誘発性細胞の活性化、ならびにTNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、およびIL-17などの炎症誘発性サイトカインの形成および放出を含む。
【０２６８】
この血液炎症(BI)モデルにおいて、2mLアリコートの新鮮に単離されたヘパリン化ヒト血液を、37℃で2時間、ポリ塩化ビニル管中で循環させた。管のループ回転後の血液試料を、C3a、C5a、およびC5b-9/sC5b-9形成について評価した。さらに、TNF-αおよび好中球エラスターゼなどの炎症マーカーも測定した。
【０２６９】
図8に示される結果は、本発明の抗体がC3a形成を阻害することを示す。C3aレベルの上昇は、顕著な病態が存在するいくつかの疾患において見出されている。過剰のC3a産生は、過剰の単球活性化および漸進的に重度な病理をもたらす。C3aの上昇が見出される多くの疾患を、本発明の抗体を用いて処置することができる。C3aの阻害は、in vivoで単球活性化の阻害および炎症の阻害を示す。かくして、ex vivoでのアッセイは、他の疾患において生じるin vivoでの炎症を反映する。
【０２７０】
図9に示される結果は、本発明の抗体がC5a形成を阻害することを示す。C5aは、好中球および単球のそれぞれの上のその対応する受容体に結合することにより、これらの細胞型を活性化する。活性化された好中球は、CD11bを発現し、エラスターゼを放出し、いくつかの炎症モデルにおける浮腫の原因となる。図11に示されるように、本発明の補体第2経路特異的抗体は、in vivoでの好中球活性化、および結果として、好中球媒介性病的転帰を阻害する。図19〜25に示されるように、AP活性化の阻害は、組織炎症、滑膜炎、骨および軟骨の分解を防止する。
【０２７１】
図11、図12および図13からの結果は、本発明の抗体が細胞活性化を防止することを示す。3つの主要な細胞型全ての活性化が阻害される。図4に示されるように、凝集体形成および血栓形成も、これらの抗体により阻害される。
【実施例７】
【０２７２】
本発明の抗体はin vivoでの溶血およびLDHを阻害する
ウサギに、PNH細胞を注射した。時間と共に溶解した細胞ならびにhemoQおよびLDHにより測定された放出されたヘモグロビンおよびLDHを、乳酸デヒドロゲナーゼを測定するキットを用いて測定し、評価した。Cytotox LDH Kitカタログ番号G1781およびG1782(Promega、Madison、WI)を、LDH測定のために用いた。図16および図17に示されるように、本発明の抗体は、in vivoでヘモグロビン放出およびLDHの放出を阻害する。本発明の抗体は、動物においてin vivoで赤血球溶解およびLDH形成を阻害した。
【０２７３】
本発明は記載された特定の実施形態に限定されず、勿論そのようなものとして変化してもよいことが理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で用いられる用語は特定の実施形態のみを説明するためのものであり、限定を意図されるものではないことも理解されるべきである。本開示で列挙または同定された全ての特許、特許出願、刊行物は、その全体が参照により本明細書に組込まれるものとする。
【図１】
2015532303.tif 000005
【図２】
2015532303.tif 000006
【図３】
2015532303.tif 000007
【図４】
2015532303.tif 000008
【図５】
2015532303.tif 000009
【図６】
2015532303.tif 000010
【図７】
2015532303.tif 000011
【図８】
2015532303.tif 000012
【図９】
2015532303.tif 000013
【図１０】
2015532303.tif 000014
【図１１】
2015532303.tif 000015
【図１２】
2015532303.tif 000016
【図１３】
2015532303.tif 000017
【図１４】
2015532303.tif 000018
【図１５】
2015532303.tif 000019
【図１６】
2015532303.tif 000020
【図１７】
2015532303.tif 000021
【図１８】
2015532303.tif 000022
【配列表】
2015532303000001.app
【国際調査報告】
2015532303.tif 000023
2015532303.tif 000024
2015532303.tif 000025
2015532303.tif 000026
2015532303.tif 000027
2015532303.tif 000028
2015532303.tif 000029