(57)【要約】皮膚の炎症及び／又は老化を抑制又は処置する皮膚科学的組成物は、皮膚科学的に適合可能な成分と、テオブロマカカオプラント由来の培養細胞又はその抽出物と、を含む。前記培養細胞は、皮膚に送達されたときに、炎症及び／又は老化を軽減する、抗酸化性化合物及び／又は抗炎症性化合物を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
皮膚の炎症及び／又は老化を抑制又は処置するための皮膚科学的組成物であって、
皮膚科学的に適合可能な成分と、
テオブロマカカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）プラント由来の培養細胞又はその抽出物と、
を含み、
該培養細胞が、抗酸化性化合物及び／又は抗炎症性化合物を含む、
ことを特徴とする組成物。
【請求項２】
前記抗酸化性化合物及び／又は抗炎症性化合物が、（−）−エピカテキン、（＋）−カテキン、プロシアニジン、ケルセチン、イソケルセチン（ケルセチン３−Ｏ−グルコシド）、ケルセチン３−Ｏ−アラビノース、ナリンゲニン、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の皮膚科学的組成物。
【請求項３】
前記皮膚科学的成分が、前記培養細胞と組み合わされて、懸濁液、乳剤、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、粉末、石鹸、界面活性剤含有クレンザー、油、パウダーファンデーション、乳化ファンデーション、ワックスファンデーション、又は噴霧剤を形成する、請求項１に記載の皮膚科学的組成物。
【請求項４】
前記組成物が、０．１重量％〜２０重量％の範囲の濃度で培養細胞を含む、請求項１に記載の皮膚科学的組成物。
【請求項５】
前記組成物が、０．０００１重量％〜１０重量％の範囲の濃度で細胞培養物由来のテオブロマカカオ細胞の抽出物を含む、請求項１に記載の皮膚科学的組成物。
【請求項６】
前記培養細胞が、花の組織又は花以外の栄養組織のうちの少なくとも１つに由来する、請求項１に記載の皮膚科学的組成物。
【請求項７】
前記培養細胞が、節、節間、若葉、成葉、茎、根、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される花以外の栄養組織である、請求項６に記載の皮膚科学的組成物。
【請求項８】
前記組成物が、ペースト、クリーム、又はゲルとして処方され、前記組成物が、動物油、植物油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク、又は酸化亜鉛を含む、請求項１に記載の皮膚科学的組成物。
【請求項９】
皮膚科学的組成物の製造方法であって、
単離したテオブロマカカオ細胞を培養し、かつ任意追加的に、該培養したテオブロマカカオ細胞から抽出物を得るステップと、
該培養したテオブロマカカオ細胞又はその抽出物を少なくとも１種類の皮膚科学的成分と組み合わせて該皮膚科学的組成物を産出するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記皮膚科学的組成物が、溶液、懸濁液、乳剤、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、粉末、石鹸、界面活性剤含有クレンザー、油、パウダーファンデーション、乳化ファンデーション、ワックスファンデーション、又は噴霧剤である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記テオブロマカカオ細胞が、抽出溶媒を使用して抽出される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記抽出溶媒が、水、１〜４個の炭素原子を含有する無水低級アルコール又は含水低級アルコール、アセトン、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジクロロメタン（ＣＨ２Ｃｌ２）、クロロホルム、ヘキサン、及び１，３−ブチレングリコールからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記単離したココア細胞が、花の組織又は花以外の栄養組織のうちの少なくとも１つに由来し、
該花の組織が、花弁、萼片、仮雄しべ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され、又は、
該花以外の栄養組織が、節、節間、若葉、成葉、茎、根、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、
請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
皮膚の処置方法であって、
炎症又は老化に対する処置が必要な皮膚を特定するステップと、
皮膚科学的に適合可能な成分と培養したテオブロマカカオ細胞又はその抽出物とを含む皮膚科学的組成物を該皮膚に局所的に塗布するステップと、
を含み、
該培養細胞又は抽出物が、抗酸化性化合物及び／又は抗炎症性化合物を含む、
ことを特徴とする方法。
【請求項１５】
前記皮膚科学的組成物が、溶液、懸濁液、乳剤、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、粉末、石鹸、界面活性剤含有クレンザー、油、パウダーファンデーション、乳化ファンデーション、ワックスファンデーション、又は噴霧剤である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物が、０．１重量％〜２０重量％の範囲の濃度で培養細胞を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、０．０００１重量％〜１０重量％の範囲の濃度で細胞培養物由来のテオブロマカカオ細胞の抽出物を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、ペースト、クリーム、又はゲルとして処方され、前記組成物が、動物油、植物油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク、又は酸化亜鉛を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物が、粉末又は噴霧剤として処方され、前記組成物が、乳糖、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、又はポリアミドの粉末を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記組成物が、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、又はソルビタンの脂肪酸エステルの群から選択される、溶媒、可溶化剤、又は乳化剤を含む、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１２年６月２６日に出願された、発明の名称が「Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  Ｃａｃａｏ  Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｏｒ  Ｉｔｓ  Ｅｘｔｒａｃｔｓ」である、米国特許仮出願第６１／６６４，７４１号の利益を主張するものであり、該出願は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、テオブロマカカオ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ  ｃａｃａｏ）の培養細胞を含む皮膚科学的組成物に関する。前記培養細胞は、天然の植物組織と比較して、高濃度の抗炎症性化合物及び抗酸化性化合物を含む。
【背景技術】
【０００３】
炎症は、損傷部位に生じて、病原体又は損傷した組織の除去を開始させる局所反応であり、心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、及び喘息などの様々な疾患において重要な役割を果たしている。炎症反応の間に、炎症性サイトカイン（例えば、インターロイキンＩＬ−１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロン（ＩＮＦ）−γ、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子）などのメディエーター類が放出される。この反応に対しては、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−ａ、及びトランスフォーミング成長因子（Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｍ．；Ｈｏｂｉｇｅｒ，Ｓ．；Ｊｕｎｇｂａｕｅｒ，Ａ．，Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｆｒｏｍ  ｆｒｕｉｔｓ，ｈｅｒｂｓ  ａｎｄ  ｓｐｉｃｅｓ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  ２０１０，１２２，９８７〜９９６）などの、抗炎症性サイトカインが拮抗する。
【０００４】
炎症反応においては、転写因子である核因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）もまた、炎症性サイトカイン、接着分子、ケモカイン、成長因子、及び、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）などの誘導酵素をコード化する様々な遺伝子の発現を調整することにより、重要な役割を果たす（Ｈａｎａｄａ，Ｔ．，＆Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，Ａ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２００２，１３（４〜５），４１３〜４２；Ｍａｋａｒｏｖ，Ｓ．Ｓ．ＮＦ−ｋｂ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ：Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ  ２０００，６（１１），４４１〜４４８）。誘導一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）及びＣＯＸ−２は、共に、炎症性メディエーターの大量生産を誘発する。
【０００５】
慢性炎症では、負の調整機構が機能不全となっていると考えられる。炎症は、本来的には（例えば、微生物、毒素、又はアレルゲンなどに対する）防御反応であるが、慢性的でかつ制御されていない炎症は、組織に対して有害である（Ｇｉｌ，Ａ．Ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  ２００２，５６（８），３８８〜３９６）。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】様々な濃度の、培養細胞からの抽出物（即ち、ココア細胞抽出物）によって処置した後の、細胞生存率を、ココア豆からの抽出物（即ち、標準ココア抽出物）と比較して示す。
【図２】サイトカイン混合物（ＩＬ−１７＋ＯＳＭ＋ＴＮＦ−α）による刺激後の、ケラチノサイトのＩＬ−８放出に対するココア細胞抽出物と標準ココア抽出物の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
Ｉ．序論
本発明は、皮膚の炎症、老化、及び／又は酸化を抑制する皮膚用組成物における、テオブロマカカオ懸濁細胞及び／又はそれらの抽出物の生産及び使用に関する。テオブロマカカオ由来の培養細胞は、抗酸化性化合物、抗炎症性化合物、及び抗老化性化合物に富み、皮膚科学用組成物に対して、これらの特性を付与する。
【０００８】
単離したココア細胞株は、本質的に、ココアプラントのいずれの部分由来のものであってよい。例えば、単離したココア細胞株は、花の組織又は花以外の栄養組織のうちの少なくとも１つに由来するものであってもよい。花の組織の例としては、花弁、萼片、仮雄しべ、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。花以外の栄養組織の例としては、節、節間、若葉、成葉、茎、根、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００９】
前記細胞は、テオブロマカカオプラントに由来し、細胞培養において成長する。培養細胞株は、細胞培養において治療的に適切な濃度の抗老化性化合物、抗炎症性化合物、及び／又は抗酸化性化合物を産生する能力により選択される。例えば、単離した培養細胞株は、例えば、（−）−エピカテキン、（＋）−カテキン、これらのモノマーに由来するオリゴマーであるプロシアニジン類、ポリフェノール類（ケルセチン、イソケルセチン（ケルセチン３−Ｏ−グルコシド）、ケルセチン３−Ｏ−アラビノース、ナリンゲニンなど）などのフラボノイドを含み得る。
【００１０】
有効量の抗炎症性化合物及び／又は抗酸化性化合物は、少なくとも５％、１０％、２０％、又は３０％のポリフェノール類を有し、かつ皮膚科学的組成物中に、少なくとも０．０１重量％、０．１重量％、０．５重量％、１重量％、５重量％、若しくは１０重量％の濃度で含まれるか、又は抽出物の場合には、前述の量と同一若しくは半分の濃度で含まれる、細胞を含む。
【００１１】
本発明の一部の実施形態では、皮膚科学的組成物は、皮膚の炎症又は老化に対する処置又は予防が必要であると特定されたヒトに投与されてよい。方法は、治療的に有効量の皮膚科学的組成物を皮膚に投与することを更に含む。研究により、培養細胞又は抽出物が、ニッケルに対する曝露による炎症反応に関与するタンパク質の産生を抑制することによって、皮膚の炎症又は老化に悩まされる被験者に、治療的効果をもたらし得ることが示されている。
【００１２】
前記培養細胞は、急速に、比較的多量にかつ高密度で成長できる。一実施形態では、単離したココア細胞株は、１００ｍｇ／Ｌ溶液中細胞体積（packed cell volume）（「ＰＣＶ」）超、２００ｍｇ／Ｌ  ＰＣＶ超、３００ｍｇ／Ｌ  ＰＣＶ超、４００ｍｇ／Ｌ  ＰＣＶ超、又は５００ｍｇ／Ｌ  ＰＣＶ超のプロシアニジンを産出する。一実施形態では、単離したココア細胞株は、細胞培養物１リットル当たり１００ｍｇ超、２００ｍｇ超、又は少なくとも２５０ｍｇのプロシアニジンを、産出する。
【００１３】
抗炎症性化合物及び抗酸化性化合物の産生のための細胞培養の使用は、従来型の植物を栽培し、豆から化合物を回収することに対して、実質的に有利である。第１に、培養細胞は、所望の化合物の産生を刺激する条件下で（それらの条件が、栽培された天然のココアプラントに好適ではない条件下であっても）、成長させることができる。それ故、培養細胞は、栽培された植物では不可能な化合物濃度を天然に（naturally）産生する機会を提供する。第２に、培養細胞の加工又は抽出では、しばしば不要な色素が産生したり、又は所望の化合物への損傷若しくは汚染が生じたりする、ココア豆の加工という厄介な作業が不要である。また、細胞培養は、作物の生産を妨害し得る環境的な条件に影響されることがなく、特定の生育環境又は生育期に拘束されることもない。
【００１４】
ＩＩ．皮膚科学的組成物
培養細胞は、皮膚科学的組成物に含まれて、抗炎症及び抗酸化という有益な効果を付与する。皮膚科学的組成物は、培養細胞と組み合わせた皮膚科学的化合物を、該組み合わせが、炎症又は老化の軽減を必要とするヒト又は動物の皮膚へ塗布するのに好適である限りは、任意の処方で含んでよい。
【００１５】
皮膚科学的組成物は、培養したテオブロマカカオ細胞を、０．０１重量％以上、０．１重量％以上、０．５重量％以上、若しくは１重量％以上の濃度で、又は、３０重量％以下、２０重量％以下、１０重量％以下、５重量％以下、若しくは１重量％以下の濃度で、又は、前述したより高い若しくはより低い濃度の範囲内で、含んでよい。
【００１６】
あるいは、皮膚科学的組成物は、培養したテオブロマカカオ細胞の抽出物を含んでもよい。抽出物の濃度は、少なくとも０．０００１重量％、０．００１重量％、０．０１重量％、若しくは０．１重量％で、かつ／又は、１０重量％未満、５重量％未満、１重量％未満、若しくは０．１重量％未満で、又は、前述したより高い若しくはより低い濃度の範囲内であってよい。培養細胞は、特有の二次代謝産物プロファイルを作り出すため、抽出物も同様に、天然のココア豆からの抽出物と比較すると、特有のプロファイルを有している。とりわけ、培養細胞からの抽出物では、抗炎症性化合物及び抗酸化性化合物の割合が、実質的に増加している。
【００１７】
培養細胞又は抽出物に加えて、皮膚科学的組成物は、培養細胞又は抽出物をヒトの皮膚に送達するための担体を含む。例えば、前記組成物は、皮膚への塗布に好適な溶液、懸濁液、乳剤、ペースト、ゲル、クリーム、ローション、粉末、石鹸、界面活性剤含有クレンザー、油、パウダーファンデーション、乳化ファンデーション、ワックスファンデーション、又は噴霧剤に処方されてもよいし、前述したものと同様の働きを有する他の化粧品に処方されてもよい。
【００１８】
前記組成物は、前記組成物の皮膚に対する送達及び使用を容易にする溶媒、担体、及びアジュバントを含んでいてもよい。一実施形態では、前記組成物は、脂肪族アルコール類、グリコール類、コレステロール、ｐＨ調節剤などを含んでもよい。
【００１９】
より具体的には、培養細胞は、皮膚軟化ローション、栄養ローション、栄養クリーム、マッサージクリーム、エッセンス、アイクリーム、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、洗浄水、パック、噴霧剤、又は粉末に処方されてもよい。
【００２０】
前記組成物がペースト、クリーム、又はゲルとして処方された場合は、前記組成物は、動物油、植物油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛などを含んでもよい。
【００２１】
前記組成物が、粉末又は噴霧剤として処方された場合は、前記組成物は、乳糖、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム又はポリアミドの粉末を含んでもよい。とりわけ、噴霧剤組成物は、クロロフルオロハイドロカーボン、プロパン／ブタン、又はジメチルエーテルなどの噴射剤を含んでもよい。
【００２２】
溶液又は乳剤向けには、前記組成物は、溶媒、可溶化剤、又は乳化剤を含んでもよい。例としては、水、エタノール、イソプロパノール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイル、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール、又はソルビタンの脂肪酸エステルが挙げられる。
【００２３】
懸濁液向けには、前記組成物は、水、エタノール又はプロピレングリコールなどの液体希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム（aluminum metahydroxide）、ベントナイト、寒天、トラガカントなどの懸濁化剤を含んでもよい。
【００２４】
界面活性剤含有クレンザー向けには、前記組成物は、脂肪族アルコール硫酸塩、脂肪族アルコールエーテル硫酸塩、スルホコハク酸モノエステル、イセチオナート、イミダゾリニウム誘導体、メチルタウリン酸塩、サルコシン酸塩、脂肪酸アミドエーテル硫酸塩、アルキルアミドベタイン、脂肪族アルコール、脂肪酸グリセリド、脂肪酸ジエタノールアミド、植物油、ラノリン誘導体、エトキシ化グリセロール脂肪酸エステルなどを担体として含んでもよい。また、皮膚科学用組成物は、酸化防止剤、安定剤、可溶化剤、ビタミン、顔料及び／又は香料などの一般的なアジュバントを含んでもよい。
【００２５】
ＩＩＩ．抗炎症性化合物及び抗酸化性化合物を有する培養細胞の産生
本明細書で提供される方法により、抗炎症特性及び／又は抗酸化特性を有する化合物を比較的濃縮された量で産生する多産型細胞培養をもたらすことができる。これらの方法の代表的な利点としては、気候条件の調節による信頼性のある持続的なバイオマス源、当該技術分野で既知の手法を使用することでココア豆から単離できる物質の組成と比較して、抽出プロセスの際の抗炎症性化合物及び抗酸化性化合物の分解を最小限に留める、急速かつ効率的な単離法などが挙げられる。
【００２６】
概説すると、本明細書で記載されるのは、テオブロマ（Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ）プラントの様々な組織からのカルス培養の形成である。形成されたカルスを使用して、様々な種類の細胞培養培地を用いた、懸濁培養物を培養する。安定した懸濁細胞培養物が形成されると、細胞を抽出し、ＨＰＬＣ−ＭＳ法による抗炎症含有量及び抗酸化含有量に対する分析を行う。これらの分析から、更なる生産性の最適化のために、所望の抗炎症性化合物及び抗酸化性化合物の産生が可能な懸濁培養物を選択する。
【００２７】
ココア培養物の生成
ココア培養物の生成プロセスをここに概説するが、詳細な例示的プロトコルは、実施例において説明される。抗炎症性化合物及び抗酸化性化合物を産生する細胞培養の開始は、体細胞胚形成に関して記載されるような、例えば、花弁、萼片、仮雄しべなどの花の組織、又は節、節間、若葉、成葉などの花以外の栄養組織などの、様々な植物部位のうちの任意のものに由来する外植片からのカルス及び懸濁培養物の形成によって達成できる。培養細胞の一部を新鮮な培地へと周期的に移すことによって、懸濁培養物は、新鮮な懸濁培地に維持される。継代スケジュール及び播種密度は、細胞増殖性能及び培地からの糖消費によって決定される。
【００２８】
一実施形態では、抗炎症性化合物及び抗酸化性化合物の濃度を変更する方法が提供され、該方法は、所望の濃度の抗炎症性化合物又は抗酸化性化合物を産生するのに十分な条件下で培養を開始することと、生産的な細胞培養を形成するのに十分な生産培地を形成することと、その後、所望の濃度の該化合物を生産するための時間を適切なものとするために該生産的な細胞培養をスケールアップさせることと、を含む。したがって、培養を開始するため、又は増殖性の培養物を形成するために必要とされる条件を変化させることにより、これらの培養物中の、所望の抗炎症性化合物及び／又は抗酸化性化合物の含有量（量）を変更することができる。植物細胞培養物の微小環境の物理的な側面（例えば、光の照射）、及び／又は化学的な側面（例えば、培地の組成又は化学的誘導剤）を変化させて、所望の含有量の変更を達成してもよい。
【００２９】
培養物内でのプロシアニジンの量を増加させるため、例えば、懸濁培地における炭水化物（例えば、スクロース又はグルコース）の濃度を、開始時に又は誘導時に増加させてもよい。更に、植物細胞培養物中の二次代謝産物の産生のために、窒素源（例えば、硝酸アンモニウム）を操作してもよい（Ｎｅｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．３１（１２）：４１４３〜４１４９，１９９２を参照されたい）。加えて、特定のアミノ酸（グルタミン、グリシン、及びセリンなど）の注入も、二次代謝産物の産生に大きく影響する。そのため、抗炎症性化合物及び／又は抗酸化性化合物の産生量を増加するために、Ｔｈｅｏｂｒｏｍａ懸濁培地において、これらのアミノ酸の濃度を上昇させてもよい。加えて、ホルモン類を培地から取り除いて、懸濁培養物における所望の化合物の産生量を増加させてもよい。
【００３０】
また、細胞培養物中の抗炎症性化合物及び／又は抗酸化性化合物含有量を変更するために、光照射条件を変化させることもできる。例えば、照射量を増加させたり、又は露光時間を長くしたりすることにより、光照射を変化させることができる。また、光照射の波長を変化させてもよい。
【００３１】
また、植物細胞培養物の微小環境の操作に関する当該技術分野で既知の、他の変更形態も、本説明の範囲内に含まれるものとして想定されている。
【００３２】
加えて、培養細胞には、回収に先立ち、ある時点でグルコースを投与することができる。グルコースを、スクロース、フルクトースなどの他の糖類で置き換えてもよい。グルコースは、播種の際、播種後１〜７日、播種後７〜１４日、播種後１４〜２１日、又はこれらの組み合わせにて、細胞培養物へと導入されてよい。他の実施例では、培養物は、ホルモン非含有培地で増殖させてもよい。ホルモン非含有培地は、播種の際、播種後１〜７日、播種後７〜１４日、播種後１４〜２１日、又はこれらの組み合わせにて、培養中の細胞へと導入されてよい。
【００３３】
一部の実施形態では、色素をほぼ有さないか、又は色素を有さないように培養細胞株を選択してもよい。例えば、培養細胞は、典型的なココア豆の産生物である、タンニン類及び／又はアントシアニン類を実質的に含まなくてもよい。一実施形態では、培養細胞及び／又はその抽出物は、２％未満、１％未満、０．５％未満のタンニン類、及び／又は１％未満、０．５％未満、０．１％未満、又は０．０１％未満のアントシアニン類を有する。
【００３４】
培養物からのココア細胞の回収
抗炎症性化合物又は抗酸化性化合物を産生するある量のＴｈｅｏｂｒｏｍａ培養細胞が、本明細書で記載されるように増殖され、細胞を回収して、培養培地から該細胞を単離する。懸濁細胞の回収は、いくつかの方法で行うことができる。
【００３５】
細胞培養物が、一旦定常期に達し、化合物の所望の生産性が達成されると、培養物を容器内でコンパクトな塊状に沈殿させ、培地をデカントさせて、大部分が固体の細胞バイオマスを残すようにすることができる。その後、細胞バイオマスを洗浄して、残存した培地を取り除き、同様にデカントする。あるいは、細胞懸濁液を遠心分離してもよく、上清（培地）を捨て、続いて細胞塊を洗浄し、再度遠心分離して液体分を捨てる。第３の選択肢は、細胞培養懸濁液を濾過して培地を取り除くことである。これらの方法のうちのいずれも、数ミリリットル〜１００Ｌ超、１０００Ｌ超、５０００Ｌ超、又は１０，０００Ｌ超の生産規模にわたる細胞培養物生産量に対して、採用され得る。
【００３６】
抽出法
回収した細胞塊は、破砕し、粉砕し、又は摩砕して細胞塊を均質化し、細胞を破壊して、抽出溶媒でこの試料の表面積を拡大させ、かつ抽出部分が確実にこの試料全体を表すものとなるようにする。
【００３７】
テオブロマ細胞培養物からの総ポリフェノールの抽出は、数か所の大きな違いを除いては、ココア豆から総ポリフェノールを抽出するのに使用される手法と類似している。ココア豆の場合には、豆の摩砕後の最初の工程は、摩砕したフレーク（ニブ）を脱脂することである。このプロセスは、ポリフェノール類の損失をもたらす。細胞培養物には、豆ほどの脂肪分がないため、この工程は必須ではない。この工程を省略すると、細胞培養物からの抽出工程の際の、ポリフェノール類の損失が低減する。
【００３８】
更に、脱脂には、ヘキサンなどの溶媒が必要となり、最終抽出物にその溶媒が微量に残ってしまう。この微量の溶媒は、ココア豆から産生した抽出物における不快臭の原因となる。また、この溶媒は、毒性となったり、食品などの特定の用途では望ましくないものとなったりする場合がある。本明細書で記載される、細胞培養物バイオマスからの抽出方法によれば、溶媒（ヘキサンなど）が使用されないため、得られる抽出物には、溶媒の混入、又は溶媒の不快臭がない。
【００３９】
一実施形態では、７０〜８０％の含水メタノール若しくは７０％の含水アセトン、又はこれらの組み合わせを用いて、摩砕され、均質化した細胞から、抗炎症性化合物及び／又は抗酸化性化合物を抽出することができる。または、水及びエタノールも使用されてきたが、これらの溶媒では、オリゴメリックプロシアニジンが部分的にしか抽出されず、高分子量ポリマーは全く抽出されない（Ｇｒａｙｅｒ，Ｉｎ  Ｊ．Ｂ．Ｈａｒｂｏｒｎｅ，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ（Ｖｏｌ．１），ｐｐ  ２８３〜３２３，１９８９．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｌｅｅ＆Ｗｉｄｍｅｒ，Ｉｎ  Ｌ．Ｍ．Ｌ．Ｎｏｌｌｅｔ，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｖｏｌ．１），ｐｐ  ８２１〜８９４，１９９６，Ｂａｓｅｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）。
【００４０】
一実施形態では、抽出溶媒は、エタノールを含んでもよい。このエタノールは、重量又は体積に基づき、エタノールを約２５％〜約１００％、より好ましくは約５０％超、より好ましくは７５％超、及び更により好ましくは９０％超で含む含水組成物であってよい。具体的な例としては、５０％のエタノール、６０％のエタノール、７０％のエタノール、及び８０％のエタノールが挙げられ、図１２では、６０％のエタノールがより好ましいことが示されている。この実施形態では、エタノール抽出溶媒は、他のアルコール類又はケトン類を含んでいない。
【００４１】
一実施形態では、抽出溶媒は、水性有機溶媒などのように、水及び／又はエタノールと共に、他のアルコール類又はケトン類を含んでもよい。例としては、イソプロピルアルコール、エタノール、メタノール、アセトン、酢酸エチル又はこれらの組み合わせが挙げられる。水性有機溶媒は、水を約２５％〜約９９％、より好ましくは約３０％〜約９０％、又は更により好ましくは５０％超含んでもよい。
【００４２】
一実施形態では、抽出溶媒は、細胞塊の量に応じて、様々な量の加工済、又は未加工の細胞と組み合わせられる。抽出溶媒の量は、細胞塊の質量又は体積の５０％以上であってもよく、より好ましくは約７５％以上であってもよく、更により好ましくは約１００％以上であってもよく、更により好ましくは２００％超であってもよい。もちろん、より大きな体積の抽出溶媒を使用してもよい。
【００４３】
一実施形態では、抽出溶媒は、抗酸化性の酸などの酸を含んでもよい。酸の例としては、酢酸、クエン酸、又はアスコルビン酸が挙げられる。前記酸は、抽出組成物の体積の、又は抽出溶媒の体積の約０．０５％〜１０％存在してよく、より好ましくは抽出組成物の体積の、又は抽出溶媒の体積の約０．７５％〜約５％、又は最も好ましくは約０．１％〜約１％又は約２％存在してよい。
【００４４】
テオブロマカカオの培養に関する更なる詳細は、２０１１年１０月３日に出願された、出願人の同時係属中の米国特許出願第１３／２５１，９６０号に見出すことができ、その全体を参照により本明細書に援用する。前述した出願の実施形態は、本明細書で記載される、本発明の様々な特徴と組み合わせて使用されてもよい。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）テオブロマカカオ懸濁細胞の調製
栄養組織（節）由来の懸濁培養物は、カルス由来のものであり、最も性能の高い細胞株を選択して、ムラシゲ・スクーグ（Murashige and Skoog）（ＭＳ）培地で増殖させ、炭素源としてのグルコース（４０ｇ／Ｌ）と併せて、オーキシン（１ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡ及び２ｍｇ／Ｌ  ＩＢＡ）、サイトカイニン（０．００５ｍｇ／Ｌ  ＴＤＺ）、及びＬ−グルタミン（２５０ｍｇ／Ｌ）を補充した。細胞の増殖速度は、細胞培養プロセスにおいて体積生産性を最大化するために、非常に重要である。大きい又は塊状の細胞凝集体を選別すると培養性能が低下するため、継代培養期間毎に、よく増殖した、塊状でない、又は凝集体を形成していない細かな細胞を、優先的に選別して、体積生産性を増加させ、かつ凝集した細胞を排除した。それ故、選択される細胞は、主に黄色の微細な細胞形態を有し、この均質な懸濁細胞の微細な懸濁培養物により、安定した増殖性及び生産性が得られた。
【００４６】
（実施例２）テオブロマカカオ培養物の懸濁細胞の抽出調製物
この実施例では、Ｔ．カカオ培養物の懸濁細胞からポリフェノール化合物を抽出するために開発された方法を記載する。培地のないＴ．カカオの新鮮な懸濁細胞、又は乾燥させ、かつ摩砕したＴ．カカオ細胞を、アセトン：水（７０：３０、ｖ／ｖ）中に再懸濁させ、暗所で室温にて１〜３時間にわたって撹拌した。この懸濁液を、２０分間にわたって３０００〜５０００ｘｇにて遠心分離して、細胞残渣を分離し、上清を回収した。抽出効率を改善させるため、この細胞残渣について、同一のプロセスを繰り返した。固相を廃棄し、上清を使用して、分析及び更なる精製プロセスを行った。その後、この上清を回転真空濃縮機を使用して濃縮し、この濃縮した試料を凍結乾燥機を使用して乾燥させた。この乾燥させた試料を、ＤＭＳＯに溶解することにより、更なる試験用のＴ．カカオ懸濁細胞のＤＭＳＯ抽出物を得た。
【００４７】
（実施例３）均質化したＴ．カカオ全細胞可溶化物の調製
この実施例では、Ｔ．カカオ懸濁培養物の全細胞可溶化物を調製するために開発された方法を記載する。培地のないＴ．カカオの新鮮な細胞、又は乾燥させたＴ．カカオ細胞を、１〜５０％のエタノール（ｖ／ｖ）中に再懸濁させ、暗所で室温にて３０〜９０分にわたって超音波処理した。この懸濁液を、機械式のホモジナイザーで均質化し、回転真空濃縮機を使用してエタノールを蒸発させ、濃縮した。その後、ＤＭＳＯを添加して蒸発したエタノールの体積を補うことによって、更なる試験用のＴ．カカオ全細胞可溶化物を得た。
【００４８】
（実施例４）細胞毒性試験
Ｔ．カカオ細胞抽出物又はＴ．カカオ全細胞可溶化物が細胞毒性であるかどうかを調べるために、次の試験を行った。１０％のＦＢＳ（ウシ胎仔血清）含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中にて、ヒト二倍体線維芽（ＨＤＦ）細胞を培養した。この線維芽細胞は、１ウェル当たりの細胞が１×１０4個となる密度で、９６ウェルプレートに播種され、１２時間にわたって培養された。その後、ＦＢＳ非含有ＤＭＥＭ培地を１〜５００ｍｇ／ＬのＴ．カカオ細胞抽出物又はＴ．ｃａｃａｏ全細胞可溶化物をそれぞれ用いて、２４時間にわたって処置した。細胞抽出物又は細胞可溶化物を用いて処置されなかった試料をコントロールとみなした。この細胞を１０％のＷＳＴ−１溶液を含有するＦＢＳ非含有ＤＭＥＭ培地にて２時間にわたって培養し、その後４５０ｎｍにて吸光度を測定することにより、線維芽細胞の生存率を判定した。結果として、Ｔ．カカオ細胞の抽出物及び全細胞可溶化物では、使用された濃度範囲内においては、細胞生存率が減少しなかった。８０％未満の細胞生存率を示す物質は細胞毒性であるとみなされることから、使用された濃度範囲内において、Ｔ．カカオ懸濁細胞の抽出物及び全細胞可溶化物が、細胞毒性ではないことが確認された。
【００４９】
（実施例５）Ｔ．カカオ懸濁細胞抽出物及びＴ．カカオ細胞可溶化物からの抽出物の抗炎症活性の測定
ニッケルは、天然に存在し得る銀白色の金属である。通常、ニッケルと他の金属とを混合して、合金が生産される。例えば、ニッケル−鉄は、最も一般的なニッケル合金であり、ステンレス鋼の製造において使用される。他のニッケル合金を使用して、コイン、衣服の宝飾品、ブラジャー又はガードルの留め金具、ジッパー、スナップ、ボタン、サスペンダーのクリップ、ヘアピン、スタッド、眼鏡の縁、ペン、ハンドル、台所用品、ペーパークリップ、鍵、及び道具類が製造される。ニッケルアレルギーは、個人の感受性に応じて、最初にかつ／若しくは短期的に、又は繰り返しかつ／若しくは長期的に、ニッケル又はニッケル含有物品に晒されることにより発症する反応である。ニッケルアレルギーはいずれの年齢においても生じ得、典型的には最初に接触してから数日後に、湿疹（アレルギー性接触皮膚炎）として表れる。この湿疹は、水ぶくれを伴う、痒く、乾燥性／硬化性の、かつ赤く／発色性の皮膚発疹を呈する。患部は、通常、接触した部位に限定されるが、体の他の部分に患部が発見されることもあり得る。一度ニッケルアレルギーを発症すると、通常は、しばしば生涯にわたる慢性症状となる。ニッケル化合物は、ヒトにおける接触アレルギー反応の主要な誘発物である。
【００５０】
リポ多糖（ＬＰＳ）、Ｅ．ｃｏｌｉ毒素、及びニッケルは、マクロファージ、線維芽細胞、樹状細胞及びリンパ球などの細胞核中の核因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）を活性化して、炎症性サイトカインの分泌を刺激し、アレルギー性炎症を引き起こす。
【００５１】
本実施例では、Ｔ．カカオ懸濁細胞抽出物及びＴ．カカオ細胞可溶化物が、ヒトの皮膚炎に関連するタンパク質の発現を抑制し、効果的な抗炎症活性を示すことが、記載される。
【００５２】
５−１．基質メタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）の発現の抑制
ＬＰＳ又はニッケルの刺激により、ＭＭＰ−２が過剰発現され、その産生物が、炎症シグナル伝達によって増加する。ＨＤＦ細胞を、ＬＰＳ及び様々な体積のＴ．ｃａｃａｏ細胞抽出物又はＴ．カカオ全細胞可溶化物で処置し、処置から０〜２４時間後に、このＨＤＦ細胞を６時間ごとに回収して、ウエスタンブロット法（Western blotting）によりＭＭＰ−２の発現を定量した。定量されたタンパク質は、ブロモフェノールブルー染色溶液と混合されてから、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけられた。電気泳動の後、このタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、０．５％の脱脂乳含有ＴＢＳ（トリス（Tris）緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．５）に浸漬して、非特異反応を防いだ。その後、この膜を、室温で３時間にわたって、１：５００に希釈したＭＭＰ−２用の抗マウス抗体と反応させてから、二次抗体としての抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。反応が完了した後、この膜をＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液で４回洗浄し、ＥＣＬ（増強化学発光）検出試薬と１分間反応させてから、室温にてＸ線フィルムに感光させた。結果からは、Ｔ．カカオ細胞の抽出物による処置と溶解物による処置との両方で、ＬＰＳによって処置された試料におけるＭＭＰ−２の減少が実証された。
【００５３】
５−２．基質メタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）の発現の抑制
ＬＰＳ又はニッケルの刺激により、ＭＭＰ−９が過剰発現され、その産生物が、炎症シグナル伝達によって増加する。ＨＤＦ細胞を、ＬＰＳ及び様々な体積のＴ．カカオ細胞抽出物又はＴ．カカオ全細胞可溶化物で処置し、処置から０〜２４時間後に、このＨＤＦ細胞を６時間ごとに回収して、ウエスタンブロット法によりＭＭＰ−９の発現を定量した。定量されたタンパク質は、ブロモフェノールブルー染色溶液と混合されてから、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけられた。電気泳動の後、このタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、０．５％の脱脂乳含有ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ  ７．５）に浸漬して、非特異反応を防いだ。その後、この膜を、室温で３時間にわたって、１：５００に希釈したＭＭＰ−９用の抗マウス抗体と反応させてから、二次抗体としての抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。反応が完了した後、この膜をＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液で４回洗浄し、ＥＣＬ（増強化学発光）検出試薬と１分間反応させてから、室温にてＸ線フィルムに感光させた。結果からは、Ｔ．カカオ細胞の抽出物による処置と溶解物による処置との両方で、ＬＰＳによって処置された試料におけるＭＭＰ−９の減少が実証された。
【００５４】
５−３．ＩＬ−１β発現の抑制
ＬＰＳ又はニッケルの刺激により、ＩＬ−１βが過剰発現され、その産生物が、炎症シグナル伝達によって増加する。ＨＤＦ細胞を、ＬＰＳ及び様々な体積のＴ．ｃａｃａｏ細胞抽出物又はＴ．カカオ全細胞可溶化物で処置し、処置から０〜２４時間後に、このＨＤＦ細胞を６時間ごとに回収して、ウエスタンブロット法によりＩＬ−１βの発現を定量した。定量されたタンパク質は、ブロモフェノールブルー染色溶液と混合されてから、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけられた。電気泳動の後、このタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、０．５％の脱脂乳含有ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ  ７．５）に浸漬して、非特異反応を防いだ。その後、この膜を、室温で３時間にわたって、１：５００に希釈したＩＬ−１β用の抗マウス抗体と反応させてから、二次抗体としての抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。反応が完了した後、この膜をＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液で４回洗浄し、ＥＣＬ（増強化学発光）検出試薬と１分間反応させてから、室温にてＸ線フィルムに感光させた。結果からは、Ｔ．カカオ細胞の抽出物による処置と溶解物による処置との両方で、ＬＰＳによって処置された試料におけるＩＬ−１βの減少が実証された。
【００５５】
５−４．ＩＬ−８発現の抑制
ＬＰＳ又はニッケルの刺激により、ＩＬ−８が過剰発現され、その産生物が、炎症シグナル伝達によって増加する。ＨＤＦ細胞を、ＬＰＳ及び様々な体積のＴ．カカオ細胞抽出物又はＴ．カカオ全細胞可溶化物で処置し、処置から０〜２４時間後に、このＨＤＦ細胞を６時間ごとに回収して、ウエスタンブロット法によりＩＬ−８の発現を定量した。定量されたタンパク質は、ブロモフェノールブルー染色溶液と混合されてから、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけられた。電気泳動の後、このタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、０．５％の脱脂乳含有ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ  ７．５）に浸漬して、非特異反応を防いだ。その後、この膜を、室温で３時間にわたって、１：５００に希釈したＩＬ−８用の抗マウス抗体と反応させてから、二次抗体としての抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。反応が完了した後、この膜をＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液で４回洗浄し、ＥＣＬ（増強化学発光）検出試薬と１分間反応させてから、室温にてＸ線フィルムに感光させた。結果からは、Ｔ．カカオ細胞の抽出物による処置と溶解物による処置との両方で、ＬＰＳによって処置された試料におけるＩＬ−８の減少が実証された。
【００５６】
５−５．ＩＬ−１８発現の抑制
ＬＰＳ又はニッケルの刺激により、ＩＬ−１８が過剰発現され、その産生物が、炎症シグナル伝達によって増加する。ＨＤＦ細胞を、ＬＰＳ及び様々な体積のＴ．カカオ細胞抽出物又はＴ．カカオ全細胞可溶化物で処置し、処置から０〜２４時間後に、このＨＤＦ細胞を６時間ごとに回収して、ウエスタンブロット法によりＩＬ−１８の発現を定量した。定量されたタンパク質は、ブロモフェノールブルー染色溶液と混合されてから、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけられた。電気泳動の後、このタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、０．５％の脱脂乳含有ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ  ７．５）に浸漬して、非特異反応を防いだ。その後、この膜を、室温で３時間にわたって、１：５００に希釈したＩＬ−１８用の抗マウス抗体と反応させてから、二次抗体としての抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。反応が完了した後、この膜をＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液で４回洗浄し、ＥＣＬ（増強化学発光）検出試薬と１分間反応させてから、室温にてＸ線フィルムに感光させた。結果からは、Ｔ．カカオ細胞の抽出物による処置と溶解物による処置との両方で、ＬＰＳによって処置された試料におけるＩＬ−１８の減少が実証された。
【００５７】
５−６．ＩＬ−２２発現の抑制
ＬＰＳ又はニッケルの刺激により、ＩＬ−２２が過剰発現され、その産生物が、炎症シグナル伝達によって増加する。ＨＤＦ細胞を、ＬＰＳ及び様々な体積のＴ．カカオ細胞抽出物又はＴ．カカオ全細胞可溶化物で処置し、処置から０〜２４時間後に、このＨＤＦ細胞を６時間ごとに回収して、ウエスタンブロット法によりＩＬ−２２の発現を定量した。定量されたタンパク質は、ブロモフェノールブルー染色溶液と混合されてから、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけられた。電気泳動の後、このタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、０．５％の脱脂乳含有ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ  ７．５）に浸漬して、非特異反応を防いだ。その後、この膜を、室温で３時間にわたって、１：５００に希釈したＩＬ−２２用の抗マウス抗体と反応させてから、二次抗体としての抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。反応が完了した後、この膜をＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液で４回洗浄し、ＥＣＬ（増強化学発光）検出試薬と１分間反応させてから、室温にてＸ線フィルムに感光させた。結果からは、Ｔ．カカオ細胞の抽出物による処置と溶解物による処置との両方で、ＬＰＳによって処置された試料におけるＩＬ−２２の減少が実証された。
【００５８】
５−７．ＩＬ−２３発現の抑制
ＬＰＳ又はニッケルの刺激により、ＩＬ−２３が過剰発現され、その産生物が、炎症シグナル伝達によって増加する。ＨＤＦ細胞を、ＬＰＳ及び様々な体積のＴ．カカオ細胞抽出物又はＴ．カカオ全細胞可溶化物で処置し、処置から０〜２４時間後に、このＨＤＦ細胞を６時間ごとに回収して、ウエスタンブロット法によりＩＬ−２３の発現を定量した。定量されたタンパク質は、ブロモフェノールブルー染色溶液と混合されてから、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけられた。電気泳動の後、このタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、０．５％の脱脂乳含有ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ  ７．５）に浸漬して、非特異反応を防いだ。その後、この膜を、室温で３時間にわたって、１：５００に希釈したＩＬ−２３用の抗マウス抗体と反応させてから、二次抗体としての抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。反応が完了した後、この膜をＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液で４回洗浄し、ＥＣＬ（増強化学発光）検出試薬と１分間反応させてから、室温にてＸ線フィルムに感光させた。結果からは、Ｔ．カカオ細胞の抽出物による処置と溶解物による処置との両方で、ＬＰＳによって処置された試料におけるＩＬ−２３の減少が実証された。
【００５９】
５−８．ＩＬ−３１発現の抑制
ＬＰＳ又はニッケルの刺激により、ＩＬ−３１が過剰発現され、その産生物が、炎症シグナル伝達によって増加する。ＨＤＦ細胞を、ＬＰＳ及び様々な体積のＴ．カカオ細胞抽出物又はＴ．カカオ全細胞可溶化物で処置し、処置から０〜２４時間後に、このＨＤＦ細胞を６時間ごとに回収して、ウエスタンブロット法によりＩＬ−２３の発現を定量した。定量されたタンパク質は、ブロモフェノールブルー染色溶液と混合されてから、１０％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけられた。電気泳動の後、このタンパク質をポリフッ化ビニリデン膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、０．５％の脱脂乳含有ＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液（１０ｍＭトリスＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ  ７．５）に浸漬して、非特異反応を防いだ。その後、この膜を、室温で３時間にわたって、１：５００に希釈したＩＬ−３１用の抗マウス抗体と反応させてから、二次抗体としての抗マウスＩｇＧ抗体と反応させた。反応が完了した後、この膜をＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）−ｔｗｅｅｎ溶液で４回洗浄し、ＥＣＬ（増強化学発光）検出試薬と１分間反応させてから、室温にてＸ線フィルムに感光させた。結果からは、Ｔ．カカオ細胞の抽出物による処置と溶解物による処置との両方で、ＬＰＳによって処置された試料におけるＩＬ−３１の減少が実証された。
【００６０】
（実施例６）Ｔ．カカオ懸濁細胞抽出物及びＴ．カカオ全細胞可溶化物の抗酸化活性の測定
ヒト二倍体線維芽（ＨＤＦ）細胞を使用して、Ｈ2Ｏ2により誘導される活性酸素種（ＲＯＳ）が、Ｔ．カカオ懸濁細胞抽出物及びＴ．カカオ全細胞可溶化物によって抑制されるかどうかを調べた。細胞内の活性酸素種の測定は、２’，７’−ジクロロフルオレセインジアセタート（ＤＣＦＤＡ）蛍光染料のＦＡＣスキャン分析によって行われた。ＤＣＦＤＡでインキュベートしたＨＤＦ細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、トリプシン−ＥＤＴＡを用いた処理によって回収した。その後、５分間にわたる９００ｒｐｍの遠心分離により細胞を回収し、細胞１０，０００個当たりのＲＯＳを測定した。細胞を６ウェルプレートに分注してから、Ｈ2Ｏ2のみにて、又はＨ2Ｏ2とＴ．カカオ懸濁細胞抽出物及びＴ．カカオ全細胞可溶化物とを組み合わせて、処置した。その後、細胞をＨＢＳＳ（ハンクス（Hank's）平衡塩溶液）で２〜３回洗浄し、３０分にわたってＨＢＳＳ中で安定化させた。３７℃で１時間にわたってＤＣＦＤＡで染色した細胞をＨＢＳＳで３回洗浄してから、蛍光顕微鏡を用いて観察した。結果として、Ｔ．カカオ懸濁細胞抽出物及びＴ．カカオ全細胞可溶化物により、ＲＯＳの産生が抑制された。
【００６１】
（実施例７）ＭＭＰ−１（ヒト線維芽細胞コラゲナーゼ）の抑制
Ｔ．カカオ懸濁細胞抽出物及びＴ．カカオ全細胞可溶化物の抗老化活性を測定するために、線維芽細胞を、１ウェル当たりの細胞が２×１０4個となる密度で、２４ウェルプレートに播種し、１２時間にわたって培養して、培養プレートに付着させた。その後、細胞を、ＦＢＳ非含有ＤＭＥＭ培地中で、１２時間にわたって飢餓状態にした。この細胞をＤＰＢＳ緩衝液で洗浄し、３６５ｎｍ、１００ｍＪ／ｃｍ2の照射量にて紫外線を照射した。また、このＤＭＥＭ培地を、それぞれ１０〜５０ｐｐｍのＴ．カカオ懸濁細胞抽出物及びＴ．カカオ全細胞可溶化物を用いて２４時間にわたって処置した。また、ポジティブコントロール群を、１μＭのＲＡ（レチノイン酸）で処置し、追加の１群を、１０〜５０ｐｐｍのＴ．カカオ懸濁細胞抽出物又はＴ．カカオ全細胞可溶化物で処置した。その後、この培地を回収して、遠心分離し、上清中のＭＭＰ−１の量を、ＥＬＩＳＡアッセイによって定量した。ＷＳＴ−１溶液を使用することにより、細胞生存率を測定し、較正した。結果として、Ｔ．カカオ懸濁細胞抽出物及びＴ．カカオ全細胞可溶化物は、優れたＭＭＰ−１産生抑制能と、それに関連する抗老化活性を示した。
【００６２】
（実施例８）メラニン形成の抑制
マウスメラノーマ細胞（Ｂ−１６  Ｆｌ）を、１ウェル当たりの細胞が１×１０5個となる密度で、６ウェルプレート内の１０％  ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地に添加し、細胞の約８０％がウェルの底に付着するまで、５％  ＣＯ2、３７℃の条件下で培養した。その後、この培地をそれぞれ１ｐｐｍ及び１０ｐｐｍのＴ．カカオ懸濁細胞抽出物又はＴ．カカオ全細胞可溶化物を含有する培地と取り換え、細胞を、５％  ＣＯ2、３７℃の条件下で一定期間培養した。また、ポジティブコントロール群を、１ｍＭのコウジ酸で処置し、ネガティブコントロール群は、本試料で処置されなかった。培地を除去した細胞をＰＢＳで洗浄し、トリプシンで処理することにより回収した。この細胞ペレットを、１０％のＤＭＳＯを含有する１００μＬの１ＭのＮａＯＨに添加することによって、細胞内のメラニンを得た。この溶液について、４９０ｎｍでの吸光度をマイクロプレートリーダーを使用して測定し、タンパク質毎のメラニンの量を計算した。タンパク質は、ブラッドフォード（Bradford）アッセイによって定量した。
【００６３】
結果として、Ｔ．カカオ懸濁細胞抽出物及びＴ．カカオ全細胞可溶化物により、メラニン形成が抑制された。
【００６４】
（実施例９）化粧用処方物
実施例９は、本発明の一実施形態による化粧用クリームの処方を提供する。
【００６５】
【表１】
2015521658.tif 000002
【００６６】
（実施例１０）皮膚科学的処方物
実施例１０は、本発明の一実施形態による皮膚科学的処方物の一例を提供する。
【００６７】
【表２】
2015521658.tif 000003
【００６８】
（実施例１１）有用な皮膚科学的軟膏
実施例１１は、本発明の一実施形態による皮膚科学的軟膏の処方を提供する。
【００６９】
【表３】
2015521658.tif 000004
【００７０】
（実施例１２）培養細胞の有効性
実施例１２では、シミュレートされた免疫反応に曝露して、培養細胞抽出物（ココア細胞抽出物）で処置した細胞と、ココア豆からの標準抽出物（標準ココア抽出物）で処置した細胞との細胞生存率の比較を記載する。図１に示されるように、培養細胞からの抽出物は、標準ココア抽出物と比較して、低濃度（例えば、２％未満）にてより効果的であった。したがって、培養細胞は、低濃度においてより効能があり、所望の効果を得るためにより少ない材料しか必要としない。この結果は予期しないものであった。
【００７１】
（実施例１３）シミュレートされたＩＬ−８
実施例１３は、シミュレートされた炎症の条件を示す。シミュレートされた炎症には、ネガティブコントロール（非刺激条件）と、炎症を誘発させるが当該コントロールの抑制は行わない第１のポジティブコントロール（シミュレーション条件）と、が含まれる。第２のポジティブコントロールでは、シミュレートされた炎症反応を抑制する。テスト試料には、培養細胞からの抽出物が０．５％と、１．０％とで含まれ、同濃度の標準抽出物と比較する。図２に示されるように、培養細胞は、シミュレートされた炎症を抑制するための実質的により優れた能力を有しており、これにより、本発明の培養細胞の抗炎症特性が実証された。１％においては、培養細胞の効能は、ポジティブコントロールの効能に迫るものであった。０．５％の濃度でさえ、どちらの濃度の標準抽出物よりも、実質的に優れている。図２のアスタリスクは、次の統計分析に対応する：スチューデントのｔ検定（Student t-Test）、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１及び***ｐ＜０．００１。
【００７２】
以上の記載が、簡明さ及び理解を目的とした実例及び例証によって、幾分詳細に説明されたが、当業者であれば、本開示の趣旨から逸脱することなく、多数かつ様々な変更を行い得ることを理解するであろう。それ故、本明細書に開示した形態はもっぱら例示目的のものであって、本開示の範囲を限定する意図はなく、むしろ、本発明の真の範囲及び趣旨に含まれるすべての変更形態及び代替形態が包含されることを意図するものであることが、明確に理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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