(57)【要約】  本発明は、酵素の助けによりモグロシドを製造する方法に関する。特に本発明は、モグロシドの製造に有用な様々な生合成経路を提唱し、モグロシドの製造に有用な酵素を提供する。さらに本発明は、本発明の方法を実施する際に有用な組換え宿主を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
モグロシド化合物の製造方法であって、本方法が、１または２以上の以下のステップ：
ステップＩＩｂ．ジオキシドスクアレンを、ジオキシドスクアレン→２４，２５エポキシククルビタジエノールへの変換を触媒可能な酵素と接触させること；
ステップＩＶａ．１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール→モグロールへの変換を触媒可能な酵素または酵素混合物と接触させること；
ステップＩＶｂ．１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロールへの変換を触媒可能な酵素と接触させること；
ステップＶ．モグロールおよび／またはグルコシル化モグロールを、モグロールおよび／またはグルコシル化モグロールのグルコシル化を触媒することができてモグロシドを形成する酵素または酵素混合物と接触させること、ここで前記酵素または酵素混合物は、ＵＧＴ１５７６、ＵＧＴ９８およびＵＧＴ ＳＫ９８からなる群から選択されるＵＧＴを含んでいる；
を含む、前記方法。
【請求項２】
方法が以下のステップを含む、請求項１に記載の方法：
ステップＩＩａ．オキシド−スクアレンを、オキシド−スクアレン→ククルビタジエノールへの変換を触媒可能な酵素と接触させること；
ステップＩＩＩａ．前記ククルビタジエノールを、ククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールへのヒドロキシル化を触媒可能な酵素と接触させること；
ステップＩＶａ．前記１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール→モグロールへの変換を触媒可能な酵素と接触させること；
ステップＶ．前記モグロールを、モグロール→モグロシドへのグルコシル化を触媒可能な酵素または酵素混合物と接触させること；
および任意に、前記モグロシドを単離すること。
【請求項３】
方法が以下のステップを含む、請求項１に記載の方法：
ステップＩＩｂ．ジオキシド−スクアレンを、ジオキシド−スクアレン→２４，２５エポキシククルビタジエノールへの変換を触媒可能な酵素と接触させること；
ステップＩＩＩｂ．前記２４，２５エポキシククルビタジエノールを、２４，２５エポキシククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールへのヒドロキシル化を触媒可能な酵素と接触させること；
ステップＩＶｂ．前記１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロールへの変換を触媒可能な酵素と接触させること；
ステップＶ．前記モグロールを、モグロール→モグロシドへのグルコシル化を触媒可能な酵素または酵素混合物と接触させること；
および任意に、前記モグロシドを単離すること。
【請求項４】
方法が以下のステップを含む、請求項１に記載の方法：
ステップＩＩＩａ．ククルビタジエノールを、ククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールへのヒドロキシル化を触媒可能な酵素と接触させること；
ステップＩＶａ．前記１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール→モグロールへの変換を触媒可能な酵素と接触させること；
ステップＶ．前記モグロールを、モグロール→モグロシドへのグルコシル化を触媒可能な酵素または酵素混合物と接触させること；
および任意に、前記モグロシドを単離すること。
【請求項５】
方法が以下のステップを含む、請求項１に記載の方法：
ステップＩＩＩｂ．２４，２５エポキシククルビタジエノールを、２４，２５エポキシククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールへのヒドロキシル化を触媒可能な酵素と接触させること；
ステップＩＶｂ．前記１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロールへの変換を触媒可能な酵素と接触させること；
ステップＶ．前記モグロールを、モグロール→モグロシドへのグルコシル化を触媒可能な酵素または酵素混合物と接触させること；
および任意に、前記モグロシドを単離すること。
【請求項６】
方法が以下のステップを含む、請求項１に記載の方法：
ステップＶ．モグロールおよび／またはグルコシル化モグロールを、モグロールおよび／またはグルコシル化モグロールのグルコシル化を触媒することができてモグロシドを形成する酵素または酵素混合物と接触させること、ここで前記酵素または酵素混合物は、ＵＧＴ１５７６、ＵＧＴ９８およびＵＧＴ ＳＫ９８からなる群から選択されるＵＧＴを含んでいる。
【請求項７】
モグロシドがＣ２４でグリコシル化される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
モグロシドがＣ３でグリコシル化される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
モグロシドが、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＶおよびモグロシドＶからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
モグロシドが、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＩＡ、モグロシドＩＩＩＡ１、シアメノシドおよびモグロシドＶからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
以下の１または２種以上の異種核酸を含む、組換え宿主細胞：
ＩＩｂ．ジオキシド−スクアレン→２４，２５エポキシククルビタジエノールへの変換を触媒可能な酵素をコードする異種核酸；
ＩＶａ．１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール→モグロールへの変換を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＶｂ．１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロールへの変換を触媒可能な酵素をコードする異種核酸；
Ｖ．モグロールおよび／またはグルコシル化モグロールのグルコシル化を触媒することができてモグロシドを形成する酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）、ここで前記酵素または酵素混合物は、ＵＧＴ１５７６、ＵＧＴ９８およびＵＧＴ ＳＫ９８からなる群から選択されるＵＧＴを含んでいる。
【請求項１２】
組換え宿主細胞が以下の異種核酸を含む、請求項１１に記載の組換え宿主：
ＩＩａ．ステップＩＩａ（オキシド−スクアレン→ククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＩＩａ．ステップＩＩＩａ（ククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＶａ．ステップＩＶａ（１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール→モグロール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
Ｖ．ステップＶ（モグロール→モグロシド）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）。
【請求項１３】
組換え宿主が以下の異種核酸を含む、請求項１１に記載の組換え宿主：
ＩＩＩａ．ステップＩＩＩａ（ククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＶａ．ステップＩＶａ（１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール→モグロール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
Ｖ．ステップＶ（モグロール→モグロシド）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）。
【請求項１４】
組換え宿主が以下の異種核酸を含む、請求項１１に記載の組換え宿主：
ＩＩｂ．ステップＩＩｂ（ジオキシド−スクアレン→２４，２５エポキシククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＩＩｂ．ステップＩＩＩｂ（２４，２５エポキシククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＶｂ．ステップＩＶｂ（１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
Ｖ．ステップＶ（モグロール→モグロシド）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）。
【請求項１５】
組換え宿主が以下の異種核酸を含む、請求項１１に記載の組換え宿主：
ＩＩＩｂ．ステップＩＩＩｂ（２４，２５エポキシククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＶｂ．ステップＩＶｂ（１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
Ｖ．ステップＶ（モグロール→モグロシド）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）。
【請求項１６】
組換え宿主が以下の異種核酸を含む、請求項１１に記載の組換え宿主：
Ｖ．モグロールおよび／またはグルコシル化モグロールのグルコシル化を触媒することができてモグロシドを形成する酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）、ここで前記酵素または酵素混合物は、ＵＧＴ１５７６、ＵＧＴ９８およびＵＧＴ ＳＫ９８からなる群から選択されるＵＧＴを含んでいる。
【請求項１７】
組換え宿主が、スクアレンエポキシダーゼをコードする異種核酸をさらに含む、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項１８】
組換え宿主が、ラノステロールシンターゼの発現を低下するように改変されている、請求項１１〜７のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項１９】
方法が、以下： 
ｉ）請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の組換え宿主を提供すること；
ｉｉ）前記組換え宿主を、培養培地中で培養すること；
ｉｉｉ）任意に、前記モグロシドを培養培地および／または組換え宿主から単離すること；
を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
オキシド−スクアレン→ククルビタジエノールの変換を触媒可能な酵素が、配列番号４３のククルビタジエノールシンターゼ、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法、または請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項２１】
ジオキシド−スクアレン→２４，２５エポキシククルビタジエノールの変換を触媒可能な酵素が、配列番号４３のククルビタジエノールシンターゼ、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法、または請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項２２】
ククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールの変換を触媒可能な酵素が、配列番号４４のＣＹＰ５４９１、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法、または請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項２３】
２４，２５エポキシククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールの変換を触媒可能な酵素が、配列番号４４のＣＹＰ５４９１、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法、または請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項２４】
１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール→モグロールの変換を触媒可能な酵素または酵素混合物が、配列番号３８のエポキシドヒドロラーゼ１、配列番号４０のエポキシドヒドロラーゼ２、およびこれらと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するこれらの機能的相同体、からなる群から選択されるポリペプチドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法、または請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項２５】
１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロールの変換を触媒可能な酵素が、配列番号３８のエポキシドヒドロラーゼ１、配列番号４０のエポキシドヒドロラーゼ２、およびこれらと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するこれらの機能的相同体、からなる群から選択されるポリペプチドである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法、または請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【請求項２６】
モグロール→モグロシドの変換を触媒可能な酵素または酵素混合物が、配列番号４８のＵＧＴ１６７５、配列番号５３のＵＧＴ９８、配列番号５０のＵＧＴ ＳＫ９８、およびこれらと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するこれらの機能的相同体、からなる群から選択されるＵＧＴを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法、または請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の組換え宿主。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モグロシド化合物の生合成のための方法および材料に関し、より具体的には、シトクロムＰ４５０酵素を使用してモグロールを製造すること、および／またはウリジン−５’−二リン酸（ＵＤＰ）依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を使用してモグロールをグリコシル化し、種々のモグロールグリコシド（モグロシド）を製造することが関与する方法に関する。方法はまた、モグロール製造用の基質の生合成に関与する酵素の使用も含んでよい。
【背景技術】
【０００２】
モグロシドは、Momordica grosvenori（Swingle）としても知られているSiraitia grosvenorii（Swingle）の果実から単離された、トリテルペングリコシドのファミリーである。果実の抽出物は、商業的に天然の甘味料として使用されている。４種の主要な化合物であるモグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、および１１−オキソモグロシドＶがSiraitia grosvenorii（Swingle）の果実から同定されており、これらは果実の甘みの素である（図１参照）。モグロシドＶは、これら４種の化合物のうち最も豊富であり、乾燥果実の約０．５７％（ｗ／ｗ）を占め、続いてモグロシドＩＶ、およびシアメノシドＩであり、これらはそれぞれ４つのグルコース部分を含む。１１−オキソモグロシドＶは、ヒドロキシルの代わりにケトン基をＣ−１１に有する。例えば、Takemoto, et al., Yakugaku Zasshi, 103, 1151-1154; 1155-1166; 1167-1173, (1983)；Kasai, et al., Agric. Biol. Chem. 53、 3347-3349 (1989)；Matsumoto, Chem. Pharm. Bull. 38, 2030-2032 (1990)；およびPrakash, et al., J.Carbohydrate Chem. 30, 16-26 (2011)を参照。しかし、モグロシドの製造に関与する酵素は、未だに同定されていない。
Tang et al. BMC Genomics 2011, 12:343には、７種のＣＹＰ４５０および５種のＵＤＰＧが、モグロシド生合成に関与する可能性のある候補として記載されている。しかしこの文献では、モグロシド生合成に関与するいかなるＣＹＰおよびＵＤＰＧも、具体的に同定されていない。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、モグロシド化合物の生合成のための方法および材料を提供する。興味深いことに、本発明は、モグロシド生合成に関与する酵素を提供する。
モグロシド生合成にはいくつかのステップが関与し得るため、本発明の一側面は、これらの各ステップを触媒することができる酵素を提供することである。しかし本方法はまた、いくつかのステップのみを酵素的に実施し、一方で他のステップは別の手段により行うことも予想されている。
一側面において、本明細書は、モグロシド化合物の製造方法を特徴とする。
【０００４】
したがって本発明は、１または２以上の以下のステップを含む、モグロシドの製造方法を提供する：
ステップＩａ．オキシド−スクアレンのレベルを強化すること
ステップＩｂ．ジオキシド−スクアレンのレベルを強化すること
ステップＩＩａ．オキシド−スクアレン→ククルビタジエノール
ステップＩＩｂ．ジオキシド−スクアレン→２４，２５エポキシククルビタジエノール
ステップＩＩＩａ．ククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール
ステップＩＩＩｂ．２４，２５エポキシククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール
ステップＩＶａ．１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール→モグロール
ステップＩＶｂ．１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロール
ステップＶ．モグロール→モグロシド
上記の各ステップを実行するための方法は、本明細書の以下に記載される。特に、上記の各ステップのために有用な酵素または酵素混合物は、本明細書において以下に詳細に記載される。
【０００５】
本発明はまた、１または２以上の以下の異種核酸を含む組換え宿主を特徴とする：
ＩＩａ．ステップＩＩａ（オキシド−スクアレン→ククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）
ＩＩｂ．ステップＩＩｂ（ジオキシド−スクアレン→２４，２５エポキシククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）
ＩＩＩａ．ステップＩＩＩａ（ククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）
ＩＩＩｂ．ステップＩＩＩｂ（２４，２５エポキシククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）
ＩＶａ．ステップＩＶａ（１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール→モグロール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）
ＩＶｂ．ステップＩＶｂ（１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）
Ｖ．ステップＶ（モグロール→モグロシド）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）
【０００６】
異種核酸に加えて、組換え宿主は、ステップＩａおよび／またはステップＩｂを達成するために改変されていてもよい。
特に別に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を、本発明を実施するために用いることができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含み、本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は単なる例示であり、限定することを意図するものではない。本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。出願人は、特許法における標準的な慣行に従い、移行句「含む」、「から本質的になる」、または「からなる」を使用して、開示された全ての発明を代替的に請求する権利を留保する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、モグロシドＶ、モグロシドＩＶ、シアメノシドＩ、および１１−オキソモグロシドＶの化学構造を示す図である。
【図２】図２は、モグロシドのグルコースからの製造経路の概略図である。
【図３】図３は、モグロールグリコシド（モグロシド）の、スクアレンからの製造の概略図である。
【図４】図４は、モグロールのククルビタジエノールからの形成のためのＰ４５０経路であって、発明者により提唱された経路（上）、および公開されている経路（下）の概略図である。
【図５】図５は、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＶ、およびモグロシドＶの、モグロールからのＵＧＴを使用した生合成を示す図である。
【０００８】
【図６】図６は、ペクチナーゼおよび／またはセルラーゼとのインキュベーション後の、モグロシドＶから得られる生成物の概略図である。
【図７】図７は、S grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ２を発現するプラスミドで形質転換された酵母株EFSC3027からの試料中の、テトラヒドロキシスクアレンのプロトン＋Ｎａ＋付加体に対応する、ＬＣ−ＭＳ質量ピーク５０１を示す図である。
【図８】図８は、酵母株におけるラノステロールのＬＣ−ＭＳクロマトグラムのピーク（上パネル）、および、ククルビタジエノールシンターゼを発現する酵母株EFSC3498における、ククルビタジエノールとラノステロールのＬＣ−ＭＳクロマトグラムのピーク（下のパネル）を示す図である。
【図９】図９は、ＣＹＰ５４９１とＣＰＲ４４９７が酵母株EFSC3498中で発現された場合の、３つのピークを有するＬＣ−ＭＳクロマトグラム（上のパネル）を示し、一方下のパネルには、これらの３つのピークの断片化スペクトルを示す。３つのピークの質量（４４３．３８、４４１．３７および４５７．３６）は、それぞれヒドロキシル化ククルビタジエノール、オキソククルビタジエノールおよびヒドロキシ＋オキソククルビタジエノールの、プロトン付加体の重量に対応する。
【０００９】
【図１０Ａ】図１０Ａは、本発明が提案する、オキシド−スクアレンからモグロールおよび１１−オキソーモグロールへの経路を示す図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、本発明が提案する、ジオキシド−スクアレンからモグロールおよび１１−オキソーモグロールへの経路を示す図である。
【図１１】図１１Ａは、参照モグロシドＩＡ１のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示し、一方図１１Ｂは、５０μＭのモグロールを供給した培養物中でＵＧＴ１５７６を発現する酵母株EFSC1563の試料の、ＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。
【図１２】図１２Ａは、ＵＧＴ ＳＫ９８とＵＧＴ１５７６を共発現する酵母株EFSC1563からの試料のＬＣ−ＭＳクロマトグラムであり、ジ−グリコシル化モグロール（モグロシドＩＩＡ）の製造を示す。図１２Ｂは、ＵＧＴ９８とＵＧＴ１５７６を共発現する酵母株EFSC1563からの試料のＬＣ−ＭＳクロマトグラムであり、ジおよびトリグリコシル化モグロールの製造を示す（中および下のフレーム）。
【図１３】図１３は、本発明により提案された、モグロールからモグロシドＩＩＩＡ１への経路を示す図である。
【００１０】
発明の詳細な説明
モグロシドの製造方法
本文書は、微生物、植物細胞、または植物などの組換え宿主を、モグロール（トリテルペンコア）および種々のモグロールグリコシド（モグロシド）の生合成に有用なポリペプチドを発現するように発達させ得るという、本発明に基づく。アグリコンモグロールは、異なる数のグルコース部分でグリコシル化されて、様々なモグロシド化合物を形成する。組換え微生物は、特に有用な宿主である。組換え宿主は、本明細書の以下のセクション「組換え宿主」に記載された、任意の組換え宿主であってよい。様々な微生物のシャーシ内でのこれらの生合成ポリペプチドの発現は、モグロールおよびそのグリコシドが、糖、グリセロール、ＣＯ２、Ｈ２および太陽光等のエネルギーおよび炭素源から、一貫した再現可能な方法で製造されることを可能にする。図２は、モグロールおよび様々なモグロシドの、グルコースからの製造のための経路の概略図を提供する。
【００１１】
本発明の一側面は、１または２以上の以下のステップを含む、モグロシドの製造方法を提供することである：
ステップＩａ．オキシド−スクアレンのレベルを強化すること
ステップＩｂ．ジオキシド−スクアレンのレベルを強化すること
ステップＩＩａ．オキシド−スクアレン→ククルビタジエノール
ステップＩＩｂ．ジオキシド−スクアレン→２４，２５エポキシククルビタジエノール
ステップＩＩＩａ．ククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール
ステップＩＩＩｂ．２４，２５エポキシククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール
ステップＩＶａ．１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール→モグロール
ステップＩＶｂ．１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロール
ステップＶ．モグロール→モグロシド
これらの各ステップを実行するための方法および材料は、本明細書において以下により詳細に記載される。方法のステップの各々は、生成物の生成をもたらす。前記生成物はまた、本明細書において「中間生成物」と呼んでもよい。各ステップは、「前駆体分子」とも称される基質を使用する。中間生成物はまた、続くステップのための前駆体分子として機能できることが、上記から明らかである。
【００１２】
したがって本発明は、次のステップを含んでもよい、モグロシドの製造方法を提供する：
ステップＩａ．オキシド−スクアレンのレベルを強化すること
ステップＩＩａ．オキシド−スクアレン→ククルビタジエノール
ステップＩＩＩａ．ククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール
ステップＩＶａ．１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール→モグロール
ステップＶ．モグロール→モグロシド
および任意に、前記モグロシドを単離すること。
本発明はまた、次のステップを含んでもよい、モグロシドの製造方法を提供する：
ａ）オキシド−スクアレンを提供すること
ｂ）上記定義のステップＩＩａ、ＩＩＩａ、ＩＶａおよびＶを実行すること
ｃ）任意に、前記モグロシドを単離すること。
【００１３】
本発明はまた、次のステップを含んでもよい、モグロシドの製造方法を提供する：
ステップＩｂ．ジオキシド−スクアレンのレベルを強化すること
ステップＩＩｂ．ジオキシド−スクアレン→２４，２５エポキシククルビタジエノール
ステップＩＩＩｂ．２４，２５エポキシククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール
ステップＩＶｂ．１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロール
ステップＶ．モグロール→モグロシド
および任意に、前記モグロシドを単離すること。
本発明はまた、次のステップを含み得る、モグロシドの製造方法を提供する：
ａ）ジオキシド−スクアレンを提供すること
ｂ）上記定義のステップＩＩｂ、ＩＩＩｂ、ＩＶｂおよびＶを実行すること
ｃ）任意に、前記モグロシドを単離すること。
【００１４】
本発明はまた、モグロシドが高度グリコシル化モグロシドである、モグロシドの製造方法であって、方法が次のステップを含んでもよい、前記方法を提供する：
ａ）ククルビタジエノールを提供すること
ｂ）上記定義のステップＩＩＩａ、ＩＶａおよびＶを実行すること
ｃ）任意に、前記モグロシドを単離すること。
本発明はまた、モグロシドが高度グリコシル化モグロシドである、モグロシドの製造方法であって、方法が次のステップを含んでもよい、前記方法を提供する：
ａ）２４，２５エポキシククルビタジエノールを提供すること
ｂ）上記定義のステップＩＩＩｂ、ＩＶｂおよびＶを実行すること
ｃ）任意に、前記モグロシドを単離すること。
【００１５】
本発明は、方法が次のステップを含んでもよい、モグロシドの製造方法を提供する：
ａ）モグロールを提供すること
ｂ）上記定義のステップＶを実行すること
ｃ）任意に、前記モグロシドを単離すること。
本発明は、方法が次のステップを含んでもよい、モグロールの製造方法を提供する：
ａ）ジオキシド−スクアレンを提供すること
ｂ）上記定義のステップＩＩｂ、ＩＩｂ、およびＩＶｂを実行すること
ｃ）任意に、前記モグロールを単離すること。
【００１６】
一般に方法は、in vitroまたはin vivoのいずれかで実施されてよい。いくつかのステップがin vitroで実施され、他はin vivoで行うことも、本発明内に含まれる。したがって例えば、最初のステップはin vitroで実施され、その後中間生成物を、この方法の残りのステップを実施可能な組換え宿主細胞に供給することができる。代替的に、最初のステップはin vivoで実施され、その後中間生成物を、in vitroで実施される続く１または２以上のステップのための基質として用いることができる。他の組み合わせも考えられる。
前記方法をin vitroで実施する場合、方法のステップの各々は、別々に行ってもよい。代替的に、ステップの１または２以上を、同じ混合物内で実施してもよい。方法のステップの一部または全てを別々に実施する態様において、各ステップの中間生成物は、次のステップを実施する前に、精製または部分的に精製してもよい。
【００１７】
前記方法をin vivoで実施する場合、方法は、１または２以上の前記酵素を発現する１つの組換え宿主の使用を採用するか、または、１または２以上の前記酵素を発現するいくつかの組換え宿主の使用を採用してもよい。方法はまた、組換えおよび非組換え宿主の混合物を使用することもできる。１より多くの宿主を使用する場合、宿主は共培養してもよく、またはそれらは別々に培養してもよい。宿主を別々に培養する場合、中間生成物を回収し、任意に精製または部分的に精製し、中間生成物を基質として使用して、組換え宿主に供給することができる。本発明で使用する有用な組換え宿主は、以下に記載されている。
前記オキシド−スクアレン、ジオキシド−スクアレン、ククルビタジエノール、２４，２５エポキシククルビタジエノールまたはモグロールは、任意の適切な様式で提供することができる。例えば前記オキシド−スクアレン、ジオキシドスクアレン、ククルビタジエノール、２４，２５エポキシククルビタジエノールまたはモグロールは、単離された形態で、または組成物もしくは抽出物の一部として提供することができる。方法をin vivoで実施する本発明の態様において、前記オキシド−スクアレン、ジオキシド−スクアレン、ククルビタジエノール、２４，２５エポキシククルビタジエノールまたはモグロールを、培養培地に添加することができる。また、オキシド−スクアレン、ジオキシドスクアレン、ククルビタジエノール、２４，２５エポキシククルビタジエノールまたはモグロールを内因的に発現する組換え宿主を使用することも、本発明の範囲内に含まれる。
【００１８】
本明細書の以下に記載の組換え宿主は、モグロシド化合物を製造するための方法において使用することができる。例えば、組換え宿主が微生物である場合、方法は、本発明の方法のステップ（単数または複数）を触媒する１または２種以上の酵素、例えばシンターゼ、ヒドロラーゼ、ＣＹＰ４５０および／またはＵＧＴが発現する条件下で、組換え微生物を培養培地中で増殖させることを含むことができる。組換え微生物は、流加培養または連続プロセスで増殖させることができる。一般的には、組換え微生物は発酵槽中で、規定の１または２以上の温度において所望の時間、増殖させる。
細胞溶解物は、１または２以上の酵素を発現する組換え宿主から調製することができ、モグロシド化合物を製造できるように、基質と接触させるために使用することができる。例えば、細胞溶解物は、１または２種以上のＵＧＴを発現する組換え宿主から調製し、モグロシド化合物を製造できるように、モグロールと接触させるために使用することができる。
【００１９】
いくつかの態様において、モグロシド化合物は、例えばモグロールなどの前駆体分子を含む原材料を供給された、全細胞を用いて製造することができる。原材料は、細胞増殖の間または細胞増殖後に、供給してよい。全細胞は、懸濁液中にあっても、または固定化されていてもよい。全細胞は、発酵ブロス中または反応緩衝液中であってもよい。いくつかの態様において、透過化剤が、基質を細胞内へ効率的に移動させるために必要とされることもある。
製品、基質および中間体のレベルは、公開された方法に従い、分析用に培養培地から試料を抽出することにより、決定することができる。モグロシド化合物は、培養物または培養培地から、当技術分野で知られている様々な技術を用いて回収することができる。
【００２０】
組換え宿主
本文書はまた、組換え宿主を特徴とする。本明細書で使用する用語「組換え宿主」は、そのゲノムが、少なくとも１つの組み込まれたＤＮＡ配列により増強されているところの宿主を指すことを意図する。前記組み込まれたＤＮＡ配列は、１または２以上のポリペプチドをコードする異種核酸であってよい。かかるＤＮＡ配列としては、限定はされないが、天然に存在しない遺伝子、通常はＲＮＡに転写されたりタンパク質に翻訳されたりしない（「発現されない」）ＤＮＡ配列、および非組換え宿主中に導入することが望まれるその他の遺伝子またはＤＮＡ配列が挙げられる。典型的には、本明細書に記載の組換え宿主のゲノムは、１または２以上の組換え遺伝子の安定な導入により増強されることが理解されるであろう。前記組換え遺伝子は、１または２以上のポリペプチドをコードする異種核酸であってよい。一般的には、導入されたＤＮＡまたは異種核酸は、ＤＮＡのレシピエントである宿主に元々は存在していないものであるが、与えられた宿主からのＤＮＡ断片を単離すること、および続いて同じ宿主にそのＤＮＡの１または２以上の追加のコピーを導入して、例えば遺伝子の産物の産生を増強し、または遺伝子の発現パターンを変化させることは、本発明の範囲内である。いくつかの例において、導入されたＤＮＡまたは異種核酸は、例えば相同組換えまたは部位特異的突然変異誘発によって、内因性遺伝子もしくはＤＮＡ配列を改変するかまたは置き換える。
【００２１】
特に、本発明による組換え宿主は、以下の１または２種以上の異種核酸を含む：
ＩＩａ．ステップＩＩａ（オキシド−スクアレン→ククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＩｂ．ステップＩＩｂ（ジオキシドスクアレン→２４，２５エポキシククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸；
ＩＩＩａ．ステップＩＩＩａ（ククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＩＩｂ．ステップＩＩＩｂ（２４，２５エポキシククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＶａ．ステップＩＶａ（１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール→モグロール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＶｂ．ステップＩＶｂ（１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
Ｖ．ステップＶ（モグロール→モグロシド）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）。
【００２２】
異種核酸に加えて、前記組換え宿主は、ステップＩａおよび／またはステップＩｂを達成するために改変されていてもよい。
これらのステップの各々を触媒可能な酵素は、本明細書の以下にさらに詳細に記載される。
本発明の一態様において、本発明による組換え宿主は、以下の異種核酸を含んでよい：
ＩＩａ．ステップＩＩａ（オキシド−スクアレン→ククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＩＩａ．ステップＩＩＩａ（ククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＶａ．ステップＩＶａ（１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール→モグロール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
Ｖ．ステップＶ（モグロール→モグロシド）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）、
および任意に、前記組換え宿主はさらに、ステップＩａを達成するために改変されていてもよい。
前記組換え宿主細胞は特に、モグロシドを製造する方法において有用である。
【００２３】
本発明の一態様において、本発明による組換え宿主は、以下の異種核酸を含んでよい：
ＩＩＩａ．ステップＩＩＩａ（ククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＶａ．ステップＩＶａ（１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール→モグロール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
Ｖ．ステップＶ（モグロール→モグロシド）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）。
前記組換え宿主細胞は特に、ククルビタジエノールを提供するステップを含む、モグロシドを製造する方法において有用である。
【００２４】
本発明の一態様において、本発明による組換え宿主は、以下の異種核酸を含んでよい：
Ｖ．ステップＶ（モグロール→モグロシド）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）。
前記組換え宿主細胞は特に、モグロールを提供するステップを含む、モグロシドを製造する方法において有用である。
本発明の一態様において、本発明による組換え宿主は、以下の異種核酸を含んでよい：
ＩＩｂ．ステップＩＩｂ（ジオキシドスクアレン→２４，２５エポキシククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＩＩｂ．ステップＩＩＩｂ（２４，２５エポキシククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＶｂ．ステップＩＶｂ（１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
Ｖ．ステップＶ（モグロール→モグロシド）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）。
および任意に、前記組換え宿主は、ステップＩｂを達成するために改変されていてもよい。
前記組換え宿主細胞は特に、モグロシドを製造する方法において有用である。
【００２５】
本発明の一態様において、本発明による組換え宿主は、以下の異種核酸を含んでよい：
ＩＩＩｂ．ステップＩＩＩｂ（２４，２５エポキシククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＶｂ．ステップＩＶｂ（１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
Ｖ．ステップＶ（モグロール→モグロシド）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）。
前記組換え宿主細胞は特に、２４，２５エポキシククルビタジエノールを提供するステップを含む、モグロシドを製造する方法において有用である。
【００２６】
本発明の一態様において、本発明による組換え宿主は、以下の異種核酸を含んでよい：
ＩＩｂ．ステップＩＩｂ（ジオキシド−スクアレン→２４，２５エポキシククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＩＩｂ．ステップＩＩＩｂ（２４，２５エポキシククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）；
ＩＶｂ．ステップＩＶｂ（１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロール）を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸；
および任意に、前記組換え宿主は、ステップＩｂを達成するために改変されていてもよい。
前記組換え宿主細胞は特に、モグロールを製造する方法において有用である。
適切な組換え宿主は、微生物、植物細胞および植物を含む。
【００２７】
したがって、一態様において、モグロシド化合物を製造する組換え宿主は、７３Ｃ３、７３Ｃ６、８５Ｃ２、７３Ｃ５および７３Ｅ１からなる群から選択される少なくとも第１のＵＧＴをコードする組換え遺伝子、およびＵＧＴ９８、ＵＧＴ１４９５、ＵＧＴ１８１７、ＵＧＴ５９１４、ＵＧＴ８４６８およびＵＧＴ１０３９１からなる群から選択される少なくとも第２のＵＧＴをコードする組換え遺伝子を含むことができる。例えば、組換え宿主は、７３Ｃ３、７３Ｃ６、８５Ｃ２および７３Ｅ１から選択される少なくとも１つのＵＧＴをコードする組換え遺伝子；７３Ｃ５をコードする組換え遺伝子；およびＵＧＴ９８、ＵＧＴ１４９５、ＵＧＴ１８１７、ＵＧＴ５９１４、ＵＧＴ８４６８およびＵＧＴ１０３９１からなる群から選択される少なくとも１つのＵＧＴをコードする組換え遺伝子を、含むことができる。以下の１または２以上もまた、組換え宿主に含めることができる：ククルビタジエノールシンターゼをコードする組換え遺伝子(例えばCucurbita pepoまたはモンクフルーツ（ラカンカ）より)；ＣＹＰ５３３、ＣＹＰ９３７、ＣＹＰ１７９８、ＣＹＰ１９９４、ＣＹＰ２０４８、ＣＹＰ２７４０、ＣＹＰ３４０４、ＣＹＰ３９６８、ＣＹＰ４１１２、ＣＹＰ４１４９、ＣＹＰ４４９１、ＣＹＰ５４９１、ＣＹＰ６４７９、ＣＹＰ７６０４、ＣＹＰ８２２４、ＣＹＰ８７２８、ＣＹＰ１００２０、およびＣＹＰ１０２８５から選択されるシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする組換え遺伝子（それぞれ、配列番号３〜２０）；およびスクアレンシンターゼをコードする組換え遺伝子（例えば、Gynostemma pentaphyllumまたはArabidopsis thalianaより）。ＣＹＰ５４９１は、以前にはＣＹＰ８７とも称されている。
【００２８】
組換え宿主中の遺伝子の少なくとも１つは、組換え遺伝子であり、使用のために選択された種または株に依存する、特定の１または２以上の組換え遺伝子である。追加の遺伝子または生合成モジュールを含むことにより、モグロールおよびモグロシドの収率を増加させ、エネルギーおよび炭素源をモグロールおよびモグロシドに変換する効率を向上させ、および／または細胞培養物もしくは植物からの生産性を向上させることができる。
組換え宿主はさらに、ククルビタジエノールシンターゼをコードする組換え遺伝子、および／またはシトクロムＰ４５０ポリペプチドをコードする組換え遺伝子（例えば、ＣＹＰ５３３、ＣＹＰ９３７、ＣＹＰ１７９８、ＣＹＰ１９９４、ＣＹＰ２０４８、ＣＹＰ２７４０、ＣＹＰ３４０４、ＣＹＰ３９６８、ＣＹＰ４１１２、ＣＹＰ４１４９、ＣＹＰ４４９１、ＣＹＰ５４９１、ＣＹＰ６４７９、ＣＹＰ７６０４、ＣＹＰ８２２４、ＣＹＰ８７２８、ＣＹＰ１００２０、またはＣＹＰ１０２８５）、および／またはスクアレンシンターゼをコードする組換え遺伝子を含むことができる。
【００２９】
また本発明に含まれるのは、組換え宿主を改変し得て、グルカナーゼ活性、特にモグロシドの脱グルコシル化をもたらし得るグルカナーゼ活性を、減少させることである。したがって組換え宿主は、例えばエキソ−１，３−β−グルカナーゼ活性を低減する、または消滅させるために改変することができる。組換え宿主が酵母である本発明の態様において、これは、EXG1遺伝子および／またはEXG2遺伝子の欠失により達成することができ、これらは両者とも、エキソ−１，３−β−グルカナーゼをコードする遺伝子である。
用語「組換え遺伝子」とは、レシピエント宿主に導入される遺伝子またはＤＮＡ配列を指し、これは、同一または類似の遺伝子またはＤＮＡ配列がすでに宿主に存在しているかどうかには関係しない。用語「異種核酸」とは、レシピエント宿主に導入される核酸を指し、ここで該宿主は、該核酸を内因的に含まないものである。この文脈における「導入される」または「増強される」とは、当技術分野において、人の手によって導入または増強されることを意味することが知られている。したがって、組換え遺伝子は別の種からのＤＮＡ配列であってもよく、または同じ種に由来するかもしくはこれに存在するが、組換え方法によって宿主に組み込まれて、組換え宿主を形成するものであってもよい。宿主に導入された組換え遺伝子は、形質転換される宿主に通常存在するＤＮＡ配列と同一であることができ、ＤＮＡの１または２以上の追加のコピーを提供するために導入されて、このＤＮＡの遺伝子産物の過剰発現または改変された発現を可能とすることが、理解される。
【００３０】
本明細書に記載の、ポリペプチドをコードする組換え遺伝子は、ポリペプチドを発現するのに適した１または２以上の調節領域にセンス方向で作動可能に連結した、そのポリペプチドのコード配列を含む。多くの微生物は、ポリシストロン性ｍＲＮＡからの複数の遺伝子産物を発現することができるため、所望であれば、複数のポリペプチドを、それらの微生物のための単一の調節領域の制御下で発現させることができる。コード配列および調節領域は、調節領域とコード配列が、調節領域が配列の転写または翻訳を調節するのに有効であるように配置されている場合に、作動可能に連結されていると考えられる。典型的には、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、モノシストロン性遺伝子のための調節領域の下流１〜約５０ヌクレオチドの間に配置される。多くの場合、本明細書に記載のポリペプチドのコード配列は、組換え宿主以外の種において同定された、すなわち異種の、核酸である。したがって組換え宿主が微生物である場合、コード配列は、他の原核微生物または真核微生物から、植物から、または動物からのものであることができる。いくつかの場合にはしかし、コード配列は、宿主に対してネイティブであって、その生物に再導入された配列である。ネイティブ配列の、天然に存在する（naturally occurring）配列からの識別は、多くの場合、外因性核酸に連結された非天然（non-natural）配列の存在により、例えば、組換え核酸構築物中のネイティブ配列に隣接する非ネイティブ調節配列の存在により、行うことができる。かかる配列もまた、異種核酸と考えることができる。さらに、安定に形質転換された外因性核酸は、典型的には、ネイティブ配列が見出される位置以外の位置に組み込まれている。
【００３１】
「調節領域」とは、転写または翻訳の開始または速度、および転写または翻訳産物の安定性および／または移動性に影響を与えるヌクレオチド配列を有する核酸を指す。調節領域は、限定することなく、プロモーター配列、エンハンサー配列、応答エレメント、タンパク質認識部位、誘導性エレメント、タンパク質結合配列、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、転写開始部位、終結配列、ポリアデニル化配列、イントロン、およびそれらの組み合わせを含む。調節領域は、典型的には、少なくともコア（基礎）プロモーターを含む。調節領域はまた、少なくとも１つの制御エレメント、例えばエンハンサー配列、上流エレメントまたは上流活性化領域（ＵＡＲ）を含んでよい。調節領域がコード配列に作動可能に連結されるのは、調節領域が配列の転写または翻訳を調節するのに有効であるように、調節領域とコード配列を配置することによる。例えば、コード配列とプロモーター配列を作動可能に連結するために、コード配列の翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位は、典型的にはプロモーターの１〜約５０ヌクレオチド下流に配置される。しかし調節領域は、さらに離れて、例えば翻訳開始部位の約５，０００ヌクレオチドも上流に、または転写開始部位の約２，０００ヌクレオチド上流に、配置することもできる。
【００３２】
含める調節領域の選択は、限定することなく、効率、選択性、誘導性、所望の発現レベル、および一定の培養段階における優先的発現を含む、いくつかの要因に依存する。当業者にとって、調節領域をコード配列に対して適切に選択して配置することにより、コード配列の発現を調節することは、ルーチンの事柄である。１つより多くの調節領域、例えばイントロン、エンハンサー、上流活性化領域、転写ターミネーター、および誘導性エレメントなどが存在してよいことが、理解されるであろう。１または２以上の遺伝子を、組換え核酸構築物中に、モグロシド製造の個別の側面のために有用な「モジュール」として組み合わせることができる。モジュール、特にポリシストロン性モジュール内に複数の遺伝子を組み合わせることで、様々な種におけるモジュールの使用を容易にする。モグロシド製造に有用な遺伝子に加えて、組換え構築物は、典型的には、複製起点および、適切な種における構造物の維持のための１または２以上の選択マーカーも含有する。
【００３３】
遺伝コードの縮重により、多数の核酸が、特定のポリペプチドをコード可能であることが理解されるであろう；すなわち、多くのアミノ酸について、このアミノ酸のためのコドンとして機能する複数のヌクレオチドトリプレットが存在する。したがって、所与のポリペプチドのコード配列中のコドンは、特定の宿主における最適な発現が、その宿主（例えば、微生物）に対する適切なコドンバイアス表を使用して得られるように、変更することができる。核酸はまた、特定の宿主に好ましいＧＣ含量に関して、および／または反復配列の数を減らすために、最適化することができる。単離された核酸として、これらの改変された配列は精製された分子として存在することができ、組換え核酸構築物のモジュールを構成する際に使用するベクターまたはウイルスに組み込むことができる。
【００３４】
多数の原核生物および真核生物が、本発明の組換え宿主として使用するのに適している。したがって、組換え宿主は、例えばグラム陰性細菌、酵母および真菌からなる群から選択されてよい。モグロシド生産株として使用するために選択された種および株を、どの生産遺伝子が株に対して内因性であり、どの遺伝子が存在しないかを決定するために分析する。内因性の対応物が株に存在しない遺伝子を、１または２以上の組換え構築物中に集合させて、これを次に、欠落した機能（単数または複数）を供給するために、株に形質転換する。こうして、ステップＩＩａ、ＩＩＩａ、ＩＶａおよびＶのどれが宿主によって既に実施されたかを分析することができ、次にこの宿主を、残りのステップを触媒する酵素をコードする異種核酸の導入によって、改変することができる。同様に、ステップＩＩｂ、ＩＩＩｂ、ＩＶｂおよびＶのどれが宿主によって既に実施されたかを分析することができ、次にこの宿主を、残りのステップを触媒する酵素をコードする異種核酸の導入によって、改変することができる。前に述べたように、組換え宿主はまた、オキシド−スクアレンおよび／またはジオキシド−スクアレンのレベルを増加させるために、改変することができる。
【００３５】
本発明の組換えとして有用な、例示の原核生物および真核生物の種を、以下により詳細に記載する。しかし、他の種も適切であり得ることが理解されるであろう。例えば、組換え宿主は、Agaricus（ハラタケ属）、Aspergillus（アスペルギルス属）、Bacillus（バチルス属）、Candida（カンジダ属）、corynebacterium（コリネバクテリウム属）、Escherichia（大腸菌属）、Fusarium／Gibberella（フザリウム属／ジベレラ属）、Kluyveromyces（クルイベロミセス属）、Laetiporus（ラエチポルス属）、Lentinus（マツオウジ属）、Phaffia（ファフィア属）、Phanerochaete（ファネロカエテ属）、Pichia（ピキア属）、Physcomitrella（ニセツリガネゴケ属）、Rhodoturula、Saccharomyces（サッカロミセス属）、Schizosaccharomyces（シゾサッカロミセス属）、Sphaceloma、XanthophyllomycesおよびYarrowia（ヤロウィア属）からなる群から選択される属のものであってよい。組換え宿主として有用な、かかる属からの例示の種としては、Lentinus tigrinus、Laetiporus sulphureus、Phanerochaete chrysosporium、Pichia pastoris、Physcomitrella patens、Rhodoturula glutinis、Rhodoturula mucilaginosa、Phaffia rhodozyma、Xanthophyllomyces dendrorhous、Fusarium fujikuroi／Gibberella fujikuroi、Candida utilisおよびYarrowia lipolyticaが挙げられる。いくつかの態様において、組換え宿主は微生物であってよく、例えば、Gibberella fujikuroi、Kluyveromyces lactis、Schizosaccharomyces pombe、Aspergillus nigerまたはSaccharomyces cerevisiaeなどの子嚢菌類であってよい。いくつかの態様において、組換え宿主は微生物であってよく、例えばEscherichia coli、Rhodobacter sphaeroidesまたはRhodobacter capsulatusなどの原核生物である。特定の微生物を用いて、目的の遺伝子をハイスループット様式でスクリーニングおよび試験することができ、一方所望の生産性や増殖特性を有する他の微生物を、モグロシド化合物の大規模生産のために使用できることが理解されるであろう。特に、食品グレードの微生物は、大規模生産のために有用となり得る。
【００３６】
Saccharomyces cerevisiae
前述のように、組換え宿主は例えば、Saccharomyces cerevisiaeであってよい。Saccharomyces cerevisiaeは、合成生物学において広く使用されているシャーシ生物であり、組換え微生物プラットフォームとして使用することができる。S. cerevisiaeに対して利用可能な変異体のライブラリー、プラスミド、代謝についての詳細なコンピュータモデルおよびその他の情報があり、生成物の収率を高めるための様々なモジュールの合理的設計を可能にしている。組換え微生物を作製するための方法が知られている。Brochado et al. 2010 (Microb Cell Fact. 9:84)からのS. cerevisiaeのVG4株は特に有用である。VG4はpdc1Δgdh1Δ↑GDH2の遺伝子型を有する。S. cerevisiaeの別の非常に有用な株は、以下の例９に記載されているBY4742、またはKirby、 J et al in FEBS Journal 275 (2008) 1852-1859に記載の酵母株である。
【００３７】
Aspergillus spp. 
組換え宿主はまた、A. oryzae、A. nigerおよびA. sojaeなどのAspergillus種であってもよい。例えば前述のものなどのアスペルギルス属は、食品生産において広く使用されている微生物であり、組換え微生物プラットフォームとしても使用することができる。A. nidulans、A. fumigatus、A. oryzae、A. clavatus、A. flavus、A. niger、およびA. terreusのゲノムに対するヌクレオチド配列が利用可能であり、フラックスを強化し生成物の収率を高めるための内因性経路の合理的な設計および改変を可能にする。これらのいずれも、組換え宿主として使用することができる。代謝モデルが、Aspergillusについて、ならびにトランスクリプトーム研究およびプロテオミクス研究のために開発されている。A. nigerは、クエン酸およびグルコン酸などの多くの食品成分の工業的生産のために培養され、したがって、A. nigerなどの種は、食品成分の製造に一般に適している。
【００３８】
Escherichia coli
組換え宿主はまた、合成生物学において広く使用されている別のプラットフォームの生物であるEscherichia coliであってもよい。Saccharomycesと同様に、E. coliに対して利用可能な変異体のライブラリー、プラスミド、代謝の詳細なコンピュータモデルおよびその他の情報があり、生成物の収率を高めるための様々なモジュールの合理的設計を可能にしている。Saccharomycesについて上述したものと類似の方法を、組換えE. coli微生物を作製するために使用することができる。
Rhodobacter spp. 
組換え宿主はまた、Rhodobacterであってもよい。大腸菌と同様に、利用可能な変異体のライブラリー、および適切なプラスミドベクターがあり、生成物の収率を向上させるために様々なモジュールの合理的設計を可能にする。E. coliについて上述したものと類似の方法を、組換えRhodobacter微生物を作製するために使用することができる。
Physcomitrella spp. 
組換え宿主はまた、Physcomitrellaコケ類であってもよい。Physcomitrellaコケ類は、懸濁培養中で増殖させた場合、酵母または他の真菌の培養物に類似した特性を有する。この属は、細胞の他の種類における生産が困難となり得る、植物の二次代謝産物の生産のための、細胞の重要な種類となっている。
【００３９】
ステップＩａ−  オキシド−スクアレンのレベルの強化
本明細書に上述したように、本発明の方法は、オキシド−スクアレンのレベルを強化するステップを含んでよい。これは、ステップＩＩａを含み、該ステップＩＩａをin vivoで実施する方法に特に関連する。ステップＩａは特に、方法で使用する組換え宿主を、前記組換え宿主中のオキシド−スクアレンのレベルを強化するような様式で改変することにより、実施することができる。本発明はまた、オキシド−スクアレンのレベルを強化するように改変された、組換え宿主にも関する。
したがって、方法はまた、オキシド−スクアレン、特に２，３−オキシド−スクアレンの形成をもたらす１または２以上のステップを含んでもよい。前記ステップは、好ましくは、以下に記載のステップＩＩａの前に、またはこれと同時に実施される。図３は、スクアレンからモグロシドへの経路の概略図を提供する。
【００４０】
オキシド−スクアレンの製造における１つのステップは、ファルネシルピロリン酸からのスクアレンの製造である。スクアレンのファルネシルピロリン酸からの製造を触媒する酵素の１つは、スクアレンシンターゼ（スクアレンシンターゼとも称される）である。前記スクアレンシンターゼは、EC 2.5.1.21に分類される任意の酵素であってよい。反応は、典型的にはＮＡＤＰＨを補基質として使用して進行すると考えられている。したがってこの方法は、ＮＡＤＰＨの存在下で、スクアレンシンターゼによって触媒される、ファルネシルピロリン酸からスクアレンを製造するステップを含むことができる。方法がin vivoで実施される本発明の態様において、組換え宿主はしたがって、スクアレンシンターゼをコードする異種核酸を含むことができる。いくつかの組換え宿主は内因性スクアレンシンターゼを含んでよく、この場合内因性の酵素で十分である。内因性スクアレン生産経路は酵母の代謝に存在し、したがって組換え宿主が酵母である場合には、本ステップは、組換え宿主に対して内因性となり得る。
【００４１】
スクアレンシンターゼは、任意の有用なスクアレンシンターゼであってよい。例えばスクアレンシンターゼは、別のウリ科植物であるGynostemma pentaphyllum（タンパク質受入番号C4P9M2）からのスクアレンシンターゼであってもよい。スクアレンシンターゼは例えば、以下からなる群：Arabidopsis thaliana（タンパク質受入番号C4P9M2）、Brassica napus、Citrus macrophylla、Euphorbia tirucalli（タンパク質受入番号B9WZW7）、Glycine max、Glycyrrhiza glabra（タンパク質受入番号Q42760、Q42761）、Glycrrhiza uralensis（タンパク質受入番号D6QX40、D6QX41、D6QX42、D6QX43、D6QX44、D6QX45、D6QX47、D6QX39、D6QX55、D6QX38、D6QX53、D6QX37、D6QX35、B5AID5、B5AID4、B5AID3、C7EDD0、C6KE07、C6KE08 、C7EDC9）、Lotusjaponicas（タンパク質受入番号Q84LE3）、Medicago truncatula（タンパク質受入番号Q8GSL6）、Pisum sativum、Ricinus communis（タンパク質受入番号B9RHC3）、およびPrunus mumeからのスクアレンシンターゼ、ならびに上述の任意の機能的相同体であって、これらと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するものから、選択されてよい。増加したコピー数、スクアレンシンターゼをコードする異種核酸、またはネイティブスクアレンシンターゼの発現の増加は、組換え宿主において製造されるモグロシドのレベルを改善することができる。
【００４２】
オキシド−スクアレンの製造における別のステップは、オキシド−スクアレンのスクアレンからの製造であってよい。オキシド−スクアレンのスクアレンからの製造を触媒する酵素の１つは、スクアレンエポキシダーゼ（スクアレンモノオキシゲナーゼとも称される）である。前記スクアレンエポキシダーゼは、EC 1.4.99.7に分類される任意の酵素であってよい。反応は、典型的にはＮＡＤＰＨを補基質として使用して進行すると考えられている。したがってこの方法は、ＮＡＤＰＨの存在下で、スクアレンエポキシダーゼによって触媒される、オキシド−スクアレンをスクアレンから製造するステップを含むことができる。方法がin vivoで実施される本発明の態様において、組換え宿主はしたがって、スクアレンエポキシダーゼをコードする異種核酸を含むことができる。いくつかの組換え宿主は内因性スクアレンエポキシダーゼを含んでよく、この場合内因性の酵素で十分である。内因性オキシド−スクアレン生産経路は酵母の代謝に存在し、したがって組換え宿主が酵母である場合には、本ステップは、組換え宿主に対して内因性となり得る。しかし、オキシド−スクアレンのレベルを強化するためには、それでも、追加のスクアレンエポキシダーゼを発現することが有利であり得る。
【００４３】
スクアレンエポキシダーゼは、任意の有用なスクアレンエポキシダーゼであってよい。スクアレンエポキシダーゼは例えば、ウリ科植物であるGynostemma pentaphyllum（タンパク質受入番号C4P9M2）からのスクアレンエポキシダーゼであってもよい。スクアレンエポキシダーゼはまた、以下からなる群： Arabidopsis thaliana（タンパク質受入番号Q9SM02、O65403、O65402、O65404、O81000、またはQ9T064）、Brassica napus（タンパク質受入番号O65727、O65726）、Euphorbia tirucalli（タンパク質受入番号A7VJN1）、Medicago truncatula（タンパク質受入番号Q8GSM8、Q8GSM9）、Pisum sativum、およびRicinus communis（タンパク質受入番号B9R6V0、B9S7W5、B9S6Y2、B9T0Y3、B9S7T0、B9SX91）からのスクアレンエポキシダーゼ、ならびに上述の任意の機能的相同体であって、これらと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するものから選択されてよい。増加したコピー数、スクアレンポキシダーゼをコードする異種核酸、またはネイティブスクアレンポキシダーゼの発現の増加は、組換え宿主において製造されるモグロシドのレベルを改善することができる。
【００４４】
スクアレンエポキシダーゼはまた、S. cerevisiaeのERG1遺伝子の産物であってよい。したがってスクアレンエポキシダーゼは、配列番号５４のポリペプチドまたはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体であってよい。
一態様において、組換え宿主は、該宿主細胞においてスクアレンエポキシダーゼの高発現を導く配列に作動可能に連結された、スクアレンエポキシダーゼをコードする異種核酸を含む。したがって、スクアレンエポキシダーゼは組換え宿主に対して内因性であってもよいが、発現レベルは、スクアレンエポキシダーゼをコードする核酸の追加のコピーにより、および／またはより強力なプロモーターの使用により、高めることができる。
【００４５】
オキシド−スクアレンは、ラノステロール製造のための基質として機能する。したがって、一態様において、オキシド−スクアレンのレベルは、ラノステロールシンターゼの活性を低下させることによって高めることができる。内因性ラノステロールシンターゼを発現する組換え宿主において、これは、ラノステロールシンターゼの発現を指向する内因性プロモーターを、より低いレベルのラノステロールシンターゼの発現を指向するより弱いプロモーターと置換することにより、達成され得る。酵母において、ERG7遺伝子はラノステロールシンターゼをコードする。したがって組換え宿主が酵母である場合、ERG7遺伝子のプロモーターを、ERG7の内因性発現レベルより低い発現レベルを導く別のプロモーターに置換してもよい。ラノステロールシンターゼは、このように、S. cerevisiaeのERG7遺伝子の産物であってよく、ここでこの配列は本明細書において配列番号５５として提供され、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体であってよい。
【００４６】
便利な弱いプロモーターの例は、MET3遺伝子のメチオニン抑制性プロモーターまたはＣＵＰ１銅誘導性プロモーターを含む。ラノステロールシンターゼの活性を低下させる方法の非限定的な例は、本明細書の以下の例９において、またはKirby et al., 2008（上記参照）に記載され、これらは本明細書に参照により組み込まれる。S. cerevisiaeのラノステロールシンターゼの配列は、配列番号５５として提供される。したがって、組換え宿主がS. cerevisiaeである場合、配列番号５５のポリペプチドは、野生型S. cerevisiaeにおける前記ポリペプチドのレベルよりも低いレベルで発現される。同様に、組換え宿主が配列番号５５のポリペプチドと類似のポリペプチド（例えば配列番号５５と少なくとも７０％同一）を発現する場合、配列番号５５と少なくとも７０％同一の前記ポリペプチドが、野生型宿主における前記ポリペプチドのレベルよりも低いレベルで発現されるのが好ましい。
さらに、酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼの切断型（ｔＨＭＧ１）の発現もまた、オキシド−スクアレンの強化されたレベルをもたらし得る。酵母ＨＭＧレダクターゼの有用な切断型（ｔＨＭＧ１）は、Donald et al., 1997, Appl.Environ. Microbiol. 63, 3341-3344に記載されている。
【００４７】
ステップＩｂ−  ジオキシド−スクアレンのレベルの強化
本明細書に上述したように、本発明の方法は、ジオキシド−スクアレンのレベルを強化するステップを含んでよい。これは、ステップＩＩｂを含み、該ステップＩＩｂをin vivoで実施する方法に特に関連する。ステップＩｂは特に、方法で使用する組換え宿主を、前記組換え宿主中のジオキシド−スクアレンのレベルを強化するような様式で改変することにより、実施することができる。本発明はまた、ジオキシド−スクアレンのレベルを強化するように改変された、組換え宿主にも関する。
したがって方法はまた、ジオキシド−スクアレンのレベルの強化をもたらす１または２以上のステップを含んでもよい。前記ステップは、好ましくは、以下に記載のステップＩＩｂの前に、またはこれと同時に実施される。
【００４８】
本発明は、特にジオキシド−スクアレンのレベルが、スクアレンエポキシダーゼの高発現によって強化され得ることを記載する。前記スクアレンエポキシダーゼは、本明細書上記のセクション「ステップＩａ−  オキシド−スクアレンのレベルの強化」に記載の任意のスクアレンエポキシダーゼであってよい。具体的には、スクアレンエポキシダーゼは、S. cerevisiaeのERG1遺伝子の産物であってよい。したがって、スクアレンエポキシダーゼは、配列番号５４のポリペプチド、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体であってよい。高発現レベルは、スクアレンエポキシダーゼをコードする異種核酸を、宿主細胞における前記スクアレンエポキシダーゼの高発現を導く配列に作動可能に連結された宿主細胞に導入することによって、達成することができる。したがって、スクアレンエポキシダーゼは、組換え宿主に対して内因性であってもよいが、しかし発現レベルは、スクアレンエポキシダーゼをコードする核酸の追加のコピーにより、および／またはより強力なプロモーターの使用により、高めることができる。
【００４９】
ジオキシド−スクアレンのレベルは、ラノステロールシンターゼの活性を低下させることによって強化することができる。ラノステロールシンターゼの活性は、本明細書上記のセクション「ステップＩａ−  オキシド−スクアレンのレベルの強化」に記載の任意の方法のいずれかによって低減することができる。
ジオキシド−スクアレンのレベルはまた、酵素３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼの切断型（ｔＨＭＧ１）の発現によって強化することができ、これはオキシド−スクアレンのレベルの強化ももたらし得る。酵母ＨＭＧレダクターゼの有用な切断型（ｔＨＭＧ１）は、Donald et al., 1997, Appl.Environ. Microbiol. 63, 3341-3344に記載されている。
【００５０】
ステップＩＩａ−  オキシド−スクアレン→ククルビタジエノール
本明細書に上述したように、本発明の方法は、オキシド−スクアレンから、特に２，３−オキシド−スクアレンから、オキシド−スクアレンの変換を触媒することができてククルビタジエノールを形成する酵素または酵素混合物を使用して、ククルビタジエノールを製造するステップを含んでよい。本発明はまた、オキシド−スクアレンのククルビタジエノールへの変換を触媒可能な酵素をコードする異種核酸を含む組換え宿主にも関する。
ステップは、in vitroにて、オキシド−スクアレンを含む組成物を、オキシド−スクアレンの変換を触媒することができてククルビタジエノールを形成する前記酵素または酵素混合物と共にインキュベートすることにより、実施することができる。
【００５１】
ステップはまたin vivoで、オキシド−スクアレンの変換を触媒することができてククルビタジエノールを形成する酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）を含む組換え宿主において、行うことができる。前記組換え宿主は、例えば組換え宿主がオキシド−スクアレン生合成経路の１または２以上の酵素を発現することによって、オキシド−スクアレンを製造可能であってもよい。代替的に、オキシド−スクアレンを、例えば培養培地中の前記組換え宿主に提供してもよい。
オキシド−スクアレンの変換を触媒することができてククルビタジエノールを形成する酵素または酵素混合物は好ましくは、ククルビタジエノールシンターゼを含むか、またはこれからなる。
前記ククルビタジエノールシンターゼは、任意の有用なククルビタジエノールシンターゼであってよく、例えば、オキシドスクアレンシクラーゼとして分類されているククルビタジエノールシンターゼ、例えばShibuya, Tetrahedron, Vol 60: pp. 6995-7003 (2004)に記載のオキシドスクアレンシクラーゼである。
【００５２】
Cucurbita pepoからのククルビタジエノールシンターゼのアミノ酸配列は、本明細書に配列番号１としてとして提供され、さらにGenBankにおいてタンパク質受入番号BAD34645.1として提供される。本発明の一態様において、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号１のポリペプチド、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体である。
例５に記載したように、モンクフルーツからのククルビタジエノールシンターゼを同定し、ポリペプチドのＣ末端部分の配列を決定した。モンクフルーツポリペプチドのＣ末端部分のアミノ酸配列は、本明細書に配列番号２として提供される。配列番号２は、配列番号１に示すC. pepoポリペプチドの残基５１５〜７６４と９７．５％同一である。したがって、本発明の一態様において、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号２に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
【００５３】
好ましい態様において、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号４３のポリペプチド、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体である。
他の相同タンパク質で、同様の長さで配列番号１と約７０％以上の相同性を有するものを見出すことができる。かかる相同体は、Lotus japonicas （BAE53431）、Populus trichocarpa（XP_002310905）、Actaea racemosa（ADC84219）、Betula platyphylla（BAB83085）、Glycyrrhiza glabra（BAA76902）、Vitis vinifera（XP_002264289）、Centella asiatica（AAS01524）、Panax ginseng（BAA33460）、およびBetula platyphylla（BAB83086）からのポリペプチドを含む。ククルビタジエノールシンターゼは、上記のいずれか、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体であってよい。
【００５４】
ステップＩＩｂ−  ジオキシド−スクアレン→２４，２５エポキシククルビタジエノール
本明細書に上述したように、本発明の方法は、ジオキシド−スクアレンから、オキシド−スクアレンの変換を触媒することができてククルビタジエノールを形成する酵素または酵素混合物を用いて、２４，２５エポキシククルビタジエノールを製造するステップを含んでよい。本発明はまた、ジオキシド−スクアレンの２４，２５エポキシククルビタジエノールへの変換を触媒可能な酵素をコードする異種核酸を含む組換え宿主にも関する。
ステップはin vitroで、ジオキシドスクアレンを含む組成物を、ジオキシド−スクアレンの変換を触媒することができて２４，２５エポキシククルビタジエノールを形成する酵素または酵素混合物と共にインキュベートすることによって、実施することができる。
【００５５】
ステップはまたin vivoで、ジオキシド−スクアレンから２４，２５エポキシククルビタジエノールへの変換を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）を含む組換え宿主において、行うことができる。前記組換え宿主は、例えば組換え宿主がジオキシド−スクアレン生合成経路の１または２以上の酵素を発現することによって、ジオキシド−スクアレンを製造可能であってもよい。しかし、前記組換え宿主は、本明細書上記のセクション「ステップＩｂ  ジオキシド−スクアレンのレベルの強化」に記載した方法のいずれかで、ジオキシド−スクアレンのレベルを強化するように改変されていることが好ましい。代替的に、ジオキシド−スクアレンは、例えば培養培地中の前記組換え宿主に提供されてもよい。
ジオキシド−スクアレンから２４，２５エポキシククルビタジエノールへの変換を触媒可能な前記酵素または酵素混合物は好ましくは、ククルビタジエノールシンターゼを含むか、これからなる。
【００５６】
前記ククルビタジエノールシンターゼは、任意の有用なククルビタジエノールシンターゼであってよく、例えば、オキシドスクアレンシクラーゼとして分類されているククルビタジエノールシンターゼ、例えばShibuya, Tetrahedron, Vol 60: pp. 6995-7003 (2004)に記載のオキシドスクアレンシクラーゼである。本発明の一態様において、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号１のポリペプチド、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体である。
好ましい態様において、ククルビタジエノールシンターゼは、配列番号４３のポリペプチド、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体である。
【００５７】
他の相同タンパク質で、同様の長さで配列番号１と約７０％以上の相同性を有するものを見出すことができる。かかる相同体は、Lotus japonicas （BAE53431）、Populus trichocarpa（XP_002310905）、Actaea racemosa（ADC84219）、Betula platyphylla（BAB83085）、Glycyrrhiza glabra（BAA76902）、Vitis vinifera（XP_002264289）、Centella asiatica（AAS01524）、Panax ginseng（BAA33460）、およびBetula platyphylla（BAB83086）からのポリペプチドを含む。ククルビタジエノールシンターゼは、上記のいずれか、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体であってよい。
【００５８】
ステップＩＩＩａ−  ククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール
本明細書に上述したように、本発明の方法は、ククルビタジエノールから、ククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒することができて１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを形成する酵素または酵素混合物を用いて、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを製造するステップを含んでよい。
ステップはin vitroで、ククルビタジエノールを含む組成物を、ククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒することができて１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを形成する酵素と共にインキュベートすることによって、実施することができる。
ステップはまたin vivoで、ククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒することができて１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを形成する酵素をコードする異種核酸（単数または複数）を含む組換え宿主において、行うことができる。前記組換え宿主は、例えば組換え宿主がククルビタジエノール生合成経路の１または２以上の酵素を発現することによって、ククルビタジエノールを製造可能であってもよい。代替的に、ククルビタジエノールは、例えば培養培地中の前記組換え宿主に提供されてもよい。
【００５９】
ククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒することができて１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを形成する前記酵素は、シトクロムＰ４５０酵素の群から選択される。
例７に示すように、ＣＹＰ５３３、ＣＹＰ９３７、ＣＹＰ１７９８、ＣＹＰ１９９４、ＣＹＰ２０４８、ＣＹＰ２７４０、ＣＹＰ３４０４、ＣＹＰ３９６８、ＣＹＰ４１１２、ＣＹＰ４１４９、ＣＹＰ４４９１、ＣＹＰ５４９１、ＣＹＰ６４７９、ＣＹＰ７６０４、ＣＹＰ８２２４、ＣＹＰ８７２８、ＣＹＰ１００２０、およびＣＹＰ１０２８５（それぞれ、配列番号３〜２０によりコードされる）の１または２以上を用いて、モグロールを製造することができる。ｅＹＡＣ技術を用いて、例８に記載のように、シトクロムＰ４５０酵素の活性を評価することができる。代替的に、in vitro反応を用いて、活性を評価することができる。したがって、本発明の一態様において、少なくとも１つのシトクロムＰ４５０酵素は、以下からなる群から選択される：配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０の核酸配列によりコードされるポリペプチド、またはアミノ酸レベルにおいてこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体。
【００６０】
本発明の好ましい態様において、ククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒することができて１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを形成する酵素は、ＣＹＰ５４９１である。したがって、ククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒して１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを形成する酵素は、配列番号４４のポリペプチド、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体であってよい。
本発明の一態様において、このステップは、少なくとも１つのＣＹＰ活性剤により補助されてもよい。本発明の方法のこのステップはしたがって、少なくとも１つのＣＹＰ活性剤と組み合わせた、上記のシトクロムＰ４５０酵素の使用を含むことができる。したがって、組換え宿主は、本明細書上記のシトクロムＰ４５０酵素をコードする異種核酸を含むことに加えて、ＣＹＰ活性剤をコードする異種核酸を含んでもよい。前記ＣＹＰ活性剤は、任意の有用なＣＹＰ活性剤であってよく、例えば、配列番号４６のポリペプチド、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体であってよい。
【００６１】
ステップＩＩＩｂ−  ２４，２５エポキシククルビタジエノール→１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール
本明細書に上述したように、本発明の方法は、２４，２５エポキシククルビタジエノールから、２４，２５エポキシククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒することができて１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを形成する酵素を用いて、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを製造するステップを含んでよい。
ステップはin vitroで、２４，２５エポキシククルビタジエノールを含む組成物を、２４，２５エポキシククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒することができて１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを形成する前記酵素と共にインキュベートすることによって、実施することができる。
ステップはまたin vivoで、２４，２５エポキシククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒することができて１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを形成する酵素をコードする異種核酸（単数または複数）を含む組換え宿主において、行うことができる。前記組換え宿主は、例えば組換え宿主が２４，２５エポキシククルビタジエノール生合成経路の１または２以上の酵素、例えばクルビタジエノールシンターゼを発現することによって、２４，２５エポキシククルビタジエノールを製造可能であってもよい。代替的に、２４，２５エポキシククルビタジエノールは、例えば培養培地中の前記組換え宿主に提供されてもよい。
ククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒することができて１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを形成する前記酵素は、シトクロムＰ４５０酵素の群から選択される。
【００６２】
本発明の好ましい態様において、２４，２５エポキシククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒することができて１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを形成する酵素は、ＣＹＰ５４９１である。したがって、２４，２５エポキシククルビタジエノールのヒドロキシル化を触媒して１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを形成する酵素は、配列番号４４のポリペプチド、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体であってよい。
本発明の一態様において、このステップは、少なくとも１つのＣＹＰ活性剤により補助されてもよい。本発明の方法のこのステップはしたがって、少なくとも１つのＣＹＰ活性剤と組み合わせた、上記のシトクロムＰ４５０酵素の使用を含むことができる。したがって、組換え宿主は、本明細書上記のシトクロムＰ４５０酵素をコードする異種核酸を含むことに加えて、ＣＹＰ活性剤をコードする異種核酸を含んでもよい。前記ＣＹＰ活性剤は、任意の有用なＣＹＰ活性剤であってよく、例えば、配列番号４６のポリペプチド、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体であってよい。
【００６３】
ステップＩＶａ−  １１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール→モグロール
本明細書に上述したように、本発明の方法は、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールから、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールの変換を触媒することができてモグロールを形成する酵素または酵素混合物を用いて、モグロールを製造するステップを含んでよい。
ステップはin vitroで、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを含む組成物を、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールの変換を触媒することができてモグロールを形成する前記酵素または酵素混合物と共にインキュベートすることによって、実施することができる。
ステップはまたin vivoで、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールの変換を触媒することができてモグロールを形成する酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）を含む組換え宿主において、行うことができる。前記組換え宿主は、例えば組換え宿主が１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノール生合成経路の１または２以上の酵素を発現することによって、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールを製造可能であってもよい。代替的に、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールは、例えば培養培地中の前記組換え宿主に提供されてもよい。
【００６４】
１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールの変換を触媒することができてモグロールを形成する前記酵素または酵素混合物は好ましくは、ＣＹＰ４５０活性およびエポキシドヒドロラーゼ活性を共に有する、１または２以上の酵素を含む。
シトクロムＰ４５０を有する酵素は、例えば以下を含む：配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０の核酸配列によりコードされるポリペプチド、またはアミノ酸レベルにおいてこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体。
ＣＹＰ４５０活性を有する別の酵素は、ＣＹＰ５４９１である。したがって、ＣＹＰ４５０活性を有する酵素は、配列番号４４のポリペプチド、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体であってよい。
【００６５】
本発明の一態様において、このステップは、少なくとも１つのＣＹＰ活性剤により補助されてもよい。本発明の方法のこのステップはしたがって、少なくとも１つのＣＹＰ活性剤と組み合わせた、上記のシトクロムＰ４５０酵素の使用を含むことができる。したがって、組換え宿主は、本明細書上記のシトクロムＰ４５０酵素をコードする異種核酸を含むことに加えて、ＣＹＰ活性剤をコードする異種核酸を含んでもよい。前記ＣＹＰ活性剤は、任意の有用なＣＹＰ活性剤であってよく、例えば、配列番号４６のポリペプチド、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体であってよい。
【００６６】
エポキシドヒドロラーゼ活性を有する酵素は、例えば、EC3.3._._に分類された酵素であってよい。前記エポキシドヒドロラーゼは、好ましくは、以下の反応を触媒する：
エポキシド＋Ｈ２Ｏ→グリコール
エポキシドヒドロラーゼ活性を有する酵素の例は、S. grosvenoriiのエポキシドヒドロラーゼ１およびS. grosvenoriiのエポキシドヒドロラーゼ２を含む。したがって、エポキシドヒドロラーゼ活性を有する酵素は、配列番号３８、配列番号４０のポリペプチド、およびこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体からなる群から選択することができる。
【００６７】
ステップＩＶａ−  １１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール→モグロール
本明細書に上述したように、本発明の方法は、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールから、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールの変換を触媒することができてモグロールを形成する酵素または酵素混合物を用いて、モグロールを製造するステップを含んでよい。
ステップはin vitroで、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを含む組成物を、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールの変換を触媒することができてモグロールを形成する前記酵素または酵素混合物と共にインキュベートすることによって、実施することができる。
【００６８】
ステップはまたin vivoで、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールの変換を触媒することができてモグロールを形成する酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）を含む組換え宿主において、行うことができる。前記組換え宿主は、例えば組換え宿主が１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノール生合成経路の１または２以上の酵素を発現することによって、１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールを製造可能であってもよい。代替的に、１１−ヒドロキシ２４，２５エポキシククルビタジエノールは、例えば培養培地中の前記組換え宿主に提供されてもよい。
１１−ヒドロキシ−２４，２５エポキシククルビタジエノールの変換を触媒することができてモグロールを形成する前記酵素または酵素混合物は、好ましくは、エポキシドヒドロラーゼ活性を有する酵素を含む。
【００６９】
エポキシドヒドロラーゼ活性を有する酵素は、例えば、EC3.3._._に分類された酵素であってよい。前記エポキシドヒドロラーゼは、好ましくは、以下の反応を触媒する：
エポキシド＋Ｈ２Ｏ→グリコール
エポキシドヒドロラーゼ活性を有する酵素の例は、S. grosvenoriiのエポキシドヒドロラーゼ１およびS. grosvenoriiのエポキシドヒドロラーゼ２を含む。したがって、エポキシドヒドロラーゼ活性を有する酵素は、配列番号３８、配列番号４０のポリペプチド、およびこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体からなる群から選択することができる。
【００７０】
ステップＶ−  モグロール→モグロシド
本発明の方法は、モグロールをグリコシル化してモグロシドを形成するステップを含んでよい。このステップは一般的に、モグロールおよび／またはグリコシル化モグロールのグリコシル化を触媒可能な酵素または酵素混合物の支援で達成される。
モグロシドは、本明細書の以下のセクション「モグロシド」に記載のモグロシドのいずれであってもよい。
ステップＶはin vitroで、モグロールを含む組成物を、モグロールのグリコシル化を触媒可能な前記酵素または酵素混合物と共にインキュベートすることによって、実施することができる。ステップはまた、それぞれのステップがモグロールまたはグリコシル化モグロールのグリコシル化を含む、別のステップに分けてもよい。
【００７１】
ステップはまたin vivoで、モグロールの、および任意にグリコシル化モグロールのグリコシル化を触媒可能な酵素または酵素混合物をコードする異種核酸（単数または複数）を含む組換え宿主において、行うことができる。前記組換え宿主は、例えば組換え宿主がモグロール生合成経路の１または２以上の酵素を発現することによって、モグロールを製造可能であってもよい。代替的に、モグロールは、例えば培養培地中の前記組換え宿主に提供されてもよい。
モグロールのグリコシル化を触媒可能な前記酵素または酵素混合物は好ましくは、ウリジン−５’−二リン酸（ＵＤＰ）依存グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）含む。特に、ステップＶがＵＧＴの使用を含むことが好ましい。
【００７２】
したがって、ステップＶは、モグロールを、少なくとも１つのウリジン−５’−二リン酸（ＵＤＰ）依存グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）とインキュベートして、モグロシド化合物（例えばモグロシドＩＥ１、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、またはＣ２４−ＯＨでグリコシル化されたモグロシド化合物）を製造することを含んでよい。
ＵＧＴは、例えば７３Ｃ３、７３Ｃ６、８５Ｃ２、７３Ｃ５、および７３Ｅ１からなる群から選択することができる。ＵＧＴはまた、配列番号２１のＵＧＴ７３Ｃ３、配列番号２３のＵＧＴ７３Ｃ６、配列番号２５のＵＧＴ８５Ｃ２、配列番号２２のＵＧＴ７３Ｃ５、配列番号２４のＵＧＴ７３Ｅ１、またはこれらと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有する、任意の前述のものの機能的相同体であってもよい。
【００７３】
ＵＧＴはまた、ＵＧＴ９８、ＵＧＴ１４９５、ＵＧＴ１８１７、ＵＧＴ５９１４、ＵＧＴ８４６８およびＵＧＴ１０３９１からなる群から選択することができる。ＵＧＴはまた、配列番号５３のＵＧＴ９８、配列番号２７によりコードされたＵＧＴ１４９５、配列番号２８によりコードされたＵＧＴ１８１７、配列番号３０によりコードされたＵＧＴ５９１４、配列番号３１によりコードされたＵＧＴ８４６８、および配列番号３２によりコードされたＵＧＴ１０３９１、またはこれらとアミノ酸レベルで少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有する、任意の前述のものの機能的相同体からなる群から、選択することができる。
方法がin vitroで実施される場合、ＵＧＴは例えば、組換え的に生産されるか、または組換え宿主の細胞溶解物であることができる。本文書はまた、モグロシド化合物を製造する方法であって、該方法が、モグロールを、ＵＧＴを発現する組換え宿主から調製した細胞溶解物と接触させて、モグロシド化合物（例えば、モグロシドＩＥ１、モグロシドＩＡ１、モグロシドＩＩＥ、モグロシドＩＩＩＡ２、モグロシドＩＩＩ、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、またはＣ２４−ＯＨでグリコシル化されたモグロシド化合物）を製造することを含む、前記方法を特徴とする。ＵＧＴは、上記ＵＧＴのいずれかであることができる。
【００７４】
本文書は、１または２以上のウリジン−５’−二リン酸（ＵＤＰ）依存グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を使用してモグロールをグリコシル化するための、方法および材料を提供する。以下に示すように、アグリコンモグロールをグリコシル化する少なくとも５つのＵＧＴが同定されている。本明細書に同定されているＵＧＴの各々は、グリコシルトランスフェラーゼファミリーＩのものである。したがって、好ましい一態様において、ＵＧＴはグリコシルトランスフェラーゼファミリーＩのＵＧＴである。
ＵＧＴである７３Ｃ３、７３Ｃ６、８５Ｃ２および７３Ｅ１は、モグロールまたはモグロシドのＣ２４−ＯＨの位置においてグリコシル化を触媒することができる（図４中のＵＧＴ＃２）。したがって、製造すべきモグロシドがＣ２４−ＯＨの位置においてグリコシル化を含む本発明の方法において、少なくとも１つのＵＧＴは、配列番号２１のＵＧＴ７３Ｃ３、配列番号２３のＵＧＴ７３Ｃ６、配列番号２５のＵＧＴ８５Ｃ２、または配列番号２４のＵＧＴ７３Ｅ１、またはこれらと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有する、任意の前述のものの機能的相同体であってよい。
【００７５】
ＵＧＴ７３Ｃ５は、モグロールまたはモグロシドのＣ３−ＯＨ（図４のＵＧＴ＃１）およびＣ２４−ＯＨ位置（ＵＧＴ＃２）の両方において、グリコシル化を触媒することができる。したがって、製造すべきモグロシドがＣ２４−ＯＨ位置（ＵＧＴ＃２）におけるグリコシル化および／またはＣ３−ＯＨ位置におけるグリコシル化を含む本発明の方法において、少なくとも１つのＵＧＴは、配列番号２２のＵＧＴ７３Ｃ５、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有する、任意の前述のものの機能的相同体であってよい。
ＵＧＴの７３Ｃ３、７３Ｃ５および７３Ｃ６は、Arabidopsis thalianaからのものである。ＵＧＴの７３Ｅ１および８５Ｃ２は、Stevia rebaudianaからのものである。ＵＧＴの７３Ｃ３、７３Ｃ５、７３Ｃ６、７３Ｅ１および８５Ｃ２のアミノ酸配列は、本明細書においてそれぞれ、配列番号２１〜２５として提供される。したがって、ＵＧＴの７３Ｃ３、７３Ｃ６、８５Ｃ２、または７３Ｅ１を、モグロシドＩＥ１をモグロールから製造するために使用することができ、ＵＧＴ７３Ｃ５は、モグロシドＩＡ１をモグロールから製造するために使用することができる。モグロシドＩＥ１は、ＵＧＴ７３Ｃ５を使用してモグロシドＩＩＥに変換することができる。モグロシドＩＡ１は、ＵＧＴの７３Ｃ３、７３Ｃ６、８５Ｃ２、または７３Ｅ１を使用してモグロシドＩＩＥに変換することができる。
【００７６】
本発明の好ましい一態様において、少なくとも１つのＵＧＴは、配列番号４８のＵＧＴ１５７６、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有する、任意の前述のものの機能的相同体であってよい。これは特に、製造すべきモグロシドがＣ２４−ＯＨ位置におけるグリコシル化を含む本発明の態様においてそうであり、何故ならば、ＵＧＴ１５７６は、モグロール２４−ＯＨ ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するグリコシルトランスフェラーゼだからである。
本発明の好ましい一態様において、少なくとも1つのＵＧＴは、配列番号５３のＵＧＴ９８、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体である。これは特に、製造すべきモグロシドが、Ｃ２４−ＯＨ位置におけるグルコースの１，２グリコシル化および１，６グリコシル化を含んでモグロシドＩＩＩＡ１を形成する、本発明の態様においてそうである。
【００７７】
本発明の好ましい一態様において、少なくとも１つのＵＧＴは、配列番号５０のＵＧＴ ＳＫ９８、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有する任意の前述のものの機能的相同体である。これは特に、製造すべきモグロシドが、Ｃ−２４位置におけるグルコースの１，２グリコシル化を含んでモグロシドＩＩＡを形成する、本発明の態様においてそうである。
図４に示すように、３種類の酵素的グリコシル化により、モグロシドＩＩＥはモグロシドＶまたは１１−オキソ−モグロシドＶに変換される。まず２つのグルコースを１，６結合により、モグロシドＩＩＥに既に存在する２つのグルコース分子に付着させる。第２に、別のグルコースをＣ２４結合グルコースへ、１，２結合によって添加する。モグロシドＩＶは、１，２結合したグルコースがＣ２４結合グルコースで欠落している中間体である。シアメノシドにおいてはこのグルコースが存在するが、Ｃ３結合したグルコースにおける１，６結合グルコースは欠けている。１１−オキソ−モグロシドＶはモグロシドＶと同一であるが、ただし１１−ＯＨが酸化されている。以下のＵＧＴの１または２以上を使用して、モグロシドＩＩＥをモグロシドＩＶ、モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、およびシアメノシドに変換することができる：ＵＧＴ９８、ＵＧＴ１４９５、ＵＧＴ１８１７、ＵＧＴ３４９４、ＵＧＴ５９１４、ＵＧＴ８４６８、ＵＧＴ１０３９１、ＵＧＴ１１７８９、ＵＧＴ１１９９９、ＵＧＴ１３６７９およびＵＧＴ１５４２３（それぞれ配列番号２６〜３６）、または機能性。例えば、ＵＧＴ９８、ＵＧＴ１４９５、ＵＧＴ１８１７、ＵＧＴ５９１４、ＵＧＴ８４６８およびＵＧＴ１０３９１の１または２以上を使用して、モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、またはシアメノシドIを製造することができる。
【００７８】
本発明の一態様において、ステップＶは、以下のステップの１または２以上を含む：
ａ）モグロールのＣ２４におけるグルコシル化により、モグロシドＩＡ１を形成
ｂ）モグロシドＩＡ１のＣ２４結合グルコースの１，６グルコシル化により、モグロシドＩＩＡを形成
ｃ）モグロシドＩＩａのＣ２４結合グルコースの１，２グルコシル化により、モグロシドＩＩＩＡ１を形成
ｄ）モグロシドＩＩＩＡ１のＣ３におけるグルコシル化により、シアメノシド１の形成
ｅ）シアメノシド１のＣ３結合グルコースの１，６グルコシル化により、モグロシドＶを形成
【００７９】
これらのステップはそれぞれ、前記ステップを触媒可能なＵＧＴによって触媒することができる。したがって、例えばステップａ）は、配列番号４８のＵＧＴ１５７６、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有する、任意の前述のものの機能的相同体によって、例えば触媒することができる。ステップｂ）は、配列番号５３のＵＧＴ９８、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体によって、例えば触媒することができる。ステップｃ）は、配列番号５３のＵＧＴ９８、配列番号５０のＵＧＴ ＳＫ９８またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有する、任意の前述のものの機能的相同体によって、例えば触媒することができる。ステップｄ）は、配列番号２２のＵＧＴ７３Ｃ５、またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体によって、例えば触媒することができる。ステップｅ）は、ＵＧＴ９１ファミリーのＵＧＴによって例えば触媒することができる。例えばステップｅ９は、配列番号５３のＵＧＴ９８またはこれと少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するその機能的相同体によって、触媒することができる。
【００８０】
ＵＧＴの活性をin vitroで評価することができる。例えば、in vitroでのＵＧＴ反応混合物は、ＵＧＴ酵素、４Ｘトリス緩衝液、基質（２５０μＭ）、ＵＤＰグルコース（７５０μＭ）および１％のアルカリホスファターゼを、約５０μｌの総反応容量中に含むことができる。反応は、滅菌９６ウェルプレート中で行うことができ、３０℃で一晩インキュベートする。インキュベーション後、２５μＬのＤＭＳＯを各反応に添加し、反応プレートを５分間遠心分離する。試料を各ウェルから採取し、濾過し、次いでＬＣ−ＭＳにより分析することができる。
【００８１】
ポリペプチドの製造
本明細書で前述したように、本発明の方法は、in vitroまたはin vivoで実施することができる。方法をin vitroで実施する本発明の態様において、方法で使用する１または２以上の酵素は、ポリペプチドを製造するための任意の従来の方法を用いて調製することができる。
したがって、本明細書に記載のシンターゼ、ヒドロラーゼ、ＵＧＴおよびＣＹＰ４５０ポリペプチドなどの酵素は、任意の方法を用いて製造することができる。例えば、シンターゼ、ヒドロラーゼ、ＵＧＴまたはＣＹＰ４５０ポリペプチドなどの酵素は、化学合成により製造することができる。代替的に、本明細書に記載のシンターゼ、ヒドロラーゼ、ＵＧＴまたはＣＹＰ４５０ポリペプチドなどの酵素は、標準的な組換え技術により、シンターゼ、ヒドロラーゼ、ＵＧＴまたはＣＹＰ４５０ポリペプチドなどの酵素をコードする異種発現ベクターを用いて、製造することができる。発現ベクターは、コードされたポリペプチドの発現のための宿主細胞に（例えば、形質転換またはトランスフェクションによって）導入することができ、これは次に任意に、精製または部分的に精製することができる。酵素を含む粗抽出物もまた、本発明の方法で使用することができる。シンターゼ、ヒドロラーゼ、ＵＧＴおよびＣＹＰ４５０ポリペプチドなどの酵素の小規模または大規模生産のために使用することができる発現系としては、限定はされないが、例えば本明細書に記載の核酸分子を含有するバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターなどの組換えＤＮＡで形質転換された細菌（例えば、E. coliおよびB. subtilis）などの微生物、または本明細書に記載の核酸分子を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、S. cerevisiaeまたはS. pombe）が挙げられる。
【００８２】
有用な発現系は、本明細書に記載の核酸分子を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染された昆虫細胞系、または、本明細書に記載の核酸分子を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、タバコモザイクウイルス）に感染された植物細胞系、または本明細書に記載の核酸分子を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系も含む。シンターゼ、ヒドロラーゼ、ＵＧＴまたはＣＹＰ４５０ポリペプチドなどの酵素はまた、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（アデノウイルス後期プロモーターおよびサイトメガロウイルスプロモーター）と、本明細書に記載の核酸分子とを含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物発現系を用いて、製造することができる。本発明の方法で使用するシンターゼ、ヒドロラーゼ、ＵＧＴまたはＣＹＰ４５０ポリペプチドなどの酵素は、以下に説明するように、Ｎ末端またはＣ末端タグを有していてもよい。
【００８３】
また、本文書では、ステップＩａ、Ｉｂ、ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、ＩＶａ、ＩＶｂおよびＶの各々において使用する酵素、例えばシンターゼ、ヒドロラーゼ、ＵＧＴまたはＣＹＰ４５０ポリペプチドなどをコードする単離された核酸も提供する。「単離された核酸」は、ゲノム中に存在する他の核酸分子から分離された核酸を意味し、これはゲノム中の核酸の片側または両側に通常隣接する核酸を含む。核酸に関して本明細書で使用する用語「単離された」とは、任意の天然に存在しない核酸配列を含み、その理由は、かかる天然に存在しない核酸配列は天然には見出されず、天然に存在するゲノム中に、直接隣接する配列（immediately contiguous sequence）を有しないからである。したがって、単離された核酸は、本発明の方法で使用する酵素のいずれかをコードするｃＤＮＡであってもよい。
【００８４】
単離された核酸は、天然に存在するゲノムにおいてそのＤＮＡ分子に直接隣接して通常見出される核酸配列の１つが、除去されたか、または存在しない場合には、例えばＤＮＡ分子であってよい。したがって、単離された核酸は、限定することなく以下を含む：他の配列から独立して、別の分子として存在するＤＮＡ分子（例えば、化学的に合成された核酸、またはＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理によって産生されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）、ならびに、ベクター、自己複製プラスミド、ウイルス（例えば、任意のパラミクソウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれているＤＮＡ。さらに、単離された核酸は、ハイブリッドまたは融合核酸の一部であるＤＮＡ分子等の、操作された核酸を含むことができる。例えばｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡの制限酵素消化を含有するゲルスライス内などの、何百万もの他の核酸の間に存在する１つの核酸は、単離された核酸とはみなされない。
【００８５】
いくつかの態様において、本発明の方法で使用するシンターゼ、ヒドロラーゼ、ＵＧＴまたはＣＹＰ４５０ポリペプチドなどの酵素をコードする核酸配列は、コードされたポリペプチドのその後の操作（例えば精製または検出の促進）、分泌または局在化を促進するよう設計された「タグ」をコードするタグ配列を含むことができる。タグ配列は、コードされたタグが、酵素のカルボキシルまたはアミノ末端のいずれかに位置するように、酵素をコードする核酸配列に挿入することができる。コードされたタグの非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＨＩＳタグ、およびフラグ（登録商標）タグ（Kodak, New Haven, CT）が挙げられる。タグの他の例としては、葉緑体輸送ペプチド、ミトコンドリア輸送ペプチド、アミロプラストペプチド、シグナルペプチド、または分泌タグが含まれる。
【００８６】
機能的相同体
上述のポリペプチドの機能的相同体は、本明細書に記載の方法および組換え宿主での使用にも適している。機能的相同体は、参照ポリペプチドに対して配列類似性を有し、参照ポリペプチドの１または２以上の生化学的または生理学的機能を実行するポリペプチドである。したがって、本明細書に記載の酵素の機能的相同体は、参照酵素に対して配列類似性を有し、かつ参照酵素と同様に、本発明の方法と同一のステップまたはステップの一部を触媒することができる、ポリペプチドである。
一般に、機能的相同体は、参照ポリペプチドと少なくともある程度の配列同一性を共有することが好ましい。したがって、本明細書に記載の任意のポリペプチドの機能的相同体は、これと少なくとも７０％、例えば少なくとも７５％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、例えば少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％の配列同一性を共有するのが好ましい。
【００８７】
アミノ酸配列の同一性は、２つの整列配列間で同一のアミノ酸配列を必要とする。したがって、参照配列と８０％のアミノ酸同一性を共有する候補配列は、アラインメント後に、候補配列中のアミノ酸の８０％が参照配列中の対応するアミノ酸と同一であることを必要とする。本発明の同一性は、コンピュータ解析の助けにより決定され、これは例えば、限定することなく、ClustalWコンピュータアラインメントプログラム（Higgins D., Thompson J., Gibson T., Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J., 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680）、およびそこに提案されているデフォルトのパラメータである。ClustalWソフトウェアは、European Bioinformatics InstituteのClustalW WWW Service http://www.ebi.ac.uk/clustalwから入手可能である。デフォルトの設定でこのプログラムを使用して、クエリと参照ポリペプチドの成熟（生理活性）部分を整列させる。完全に保存された残基の数を数え、参照ポリペプチドの長さによって割り算する。配列同一性は、参照ポリペプチドの全長にわたって決定される。
【００８８】
機能的相同体および参照ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドであってよく、配列類似性は、収束または発散進化的事象に起因するものであってよい。このように、機能的相同体は、しばしば相同体、またはオルソログ、またはパラログとして文献に示されている。天然に存在する機能的相同体の変異体、例えば野生型コード配列の変異体によってコードされるポリペプチドなどは、それ自体が機能相同体であり得る。機能的相同体はまた、ポリペプチドのコード配列の部位特異的突然変異誘発を介して、または別の天然に存在するポリペプチドのコード配列からのドメインを組み合わせることにより（「ドメイン交換」）、作製することができる。本発明の方法で使用されるシンターゼ、ヒドロラーゼ、ＵＧＴまたはＣＹＰ４５０ポリペプチドなどの酵素の機能的相同体をコードする遺伝子を改変するための技術は知られており、特に指向性進化技術、部位特異的突然変異誘発技術、およびランダム突然変異誘発技術を含み、これらは、ポリペプチドの特定の活性を増加させ、基質特異性を変更し、発現レベルを変化させ、細胞内位置（subcellular location）を変化させ、またはポリペプチド：ポリペプチドの相互作用を所望の様式で改変するのに使用することができる。かかる改変されたポリペプチドは、機能的相同体と考えられる。用語「機能的相同体」は、機能的に相同なポリペプチドをコードする核酸に適用される場合がある。
【００８９】
機能的相同体は、ヌクレオチドおよびポリペプチド配列のアラインメントの分析によって同定することができる。例えば、ヌクレオチドまたはポリペプチド配列のデータベース上でクエリを実行することにより、本発明の方法で使用する、シンターゼ、ヒドロラーゼ、ＵＧＴまたはＣＹＰ４５０ポリペプチドなどの酵素の相同体を同定することができる。
配列分析は、本発明の方法で使用するシンターゼ、ヒドロラーゼ、ＵＧＴまたはＣＹＰ４５０アミノ酸などの酵素をコードする本明細書中で同定された配列の１つを参照配列として用いた、非冗長データベースのBLAST、相互BLAST、またはPSI-BLAST分析を含むことができる。アミノ酸配列は、いくつかの例では、ヌクレオチド配列から推定される。４０％を超える配列同一性を有するデータベース内のこれらのポリペプチドは、シンターゼ、ヒドロラーゼ、ＵＧＴまたはＣＹＰ４５０ポリペプチドとしての適合性のさらなる評価のための候補である。アミノ酸配列の類似性は、保存的アミノ酸置換、例えば１つの疎水性残基の別のものとの置換、または１つの極性残基の別のものとの置換などを可能とする。所望であれば、かかる候補の手動検査を実施して、さらに評価すべき候補の数を絞ることができる。手動検査は、本発明の方法で使用するシンターゼ、ヒドロラーゼ、ＵＧＴまたはＣＹＰ４５０ポリペプチドなどの酵素に存在する領域、例えば保存された機能的ドメインを有するように見えるこれらの候補の選択により、行うことができる。
【００９０】
保存領域の同定は、ポリペプチドの一次アミノ酸配列内の領域であって、反復配列である、いくつかの二次構造（例えば、ヘリックスおよびβシート）を形成する、正または負に帯電したドメインを確立する、またはタンパク質モチーフもしくはドメインを表す、前記領域の位置を特定することにより、実施することができる。例えば、World Wide Web at sanger.ac.uk/Software/Pfam/およびpfam.janelia.org/の、さまざまなタンパク質モチーフおよびドメインについてのコンセンサス配列を記述するPfamウェブサイトを参照されたい。Pfamデータベースに含まれる情報は、Sonnhammer et al., Nucl. Acids Res., 26:320-322 (1998)；Sonnhammer et al., Proteins, 28:405-420 (1997)；およびBateman et al., Nucl. Acids Res., 27:260-262 (1999)に記載されている。保存領域はまた、密接に関連する種からの同一または関連するポリペプチドの配列を整列させることにより、決定することもできる。密接に関連する種は、好ましくは、同一の科（family）からのものである。いくつかの態様において、２つの異なる種からの配列のアラインメントが適切である。典型的には、少なくとも約４０％のアミノ酸配列同一性を示すポリペプチドは、保存領域を同定するのに有用である。関連ポリペプチドの保存領域は、少なくとも４５％のアミノ酸配列同一性（例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性）を示す。いくつかの態様において、保存領域は、少なくとも９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％のアミノ酸配列同一性を示す。配列同一性は、上記のように決定することができる。
【００９１】
モグロシド
本発明は、かかる方法における使用のためにモグロシドおよび材料を製造する方法に関する。本明細書で使用する用語「モグロシド」は、１つまたは２つ以上の位置でグリコシル化されたモグロールを指す。特に、本発明によるモグロシドは、３および／または２４の位置で１または２個以上のグルコース残基によりグリコシル化されたモグロールであってよい。モグロシドが１１および２５の位置でグリコシル化されているものは、あまり好ましくない。モグロールは、次の式Ｉの化合物であり、式中Ｒ１およびＲ２の両方は−Ｈである。
【００９２】
モグロシドは、下記式Ｉの化合物であることが好ましい：
【化１】
2015536157.tif 000002
式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、−Ｈ、モノグルコース、ジグルコース、トリグルコースであり、少なくともＲ１およびＲ２の１つは−Ｈではない。
特に、モグロシドは、本明細書下記の表１に記載のモグロシドの１つであってよい。
【００９３】
【表１】
2015536157.tif 000003
【００９４】
モグロシドＩＡ１は、モグロシドＩｂと称される場合もある。モグロシドＩＥ１は、モグロシドＩａと称される場合もある。モグロシドＩＩＥは、モグロシドＩＩと称される場合もある。モグロシドＩＩＩＡ２は、モグロシドＩＩＩａと称される場合もある。モグロシドＩＩＩは、モグロシドＩＩＩｂと称される場合もある。この代替命名法は、例えばUSSN61/733220で使用される。
本発明はさらに以下の実施例に記載されるが、これらは特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【００９５】
配列表
【表２】
2015536157.tif 000004
【００９６】
【表３】
2015536157.tif 000005
【００９７】
【表４】
2015536157.tif 000006
【実施例】
【００９８】
例１−  モグロシドＶの精製
モグロシドＶを、市販のモンクフルーツ抽出物（PureLo（登録商標）、Swanson）から以下のようにして精製した。３本のPureLo（登録商標）（２４０ｇ）を水（９００ｍＬ）に溶解し、ついでＨＰ−２０樹脂（４００ｇの樹脂）カラムにロードした。カラムを水（２．５Ｌ）で洗浄し；その後、２０％メタノール−水でさらに洗浄した。生成物をメタノールで溶出した。溶媒を蒸発させ高真空での乾燥後に、モグロシドＶ（２．５ｇ、純度〜８０％、１１−オキソモグロシドＶが主要な不純物）を得た。
【００９９】
例２−  モグロールのモグロシドＶからの酵素的合成
モグロシドＶ（３００ｍｇ）を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、１００ｍＬ）に溶解し、Aspergillus nigerからの粗ペクチナーゼ（２５ｍＬ、Sigma P2736）を添加した。混合物を５０℃で４８時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を真空下で乾燥し、次いで分取ＨＰＬＣで精製した。純粋なモグロール（４０ｍｇ）を得て、その構造をＮＭＲおよび質量分析で確認した。図６参照。
【０１００】
例３−  モグロール３−Ｏ−グルコシド（モグロシドＩＥ１）およびモグロール２４−Ｏ−グルコシド（モグロシドＩＡ１）のモグロシドＶからの酵素的合成
モグロシドＶ（３００ｍｇ）を０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、１００ｍＬ）に溶解し、Aspergillus nigerからの粗ペクチナーゼ（２５ｍＬ、Sigma P2736）を添加した。混合物を５０℃で６．５時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチル（２×１００ｍｌ）で抽出した。有機抽出物を真空下で乾燥し、次いで分取ＨＰＬＣで精製した。純粋なモグロシドＩＥ１（１１．０ｍｇ）およびモグロシドＩＡ１（８．０ｍｇ）を得た。それらの構造をＮＭＲおよび質量分析で確認した。図６参照。
【０１０１】
例４−  in vitroでのＵＧＴのスクリーニングおよび反応
モグロールと２３０のＵＧＴ酵素のパネルのin vitro反応を行い、生成物をＬＣ−ＭＳで分析した。in vitroＵＧＴ反応混合物は、４Ｘトリス緩衝液、モグロール（２５０μＭ）、ＵＤＰ−グルコース（７５０μＭ）および１％のアルカリホスファターゼを含む。５μｌの各部分精製ＵＧＴ酵素または粗酵素抽出液を反応物に添加し、反応容量を水で５０μｌとした。反応物は３０℃で一晩インキュベートし、滅菌９６ウェルプレート中で行った。インキュベーション後、２５μＬのＤＭＳＯを各反応物に添加し、反応プレートを５分間遠心分離した。４０μＬの試料を各ウェルから採取し、濾過し、ＬＣ−ＭＳ分析に使用した。ＵＧＴの７３Ｃ３、７３Ｃ６および８５Ｃ２は、全てのモグロール基質をモグロシドＩＡ１に変換することが見出された。ＵＧＴ７３Ｃ５はモグロシドＩＥ１とＩＡ１の両方を生産した。ＵＧＴ ２０ ７３Ｅ１との反応では、反応は完了しなかったが、モグロシドＩＡ１が、新規なグリコシル化モグロール（モグロシドＩＥ１でもＩＡ１でもない；正確な質量はモグロシドIとして示されたが、これはおそらく、Ｃ１１−ＯＨ上のグリコシル化事象による）と共に、主生成物として見出された。
【０１０２】
例５−  モンクフルーツのククルビタジエノールシンターゼの同定
ククルビタジエノールシンターゼをコードするモンクフルーツの遺伝子はCirCSであり、推定で７６４アミノ酸の３３８個をカバーする部分的遺伝子配列を、アセンブルされたデータのtBLASTn解析をCucurbita pepoからのククルビタジエノールシンターゼクエリ（受入番号BAD34645.1、配列番号１）を用いて行うことにより、同定した。CirCSの一部は、C. pepo遺伝子とタンパク質レベルで９７．５％同一である（配列番号２；配列番号１の残基５１５〜７６４から）。
【０１０３】
例６−  ククルビタジエノールからのモグロールの形成を触媒するＰ４５０酵素に対する、モンクフルーツの候補遺伝子の同定
ククルビタジエノールからモグロールへの経路は、Tang et al., BMC Genomics, 12, 343 (2011)によって提案されている。ククルビタジエノールとモグロールの中間体が果実内に存在するが、これらはマイナーな産物として単離されている。Ukiya, et al., J. Agric. Food Chem. 50, 6710-6715 (2002)を参照。グリコシド中間体は、１１−ヒドロキシ系および１１−オキソ系の両方に存在し、果実が熟すにつれて、モグロシドIからモグロシドＶへと徐々に変化するが、これはトリテルペンコアが、その後のグリコシル化の前にＰ４５０酵素によって完全に酸化されることを示している。Tangらにより提案されたスキームによれば、３つの独立しシトクロムＰ４５０酵素触媒酸化は、ククルビタジエノールからのモグロールの形成をもたらす（図４の下側の経路）。本発明者らは、提案された一次反応が非常に可能性が低いことを見出した。したがって経路には、１つのシトクロムＰ４５０酵素によるエポキシ化と、続いて自発的または酵素が触媒する水和、および別のＰ４５０酵素が触媒する酸化（図４の上側の経路に視覚化）が伴い得ること、または経路が、図１０Ａに示すような別の順序での類似のステップを含み得ることが、提示される。本発明者らはまた、図１０Ｂに示すような、ジオキシド−スクアレンから開始される別の経路も提唱する。
【０１０４】
モンクフルーツから最も可能性の高い候補Ｐ４５０遺伝子を同定するために、最も知られている酵素のサブファミリーおよび変異を表す、パブリックドメインのArabidopsis thalianaの２３９のシトクロムＰ４５０酵素のポリペプチド配列からなる、BLASTデータベースを作成した。配列を、アセンブルされたモンクフルーツトランスクリプトームデータのtBLASTn（翻訳ヌクレオチドデータベース）分析に使用して、１０Ｅ−１０以下のＥ値を有するデータベースクエリー配列のいずれかと相同性を有する全ての配列を同定した。７２の配列が同定された。典型的には、トランスクリプトーム研究において発現配列タグの完全長または長い遺伝子の長さをアセンブルする能力は、問題の遺伝子に多くの配列タグが存在したことを意味する。現在の実験において、これは、この遺伝子がモンクフルーツ組織で高発現されたことを示し、したがって、目的の２つのＰ４５０酵素のうち１つについての候補である可能性が高い。７２の配列のうち、１８は、完全長またはほぼ完全長であった。アセンブルされた遺伝子は、ＣＹＰ５３３、ＣＹＰ９３７、ＣＹＰ１７９８、ＣＹＰ１９９４、ＣＹＰ２０４８、ＣＹＰ２７４０、ＣＹＰ３４０４、ＣＹＰ３９６８、ＣＹＰ４１１２、ＣＹＰ４１４９、ＣＹＰ４４９１、ＣＹＰ５４９１、ＣＹＰ６４７９、ＣＹＰ７６０４、ＣＹＰ８２２４、ＣＹＰ８７２８、ＣＹＰ１００２０、およびＣＹＰ１０２８５と命名した。
【０１０５】
これらは、ククルビタジエノールのモグロールへの変換の触媒に関与する２つのＰ４５０酵素に対する、候補遺伝子である。完全長遺伝子配列は、次の遺伝子コンティグについてＰＣＲにより増幅した：ＣＹＰ５３３、ＣＹＰ９３７、ＣＹＰ１７９８、ＣＹＰ１９９４、ＣＹＰ２７４０、ＣＹＰ４１１２、ＣＹＰ４１４９、ＣＹＰ４４９１、ＣＹＰ５４９１、ＣＹＰ７６０４、ＣＹＰ８２２４、およびＣＹＰ１０２８５；ここでモンクフルーツの葉のゲノムＤＮＡまたは根のｃＤＮＡを用い、および配列重複拡張技術を使用して常在イントロン配列を除去した。ＣＹＰ５３３、ＣＹＰ９３７、ＣＹＰ１７９８、ＣＹＰ１９９４、ＣＹＰ２０４８、ＣＹＰ２７４０、ＣＹＰ３４０４、ＣＹＰ３９６８、ＣＹＰ４１１２、ＣＹＰ４１４９、ＣＹＰ４４９１、ＣＹＰ５４９１、ＣＹＰ６４７９、ＣＹＰ７６０４、ＣＹＰ８２２４、ＣＹＰ８７２８、ＣＹＰ１００２０、およびＣＹＰ１０２８５のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号３〜２０として提供されている。
【０１０６】
例７−  モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＩＩＡ２およびｂ、およびシアメノシドの、モグロシドＩＩＥからの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼについてのモンクフルーツの候補遺伝子の同定
３つの酵素的グリコシル化が、モグロシドＩＩＥをモグロシドＶまたは１１−オキソ−モグロシドＶに変換するために必要である。２つのグルコースは、モグロシドＩＩＥに既に存在する２つのグルコース分子に１，６結合で結合する。これは１つのＵＧＴ酵素により行うことができる。別のグルコースを、Ｃ２４結合グルコースに１，２結合で添加する。モグロシドＩＶは、１，６結合グルコースがＣ２４結合グルコースで欠落している中間体である。シアメノシドでは、このグルコースは存在するが、しかしＣ３結合グルコースにおける１，６結合グルコースは欠落している。１１−オキソ−モグロシドＶは、１１−ＯＨが酸化されていることのみを除き、モグロシドＶと同一である。モグロシドＩＶ、モグロシドＶ、１１−オキソ−モグロシドＶ、およびシアメノシドの構造について、図１を参照されたい。
【０１０７】
アセンブルされたモンクフルーツのトランスクリプトームデータ内の全ての可能なＵＧＴ遺伝子を同定するために、全ての既知のサブファミリーのグリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）のポリペプチド配列からなる、全部で１６０個の配列のデータベースをアセンブルした。tBLASTn分析を、このデータベースとアセンブルされたモンクフルーツデータの間で実施した。ジ−グリコシル化（すなわち、糖を、アグリコン上に存在する別の糖に順に付着させること）を行うＵＧＴは常に、ファミリー１のＵＧＴのサブファミリー７６、７９、９１または９４から来る（後者の３つは「オルソロジー群８」を形成する）。サブファミリー７６の酵素は通常１，３結合を作るが、オルソロジー群８のＵＧＴは常に１，２または１，６結合を作る。
【０１０８】
オルソロジー群８酵素に対して、他の全てのＵＧＴ酵素または全ての非ＵＧＴ遺伝子よりも高い相同性を示す配列が同定された。こうして、１１のコンティグが、モグロシドＩＩＥをモグロシドＶに変換するのに必要な２つのグリコシルトランスフェラーゼをコードする有望な候補として同定された：ＵＧＴ９８、ＵＧＴ１４９５、ＵＧＴ１８１７、ＵＧＴ３４９４、ＵＧＴ５９１４、ＵＧＴ８４６８、ＵＧＴ１０３９１、ＵＧＴ１１７８９、ＵＧＴ１１９９９、ＵＧＴ１３６７９およびＵＧＴ１５４２３（それぞれ配列番号２６〜３６）。これらの中で、ＵＧＴ９８、ＵＧＴ１４９５、ＵＧＴ１８１７、ＵＧＴ５９１４、ＵＧＴ８４６８およびＵＧＴ１０３９１を、モンクフルーツの葉のゲノムＤＮＡまたは根のｃＤＮＡを使用して、ＰＣＲにより増幅することができた。増幅された遺伝子は、大腸菌発現プラスミドベクターに挿入した。
【０１０９】
酵素を発現させ、ニッケルカラム上で精製した。モグロシドＩＡ１、ＩＥ１およびＩＩＥの、６つの精製ＵＧＴ酵素のパネルとのin vitro反応を実施し、生成物をＬＣ−ＭＳで分析した。in vitroＵＧＴ反応混合物は、４Ｘトリス緩衝液、基質（２５０μＭ）、ＵＤＰ−グルコース（７５０μＭ）および１％のアルカリホスファターゼを含む。５μｌのそれぞれの部分精製ＵＧＴ酵素を反応物に添加し、反応容量を水で５０μｌとした。反応物は、３０℃で一晩インキュベートし、滅菌９６ウェルプレート中で行った。インキュベーション後、２５μＬのＤＭＳＯを各反応物に添加し、反応プレートを５分間遠心分離した。４０μＬの試料を各ウェルから採取し、濾過し、ＬＣ−ＭＳで分析した。１，６結合の形成を触媒するＵＧＴのみでなく、１，２結合の形成を触媒する酵素も、ＬＣ−ＭＳ分析に基づいて同定した。
【０１１０】
例８−  ｅＹＡＣ技術を用いて、ククルビタジエノールのモグロールへの変換に関与するシトクロムＰ４５０酵素を同定
ｅＹＡＣ遺伝子発現技術を用いて、候補遺伝子のコレクション内の活性なシトクロムＰ４５０酵素を同定した。以下の遺伝子を、「エントリーベクター」（異なるヌクレオチド配列を有するが、全てアミノ酸メチオニンの添加によって３０抑制性である、遺伝子プロモーターおよびターミネーター配列を含むプラスミドベクターのコレクション）に挿入した：Cucurbita pepoククルビタジエノールシンターゼ遺伝子、ＣＹＰ５３３（配列番号３）、ＣＹＰ９３７（配列番号４）、ＣＹＰ１７９８（配列番号５）、ＣＹＰ１９９４（配列番号６）、ＣＹＰ２７４０（配列番号８）、ＣＹＰ４１１２（配列番号１１）、ＣＹＰ４１４９（配列番号１２）、ＣＹＰ４４９１（配列番号１３）、ＣＹＰ５４９１（配列番号１４）、ＣＹＰ７６０４（配列番号１６）、ＣＹＰ８２２４（配列番号１７）、およびＣＹＰ１０２８５（配列番号２０）；Arabidopsis thalianaからの２つのシトクロムＰ４５０オキシドレダクターゼ（ＣＰＲ）遺伝子（ＡＴＲ１およびＡＴＲ２）；Stevia rebaudianaからのＣＰＲ（ＣＰＲ８）；モンクフルーツから単離されたＣＰＲ；およびA. thalianaからのグリコシルトランスフェラーゼＵＧＴ７３Ｃ５（配列番号２２）およびＵＧＴ７３Ｃ６（配列番号２３）、S. rebaudianaからのグリコシルトランスフェラーゼＵＧＴ８５Ｃ２（配列番号２５）。
【０１１１】
これらの１７のプラスミドからの発現カセットは、AscI＋SrfI消化後に切除し、精製し、ライゲーション反応でランダムに連結して、酵母人工染色体（「ｅＹＡＣ」）を作成した。３０〜２００μｇのＤＮＡを、それぞれ１０の、カセットを含むエントリーベクターから調製し、カセットは、３時間の反応でＴ４リガーゼでのライゲーションによりｅＹＡＣに連結する。連結反応の成功は、連結されたＤＮＡが高粘性であるため、反応混合物の粘度によって評価する。セントロメア、２つのテロメアおよびLEU2およびTRP1選択マーカーを含むＤＮＡ断片（「アーム」）を、１５の連結発現カセットの最後に追加し、これにより、機能性ｅＹＡＣを作製する。ｅＹＡＣを、酵母細胞壁のザイモリアーゼ消化により、erg7酵母株の形質転換コンピテントスフェロプラストに形質転換し、次いでＣａＣｌ２／ＰＥＧ緩衝液で処理して、ｅＹＡＣなどの大きな分子に対して透過性のスフェロプラストを作成した。形質転換後、酵母スフェロプラストを、細胞壁の再生を生じ得る「ノーブル寒天（noble agar）」系固体増殖培地中に埋め込む。コロニーは、接種後４〜８日から現れる。再生培地はアミノ酸のロイシンおよびトリプトファンを欠き、こうして酵母細胞中で二重武装ｅＹＡＣの存在について選択される。１００個の形質転換体を選択し、モグロシドＩＥ１、ＩＡ１およびＩＩＥの生産について分析する（液体クロマトグラフィー結合質量分析（トリプル四重極型））。
【０１１２】
各形質転換体を画線培養し、酵母株のマーカーおよびｅＹＡＣの両方のアームの遺伝的存在、すなわちLEU2およびTRP1マーカーについて試験する。形質転換体の９５％以上が正しい遺伝子型を有している。各形質転換体には、ＣＥＹ指定番号が与えられる。当初４８のＣＥＹを、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ内の５０ｍｌの合成完全培地（ＳＣ）中にて、メチオニンなしで増殖させてｅＹＡＣからの遺伝子発現を誘導するようにし、およびトリプトファン、ロイシンおよびヒスチジンなしでｅＹＡＣの損失に対して逆選択（counter-select）するようにした。培養物は、０．２５のＯＤ６００に対応する開始密度を有し、３０℃で４８時間、ゆっくり振盪（１５０ｒｐｍ）して接種した。２４時間後、それぞれの培養物から１ｍｌの上清を回収し、ＬＣ−ＭＳ分析に供した。陽性のＣＥＹ（すなわち、アッセイしたいずれかのモグロシドを生産するもの）をＰＣＲ分析に供して、どのＣＹＰ遺伝子が保有ｅＹＡＣ上に存在するかを評価し、こうして、モグロール経路Ｐ４５０酵素を同定した。
【０１１３】
例９−  モグロール経路前駆体の利用可能性の増強
本研究で用いたバックグラウンド株は、TRP1遺伝子が欠失したBY4742株である。この株はEFSC301と呼ばれる。この実験室酵母株におけるオキシドスクアレンとジオキシドスクアレンの利用可能性を向上させるために、内因性ERG7遺伝子のプロモーターを、Nurseothricinマーカー（ＮａｔＭＸ）およびＣＵＰ１の銅誘導性プロモーターからなるＰＣＲ断片で置き換えた。この置換は低い転写をもたらし、これにより、酵母株を合成完全培地（ＳＣ培地）などの通常の増殖培地中で増殖させた場合に、ERG7の低い発現を与える。ERG7はラノステロールシンターゼをコードし、低い発現は、パン酵母でオキシドスクアレンとジオキシドスクアレンの蓄積をもたらすことが知られている。オキシドスクアレンは、一般的にトリテルペノイドの前駆体であり、モグロール経路の前駆体の可能性もある。さらにオキシドスクアレンとジオキシドスクアレンの利用可能性を向上させるために、ERG1によってコードされるスクアレンエポキシダーゼを、ゲノムに組み込まれた遺伝子のコピーから、ＧＰＤ１プロモーターによって過剰発現させた。ERG1によってコードされるスクアレンエポキシダーゼの配列は、本明細書中に配列番号５４として提供される。さらに、酵母ＨＭＧレダクターゼの切断型コピー（ｔＨＭＧ１）は、ＧＰＤ１プロモーターからの発現により、遺伝的に組み込まれた遺伝子コピーから発現させた。得られた株はEFSC3027と呼ばれる。
【０１１４】
EFSC3027株における、オキシドスクアレンとジオキシドスクアレンの製造の増強の成功は、２つの可溶性S. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼのどちらか１つがこの株で発現された場合の、テトラヒドロキシスクアレンの生産によって実証された。１つのエポキシドヒドロラーゼは、配列番号３８のS. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ１であった。これを発現する酵母を調製するために、S. cerevisiae用にコドン最適化されたS. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ１の配列番号３７の遺伝子配列を、酵母株EFSC3027に導入した。他のエポキシドヒドロラーゼは、配列番号４０のS. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ２であった。これを発現する酵母を調製するために、S. cerevisiae用にコドン最適化されたS. grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ１の配列番号３９の遺伝子配列を、酵母株EFSC3027に導入した。図７は、S grosvenoriiエポキシドヒドロラーゼ２を発現するプラスミドで形質転換された酵母株EFSC3027からの試料中の、テトラヒドロキシスクアレンのプロトン＋Ｎａ＋付加体に対応するＬＣ−ＭＳ質量ピーク５０１を示す。テトラヒドロキシスクアレンは、ジオキシドスクアレンの２，３および２２，２３エポキシド結合により作製される。テトラヒドロキシスクアレンの蓄積は、EFSC301バックグラウンド株では検出されなかった。試料は、培養物アリコートを５０％ＤＭＳＯ中で煮沸した後、遠心分離で細胞材料をペレット化することにより作製した。上清をその後ＥＳＩ ＬＣ−ＭＳにより測定した。
βアミリンの製造用にオキシドスクアレンの利用可能性を増強するための同様のシステムは、Kirby, J et al in FEBS Journal 275 (2008) 1852-1859に記載されている。
【０１１５】
例１０−  酵母株EFSC3027でのククルビタジエノールの製造
Siraitia grosvenoriiククルビタジエノールシンターゼ、受入番号HQ128567（本明細書に配列番号４２として提供される配列）のS. cerevisiae用にコドン最適化された遺伝子のコピーを、酵母株EFSC3027のゲノムに組み込み、この遺伝子の転写をＧＰＤ１プロモーターで駆動すると、ククルビタジエノールシンターゼの発現により、ＥＳＩ ＬＣ−ＭＳによって容易に検出可能な量のククルビタジエノールが酵母株で発現される（図８参照）。Siraitia grosvenoriiククルビタジエノールシンターゼのアミノ酸配列は、本明細書において配列番号４３として提供される。ククルビタジエノールを製造する配列番号４２を含む株は、EFSC3498と呼ばれる。酵母株を、２％グルコースを含有する合成完全培地中で３０℃にて５日間増殖させ、ククルビタジエノールの抽出を、培養物試料を５０％エタノール／２０％ＫＯＨ中で５分間煮沸し、次いで等量のヘキサンで抽出し、その後ヘキサンを蒸発させ、乾燥抽出物をメタノール中に再懸濁することにより、実施する。図８は、EFSC3027でのラノステロールのＬＣ−ＭＳクロマトグラムピーク（上フレーム）、およびEFSC3498でのククルビタジエノールとラノステロールのＬＣ−ＭＳクロマトグラムピーク（下フレーム）を示す。ラノステロールに対応するピークは〜８．０５の保持時間を示し、一方ククルビタジエノールに対応するピークは７．８５の保持時間を有する。ラノステロールとククルビタジエノール両方は、ＬＣ−ＭＳクロマトグラムでの質量４０９．４を示す（プロトン付加体マイナス１個のＨ２Ｏ）。
【０１１６】
例１１−  S. cerevisiaeにおけるオキソおよびヒドロキシククルビタジエノールの製造
ククルビタジエノール生産酵母株EFSC3498（実施例１０に記載のように調製）を、２つのプラスミド、１つはＴＥＦ１プロモーターからS. grosvenoriiＣＹＰ５４９１を発現するもの、もう１つもＴＥＦ１プロモーター（配列番号１４として提供されている、ＣＰＲ４４９７をコードするＤＮＡ配列）からS. grosvenoriiＣＰＲ４４９７を発現するもので形質転換すると、３つの明らかなピークが出現する（ＬＣ−ＭＳクロマトグラムのピークについて図９を参照）。S. grosvenoriiＣＹＰ５４９１のアミノ酸配列は、本明細書中に配列番号４４として提供され、S. grosvenoriiＣＹＰ５４９１をコードするＤＮＡ配列は、配列番号１４として提供される。S. grosvenoriiＣＰＲ４４９７のアミノ酸配列は、本明細書中に配列番号４６として提供され、S. grosvenoriiＣＰＲ４４９７をコードするＤＮＡ配列は、配列番号４５として提供される。図９の上部フレームは、ＣＹＰ５４９１とＣＰＲ４４９７がEFSC3498に発現された場合に現れる３つのピークのＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示し、一方３つの下部フレームは、これらの３つのピークの断片化スペクトルを示す。ＣＹＰ５４９１は、受入番号HQ128570およびHQ128571に対して、アミノ酸およびヌクレオチド配列レベルの両方で９９％同一である。３つのピークの質量（４４３．３８、４４１．３７および４５７．３６）は、それぞれ、ヒドロキシル化ククルビタジエノール、オキソククルビタジエノールおよびヒドロキシ＋オキソククルビタジエノールのプロトン付加体の重量に対応する。理論に束縛されるものではないが、ヒドロキシル化ククルビタジエノール（プロトン化質量４４３．３８）および酸化ククルビタジエノール（プロトン化質量４４１．３７）は、それぞれ、１１−ヒドロキシ−ククルビタジエノールおよび１１−オキソ−ククルビタジエノールであると考えられる。オキソ＋ヒドロキシククルビタジエノール（プロトン化質量４５７．３６）の両方に対応するピークは、１１−オキソ２４，２５エポキシククルビタジエノールであって、次のどちらかから形成されたものである可能性がある：ククルビタジエノールシンターゼによるジオキシドスクアレンの環化およびＣＹＰ５４９１による１１ヒドロキシル化（図１０Ｂ）、または、ＣＹＰ５４９１が多機能性であることにより、１１−酸化および２４，２５−エポキシ化の両方を行う（図１０Ａ）。
【０１１７】
例１２−  S. grosvenoriiＵＧＴの発現によるS. cerevisiaeにおけるモグロールのグリコシル化
ＵＧＴの９８、ＳＫ９８および１５７６を、イルミナの配列データからアセンブルしたフルーツ遺伝子コンティグから設計されたプライマーにより、S. grosvenoriiの葉と根のｃＤＮＡからクローニングした。S. grosvenoriiは、Horizon Herbs, LLC, United Statesから購入した。ＵＧＴ９８のＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、それぞれ本明細書において配列番号５１および５３として提供され、一方配列番号５２は、S. cerevisiaeにおける発現のためにコドン最適化されたＵＧＴ９８をコードするＤＮＡ配列を提供する。ＵＧＴＳＫ９８のＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、それぞれ本明細書において配列番号４９および５０として提供され、ＵＧＴ１５７６のＤＮＡ配列およびタンパク質配列は、それぞれ本明細書において配列番号４７および４８として提供される。酵母株EFSC1563は、両方ともエキソ−１，３−β−グルカナーゼをコードするEXG1遺伝子とEXG2遺伝子の欠失を有する。酵母株EFSC1563（EFSC301 exg1 exg2）を、ＧＰＤ１プロモーターによって駆動され、成長培地中１０〜１００μＭの濃度までモグロールを供給された、ＵＧＴ１５７６を発現するプラスミドで形質転換した場合、モグロシドＩＡ１の明確な形成がＬＣ−ＭＳによって検出された（図１１Ｂ）。製造されたモグロシドＩＡ１は、ＬＣ−ＭＳ分析において参照モグロシドＩＡ１と同じ保持時間を示す。図１１Ａは、参照モグロシドＩＡ１のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示し、一方図１１Ｂは、５０μＭのモグロールを供給した培養物中の、ＵＧＴ１５７６を発現するEFSC1563の試料からのピークを示す。これらのデータは、ＵＧＴ１５７６遺伝子がモグロール２４−ＯＨ ＵＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するグリコシルトランスフェラーゼをコードすることを示す。試料は、培養物アリコートをＤＭＳＯと１：１で混合し、次に５分間煮沸し（８０℃）、遠心分離によってペレット化することにより、作製した。上清をその後、ＥＳＩ ＬＣ−ＭＳに供した。
【０１１８】
ＧＰＤ１プロモーターからの発現により酵母発現プラスミドにクローニングされたＵＧＴの９８およびＳＫ９８を、ＵＧＴ１５７６発現プラスミドの共形質転換なしでFSC1563に形質転換すると、供給されたモグロールの変換は検出されない。これとは対照的に、ＵＧＴ９８またはＵＧＴ ＳＫ９８をＵＧＴ１５７６と共にモグロール供給EFSC1563で共発現すると、モグロシドＩＡ１の更なるグリコシル化がもたらされる。ＵＧＴ１５７６と共に共発現されたＵＧＴ ＳＫ９８は、ジ−グリコシル化モグロールの製造をもたらし（モグロシドＩＩＡ、図１２Ａ）、一方ＵＧＴ ＳＫ９８のＵＧＴ９８との共発現は、ジおよびトリグリコシル化モグロールの製造をもたらす（中央と下部フレーム、図１２Ｂ）。ＵＧＴ９８とＵＧＴ ＳＫ９８の両方によって形成されるジ−グリコシル化モグロールは、ＬＣ−ＭＳ中のモグロシドＩＩＥおよびモグロシドＩＩＡ１とは異なる保持時間を有し、これがモグロシドＩＩＡであることをより確からしくする。これは、ＵＧＴ９８とＵＧＴ ＳＫ９８の両方が、モグロシドＩＡ１のグルコースの１，２グルコシル化を触媒できることを意味する。ＵＧＴ９８は多機能性であるらしく、モグロシドＩＡ１の１，２グリコシル化を触媒して、モグロシドＩＩＡの形成をもたらし、続いて、モグロシドＩＩＡのおそらくは１，６グリコシル化を触媒して、モグロシドＩＩＩＡ１を形成する（図１２Ｂ）。ＵＧＴ９８はモグロール自体をグリコシル化しないため、我々は、ＵＧＴ９８はモグロシドＩＩの１，６グリコシル化を触媒すると考えている。したがって、ＵＧＴ９８は多機能性であり、モグロシドの２４グルコース部分の１，２および１，６ ＵＤＰ−グルコースグリコシルトランスフェラーゼの両方である可能性が高い。ＵＧＴの９８およびＳＫ９８は、ＵＤＰ−グルコースグリコシルトランスフェラーゼのＵＧＴ９１ファミリーに属し、このファミリーのメンバーは１，２および１，６グリコシルトランスフェラーゼであることが知られている。
図１３は、モグロールからモグロシドＩＩＩＡ１へのグリコシル化反応を概略的にまとめたものである。
【０１１９】
その他の実施形態
本発明は、その詳細な説明との関連で記載されているが、前述の説明は例示を意図しており、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定するものではないことを理解すべきである。他の側面、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１５−５】
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【図１５−６】
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【図１５−７】
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【図１５−８】
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【図１５−９】
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【図１５−１０】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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