(57)【要約】  クロマトグラフィープロセス、特に、液液クロマトグラフィーによって、有機溶媒溶液から化合物を分離する方法であって、クロマトグラフィープロセスの前に、溶媒交換のための有機溶媒ナノフィルトレーションプロセスの手段によってその溶液の組成を変更する方法。それに加えてまたはその代わりに、クロマトグラフィープロセス後に、そのクロマトグラフィープロセスからの排出物を有機溶媒ナノフィルトレーションのプロセスに供して、溶媒回収のために排出物中に残存する対象化合物および／または不純物を除去する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機溶媒媒体中の対象化合物溶液から対象化合物を分離する方法であって、前記溶液を液体移動相もしくは固定相としてまたは液体移動相もしくは固定相と混合して、それぞれの対応する固定相または液体移動相とともに用い、対象化合物が液体移動相と固定相との間で分配されて、溶解対象化合物が移動相の画分に濃縮された状態とすることができるクロマトグラフィープロセスによるものであり、
クロマトグラフィープロセスの前に、第１の有機溶媒媒体中の第１の対象化合物溶液の組成が、溶媒交換のための有機溶媒ナノフィルトレーションのプロセスの手段によって変更され、前記対象化合物溶液を、前記第１の溶液とは異なる有機溶媒組成を有する第２の有機溶媒媒体中の第２の対象化合物溶液として提供し、かつ／あるいは
前記クロマトグラフィープロセス後に、該クロマトグラフィープロセスから排出された移動相が有機溶媒ナノフィルトレーションプロセスに供され、該プロセスにおいて、クロマトグラフィープロセスからの排出移動相が有機溶媒ナノフィルトレーション膜に通されて、排出移動相中に残存する対象化合物および／または不純物が保持液中に保持され、かつ、精製された移動相がその膜を通過する、方法。
【請求項２】
溶媒交換のための有機溶媒ナノフィルトレーションを用いて第１の溶液の組成を変更して第２の有機溶媒媒体中の第２の対象化合物溶液を提供し、
クロマトグラフィープロセスにおいて、第２の溶液を液体移動相もしくは固定相としてまたは液体移動相もしくは固定相と混合して、それぞれの対応する固定相または液体移動相とともに用い、対象化合物が液体移動相と固定相との間で分配されて、溶解している対象化合物が移動相の画分に濃縮された状態とすることができること
を含んでなる、第１の有機溶媒媒体中の第１の対象化合物溶液から対象化合物を分離するための、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象化合物が、溶液中に対象化合物を含有する液体移動相の画分からさらに単離される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ナノフィルトレーションによる溶媒交換が、第１の溶液の供給を、膜を通過させることによって濃縮した後に通過を停止させ、次に、前記第２の有機溶媒媒体の１つまたは複数の溶媒成分と混合することにより供給容量を調整する不連続プロセスによって行われる、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記対象化合物を含有する溶媒媒体の各膜通過によって５０％を超える溶媒媒体が除去される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
５〜８回の通過が行われる、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記ナノフィルトレーションによる溶媒交換が、前記第２の有機溶媒媒体の新鮮な１つまたは複数の溶媒成分を透過と等しい速度で第１の溶液供給に添加し、これにより前記第１の溶液の組成から前記第２の溶液の組成へ徐々に組成が変わる連続プロセスによって行われる、請求項２または３に記載の方法。
【請求項８】
前記対象化合物の膜阻止率Ｒｉが９０％以上である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の溶液を溶媒交換のプロセスに供する前に、前記第２の有機溶媒媒体の１つまたは複数の溶媒成分が前記第１の対象化合物溶液に添加される、請求項２〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
膜に通す前に、４０容量％以上の第２の有機溶媒が前記第１の溶液に添加される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１の対象化合物溶液が対象化合物の結晶化から回収された母液である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１の溶液が、前記対象化合物溶液の調製から生じる対象化合物を含有する調製媒体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記クロマトグラフィープロセスが液液クロマトグラフィープロセスであり、前記固定相が液相である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記液液クロマトグラフィープロセスが向流クロマトグラフィープロセスである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２の溶液が前記液体移動相としてまたは液体移動相の成分として使用される、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の溶液が、サンプルとして液体移動相に導入されて液体移動相の一成分となり、前記クロマトグラフィープロセスにおいて固定相と接触される、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記クロマトグラフィープロセスにおいて、前記第２の溶液がクロマトグラフィーカラムに注入され、液体移動相流中でカラムに流される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
液体移動相流がカラムに流され、この移動相流に前記第２の溶液が導入される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の溶液の第２の有機溶媒媒体が、液体固定相不混和性の液体移動相に好適な１種類以上の液体成分を含んでなる、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記移動相および固定液相が、Ｃ１−６アルキルＣ１−６アルカン酸エステル、液体Ｃ５−１０アルカン、およびＣ１−８アルカノールから選択される溶媒を含んでなる、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記移動相および固定相が、それぞれ成分ヘプタン、酢酸エチル、メタノールおよび水を含んでなる１対の不混和性液相である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記固定相が５０％以上のメタノール・水混合物を含んでなり、移動相が８０％以上のヘプタン・酢酸エチル混合物を含んでなる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の溶液の第２の有機溶媒媒体が成分ヘプタン、酢酸エチル、メタノールおよび水を含んでなる、請求項１３〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第２の溶液の第２の有機溶媒媒体が、液液クロマトグラフィープロセスに用いられる液体移動相または液体固定相の組成に相当する組成を有する、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記クロマトグラフィーカラムから排出された移動相が溶媒回収工程においてさらなる有機溶媒ナノフィルトレーションプロセスによって精製され、該プロセスにおいて、クロマトグラフィープロセスからの排出移動相が有機溶媒ナノフィルトレーション膜を通過して、排出移動相中に残存する前記対象化合物および／または不純物が保持液中に保持され、かつ、精製された移動相がその膜を通過する、請求項２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
クロマトグラフィープロセスから排出された前記液体移動相が、優先的に有機溶媒分子を通過させ、従って溶質分子の通過を阻止する膜を用いた有機溶媒ナノフィルトレーションプロセスに供される、方法。
【請求項２７】
前記液体移動相排出物が液液クロマトグラフィープロセスから排出された移動相である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記溶媒回収プロセスが、透過と等しい速度でシステムに添加される供給移動相を用いた定容量ダイアフィルトレーションとして操作される、請求項２６または２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規方法、特に、クロマトグラフィー、特に、液液クロマトグラフィーを用いた溶液からの対象化合物の分離の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
クロマトグラフィーは、溶解対象物質を含有する液体移動相を固定相に流し、溶解している対象物質が移動相と固定相との間で分配され、その結果、溶解る対象物質が、移動相の画分中に濃縮された状態になり、移動相から単離することができる、周知の分離方法である。
【０００３】
一般には、クロマトグラフィープロセスでは、液体移動相流の流動が確立され、移動相と混和性の溶媒媒体中の対象物質溶液のサンプルがその流れに導入され、それにより、サンプルが固定相と接触して流れる。
【０００４】
固定相が固体である固液クロマトグラフィーは最も一般的なタイプのクロマトグラフィーである。一般には、固体の粒子が長管状のカラムに収容される。
【０００５】
液液クロマトグラフィーは公知の分離方法である。液液クロマトグラフィーは、固定液相と移動液相を含んでなる２相の液体系を用いる。固定相は、相間での成分の分離を可能にするために、液体移動相と不混和性の相を形成する必要がある。しかしながら、このような２相系は本質的に不安定であり、固定相は常に移動相に一部溶解し、カラムからの固定相の剥離が徐々に起こる。固定液相は、カラム中の固体材料（例えば、珪藻土またはシリカゲル）上に、あるいは操作中に細長いカラム中で、例えば、遠心力により、実質的に適切な位置に保持されることにより（従来の固液クロマトグラフィーにおいて管状のカラムに収容された固相と類似）支持することができ、移動液相は液体固定相と接触してカラムに流される。このような流動の間に、物質は、従来の固相クロマトグラフィーと類似した様式で移動相と固定相との間で分配される。液液クロマトグラフィー技術では、移動相が物質を溶出し、従来の液固相クロマトグラフィーと類似した画分に分離される。
【０００６】
様々な液液クロマトグラフィー技術が知られている。
【０００７】
１つの技術は向流クロマトグラフィー（本明細書では「ＣＣＣ」と呼ぶ）である。ＣＣＣ装置では、円形、例えば、らせん形または渦巻き形の管状カラムが複数の軸の周りを、いわゆる遊星回転する。このカラムでは、カラムが回転する際の遠心力により液体の「固定相」はカラム内の適切な位置に保持される。固定相と不混和性の相を形成し、そこに溶解した対象化合物を含有する液体の「移動相」は、固定相と接触してカラムに流される。また、一部の用途では、対象化合物は固定相に溶解させてもよい。回転運動が組み合わさることによってカラム内に振動遠心力場が作り出され、カラムに沿って固定相と移動相の混合ゾーンと分離ゾーンが生じることになり、その結果、移動相がカラムに沿って流れると、対象化合物は移動相と固定相との間で分配され、液固クロマトグラフィーと類似した移動相の画分中に局在するようになる。典型的なＣＣＣ装置はＷＯ−Ａ−０３／０８６６３９(Brunei University)に開示されている。
【０００８】
もう１つの公知技術として遠心分配クロマトグラフィー（本明細書では「ＣＰＣ」と呼ぶ）がある。一般に、ＣＰＣ装置は、回転軸の周りを回転させるために周囲に１つまたは複数の円を描いて配置された多くの（場合によっては、最大１０００）小さなチャンバー（「分配セル」と呼ばれることもある）を備えたカラムを含んでなる。これらの分配セルはさらに、流路によって相互接続されているため、液体は連続的にそれらに流れ込むことができる。１つの公知の配置では、複数の分配セルは、ディスクの周囲にエッチングまたは機械加工され、例えば、ステンレス鋼などの金属で作製されており、複数のディスクがそれらの回転中心軸の周囲に積層されてローターを形成し、このローターを回転軸の周りに回転させることができる。積層数が比較的少ないディスクと比較的大容量の分配セルを備えたいくつかの形態のＣＰＣ装置を遠心分配抽出装置と呼ぶことがある。典型的なＣＰＣ装置は、例えば、ＵＳ−Ａ−６，５３７，４５２(Kromaton)、ＷＯ−Ａ−２００４／０７９３６３(Partus)および他の科学文献および商業文献に開示されている。
【０００９】
ＣＰＣプロセスでは、液相を一連の分配セルおよび流路に導入すると同時に、１または複数の分配セルリングを、回転軸の周囲に回転させる。この回転は遠心力を引き起こし、この遠心力によってこの相、すなわち固定相は適切な位置に保持される。次に、第２の液相である移動相を分配セルに流し、カラムクロマトグラフィーにおいて物質が移動溶離液と固定固相との間で分配されるのと類似した様式で、移動相に溶解している物質が移動相と固定相との間で分配されうる。
【００１０】
ＣＰＣ装置は、いわゆる「下降」または「上昇」式のいずれかで操作することができる。移動相と固定相の密度が異なる場合、カラムの回転によって生じる遠心力は、密度が高い方の相を密度が低い方の相よりも回転軸から放射状により外側に向かわせる。移動相がこのより密度の高い、放射状により外側の相である場合、これを「下降式」と呼ぶ。逆に、固定相がこのより密度が高い、放射状により外側の相である場合、これを「上昇式」と呼ぶ。
【発明の概要】
【００１１】
クロマトグラフィーは、固液または液液のいずれも、液体反応混合物、いわゆる「母液」などの溶液から、または廃棄物から対象化合物を分離するためによく用いられる。しかしながら、このような場合に共通する問題は、溶液の溶媒媒体がクロマトグラフィーカラムへの直接注入に適していないということある。この問題を解決するために、最も一般的には、例えば、加熱または真空蒸発によって溶液から溶媒を除去して粗固体材料とし、これを好適な溶媒媒体に溶解してクロマトグラフィー分離に好適なサンプルを作出する。移動相または固定相としての使用に好適な、サンプル調製用の溶媒媒体を選択する。それぞれの沸点によっては、大規模での総ての溶媒の完全蒸発が難しいことがある。加熱および真空蒸発などの濃縮方法は相当な量のエネルギーを必要とするため不利となる場合がある。エネルギー要求が高いことは、溶液が対象化合物を比較的小さな割合で含んでいる場合に特に問題となり得る。医薬産業では、反応母液および液体廃棄物から、有効医薬品成分（「ＡＰＩ」）である化合物を分離することは、ＡＰＩが極めて有益であり得ることから特に重要である。
【００１２】
本発明の目的は、分離において効率が良い上、工業生産規模での使用にも適した方法を提供することによって、クロマトグラフィーサンプルの調製および不純物からの対象化合物の分離についての上記問題に対処することである。本発明の他の目的および利点は以下の説明から明らかとなる。
【００１３】
本発明によれば、有機溶媒媒体中の対象化合物溶液から対象化合物を分離する方法であって、前記溶液を液体移動相もしくは固定相としてまたは液体移動相もしくは固定相と混合して、それぞれの対応する固定相または液体移動相とともに用い、対象化合物が液体移動相と固定相との間で分配されて、溶解対象化合物が移動相の画分に濃縮された状態とすることができるクロマトグラフィープロセスによるものであり、
ここで、クロマトグラフィープロセスの前に、第１の有機溶媒媒体中の第１の対象化合物溶液の組成が、溶媒交換のための有機溶媒ナノフィルトレーションのプロセスの手段によって変更され、前記対象化合物溶液を、前記第１の溶液とは異なる有機溶媒組成を有する第２の有機溶媒媒体中の第２の対象化合物溶液として提供し、かつ／あるいは
前記クロマトグラフィープロセス後に、そのクロマトグラフィープロセスから排出された移動相が有機溶媒ナノフィルトレーションロセスに供され、このプロセスにおいて、クロマトグラフィープロセスからの排出移動相が有機溶媒ナノフィルトレーション膜に通され、その結果、排出移動相中に残存する対象化合物および／または不純物が保持液中に保持され、かつ、精製された移動相がその膜を通過する方法が提供される。
【００１４】
本発明の一面では、溶媒交換のための有機溶媒ナノフィルトレーションプロセスは、溶液を提供するために、クロマトグラフィープロセスの前に行われる。
【００１５】
本発明のこの第１の面によれば、第１の有機溶媒媒体中の第１の対象化合物溶液から対象化合物を分離する方法は、
溶媒交換のための有機溶媒ナノフィルトレーションを用いて第１の溶液の組成を変更して第２の有機溶媒媒体中の第２の対象化合物溶液を提供する工程、
次に、クロマトグラフィープロセスにおいて、第２の溶液を液体移動相もしくは固定相としてまたは液体移動相もしくは固定相と混合して、それぞれの対応する固定相または液体移動相とともに用い、対象化合物が液体移動相と固定相との間で分配されて、溶解対象化合物が移動相の画分に濃縮された状態とすることができる工程
を含む。
【００１６】
その後、対象化合物は、溶液中に対象化合物を含有する液体移動相の画分から、例えば、公知の方法、例えば、結晶化を用いて、単離され得る。
【００１７】
有機溶媒ナノフィルトレーションは膜に基づいた公知の分離プロセスであり、このプロセスでは、１種類以上の溶質の溶媒媒体溶液の流入供給流が、通常は、圧力を駆動力として利用して、膜に通され、「透過液」（膜を通過することができる溶媒および溶質）ならびに「保持液」（膜を通過することができない溶媒および溶質）と呼ばれる２つの成分に分離される。
【００１８】
溶質の特定の溶液では、膜および他のプロセス条件の選択は様々な因子によって異なり、このような因子には、とりわけ、溶液中に存在する１または複数の溶媒および１または複数の溶質の分子サイズが含まれる。有機溶媒ナノフィルトレーション膜の選択性は、主に、立体因子、つまり、小さな（例えば、溶媒）分子は通過させるが、より大きな溶質分子は保持する膜の選択、に基づく。このような立体排除に加え、膜−溶媒相互作用、圧力、供給濃度、温度および系の電荷を用いて分離性能を微調整することができる。
【００１９】
膜の性能は、最も一般的には、阻止率および流束に関して記載される。膜阻止率は、膜を通過することができない特定の溶質のパーセンテージと定義され、式１（式中、Ｒｉは種ｉの阻止率であり、Ｃｉは供給液（ｆ）および透過液（ｐ）それぞれにおける濃度である）に従って算出することができる。
【００２０】
【数１】
2015505954.tif 000003
【００２１】
阻止率Ｒｉは、透過液と供給液よりもむしろ、透過液濃度と保持液濃度の間の比率と定義されることもある。最も正確な阻止率の測定のためには、透過液サンプリング時の供給容器中の濃度を計算に用いるべきである。しかしながら、実験室スケールのバッチ濾過装置では、通常、実施中に供給液のサンプリングができないため、供給液と保持液の値に基づいた推定濃度が濃度についての最も代表的な利用可能な値である可能性が高い。透過液の流束Ｊは、単位時間当たりに膜の単位面積を通過する溶媒の容量と定義される。この流束は、式２（式中、Ｊは流束であり、Ｖは容量であり、Ａは膜面積であり、ｔは収集時間である）に従って算出される。
【数２】
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【００２２】
膜の分離性能を記載するためによく用いられるさらなるパラメーターは分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）であり、これは膜によって所定の溶質の９０％が阻止される場合の分子量と定義される。ＭＷＣＯ値は、製造者が提供している場合が多く、膜使用範囲の初期指標となる。しかしながら、ＭＷＣＯは、膜の特性評価に用いる溶媒−溶質系に依存するところが大きく、製造業者が異なれば違う方法が採用されているので、これらの値に頼る前には注意が必要である。ＭＷＣＯの適用に関する他の不十分な点としては、阻止率を９０％から１００％へと変更するのに必要な分子量の変化である。膜阻止率の曲線がシャープでない場合には、完全阻止率を達成するのに必要な分子量はＭＷＣＯで示された値よりも著しく高い可能性がある。現在の膜特性評価技術の欠点は、多数の膜のスクリーニングが膜プロセス開発の不可欠な要素であり続けるということである。
【００２３】
明確さに乏しいＭＷＣＯ曲線が、ＡＰＩ回収における市販の有機溶媒ナノフィルトレーション膜の限定要因となっている。しかしながら、有機溶媒ナノフィルトレーションは、総ての種を保持する厳格な膜の使用によるクリーンな溶媒の回収のため、および、溶媒交換のために有用な手段であり得る。
【００２４】
また、溶媒交換のために有機溶媒ナノフィルトレーションを用いるプロセスも公知のプロセスであり、このプロセスでは、クロマトグラフィープロセスでの液相としての使用に適してない可能性がある第１の有機溶媒媒体中の１種類以上の溶質の第１の溶液を、上記のように膜に通す。膜通過によって、第１の有機溶媒媒体の溶媒成分のいくつかまたは、好ましくは、総ては透過液として通過するが、溶液中のある溶質の分子は保持液中に選択的に保持される。保持液に第２の有機溶媒媒体の１種類以上の溶媒成分が添加され、その結果、溶媒組成が変わる。このようなプロセスを１回以上繰り返して、溶液の組成が第１の溶液から第２の溶液へと変わるようにすることができる。
【００２５】
第２の有機溶媒媒体の前記の１または複数の溶媒成分は、液体が膜を通過する速度と同じ速度で第１の溶液に添加することができる。溶質、例えば、対象化合物の阻止率が高い場合、保持液中の溶質の濃度は一定レベルに保たれつつ、溶媒組成は第１の有機溶媒組成から第２の有機溶媒組成へと変化する。あるいは、第２の有機溶媒媒体の１または複数の溶媒成分を液体が膜を通過する速度とは異なる速度で添加する場合、第２の溶液中の対象化合物の濃度は上昇または低下する。このようなプロセスは連続プロセスとして行うことができる。
【００２６】
前記１または複数の溶媒成分の添加および透過液の除去は、所望の第２の溶液組成に達するまで続けることができる。
【００２７】
好適な第２の溶液組成は、クロマトグラフィープロセスにおいて液相として、例えば、液液クロマトグラフィーにおいて移動相または固定相として使用することができるか、あるいは導入されるサンプルとしてこのような相との混合に好適な組成である。
【００２８】
ナノフィルトレーションによる溶媒交換は、不連続プロセスまたは連続プロセスによって行うことができる。「プットアンドテイク(put and take)」プロセスとも呼ばれる不連続プロセスでは、供給液、すなわち、第１の溶液は一般に、膜通過によって所定のレベルに濃縮された後に、一般には減圧によって通過が停止され、第２の有機溶媒媒体の１または複数の溶媒成分との混合により、一般には最初の容量となるように供給容量が調整される。このようなプロセス工程は、所望の第２の溶液組成に達するまで必要なサイクルで繰り返すことができる。
【００２９】
有機溶媒ナノフィルトレーションを用いた溶媒交換の不連続プロセスまたは「プットアンドテイク」プロセスでは、対象化合物を含有する溶媒媒体の各膜通過を用いて、５０％を超える溶媒媒体、例えば、最大７０％以上の溶媒媒体を除去することができる（液体媒体に関して本明細書に示す％は総て容量％である）。第２の溶液の所望の有機溶媒組成に達するまで、各膜通過の後に、第２の有機溶媒媒体の１または複数の溶媒成分を、一般には、第１の溶媒の最初の容量まで添加する。実際には、使用可能な第２の溶液を得るためには、一般には、５〜８回の、このような通過および添加が好適であることが分かっている。
【００３０】
連続プロセスでは、第２の有機溶媒媒体の新鮮な１または複数の溶媒成分が透過と等しい速度で第１の溶液に添加すればよく、その結果、組成が第１の溶液の組成から第２の溶液の組成へと徐々に変わる。連続操作には、プロセスモニタリングおよび手動操作の必要性が少なくなるという潜在的利点があるが、連続プロセスの溶媒要求量は不連続プロセスの場合よりも多くなることがある。
【００３１】
有機溶媒ナノフィルトレーションを用いた溶媒交換には、非熱的プロセスであるという利点があり、従って、熱分解を受けやすい対象化合物に有利である。有機溶媒ナノフィルトレーションを用いた溶媒交換のさらなる利点は、高沸点溶媒から低沸点溶媒へ変更するような、これ以外の方法では困難な場合を含め、任意の混和性溶媒間での溶媒交換が可能であるということである。
【００３２】
有機溶媒ナノフィルトレーション用の装置は市販されており、製造者の仕様書に従って、溶媒交換のプロセスにおいて使用することができる。有機溶媒ナノフィルトレーション用の市販装置の例は、Ｓｔａｒｍｅｎ（商標）（UOP LLC, Des Plaines Illinois, USAの商標）１２２または２４０膜を用いたＭＥＴ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｄ−ｅｎｄ濾過システムである。
【００３３】
保持液中の１または複数の溶質、例えば、対象化合物の最大量を保持し、それによって、対象化合物の損失を最小限に抑えるためには、対象化合物の膜阻止率Ｒｉはできる限り高くあるべきである。好ましくは、膜阻止率Ｒｉは、９０％以上、より好ましくは９５％以上であるべきであり、実際には、有効医薬化合物である多くの既知対象化合物に関しては、９８．５％以上のＲｉが達成可能である。
【００３４】
膜阻止率Ｒｉに加えて、有機溶媒ナノフィルトレーションを用いた溶媒交換の処理時間を最小限に抑えるために、流束Ｊ、すなわち、膜の単位面積当たりの透過速度は速いことが望ましい。しかしながら、流束は膜面積と関係があり、低流束の場合、より大きな面積を使用すれば妥当な処理時間を維持することができる。特定の膜および特定の溶媒媒体に好適な流束は実験により決定することができる。
【００３５】
異なる有機溶媒組成で使用する場合、同じ膜でも特定の溶媒の阻止率(rejection)は変動し得る。そのため、第１の溶液を溶媒交換プロセスに供する前に、第２の有機溶媒媒体の１または複数の溶媒成分を第１の対象化合物溶液に添加することが有利な場合がある。例えば、本実施例において用いる膜（Ｓｔａｒｍｅｎ（商標）１２２）の場合、対象化合物の阻止率は、酢酸エチルを含有する第２の溶液中では、メタノール、メチルイソブチルケトンおよびトルエンを含んでなる初期溶媒媒体に比べて高いことが判明した。第１の溶液に酢酸エチルを添加することにより、対象化合物の阻止率は処理中に高まり、対象化合物の全損失は減少した。
【００３６】
例えば、膜に通す前に、第１の溶液に、４０％以上、例えば、５０％以上の第２の有機溶媒、例えば、酢酸エチルを添加することができる。
【００３７】
一実施態様では、第１の対象化合物溶液は、対象化合物の結晶化から回収された母液であり得る。母液は、ケーク濾液とケーク洗浄液で構成されていてよく、対象化合物のバッチを結晶化させた後に残存量の対象化合物および不純物を含み得る。この実施態様は、対象化合物を有機溶媒媒体から結晶化させる工程、結晶化した対象化合物をこの有機溶媒媒体母液から分離する工程、およびこの対象化合物含有母液を第１の溶液として提供する工程を含み得る。
【００３８】
もう１つの実施態様では、第１の溶液は、対象化合物の調製から生じる対象化合物を含有する調製媒体であり得る。このような調製媒体は、不純物および残存する出発試薬を含み得る。この実施形態は、対象化合物の有機溶媒媒体溶液を調製する工程、およびこの調製媒体を第１の有機溶媒媒体中の第１の対象化合物溶液として提供する工程を含み得る。
【００３９】
有機溶媒ナノフィルトレーションプロセスから生じる保持液である第２の溶液は、１または複数の溶質、例えば、対象化合物および不純物を含有し、単一の有機溶媒または有機溶媒混合物を含んでなり得る。例えば、有機溶媒ナノフィルトレーションを用いた溶媒交換のプロセスから生じる第２の溶液は、９０重量％以上、例えば、９５重量％以上の単一の有機溶媒を含んでなる溶媒媒体中の対象化合物溶液を含んでなり得る。クロマトグラフィープロセスの場合、液体移動相、および対応する液体固定相の所望の組成は、通常、所望の分離性能および選択される操作条件に基づいて選択され、一般的には、溶媒の混合物で構成される。
【００４０】
有機溶媒ナノフィルトレーション溶媒交換から生じる保持液である第２の溶液は、クロマトグラフィープロセスにおいて液体移動相または固定相としてそのままで使用可能であり得る。
【００４１】
あるいは、このような第２の溶液を、１種類以上の付加的有機溶媒とともに導入して、所望の移動相組成または固定相組成を作成することができる。
【００４２】
あるいはおよび好ましくは、第２の溶液が、液体移動相と混和性のサンプルとして液体移動相に導入され、クロマトグラフィープロセスにおいて固定相と接触させることができる。
【００４３】
本プロセスの一実施態様では、クロマトグラフィープロセスにおいて、有機溶媒ナノフィルトレーション溶媒交換から生じる第２の溶液は、そのまままたは付加的な溶媒と混合されて、クロマトグラフィーカラムに注入され、液体移動相流においてカラムに流すことができる。例えば、液体移動相流がカラムに流され、この移動相流に第２の溶液を導入することができる。画分の分離および溶出は、対象化合物がカラムを通過してカラムから出てくるまで、移動相をカラムに通すことによって可能になる。
【００４４】
クロマトグラフィープロセスは、従来のクロマトグラフィーの場合と同様に、カラムに固体固定相を備えた固液クロマトグラフィープロセスであってよい。
【００４５】
好ましい実施態様では、クロマトグラフィープロセスは液液クロマトグラフィープロセスであり、移動相および固定相はともに液相である。
【００４６】
液液クロマトグラフィープロセスは、例えば、それぞれ適当なクロマトグラフィーカラムを用いるＣＣＣもしくはＣＰＣ、または遠心分配抽出などの、いずれの公知のタイプの液液クロマトグラフィープロセスであってもよい。
【００４７】
特に好ましい実施態様では、クロマトグラフィープロセスは液液ＣＣＣプロセスであり、特に、このプロセスでは、第２の溶液は液体移動相として、または液体移動相の一成分として用いられる。
【００４８】
液液ＣＣＣに用いるには、移動相が、固定相と実質的に不混和性の相を形成することが必要である。液液クロマトグラフィーでは、多くの有機溶媒に基づく系が知られており、このような系から、移動相および固定相としての使用に好適な不混和相の対を調製することができ、第２の有機溶媒媒体は、好ましくは、これらおよびこれらを含んでなる混合物から選択される。
【００４９】
このような不混和相の対に使用するために好適な有機溶媒としては、水と実質的に不混和性の有機液、例えば、Ｃ１−６アルキルＣ１−６アルカン酸エステル、例えば、酢酸エチルから選択される溶媒；液体Ｃ５−１０アルカン、例えば、ヘプタン、水と混和性の有機液体、例えば、Ｃ１−８アルカノール、例えば、ｎ−ブタノール、エタノールまたはメタノール；および場合により水が挙げられる。
【００５０】
例えば、液液クロマトグラフィープロセスに用いられる不混和性の液相対は、それぞれが成分ヘプタン、酢酸エチル、メタノールおよび水で構成されていてよい。例えば、このような系から調製される固定相は、主に、例えば５０％または好ましくは７０％以上のメタノール・水混合物を含んでなってよく、一方、移動相は、主に、例えば８０％または好ましくは９０％以上のヘプタン・酢酸エチル混合物を含んでなってよい。
【００５１】
このような固定相の好適な例は、４２％のメタノール、３８％の水、１９％の酢酸エチルおよび０〜１％のヘプタンを含んでなる。このような固定相とともに使用するための対応する移動相の好適な例は、６７％のヘプタン、３０％の酢酸エチル、２％のメタノール、０〜１％の水を含んでなる。固定相と移動相のこのような組合せを本明細書ではＨＥＭＷａｔ１７．５と呼ぶ。
【００５２】
液液クロマトグラフィーに使用するための固定相と移動相の組合せを作製するのに好適な他の有機溶媒組合せは当業者には明らかであろう。
【００５３】
好適には、このような相は、各液体を混合し、その系を平衡化し、安定させることにより作製することができる。
【００５４】
溶解対象化合物を含有する第２の溶液は、液体移動相または固定相と、好ましくは移動相と、混和性であるべきである。
【００５５】
好ましくは、第２の溶液の第２の有機溶媒媒体は、液液クロマトグラフィープロセスに用いられる液体移動相または液体固定相の組成に相当する組成、好ましくは液体移動相、を有し、そのため、第２の有機溶媒媒体は移動相と混合可能である。
【００５６】
あるいは、第２の溶液は、主に、例えば７５％以上、好ましくは９０％以上の、前記液体移動相の液体成分の１種、またはそれらの２種以上の混合物を含んでなる組成を有してよい。
【００５７】
従って、前記の系とともに使用するためには、好ましくは、第２の溶液の第２の有機溶媒媒体は、上記に挙げた有機溶媒の１種類以上、例えば、Ｃ１−６アルキルＣ１−６アルカン酸エステル、例えば、酢酸エチル；液体Ｃ５−１０アルカン、例えば、ヘプタン、水と混和性の有機液体、例えば、Ｃ１−８アルカノール、例えば、ｎ−ブタノール、エタノールまたはメタノール；および場合により水から選択される溶媒を含んでなる。
【００５８】
有機溶媒ナノフィルトレーションを用いた溶媒交換のプロセスでは、第２の有機溶媒が第１の有機溶媒媒体と混和性であることも望ましい。
【００５９】
有機溶媒ナノフィルトレーションを用いた溶媒交換のプロセスの結果として得られる第２の溶液は、液液クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィープロセスに使用するための液体移動相において上記に挙げたものなどの他の液体溶媒成分と混合することができる。例えば、第２の溶液の有機溶媒媒体が主に酢酸エチルを含んでなる場合には、そのような第２の溶液はヘプタン、メタノールおよび水と混合してもよい。
【００６０】
液液ＣＣＣなどの液液クロマトグラフィープロセスでは、通常、好適には、製造者の仕様書に定められているように、まず、クロマトグラフィーカラムに液体固定相を導入し、そのカラムを選択した操作速度で回転させる。次に、対象化合物を含まない液体移動相をそのカラムに導入し、液体固定相と接触して流れるようにする。移動相は、平衡に達するまで固定相を置き換える。移動相によって固定相の液体が溶出しなくなる（平衡に達していることを示す）まで、カラムからの排出物をモニタリングする。このようなプロセスでは、溶解している溶質の対象化合物を含有する第２の溶液を、その後、移動相として、または移動相の一成分、例えば、移動相に溶解しているサンプルとしてクロマトグラフィーカラムに導入し、カラムに流すことができる。
【００６１】
クロマトグラフィープロセスの間に、対象化合物は、第２の溶液中に対象化合物とともに存在する不純物から分離された状態になり、排出移動相の画分に回収することができる。その後、結晶化などの公知の技術を用いてこのような移動相の画分から対象化合物を単離することができる。
【００６２】
本方法の好ましい実施態様では、クロマトグラフィープロセスから排出された移動相は、クロマトグラフィープロセスの前にナノフィルトレーションによる溶媒交換を用いたかどうかに関係なく、クロマトグラフィープロセス後の溶媒回収工程(stage)において有機溶媒ナノフィルトレーションプロセスによって精製され、このプロセスにおいて、クロマトグラフィープロセスから排出された移動相が有機溶媒ナノフィルトレーション膜に通され、その結果、排出移動相中に残存する対象化合物および／または不純物が保持液中に保持され、精製された移動相が透過液としてその膜を通過する。
【００６３】
クロマトグラフィープロセスから排出された移動相に適用される有機溶媒ナノフィルトレーションを用いた上述の溶媒回収は、クロマトグラフィープロセスの前に、有機溶媒ナノフィルトレーションを用いた溶媒交換を用いていない場合のクロマトグラフィープロセスから排出された移動相に関しても用いることができる。
【００６４】
よって、本発明の第２の面は、クロマトグラフィープロセスから排出された液体移動相を、優先的に有機溶媒分子に通過させ、従って溶質分子の通過を阻止する膜を用いた有機溶媒ナノフィルトレーションプロセスに供する方法を提供する。
【００６５】
膜は、例えば、有機溶媒中の対象化合物および／または不純物の分子の通過を阻止してもよい。
【００６６】
このような有機溶媒ナノフィルトレーション工程は、有利には、移動相またはその成分を、保持液中に大部分または総てが残る夾雑溶質について比較的精製された形で再利用することを可能にし得る。
【００６７】
この後者の面における液体移動相排出物は、例えば、上記のように、液液クロマトグラフィープロセスから排出された移動相であってよく、上記に挙げたように、場合により、水を含む、有機溶媒およびそれらの混合物に基づいたものであってよい。このような溶媒回収工程における、例えば膜の阻止率などの好適な要件は、上に概説するとおりである。
【００６８】
例えば、本発明の第１の面に関して上記したように、クロマトグラフィープロセスの前に、溶媒交換のための有機溶媒ナノフィルトレーションプロセスを適用して、クロマトグラフィープロセスに使用するための上述の第２の溶液を提供してもよく、クロマトグラフィープロセスから排出された液体移動相への有機溶媒ナノフィルトレーションプロセスの適用は前記プロセスの二次処理であってよい。
【００６９】
このような溶媒回収プロセスでは、各画分の総容量が装置作動容量より多くなる可能性があるため、溶媒回収プロセスは、好ましくは、透過と等しい速度でシステムに添加される供給移動相を用いた定容量ダイアフィルトレーションとして作動させる。このような定容量ダイアフィルトレーションはさらに、操作中に膜が受ける圧力サイクル数を低減することができる。
【００７０】
Ｓｔａｒｍｅｎ（商標）（UOP LLC, Des Plaines Illinois, USAの商標）１２２膜は、本明細書において論じる移動相とともに、特に、ヘプタン、酢酸エチル、メタノールおよび水に基づいた移動相とともに、このような溶媒回収プロセスに使用するために好適であり得る。このように精製された移動相は、その後、さらに、クロマトグラフィープロセスの次サイクルに再利用してもよい。例えば、透過液は、その後、移動相として再使用してもよく、この移動相に、上記のように、第２の溶液のさらなるサンプルを導入してもよい。それに加えてまたはその代わりに、透過液を、第２の有機溶媒媒体の新鮮なバッチとして、またはそのバッチの一成分として使用してもよい。
以下、添付の図面を参照し、限定されない例により本発明を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】図１は、実行可能なプロセスレイアウトの概略図を示す。
【図２】図２は、有機溶媒ナノフィルトレーションを用いた溶媒交換の間に得られる溶媒レベルの計算値および測定値のグラフを示す。
【図３】図３は、新鮮な移動相および回収した移動相を用いたＣＣＣ試験のグラフ比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７２】
図１に関しては、これは、本発明の方法を実施するための装置配置概略図を示す。
【００７３】
図１に示すプロセスは、サンプル調製工程Ａおよび溶媒回収工程Ｂ、ならびに液液向流クロマトグラフィー（「ＣＣＣ」）工程Ｃを含む。図１に示すプロセスでは、第１の溶液供給１は結晶化母液である。下記の実験では、この供給液１は、８２容量％メタノール、１５．９容量％メチルイソブチルケトンおよび２．１容量％トルエンという組成を有し、４．５ｇ／Ｌの有効医薬品成分（「ＡＰＩ」）を含有した。供給液２は新鮮な酢酸エチルである。供給液３は、ヘプタンおよびメタノールを含んでなる向流クロマトグラフィー工程の移動相である。有機溶媒ナノフィルトレーションシステム（「ＯＳＮ」）を概略として４で示す。ＯＳＮシステムから排出される廃液を５で示す。供給液６は、下記の実験では、６７．３２容量％ヘプタン、３０．２９容量％酢酸エチル、２．１６容量％メタノールおよび０．２４容量％水という組成を有するＣＣＣ移動相投入物である。ＣＣＣ装置全体を概略として７で示し、下記の実験では、４２．１１容量％メタノール、３８．２４容量％水、１９．３５容量％酢酸エチルおよび０．３１容量％ヘプタンという組成を有するＣＣＣ固定相供給を８で示す。さらなるＯＳＮシステムを９で示す。排出液１０はＯＳＮシステム９からの排出液を示し、この排出液は、ＣＣＣ装置７からの排出液のＡＰＩ含有画分をＯＳＮシステム９への投入物として用いる場合には濃縮されたＡＰＩ溶液であり得、またはＣＣＣ装置７からの排出液の不純物含有画分をＯＳＮシステム９への投入物として用いる場合には、濃縮された不純物溶液であり得る。フローライン１１は、ＣＣＣ装置７への再利用のためにＯＳＮシステム９から回収されるＣＣＣ移動相の流れを示す。
【００７４】
１．有機溶媒ナノフィルトレーション
１．１  膜のプレコンディショニング
供給溶液を添加する前に、総ての膜ディスクを膜１ｍ２あたり最低４０Ｌ（すなわち、０．００５４ｍ２ディスクの場合０．２２Ｌ）の純溶媒で洗浄した。洗浄溶媒は供給組成に基づいて選択し、溶媒交換膜には純酢酸エチルを使用し、溶媒回収膜には酢酸エチルおよびヘプタンの３０：７０％混合物を使用した。洗浄後、濾過システムを減圧し、内容物を供給溶液に充填した。供給液を、膜を通して所望の操作圧で最低１．０時間または安定な流束に達するまで再循環させた。安定な流束で作動している場合、膜は最大圧縮(maximam compaction)に近づいたものと想定され、それぞれ膜スクリーニング、溶媒交換および溶媒回収に関して試験を開始した。総ての処理を３０バール圧および周囲温度（２５〜３０℃の範囲）で行った。
【００７５】
１．２  膜スクリーニング
膜スクリーニングは、各面積０．００５４ｍ２の２〜３個の直列濾過セルに接続したＭＥＴ(商標）Ｃｅｌｌ  Ｃｒｏｓｓ−Ｆｌｏｗシステムを用いて行った。それぞれＣＣＣ移動相（スクリーニング溶液Ｉ）、純酢酸エチル（スクリーニング溶液ＩＩ）および母液（スクリーニング溶液ＩＩＩ）を模倣する溶液中での性能を見る３つの独立した試験を行った。膜性能は、プレコンディショニング相の終了時にサンプリングした透過液、ならびに各試験の開始時と終了時に採取した供給液および保持液のサンプルを用い、流束および阻止率の算出により評価した（上記の式１および２参照）。流束は、所与の時間、透過液をメスシリンダーに回収することにより０．５時間ごとに測定した。
【００７６】
１．３  有機溶媒ナノフィルトレーションを用いた溶媒交換
開始時の第１の溶液は、８２．０％メタノール、１５．９％メチルイソブチルケトンおよび２．１％トルエンを含んでなり、かつ、４．５ｇＬ−１の対象化合物（分子量約６００ｇｍｏｌ−１）と種々の不純物を含有する結晶化母液であった。
【００７７】
溶媒交換は、ＭＥＴ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｄ−Ｅｎｄ濾過システムにて、Ｓｔａｒｍｅｍ（商標）１２２膜（バッチ９１０１．４）とプットアンドテイクダイアフィルトレーションでのエチルの段階的添加を用いて行った。各ダイアフィルトレーションサイクルでは、供給液（結晶化母液および酢酸エチル５０：５０％）を、元の溶媒の７０％を除去することにより濃縮し、その後、システムを減圧し、残存する保持液を純酢酸エチルと混合して容量２００ｍＬとした。第２の溶液の所望の溶媒組成となるまで、濃縮と酢酸エチルの添加を何回か繰り返した。ＣＣＣサンプル中に最大濃度の対象化合物を確保するため、最終のプットアンドテイクサイクルの後は酢酸エチルの添加は行わなかった。流束は、プレコンディショニング中は０．５時間ごとに、溶媒交換サイクル中は５０ｍＬの透過液が通過するごとに測定した。各濃縮実行の開始時と終了時に透過液サンプルを、混合透過液のサンプルに加えて採取した。対象化合物の損失を最小限にするために、供給液および保持液は、全溶媒交換の開始時との終了時にのみサンプリングし、その間の総ての工程での阻止率の算出には、質量収支に基づく推定濃度を用いた。膜性能を経時的に調べるため、全溶媒交換に同じ膜ディスクを使用し、膜は９回の加圧サイクルに曝され、その後２晩保存した。
【００７８】
図２は、主にメタノールを含んでなる上述の開始溶液から開始し、有機溶媒ナノフィルトレーションの６回の一連の「プットアンドテイク」サイクル後に、最終的な第２の溶液、すなわち保持液がほぼ１００％の酢酸エチルを含んでなるというのがどのようなものかを示す。第２の溶液のこの組成は事実上ほとんど３回の前記サイクルの後に達成された。この第２の溶液を下記のＣＣＣ分離プロセスでサンプルとして導入した。
【００７９】
１．４  ＣＣＣ分離
分析的規模のＣＣＣ試験をＤｙｎａｍｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｌｔｄ．により供給されているＭｉｎｉ遠心機を用いて行った。このＭｉｎｉ装置は、内径０．８ｍｍの配管で構成されているシングルボビン２０ｍＬコイルを備えた遠心機を含む。ＣＣＣ操作中、このコイルはカラムとして働き、このＭｉｎｉ操作では、回転速度は一定値２１００ｒｐｍに設定した。カラムを平衡化した後、対象化合物が溶解したサンプル容量０．９ｍＬの第２の溶液を注入し、流速１．５ｍＬ分−１を用い、計３５分間ＣＣＣ操作を行い、各５．２５ｍＬの１０画分を採取した。これもまたＤｙｎａｍｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ  Ｌｔｄ．により供給されているＭｉｄｉ遠心分離システムを用いて、より大規模なＣＣＣ試験を行った。Ｍｉｄｉ装置の設定は、遠心容量を、内径４．０ｍｍの配管の２つのボビンコイル（合計容量９２５ｍＬ）に分けたこと以外は、Ｍｉｎｉの場合と同様であった。Ｍｉｄｉ規模の操作では、Ｍｉｎｉの実行に匹敵する重力場を維持するために、１４００ｒｐｍというより低い回転速度を用いた。他のパラメーターは、移動相の流速７０ｍＬ分−１で総処理時間３５分を用いてサンプルサイズ４１ｍＬを注入し、各２４５ｍＬの１０画分を採取する場合の直線的容量スケールアップによって見積もった。Ｍｉｎｉ試験でもＭｉｄｉ試験でも、画分採取はサンプルを注入した直後に開始した。Ｍｉｎｉ規模でもＭｉｄｉ規模でもサンプル注入前に、カラムに移動相を送り込んで固定相を徐々に置き換えることによりカラムをプレコンディショニングした。プレコンディショニングは、固定相が溶出しなくなる平衡状態（その時点で固定相の保持が最大と仮定される）まで行った。総てのＣＣＣ試験で、外側に向かう流れを、２６０ｎｍに設定したダイオードアレイ検出器に接続し、不純物および対象化合物の溶出をインプロセスでのモニタリングを可能とした。
【００８０】
溶媒要求量を最小限とし、工業生産の模倣類似性を維持するために、固定相および移動相は単一の飽和相として個々に作製した。従前の方法開発に基づき、最も好適な溶媒系を、固定相組成が４２．１１％メタノール、３８．２４％水、１９．３５％酢酸エチルおよび０．３１％ヘプタンに相当し、移動相組成が６７．３２％ヘプタン、３０．２９％酢酸エチル、２．１６％メタノールおよび０．２４％水に相当するヘプタン／酢酸エチル／メタノール／水（ＨＥＭＷａｔ  １７．５に相当）とした。固定相および移動相の一貫性を確保するために、個々に作製した相からのデータとバルク相系として作製したこれらの組成物を比較する分配試験を行った。分配試験として、それぞれＣＣＣ試験１に用いた新鮮溶媒系、ＣＣＣ試験２に用いた回収溶媒系およびバルク相系として作製したＨＥＭＷａｔ  １７．５からの固定相および移動相０．５ｍＬに１ｍｇの粗物質（完全に蒸発させた母液サンプル）を溶解させた。サンプルを混合し、安定化させた後、各相のＨＰＬＣ分析を行った。
【００８１】
１．５  溶媒の回収
溶媒の回収は、ＭＥＴ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｄ−Ｅｎｄ濾過システムにて、総ての処理にＳｔａｒｍｅｍ（商標）２４０（バッチ９２１７．１）を用いて行った。加圧サイクルの回数を最小限とするため、および、各画分の総容量が装置作動容量より多くなったため、透過と等しい速度でシステムに添加される供給溶液を用いた定容量ダイアフィルトレーションにて溶媒回収を行った。ダイアフィルトレーションは全容量がシステムに添加されるまで続け、その後、供給液を各画分の溶解度限界を限界とするレベルまで濃縮した。流束は、プレコンディショニング中は０．５時間ごと、回収中には５０ｍＬの透過液が通過するごとに測定した。各回収実行の開始時と終了時に透過液サンプルを、混合透過液のサンプルに加えて採取し、各画分からの回収の開始時と終了時に供給液と保持液をサンプリングした。一貫した膜性能を確保するために、各画分からの溶媒回収には新しい膜ディスクを用いた。
【００８２】
１．６  分析
対象化合物および不純物の濃度を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００シリーズＨＰＬＣシステムを用いてモニタリングした。対象化合物の構造および特性の機密性を確保するために、分析技術の詳細を開示することはできない。
【００８３】
酢酸エチル、ヘプタン、メタノール、メチルイソブチルケトンおよびトルエン（後者は第１の溶液に存在する）の溶媒レベルを、Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ  ＨＰ  ６８９０シリーズガスクロマトグラフ（ＧＣ）システムを用いて分析した。サンプルは、長さ１０ｍ、直径２００μｍおよびフィルム厚１．１２μｍのＤＢ−６２４  ＧＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｅｌａｗａｒｅ）を備えた炎イオン化検出器を用いて分析した。オーブン温度は最初２４０℃に保持し、カラム温度は、初期値３５℃で２．０分間の保持から、５０℃分−１で８０℃に昇温して１．０分間保持、最後に２１０℃−１で１５０℃に昇温して１．０分間保持までに及ぶプログラムで制御した。インジェクター温度は２００℃で一定に保ち、総注入容量は、４０：１のスプリットインジェクターモードを用いて１．０μＬに設定した。検出器温度は２５０℃に設定し、３４．０ｍＬ分−１窒素のメイクアップ流(make-up flow)を４５０．０ｍＬ分−１の空気流および４０．０ｍＬ分−１の水素流と組み合わせて用い、検出を可能とした。キャリアガスとしてヘリウムを用い、流速は、６．３分で２．８５〜３０．６ｐｓｉの範囲という圧力傾斜から決定した。溶媒混合物中の水の痕跡は、容積測定Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ  Ｋａｒｌ  ＦｉｓｃｈｅｒモイスチャーメーターＣＡ−１００／ＫＦ−１００を用いて測定した。
【００８４】
２．結果および考察
２．１  膜のスクリーニング
有機溶媒ナノフィルトレーションの操作の成功に最も重要な部分は好適な膜の選択であり、有機溶媒ナノフィルトレーション適用の第一工程は通常、膜のスクリーニングである。理想的には、選択する膜は、使用する総ての処理溶媒中で優れた長時間安定性を持ち、最大１００％阻止から、濾過中の溶媒要求量および溶質損失を最小限とするまでの、シャープなＭＷＣＯ曲線を示す。さらには、高い溶媒透過速度が望ましく、流束は、妥当な時間および膜面積の範囲内で処理を可能とするに十分大きいものでなければならない。
【００８５】
本明細書に述べる有機溶媒ナノフィルトレーション適用では、溶媒回収および大部分の溶媒交換が、理想的には、ＣＣＣ移動相（６７．３２％ヘプタン、３０．２９％酢酸エチル、２．１６％メタノールおよび０．２４％水）と同様の溶媒組成で行われるべきである。従って、膜性能を評価するために、移動相組成をスクリーニング溶液Ｉとして選択し、４．５ｇＬ−１の対象化合物を含有する溶液を試験に用いた。結晶化母液は、対象化合物の他、様々な濃度の２７種の異なる不純物を含有していた。膜選択の前に最大限の情報を得るために、理想的には、総ての不純物がスクリーニング溶液に含まれるべきである。しかしながら、不純物は乾燥形態では容易に得られず、従って、対象化合物を、膜性能を評価するための単一の初期マーカーとして選択した（表１参照）。スクリーニング試験に選択された膜には、有機溶媒中での使用に好適な一定範囲の市販の膜、すなわち、Ｄｕｒａｍｅｍ（商標）、Ｓｔａｒｍｅｍ（商標）およびＰｕｒａｍｅｍ（商標）シリーズの膜が含まれた。
【００８６】
【表１】
2015505954.tif 000005
【００８７】
ＣＣＣ移動相でのスクリーニングは、総ての供試膜で見られた阻止率は所望の値である＞９９％を下回ったことを示したが、最も有望な結果は、測定阻止率９８．５％および流束４８Ｌｍ−２ｈ−１を有するＳｔａｒｍｅｍ（商標）２４０で見られた（表１参照）。Ｄｕｒａｍｅｍ（商標）１５０、Ｄｕｒａｍｅｍ（商標）２００およびＳｔａｒｍｅｍ（商標）１２２で見られた低い阻止率（それぞれ７６．１、２１．７および８３．１％）は、３つの膜が総て、対象化合物の分子量を有意に下回るＭＷＣＯを有するので、予期されなかった。予想阻止率値からの逸脱は、膜スクリーニングではＭＷＣＯ特性評価と比べて異なる溶媒が使用された結果であると思われる。異なる溶媒−溶質の組合せで結果が変化することは、膜性能のより普遍的な特性評価が極めて望ましいことを示した。しかしながら、このようなデータが入手可能となるまでは、開発下のいずれの膜プロセスにとっても依然として膜のスクリーニングが重要な部分となる。さらに注目すべきは、Ｄｕｒａｍｅｍ（商標）２００の流束がスクリーニング中、１１から２７〜２９Ｌｍ−１ｈ−１の半安定値に上昇していたことである。この流束の増大は低い阻止率値が見られたことと併せれば、この膜がヘプタンを含有する溶媒混合物中で使用するにはあまり適さなかったことを示し得る。
【００８８】
Ｓｔａｒｍｅｍ（商標）２４０は対象化合物に対して高い阻止率を示すことから、単一膜または複数膜の通過によりＣＣＣ移動相の回収に使用できる可能性がある（上記第１．５節参照）。しかしながら、溶媒交換では、処理上の見通しから複数回の透過液の通過は適切でなく、Ｓｔａｒｍｅｍ（商標）２４０の９８．５％という測定阻止率は、溶媒交換中におよそ８％の対象化合物損失をもたらすと算出された。対象化合物の潜在的損失は、直接移動相との溶媒交換が実現可能ではあったが理想的ではなく、別の選択肢が極めて望ましかったことを示す。ＣＣＣ移動相中の２番目に多い成分は酢酸エチルであり、阻止率を改善し、それ故に、全体的な対象化合物損失を最小化するための試みにおいて、最初の溶媒結晶化母液から、完全なＣＣＣ移動相組成物ではなくむしろ純粋な酢酸エチルに直接溶媒交換を行った。これらの成分が酢酸エチル中に交換されたところで、その溶液を適正なＣＣＣサンプル組成に構成することができる。酢酸エチルへの直接交換の場合、ＣＣＣサンプルはより希釈されるが、酢酸エチル中での使用に安定な数種の膜が市販されているので、このプロセスは大きな利点を付与する。純粋な酢酸エチルを、膜性能のマーカーとして使用する、対象化合物と共に用いるスクリーニング溶液ＩＩとして選択した（表２参照）。最後に、異なる溶媒に対する膜性能における潜在的変化を評価するため、さらに、存在する不純物の阻止率の評価を得るために、結晶化母液をスクリーニング溶液ＩＩＩとして選択した（表２参照）。
【００８９】
【表２】
2015505954.tif 000006
【００９０】
酢酸エチル（溶液ＩＩ）におけるスクリーニングでは、Ｓｔａｒｍｅｍ（商標）１２２で最強の膜性能が見られ、対象化合物阻止率９９．８％と最大流束８４Ｌｍ−２ｈ−１の組合せを持っていた。しかしながら、結晶化母液（溶液ＩＩＩ、約４．５ｇＬ−１の対象化合物および２７種類の異なる有機不純物を含有する、８２．０％メタノール、１５．９％メチルイソブチルケトン、２．１％トルエン）を用いる場合には、Ｓｔａｒｍｅｍ（商標）１２２の対象化合物阻止率は９８．４％に下がり、最も好適な膜性能は、阻止率９９．２％と流束１６Ｌｍ−２ｈ−１の組合せを有するＤｕｒａｍｅｍ（商標）１５０で見られた。酢酸エチルおよび結晶化母液でのスクリーニング試験からのデータを比較した場合に、Ｓｔａｒｍｅｍ（商標）２４０およびＰｕｒａｍｅｍ（商標）２８０でも阻止率における同様の低下が見られたが、Ｄｕｒａｍｅｍ（商標）１５０およびＤｕｒａｍｅｍ（商標）２００では、阻止率は一定のままであったか、または酢酸エチルでのデータに比べて母液でのスクリーニングの際に上昇した。阻止率の変化は、溶媒の変化が膜性能に影響を及ぼす結果であると思われるが、溶媒−溶質の相互作用などの付加的要因も、観察された変化に関与する可能性がある。本明細書で述べた大部分の溶媒交換では、主に酢酸エチルからなる溶液を使用したが、最初の濃縮工程だけは、結晶化母液組成に近い供給液を用いて行われた（第２．２節参照）。この情報に基づき、Ｓｔａｒｍｅｍ（商標）１２２を、溶媒交換のための、最も好適な膜候補として選択した。
【００９１】
２．２  溶媒交換
記載の溶媒交換では、計算によれば、不連続操作に比べて、連続操作では、所望の第２の溶液溶媒組成に達するために、さらに３．５ダイアフィルトレーション容量（１ダイアフィルトレーション容量＝２００ｍＬまたは供給容量）の溶媒を必要としたことが示された。質量効率を保持するために、結晶化母液と酢酸エチルの５０：５０混合物４００ｍＬを供給液として用い、各サイクルで７０％の濃度レベルを用いるプットアンドテイクダイアフィルトレーションを溶媒交換のために選択した。
【００９２】
第２の溶液の溶媒対象組成は、母液からの痕跡レベルの溶媒（メタノール、メチルイソブチルケトンおよびトルエン）を最大レベル０．０１％（容量％）に制限し、９９．９９％（容量％）酢酸エチルに設定した。母液溶媒痕跡のレベルは、ＣＣＣ固定相のコンタミネーションの可能性を制限するために極めて低い値に設定した。各サイクルの溶媒レベルは、存在する総ての溶媒に関して阻止率０％を仮定し、質量収支を用いて計算した（図２参照）。質量収支は式３に基づいて計算し、式中、Ｃは、それぞれ供給液（ｆ）、透過液（ｐ）、添加したダイアフィルトレーション容量（ｄ）および保持液（ｒ）中の溶媒成分ｉの濃度であり、Ｖは容量である。保持液容量はプットアンドテイクサイクルが完了した後の容量を意味し、従って、供給容量に等しいことを留意することが重要である。
【数３】
2015505954.tif 000007
【００９３】
溶媒レベルは溶媒交換のプットアンドテイクサイクルごとにＧＣを用いてモニタリングした。データは、２００ｍＬの母液を含有する４００ｍＬの開始容量に対して、合計５．９ダイアフィルトレーション容量を構成する８回の酢酸エチル添加の後に所望の溶媒組成に達したことを示す（図２および表３参照）。測定された溶媒組成は質量収支から算出されたレベルとよく相関していたが、これは溶媒阻止率０％という仮定が所与のシステムに当てはまることを示し、よく混合された溶液では、その溶媒組成は膜上で維持されるはずである（図２参照）。
【００９４】
供給液、透過液および保持液中の対象化合物濃度の分析は、対象化合物阻止率が総てのプットアンドテイクサイクルについて９９．３〜９９．９％の間の範囲であり、その結果、全対象化合物損失は２．３％となることを示した（表３参照）。観察された阻止率は、母液の初期濃度を除き、総ての工程の膜スクリーニング中に測定されたデータに一致していた（第２．１節参照）。最初のプットアンドテイクサイクルの前に、結晶化母液に酢酸エチルを加えて５０％（容量％）のレベルとした。混合供給液については、対象化合物阻止率は期待値９８．４％から９９．３％の値に上昇することが認められ（表３参照）、対象化合物の損失がいくらか起こるとしても、この試験は、最初に酢酸エチルを加えることにより全体的な損失を最小限とすることができることを示した。酢酸エチルを添加した場合に見られた対象化合物阻止率の上昇は、膜スクリーニングの際に見られた傾向と一致しており（表２参照）、Ｓｔａｒｍｅｍ（商標）１２２の性能が膜−溶媒−溶質の相互作用に依存していたことを強く示した。
【００９５】
【表３】
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【００９６】
２．３  向流クロマトグラフィー（ＣＣＣ）
ＣＣＣ分離の前に、個々に調製した固定相および移動相のＫｄ値を評価した。サンプルの分配をＨＰＬＣで分析したところ、データは、Ｍｉｎｉ試験用およびバルク調製ＨＥＭＷａｔ  １７．５システム用に個々に調製された相の新鮮溶媒および回収溶媒の両方で、  Ｋｄ値は１．０６に等しいことを示した。一貫したＫｄ値は、単一相として構成された溶媒系とバルク相として構成されたＨＥＭＷａｔ  １７．５との間で分配に有意な差が無かったことを示した。さらに、対象化合物と関連不純物に関して算出されたＫｄ比は、値がそれぞれ１．１および１．３であった２つを除いた総ての不純物で分離係数が１．５を超えた。分離係数は単一相とＨＥＭＷａｔ  １７．５との間で一貫したものであり、ＨＥＭＷａｔ  １７．５が、共溶出がわずかしか起こらずに対象化合物と不純物の分離のために最も好適な溶媒系であったことを示す従前のデータに一致していた。
【００９７】
ＣＣＣ操作では、溶媒交換から得られた溶液（第２．２節参照）を新鮮なメタノール、ヘプタンおよび水と混合して、６７．３２％ヘプタン、３０．２９％酢酸エチル、２．１６％メタノールおよび０．２４％水という所望の移動相組成を有するサンプルを調製した。次に、ＣＣＣを用いて流入供給流に存在する不純物から対象化合物を分離した。移動相としてそれぞれ新鮮溶媒（ＣＣＣ試験１）および回収溶媒（ＣＣＣ試験２、第２．４節参照）を用い、０．９ｍＬのサンプル規模で２回のＣＣＣ  Ｍｉｎｉ試験を実施した。どちらのＭｉｎｉ試験でも、固定相の保持率は８３％と測定され、各分離は、画分採取をサンプル注入直後に開始し、３．５分間隔で計１０回続けながら、計３５分間実施した。試験１および２からの個々のＣＣＣ画分をＨＰＬＣで分析したところ、データは、それぞれ新鮮移動相と回収移動相で作動するＣＣＣ試験１および２の分離プロフィールはほとんど同一であった（図３参照）。ＣＣＣ試験１および２の両方では、大部分の不純物は５分〜１５分の間に溶出し、以降の溶出時間で見られるのはごく微量であった（図３参照）。対象化合物は、初期不純物遮断の後の２０分〜３０分の間に溶出し、ＨＰＬＣデータは、添加した対象化合物の７７．５〜８０．０％が９１．６〜１００％の範囲の純度で画分中に溶出されたことを示した。その他の対象化合物含有画分は総て純度２７．０〜８５．２％の間の範囲であり、全対象化合物回収率は両試験ともおよそ１００％まで加算される（表４参照）。９０％の純度は最終産物として十分であるとは考えられなかったが、これらの画分から結晶化により(though crystallisation)対象化合物を回収し、一般に＞９９％の純度が得られた。
【００９８】
ＣＣＣ試験１および２では一貫した性能が見られ、回収された溶媒を分離のための移動相として使用しても対象化合物含有画分において不純物が富化される兆候はなかったことに留意することが重要である。対象化合物画分の純度が比較的高いことはさらに、ＣＣＣに関する十分な分離性能および初期対象化合物精製の実現可能性が証明されたと考えることができることを示した。
【００９９】
実現可能性の実証のための小規模ＣＣＣ試験に加え、回収および次のＣＣＣ操作への再循環のために十分な移動相を生成するために（ＣＣＣ試験２における使用のため）、より大規模の（Ｍｉｄｉ）で１回の試験を行った。より大規模な試験では、固定相保持は８０％と測定され、４１ｍＬのサンプルと新鮮溶媒を用いて移動相を調製し、ＣＣＣ分離を行い、合計２４５０ｍＬの溶媒を１０の個々の画分に溶出させた。ＨＰＬＣデータは、対象化合物が最後の５つの画分に溶出し、６２．２〜１００．０％の範囲の不純物を伴っていたことを示した（図３参照）。注目すべきは、純度の低い画分は低い対象化合物濃度を有し、存在する不純物の絶対値は最小であり、結晶化による対象化合物の回収の際におそらく洗い流されたということである。Ｍｉｄｉ試験の溶出プロフィールは、Ｍｉｎｉ操作の際に見られたものとはやや異なっていた（図３参照）。不純物と対象化合物はＭｉｎｉ試験の場合とほぼ同じ時間内になお溶出してはいたが、対象化合物ピークは広くなり、その結果、対象化合物はより広い画分範囲にわたって溶出していた。溶出プロフィールの若干の違いは、Ｍｉｄｉ試験の固定相保持率が低いことで示される相組成の若干の違いと、様々な大きさの装置内での混合における若干の違いが組み合わさった結果である可能性がある。
【０１００】
しかしながら、このより大規模なＭｉｄｉ  ＣＣＣ試験からの対象化合物の溶出時間ならびに対象化合物画分の純度は小規模試験で見られたデータと同等であり、ＣＣＣ性能は、試験したこれら２つの規模で一貫性が認められたことに着目することが重要である。図３は、ＣＣＣ試験１（Ｍｉｎｉ、移動相に新鮮溶媒）、試験２（Ｍｉｎｉ、移動相に回収溶媒）および試験３（Ｍｉｄｉ、移動相に新鮮溶媒−溶媒回収用材料）に関するＨＰＬＣ再構成クロマトグラムの比較を示す。
【０１０１】
【表４】
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【０１０２】
２．４  溶媒回収
より大規模なＣＣＣ試験から回収された移動相に関して溶媒回収の実現可能性を検討した（第３．３節参照）。溶出した移動相を内容物に応じて４画分に分け（表５参照）、溶媒回収の実現可能性を各画分について個別に検討した。対象化合物の回収が可能かどうか、また、回収された溶媒中に、有機溶媒ナノフィルトレーションによっては容易に除去できない低分子量不純物を含むリスクを最小化するかどうか、画分を調べた。
【０１０３】
【表５】
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【０１０４】
溶媒を次のＣＣＣ操作に再循環させるには、選択される溶媒仕様が、回収された溶媒は所望の溶媒組成の０．５％（容量％）以内になければならず、かつ、不純物の含有がせいぜい全量の１％（ＨＰＬＣによる面積％）である必要があった。ＨＰＬＣデータは、画分Ｆ０およびＦ３〜Ｆ５の場合、全不純物含量および濃度は低かったことを示し（図３および表５参照）、阻止率値は１３〜１００％の範囲であるものの、不純物の除去は、単回の膜通過で溶媒回収を試みるのに十分であることが予想された。対象化合物と濃縮材料を含んだ画分Ｆ６〜Ｆ１０は、結晶化による対象化合物回収を意図したものであった。対象化合物の阻止率は９８．５％と高く、単回の膜通過で溶媒が回収可能であることを示す。しかしながら、対象化合物の最小損失を保証するために、溶媒回収に二重の膜工程を用い、各工程からの保持液を別に回収した。最後に、画分Ｆ１〜Ｆ２のＨＰＬＣデータは、全不純物含量および濃度が高く、０〜１００％の範囲の不純物阻止率を有したことを示した。高い開始濃度ともに低い阻止率が測定されたことは、たとえ複数回の膜通過を用いたとしても、回収される透過液は溶媒仕様からはいまだに遠いであろうことを示した。従って、画分Ｆ１〜Ｆ２は溶媒回収には不適であると考えられ、廃液として廃棄した。各回収画分の溶媒組成はＧＣおよびカールフィッシャーを用いて分析した後、その溶媒を最終的な回収移動相と合わせた（表６参照）。混合溶媒の組成は、６７．７％ヘプタン、３０．２％酢酸エチル、１．９％メタノールおよび０．３％水であると測定され、従って、所望のＨＥＭＷａｔ  １７．５組成から、ヘプタンに関して最大０．４％（容量％）のずれがあった。分配試験では、回収された移動相における対象化合物のＫｄが１．０６であったことが明らかになり、これはＨＥＭＷａｔ  １７．５およびＣＣＣ試験１に用いた新鮮溶媒相（第２．３節参照）で見られた値と一致していた。対象化合物Ｋｄ値の一貫性は、溶媒組成の若干の違いが溶質の分配に有意な影響を及ぼさないことを示した。
【０１０５】
回収された溶媒のＨＰＬＣ分析はさらに、混合透過液中の不純物の痕跡は０．４６％（ＨＰＬＣによる面積％）であったことを示し、これは設定目標である１％（ＨＰＬＣによる面積％）よりも有意に低かった。従って、回収された溶媒は溶媒仕様の範囲内にあり、次のＣＣＣ操作に再循環させるのに好適であると考えられた。溶媒回収の実現可能性はさらにＣＣＣ性能の一貫性によっても確認され、回収溶媒を用いて操作しても対象化合物含有画分中に不純物の増大は見られなかった（ＣＣＣ試験２、第２．３節参照）。
【０１０６】
【表６】
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【０１０７】
２．５  溶媒の質量強度
プロセスの質量強度は、生産される単位対象化合物あたりの一定量の生成物を生成するために用いる材料の総質量の比と定義され、製薬産業においてプロセス比較の指標として用いられる。質量強度値は、それぞれ溶媒回収および有機溶媒ナノフィルトレーション溶媒交換が有りおよび無しの場合のＣＣＣ操作の比較に基づいて算出および使用した（表７参照）。予想されたように、質量強度データは、ＣＣＣ操作単独の溶媒強度が２９×１０３の値で高かったが、ＣＣＣ操作を溶媒回収と組み合わせた場合には、溶媒の質量強度は、溶媒回収レベル７０％（ＣＣＣ試験３から得られた回収レベル）に対して６０％の低下と計算された。溶媒の質量強度のデータはさらに、有機溶媒ナノフィルトレーション溶媒交換の溶媒要求量を比較に含めた場合には、全溶媒強度が増大したことを示した。これは、付加的な溶媒を用いた場合に予想される挙動と一致している。しかしながら、有機溶媒ナノフィルトレーション溶媒交換は、溶媒回収を行わないＣＣＣプロセスでは５％、また、溶媒回収を行うＣＣＣプロセスでは１０％の相対的質量強度増加をもたらしたに過ぎなかった。全体的なＣＣＣプロセスを比較した場合、これはさらに、比較的溶媒強度のある有機溶媒ナノフィルトレーション溶媒交換を用いる場合であっても、溶媒回収有りおよび無しのＣＣＣ操作の全溶媒質量強度は５６％低下する可能性があることを意味する。
【０１０８】
【表７】
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【０１０９】
４．結論
本明細書で示した実験研究によれば、ＣＣＣを用いた分離は、有機溶媒ナノフィルトレーション技術と組み合わせた場合にはるかに効果的となり得ることが実証された。有機溶媒ナノフィルトレーション溶媒交換はＣＣＣのためのサンプル溶液を仕様の範囲内で生成し、好結果のＣＣＣ操作により実現可能性が実証された。有機溶媒ナノフィルトレーションダイアフィルトレーションを用いた溶媒交換は比較的溶媒強度のあるプロセスであるが（表７参照）、特に、共沸混合物が存在する場合、または高沸点溶媒から低沸点溶媒への交換である場合には、選択的熱経路が問題となる場合がある。さらに、有機溶媒ナノフィルトレーションは対象化合物の潜在的熱分解を回避することができ、エネルギー効率の向上という点で利益をもたらし得る。溶媒交換の間、対象化合物阻止率は＞９９％に維持され、高い対象化合物阻止率にもかかわらず、加算された全対象化合物損失は最大２．３％であった。対象化合物の損失は、１００％の阻止率を有する膜が望ましく、膜の開発は依然として重要な研究領域であることを強調する。有機溶媒ナノフィルトレーション溶媒回収およびＣＣＣ移動相の再循環によりプロセス全体の質量強度の改善が示された。
【０１１０】
溶媒回収の実現可能性は、記載の溶媒仕様の範囲内の溶媒の回収および新鮮溶媒を用いて調製した移動相に対する一貫した分配値をもって実証された。回収された溶媒は首尾よくＣＣＣ分離に使用され、新鮮溶媒を用いて行った操作に対して一貫した性能が示された。質量強度データの比較は、溶媒強度のある有機溶媒ナノフィルトレーション溶媒交換をサンプル調製に用いた場合であっても、移動相の再循環によりこのＣＣＣプロセスの質量強度に５６％の改善をもたらしたことを示したが、このことは、全体的なＣＣＣ質量効率の改善に対する重要な可能性を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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