(57)【要約】  本発明は、チクングニアウイルスポリペプチドを発現する組換え麻疹ウイルスに関し、特に、その表面にチクングニアウイルスのエンベロープおよびキャプシドタンパク質を含有するウイルス様粒子(VLP)に関する。これらの粒子は、投与後に宿主中で複製することができる組換え感染性粒子である。本発明は、これらの組換え感染性粒子を生成するための手段、特に、核酸、ベクター、細胞および救済系を提供する。本発明はまた、チクングニアウイルスによる感染の処置または防止のための、特に、組成物の形態の下、より詳細には、ワクチン製剤での、これらの組換え感染性粒子の使用にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つのチクングニアウイルス(CHIKV)構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、前記ポリヌクレオチドが、麻疹ウイルス(MV)の完全長感染性アンチゲノム(+)RNA鎖のヌクレオチド配列をコードするcDNA分子に作動可能に連結され、特に、クローニングされている、核酸構築物。
【請求項２】
麻疹ゲノムの6の規則に従うことを特徴とする、請求項1に記載の核酸構築物。
【請求項３】
5'から3'に向かって、
(a)MVのNタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(b)MVのPタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(c)少なくとも1つのCHIKV構造タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(d)MVのMタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(e)MVのFタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(f)MVのHタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
(g)MVのLタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を包含する遺伝子転写単位を含み、前記ポリヌクレオチドが、核酸構築物中で作動可能に連結され、MVリーダーおよびトレイラー配列などのウイルス複製および転写調節配列の制御下にある、請求項1または2に記載の核酸構築物。
【請求項４】
前記麻疹ウイルスが弱毒化ウイルス株であり、前記株が特に、Schwarz株、Zagreb株、AIK-C株およびMoraten株の群において選択されることを特徴とする、請求項1から3のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項５】
CHIKV構造タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドがマカクコドン使用について最適化されているか、またはヒトコドン使用について最適化されていることを特徴とする、請求項1から4のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項６】
麻疹編集様配列がCHIKV構造タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドから欠失されていることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項７】
CHIKV構造タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、E1、E2、E3、Cおよび6Kタンパク質の群から選択される1つまたはいくつかのタンパク質をコードすることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項８】
前記チクングニアウイルスが06-49株と命名された株由来であることを特徴とする、請求項1から7のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項９】
配列番号3、5、7、9に定義される可溶性形態のエンベロープタンパク質E2をコードすることを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
エンベロープタンパク質E2のエクトドメインをコードするポリヌクレオチドが配列番号11、13、15の配列を有することを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
配列番号17、19、21、22、23、24、25、26および28に定義される1つまたはいくつかのCHIKV構造タンパク質E1、E2、E3、Cおよび6Kをコードすることを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１２】
配列番号30に定義されるステム領域を含まない可溶性形態のエンベロープタンパク質E2をコードすることを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、27、29および31に定義されることを特徴とする、請求項1から8のいずれか一項に記載の核酸構築物。
【請求項１４】
請求項1から12のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む移入ベクタープラスミド。
【請求項１５】
pMV-CHIKVであることを特徴とする、請求項14に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項1から15のいずれか一項に記載の核酸構築物または移入ベクタープラスミドで形質転換されることを特徴とする細胞、特に、真核細胞、例えば、鳥類細胞、特に、CEF細胞、哺乳動物細胞または酵母細胞。
【請求項１７】
少なくとも宿主細胞により認識されるRNAポリメラーゼ、MVの核タンパク質(N)、MVのホスホタンパク質(P)および場合により、MV RNAポリメラーゼラージタンパク質(L)を生成する宿主細胞、特に、それらを安定に生成する宿主細胞における、請求項1から12のいずれか一項に記載の核酸構築物または請求項14もしくは15に記載のベクターの発現の生成物であることを特徴とする、組換え感染性複製可能MV-CHIKウイルス粒子。
【請求項１８】
CHIKV構造タンパク質を発現するCHIKVウイルス様粒子、特に、CHIKV-CE3E26KE1 VLPと会合した、請求項17に記載の組換え感染性複製可能MV-CHIKウイルス粒子と、薬学的に許容されるビヒクルとを含む活性成分の組成物または集合物。
【請求項１９】
宿主、特に、それを必要とするヒト宿主における、CHIKウイルスに対する防御免疫応答の惹起における、特に、前記CHIKVタンパク質に対する抗体および/または細胞性免疫応答の惹起のためのワクチンとしての使用のための、CHIKV構造タンパク質、特に、CHIKVウイルス様粒子、特に、CHIKV-CE3E26KE1 VLPと会合した組換え感染性複製可能MV-CHIKウイルス粒子を含む活性成分の組成物もしくは集合物、または請求項1から18のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
対象、特に、ヒトにおけるチクングニアウイルスによる感染の処置または防止における使用のための、CHIKV構造タンパク質、特に、CHIKVウイルス様粒子、特に、CHIKV-CE3E26KE1 VLPと会合した組換え感染性複製可能MV-CHIKウイルス粒子または請求項18に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、チクングニアウイルスポリペプチドを発現する組換え麻疹ウイルスを対象とし、特に、その表面にチクングニアウイルスのエンベロープおよびキャプシドタンパク質を含有するウイルス様粒子(VLP)に関する。これらの粒子は、投与後に宿主中で複製することができる組換え感染性粒子である。本発明は、これらの組換え感染性粒子を生成するための手段、特に、核酸、ベクター、細胞および救済系を提供する。本発明はまた、チクングニアウイルスによる感染の処置または防止のための、特に、組成物の形態の下、より詳細には、ワクチン製剤での、これらの組換え感染性粒子の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
チクングニアウイルス(CHIKV)は、1952年にタンザニアで初めて単離された、トガウイルス(Togaviridae)科内のアルファウイルス(Alphavirus)属のプラス鎖RNAウイルスである。
【０００３】
このウイルスによる感染は、デング熱に似た症状を特徴とするヒト疾患を引き起こし、2〜5日の急性発熱期、次いで、四肢の関節に影響する長期に及ぶ関節痛疾患である。CHIKVはアフリカ、インドおよび東南アジアにおける風土病であり、都市または森林伝染サイクルを介してヤブカ(Aedes)によって伝染する。2006年に、CHIKV熱の大流行がインド洋のいくつかの島(コモロ、モーリシャス、セイシェル、マダガスカル、レユニオン島など)で発生した後、インドに飛び火し、そこでは見積もりで140万件が報告された。より最近では、輸入感染が欧州で記載されており、約200件の風土病がイタリアで報告された(Jose, J.ら、「A structural and functional perspective of alphavirus replication and assembly」、Future Microbiol、2009. 4(7): 837〜56頁)。臨床的には、このCHIKV風土病は、以前の大流行よりも重篤な症状を伴い、重症多発関節痛および筋肉痛、合併症および死亡が報告された。
【０００４】
CHIKVゲノムは、11.8kbの、正の極性の一本鎖RNA分子である。このウイルスはセムリキ森林(Semliki Forest)ウイルス(SFV)、シンドビス(Sindbis)ウイルス(SINV)、および他の旧世界アルファウイルスと密接に関連し、ベネズエラウマ脳炎ウイルスのような新世界アルファウイルスとより距離的に関連する(Griffin, D.E.、「Alphaviruses, in Fields Virology」、第5版、D.M. Knipe(編)、2007、Wolters Kluwer、Lippincott Williams & Wilkins. 1023〜1067頁)。ゲノムRNAはキャップ付であり、ゲノムの5'側2/3によりコードされるP1234と呼ばれる完全長非構造的ポリタンパク質(nsP)に直接翻訳される(Jose, J.、J.E. Snyder、およびR.J. Kuhn、「A structural and functional perspective of alphavirus replication and assembly」、Future Microbiol、2009. 4(7): 837〜56頁; Kuhn, R.J.、「Togaviridae: the viruses and their replication, in Fields Virology」、第5版、D.M. Knipe(編)、2007、Wolters Kluwer、Lippincott Williams & Wilkins. 1001〜1022頁)。この前駆体はそれ自身を切断して、RNA依存的RNAポリメラーゼ活性を担持するP123およびnsP4を生成する。これらのタンパク質は、細胞コファクターと一緒になって、アンチセンスゲノムRNA分子を生成する複製複合体に集合する。P123のnsP1およびP23へのその後の切断は、センスおよびアンチセンスの両方のゲノムRNAを作るポリメラーゼ複合体を生じさせる。P23のnsP2およびnsP3へのさらなるプロセシングは、プラスセンスゲノムRNA分子のみを作るポリメラーゼ複合体を生じさせる。ウイルスゲノムの複製に加えて、このウイルスタンパク質複合体は、ウイルスゲノムの3'末端から26SのサブゲノムRNAを転写する。このメッセンジャーRNAはポリタンパク質前駆体に翻訳され、ウイルスおよび細胞酵素の組合せによって切断され、キャプシドタンパク質(C)、2つの主要エンベロープタンパク質(E1およびE2)、ならびに2つのより小さいアクセサリーペプチド、E3および6kを生成する。一度集合したら、CHIKVビリオンは直径65〜70nmの球状粒子となり、本質的には、キャプシドタンパク質と会合したゲノムRNA分子から構成され、正二十面体格子に組織化されたE1-E2ヘテロ二量体により修飾された宿主由来脂質膜中に包まれる(Voss, J.E.ら、「Glycoprotein organization of Chikungunya virus particles revealed by X-ray crystallography」、Nature、2010. 468(7324): 709〜12頁)。
【０００５】
新しい地理的領域へのウイルスの進化および拡散と同様、疾患の重症度は、解決する必要がある重大な公衆衛生問題である。この問題を解決するために、弱毒化生ウイルス、キメラアルファウイルス、組換えDNAまたはウイルス様粒子を含むワクチンが開発されてきた。
【０００６】
ホルマリン不活化ワクチンは、非ヒト霊長類およびヒトにおいて免疫原性であることが示されたが、BSL-3条件下で調製される必要がある集団予防接種にとって必要な多量の抗原が、この戦略の開発にとっての制限である(Tiwari, M.ら、「Assessment of immunogenic potential of Vera adapted formalin inactivated vaccine derived from novel ECSA genotype of Chikungunya virus」、Vaccine、2009. 27(18): 2513〜22頁)。米国陸軍により開発された弱毒化生TSI-GSD-218 CHIKVワクチンは、免疫原性であったが、安全性の問題を生じさせるビルレンスへの復帰と関連する第II相臨床試験において副作用を引き起こした。したがって、弱毒化生ウイルスに基づくワクチンを用いて得られた結果は、効率的な免疫化をこの方法によって達成することができることを示すが、場合により副作用の危険性があるため、これらのワクチンは依然として疑問の余地がある(Edelman Rら、Am J Trop Med Hyg. 2000 Jun;62(6):681〜685頁)。CHIKV由来のE1、E2およびキャプシドタンパク質をコードするキメラアルファウイルスワクチン戦略は、マウスにおいて免疫原性である(Wang, E.ら、「Chimeric alphavirus vaccine candidates for Chikungunya」、Vaccine、2008. 26(39): 5030〜9頁)が、容易に組み換えるアルファウイルスの能力は、そのような戦略の開発に対して安全性の問題を生じさせる(Weaver, S.C.ら、「Recombinational history and molecular evolution of western equine encephalomyelitis complex alphaviruses」、J Virol、1997. 71 (1): 613〜23頁)。
【０００７】
探索されている別の戦略は、ワクチンとしての使用のための組換えDNA構築物を設計することである。E1、E2およびキャプシドタンパク質をコードするDNAに基づくCHIKVワクチンは、マウスおよび非ヒト霊長類において免疫原性であることが示されている(Muthumani, K.ら、「Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against Chikungunya virus」、Vaccine、2008. 26(40): 5128〜34頁; Mallilankaraman, K.ら、「A DNA vaccine against chikungunya virus is protective in mice and induces neutralizing antibodies in mice and nonhuman primates」、PLoS Negl Trop Dis、2011. 5(1): e928頁)が、このDNA戦略はヒトにおいてはCHIKVクリアランスにとって必要とされる強力な中和免疫応答を誘導しない。DNAワクチンの欠点は、免疫応答を誘導するためには大量のDNAが必要であり、複数回の追加ワクチン接種を実施しなければならないことである。複数回の追加および多くの細胞の核に注入される大量のDNAの必要性は、DNAワクチンが宿主DNAに組み込まれ、挿入突然変異を引き起こし得るという事実に関する関心を引き起こす。したがって、最近の研究は、弱毒化生ウイルスと組み合わせたDNAワクチンの使用を報告している(WO2011/082388)。この技術により、弱毒化生ウイルスおよびDNAワクチンの欠点を軽減することができるが、副作用が軽減されたワクチンを提供することが依然として必要である。
【０００８】
弱毒化生ウイルスおよびDNAワクチンの欠点を回避するために、チクングニアウイルスの構造タンパク質を発現させることによって得られるウイルス様粒子(VLP)に基づくワクチンなどの他の種類のワクチンが開発されている。これらの構造タンパク質は、ウイルス様粒子中で自己集合することができる。それに基づいて、全てのチクングニアウイルス構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むワクチンが考案された(Akahata, W.ら、「A virus-like particle vaccine for epidemic Chikungunya virus protects nonhuman primates against infection」、Nat Med、2010. 16(3): 334〜8頁)。しかしながら、in vitroで生成されたVLPは製造するには高価であり、完全な免疫のためには3回の投与が必要であり、したがって、これらのワクチンは安価に得られるものではない。Akataらに開示されたCHIKV VLP戦略は、保護を誘導するためにアジュバントを用いる数回の免疫化を必要とするものであった。この理由から、感染した細胞、特に、宿主の感染した細胞中、in vivoでCHIKV VLPを生成し、かくして、特に、1回または2回のみの投与工程後に生涯続く免疫を誘導する効率的で、長く続く免疫を提供することができる改良されたワクチンの設計が依然として必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】WO2011/082388
【特許文献２】WO2004/000876
【特許文献３】WO2008/078198
【特許文献４】WO2007/105111
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Jose, J.ら、「A structural and functional perspective of alphavirus replication and assembly」、Future Microbiol、2009. 4(7): 837〜56頁
【非特許文献２】Griffin, D.E.、「Alphaviruses, in Fields Virology」、第5版、D.M. Knipe(編)、2007、Wolters Kluwer、Lippincott Williams & Wilkins. 1023〜1067頁
【非特許文献３】Kuhn, R.J.、「Togaviridae: the viruses and their replication, in Fields Virology」、第5版、D.M. Knipe(編)、2007、Wolters Kluwer、Lippincott Williams & Wilkins. 1001〜1022頁
【非特許文献４】Voss, J.E.ら、「Glycoprotein organization of Chikungunya virus particles revealed by X-ray crystallography」、Nature、2010. 468(7324): 709〜12頁
【非特許文献５】Tiwari, M.ら、「Assessment of immunogenic potential of Vera adapted formalin inactivated vaccine derived from novel ECSA genotype of Chikungunya virus」、Vaccine、2009. 27(18): 2513〜22頁
【非特許文献６】Edelman Rら、Am J Trop Med Hyg. 2000 Jun;62(6):681〜685頁
【非特許文献７】Wang, E.ら、「Chimeric alphavirus vaccine candidates for Chikungunya」、Vaccine、2008. 26(39): 5030〜9頁
【非特許文献８】Weaver, S.C.ら、「Recombinational history and molecular evolution of western equine encephalomyelitis complex alphaviruses」、J Virol、1997. 71 (1): 613〜23頁
【非特許文献９】Muthumani, K.ら、「Immunogenicity of novel consensus-based DNA vaccines against Chikungunya virus」、Vaccine、2008. 26(40): 5128〜34頁
【非特許文献１０】Mallilankaraman, K.ら、「A DNA vaccine against chikungunya virus is protective in mice and induces neutralizing antibodies in mice and nonhuman primates」、PLoS Negl Trap Dis、2011. 5(1): e928頁
【非特許文献１１】Akahata, W.ら、「A virus-like particle vaccine for epidemic Chikungunya virus protects nonhuman primates against infection」、Nat Med、2010. 16(3): 334〜8頁
【非特許文献１２】Enders, J. F.、およびT. C. Peebles、1954、「Propagation in tissue cultures of cytopathogenic agents from patients with measles」、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86:277〜286頁
【非特許文献１３】Horikami S.M.およびMoyer S.A. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1995) 191、35〜50頁
【非特許文献１４】Combredet C.ら(Journal of Virology、Nov 2003、11546〜11554頁)
【非特許文献１５】Neumann G.ら(Journal of General Virology (2002) 83、2635〜2662頁)
【非特許文献１６】Fields、Virology (Knipe & Howley、2001)
【非特許文献１７】www.fda.gov/cber/vaccine/vacappr.htm
【非特許文献１８】Kam Y. Wら(EMBO Mol Med 4、330〜343頁)
【非特許文献１９】Cattaneo Rら、Cell. 1989 Mar 10;56(5):759〜64頁
【非特許文献２０】Combredet, Cら、「A molecularly cloned Schwarz strain of measles virus vaccine induces strong immune responses in macaques and transgenic mice」、J Virol、2003. 77(21): 11546〜54頁
【非特許文献２１】Radecke, F.ら、「Rescue of measles viruses from cloned DNA」、Embo J、1995. 14(23):5773〜84頁
【非特許文献２２】Lucas, M.ら、「Infection of mouse neurons by West Nile virus is modulated by the interferon-inducible 2'-5' oligoadenylate synthetase 1 b protein」、Immun. Cell Biol.、2003. 81：230〜236頁
【非特許文献２３】Pletnev, S.V.ら、「Locations of carbohydrate sites on alphavirus glycoproteins show that E1 forms an icosahedral scaffold」、Cell、2001. 105(1): 127〜36頁
【非特許文献２４】Zhang, W.ら、「Placement of the structural proteins in Sindbis virus」、J Virol、2002. 76(22): 11645〜58頁
【非特許文献２５】Warter Lら、JIM 2011
【非特許文献２６】Russell PKら、JIM 1967
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
この目的のために、本発明者らは、組換えウイルスが特に、投与後に宿主中で複製する場合に回収される、チクングニアウイルス抗原をコードするポリヌクレオチドを用いて組み換えた組換え感染性複製可能麻疹ウイルスに基づくワクチンの生成を達成した。本発明は、かくして、広く用いられているSchwarz小児用麻疹ワクチンに基づくCHIKV生ワクチン活性成分に関する。好ましい実施形態において、この組換えMV-CHIKV生ワクチンは、感染した細胞中で複製することによりCHIKウイルス様粒子を得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
麻疹ウイルスは、パラミクソウイルス(Paramyxoviridae)科内のモルビリウイルス(Morbilivirus)属の非断片化一本鎖マイナスセンスエンベロープRNAウイルスである。このウイルスは1954年に単離され(Enders, J. F.、およびT. C. Peebles、1954、「Propagation in tissue cultures of cytopathogenic agents from patients with measles」、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86:277〜286頁)、弱毒化生ワクチンは、それ以来、ワクチン株を提供するためにこのウイルスから、特にSchwarz株から誘導されている。麻疹ワクチンは、この30年にわたって何億人もの子供に投与されており、その効率性および安全性を証明してきた。それは多くの国々で大規模に製造され、低コストで配布されている。これらの全ての理由から、本発明者らは、チクングニアウイルスの構造的抗原を安定に発現する組換え麻疹ウイルス粒子を、特に、VLPとして生成するために弱毒化麻疹ウイルスを用いた。
【００１３】
かくして、本発明は、少なくとも1つのチクングニアウイルス(CHIKV)構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、前記ポリヌクレオチドが、麻疹ウイルス(MV)の完全長感染性アンチゲノム(+)RNA鎖のヌクレオチド配列をコードするcDNA分子に作動可能に連結された、特に、クローニングされている、核酸構築物に関する。
【００１４】
本発明による核酸構築物は、特に、作動可能に一緒に連結された、異なる起源の様々なポリヌクレオチドの組換えにより得られた、または得られる精製されたDNA分子である。
【００１５】
「作動可能に連結された」という表現は、異なるポリヌクレオチドと核酸構築物が、特に、細胞もしくは細胞系、特に、本発明のキメラ感染性MV粒子の生成のための救済系の一部として用いられる細胞もしくは細胞系、または宿主細胞中で、効率的に転写され、必要に応じて翻訳されるような、本発明の核酸構築物の異なるポリヌクレオチド間に存在する機能的連結を指す。
【００１６】
本発明の特定の実施形態においては、構築物は、麻疹ウイルスの完全長アンチゲノム(+)RNAをコードするcDNA中に、CHIKVの1つの構造タンパク質または複数の構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングすることにより調製される。あるいは、本発明の核酸構築物を、PCRなどによる、核酸断片の合成または鋳型からの重合の工程を用いて調製することができる。
【００１７】
本発明の特定の実施形態においては、CHIKVの少なくとも1つのタンパク質をコードするポリヌクレオチド、またはこれらのポリヌクレオチドのそれぞれは、麻疹ウイルスのcDNAに挿入されたATU(追加転写単位)中にクローニングされる。ATU配列は当業者には公知であり、MVのcDNA中へのクローニングの工程における使用のために、MV cDNA中の、先行する遺伝子のプロモーター、複数のクローニング部位カセット中に挿入されたCHIKVタンパク質をコードするポリヌクレオチドにより表される挿入物などの、トランスジーンのMV依存的発現にとって必要なシス作用配列を含む。
【００１８】
本発明を実施するために用いられる場合、ATUは、MVのアンチゲノムの完全長(+)RNA鎖をコードするcDNA分子のN末端配列中に有利に位置し、特に、このウイルスのP遺伝子とM遺伝子との間またはH遺伝子とL遺伝子との間に位置する。MVのウイルスRNAの転写は、5'末端から3'末端に向かう勾配に従うことが観察された。これは、cDNAのコード配列の5'末端に挿入された場合、ATUが、それが含有する異種DNA配列(例えば、CHIKVの少なくとも1つの構造タンパク質をコードするポリヌクレオチド)のより効率的な発現を可能にすることを説明するものである。
【００１９】
かくして、CHIKVの少なくとも1つの構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、麻疹ウイルスのcDNA分子の任意の遺伝子間領域、特に、ATU中に挿入することができる。本発明の特定の構築物は、実施例に例示されるものである。
【００２０】
特定の実施形態においては、いくつかの異なるポリヌクレオチドがDNA構築物中に存在する場合、CHIKVの少なくとも1つの構造タンパク質をコードするこれらのポリヌクレオチドのそれぞれを、MV cDNAの異なる部位、場合により、麻疹ウイルスのcDNAの異なるATU中に挿入することができる。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態においては、CHIKVの少なくとも1つの構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、麻疹ウイルスのcDNA分子のP遺伝子とM遺伝子の遺伝子間領域、特に、ATU中に挿入される。
【００２２】
本出願で用いられる「コードする」という表現は、選択された細胞または細胞系中で転写され、適切な場合、生成物発現のために翻訳される核酸分子の能力を定義する。したがって、本発明の核酸構築物は、コード配列の転写を制御する調節エレメント、特に、転写のためのプロモーターおよび終結配列ならびにおそらくエンハンサーおよび他のシス作用エレメントを含んでもよい。これらの調節エレメントは、CHIKVポリヌクレオチド配列に関して異種であってもよい。
【００２３】
用語「タンパク質」は、用語「抗原」または「ポリペプチド」と互換的に用いられ、アミノ酸残基の連結の結果得られる分子を定義するものである。特に、本出願で開示されるタンパク質は、CHIKVを起源とし、天然タンパク質と同一であってよいか、またはあるいは、置換(特に、保存的アミノ酸残基)もしくはアミノ酸残基の付加もしくは翻訳後の二次的改変もしくは参照の天然タンパク質に関してサイズが短縮された断片をもたらす天然タンパク質の一部の欠失などの突然変異によりそれから誘導されてもよい構造タンパク質である。断片は、それらが宿主、特に、ヒト宿主における免疫応答、好ましくは、CHIKV感染またはCHIKV関連疾患に対する保護を可能にする応答の惹起にとって好適な天然タンパク質のエピトープを担持する程度で本発明内に包含される。エピトープは、特に、タンパク質が投与された、またはそれが本発明の感染性複製粒子の投与後に発現される宿主中での抗体の生成の活性化による体液性免疫応答の惹起に関与するBエピトープの種類のものである。あるいは、エピトープは、細胞媒介性免疫応答(CMI応答)の惹起に関与するTエピトープの種類のものであってもよい。断片は、CHIKVの天然タンパク質の50%を超える、好ましくは、少なくとも90%または95%を占めるアミノ酸配列サイズであるサイズを有してもよい。あるいは、断片は、天然タンパク質のエピトープを担持する、少なくとも10アミノ酸残基を有する短いポリペプチドであってもよい。これに関する断片はまた、本明細書で定義されるポリエピトープを含んでもよい。
【００２４】
本発明の特定の実施形態においては、核酸構築物中のMVの完全長感染性アンチゲノム(+)RNA鎖のヌクレオチド配列をコードするcDNAは、麻疹ウイルスゲノムの6の規則(rule of six)に従う。
【００２５】
麻疹ウイルスのゲノムの組織化ならびにその複製および転写プロセスは、従来技術で完全に同定されており、特に、Horikami S.M.およびMoyer S.A. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. (1995) 191、35〜50頁に、またはウイルスのSchwarzワクチン接種株または広く考えられるマイナスセンスRNAウイルスについてはCombredet C.ら(Journal of Virology、Nov 2003、11546〜11554頁)に、Neumann G.ら(Journal of General Virology (2002) 83、2635〜2662頁)に開示されている。
【００２６】
「6の規則」は、MV(+)鎖RNAゲノムである核酸またはそれを含む核酸構築物中に存在するヌクレオチドの総数が、6の倍数であるという事実で表される。「6の規則」は、MVゲノムRNAの効率的な、または最適化された複製を可能にする、麻疹ウイルスのゲノム中のヌクレオチドの総数に関する要件として技術水準において認識されている。6の規則を満たす核酸構築物を定義する本発明の実施形態において、前記規則は、完全長MV(+)鎖RNAゲノムをコードするcDNAを特定する核酸構築物に適用される。これに関して、6の規則は、おそらく必ずしも前記cDNA中にクローニングされ、CHIKVの1つまたは複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチドではなく、麻疹ウイルスの完全長感染性アンチゲノム(+)RNA鎖のヌクレオチド配列をコードするcDNAに個別に適用される。
【００２７】
本発明の特定の態様によれば、核酸構築物は、5'から3'に向かって、
(a)MVのNタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(b)MVのPタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(c)少なくとも1つのCHIKV構造タンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(d)MVのMタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(e)MVのFタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
(f)MVのHタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および
(g)MVのLタンパク質をコードするポリヌクレオチド
を包含する遺伝子転写単位を含み、前記ポリヌクレオチドおよび核酸構築物は、作動可能に連結され、ウイルス複製および転写調節配列、例えば、MVリーダーおよびトレイラー配列の制御下にある。
【００２８】
「Nタンパク質」、「Pタンパク質」、「Mタンパク質」、「Fタンパク質」、「Hタンパク質」および「Lタンパク質」という表現は、それぞれ、麻疹ウイルスの核タンパク質(N)、ホスホタンパク質(P)、マトリックスタンパク質(M)、融合タンパク質(F)、ヘマグルチニンタンパク質(H)およびRNAポリメラーゼラージタンパク質(L)を指す。これらの成分は、先行技術において同定されており、特に、Fields、Virology (Knipe & Howley、2001)に開示されている。
【００２９】
本発明の好ましい実施形態においては、麻疹ウイルスの完全長感染性アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子は、MVの弱毒化株の特徴であるか、またはそれから得られる。
【００３０】
麻疹ウイルスの「弱毒化株」は、非病原性であるか、または宿主に投与された場合、免疫原性および場合によりアジュバント性を維持しながら、すなわち、免疫優勢TおよびB細胞エピトープならびに場合によりT細胞共刺激タンパク質またはサイトカインIL-12の誘導などのアジュバント性を保持しながら、同じ宿主において親株よりもビルレンスが低い株と定義される。
【００３１】
したがって、麻疹ウイルスの弱毒化株は、選択された細胞上で連続的に継代され、場合により、病原性の復帰も宿主染色体への組込みも許容しない安定なゲノムを担持する、ワクチン株の調製にとって好適な種株を生成するための他の細胞に適合化された株を指す。特定の「弱毒化株」として、ワクチンのために認可された株は、それがFDA(米国食品医薬品局)により規定された基準を満たす場合(www.fda.gov/cber/vaccine/vacappr.htm)、すなわち、それが実験および臨床データの厳格な再検討後に安全性、効能、品質および再現性の基準を満たす場合、本発明にとって好適な弱毒化株である。
【００３２】
本発明を実施するため、特に、核酸構築物のMV cDNAを誘導するために用いることができる特定の株は、Schwarz MV株、Zagreb株、AIK-C株およびMoraten株である。これらの株は全て、先行技術に記載されており、それらへのアクセスは特に、市販のワクチンとして提供されている。
【００３３】
本発明の特定の実施形態によれば、cDNA分子は、異種発現制御配列の制御下に置かれる。cDNAの発現のためのそのような制御の挿入は、このcDNAの発現がその天然の制御配列を用いた場合にcDNAの完全な転写を可能にしない細胞型において求められる場合に好ましい。
【００３４】
本発明の特定の実施形態によれば、異種発現制御配列は、T7プロモーターおよびT7ターミネーター配列を含む。これらの配列はそれぞれ、MVの完全長アンチゲノム(+)RNA鎖のコード配列の5'および3'に位置し、このコード配列の周囲の隣接配列に由来する。
【００３５】
本発明の特定の実施形態においては、上記に定義されたcDNA分子は、改変される、すなわち、追加のヌクレオチド配列またはモチーフを含む。
【００３６】
好ましい実施形態においては、本発明のcDNA分子は、その5'末端で、MV認可ワクチン株の完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするヌクレオチド配列の最初のヌクレオチドに隣接する、GGGモチーフ、次いで、ハンマーヘッド型リボザイム配列をさらに含み、その3'末端で、完全長アンチゲノム(+)RNA鎖をコードする前記ヌクレオチド配列の最後のヌクレオチドに隣接する、リボザイムの配列を含む。肝炎デルタウイルスリボザイム(δ)は、本発明を実施するのに適切である。
【００３７】
5'末端で、上記のコード配列の最初のヌクレオチドに隣接して置かれるGGGモチーフは、前記cDNAコード配列の転写の効率を改善する。麻疹ウイルス粒子の適切な集合のための要件はアンチゲノム(+)RNAをコードするcDNAが6の規則に従うという事実であるため、GGGモチーフが付加される場合、MVの完全長アンチゲノム(+)RNA鎖の最初のコードヌクレオチドでの転写物の切断を可能にするために、リボザイムもcDNAのコード配列の5'末端で、GGGモチーフから3'側に付加される。
【００３８】
本発明の特定の実施形態においては、本発明の核酸構築物を調製するために、先行技術に開示された麻疹ウイルスの完全長アンチゲノム(+)RNAをコードするcDNA分子の調製は、公知の方法により達成される。前記cDNAは、特に、それがプラスミドなどのベクター中に挿入される場合、ゲノムベクターを提供する。
【００３９】
本発明の核酸構築物の調製にとって好適な特定のcDNA分子は、麻疹ウイルスのSchwarz株を用いて得られたものである。したがって、本発明内で用いられるcDNAを、WO2004/000876に開示されたように取得するか、または2002年6月12日にI-2889の番号の下でCNCMのInstitut Pasteurにより寄託されたプラスミドpTM-MVSchwから取得することができ、その配列は参照により本明細書に組み込まれるWO2004/000876に開示される。プラスミドpTM-MVSchwは、Bluescriptプラスミドから得られたものであり、T7 RNAポリメラーゼのプロモーターの制御下に置かれたSchwarz株の完全長麻疹ウイルス(+)RNA鎖をコードするポリヌクレオチドを含む。それは18967個のヌクレオチドおよび配列番号1として表される配列を有する。他のMV株由来のcDNA分子(便宜上、麻疹ウイルスのcDNAまたはMV cDNAとも呼ばれる)を、本明細書に記載されるものなどの弱毒化MVのウイルス粒子から精製された核酸から出発して同様に取得することができる。
【００４０】
本発明の核酸構築物は、組換え感染性複製可能麻疹-チクングニアウイルス(MV-CHIKV)の調製にとって好適であり、それが意図され、したがって、前記核酸構築物は、前記MV-CHIKVウイルスの生成およびCHIKV構造タンパク質、特に、CHIKV VLPの収率のための、麻疹ウイルス、特に、Schwarz株のcDNA分子を結果として含む移入ゲノムベクター中への挿入が意図される。pTM-MVSchwプラスミドは、CHIKV構造タンパク質、特に、CHIKV VLPの発現にとって必要なCHIKVポリヌクレオチドの挿入により、移入ベクターを調製するのに好適である。
【００４１】
かくして、本発明は、ヘルパー細胞から救済された場合、組換えMV-CHIKV粒子の調製のために用いられる移入ベクターに関する。本発明の移入ベクターは、有利にはプラスミド、特に、Bluescriptプラスミドから得られたプラスミドである。
【００４２】
本発明はまた、ウイルスMV-CHIKV粒子の救済にとって好適な細胞を形質転換する、特に、それぞれ、本発明の核酸構築物を担持するプラスミドまたはウイルスベクターで、そのような細胞をトランスフェクトするか、または形質導入するための移入ベクターの使用に関し、前記細胞は、組換え、感染性、複製可能MV-CHIKV粒子中の本発明の核酸構築物に対応するウイルスの組換えゲノムの適切な複製、転写およびキャプシド形成にとって必要な麻疹ウイルスタンパク質を発現するその能力について選択される。
【００４３】
本発明はまた、本発明の移入ベクター、ならびにヘルパー機能を提供するさらなるポリヌクレオチドおよびタンパク質によりかくして形質転換された細胞または細胞系にも関する。
【００４４】
かくして、特に、好ましくは、組換えウイルスMV-CHIKV粒子の転写および複製において機能的な少なくともNおよびPタンパク質について安定に発現されるタンパク質として、麻疹ウイルスのN、PおよびLタンパク質(すなわち、リボ核タンパク質(RNP)複合体を形成することができる天然MVタンパク質またはその機能的変異体)を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドが前記細胞中に存在する。NおよびPタンパク質を、そのコード配列を含むプラスミドから細胞中で発現させるか、または細胞のゲノム中に挿入されたDNA分子から発現させることができる。Lタンパク質を、異なるプラスミドから発現させることができる。それを一過的に発現させることができる。ヘルパー細胞はまた、場合により安定に発現されるRNAポリメラーゼとして、本発明の核酸構築物から誘導される組換えRNAの合成を可能にするのに好適なRNAポリメラーゼを発現することもできる。RNAポリメラーゼは、T7ファージポリメラーゼまたはその核形態(nlsT7)であってもよい。
【００４５】
一実施形態においては、麻疹ウイルスのcDNAクローンは、Nタンパク質および/またはPタンパク質および/またはLタンパク質と同じ麻疹ウイルス株由来である。別の実施形態においては、麻疹ウイルスのcDNAクローンは、Nタンパク質および/またはPタンパク質および/またはLタンパク質と異なるウイルス株由来である。
【００４６】
かくして、本発明は、組換え感染性麻疹ウイルス粒子の調製のための方法であって、
1)そのcDNAからのMVのアンチゲノム(+)RNA配列の転写、複製およびキャプシド形成にとって必要なタンパク質も発現するヘルパー細胞系中に、ウイルス粒子集合を可能にする条件下で、本発明の核酸構築物またはそのような核酸構築物を含有する移入ベクターを移入する、特に、トランスフェクトする工程ならびに
2)CHIKVの少なくとも1つの構造タンパク質を発現する組換え感染性MV-CHIKVウイルスを回収する工程
を含む、方法に関する。
【００４７】
特定の実施形態によれば、この方法は、
1)RNAポリメラーゼを発現すること、ならびにMVウイルスのN、PおよびLタンパク質を発現するヘルパー機能を発現することができるヘルパー細胞に、移入ベクターを含む本発明による核酸構築物をトランスフェクトする工程;
2)工程1)の前記トランスフェクトされたヘルパー細胞を、cDNAが起源とするMV弱毒化株の継代にとって好適な継代された細胞と同時に培養する工程;
3)CHIKVの少なくとも1つの構造タンパク質を発現する組換え感染性MV-CHIKVウイルスを回収する工程
を含む。
【００４８】
本発明の別の特定の実施形態によれば、組換え感染性MV-CHIKVウイルスの生成のための方法は、
1)RNAポリメラーゼ、麻疹ウイルスの核タンパク質(N)および麻疹ウイルスのポリメラーゼコファクターホスホタンパク質(P)を安定に生成する細胞または細胞培養物を、本発明の核酸構築物、および麻疹ウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質(L)をコードする核酸を含むベクターで組み換える工程、ならびに
2)前記組換え細胞または組換え細胞の培養物から、感染性MV-CHIKVウイルスを回収する工程
を含む。
【００４９】
前記方法の特定の実施形態によれば、CHIKV構造タンパク質、特に、粒子が抗原、例えば、CHIKウイルスのCE3E26KE1抗原の組合せを発現するCHIKV VLPを発現する組換えMVが生成される。例示として、CHIKV構造タンパク質、特に、CHIKV VLPを発現する組換えMVを救済するための方法は、
1)T7 RNAポリメラーゼ、ならびに麻疹NおよびPタンパク質を安定に発現するヘルパー細胞、特に、HEK293ヘルパー細胞に、(i)CHIKV構造タンパク質をコードする、例えば、CHIKV-CE3E26KE1抗原をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドで組み換えた麻疹ウイルスの完全長アンチゲノム(+)RNAをコードするcDNAを含む移入ベクター、特に、プラスミドと、(ii)MV LポリメラーゼcDNAをコードするベクター、特に、プラスミドとを同時トランスフェクトする工程;
2)MV-CHIKV組換えウイルスの生成を可能にする条件で前記同時トランスフェクトされたヘルパー細胞を培養する工程;
3)かくして生成された組換えウイルスを、工程2)の前記ヘルパー細胞を、Vero細胞などの前記増殖を可能にする細胞と同時培養することにより増殖させる工程;
4)複製するMV-CHIKV組換えウイルスおよびCHIKV構造タンパク質、特に、CHIKVウイルス様粒子、特に、CHIKV-CE3E26KE1 VLPを回収する工程
を含む。
【００５０】
そのような方法は、用いられる構築物および条件と一緒に、図1Bに例示される。
【００５１】
本明細書で用いられる場合、「組換え」とは、例えば、ベクターの形態の下で、少なくとも1つのポリヌクレオチドを細胞中に導入することを意味し、前記ポリペプチドは細胞ゲノム(上記で定義されるものなど)中に組み込まれる(全体的もしくは部分的に)または組み込まれない。
【００５２】
特定の実施形態によれば、組換えは、本発明の核酸構築物である第1のポリヌクレオチドを用いて取得することができる。組換えはまた、またはあるいは、麻疹ウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質(L)をコードするベクターであるポリヌクレオチドを導入することを包含し、その定義、性質および発現の安定性は本明細書に記載されている。
【００５３】
本発明によれば、RNAポリメラーゼ、麻疹ウイルスの核タンパク質(N)および麻疹ウイルスのポリメラーゼコファクターホスホタンパク質(P)を安定に生成する細胞または細胞系または細胞培養物は、本明細書で定義される細胞もしくは細胞系または本明細書で定義される細胞培養物である、すなわち、それらが上記で定義された1つまたは複数のポリヌクレオチドの導入により改変された程度で組換え細胞でもある。本発明の特定の実施形態においては、RNAポリメラーゼ、NおよびPタンパク質を安定に生成する細胞または細胞系または細胞培養物は、麻疹ウイルスのLタンパク質を生成しないか、または麻疹ウイルスのLタンパク質を安定に生成しない、例えば、その一過的発現もしくは生成を可能にする。
【００５４】
本発明のMV-CHIKVウイルスの生成は、本明細書に記載のように形質転換された細胞の移入を含んでもよい。本明細書で用いられる場合、「移入」とは、異なる細胞型、特に、異なる細胞型の単層上への組換え細胞の塗布を指す。これらの後者の細胞は、感染性MV-CHIKVウイルスの複製と生成の両方、すなわち、それぞれ、細胞の内部での感染性ウイルスの形成と、場合により細胞の外部へのこれらの感染性ウイルスの放出を持続する能力を有する。この移入は、本発明の組換え細胞と、前記の文で定義されたコンピテント細胞との同時培養をもたらす。上記移入は、組換え細胞が効率的なウイルス生成培養物ではない場合、すなわち、感染性MV-CHIKVウイルスをこれらの組換え細胞から効率的に回収することができない場合、追加の、すなわち、任意選択の工程であってもよい。この工程は、本発明の組換え細胞の、本発明の核酸構築物、および場合により、麻疹ウイルスのRNAポリメラーゼラージタンパク質(L)をコードする核酸を含むベクターによるさらなる組換え後に導入される。
【００５５】
本発明の特定の実施形態においては、通常は容易に組み換えられるその能力について選択される組換え細胞は、組換え感染性MV-CHIKVウイルスの持続および生成において十分に効率的ではないため、移入工程が必要である。前記実施形態においては、上記で定義された方法の工程1)の細胞または細胞系または細胞培養物は、本発明による組換え細胞または細胞系または組換え細胞の培養物である。
【００５６】
本発明の組換え細胞の調製にとって好適な細胞は、原核または真核細胞、特に、動物または植物細胞、より詳細には、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞または非ヒト哺乳動物細胞または鳥類細胞または酵母細胞である。特定の実施形態においては、細胞は、そのゲノムの組換え前に、初代培養または細胞系のいずれかから単離される。本発明の細胞は、分裂または非分裂細胞であってもよい。
【００５７】
好ましい実施形態によれば、ヘルパー細胞は、ヒト胚性腎細胞系293から誘導され、細胞系293はCRL-1573の下でATCCに預託されている。特定の細胞系293は、WO2008/078198に開示され、以下の実施例に記載の細胞系である。
【００５８】
この方法の別の態様によれば、継代にとって好適な細胞は、CEF細胞である。CEF細胞を、EARL Morizeau社、8 rue Moulin、28190 Dangers、Franceから、または受精鶏卵の任意の他の生産者から得られるような受精鶏卵から調製することができる。
【００５９】
本発明に従って開示される方法は、免疫化組成物としての使用にとって適切な感染性複製可能MV-CHIKVウイルスの生成のために有利に用いられる。
【００６０】
かくして、本発明は、有効成分が本発明の核酸構築物から救済され、特に、開示された方法により得られた感染性複製可能MV-CHIKVウイルスを含む免疫原性組成物に関する。
【００６１】
本明細書で定義される通り、本発明の核酸構築物および本発明のMV-CHIKVウイルスは、少なくとも1つのCHIKV構造タンパク質をコードまたは発現する。
【００６２】
「チクングニアウイルス構造タンパク質」とは、本明細書で定義される「タンパク質」を意味し、その配列は、CHIKVの構造タンパク質の天然の成熟体もしくは前駆体であるか、または本明細書で定義されるその断片もしくはその突然変異体、特に、天然に存在するチクングニアウイルスキャプシドまたはエンベロープタンパク質に対する少なくとも50%、少なくとも80%、特に有利には、少なくとも90%もしくは好ましくは、少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する断片もしくは突然変異体であるポリペプチドなどの、CHIKVの株における対応物と同一である。当業者であれば、アミノ酸配列同一性を、手動のアラインメントを用いる、または利用可能ないくつかのアラインメントプログラムを用いるアラインメントにより決定することができる(例えば、BLASTP - http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。本発明のCHIKV構造タンパク質の断片または突然変異体を、本明細書に例示される特定のアミノ酸配列に関して定義することができる。
【００６３】
本発明によれば、CHIKVの少なくとも1つの構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、構造的糖タンパク質、構造的ポリペプチドおよびキャプシドタンパク質の群において選択される1つまたは複数のタンパク質をコードする。
【００６４】
特定の実施形態においては、糖タンパク質は、エンベロープ糖タンパク質E1、E2およびE3エンベロープ糖タンパク質を包含する。ポリペプチドは、6Kポリペプチドおよびキャプシドタンパク質を包含する。以下の段落において、タンパク質または糖タンパク質の用語は、E1、E2もしくはE3糖タンパク質またはその組合せを指すように互換的に用いられる。
【００６５】
本発明の特定の実施形態によれば、CHIKV構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、
-  E1、E2、E3、6KまたはCタンパク質の1つをコードするポリヌクレオチド;
-  E1、E2、E3、6KおよびCタンパク質の中から選択されるいくつかのタンパク質をコードする融合ポリヌクレオチド;
-  E3-E2-6K-E1ポリタンパク質をコードするポリヌクレオチド;
-  C-E3-E2-6K-E1ポリタンパク質および特に、CHIKVゲノムから誘導されるオープンリーディングフレーム(ORF)をコードするポリヌクレオチドまたは前記ポリタンパク質をコードする対応するcDNA;
-  突然変異形態の1つまたは複数のこれらのタンパク質、特に、突然変異形態のE2タンパク質をコードするために改変されたこれらのポリヌクレオチドのいずれか
の群において選択される。
【００６６】
これに関して、特定のポリヌクレオチドは、可溶性形態のE2タンパク質(sE2)をコードするか、またはE2タンパク質もしくはその可溶性形態(sE2Δstem)のエクトドメインをコードする。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、以下のポリペプチド:E3-sE2-6K-E1、E3-sE2Δstem-6K-E1、C-E3-sE2-6K-E1、およびC-E3-sE2Δstem-6K-E1のうちの1つをコードする。
【００６７】
本明細書で用いられる用語「エクトドメイン」は、ウイルス粒子の外部に伸びる糖タンパク質E2のドメインを意味し、CHIKVウイルス粒子による感染中の細胞への結合および細胞への進入を担う。
【００６８】
特定の実施形態によれば、ポリヌクレオチドは、CHIKV構造タンパク質の単一のエピトープをコードするか、または1つもしくは多くのCHIKV構造タンパク質の反復エピトープ(同一もしくは類似する配列を有する)もしくは複数の異なるエピトープの発現の結果得られるポリエピトープをコードする。
【００６９】
例えば、ポリエピトープは、フリンE2/E3切断部位に近いE2糖タンパク質のN末端に位置するE2 EP3単一エピトープをコードする反復ポリヌクレオチドの融合により形成される。E2 EP3エピトープのアミノ酸配列は、Kam Y. Wら(EMBO Mol Med 4、330〜343頁)に、および配列番号33として開示される。
【００７０】
本発明の特定の実施形態によれば、それぞれのポリヌクレオチドがCHIKVの少なくとも1つの構造タンパク質をコードするいくつかのポリヌクレオチドを組み合わせるか、または融合させて、CHIKVのいくつかの構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドを形成させる。これらのポリヌクレオチドは、それらがCHIKVの様々な株のタンパク質をコードするという事実により、互いに識別することができる。結果として、ポリヌクレオチドは、単一のE2 EP3エピトープのポリエピトープなどの、本明細書に記載のポリエピトープをコードする。
【００７１】
CHIKVの少なくとも1つの構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドを、麻疹ウイルスの完全長感染性アンチゲノム(+)RNA鎖をコードするcDNA分子中にクローニングして、場合により異なる部位に、本発明の核酸構築物を生じさせる。
【００７２】
本発明の一態様によれば、少なくとも1つのチクングニアウイルス(CHIKV)構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、CHIKVの単離および精製された野生株のゲノムから誘導される。CHIKVの野生株は、例えば、両方とも1952年のタンザニアでの大流行中に患者から単離された、Ross株(GenBank: AF490259.3)、もしくはS27株(GenBank: AF339485.1)、または1983年のセネガルでの大流行中に単離されたAe.furciferという名称の株(GenBank: AY726732.1)であってもよい。
【００７３】
本発明の別の態様によれば、少なくとも1つのCHIKV構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、WO2007/105111に記載された、CHIKVの以下の精製および単離された野生株:05.61、05.115、05.209、06.21、06.27および06.49から誘導される。チクングニアウイルスのインド洋での大流行の異なる地域起源、時点および臨床形態を代表するこれらのCHIKV単離物のほぼ完全なゲノム配列が配列決定され、WO2007/105111に開示されている。参照として取られた1952年のタンザニア単離物S27のヌクレオチド配列(全長11,826nt)中の11,667(3'NTR、第3の反復配列エレメントの末端)の位置52(5'NTR)に対応する11,601ヌクレオチドが決定された。
【００７４】
WO2007/105111に提示され、本発明によるポリヌクレオチドを本発明の特定の実施形態において誘導することができる単離物05.61、05.115、05.209、06.21、06.27および06.49のゲノム配列は、以下のように組織化される。コード配列は、それぞれ、非構造ポリタンパク質(2,474アミノ酸)および構造ポリタンパク質(1,248アミノ酸)をコードする7,422ntおよび3,744ntの2つの大きなオープンリーディングフレーム(ORF)からなる。非構造ポリタンパク質は、タンパク質nsP1(535aa)、nsP2(798aa)、nsP3(530aa)およびnsP4(611aa)の前駆体であり、構造ポリタンパク質は、タンパク質C(261aa)、p62(487aa、E3の前駆体-64aaおよびE2の前駆体-423aa)、6K(61aa)、およびE1(439aa)の前駆体である。非構造および構造ポリタンパク質中のアルファウイルス科に特徴的な切断部位は保存されている。E3、E2およびE1中のグリコシル化部位も保存されている。ゲノム配列の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
一実施形態によれば、CHIKV構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、指定されたCHIKVの以下の群の野生株:以前に記載された06.115、06.21、06.27および06.49のゲノムから誘導される。
【００７６】
ポリヌクレオチドの定義に出現する用語「誘導する」は、前記ポリヌクレオチドの配列がCHIKV株中の対応する配列と同一であってよいか、またはそれが本発明による「タンパク質」の定義を満たすCHIKVの構造タンパク質をコードする程度で変化してもよいことを単に特定するものである。したがって、この用語は、ポリヌクレオチドの生成様式を限定しない。
【００７７】
本発明のポリヌクレオチドおよび核酸構築物を、むしろ当業界における任意の公知の方法に従って調製し、特に、クローニングし、特にPCR法を用いる重合により取得するか、または合成することができる。
【００７８】
本発明の核酸構築物は、少なくとも1つのCHIKV構造タンパク質をコードする以下のポリヌクレオチドの1つを含むものとしてさらに定義される。
【００７９】
特定の実施形態によれば、CHIKVの1つまたはいくつかの構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、可溶性形態の糖タンパク質E2をコードする。例として、そのようなポリヌクレオチドは、配列番号2、4、6、8の配列を有するコードドメインを含む。
【００８０】
特定の実施形態においては、CHIKVの1つまたはいくつかの構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、E2エクトドメインをコードする。例として、そのようなポリヌクレオチドは、配列番号10、12、14の配列を有するコードドメインを含む。
【００８１】
本発明の別の実施形態においては、可溶性形態の糖タンパク質E2をコードするポリヌクレオチドは、配列番号3、5、7、9の群において選択されるアミノ酸配列を有する1つのポリペプチドをコードする。
【００８２】
本発明の別の実施形態においては、糖タンパク質E2のエクトドメインをコードするポリヌクレオチドは、配列番号11、13、15の群において選択されるアミノ酸配列を有する1つのポリペプチドをコードする。
【００８３】
本発明の特定の実施形態によれば、CHIKVの構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、可溶性形態のE2糖タンパク質または前記タンパク質のエクトドメインをコードする上記で定義されたヌクレオチド配列の1つを包含し、さらに、E3、E1、6KもしくはCタンパク質の1つをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の組合せをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００８４】
したがって、Frejusで単離されたFrance/2010株の構造タンパク質E2-6K-E1をコードする本発明の特定のポリヌクレオチドは、以下の群:配列番号16(GenBank: CCA61130.1)および配列番号20(GenBank: CCA61131.1)の配列を有するコードドメインを含むポリヌクレオチド中で選択される。
【００８５】
本発明の好ましいポリヌクレオチドは、CHIKVの株由来の構造タンパク質C-E3-E2-6K-E1をコードする。特定の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、S27または06.49という名称の株の1つのポリタンパク質C-E3-E2-6K-E1をコードし、それぞれ、配列番号20および配列番号27の配列を有する。
【００８６】
本発明の別の実施形態においては、用いられるポリヌクレオチドは、E2 EP3エピトープまたはこのエピトープの反復と共に形成されるか、もしくはそのような反復を含むポリエピトープをコードする。このポリヌクレオチドは、特に、配列番号32として開示されるヌクレオチド配列を有する。
【００８７】
好ましい実施形態によれば、本発明はまた、宿主中のMV-CHIKVのキメラ感染性粒子の表面でのチクングニアウイルスタンパク質の効率的な発現を可能にするポリヌクレオチドの改変および最適化にも関する。
【００８８】
この実施形態によれば、核酸分子のシス作用ドメイン:内部TATAボックス、カイ部位およびリボソーム進入部位;ATリッチまたはGCリッチ配列ストレッチ;ARE、INS、CRS配列エレメント;反復配列およびRNA二次構造;隠蔽スプライスドナー部位およびアクセプター部位、分岐点を回避するポリヌクレオチド配列の最適化を行うことができる。
【００８９】
最適化されたポリヌクレオチドを、特定の細胞型における発現についてコドン最適化することもでき、特に、マカク(Maccaca)コドン使用またはヒトコドン使用について改変することができる。この最適化により、発現されるタンパク質に影響することなく、細胞中でのキメラ感染性粒子生成の効率を増大させることができる。
【００９０】
特に、CHIKVタンパク質をコードするポリヌクレオチドの最適化を、元のものに関して前記コドンから翻訳されるアミノ酸残基の同一性に影響することなく、コドン中の不安定位置の改変により実施することができる。
【００９１】
最適化はまた、麻疹ウイルスの編集様配列を回避するために実施される。麻疹ウイルスの転写物の編集は、特に、麻疹ウイルスのP遺伝子によりコードされる転写物中で起こるプロセスである。この編集は、P転写物内の特定の部位での追加のG残基の挿入により、Pタンパク質と比較してトランケートされた新しいタンパク質を生じさせる。単一のG残基だけの追加は、独特のカルボキシル末端を含有するVタンパク質の発現をもたらす(Cattaneo Rら、Cell. 1989 Mar 10;56(5):759〜64頁)。
【００９２】
本発明のこの特定の実施形態によるポリペプチドにおいて、麻疹ウイルス由来の以下の編集様配列を突然変異させることができる:AAAGGG、AAAAGG、GGGAAA、GGGGAA、ならびにその相補配列: TTCCCC、TTTCCC、CCTTTT、CCCCTT。例えば、AAAGGGをAAAGGC中で突然変異させ、AAAAGGをAGAAGGまたはTAAAGGまたはGAAAGG中で突然変異させ、GGGAAAをGCGAAA中で突然変異させることができる。
【００９３】
本発明による改変および最適化されたポリヌクレオチドの実施形態は、配列番号29に定義される通りである。このポリヌクレオチドは、ステム領域を含まない可溶性形態のエンベロープタンパク質E2をコードする。
【００９４】
全ての構造タンパク質C-E3-E2-6K-E1をコードする改変および最適化されたポリヌクレオチドの実施形態は、配列番号31に定義される通りである。
【００９５】
配列番号29および配列番号31に定義される本発明のこの特定の実施形態によるこれらの最適化されたポリヌクレオチドは、クローニング目的のための部位を維持するために、これらの配列の末端ではなく、配列の内部のBsiWIおよびBssHII部位に突然変異を提示する。
【００９６】
したがって、特定の実施形態によれば、本発明は、キメラMV-CHIKV感染性粒子生成の効率を増大させるポリヌクレオチドを含む核酸構築物を提供する。
【００９７】
CHIKVの構造タンパク質をコードする配列を含み、本発明の核酸構築物における使用にとって好適でもある他の最適化されたポリヌクレオチドは、以下の組合せの構造タンパク質:E3-E2-6K-E1、E3-sE2-6K-E1、E3-sE2Δstem-6K-E1、C-E3-E2-6K-E1、C-E3-SE2-6K-E1、およびC-E3-sE2Δstem-6K-E1の1つをコードする最適化された融合ポリヌクレオチドである。
【００９８】
本発明はまた、CHIKVの少なくとも1つの構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドが以下のポリペプチドの1つをコードする核酸構築物にも関する。
【００９９】
本発明の好ましい実施形態により、05.115、06.21、06.27および06.49と命名された株由来の可溶性形態の糖タンパク質E2に関連するCHIKウイルス構造タンパク質のアミノ酸配列の例は、配列番号3、5、7、9に定義される通りである。
【０１００】
本発明の好ましい実施形態により、05.115、06.21、06.27および06.49と命名された株由来の糖タンパク質E2のエクトドメインに関連するCHIKウイルス構造タンパク質のアミノ酸配列の例は、配列番号11、13、15に定義される通りである。
【０１０１】
特定の実施形態においては、本発明は、Frejusで単離されたFrance/2010株の構造タンパク質E2-6K-E1により構成される融合タンパク質に関する。これらのタンパク質は、それぞれ、配列番号16(GenBank: CCA61130.1)および配列番号18(GenBank: CCA61131.1)の配列を有するポリヌクレオチドの発現の結果得られる。それらの配列は、それぞれ、配列番号17および配列番号19に定義される。
【０１０２】
特に好ましい実施形態においては、本発明は、全てのCHIKV構造タンパク質により構成される融合タンパク質に関する。これらのタンパク質は、全ての構造タンパク質C-E3-E2-6K-E1をコードするポリヌクレオチドの発現の結果得られるものであり、配列番号21、22、23、24、25、26および28に定義される。
【０１０３】
得られる構造タンパク質C-E3-E2-6K-E1は、CHIKV-MV粒子中で、CHIKVウイルス様粒子(VLP)に自己集合することができる。
【０１０４】
本明細書で用いられる用語「ウイルス様粒子」(VLP)とは、少なくとも1つの属性において、ウイルスと似ているが、そのようなものとして感染性であることが証明されていない構造を指す。本発明によるウイルス様粒子は、ウイルス様粒子のタンパク質をコードする遺伝子情報を担持せず、一般的に、ウイルス様粒子は、ウイルスゲノムを欠き、したがって、非感染性であり、非複製性である。本発明によれば、ウイルス様粒子を大量に生成し、CHIKV-MV組換え粒子と一緒に発現させることができる。
【０１０５】
特定の実施形態においては、本発明は、06.49と命名されたCHIKVの株由来のステム領域を含まない可溶性形態の糖タンパク質E2に関する。この糖タンパク質は、配列番号29に定義される改変および最適化されたポリヌクレオチドの発現の結果得られる。その配列は配列番号30に定義される。
【０１０６】
別の態様によれば、本発明は、特に、その核酸およびポリペプチド配列を参照することにより、本明細書で定義されるチクングニアウイルス構造タンパク質を発現する組換えCHIKV-麻疹ウイルス粒子に関する。組換えCHIKV-MVウイルスは、有利にはVLPとしてCHIKV構造タンパク質を発現する。
【０１０７】
本発明はまた、CHIKV構造タンパク質のウイルス様粒子、特に、C-E3-E2-6K-E1のVLPの、CHIKV-MV感染性複製可能ウイルス粒子との、組成物中での会合に関する。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態によれば、組換え麻疹ウイルスベクターは、そのような方法で設計され、その生成方法は、ワクチン接種のために適合化された麻疹ウイルス株を起源とする、前記ベクターでトランスフェクトまたは形質転換されたヘルパー細胞中で生成されるウイルス粒子が、免疫原性組成物、好ましくは、保護的またはさらにはワクチン組成物における使用のための組換え麻疹-チクングニア感染性および複製可能ウイルスの生成ならびにCHIKV-VLPの生成を可能にするような細胞を含む。
【０１０９】
有利には、本発明の組換え麻疹-チクングニア感染性ウイルスのゲノムは、複製能力がある。「複製能力がある」とは、MVのN、PおよびLタンパク質を発現するヘルパー細胞系に形質導入した場合、新しいウイルス粒子を生成するために転写および発現させることができる核酸を意味する。
【０１１０】
MV-CHIKVの組換えゲノムの調製のためにMV cDNAを用いて得られる本発明の組換えウイルスの複製を、宿主、特に、組換えMV-CHIKVが投与されるヒト宿主中でin vivoで達成することもできる。
【０１１１】
本発明はまた、CE3E26KE1タンパク質のVLPなどの、CHIKV構造タンパク質のVLPと会合した組換え麻疹-チクングニア複製可能ウイルスを含む活性成分の組成物または集合物に関する。これらの組成物または集合物は、チクングニアウイルスに対する免疫応答、特に、防御免疫応答を誘導し、特に、チクングニアウイルス構造タンパク質に対する抗体生成を惹起する、および/またはCHIKV感染に対する細胞性免疫応答を惹起する。これらの組成物はしたがって、投与のための好適なビヒクル、例えば、宿主、特に、ヒト宿主にとって薬学的に許容されるビヒクルを含んでもよく、必須ではないが、宿主において免疫応答を増強するためのアジュバントをさらに含んでもよい。本発明者らは、本発明の活性成分の投与が、アジュバント化を必要とすることなく免疫応答を惹起することができることを実際に示した。
【０１１２】
本発明は、特に、子供への投与のための組成物に関する。
【０１１３】
本発明はまた、免疫原性組成物、特に、ワクチン組成物、特に、子供への投与のためのワクチン組成物も対象とする。前記組成物またはワクチンは、予防的処置においてCHIKV感染に対する保護のために用いられる。そのようなワクチン組成物は、有利には、CE3E26KE1タンパク質のVLPなどのCHIKV構造タンパク質のVLPと会合した本明細書で定義されたベクターから救済された組換え麻疹-チクングニア感染性複製可能ウイルス粒子を含む有効成分(活性成分)を有する。
【０１１４】
本発明の文脈において、用語「会合する」または「会合した」とは、特にVLPとして、通常は物理的に別の実体としての、MV-CHIKV組換えウイルス粒子とCHIKV構造タンパク質の両方の、独特の組成物中での存在を指す。
【０１１５】
本発明はまた、対象、特に、ヒトにおけるチクングニアウイルスによる感染の処置または防止における使用のための、CHIKV-ウイルス構造タンパク質と会合した組換えMV-CHIKV感染性複製可能ウイルス粒子、特に、CHIKV構造タンパク質を発現するCHIKV-ウイルス様粒子、特に、CHIKV-CE3E26KE1 VLPまたは本発明による組成物にも関する。
【０１１６】
本発明はまた、特に、ヒト宿主における、CHIKVウイルス感染または誘導された疾患に対する、免疫応答、有利には、防御免疫応答を惹起する投与スキームにおける、および投薬レジメによる使用のための、MV-CHIKV感染性複製可能ウイルスおよび会合したCHIKV-ウイルス構造タンパク質、特に、CHIKV構造タンパク質の会合したVLP、例えば、CE3E26KE1タンパク質のVLPにも関する。
【０１１７】
投与スキームおよび投薬レジメは、選択された用量のMV-CHIKV感染性複製可能ウイルスおよび会合したCHIKV構造タンパク質、特に、CHIKV構造タンパク質の会合したVLP、例えば、CE3E26KE1タンパク質のVLPの独特の投与を必要としてもよい。
【０１１８】
あるいは、それは、初回-追加レジメンにおける複数用量の投与を必要としてもよい。初回接種および追加接種は、MV-CHIKV感染性複製可能ウイルスおよび会合したCHIKV構造タンパク質、特に、CHIKV構造タンパク質の会合したVLP、例えば、CE3E26KE1タンパク質のVLPからなる同一の活性成分を用いて達成することができる。
【０１１９】
あるいは、初回投与および追加投与を、少なくとも1つの投与工程において、MV-CHIKV感染性複製可能ウイルスおよび会合したCHIKV構造タンパク質、特に、CHIKV構造タンパク質の会合したVLP、例えば、CE3E26KE1タンパク質のVLPを含む異なる活性成分を用いて、他の投与工程においては、CHIKVの他の活性免疫原、例えば、CHIKVタンパク質またはC-E3-E2-6K-E1ポリタンパク質を発現するVLPを用いて達成することができる。
【０１２０】
本発明はまた、これらの成分の1つとして、MV-CHIKV感染性複製可能ウイルスおよび会合したCHIKV構造タンパク質、特に、CHIKV構造タンパク質の会合したVLP、例えば、CE3E26KE1タンパク質のVLPを含む異なる活性成分の集合物にも関する。活性成分の集合物は、有利には、宿主、特に、ヒト宿主の免疫化における使用のためのものである。
【０１２１】
本発明者らは、MV-CHIKV感染性複製可能ウイルスおよびCHIKV構造タンパク質の会合したVLPの投与が、免疫応答を惹起する、特に、少なくともECSA遺伝子型における、様々なCHIKV株について交差反応する抗体を惹起することを示した。したがって、本発明による活性成分の投与は、CHIKVの特定の株のコード配列を用いて調製された場合、CHIKVの株の群、特に、ECSA遺伝子型の株の群、特に、CHIKVインド株、CHIKVコンゴ株、CHIKVタイ株およびCHIKVレユニオン株を包含する株の群に対する免疫応答を惹起することができることが示された。
【０１２２】
ウイルス様粒子(VLP)の投与を含む他の病原体(HBVまたはHPVなど)にとって好適なワクチンおよびまた公知のヒトMVワクチンの用量に関する利用可能な知識を考慮して、本発明者らは、組換えMV-CHIKVウイルスを用いるCHIKV-VLPの回収が有効な低用量の活性成分の投与を提唱することを可能にすると決定した。実際、組換えMV-CHIKVウイルスが組換えMV-CHIKV複製粒子あたり約104個のCHIKV-VLPの生成を可能にすることを考慮し、ヒトMVワクチンの現在公知の用量が103〜104pfuの範囲にあることを考慮すれば、投与される組換えMV-CHIKVウイルスの好適な用量は、0.1〜10ngの範囲、特に、0.2〜6ng、および場合により、0.2〜2ngの低さであってもよい。比較のために、HBVまたはHPVワクチンの場合に投与されるVLPの用量は、10μgの範囲にあり、組換えMV-CHIKVワクチンの用量は、約2000倍または最大で5000〜10000倍少ないVLPを含んでもよい。
【０１２３】
本発明の特定の実施形態によれば、本明細書に定義される免疫原性組成物またはワクチンを、麻疹ウイルスによる感染に対する防御のために用いることもできる。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１Ａ】提唱されるチクングニアウイルスの構造タンパク質およびMVゲノムの骨格-麻疹ウイルスによる発現のための前記CHIKウイルスの抗原を含むMV-CHIKV構築物のORFの略図である。
【図１Ｂ】CHIKV VLPを発現する組換えMVの救済を示す図である。
【図２】MOI 0.1で24時間、組換えMV-CHIKVにより感染させたVero細胞中でのE2抗原の免疫蛍光検出を示す図である。E2を、1/100の希釈率で用いた抗E2 Mab 3E4を用いて検出し、二次抗体を1/5000の希釈率で用いた。
【図３】MV-CHIKVベクターによるE2およびキャプシドタンパク質の発現を示す図である。MV-sE2Δstem、およびMV-CE3E26KE1により24時間感染させたVero細胞の細胞溶解物(細胞)および上清(SN)を、ウェスタンブロットにより分析した。E2を3E4 Mabでプローブ化し、Cタンパク質を1/100の希釈率で用いた抗キャプシドMab(P.Despres社から)を用いて検出し、二次抗体を1/5000の希釈率で用いた。
【図４】MOI 0.1でMV-CE3E26KE1組換えウイルスにより感染させたVero細胞の上清中に分泌されたCHIKV VLPの電子顕微鏡分析を示す図である。スケールバーは200nm(左)および100nm(右)である。赤色の矢印は、粒子表面上の突起の特異的配置および粒子内部のキャプシドタンパク質の正二十面体対称を示す。
【図５】MV-sE2組換えウイルス(156aa、19kDa)により発現されたトランケートされたsE2の配列を示す図である。
【図６】Vero細胞上の標準的なMV(MOI 0.01)と比較した組換えMV-sE2Δstem、およびMV-CE3E26KE1ウイルスの増殖動力学を示す図である。細胞関連ウイルス力価をTCID50で示す。
【図７】実施例2の免疫化およびチャレンジスケジュールを示す図である。
【図８】MV-CE3E26KE1組換えウイルスを用いる2回の免疫化後に100PFUのCHIKV-06-49で致死的にチャレンジしたマウスの生存曲線を示す図である。
【図９】実施例3の免疫化およびチャレンジスケジュールを示す図である。
【図１０】MV-CE3E26KE1組換えウイルスを用いる1回の免疫化後に100PFUのCHIKV-06-49で致死的にチャレンジしたマウスの生存曲線を示す図である。
【図１１】実施例4の免疫化およびチャレンジスケジュールを示す図である。
【図１２】異なる用量のMV-CE3E26KE1組換えウイルスを用いる免疫化後に100PFUのCHIKV-06-49で致死的にチャレンジしたマウスの生存曲線を示す図である。
【図１３】実施例5の免疫血清の受動的移入およびチャレンジスケジュールを示す図である。
【図１４】MV-CE3E26KE1免疫血清の受動的移入後に100PFUのCHIKV-06-49で致死的にチャレンジしたマウスの生存曲線を示す図である。
【図１５】106 TCID50のMV-CHIKVの単回注射により免疫されたCD46-IFNARマウスの脾臓細胞中で惹起された細胞媒介性免疫応答を示す図である。
【図１６】実施例6の免疫化およびチャレンジスケジュールを示す図である。
【図１７】MV-CE3E26KE1を用いる免疫化後に100PFUのCHIKV-06-49で致死的にチャレンジしたMV予備免疫マウスの生存曲線を示す図である。
【図１８】90日目(追加前)および111日目(追加後21日目)に1回目の免疫化の前にCHIKに対して実施されたPRNTアッセイを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【０１２５】
(チクングニアウイルスタンパク質を発現する組換え麻疹ウイルスベクターの構築および特徴付け)
本発明者らは、チクングニアウイルスの株06-49の天然タンパク質由来のペプチド配列に基づいて3つのチクングニアウイルス抗原を設計した。これらのペプチド配列の調製を可能にする天然タンパク質は、キャプシド(C)エンベロープならびにアクセサリータンパク質E1、E2、E3および6Kからなる5つの構造タンパク質であった。
【０１２６】
第1の構築物は、可溶性形態のエンベロープタンパク質E2(sE2)の発現に対するものであり、第2の構築物は、ステム領域を含まないsE2(sE2Δstem)の発現に対するものであり、第3の構築物は、全てのウイルス構造タンパク質(C-E3-E2-6K-E1)の発現に対するものであった(図1)。実験プロトコールは、この後者の構築物に関して本明細書に記載されている。
【０１２７】
細胞培養。Vero(アフリカミドリザル腎臓)細胞を、5%熱不活化ウシ胎仔血清(FCS、Invitrogen社、Frederick、MD)を添加したDMEM GlutaMAX(商標)(Gibco-BRL社)中で維持した。組換え麻疹ウイルス救済のために用いたHEK-293-T7-MVヘルパー細胞(WO2008/078198)を、10%FCSを添加したDMEM中で増殖させた。
【０１２８】
pTM-MVSchw-CE3E26KE1の構築。Schwarz MVワクチン株のアンチゲノムに対応する感染性MV cDNAを含有するプラスミドpTM-MVSchwは、他の場所に記載されている(Combredet, Cら、「A molecularly cloned Schwarz strain of measles virus vaccine induces strong immune responses in macaques and transgenic mice」、J Virol、2003. 77(21): 11546〜54頁)。構造的CE3E26KE1 CHIKV抗原をコードするcDNAを、化学合成により作製した(GenScript社、USA)。それは、CHIKV株06-49由来のウイルス構造タンパク質C-E3-E2-6K-E1の配列を含有する(WO2007/105111)。完全な配列は、MVゲノム中のヌクレオチド数が6の倍数でなければならないという「6の規則」を順守し、5'末端にBsiWI制限部位を、3'末端にBssHII制限部位を含有する。配列を、哺乳動物細胞中での麻疹ウイルス発現について最適化した。このcDNAを、Schwarz MVゲノムのホスホタンパク質(P)とマトリックス(M)遺伝子との間に追加転写単位(ATU)を含有する、BsiWI/BssHII消化されたpTM-MVSchw-ATU2中に挿入した(Combredet, Cら、「A molecularly cloned Schwarz strain of measles virus vaccine induces strong immune responses in macaques and transgenic mice」、J Virol、2003. 77(21): 11546〜54頁)。得られるプラスミドを、pTM-MVSchw-CE3E26KE1と命名した。
【０１２９】
組換えMV-CE3E26KE1の救済。プラスミドpTM-MVSchw-CE3E26KE1からの組換えSchwarz MV-CHIKVの救済を、以前に記載された救済系を用いて以前に記載されたように実施した(Radecke, F.ら、「Rescue of measles viruses from cloned DNA」、Embo J、1995. 14(23):5773〜84頁;WO2008/078198)。ウイルス力価を、Vero細胞上で終点限界希釈アッセイにより決定し、TCID50をKarber法を用いることにより算出した。
【０１３０】
免疫蛍光。免疫蛍光染色を、他の場所に記載のように、感染した細胞上で実施した(Lucas, M.ら、「Infection of mouse neurons by West Nile virus is modulated by the interferon-inducible 2'-5' oligoadenylate synthetase 1 b protein」、Immun. Cell Biol.、2003. 81:230〜236頁)。細胞を、マウス抗E2(3E4)および抗キャプシド抗体を用いてプローブ化した。Cy3コンジュゲート化ヤギ抗マウスIgG抗体Cy3コンジュゲート化(Jackson Immunoresearch laboratories社)を、二次抗体として用いた。
【０１３１】
ウェスタンブロット分析。組換えウイルスに感染したVero細胞からのタンパク質溶解物を、SDS-PAGEゲル電気泳動により分画し、セルロース膜(Amersham Pharmacia Biotech社)に移した。ブロットを、マウスMab 3E4抗E2および抗キャプシドでプローブ化した。ヤギ抗マウス免疫グロブリンG(IgG)-西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)コンジュゲート(Amersham社)を、二次抗体として用いた。ペルオキシダーゼ活性を、増強化学発光検出キット(Pierce社)を用いて可視化した。
【０１３２】
電子顕微鏡によるVLP生成の分析。Vero細胞(3xT-150フラスコ)を、MOI 1でMV-CHIKV組換えウイルスに感染させた。感染の36時間後に回収された上清を、3000rpmで30分の遠心分離により清澄化し、PBS中の20%スクロースクッション上で層状にし、SW41ローター中、41,000rpmで2時間遠心分離した。ペレットを1%BSAを含むPBS中に再懸濁し、電子顕微鏡により分析した。炭素で被覆した銅グリッド上で2%酢酸ウラニルにより陰性染色を行い、使用直前にグロー放電を行った。試料を、Jeol JEM1200(Tokyo、Japan)透過型電子顕微鏡を用いて、80kVで観察した。Eloise KeenviewカメラおよびAnalysis Proソフトウェアバージョン3.1(Eloise SARL社、Roissy、France)を用いて画像を記録した。
【０１３３】
マウス実験。MV感染に罹りやすいCD46-IFNARマウスを、以前に記載のように生成した(Combredet, Cら、「A molecularly cloned Schwarz strain of measles virus vaccine induces strong immune responses in macaques and transgenic mice」、J Virol、2003. 77(21): 11546〜54頁)。マウスを、Pasteru Institute動物施設で特定の無病原体条件下で飼育した。免疫化のために、6週齢のCD46-IFNARマウスに、105TCID50の組換えMV-CE3E26KE1またはMVを腹腔内(i.p.)接種した。保護アッセイのために、免疫したマウスに、100pfuのCHIKV 06-49株をi.p.接種し、死亡を2週間追跡した。全ての実験は、Pasteur InstituteのOffice of Laboratory Animal Careの指針に従って認可および実施された。受動的移入試験のため、CD46-IFNARマウスに、105TCID50のMV-CE3E26KE1で免疫した6匹のマウスからプールした20μlの血清を腹腔内接種した。対照マウスは、105TCID50の空のMVSchwで免疫したマウスからプールした20μlの血清または20μlの抗CHIKV HMAFのいずれかを受けた。血清を、PBS中で100μlの総量に希釈した後、24時間および16時間で受動的移入を行った後、100pfuのCHIKV 06-49株をチャレンジし、次いで、チャレンジの12h後に感染した動物中での抗体持続性を模倣した。マウスの死亡率を2週間分析して、保護を決定した。
【０１３４】
体液性免疫応答の分析。特異的抗体応答を評価するために、免疫化後の異なる時間で眼窩周囲経路によりマウスを出血させた。血清を56℃で30分熱不活化し、抗MV抗体をELISA(ENZYGNOST-Siemens社)により検出した。HRPコンジュゲート化抗マウス免疫グロブリン(Jackson Immuno Research社)を、二次抗体として用いた。抗CHIKV抗体を、特異的ELISAを用いて検出した。簡単に述べると、96穴プレートを、大腸菌(E.coli)中で生成された組換えCHIKV-E2タンパク質で被覆した。HRPコンジュゲート化抗マウス免疫グロブリンを、二次抗体として用いた。プールされた血清の終点力価を、陰性対照として役立つMVを接種されたマウスからの血清の吸光度の2倍を与える最後の希釈の逆数として算出した。抗CHIKV中和抗体を、プラーク減少中和テスト(PRNT)を用いることにより測定した。Vero細胞を12穴プレート中に24h播種した。血清試料をDMEM Glutamax/2%FCS中で連続希釈した。100μlの希釈液を、穏やかに撹拌しながら、100pfuの06-49株を含有する等量のCHIKVと共に、37℃で2hインキュベートした。次いで、残存感染性を、0.8%最終(wt/vol)カルボキシメチルセルロースを含有するDMEM GlutaMAX(商標)/2%FCSをオーバーレイしたVero細胞単層上でアッセイした。インキュベーションの3日後、細胞を固定し、プラーク計数決定のためにクリスタルバイオレットで染色した。終点中和力価を、プラーク数を少なくとも50%減少させた(PRNT50)、試験した最も高い血清希釈率として算出した。
【０１３５】
細胞媒介性免疫応答の分析。6週齢のCD46+/-IFNα/βR-/-マウスに、106TCID50のMV-CHIKV組換えウイルスを腹腔内接種した。対照マウスを、106TCID50の空のMVベクターで免疫した。マウスを感染後7日で安楽死させ、脾臓を採取した。免疫したマウスからの脾細胞を、RPMI、10%FCS、および10IUの組換えヒトインターロイキン-2(rh-IL-2;Boehringer Mannheim社)中でインキュベートした。刺激時にIFN-γを分泌するその能力を、酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイにより試験した。細胞を、陽性対照としてのコンカナバリンA(5μg/ml;Sigma社)、陰性対照としてのRPMI-IL-2(10U/ml)、CHIKV(MOI 1)、またはMV(MOI 1)により18h刺激した。マルチスクリーン-HA 96穴プレートを、PBS中の5μgの抗マウスIFN-γ/ml(R4-6A2; Pharmingen社)で4℃で一晩被覆し、洗浄した後、100μlのRPMIおよび10%FCSと共に37℃で1時間インキュベートした。培地を、100μlの細胞懸濁液(5x105個の脾細胞/穴で3回)および100μlの刺激剤で置き換えた。37℃で2時間後、加熱したFCS(10%)を添加し、プレートを37℃で18時間インキュベートした。洗浄後、ビオチン化抗マウスIFN-γ抗体(XMG1.2; Pharmingen社)を添加し、プレートを室温で2時間インキュベートした。ストレプトアビジン-アルカリホスファターゼコンジュゲート(Roche社)を、二次工程として用いた。スポットをBCIP/NBT(Promega社)で発色させ、計数した(ELISpot Reader; Bio-Sys社)。
【０１３６】
組換えMVベクターによるCHIKVウイルス様粒子の発現。CHIKV VLPは、CHIKV感染に対する防御免疫を惹起することが示されている(Akahata, W.ら、「A virus-like particle vaccine for epidemic Chikungunya virus protects nonhuman primates against infection」、Nat Med、2010. 16(3): 334〜8頁)。この能力から利益を得るため、本発明者らは、CHIKV VLPの分泌を誘導することができる組換えMVベクターを設計した。この目的のために、CHIKV VLP生成にとって必要とされるC-E3-E2-6K-E1構造タンパク質をコードするcDNAを化学合成し(Genscript社)、哺乳動物細胞中での麻疹ウイルス発現について最適化した後、Schwarz MVワクチン感染性cDNAの追加転写単位(ATU)中に導入した(図1)。このプラスミドをHEK-293ヘルパー細胞中にトランスフェクトし、Vero細胞上で増殖させることにより、組換えMV-CHIKVウイルスを得た。ウイルスストックをVero細胞上で増殖させ、力価を決定した。
【０１３７】
免疫蛍光、ウェスタンブロットおよび電子顕微鏡により示されたように、大量のCHIKV VLPが感染細胞の培養培地中で分泌された。
【０１３８】
この戦略は、それぞれの複製ラウンドでCHIKV VLPを分泌する組換えMV生ワクチンウイルスを提供する。天然アルファウイルス粒子の集合が起こり、これらのVLPがパラミクソウイルスの同時的複製を妨げないことは予想外であった。これは、ここで初めて証明される。MVワクチンは粗ウイルス抽出物として工業生産されるため、組換えMV-CHIKVのバッチは、MV生ウイルスと非複製性CHIKIV VLPの両方を含有する。この戦略により、細心かつ高価な精製および濃縮プロセスを必要とすることなく、VLP上に展示された多量体抗原の有利な免疫原性特性から利益を得ることができる。さらに、VLPは、平衡したTh1応答および長期記憶などの、生ワクチンの有利な免疫原性特性から利益を得るため、アジュバントは必要ない。
【０１３９】
CHIKVのE2タンパク質に対する特異的抗体(Mab 3E4)を用いる免疫蛍光により、感染したVero細胞中でCHIKV E2およびキャプシド抗原の発現が示された(図2)。分泌されたVLPの存在を探すために、感染細胞の培養培地を、低速度遠心分離により清澄化した後、20%スクロースクッション上で層状にし、41,000rpmで2時間、SW41ローター中での遠心分離により濃縮した。ペレットを1%BSAを含むPBS中に溶解した。細胞溶解物および濃縮された培養培地から抽出されたタンパク質を、SDS-PAGEゲル電気泳動により分画し、セルロース膜に移した。ブロットを、E2および抗キャプシドMabの検出のために、Institut Pasteurの名においてI-3824番の下で2007年9月6日にCNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes、Paris、France)に預託されたハイブリドーマにより生成される3E4マウスMabを用いてプローブ化した(図3)。E2タンパク質は、補正されたサイズ(46KDa)で細胞溶解物および感染細胞の濃縮された上清の両方において見出されたが、これはE2タンパク質を含有する高密度粒子の分泌を誘導するMV-CHIKVウイルスの能力を示している。キャプシドタンパク質もまた高密度粒子中に見出されたが、これはCHIKV-VLPの形成を確認するものである。感染細胞の濃縮された上清中のCとE2タンパク質の両方の存在は、CHIKV VLPの形成を示唆する。その物理的存在を観察するために、本発明者らは、MV-CHIKV感染細胞の上清から濃縮されたペレットを電子顕微鏡により分析した。画像は、野生型CHIKV感染後に記載されたものと類似するサイズおよび形態の大量の粒子の存在を示した(Pletnev, S.V.ら、「Locations of carbohydrate sites on alphavirus glycoproteins show that E1 forms an icosahedral scaffold」、Cell、2001. 105(1): 127〜36頁; Zhang, W.ら、「Placement of the structural proteins in Sindbis virus」、J Virol、2002. 76(22): 11645〜58頁)(図4)。観察された粒子は、65nmの外径および40nmのコア径を示す。表面構造は、他のアルファウイルスと同様に配置された、VLPの表面上の突起の存在を示す(Pletnev, S.V.ら、「Locations of carbohydrate sites on alphavirus glycoproteins show that E1 forms an icosahedral scaffold」、Cell、2001. 105(1): 127〜36頁; Zhang, W.ら、「Placement of the structural proteins in Sindbis virus」、J Virol、2002. 76(22): 11645〜58頁)。この観察により、組換えMV-CHIKVウイルスによるVero細胞の感染は、自己集合する大量のCHIK VLPの分泌を可能にすることが確認される。
【０１４０】
E2タンパク質はまた、麻疹ウイルス-sE2Δstem組換えウイルス、および麻疹ウイルス-CE3E26KE1組換えウイルスに感染した細胞により、補正されたサイズ(46KDa)で発現および分泌された。
【０１４１】
不幸なことに、MV-sE2感染細胞の分析により、トランケート型のE2タンパク質の発現が繰り返し示された。本発明者らは、感染細胞のRT-PCR増幅後にMV-sE2ウイルスにより生成されたE2 mRNAを配列決定した。この分析により、トランケーションの原因となる、STOPコドンを生成する突然変異の存在が示された(図5)。
【０１４２】
次いで、本発明者らは、低いMOI(0.01)を用いて、Vero細胞上での麻疹ウイルス-sE2、麻疹ウイルス-sE2Δstem、および麻疹ウイルス-CE3E26KE1組換えウイルスの複製速度を、標準麻疹ウイルスストック生成と比較した(図6)。MV-sE2の増殖は、対照MVのものと類似していた。麻疹ウイルス-sE2Δstemおよび麻疹ウイルス-CE3E26KE1組換えウイルスの増殖はわずかに遅延したが、その最終的な力価は空の麻疹ウイルスのものと同じ範囲にあった。
【０１４３】
(MV-sE2およびMV-CE3E26KE1の免疫原性とCD46-IFNARマウスにおける防御)
MV感染に罹りやすいCD46-IFNARマウスを用いて、組換えMV-CHIKVウイルスの免疫原性およびその防御効果を評価した。これらのマウスは、ヒトと同様の組織特異性でヒトCD46遺伝子を発現し、I型インターフェロン受容体を欠く。マウスはPasteur Institute動物施設で特異的無病原体条件下で飼育され、全ての実験はPasteur InstituteのOffice of Laboratory Animal Careの指針に従って認可および実施された。6週齢のCD46-IFNARマウスに、103〜105の範囲のTCID50の用量のMV-CHIKV組換えウイルスを腹腔内(i.p.)接種し、同じ用量の組換えウイルスを1カ月後に追加接種した。対照マウスを、同じ用量の空のMVSchwベクターで免疫した。抗体の決定のため、1回目の接種の1カ月後、次いで、追加接種の2または4週間後に血液試料を眼窩周囲経路により採取した。
【０１４４】
以前の研究により、IFNARマウスが致死的なチクングニアウイルス感染に罹りやすく、感染の病理学的徴候を示し、防御免疫機構を評価するためのモデルを提供することが示された(Coudercら、2008)。
【０１４５】
麻疹ウイルス感染に罹りやすいCD46-IFNARマウスを用いて、組換え麻疹-チクングニアウイルスの免疫原性およびその防御効果を評価した。これらのマウスは、ヒトと同様の組織特異性でヒトCD46遺伝子を発現し、I型インターフェロン受容体を欠く。マウスはPasteur Institute動物施設で特異的無病原体条件下で飼育され、全ての実験はPasteur InstituteのOffice of Laboratory Animal Careの指針に従って認可および実施された。
【０１４６】
(実験1:CD46-IFNARマウスにおける麻疹ウイルス-CE3E26KE1組換えウイルスの免疫原性および防御効果の分析)
麻疹ウイルス感染に罹りやすい6週齢のCD46-IFNARマウスに、2.104TCID50の麻疹ウイルス-チクングニアウイルス組換えウイルスを腹腔内接種し、同じ用量の組換えウイルスを1カ月後に追加接種した。対照マウスを、同じ用量の空の麻疹ウイルスSchwarzベクター(MV Schw)で免疫した。抗体の決定のため、1回目の接種の1カ月後、次いで、追加接種の2週間後に血液試料を眼窩周囲経路により採取した。次いで、防御を評価するために、マウスを100pfuのチクングニアウイルス06-49株のi.p.注射によりチャレンジした(免疫化およびチャレンジのスケジュールは図7に示される)。
【０１４７】
特異的抗体応答を評価するために、マウスを、接種後の異なる時点で出血させた。血清を56℃で30min熱不活化し、抗チクングニアウイルス抗体をELISAにより検出した。96穴プレートを、大腸菌中で生成された組換えチクングニアウイルス-E2タンパク質で被覆した。HRPコンジュゲート化抗マウス免疫グロブリンを二次抗体として使用し、マウス抗体抗チクングニアウイルスを陽性対照として使用した。抗チクングニアウイルス中和抗体を、50PFUのチクングニアウイルス06-49(Vero細胞上で生成された)を用いるVero細胞上でのプラーク減少中和テスト(PRNT)により検出した(Warter Lら、JIM 2011 (封入されたD4)およびRussell PKら、JIM 1967)。終点力価を、PFU数を少なくとも50%(PRNT50)または90%(PRNT90)減少させた、試験した最も高い血清希釈率として算出した。
【０１４８】
麻疹ウイルス-CE3E26KE1組換えウイルスの単回注射は、高い抗体力価を誘導し、2回目の注射により強く促進された(Table 1(表1)-図8)。2回の免疫化後、高い中和力価が誘導された(PRNT50 = 450〜4050およびPRNT90 = 50〜450)。104または105のTCID50で免疫された全ての動物は、100PFUのCHIKV-06-49を用いるCHIKVの致死的チャレンジから保護されたが、より低用量(103のTCID50)での免疫化により83%の動物が保護された。
【０１４９】
【表１】
2015532090.tif 000002
【０１５０】
2回の免疫化後、高い中和力価が誘導され(PRNT50 = 1350およびPRNT90 = 150)、100PFUのチクングニアウイルス06-49を用いる致死的チャレンジからマウスを保護した。
【０１５１】
(実験2:CD46-IFNARマウスにおける単回用量の麻疹ウイルス-CE3E26KE1組換えウイルスの免疫原性および防御効果の分析)
6週齢のCD46-IFNARマウスに、105のTCID50の麻疹ウイルス-CE3E26KE1組換えウイルスをi.p.接種した。対照マウスを、同じ用量の空の麻疹ウイルスSchwベクターで免疫した。抗体の決定のために、血液試料を免疫化の2週間後に眼窩周囲経路により採取した後、マウスを100pfuのチクングニアウイルス06-49のi.p.注射によりチャレンジした(免疫化およびチャレンジのスケジュールは図9に示される)。
【０１５２】
麻疹ウイルス-CE3E26KE1組換えウイルスは、単回注射後に高い抗体力価を誘導し(Table 2(表2)-図10)、中和力価はIFNARマウスにおいて100PFUのチクングニアウイルス-06-49を用いる致死的チャレンジに対する防御を付与するのに十分なものであった。
【０１５３】
【表２】
2015532090.tif 000003
【０１５４】
(実験3:CD46-IFNARマウスにおける麻疹ウイルス-CE3E26KE1組換えウイルスの防御用量の決定)
6週齢のCD46-IFNARマウスに、103〜105の範囲のTCID50の用量のMV-CHIKV組換えウイルスを腹腔内(i.p.)接種し、同じ用量を1カ月後に追加接種した。対照マウスを、同じ用量の空のMVSchwベクターで免疫した。最後の免疫化の1カ月後、マウスを100pfuのCHIKV 06-49のi.p.注射によりチャレンジした(免疫化およびチャレンジのスケジュールは図11に示される)。抗体の決定のために、1回目の接種の1カ月後、次いで、追加接種の1カ月後、チャレンジの直前に、眼窩周囲経路により血液試料を採取した。特異的ELISAを実施して、抗MVおよび抗CHIKV結合抗体を検出した。抗CHIKV中和抗体力価を、Vero細胞上でのプラーク減少中和テスト(PRNT)により決定した。
【０１５５】
その結果を、Table 3(表3)および図12に示す。
【０１５６】
【表３】
2015532090.tif 000004
【０１５７】
組換えMVの用量が増加した場合、抗MVおよび抗CHIKV抗体力価の両方が増加した。MV-CE3E26KE1ウイルスを用いる1回の免疫化は、高い抗体力価を誘導し、これは2回目の注射によって促進された。2回の免疫化の後、高い中和力価が誘導された(PRNT50 = 450〜4050およびPRNT90 = 50〜450)。104または105のTCID50で免疫した全ての動物が、100PFUのCHIKV-06-49を用いるCHIKVの致死的チャレンジから保護されたが、より低用量(103のTCID50)での免疫化により83%の動物が保護された(図12)。
【０１５８】
(実験4:組換えMV-CE3E26KE1ウイルスで免疫したマウス由来の血清の受動的移入により付与された防御の評価)
6週齢のCD46-IFNARマウスに、105TCID50の組換えMV-CE3E26KE1で免疫したマウスからのプールされた20μlの血清をi.p.接種した。対照マウスは、105TCID50の空の麻疹ウイルスSchwarzで免疫したマウスからのプールされた20μlの血清または20μlの抗チクングニアウイルスHMAFのいずれかを受けた。血清を、総量100μlのPBS中に希釈した。血清を24時間および16時間で移した後、100pfuのチクングニアウイルス06-49でチャレンジし、次いで、チャレンジの12時間後に感染した動物中での抗体持続性を模倣した。マウスの死亡率を2週間分析して、防御を決定した(免疫化およびチャレンジのスケジュールは図13に示される)。
【０１５９】
MV-CE3E26KE1ウイルスで免疫したマウスの免疫血清の受動的移入は、致死的チクングニアウイルスチャレンジから83%のレシピエントマウスを保護したが、抗チクングニアウイルスHMAFを受けたマウスは完全に保護された。対照的に、空の麻疹ウイルスで免疫したマウスからの免疫血清を受けたマウスは、全て死んだ。これらの結果は、麻疹ウイルス-CE3E26KE1組換えウイルスにより誘導された体液性免疫応答が、CD46-IFNARマウスにおいてチクングニアウイルス感染に対する防御を付与することを示す(図14)。
【０１６０】
(実験5:特異的細胞媒介性免疫応答の誘導)
MV-CHIKVを用いる免疫化が細胞媒介性免疫応答を惹起したかどうかを決定するために、本発明者らは、免疫したマウス由来の脾細胞が特異的ex vivo刺激の際にIFN-γを分泌する能力をELISPOTアッセイによって測定した。脾細胞を単回投与の7日後に採取し、MV特異的およびCHIKV特異的応答の両方を評価した。脾細胞刺激のためにCHIKVおよびMVを、MOI 1で用いた。有意な数のCHIKV特異的細胞(最大300/106脾細胞、平均150/106)が検出され(図15)、これは類似する刺激条件でのMV特異的応答(最大600/106脾細胞、平均500/106)の1/3であった。MV-CHIKVで免疫した全てのマウスは、1/8を除いて、CHIKVに対する有意なCMI応答を有していた。対照的に、空のMVSchwで免疫した対照マウスは、同様のMV特異的応答を有していたが、CHIKV特異的応答は有していなかった。これらの結果は、MV-CHIKVの単回接種が、免疫したマウスの脾臓において高レベルのCHIKV-およびMV-特異的細胞性免疫応答を誘導したことを示している。
【０１６１】
(実験6:CD46-IFNARマウスにおける組換えMV-CE3E26KE1ウイルスの免疫原性および防御効果に対する麻疹ウイルス予備免疫の影響の分析)
6週齢のCD46-IFNARマウスに、5.103TCID50の空の麻疹ウイルスSchwarz(1群、図16)をi.p.接種して、予備免疫を模倣した。3カ月後、これらのマウスに、1カ月の間隔で、105TCID50の麻疹ウイルス-CE3E26KE1組換えウイルスを2回注射した。対照マウスを、105TCID50の麻疹ウイルス-CE3E26KE1組換えウイルス(2群)または105TCID50の空の麻疹ウイルスSchw(3群)で免疫した。抗体の決定のために、図16に示されるように眼窩周囲経路により血液試料を採取した後、防御アッセイのためにマウスを100pfuのチクングニアウイルス06-49株のi.p.注射によりチャレンジした。
【０１６２】
この実験は、5.103TCID50の空の麻疹ウイルスで予め免疫されたCD46-IFNARマウスが、麻疹ウイルス-CE3E26KE1組換えウイルスを用いる免疫化後に防御的チクングニアウイルス免疫応答を上昇させることができることを証明するものである。ELISAおよびPRNT力価(Table 4(表4)-図17)は高いままであり、それと同じ範囲でナイーブなマウスにおいても誘導された(ELISA力価は変化せず、PRNT力価は1倍希釈で低下した)。ワクチン接種された動物の100%が、麻疹ウイルス-CE3E26KE1組換えウイルスで免疫した動物の予備免疫群とナイーブ群との両方においてチクングニアウイルス致死的チャレンジから保護された。
【０１６３】
【表４】
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【０１６４】
(実験7:ワクチン接種により惹起されたAbの交差反応性)
MV-CHIKVを用いる免疫化が異なるCHIKV一次単離物に対する交差反応性抗体応答を惹起したかどうかを決定するために、実験4の動物から得られた血清を、異なるCHIKV一次単離物を中和するその能力について試験した。ECSA遺伝子型に属する4つの株を選択した:
・2011年に単離された、CHIKVインド株、臨床単離物n 3710(アルボウイルスのNRC、France)。Vero細胞上での継代1(2011年12月)、ウイルス力価6.3log PFU/ml
・2011年に単離された、CHIKVコンゴ株、臨床単離物n 525(アルボウイルスのNRC、France)。Vero細胞上での継代1(2011年6月)、ウイルス力価6.5log PFU/ml
・2009年に単離された、CHIKVタイ株、臨床単離物n 1499(アルボウイルスのNRC、France)。C6/36細胞上での継代(2009年12月)、ウイルス力価6.3log PFU/ml
・2006年に単離された、CHIKVレユニオン株、臨床単離物2006.49(アルボウイルスのNRC、France)。Vero細胞上での継代3(2011年4月4日)、ウイルス力価7.3log PFU/ml。
【０１６５】
抗CHIKV中和抗体を、プラーク減少中和テスト(PRNT)の使用により検出した。Vero細胞を、12μ穴プレート中に24h播種した。血清試料をDMEM Glutamax/2%FCS中で連続希釈した。希釈液100μlを穏やかに撹拌しながら、100pfuの06-49株を含有する等量のCHIKVと共に、37℃で2hインキュベートした。次いで、残存感染性を、0.8%最終(wt/vol)カルボキシメチルセルロースを含有するDMEM GlutaMAX/2%FCSでオーバーレイしたVero細胞単層上でアッセイした。インキュベーションの3日後、細胞を固定し、プラーク計数決定のためにクリスタルバイオレットで染色した。終点中和力価を、プラーク数を少なくとも50%減少させた(PRNT50)、試験した最も高い血清希釈率として算出した。
【０１６６】
【表５】
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【０１６７】
結果は、MV-CHIKVを用いるマウスの免疫化が、異なる国からのCHIKVのいくつかの一次単離物を中和することができる交差反応性抗体を誘導することを示す。興味深いことに、06-49レユニオンウイルスを用いる動物のチャレンジは、応答の広がりさえもたらし、インドおよびタイの単離物の中和を非常に強力なレベルに促進する。Institut Pasteurでのその利用可能性のため、ECSA遺伝子型のみを試験した。
【０１６８】
(実験8:カニクイザルにおけるMV-CHIKVの免疫原性)
チクングニアに対する組換え麻疹ウイルスワクチンの免疫原性を、非ヒト霊長類において試験した。フラビウイルスおよび麻疹ウイルスについて血清陰性であると予め選択された4匹のカニクイザル(macaca fascicularis)の2群に、0日目に104または105TCID50のMV-CHIKVを皮下的にワクチン接種した後、同じ用量で90日目に追加接種した。血清および血漿を採取し、後の分析のために-20℃で保存した。チクングニアウイルスに対する中和抗体を、PRNTアッセイを用いることにより検出した。
【０１６９】
【表６】
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【０１７０】
Table 6(表6)に提示された結果は、全てのサルがCHIKVを中和する高力価の抗体を生じたことを示す。最も高い用量は、低用量よりも有効であった。図18に示されるように、多くの動物において、追加接種は有効であった(90日目、追加接種日対111日目、追加接種の21日後)。これらの結果は、非ヒト霊長類におけるMV-CHIKVワクチン候補の免疫原性を示すものである。
【０１７１】
(全体的結論)
本発明者らは、CHIKV株06.49の完全な構造タンパク質CE3E26KE1を安定に発現する組換えMV-CHIKウイルスを作製した。この組換えウイルスにより感染したVero細胞は、高レベルのCHIKVタンパク質を発現し、高密度のVLPを分泌した。組換えウイルスは増殖速度がわずかに遅くなったが、空のMVベクターと類似する力価が得られた。MV感染に罹りやすいCD46-IFNARマウス中で評価した場合、このワクチン候補は、用量および投与回数に依存してCHIKVに対する高レベルの中和抗体を誘導した(PRNT50 = 450〜4050;PRNT90 = 150〜450)。全ての免疫したマウスが、単回投与後でも繰り返し保護されたが、これはこのワクチン候補の強力な免疫能力を証明するものである。ナイーブな動物中での免疫血清の受動的移入は、これらの高感受性マウスにおいても、致死的チャレンジからの防御を付与した。最後に、本発明者らは、CD46-IFNARマウス中のMVベクターに対する元々存在する免疫の存在が、MV-CE3E26KE1ワクチン候補を用いる免疫化後に防御免疫の誘導を防止しないことを証明した。この結果を考慮すれば、かくして得られた組換えベクターは、感染の信頼できる非ヒト霊長類モデルにおいて評価されるに値する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015532090.tif 000028
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