(57)【要約】  本発明の開示は、処置を必要とする患者を、動員血液試料または動員アフェレシス試料から選択されるかおよび／または拡大される治療的有効量の治療用Ｔ細胞集団を投与することを包含する免疫再構築療法で処理する方法であって、選択が定常状態マーカーおよび／または活性化マーカーとその後の拡大に基づいており、あるいは拡大が抗原、例えばウィルス抗原の存在下である方法を提供する。該方法は、前記の治療用Ｔ細胞集団およびそれから獲得可能な生成物の生成方法にも及ぶ。
2015505852.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
処置を必要とするヒト患者を、動員血液試料または動員アフェレシス試料から選択されるか、および／または拡大される治療的有効量の治療用Ｔ細胞集団を投与することにより免疫再構築療法で処置する方法であって、選択が、定常状態マーカーおよび／または活性化マーカーに、任意にその後の拡大に基づいており、あるいは拡大が抗原、例えばウィルス抗原の存在下である、方法。
【請求項２】
前記患者が、造血幹細胞移植後である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｔ細胞集団が抗原特異的Ｔ細胞集団である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記抗原特異的Ｔ細胞集団が、ウィルス、例えば、サイトメガロウィルス、アデノウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、ＢＫウィルス、ヒトパピローマウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、エプスタイン・バーウィルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウィルスおよびヒトＴリンパ好性ウィルスからなる群から選択されるウィルス、例えばサイトメガロウィルスまたはアデノウィルスに特異的である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ヒト療法、例えば免疫再構築療法に用いるための、動員血液試料または動員アフェレシスから選択されるか、および／または拡大される治療用Ｔ細胞集団、またはそれを含む薬学的組成物であって、選択が、定常状態マーカーおよび／または活性化マーカーに、任意にその後の拡大に基づいており、あるいは前記拡大が抗原、例えばウィルス抗原の存在下である、治療用Ｔ細胞集団またはそれを含む薬学的組成物。
【請求項６】
前記療法が、造血幹細胞移植後患者のための免疫再構築療法である、請求項５に記載の治療用Ｔ細胞集団またはそれを含む薬学的組成物。
【請求項７】
前記Ｔ細胞集団が抗原特異的Ｔ細胞集団である、請求項５または６に記載の治療用Ｔ細胞集団またはそれを含む薬学的組成物。
【請求項８】
前記抗原特異的Ｔ細胞集団が、ウィルス、例えば、サイトメガロウィルス、アデノウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、ヒトパピローマウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＢＫウィルス、エプスタイン・バーウィルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウィルスおよびヒトＴリンパ好性ウィルスからなる群から選択されるウィルスからなる群から選択されるウィルス、例えばサイトメガロウィルスまたはアデノウィルスに特異的である、請求項７に記載の治療用Ｔ細胞集団またはそれを含む薬学的組成物。
【請求項９】
前記集団が、例えば特定のＨＬＡ：ペプチド複合体、特にテトラ、ペンタおよび／またはヘキサＳｔｒｅｐｔａｍｅｒによるＴ細胞受容体の可逆的結紮により、定常状態マーカー、すなわちＴ細胞受容体を基礎にして直接的に選択される、請求項５〜８のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞集団または薬学的組成物。
【請求項１０】
前記活性化マーカーが抗原刺激の結果として上方調節される細胞表面マーカー、例えばＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるものである、請求項５〜９のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞集団または薬学的組成物。
【請求項１１】
前記Ｔ細胞生成物が、特に抗原特異的方式で拡大される拡大Ｔ細胞生成物である、請求項５〜１０のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞集団または薬学的組成物。
【請求項１２】
前記集団が、ＣＤ２５マーカーを有する細胞に関して実質的に陰性である、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞集団または薬学的組成物。
【請求項１３】
前記Ｔ細胞集団が同種異系である、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞集団または薬学的組成物。
【請求項１４】
免疫再構築療法のための医薬品の製造のための、請求項５〜１３のいずれかで定義されるような治療用Ｔ細胞集団または薬学的組成物の使用。
【請求項１５】
動員血液または動員アフェレシス試料からのウィルスに特異的である標的Ｔ細胞集団を選択し、および／または拡大する方法であって、選択が、Ｔ細胞の表面の定常状態マーカーまたは活性化マーカーをターゲッティングすることを用い、そして拡大が、特に同種異系ドナーに由来する抗原特異的Ｔ細胞集団の拡大に適した条件を用いる、方法。
【請求項１６】
前記標的抗原が、例えばＤＮＡウィルスまたはＲＮＡウィルスから選択されるウィルス抗原、例えばＤＮＡウィルスである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ウィルスが、サイトメガロウィルス、アデノウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、ヒトパピローマウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＢＫウィルス、エプスタイン・バーウィルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウィルスおよびヒトＴリンパ好性ウィルス、例えばサイトメガロウィルスまたはアデノウィルスからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記定常状態マーカーが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、例えば前記Ｔ細胞集団が、直接選択の工程において特定のＨＬＡ：ペプチド複合体によるＴＣＲの可逆的結紮により選択される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記直接選択が、多量体ＨＬＡ：ペプチド複合体、例えばテトラ-、ペンタ-、ヘキサ-およびＳｔｒｅｐｔａｍｅｒを用いる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＨＬＡペプチドまたは多量体が、特定のＨＬＡ型、例えばＡ１、Ａ２、Ｂ７、Ａ２４、Ｂ３５、例えばＡ０２０１またはＢ０７０２を有する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記活性化マーカーが、抗原刺激の結果として上方調節される細胞表面マーカー、例えばＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４およびその組合せから選択されるものである、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｔ細胞集団が、このような活性化マーカーに対して向けられる単量体、二量体または多量体抗体または抗体断片による活性化マーカーの可逆的結紮により選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記定常状態マーカーが、標的ウィルスに関連した刺激に曝露後５〜２５時間、例えば６〜２４時間で発現される、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記標的Ｔ細胞集団が、特に抗原の存在下で、Ｔ細胞拡大培地中で培養することにより拡大される、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記標的細胞集団が、定常状態または活性化マーカーによる前もっての選択なしに、動員アフェレシスから選択的に拡大される、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記拡大が迅速拡大工程、例えば１５日以下、例えば１４、１３、１２、１１、１０、９、８または７日、例えば約１０日である、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記培地が、拡大期間に亘って、変化しないまま且つ補足されないままである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１５〜２７のいずれか一項に記載の方法から得られるかまたは獲得可能であるウィルス特異的拡大Ｔ細胞生成物またはそれを含む薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の開示は、例えば免疫再構築のための、動員血液試料からのＴ細胞免疫療法製品を調製するための方法、上記方法から得られるＴ細胞集団およびそれを含む薬学的組成物に関する。本開示は、例えば、ウィルス感染、例えばＣＭＶおよびアデノウィルス感染の処置または予防における療法、特に免疫再構築療法に用いるためのＴ細胞集団および上記薬学的処方物も提供する。
【背景技術】
【０００２】
免疫無防備状態患者は、日和見ウィルス感染に感受性である。これは骨髄移植患者において非常に大きな問題であるが、それは、彼らの免疫細胞が、時として、骨髄移植手順の一部として意図的に激減され、他の場合には、骨髄移植の一般的合併症である移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のためのステロイド処置のために非機能性にされる。潜在性ウィルス、例えばＣＭＶおよびアデノウィルスは、再活性化されるようになり、身体は感染と闘うことができない。
【０００３】
免疫再構築の実行が開発されてきたが、これは、適合ＨＬＡドナー（通常、骨髄または末梢幹細胞移植を提供する同一ドナー）からの免疫細胞の移植患者への移植片（養子免疫伝達）を包含する。ドナーの造血幹細胞の移植により患者自身の免疫系が完全に再構築され、次いで、多様な一連の血液細胞および免疫細胞に発達するまで、これらの細胞は、患者に移植して病原体に対する長期免疫を提供するか、あるいは感染と闘う場合に少なくとも暫時の手助けを提供する。
【０００４】
骨髄移植後の患者における免疫再構築を達成するためのドナー免疫細胞の養子免疫伝達への臨床研究の時期は、このアプローチの利益ならびに当該アプローチを最適化して一貫した有効且つ安全な結果を保証するという難題を例証してきた。いくつかの場合、特定の病原体に対する免疫再構築を実行するために必要なドナー免疫細胞の数は、単なる機械的選択システムにより獲得できない。ドナー試料からの細胞の拡大の工程は、一般的に約２１日を要し、関連細胞集団の考え得る最高数（収量）ならびに関連細胞集団の考え得る最高純度を得るために、例えばできるだけ所望細胞の１００％に近い集団を獲得するために、特定の細胞を拡大することが主眼であった、ということを従来技術は示している。
【０００５】
細胞の出発集団は、ドナー由来の血液試料または専用アフェレシス生成物から得られる。以下で考察される理由のため、ドナーがＧＣＳＦ処置を受けたことがなく、したがって動員血液試料でない場合、現行作業は、アフェレシス生成物が専用アフェレシスで収穫されるというものである。
【０００６】
組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ-ＣＳＦ）による動員は、臓器提供前の循環におけるドナー幹細胞の数を増大するために用いられる。これは、骨髄移植とは対照的に、末梢血幹細胞移植を可能にする。末梢血幹細胞移植は、骨髄移植を上回る多数の利点を有する。
【０００７】
現行作業は、ドナーから患者への幹細胞移植後、動員の効果が落ち込んだ場合、患者の免疫応答を増大するために、治療用Ｔ細胞生成物を生成するために用いられ得るさらなる非動員血液試料またはアフェレシスを提供するよう、将来的時点でドナーを戻す必要があるということである。Ｔ細胞生成物は、試料からの細胞の小群から選択され得るし、および／または血液またはアフェレシス試料の分画から拡大され得る。
【０００８】
二次手順のために戻さねばならないことは、ドナーに関して非常に不便であり、非遵守を生じ得るが、これは、患者の免疫応答を増大するために拡大Ｔ細胞生成物を生成するために、時として、血液試料または白血球アフェレシスが利用可能でない、ということを意味する。
【０００９】
一般に、動員血液は拡大Ｔ細胞生成物を生成するために用いられないが、それは、動員血液は非動員血液と同一特性を有さず、特に、動員血液中のＴ細胞における活性低減が認められ得るということを初期の研究が確立しているためであって、例えばＭｉｅｌｃａｒｅｋ等は、Ｂｌｏｏｄ，  Ｍａｒｃｈ  １，  １９９７  ｖｏｌ．  ８９  ｎｏ．  ５  １６２９−１６３４で、顆粒球コロニー刺激因子-動員末梢血単核球由来のＣＤ１４＋細胞による同種異系抗原誘導性Ｔ細胞増殖の抑圧を記載している。
【００１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＧ−ＣＳＦ刺激直後に、ヒトおよびネズミＴ細胞は、細胞傷害性活性低減を示す。増殖応答低減も、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激時に観察される。
【００１１】
Ｒｅｙｅｓ等は、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  （１９９９）  ８０  （１／２），  ２２９−２３５において、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）が、如何にして有糸分裂刺激Ｔ細胞増殖応答を一時的に抑圧するかを記載している。
【００１２】
Ｇ-ＣＳＦ動員は、単一細胞レベルとしての分泌の抑制を介してＴ細胞による１型サイトカイン産生を抑制し、ならびに末梢におけるサイトカイン分泌細胞の分画を低減し；養子免疫療法におけるこれらの細胞の使用に反対の結論を示す、ということをネズミおよびヒト研究は示唆している（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ  １９９９，  Ａｒｐｉｎａｔｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００  ａｎｄ  Ｔａｙｅｂｉ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）。
【００１３】
動員血液からのある細胞のこの機能性低減は、多数の著者により確証された（例えば、Ｊｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ  −Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄｏｎｏｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  Ｂｌｏｏｄ，  １５  Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００１  Ｖｏｌ  ９８，  Ｎｏ  ６，  １９６３−１９７０、およびＮａｗａ  ｅｔ  ａｌ  Ｇ−ＣＳＦ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ＩＦＮ−γ  ａｎｄ  ＩＬ−４  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｆｔｅｒ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  （２０００）  ２５，  １０３５−１０４０参照）。
【００１４】
Ｇ-ＣＳＦは、免疫寛容においてある役割を有するとも考えられた（例えば、Ａｎｋｅ  Ｆｒａｎｚｋｅ’ｓ  ｒｅｖｉｅｗ  ｉｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ＆  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １７  （２００６）  ２３５−２４４  ｅｎｔｉｔｌｅｄ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｇ−ＣＳＦ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  Ｒｕｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ，  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００５  ７０８５−７０９７参照）。移植細胞に対する免疫寛容は望ましいが、患者の免疫応答を増大するために治療用Ｔ細胞生成物を生成する場合、全身免疫寛容は望ましくない。実際、寛容は、Ｔ細胞アナジーまたは低応答性と何らかの関連を有し得る。
【００１５】
他の研究は、Ｇ-ＣＳＦがＴ細胞集団を、細胞内ウィルス感染を制御するに際してあまり有効でないＴｈ２群向きにし得ることを示唆している。
【００１６】
したがって、当該分野における業務は、拡大Ｔ細胞生成物の調製のために動員血液を用いないことである。
【００１７】
動員血液からのｉｎ  ｖｉｔｒｏＴ細胞は、図６によれば、インターフェロン・ガンマ（抗原刺激性Ｔ細胞に関する活性化マーカー）をあまり分泌できないと思われるが、それにもかかわらず、当該細胞は、Ｔ細胞治療用生成物として用いるのに適している、と本発明人等は考える。インターフェロン・ガンマは免疫応答に関与する前炎症性サイトカインであり、このサイトカインの低レベルの分泌は一般的に動員血液からのＴ細胞の低活性を示している、と当業者は自然に考えるため、この観察は普通では信じがたい。しかしながら、動員血液から抗原特異的Ｔ細胞を選択し、拡大することができ、動員細胞環境から一旦得られると、これらの細胞は非動員血液からのＴ細胞に対して機能の点で劣らない。
【００１８】
実際、Ｇ-ＣＳＦ動員血液または動員アフェレシスから選択されおよび／または拡大される治療用Ｔ細胞生成物は、造血幹細胞移植後患者にｉｎ ｖｉｖｏ投与した場合、安全且つ有効であるということを、意外にも本発明人等は確立した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
一実施形態では、それを必要とするヒト患者を、特に、患者が造血幹細胞移植後である場合、Ｇ-ＣＳＦ動員血液試料または動員アフェレシスから選択されるか、および／または拡大される治療的有効量の治療用Ｔ細胞集団を投与することにより免疫再構築療法で処置する方法が提供される。
【００２０】
本発明の開示は、Ｇ-ＣＳＦ動員血液試料から選択され、および／または拡大される、あるいは処置に、特に造血幹細胞移植後患者の処置に用いるための治療用Ｔ細胞集団も提供する。
【００２１】
一実施形態では、治療用Ｔ細胞集団は、抗原特異的Ｔ細胞集団である。
【００２２】
一実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞集団は、ウィルス、例えば、サイトメガロウィルス、アデノウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、ヒトパピローマウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＢＫウィルス、エプスタイン・バーウィルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウィルスおよびヒトＴリンパ好性ウィルスからなる群から選択されるウィルス、例えばサイトメガロウィルスまたはアデノウィルスに特異的である。
【００２３】
一実施形態では、ウィルスはサイトメガロウィルスである。
【００２４】
一実施形態では、治療用Ｔ細胞集団は、ウィルス感染、特に本明細書中に記載される特定のウィルス感染またはその組合せを処置するのに適している。
【００２５】
一実施形態では、Ｔ細胞は、同種異系であり、すなわち、ＨＬＡ適合ドナー、特に完全適合ドナーに由来する。
【００２６】
一実施形態では、Ｔ細胞集団は、定常マーカー、例えばＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に基づいて選択される。
【００２７】
一実施形態では、Ｔ細胞集団は、マーカー、例えばＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４から独立して選択されるマーカー、ならびにその組合せ、例えばＣＤ６９、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４およびその組合せを基礎にして選択される。
【００２８】
選択後、細胞集団は、患者に利用可能な細胞の用量を増大するために拡大され得る。
【００２９】
代替的には、細胞の出発集団は、抗原の存在下で拡大され得る。この工程は、天然選択要素を包含したが、この場合、当該工程は、抗原に特異的な細胞を特定的に培養し、非標的細胞集団は低減されるかまたは排除される。
【００３０】
一実施形態では、Ｔ細胞の集団は、有意量の細胞表面マーカーＣＤ２５を含まない。
【００３１】
一実施形態では、治療用Ｔ細胞生成物は、Ｇ-ＣＳＦ動員アフェレシスから選択される。
【００３２】
一実施形態では、治療用Ｔ細胞生成物は、Ｇ-ＣＳＦ動員血液試料から拡大される。
【００３３】
動員試料由来の細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのインターフェロン・ガンマ分泌のレベル低減を示し得る。それにもかかわらず、これらの細胞が機能しており、ｉｎ ｖｉｔｒｏ特性にもかかわらず治療用生成物に用いるのに適している、ということを示唆する証拠を、本発明人等は有する。これは、関連集団の選択に関して実際的困難を生じるが、それは、ガンマ捕捉のような方法に基づいた関連Ｔ細胞集団の選択が次善の選択であるためである。したがって、選択が用いられるべきである場合、定常状態Ｔ細胞マーカーおよび／または活性化マーカーが用いられなければならない。一実施形態では、これは、刺激ステップと、その後の細胞表面マーカー、例えばＣＤ１５４に関する選択を用いるが、他の実施形態では、これは直接選択方法、例えばＴ細胞受容体-Ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ選択に基づいた方法を用いる。
【００３４】
したがって、実際、動員血液がＴ細胞生成物の調製のための適切な出発材料であり、そして動員血液試料からの出発Ｔ細胞集団からのウィルスに特異的である標的Ｔ細胞集団を選択し、および／または拡大する方法も提供されるが、この場合、選択は、Ｔ細胞の表面の定常状態マーカーをターゲッティングする直接選択を用い、拡大は、標的ウィルス特異的Ｔ細胞集団の拡大に適した条件を用いる。
【００３５】
Ｔ細胞生成物の調製のための動員血液試料の使用に関連した否定的開示を仮定すると、当該材料が、実際、首尾よく用いられ得る、ということは非常に意外である。付加的には、動員血液試料の使用は、拡大Ｔ細胞療法が、従来技術の方法によりドナーに生じた不便や欠点なしに、より多くの患者に利用可能であるため、本発明の開示による方法は、ドナー、患者および健康管理従業者に非常に大きな利点を提供する。
【００３６】
二次試料の収集、運搬および貯蔵は有意量の付加的な人的および財政的供給源を要するため、本発明の方法に関連した有意の省資源化も存在する。
【００３７】
さらに、動員血液からのＴ細胞を用いる免疫療法を提供し得ることは、治療用生成物が供与直後に調製され、それにより、非動員試料を得ることに伴う「時間差」を回避し、次いで、それを加工処理して、治療用生成物を提供し得る、というさらなる利点を有し得る。
【００３８】
最後に、ドナーは、付加的医学的介入を受けなければならないということはなく、したがって、付加的白血球アフェレシス手順に関連した危険におかれない。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】非対合Ｇ-ＣＳＦ動員（ｎ＝６）および非動員（ｎ＝６）ドナーにおける機能プロフィル。１６時間ＣＭＶｐｐ６５刺激後の培養の上清中のＩＬ-２、ＴＮＦ、ＩＦＮ-γ、ＩＬ-１０、ＩＬ-４およびＩＬ-５の定量的査定。サイトカインの濃度は、陰性対照（非刺激）を差し引いたのちの正味値として表される。
【図２】非対合Ｇ-ＣＳＦ動員（ｎ＝６）および非動員（ｎ＝６）ドナーにおけるＩＦＮーｇ分泌抗原特異的Ｔ細胞の同定および単離。（２Ａ）ＰＢＭＣをＣＭＶｐｐ６５で１６時間刺激して、ＩＦＮ-γ分泌細胞の頻度をＣＤ３＋Ｔ細胞の間で分析した。（２Ｂ）ＩＦＮ-γ分泌細胞を磁気細胞選別を用いて単離して、純度および収率をＣＤ３＋集団内で確定した。
【図３】Ｇ-ＣＳＦ動員（ｎ＝５）および非動員（ｎ＝５）ＰＢＭＣにおけるＣＭＶｐｐ６５刺激に応答する活性化マーカーの発現の最適時間。ＰＢＭＣを２４時間にわたって刺激して、１、４、６、１６および２４時間でのＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１５４およびＣＤ１３７発現に関して、試料を分析した。ＩＦＮ-γ分泌を、１６時間で分析した。バーは、発現の最適時間での各活性化マーカーに関するＣＤ３＋集団における正味発現を表す。
【図４】４および６時間でのＣＤ１５４表面発現のＧ-ＣＳＦ動員および非動員ドナー間の直接比較。（４Ａ）ＰＢＭＣを、ＣＤ４０-特異的抗体（１μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、ＣＭＶｐｐ６５  ＰｅｐｔｉｖａｔｏｒまたはＳＥＢで刺激した。細胞をＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞上でゲート制御する。（４Ｂ、Ｃ）非動員（ｎ＝５）およびＧ-ＣＳＦ動員（ｎ＝５）ドナーにおけるＣＤ１５４発現の比較。データは、標準偏差（ＳＤ）を伴う平均として示される。
【図５】２つの非対合ドナーにおけるＣＤ１５４発現によるＣＭＶ特異的Ｔ細胞の単離。（Ａ）非動員およびＧ-ＣＳＦ動員ドナーからのＰＢＭＣを、ＣＤ４０特異的抗体の存在下で６時間、ＣＭＶｐｐ６５  Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒで刺激した。刺激前、刺激後、そしてＭｉｎｉＭＡＣＳでのＣＤ１５４＋Ｔ細胞の選別後に、ＣＤ３＋リンパ球の中でＣＤ１５４に関して、細胞を染色した。（Ｂ）Ｇ-ＣＳＦ動員（ｎ＝４）および非動員（ｎ＝４）ＰＢＭＣにおけるＣＭＶｐｐ６５刺激後に、ＣＤ１５４＋からの陽性分画を選別する。データは、ＳＤを伴う平均として示される。
【図６】拡大ＣＤ１５４＋Ｔ細胞の再刺激。（Ａ）培養中で２１日後、再刺激前のＣＤ３およびＣＤ４に関して染色された拡大ＣＤ１５４＋Ｔ細胞。（Ｂ）ＣＤ４０特異的抗体の存在下で６時間、ＣＭＶｐｐ６５を用いた場合と用いない場合で、拡大ＣＤ１５４＋を、自系ＰＢＭＣと共培養した。刺激後、ＣＤ１５４対ＣＤ６９の発現を分析した。（Ｃ）Ｇ-ＣＳＦ動員（ｎ＝３）および非動員（ｎ＝３）ＰＢＭＣからのＣＤ１５４＋拡大細胞を、ＣＤ１５４、ＣＤ６９に関して分析した。（Ｄ）Ｇ-ＣＳＦ動員ＰＢＭＣからの拡大ＣＤ１５４＋を、ブレフェルジンＡおよびＣＤ２８特異的抗体の存在下で、前期と同様に刺激した。細胞を固定し、透過性にして、ＣＤ１５４対ＩＬ-、ＴＮＦおよびＩＦＮ-γの発現に関して分析した。（Ｅ）Ｇ-ＣＳＦ動員（ｎ＝３）および非動員（ｎ＝３）ＰＢＭＣにおいて自系ＣＭＶｐｐ６５  ＰＢＭＣで再刺激後のＩＬ-２、ＩＦＮ-γおよびＴＮＦ発現の分析。データは、ＳＤを伴う平均として示される。
【図７】Ｇ-ＣＳＦ動員ＰＢＭＣから単離されたＣＤ１５４＋ＣＭＶ特異的Ｔ細胞は標的細胞を有効に死滅させる。蛍光染料カルセイン-ＡＭ細胞傷害性検定を用いて、５０：１〜０．５：１のＥ：Ｔ比で、ＣＭＶｐｐ６５を負荷した自系ＰＨＡ芽球の特異的溶解を確定した。
【図８】迅速拡大工程（Ｇ-ｒｅｘ４０培養装置ならびにＩＬ-４およびＩＬ-７使用）を用いて、動員アフェレシス生成物の試料を１０日間拡大させた。次いで、細胞を培地単独（非刺激）またはＣＭＶｐｐ６５ペプチドで再刺激した。フローサイトメトリーにより、ＩＦＮガンマ産生の量を測定した。細胞を、肝臓リンパ球およびＣＤ３でゲート処理した。このプロットは、Ｑ１において、動員血液からの拡大細胞の所望の集団がインターフェロン・ガンマを分泌し得ることを示す。このプロットで示されるプロフィルは、非動員血液から拡大された細胞に関して同一条件下で得られるプロフィルに匹敵する、と当業者は理解する。
【図９】迅速拡大工程（Ｇ-ｒｅｘ４０培養装置ならびにＩＬ-４およびＩＬ-７使用）を用いて、動員アフェレシス生成物の試料を１０日間拡大させた。次いで、細胞を培地単独（非刺激）またはＡＤＶ  ＨｅｘｏｎＶペプチドで再刺激した。フローサイトメトリーにより、ＩＦＮガンマ産生の量を測定した。細胞を、肝臓リンパ球およびＣＤ３でゲート処理した。このプロットは、Ｑ１において、動員血液からの拡大細胞の所望の集団がインターフェロン・ガンマを分泌し得ることを示す。このプロットで示されるプロフィルは、非動員血液から拡大された細胞に関して同一条件下で得られるプロフィルに匹敵する、と当業者は理解する。
【図１０】動員アフェレシス生成物の試料を幹細胞収穫物から得て、加工処理のためにＣｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａに送った。細胞を特定のＳｔｒｅｐｔａｍｅｒ選択試薬に曝露して、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳを用いて選択した。次に、これを、患者への投与のために３×１０ｅ４  Ｔ細胞／ｋｇで用量投与した。ＣＭＶ特異的Ｔ細胞受容体（ストタンパク質陽性）を発現する細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーにより測定した。これは、非動員生成物と等価の用量および純度で、Ｔ細胞が動員アフェレシス試料から首尾よく得られ、患者に安全に投与され得る、ということを示している。
【図１１】リンパ球およびＣＤ３でゲート制御された図１０からの細胞を示す。
【図１２】抗原特異的Ｔ細胞が、動員される元の試料から得られる場合でさえ、機能性である、ということを示す。
【図１３】抗原特異的Ｔ細胞が、動員される元の試料から得られる場合でさえ、機能性である、ということを示す。
【図１４】難治性ＣＭＶ感染患者を処置するために用いられるガンマ捕捉により選択される治療用Ｔ細胞の試料ならびにそれが得られる出発材料の分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
詳細な説明
動員血液は、本明細書中で用いる場合、Ｇ-ＣＳＦのような作用物質での処置により動員されたドナーからの血液試料を指す。動員の工程は、末梢血中の幹細胞の数を増大する。
【００４１】
アフェレシスは、本明細書中で用いる場合、血液から１つ以上の特定の構成成分を分離して取り出して、残りをドナーの循環中に戻す機器をドナーの血液が通過する工程の生成物である。
【００４２】
アフェレシスは、肝細胞移植に用いられる白血球アフェレシスを生じるために用いられる。
【００４３】
幹細胞移植のための調製において、白血球アフェレシス生成物は、ＣＤ３４＋幹細胞に関する選択を受け得る。副生成物は、ＣＤ３４―分画として既知のこの工程から得られる。有益であるのは、本発明の工程がこの副生成物を用いて、治療用Ｔ細胞集団を選択し、または拡大し得ることである。一実施形態では、アフェレシスはＣＤ３４―分画である。
【００４４】
アフェレシスは、それが潜在的に、出発材料中の多数の細胞、例えば１００億〜１０００億個の細胞、例えば２００億、３００億、４００億、５００億、６００億、７００億、８００億または９００億個の細胞に近づく方法を提供する、という点でも有益である。細胞のこの数は、選択のみにより、すなわちその後の拡大のための要件なしに、Ｔ細胞の適切な治療用量を生じるのに十分である。
【００４５】
対照的に、血液試料は、２０００万個の領域の細胞を含有するに過ぎない。したがって、出発材料が血液試料または相対的に少数の細胞を含有する血液である場合には、拡大ステップは、一般的に、患者に必要な治療用量の細胞を生じることを必要とする。
【００４６】
動員アフェレシスは、本明細書中で用いる場合、Ｇ-ＣＳＦのような作用物質での処置により動員されたドナーからの試料を指す。動員の工程は、末梢血中の幹細胞の数を増大する。
【００４７】
本発明の工程の種々の変形が存在するが、これらを以下に要約する：
１．  治療用量を提供するためのＴＣＲマーカーのような定常状態マーカーに基づいた直接選択（出発材料アフェレシス）、
２．  治療用量を提供するための本明細書中に記載されるような活性化マーカーに基づいた選択（出発材料アフェレシス）、
３．  治療用量を提供するための定常状態マーカーに基づいた直接選択とその後の拡大（出発材料血液またはアフェレシス）、
４．  治療用量を提供するための活性化マーカーに基づいた選択とその後の拡大、
５．  治療用量の抗原特異的Ｔ細胞集団を生成するための抗原の存在下での拡大（出発材料血液またはアフェレシス）。
【００４８】
免疫再構築は、本明細書中で用いる場合、免疫応答を生じるためのメカニズムを宿主に提供すること、あるいは健常個体と同様に宿主の免疫応答を増大することを指すよう意図される（そうでなければ、宿主の応答は、損傷のために最小限であるかまたは存在しない）。
【００４９】
一実施形態では、造血幹細胞移植は、別記しない限り、関連または非関連ドナーからの、または臍帯血からの幹細胞供与を伴う手順を含めた同種異系造血幹細胞移植（アロＨＳＣＴ）、例えば末梢幹細胞移植である。
【００５０】
処置に有効とは、本明細書中で用いる場合、患者への投与に関して安全であり、非動員血液由来の従来技術のＴ細胞療法と少なくとも後半に匹敵する療法を指す。
【００５１】
本発明の開示の状況における療法は、予防的療法を包含し、これは、免疫再構築の状況では標準業務である。
【００５２】
「細胞」は、当該技術分野で一般に用いられる用語であり、胸腺細胞、未熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、残りのＴリンパ球または活性化Ｔリンパ球を含めたすべてのＣＤ３＋細胞を包含するよう意図される。Ｔ細胞は、Ｔヘルパー（Ｔｈ）細胞、例えばＴヘルパー１（Ｔｈ１）またはＴヘルパー２（Ｔｈ２）細胞であり得るが、しかしＴ細胞集団の他の群が、集中的研究に基づいて発見されつつある。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４−ＣＤ８−Ｔ細胞またはＴ細胞の任意の他の部分集合であり得る。
【００５３】
細胞生成物は、本明細書中で用いる場合、療法、例えば免疫再構築療法に用いるのに適したＴ細胞の集団を指す。
【００５４】
標的Ｔ細胞集団を拡大することは、本明細書中で用いる場合、例えば、適切な培地中で細胞の出発集団を培養することにより、細胞分裂の結果として細胞の一集団中の標的細胞の数を増大することを指すよう意図される。
【００５５】
細胞拡大は、生育可能なＣＤ３＋細胞（すなわち、細胞の標的集団）を計数することにより評価され得る。
【００５６】
生育可能細胞は、トリパンブルー（および光学顕微鏡）または７-アミノアクチノマイシンＤ、６７０ｎｍで発光する生体染料（またはＶｉａＰｒｏｂｅ：７ＡＡＤの市販の簡易溶液）およびフローサイトメトリーでの細胞染色により、ならびに当該技術分野で既知の技法を用いることにより、試験され得る。染色が細胞中に浸透する場合、細胞は生育可能でないとみなされる。染料を取り込まない細胞は、生育可能であるとみなされる。例示的一方法は、約１００μＬの細胞懸濁液当たり約５μＬの７ＡＡＤおよび約５μＬのアネキシン-Ｖ（リン脂質結合タンパク質：これは、アポトーシス中に曝露される外部リン脂質ホスファチジルセリンと結合する）を用い得る。この混合物は、光の非存在下で、周囲温度で約１５分間、インキュベートされ得る。次いでフローサイトメトリーを用いて、分析が実施され得る。例えば、ＭＧ  Ｗｉｎｇ，  ＡＭＰ  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，  Ｓ．  Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  ＪＶ  Ｗａｔｓｏｎ．    Ａｎ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  Ｓａｍｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｌｏｗ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｕｓｉｎｇ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．    Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２６：  ２１−２７  １９９０参照。
【００５７】
代替的染色はＴＯ-ＰＲＯ-３であって、これは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７またはＣｙ５染色と同様の遠赤外蛍光を有するカルボシアニン単量体核酸染色である。それは、核対比染色および死細胞指標として有用であり、核酸検出のための最高感受性プローブの１つである。
【００５８】
一実施形態では、Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のような定常状態マーカーに基づいた直接選択により動員血液から選択される。この工程は、Ｔ細胞受容体と結紮する、特に多量体の形態の、例えば四、五および／または六量体のＨＬＡ：ペプチド複合体を用いる。これらのペプチドは、例えば、蛍光標識または磁気ビーズで標識され、これにより、次にこれらは同定され、選択され得る。一実施形態では、磁気標識が用いられる。
【００５９】
したがって、直接選択は、一般的に、動員アフェレシス生成物の分画からのリンパ球の臨床等級濃化を包含する。これは、専用装置、例えばＳｅｐａｘ装置（Ｂｉｏｓａｆｅから）を用い得る。その結果生じるリンパ球は、次に、磁気ビーズと結合される多量体化ＭＨＣ／ペプチド複合体である選択試薬とともにインキュベートされる。ＭＨＣ／ペプチド複合体は、患者およびドナーに適合される場合、抗原特異的Ｔ細胞受容体に特異的である。インキュベーション後、細胞は洗浄され、結合細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳのような装置、または磁気ビーズを用いて細胞選択を可能にする任意の他の技法で選択されるが、この場合、陽性細胞は磁気カラム上にまたは袋中に保持され、陰性細胞は洗い落とされる。次いで磁気が除去され、抗原特異的細胞が溶離される。
【００６０】
一実施形態では、多量体はＳｔｒｅｐｔａｍｅｒである。ＳｔｒｅｐｔａｍｅｒによるＴＣＲの結紮は可逆的であり、細胞の所望の集団の選択後には、特定試薬による処置は細胞からの複合体の除去である。
【００６１】
用いられるＨＬＡ複合体は、ＨＬＡ型と適合される必要があり、したがって、それらは、ペプチドまたは多量体が特定のＨＬＡ型、例えばＡ１、Ａ２、Ｂ７、Ａ２４、Ｂ３５、例えばＡ０２０１およびＢ０７０２を有するよう、Ｔ細胞のウィルス特異的集団を結紮し得る。
【００６２】
選択は、さらにまたあるいは代替的には、活性化マーカーを基礎にし得る。これらは、抗原刺激の結果として上方調節されるマーカーである。多量のこれらが存在し、当業者に既知であって、例としては、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４のようなマーカーおよびその組合せが挙げられる。
【００６３】
これらのマーカーは、単量体、二量体、多量体抗体またはその結合断片との結紮により選択され得る。これらの抗体または断片は、例えば蛍光標識または磁気ビーズで標識され、その後、これにより、それらが同定され、選択される。一実施形態では、磁気標識が用いられる。
【００６４】
一実施形態では、用いられる抗体または断片は、例えばｆａｂ-ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ（ＩＢＡ  ＧｍＢＨ  Ｇｅｒｍａｎｙから入手可能）である。
【００６５】
これらのｆａｂ-ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒの結合は、所望の細胞集団の選択後、適切な試薬での処置がそれらを細胞から放出する、という点で可逆的である。
【００６６】
結紮は、本明細書中で用いる場合、結合を指す。
【００６７】
一実施形態では、Ｔ細胞集団は、動員血液から選択され、次いで拡大される。
【００６８】
一実施形態では、拡大工程の小面である細胞の標的集団に関して拡大は選択的に濃化するため、選択は拡大前には必要でない。
【００６９】
ウィルスに特異的なＴ細胞集団は、本明細書中で用いる場合、細胞の関連集団が、特異的である少なくとも１つのウィルス抗原をおもに認識し、そして例えば標的ウィルスの認識後、免疫応答を生じる、という事実を指すよう意図される。この状況での特異性は、標的ウィルスだけが認識される、ということを必ずしも意味しないが、いくつかの場合、標的ウィルスだけが認識され、しかし少なくとも標的ウィルスは、非標的ウィルスと比較してより大きい親和性、結合活性または応答の大きさで認識される。
【００７０】
ウィルス抗原は、本明細書中で用いる場合、特定の免疫学的応答により検出され得るウィルスゲノム（しばしば、外被タンパク質）により特定される抗原を指す。一実施形態では、ウィルス抗原は表面抗原である。
【００７１】
一実施形態では、ウィルスはＤＮＡウィルス、例えば二本鎖ＤＮＡウィルスである。
【００７２】
一実施形態では、ウィルスはＲＮＡウィルスである。
【００７３】
典型的には、ＰＢＭＣは、当業者に既知のフィコール密度勾配分離により血液またはアフェレシス生成物から得られる。
【００７４】
患者からの試料採取のステップは、血液試料採取の通例の技法であり得る。この工程は、患者にとってほとんど危険でなく、医者より実施される必要はないが、しかし適切に訓練されたサポートスタッフにより実施され得る。一実施形態では、患者から得られる試料は、約５００ｍｌ、４００ｍｌ、３００ｍｌ、２００ｍｌ、１００ｍｌ、５０ｍｌ、４０ｍｌ、３０ｍｌ、２０ｍｌ、１０ｍｌ、５ｍｌまたはそれ以下の血液である。
【００７５】
一実施形態では、出発材料は、患者のためのＣＤ３４＋用量が達成されていることが一旦保証されたら採取される動員アフェレシス生成物の分画である。例えば、４×１０ｅ６  ＣＤ３４＋細胞／患者の体重１ｋｇ。
【００７６】
一実施形態では、幹細胞移植の副生成物である細胞が用いられる。移植のための幹細胞は、しばしば、ＣＤ３４を基礎にして選択される。ＣＤ３４に関して陰性である集団は、しばしば、選択後に廃棄される。しかしながら、この除外集団は、例えば本明細書中に記載される方法、例えばＴ細胞拡大を用いて、治療用Ｔ細胞生成物を生成するのに適している。
【００７７】
当業者に既知であるように、Ｔ細胞の拡大は、一般的に、適切なＴ細胞拡大培地中で実施される。Ｔ細胞拡大培地は、一般的に、拡大ステップに用いられる血清、培地および任意のサイトカインを含む。
【００７８】
一実施形態では、培地は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＲＰＭＩ培地またはＲＰＭＩ培地１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）である。
【００７９】
一実施形態では、細胞拡大培地は、１０％ヒトＡＢ血清、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよびＲＰＭＩ−１６４０を含む。
【００８０】
一実施形態では、培地は、４５％上級ＲＰＭＩ、４５％ＥＨＡＡ、１０％ＦＣｓおよび２００ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含む。
【００８１】
一実施形態では、細胞拡大培地は、１０％ヒトＡＢ血清、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、４５％アール・ハムのアミノ酸（ＥＨＡＡまたはクリック培地）および４５％上級ＲＰＭＩまたはＲＰＭＩ−１６４０を含む。
【００８２】
一実施形態では、用いられるサイトカインは、以下で考察される。
【００８３】
一実施形態では、用いられるＴ細胞拡大培地は、特に迅速拡大工程が用いられる場合、拡大工程中に負荷されないし、補足されない。迅速拡大は、本明細書中で用いる場合、１８日未満以内、例えば７〜１０日に治療生成物が得られる工程を指す。
【００８４】
したがって、一実施形態では、本発明の開示に従って、抗原特異的Ｔ細胞（例えば同種異系抗原特異的Ｔ細胞）の迅速拡大のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ拡大工程であって、標的抗原（単数または複数）に関連したペプチドまたはペプチド混合物の存在下で、サイトカインが外因性ＩＬ-２以外である点で特性化される外因性サイトカインの存在下で、気体透過性容器中で、ＰＢＭＣ（例えば、同種異系ＰＢＭＣ）の集団を培養するステップを包含する工程が提供される。
【００８５】
一実施形態では、本発明の開示に従って、抗原特異的Ｔ細胞、例えば同種異系抗原特異的Ｔ細胞の迅速拡大のためのｉｎ ｖｉｔｒｏ拡大工程であって、抗原、例えば標的抗原（単数または複数）に関連したペプチドまたはペプチド混合物の存在下で、Ｔ細胞の所望の集団を提供するための拡大が１４日以下、例えば９、１０、１１または１２日、例えば１０日である点で特性化される外因性サイトカインの存在下で、気体透過性容器中で、ＰＢＭＣ（例えば、同種異系ＰＢＭＣ）の集団を培養するステップを包含する工程が提供される。
【００８６】
本発明の開示の工程で用いられ得るサイトカインとしては、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５が挙げられる。
【００８７】
大量の、今までのところ非限定的な、文献が、ＩＬ−２は、Ｔ細胞クローン拡大および縮小を制御し、そしてリンパ球分化を促進する。ＩＬ−２およびＩＬ−１５は、記憶細胞分裂も支持し得るし、ＣＴＬの拡大のために、抗原駆動性刺激と組み合わせて用いられてきた。
【００８８】
ＩＬ−７は、末梢Ｔ細胞恒常性を調節し、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＤ４１およびＣＤ８１記憶Ｔリンパ球の両方の生成および長期生存に寄与する。
【００８９】
一実施形態では、本発明の開示に従って拡大工程で用いられるサイトカインは、独立して、ＩＬ−４、ＩＬ−７およびＩＬ−１５、特にＩＬ−４およびＩＬ−７から選択される。
【００９０】
一実施形態では、用いられるサイトカインは、ＩＬ−４および／またはＩＬ−７である。理論に縛られずに考えると、これらのサイトカインは、ウィルス抗原特異的Ｔ細胞の頻度、レパートリーおよび拡大を具体化するに際して果たす役割を有する。
【００９１】
一実施形態では、本発明の開示による方法は、抗原特異的Ｔ細胞の一レパートリーを有するＴ細胞集団を提供する。
【００９２】
Ｔ細胞のレパートリーは、各ペプチドが２つのプールで独自に表示されるよう、プールにアリコート化されたペプチドライブラリーでの刺激後のＥＬＩＳＰＯＴ分析により（Ｋｅｒｎ，Ｆ．，Ｎ．Ｆａｕｌｈａｂｅｒ，Ｃ．Ｆｒｏｍｍｅｌ，Ｅ．Ｋｈａｔａｍｚａｓ，Ｓ．Ｐｒｏｓｃｈ，Ｃ．Ｓｃｈｏｎｅｍａｎｎ，Ｉ．Ｋｒｅｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｒ．Ｖｏｌｋｍｅｒ−Ｅｎｇｅｒｔ，Ｈ．Ｄ．Ｖｏｌｋ，ａｎｄ  Ｐ．Ｒｅｉｎｋｅ．２０００．  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＣＤ８  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｐｏｏｌｓ  ｏｆ  ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ  ｐｅｎｔａｄｅｃａｐｅｐｔｉｄｅｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３０：１６７６−１６８２およびＳｔｒａａｔｈｏｆ，Ｋ．Ｃ．，Ａ．Ｍ．Ｌｅｅｎ，Ｅ．Ｌ．Ｂｕｚａ，Ｇ．Ｔａｙｌｏｒ，Ｍ．Ｈ．Ｈｕｌｓ，Ｈ．Ｅ．Ｈｅｓｌｏｐ，Ｃ．Ｍ．Ｒｏｏｎｅｙ，ａｎｄ  Ｃ．Ｍ．Ｂｏｌｌａｒｄ．  ２００５．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｔｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ＣＴＬ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＥＢＶ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ａｎｄ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７５：４１３７−４１４７）、あるいは丸底９６ウェルプレート中で、１ｕｇ／ｍｌの濃度で細胞を再刺激するために上記のようなペプチドを用いて、２００，０００個の最終Ｔ細胞生成物をプレート化することによる細胞内サイトカイン染色により、確定され得る。これは、５ｕｇ／ｍｌのブレフェルジンＡの存在下で一晩実施されるが、これにより、サイトカインの分泌が防止され、したがって、フローサイトメトリーを用いた計数のための細胞内部のＩＦＮｇの増加を保証するために用いられる。
【００９３】
ＩＬ−４は、一般的に、２５０ｎｇ／培養１ｍｌ、またはそれ未満、例えば２００ｎｇ／ｍｌ以下の最終濃度で用いられる。
【００９４】
ＩＬ−７は、一般的に、５０ｎｇ／培養１ｍｌ、またはそれ未満、例えば２０ｎｇ／ｍｌ以下、特に１０ｎｇ／ｍｌの最終濃度で用いられる。
【００９５】
ＩＬ−１５が用いられる場合、適切な最終濃度は、５０ｎｇ／培養１ｍｌ、またはそれ未満、例えば２０ｎｇ／ｍｌ以下、特に１０ｎｇ／ｍｌである。
【００９６】
一実施形態では、約２０ｍｌ／ＧＲｅｘ−１０（例えば、２０×１０６ＰＢＭＣ）において、ＩＬ−４（１６６６単位／ｍＬ）およびＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有するさらに１０ｍｌの培地が付加される。
【００９７】
ＩＬ−１２は、Ｔｈ１フォーカシングにおいて一役を有し、外因性ＩＬ−１２は、平衡化Ｔｈ１／Ｔｈ２が望ましい場合、省かれ得る。一実施形態では、本発明の開示の工程は、外因性ＩＬ−１２を用いない。しかしながら、本発明のＴ細胞生成物の状況では、ＣＤ４＋集団におけるＴｈ１応答は望ましいと考えられる。
【００９８】
一実施形態では、ＩＬ−４が用いられる場合、本発明の開示の拡大工程で用いられる。１０日目または１１日目に、拡大細胞の数は、ＩＬ−４をＩＬ−２の代わりとして、類似のプロトコールを用いて拡大される細胞より、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００または２００％高いことがある。
【００９９】
外因性ＩＬ−２が迅速拡大系で用いられる場合、Ｔ細胞のより高い増殖が生成される。このより高い迅速拡大が起こる場合には、望ましいＴ細胞および残りの細胞の平衡は、拡大が非常に迅速に起こるので、多数の残りの細胞は死んでいるわけではなく、したがって全細胞集団中に依然として存在する、という点で次善のものである。したがって、迅速拡大の固有の不適合因子と、非標的細胞の死を可能にする期間、細胞を培養するという選択肢とを、本発明人等は調停して、ＩＬ-２を省くことが所望の細胞対残りの細胞の比率を改善する、ということを見出した。さらに、７〜１４日、例えば１０日の期間において、所望の細胞対残りの細胞の比率は、培養生成物が治療に用いるのに適するようになる交差点である。この交差点は、５×１０５ＣＤ３＋  Ｔ細胞／患者の体重１ｋｇ以下の安全閾値内にある十分最小量の治療用Ｔ細胞の用量が用量投与処方物内で達成される場合、と定義される。
【０１００】
一実施形態では、同種異系としてのＴ細胞集団、いわゆるＴ細胞集団は、患者でないドナーから得られる。
【０１０１】
一般的に、ドナーは完全にＨＬＡ適合性である。
【０１０２】
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系は、ヒトにおける主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）の名称である。超遺伝子座は、ヒトにおける免疫系機能に関連した多数の遺伝子を含有する。この群の遺伝子は、第六染色体上に存在し、細胞表面抗原提示タンパク質および多数の他の遺伝子をコードする。ＨＬＡ遺伝子は、ほとんどの脊椎動物において見出されるＭＨＣ遺伝子のヒトバージョンである（したがって、最も研究されたＭＨＣ遺伝子である）。ある遺伝子によりコードされるタンパク質は、臓器移植における因子としての歴史的発見の結果として、抗原としても既知である。主要ＨＬＡ抗原は、免疫機能のための必須要素である。異なるクラスは、異なる機能を有する：
【０１０３】
ＭＨＣクラスＩ（Ａ、ＢおよびＣ）に対応するＨＬＡは、細胞内部からのペプチドを提示する（存在する場合、ウィルスペプチドを含む）。これらのペプチドは、プロテアソーム中で分解される消化タンパク質から生成される。概して、当該ペプチドは、約９アミノ酸長の小型ポリマーである。外来抗原は、細胞を破壊するキラーＴ細胞（ＣＤ８陽性細胞または細胞傷害性Ｔ細胞ともよばれる）を引き寄せる。
【０１０４】
ＭＨＣクラスＩＩ（ＤＰ、ＤＭ、ＤＯＡ、ＤＯＢ、ＤＱおよびＤＲ）に対応するＨＬＡは、細胞の外側からの抗原をＴリンパ球に提示する。これらの特定の抗原は、Ｔ-ヘルパー細胞の増殖を刺激し、これが次に、抗体産生Ｂ細胞を刺激して、特定の抗原に対する抗体を産生する。自己抗原は、サプレッサーＴ細胞により抑圧される。
【０１０５】
一実施形態では、細胞の選択は、抗原、特に関連抗原のペプチドによる細胞の刺激後の、インターフェロン-ガンマ分泌または細胞表面活性化マーカーに基づいている。
【０１０６】
一実施形態では、ドナーから得られる動員血液試料は、加工処理前に凍結保存され得る。  
【０１０７】
一実施形態では、拡大後、任意に、１つ以上の構成成分、例えば安定化剤および／または凍結保存剤、例えばヒト血清アルブミン、グリセロール、ＤＭＳＯ等が、処方物に付加される。
【０１０８】
本発明は、本発明による同種異系抗原特異的Ｔ細胞集団を含む組成物にも及ぶ。これらの組成物は、希釈剤、担体、安定化剤、界面活性剤、ｐＨ調節剤、または主要工程ステップ後に細胞集団に付加される任意のその他の製薬上許容可能な賦形剤を含み得る。賦形剤は、一般的に、処方物を安定化し、半減期を延長し、組成物を患者のｉｎ ｖｉｖｏ系とより適合性にさせる等の機能を有する。
【０１０９】
一実施形態では、タンパク質安定化剤、例えばアルブミン、特にヒト血清アルブミン（安定化剤として作用し得る）は、製造後に細胞培養に付加される。処方物中に用いられるアルブミンの量は、１０〜５０％ｗ／ｗ、例えば約１２．５％ｗ／ｗであり得る。
【０１１０】
一実施形態では、処方物は、凍結保存剤、例えばグリセロールまたはＤＭＳＯも含有する。ＤＭＳＯの量は、一般的に１２％以下、例えば約１０％ｗ／ｗである。
【０１１１】
一実施形態では、本発明の工程は、製薬上許容可能な賦形剤、特に本明細書中に記載されるような賦形剤、例えば希釈剤、安定化剤および／または防腐剤を付加することにより、薬学的処方物を調製するというさらなるステップを包含する。
【０１１２】
賦形剤は、本明細書中で用いる場合、生物学的または生理学的機能を有さないＴ細胞集団に付加されるすべての成分を包含する一般用語である。
【０１１３】
一実施形態では、薬学的組成物は、注入による投与のために適合される。
【０１１４】
一実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞集団が生成される標的ウィルスはＣＭＶであり、例えば標的ウィルスに対して用いられる抗原は、ｐｐ６５である。ヒトサイトメガロウィルス（菌株ＡＤ１６９）に関する配列は、番号Ｐ０６７２５でＵｎｉＰｒｏｔデータベース中に存在する。組換えタンパク質は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入可能である。この会社は、ＰｅｐＴｉｖａｔｏｒ（登録商標）ＣＭＶｐｐ６５も提供しているが、これは、主に１５−ｍｅｒペプチド（１１-アミノ酸（ａａ）オーバーラップを含む）からなり、ヒトサイトメガロウィルスのｐｐ６５タンパク質の完全配列を包含するペプチドプールである。
【０１１５】
本発明の態様において、開示は、本発明の方法から得られるかまたは得られる可能性があるＴ細胞生成物に及ぶ。
【０１１６】
一態様では、本開示は、ウィルス特異的拡大Ｔ細胞生成物に及ぶ。
【０１１７】
一実施形態では、本開示は、骨髄移植片または末梢幹細胞移植片を受容後、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週間、またはそれ以上後に、本発明の開示によるＴ細胞生成物、またはそれを含む組成物で患者を処置するかまたは予防することを包含する。
【０１１８】
本明細書中で言及される引用文および文書はすべて、参照により具体的に援用される。文献および特許文書への参照はすべて、参照により援用される。
【０１１９】
全体として含むことは、本発明の状況においては、全体の一部として含むことを意味する。
【０１２０】
上記は、ある種の完全体を含む実施形態である。上記の本発明の実施形態は、技術的に適切である場合、組み合わされ得る。本発明の開示は、本明細書中に記載されるような上記の完全体からなる対応する実施形態にも及ぶ。
実施例
実施例１
血液ドナーおよび細胞調製
【０１２１】
３〜５時間白血球アフェレシス後に、Ｇ-ＣＳＦ動員および非動員健常ドナーの両方からの血液試料を得た。ヘルシンキ宣言に従ってインフォームド・コンセントを得て、試験は、Ｒｏｙａｌ  Ｆｒｅｅ  ＮＨＳ  Ｔｒｕｓｔ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｒｅｖｉｅｗ  ｂｏａｒｄにより承認された。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、フィコール（Ａｘｉｓ  Ｓｈｉｅｌｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）密度勾配分離を用いて生成し、そして１％抗生物質（Ｇｉｂｃｏ）および１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清（Ｂｉｏｓｅｒａ）を１×１０７／ｍｌの濃度で補足したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。過剰量のＰＢＭＣを、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）４．５％（Ｂｉｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）（フィーダー細胞の将来的供給源として２０％ＤＭＳＯ（ＷａｋＣｈｅｍｉｅ）を含有）とともに１：１で凍結保存した。ＣＭＶｐｐ６５  Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を有する６ウェル培養プレート（Ｎｕｎｃ）中で、３７°Ｃ／５％ＣＯ２で、２４時間までの間、ＰＢＭＣを刺激した。ＣＤ１５４実験に関しては、１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の存在下で、培養を刺激した。
フローサイトメトリー解析
【０１２２】
フローサイトメトリー実験は４〜６カラーパネルで構成されたが、この場合、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーター（Ｃｙｔｅｋ  ＵＫ）でのＦＳＣおよびＳＳＣシグナルを用いて、生存可能リンパ球のゲート制御後に、最小で５０，０００のＣＤ３＋を獲得し、そしてＦｌｏｗＪｏバージョン７．６（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いてデータを解析した。サイトカインおよび活性化マーカーのアイソタイプ対照染色に関しては、ＰＥ結合型マウスＩｇＧ１  κ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。細胞を暗所で１５分間染色し、２ｍｌのＨＢＳＳ中で５分間洗浄して、２００μｌのＦＡＣＳ  Ｆｌｏｗ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）中に再懸濁した後、獲得した。ＣＭＶｐｐ６５刺激および非刺激ＰＢＭＣからの上清のサイトカイン解析をＦＡＣＳ  Ａｒｉａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で実施して、最小で２０，０００事象を収集した。
血球計数ビーズアレイ（ＣＢＡ）によるサイトカイン解析
【０１２３】
動員および非動員ドナーの両方からの１６〜２４時間でのＣＭＶｐｐ６５刺激および非刺激対照培養から上清を収集し、−８０℃で保存した。血球計数ビーズアレイキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）による解析を用いて、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦのレベルを定量した。ＦＣＡＰ  Ａｒｒａｙソフトウェア  バージョン１．０．１（Ｓｏｆｔ  Ｆｌｏｗ  Ｈｕｎｇａｒｙ  Ｌｔｄ．）を用いて、得られたデータの解析を実施した。
経時的検定
【０１２４】
動員および非動員ドナーから単離されたＰＢＭＣを、９６ウェルプレート中で、１×１０７／ｍｌの濃度で、２４時間、ＣＭＶｐｐ６５  Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒまたは１μｇ／ｍｌ  ＳＥＢ（Ｓｉｇｍａ）で刺激するか、あるいは何もせずにそのままにしておいた。１、４、６、１６および２４時間で試料を採取して、ＡＰＣ−結合型抗ＣＤ３、ＦＩＴＣ−結合型抗ＣＤ４、ＰｅｒＣＰ−結合型抗ＣＤ８、およびいずれかのＰＥ−結合型抗ＣＤ１５４、抗ＣＤ２５およびＣＤ６９または抗ＣＤ１３７（すべて、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。
抗原特異的Ｔ細胞の単離
【０１２５】
ＣＭＶｐｐ６５刺激後の抗原特異的Ｔ細胞の単離のために、１６時間後にＰＥ結合型抗ＣＤ２５で、または６時間後にＰＥ結合型抗ＣＤ１５４で（ともに、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、細胞を染色した。１００μｌのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液中の抗体／１０７細胞  １０μｌを用いて、２０分間、標識化を実施した。８０μｌのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ緩衝液中でＰＥ結合型マイクロビーズ（２０μｌ／１０７細胞）とともに２０分間インキュベーション後、ＭｉｎｉＭＡＣＳ上でＭＳカラムを用いて（すべて、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、細胞懸濁液を濃化した。インキュベーションステップはすべて、暗所で４〜８℃で実施した。抗原特異的Ｔ細胞を、さらにまた、メーカーの推奨（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に従って、ＩＦＮ−γ分泌検定を用いて単離した。単離は、ＣＤ１５４およびＣＤ２５分離のものと同一であった。
【０１２６】
これを、定常状態特異性マーカー、例えば特異的Ｔ細胞受容体においても実施し、それにより、Ｓｔａｇｅ／ＩＢＡ生成物−ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒｓを、選択試薬として、選択のためにＣｌｉｎｉＭＡＣＳを用いて臨床規模で用いた。
抗原特異的Ｔ細胞株の拡大
【０１２７】
６時間インキュベーション後、１０％ヒトＡＢ血清、１％抗生物質を含有し、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７およびＩＬ−１５（Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｉｘ）を補足されたＲＰＭＩ  １６４０培地を有する２４ウェルプレート中で、フィーダー細胞として作用するよう、５０：１  γ−照射（３０Ｇｙ）自系ＰＢＭＣの存在下で、０．２５×１０６単離ＣＤ１５４＋細胞に育て上げた。培地を、２〜３日毎に補充して、必要な場合には、細胞を分割した。細胞を、最大で２３日まで拡大させた後、収穫した。
【０１２８】
拡大前に細胞を選択しなかった場合、Ｇ−ｒｅｘ１０拡大系（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ）で、２０ｍｌ中に、２×１０ｅ６  ＰＢＭＣ／ｍｌで細胞を植え付けた。細胞を、特定のペプチド、ＩＬ−４およびＩＬ−７とともにＲＰＭＩ  １０％ヒト血清中に植え付けて、１０日間、そのまま何もせずに培養した。
拡大抗原特異的Ｔ細胞株の再刺激
【０１２９】
ＣＭＶｐｐ６５  Ｐｅｐｔｉａｖｔｏｒ、ＣＭＶ  ＩＥ−１  （ＪＰＴ）負荷自系ＰＢＭＣまたは対照として手を付けていない自系ＰＢＭＣ（すべて、１μＭ  ＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ）で標識）を２．５：１の比率で用いて、４８ウェルプレート中で１×１０７／ｍｌの濃度で、５〜６時間の期間、拡大細胞を再刺激した。細胞内サイトカインおよびＣＤ１５４の分析のために、抗ＣＤ２８抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下で細胞をインキュベートし、２時間後に、１μｇ／ｍｌのブレフェルジンＡ（Ｓｉｇｍａ）を付加した。細胞を固定し、メーカーの使用説明書に従ってイントラステイン（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ）を用いて透過性にして、ＡＰＣ結合型抗ＣＤ１５４、ＰｅｒＣＰ結合型抗ＣＤ４、いずれかのＰＥ−結合型抗ＩＬ-２および抗ＴＮＦまたは抗ＩＦＮ-γ（すべて、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。表面染色のために、細胞を抗ＣＤ４０抗体の存在下でインキュベートし、次いで、ＦＩＴＣ結合型抗ＣＤ４、ＰＥ結合型抗ＣＤ１５４、ＰｅｒＣＰ結合型抗ＣＤ８、ＡＰＣ結合型抗ＣＤ３およびＡＰＣ  Ｃｙ７結合型ＣＤ６９（すべて、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、１０分間染色した。
細胞傷害性検定
【０１３０】
自系ＰＢＭＣを３μｇ／ｍｌのＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ）で２４時間、次に、２０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で、１×１０６／ｍｌの濃度で、ＲＰＭＩ  １６４０（１０％ＡＢ血清を有する）中で、刺激した。次に、ＰＨＡ芽球に、ＣＭＶｐｐ６５  Ｐｅｐｔｉｖａｔｏｒを負荷して、標的細胞として用いた。負荷標的細胞を、カルセイン−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で、１０μＭの濃度で標識して、３７℃で１時間インキュベートした。完全培地中で４回洗浄後、細胞を７×１０４／ｍｌに調整して、Ｕ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、三重反復実験で、２０：１〜０．５：１の範囲のＥ：Ｔで、エフェクター細胞に付加した。三つ組ウェルも設定して、自発的放出（標的細胞のみ）、最大放出（標的細胞＋２％トリトンＸ−１００）および培地単独を測定した。３７℃／５％ＣＯ２で４時間のインキュベーション後、１００μｌの上清を収穫して、新しいプレートに移した。ＢＭＧ  ＦＬＵＯｓｔａｒ  Ｇａｌａｘｙマイクロプレート蛍光分光計（ＭＴＸ  Ｌａｂ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）（励起フィルター：４８５±９ｎｍ：帯域通過フィルター：５３０±９ｎｍ）を用いて、試料を測定した。データを、随意蛍光単位（ＡＦＵ）として表して、溶解パーセントを、式［（試験放出−自発的放出／最大放出−自発的放出）×１００］を用いて算定した。
統計学的分析
【０１３１】
ＡＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ４．０を用いて、分析を実行した。ノンパラメトリック・マン・ホイットニー検定を用いて、Ｇ−ＣＳＦ動員および非動員ＰＢＭＣ間の統計学的有意、ならびにＣＤ１５４発現に及ぼすＣＤ４０遮断の影響を分析するためのペアドｔ検定を確定した。統計学的有意は、Ｐが０．０５未満である場合に、達成された。
結果
ＣＭＶｐｐ６５刺激Ｇ-ＣＳＦ動員ＰＢＭＣのサイトカインプロフィル
【０１３２】
初期実験は、Ｇ-ＣＳＦ動員ＰＢＭＣからのＣＭＶｐｐ６５刺激ＰＢＭＣのサイトカインプロフィルを検査して、非動員ＰＢＭＣとの等価が存在するか否かを確定することを目指した。ＣＭＶ＋健常個体からのＰＢＭＣを、１６時間培養においてＣＭＶｐｐ６５重複ペプチドで刺激した。１６時間後、上清のアリコートを、刺激および手つかずのままの培養から採取し、−８０℃で凍結させた。フローサイトメトリーベースの検定、サイトカインビーズアレイ（ＣＢＡ）を用いて、培養期間中のサイトカイン放出に関して上清を検定した。ＩＬ−２、ＴＮＦ、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１０、ＩＬ−４およびＩＬ−５分泌を、分析した（図１）。Ｇ−ＣＳＦ動員および非動員ＰＢＭＣ間で、ＴＨ１サイトカインＩＬ−２、ＴＮＦおよびＩＦＮ−γに関して有意差は観察されなかったが、しかし、Ｇ−ＣＳＦ動員ＰＢＭＣからのＩＬ-１０分泌において有意の減少（Ｐ＝０．０１）が検出され、この傾向は、低レベルのＩＬ−４およびＩＬ−５分泌においても明らかであった。
【０１３３】
次に、非動員ＰＢＭＣからのＣＭＶ特異的Ｔ細胞の製造のために依然この系を用いたように、ＩＦＮ-γ分泌に基づいてＧ-ＣＳＦ動員ＰＢＭＣからＣＭＶ特異的Ｔ細胞が単離され得るか否かを評価し、それらの臨床的効力を実証した。ＣＭＶｐｐ６５刺激に応答してＩＦＮ-γを分泌する細胞を、ＩＦＮ−γ特異的抗体を用いて捕捉し、磁気ビーズを用いて選択した。磁気的濃化の前および後にＩＦＮ−γを測定して、動員および非動員ＰＢＭＣ間の純度および収率を査定した。有意ではないが、ＩＦＮ−γ分泌はＣＭＶｐｐ６５刺激後に減少し（図２Ａ）、そして純度および収率（図２Ｂ）も、Ｇ−ＣＳＦ動員ＰＢＭＣにおいて負の影響を及ぼされる、ということを示した。ＣＤ４＋対ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ分泌細胞の比は、Ｇ−ＣＳＦ動員ＰＢＭＣにおいては変わらないように見えた。要するに、Ｇ−ＣＳＦ動員ＰＢＭＣからのＰＢＭＣは、非動員ＰＢＭＣと同様のレベルでＩＦＮ−γおよびその他のエフェクターサイトカインを分泌し得るが、しかし、ＣＭＶｐｐ６５刺激後の細胞当たりの単離および検出は、減損されると思われる。これらの結果は、従来の発表済みデータと一致しており、このことは、Ｇ−ＣＳＦ動員が、単一細胞レベルでＩＦＮ-γ産生に関する能力を減損する、ということを示唆している。
ＣＭＶｐｐ６５刺激後の活性化マーカー発現の解析
【０１３４】
次に、Ｇ−ＣＳＦ動員ＰＢＭＣにおけるＣＭＶｐｐ６５特異的Ｔ細胞に関する活性化誘導性ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１５４およびＣＤ１３７発現の動力学を調べて、非動員ＰＢＭＣと比較した場合の刺激の最適持続時間を確定した。２４時間の期間に亘って、ＣＭＶｐｐ６５ペプチドでＰＢＭＣを刺激して、１、４、６、１６および２４時間で培養からＰＢＭＣ集団を取り出して、次に、フローサイトメトリーにより活性化マーカーの表面発現に関して解析した（図３）。ＣＤ２５の抗原誘発性発現は１６時間で最適で、Ｇ−ＣＳＦ動員および非動員ＰＢＭＣにおいて同一強度を有した。ＣＤ６９およびＣＤ１５４は６時間で最適で、両方の発現は、Ｇ−ＣＳＦ動員ＰＢＭＣで高くなった。ＣＤ１３７発現は、２４時間でピーク強度に達し、これもＧ−ＣＳＦ動員ＰＢＭＣで増大された。従来の結果と一致して、ＣＭＶｐｐ６５刺激後１６時間でＧ-ＣＳＦ動員ＰＢＭＣからのＩＦＮ-γ分泌のレベルの低減が観察された。
Ｇ-ＣＳＦ動員ＰＢＭＣにおけるＣＤ１５４の抗原特異的発現の査定
【０１３５】
従来公表済みのデータは、ＣＤ１５４がＣＭＶ特異的Ｔ細胞の検出および単離のための適切なマーカーであることを実証している。したがって、Ｇ−ＣＳＦ動員ＰＢＭＣにおけるＣＤ１５４発現が非動員ＰＢＭＣと一致するか否かを、ＣＤ４０特異的抗体を用いて調べて、ＣＤ４０との結紮を防止することにより、細胞表面にＣＤ１５４を保存した。ＰＢＭＣを、ＣＤ４０特異的抗体の存在下または非存在下で、ＳＥＢまたはＣＭＶｐｐ６５ペプチドで４〜６時間刺激して、次に、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の中でＣＤ１５４発現に関して解析した（図４Ａ）。
【０１３６】
残りのＣＤ＋Ｔ細胞における低バックグラウンドＣＤ１５４発現は、Ｇ−ＣＳＦ動員ＰＢＭＣ（０．３０％）と非動員ＰＢＭＣ（０．２２％）との間で比較可能であった。６時間の最適時点でのＣＤ４０特異的抗体の存在下でのＣＤ１５４発現は、Ｇ−ＣＳＦ動員ＰＢＭＣ（１．８６％）と非動員ＰＢＭＣ（１．２２％）との間に統計学的有意差はないことを示したが、しかし実際、Ｇ−ＣＳＦ動員ドナー設定において増大され（図４Ｂ〜Ｃ）、いかなる非特異的活性化誘導性ＣＤ１５４発現も伴わなかった。
ＣＤ１５４発現によるＧ−ＣＳＦ動員および非動員ＰＢＭＣからの抗原特異的Ｔ細胞の単離
【０１３７】
次に、Ｇ-ＣＳＦ動員および非動員ＰＢＭＣからのＣＤ４０特異的抗体の存在下での、ＣＭＶｐｐ６５刺激ＰＢＭＣの単一濃化ステップ（図５Ａ〜Ｂ）を、４例のＣＭＶ＋健常非対合ドナーにおける磁気細胞分離を用いて、実施した。Ｇ−ＣＳＦ動員（４８．９４％）および非動員（５８．０８％）ＰＢＭＣ間で、ＣＤ１５４＋ＣＭＶ特異的Ｔ細胞の純度における有意差は観察されなかった（図５Ｃ）。その後、ＣＤ１５４陽性分画を、短期培養で拡大させて、単離細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖およびＣＭＶ特異性を確定した。
Ｇ−ＣＳＦ動員ＰＢＭＣからのｉｎ ｖｉｔｒｏ拡大抗原特異的Ｔ細胞の再刺激
【０１３８】
ＣＤ１５４＋ＣＭＶ特異的Ｔ細胞を、自系照射フィーダー細胞の存在下で、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を含有する完全培地中で２１日間に亘って培養した。ＣＤ１５４＋応答体集団は、Ｇ-ＣＳＦ動員ＰＢＭＣ（ｎ＝３）において７４．６倍（４８〜８４の範囲）の平均増幅因子を示したが、これに比して、非増幅ＰＢＭＣ（ｎ＝３）では１０３．６（１８〜１６８の範囲）であった。拡大細胞は、すべての培養において主にＣＤ３＋ＣＤ４＋であった（図６Ａ）。全培養が、自系ＣＭＶｐｐ６５負荷ＰＢＭＣでの再試験時に、ＣＤ１５４＋およびＣＤ６９＋発現の上方調節により確定されたＣＭＶｐｐ６５に関する高い特異性を示した。自系ＰＢＭＣを用いた対照再試験実験では、ｌｏｗ  ｔｏ  ｕｎｄｅｔｅｃｔａｂｌｅ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  観察されたＣＤ１５４発現のレベルは低いかまたは非検出であった（図６Ｂ）。Ｇ−ＣＳＦ動員ＰＢＭＣから拡大された細胞における再試験時のＣＤ１５４＋ＣＤ６９＋発現の上方調節において増大が観察されたが（平均９３．１３％）、これに比して、フローサイトメトリー解析後の非動員ＰＢＭＣは平均で６３．０％であった（図６Ｃ）。いくつかの実験において、拡大細胞をＣＭＶ  ＩＥ−１ペプチドで再試験したが、ＣＤ１５４活性化は観察されず、これが、特異性を確証した（データは示されていない）。
【０１３９】
拡大細胞の機能性を解析するために、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）により、ＩＬ−２、ＴＮＦおよびＩＦＮ−γの産生に関しても試験した（図６Ｄ）。拡大細胞は、３つのサイトカインすべてを合成し、分泌することができたが、しかし主にＩＦＮ−γであった。拡大細胞を刺激しないかまたはＣＭＶ  ＩＥ−１ペプチドとともにインキュベートした実験では、最小サイトカイン分泌が観察された。Ｇ-ＣＳＦ動員ＰＢＭＣと非動員ＰＢＭＣとの間に、ＩＬ−２、ＴＮＦまたはＩＦＮ−γ分泌における有意差は検出されなかった（図６Ｅ）。ＣＤ１５４検定は、Ｇ-ＣＳＦ動員ＰＢＭＣからの拡大可能および機能的ＣＭＶ特異的Ｔ細胞の両方の特異的単離を可能にし、これは非動員ＰＢＭＣにおける公表済みデータと等価である、ということが実証された。
拡大細胞の細胞傷害活性
【０１４０】
最後に、Ｇ-ＣＳＦ動員ＰＢＭＣから単離された拡大ＣＤ１５４＋ＣＭＶ特異的Ｔ細胞が、標的細胞を溶解し得るか否かを調べた。ＣＭＶｐｐ６５ペプチドを負荷され、カルセイン-ＡＭ染料で標識された自系ＰＨＡ芽球を、標的として用いた。標的は、すべてのＥ：Ｔ比率で、拡大細胞により有効に死滅させられた（図７）。
実施例２    ＣＤ３４選択の陰性分画から得られた細胞の解析
【０１４１】
出発材料は、動員ＨＰＣ−Ａ（本明細書中ではアフェレシス試料としても言及される）からのＣＤ３４選択からの陰性分画であった。
【０１４２】
細胞は、密度勾配遠心分離を受けた後、ＡＤＶペプチド、ＩＬ−４およびＩＬ−７とともに１０日間培養された。１０日目に、細胞を収穫し、洗浄し、計数して、用量投与し、凍結保存した。ガンマ産生に関する有効性試験、ならびに純度および生存率に関する表現型分類も実施した。
【０１４３】
１×１０お４よび１×１０５個のＴ細胞／ｋｇの用量を凍結した（１２ｋｇ）。
【０１４４】
ＡＤＶペプチドでの再刺激（放出判定基準状態１％）およびすべての他の放出判定基準（Ｔ細胞純度、生存率、微生物学、マイコプラズマ、内毒素）後のＴ細胞産生ＩＦＮγの７．５６％が基準を満たした。この解析に関する散布図を、図１１に示す。
【０１４５】
対合試料は解析されなかったが、しかし９つの産生実験を各出発材料で実施した。動員および非動員生成物の両方に関する再刺激時のＩＦＮγ産生を、以下の表に示す。
【０１４６】
【表１】
2015505852.tif 000003
実施例３
【０１４７】
図１２および１３のデータは、抗原特異的Ｔ細胞が、動員される元の試料から得られる場合でも機能的である、ということを示す。動員アフェレシス由来ＰＢＭＣを、細胞に取り込まれるＣＦＳＥ−ａ染料で染色し、細胞が分裂すると、細胞の明るさは低減され、これは、フローサイトメトリーにより検出され得る。細胞を、刺激なし（ｎｉｌ）または抗原特異的ペプチドを用いて、３７℃で５日間培養した後、ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ、ＣＤ３、ＣＤ８に関して染色し、フローサイトメーターで調べた。これは、十分な刺激が存在するほど長い間動員されているにも関わらず細胞は増殖し得るし、刺激が存在しなければ増殖しない、すなわち機能を示す、ということを示している。
実施例４    患者の処置
【０１４８】
凍結動員アフェレシス試料からのガンマ捕捉により細胞を選択し、ＣＭＶ網膜炎に伴う難治性ＣＭＶを有する７２Ｋｇ患者の処置（少なくとも２か月）のために用いた。約２２，０００  ＣＭＶ特異的Ｔ細胞の用量を、注入により投与した。処置後、ＣＭＶおよび網膜炎は消散し、患者は退院した。したがって、動員にもかかわらず、投与された細胞は機能的であった。図１４は、いくつかのガンマが前選択集団において産生され、それが、陰性分画では軽減され、陽性分画は、患者に実際に投与された生成物であった、ということを示している。
【図１４】
2015505852.tif 000004
【図１】
2015505852.tif 000005
【図２Ａ】
2015505852.tif 000006
【図２Ｂ】
2015505852.tif 000007
【図３】
2015505852.tif 000008
【図４】
2015505852.tif 000009
【図５】
2015505852.tif 000010
【図６Ａ】
2015505852.tif 000011
【図６Ｂ】
2015505852.tif 000012
【図６Ｃ】
2015505852.tif 000013
【図６Ｄ】
2015505852.tif 000014
【図６Ｅ】
2015505852.tif 000015
【図７】
2015505852.tif 000016
【図８】
2015505852.tif 000017
【図９】
2015505852.tif 000018
【図１０】
2015505852.tif 000019
【図１１】
2015505852.tif 000020
【図１２】
2015505852.tif 000021
【図１３】
2015505852.tif 000022
【配列表】
2015505852000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年8月12日(2014.8.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト療法、例えば造血幹細胞移植後患者のための免疫再構築療法に用いるための、動員血液試料または動員アフェレシスから選択されるか、および／または拡大される治療用Ｔ細胞集団、またはそれを含む薬学的組成物であって、選択が、定常状態マーカーおよび／または活性化マーカーに、任意にその後の拡大に基づいており、あるいは前記拡大が抗原、例えばウィルス抗原の存在下である治療用Ｔ細胞集団またはそれを含む薬学的組成物。
【請求項２】
前記Ｔ細胞集団が抗原特異的Ｔ細胞集団である、請求項１に記載の治療用Ｔ細胞集団またはそれを含む薬学的組成物。
【請求項３】
前記抗原特異的Ｔ細胞集団が、ウィルス、例えば、サイトメガロウィルス、アデノウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、ヒトパピローマウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＢＫウィルス、エプスタイン・バーウィルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウィルスおよびヒトＴリンパ好性ウィルスからなる群から選択されるウィルスからなる群から選択されるウィルスに、例えばサイトメガロウィルスまたはアデノウィルスに特異的である、請求項２に記載の治療用Ｔ細胞集団またはそれを含む薬学的組成物。
【請求項４】
前記集団が、例えば特定のＨＬＡ：ペプチド複合体、特にテトラ、ペンタおよび／またはヘキサＳｔｒｅｐｔａｍｅｒによるＴ細胞受容体の可逆的結紮により、定常状態マーカー、すなわちＴ細胞受容体を基礎にして直接的に選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞集団または薬学的組成物。
【請求項５】
前記活性化マーカーが抗原刺激の結果として上方調節される細胞表面マーカー、例えばＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７およびＣＤ１５４からなる群から選択されるものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞集団または薬学的組成物。
【請求項６】
前記Ｔ細胞生成物が、特に抗原特異的方式で拡大される拡大Ｔ細胞生成物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞集団または薬学的組成物。
【請求項７】
前記集団が、ＣＤ２５マーカーを有する細胞に関して実質的に陰性である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞集団または薬学的組成物。
【請求項８】
前記Ｔ細胞集団が同種異系である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の治療用Ｔ細胞集団または薬学的組成物。
【請求項９】
免疫再構築療法のための医薬品の製造のための、請求項１〜８のいずれかで定義されるような治療用Ｔ細胞集団または薬学的組成物の使用。
【請求項１０】
動員血液または動員アフェレシス試料からのウィルスに特異的である標的Ｔ細胞集団を選択し、および／または拡大する方法であって、選択が、Ｔ細胞の表面の定常状態マーカーまたは活性化マーカーをターゲッティングすることを用い、そして拡大が、特に同種異系ドナーに由来する抗原特異的Ｔ細胞集団の拡大に適した条件を用いる、方法。
【請求項１１】
前記標的抗原が、例えばＤＮＡウィルスまたはＲＮＡウィルスから選択されるウィルス抗原、例えばＤＮＡウィルスである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ウィルスが、サイトメガロウィルス、アデノウィルス、水痘帯状疱疹ウィルス、ヒトパピローマウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、Ｃ型肝炎ウィルス、ＢＫウィルス、エプスタイン・バーウィルス、カポジ肉腫関連ヘルペスウィルスおよびヒトＴリンパ好性ウィルス、例えばサイトメガロウィルスまたはアデノウィルスからなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記定常状態マーカーが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であり、例えば前記Ｔ細胞集団が、直接選択の工程において特定のＨＬＡ：ペプチド複合体によるＴＣＲの可逆的結紮により選択される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記直接選択が、多量体ＨＬＡ：ペプチド複合体、例えばテトラ-、ペンタ-、ヘキサ-およびＳｔｒｅｐｔａｍｅｒを用いる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＨＬＡペプチドまたは多量体が、特定のＨＬＡ型、例えばＡ１、Ａ２、Ｂ７、Ａ２４、Ｂ３５、例えばＡ０２０１またはＢ０７０２を有する、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性化マーカーが、抗原刺激の結果として上方調節される細胞表面マーカー、例えばＣＤ２５、ＣＤ６９、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４およびその組合せから選択されるものである、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｔ細胞集団が、このような活性化マーカーに対して向けられる単量体、二量体または多量体抗体または抗体断片による活性化マーカーの可逆的結紮により選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記定常状態マーカーが、標的ウィルスに関連した刺激に曝露後５〜２５時間、例えば６〜２４時間で発現される、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的Ｔ細胞集団が、特に抗原の存在下で、Ｔ細胞拡大培地中で培養することにより拡大される、請求項１０〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的細胞集団が、定常状態または活性化マーカーによる前もっての選択なしに、動員アフェレシスから選択的に拡大される請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記拡大が迅速拡大工程、例えば１５日以下、例えば１４、１３、１２、１１、１０、９、８または７日、例えば約１０日である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記培地が、拡大期間に亘って、変化しないまま且つ補足されないままである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
請求項１０〜２２のいずれか一項に記載の方法から得られるかまたは獲得可能であるウィルス特異的拡大Ｔ細胞生成物またはそれを含む薬学的組成物。
【国際調査報告】
2015505852.tif 000023
2015505852.tif 000024