(57)【要約】  クラミジア・トラコマチス(CT)およびナイセリア・ゴノレア(NG)を検出するための組成物および方法が提供される。本発明はまた、ゲノムコピー数に基づいて感染/炎症に関してスクリーニングするための方法および組成物も提供する。ゲノムコピー数の指標に関して哺乳動物の泌尿生殖路から得たサンプルをアッセイする工程を伴い、コントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高いゲノムコピー数のレベルは泌尿生殖路の感染または炎症の存在を示す、方法が本願に記載される。また、ゲノムコピー数の指標を検出もしくは配列決定するためのプライマーおよび/またはプローブであって、ゲノムコピー数の指標は、1コピーまたは2コピーで哺乳動物のゲノム中に存在すると思われる核酸配列を含むプライマーおよび/またはプローブ、ならびに泌尿生殖路に感染する病原体もしくは炎症に関連するmiRNAを示す核酸配列を検出するもしくは配列決定するためのプライマーおよび/またはプローブを含む本発明のキットも記載される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
泌尿生殖路の感染または炎症に関する哺乳動物のスクリーニング方法であって、ゲノムコピー数の指標に関して哺乳動物の泌尿生殖路から得たサンプルをアッセイする工程を含み、コントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高いゲノムコピー数のレベルは泌尿生殖路の感染または炎症の存在を示す、方法。
【請求項２】
ゲノムコピー数の複数の指標に関してサンプルをアッセイする工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ゲノムコピー数の指標は、1コピーまたは2コピーで哺乳動物のゲノム中に存在すると思われる核酸配列を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
ゲノムコピー数の指標は、ヒドロキシメチルビランシンターゼ(HMBS)核酸配列、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)核酸配列、ベータ-アクチン核酸配列およびベータ-グロビン核酸配列から成る群から選択される核酸配列を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ゲノムコピー数の指標はHBMS核酸配列を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記アッセイする工程は、核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーションおよび/または核酸配列決定を含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記アッセイする工程は核酸増幅を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
核酸増幅はリアルタイムPCRを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
ゲノムコピー数の指標はHBMS配列を含み、HBMS配列は、配列番号113を含むプライマーおよび配列番号114を含むプライマーを使用して増幅される、請求項7または8に記載の方法。
【請求項１０】
プライマーにより増幅されるアンプリコンを、プローブを使用して検出する、請求項7から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ゲノムコピー数の指標はHBMS核酸配列を含み、プローブは配列番号115を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記アッセイする工程は、サンプルの核酸に少なくとも1種のプローブを厳密な条件下でハイブリダイズさせる工程を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１３】
プローブは基質上に固定されている、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記アッセイする工程は核酸配列決定を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１５】
核酸配列決定は高スループットDNA配列決定を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物はヒトである、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物は雄である、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物は雌である、請求項1から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物は、泌尿生殖器の感染または炎症の少なくとも1種の臨床症状を有すると同定されている、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物は、過去に性行為感染症を有していたものである、請求項1から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物は、前立腺癌の指標として前立腺特異的抗原(PSA)に関して検査されており、生検の候補であるように十分に上昇したPSAレベルを有することが分かっているヒト雄である、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高い場合、上昇したPSAが癌ではなく感染に起因する可能性があるものとして哺乳動物を同定する工程を更に含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
感染が除外または消散される後まで生検を延期する工程を更に含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
病原体に関して哺乳動物からの同じもしくは異なるサンプルの1種もしくは複数の更なるアッセイを実施する工程または1種もしくは複数の更なるアッセイを実施させる工程を更に含む、請求項22または23に記載の方法。
【請求項２５】
ゲノムコピー数の指標に関して哺乳動物の泌尿生殖路から得たサンプルの第2のアッセイを実施する工程または第2のアッセイを実施させる工程を更に含む、請求項22から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
感染に関して哺乳動物を治療する工程を更に含む、請求項22から25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
最初のアッセイにおいて、サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高かった場合、および第2のアッセイにおいて、サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベル以下である場合、第2のPSA検査を実施する工程を更に含む、請求項25に記載の方法。
【請求項２８】
サンプルは、尿サンプル、尿道スワブサンプル、膣スワブサンプルおよび子宮頸管スワブサンプルから成る群から選択されるサンプルを含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
病原体を示す核酸配列の存在に関して哺乳動物からのサンプルをアッセイする工程を更に含む、請求項1から28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
病原体は、クラミジア・トラコマチス(CT)およびナイセリア・ゴノレア(NG)から成る群から選択される病原体を含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
炎症に関連するマイクロRNA(miRNA)の存在および/またはレベルに関して哺乳動物からのサンプルをアッセイする工程を更に含む、請求項1から30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
1コピーまたは2コピーで哺乳動物のゲノム中に存在すると思われる核酸配列および病原体またはmiRNAを示す核酸配列それぞれに関して同じサンプルを同時にアッセイする、請求項29または31に記載の方法。
【請求項３３】
アッセイを、マルチプレックスリアルタイムPCRを使用して実行する、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高い場合、泌尿生殖路の感染または炎症を有する可能性があるものとして哺乳動物を同定する工程を更に含む、請求項1から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
サンプルがクラミジア・トラコマチス(CT)および/またはナイセリア・ゴノレア(NG)に関して陽性である場合ならびにサンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高い場合、哺乳動物をCTまたはNGそれぞれに感染しているものとして同定する、請求項30に記載の方法。
【請求項３６】
サンプルがクラミジア・トラコマチス(CT)および/またはナイセリア・ゴノレア(NG)に関して陰性である場合ならびにサンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高い場合、哺乳動物を、異なる病原体が感染している可能性があるまたは感染に起因しない泌尿生殖路の炎症を有する可能性があるものとして同定する、請求項30に記載の方法。
【請求項３７】
アッセイの結果および/またはアッセイの結果に少なくとも部分的に基づく診断を患者の診療記録に記録する工程を更に含む、請求項1から36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記記録する工程は、アッセイの結果または診断をコンピュータ可読媒体に記録する工程を含む、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
前記患者の診療記録を、検査室、医師のオフィス、病院、健康保険維持機構、保険会社または個人の医療記録ウエブサイトにより保存する、請求項37に記載の方法。
【請求項４０】
1種もしくは複数の更なるアッセイもしくは検査を実施する工程または1種もしくは複数の更なるアッセイもしくは検査を実施させる工程を更に含む、請求項1から23、28から36、38および39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
サンプル中のゲノムコピー数のレベルはコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高く、更なるアッセイは病原体に関する哺乳動物からの同じまたは異なるサンプルのアッセイを含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
更なるアッセイは、クラミジア・トラコマチス(CT)、ナイセリア・ゴノレア(NG)、マイコプラズマ、ウレアプラズマおよびトリコモナスから成る群から選択される1種または複数の病原体に関するアッセイを含む、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
サンプル中のゲノムコピー数のレベルはコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高く、更なるアッセイは、自己免疫性尿道炎、前立腺炎、膀胱癌、前立腺癌、腎臓癌から成る群から選択される状態に関する哺乳動物からの同じまたは異なるサンプルのアッセイまたは前記状態に関する哺乳動物の検査を含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも2種の更なるアッセイを実施し、ゲノムコピー数のレベルの経時的な任意の変化をモニタリングする、請求項40に記載の方法。
【請求項４５】
少なくとも2種の更なるアッセイを実施し、1種または複数の臨床症状の出現または経時的な任意の変化をモニタリングする、請求項40に記載の方法。
【請求項４６】
(a)請求項1から45のいずれか一項に記載の方法からの結果を受け取る工程、ならびに
(b)泌尿生殖路の感染もしくは炎症に関する療法を開始するおよび/もしくは変更する工程または療法を開始させるおよび/もしくは変更させる工程
を含む、泌尿生殖路の感染または炎症に関する哺乳動物の治療方法。
【請求項４７】
前記結果を、泌尿生殖路の感染または炎症の種類に対して異なる診断を行うのに用いる、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
ゲノムコピー数の指標を検出もしくは配列決定するためのプライマーおよび/またはプローブであって、ゲノムコピー数の指標は、1コピーまたは2コピーで哺乳動物のゲノム中に存在すると思われる核酸配列を含む、プライマーおよび/またはプローブ、ならびに
泌尿生殖路に感染する病原体を示す核酸配列もしくは炎症に関連するmiRNAを検出もしくは配列決定するためのプライマーおよび/またはプローブ
を含むキット。
【請求項４９】
ゲノムコピー数の複数の指標それぞれを検出もしくは配列決定するためのプライマーおよび/またはプローブを含む、請求項48に記載のキット。
【請求項５０】
ゲノムコピー数の指標は、ヒドロキシメチルビランシンターゼ(HMBS)核酸配列、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)核酸配列、ベータ-アクチン核酸配列およびベータ-グロビン核酸配列から成る群から選択される核酸配列を含む、請求項48または49に記載のキット。
【請求項５１】
ゲノムコピー数の指標はHBMS核酸配列を含む、請求項48から50のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５２】
ゲノムコピー数の指標はHBMS配列を含み、キットは、配列番号113を含むプライマーおよび配列番号114を含むプライマーを含む、請求項48から51のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５３】
ゲノムコピー数の指標はHBMS配列を含み、キットは、配列番号115を含むプローブを含む、請求項48から52のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５４】
基質上に固定されている複数のプローブを含む、請求項48から51のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５５】
泌尿生殖路に感染する病原体を示す核酸配列を検出もしくは配列決定するためのプライマーおよび/またはプローブを含む、請求項48から54のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５６】
病原体は、クラミジア・トラコマチス(CT)およびナイセリア・ゴノレア(NG)から成る群から選択される、請求項55に記載のキット。
【請求項５７】
炎症に関連するmiRNAを検出もしくは配列決定するためのプライマーおよび/またはプローブを含む、請求項48から56のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５８】
尿サンプル用の、または尿道スワブサンプル、膣スワブサンプルもしくは子宮頸管スワブサンプルを採取するためのスワブ用の容器を含む、請求項48から55のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５９】
対象からのサンプル中におけるクラミジア・トラコマチス(CT)およびナイセリア・ゴノレア(NG)の検出方法であって、サンプル中における、配列番号2の配列を含む第1の遺伝子の存在を検出する工程、配列番号4の配列を含む第2の遺伝子の存在を検出する工程、ならびに配列番号7の配列を含む遺伝子および配列番号8の配列を含む遺伝子から選択される第3の遺伝子の存在を検出する工程を含み、第1の遺伝子および第2の遺伝子の存在はサンプルがNGを含有することを示し、第3の遺伝子の存在はサンプルがCTを含有することを示す、方法。
【請求項６０】
第3の遺伝子は配列番号7の配列を含む、請求項59に記載の方法。
【請求項６１】
内因性コントロールを検出する工程を更に含む、請求項59または60に記載の方法。
【請求項６２】
内因性コントロールは、HMBS核酸配列、GAPDH核酸配列、ベータ-アクチン核酸配列および/またはベータ-グロビン核酸配列を含む核酸配列を含む、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
内因性コントロールはHMBS核酸配列を含む、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
外因性コントロールを検出する工程を更に含む、請求項59から63のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
外因性コントロールは細菌のDNA配列を含む、請求項64に記載の方法。
【請求項６６】
遺伝子の存在を検出する工程はリアルタイムPCRを含む、請求項59から65のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
サンプルからのDNAと、第1の遺伝子を検出するための第1のプライマー対、第2の遺伝子を検出するための第2のプライマー対および第3の遺伝子を検出するための第3のプライマー対とを接触させる工程を含む、請求項59から66のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
第1のプライマー対は、配列番号32の配列を有するプライマーおよび配列番号33の配列を有するプライマーを含み、第2のプライマー対は、配列番号47の配列を有するプライマーおよび配列番号48の配列を有するプライマーを含み、第3のプライマー対は、配列番号71の配列を有するプライマーおよび配列番号72の配列を有するプライマーを含む、請求項67に記載の方法。
【請求項６９】
サンプルからのDNAと内因性コントロールを検出するための第4のプライマー対とを接触させる工程を更に含む、請求項67または68に記載の方法。
【請求項７０】
第4のプライマー対はHMBSを検出するためのものである、請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
第4のプライマー対は、配列番号113の配列を有するプライマーおよび配列番号114の配列を有するプライマーを含む、請求項70に記載の方法。
【請求項７２】
サンプルからのDNAと外因性コントロールを検出するための第5のプライマー対とを接触させる工程を更に含む、請求項67から71のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
外因性コントロールは細菌のDNA配列を含む、請求項72に記載の方法。
【請求項７４】
サンプルからのDNAと、第1の遺伝子からのアンプリコンを検出するための第1のプローブ、第2の遺伝子からのアンプリコンを検出するための第2のプローブおよび第3の遺伝子からのアンプリコンを検出するための第3のプローブとを接触させる工程を含む、請求項67から73のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
第1のプローブは配列番号34の配列を有し、第2のプローブは配列番号49の配列を有し、第3のプローブは配列番号73の配列を有する、請求項74に記載の方法。
【請求項７６】
各プローブは色素を含み、各色素は他の前記色素と検出可能な程度に異なる、請求項74または75に記載の方法。
【請求項７７】
各プローブは蛍光色素およびクエンチャー分子を含む、請求項76に記載の方法。
【請求項７８】
サンプルからのDNAと内因性コントロールからのアンプリコンを検出するための第4のプローブとを接触させる工程を含む、請求項74から77のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
内因性コントロールは、HMBS核酸配列、GAPDH核酸配列、ベータ-アクチン核酸配列および/またはベータ-グロビン核酸配列を含む核酸配列を含む、請求項78に記載の方法。
【請求項８０】
内因性コントロールはHMBS核酸配列を含む、請求項79に記載の方法。
【請求項８１】
第4のプローブは配列番号115の配列を有する、請求項80に記載の方法。
【請求項８２】
第4のプローブは、第1、第2および第3のプローブの色素と検出可能な程度に異なる色素を含む、請求項78から81のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
第4のプローブは蛍光色素およびクエンチャー分子を含む、請求項82に記載の方法。
【請求項８４】
サンプルからのDNAと外因性コントロールからのアンプリコンを検出するための第5のプローブとを接触させる工程を含む、請求項74から83のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
外因性コントロールは細菌のDNA配列を含む、請求項84に記載の方法。
【請求項８６】
第1、第2および第3の遺伝子を単一の多重反応で検出する、請求項59から85のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
内因性コントロールを、第1、第2および第3の遺伝子と同じ多重反応で検出する、請求項86に記載の方法。
【請求項８８】
外因性コントロールを、第1、第2および第3の遺伝子と同じ多重反応で検出する、請求項86または87に記載の方法。
【請求項８９】
サンプルは、尿サンプル、尿道スワブサンプル、膣スワブサンプル、子宮頸管スワブサンプル、口咽頭スワブサンプル、直腸スワブサンプルまたは眼スワブサンプルを含む、請求項59から88のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
サンプルは、尿サンプル、尿道スワブサンプル、膣スワブサンプルまたは子宮頸管スワブサンプルを含む、請求項89に記載の方法。
【請求項９１】
検出する工程はリアルタイムPCRを含み、サンプルからのDNAを、DNAをプライマーと接触させる前に第1の変性工程にかける、請求項59から90のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
サンプルからのDNAを、DNAをプライマーと接触させた後に第2の変性工程にかける、請求項91に記載の方法。
【請求項９３】
対象は性感染症の病歴を有する、請求項59から92のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
プライマー対のセットを含む組成物であって、プライマー対のセットは、配列番号2の配列を含む第1の遺伝子を検出するための第1のプライマー対、配列番号4の配列を含む第2の遺伝子を検出するための第2のプライマー対、ならびに配列番号7の配列を含む遺伝子および配列番号8の配列を含む遺伝子から選択される第3の遺伝子を検出するための第3のプライマー対を含む、組成物。
【請求項９５】
第3の遺伝子は配列番号7の配列を含む、請求項94に記載の組成物。
【請求項９６】
第1のプライマー対は、配列番号32の配列を有するプライマーおよび配列番号33の配列を有するプライマーを含み、第2のプライマー対は、配列番号47の配列を有するプライマーおよび配列番号48の配列を有するプライマーを含み、第3のプライマー対は、配列番号71の配列を有するプライマーおよび配列番号72の配列を有するプライマーを含む、請求項95に記載の組成物。
【請求項９７】
組成物はプローブのセットを更に含み、プローブのセットは、第1の遺伝子からのアンプリコンを検出するための第1のプローブ、第2の遺伝子からのアンプリコンを検出するための第2のプローブおよび第3の遺伝子からのアンプリコンを検出するための第3のプローブを含む、請求項94から96のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９８】
第1のプローブは配列番号34の配列を有し、第2のプローブは配列番号49の配列を有し、第3のプローブは配列番号73の配列を有する、請求項97に記載の組成物。
【請求項９９】
各プローブは色素を含み、各色素は他の前記色素と検出可能な程度に異なる、請求項98に記載の組成物。
【請求項１００】
各プローブは蛍光色素およびクエンチャー分子を含む、請求項99に記載の組成物。
【請求項１０１】
内因性コントロールからのアンプリコンを検出するための第4のプローブを含む、請求項94から100のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０２】
内因性コントロールは、HMBS核酸配列、GAPDH核酸配列、ベータ-アクチン核酸配列および/またはベータ-グロビン核酸配列を含む核酸配列を含む、請求項101に記載の組成物。
【請求項１０３】
内因性コントロールはHMBS核酸配列を含む、請求項102に記載の組成物。
【請求項１０４】
プローブは配列番号115の配列を有する、請求項103に記載の組成物。
【請求項１０５】
第4のプローブは、第1、第2および第3のプローブの色素と検出可能な程度に異なる色素を含む、請求項101から104のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０６】
第4のプローブは蛍光色素およびクエンチャー分子を含む、請求項105に記載の組成物。
【請求項１０７】
凍結乾燥組成物である、請求項94から106のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０８】
溶液である、請求項94から106のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０９】
CTおよびNGに関して検査している対象からのサンプルからのDNAを更に含む、請求項108に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連する出願への相互参照
本出願は、2012年5月23日に出願された米国仮出願第61/650,969号、2012年5月24日に出願された米国仮出願第61/651,525号および2012年9月21日に出願された米国仮出願第61/704,352号の利益を主張し、これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
２．連邦支援の研究開発の下でなされた発明に対する権利に関する陳述
適用されない。
【０００３】
３．本発明の技術分野
本発明は一般に、分子診断学の領域に関する。クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)(CT)およびナイセリア・ゴノレア(Neisseria gonorrhoeae)(NG)を検出するための組成物および方法が提供される。具体的には、CTおよびNGの検出に有用なCTマーカーおよびNGマーカーならびにマーカーのパネルが提供される。加えて、本発明は、ゲノムコピー数に基づいて感染/炎症に関してスクリーニングするための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
４．本発明の背景
クラミジア・トラコマチス(CT)は、グラム陰性菌のクラミジア科における3つの種の内の1つである。CTは偏性細胞内病原体であり、CTのホスト細胞内でのみ繁殖することができる。CTには少なくとも2つの次亜種が、即ちトラコーマおよび鼠径リンパ肉芽腫症(LGV)が含まれる。トラコーマ次亜種には、主に粘膜の上皮細胞中で感染する少なくとも14種の血清型が含まれる。LGVには、リンパ組織へ浸潤することができる少なくとも4種の血清型が含まれる。毎年、推定3百万人がCT感染しており、その大部分は無症状である。米国では、2006年での全国のCT感染率は100,000人当たり348例であり、2005年から5.6%増加した。
【０００５】
ナイセリア・ゴノレア(NG)は、グラム陰性でオキシダーゼ陽性の双球菌である。毎年、推定700,000人がNG感染している。米国におけるNG感染率も2005年から2006年に5%を超えて増加し、即ち100,000人当たり約121例に増加した。NG感染の症状は感染部位によって異なるが、感染した女性の大部分および感染した男性のかなりの割合は無症状である。
【０００６】
治療せずに放置する場合、CT感染およびNG感染の両方とも、女性では骨盤内炎症性疾患および不妊症を引き起こす可能性があり、男性では尿道炎を引き起こす可能性がある。疾病管理センター(CDC)は現在、26歳未満の性的に活発な全女性に年1回のCTスクリーニングを推奨する。
【０００７】
多くの現在のCT/NG検査は、いくつかの異なる装置を必要とする複雑なアッセイであり、従ってバッチ式で行なわれる。バッチ式の検査はオンデマンドでは行なわれず、従って典型的には数日間は結果が知らされず、この期間中に感染が広がる可能性がある。加えて、主要な検査は、プラスミドに位置するCT遺伝子を検出する。この配列はより高いコピーで存在するが、プラスミドが欠失していたことから検出から漏れた多様体CT株のスウェーデンでの出現および速やかな広がりで実証されたように、この配列はまた、より容易に欠損される。例えばSeth-Smith等、BMC Genomics、10:239頁(2009)を参照。加えて、ナイセリア科の種は近縁関係にあり、いくつかの現在の検査はNGに関する偽陽性率が高い。
【０００８】
ゲノムコピー数分析は通常、対象のサンプルにおける特異的ゲノム座位でのDNAコピー数多型のアッセイにより生成されたデータの分析方法を指す。そのような分析は、癌等の疾患を引き起こす可能性がある、該疾患のリスクを高める可能性がある、または該疾患に関連する可能性がある特異的座位でのコピー数多型の検出に役立つ。蛍光インサイチュハイブリダイゼーション、比較ゲノムハイブリダイゼーションならびにアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション(aCGH)技術およびSNPアレイ技術に基づく高分解能アレイベースの検査等の様々な種類の検査によりコピー数多型を検出することができる。アレイベースの方法は、その分解能特性および高スループット特性の観点から最も効率的であると認められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第6,027,998号
【特許文献２】米国特許第6,605,451号
【特許文献３】WO97/31256
【特許文献４】WO01/92579
【特許文献５】米国特許第5,830,711号
【特許文献６】米国特許第6,027,889号
【特許文献７】米国特許第5,686,243号
【特許文献８】WO0056927A3
【特許文献９】WO9803673A1
【特許文献１０】WO96/17958
【特許文献１１】米国特許第5,234,809号
【特許文献１２】米国特許第5,958,349号
【特許文献１３】米国特許第6,403,037号
【特許文献１４】米国特許第6,440,725号
【特許文献１５】米国特許第6,783,736号
【特許文献１６】米国特許第6,818,185号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Seth-Smith等、BMC Genomics、10:239頁(2009)
【非特許文献２】Ausbel等; PCR Primer: A Laboratory Manual、Diffenbach編、Cold Spring Harbor Press (1995)
【非特許文献３】The Electronic Protocol Book、Chang Bioscience (2002)
【非特許文献４】Msuih等、J. Clin. Micro. 34:501〜07頁(1996)
【非特許文献５】The Nucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley編、Humana Press、Totowa、N.J. (2002)
【非特許文献６】Abramson等、Curr Opin Biotechnol. 1993年2月;4(1):41〜7頁
【非特許文献７】Day等、Genomics、29(1):152〜162頁(1995)
【非特許文献８】Ehrlich等、Science 252:1643〜50頁(1991)
【非特許文献９】Innis等、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Academic Press (1990)
【非特許文献１０】Favis等、Nature Biotechnology 18:561〜64頁(2000)
【非特許文献１１】Rabenau等、Infection 28:97〜102頁(2000)
【非特許文献１２】Belgrader、BaranyおよびLubin、Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay、Sixth International Symposium on Human Identification、1995
【非特許文献１３】promega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.html
【非特許文献１４】LCR Kit Instruction Manual、カタログ番号200520、改訂番号050002、Stratagene、2002
【非特許文献１５】Barany、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:188〜93頁(1991)
【非特許文献１６】BiおよびSambrook、Nucl. Acids Res. 25:2924〜2951頁(1997)
【非特許文献１７】Zirvi等、Nucl. Acid Res. 27:e40i-viii (1999)
【非特許文献１８】Dean等、Proc Natl Acad Sci USA 99:5261〜66頁(2002)
【非特許文献１９】BaranyおよびGelfand、Gene 109:1〜11頁(1991)
【非特許文献２０】Walker等、Nucl. Acid Res. 20:1691〜96頁(1992)
【非特許文献２１】Polstra等、BMC Inf. Dis. 2:18- (2002)
【非特許文献２２】Lage等、Genome Res. 2003年2月;13(2):294〜307頁
【非特許文献２３】Landegren等、Science 241:1077〜80頁(1988)
【非特許文献２４】Demidov, V.、Expert Rev Mol Diagn. 2002年11月;2(6):542〜8頁
【非特許文献２５】Cook等、J Microbiol Methods. 2003年5月;53(2):165〜74頁
【非特許文献２６】Schweitzer等、Curr Opin Biotechnol. 2001年2月;12(1):21〜7頁
【非特許文献２７】Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes  第I部、第2章、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」、Elsevier、NY
【非特許文献２８】SambrookおよびRussell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版)第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Press、NY
【非特許文献２９】Ryan等(2012年4月)「microRNA Regulation of Inflammatory Responses」Annual Review of Immunology 30: 295〜31頁
【非特許文献３０】Frieden, M.等(2008) Curr. Pharm. Des. 14(11):1138〜1142頁
【非特許文献３１】www.genelink.com/newsite/products/mbintro.asp
【非特許文献３２】www.premierbiosoft.com/tech_ notes/Scorpion.html
【発明の概要】
【００１１】
５．本発明の概要
対象からのサンプル中におけるクラミジア・トラコマチス(CT)および/またはナイセリア・ゴノレア(NG)の検出方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中における、配列番号2の配列を含む第1の遺伝子の存在を検出する工程、配列番号4の配列を含む第2の遺伝子の存在を検出する工程、ならびに配列番号7の配列を含む遺伝子および配列番号8の配列を含む遺伝子から選択される第3の遺伝子の存在を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、第1の遺伝子および第2の遺伝子の存在は、サンプルがNGを含有することを示す。いくつかの実施形態では、第3の遺伝子の存在は、サンプルがCTを含有することを示す。いくつかの実施形態では、第3の遺伝子は配列番号7の配列を含む。いくつかの実施形態では、方法は内因性コントロールを検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、内因性コントロールは、HMBS核酸配列、GAPDH核酸配列、ベータ-アクチン核酸配列および/またはベータ-グロビン核酸配列を含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、内因性コントロールはHMBS核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、方法は、外因性コントロールを検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、外因性コントロールは細菌のDNA配列を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、検出方法は核酸増幅を含む。適切な非限定の例示的増幅方法には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写PCR、リアルタイムPCR、ネステッドPCR、マルチプレックスPCR、定量PCR(Q-PCR)、核酸配列ベースの増幅(NASBA)、転写介在増幅(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、ローリングサークル増幅(RCA)および鎖置換増幅(SDA)が含まれ得る。
【００１３】
いくつかの実施形態では、増幅方法は、約1〜約10分にわたる約90℃〜約100℃での最初の変性の後に、約1〜約30秒にわたる約90℃〜約100℃での変性、約1〜約30秒にわたる約55℃〜約75℃でのアニーリングおよび約5〜約60秒にわたる約55℃〜約75℃での伸長を含むサイクルを含む。いくつかの実施形態では、最初の変性後の第1のサイクルに関しては、サイクルの変性工程が省略される。具体的な時間および温度は、増幅させる具体的な核酸配列に依存し、当業者によって容易に決定され得る。
【００１４】
いくつかの実施形態では、遺伝子の存在を検出する工程はリアルタイムPCRを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプルからのDNAと、第1の遺伝子を検出するための第1のプライマー対、第2の遺伝子を検出するための第2のプライマー対および第3の遺伝子を検出するための第3のプライマー対とを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、第1のプライマー対は、配列番号32の配列を有するプライマーおよび配列番号33の配列を有するプライマーを含む。いくつかの実施形態では、第2のプライマー対は、配列番号47の配列を有するプライマーおよび配列番号48の配列を有するプライマーを含む。いくつかの実施形態では、第3のプライマー対は、配列番号71の配列を有するプライマーおよび配列番号72の配列を有するプライマーを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプルからのDNAと内因性コントロールを検出するための第4のプライマー対とを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、第4のプライマー対はHMBSを検出するためのものである。いくつかの実施形態では、第4のプライマー対は、配列番号113の配列を有するプライマーおよび配列番号114の配列を有するプライマーを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプルからのDNAと外因性コントロールを検出するための第5のプライマー対とを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、外因性コントロールは細菌のDNA配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、方法は、サンプルからのDNAと、第1の遺伝子からのアンプリコンを検出するための第1のプローブ、第2の遺伝子からのアンプリコンを検出するための第2のプローブおよび第3の遺伝子からのアンプリコンを検出するための第3のプローブとを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、第1のプローブは配列番号34の配列を有する。いくつかの実施形態では、第2のプローブは配列番号49の配列を有する。いくつかの実施形態では、第3のプローブは配列番号73の配列を有する。いくつかの実施形態では、各プローブは色素を含む。いくつかの実施形態では、各色素は他の前記色素と検出可能な程度に異なる。いくつかの実施形態では、各プローブは蛍光色素およびクエンチャー分子を含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプルからのDNAと内因性コントロールからのアンプリコンを検出するための第4のプローブとを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、内因性コントロールは、HMBS核酸配列、GAPDH核酸配列、ベータ-アクチン核酸配列および/またはベータ-グロビン核酸配列を含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、内因性コントロールはHMBS核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第4のプローブは配列番号115の配列を有する。いくつかの実施形態では、第4のプローブは、第1の、第2のおよび第3のプローブの色素と検出可能な程度に異なる色素を含む。いくつかの実施形態では、第4のプローブは蛍光色素およびクエンチャー分子を含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプルからのDNAと外因性コントロールからのアンプリコンを検出するための第5のプローブとを接触させる工程を含む。いくつかの実施形態では、外因性コントロールは細菌のDNA配列を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、第1、第2および第3の遺伝子を単一の多重反応で検出する。いくつかの実施形態では、内因性コントロールを、第1、第2および第3の遺伝子と同じ多重反応で検出する。いくつかの実施形態では、外因性コントロールを、第1、第2および第3の遺伝子と同じ多重反応で検出する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、サンプルは、尿サンプル、尿道スワブサンプル、膣スワブサンプル、子宮頸管スワブサンプル、口咽頭スワブサンプル、直腸スワブサンプルまたは眼スワブサンプルを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、尿サンプル、尿道スワブサンプル、膣スワブサンプルまたは子宮頸管スワブサンプルを含む。いくつかの実施形態では、対象は性感染症の病歴を有する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、検出する工程はリアルタイムPCRを含み、サンプルからのDNAを、DNAをプライマーと接触させる前に第1の変性工程にかける。いくつかの実施形態では、サンプルからのDNAを、DNAをプライマーと接触させた後に第2の変性工程にかける。
【００１９】
いくつかの実施形態では、プライマー対のセットを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、プライマー対のセットは、配列番号2の配列を含む第1の遺伝子を検出するための第1のプライマー対、配列番号4の配列を含む第2の遺伝子を検出するための第2のプライマー対、ならびに配列番号7の配列を含む遺伝子および配列番号8の配列を含む遺伝子から選択される第3の遺伝子を検出するための第3のプライマー対を含む。いくつかの実施形態では、第3の遺伝子は配列番号7の配列を含む。いくつかの実施形態では、第1のプライマー対は、配列番号32の配列を有するプライマーおよび配列番号33の配列を有するプライマーを含む。いくつかの実施形態では、第2のプライマー対は、配列番号47の配列を有するプライマーおよび配列番号48の配列を有するプライマーを含む。いくつかの実施形態では、第3のプライマー対は、配列番号71の配列を有するプライマーおよび配列番号72の配列を有するプライマーを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、組成物はプローブのセットを含む。いくつかの実施形態では、プローブのセットは、第1の遺伝子からのアンプリコンを検出するための第1のプローブ、第2の遺伝子からのアンプリコンを検出するための第2のプローブおよび第3の遺伝子からのアンプリコンを検出するための第3のプローブを含む。いくつかの実施形態では、第1のプローブは配列番号34の配列を有する。いくつかの実施形態では、第2のプローブは配列番号49の配列を有する。いくつかの実施形態では、第3のプローブは配列番号73の配列を有する。いくつかの実施形態では、各プローブは色素を含み、各色素は他の前記色素と検出可能な程度に異なる。いくつかの実施形態では、各プローブは蛍光色素およびクエンチャー分子を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、組成物は、内因性コントロールからのアンプリコンを検出するための第4のプローブを含む。いくつかの実施形態では、内因性コントロールは、HMBS核酸配列、GAPDH核酸配列、ベータ-アクチン核酸配列および/またはベータ-グロビン核酸配列を含む核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、内因性コントロールはHMBS核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プローブは配列番号115の配列を有する。いくつかの実施形態では、第4のプローブは、第1、第2および第3のプローブの色素と検出可能な程度に異なる色素を含む。いくつかの実施形態では、第4のプローブは蛍光色素およびクエンチャー分子を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、組成物は凍結乾燥組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は溶液である。いくつかの実施形態では、組成物は、CTおよびNGが検査される対象からのサンプルからのDNAを更に含む。いくつかの実施形態では、組成物はビーズ状である。
【００２３】
本発明の別の態様は、泌尿生殖路の感染または炎症に関する哺乳動物のスクリーニング方法を含む。方法は、ゲノムコピー数の指標に関して哺乳動物の泌尿生殖路から得たサンプルをアッセイする工程を伴い、コントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高いゲノムコピー数のレベルは、泌尿生殖路の感染または炎症の存在を示す。いくつかの実施形態では、方法は、ゲノムコピー数の複数の指標に関してサンプルをアッセイする工程を含む。いくつかの実施形態では、ゲノムコピー数の指標は、1コピーまたは2コピーで哺乳動物のゲノム中に存在すると思われる核酸配列を含む。ゲノムコピー数の例示的な指標として、ヒドロキシメチルビランシンターゼ(HMBS)核酸配列、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)核酸配列、ベータ-アクチン核酸配列およびベータ-グロビン核酸配列等の核酸配列が挙げられる。
【００２４】
スクリーニング方法のいくつかの実施形態では、用いるアッセイは、核酸増幅、核酸ハイブリダイゼーションおよび/または核酸スクリーニングを含む。いくつかの実施形態では、アッセイは核酸増幅を含み、例えばリアルタイムPCRを含む。いくつかの実施形態では、ゲノムコピー数の指標はHBMS配列を含み、HBMS配列は配列番号113および配列番号114を含むプライマーを使用して増幅される。いくつかの実施形態では、プライマーにより増幅されるアンプリコンを、プローブを使用して検出する。ゲノムコピー数の指標がHBMS核酸配列を含む場合、例示的なプローブは配列番号115を含む。
【００２５】
スクリーニング方法のいくつかの実施形態では、アッセイは、サンプルの核酸に少なくとも1種のプローブを厳密な条件下でハイブリダイズさせる工程を含む。いくつかの実施形態では、プローブは基質上に固定されている。
【００２６】
スクリーニング方法のいくつかの実施形態では、アッセイは核酸配列決定を含み、例えば高スループットDNA配列決定を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、スクリーニング方法にかける哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、スクリーニング方法にかける哺乳動物は雄または雌である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、泌尿生殖器の感染または炎症の少なくとも1種の臨床症状を有することができる。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、過去に性行為感染症を有していたものであることができる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、哺乳動物は、前立腺癌の指標として前立腺特異的抗原(PSA)に関して検査されており、生検の候補であるように十分に上昇したPSAレベルを有することが分かっているヒト雄である。サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高い、上昇したPSAレベルを含むいくつかの実施形態では、方法は、上昇したPSAが癌ではなく感染に起因する可能性があるものとしてヒト雄を同定する工程を更に伴う。いくつかの実施形態のバリエーションでは、方法は、感染が除外または消散される後まで生検を延期する工程を更に伴う。いくつかの実施形態では、方法は、ゲノムコピー数の指標に関してヒト雄の泌尿生殖路から得たサンプルの第2のアッセイを実施する工程または該更なるアッセイを実施させる工程を更に伴う。いくつかの実施形態では、方法は、感染に関してヒト雄を治療する工程を更に伴う。いくつかの実施形態では、最初のアッセイにおいて、サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高かった場合、および第2のアッセイにおいて、サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベル以下である場合、方法は、第2のPSA検査を実施する工程を更に含む。
【００２９】
スクリーニング方法のいくつかの実施形態では、サンプルは、尿サンプル、尿道スワブサンプル、膣スワブサンプルおよび子宮頸管スワブサンプルから成る群から選択されるサンプルを含む。
【００３０】
スクリーニング方法のいくつかの実施形態では、方法は、病原体を、例えばクラミジア・トラコマチス(CT)およびナイセリア・ゴノレア(NG)を示す核酸配列の存在に関して哺乳動物からのサンプルをアッセイする工程を更に伴う。いくつかの実施形態では、方法は、炎症に関連するマイクロRNA(miRNA)の存在および/またはレベルに関して哺乳動物からのサンプルをアッセイする工程を更に伴うことができる。いくつかの実施形態では、1コピーもしくは2コピーで哺乳動物のゲノム中に存在すると思われる核酸配列および/または病原体もしくはmiRNAを示す核酸配列それぞれに関して同じサンプルを同時にアッセイすることができる。そのようなアッセイを、例えばマルチプレックスリアルタイムPCRを使用して実行することができる。
【００３１】
スクリーニング方法のいくつかの実施形態では、サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高い場合、方法は、泌尿生殖路の感染または炎症を有する可能性があるものとして哺乳動物を同定する工程を更に含む。サンプルがクラミジア・トラコマチス(CT)および/またはナイセリア・ゴノレア(NG)に関してアッセイされており、陽性であることが分かっている実施形態では、サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高い場合、哺乳動物は、いくつかの実施形態ではCTまたはNGそれぞれに感染しているものとして同定される。しかしながら、サンプルがクラミジア・トラコマチス(CT)および/またはナイセリア・ゴノレア(NG)に関して陽性であるが、サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高くない場合、哺乳動物は、CTまたはNGそれぞれに感染していない可能性があるものとして同定される。いくつかの実施形態では、そのような哺乳動物を、クラミジア・トラコマチス(CT)および/またはナイセリア・ゴノレア(NG)に関して再検査する。あるいは、サンプルがクラミジア・トラコマチス(CT)およびナイセリア・ゴノレア(NG)に関して陰性である場合、ならびにサンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高い場合、哺乳動物は、いくつかの実施形態では異なる病原体に感染している可能性があるものとして、または感染に起因しない泌尿生殖路の炎症を有する可能性があるものとして同定される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、スクリーニング方法は、アッセイの結果および/またはアッセイの結果に少なくとも部分的に基づく診断を患者の診療記録に記録する工程を更に伴う。いくつかの実施形態では、アッセイの結果または診断をコンピュータ可読媒体に記録する。患者の診療記録は、いくつかの実施形態では、検査室、医師のオフィス、病院、健康保険維持機構、保険会社または個人の医療記録ウエブサイトにより保存され得る。
【００３３】
いくつかの実施形態では、方法は、1種もしくは複数の更なるアッセイもしくは検査を実施する工程または1種もしくは複数の更なるアッセイもしくは検査を実施させる工程を更に伴う。サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高い場合、更なるアッセイは、病原体に関する、例えばクラミジア・トラコマチス(CT)、ナイセリア・ゴノレア(NG)、マイコプラズマ、ウレアプラズマおよび/またはトリコモナスに関する哺乳動物からの同じまたは異なるサンプルのアッセイを含むことができる。いくつかの実施形態では、サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高い場合、更なるアッセイは、自己免疫性尿道炎、前立腺炎、膀胱癌、前立腺癌、腎臓癌から成る群から選択される状態に関する哺乳動物からの同じもしくは異なるサンプルのアッセイまたは前記状態に関する哺乳動物の検査を含むことができる。いくつかの実施形態では、少なくとも2種の更なるアッセイを実施し、ゲノムコピー数のレベルの経時的な任意の変化をモニタリングする。例えば、いくつかの実施形態では、少なくとも2種の更なるアッセイを実施し、1種または複数の臨床症状の出現または経時的な任意の変化をモニタリングする。
【００３４】
本発明の更なる態様は、スクリーニング方法からの結果を受け取る工程、ならびに泌尿生殖路の感染もしくは炎症に関する療法を開始するおよび/もしくは変更する工程または療法を開始させるおよび/もしくは変更させる工程を含む、泌尿生殖路の感染または炎症に関する哺乳動物の治療方法を含む。いくつかの実施形態では、結果を、泌尿生殖路の感染または炎症の種類に対して異なる診断を行うのに用いる。
【００３５】
本発明の別の態様は、ゲノムコピー数をアッセイすることに基づく泌尿生殖路の感染または炎症に関する哺乳動物のスクリーニング方法に有用なキットを含む。いくつかの実施形態では、キットは、ゲノムコピー数の指標を検出もしくは配列決定するためのプライマーおよび/またはプローブであって、ゲノムコピー数の指標は、1コピーまたは2コピーで哺乳動物のゲノム中に存在すると思われる核酸配列を含むプライマーおよび/またはプローブ、ならびに泌尿生殖路に感染する病原体を示す核酸配列もしくは炎症に関連するmiRNAを検出もしくは配列決定するためのプライマーおよび/またはプローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、ゲノムコピー数の複数の指標それぞれを検出もしくは配列決定するためのプライマーおよび/またはプローブを含む。いくつかの実施形態では、ゲノムコピー数の指標は、ヒドロキシメチルビランシンターゼ(HMBS)核酸配列、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)核酸配列、ベータ-アクチン核酸配列およびベータ-グロビン核酸配列から成る群から選択される核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ゲノムコピー数の指標はHBMS配列を含み、キットは、配列番号113を含むプライマーおよび配列番号114を含むプライマーを含む。いくつかの実施形態では、ゲノムコピー数の指標がHBMS核酸配列を含む場合、キットは、配列番号115を含むプローブを含むことができる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、スクリーニング方法を実施するためのキットは、基質上に固定されている複数のプローブを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、キットは、泌尿生殖路に感染する病原体を示す核酸配列を検出もしくは配列決定するためのプライマーおよび/またはプローブを含む。いくつかの実施形態では、病原体はクラミジア・トラコマチス(CT)および/またはナイセリア・ゴノレア(NG)である。いくつかの実施形態では、キットは、炎症に関連するmiRNAを検出もしくは配列決定するためのプライマーおよび/またはプローブを含むことができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、キットは、尿サンプル用の、または尿道スワブサンプル、膣スワブサンプルもしくは子宮頸管スワブサンプルを採取するためのスワブ用の容器を含むことができる。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態および詳細が以下に記載される。
【００４０】
６．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１Ａ】実施例2に記載するように、3種の異なるリアルタイムPCR条件を使用するNG2およびNG4の検出に関するCt値を示すグラフである。
【図１Ｂ】実施例2に記載するように、3種の異なるリアルタイムPCR条件を使用するCT1およびCT2の検出に関するCt値を示すグラフである。
【図２】実施例4で論じるように、患者の感染状態のグリッドを示す表である。両方のコンパレーターアッセイ(comparator assay)からのスワブの結果が陰性であり、および両方のコンパレーターアッセイに関する尿の結果が陽性である女性の対象に関しては、2種のサンプルのタイプに関して感染状態を別々に決定した。そのような場合、スワブサンプルに関する患者の感染状態は陰性であると見なし、尿サンプルに関する患者の感染状態は陽性であると見なした。
【図３Ａ】5種の現在利用可能なアッセイおよび本明細書に記載のアッセイ(「Xpert CT/NGアッセイ」)によるCT検出の感度を示す表である。VS=膣スワブ;ES=子宮頸管スワブ。
【図３Ｂ】5種の現在利用可能なアッセイおよび本明細書に記載のアッセイ(「Xpert CT/NGアッセイ」)によるCT検出の特異度を示す表である。VS=膣スワブ;ES=子宮頸管スワブ。
【図３Ｃ】5種の現在利用可能なアッセイおよび本明細書に記載のアッセイ(「Xpert CT/NGアッセイ」)によるNG検出の感度を示す表である。VS=膣スワブ;ES=子宮頸管スワブ。
【図３Ｄ】5種の現在利用可能なアッセイおよび本明細書に記載のアッセイ(「Xpert CT/NGアッセイ」)によるNG検出の特異度を示す表である。VS=膣スワブ;ES=子宮頸管スワブ。
【図４Ａ】Xpert CT/NGアッセイでアッセイした患者サンプルをGeneXpert(登録商標)で上昇したゲノムコピー数に関してもスクリーニングした、実施例5で論じた研究の結果を示すグラフである。用語「SAC」はHMBSを指すために使用され、HMBSをゲノムコピー数の指標としてアッセイした。各パネルにおいて、「TN」は「真陰性」を指し、「TP」は「真陽性」を指す。子宮頸管サンプル(ES)-CTに関して陰性または陽性を検査するサンプルに関するSACの結果。
【図４Ｂ】Xpert CT/NGアッセイでアッセイした患者サンプルをGeneXpert(登録商標)で上昇したゲノムコピー数に関してもスクリーニングした、実施例5で論じた研究の結果を示すグラフである。用語「SAC」はHMBSを指すために使用され、HMBSをゲノムコピー数の指標としてアッセイした。各パネルにおいて、「TN」は「真陰性」を指し、「TP」は「真陽性」を指す。膣サンプル(VS)-CTに関して陰性または陽性を検査するサンプルに関するSACの結果。
【図４Ｃ】Xpert CT/NGアッセイでアッセイした患者サンプルをGeneXpert(登録商標)で上昇したゲノムコピー数に関してもスクリーニングした、実施例5で論じた研究の結果を示すグラフである。用語「SAC」はHMBSを指すために使用され、HMBSをゲノムコピー数の指標としてアッセイした。各パネルにおいて、「TN」は「真陰性」を指し、「TP」は「真陽性」を指す。女性の尿サンプル-CTに関して陰性または陽性を検査するサンプルに関するSACの結果。
【図４Ｄ】Xpert CT/NGアッセイでアッセイした患者サンプルをGeneXpert(登録商標)で上昇したゲノムコピー数に関してもスクリーニングした、実施例5で論じた研究の結果を示すグラフである。用語「SAC」はHMBSを指すために使用され、HMBSをゲノムコピー数の指標としてアッセイした。各パネルにおいて、「TN」は「真陰性」を指し、「TP」は「真陽性」を指す。子宮頸管サンプル(ES)-NGに関して陰性または陽性を検査するサンプルに関するSACの結果。
【図４Ｅ】Xpert CT/NGアッセイでアッセイした患者サンプルをGeneXpert(登録商標)で上昇したゲノムコピー数に関してもスクリーニングした、実施例5で論じた研究の結果を示すグラフである。用語「SAC」はHMBSを指すために使用され、HMBSをゲノムコピー数の指標としてアッセイした。各パネルにおいて、「TN」は「真陰性」を指し、「TP」は「真陽性」を指す。膣サンプル(VS)-NGに関して陰性または陽性を検査するサンプルに関するSACの結果。
【図４Ｆ】Xpert CT/NGアッセイでアッセイした患者サンプルをGeneXpert(登録商標)で上昇したゲノムコピー数に関してもスクリーニングした、実施例5で論じた研究の結果を示すグラフである。用語「SAC」はHMBSを指すために使用され、HMBSをゲノムコピー数の指標としてアッセイした。各パネルにおいて、「TN」は「真陰性」を指し、「TP」は「真陽性」を指す。女性の尿サンプル-NGに関して陰性または陽性を検査するサンプルに関するSACの結果。
【図４Ｇ】Xpert CT/NGアッセイでアッセイした患者サンプルをGeneXpert(登録商標)で上昇したゲノムコピー数に関してもスクリーニングした、実施例5で論じた研究の結果を示すグラフである。用語「SAC」はHMBSを指すために使用され、HMBSをゲノムコピー数の指標としてアッセイした。各パネルにおいて、「TN」は「真陰性」を指し、「TP」は「真陽性」を指す。男性の尿サンプル-CTに関して陰性または陽性を検査するサンプルに関するSACの結果。
【図４Ｈ】Xpert CT/NGアッセイでアッセイした患者サンプルをGeneXpert(登録商標)で上昇したゲノムコピー数に関してもスクリーニングした、実施例5で論じた研究の結果を示すグラフである。用語「SAC」はHMBSを指すために使用され、HMBSをゲノムコピー数の指標としてアッセイした。各パネルにおいて、「TN」は「真陰性」を指し、「TP」は「真陽性」を指す。男性の尿サンプル-NGに関して陰性または陽性を検査するサンプルに関するSACの結果。
【図５】ゲノムコピー数のレベルがサンプルのタイプ;子宮頸管サンプル(ES);男性の尿サンプル(UR);女性の尿サンプル(UR-F);および膣サンプル(VS)の間で異なることを示すグラフである。具体的には、ゲノムコピー数のレベルは、膣または子宮頸管のサンプル中よりも尿中で低かった。
【図６Ａ】感染状態の関数として様々なサンプルのタイプにおけるゲノムコピー数を示すグラフである。自己採取した膣サンプル:CTおよびNGに関して陰性であったサンプルは約24以上のSAC Ctを特徴としたが、感染に関して陽性であったサンプルは約20以下のSAC Ctを有する傾向があった。
【図６Ｂ】感染状態の関数として様々なサンプルのタイプにおけるゲノムコピー数を示すグラフである。男性の尿サンプル:CTおよびNGに関して陰性であったサンプルは約28以上のSAC Ctを特徴としたが、感染に関して陽性であったサンプルは約24以下のSAC Ctを有する傾向があった。
【図６Ｃ】感染状態の関数として様々なサンプルのタイプにおけるゲノムコピー数を示すグラフである。32例のCT/NG重感染の男性の尿では、全32例はSAC値の左端の十分位数に存在しており、即ち全てが24未満のSAC Ctを有した。
【図７】症状:真陰性(TN);真陽性-無症状(TN-A);真陽性-有症状(TP-S)によって分類した男性の尿におけるゲノムコピー数の値を示すグラフである。SAC Ct値は、CT/NG感染に関して陽性であった有症状の対象に関してはより低く、CT/NG感染に関して陽性であった無症状の対象に関して中程度であり、真陰性の対象に関してはより高かった。約24未満のSAC Ct値を有するCT/NG-陰性の対象は異なる泌尿生殖器感染を有する可能性があり、更なる検査の候補である。
【図８】様々な状態(左から右へ):陰性コントロール(健康な対象からの尿);炎症しているが病原体はない;マイコプラズマ・ゲニタリウム(mycoplasma genitalium)陽性;膣トリコモナス(trichomonas vaginalis)の可能性;炎症を伴わないウレアプラズマ・パルバム(ureaplasma parvum)陽性;炎症を伴うウレアプラズマ・パルバム陽性;炎症を伴わないウレアプラズマ・ウレアリチカム(ureaplasma urealyticum)陽性;および炎症を伴うウレアプラズマ・ウレアリチカム陽性における尿のゲノムコピー数(SAC Ct値)を示すグラフである。
【図９】偽陽性を同定するためにゲノムコピー数を使用することができることを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
７．詳細な説明
クラミジア・トラコマチス(CT)およびナイセリア・ゴノレア(NG)を検出するための組成物および方法が提供される。具体的には、CTおよびNGの検出に有用なCTマーカーおよびNGマーカーならびにマーカーのパネルが提供される。
【００４３】
加えて、本発明は、感染および炎症のマーカーとして泌尿生殖器のサンプル中のゲノムコピー数を定量化するための方法およびキットを提供する。これまでのゲノムコピー数分析は、染色体全体の増加もしくは減少から、または疾患に関連することが知られている個々の染色体座位での増幅もしくは欠失から情報を得る。これに対して、本明細書に記載のスクリーニング方法は、感染および炎症のマーカーとして個体からのサンプル中のゲノムの数(例えばゲノムDNAの総量)の指標をアッセイすることに基づく。
【００４４】
７．１．定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「検出する(detect)」、「検出する(detecting)」または「検出」は、検出可能に標識化された組成物の発見もしくは識別のための一般的行為または該組成物の特異的観察を説明することができる。
【００４６】
本明細書で使用する場合、用語「検出可能な程度に異なる」は、同時に検出されて識別され得る標識(色素等)のセットを指す。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「患者」および「対象」は、ヒトを指すために互換的に使用される。いくつかの実施形態では、本発明に記載の方法を、非ヒト動物からのサンプル、例えばイヌ、ネコ、霊長類、ウマおよび他の非ヒト哺乳動物からのサンプルで使用することができる。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」等は、DNAを含むがそれに限定されない核酸含有分子を指す。本用語は、4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプソイドウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチル-グアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノ-メチル-2-チオウラシル、β-D-マンノシルクェオシン、5'-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、クェオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、プソイドウラシル、クェオシン、2-チオシトシン、および2,6-ジアミノプリンを含むがこれらに限定されないDNAおよびRNAの既知の塩基類似体のいずれかを含む配列を包含する。
【００４９】
本明細書で使用する場合、用語「オリゴヌクレオチド」は、500個未満のヌクレオチドを有する一本鎖ポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、8〜200個の、8〜100個の、12〜200個の、12〜100個の、12〜75個のまたは12〜50個のヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドをその長さで称することができ、例えば24残基のオリゴヌクレオチドを「24-mer」と称することができる。
【００５０】
本明細書で使用する場合、標的遺伝子(またはその標的領域)に対する用語「相補的な」および標的遺伝子配列に対するプローブ配列の「相補性」の割合とは、標的遺伝子の配列に対するまたは標的遺伝子の配列の相補体に対する「同一性」の割合のことである。本明細書に記載の組成物(またはその領域)で使用されるプローブと本明細書に開示されたもの等の標的遺伝子との間の「相補性」の程度の決定において、「相補性」の程度は、プローブ(またはその領域)の配列と、標的遺伝子の配列またはプローブと最も一致する標的遺伝子の配列の相補体の配列との間の同一性の割合として表される。2つの配列間で同一である一致した塩基の数を計数し、プローブにおける連続ヌクレオチドの総数で割り、100を掛けることにより割合が算出される。用語「相補的な」を使用する場合、対象のオリゴヌクレオチドは、特段の指示がない限り標的分子に少なくとも90%相補的である。いくつかの実施形態では、対象のオリゴヌクレオチドは、標的分子に少なくとも91%相補的である、少なくとも92%相補的である、少なくとも93%相補的である、少なくとも94%相補的である、少なくとも95%相補的である、少なくとも96%相補的である、少なくとも97%相補的である、少なくとも98%相補的である、少なくとも99%相補的である、または100%相補的である。
【００５１】
「プライマー」または「プローブ」は本明細書で使用する場合、標的遺伝子等の標的核酸分子の少なくとも8個の連続ヌクレオチドの配列に相補的である領域を含むオリゴヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、プライマーまたはプローブは、標的分子の少なくとも9個の、少なくとも10個の、少なくとも11個の、少なくとも12個の、少なくとも13個の、少なくとも14個の、少なくとも15個の、少なくとも16個の、少なくとも17個の、少なくとも18個の、少なくとも19個の、少なくとも20個の、少なくとも21個の、少なくとも22個の、少なくとも23個の、少なくとも24個の、少なくとも25個の、少なくとも26個の、少なくとも27個の、少なくとも28個の、少なくとも29個のまたは少なくとも30個の連続ヌクレオチドの配列に相補的である領域を含む。プライマーまたはプローブが「標的分子の少なくともx個の連続ヌクレオチドに相補的である」領域を含む場合、プライマーまたはプローブは、標的分子の少なくともx個の連続ヌクレオチドに少なくとも95%相補的である。いくつかの実施形態では、プライマーまたはプローブは、標的分子に少なくとも96%相補的である、少なくとも97%相補的である、少なくとも98%相補的である、少なくとも99%相補的である、または100%相補的である。
【００５２】
用語「核酸増幅」は、線形的にまたは指数関数的に核酸配列を増幅させるための広範な技法を含むがこれに限定されない、少なくとも1種の標的核酸の少なくとも一部を典型的には鋳型依存的に複製する任意の手段を包含する。増幅工程を実施するための例示的な手段として、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、リガーゼ検出反応(LDR)、多重ライゲーション依存性プローブ増幅(MLPA)、ライゲーションとその後のQレプリカーゼ増幅、プライマー伸長、鎖置換増幅(SDA)、超分岐鎖置換増幅、多置換増幅(MDA)、核酸鎖ベースの増幅(NASBA)、二段階の多重増幅、ローリングサークル増幅(RCA)等、それらの複合バージョンおよび組み合わせ、例えば限定されないがOLA/PCR、PCR/OLA、LDR/PCR、PCR/PCR/LDR、PCR/LDR、LCR/PCR、PCR/LCR(複合連鎖反応-CCRとしても知られている)、デジタル増幅等が挙げられる。そのような技術の記載を他の出典の中に見出すことができるが、以下に見出すことができる:Ausbel等; PCR Primer: A Laboratory Manual、Diffenbach編、Cold Spring Harbor Press (1995);The Electronic Protocol Book、Chang Bioscience (2002);Msuih等、J. Clin. Micro. 34:501〜07頁(1996);The Nucleic Acid Protocols Handbook, R. Rapley編、Humana Press、Totowa、N.J. (2002);Abramson等、Curr Opin Biotechnol. 1993年2月;4(1):41〜7頁、米国特許第6,027,998号;米国特許第6,605,451号、Barany等、PCT公開第WO97/31256;Wenz等、PCT公開第WO01/92579;Day等、Genomics、29(1):152〜162頁(1995)、Ehrlich等、Science 252:1643〜50頁(1991);Innis等、PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications、Academic Press (1990);Favis等、Nature Biotechnology 18:561〜64頁(2000);およびRabenau等、Infection 28:97〜102頁(2000);Belgrader、BaranyおよびLubin、Development of a Multiplex Ligation Detection Reaction DNA Typing Assay、Sixth International Symposium on Human Identification、1995(ワールドワイドウェブpromega.com/geneticidproc/ussymp6proc/blegrad.htmlで利用可能);LCR Kit Instruction Manual、カタログ番号200520、改訂番号050002、Stratagene、2002;Barany、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:188〜93頁(1991);BiおよびSambrook、Nucl. Acids Res. 25:2924〜2951頁(1997);Zirvi等、Nucl. Acid Res. 27:e40i-viii (1999);Dean等、Proc Natl Acad Sci USA 99:5261〜66頁(2002);BaranyおよびGelfand、Gene 109:1〜11頁(1991);Walker等、Nucl. Acid Res. 20:1691〜96頁(1992);Polstra等、BMC Inf. Dis. 2:18- (2002);Lage等、Genome Res. 2003年2月;13(2):294〜307頁およびLandegren等、Science 241:1077〜80頁(1988)、Demidov, V.、Expert Rev Mol Diagn. 2002年11月;2(6):542〜8頁、Cook等、J Microbiol Methods. 2003年5月;53(2):165〜74頁、Schweitzer等、Curr Opin Biotechnol. 2001年2月;12(1):21〜7頁、米国特許第5,830,711号、米国特許第6,027,889号、米国特許第5,686,243号、PCT公開第WO0056927A3およびPCT公開第WO9803673A1。
【００５３】
いくつかの実施形態では、増幅は、以下の連続的な手順の少なくとも1サイクルを含む: 少なくとも1種のプライマーを、少なくとも1種の標的核酸中の相補的なまたは実質的に相補的な配列とアニーリングさせる工程;ポリメラーゼを使用してテンプレート依存的にヌクレオチドの少なくとも1本の鎖を合成する工程;および新しく形成した核酸二本鎖を変性させて該核酸二本鎖を分離する工程。サイクルを繰り返してもよいし、繰り返さなくてもよい。増幅はサーマルサイクリングを含むことができ、または等温的に実施され得る。
【００５４】
特段の指示がない限り、用語「ハイブリダイズする」は本明細書において、いくつかの実施形態では厳密な条件下で、核酸分子が優先的に特定のヌクレオチド配列に結合する、二本鎖形成するまたはハイブリダイズする「特異的ハイブリダイゼーション」を指すために使用される。用語「厳密な条件」は、プローブがその標的配列に優先的にハイブリダイズし、他の配列にはより低い程度でハイブリダイズするまたは全くハイブリダイズしない条件を指す。(例えばアレイ、サザンハイブリダイゼーションまたはノーザンハイブリダイゼーションにおける)核酸ハイブリダイゼーションの状況における「厳密なハイブリダイゼーション」および「厳密なハイブリダイゼーション洗浄条件」は配列依存的であり、様々な環境パラメータ下で異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する膨大な指針が、例えばTijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes  第I部、第2章、「Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays」、Elsevier、NY (「Tijssen」)中に見出される。一般的に、フィルタハイブリダイゼーションに関する高度に厳密なハイブリダイゼーション条件および洗浄条件は、規定したイオン強度およびpHで特定の配列に関する熱的融点(Tm)よりも約5℃低くなるように選択される。Tmは、(規定したイオン強度およびpH下で)標的配列の50%が、完全に一致するプローブにハイブリダイズする温度である。非常に厳密な条件は、特定のプローブに関するTmと等しくなるように選択される。緩衝液の組成、温度およびプローブ長へのハイブリダイゼーションの厳密さの依存度は当業者に公知である(例えばSambrookおよびRussell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第3版)第1〜3巻、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Press、NYを参照)。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「サンプル」として、尿サンプル(尿サンプル由来のサンプルを含む)、子宮頸管スワブ、膣スワブ、尿道スワブ、直腸スワブ、目スワブ、咽頭スワブ(口咽頭スワブ)、液状の細胞診サンプルならびに他の種類のヒトサンプル、例えば血液サンプル、便サンプルおよび生検サンプルが挙げられる。用語サンプルとして、希釈されたおよび/または緩衝された形態の上記サンプル、例えばスワブサンプルが留置されている緩衝液、緩衝液が添加されている尿サンプル等も挙げられる。
【００５６】
「内因性コントロール」は本明細書で使用する場合、検出に使用するサンプル中に天然に存在する部分を指す。いくつかの実施形態では、内因性コントロールは、サンプル中のヒト細胞に見出されるポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、内因性コントロールは、ヒトDNA(ゲノムDNA等)である。非限定的で例示的な内因性コントロールとして、HMBS(ヒドロキシメチルビランシンターゼ)、GAPDH、ベータ-アクチンおよびベータ-グロビンが挙げられる。いくつかの実施形態では、CTマーカーおよびNGマーカーの検出と同じ方法で検出することができる、ならびにいくつかの実施形態ではCTマーカーおよびNGマーカーと同時に検出することができる内因性コントロールが選択される。
【００５７】
「外因性コントロール」は本明細書で使用する場合、検出に使用するサンプルに添加される部分を指す。検出に使用するサンプル中に存在しないと思われる、またはサンプル中に天然に存在する部分の量が検出不可能であるようなもしくは外因性コントロールとしてサンプルに添加する量よりも非常に低いレベルで検出されるようなサンプル中に非常に低いレベルで存在する外因性コントロールが典型的には選択される。いくつかの実施形態では、外因性コントロールは、標的遺伝子の検出に使用するサンプルのタイプ中には存在しないと思われるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、外因性コントロールは、サンプルを採取する種には存在しないことが知られているヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、外因性コントロールは、サンプルを採取した対象とは異なる種からのヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、外因性コントロールは、いずれの種にも存在しないことが知られているヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、CTマーカーおよびNGマーカーの検出と同じ方法で検出することができる、ならびにいくつかの実施形態ではCTマーカーおよびNGマーカーと同時に検出することができる外因性コントロールが選択される。いくつかの実施形態では、外因性コントロールは細菌のDNAである。いくつかの実施形態では、細菌は、検査するサンプルのタイプ中に見出されないと思われる種である。
【００５８】
本開示では、「から選択される配列」は、「から選択される1種の配列」および「から選択される1種または複数の配列」の両方を包含する。そのため、「から選択される配列が」が使用される場合、列挙された配列の内の1種または複数を選択することができることを理解すべきである。
【００５９】
本開示では、「から成るCTマーカーおよびNGマーカーのセット」を検出する工程を含む方法は、セットのCTマーカーおよびNGマーカーのみの検出を含み、更なるいずれのCTマーカーまたはNGマーカーの検出も含まない。しかしながら、方法は、内因性のおよび/または外因性のコントロールを検出する工程等の更なる構成要素または工程を含むことができる。同様に、「から成るCTおよびNGのマーカー用プライマー対のセット」ならびに/または「から成るCTおよびNGのマーカー用プローブのセット」を含む方法または組成物は、セットのCTマーカーおよびNGマーカー専用であり他のいずれのCTマーカーまたはNGマーカー用でもないプライマー対および/またはプローブを含むことができる。しかしながら、方法または組成物は、1種もしくは複数の内因性コントロール用プライマー対および/または1種もしくは複数の外因性コントロール用プライマー対等の更なる構成要素を含むことができる。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「ゲノムコピー数の指標」は、サンプル中に存在するホストゲノムの数を示すよりも任意のバイオマーカーを指す。これに関して、「ホスト」は、サンプルが由来する個体を指す。そのため、バイオマーカーは、ホストのゲノムDNAのレベルを定量化するために使用することができるものである。他の1種または複数の他の生物のDNAがサンプル中に存在する場合、バイオマーカーは一般的に、夾雑DNA中に存在しないものである。ゲノムコピー数の典型的な指標は、サンプルが由来する種の様々な個体にわたって比較的一定であると思われる既知のコピー数を有する核酸配列である。いくつかの実施形態では、例えば、哺乳動物用のゲノムコピー数の指標は、1コピーまたは2コピーで哺乳動物のゲノム中に存在すると思われる核酸配列である。ゲノムコピー数の核酸配列指標は、DNA配列またはRNA配列であることができる。
【００６１】
用語「コントロールのゲノムコピー数のレベル」は、任意の疾患または障害(例えば感染および/または炎症)を患っていない動物の身体の領域から得たサンプル(例えば哺乳動物の泌尿生殖路から得たサンプル)中でゲノムコピー数の指標を測定する場合に得られるレベルを指すために使用される。コントロールのゲノムコピー数のレベルを具体的な値としてまたは値の範囲として表すことができる。
【００６２】
「コントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高いゲノムコピー数のレベル」は、コントロールのゲノムコピー数のレベルに相当する具体的な値よりも上であるまたはコントロールのゲノムコピー数のレベルを規定する範囲の上限よりも上であるレベルを指す。
【００６３】
本明細書で使用する場合、語句「感染または炎症の存在を示す」は、感染および/または炎症が存在し得ることを示す傾向がある特定の結果を意味する。この語句は、感染および/または炎症が存在する最終的な決定を意味しない。医師が適切だと考える更なる検査(examination)または検査(testing)に基づいて最終的な決定がなされ得る。更に、この語句は、特定の結果のみに基づいて感染または炎症のどちらの状態が存在する可能性があるかの決定がなされることを必要としない。むしろ、鑑別診断に至る他の検査(examination)または検査(test)の結果を踏まえて陽性の結果を考慮することができると考えられる。
【００６４】
７．２．検出方法
７．２．１．CTおよびNGの一般的な検出方法
本発明者らは、尿およびスワブ等のヒトサンプル中におけるCTおよびNGを高感度でおよび高特異度で検出するためのアッセイを開発した。アッセイは、以下の表1(表1)に示すNG2、NG4、CT1およびCT2から選択される少なくとも3種のマーカーを検出する工程を含む。本明細書に記載のアッセイは、CTおよびNGに関する従来のアッセイに対していくつかの利点を有する。例えば、本アッセイは、検出を逃れる可能性があるCTの株をもたらす、除去されるまたは失われる可能性があるプラスミド配列ではなく、CTのゲノム配列を検出する。オンデマンド方式で自動化システムを使用して、例えばGeneXpert(登録商標)システムを使用して、2時間未満で本アッセイを実行することもできる。従来の検査では、検査室がバッチを完了させて結果を送るのに数日を要する可能性がある。
【００６５】
CTおよびNGを検出するための組成物および方法が提供される。
【００６６】
いくつかの実施形態では、CTおよびNGの検出方法は、NGマーカーであるNG2およびNG4ならびにCT1およびCT2から選択されるCTマーカーの存在を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、CTおよびNGの検出方法は、NG2、NG4およびCT1を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、CTおよびNGの検出方法は、NG2、NG4およびCT1ならびに少なくとも1種の内因性コントロールを検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、CTおよびNGの検出方法は、NG2、NG4およびCT1ならびに少なくとも1種の内因性コントロールおよび少なくとも1種の外因性コントロールを検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、CTおよびNGの検出方法は、NG2、NG4およびCT2を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、CTおよびNGの検出方法は、NG2、NG4およびCT2ならびに少なくとも1種の外因性コントロールを検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、CTおよびNGの検出方法は、NG2、NG4およびCT2ならびに少なくとも1種の外因性コントロールを検出する工程を含む。
【００６７】
本開示では、用語「標的遺伝子」は、NG2遺伝子、NG4遺伝子、CT1遺伝子およびCT2遺伝子を指すために便宜上使用され、外因性コントロールおよび/または内因性コントロール等の他の標的遺伝子を指すためにも便宜上使用される。そのため、標的遺伝子に関して考察されている場合、この考察はNG2標的遺伝子、NG4標的遺伝子、CT1標的遺伝子およびCT2標的遺伝子ならびに/または他の標的遺伝子を包含することが明確に意図されていることを理解すべきである。
【００６８】
いくつかの実施形態では、1種または複数の標的遺伝子を尿サンプル中で検出する。いくつかの実施形態では、1種または複数の標的遺伝子を、子宮頸管スワブサンプル、尿道サンプル、口咽頭スワブまたは膣スワブサンプル(自己採取した膣スワブサンプルを含む)等のスワブサンプル中で検出する。いくつかの実施形態では、緩衝液を尿サンプルに添加する、および/またはスワブサンプルを採取後に緩衝液中に留置する。
【００６９】
いくつかの実施形態では、NG2およびNG4の検出はサンプル中におけるNGの存在を示し、従って対象のNG感染を示す。いくつかの実施形態では、NG2またはNG4の内の一方のみの検出はサンプル中にNGがないことを示し、従って、対象の非NG感染を示す。いくつかの実施形態では、CT1の検出はサンプル中におけるCTの存在を示し、従って対象のCT感染を示す。いくつかの実施形態では、CT2の検出はサンプル中におけるCTの存在を示し、従って対象のCT感染を示す。いくつかの実施形態では、NGマーカー遺伝子またはCTマーカー遺伝子が検出されないサンプル中における内因性コントロールまたは外因性コントロールの検出の失敗は、アッセイの失敗を示す。いくつかの実施形態では、標的遺伝子を検出する工程は、ポリヌクレオチドと、標的遺伝子、標的遺伝子のDNAアンプリコンおよび標的遺伝子の相補体から選択される核酸とを含む複合体を形成する工程を含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子を検出する工程はリアルタイムPCRを含む。
【００７０】
いくつかの実施形態では、対象のサンプル中におけるCTおよびNGを検出するためにCT/NGアッセイをオンデマンドで実行し、対象は結果を待つ。いくつかの実施形態では、雌の対象が分娩中である間にCT/NGアッセイを実行して該対象がCTまたはNGを有するかどうかを決定し、CTまたはNGは新生児に危険をもたらす可能性がある。いくつかの実施形態では、CT/NGアッセイは、年に1回のまたは半年に1回の理学的検査等の定期的な理学的検査の一部である。いくつかの実施形態では、例えば、CT/NGアッセイをオンデマンドで実行する場合、緩衝液を添加することなく尿サンプルを分析する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、3ml未満の、2ml未満のもしくは約1mlの尿または緩衝液と混合された尿を本方法で使用する。いくつかの実施形態では、3ml未満の、2ml未満のまたは約1mlの、緩衝液中のスワブサンプルからの液相を本方法で使用する。いくつかの実施形態では、遠心分離工程を行なうことなくサンプルを分析する。そのため、いくつかの実施形態では、本方法を遠心分離なしで実行する。
【００７２】
検査する臨床サンプルは、いくつかの実施形態では新鮮である(即ち凍結されていない)。いくつかの実施形態では、サンプルは凍結検体である。
【００７３】
いくつかの実施形態では、検査するサンプルを、複数の性的パートナー、一貫性のないコンドームの使用またはコンドームの不使用、性感染症の病歴、膣分泌物の存在、排尿時痛、下腹部痛、腰痛、発熱、性行時の痛み、月経期間中の出血、直腸痛、直腸分泌物、直腸出血、陰茎分泌物および有痛性のまたは腫大した睾丸等のCTおよび/またはNGの感染の1つまたは複数の危険因子および/または症状を有する個体から得る。いくつかの実施形態では、検査するサンプルを、CTおよび/またはNGの感染の病歴を有する個体から得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、危険因子または症状がない健康な個体を定期的にスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、1種または複数の上記危険因子を有する無症状の個体をスクリーニングすることができる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、本明細書の方法を使用してCTおよび/またはNGの治療効果を評価することができる。例えば、いくつかの実施形態では、本アッセイを使用して治療をモニタリングする、または本アッセイを使用して一連の全ての治療後の感染の消失を実証する。
【００７６】
本明細書の記載の実施形態のいずれかでは、2種以上の標的遺伝子を同じアッセイ反応または別々のアッセイ反応で並行してまたは同時に検出することができる。いくつかの実施形態では、NG2、NG4およびCT1等の3種の標的遺伝子を同じアッセイ反応で検出する。いくつかの実施形態では、3種の標的遺伝子に加えて、内因性コントロールおよび/または外因性コントロール等の1種または複数のコントロールを同じアッセイ反応で検出する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、対象のCT感染および/またはNG感染の診断を容易にする方法が提供される。そのような方法は、対象からのサンプル中においてNG2、NG4ならびにCT1およびCT2の内の少なくとも一方を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、NG2、NG4およびCT1を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、NG2、NG4およびCT2を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、対象からのサンプル中におけるNG2、NG4ならびにCT1およびCT2の内の少なくとも一方の検出に関する情報を医師に連絡する。「医師」は本明細書で使用する場合、健康保険維持機構、病院、診療所、医師のオフィス、医師、看護師または上述した組織および個体の内のいずれかの代理人等の、患者を診断するおよび/または治療する個体または組織を指す。いくつかの実施形態では、NG2、NG4ならびにCT1およびCT2の内の少なくとも一方を検出する工程を、対象のサンプルを医師また医師の代理人から受け取った検査室で実行する。検査室では本明細書に記載のものを含む任意の方法により検出が実行され、次いで結果が医師に連絡される。本明細書で使用する場合、結果が任意の手段により医師に提供される場合に結果が「連絡される」。いくつかの実施形態は、そのような連絡は口頭または書面であることができ、電話によることができ、直接であることができ、電子メールによることができ、郵便もしくは他の宅配便業者によることができ、または例えば医師によって制御されないデータベースを含む医師がアクセス可能なデータベースに情報を直接置くことにより連絡がなされ得る。いくつかの実施形態では、情報は電子的形態で保持される。いくつかの実施形態では、情報を、メモリまたは他のコンピュータ可読媒体、例えばRAM、ROM、EEPROM、フラッシュメモリ、コンピュータチップ、デジタルビデオディスク(DVD)、コンパクトディスク(CD)、ハードディスクドライブ(HDD)、磁気テープ等に保存することができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、対象からのサンプル中におけるCTおよび/またはNGの存在の検出方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、対象からサンプルを得る工程、ならびにサンプルを検査室に提供してサンプル中におけるNG2、NG4ならびにCT1およびCT2の内の少なくとも一方を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中でNGおよび/またはCTが検出されたかどうかを示す連絡を検査室から受け取る工程を更に含む。いくつかの実施形態では、NG2およびNG4の両方をサンプル中で検出する場合にNGが存在する。いくつかの実施形態では、CT1またはCT2をサンプル中で検出する場合にCTが存在する。いくつかの実施形態では、検査室からの連絡は、サンプル中で各標的遺伝子が検出されたかどうかを示す。いくつかの実施形態では、検査室からの連絡は、サンプル中でNGおよび/またはCTが検出されたかどうかを示す。「検査室」は本明細書で示す場合、本明細書に記載の方法を含む任意の方法でサンプル中におけるCT標的遺伝子およびNG標的遺伝子を検出し、CT標的遺伝子および/またはNG標的遺伝子の有無を医師に連絡する任意の施設である。いくつかの実施形態では、検査室は医師の管理下である。いくつかの実施形態では、検査室は医師の管理下ではない。
【００７９】
検査室がアッセイの結果を医師に連絡する場合、いくつかの実施形態では、検査室は、「NG検出、CT非検出」、「NG非検出、CT検出」、「NG非検出、CT非検出」もしくは「NG検出、CT検出」等の各病原体(即ちNGおよびCT)に関する結果または「無効」等のアッセイが失敗したことを示す結果を連絡する。
【００８０】
本明細書で使用する場合、方法がCTおよび/もしくはNGの検出、CTおよび/もしくはNGの存在の決定、CTおよび/もしくはNGの治療のモニタリングならびに/またはCTおよび/もしくはNGの治療の成功の確認に関する場合、方法は、方法の工程を実行するが結果はCTおよび/またはNGの存在に関して陰性であるというアクティビティ(activity)を含む。換言すると、CTおよび/またはNGの検出、決定およびモニタリング等は、陽性または陰性のいずれかの結果になる方法を実行する例を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、1種以上の標的遺伝子を単一の反応で同時に検出する。いくつかの実施形態では、NG2、NG4およびCT1を単一の反応で同時に検出する。いくつかの実施形態では、NG2、NG4およびCT2を単一の反応で同時に検出する。いくつかの実施形態では、NG2、NG4およびCT1ならびに少なくとも1種の内因性コントロールおよび/または少なくとも1種の外因性コントロールを単一の反応で同時に検出する。いくつかの実施形態では、NG2、NG4およびCT2ならびに少なくとも1種の内因性コントロールおよび/または少なくとも1種の外因性コントロールを単一の反応で同時に検出する。いくつかの実施形態では、NG2、NG4およびCT1ならびに内因性コントロールおよび外因性コントロールを単一の反応で同時に検出する。いくつかの実施形態では、NG2、NG4およびCT2ならびに内因性コントロールおよび外因性コントロールを単一の反応で同時に検出する。
【００８２】
７．２．１．１．例示的なコントロール
いくつかの実施形態では、コントロールは内因性コントロールDNAである。内因性コントロールDNAは、例えばサンプル中に存在すると思われるヒト細胞からのDNA等の目的に適した任意のDNAであることができる。非限定の例示的な内因性コントロールDNAとして、HMBS、GAPDH、ベータ-アクチンおよびベータ-グロビンが挙げられる。内因性コントロールは、いくつかの実施形態では、十分なサンプルが反応中に存在する等のサンプルの完全性を確認するために使用される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、コントロールは外因性コントロールDNAである。外因性コントロールを、いくつかの実施形態では、検出アッセイ反応が失敗したかどうか、従って結果に意味がないかどうかを決定するために使用することができる。例えば、外因性コントロールDNAがアッセイ反応で増幅されない場合、そのときは標的遺伝子に関する陰性の結果に意味がないと思われる。なぜならば、非存在は、標的遺伝子(および従って標的生物)が非存在であるのではなく反応が失敗していることを反映する可能性があるからである。反応の失敗は、サンプル中における反応阻害剤の存在(「阻害サンプル」)、試薬の損傷等が挙げられるがこれらに限定されない、いくつもの理由によって起こる可能性がある。サンプルの採取および分析の任意の段階で外因性コントロールを添加することができる。例えば、いくつかの実施形態では、外因性コントロールDNAを、緩衝液の添加時にサンプルに添加する、臨床検査室が受け取った際にサンプルに添加する、分析直前にサンプルに添加する、または分析中(非限定の例として増幅試薬の添加前または増幅試薬の添加と同時)にサンプルに添加する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、サンプル中における標的遺伝子の検出として、例えば同じアッセイまたは一群のアッセイにおいて、内因性コントロールおよび/または外因性コントロールのレベルを同時に決定する。いくつかの実施形態では、アッセイは、NG2、NG4ならびにCT1およびCT2の内の少なくとも一方ならびに内因性コントロールを同じアッセイ反応で同時に検出するための試薬を含む。いくつかの実施形態では、アッセイは、NG2、NG4ならびにCT1およびCT2の内の少なくとも一方ならびに外因性コントロールを同じアッセイ反応で同時に検出するための試薬を含む。いくつかの実施形態では、アッセイは、NG2、NG4ならびにCT1およびCT2の内の少なくとも一方、内因性コントロールならびに外因性コントロールを同じアッセイ反応で同時に検出するための試薬を含む。いくつかの実施形態では、例えば、アッセイ反応は、NG2、NG4ならびにCT1およびCT2の内の少なくとも一方それぞれの一部を増幅させるためのプライマーセット、内因性コントロールを増幅させるためのプライマーセットおよび/または外因性コントロールを増幅させるためのプライマーセット、ならびに増幅産物を検出するための検出可能な異なる標識プローブ(例えば検出する様々なアンプリコン用の検出可能な様々な色素を有するTaqMan(登録商標)プローブ等)を含む。
【００８５】
７．２．２．泌尿生殖路の感染または炎症に関する哺乳動物の一般的なスクリーニング方法
本発明はまた、いくつかの実施形態では、泌尿生殖路の感染または炎症に関する哺乳動物のスクリーニング方法も提供する。この方法は、ゲノムコピー数の指標に関して哺乳動物の泌尿生殖路から得たサンプルをアッセイする工程を伴い、コントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高いゲノムコピー数のレベルは泌尿生殖路の感染または炎症の存在を示す。いくつかの実施形態では、方法は、ゲノムコピー数の複数の指標に関してサンプルをアッセイする工程を含み、これによりアッセイの信頼性を高めることができる。
【００８６】
ゲノムコピー数の任意の指標をこのスクリーニング方法で用いることができる。いくつかの実施形態では、ゲノムコピー数の指標は核酸配列であり、核酸配列はDNA配列またはRNA配列であることができる。いくつかの実施形態では、核酸配列は、1コピーまたは2コピーで哺乳動物のゲノム中に存在すると思われる。そのような核酸配列の例として、ヒドロキシメチルビランシンターゼ(HMBS)核酸配列、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)核酸配列、ベータ-アクチン核酸配列およびベータ-グロビン核酸配列が挙げられるがこれらに限定されない。ゲノムコピー数の指標としてのヒトHBMS核酸配列の検出を実施例に記載する。
【００８７】
スクリーニング方法は、ゲノムコピー数を決定するための任意の手段を使用することができる。ゲノムコピー数の指標が核酸配列である場合、スクリーニング方法は、1種または複数の核酸の増幅、核酸のハイブリダイゼーションおよび/または核酸の配列決定を含むアッセイに基づくことができる。いくつかの実施形態では、増幅ベースのアッセイが使用される。簡便な増幅アッセイはPCRを含み、例えばリアルタイムPCRまたはエンドポイントPCRを含む。これらの方法の実行での留意点が本明細書に詳細に記載されており、当業者は、この留意点がCT/NG遺伝子の検出におよびゲノムコピー数の核酸配列指標に等しく当てはまることを容易に認識するだろう。ヒトのスクリーニングに有用ないくつかの実施形態では、ゲノムコピー数の指標はヒトHBMS配列であり、ヒトHBMS配列は、例えば配列番号113を含むプライマーおよび配列番号114を含むプライマーを使用して増幅される。核酸増幅により産生されたアンプリコンの検出および定量化を、当分野に既知のおよび/または本明細書に記載の方法を使用して実行することができる。例えば、Taqman(登録商標)プローブ等のプローブを使用して、リアルタイムPCR反応においてアンプリコンを検出および/または定量化することができる。いくつかの実施形態では、ゲノムコピー数の指標が、例えば配列番号113を含むプライマーおよび配列番号114を含むプライマーを使用して増幅されるヒトHBMS配列である場合、適切なプローブは配列番号115を含む。
【００８８】
プローブを、ハイブリダイゼーションアッセイにおける検出および定量化に使用することもできる。プローブおよび/またはプライマーをそれらの核酸標的に特異的にハイブリダイズさせるための条件は、特異的ハイブリッドを生成するための所与のハイブリダイゼーション手順で使用可能な条件の組み合わせを一般的に含み、当業者により容易に決定され得る。そのような条件は典型的には、制御された温度、液相およびプローブと標的との接触を含む。ハイブリダイゼーションの条件は、プローブ/プライマー濃度、標的の長さ、標的およびプローブ/プライマーのG-C含有量、溶媒の組成、温度およびインキュベーションの持続時間を含む多くの因子に応じて変化する。少なくとも1つの変性工程がプローブ/プライマーと標的との接触に先行することができる。あるいは、プローブ/プライマーと核酸標的との両方が、互いに接触しつつまたはプローブ/プライマーと生体サンプルとの接触前に、共に変性条件に曝され得る。ハイブリダイゼーションを、例えば、アッセイの後続の工程に適合する液相中におけるプローブ/プライマー/サンプルの後続のインキュベーションにより達成することができる。例えば、後続の酵素的増幅を必要としない場合、液相は、約25〜約55℃の範囲の温度で2〜4×SSCおよびホルムアミドの約50:50の体積比の混合物を含むことができる。ホルムアミドが液相に含まれない場合、より高いハイブリダイゼーション温度が典型的には用いられる。温度はまた、ハイブリダイゼーションに関与している相補配列の長さに基づいて調整される。ハイブリダイゼーションの時間は、PCRプライマー用の約数秒から約96時間の範囲である。当業者には容易に明らかになるように、プローブ/プライマーをサンプル中に存在するそれらの核酸標的に特異的にハイブリダイズさせるために他の条件を容易に用いることができる。
【００８９】
適切なインキュベーション期間の完了時に、プローブのサンプル(またはサンプル由来)の核酸への非特異的な結合を、1回のまたは一連の洗浄により除去することができる。所望の厳密性のために、温度、塩濃度およびホルムアミド等の濃度が適切に選択される。必要とされる厳密性のレベルは、ゲノム配列に関連する具体的なプローブ配列の複雑さに依存し、既知の遺伝子構成のサンプルにプローブを系統的にハイブリダイズさせることにより決定され得る。一般に、ホルムアミドを用いない高厳密性の洗浄を、約0.2×〜約4×のSSCおよびNonidet P-40(NP40)等の約0.1%〜約1%の非イオン性洗剤により約65〜約80℃の範囲の温度で、従来の核酸に対して実行することができる。より低い厳密性の洗浄が必要である場合、高い塩濃度により、より低い温度で洗浄を実行することができる。
【００９０】
多種多様な方式のハイブリダイゼーションベースのアッセイが利用可能であり、ゲノムコピー数の指標のアッセイでの使用に適している。いくつかの実施形態では、プローブを基質上に固定することができる。例えば、ゲノムコピー数の複数の指標を1つのハイブリダイゼーションアッセイで同時にアッセイしなくてはならない場合、複数のプローブを基質上に固定することができる。このアプローチは、例えばアレイ比較ゲノムハイブリダイゼーション(aCGH)で使用されている。WO96/17958に記載されているように、aCGHではプローブは標識されておらず、むしろ基質上の異なる位置に固定されている。これに関して、プローブは「標的核酸」と称されることが多い。サンプルの核酸は、ハイブリダイゼーション複合体の検出を可能とするために典型的には標識されている。ハイブリダイゼーション反応前に、ハイブリダイゼーションで使用されるサンプルの核酸を検出可能に標識することができる。あるいは、ハイブリダイゼーション産物に結合する検出可能な標識を選択することができる。2色のまたは多色のaCGHでは、標的核酸アレイが、別々に標識された核酸の2種以上の回収物に同時にまたは連続してハイブリダイズされる。例えば、サンプルの核酸および(例えばコントロールからの)参照核酸はそれぞれ、別々の識別可能な標識で標識される。各標的核酸のスポットでの各シグナルの強度の差をコピー数の差の指標として検出することができる。任意の適切で検出可能な標識をaCGH用に用いることができるが、蛍光標識が典型的には最も簡便である。例えばAffymetrix自動化SeqWright等の商用サービスを使用して、アレイベースの相対的なコピー数を決定することができる。
【００９１】
ゲノムコピー数の決定を、核酸配列決定により、例えば高スループットDNA配列決定により実行することもできる。いくつかの実施形態では、増幅方法を用いて、高スループット(即ち自動化)DNA配列決定に適したアンプリコンを産生する。一般的に、標的ヌクレオチド配列の実質的に均一な増幅をもたらす増幅方法が、良好なカバレッジを有するDNA配列決定ライブラリの調製に用いられる。自動化DNA配列決定に関連して、用語「カバレッジ」は、配列決定時に配列が測定される回数を指す。得られた数値は典型的には、参照サンプルまたは相対的なコピー数を決定するためのサンプルと比較して正規化される。そのため、複数の標的アンプリコンの自動化配列決定の実施時に、配列が測定される正規化された回数は、サンプルDNAにおける標的配列のコピーの数を順に反映する配列を含んでいる標的アンプリコンの数を反映する。
【００９２】
配列決定のための増幅は、個々のDNA分子がプライマー被覆のビーズと共に油相内の水滴中に存在するエマルジョンPCRの分離体を含むことができる。次いで、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、DNA分子のクローンコピーで各ビーズが被覆され、続いて後の配列決定のために固定される。エマルジョンPCRは、Marguilis等による方法(454 Life Sciencesから市販されている)、ShendureおよびPorreca等による方法(「ポロニー配列決定」としても知られている)ならびにSOLiD配列決定(Agencourt、即ち現在のApplied Biosystemsにより開発されている)で使用される。Illumina Genome Analyzerで使用されるように、配列決定用のインビトロクローン増幅のための別の方法は、固体表面に付着したプライマー上でフラグメントが増幅されるブリッジPCRである。いくつかの配列決定方法、例えばQuake laboratoryにより開発された単一分子法(後にHelicosから市販されている)は増幅を必要としない。この方法は、表面に固定された個々のDNA分子からのパイロ配列決定事象(pyrosequencing event)を検出するために、明るい蛍光体およびレーザー励起を使用する。Pacific Biosciencesもまた、増幅を必要としない単一分子配列決定アプローチを開発している。
【００９３】
インビトロでのクローン増幅後に(必要に応じて)、表面に物理的に結合しているDNA分子が配列決定される。ダイターミネーション電気泳動配列決定のような合成による配列決定は、DNAポリメラーゼを使用して塩基配列を決定する。可逆的ターミネーター法(IlluminaおよびHelicosで使用される)は、可逆バージョンのダイターミネーションを使用して1度に1個のヌクレオチドを追加し、保護基を繰り返し除去して別のヌクレオチドの重合を可能にすることにより、リアルタイムで各位置での蛍光を検出する。パイロ配列決定(454で使用される)も、DNA重合を使用して1度に1個のヌクレオチド種を追加し、および付着したピロリン酸塩の遊離により発光される光を介して所与の位置に追加されたヌクレオチドの数を検出および定量化する。
【００９４】
Pacific Biosciencesの単一分子リアルタイム(SMRT(商標))配列決定は、単一分子を配列決定するDNAポリメラーゼの処理能力に依存し、各ヌクレオチドが異なる着色蛍光体で標識されているリン酸基連結ヌクレオチド(phospholinked nucleotide)を使用する。ヌクレオチドが相補的なDNA鎖に取り込まれる場合、ヌクレオチドは、ヌクレオチドを検出容量中に拡散して該検出容量から拡散させるよりも長時間にわたってDNAポリメラーゼにより検出容量内に保持される。次いで、DNAポリメラーゼが、適当な位置に蛍光体を既に保持する結合を切断して色素が検出容量から拡散し、その結果、蛍光シグナルがバックグラウンドに戻る。重合の進行に伴ってプロセスが繰り返される。
【００９５】
ライゲーションによる配列決定は、DNAリガーゼを使用して標的配列を決定する。ポロニー法およびSOLiD技術で使用する場合、この方法は、配列決定された位置に従って標識された、固定長の全ての可能なオリゴヌクレオチドのプールを用いる。オリゴヌクレオチドは、アニールされてライゲートされ、一致している配列に対するDNAリガーゼによる優先的なライゲーションにより、その位置でのヌクレオチドのシグナル情報が生じる。これらのDNA配列決定技術のいずれかを、本明細書に記載の方法で用いることができる。
【００９６】
本明細書に記載の泌尿生殖路の感染または炎症に関して、任意の哺乳動物をスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。哺乳動物は雄または雌であることができる。いくつかの実施形態では、スクリーニングした個々の哺乳動物は、複数の性的パートナー、一貫性のないコンドームの使用またはコンドームの不使用、性感染症の病歴、膣分泌物の存在、排尿時痛、下腹部痛、腰痛、発熱、性行時の痛み、月経期間中の出血、陰茎分泌物および有痛性のまたは腫大した睾丸等の泌尿生殖器の感染または炎症の1種または複数の危険因子および/または症状を有する。いくつかの実施形態では、スクリーニングした個体は、泌尿生殖器の感染または炎症の少なくとも1種の臨床症状を有すると同定されているものである。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を、危険因子または症状がない健康な個体を定期的にスクリーニングするために使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法を使用して、1種または複数の上記危険因子を有する無症状の個体をスクリーニングすることができる。いくつかの実施形態では、スクリーニングした個々の哺乳動物は、過去に性行為感染症を有していたものである。
【００９８】
いくつかの実施形態では、方法を、炎症または感染と癌との識別を補助するために実行する。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、前立腺癌の指標として前立腺特異抗原(PSA)に関して既に検査されており、生検の候補であるほどに十分に上昇したPSAレベルを有することが分かっているヒト雄である。PSAは典型的には、血液サンプルの免疫アッセイにより測定される。前立腺癌のリスクは、PSAレベルの上昇と共に上昇する。1994年に、初の市販のPSA検査に関して承認された指標として、50歳以上の男性における前立腺癌の検出に加えてアメリカ食品医薬品局のベースとなる臨床試験において生検に関する決定レベルとして4ng/mLのPSAレベルが選択された。他の臨床試験は生検決定レベルとして3ng/mLまたは4ng/mLを使用している。2007年のNCCNガイドラインでは2.5ng/mLが使用された。
【００９９】
陽性のPSA検査結果後に行なわれる生検は有痛性であり、過度の出血および感染等の合併症を引き起こす可能性がある。このことから、および癌以外の多くの理由のためにPSAレベルが変化する可能性があることから、PSAスクリーニングには依然として議論の余地がある。高PSAレベルの2種の一般的な原因は、前立腺の肥大(良性前立腺肥大)および前立腺の感染(前立腺炎)である。そのため、陽性のPSA結果後に、対象を本明細書に記載の泌尿生殖路の感染または炎症に関してスクリーニングし、対象が癌ではなく感染に起因して上昇したPSAを有する可能性があるかどうかを決定することができる。陽性のPSA結果は例えば、標準的な医療行為で用いられる2.5ng/mLのPSAまたは任意の生検決定レベルと等しいまたはそれらよりも高いPSAレベルであることができる。例えば、前立腺癌に関してスクリーニングされているまたは前立腺癌の再発もしくは進行に関してモニタリングされている男性において、上昇したゲノムコピー数に関してこのスクリーニングを実行することができる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスクリーニング方法は、サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高い場合、上昇したPSAが癌ではなく感染に起因する可能性があるものとして対象を同定する工程を伴うことができる。そのような対象では、感染が除外または消散される後まで前立腺生検を延期することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のスクリーニング方法は、PSAレベルの上昇の一因である可能性がある病原体に関して、対象からの同じまたは異なるサンプルの1種または複数の更なるアッセイを実施する工程(または1種もしくは複数の更なるアッセイを実施させる工程)を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、上昇したゲノムコピー数に関する1種もしくは複数の更なるアッセイおよび/または生検を考慮する前の1種もしくは複数の更なるPSA検査を実施する工程(または実施させる工程)を伴うことができる。いくつかの実施形態では、方法は、感染に関して対象を治療する工程、ならびに上昇したゲノムコピー数および/またはPSAに関して任意選択で再アッセイする工程を伴うことができる。前立腺炎の抗生物質治療は公知であり、例えばドキシサイクリンが挙げられる。いくつかの実施形態では、PSAに関して陽性である対象の最初のスクリーニングアッセイにおいて、サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコトンロールのゲノムコピー数のレベルよりも高かった場合、対象は、感染または自然の消散が可能である推定上の感染を治療することができた。次いで、第2のスクリーニングアッセイを実施することができ、ゲノムコピー数のレベルが正常(即ち、コントロールのレベル以下またはコントロールの範囲内)であることが分かった場合、PSA検査を繰り返すことができた。上昇したゲノムコピー数に関するスクリーニングでの陰性の結果後の陽性のPSA結果により、陽性のPSA結果が炎症に起因する可能性が低く、従って癌に起因する可能性が高いことを示すことができた。そのため、上昇したコピー数に関するスクリーニングは、不必要な生検がそれに伴うリスクと共に実施されないことを確実にするのに役立つことができた。
【０１０１】
泌尿生殖路の感染または炎症に関するスクリーニング方法を泌尿生殖路サンプルで実行し、泌尿生殖路サンプルとして尿および尿道スワブサンプルが挙げられ、または雌の対象に関しては膣スワブサンプルおよび子宮頸管スワブサンプルが挙げられる。サンプルを、CT/NG検出に関して本明細書に記載したように得て処理することができる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、泌尿生殖路の感染または炎症に関するスクリーニング方法は、病原体、例えば泌尿生殖路に感染することが知られている病原体を示す核酸配列の存在に関して哺乳動物からのサンプルをアッセイする工程を更に含む。いくつかの実施形態では、スクリーニング方法は、例えば本明細書に記載の検出方法を使用してクラミジア・トラコマチス(CT)およびナイセリア・ゴノレア(NG)をアッセイする工程を含む。病原体アッセイを本明細書に記載のゲノムコピー数アッセイと同時に実行することができるが、必ずしもそうする必要はない。病原体アッセイをゲノムコピー数アッセイと同じ反応混合物中で実行することもできるが、必ずしもそうする必要はない。例えば、病原体アッセイおよびゲノムコピー数アッセイをマルチプレックスPCRで、例えばマルチプレックスリアルタイムPCRで実行することができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、泌尿生殖路の感染または炎症に関するスクリーニング方法は、炎症に関連するマイクロRNA(miRNA)の存在および/またはレベルに関して哺乳動物からのサンプルをアッセイする工程を更に含む。炎症に関連するmiRNAは既知である。例示的なmiRNAならびにmiRNAが調節する炎症性遺伝子および抗炎症性遺伝子を以下に示す(miRNAを最初に列挙し、miRNAが調節する遺伝子とコロンで区別する)。
【０１０４】
let-7a、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f、let-7g、let-7i、miR-98:Casp3、Ccr7、Fgf11、Fgf5、Gdf6、Il13、Masp1、Olr1、Osmr。
【０１０５】
miR-106a、miR-106b、miR-17、miR-20a、miR-20b、miR-93:F3、Mgll、Mink1、Osm、Pdcd1lg2、Ptger3、Stat3。
【０１０６】
miR-1192、miR-495:Atrn、Bcl11a、Clcf1、Cyp26b1、Fgf7、Ptpra。
【０１０７】
miR-126-5p:Ap3b1、Cast、Cntnap2、Fgf7、Gfra2、Hdac4、Hipk2、Il13、Il17a、Il1f5、Il7、Ptger3。
【０１０８】
miR-128:Bmi1、Csf1、Hipk2、Lifr、Nfx1、Pik3r1。
【０１０９】
miR-130a、miR-130b、miR-301a、miR-301b、miR-721:Cast、Cbfb、Chst1、Eda、Erbb2ip、Hprt1、Impdh1、Inhbb、Irf1、Plaa、Pparg、Tnf。
【０１１０】
miR-140、miR-876-3p:Bmp2、Fgf9、Hdac4、Hdac7、Rac1、Spred1、Tnfsf8、Vegfa。
【０１１１】
miR-144:Cxcl12、Eda、Gdf10、Lifr、Ptgs2、Tnfsf11、Ttn。
【０１１２】
miR-155:Cebpb、Cyp26b1、Fgf7、Gdf6、Ms4a1、Sdcbp、Sp3。
【０１１３】
miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、miR-322、miR-497:Cd28、Eda、Fgf7、Ghr、Ifnk、Il10ra、Pik3r1、Spred1、Vegfa。
【０１１４】
miR-181a、miR-181b、miR-181c、miR-181d:Cd4、Il1a、Il7、Lif、Phf20l1、Prkcd、Tnf、Tnfrsf11b、Txndc5。
【０１１５】
miR-182:Bcl11a、Chst1、Fgf9、Gdf6、Hdac9、Ndrg1、Rac1、Sh2d1a、Sp3、Zfp36。
【０１１６】
miR-186:Cast、Cntnap2、Cxcl13、Gdf6、Il13ra1、Pdgfc、Vegfa。
【０１１７】
miR-19a、miR-19b:Cast、Cbfb、Chst1、Cntfr、Cxcl12、F3、Impdh1、Plaa、Tnf。
【０１１８】
miR-200c、miR-429:Gpr68、Hmgb3、Il13、Ntf3、Prkca、Ripk2、Vegfa。
【０１１９】
miR-221、miR-222:Cbfb、Cd4、Cxcl12、Fos、Hipk2、Lifr、Ntf3、Spred2。
【０１２０】
miR-23a、miR-23b:Btla、Ccl7、Cxcl12、Erbb2ip、Fas、Grem1、Irf1、Prkca、Stat5b、Tnfaip6、Tpst1。
【０１２１】
miR-26a、miR-26b:Cmtm4、Inhbb、Pawr、Ppp3cb、Prkcd、Prkcq、Ptgs2、Srgap1。
【０１２２】
miR-27a、miR-27b:Bmi1、Bmp3、Cd28、Cntnap2、Csf1、Fgf1、Grem1、Hipk2、Irf4、Lifr、Mstn、Pparg、Rgs1。
【０１２３】
miR-291a-3p、miR-294、miR-295、miR-302b、miR-302d:Bcl11a、Bcl6、Cdkn1a、Cyp26b1、Dock2、F3、Il28ra、Lefty1、Lefty2。
【０１２４】
miR-297b-3p、miR-466b-3-3p、miR-466d-3p:Bmp3、Cebpb、Cmtm8、Cntnap2、Hdac4、Il12b、Il1a、Il3、Lyst、Pik3r1、Prkca、Sele、Sp3、Spred1、Spred2、Vegfa。
【０１２５】
miR-29a、miR-29b、miR-29c:Atrn、Bcl11a、Hdac4、Il1rap、Lif、Pdgfc、Tnfrsf1a、Vegfa、Zfp36。
【０１２６】
miR-30a、miR-30b、miR-30c、miR-30d、miR-30e、miR-384-5p:Cbfb、Chst1、Chst2、Hdac9、Hipk2、Ifnar2、Il1a、Irf4、Lepr、Lifr、Lyst、Pawr、Pik3cd。
【０１２７】
miR-325:Akt1、Cd86、Cdkn1a、Cxcl13、Cxcr3、Ephx2、F2、Fcer1a、Grem1、Il1r1、Il22ra2、Il23a、Impdh2、Ntf3、Pik3r1。
【０１２８】
miR-338-5p:Atrn、Cast、Cyp26b1、Hdac4、Hipk2、Hmgb3、Il19、Nfkb1、Ntf3、Ptx3、Sh2d1a、Sp3。
【０１２９】
miR-340-5p:Bcl11a、Bmi1、Cast、Cmtm6、Cntnap2、Cyp26b1、Fgf7、Hdac4、Hipk2、Il10、Il4、Nfkb1、Osm。
【０１３０】
miR-369-3p:Ccl22、Cebpb、Gfra2、Inhbb、Prkca、Sp3、Spred1。
【０１３１】
miR-374:Akt1、Bmp2、Ccl22、Cebpb、Cyp26b1、Il10、Ntf3、Sp3。
【０１３２】
miR-410:Csf2、F3、Fgf7、Il4、Nr3c1、Pdgfa、Sp3、Vegfa。
【０１３３】
miR-466d-5p、miR-466k:Atrn、Bmp3、Bmp4、Cd40lg、Chst2、Gfra2、Il28ra、Inhba、Itgam、Muc4。
【０１３４】
miR-466f-3p:Eda、Hipk2、Il1rap、Pik3r1、Ppp3cb、Spred1、Stat5b。
【０１３５】
miR-590-3p:Btla、Ccl5、Cd28、Cx3cl1、Fcgr2b、Fgf5、Hipk2、Il17f、Sp3。
【０１３６】
miR-669f:Atrn、Cdkn1a、Cmtm8、Cntfr、Cyp26b1、Eda、F3、Fgf4、Fgf7、Gdf6、Hipk2、Hmgb3、Ifngr1、Il16、Il7、Map2k3、Mink1、Ncf1、Nr3c1、Pik3r1、Prkcd、Ptpra、Spred1、Stat3、Ttn、Vegfa。
【０１３７】
miR-669h-3p、miR-669k:Cd8a、Hdac7、Hipk2、Ntf3、Pparg、Ppp3cb、Sp3。
【０１３８】
miR-692:Bcl11a、Bcl6、Cd86、Fcer1a、Hprt1、Pou2f2、Socs2、Sp3、Tnfsf12、Vegfa。
【０１３９】
miR-694:Ccl8、Gdf6、Hipk2、Il1rap、Il7、Nr3c1、Prkca、Sh2d1a、Sp3。
【０１４０】
miR-712:Bcl6、Cntnap2、Csf1、Il2ra、Inhba、Itgam、Lepr、Lif、Pou2f2、Stat5a、Vegfa。
【０１４１】
miR-743a、miR-743b-3p:Cyp26b1、Fgf5、Hdac4、Hipk2、Il13ra1、Inhbb、Ppp3cb。
【０１４２】
miR-9:Ap3b1、Cmtm6、Cxcl11、Hdac5、Inhbb、Pdgfc。
【０１４３】
Ryan等(2012年4月)「microRNA Regulation of Inflammatory Responses」Annual Review of Immunology 30: 295〜31頁も参照(これは、炎症に関連するmiRNAの記載に関して参照により本明細書に援用される)。miRNAアッセイを本明細書に記載のゲノムコピー数アッセイと同時に実行することができるが、必ずしもそうする必要はない。miRNAアッセイをゲノムコピー数アッセイと同じ反応混合物中で実行することもできるが、必ずしもそうする必要はない。例えば、miRNAアッセイおよびゲノムコピー数アッセイをマルチプレックスPCRで、例えばマルチプレックスリアルタイムPCRで実行することができる。
【０１４４】
サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高い場合、スクリーニング方法は、泌尿生殖路の感染または炎症を有する可能性があるものとして哺乳動物を同定する工程を更に含むことができる。サンプルがクラミジア・トラコマチス(CT)および/またはナイセリア・ゴノレア(NG)等の病原体に関して陽性である場合、上昇したゲノムコピー数に関する陽性の結果は、いくつかの実施形態において感染の存在を裏付けることができ、哺乳動物を泌尿生殖路の感染または炎症を有する可能性があるものとして同定する工程へのより高い信頼性を提供する。しかしながら、サンプルが病原体に関して陽性であるが、サンプル中のゲノムコピー数のレベルがコントロールのゲノムコピー数のレベルよりも高くない場合、このことは偽陽性を示す可能性があり、この場合には病原体に関して哺乳動物を再検査するのが賢明であるかもしれない。サンプルがクラミジア・トラコマチス(CT)および/またはナイセリア・ゴノレア(NG)等の病原体に関して陰性である場合、上昇したゲノムコピー数による陽性の結果は、いくつかの実施形態では、異なる病原体が感染している可能性があるまたは感染に起因しない泌尿生殖路の炎症を有する可能性があるものとしての哺乳動物の同定につながる可能性がある。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、泌尿生殖路の感染または炎症に関するスクリーニング方法は、CT/NG検出ならびに/または患者の診療記録にアッセイの結果および/もしくはアッセイの結果に少なくとも部分的に基づく診断を記録する工程に関して上述したように、アッセイの結果を医師に連絡する工程を更に伴う。診療記録は紙の形であることができ、および/またはコンピュータ可読媒体中に保存され得る。診療記録は、検査室、医師のオフィス、病院、健康保険維持機構、保険会社および/または個人の医療記録ウエブサイトにより保存され得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、上昇したゲノムコピー数の存在および/またはこの所見に少なくとも部分的に基づく診断を、スクリーニングした個体に知らせる工程を含む。患者は口頭で、書面でおよび/または電子的に知らされ得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、1種もしくは複数の更なるアッセイもしくは検査を要求するおよび/または実施する工程、または1種もしくは複数の更なるアッセイもしくは検査を実施させる工程を伴うことができる。例えば、ゲノムコピー数が上昇したと決定される場合、病原体に関するアッセイまたは検査を実施することができる。病原体アッセイは、核酸ベースのアッセイまたは臨床アッセイであることができる。アッセイする例示的な病原体として、クラミジア・トラコマチス(CT)、ナイセリア・ゴノレア(NG)、マイコプラズマ、ウレアプラズマおよびトリコモナスが挙げられる。いくつかの実施形態では、ゲノムコピー数が上昇したと決定される場合、泌尿生殖器の状態に関するアッセイまたは検査は、例えば自己免疫性尿道炎、前立腺炎、膀胱癌、前立腺癌、腎臓癌等の炎症を特徴とする。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、少なくとも2種の更なるアッセイを最初のアッセイの対象(またはそのサンプル)に実施して、ゲノムコピー数のレベルの経時的な任意の変化をモニタリングする。更なるアッセイは、最初のアッセイの繰り返しであることができる、もしくは異なる方式を有することができる、および/または異なるサンプルを用いることができる。いくつかの実施形態では、少なくとも2種以上の臨床アッセイを実施して、1種もしくは複数の臨床症状の出現または経時的な任意の変化をモニタリングする。そのような更なるアッセイを実施して、治療効果を評価することができる、一連の全ての治療後の感染および/もしくは炎症の消失を実証することができる、または再発を実証することができる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、泌尿生殖路の感染または炎症を有すると決定されている哺乳動物を治療する工程であって、この決定は、上昇したゲノムコピー数の決定に少なくとも部分的に基づいている工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載のスクリーニング方法の内のいずれかからの結果を受け取る工程、ならびに泌尿生殖路の感染もしくは炎症の療法を開始するおよび/もしくは変更する工程または(例えば処方箋により)療法を開始させるおよび/もしくは変更させる工程を伴う。泌尿生殖路の感染または炎症があると哺乳動物が予め診断されていない場合、方法は、療法を開始する工程(または療法を開始させる工程)を伴うことができる。哺乳動物が泌尿生殖路の感染または炎症の1種または複数の症状を有し、それにより治療を受けている場合、方法は、任意選択で他のアッセイのおよび/または検査の結果との組み合わせで、上昇したゲノムコピー数に基づくより特異的なおよび/または確定的な診断(例えば鑑別診断)に基づいて療法を変更する工程を伴うことができる。哺乳動物が泌尿生殖路の感染または炎症の1種または複数の症状を有しており、それにより治療を受けているが、ゲノムコピー数がコントロールレベル以下である(または以前よりも著しく低いレベルである)場合、このことは、感染もしくは炎症の消散(または例えば治療に反応した状態の重症度の低下)を示す可能性がある。従って、いくつかの実施形態では、方法は、泌尿生殖路の感染または炎症の治療を受けていた哺乳動物においてゲノムコピー数がコントロールレベル以下である(または著しく低いレベルである)と決定したときに療法を終えるまたは変更する工程を伴う。そのような哺乳動物では、方法は、定期的なモニタリング工程であって、コントロールレベルよりも高い(または以前よりも著しく高いレベルでの)ゲノムコピー数の検出は再発を示し、この場合には療法が再開される(療法が終わっている場合)または変更される可能性がある工程を伴うことができる。
【０１４９】
例示的なサンプル調製
７．２．２．１．例示的な緩衝液
いくつかの実施形態では、緩衝液を尿サンプルに添加する。いくつかの実施形態では、尿サンプルの採取時(例えば、排尿時)から1時間以内に、2時間以内に、3時間以内にまたは6時間以内に緩衝液を添加する。いくつかの実施形態では、尿サンプルの本明細書に記載の方法による分析前1時間以内に、2時間以内に、3時間以内にまたは6時間以内に緩衝液を尿サンプルに添加する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、スワブサンプルを緩衝液中に留置する。いくつかの実施形態では、スワブサンプルの採取時から1時間以内に、2時間以内に、3時間以内にまたは6時間以内にスワブサンプルを緩衝液中に留置する。いくつかの実施形態では、スワブサンプルの本明細書に記載の方法による分析前1時間以内に、2時間以内に、3時間以内にまたは6時間以内にスワブサンプルを緩衝液中に留置する。
【０１５１】
非限定の例示的な市販の緩衝液として、PreservCyt(Hologic、ベッドフォード、マサチューセッツ州)、SurePath(BD、フランクリンレイクス、ニュージャージー州)およびCyMol(Copan Diagnostics、マリエータ、カリフォルニア州)が挙げられる。
【０１５２】
７．２．２．２．例示的なDNA調製
サンプルDNAを任意の適切な方法で調製することができる。いくつかの実施形態では、サンプルと溶解緩衝液とを接触させ、DNAとガラス基質またはシリカ基質等のDNA結合基質とを結合させることにより、標的DNAを調製する。結合基質は、粒子状、多孔質の固形状または膜状等の任意の適切な形状を有することができる。例えば、担体は、ヒドロキシセルロース、ガラス繊維、セルロース、ニトロセルロース、水酸化ジルコニウム、酸化チタン(IV)、二酸化ケイ素、ケイ酸ジルコニウムまたはシリカ粒子を含むことができる(例えば米国特許第5,234,809号を参照)。多くのそのようなDNA結合基質は当分野で既知である。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、最初にDNAを単離するまたは分離することなく溶解物中でDNAを検出する。いくつかの実施形態では、サンプルを溶解工程にかけてDNAを遊離させる。非限定の例示的な溶解方法として、超音波処理(例えば2〜15秒、36kHzで8〜18μm)、例えば界面活性剤を使用する化学的溶解および様々な市販の溶解試薬が挙げられる。いくつかの実施形態では、DNAが少なくともいくつかの他の細胞成分から単離されているまたは分離されているサンプル中でDNAを検出および測定する。
【０１５４】
本明細書で論じた方法が標的遺伝子を検出することを示す場合、そのような検出を、本明細書に示す標的遺伝子配列の代わりに、または該標的遺伝子配列に加えて、標的遺伝子の相補体に対して実行することができる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子の相補体を検出する場合、標的遺伝子の相補体に相補的である検出用ポリヌクレオチドを使用する。いくつかの実施形態では、検出用ポリヌクレオチドは、標的遺伝子と配列が一致している部分を少なくとも含むが、修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【０１５５】
７．２．３．例示的な分析方法
上述したように、対象からのサンプル中におけるCTおよび/またはNGの検出方法が示される。方法は、NG2、NG4ならびにCT1およびCT2の内の少なくとも一方を検出する工程、ならびに少なくとも1種の内因性コントロールおよび/または少なくとも1種の外因性コントロールを任意選択で検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、NG2およびNG4の検出は、サンプル中におけるNGの存在を示す。いくつかの実施形態では、CT1またはCT2の検出は、サンプル中におけるCTの存在を示す。いくつかの実施形態では、方法は、NG2、NG4およびCT1を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、NG2、NG4およびCT2を検出する工程を含む。
【０１５６】
哺乳動物からのサンプルをスクリーニングすることによる泌尿生殖路の感染または炎症の検出方法も上述されている。この方法は、ゲノムコピー数の指標に関して哺乳動物の泌尿生殖路から得たサンプルをアッセイする工程を伴う。いくつかの実施形態では、ゲノムコピー数の指標は、サンプルが由来する種の様々な個体にわたって比較的一定であると思われる既知のコピー数を有する1種または複数の核酸配列、例えばHMBS、GAPDH、ベータ-アクチンおよびベータ-グロビンを含む。そのような核酸配列を、NG2、NG4、CT1およびCT2を含む任意の標的遺伝子と同じ方法で検出することができる。従って、当業者は、この標的遺伝子に集中する以下の考察がゲノムコピー数の多くの指標にも当てはまることを容易に認識することができる。
【０１５７】
NG2、NG4、CT1およびCT2等の標的遺伝子の特異的検出を可能にすることができる任意の分析手順を、本明細書に示した方法で使用することができる。そのような分析手段として、PCR法および当業者に既知の他の方法が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、NG2、NG4、CT1またはCT2等の標的遺伝子の検出方法は、標的遺伝子のある領域を増幅させる工程を含む。そのような増幅を任意の方法で達成することができる。例示的な方法として、リアルタイムPCRおよびエンドポイントPCRが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１５９】
標的遺伝子を増幅させる場合、いくつかの実施形態では標的遺伝子のアンプリコンが形成される。アンプリコンは一本鎖または二本鎖であることができる。いくつかの実施形態では、アンプリコンが一本鎖である場合、アンプリコンの配列は、センスまたはアンチセンスの方向で標的遺伝子と合致する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子自体ではなく標的遺伝子のアンプリコンを検出する。そのため、本明細書で論じた方法が標的遺伝子を検出することを示す場合、そのような検出を、標的遺伝子自体の代わりに、または標的遺伝子自体に加えて、標的遺伝子のアンプリコンに対して実行することができる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子ではなく標的遺伝子のアンプリコンを検出する場合、標的遺伝子の相補体に相補的である検出用ポリヌクレオチドを使用する。いくつかの実施形態では、標的遺伝子ではなく標的遺伝子のアンプリコンを検出する場合、標的遺伝子に相補的である検出用ポリヌクレオチドを使用する。更に、いくつかの実施形態では、検出用の複数のポリヌクレオチドを使用することができ、いくつかのポリヌクレオチドは標的遺伝子に相補的であることができ、いくつかのポリヌクレオチドは標的遺伝子の相補体に相補的であることができる。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、NG2、NG4、CT1またはCT2等の1種または複数の標的遺伝子の検出方法は、以下に記載するようにPCRを含む。いくつかの実施形態では、1種または複数の標的遺伝子を検出する工程はPCR反応をリアルタリムでモニタリングする工程を含み、該モニタリングする工程は任意の方法により実現され得る。そのような方法として、TaqMan(登録商標)、分子ビーコンまたはスコーピオンプローブ(即ち、FRETプローブ等のエネルギー転移(ET)プローブ)の使用、およびSYBRグリーン、エバグリーン、チアゾールオレンジ、YO-PRO、TO-PRO等の挿入色素の使用が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６１】
NG2、NG4、CT1またはCT2等の標的遺伝子を増幅させるための非限定の例示的な条件として、本明細書に記載の二重変性(double-denature)方法が挙げられる。いくつかの実施形態では、増幅にTaqポリメラーゼを使用する。いくつかの実施形態では、サイクルを少なくとも10回、少なくとも15回、少なくとも20回、少なくとも25回、少なくとも30回、少なくとも35回または少なくとも45回実行する。いくつかの実施形態では、ホットスタート機能を有するTaqを使用する。いくつかの実施形態では、GeneXpert(登録商標)カートリッジ中で増幅反応が起こり、少なくとも3種の標的遺伝子の増幅が同じ反応で起こる。いくつかの実施形態では、最初の変性から最後の伸長までの3時間未満で、2.5時間未満で、2時間未満で、100分未満でまたは90分未満で標的遺伝子の検出が起こる。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子の検出は、標的遺伝子またはその相補体に相補的であるポリヌクレオチドと、標的遺伝子、標的遺伝子のアンプリコンおよび標的遺伝子の相補体から選択される核酸とを含む複合体を形成する工程を含む。そのため、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは標的遺伝子と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子の相補鎖等の標的遺伝子の相補体と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、標的遺伝子のアンプリコンと複合体を形成する。二本鎖の標的遺伝子またはアンプリコンが複合体の一部である場合は本明細書で使用する場合、複合体は、標的遺伝子またはアンプリコンの内の一方の鎖または両方の鎖を含むことができる。そのため、いくつかの実施形態では、複合体は、標的遺伝子またはアンプリコンの内の一方の鎖のみを含む。いくつかの実施形態では、複合体は三重であり、ポリヌクレオチドと標的遺伝子またはアンプリコンの両方の鎖とを含む。いくつかの実施形態では、複合体は、ポリヌクレオチドと、標的遺伝子、標的遺伝子の相補体または標的遺伝子のアンプリコンとの間のハイブリダイゼーションにより形成される。ポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態ではプライマーまたはプローブである。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、方法は複合体を検出する工程を含む。いくつかの実施形態では、複合体は、検出時に結合している必要はない。換言すれば、いくつかの実施形態では、複合体が形成され、次いで複合体が何らかの方法で解離され、または分解され、複合体からの成分が検出される。そのようなシステムの例はTaqMan(登録商標)アッセイである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドがプライマーである場合、複合体の検出は、標的遺伝子、標的遺伝子の相補体または標的遺伝子のアンプリコンの増幅を含むことができる。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法における少なくとも1種の標的遺伝子を検出する工程に使用する分析方法はリアルタイムPCRを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも1種の標的遺伝子を検出する工程に使用する分析方法は、TaqMan(登録商標)プローブの使用を含む。アッセイは、蛍光共鳴エネルギー転移(「FRET」)等のエネルギー転移(「ET」)を使用して、合成したPCR産物を検出および定量化する。典型的には、TaqMan(登録商標)プローブは、5'末端に連結される蛍光色素分子および3'末端に連結されるクエンチャー分子を含み、その結果、色素およびクエンチャーが極めて近接しており、クエンチャーがFRETによる色素の蛍光シグナルを抑制することが可能になる。ポリメラーゼが、TaqMan(登録商標)プローブに結合しているキメラアンプリコン鋳型を複製する場合、ポリメラーゼの5'ヌクレアーゼはプローブを切断し、色素とクエンチャーとを分断し、その結果、色素シグナル(蛍光等)が検出される。シグナル(蛍光等)は、切断されるプローブの量に比例して各PCRサイクルにより増加する。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、標的遺伝子は、PCRサイクリング中にTaqManプローブから任意のシグナルが生成される場合に検出されると考えられる。例えば、いくつかの実施形態では、PCRが45サイクルを含む場合に、増幅中に任意のサイクルでシグナルが生成される場合、標的遺伝子は存在しており検出されると考えられる。いくつかの実施形態では、PCRサイクリングの終了までにシグナルが生成されない場合、標的遺伝子は存在しておらず検出されないと考えられる。
【０１６６】
TaqMan(登録商標)アッセイに加えて、本明細書に示す方法においてPCR産物の検出に有用な他のリアルタイムPCR化学として、分子ビーコン、スコーピオンプローブ、およびSYBRグリーン、エバグリーン、チアゾールオレンジ、YO-PRO、TO-PRO等の挿入色素が挙げられるがこれらに限定されず、これらを以下で論じる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、リアルタイムPCR検出を利用して、単一の多重反応においてNG2、NG4およびCT1(またはCT2)等の3種の標的遺伝子、ならびに任意選択で少なくとも1種の内因性コントロールおよび/または少なくとも1種の外因性コントロールを検出する。いくつかの複合実施形態では、それぞれが異なる標的遺伝子に特異的である、TaqMan(登録商標)プローブ等の複数のプローブを使用する。いくつかの実施形態では、各標的遺伝子に特異的なプローブは、同じ多重反応で使用する他のプローブからスペクトル的に識別可能である。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、リアルタイムPCR産物の検出は、SYBRグリーン、エバグリーン、チアゾールオレンジ、YO-PRO、TO-PRO等の、二本鎖DNA産物に結合する色素を使用して達成される。
【０１６９】
当分野で入手可能な任意のPCR装置を使用してリアルタイムPCRを実施する。典型的には、リアルタイムPCRデータの収集および分析で使用する装置は、サーマルサイクラー、蛍光の励起および発光収集用の光学ならびに任意選択でコンピュータおよびデータ収集および分析ソフトウェアを含む。
【０１７０】
７．２．４．例示的な自動化およびシステム
いくつかの実施形態では、自動化したサンプルの取り扱いおよび/または分析プラットフォームを使用して標的遺伝子を検出する。いくつかの実施形態では、市販の自動化分析プラットフォームを利用する。例えば、いくつかの実施形態では、GeneXpert(登録商標)システム(Cepheid、サニーベール、カリフォルニア州)を利用する。
【０１７１】
GeneXpertシステムと共に使用する本発明を説明する。例示的なサンプルの調製方法および分析方法を後述する。しかしながら、本発明は、特定の検出方法または分析プラットフォームに限定されない。当業者は、任意の数のプラットフォームおよび方法を利用することができることを認識する。
【０１７２】
GeneXpert(登録商標)は、自己完結型の使い捨てカートリッジを利用する。この自己完結型の「カートリッジ中の検査室」内で、サンプルの抽出、増幅および検出を全て実行することができる(例えば米国特許第5,958,349号、米国特許第6,403,037号、米国特許第6,440,725号、米国特許第6,783,736号、米国特許第6,818,185号を参照;これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される)。
【０１７３】
カートリッジの構成要素として、試薬を含有する処理チャンバ、フィルタ、ならびに標的核酸の抽出、精製および増幅に有用な捕捉技術が挙げられるがこれらに限定されない。バルブにより、液体がチャンバからチャンバへ移動し、核酸溶解物およびろ過成分を含有することが可能になる。光学窓により、リアルタイムでの光学検出が可能になる。反応チューブにより、非常に速やかなサーマルサイクリングが可能になる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、GenXpert(登録商標)システムは、拡張性のための複数のモジュールを含む。各モジュールは、サンプルの取り扱いおよび分析用の構成要素と共に複数のカートリッジを含む。
【０１７５】
サンプルをカートリッジに添加した後、サンプルが溶解緩衝液と接触し、遊離したDNAが、シリカ基質またはガラス基質等のDNA結合基質に結合する。次いで、サンプルの上清が除去され、DNAがTris/EDTA緩衝液等の溶出緩衝液中に溶出される。次いで溶出液がカートリッジ内で処理され得、本明細書に記載の標的遺伝子が検出される。いくつかの実施形態では、溶出液を使用してPCR試薬の少なくともいくつかを再構成し、PCR試薬は凍結乾燥粒子としてカートリッジ中に存在する。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、PCRを使用して、CT標的遺伝子および/もしくはNG標的遺伝子ならびに/またはゲノムコピー数を示す標的遺伝子の存在を増幅させて検出する。いくつかの実施形態では、PCRは、AptaTaq(Roche)等のホットスタート機能を有するTaqポリメラーゼを使用する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、二重変性方法を使用して低コピー数の標的を増幅させる。二重変性方法は、いくつかの実施形態では、第1の変性工程、その後の標的遺伝子の検出用のプライマーおよび/またはプローブの添加を含む。次いで、場合によっては標的遺伝子のサイクリングおよび検出のためにサンプルの一部を分取する前に、DNA含有サンプル(DNA溶出液等)の全てまたは相当な部分の2回目の変性を行なう。いずれの特定の理論に拘束されることを意図するものではないが、二重変性のプロトコールにより、低コピー数の標的遺伝子(またはその相補体)が、サイクリングおよび検出用に選択されたアリコート中に存在することができる確率を高めることができる。なぜならば、第2の変性により、アリコートをサイクリング用に選択する前に標的の数が効率的に倍加する(即ち、第2の変性により標的とその相補体とが2つの別々の鋳型に分離される)からである。いくつかの実施形態では、第1の変性工程は、30秒〜5分の合計時間90℃〜100℃の温度に加熱する工程を含む。いくつかの実施形態では、第2の変性工程は、5秒〜3分の合計時間90℃〜100℃の温度に加熱する工程を含む。いくつかの実施形態では、第1の変性工程および/または第2の変性工程を、サンプルのアリコートを別々に加熱することにより実行する。いくつかの実施形態では、各アリコートを上記に列挙した時間にわたり加熱することができる。非限定の例として、DNA含有サンプル(DNA溶出液等)用の第1の変性工程は、サンプルの少なくとも1個の、少なくとも2個の、少なくとも3個のまたは少なくとも4個のアリコートを別々に(順次にまたは同時に)90℃〜100℃の温度にそれぞれ60秒間加熱する工程を含むことができる。非限定の例として、酵素、プライマーおよびプローブを含有するDNA含有サンプル(DNA溶出液等)用の第2の変性工程は、溶出液の少なくとも1個の、少なくとも2個の、少なくとも3個のまたは少なくとも4個のアリコートを別々に(順次にまたは同時に)90℃〜100℃の温度にそれぞれ5秒間加熱する工程を含むことができる。いくつかの実施形態では、アリコートはDNA含有サンプル(DNA溶出液)全体である。いくつかの実施形態では、アリコートはDNA含有サンプル(DNA溶出液等)の全体未満である。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、DNA溶出液等のDNA含有サンプル中の標的遺伝子を、以下のプロトコールを使用して検出する:DNA含有サンプルの1個または複数個のアリコートを別々に95℃にそれぞれ60秒間加熱する。酵素ならびにプライマーおよびプローブをDNA含有サンプルに添加し、1個または複数個のアリコートを別々に95℃にそれぞれ5秒間加熱する。次いで、酵素、プライマーおよびプローブを含有するDNG含有サンプルの少なくとも1個のアリコートを94℃に60秒間加熱する。次いで、アリコートに対して以下の2段階サイクル:(1)94℃で5秒間、(2)66℃で30秒間を45回繰り返す。
【０１７９】
本発明は、特定のプライマー配列および/またはプローブ配列に限定されない。例示的な増幅用プライマーおよび検出用プローブを実施例に記載する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、オフラインの遠心分離(off-line centrifugation)を使用して、低細胞含有量のサンプルによるアッセイの結果を改善させる。緩衝液が添加されているまたは添加されていないサンプルを遠心分離し、上清を除去する。次いで、ペレットを少量の上清中に、緩衝液中にまたは他の液体中に再懸濁させる。次いで、再懸濁させたペレットを前述のGeneXpert(登録商標)カートリッジに添加する。
【０１８１】
７．２．５．例示的なデータ分析
いくつかの実施形態では、コンピュータベースの分析プログラムを使用して、検出アッセイ(例えば、本明細書に記載のNG標的遺伝子およびCT標的遺伝子の検出、またはゲノムコピー数を示す標的遺伝子の検出)で生成された生データを臨床医のための予測値のデータに変換する。臨床医は、任意の適切な手段を使用して予測データにアクセスすることができる。そのため、いくつかの実施形態では、本発明は、遺伝学または分子生物学の教育を受けている可能性が低い臨床医が生データを理解する必要がないという更なる利点を提供する。データは、最も有用な形態で臨床医に直接示される。次いで、臨床医は、情報を直ちに利用して対象のケアを最適化することができる。
【０１８２】
本発明は、アッセイを行なっている検査室から情報を受け取り、処理して検査室に伝達することができる任意の方法を検討し、情報が利用関係者および対象に提供される。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、サンプル(例えば尿サンプル)を対象から得て、生データを生成するために、世界の任意の場所にある(例えば対象が居住する国または情報が最終的に使用される国とは異なる国の)プロファイリングサービス(例えば医療機関での臨床検査室、ゲノムプロファイリングビジネス等)に提出する。サンプルが組織または他の生物試料を含む場合、対象は、サンプルを得てプロファイリングセンターに送るために医療センターを訪れることができる、または対象が自身でサンプル(例えば尿サンプルまたは膣スワブ)を採取し、該サンプルをプロファイリングセンターに直接送ることができる。サンプルが、既に決定された生物情報を含む場合、情報を対象によりプロファイリングサービスに直接送ることができる(例えば、情報を含有する情報カードをコンピュータで読み取り、データを、電子通信システムを使用してプロファイリングセンターのコンピュータに送信することができる)。プロファリングサービスが受け取ると、サンプルが処理され、対象に望ましい診断情報または予測情報に特化したプロファイルが作成される。
【０１８３】
次いで、プロファイルデータは、治療を行なっている臨床医による解釈に適したフォーマットに調製される。例えば、生データを提供するのではなく、調製されたフォーマットが、特定の治療選択肢の推奨と共に対象の診断またはリスク評価を表すことができる。任意の適切な方法でデータを臨床医に表示することができる。例えば、いくつかの実施形態では、プロファイリングサービスは、臨床医のために(例えばケアの時点で)印刷することができるまたはコンピュータのモニタ上で臨床医に表示することができるレポートを作成する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、情報は、ケアの時点でまたは地域の施設で最初に分析される。次いで、生データは、更なる分析のためにおよび/または生データを臨床医もしくは患者に有用な情報に変換するために、中心処理施設に送られる。中心処理施設は、データ分析のプライバシー(全てのデータが均一のセキュリティプロトコルにより中心施設に保存される)、速度および均一性という利点を提供する。次いで、中心処理施設は、対象の治療後のデータの行方を制御することができる。例えば、電気通信システムを使用して、中心施設はデータを臨床医、対象または研究者に提供することができる。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、対象は、電気通信システムを使用してデータに直接アクセスすることができる。対象は、結果に基づいて更なる治療介入またはカウンセリングを選択することができる。いくつかの実施形態では、データは研究用途に使用される。例えば、治療の行動方針を決定するために、データを使用して、疾患の特定の状態もしくは段階の有用な指標としてのまたはコンパニオン診断としてのマーカーの包含または除去を更に最適化することができる。
【０１８６】
７．２．６．例示的なポリヌクレオチド
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、合成ポリヌクレオチドが提供される。合成ポリヌクレオチドは本明細書で使用する場合、化学的にまたは酵素的にインビトロで合成されているポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドの化学的合成として、例えばOligoPilot(GE Healthcare)、ABI 3900 DNA合成装置(Applied Biosystems)等のポリヌクレオチド合成装置を使用する合成が挙げられるがこれらに限定されない。酵素的な合成として、酵素的増幅による、例えばPCRによるポリヌクレオチドの産生が挙げられるがこれに限定されない。ポリヌクレオチドは、本明細書で論じた1種または複数のヌクレオチド類似体(即ち修飾ヌクレオチド)を含むことができる。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、NG2、NG4、CT1およびCT2からまたは例えばHMBS、GAPDH、ベータ-アクチンおよびベータ-グロビン等のゲノムコピー数を示す標的遺伝子から選択される配列の少なくとも8個の、少なくとも9個の、少なくとも10個の、少なくとも11個の、少なくとも12個の、少なくとも13個の、少なくとも14個の、少なくとも15個の、少なくとも16個の、少なくとも17個の、少なくとも18個の、少なくとも19個の、少なくとも20個の、少なくとも21個の、少なくとも22個の、少なくとも23個の、少なくとも24個の、少なくとも25個の、少なくとも26個の、少なくとも27個の、少なくとも28個の、少なくとも29個のまたは少なくとも30個の連続ヌクレオチドと同一であるまたは該連続ヌクレオチドに相補的である領域を含むポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、NG2、NG4、CT1、CT2、HMBS、GAPDH、ベータ-アクチンおよびベータ-グロビンから選択される配列の6〜100個の、8〜100個の、8〜75個の、8〜50個の、8〜40個のまたは8〜30個の連続ヌクレオチドの全長と同一であるまたは該全長に相補的である領域を含むポリヌクレオチドが提供される。非限定の例示的なポリヌクレオチドを表2(表2)に示す。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、500個未満の、300個未満の、200個未満の、150個未満の、100個未満の、75個未満の、50個未満の、40個未満のまたは30個未満のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、6〜200個の、8〜200個の、8〜150個の、8〜100個の、8〜75個の、8〜50個の、8〜40個のまたは8〜30個のヌクレオチド長である。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはプライマーである。いくつかの実施形態では、プライマーは検出可能な部分で標識される。いくつかの実施形態では、プライマーは標識されない。プライマーは本明細書で使用する場合、標的遺伝子、または標的遺伝子から増幅されているアンプリコン(まとめて「鋳型」とも称される)に特異的にハイブリダイズすることができ、鋳型、ポリメラーゼならびに適切な緩衝液および試薬の存在下で伸長してプライマー伸長産物を形成することができるポリヌクレオチドである。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはプローブである。いくつかの実施形態では、プローブは検出可能な部分で標識される。本明細書で使用する場合、検出可能な部分として、蛍光色素等の直接的に検出可能な部分と、結合対のメンバー等の間接的に検出可能な部分との両方が挙げられる。検出可能な部分が結合対のメンバーである場合、いくつかの実施形態では、プローブと結合対の第2のメンバーに結合している検出可能な標識とをインキュベートすることにより、プローブを検出することができる。いくつかの実施形態では、プローブが捕捉プローブである場合、例えばマイクロアレイまたはビーズ上の捕捉プローブである場合等には、プローブは標識されない。いくつかの実施形態では、例えばポリメラーゼにより、プローブは伸長可能ではない。いくつかの実施形態では、プローブは伸長可能である。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、いくつかの実施形態では5'末端で蛍光色素(ドナー)により標識されており、3'末端で、基が極めて接近している(即ち同じプローブに付着している)場合に色素からの蛍光発光を吸収する(即ち抑制する)化学基であるクエンチャー(アクセプター)により標識されているFRETプローブである。いくつかの実施形態では、色素およびクエンチャーはFRETプローブの末端にはない。そのため、いくつかの実施形態では、色素の発光スペクトルがクエンチャーの吸収スペクトルと相当に重複する必要がある。
【０１９２】
７．２．６．１．例示的なポリヌクレオチド修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の少なくとも1種の標的DNAの検出方法は、1種または複数の親和性強化ヌクレオチド(affinity-enhancing nucleotide)類似体を含むポリヌクレオチド等の修飾されている1種または複数のポリヌクレオチドを用いる。本明細書に記載の方法で有用な修飾ポリヌクレオチドとして、逆転写用のプライマー、PCR増幅用プライマーおよびプローブが挙げられる。いくつかの実施形態では、親和性強化ヌクレオチドの取り込みにより、デオキシリボヌクレオチドのみを含有するポリヌクレオチドと比較してポリヌクレオチドのその標的核酸に対する結合親和性および特異度が高まり、より短いポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと標的核酸との間のより短い相補性領域の使用が可能になる。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、親和性強化ヌクレオチド類似体として、1種または複数の塩基修飾、糖修飾および/または骨格修飾を含むヌクレオチドが挙げられる。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、親和性強化ヌクレオチド類似体で使用する修飾塩基として、5-メチルシトシン、イソシトシン、偽イソシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、2-クロロ-6-アミノプリン、キサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、親和性強化ヌクレオチド類似体として、2'-O-アルキル-リボース糖、2'-アミノ-デオキシリボース糖、2'-フルオロ-デオキシリボース糖、2'-フルオロ-アラビノース糖および2'-O-メトキシエチル-リボース(2'MOE)糖等の2'-置換糖等の修飾糖を有するヌクレオチドが挙げられる。いくつかの実施形態では、修飾糖はアラビノース糖またはd-アラビノ-ヘキシトール糖である。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、親和性強化ヌクレオチド類似体は、ペプチド核酸(PNA、例えばアミノ酸骨格により互いに連結されている核酸塩基を含むオリゴマー)の使用等の骨格修飾を含む。他の骨格修飾として、ホスホロチオエート連結、ホスホジエステル修飾核酸、ホスホジエステルとホスホロチオエート核酸との組み合わせ、メチルホスホネート、アルキルホスホネート、リン酸エステル、アルキルホスホノチオエート、ホスホルアミデート、カルバミン酸塩、炭酸塩、リン酸トリエステル、アセトアミデート、カルボキシメチルエステル、メチルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、p-エトキシおよびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、修飾塩基を有する少なくとも1種の親和性強化ヌクレオチド類似体、修飾糖を有する少なくともヌクレオチド(同じヌクレオチドであることができる)および/または天然には生じない少なくとも1個のヌクレオチド間連結を含む。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、親和性強化ヌクレオチド類似体はロックド核酸(「LNA」)糖を含有し、該ロックド核酸糖は二環式糖である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用するポリヌクレオチドは、LNA糖を有する1種または複数のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、LNA糖を有するヌクレオチドから成る1個または複数個の領域を含有する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドが散在しているLNA糖を有するヌクレオチドを含有する。例えばFrieden, M.等(2008) Curr. Pharm. Des. 14(11):1138〜1142頁を参照。
【０１９９】
７．２．６．２．例示的なプライマー
いくつかの実施形態では、プライマーが提供される。いくつかの実施形態では、プライマーは、NG2、NG4、CT1もしくはCT2からまたは例えばHMBS、GAPDH、ベータ-アクチンおよびベータ-グロビン等のゲノムコピー数を示す標的遺伝子から選択される配列の少なくとも8個の、少なくとも9個の、少なくとも10個の、少なくとも11個の、少なくとも12個の、少なくとも13個の、少なくとも14個の、少なくとも15個の、少なくとも16個の、少なくとも17個の、少なくとも18個の、少なくとも19個の、少なくとも20個の、少なくとも21個の、少なくとも22個の、少なくとも23個の、少なくとも24個の、少なくとも25個の、少なくとも26個の、少なくとも27個の、少なくとも28個の、少なくとも29個のまたは少なくとも30個の連続ヌクレオチドと同一である、または該連続ヌクレオチドに相補的である。いくつかの実施形態では、NG2、NG4、CT1およびCT2からまたは例えばHMBS、GAPDH、ベータ-アクチンおよびベータ-グロビン等のゲノムコピー数を示す標的遺伝子から選択される配列の6〜100個の、8〜100個の、8〜75個の、8〜50個の、8〜40個のまたは8〜30個の連続ヌクレオチドの全長と同一であるまたは該全長に相補的である領域を含むプライマーが提供される。非限定の例示的なプライマーを表2(表2)に示す。いくつかの実施形態では、プライマーはまた、標的遺伝子と同一ではないもしくは該標的遺伝子に相補的ではない部分または領域を含むこともできる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子と同一であるまたは該標的遺伝子に相補的である、プライマーの領域は連続しており、その結果、標的遺伝子と同一ではないまたは該標的遺伝子に相補的ではない、プライマーの任意の領域は、同一のまたは相補的な領域を分断しない。
【０２００】
本明細書で使用する場合、「選択的にハイブリダイズする」は、プライマーまたはプローブ等のポリヌクレオチドが、ハイブリダイズ領域で異なるヌクレオチド配列を有する、サンプル中に存在する別の核酸にハイブリダイズすることができる場合よりも少なくとも5倍高い親和性で同じサンプル中の特定の核酸にハイブリダイズすることができることを意味する。例示的なハイブリダイゼーション条件を、例えば逆転写反応またはPCR増幅反応に関連して本明細書で論じる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、ハイブリダイズ領域に異なるヌクレオチド配列を有する、サンプル中に存在する別の核酸配列にハイブリダイズすることができる場合よりも少なくとも10倍高い親和性で同じサンプル中の特定の核酸にハイブリダイズすることができる。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、プライマーを使用して標的DNAを増幅させる。いくつかの実施形態では、増幅は、例えば本明細書で論じた定量PCRである。いくつかの実施形態では、プライマーは検出可能な部分を含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、プライマー対が提供される。そのようなプライマー対は、NG2、NG4、CT1またはCT2等の標的遺伝子;内因性コントロールDNA;または外因性コントロールDNA;または例えばHMBS、GAPDH、ベータ-アクチンおよびベータ-グロブリン等のゲノムコピー数を示す標的遺伝子の一部を増幅するように設計される。いくつかの実施形態では、プライマー対は、50〜1500個のヌクレオチド長である、50〜1000個のヌクレオチド長である、50〜750個のヌクレオチド長である、50〜500個のヌクレオチド長である、50〜400個のヌクレオチド長である、50〜300個のヌクレオチド長である、50〜200個のヌクレオチド長である、50〜150個のヌクレオチド長であるまたは50〜100個のヌクレオチド長であるアンプリコンを産生するように設計される。非限定の例示的なプライマー対を表2(表2)に示す。
【０２０３】
７．２．６．３．例示的なプローブ
いくつかの実施形態では、CTおよびNGの存在の検出方法または泌尿生殖路の感染もしくは炎症に関する哺乳動物のスクリーニング方法は、プローブを有するサンプルの核酸または該サンプル由来の核酸をハイブリダイズする工程を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、NG2、NG4、CT1もしくはCT2等の標的遺伝子または例えばHMBS、GAPDH、ベータ-アクチンおよびベータ-グロビン等のゲノムコピー数を示す標的遺伝子に相補的である部分を含む。いくつかの実施形態では、プローブは、標的遺伝子中に同様に存在する部分を含む。いくつかの実施形態では、標的遺伝子に相補的であるプローブは標的遺伝子の十分な部分に相補的であり、その結果、プローブは、使用している特定のアッセイの条件下で標的遺伝子に選択的にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、標的遺伝子に相補的であるプローブは、NG2、NG4、CT1またはCT2等の標的遺伝子の少なくとも8個の、少なくとも9個の、少なくとも10個の、少なくとも11個の、少なくとも12個の、少なくとも13個の、少なくとも14個の、少なくとも15個の、少なくとも16個の、少なくとも17個の、少なくとも18個の、少なくとも19個の、少なくとも20個の、少なくとも21個の、少なくとも22個の、少なくとも23個の、少なくとも24個の、少なくとも25個の、少なくとも26個の、少なくとも27個の、少なくとも28個の、少なくとも29個のまたは少なくとも30個の連続ヌクレオチドに相補的である領域を含む。非限定の例示的なプローブを表2(表2)に示す。標的遺伝子に相補的であるプローブはまた、標的遺伝子に相補的ではない部分または領域も含むことができる。いくつかの実施形態では、標的遺伝子に相補的であるプローブの領域は連続しており、その結果、標的遺伝子に相補的ではない、プローブの任意の領域は、相補的な領域を分断しない。
【０２０４】
上述したように、いくつかの実施形態では、FRETプローブを使用してリアルタイムPCR検出を実施することができ、FRETプローブとして、TaqMan(登録商標)プローブ、分子ビーコンプローブおよびスコーピオンプローブが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、リアルタイプRT-PCRによる検出および定量化を、TaqMan(登録商標)プローブにより、即ち典型的にはDNAの一端で共有結合している蛍光色素およびDNAの他端で共有結合しているクエンチャー分子を有する直鎖状プローブにより実施する。FRETプローブは、標的遺伝子のある領域に相補的である配列を含み、その結果、FRETプローブが標的遺伝子または標的遺伝子のアンプリコンにハイブリダイズする場合には色素の蛍光が消光され、標的遺伝子または標的遺伝子のアンプリコンの増幅中にプローブが消化される場合には色素がプローブから遊離されて蛍光シグナルを生成する。いくつかの実施形態では、サンプル中における標的遺伝子の存在が検出される。
【０２０５】
TaqMan(登録商標)プローブは典型的には、標的遺伝子のある領域中に同様に存在するまたは該領域に相補的である配列を有する連続ヌクレオチドの領域を含み、その結果、プローブは、結果として生じるPCRアンプリコンに特異的にハイブリダイズ可能である。いくつかの実施形態では、プローブは、標的遺伝子のある領域に完全に相補的であるまたは該領域中に同様に存在する配列を有する少なくとも6個の連続ヌクレオチドの領域を含み、例えば検出する標的遺伝子のある領域に相補的であるまたは該領域中に同様に存在する配列を有する少なくとも8個の連続ヌクレオチドの、少なくとも10個の連続ヌクレオチドの、少なくとも12個の連続ヌクレオチドの、少なくとも14個の連続ヌクレオチドのまたは少なくとも16個の連続ヌクレオチドの領域を含む。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、TaqMan(登録商標)プローブ配列に相補的である配列を有する、DNAアンプリコンの領域は、DNAアンプリコンの中心または該中心の付近である。いくつかの実施形態では、相補性領域の5'末端および3'末端でDNAアンプリコンの少なくとも2個のヌクレオチドが、例えば少なくとも3個のヌクレオチドが、例えば少なくとも4個のヌクレオチドが、例えば少なくとも5個のヌクレオチドが独立して存在する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、分子ビーコンを使用してPCR産物を検出および定量化することができる。TaqMan(登録商標)プローブと同様に、分子ビーコンはFRETを使用して、プローブの端部で付着する蛍光色素およびクエンチャーを有するプローブによりPCR産物を検出および定量化する。TaqMan(登録商標)プローブとは異なり、分子ビーコンはPCRサイクル中にインタクトのままである。分子ビーコンプローブは溶液中に遊離している場合にステム-ループ構造を形成し、それにより、色素およびクエンチャーを十分に接近させて蛍光消光を生じさせることが可能になる。分子ビーコンが標的にハイブリダイズする場合、ステム-ループ構造が破壊され、その結果、色素およびクエンチャーが空間中で離れ離れになり、色素が蛍光を発する。分子ビーコンは例えばGene Link(商標)から入手可能である(www.genelink.com/newsite/products/mbintro.aspを参照)。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、スコーピオンプローブを、配列特異的プライマーならびにPCR産物の検出および定量化用の両方として使用することができる。分子ビーコンと同様に、スコーピオンプローブは、標的核酸にハイブリダイズしない場合にステム-ループ構造を形成する。しかしながら、分子ビーコンとは異なり、スコーピオンプローブは、配列特異的なプライミングおよびPCR産物の検出の両方を達成する。蛍光色素分子はスコーピオンプローブの5'末端に付着し、クエンチャーは3'末端に付着する。プローブの3'部分はPCRプライマーの伸長産物に相補的であり、この相補部分は、増幅不能な部分によりプローブの5'末端に連結される。スコーピオンプライマーの伸長後、伸長したアンプリコン内でプローブの標的特異的配列がその相補体に結合し、そのためステム-ループ構造が開き、5'末端上の色素が蛍光を発してシグナルを生成することが可能になる。スコーピオンプローブは例えばPremier Biosoft Internationalから入手可能である(www.premierbiosoft.com/tech_ notes/Scorpion.htmlを参照)。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、FRETプローブで使用することができる標識として、比色色素および蛍光色素、例えばアレクサフルオロ色素、BODIPY FL等のBODIPY色素;カスケードブルー;カスケードイエロー;7-アミノ-4-メチルクマリン、アミノクマリンおよびヒドロキシクマリン等のクマリンおよびその誘導体;Cy3およびCy5等のシアニン色素;エオシンおよびエリスロシン;フルオレセインイソチオシアネート等のフルオレセインおよびその誘導体;Quantum Dye(商標)等のランタニドイオンのマクロサイクリックキレート;マリーナブルー;オレンジグリーン;ローダミンレッド、テトラメチルローダミンおよびローダミン6G等のローダミン色素;テキサスレッド;チアゾールオレンジ-エチジウムヘテロダイマー等の蛍光エネルギー転移色素;ならびにTOTABが挙げられる。
【０２１０】
色素の具体例として、上記で同定したものおよび以下のものが挙げられるがこれらに限定されない:アレクサフルオロ350、アレクサフルオロ405、アレクサフルオロ430、アレクサフルオロ488、アレクサフルオロ500、アレクサフルオロ514、アレクサフルオロ532、アレクサフルオロ546、アレクサフルオロ555、アレクサフルオロ568、アレクサフルオロ594、アレクサフルオロ610、アレクサフルオロ633、アレクサフルオロ647、アレクサフルオロ660、アレクサフルオロ680、アレクサフルオロ700およびアレクサフルオロ750;BODIPY 493/503、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/655、BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMRおよびBODIPY-TR等のアミン反応BODIPY色素;Cy3、Cy5、6-FAM、フルオロセインイソチオシアネート、HEX、6-JOE、オレンジグリーン488、オレンジグリーン500、オレンジグリーン514、パシフィックブルー、REG、ローダミングリーン、ローダミンレッド、レノグラフィン(Renographin)、ROX、SYPRO、TAMRA、2',4',5',7'-テトラブロモスルホンフルオレセインおよびTET。
【０２１１】
色素/クエンチャー対(即ちドナー/アクセプター対)の例として、フルオロセイン/テトラメチルローダミン;IAEDANS/フルオロセイン;EDANS/ダブシル;フルオロセイン/フルオロセイン;BODIPY FL/BODIPY FL;フルオロセイン/QSY 7色素またはQSY 9色素が挙げられるがこれらに限定されない。ドナーおよびアクセプターが同じである場合、いくつかの実施形態では蛍光偏光解消によりFRETを検出することができる。色素/クエンチャー対(即ちドナー/アクセプター対)のある具体例として、アレクサフルオロ350/アレクサフルオロ488;アレクサフルオロ488/アレクサフルオロ546;アレクサフルオロ488/アレクサフルオロ555;アレクサフルオロ488/アレクサフルオロ568;アレクサフルオロ488/アレクサフルオロ594;アレクサフルオロ488/アレクサフルオロ647;アレクサフルオロ546/アレクサフルオロ568;アレクサフルオロ546/アレクサフルオロ594;アレクサフルオロ546/アレクサフルオロ647;アレクサフルオロ555/アレクサフルオロ594;アレクサフルオロ555/アレクサフルオロ647;アレクサフルオロ568/アレクサフルオロ647;アレクサフルオロ594/アレクサフルオロ647;アレクサフルオロ350/QSY35;アレクサフルオロ350/ダブシル;アレクサフルオロ488/QSY 35;アレクサフルオロ488/ダブシル;アレクサフルオロ488/QSY 7またはQSY 9;アレクサフルオロ555/QSY 7またはQSY9;アレクサフルオロ568/QSY 7またはQSY 9;アレクサフルオロ568/QSY 21;アレクサフルオロ594/QSY 21;およびアレクサフルオロ647/QSY 21が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、同じクエンチャーを多重色素に使用することができ、例えばIowa Black(登録商標)クエンチャー(Integrated DNA Technologies、コーラルヴィル、アイオワ州)またはBlack Hole Quencher(商標)(BHQ(商標);Sigma-Aldrich、セントルイス、ミズーリ州)等の広域スペクトルクエンチャーを多重色素に使用することができる。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、例えば2種以上の部分(アンプリコン等)を同時に検出する多重反応において各プローブは検出可能程度に異なる色素を含み、その結果、同じ反応で同時に検出する場合に色素を識別することができる。当業者は、多重反応で使用する検出可能な程度に異なる色素のセットを選択することができる。
【０２１３】
本明細書に記載の方法のいくつかの実施形態で使用するリアルタイムPCR用プローブの調製に有用な蛍光標識リボヌクレオチドの具体例はMolecular Probes(Invitrogen)から入手可能であり、これらとしてアレクサフルオロ488-5-UTP、フルオレセイン-12-UTP、BODIPY FL-14-UTP、BODIPY TMR-14-UTP、テトラメチルローダミン-6-UTP、アレクサフルオロ546-14-UTP、テキサスレッド-5-UTPおよびBODIPY TR-14-UTPが挙げられる。Cy3-UTPおよびCy5-UTP等の他の蛍光リボヌクレオチドがAmersham Biosciences(GE Healthcare)から入手可能である。
【０２１４】
本明細書に記載の方法で使用するリアルタイムPCR用プローブの調製に有用な蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの例として、ジニトロフェニル(DNP)-1'-dUTP、カスケードブルー-7-dUTP、アレクサフルオロ488-5-dUTP、フルオレセイン-12-dUTP、オレゴングリーン488-5-dUTP、BODIPY FL-14-dUTP、ローダミングリーン-5-dUTP、アレクサフルオロ532-5-dUTP、BODIPY TMR-14-dUTP、テトラメチルローダミン-6-dUTP、アレクサフルオロ546-14-dUTP、アレクサフルオロ568-5-dUTP、テキサスレッド-12-dUTP、テキサスレッド-5-dUTP、BODIPY TR-14-dUTP、アレクサフルオロ594-5-dUTP、BODIPY 630/650-14-dUTP、BODIPY 650/665-14-dUTP;アレクサフルオロ488-7-OBEA-dCTP、アレクサフルオロ546-16-OBEA-dCTP、アレクサフルオロ594-7-OBEA-dCTP、アレクサフルオロ647-12-OBEA-dCTPが挙げられる。蛍光標識ヌクレオチドは市販されており、例えばInvitrogenから購入することができる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、色素およびクエンチャー等の他の部分は、修飾ヌクレオチドを介して、FRETプローブ等の本明細書に記載の方法で使用するポリヌクレオチド中に導入される。「修飾ヌクレオチド」は、化学修飾されているがヌクレオチドとして依然として機能するヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、色素またはクエンチャー等の共有結合的に付着している化学的部分を有し、例えばポリヌクレオチドの固相合成により、ポリヌクレオチド中に導入され得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドの核酸中への組み込み前に、組み込み中にまたは組み込み後に色素またはクエンチャーと反応することができる1種または複数の反応基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドはアミン修飾ヌクレオチドであり、即ち反応性アミン基を有するように修飾されているヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドは、ウリジン、アデノシン、グアノシンおよび/またはシトシン等の修飾塩基部分を含む。いくつかの実施形態では、アミン修飾ヌクレオチドは、5-(3-アミノアリル)-UTP;8-[(4-アミノ)ブチル]-アミノ-ATPおよび8-[(6-アミノ)ブチル]-アミノ-ATP;N6-(4-アミノ)ブチル-ATP、N6-(6-アミノ)ブチル-ATP、N4-[2,2-オキシ-ビス-(エチルアミン)]-CTP;N6-(6-アミノ)ヘキシル-ATP;8-[(6-アミノ)ヘキシル]-アミノ-ATP;5-プロパギルアミノ-CTP、5-プロパギルアミノ-UTPから選択される。いくつかの実施形態では、様々な核酸塩基部分を有するヌクレオチドが同様に修飾され、例えば5-(3-アミノアリル)-UTPの代わりに5-(3-アミノアリル)-GTPが修飾される。多くのアミン修飾ヌクレオチドが、例えばApplied Biosystems、Sigma、Jena BioscienceおよびTriLinkから市販されている。
【０２１６】
例示的な検出可能部分として結合対のメンバーも挙げられるがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、結合対の第1のメンバーがポリヌクレオチドに連結される。結合対の第2のメンバーが、蛍光標識等の検出可能な標識に連結される。結合対の第1のメンバーに連結されているポリヌクレオチドが、検出可能な標識に連結されている結合対の第2のメンバーとインキュベートされる場合、結合対の第1のメンバーおよび第2のメンバーが結合してポリヌクレオチドが検出され得る。例示的な結合対として、ビオチンおよびストレプトアビジン、抗体および抗原等が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、単一の多重反応で複数の標的遺伝子を検出する。いくつかの実施形態では、異なる遺伝子を標的とする各プローブは、プローブから遊離される場合にスペクトル的に識別可能である。そのため、各標的遺伝子を固有の蛍光シグナルにより検出する。
【０２１８】
当業者は、選択したアッセイに適した、例えばリアルタイムPCRアッセイに適した検出方法を選択することができる。選択した検出方法は上述した方法である必要はなく、任意の方法であることができる。
【０２１９】
７．３．例示的な組成物およびキット
別の態様では組成物が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法で使用する組成物が提供される。
【０２２０】
７．３．１．CTおよびNGを検出するための組成物およびキット
いくつかの実施形態では、少なくとも1種の標的遺伝子特異的プライマーを含む組成物が提供される。用語「標的遺伝子特異的プライマー」は、(i)NG2、NG4、CT1もしくはCT2等の標的遺伝子中に同様に存在する配列または(ii)NG2、NG4、CT1もしくはCT2等の標的遺伝子中に見出される連続ヌクレオチドの領域の配列に相補的である配列を有する連続ヌクレオチドの領域を有するプライマーを包含する。いくつかの実施形態では、少なくとも1対の標的遺伝子特異的プライマーを含む組成物が提供される。用語「標的遺伝子特異的プライマーの対」は、NG2、NG4、CT1またはCT2等の標的遺伝子の規定の領域を増幅させるのに適しているプライマーの対を包含する。標的遺伝子特異的プライマーの対は典型的には、標的遺伝子のある領域の配列と同一である配列を含む第1のプライマーと、標的遺伝子のある領域に相補的である(即ち標的遺伝子の相補鎖と同一である)配列を含む第2のプライマーとを含む。プライマーの対は典型的には、50〜1500個のヌクレオチド長である、50〜1000個のヌクレオチド長である、50〜750個のヌクレオチド長である、50〜500個のヌクレオチド長である、50〜400個のヌクレオチド長である、50〜300個のヌクレオチド長である、50〜200個のヌクレオチド長である、50〜150個のヌクレオチド長であるまたは50〜100個のヌクレオチド長である、標的遺伝子のある領域を増幅させるのに適している。非限定の例示的なプライマーおよびプライマーの対を表2(表2)に示す。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、組成物は、1対がNG2、NG4およびCT1のそれぞれを増幅させるためのものである3対の標的遺伝子特異的プライマーを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、1対がNG2、NG4およびCT2のそれぞれを増幅させるためのものである3対の標的遺伝子特異的プライマーを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、内因性コントロールDNAを増幅させるための1対の標的特異的プライマーおよび/または外因性コントロールDNAを増幅させるための1対の標的特異的プライマーを更に含む。
【０２２２】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも1種の標的遺伝子特異的プローブを含む。用語「標的遺伝子特異的プローブ」は、(i)NG2、NG4、CT1もしくはCT2等の標的遺伝子中に同様に存在する配列または(ii)NG2、NG4、CT1もしくはCT2等の標的遺伝子中に見出される連続ヌクレオチドの領域の配列に相補的である配列を有する連続ヌクレオチドの領域を有するプローブを包含する。非限定の例示的な標的特異的プローブを表2(表2)に示す。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、組成物は、1対がNG2、NG4およびCT1のそれぞれを増幅させるためのものである3対の標的遺伝子特異的プライマーを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、1対がNG2、NG4およびCT2のそれぞれを増幅させるためのものである3対の標的遺伝子特異的プライマーを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、内因性コントロールを検出するためのプローブおよび/または外因性コントロールDNAを検出するためのプローブを更に含む。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、組成物は水性組成物である。いくつかの実施形態では、以下で論じるように、水性組成物は、例えばリン酸塩、トリス、HEPES等の緩衝成分および/または追加成分を含む。いくつかの実施形態では、組成物は乾燥しており、例えば凍結乾燥されており、液体の添加による再構成に適している。乾燥組成物は、1種もしくは複数の緩衝成分および/または追加成分を含むことができる。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、組成物は、1種または複数の追加成分を更に含む。追加成分として、NaCl、KClおよびMgCl2等の塩類;Taq等の耐熱性ポリメラーゼを含むポリメラーゼ;dNTP;ウシ血清アルブミン(BSA)等;β-メルカプトエタノール等の還元剤;EDTA等が挙げられるがこれらに限定されない。当業者は、組成物の使用目的に応じて適切な組成物成分を選択することができる。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、少なくとも1種の標的遺伝子を検出するための少なくとも1種のポリヌクレオチドを含む組成物が提供される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを増幅用のプライマーとして使用する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドをリアルタイムPCR用のプライマーとして使用する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドを、少なくとも1種の標的遺伝子を検出するためのプローブとして使用する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは検出可能に標識される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはFRETプローブである。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドはTaqMan(登録商標)プローブ、分子ビーコンまたはスコーピオンプローブである。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、組成物は、NG2、NG4、CT1またはCT2のある領域中に同様に存在するまたは該領域に相補的である配列を有する少なくとも1種のFRETプローブを含む。いくつかの実施形態では、FRETプローブはドナー/アクセプター対で標識され、その結果、PCR反応中にプローブが消化される場合、プローブは特定の標的遺伝子または標的遺伝子のアンプリコンに関連する固有の蛍光発光を生じる。いくつかの実施形態では、組成物が複数のFRETプローブを含む場合、各プローブは異なるドナー/アクセプター対で標識され、その結果、PCR反応中にプローブが消化される場合、それぞれが、特定のプローブ配列および/または標的遺伝子に関連する固有の蛍光発光を生じる。いくつかの実施形態では、FRETプローブの配列は標的遺伝子の標的領域に相補的である。いくつかの実施形態では、FRETプローブは、標的遺伝子の最も一致した標的領域の配列と比較した場合に1個または複数個の塩基ミスマッチを含む配列を有する。
【０２２８】
いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも8個の、少なくとも9個の、少なくとも10個の、少なくとも11個の、少なくとも13個の、少なくとも14個の、少なくとも15個の、少なくとも16個の、少なくとも17個の、少なくとも18個の、少なくとも19個の、少なくとも20個の、少なくとも21個の、少なくとも22個の、少なくとも23個の、少なくとも24個のまたは少なくとも25個のヌクレオチドから成るFRETプローブを含み、配列の少なくとも一部はNG2、NG4、CT1またはCT2のある領域中に同様に存在するまたは該領域に相補的である。いくつかの実施形態では、FRETプローブの少なくとも8個の、少なくとも9個の、少なくとも10個の、少なくとも11個の、少なくとも13個の、少なくとも14個の、少なくとも15個の、少なくとも16個の、少なくとも17個の、少なくとも18個の、少なくとも19個の、少なくとも20個の、少なくとも21個の、少なくとも22個の、少なくとも23個の、少なくとも24個のまたは少なくとも25個のヌクレオチドは、NG2、NG4、CT1またはCT2のある領域中に同様に存在するまたは該領域に相補的である。いくつかの実施形態では、FRETプローブは、NG2、NG4、CT1またはCT2の配列または相補体と比較した場合に1個の、2個のまたは3個の塩基ミスマッチを有する配列を有する。
【０２２９】
いくつかの実施形態では、キットは、上記で論じたポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、キットは、上記で論じた少なくとも1種のプライマーおよび/またはプローブを含む。いくつかの実施形態では、キットは、耐熱性ポリメラーゼ等の少なくとも1種のポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、キットはdNTPを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリアルタイムPCR方法で使用するキットは、1種もしくは複数の標的遺伝子特異的FRETプローブおよび/または標的遺伝子の増幅用の1種もしくは複数のプライマーを含む。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、1種もしくは複数のプライマーおよび/またはプローブは「直鎖状」である。「直鎖状」プライマーは、一本鎖分子であるおよびプライマーが内部二本鎖を形成するような同じポリヌクレオチド内の別の領域に相補的である例えば少なくとも3個の、4個のまたは5個の連続ヌクレオチドの短い領域を典型的には含まないポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、逆転写で使用するプライマーは、標的遺伝子の5'末端で少なくとも4個の、例えば少なくとも5個の、例えば少なくとも6個の、例えば少なくとも7個のまたはそれ以上の連続ヌクレオチドの領域に相補的である配列を有する、3'末端で少なくとも4個の、例えば少なくとも5個の、例えば少なくとも6個の、例えば少なくとも7個のまたはそれ以上の連続ヌクレオチドの領域を含む。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、キットは、NG2、NG4、CT1またはCT2等の標的遺伝子の増幅用の1対または複数対の直鎖状プライマー(「フォワードプライマー」および「リバースプライマー」)を含む。従って、いくつかの実施形態では、第1のプライマーは、遺伝子の第1の位置で少なくとも8個の、少なくとも9個の、少なくとも10個の、少なくとも11個の、少なくとも12個の、少なくとも13個の、少なくとも14個の、少なくとも15個の、少なくとも16個の、少なくとも17個の、少なくとも18個の、少なくとも19個の、少なくとも20個の、少なくとも21個の、少なくとも22個の、少なくとも23個の、少なくとも24個のまたは少なくとも25個の連続ヌクレオチドの領域の配列と同一である配列を有する少なくとも8個の、少なくとも9個の、少なくとも10個の、少なくとも11個の、少なくとも12個の、少なくとも13個の、少なくとも14個の、少なくとも15個の、少なくとも16個の、少なくとも17個の、少なくとも18個の、少なくとも19個の、少なくとも20個の、少なくとも21個の、少なくとも22個の、少なくとも23個の、少なくとも24個のまたは少なくとも25個の連続ヌクレオチドの領域を含む。更に、いくつかの実施形態では、第2のプライマーは、遺伝子の第2の位置で少なくとも8個の、少なくとも9個の、少なくとも10個の、少なくとも11個の、少なくとも12個の、少なくとも13個の、少なくとも14個の、少なくとも15個の、少なくとも16個の、少なくとも17個の、少なくとも18個の、少なくとも19個の、少なくとも20個の、少なくとも21個の、少なくとも22個の、少なくとも23個の、少なくとも24個のまたは少なくとも25個の連続ヌクレオチドの領域の配列に相補的である配列を有する少なくとも8個の、少なくとも9個の、少なくとも10個の、少なくとも11個の、少なくとも12個の、少なくとも13個の、少なくとも14個の、少なくとも15個の、少なくとも16個の、少なくとも17個の、少なくとも18個の、少なくとも19個の、少なくとも20個の、少なくとも21個の、少なくとも22個の、少なくとも23個の、少なくとも24個のまたは少なくとも25個の連続ヌクレオチドの領域を含み、その結果、これら2つのプライマーを使用するPCR反応により、標的遺伝子の第1の位置から標的遺伝子の第2の位置に伸長するアンプリコンが生じる。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも2セットの、少なくとも3セットのまたは少なくとも4セットのプライマーを含み、これらの内のそれぞれは、NG2、NG4、CT1またはCT2等の異なる標的遺伝子の増幅用である。いくつかの実施形態では、キットは、内因性コントロールおよび/または外因性コントロール等のコントロールDNAの増幅用の少なくとも1セットのプライマーを更に含む。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物で使用するプローブおよび/またはプライマーはデオキシリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物で使用するプローブおよび/またはプライマーは、デオキシリボヌクレオチドと、LNA類似体または上述の他の二本鎖安定ヌクレオチド類似体等の1種もしくは複数のヌクレオチド類似体とを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物で使用するプローブおよび/またはプライマーは、全てのヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態では、プローブおよび/またはプライマーは、相補性領域中にLNA類似体等の1種または複数の二本鎖安定ヌクレオチド類似体を含む。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のリアルタイムPCR方法で使用するキットは、増幅反応で使用する試薬を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、Taqポリメラーゼ等の耐熱性DNAポリメラーゼ等の酵素を含む。いくつかの実施形態では、キットは、増幅で使用するデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、プローブおよびプライマーの特異的ハイブリダイゼーションに最適化されている緩衝液を含む。
【０２３５】
７．３．２．泌尿生殖路の感染または炎症に関する哺乳動物のスクリーニング用キット
本発明はまた、泌尿生殖路の感染または炎症に関する哺乳動物のスクリーニング用キットも提供する。そのようなキットは、本明細書に記載のスクリーニング方法のいずれかの実行に有用である1種または複数の試薬を含む。キットは一般的に、1種もしくは複数の別々の組成物としてまたは任意選択で試薬が相溶するであろう混合物として試薬を保持する1個または複数個の容器を有するパッケージを含む。キットはまた、緩衝液、希釈液、標準物質等のユーザーの観点から望ましい可能性がある他の材料および/またはサンプル処理、洗浄もしくはアッセイの任意の他の工程を行なうのに有用な任意の他の材料を含むこともできる。
【０２３６】
キットは、本明細書に記載の1種または複数のスクリーニング方法を実行するための説明書を好ましくは含む。本発明のキットに含まれる説明書は、パッケージ材料に添付され得る、またはパッケージ挿入物として含まれ得る。説明書は典型的には記載物または印刷物であるが、説明書はそのようなものに限定されない。そのような説明書を記憶することができるおよびエンドユーザーに説明書を通信することができる任意の媒体が本発明により意図される。そのような媒体として、電子記憶媒体(例えば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ)、光学媒体(例えばCD ROM)等が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で使用する場合、用語「説明書」は、説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含むことができる。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、上昇したゲノムコピー数および病原体のスクリーニング方法を実施するためのキットは、ゲノムコピー数の指標を検出するためのもしくは配列決定するための少なくとも1種のプライマーおよび/またはプローブと、泌尿生殖路に感染する病原体および/もしくは炎症に関連するmiRNAを示す核酸配列を検出するためのまたは配列決定するための少なくとも1種のプライマーおよび/またはプローブとを含む。これらの実施形態のバリエーションでは、ゲノムコピー数の指標として、1コピーまたは2コピーで哺乳動物のゲノム中に存在すると思われる少なくとも1種の核酸配列が挙げられる。そのような核酸配列の例として、ヒドロキシメチルビランシンターゼ(HMBS)核酸配列、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)核酸配列、ベータ-アクチン核酸配列およびベータ-グロビン核酸配列が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、キットは、ゲノムコピー数の複数の指標それぞれを検出するためのもしくは配列決定するための少なくとも1種のプライマーおよび/またはプローブを含むことができる。検出する病原体がクラミジア・トラコマチス(CT)およびナイセリア・ゴノレア(NG)である場合、本目的に関して本明細書に記載のプライマーおよび/またはプローブのいずれかがキットに含まれ得る。泌尿生殖路に感染する他の病原体を検出するためのもしくは配列決定するための他のプライマーおよびプローブは既知である、または容易に設計され得る、ならびにキットに含まれ得る。同様に、本明細書に記載のものを含む、炎症に関連するmiRNAを検出するためのもしくは配列決定するためのプライマーおよびプローブは既知である、または容易に設計され得る、およびキットに含まれ得る。
【０２３８】
ヒトスクリーニングに有用であるいくつかの実施形態では、ゲノムコピー数の指標はヒトHBMS配列であり、キットは、HBMSの増幅に有用である配列番号113および配列番号114を含む1種または複数のプライマーを含む。いくつかの実施形態では、キットは、配列番号115を含むプローブを含むことができる。このプローブは、例えば配列番号113を含むプライマーおよび配列番号114を含むプライマーを使用して増幅されるヒトHBMS配列の検出に有用である。プローブを標識して、例えばリアルタイプPCR反応での検出を容易にすることができる。いくつかの実施形態では、プローブはTaqman(登録商標)プローブである。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、キットは、1個または複数個のGeneXpert(登録商標)サンプルカートリッジ中に供給されている上述の試薬を含むことができる。これらのカートリッジにより、この自己完結型の「カートリッジ中の検査室」内での抽出、増幅および検出の実行が可能になる(例えば米国特許第5,958,349号、米国特許第6,403,037号、米国特許第6,440,725号、米国特許第6,783,736号、米国特許第6,818,185号を参照;これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に援用される)。ゲノムコピー数のレベルを測定するためのおよび病原体を検出するための試薬をキット内の別々のカートリッジ中に供給することができ、またはこれらの試薬(多重検出に適している)を単一のカートリッジ中に供給することができた。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、例えばゲノムコピー数の複数の指標をアッセイするのに有用であるキットは、基質上に、例えばDNAアレイ上に固定されているプローブを含むことができる。
【０２４１】
本明細書に記載のキットのいずれかは、いくつかの実施形態では、尿サンプル用の、または尿道スワブサンプル、膣スワブサンプルもしくは子宮頸管スワブサンプルを採取するためのスワブ用の容器を含むことができる。
【０２４２】
以下の実施例は説明を目的とするのみであり、限定することを決して意味しない。
【実施例】
【０２４３】
８．実施例
８．１．実施例1：CT標的遺伝子およびNG標的遺伝子、ならびに標的遺伝子を検出するためのプローブおよびプライマー
候補NG標的領域を選択し、ナイセリア・ゴノレアの約125種の異なる市販の株中に存在することを確認した。候補CT標的領域を選択し、クラミジア・トラコマチスの14種の市販の血清型中に存在することを確認した。特異的で敏感なCT/NG診断検査を開発するために選択した12種の標的遺伝子を表1(表1)に示す。
【０２４４】
【表１Ａ】
2015525067.tif 000003
【０２４５】
【表１Ｂ】
2015525067.tif 000004
【０２４６】
【表１Ｃ】
2015525067.tif 000005
【０２４７】
【表１Ｄ】
2015525067.tif 000006
【０２４８】
表2(表2)は、リアルタイムPCR反応で各標的遺伝子を検出するために使用することができる例示的なプライマーおよびプローブと、内因性コントロールであるHMBSを検出するために使用することができる例示的なプライマーおよびプローブとの配列を示す。
【０２４９】
【表２Ａ】
2015525067.tif 000007
【０２５０】
【表２Ｂ】
2015525067.tif 000008
【０２５１】
【表２Ｃ】
2015525067.tif 000009
【０２５２】
HMBSのフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、HMBS遺伝子のある領域を増幅する。検出用の遺伝子の特定のセットに関して、該セット用の各プローブは、検出可能な程度に異なる色素、即ち多重反応で同時に検出されて識別され得る色素を含む。各プローブはまた、クエンチャーを含むこともできる(本明細書で論じたように、1個または複数個のクエンチャーが同じであることができる)。例えば、4種の遺伝子をCT/NG診断アッセイで検出する場合、各遺伝子用の1種のプローブに加えて、各遺伝子用の1セットのプライマーを使用することができる。アッセイにおける各プローブは、検出可能な程度に異なる色素およびクエンチャーを含むことができる。非限定で例示的でもある検出可能な程度に異なる色素およびクエンチャーを本明細書で論じる。いくつかの実施形態では、色素はプローブの5'末端上にあり、クエンチャーはプローブの3'末端上にある。
【０２５３】
加えて、いくつかの実施形態では、フォワードプライマーおよびリバースプライマーならびに外因性コントロールを検出するためのプローブ(プローブは、反応中の他のプローブと検出可能な程度に異なる色素を含む)と共に、無関係の細菌のDNAに由来する外因性DNAコントロールを使用する。
【０２５４】
８．２．実施例2：リアルタイムPCRを使用してCTおよびNGを検出するための二重変性方法
CTおよびNGを検出するためのより安定したゲノム標的遺伝子の使用の潜在的弱点の1つは、いくつかの他の診断検査で使用するプラスミド標的のように、ゲノム標的遺伝子が高コピー数で存在しないことである。結果として、標的検出の感度を高めるために二重変性工程を開発した。二重変性工程では、サンプルの1回目の変性を行ない、次いでプライマーおよびプローブを添加し、サンプルの2回目の変性を行なった後にサーマルサイクリングを開始する。いずれの特定の理論に拘束されることを意図するものではないが、最初の変性工程は、プライマーおよびプローブの添加前に、反応中のテンプレートの数(従ってテンプレートの濃度)を効率的に倍加することができる。
【０２５５】
二重変性工程の効果を検査するために、各標的遺伝子NG2、NG4、CT1およびCT2に関して3種の異なる反応を実行した。最終的な反応成分はいずれの場合も同じであり、50〜100mMのKCl、4〜9mMのMgCl2、200〜500μMのdNTP、50mMのTris、pH8.6、1mMのEDTAを含んだ。AptaTaq(0.25単位/μl;Roche)を増幅用に使用した。この実験では、NG2eプライマーおよびプローブ(各200nM)、NG4dプライマーおよびプローブ(各200nM)、CT1cプライマーおよびプローブ(プライマー400nM、プローブ200nM)ならびにCT2aプライマーおよびプローブ(プライマー400nM、プローブ200nM)を使用した。加えて、HMBSを検出するためのプライマーおよびプローブ(各200nM)ならびに外因性コントロールDNAを検出するためのプライマーおよびプローブのセットを入れた。各プローブは、5'末端上に検出可能な程度に異なる色素を含み、3'末端上にクエンチャーを含んだ。プライマーおよびプローブの配列に関して表2(表2)を参照。
【０２５６】
1mLのサンプルをGeneXpert(登録商標)カートリッジ(Cephied、サニーベール、カリフォルニア州)中に充填し、分析するためにGeneXpert(登録商標)システム中に置いた。カートリッジ中において、サンプルの100μlのアリコートを、200μlのチオシアン酸グアニジン溶解試薬(3〜5Mのチオシアン酸グアニジン、100〜150mMのクエン酸ナトリウム、0.1%〜0.5%w/vのN-ラウロイルザルコシンおよび0.5%〜3%w/vのN-アセチル-L-システインを含有する)と混合する。次いで、200μlのDNA結合試薬(70〜100%のポリエチレンオキシド200)をアリコートに添加し、DNAをガラス繊維に結合させる。サイクルを10回繰り返し、次いで、全DNAを約85μlのTris/EDTA緩衝液(50mMのTris、1mMのEDTA)中に溶出させる。DNAの溶出後に、3種の反応条件の内の1種を適用した。
【０２５７】
コントロールの反応において、リアルタイムPCRのプロトコールは以下の通りであった:酵素、プライマーならびにNG2、NG4、CT1、CT2、内因性コントロール(HMBS)および細菌DNA外因性コントロールを検出するためのプローブをDNAの溶出液に添加した。25μlのアリコートを60秒間94℃に加熱する。次いで、アリコートに対して以下の2段階サイクル:(1)94℃で5秒間、(2)66℃で30秒間を45回繰り返す。
【０２５８】
プレ変性反応において、リアルタイムPCRのプロトコールは以下の通りであった:溶出液の25μlのアリコートを95℃で60秒間加熱し、次いで溶出液の2つの20μlのアリコートを60秒間95℃に順次加熱する。酵素ならびにプライマーならびにNG2、NG4、CT1、CT2、内因性コントロール(HMBS)および細菌DNA外因性コントロールを検出するためのプローブを溶出液に添加する。次いで、酵素、プライマーおよびプローブを含有するDNA溶出液の25μlのアリコートを60秒間94℃に加熱する。次いで、アリコートに対して以下の2段階サイクル:(1)94℃で5秒間、(2)66℃で30秒間を45回繰り返す。
【０２５９】
二重変性方法において、リアルタイムPCRのプロトコールは以下の通りであった:溶出液の25μlのアリコートを95℃で60秒間加熱し、次いで溶出液の2つの20μlのアリコートを60秒間95℃に順次加熱する。酵素ならびにプライマーならびにNG2、NG4、CT1、CT2、内因性コントロール(HMBS)および細菌DNA外因性コントロールを検出するためのプローブを溶出液に添加する。それぞれが15〜25μlである6つのアリコートを5秒間95℃に順次加熱する。次いで、酵素、プライマーおよびプローブを含有するDNA溶出液の25μlのアリコートを60秒間94℃に加熱する。次いで、アリコートに対して以下の2段階サイクル:(1)94℃で5秒間、(2)66℃で30秒間を45回繰り返す。結果までの時間は約87分であった。
【０２６０】
この実験の結果を図1に示す。標的NG2に関しては、コントロールのプロトコールで検出された3つのサンプルおよびプレ変性のプロトコールで検出された2つのサンプルが増幅に失敗したが、二重変性のプロトコールで検出された1つのサンプルのみが増幅に失敗した。NG4に関しては、コントロールのプロトコールで検出された5つのサンプルおよびプレ変性のプロトコールで検出された1つのサンプルが増幅に失敗し、二重変性のプロトコールで検出された1つのサンプルのみが増幅に失敗した。CT1に関しては、コントロールのプロトコールで検出された2つのサンプルおよびプレ変性のプロトコールで検出された1つのサンプルが増幅に失敗したが、二重変性のプロトコールで検出されたサンプルは増幅に失敗しなかった。CT2に関しては、3種全ての反応条件を使用して全てのサンプルが増幅した。そのため、4種の標的遺伝子の内の3種に関して、二重変性のプロトコールを使用した場合に、標的の増幅に失敗したサンプルの数が減少した。加えて、4種全ての標的に関して、コントロールまたはプレ変性のプロトコールにおいてよりも二重変性のプロトコールにおいて早いサイクル回数で陽性のシグナルが出現した。
【０２６１】
８．３．実施例3：CT/NG診断検査の包括性および排他性
標的遺伝子NG2、NG4およびCT1を検出する診断検査の特異度および感度を確認するために、以下のCT株およびNG株ならびにサンプルのタイプを分析した:
1.CTの15種の血清型;
2.CTを含有することが知られている30種の臨床検体;
3.スウェーデン多様体nvCTを含有することが知られている11種の臨床検体;
4.米国、英国およびスウェーデンからの50種の地理的に多様なNG株;ならびに
5.生殖器に頻繁にコロニーを形成する101種の非CT/非NGの病原体および生物。表3(表3)を参照。
【０２６２】
【表３Ａ】
2015525067.tif 000010
【０２６３】
【表３Ｂ】
2015525067.tif 000011
【０２６４】
【表３Ｃ】
2015525067.tif 000012
【０２６５】
この実験では、NG2eプライマーおよびプローブ(各200nM)、NG4dプライマーおよびプローブ(各200nM)ならびにCT1cプライマーおよびプローブ(プライマー400nM、プローブ200nM)を使用した。加えて、HMBSを検出するためのプライマーおよびプローブ(各200nM)ならびに外因性コントロールDNAを検出するためのプライマーおよびプローブのセットを入れた。各プローブは、5'末端上に検出可能な程度に異なる色素を含み、3'末端上にクエンチャーを含んだ。プライマーおよびプローブの配列に関して表2(表2)を参照。表4(表4)は、NG2、NG4およびCT1を検出する診断検査に関する結果の検索表を示す。
【０２６６】
【表４】
2015525067.tif 000013
【０２６７】
表4(表4)に示すように、NG2およびNG4の両方を検出する場合にはサンプル中にNGを検出するが、それらの内の一方のみの検出はNGを検出しなかったことを意味する。更に、内因性コントロールおよび外因性コントロールの結果は、CTマーカーまたはNGマーカーのいずれかを検出する場合には無視される。
【０２６８】
診断検査は上記(1)〜(4)の全ての株を検出することができ、示した場合を除いて106CFU/mLの濃度で検査した(5)における非CT/非NGの病原体および生物(表3(表3)を参照)のいずれとも交差反応性はなかった。加えて、検査は、泌尿生殖器の検体中に存在することができる物質の以下の濃度の存在下で正確であった:スワブに対して1%v/v未満の血液、スワブに対して0.8%w/v未満のムチン、尿に対して0.3%v/v未満の血液、尿に対して0.2%w/v未満のムチン、尿に対して0.3mg/mL未満のビリルビン、尿に対して0.2%未満のVagisil(登録商標)粉末。
【０２６９】
８．４．実施例4：患者のサンプル中におけるCTおよびNGの検出
GeneXpert(登録商標)で検査するために、各男性の患者から尿サンプルを採取した。女性の患者に関しては、尿サンプル、子宮頸管スワブサンプルおよび膣スワブサンプルを採取した。使用前に、緩衝液を尿サンプルに添加し、スワブを緩衝液中に留置した。この実験では、NG2eプライマーおよびプローブ(各200nM)、NG4dプライマーおよびプローブ(各200nM)およびCT1cプライマーおよびプローブ(プライマー400nM、プローブ200nM)を使用した。加えて、HMBSを検出するためのプライマーおよびプローブ(各200nM)ならびに外因性コントロールDNAを検出するためのプライマーおよびプローブのセットを入れた。各プローブは、5'末端上に検出可能な程度に異なる色素を含み、3'末端上にクエンチャーを含んだ。プライマーおよびプローブの配列に関して表2(表2)を参照。
【０２７０】
1mLのサンプルをGeneXpert(登録商標)カートリッジ(Cephied、サニーベール、カリフォルニア州)中に充填し、分析するためにGeneXpert(登録商標)システム中に置いた。カートリッジ中において、サンプルの100μlのアリコートを、200μlのチオシアン酸グアニジン溶解試薬(3〜5Mのチオシアン酸グアニジン、100〜150mMのクエン酸ナトリウム、0.1%〜0.5%w/vのN-ラウロイルザルコシンおよび0.5%〜3%w/vのN-アセチル-L-システインを含有する)と混合する。次いで、200μlのDNA結合試薬(70〜100%のポリエチレンオキシド200)をアリコートに添加し、DNAをガラス繊維に結合させる。サイクルを10回繰り返し、次いで全DNAを約85μlのTris/EDTA緩衝液(50mMのTris、1mMのEDTA)中に溶出させる。
【０２７１】
DNAの溶出後、上述の二重変性のプロトコールを使用して以下のようにCT標的およびNG標的を検出する。溶出液の25μlのアリコートを95℃で60秒間加熱し、次いで溶出液の2つの20μlのアリコートを60秒間95℃に順次加熱する。酵素ならびにプライマーならびにNG2、NG4、CT1、内因性コントロール(HMBS)および細菌DNA外因性コントロールを検出するためのプローブを溶出液に添加する。それぞれが15〜25μlである6つのアリコートを5秒間95℃に順次加熱する。次いで、酵素、プライマーおよびプローブを含有するDNA溶出液の25μlのアリコートを60秒間94℃に加熱する。次いで、アリコートに対して以下の2段階サイクル:(1)94℃で5秒間、(2)66℃で30秒間を45回繰り返す。結果までの時間は約87分であった。全ての標的遺伝子に関して、45サイクルの終了前の任意の時間での陽性のシグナルを陽性の結果と見なした。
【０２７２】
検査の感度および特異度を決定するために、CTおよびNGの両方からのリボソームRNAを検出するGenProbe APTIMA Combo 2(登録商標)アッセイで各サンプルを分析することにより、ならびにCTの潜在プラスミドのDNAおよびNGのゲノムDNAを検出するBD ProbeTec(商標)ETクラミジア・トラコマチスおよびナイセリア・ゴノレア増幅DNAアッセイで各サンプルを分析することにより、患者の感染状態を決定した。各検査を使用して、各女性の患者からの尿サンプルおよび子宮頸管スワブサンプルならびに男性の患者からの尿サンプルおよび尿道スワブサンプルを分析した。図2は、各検査からの結果による患者の感染状態のグリッドを示す。この図において、EQ=疑わしい(即ち、アッセイのグレーゾーンに含まれる場合);I=感染している;およびNI=感染していない。しかしながら、2種の検査の組み合わせを使用して患者の感染状態を決定したことから、全患者の感染状態の正確さは、2種の検査のいずれかのみで得られるであろうよりも高かった。
【０２７３】
本明細書に記載のCT/NG検査を使用して6,550個のサンプルを検査した。1回目の試みで、サンプルの97.1%(6,360/6550)を感染しているまたは感染していないと正確に同定した。1回目の試みで失敗している190個のサンプル(システムエラー(159個)、無効な結果(17個)または結果なし(14個)が原因)について、185個を再検査した。2回目の試みで、再検査したサンプルの内の164個を感染しているまたは感染していないと正確に同定した。そのため、アッセイの全体的な成功率は99.6%(6,524/6550)であった。
【０２７４】
本アッセイ(「Xpert CT/NGアッセイ」と称する)および現在入手可能である5種の異なるCT/NGアッセイの全体的な感度および特異度を図3に示す。図3Aに示すように、本アッセイは、4種全てのサンプルのタイプに関して5種の現在入手可能なアッセイよりも高いCT検出の感度を有した。図3Bに示すように、本アッセイは99%を超えるCT検出の特異度を有し、4種のサンプルのタイプに関して5種の現在入手可能なアッセイに相当した、または該アッセイよりも高かった。図3Cに示すように、本アッセイは、両タイプのスワブサンプルにおいて100%のNG検出の感度を有し、4種の現在入手可能なアッセイの内の3種よりも高かった、および女性の尿サンプルに関して3種の現在入手可能な検査の内の2種よりも高い感度を有した。図3Dに示すように、本アッセイは、4種全てのサンプルのタイプにおいて99.9%〜100%のNG検出の特異度を有した。
【０２７５】
８．５．実施例5：上昇したゲノムコピー数に関する患者サンプルのスクリーニング
ゲノムコピー数の指標としてHMBSを使用し、本質的に実施例4に記載したGeneXpert(登録商標)で上昇したゲノムコピー数に関して患者サンプルをスクリーニングした。プライマーおよびプローブを表2(表2)に列挙する。結果の統計的分析を表5(表5)に示す。
【０２７６】
【表５Ａ】
2015525067.tif 000014
【０２７７】
【表５Ｂ】
2015525067.tif 000015
【０２７８】
これらの結果のプロットを図4に示す(用語「SAC」はHMBSを指すために使用される)。これらの結果は、感染および炎症のマーカーとしてのヒトゲノムコピー数の定量化の臨床的有用性を実証する。全ての群の平均値は重複しないが、男性の尿検体において非常に大きな差異が見られる。実際に、NG感染に関しては、ピーク分離が明確であるため、大抵の場合にはSAC値のみに基づいて感染の有無を予測することができるであろう。
【０２７９】
これらの結果は、泌尿生殖路における炎症反応をおそらく反映する。観測したシグナルは、浸潤細胞中のDNAに少なくとも部分的におそらく起因する。しかしながら、シグナルの少なくとも一部は、尿中に遊離したDNAからであることができ、これは、尿道におけるアポトーシスまたは細胞傷害性の免疫反応の機能として生じた可能性があった。
【０２８０】
特に、ゲノムコピー数のレベルは、サンプルのタイプの間で異なる。具体的には、ゲノムコピー数のレベルは、膣または子宮頸管のサンプル中よりも尿中で低かった。図5を参照。図6A〜図6Cは、感染状態の関数として様々なサンプルのタイプにおけるゲノムコピー数を示す。自己採取した膣サンプル(6A)では、CTおよびNGに関して陰性であったサンプルは約24以上のSAC Ctを特徴としたが、感染に関して陽性であったサンプルは約20以下のSAC Ctを有する傾向があった。男性の尿(6B)では、CTおよびNGに関して陰性であったサンプルは約28以上のSAC Ctを特徴としたが、感染に関して陽性であったサンプルは約24以下のSAC Ctを有する傾向があった。32例のCT/NG重感染の男性の尿では、全32例はSAC値の左端の十分位数に存在しており、即ち全てが24未満のSAC Ctを有した(6C)。
【０２８１】
図7から明らかなように、ゲノムコピー数は症状とも関連する。SAC Ct値は、CT/NG感染に関して陽性であった有症状の対象に関してより低く、CT/NG感染に関して陽性であった無症状の対象に関して中程度であり、真陰性の対象に関してはより高かった。約24未満のSAC Ct値を有するCT/NG-陰性の対象は異なる泌尿生殖器感染を有する可能性があり、更なる検査の候補である。
【０２８２】
図8は、様々な状態(左から右へ):陰性(コントロール)尿;炎症しているが病原体はない;マイコプラズマ・ゲニタリウム陽性;膣トリコモナスの可能性;炎症を伴わないウレアプラズマ・パルバム陽性;炎症を伴うウレアプラズマ・パルバム陽性;炎症を伴わないウレアプラズマ・ウレアリチカム陽性;および炎症を伴うウレアプラズマ・ウレアリチカム陽性におけるゲノムコピー数(SAC Ct値)を示す。
【０２８３】
HMBSシグナルの解釈は、例えば真陽性を確認するおよび偽陽性の可能性を同定するCTまたはNGの結果の解釈への信頼を高める(図9を参照)。更に、HMBSシグナルの解釈を、両方の病原体に関して陰性の患者における、別の潜在的な感染性の(マイコプラズマ、ウレアプラズマ、トリコモナスもしくは更に記載の他の生物による感染)または非感染性の(自己免疫性尿道炎、前立腺炎、膀胱癌、前立腺癌、腎臓癌)過程の間接的な指標として潜在的に使用することができる。
【０２８４】
本出願で引用した全ての出版物、特許、特許出願および他の文書は、個々の出版物、特許、特許出願また他の文書が全ての目的のために参照により援用されると個々に指示されたのと同じ程度まで、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０２８５】
様々な例示的実施形態が、理解を明確にするためにおよび例として詳細に説明されているおよび記載されているが、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく変更がなされ得ることが理解されるだろう。
【図１Ａ】
2015525067.tif 000016
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2015525067.tif 000021
【図３Ｄ】
2015525067.tif 000022
【図４Ａ】
2015525067.tif 000023
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図５】
2015525067.tif 000031
【図６Ａ】
2015525067.tif 000032
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
2015525067000001.app
【国際調査報告】
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2015525067.tif 000039
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