(57)【要約】エクスビボで生物試料を培養しかつ該生物試料における薬理学的応答および代謝応答をモニターするための、システムおよび方法を提供し、該システムおよび該方法が、患者から取得した該生物試料を流体装置に収容すること、該生物試料を該流体装置のチャネル内に保持すること、該流体装置の該チャネル内に該生物試料の培養物を供給すること、該生物試料を通る流体を流すこと、該試料の薬理学的応答および／または代謝応答を判定するために該流体を取得および分析することを含む。2015536141.tif 000004
2015536141.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基板と、
生物試料を収容するためおよび該生物試料を横切る流体流れを搬送するために、該基板内に配置されたチャネルと、
該チャネル中を流れる流体が、該生物試料における剪断速度を約0.375〜0.500ダイン／cm2の範囲内に維持しながら該生物試料に該流体を灌流させるために、該生物試料を通る該流体の間隙流を誘導することを可能にするように、凹形保持障壁の幾何学形状が構成されている、該生物試料を保持するために該チャネル内に配置された該凹形保持障壁と
を備える、流体装置。
【請求項２】
前記凹形保持障壁が、前記チャネルの床面から実質的に該チャネルの上面まで伸びている複数のポストを備える、請求項1に記載の装置。
【請求項３】
前記複数のポストが、実質的に前記チャネルの高さ全体に伸びている3〜10個の自立型ポスト、および、チャネル側壁から突き出て伸びている少なくとも1個の埋込型ポストを含む、請求項2に記載の装置。
【請求項４】
前記凹形保持障壁が、5個の自立型ポストおよび2個の埋込型ポストを備える、請求項3に記載の装置。
【請求項５】
隣接するポストが、約20μm〜約40μmの側方離隔距離を有するように互いから間隔をおいて配置されている、請求項2に記載の装置。
【請求項５】
任意の隣接する2個のポスト間の最短距離が約65μm〜85μmである、請求項2に記載の装置。
【請求項６】
前記複数のポストのうち最も外側の自立型ポストが、最も近いチャネル側壁から約65μm〜85μmの間隔をおいて配置されている、請求項3に記載の装置。
【請求項７】
流体を前記チャネル中に流すように構成された流体供給部を備える、請求項2に記載の装置。
【請求項８】
前記流体供給部が、前記チャネルの遠位端を通って既に流れた流体を迂回させて該チャネルの近位端を通って戻すように構成された閉鎖ループ流体供給部を含む、請求項7に記載の装置。
【請求項９】
前記流体の試料がチャネルに流れた後に該流体の試料を取り出すように構成された流体取り出し部（fluid extractor）を備える、請求項7に記載の装置。
【請求項１０】
前記保持障壁内に配置された生物試料の状態を光学的にモニターするための光学センサーを備える、請求項2に記載の装置。
【請求項１１】
直径が約100〜約500マイクロメートルである前記生物試料を含む、請求項1に記載の装置。
【請求項１２】
エクスビボ組織試料に対する薬理学的作用物質の影響を評価する方法であって、
約100〜500マイクロメートルの直径を有する組織試料を、フローチャネルに形成された凹形保持障壁に導入する段階、
該薬理学的作用物質を含む流体が該チャネル中を該組織試料を横切って流れ、それによって、該組織試料および該保持障壁を通る該流体の間隙流を誘導するように、かつ該流体が該組織試料を灌流するように、該流体を該チャネルの近位端に導入する段階、
該流体の一部分を該チャネルの遠位端で収集する段階、ならびに
収集した該流体部分を、該組織試料に対する薬理学的影響の証拠に関して分析する段階
を含む、方法。
【請求項１３】
前記薬理学的影響の証拠が、細胞死の証拠を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記流体を前記チャネル中に流した後に前記組織試料の画像を取り込む段階、および、取り込んだ該画像を、該組織試料に対する薬理学的影響の証拠に関して分析する段階をさらに含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
1時間当たり約500マイクロリットルの速度で前記流体を前記チャネル中に流す段階を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織試料が、細針生検（FNBA）を用いて収集された組織試料を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１７】
前記凹形保持障壁が、前記チャネルの床面から実質的に該チャネルの上面まで伸びている複数のポストを備える、請求項12に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数のポストが、実質的に前記チャネルの高さ全体に伸びている3〜10個の自立型ポスト、および、チャネル側壁から突き出て伸びている少なくとも1個の埋込型ポストを含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
約100〜500マイクロメートルの直径を有する第2の組織試料を、第2のフローチャネルに形成された第2の凹形保持障壁に導入する段階、
第2の薬理学的作用物質を含む第2の流体が該第2のチャネル中を該第2の組織試料および該第2の凹形保持障壁を横切って流れるように、かつ該第2の流体が該第2の組織試料中を灌流するように、該第2の流体を該第2のチャネルの近位端に導入する段階、
該第2の流体の一部分を該第2のチャネルの遠位端で収集する段階、
該第2の流体の収集した該部分を、該第2の組織試料に対する薬理学的影響の証拠に関して分析する段階、ならびに
第1の前記薬理学的作用物質および該第2の薬理学的作用物質の薬理学的影響を比較する段階
をさらに含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
第1および第2の前記薬理学的作用物質のうちの一方を、前記薬理学的影響の比較に基づいて動物の処置のために選択する段階を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記動物が、第1および第2の前記組織試料の供給源である、請求項20に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2012年11月1日に提出された米国特許仮出願61／721,183号に対する優先権を主張し、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本発明は、生物試料を培養およびモニターすることに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
製薬産業内およびバイオテクノロジー産業内では、医薬治験における費用のかかる後期での失敗の発生率を低下させるため、ならびに薬物試験における動物の使用を減らすために、正常ヒト組織および罹患ヒト組織における生理的応答を予測する際に臨床的により妥当なスクリーニングシステムを同定することに大きな関心が寄せられている。癌治療における経験的アプローチでは、多くの患者で、複数の治療サイクルを受けた後にはじめて、有効性がないことが明らかになるということが起こる。
【０００４】
治療法および個別化した治療薬の同定は、癌の臨床的研究にとって極めて重要である。薬物有効性を予測するための臨床的に妥当なアッセイ法の開発により、ある特定の治療法によって恩恵を受ける可能性のある患者が同定され、それと同時に、それ以外の者が無益な治療の副作用を受けないようにすることができる。
【０００５】
患者選択を改善できること、および、所与の腫瘍型を有する患者に対する有効な候補レジメンがより良好に同定されるように治験を充実させるための手段は、分子医学の将来像である。しかしながら、エクスビボでの化学療法感受性アッセイ法は、これまで楽観のうねりにもかかわらず、主としてインビボ条件をエクスビボ環境で再現できなかったことが理由で、実際には一度も実を結んだことがない。
【発明の概要】
【０００６】
概要
本開示の1つの局面によれば、流体装置は、基板と、基板内に配置されたチャネルと、チャネル内に配置された凹形保持障壁とを備える。チャネルは、生物試料を収容するように、かつ生物試料を横切る流体流れを搬送するように構成されている。凹形保持障壁は、生物試料を保持するように構成されている。凹形保持隔壁の幾何学形状は、チャネル中を流れる流体が、生物試料における剪断速度を約0.375〜0.500ダイン／cm2の範囲内に維持しながら生物試料に流体を灌流させるために、生物試料を通る流体の間隙流を誘導することを可能にするように、構成される。
【０００７】
いくつかの実施形態(implementation)において、凹形保持障壁は、チャネルの床面からチャネルの上面まで伸びている複数のポストを備える。いくつかの実施形態において、複数のポストは、チャネルの高さ全体に伸びている3〜10個の自立型ポスト、および、チャネル側壁から突き出て伸びている少なくとも1個の埋込型ポストを含む。いくつかの実施形態において、凹形保持障壁は5個の自立型ポストおよび2個の埋込型ポストを備える。
【０００８】
いくつかの実施形態において、隣接するポストは、約20μm〜約30μmの側方離隔距離を有するように互いから間隔をおいて配置されている。いくつかの実施形態において、任意の隣接する2個のポストの間の最短距離は約65μm〜85μmである。いくつかの実施形態において、複数のポストのうち最も外側の自立型ポストは、最も近いチャネル側壁から約65μm〜85μmの間隔をおいて配置されている。
【０００９】
いくつかの実施形態において、流体装置はまた、流体をチャネル中に流すように構成された流体供給部も備える。いくつかの実施形態において、流体供給部は、チャネルの遠位端を通って既に流れた流体を迂回させてチャネルの近位端を通って戻るように構成された、閉鎖ループ流体供給部を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、流体装置はまた、流体の試料がチャネルに流れた後に流体の試料を取り出すように構成された、流体取り出し部（fluid extractor）も備える。
【００１１】
いくつかの実施形態において、流体装置はまた、保持障壁内に配置された生物試料の状態を光学的にモニターするための光学センサーも備える。
【００１２】
いくつかの実施形態において、生物試料は直径が約100〜約500マイクロメートルである。
【００１３】
本開示の別の局面によれば、エクスビボ組織試料に対する薬理学的作用物質の影響を評価する方法は、約100〜500マイクロメートルの直径を有する組織試料を、フローチャネルに形成された凹形保持障壁に導入する段階、薬理学的作用物質を含む流体がチャネル中を該組織試料を横切って流れるように、該流体を該チャネルに導入する段階、該流体の一部分を収集する段階、および、収集した該流体部分を、該組織試料に対する薬理学的影響の証拠に関して分析する段階を含む。チャネルおよび凹形保持障壁は、流体が組織試料を灌流するように、組織試料を通る流体の間隙流を誘導するよう構成されている。いくつかの実施形態において、薬理学的影響の証拠には細胞死の証拠が含まれる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、本方法はまた、流体をチャネル中に流した後に組織試料の画像を取り込む段階、および、取り込んだ該画像を、該組織試料に対する薬理学的影響の証拠に関して分析する段階も含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、チャネルを通る流体流れは、1時間当たり約500マイクロリットルの速度である。いくつかの実施形態において、組織試料は、細針生検（FNBA）を用いて収集された組織試料を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、凹形保持障壁は、チャネルの床面からチャネルの上面まで伸びている複数のポストを備える。いくつかの実施形態において、複数のポストは、チャネルの高さ全体に伸びている3〜10個の自立型ポスト、および、チャネル側壁から突き出て伸びている少なくとも1個の埋込型ポストを含む。
【００１７】
他の実施形態において、本方法は、約100〜500マイクロメートルの直径を有する第2の組織試料を、第2のフローチャネルに形成された第2の凹形保持障壁に導入する段階、第2の薬理学的作用物質を含む第2の流体がチャネル中を該第2の組織試料を横切って流れるように、該流体を該チャネルに導入する段階、該第2の流体の一部分を収集する段階、ならびに、収集した該流体部分を、該第2の組織試料に対する薬理学的影響の証拠に関して分析する段階、ならびに、前記第1の薬理学的作用物質および該第2の薬理学的作用物質の薬理学的影響を比較する段階を含む。いくつかの実施形態において、動物の処置のための第1または第2の薬理学的作用物質の選択は、薬理学的影響の比較に基づく。いくつかの実施形態において、動物は第1および第2の組織試料の供給源である。
【００１８】
本発明の1つまたは複数の実施形態の詳細について、添付の図面および以下の説明において述べる。本発明の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本装置について、添付の例としての図面で、さらにより詳細に説明する。図面は、装置の構造、および、単独でまたは他の特徴物と組み合わせて用いることのできるある特定の特徴物を図で説明するための単なる例に過ぎない。本技術は、示されている実施形態に限定されない。本特許または本出願ファイルは、カラー刷りで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラーの図面が付された本特許または本特許出願公報の写しは、請求および所要の手数料の納付を行うことにより、官庁によって提供されうる。
【図１Ａ】微小規模のマイクロ流体装置およびその保持エレメントの例を示している略図である。
【図１Ｂ】チャネルの例を示している略図である。
【図１Ｃ】自立型ポストの寸法の例を示している略図である。
【図１Ｄ】保持エレメントの例を示している略図である。
【図１Ｅ】閉鎖ループ状マイクロ流体システムの略図である。
【図１Ｆ】マイクロ流体システムの略図である。
【図２Ａ】一例の流体装置および生物試料の透視図である。
【図２Ｂ】一例のマイクロ流体システムデバイスの透視図である。
【図２Ｃ】一例の流体装置内に保持された、細針吸引生検を用いて収集された生物試料の図である。
【図３】一例の流体工学（fluidics）装置の流体力学のモデルである。
【図４】蛍光染色に供した例示的な腫瘍試料を含む表である。
【図５】生物試料をアッセイするための例示的な方法を示している流れ図である。
【図６】患者に対する個別化された治療を決定するための例示的な方法を示している流れ図である。
【図７Ａ】異種移植マウスモデルにおけるインビボでのMK-1775およびゲムシタビンの効果を図示している表である。
【図７Ｂ】初期腫瘍体積からの変化率を時間の関数として図示している表である。
【図７Ｃ】エクスビボのマイクロ流体装置における腫瘍応答の画像を提示している。
【図８】抽出イオンクロマトグラムの拡大図を提示している。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
本発明の総合的な理解を提供するために、生体模倣環境において細胞を培養するための装置および方法を含む特定の例示的な実施形態について以下に説明する。しかし、当業者には、本明細書に記載するシステムおよび方法が、対処する用途に対して適切であれば適合化および改変されうること、ならびに本明細書に記載のシステムおよび方法が、その他の適切な用途に採用されうること、およびそのようなその他の追加および改変はそれらの範囲から逸脱しないことが理解されると考えられる。
【００２１】
エクスビボで、生物試料を培養し、かつ生物試料における薬理学的応答および代謝応答をモニターするための、装置、システム、ならびに方法を提供する。例えば、本開示は、被験作用物質を灌流させることのできる細針吸引生検（FNAB）試料または他の組織試料を用いて、患者によって引き起こされる薬理学的応答および代謝応答を、エクスビボで微小規模の流体装置においてモニターする、費用対効果の大きい方法を含む。追加的または代替的に、本技術は、細針吸引生検（FNAB）または他の抽出方法によって得られた微視的な腫瘍組織を用いて従来の抗癌薬および標的指向性抗癌薬に対する腫瘍応答を分析するためにマイクロ流体工学アッセイ基板を用いる、癌治療法の選択を個人に合わせるための標準化された腫瘍微小環境モデルも対象とする。
【００２２】
薬物応答のハイスループットでのリアルタイムモニタリングのための生体分子センサーが任意で、このプラットフォームに組み込まれる。本開示は、説明を簡単にするために単一のチャネル装置を中心に論じているが、さまざまな薬物濃度でのハイスループット多薬物分析のための複数のチャネルを有する他の装置を用いることもできる。また、本装置を、複雑なシステムにおける薬力学的／薬物動態学的／プロテオミクス的／メタボロミクス的な多組織相互作用に対して、およびインビボで複数の臓器システムによる影響を受けるゲノム過程に対して用いて、化学療法の治験に対する患者の具体的な応答についての再現性のある繰り返し可能な臨床モデルを作製することもできる。
【００２３】
流体装置は、基板と、基板内に配置されたチャネルと、生物試料を保持するためにチャネル内に配置された保持エレメントと、流体をチャネルに供給するための供給装置と、流体をチャネルから取得するための取得装置と、チャネルの目視観察を提供する可視部（visual field）とを備えうる。三次元（3-D）微小規模流体工学装置の非限定的な例は、図1A〜Dに提示されている。図1Aは、5つのチャネル101を備える微小規模の流体工学装置100の略図である。いくつかの実施形態において、微小規模の流体工学基板は、1個のチャネル、または2個のチャネル、または3個のチャネル、または4個のチャネル、または5個のチャネル、または6個のチャネルを有する。いくつかの実施形態において、微小規模の流体工学基板は、最大で10個または10個超のチャネルを有する。いくつかの実施形態において、100個または100個超のチャネルを備えるハイスループット微小規模流体工学装置を製造することもできる。各チャネルに投入される生物試料は、チャネル毎に同じであってもよいか、チャネル毎に異なってもよいか、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００２４】
図1Bは、単一のチャネル101の略図である。チャネル101は長さ
2015536141.tif 000003
が約10mmであり、幅（w）が約615μmである。さまざまな実施形態において、チャネル101は長さが約5mm〜約20mmであり、幅が約400μm〜約1000μmであり、高さが約75μm〜約500μmである。チャネル101は、流体入口105、流体出口104、および凹形保持障壁106を有する。
【００２５】
チャネル101における凹形保持障壁106は、5個の自立型ポスト102、および、チャネル101の側壁にある一対の埋込型ポスト103を備える。自立型ポスト102および埋込型ポスト103は、チャネル101を通る流体の流れの方向を向いたV字状構成で配列されている。凹形保持障壁106は、生物試料を同じ位置に保つために用いられる。いくつかの実施形態において、凹形保持障壁106は5個超の自立型ポストを備える。いくつかの他の実施形態においては、凹形保持障壁106 1個当たり6個、7個、8個、9個、または10個の自立型ポストが存在する。いくつかの他の実施形態においては、5個未満の自立型ポストが存在する。
【００２６】
いくつかの実施形態においては、V字状構成に配列される代わりに、凹形保持障壁106の自立型ポスト102は、半円形の形態に、U字状構成に、または、チャネル101を通る流れの方向に対して凹形である他の任意の形状に、構成されている。
【００２７】
いくつかの実施形態においては、チャネル101 1個当たり複数の凹形保持障壁106が存在する。例えば、いくつかの実施形態において、単一のチャネル101において2個、3個、4個、または5個の凹形保持障壁106が存在する。いくつかの実施形態においては、複数の凹形保持障壁がチャネルの長さ方向に沿って並んで、一連の凹形保持障壁を作り出す。他の実施形態においては、複数の凹形保持障壁がチャネルの幅方向に並んで、凹形保持障壁のラインを形成する。いくつかの実施形態において、チャネル101における凹形保持障壁106のそれぞれは同一である。他の実施形態において、保持エレメントは、さまざまなサイズの組織試料を捕捉するように、異なる寸法および間隔を有するポストから形成される。例えば、漸次により小さい組織試料を捕捉するように、チャネルの長さ方向に進むにつれて、ポストおよびポスト間の経路が漸次に縮小してもよい。
【００２８】
図1Aおよび1Cに示すように、自立型ポスト102は、長さ203が約150μm、幅204が約75μm、かつ高さ107が約125μmである。いくつかの実施形態において、自立型ポストは、長さが約50μm〜約200μm、幅が約50μm〜約100μm、かつ高さが約50μm〜約500μmである。埋込型ポスト103は、長さが約150μmで高さが約125μmである。いくつかの実施形態において、埋込型ポストは、長さが約25μm〜約175μm、かつ高さが約100μm〜約150μmである。いくつかの実施形態において、自立型ポスト102は、長さと幅との比が約2：1〜約3：1である。いくつかの実施形態において、自立型ポスト102および／または埋込型ポスト103はチャネル101と同じ高さである。他の実施形態において、チャネルの高さは、生物試料の直径と比較した比が最大で約1：2である。
【００２９】
図1Dは、凹形保持障壁106の埋込型ポスト103Aおよび103Bならびに自立型ポスト102A〜102Eの例示的な間隔を示している略図である。いくつかの実施形態において、自立型ポスト102および埋込型ポスト103は、相補的ポストの前端（leading end）が整列するように、例えば、102Aおよび102Eの前端が整列するように整列化される。追加的または代替的に、いくつかの実施形態において、1つの自立型ポストの前縁（leading edge）は、チャネル101における次の自立型ポストの後縁と整列化され、例えば、102Bの前縁を102Cの後縁と整列させてもよい。
【００３０】
チャネル側壁に最も近い自立型ポスト102Aおよび102Eの側壁との間の距離205は約70μmである。いくつかの実施形態において、チャネル側壁に最も近い自立型ポスト102Aおよび102Eの側壁との間の距離108は約60μm〜約80μmである。埋込型ポスト103Aおよび103Bに最も近い自立型ポスト102Aおよび102Eの最近点との間の対角距離110は約75μmである。いくつかの他の実施形態において、埋込型ポスト103Aおよび103Bに最も近い自立型ポスト102Aおよび102Eの最近点との間の対角距離110は約65μm〜約85μmである。自立型ポスト102Aおよび102Eの外壁と埋込型ポスト103Aおよび103Bの外壁との間の側方間隔112は約25μmである。いくつかの実施形態において、自立型ポストの外壁と埋込型ポストの外壁との間の側方距離112は約20μm〜40μmである。
【００３１】
隣接する自立型ポスト、例えば、102Aと102B、102Bと102C、102Cと102D、および102Dと102Eの壁の間の側方間隔111は、約25μmである。いくつかの実施形態において、隣接する自立型ポストの外壁間の側方距離111は約20μm〜40μmである。隣接する2個の自立型ポスト、例えば、102Aと102B、102Bと102C、102Cと102D、および102Dと102Eの最近点間の対角距離109は、約75μmである。いくつかの他の実施形態において、隣接する2個の自立型ポストの最近点間の対角距離109は約65μm〜85μmである。
【００３２】
チャネル101の幾何学形状、および、凹形保持障壁106の構成要素の間隔は、直径が300μmおよびそれ未満のオーダーであるサイズを有する組織試料を培養することに関する、それらの有益な特性の点から選択される。ポストの寸法形状および間隔は、流速、剪断速度、および圧力を含みインビボ条件に近似した、流体力学を提供する。チャネル環境内での生物試料の培養の結果として、剪断に関連した細胞応答を誘発することなしに生物試料をインタクトのままにすることができる。いくつかの実施形態において、流速は約100μl／時、または約250μl／時、または約500μl／時、または約1000μl／時、またはこれらの値のいずれか2つの間の範囲である。いくつかの実施形態において、幾何学形状および流速は、生理的に妥当でありかつシステムまたは試料に対して大きな撹乱を引き起こさない、約0.350、または約0.375、または約0.400、または約0.425、または約0.450、または約0.500ダイン／cm2、またはこれらの値のいずれか2つの間の任意の値である試料に対する剪断応力を達成するように選択される。例えば、いくつかの実施形態において、幾何学形状および流速は、約0.375〜0.500ダイン／cm2の剪断速度がもたらされるように選択される。いくつかの実施形態において、流速および幾何学形状は、約0.389ダイン／cm2の剪断速度がもたらされるように選択される。
【００３３】
チャネル101内での流速および剪断速度は、チャネル202の幅および自立型ポスト102と埋込型ポスト103の間隔によって影響される。幅の広いチャネルでは、流体が、試料の周辺を移動することが可能であり、それ故に接触および灌流が減少するために、生物試料への間隙流が減少する。幅の狭いチャネルでは剪断応力を高めることができ、そのことは遺伝子発現の剪断誘発活性化につながりうる。遺伝子発現の剪断誘発活性化は、生物試料における生化学的接着カスケードおよび組織形質転換につながりうる。さらに、いくつかの研究によって、剪断応力を変化させると、組織が経時的に細胞外マトリックスタンパク質の改変をきたし、細胞侵入、血管新生および組織リモデリングという腫瘍への可能性が変化することが示されている。機械的シグナル伝達によって誘導される生物試料の変化は、生物試料のアッセイ法に対して有害作用を及ぼす恐れがある。試験される剤に対するインビボでの組織応答を、患者の癌のある時点でのスナップショットとして有効に再現するには、これらの条件のそれぞれを回避することが好ましい。
【００３４】
埋込型ポスト103はまた、向上したフローパラメーターを維持する一助ともなる。埋込型ポスト103を伴わないチャネル101、すなわち、チャネル壁が、平坦であり、かつ最も近い自立型ポスト102から間隔をおいて配置されているチャネル101は、生物試料全体にわたる間隙流および薬物灌流が減少するが、これは、最も外側の2つの自立型ポスト102とチャネル側壁との間の間隔によって大きな経路がもたらされ、そのために流体が生物試料の周辺を流れるためである。加えて、大量製造のために適用されるような従来の微細加工および射出成形過程を用いることによって、最も外側の自立型ポスト102と平坦チャネル壁との間に望ましい流れが得られるような十分に狭い間隙を維持するのは、不可能ではないにしても現実的ではない。埋込型ポスト103の使用により、この問題は大きく軽減される。
【００３５】
アッセイされる生物試料を、凹形保持障壁106に投入する。いくつかの実施形態において、生物試料は腫瘍試料または組織試料である。生物試料はマイクロメートル規模の試料である。いくつかの実施形態において、生物試料は直径が約100μm〜約500μmであり、いくつかの実施形態において、約300μm未満である。例えば、いくつかの実施形態において、生物試料は細針吸引生検試料（FNAB）である。
【００３６】
流体装置は、当技術分野において公知の方法によって作製することができる。限定的ではないが、一例を挙げると、流体装置を作製するための方法には、射出成形、微細加工、熱および／または加圧型押、ならびにフォトリソグラフィーが含まれる。いくつかの実施形態において、流体装置は、すべての表面、例えば、フローチャネル、自立型ポストおよび埋込型ポストの底面および側面に沿って実質的に平坦である。このことは、流れにおける渦および渦流を防止するのに役立つとともに、チャネルおよび凹形保持障壁の表面との望ましくない細胞相互作用も防止する。
【００３７】
流体装置は、当技術分野における公知の材料から加工することができる。いくつかの実施形態において、流体装置は透明であり、生物試料のリアルタイム目視分析が可能である。流体装置用に選択される材料は、スペクトルの可視部分、さらには約200nmまたはそれ未満の波長に至るまでの光に対しては実質的に透明（すなわち、50％超）である。
【００３８】
いくつかの実施形態において、流体装置は光学ガラスまたはガラス状の材料で作製されている。例示的な光学ガラス材料は、N-FK51A、N-PK52A、N-PK51、N-FK5、P-BK7、P-SK58A、P-SK57、P-SK57Q1、P-SK60、N-KZFS2、P-LAK35、P-LAF37、N-KZFS4、N-KZFS4HT、N-LAF33、N-KZFS11、P-LASF51、P-LASF47、P-LASF50、N-KZFS5、N-KZFS8、N-LASF46B、P-SF8、P-SF69、P-SF67、およびP-SF68（Schott, Incから入手可能）を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、流体装置は、チャネル101の上面を形成する覆いを備える。いくつかの実施形態において、覆いは流体装置と同じ材料から作製されている。
【００３９】
いくつかの実施形態において、流体装置はポリマーから作製されている。例示的なポリマーは、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、ポリアミド（PA）、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、および環状オレフィンコポリマー（COC）を含むが、これらに限定されない。
【００４０】
図1Eおよび1Fは、薬物または治療的作用物質による生物試料のエクスビボ処理の分析のための本開示の例示的なマイクロ流体システムを示している略図である。図1Eは、例示的な連続閉鎖ループシステム200である。供給装置201は、単一の流体入口（または複数の流体入口）を通って流体装置100の1チャネル（または複数のチャネル）に流体をポンプで注入し、1つの流体出口（または複数の流体出口）から受け取った流体を再び循環させ、その結果、生物試料は流体によって連続的に灌流される。例えば、3-D微小環境プラットフォームにおけるFNAB試料の寿命を判定するために、試料を閉鎖ループの中で7日間の期間にわたって連続的に灌流させることができる。いくつかの実施形態においては、試料を閉鎖ループ中で12〜24時間、または12〜36時間、または12〜48時間、または24〜72時間の期間にわたって連続的に灌流させる。
【００４１】
図1Fは、別の例示的な連続閉鎖ループシステム250である。供給装置201は、単一の流体入口（または複数の流体入口）を通って流体装置100の1つのチャネル（または複数のチャネル）に流体をポンプで注入し、その結果、生物試料は流体によって連続的に灌流される。回収装置203は、生物試料を通過した／通った流体を収集する。いくつかの実施形態において、回収装置203は、試料および／または流体に付随する薬理学的応答および代謝応答を判定するために、流体を分析装置204に提供する。いくつかの実施形態において、回収装置は流体の試料のみを収集し、残りの部分を供給装置に戻すことにより、閉鎖ループ流体システムをもたらす。
【００４２】
図1Eまたは1Fのマイクロ流体システムが可視化装置202を備えることもでき、これは例えば、倒立型組織培養顕微鏡を用いた目視観察が行えるように構成することができる。例えば、Zeiss Axio ObserverをApoTome技術とともに用いて、マイクロ流体工学チャネルにおける細胞の増殖および死滅、ならびにその結果としての構造および分化の存在について判定するための肉眼的な形態学的測定を行うこともできる。加えて、可視化装置202が、試料について可視スペクトルから約200nmまでに至る範囲の波長に関する光学的情報を捕捉するための画像センサーを備えてもよい。
【００４３】
図2Aおよび2Bは、エクスビボで、生物試料を培養し、かつ生物試料における薬理学的応答および代謝応答をモニターするための、微小規模の流体装置のさらなる例の説明図を示している。装置は、基板と、生物試料を収容するために基板内に配置されたチャネルと、生物試料を保持するためにチャネル内に配置された保持エレメントと、流体をチャネルに供給するための供給装置と、流体をチャネルから取得するための取得装置と、チャネルの目視観察を行えるようにする可視部とを備えうる。図2Aおよび2Bに図示されているように、基板は、顕微鏡検査が容易になるようにガラス基板または他の透明なカバースリップ上に、ポリジメチルシロキサン（PDMS）から、PDMS製ポスト（または上記に特定した他の材料のうちのいずれか）を備えて加工することができる。一例の生物試料を23〜27ゲージ針を用いるFNABによって収集すると、典型的には、3-D構造にある内径が500マイクロメートル（μm）未満、場合によっては300μm未満のサイズの微視的腫瘍断片が得られる。一例の腫瘍細胞の生物試料は、線維芽細胞、内皮細胞および免疫細胞などの間質構成要素と密接に相互作用する腫瘍細胞を含みうる。このサイズ（すなわち、500μmまたはそれ未満、場合によっては約300μmまたはそれ未満）の断片では、腫瘍の組織学的および細胞学的な構造を保ちながら、マイクロ流体条件における腫瘍細胞を通る拡散または間隙流によってチャネル中を流れる薬物への腫瘍細胞の実質的に完全な曝露が可能になる。したがって、生物試料は、代謝的に活性であるか、または代謝的に活性であると予想される、1つまたは複数の細胞を含みうる。1つまたは複数の細胞は腫瘍細胞も含みうる。1つまたは複数の細胞は非腫瘍細胞も含みうる。1つまたは複数の細胞はまた、少なくとも1つの腫瘍細胞および少なくとも1つの非腫瘍細胞を含む、複数の細胞も含みうる。
【００４４】
チャネルは、細針吸引を用いて取得された生物試料の培養物が得られるようなサイズおよび構成であることができる。図2Aおよび2Bに示されたデバイスにおけるチャネルは、幅が約550μmで、高さが約120μmで、長さが約1cmである。チャネルは、生物試料の三次元細胞培養物の増殖が得られるようなサイズおよび構成である。1つのさらなる例では、チャネルを、多チャネル3-Dマイクロ流体細胞培養チップ上での生物試料の増殖が得られるようなサイズおよび構成であることができる。
【００４５】
図2Bに示された基板は、第2の生物試料を収容するための第2のチャネルを備える。第2の生物試料は、第1のチャネルに含まれるものと同じ腫瘍に由来してもよく、異なる腫瘍に由来してもよい。第2の供給装置は第2の流体を第2のチャネルに供給することができる。第2の流体は、第1のチャネル中の第1の試料に供給されるものと同じかまたは異なる流体を含んでもよい。
【００４６】
チャネルは、生物試料を保持するためにチャネル内に配置された、図1B〜1Dに示された凹形保持障壁に類似した凹形保持障壁を備える。例えば、保持エレメントはチャネルの床面から上方に伸びている一連のポストを備えうる。図2Cは、組織試料が入っている凹形保持障壁の一例の顕微鏡写真である。凹形保持障壁は、流体流れの方向を向いたV字状構成にある一連のポストを備える。この例では、ポストの寸法は幅が約25μmで高さが約100μmであり、ポスト間の側方距離は約25μmである。
【００４７】
図3は、図2Aに示された流体装置に組み入れられたチャネルの流体力学のモデルを示している。このモデルは、流速を100μl／時と仮定した上で、流体の速度および圧力の両方を図示している。
【００４８】
微小規模の流体装置を用いることにより、エクスビボで、生物試料の培養、ならびに生物試料における薬理学的応答および代謝応答のモニタリングを実現することができる。まず、患者から取得した生物試料を流体装置に供給する。上記に概要を述べたように、生物試料は細針吸引を用いて取得することができ、これは直径が約500μm（またはいくつかの実施形態においては300μm）またはそれ未満である試料を含む。一例の試料は、腫瘍細胞および間質細胞のうちの少なくとも一方を含む。
【００４９】
生物試料の培養物を流体装置のチャネルにおいて供給する。培養物は三次元細胞培養物であってもよい。細胞を多チャネル3-Dマイクロ流体細胞培養チップで培養することができる。
【００５０】
流体をチャネル内部の生物試料に供給する。流体には、例えば、培地、媒体、および薬物が含まれうる。流体を連続閉鎖ループシステムによって供給することもできる。
【００５１】
試料は、流体装置に設けられた可視部で観察することができる。例えば、倒立型組織培養顕微鏡を用いて、培養物および試料を可視部で観察することができる。生体分子センサーを試料に適用してもよい。例えば、蛍光染色を試料に適用することができる。図4に図示した1つの例の実施形態では、LIVE／DEAD（登録商標）アッセイ法（Invitrogen, Carlsbad, CA）などの蛍光に基づくアッセイ法を用いて細胞死および生存度を評価している。ヘキスト染色によって核構造が明示されており、圧縮像ではマイクロ流体装置における腫瘍FNAB試料の位相差像が示されている。このデータを用いて、特徴的な細胞死代謝プロファイルと微視的分析とを相関付けて、装置中を灌流させて腫瘍と接触させた培地を分析することによって薬物感受性を示すことができる。代謝分析にはまた、この例示的なマイクロ流体装置において対照応答と薬物応答とを比較する方法も含まれる。
【００５２】
本明細書に記載の方法、装置、およびシステムは、化学療法に対する患者の腫瘍応答を予測するために用いることもでき、エクスビボでの腫瘍および他の組織における薬物プロセシングの分析も行える。本システムは、薬物開発、バイオマーカーの探索、および最も有効な薬物／薬物の組み合わせを短期間で同定するための個々の患者に対する個別化された治療法の目的に向けて用いることができる。
【００５３】
本方法、本装置、および本システムは、少なくとも1つの生細胞または生存可能であると予想される細胞を有する生物試料を通る流体を流すこと、流体を取得すること、ならびに、試料の薬理学的応答および代謝応答のうちの少なくとも一方を判定するために流体を分析することを含みうる。薬理学的応答は、例えば、薬理学的作用物質を含む流体を生体試料の上に流すことによって引き起こされうる。作用物質に対する試料の応答は、流体を、生体試料の細胞により、それと薬理学的作用物質との相互作用によって産生または惹起される化合物、因子などに関して分析することによって判定することができる。また、応答を、生体試料の目視分析によって、例えば、顕微鏡検査を単独で、または流体化合物、因子などの検出と組み合わせて用いることによって判定することもできる。一例の薬理学的作用物質は化学療法薬である。同様に、代謝応答は、例えば、生体試料における代謝応答を引き起こす作用物質を含む流体を生体試料の上に流すことによって引き起こすことができる。作用物質に対する試料の応答は、流体を、生体試料の細胞により、それと作用物質との相互作用によって産生されるかまたは惹起される化合物、因子、代謝産物などに関して分析することによって判定することができる。生体試料の目視分析のみによって、または流体化合物、因子などの検出と組み合わせて用いることによって、応答を判定することもできる。一例の代謝性作用物質はグルコースである。代替的または追加的に、流体の分析によって、試料の1つまたは複数の細胞が生存不可能であることも示される。
【００５４】
図5は、開示されたマイクロ流体装置を用いて生物試料を分析するための1つの非限定的な例示的方法300を示している流れ図である。まず、生物試料を得る（段階301）。例えば、いくつかの実施形態において、生物試料は、直径が約300μmまたはそれよりも小さいオーダーである組織試料または腫瘍試料である。いくつかの実施形態において、生物試料はFNABによって、または同程度のサイズの組織試料もしくは腫瘍試料を得るのに適した他の抽出方法によって得られる。この生物試料を、流体装置のチャネルに配置された凹形保持障壁（段階302）、例えば図1Cに示された凹形保持障壁などに投入する。次に、流れる流体（段階303）に生物試料を曝露させる。いくつかの実施形態において、流体は薬物または化合物を含む。いくつかの実施形態において、生物試料は、閉鎖ループ内での連続的な流体流れに約2〜4時間、約4〜8時間、約8〜12時間、約12〜24時間、約12〜36時間、または約12〜48時間、または約24〜72時間にわたって供される。いくつかの実施形態において、流れの流体を収集して分析する（段階304）。流れの流体を、薬物または化合物による処理と関連のある代謝産物または他の細胞副産物に関して分析する。いくつかの実施形態において、流れの流体を約6時間毎、12時間毎、18時間毎、24時間毎、36時間毎、または48時間毎に収集する。アッセイの終了時またはアッセイ中に定期的に、生物試料を目視分析に供する（段階305）。流れの流体の分析および生物試料の目視分析を用いることで、薬物または化合物の有効性を判定する（段階306）。
【００５５】
一例のシステムは、FNABによって得られた腫瘍細胞および間質細胞の短期培養のための三次元（3-D）マイクロ流体プラットフォームを備え、これは、腫瘍微小環境および灌流培地の顕微鏡的分析、薬力学的分析、薬物動態学的分析、プロテオミクス的分析、メタボロミクス的分析、および核酸（DNA、mRNA、およびmiRNAを含むがこれらに限定されない）分析を取り入れることにより、化学療法に対する詳細な腫瘍応答を評価することによって、これらを薬物感受性試験のために用いることを目的とする。
【００５６】
この例示的なFNABマイクロ流体工学システムにより、薬物に対する正常組織および罹患状態組織の分析を、単一の組織断片として、または多組織システムにおいて、1つのチップ形式上で行うことが可能になる。このプラットフォームは以下の目的に用いることができる：薬物の開発および有効性に関する薬物試験；マイクロ流体工学（micofluidics）におけるバイオマーカーの探索および検証；個々の患者からの腫瘍細胞／組織を最も有効な薬物／薬物の組み合わせに関して短期間で試験することができる個別化された治療法；個別化された腫瘍微小環境の薬物動態学的試験；ならびに肝臓および他の非腫瘍性組織断片を用いる毒物学的アッセイ法。
【００５７】
図6は、有望な治療的作用物質がどのようにして同定されるかを示している流れ図400である。まず、1つまたは複数の生物試料を患者から得る（段階401）。続いて、流体装置内の複数の異なるチャネルの保持障壁に生物試料を投入する（段階402）。続いて、チャネルを流体流れに供す（段階403）。いくつかの実施形態において、各チャネル中の流体は、異なる治療的作用物質および／または異なる濃度の同じ治療的作用物質を含有する。追加的または代替的に、いくつかの実施形態において、流体は1つまたは複数の治療的作用物質を有しうる。いくつかの実施形態において、生物試料を閉鎖ループ内での連続流体流れに約2〜4時間、約4〜8時間、約8〜12時間、約12〜24時間、約12〜36時間、または約12〜48時間、または約24〜72時間にわたって供す。いくつかの実施形態において、流れの流体を収集および分析する（段階404）。流れの流体を、治療的作用物質または作用物質の組み合わせと関連のある代謝産物または他の細胞副産物に関して分析する。いくつかの実施形態において、流れの流体を約6時間毎、12時間毎、18時間毎、24時間毎、36時間毎、または48時間毎に収集する。アッセイの終了時またはアッセイ中に定期的に、生物試料を目視分析に供する（段階405）。いくつかの実施形態においては、顕微鏡または他の光学センサーを目視分析および／または光学的分析のために用いる。流れの流体の分析および生物試料の目視分析を用いることで、各治療的作用物質または作用物質の組み合わせの有効性を判定する（段階406）。その結果に基づいて、その患者に特別に合わせられた治療に関する治療コースを決定する（段階406）。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例は、本技術のさまざまな実施形態をさらに詳細に説明するために提供される。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとは全く見なされるべきではない。
【００５９】
実施例1‐骨肉腫の治療に有効な作用物質を同定する際の、微小規模の流体装置の使用
微小規模の流体装置を用いて、骨肉腫の細針生検試料（FNBA）の、ゲムシタビンおよびMK-1775のいずれか単独または組み合わせに対する応答を、細胞死および腫瘍退縮へのそれらの効果に関して調べた。
【００６０】
A．微小規模の流体装置
本技術による微小規模の流体装置8つをソフトフォトリソグラフィーによって加工し、ガラス製カバースリップスライド上に結合させた。装置はエチレンオキシド（EtO）ガスによって滅菌した。流体装置の構造は図2Aおよび2Cに示されている。各流体装置は単一のチャネルを備え、チャネルの中央部は保持エレメントと総称される7つの一連の自立型ポストを備えており、これらをFNBA骨肉腫試料の保持のために用いた（図3A参照）。流体は、入口ポートによってチャネルに流れ込み、出口ポートによってチャネルから流れ出る。
【００６１】
B．骨肉腫試料の調製
FNAB骨肉腫試料は、患者由来の骨肉腫を有する異種移植マウスから、25ゲージ針を用いて採取した。FNABを処理し、使用前にH&E染色手順によって生存度に関して選別した上で、各保持エレメントに1つずつ個別に装入し、顕微鏡検査によって撮像して、サイズを測定した（アッセイしたFNABはすべて、直径がほぼ300μmであった）。
【００６２】
C．流体装置におけるエクスビボでの骨肉腫試料の処理
8つのFNAB試料を分割して以下の通りに処理した。2つのFNAB試料は培地のみで処理した（対照）（10％ FBS、300mg／L L-グルタミン、2000mg／L D-グルコース、2000mg／L炭酸水素ナトリウムを含むRPMI）。2つのFNAB試料は、Wee 1阻害物質である1μM MK-1775（SelleckChem, Houston, TX）を用いて細胞培地中で処理した。2つのFNAB試料は、抗癌薬である3μMゲムシタビン（Eli Lilly, Indianapolis, IN）を用いて細胞培地中で処理した。2つのFNAB試料は、1μM MK-1775および3μMゲムシタビンの組み合わせを用いて細胞培地中で処理した。
【００６３】
流体装置をそれらの各々のシリンジポンプに接続した。FNAB試料にはまず培地を数回通過させる準備処理を行った。準備処理の後に、各FNAB試料を、それらの各々の処理に関して、100μl／時の定速層流に72時間にわたって供した。培地を24時間毎に収集し、カスパーゼ3および7ならびに乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）に関して分析した。
【００６４】
各流動実験の終了時に、核対比染色に関してはDNA内へのインターカレートによるヘキスト染色によって、細胞死に関してはSytox Greenによって、各FNAB試料を顕微鏡下で可視化した。
【００６５】
D．インビボでの骨肉腫試料の処理
ヒト骨肉腫腫瘍を担持する異種移植マウスを、媒体、ゲムシタビン、MK-1775、またはゲムシタビンとMK-1775の組み合わせによって15日間処置した。処置は第1日、第3日、第8日、および第10日に実施された。FNAB試料を、処置前（第0日）ならびに処置の6時間後および24時間後に採取した。MK-1775の標的であるCDC2Y15の発現レベルをウエスタンブロット法によって評価するために、細胞抽出物をFNAB試料から調製した。第15日の後に、腫瘍をT2強調MRIによって分析し、腫瘍のパラフィン切片を調製して、H&E染色による細胞死の微視的特徴の評価、および切断されたカスパーゼ3のレベルの評価を行った。
【００６６】
E．結果
図7AおよびBは、インビボでの異種移植マウスモデルにおけるMK-1775、ゲムシタビン、またはMK-1775とゲムシタビンの組み合わせの効果を示している。図7Cは、エクスビボでの流体装置モデルを用いたMK-1775、ゲムシタビン、またはMK-1775とゲムシタビンの組み合わせの効果を示している。
【００６７】
図7Aは、MK-1775およびそれと抗癌薬ゲムシタビンとの併用により、インビボでの患者由来骨肉腫異種移植マウスモデルにおいて細胞死がもたらされたことを示している。列（a）は、MK-1775および併用処置による骨肉腫異種移植マウスのインビボ処置によって、媒体およびゲムシタビンによる処置と比較して、CDC2Y15の発現レベルが低下することを示している。列（b）は、MK-1775で処置したマウスおよび併用処置したマウスにおいて、媒体およびゲムシタビンによる処置と比較して第15日の時点で腫瘍体積が減少したことを示している。列（c）は、MK-1775および併用処置されたマウスでは、媒体およびゲムシタビンによる処置と比較して、DNA染色が減少し、かつカスパーゼ3に対する高い免疫反応性が見られたことを示している。
【００６８】
図7Bは、初期腫瘍体積（すなわち、第0日）からの変化率を時間の関数として示し、対照群では他の処置群と比較して第0日から第15日までの腫瘍増殖に関して有意な増加が見られたことを提示している。記号（*）は統計学的有意性を示している（p＜0.05）。
【００６９】
図7Cは、エクスビボでのマイクロ流体装置における腫瘍応答を示している。これらの結果は、MK-1775およびそれとゲムシタビンとの併用により、エクスビボで腫瘍断片における細胞死がもたらされることを示している。FNAB試料には薬物を十分に浸透させた。腫瘍細胞をHCS LIVE／DEAD（登録商標）Green Kit（Life Technologies, Carlsband, CA）で染色し、画像を倒立型蛍光顕微鏡で得た上で、死細胞（緑色）と生細胞（青色）細胞を判定した。
【００７０】
これらの結果は、流体装置を用いた有望な治療的作用物質による骨肉腫腫瘍試料のエクスビボ処理によって、骨肉腫異種移植マウスのインビボ処置の場合と同様の結果が生じたことを示している。いずれのモデルも、MK-1775処置またはMK-1775とゲムシタビンとの併用処置によって癌細胞のアポトーシスを誘導しうることを同定することができた。しかし、エクスビボ処理では、1つの作用物質または複数の作用物質の有効性を72時間という期間で同定することができたのに対して、インビボモデルでは15日間の処置が必要であった（この15日には、ヌードマウスで異種移植腫瘍を増殖させるために必要な時間は考慮していない）。
【００７１】
図8は、代謝産物の可能性のあるものをバックグラウンド試料に比して強調表示している抽出イオンクロマトグラム（XIC）の拡大図を提示している。灌流させた流体を、FNAB試料を用いて行った上記の実験（図2A〜C）に関して上述した通りに流体装置から収集し、腫瘍によって媒介される薬物プロセシングおよび代謝産物を分析しうるか否かについて判定した。流体試料は濾過によって調製し、質量分析法によって分析した。図8は、患者由来骨肉腫異種移植モデルからFNABによって得られた腫瘍断片が、薬物を取り込んで、薬物を活性のある代謝型に変換することができることを示している。質量分析データは、ゲムシタビンのその活性型である三リン酸化物への活性代謝、およびMK-1775のその代謝型への代謝を示している。同じ流体試料を、活性カスパーゼELISAキットを用いて細胞死に関して分析したところ、MK-1775処理では細胞死が増加するが、ゲムシタビン処理では増加しないことが明らかになった（データは提示せず）。これらの結果は、本流体装置が生物試料に薬物または治療的作用物質を灌流させるのに有効であることを示している。
【００７２】
前記の説明および図面は本発明の例示的な実施形態を表しているが、添付の特許請求の範囲において定義された本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな追加、改変、組み合わせ、および／または置き換えをそれに行いうることは理解されるであろう。特に、本発明が、他の特定の形態、構造、配置、比率で、また他の要素、材料、および構成要素を用いて、その趣旨または本質的な特性から逸脱することなく具現化されうることは当業者には明らかであろう。当業者は、本発明が、本発明の原理から逸脱することなく、特定の環境および動作要件に特に適合される本発明の実践において使用される、構造、配置、比率、材料、および構成要素ならびに他のものの多くの改変を伴って使用されうることを認識するであろう。加えて、本明細書に記載された特徴物は単独で用いてもよいか、または他の特徴物と組み合わせて用いてもよい。したがって、本明細書に開示された実施形態は、あらゆる点において、限定的なものではなく、例示的なものであると見なされるべきであり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によって示され、前述の説明に限定されることはない。
【００７３】
当業者には、上記の実施形態に、その広い発明的概念から逸脱することなく変更を加えうることが認識されるであろう。したがって、本発明が、開示された特定の実施形態には限定されず、添付の特許請求の範囲によって定義された本発明の趣旨および範囲内にある改変も範囲に含むことを意図していることは理解されよう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【国際調査報告】
2015536141.tif 000024
2015536141.tif 000025