(57)【要約】  インフルエンザウイルス抗原、例えばＭ２ｅペプチドに由来する１つ以上の抗原ペプチドを含む組換えパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）コートタンパク質であって、前記コートタンパク質のＮ末端の１３アミノ酸内の予想ランダムコイル内の１つの位置で融合したＰａｐＭＶコートタンパク質、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を製造するためのその使用およびインフルエンザワクチンにおける前記ＶＬＰの使用。
2015514097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸６、７、８、９、１０、１１もしくは１２に対応するアミノ酸の後のパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）コートタンパク質に融合したインフルエンザＭ２ｅペプチドに由来するペプチド抗原を含む融合タンパク質であって、前記融合タンパク質は自己集合してウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成することができ、前記ペプチド抗原は、長さが２０アミノ酸以下であり、一般配列Ｖ−Ｘ１−Ｔ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５［配列番号９６］（式中、Ｘ１はＥもしくはＤである、Ｘ２はＰもしくはＬである、Ｘ３はＴもしくはＩである、Ｘ４はＲもしくはＫである、およびＸ５はＮ、ＳもしくはＫである）を含む融合タンパク質。
【請求項２】
前記ペプチド抗原は、配列番号１のアミノ酸６、７もしくは１０に対応するアミノ酸の後で融合している請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ペプチド抗原は、配列番号１のアミノ酸６に対応するアミノ酸の後で融合している請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＰａｐＭＶコートタンパク質は配列番号４に記載したアミノ酸を含み、前記ペプチド抗原は配列番号４の１、２、３、４、５、６、７もしくは８の後で前記ＰａｐＭＶコートタンパク質に融合している請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ペプチド抗原は、配列番号４のアミノ酸２、３もしくは６の後で前記ＰａｐＭＶコートタンパク質に融合している請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ペプチド抗原は、長さが約７〜約１２アミノ酸、または長さが約７〜約１０アミノ酸である請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ペプチド抗原は、長さが約７〜約９アミノ酸である請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ペプチド抗原は、配列番号１４〜２２および９６〜１０４のいずれか１つに記載の配列を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記ペプチド抗原は、配列ＥＶＥＴＰＩＲＮＥ［配列番号２１］またはＶＥＴＰＩＲＮ［配列番号２２］を含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ペプチド抗原は、配列ＥＶＥＴＰＩＲＮＥ［配列番号２１］またはＶＥＴＰＩＲＮ［配列番号２２］から本質的になる請求項１〜８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記融合タンパク質は、配列番号２３におけるアミノ酸１〜２２４、配列番号２４におけるアミノ酸１〜２２２、配列番号２５におけるアミノ酸１〜２２１、配列番号２６におけるアミノ酸１〜２１９、配列番号２７におけるアミノ酸１〜２２４、または配列番号２８におけるアミノ酸１〜２２２に記載したアミノ酸配列を含む請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記融合タンパク質は、配列番号２３におけるアミノ酸１〜２２４に記載したアミノ酸配列を含む請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ＶＬＰは、少なくとも３７℃の温度で安定である請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１５】
請求項１４に記載のＶＬＰおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１６】
ワクチンとして調製した請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
被験者におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、前記被験者に有効量の請求項１４に記載のＶＬＰを投与する工程を含む方法。
【請求項１８】
被験者のインフルエンザを発症するリスクを低減させる方法であって、前記被験者に有効量の請求項１４に記載のＶＬＰを投与する工程を含む方法。
【請求項１９】
インフルエンザウイルスによる感染に対して被験者を免疫する方法であって、前記被験者に有効量の請求項１４に記載のＶＬＰを投与する工程を含む方法。
【請求項２０】
前記ＶＬＰは、前記被験者における体液性免疫応答を誘導する請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
それを必要とする被験者におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するために使用する請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２２】
それを必要とする被験者におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための請求項１〜１３のいずれか一項に記載の記融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の使用。
【請求項２３】
被験者におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための医薬品の製造における請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の使用。
【請求項２４】
インフルエンザを発症する被験者のリスクを低減させるために使用する請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２５】
インフルエンザを発症する被験者のリスクを低減させるための請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の使用。
【請求項２６】
インフルエンザを発症する被験者のリスクを低減させるための医薬品の製造における請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の使用。
【請求項２７】
インフルエンザウイルスによる感染に対して被験者を免疫するために使用する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項２８】
インフルエンザウイルスによる感染に対して被験者を免疫するための請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の使用。
【請求項２９】
インフルエンザウイルスによる感染に対して被験者を免疫するための医薬品の製造における請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）の使用。
【請求項３０】
請求項２１、２４もしくは２７のいずれか一項に記載のＶＬＰ、または請求項２２、２３、２５、２６、２８もしくは２９のいずれか一項に記載の使用であって、前記ＶＬＰが被験者において体液性免疫応答を誘導する、ＶＬＰ又は使用。
【請求項３１】
請求項１４に記載のＶＬＰおよび取扱説明書を含む医薬キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性製剤の分野、および特にインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する目的で使用する組換えパパイヤモザイクウイルスコートタンパク質を含む製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
パパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）ＶＬＰが免疫増強剤およびアジュバントとして機能する能力は、以下の特許および特許出願に記載されている。
【０００３】
特許文献１（米国特許第７６４１８９６号明細書）、特許文献２（カナダ国特許出願第２４３４０００号明細書）および特許文献３（国際出願ＰＣＴ／ＣＡ０３／００９８５（ＷＯ２００４／００４７６１）号明細書）は、動物における免疫応答を増強するためのＰａｐＭＶコートタンパク質に由来するＰａｐＭＶもしくはＶＬＰの使用について記載している。さらに、ＰａｐＭＶコートタンパク質と免疫原との融合についても記載されている。
【０００４】
特許文献４（国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００２０６９（ＷＯ２００８／０５８３９６）号明細書）は、ＰａｐＭＶおよびＰａｐＭＶ  ＶＬＰに基づくインフルエンザワクチンについて記載している。これらのワクチンは、１種以上のインフルエンザ抗原と結合した、または融合したＰａｐＭＶもしくはＰａｐＭＶ  ＶＬＰを含む。
【０００５】
特許文献５（国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１９０４（ＷＯ２００８／０５８３６９）号明細書）は、ＰａｐＭＶに基づく免疫親和性接合抗原系について記載している。親和性ペプチドが化学的手段もしくは遺伝子融合によってコートタンパク質に付着させられる、ＰａｐＭＶコートタンパク質と重要な抗原に結合可能な複数の親和性ペプチドとの融合について記載されている。
【０００６】
特許文献６（国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２００７／０００１５４（ＷＯ２００８／０８９５６９）号明細書）は、ＰａｐＭＶに基づくチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）および他の病原性腸内細菌に対するワクチンについて記載している。ＰａｐＭＶコートタンパク質と１種以上の腸内細菌抗原との融合について記載されている。
【０００７】
特許文献７（国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００６３６（ＷＯ２０１０／０１２０６９）号明細書）は、ＰａｐＭＶもしくはＶＬＰと市販のインフルエンザワクチンとの組み合わせを含む、ＰａｐＭＶに基づく多価ワクチンについて記載している。
【０００８】
他の刊行物は、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰの体液性および細胞性免疫応答を引き出す能力について記載している（非特許文献１（Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６３：５９−６８）、非特許文献２（Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｖａｃｃｉｎｅ，２６：３３９５−３４０３）、非特許文献３（Ｌｅｃｌｅｒｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８１：１３１９−２６）及び非特許文献４（Ｌａｃａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００８；８２：７８５−９４））。
【０００９】
ＰａｐＭＶコートタンパク質のＮ末端での突然変異およびそれがＰａｐＭＶ−宿主相互作用に及ぼす作用については記載がある（非特許文献５（Ｉｋｅｇａｍｉ，“Ｐａｐａｙａ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，”Ｍ．Ｓｃ．Ｔｈｅｓｉｓ，１９９５，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ，Ｏｔｔａｗａ））。これらの突然変異は野生型配列３位でのリシンからアルギニンへの保存的置換、３位の下流での１８アミノ酸欠失、ならびにＮ末端への付加としての１１アミノ酸インフレーム挿入および野生型Ｎ末端配列の置換を含んでいた。全３つの突然変異体は、球状角膜（Ｃ．ｇｌｏｂｏｓａ）における局所性病巣を生成し、全身性宿主パパイヤ（Ｃ．ｐａｐａｙａ）を感染させることができ、これはこれらの突然変異体が集合して全身にわたって移動できたことを示唆している。
【００１０】
ＰａｐＭＶコートタンパク質内の数箇所の表面が露出した推定部位へのＨＡ１１ペプチドの融合も調査されてきた（非特許文献６（Ｒｉｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，７（２），ｅ３１９２５））。コートタンパク質の１２位および１８７位でのペプチドの融合は、ＶＬＰに自己集合可能な融合タンパク質を生じさせた。コートタンパク質の１２位でペプチドの融合を含むＶＬＰは安定であり、ＨＡ１１ペプチドに対する免疫応答を誘導することができた。
【００１１】
この背景情報を提供するのは、本出願人が本発明に関連があると考える情報を公知とするためである。先行情報のいずれかが本発明にとっての先行技術を構成すると認めることを必ずしも意図しておらず、先行技術を構成すると解釈すべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第７６４１８９６号明細書
【特許文献２】カナダ国特許出願第２４３４０００号明細書
【特許文献３】国際出願ＰＣＴ／ＣＡ０３／００９８５（ＷＯ２００４／００４７６１）号明細書
【特許文献４】Ｌａｃａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００８；８２：７８５−９４
【特許文献５】国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２００７／００１９０４（ＷＯ２００８／０５８３６９）号明細書
【特許文献６】国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２００７／０００１５４（ＷＯ２００８／０８９５６９）号明細書
【特許文献７】国際出願ＰＣＴ／ＣＡ２００９／００６３６（ＷＯ２０１０／０１２０６９）号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６３：５９−６８
【非特許文献２】Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｖａｃｃｉｎｅ，２６：３３９５−３４０３
【非特許文献３】Ｌｅｃｌｅｒｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，８１：１３１９−２６
【非特許文献４】Ｌａｃａｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００８；８２：７８５−９４
【非特許文献５】Ｉｋｅｇａｍｉ，“Ｐａｐａｙａ  Ｍｏｓａｉｃ  Ｐｏｔｅｘｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，”Ｍ．Ｓｃ．Ｔｈｅｓｉｓ，１９９５，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｃａｎａｄａ，Ｏｔｔａｗａ
【非特許文献６】Ｒｉｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，７（２），ｅ３１９２５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の課題は、組換えパパイヤモザイクウイルスコートタンパク質の提供、および被験者におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するためのその使用である。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の一態様によると、配列番号１のアミノ酸６〜１２のいずれか１つに対応するアミノ酸の後のパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）コートタンパク質に融合したインフルエンザＭ２ｅに由来するペプチド抗原を含む融合タンパク質であって、融合タンパク質は自己集合してウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成することができ、ペプチド抗原は、長さが２０アミノ酸以下であり、一般配列：Ｖ−Ｘ１−Ｔ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５［配列番号９６］（式中、Ｘ１はＥもしくはＤである、Ｘ２はＰもしくはＬである、Ｘ３はＴもしくはＩである、Ｘ４はＲもしくはＫである、およびＸ５はＮ、ＳもしくはＫである）を含む融合タンパク質が提供される。
【００１６】
本発明のまた別の態様によると、融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。
【００１７】
本発明のまた別の態様によると、ＶＬＰおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物が提供される。
【００１８】
本発明の方法のまた別の態様によると、被験者におけるインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法であって、被験者に有効量のＶＬＰを投与する工程を含む方法が提供される。
【００１９】
本発明の方法のまた別の態様によると、被験者がインフルエンザを発症するリスクを低減させる方法であって、被験者に有効量のＶＬＰを投与する工程を含む方法が提供される。
【００２０】
本発明の方法のまた別の態様によると、被験者をインフルエンザウイルスによる感染に対して免疫する方法であって、被験者に有効量のＶＬＰを投与する工程を含む方法が提供される。
【００２１】
本発明の方法のまた別の態様によると、それを必要とする被験者においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する目的で使用する上記の融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。
【００２２】
本発明の方法のまた別の態様によると、それを必要とする被験者においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するために融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が使用される。
【００２３】
本発明の方法のまた別の態様によると、被験者においてインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための医薬品の製造における融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が使用される。
【００２４】
本発明の方法のまた別の態様によると、被験者がインフルエンザを発症するリスクを低減させる目的で使用するための融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。
【００２５】
本発明の方法のまた別の態様によると、被験者がインフルエンザを発症するリスクを低減させるための融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が使用される。
【００２６】
本発明の方法のまた別の態様によると、被験者がインフルエンザを発症するリスクを低減させるための医薬品の製造における融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が使用される。
【００２７】
本発明の方法のまた別の態様によると、インフルエンザウイルスによる感染に対して被験者を免疫する目的で使用するための融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が提供される。
【００２８】
本発明の方法のまた別の態様によると、インフルエンザウイルスによる感染に対して被験者を免疫するための融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が使用される。
【００２９】
本発明の方法のまた別の態様によると、インフルエンザウイルスによる感染に対して被験者を免疫するための医薬品の製造における融合タンパク質を含むウイルス様粒子（ＶＬＰ）が使用される。
【００３０】
本発明のまた別の態様によると、上記のＶＬＰおよび取扱説明書を含む医薬キットが提供される。
【００３１】
本発明の方法のまた別の態様によると、配列番号１のアミノ酸６〜１２、１８５〜１９２、１９７〜２１４のいずれか１つに対応するアミノ酸の後のパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）コートタンパク質に融合した１つ以上のペプチド抗原を含む融合タンパク質であって、融合タンパク質は自己集合してウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成することができ、ＶＬＰは少なくとも２５℃で安定である融合タンパク質が提供される。
【００３２】
本発明の方法のまた別の態様によると、ペプチド抗原に融合した、被験者におけるペプチド抗原に対する免疫応答を増強可能なウイルス様粒子（ＶＬＰ）を同定する方法であって、ペプチド抗原に融合したパパイヤモザイクウイルス（ＰａｐＭＶ）コートタンパク質を含むＶＬＰを提供する工程と、少なくとも２５℃でＶＬＰの安定性を決定する工程とを含み、少なくとも２５℃での安定性はＶＬＰがペプチド抗原に対する免疫応答を強化できる指標である、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
本発明のこうした特徴およびその他の特徴は、添付の図面を参照し、下記の発明を実施するための形態においてより明白になる。
【図１】（Ａ）野生型ＰａｐＭＶコートタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）、（Ｂ）野生型ＰａｐＭＶコートタンパク質のヌクレオチド配列（配列番号２）、（Ｃ）修飾ＰａｐＭＶコートタンパク質ＣＰΔＮ５のアミノ酸配列（配列番号４）、（Ｄ）修飾ＰａｐＭＶコートタンパク質ＰａｐＭＶ  ＣＰｓｍのアミノ酸配列（配列番号５）を示す。
【図２】実施例の項に記載した組換えＰａｐＭＶコートタンパク質の核酸およびアミノ酸配列を示す。抗原ペプチドに対応する挿入配列はボールド体および下線で表示した。（Ａ）ＰａｐＭＶ  ＮＰ−８の核酸およびアミノ酸配列［各々、配列番号７２および７３］、（Ｂ）ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１８３の核酸およびアミノ酸配列［各々、配列番号７４および７５］、（Ｃ）ＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃの核酸およびアミノ酸配列［各々、配列番号７６および７７］、（Ｄ）ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−８の核酸およびアミノ酸配列［各々、配列番号７８および７９］、（Ｅ）ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−１８３の核酸およびアミノ酸配列［各々、配列番号８０および８１］、（Ｆ）ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−Ｃの核酸およびアミノ酸配列［各々、配列番号８２および８３］、（Ｇ）ＰａｐＭＶ  ３ＮＰ−Ｃの核酸およびアミノ酸配列［各々、配列番号８４および８５］、（Ｈ）ＰａｐＭＶ  ＮＰ−８／１８３の核酸およびアミノ酸配列［各々、配列番号８６および８７］、（Ｉ）ＰａｐＭＶ  ＮＰ−８／Ｃの核酸およびアミノ酸配列［各々、配列番号８８および８９］、（Ｊ）ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１８３／Ｃの核酸およびアミノ酸配列［各々、配列番号９０および９１］、（Ｋ）ＰａｐＭＶ  ３ＮＰ−８の核酸およびアミノ酸配列［各々、配列番号９２および９３］、（Ｌ）ＰａｐＭＶ  ３ＮＰ−８／１８３／Ｃ（ＰａｐＭＶトリプルＮＰ）［各々、配列番号６および９４］。
【図３】実施例１に記載したＰａｐＭＶコートタンパク質−Ｍ２ｅペプチド融合についてのアミノ酸配列を示す。（Ａ）構築物＃１［配列番号２３］。（Ｂ）構築物＃２［配列番号２４］、（Ｃ）構築物＃３［配列番号２５］、（Ｄ）構築物＃４［配列番号２６］、（Ｅ）構築物＃５［配列番号２７］、（Ｆ）構築物＃６［配列番号２８］。挿入Ｍ２ｅペプチド配列はボールド体で示した。
【図４】Ｒｉｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，７（２），ｅ３１９２５）においてＰａｐＭＶ  ＣＰアミノ酸配列（配列番号４）におけるＨＡ１１ペプチド配列が挿入された場所を示しているＰａｐＭＶコートタンパク質（ＣＰ）の二次構造予測を示す（Ｌｅｃｏｕｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＰＥＰ，４７：２７３−８０から援用）。
【図５】実施例１で試験した構築物についてのＰａｐＭＶコートタンパク質へのＭ２ｅペプチド融合の位値および配列を示す（挿入配列はボールド体および下線付けで表示した）。
【図６】Ｓｙｐｒｏ−Ｏｒａｎｇｅの疎水性残基への結合によって観察された、実施例１のＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ構築物の変性を示す。
【図７】図５からの熱安定性構築物（＃１、２、３、４、５、６、９、１０）の透過型電子顕微鏡写真を示す。
【図８】実施例１のＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ構築物を含むＶＬＰの免疫原性の評価結果を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり５匹）をＶＬＰで（第１日および第１４日に）２回免疫した。血液サンプルを各免疫の１４日後に入手し、体液性応答をＥＬＩＳＡによって測定した。Ａ）第１４日および第２８日の総抗Ｍ２ｅ  ＩｇＧ力価、Ｂ）第１４日および第２８日の抗Ｍ２ｅ  ＩｇＧ２ａ力価。＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．１。
【図９】（Ａ）チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）−ｌｏｏｐ−６ペプチドの融合部位でのＰａｐＭＶ  ＣＰのアミノ酸配列、（Ｂ）組換えＰａｐＭＶ  ＣＰ融合タンパク質の産生についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：タンパク質ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−８の誘導前（レーン１）および発現後（レーン２）の細菌溶解物、レーン３：精製ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−８、タンパク質ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−１８３の誘導前（レーン４）および発現後（レーン５）の細菌溶解物、レーン６：精製ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−１８３。タンパク質ＰａｐＭＶ  −ｌｏｏｐ−６−Ｃの誘導前（レーン７）および発現後（レーン８）の細菌溶解物、およびレーン９：精製ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−Ｃ、（Ｃ）ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−８、ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−１８３およびＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−Ｃを含むＶＬＰの電子顕微鏡写真、および（Ｄ）ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−８、ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−１８３およびＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−Ｃを含むＶＬＰの動的光散乱法（ＤＬＳ）を示す。
【図１０】ＰａｐＭＶ  ＳＭ（もしくはＷＴ）、ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−８（ｌｏｏｐ６−８）、ＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−１８３（ｌｏｏｐ−６−１８３）およびＰａｐＭＶ−ｌｏｏｐ−６−Ｃ（ｌｏｏｐ６−Ｃ）に対する体液性応答を描出するデータを示す：ＰａｐＭＶプラットフォームに向けられた総ＩｇＧ（Ａ）およびＩｇＧ２ａ（Ｂ）ならびにｌｏｏｐ−６ペプチドに向けられた総ＩｇＧ（Ｃ）およびＩｇＧ２ａ（Ｄ）はＥＬＩＳＡによって測定した。
【図１１】（Ａ）ＮＰペプチドとの融合部位でのＰａｐＭＶ  ＣＰのアミノ酸配列、（Ｂ）ＮＰ  ＣＴＬエピトープに融合したＰａｐＭＶタンパク質およびＶＬＰの発現を示しているＳＤＳ−ＰＡＧＥ、（Ｃ）ＰａｐＭＶ  ＮＰ−８、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１８３およびＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃを含むＶＬＰの電子顕微鏡写真、（Ｄ）ＰａｐＭＶ  ＮＰ−８、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１８３およびＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃ  ＶＬＰならびにディスクの動的光散乱法（ＤＬＳ）を示す。
【図１２】インフルエンザＮＰ１４７−１５５ペプチドに融合したＰａｐＭＶ  ＣＰを含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰおよびディスクを用いたワクチン接種後のマウスにおけるＩＦＮ−γ分泌を示しているＥＬＩＳＰＯＴ分析結果を示す（Ａ）ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１２、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１８７、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−ＣもしくはＰａｐＭＶ  ＣＰを含むＶＬＰ（＊＊＊ｐ≦０．００１、全群に比較して）。（Ｂ）ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１２もしくはＰａｐＭＶ  ＣＰを含むＶＬＰおよびディスク（＊＊＊ｐ≦０．００１、全群に比較して）、および（Ｃ）グルタルアルデヒド（Ｇｌｕｔ）と架橋した、または架橋していないＰａｐＭＶ  ＮＰ−１２、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−ＣもしくはＰａｐＭＶ  ＣＰを含むＶＬＰ（＊ｐ≦０．０５および＊＊ｐ≦０．０１）。
【図１３】（Ａ）ＮＰ１４７−１５５ペプチドとの融合部位でのＰａｐＭＶ  ＣＰのアミノ酸配列、（Ｂ）ＮＰ１４７−１５５ペプチドの多数のコピーを含んでいるＰａｐＭＶタンパク質およびＶＬＰの発現を示しているＳＤＳ−ＰＡＧＥ、および（Ｃ）ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ  ３ＮＰ−Ｃ、ＮＰ−８／１８３、ＮＰ−８／Ｃ、ＮＰ−８／ＣおよびトリプルＮＰの動的光散乱法（ＤＬＳ）を示す。
【図１４】ＰａｐＭＶ  ＶＬＰで免疫したマウスの血清を用いてハイブリダイズしたＰａｐＭＶ  ＣＰからの２７個の重複ペプチドのマイクロアレイ分析結果を示す。閾値は、ペプチド１が表面を露出していることが公知であるので、ペプチド１の比蛍光強度に置いた。
【図１５】化学修飾ＰａｐＭＶ  ＶＬＰの電子顕微鏡検査および動的光散乱法分析の結果を示す。電子顕微鏡検査（Ａ）および動的光散乱法（Ｂ）によってどちらも証明されたように、ＤＥＰＣもしくはＥＤＣで処置したＶＬＰがそれらの四次構造の破壊を維持しないことを示す。
【図１６】野生型ＰａｐＭＶコートタンパク質［配列番号１］のアミノ酸配列を示す。Ｃ末端およびＮ末端での予測ランダムコイルに関係するアミノ酸残基はボールド体で表示して下線を引いた。
【図１７】インフルエンザＮＰ１４７−１５５ペプチドの多数のコピーに融合したＰａｐＭＶ  ＣＰを含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰおよびディスクのＥＬＩＳＰＯＴ分析結果を示す。
【図１８】動的光散乱法によって測定したインフルエンザＮＰ１４７−１５５ペプチドに融合したＰａｐＭＶ  ＣＰを含むＶＬＰの構造における変化を描出するチャートを示す。（Ａ）マウスの体温より低い温度でのＰａｐＭＶ  ＮＰ−１８７およびＮＰ−Ｃ  ＶＬＰの凝集を示している融合を伴わないＰａｐＭＶ  ＶＬＰに比較した組換えＰａｐＭＶ  ＣＰ  ＮＰ１４７−１５５ペプチド融合を含むＶＬＰ、（Ｂ）高温安定性を示す架橋ＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃ  ＶＬＰ、および（Ｃ）グルタルアルデヒドによる架橋結合を伴う、または伴わない組換えＰａｐＭＶ  ＣＰ  ＮＰ１４７−１５５ペプチドを含むＶＬＰのトリプシン消化の結果。
【図１９】ＥＤＣによる化学修飾を含む消化ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。修飾を含有する領域は、（Ａ）Ｖ１６〜Ｋ３０、（Ｂ）Ｍ１２２〜Ｋ１３７および（Ｃ）Ｇ１９９〜Ｒ２２１である。下線の引かれたプロダクトイオンは、ＥＤＣ修飾を含有する。
【図２０】ＤＥＰＣによる化学修飾を含む消化ペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。修飾を含有する領域は、（Ａ）Ｍ１２２〜Ｋ１３７、（Ｂ）Ｇ１９９〜Ｒ２２１である。ＢにおけるＤＥＰＣ修飾は正確に位置指定できないため２つのトレオニンのいずれか１つである。下線の引かれたプロダクトイオンは、ＤＥＰＣ修飾を含有する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、コートタンパク質（ＣＰ）「表面コイル」領域内、詳細には野生型ＣＰのＮ末端の１３アミノ酸を含む予測ランダムコイル（配列番号１、図１６を参照）内に融合した１つ以上の抗原ペプチドを含む組換えＰａｐＭＶコートタンパク質に関する。融合抗原ペプチドを含む組換えＰａｐＭＶ  ＣＰは、自己集合してウイルス様粒子（ＶＬＰ）を形成することができる。
【００３５】
所定の実施形態において１つ以上の抗原は、インフルエンザウイルス、好ましくはＭ２ｅペプチドに由来し、配列番号１のアミノ酸６〜１２もしくはそれに対応する位置のいずれか１つの後、例えば配列番号４のアミノ酸１〜８のいずれか１つの後でＰａｐＭＶ  ＣＰ内に挿入される。これらの組換えコートタンパク質から作成されたウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、インフルエンザウイルスに対する防御免疫応答を誘導するのに有用である。このため、一部の実施形態は、例えヒトなどの哺乳動物におけるインフルエンザウイルスに対する防御免許応答を誘導するためのこれらのＶＬＰの使用に関する。所定の実施形態では、ＶＬＰをインフルエンザワクチンとして使用してよいと企図されている。
【００３６】
本発明の所定の実施形態は、インフルエンザウイルスに由来する抗原ペプチド、例えばＭ２ｅ由来ペプチドに由来する抗原ペプチドの融合を、配列番号１に示したＰａｐＭＶ  ＣＰ配列のアミノ酸６、７もしくは１０のいずれか１つに対応する位置の後で、例えば配列番号４に示したＰａｐＭＶ  ＣＰ配列のアミノ酸２、３もしくは６の後で含む組換えＰａｐＭＶ  ＣＰに関する。一部の実施形態において抗原ペプチドは、一般配列：Ｖ−Ｘ１−Ｔ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５［配列番号９６］（式中、Ｘ１はＥもしくはＤである、Ｘ２はＰもしくはＬである、Ｘ３はＴもしくはＩである、Ｘ４はＲもしくはＫである、およびＸ５はＮ、ＳもしくはＫである）を含むＭ２ｅ由来ペプチドである。本明細書で証明するように、配列番号１に示したＰａｐＭＶ  ＣＰ配列のアミノ酸６、７もしくは１０のいずれか１つに対応する位置の後で配列番号９６の一般配列を含むＭ２ｅ由来ペプチドに融合したＰａｐＭＶ  ＣＰを含むＶＬＰは、単回免疫でインフルエンザウイルスに対する防御免許応答を提供することができる。
【００３７】
所定の実施形態は、組換えＰａｐＭＶ  ＣＰがＣＰの第２表面コイル領域および／またはＣ末端で融合した１つ以上の抗原ペプチドをさらに含むことができると企図している。
【００３８】
本明細書に記載したように、一部の実施形態では、組換えＣＰを含むＶＬＰの融合ペプチドへの効果的な免疫応答を誘発する能力をＶＬＰの熱安定性に基づいて予測することができる。そこで所定の実施形態において組換えＣＰを含むＶＬＰは、少なくとも３０℃で安定であるように選択される。
【００３９】
用語の定義
他に規定しない限り、本明細書で使用する全ての技術用語および科学用語は本発明が属する分野の当業者であれば一般に理解する意味を有する。
【００４０】
本明細書で使用する用語「約」は、任意の数値からおよそ±１０％の変動を意味する。当然のことながら、このような変動は、詳細に言及されていてもいなくても、本明細書に提供される任意の数値に必ず含まれる。
【００４１】
本明細書で使用する用語「免疫原性」は、物質が動物において検出可能な免疫応答を誘導する能力を意味する。
【００４２】
本明細書で使用する用語「免疫応答」は、物質（例えば、化合物、分子、材料）の投与に応答した動物の免疫系の応答性における変化を意味しており、抗体産生、細胞媒介性免疫の誘導、補体活性化、免疫寛容の発達またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００４３】
本明細書で使用する用語「ワクチン接種」は、有益な免疫応答を生成するための被験者へのワクチンの投与を意味する。ワクチン接種は、予防作用、治療作用またはそれらの組み合わせを有し得る。ワクチン接種は、治療対象の被験者に依存して、非経口投与、例えば腹腔内注射（ｉ．ｐ．）、静脈内注射（ｉ．ｖ．）もしくは筋肉内注射（ｉ．ｍ）、経口投与、鼻腔内投与、皮内投与、経皮投与および浸漬法を含むがそれらに限定されない様々な方法を用いて実施できる。
【００４４】
本明細書で使用する用語「ワクチン」は、有益な免疫応答を生成可能な組成物を意味する。
【００４５】
本明細書で使用する、物体に適用される用語「天然（型）」は、物体を自然に見出せるという事実を意味する。例えば、生物（ウイルスを含む）または天然の起源から単離可能な生物内に存在する、および研究室内のヒトが故意に修飾していないポリペプチドもしくはポリヌクレオチド配列は天然型である。
【００４６】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」もしくは「ペプチド」は、その中にペプチド結合によって結合された少なくとも２個のアミノ酸、例えば少なくとも４個のアミノ酸が存在する分子を意味すると意図されている。
【００４７】
本明細書で使用する用語「ウイルス様粒子（ＶＬＰ）」は、ウイルス粒子に類似した外見を有する自己集合性粒子を意味する。ＶＬＰは場合により、核酸を含む。ＶＬＰは、一般に複製することができない。
【００４８】
本明細書で使用する用語「ディスク」は、約１８〜約２２サブニットを含み、約４００ｋＤａ〜約５００ｋＤａの分子量を有するＰａｐＭＶコートタンパク質の多重結合形を意味する（Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＦＥＢＳ，２７３：１４−２５）。規定構造を有していない非特異的凝集体とは対照的に、ディスクは、ＤＬＳによって測定される約４０ｎｍ以下の径を有する実質的に球体の構造として出現する。
【００４９】
本明細書で使用する用語「抗原」は、被験者における免疫応答を単独で、またはアジュバントとの組み合わせで誘導できる、細胞全体および組織全体までを含む１つ以上の分子、分子の１つ以上の部分または分子の組み合わせを意味する。免疫原／抗原は、単一または複数のエピトープを含むことができる。そこでこの用語は、ペプチド、炭水化物、タンパク質、核酸、ならびにウイルス、細菌および寄生虫を全部または一部含む様々な微生物を含んでいる。ハプテンも本明細書で使用する用語「抗原」に含まれると見なされる。
【００５０】
本明細書で使用する用語「被験者」もしくは「患者」は、ワクチン接種および／または治療を必要とする動物を意味する。
【００５１】
本明細書で使用する用語「動物」は、ヒトならびに哺乳動物、鳥類および魚類を含むがそれらに限定されない非ヒト動物の両方を意味しており、家庭内動物、家畜、動物園の動物、実験用動物および野生動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジもしくは他の有蹄動物、イヌ、ネコ、ニワトリ、カモ、非ヒト霊長類、モルモット、ウサギ、フェレット、ラット、ハムスターおよびマウスを含む。
【００５２】
核酸もしくはアミノ酸配列に関連して本明細書で使用する用語「実質的に同一」は、例えば以下に記載の方法を用いて最適にアラインメントされた場合、核酸もしくはアミノ酸配列が、規定第二核酸もしくはアミノ酸配列（または「参照配列」）との少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を共有することを示している。「実質的同一性」は、様々なタイプおよび長さの配列、例えば全長配列、官能的ドメイン、コーディングおよび／または調節配列、プロモーターおよびゲノム配列について言及するのに使用できる。２つのアミノ酸もしくは核酸配列間の同一性率は、当業者の技術の範囲内に含まれる様々な方法で、例えば公になっているコンピュータソフトウェア、例えばＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ（Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍ．Ｓ．Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １４７：１９５−７）、ＧｅｎｅＭａｔｃｈｅｒ  ＰｌｕｓＴＭ，Ｓｃｈｗａｒｚ  ａｎｄ  Ｄａｙｈｏｆ（１９７９）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｄａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｏ．，Ｅｄ  ｐｐ３５３−３５８に組み込まれている“ＢｅｓｔＦｉｔ”（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，４８２−４８９（１９８１））、ＢＬＡＳＴプログラム（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．，Ｗ．Ｇｉｓｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３−１０）ならびにＢＬＡＳＴ−２、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、ＢＬＡＳＴ−Ｎ、ＢＬＡＳＴ−Ｘ、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２、ＣＬＵＳＴＡＬおよびＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアを含むそれらの変形を使用して決定できる。さらに、当業者であれば、比較対象の配列の全長にわたって最高アラインメントを達成するために必要とされるアルゴリズムを含むアラインメントを測定するために適切なパラメーターを決定できる。一般に、アミノ酸配列については、比較配列の長さは少なくとも１０アミノ酸になる。当業者であれば、実際の長さは、比較される配列の全長に依存することになり、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０もしくは少なくとも２００アミノ酸であってよい、またはアミノ酸配列の全長であってよいことを理解するだろう。核酸については、比較配列の長さは、一般には少なくとも２５ヌクレオチドになるが、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、少なくとも５００、少なくとも５５０もしくは少なくとも６００ヌクレオチドであってよい、また���核酸配列の全長であってよい。
【００５３】
本明細書で使用する用語「複数」は、１つより多い、例えば２つ以上、３つ以上、４つ以上を意味する。
【００５４】
用語「〜を含む」と結び付けて本明細書で使用する用語「１つの」の使用は、「１つ」を意味し得るが、これは「１つ以上」、「少なくとも１つ」および「１つまたは１つより多い」ことも意味する。
【００５５】
本明細書で使用する用語「〜を含む」、「〜を有する」、「〜を包含する」および「〜を含有する」ならびにそれらの文法上の変形は包括的もしくは制限なく、および追加の列挙されていない要素および／または方法工程を排除しない。組成物、使用または方法と結び付けて本明細書で使用する用語「〜から本質的になる」は、追加の要素および／または方法工程が存在してよいが、これらの追加は言及された組成物、方法もしくは使用が機能する方法に実質的には影響を及ぼさないことを意味する。組成物、使用もしくは方法と結び付けて本明細書で使用する用語「〜からなる」は、追加の要素および／または方法工程を排除する。所定の要素および／または工程を含むと本明細書で記載された組成物、使用もしくは方法は、さらに、これらの実施形態が詳細に言及しているかどうかにかかわらず、所定の実施形態では、本質的にそれらの要素および／または工程からなり、他の実施形態では、それらの要素および／または工程からなる。
【００５６】
本明細書で考察したいずれかの実施形態は、本発明の任意の方法、使用もしくは組成物に関して実施できる、およびその逆もまた同様であることが企図されている。さらに、本発明の組成物およびキットは、本発明の方法および使用を達成するために使用できる。
【００５７】
組換えＰａｐＭＶコートタンパク質
本発明による組換えＰａｐＭＶコートタンパク質（ＣＰ）は、ＣＰ  Ｎ末端表面コイル領域内の位置でＰａｐＭＶ  ＣＰに融合した抗原に由来する１つ以上の抗原ペプチドを含んでいる。
【００５８】
一部の実施形態では、組換えＣＰは複数（つまり、２つ以上）の抗原ペプチドを含むことができ、複数のペプチドは、Ｎ末端表面コイル領域内に融合させることができる、または、異なる表面コイル領域内および／またはＣ末端で各々融合させることができる。
【００５９】
ＰａｐＭＶコートタンパク質
本発明による組換えＰａｐＭＶ  ＣＰの製造に使用するＰａｐＭＶコートタンパク質は、ＰａｐＭＶ  ＣＰ全体もしくはその一部であってよい、または野生型ＰａｐＭＶ  ＣＰの遺伝子修飾版であって、ＣＰがＶＬＰに自己集合する能力を維持していることを前提に、例えば、１つ以上のアミノ酸の欠失、挿入、置換などを含む遺伝子修飾版であってよい。野生型ＰａｐＭＶコート（もしくはカプシド）タンパク質のアミノ酸配列は当該分野において公知であり（例えば、Ｓｉｔ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ，７０：２３２５−２３３１およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＰ＿０４４３３４．１を参照）、本明細書において配列番号１とした（図１Ａを参照）。ＰａｐＭＶ  ＣＰのヌクレオチド配列は当該分野において公知であり（例えば、Ｓｉｔ，ｅｔ  ａｌ．，ｉｂｉｄ．およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ＿００１７４８（ヌクレオチド５８８９〜６５３６）を参照）、本明細書において配列番号２とした（図１Ｂを参照）。
【００６０】
上述したように、組換えＰａｐＭＶ  ＣＰの製造に使用されるＰａｐＭＶ  ＣＰのアミノ酸配列は、親（野生型）配列と正確に一致する必要はない、つまり「変異体配列」であってよい。例えば、ＰａｐＭＶ  ＣＰは、１つ以上のアミノ酸残基の置換、挿入もしくは欠失によって突然変異させることができるので、その部位での残基は親（参照）配列に一致しない。しかし当業者であれば、そのような突然変異は広範囲ではないこと、そして組換えＰａｐＭＶ  ＣＰがＶＬＰに自己集合する能力に劇的には影響を及ぼさないことを理解するだろう。ＰａｐＭＶ  ＣＰの変異体版がＶＬＰに自己集合する能力は、例えば、本明細書の実施例の項に記載した典型的方法などの標準技術の後に電子顕微鏡検査によって評価できる。
【００６１】
ＰａｐＭＶ  ＣＰの天然型変異体も公知である。例えば、Ｎｏａ−Ｃａｒｒａｚａｎａ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖａ−Ｒｏｓａｌｅｓ（Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，２００１，８５：５５８）は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｄ１３９５７（つまり、配列番号１）の下で預託されたＰａｐＭＶコートタンパク質配列との８８％の配列類似性および９４％の相互配列類似性を共有したコートタンパク質を有するＰａｐＭＶの２つのＭｅｘｉｃａｎ単離体の同定について報告した。そのような天然型変異体も本発明の所定の実施形態に企図されている。
【００６２】
一部の実施形態では、ＶＬＰに自己集合する能力を保持している野生型ＣＰのフラグメント（つまり、「官能的フラグメント」）を使用して製造された組換えＰａｐＭＶ  ＣＰも企図されている。例えば、フラグメントは、タンパク質のＮ末端、Ｃ末端もしくは内部、またはそれらの組み合わせ由来の１つ以上のアミノ酸の欠失を含むことができる。一般に、官能的フラグメントは長さが少なくとも１００アミノ酸である。本発明の一部の実施形態において官能的フラグメントは、長さが少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１６０アミノ酸、少なくとも１７０アミノ酸、少なくとも１８０アミノ酸および少なくとも１９０アミノ酸であると規定されている。
【００６３】
本発明の所定の実施形態では、組換えＣＰが変異体配列を含む場合、変異体配列は、親（参照）配列と少なくとも約７０％同一である、例えば参照配列と少なくとも約７５％同一である。一部の実施形態では、変異体配列は、参照配列と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、またはそれらの間の任意の数値だけ同一である。一実施形態において、参照アミノ酸配列は、配列番号１である（図１Ａ）。
【００６４】
本発明の一部の実施形態では、組換えＰａｐＭＶ  ＣＰの製造に使用されるＰａｐＭＶ  ＣＰは、ＰａｐＭＶ  ＣＰの遺伝子修飾（つまり、変異体）版である。一部の実施形態においてＰａｐＭＶ  ＣＰは、タンパク質のＮもしくはＣ末端由来のアミノ酸を欠失させるため、および／または１つ以上のアミノ酸置換を含むために遺伝子修飾指されている。所定の実施形態においてＰａｐＭＶ  ＣＰは、タンパク質のＮもしくはＣ末端由来の約１〜約１０アミノ酸、例えば約１〜約５アミノ酸を欠失させるために遺伝子修飾されている。
【００６５】
一実施形態において、ＰａｐＭＶ  ＣＰは、野生型タンパク質のＮ末端の近位で発生し、翻訳を（つまり、配列番号１の１位および６位で）開始する２つのメチオニンコドンの１つを除去するために遺伝子修飾されている。翻訳開始コドンの１つの除去は、均質集団のタンパク質生成を可能にする。選択されたメチオニンコドンは、例えば、コドンがメチオニン以外のアミノ酸をコードするように、またはナンセンスコドンになるようにコドンを作り上げる１つ以上のヌクレオチドを置換する工程によって除去できる。または、コドンの全部もしくは一部、または選択されたコドンを含むタンパク質をコードする核酸の５’領域を欠失させることができる。一部の実施形態においてＰａｐＭＶ  ＣＰは、例えば、タンパク質のＮ末端から１〜５アミノ酸を欠失させる工程によって、１位でメチオニンを欠失させるために遺伝子修飾されている。一部の実施形態において遺伝子修飾ＰａｐＭＶ  ＣＰは、配列番号４（図１Ｃ）と実質的に同一のアミノ酸配列を有しており、場合により６個までのヒスチジン残基のヒスチジンタグを含むことができる。一部の実施形態においてＰａｐＭＶ  ＣＰは、Ｃ末端で追加のアミノ酸（例えば、約１〜約８アミノ酸）を含むように遺伝子組み換えされている。そのようなアミノ酸の導入は、例えば、コーディングヌクレオチド配列内の１つ以上の特異的制限酵素部位の作成を生じさせることができる。所定の実施形態においてＰａｐＭＶ  ＣＰは、ヒスチジンタグを備える、または備えない配列番号５（図１Ｄ）と実質的に同一のアミノ酸配列を有している。
【００６６】
組換えＰａｐＭＶ  ＣＰが１つ以上のアミノ酸置換を含有する変異体ＰａｐＭＶ  ＣＰを使用して製造される場合、これらは「保存的」置換または「非保存的」置換であってよい。保存的置換は、類似の側鎖特性を有するまた別の残基による１つのアミノ酸残基の置換を含んでいる。当該分野において公知であるように、２０種の天然型アミノ酸は、側鎖の物理化学的特性によって分類できる。適切な分類には、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、フェニルアラニンおよびトリプトファン（疎水性側鎖）、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミン（極性の非荷電側鎖）、アスパラギン酸およびグルタミン酸（酸性側鎖）およびリシン、アルギニンおよびヒスチジン（塩基性側鎖）が含まれる。アミノ酸のまた別の分類は、フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン（芳香族側鎖）である。保存的置換は、アミノ酸と同一群由来のまた別のアミノ酸との置換を含んでいる。非保存的置換は、１つのアミノ酸残基と異なる側鎖特性を有するまた別の残基との置換、例えば１つの酸性残基と中性もしくは塩基性残基との置換、中性残基と酸性もしくは塩基性残基との置換、疎水性残基と親水性残基との置換を含んでいる。
【００６７】
所定の実施形態では、組換えＣＰは、１つ以上の非保存的置換を有する変異体配列を含んでいる。１つのアミノ酸と異なる特性を有するまた別のアミノ酸との置換は、ＣＰの特性を改良することができる。例えば、以前記載されたようにＣＰの残基１２８の突然変異は、ＶＬＰへのタンパク質の集合を改良する（Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＦＥＢＳ，２７３：１４−２５）。このため一部の実施形態においてＣＰは、この位置でのグルタミン酸残基が中性残基で置換されている残基１２８での突然変異を含んでいる。一実施形態において１２８位でのグルタミン酸残基は、アラニン残基で置換されている。
【００６８】
野生型ＰａｐＭＶ  ＣＰのＦ１３位でのフェニルアラニン残基とまた別の疎水性残基との置換は、野生型タンパク質配列が使用される場合よりも組換えタンパク質が発現する場合にはより高比率のＶＬＰを生じさせることが証明されてきた。本発明の状況では、以下のアミノ酸残基：Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＭｅｔおよびＴｙｒがＦ１３位での置換のために適合する疎水性残基であると考えられる。所定の実施形態において組換えＣＰは、１３位でのＰｈｅとＩｌｅ、Ｔｒｐ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、ＭｅｔもしくはＴｙｒとの置換を含んでいる。一実施形態において組換えＣＰは、１３位でのＰｈｅとＬｅｕもしくはＴｙｒとの置換を含んでいる。
【００６９】
所定の実施形態においてＦ１３位でのＣＰの突然変異は、Ｅ１２８位での突然変異、Ｎ末端での欠失、Ｃ末端での欠失またはそれらの組み合わせと組み合わせることができる。
【００７０】
同様に、組換えＰａｐＭＶ  ＣＰの製造に使用されるＰａｐＭＶ  ＣＰをコードする核酸配列は、親参照配列と正確に一致する必要はないが、遺伝コードの縮重によって、および／または上述したように変異体アミノ酸配列をコードするように変動してもよい。このため本発明の所定の実施形態において変異体ＣＰをコードする核酸配列は、参照配列と少なくとも約７０％同一である。一部の実施形態において組換えＣＰをコードする核酸配列は、親（参照）配列と少なくとも約７５％、例えば少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、またはそれらの間の任意の数値だけ同一である。一実施形態において参照核酸配列は、配列番号２である（図１Ｂ）。
【００７１】
抗原ペプチド
本発明による組換えＰａｐＭＶ  ＣＰは、予測ＣＰ  Ｎ末端表面コイル内でＣＰに融合した１つ以上の抗原ペプチドを含んでいる。好ましくは、抗原ペプチドは、インフルエンザ抗原に由来する。抗原ペプチドは、組換えＣＰが発現する能力、またはＶＬＰに自己集合する能力を妨害しないように選択され、どちらも例えば本明細書に記載の標準技術によって試験できる。
【００７２】
ＣＰと融合するための抗原ペプチドは様々なサイズであってよいが、一般には長さが約３アミノ酸〜約５０アミノ酸、例えば約３〜約４０アミノ酸、約３〜約３０アミノ酸、約３〜約２５アミノ酸、約３〜約２０アミノ酸、約３〜約１５アミノ酸、長さが約３〜約１２アミノ酸またはそれらの間の任意の長さである。一部の実施形態において抗原ペプチドは、長さが少なくとも５アミノ酸、例えば長さが少なくとも６もしくは少なくとも７アミノ酸および約１０、１１、１２、１５もしくは２０アミノ酸、またはそれらの間のいずれかの量までの長さを有する。本発明の所定の実施形態において抗原ペプチドは、長さが２５アミノ酸以下、例えば２０アミノ酸以下、１５アミノ酸以下、１４アミノ酸以下、１３アミノ酸以下、１２アミノ酸以下であり、範囲の下限は、例えば、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０アミノ酸である。所定の実施形態において抗原ペプチドは、長さが約５、６、７、８、９、１０、１１、１２もしくは１３アミノ酸である。
【００７３】
抗原ペプチドがそれに由来する抗原は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ上の表面構造、クラスＩもしくはＩＩ  ＡＰＣ（抗原提示細胞）関連性細胞表面構造またはそれらの組み合わせによって認識されるエピトープを含むことができる。所定の実施形態において抗原ペプチドは、Ｔ細胞もしくはＣＴＬエピトープを含んでいる。当該分野において公知であるように、Ｔ細胞エピトープおよびＣＴＬエピトープは、Ｔ細胞受容体によって認識および結合され、抗原の内側の非露出部分に位置する可能性があり、抗原のタンパク質分解過程後、Ｔ細胞受容体に接近できるようになる。ＣＴＬエピトープは、抗原の表面上で見いだすこともできる。インフルエンザウイルスに関連する様々なＴ細胞エピトープおよびＣＴＬエピトープは、当該分野において公知である。一部の実施形態では、ＰａｐＭＶ  ＣＰとの融合のために選択された抗原ペプチドは、Ｂ細胞エピトープを含んでいる。当該分野において公知であるように、Ｂ細胞エピトープは、Ｂ細胞受容体によって認識および結合される。このようなエピトープは、典型的には抗原の表面上で位置指定される。インフルエンザウイルスに関連する様々なＢ細胞エピトープは、当該分野において公知である。
【００７４】
所定の実施形態において抗原ペプチドは、例えば、組換えＣＰが１つより多い抗原ペプチドを含む場合、Ｔ細胞エピトープもしくはＣＴＬエピトープおよびＢ細胞エピトープの組み合わせを含むことができる。
【００７５】
公知のインフルエンザウイルス抗原には、例えば、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、Ｍ１およびＭ２タンパク質由来の抗原が含まれる。これらのタンパク質の配列は当該分野において公知であり、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって保持されるＧｅｎＢａｎｋデータベースから容易に入手することができる。ＨＡ、ＮＰおよびマトリックスタンパク質の適切な抗原ペプチドには、１つ以上のヘマグルチニンエピトープを含むフラグメント：ＨＡ９１−１０８、ＨＡ３０７−３１９およびＨＡ３０６−３２４（Ｒｏｔｈｂａｒｄ，Ｃｅｌｌ，１９８８，５２：５１５−５２３）、ＨＡ４５８−４６７（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９７，１５９（１０）：４７５３−６１）、ＨＡ２１３−２２７、ＨＡ２４１−２５５、ＨＡ５２９−５４３およびＨＡ５３３−５４７（Ｇａｏ，ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，２００６，８０：１９５９−１９６４）、核タンパク質エピトープ：ＮＰ２０６−２２９（Ｂｒｅｔｔ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：９８４−９９１）、ＮＰ３３５−３５０およびＮＰ３８０−３９３（Ｄｙｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ，１９９３，Ｉｎ：Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ，ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｅｄ．：Ｒｉｃｋｗｏｏｄ，Ｄ．ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．２９２、Ｇｕｌｕｋｏｔａ  ａｎｄ  ＤｅＬｉｓｉ，１９９６，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１３：８１）、ＮＰ３０５−３１３（ＤｉＢｒｉｎｏ，１９９３，ＰＮＡＳ９０：１５０８−１２）、ＮＰ３８４−３９４（Ｋｖｉｓｔ，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：４４６−４４８）、ＮＰ８９−１０１（Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎ．２４４：１６９−７）、ＮＰ９１−９９（Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６０：３６７−３６９）、ＮＰ３８０−３８８（Ｓｕｈｒｂｉｅｒ，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７９：１７１−１７３）、ＮＰ４４−５２およびＮＰ２６５−２７３（ＤｉＢｒｉｎｏ，１９９３，ｉｂｉｄ．）、ならびにＮＰ３６５−３８０（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４４：９５９−９６８）、マトリックスタンパク質（Ｍ１）エピトープ：Ｍ１  ２−２２、Ｍ１  ２−１２、Ｍ１  ３−１１、Ｍ１  ３−１２、Ｍ１  ４１−５１、Ｍ１  ５０−５９、Ｍ１  ５１−５９、Ｍ１  １３４−１４２、Ｍ１  １４５−１５５、Ｍ１  １６４−１７２、Ｍ１  １６４−１７３（全てＮｉｊｍａｎ，１９９３，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１２１５−１２１９に記載された）、Ｍ１  １７−３１、Ｍ１  ５５−７３、Ｍ１  ５７−６８（Ｃａｒｒｅｎｏ，１９９２，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：１１３１−１１４０）、Ｍ１  ２７−３５、Ｍ１  ２３２−２４０（ＤｉＢｒｉｎｏ，１９９３，ｉｂｉｄ．）、Ｍ１  ５９−６８およびＭ１  ６０−６８（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４，２４（３）：７７７−８０）、ならびにＭ１  １２８−１３５（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９６，２６（２）：３３５−３��）が含まれるがそれらに限定されない。
【００７６】
インフルエンザウイルスタンパク質の他の抗原性領域およびエピトープは、例えば、Ｍ２ｅペプチド（Ｍ２の細胞外ドメイン）を含む公知のインフルエンザイオンチャネルタンパク質（Ｍ２）のフラグメントである。このペプチドの配列は、様々なインフルエンザ菌株に高度に保存されている。本発明の所定の実施形態において抗原ペプチドは、Ｍ２ｅペプチドに由来する。Ｍ２ｅペプチド配列の例は、表１に配列番号８として示した。この配列の変異体は同定されており、このような変異体の一部の例も表１に示した。
【００７７】
【表１】
2015514097.tif 000003
【００７８】
所定の実施形態では、Ｍ２ｅ配列全体を使用できる。一部の実施形態では、好ましくは部分Ｍ２ｅ配列、例えばＭ２ｅ変異体全域で保存されている部分配列、例えばアミノ酸２〜１０によって規定された領域を含むフラグメント、またはアミノ酸６〜１３によって規定された領域を含むフラグメントが使用される。
【００７９】
所定の実施形態において抗原ペプチドは、アミノ酸６〜１３またはそれらのフラグメントによって規定される領域を含むＭ２ｅに由来するペプチドを含んでいる。アミノ酸６〜１３によって規定されたＭ２ｅの領域の配列は、以下のように規定することができる。
【００８０】
Ｅ−Ｖ−Ｘ１−Ｔ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５［配列番号９５］
（式中、
Ｘ１は、ＥもしくはＤである、
Ｘ２は、ＰもしくはＬである、
Ｘ３は、ＴもしくはＩである、
Ｘ４は、ＲもしくはＫである、および
Ｘ５は、Ｎ、ＳもしくはＫである）
【００８１】
例えば、エピトープＥＶＥＴＰＩＲＮ［配列番号１３］は、ＧｅｎＢａｎｋで入手可能なヒトインフルエンザＡ菌株の８４％に見られる。同様に同定されているこの配列の変異体には、ＥＶＥＴＬＴＲＮ［配列番号１４］（９．６％）、ＥＶＥＴＰＩＲＳ［配列番号１５］（２．３％）、ＥＶＥＴＰＴＲＮ［配列番号１６］（１．１％）、ＥＶＥＴＰＴＫＮ［配列番号１７］（１．１％）およびＥＶＤＴＬＴＲＮ［配列番号１８］、ＥＶＥＴＰＩＲＫ［配列番号１９］およびＥＶＥＴＬＴＫＮ［配列番号２０］（各０．６％）（Ｚｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，５：６３１−６３５、Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００５，Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，７：１７１−１７７を参照）が含まれる。
【００８２】
このため所定の実施形態において抗原ペプチドは、一般配列：Ｅ−Ｖ−Ｘ１−Ｔ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５［配列番号９５］を含むＭ２ｅ由来ペプチド、例えば上記に例示したペプチドまたはそれらのフラグメントである。典型的なフラグメントには、配列：Ｖ−Ｘ１−Ｔ−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５［配列番号９６］、例えばＶＥＴＰＩＲＮ［配列番号９７］、ＶＥＴＬＴＲＮ［配列番号９８］、ＶＥＴＰＩＲＳ［配列番号９９］、ＶＥＴＰＴＲＮ［配列番号１００］、ＶＥＴＰＴＫＮ［配列番号１０１］、ＶＤＴＬＴＲＮ［配列番号１０２］、ＶＥＴＰＩＲＫ［配列番号１０３］およびＶＥＴＬＴＫＮ［配列番号１０４］を有するフラグメントが含まれる。
【００８３】
所定の実施形態においてＰａｐＭＶ  ＣＰとの融合のために選択された抗原ペプチドは、長さが約５〜約１２アミノ酸、例えば長さが約５〜約１０アミノ酸のＭ２ｅペプチドの一部分を含んでいる。Ｍ２ｅエピトープの適切な部分には、上述された部分が含まれる。一部の実施形態において抗原ペプチドは、長さが約５〜約１２アミノ酸、例えば長さが約５〜約１０アミノ酸のＭ２ｅペプチドの一部分を含んでいる。一部の実施形態において抗原ペプチドは、長さが１０アミノ酸未満であり、配列番号９５もしくは９６、例えば配列ＥＶＥＴＰＩＲＮＥ［配列番号２１］もしくはＶＥＴＰＩＲＮ［配列番号２２］のペプチドを含んでいる。所定の実施形態において抗原ペプチドは、配列ＥＶＥＴＰＩＲＮＥ［配列番号２１］もしくはＶＥＴＰＩＲＮ［配列番号２２］から本質的になる。
【００８４】
Ｍ２ｅペプチドを含む組換えＰａｐＭＶ  ＣＰの典型的な非限定的例には、配列番号２３のアミノ酸１〜２２４、配列番号２４のアミノ酸１〜２２２、配列番号２５のアミノ酸１〜２２１、配列番号２６のアミノ酸１〜２１９、配列番号２７のアミノ酸１〜２２４、および配列番号２８のアミノ酸１〜２２２に規定したアミノ酸配列を含むＰａｐＭＶ  ＣＰ融合ならびに配列番号２３〜２８のいずれか１つに記載したアミノ酸配列を含むＰａｐＭＶ  ＣＰ融合が含まれる。
【００８５】
ＰａｐＭＶ  ＣＰ表面コイル領域内の抗原ペプチドの融合
本発明の所定の実施形態によると、組換えＰａｐＭＶ  ＣＰは、ＣＰのＮ末端の１３アミノ酸内の予想ランダムコイル内で融合した１つ以上の抗原ペプチドを含んでいる（図１６を参照、図中ＣＰのＮおよびＣ末端にあるランダムコイル領域がボールド体で表示されている）。
【００８６】
したがって、本発明の一部の実施形態は、１つ以上の抗原ペプチドが配列番号１に示したＰａｐＭＶ  ＣＰ配列のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１もしくは１２に一致する位置の後に融合している組換えＰａｐＭＶ配列を提供する。一部の実施形態において融合タンパク質の製造に使用されるＰａｐＭＶ  ＣＰは、配列番号１の１位にあるメチオニンが、発現したＣＰの第１残基が配列番号１の５位にあるメチオニンであるように欠失もしくは置換されている変異体である。そのような実施形態では、配列番号１に示したＰａｐＭＶ  ＣＰ配列のアミノ酸６、７、８、９、１０、１１もしくは１２に対応する位置の後の抗原ペプチドの融合が企図されている。所定の実施形態において抗原ペプチドは、配列番号１に示したＰａｐＭＶ  ＣＰ配列のアミノ酸６、７、８、９もしくは１０に対応する位置の後で融合されていてよい。所定の実施形態において抗原ペプチドは、配列番号１に示したＰａｐＭＶ  ＣＰ配列のアミノ酸６、７もしくは１０に対応する位置の後で融合されていてよい。
【００８７】
所定の実施形態において融合タンパク質の製造に使用されるＰａｐＭＶ  ＣＰは、配列番号４に規定した配列（図１Ｃ）を有しており、１つ以上の抗原ペプチドは、配列番号４のアミノ酸１、２、３、４、５、６、７もしくは８の後で融合されている。一部の実施形態において融合タンパク質は、配列番号４に示したＰａｐＭＶ  ＣＰ配列のアミノ酸２、３、４、５もしくは６の後で融合した１つ以上の抗原ペプチドを含んでいてよい。一部の実施形態において融合タンパク質は、配列番号４に示したＰａｐＭＶ  ＣＰ配列のアミノ酸２、３、４、５もしくは６の後で融合した１つ以上の抗原ペプチドを含んでいてよい。一部の実施形態において融合タンパク質は、配列番号４に示したＰａｐＭＶ  ＣＰ配列のアミノ酸２、３もしくは６の後で融合した１つ以上の抗原ペプチドを含んでいてよい。
【００８８】
所定の実施形態は、配列番号１に示したＰａｐＭＶ  ＣＰ配列のアミノ酸６、７もしくは１０に対応する位置の後で、例えば配列番号４に示したＰａｐＭＶ  ＣＰ配列のアミノ酸２、３もしくは６の後のＭ２ｅ由来ペプチドの融合に関する。Ｍ２ｅ由来ペプチドは、例えば、長さが約５〜約１０アミノ酸であってよく、上記の配列を含んでいてよい。
【００８９】
一部の実施形態は、配列番号１に示したＰａｐＭＶ  ＣＰ配列のアミノ酸１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１もしくは１９２の後で融合した抗原ペプチドおよび／またはＣＰの３０Ｃ末端アミノ酸内に位置する他の１つの予想ランダムコイル内で融合した抗原ペプチドおよび／またはＣＰのＣ末端で融合した１つ以上の抗原ペプチドをさらに含む組換えＣＰに関する。
【００９０】
一部の実施形態は、配列番号１に示したＰａｐＭＶ  ＣＰ配列のアミノ酸１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３もしくは２１４の後で融合した抗原ペプチドおよび／または配列番号１に示したＰａｐＭＶ  ＣＰ配列のアミノ酸１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１もしくは１９２の後に融合した抗原ペプチドおよび／またはＣＰのＣ末端で融合した１つ以上の抗原ペプチドをさらに含む組換えＣＰに関する。
【００９１】
所定の実施形態において組換えＣＰは、単一ＣＰ表面コイル領域内のＣＰに融合した１つの抗原ペプチドを含んでいる、または１つ以上のＣＰ表面コイル領域各々の内に融合した１つの抗原ペプチドを含んでいてよい、または２つ以上のＣＰ表面コイル領域各々の内に融合した１つの抗原ペプチドを含んでいてよい。場合により、組換えＣＰは、ＣＰのＣ末端で融合した１つ以上の抗原ペプチドをさらに含んでいてよい。
【００９２】
一部の実施形態において組換えＰａｐＭＶ  ＣＰは１つ以上のＣＰ表面コイル部位内のＣＰに融合した同一抗原ペプチドの１つより多いコピー、例えば同一抗原ペプチドの１つより多いコピーは単一ＣＰ表面コイル部位内に融合させることができる、または同一抗原ペプチドの１つより多いコピーは１つ以上のＣＰ表面コイル部位各々の内に融合させることができる。場合により、組換えＣＰは、ＣＰのＣ末端で融合した１つ以上の抗原ペプチドをさらに含んでいてよい。
【００９３】
１つより多い抗原ペプチドがＣＰに融合している実施形態において、抗原ペプチドは同一であってよい、または各抗原ペプチドは相違していてよい。
【００９４】
抗原ペプチドの多数のコピーがＣＰ内の一部位で融合している実施形態において、挿入の全長は一般に約５０アミノ酸未満、例えば４０アミノ酸以下、３５アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２５アミノ酸以下、２０アミノ酸以下または１５アミノ酸以下である。
【００９５】
所定の実施形態において選択された抗原エピトープは、抗原ペプチドの提示を支援するために１つ以上のフランキング配列とともにＰａｐＭＶ  ＣＰ内に挿入される。そのようなフランキング配列は、抗原ペプチドの片側または両側上に存在してよい。フランキング配列が両側に存在する場合、これらのフランキング配列のアミノ酸配列は同一であってよい、または相違していてよい。フランキング配列は、使用される場合、典型的には、長さが約１〜約１０アミノ酸、約２〜約１０アミノ酸、約２〜約９アミノ酸、約２〜約８アミノ酸、約２〜約７アミノ酸、約２〜約６アミノ酸、約２〜約５アミノ酸または約３〜約５アミノ酸である。フランキング配列は、ＣＴＬエピトープを含む抗原ペプチドと結び付けると特に有用である。一般に、フランキング配列を使用する実施形態における、挿入配列の全長は、約５０アミノ酸未満、例えば４０アミノ酸以下、３５アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２５アミノ酸以下、２０アミノ酸以下または１５アミノ酸以下に維持される。
【００９６】
組換えＰａｐＭＶコートタンパク質の製造
本発明は、１つ以上の抗原ペプチドを含む組換えＰａｐＭＶ  ＣＰを提供する。抗原ペプチドをＣＰに遺伝的に融合させる方法は当該分野において公知であり、以下および実施例の項に記載した方法が含まれる。抗原ペプチドをタンパク質へ化学的に架橋させる方法は当該分野において周知であり、適切であれば使用できる。
【００９７】
組換えＰａｐＭＶコートタンパク質
本発明による組換えＰａｐＭＶ  ＣＰは、野生型もしくは親タンパク質の配列が提供された当業者であれば標準遺伝子工学技術によって容易に製造できる。タンパク質を遺伝子組み換えする方法は、野生型ＰａｐＭＶ  ＣＰ（配列番号１および２を参照）のアミノ酸およびヌクレオチド配列と同様に、当該分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４  ＆  ｕｐｄａｔｅｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。
【００９８】
必要であれば、野生型タンパク質をコードする核酸配列の単離およびクローニングは、標準技術を使用して達成できる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｂｉｄ．を参照）。例えば、核酸配列は、標準技術によってＲＮＡを抽出する工程および次にＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成する工程によって（例えばＲＴ−ＰＣＲによって）ＰａｐＭＶから直接入手することができる。ＰａｐＭＶは、標準技術によってモザイク症状を示す感染植物の葉から精製できる。
【００９９】
または、組換えＣＰをコードする核酸配列は、公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｂｉｄ．を参照）によって製造できる。
【０１００】
ＣＰをコードする核酸配列は、次に適切な発現ベクター内に直接、または１つ以上のサブクローニング工程後に挿入される。当業者であれば、寸分違わないベクターの使用が本発明にとって重要ではないことを理解するだろう。適切なベクターの例には、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルスもしくはＤＮＡウイルスが含まれるがそれらに限定されない。
【０１０１】
または、ＣＰをコードする核酸配列は、当該分野において周知の標準ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特定部位突然変異誘発技術によって、上述した突然変異のような１つ以上の突然変異を導入するためにさらに遺伝子組み換えできる。突然変異は、コーディング配列を作り上げる１つ以上の適切なヌクレオチドの欠失、挿入、置換、転位またはそれらの組み合わせによって導入できる。これは、例えば、１つ以上のヌクレオチドミスマッチ、挿入もしくは欠失を組み込むプライマーがそのために設計される、ＰＣＲをベースとする技術によって達成できる。突然変異の存在は、例えば制限解析による、またはＤＮＡシーケンシングによる多数の標準技術によって検証できる。
【０１０２】
組換えＰａｐＭＶ  ＣＰは、組換えＣＰ融合を生成する目的で、所望の部位で１つ以上の抗原ペプチドを挿入するために遺伝子組み換えされる。融合タンパク質を製造する方法は、当業者には周知である。融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、上述したように適切な発現ベクター内に挿入できる。
【０１０３】
当業者であれば、ＣＰもしくは融合タンパク質をコードするＤＮＡを、コードされたタンパク質の活性に影響を及ぼさずに様々な方法で変化させることができると理解するだろう。例えば、ＤＮＡ配列における変化を使用すると、タンパク質を発現させるために使用される宿主細胞におけるコドン選択を最適化できる、または発現を促進するために他の配列変化を含有できる。
【０１０４】
当業者であれば、発現ベクターは、コートタンパク質もしくは融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の効率的な転写のために必要とされる調節エレメント、例えば転写エレメントをさらに含むことができると理解するだろう。ベクター内に組み込むことのできる調節エレメントの例には、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターおよびポリアデニル化シグナルが含まれるがそれらに限定されない。このため本発明は、組換えＣＰをコードする核酸配列に機能的に連結した調節エレメントを含むベクターを提供する。当業者であれば、適切な調節エレメントの選択が遺伝子組換えＣＰを発現させるために選択された宿主細胞に依存すること、およびそのような調節エレメントは、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物もしくは昆虫の遺伝子を含む様々な起源から引き出せることを理解するだろう。
【０１０５】
本発明との関連において、発現ベクターは、発現したタンパク質の精製を促進する異種核酸配列を追加して含有することができ、そのような異種核酸配列は、ＣＰのカルボキシル末端またはアミノ末端で位置指定できる。そのような異種核酸配列の例には、親和性タグ、例えば金属親和性タグ、ヒスチジンタグ、アビジン／ストレプトアビジンコーディング配列、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コーディング配列およびビオチンコーディング配列が含まれるがそれらに限定されない。核酸の発現に対応するアミノ酸は、当該分野において公知の方法によって使用前に発現したＣＰから除去できる。または、異種核酸配列の発現に対応するアミノ酸は、その多量体化を妨害しなければＣＰ上で保持できる。
【０１０６】
本発明の一部の実施形態においてＣＰは、ヒスチジンタグ付きタンパク質として発現される。ヒスチジンタグは、ＣＰのカルボキシル末端またはアミノ末端で位置指定できる。所定の実施形態においてヒスチジンタグは、ＣＰのカルボキシル末端で位置指定される。
【０１０７】
発現ベクターは、当該分野において公知の様々な方法の１つによって適切な宿主細胞もしくは組織内に導入できる。そのような方法は、一般にＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｉｂｉｄ．）に見いだすことができ、例えば、組み換えウイルスベクターを用いた安定性もしくは一過性のトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が含まれる。当業者であれば、組換えＣＰを発現させるための適切な宿主細胞の選択は、選択されたベクターに依存することを理解できる。宿主細胞の例には、細菌、酵母、昆虫、植物および哺乳動物細胞が含まれるがそれらに限定されない。寸分違わない宿主細胞の使用は、本発明にとって重要ではない。組換えＣＰは、原核生物宿主（例、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、Ａ．サルモニシダ（Ａ．ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）もしくは枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））中、または真核生物宿主（例、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）もしくはピチア属（Ｐｉｃｈｉａ））、哺乳動物細胞、例、ＣＯＳ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３もしくはＨｅＬａ細胞、または昆虫細胞）内で生成できる。一実施形態において組換えＣＰは、原核細胞内で発現させられる。
【０１０８】
所望であれば、組換えＣＰは、当該分野において公知の標準技術によって宿主細胞から精製できる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｅｄ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ，ＮＹを参照）、および場合によりタンパク質の同一性を確認するために無傷タンパク質もしくはそのタンパク質分解性フラグメントいずれかを使用する標準ペプチドシーケンシング技術によってシーケンシングできる。
【０１０９】
ＶＬＰの製造
本発明との関連において有用なＰａｐＭＶ  ＣＰは、ＶＬＰに集合することができる。本発明の所定の実施形態において組換えＣＰは、ＣＰを発現する宿主細胞内でＶＬＰに集合することができる。ＶＬＰは、例えばＤｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６３：５９−６８、Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｖａｃｃｉｎｅ，２６、３３９５−３４０３およびＴｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＦＥＢＳ，２７３：１４−２５に記載の標準技術によって、宿主細胞から単離することができる。一般に、宿主細胞から入手した単離体は、ＣＰのＶＬＰ、ディスクおよび余り組織化されていない形態（例えば、単量体および二量体）の混合物を含有している。
【０１１０】
所定の実施形態においてＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、国際特許出願公開ＰＣＴ／ＣＡ２０１２／０５０２７９号明細書（ＷＯ２０１２／１５５２６２）に記載されたように、組換えＰａｐＭＶ  ＣＰ（主として、しかし排他的ではないがモノマー）の低分子量形を宿主細胞から単離し、ＣＰをｉｎ  ｖｉｔｒｏで集合させることによって製造することができる。本方法によると、組換えＣＰおよびｓｓＲＮＡは、重量で約１：１〜５０：１のタンパク質：ＲＮＡ比、約６．０〜約９．０のｐＨおよび約２℃〜約３７℃の温度で、ＶＬＰを集合させるのに十分な時間にわたって結合させられる。ＶＬＰは続いて、粒子からＲＮＡ突出部を除去するためにヌクレアーゼを用いて処理され、場合により他の工程成分から分離される。このｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、ＶＬＰに変換される約８０％までの組換えＣＰを提供できる。
【０１１１】
ＶＬＰは、最終ＶＬＰが同一のＣＰサブユニットを含むように、同一アミノ酸配列を有する複数の組換えＣＰから製造できる、またはＶＬＰは、最終ＶＬＰがそのＣＰサブユニット内に変異を含むように異なるアミノ酸配列を有する複数の組換えＣＰから製造できる。
【０１１２】
必要であれば、ＶＬＰは、実質的に純粋なＶＬＰ製剤を提供するために、例えば、超遠心法またはゲルろ過クロマトグラフィー（例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｇ−２００を使用する）によって他のＣＰ成分から分離できる。これに関連して「実質的に純粋」は、この製剤が７０％以上、例えば７５％以上、８０％以上、８５％以上、またはそれらの間の任意の量のＶＬＰを含有することを意味する。最終ワクチン組成物中では様々な形態のＣＰの混合物を使用できることが企図されているが、実質的に純粋なＶＬＰ製剤の使用が好ましい。
【０１１３】
所定の実施形態では、ＶＬＰおよびディスクの両方を含有する組換えＣＰの製剤が使用される。これらは、例えば透析および／または濃縮工程を用いて、または用いずにＶＬＰおよびディスクを含む発現組換えＣＰを利用する工程によって製造できる。
【０１１４】
ＶＬＰは、汚染宿主細胞タンパク質または他の化合物、例えばＬＰＳ（リポ多糖類）を除去するために、標準技術、例えばクロマトグラフィーによってさらに精製できる。本発明の一実施形態において、ＶＬＰを精製しＬＰＳを除去する。
【０１１５】
組換えコートタンパク質の特性解析
組換えＣＰは、それらがＶＬＰに自己集合する能力について、標準技術、例えば電子顕微鏡によって精製組換えタンパク質を視認する工程によって分析できる（例えば、本明細書に記載した実施例の項を参照）。ＶＬＰの形成は、超遠心法によっても決定することができ、所望であれば円二色性（ＣＤ）分光測光法を使用して組換えタンパク質の二次構造をＷＴウイルスと比較することができる。ＶＬＰのサイズは、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって評価できる。
【０１１６】
ＶＬＰの安定性は、所望であれば、当該分野において公知の技術によって、例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびプロテインキナーゼＫ分解分析によって決定できる。ＶＬＰの熱安定性は、例えば、ＣＤ分光測光法および／またはＤＬＳによって評価できる（実施例に記載）。
【０１１７】
本発明の所定の実施形態において組換えＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、高温で安定である。一部の実施形態において組換えＰａｐＭＶ  ＶＬＰは高温で安定であるので、室温で容易に保存できる。一部の実施形態において組換えＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって評価して、２５℃以上、例えば３０℃以上、３５℃以上または３７℃以上で安定である。
【０１１８】
組換えＰａｐＭＶ  ＣＰから形成されたＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、長いらせん配列のＣＰサブユニットを含んでいる。野生型ウイルスは、１２００超のＣＰサブユニットを含み、長さは約５００ｎｍである。しかし野生型ウイルスより短い、または長いＰａｐＭＶ  ＶＬＰどちらも有効な可能性がある。本発明の一実施形態において組換えＰａｐＭＶ  ＣＰから形成されたＶＬＰは、少なくとも４０ＣＰサブユニットを含んでいる。また別の実施形態では、組換えＰａｐＭＶ  ＣＰから形成されたＶＬＰは、約４０〜約１，６００ＣＰサブユニットを含んでいる。また別の実施形態では、組換えＰａｐＭＶ  ＣＰから形成されたＶＬＰは、長さが少なくとも４０ｎｍである。また別の実施形態では、ＶＬＰは長さが約４０ｎｍ〜６００ｎｍである。
【０１１９】
有効性の評価
組換えＰａｐＭＶ  ＣＰを含むＶＬＰが組換えＣＰによって構成される抗原ペプチドに対する免疫応答を誘導する有効性は、当該分野において公知の様々な標準のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ技術によって評価できる。
【０１２０】
例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のためには、実験動物（例えばマウス）の群に標準技術によってＶＬＰを接種することができる。非接種動物および／または抗原ペプチド、市販のワクチンまたは他の陽性コントロールを接種した動物を含むコントロール群を並行して構成する。次に接種前および接種後に動物から収集した血液サンプルを抗原に対する抗体応答について分析する。抗体応答の適切な試験には、ウエスタンブロット分析およびＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）が含まれるがそれらに限定されない。
【０１２１】
組換えＰａｐＭＶ  ＣＰを含むＶＬＰのワクチンとしての有効性を詳細に評価するため、チャレンジ（抗原投与）試験を実施できる。上述したように、およびワクチン接種後の適切な時点で、動物に重要な疾患誘発因子、例えばインフルエンザウイルスでチャレンジする。血液サンプルを収集して分析する。動物をさらに、体温、体重などを含む、感染に関連する他の状態の発生について監視する。所定の場合、例えばインフルエンザウイルスの所定の菌株を使用する場合、生存率も適切なマーカーである。感染の程度は、動物の犠死後に標準技術を使用して肺ウイルス力価を測定し評価することもできる。
【０１２２】
所望であれば、細胞免疫応答も当該分野において公知の技術（例えば、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ上で発現したエピトープのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの樹状細胞による特異的リンパ球へのプロセッシングおよび交差提示を通して）によって評価できる。細胞性免疫（Ｔリンパ球）の誘導を評価するための他の有用な技術には、例えばサイトカインの誘導を監視するためのＥＬＩＳＡによる、Ｔ細胞拡張およびＩＦＮ−γ分泌放出の監視が含まれる。
【０１２３】
医薬組成物およびワクチン製剤
本発明の所定の実施形態は、組換えＰａｐＭＶ  ＣＰを含むＶＬＰを１つ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤とともに含む医薬組成物に関する。所望であれば、本組成物中には他の有効成分、アジュバントおよび／または免疫増強剤を含めることができる。所定の実施形態において本医薬組成物は、ワクチン内に含めることができる、またはワクチンとして調製できる。
【０１２４】
本医薬組成物および／またはワクチンは、様々な経路による投与のために調製できる。例えば、本組成物は、経口、局所、直腸、鼻腔もしくは非経口投与のため、または吸入もしくはスプレーによる投与のために調製できる。本明細書で使用する用語「非経口」には、皮下注射、静脈内、筋肉内、気管内、胸骨内注射または注入技術が含まれる。被験者への鼻腔内投与には、本医薬組成物を被験者の鼻孔もしくは鼻腔の粘膜へ投与する工程が含まれる。所定の実施形態において本組成物は、非経口投与のため、または吸入もしくはスプレー、例えば鼻腔内経路による投与のために調製される。一部の実施形態において本組成物は、非経口投与のために調製される。
【０１２５】
本組成物は、好ましくは組換えＰａｐＭＶ  ＣＰを含む有効量のＶＬＰを含んでいる。本明細書で使用する用語「有効量」は、検出可能な免疫応答を誘導するために必要なＶＬＰの量を意味する。所定の適応のためのＶＬＰの有効量は、最初に、例えば、細胞培養アッセイもしくは動物モデル、通常は齧歯類、ウサギ、イヌ、ブタもしくは霊長類において推定できる。動物モデルを用いて、さらに適切な濃度範囲および投与経路を決定することができる。そのような情報を用いて、次にヒトを含む治療対象の動物に投与するために有用な用量および経路を決定することができる。本発明の一実施形態において単位用量は、約１０μｇ〜約１０ｍｇのタンパク質を含んでいる。また別の実施形態において単位用量は、約１０μｇ〜約５ｍｇのタンパク質を含んでいる。さらに別の実施形態において単位用量は、約４０μｇ〜約２ｍｇのタンパク質を含んでいる。動物を免疫するためには１つ以上の用量を使用することができ、これらは、同日に、または数日間もしくは数週間にわたって投与することができる。所定の実施形態では、保護作用を提供するためには、ワクチン組成物の単回投与で十分である。一部の実施形態では、適切な間隔での１回以上の追加のブースター接種もまた企図されている。
【０１２６】
経口使用のための組成物は、例えば、錠剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性もしくは油性懸濁剤、分散性粉末もしくは顆粒剤、エマルジョン硬質もしくは軟質カプセル、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤として調製できる。そのような組成物は、医薬組成物を製造する分野において公知の標準方法にしたがって製造することができ、薬学上の上品な口当たりがいい製剤を提供するために、甘味剤、矯味剤、着色剤および保存剤からなる群から選択される１つ以上の物質を含有していてよい。錠剤は、適切な非毒性の、例えば、不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムもしくはリン酸ナトリウム、造粒剤および崩壊剤、例えばコーンスターチもしくはアルギン酸、結合剤、例えばデンプン、ゼラチンもしくはアカシアおよび潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくはタルクを含む、薬学的に許容される賦形剤との混合物中にＶＬＰを含有している。錠剤は、コーティングしないままでよい、または錠剤は、消化管での崩壊および吸収を遅延させて長期間にわたって持続性作用を提供するために、公知の技術によってコーティングすることができる。例えば、時間遅延物質、例えばモノステアリン酸グリセリルもしくはジステアリン酸グリセリルを使用できる。
【０１２７】
鼻腔投与用組成物には、例えば、鼻スプレー、点鼻薬、懸濁剤、液剤、ゲル剤、軟膏剤、クリーム剤および散剤を含めることができる。本組成物は、適切な市販の鼻スプレー器具、例えばＡｃｃｕｓｐｒａｙ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社）での投与のために調製できる。鼻腔投与のための他の方法は、当該分野において公知である。
【０１２８】
水性懸濁剤として調製される組成物は、１つ以上の賦形剤との、例えば、懸濁化剤、例えばカルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロポリメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、トラガントゴムおよびアカシアゴム、分散剤もしくは湿潤剤、例えば天然ホスファチド、例えばレシチン、もしくは酸化アルキレンと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、または酸化エチレンと長鎖脂肪アルコールとの縮合生成物、例えば、７−デカエチレンオキシセタノール、または酸化エチレンと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルとの、縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、または酸化エチレンと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートとの混合物中にＶＬＰを含有している。水性懸濁剤は、さらに１つ以上の保存剤、例えば、エチル、もしくはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシ−ベンゾエート、１つ以上の着色剤、１つ以上の矯味剤または１つ以上の甘味剤、例えばスクロースもしくはサッカリンも含有していてよい。
【０１２９】
組成物は、ＶＬＰを植物油、例えば落花生油、オリーブ油、ゴマ油もしくはヤシ油中に、または鉱油、例えば流動パラフィン中に懸濁させることによって油性懸濁剤として調製できる。油性懸濁剤は、増粘剤、例えばミツロウ、固形パラフィンもしくはセチルアルコールを含有していてよい。これらの組成物は、酸化防止剤、例えばアスコルビン酸を添加することによって保存できる。
【０１３０】
本組成物は、続いて水を添加することにより水性懸濁剤を製造するために使用できる分散性粉末もしくは顆粒剤として調製することができる。そのような分散性粉末もしくは顆粒剤は、１つ以上の分散剤もしくは湿潤剤、懸濁化剤および／または保存剤との混合物中のＶＬＰを提供する。適切な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤は、上述のものによって例示される。
【０１３１】
本発明の組成物は、水中油型エマルジョンとして調製することもできる。油相は、植物油、例えばオリーブ油もしくは落花生油、または鉱油、例えば流動パラフィンであってよい、またはこれらの油の混合物であってよい。これらの組成物中に包含するのに適切な乳化剤には、天然ゴム、例えば、アカシアゴムもしくはトラガントゴム、天然ホスファチド、例えばダイズ、レシチン、またはエステルもしくは脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、および上記の部分エステルと酸化エチレンとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが含まれる。
【０１３２】
本組成物は、当該分野において公知の方法にしたがって、および適切な１つ以上の分散剤もしくは湿潤剤および／または例えば上記の懸濁剤を使用して、例えば無菌注射用水性もしくは油性懸濁剤として調製できる。この無菌注射用製剤は、非毒性の非経口用として許容される希釈剤もしくは溶媒中の、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液としての無菌注射溶液もしくは懸濁剤であってよい。使用可能な許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、乳酸加リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液が含まれるがそれらに限定されない。その他の例には、溶媒もしくは懸濁化媒質として便宜的に使用される無菌の不揮発性油および例えば合成モノグリセリドもしくはジグリセリドを含む様々なブランドの不揮発性油が含まれる。脂肪酸、例えばオレイン酸も注射可能物質の調製に使用できる。
【０１３３】
場合により、本発明の組成物は、保存剤、例えば抗菌物質、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガスおよび／または安定剤、例えば炭水化物（例、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコースもしくはデキストラン）、タンパク質（例、アルブミンもしくはカゼイン）またはタンパク質含有物質（例、ウシ血清もしくは脱脂乳）を適切なバッファー（例、リン酸塩バッファー）とともに含有していてよい。本組成物の様々な成分のｐＨおよび正確な濃度は、周知のパラメーターにしたがって調整できる。
【０１３４】
さらに、本組成物には、場合によりアジュバント活性を有する１つ以上の化合物を加えることができる。適切なアジュバントには、例えば、アラム（ミョウバン）アジュバント（例えば、水酸化、リン酸化もしくは酸化アルミニウム）、（例えば、Ｂａｙｏｌ  Ｆ（登録商標）もしくはＭａｒｃｏｌ５２（登録商標））の油エマルジョン、サポニン、もしくはビタミンＥ可溶化質が含まれる。ウィロソームは、アジュバント特性を有することが公知であり（Ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｓｏｍｅｓ，Ｇｌｕｃｋ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２：３９５−４００）、本発明に従い多量体と結び付けて使用できる。
【０１３５】
以前に証明されたように、ＰａｐＭＶおよびＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、アジュバント特性を有する。したがって、本発明の一実施形態において、本組成物はアジュバントとして追加のＰａｐＭＶもしくはＰａｐＭＶ  ＶＬＰを含むことができる。一部の実施形態においてＰａｐＭＶもしくはＰａｐＭＶ  ＶＬＰの使用は、ＰａｐＭＶもしくはＰａｐＭＶ  ＶＬＰが注射によって投与された場合に明白な局所毒性を誘発しないことが観察されている点で、市販のアジュバントより優れた利点を提供できる（例えば、国際公開第２００８／０５８３９６号パンフレットを参照）。
【０１３６】
他の医薬組成物および医薬組成物を製造する方法は当該分野において公知であり、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”（以前の“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”）、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２０００）に記載されている。
【０１３７】
投与および使用
組換えＰａｐＭＶ  ＣＰを含むＶＬＰの多数の投与および使用が、本発明によって企図されている。本発明の所定の実施形態は、インフルエンザウイルスに対して防御免疫応答を誘導するためのＶＬＰの使用に関する。インフルエンザ感染に対してＶＬＰを使用して被験者を免疫する方法も所定の実施形態において提供される。本発明の一部の実施形態は、インフルエンザに罹患するリスクを低下させるために被験者に予防投与するためのＶＬＰを含むワクチンに関する。
【０１３８】
そこで本発明の一部の実施形態は、ワクチンおよび／または医薬組成物を含む医薬品を製造するためのＶＬＰの使用に関する。
【０１３９】
本発明の所定の実施形態は、被験者におけるインフルエンザウイルスに対する体液性免疫応答を誘導するための組換えＣＰを含むＶＬＰの使用に関し、例えば一部の実施形態では、組換えＣＰは、Ｂ細胞エピトープを含み、被験者における体液性免疫応答を誘導するための使用に適した抗原ペプチドを含んでいる。
【０１４０】
一部の実施形態において組換えＣＰは、Ｔ細胞エピトープもしくはＣＴＬエピトープを含み、被験者における細胞性免疫応答を誘導するためのワクチンとして使用するのに適した抗原ペプチドを含んでいる。
【０１４１】
本発明の所定の実施形態は、インフルエンザウイルスの２つ以上の菌株に対する防御を提供するためのＶＬＰを含むワクチンに関する。
【０１４２】
本発明の所定の実施形態は、ヒトにおいて防御免疫応答を誘導するためのＶＬＰの使用に関する。本発明の一部の実施形態は、家庭内動物および家畜を含む非ヒト動物において防御免疫応答を誘導するためのＶＬＰの使用に関する。ＶＬＰについての投与レジメンは、任意の他の一般に容認されるワクチン接種プログラムと異なる必要はない。有効な免疫応答を誘導するのに十分な量のＶＬＰの単回投与を使用できる、または組換えＶＬＰの初期投与の他のレジメンとその後の適切な抗原単独もしくはＶＬＰをともに用いた１回または２回以上のブースティング投与を使用できる。同様に、適切な抗原単独もしくはＶＬＰのいずれかを用いたブースティングは、抗体力価が容認できる水準より低下すれば初期投与後の良好に行える時点に実施することができる。適切な投与レジメンは、当業者であれば容易に決定できる。
【０１４３】
医薬品パックおよびキット
本発明の一部の実施形態は、組換えＣＰを含むＶＬＰを含む医薬品パックもしくはキットに関する。１つ以上の組換えＣＰをコードする核酸を含むキットも提供される。キットの個々の成分は、別個の容器に包装される、およびそのような容器と関連付けられ、注意書は医薬品もしくは生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府官庁によって規定された様式であってよく、その注意書は、製造、使用または販売の規制官庁による承認を反映している。キットは、場合によりＶＬＰの使用もしくは投与レジメンの方法、または組換ＣＰをコードする核酸からのＶＬＰの製造について概説している取扱説明書もしくは指示書を含有していてよい。
【０１４４】
キットの１つ以上の成分が液剤、例えば水溶液または無菌水溶液として提供される場合は、容器手段は、それ自体が吸入器、シリンジ、ピペット、点眼器であってよい、または液剤を被験者に投与できる、またはキットの他の成分に適用して混合可能な他の同様の容器であってよい。
【０１４５】
キットの成分は、さらに乾燥形もしくは凍結乾燥形で提供することもでき、キットは追加して、凍結乾燥成分を再構成するために適切な溶剤を含有することができる。容器の数もしくはタイプとは無関係に、本発明のキットは、患者への組成物の投与を支援する器具をさらに含むことができる。そのような器具は、吸入器、鼻スプレー器具、シリンジ、ピペット、ピンセット、計量スプーン、点眼器もしくは類似の医学的に承認される送達ビヒクルであってよい。
【０１４６】
本明細書に記載した本発明をよりよく理解するために、以下に実施例を記載する。当然のことながら、これらの実施例は、本発明の具体的な実施形態を説明するためのものであり、決して本発明の範囲を制限することは意図されない。
【実施例】
【０１４７】
実施例の項では、ＰａｐＭＶ  ＣＰにおける様々な位置への抗原ペプチドの融合について記載する。これらの位置は、実施例の項では図１Ｃに示したＮ末端欠失配列（配列番号４）内の位置に基づいて言及する。（配列番号４を参照して）８、２９、８０、１１８、１３０、１５８および１８３位として言及した位置は、野生型配列［配列番号１、図１Ａ］の１２、３３、８４、１２２、１３４、１６２および１８７位各々に類似する。
【実施例１】
【０１４８】
インフルエンザＭ２ｅペプチドに融合した組換えＰａｐＭＶコートタンパク質の製造および評価
ＰａｐＭＶコートタンパク質（ＣＰ）がＣＰの様々な領域でＨＡ１１エピトープと融合した場合に発現する能力は、Ｒｉｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，７（２）：ｅ３１９２５）において調査され結果が報告された。ＰａｐＭＶ  ＣＰ［配列番号４］のアミノ酸８０の後またはアミノ酸１３０の後でのＨＡ１１ペプチドの融合は不安定なタンパク質をもたらし、ＨＡ１１ペプチドのアミノ酸２９、１１８もしくは１５８の後での融合は組換え融合タンパク質の産生をもたらしたが、これは低収率であった。しかしＰａｐＭＶ  ＣＰのアミノ酸８、１８３の後またはＣ末端でのＨＡ１１ペプチドの融合は、高収率で組換えＣＰの産生を生じさせた。これらの組換えタンパク質は、さらにまたＶＬＰに自己集合することができ、アミノ酸８の後にＨＡ１１融合を含むＶＬＰはマウスにおいてＨＡペプチドへの免疫応答を誘発した。
【０１４９】
ＰａｐＭＶ  ＣＰのＣ末端へのＭ２ｅペプチド（２８アミノ酸）の融合を有するＶＬＰは、以前に報告されており（Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：３３９５−３４０３）、Ｍ２ｅペプチドへの免疫応答とマウスにおけるインフルエンザ抗原投与に対するあるレベルの防御を誘発することが証明されたが、これはＰａｐＭＶ  ＶＬＰ（融合ペプチドを含んでいない）の添加によってさらに改良された。動的光散乱法（ＤＬＳ）によるＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅ−Ｃ  ＶＬＰの分析は、これらＶＬＰが３０℃超では不安定であることを証明し、これはこのペプチドのＣ末端での融合が最適ではないことを示唆している（Ｒｉｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｂｉｄ．を参照）。
【０１５０】
Ｍ２ｅペプチドを有するＰａｐＭＶ  ＶＬＰの安定性を増加させようと試み、Ｒｉｏｕｘ  ｉｅｔ  ａｌ．，（ｉｂｉｄ．）はさらにＣＰ［配列番号４］の８位の後に融合したＭ２ｅペプチド（ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳ、配列番号７）を含有する構築物を製造した。組換えＣＰは安定であるように見えたが、ＶＬＰに集合できなかった。
【０１５１】
より短いＭ２ｅペプチドの融合はＣＰの自己集合に小さな影響しか及ぼさず、安定性および免疫原性ＶＬＰの産生を可能にすると予測されている。この予測を調査するために、Ｍ２ｅペプチドの中心部分の融合を、特に配列ＥＶＥＴＰＩＲＮＥ［配列番号２１］およびＶＥＴＰＩＲＮ［配列番号２２］を使用して実施した。Ｍ２ｅ由来ペプチド（ＥＶＥＴＰＩＲＮＥ［配列番号２１］もしくはＶＥＴＰＩＲＮ［配列番号２２］）に融合したＰａｐＭＶコートタンパク質を含む１０個の構築物を調製した。８個の構築物（構築物＃１〜８）はコートタンパク質のＮ末端領域内に融合を含み、２個（構築物＃９および１０）はＣ末端領域内に融合を含んでいた（表２および図５を参照）。８個の構築物（構築物＃１〜６、９および１０）は、適切なサイズ、熱安定性およびＶＬＰ形成能力を示した（図６および７を参照）。免疫応答を起こす能力を評価するためにこれら８個の構築物をマウスに注射した。構築物＃９および１０を除いて、これらの構築物は、驚くべきことに、たった１回の免疫後に強度の体液性応答を生じさせることができた。これとは対照的に、構築物＃１にだけは第２回免疫後に抗体レベルの増加が観察された。これらの結果から、Ｍ２ｅペプチドについては、融合の配置およびペプチ土の長さが、構築物による免疫系の刺激に影響を及ぼすコートタンパク質内の構造的変化を惹起する可能性があると思われる。
【０１５２】
これらの結果は、構築物＃１が、最高の体液性応答を生じさせ、ユニバーサルインフルエンザワクチンＡに使用するための適切な候補になることを証明した。
【０１５３】
【表２】
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【０１５４】
方法：
これらの組換えタンパク質は、１ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導できるｐＥＴ３Ｄベクターを使用して大腸菌ＢＬ２１９ＤＥ３内で発現させた。この組換えタンパク質は、以前Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｖａｃｃｉｎｅ，２６、３３９５−３４０３に記載されたように精製した。タンパク質の発現は、２５℃で１６時間にわたり実施した。細菌ペレットは、Ｆｒｅｎｃｈプレスを用いて溶解させ、遠心（２０分間にわたり１０，０００ｇ）によって浄化し、Ｎｉ２＋カラム（ＩＭＡＣ社）上に装填した。結合組換えタンパク質は、５００ｍＭ〜１Ｍのイミダゾールを用いてＩＭＡＣカラムから溶出させた。洗剤（ＴＸ−１００（１〜２％）＋Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（１％））を使用してＬＰＳを除去した。溶出後、イミダゾールは１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８）中での透析によって除去した。ＰａｐＭＶ  ＶＬＰは透析後に１００，０００ｇで９０分間の超遠心によって回収した。ＶＬＰを含有するペレットは、１ｍｇ／ｍＬで１０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中に再懸濁させた。
【０１５５】
これらのタンパク質が正確に形成されたＶＬＰを有していたことを確証するために、温度がタンパク質の変性開始点に達すると露出される疎水性残基への染料（Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ）の結合によってタンパク質の部分成熟分裂を測定した。詳細分析に含めるためには、ＶＬＰは３７℃で安定である必要があった。幾つかの構築物は安定であることが見いだされたので、詳細な評価に含めた（図６）。電子顕微鏡検査による観察は、様々な構築物がロッド形構造であることを確証した（図７）。
【０１５６】
Ｍ２ｅペプチドに対する免疫応答は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて１回もしくは２回の免疫により、ＶＬＰを用いたマウスの筋肉内免疫によって評価した。体液性応答（全ＩｇＧおよびＩｇＧ２ａ）を第１４日（第１回免疫後）および第２８日（第２回免疫後）に監視した。
【０１５７】
結果：
構築物の評価結果は表７および図６〜８に示した。構築物＃１〜６の配列は図３に示した［配列番号２３〜２８］。
【０１５８】
図６は、構築物＃１、２、３、４、５および９が４０℃までは熱安定である、構築物＃６および１０は３８℃まで熱安定である、およびＰａｐＭＶ−Ｍ２ｅは３７℃まで熱安定であることを示している。構築物＃７および８は、各々３２℃〜３４℃で不安定になる。
【０１５９】
図７は、熱安定性構築物（＃１、２、３、４、５、６、９および１０）全てがＶＬＰを形成し、サイズおよび形状が類似していることを示している。
【０１６０】
図８は、構築物＃９および１０を除いて、これらの熱安定性構築物全てが、第１回の免疫後に強度の体液性応答を生じさせることができたことを示している。構築物＃１だけは、（Ａ）ＩｇＧ抗体のレベルが第２回免疫後に増加した。（Ｂ）抗体サブタイプＩｇＧ２ａのレベルの第２回免疫後の増加は大多数の群で観察された。
【０１６１】
考察：
ディスクを形成した構築物＃７を除いて、全構築物がＶＬＰを形成した。これは、コートタンパク質の構造を変化させ、それが多量体化してＶＬＰを形成する能力を妨害する可能性がある、Ｍ２ｅペプチド挿入の位置に起因する可能性が高い。
【０１６２】
融合ペプチドに対する免疫応答を誘導するために、注射されるタンパク質は動物の体内温度（３７℃−図６において赤色バーで表示）で熱安定性でなければならない。Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅを用いた反応は、蛍光の増加を測定することによってタンパク質が変性する時点の同定を可能にする。２つの構築物＃７および８だけが、標的温度に達する前に変性した。
【０１６３】
表２に示したＤＬＳによって得られた結果を確証するため、および粒子の形態を視認するため、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を入手した。全ての熱安定性構築物（＃１、２、３、４、５、６、９および１０）についてロッドが観察された（図７）。ロッド形ＶＬＰは、より免疫原性であるために望ましい。
【０１６４】
融合の各々の免疫原性を比較するために、各免疫の１４日後に収集した血清を使用してＭ２ｅペプチドに対してＥＬＩＳＡを実施した。予測された結果とは対照的に、構築物＃１を除いて、ＩｇＧ抗体のレベルは第２回免疫後に増加しなかった（図８Ａ）。第２回免疫後の抗体サブタイプＩｇＧ２ａのレベル上昇は大多数の群について観察された（図８Ｂ）。
【０１６５】
これらを結論付けると、構築物＃１〜６、９および１０は、全ての構造的選択基準を満たしたが、Ｍ２ｅエピトープ特異的免疫応答を誘導できたのは構築物＃１〜６だけであった。構築物＃１はＭ２ｅペプチドに対してより良好な体液性応答を生成したが、これは配列番号４の２位の後でのＭ２ｅペプチドの融合が誘発するコートタンパク質における構造的変化が小さいことを示唆した。これらの結果はさらに、構築物＃１において使用したような最長のエピトープＥＶＥＴＰＩＲＮＥ［配列番号２１］は、天然Ｍ２ｅ抗原に対してより強烈な抗体を産生することを示唆した。
【実施例２】
【０１６６】
サルモネラ菌ポーリン（ＳＡＬＭＯＮＥＬＬＡ  ＰＯＲＩＮ）抗原ペプチドに様々な位置で融合した組換えＰａｐＭＶ  ＣＰの生化学的および生物物理学的特性解析
組換えＣＰ融合タンパク質は、チフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）由来のＢ細胞エピトープ：ＯｍｐＣポーリン由来のｌｏｏｐ６ペプチド（ＧＴＳＮＧＳＮＰＳＴＳＹＧＦＡＮ［配列番号２９］）を用いて調製した。ｌｏｏｐ６エピトープは、細菌の表面上で露出したチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）（腸チフスの作用因子）の膜結合タンパク質であるＯｍｐＣポーリンに由来し、ポーリンを用いた免疫によって誘導される防御機序に含まれることが証明されている（Ｐａｎｉａｇｕａ−Ｓｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，１４：３１−６）。これらの領域はチフス菌ポーリン内にのみ存在するので、他のグラム陰性菌由来のポーリンとの交差反応性は見いだされていない。
【０１６７】
ＰａｐＭＶ  ＣＰの８位、１８３位またはＣ末端でｌｏｏｐ６ペプチドの融合を有するタンパク質を生成した（図９Ａを参照）。各融合をＰａｐＭＶ  ＣＰ  Ｌｏｏｐ６−８、ＰａｐＭＶ  ＣＰ  Ｌｏｏｐ６−１８３およびＰａｐＭＶ  ＣＰ  Ｌｏｏｐ６−Ｃと命名した。組換えタンパク質のクローニング、大腸菌内での発現、精製、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＶＬＰの単離およびＤＬＳ分析は、以下に記載のように実施した。
【０１６８】
ｌｏｏｐ６ペプチドは、ＰＣＲおよび以下の表３に示したオリゴヌクレオチドを用いてＰａｐＭＶ  ＣＰ遺伝子内の様々な位置で融合させた。手短には、ＣＰ変異体“ＰａｐＭＶ  ＣＰｓｍ”をコードするヌクレオチド配列を含有するプラスミドｐＥＴ−３ＤをＰＣＲ鋳型として使用した。ＰａｐＭＶ  ＣＰｓｍは５個のＮ末端アミノ酸の欠失を有し、Ｃ末端で６ｘＨｉｓタグを含んでいる。多数のクローニング部位が、結果としてこの位置で５つのアミノ酸（ＴＳＴＴＲ）（図１Ｄを参照、配列番号３）の添加を生じさせるＳｐｅＩおよびＭｌｕＩ制限部位を含めるために６ｘＨｉｓタグとＣ末端との間に含められる。
【０１６９】
表３に示したプライマー組み合わせの各々を使用して、融合を導入し、ＰａｐＭＶ  ＣＰｓｍ組換えタンパク質を含むプラスミド全体を含有するＰＣＲ産物を生成した。このＰＣＲ産物は、線状ｄｓＤＮＡ産物であり、これをさらに制限酵素Ａｃｃ６５１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ社、マサチューセッツ州イプスウィッチ）（表３において下線を付した）を用いてさらに消化した。この制限酵素は、加熱またはフェノール／クロロホルム抽出によって不活性化した。結果として生じた消化ＤＮＡは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用してセルフライゲートさせた。ライゲート産物は、新規の遺伝子組換えＰａｐＭＶ  ＣＰを含有する完全に有能なプラスミドを生じさせた。これらの配列は、ＤＮＡシーケンシングによって検証した。このプラスミドを使用して、タンパク質の発現および精製のために大腸菌株ＢＬ２１を形質転換させた。
【０１７０】
【表３】
2015514097.tif 000005
【０１７１】
ＰａｐＭＶ構築物の発現および精製は、小さな変更を加えて以前に記載されたように実施した（Ｔｒｅｍｂｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，ＦＥＢＳ，２７３：１４−２５）。手短には、細菌はＦｒｅｎｃｈプレスに通して溶解させ、次にＮｉ２＋カラム上に装填し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／５０ｍＭのイミダゾール／０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００（ｐＨ８）を用いて、次に１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／５０ｍＭイミダゾール／１％のＺｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ（ｐＨ８）を用いて洗浄しエンドトキシン汚染を除去した。タンパク質の溶出後、溶液は１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に対して、分子量が６〜８ｋＤａのカットオフ膜（Ｓｐｅｃｔｒａ社）を使用して１２〜１６時間透析した。透析したタンパク質をＢｅｃｋｍａｎ  ５０．２  ＴＩローター内で４５分間高速遠心（１００，０００ｘｇ）にかけた。ＶＬＰペレットをエンドトキシンフリーＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）中に再懸濁させた。タンパク質溶液は、使用前に０．２２〜０．４５μＭフィルターを用いてろ過した。タンパク質の純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。タンパク質の量は、ＢＣＡタンパク質キット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を使用して評価した。各組換えタンパク質の発現レベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定した。精製タンパク質中のＬＰＳ汚染は、リムルス（Ｌｉｍｕｌｕｓ）テストを製造業者の取扱説明書（Ｃａｍｂｒｅｘ社）にしたがって評価したが、組換えタンパク質では５ＥＵ／ｍｇ未満であった。
【０１７２】
ｌｏｏｐ  ６融合を含むＶＬＰのサイズおよび構造は、ＴＥＭ（ＪＥＯＬ−１０１０、日本国東京）上での観察によって確証した。動的光散乱法（ＤＬＳ）を使用してさらにＶＬＰの平均サイズを決定した。
【０１７３】
結果
結果は、図９に示した。図９Ｂは、組換えＰａｐＭＶ  ＣＰ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、レーン１は、誘導前の細菌の細菌溶解物を含有する。レーン２は、タンパク質ＰａｐＭＶ  Ｌｏｏｐ６−８の発現後の細菌の細菌溶解物を含有する。レーン３は、精製ＰａｐＭＶ  Ｌｏｏｐ６−８を含有する、レーン４は、誘導前の細菌の細菌溶解物を含有する。レーン５は、タンパク質ＰａｐＭＶ  Ｌｏｏｐ６−１８３の発現後の細菌の細菌溶解物を含有する。レーン６は、精製ＰａｐＭＶ  Ｌｏｏｐ６−１８３を含有する。レーン７は、誘導前の細菌の細菌溶解物を含有する。レーン８は、タンパク質ＰａｐＭＶ  Ｌｏｏｐ６−Ｃの発現後の細菌の細菌溶解物を含有する。レーン９は、精製ＰａｐＭＶ  Ｌｏｏｐ６−Ｃを含有する。全ての場合において、組換えタンパク質は大腸菌内で良好に発現し、Ｎｉ２＋カラム上の親和性クロマトグラフィーによって容易に精製された。
【０１７４】
図９Ｃは、ＰａｐＭＶ  Ｌｏｏｐ６−８、ＰａｐＭＶ  Ｌｏｏｐ６−１８３およびＰａｐＭＶ  Ｌｏｏｐ６−Ｃを各々含むＶＬＰの電子顕微鏡写真を示している。図９Ｄは、ＰａｐＭＶ  Ｌｏｏｐ６−８、ＰａｐＭＶ  Ｌｏｏｐ６−１８３およびＰａｐＭＶ  Ｌｏｏｐ６−Ｃを含むＶＬＰの動的光散乱法（ＤＬＳ）の結果を示しており、この結果は、ｌｏｏｐ  ６エピトープの融合を有している構築物全てについてＶＬＰの平均サイズがおよそ８０ｎｍであることを確証した。
【実施例３】
【０１７５】
組換えＰａｐＭＶ  ＣＰ−Ｌｏｏｐ６ペプチド融合が体液性免疫応答を誘導する能力
下記の実験は、実施例２に記載したＣＰ融合タンパク質を含むＰａｐＭＶ  ＶＬＰがマウスにおいて体液性応答を誘導する能力を評価するために実施した。
【０１７６】
手短には、ＰａｐＭＶ  ｌｏｏｐ６−Ｃ  ＶＬＰで免疫したマウス４匹を含む群を除いて、１群当たり５匹のマウスを実施例２に記載した各１００μｇの異なるＶＬＰで免疫した。
【０１７７】
第２８日に、マウスを出血させ、ｌｏｏｐ６合成ペプチドに融合したＧＳＴタンパク質を使用して標準ＥＬＩＳＡによって免疫応答を評価した。ＥＬＩＳＡは、抗ＰａｐＭＶ応答を評価するためにＰａｐＭＶ  ＶＬＰ（０．１μｇ／ｍＬ）に対して、および抗−ｌｏｏｐ６応答を評価するためにｌｏｏｐ６ペプチド（０．１μｇ／ｍＬ）に対して実施した。Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００８，Ｖａｃｃｉｎｅ，２６、３３９５−３４０３）に記載された一般方法にしたがった。
【０１７８】
結果
結果は図１０に示したが、ｌｏｏｐ−６融合を有するＰａｐＭＶプラットフォームが高度に免疫原性であることを確証している。ＰａｐＭＶ特異的全ＩｇＧの産生は、動物をＰａｐＭＶ  ＣＰｓｍ、ＰａｐＭＶ  ＣＰ  Ｌｏｏｐ６−８、ＰａｐＭＶ  ＣＰ  Ｌｏｏｐ６−１８３およびＰａｐＭＶ  ＣＰ  Ｌｏｏｐ６−Ｃのいずれかを含むＶＬＰで免疫した場合には誘発されたが（図１０Ａ）、プラットフォームに向けられたＩｇＧ２ａ力価は、ＰａｐＭＶ  ＣＰ  Ｌｏｏｐ６−１８３構築物については極めて低かった（図１０Ｂ）。ｌｏｏｐ−６ペプチドに向けた検出可能な全ＩｇＧ応答を誘導したのはＰａｐＭＶ  Ｌｏｏｐ−６−Ｃ  ＶＬＰだけであった（図１０Ｃ）。ｌｏｏｐ−６ペプチドに向けての検出可能なＩｇＧ２ａ応答を引き起こしたＶＬＰはなかった（図１０Ｄ）。全部のＶＬＰが高度に免疫原性であったので、ｌｏｏｐ６ペプチドのＣＰへの融合は、融合ペプチドに立てられた抗体が（ＥＬＩＳＡにおいて使用されるような）遊離ペプチドとは反応しないようにペプチドの構造に影響を及ぼせる可能性が高い。しかしＣ末端での融合は、ＰａｐＭＶ  Ｌｏｏｐ６−Ｃ  ＶＬＰで免疫したマウスの一部に由来するＩｇＧがＥＬＩＳＡにおける遊離ペプチドに結合できるほどにはペプチドの構造に影響を及ぼさないと思われた。ＰａｐＭＶ  Ｌｏｏｐ６−Ｃ  ＶＬＰで免疫したマウス全部が免疫応答を増加させることができた訳ではないので、そのような実験において頻回に観察される作用であるマウスの免疫レパートリーは、個体毎に異なる可能性が高い。
【実施例４】
【０１７９】
ＣＴＬエピトープに融合した組換えＰａｐＭＶコートタンパク質を含むＶＬＰの調製
下記の実験では、インフルエンザウイルスの高度に保存されたＮＰタンパク質に由来するＣＴＬエピトープに融合した組換えＰａｐＭＶ  ＣＰの調製を説明する。このペプチド（ＮＰ１４７−１５５とも呼ばれるＴＹＱＲＴＲＡＬＶ［配列番号３６］）は、マウスモデルにおけるインフルエンザによる感染に対する防御ＣＴＬ応答を誘導するために使用できるＢａｌｂ／ｃのＨ−２ｄ  ＣＴＬエピトープである（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７１：２７１５−２７２１、Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８１：２５３−１６０）。このためこのペプチドは、Ｂａｌｂ／ｃマウスモデルにおいてＰａｐＭＶ  ＶＬＰがＩＦＮ−γ細胞応答を誘導する能力を評価するために選択した。
【０１８０】
ＰａｐＭＶ  ＣＰの８位、１８３位またはＣ末端でのＮＰ  ＣＴＬペプチドの融合を有するタンパク質を生成した（各々、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−８、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１８３およびＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃ）。ＮＰペプチドは、ＰＣＲおよび以下の表４に示したオリゴヌクレオチドを用いてＰａｐＭＶ  ＣＰ遺伝子内の様々な位置で融合した。実施例２および３に概説したプロトコールをクローニング、大腸菌における発現、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、精製およびＶＬＰの産生に使用した。ディスクは、（Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３６３：５９−６８およびＤｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｖａｃｃｉｎｅ，２６、３３９５−３４０３に記載したように）高速超遠心法によってＶＬＰから分離した。
【０１８１】
【表４】
2015514097.tif 000006
【０１８２】
結果
結果は、図１１に示した。タンパク質のアミノ酸８位、１８３位の後およびＣ末端で挿入したＣＴＬエピトープを用いる３種の異なる組換えＰａｐＭＶ  ＣＰ融合を生成した（図１１Ａ）。ＣＴＬエピトープの両側では、図１１Ａに示したようにマウス抗原提示細胞（ＡＰＣｓ）内でのＣＴＬエピトープの適正なプロセッシングを保証するために、５個のフランキングアミノ酸（ＮＬＮＤＡ［配列番号４３］およびＲＴＧＭＤ［配列番号４４］）を加えた。
【０１８３】
図１１Ｂは、融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示し、レーン１は誘導前の細菌の細菌溶解物。レーン２はタンパク質ＰａｐＭＶ  ＮＰ−８の発現後の細菌の細菌溶解物。レーン３は精製ＰａｐＭＶ  ＮＰ−８。レーン４は誘導前の細菌の細菌溶解物。レーン５はタンパク質ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１８３の発現後の細菌の細菌溶解物。レーン６は精製ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１８３。レーン７は誘導前の細菌の細菌溶解物。レーン８はタンパク質ＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃの発現後の細菌の細菌溶解物。レーン９は精製ＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃを含有している。３つの構築物については高レベルの発現が観察され、遺伝子組み換えＰａｐＭＶ融合の全部がＶＬＰを形成することができた（図１１Ｃ）。各融合タンパク質によって形成されたディスクおよびＶＬＰのサイズをＤＬＳによって評価した（図１１Ｄ）。全ＶＬＰは、およそ９０ｎｍの予想平均長さを示した（例えば、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−８は８０ｎｍおよびＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃは８８ｎｍ）。ディスクは、全構築物についておよそ３０ｎｍの平均径を示した（例えば、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−８は２８ｎｍおよびＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃは３２ｎｍ）。
【実施例５】
【０１８４】
組換えＰａｐＭＶ  ＣＰ−ＮＰ融合を含むＶＬＰがＣＴＬ免疫応答を誘導する能力
ＰａｐＭＶ−ＮＰ構築物を用いる免疫スケジュール
５匹の６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社、マサチューセッツ州ウィルミントン）に腹腔内注射（ｉ．ｐ．）により１００μｇの組換えＰａｐＭＶ  ＣＰｓｍ、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−８、ＰａｐＭＶ−ＮＰ−１８３およびＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃを用いて２週間の間隔で３回免疫した。マウスは、同一融合を有するＶＬＰもしくはディスクのいずれかで免疫した。最終ブーストの２週間後、以下に記載するようにマウスを犠死させ、脾臓を切除し、脾細胞を単離した。
【０１８５】
ＥＬＩＳＰＯＴおよびＩＦＮ−γの分泌
脾細胞単離の前日、エタノール（７０％）処理ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ−ＩＰ不透明９６ウエルプレート（高タンパク質結合イモビリン−Ｐ膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、マサチューセッツ州ベッドフォード）を一晩かけて４℃で、マウスインターフェロン−γＥＬＩＳＰＯＴキット内で製造業者によって提案されるようにＤＰＢＳ（Ａｂｃａｍ社、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）中に希釈させた１００μＬ／ウエルの捕捉ＩＦＮ−γ抗体を用いてコーティングした（Ａｂｃａｍ社、米国マサチューセッツ州ケンブリッジ）。一晩のインキュベーション後、プレートを２００μＬのＰＢＳ／ウエルを用いて３回洗浄し、ＰＢＳ中の１００μＬ／ウエルの２％乾燥脱脂乳を用いて３７℃、５％のＣＯ２で２時間ブロックした。
【０１８６】
最終ブーストの２週間後、マウスを犠死させ、脾臓を無菌法で除去した。脾臓を培養培地中で細分化し、ホモジネートを１００μｍの細胞ストレーナーに通過させた。細胞を遠心し、赤血球を塩化アンモニウム−カリウム溶解バッファー（１５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、０．１ｍＭのＮａ２ＥＤＴＡ（ｐＨ７．２〜７．４））中での５分間の室温インキュベーションによって除去した。単離赤血球枯渇脾細胞をＰＢＳ中で２回洗浄し、培養培地（２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１ｍＭの２−メルカプトエタノール、１０％の熱不活化ウシ胎児血清、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補給したＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カナダ国））中で希釈した。２．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ウエルでの二重反復試験片を培養培地単独またはＮＰ１４７−１５５ペプチド（５μｇ／ｍＬ）いずれかを用いて再活性化し、３６時間にわたり５％のＣＯ２を含む３７℃で培養した。インキュベーションの終了時に、プレートは２００μＬ／ウエルのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１％）を用いて手作業で３回洗浄した。ＰＢＳ／ＢＳＡ（１％）中のビオチン化検出用抗マウスＩＦＮ−γ抗体を１００μＬ／ウエルで加え、プレートを９０にわたり３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。プレートはＰＢＳを用いて手作業で３回洗浄し、ＰＢＳ／ＢＳＡ（１％）中に希釈した１００μＬ／ウエルのストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ共役二次抗体を１時間にわたり３７℃、５％のＣＯ２で加えた。これらのプレートをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０（０．１％）で最後に３回洗浄した。スポットは、２〜１５分間にわたり各ウエル内に１００μＬの使用準備済みＢＣＩＰ／ＮＢＴバッファーを加えることによって視認した。スポットは、双眼顕微鏡下で計数した。特異的Ｔ細胞の前駆体頻度は、培地単独中のバックグラウンドスポット数をペプチドを用いて再活性化したウエル内で見られたスポット数から減じることによって決定した。
【０１８７】
結果
精製脾細胞によって分泌されたＩＦＮ−γのレベルは融合ペプチドに特異的なＣＤ８＋細胞毒性リンパ球の前駆体のレベルと比例するであろうから、ＩＦＮ−γ分泌の評価により、各組換えＶＬＰがＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて細胞免疫応答を誘導する能力を比較することができる。結果を図１２Ａに示した。この結果は、ＮＰ１４７−１５５ペプチドに融合した全ＰａｐＭＶ  ＶＬＰはＰａｐＭＶ  ＣＰ  ＶＬＰ単独より高いレベルでＩＦＮ−γの分泌を誘導することができたが、ＰａｐＭＶ  ＣＰ  ＶＬＰ単独より有意に高いＩＦＮ−γの分泌を誘発したのはＰａｐＭＶ  ＮＰ−１２  ＶＬＰだけであることを示している。驚くべきことに、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃ  ＶＬＰによって誘導されたＩＦＮ−γ分泌の量は、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃ  ＶＬＰを用いた３回の免疫後にワクチンプラットフォームに向けられた抗体の産生によって証明されたように、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃが免疫系に良好に提示された場合でさえＰａｐＭＶ  ＣＰ  ＶＬＰ単独によって誘導された分泌量と有意に相違しなかった。
【０１８８】
図１２Ｂに示したように、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１２  ＶＬＰに対して特異的な脾細胞によって分泌されたＩＦＮ−γのレベルはＰａｐＭＶ  ＮＰ−１２ディスクによって誘発されたレベルより有意に高かったが、これは、体液性および細胞性応答の両方に関して、免疫系の強い刺激のためにはＶＬＰへの自己集合が必要であることを示している。しかしディスクが低い応答を刺激する能力は、少量のディスクを含むＶＬＰを調製すればを依然として免疫応答を効果的に刺激できることを示唆している。
【実施例６】
【０１８９】
組換えＰａｐＭＶ  ＣＰ−ＮＰ融合を含むＶＬＰの安定性
動的光散乱法
動的光散乱法（ＤＬＳ）のため、ＶＬＰのサイズをＺｅｔａＳｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社、英国ウスターシア）を用いて１０℃の温度でＰＢＳ  １×中に希釈した０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で記録した。温度変動によって誘導されたＶＬＰサイズの変動は、同一実験条件下で１℃の温度増分で測定した。
【０１９０】
グルタルアルデヒドとの化学的架橋結合
最終量５０μＬ中１０ｍＭのＴｒｉｓ中の０．１％のグルタルアルデヒド、５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．５）を使用した。架橋に使用したタンパク質の最適濃度は１５０ｎｇ／ｍＬであった。グルタルアルデヒドの添加後、混合液を暗所にて室温で３０分間インキュベートした。この反応を１５μＬのローディングダイを用いて停止させ、９５℃で１０分間加熱し、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。免疫のために使用した架橋タンパク質は、ローディングダイを加えずに免疫時まで４℃で保存した。
【０１９１】
トリプシン消化
１０μｇのタンパク質は５０μＬの量で３７℃で１２０分間、０．２μｇのトリプシンを含む１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）（Ｒｏｃｈｅ社、１４１８４７５）中でインキュベートした。この反応は、１０μＬのローディングダイを添加して停止させた。サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の前に９５℃で１０分間加熱した。
【０１９２】
結果
ＤＬＳを使用してＰａｐＭＶ  ＮＰ−１２、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１８７、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−ＣおよびＰａｐＭＶ  ＣＰ  ＶＬＰの安定性を評価した（図１８Ａ）。ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１８７  ＶＬＰおよびＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃ  ＶＬＰはどちらも、マウスの体温（３６．９℃）より低い温度（各々、およそ２０℃および２５℃）で凝集し始めた。これとは対照的に、ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１２  ＶＬＰは、ＰａｐＭＶ  ＣＰ  ＶＬＰに類似するおよそ３７℃で凝集し始めた（図１８Ａ）。ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１２  ＶＬＰのより大きな安定性は、実施例５に示したようにそれらがＣＴＬ反応を刺激する能力と良好に相関する。
【０１９３】
グルタルアルデヒドを用いた組換えＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃ  ＶＬＰの架橋結合について、ＶＬＰを安定化させてそれらが免疫応答を刺激する能力を潜在的に増加させる方法として調査した。ＤＬＳを使用して架橋結合ＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃ  ＶＬＰの安定性を評価すると、これらのＶＬＰが３７℃で安定であることが証明された（図１８Ｂ）。
【０１９４】
架橋ＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃ  ＶＬＰ（１００μｇ）をさらに、コンパレーターとしての非架橋ＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃ  ＶＬＰおよびＰａｐＭＶ  ＣＰ  ＶＬＰ（各１００μｇ）でマウスを免疫した。特異的脾細胞によって分泌されたＩＦＮ−γのレベルは、実施例５に記載されたように測定した。架橋ＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃ  ＶＬＰは、ＮＰ１４７−１５５ペプチドを用いた脾細胞の刺激後に高レベルのＩＦＮ−γを誘導しなかったが（図１２Ｃ）、残留している特異的脾細胞によって分泌されたＩＦＮ−γの量は非架橋ＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃ  ＶＬＰを用いて得られた量に類似しており、これは十分な細胞性応答を刺激する能力をこの融合に付与するためには生理学的温度での安定性だけでは不十分であることを証明している。
【０１９５】
ＰａｐＭＶ  ＣＰ−ＮＰ融合のトリプシン消化を使用して、架橋結合が細胞プロテアーゼによるＮＰ１４７−１５５ペプチドの切断を阻害する可能性を調査した。図１８Ｃに示したように、未処理架橋ＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃ  ＶＬＰとトリプシンを用いて処理した架橋ＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃ  ＶＬＰとに差は観察されなかった（どちらのバンドも同一強度を有すると見なすことができる）。これは、トリプシンによって良好に消化されたＰａｐＭＶ  ＮＰ−１２およびＰａｐＭＶ  ＮＰ−Ｃ  ＶＬＰとは対照的である（図１８Ｃを参照）。
【０１９６】
これらの結果は、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰの架橋結合が、ペプチドを遮蔽することによって、および／またはプロテアーゼ切断が発生できないようにＶＬＰの剛性を増加させることによって、立体障害の細胞プロテアーゼによるＮＰ１４７−１５５ペプチドへの接近を生じさせることを指示している。
【実施例７】
【０１９７】
インフルエンザヌクレオカプシドペプチドの多数のコピーに融合した組換えＰａｐＭＶコートタンパク質の調製
この実験では、ＣＰ内の単独位置またはＣＰ内の相違する位置に挿入された２もしくは３ＣＴＬペプチドを有する組換えＰａｐＭＶコートタンパク質の調製および分析について記載する。この実験では、実施例４に記載したＮＰ１４７−１５５ペプチドを使用した。
【０１９８】
下記の構築物が生成した：
ＰａｐＭＶ  ３ＮＰ−Ｃ  −  Ｃ末端で挿入されたＮＰ  ＣＴＬペプチドの３つのコピーを備える。
ＰａｐＭＶ  ＮＰ−８／１８３  −  アミノ酸８の後で挿入された１つのＮＰ  ＣＴＬペプチドおよびアミノ酸１８３の後で挿入された１つを備える。
ＰａｐＭＶ  ＮＰ−８／Ｃ  −  アミノ酸８の後で挿入された１つのＮＰ  ＣＴＬペプチドおよびＣ末端で挿入された１つを備える。
ＰａｐＭＶ  ＮＰ−１８３／Ｃ  −  アミノ酸１８３の後で挿入された１つのＮＰ  ＣＴＬペプチドおよびＣ末端で挿入された１つを備える。
ＰａｐＭＶ  ３ＮＰ−８  −  アミノ酸８で挿入されたＮＰ  ＣＴＬペプチドの３つのコピーを備える。
ＰａｐＭＶ  ＮＰ−８／１８３／Ｃ（ＰａｐＭＶトリプルＮＰ）  −  アミノ酸８の後で挿入された１つのＮＰ  ＣＴＬペプチドおよびＣ末端で挿入された１つを備える。
【０１９９】
実施例２および３に概説したプロトコールをクローニング、大腸菌における発現、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析、精製およびＶＬＰの調製に使用した。ディスクは、高速超遠心法によってＶＬＰから分離した（Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，２００８，ｉｂｉｄ．）。
【０２００】
結果
挿入部位のアミノ酸配列は図１３Ａに示した。図１３Ｂは、これらの組み換えＰａｐＭＶ  ＣＰ融合の発現についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示している：レーン１：誘導前の細菌の細菌溶解物。レーン２：多重融合タンパク質ＰａｐＭＶ−ＮＰ８／１８３の発現後の細菌の細菌溶解物。レーン３：誘導前の細菌の細菌溶解物。レーン４：多重融合タンパク質ＰａｐＭＶ−ＮＰ８／Ｃの発現後の細菌の細菌溶解物。レーン５：誘導前の細菌の細菌溶解物。レーン６：タンパク質ＰａｐＭＶ−ＮＰ１８３／Ｃの発現後の細菌の細菌溶解物。レーン７：誘導前の細菌の細菌溶解物。レーン８：多重融合タンパク質ＰａｐＭＶ−トリプルＮＰの発現後の細菌の細菌溶解物。レーン９：誘導前の細菌の細菌溶解物。レーン１０：多重融合タンパク質ＰａｐＭＶ−３ＮＰ／８の発現後の細菌の細菌溶解物。レーン１１：誘導前の細菌の細菌溶解物。レーン１２：多重融合タンパク質ＰａｐＭＶ−３ＮＰ／Ｃの発現後の細菌の細菌溶解物。
【０２０１】
図１３Ｃは、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰ  ３ＮＰ−Ｃ、ＮＰ−８／１８３、ＮＰ−８／Ｃ、ＮＰ−８／ＣおよびトリプルＮＰの動的光散乱法（ＤＬＳ）分析を示している。各グラフ上にＶＬＰの平均長さを指示した。ＰａｐＭＶ  ＣＰは、ＤＬＳによって測定して長さが４０ｎｍを超えた場合にのみＶＬＰを形成すると考えられる。
【０２０２】
図１３ＢおよびＣは、構築物全部が大腸菌内で安定性タンパク質を生成でき、ＶＬＰに自己集合できたことを示している。これらの構築物によって生成されたＶＬＰを使用してマウスを免疫し、それらのＶＬＰが同一ペプチドの融合を１つしか有していないＰａｐＭＶ  ＶＬＰに比較してＮＰペプチドに対する免疫応答を改良する能力を評価することができる。
【０２０３】
図１７は、様々な構築物の（本質的には実施例３に記載したように実施した）ＶＬＰ（Ｖ）およびディスク（Ｄ）についてのＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果を示している。
【実施例８】
【０２０４】
ＰａｐＭＶコートタンパク質の表面が露出した領域のペプチドマッピング
ペプチド合成
ＰａｐＭＶ−ＣＰの全アミノ酸配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）によって短鎖ペプチドで合成し、これらをＨＰＬＣ精製を行わずに粗ペプチドとして使用した。これらのペプチドは、長さが１２アミノ酸となり、４アミノ酸ずつフランキングペプチドと重複するようにそれぞれ設計した（表５）。ペプチド８および１３中のシステインは、本実験において他の化合物によるスルファイド結合の干渉が発生する可能性を回避するためにセリンに変更した。システインを含有するペプチドについても試験し、結果は、これらがＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ）による干渉ペプチドを生成しないことを示していたので、ＨＰＬＣ精製を行わずに粗物質として使用した。ペプチドは長さが１２アミノ酸であり、各端で４アミノ酸ずつ重複しており、後続ペプチドおよび先行ペプチドを備える（表５）。ペプチド８および１３中のシステインは、本実験において他の化合物によるスルファイド結合の干渉が発生する可能性を回避するためにセリンに代えた。システインを含有するペプチドについても試験し、干渉を全く生成しないことが証明された。
【０２０５】
ＰａｐＭＶ  ＶＬＰの免疫および免疫ドットブロット
５匹の６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに１００μｇのＰａｐＭＶ  ＶＬＰを皮下注射した１９９。ブースターショット（追加抗原投与）は第１回注射の２週間後に実施し、血液サンプルはブーストの２週間後に入手した。ペプチドは、製造業者のプロトコールにしたがってＮｅｘｔｅｒｉｏｎ−ＥスライドＭＰＸ  １６（Ｓｃｈｏｔｔ社、米国ニューヨーク州エルムスフォード）上に２回ずつ適用した。次にスライドを室温で１時間にわたり、ＰＢＳ＋Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（０．０５％）＋ＢＳＡ（１％）を用いてブロックした。５匹の免疫マウスからのプール血清をアレイ上にブロッキングバッファー中の１：１００の希釈率で２回ずつ１時間室温で配置した。ペプチド抗体は、１時間１：８００の希釈率でＡｌｅｘａ−ｆｌｕｏｒ  ６４７抗マウスＩｇＧヤギ抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、米国カリフォルニア州カールスバッド）を用いて検出した。スライドは、室温で３分間ＰＢＳ−Ｔを用いて各工程間に３回洗浄した。ガラススライドは、ＳｃａｎＡｒｒａｙ  ４０００ＸＬ（ＧＳＩ  Ｌｕｍｏｎｉｃｓ社）を用いて読取り、ＧｅｎｅＰｉｘ  ６．１．０．４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて分析した。
【０２０６】
【表５】
2015514097.tif 000007
【０２０７】
結果
図１４は、免疫ドット分析の結果を示している。予想どおり、ＮおよびＣ末端に対応するペプチドは、ポリクローナル抗体によって検出した。さらに、ＰａｐＭＶポリクローナル抗体はペプチド１５、１６、１８、２２および２４に対応する５つの他の領域も（高親和性で）検出することができた。同一実験を単一マウスからの別個の血清を使用して実施すると本質的に同一の結果が得られたが、ペプチド１８、２２および２４について記録された信号の強度には変動が見られた。しかし、全マウスで一貫して、ペプチド１５および１６は強度の信号を生じさせた。
【実施例９】
【０２０８】
ＰａｐＭＶコートタンパク質の化学修飾した表面が露出した残基の分析
ＤＥＰＣおよびＥＤＣを用いた化学修飾
ＰａｐＭＶナノ粒子は、溶液中で所定のアミノ酸と選択的に相互作用する化学的で化学修飾した。カルボキシル基には１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いて、ならびにセリン、トレオニン、ヒスチジンおよびチロシンにはジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ）を用いた。どちらの反応も用量１００μＬ中の１ｍｇ／ｍＬのＰａｐＭＶ  ＶＬＰを用いて実施した。手短には、ＥＤＣ反応は、５０ｍＭの塩酸グリシンアミドバッファー（ｐＨ６．０）中で２．０ｍＭの濃度を得るためにＥＤＣを加える工程および室温で１時間にわたりこの反応液をインキュベートする工程によって実施した。ＤＥＰＣ反応は、５０ｍＭの酢酸アンモニウム＋１％アセトニトリル溶液中の０．４ｍＭのＤＥＰＣの濃度で３７℃にて１分間実施した。ＶＬＰは、ＤＥＰＣには５０ｍＭの酢酸アンモニウムおよびＥＤＣには１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を用いて０．５ｍＬのＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（１０ｋＤａ）ＭＷＣＯ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、米国マサチューセッツ州ビルリカ）中で１４，０００×ｇでの２回の遠心によって１５分間洗浄した。ＶＬＰの完全性は、電子顕微鏡および動的光散乱法によって検証した。消化および質量分析法実験は、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｑｕｅｂｅｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｃｅｎｔｅｒ（カナダ国ケベック州）のＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓプラットフォームによって実施した。
【０２０９】
電子顕微鏡および動的光散乱法
ＶＬＰを水中で０．０３ｍｇ／ｍＬの濃度へ希釈し、１０μＬのサンプルと１０μＬの３％のアセテートウラニルとを暗所で７分間混合し、その後にこの溶液８μＬをカーボン−ホルムバールグリッド上に５分間置いて染色した。グリッドは、ＪＥＯＬ−１０１０透過型電子顕微鏡（日本国東京）を用いて観察した。ＶＬＰのサイズは、ＺｅｔａＳｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ社、英国ウスターシア）を用いて４℃で、ＰＢＳ  １×中に希釈した０．１ｍｇ／ｍＬの濃度で記録した。
【０２１０】
トリプシンによるタンパク質消化
トリプシン消化は、製造業者の仕様書およびＳｈｅｖｃｈｅｎｋｏ  ｅｔ  ａｌ．のプロトコール（１９９６，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ６８：８５０−８５８）にしたがって、Ｈａｖｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．によって提案された修正（２００３，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７５：１３００−１３０６）を加えて、ＭａｓｓＰｒｅｐ液体取扱いロボット（Ｗａｔｅｒｓ社、米国ミルフォード）上で実施した。手短に言えば、タンパク質は１０ｍＭのＤＴＴで還元し、５５ｍＭのヨードアセトアミドを用いてアルキル化した。トリプシン消化は、１０５ｍＭの改質ブタトリプシン（シーケンシング等級、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）を使用して５８℃で１時間実施した。消化生成物は、１％ギ酸、２％アセトニトリル、その後に１％のギ酸、５０％のアセトニトリルを使用して抽出した。回収した抽出物をプールし、真空遠心乾燥させ、次に７μＬの０．１％のギ酸中に再懸濁した。２μＬを質量分析法によって分析した。
【０２１１】
修飾ＶＬＰの質量分析法
ペプチドサンプルはオンライン逆相（ＲＰ）ナノスケールのキャピラリー液体クロマトグラフィー（ｎａｎｏＬＣ）によって分離し、エレクトロスプレー質量分析法（ＥＳ  ＭＳ／ＭＳ）によって分析した。これらの実験は、ナノエレクトロスプレーイオン源（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、米国カリフォルニア州サンホセ）を装備したＬＴＱ線形イオントラップ質量分析計（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、米国カリフォルニア州サンホセ）に接続したＴｈｅｒｍｏ  Ｓｕｒｖｅｙｏｒ  ＭＳポンプを用いて実施した。ペプチド分離は、Ｊｕｐｉｔｅｒ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）５ｕ、３００Ａ  Ｃ１８、１０ｃｍ×０．０７５ｍｍ（内径）をパッキングしたセルフパック式ＰｉｃｏＦｒｉｔカラム（Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社、マサチューセッツ州ウォバーン）上で実施した。ペプチドは２〜５０％の溶媒Ｂ（アセトニトリル、０．１％のギ酸）からの線形勾配を用いて３０分間、２００ｎＬ／分（フロー・スプリッティングによって得た）で溶出した。質量スペクトルは、Ｘｃａｌｉｂｕｒソフトウエアバージョン２．０を使用してデータ依存性収集モードを用いて収集した。各フルスキャン質量スペクトル（４００〜２，０００ｍ／ｚ）は、７個の最強度イオンの衝突誘起解離法にしたがった。動的除外（３０秒間の排除時間）機能を有効にし、相対衝突破壊エネルギーは３５％に設定した。
【０２１２】
データベース検索
全ＭＳ／ＭＳサンプルは、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社、英国ロンドン２６５、バージョン３．１．２）を使用して分析した。Ｍａｓｃｏｔを設定して、消化酵素トリプシンを想定したＰａｐＭＶ−ＣＰアミノ酸配列を検索した。Ｍａｓｃｏｔは、フラグメントイオン質量公差０．５０Ｄａおよび親イオン公差２．０Ｄａを用いて検索した。システインのヨードアセトアミド誘導体を固定修飾として規定し、メチオニンの酸化は可変修飾と規定した。２つのミスセンス切断が許容された。
【０２１３】
修飾を同定するための基準
スカフォールド（３．２．０、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、オレゴン州ポートランド）を使用してＭＳ／ＭＳに基づくペプチドおよびタンパク質同定の妥当性を確認した。ペプチド同定は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｐｈｅｔアルゴリズム（Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７４：５３８３−５３９２）によって規定した９５．０％より高い確率で同定できた場合は容認された（Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ  ７４：５３８３−５３９２）。修飾は、ＥＤＣについて５６ＤａおよびＤＥＰＣについて７２Ｄａのペプチド質量におけるシフトで同定した。
【０２１４】
結果
実施例８に記載した免疫学的結果を確証するために、ＰａｐＭＶ  ＶＬＰは、表面が露出した残基で化学修飾し、質量分析法によって分析した。修飾ＶＬＰはさらに、一般的態様を保証するために電子顕微鏡およびＤＬＳによって分析し、長さは未処理ＶＬＰの長さに類似であった（図１５）。ＶＬＰは、次にトリプシンを用いて消化し、エレクトロスプレー質量分析法によって分析した。ＰａｐＭＶコートタンパク質のおよそ７０％のアミノ酸配列は、トリプシン消化後の修飾について分析することができた。ＥＤＣおよびＤＥＰＣによる修飾は、ペプチドの分子量に５６Ｄａおよび７２Ｄａを各々加えた。ＥＤＣ修飾は、ＭＳ／ＭＳスペクトル上に示したように、Ｄ１７位、Ｅ１２８位およびＥ２１５位で（図１９）ならびにＤＥＰＣ修飾はＳ１３５位およびＴ２１９位で見られた（図２０）。Ｎ末端およびＣ末端はどちらも化学修飾されたためＰａｐＭＶ  ＶＬＰの表面に位置することが確証された。興味深いことに、中央領域Ｅ１２８およびＳ１３５は、免疫ブロット法およびＭＳ／ＭＳによって確証されたようにＶＬＰの表面で露出していると思われた。
【０２１５】
免疫ブロットペプチドアレイは、ＶＬＰの表面をマッピングするためにはＭＳ／ＭＳ分析法より高感受性であると思われた。実際に、ＭＳ／ＭＳは、サンプル中で優勢であってこのため架橋結合に利用可能な修飾しか解明できない。表面で露出したＰａｐＭＶ  ＶＬＰの領域全部が、これら２つの技術を組み合わせた場合でさえ同定することができなかったが、これは免疫ブロット技術はアレイによって提示された線形エピトープとしか反応できないからであり、ＭＳ／ＭＳは、化学架橋結合を通した表面の標識化の効率によって制限され−この状況は良好で高感受性である分解能を得るために最適でなければならない。
【実施例１０】
【０２１６】
マウスの免疫によるＰａｐＭＶコートタンパク質の表面が露出した残基の確証
ｍｃＫＬＨアジュバントタンパク質へのペプチド結合、免疫およびＥＬＩＳＡ
ペプチドは、ｍｃＫＬＨ結合キットを使用してｍｃＫＬＨへ結合させた（Ｐｉｅｒｃｅ社、米国イリノイ州ロックフォード）。免疫は、ペプチド１、１３、１５、１６、１７、１８、２２、２４および２６に対して１０μｇのＱｕｉｌ−Ａサポニン（Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ社、デンマーク国）アジュバントとともに１００μｇの結合ｍｃＫＬＨを使用して、ブーストショット前に２週間の間隔で実施した。抗原として天然ＰａｐＭＶ  ＶＬＰを０．１μｇ／ｍＬで使用して他の箇所（Ｓａｖａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ６：ｅ２１５２２）に記載されたように天然タンパク質ＥＬＩＳＡによって分析するために第２８日にペプチド１つ当たりマウス２匹の血清を採取した。力価は、最適密度が免疫前血清より３倍高い場合に陽性と見なした。
【０２１７】
結果
抗体および化学修飾が標的とする残基（実施例８および９）がＰａｐＭＶ  ＶＬＰの表面上にあることをさらに確証するために、ペプチド１、１５、１６、１８、２２、２４および２６に対する抗体をｍｃＫＬＨアジュバントタンパク質への融合によって生成した。ペプチド１３および１７への融合も陰性コントロールとして生成した。表面上にあると予想される全ペプチドは、ペプチド１５を除いて、高い全ＩｇＧ力価によって確証された（表６）。２つのコントロールであるペプチド１３および１７は、予測どおり陰性であった。
【０２１８】
【表６】
2015514097.tif 000008
【０２１９】
本明細書で言及した、公表された特許出願を含む全ての特許、刊行物およびデータベース全体は、そのような個別の特許、刊行物およびデータベース記入事項各々が明示的および個別に参考として援用されると指示されているのと同程度完全に参考として援用される。
【０２２０】
本発明は、所定の特定実施形態を参照して記載してきたが、それらの様々な修正は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく当業者には明白であろう。当業者には明白であろうそのような修正の全ては以下の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
【図１】
2015514097.tif 000009
【図２−１】
2015514097.tif 000010
【図２−２】
2015514097.tif 000011
【図２−３】
2015514097.tif 000012
【図２−４】
2015514097.tif 000013
【図２−５】
2015514097.tif 000014
【図２−６】
2015514097.tif 000015
【図３】
2015514097.tif 000016
【図４】
2015514097.tif 000017
【図５】
2015514097.tif 000018
【図６】
2015514097.tif 000019
【図７】
2015514097.tif 000020
【図８】
2015514097.tif 000021
【図９】
2015514097.tif 000022
【図１０】
2015514097.tif 000023
【図１１】
2015514097.tif 000024
【図１２】
2015514097.tif 000025
【図１３】
2015514097.tif 000026
【図１４】
2015514097.tif 000027
【図１５】
2015514097.tif 000028
【図１６】
2015514097.tif 000029
【図１７】
2015514097.tif 000030
【図１８】
2015514097.tif 000031
【図１９】
2015514097.tif 000032
【図２０】
2015514097.tif 000033
【配列表】
2015514097000001.app
【国際調査報告】
2015514097.tif 000034
2015514097.tif 000035
2015514097.tif 000036