(57)【要約】  本発明は、Ｃ４物質、好ましくは酪酸及び／又はブタノールを製造するための方法に関し、当該製造方法は、水性媒体中に酢酸産生バクテリア細胞を含有する水性媒体を合成ガスと接触させる工程、及び工程ａ）で得られる混合物を０〜１００℃の温度で少なくとも３０分間インキュベートする工程を有し、前記水性媒体は工程ｂ）において、エタノール及び／又はアセテートを合計濃度で少なくとも０．１ｇＬ-1有する。
2015508659.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃ４物質、好ましくは酪酸及び／又はブタノールの製造方法であって、以下の工程ａ）及びｂ）：
ａ）酢酸産生バクテリア細胞を、水性媒体中で嫌気性条件下、かつ好ましくは炭水化物の不在下で、合成ガスと接触させる工程、及び
ｂ）前記工程ａ）で得られた混合物を、０〜１００℃の温度で少なくとも３０分間、インキュベートする工程
を有し、
前記水性媒体は、前記工程ｂ）において、エタノール及び／又はアセテートを合計濃度で少なくとも０．１ｇＬ-1含有する、前記製造方法。
【請求項２】
前記エタノール及び／又はアセテートが、外因性で製造されたエタノール及び／又はアセテートである、請求項１に記載の製造方法。
【請求項３】
前記エタノール及び／又はアセテートの合計濃度が、０．５ｇ〜２０ｇＬ-1である、請求項１又は２に記載の製造方法。
【請求項４】
前記合成ガスが、ＣＯを４０〜１００％、好ましくは４０〜９５％含有する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項５】
前記合成ガスが、ＣＯ2を１０％未満で含有する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項６】
前記合成ガスが、ＣＯを１０％未満で含有する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項７】
ｃ）前記工程ｂ）後の混合物から、エタノール及び／又はアセテートを分離し、任意で前記エタノール及び／又はアセテートを再利用する工程、
を有する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項８】
前記酢酸生成バクテリア細胞が、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、モレーラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）、及びカルボキシテルムス（Ｃａｒｂｏｘｙｔｈｅｒｍｕｓ）を含む群から選択され、好ましくはクロストリジウム・カルボキシジボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ）である、請求項１から７までのいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項９】
前記工程ａ）及びｂ）におけるｐＨを、３〜７、好ましくは４〜６、より好ましくは５〜５．５に維持する、請求項１から８までのいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記工程ｂ）を、１５〜４５℃、好ましくは３０〜４０℃の温度で行う、請求項１から９までのいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１１】
前記合成ガスが、前記工程ａ）に当初存在する炭素の８０％超、好ましくは９０％超をもたらす、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１２】
前記工程を連続法で行う、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１３】
前記工程ｂ）を、炭水化物の不在下で行う、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の製造方法。
【請求項１４】
嫌気性条件下、水性媒体中で酢酸産生バクテリア細胞によりＣ４物質に、好ましくは酪酸及び／又はブタノールに変換される合成ガスの割合を増加させるための、エタノール及び／又はアセテートの使用。
【請求項１５】
前記エタノール及び／又はアセテートが、外因性で製造されたエタノール及び／又はアセテートであり、好ましくは、前記細胞により内因性で製造されたエタノール及び／又はアセテートの検出可能量が蓄積される前に、水性媒体に添加される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記アセテート及び／又はエタノールが、酢酸産生バクテリア細胞を含有する水性媒体中に、合計濃度で０．５〜５ｇＬ-1存在する、請求項１４又は１５に記載の使用。
【請求項１７】
前記酢酸産生バクテリア細胞が、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、モレーラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）、及びカルボキシテルムス（Ｃａｒｂｏｘｙｔｈｅｒｍｕｓ）を含む群から選択され、好ましくはクロストリジウム・カルボキシジボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ）である、請求項１４から１６までのいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ４物質、好ましくは酪酸及び／又はブタノールの製造方法に関し、当該製造方法は、酢酸産生バクテリア細胞を水性媒体中で、合成ガスと接触させる工程、及び工程ａ）で得られる混合物を、０〜１００℃の温度で、少なくとも３０分間インキュベートする工程を有し、ここで前記水性媒体は、工程ｂ）においてエタノール及び／又はアセテートを合計濃度で少なくとも０．１ｇＬ-1含有する。
【０００２】
再生できない化石燃料の時代は、終わりを告げようとしている。化学者達が現在に至るまで石炭、石油、及び天然ガスの供給に実質的には制限されること無く依存可能であった一方、バクテリア、プランクトン、植物性や動物性の物質が海洋に何百万年もの間堆積することによって形成されるこのような資源の利用は、非常に近い将来に制限されることになるだろう。さらに化石燃料の燃焼は、大気中のＣＯ2濃度の増加、及びそれに伴う気候変動と関連しており、最も顕著なのは地球温暖化である。従って、従来は化石資源から誘導されてきたバルクケミカル（例えばブタノール、酪酸、及びこれらの誘導体）を製造するための次世代の方法を、再生可能資源（すなわち、地質時代的な観点で容易かつ迅速に補給できる材料）で始めなければならない。
【０００３】
工業的な生化学、すなわち生体触媒（例えば酵素）、又は触媒成分の有機体を工業用触媒として適用することにより、化石資源を原料として用いる慣用の多くのプロセスに対する代替手段が得られる。生体触媒は、再生可能原料（これはしばしば、再生しなければ廃棄せざるを得ない農業廃棄物、又は工業廃棄物である）から製造される化合物を変換可能なだけではなく、また毒性のある化合物を用いる必要が無く、さらには、従来の方法に比べて、温室効果ガス放出量を低減させることができる。
【０００４】
ブタノール（ＣＨ3−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＨ2−ＯＨ）、及び酪酸（ＣＨ3−ＣＨ2−ＣＨ2−ＣＯＯＨ、ブチレートとも言われる）、及びこれらのＣ４誘導体を製造するための方法は、従来技術において多数報告されているが、これらのほとんどは、化石燃料の接触分解（クラッキング）と、こうして得られる低級炭化水素の酸化に依存している。これとは対照的に、一酸化炭素若しくは二酸化炭素の形態、排出ガスから得られる化合物の形態、及び合成ガスの形態で、炭素から開始する方法は、ほとんど記載されていない。
【０００５】
合成ガス（水及び水素の少なくとも一方と、一酸化炭素及び二酸化炭素の少なくとも一方とを含有する様々な混合物を言う）は、炭素の再生可能資源であり、既に世界中で利用可能である。その製造方法としては、様々な開始材料を用いたものが知られており、例えば天然ガス若しくは液状炭化水素の水蒸気改質、及び石炭若しくはバイオマスのガス化がある。
【０００６】
炭素鎖を有する化合物を製造するために合成ガスを用いることは、従来技術で報告されている。しかしながらこれまでに記載された方法は、さらなる基質（特に炭水化物、例えばグルコース）の添加に依存している。炭素源としての合成ガスを微生物により消費させることに基づく方法はむしろ、所望の化合物の収率が不充分になる。
【０００７】
従って本発明の課題は、好ましくは合成ガス形態の、一酸化炭素若しくは二酸化炭素から出発して、Ｃ４物質（好ましくはブタノール及び／又は酪酸）を製造するための方法を提供することである。
【０００８】
本発明のさらなる課題は、一酸化炭素若しくは二酸化炭素から出発して、Ｃ４物質（好ましくはブタノール及び／又は酪酸）を製造するための方法を提供することであって、当該方法は、従来技術の方法に比べて、形成されるブタノール及び／又は酪酸の収率及び／又は純度の点で向上しているか、又は合成ガス由来の炭素原子から製造されたＣ４物質（好ましくはブタノール及び／又は酪酸）の割合の点で、他の炭素源、特に炭水化物（例えばグルコース）よりも、向上している。
【０００９】
本発明のさらなる課題は、合成ガスから出発してＣ４物質を製造するための方法を提供することであって、この方法ではＣ４生成物の収率が、一酸化炭素及び二酸化炭素以外の炭素含有反応物質に比べて改善されている、つまり、合成に必要となる、一酸化炭素と二酸化炭素以外の炭素化合物の量が減少している。
【００１０】
第一の態様において本発明の課題は、以下の工程を有するＣ４物質、好ましくは酪酸及び／又はブタノールの製造方法によって解決される：
ａ）酢酸産生バクテリア細胞を、水性媒体中で嫌気性条件下、合成ガスと接触させる工程、
ｂ）前記工程ａ）で得られる混合物を、０〜１００℃の温度で少なくとも３０分間、インキュベートする工程、
ここで前記水性媒体は、前記工程ｂ）において、エタノール及び／又はアセテートを合計濃度で０．１ｇＬ-1超、含有する。
【００１１】
本発明の第一の態様の第一の実施形態において前記課題は、前記エタノール及び／又はアセテートが、外因性で製造されたエタノール及び／又はアセテートである方法によって解決される。
【００１２】
本発明の第一の態様の第二の実施形態（これは第一の態様の第一の実施形態の１形態でもある）において前記課題は、前記エタノール及び／又はアセテートの合計濃度が、０．５ｇＬ-1〜２０ｇＬ-1である方法によって解決される。
【００１３】
第一の態様の第三の実施形態（これは第一の態様の第一〜第二の実施形態の１形態でもある）において前記課題は、合成ガスがＣＯを４０〜１００％、好ましくは４０〜９５％含有する方法によって解決される。
【００１４】
第一の態様の第四の実施形態（これは第一の態様の第一〜第三の実施形態の１形態でもある）において前記課題は、合成ガスがＣＯ2を１０％未満しか含有しない方法によって解決される。
【００１５】
第一の態様の第五の実施形態（これは第一の態様の第一〜第四の実施形態の１形態でもある）において前記課題は、合成ガスがＣＯを１０％未満しか含有しない方法によって解決される。
【００１６】
第一の態様の第六の実施形態（これは第一の態様の第一〜第五の実施形態の１形態でもある）において前記課題は、前記方法が以下の工程ｃ）：
ｃ）前記工程ｂ）後の混合物から、エタノール及び／又はアセテートを分離し、任意で、前記エタノール及び／又はアセテートを再利用する工程
を有することによって解決される。
【００１７】
第一の態様の第七の実施形態（これは第一の態様の第一〜第六の実施形態の１形態でもある）において前記課題は、前記酢酸生成バクテリア細胞が、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、モレーラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）、及びカルボキシテルムス（Ｃａｒｂｏｘｙｔｈｅｒｍｕｓ）を含む群から選択される方法、好ましくはクロストリジウム・カルボキシジボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ）である方法によって解決される。
【００１８】
第一の態様の第八の実施形態（これは第一の態様の第一〜第七の実施形態の１形態でもある）において前記課題は、前記工程ａ）及びｂ）におけるｐＨが、３〜７、好ましくは４〜６、より好ましくは５〜５．５に維持される方法によって解決される。
【００１９】
第一の態様の第九の実施形態（これは第一の態様の第一〜第八の実施形態の１形態でもある）において前記課題は、前記工程ｂ）を、１５〜４５℃、好ましくは３０〜４０℃の温度で実施する方法によって解決される。
【００２０】
第一の態様の第十の実施形態（これは第一の態様の第一〜第九の実施形態の１形態でもある）において前記課題は、前記合成ガスが、前記工程ａ）に当初存在する炭素の８０％超、好ましくは９０％超をもたらす方法によって解決される。
【００２１】
第一の態様の第十一の実施形態（これは第一の態様の第一〜第十の実施形態の１形態でもある）において前記課題は、前記工程を連続法で行う方法によって解決される。
【００２２】
第一の態様の第十二の実施形態（これは第一の態様の第一〜第十一の実施形態の１形態でもある）において前記課題は、前記工程ｂ）を炭水化物不在下で行う方法によって解決される。
【００２３】
本発明の課題は、第二の態様において、酢酸産生バクテリア細胞によってＣ４物質（好ましくは酪酸及び／又はブタノール）に変換される合成ガスの割合を増加させるために、エタノール及び／又はアセテートを使用することによって解決される。
【００２４】
第二の態様の第一の実施形態において前記課題は、エタノール及び／又はアセテートが、外因性で製造されたエタノール及び／又はアセテートであり、好ましくは、前記エタノール及び／又はアセテートが、前記細胞により内因性で製造されたエタノール及び／又はアセテートの検出可能量が蓄積される前に、酢酸産生バクテリア細胞を含有する水性媒体に添加される使用によって解決される。
【００２５】
第二の態様の第二の実施形態（これは第二の態様の第一の実施形態の１形態でもある）において前記課題は、アセテート及び／又はエタノールが、前記酢酸産生バクテリア細胞を含有する水性媒体中に、エタノール及び／又はアセテートの合計濃度で０．５ｇＬ-1超、ただし２０ｇＬ-1以下で存在する使用によって解決される。
【００２６】
第二の態様の第三の態様（これは第二の態様の第一〜第二の実施形態の１形態でもある）において前記課題は、前記酢酸生成バクテリア細胞が、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、モレーラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）、及びカルボキシテルムス（Ｃａｒｂｏｘｙｔｈｅｒｍｕｓ）を含む群から選択される方法、好ましくはクロストリジウム・カルボキシジボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｉｄｉｖｏｒａｎｓ）である使用によって解決される。
【００２７】
特定の理論と結びつけるつもりはないが、本発明の発明者らは、エタノール又はアセテートが存在することにより、合成ガスをＣ４物質（好ましくはブタノール及び／又は酪酸）に変換するために必要な遺伝子の発現が誘発され、これにより合成ガスに含まれる一酸化炭素と二酸化炭素を代謝するための、酢酸産生バクテリア細胞の能力が向上するとの仮説を立てている。
【００２８】
本発明は、酢酸産生バクテリア細胞を用いた、Ｃ４物質（好ましくはブタノール及び／又は酪酸）の製造に焦点を当てる。好ましい態様において「酢酸産生バクテリア細胞」とは、本発明に関する限り、嫌気性条件下で（好ましくは水素を電子供与体として用い、かつ二酸化炭素を電子受容体として用いて、又は二酸化炭素の代わりに、一酸化炭素を用いて）、アセテートを生産可能なバクテリア細胞又は古細菌細胞である。多くの酢酸産生バクテリアが、従来技術に開示されているが、これらに制限されることはない：クロストリジウム・アセティクム（Clostridium aceticum）；Wieringa, K.T. (1936), J. Microbiol. Serol. 3, 263-273、アセトバクテリウム・ウッディ（Acetobacterium woodi）；Balch, W. E., Schobert, S., Tanner, R. S., and Wolfe, R. S. (1977), Int. J. Sys. Bacteriol. 27, 335-361、クロストリジウム・テルマセティクム（Clostridium thermaceticum）；Fontaine, F. E, Peterson, W. H., McCoy, E. and Johnson, M. J. (1942), J. Bact. 43, 701 -715、クロストリジウム・リュングダーリイ（Clostridium ljungdahlii）；WO0068407、クロストリジウム・アウトエタノゲヌム（Clostridium autoetanogenum）；Aribini et al., Archives of Microbiology 161 , 345-351、モレーラ（Moorella）sp. HUC22-1；Sakai et al., Biotechnology Letters 29, 1697-1612、及びカルボキシドテルムス属（Carboxydothermus）；Svetlichny et al. (1991), Systematic and Applied Microbiology 14, 254-260のものである。これらの酢酸産生バクテリア細胞、及びその他のものは市販で手に入り、例えばAmerican Tissue and Culture Collection社（ＡＴＴＣ、米国）、又はDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ドイツ連邦共和国、Braunschweig在）から得られる。本発明の範囲には、酢酸産生バクテリア細胞を少なくとも２種含有する混合培養体も含まれる。
【００２９】
好ましい態様において「Ｃ４物質」とは、本発明に関する限り、全部で４個の炭素原子を有するあらゆる有機化合物であり、これは炭素以外の原子を含有する官能基とのあらゆる組み合わせであってもよい。より好ましい態様において「Ｃ４物質」とは、本発明に関する限り、ブタノール又はブチレートから作成されるあらゆる誘導体である。最も好ましい態様において前記誘導体は、最終的な炭素原子の付加又は除去以外のあらゆる誘導を包含する、ブタノール、又はブチレート、又はこれらの誘導体への誘導によって得られる。これに含まれるのは、酸化、特にヒドロキシル化、還元、メチル転移であるが、これらに限られることはなく、ここで「最終的な炭素原子付加又は除去」とは、炭素原子の一時的な付加又は除去（例えばＣ４物質又は誘導体を、一時的に酵素若しくはその補助要素につなぐこと）を排除するものではない。Ｃ４物質の例に含まれるのは、１−ブタノール（本願では「ブタノール」と呼ぶ）、２−ブタノール、ブチレート、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジオール、アミノブタン、チオブタノール、イソブテノール、及びイソブタノールである。
【００３０】
本発明は、野生型の酢酸産生バクテリア細胞と、遺伝子変異型酢酸産生バクテリア細胞の両方を使用することを考慮している。好ましい態様において、遺伝子変性型酢酸産生バクテリア細胞は、Wood-Ljungdahl経路（すなわち、一酸化炭素、二酸化炭素、及び水素を酢酸に変換する経路）に関連する少なくとも１つの酵素の活性を変異させた酢酸産生バクテリア細胞である。好ましい態様において「Wood-Ljungdahl経路に関連する酵素」には、本発明に関する限り、基質がアセテート若しくはその誘導体へと変換されるにつれて、前記経路の基質の１つ（好ましくは一酸化炭素、二酸化炭素、又は水素）、又はこれらのあらゆる基質から出発する経路内で形成されるあらゆる中間体を、基質に結合する、好ましくは基質として受容する、あらゆる酵素が含まれる。別の好ましい態様において、本発明に関する限り、「Wood-Ljungdahl経路に関連する酵素」とは、ＣＯ脱水素酵素、及びアセチルＣｏＡ合成酵素の群から選択される酵素をいう（Diekert and Wohlfahrt, (1994) Antonie van Leeuwenhoek 66 (1-3), 209-221）。バクテリア細胞の遺伝子を変異させるために一般的に使用される技術は、従来技術に開示されており（例えばSambrook et al. Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press）、バクテリア細胞における酵素活性を増加させるための方法としては例えば、染色体遺伝子の増幅により、対象となる活性を有する酵素をコードする遺伝子の発現を増大させることが開示されている（WO 03/014330、及びWO 03/040373）。好ましい態様において、酢酸産生バクテリア細胞は、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Clostridium carboxidivorans）、クロストリジウム・ドラケイ（Clostridium drakei）、及びクロストリジウム・リュングダーリイ（Clostridium ljungdahlii）を含む群から選択する。
【００３１】
嫌気性条件下で方法を行うことが、重要である。好ましい態様において「嫌気性条件」とは、本発明に関する限り、対象となる溶液中の酸素飽和度が、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２．５％未満、又は１％未満であり（少ない方がより好ましい）、ここで１００％の飽和度とは、同等の条件下で（例えば２０℃で大気圧下）溶液を純粋な酸素ガスとともに広範に撒布した場合に存在する酸素の濃度を表す。気体に関して「嫌気性条件下」とは、本発明に関する限り、好ましい態様において、ガスが全体積に対して、酸素を３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、２．５％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、０．０１％未満含有することを意味する（少ない方がより好ましい）。別の好ましい態様において、「嫌気性条件」とは、本発明に関する限り、ガス混合物中、又は溶液中における酸素の濃度が、嫌気性酢酸産生バクテリア（好ましくはクロストリジウム・カルボキシジボランス）の成長を妨げない程度であることを表す。当業者であれば、反応槽及び溶液を嫌気性にするために使用できる技術に精通しており、例えば気密な容器及び溶液を、窒素、アルゴンなどでガス洗浄するか、又は水溶液に酸素を消費する酵素系（例えばβ−Ｄ−グルコース０．６％（ｗ／ｖ）、グルコースオキシダーゼ（Sigma社製）０．５単位ｍｌ-1、及びカタラーゼ（Sigma社製）２００単位ｍｌ-1）を補う（Richter, C. D. et al. (2002), J. Biol. Chem. 277 (5), 3094-3100）。
【００３２】
合成ガスは、本発明によるＣ４物質（好ましくはブタノール及び／又は酪酸）の製造にとって主要な炭素源である。好ましい態様において「合成ガス」とは、本発明に関する限り、水と水素（Ｈ2）の少なくとも一方と、一酸化炭素（ＣＯ）と二酸化炭素（ＣＯ2）の少なくとも一方とを含有する混合物であり、ここで水、水素、一酸化炭素、及び二酸化炭素の合計体積が、前記混合物の全体積の少なくとも８０％、好ましくは９０％である。さらなる成分には、窒素、希ガスなどが含まれる。好ましい態様において合成ガスは、一酸化炭素を４０〜９５％含有する。好ましい態様において合成ガスは、二酸化炭素を４０〜１００％、好ましくは４０〜９５％、Ｈ2を０．５〜２０％含有する。別の好ましい態様において、合成ガスは二酸化炭素を１０％未満しか含有しない。別の好ましい態様において、合成ガスは一酸化炭素を１０％未満しか含有しない。別の好ましい態様において、合成ガスは一酸化炭素を少なくとも５％、好ましくは１０％含有する。別の好ましい態様において、水素と二酸化炭素の合計体積は、前記混合物の全体積の５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、又は９９％超である（多い方がより好ましい）。好ましい態様において、本発明に関する限り、微生物を本願特定のあらゆる組成の「合成ガス」と「接触させる」とは、微生物が、特定の組成の合成ガスから成る雰囲気中に存在するということである。
【００３３】
本発明の方法によれば、酢酸産生バクテリア細胞は、水性媒体中、酸素の不在下で合成ガスと接触させる。好ましい態様において、「水性媒体」という用語には、酢酸産生バクテリア細胞を成長又は維持するため、及び酢酸生成を維持するために必要な量の塩と緩衝液を含有する、あらゆる水溶液が含まれる。例えば、Hurst, K. M., and Lewis, R. (2010)に記載の水性媒体、及びBiochemical Engineering Journal 2010, 48, 159-165に記載の水性媒体は、本発明の教示を実施するために使用できる。好ましい態様において水性媒体は、酵母抽出物を含有する。
【００３４】
本発明の重要な態様は、エタノール（ＣＨ3ＣＨ2−ＯＨ）及び／又はアセテート（ＣＨ3−ＣＯＯ-）が、合計濃度で反応の開始当初から水性媒体中に存在することであり、それはすなわち、アセテートカチオンの濃度とエタノールカチオンとの合計が、少なくとも０．１ｇＬ-1であるということである。別の好ましい態様において、エタノール及び／又はエタノールの濃度は、０．１〜５０、０．２〜４０、０．２５〜２０、又は０．５〜２０ｇＬ-1である。
【００３５】
細胞が内因性でアセテートを産生するのを待つよりはむしろ、外因性で製造されたアセテート及び／又はエタノールが、工程ａ）において当初から水性媒体中に存在するのが好ましい。好ましい態様において、「外因性で製造された」アセテート及び／又はエタノールという記載は、本発明に関する限り、酢酸産生バクテリア細胞に接触させる前に、別の反応槽で製造又は精製されたエタノールのアセテートを意味し、これは工程ｂ）で（すなわち工程ａ）の後に）製造されたアセテート及び／又はエタノールとは対照的である。好ましい態様において、「外因性に製造された」アセテート及び／又はエタノールという言葉には、酢酸産生バクテリア細胞によって、又は同じ酢酸産生バクテリア細胞において工程ａ）で用いられるのと同じように製造されるアセテート及び／又はエタノールが含まれるが、これは反応槽から取り出されたものであり、また製造され、再利用されたあらゆるＣ４物質から分離されたものである。好ましい態様において、外因性に製造されたアセテート及び／又はエタノールの濃度は、水性媒体中において、工程ｂ）における酢酸産生バクテリア細胞によって触媒される反応が続く限り、初期に存在した値、又は初期に存在した値の範囲が維持される。好ましい態様において、水性媒体中におけるアセテート及び／又はエタノールは全体で、水性媒体中に存在する全てのアセテート及び／又はエタノールの８０％超、好ましくは９０％超が、外因性で製造されたアセテート及び／又はエタノールとして考慮されれば、外因性とみなされる。
【００３６】
工程ａ）で得られる混合物は、少なくとも０．５時間、１時間、２時間、３時間、５時間、１０時間、１２時間、１６時間、２４時間、３６時間、４８時間、１２０時間、又は１６０時間、インキュベートすることができる。好ましい態様において還元剤は、工程ｂ）に存在する。当業者は還元剤に精通しており、それは例えばチオール含有剤（例えばシステイン、又はジチオナイト）である。初期濃度は少なくとも、０．１ｍＭ、０．５ｍＮ、１ｍＭ、２ｍＭ、５ｍＭ、又は１０ｍＭであり得る。
【００３７】
前記方法が、後続の工程ｂ）の後に、混合物からエタノール及び／又はアセテートを再利用する工程を有することが好ましい。好ましい態様においてこれは、工程ｂ）からの反応混合物の一部が除去され、その中に含まれるアセテート及び／又はエタノールが、形成されるあらゆるＣ４物質から分離され、その後、このようにして得られたアセテート及び／又はエタノールを、再度反応混合物に移行させることを意味する。反応混合物の一部は、工程ｂ）においてバッチ法で、又は好ましくは連続法で除去することができる。連続法の場合、除去された反応混合物は、分離工程の前に、連続的に回収することができる。
【００３８】
当業者は、水溶液中に存在するあらゆるブタノール及び／又は酪酸から、アセテート及び／又はエタノールを分離するために使用可能な方法に精通しており、それは例えば、疎水性の有機溶媒を用いた抽出、蒸留などである。
【００３９】
本願で言及するあらゆる有機化合物（例えばＣ４物質、アセテート、エタノール、ブチレート、及びブタノール）は、目的とする化合物のプロトン化形態も、前記化合物の様々な塩も、ともに含有する。例えばアセテートは、酢酸（ＣＨ3−ＣＯＯＨ）も、また様々な酢酸塩も（例えば酢酸ナトリウム（ＣＨ3−ＣＯＯ-Ｎａ+）、酢酸カリウム（ＣＨ3−ＣＯＯ-Ｋ+）酢酸アンモニウム（ＣＨ3−ＣＯＯ-ＮＨ4+）など）ともに含有することができる。
【００４０】
本発明の好ましい態様において、本発明は連続法で行い、ここで工程ａ）及びｂ）を実施するために使用される槽からの水溶液を連続的に除去し、Ｃ４物質（好ましくはブタノール及び／又は酪酸）を増加させたフラクションと、アセテート及び／又はエタノールを増加させた別のフラクションとに分離し、前記別のフラクションを、工程ａ）及びｂ）を実施するために使用する槽に添加する。
【００４１】
工程ａ）及びｂ）における温度については、酢酸産生バクテリア細胞の必要性と、一方でまた、動熱力学的なパラメータの必要性とを考慮して選択する必要がある。従来技術には、広範な酢酸産生バクテリアについて最適な温度が教示されている。例えば、クロストリジウム・テルモアセティクムは、最大６０℃の温度でインキュベートすることができる（Fontaine et al., 1942）。酢酸産生バクテリア細胞及び古細菌を成長させるために使用可能な温度については、微生物学の標準的な教科書を参照されたい（例えばDworkin et al. (2006), The Prokaryotes - A Handbook on the Biology of Bacteria, Volume 2）。好ましい態様において、工程ｂ）で適用される温度は、０〜１００℃、１０〜８０℃、２０〜６０℃、及び３０〜４５℃である。好ましい態様において適用される合成ガスの圧力は、０．５〜１０ｂａｒ、より好ましくは０．８〜８ｂａｒ、さらに好ましくは１．５〜６ｂａｒである。別の好ましい態様において、前記圧力は１ｂａｒ超、１．５ｂａｒ超、２ｂａｒ超、３ｂａｒ超、４ｂａｒ超、５ｂａｒ超、６ｂａｒ超、７ｂａｒ超、８ｂａｒ超、９ｂａｒ超、１０ｂａｒ超である。好ましい態様において、適用される前記圧力は、大気圧を上回る。好ましい態様において「ゲージ圧」という単位は、本発明に関連する限り、局所的な大気圧又は周辺圧力に対する圧力を言う。例えば、局所的な大気圧が１ｂａｒであり、かつ槽内部の圧力が１．８ｂａｒである場合、ゲージ圧は、０．８ｂａｒとなる（gauge pressure）。
【００４２】
本発明の特別な利点は、Ｃ４物質（好ましくはブタノール及び／又は酪酸）の形成が、２個超の炭素鎖を有する有機化合物の有意な存在量に依存しないことである。好ましい態様において、工程ａ）及びｂ）は炭水化物の不在下で実施するが、必ずしも炭水化物の不在下で行わなければならないわけではない。好ましい態様において、「炭水化物の不在下」という用語は、炭水化物の濃度が、質量／体積で５％未満、１％未満、０．５％未満、０．１％未満、又は０．０５％未満である（少ない方がより好ましい）。好ましい態様において、「炭水化物」という用語には、ヒドロキシ基、アルデヒド基、又はケト基を含む群から選択される官能基であって、５個以上の炭素原子の炭素直鎖を有する前記官能基を少なくとも２個有する、あらゆる有機化合物が包含される。例示的な炭水化物には、ヘキソース（例えばグルコース若しくはフルクトース）、ペントース（例えばリブロース）、及び炭水化物モノマーを２個以上有する糖錯体（例えばスクロース）が含まれる。
【００４３】
同様に合成ガスは、工程ａ）の当初において、炭素の７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、又は９５％超を供給するのが好ましい（多い方がより好ましい）。好ましい態様において、「合成ガスを、工程ａ）に当初存在する炭素のＸ％超供給する」という記載は、本発明に関する限り、反応槽に存在する炭素原子のＸ％超が、一酸化炭素分子又は二酸化炭素分子における炭素原子であることを意味する。例えば、二酸化炭素が９モル、メタンが１モル未満、及び若干の水素が存在し、１個以上の炭素原子を有する他の化合物が存在しない場合、合成ガスは炭素原子の９０％超を供給することになる。
【００４４】
この方法は、バッチ法で行うことができる。この場合、「混合物を少なくともＸ分インキュベートする」という記載は、本発明に関する限り、好ましい態様において、酢酸産生バクテリア細胞のバッチをＸ分間、特定の条件下（例えば水性媒体の存在、酢酸産生バクテリア細胞と接触する合成ガスの存在、温度調整、エタノール及び／又はアセテートの存在など）に保つことを意味する。代替的に、この方法を連続法で行うことができる。この場合、「混合物を少なくともＸ分インキュベートする」という記載は、本発明に関する限り、好ましい態様において、槽内で、又は特定条件下で、反応体の分子（例えば水素分子）によって、消費される平均時間がＸ分であるということである。例えば、気密な容器が水素を１０リットル有し、水素を１分あたり１リットルの流速で添加し、この容器は、水素分子が入口に近い方から容器を去ると仮定するように構成されている場合、費やされる平均時間（すなわち、水素分子を、容器内に設定された条件下でインキュベートするために費やされる時間）は、１０分間である。
【００４５】
大規模なプロセスが意図されている場合、本発明による教示を、連続的に実施するのが有利であり得る。好ましい態様において、「連続法」という言葉は、本発明に関する限り、基質を連続的にバイオリアクター内に供給する工程、及びバイオリアクターから生成物を含有する媒体を除去する工程を有する方法を言う。連続法はさらに、栄養を一定に供給する工程を有することができる。バイオリアクター内の細胞は成長することができ、代替的には、栄養を細胞が定常期に達する程度に制限することができる。これはすなわち、成長は栄養の欠如によって制限されるが、細胞は代謝的には活性であり続け、合成ガスのような基質を変換し続けるということである。好ましい態様において、「定常期」という言葉は、本発明に関する限り、このような期にある細胞が、代謝的には活性であるが、実質的に増殖しないということである。
【００４６】
本発明は、嫌気性条件下が維持可能なあらゆる種類の容器を用いて、実施することができる。小規模で行う場合、低酸素又は酸素不含の環境をもたらす気密なグローブが使用できる。大規模の場合、大容量の合成ガス発酵槽が、より現実的であろう。好ましい態様では、反応混合物を常に撹拌して、細胞、栄養、基質、及び生成物が、水性媒体全体に均一に分散されているようにする。
【００４７】
従来技術の分析手段により、バイオリアクターにおける多くの化合物を常にモニタリングすることができ、例えば反応混合物から定期的に試料を採取し、その試料をＨＰＬＣ分析にかける。重要なパラメータ（例えばｐＨ、及び基質と生成物の濃度）は、必要があればオンラインで調整できる。好ましい態様において、常に監視下にある少なくとも１種のエタノール及びブタノールの濃度、並びにその水準は、使用される酢酸産生バクテリア細胞の成長及び触媒活性に適合した濃度に調整する。
【００４８】
本発明をさらに、以下の図及び非制限的な実施例によって説明するが、これらから本発明のさらなる特徴、態様、実施形態、及び利点を読み取ることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】例１で得られる炭素含量に関する培養開始と培養終了時の生成物濃度の差違を示す。「ｍｍｏｌＣ／ｌ」という単位は、１リットルあたりの炭素量（ｍｍｏｌ）のことである。
【図２】例２で得られる炭素含量に関する培養開始と培養終了時の生成物濃度の差違を示す。「ｍｍｏｌＣ／ｌ」という単位は、１リットルあたりの炭素量（ｍｍｏｌ）のことである。
【図３】クロストリジウム・ドラケイ株を用いた例３で得られる炭素含量に関する培養開始と培養終了時の生成物量を示す。
【図４】クロストリジウム・リュングダーリイ株を用いた例３で得られる炭素含量に関する培養開始と培養終了時の生成物濃度の差違を示す。
【００５０】
例１：エタノールの不在下又は存在下での、酪酸の製造
クロストリジウム・カルボキシジボランスDSMZ 15243前培養体を、Hurst, K. M., and Lewis, R. (2010), Biochemical Engineering Journal 2010, 48, 159-165に従って変性されたＰＥＴＣを２００ｍＬ含有する、ブチルゴム隔膜で封止された１Ｌの嫌気性ビン内で成長させたのだが、前記ＰＥＴＣは、酵母抽出物１ｇ、及びＭＥＳ１９ｇ、無機塩溶液３０ｍＬ、微量元素溶液１０ｍＬ、及びビタミン溶液１０ｍＬから構成されたものである。前記無機塩溶液は１リットルあたり、ＮａＣｌを８０ｇ、塩化アンモニウムを１００ｇ、塩化カリウムを１０ｇ、モノリン酸カリウムを１０ｇ、硫酸マグネシウムを２０ｇ、そして塩化カルシウムを４ｇ含有する。前記ビタミン溶液は１リットルあたり、ピリドキシン０．０１ｇ、チアミン０．００５ｇ、リボフラビン０．００５ｇ、パントテン酸カルシウム０．００５ｇ、チオクト酸０．００５ｇ、ｐ−アミノ安息香酸０．００５ｇ、ニコチン酸０．００５ｇ、ビタミンＢ１２  ０．００５ｇ、葉酸０．００２ｇ、及びＭＥＳＮＡ０．０１ｇから成る。前記微量元素溶液は１リットルあたり、ニトリロ酢酸２ｇ、ＭｎＳＯ4１ｇ、硫酸アンモニウム鉄０．８ｇ、塩化コバルト０．２ｇ、硫酸亜鉛０．２ｇ、塩化銅（ＩＩ）０．０２ｇ、塩化ニッケル０．０２ｇ、モリブデン酸ナトシウム０．０２ｇ、Ｎａ2ＳｅＯ4０．０２ｇ、Ｎａ2ＷＯ4０．０２ｇから成る。ＰＨは、５．９に調整した。
【００５１】
播種する前に培地を２０分間煮沸し、続いて２０分間、純粋な窒素で洗浄した。引き続き、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理し、それから冷却し、そして１ｂａｒのゲージ圧でＣＯを５０％、Ｈ2を４５％、ＣＯ2を５％含有するプロセスガスで充填した。続いて、この圧力を０．８ｂａｒのゲージ圧に調整した。
【００５２】
また播種の前に、硫酸ナトリウムとシステイン塩酸塩とをそれぞれ４％含有する溶液１．５ｍＬを還元剤として、滅菌した嫌気性条件下で添加した。
【００５３】
この培養体を３７℃、１００ｒｐｍで成長させた。この培養体は７２時間ごとに、新しい培地に移した。
【００５４】
この実験のために同じ方法で、ＣＯを９５％、ＣＯ2を５％含有するプロセスガスを用いて、培地を作製した。さらに、１リットル当たり０．６ｇのエタノールを、滅菌した嫌気性条件下、フラスコの半分まで添加した。
【００５５】
この溶液は、滅菌された嫌気性条件下、接種材料の１０体積％を用いて、４８時間の培養体から接種した。フラスコを３７℃で、１００ｒｐｍで１６０時間振った。乾燥したバイオマスと生成物濃縮体を、実験の最初と最後で測定した。
【００５６】
酢酸、エタノール、酪酸、及びブタノールの濃度は、ＨＰＬＣによって測定した。固定相として、aminex HPX-87Hカラムを用いた。硫酸５ｍＭを溶離液として、０．６ｍＬ／分という一定の流速で使用した。カラムの温度は４０℃だった。エタノールとブタノールは、屈折指数検知器を用いて検知した。ダイオードアレイ検知器は２１０ｎｍの波長で、酢酸と酪酸を検知するために使用した。化合物の濃度は、規定濃度における各化合物の較正グラフを用いてピークの積分により算出した。
【００５７】
図１は、炭素含量に関する培養開始と培養終了時の生成物濃度の差違を示す。
【００５８】
エタノールが存在する場合、酢酸が１０５ｍｍｏｌＣ／Ｌ形成され、エタノールが存在しない場合に形成される酢酸は、９７．１７ｍｍｏｌＣ／Ｌであった。エタノールが存在する場合、酪酸は２２．０６ｍｍｏｌＣ／Ｌ形成され、エタノールが存在しない場合に形成される酪酸は、１３．５７ｍｍｏｌＣ／Ｌであった（等量の乾燥バイオマス、具体的には４８０ｍｇ／Ｌを用いた場合）。
【００５９】
要約：エタノールの添加によって、形成される酪酸の量が大きく増加する。
【００６０】
例２：アセテートの不在下又は存在下での、酪酸の製造
実験プロトコルは例１で記載した通りだが、例１と異なるのは、エタノール０．６ｇ／Ｌの代わりに、酢酸２ｇ／Ｌをフラスコの半分まで添加したこと、また一酸化炭素を５０％、水素を５０％含有する合成ガスをバッチとして使用したことである。
【００６１】
図２は、炭素含量に関する培養開始と培養終了時の生成物濃度の差違を示す。アセテートが存在する場合、酪酸が４２．１３ｍｍｏｌＣ／Ｌ形成されたのだが、アセテートが存在しない場合、形成された酪酸は２６．４３ｍｍｏｌＣ／Ｌであった。
【００６２】
要約：アセテートの添加によっても、形成される酪酸の量が増加する。
【００６３】
例３：別種の株とガス混合物を用いた、酢酸又はエタノールの存在下での、酪酸の製造
使用した培地と溶液：
【表１】
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【００６４】
物質をビタミン及び微量元素と混合し、その体積を脱塩水（ＶＥ水）を用いて調節した。続いてｐＨ値をＮａＯＨ溶液で６．０に調整し、この培地を煮沸し、耐圧性のガラス瓶（１Ｌ）に移した。引き続き、この媒体を氷上で冷却し、Ｎ2で洗浄して残留酸素を除去した。
【００６５】
続いて、培地をオートクレーブ処理した。それから還元剤をこの培地に添加し、その体積を嫌気性の脱塩水で調節した。還元剤を個別に滅菌し、嫌気性条件下で貯蔵した。
【表２】
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【００６６】
物質、ビタミン、及び微量元素を混合し、その体積を脱塩水（ＶＥ水）で調整した。続いてｐＨ値をＮａＯＨ溶液で６．０に調整し、この培地を煮沸し、耐圧性のガラス瓶（１Ｌ）に移した。引き続き、この培地を氷上で冷却し、Ｎ2で洗浄して残留酸素を除去した。
【００６７】
続いて、培地をオートクレーブ処理した。それから還元剤をこの培地に添加し、その体積を嫌気性の脱塩水で調節した。還元剤を個別に滅菌し、嫌気性条件下で貯蔵した。
【表３】
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【００６８】
物質、ビタミン、及び微量元素を混合し、その体積を脱塩水（ＶＥ水）で調整した。続いてｐＨ値をＮａＯＨ溶液で６．０に調整し、この培地を煮沸し、耐圧性のガラス瓶（１Ｌ）に移した。引き続き、この培地を氷上で冷却し、Ｎ2で洗浄して残留酸素を除去した。
【００６９】
続いて、培地をオートクレーブ処理した。それから還元剤をこの培地に添加し、その体積を嫌気性の脱塩水で調節した。還元剤を個別に滅菌し、嫌気性条件下で貯蔵した。
【表４】
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【００７０】
まず、ニトリロ三酢酸を１Ｌの脱塩水（ＶＥ水）に溶解させ、そしてＫＯＨ溶液でｐＨ値を６．０に調整した。続いて、他の全ての化学物質を添加した。微量元素溶液は、冷暗所で４℃で貯蔵した。
【表５】
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【００７１】
これらの物質を１Ｌの脱塩水（ＶＥ水）に溶解させ、使用するまで、滅菌したFalcon社製チューブ（１０ｍＬ）内で−２０℃で凍結させた。
【表６】
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【００７２】
これらの物質を１Ｌの脱塩水（ＶＥ水）に溶解させた。無機溶液は、４℃で冷暗所に貯蔵した。
【表７】
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【００７３】
まずＮａＯＨを１Ｌの脱塩水（ＶＥ水）に溶解させ、煮沸した。続いてこの溶液を、耐圧性のガラス瓶（１Ｌ）に移し、氷上で冷却しながらＮ2で洗浄した。その他の物質は、溶液を冷却する間に添加した。続いて、還元剤を２０分間、オートクレーブ処理した。
【００７４】
使用した株：
ＣＯＸ−Ｃｄｒ−００１  （クロストリジウム・ドラケイ）
ＣＯＸ−Ｃｌｊ−００１  （クロストリジウム・リュングダーリイ）
【００７５】
前培養体：
使用したこれらの株は、低温培養で作製されてから直ちに、前培養体に移した（指数関数的な相で４ｍｌの培養体と、保存用の５０％グリセリン溶液１ｍｌとを用いた培養の前に、−８０℃で貯蔵）。これらの前培養体はそれぞれ、変性ＡＴＣＣ１７５４（ＰＥＴＣ）培地５ｍｌと、固定された株の接種材料とから成っていた。理想的な接種材料濃度は、各株についてのパイロット試験で測定した。
ＣＯＸ−Ｃｄｒ−００１：培地５ｍｌ中で０．１％
ＣＯＸ−Ｃｌｊ−００１：培地５ｍｌ中で１０％。
【００７６】
培養体：
使用した各培地をそれぞれ５０ｍｌ、滅菌した嫌気性（酸素不含の）耐圧性ガラス瓶（２５０ｍｌ）に移し、３日経った古い前培養体から新たに作製した、使用株の１０％（５ｍｌ）を用いて接種した。
【００７７】
この培養体は、滅菌されたブチル栓と赤蓋（３個の穿孔あり）を用いて閉鎖した。中空の針（Sterican社製、φ０．９０×４０ｍｍ）を、３つ全ての穴に通した。圧力を制御するための圧力計を、中空針の１つに取り付けた（理想的には、真ん中の針に）。その他の中空針にバルブを取り付けることにより、添加されたガスと、培養フラスコから除去されたガスが、相互に独立して制御可能なようにした。
【００７８】
使用した株はそれぞれ、直接再現可能な結果のためにペアで培養した。
【００７９】
培養体の作製：
実際の培養を開始する前に、それぞれの瓶を合成ガスで三回洗浄した。この洗浄はバルブの１つに、瓶内にガスを供給するためのチューブを取り付け、そしてもう１つのバルブに、制御に従ってフード下で、除去されたガスを開放するためのチューブを取り付けることによって行った。
【００８０】
ガス添加チューブを有するバルブを開放することにより、合成ガスを培養フラスコ内に、圧力計の針が０．８ｂａｒの圧力値を示すまで給送した。続いて、ガス添加バルブを閉鎖し、ガス除去バルブを、圧力計の針が０ｂａｒの値を示すまで開放した。この手順を、それぞれの培養フラスコについて三回繰り返した。この手順を４回目に繰り返した時に、瓶内の圧力を維持した、つまり培養体は、合成ガスで覆われた。
【００８１】
その後、培養試料は、培養のために３５℃、１００ｒｐｍで揺動式水浴中に用意した。
【００８２】
試料の採取：
一日に１回又は２回、培養体を約１ｍｌ取り出して、６００ｎｍでの光学密度を測定した（培養体の成長を記録）。
【００８３】
実験の最初と最後に、１．５ｍｌの試料２つをそれぞれ、２ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、ＮＭＲ分析用に用いた。
【００８４】
ガスの添加：
規則的な間隔で（一日に数度）、培養フラスコ内部の圧力を確認し、圧力が一定であることを担保する。培養体の成長、及びその代謝により、様々な量の合成ガスが消費された。圧力が減少した場合には、上述のようにさらなるガスを添加した。試料を取り出す前に、培養フラスコからガスが除去された場合には、同じ手順を実施した。
【００８５】
実験の終了：
実験は約１週間後、各培養フラスコを窒素で１０分間、連続的に洗浄することによって終了させ、それから安全性を高めるため、中空針を取り除いた。これらの培養体は、滅菌フードの下で、滅菌した５０ｍｌのFalcon社製チューブに移し、３０分間、４５００ｇで遠心分離にかけた。もはや嫌気性条件下で作業する必要はなかった。回収された細胞ペレットは廃棄し、培養体の上澄みは、滅菌フードの下で、滅菌したシリンジ（５０ｍＬ）に移した。この上澄みを、０．２μｍの滅菌フィルタを介して、滅菌したFalcon社製の新しいチューブに移し、予備の試料として−２０℃で凍結させた。
【００８６】
実験１：酵母抽出物と、エタノール０．６ｇ／Ｌを用いた培養（BF-DM-12-COX-038）
この実験は、酵母抽出物を１ｇ／Ｌ含有する変性ATCC1754（PETC）培地を用いて行った。さらに、エタノール０．６ｇ／Ｌを、炭素源として使用した。使用したガス混合物は、ＣＯ2を３０％、そしてＨ2を７０％含有していた。
【００８７】
実験２：酵母抽出物と、酢酸２ｇ／Ｌを用いた培養（BF-DM-12-COX-041）
この実験は、実験１に記載したように行ったのだが、実験１と異なるのは、培地にエタノールでは無く、酢酸を添加したことである。
【００８８】
実験３：酵母抽出物による培養（BF-DM-12-COX-042）（比較実験）
直接比較するために、同じ培地を用いたのだが、エタノール又は酢酸を添加せずに行った。
【００８９】
これらの結果が、図３及び４に示されている。要約：例１で示された効果は、別のガス混合物、及び他の酢酸産生バクテリア株を用いても、再現可能である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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2015508659.tif 000015