(57)【要約】  本発明は，４位及び５位に二重結合，及び，多糖のグルコサミン部分の６位にアルデヒド基を有するヒアルロナンのα，β‐不飽和アルデヒドの調製及び使用に関する。この調製方法は，多糖のグルコサミン部分の６位にアルデヒド基を有するヒアルロナンの脱水に基づく。記載されている２種類の方法は，溶液中の脱水，若しくは溶媒，塩基又は他の添加物の非存在下における固体状態での加熱である。この誘導体によって，アルデヒドの部位から多重結合によりアミノ化合物とのヒアルロナン複合体が安定し，それにより実際に生理学的条件下では，アミノ基を含むあらゆる化合物は，このような修飾ヒアルロナンに効果的に固定することができる。ジアミン，又は３つ以上のアミノ基を含む化合物或いはポリマーを使用する場合，架橋ヒアルロナン誘導体を調製することが可能である。記載された溶液は，生物学的活性物質の担体の分野のみならず，生理学的条件下で生物学的に許容可能なアミノ化合物との架橋が非常に需要のある組織工学分野でもかなり優位である。2015525820.tif 000016【選択図】なし
2015525820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖のグルコサミン部分の４位及び５位で二重結合により修飾されると同時に，多糖のグルコサミン部分の６位でアルデヒドへと酸化される構造式Ｘに従ったヒアルロン酸誘導体，又は構造式Ｙに従ったその水和形態であって
2015525820.tif 000015
式中，Ｒは水素，任意の金属カチオン又は有機カチオンであるヒアルロン酸誘導体。
【請求項２】
分子量が１〜５×１０５の範囲内であり，Ｒがナトリウム，カリウム，カルシウムカチオン，又はテトラＣ１‐Ｃ６‐アルキルアンモニウム，プロトン化Ｃ１‐Ｃ６‐アルキルアミンから成る群より選択される有機カチオン，好ましくはテトラブチルアンモニウム又はプロトン化トリエチルアミンであることを特徴とする請求項１記載のヒアルロン酸誘導体。
【請求項３】
グルコサミン部分の６位でアルデヒドへと酸化されたヒアルロン酸を，水／極性非プロトン性溶媒の混合液中において，温度３０〜８０℃，好ましくは５０〜６０℃でグルコサミン部分の４位及び５位で脱水することを特徴とする請求項１又は２で定義したヒアルロン酸誘導体の調製方法。
【請求項４】
前記混合液がヒアルロン酸二量体に対して０．０１〜２０当量，好ましくは５〜１０当量の塩基を更に含み，前記塩基が有機塩基，例えばトリエチルアミン又はジイソプロピルエチルアミン，若しくは無機塩基，例えばＣａ（ＯＨ）２から成る群より選択されることを特徴とする請求項３記載の調製方法。
【請求項５】
前記非プロトン性溶媒が水混和性であり，例えばＤＭＳＯ又はスルホンを含み，溶媒／水の体積比が３／１〜１／２であることを特徴とする請求項３記載の調製方法。
【請求項６】
反応が１２〜１５０時間で進行することを特徴とする請求項３〜５いずれか１項記載の調製方法。
【請求項７】
溶媒又は他の添加物を使用せずに，グルコサミン部分の６位でアルデヒドへと酸化されたヒアルロン酸を，５０〜１００℃，好ましくは７０〜８０℃で１２時間〜１０日間，好ましくは４〜５日間加熱することにより，固相中のグルコサミン部分の４位及び５位で脱水することを特徴とする請求項１又は２で定義したヒアルロン酸誘導体の調製方法。
【請求項８】
初期ヒアルロン酸の分子量が１×１０４〜５×１０６であることを特徴とする請求項３〜７いずれか１項記載の調製方法。
【請求項９】
前記誘導体が一般式Ｈ２Ｎ‐Ｒ２のアミンと反応し，Ｒ２はＣ１‐Ｃ３０アルキル，芳香族，複素芳香族，直鎖又は分岐鎖であり，場合によりＮ，Ｓ又はＯ原子を含むことを特徴とする請求項１又は２で定義したヒアルロン酸誘導体の修飾方法。
【請求項１０】
前記誘導体がアミノ酸又はペプチドと反応することを特徴とする請求項９記載のヒアルロン酸誘導体の修飾方法。
【請求項１１】
前記誘導体が遊離アミノ基を含有するポリマーと反応することを特徴とする請求項９記載のヒアルロン酸誘導体の修飾方法。
【請求項１２】
前記ポリマーが，例えば脱アセチル化ヒアルロン酸，リンカーを介してアミノ基が結合したヒアルロン酸，又はゼラチン，若しくは別の生物学的に許容できるポリマーであることを特徴とする請求項１１記載のヒアルロン酸誘導体の修飾方法。
【請求項１３】
アミン，アミノ酸，ペプチド，又はポリマーの遊離アミノ基の量が，ヒアルロナン二量体に対して０．０５〜２当量の範囲内であることを特徴とする請求項９〜１２いずれか１項記載の修飾方法。
【請求項１４】
前記アミン，アミノ酸，ペプチド，又は遊離アミノ基を含むポリマーとの反応が，水中，リン酸緩衝液中，又は水‐有機溶媒系中で，温度２０〜６０℃の範囲内で１０分〜１５０時間行われることを特徴とする請求項９〜１３いずれか１項記載の修飾方法。
【請求項１５】
前記有機溶媒が，水混和性アルコール，特にイソプロパノール又はエタノール，及び水混和性の極性非プロトン性溶媒，特にジメチルスルホキシドから成る群より選択され，混合液中の水分が少なくとも５０体積％であることを特徴とする請求項１４記載の修飾方法。
【請求項１６】
抗癌効果を有する材料を調製するための請求項１又は２で定義した誘導体の使用。
【請求項１７】
化粧品や薬品中の生物学的活性物質の担体，又はpH値を変えることで放出が制御された生物学的活性物質の担体としての請求項１又は２で定義した誘導体の使用。
【請求項１８】
架橋材料及びハイドロゲルを調製するための，また，組織工学又は生物医薬用途の材料を調製するための請求項９〜１７いずれか１項で定義した方法により調製された誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，多糖のグルコサミン部分の４位及び５位の二重結合と多糖鎖のグルコサミン部分の６位のアルデヒド基とを有する式Ｘに従った新規なヒアルロン酸誘導体，又は多糖のグルコサミン部分の６位のジェミナルなジオールと多糖のグルコサミン部分の４位及び５位に維持された二重結合とを有する式Ｙに従った，そのヒアルロン酸誘導体の水和形態の調製及び使用に関するものであり，
2015525820.tif 000003
式中，Ｒは水素，任意の金属カチオン又は有機カチオンである。
【０００２】
ヒアルロナンアルデヒドのこの不飽和誘導体は，主に生理学的条件下でアミノ基を含む化合物の結合に適している。その結合した化合物が２つ以上のアミノ基を含む場合は，架橋材料を調製してもよい。
【背景技術】
【０００３】
ヒアルロン酸はβ‐（１，３）‐Ｄ‐グルクロン酸及びβ‐（１，４）‐Ｎ‐アセチル‐Ｄ‐グルコサミンという２つの反復単位から構成されるグリコサミノグリカンである。
2015525820.tif 000004
スキーム１    ヒアルロン酸
【０００４】
それは単離方法と出発物質にもよるが，５×１０４〜５×１０６という高い分子量が特徴的である。この非常に親水性のある多糖は，pHの全範囲内において塩の形態を取り，水溶性である。それは結合組織，皮膚，関節滑液の一部でもあり，水和，プロテオグリカンの組織化，細胞分化，増殖及び血管形成等の多数の生物学的プロセスにおいて重要な役割を担っている。このポリマーは生体に天然に存在し，よって生分解性であることから，組織工学の好適な基剤又は生物学的活性物質の担体となる。
【０００５】
ヒアルロン酸をＨＡ‐アルデヒドにする修飾
ＨＡ‐アルデヒドは天然ヒアルロナンの選択的酸化により調製することが最も多い。多糖の酸化は，多糖の官能基の酸化度を変えるプロセスである。アルデヒドを形成する場合，形式上，酸化度は１度数上昇させる。カルボン酸基（２度数の酸化）も高頻度に形成され，これはアルデヒドへの酸化の副産物であり得る。ヒアルロン酸の場合，アルデヒド基が結合しているヒアルロナン（ＨＡ‐アルデヒド）を調製する幾つかのアプローチが既知である。これらのヒアルロナン誘導体は，化学修飾したヒアルロナンから生体材料を調製するために最も使用される前駆体の１つである。主な理由として，生理学的条件下ではアルデヒド基は非常に安定的ではあるが，同時に，例えばアミンと迅速かつ効果的に化学反応する程に反応性が依然として残る。
【０００６】
ＨＡ‐アルデヒドを調製する主要な方法を下記のスキーム２に示す。
スキーム２
2015525820.tif 000005
【０００７】
ヒアルロナンにアルデヒド基を導入するために極めて高頻度に利用されている方法は，水中でＮａＩＯ４を使用する酸化である（スキーム２，構造１）（Spiro Robertら：国際公開第９９／０１１４３号，Aeschlimann Daniel，Bulpitt Paul：国際公開第２００７／０１４９４４１号）。この修飾により糖環が開環し，２つのアルデヒド基が形成される。
【０００８】
別の方法は，水中でのＮａＣｌＯ／ＴＥＭＰＯ系（Buffa R.，Kettou S.，Velebny V.ら，国際公開第２０１１／０６９４７５号）又はＤＭＳＯ中でのデス‐マーチンペリオジナン（Buffa R.，Kettou S.，Velebny V.ら，国際公開第２０１１／０６９４７４号）により，多糖のグルコサミン部分の６位で第１級水酸基をアルデヒドへと酸化させることである（スキーム２，構造２）。構造１とは対照的に，この位置でのアルデヒド基は，ポリマー鎖の剛性を維持している。
【０００９】
ヒアルロナンにアルデヒド基を導入する１つの興味深い方法は，リンカーを介してこの基を結合できる可能性である（スキーム２，構造３）。ここでは可能なアプローチが多様にあり，アミドを介したヒアルロナンのカルボン酸基への隣接ジオールの導入及び，リンカーを介してアルデヒドを結合させるＮａＩＯ４によるジオールのその後の酸化等が挙げられる（Hilborn J.ら：国際公開第２０１０／１３８０７４号）。この戦略は，任意で更に修飾する場合に，アルデヒド基が立体的に扱いやすくなることで優位である。
【００１０】
別の特許出願（Aeschlimann Daniel及びBulpitt Paul：国際公開第２００７／０１４９４４１号）には，薬剤９‐ＢＢＮ（９‐ボラビシクロ［３，３，１］ノナン(nonan)）を使用してヒアルロナンのカルボン酸基を還元することで，ＨＡ‐アルデヒドを調製することが可能であることが記載されている。結果として，ヒアルロナンは多糖のグルクロン部分の６位にアルデヒド基を有することとなる（スキーム２，構造４）。
【００１１】
Ｎ‐求核試薬によるＨＡ‐アルデヒドの縮合
Ｎ‐求核試薬（アミン）によるＨＡ‐アルデヒドの縮合の応用に関する主要な長所は，生理学的条件下で行えるということである。一般的に，この反応は下記のスキーム３で説明される：
スキーム３
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【００１２】
得られたイミン‐ＣＨ＝Ｎ結合の加水分解安定性は，Ｘ基の性質に大幅に依存している。‐ＣＨ２‐基等，Ｘが自由電子対を有さない原子であれば，加水分解安定性が非常に不安定なイミンＨＡ‐ＣＨ＝Ｎ‐ＣＨ２‐が形成される。Ｘが自由電子対を有する原子であれば，加水分解安定性が高まった複合体が形成され（オキシム  ＨＡ‐ＣＨ＝Ｎ‐Ｏ‐，ヒドラゾン  ＨＡ‐ＣＨ＝Ｎ‐ＮＨ‐，セミカルバゾン  ＨＡ‐ＣＨ＝Ｎ‐ＮＨ‐ＣＯ‐等），イミン結合‐ＣＨ＝Ｎ‐は原子Ｘの自由電子対と共役することにより安定化される。一般式ＮＨ２‐Ｘ‐を有するアミンの結合を開示している多くの特許が既知であり，ここではＸは，窒素又は酸素であり，ヒアルロナンをアルデヒドに酸化し，最終物質は広範な生物医薬用途に適用可能になるよう生理学的に許容可能な条件下で形成される。近年の特許には，アルデヒド，マレインイミド，アクリル酸塩，アクリルアミド，メタクリル酸塩，メタクリルアミド，ビニルスルホン及びアジリジン等の求電子性基に修飾されたヒアルロン酸をベースとする材料を請求する特許が挙げられる（Bergman K.，ら：国際公開第２００９／１０８１００号）。ヒドラジド，セミカルバジド，チオセミカルバジド，アミノオキシ，チオール及びβ‐アミノチオール基が架橋求核試薬として記載されている。別の特許出願（Hilborn J.ら：国際公開第２０１０／１３８０７４号）が類似しており，過ヨウ素酸ナトリウムによる酸化によりアルデヒドに酸化したヒアルロナンにＮ，Ｓ又は同時にＮ及びＳ求核試薬が直接結合することが開示されている。
【００１３】
Ｘが脂肪族炭素である場合（スキーム３），得られたイミンには加水分解安定性は無く（結合‐Ｃ＝Ｎ‐は共役のパートナーを持たない），元のアルデヒド及びアミンに可逆的に変換されることが一般に知られている（Buffa R.，Kettou S.，Velebny V.ら，国際公開第２０１１／０６９４７４号）。この状態をスキーム４において説明する。
スキーム４
2015525820.tif 000007
【００１４】
前記イミンを安定化させる可能性のある別の方法は，別の部位，すなわちアルデヒドの部位から接合部を拡大させることであり，これは多重‐Ｃ＝Ｃ‐結合を有する接合部のあるイミンが得られることを意味する。一般的な反応をスキーム５に示す。
スキーム５
2015525820.tif 000008
【００１５】
このアプローチが文献に記載されることは非常に稀であり，例えば，いわゆるシッフ塩基を形成する芳香族アルデヒドとアミンとの反応について記載されており，ここでは安定性は芳香族環Ａｒ‐ＣＨＯ＋Ｈ２Ｎ‐Ｒ→Ａｒ‐ＣＨ＝Ｎ‐Ｒとの共役により支持されている。しかし，一般的に多糖又はポリマーの場合，類似例は全く見出されていない。ポリマーのこのような修飾では，芳香族基，又は一般的に共役した多重結合をアルデヒド上のリンカーを介して導入することが必要であり，これは技術的に複雑であり，材料の生体適合性に保証はない。しかし，この方法は別の複雑要因である可能性も指摘されている。芳香族系又は更に複合化された多重結合が存在する場合，材料はすでに可視領域を吸収した状態であり，よって当該化合物は一般的に望ましくない色に変色する（in vitro試験の分析における複雑要因である光感受性の可能性）。
【００１６】
発明の概要
本発明の対象は一般構造式Ｘ又はＹのヒアルロン酸であり，これは４位及び５位において二重結合で修飾された多糖のグルコサミン環を幾つか有すると同時に，アルデヒド基が存在するか，或いは多糖のグルコサミン部分の６位においてジェミナルジオール（構造Ｙ）を有し，
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式中，Ｒは水素，任意の金属カチオン又は有機カチオンである。前記誘導体の分子量は１〜５００kDaの範囲内であることが好ましい。Ｒはナトリウム，カリウム，カルシウムカチオン，又はテトラＣ１‐Ｃ６アルキルアンモニウム，プロトン化Ｃ１‐Ｃ６アルキルアミンから成る群より選択される有機カチオン，好ましくはテトラブチルアンモニウム又はプロトン化トリエチルアミンである。
【００１７】
この溶液によって，アルデヒドの部位から多重結合によりアミノ化合物とのヒアルロナン複合体が安定し，それにより実際，生理学的条件下ではアミノ基を含む化合物は全て，このような修飾ヒアルロナンに結合させることができ得る。
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【００１８】
一般式Ｈ２Ｎ‐Ｘ‐の化合物に強く結合し得る生理学的条件下にあり，Ｘが自由電子対を有する原子，通常は酸素又は窒素であるヒアルロナンの飽和アルデヒドと比較すると，このことは重要な違いである。基を形成するＨ２Ｎ‐Ｘ‐を含む天然物質が非常に少ないため，本願に記載の溶液は，生物学的活性物質と見込まれる担体としてのみならず，生理学的条件下で生物学的に許容できるアミノ化合物と架橋したヒアルロナン誘導体が高頻度に使用されている組織工学においても，多大な利益をもたらす。
【００１９】
更に，本発明は構造式Ｘ又はＹに従った誘導体の調製方法に関するものであり，この方法では，初めに，グルコサミン部分の６位においてヒアルロン酸をＨＡ‐アルデヒドへと酸化し（以下，工程１と称する），その後，溶液中で，或いは溶媒，塩基又は他の添加物を利用せず加熱のみでＨＡ‐アルデヒドを脱水する（以下，工程２と称する）。これら２つの工程を以下に詳述する：
工程１：多糖のグルコサミン部分の６位におけるヒアルロン酸の第１級水酸基をアルデヒドにする選択的酸化。例えば水中での酸化系２，２，６，６‐テトラメチル‐１‐ピペリジニルオキシルラジカルＲ１‐ＴＥＭＰＯ／ＮａＣｌＯにより反応を行う。式中，Ｒ１は水素又は基Ｎ‐アセチルである：
2015525820.tif 000011
この工程は温度−５〜１０℃の水中で行われることが好ましく，ヒアルロン酸の二量体に対して，ＮａＣｌＯのモル量は０．０５〜０．７当量の範囲内であり，Ｒ１‐ＴＥＭＰＯのモル量は０．００５〜０．２当量の範囲内である。出発物質のヒアルロン酸の分子量は１０kDa〜５MDaの範囲内である。
工程２：
改変例１：温度３０〜８０℃，好ましくは５０〜６０℃の極性非プロトン性溶媒及び水中でのＨＡ‐アルデヒドの脱水，又は，
改変例２：乾燥状態で純粋飽和ＨＡ‐アルデヒドを温度５０〜１００℃，好ましくは７０〜８０℃まで高める加熱。
2015525820.tif 000012
【００２０】
第１の改変例は水系有機媒体における脱水であり，ここでは有機溶媒は水混和性であり，溶媒／水の体積比は３／１〜１／２の範囲内である。この工程では，有機塩基，例えばトリエチルアミン又はＮ‐ジイソプロピル‐Ｎ‐エチルアミン，又は無機塩基，例えばＣａ（ＯＨ）２等の限定的な求核特性を有する塩基を使用することが好ましい。反応における塩基の量は，ヒアルロナン二量体に対して０．０１〜２０当量，好ましくは５〜１０当量である。塩基はアルデヒドのアルファ位（環の５位）の陽子を切断することで脱離を補助するものであり，得られた炭素アニオンは４位の水酸基を脱離させ，多重結合を形成する。有機溶媒としては，水混和性の非プロトン性極性溶媒，好ましくはＤＭＳＯ又はスルホランを使用できる。反応は１２〜１５０時間行うことが好ましい。
【００２１】
第２に，工程２を実現するための技術的に非常に有用な改変例は，出発物質である飽和アルデヒドを添加剤のない乾燥状態で，１２時間〜１０日間，好ましくは４〜５日間，高温，好ましくは７０〜８０℃まで加熱することである。
【００２２】
更に，本発明は，アミンを結合するための不飽和ＨＡ‐アルデヒドの使用に関するものである。より具体的には，本発明は，誘導体が一般式Ｈ２Ｎ‐Ｒ２に従ったアミンと反応する式Ｘ又はＹに従ったヒアルロン酸誘導体の修飾方法に関するものであり，式中Ｒ２は，場合によりＮ，Ｓ又はＯ原子を含むアルキル，芳香族，複素芳香族，直鎖又は分岐鎖Ｃ１‐Ｃ３０である。前記アミンは例えば，アミノ酸，遊離アミノ基を含むペプチド又はポリマーでもよく，このようなポリマーは例えば，脱アセチル化ヒアルロン酸，リンカーを介してアミノ基を結合させたヒアルロン酸，又はゼラチン，若しくは生物学的に許容できる他のポリマーでもよい。アミン，アミノ酸，ペプチド，又はポリマーにおける遊離アミノ基の量は，ヒアルロナン二量体に対して０．０５〜２当量の範囲内であることが好ましい。
【００２３】
前記複合体の調製には特別な条件は必要ない。反応は水，リン酸緩衝液又は水‐有機溶媒系で，２０〜６０℃の範囲内で１０分〜１５０時間行う。有機溶媒は水混和性アルコール，特にイソプロパノール又はエタノール，及び水混和性極性非プロトン性溶媒，特にジメチルスルホキシドを含む群より選択可能であり，混合液中の水分は少なくとも５０体積％である。反応は，単純なアミノ酸から複雑なペプチドまで多様なアミンと共に，pH＝７．４のリン酸緩衝液等の生理学的条件において，３７℃で円滑に進行する。これらの条件下では，問題なくヒドラジン，ヒドロキシルアミン，ヒドラジド，セミカルバジド又はチオセミカルバジドと結合することも可能である。２つ以上のアミノ基を含む化合物を結合させる場合，多様な粘弾性特性を有する不溶性の架橋誘導体を調製することが可能である。
2015525820.tif 000013
【００２４】
アミン及び不飽和ＨＡ‐アルデヒドの結合の安定性が，その飽和類似体よりも高いと，ヒアルロナンをベースとする安定的で良好に架橋された不溶性生体材料が調製できる。この状態は「実施例」の部の実施例２１に詳述されており，ここでは脱アセチル化ヒアルロナンとの架橋の際の最終レオロジー特性に関し，類似の置換度及び分子量を有するＨＡ‐アルデヒドの飽和誘導体と不飽和誘導体とを比較している。
【００２５】
生理学的条件下で非常に広範なアミノ基含有化合物がヒアルロン酸に強く結合可能であるという点で，提示された修飾の方法は「先行技術」の部で記述された類似体より優位である。このことは特に組織工学での応用に非常に優位であり，生体細胞の存在下でさえ，多くの生体適合性架橋アミノリンカーが生理学的条件下で使用可能である。修飾した誘導体は例えば，架橋材料及びハイドロゲルの調製，組織工学又は生物医薬的用途のための材料の調製に使用できる。架橋には，一般的に多糖又はアミノ基含有ポリマーも使用できる。好ましくは，前記発明は生物学的活性物質の担体の分野でも使用できる。考案した方法により，ヒアルロナンの生物学的活性アミン（例えばペプチド）がより広範囲に固定可能になり，その後はその天然（活性）形態で自然に放出される場合もある。低いpHでは，アミン‐不飽和ＨＡ‐アルデヒド結合の加水分解安定性は低く，したがって，調製された複合体はpH反応性材料（担体，ゲル等）としても使用できることが判明した。不飽和ＨＡ‐アルデヒド単独では細胞毒性は無く，したがって，その複合体は多様な生物医薬用途に好適な候補薬であることが明らかになった。例えばアクロレインＣＨ２＝ＣＨ‐ＣＨＯは毒性が高く，刺激性物質であることから，‐Ｃ＝Ｃ‐多重結合を有するアルデヒド部位からの接合部は毒性が高いということを当業者が予測できるとしても，予測通りではない。本発明による誘導体はポリマー構造の直ぐ内側に二重結合を有し（リンカーは無い），最終的な基剤は，いかなる毒性も示さない。化粧品や薬剤中の生物学的活性物質の担体，又はpH値を変えることで放出が制御された生物学的活性物質の担体として，式Ｘ又はＹに従った誘導体は，抗癌効果を有する材料の調製に使用し得る。
【００２６】
本願に記載の溶液の実現は技術的に複雑ではなく，高額な化学薬品，溶剤又は単離工程を利用する必要はない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】実施例２０に従って調製した弾性材料。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
ＤＳ＝置換度＝１００％＊（結合置換基又は修飾二量体のモル量）／（全多糖二量体のモル量）
【００２９】
本明細書で使用されている用語「当量（eq)」は，特に指定が無ければヒアルロン酸二量体を意味する。百分率は特に指定が無ければ重量パーセントである。
【００３０】
初期ヒアルロン酸（入手元：シーピーエヌ  エスピーオーエル．エス．アール．オー(CPN spol. s r. o.)，ドルニ  ドブロウク，チェコ）の分子量は重量平均であり，ＳＥＣ‐ＭＡＬＬＳにより測定された。
【００３１】
実施例１  グルコサミン部分の６位で酸化したＨＡ‐アルデヒドの調製
ヒアルロン酸の酸化
窒素雰囲気下でＮａＣｌＯ（０．５当量）の水溶液を，１％のＮａＣｌ，１％のＫＢｒ，ＴＥＭＰＯ（０．０１当量）及びＮａＨＣＯ３（２０当量）を含有するヒアルロナン（１g，２００kDa）の１％溶液に徐々に添加した。混合液を−５℃で１２時間撹拌した後，０．１gのエタノールを添加し，混合液を更に１時間撹拌した。その後，得られた溶液を蒸留水で０．２％に希釈し，混合液（０．１％のＮａＣｌ，０．１％のＮａＨＣＯ３）に対して３×５リットル（１日１回）透析し，蒸留水に対して７×５リットル（１日２回）透析した。その後，最終溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ１０％（ＮＭＲで測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）  δ５．２６（ｓ，１Ｈ，ポリマー‐ＣＨ（ＯＨ）２）
ＨＳＱＣ（Ｄ２Ｏ）      クロスシグナル５．２６ppm（１Ｈ）‐９０ppm（１３Ｃ）（ポリマー‐ＣＨ（ＯＨ）２）
【００３２】
実施例２  ＨＡ‐アルデヒドの脱水
６．７mlのＤＭＳＯ及び塩基ＤＩＰＥＡ（５当量）をＨＡ‐アルデヒド（０．１g，酸化度(oxidation degree)ＤＳ＝１０％，実施例１）の３％水溶液に添加した。混合液を４０℃で７２時間撹拌した。その後，イソプロパノール／ヘキサン混合液により最終溶液を沈殿させ，固形分を真空乾燥した。
ＤＳ６％（ＮＭＲで測定），Ｍｗ＝１１０kDa（ＳＥＣ  ＭＡＬＬＳで測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）  δ９．２４（ｓ，１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｏ），６．３２（ｍ，１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｏ）
ＵＶ‐Ｖｉｓ（Ｄ２Ｏ）  ２５２nm，α，β‐不飽和アルデヒドのπ‐π＊遷移
【００３３】
実施例３  ＨＡ‐アルデヒドの脱水
７．５mlのＤＭＳＯ及び塩基ＤＩＰＥＡ（５当量）をＨＡ‐アルデヒド（０．１g，酸化度ＤＳ＝１０％，実施例１）の４％水溶液に添加した。混合液を５０℃で７２時間撹拌した。その後，イソプロパノール／ヘキサン混合液により最終溶液を沈殿させ，固形分を真空乾燥した。
ＤＳ５％（ＮＭＲで測定，詳細は実施例２参照）
【００３４】
実施例４  ＨＡ‐アルデヒドの脱水
２．５mlのＤＭＳＯ及び塩基ＤＩＰＥＡ（５当量）をＨＡ‐アルデヒド（０．１g，酸化度ＤＳ＝１０％，実施例１）の２％水溶液に添加した。混合液を５０℃で７２時間撹拌した。その後，イソプロパノール／ヘキサン混合液により最終溶液を沈殿させ，固形分を真空乾燥した。
ＤＳ２％（ＮＭＲで測定，詳細は実施例２参照）
【００３５】
実施例５  ＨＡ‐アルデヒドの脱水
６．７mlのスルホランをＨＡ‐アルデヒド（０．１g，酸化度ＤＳ＝１０％，実施例１）の３％水溶液に添加した。混合液を６０℃で７２時間撹拌した。その後，イソプロパノール／ヘキサン混合液により最終溶液を沈殿させ，固形分を真空乾燥した。
ＤＳ１％（ＮＭＲで測定，詳細は実施例２参照）
【００３６】
実施例６  ＨＡ‐アルデヒドの脱水
６．７mlのスルホラン及び塩基Ｅｔ３Ｎ（５当量）をＨＡ‐アルデヒド（０．１g，酸化度ＤＳ＝１０％，実施例１）の３％水溶液に添加した。混合液を５０℃で７２時間撹拌した。その後，イソプロパノール／ヘキサン混合液により最終溶液を沈殿させ，固形分を真空乾燥した。
ＤＳ５％（ＮＭＲで測定，詳細は実施例２参照）
【００３７】
実施例７  ＨＡ‐アルデヒドの脱水
６．７mlのスルホラン及び塩基ＤＩＰＥＡ（２当量）をＨＡ‐アルデヒド（０．１g，酸化度，実施例１）の３％水溶液に添加した。混合液を８０℃で１２時間撹拌した。その後，イソプロパノール／ヘキサン混合液により最終溶液を沈殿させ，固形分を真空乾燥した。
ＤＳ２％（ＮＭＲで測定，詳細は実施例２参照）
【００３８】
実施例８  ＨＡ‐アルデヒドの脱水
６．７mlのスルホラン及び塩基Ｃａ（ＯＨ）２（１当量）をＨＡ‐アルデヒド（０．１g，酸化度，実施例１）の３％水溶液に添加した。混合液を３０℃で１５０時間撹拌した。その後，イソプロパノール／ヘキサン混合液により最終溶液を沈殿させ，固形分を真空乾燥した。
ＤＳ２％（ＮＭＲで測定，詳細は実施例２参照）
【００３９】
実施例９  ＨＡ‐アルデヒドの脱水
ＨＡ‐アルデヒド（０．１g，酸化度ＤＳ＝１０％，実施例１）を８０℃で５日間，固体状態で加熱した。その後，ＮＭＲにより分析した。
ＤＳ３％（ＮＭＲで測定，詳細は実施例２参照）
【００４０】
実施例１０  ＨＡ‐アルデヒドの脱水
ＨＡ‐アルデヒド（０．１g，酸化度ＤＳ＝１０％，実施例１）を１００℃で１２時間，固体状態で加熱した。その後，ＮＭＲにより分析した。
ＤＳ２％（ＮＭＲで測定，詳細は実施例２参照）
【００４１】
実施例１１  ＨＡ‐アルデヒドの脱水
ＨＡ‐アルデヒド（０．１g，酸化度ＤＳ＝１０％，実施例１）を５０℃で１０日間，固体状態で加熱した。その後，ＮＭＲにより分析した。
ＤＳ２％（ＮＭＲで測定，詳細は実施例２参照）
【００４２】
実施例１２  α，β‐不飽和ＨＡ‐アルデヒドへのアミンの結合
ｎ‐ブチルアミン（２当量）を，pH７．４の０．１M水性リン酸緩衝液中の不飽和ＨＡ‐アルデヒド（０．１g，置換度ＤＳ＝６％，実施例２）１％溶液に添加した。混合液を３７℃で５時間撹拌した。その後，最終溶液をイソプロパノール／ヘキサン混合液により沈殿させ，固形分を真空乾燥した。
ＤＳ５％（ＮＭＲで測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）  δ７．７４（ｓ，１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｎ‐Ｂｕ），５．６８（ｍ，１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐Ｂｕ）
ＨＳＱＣ（Ｄ２Ｏ）  クロスシグナル７．７４ppm（１Ｈ）‐１５８ppm（１３Ｃ）  ‐ＣＨ＝Ｎ‐Ｂｕ
クロスシグナル５．６８ppm（１Ｈ）‐１１２ppm（１３Ｃ）  ‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐Ｂｕ
【００４３】
実施例１３  α，β‐不飽和ＨＡ‐アルデヒドへのアミンの結合
ｎ‐ブチルアミン（０．０５当量）を，pH７．４の０．１M水性リン酸緩衝液中の不飽和ＨＡ‐アルデヒド（０．１g，置換度ＤＳ＝６％，実施例２）１％溶液に添加した。混合液を２０℃で１５０時間撹拌した。その後，最終溶液をイソプロパノール／ヘキサン混合液により沈殿させ，固形分を真空乾燥した。
ＤＳ２％（ＮＭＲで測定，詳細は実施例１２参照）
【００４４】
実施例１４  α，β‐不飽和ＨＡ‐アルデヒドへのアミンの結合
ｎ‐ブチルアミン（０．３当量）を，不飽和ＨＡ‐アルデヒド（０．１g，置換度ＤＳ＝６％，実施例２）の１％水溶液に添加した。混合液を６０℃で１０分間撹拌した。その後，イソプロパノール／ヘキサン混合液により最終溶液を沈殿させ，固形分を真空乾燥した。
ＤＳ５％（ＮＭＲで測定，詳細は実施例１２参照）
【００４５】
実施例１５  α，β‐不飽和ＨＡ‐アルデヒドへのリジンの結合
リジン（０．３当量）を，pH７．４の０．１M水性リン酸緩衝液中の不飽和ＨＡ‐アルデヒド（０．１g，置換度ＤＳ＝６％，実施例２）１％溶液に添加した。混合液を２０℃で２４時間撹拌した。その後，最終溶液をイソプロパノール／ヘキサン混合液により沈殿させ，固形分を真空乾燥した。
ＤＳ５％（ＮＭＲで測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）  δ７．７６（ｓ，１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｎ‐リジン），５．６５（ｍ，１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐リジン）
【００４６】
実施例１６    α，β‐不飽和ＨＡ‐アルデヒドへのペンタペプチドｐａｌ‐ＫＴＴＫＳ（パルミトイル‐Ｌｙｓ‐Ｔｈｒ‐Ｔｈｒ‐Ｌｙｓ‐Ｓｅｒ）の結合
５mlのＩＰＡ，次いで置換ペンタペプチドｐａｌ−ＫＴＴＫＳ（０．１当量）のイソプロピルアルコール溶液５mlを，pH７．４の０．１M水性リン酸緩衝液中の不飽和ＨＡ‐アルデヒド（０．１g，置換度ＤＳ＝６％，実施例２）１％溶液に添加した。混合液を２０℃で７２時間撹拌した。最終溶液を回転式真空蒸発装置中で，体積が３分の１になるまで蒸発させ，その後，イソプロパノール／ヘキサン混合液により沈殿させ，固形分を真空乾燥した。
ＤＳ１％（ＮＭＲで測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）  δ７．７５（ｓ，１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｎ‐ペプチド），５．６６（ｍ，１Ｈ，‐ＣＨ＝Ｃ‐ＣＨ＝Ｎ‐ペプチド）
【００４７】
実施例１７  リジンによるα，β‐不飽和ＨＡ‐アルデヒドの架橋
リジンの１％水溶液（０．１当量）を，pH７．４の０．１M水性リン酸緩衝液中の不飽和ＨＡ‐アルデヒド（０．１g，置換度ＤＳ＝６％，実施例２）５％溶液に添加した。混合液を２０℃で２４時間撹拌した。最終溶液では粘度の上昇が見られた。
【００４８】
実施例１８  アジピン酸ジヒドラジドによるα，β‐不飽和ＨＡ‐アルデヒドの架橋
アジピン酸ジヒドラジドの１％水溶液（０．１当量）を，pH７．４の０．１M水性リン酸緩衝液中の不飽和ＨＡ‐アルデヒド（０．０１５g，置換度ＤＳ＝６％，実施例２）５％溶液に添加した。混合液を２０℃で２４時間撹拌した。最終溶液では粘度の上昇が見られた。
【００４９】
実施例１９  脱アセチル化ヒアルロナンの調製
６５mlのスルホランを，３０gの硫酸ヒドラジンを含むヒドラジン水和物中のヒアルロナン（１g，８３０kDa）３％溶液に添加し，その混合液を７０℃で４８時間加熱した。最終溶液を蒸留水で０．２％に希釈し，混合液（０．１％のＮａＣｌ，０．１％のＮａＨＣＯ３）に対して３×５リットル（１日１回）透析し，蒸留水に対して７×５リットル（１日２回）透析した。その後，最終溶液を蒸発させ，分析した。
ＤＳ３２％（ＮＭＲで測定），Ｍｗ３７kDa（ＳＥＣ‐ＭＡＬＬＳにより測定）
１Ｈ  ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ中の１％ＮａＯＤ）  δ２．７５（ｓ，１Ｈ，‐ＣＨ‐ＮＨ２）
【００５０】
実施例２０  脱アセチル化ヒアルロナンによるα，β‐不飽和ＨＡ‐アルデヒドの架橋
pH７．４の０．１M水性リン酸緩衝液（０．１当量）中の脱アセチル化ヒアルロナン（０．０１５g，実施例１９）３％溶液を，pH７．４の０．１M水性リン酸緩衝液中の不飽和ＨＡ‐アルデヒド（０．０２５g，置換度ＤＳ＝６％，実施例２）３％溶液に添加した。混合液を２０℃で２４時間撹拌した。最終溶液では粘度の上昇が見られた。
【００５１】
実施例２１  架橋α，β‐不飽和ＨＡ‐アルデヒドをベースとするハイドロゲルと架橋飽和ＨＡ‐アルデヒドをベースとするハイドロゲルとの，機械特性及び粘弾性特性についての比較
‐  脱アセチル化ヒアルロナンによる架橋
材料１：pH７．４のＰＢＳ中の不飽和ＨＡ‐アルデヒド（０．０６g，ＤＳ＝６％，Ｍｗ＝１１０kDa，実施例２）３％溶液  ＋  pH７．４のＰＢＳ中の脱アセチル化ヒアルロナン（０．０２g，実施例１９）３％溶液
材料２：pH７．４のＰＢＳ中の飽和ＨＡ‐アルデヒド（０．０６g，ＤＳ＝７％，Ｍｗ＝１００kDa）３％溶液  ＋  pH７．４のＰＢＳ中の脱アセチル化ヒアルロナン（０．０２g，実施例１９）３％溶液
【００５２】
両材料の成分を混合及び完全均質化することにより，前記材料からハイドロゲル試料を調製した（ＰＢＳ中の不飽和ＨＡ‐アルデヒド３％溶液／飽和ＨＡ‐アルデヒドの３％溶液と，ＰＢＳ中の脱アセチル化ヒアルロナン３％溶液）。試料は常に室温で２４０分間熟成させ，その後，均質な透明ゲルを形成させる。全ての試料は同じ配合比であり，一定の実験条件（温度圧力，湿度）で測定した。
【００５３】
試料の機械特性を測定した。より具体的には，材料の硬度／弾性を示す圧縮ヤング率，試料の抵抗性及び永久的変形を生じずに材料が吸収し得るエネルギーの種類を示す靭性係数がある。更に，永久的変形を生じずに材料が吸収し得る最大負荷を示す圧縮破壊応力，粘弾特性の構成の範囲では，剪断損失角での貯蔵弾性率がある。
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【００５４】
本実施例で得られた結果から，より剛性で，かつ，より粘着性の強い（より架橋された）組織工学に適した材料の調製に関し，飽和ＨＡ‐アルデヒドよりも，不飽和ＨＡ‐アルデヒドを使用した方が優位であることが明らかになった。
【図１】
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【国際調査報告】
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