(57)【要約】  本発明は、アルコールなどの発酵産物の生成のための方法およびシステムに関する。本発明は、改良されたバイオマスの処理および生産性のために原料流成分を分離するための方法も提供する。
2015523088.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵産物を生成するための方法であって、
発酵性炭素源、非溶解固体、および油を含む原料スラリーを提供する工程と；
前記原料スラリーから前記非溶解固体および油の一部を分離し、それによって、発酵性炭素源を含む水溶液、固体を含むウェットケーキおよび油流が形成される工程と；
前記水溶液を、微生物を含む発酵ブロスに加え、それによって、前記発酵産物が生成される工程と
を含む方法。
【請求項２】
前記油流を回収する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウェットケーキを洗浄して、炭水化物を含む水流を得る工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
請求項３に記載の水流を前記発酵ブロスに加える工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記水溶液が、約５重量％以下の非溶解固体を含有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記油が、トウモロコシ油であり、トリグリセリド、脂肪酸、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ウェットケーキの一部および油の一部を組み合わせて、トリグリセリド、遊離脂肪酸、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質を含むウェットケーキを生成する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記水溶液を、前記ウェットケーキの一部と組み合わせて、前記水溶液とウェットケーキとの混合物を生成し、前記混合物を前記発酵ブロスに加える工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記原料スラリーを分離する工程が、単一工程プロセスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記非溶解固体および油が、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、膜ろ過、クロスフローろ過、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せによって、原料スラリーから分離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記分離デバイスの１つ以上の制御パラメータが、前記原料スラリーの分離を向上させるように調整される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の制御パラメータが、差速、ボウル速度、流量、羽根車の位置、せきの位置、スクロールピッチ、滞留時間、および排出体積から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記発酵産物が、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、およびフーゼルアルコールから選択される生成物アルコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物が、ブタノール生合成経路を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ブタノール生合成経路が、１−ブタノール生合成経路、２−ブタノール生合成経路、またはイソブタノール生合成経路である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
リアルタイム測定が、前記原料スラリーの分離を監視するのに使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
分離が、フーリエ変換赤外分光法、近赤外分光法、ラマン分光法、高圧液体クロマトグラフィー、粘度計、密度計、張力計、液滴径分析器、粒子分析器、またはそれらの組合せによって監視される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）発酵性炭素源および非溶解固体を含む原料スラリーを提供する工程と；
ｂ）前記原料スラリーから前記非溶解固体の少なくとも一部を分離し、それによって、発酵性炭素源を含む水溶液および固体を含むウェットケーキが生成される工程と；
ｃ）前記ウェットケーキを液体と接触させて、ウェットケーキ混合物を形成する工程と；
ｄ）前記ウェットケーキ混合物から非溶解固体の少なくとも一部を分離し、それによって、発酵性炭素源を含む第２の水溶液および固体を含む第２のウェットケーキが生成される工程と
を含む方法。
【請求項１９】
前記液体が、新鮮な水、逆流、調理水、プロセス水、蒸留残留水、蒸発水、またはそれらの組合せから選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程ｃ）およびｄ）が繰り返される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
発酵性炭素源、非溶解固体、および油を含む原料スラリーを提供する工程と；
前記原料スラリーから前記油および非溶解固体の少なくとも一部を分離し、それによって、発酵性炭素源を含む水溶液、油流；および固体を含むウェットケーキが生成される工程と；
ｃ）前記ウェットケーキを液体と接触させて、ウェットケーキ混合物を形成する工程と；
ｄ）前記ウェットケーキ混合物から非溶解固体および油の少なくとも一部を分離し、それによって、発酵性炭素源を含む第２の水溶液、第２の油流；および固体を含む第２のウェットケーキが生成される工程と
を含む方法。
【請求項２２】
前記原料スラリーを分離する工程が、単一工程プロセスである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記非溶解固体および油が、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、膜ろ過、クロスフローろ過、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せによって、原料スラリーから分離される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記分離デバイスの１つ以上の制御パラメータが、前記原料スラリーの分離を向上させるように調整される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記１つ以上の制御パラメータが、差速、ボウル速度、流量、羽根車の位置、せきの位置、スクロールピッチ、滞留時間、および排出体積から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
リアルタイム測定が、前記原料スラリーの分離を監視するのに使用される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
分離が、フーリエ変換赤外分光法、近赤外分光法、ラマン分光法、高圧液体クロマトグラフィー、粘度計、密度計、張力計、液滴径分析器、粒子分析器、またはそれらの組合せによって監視される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
発酵性炭素源、非溶解固体、および油を含む原料スラリーを提供する工程と；
前記原料スラリーを分離し、それによって、（ｉ）発酵性炭素源を含む第１の水溶液、（ｉｉ）固体を含む第１のウェットケーキ、および（ｉｉｉ）油、固体、および発酵性炭素源を含む水流を含む流れが形成される工程と；
前記第１の水溶液を、微生物を含む発酵ブロスに加え、それによって、発酵産物が生成される工程と
を含む方法。
【請求項２９】
油、固体、および発酵性炭素源を含む水流を含む前記流れを分離し、それによって、（ｉ）発酵性炭素源を含む第２の水溶液、（ｉｉ）固体を含む第２のウェットケーキ、および（ｉｉｉ）油流が形成される工程
をさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１および第２の水溶液が、前記発酵ブロスへの前記添加の前に組み合わされる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２の水溶液が、油をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記第２の水溶液の前記油またはその一部が、抽出剤を生成するように処理される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記油が、化学的にまたは酵素的に処理される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
分離が、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せによって行われる、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３５】
発酵性炭素源、非溶解固体、および油を含む原料スラリーを提供する工程と；
前記原料スラリーを分離し、それによって、（ｉ）発酵性炭素源および固体を含む第１の水溶液、（ｉｉ）固体を含む第１のウェットケーキ、および（ｉｉｉ）第１の油流が形成される工程と；
油を前記第１の水溶液に加え、それによって、固体を含む油層および発酵性炭素源を含む第２の水溶液が形成される工程と
を含む方法。
【請求項３６】
固体を含む前記油層が、分離されて、（ｉ）第２の油流、（ｉｉ）固体を含む第２のウェットケーキ、および（ｉｉｉ）発酵性炭素源を含む第３の水溶液が形成される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の水溶液および前記第３の水溶液が、微生物を含む発酵ブロスに加えられ、それによって、発酵産物が生成される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２の水溶液および前記第３の水溶液が、油をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２の水溶液および前記第３の水溶液が、組み合わされ、前記第２の水溶液および前記第３の水溶液の前記油またはその一部が、抽出剤を生成するように処理される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記油が、化学的にまたは酵素的に処理される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
分離が、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せによって行われる、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項４２】
原料スラリーを生成するために原料を液化するように構成される１つ以上の液化ユニットであって、
前記原料を受け入れるための入口；および
原料スラリーを排出するための出口を含み、ここで、前記原料スラリーが、発酵性炭素源、油、および非溶解固体を含む液化ユニットと；
前記原料スラリーから前記油および非溶解固体を除去して、前記発酵性炭素源を含む水溶液、油流、および前記非溶解固体の一部を含むウェットケーキを生成するように構成される１つ以上の分離ユニットであって、前記遠心分離機が、
前記原料スラリーを受け入れるための入口；
前記水溶液を排出するための第１の出口；
前記ウェットケーキを排出するための第２の出口；および
前記油を排出するための第３の出口
を含む分離ユニットと
を含むシステム。
【請求項４３】
前記ウェットケーキから前記発酵性炭素源を回収するように構成される１つ以上の洗浄システムをさらに含み、前記洗浄システムが、
１つ以上の混合ユニット；および
１つ以上の分離ユニット
を含む、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４４】
前記分離ユニットが、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、膜ろ過、クロスフローろ過、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、およびそれらの組合せから選択される、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４５】
生成物アルコールを生成するために前記水溶液を発酵するように構成される１つ以上の発酵装置をさらに含み、前記発酵装置が、
前記水溶液および／またはウェットケーキを受け入れるための入口；および
生成物アルコールを含む発酵ブロスを排出するための出口
を含む、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４６】
オンライン測定デバイスをさらに含む、請求項４２に記載のシステム。
【請求項４７】
前記オンライン測定デバイスが、粒度分析器、フーリエ変換赤外線分光器、近赤外線分光器、ラマン分光器、高圧液体クロマトグラフィー、粘度計、密度計、張力計、液滴径分析器、ｐＨ計、溶解された酸素プローブ、またはそれらの組合せから選択される、請求項４６に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／６７４，６０７号；２０１２年９月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／６９９，９７６号；２０１２年１０月１１日に出願された米国仮特許出願第６１／７１２，３８５号；２０１３年３月１４日に出願された米国特許出願第１３／８２８，３５３号；および２０１３年３月１５日に出願された米国特許出願第１３／８３６，１１５号の利益を主張するものであり、それぞれの内容全体が、参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本出願に関連する配列表は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子書式で提出され、全体が参照により本明細書に援用される。
【０００３】
本発明は、アルコールなどの発酵産物の生成のための方法およびシステムに関する。本発明は、改良されたバイオマスの処理生産性のために原料流成分を分離するための方法も提供する。
【背景技術】
【０００４】
アルコールには、燃料、試薬、および溶媒などの様々な産業的および科学的な用途がある。例えば、ブタノールは、燃料添加剤として、プラスチック産業における原料化学物質として、ならびに食品および香料産業における食品グレードの抽出剤としての使用を含む様々な用途を有する重要な産業用化学物質である。したがって、ブタノールなどのアルコールならびに例えば、発酵プロセスおよびこれらのプロセスのための原料としてのバイオマスの使用を含む効率的でかつ環境に優しい生成方法に対する高い需要がある。
【０００５】
発酵によるアルコールの生成は、１つのこのような環境に優しい生成方法である。高収率でアルコールを生成するいくつかの微生物は、低い毒性閾値も有するため、アルコールは、生成されるにつれて発酵装置から除去される必要がある。原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）という一方法を用いて、アルコールが生成されるにつれて発酵装置からアルコールを除去し、それによって、微生物が、高収率でアルコールを生成することが可能になり得る。当該技術分野で説明されているＩＳＰＲの例が、液液抽出（例えば、特許文献１を参照）である。技術的および経済的に実行可能であるために、液液抽出は、効率的な物質移動のための抽出剤と発酵ブロスとの接触；発酵ブロスからの抽出剤の相分離；抽出剤の効率的な回収および再利用；および長期間の運転にわたる抽出剤の劣化および／または汚染が最小限であることを必要とする。
【０００６】
発酵装置に入る水流が、原料からの非溶解固体を含有するとき、非溶解固体は、液液抽出を妨げることがあり、抽出方法は、技術的および経済的に実行可能でなくなり、例えば、資本コストおよび運転コストの増加につながり得る。抽出発酵中の非溶解固体の存在は、物質移動係数を低下させ、相分離を妨げ、抽出剤中の非溶解固体からの油の蓄積を生じ、時間の経過とともに抽出効率の低下を招くことがあり、抽出剤が、固体に捕捉され、可溶物含有乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）として最終的に除去されるため、抽出剤の損失を増加することがあり、発酵ブロスからの抽出剤液滴の離脱を遅くすることがあり、および／または発酵装置体積効率を低下させることがある。したがって、固体除去は、発酵プロセスからアルコールを生成し、それを回収するための効率的な手段を提供する。
【０００７】
固体除去に加えて、原料からの油の除去は、アルコールの生成に対する有益な効果ならびに商業的な利益も提供し得る。例えば、トウモロコシ油および大豆油などのいくつかの油が、バイオディーゼルの原料として使用され得るため、アルコール製造業者のための追加の収入源になり得る。さらに、油の除去は、より効率的な発酵による生産工場のエネルギー節約、油の除去による汚損の減少、発酵装置体積効率の向上、およびエネルギー必要量、例えば、穀類蒸留粕を乾燥させるのに必要なエネルギーの減少をもたらし得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
エタノールおよびブタノールなどのアルコールを生成するためのより効率的な方法およびシステムを開発することが引き続き必要とされている。本発明は、この必要性を満たし、発酵の前に原料流成分を分離し、発酵プロセスにおける非溶解固体および／または油の量を制御するための方法およびシステムを含む、アルコールを生成するための方法およびシステムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、原料流成分を分離し、発酵産物の生成の際に発酵装置原料流における非溶解固体および／または油の量を制御するための方法およびシステムに関する。分離された成分は、アルコール発酵副産物プロファイルを向上させることを含む、バイオマス処理生産性を向上させるための機構を提供する。（１）発酵性炭素源を含む水流、（２）油を含む原料流、および（３）非溶解固体を含む原料流を含む特定の成分へと原料流を分離することによって、これらの成分が、制御された方法で再度組み合わされ、または他の用途のためにシステムから除去され得る。これは、より高タンパク質またはより高脂肪の飼料を必要とする動物飼料市場などの様々な市場のニーズのための副産物組成物を開発するための機構を提供する。
【００１１】
本発明は、発酵産物の生成の際に発酵装置原料流から油を除去するための方法およびシステムにも関する。ある実施形態において、非溶解固体および油が、発酵装置原料流から除去され得る。
【００１２】
本発明は、生成物アルコールを生成するための方法であって、発酵性炭素源、非溶解固体、および油を含む原料スラリーを提供する工程と；原料スラリーから非溶解固体および油の一部を分離し、それによって、発酵性炭素源を含む水溶液、固体を含むウェットケーキおよび油流が形成される工程と；水溶液を、微生物を含む発酵ブロスに加え、それによって、生成物アルコールが生成される工程とを含む方法に関する。ある実施形態において、本方法は、油流を回収する工程をさらに含む。ある実施形態において、本方法は、ウェットケーキを洗浄して、炭水化物を含む水流を得る工程をさらに含む。ある実施形態において、本方法は、水流を発酵ブロスに加える工程をさらに含む。ある実施形態において、水溶液は、約５重量％以下の非溶解固体を含有する。ある実施形態において、油は、トウモロコシ油であり、トリグリセリド、脂肪酸、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質のうちの１つ以上を含む。ある実施形態において、本方法は、ウェットケーキの一部および油の一部を組み合わせて、トリグリセリド、遊離脂肪酸、ジグリセリド、モノグリセリド、およびリン脂質を含むウェットケーキを生成する工程をさらに含む。ある実施形態において、本方法は、水溶液を、ウェットケーキの一部と組み合わせて、水溶液とウェットケーキとの混合物を生成し、混合物を発酵ブロスに加える工程をさらに含む。ある実施形態において、原料スラリーを分離する工程は、単一工程プロセスである。ある実施形態において、非溶解固体および油は、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、膜ろ過、クロスフローろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子（ｇｒａｔｉｎｇ）、多孔質格子、浮遊法（ｆｌｏｔａｔｉｏｎ）、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器（ｖｏｒｔｅｘ  ｓｅｐａｒａｔｏｒ）、またはそれらの組合せによって、原料スラリーから分離される。ある実施形態において、分離デバイスの１つ以上の制御パラメータが、原料スラリーの分離を向上させるように調整される。ある実施形態において、１つ以上の制御パラメータは、差速、ボウル速度、流量、羽根車の位置、せきの位置、スクロールピッチ、滞留時間、および排出体積から選択される。ある実施形態において、生成物アルコールは、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、およびフーゼルアルコールから選択される。ある実施形態において、微生物は、ブタノール生合成経路を含む。ある実施形態において、ブタノール生合成経路は、１−ブタノール生合成経路、２−ブタノール生合成経路、またはイソブタノール生合成経路である。ある実施形態において、リアルタイム測定が、原料スラリーの分離を監視するのに使用される。ある実施形態において、分離は、フーリエ変換赤外分光法、近赤外分光法、ラマン分光法、高圧液体クロマトグラフィー、粘度計、密度計、張力計、液滴径分析器、粒子分析器、またはそれらの組合せによって監視される。
【００１３】
本発明は、発酵性炭素源および非溶解固体を含む原料スラリーを提供する工程と；原料スラリーから非溶解固体の少なくとも一部を分離し、それによって、発酵性炭素源を含む水溶液および固体を含むウェットケーキが生成される工程と；ウェットケーキを液体と接触させて、ウェットケーキ混合物を形成する工程と；ウェットケーキ混合物から非溶解固体の少なくとも一部を分離し、それによって、発酵性炭素源を含む第２の水溶液および固体を含む第２のウェットケーキが生成される工程とを含む方法にも関する。ある実施形態において、液体は、新鮮な水（ｆｒｅｓｈ  ｗａｔｅｒ）、逆流（ｂａｃｋｓｅｔ）、調理水（ｃｏｏｋ  ｗａｔｅｒ）、プロセス水、蒸留残留水（ｌｕｔｔｅｒ  ｗａｔｅｒ）、蒸発水、またはそれらの組合せから選択される。ある実施形態において、接触工程および分離工程が繰り返され得る。
【００１４】
本発明は、発酵性炭素源、非溶解固体、および油を含む原料スラリーを提供する工程と；原料スラリーから油および非溶解固体の少なくとも一部を分離し、それによって、発酵性炭素源を含む水溶液、油流；および固体を含むウェットケーキが生成される工程と；ウェットケーキを液体と接触させて、ウェットケーキ混合物を形成する工程と；ウェットケーキ混合物から非溶解固体および油の少なくとも一部を分離し、それによって、発酵性炭素源を含む第２の水溶液、第２の油流；および固体を含む第２のウェットケーキが生成される工程とを含む方法に関する。ある実施形態において、原料スラリーを分離する工程は、単一工程プロセスである。ある実施形態において、非溶解固体および油は、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、膜ろ過、クロスフローろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せによって、原料スラリーから分離される。ある実施形態において、分離デバイスの１つ以上の制御パラメータが、原料スラリーの分離を向上させるように調整される。ある実施形態において、１つ以上の制御パラメータは、差速、ボウル速度、流量、羽根車の位置、せきの位置、スクロールピッチ、滞留時間、および排出体積から選択される。ある実施形態において、リアルタイム測定が、原料スラリーの分離を監視するのに使用される。ある実施形態において、分離は、フーリエ変換赤外分光法、近赤外分光法、ラマン分光法、高圧液体クロマトグラフィー、粘度計、密度計、張力計、液滴径分析器、粒子分析器、またはそれらの組合せによって監視される。
【００１５】
本発明は、発酵性炭素源、非溶解固体、および油を含む原料スラリーを提供する工程と；原料スラリーを分離し、それによって、（ｉ）発酵性炭素源を含む第１の水溶液、（ｉｉ）固体を含む第１のウェットケーキ、および（ｉｉｉ）油、固体、および発酵性炭素源を含む水流を含む流れが形成される工程と；第１の水溶液を、微生物を含む発酵ブロスに加え、それによって、発酵産物が生成される工程とを含む方法に関する。ある実施形態において、本方法は、油、固体、および発酵性炭素源を含む水流を含む流れを分離し、それによって、（ｉ）発酵性炭素源を含む第２の水溶液、（ｉｉ）固体を含む第２のウェットケーキ、および（ｉｉｉ）油流が形成される工程をさらに含み得る。ある実施形態において、第１および第２の水溶液は、発酵ブロスへの添加の前に組み合わされ得る。ある実施形態において、第２の水溶液は、油をさらに含み得る。ある実施形態において、第２の水溶液の油またはその一部は、抽出剤を生成するように処理され得る。ある実施形態において、油は、化学的にまたは酵素的に処理され得る。ある実施形態において、分離は、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せによって行われ得る。
【００１６】
本発明は、発酵性炭素源、非溶解固体、および油を含む原料スラリーを提供する工程と；原料スラリーを分離し、それによって、（ｉ）発酵性炭素源および固体を含む第１の水溶液、（ｉｉ）固体を含む第１のウェットケーキ、および（ｉｉｉ）第１の油流が形成される工程と；油を前記第１の水溶液に加え、それによって、固体を含む油層および発酵性炭素源を含む第２の水溶液が形成される工程とを含む方法に関する。ある実施形態において、固体を含む油層は、分離されて、（ｉ）第２の油流、（ｉｉ）固体を含む第２のウェットケーキ、および（ｉｉｉ）発酵性炭素源を含む第３の水溶液が形成され得る。ある実施形態において、第２の水溶液および〆第３の水溶液は、微生物を含む発酵ブロスに加えられてもよく、それによって、発酵産物が生成される。ある実施形態において、第２の水溶液および第３の水溶液は、油をさらに含み得る。ある実施形態において、第２の水溶液および第３の水溶液は、組み合わされてもよく、第２の水溶液および第３の水溶液の油またはその一部は、抽出剤を生成するように処理される。ある実施形態において、油は、化学的にまたは酵素的に処理され得る。ある実施形態において、分離は、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せによって行われ得る。
【００１７】
本発明は、原料スラリーを生成するために原料を液化するように構成される１つ以上の液化ユニットであって、原料を受け入れるための入口；および原料スラリーを排出するための出口を含み、ここで、原料スラリーが、発酵性炭素源、油、および非溶解固体を含む液化ユニットと；原料スラリーから油および非溶解固体を除去して、発酵性炭素源を含む水溶液、油流、および非溶解固体の一部を含むウェットケーキを生成するように構成される１つ以上の分離ユニットであって、遠心分離機が、原料スラリーを受け入れるための入口；水溶液を排出するための第１の出口；ウェットケーキを排出するための第２の出口；および油を排出するための第３の出口を含む分離ユニットとを含むシステムにも関する。ある実施形態において、システムは、ウェットケーキから発酵性炭素源を回収するように構成される１つ以上の洗浄システムであって、１つ以上の混合ユニット；および１つ以上の分離ユニットを含む洗浄システムをさらに含む。ある実施形態において、分離ユニットは、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、加圧ろ過、膜ろ過、クロスフローろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、およびそれらの組合せから選択される。ある実施形態において、本システムは、生成物アルコールを生成するために水溶液を発酵するように構成される１つ以上の発酵装置であって、水溶液および／またはウェットケーキを受け入れるための入口；および生成物アルコールを含む発酵ブロスを排出するための出口を含む発酵装置をさらに含む。ある実施形態において、本システムは、オンライン測定デバイスをさらに含む。ある実施形態において、オンライン測定デバイスは、粒度分析器、フーリエ変換赤外線分光器、近赤外線分光器、ラマン分光器、高圧液体クロマトグラフィー、粘度計、密度計、張力計、液滴径分析器、ｐＨ計、溶解された酸素プローブ、またはそれらの組合せから選択される。
【００１８】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を成す添付の図面は、本発明を例示し、さらに、本明細書とともに、本発明の原理を説明し、関連技術分野の当業者が本発明を行い、使用できるようにする働きを果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】液化の後かつ発酵の前に、非溶解固体が分離によって除去される、本発明の例示的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図２】原料が粉砕される、本発明の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図３】非溶解固体および油が分離によって除去される、本発明の別の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図４】ウェットケーキが１回以上の洗浄サイクルに供される、本発明の別の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図５】非溶解固体および油が分離によって除去され、ウェットケーキが１回以上の洗浄サイクルに供される、本発明の別の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図６】水溶液およびウェットケーキが組み合わされ、発酵に送られる、本発明の別の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図７】水溶液が発酵前に糖化される、本発明の別の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図８】原料スラリーが分離前に糖化される、本発明の別の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図９Ａ】追加の分離ユニットが非溶解固体および油を除去するのに用いられる、本発明の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図９Ｂ】追加の分離ユニットが非溶解固体および油を除去するのに用いられる、本発明の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図９Ｃ】追加の分離ユニットが非溶解固体および油を除去するのに用いられる、本発明の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図９Ｄ】追加の分離ユニットが非溶解固体および油を除去するのに用いられる、本発明の例示的な代替的な方法およびシステムを概略的に示す。
【図１０】発酵プロセスを監視するためにオンライン、インライン、アットライン、および／またはリアルタイム測定を用いる例示的な発酵プロセスを概略的に示す。
【図１１】下流の処理を含む本発明の例示的な発酵プロセスを概略的に示す。
【図１２】液化されたトウモロコシでんぷんの水溶液から、２．０３ｍｍの内径を有するノズルを用いてオレイルアルコールを分配するときに気泡塔を通って上方に流れるオレイルアルコール液滴の分散体へのｉ−ＢｕＯＨの移動についての全体積物質移動係数、ｋＬａに対する非溶解トウモロコシマッシュ固体の存在の影響を示す。
【図１３】液化されたトウモロコシでんぷんの水溶液から、０．７６ｍｍの内径を有するノズルを用いてオレイルアルコールを分配するときに気泡塔を通って上方に流れるオレイルアルコール液滴の分散体へのｉ−ＢｕＯＨの移動についての全体積物質移動係数、ｋＬａに対する非溶解トウモロコシマッシュ固体の存在の影響を示す。
【図１４】（重力）沈降時間に応じた、発酵試料管における液液界面の位置を示す。実行時間：５．３時間、２９．３時間、５３．３時間、および７０．３時間の実行時間について示される相分離データ。固体がマッシュ原料から除去され、オレイルアルコールが溶媒であった場合の抽出−発酵からの試料データ。
【図１５】（重力）沈降時間に応じた、最終的な発酵ブロスの液液界面の位置を示す。固体がマッシュ原料から除去され、オレイルアルコールが溶媒であった場合の抽出−発酵からのデータ。
【図１６】バッチ１およびバッチ２についての、時間に応じたスラリーの水相中のグルコースの濃度を示す。
【図１７】バッチ３およびバッチ４についての、時間に応じたスラリーの水相中のグルコースの濃度を示す。
【図１８】でんぷんの転化に対する、酵素充填および＋／−高温段階が液化中のある時点で適用されたか否かの影響を示す。
【図１９Ａ】原料スラリーの分離に対する、三相遠心分離条件の影響を示す。
【図１９Ｂ】原料スラリーの分離に対する、三相遠心分離条件の影響を示す。
【図１９Ｃ】原料スラリーの分離に対する、三相遠心分離条件の影響を示す。
【図１９Ｄ】原料スラリーの分離に対する、三相遠心分離条件の影響を示す。
【図１９Ｅ】原料スラリーの分離に対する、三相遠心分離条件の影響を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、定義を含めて本出願が優先するものとする。また、文脈上異なる解釈を要する場合を除き、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書に記載される全ての刊行物、特許、および他の参照文献は、あらゆる目的のために、全体が参照により本明細書に援用される。
【００２１】
本発明をさらに定義するために、以下の用語および定義が、本明細書において提供される。
【００２２】
本明細書において使用される際の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語、またはそれらの任意の他の活用形は、記載される整数または整数の群を包含するが、任意の他の整数または整数の群を除外しないことを意味することが理解されよう。例えば、要素の列挙を含む組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置は、必ずしもそれらの要素のみに限定されるわけではなく、明示的に列挙されていないかあるいはこのような組成物、混合物、プロセス、方法、物品、または装置に固有の他の要素を含み得る。さらに、相反する明示的な記載がない限り、「または」は、排他的な「または」ではなく包括的な「または」を指す。例えば、条件ＡまたはＢは、以下のうちの１つによって満たされる：Ａが真であり（または存在する）かつＢが偽である（または存在しない）、Ａが偽であり（または存在しない）かつＢが真である（または存在する）、ＡおよびＢの両方とも真である（または存在する）。
【００２３】
また、本発明の要素または構成要素の前にある不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、事例の数、すなわち、要素または構成要素の出現の数に関して限定されないことが意図される。したがって、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは少なくとも１つを含むものと読まれるべきであり、要素または構成要素の単数語形は、数値が単数であることを明白に意味しない限り、複数も含む。
【００２４】
本明細書において使用される際の「発明」または「本発明」の用語は、非限定的な用語であり、特定の発明の任意の１つの実施形態を指すことは意図されず、本出願に記載される考えられる全ての実施形態を包含する。
【００２５】
本明細書において使用される際の、用いられる本発明の成分または反応剤の量を修飾する「約」という用語は、例えば、現実の世界で濃縮物または溶液を作製するのに使用される典型的な測定および液体処理手順によって；これらの手順における不注意による誤りによって；組成物を作製するかまたは方法を行うのに用いられる成分の製造、供給源、または純度の差などによって起こり得る数量の変動を指す。「約」という用語は、特定の初期混合物から得られる組成物のための平衡条件が異なるために異なる量も包含する。「約」という用語によって修飾されているか否かにかかわらず、特許請求の範囲は、量に対する均等物を含む。一実施形態において、「約」という用語は、報告される数値の１０％以内、あるいは報告される数値の５％以内を意味する。
【００２６】
本明細書において使用される際の「バイオマス」は、トウモロコシ、サトウキビ（またはトウ）、小麦、セルロース系またはリグノセルロース系材料ならびにセルロース、ヘミセルロース、リグニン、でんぷん、オリゴ糖、二糖類および／または単糖類、およびそれらの混合物を含む材料などの天然資源に由来する任意の糖類およびでんぷんを含む発酵性糖を提供する加水分解性多糖類を含有する天然産物を指す。バイオマスは、タンパク質および／または脂質などのさらなる成分も含み得る。バイオマスは、１つの供給源に由来してもよく、またはバイオマスは、２つ以上の供給源に由来する混合物を含み得る。例えば、バイオマスは、トウモロコシの穂軸とトウモロコシの茎葉との混合物、または草と葉との混合物を含み得る。バイオマスとしては、以下に限定はされないが、バイオエネルギー作物、農業残渣、都市固形廃棄物、産業固形廃棄物、製紙からの汚泥、庭ごみ、木くずおよび林業廃棄物（例えば、森林間伐材）が挙げられる。バイオマスの例としては、以下に限定はされないが、トウモロコシの穀粒、トウモロコシの穂軸、トウモロコシの皮、トウモロコシの茎葉などの作物残渣、草、小麦、ライ麦、小麦のわら、スペルト小麦、ライ小麦、大麦、大麦のわら、オート麦、牧草、稲、稲わら、スイッチグラス、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、キクイモ、サトウキビの絞りかす、ソルガム、サトウキビ、テンサイ、飼料用ビート、大豆、ヤシ、ココナツ、ナタネ、ベニバナ、ヒマワリ、アワ、ユーカリ、茅、古紙、穀類の粉砕から得られる成分、樹木、枝、根、葉、木質チップ、おがくず、潅木および低木、野菜、果物、花、動物の糞尿、およびそれらの混合物が挙げられる。マッシュ、絞り汁、糖蜜、または加水分解物が、粉砕、（例えば、酵素的、化学的）処理、および／または液化などの発酵のためにバイオマスを処理するための当該技術分野において公知の任意の方法によって、バイオマスから形成され得る。処理されるバイオマスは、発酵性糖および／または水を含み得る。セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスは、当業者に公知の任意の方法によって発酵性糖を含有する加水分解物を得るように処理され得る。例えば、低アンモニア前処理が、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号明細書に開示されている。セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスの酵素的糖化は、通常、セルロースおよびヘミセルロースを加水分解して、グルコース、キシロース、およびアラビノースを含む糖類を含有する加水分解物を生成するために酵素混合物を利用する。セルロース系および／またはリグノセルロース系バイオマスに適した糖化酵素は、Ｌｙｎｄ，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６６：５０６−５７７，２００２）に概説されている。
【００２７】
本明細書において使用される際の「発酵性炭素源」または「発酵性炭素基質」は、微生物によって代謝されることが可能な炭素源を指す。好適な発酵性炭素源としては、以下に限定はされないが、グルコースまたはフルクトースなどの単糖類；ラクトースまたはスクロースなどの二糖類；オリゴ糖；でんぷんまたはセルロースなどの多糖類；１つの炭素基質；およびそれらの混合物が挙げられる。
【００２８】
本明細書において使用される際の「発酵性糖」は、アルコールなどの発酵産物の生成のための、微生物によって代謝されることが可能な１種以上の糖類を指す。
【００２９】
本明細書において使用される際の「原料」は、発酵プロセスにおける原料を指す。原料は、発酵性炭素源を含んでいてもよく、非溶解固体および／または油を含み得る。該当する場合、原料は、発酵性炭素源がでんぷんから遊離されたかまたは液化、糖化、または他のプロセスなどによるさらなる処理による複合糖類の加水分解から得られる前または後に発酵性炭素源を含み得る。原料は、バイオマスを含むかまたはバイオマスに由来し得る。好適な原料としては、以下に限定はされないが、ライ麦、小麦、トウモロコシ、トウモロコシマッシュ、サトウキビ、サトウキビマッシュ、大麦、セルロース系材料、リグノセルロース系材料、またはそれらの混合物が挙げられる。「原料油」に言及される場合、この用語が、所与の原料から生成される油を包含することが理解されよう。
【００３０】
本明細書において使用される際の「発酵ブロス」は、水と、発酵性炭素源（例えば、糖類、でんぷん）と、溶解固体と、任意に発酵産物を生成する微生物と、任意に発酵産物（例えば、生成物アルコール）と、任意に非溶解固体と、発酵産物、水、および二酸化炭素（ＣＯ２）を形成するための、微生物による発酵性炭素源の代謝によって発酵産物が作製される発酵装置中に保持される材料の他の成分との混合物を指す。場合により、本明細書において使用される際の「発酵培地」および「発酵された混合物」という用語は、「発酵ブロス」と同義に使用され得る。
【００３１】
本明細書において使用される際の「発酵装置」または「発酵槽」は、発酵反応が行われ、それによって、発酵産物（例えば、エタノールまたはブタノールなどの生成物アルコール）が発酵性炭素源から作製される槽、ユニット、またはタンクを指す。また、発酵装置は、微生物の増殖が起こる槽、ユニット、またはタンクを指すことがある。場合によっては、微生物増殖および発酵の両方が、発酵装置中で起こり得る。「発酵装置」という用語は、「発酵槽」と同義に使用され得る。
【００３２】
本明細書において使用される際の「糖化槽」は、糖化（すなわち、オリゴ糖の単糖類への加水分解）が行われる槽、ユニット、またはタンクを指す。発酵および糖化が同時に行われる場合、糖化槽および発酵装置は、同じ槽であってもよい。
【００３３】
本明細書において使用される際の「糖化酵素」は、多糖類および／またはオリゴ糖、例えば、グリコーゲン、またはでんぷんのα−１，４−グルコシド結合を加水分解することが可能な１種以上の酵素を指す。糖化酵素は、セルロース系またはリグノセルロース系材料を加水分解することが可能な酵素も含み得る。
【００３４】
本明細書において使用される際の「液化槽」は、液化が行われる槽、ユニット、またはタンクを指す。液化は、オリゴ糖を得るために、でんぷんが、例えば、酵素プロセスによって加水分解されるプロセスである。原料がトウモロコシである実施形態において、オリゴ糖は、液化中にトウモロコシでんぷん含有物から加水分解される。
【００３５】
本明細書において使用される際の「糖」は、オリゴ糖、二糖類、単糖類、および／またはそれらの混合物を指す。「糖」という用語は、でんぷん、デキストラン、グリコーゲン、セルロース、ペントサン、ならびに糖類を含む炭水化物も含み得る。
【００３６】
本明細書において使用される際の「非溶解固体」は、液相または水相に溶解されない原料の非発酵性部分、例えば、胚芽、繊維、およびグルテンを指す。原料の非発酵性部分は、原料の固体として残る部分を含み、発酵ブロスから液体を吸収し得る。場合により、本明細書において使用される際の「非溶解固体」という用語は、「固体」または「懸濁固体」と同義に使用され得る。
【００３７】
本明細書において使用される際の「抽出剤」は、発酵産物を抽出するのに使用される溶媒を指す。場合により、本明細書において使用される際の「抽出剤」という用語は、「溶媒」と同義に使用され得る。
【００３８】
本明細書において使用される際の「原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）」は、生成物が生成される際に、生物学的プロセスにおける生成物濃度を制御するための、発酵などの生物学的プロセスからの生成物の選択的な除去を指す。
【００３９】
本明細書において使用される際の「生成物アルコール」は、発酵性炭素源としてバイオマスを用いる発酵プロセスにおいて微生物によって生成され得る任意のアルコールを指す。生成物アルコールとしては、以下に限定はされないが、Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールが挙げられる。ある実施形態において、生成物アルコールはＣ２〜Ｃ８のアルキルアルコールである。他の実施形態において、生成物アルコールはＣ２〜Ｃ５のアルキルアルコールである。Ｃ１〜Ｃ８のアルキルアルコールとしては、以下に限定はされないが、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、およびそれらの異性体が挙げられることが理解されよう。同様に、Ｃ２〜Ｃ８のアルキルアルコールとしては、以下に限定はされないが、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、およびそれらの異性体が挙げられる。「アルコール」という用語はまた、生成物アルコールに関連して本明細書において使用され得る。
【００４０】
本明細書において使用される際の「ブタノール」は、ブタノール異性体：１−ブタノール（１−ＢｕＯＨ）、２−ブタノール（２−ＢｕＯＨ）、第３級−ブタノール（ｔｅｒｔ−ＢｕＯＨ）、および／またはイソブタノール（ｉＢｕＯＨ、ｉ−ＢｕＯＨ、またはＩ−ＢＵＯＨ）を、個々にまたはそれらの混合物として指す。
【００４１】
本明細書において使用される際の「プロパノール」は、プロパノール異性体：イソプロパノールまたは１−プロパノールを、個々にまたはそれらの混合物として指す。
【００４２】
本明細書において使用される際の「ペンタノール」は、ペンタノール異性体：１−ペンタノール、３−メチル−１−ブタノール、２−メチル−１−ブタノール、２，２−ジメチル−１−プロパノール、３−ペンタノール、２−ペンタノール、３−メチル−２−ブタノール、または２−メチル−２−ブタノールを、個々にまたはそれらの混合物として指す。
【００４３】
本明細書において使用される際の「有効力価」は、発酵によって生成される特定の発酵産物（例えば、生成物アルコール）の総量を指す。発酵産物が生成物アルコールである、ある実施形態において、有効力価は、発酵培地のリットル当たりの、アルコールエステル化によって生成されるアルコールエステルのアルコール当量を指す。
【００４４】
本明細書において使用される際の「水不混和性」または「不溶性」は、１つの液相を形成するように、発酵ブロスなどの水溶液と混合することができない抽出剤または溶媒などの化学成分を指す。
【００４５】
本明細書において使用される際の「水相」は、発酵ブロスを抽出剤、例えば、水不混和性有機抽出剤と接触させることによって得られる少なくとも二相の混合物の水相を指す。発酵抽出を含む本明細書に記載されるプロセスの一実施形態において、「発酵ブロス」という用語は、この場合、二相性発酵抽出における水相を指す。
【００４６】
本明細書において使用される際の「水相力価」は、水相中の発酵（例えば、生成物アルコール）の濃度を指す。
【００４７】
本明細書において使用される際の「有機相」は、発酵ブロスを抽出剤、例えば、水不混和性有機抽出剤と接触させることによって得られる少なくとも二相の混合物の非水相を指す。
【００４８】
プロセス流に関して本明細書において使用される際の「部分」は、流れ全体、ならびに流れの全ての成分を含む、流れの任意の１つまたは複数の成分を含む、流れの組成物を保持する流れの任意の分画部分を指す。
【００４９】
本明細書において使用される際の「副生成物」または「副産物」は、別の生成物の生成中に生成される生成物を指す。場合によっては、「副産物」という用語は、「副生成物」という用語と同義に使用され得る。副産物としては、例えば、原料スラリーから回収される油、ウェットケーキ、およびＤＤＧＳが挙げられる。副産物は、価値を向上させるため、および／または油からのバイオディーゼルなどの、他の生成物の製造のための、油、ウェットケーキ、およびＤＤＧＳの改質物（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）も含み得る。
【００５０】
本明細書において使用される際の「蒸留副産物」は、発酵の前または後に単離され得る、生成物アルコール生成プロセスからの副生成物を指す。蒸留副産物は、生成物アルコールが発酵されたマッシュから除去された後に残る非発酵性生成物およびマッシュから単離された固体を含む。本明細書において使用される際の蒸留副産物は、様々な動物飼料および非動物飼料用途に使用され得る。蒸留副産物の例としては、以下に限定はされないが、油の加水分解からの脂肪酸、希薄な蒸留廃液（ｔｈｉｎ  ｓｔｉｌｌａｇｅ）の蒸発からの脂質、シロップ、穀類蒸留粕、可溶物含有穀類蒸留粕、発酵前のマッシュからの固体、および発酵後の全蒸留廃液（ｗｈｏｌｅ  ｓｔｉｌｌａｇｅ）からの固体、バイオディーゼル、およびアシルグリセリドが挙げられる。
【００５１】
本明細書において使用される際の「動物飼料用の蒸留副産物」は、動物飼料中でまたは動物飼料として使用するのに適した蒸留副産物を指す。動物飼料用の蒸留副産物の例としては、以下に限定はされないが、油の加水分解からの脂肪酸、希薄な蒸留廃液の蒸発からの脂質、シロップ、穀類蒸留粕、可溶物含有穀類蒸留粕、発酵前のマッシュからの固体、および発酵後の全蒸留廃液からの固体が挙げられる。
【００５２】
本明細書において使用される際の「穀類蒸留粕」または「ＤＧ」は、生成物アルコーが発酵されたマッシュから除去された後に残る非発酵性生成物を指す。乾燥された穀類蒸留粕は、「乾燥穀類蒸留粕」または「ＤＤＧ」として知られている。乾燥されていない穀類蒸留粕は、「湿潤穀類蒸留粕」または「ＷＤＧ」として知られている。
【００５３】
本明細書において使用される際の「可溶物含有穀類蒸留粕」または「ＤＧＳ」は、可溶性物質と混合された、生成物アルコールが発酵されたマッシュから除去された後に残る非発酵性生成物を指す。乾燥された可溶物含有穀類蒸留粕は、「可溶物含有乾燥穀類蒸留粕」または「ＤＤＧＳ」として知られている。乾燥されていない可溶物含有穀類蒸留粕は、「可溶物含有湿潤穀類蒸留粕」または「ＷＤＧＳ」として知られている。
【００５４】
本明細書において使用される際の「可溶物含有乾燥穀類蒸留粕」（ＤＤＧＳ）は、原料またはバイオマスの発酵（例えば、生成物アルコールを生成する穀類または穀類混合物の発酵）からの副産物または副生成物を指す。ある実施形態において、ＤＤＧＳは、生成物アルコールを作製するプロセスから生成される動物飼料も指すこともある。
【００５５】
本明細書において使用される際の「脂質」は、不水溶性でありかつ非極性溶媒に可溶である、脂肪ならびに脂肪酸、中性脂肪、ろう、およびステロイドを含む脂肪様の物質の不均一な群のいずれかを指す。脂質の例としては、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、およびリン脂質が挙げられる。
【００５６】
プロセス流に関して本明細書において使用される際の「蒸発からの脂質」は、生成物アルコール生成プロセスにおける発酵の後、希薄な蒸留廃液の蒸発および遠心分離によって生成される脂質副生成物を指す。
【００５７】
プロセス流に関して本明細書において使用される際の「シロップ」または「濃縮蒸留可溶物（ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  ｓｏｌｕｂｌｅ）」（ＣＤＳ）は、生成物アルコール生成プロセスにおける発酵の後、希薄な蒸留廃液の蒸発によって生成される副生成物を指す。
【００５８】
本明細書において使用される際の「プロセス流」は、発酵産物生成プロセスによって形成される任意の副生成物または副産物を指す。プロセス流の例としては、以下に限定はされないが、ＣＯＦＡ、蒸発からの脂質、シロップ、ＤＧ、ＤＤＧ、ＷＤＧ、ＤＧＳ、ＤＤＧＳ、およびＷＤＧＳが挙げられる。プロセス流の別の例としては、発酵産物生成プロセスにおける発酵の前に、マッシュから（例えば、遠心分離によって）除去される固体（例えば、発酵前にトウモロコシマッシュから除去される固体）である。これらの固体は、それらが乾燥されていない場合、「ウェットケーキ」と呼ばれることがあり、それらが乾燥されている場合、「ドライケーキ」と呼ばれることがある。プロセス流の別の例は、発酵産物生成プロセスにおける発酵の後、全蒸留廃液から（例えば、遠心分離によって）除去される固体である。これらの固体は、それらが乾燥されていない場合、「ＷＳウェットケーキ」と呼ばれることがあり、それらが乾燥されている場合、「ＷＳドライケーキ」と呼ばれることがある。場合により、本明細書において使用される際の「プロセス流」という用語は、「流れ」と同義に使用され得る。
【００５９】
本発明は、発酵を用いて生成物アルコールなどの発酵産物を生成するためのプロセスおよび方法を提供する。本明細書に記載されるプロセスおよび方法を用いて生成され得る他の発酵産物としては、プロパンジオール、ブタンジオール、アセトン、乳酸、酢酸、酪酸、およびプロピオン酸などの酸；水素、メタン、および二酸化炭素などのガス；アミノ酸；ビオチン、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ１２（例えば、コバラミン）、アスコルビン酸（例えば、ビタミンＣ）、ビタミンＥ（例えば、ａ−トコフェロール）、およびビタミンＫ（例えば、メナキノン）などのビタミン；エリスロマイシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、およびテトラサイクリンなどの抗生物質；ならびにクエン酸、インベルターゼ、ソルビトール、ペクチナーゼ、およびキシリトールなどの他の生成物が挙げられる。
【００６０】
本明細書において提供されるプロセスおよび方法の例として、原料が、液化されて、発酵性炭素源（例えば、可溶性糖）および非溶解固体を含む原料スラリーが生成され得る。場合によっては、「原料スラリー」および「マッシュ」という用語は、同義に使用され得る。ある実施形態において、原料スラリーは、可溶性糖、非溶解固体、および油を含む。原料スラリーが、発酵装置に直接供給される場合、非溶解固体および／または油は、生成物アルコールなどの発酵産物の効率的な除去および回収を妨げ得る。例えば、液液抽出が、発酵ブロスから生成物アルコールを抽出するのに用いられる場合、非溶解固体の存在は、抽出剤と発酵ブロスとの接触を妨げることによって、抽出剤への生成物アルコールの物質移動速度を低下させること；発酵装置中でエマルジョンを生成し、それによって、抽出剤および発酵ブロスの相分離を妨げること；発酵ブロスからの抽出剤の離脱を遅くすること；抽出剤および生成物アルコールの少なくとも一部が、固体に「捕捉される」ため、抽出剤を回収し、再利用する効率を低下させること；油による汚染によって、抽出剤の寿命が短縮されること；および発酵装置中の体積を占める固体があるため、発酵装置体積効率を低下させることを含むがこれらに限定されない、システムの非効率を招き得る。これらの影響は、資本コストおよび運転コストを増加させ得る。さらに、可溶物含有乾燥穀類蒸留粕（ＤＤＧＳ）を生成するのに使用される非溶解固体に「捕捉される」抽出剤は、ＤＤＧＳ値および動物飼料として販売するための必要条件から外れ得る。したがって、これらの問題を回避し、および／または最小限に抑えるために、非溶解固体の少なくとも一部が、原料スラリーを発酵装置に加える前に、原料スラリーから除去され得る。生成物アルコール生成の抽出活性および効率が、非溶解固体が除去されていない水溶液を含有する発酵ブロスにおいて行われる抽出と比べて、非溶解固体が除去された水溶液を含有する発酵ブロスにおいて抽出が行われる場合に高められ得る。
【００６１】
本発明の方法およびシステムは、図を参照して説明される。ある実施形態において、例えば、図１に示されるように、システムは、原料を液化して、原料スラリーを生成するように構成される液化１０を含む。
【００６２】
例えば、原料１２は、液化１０の入口に導入され得る。原料１２は、大麦、オート麦、ライ麦、ソルガム、小麦、ライ小麦、スペルト小麦、アワ、サトウキビ、トウモロコシ、またはそれらの組合せを含むがこれらに限定されない、でんぷんなどの発酵性炭素源を含有する任意の好適なバイオマス材料であり得る。水も液化１０に導入され得る。
【００６３】
原料１２を液化するプロセスは、原料１２を加水分解して、水溶性糖を生成することを含む。酸プロセス、酵素プロセス、または酸−酵素プロセスを含むがこれらに限定されない、当業界で用いられる任意の公知の液化プロセスが使用され得る。このようなプロセスは、単独でまたは組み合わせて使用され得る。ある実施形態において、酵素プロセスを用いることができ、適切な酵素１４、例えば、α−アミラーゼが、液化１０の入口に導入される。本発明の方法およびシステムに使用され得るα−アミラーゼの例が、米国特許第７，５４１，０２６号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２０９０２６号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２３８９２３号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２５２８２８号明細書；米国特許出願公開第２００９／０３１４２８６号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０２２７８９７０号明細書；米国特許出願公開第２０１０／００４８４４６号明細書；および米国特許出願公開第２０１０／００２１５８７号明細書に記載されており、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される。
【００６４】
ある実施形態において、液化および／または糖化のための酵素が、微生物（例えば、微生物３２）によって生成され得る。このような酵素を生成する微生物の例が、米国特許第７，４９８，１５９号明細書；米国特許出願公開第２０１２／０００３７０１号明細書；米国特許出願公開第２０１２／０１２９２２９号明細書；ＰＣＴ国際公報の国際公開第２０１０／０９６５６２号パンフレット；およびＰＣＴ国際公報の国際公開第２０１１／１５３５１６号パンフレットに記載されており、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される。
【００６５】
原料１２を液化するプロセスは、発酵性炭素源および非溶解固体を含む原料スラリー１６を生成する。ある実施形態において、原料スラリー１６は、発酵性炭素源、油、および非溶解固体を含み得る。非溶解固体は、原料１２の非発酵性部分である。ある実施形態において、原料１２は、乾式粉砕された、分画されていないトウモロコシの実などのトウモロコシであり得、非溶解固体は、胚芽、繊維、およびグルテンを含み得る。ある実施形態において、原料１２は、トウモロコシまたはトウモロコシの実であり、原料スラリー１６は、トウモロコシマッシュスラリーである。原料スラリー１６は、液化１０の出口から排出され、分離２０に送られ得る。
【００６６】
ある実施形態において、アミノ酸、窒素、ミネラル、微量元素、および／またはビタミンなどの栄養が、原料スラリー１６または発酵３０に加えられ得る。例えば、以下のもの：ビオチン、パントテナート、葉酸、ナイアシン、アミノ安息香酸、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、イノシトール、カリウム（例えば、リン酸カリウム）、ホウ酸、カルシウム、塩化物、クロム、銅（例えば、硫酸銅）、ヨウ化物（例えば、ヨウ化カリウム）、鉄（例えば、塩化第二鉄）、リチウム、マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム）、マンガン（例えば、硫酸マンガン）、モリブデン、塩化カルシウム、リン、カリウム、塩化ナトリウム、バナジウム、亜鉛（例えば、硫酸亜鉛）、酵母エキス、大豆ペプトンなどのうちの１つ以上が、原料スラリー１６または発酵３０に加えられ得る。アミノ酸の例としては、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、およびバリンなどの必須アミノ酸ならびにアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、オルニチン、プロリン、セリン、およびチロシンなどの他のアミノ酸が挙げられる。
【００６７】
入口を介した分離２０が、原料スラリー１６から非溶解固体を除去するように構成され得る。分離２０はまた、油を除去し、または油および非溶解固体の両方を除去するように構成され得る。分離２０は、固体と液体を分離することが可能な任意のデバイスであり得る。例えば、分離２０は、例えば、デカンターボウル遠心分離機、三相遠心分離機、ディスクスタック遠心分離機、ろ過遠心分離機、またはデカンター遠心分離機を含む、当業界で用いられる任意の従来の遠心分離機であり得る。ある実施形態において、分離は、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、膜ろ過、クロスフローろ過、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、火格子（ｇｒａｔｅ）または格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、あるいは固体と液体を分離するのに使用され得る任意の方法または分離デバイスによって行われ得る。
【００６８】
分離２０に送られる原料スラリー１６は、分離されて、液相、水流、または水溶液２２（低粘度のマッシュとしても知られている）および固相、固体流、またはウェットケーキ２４が形成され得る。水溶液２２は、例えば、オリゴ糖の形態の糖、および水を含み得る。ある実施形態において、水溶液２２は、少なくとも約１０重量％のオリゴ糖、少なくとも約２０重量％のオリゴ糖、または少なくとも約３０重量％のオリゴ糖を含み得る。ある実施形態において、水溶液２２は、分離２０の上部の近くに位置する出口から排出され得る。ある実施形態において、水溶液２２は、約２０センチポアズ（ｃＰ）未満の粘度を有し得る。ある実施形態において、水溶液２２は、約２０ｇ／Ｌ未満のモノマーグルコース、約１０ｇ／Ｌ未満のモノマーグルコース、または約５ｇ／Ｌ未満のモノマーグルコースを含み得る。高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのモノマーグルコースの量を決定するための好適な方法が、当該技術分野において周知である。
【００６９】
ウェットケーキ２４は、分離２０から排出され得る。ある実施形態において、ウェットケーキ２４は、分離２０の底部の近くに位置する出口から排出され得る。ウェットケーキ２４は、非溶解固体を含み得る。ある実施形態において、ウェットケーキ２４は、糖および水の一部も含み得る。水溶液２２が分離２０から排出されてから、ウェットケーキ２４は、分離２０を用いてさらなる水で洗浄され得る。ある実施形態において、ウェットケーキ２４は、さらなる分離デバイスを用いて、さらなる水で洗浄され得る。ウェットケーキ２４の洗浄により、ウェットケーキ中に存在する糖または糖源（例えば、オリゴ糖）を回収し、回収された糖および水は、液化１０に再利用され得る。洗浄後、ウェットケーキ２４は、任意の好適な公知の方法を用いて、ＤＤＧＳを形成するように処理され得る。ウェットケーキ２４からのＤＤＧＳの形成にはいくつかの利点がある。例えば、非溶解固体が発酵装置に送られないため、非溶解固体は、発酵装置の条件に供されないため、非溶解固体は、発酵装置中に存在する微生物と接触せず、生成物アルコールなどの発酵産物または抽出剤などの他の成分が、非溶解固体に捕捉されない。ＤＤＧＳは、微生物または発酵ブロスの他の成分（例えば、生成物アルコール、抽出剤）を含有しないため、これらの影響が、例えば、動物飼料としてのＤＤＧＳの後の処理および使用に利点を与える。
【００７０】
ある実施形態において、非溶解固体は、原料スラリーから分離されて、２つの生成物流、例えば、原料スラリーと比較してより低い濃度の固体を含有するオリゴ糖の水溶液、および原料スラリーと比較してより高い濃度の固体を含有するウェットケーキが形成され得る。さらに、油を含有する第３の流れが生成され得る。したがって、いくつかの生成物流が、異なる分離技術またはそれらの組合せを用いて生成され得る。例として、原料スラリー１６は、三相遠心分離機を用いて分離され得る。三相遠心分離機は、２つの液相（例えば、水流および油流）および１つの固体流（例えば、固体またはウェットケーキ）を生じる三相分離を可能にする（例えば、Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標），Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  ＡＧ，Ｖｉｌｓｉｂｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙを参照）。２つの液相は、例えば、二次汚染を防止するために２つの排出システムを介してボウルから分離またはデカントされてもよく、固体流は、別個の排出システムを介して除去され得る。
【００７１】
原料１２としてトウモロコシを用いるある実施形態において、三相遠心分離機が、原料スラリー１６（例えば、液化されたトウモロコシマッシュ）から固体およびトウモロコシ油を同時に除去するのに使用され得る。固体は、でんぷんが液化中に可溶性オリゴ糖へと加水分解された後に残る非溶解固体であり、トウモロコシ油は、磨砕および／または液化中に胚芽から取り出された遊離油である。ある実施形態において、三相遠心分離機は、１つの原料流および３つの出口流を有し得る。原料流は、液化中に生成される液化されたトウモロコシマッシュからなり得る。マッシュは、液化でんぷん（例えば、オリゴ糖）の水溶液；トウモロコシに由来する不溶性の非でんぷん成分からなる非溶解固体；ならびにグリセリドおよび遊離脂肪酸からなるトウモロコシ油からなり得る。三相遠心分離機からの３つの出口流は、マッシュからの非溶解固体を含有するウェットケーキ（すなわち、ウェットケーキ２４）；マッシュからの液化でんぷんを含有する重質遠心分離液（ｈｅａｖｙ  ｃｅｎｔｒａｔｅ）流；およびマッシュからのトウモロコシ油を含有する軽質遠心分離液（ｌｉｇｈｔ  ｃｅｎｔｒａｔｅ）流であり得る。ある実施形態において、軽質遠心分離液流（すなわち、油２６）は、油の貯蔵に適した貯蔵タンクまたは任意の槽に送られ得る。ある実施形態において、油は、副産物として販売され、別の副産物に転化され、またはトウモロコシ油をトウモロコシ油脂肪酸に転化する場合などの処理に使用され得る。ある実施形態において、重質遠心分離液流（すなわち、水溶液２２）は、発酵に使用され得る。ある実施形態において、ケーキの液相中の可溶性でんぷんを回収するために、本明細書に記載される蒸発器凝縮物および／または逆流などのウェットケーキは、プロセス再利用水で洗浄され得る。
【００７２】
ある実施形態において、ウェットケーキ２４は、原料スラリー１６から形成される組成物であり、原料スラリー中に存在する少なくとも約５０重量％の非溶解固体、原料スラリー中に存在する少なくとも約５５重量％の非溶解固体、原料スラリー中に存在する少なくとも約６０重量％の非溶解固体、原料スラリー中に存在する少なくとも約６５重量％の非溶解固体、原料スラリー中に存在する少なくとも約７０重量％の非溶解固体、原料スラリー中に存在する少なくとも約７５重量％の非溶解固体、原料スラリー中に存在する少なくとも約８０重量％の非溶解固体、原料スラリー中に存在する少なくとも約８５重量％の非溶解固体、原料スラリー中に存在する少なくとも約９０重量％の非溶解固体、原料スラリー中に存在する少なくとも約９５重量％の非溶解固体、または原料スラリー中に存在する少なくとも約９９重量％の非溶解固体を含み得る。
【００７３】
ある実施形態において、原料スラリー１６から形成される水溶液２２は、原料スラリー中に存在する約５０重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約４５重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約４０重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約３５重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約３０重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約２５重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約２０重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約１５重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約１０重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約５重量％以下の非溶解固体、または原料スラリー中に存在する約１重量％の非溶解固体を含み得る。
【００７４】
水溶液２２を発酵させて、生成物アルコールなどの発酵産物を生成するように構成される発酵３０は、水溶液２２を受け入れるための入口を有する。発酵３０は、発酵ブロスを含み得る。ある実施形態において、細菌、シアノバクテリア、糸状菌、および酵母からなる群から選択される微生物３２が、発酵ブロスに含まれるべく発酵３０に導入され得る。ある実施形態において、微生物３２は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの細菌であり得る。ある実施形態において、微生物３２は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であり得る。ある実施形態において、微生物３２は、水溶液２２中の糖を消費し、ブタノールを生成する。ある実施形態において、微生物３２は、組み換え微生物であり得る。
【００７５】
ある実施形態において、微生物３２は、生合成経路を含むように改変され得る。ある実施形態において、生合成経路は、ブタノール生合成経路であり得る。ある実施形態において、ブタノール生合成経路は、１−ブタノール生合成経路、２−ブタノール生合成経路、またはイソブタノール生合成経路であり得る。ある実施形態において、生合成経路は、ピルビン酸を発酵産物に転化する。ある実施形態において、生合成経路は、ピルビン酸ならびにアミノ酸を発酵産物に転化する。ある実施形態において、生合成経路は、生合成経路の基質−生成物転化を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１種の異種のポリヌクレオチドを含む。ある実施形態において、生合成経路の各基質−生成物転化は、異種のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドによって触媒される。生合成経路を含む微生物による生成物アルコールの生成の例が、例えば、米国特許第７，８５１，１８８号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書；同第２００７／０２５９４１０号明細書；同第２００７／０２９２９２７号明細書；同第２００８／０１８２３０８号明細書；同第２００８／０２７４５２５号明細書；同第２００９／０１５５８７０号明細書；同第２００９／０３０５３６３号明細書；および同第２００９／０３０５３７０号明細書に開示されており、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される。
【００７６】
ある実施形態において、微生物３２はまた、吸着、共有結合、架橋、閉じ込め、および封入などによって固定化され得る。細胞を閉じ込めるための方法が、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１／０３０６１１６号明細書など、当該技術分野において公知である。
【００７７】
本明細書に記載される方法およびシステムのある実施形態において、原位置生成物除去（ＩＳＰＲ）が、発酵ブロスから生成物アルコール（例えば、ブタノール）などの発酵産物を除去するのに用いられ得る。ある実施形態において、発酵産物が微生物によって生成されるにつれて、ＩＳＰＲが、発酵３０中で、または発酵３０の外部で、例えば、液液抽出を用いて行われ得る。抽出発酵を用いて発酵ブロスから生成物アルコールを生成し、回収するための方法が、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０２２１８０２号明細書；米国特許出願公開第２０１１／００９７７７３号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４４号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４３号明細書；および米国特許出願公開第２０１２／０１５６７３８号明細書に記載されており；それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される。
【００７８】
ある実施形態において、発酵３０は、抽出剤３４を受け入れるための入口を有し得る。ある実施形態において、抽出剤３４は、発酵３０の外部で発酵ブロスに加えられ得る。ある実施形態において、抽出剤３４は、外部の抽出器または外部の抽出ループに加えられ得る。抽出３４を発酵３０にまたは発酵３０の外部に加える代替的な手段は、点線で表される。ある実施形態において、抽出剤３４は、不混和性有機溶媒であり得る。ある実施形態において、抽出剤３４は、水不混和性有機溶媒であり得る。ある実施形態において、抽出剤３４は、飽和、単不飽和、多価不飽和化合物、およびそれらの混合物からなる群から選択される有機抽出剤であり得る。ある実施形態において、抽出剤３４は、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アミド、およびそれらの混合物からなる群から選択され得る。ある実施形態において、抽出剤３４はまた、Ｃ４〜Ｃ２２の脂肪アルコール、Ｃ４〜Ｃ２８の脂肪酸、Ｃ４〜Ｃ２８の脂肪酸のエステル、Ｃ４〜Ｃ２２の脂肪アルデヒド、およびそれらの混合物からなる群から選択され得る。ある実施形態において、抽出剤３４は、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルコール、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪酸のエステル、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アルデヒド、Ｃ１２〜Ｃ２２の脂肪アミド、およびそれらの混合物から選択される第１の抽出剤；およびＣ７〜Ｃ１１の脂肪アルコール、Ｃ７〜Ｃ１１の脂肪酸、Ｃ７〜Ｃ１１の脂肪酸のエステル、Ｃ７〜Ｃ１１の脂肪アルデヒド、およびそれらの混合物から選択される第２の抽出剤を含み得る。ある実施形態において、抽出剤３４は、カルボン酸であり得る。ある実施形態において、抽出剤３４は、トウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）または大豆油脂肪酸（ＳＯＦＡ）であり得る。ある実施形態において、抽出剤３４は、オレイルアルコール、ベヘニルアルコール、セチルアルコール、ラウリルアルコール、ミリスチルアルコール、ステアリルアルコール、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸メチル、オレイン酸メチル、１−ノナノール、１−デカノール、２−ウンデカノール、１−ノナナール、１−ウンデカノール、ウンデカナール、ラウリンアルデヒド、２０−メチルウンデカナール、およびそれらの混合物などの有機抽出剤であり得る。本明細書に記載され、図に示される方法およびシステムでは、抽出剤が、発酵装置または外部の抽出器に加えられ得る。
【００７９】
ある実施形態において、抽出剤は、特定の特性に基づいて選択され得る。例えば、抽出剤は、高いＫｄを有し得る。Ｋｄは、抽出剤相（例えば、有機相）と水相との間での発酵産物（例えば、生成物アルコール）の分配係数を指す。ある実施形態において、抽出剤は、高い選択性を有し得る。例えば、選択性は、抽出剤によって取り込まれる水に対する生成物アルコールの相対量を指す。
【００８０】
ある実施形態において、抽出剤は、生体適合性であり得る。ある実施形態において、生体適合性は、微生物が抽出剤の存在下で発酵性炭素源を利用する能力の尺度を指す。ある実施形態において、抽出剤は、生体適合性抽出剤と非生体適合性抽出剤との混合物であり得る。ある実施形態において、非生体適合性抽出剤は、微生物が発酵性炭素源を利用する能力を妨げる抽出剤を指す。例えば、非生体適合性抽出剤の存在下で、微生物は、抽出剤が存在しない場合の率の約５０％を超える率で発酵性炭素源を利用しない。ある実施形態において、非生体適合性抽出剤の存在下で、微生物は、抽出剤が存在しない場合の率の約２５％を超える率で発酵性炭素源を利用しない。生体適合性抽出剤と非生体適合性抽出剤との混合物の例としては、以下に限定はされないが、オレイルアルコールおよびノナノール、オレイルアルコールおよび１−ウンデカノール、オレイルアルコールおよび２−ウンデカノール、オレイルアルコールおよび１−ノナナール、オレイルアルコールおよびデカノール、およびオレイルアルコールおよびドデカノールが挙げられる。生体適合性および非生体適合性抽出剤のさらなる例が、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１／００９７７７３号明細書に記載されている。
【００８１】
抽出剤３４は、発酵ブロスと接触し、二相混合物（すなわち、水相および有機相）を含む流れ３６が形成される。発酵産物が生成物アルコールである場合、発酵ブロス中に存在する生成物アルコールが、抽出剤３４に移され、生成物アルコール（例えば、有機相）に富んだ抽出剤が形成される。ある実施形態において、流れ３６は、発酵３０の出口を通って排出され得る。生成物アルコールは、従来の技術を用いて、流れ３６中の抽出剤から分離され得る。原料流が、発酵３０に加えられ得る。発酵３０は、当該技術分野において公知の任意の好適な発酵装置であり得る。
【００８２】
ある実施形態において、抽出剤３４が発酵ブロスに加えられない場合、流れ３６は、発酵ブロスおよび生成物アルコールを含む。生成物アルコールおよび発酵ブロスを含む流れ３６またはその一部は、発酵３０から排出され、生成物アルコールの回収のためにさらに処理され得る。ある実施形態において、発酵ブロスは、発酵３０に再利用され得る。
【００８３】
ある実施形態において、同時糖化発酵（ＳＳＦ）が、発酵３０中で行われ得る。酸プロセス、酵素プロセス、または酸−酵素プロセスを含むがこれらに限定されない、当業界で用いられる任意の公知の糖化プロセスが使用され得る。ある実施形態において、グルコアミラーゼなどの酵素３８が、原料スラリー１６または水溶液２２中の糖類（例えば、オリゴ糖）を加水分解して単糖類を形成するために導入され得る。本発明の方法およびシステムに使用され得るグルコアミラーゼの例が、米国特許第７，４１３，８８７号明細書；米国特許第７，７２３，０７９号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２７５０８０号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０２６７１１４号明細書；米国特許出願公開第２０１１／００１４６８１号明細書；米国特許出願公開第２０１１／００２０８９９号明細書に記載されており、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される。ある実施形態において、グルコアミラーゼは、発酵産物（例えば、生成物アルコール）も生成する組み換え微生物によって発現され得る。
【００８４】
ある実施形態において、グルコアミラーゼなどの酵素が、液化に加えられ得る。液化へのグルコアミラーゼなどの酵素の添加により、原料スラリーまたは液化されたマッシュの粘度が低下され得、分離効率が向上され得る。ある実施形態において、原料スラリーの粘度を低下させることが可能な任意の酵素が使用され得る（例えば、Ｖｉｓｃｏｚｙｍｅ（登録商標），Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。原料の粘度は、実施例２２に記載される方法を含む、当該技術分野において公知の任意の方法によって測定され得る。
【００８５】
ある実施形態において、流れ３５が、発酵３０の出口から排出され得る。排出される流れ３５は、酵母などの微生物３２を含み得る。微生物３２は、例えば、遠心分離（図示せず）によって、流れ３５から分離され得る。その後、微生物３２は、発酵３０に再利用することができ、発酵３０は、時間の経過とともに、生成物アルコールの生成速度を上げ、それによって、生成物アルコール生成の効率を高めることができる。
【００８６】
流れ３５の一部が発酵３０を出るとき、流れ３５は、原料スラリー中に存在する約５０重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約４５重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約４０重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約３５重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約３０重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約２５重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約２０重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約１５重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約１０重量％以下の非溶解固体、原料スラリー中に存在する約５重量％以下の非溶解固体、または原料スラリー中に存在する約１重量％以下の非溶解固体を含み得る。
【００８７】
ある実施形態において、例えば、図２に示されるように、本発明の方法およびシステムは、原料１２を乾式粉砕するように構成される粉砕機４０を含み得る。原料１２は、入口を通って粉砕機４０に入り得る。粉砕機４０は、原料１２を粉砕または磨砕し得る。ある実施形態において、原料１２は、分画されなくてもよい。ある実施形態において、原料１２は、分画されていないトウモロコシの実であり得る。粉砕機４０は、任意の好適な公知の粉砕機、例えば、ハンマーミルであり得る。乾式粉砕された原料４４は、出口を通して粉砕機４０から排出され、液化１０に入る。図２の残りの部分は図１と同様であるため、再度詳細に説明しない。他の実施形態において、原料は、分画されないか、および／または乾式粉砕される代わりに、当業界で公知のように分画および／または湿式粉砕され得る。
【００８８】
湿式粉砕は、各副産物から別々に価値を得るために、バイオマスを、胚芽、種皮繊維、でんぷん、およびグルテンなどのいくつかの成分に分離する多工程プロセスである。原料としてトウモロコシを用いて、このプロセスにより、いくつかの副産物：でんぷん、グルテンフィード、グルテンミール、およびトウモロコシ油流が生成される。これらの流れは、再結合され、飼料業界向けにカスタマイズされた製品を生成するように処理され得る。湿式粉砕プロセスの例として、原料（例えば、トウモロコシ）が、浸漬タンクに送られてもよく、ここで原料は、約１２０〜１３０°Ｆ（約５０〜５５℃）で約３０〜５０時間にわたって、例えば、二酸化ナトリウム溶液に浸漬される。水中に放出される栄養が、収集され、蒸発されて、凝縮された発酵抽出物（または浸出液）が生成され得る。胚芽は、浸漬された原料から除去され、油および胚芽ミールを回収するようにさらに処理され得る。胚芽の除去の後、原料の残りの部分は、ふすまを除去し、でんぷんおよびグルテンスラリーを生成するように処理され得る。スラリーは、でんぷんおよびグルテンタンパク質（これが、乾燥されて、グルテンミールが形成され得る）を分離するようにさらに処理され得る。でんぷん流は、発酵産物（例えば、生成物アルコール）を生成するように発酵によってさらに処理されてもよく、または食品、紙、または繊維業界によって用いられ得る。例えば、でんぷん流は、甘味料を生成するのに使用され得る。タンパク質、脂肪、および繊維をいずれも含有するグルテンミールおよびグルテンフィード流は、乳牛および肉牛、家禽、ブタ、家畜、ウマ、水産養殖、およびペット用の飼料に使用され得る。グルテンフィードは、添加される微量栄養素の担体としても使用され得る。グルテンミールは、例えば、家禽飼料中で顔料成分として使用され得るメチオニンおよびキサントフィルも含有し得る（例えば、顔料は、黄色の着色を有する卵黄を提供する）。タンパク質、成長因子、ビタミンＢ、およびミネラルを含有する凝縮された発酵抽出物が、高エネルギー液体飼料成分として使用され得る。凝縮された抽出物は、ペレット結合剤としても使用され得る。このプロセスにより、精製されたでんぷん流が得られるが；このプロセスはコストがかかり、バイオマスを、発酵生成に不要であり得るその非でんぷん成分に分離することを含む。
【００８９】
分画により、磨砕された全粒トウモロコシ中に存在する脂質（例えば、油）の大部分を含有する繊維および胚芽が除去され、より高いでんぷん（胚乳）含量を有する分画されたトウモロコシが得られる。ある実施形態において、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれ以上の油が、分画によって胚芽から除去され得る。ある実施形態において、分画により、原料の非溶解固体含量が、原料の少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、または少なくとも約５％まで減少され得る。
【００９０】
乾式分画は、繊維から胚芽を分離しないため、湿式粉砕よりコストが低い。分画の利点としては、例えば、生成物の向上した収率、発酵装置中の増加した体積（すなわち、空間）、より小さいカラム直径、より低い酵素充填および糖化の向上した効率、向上した油の除去、油の存在による装置の詰まりの減少、より少ない清掃のための運転停止、ＤＤＧＳ中の増加したタンパク質レベル、ＤＤＧＳの減少した乾燥時間、および減少したエネルギー消費が挙げられる。しかしながら、分画は、繊維または胚芽の全体を除去せず、固体を完全に除去しない。さらに、分画の際にでんぷんをいくらか損失する。
【００９１】
乾式粉砕は、原料処理にも用いられ得る。原料は、例えば、ハンマーミルを用いて粉砕されて、ミールが生成され得、次に、これが、水と混合されて、スラリーが形成され得る。スラリーは、でんぷんを加水分解して糖類にし、マッシュを形成するために、アミラーゼなどの酵素の添加によって液化に供され得る。マッシュは、酵素を不活性化するために加熱（「調理」）され、次に、発酵に加えるために冷却され得る。冷却されたマッシュ、微生物、およびグルコアミラーゼなどの酵素が、発酵産物（例えば、生成物アルコール）の生成のために発酵に加えられ得る。発酵の後、発酵ブロスは、発酵産物の回収のために蒸留に送られ得る。非溶解固体が除去されていない場合、蒸留塔の塔底流は、さらなる処理のために収集され得る、発酵されていない固体（例えば、蒸留穀類固体）、溶解材料、および水を含有する全蒸留廃液である。例えば、全蒸留廃液は、固体（例えば、ウェットケーキ）および希薄な蒸留廃液へと分離され得る。分離は、遠心分離、ろ過、ふるい分け分離、ハイドロクロン、あるいは固体から液体を分離するための任意の他の手段または分離デバイスを含むがこれらに限定されないいくつかの手段によって行われ得る。希薄な蒸留廃液は、蒸発に送られて、濃縮蒸留可溶物（ＣＤＳ）またはシロップが形成され得る。希薄な蒸留廃液は、可溶性の栄養、小穀物固体（または微粒子）、および微生物を含み得る。固体（例えば、ウェットケーキ）は、シロップと組み合わされ、次に、乾燥されて、ＤＤＧＳが形成され得る。シロップは、タンパク質、脂肪、および繊維ならびにビタミンおよびリンおよびカリウムなどのミネラルを含有し；その栄養価および嗜好性のために動物飼料に加えられ得る。ＤＤＧＳは、タンパク質、脂肪、および繊維を含有し；バイパスタンパク質源を提供する。ＤＤＧＳは、乳牛および肉牛、家禽、ブタ、家畜、ウマ、水産養殖、およびペット用の動物飼料に使用され得る。
【００９２】
ある実施形態において、例えば、図３に示されるように、本発明の方法およびシステムは、分離２０の出口からの油２６の排出を含み得る。図３は、油流２６が分離２０を出ることを除いて図１と同様であるため、再度詳細に説明しない。
【００９３】
分離２０に送られる原料スラリー１６は、発酵性糖を含有する第１の液相または水溶液２２、油２６を含有する第２の液相、および非溶解固体を含有する固相またはウェットケーキ２４へと分離され得る。任意の好適な分離デバイス、例えば、三相遠心分離機が、水溶液２２（または水流）、ウェットケーキ２４（または固体流）、および油２６（または油流）を排出するのに使用され得る。ある実施形態において、原料１２はトウモロコシであり、油２６は、トウモロコシ油（例えば、フリートウモロコシ油）である。本明細書において使用される際のフリートウモロコシ油という用語は、トウモロコシの胚芽を含まないトウモロコシ油を意味する。ある実施形態において、油２６は、油の貯蔵に適した貯蔵タンクまたは任意の槽に送られ得る。ある実施形態において、原料がトウモロコシである場合、トウモロコシ油などの原料１２からの油の一部が、ウェットケーキ２４中に残る。
【００９４】
ある実施形態において、油２６が、原料１２から分離２０を介して除去されるとき、発酵３０中の発酵ブロスは、減少された量のトウモロコシ油を含む。ある実施形態において、発酵ブロスは、約２５重量％以下の非溶解固体を有し、発酵ブロスは、約１５重量％以下の非溶解固体を有し、発酵ブロスは、約１０重量％以下の非溶解固体を有し、発酵ブロスは、約５重量％以下の非溶解固体を有し、発酵ブロスは、約１重量％以下の非溶解固体を有し、または発酵ブロスは、約０．５重量％以下の非溶解固体を有する。
【００９５】
ある実施形態において、図２の方法およびシステムは、図３の方法およびシステムに関連して本明細書に記載される分離２０からの油流の排出を含むように変更され得る。
【００９６】
図４に示されるように、油が別々に排出されない場合、油はウェットケーキ２４とともに除去され得る。ウェットケーキ２４が、分離２０を介して除去されるとき、ある実施形態において、原料がトウモロコシである場合、トウモロコシ油などの原料１２からの油の一部が、ウェットケーキ２４中に残る。ウェットケーキ２４は、混合６０に送られ、水または他の溶媒と組み合わされて、ウェットケーキ混合物６５が形成され得る。ある実施形態において、水は、新鮮な水、逆流、調理水、プロセス水、蒸留残留水、蒸発水、または発酵処理施設で入手可能な任意の水源、またはそれらの任意の組合せであり得る。ウェットケーキ混合物６５は、分離７０に送られ、ウェットケーキ２４から回収される発酵性糖、およびウェットケーキ７４を含む洗浄遠心分離液７５が生成され得る。洗浄遠心分離液７５は、液化１０に再利用され得る。図４の残りの部分は図１と同様であるため、再度詳細に説明しない。
【００９７】
ある実施形態において、分離７０は、例えば、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、膜ろ過、クロスフローろ過、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せを含む、固体および液体を分離することが可能な任意の分離デバイスであり得る。
【００９８】
ある実施形態において、ウェットケーキは、１回以上の洗浄サイクルまたは洗浄システムに供され得る。例えば、ウェットケーキ７４は、ウェットケーキ７４を第２の洗浄システムに送ることによって、さらに処理され得る。ある実施形態において、ウェットケーキ７４は、第２の混合６０’に送られ、ウェットケーキ混合物６５’が形成され得る。ウェットケーキ混合物６５’は、第２の分離７０’に送られ、洗浄遠心分離液７５’およびウェットケーキ７４’が生成され得る。洗浄遠心分離液７５’は、液化１０に再利用されてもよく、および／または洗浄遠心分離液７５’は、洗浄遠心分離液７５と組み合わされてもよく、組み合わされた洗浄遠心分離液は、液化１０に再利用され得る。ウェットケーキ７４’は、本明細書に記載されるさらなる処理のためにウェットケーキ７４と組み合わされ得る。ある実施形態において、分離７０’は、例えば、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、膜ろ過、クロスフローろ過、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せを含む、固体および液体を分離することが可能な任意の分離デバイスであり得る。ある実施形態において、ウェットケーキは、１回、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上の洗浄サイクルまたは洗浄システムに供され得る。
【００９９】
ウェットケーキ７４は、可溶物と組み合わされ、次に、乾燥されて、任意の好適な公知のプロセスを通してＤＤＧＳが形成され得る。ウェットケーキ７４からのＤＤＧＳの形成にはいくつかの利点がある。例えば、非溶解固体が発酵装置に加えられないため、非溶解固体は、発酵装置の条件に供されないため、非溶解固体は、発酵装置中に存在する微生物と接触せず、生成物アルコールなどの発酵産物または抽出剤などの他の成分が非溶解固体に捕捉されない。ＤＤＧＳは、微生物または発酵ブロスの他の成分（例えば、生成物アルコール、抽出剤）を含有しないため、これらの影響が、例えば、動物飼料としてのＤＤＧＳの後の処理および使用に利点を与える。
【０１００】
図４に示されるように、油は、ウェットケーキから別々に排出されず、油は、ウェットケーキの一部として含まれ、最終的にＤＤＧＳ中に存在する。トウモロコシが、原料として用いられる場合、トウモロコシ油は、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、脂肪酸、およびリン脂質を含有し、これらは、動物の代謝エネルギー源を提供する。ウェットケーキ中および最終的にＤＤＧＳ中の油の存在により、望ましい動物飼料、例えば、高脂肪含量の動物飼料が得られる。
【０１０１】
ある実施形態において、油が、ＤＤＧＳから分離され、同じかまたは異なる発酵プロセスにおいてその後の使用のためにＩＳＰＲ抽出剤に転化され得る。バイオマスから抽出剤を得るための方法が、米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４３号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４４号明細書、米国特許出願公開第２０１２／０１５６７３８号明細書、およびＰＣＴ国際公報の国際公開第２０１１／１５９９９８号パンフレットに記載されており；それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される。油が、例えば、溶媒抽出プロセスを含む任意の好適な公知のプロセスを用いてＤＤＧＳから分離され得る。本発明の一実施形態において、ＤＤＧＳは、抽出槽に充填され、ヘキサンなどの溶媒で洗浄されて、油が除去される。用いられ得る他の溶媒としては、例えば、イソブタノール、イソヘキサン、エタノール、石油エーテルなどの石油蒸留物、またはそれらの混合物が挙げられる。油の抽出の後、ＤＤＧＳは、一切の残留溶媒を除去するように処理され得る。例えば、ＤＤＧＳは、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて、一切の残留溶媒を蒸発させるように加熱され得る。溶媒を除去した後、ＤＤＧＳは、一切の残留水を除去するように乾燥プロセスに供され得る。処理されたＤＤＧＳは、乳牛および肉牛、家禽、ブタ、家畜、ウマ、水産養殖、およびペットなどの動物用の補足飼料として使用され得る。
【０１０２】
ＤＤＧＳからの抽出の後、得られる油および溶媒混合物は、溶媒から油を分離するために収集され得る。一実施形態において、油／溶媒混合物は、蒸発によって処理されてもよく、それによって、溶媒は蒸発され、収集され、再利用され得る。回収された油は、同じかまたは異なる発酵プロセスにおいてその後の使用のためにＩＳＰＲ抽出剤に転化され得る。
【０１０３】
発酵装置中に存在する油が脂肪酸およびグリセリンに加水分解され得るため、原料の油成分の除去は生成にとって有利である。グリセリンは、水中に蓄積し、発酵システム全体にわたって再利用のために利用可能な水の量を減少させ得る。したがって、原料の油成分の除去は、システムを通して再利用され得る水の量を増加させることによって、生成の効率を高める。さらに、油の除去は、より効率的な発酵による生産工場のエネルギー節約、油の除去による汚損の減少、発酵装置体積効率の向上、およびエネルギー必要量、例えば、穀類蒸留粕を乾燥させるのに必要なエネルギーの減少をもたらし得る。
【０１０４】
図５に示されるように、油が、本明細書に記載されるプロセス中の様々な時点で除去され得る。原料スラリー１６は、例えば、三相遠心分離機を用いて、第１の液相または水溶液２２（または水流）、油２６を含む第２の液相（または油流）、および固相またはウェットケーキ２４（または固体流）へと分離され得る。ウェットケーキ２４は、発酵性糖および油を回収するようにさらに処理され得る。ウェットケーキ２４は、混合６０に送られ、水または他の溶媒と組み合わされて、ウェットケーキ混合物６５が形成され得る。ある実施形態において、水は、逆流、調理水、プロセス水、蒸留残留水、蒸発から収集される水、または発酵処理施設で入手可能な任意の水源、またはそれらの任意の組合せであり得る。ウェットケーキ混合物６５は、分離７０（例えば、三相遠心分離機）に送られ、発酵性糖、油７６、およびウェットケーキ７４を含む洗浄遠心分離液７５が生成され得る。洗浄遠心分離液７５は、液化１０に再利用され得る。油７６および油２６は、組み合わされ、様々な消費者製品の製造のためにさらに処理され得る。ある実施形態において、油（例えば、油２６、油７６）は、抽出剤を生成するようにさらに処理され得る。例えば、油は、化学的にまたは酵素的に処理されて、抽出剤が生成され得る。油がトウモロコシ油である、ある実施形態において、トウモロコシ油は、化学的にまたは酵素的に処理されて、脂肪酸（例えば、トウモロコシ油脂肪酸）が生成されてもよく、これが、抽出剤として使用され得る。油が酵素的に処理されるある実施形態において、酵素反応は、酵素を不活性化するために、転化の後、処理（例えば、熱）に供され得る。ある実施形態において、油は、エステラーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、リゾホスホリパーゼ、またはそれらの組合せなどの酵素を用いて、酵素的に処理され得る。ある実施形態において、油は、水酸化アンモニウム、無水アンモニア、酢酸アンモニウム、過酸化水素、トルエン、氷酢酸、またはそれらの組合せで化学的に処理され得る。バイオマスから抽出剤を得るための方法が、米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４３号明細書および米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４４号明細書に記載されており、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される。油がトウモロコシ油である、ある実施形態において、原料スラリーは、少なくとも約１重量％、少なくとも約２重量％、少なくとも約３重量％、少なくとも約４重量％のトウモロコシ油、または少なくとも約５重量％のトウモロコシ油を含み得る。図５の残りの部分は図１と同様であるため、再度詳細に説明しない。
【０１０５】
本明細書に記載されるように、ウェットケーキは、１回以上の洗浄サイクルまたは洗浄システムに供され得る。ある実施形態において、ウェットケーキ７４は、第２の混合６０’に送られ、ウェットケーキ混合物６５’が形成され得る。ウェットケーキ混合物６５’は、第２の分離７０’に送られ、洗浄遠心分離液７５’、油７６’、およびウェットケーキ７４’が生成され得る。洗浄遠心分離液７５’は、液化１０に再利用されてもよく、および／または洗浄遠心分離液７５’は、洗浄遠心分離液７５と組み合わされてもよく、組み合わされた洗浄遠心分離液は、液化１０に再利用され得る。ウェットケーキ７４’は、本明細書に記載されるさらなる処理のためにウェットケーキ７４と組み合わされ得る。油７６、油７６’、および油２６は、組み合わされ、様々な消費者製品の製造のためにさらに処理され得る。ある実施形態において、油（例えば、油２６、油７６、油７６’）は、本明細書に記載されるように抽出剤を生成するようにさらに処理され得る。バイオマスから抽出剤を得るための方法が、米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４３号明細書および米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４４号明細書に記載されており、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０１０６】
図６に示されるように、水溶液２２およびウェットケーキ２４は、組み合わされ、冷却され、発酵３０に送られ得る。原料スラリー１６は、例えば、三相遠心分離機を用いて、第１の液相または水溶液２２、油２６を含む第２の液相、および固相またはウェットケーキ２４へと分離され得る。ある実施形態において、油２６（または油流）は、油の貯蔵に適した貯蔵タンクまたは任意の槽に送られ得る。水溶液２２（または水流）およびウェットケーキ２４（固体流）は、混合８０に送られ、再スラリー化され、水溶液／ウェットケーキ混合物８２が形成され得る。混合物８２は、冷却器９０に送られ、冷却された混合物９２が生成されてもよく、これが、発酵３０に送られ得る。ある実施形態において、油２６が、分離２０を介して原料１２から除去される場合、混合物８２および９２は、減少された量のトウモロコシ油を含む。図６の残りの部分は図１と同様であるため、再度詳細に説明しない。
【０１０７】
ある実施形態において、例えば、図７および８に示されるように、糖化は、分離２０と発酵３０との間（図７）または液化１０と分離２０との間（図８）に位置する別個の糖化システム５０において行われ得る。図７および８は、別個の糖化５０を含むことおよび発酵３０が酵素３８を受け入れないことを除いて、図１と同様である。ある実施形態において、酵素３８はまた、発酵３０に加えられ得る。
【０１０８】
酸プロセス、酵素プロセス、または酸−酵素プロセスを含むがこれらに限定されない、当業界で用いられる任意の公知の糖化プロセスが使用され得る。糖化５０が、任意の好適な糖化槽で行われ得る。ある実施形態において、グルコアミラーゼなどの酵素３８が、原料スラリー１６または水溶液２２中の糖類（例えば、オリゴ糖）を加水分解して単糖類を形成するために導入され得る。例えば、図７において、分離２０から排出され、入口を通して糖化５０に送られる、水溶液２２中に存在するオリゴ糖が、単糖類に加水分解される。単糖類を含有する水溶液５２が、出口を通して糖化５０から排出され、発酵３０に送られる。あるいは、図８に示されるように、液化１０から排出され、入口を通して糖化５０に送られる、原料スラリー１６中に存在するオリゴ糖が、単糖類に加水分解される。単糖類を含有する原料スラリー５４が、出口を通して糖化５０から排出され、分離２０に送られる。
【０１０９】
ある実施形態において、図１〜６のシステムおよび方法は、図７および８のシステムおよび方法に関連して本明細書に記載されるように別個の糖化システムを含むように変更され得る。
【０１１０】
ある実施形態において、例えば、図９Ａ〜９Ｄに示されるように、本発明のシステムおよび方法は、一連の２つ以上の分離デバイスを含み得る。図９Ａ〜９Ｄは、分離システムが追加されたことを除いて図１と同様であるため、再度詳細に説明しない。
【０１１１】
分離２０から排出される水溶液２２は、分離２０’に送られ得る。分離２０’は、分離２０と同一であってもよく、または分離２０と異なっていてもよく、同じように動作し得る。分離２０’は、水溶液２２から分離されない非溶解固体および油を除去して、（ｉ）水溶液２２と比較して減少された量の非溶解固体および油を含有する以外は水溶液２２と類似の水溶液２２’、（ｉｉ）ウェットケーキ２４と類似のウェットケーキ２４’、および（ｉｉｉ）油２６と類似の油２６’を生成し得る。次に、水溶液２２’は、発酵３０に導入され得る。ある実施形態において、分離２０’の後に１つ以上のさらなる分離デバイスが存在し得る。
【０１１２】
ある実施形態において、分離２０’は、例えば、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、膜ろ過、クロスフローろ過、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せを含む、固体および液体を分離することが可能な任意の分離デバイスであり得る。
【０１１３】
ある実施形態において、図１〜９のシステムおよび方法は、本明細書に記載されるシステムおよび方法に関連して本明細書に記載されるように非溶解固体を除去するためのさらなる分離デバイスを含むように変更され得る。
【０１１４】
ある実施形態において、流れ３５は、発酵３０の出口から排出され得る。流れ３５を介して発酵３０を出る非溶解固体がないかまたは最小限であることには、いくつかのさらなる利点がある。例えば、ビール塔（ｂｅｅｒ  ｃｏｌｕｍｎ）または蒸留塔などの、例えば、下流の処理におけるユニットおよび作業の必要性を、減少させるかまたはなくし、それによって、生成の効率を高めることができる。また、発酵装置を出る流れ中の非溶解固体がより少ないことの結果として、全蒸留廃液の遠心分離機の一部または全てを省略することができる。
【０１１５】
図９Ｂを参照すると、分離２０から排出される水溶液２２は、分離２０’に送られ得る。分離２０’は、分離２０と同一であってもよく、または分離２０と異なっていてもよい。分離２０’は、抽出剤または凝集剤などの分離添加剤２８を含み得るように動作し得る。分離添加剤２８は、油または固体の除去を補助し得る。分離２０’は、水溶液２２から分離されない非溶解固体および油を除去して、（ｉ）水溶液２２と比較して減少された量の非溶解固体および油を含有する以外は水溶液２２と類似の水溶液２２’、および（ｉｉ）油２６およびウェットケーキ２４の組み合わされた流れと同様であり得、分離添加剤２８も含有し得る流れ２３を生成し得る。流れ２３は、分離２０”に送られてもよく、分離添加剤２８’、およびウェットケーキ２４’を含有する流れを生成し得る。分離２０”は、分離２０および分離２０’と同一であってもよく、または分離２０および分離２０’と異なっていてもよい。水溶液２２’は、発酵３０に導入され得る。
【０１１６】
ある実施形態において、分離２０、分離２０’、および分離２０”は、例えば、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、膜ろ過、クロスフローろ過、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せを含む、固体および液体を分離することが可能な任意の分離デバイスであり得る。
【０１１７】
図９Ｃを参照すると、原料スラリー１６は、液化１０から排出され、分離２０に送られ得る。原料スラリー１６は、分離されて、以下の流れ：（ｉ）水溶液２２、（ｉｉ）ウェットケーキ２４、および（ｉｉｉ）油、固体、および発酵性炭素源を含む水流を含む流れ２５が生成され得る。ある実施形態において、流れ２５の固体は、軽質の固体であり得る。ある実施形態において、軽質の固体は、水より低密度であるが、油より高密度である固体であり得る。ある実施形態において、軽質の固体は、油中で被覆され、水より低密度の固体になり得る。ある実施形態において、固体は、親油性および／または親水性を有し得る。ある実施形態において、流れ２５の固体は、以下のもの：胚芽、繊維、でんぷん、およびグルテンのうちの１つ以上を含み得る。ある実施形態において、流れ２５の固体は、微粒子を含み得る。ある実施形態において、流れ２５の固体は、胚芽、グルテン、および繊維を含む。ある実施形態において、発酵性炭素源を含む水溶液２２は、本明細書に記載される発酵産物の生成のために発酵３０に送られ得る。ある実施形態において、ウェットケーキ２４は、本明細書に記載されるようにさらに処理され、例えば、ＤＤＧＳを形成するように処理され得る。
【０１１８】
分離２０から排出される流れ２５は、分離２０’に送られ得る。分離２０’は、分離２０と同一であってもよく、または分離２０と異なっていてもよい。ある実施形態において、分離２０および分離２０’は、例えば、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、膜ろ過、クロスフローろ過、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せを含む、固体および液体を分離することが可能な任意の分離デバイスであり得る。ある実施形態において、分離は、単一工程プロセスであり得る。
【０１１９】
流れ２５は、分離２０’によって分離されて、以下の流れ：（ｉ）水溶液２２’、（ｉｉ）ウェットケーキ２４’、および（ｉｉｉ）油２６が生成され得る。ある実施形態において、水溶液２２’は、水溶液２２と組み合わされてもよく、組み合わされた水溶液は、発酵３０に送られ得る。ある実施形態において、水溶液２２’中の固体の量は、水溶液２２中の固体の量と比較して減少される。ある実施形態において、水溶液２２’は、油を含んでいてもよく、水溶液２２’中の油は、抽出剤を生成するようにさらに処理され得る。例えば、水溶液２２’は、化学的にまたは酵素的に処理されて、抽出剤が生成され得る。ある実施形態において、水溶液２２’は、化学的にまたは酵素的に処理されて、抽出剤として使用され得る脂肪酸（例えば、トウモロコシ油脂肪酸）が生成され得る。水溶液２２’が酵素的に処理されるある実施形態において、酵素反応は、酵素を不活性化するために、転化の後、処理（例えば、熱）に供され得る。比較的小さい流れ体積を有する水溶液２２’中の油を脂肪酸に転化することにより、酵素的または化学的転化を介して抽出剤を生成する資本コストが減少され得る。バイオマスから抽出剤を得るための方法が、米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４３号明細書および米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４４号明細書に記載されており、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０１２０】
ある実施形態において、ウェットケーキ２４’は、ウェットケーキ２４と組み合わされてもよく、組み合わされたウェットケーキは、本明細書に記載されるようにさらに処理され得る。ある実施形態において、ウェットケーキ２４’は、油を含んでいてもよく、およびこの油富化ウェットケーキは、ウェットケーキ２４を組み合わされて、動物飼料の代謝エネルギー源を提供し得る増加した脂肪含量（例えば、増加したトリグリセリド含量）を有するウェットケーキが生成され得る。ある実施形態において、増加した脂肪含量を有するこのウェットケーキは、シロップと組み合わされて、高トリグリセリド、高タンパク質、低炭水化物ＤＤＧＳが生成され得る。ある実施形態において、油を含むウェットケーキ２４’は、例えば、ＤＤＧＳを生成するように、本明細書に記載されるようにさらに処理され得る。
【０１２１】
ある実施形態において、油２６は、油の貯蔵に適した貯蔵タンクまたは任意の槽に送られ得る。ある実施形態において、油２６またはその一部が、原料スラリー１６と組み合わされ得る（点線、図９Ｃ）。原料スラリーへの油の添加は、捕捉される固体の量を増加させることによって、流れ２５を介した固体の除去を向上させ得る。
【０１２２】
ある実施形態において、油２６は、本明細書に記載されるように抽出剤を生成するようにさらに処理され得る。比較的小さい流れ体積を有し、かつ原料スラリー１６と比較して減少された流量を有し得る油２６の転化により、酵素的または化学的転化を介して抽出剤を生成する資本コストならびにエネルギー必要量が減少され得る。ある実施形態において、油２６の流量は、原料スラリー１６の流量の約１％〜約１０％であり得る。バイオマスから抽出剤を得るための方法が、米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４３号明細書および米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４４号明細書に記載されており、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０１２３】
ある実施形態において、流れ２５は、分離デバイスの１つ以上のパラメータを調整することによって生成され得る。例えば、流れ２５は、デカンター遠心分離機または三相遠心分離機などの遠心分離機のせき（または浸漬せき）を調整することによって生成され得る。
【０１２４】
本明細書に記載されるように、固体は、液液抽出を妨げ得るため、抽出方法を用いることは、技術的および経済的に実行可能でないことがある。抽出プロセス中、ラグ（ｒａｇ）層が、水相および有機相の界面に形成されることがあり、固体（例えば、軽質の固体）から構成されるラグ層は、蓄積し、相分離を妨げる可能性がある。ラグ層の形成を軽減するために、発酵前の流れ２５を介した固体の除去により、ラグ層の形成がなくなり、それによって、発酵ブロスの下流の処理および発酵産物の回収が向上され得る。
【０１２５】
ラグ層の形成を軽減する別の実施形態において、油が、ラグ層を形成する固体を選択的に捕捉するための手段として水溶液に加えられ得る。図９Ｄを参照すると、原料スラリー１６は、液化１０から排出され、分離２０に送られ得る。原料スラリー１６は、分離されて、以下の流れ：（ｉ）水溶液２２、（ｉｉ）ウェットケーキ２４、および（ｉｉｉ）油２６が生成され得る。ある実施形態において、ウェットケーキ２４は、本明細書に記載されるようにさらに処理され、例えば、ＤＤＧＳを形成するように処理され得る。ある実施形態において、油が、水溶液２２に加えられてもよく、得られた混合物は、槽８０に送られてもよく、ここで、混合物は、沈降し、または分離して、（ｉ）固体８６を含む油層および（ｉｉ）水溶液２２’を形成する。ある実施形態において、水溶液２２’は、本明細書に記載されるように発酵産物の生成のために発酵３０に送られ得る。ある実施形態において、水溶液２２’中の固体の量は、水溶液２２中の固体の量と比較して減少される。ある実施形態において、固体富化油層８６は、除去され（例えば、混合物から取り除かれ）、ろ過されて、油層から固体が除去され得る。ある実施形態において、固体富化油層８６は、分離２０’に送られてもよく、分離されて、以下の流れ：（ｉ）水溶液２２”、（ｉｉ）ウェットケーキ２４’、および（ｉｉｉ）油２６’（固体が少ない油）が生成され得る。ある実施形態において、水溶液２２に加えられる油は、原料スラリー１６から分離される油２６、油２６’、および／または外部の油源であり得る。
【０１２６】
ある実施形態において、ウェットケーキ２４’は、ウェットケーキ２４と組み合わされてもよく、組み合わされたウェットケーキは、本明細書に記載されるようにさらに処理され得る。ある実施形態において、ウェットケーキ２４’は、油を含んでいてもよく、この油富化ウェットケーキは、ウェットケーキ２４と組み合わされて、増加した脂肪含量を有するウェットケーキが生成されてもよく、本明細書に記載されるようにさらに処理され得る。ある実施形態において、油を含むウェットケーキ２４’は、本明細書に記載されるようにさらに処理され得る。
【０１２７】
ある実施形態において、水溶液２２”は、水溶液２２’と組み合わされてもよく、組み合わされた水溶液は、発酵３０に送られ得る。この組み合わされた水溶液中の固体の量は、水溶液２２と比較して減少され得、固体の減少により、ラグ層の形成が軽減されるであろう。ある実施形態において、水溶液２２’および水溶液２２”は、油を含んでいてもよく、油は、抽出剤を生成するようにさらに処理され得る。例えば、水溶液２２’および水溶液２２”は、組み合わされてもよく、化学的にまたは酵素的に処理されて（図９Ｄの点線）、本明細書に記載されるように抽出剤が生成され得る。バイオマスから抽出剤を得るための方法が、米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４３号明細書および米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４４号明細書に記載されており、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０１２８】
ある実施形態において、分離２０および分離２０’は、例えば、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、膜ろ過、クロスフローろ過、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せを含む、固体および液体を分離することが可能な任意の分離デバイスであり得る。ある実施形態において、分離は、単一工程プロセスであり得る。ある実施形態において、槽８０は、スタティックミキサー、ミキサーセトラー、デカンター、重力沈降器、およびそれらの組合せであり得る。ある実施形態において、プロセスは、汚染を最小限に抑える温度（例えば、７０〜１１０℃）に維持され得る。
【０１２９】
ある実施形態において、例えば、図１０に示されるように、本発明のシステムおよび方法は、オンライン、インライン、アットライン、および／またはリアルタイム測定のための手段を含み得る（丸は、測定デバイスを表し、点線は、フィードバックループを表す）。図１０は、オンライン、インライン、アットライン、および／またはリアルタイム測定用の測定デバイスが追加されたことを除いて図５と同様であるため、再度詳細に説明しない。
【０１３０】
本明細書に記載されるプロセスは、発酵中に生成される様々な流れ（例えば、原料スラリー、水溶液、油流、ウェットケーキ、ウェットケーキ混合物、洗浄遠心分離液など）の例えば濃度および他の物理的特性のオンライン、インライン、アットライン、および／またはリアルタイム測定を用いた、統合された発酵プロセスであり得る。これらの測定は、例えば、フィードバックループにおいて、発酵の条件および／または発酵装置、液化ユニット、分離ユニット、および混合ユニットの条件を調整し、制御するのに使用され得る。ある実施形態において、発酵産物および／または発酵ブロス中の他の代謝産物および基質の濃度は、オンライン、インライン、アットライン、および／またはリアルタイム測定用の任意の好適な測定デバイスを用いて測定され得る。ある実施形態において、測定デバイスは、以下のもの：フーリエ変換赤外線分光器（ＦＴＩＲ）、近赤外線分光器（ＮＩＲ）、ラマン分光器、高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、粘度計、密度計、張力計、液滴径分析器、粒子分析器、ｐＨ計、溶存酸素（ＤＯ）プローブなどのうちの１つ以上であり得る。ある実施形態において、発酵装置から放出されるオフガスが、例えば、インライン質量分析計によって分析され得る。発酵装置から放出されるオフガスの測定は、発酵反応中に存在する化学種を特定するための手段として使用され得る。発酵産物および他の代謝産物および基質の濃度はまた、本明細書に記載される技術およびデバイスを用いて測定され得る。
【０１３１】
ある実施形態において、測定された入力が、制御装置および／または制御システムに送られてもよく、発酵装置（温度、ｐＨ、栄養、酵素および／または基質濃度）、液化ユニット、分離ユニット、および混合ユニット内の条件が、様々な流れの濃度または濃度プロファイルを維持するように変更され得る。このような制御システムを用いて、プロセスパラメータが、全体的な工場の生産性および経済的目標を向上させるように維持され得る。ある実施形態において、発酵のリアルタイム制御が、発酵装置、液化ユニット、分離ユニット、および混合ユニット中の成分（例えば、バイオマス、糖類、酵素、栄養、微生物など）の濃度の変動によって行われ得る。ある実施形態において、自動システムが、分離および混合条件、分離および混合操作へのおよび分離および混合操作からの流量、固体および油の除去、ならびに糖およびでんぷんの回収を調整するのに使用され得る。
【０１３２】
発酵プロセス中、操作のユニットが時間の経過とともに準最適なレベルで機能することが可能である。全体的な工場の生産性を維持するために、液化および分離などの操作のための流量、混合速度、装置設備などを調整する必要があり得る。本明細書に記載される方法およびシステムは、原料スラリー１６、水溶液２２、油２６、およびウェットケーキ２４などの発酵流の濃度および他の物理的特性を監視するためにオンライン、インライン、アットライン、および／またはリアルタイム測定を用いて統合され得る。これらの測定は、例えば、フィードバックループにおいて、原料スラリーの発酵、分離の条件、および洗浄サイクル性能を調整し、制御するのに使用され得る。オンライン、インライン、アットライン、および／またはリアルタイム測定を用いて、プロセス条件の即時のフィードバックおよび調整が行われてもよく、全体的な向上した発酵プロセスが得られる。例えば、発酵性炭素源（例えば、でんぷん、糖類）、油、および固体の量は、例えば、ＦＴＩＲまたはＮＩＲを用いて、原料スラリー１６、水溶液２２、および流れ６５および７５中で監視され得る。これらのパラメータを監視することによって、液化および糖化のための酵素濃度および滞留時間は、原料スラリー１６の調製を向上させるように調整されてもよく、分離および混合条件は、例えば、水溶液２２および流れ６５および７５中の発酵性炭素源、油、および／または固体の量を増加させるように調整され得る。
【０１３３】
別の例として、ウェットケーキ２４の洗浄により、ウェットケーキ中の糖類、でんぷん、および油の回収が可能になり、これらの発酵性炭素源および油の収率低下を最小限に抑える。流れ２４、６５、７４、および７５の水分、糖、でんぷん、および油含量を監視することによって、洗浄性能は、糖、でんぷん、および油の回収を向上させるように調整され得る。例えば、これらの流れの糖、でんぷん、および油含量のリアルタイム測定は、ＦＴＩＲおよびＮＩＲによって行われてもよく、これらの測定は、混合（６０）および分離（２０、７０）条件の即時のフィードバックおよび調整を可能にする。分離デバイスの差速、供給速度、ボウル速度、スクロール差速、羽根車の位置、せきの位置、スクロールピッチ、滞留時間、および排出体積が、流れ２４、６５、７４、および７５の水分、糖、でんぷん、および油含量を変更するように調整され得る。ポンプ速度または撹拌器速度などの混合（６０）条件も、流れ２４、６５、７４、および７５の水分、糖、でんぷん、および油含量を変更するように調整され得る。さらに、洗浄比（例えば、水とウェットケーキとの間の比率）も、流れ２４、６５、および７４の水分、糖、でんぷん、および油含量を変更するように調整され得る。ＦＴＩＲ測定および液滴撮像が、油流（２６、７６）中の含水量を監視するのに使用され得る。さらに、油流（２６、７６）の色および濁度が、油の品質を評価するために監視され得る。このリアルタイム測定により、より清浄な油流（例えば、より少ない水）を生じる分離（２０、７０）条件への調整が可能になるであろう。
【０１３４】
本明細書に記載される方法およびシステムの別の実施形態において、ウェットケーキ２４の水分含量が、リアルタイム測定を用いて監視され得る。ウェットケーキの水分含量のリアルタイム測定は、ＮＩＲによって行われてもよく、これらの測定により、分離（２０、７０）条件の即時のフィードバックおよび調整が可能になる。ウェットケーキの含水量を減少させることによって、ウェットケーキを乾燥させるのにより少ないエネルギーが必要とされるため、生成プロセスのための全体的なエネルギー利用が向上され得る。さらに、ウェットケーキのより少ない含水量により、でんぷんの回収が向上され得る。
【０１３５】
リアルタイム測定を用いたプロセス制御法の別の例として、水溶液２２および油２６、７６中の固体が、プロセス粒子分析器（ＪＭ  Ｃａｎｔｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）、集束ビーム反射測定法（ＦＢＲＭ（登録商標））、または粒子顕微画像鏡測定法（ＰＶＭ（登録商標））技術（Ｍｅｔｔｌｅｒ−Ｔｏｌｅｄｏ，ＬＬＣ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  ＯＨ）などの粒度分析を用いて測定され得る。固体をリアルタイムで監視することによって、プロセス工程が、固体の除去を向上させるように調整され、それによって、水溶液および油流中の固体の量を最小限に抑え、固体の回収を最大にし、下流の処理を含む全体的な発酵プロセスを向上させ得る。
【０１３６】
図１〜１０に開示されている方法およびシステムは、原料スラリー１６から非溶解固体および／または油を除去することを含み、結果として、処理生産性および費用対効果を向上させる。向上した生産性としては、発酵前に非溶解固体および／または油を除去しない方法およびシステムを比べて発酵産物生成の向上した効率および／または向上した抽出活性が挙げられる。
【０１３７】
下流の処理を含む本発明の例示的な発酵プロセスが、図１１に記載されている。図１１中のいくつかのプロセスおよび流れは、図１〜１０において使用されるのと同じ名称および付番を用いて特定されており、図１〜１０に記載されるのと同じかまたは類似のプロセスおよび流れを表す。
【０１３８】
図１〜１０を参照して本明細書に記載されるように、原料１２は、処理され、非溶解固体および／または油が分離され得る（１００）。簡潔に、原料１２は、液化されて、非溶解固体、発酵性炭素源、および油を含む原料スラリーが生成され得る。例えば、粉砕された穀類および１種以上の酵素が組み合わされて、原料スラリーが生成され得る。この原料スラリーは、加熱され（または調理され）、液化され、および／またはフラッシュ蒸気でフラッシュされて、「調理された」原料スラリーまたはマッシュが生成され得る。ある実施形態において、原料スラリーは、少なくとも約１００℃に加熱され得る。ある実施形態において、原料スラリーは、約３０分間加熱され得る。ある実施形態において、原料スラリーは、生でんぷん加水分解（低温調理または低温加水分解としても知られている）に供され得る。生でんぷん加水分解プロセスにおいて、加熱（または調理）工程が省略され、この工程の省略により、エネルギー消費および蒸気負荷（例えば、水消費）が減少される。ある実施形態において、液化および／または糖化は、発酵温度（例えば、約３０℃〜約５５℃）で行われ得る。ある実施形態において、液化および／または糖化は、Ｓｔａｒｇｅｎ（商標）（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）およびＢＰＸ（商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）などの生でんぷん酵素または低温加水分解酵素を用いて行われ得る。ある実施形態において、液化および／または糖化は、約５０℃未満の温度で行われ得る。
【０１３９】
次に、原料スラリーは、分離に供されて、非溶解固体が除去され、ウェットケーキ２４、油２６、および発酵性炭素源、例えば、溶解された発酵性糖を含む水溶液２２（または遠心分離液）が生成され得る。分離は、デカンターボウル遠心分離、三相遠心分離、ディスクスタック遠心分離、ろ過遠心分離、デカンター遠心分離、ろ過、真空ろ過、ベルトフィルター、膜ろ過、クロスフローろ過、加圧ろ過、ふるいを用いたろ過、ふるい分け分離、格子、多孔質格子、浮遊法、ハイドロクロン、フィルタープレス、スクリュープレス、重力沈降器、ボルテックス分離器、またはそれらの組合せを含むがこれらに限定されないいくつかの手段によって行われ得る。この分離工程は、原料スラリーから少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の非溶解固体を除去し得る。ある実施形態において、水溶液２２は、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、または少なくとも約２％の非溶解固体を含み得る。
【０１４０】
ウェットケーキ２４は、水で再スラリー化または洗浄され、分離に供されて、さらなる発酵性糖が除去され、洗浄されたウェットケーキ（例えば、図１〜１０に記載される７４、７４’）が生成され得る。ある実施形態において、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、または約１５％の発酵性糖が、洗浄されたウェットケーキから回収され得る。洗浄プロセスは、何回か、例えば、１回、２回、３回、４回、５回、またはそれ以上の回数で繰り返され得る。ウェットケーキを再スラリー化または洗浄するのに使用される水は、発酵プロセス中に生成される再利用水（例えば、逆流、調理水、プロセス水、蒸留残留水、蒸発水）であり得る。ある実施形態において、ウェットケーキは、ビールで再スラリー化または洗浄され得る。洗浄／分離プロセスによって生成される洗浄遠心分離液（例えば、図４および図５に記載される７５、７５’）は、粉砕された穀類とともにスラリーを形成するように混合工程に戻されるか、または液化プロセスに使用され得る。ある実施形態において、洗浄遠心分離液は、混合工程の前に、加熱または冷却され得る。
【０１４１】
水溶液２２は、本明細書に記載されるようにさらに処理され得る。例えば、水溶液２２は、蒸気またはプロセス間熱交換（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｔｏ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｈｅａｔ  ｅｘｃｈａｎｇｅ）を用いて加熱され得る。糖化酵素が、水溶液２２に加えられてもよく、水溶液２２の溶解された発酵性糖は、部分的にまたは完全に糖化され得る。糖化された水溶液２２は、プロセス間交換、冷却水による交換、または冷水による交換などのいくつかの手段によって冷却され得る。
【０１４２】
水溶液２２および微生物３２は、発酵３０に加えられてもよく、ここで、発酵性糖は、微生物３２によって代謝されて、発酵産物（例えば、生成物アルコール）を含有する流れ１０５が生成される。ある実施形態において、微生物３２は、１−ブタノール、２−ブタノール、またはイソブタノールなどの生成物アルコールを生成することが可能な組み換え微生物であり得る。ある実施形態において、アンモニアおよび再利用流も、発酵３０に加えられ得る。ある実施形態において、このプロセスは、少なくとも１つの発酵装置、少なくとも２つの発酵装置、少なくとも３つの発酵装置、少なくとも４つの発酵装置、少なくとも５つの発酵装置、またはそれ以上の発酵装置を含み得る。ある実施形態において、大気放出（例えば、アルコール大気放出）を減少させ、生成物の収率を高めるために、発酵中に生成される二酸化炭素がスクラバーに排気され得る。
【０１４３】
生成物アルコールを含む流れ１０５が、ビール塔１２０に送られて、アルコール富化流れ１２２および塔底流１２５が生成され得る。アルコール富化流れ１２２は、生成物アルコールの回収のためにアルコール回収１６０に送られ得る。生成物アルコールは、蒸留、（例えば、樹脂による）吸着、分子篩による分離、パーベーパレーション、ガスストリッピング、抽出などを含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の方法を用いて、アルコール富化流れ１２２から回収され得る。発酵前に除去される固体の大部分とともに、希薄な蒸留廃液を含む塔底流１２５が、蒸発１３０を介した蒸発によって濃縮されて、シロップ１３５が形成され得る。シロップ１３５は、混合器１４０中でウェットケーキ（本明細書に記載される２４、７４、７４’）と組み合わされてもよく、次に、ウェットケーキおよびシロップの組み合わされた流れ１４５は、乾燥器１５０中で乾燥されて、ＤＤＧＳが生成され得る。
【０１４４】
ある実施形態において、流れ１０５が脱気され得る。ある実施形態において、流れ１０５は、例えば、高温マッシュによるプロセス間交換によって、脱気の前に加熱され得る。ある実施形態において、蒸気が、凝縮器、次に、スクラバーに排気されてもよい。脱気された流れ１０５は、例えば、蒸留および／またはアルコール回収領域中の他の流れによるプロセス間熱交換によってさらに加熱され得る。
【０１４５】
図１１の別の実施形態において、水溶液２２、微生物３２、および抽出剤は、発酵３０に加えられて、二相流れが生成され得る。ある実施形態において、抽出剤が、再利用ループを介して発酵３０に加えられ得る。ある実施形態において、抽出剤は、発酵３０の下流または発酵３０の外部に加えられ得る。発酵ブロスおよび発酵産物（例えば、生成物アルコール）を含む流れが、外部の抽出器に送られて、生成物アルコールを含む流れおよび塔底流が生成され得る。ある実施形態において、生成物アルコールを含む流れは、生成物アルコールの回収のためにアルコール回収１６０に送られ得る。ある実施形態において、塔底流を希薄な蒸留廃液および抽出剤へと分離するために、塔底流は、分離デバイスに送られ得る。ある実施形態において、回収された抽出剤は、生成物アルコールの抽出のために再利用され得る。発酵前に除去される固体の大部分を含む、希薄な蒸留廃液は、蒸発１３０によって濃縮されて、シロップが形成され得る。シロップは、混合器１４０中でウェットケーキ（本明細書に記載される２４、７４、７４’）と組み合わされてもよく、次に、ウェットケーキおよびシロップの組み合わされた流れ１４５は、乾燥器１５０中で乾燥されて、ＤＤＧＳが生成され得る。
【０１４６】
ある実施形態において、水溶液２２、微生物３２、および抽出剤が、発酵３０に加えられて、単一の液相流が形成され得る。ある実施形態において、二相流または単一の液相流は、発酵３０からバッチ式に引き抜かれてもよく、または発酵３０から連続して引き抜かれてもよい。ある実施形態において、抽出剤が、発酵３０の下流または発酵３０の外部に加えられて、単一の液相流が形成され得る。ある実施形態において、抽出剤は、外部の抽出器に加えられて、単一の液相流が形成され得る。
【０１４７】
アルコール回収のための例示的なプロセスが、本明細書に記載され、発酵ブロスから生成物アルコールを回収するためのさらなる方法が、米国特許出願公開第２００９／０３０５３７０号明細書；米国特許出願公開第２０１０／０２２１８０２号明細書；米国特許出願公開第２０１１／００９７７７３号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４４号明細書；米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４３号明細書；米国特許出願公開第２０１２／００３５３９８号明細書；米国特許出願公開第２０１２／０１５６７３８号明細書；ＰＣＴ国際公報の国際公開第２０１１／１５９９９８号パンフレット；およびＰＣＴ国際公報の国際公開第２０１２／０３０３７４号パンフレットに記載されており；それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される。例えば、真空蒸発が、発酵ブロスから生成物アルコールを回収するのに使用され得る。予め加熱されたビール（例えば、水流２２）および溶媒（例えば、抽出剤）が、従来の乾式磨砕燃料エタノールプラントのビール塔の改造であり得るプレフラッシュ塔に入り得る。この塔は、大気圧より低い圧力で運転され、一連の蒸発器からまたはマッシュ調理工程から取り出された水蒸気によって駆動され得る。プレフラッシュ塔の塔頂物は、冷却水と、プレフラッシュ塔原料による熱交換を含むプロセス間熱交換とのいくつかの組み合わせによる熱交換によって凝縮され得る。液体凝縮物は、アルコール／水デカンターに送られ得る。
【０１４８】
プレフラッシュ塔の塔底物は、溶媒デカンターに進められ得る。プレフラッシュ塔の塔底物は、生成物アルコールを実質的に取り除かれ得る。デカンターは、スティルウェル（ｓｔｉｌ  ｗｅｌｌ）、遠心分離機、またはハイドロクロンであり得る。水が、このデカンター中の溶媒相から実質的に分離され、水相が生成され得る。懸濁され、溶解された固体を含む水相は、遠心分離されて、ウェットケーキおよび希薄な蒸留廃液が生成され得る。ウェットケーキは、他の流れと組み合わされ、乾燥されて、ＤＤＧＳが生成され得、それは、ＤＤＧＳを生成する他の流れと別個に、乾燥され、販売され得るか、またはそれはウェットケーキとして販売され得る。水相は、本明細書に記載されるウェットケーキを再スラリー化するために部分的に使用される逆流を提供するために分割され得る。分割は、希薄な蒸留廃液も提供し、これは、さらなる処理のために蒸発器に注入され得る。
【０１４９】
溶媒デカンター中で生成される有機相は、アルコールのエステルであり得る。溶媒は、加水分解されて、反応性溶媒が再生され、さらなるアルコールが回収され得る。あるいは、有機相は、ろ過され、製品として販売され得る。加水分解は、熱によって推進され、均一触媒によるか、または不均一触媒により得る。このプロセスへの熱注入は、加熱炉、高温油、電気的熱注入、または高圧蒸気であり得る。加水分解を推進するために加えられる水は、再利用された水流、新鮮な水、または蒸気に由来し得る。
【０１５０】
冷却され、加水分解された溶媒は、大気圧より低い圧力の溶媒塔に注入されてもよく、ここで、溶媒は、蒸気によって生成物アルコールを実質的に取り除かれ得る。この蒸気は、蒸発器からの水蒸気であってもよく、マッシュプロセスのフラッシュ工程からの蒸気であってもよく、またはボイラーからの蒸気であってもよい（例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００９／０１７１１２９号明細書を参照）。従来の乾式磨砕エタノールプラントからの整流塔が、溶媒塔として適し得る。整流塔は、溶媒塔として働くように改造され得る。溶媒塔の塔底物は、例えば、冷却水またはプロセス間熱交換によって冷却され得る。冷却された塔底物は、残留水を除去するためにデカントされてもよく、この水は、このプロセスの他の工程に再利用されてもよく、または液化に再利用されてもよい。
【０１５１】
溶媒塔の塔頂物は、冷却水による交換によってまたはプロセス間熱交換によって冷却されてもよく、凝縮物が、プレフラッシュ塔の塔頂物と共用され得る排気されたアルコール／水デカンターに送られ得る。スクラバー塔底物および脱気工程からの凝縮物を含む、他の混合される水および生成物アルコール流が、このデカンターに加えられてもよい。二酸化炭素を含む排気が、水スクラバーに送られてもよい。このデカンターの水層はまた、溶媒塔に供給されてもよく、または小型の専用の蒸留塔中で生成物アルコールを取り除かれ得る。水層は、プレフラッシュ塔の塔頂物、溶媒塔の塔頂物、または溶媒塔の塔底物によるプロセス間交換によって予め加熱され得る。この専用の塔は、従来の乾式磨砕燃料エタノールプロセスのサイドストリッパーから改造され得る。
【０１５２】
アルコール／水デカンターの有機層は、アルコール塔に注入され得る。この塔は、過圧（ｓｕｐｅｒ−ａｔｍｏｓｐｈｅｒｉｃ）塔であってもよく、ボイラー内の蒸気凝縮によって駆動され得る。塔を運転するためのエネルギー需要を減少させるために、塔への原料がプロセス間熱交換によって加熱され得る。このプロセス間熱交換器は、プレフラッシュ塔の分縮器、溶媒塔の分縮器、加水分解装置の生成物、蒸発器からの水蒸気、またはアルコール塔の塔底物を含み得る。アルコール塔の蒸気の凝縮物は、冷却されてもよく、アルコール／水デカンターに戻されてもよい。アルコール塔の塔底物は、アルコール塔原料による交換を含むプロセス間熱交換によって冷却されてもよく、冷却水によってさらに冷却され、ろ過され、生成物アルコールとして販売され得る。
【０１５３】
本明細書に記載されるようにプレフラッシュ塔の塔底物から生成される希薄な蒸留廃液は、多重効用蒸発器に送られ得る（例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１／０３１５５４１号明細書を参照）。この蒸発器は、２つ、３つ、またはそれ以上の段階を有し得る。蒸発器は、燃料エタノールプラントの従来の設計と類似の２つの効用部による４つの本体の構成を有してもよく、３つの効用部による３つの本体を有してもよく、または他の構成を有してもよい。希薄な蒸留廃液は、複数の効用部のいずれかに入り得る。第１の効用部本体の少なくとも１つが、過圧アルコール塔からの蒸気によって加熱され得る。蒸気は、最も圧力の低い効用部から取り出されて、水蒸気の形態の熱が、大気圧より低い圧力のプレフラッシュ塔および溶媒塔に与えられ得る。蒸発器からのシロップが、蒸留器の穀類乾燥器に加えられてもよい。
【０１５４】
発酵装置、脱気装置（ｄｅｇａｓｓｅｒ）、アルコール／水デカンター、および他の供給源からの二酸化炭素放出は、水スクラバーに送られ得る。このスクラバーの上部に供給される水は、新鮮な水であってもよく、再利用水であってもよい。再利用水は、揮発性有機化合物を除去するために処理（例えば、生物学的に消化）され、急冷され得る。スクラバーの塔底物は、アルコール／水デカンター、溶媒塔に送られてもよく、または他の再利用水とともに使用されて、本明細書に記載されるようにウェットケーキが再スラリー化されてもよい。蒸発器からの凝縮物は、嫌気性の生物学的消化または他のプロセスによって処理されて、ウェットケーキを再スラリー化するために再利用する前に水が精製され得る。
【０１５５】
油は、いくつかの点のいずれかにおいてプロセス流から分離され得る。例えば、遠心分離機が、調理されたマッシュのろ過の後に油流を生成するように運転されてもよく、またはプレフラッシュ塔水相遠心分離機が、油流を生成するように運転されてもよい。中間の濃縮シロップまたは最終的なシロップが遠心分離されて、油流が生成され得る。
【０１５６】
別の実施形態において、多相材料が、プレフラッシュ塔の塔底を出て、本明細書に記載されるように分離システムにおいて処理され得る。濃縮された固体は、水流に再分配され得、この組み合わされた流れは、液化されたマッシュから分離され、洗浄された低でんぷん固体を再パルプ化し、注入するのに使用され得る。
【０１５７】
生成物アルコール回収のための別の例示的なプロセスにおいて、発酵ブロス中の生成物アルコールを特定の濃度未満に維持するために、抽出剤が、発酵中に発酵ブロスから生成物アルコールを除去するのに用いられ得る。ある実施形態において、生成物アルコールの除去が、アルコールエステルを生成するために、触媒の存在下で、カルボン酸によるエステル化によって行われ得る。アルコールエステルの形成によってアルコールを抽出するための方法およびシステムの説明が、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１２／０１５６７３８号明細書に見られる。例えば、原料スラリーから分離される油が、エステラーゼ（例えば、リパーゼ）などの触媒によって加水分解されて、油中のトリグリセリドが、カルボン酸などの脂肪酸に転化され得る。これらの脂肪酸は、生成物アルコールの回収のための抽出剤として使用され得る。ある実施形態において、油の加水分解は、発酵装置への触媒の添加によって、発酵装置において行われ得る。ある実施形態において、油の加水分解は、別個の槽において行われてもよく、脂肪酸は、発酵装置に加えられ得る。例えば、原料スラリーは、槽またはタンクに送られてもよく、リパーゼなどのエステラーゼが、槽に加えられて、原料スラリー中に存在する油が脂肪酸に転化され得る。脂肪酸を含む原料スラリーは、発酵装置に送られ得る。
【０１５８】
発酵によって生成される生成物アルコールは、脂肪酸と反応して、アルコールエステルを生成し得る。ある実施形態において、これらのアルコールエステルは、発酵ブロスから抽出され得る。例えば、アルコールエステルを含む発酵ブロスは、発酵ブロスを３つの流れ：非溶解固体（微生物を含む）、水流、およびアルコールエステルを含む有機流へと分離するために、三相遠心分離機などの分離デバイスに移され得る。ある実施形態において、発酵ブロスは、２つの流れ：非溶解固体（微生物を含む）ならびに水相および有機相を含む二相混合物へと分離され得る。発酵ブロスのこの分離は、例えば、分離のために発酵ブロスの一部を除去することによって発酵中に連続して、またはバッチ式に行われてもよく、例えば、発酵装置の全内容物が、分離のために除去され得る。
【０１５９】
ある実施形態において、二相混合物は、アルコールエステルを含有する有機相および水相へと分離されてもよく、この分離は、吸上げ（ｓｉｐｈｏｎｉｎｇ）、吸引、デカンテーション、遠心分離、重力沈降器、膜による分相、ハイドロクロンなどを含むがこれらに限定されない、当該技術分野において公知の任意の方法を用いて行われ得る。アルコールエステルを含有する有機相は、生成物アルコールを回収するようにさらに処理され得る。例えば、アルコールエステルを含有する有機相は、槽に移されてもよく、ここで、アルコールエステルは、触媒の存在下で加水分解されて、生成物アルコールおよび脂肪酸が形成されてもよく、生成物アルコールと脂肪酸とのこの混合物が、生成物アルコールおよび脂肪酸を分離するために蒸留によって処理され得る。
【０１６０】
ある実施形態において、脂肪酸は、発酵装置または抽出塔に再利用され得る。ある実施形態において、水流および非溶解固体は、発酵装置に再利用され得る。
【０１６１】
ある実施形態において、生成物アルコールの抽出は、発酵装置の下流または発酵装置の外部で行われ得る。ある実施形態において、発酵システムは、例えば、混合デバイスおよび分離システムを含む外部の抽出システムを含み得る。発酵ブロスは、混合デバイスに送られてもよく、抽出剤は、混合デバイスに加えられ、発酵ブロスと組み合わされて、二相混合物が生成され得る。二相混合物は、分離システムに導入されてもよく、ここで、二相混合物の分離により、アルコールを含有する有機相および水相が生成される。ある実施形態において、水相またはその一部は、発酵装置に戻され得る。ある実施形態において、アルコールを含有する有機相は、抽出剤塔に送られ得る。これらの実施形態におけるバイオマス処理生産性は、液化後であるが発酵前に、バイオマス原料流成分の分離によって大幅に向上される。特に、非溶解固体および／または油の量を減少させることにより、外部のアルコール抽出システムの向上した効率が得られる。
【０１６２】
ある実施形態において、油が、原料または原料スラリーから分離されてもよく、油の貯蔵槽に貯蔵され得る。例えば、油は、三相遠心分離または機械的抽出を含む分離のための任意の好適な手段を用いて、原料または原料スラリーから分離され得る。原料または原料スラリーからの油の除去を向上させるために、界面活性剤、抗乳化剤、または凝集剤ならびに酵素などの油抽出助剤が用いられ得る。油抽出助剤の例としては、以下に限定はされないが、非高分子液体界面活性剤；タルカムパウダー；微細タルカムパウダー；Ｐｅｃｔｉｎｅｘ（登録商標）Ｕｌｔｒａ  ＳＰ−Ｌ、Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ（登録商標）、およびＶｉｓｃｏｚｙｍｅ（登録商標）Ｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、およびＮＺ  ３３０９５（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）；塩（ＮａＯＨ）などの酵素；および炭酸カルシウムが挙げられる。油の除去を向上させるための別の手段は、ｐＨを上昇または低下させるなどのｐＨ調整であり得る。油の除去のさらなる利点としては、向上した油の収率、向上した油の品質、減少されたシステムの付着物（ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）、および減少された休止時間が挙げられる。さらに、油の除去はまた、より清浄なより高品質の油をもたらし得る。
【０１６３】
次に、残りの原料または原料スラリーが、一切の残油を除去するようにさらに処理され得る。例えば、油の分離後の原料または原料スラリーは、槽またはタンクに送られてもよく、エステラーゼ（例えば、リパーゼ）などの触媒が、槽に加えられ、原料または原料スラリー中に存在する油が脂肪酸に転化され得る。原料または原料スラリーからの油の除去により、酵素の効率が向上されるだけでなく、本明細書に記載されるプロセスに必要とされる酵素の量が減少され得る。次に、原料または原料スラリーは、発酵装置に送られてもよく、生成物アルコールの生成のために、微生物も発酵装置に加えられ得る。ある実施形態において、触媒は、例えば、加熱によって失活され得る。ある実施形態において、失活は、別個の槽、例えば、失活槽中で行われ得る。失活された原料または原料スラリーは、発酵装置に送られてもよく、生成物アルコールの生成のために、微生物も発酵装置に加えられ得る。油を脂肪酸に転化することによる原料または原料スラリーからの油の除去は、より効率的な発酵による生産工場のエネルギー節約、油の除去による汚損の減少、およびエネルギー必要量、例えば、穀類蒸留粕を乾燥させるのに必要なエネルギーの減少をもたらし得る。発酵の後、生成物アルコールを含む発酵ブロスは、生成物アルコールの回収のために、外部の槽、例えば、外部の抽出器または外部の抽出ループに送られ得る。本明細書において提供される油の除去は、安定したエマルジョンが原料流分離プロセスによって生じにくいように本発明の実施形態が原料スラリーから油を分離する点で、公知の技術と異なり、発酵後の、取り込まれたバイオオイルの回収とともに形成されるエマルジョンを分解するためのプロトン性溶媒の添加が必要となる可能性が低くなる（例えば、米国特許第７，６０１，８５８号明細書；米国特許第８，１９２，６２７号明細書を参照）。本発明のある実施形態において、エマルジョンが形成され得るが、機械的処理または他の従来の手段によって、容易に分解される。
【０１６４】
抽出剤が、生成物アルコールを回収するのに使用される場合、発酵プロセスの前の油の除去により、抽出剤によって取り込まれる油の量が減少され、ひいては生成物アルコールを回収するための抽出剤の有効性が延長され得る。抽出剤によって取り込まれる油は、抽出剤のＫｄならびに選択性を低下させることがあり、ひいては生成プロセスの運転コストを増加させ得る。抽出剤は、生成プロセスにおいて再利用され得るため、各発酵サイクルにより、抽出剤が、抽出剤によって取り込まれるより多い油に曝され、時間の経過とともに、抽出剤のＫｄおよび選択性が著しく低下され得る。本明細書に記載される方法およびシステムは、原料または原料スラリーから油を除去し、および／または触媒の添加によって油を脂肪酸に転化することによって、抽出剤のＫｄおよび選択性を維持するための手段を提供する。
【０１６５】
本明細書に記載される方法およびシステムは、非溶解固体の除去の結果として、発酵産物（例えば、生成物アルコール）生成における向上した抽出活性および／または効率をもたらし得る。例えば、非溶解固体の存在なしでの抽出発酵は、発酵ブロスから抽出剤への生成物アルコールの上昇した物質移動速度、より良好な相分離、および上昇した抽出剤液滴上昇速度の結果としての抽出剤のより低い保持（ｈｏｌｄ−ｕｐ）をもたらし得る。また、例えば、発酵の際に発酵ブロス中に保持される抽出剤液滴は、発酵ブロスからより速く、より完全に離脱し、それによって、発酵ブロス中の遊離抽出剤が少なくなる。さらに、抽出剤のより低い保持により、プロセス中に喪失される抽出剤の量を減少させることができる。固体の除去のさらなる利点としては、例えば、資本コストおよびエネルギー使用を減少させる、発酵装置における撹拌器ならびにビール塔および遠心分離機などの下流の処理装置の省略；向上した発酵装置生産性をもたらす、増加した発酵装置体積；向上した生産効率をもたらす、減少された抽出剤の保持、抽出剤の増加した回収および再利用、運転コストを低下させる抽出剤の減少された流量、および連続発酵またはより小型の発酵装置を使用する可能性が挙げられる。ある実施形態において、発酵に利用可能な発酵装置の体積は、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、またはそれ以上だけ増加され得る。
【０１６６】
向上した抽出効率の例としては、例えば、分配係数の安定化、向上した相分離、向上した物質移動係数、より低い力価での運転、向上したプロセス流再利用性、向上した発酵体積効率、向上した原料負荷供給、微生物の向上した生成物アルコール力価耐性、水の再利用、エネルギーの減少、抽出剤の増加した再利用、および微生物の再利用が挙げられる。例えば、発酵ブロス中の油が、発酵の前に原料スラリーから固体を除去することによって減少され得るため、抽出剤は、より少ない油に曝され、油は、抽出剤と組み合わされて、抽出剤の分配係数を低下させ得る。したがって、発酵ブロス中の油の減少により、複数の発酵サイクルにわたるより安定した分配係数が得られる。ある実施形態において、分配係数は、１０回以上の発酵サイクルにわたって、約１０％未満、約５％未満、または約１％未満だけ減少され得る。向上した抽出効率の別の例として、より高い物質移動速度（例えば、より高い物質移動係数の形態における）により、生成物アルコール生成の向上した効率が得られる。ある実施形態において、物質移動係数は、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍増加され得る。
【０１６７】
発酵ブロスと抽出剤との間の相分離の向上は、放出物の形成の可能性を減少させて、生成物アルコール生成の向上した効率が得られる。例えば、エマルジョンの非存在下で、相分離は、より速く行うことができ、より完全であり得る。ある実施形態において、感知できる相分離が予め観察されなかった場合に相分離が行われ得る。ある実施形態において、相分離は、２４時間で行われ得る。ある実施形態において、相分離は、固体が除去されなかった場合またはエマルジョンが形成された場合の相分離と比較して、少なくとも約２倍（２×）速く、少なくとも約５倍（５×）速く、または少なくとも約１０倍（１０×）速く行われ得る。
【０１６８】
本明細書に記載されるように、窒素、ミネラル、微量元素、および／またはビタミンなどの栄養が、原料スラリーまたは発酵装置に添加され得る。これらの添加される栄養ならびに原料中に自然に存在する栄養は、油に可溶であり得るため、原料または原料スラリー中の油の存在により、発酵ブロス中のこれらの栄養の濃度が低下され得る。原料または原料スラリーからの油の除去により、栄養の損失が最小限に抑えられ得る。さらに、発酵ブロス中の固体の存在により、栄養の濃度が低下されることもある。原料または原料スラリーからの固体および／または油の除去により、栄養の損失が最小限に抑えられ得る。
【０１６９】
本明細書に記載される方法およびシステムでは、発酵プロセスにおける油の存在は、複数の発酵にわたって、抽出剤の分配係数に影響を与え得る。原料または原料スラリーからの油の除去により、複数の発酵にわたって、抽出剤の分配係数の変動性が減少され、ひいては本明細書に記載される方法およびシステムのスケーラビリティが向上され得る。スケーラビリティは、機能性を犠牲にせずに、例えば、製造上の必要性（ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｄｅｍａｎｄ）（例えば、運転容量）に対応するように方法またはシステムを変更する（例えば、拡大または縮小する）能力を指す。
【０１７０】
さらに、原料または原料スラリーからの固体の除去も、スケーラビリティに影響を与え得る。例えば、外部の抽出器が用いられる場合、固体の減少（例えば、全懸濁固体、ＴＳＳの減少）が、向上した性能およびより良好なスケーラビリティをもたらし得る。固体の減少は、水相と有機相（例えば、発酵ブロスおよび抽出剤）の間の生成物アルコールの物質移動速度を向上させる。固体粒子が、抽出剤液滴の表面を効果的に被覆して、物質移動の面積を減少させる。固体粒子はまた、粘度および乳化の傾向を増加させることによって、相分離を阻害する。固体の存在が、外部の抽出器の操作を妨げ得るため、原料または原料スラリーからの固体の除去が、外部の抽出器の向上したスケーラビリティおよび信頼性を提供する。
【０１７１】
したがって、固体および／または油の除去により、本明細書に記載される方法およびシステムの単位操作のスケーラビリティが向上され得る。例えば、固体および／または油の除去により、以下に限定はされないが、抽出器性能、蒸留塔性能、熱交換器性能、および／または蒸発器性能などの単位操作が向上され得る。
【０１７２】
向上した単位操作の例として、図１１を参照すると、流れ１０５が、ビール塔１２０に送られて、アルコール富化流１２２および塔底流１２５が生成され得る。発酵前に除去される固体の大部分とともに、希薄な蒸留廃液を含む塔底流１２５が、蒸発１３０によって濃縮され得る。発酵前に固体を除去することによって、より少ない固体が蒸発器に送られ得、蒸発器へのより低い供給速度が得られる。より低い供給速度は、より少ないエネルギー、ひいてはより低いエネルギー必要量によるより低いコストを必要とする。
【０１７３】
ある実施形態において、原料または原料スラリーから回収される油から水を除去する必要があることがある。ある実施形態において、水が、重力分離、合体分離器（ｃｏａｌｅｓｃｉｎｇ  ｓｅｐａｒａｔｏｒ）、遠心分離（例えばデカンター）、吸着または吸収、蒸留、加熱、真空脱水、および／または空気ストリッピング（例えば、空気、窒素）を含むいくつかの方法によって除去され得る。吸着媒体の例としては、以下に限定はされないが、活性アルミナ、ベントナイト粘土、塩化カルシウム、硫酸カルシウム、セルロース、硫酸マグネシウム、分子篩、ポリマー、および／またはシリカゲルが挙げられる。ある実施形態において、吸着媒体は、油とともに連続して撹拌されてもよく、または油は、吸着媒体とともに充填床を通って流れ得る。
【０１７４】
場合により、生成物アルコールなどの発酵産物の生成に使用される設備を洗浄および／または滅菌する必要があることがある。設備の例としては、以下に限定はされないが、発酵装置、液化槽、糖化槽、保持タンク、貯蔵タンク、熱交換器、パイプライン、設備接続部、ノズル、取付具、および弁が挙げられる。清浄化および滅菌は、微生物汚染を減少させるかまたはなくすだけでなく、設備への残渣（例えば、炭水化物、糖類）の蓄積を最小限に抑えることができる。設備への残渣の堆積は、望ましくない微生物に栄養源を与え、これらの微生物の増殖につながることがある。定置洗浄（ＣＩＰ）および定置滅菌（ＳＩＰ）を含む、発酵設備を洗浄および／または滅菌するのに用いられるいくつかの方法がある。ＣＩＰおよびＳＩＰは、手作業で行われてもよく、または自動システムも利用可能である。好適なだけでなく効率的なＣＩＰまたはＳＩＰは、例えば、微生物汚染により運転を停止する必要を最小限に抑えることによって、生産工場の利益を最大にすることができる。
【０１７５】
本明細書に記載される方法およびシステムにおいて、例えば、発酵の前の原料または原料スラリーからの固体および油の除去により、ＣＩＰおよびＳＩＰの効率が向上され得る。発酵設備中に固体がないことで、より少ない洗浄水、より少ない洗浄液、およびＣＩＰおよびＳＩＰを行う時間の短縮が可能になる。したがって、固体の除去により、ＣＩＰおよびＳＩＰプロセスの効率が向上され、ＣＩＰおよびＳＩＰプロセスのコストが減少され得る。また、ＣＩＰに使用される腐食剤（例えば、水酸化ナトリウム）が、油中のトリグリセリドと反応して石鹸を形成することがあり（すなわち、鹸化）、これが、ＣＩＰの効率に影響を与え得る。したがって、油の除去により、ＣＩＰの際の石鹸の形成を減少させ、ＣＩＰの効率を向上させることができる。
【０１７６】
発酵プロセス中、汚損が、生成プロセスの生産性および効率に影響を与え得る。一般に、汚損は、外部からの材料または粒子の付着、例えば、熱交換器および蒸留塔リボイラーの表面への材料の付着を指す。熱交換器の表面への材料のこの付着は、熱の伝達を妨げ、熱交換器の動作能力を低下させることがある。例えば、材料の付着は、交換器を通る流体の流れを妨げて、流れ抵抗を増大させ得る。また、熱交換器または他の装置の表面への材料の付着は、さらなる清浄化を必要とし得る。これらのさらなる清浄化の必要性は、工場の運転停止を必要とし、工場の生産性を低下させ得る。本明細書に記載される方法およびシステムにおいて、例えば、発酵の前の原料または原料スラリーからの油および／または固体の除去により、材料の付着が最小限に抑えられ、熱交換器などの装置の表面への材料の付着の速度が低下され得る。したがって、固体および油の除去により、熱交換器の汚損の速度が低下され、熱伝達および動作能力に対する汚損の影響が最小限に抑えられ得る。
【０１７７】
本発明の方法およびシステムの一実施形態の別の例において、発酵装置から排出される材料は、遠心分離機、沈降器、ハイドロクロンなど、およびそれらの組合せなどのデバイスを含む分離システムにおいて処理されて、直接または再調整の後のいずれかに次の発酵における再度の使用のために再利用され得る濃縮された形態の微生物が回収され得る。微生物を再利用する能力は、生成物アルコール生成などの発酵産物生成の全体速度を上げ、全力価要件を低下させ、および／または水性力価要件を低下させ、それによって、より健康な微生物およびより高い生成速度をもたらすことができる。この分離システムは、発酵から生成される発酵産物（例えば、生成物アルコール）および他の副生成物を含む有機流、ならびにわずかな微量レベルの不混和性有機物を含む水流も生成し得る。この水流は、原料スラリーから分離された固体を洗浄するために、生成物アルコール含有物を取り除く前または後に使用され得る。これには、本来であれば、液化領域から穀類乾燥およびシロップ混合領域へとこれらの固体を移動するための長いベルトで駆動される搬送システムであり得るものを回避するという利点がある。さらに、生成物アルコールが取り除かれた後に生成される全蒸留廃液は、既存のまたは新規な分離デバイスを用いて、希薄な蒸留廃液とウェットケーキ画分とに分離される必要がある。希薄な蒸留廃液は、発酵性マッシュの新しいバッチを調製するために調理水と組み合わされ得る逆流を部分的に形成し得る。この実施形態の別の利点は、原料スラリーから分離される固体中に保持された任意の残留発酵性糖の一部が捕捉され、この逆流を通して回収され得ることである。あるいは、固体流に含まれる微生物は、水流に再分配され得、この組み合わされた流れは、発酵から残っているあらゆる生成物アルコール含有物を蒸留によって取り除かれる。微生物が生育不能である場合、生育不能の微生物は、例えば、繁殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）プロセスにおける栄養として使用するためにさらに分離され得る。
【０１７８】
本明細書に記載される方法およびシステムのある実施形態において、発酵プロセスの副生成物（または副産物）が、さらに処理されてもよく、例えば、非溶解固体が、ＤＤＧＳを生成するように処理され得る。微生物に対する阻害作用を有し得る脂肪酸エステルなどの他の副生成物が、発酵ブロスおよび／または副生成物流から回収され、生成物アルコールの収率が向上され得る。脂肪酸エステルまたは他の脂質の回収は、副生成物流から脂肪酸エステルを抽出するために溶媒を用いて行われ得る。ある実施形態において、いくつかの副生成物流が組み合わされてもよく、脂肪酸エステルが、組み合わされた流れから回収され得る。
【０１７９】
脂質（例えば、脂肪酸エステル）の溶媒抽出の一実施形態において、固体が、全蒸留廃液から分離され得る（「分離された固体」）が、これは、この流れが、脂肪酸エステルの大部分を含有し得るためである。次に、これらの分離された固体は、抽出器に供給され、溶媒を用いて洗浄され得る。ある実施形態において、分離された固体は、少なくとも２回以上洗浄され得る。洗浄後、ミセラとして知られている、脂質と溶媒との得られる混合物が、溶媒からの抽出される脂質の分離のために収集され得る。例えば、脂質と溶媒との得られる混合物は、さらなる処理のために分離器または抽出器に送られ得る。抽出プロセスの際、溶媒は、脂質を溶液中に抽出するだけでなく、微粒子（「微粉」）も収集する。これらの微粉は、一般に、ミセラ中の望ましくない不純物であり、一実施形態において、ミセラは、分離器または抽出器から排出され、ミセラから微粉を分離するかまたは洗い落とす（ｓｃｒｕｂ）分離デバイスに送られ得る。
【０１８０】
ミセラ中に含まれる脂質および溶媒を分離するために、ミセラは、蒸留工程に供され得る。この工程において、ミセラは、例えば、蒸発器によって処理することができ、蒸発器は、溶媒を蒸発させるのに十分に高いが、抽出される脂質に悪影響を与えるかまたは蒸発させるほど十分高くはない温度にミセラを加熱する。溶媒が蒸発するにつれて、溶媒は、例えば、凝縮器に収集され、将来の使用のために再利用され得る。ミセラからの溶媒の分離により、粗脂質の蓄積が得られ、これは、水、脂肪酸エステル（例えば、脂肪酸イソブチルエステル）、脂肪酸、およびトリグリセリドを分離するようにさらに処理され得る。トリグリセリドを回収するための溶媒系の抽出システムが、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１０／００９２６０３号明細書に記載されている。
【０１８１】
脂質の抽出の後、固体は、抽出器から送られてもよく、残留溶媒を除去するストリッピングデバイス（例えば、脱溶媒器（ｄｅｓｏｌｖｅｎｔｉｚｅｒ））に送られ得る。残留溶媒の回収は、プロセス経済性にとって重要であり得る。ある実施形態において、固体は、固体から一時的に蒸発し得る溶媒を貯蔵し、収集するために、気密（ｖａｐｏｒ  ｔｉｇｈｔ）環境にある脱溶媒器に送られ得る。固体が脱溶媒器に入る際、固体は加熱されて、残留溶媒が蒸発され、除去され得る。固体を加熱するために、脱溶媒器は、固体を１つ以上のトレイに分配するための機構を含んでいてもよく、固体は、加熱された空気または蒸気との直接接触などによって、直接加熱されるか、あるいは固体を運ぶトレイを加熱することなどによって間接的に加熱され得る。１つのトレイから別のトレイへの固体の移動を容易にするために、固体を運ぶトレイは、固体を１つのトレイから次のトレイへと送らせる開口部を含み得る。脱溶媒器から、固体は、任意に、混合器に送られてもよく、ここで、固体は、乾燥器に送られる前に、他の副生成物と混合される。ある実施形態において、固体は、脱溶媒器に送られ、固体は、蒸気によって接触される。ある実施形態において、脱溶媒器中の蒸気および固体の流れは、逆向きであってもよい。ある実施形態において、脱溶媒器を出る蒸気は凝縮され、任意にミセラと混合され、次にデカンターに供給され、水富化相が形成され得る。デカンターを出る水富化相は、蒸留塔に供給されてもよく、ここで、溶媒が、水富化流から除去される。ある実施形態において、溶媒減損水富化流は、蒸留塔の塔底を出て、発酵プロセスに再利用されてもよく、例えば、それは、原料を処理するのに使用され得る。ある実施形態において、蒸留塔の塔頂および塔底生成物は、発酵プロセスに再利用され得る。例えば、脂質富化塔底物は、加水分解装置の原料に加えられ得る。塔頂物は、例えば、凝縮され、デカンターに供給され、溶媒富化流および水富化相が形成され得る。このデカンターを出る溶媒富化流は、抽出器への溶媒原料として任意に使用されてもよく、このデカンターを出る水富化相は、溶媒を水から取り除くためにストリッピング塔に供給され得る。
【０１８２】
ある実施形態において、副生成物または副産物が、発酵プロセスに使用される原料スラリーから得られる。本明細書に記載されるように、トウモロコシが原料として使用される場合、トウモロコシ油は、発酵の前に原料スラリーから分離され得る。発酵プロセスの前にトウモロコシ油を除去する利点は、（例えば、シロップからの）発酵プロセスの終了時におけるトウモロコシ油の除去と比較してより多いトウモロコシ油の回収、発酵プロセスの終了時におけるトウモロコシ油の除去と比較してより高い品質ひいてはより高い価値の油の回収、副産物としてのトウモロコシ油の生成、およびトウモロコシ油から他の生成物への転化である。
【０１８３】
例えば、トウモロコシ油が、トリグリセリド、ジグリセリド、モノグリセリド、脂肪酸、植物ステロール、ビタミンＥ、カロテノイド（例えば、β−カロテン、β−クリプトキサンチン、ルテインゼアキサンチン）、リン脂質、およびトコフェロールなどの酸化防止剤を含有する際、トウモロコシ油は、異なる濃度または速度で他の副産物に加えられ、得られる副産物中のこれらの成分の量を変化させる能力が得られる。このように、得られる副産物の脂肪含量が、例えば、高脂肪製品と比較して乳牛の必要性により適合するより低脂肪で、高タンパク質の動物飼料を得るように制御され得る。高脂肪の動物飼料が所望され得る別の実施形態において、トウモロコシ油は、その高トリグリセリド含量により代謝エネルギーの供給源となり得るため、動物飼料の成分として使用され得る。さらに、トウモロコシ油中の天然の酸化防止剤が、酸敗臭の発生を減少させるだけでなくビタミンＥの供給源となる。
【０１８４】
原料から分離されるトウモロコシ油は、消費者用途のための精製されたトウモロコシ油または食用油を生成するようにさらに処理され得る。例えば、粗トウモロコシ油が、リン脂質を除去するための脱ガム（ｄｅｇｕｍｍｉｎｇ）、遊離脂肪酸を中和するためのアルカリ精製、有色体（ｃｏｌｏｒ  ｂｏｄｙ）および微量元素の除去のための脱色、ろうを除去するための脱ろう、および脱臭（例えば、Ｃｏｒｎ  Ｏｉｌ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｒｎ  Ｒｅｆｉｎｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，２００６を参照）によって、精製されたトウモロコシ油を生成するようにさらに処理され得る。精製されたトウモロコシ油は、例えば、食品の製造のために、食品メーカーによって使用され得る。アルカリ精製によって除去される遊離脂肪酸は、ソーダ油さい（ｓｏａｐｓｔｏｃｋ）として使用されてもよく、脱ろう工程から回収されるろうは、動物飼料に用いられ得る。
【０１８５】
トウモロコシ油は、樹脂、プラスチック、ポリマー、潤滑剤、塗料、ワニス、印刷用インク、石鹸、および織物の製造に使用されてもよく；薬剤配合物の成分として医薬品業界でも用いられ得る。トウモロコシ油は、バイオディーゼルまたは再生可能なディーゼルの原料としても使用され得る。
【０１８６】
ある実施形態において、トウモロコシ油などの油が、抽出発酵用の抽出剤の生成のための原料として使用され得る。例えば、バイオマスに由来する油は、発酵ブロスからのブタノールなどの生成物アルコールの除去に利用可能な抽出剤へと転化され得る。油中のグリセリドは、発酵産物抽出剤として使用され得る、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪アミド、脂肪酸アルキルエステル、脂肪酸グリコールエステル、および水酸化トリグリセリド、またはそれらの混合物などの反応生成物へと化学的にまたは酵素的に転化され得る。トウモロコシ油を例として用いると、トウモロコシ油トリグリセリドは、水酸化アンモニアまたは水酸化ナトリウムなどの塩基と反応されて、脂肪アミド、脂肪酸、およびグリセロールが得られる。これらの脂肪アミド、脂肪酸、またはそれらの混合物は、抽出剤として使用され得る。ある実施形態において、トウモロコシ油などの植物油が、リパーゼなどの酵素によって加水分解されて、脂肪酸（例えば、トウモロコシ油脂肪酸）が形成され得る。バイオマスから抽出剤を得るための方法が、米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４３号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０３１２０４４号明細書、およびＰＣＴ国際公報の国際公開第２０１１／１５９９９８号パンフレットに記載されている。ある実施形態において、抽出剤は、動物飼料の成分として、全てまたは部分的に使用されてもよく、または抽出剤は、バイオディーゼルまたは再生可能なディーゼルの原料として使用され得る。
【０１８７】
ある実施形態において、トウモロコシ油も、バイオディーゼルまたは再生可能なディーゼルの原料として使用され得る。ある実施形態において、油または油の組合せも、バイオディーゼルまたは再生可能なディーゼルの原料として使用され得る。油の例としては、キャノーラ油、ヒマシ油、トウモロコシ油、ホホバ油、カランジャ油、マフア油、亜麻仁油、大豆油、ヤシ油、ピーナツ油、菜種油、米油、ベニバナ油、およびヒマワリ油が挙げられる。バイオディーゼルは、メタノール、エタノール、およびブタノールなどのアルコールと植物油とのエステル交換またはエステル化のいずれかから得られる。例えば、バイオディーゼルは、酸触媒、アルカリ触媒、または酵素触媒のエステル交換またはエステル化（例えば、植物油由来のトリグリセリドのエステル交換または植物油由来の遊離脂肪酸のエステル化）によって生成され得る。硫酸、塩酸、およびリン酸などの無機酸；トルエンスルホン酸およびナフタレンスルホン酸などの有機酸；Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ（登録商標）スルホン酸化ポリスチレン樹脂などの固体酸；またはゼオライトが、酸触媒エステル交換またはエステル化のための触媒として使用され得る。水酸化カリウム、カリウムメトキシド、水酸化ナトリウム、ナトリウムメトキシド、または水酸化カルシウムなどの塩基が、アルカリ触媒エステル交換またはエステル化のための触媒として使用され得る。ある実施形態において、バイオディーゼルは、統合プロセス、例えば、遊離脂肪酸の酸触媒エステル化と、その後のトリグリセリドの塩基触媒エステル交換によって生成され得る。
【０１８８】
リパーゼまたはエステラーゼなどの酵素が、エステル交換またはエステル化反応を触媒するのに使用され得る。リパーゼは、細菌または真菌、例えば、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サーモマイセス属（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、およびリゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）に由来し得る。ある実施形態において、リパーゼは、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・セパシア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｅｐａｃｉａ）、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、バークホルデリア・セパシア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｃｅｐａｃｉａ）、サーモマイセス・ラヌギノサ（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、またはカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）に由来し得る。ある実施形態において、酵素は、可溶性または不溶性担体に固定化され得る。酵素の固定化は、１）共有結合による担持（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｓｕｐｐｏｒｔ）、物理吸着、静電結合、または親和結合を介した、多孔質または非多孔質キャリア担体への酵素の結合；２）二官能性または多官能性試薬による架橋；３）ゲルマトリックス、ポリマー、エマルジョン、または何らかの形態の膜への取り込み；および４）これらの方法のいずれかの組合せを含む様々な技術を用いて行われ得る。ある実施形態において、リパーゼは、例えば、アクリル樹脂、シリカ、またはビーズ（例えば、ポリメタクリレートビーズ）に固定化され得る。ある実施形態において、リパーゼは可溶性である得る。
【０１８９】
ある実施形態において、本明細書に記載されるバイオディーゼルは、以下の脂肪酸アルキルエステル（ＦＡＡＥ）：脂肪酸メチルエステル（ＦＡＭＥ）、脂肪酸エチルエステル（ＦＡＥＥ）、および脂肪酸ブチルエステル（ＦＡＢＥ）のうちの１つ以上を含み得る。ある実施形態において、本明細書に記載されるバイオディーゼルは、以下のもの：ミリステート、パルミテート、ステアレート、オレエート、リノレエート、リノレネート、アラキデート、およびベヘネートのうちの１つ以上を含み得る。
【０１９０】
ある実施形態において、発酵プロセスからの油は、蒸発によって回収されて、非水性流が形成され得る。この非水性流は、脂肪酸エステルおよび脂肪酸を含んでいてもよく、この流れは、生成物アルコールおよび脂肪酸を回収するために加水分解装置に送られ得る。ある実施形態において、この流れは、バイオディーゼル生成の原料として使用され得る。
【０１９１】
ある実施形態において、本明細書に記載されるバイオディーゼルは、米国材料試験協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）（ＡＳＴＭ）Ｄ６７５１の仕様を満たす。ある実施形態において、本明細書に記載されるバイオディーゼルは、欧州規格ＥＮ  １４２１４の規格を満たす。
【０１９２】
ある実施形態において、バイオディーゼルの生成のための反応器形態としては、例えば、バッチ式撹拌タンク反応器、連続式撹拌タンク反応器、充填床反応器、流動床反応器、膨張床反応器、および再循環膜反応器が挙げられる。
【０１９３】
ある実施形態において、組成物は、少なくとも２％のバイオディーゼル、少なくとも５％のバイオディーゼル、少なくとも１０％のバイオディーゼル、少なくとも２０％のバイオディーゼル、少なくとも３０％のバイオディーゼル、少なくとも４０％のバイオディーゼル、少なくとも５０％のバイオディーゼル、少なくとも６０％のバイオディーゼル、少なくとも７０％のバイオディーゼル、少なくとも８０％のバイオディーゼル、少なくとも９０％のバイオディーゼル、または１００％のバイオディーゼルを含み得る。
【０１９４】
ある実施形態において、本明細書に記載されるバイオディーゼルは、石油系ディーゼル燃料と混合されて、バイオディーゼルブレンドが形成され得る。ある実施形態において、バイオディーゼルブレンドは、少なくとも２体積％のバイオディーゼル、少なくとも３体積％のバイオディーゼル、少なくとも４体積％のバイオディーゼル、少なくとも５体積％のバイオディーゼル、少なくとも６体積％のバイオディーゼル、少なくとも７体積％のバイオディーゼル、少なくとも８体積％のバイオディーゼル、少なくとも９体積％のバイオディーゼル、少なくとも１０体積％のバイオディーゼル、少なくとも１１体積％のバイオディーゼル、少なくとも１２体積％のバイオディーゼル、少なくとも１３体積％のバイオディーゼル、少なくとも１４体積％のバイオディーゼル、少なくとも１５体積％のバイオディーゼル、少なくとも１６体積％のバイオディーゼル、少なくとも１７体積％のバイオディーゼル、少なくとも１８体積％のバイオディーゼル、少なくとも１９体積％のバイオディーゼル、または少なくとも２０体積％のバイオディーゼルを含み得る。ある実施形態において、バイオディーゼルブレンドは、最大で約２０体積％のバイオディーゼルを含み得る。
【０１９５】
バイオディーゼル生成の副生成物は、グリセロールである。さらに、グリセロールはまた、油および発酵プロセスの副生成物からの抽出剤の生成の副生成物であり得る。バイオディーゼルの原料は、ＣＯＦＡなどの脂肪酸をグリセロールと反応させることによって生成され得る。反応は、硫酸などの強無機酸によってまたはＡｍｂｅｒｌｙｓｔ（商標）ポリマー触媒などの固体酸触媒およびイオン交換樹脂によって触媒され得る。高い転化率は、反応塊から水を抜き取ることによって得られる。反応生成物は、反応剤の比率および反応の程度によって決定される割合でモノグリセリド、ジグリセリド、およびトリグリセリドを含有し得る。グリセリド混合物は、バイオディーゼルを作製するのに通常使用されるトリグリセリド原料の代わりに使用され得る。ある実施形態において、グリセリドは、界面活性剤としてまたはバイオディーゼルの原料として使用され得る。
【０１９６】
ある実施形態において、固体は、原料スラリーから分離されてもよく、トリグリセリドおよび脂肪酸を含み得る。これらの固体は、動物飼料として使用されてもよく、遠心分離からの排出としてまたは乾燥後のいずれかで回収され得る。固体は、利用可能なリジンおよびバイパスまたは第一胃非分解性タンパク質の含量が高いため、反すう動物（例えば、乳牛）の飼料として特に適し得る。例えば、これらの固体は、高タンパク質、低脂肪の飼料に特に有用であり得る。ある実施形態において、これらの固体は、基剤として使用されてもよく、すなわち、シロップなどの他の副生成物が、動物飼料として使用され得る生成物を形成するために固体に加えられてもよい。ある実施形態において、様々な量の他の副生成物が、得られる生成物の特性が特定の動物種（例えば、乳牛および肉牛、家禽、ブタ、家畜、ウマ、水産養殖、およびペット）の必要性を満たすように調整するために固体に加えられてもよい。
【０１９７】
低脂肪の動物飼料が所望されるある実施形態において、油が、発酵の前に原料から除去され得る。トウモロコシ油を除去することによって、生成されるＤＤＧＳは、低脂肪、高タンパク質含量を有し得る。トウモロコシ油が除去されない場合、ウェットケーキ中に存在する油は、乾燥プロセスによって酸化され得る。この酸化により、暗色化作用が生じ、より暗色のＤＤＧＳが生成される。油が発酵の前に原料から除去される場合、生成されるＤＤＧＳの色が、より明るくなり、このより明るい色のＤＤＧＳは、ある動物飼料製品に望ましいことがある。
【０１９８】
全蒸留廃液から分離される固体の組成物は、例えば、粗タンパク質、脂肪酸、および脂肪酸エステルを含み得る。ある実施形態において、この組成物は、動物飼料として湿潤または乾燥した状態で使用されてもよく、その場合、例えば、高タンパク質（例えば、高リジン）、低脂肪、および高い繊維含量が所望される。ある実施形態において、より高脂肪、低繊維の動物飼料が所望される場合、例えば、別の副生成物流から、脂肪がこの組成物に加えられてもよい。ある実施形態において、このより高脂肪、低繊維の動物飼料は、ブタまたは家禽に使用され得る。ある実施形態において、ＣＤＳの非水性組成物は、例えば、タンパク質、脂肪酸、および脂肪酸エステルならびに塩および炭水化物などの他の溶解および懸濁固体を含み得る。このＣＤＳ組成物は、例えば、動物飼料として湿潤または乾燥した状態で使用されてもよく、その場合、高タンパク質、低脂肪、高無機塩の飼料成分が所望される。ある実施形態において、この組成物は、乳牛の飼料の成分として使用されてもよい。
【０１９９】
ある実施形態において、発酵プロセスによる生成物アルコールの生成によって生成される１つ以上の流れは、組み合わされて、バイオディーゼルなどの燃料源として使用され得る少なくとも約９０％の脂肪酸を含む組成物が生成され得る。
【０２００】
発酵プロセスによる生成物アルコールの生成によって生成される様々な流れは、いくつかの副産物を生成するために多くの方法で組み合わされ得る。例えば、マッシュからの粗トウモロコシを用いて、抽出剤として用いられる脂肪酸を生成し、脂質が、蒸発器によって抽出される場合、残りの流れが、組み合わされ、粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、および脂肪酸エステルを含む副産物組成物を生成するように処理され得る。別の例において、トウモロコシ油などの油が、原料スラリーから除去される場合、油は、例えば、動物飼料製品を生成するために、穀類蒸留粕に加えられ得る。
【０２０１】
ある実施形態において、本明細書に記載される方法およびシステムの組成物は、少なくとも約２０〜３５重量％の粗タンパク質、少なくとも約１〜２０重量％の粗脂肪、少なくとも約０〜５重量％のトリグリセリド、少なくとも約４〜１０重量％の脂肪酸、および少なくとも約２〜６重量％の脂肪酸エステルを含み得る。ある実施形態において、組成物は、約２５重量％の粗タンパク質、約１０重量％の粗脂肪、約０．５重量％のトリグリセリド、約６重量％の脂肪酸、および約４重量％の脂肪酸エステルを含み得る。ある実施形態において、組成物は、少なくとも約２５〜３１重量％の粗タンパク質、少なくとも約６〜１０重量％の粗脂肪、少なくとも約４〜８重量％のトリグリセリド、少なくとも約０〜２重量％の脂肪酸、および少なくとも約１〜３重量％の脂肪酸エステルを含み得る。ある実施形態において、組成物は、約２８重量％の粗タンパク質、約８重量％の粗脂肪、約６重量％のトリグリセリド、約０．７重量％の脂肪酸、および約１重量％の脂肪酸エステルを含み得る。ある実施形態において、脂肪酸エステルは、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル、脂肪酸ブチルエステル、または脂肪酸イソブチルエステルであり得る。
【０２０２】
ある実施形態において、全蒸留廃液から分離される固体および原料スラリーから抽出される油は、組み合わされてもよく、得られる組成物は、粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、脂肪酸エステル、リジン、中性デタージェント繊維（ＮＤＦ）、および酸性デタージェント繊維（ＡＤＦ）を含み得る。ある実施形態において、組成物は、少なくとも約２６〜３４重量％の粗タンパク質、少なくとも約１５〜２５重量％の粗脂肪、少なくとも約１２〜２０重量％のトリグリセリド、少なくとも約１〜２重量％の脂肪酸、少なくとも約２〜４重量％の脂肪酸エステル、少なくとも約１〜２重量％のリジン、少なくとも約１１〜２３重量％のＮＤＦ、および少なくとも約５〜１１重量％のＡＤＦを含み得る。ある実施形態において、組成物は、約２９重量％の粗タンパク質、約２１重量％の粗脂肪、約１６重量％のトリグリセリド、約１重量％の脂肪酸、約３重量％の脂肪酸エステル、約１重量％のリジン、約１７重量％のＮＤＦ、および約８重量％のＡＤＦを含み得る。ある実施形態において、脂肪酸エステルは、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステル、脂肪酸ブチルエステル、または脂肪酸イソブチルエステルであり得る。この組成物の高脂肪、トリグリセリド、およびリジン含量およびより低い繊維含量は、ブタおよび家禽の飼料として望ましいであろう。
【０２０３】
本明細書に記載されるように、発酵プロセスによる生成物アルコールの生成によって生成される様々な流れは、粗タンパク質、粗脂肪、トリグリセリド、脂肪酸、および脂肪酸エステルを含む組成物を生成するために多くの方法で組み合わされ得る。例えば、少なくとも約６％の粗脂肪および少なくとも約２８％の粗タンパク質を含む組成物が、乳畜の動物飼料製品として用いられ得る。少なくとも約６％の粗脂肪および少なくとも約２６％の粗タンパク質を含む組成物が、フィードロット牛の動物飼料製品として用いられ得る一方、少なくとも約１％の粗脂肪および少なくとも約２７％の粗タンパク質を含む組成物が、越冬牛の動物飼料製品として用いられ得る。少なくとも約１３％の粗脂肪および少なくとも約２７％の粗タンパク質を含む組成物が、家禽の動物飼料製品として用いられ得る。少なくとも約１８％の粗脂肪および少なくとも約２２％の粗タンパク質を含む組成物が、単胃動物の動物飼料製品として用いられ得る。様々な流れは、特定の動物種（例えば、家畜、反すう動物、ウシ、乳畜、ブタ、ヤギ、ヒツジ、家禽、ウマ、水産養殖、またはイヌ、ネコ、およびウサギなどのペット）向けに飼料製品をカスタマイズするように組み合わされ得る。
【０２０４】
本発明の方法によって生成されるＤＤＧＳは、以下のもの：タンパク質、脂肪、繊維、灰、脂質、アミノ酸、ビタミン、およびミネラルの１つ以上の添加によってカスタマイズされた高付加価値の飼料製品を生成するように変性され得る。アミノ酸としては、例えば、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、およびバリンなどの必須アミノ酸ならびにアラニン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒドロキシリシン、ヒドロキシプロリン、オルニチン、プロリン、セリン、およびチロシンなどの他のアミン酸が挙げられる。ミネラルとしては、例えば、カルシウム、塩化物、コバルト、銅、フッ化物、ヨウ素、鉄、マグネシウム、マンガン、リン、カリウム、セレン、ナトリウム、硫黄、および亜鉛が挙げられる。ビタミンとしては、例えば、ビタミンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、およびＢ（チアミン、リボフラビン、ナイアシン、パントテン酸、ビオチン、ビタミンＢ６、ビタミンＢ１２および葉酸塩）が挙げられる。
【０２０５】
本明細書に記載されるように、本発明の方法およびシステムは、ブタノールなどの生成物アルコールの向上した生成をもたらし得るいくつかの利点を提供する。例えば、物質移動の改善は、より低い水性力価における運転を可能にし、微生物が「より健康」になる。より良好な相分離は、向上した発酵装置体積効率ならびにビール塔、蒸留塔などを通るより少ない反応器含有物の処理の可能性につながり得る。さらに、固体を介した溶媒損失がより少なく、細胞の再利用の可能性がある。本発明の方法およびシステムは、ＤＤＧＳのより高い品質も提供し得る。
【０２０６】
本明細書に記載される方法およびシステムは、発酵前の油の除去も提供し、これにより、発酵への油の制御された添加が可能になり得る。さらに、発酵前の油の除去は、ＤＤＧＳ中に存在する油の量に柔軟性をもたせ得る。すなわち、油は、様々な量でＤＤＧＳに加えられてもよく、特定の動物種の栄養必要量に応じて様々な脂肪含量を有するＤＤＧＳが生成される。
【０２０７】
本明細書に記載される方法およびシステムは、Ａｓｐｅｎモデル化などの計算機モデル化を用いて実証され得る（例えば、米国特許第７，６６６，２８２号明細書を参照）。例えば、市販のモデル化ソフトウェアＡｓｐｅｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）（Ａｓｐｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）は、統合されたアルコール発酵、精製、および水管理プロセスのためのＡｓｐｅｎモデルを作り出すために、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）から入手可能なＤＩＰＰＲ（Ｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）などの物理的特性データベースとともに使用され得る。このプロセスモデル化は、多くの基礎工学的計算、例えば、物質収支およびエネルギー収支、気／液平衡、および反応速度計算を行うことができる。Ａｓｐｅｎモデルを生成するために、情報入力は、例えば、実験データ、含水量および原料の組成、マッシュの調理およびフラッシュのための温度、糖化条件（例えば、酵素原料、でんぷん転化率、温度、圧力）、発酵条件（例えば、微生物原料、グルコース転化率、温度、圧力）、脱気条件、溶媒塔、プレフラッシュ塔、凝縮器、蒸発器、遠心分離機などを含み得る。
【０２０８】
組み換え微生物
理論によって制約されるのを望むものではないが、本明細書に記載される方法は、任意のアルコール生成微生物、特に、それらの耐性レベルを超える力価でアルコールを生成する組み換え微生物に関連して有用であると考えられる。
【０２０９】
アルコール生成微生物は、当該技術分野において公知である。例えば、メタン資化性細菌（例えば、メチロサイナス・トリコスポリウム（Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ  ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ））によるメタンの発酵酸化により、メタノールが生成され、酵母菌株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ（ＣＢＳ  ８３４０，ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａａｌ  Ｂｕｒｏ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅ；ｖａｎ  Ｄｉｊｋｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏ．２６：７０６−７１４，２０００）により、エタノールが生成される。  アルコールを生成する組み換え微生物も、当該技術分野において公知である（例えば、Ｏｈｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５７：８９３−９００，１９９１；Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１−１０８１，２００２；Ｓｈｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉａｏ，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．１０：３１２−３２０，２００８；Ｈａｈｎａｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３：７８１４−７８１８，２００７；米国特許第５，５１４，５８３号明細書；米国特許第５，７１２，１３３号明細書；ＰＣＴ出願公開番号国際公開第１９９５／０２８４７６号パンフレット；Ｆｅｌｄｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：３５４−３６１，１９９２；Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：２４０−２４３，１９９５；米国特許出願公開第２００７／００３１９１８Ａ１号明細書；米国特許第７，２２３，５７５号明細書；米国特許第７，７４１，１１９号明細書；米国特許第７，８５１，１８８号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２０３０９９Ａ１号明細書；米国特許出願公開第２００９／０２４６８４６Ａ１号明細書；およびＰＣＴ出願公開番号国際公開第２０１０／０７５２４１号パンフレット、これらは全て参照により本明細書に援用される）。
【０２１０】
さらに、微生物は、エタノールおよびブタノールなどの生成物アルコールを生成することが可能な組み換え微生物を生成するための組み換え技術を用いて改変され得る。生合成経路を介して生成物アルコールを生成するように組み換え技術によって改変される微生物としては、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、エルウイニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、乳酸杆菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバチルス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイベロマイセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ピヒア属（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、イサタケンキア属（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）、またはサッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーが挙げられる。ある実施形態において、組み換え微生物は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、クルイベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）からなる群から選択され得る。ある実施形態において、組み換え微生物は酵母である。ある実施形態において、組み換え微生物は、サッカロマイセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ジゴサッカロマイセス属（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロマイセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、デッケラ属（Ｄｅｋｋｅｒａ）、トルロプシス属（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ）、ブレタノマイセス属（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ）、およびカンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）のいくつかの種から選択されるクラブトリー陽性酵母である。クラブトリー陽性酵母種としては、以下に限定はされないが、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、サッカロマイセス・バイアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロマイセス・ミカタエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｍｉｋｉｔａｅ）、サッカロマイセス・パラドキサス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｒａｄｏｘｕｓ）、ジゴサッカロマイセス・ルーキシィ（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｒｏｕｘｉｉ）、およびカンジダ・グラブラタ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）が挙げられる。
【０２１１】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が、当該技術分野において公知であり、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）Ｆｕｎｇａｌ  Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｅｎｔｒｅ、ＬｅＳａｆｆｒｅ、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＡＢ、Ｆｅｒｍ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｍａｒｔｒｅｘ、およびＬａｌｌｅｍａｎｄを含むがこれらに限定されない様々な供給元から入手可能である。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）としては、以下に限定はされないが、ＢＹ４７４１、ＣＥＮ．ＰＫ  １１３−７Ｄ、Ｅｔｈａｎｏｌ  Ｒｅｄ（登録商標）酵母、Ｆｅｒｍ  Ｐｒｏ（商標）酵母、Ｂｉｏ−Ｆｅｒｍ（登録商標）ＸＲ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ  Ｂａｔｃｈ  Ｔｕｒｂｏアルコール酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｐｏｔ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ酵母、Ｇｅｒｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｔｕｒｂｏ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｒｅｅｎ酵母、ＦｅｒＭａｘ（商標）Ｇｏｌｄ酵母、Ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃ（登録商標）酵母、ＢＧ−１、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、およびＣＢＳ７９６１が挙げられる。
【０２１２】
ある実施形態において、微生物は、固定化または封入され得る。例えば、微生物は、アルギネート、アルギン酸カルシウム、またはポリアクリルアミドゲルを用いて、または珪藻岩、セライト、珪藻土、シリカゲル、プラスチック、または樹脂などの様々な高表面積支持基質へのバイオフィルム形成の誘導によって固定化または封入され得る。ある実施形態において、ＩＳＰＲは、固定化または封入された微生物と組み合わせて使用され得る。この組合せは、比体積生産性、代謝率、生成物アルコール収率、生成物アルコールへの耐性などの生産性を向上させ得る。さらに、固定化および封入は、微生物に対するせん断などのプロセス条件の影響を最小限に抑え得る。
【０２１３】
発酵を用いたブタノールの生成、ならびにブタノールを生成する微生物は、例えば、米国特許第７，８５１，１８８号明細書、および米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書；同第２００７／０２５９４１０号明細書；同第２００７／０２９２９２７号明細書；同第２００８／０１８２３０８号明細書；同第２００８／０２７４５２５号明細書；同第２００９／０１５５８７０号明細書；同第２００９／０３０５３６３号明細書；および同第２００９／０３０５３７０号明細書に開示されており、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される。ある実施形態において、微生物は、生合成経路を含むように改変される。ある実施形態において、生合成経路は、改変されたブタノール生合成経路である。ある実施形態において、生合成経路は、ピルビン酸を発酵産物に転化する。ある実施形態において、生合成経路は、ピルビン酸ならびにアミノ酸を発酵産物に転化する。ある実施形態において、経路の各基質−生成物転化を触媒する少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つのポリペプチドが、微生物中の異種のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態において、経路の基質−生成物転化を触媒する全てのポリペプチドが、微生物中の異種のポリヌクレオチドによってコードされる。ある実施形態において、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への基質−生成物転化を触媒するポリペプチドおよび／またはイソブチルアルデヒドからイソブタノールへの基質−生成物転化を触媒するポリペプチドは、補因子として還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）を用いることが可能である。
【０２１４】
生合成経路
使用され得るイソブタノールの生成のための生合成経路としては、参照により本明細書に援用される米国特許第７，８５１，１８８号明細書に記載されているものが挙げられる。一実施形態において、イソブタノール生合成経路は、以下の基質−生成物転化を含む：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒され得る、ピルビン酸からアセト乳酸；
ｂ）例えば、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによって触媒され得る、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸；
ｃ）例えば、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒され得る、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸；
ｄ）例えば、分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼによって触媒され得る、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒド；および
ｅ）例えば、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、イソブチルアルデヒドからイソブタノール。
【０２１５】
別の実施形態において、イソブタノール生合成経路は、以下の基質−生成物転化を含む：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒され得る、ピルビン酸からアセト乳酸；
ｂ）例えば、ケトール酸レダクトイソメラーゼによって触媒され得る、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸；
ｃ）例えば、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒され得る、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からａ−ケトイソ吉草酸；
ｄ）例えば、トランスアミナーゼまたはバリンデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、α−ケトイソ吉草酸からバリン；
ｅ）例えば、バリンデカルボキシラーゼによって触媒され得る、バリンからイソブチルアミン；
ｆ）例えば、オメガトランスアミナーゼによって触媒され得る、イソブチルアミンからイソブチルアルデヒド；および
ｇ）例えば、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、イソブチルアルデヒドからイソブタノール。
【０２１６】
別の実施形態において、イソブタノール生合成経路は、以下の基質−生成物転化を含む：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒され得る、ピルビン酸からアセト乳酸；
ｂ）例えば、アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼによって触媒され得る、アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸；
ｃ）例えば、アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼによって触媒され得る、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸；
ｄ）例えば、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼによって触媒され得る、α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡ；
ｅ）例えば、アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒド；および
ｆ）例えば、分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、イソブチルアルデヒドからイソブタノール。
【０２１７】
使用され得る１−ブタノールの生成のための生合成経路としては、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００８／０１８２３０８号明細書に記載されているものが挙げられる。一実施形態において、１−ブタノール生合成経路は、以下の基質−生成物転化を含む：
ａ）例えば、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼによって触媒され得る、アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡ；
ｂ）例えば、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡ；
ｃ）例えば、クロトナーゼによって触媒され得る、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡ；
ｄ）例えば、ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡ；
ｅ）例えば、ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒド；および
ｆ）例えば、ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、ブチルアルデヒドから１−ブタノール。
【０２１８】
使用され得る２−ブタノールの生成のための生合成経路としては、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書および米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書に記載されているものが挙げられる。一実施形態において、２−ブタノール生合成経路は、以下の基質−生成物転化を含む：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒され得る、ピルビン酸からα−アセト乳酸；
ｂ）例えば、アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒され得る、α−アセト乳酸からアセトイン；
ｃ）例えば、アセトインアミナーゼによって触媒され得る、アセトインから３−アミノ−２−ブタノール；
ｄ）例えば、アミノブタノールキナーゼによって触媒され得る、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールホスフェート；
ｅ）例えば、アミノブタノールホスフェートホスホリラーゼによって触媒され得る、３−アミノ−２−ブタノールホスフェートから２−ブタノン；および
ｆ）例えば、ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、２−ブタノンから２−ブタノール。
【０２１９】
別の実施形態において、２−ブタノール生合成経路は、以下の基質−生成物転化を含む：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒され得る、ピルビン酸からα−アセト乳酸；
ｂ）例えば、アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒され得る、α−アセト乳酸からアセトイン；
ｃ）例えば、ブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、アセトインから２，３−ブタンジオール；
ｄ）例えば、ジオールデヒドラターゼによって触媒され得る、２，３−ブタンジオールから２−ブタノン；および
ｅ）例えば、ブタノールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、２−ブタノンから２−ブタノール。
【０２２０】
使用され得る２−ブタノンの生成のための生合成経路としては、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書および米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書に記載されているものが挙げられる。一実施形態において、２−ブタノン生合成経路は、以下の基質−生成物転化を含む：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒され得る、ピルビン酸からα−アセト乳酸；
ｂ）例えば、アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒され得る、α−アセト乳酸からアセトイン；
ｃ）例えば、アセトインアミナーゼによって触媒され得る、アセトインから３−アミノ−２−ブタノール；
ｄ）例えば、アミノブタノールキナーゼによって触媒され得る、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールホスフェート；および
ｅ）例えば、アミノブタノールホスフェートホスホリラーゼによって触媒され得る、３−アミノ−２−ブタノールホスフェートから２−ブタノン。
【０２２１】
別の実施形態において、２−ブタノン生合成経路は、以下の基質−生成物転化を含む：
ａ）例えば、アセト乳酸シンターゼによって触媒され得る、ピルビン酸からα−アセト乳酸；
ｂ）例えば、アセト乳酸デカルボキシラーゼによって触媒され得る、α−アセト乳酸からアセトイン；
ｃ）例えば、ブタンジオールデヒドロゲナーゼによって触媒され得る、アセトインから２，３−ブタンジオール；および
ｄ）例えば、ジオールデヒドラターゼによって触媒され得る、２，３−ブタンジオールから２−ブタノン。
【０２２２】
「アセトヒドロキシ酸シンターゼ」、「アセト乳酸シンターゼ」、および「アセト乳酸シンテターゼ」（「ＡＬＳ」と略記される）という用語は、ピルビン酸からアセト乳酸およびＣＯ２への転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指すために本明細書において同義に使用される。アセト乳酸シンターゼの例は、ＥＣ番号２．２．１．６（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）によって知られている。これらの未修飾酵素は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＢ１５６１８（配列番号１）、Ｚ９９１２２（配列番号２）、ＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））アミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＡ２５０７９（配列番号３）、Ｍ７３８４２（配列番号４））、および乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＡ２５１６１（配列番号５）、Ｌ１６９７５（配列番号６））を含むがこれらに限定されないいくつかの供給源から入手可能である。
【０２２３】
「ケト酸レダクトイソメラーゼ」（「ＫＡＲＩ」）、「アセトヒドロキシ酸イソメロレダクターゼ」、および「アセトヒドロキシ酸レダクトイソメラーゼ」という用語は、同義に使用され、（Ｓ）−アセト乳酸から２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸への反応を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。ＫＡＲＩ酵素の例は、ＥＣ番号ＥＣ  １．１．１．８６（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）として分類されてもよく、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿４１８２２２（配列番号７）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号８））、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿０１３４５９（配列番号９）、ＮＣ＿００１１４４（配列番号１０））、メタノコッカス・マリパルディス（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＦ３０２１０（配列番号１１）、ＢＸ９５７２２０（配列番号１２））、および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＢ１４７８９（配列番号１３）、Ｚ９９１１８（配列番号１４））を含むがこれらに限定されない広範囲の微生物から入手可能である。ＫＡＲＩとしては、アナエロスティペス・カカエ（Ａｎａｅｒｏｓｔｉｐｅｓ  ｃａｃｃａｅ）ＫＡＲＩ変異体「Ｋ９Ｇ９」および「Ｋ９Ｄ３」（それぞれ、配列番号１５および１６）が挙げられる。ケト酸レダクトイソメラーゼ（ＫＡＲＩ）酵素が、参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２００８／０２６１２３０号明細書、同第２００９／０１６３３７６号明細書、および同第２０１０／０１９７５１９号明細書、およびＰＣＴ出願公報番号国際公開第２０１１／０４１４１５号パンフレットに記載されている。これらの文献に開示されているＫＡＲＩの例は、乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１、および蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＦ５突然変異体に由来するものである。ある実施形態において、ＫＡＲＩはＮＡＤＨを用いる。ある実施形態において、ＫＡＲＩは、還元型のニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）を用いる。
【０２２４】
「アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼ」および「ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ」（「ＤＨＡＤ」）という用語は、２，３−ジヒドロキシイソ吉草酸からα−ケトイソ吉草酸への転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。アセトヒドロキシ酸デヒドラターゼの例は、ＥＣ番号４．２．１．９によって知られている。このような酵素は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＹＰ＿０２６２４８（配列番号１７）、ＮＣ０００９１３（配列番号１８））、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿０１２５５０（配列番号１９）、ＮＣ  ００１１４２（配列番号２０）、Ｍ．マリパルディス（Ｍ．ｍａｒｉｐａｌｕｄｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＦ２９８７４（配列番号２１）、ＢＸ９５７２１９（配列番号２２））、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＢ１４１０５（配列番号２３）、Ｚ９９１１５（配列番号２４））、乳酸連鎖球菌（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）、およびアカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）を含むがこれらに限定されない広範囲の微生物から入手可能である。参照により本明細書に援用される、米国特許出願公開第２０１０／００８１１５４号明細書、および米国特許第７，８５１，１８８号明細書には、ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）に由来するＤＨＡＤを含むジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ＤＨＡＤ）が記載されている。
【０２２５】
「分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ」、「α−ケト酸デカルボキシラーゼ」、「α−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ」、または「２−ケトイソ吉草酸デカルボキシラーゼ」（「ＫＩＶＤ」）という用語は、α−ケトイソ吉草酸からイソブチルアルデヒドおよびＣＯ２への転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。分枝鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼの例は、ＥＣ番号４．１．１．７２によって知られており、乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＳ４９１６６（配列番号２５）、ＡＹ５４８７６０（配列番号２６）；ＣＡＧ３４２２６（配列番号２７）、ＡＪ７４６３６４（配列番号２８）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿４６１３４６（配列番号２９）、ＮＣ＿００３１９７（配列番号３０））、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿１４９１８９（配列番号３１）、ＮＣ＿００１９８８（配列番号３２））、Ｍ．カセオリティクス（Ｍ．ｃａｓｅｏｌｙｔｉｃｕｓ）（配列番号３３）、およびＬ．グライ（Ｌ．ｇｒａｙｉ）（配列番号３４）を含むがこれらに限定されないいくつかの供給源から入手可能である。
【０２２６】
「分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼ」（「ＡＤＨ」）という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。分枝鎖アルコールデヒドロゲナーゼの例は、ＥＣ番号１．１．１．２６５によって知られているが、他のアルコールデヒドロゲナーゼ（特に、ＥＣ  １．１．１．１または１．１．１．２）にも分類され得る。アルコールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＰＨ依存性またはＮＡＤＨ依存性であり得る。このような酵素は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿０１０６５６（配列番号３５）、ＮＣ＿００１１３６（配列番号３６）、ＮＰ＿０１４０５１（配列番号３７）、ＮＣ＿００１１４５（配列番号３８））、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿４１７４８４（配列番号３９）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号４０））、Ｃ．アセトブチリクム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿３４９８９２（配列番号４１）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号４２）；ＮＰ＿３４９８９１（配列番号４３）、ＮＣ＿００３０３０（配列番号４４））を含むがこれらに限定されないいくつかの供給源から入手可能である。米国特許出願公開第２００９／０２６９８２３号明細書には、ＳａｄＢ、アクロモバクター・キシロソキシダンス（Ａｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒ  ｘｙｌｏｓｏｘｉｄａｎｓ）に由来するアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）が記載されている。アルコールデヒドロゲナーゼは、（参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１／０２６９１９９号明細書に記載されているように）ウマ肝臓由来のＡＤＨおよびベイジェリンキア・インディカ（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉａ  ｉｎｄｉｃａ）ＡＤＨも含む。
【０２２７】
「ブタノールデヒドロゲナーゼ」という用語は、イソブチルアルデヒドからイソブタノールへの転化または２−ブタノンおよび２−ブタノールの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチド（またはポリペプチド）を指す。ブタノールデヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼの幅広いファミリーのサブセットである。ブタノールデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤ−またはＮＡＤＰ依存性であり得る。ＮＡＤ依存性酵素は、ＥＣ  １．１．１．１として知られており、例えば、ロドコッカス・ルーバー（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｒｕｂｅｒ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＤ３６４７５、ＡＪ４９１３０７）から入手可能である。ＮＡＤＰ依存性酵素は、ＥＣ  １．１．１．２として知られており、例えば、ピュロコックス・フリオスス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＣ２５５５６、ＡＦ０１３１６９）から入手可能である。さらに、ブタノールデヒドロゲナーゼは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ  ４１７４８４、ＮＣ＿０００９１３）から入手可能であり、シクロヘキサノールデヒドロゲナーゼは、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＧ１００２６、ＡＦ２８２２４０）から入手可能である。「ブタノールデヒドロゲナーゼ」という用語は、補因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかを用いたブチルアルデヒドから１−ブタノールへの転化を触媒する酵素も指す。ブタノールデヒドロゲナーゼは、例えば、Ｃ．アセトブチリクム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿１４９３２５、ＮＣ＿００１９８８；注記：この酵素は、アルデヒドおよびアルコールデヒドロゲナーゼ活性の両方を有する）；ＮＰ＿３４９８９１、ＮＣ＿００３０３０；およびＮＰ＿３４９８９２、ＮＣ＿００３０３０）および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿４１７−４８４、ＮＣ＿０００９１３）から入手可能である。
【０２２８】
「分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ」という用語は、通常、電子受容体としてＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）を用いた、α−ケトイソ吉草酸からイソブチリル−ＣｏＡ（イソブチリル−補酵素Ａ）への転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼの例は、ＥＣ番号１．２．４．４によって知られている。このような分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼは、４つのサブユニットから構成され、全てのサブユニットからの配列が、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＢ１４３３６（配列番号４５）、Ｚ９９１１６（配列番号４６）；ＣＡＢ１４３３５（配列番号４７）、Ｚ９９１１６（配列番号４８）；ＣＡＢ１４３３４（配列番号４９）、Ｚ９９１１６（配列番号５０）；およびＣＡＢ１４３３７（配列番号５１）、Ｚ９９１１６（配列番号５２））およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＡ６５６１４（配列番号５３）、Ｍ５７６１３（配列番号５４）；ＡＡＡ６５６１５（配列番号５５）、Ｍ５７６１３（配列番号５６）；ＡＡＡ６５６１７（配列番号５７）、Ｍ５７６１３（配列番号５８）；およびＡＡＡ６５６１８（配列番号５９）、Ｍ５７６１３（配列番号６０））を含むがこれらに限定されない広範囲の微生物から入手可能である。
【０２２９】
「アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼ」という用語は、通常、電子供与体としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨのいずれかを用いた、イソブチリル−ＣｏＡからイソブチルアルデヒドへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。アシル化アルデヒドデヒドロゲナーゼの例は、ＥＣ番号１．２．１．１０および１．２．１．５７によって知られている。このような酵素は、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＤ３１８４１（配列番号６１）、ＡＦ１５７３０６（配列番号６２））、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿１４９３２５（配列番号６３）、ＮＣ＿００１９８８（配列番号６４）；ＮＰ＿１４９１９９（配列番号６５）、ＮＣ＿００１９８８（配列番号６６））、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＡ８９１０６（配列番号６７）、Ｕ１３２３２（配列番号６８））、およびサーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＹＰ＿１４５４８６（配列番号６９）、ＮＣ＿００６４６１（配列番号７０））を含むがこれらに限定されない複数の供給源から入手可能である。
【０２３０】
「トランスアミナーゼ」という用語は、アミン供与体としてアラニンまたはグルタミン酸塩のいずれかを用いた、α−ケトイソ吉草酸からＬ−バリンへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。トランスアミナーゼの例は、ＥＣ番号２．６．１．４２および２．６．１．６６によって知られている。このような酵素は、いくつかの供給源から入手可能である。アラニン依存性酵素の供給源の例としては、以下に限定はされないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＹＰ＿０２６２３１（配列番号７１）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号７２））およびバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＹＰ＿０９３７４３（配列番号７３）、ＮＣ＿００６３２２（配列番号７４））が挙げられる。グルタミン酸塩依存性酵素の供給源の例としては、以下に限定はされないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＹＰ＿０２６２４７（配列番号７５）、ＮＣ＿０００９１３（配列番号７６））、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿０１２６８２（配列番号７７）、ＮＣ＿００１１４２（配列番号７８））およびメタノバクテリウム・サーモオートトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿２７６５４６（配列番号７９）、ＮＣ＿０００９１６（配列番号８０））が挙げられる。
【０２３１】
「バリンデヒドロゲナーゼ」という用語は、通常、電子供与体としてＮＡＤ（Ｐ）Ｈおよびアミン供与体としてアンモニアを用いた、α−ケトイソ吉草酸からＬ−バリンへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。バリンデヒドロゲナーゼの例は、ＥＣ番号１．４．１．８および１．４．１．９によって知られており、このような酵素は、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿６２８２７０（配列番号８１）、ＮＣ＿００３８８８（配列番号８２））および枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＢ１４３３９（配列番号８３）、Ｚ９９１１６（配列番号８４））を含むがこれらに限定されないいくつかの供給源から入手可能である。
【０２３２】
「バリンデカルボキシラーゼ」という用語は、Ｌ−バリンからイソブチルアミンおよびＣＯ２への転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。バリンデカルボキシラーゼの例は、ＥＣ番号４．１．１．１４によって知られている。このような酵素は、例えば、ストレプトマイセス・ビリジファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＮ１０２４２（配列番号８５）、ＡＹ１１６６４４（配列番号８６））などのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に見られる。
【０２３３】
「オメガトランスアミナーゼ」という用語は、アミン供与体として好適なアミノ酸を用いた、イソブチルアミンからイソブチルアルデヒドへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。オメガトランスアミナーゼの例は、ＥＣ番号２．６．１．１８によって知られており、アルカリゲネス・デニトリフィカンス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）（ＡＡＰ９２６７２（配列番号８７）、ＡＹ３３０２２０（配列番号８８））、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＹＰ＿２９４４７４（配列番号８９）、ＮＣ＿００７３４７（配列番号９０））、シェワネラ・オネイデンシス（Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿７１９０４６（配列番号９１）、ＮＣ＿００４３４７（配列番号９２））、およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＮ６６２２３（配列番号９３）、ＡＥ０１６７７６（配列番号９４））を含むがこれらに限定されないいくつかの供給源から入手可能である。
【０２３４】
「アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ」という用語は、アセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡおよび補酵素Ａ（ＣｏＡ）の２つの分子の転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼの例は、短鎖アシル−ＣｏＡおよびアセチル−ＣｏＡに対する基質選択性（順方向の反応）を有するアセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼであり、Ｅ．Ｃ．２．３．１．９［Ｅｎｚｙｍｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  １９９２，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ］として分類されるが；より広い基質範囲を有する酵素（Ｅ．Ｃ．２．３．１．１６）が同様に機能する。アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼは、いくつかの供給源、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿４１６７２８、ＮＣ＿０００９１３；ＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ））アミノ酸配列、ＮＣＢＩヌクレオチド配列）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿３４９４７６．１、ＮＣ＿００３０３０；ＮＰ＿１４９２４２、ＮＣ＿００１９８８、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿３９０２９７、ＮＣ＿０００９６４）、およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿０１５２９７、ＮＣ＿００１１４８）から入手可能である。
【０２３５】
「３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、アセトアセチル−ＣｏＡから３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの例は、ＮＡＤＨ依存性であってもよく、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選択性を有する。例は、それぞれＥ．Ｃ．１．１．１．３５およびＥ．Ｃ．１．１．１．３０として分類されてもよい。さらに、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、ＮＡＤＰＨ依存性であってもよく、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選択性を有し、それぞれＥ．Ｃ．１．１．１．１５７およびＥ．Ｃ．１．１．１．３６として分類される。３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、いくつかの供給源、例えば、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿３４９３１４、ＮＣ＿００３０３０）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＢ０９６１４、Ｕ２９０８４）、ラルストニア・ユートロファ（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｅｕｔｒｏｐｈａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＹＰ＿２９４４８１、ＮＣ＿００７３４７）、およびアルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＡ２１９７３、Ｊ０４９８７）から入手可能である。
【０２３６】
「クロトナーゼ」という用語は、３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡからクロトニル−ＣｏＡおよびＨ２Ｏへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。クロトナーゼの例は、（Ｓ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡまたは（Ｒ）−３−ヒドロキシブチリル−ＣｏＡに対する基質選択性を有してもよく、それぞれＥ．Ｃ．４．２．１．１７およびＥ．Ｃ．４．２．１．５５として分類されてもよい。クロトナーゼは、いくつかの供給源、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿４１５９１１、ＮＣ＿０００９１３）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿３４９３１８、ＮＣ＿００３０３０）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＢ１３７０５、Ｚ９９１１３）、およびエロモナス・キャビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｖｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＢＡＡ２１８１６、Ｄ８８８２５）から入手可能である。
【０２３７】
「ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼ」という用語は、クロトニル−ＣｏＡからブチリル−ＣｏＡへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼの例は、ＮＡＤＨ依存性、ＮＡＤＰＨ依存性、またはフラビン依存性であってもよく、それぞれＥ．Ｃ．１．３．１．４４、Ｅ．Ｃ．１．３．１．３８、およびＥ．Ｃ．１．３．９９．２として分類されてもよい。ブチリル−ＣｏＡデヒドロゲナーゼは、いくつかの供給源、例えば、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿３４７１０２、ＮＣ＿００３０３０）、ミドリムシ（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：Ｑ５ＥＵ９０、ＡＹ７４１５８２）、ストレプトマイセス・コリヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｌｌｉｎｕｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＡ９２８９０、Ｕ３７１３５）、およびストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＡ２２７２１、ＡＬ９３９１２７）から入手可能である。
【０２３８】
「ブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ」という用語は、補因子としてＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを用いた、ブチリル−ＣｏＡからブチルアルデヒドへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。ＮＡＤＨに対する選択性を有するブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼは、Ｅ．Ｃ．１．２．１．５７として知られており、例えば、クロストリジウム・ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＤ３１８４１、ＡＦ１５７３０６）およびクロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ．ｓｕｂ．−−１４９３２５、ＮＣ．ｓｕｂ．−−００１９８８）から入手可能である。
【０２３９】
「イソブチリル−ＣｏＡムターゼ」という用語は、ブチリル−ＣｏＡからイソブチリル−ＣｏＡへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。この酵素は、補因子として補酵素Ｂ１２を使用する。イソブチリル−ＣｏＡムターゼの例は、ＥＣ番号５．４．９９．１３によって知られている。これらの酵素は、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｎｎａｍｏｎｅｎｓｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＣ０８７１３（配列番号９５）、Ｕ６７６１２（配列番号９６）；ＣＡＢ５９６３３（配列番号９７）、ＡＪ２４６００５（配列番号９８））、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＢ７０６４５（配列番号９９）、ＡＬ９３９１２３（配列番号１００）；ＣＡＢ９２６６３（配列番号１０１）、ＡＬ９３９１２１（配列番号１０２））、およびストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＮＰ＿８２４００８（配列番号１０３）、ＮＣ＿００３１５５（配列番号１０４）；ＮＰ＿８２４６３７（配列番号１０５）、ＮＣ＿００３１５５（配列番号１０６））を含むがこれらに限定されないいくつかのストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）に見られる。
【０２４０】
「アセト乳酸デカルボキシラーゼ」という用語は、α−アセト乳酸からアセトインへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。アセト乳酸デカルボキシラーゼの例は、ＥＣ  ４．１．１．５として知られており、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＡ２２２２３、Ｌ０４４７０）、クレブシエラ・テリゲナ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｔｅｒｒｉｇｅｎａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＡ２５０５４、Ｌ０４５０７）および肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＵ４３７７４、ＡＹ７２２０５６）から入手可能である。
【０２４１】
「アセトインアミナーゼ」または「アセトイントランスアミナーゼ」という用語は、アセトインから３−アミノ−２−ブタノールへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。アセトインアミナーゼは、補因子ピリドキサール５’−リン酸またはＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを用い得る。得られる生成物は、３位に（Ｒ）または（Ｓ）立体化学を有し得る。ピリドキサールリン酸依存性酵素は、アミノ供与体としてアラニンまたはグルタミン酸塩などのアミノ酸を使用し得る。ＮＡＤＨ−およびＮＡＤＰＨ依存性酵素は、第２の基質としてアンモニアを使用し得る。アミノアルコールデヒドロゲナーゼとしても知られているＮＡＤＨ依存性アセトインアミナーゼの好適な例が、Ｉｔｏら（米国特許第６，４３２，６８８号明細書）によって記載されている。ピリドキサール依存性アセトインアミナーゼの例は、ＳｈｉｎおよびＫｉｍ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：２８４８−２８５３，２００２）によって記載されているアミン：ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（アミン：ピルビン酸トランスアミナーゼとも呼ばれる）である。
【０２４２】
「アセトインキナーゼ」という用語は、アセトインからホスホアセトインへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。アセトインキナーゼは、反応におけるリン酸供与体としてＡＴＰ（アデノシン三リン酸）またはホスホエノールピルビン酸を用い得る。類似の基質であるジヒドロキシアセトンにおける類似の反応を触媒する酵素としては、例えば、ＥＣ  ２．７．１．２９（Ｇａｒｃｉａ−Ａｌｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：１３０３７−１３０４６，２００４）として知られている酵素が挙げられる。
【０２４３】
「アセトインリン酸アミナーゼ」という用語は、ホスホアセトインから３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸への転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。アセトインリン酸アミナーゼは、補因子ピリドキサール５’−リン酸、ＮＡＤＨ、またはＮＡＤＰＨを使用し得る。得られる生成物は、３位に（Ｒ）または（Ｓ）立体化学を有し得る。ピリドキサールリン酸依存性酵素は、アラニンまたはグルタミン酸塩などのアミノ酸を使用し得る。ＮＡＤＨ依存性およびＮＡＤＰＨ依存性酵素は、第２の基質としてアンモニアを使用し得る。ホスホアセトインにおけるこの反応を触媒する酵素の報告はないが、類似の基質であるセリノールリン酸塩（ｓｅｒｉｎｏｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）における類似の反応を行うことが提示されるピリドキサールリン酸依存性酵素がある（Ｙａｓｕｔａ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．６７：４９９９−５００９，２００１）。
【０２４４】
「アミノアルコールＯ−リン酸リアーゼ」とも呼ばれる「アミノブタノールリン酸ホスホリアーゼ」という用語は、３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸から２−ブタノンへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。アミノブタノールリン酸ホスホ−リアーゼは、補因子ピリドキサール５’−リン酸を用い得る。類似の基質である１−アミノ−２−プロパノールリン酸における類似の反応を触媒する酵素の報告がある（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１３４：１６７−１８２，１９７３）。米国特許出願公開第２００７／０２５９４１０号明細書には、生物のエルウィニア・カロトボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）に由来するアミノブタノールリン酸ホスホ−リアーゼが記載されている。
【０２４５】
「アミノブタノールキナーゼ」という用語は、３−アミノ−２−ブタノールから３−アミノ−２−ブタノールＯ−リン酸への転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。アミノブタノールキナーゼは、リン酸供与体としてＡＴＰを用い得る。３−アミノ−２−ブタノールにおけるこの反応を触媒する酵素の報告はないが、類似の基質であるエタノールアミンおよび１−アミノ−２−プロパノールにおける類似の反応を触媒する酵素の報告がある（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．、上掲）。米国特許出願公開第２００９／０１５５８７０号明細書には、実施例１４において、エルウィニア・カロトボラ亜種アトロセプティカ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ  ｓｕｂｓｐ．Ａｔｒｏｓｅｐｔｉｃａ）のアミノアルコールキナーゼが記載されている。
【０２４６】
「アセトインレダクターゼ」としても知られている「ブタンジオールデヒドロゲナーゼ」という用語は、アセトインから２，３−ブタンジオールへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。ブタンジオールデヒドロゲナーゼは、アルコールデヒドロゲナーゼの幅広いファミリーのサブセットである。ブタンジオールデヒドロゲナーゼ酵素は、アルコール生成物における（Ｒ）−または（Ｓ）−立体化学の生成に対する特異性を有し得る。（Ｓ）に特異的なブタンジオールデヒドロゲナーゼは、ＥＣ  １．１．１．７６として知られており、例えば、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＢＢＡ１３０８５、Ｄ８６４１２）から入手可能である。（Ｒ）に特異的なブタンジオールデヒドロゲナーゼは、ＥＣ  １．１．１．４として知られており、例えば、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号ＮＰ  ８３０４８１、ＮＣ＿００４７２２；ＡＡＰ０７６８２、ＡＥ０１７０００）、および乳酸連鎖球菌（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号ＡＡＫ０４９９５、ＡＥ００６３２３）から入手可能である。
【０２４７】
「ジオールデヒドラターゼ」または「プロパンジオールデヒドラターゼ」としても知られている「ブタンジオールデヒドラターゼ」という用語は、２，３−ブタンジオールから２−ブタノンへの転化を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。ブタンジオールデヒドラターゼは、補因子アデノシルコバラミン（補酵素ＢｗまたはビタミンＢ１２としても知られているが；ビタミンＢ１２は、補酵素Ｂ１２でない他の形態のコバラミンを指すこともある）を用い得る。アデノシルコバラミン依存性酵素は、ＥＣ  ４．２．１．２８として知られており、例えば、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｏｘｙｔｏｃａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡ０８０９９（αサブユニット）、Ｄ４５０７１；ＢＡＡ０８１００（βサブユニット）、Ｄ４５０７１；およびＢＢＡ０８１０１（γサブユニット）、Ｄ４５０７１（全ての３つのサブユニットが活性に必要とされることに留意されたい）、および肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＣ９８３８４（αサブユニット）、ＡＦ１０２０６４；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＣ９８３８５（βサブユニット）、ＡＦ１０２０６４、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＣ９８３８６（γサブユニット）、ＡＦ１０２０６４）から入手可能である。他の好適なジオールデヒドラターゼとしては、以下に限定はされないが、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＢ８４１０２（大型サブユニット）、ＡＦ０２６２７０；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＢ８４１０３（中型サブユニット）、ＡＦ０２６２７０；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＡＡＢ８４１０４（小型サブユニット）、ＡＦ０２６２７０）；およびラクトバチルス・コリノイデス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏｌｌｉｎｏｉｄｅｓ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＣ８２５４１（大型サブユニット）、ＡＪ２９７７２３；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＣ８２５４２（中型サブユニット）；ＡＪ２９７７２３；ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＤ０１０９１（小型サブユニット）、ＡＪ２９７７２３）から入手可能なＢ１２依存性ジオールデヒドラターゼ；ならびにラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）（特に、株ＣＮＲＺ  ７３４およびＣＮＲＺ  ７３５、Ｓｐｅｒａｎｚａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４５：３４７６−３４８０，１９９７）に由来する酵素、および対応する酵素をコードするヌクレオチド配列が挙げられる。ジオールデヒドラターゼ遺伝子単離の方法は、当該技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，６８６，２７６号明細書）。
【０２４８】
「ピルビン酸デカルボキシラーゼ」という用語は、ピルビン酸からアセトアルデヒドおよび二酸化炭素への脱炭酸を触媒する酵素活性を有するポリペプチドを指す。ピルビン酸デヒドロゲナーゼは、ＥＣ番号４．１．１．１によって知られている。これらの酵素は、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）番号：ＣＡＡ９７５７５（配列番号１０７）、ＣＡＡ９７７０５（配列番号１０９）、ＣＡＡ９７０９１（配列番号１１１））を含むいくつかの酵母に見られる。
【０２４９】
本明細書において提供されるイソブタノール生合成経路を含む微生物が、１つ以上のさらなる修飾をさらに含み得ることが理解されよう。米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書（参照により援用される）には、細胞質ゾルに限局されたアセト乳酸シンターゼの発現およびピルビン酸デカルボキシラーゼ活性の実質的な消失のために酵母を改変することによるピルビン酸からアセト乳酸への増加した転化が開示されている。ある実施形態において、微生物は、グリセロール−３−リン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させるための修飾および／またはピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも１つの遺伝子の崩壊または米国特許出願公開第２００９／０３０５３６３号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるようなピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子発現を制御する調節要素をコードする少なくとも１つの遺伝子の崩壊、および／または米国特許出願公開第２０１０／０１２０１０５号明細書（参照により本明細書に援用される）に記載されるようなエントナー−ドウドロフ経路を介した増加した炭素フラックスまたは還元当量の平衡を提供する修飾を含み得る。他の修飾には、ピルビン酸を利用する生合成経路における工程を触媒するポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドの組み込みが含まれる。他の修飾には、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける少なくとも１つの欠失、突然変異、および／または置換が含まれる。ある実施形態において、アセト乳酸レダクターゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＹＭＲ２２６Ｃ（配列番号１２７、１２８）またはその相同体である。さらなる修飾には、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよび／またはアルデヒドオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする内因性ポリヌクレオチドにおける欠失、突然変異、および／または置換が含まれる。ある実施形態において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドは、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するＡＬＤ６またはその相同体である。酵母生成宿主細胞がｐｄｃ−である、グルコース抑制を低下させる効果を有する遺伝子修飾が、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１／０１２４０６０号明細書に記載されている。ある実施形態において、欠失または下方制御されるピルビン酸デカルボキシラーゼは、ＰＤＣ１、ＰＤＣ５、ＰＤＣ６、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある実施形態において、ピルビン酸デカルボキシラーゼは、表１中の酵素から選択される。ある実施形態において、微生物は、グリセルアルデヒド−３−リン酸からグリセリン酸１，３，ビスリン酸への転化を触媒するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの欠失または下方制御を含み得る。ある実施形態において、この反応を触媒する酵素は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼである。
【０２５０】
【表１】
2015523088.tif 000003
【０２５１】
ある実施形態において、任意の特定の核酸分子またはポリペプチドは、本明細書に記載されるヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。当該技術分野において公知の「同一性パーセント」という用語は、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列間における、それらの配列を比較することによって決定される関係である。当該技術分野において、「同一性」は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間における、場合によっては、このような配列のストリング間のマッチによって決定される配列の関連性の程度も意味する。同一性および類似度は、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，Ｅｄ．）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ：ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ：ＮＹ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎｉａ：ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，Ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ：ＮＹ（１９９１）に開示されているものを含むがこれらに限定されない公知の方法によって容易に計算され得る。
【０２５２】
同一性を決定するための方法は、試験される配列間のベストマッチをもたらすように設計され得る。同一性および類似度を決定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムで体系化される。配列アラインメントおよび同一性パーセント計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムを用いて行われ得る。配列の多重アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖという名称のアラインメント方法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３，１９８９；Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１，１９９２によって開示されている）に対応し、かつＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）プログラムに見られるＣｌｕｓｔａｌ  Ｖアラインメント法を含む、数種類のアルゴリズムを包含するＣｌｕｓｔａｌアラインメント法を用いて行われ得る。多重アラインメントでは、デフォルト値は、ギャップペナルティ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０およびギャップ長ペナルティ（ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０に対応する。Ｃｌｕｓｔａｌ法を用いたタンパク質配列のペアワイズアラインメントおよび同一性パーセント計算のためのデフォルトパラメータは、Ｋタプル（ＫＴＵＰＬＥ）＝１、ギャップペナルティ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝３、ウィンドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝５およびダイアゴナル・セーブド（ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ）＝５である。核酸についてのこれらのパラメータは、Ｋタプル（ＫＴＵＰＬＥ）＝２、ギャップペナルティ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝５、ウィンドウ（ＷＩＮＤＯＷ）＝４およびダイアゴナル・セーブド（ＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ）＝４である。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｖプログラムを用いた配列のアラインメントの後、同じプログラムの配列距離テーブルを見ることによって、同一性パーセントを得ることが可能である。さらに、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアラインメント法が利用可能であり、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗという名称のアラインメント方法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１−１５３，１９８９；Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．８：１８９−１９１，１９９２によって記載されている）に対応し、かつＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．）のＭｅｇＡｌｉｇｎ（商標）ｖ６．１プログラムに見られる。多重アラインメントについてのデフォルトパラメータ（ギャップペナルティ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝１０、ギャップ長ペナルティ（ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ）＝０．２、ディレイディバージェント配列（Ｄｅｌａｙ  Ｄｉｖｅｒｇｅｎ  Ｓｅｑｓ）（％）＝３０、ＤＮＡトランジションウェイト（ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  Ｗｅｉｇｈｔ）＝０．５、タンパク質ウェイト行列（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ）＝Ｇｏｎｎｅｔシリーズ、ＤＮＡウェイト行列（ＤＮＡ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ）＝ＩＵＢ）。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗプログラムを用いた配列のアラインメントの後、同じプログラムの配列距離テーブルを見ることによって、同一性パーセントを得ることが可能である。
【０２５３】
標準的な組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術が、当該技術分野において周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９、本明細書においてＭａｎｉａｔｉｓと呼ばれる）によっておよびＡｕｓｕｂｅｌら（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂ．ｂｙ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８７）によって記載されている。ブタノール生合成経路を含む微生物を構築するための方法の例が、例えば、米国特許第７，８５１，１８８号明細書、および米国特許出願公開第２００７／００９２９５７号明細書；同第２００７／０２５９４１０号明細書；同第２００７／０２９２９２７号明細書；同第２００８／０１８２３０８号明細書；同第２００８／０２７４５２５号明細書；同第２００９／０１５５８７０号明細書；同第２００９／０３０５３６３号明細書；および同第２００９／０３０５３７０号明細書に開示されており、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０２５４】
さらに、本発明の様々な実施形態を本明細書に説明してきたが、それらは例として示されたに過ぎず、限定するものではないことを理解されたい。本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに本発明の形態および細部の様々な変更を行うことができることが、関連技術の当業者に明らかであろう。したがって、本発明の広さおよび範囲は、上述した例示的実施形態のいずれによって限定されるものでもなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物のみにしたがって規定されるものである。
【０２５５】
本明細書に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関する技術分野の当業者の技能のレベルを示し、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により援用されることが具体的にかつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【実施例】
【０２５６】
以下の非限定的な実施例は、本発明をさらに例示する。以下の実施例が原料としてトウモロコシを含む一方、本発明から逸脱せずに、他のバイオマス源が原料に使用され得ることを理解されたい。
【０２５７】
本明細書において使用される際、使用される略語の意味は以下のとおりであった：「ｇ」はグラムを意味し、「ｋｇ」はキログラムを意味し、「ｌｂｍ」はポンド質量を意味し、「ｇｐｍ」はガロン／分を意味し、「ｇａｌ」はガロンを意味し、「ＭＭＧＰＹ」は１００万ガロン／年を意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ／Ｌ」はミリリットル／リットルを意味し、「ｍＬ／分」はミリリットル／分を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈｒ」は時間を意味し、「ＤＩ」は脱イオン化されていることを意味し、「ｕＭ」はマイクロメートルを意味し、「ｎｍ」はナノメートルを意味し、「ｗ／ｖ」は重量／体積を意味し、「重量％」は重量パーセントを意味し、「ＯＤ」は光学密度を意味し、「ＯＤ６００」は６００ｎＭの波長における光学密度を意味し、「ｄｃｗ」は乾燥菌体重量を意味し、「ｒｐｍ」は毎分回転数を意味し、「℃」は摂氏温度を意味し、「℃／分」は摂氏温度／分を意味し、「ｓｌｐｍ」は標準リットル／分を意味し、「ｐｐｍ」は百万分率を意味し、「ｃＰ」はセンチポアズを意味し、「ＩＤ」は内径を意味し、「ＧＣ」はガスクロマトグラフを意味する。
【０２５８】
実施例１
物質移動の速度に対する非溶解固体の影響
ＳＳＦバッチ用の液相の平均的な組成を模倣するために、同時糖化発酵（ＳＳＦ）発酵のほぼ中間段階（すなわち、オリゴ糖の約５０％の転化率）の、トウモロコシマッシュから得られる発酵ブロスの組成をシミュレートする水相からのｉ−ＢｕＯＨの物質移動の速度に対する非溶解固体の影響を測定するために以下の実験を行った。
【０２５９】
約１００ｋｇの液化されたトウモロコシマッシュを、３０Ｌのガラスの被覆された樹脂ケトルを用いて、３つの等しいバッチで調製した。ケトルは、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。３つのバッチに使用されるプロトコルは以下のとおりであった：（ａ）磨砕トウモロコシを水道水と混合し（乾燥量基準で３０重量％のトウモロコシ）、（ｂ）スラリーを、撹拌しながら５５℃まで加熱し、（ｃ）スラリーのｐＨを、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかを用いて５．８に調整し、（ｄ）α−アミラーゼ（乾燥トウモロコシ基準で０．０２重量％）を加え、（ｅ）スラリーを８５℃まで加熱し、（ｆ）ｐＨを５．８に調整し、（ｇ）スラリーを、ｐＨを５．８に保ちながら８５℃で２時間保持し、（ｈ）スラリーを２５℃に冷却した。
【０２６０】
Ｐｉｏｎｅｅｒ  ３３３５雑種トウモロコシ、全粒イエローコーンを使用し（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｈｉ−Ｂｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＩＡ）、それを、１ｍｍのふるいを用いて、ハンマーミルで磨砕した。磨砕トウモロコシの水分含量は１２重量％であり、磨砕トウモロコシのでんぷん含量は、乾燥トウモロコシ基準で７１．４重量％であった。α−アミラーゼ酵素は、Ｌｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）であった。３つのバッチを合わせて使用される成分の総量は：３３．９ｋｇの磨砕トウモロコシ（１２％の水分）、６５．４ｋｇの水道水、および０．００６ｋｇのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳであった。合計で０．２９７ｋｇのＮａＯＨ（１７重量％）を、ｐＨを制御するために加えた。Ｈ２ＳＯ４は不要であった。３つの３０Ｌのバッチから回収された、液化されたトウモロコシマッシュの総量は９９．４ｋｇであった。
【０２６１】
６つの１Ｌのボトルを含む大容量（ｌａｒｇｅ  ｆｌｏｏｒ）遠心分離機における遠心分離によって、マッシュから固体を除去した。マッシュ（７３．４ｋｇ）を、２５℃で２０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離したところ、４４．４ｋｇの遠心分離液および２６．９ｋｇのウェットケーキが得られた。遠心分離液が１重量％未満の懸濁固体を含有し、ウェットケーキが約１８重量％の懸濁固体を含有していたことが分かった。これは、元の液化されたマッシュが、約７重量％の懸濁固体を含有していたことを示唆している。これは、でんぷんの大部分が液化されたと仮定した場合、トウモロコシ充填量および使用されるトウモロコシのでんぷん含量と一致する。でんぷんの全てが液化された場合、遠心分離機から直接回収される４４．４ｋｇの遠心分離液は、約２３重量％の溶解されたオリゴ糖（液化でんぷん）を含有していたであろう。約０．６ｋｇのｉ−ＢｕＯＨを３５．４ｋｇの遠心分離液に加えて、それを保存した。１．６重量％のｉ−ＢｕＯＨを含有する得られた３６．０ｋｇの遠心分離液を、原液として使用した。この遠心分離液は、ＳＳＦの開始時の液相の組成を模倣している。したがって、その一部を、質量基準で等量のＨ２Ｏで希釈して、約５０％の転化率におけるＳＳＦを模倣する遠心分離液を生成した。さらなるｉ−ＢｕＯＨを加えて、希釈された遠心分離液中のｉ−ＢｕＯＨの最終濃度を３．０重量％（約３０ｇ／Ｌ）にした。
【０２６２】
希釈された遠心分離液を以下のように調製した：１．６重量％のｉ−ＢｕＯＨを含有する１８ｋｇの遠心分離液原液を、１８ｋｇの水道水と混合し、０．８２ｋｇのｉ−ＢｕＯＨを加えた。希釈された遠心分離液の得られた３６．８ｋｇの溶液は、約１１重量％のオリゴ糖および約３０ｇ／Ｌのｉ−ＢｕＯＨからなっていた。この溶液は、オリゴ糖の約５０％の転化率におけるトウモロコシマッシュ発酵（ＳＳＦ）の液相および３０ｇ／Ｌのｉ−ＢｕＯＨの水性力価を模倣している。
【０２６３】
非溶解固体の大部分が除去された後、液化されたトウモロコシマッシュから得られるブロスにおける物質移動性能を模倣する水相として、この溶液を用いて、物質移動試験を行った。物質移動試験の目的は、液化されたトウモロコシマッシュから得られる、シミュレートされるブロスから、シミュレートされるブロスを通って上昇する溶媒（抽出剤）液滴の分散体へのｉ−ＢｕＯＨの移動の全体積物質移動係数（ｋＬａ）に対する非溶解固体の影響を測定することであった。運転パラメータの主な設計とのｋＬａの相関は、物質移動運転の規模を拡大するのに使用され得る。規模を拡大するのに有用な、より小さい規模のデータからのｋＬａの相関を生成するためにできる限り一定に保持されるべきパラメータの例は、液滴サイズを決定する相および設計パラメータの両方の物理的特性（例えば、ノズル直径、ノズルを通して分散される相の速度）である。
【０２６４】
６インチの直径、７フィートの高さのガラスの被覆されたカラムを用いて、懸濁されたマッシュ固体を含むかまたは含まない、（液化されたトウモロコシマッシュから得られる）オリゴ糖の水溶液から、シミュレートされるブロスを通って上昇するオレイルアルコール（ＯＡ）液滴の分散体へのｉ−ＢｕＯＨの移動のｋＬａを測定した。ｉ−ＢｕＯＨを水相に加えたところ、約３０ｇ／Ｌの、ｉ−ＢｕＯＨの初期濃度が得られた。約１１重量％のオリゴ糖および約３０ｇ／Ｌのｉ−ＢｕＯＨを含有する所定の量の水相（通常、約３５ｋｇ）を、カラムに投入し、ジャケットを通して温かいＨ２Ｏを流すことによってカラムを３０℃まで加熱した。試験中、カラムに出入りする水相の流れは存在しなかった。
【０２６５】
新鮮なオレイルアルコール（８０／８５％グレード、Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を、１つのノズルを通してカラムの塔底に散布して、水相を通って上方に流れる抽出剤液滴の分散体を生成した。水相の上部に達した後、抽出剤液滴により別個の有機相が形成され、これはその後、カラムの上部から溢れ、受け器に収集された。通常、１つの試験につき３〜５ガロンのオレイルアルコールが、カラムを通って流れた。
【０２６６】
水相の試料を、試験全体を通して数回カラムから収集し、溢流から収集された全「富化」オレイルアルコールの複合試料を試験の最後に収集した。全ての試料を、ＨＰ−６８９０  ＧＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）を用いてｉ−ＢｕＯＨについて分析した。水相中のｉ−ＢｕＯＨの濃度プロファイル（すなわち、時間に対するｉ−ＢｕＯＨ濃度）を用いて、所与の運転条件におけるｋＬａを計算した。試験中に収集される全「富化」オレイルアルコールの最終的な複合試料を用いて、ｉ−ＢｕＯＨの物質収支を調べた。
【０２６７】
ノズルサイズおよびノズル速度（供給ノズルを通るオレイルアルコールの平均速度）を様々に変化させて、ｋＬａに対する影響を観察した。マッシュ固体が除去されたオリゴ糖の水溶液（液化されたトウモロコシマッシュから得られる希釈された遠心分離液）を用いて、一連の試験を行った。ＳＳＦの途中で液化されたトウモロコシマッシュ（非溶解固体を含む）をシミュレートするためにマッシュ固体を戻し加えた後、オリゴ糖の同じ水溶液を用いて、同様の一連の試験を行った。ある運転条件（例えば、より高いオレイルアルコール流量）下で、カラムの上部において不十分な相分離が得られ、試験中に収集される全「富化」オレイルアルコールの典型的な複合試料を得るのが困難になることが留意される。ある運転条件下で、水相の試料がかなりの量の有機相を含有していたことも留意される。特殊な試料処理および調製技術を用いて、試料が収集されたときにカラム中の水相のできる限り典型的な水相の試料を得た。
【０２６８】
ｉ−ＢｕＯＨの濃度が所与の時点でカラムの長さに沿ってそれほど変化しなかったため、カラム中の水相があらゆる実用的な目的のために「よく混合された」ことが分かった。溶媒液滴相もよく混合されたと仮定すると、カラム中の水相から溶媒相へのｉ−ＢｕＯＨの全物質移動を、以下の式によって概算することができる：
【数１】
2015523088.tif 000004
式中、
ｒＢ＝水相の単位体積当たりの単位時間当たりの水相から溶媒相へと移動されるｉ−ＢｕＯＨの全質量（ｉ−ＢｕＯＨのグラム／水相のリットル／時またはｇ／Ｌ／時）である。
ｋＬａ＝水相から溶媒相へのｉ−ＢｕＯＨの物質移動を表す全体積物質移動係数（毎時）である。
ＣＢ，ブロス＝シミュレートされるブロス（水）相中のｉ−ＢｕＯＨの平均濃度（ｉ−ＢｕＯＨのグラム／水相のリットルまたはｇ／Ｌ）である。
ＣＢ，溶媒＝試験全体にわたる溶媒相中のｉ−ＢｕＯＨの平均濃度（ｉ−ＢｕＯＨのグラム／溶媒相のリットルまたはｇ／Ｌ）である。
ＫＢ＝溶媒と水相との間のｉ−ＢｕＯＨの平均平衡分配係数（（ｉ−ＢｕＯＨのグラム／溶媒相のリットル）／（ｉ−ＢｕＯＨのグラム／水相のリットル））である。
【０２６９】
パラメータｒＢ、ＣＢ，ブロス、およびＣＢ，溶媒を、水相および溶媒相の試料から得られる濃度データから各試験について計算した。液化されたトウモロコシマッシュからの水性遠心分離液、オレイルアルコール、およびｉ−ＢｕＯＨを混合し、２つの液相が平衡状態になるまで系を激しく混合することによって、パラメータＫＢを独立して測定した。ｉ−ＢｕＯＨの濃度を両方の相において測定して、ＫＢを決定した。ｒＢ、ＣＢ，ブロス、ＣＢ，溶媒、およびＫＢを所与の試験について決定した後、式（１）の配列を変更することによってｋＬａを計算することができた：
【数２】
2015523088.tif 000005
【０２７０】
水相として希釈された遠心分離液（固体を除去したもの）を用いて５フィート／秒〜２１フィート／秒の範囲のノズル速度で２つの異なるサイズのノズルを用いて、物質移動試験を行った。０．７６ｍｍのＩＤを有するノズルを用いて３つの試験を行い、２．０３ｍｍの内径を有するノズルを用いて３つの試験を行った。溶媒としてオレイルアルコールを用いて上記の６インチの直径のカラム中で３０℃で全ての試験を行った。オレイルアルコールと、固体を除去することによって液化されたトウモロコシマッシュから得られた希釈された遠心分離液との間のｉ−ＢｕＯＨの平衡分配係数は、約５であった。希釈された遠心分離液（固体を除去したもの）を用いた物質移動試験の結果を表２に示す。
【０２７１】
【表２】
2015523088.tif 000006
【０２７２】
ＳＳＦの途中の段階の（非溶解固体を含有する）液化されたトウモロコシマッシュからの発酵ブロスをシミュレートする水相を、ウェットケーキ（液化されたトウモロコシマッシュから固体を除去することによって最初に得られた）の一部を、希釈された遠心分離液に加えることによって合成した。ウェットケーキ中に保持される液相を希釈するためにいくらかの水も加えた。この液体は濃縮された遠心分離液と同じ組成を有するためである。希釈された上清（１７．８ｋｇ）、１３．０ｋｇのウェットケーキ（約１８重量％の非溶解マッシュ固体を含有する）、５．０ｋｇのＨ２Ｏ、および０．８３ｋｇのｉ−ＢｕＯＨを一緒に混合したところ、約６．３重量％の非溶解固体と、約１３重量％の液化でんぷんおよび約２．４重量％のｉ−ＢｕＯＨ（残りはＨ２Ｏ）からなる液相とを含有する３６．６ｋｇのスラリーが得られた。このスラリーは、約３０％のトウモロコシ充填量におけるｉ−ＢｕＯＨへの、トウモロコシのＳＳＦの途中の段階の発酵ブロスの組成を模倣している。こうしたタイプのブロスに見られる非溶解固体およびオリゴ糖のレベルが、それぞれ約６〜８重量％および１０〜１２重量％であるためである。
【０２７３】
水相として希釈された遠心分離液および非溶解マッシュ固体のスラリーを用いて、５フィート／秒〜２２フィート／秒の範囲のノズル速度で２つの異なるサイズのノズルを用いて、物質移動試験を行った。３つの試験を、０．７６ｍｍの内径を有するノズルを用いて行い、３つの試験を、２．０３ｍｍの内径を有するノズルを用いて行った。溶媒としてオレイルアルコールを用いて上記の６インチの直径のカラム中で３０℃で全ての試験を行った。希釈された遠心分離液および非溶解マッシュ固体のスラリーを用いた物質移動試験の結果を表３に示す。
【０２７４】
【表３】
2015523088.tif 000007
【０２７５】
図１２は、液化トウモロコシでんぷん（すなわち、オリゴ糖）の水溶液から、気泡塔を通って上方に流れるオレイルアルコール液滴の分散体へのｉ−ＢｕＯＨの移動の全体積物質移動係数、ｋＬａに対する非溶解トウモロコシマッシュ固体の存在の影響を示す。オレイルアルコールを、内径２．０３ｍｍのノズルを通してカラムに供給した。固体が除去されていない系のｋＬａに対する固体が除去された系のｋＬａの比率が、２．０３ｍｍのノズルのノズル速度に応じて２〜５であることが発見された。
【０２７６】
図１３は、液化トウモロコシでんぷん（すなわち、オリゴ糖）の水溶液から、気泡塔を通って上方に流れるオレイルアルコール液滴の分散体へのｉ−ＢｕＯＨの移動の全体積物質移動係数、ｋＬａに対する非溶解トウモロコシマッシュ固体の存在の影響を示す。オレイルアルコールを、内径０．７６ｍｍのノズルを通してカラムに供給した。固体が除去されていない系のｋＬａに対する固体が除去された系のｋＬａの比率が、０．７６ｍｍのノズルのノズル速度に応じて２〜４であることが発見された。
【０２７７】
実施例２
水相と溶媒相との間の相分離に対する非溶解固体の除去の影響
この実施例は、非溶解固体が除去されていない液化されたトウモロコシマッシュから得られるオリゴ糖の水溶液および同じ溶媒と比較した、非溶解固体が除去された液化されたトウモロコシマッシュから得られるオリゴ糖の水溶液と溶媒相との間の向上した相分離を示す。両方の系がｉ−ＢｕＯＨを含有していた。水相からの溶媒相の十分な分離は、液液抽出がＩＳＰＲを実施するための実行可能な分離方法であるために重要である。
【０２７８】
約９００ｇの液化されたトウモロコシマッシュを、１Ｌのガラスの被覆された樹脂ケトル中で調製した。ケトルは、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。以下のプロトコルを使用した：磨砕トウモロコシを水道水と混合し（乾燥量基準で２６重量％のトウモロコシ）、スラリーを、撹拌しながら５５℃まで加熱し、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかを用いてｐＨを５．８に調整し、α−アミラーゼ（乾燥トウモロコシ基準で０．０２重量％）を加え、８５℃まで加熱し続け、ｐＨを５．８に調整し、ｐＨを５．８に保ちながら８５℃で２時間保持し、２５℃に冷却した。
【０２７９】
Ｐｉｏｎｅｅｒ  ３３３５雑種トウモロコシ、全粒イエローコーンを使用し（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｈｉ−Ｂｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＩＡ）、それを、１ｍｍのふるいを用いて、ハンマーミルで磨砕した。磨砕トウモロコシの水分含量は１２重量％であり、磨砕トウモロコシのでんぷん含量は、乾燥トウモロコシ基準で７１．４重量％であった。α−アミラーゼ酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）製のＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳであった。使用される成分の総量は：２６５．９ｇの磨砕トウモロコシ（１２％の水分）、６３４．３ｇの水道水、および０．０５６ｇのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳであった。回収された、液化されたトウモロコシマッシュの総量は８８３．５ｇであった。
【０２８０】
液化されたトウモロコシマッシュの一部を、非溶解固体を除去せずにそのまま用いて、固体を含む、相分離試験用の水相を調製した。液化されたトウモロコシマッシュの一部を遠心分離して、非溶解固体の大部分を除去し、それを用いて、固体を含まない、相分離試験用の水相を調製した。
【０２８１】
固体を、大容量遠心分離機における遠心分離によってマッシュから除去した。マッシュ（５８３．５ｇ）を、３５℃で２０分間、５０００ｒｐｍで遠心分離したところ、３９４．４ｇの遠心分離液および１８９．０ｇのウェットケーキが得られた。遠心分離液が約０．５重量％の懸濁固体を含有し、ウェットケーキが約２０重量％の懸濁固体を含有していたことが分かった。これは、元の液化されたマッシュが、約７重量％の懸濁固体を含有していたことを示唆している。これは、でんぷんの大部分が液化されたと仮定した場合、トウモロコシ充填量および使用されるトウモロコシのでんぷん含量と一致する。でんぷんの全てが液化された場合、遠心分離機から直接回収された遠心分離液は、固体を含まない場合、約２０重量％の溶解されたオリゴ糖（液化でんぷん）を含有していたであろう。
【０２８２】
相分離試験の目的は、液化されたトウモロコシマッシュから得られるブロスをシミュレートする溶媒相と水相との間の相分離の程度に対する非溶解固体の影響を測定することであった。全ての試験において、水性液相は、約２０重量％のオリゴ糖を含有し、有機相は、オレイルアルコール（ＯＡ）を含有していた。さらに、ｉ−ＢｕＯＨを全ての試験に加えたところ、相が平衡状態になったときに水相中約２５ｇ／Ｌが得られた。２つの振とう試験を行った。第１の試験の水相（固体を含むもの）を、６０．０ｇの液化されたトウモロコシマッシュを３．５ｇのｉ−ＢｕＯＨと混合することによって調製した。第２の試験の水相（固体を除去したもの）を、固体を除去することによって液化されたトウモロコシマッシュから得られた６０．０ｇの遠心分離液を、３．５ｇのｉ−ＢｕＯＨと混合することによって調製した。オレイルアルコール（１５．０ｇ、８０／８５％グレード、Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）を、振とう試験ボトルのそれぞれに加えた。オレイルアルコールは、両方のボトル中の水相の上部に別個の液相を形成し、相の質量比、すなわち水相／溶媒相が約１／４になった。両方のボトルを２分間激しく振とうして、水相と有機相とを密着させ、ｉ−ＢｕＯＨが二相間で平衡に達するようにした。ボトルを１時間静置（ｓｅｔ）しておいた。写真を様々な時間（０分、１５分、３０分、および６０分）で撮影して、液化されたトウモロコシマッシュから得られる水相、オレイルアルコールを含有する溶媒相、およびｉ−ＢｕＯＨを含有する系における相分離に対する非溶解固体の影響を観察した。時間ゼロ（０）は、振とう期間が完了した２分直後の時間に対応する。
【０２８３】
固体（液化されたトウモロコシマッシュに由来する）を含む系および固体を除去した系（液化されたトウモロコシマッシュからの液体遠心分離液）についての、時間に応じた有機（溶媒）相と水相との間の分離の程度は、任意の時点で両方の系においてほぼ同じであるようであった。固体を含む場合、有機相は、わずかに暗色で濁っており、界面が少し曖昧であった（界面の周りの「ラグ（ｒａｇ）」層がより厚い）。しかしながら、溶媒が連続して操作される抽出発酵では、有機相の上部の組成は、次の工程が蒸留である抽出発酵の下流のプロセスに関与する。
【０２８４】
微生物は、蒸留塔において熱的に不活性化されるため、有機相の上部における微生物の量を最小限に抑えることが有利であり得る。微生物は、蒸留塔を詰まらせ、リボイラーを汚染し、カラムの基部に位置する溶媒／水デカンターにおける不十分な相分離の原因となり得、または上述した問題の任意の組合せであり得るため、有機相の上部における非溶解溶媒の量を最小限に抑えることが有利であり得る。有機相の上部における相の水の量を最小限に抑えることが有利であり得る。相の水は、別個の水相として存在する水である。さらなる量の水相は、蒸留塔における負荷およびエネルギー要件を増大させる。１０ミリリットル（１０ｍＬ）の試料を、「固体を含む」および「固体を除去した」ボトルからの有機層の上部から除去し、両方の試料を遠心分離して、６０分間の沈降時間の後、「固体を含む」および「固体を除去した」ボトルにおける有機相の組成を明らかにし、比較した。結果は、両方の振とう試験の最後の時点での「有機相」が、いくらかの望ましくない相を含有していた（両方の有機相が濁っている）ことを示す。しかしながら、結果は、固体が除去された、遠心分離液を含む相分離試験からの上層が、非溶解固体を実質的に含有していなかったことも示す。一方、非溶解固体は、マッシュを含む試験の有機相の上部から収集された１０ｍＬの試料の底部においてはっきりと見られる。有機層の上部から収集された試料の３％がマッシュ固体を洗浄することが推定された。抽出発酵プロセスの発酵装置を出る富化溶媒相が、３％の非溶解固体を含有していた場合、以下の問題の１つ以上が起こり得る：かなりの量の微生物の損失、溶媒塔リボイラーの汚染、溶媒塔の閉塞。結果は、遠心分離液を含む相分離試験からの上層がより少ない相の水を含有していたことも示す。表４は、６０分間の沈降時間の後の両方の振とう試験ボトルにおける上側「有機」層にわたって分散された相の相対量の推定値を示す。
【０２８５】
【表４】
2015523088.tif 000008
【０２８６】
この実施例は、液化されたトウモロコシマッシュから非溶解固体の大部分を除去すると、マッシュから得られる液体、水相がオレイルアルコールなどの溶媒と接触された後、向上した相分離が得られることを示す。この実施例は、マッシュの液体部分を有機溶媒と接触させる前に固体がまず除去される場合、相分離後に得られる上側相が大幅に少ない非溶解固体を含有することを示す。これは、抽出発酵のための相分離の上側（「有機」）層におけるマッシュの非溶解固体含量を最小限に抑えることの利点を示す。
【０２８７】
また、この実施例に記載される相分離振とう試験を繰り返す前に、試料調製の完了後に試料を数日間静置しておいた。固体を含む試料は、液化されたトウモロコシマッシュ、ｉ−ＢｕＯＨ、およびオレイルアルコールからなっており、固体を除去した試料は、液化されたトウモロコシマッシュから非溶解固体の大部分を除去することによって生成された遠心分離液、ｉ−ＢｕＯＨ、およびオレイルアルコールからなっていた。液化されたマッシュは、約７重量％の懸濁固体を含有し、マッシュから生成される遠心分離液は、約０．５重量％の懸濁固体を含有していた。磨砕トウモロコシ中のでんぷんの全てが液化された場合、液化されたマッシュ中の液相およびマッシュから生成される遠心分離液は、固体を含まない場合、約２０重量％の溶解されたオリゴ糖（液化でんぷん）を含有していた。両方の試料は、相の質量比、すなわち溶媒相／水相が約１／４である量でオレイルアルコールを含有していた。さらに、ｉ−ＢｕＯＨを全ての試験に加えたところ、相が平衡状態になったときに水相中約２５ｇ／Ｌが得られた。
【０２８８】
相分離試験の目的は、抽出発酵全体にわたって系の特性の潜在的変化を模倣するために、多相混合物を室温で数日間静置した後に、相分離の程度に対する非溶解固体の影響を測定することであった。２つの振とう試験を行った。両方のボトルを２分間激しく振とうして、水相と有機相とを密着させた。ボトルを１時間静置しておいた。写真を様々な時間（０分、２分、５分、１０分、２０分、および６０分）で撮影して、数日間エージングしたこれらの系における相分離に対する非溶解固体の影響を観察した。時間ゼロ（０）は、ボトルをベンチに置いた直後の時間に対応する。
【０２８９】
固体が２分後に除去された試料において相分離が起こり始めた。有機相が二相混合物の全体積の約２５％を占めていたことに基づいて、固体がわずか５〜１０分後に除去された場合、ほぼ完全な相分離が試料において起こったと考えられる。有機相が全体積の約２０％を占めていた場合、それが相の初期の比率に対応するため、完全な分離が示され得ることが予測され得る。１時間後でさえ、固体が除去されなかった試料では明らかな相分離は起こっていなかった。
【０２９０】
両方の試料の上側相の組成も比較した。上側相の組成は、次の工程が蒸留である抽出発酵の下流のプロセスのための意味を有する。微生物は蒸留塔において熱的に不活性化されるため、有機相の上部における微生物の量を最小限に抑えることが有利である。固体は、蒸留塔を詰まらせ、リボイラーを汚染し、カラムの基部に位置する溶媒／水デカンターにおける不十分な相分離の原因となり得、または上述した問題の任意の組合せであり得るため、有機相の上部において最小限に抑えるべき別の構成要素は、非溶解固体の量である。さらに、有機相の上部において最小限に抑えるべき別の構成要素は、別個の水相として存在する水である相の水の量であり、その理由は、このさらなる量の水相は、その後の蒸留塔における負荷およびエネルギー要件を増大させるためである。
【０２９１】
１０ミリリットル（１０ｍＬ）の試料を、「固体を含む」および「固体を除去した」ボトルからの有機層の上部から除去し、両方の試料を遠心分離して、６０分間の沈降時間の後、「固体を含む」および「固体を除去した」ボトルにおける有機相の組成を明らかにし、比較した。「固体を含む」試料の上部から収集された試料の組成は、６０分以内に当該試料において相分離が実質的に全く起こらなかったことを確認している。特に、「固体を含む」振とう試験ボトルの上部から収集された試料中の全水相（水性液体＋懸濁固体）に対する溶媒相の比率は、約１／４ｗ／ｗであり、これは、試験の前に試料を調製するのに使用されるのと同じ比率である。また、「固体を含む」振とう試験ボトルの上部から収集された試料中の非溶解固体の量は、液化されたトウモロコシマッシュにおいて見られる量とほぼ同じであり、これは、６０分以内にこの振とう試験ボトルにおいて固体が実質的に全く沈降しなかったことを示す。一方、固体を除去した遠心分離液（「固体を除去した」）を含む相分離試験からの上層は、非溶解固体を実質的に含有していなかった。結果は、遠心分離液を含む相分離試験からの上層がより少ない相の水を含有していたことも示す。これは、試料ボトルにおける水相に対する溶媒相の比率が約１／１ｗ／ｗであることによって示され、これは、固体を除去した場合の試験において有機相が溶媒（オレイルアルコール）で富化されたことを示す。表５は、６０分間の沈降時間の後の両方の振とう試験ボトルにおける上側「有機」層にわたって分散された相の相対量の推定値を示す。
【０２９２】
【表５】
2015523088.tif 000009
【０２９３】
この実施例は、ｉ−ＢｕＯＨを含有する液化されたトウモロコシマッシュから非溶解固体を除去し、それを溶媒相と接触させ、それを数日間静置させ、相を再度混合すると、非溶解固体を液化されたマッシュから除去しなかった試料と比較して、向上した相分離が得られることを示す。実際に、この実施例は、非溶解固体を除去しなかった試料において、６０分後でさえ相分離が実質的に全く起こらないことを示す。この実施例は、マッシュの液体部分を有機溶媒と接触させる前に固体がまず除去される場合、相分離後に得られる上側相が大幅に少ない非溶解固体を含有することを示す。抽出発酵のための相分離の上側（「有機」）層において最小限に抑えられるべき最も重要な種の２つが、微生物のレベルおよびマッシュからの非溶解固体のレベルであるため、これは重要である。前の実施例は、液化されたトウモロコシマッシュから固体を除去すると、水相を溶媒相と接触させた直後に向上した相分離が得られることを示した。これにより、抽出発酵が、発酵のより早い時点で実行可能になり得る。この実施例は、液化されたトウモロコシマッシュから固体を除去すると、溶媒相と接触させた水相（固体を除去したオリゴ糖溶液）を含有するエージングした試料において向上した相分離が得られることも示す。また、これにより、抽出発酵が発酵のより遅い時点で実行可能になり得る。
【０２９４】
実施例３
ＩＳＰＲ抽出溶媒の損失に対する非溶解固体の除去の影響−ディスクスタック遠心分離機
この実施例は、半連続的なディスク−スタック遠心分離機を用いて、発酵前にトウモロコシマッシュから非溶解固体を除去することによって、抽出発酵プロセスによって生成されるＤＤＧＳを介した溶媒の損失を減少させる可能性を示す。
【０２９５】
約２１６ｋｇの液化されたトウモロコシマッシュを、被覆されたステンレス鋼反応器中で調製した。反応器は、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。使用されるプロトコルは以下のとおりであった：磨砕トウモロコシを水道水と混合し（乾燥量基準で２５重量％のトウモロコシ）、スラリーを、４００ｒｐｍで撹拌しながら５５℃まで加熱し、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかを用いてｐＨを５．８に調整し、α−アミラーゼ（乾燥トウモロコシ基準で０．０２重量％）を加え、８５℃まで加熱し続け、ｐＨを５．８に調整し、ｐＨを５．８に保ちながら８５℃で３０分間保持し、生蒸気噴射を用いて１２１℃まで加熱し、ジェットクッカーをシミュレートするために１２１℃で３０分間保持し、８５℃に冷却し、ｐＨを５．８に調整し、α−アミラーゼ（乾燥トウモロコシ基準で０．０２重量％）の第２の投入を加え、ｐＨを５．８に保ちながら８５℃で６０分間保持して、液化を完了させた。次に、マッシュを６０℃に冷却し、遠心分離機の供給タンクに移した。
【０２９６】
Ｐｉｏｎｅｅｒ  ３３３５雑種トウモロコシ、全粒イエローコーンを使用し（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｈｉ−Ｂｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＩＡ）、それを、１ｍｍのふるいを用いて、ハンマーミルで磨砕した。磨砕トウモロコシの水分含量は１２重量％であり、磨砕トウモロコシのでんぷん含量は、乾燥トウモロコシ基準で７１．４重量％であった。α−アミラーゼ酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）製のＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳであった。使用される成分の量は：６１．８ｋｇの磨砕トウモロコシ（１２％の水分）、１４７．３ｋｇの水道水、第１のα−アミラーゼ投入のための１ｋｇの水中の０．０１０９ｋｇのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳの溶液、第２のα−アミラーゼ投入（調理段階後）のための１ｋｇの水中の０．０１０９ｋｇのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳの別の溶液であった。約５ｋｇのＨ２Ｏを、調理段階中に蒸気凝縮液を介してバッチに加えた。合計で０．２５ｋｇのＮａＯＨ（１２．５重量％）および０．１２ｋｇのＨ２ＳＯ４（１２．５重量％）を、ｐＨを制御するために実験全体にわたって加えた。回収された、液化されたトウモロコシマッシュの総量は２１６ｋｇであった。
【０２９７】
最終的な液化されたトウモロコシマッシュスラリーの組成は、約７重量％の非溶解固体および９３重量％の液体であると推定された。液相は、約１９重量％（１９０ｇ／Ｌ）の液化でんぷん（可溶性オリゴ糖）を含有していた。マッシュのレオロジーは、スラリーをその成分に分離する能力に関して重要である。マッシュ中の液相は、３０℃で約５．５ｃＰの粘度を有するニュートン流体であることが分かった。マッシュスラリーは、せん断速度に応じて、８５℃で約１０〜７０ｃＰの体積粘度を有するずり薄化（ｓｈｅａｒ−ｔｈｉｎｎｉｎｇ）流体であることが分かった。
【０２９８】
液化されたマッシュ（２０９ｋｇ、１９０Ｌ）を、ディスク−スタック分離ボウル（ｓｐｌｉｔ−ｂｏｗｌ）遠心分離機（Ａｌｆａ  Ｌａｖａｌ  Ｉｎｃ．，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）を用いて遠心分離した。遠心分離機を、連続した供給、連続した遠心分離液排出、およびウェットケーキのバッチ排出を含むセミバッチモードで運転した。液化されたトウモロコシマッシュを、１Ｌ／分の速度で連続して供給し、浄化された遠心分離液を連続して除去し、ウェットケーキを４分ごとに定期的に排出した。ディスクスタックからの固体の適切な排出間隔を決定するために、ディスクスタックに供給されるマッシュの試料を、高速の実験用遠心分離機で遠心分離した。マッシュ（４８．５ｇ）を、室温で約１０分間、１１，０００ｒｐｍ（約２１，０００ｇ）で回転させた。浄化された遠心分離液（３６．１ｇ）および１２．４ｇのペレット（ウェットケーキ）を回収した。浄化された遠心分離液は、約０．３重量％の非溶解固体を含有し、ペレット（ウェットケーキ）は、約２７重量％の非溶解固体を含有していたことが分かった。このデータに基づいて、４分間の排出間隔を、ディスクスタック遠心分離機の運転のために選択した。
【０２９９】
ディスクスタック遠心分離機を、１Ｌ／分の液化されたトウモロコシマッシュ供給速度および約６０℃で、９０００ｒｐｍ（６１００ｇ）で運転した。マッシュ（２０９ｋｇ）を、１５５ｋｇの浄化された遠心分離液と、５５ｋｇのウェットケーキとに分離した。半連続ディスクスタックによって得られる、（遠心分離液の量）／（供給されるマッシュの量）として定義されるスプリット（ｓｐｌｉｔ）は、バッチ式遠心分離機において得られるスプリットと同様であった。６１００ｇ、１Ｌ／分の供給速度、および４分間の排出間隔で運転されるディスクスタックセミバッチ式遠心分離機のスプリットは、（１５５ｋｇ／２０９ｋｇ）＝７４％であり、２１，０００ｇで１０分間運転される実験用のバッチ式遠心分離機のスプリットは、（３６．１ｇ／４８．５ｇ）＝７４％であった。
【０３００】
ディスクスタック遠心分離から回収される浄化された遠心分離液の４５ｍＬの試料を、実験用遠心分離機において２１，０００ｇで１０分間回転させて、遠心分離液中の懸濁固体のレベルを推定した。約０．１５〜０．３ｇの非溶解固体を、４５ｍＬの遠心分離液から回収した。これは、遠心分離液中の０．３〜０．７重量％の非溶解固体に相当し、これは、遠心分離機に供給されるマッシュからの非溶解固体の約１０倍の減少である。発酵前にトウモロコシマッシュから懸濁固体を除去するために、抽出発酵の際に存在する非溶解固体のレベルが、いくつかの固／液分離デバイスまたはデバイスの組合せを用いて、１桁減少される場合、ＤＤＧＳを介したＩＳＰＲ抽出溶媒損失が、約１桁減少され得ると仮定することが妥当である。ＤＤＧＳを介した溶媒損失を最小限に抑えることは、抽出発酵プロセスの経済性およびＤＤＧＳ品質の重要な要因である。
【０３０１】
実施例４
ＩＳＰＲ抽出溶媒の損失に対する非溶解固体の除去の影響−ボトル回転試験
この実施例は、遠心分離機を用いて、発酵前にトウモロコシマッシュから非溶解固体を除去することによって、抽出発酵プロセスによって生成されるＤＤＧＳを介した溶媒の損失を減少させる可能性を示す。
【０３０２】
実験室規模のボトル回転試験を、液化されたトウモロコシマッシュを用いて行った。試験は、商業的なエタノールプラント中の全蒸留廃液から非溶解固体を除去するのに使用される典型的なデカンター遠心分離機の運転条件をシミュレートするものである。商業的なエタノールプラントにおけるデカンター遠心分離機は、通常、約３０００ｇの相対遠心力（ＲＣＦ）および約３０秒間の全蒸留廃液滞留時間で運転される。これらの遠心分離機は、通常、約５％〜６％の懸濁固体（ビール塔の後）を含有する全蒸留廃液中の懸濁固体の約９０％を除去し、約０．５％の懸濁固体を含有する希薄な蒸留廃液が得られる。
【０３０３】
液化されたトウモロコシマッシュを、実施例２に記載されるプロトコルにしたがって作製した。約１０ｍＬのマッシュを遠心分離機管に入れた。試料を、合計１分間、約３０００ｇのＲＣＦ（４４００ｒｐｍのローター速度）で遠心分離した。試料を、遠心分離機の加速および減速により、３０００ｇで約３０〜４０秒間および３０００ｇ未満の速度で合計２０〜３０秒間経過させた。試料温度は約６０℃であった。
【０３０４】
約７重量％の懸濁固体を含有するマッシュ（１０ｍＬ）を、約６．２５ｍＬの浄化された遠心分離液と、３．７５ｍＬのウェットケーキ（遠心分離機管の底部におけるペレット）とに分離した。ボトル回転試験によって得られる、（遠心分離液の量）／（投入される元のマッシュの量）として定義されるスプリットは、約６２％であった。浄化された遠心分離液は、約０．５重量％の懸濁固体を含有し、これは、元のマッシュ中の懸濁固体のレベルと比較して懸濁固体中では１０倍を超える減少であることが分かった。浄化されたペレットは、約１８重量％の懸濁固体を含有していたことも分かった。
【０３０５】
表６は、商業的なエタノールプロセスにおいて全蒸留廃液を希薄な蒸留廃液に転化するデカンター遠心分離機の運転の典型的な条件でのボトル回転試験の懸濁（非溶解）固体の物質収支をまとめたものである。表６に示される全ての値は概算値である。
【０３０６】
【表６】
2015523088.tif 000010
【０３０７】
遠心分離液は、約１９０ｇ／Ｌの溶解されたオリゴ糖（液化でんぷん）を含有していたことも分かった。これは、使用されるトウモロコシ充填量（乾燥トウモロコシ基準で約２６重量％）および液化されたマッシュ（乾燥トウモロコシ基準で約７１．４重量％のでんぷん）を生成するのに使用されるトウモロコシにおけるでんぷん含量に基づいて、磨砕トウモロコシ中のでんぷんの大部分が液化プロセスにおいて液化された（すなわち、可溶性オリゴ糖に加水分解された）という仮定と一致する。２６％の乾燥トウモロコシ充填量における磨砕トウモロコシ中のでんぷんの大部分を加水分解すると、ボトル回転試験に使用される遠心分離機に投入される液化されたトウモロコシマッシュ中の約７重量％の懸濁（非溶解）固体が得られる。
【０３０８】
浄化された遠心分離液が、わずか約０．５重量％の非溶解固体を含有していたことは、ボトル回転試験に使用される条件が、投入されるマッシュからの非溶解固体の１０倍を超える減少をもたらしたことを示す。この同じ固体除去性能が発酵前に連続デカンター遠心分離機によって得られる場合、ＤＤＧＳ中のＩＳＰＲ抽出溶媒損失が、約１桁減少され得ると仮定することが妥当である。ＤＤＧＳを介した溶媒損失を最小限に抑えることは、抽出発酵プロセスの経済性およびＤＤＧＳ品質の重要な要因である。
【０３０９】
実施例５
非溶解固体を除去することによるトウモロコシ油の除去
この実施例は、発酵前に非溶解固体を除去することによって、トウモロコシマッシュからトウモロコシ油を除去および回収する可能性を示す。抽出溶媒の有効性は、トウモロコシ油が、非溶解固体の除去によって除去される場合に向上され得る。さらに、非溶解固体の除去によるトウモロコシ油の除去により、溶媒分配係数の減少を最小限に抑えることができ、向上した抽出発酵プロセスが得られる可能性もある。
【０３１０】
約１０００ｇの液化されたトウモロコシマッシュを、１Ｌのガラスの被覆された樹脂ケトル中で調製した。ケトルは、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。以下のプロトコルを使用した：磨砕トウモロコシを水道水と混合し（乾燥量基準で２６重量％のトウモロコシ）、スラリーを、撹拌しながら５５℃まで加熱し、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかを用いてｐＨを５．８に調整し、α−アミラーゼ（乾燥トウモロコシ基準で０．０２重量％）を加え、８５℃まで加熱し続け、ｐＨを５．８に調整し、ｐＨを５．８に保ちながら８５℃で２時間保持し、２５℃に冷却した。
【０３１１】
Ｐｉｏｎｅｅｒ  ３３３５雑種トウモロコシ、全粒イエローコーンを使用し（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｈｉ−Ｂｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＩＡ）、それを、１ｍｍのふるいを用いて、ハンマーミルで磨砕した。磨砕トウモロコシの水分含量は約１１．７重量％であり、磨砕トウモロコシのでんぷん含量は、乾燥トウモロコシ基準で約７１．４重量％であった。α−アミラーゼ酵素は、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）製のＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳであった。使用される成分の総量は：２９４．５ｇの磨砕トウモロコシ（１１．７％の水分）、７０５．５ｇの水道水、および０．０５９ｇのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳであった。酵素を希釈するために水（４．３ｇ）を加え、合計で２．３ｇの２０％のＮａＯＨ溶液を、ｐＨを制御するために加えた。約９５２ｇのマッシュを回収した。
【０３１２】
液化されたトウモロコシマッシュを、４０℃で３０分間、５０００ｒｐｍ（７２６０ｇ）で遠心分離して、オリゴ糖の水溶液から非溶解固体を除去した。遠心分離によって固体を除去すると、水相の上部の別個の有機液体層としてフリートウモロコシ油も除去される。約１．５ｇのトウモロコシ油を、水相の上部に浮遊する有機層から回収した。液化されたマッシュを生成するのに使用される磨砕トウモロコシは、乾燥トウモロコシ基準で約３．５重量％のトウモロコシ油を含有していたことが、ヘキサン抽出によって分かった。これは、磨砕トウモロコシを含む、液化プロセスに供給される約９ｇのトウモロコシ油に相当する。
【０３１３】
トウモロコシ油を液化されたマッシュから回収した後、オリゴ糖の水溶液をデカントして、ウェットケーキから取り除いた。約６１７ｇの液化でんぷん溶液を回収したところ、約３３４ｇのウェットケーキが残った。ウェットケーキは、液化されたマッシュ中にあった非溶解固体の大部分を含有していた。液化でんぷん溶液は、約０．２重量％の非溶解固体を含有していた。ウェットケーキは、約２１重量％の非溶解固体を含有していた。ウェットケーキを１０００ｇの水道水で洗浄して、ケーキ中に残っているオリゴ糖を除去した。ケーキを水と混合して、スラリーを形成することによって、これを行った。次に、洗浄された固体を回収するために、元のマッシュを遠心分離するのに使用されるのと同じ条件下でスラリーを遠心分離した。洗浄スラリーを遠心分離することによって洗浄された固体を除去すると、液化されたマッシュから生成される元のウェットケーキとともに残っているはずのいくらかのさらなるフリートウモロコシ油も除去された。このさらなるトウモロコシ油は、遠心分離された洗浄混合物の水相の上部における別個の薄い有機液体層として観察された。約１ｇのさらなるトウモロコシ油を洗浄プロセスから回収した。
【０３１４】
湿潤固体を、毎回１０００ｇの水道水を用いてさらに２回洗浄して、液化でんぷんの実質的に全てを除去した。目視可能なさらなるトウモロコシ油は、マッシュ固体の２回目および３回目の水洗浄から除去されなかった。最終的な洗浄固体を、真空オーブン中で一晩、８０℃および約２０水銀柱インチの真空下で乾燥させた。乾燥固体中に残っている（おそらく胚芽中に残っている）トウモロコシ油の量を、ヘキサン抽出によって測定した。比較的乾燥した固体（３．６０ｇ、約２重量％の水分）の３．６０ｇの試料が、０．２２ｇのトウモロコシ油を含有していた。この結果は、乾燥固体のｇ当たり０．０６２４ｇのトウモロコシ油に相当する。これは、湿潤固体中に残留オリゴ糖がないことを意味する洗浄された固体の場合であった。液化されたトウモロコシマッシュを遠心分離して、フリートウモロコシ油の層およびオリゴ糖の水溶液をウェットケーキから分離した後、約２１重量％の非溶解固体を含有する約３３４ｇのウェットケーキが残っていたことが分かった。これは、約７０．１ｇの非溶解固体を含むウェットケーキに相当する。乾燥固体のｇ当たり０．０６２４ｇのトウモロコシ油において、ウェットケーキ中の固体は、約４．４ｇのトウモロコシ油を含有するはずである。
【０３１５】
要約すると、液化されたマッシュを遠心分離することによって、約１．５ｇのフリートウモロコシ油を回収した。マッシュから生成される元のウェットケーキを洗浄するために生成された第１の（水）洗浄スラリーを遠心分離することによって、さらなる１ｇのフリートウモロコシ油を回収した。最終的に、洗浄された固体が、約４．４ｇのトウモロコシ油を依然として含有していたことが分かった。液化に投入されたトウモロコシが、約９ｇのトウモロコシ油を含有していたことも分かった。したがって、合計６．９ｇのトウモロコシ油を以下のプロセス工程から回収した：液化、液化されたマッシュからの固体の除去、マッシュからの固体の洗浄、および最終的な洗浄された固体。その結果、液化に供給されるトウモロコシ中の全トウモロコシ油の約７６％を、本明細書に記載される液化および固体除去プロセス中に回収した。
【０３１６】
実施例６
糖源としてマッシュおよび遠心分離液を用いた抽出発酵
この実施例は、糖源としてトウモロコシマッシュおよびトウモロコシマッシュ遠心分離液を用いて行われる抽出発酵を説明する。発酵前にトウモロコシマッシュから非溶解固体を除去することによって、トウモロコシマッシュ遠心分離液を生成した。４つの抽出発酵を、並行して行い、２つは、液化されたトウモロコシマッシュを糖源（固体を除去したもの）として用い、２つは、非溶解固体の大部分を液化されたトウモロコシマッシュから除去することによって得られる液化されたマッシュ遠心分離液（オリゴ糖の水溶液）を用いた。オレイルアルコール（ＯＡ）を発酵の２つ（１つは固体を含み、１つは固体を除去したもの）に加えて、生成物が形成されるにつれて生成物（ｉ−ＢｕＯＨ）をブロスから抽出した。トウモロコシ油脂肪酸（ＣＯＦＡ）の混合物を、発酵の他の２つ（１つは固体を含み、１つは固体を除去したもの）に加えて、生成物が形成されるにつれて生成物をブロスから抽出した。トウモロコシ油を加水分解することによってＣＯＦＡを作製した。これらの発酵の目的は、溶媒とブロスとの間の相分離に対する固体の除去の影響を試験することおよび固体を除去したまたは除去しなかった発酵ブロスから回収される非溶解固体に捕捉される残留溶媒の量を測定することであった。
【０３１７】
液化されたトウモロコシマッシュの調製
約３１ｋｇの液化されたトウモロコシマッシュを、３０Ｌの被覆されたガラス樹脂ケトル中で調製した。反応器は、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。使用されるプロトコルは以下のとおりであった：磨砕トウモロコシを水道水と混合し（乾燥量基準で４０重量％のトウモロコシ）、スラリーを、２５０ｒｐｍで撹拌しながら５５℃まで加熱し、ＮａＯＨまたはＨ２ＳＯ４のいずれかを用いてｐＨを５．８に調整し、α−アミラーゼの希薄水溶液（乾燥トウモロコシ基準で０．１６重量％）を加え、５５℃で６０分間保持し、９５℃まで加熱し、ｐＨを５．８に調整し、ｐＨを５．８に保ちながら９５℃で１２０分間保持して、液化を完了させた。汚染を防止するために、マッシュを滅菌した遠心分離機ボトルに移した。
【０３１８】
使用されるトウモロコシは、全粒イエローコーン（Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｈｉ−Ｂｒｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，ＩＡ）であり、それを、１ｍｍのふるいを用いて、パイロット規模のハンマーミルで磨砕した。磨砕トウモロコシの水分含量は約１２重量％であり、磨砕トウモロコシのでんぷん含量は、乾燥トウモロコシ基準で約７１．４重量％であった。使用されるα−アミラーゼ酵素は、Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｒｅｄ−Ｌ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（登録商標），Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）であった。使用される成分の量は：１４．１ｋｇの磨砕トウモロコシ（１２％の水分）、１６．９ｋｇの水道水、２．０ｋｇの水中の１９．５ｇのＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｒｅｄ−Ｌからなるα−アミラーゼの溶液であった。α−アミラーゼを滅菌ろ過した。ｐＨを制御するために、合計で０．２１ｋｇのＮａＯＨ（１７重量％）を実験全体にわたって加えた。
【０３１９】
液化されたトウモロコシマッシュは、全てのでんぷんが液化中に加水分解されたと仮定して、使用されるトウモロコシ充填量、トウモロコシのでんぷん含量を基準にして、約２８重量％（約２８０ｇ／Ｌ）の液化でんぷんを含有していたことが推定された。マッシュを、発酵に必要とされるより高濃度のオリゴ糖を用いて調製して、栄養、接種材料、グルコアミラーゼ、および基剤を初期の発酵ブロスに加えるときに希釈を可能にした。栄養、接種材料、グルコアミラーゼ、および基剤の添加によって希釈した後、マッシュ（固体を除去していないもの）中の予測される全初期可溶性糖は約２５０ｇ／Ｌであった。
【０３２０】
約１３．９ｋｇの液化されたマッシュを、６つの１Ｌのボトルを含むボトル遠心分離機を用いて遠心分離した。遠心分離機を、室温で２０分間、５０００ｒｐｍ（７２６０ＲＣＦ）で運転した。マッシュを、約５．５ｋｇの浄化された遠心分離液と、約８．４ｋｇのウェットケーキ（遠心分離機ボトルの底部におけるペレット）とに分離した。（遠心分離液の量）／（供給されるマッシュの量）として定義されるスプリットは、約（５．５ｋｇ／１３．９ｋｇ）＝４０％であった。
【０３２１】
後述される２０１０Ｙ０３４および２０１０Ｙ０３６発酵に投入されるマッシュから固体を除去しなかった。発酵２０１０Ｙ０３３および２０１０Ｙ０３５（後述もされている）に投入される遠心分離液を、上記のプロトコルにしたがって懸濁固体の大部分をマッシュから遠心分離によって除去することによって生成した。
【０３２２】
発酵の一般的な方法
シードフラスコ増殖（Ｓｅｅｄ  Ｆｌａｓｋ  Ｇｒｏｗｔｈ）
炭水化物源からイソブタノールを生成するように改変された（ｐｄｃ１、ｐｄｃ５、およびｐｄｃ６が欠損した）サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株を、凍結された培地からのシードフラスコ中で０．５５〜１．１ｇ／Ｌ  ｄｃｗ（ＯＤ６００  １．３〜２．６−Ｔｈｅｒｍｏ  Ｈｅｌｉｏｓ  α  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）まで増殖させた。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１２／０１６４３０２号明細書に記載されている。培地を、３００ｒｐｍで回転する培養器中、２６℃で増殖させた。凍結した培地を−８０℃で予め貯蔵した。第１のシードフラスコ培地の組成は以下のとおりであった：
３．０ｇ／Ｌのデキストロース
３．０ｇ／Ｌの無水エタノール
３．７ｇ／ＬのＦｏｒＭｅｄｉｕｍ（商標）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（Ｋａｉｓｅｒ）Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ：ＨＩＳなし、ＵＲＡなし（参照番号ＤＳＣＫ１６２ＣＫ）
アミノ酸を含まない６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（番号２９１９２０）。
【０３２３】
第１のシードフラスコ培地からの１２ミリリットル（１２ｍＬ）を、２Ｌのフラスコに移し、３００ｒｐｍで回転する培養器中、３０℃で増殖させた。第２のシードフラスコは、２２０ｍＬの以下の培地を有する：
３０．０ｇ／Ｌのデキストロース
５．０ｇ／Ｌの無水エタノール
３．７ｇ／ＬのＦｏｒＭｅｄｉｕｍ（商標）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ（Ｋａｉｓｅｒ）Ｄｒｏｐ−Ｏｕｔ：ＨＩＳなし、ＵＲＡなし（参照番号ＤＳＣＫ１６２ＣＫ）
アミノ酸を含まない６．７ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｎｉｔｒｏｇｅｎ  Ｂａｓｅ（番号２９１９２０）
ｐＨ５．５〜６．０に滴定された０．２ＭのＭＥＳ緩衝液。
【０３２４】
培地を、０．５５〜１．１ｇ／Ｌ  ｄｃｗ（ＯＤ６００  １．３〜２．６）で増殖させた。２００ｇ／Ｌのペプトンおよび１００ｇ／Ｌの酵母抽出物を含有するさらなる３０ｍＬの溶液を、この細胞濃縮物に加えた。次に、さらなる３００ｍＬの０．２ｕＭのろ過滅菌された、９０〜９５％のオレイルアルコール（Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）をフラスコに加えた。４ｇ／Ｌ  ｄｃｗ超（ＯＤ６００＞１０）まで培地を増殖させ続けてから、採取し、発酵に加えた。
【０３２５】
発酵調製
初期の発酵装置調製
ガラスの被覆された２Ｌの発酵装置（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＡＧ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に、固体を含むかまたは固体を含まない液化されたマッシュ（遠心分離液）を投入した。ｐＨプローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｅａｓｙｆｅｒｍ  Ｐｌｕｓ  Ｋ８、部品番号：２３８６２７、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｂｏｎａｄｕｚ  ＡＧ，Ｂｏｎａｄｕｚ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＤＣＵ−３  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｔｏｗｅｒ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎメニューによって較正した。ｐＨ＝７でゼロ較正を行った。ｐＨ＝４でスパン較正を行った。次に、プローブを、ステンレス鋼のヘッドプレートを通して発酵装置に入れた。溶解された酸素プローブ（ｐＯ２プローブ）も、ヘッドプレートを通して発酵装置に入れた。栄養、シード培地、抽出溶媒、および基剤を送達するのに使用される管をヘッドプレートに取り付け、端部に箔を被せた（ｆｏｉｌ）。発酵装置全体をオートクレーブ（Ｓｔｅｒｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｅｎｔｏｒ，Ｏｈｉｏ）に入れ、液体サイクル中で３０分間滅菌した。
【０３２６】
発酵装置をオートクレーブから取り出し、ロードセル上に設置した。ジャケット水供給および戻り管路を、それぞれ家庭用水および排水管（ｈｏｕｓｅ  ｗａｔｅｒ  ａｎｄ  ｃｌｅａｎ  ｄｒａｉｎ）に連結した。流入水および流出水の配管を冷却する凝縮器を、７℃で運転される６Ｌの再循環温度浴に連結した。発酵装置からのガスを移送する通気管路を、Ｔｈｅｒｍｏ質量分析計（Ｐｒｉｍａ  ｄＢ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）に連結された移送管路に連結した。スパージャ管路をガス供給管路に連結した。栄養、抽出溶媒、シード培地、および基剤を加えるための管を、ポンプを通して配管し（ｐｌｕｍｂ）、しっかりと固定した。オートクレーブ材料、０．９％  ｗ／ｖのＮａＣｌを、液化されたマッシュを加える前に排出した。
【０３２７】
液化後のリパーゼ処理
液化サイクルが完了した後、発酵装置温度を３０℃の代わりに５５℃に設定した。必要に応じて酸または塩基のボーラス添加を行うことによって、ｐＨをｐＨ＝５．８に手作業で制御した。リパーゼ酵素原液を、最終的なリパーゼ濃度が１０ｐｐｍになるように発酵装置に加えた。発酵装置を、５５℃、３００ｒｐｍ、および０．３ｓｌｐｍのＮ２重層（ｏｖｅｒｌａｙ）で６時間超にわたって保持した。リパーゼ処理が完了した後、発酵装置温度を３０℃に設定した。
【０３２８】
接種の前の栄養添加
接種の直前に７．０ｍＬ／Ｌ（接種後の体積）のエタノール（２００プルーフ、無水）を加えた。接種の直前に２０ｍｇ／Ｌの最終濃度になるようにチアミンを加えた。接種の直前に１００ｍｇ／Ｌのニコチン酸を加えた。
【０３２９】
発酵装置の接種
Ｎ２を発酵装置に加えながら、発酵装置ｐＯ２プローブをゼロに較正した。発酵装置ｐＯ２プローブを、３００ｒｐｍにおける滅菌空気スパージを用いてそのスパンに較正した。第２のシードフラスコが４ｇ／Ｌ  ｄｃｗ超になった後、発酵装置に接種した。振とうフラスコを培養器／振とう器から５分間取り出して、オレイルアルコール相と水相との相分離を可能にした。水相（５５ｍＬ）を滅菌した接種ボトルに移した。接種材料を、蠕動ポンプを通して発酵装置に注入した。
【０３３０】
接種後のオレイルアルコールまたはトウモロコシ油脂肪酸の添加
接種の直後に１Ｌ／Ｌ（接種後の体積）のオレイルアルコールまたはトウモロコシ油脂肪酸を加えた。
【０３３１】
発酵装置の運転条件
発酵装置を、増殖および生成段階全体について３０℃で運転した。ｐＨを、酸を全く加えずに５．７〜５．９のｐＨから５．２の制御設定点まで低下させた。増殖および生成段階の残りでは、水酸化アンモニウムを用いて、ｐＨをｐＨ＝５．２に制御した。増殖および生成段階の残りでは、無菌の空気を、スパージャを介して、０．３ｓｌｐｍで発酵装置に加えた。Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＤＣＵ−３  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｂｏｘ  ＰＩＤ制御ループによって、撹拌制御のみを用いて、撹拌器を最小で３００ｒｐｍに設定し、最大で２０００ｒｐｍに設定して、ｐＯ２を、３．０％に制御されるように設定した。α−アミラーゼ（グルコアミラーゼ）を加えることによって、液化されたトウモロコシマッシュの同時糖化発酵によってグルコースを供給した。でんぷんが糖化に利用できる限り、グルコースを過剰（１〜５０ｇ／Ｌ）に保った。
【０３３２】
試料Ａ
実験識別子２０１０Ｙ０３３は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、固体を除外したトウモロコシマッシュを用いた初期の発酵装置の調製方法、液化後のリパーゼ処理、接種方法の前の栄養添加、発酵装置の接種方法、発酵装置の運転条件方法、および分析方法の全て。トウモロコシ油脂肪酸を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。
【０３３３】
試料Ｂ
実験識別子２０１０Ｙ０３４は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、固体を含むトウモロコシマッシュを用いた初期の発酵装置の調製方法、液化後のリパーゼ処理、接種方法の前の栄養添加、発酵装置の接種方法、発酵装置の運転条件方法、および分析方法の全て。トウモロコシ油脂肪酸を、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。
【０３３４】
試料Ｃ
実験識別子２０１０Ｙ０３５は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、固体を除外したトウモロコシマッシュを用いた初期の発酵装置の調製方法、接種方法の前の栄養添加、発酵装置の接種方法、発酵装置の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。
【０３３５】
試料Ｄ
実験識別子２０１０Ｙ０３６は以下のものを含んでいた：シードフラスコ増殖方法、固体を含むトウモロコシマッシュを用いた初期の発酵装置の調製方法、接種方法の前の栄養添加、発酵装置の接種方法、発酵装置の運転条件方法、および分析方法の全て。オレイルアルコールを、接種後０．１〜１．０時間、単一のバッチに加えた。試料Ａ〜Ｄの結果を表７に示す。
【０３３６】
【表７】
2015523088.tif 000011
【０３３７】
実施例７
発酵装置体積効率の向上に対する発酵装置原料からの非溶解固体の除去の影響
この実施例は、発酵装置体積効率に対する、発酵前のマッシュからの非溶解固体の除去の影響を示す。トウモロコシマッシュ中の非溶解固体は、トウモロコシ充填量およびでんぷん含量に応じて、マッシュ体積の少なくとも５％を占める。発酵前の固体の除去により、少なくとも５％多くの糖を発酵装置に投入することができ、したがってバッチの生産性を高める。
【０３３８】
実施例５で生成された液化されたトウモロコシマッシュは、全てのでんぷんが液化中に可溶性オリゴ糖に加水分解されたと仮定して、使用されるトウモロコシ充填量（乾燥トウモロコシ基準で４０％）、トウモロコシのでんぷん含量（乾燥トウモロコシ基準で７１．４％）を基準にして、約２８重量％（２８０ｇ／Ｌ）の液化でんぷんを含有していたことが推定された。マッシュを、発酵に必要とされるより高濃度のオリゴ糖を用いて調製して、栄養、接種材料、グルコアミラーゼ、および基剤を初期の発酵ブロスに加えるときに希釈を可能にした。これらの成分を加えた後、マッシュを約１０％だけ希釈した。したがって、発酵２０１０Ｙ０３４および２０１０Ｙ０３６の開始時におけるマッシュ（固体を含む）中の液化でんぷんの予測される濃度は約２５０ｇ／Ｌであった。２０１０Ｙ０３４および２０１０Ｙ０３６発酵に投入される実際のグルコース当量は、それぞれ２３９ｇ／ｋｇおよび２４１ｇ／ｋｇであった。比較して、２０１０Ｙ０３３および２０１０Ｙ０３５発酵に投入されるグルコース当量は、それぞれ２５７ｇ／ｋｇおよび２６３ｇ／ｋｇであった。これらの発酵の原料は、遠心分離液（固体の大部分を除去したマッシュ）であったことに留意されたい。約１．２Ｌの糖源（マッシュまたは遠心分離液）を、各発酵に投入した。したがって、このデータに基づいて、マッシュ（２０１０Ｙ０３４および２０１０Ｙ０３６）と比較して約８．３％多くの糖を、遠心分離液（２０１０Ｙ０３３および２０１０Ｙ０３５）を使用する発酵装置に投入した。これらの結果は、発酵前のトウモロコシマッシュからの非溶解固体の除去により、単位体積当たりに投入される糖がかなり増加し得ることを示す。これは、固体が存在する場合、それが貴重な発酵装置体積を占めることを示唆している。固体が原料から除去される場合、非溶解固体が存在しないために、より多くの糖が、発酵装置に加えられ得る（「適する」）。この実施例は、発酵装置体積効率が、発酵前にマッシュから非溶解固体を除去することによって、かなり向上され得ることを示す。
【０３３９】
実施例８
抽出溶媒とブロスとの間の相分離に対する非溶解固体の除去の影響−抽出発酵
この実施例は、発酵前にトウモロコシマッシュから非溶解固体を除去することによる、抽出発酵プロセスの際およびその後の溶媒相とブロス相との間の向上した分離を示す。２つの抽出発酵を、並行して行い、１つは、液化されたトウモロコシマッシュを糖源（固体を除去したもの）として用い、１つは、非溶解固体の大部分を液化されたトウモロコシマッシュから除去することによって生成された遠心分離液（オリゴ糖の水溶液）を用いた。オレイルアルコール（ＯＡ）を両方の発酵に加えて、生成物が形成されるにつれて生成物（ｉ−ＢｕＯＨ）をブロスから抽出した。固体が原料（トウモロコシマッシュを使用した）から除去されなかった場合の、この実施例において言及される発酵ブロスは、実施例６に記載される２０１０Ｙ０３６であった。固体が原料（トウモロコシマッシュから生成される遠心分離液を使用した）から除去された場合の、この実施例において言及される発酵ブロスは、実施例６に記載される２０１０Ｙ０３５であった。オレイルアルコールが、両方の発酵に使用される抽出溶媒であった。最終的な発酵ブロスについてだけではなく発酵全体にわたって、相分離の速度および程度を測定し、比較した。抽出発酵プロセス中の十分な相分離は、微生物の最小限の損失および最小限の溶媒損失ならびに下流の処理のより低い資本コストおよび運転コストにつながり得る。
【０３４０】
発酵中の溶媒相とブロス相との間の相分離
約１０ｍＬの試料を、５．３時間、２９．３時間、５３．３時間、および７０．３時間の時点で各発酵装置から引き抜き、試料から固体を除去した場合の発酵（２０１０Ｙ０３５）および固体を除去しなかった場合の発酵（２０１０Ｙ０３６）からの試料について相分離を比較した。試料を約２時間静置させ、液液界面の位置を追跡することによって、全ての実行時間からの全ての試料について、相分離を観察し、比較した。固体を除去しなかった場合の発酵から引き抜かれた試料のいずれについても相分離が実質的に全く観察されなかった。発酵前に液化されたトウモロコシマッシュから固体を除去した場合の発酵からの全ての試料について相分離が観察された。全ての発酵時間について固体を除去した場合の実験から試料を引き抜いた約１０〜１５分以内に分離が起こり始め、２時間の期間にわたって向上し続けた。約７分間の沈降時間の後、遠心分離液発酵（固体を除去したもの）から、５．３時間の発酵実行時間の時点で引き抜かれた試料において相分離が起こり始めた。約１７分間の沈降時間の後、遠心分離液発酵（固体を除去したもの）から５３．３時間の時点で引き抜かれた試料において相分離が起こり始めた。
【０３４１】
図１３は、（重力）沈降時間に応じた、発酵試料管における液液界面の位置のプロットである。データは、遠心分離液が糖源として供給された（固体がトウモロコシマッシュから除去されたもの）場合の抽出発酵から引き抜かれた試料についてのものであり、オレイルアルコールは、ＩＳＰＲ抽出溶媒（実施例６の実験２０１０Ｙ０３５）であった。このプロットにおける相分離データは、５．３時間、２９．３時間、５３．３時間、および７０．３時間の実行時間の時点で発酵２０１０Ｙ０３５から引き抜かれた試料についてのものである。界面位置が、試料管中の全ブロス高さにおけるパーセンテージとして報告される。例えば、５．３時間の実行時間の時点で２０１０Ｙ０３５発酵（遠心分離液／オレイルアルコール）から引き抜かれた試料の界面位置は、１２０分間の沈降時間の後、試料管の底部（分離なし）から３．５ｍＬに増加した。その特定の試料管中には約１０ｍＬの全ブロスが存在していた。したがって、その試料の界面位置は、図１３において３５％として報告された。同様に、５３．３時間の実行時間の時点で２０１０Ｙ０３５発酵（遠心分離液／オレイルアルコール）から引き抜かれた試料の界面位置は、１２５分間の沈降時間の後、試料管の底部（分離なし）から約３．９ｍＬに増加した。その特定の試料管中には約１０ｍＬの全ブロスが存在していた。したがって、その試料の界面位置は、図１３において３９％として報告された。
【０３４２】
発酵を完了した後の溶媒相とブロス相との間の相分離
７０時間の実行時間の後、発酵を停止し、オレイルアルコール抽出発酵からの２つのブロスを、別個の２Ｌのガラス製メスシリンダーに移した。溶媒相とブロス相との分離を観察し、比較した。発酵前に固体を除去しなかった場合のブロス（実験２０１０Ｙ０３６）については、約３時間後に相分離がほとんど観察されなかった。発酵前に液化されたトウモロコシマッシュから固体を除去した場合のブロス（実験２０１０Ｙ０３５）については、相分離が観察された。約１５分間の沈降時間の後に分離が起こり始め、３時間の期間にわたって向上し続けた。１５分後、液液界面が、二相混合物の全高さの約１０％のレベルで確立された。これは、水相がまず分散体から分割され、混合物の底部において蓄積され始めたことを示す。時間が経過するにつれて、より多くの水相が混合物の底部に蓄積され、界面の位置を上昇させた。約３時間の沈降時間の後、界面は、二相混合物の全高さの約４０％のレベルに増加した。これは、最初に発酵に投入した遠心分離液およびオレイルアルコールの量に基づいて、固体を除去した場合の最終的な二相のブロスについて、ほぼ完全な相分離が、約３時間の（重力）沈降時間の後に起こったことを示す。ほぼ等しい体積の初期の遠心分離液および溶媒を、両方の発酵に投入した。約１．２Ｌの液化されたトウモロコシマッシュおよび約１．１Ｌのオレイルアルコールを、発酵２０１０Ｙ０３６に投入した。マッシュの同じバッチから生成された約１．２Ｌの遠心分離液、および約１．１Ｌのオレイルアルコールを、発酵２０１０Ｙ０３５に投入した。水相中の約１００ｇ／ｋｇの初期の糖が消費されたことおよび生成されるｉ−ＢｕＯＨの約７５％が溶媒相中にあったことを把握した後、完全な分離が起こった場合、最終的な水相および有機相の相対体積が約１：１であろうことが予測され得る。図１４は、固体を除去した場合の抽出発酵（２０１０Ｙ０３５）からの最終的な二相のブロスについての（重力）沈降時間に応じた液液界面位置のプロットである。界面位置は、最終的なブロスの相分離を観察するために使用される２Ｌのメスシリンダー中の全ブロス高さにおけるパーセンテージとして報告される。２０１０Ｙ０３５発酵からの最終的なブロスの界面位置は、１７５分間の沈降時間の後、メスシリンダーの底部（分離なし）から二相混合物の全高さの約４０％のレベルに増加した。したがって、最終的なブロス中の二相のほぼ完全な分離が、３時間の沈降時間の後に起こった。約５０％の界面位置が、完全な分離に相当し得る。
【０３４３】
１０ｍＬの試料を、固体を除去した場合の発酵からの最終的なブロス（約３時間沈降させた）の有機相の上部から引き抜いた。試料を、高速の実験用遠心分離機において回転させて、ブロスを３時間沈降させた後に有機相中に存在する水相の量を測定した。結果は、最終的なブロスの上層の約９０％が溶媒相であったことを示した。比較的少量の非溶解固体を含む、最終的なブロスの上層の約１０％が水相であった。いくらかの固体が水相の底部（水相より濃い）に位置し、また、少量の固体が液液界面に蓄積されていた。
【０３４４】
１０ｍＬの試料を、固体を除去した場合の発酵からの最終的なブロス（約３時間沈降させた）の底相からも引き抜いた。試料を、高速の実験用遠心分離機において回転させて、ブロスを３時間沈降させた後に水相中に存在する有機相の量を測定した。ブロスを３時間沈降させた後、固体を除去した発酵からの最終的なブロスの底（水）相中に有機相が実質的に存在しなかったことが分かった。これらの結果は、固体を除去した場合の発酵からの最終的なブロスについては、ほぼ完全な相分離が起こったことを確認する。固体を除去しなかった場合の発酵からの最終的なブロスについては、相分離がほとんど見られなかった。このデータは、抽出発酵前の液化されたトウモロコシマッシュからの固体の除去により、発酵中および発酵後の相分離のかなりの向上が可能になり得、下流の処理への微生物、非溶解固体、および水の損失が減少され得ることを示唆する。
【０３４５】
１０ｍＬの試料を、ブロスを約３時間静置させた後に固体を除去しなかった発酵からの最終的なブロスの上部から引き抜いた。試料を、高速の実験用遠心分離機において回転させて、最終的なブロスの上部における溶媒相および水相の相対量を測定した。このブロスは、液化されたトウモロコシマッシュ固体からの全ての固体を含有していた。試料の約半分が水相であり、約半分が有機相であった。水相は、固体を除去した場合のブロスからの上層の試料と比較して、かなり多くの非溶解固体（液化されたマッシュに由来する）を含有していた。この試料中の水相および溶媒相の量はほぼ同じであり、これは、（３時間の沈降時間の後でさえ）固体を除去しなかった場合の最終的なブロスにおいて相分離が実質的に起こらなかったことを示す。このデータは、固体が、抽出発酵前に液化されたトウモロコシマッシュから除去されない場合、発酵中および発酵後に相分離がほとんどないし全く起こらない可能性が高いことを示唆する。これは、下流の処理への微生物、非溶解固体、および水のかなりの損失をもたらし得る。
【０３４６】
実施例９
ＩＳＰＲ抽出溶媒の損失に対する非溶解固体の除去の影響−抽出発酵
この実施例は、発酵前にトウモロコシマッシュから非溶解固体を除去することによって、抽出発酵プロセスの最終段階から出るＤＤＧＳについての溶媒損失を減少させる可能性を示す。実施例６は、並行して行われる２つの抽出発酵を説明し、１つは、糖源として液化されたトウモロコシマッシュ（２０１０Ｙ０３６−固体を除去しないもの）を用い、１つは、非溶解固体の大部分を液化されたトウモロコシマッシュから除去することによって得られる液化されたマッシュ遠心分離液（２０１０Ｙ０３５−オリゴ糖の水溶液）を用いた。オレイルアルコール（ＯＡ）を両方の発酵に加えて、生成物が形成されるにつれて生成物イソブタノール（ｉ−ＢｕＯＨ）をブロスから抽出した。最終的な発酵ブロスから回収される非溶解固体に捕捉される残留溶媒の量を測定し、比較した。
【０３４７】
実施例６に記載される発酵２０１０Ｙ０３５および２０１０Ｙ０３６が完了した後、ブロスを採取し、相分離試験を行うのに使用した。次に、非溶解固体（発酵前に除去されなかったトウモロコシマッシュからの微粒子）を、各ブロスから回収し、全抽出可能油について分析した。固体の各ロットから回収される油を、オレイルアルコールおよびトウモロコシ油について分析した。両方のブロスについて以下のプロトコルにしたがった：
・ブロスを遠心分離して、有機相と、水相と、固相とに分離した。
・有機相および水相を、固体からデカントして、遠心分離機ボトルの底部にウェットケーキを残した。
・ウェットケーキを水で十分に洗浄して、残留オリゴ糖、グルコース、塩、酵素などの、ケーキ中に保持される溶解固体の実質的に全てを除去した。
・洗浄されたウェットケーキを、一晩、真空オーブン（８０℃で家庭用の真空）中で乾燥させて、ケーキ中の水の実質的に全てを除去した。
・乾燥固体の一部を、Ｓｏｘｈｌｅｔ抽出器中でヘキサンと十分に接触させて、固体から油を除去した。
・固体から回収される油をＧＣによって分析して、固体から回収される油中に存在するオレイルアルコールおよびトウモロコシ油の相対量を測定した。
・両方の発酵ブロスから回収される固体についての粒度分布（ＰＳＤ）を測定した。
【０３４８】
両方の発酵ブロスからの非溶解固体の回収およびヘキサン抽出についてのデータを表８に示す。データは、（固体の単位質量当たり）ほぼ同じ量の油が、両方の発酵において固体によって吸収されたことを示す。
【０３４９】
【表８】
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【０３５０】
実施例１０
ウェットケーキを水で洗浄することによる、液化されたトウモロコシマッシュからの固体の除去から生成されるウェットケーキからの可溶性でんぷんの回収−２段階プロセス
この実施例は、ケーキを水で２回洗浄することによる、ウェットケーキからの可溶性でんぷんの回収を示し、ここで、ケーキは、液化されたマッシュを遠心分離することによって生成された。液化されたトウモロコシマッシュを、連続デカンター遠心分離機に供給して、遠心分離液流（Ｃ−１）およびウェットケーキ（ＷＣ−１）を生成した。遠心分離液は、比較的固体を含まない、可溶性でんぷんの水溶液であり、原料マッシュと比較して、ウェットケーキを固体に濃縮した。ウェットケーキの一部を、高温水と混合して、スラリー（Ｓ−ｌ）を形成した。スラリーをデカンター遠心分離機に再び注入して、洗浄水遠心分離液（Ｃ−２）および洗浄されたウェットケーキ（ＷＣ−２）を生成した。Ｃ−２は、比較的固体を含まない、可溶性でんぷんの希薄水溶液であった。Ｃ−２中の可溶性でんぷんの濃度は、マッシュの分離から生成される遠心分離液中の可溶性でんぷんの濃度より低かった。ＷＣ−２中に保持される液相は、マッシュの分離から生成されるウェットケーキ中の液体より、でんぷんが希薄であった。洗浄されたウェットケーキ（ＷＣ−２）を、高温水と混合して、スラリー（Ｓ−２）を形成した。投入されるウェットケーキ中の可溶性でんぷんの量に対する投入される水の比率は、両方の洗浄工程において同じであった。第２の洗浄スラリーを、デカンター遠心分離機に再び注入して、２回洗浄した、第２の洗浄水遠心分離液（Ｃ−３）およびウェットケーキ（ＷＣ−３）を生成した。Ｃ−３は、比較的固体を含まない、可溶性でんぷんの希薄水溶液であった。Ｃ−３中の可溶性でんぷんの濃度は、第１の洗浄段階（Ｃ−２）において生成される遠心分離液中の可溶性でんぷんの濃度より低く、したがって、ＷＣ−３（第２の洗浄されたウェットケーキ）中に保持される液相は、ＷＣ−２（第１の洗浄されたウェットケーキ）中のでんぷんより希薄であった。２つの洗浄遠心分離液（Ｃ−２およびＣ−３）中の全可溶性でんぷんは、回収され、液化に再利用され得るでんぷんである。最終的な洗浄されたウェットケーキ中に保持される液体中の可溶性でんぷんは、マッシュの元の分離において生成されるウェットケーキ中よりはるかに少ない。
【０３５１】
液化されたトウモロコシマッシュの生成
約１０００ガロンの液化されたトウモロコシマッシュを、ハンマーミル、スラリー混合器、スラリータンク、および液化タンクからなる連続乾式磨砕液化システムにおいて生成した。磨砕トウモロコシ、水、およびα−アミラーゼを連続して供給した。反応器は、アンモニアまたは硫酸のいずれかを用いて、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。反応条件は以下のとおりであった：
・ハンマーミルのふるいサイズ：７／６４インチ
・スラリー混合器への供給速度
−磨砕トウモロコシ：５６０質量ポンド／時（１４．１重量％の水分）
−処理水：１６．６質量ポンド／分（２００Ｆ）
−α−アミラーゼ：６１ｇ／時（Ｇｅｎｅｃｏｒ：Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）Α）
・スラリータンク条件：
−温度：１８５°Ｆ（８５℃）
−ｐＨ：５．８
−滞留時間：０．５時間
−乾燥トウモロコシ充填量：３１重量％
−酵素充填量：０．０２８重量％（乾燥トウモロコシ基準）
・液化タンク条件：
−温度：１８５°Ｆ（８５℃）
−ｐＨ：５．８
−滞留時間：約３時間
−さらなる酵素添加なし。
【０３５２】
液化されたトウモロコシマッシュの生成速度は約３ガロン／分（ｇｐｍ）であった。磨砕トウモロコシのでんぷん含量は、乾燥トウモロコシ基準で約７０重量％であった。液化されたマッシュの全固形分（ＴＳ）は約３１重量％であり、全懸濁固体（ＴＳＳ）は約７重量％であった。液相は、ＨＰＬＣによって測定した際に約２３〜２４重量％の液化でんぷん（可溶性オリゴ糖）を含有していた。
【０３５３】
液化されたマッシュを、連続デカンター遠心分離機において以下の条件で遠心分離した：
・ボウル速度：５０００ｒｐｍ（約３６００ｇ’ｓ）
・差速：１５ｒｐｍ
・せきの直径：１８５ｍｍ（せき板を取り外した場合）
・供給速度：５〜２０ガロン／分で変動。
【０３５４】
約８５０ガロンの遠心分離液および約１４００質量ポンドのウェットケーキを、マッシュを遠心分離することによって生成した。ウェットケーキ中の全固形分は、水分収支によって測定したところ、約４６．３％（懸濁固体＋溶解固体）であった。液相が約２３重量％の可溶性でんぷんを含有していたことが分かり、ウェットケーキ中の全懸濁固体が約２８重量％であったことが推定された。ウェットケーキが、遠心分離機運転の前に液化されたマッシュ中に存在する約１２％の可溶性でんぷんを含有していたことが推定された。
【０３５５】
固体を水で洗浄することによるウェットケーキからの可溶性でんぷんの回収−１回目の洗浄
液化されたマッシュの分離から回収される約７０７質量ポンドのウェットケーキを、３００ガロンのステンレス鋼容器中で、１６５ガロンの高温（９１℃）の水と混合した。得られたスラリーを、約３０分間混合した。スラリーをデカンター遠心分離機に連続して供給して、洗浄された固体をスラリーから除去した。洗浄スラリーを分離するのに使用される遠心分離機は、上記の液化されたマッシュから固体を除去するのに使用されるのと同じものであり、スラリーを供給する前に、それを新鮮な水ですすいだ。遠心分離機を以下の条件で運転して、洗浄スラリーから固体を除去した：
・ボウル速度：５０００ｒｐｍ（約３６００ｇ’ｓ）
・差速：５ｒｐｍ
・せきの直径：１８５ｍｍ（せき板を取り外した場合）
・供給速度：５ガロン／分。
【０３５６】
約６００質量ポンドの洗浄されたウェットケーキを遠心分離機によって生成したが、材料の損失のためにわずか４００質量ポンドが回収されたに過ぎなかった。ウェットケーキ中の全固形分は、水分収支によって測定したところ、約３６．７％（懸濁固体＋溶解固体）であった。スラリーの液相中および洗浄水遠心分離液（スラリーから得られる）中の全可溶性でんぷん（グルコース、ＤＰ２、ＤＰ３、およびＤＰ４＋の合計）をＨＰＬＣによって測定したところ、それぞれ約６．７重量％および６．９重量％であった。ＤＰ２は、２つのグルコース単位（グルコース二量体）を含有するデキストロースポリマーを指す。ＤＰ３は、３つのグルコース単位（グルコース三量体）を含有するデキストロースポリマーを指す。ＤＰ４＋は、４つ以上のグルコース単位（グルコース四量体およびより高次の多量体）を含有するデキストロースポリマーを指す。これにより、よく混合された希釈洗浄段階が行われたことを確認した。したがって、洗浄されたウェットケーキ中に保持される液相中の可溶性でんぷんの濃度は、この希釈洗浄について約６．８重量％（物質収支によって）であったはずである。全固形分および溶解されたオリゴ糖のデータに基づいて、洗浄されたウェットケーキ中の全懸濁固体は約３２重量％であったことが推定された。遠心分離機によって生成されるケーキの全ての６００質量ポンドを洗浄することができた場合、洗浄されたウェットケーキは、元の液化されたマッシュ中に存在する約２．６％の可溶性でんぷんを含有していたことが推定された。これは、洗浄前のマッシュウェットケーキと比較して、洗浄されたウェットケーキ中の可溶性でんぷんの約７８％の減少を表す。液化されたマッシュの分離から生成されるウェットケーキを洗浄しなかった場合、マッシュ中の全でんぷんの約１２％が、可溶性（液化）でんぷんとして喪失されるであろう。マッシュの分離から生成されるウェットケーキを、この実施例に示される条件で水で洗浄する場合、マッシュからの全でんぷんの２．６％が、可溶性（液化）でんぷんとして喪失されるであろう。
【０３５７】
液化されたマッシュウェットケーキの第１の再スラリー洗浄から回収される約４００質量ポンドの洗浄されたウェットケーキを、３００ガロンのステンレス鋼容器中で１１０ガロンの高温（９０℃）水と混合した。得られたスラリーを約３０分間混合した。スラリーをデカンター遠心分離機に連続して供給して、洗浄された固体をスラリーから除去した。第２の洗浄スラリーを分離するのに使用される遠心分離機は、上記の第１の洗浄に使用されるのと同じであり、第２の洗浄スラリーを供給する前に、それを新鮮な水ですすいだ。遠心分離機を以下の条件で運転して、洗浄スラリーから固体を除去した：
・ボウル速度：５０００ｒｐｍ（約３６００ｇ’ｓ）
・差速：５ｒｐｍ
・せきの直径：１８５ｍｍ（せき板を取り外した場合）
・供給速度：４ガロン／分。
【０３５８】
約３２２質量ポンドの洗浄されたウェットケーキを、遠心分離機によって生成した。第２の洗浄からのウェットケーキ中の全固形分は、水分収支によって測定したところ、約３７．４％（懸濁固体＋溶解固体）であった。スラリーの液相中および洗浄水遠心分離液（スラリーから得られる）中の全可溶性でんぷん（グルコース、ＤＰ２、ＤＰ３、およびＤＰ４＋の合計）をＨＰＬＣによって測定したところ、それぞれ約１．６重量％および１．６重量％であった。これにより、よく混合された希釈洗浄段階が第２の洗浄において行われたことを確認した。したがって、洗浄されたウェットケーキ中に保持される液相中の可溶性でんぷんの濃度は、この希釈洗浄について約１．６重量％（物質収支によって）であったはずである。全固形分および溶解されたオリゴ糖のデータに基づいて、洗浄されたウェットケーキ中の全懸濁固体は約３６重量％であったことが推定された。第１の洗浄段階において生成されるケーキの全ての６００質量ポンドを洗浄することができた場合、洗浄されたウェットケーキは、元の液化されたマッシュ中に存在する約０．５％の可溶性でんぷんを含有していたことが推定された。これは、約９６％の洗浄の前のマッシュウェットケーキと比較して、２回洗浄されたウェットケーキ中の可溶性でんぷんの全減少を表す。液化されたマッシュの分離から生成されるウェットケーキを除去しなかった場合、マッシュ中の全でんぷんの約１２％が可溶性（液化）でんぷんとして喪失されるであろう。マッシュの分離から生成されるウェットケーキを、この実施例に示される条件で水で２回洗浄する場合、マッシュからの全でんぷんの０．５％が、可溶性（液化）でんぷんとして喪失されるであろう。
【０３５９】
実施例１１
トウモロコシ固体中のでんぷんの、可溶性（液化）でんぷんへの転化率に対する液化中の高温段階の影響
この実施例は、反応の途中のある時点における高温（または「調理」）段階による液化の操作が、トウモロコシ固体中のでんぷんの、可溶性（液化）でんぷんへのより高い転化率につながり得ることを示す。この実施例に示される「調理」段階は、液化が開始した後のある時点で液化温度を上昇させる工程と、より高温である期間保持する工程と、次に、温度を再び元の値まで低下させて、液化を完了させる工程とを含む。
【０３６０】
Ａ．液化後に固体中に残っている非加水分解でんぷんを測定する手順
液化されたトウモロコシマッシュを、実施例１（中間の高温段階はない）のプロトコルにしたがって１回の実行で調製した。液化されたトウモロコシマッシュを、中間の高温段階を追加した以外は第１の実行と同じ条件における別の実行で調製した。両方の実行からのマッシュを、以下の工程にしたがって後処理（ｗｏｒｋ  ｕｐ）した。それを遠心分離して、液化でんぷんの水溶液を非溶解固体から分離した。液化でんぷんの水溶液をデカントして取り除いて、ウェットケーキを回収した。ウェットケーキは、マッシュからの非溶解固体の大部分を含有していたが、固体は、液化でんぷん溶液でまだ湿っていた。ウェットケーキを水で十分に洗浄し、得られたスラリーを遠心分離して、水層を非溶解固体から分離した。ケーキを、十分な水で、合計５回洗浄して、液化から回収される元のウェットケーキ中に保持された可溶性でんぷんのほぼ全てを除去した。その結果、最終的な洗浄されたウェットケーキ中に保持される液相は、可溶性でんぷんを実質的に含有しない水からなっていた。
【０３６１】
最終的な洗浄されたウェットケーキを、水中で再スラリー化し、非常に過剰なα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの両方を加えた。温度およびｐＨを制御しながら、スラリーを少なくとも２４時間混合して、α−アミラーゼが、非溶解固体中に残っている実質的に全ての非加水分解でんぷんを可溶性オリゴ糖に転化するのを可能にした。その後、残留でんぷん（対象とする条件における液化中に加水分解されなかった）から生成される可溶性オリゴ糖を、存在するグルコアミラーゼによってグルコースに転化した。グルコース濃度を、ＨＰＬＣによって時間とともに追跡して、残留でんぷんから生成される全てのオリゴ糖がグルコースに転化されたことおよびグルコース濃度がもはや時間とともに増加しないことを確認した。
【０３６２】
Ｂ．液化されたトウモロコシマッシュの生成
２つのバッチの液化されたトウモロコシマッシュを、Ｌｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）製のα−アミラーゼ）を用いて、８５℃で（それぞれ約１Ｌ）調製した。両方のバッチを、８５℃で２時間余り運転した。ただし、「調理」期間を、第２のバッチ（「バッチ２」）の途中で追加した。バッチ２の温度分布は、８５℃で約３０分間、温度を８５℃から１０１℃まで上昇させ、１０１℃で約３０分間保持し、８５℃に冷却し、さらに１２０分間液化を続けた。両方のバッチに使用される磨砕トウモロコシは、実施例１と同じであった。２６重量％（乾燥トウモロコシ基準）のトウモロコシ充填量を両方のバッチに使用した。両方の実行に使用される酵素の総量は、０．０８重量％（乾燥トウモロコシ基準）に相当していた。両方の液化実行中、ｐＨを５．８に制御した。液化を、ガラスの被覆された樹脂ケトル中で行った。ケトルは、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。
【０３６３】
以下のプロトコルにしたがって、バッチ１の液化されたトウモロコシマッシュを調製した：
・α−アミラーゼを水道水で希釈した（２０．８０２ｇの水中の０．４１８ｇの酵素）。
・７０４．５ｇの水道水をケトルに投入した。
・撹拌器のスイッチを入れた。
・磨砕トウモロコシ（１９８ｇ）の第１の投入を行った。
・撹拌しながら５５℃まで加熱した。
・Ｈ２ＳＯ４またはＮａＯＨを用いて、ｐＨを５．８に調整した。
・α−アミラーゼ溶液（７．１１１ｇ）の第１の投入を行った。
・８５℃まで加熱した
・８５℃で３０分間保持した。
・α−アミラーゼ溶液（３．５０１ｇ）の第２の投入を行った。
・磨砕トウモロコシ（９７．５ｇ）の第２の投入を行った。
・８５℃でさらに１００分間、運転し続けた。
・液化が完了した後、６０℃に冷却した。
・反応器の中身を空け（ｄｕｍｐ）、９９８．５ｇの液化されたマッシュを回収した。
【０３６４】
以下のプロトコルにしたがって、バッチ２の液化トウモロコシマッシュを調製した：
・α−アミラーゼを水道水で希釈した（１６．６４２ｇの水中の０．３３６６ｇの酵素）。
・５６２．６ｇの水道水をケトルに投入した。
・撹拌器のスイッチを入れた。
・磨砕トウモロコシ（２３７．５ｇ）を投入した。
・撹拌しながら５５℃まで加熱した。
・希薄Ｈ２ＳＯ４またはＮａＯＨを用いて、ｐＨを５．８に調整した。
・α−アミラーゼ溶液（４．２５ｇ）の第１の投入を行った。
・８５℃まで加熱した。
・８５℃で３０分間保持した。
・１０１℃まで加熱した。
・１０１℃で３０分間保持した。
・マッシュの温度を再び８５℃に低下させた。
・希薄Ｈ２ＳＯ４またはＮａＯＨを用いて、ｐＨを５．８に調整した。
・α−アミラーゼ溶液（４．２４３９ｇ）の第２の投入を行った。
・８５℃でさらに１２０分間、運転し続けた。
・液化が完了した後、６０℃に冷却した。
【０３６５】
Ｃ．液化されたマッシュからの非溶解固体の除去および可溶性でんぷんを除去するための水によるウェットケーキの洗浄
バッチを室温で２０分間、５０００ｒｐｍで大容量遠心分離機において遠心分離することによって、液化されたマッシュの両方のバッチから固体の大部分を除去した。バッチ１からの５００ｇのマッシュの遠心分離により、３３４．１ｇの遠心分離液および１６５．９ｇのウェットケーキが得られた。バッチ２からの８７２ｇのマッシュの遠心分離により、６５４．７ｇの遠心分離液および２１７ｇのウェットケーキが得られた。液化されたマッシュの各バッチから回収されるウェットケーキを、水道水で５回洗浄して、ケーキ中に保持される可溶性でんぷんの実質的に全てを除去した。容器間でケーキが移るのを防ぐために、元のマッシュを遠心分離するのに使用されるのと同じボトルにおいて洗浄を行った。各洗浄段階では、ケーキを水と混合し、得られた洗浄スラリーを室温で（５０００ｒｐｍで２０分間）遠心分離した。マッシュの両方のバッチから回収されるウェットケーキにおいて行われる全ての５回の洗浄段階についてこれを行った。約１６５ｇの水を、バッチ１からのウェットケーキの５回の洗浄のそれぞれに使用し、これは、バッチ１からのウェットケーキを洗浄するのに使用される合計８２８．７ｇの水になった。約５００ｇの水を、バッチ２からのウェットケーキの５回の洗浄のそれぞれに使用し、これは、バッチ２からのウェットケーキを洗浄するのに使用される合計２５００ｇの水になった。バッチ１からのウェットケーキの全ての５回の水洗浄から回収される全洗浄遠心分離液は８９３．１ｇであった。バッチ２からのウェットケーキの全ての５回の水洗浄から回収される全洗浄遠心分離液は２５６６．３ｇであった。バッチ１から回収される最終的な洗浄されたウェットケーキは１０１．５ｇであり、バッチ２から回収される最終的な洗浄されたウェットケーキは１５１．０ｇであった。各バッチから得られる最終的な洗浄されたウェットケーキは、可溶性でんぷんを実質的に含有しておらず；したがって、各ケーキ中に保持される液体は主に水であった。ウェットケーキの全固形分（ＴＳ）を、水分収支を用いて測定した。バッチ１からのウェットケーキの全固形分は２１．６３重量％であり、バッチ２からのウェットケーキのＴＳは２３．６６重量％であった。
【０３６６】
Ｄ．液化後に非溶解固体中に残っている非加水分解でんぷんのレベルを測定するための、洗浄されたウェットケーキの液化／糖化
両方の洗浄されたウェットケーキ中に存在する固体中に残っている非加水分解でんぷんのレベルを、水中のケーキを再スラリー化し、過剰のα−アミラーゼおよび過剰のグルコアミラーゼを加えることによって測定した。α−アミラーゼは、固体中の残留非加水分解でんぷんを、スラリーの水相に溶解する可溶性オリゴ糖に転化する。その後、グルコアミラーゼが、α−アミラーゼによって生成される可溶性オリゴ糖をグルコースに転化する。反応を５５℃（グルコアミラーゼの推奨される最高温度）で少なくとも２４時間実行して、固体中の残留でんぷんの全てが可溶性オリゴ糖に転化され、全ての可溶性オリゴ糖がグルコースに転化されるのを確実にした。液化中に加水分解されなかったでんぷんである、固体中の残留非加水分解でんぷんは、この手順によって生成されるグルコースの量から計算することができる。
【０３６７】
以下のプロトコルに使用されるα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼ酵素は、それぞれＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳおよびＳｐｉｒｉｚｙｍｅ（登録商標）Ｆｕｅｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）であった。洗浄されたウェットケーキを処理するのに使用される容器は、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えた２５０ｍＬの被覆されたガラス樹脂ケトルであった。使用されるＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）の量は、「乾燥トウモロコシ基準」における０．０８重量％の酵素充填量に相当していた。使用されるＳｐｉｒｉｚｙｍｅ（登録商標）の量は、「乾燥トウモロコシ基準」における０．２重量％の酵素充填量に相当していた。この基準は、全てのでんぷんが可溶性オリゴ糖に加水分解されると仮定して、洗浄されたケーキ中に保持される非溶解固体の量を得るのに必要とされる磨砕トウモロコシの量として定義される。洗浄されたケーキ中に保持される非溶解固体はほとんど、トウモロコシのでんぷんでない非発酵性の部分であると考えられる。これらの酵素充填量は、２６％のトウモロコシ充填量で完全な液化および糖化を得るのに必要とされるより少なくとも４倍多い。酵素を非常に過剰に用いて、固体中の残留でんぷんの完全な加水分解およびグルコースへのオリゴ糖の完全な転化を確実にした。
【０３６８】
以下のプロトコルにしたがって、バッチ１のマッシュからの洗浄されたウェットケーキ中に存在する固体中の非加水分解でんぷんのレベルを測定した：
・α−アミラーゼを水道水で希釈した（１０．３６０７ｇの水中の０．１２９７ｇの酵素）。
・グルコアミラーゼを水道水で希釈した（１５．６０５４ｇの水中の０．３２１２ｇの酵素）。
・１３２ｇの水道水をケトルに投入した。
・撹拌器のスイッチを入れた。
・液化バッチ１から生成される６８ｇの洗浄されたウェットケーキ（ＴＳ＝２１．６３重量％）を投入した。
・撹拌しながら５５℃まで加熱した。
・希薄Ｈ２ＳＯ４またはＮａＯＨを用いて、ｐＨを５．５に調整した。
・α−アミラーゼ溶液（３．４９９２ｇ）を投入した。
・グルコアミラーゼ溶液（５．３１９ｇ）を投入した。
・ｐＨを５．５に制御しながら５５℃で２４時間運転し、グルコース用のスラリーを定期的に採取した。
【０３６９】
以下のプロトコルにしたがって、バッチ２からの洗浄されたウェットケーキ中に存在する固体中の非加水分解でんぷんのレベルを測定した。
・α−アミラーゼを水道水で希釈した（１１．７０９ｇの水中の０．２３８４ｇの酵素）。
・グルコアミラーゼを水道水で希釈した（１７．５５３８ｇの水中の０．３５０９ｇの酵素）。
・１５４．３ｇの水道水をケトルに投入した。
・撹拌器のスイッチを入れた。
・液化バッチ１から生成される７０．７ｇの洗浄されたウェットケーキ（ＴＳ＝２３．６６重量％）を投入した。
・撹拌しながら５５℃まで加熱した。
・希薄Ｈ２ＳＯ４またはＮａＯＨを用いて、ｐＨを５．５に調整した。
・α−アミラーゼ溶液（２．３９３ｇ）を投入した。
・グルコアミラーゼ溶液（５．９７０１ｇ）を投入した。
・ｐＨを５．５に制御しながら５５℃で２４時間運転し、グルコース用のスラリーを定期的に採取した。
【０３７０】
洗浄されたウェットケーキの液化／糖化の結果の比較
上述したように、バッチ１および２からの洗浄されたウェットケーキを、水中で再スラリー化し、固体中に残っている一切のでんぷんを加水分解し、それをグルコースに転化するために、非常に過剰なα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの両方をスラリーに加えた。図１５は、時間に応じたスラリーの水相中のグルコースの濃度を示す。
【０３７１】
グルコース濃度は、時間とともに増加し、両方の反応について約２４時間の時点で最大値で安定した。２４時間〜４８時間のグルコースのわずかな減少は、微生物汚染によるものであり得；したがって、各系において達するグルコースの最大レベルを用いて、洗浄されたウェットケーキの固体中にある残留非加水分解でんぷんのレベルを計算した。（α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの存在下で）バッチ１の液化から得られる洗浄されたウェットケーキを反応させることによって達するグルコースの最大レベルは４．４８ｇ／Ｌであった。比較して、（α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの存在下で）バッチ２の液化から得られる洗浄されたウェットケーキを反応させることによって達するグルコースの最大レベルは２．３９ｇ／Ｌであった。
【０３７２】
液化されたマッシュ中の非溶解固体中にある残留非加水分解でんぷん（液化中に加水分解されなかった）のレベルを、マッシュの対応するバッチから得られる洗浄されたウェットケーキから得られるグルコースのデータに基づいて計算した。
・液化バッチ１：固体中の残留非加水分解でんぷんは、液化に供給されるトウモロコシ中の全でんぷんの２．１％に相当する。これは、トウモロコシ中のでんぷんの２．１％が、バッチ１の液化条件で加水分解されなかったことを示唆する。液化バッチ１中、中間の高温（「調理」）段階を行わなかった。
・液化バッチ２：固体中の残留非加水分解でんぷんは、液化に供給されるトウモロコシ中の全でんぷんの１．１％に相当する。これは、トウモロコシ中のでんぷんの１．１％が、バッチ２の液化条件で加水分解されなかったことを示唆する。液化バッチ２中、高温（「調理」）段階を行った。
【０３７３】
この実施例は、液化中のある時点における高温「調理」段階の追加が、より高いでんぷん転化率をもたらし得ることを示す。これにより、液化されたトウモロコシマッシュ中の非溶解固体中に残っている残留非加水分解でんぷんが少なくなり、非溶解固体が液化の前にマッシュから除去される場合のプロセスにおけるでんぷんの損失が少なくなる。
【０３７４】
実施例１２
トウモロコシ固体中のでんぷんの、可溶性（液化）でんぷんへの転化率に対する液化中の高温段階の影響
液化されたトウモロコシマッシュの２つのバッチ（バッチ３およびバッチ４）を、Ｌｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ（Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）製のα−アミラーゼ）を用いて８５℃で調製した。両方のバッチを、８５℃で２時間余り運転した。ただし、「調理」期間を、バッチ４の途中で追加した。バッチ４の温度分布は、８５℃で約３０分間、温度を８５℃から１２１℃まで上昇させ、１２１℃で約３０分間保持し、８５℃に冷却し、さらに９０分間液化を続けた。両方のバッチに使用される磨砕トウモロコシは、実施例１と同じであった。２６重量％（乾燥トウモロコシ基準）のトウモロコシ充填量を両方のバッチに使用した。両方の実行に使用される酵素の総量は、０．０４重量％（乾燥トウモロコシ基準）に相当していた。両方の液化実行中、ｐＨを５．８に制御した。バッチ３の液化を、１Ｌのガラスの被覆された樹脂ケトル中で行い、バッチ４の液化を、２００Ｌのステンレス鋼発酵装置中で行った。両方の反応器は、機械的撹拌、温度制御、およびｐＨ制御を備えていた。
【０３７５】
この実施例の実験条件は、以下の相違点を除き、実施例９について記載される実験条件と同様であった：
【０３７６】
バッチ３の液化されたトウモロコシマッシュの生成では：０．２１１ｇのα−アミラーゼを、１０．４０３ｇの水道水で希釈した。α−アミラーゼ溶液の第１の投入は３．５５６ｇであった。α−アミラーゼ溶液の第２の投入は１．７５５ｇであり、反応を、８５℃でさらに９０分間実行し続けた。
【０３７７】
バッチ４の液化されたトウモロコシマッシュの生成では：２２ｇのα−アミラーゼを、２ｋｇの水道水で希釈し、１４７．９ｋｇの水道水を発酵装置に投入し、６１．８ｋｇの磨砕トウモロコシを投入した。α−アミラーゼ溶液の第１の投入は１．０ｋｇであり、反応物を８５℃まで加熱し、８５℃で３０分間保持し、次に、反応物を１２１℃まで加熱し、１２１℃で３０分間保持した。α−アミラーゼ溶液の第２の投入は１ｋｇであり、反応を、８５℃でさらに９０分間実行し続けた。
【０３７８】
液化されたマッシュからの非溶解固体の除去および可溶性でんぷんを除去するための水によるウェットケーキの洗浄
バッチを室温で１５分間、５０００ｒｐｍで大容量遠心分離機において遠心分離することによって、液化されたマッシュの両方のバッチから固体の大部分を除去した。バッチ３からの５００．１ｇのマッシュの遠心分離により、３３７．２ｇの遠心分離液および１６２．９ｇのウェットケーキが得られた。バッチ４からの５０９．７ｇのマッシュの遠心分離により、３４６．３ｇの遠心分離液および１６３．４ｇのウェットケーキが得られた。液化されたマッシュの各バッチから回収されるウェットケーキを、水道水で５回洗浄して、ケーキ中に保持される可溶性でんぷんの実質的に全てを除去した。容器間でケーキが移るのを防ぐために、元のマッシュを遠心分離するのに使用されるのと同じボトルにおいて洗浄を行った。各洗浄段階では、ケーキを水と混合し、得られた洗浄スラリーを室温で（５０００ｒｐｍで１５分間）遠心分離した。マッシュの両方のバッチから回収されるウェットケーキにおいて行われる全ての５回の洗浄段階についてこれを行った。約１６４ｇの水を、バッチ３からのウェットケーキの５回の洗浄のそれぞれに使用し、これは、バッチ３からのウェットケーキを洗浄するのに使用される合計８１９．８ｇの水になった。約４００ｇの水を、バッチ４からのウェットケーキの５回の洗浄のそれぞれに使用し、これは、バッチ４からのウェットケーキを洗浄するのに使用される合計２０００ｇの水になった。バッチ３からのウェットケーキの全ての５回の水洗浄から回収される全洗浄遠心分離液は８７９．５ｇであった。バッチ４からのウェットケーキの全ての５回の水洗浄から回収される全洗浄遠心分離液は２０４８．８ｇであった。バッチ３から回収される最終的な洗浄されたウェットケーキは１０３．２ｇであり、バッチ４から回収される最終的な洗浄されたウェットケーキは１１４．６ｇであった。各バッチから得られる最終的な洗浄されたウェットケーキは、可溶性でんぷんを実質的に含有しておらず；したがって、各ケーキ中に保持される液体は主に水であった。ウェットケーキの全固形分（ＴＳ）を、水分収支を用いて測定した。バッチ３からのウェットケーキの全固形分は２１．８８重量％であり、バッチ４からのウェットケーキのＴＳは１８．１重量％であった。
【０３７９】
この実施例の実験条件は、以下の相違点を除き、実施例９について記載される実験条件と同様であった：
【０３８０】
バッチ３についての、液化の後に非溶解固体中に残っている非加水分解でんぷんのレベルの測定するための洗浄されたウェットケーキの液化／糖化では：バッチ３の液化から生成される６８ｇの洗浄されたウェットケーキを投入した（ＴＳ＝２１．８８重量％）。３．４９８４ｇのα−アミラーゼ溶液および５．３０４２ｇのグルコアミラーゼを投入した。ｐＨを５．５に制御しながら５５℃で４７時間反応を実行し、グルコース用のスラリーを定期的に採取した。
【０３８１】
バッチ４についての、液化の後に非溶解固体中に残っている非加水分解でんぷんのレベルの測定するための洗浄されたウェットケーキの液化／糖化では：０．１６６３ｇのα−アミラーゼを、１３．８１３９ｇの水道水で希釈し、０．２１３ｇのグルコアミラーゼを、２０．８００２ｇの水道水で希釈した。１１７．８ｇの水道水をケトルに投入した。バッチ４の液化から生成される８２．２４ｇの洗浄されたウェットケーキを投入した（ＴＳ＝１８．１重量％）。３．４９５２ｇのα−アミラーゼ溶液および１０．５１０ｇのグルコアミラーゼを投入した。ｐＨを５．５に制御しながら５５℃で５０時間反応を実行し、グルコース用のスラリーを定期的に採取した。
【０３８２】
洗浄されたウェットケーキの液化／糖化の結果の比較
上述したように、バッチ３および４からの洗浄されたウェットケーキを、水中で再スラリー化し、固体中に残っている一切のでんぷんを加水分解し、それをグルコースに転化するために、非常に過剰なα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの両方をスラリーに加えた。図１６は、時間に応じたスラリーの水相中のグルコースの濃度を示す。
【０３８３】
グルコース濃度は、時間とともに増加し、バッチ３からの洗浄されたウェットケーキについて約２６時間の時点で最大値で安定した。バッチ４の洗浄されたウェットケーキでは、グルコース濃度は、２４時間〜４７時間でわずかに増加し続けた。バッチ４のウェットケーキについて４７時間の時点で測定したグルコース濃度が、最大値にほぼ等しいことが仮定される。（α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの存在下で）バッチ３の液化から得られる洗浄されたウェットケーキを反応させることによって達するグルコースの最大レベルは８．３３ｇ／Ｌであった。比較して、（α−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの存在下で）バッチ４の液化から得られる洗浄されたウェットケーキを反応させることによって達するグルコースの最大レベルは４．９２ｇ／Ｌであった。
【０３８４】
液化されたマッシュ中の非溶解固体中にある残留非加水分解でんぷん（液化中に加水分解されなかった）のレベルを、（過剰のα−アミラーゼおよびグルコアミラーゼの存在下で）マッシュの対応するバッチから得られる洗浄されたウェットケーキを「加水分解」することによって得られるグルコースのデータに基づいて計算した。
・液化バッチ３：固体中の残留非加水分解でんぷんは、液化に供給されるトウモロコシ中の全でんぷんの３．８％に相当する。これは、トウモロコシ中のでんぷんの３．８％が、バッチ３の液化条件で加水分解されなかったことを示唆する。液化バッチ３中、中間の高温（「調理」）段階を行わなかった。
・液化バッチ４：固体中の残留非加水分解でんぷんは、液化に供給されるトウモロコシ中の全でんぷんの２．２％に相当する。これは、トウモロコシ中のでんぷんの２．２％が、バッチ４の液化条件で加水分解されなかったことを示唆する。液化バッチ４中、高温（「調理」）段階を行った。
【０３８５】
この実施例は、液化中のある時点における高温「調理」段階の追加が、より高いでんぷん転化率をもたらし得ることを示す。これにより、液化されたトウモロコシマッシュ中の非溶解固体中に残っている残留非加水分解でんぷんが少なくなり、非溶解固体が液化の前にマッシュから除去される場合のプロセスにおけるでんぷんの損失が少なくなる。
【０３８６】
実施例１１および１２の概要および比較
液化条件は、トウモロコシ固体中のでんぷんの、可溶性（液化）でんぷんへの転化率に影響を与え得る。磨砕トウモロコシ中のでんぷんの、可溶性でんぷんへの転化率に影響し得る考えられる液化条件は、温度、酵素（α−アミラーゼ）充填量、および＋／−高温（「調理」）段階が液化中のある時点で行われるか否かである。実施例１１および１２は、液化中のある時点における高温（「調理」）段階の実施により、トウモロコシ固体中のでんぷんの、可溶性（液化）でんぷんへのより高い転化率が得られることを示した。実施例１１および１２に記載される液化中の高温段階は、液化が開始した後のある時点で液化温度を上昇させる工程と、ある期間、より高い温度に保持する工程と、次に、温度を再び元の値まで低下させて、液化を完了させる工程とを含んでいた。
【０３８７】
実施例１１において比較される液化反応を、実施例１２において比較される反応と異なる酵素充填量で実行した。これらの実施例は、でんぷん転化率に対する２つの主な液化条件：（１）酵素充填量、および（２）＋／−高温段階が液化中のある時点で適用されるか否かの影響を示す。
【０３８８】
実施例１１および１２に記載される液化されたトウモロコシマッシュの４つのバッチを調製するのに使用される条件を、以下および表９にまとめる。
【０３８９】
全てのバッチに共通の条件：
・液化温度−８５℃
・液化温度における合計時間−約２時間
・トウモロコシを磨砕するのに使用されるふるいサイズ−１ｍｍ
・ｐＨ−５．８
・乾燥トウモロコシ充填量−２６％
・α−アミラーゼ−Ｌｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）ＳＣ  ＤＳ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）。
【０３９０】
【表９】
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【０３９１】
バッチ２および４の温度分布（全ての値は概算値である）は：８５℃で３０分間、３０分間の高温段階、８５℃で９０分間であった。最初の８５℃の期間の前に半分の酵素を加え、最後の８５℃の期間にわたる高温段階の後に半分を加えた。
【０３９２】
図１７は、でんぷん転化率に対する、酵素充填量および＋／−高温段階が液化中のある時点で適用されたか否かの影響を示す。固体中の残留非加水分解でんぷんのレベルは、対象とする液化条件で加水分解されなかったでんぷんである。図１７は、固体中の非加水分解でんぷんのレベルが、液化中のある時点における高温（「調理」）段階の適用によってほぼ半分だけ減少されたことを示す。これは、２つの異なる酵素充填量で示された。図１７のデータは、高温段階が液化中に適用されたか否かにかかわらず、酵素充填量を２倍にすると、固体中に残っている非加水分解でんぷんのレベルがほぼ半分になったことも示す。これらの実施例は、より高い酵素（α−アミラーゼ）充填量による液化の実行および／または反応中のある時点における高温（「調理」）段階の追加が、液化されたトウモロコシマッシュ中に存在する非溶解固体中の残留非加水分解でんぷんをかなり減少させ得、非溶解固体が液化の前にマッシュから除去される場合のプロセスにおけるでんぷんの損失を減少させ得ることを示す。液化の後の固体中の一切の残留でんぷんには、固体が発酵の前に除去される場合のプロセスにおいて発酵中に加水分解する機会がない。
【０３９３】
実施例１３
８５℃での酵素消化の後のでんぷんおよび不溶物のふるい分け分離
実施例１に記載される方法ごとに調製されるマッシュ（３０１グラム）を、調整が必要な場合にＮａＯＨ溶液の液滴を用いてｐＨ５．８に保ち、業者指定の用量の約０．０６４グラムのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）α−アミラーゼ酵素（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ，Ｆｒａｎｋｌｉｎｔｏｎ，ＮＣ）で処理し、８５℃で５時間保持した。生成物を冷蔵した。
【０３９４】
冷蔵された生成物を約５０℃に温め、４８ｇを、１００メッシュスクリーンを含むフィルターアセンブリに注ぎ、−１５水銀柱インチ（ｉｎ  Ｈｇ）〜−２０水銀柱インチで家庭用真空源に接続した。ふるい皿は、４４ｃｍ２の露出されたふるい表面積を有し、このふるい皿を、Ｎａｌｇｅｎｅ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）によって提供されるプラスチックフィルターハウジング中に密閉した。スラリーをろ過したところ、ふるい上にウェットケーキが形成され、受け器ボトル中に４０．４ｇの黄色の濁ったろ液が形成された。ウェットケーキを所定の位置で水ですぐに洗浄してから、中断した一方、真空源は、最終的な洗浄されたケーキを通して遊離水分を引き続けた。フィルターの下側からの滴りが停止したとき、ろ過を停止した。さらなる２８．５ｇの洗浄ろ液を３段階にわたって収集し、ここで、最終段階のろ液が、最も少ない色および濁りを示した。７．６ｇの最終的なウェットケーキ質量を、室温で２４時間にわたって２．１ｇになるまで空気乾燥させた。２．１ｇは、加熱ランプを用いて乾燥させた後に７．７３％の水を含有することが分かった。この実験の真空ろ過により、合計２５％の乾燥固体を含有するウェットケーキが生成された。
【０３９５】
ろ液の試料を、室温でオレイルアルコールと組み合わせて、激しく混合し、沈降させた。界面を約１５分間回復させたが、濁ったラグ層が残った。
【０３９６】
１ｇの９９．９９％超（微量金属基準）のヨウ素、２ｇのＲｅａｇｅｎｔＰｌｕｓ（登録商標）グレード（９９％超）のヨウ化カリウム（両方ともＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製）、および１滴の量の１７ｇの家庭用脱イオン水からなるルゴール液（でんぷん指示薬）を、ろ液の試料、水中で再スラリー化された、乾燥されたケーキ固体および水の対照試料に加えた。ろ液が濃い青色または紫色に変化し、固体スラリーが非常に濃い青色に変化し、水の色が薄い琥珀色になった。琥珀色より濃い色は、１２単位長より長いオリゴ糖の存在を示す。
【０３９７】
この実験は、大部分の懸濁固体が、１００メッシュスクリーンにおいて、中程度の速度で、上述したように調製されるでんぷん溶液から分離され得ること、およびでんぷんがろ過ケーキ固体とともに残ることを示した。これは、加水分解されたでんぷんの一部が残るケーキの不完全な洗浄を示す。
【０３９８】
この実験を、直径６３ｍｍの１００メッシュスクリーン上で１５６グラムのマッシュを用いて繰り返した。最高温度は１０２℃であり、酵素はＳｐｅｚｙｍｅ（登録商標）であり、スラリーを、８５℃超で、３時間保持した。ふるい分け速度を測定し、決定したところ、ふるい面積の平方フィート当たり毎分０．００４ガロン以下であった。
【０３９９】
実施例１４
１１５℃での酵素消化の後のでんぷんおよび不溶物のふるい分け分離
家庭用脱イオン水（２００ｇ）を、空のＰａｒｒ  Ｍｏｄｅｌ  ４６３５の１リットルの圧力容器（Ｍｏｌｉｎｅ，ＩＬ）に投入し、８５℃の温度まで加熱した。水を、磁気撹拌子を用いて撹拌した。実施例１に記載されるように調製される乾式磨砕トウモロコシ（９０ｇ）をスプーンで加えた。アンモニア水溶液の原液を用いて、ｐＨを５．２から約６．０に上げた。約０．０６４グラムのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）溶液を、小型の較正されたピペットで加えた。圧力容器の蓋を閉め、家庭用窒素を用いて容器を５０ｐｓｉｇに加圧した。撹拌された混合物を６分以内に１１０℃まで加熱し、１０６〜１１６℃で合計２０分間保持した。加熱を抑え、圧力を軽減し、容器を開放した。さらなる０．０６４ｇのＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）を加え、温度をさらに１４２分間、６３〜７５℃で保持した。
【０４００】
少量のスラリーを、Ｐａｒｒ容器から取り、１００、１４０、および１７０メッシュスクリーンのスタックを通して重力によりふるい分け（ｇｒａｖｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎ）した。１００メッシュスクリーン上のみに固体が留まった。
【０４０１】
スラリーの一部、約４０％を、直径７５ミリメートルの１００および２００メッシュ皿の２重ふるいアセンブリの上部に、高温のまま移した。いくらかの重力ろ過を行った。−１５〜−２０水銀柱インチの真空を、ろ液受け器に引き、一定のろ過を設定した。ろ液は黄色で濁っていたが、分散は安定していた。ケーキの表面を５分以内の間、露出させた。ケーキを、脱イオン水の噴霧で２〜３分間洗浄し、ろ液の濁りが一定になるまで（合計５回の噴霧）、受け器を変えて繰り返した。ふるいを調べたところ、全ての固体が１００メッシュスクリーン上にあり、２００メッシュ上に固体がなかったという結論となった。ウェットケーキは厚さ５ｍｍであった。ウェットケーキの質量を測定したところ、１８．９ｇであり、ろ液の合計質量は１９２ｇであった。
【０４０２】
スラリーの残りの質量を、６５℃で所定の位置で１００メッシュスクリーンを備えたフィルターアセンブリに移し、５〜１０分間にわたってろ過した。ケーキを脱イオン水の噴霧で３〜４分間洗浄し、ろ液の濁りが一定になるまで（合計８回の噴霧）、受け器を変えて繰り返した。フィルターの下側から落ちる液滴が観察されなくなるまで真空をかけ続けた。ウェットケーキは、厚さ８ｍｍで、直径７５ｍｍであり、質量が３６．６ｇであった。ろ液の重量の合計は２６１ｇであった。
【０４０３】
３つの容器を、上記の方法ごとにでんぷんについて試験した。１つの容器は水を含有し、他の２つの容器は、脱イオン水中でスラリー化されたウェットケーキの試料を含有していた。全ての容器の色が黄色の琥珀色に変化した。これは、ろ過ケーキを洗浄してでんぷんのオリゴ糖を取り除いたことを意味するものと解釈される。これらの固体を、長期の液化およびその後の糖化を用いて正確に分析して、グルコース基準で、ウェットケーキが、元のトウモロコシ中にある全でんぷんの０．２％以下を含有していたことを確認した。
【０４０４】
ろ液の試料を、容器中でオレイルアルコールと組み合わせて、激しく混合し、沈降させた。透明の油層が迅速に得られ、界面にはほとんどラグ層がなく、明確に画定されていた。この実施例は、トウモロコシマッシュが約１１０℃で２０分間の調理という熱水条件まで加熱され、ろ過および洗浄される前に８５℃で２時間超さらに液化されるプロセスにおいて、全ろ液が、穀類に供給される実質的に全てのでんぷんを含有していたことを示した。さらに、ろ液に含まれるオレイルアルコールと不純物との間の干渉がそれほど観察されない。
【０４０５】
この実験を、直径７５ｍｍの８０メッシュスクリーンにおいて２４７グラムのマッシュを用いて繰り返した。最高調理温度は１１５℃であり、酵素はＬｉｑｕｏｚｙｍｅ（登録商標）であり、スラリーを８５℃以上で３時間保持した。ふるい分け速度を測定し、決定したところ、ふるい面積の平方フィート当たり毎分０．１ガロン超であった。
【０４０６】
実施例１５
この実施例は、蒸留廃液からの固体の除去ならびに脂肪酸、エステル、およびトリグリセリドを固体から回収するための脱溶媒器による抽出を示した。発酵中、固体を全蒸留廃液から分離し、脱溶媒器に供給し、脱溶媒器において固体を１．１トン／時の蒸気と接触させる。全蒸留廃液のウェットケーキ（抽出器原料）、溶媒、抽出器のミセラ、および抽出器の排出固体の流量は、表１０に示されるとおりである。表の値の単位は、ショートトン／時である。
【０４０７】
【表１２】
2015523088.tif 000014
【０４０８】
脱溶媒器を出る固体を、乾燥器に供給する。脱溶媒器を出る蒸気は、０．５５トン／時のヘキサンおよび１．１０２トン／時の水を含有する。この流れを凝縮し、デカンターに供給する。デカンターを出る水富化相は、約３６０ｐｐｍのヘキサンを含有する。この流れを蒸留塔に供給し、蒸留塔において、ヘキサンを水富化流から除去する。蒸留塔の上部を出るヘキサン富化流を凝縮し、デカンターに供給する。デカンターを出る有機物富化流を蒸留塔に供給する。蒸気（１１．０２トン／時）を、蒸留塔の塔底に供給する。この塔の塔頂および塔底生成物の組成を表１１に示す。表の値の単位は、トン／時である。
【０４０９】
【表１１】
2015523088.tif 000015
【０４１０】
実施例１６
副生成物の回収
この実施例は、マッシュからの副生成物の回収を示す。三相遠心分離機（Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）Ｚ２３−４ボウル直径、２３０ｍｍ、長さ対直径の比率４：１）をこれらの条件で使用したことを除いて、実施例６に記載される条件下でトウモロコシ油をマッシュから分離する：
・ボウル速度：５０００ｒｐｍ
・差速：１０ｒｐｍ
・供給速度：３ｇｐｍ
・相分離機ディスク：１３８ｍｍ
・羽根車の設定：１４４ｍｍ。
【０４１１】
分離されたトウモロコシ油は、ガスクロマトグラフィーおよび薄層クロマトグラフィーによって測定した際に、８１％のトリグリセリド、６％の遊離脂肪酸、４％のジグリセリド、および合計５％のリン脂質およびモノグリセリドを有していた（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１６４３０２号明細書を参照）。
【０４１２】
上記の条件下でマッシュから分離された固体は、乾燥時の重量損失によって測定した際に５８％の水分含量を有し、ガスクロマトグラフィーによって測定した際に１．２％のトリグリセリドおよび０．２７％の遊離脂肪酸を有していた（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１６４３０２号明細書を参照）。
【０４１３】
表１４中の全蒸留廃液から分離された固体、蒸発器段階の間に抽出された油、副生成物抽出剤および凝縮蒸留可溶物（ＣＤＳ）の組成を、表１２に示される全蒸留廃液の組成を前提とし、表１３（三相遠心分離機における分離）を前提として計算した。表１１の値を、Ａｓｐｅｎ  Ｐｌｕｓ（登録商標）モデル（Ａｓｐｅｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から得た。このモデルは、トウモロコシ油がマッシュから抽出されていないことを前提としている。細胞、溶解固体、および懸濁固体の乾燥量基準でのタンパク質含量が、それぞれ約５０％、２２％、および３５．５％であることが推定される。副生成物抽出剤の組成は、乾燥量基準で７０．７％の脂肪酸および２９．３％の脂肪酸イソブチルエステルであることが推定される。
【０４１４】
【表１２】
2015523088.tif 000016
【０４１５】
【表１３】
2015523088.tif 000017
【０４１６】
【表１４】
2015523088.tif 000018
【０４１７】
実施例１７
液化されたトウモロコシマッシュからのトウモロコシ油の除去
この実施例では、液化されたトウモロコシマッシュからトウモロコシ油を除去するための三相遠心分離機の使用を説明する。全粒トウモロコシの実は、通常、約３〜６重量％のトウモロコシ油を含有し、その大部分は胚芽に存在する。トウモロコシ油は、乾式粉砕および液化中に胚芽から放出される。その結果、トウモロコシマッシュは、フリートウモロコシ油を含有する。
【０４１８】
例えば、乾式磨砕トウモロコシ−エタノールプロセスに使用される標準的な連続液化プロセスを用いて、液化されたトウモロコシマッシュを生成した。磨砕トウモロコシは、４．１６重量％のトウモロコシ油（乾燥トウモロコシ基準）を含有し、１４．７重量％の水分含量を有していた。磨砕トウモロコシおよび水を、それぞれ１０．２ポンド／分および１７．０ポンド／分でスラリータンクに供給したところ、３２重量％の乾燥トウモロコシ充填量が得られた。α−アミラーゼを、乾燥トウモロコシ基準で約０．０２５重量％の酵素充填量に対応する速度でスラリータンクに供給した。スラリータンクおよび液化タンクを、両方とも８５℃および５．８のｐＨで運転した。８５℃における全滞留時間は約２時間であった。マッシュを、約３ｇｐｍの速度で生成し、これは、湿量基準で約１．３重量％のトウモロコシ油を含有していた。この油の一部は遊離油として存在し、一部は非溶解固体で存在していた。これは、トウモロコシ１ブッシェル当たりおよそ２．０ポンドのトウモロコシ油であるマッシュの全トウモロコシ油含量に対応する。マッシュ中の全固形分（ＴＳ）は３２重量％であり、全懸濁固体（ＴＳＳ）は７．７重量％であった。
【０４１９】
液化されたトウモロコシマッシュを、約３ｇｐｍの速度で三相遠心分離機（Ｍｏｄｅｌ  Ｚ２３−４／４４１，Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標），Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  ＡＧ，Ｖｉｌｓｉｂｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に供給した。供給温度は約８０℃であった。マッシュを、以下の３つの流れ：（１）トウモロコシ油、（２）オリゴ糖（液化でんぷん）の水溶液、および（３）ウェットケーキへと分離した。Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）の運転条件は以下のとおりであった：
・ボウル速度：５０００ｒｐｍ
・重力：約４０００ｇ’ｓ
・差速：１０ｒｐｍ
・羽根車の設定：約１４５
・相分離機ディスク：約１３８ｍｍ。
【０４２０】
表１５は、原料流およびＴｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）からの３つの出口流について測定したデータ（流量、密度、固体含量、およびトウモロコシ油含量）をまとめたものである。
【０４２１】
【表１５】
2015523088.tif 000019
【０４２２】
Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）によってマッシュから除去されるトウモロコシ油は、マッシュ原料中の全トウモロコシ油の３９％を占めていた。トウモロコシ油除去率は、トウモロコシ１ブッシェル当たり約０．８ポンドに等しかった。液化されたトウモロコシマッシュから分離され、回収されたトウモロコシ油は、約８５重量％のグリセリドを含有していた。
【０４２３】
トウモロコシ１ブッシェル当たり約０．８ポンドのトウモロコシ油が除去されるプロセスにおいて、マッシュ流量は、３．９ガロン／分だけ減少するであろう：
【数３】
2015523088.tif 000020
【０４２４】
発酵への全マッシュ流が約７００ｇｐｍである生産工場において、除去された油は、全マッシュ流の約０．５５％を占めるであろう。生産工場が、追加の容量を利用するために処理量を比例的に上げるものと仮定すると、年間の生産が０．５５％だけ増加することは、５６ＭＭＧＰＹのプラントが、さらなる３１０，０００ガロンのエタノールを生成するであろうことを意味する。
【０４２５】
実施例１８
液化されたトウモロコシマッシュからのトウモロコシ油の除去−供給速度の調整
この実施例において、液化されたトウモロコシマッシュを、１ｇｐｍの供給速度で三相遠心分離機に供給した。例えば、乾式磨砕トウモロコシ−エタノールプロセスに使用される標準的な連続液化プロセスを用いて、液化されたトウモロコシマッシュを生成した。磨砕トウモロコシは、４．１６重量％のトウモロコシ油（乾燥トウモロコシ基準）を含有し、１４．７重量％の水分含量を有していた。磨砕トウモロコシおよび水を、それぞれ８．２ポンド／分および１９．０ポンド／分でスラリータンクに供給したところ、約２６重量％の乾燥トウモロコシ充填量が得られた。α−アミラーゼを、乾燥トウモロコシ基準で約０．０２６重量％の酵素充填量に対応する５０ｇ／時の速度でスラリータンクに供給した。スラリータンクおよび液化タンクを、両方とも８５℃および５．８のｐＨで運転した。ジェットクッカーは使用しなかった。８５℃における全滞留時間は約２時間であった。マッシュを、約３ｇｐｍの速度で生成し、遠心分離試験のために１５００ガロンのタンクに在庫として入れた（ｉｎｖｅｎｔｏｒｉｅｄ）。マッシュは、湿量基準で約１．１重量％のトウモロコシ油を含有していた。この油の一部は遊離油として存在し、一部は非溶解固体で存在していた。これは、トウモロコシ１ブッシェル当たりおよそ２．０ポンドのトウモロコシ油であるマッシュの全トウモロコシ油含量に対応する。マッシュ中のＴＳは２５．６重量％であり、ＴＳＳは５．３重量％であった。
【０４２６】
液化されたトウモロコシマッシュを、約１ｇｐｍの速度で、供給タンクから三相遠心分離機（Ｍｏｄｅｌ  Ｚ２３−３，Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標），Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  ＡＧ，Ｖｉｌｓｉｂｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に供給した。供給温度は約８０℃であった。マッシュを、以下の３つの流れ：（１）トウモロコシ油、（２）オリゴ糖（液化でんぷん）の水溶液、および（３）ウェットケーキへと分離した。Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）の運転条件は以下のとおりであった：
・ボウル速度：５０００ｒｐｍ
・重力：約４０００ｇ’ｓ
・差速：１２ｒｐｍ
・羽根車の設定：約１５６
・相分離機ディスク：約１４０ｍｍ。
【０４２７】
表１６は、原料流およびＴｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）からの３つの出口流について測定したデータ（流量、密度、固体含量、およびトウモロコシ油含量）をまとめたものである。トウモロコシ油の物質収支の質は１０２％であり、全固形分の物質収支の質は１０５％であった。
【０４２８】
【表１６】
2015523088.tif 000021
【０４２９】
Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）によってマッシュから除去されるトウモロコシ油は、マッシュ原料中の全トウモロコシ油の１７％を占めていた。このトウモロコシ油除去率は、トウモロコシ１ブッシェル当たり約０．３４ポンドに等しかった。液化されたトウモロコシマッシュから分離され、回収されたトウモロコシ油は、約８１．４重量％のグリセリドおよび８．３重量％の遊離脂肪酸を含有していた。
【０４３０】
実施例１９
液化されたトウモロコシマッシュからのトウモロコシ油の除去−供給速度の調整
この実施例において、液化されたトウモロコシマッシュを、１０．１ｇｐｍの供給速度で三相遠心分離機に供給した。例えば、乾式磨砕トウモロコシ−エタノールプロセスに使用される標準的な連続液化プロセスを用いて、液化されたトウモロコシマッシュを生成した。磨砕トウモロコシは、４．１６重量％のトウモロコシ油（乾燥トウモロコシ基準）を含有し、１４．７重量％の水分含量を有していた。磨砕トウモロコシおよび水を、それぞれ８．２ポンド／分および１９．０ポンド／分でスラリータンクに供給したところ、約２６重量％の乾燥トウモロコシ充填量が得られた。α−アミラーゼを、乾燥トウモロコシ基準で約０．０２６重量％の酵素充填量に対応する５０ｇ／時の速度でスラリータンクに供給した。スラリータンクおよび液化タンクを、両方とも８５℃および５．８のｐＨで運転した。ジェットクッカーは使用しなかった。８５℃における全滞留時間は約２時間であった。マッシュを、約３ｇｐｍの速度で生成し、遠心分離試験のために１５００ガロンのタンクに在庫として入れた。マッシュは、湿量基準で約１．１重量％のトウモロコシ油を含有していた。この油の一部は遊離油として存在し、一部は非溶解固体で存在していた。これは、トウモロコシ１ブッシェル当たりおよそ２．０ポンドのトウモロコシ油であるマッシュの全トウモロコシ油含量に対応する。マッシュ中のＴＳは２６．２重量％であり、ＴＳＳは６．７重量％であった。
【０４３１】
液化されたトウモロコシマッシュを、約１０．１ｇｐｍの速度で、供給タンクから三相遠心分離機（Ｍｏｄｅｌ  Ｚ２３−４／４４１，Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標），Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  ＡＧ，Ｖｉｌｓｉｂｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に供給した。供給温度は約８０℃であった。マッシュを、以下の３つの流れ：（１）トウモロコシ油、（２）オリゴ糖（液化でんぷん）の水溶液、および（３）ウェットケーキへと分離した。Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）の運転条件は以下のとおりであった：
・ボウル速度：５０００ｒｐｍ
・重力：約４０００ｇ’ｓ
・差速：２０ｒｐｍ
・羽根車の設定：約１４８
・相分離機ディスク：約１３８ｍｍ。
【０４３２】
表１７は、原料流およびＴｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）からの３つの出口流について測定したデータ（流量、密度、固体含量、およびトウモロコシ油含量）をまとめたものである。トウモロコシ油の物質収支の質は９５％であった。
【０４３３】
【表１７】
2015523088.tif 000022
【０４３４】
Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）によってマッシュから除去されるトウモロコシ油は、マッシュ原料中の全トウモロコシ油の１８％を占めていた。このトウモロコシ油除去率は、トウモロコシ１ブッシェル当たり約０．３６ポンドに等しかった。液化されたトウモロコシマッシュから分離され、回収されたトウモロコシ油は、約８１．４重量％のグリセリドおよび８．３重量％の遊離脂肪酸を含有していた。
【０４３５】
実施例２０
マッシュからのトウモロコシ油の回収に対する液化されたトウモロコシマッシュのｐＨの影響
液化されたトウモロコシマッシュを、通常、乾式磨砕トウモロコシ−エタノールプロセスに使用される標準的な連続液化プロセスを用いて生成した。磨砕トウモロコシは、４．６重量％のトウモロコシ油（乾燥トウモロコシ基準）を含有し、１２．５重量％の水分含量を有していた。磨砕トウモロコシおよび水を、２５．９重量％の乾燥トウモロコシ充填量で３ｇｐｍのトウモロコシマッシュを生成する速度でスラリータンクに供給した。スラリータンクを、３０分間の滞留時間で、８５℃で運転した。次に、スラリーを、ジェットクッカー中で生蒸気を用いて１０５℃まで加熱し、その温度で約３０分間保持した。保持管を出た後、スラリーを、９０分間の滞留時間で、８５℃で運転される液化タンクに供給した。α−アミラーゼ（Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＡＬＰＨＡ，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（登録商標），Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を、乾燥トウモロコシ基準における０．０４重量％の酵素の全酵素充填量に対応する速度でプロセスに連続して供給した。全酵素の４０パーセント（４０％）を、スラリータンクに加え、６０％を、液化タンクに加えた。スラリータンクおよび液化タンクを両方とも５．８のｐＨで運転した。マッシュを、約３ｇｐｍの速度で生成し、遠心分離試験のために１５００ガロンのタンクに在庫として入れた。液化されたトウモロコシマッシュは、湿量基準で約１．１２重量％のトウモロコシ油を含有していた。これは、トウモロコシ１ブッシェル当たりおよそ２．２ポンドのトウモロコシ油であるマッシュの全トウモロコシ油含量に対応する。この油の一部は、遊離油として存在し；一部は、まだ非溶解固体中にあった。マッシュ中のトウモロコシ油中の遊離脂肪酸に対するグリセリドの比率は、約７．６〜１であった。マッシュ中の全固形分（ＴＳ）は２５．９重量％であり、全懸濁固体（ＴＳＳ）は４．７重量％であった。最終的なマッシュのＤＥ（デキストロース当量）およびｐＨは、それぞれ１５．９および５．７５であった。マッシュの密度は、１．０８ｇ／ｍＬであった。
【０４３６】
３つの異なる供給流量：１．２４ガロン／分、５．１ガロン／分および１０ガロン／分で、三相遠心分離機（Ｍｏｄｅｌ  Ｚ２３−４／４４１，Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標），Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  ＡＧ，Ｖｉｌｓｉｂｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、液化されたマッシュを分離した。供給温度は約８０℃であった。マッシュを、以下の３つの流れ：（１）トウモロコシ油、（２）オリゴ糖（液化でんぷん）の水溶液、および（３）ウェットケーキへと分離した。ボウル速度を、約５０００ｒｐｍ（約４０００ｇ’ｓ）で一定に保持した。表１８は、５．８のマッシュｐＨでのＴｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）へのマッシュ供給速度に応じたトウモロコシ油の回収率を比較している。表１８に示されるデータは、ｐＨ＝５．８のトウモロコシ油の回収率に対するＴｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）への供給速度の影響があることを示す。
【０４３７】
【表１８】
2015523088.tif 000023
【０４３８】
トウモロコシ油の回収率は、マッシュに含まれる全油（遊離油および固体中の油の両方）に基づく。Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）に供給されたマッシュは、１．１〜１．２重量％のトウモロコシ油（遊離油および固体中の油を含む）を含有していた。
【０４３９】
表１８中のデータは、（試験される条件における）トウモロコシ油の回収率に対するマッシュ供給速度の影響があることを示す。表１９は、試験される３つの条件についての水性遠心分離液中の油相、油遠心分離液中の水相、および油遠心分離液中の固体の量をまとめたものである。
【０４４０】
【表１９】
2015523088.tif 000024
【０４４１】
表１９中のデータは、回収されたトウモロコシ油が、ごく少ない水相およびごく少ない固体を含有していたため、かなり清浄であったことを示す。液化されたトウモロコシマッシュから分離され、回収されたトウモロコシ油は、約８５．１重量％のグリセリドおよび８．０重量％の遊離脂肪酸を含有していた。残りは、固体、水相、および他の抽出可能物（例えば、リン脂質、ステロールなど）であった。
【０４４２】
Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）供給タンク中に残っている液化されたトウモロコシマッシュのｐＨを、約３に低下させた。２つの異なる供給流量：１．３ガロン／分および５ガロン／分で、三相遠心分離機（Ｍｏｄｅｌ  Ｚ２３−４／４４１，Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標），Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  ＡＧ，Ｖｉｌｓｉｂｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、酸性のマッシュを分離した。供給温度は約８０℃であった。マッシュを、以下の３つの流れ：（１）トウモロコシ油、（２）オリゴ糖（液化でんぷん）の水溶液、および（３）ウェットケーキへと分離した。ボウル速度を、約５０００ｒｐｍ（約４０００ｇ’ｓ）で一定に保持した。表２０は、３．０のマッシュｐＨでのＴｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）へのマッシュ供給速度に応じたトウモロコシ油の回収率を比較している。
【０４４３】
【表２０】
2015523088.tif 000025
【０４４４】
マッシュをｐＨ＝５．８で生成し、次に、遠心分離機に供給する前に、最終的なマッシュのｐＨを３に低下させた。トウモロコシ油の回収率は、マッシュに含まれる全油（遊離油および固体中の油の両方）に基づく。Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）に供給されたマッシュは、約０．９重量％のトウモロコシ油（遊離油および固体中の油を含む）を含有していた。Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）に供給されたマッシュの全固形分は２７．１重量％であり、マッシュの全懸濁固体は５．５重量％であった。
【０４４５】
表２１は、試験される２つの条件についての水性遠心分離液中の油相、油遠心分離液中の水相、および油遠心分離液中の固体の量をまとめたものである。表２１中のデータは、回収されたトウモロコシ油が、ごく少ない水相およびごく少ない固体を含有していたため、かなり清浄であったことを示す。
【０４４６】
【表２１】
2015523088.tif 000026
【０４４７】
試験Ａ（表１８）〜試験Ｄ（表２０）の結果の比較および試験Ｂ（表１９）〜試験Ｅ（表２１）の結果の比較は、Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）を用いたトウモロコシ油回収に対するマッシュｐＨの影響を示す。データは、Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）を用いてマッシュを分離する前にマッシュのｐＨを低下させると、より高いトウモロコシ油回収率が得られることを示唆する。これらの比較を表２２に示す。
【０４４８】
【表２２】
2015523088.tif 000027
【０４４９】
表２２に示されるパーセンテージは、マッシュに含まれる全油（遊離油および固体中の油の両方）に基づくトウモロコシ油の回収率である。Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）に供給されたマッシュ中のトウモロコシ油の組成物は、この実施例に記載される全ての試験について、０．９％〜１．２重量％のトウモロコシ油（遊離油および固体中の油を含む）の範囲であった。Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標）を５０００ｒｐｍ（約４０００Ｇ’ｓ）で運転し、差速および羽根車の設定は、それぞれ５〜１０ｒｐｍおよび１４５ｍｍであった。
【０４５０】
実施例２１
トウモロコシマッシュからのトウモロコシ油および固体の回収
乾燥トウモロコシ基準で３０〜３１重量％で、乾式磨砕トウモロコシ−エタノールプロセスに使用される標準的な連続液化プロセスを用いて、液化されたトウモロコシマッシュを生成した。全固形分（ＴＳ）を約３３重量％に高めた、調理水および逆流からなる再利用水を使用した。α−アミラーゼ（Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＲＳＬ，Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（登録商標），Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を、約０．０２重量％の乾燥トウモロコシ基準での酵素充填量に対応する速度で、スラリータンク（８５℃、ｐＨ約５．８、３０分間の滞留時間）に加えた。ジェットクッカーを用いて、１８分間の調理時間で温度を１０５から１１０℃に上昇させた。液化タンクを、約５．８のｐＨで、８５℃で運転した。Ｓｐｅｚｙｍｅ（登録商標）ＲＳＬ（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（登録商標），Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）も、約０．００５重量％の乾燥トウモロコシ基準での酵素充填量に対応する速度で液化タンクに加え、液化タンク中の全滞留時間は約９０分間であった。マッシュの側流（ｓｉｄｅ  ｓｔｒｅａｍ）を液化タンクから収集し、小型の希釈タンクに移し、ここで、所望の希釈を得るようにプロセス凝縮物（ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｅ）を加えた。元のマッシュは、湿量基準で約１．５５重量％のトウモロコシ油を含有していた。この油の一部は遊離油として存在し、一部は非溶解固体で存在していた。これは、トウモロコシ１ブッシェル当たりおよそ３．０ポンドのトウモロコシ油である元のマッシュの全トウモロコシ油含量に対応する。元のマッシュ中のＴＳは３３．２重量％であり、全懸濁固体（ＴＳＳ）は６．５重量％であった。プロセス凝縮物による希釈により、ＴＳが約２７重量％に低下され、ＴＳＳが約５．５重量％に低下され、油含量が約１．３重量％（湿量基準）に低下された。
【０４５１】
液化されたトウモロコシマッシュを、９〜１１ｇｐｍの速度で、供給タンクから三相遠心分離機（Ｍｏｄｅｌ  Ｚ２３−４／４４１，Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  Ｔｒｉｃａｎｔｅｒ（登録商標），Ｆｌｏｔｔｗｅｇ  ＡＧ，Ｖｉｌｓｉｂｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に供給した。供給温度は約８５℃であった。マッシュを、以下の３つの流れ：（１）トウモロコシ油、（２）オリゴ糖（液化でんぷん）の水溶液、および（３）ウェットケーキへと分離した。三相遠心分離機の運転条件は以下のとおりであった：
・ボウル速度：５０００ｒｐｍ
・重力：約３２００ｇ
・差速：２５ｒｐｍ
・羽根車の設定：表を参照
・相分離機ディスク：約１３８ｍｍ
【０４５２】
表２３は、分離後の三相遠心分離機の条件および特性をまとめたものである。３３重量％および２６重量％の両方のトウモロコシ充填量での流れを、３８〜４１重量％の全固形分で、非常に清浄なトウモロコシ油流およびウェットケーキへと分離した。重質相中の懸濁固体濃度は、トウモロコシ充填量に強く影響された。３３重量％の試料が、約３．５〜４重量％の遠心分離液ＴＳＳを生成した一方、２６重量％のＴＳは、約１．７〜２重量％でより低いＴＳＳの遠心分離液を生成する。
【０４５３】
【表２３】
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【０４５４】
結果は図１９Ａ〜１９Ｅにも示される。図１９Ａは、約４ｇｐｍの低い流量で、遠心分離液のＴＳＳが約３．３％であり、１１．５ｇｐｍの流量で、遠心分離液のＴＳＳが、約４．２から４．７％に増加したことを示す。
【０４５５】
図１９Ｂは、流量に応じた懸濁固体の回収率を示す。約４ｇｐｍの低い流量で、約６０％の懸濁固体を、ウェットケーキ中で回収した。流量を約１１．５ｇｐｍに増加させることによって、回収率は、約４０〜５０％に減少した。
【０４５６】
図１９Ｃは、流量に応じたウェットケーキ全固形分を示す。約４ｇｐｍの低い流量で、ウェットケーキ全固形分は約４１％であった。流量を約１１．５ｇｐｍに増加させることによって、ウェットケーキ全固形分は、約３９％に減少した。
【０４５７】
図１９Ｄは、全ウェットケーキ固体に対する差速ｒｐｍの影響を示す。ウェットケーキ
固体は、上昇した差速ｒｐｍで減少した。
【０４５８】
図１９Ｅは、トウモロコシ油の回収率に対する供給速度の影響を示す。低い流量で、油の回収率は約４８％であった。流量を約１１．５ｇｐｍに増加させた場合、油の回収率は約３５％に減少する。より少ない油がより高い流量で原料流から分離されるようである。
【０４５９】
実施例２２
トウモロコシマッシュのレオロジー特性
羽根形状で構成されるＡＲ−Ｇ２回転式レオメータ（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｅｗ  Ｃａｓｔｌｅ，ＤＥ）を用いて、トウモロコシマッシュの粘度を測定する。磨砕トウモロコシおよび水のスラリーを調製し、混合し、樹脂ケトル中で５５℃まで加熱する。ｐＨを５．８に調整し、酵素（例えば、α−アミラーゼおよび／またはグルコアミラーゼ）をスラリーに加える。スラリーを、２℃／分の速度で６５℃まで加熱する。試料を除去し、６５℃に予め加熱された、ナローギャップ型の同心円筒形状（ｎａｒｒｏｗ  ｇａｐ  ｃｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  ｃｙｌｉｎｄｅｒ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ）を備えたレオメータに移される。次に、温度上昇を行って、２℃／分の速度で６５℃から８５℃まで温度を上昇させる。温度上昇を固定されたせん断速度で行う（例えば、７５〜２００ｓ−１）。粘度を時間に応じて測定する。
【０４６０】
本発明の様々な実施形態を上に説明してきたが、それらは例として示されたに過ぎず、限定するものではないことを理解されたい。本発明の趣旨および範囲から逸脱せずに本発明の形態および細部の様々な変更を行うことができることが、関連技術の当業者に明らかであろう。したがって、本発明の広さおよび範囲は、上述した例示的実施形態のいずれによって限定されるものでもなく、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物のみにしたがって規定されるものである。
【０４６１】
本明細書に記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関する技術分野の当業者の技能のレベルを示し、それぞれの個々の刊行物、特許または特許出願が参照により援用されることが具体的にかつ個々に示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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