(57)【要約】本発明は、カワラタケから9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステル (9-KODEメチルエステル)を効率的かつ簡便に単離する方法を提供する。さらに、本発明は、カワラタケ抽出物の治療的な使用、カワラタケから単離した生物学的に活性な化学成分、ならびに9-KODEメチルエステルおよびそれに関連する化合物も提供する。好ましい態様において、本発明は癌細胞の転移拡散を阻害するために使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)十分な量のカワラタケ(Coriolus versicolor)原料を用意する工程、
(b)約15℃〜約30℃の温度にて、アルコールまたはアルコール-水混合液である極性溶媒で該カワラタケ原料を抽出して、カワラタケアルコール抽出物および残留物を産生し、かつ該カワラタケアルコール抽出物を回収する工程、ならびに
(c)該カワラタケアルコール抽出物から9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステルを単離する工程
を含む、単離した9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステル(9-KODEメチルエステル)を得る方法であって、該工程(b)を一回または複数回行う、方法。
【請求項２】
前記極性溶媒がエタノールまたは水-エタノール混合液である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
式Iで表す化学構造を有する化合物、またはその塩：
2015514129.tif 000009
式中、
2015514129.tif 000010
は、二重結合または単結合であり；
R1は、H、OH、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基、またはORaであり、ここでRaは直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基であり；かつ
R2は、H、O、または直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基であり；かつ
R3は、H、OH、O、ハロ、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基、またはORaであり、ここでRaは直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基である。
【請求項４】
R1が、OH、OCH3、またはOC2H5である、請求項3記載の化合物。
【請求項５】
R2がOである、請求項3記載の化合物。
【請求項６】
R3がOまたはOHである、請求項3記載の化合物。
【請求項７】
9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステルである、請求項3記載の化合物。
【請求項８】
請求項3記載の化合物を含む組成物。
【請求項９】
治療上許容される担体をさらに含む、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステルを含む、請求項8記載の組成物。
【請求項１１】
癌または腫瘍を治療するための方法であって、そのような治療を必要とする対象に、式Iの化合物またはその塩を含む組成物の有効量を投与する工程を含む、方法：
2015514129.tif 000011
式中、
2015514129.tif 000012
は、二重結合または単結合であり；
R1は、H、OH、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基、またはORaであり、ここでRaは直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基であり；かつ
R2は、H、O、または直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基であり；かつ
R3は、H、OH、O、ハロ、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基、またはORaであり、ここでRaは直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基である。
【請求項１２】
前記化合物が9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステルである、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記対象がヒトである、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が転移性癌を有しており、かつ前記組成物の投与が癌転移を低減するために使用される、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
前記癌または腫瘍が、脳の癌または腫瘍、鼻咽頭癌、乳房の癌または腫瘍、肺の癌または腫瘍、白血病、リンパ腫、結腸の癌または腫瘍、肝臓の癌または腫瘍、腹部の癌または腫瘍、食道の癌または腫瘍、膀胱の癌または腫瘍、および胃の癌または腫瘍からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が脳の癌または腫瘍を有しており、かつ前記組成物の投与が脳の癌または腫瘍を治療するために使用される、請求項11記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が乳房の癌または腫瘍を有しており、かつ前記組成物の投与が乳房の癌または腫瘍を治療するために使用される、請求項11記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が肺の癌または腫瘍を有しており、かつ前記組成物の投与が肺の癌または腫瘍を治療するために使用される、請求項11記載の方法。
【請求項１９】
MMP3の発現を阻害するために使用される、請求項11記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2012年4月11日に出願された米国仮出願第61/622,846号の恩典を主張し、これらは全て参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
ハラタケ(Agaricus versicolor)、ヤマドリタケ(Boletus versicolor)、アシグロタケ(Polyporus versicolor)、ツバサタケ(Polystictus versicolor)、ニクアナタケ(Poria versicolor)、ホウロクタケ(Trametes versicolor)、ユンジ(Yun-Zhi)(中国)、カワラタケ(Kawaratake)(日本)、および「ターキーテール(turkey tail)」(北アメリカ)としても知られるカワラタケ(Coriolus versicolor)は、担子菌類およびサルノコシカケ科に属する。これは世界中に広く分布しており、アジア、欧州および北アメリカの森林温度帯において120以上の株が同定されている。
【０００３】
カワラタケの医療的価値は、中国の明王朝時代(1368〜1644AD)にLi Shi Zhenにより本草綱目(Compendium of Materia Medica(Compendium Medica))に初めて記録された。本草綱目(Compendium Medica)によれば、カワラタケ(ユンジ)を定期的に摂取すると、活力を活性化させ、その人の最適体重を維持し、寿命を延ばし、不必要な老化を避けることができる。また、カワラタケは、肝臓および脾臓機能に対する保護効果を有すると信じられ、肝機能障害および気道感染症に伴う様々な症状の治療に使われてきた。中国および日本においては、カワラタケは乾燥および粉砕してお茶にされる。カワラタケは長年の使用において有毒作用を有することは報告されていない。
【０００４】
カワラタケは、免疫調節、抗癌、抗菌、および抗ウイルス効果を有することが報告されている。これらの薬理作用の大部分が、多糖類クレスチン(PSK)等の多糖ペプチド(PSP)によって生じる。
【０００５】
カワラタケは経験的に使用されてきた長い歴史を持つが、それが薬理作用を発揮する正確なメカニズムについての知識はまだ限定されている。さらに、カワラタケの生物学的に活性な化学成分の多くが同定されていない。カワラタケ抽出物の生成規模を拡大するため、および治療上の使用のためにその生物学的に活性な化学成分を同定するために、より効率的かつ簡便な抽出プロトコールの開発が必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、カワラタケから9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステル(9-KODEメチルエステル)を効率的かつ簡便に単離する方法を提供する。一態様において、本方法は、
カワラタケ抽出物を得る工程、および
該カワラタケ抽出物から9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステルを単離する工程
を含む。
【０００７】
一つの特定の態様において、カワラタケから9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステル(9-KODEメチルエステル)を単離する方法は、
(a)十分な量のカワラタケ原料を用意する工程、
(b)約15℃〜約30℃の温度にて極性溶媒でカワラタケ原料を抽出して、カワラタケ抽出物および残留物を産生する工程、ここで、工程(b)は、一回または複数回行われる、
(c)該カワラタケ抽出物を回収する工程、ならびに
(d)該カワラタケ抽出物から9-KODEメチルエステルを単離する工程
を含む。
【０００８】
一態様において、上記方法の工程(b)において使用する溶媒は極性溶媒である。特定の態様において、溶媒はエタノール-水混合液である。特定の態様において、9-KODEメチルエステルは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用してカワラタケ抽出物から単離される。
【０００９】
別の態様において、本発明は、式Iの化合物およびその塩の治療的な使用を提供する：
2015514129.tif 000002
式中
2015514129.tif 000003
は、二重結合または単結合であり；
R1は、H、OH、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基(例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、s-ブチルもしくはt-ブチル基)、またはORaであり、ここでRaは直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基であり；かつ
R2はH、O、または直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基であり；かつ
R3はH、OH、O、ハロ、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基(例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、s-ブチルもしくはt-ブチル基)、またはORaであり、ここでRaは直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基である。
【００１０】
一態様において、R2はOであり、R1は、OH、OCH3、またはOC2H5である。別の態様において、R3はOまたはOHである。
【００１１】
特定の態様において、式Iの化合物は、9-KODEメチルエステルまたは9-KODEである。
【００１２】
有利なことに、カワラタケ抽出物および式Iの化合物は、マトリクスメタロプロテイナーゼ3(MMP3)発現を阻害し、癌または腫瘍細胞の成長、浸潤および/または転移を阻害するために使用できる。
【００１３】
本発明は、本抽出方法によって生成されるカワラタケ抽出物をさらに提供する。治療上有効量の本カワラタケ抽出物、カワラタケから単離された生物学的に活性な化学成分、および/または式Iの化合物、ならびに任意に薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。
【００１４】
本発明は、免疫反応の調節が有益となる疾患または病態を予防、治療、または改善する方法も提供する。一態様において、本方法は、そのような治療を必要とする対象に、治療上有効量の本発明のカワラタケ抽出物、カワラタケから単離された生物学的に活性な化学成分（9-KODEメチルエステルなど）、および/または式Iの化合物を含む有効量の組成物を投与する工程を含む。
【００１５】
一態様において、本発明の組成物を使用して、脳腫瘍、上咽頭癌、乳癌、肺癌、白血病、リンパ腫、結腸癌、肝臓癌、胃がん、食道癌、膀胱癌、および胃癌を含むが、これらに限定されない癌または腫瘍を治療または改善できる。特定の態様において、本発明の組成物は、腫瘍または癌細胞の転移または浸潤を低減または改善するのに使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】カワラタケの抽出スキームの例示を示している。室温にてEtOH(12倍量)中で1時間の連続的な超音波処理によりカワラタケを抽出することでカワラタケのエタノール抽出物を得た。手短に述べると、カワラタケの原料を、12倍量のエタノール中で1時間の連続的な超音波処理により浸軟させた。残留物を10倍量のEtOH中で浸軟させ、抽出手順を二回繰り返した。抽出物を回収し、混ぜ合わせ、真空下で蒸発乾燥させた。
【図１Ｂ】カワラタケの抽出スキームの例示を示している。室温にて12×EtOHを第一の溶媒として使用し、加熱条件下で10×50％EtOHを第二の溶媒として使用し、加熱条件下で10×0.04％NaOH溶液を第三の溶媒として使用する連続抽出によってカワラタケ抽出物を調製した。抽出物を回収、混ぜ合わせ、濃縮、および凍結乾燥した。
【図１Ｃ】カワラタケの抽出スキームの例示を示している。10×50％EtOHを第一の溶媒として使用し、10×0.04％NaOH溶液を第二の溶媒として使用する連続抽出によってカワラタケ抽出物を調製した。抽出手順は、加熱条件下で行った。抽出物を回収、混ぜ合わせ、濃縮、および凍結乾燥した。
【図２Ａ】図1Aに示す抽出スキームを使用して調製したカワラタケエタノール抽出物の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のクロマトグラムを示す。ODS結合シリカゲルをパックされたカラム(Lichrospher 100 RP C18、EC 5um)と共にAgilent1200シリーズHPLC系を使用して、カワラタケエタノール抽出物をHPLCに供した。流量は1.0 ml/分にセットし、水-アセトニトリル混合液を移動相として使用した。210、254、および280 nmにてピークを検出した。図2Aは、連続的な超音波処理下にて1時間エタノールで抽出されたカワラタケ抽出物のHPLCクロマトグラムである。抽出手順は2回繰り返した。
【図２Ｂ】カワラタケの原料をエタノール中で18時間浸軟させて調製したカワラタケエタノール抽出物の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のクロマトグラムを示す。ODS結合シリカゲルをパックされたカラム(Lichrospher 100 RP C18、EC 5um)と共にAgilent1200シリーズHPLC系を使用して、カワラタケエタノール抽出物をHPLCに供した。流量は1.0 ml/分にセットし、水-アセトニトリル混合液を移動相として使用した。210、254、および280 nmにてピークを検出した。図2Bは、エタノール中で18時間浸軟させることで抽出したカワラタケ抽出物のHPLCクロマトグラムである。
【図２Ｃ】図1Bに示す抽出スキームを使用して調製したカワラタケエタノール抽出物の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)のクロマトグラムを示す。ODS結合シリカゲルをパックされたカラム(Lichrospher 100 RP C18、EC 5um)と共にAgilent1200シリーズHPLC系を使用して、カワラタケエタノール抽出物をHPLCに供した。流量は1.0 ml/分にセットし、水-アセトニトリル混合液を移動相として使用した。210、254、および280 nmにてピークを検出した。図2Cは、図1Bに示す抽出スキームを使用して抽出したカワラタケ抽出物のHPLCクロマトグラムである。手短に述べると、室温にてエタノールでカワラタケを抽出した後、加熱条件下にて50％エタノールで抽出した。
【図３】図3A〜Bは、図1Aに示す抽出スキームを使用するか、またはカワラタケの原料をエタノール中で18時間浸軟させて調製したカワラタケエタノール抽出物のガスクロマトグラフィー(GC)全イオンクロマトグラムを示す。抽出物をピリジンおよび誘導化剤BSTFA[N,O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド]と70℃にて2時間混合した。得られた混合液を、HP-5MSカラム(30m×250um×0.25um)を用いたガスクロマトグラフィー質量分析法(GC-MS)により分析した。初期オーブン温度を70℃にて1分間維持し、10℃/分の速度で180℃まで上げ、180℃にて2分間維持し、10℃/分の速度で280℃まで上げ、280℃にて3分間維持した。注入装置温度は275℃にセットした。ヘリウムを1 ml/分の流量で担体ガスとして使用した。(A)1時間の連続的な超音波処理下にてエタノールで抽出したカワラタケ抽出物のガスクロマトグラフィー(GC)全イオンクロマトグラム。抽出手順は2回繰り返した。(B)エタノール中で18時間浸軟させることで抽出したカワラタケ抽出物のガスクロマトグラフィー(GC)全イオンクロマトグラム。
【図４】図1Aに示す抽出スキームを使用して調製したカワラタケエタノール抽出物(MPUB-EtOH)のHPLCクロマトグラムを示す。逆相カラム(Lichrospher 100 RP C18、EC 5um)を使用してMPUB-EtOHの抽出物をさらに5つのフラクションに分けた。流量を1.0 ml/分にセットし、水-アセトニトリル混合液を移動相として使用した。210、254、および280 nmにおいてピークを検出した。
【図５】図5A〜Bは、ポリイノシン-ポリシチジル酸(ポリ(I:C))で処理した初代ヒト血液マクロファージにおいて、カワラタケ抽出物(MPUB-EtOH)が、INFβ生成を増大させ(A)、かつIL10生成を低減する(B)ことを示す。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。<O.05(*)または<0.001(**)のp値を統計的に有意であるとみなした。
【図６】図6A〜Bは、カワラタケ抽出物(MPUB-EtOH)がLPS誘導型TNFα生成を低減することを示す。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。<O.05(*)または<0.001(**)のp値を統計的に有意であるとみなした。
【図７】カワラタケ抽出物(MPUB-EtOH)がLPS誘導型亜硝酸塩の生成を低減することを示す。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。<O.05(*)のp値を統計的に有意であるとみなした。
【図８Ａ】カワラタケ抽出物(MPUB-EtOH)の抗ウイルス効果を示す。図8Aは、カワラタケ抽出物による単純ヘルペスウイルス(HSV)のウイルス価の低下を示す。カワラタケ抽出物(MPUB-EtOH)を、図4に示すようにフラクション1〜5に分割する。フラクション4〜5は細胞傷害性を示したため(データは示していない)、抗ウイルス効果についてそれ以上は検査しなかった。
【図８Ｂ】カワラタケ抽出物(MPUB-EtOH)の抗ウイルス効果を示す。図8Bは、カワラタケ抽出物(MPUB-EtOH)のフラクション1〜3によるHSVウイルス価の低下を示す。
【図８Ｃ】カワラタケ抽出物(MPUB-EtOH)の抗ウイルス効果を示す。図8Cは、カワラタケ抽出物(MPUB-EtOH)のフラクション3によるHSVウイルス価の低下を示す。<0.001(**)のp値を統計的に有意であるとみなした。
【図９】カワラタケ抽出物(MPUB-EtOH)がMMP-3発現を低下させたことを示す。<O.05(*)のp値を統計的に有意であるとみなした。
【図１０】カワラタケ抽出物(MPUB-EtOH)がマウスにおけるHSV感染の重症度を低下させたことを示す。
【図１１】異なるバッチの50μg/mlのカワラタケエタノール抽出物(R08PUB、R09PUB、R10PUB、およびR11PUB)が、TNF-α誘導型MMP-3 mRNAレベルを抑制したことを示す。簡単に言うと、膠芽腫細胞(T98G、脳細胞)を異なるバッチのカワラタケエタノール抽出物で18時間前処置した後、組換えヒトTNF-α(10ng/ml)で3時間処置した。MMP-3 mRNAレベルをTaqMan遺伝子発現アッセイにより分析した。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。*P＜O.05または**P＜0.01を統計的に有意であるとみなした(「R08」、「R09」、および「R11」は、カワラタケの収穫年がそれぞれ2008、2009、および2011年だったことを示す)。
【図１２】異なるバッチの50μg/mlのカワラタケエタノール抽出物(R08PUB、R09PUB、R10PUB、およびR11PUB)が、TNF-α誘導型MMP-3タンパク質発現を阻害したことを示す。簡単に言うと、膠芽腫細胞(T98G、脳細胞)を異なるバッチのカワラタケエタノール抽出物で18時間前処置した後、組換えヒトTNF-α(10ng/ml)でさらに24時間処置した。MMP-3タンパク質発現を酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で分析した。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。*P＜O.05または**P＜0.01を統計的に有意であるとみなした。
【図１３】カワラタケから単離した化合物(本明細書において「Cove-1」とも称する)のHPLCクロマトグラムおよびUV吸光度を示す。化合物Cove-1を、20％〜90％のアセトニトリルの勾配溶離を1 ml/分の流速で使用する逆相HPLCにより精製した。およそ8.5分において溶出された単一のピークを、フォトダイオードアレイ検出器を使用して280 nmにて検出した。化合物Cove-1のUV吸光度は277nmで最大となり、これにより化合物Cove-1が共役したカルボニル基を有することが明らかになった。
【図１４】化合物Cove-1の1H(A)および13C NMR(B)スペクトルを示す。1Hについては500 MHz、13C NMRについては125.765 MHzにて作動させるBruker 500 MHz DRX NMR分光計により、メタノール-dを溶媒として使用して、化合物Cove-1の構造を解明した。化合物Cove-1の1H NMRスペクトルは、0.9、1.3〜1.4、1.45、1.58、2.19、2.25、2.58、3.33、6.12、6.26、および7.22においてシグナルを示した。化合物Cove-1の13C NMRスペクトルは、14.5、23.7、25.7、26.3、29.7、30.3、30.3、30.3、32.7、34.3、35.4、41.1、50.0、128.9、130.4、145.5、147.6、178.2、および204.1においてシグナルを示した。
【図１５】化合物Cove-1の化学構造を示す。1H NMR (500MHz): δ0.9 (3H, H-18), 1.3-1.4 (10H, H-4, 5, 6, 16, 17), 1.45 (2H, H-15), 1.58 (4H, H-3, 7), 2.19 (2H, H-14), 2.25 (2H, H-2), 2.58 (2H, H-8), 3.33 (3H, CH3OOC), 6.12 (1H, H-10), 6.26 (2H, H-12, 13), 7.22 (1H, H-11)。13C NMR (125MHz): δ14.5 (C-18), 23.7 (C-17), 25.7 (C-7), 26.3 (C-3), 29.7 (C-15), 30.3 (C-4*), 30.3(C-5*), 30.3(C-6*), 32.7 (C-16), 34.3 (C-14), 35.4 (C-2), 41.1 (C-8), 50.0 (OCH3), 128.9 (C-10), 130.4 (C-12), 145.5 (C-11), 147.6 (C-13), 178.2 (C-1)および204.1 (C-9)。*置き換え可能。結果をDept 135、HSQCおよび1H-1H COSYにより確認した。化合物Cove-1は、m/z 55、67、81、95、151 、166、276、308においてイオンピークを示した。文献で報告されているデータと分光分析データを比較したところ、化合物Cove-1は、9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステル(9-KODEメチルエステル)と同定された。
【図１６】10、25、および50μg/mlの精製化合物Cove-1がTNF-α誘導型MMP-3 mRNAレベルを抑制したことを示す。簡単に言うと、膠芽腫細胞(T98G、脳細胞)を精製Cove-1 化合物で18時間前処置した後、組換えヒトTNF-α(10ng/ml)で3時間処置した。MMP-3 mRNAレベルをTaqMan遺伝子発現アッセイで分析した。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。**P＜0.01を統計的に有意であるとみなした。
【図１７】10、25、および50μg/mlの精製化合物Cove-1がTNF-α誘導型MMP-3タンパク質発現を阻害したことを示す。簡単に言うと、膠芽腫細胞(T98G、脳細胞)を精製化合物Cove-1で18時間前処置した後、組換えヒトTNF-α(10ng/ml)でさらに24時間処置した。MMP-3タンパク質発現を酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)で分析した。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。*P＜O.05、**P＜0.01を統計的に有意であるとみなした。
【図１８】T98G細胞に対して、50μg/mlの異なるバッチのカワラタケエタノール抽出物(R08PUB、R09PUB、R10PUB、およびR11PUB)とインキュベートした細胞の代謝活性に有意な差がなかったことを示す。MTT(3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジ-フェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイを48時間の時間にわたり行った。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。
【図１９】T98G細胞に対して、10、25、および50μg/mlの精製化合物(Cove-1)とインキュベートした細胞の代謝活性に有意な差がなかったことを示す。MTT(3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジ-フェニルテトラゾリウムブロミド)アッセイを48時間の時間にわたり行った。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。結果は、化合物Cove-1が有意な毒性を持たないことを示す。
【図２０】50μg/mlのカワラタケエタノール抽出物(R11PUB)が、T98G細胞浸潤性を低減したことを示す。マトリゲル浸潤チャンバーを使用して細胞浸潤性を検査した。膠芽腫細胞(T98G、脳細胞)をR11PUBで18時間処置し、さらに24時間、細胞をマトリクスに浸潤させた。浸潤した細胞の数を光学顕微鏡の下で数えた。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。**P＜0.01を統計的に有意であるとみなした。
【図２１】25および50μg/mlのカワラタケエタノール抽出物(R11PUB)が細胞浸潤性を低減したことを示す。マトリゲル浸潤チャンバーを使用して細胞浸潤性を検査した。膠芽腫細胞(T98G)、肺癌(A549)、および乳腺癌(MDA-MB-231)細胞をR11PUBで18時間処置した後、さらに24時間、細胞をマトリクスに浸潤させた。浸潤した細胞の数を光学顕微鏡の下で数えた。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。**P＜0.01を統計的に有意であるとみなした。
【図２２】25μg/mlの9-KODEメチルエステル(Cove-1)がT98G細胞浸潤性を低減したことを示す。マトリゲル浸潤チャンバーを使用して細胞浸潤性を検査した。膠芽腫細胞(T98G)をCove-1で18時間処置した後、さらに24時間、細胞をマトリクスに浸潤させた。浸潤した細胞の数を光学顕微鏡の下で数えた。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。**P＜0.01を統計的に有意であるとみなした。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明は、カワラタケから9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステル(9-KODEメチルエステル)を効率的かつ簡便に単離する方法を提供する。一態様において、本方法は、
カワラタケ抽出物を得る工程、および
該カワラタケ抽出物から9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステルを単離する工程
を含む。
【００１８】
一つの特定の態様において、カワラタケから9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステル(9-KODEメチルエステル)を単離する方法は、
(a)十分な量のカワラタケ原料を用意する工程、
(b)約15℃〜約30℃の温度にて極性溶媒で該カワラタケ原料を抽出して、カワラタケ抽出物および残留物を産生する工程、ここで、工程(b)は、一回または複数回行われる、
(c)該カワラタケ抽出物を回収する工程、ならびに
(d)該カワラタケ抽出物から9-KODEメチルエステルを単離する工程
を含む。
【００１９】
一態様において、上記方法の工程(b)において使用する溶媒は極性溶媒である。特定の態様において、溶媒はエタノール-水混合液である。特定の態様において、9-KODEメチルエステルは、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用してカワラタケ抽出物から単離される。
【００２０】
本発明はまた、カワラタケ抽出物を調製する効率的かつ簡便な方法を提供する。一つの好適な態様において、カワラタケ抽出物は、水、エタノール、またはエタノール-水の混合液を溶媒として使用して室温にて調製される。一態様において、カワラタケ抽出物をさらに蒸発させて固体または半固体組成物を生成することができる。
【００２１】
本発明はさらに、本抽出方法によって生成されたカワラタケ抽出物を提供する。また、治療上有効量の本カワラタケ抽出物、カワラタケから単離された生物学的に活性な化学成分（9-KODEメチルエステルなど）、および/または式Iの化合物、および任意で、薬学的に許容される担体を含む治療組成物または医薬組成物も提供する。また、本発明は、免疫反応の調節が有益となる疾患または病態を予防、治療、または改善する方法も提供する。一態様において、この方法は、そのような治療を必要とする対象に、本発明のカワラタケ抽出物を含む有効量の組成物ならびに複数の化合物および組成物を投与する工程を含む。
【００２２】
具体的には、本発明の組成物は、IFNβ生成の促進、ならびに/またはTNF-α、IL10および/もしくはMMP-3生成の低下が有益な疾患または病態を治療または改善するために使用できる。
【００２３】
好適な態様において、本発明を使用して多形性神経膠芽腫および/または上咽頭癌を治療することができる。別の態様において、本発明を使用して、細菌感染、ウイルス感染、および/または微生物感染を治療することができる。特定の態様において、本発明を使用して、癌または免疫不全患者においてよくみとめられるウイルス感染である水痘帯状疱疹、サイトメガロウイルス、およびヘルペスウイルス8感染を含むがこれらに限定されない感染を治療することができる。
【００２４】
カワラタケ抽出物および単離された化学成分
本発明の一局面は、カワラタケ抽出物を調製する方法を提供する。また、本方法を使用してカワラタケから生物学的に活性な化学成分を単離できる。また、本発明により調製したカワラタケ抽出物、ならびにカワラタケから単離された化合物および生物学的に活性な化学成分も提供する。
【００２５】
さらに、本発明はカワラタケから9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステル(9-KODEメチルエステル）を単離する方法を提供する。一態様において、本方法は、カワラタケ抽出物を得る工程、およびカワラタケ抽出物から9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステルを単離する工程を含む。
【００２６】
好適な態様において、本発明は、
(a)カワラタケの、十分な量の原料を用意する工程；
(b)カワラタケ抽出物および残留物を産生するために約15℃〜約30℃の温度にて溶媒でカワラタケの原料を抽出する工程、ここで、工程(b)は、一回または複数回行われる；
(c)カワラタケ抽出物を回収する工程；および任意で
(d）カワラタケ抽出物から生物学的に活性な化学成分を単離する工程
を含むか、これらの工程から本質的になるか、またはこれらの工程からなる、カワラタケ抽出物を調製する方法、および/またはカワラタケから生物学的に活性な化学成分（例えば9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステルなど）を単離する方法を提供する。
【００２７】
一態様において、上記の方法の工程(b）で用いた溶媒は、極性溶媒である。有利なことに、約15℃〜約30℃の温度で極性溶媒を使用することで、抗癌および/または抗ウイルス効果を有する1つ以上の生物学的に活性な低分子化学成分の抽出が容易になる。
【００２８】
一態様において、カワラタケから単離した生物学的に活性な化学成分は、9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステルである。一態様において、カワラタケ抽出物は、9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステルを含む。カワラタケの原料は乾燥および粉末粉砕されることが好ましい。カワラタケ抽出物は、多糖類クレスチン(PSK)等の多糖ペプチド(PSP)を含む生物学的に活性な化学成分を含むことが好ましい。原料はカワラタケ子実体であることが好ましい。
【００２９】
特定の態様において、カワラタケの調製に適した溶媒としては、アルコール(例えば、C1-C8アルコール(例えば、メタノール、エタノール、プロパノールおよびブタノール；C1-C8アルキルポリオール)；C1-C8ケトン(例えば、アセトン)またはアルキルケトン；クロロホルム；酢酸；水；ならびに塩酸等の無機酸が挙げられるがこれらに限定されない。
【００３０】
一態様において、本発明は、1:5〜1:20、好ましくは約1:10、1:12、または1:15のカワラタケ 対 溶媒比(v/v)を利用する。好適な態様において、本抽出手順は、水、アルコール(例えば、エタノール)、またはアルコール-水の混合液(例えば、エタノール-水)を溶媒として利用する。アルコール-水(例えば、エタノール-水)混合液は、約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％または95％のアルコール(例えば、エタノール)を含み得る。
【００３１】
具体的な態様において、溶媒は、12倍体積の95％エタノールを含む水-エタノール混合物である。抽出手順の工程(b)は室温で行うことが好ましい。工程(b)は室温より僅かに上下する温度においても行うことができる。一態様において、工程(b)は約15℃〜約30℃、約18℃〜約28℃、約20℃〜約28℃、または約22℃〜約26℃の温度で行う。特定の態様において、工程(b)は約25℃で行う。
【００３２】
一態様において、抽出手順の工程(b)の間、カワラタケの原料を好ましくは室温または室温未満の冷たい溶媒中で浸軟させる。一態様において、抽出手順の工程(b)の前および/または該工程中、溶媒もカワラタケの原料も、50℃を上回るかまたは45℃を上回る温度に煮沸または加熱されない。
【００３３】
一態様において、カワラタケの原料を溶媒と少なくとも約15分間混合して、生物学的に活性な化学成分を抽出する。抽出時間は少なくとも約20分間、30分間、40分間、50分間、1時間、1.5時間、2時間、2.5時間、3時間、4時間または5時間であることが好ましい。
【００３４】
抽出の工程(b)は連続的な超音波処理により行うことが好ましい。超音波処理は、場合によって、乾燥した医薬材料から化合物を抽出する際の効率を改善し、抽出時間を短くし得る方法である。このような向上の根本にあるメカニズムとしては、質量移動が強まり、溶媒が医薬材料の中により入り易くなることがある。従って、超音波処理は、従来の抽出技術に代わる迅速で、安価、かつ効率的な代替法であり、場合によっては、超臨界流体およびマイクロ波支援型抽出よりも優れている。
【００３５】
好適な態様において、工程(b)中、少なくとも約5分間、10分間、15分間、20分間、30分間、40分間、50分間、1時間、1.5時間、2時間、2.5時間、3時間、4時間または5時間の連続的な超音波処理によって、カワラタケの原料を溶媒と混合する。しかし、本発明者らによって、特定の場合においては、超音波処理が、医薬原料から溶媒に簡単に浸出し得る特定の化学成分の抽出収率を改善しないかもしれないことが分かっている。このような場合、超音波処理無しで、またはわずかな超音波処理で抽出手順を行うことが好ましい。
【００３６】
カワラタケ抽出物は、例えば、溶媒抽出物を含む液相から固相(例えば、残留物)を分離し易くする技術(遠心分離等)によって回収できる。例えば、濾過によって残留物を除去して抽出物を収集できる。一態様において、カワラタケ抽出物をさらに蒸発させて固体または半固体組成物を生成してもよい。別の態様において、カワラタケ抽出物は濃縮および/または精製してもよい。
【００３７】
カワラタケ抽出物および／または生物学的に活性な化学成分は、単回抽出または連続抽出を介して得ることができる。一態様において、一回目の抽出物を回収した後、残留物を同じ溶媒に再度溶解してさらに抽出してもよい。別の態様において、溶媒-抽出物または残留物を毎回異なる溶媒で抽出して所望の生物学的に活性な化学成分を抽出することによって、連続抽出によりカワラタケ抽出物および／または生物学的に活性な化学成分を得ることができる。
【００３８】
一態様において、本発明の抽出方法は、工程(a)〜(b)の後、第二のカワラタケ抽出物および第二の残留物を産生するために、加熱条件(約60℃以上の温度等)下でカワラタケ残留物を溶媒で抽出する工程、ならびに任意で、カワラタケ抽出物から生物学的に活性な化学成分を単離する工程をさらに含むか、該工程から本質的になるか、または該工程からなる。具体的な一態様において、極性溶媒を用いて加熱条件下でカワラタケ残留物を抽出する。
【００３９】
別の態様において、本発明の抽出方法は、工程(a)〜(b)の後、第二のカワラタケ抽出物および第二の残留物を産生するために、加熱条件(約60℃以上の温度等)下でカワラタケ残留物をアルカリ性水溶液(NaOHおよびKOH等)で抽出する工程、ならびに任意で、カワラタケ抽出物から生物学的に活性な化学成分を単離する工程をさらに含むか、該工程から本質的になるか、または該工程からなる。一態様において、アルカリ性水溶液は、0.1N、または0.1N未満の任意の値、例えば0.05N、0.02N、0.01Nまたは0.001N等の規定度を有する。
【００４０】
具体的な態様において、本発明の抽出方法は、
(a)カワラタケの、十分な量の原料を用意する工程；
(b)第一のカワラタケ抽出物および第一の残留物を産生するために、約15℃〜約30℃の温度にて該カワラタケの原料を第一の溶媒で抽出する工程；
(c)第二のカワラタケ抽出物および第二の残留物を産生するために、加熱条件(約60℃以上の温度等)下で該第一の残留物を第二の溶媒で抽出する工程；
(d)第三のカワラタケ抽出物および第三の残留物を産生するために、加熱条件(約60℃以上の温度等)下で該第二の残留物をアルカリ溶液で抽出する工程； 
(e)カワラタケ抽出物を回収する工程；ならびに任意で
(f）カワラタケ抽出物から生物学的に活性な化学成分を単離する工程
を含む。
【００４１】
具体的な一態様において、第一および第二の溶媒は、極性溶媒である。
【００４２】
別の具体的な態様において、本発明の抽出方法は、
(a)カワラタケの、十分な量の原料を用意する工程；
(b)第一のカワラタケ抽出物および第一の残留物を産生するために、加熱条件(約60℃以上の温度等)下で該カワラタケの原料を第一の極性溶媒で抽出する工程；
(c)第二のカワラタケ抽出物および第二の残留物を産生するために、加熱条件(約60℃以上の温度等)下で該第一の残留物をアルカリ性水溶液(NaOHおよびKOH等)で抽出する工程；
(d)カワラタケ抽出物を抽出する工程；ならびに任意で
(e）カワラタケ抽出物から生物学的に活性な化学成分を単離する工程
を含む。
【００４３】
一態様において、本発明の抽出方法は、
(a)カワラタケの、十分な量の原料を用意する工程；
(b)カワラタケ抽出物および残留物を産生するためにカワラタケの原料を極性溶媒で抽出して、カワラタケ抽出物を回収する工程、ここで、工程(b)は、一回または複数回行われる；
(c)水性抽出物を得るために該工程(b)で得た残留物をアルカリ性水溶液で抽出して、水性抽出物を回収する工程、ここで、工程(c)は、一回または複数回行われる；
(d)カワラタケ抽出物を得るために、該工程(b)および(c)から得た1つ以上の抽出物を混ぜ合わせる工程；ならびに任意で
(e）カワラタケ抽出物から生物学的に活性な化学成分を単離する工程
を含むか、それらの工程から本質的になるか、またはそれらの工程からなる。
【００４４】
特定の態様において、加熱条件下でカワラタケを抽出するために使用する極性溶媒は、C1-C8アルコール(例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、およびブタノール)を含む。特定の態様において、加熱条件下でカワラタケを抽出するために使用する極性溶媒はエタノールまたはエタノール-水混合液である。ある特定の態様において、加熱条件下でカワラタケを抽出するために使用する極性溶媒は水ではない。
【００４５】
本発明によれば、加熱は、60℃を上回る、65℃を上回る、70℃を上回る、75℃を上回る、80℃を上回る、85℃を上回る、90℃を上回る、95℃を上回る、または100℃を上回る温度にて行うことができる。
【００４６】
図1A〜Cは、本発明の抽出方法の好適な態様を図示する。
【００４７】
有利なことに、アルカリ溶液を溶媒として使用すると、多糖類クレスチン(PSK)等の多糖ペプチド(PSP)を含む生物学的に活性な高分子化学成分が抽出し易い。
【００４８】
さらなる態様において、カワラタケ粗抽出物を分画するかまたは分けて、所望の生物学的に活性な化学成分を含む1つ以上のフラクションを産生することができる。一態様において、カワラタケ粗抽出物を、水-アセトニトリルを移動相として使用するHPLCに供する。特定の態様において、水-アセトニトリルは、5：95、10：90、20：80、30：70、40：60、50：50、60：40、70：30、80：20、90：10、および95：5の水：アセトニトリルを含むがこれらに限定されない1:100〜100:1の水：アセトニトリルの任意の範囲内で提供される。具体的な態様において、カワラタケ粗抽出物を、表1に示す溶出パラメータを使用するHPLCに供して、図4に示す5つのフラクションを産生する。
【００４９】
さらなる態様において、本方法は、HPLCおよび/またはガスクロマトグラフィー質量分析法(GC-MS)の組合せを使用してカワラタケ抽出物についての化学的プロファイルを作成する工程を含む。一態様において、本方法は、抽出物をHPLCに供する工程、該抽出物を溶出する工程、およびHPLC後の抽出物についての化学的プロファイルを作成する工程を含む。別の態様において、本方法は、抽出物をガスクロマトグラフィー質量分析法に供する工程、および該抽出物についてのクロマトグラフィー/質量分析プロファイルを作成する工程を含む。
【００５０】
本発明は、本抽出方法によって生成したカワラタケ抽出物をさらに提供する。具体的な態様において、カワラタケ抽出物は、図2A、2B、2C、もしくは図4に示すフラクション1〜5のいずれかに示す高速液体クロマトグラフィー(HPLC)プロファイル；および/または図3Aもしくは3Bに示すガスクロマトグラフィー質量分析法(GC-MS)プロファイルを有する。
【００５１】
本明細書で使用する「から本質的になる」という用語は、本発明の範囲を、特定の工程、ならびに本発明の基本的および新規な特徴、すなわちカワラタケ抽出物を調製するおよび/またはカワラタケから生物学的に活性な化学成分を単離する方法に実質的に影響しない工程に限定する。例えば、「から本質的になる」を使用すると、カワラタケ抽出物の調製方法は、カワラタケを抽出するまたはそれに接触する工程のうち特定されていないあらゆる工程(例えば、特定されていない溶媒によりカワラタケを抽出するもしくはそれに接触させるような追加の工程、または特定する条件とは異なる条件下(例えば、温度)でカワラタケを抽出する工程)を含まない。また、「から本質的になる」という用語を使用することで、本プロセスは、カワラタケからの生物学的に活性な化学成分の抽出に実質的に影響しない工程(カワラタケ抽出物を収集または回収する工程、カワラタケ抽出物を濃縮する工程、複数のカワラタケ抽出物を単一の組成物に混ぜ合わす工程、カワラタケ抽出物を固体または半固体組成物に凍結乾燥または乾燥させる工程、カワラタケ抽出物を溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、煎じ薬、およびチンキ剤等の医薬組成物に製剤化する工程、カワラタケ抽出物を薬学的に許容される担体、賦形剤、香味料、緩衝剤、および/または乳化剤と混合する工程、ならびにカワラタケ抽出物を包装する工程を含む)を含み得る。
【００５２】
化合物
別の局面において、本発明は、9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステル(9-KODEメチルエステル)および関連する化合物に関する。一態様において、本発明による有用な化合物は式Iで表す化学構造を有する：
2015514129.tif 000004
式中
2015514129.tif 000005
は、二重結合または単結合であり；
R1は、H、OH、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基(例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、s-ブチルもしくはt-ブチル基)、またはORaであり、ここでRaは直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基であり；かつ
R2はH、O、または直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基であり；かつ
R3はH、OH、O、ハロ、直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基(例えば、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、s-ブチルもしくはt-ブチル基)、またはORaであり、ここでRaは直鎖もしくは分岐鎖C1〜C4アルキル基である。
【００５３】
一態様において、R2はOであり、R1は、OH、OCH3、またはOC2H5である。別の態様において、R3はOまたはOHである。
【００５４】
一態様において、式Iのアルキル基は置換されていても、または置換されていなくてもよい。
【００５５】
本明細書で使用する「アルキル」という用語は、炭素および水素を含む直線または分岐飽和一価ラジカルを指す。アルキル基の代表的な例としては、メチル、エチル、プロピル、2-プロピル、n-ブチル、イソ-ブチル、およびtert-ブチルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５６】
「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
【００５７】
「ヒドロキシ」という用語は、ラジカル-OHを意味する。
【００５８】
本明細書で使用する「置換された」という用語は、化合物の少なくとも1つの水素原子または化学部分が第二の化学部分で置き換えられていることを指す。置換基の限定するものではない例としては、本明細書に開示する例示の化合物および態様においてみとめられるもの、ならびにハロゲン；アルキル；アルケニル；アルキニル；ヒドロキシ；アルコキシル；アミノ；ハロアルキル(例えば、トリフルオロメチル)；および-COOHがある。特に明示しない限り本明細書に開示する全ての化学基が置換され得る。例えば、本明細書に記載する「置換された」アルキル、アルケニル、またはアルキニル部分は、ヒドロカルビル部分、ハロ、アルコキシ、および-COOH等の第二の化学部分で置換された部分である。置換されたアルキル基としては、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、カルボキシアルキル(carboxylalkyl)、およびアミノアルキルが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５９】
一態様において、本発明による有用な式Iの化合物は、以下の構造を有する9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステル(9-KODEメチルエステル)である。
2015514129.tif 000006
【００６０】
別の態様において、本発明による有用な式Iの化合物は9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸(9-KODE)である。
【００６１】
特定の態様において、本発明は、式Iで表す単離されたまたは実質的に純粋な化合物の使用に関する。本明細書において使用する「実質的に純粋」という用語は99％を上回る純度を指す。
【００６２】
有利なことに、式Iの化合物は、TNF-α誘導型マトリクスメタロプロテイナーゼ3(MMP3)発現を阻害し、癌または腫瘍細胞の成長、浸潤および/または転移を阻害するために使用できる。
【００６３】
本発明の化合物は、植物から単離され得るか、または当該分野で公知の方法を使用して合成され得る。Kuklevら(1997)およびAndreouら(2009)を参照のこと。
【００６４】
本明細書で使用する「単離された」とは、その中で自然に存在し得るあらゆる環境から取り出された化合物を指す。例えば、単離された化合物とは、化合物が単離され得る植物に存在する状態の化合物を指さない。好適な態様において、本発明の化合物は、少なくとも75％純粋、好ましくは少なくとも90％純粋、より好ましくは95％を上回って純粋、最も好ましくは99％を上回って純粋(実質的に純粋)である。
【００６５】
本発明はさらに、式(I)の化合物の立体異性体として具体化される。「立体異性体」という用語は、本明細書に開示する全ての鏡像異性的に/立体異性的に純粋な化合物、および鏡像異性的に/立体異性的に富んだ化合物を包含する。
【００６６】
一態様において、本発明は、式(I)の化合物の鏡像異性体に関する。本発明の化合物の鏡像異性体は、互いを実質的に含まない(すなわち、鏡像異性体過剰)。換言すると、化合物の「R」型は、化合物の「S」型を実質的に含まず、すなわち「S」型に対して鏡像異性体過剰の状態にある。逆に言えば、化合物の「S」型は、化合物の「R」型を実質的に含まず、すなわち「R」型に対して鏡像異性体過剰の状態にある。本発明の一態様において、鏡像異性化合物は少なくとも約80％の鏡像異性体過剰率を有する。好ましい態様において、化合物は少なくとも約90％の鏡像異性体過剰率を有する。より好ましい態様において、化合物は少なくとも約95％の鏡像異性体過剰率を有する。さらに好ましい態様において、化合物は少なくとも約97.5％の鏡像異性体過剰率を有する。最も好ましい態様において、化合物は少なくとも約99％の鏡像異性体過剰率を有する。
【００６７】
免疫応答の調節および癌の治療のための使用
本発明の別の局面は、免疫応答を調節および癌を治療するための、カワラタケ抽出物、カワラタケから単離した生物学的に活性な置換基(例えば、9-KODEメチルエステル)、ならびに/または式Iの化合物およびその塩、そして上記成分の一つ以上を含む治療組成物の治療的な使用を提供する。
【００６８】
有利なことに、本発明のカワラタケ抽出物および式Iの化合物は、保護的な免疫反応を刺激する一方で、疾患を生じ得る望ましくない免疫反応を抑制する。例えば、カワラタケ抽出物および式Iの化合物は、例えば、抗癌剤の投与に起因する免疫系機能の低下を回復または改善することができる。
【００６９】
別の態様において、カワラタケ抽出物および式Iの化合物は、ウイルス感染、細菌感染、および/または微生物感染から防御する保護的な免疫反応を刺激できる。
【００７０】
さらに、本発明のカワラタケ抽出物および式Iの化合物は、転移を促すために特定の腫瘍細胞によって利用されるTNF-αの生成およびそれによるメタロプロテイナーゼ生成の誘導等の望ましくない免疫反応を抑制できる。
【００７１】
特に、今回、本発明者らは、本発明のカワラタケ抽出物および式Iの化合物が、病原性感染および腫瘍発生に対する急性期免疫反応において重要な役割を果たす炎症性メディエータであるTNF-αの生成を低減することを発見した。TNF-αはまた、細胞外マトリックスタンパク質を分解するマトリックスメタロプロテイナーゼ(MMP)およびMMPファミリーメンバーの生成を誘導する。しかし、特定の腫瘍細胞(膠芽腫細胞、上咽頭癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、および結腸癌等)は、TNF-αの細胞傷害性作用に対する耐性を発達させている。その結果、これらの腫瘍細胞は、TNF-αによるMMPの誘導を利用して、近隣組織、および身体の遠位部分にある器官に浸潤する。
【００７２】
有利なことに、本発明のカワラタケ抽出物および式Iの化合物は、腫瘍細胞におけるTNF-α生成を阻害するため、TNF-αに対して耐性の悪性腫瘍細胞(膠芽腫細胞、上咽頭癌、乳癌、肺癌、前立腺癌細胞、および結腸癌等)の転移拡散の予防または低減のために特に有用である。
【００７３】
さらに、今回、本発明者らは、カワラタケが、炎症性サイトカインの発現を下方制御する抗炎症性サイトカインであるIL-10の生成を低減することを発見した。また、本発明者らによって、カワラタケが、病原性浸潤に対する急性期免疫反応を刺激するIFN-βの生成を向上することも発見されている。
【００７４】
一態様において、本発明は、免疫反応の調節が有益であり得る疾患または病態を予防、治療または改善する方法を提供する。この方法は、そのような治療を必要とする対象に、本発明のカワラタケ抽出物、カワラタケから単離された生物学的に活性な置換基(例えば、9-KODEメチルエステル)、および/または式Iの化合物を含む有効量の組成物を投与する工程を含む。
【００７５】
具体的には、本発明の組成物は、IFNβ生成の促進、ならびに/またはTNF-α、MMP3、および/もしくはIL-10の生成またはレベルの低減が有益であり得る疾患または病態を治療または改善するために使用できる。 
【００７６】
本明細書において使用される「対象」という用語は、本発明の組成物での治療を行うことができる霊長類等の哺乳動物を含む生物を表す。開示の治療方法によって益を得る哺乳動物種としては、類人猿、チンパンジー、オランウータン、ヒト、サル；イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ等の家畜；ならびにマウス、ラット、モルモット、およびハムスター等のその他の動物が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７７】
一態様において、対象は、本発明に従って治療され得る症状を患っていることが診断される。特定の態様において、治療を必要とする対象は、膠芽腫細胞、脳腫瘍、鼻咽頭癌、乳癌、白血病、リンパ腫、結腸癌、肝臓癌、腹部癌、食道癌、膀胱癌、肺癌、前立腺癌、および胃癌を含むがこれらに限定されない癌または腫瘍を患っていることが診断される。一態様において、治療を必要とする対象は転移性癌を患っている。一態様において、治療を必要とする対象は、ウイルス、細菌、および/または微生物感染している。
【００７８】
一態様において、本発明は、対象が本発明に従って治療され得る症状であるかを診断する工程を含む。
【００７９】
特定の態様において、本発明の化合物および組成物を使用して、良性および/または悪性腫瘍を治療できる。
【００８０】
本明細書で使用する「治療」という用語またはその文法的な変化形(例えば、治療する、治療している、および治療、等)としては、疾患の症状または病態を改善または軽減すること、進行、重症度、および/または病態の範囲を低下、抑制、阻害、少なくする、またはそれらに作用することが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８１】
本明細書で使用する「予防」という用語またはその文法的な変化形(例えば、予防する、予防している、および予防、等)としては、症状の発症の遅延、疾患の再発の予防、症候性発作の間の潜在期間を長くすること、またはそれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で使用する予防は、症状が完全に無くなることを必要としない。
【００８２】
本明細書で使用する「有効量」という用語は、疾患または病態を治療もしくは改善可能な量、または意図する治療効果をもたらすことが可能な量を指す。特定の態様において、有効量は、TNF-α、MMP3、および/またはIL-10の生成またはレベルの少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％の低下を可能にする。特定の態様において、有効量は、IFNβレベルまたは生成の少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、または100％の増加を可能にする。
【００８３】
一態様においては、本発明の化合物および組成物を使用して、神経膠芽腫、脳腫瘍、上咽頭癌、乳癌、白血病、リンパ腫、結腸癌、肝臓癌、胃がん、食道癌、膀胱癌、および胃癌を含むがこれらに限定されない癌または腫瘍を治療または改善することができる。好適な態様においては、本発明を使用して、腫瘍細胞、特にTNF-αの細胞傷害性作用に対して耐性になる腫瘍細胞の転移拡散を予防または軽減できる。具体的な態様においては、本発明を使用して、多形性神経膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、および/または上咽頭癌を治療することができる。さらに具体的な態様においては、本発明を使用して、多形性神経膠芽腫、乳癌、肺癌、前立腺癌、結腸癌、および/または上咽頭癌の転移拡散を予防または低減することができる。
【００８４】
一態様において、本発明を使用して、免疫系を強化、および/または免疫系機能を回復もしくは改善することができる。具体的な態様において、本発明の組成物を使用して、化学療法および/または放射線療法の免疫抑制効果を治療または改善することができる。一態様において、免疫系に対する化学治療剤の抑制効果に対抗するために、本発明の組成物は化学治療剤の投与の前、途中および/または後に投与される。
【００８５】
さらに、本発明の組成物を使用して、細菌、ウイルス、真菌、原虫、および/もしくは他の微生物による感染、または病原性の感染を予防、治療または改善することができる。有利なことに、本発明の組成物は、病原性感染に反応する免疫系機能を調節および/または強化する。
【００８６】
一態様において、本発明の組成物を使用して、例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、A型インフルエンザウイルス、B型インフルエンザウイルス、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、C型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス(HSV)、水痘帯状疱疹(帯状疱疹)、ヘルペスウイルス-8、サイトメガロウイルス、ヒトTリンパ球向性ウイルスI型(HTLV-1)、ウシ白血病ウイルス(BLV)、エプスタイン・バーウイルス、およびコロナウイルスによる感染等のウイルス感染を治療または改善することができる。
【００８７】
特定の態様においては、本発明の組成物を使用して、カンジダおよびアスペルギルス属による感染を含むがこれらに限定されない真菌感染；マイコバクテリア(結核菌(M. tuberculosis)等)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎レンサ球菌(Streptococcus pneumoniae)、大腸菌(Escherichii coli)、リステリア菌(Listeria monocytogenes)、およびアマゾンリーシュマニア(L.amazonensis)による感染を含むがこれらに限定されない細菌感染；ならびにニューモシスティス(Pneumocystis)およびトキソプラズマ(Toxoplasma)属による感染を含むがこれらに限定されない原虫感染を、治療または改善できる。
【００８８】
一態様において、本発明の組成物を使用して、肝機能障害、気道感染、および気管支炎を治療することができる。
【００８９】
治療組成物および製剤
本発明は、治療上有効量の本発明のカワラタケ抽出物、生物学的に活性な化学成分および／または化合物、および任意で薬学的に許容される担体を含む治療組成物または医薬組成物を提供する。また、本発明は、本発明によってカワラタケから単離された生物学的に活性な化合物または化学成分を含む治療組成物または医薬組成物も提供する。本発明はまた、本発明のカワラタケ抽出物を含む栄養補助食品、ならびに健康食品または飲料製剤も具体化する。
【００９０】
「担体」という用語は、化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。このような医薬担体は、水および油(鉱油等の石油、ピーナッツ油、ダイズ油、およびゴマ油等の植物油、動物油、または合成由来源の油のもの等)等の滅菌液体であり得る。生理食塩溶液、ならびに水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、特に注射可能溶液用の液体担体として採用できる。
【００９１】
適切な医薬賦形剤としては、デンプン、ブドウ糖、乳糖、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等が挙げられる。治療組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤、乳化剤、またはpH緩衝剤も含み得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、カプセル、顆粒、粉末、持続放出製剤等の形態を取り得る。組成物は、トリグリセリド等の従来の結合剤および担体と共に製剤化され得る。適切な医薬担体の例は、E.W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。患者に正確な投与を提供するために、このような組成物は、治療上有効量の治療組成物を適切な量の担体と共に含む。製剤は投与の様式に適したものであるべきである。
【００９２】
本発明の治療組成物または医薬組成物は、中性または塩の形態で製剤化され得る。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸、ナトリウム、カリウム、アンモニア、カルシウム、水酸化鉄等で形成される塩が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９３】
本発明は、本発明の医薬組成物の1つ以上の成分、例えば化合物、担体で満たされた1つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットも提供する。
【００９４】
本発明の組成物はまた、従来の漢方医薬実践に沿うように製剤化されてもよい。特定の疾患、病態、または障害の治療において効果的な製剤の組成および投与量は、標準的な臨床技術による疾患、病態、または障害の性質に依存する。
【００９５】
従来の漢方医薬は、処方量で、ヒトまたは動物に投与するのに適したあらゆる形態の薬物に容易に作ることができる。適切な形態としては、例えば、チンキ剤、煎じ薬、および乾燥抽出物が挙げられる。これらは経口的に摂取、静脈注射、または粘膜により適用され得る。活性成分は、カプセル、粉末、パレット(pallet)、トローチ、坐薬、経口溶液、低温殺菌胃腸懸濁注射剤、少量または大量の注射剤、凍結粉末注射剤、低温殺菌粉末注射剤等にも製剤化され得る。上記方法は全て、当業者に公知であり、文献に記載されており、植物薬の医師によって一般的に使用されている。
【００９６】
チンキ剤は、医薬原料(例えば、薬草および真菌)を、例えば、ワインまたは蒸留酒等のアルコール溶液に懸濁することによって調製される。懸濁期間の後、液体(アルコール溶液)は、例えば、一回にティースプーン一杯を、一日に二、三回投与され得る。
【００９７】
抽出物は、医薬原料の基本的成分の濃縮調製物である。典型的に、医薬原料(例えば、薬草および真菌)を、適切に選択した溶媒、典型的に水、エタノール/水混合液、メタノール、ブタノール、イソブタノール、アセトン、ヘキサン、石油エーテル、または他の有機溶媒に懸濁することにより、基本的成分が医薬原料から抽出される。抽出プロセスは、浸軟、パーコレーション、連続パーコレーション、向流抽出、ターボ抽出(turbo-extraction)、または二酸化炭素超臨界(温度/圧力)抽出の手段によってさらに容易にすることができる。薬草残屑を取り除くために濾過した後、抽出溶液をさらに蒸発させ、それによって濃縮して、軟抽出物(extractum spissum)、および/または最終的に、噴霧乾燥、真空炉乾燥、流動層乾燥、もしくは凍結乾燥によって乾燥抽出物(extractum siccum)を産生してもよい。軟抽出物または乾燥抽出物は、所望の濃度まで適切な液体にさらに溶解されて、投与されるか、または丸薬、カプセル、注射剤等の形態に加工され得る。
【００９８】
投与経路
本発明の化合物および組成物は、経口、吸入、または静脈内、皮下、局所、経皮、皮内、経粘膜、腹腔内、筋内、嚢内、眼窩内、心腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内の注射、点滴、ならびにエレクトロポレーションを含む非経口投与を含む標準的な経路によって、治療される対象に投与され、また、対象に(一時的または永久的に)挿入されるあらゆる医療機器または物体の構成要素として同時投与され得る。好適な態様において、本発明の化合物および組成物は経口投与によって対象に投与される。
【００９９】
特定の疾患、病態または障害の治療において有効な本発明の治療組成物または医薬組成物の量は、投与の経路、および疾患、病態または障害の重症度に依存し、医師の判断、および各患者の状況に応じて決定されるべきである。一般的に、投薬量は約0.001mg/kg〜約3g/kgにわたる。
【０１００】
例えば、適切な単位投薬量は、約0.01〜約500 mg、約0.01〜約400 mg、約0.01〜約300 mg、約0.01〜約200 mg、約0.01〜約100 mg、約0.01〜約50 mg、約0.01〜約30 mg、約0.01〜約20 mg、約0.01〜約10 mg、約0.01〜約5 mg、約0.01〜約3 mg、約0.01〜約1 mg、または約0.01〜約0.5 mgであり得る。このような単位用量は、一日に二回以上、例えば、一日に二、三回投与され得る。
【０１０１】
単回投薬量形態を生成するために担体材料と組み合わせられ得る活性成分の量は、病態の種類および治療される対象に応じて異なる。一般的に、治療組成物は、約5％〜約95％の活性成分(w/w)を含む。より具体的には、治療組成物は、約20％(w/w)〜約80％、または約30％〜約70％の活性成分(w/w)を含む。
【０１０２】
一旦、患者の病態が改善されたら、必要に応じて、維持用量が投与される。その後、改善された状態が保持されるレベルになるように、症状に比例して投薬量もしくは投与の頻度、または両方を少なくしてもよい。症状が所望のレベルまで軽減された際には、治療を停止する。しかし、疾患症状の再発の際には、患者は長期的に断続的な治療を必要とする場合がある。
【０１０３】
さらに、インビトロアッセイを任意で採用して、最適な投薬量範囲を特定する助けにすることができる。製剤において採用される正確な用量も、投与の経路、および疾患、病態、または障害の重症度に依存し、医師の判断および各患者の状況に応じて決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル検査系から導き出した用量応答曲線から推定され得る。
【０１０４】
材料および方法
バイオアッセイ用の細胞培養
初代ヒト血液マクロファージおよびヒト白血病単球リンパ腫細胞(U937)を、免疫系に対するカワラタケ抽出物の影響を検査するバイオアッセイに使用した。健康なドナーの血液サンプル(香港赤十字輸血サービス(Hong Kong Red Cross Blood Transfusion Service))からFicoll-Paque遠心分離によって血液単核細胞を単離し、以前に記載されている接着方法(adherence method)によって精製した(Yang et al. (2009); Cheng et al. (2009))。
【０１０５】
手短に述べると、血液サンプルを3000rpmにて15分間遠心分離し、血漿と細胞層とに分離した。細胞層を、1:1の比率でリン酸緩衝化生理食塩(PBS)で希釈した。希釈した細胞をゆっくりFicoll(GE Healthcare)上に重ね、2300rpmにて20分間遠心分離して、赤血球から単核細胞を分離させた。単核細胞層を取り除き、上清が透明になるまでRPMI1640培地(Gibco)で洗浄した。
【０１０６】
細胞ペレットを、5％自家血漿、1％ペニシリンおよびストレプトマイシン(Gibco)が補充されたRPMI1640に再懸濁した。懸濁液をペトリ皿に蒔き、37℃にて1時間インキュベートして単球接着させた。RPMI1640での洗浄、および一晩のインキュベーションの後、接着単球を、5mM EDTAを含有する冷たいRPMI1640で剥離させた。
【０１０７】
単球を、0.5×106細胞/ウェルの密度で24ウェル組織培養プレート上に播種し、5％自家血漿、1％ペニシリンおよびストレプトマイシンが補充されたRPMI1640とインキュベートした。本発明者らの以前の報告(Yang et al. (2009); Lee et al. (2009))に記載されているように、14日間のインビトロ培養後に分化マクロファージを得た。
【０１０８】
American Type Culture Collectionから得たマウスマクロファージ(RAW 264.7)およびヒト神経芽細胞(SKNSH)を培養で維持し、それぞれ一酸化窒素アッセイおよび単純ヘルペスウイルス感染アッセイに使用した。
【０１０９】
mRNAを分析するためのリアルタイム逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応
TRIzol試薬(Invitrogen)を製造元の指示書に従って使用して全RNA抽出を行った。全RNAをデオキシリボヌクレアーゼ(DNase)で処理した後、オリゴ(dT)プライマーを使用してSuperscript II逆転写酵素(Invitrogen)で逆転写した。本発明者らの以前の報告(Yang et al. (2009); Cheng et al. (2009); Law et al. (2009); Lee et al. (2009))に記載されているように、TaqMan遺伝子発現アッセイ(Applied Biosystems)を使用して、サイトカインのmRNAレベルをアッセイした。 
【０１１０】
サイトカインを分析するための酵素結合免疫吸着アッセイ
市販のアッセイキット(R & D Systems)を使用した酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により(Yang et al. (2009); Cheng et al. (2009); Law et al. (2009); Lee et al. (2009))、細胞培養上清中のサイトカインのタンパク質レベルを測定した。各サンプルを二重にアッセイした。
【０１１１】
カワラタケのエタノール(EtOH)抽出物の調製
薬草カワラタケの認証済みサンプルをPuraPharm International(香港、中国)から得た。4つのバッチのカワラタケ(R08PUB、R09PUB、R10PUBおよびR11PUB)を別々に12倍容量の95％EtOHに浸軟させた後、1時間の連続超音波、または室温にて24時間の浸軟により抽出した。抽出手順を二回繰り返した。抽出物を混ぜ合わせ、真空下で蒸発乾燥させた。
【０１１２】
R10PUB由来の化合物Cove-1の単離および同定
R10PUBをSep-Pak C18カートリッジ(Waters、Ireland)を使用して分離した。以下の溶媒系：すなわちACN/H2O(5：95)、ACN/H2O(10：90)、ACN/H2O(15：85) ACN/H2O(30：70) ACN/H2O(50：50) 、およびACN(100％)を使用してカラムから溶出させた。バイオアッセイ誘導型分画スキームを使用して、100％ACN(R10PUB-S6)で溶出した活性画分をSep-Pak C18カートリッジを用いてさらに分離した。以下の溶媒系：すなわちACN/H2O(50：50)、ACN/H2O(60：40)、ACN/H2O(70：30)、ACN/H2O(80：20)、ACN/H2O(90：10) 、およびACN(100％)を使用してカラムから溶出させた。80％ACN(R10PUB-S6-4)で溶出して得られた生物活性画分を、逆相5μm C18Eclipse(4.6×250 mm)カラムを備えたHPLCを用いて精製した。20％ACN〜90％ACNの勾配溶離を1.0 ml/分の流速で用いて化合物を溶出し、全ての測定を室温にて行った。210、254、および280 nmに設定したAgilent 1200シリーズの高速走査フォトダイオードアレイ検出器を用いてピーク検出を達成した。HPLCを用いた精製プロセスを繰り返して、95％を上回る純度の純粋化合物(化合物Cove-1)(3.3 mg)を得た。
【０１１３】
分子構造の構造解明
1D[1H(500 MHz)、13C(125 MHz) 、およびDept 135°]ならびに2D(1H-1H COSYおよびHSQC)を、Bruker 500MHz DRX NMR分光計で得た。メタノール-dに入った溶液についての内部標準(CH3)4Si(0 ppm)に対して化学シフトを参照した。HP-5MSカラム(30m×250μm×0.25μm)を備えたAgilent GC-質量分光計(GC：Agilent、7890A、MS：Agilent、5975C)でEI-MSを行った。1マイクロリットルのサンプルを注入した。担体ガスとしてヘリウムを1 ml/分の流量で用いた。炉温度を70℃で1分間開始した後、10℃/分の速度で280℃に上昇させ、3分間保持した。界面温度は250℃、イオン源温度は230℃、および電子衝突イオン化(EI)は200eVであった。50〜350の範囲の原子質量単位(amu)、25分間の実行時間で、質量スペクトルを分析した。G1701EAケムステーション(chemstation)(Agilent、Santa Clara、CA)を使用してMSデータ分析を行った。
【０１１４】
mRNAを分析するためのリアルタイム逆転写-ポリメラーゼ連鎖反応
膠芽腫細胞(T98G、脳細胞)を異なるバッチのカワラタケのエタノール抽出物または精製化合物で18時間前処置した後、組換えヒトTNF-α(10ng/ml)でさらに3時間処置した。全RNA抽出を、TRIzol試薬(Invitrogen)で製造元の指示書に従って行った。全RNAを、オリゴ(dT)プライマーを使用してSuperscript II逆転写酵素(Invitrogen)で逆転写した。MMP-3 mRNAレベルをTaqMan遺伝子発現アッセイ(Applied Biosystems)で分析した。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。*P＜O.05または**P＜0.01を統計的に有意であるとみなした。
【０１１５】
MMP-3を分析するための酵素結合免疫吸着アッセイ
T98G細胞を、異なるバッチのカワラタケエタノール抽出物で18時間、前処置した後、組換えヒトTNF-α(10ng/ml)でさらに24時間処置した。細胞培養物上清中のMMP-3のタンパク質レベルを、市販のアッセイキット(R & D Systems)を用いた酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により分析した。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。*P＜O.05または**P＜0.01を統計的に有意であるとみなした。
【０１１６】
MTTアッセイ
T98G細胞を異なるバッチのカワラタケのエタノール抽出物または精製化合物と48時間インキュベートした。処置後、MTT(3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジ-フェニルテトラゾリウムブロミド)(Sigma)を1 mg/mlの最終濃度で培地に添加した後、37℃にて2時間のインキュベーションを行った。次に、形成したMTTホルマザンを200μlのイソプロパノールに溶解させ、上清の吸光度を570 nmにて96-ウェルマイクロプレートリーダーを使用して測定した。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。
【０１１７】
腫瘍細胞浸潤アッセイ
BD BioCoat(商標)マトリゲル(商標)浸潤チャンバー(BD Biosciences)を使用して細胞浸潤性を検査した。1％FBS、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、および1％ピルビン酸ナトリウムを含有するMEMに懸濁したT98G細胞を、各チャンバーに入ったゲルの上に一晩播種した。重炭酸ベースの培養培地をプレートの底ウェルに添加した。インキュベーションの後、細胞をカワラタケのエタノール抽出物/Cove-1で18時間処置した。次に、チャンバーを、各ウェルが10％FBSを補充したMEMを含む新しいプレートに移した。37℃にてさらに24時間、細胞をマトリクスに浸潤させた。浸潤アッセイの後、チャンバーの底面上にある浸潤した細胞を、100％メタノールで2分間固定し、クリスタルバイオレットで染色した。浸潤した細胞の数を光学顕微鏡の下で数えた。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。**P＜0.01を統計的に有意であるとみなした。
【実施例】
【０１１８】
以下は、本発明を実施するための態様を例示する実施例である。これらの実施例は、限定するものと解釈されるべきではない。すべての溶媒混合物の比率は、そうではないと注記されていない限り、体積で表される。
【０１１９】
実施例1 - カワラタケ抽出物の調製
本実施例は、カワラタケ抽出物を調製するための好ましい抽出スキームを例示する。
【０１２０】
図1Aは、抽出スキームの一態様を示す。手短に述べると、カワラタケの原料を12倍量のEtOH中で浸軟させ、室温にて連続的な超音波処理で1時間抽出し、遠心分離して、エタノール抽出物および残留物を産生した。残留物を10倍量のEtOH中で浸軟させ、図1Aに示すように抽出手順を二回繰り返した。抽出物を収集し、混ぜ合わせ、真空下で蒸発乾燥させて、カワラタケ抽出物を含む顆粒を生成した。
【０１２１】
一態様では、カワラタケの原料をエタノール中で18時間浸軟させ、遠心分離してエタノール抽出物および残留物を産生した。
【０１２２】
一態様では、ミリQ水を、カワラタケ抽出物を調製するための溶媒として使用した。手短に述べると、カワラタケの原料を15倍量のミリQ水中で浸軟させ、室温にて連続的な超音波処理で30分間抽出し、遠心分離して、水抽出物および残留物を産生した。残留物を10倍量の水に再度溶解し、抽出手順を二回繰り返した。水抽出物を収集し、混ぜ合わせ、真空下で蒸発乾燥させて、カワラタケ水抽出物を含む顆粒を生成した。
【０１２３】
PSK等の多糖ペプチド(PSP)を含む生物活性高分子、およびその他の生物活性低分子を抽出し易くするために、カワラタケの原料またはカワラタケ残留物をさらにアルカリ溶液(例えば、NaOH、KOH)で抽出した。
【０１２４】
図1Bは、抽出スキームの別態様を示す。手短に述べると、カワラタケの原料を、連続的な超音波処理を行いながら、室温にて12倍量のエタノール中で1時間浸軟させた。遠心分離後、第一の抽出物および第一の残留物を得た。この手順を二回繰り返した。第一の残留物を、室温にて10倍量の50％エタノール中で2時間浸軟させた。その後、エタノール中で浸軟させた残留物をさらに2時間煮沸した。不溶性物質を濾過により上清から分離して、第二の残留物および第二の抽出物を得た。第二の残留物を10×0.04％NaOHに加え、6時間煮沸した。不溶性物質を濾過により上清から分離して、第三の残留物および第三の抽出物を得た。抽出物を収集し、混ぜ合わせ、凍結乾燥させた。
【０１２５】
図1Cは、抽出スキームの別態様を示す。手短に述べると、室温にてカワラタケの原料を10倍の50％エタノール中で2時間浸軟させた。エタノール中で浸軟させたカワラタケ原料をさらに2時間煮沸した。不溶性物質を濾過により上清から分離して、第一の残留物および第一の抽出物を得た。第一の残留物を10×0.04％NaOHに加え、さらに6時間煮沸した。不溶性物質を濾過により上清から分離して、第二の残留物および第二の抽出物を得た。抽出物を収集し、混ぜ合わせ、凍結乾燥させた。
【０１２６】
実施例2 - カワラタケ抽出物の高速液体クロマトグラフィー分析
本実施例では、カワラタケ抽出物の化学フィンガープリントを高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって分析する。図1A、1Bに示す抽出スキームを使用するか、またはカワラタケの原料をエタノール中で18時間浸軟させて、カワラタケ抽出物を得た。
【０１２７】
手短に述べると、PDA検出器(G1315C)およびオートサンプラー(G1367C)を備えたAgilent 1200シリーズHPLC系(バイナリーポンプSL、G1312B)を使用して、100 ug/uLのEtOH抽出物を高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析に供した。クロマトグラフィーカラム(4.6×250 mm)にはODS結合シリカゲル(Lichrospher 100 RP C18、EC 5um)をパックし、分離の間はカラム温度を室温に維持した。
【０１２８】
5 mlのカワラタケ抽出物をHPLC系に注入した。1.0 ml/分の流速で水およびアセトニトリルの混合液を移動相として使用してHPLCを行った。表1に示すように勾配溶出方法論を採用した。210、254、および280 nmにセットしたAgilent 1200シリーズ高速走査フォトダイオードアレイ検出器を用いてピーク検出を達成した。図2A〜Cは、HPLC後のカワラタケエタノール抽出物の化学的プロファイルを示す。
【０１２９】
（表1）図1Aおよび1Bの抽出スキームを使用して得たカワラタケ抽出物のフィンガープリント分析に適用したHPLC勾配溶出プロファイル
2015514129.tif 000007
【０１３０】
実施例3 - カワラタケ抽出物のガスクロマトグラフィー質量分析法
本実施例では、ガスクロマトグラフィー質量分析法(GC-MS)によりカワラタケ抽出物の化学フィンガープリントをさらに分析する。図1Aに示す抽出スキームを使用するか、またはカワラタケの原料をエタノール中で18時間浸軟させて、カワラタケ抽出物を得た。 
【０１３１】
GC-MSによる分析の前に、カワラタケ抽出物をシリル化に供した。簡単に言うと、100 ulの抽出物(30 ug/μL)含有アセトニトリルを1 ml反応バイアル(Alltech)に移した後、50 ulのピリジン、および幅広い極性化合物と反応する50 ulの誘導化剤BSTFA[N,O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド]を加えて、極性化合物の不安定水素原子を-Si(CH3)3基で置き換えた。70℃にて2時間のインキュベーションの後、GC-MS分析のための混合液が準備できた。
【０１３２】
混合液を、(GC: Agilent、7890A；MS: Agilent、5975C)およびHP-5MSカラム(30m×250um×0.25um)を使用してGC-MSで分析した。1:50の分割比を有するヘリウムを担体ガスとして使用し、1 ulヘリウムを1 ml/分の流量でカラムに注入した。初期オーブン温度は70℃であり、これを1分間維持し、10℃/分の速度で180℃まで上げ、180℃で2分間維持し、10℃/分の速度で280℃まで上げ、280℃で3分間維持した。注入装置の温度は275℃、界面温度は250℃、イオン源温度は230℃で、電子衝突イオン化(EI)を200eVで行った。50〜700原子質量単位(amu)の範囲において、22分間の実行時間で質量スペクトルを分析し、Agilent G1701EAケムステーション(chemstation)を使用してデータを処理した。図3は、GC-MS分析後のカワラタケエタノール抽出物のクロマトグラフィープロファイルを示す。
【０１３３】
実施例4 - カワラタケ抽出物の分画
図1Aに示す抽出スキームを使用して得たカワラタケエタノール抽出物(MPUB-EtOH)を、1525 HPLCバイナリーポンプ、2998フォトダイオードアレイ検出器、およびWatersフラクションコレクターIIIを備えたWaters分取液体クロマトグラフィー系を使用して、さらに5つのフラクションに分けた(図4)。分画は、逆相カラム(Lichrospher 100 RP C18、EC 5um)を使用して行い、検出波長は210、254、および280 nmにセットした。勾配プログラムは、以下のように2つの溶媒、(A)水および(B)アセトニトリルで、1 ml/分の流速で構成した:0〜16分間、10〜90％B、16〜18分間、90％B、および18〜22分間、10％B。
【０１３４】
実施例5 - サイトカイン生成に対するカワラタケ抽出物の影響
IFNβおよびIL-10生成に対するカワラタケ抽出物(MPUB-EtOH)の影響を調べるために、初代ヒト血液マクロファージを50ug/mlのMPUB-EtOHで18時間前処理した。その後、細胞をポリイノシン-ポリシチジル酸(ポリI:C)(50ug/ml)で3時間処理した。IFNβmRNAおよびIL-10 mRNAレベルをTaqMan遺伝子発現アッセイで分析した。図5A〜Bに示すように、カワラタケ抽出物は、IFNβ生成を増加し、IL-10生成を阻害した。
【０１３５】
LPS誘導型TNFα生成に対するカワラタケ抽出物(MPUB-EtOH)の影響を調べるために、初代ヒト血液マクロファージを様々な濃度(1、10および50ug/ml)のMPUB-EtOHで18時間前処理した。次いで、細胞をリポ多糖類(LPS)(lng/ml)で3および24時間処理した。TNFαmRNAレベルおよびタンパク質レベルを、それぞれTaqMan遺伝子発現アッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)により分析した。図6A〜Bに示すように、カワラタケ抽出物はTNFα生成を用量依存的に低減した。
【０１３６】
LPS誘導型亜硝酸塩の生成に対するカワラタケ抽出物(MPUB-EtOH)の影響を調べるために、マウスマクロファージ(RAW 264.7)を様々な濃度(20、50および100ug/ml)のMPUB-EtOHで24時間前処理した。次いで、細胞をLPS(100ng/ml)で18時間処理し、亜硝酸塩濃度(uM)をグリース試薬で測定した。図7に示すように、カワラタケ抽出物は、用量依存的に亜硝酸塩の生成を阻害した。
【０１３７】
実施例6 - カワラタケ抽出物の抗ウイルス効果の決定
カワラタケ抽出物の抗ウイルス効果を調べるために、ヒト神経細胞(SKNSH)を10ug/mlのMPUB-EtOHで18時間前処理した。培養上清は連続インキュベーションのために取っておいた。その後、細胞を単純ヘルペスウイルス(HSV)に0.01のm.o.i.(multiplicity of infection：感染多重度)で1時間感染させた。ウイルス感染後、細胞をPBSで二回洗浄し、取っておいた培養上清とさらに18時間インキュベートした。ウイルス価を決定するために培養上清を収集し、T98G(ヒト膠芽腫細胞系統)細胞の感染の間の組織培養感染量50(TCID50)を滴定することにより測定した。
【０１３８】
実施例4に記載したように、MPUB-EtOHをさらに5つのフラクションに分画した。SKNSH細胞をMPUB-EtOH-1、-2、および-3で前処理し、上述したようにHSVウイルスに感染させた。培養上清のウイルス価(TCID50)を測定した。MPUB-EtOH-4および-5は、細胞に対して細胞傷害性であったため(データは示していない)、抗ウイルス効果についてそれ以上調べなかった。図8Aおよび8Cに示す全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。<0.001(**)のp値を統計的に有意であるとみなした。
【０１３９】
図8に示すように、カワラタケ抽出物は培養上清においてウイルス価を有意に低減し、フラクション3が最も強力な抗ウイルス効果を示した(図8Bおよび8C)。
【０１４０】
実施例7 - MMP-3発現に対するカワラタケ抽出物の影響
本実施例は、カワラタケ抽出物がMMP-3 発現を低減することを示す(図9)。手短に述べると、膠芽腫細胞(T98G、脳細胞)を、異なる濃度(1、10および50ug/ml)のMPUB-EtOHで18時間、次いで組換えヒトTNFα(10ng/ml)で3時間前処理した。MMP-3mRNAレベルをTaqMan遺伝子発現アッセイで分析した。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。<0.05(*)のp値を統計的に有意であるとみなした。
【０１４１】
実施例8 - カワラタケ抽出物のインビボでの抗ウイルス効果の判定
カワラタケ抽出物のインビボでの抗ウイルス効果を調べるために、3週齢のオスBALB/cマウス(1グループ当たり15匹のマウス)に、ジメチルスルホキシド(DMSO)(MPUB-EtOH用の溶媒)またはMPUB-EtOH(250mg/kg)を、一日一回、24時間の間隔で、7日間腹腔内(ip)投与した。
【０１４２】
手短に述べると、0日目に、1×105TCID50/mlでHSVを腹腔内接種して、マウスを感染させた。感染の1時間後から開始して、DMSO、MPUB-EtOH、またはアシクロビル(l0mg/kg)を、一日に一回、24時間の間隔で、5日間、腹腔内投与した。マウスを毎日調査し、以下の採点システムに基づいて後肢麻痺によって疾患重症度を測定した: 0、麻痺無し；1、後肢を動かすのが明らかに困難；2、一本の後肢が不完全麻痺；3、一本の後肢が完全麻痺；4、両方の後肢が不完全麻痺；5、両方の後肢が完全麻痺。図10に示すように、カワラタケ抽出物(MPUB-EtOH)は、マウスにおけるHSV感染の重症度を、DMSO処置した対照と比べて有意に低減した。カワラタケ抽出物の抗ウイルス効果は、アシクロビルの抗ウイルス効果に匹敵した。
【０１４３】
実施例9-MMP-3発現に対するカワラタケ抽出物および9-KODEメチルエステルの影響
本実施例は、カワラタケのエタノール抽出物、および9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステル(9-KODEメチルエステル)がTNF-α誘導型マトリクスメタロプロテイナーゼ3(MMP3)発現を阻害し、腫瘍転移を阻害または低減するために使用できることを示す。
【０１４４】
図11および12に示すように、カワラタケ(PUB)抽出物は、TNF-α誘導型MMP3発現、およびヒト神経膠腫T98G細胞の移動を調節する。異なるバッチの50μg/mlのカワラタケエタノール抽出物(R08PUB、R09PUB、R10PUB、およびR11PUB)は、TNF-α誘導型MMP-3 mRNAおよびタンパク質発現の両方を抑制した(図11および12)。特に、50μg/mlのR11PUBエタノール抽出物はT98G細胞浸潤性を低減した(図20)。
【０１４５】
9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステル(9-KODEメチルエステル；本明細書において「Cove-1」とも称する)をカワラタケから単離する(図13〜15)。図16および17に示すように、9-KODEメチルエステルは、TNF-α誘導型マトリクスメタロプロテイナーゼ3発現、およびヒト神経膠腫T98G細胞の移動を調節する。特に、10、25、および50μg/mlの9-KODEメチルエステルは、TNF-α誘導型MMP-3 mRNAおよびタンパク質発現の両方を抑制した(図16および17)。
【０１４６】
さらに、結果は、異なるバッチのカワラタケエタノール抽出物または9-KODEメチルエステルが、細胞毒性をほとんど持たないことを示す(図18および19)。
【０１４７】
実施例10-癌細胞の浸潤性の低減に対するカワラタケ抽出物および9-KODEメチルエステルの影響
本実施例は、カワラタケのエタノール抽出物(R11PUB)が、T98G細胞、A549細胞、およびMDA-MB-231細胞を含む癌細胞の浸潤性を、用量依存的に低減したことを示す(図21)。
【０１４８】
特に、癌細胞浸潤性に対するカワラタケの影響を、マトリゲル浸潤チャンバーを用いて検査した。膠芽腫細胞(T98G)、肺癌(A549)、および乳腺癌(MDA-MB-231)細胞を、1バッチのカワラタケのエタノール抽出物(R11PUB)で18時間処置した後、さらに24時間、細胞をマトリクスに浸潤させた。浸潤した細胞の数を光学顕微鏡の下で数えた。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。**P＜0.01を統計的に有意であるとみなした。図21に示すように、25および50μg/mlのカワラタケエタノール抽出物(R11PUB)は細胞浸潤性を低減した。
【０１４９】
さらに、9-オキソ-10E,12E-オクタデカジエン酸メチルエステル(9-KODEメチルエステル；本明細書において「Cove-1」とも称する)(25μg/ml)は、T98Gの浸潤性を有意に低減した(図22)。
【０１５０】
特に、細胞浸潤性に対する9-KODEメチルエステルの影響を、マトリゲル浸潤チャンバーを用いて検査した。膠芽腫細胞(T98G)を9-KODEメチルエステルで18時間処置した後、さらに24時間、細胞をマトリクスに浸潤させた。浸潤した細胞の数を光学顕微鏡の下で数えた。全てのデータは、少なくとも3つの独立した実験の平均値±SDとしてプロットした。**P＜0.01を統計的に有意であると考慮した。図22に示すように、25μg/mlの9-KODEメチルエステルはT98G細胞浸潤性を低減した。
【０１５１】
本明細書で引用する文献、特許出願および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献を個別かつ具体的に参照により組み込むと表記したのと等しく、本明細書において全体が記載されるのと同じ意味合いで、参照により本明細書に組み込む。
【０１５２】
本発明を説明する上で、単数形および定冠詞、ならびに同様の指示語は、本明細書において特に表示されない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を含むと解釈される。
【０１５３】
本明細書における値の範囲の列挙は、特に指定のない限り、その範囲内に当てはまる異なる値を個別に参照する簡易な方法の役割を果たしていることを意図しているに過ぎず、各個別の値は、本明細書に個別に列挙されるのと同等の意味で明細書に組み入れられる。特に明記しない限り、本明細書で提示する全ての厳密な値は対応する近似値を代表するものである(例えば、特定の因子または測定値に関して提示する例示としての厳密な値は全て、適切な場合には「約」で修飾されて、対応する近似測定値も提示すると考えられ得る)。
【０１５４】
本明細書で提示する実施例または例示の文体(例えば、「等」)の使用はどれも、本発明をより良く理解しやすくするために意図しているに過ぎず、特に記述しない限り本発明の範囲を限定することを提起するものではない。明細書のいずれの文体も、そのように明確に記述しない限り、どの構成要素もが本発明の実施のために必須であることを示すと解釈されるべきではない。 
【０１５５】
一つまたは複数の構成要素に関して「含む(comprising)」、「有する(having)」、「含む(including)」、または「含む(containing)」等の用語を使用する、本明細書における本発明のあらゆる局面または態様の記載は、特に記述しない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、その特定の一つまたは複数の構成要素「からなる」か、「から本質的になる」か、または「実質的に含む」本発明の類似の局面または態様について示唆することを意図している(例えば、特定の構成要素を含む本明細書に記載の組成物は、特に記述しない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、その構成要素からなる組成物も記載していると理解されるべきである)。
【０１５６】
本明細書に記載の実施例および態様は例示の目的のためのみであり、それらを考慮した様々な改変および変更が当業者に示唆され、本出願の精神および範囲に含まれることが理解されるべきである。
【０１５７】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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