(57)【要約】  治療有効量のシアリダーゼ活性を有するタンパク質を含む組成物を患者の気道に投与することにより免疫不全患者のパラインフルエンザ又はインフルエンザウイルス感染を低減又は処置する方法。【選択図】図２１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者を処置する方法であって、治療有効量のシアリダーゼ活性を有するポリペプチドを含む液体組成物を前記患者の気道に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記患者が、インフルエンザウイルス又はパラインフルエンザウイルスに感染している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記患者が呼吸機能低下を患っている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記液体組成物が水性組成物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記患者の呼吸機能が、ドライパウダー吸入器の使用に不適当である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記液体が、ネブライザー、気化器、気管内チューブ、鼻腔スプレー、加圧噴霧式定量吸入器、又は呼吸作動式（ｂｒｅａｔｈ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ）加圧噴霧式定量吸入器を用いて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記液体組成物中のポリペプチドの濃度が０．１〜１０．０ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記液体組成物中のポリペプチドの濃度が０．５〜２．０ｍｇ／ｍＬである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、配列番号１と少なくとも９０％同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質が、配列番号１又は２を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
１回の投薬で０．００１〜５ｍｇ／ｋｇの前記ポリペプチドが前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
０．１〜１００ｍｇの前記ペプチドが３０日間又はそれ未満にわたり前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記投与が、１〜３０日間毎日なされる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
１日に０．１〜１０ｍｇのポリペプチドが投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
１日に有効用量０．１〜１０ｍｇのポリペプチドが投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与が、１〜１０ミクロンのＭＭＡＤを有する液体組成物のエアゾール粒子を投与することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記患者が、呼吸補助を必要とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記患者が、挿管される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
免疫不全患者のパラインフルエンザ又はインフルエンザウイルス感染を低減又は処置する方法であって、治療有効量のシアリダーゼ活性を有するタンパク質を含む組成物を前記患者の気道に投与することを含む方法。
【請求項２０】
パラインフルエンザ又はインフルエンザウイルスの感染のリスクがある免疫不全患者を処置する方法であって、治療有効量のシアリダーゼ活性を有するタンパク質を前記患者の気道に投与することを含む方法。
【請求項２１】
前記免疫不全患者が、原発性免疫不全症を患っている、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫不全患者が、続発性免疫不全症を患っている、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫不全患者が、免疫抑制療法で処置されている又はされたことがある、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記免疫不全患者が、化学療法剤で処置されている又はされたことがある、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫不全患者が、移植患者である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記タンパク質が、配列番号１と少なくとも９０％同一である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項２７】
前記タンパク質が、配列番号１又は２を含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、１又は複数の追加的化合物を含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記投与が、鼻腔スプレーの使用によるものである、請求項１９〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記投与が、吸入器の使用によるものである、請求項１９〜２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質が、シアリダーゼ又はその活性部分を含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記シアリダーゼ又はその活性部分が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓシアリダーゼ若しくはその触媒ドメイン、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ若しくはその触媒ドメイン、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ若しくはその触媒ドメイン、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ若しくはその触媒ドメインヒトＮｅｕ２シアリダーゼ若しくはその触媒ドメイン、又はヒトＮｅｕ４シアリダーゼ若しくはその触媒ドメインと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記シアリダーゼ又はその活性部分が、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ又はその触媒ドメインと少なくとも９０％同一である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ペプチドが、アンカリングドメインを含み、前記アンカリングドメインが、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合ドメインである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＧＡＧ結合ドメインが、ヒト血小板因子４のＧＡＧ結合ドメイン、ヒトインターロイキン８のＧＡＧ結合ドメイン、ヒトアンチトロンビンＩＩＩのＧＡＧ結合ドメイン、ヒトアポタンパク質ＥのＧＡＧ結合ドメイン、ヒト血管関連遊走タンパク質のＧＡＧ結合ドメイン、又はヒトアンフィレギュリンのＧＡＧ結合ドメインと少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記投与が、ネブライザー、気化器、気管内チューブ、鼻腔スプレー、ドライパウダー吸入器、加圧噴霧式定量吸入器、又は呼吸作動式加圧噴霧式定量吸入器による、請求項１９〜２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物が液体の形態である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項３８】
前記組成物がドライパウダーの形態である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項３９】
ＰＩＶ感染を患っている患者のＰＩＶウイルス量を減少させる方法であって、前記患者にＤＡＳ１８１を含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項４０】
前記組成物が、前記患者の気道に投与される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物が、ネブライザー又はドライパウダー吸入器を用いて投与される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記患者が免疫不全である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
ＰＩＶ感染を患っている患者の肺機能を向上させる方法であって、前記患者にＤＡＳ１８１を含む組成物を投与することを含む方法。
【請求項４４】
前記組成物が、前記患者の気道に投与される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記組成物が、ネブライザー又はドライパウダー吸入器を用いて投与される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記患者が免疫不全である、請求項４３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景技術
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）は呼吸器疾患の一般的な原因である。４種類のヒトＰＩＶの臨床的及び疫学的特徴は異なる。ＰＩＶ−１及びＰＩＶ−２感染症は、喉頭気管気管支炎又は声帯並びに上気道及び中気道のその他の部分の周辺の膨張に関連している。ＰＩＶ−３はしばしば細気管支炎及び肺炎に関連している。ＰＩＶ−４は一般的に、他の種類のヒトＰＩＶより症状が穏やかである。
【０００２】
インフルエンザウイルス（ＩＦＶ）は、主に鼻、咽喉、気管支、及び肺に影響する感染症を引き起こすことがある。感染症は、高熱、筋肉痛、頭痛、及び重度の倦怠感の突然の発生、乾性咳嗽、咽喉痛、並びに鼻炎を特徴とする。一部のインフルエンザウイルスは、感染した人が咳又はくしゃみをした時に生成する液滴及び小粒子を介して人から人へ容易に伝染する。ほとんどの感染者は医学的処置を必要とせずに１〜２週間以内に回復する。しかし、非常に若い人、高齢者、及び他の重篤な医学的状態を有する人では、感染症は、基礎となる状態の重篤な合併症、肺炎、及び死亡につながり得る。更に、インフルエンザウイルスの特定の株及び種類は健康な成人でも重篤な病気を引き起こし得る。
【０００３】
ドライパウダー吸入器は気道、例えば肺への薬物投与に一般的に用いられる。しかし、一部の患者、例えば子供、特に５歳未満の子供、高齢者、免疫不全患者、及び重篤な病人には、ドライパウダー吸入器は効率的に用いることが難しいことがある。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、シアリダーゼ活性を有するタンパク質、例えば融合タンパク質（例えば、ＤＡＳ１８１）の液体（例えば、噴霧化）製剤を用いて患者を処置する方法及び製剤に関する。この方法及び製剤は、ＰＩＶ又はインフルエンザウイルス（ＩＦＶ）に感染した患者を処置するために用いることができる。本発明は更に、シアリダーゼ活性を有するタンパク質、例えば融合タンパク質（例えば、ＤＡＳ１８１）を用いて免疫不全患者のＰＩＶ感染を処置する方法に関する。そのような免疫不全患者は、乾燥製剤又は液体（例えば、噴霧化）製剤で処置することができる。
【０００５】
シアルジアーゼ活性を有する有用なタンパク質には、シアリダーゼを呼吸上皮にアンカリングするアンフィレギュリングリコサミノグリカン結合配列と融合したシアリダーゼ機能性ドメインからなる４６−ｋＤａ組換え融合タンパク質であるＤＡＳ１８１が含まれる。ＤＡＳ１８１は、宿主細胞表面からシアル酸（ＳＡ）を切断することにより、ＰＩＶ及びＩＦＶの両方に認識される宿主細胞受容体を不活性化し、これにより、宿主細胞をＰＩＶ及びＩＦＶ感染に対して抵抗性にし得る。
【０００６】
本発明は、患者のＰＩＶ又はＩＦＶ感染を処置する方法であって、シアリダーゼ活性を有するタンパク質を含む治療有効量の液体組成物（例えば、噴霧化組成物）を含む組成物を患者の気道に投与することを含む方法に関する。本発明は更に、ＰＩＶ又はＩＦＶ感染のリスクがある対象を処置する方法であって、シアリダーゼ活性を有するタンパク質を含む液体組成物（例えば、噴霧化組成物）又はドライパウダー製剤を含む組成物（例えば、治療有効量の組成物）を対象の気道に投与することを含む方法に関する。種々のケースで、患者は免疫不全患者であり；患者は原発性免疫不全症に罹患しており；免疫不全患者は続発性免疫不全症に罹患しており；免疫不全患者は免疫抑制療法で処置を受けている又は受けたことがあり；免疫不全患者は化学療法剤での処置を受けている又は受けたことがあり；免疫不全患者は移植患者であり；タンパク質は、配列番号１又は２と少なくとも９０％（９５％、９８％）同一であるか完全に同一であるアミノ酸配列を含む又はからなり；タンパク質はＤＡＳ１８１であり；組成物は、１又は複数の追加的な化合物を更に含み；投与はドライパウダー吸入器の使用により；投与は鼻腔スプレーの使用により；投与はネブライザーの使用により；投与は気管内チューブ（ＥＴチューブ）及びドライパウダー吸入器の使用により；タンパク質は、シアリダーゼ又はその活性部分を含む。場合によっては、シアリダーゼ又はその活性部分は、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ若しくはその触媒ドメイン、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓシアリダーゼ若しくはその触媒ドメイン、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ若しくはその触媒ドメイン、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓシアリダーゼ若しくはその触媒ドメイン、ヒトＮｅｕ２シアリダーゼ若しくはその触媒ドメイン、又はヒトＮｅｕ４シアリダーゼ若しくはその触媒ドメインと少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％同一なアミノ酸配列を含み、別の場合には、シアリダーゼ又はその活性部分は、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｖｉｓｃｏｓｕｓシアリダーゼ又はその触媒ドメインと少なくとも９０％同一である。場合によっては、ペプチドは、アンカリングドメインを含み、アンカリングドメインは、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）結合ドメインである（例えば、ＧＡＧ結合ドメインは、ヒト血小板因子４のＧＡＧ結合ドメイン、ヒトインターロイキン８のＧＡＧ結合ドメイン、ヒトアンチトロンビンＩＩＩのＧＡＧ結合ドメイン、ヒトアポタンパク質ＥのＧＡＧ結合ドメイン、ヒト血管関連遊走タンパク質（ａｎｇｉｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のＧＡＧ結合ドメイン、又はヒトアンフィレギュリンのＧＡＧ結合ドメインと少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％同一である）。
【０００７】
場合によっては、患者は、肺機能がドライパウダー吸入器を効果的に用いるのに不充分であるか、ドライパウダー吸入器を全く使用できず、例えば患者は人工呼吸器に維持されている。場合によっては、患者は、ＰＩＶに感染した免疫不全患者であり、液体製剤で処置されるか（例えば、ネブライザーを用いる）、乾燥製剤で処置される（例えば、ドライパウダー吸入器を用いる）。
【０００８】
場合によっては、免疫不全患者は、悪性腫瘍、白血病、コラーゲン−血管性疾患、先天性又は後天性の免疫不全症（例えばＡＩＤＳ）の患者、免疫抑制療法を受けている臓器移植レシピエント、及び免疫抑制療法を受けているその他の患者を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
本発明のその他の特徴及び利点が以下の詳細な説明、図面、及び請求項から明らかになるであろう。
【図１】図１は、ウイルスの成長及び培養を示す写真のセットである。ＬＬＣＭＫ−２細胞を感染の２４時間前に播種し、その後、０．０２又は０．２ｍＬのウイルス培養陽性試料を接種した。細胞は感染前にちょうどサブコンフルエントであった。感染の進行を接種の３日後及び５日後に記録した。細胞死及びＣＰＥは接種の３日後までに検出可能となり、接種の５日後までに有意に進行した。０．０２及び０．２ｍＬの初回接種はどちらも感染を開始させるのに充分である。ＮＶ＝非ウイルス。ＰＩ＝感染後。
【図２】図２は、ＤＦＡ分析の結果を示す写真のセットである。細胞をカバースリップ上で成長させ、ＴＦＩＤ５０で感染させ、その後、感染の７２時間後に固定した。固定後、Ｌｉｇｈｔ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＰＩＶ３  ＤＦＡアッセイを用いて細胞を染色した。染色に特異的なチャネルを用いて顕微鏡下で蛍光を可視化し、ＰｒｏｇＲｅｓ  ＣａｐｔｕｒｅＰｒｏソフトウェア（イエナオプティック社（Ｊｅｎｏｐｔｉｋ）製）を用いて写真を撮った。
【図３】図３は、ＤＦＡ試薬を用いた代表的プラークを示す写真のセットである。プラークアッセイを２４ウェルプレートで行い、次いで材料及び方法に記載されているようにＤＦＡ試薬を用いて染色した。各希釈物の代表的プラークが示されており、ウェル中の全プラークの計数から得られた最終タイターを画像の右側に示す。タイターを得るために、計数可能なウェルを平均化し、希釈倍率をかけた。プラークは緑色で示されており、核は青色で示されている。ＴＮＴＣ＝多すぎて計数不可。ＰＩ＝感染後。
【図４】図４は、ＤＦＡ試薬を用いた代表的プラークを示す写真のセットである。プラークアッセイを２４ウェルプレートで行い、次いで材料及び方法に記載されているようにＤＦＡ試薬を用いて染色した。各希釈物の代表的プラークが示されており、ウェル中の全プラークの計数から得られた最終タイターを画像の右側に示す。タイターを得るために、計数可能なウェルを平均化し、希釈倍率をかけた。プラークは緑色で示されており、核は青色で示されている。ＴＮＴＣ＝多すぎて計数不可。ＰＩ＝感染後。
【図５】図５は、６日目及び７日目の標準的なプラーク減少アッセイを示すグラフのペアである。プラーク減少アッセイを種々の濃度のＤＡＳ１８１を用いて６ウェルプレートで行い、プラークを可視化できた感染の６日後又は７日後のいずれかで固定した。ＤＡＳ１８１はアッセイ全体を通してオーバーレイ中に残っていた。プラークを数え、グラフ化してＥＣ５０値を決定した。
【図６】図６は、蛍光分析を用いた代表的プラーク形成を示す写真のセットである。感染の４８時間後に細胞を固定し、ＰＩＶ３  ＤＦＡ試薬を用いてプラーク形成を可視化した。プラークは緑色で示されており、核は青色で示されている。
【図７】図７は、３連で行ったプラーク減少アッセイを示すグラフであり、ＥＣ５０値を各アッセイについて決定した。これらの値から得られた平均ＥＣ５０値は約４ｎＭであった。
【図８】図８は、ＴＣＩＤ５０の抑制を示す写真のセットである。ＬＬＣＭＫ−２細胞を感染の２４時間前に播種し、その後、公知のＴＣＩＤ５０で感染させた。感染の２時間後、プレートを０．０５％グルタルデヒドで固定し、次いでαＰＩＶ抗体で染色した。暗い染色はウイルスの拡散を示す。
【図９】図９は、ウイルス拡散分析を示す写真のセットである。細胞を０．１のＭＯＩで感染し、その後、ＤＡＳ１８１処置（１０ｎＭ）あり又はなしで、感染の２４、４８、及び７２時間後のウイルス拡散についてアッセイした。細胞を固定した後、ＰＩＶ３特異的ＤＦＡ試薬で染色し、顕微鏡下で可視化した。ＰＩＶ３感染の存在が緑色で示されており、核は青色で示されている。
【図１０】図１０は、１０ｎＭ  ＤＡＳ１８１処置でのウイルス放出を示すグラフである。感染後（ＭＯＩ＝０．１）、細胞を１０ｎＭ  ＤＡＳ１８１で処置し（又は偽処置）、その後、細胞から放出された感染性ウイルスをプラークアッセイにより測定した。組織培養上清（ＤＡＳ１８１あり又はなし）を１、２、及び３日目に試験し、時間に対してタイターをプロットした。
【図１１】図１１は、６日間のＰＩＶ３ウイルス放出実験を示すグラフである。細胞を低ＭＯＩ（０．０１）で感染し、その後、１０ｎＭ  ＤＡＳ１８１処置又は偽処置した。組織培養上清の回収によりウイルス放出を測定し、プラークアッセイにより感染性ウイルスをアッセイした。
【図１２】図１２は、患者サンプルの初回接種を示す写真のセットである。ＥＩＮＤ患者から回収されたＰＩＶ３を含むと思われるサンプルをＬＬＣＭＫ２細胞の接種に用いた。培養をＣＰＥ及びウイルス感染の証拠についてモニタリングした。感染後５日目までに、０．２ｍＬの患者サンプルを接種したウェルは、ウイルス感染を示す相当のＣＰＥ及び細胞死を示した。これらのウェルから更なる増幅のためのウイルスを回収した。ＤＦＡアッセイによりＰＩＶ３の存在が確認された（図１３）。ＮＶ対照は、ＰＩＶ３抗原の陽性染色を示さず、感染したＰＩＶ３サンプルは視野中の全細胞がＰＩＶ３陽性（緑色で示される）であることを示している。核は青色で示されている。
【図１３】図１３は、ウイルスの種類の同定を示す写真のセットである。接種したウイルス培養物を呼吸器系ウイルスの存在について及びＰＩＶ３の存在についてＤＦＡ分析で特異的に試験した。感染細胞をスライドガラス上にスポットし、適切な抗体（呼吸器系ウイルスのパネルを認識する抗体又はＰＩＶ３に特異的な抗体のいずれか）で染色した。染色に特異的なチャネルを用いて顕微鏡下で蛍光を可視化し、ＰｒｏｇＲｅｓ  ＣａｐｔｕｒｅＰｒｏソフトウェア（イエナオプティック社製）を用いて写真を撮った。
【図１４】図１４は、ＤＦＡ試薬を用いた代表的プラークの写真のセットである。プラークアッセイを２４ウェルプレート中で行い、その後、材料及び方法に記載されているようにＤＦＡ試薬を用いて染色した。１つの希釈物の代表的プラークが示されており、これは４８時間までのウイルスプラークの急速な拡散を示している。タイターを得るために、計数可能なウェルを平均化し、希釈倍率をかけた。プラークは緑色で示されており、視野中の全細胞が青色で示されている。
【図１５】図１５は、プラーク減少アッセイ（ＰＲＡ）を示すグラフである。プラーク減少アッセイを３連で行い、各アッセイでＥＣ５０値を求めた。これらの値を用いて得られた平均ＥＣ５０値は約２８ｎＭであった。
【図１６】図１６は、ＴＣＩＤ５０の抑制を示す写真のセットである。ＬＬＣＭＫ−２細胞を感染の２４時間前に播種し、その後、公知のＴＣＩＤ５０で感染させた。感染の２時間後、プレートを洗浄して残留ウイルスを除き、その後、段階希釈したＤＡＳ１８１を含むアガロース／培地で表面を覆った。感染の３日後、プレートを０．０５％グルタルアルデヒドで固定し、次いでａＰＩＶ３抗体で染色した。緑色蛍光は単層全体へのウイルスの拡散を示しており、一方、全細胞が青色の染色で示されている。
【図１７】図１７は、３日間のＰＩＶ３ウイルス放出実験の結果を示すグラフである。細胞を低ＭＯＩ（０．０１）で感染し、その後、１００ｎＭ  ＤＡＳ１８１処置又は偽（ｍｏｃｋ）処置した。組織培養上清の回収によりウイルス放出を測定し、プラークアッセイにより感染性ウイルスをアッセイした。
【図１８】図１８は、ウイルス量の減少を示すグラフである（投与日を赤色で示す）。
【図１９】図１９は、ウイルス量の変化を示すグラフである。
【図２０】図２０は、処置日に対するウイルス量の変化を示すグラフである。
【図２１】図２１は、プレドニゾン及びタクロリムスによる処置、酸素投与、並びにＰＩＶ３量を示すグラフのセットである。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
シリダーゼ活性を有する融合タンパク質であるＤＡＳ１８１がＰＩＶの臨床単離株及びＰＩＶ感染患者に対して有効であることを示す実験を以下に説明する。シアリダーゼ活性を有する種々のタンパク質が米国特許第８，０８４，０３６号に記載されており、ＤＡＳ１８１が米国特許第７，８０７，１７４に記載されており、これらの両方の全体を参照により本明細書に援用する。
【００１１】
ＤＡＳ１８１は、シアリダーゼの触媒ドメイン及びアンカリングドメインを含む融合タンパク質である。単離されたＤＡＳ１８１は、アミノ末端メチオニン（Ｍｅｔ）を有する場合もあり、有さない場合もある。本明細書中、ＤＡＳ１８１という用語は、その配列が配列番号１及び２として本明細書中に提供されている２つの形態のいずれか又は混合物を指す。本明細書中に記載されている例の複数でＤＡＳ１８１又はＤＡＳ１８１を含む組成物を用いる。
【００１２】
ＤＡＳ１８１及びシアリダーゼ活性を有する他のタンパク質、例えば米国特許第８，０８４，０３６号又は同第７，８０７，１７４号に記載のタンパク質は、液体製剤又は乾燥製剤で気道に送達される医薬組成物中に含められ得る。
【００１３】
本明細書に記載のタンパク質は、種々の補形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）を含む医薬組成物へと製剤化され得る。場合によっては、製剤は、追加的な有益な作用をもたらす追加的な活性成分を含んでよい。
【００１４】
本発明は、少なくとも１つのシアリダーゼ活性を含む治療化合物及び組成物を用いる方法を含む。配列番号１又は２と少なくとも９０％、９５％、９８％、又は９９％同一なタンパク質がとりわけ有用であり得る。場合によっては、配列番号１又は２中のアミノ酸と異なるアミノ酸は保存的置換である。保存的置換は、以下の５グループのいずれかの内における交換として定義することができる：
Ｉ．小さく、脂肪族であり、非極性又はわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ
ＩＩ．負に帯電した極性残基及びそのアミド；Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ
ＩＩＩ．正に帯電した極性残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ
ＩＶ．大きな脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ
Ｖ．大きな芳香族残基：Ｐｈｅ、Ｔｒｙ、Ｔｒｐ
【００１５】
上記グループ中、以下の置換が「高度に保存的」であると見なされる：Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｈｉｓ／Ａｒｇ／Ｌｙｓ、Ｐｈｅ／Ｔｙｒ／Ｔｒｐ、及びＭｅｔ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ／Ｖａｌ。半保存的置換は、上記（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）を含むスーパーグループ（Ａ）又は上記（ＩＶ）及び（Ｖ）を含むスーパーグループ（Ｂ）に限定される上記グループ（Ｉ）〜（ＩＶ）の２つの間での交換として定義される。更に、本願中で疎水性アミノ酸が指定される場合、それらはアミノ酸Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ、Ｐｈｅ、及びＴｒｐを指し、親水性アミノ酸はＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、及びＴｙｒを指す。
【００１６】
ネブライザーによる投与又は剤形は一般的に、活性成分に加えて大量の水を含む。少量の他の成分、例えばｐＨ調整剤、乳化剤、又は分散剤、保存剤、界面活性剤、又は緩衝剤及び他の安定化剤及び溶解補助剤も存在し得る。
【００１７】
経鼻製剤は、滴薬、噴霧薬、エアゾール剤として、又は任意の他の鼻腔内用の剤形で投与することができる。必要に応じて、送達系は単位用量送達系であり得る。１回の投薬で送達される溶液又は懸濁液の体積は約５〜約２０００マイクロリットル、約１０〜約１０００マイクロリットル、又は約５０〜約５００マイクロリットルのどこかであり得る。これらの種々の剤形の送達系は、単位用量又は複数回用量パッケージでの、ドロッパーボトル、プラスチックスクイズユニット（ｓｑｕｅｅｚｅ  ｕｎｉｔ）、アトマイザー、ネブライザー、又は薬剤エアゾールであり得る。
【００１８】
本発明の液体製剤は、以下を含むように変えることができる：（１）ｐＨを調整するためのその他の酸及び塩基；（２）ソルビトール、グリセリン、及びデキストロース等のその他の等張化剤；（３）その他のパラヒドロキシ安息香酸エステル、ソルバート、ベンゾアート、プロピオナート、クロルブタノール、フェニルエチアルコール、塩化ベンザルコニウム、及び水銀剤等のその他の抗微生物保存剤；（４）カルボキシメチルセルロースナトリウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、及び他のゴム等のその他の粘稠化剤；（５）好適な吸収促進剤、（６）安定化剤、例えば、バイサルファイト及びアスコルバート等の酸化防止剤、エデト酸ナトリウム等の金属キレート化剤、並びにポリエチレングリコール等の薬物溶解促進剤；及び（７）アミノ酸等のその他の剤。
【００１９】
本発明の一実施形態は、約０．０１ｍｇ〜約１００ｍｇのＤＡＳ１８１（又はシアリダーゼ活性を有する別のポリペプチド）投与量等の種々の投与量の液体医薬組成物を含む。そのような投与量の例としては、約０．０５ｍｇ、０．０６ｍｇ、０．１ｍｇ、０．５ｍｇ、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ、又は１００ｍｇ／日の用量が含まれる。上記の用量は、１日に１回又は複数回、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、又は１４日、又はそれ以上の期間投与され得る。より多い又はより少ない用量も投与され得る。典型的には、投与量は、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｎｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、及び約１００ｎｇ／ｋｇ〜約１００マイクログラム／ｋｇであり得る。本明細書に記載の種々の例において、０．０００８ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、及び５．０ｍｇ／ｋｇの投与量を含む種々の投与量の本明細書に記載の組成物でマウスを処置した。
【００２０】
「シアリダーゼ」とは、基質分子からシアル酸残基を除去できる酵素である。シアリダーゼ（Ｎ−アシルノイラミノシルグリコヒドロラーゼ（Ｎ−ａｃｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｏｓｙｌｇｌｙｃｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）、ＥＣ  ３．２．１．１８）は、シアロ−コンジュゲートから加水分解的にシアル酸残基を除去できる酵素の一群である。シアル酸は、糖タンパク質及び糖脂質に結合したオリゴ糖鎖の最も外側の位置に通常見出される９炭素骨格を有するαケト酸である。シアル酸の主な種類のシアル酸の１つはＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）であり、これは他の種類のほとんどの生合成前駆体である。基質分子は、オリゴ糖、多糖、糖タンパク質、ガングリオシド、又は合成分子であり得るが、これに限定されるものではない。例えば、シアリダーゼは、シアル酸残基と基質分子の残部との間でα（２，３）−Ｇａｌ、α（２，６）−Ｇａｌ、又はα（２，８）−Ｇａｌ連結を有する結合を切断することができる。シアリダーゼは更に、シアル酸残基と基質分子の残部との間でいずれか又は全ての連結を切断することができる。Ｎｅｕ５Ａｃと炭水化物側鎖の最後から２番目のガラクトース残基との間の２つの主な連結、すなわちＮｅｕ５Ａｃα（２，３）−Ｇａｌ及びＮｅｕ５Ａｃα（２，６）−Ｇａｌが自然界に見出される。ヒトウイルスはＮｅｕ５Ａｃα（２，６）−Ｇａｌを好むようであり、トリ及びウマのウイルスは主にＮｅｕ５Ａｃα（２，３）−Ｇａｌを認識するが、Ｎｅｕ５Ａｃα（２，３）−Ｇａｌ及びＮｅｕ５Ａｃα（２，６）−Ｇａｌ分子はどちらもインフルエンザウイルスに受容体として認識され得る。シアリダーゼは天然のシアリダーゼであってもよく、操作されたシアリダーゼ（例えば、限定されるものではないが、アミノ酸配列が天然シアリダーゼの配列に実質的に相同な配列を含む天然シアリダーゼの配列に基づくシアリダーゼ）であってもよい。本発明において、「シアリダーゼ」は更に、天然シアリダーゼの活性部分又は天然シアリダーゼの活性部分に基づく配列を含むペプチド若しくはタンパク質を意味し得る。
【００２１】
「融合タンパク質」とは、少なくとも２つの異なるソースに由来するアミノ酸配列を含むタンパク質である。融合タンパク質は、天然タンパク質に由来する又は天然のタンパク質の全部若しくは一部に実質的に相同なアミノ酸配列を含み得、それに加え、異なる天然タンパク質の全部若しくは一部に由来する又は実質的に相同な１個から非常に多数のアミノ酸を含み得る。あるいは、融合タンパク質は、天然タンパク質に由来する又は天然タンパク質の全部若しくは一部に実質的に相同なアミノ酸配列を含み得、それに加え、合成配列である１個から非常に多数のアミノ酸を含み得る。
【００２２】
「シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質」とは、シアリダーゼの触媒ドメインを含むタンパク質又はシアリダーゼの触媒ドメインに実質的に相同であるが触媒ドメインが由来するシアリダーゼの全アミノ酸配列は含まないアミノ酸配列を含むタンパク質であり、シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、触媒ドメインが由来するインタクトなシアリダーゼと実質的に同じ活性を保持している。シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、シアリダーゼに由来しないアミノ酸配列を含み得るが、必ずではない。シアリダーゼ触媒ドメインタンパク質は、１又は複数の他の公知のタンパク質のアミノ酸配列に由来する又はこれと実質的に相同なアミノ酸配列を含んでよく、あるいは、他の公知のタンパク質のアミノ酸配列に由来しない又はこれと実質的に相同でない１又は複数のアミノ酸を含んでよい。
【００２３】
「治療有効量」とは、組成物又は化合物が単一剤形で対象に投与された時に所望の治療的、予防的、又は他の生物学的な作用又は反応に必要な組成物又は化合物の量を意味する。組成物又は化合物の具体的な量は、組成物又は化合物の性質、処置される状態の性質、対象の年齢及びサイズ等の条件に応じて広く異なり得る。
【００２４】
「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、状態、障害、又は疾患の症状の１又は複数を回復させるかその他の点で有益に変化させるあらゆる方法を意味する。処置は更に、例えば気道の粘液を減少させるための、本明細書に記載の組成物又は化合物の任意の医薬的使用を包含する。
【００２５】
「気道」とは、鼻、咽喉、咽頭、喉頭、気管、及び気管支を含む鼻から肺胞への空気の通り道を意味し、これは肺も含み、医師に呼吸器系と呼ばれることもある。
【００２６】
「吸入器」とは、鼻又は口を介して吸入される（自然に肺に吸い込まれるか機械により肺に吸い込ませる）スプレー又はドライパウダーの形態の薬を与えるためのデバイスを意味し、限定されるものではないが、受動的又は能動的な人工呼吸器（機械的構造であり、気管内チューブを備えても備えていなくてもよい）、ネブライザー、ドライパウダー吸入器、定量吸入器、及び加圧噴霧式定量吸入器を含む。
【００２７】
「吸入薬」とは、鼻又は口を介して吸入される任意の物質である。
【００２８】
本発明において「補形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）」とは、薬剤の活性成分のキャリアとして単独で又は組み合せて用いられる１又は複数の不活性な物質又は化合物を意味する。本発明において、「補形剤」は更に、有益な作用を向上させるために医薬組成物に含められる又は活性成分との相乗作用を有する、１又は複数の物質又は化合物を意味する。
【実施例】
【００２９】
実施例１−臨床単離株
ＤＡＳ１８１がＰＩＶの臨床単離株を抑制できることを示すインビトロ実験を以下に記載する。ＰＩＶの臨床単離株はＰＩＶの研究室株より患者に感染するＰＩＶにより似ているので、この実験は意味がある。このウイルスで確立されたウイルス複製を５０％抑制するのに必要な有効濃度（ＥＣ５０）は約４ｎＭ  ＤＡＳ１８１であった。
【００３０】
更に、ウイルス成長分析により、ＤＡＳ１８１なしでは、０．０１又は０．１のＭＯＩのどちらで感染させてもウイルスは細胞培養単層中を急速に進行することが示された。どちらの場合も、ＤＡＳ１８１処置なしでは感染後３日目までに有意な細胞変性効果（ＣＰＥ）及び細胞死が観察された。しかし、１０ｎＭ  ＤＡＳ１８１の存在下では、細胞層は感染の経過中そのまま留まっており、プラークアッセイにより測定されるウイルス放出はかなり低減した。総合すると、これらのデータは、ＤＡＳ１８１がこのＰＩＶ３の臨床単離株に対して有効であり、ウイルスにより誘発される細胞毒性及び細胞死に対して保護的であることを示している。
【００３１】
実験デザイン及び結果
ドライアイス上で受け取った試料を分析時まで−８０℃で保存した。分析の準備ができた時、サンプルを、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いてウイルスについて試験し、ウイルス感染について評価した（ウイルスの種類及び株）。感染が確認された場合、ウイルスを２回、ウイルスストックの増幅が充分になるまで継代した。ウイルスの成長特性の特徴解析及びＤＡＳ１８１の有効抑制用量を確立した。
【００３２】
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【００３３】
短時間の低速遠心により細胞を除去して上清だけを得た後、ＬＬＣＭＫ２細胞への接種に試料（ＢＡＬ及び組織培養陽性上清）を用いた。呼吸器系ウイルス直接蛍光分析（ＤＦＡ）スクリーンを用いたウイルス種の最初の同定にＤＦＡを行った。分離されたウイルス上清（０．０２又は０．２ｍＬ）を、適切なラベリング及び同定手順を用いて６ウェルプレートに接種した。
【００３４】
初回ウイルス接種を含むウェルから得られた上清を、ウイルス成長培地（ＶＧＭ）を含む新鮮な細胞の複数のウェルに入れた。細胞を前述したようにＣＰＥについてモニタリングした。感染の３日後、各単離株のウェルの１つをＤＦＡ分析のために回収した。
【００３５】
ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の初回ウイルス接種物を数日間（ウイルス株及び成長特性によって異なる）ＣＰＥについてモニタリングした。細胞死、シンシチウム形成、細胞の円形化又は拡大、及び細胞成長の全体的変化等の観察結果を記録した。感染の約３〜５日後（又は細胞がＣＰＥを示した時）、細胞を−７０〜−８０℃で凍結してウイルスを放出させた。より大きな成長容器中へのウイルスの増幅後、ウイルスを−７０〜−８０℃で凍結して長期間保存した。
【００３６】
ウイルスサンプルの継代：上記初回単離の複製ウェルを用いてウイルスの成長を続けた。実質的な細胞溶解／細胞死後、上清を新しい細胞に移した。ウイルスの各継代からのウイルスも−７０〜−８０℃で凍結してウイルスストックを保存した。増幅させるために、高いタイターのウイルスがかなりの体積で得られるまでウイルスを未感染細胞と継代した。ウイルスを凍結するために、１％ＤＭＳＯを加え、ウイルスを小分けにして−７０〜−８０℃で凍結した。
【００３７】
呼吸器系ウイルス抗原の確認：呼吸器系ウイルス病原体（アデノウイルス、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、パラインフルエンザ１型、パラインフルエンザ２型、パラインフルエンザ３型、及び呼吸器多核体ウイルスを含む）の存在についてスクリーニングするために最初のＤＦＡ分析を用いた。ＤＦＡ分析はメーカーの指示書（カタログ番号３１３７、ミリポア社、テメキュラ、カリフォルニア州）に従って行った。呼吸器系ウイルス抗原の存在を示すスクリーニング試験の陽性結果の後、個々のウイルスの株及びサブタイプに特異的な上記キットの構成要素を用いてウイルス株を確認した。ウイルス株の分析後、メーカーの指示書に従って細胞をスライド上にスポットして（又はガラス製カバースリップ上で成長させて）適切な分析ができるようにした。
【００３８】
ウイルス単離株の同定：上記のようにウイルスを継代した後、増殖性感染を生じた試料で確認のためのＤＦＡ分析を行い、同定されたウイルスサブタイプを確認した。ウイルスの種類の変化をモニタリングできるようにウイルス実験中に異なる期間で連続的確認を行った。
【００３９】
ウイルスストックの凍結及び組織化：ウイルス株を同定及び確認した後、元の単離株からウイルスストックを増幅し、確実に継代数が少なくなるように複数に小分けして−７０℃で凍結した。ＳＯＰ、及びプラークアッセイの改変を以下に記載するように行った。元の単離株にできるだけ近い特徴（表現型及び遺伝子型の両方）を維持するために、その後の全ての分析に低継代ウイルスを用いた。
【００４０】
ウイルスストックのタイター測定：ウイルスストックをＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層上でタイターし、感染後２〜７日目に、０．０５％グルタルアルデヒド又は４％ホルムアルデヒドで固定した後、ＰＩＶサブタイプ特異的抗体及びＤＦＡ試薬と一緒にインキュベートすることによりアッセイした。染色後、プラークを数え、カウント数に従ってタイターを決定した。
【００４１】
ＴＣＩＤ５０の抑制：感染の１日前に３×１０６細胞／プレートの密度でＬＬＣ−ＭＫ２細胞を６ウェルプレートにプレーティングした。翌日、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄した後、ウイルスストックで同定されたＴＣＩＤ５０で感染させた。感染の２時間後、１０００ｎＭ〜０．１ｎＭの種々の濃度のＤＡＳ１８１（１０倍の段階希釈）を含むアガロースで細胞を覆った。非薬物対照及び非ウイルス（ＮＶ）対照も評価した。感染の３〜５日後（細胞が実質的な細胞変性効果を示した時）、細胞を固定し、次いでＰＩＶ２／３に特異的な抗体で染色した。抗体で染色した後、プレートを１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。次いで、プレートをＴＢＰ／ＢＣＩＰ基質で１０〜１５分間又は染色が見えるようになるまで染色した。代表的な写真を撮り、ウイルスの拡散及びＤＡＳ１８１処置による抑制レベルに関して観察を行った。
【００４２】
プラーク減少アッセイ：改変プラーク減少アッセイ（ＰＲＡ）を行って、感染を５０％抑制するのに充分なＤＡＳ１８１レベル（ＥＣ５０）を決定した。感染前日に３×１０６細胞／プレートの密度で細胞を２４ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を１×ＰＢＳで洗浄した後、１００ｐｆｕ／ウェル以下で２時間感染させた。最初の２時間の後、培地を吸引し、細胞を再度１×ＰＢＳで洗浄した。適切な濃度のＤＡＳ１８１（１０００ｎＭ〜０．１ｎＭ）を含む、アガロースを含む２×イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）（比率１：１）でプレートを覆った。各濃度のＤＡＳ１８１を２連（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）のウェルでアッセイし、得られたプラーク数を２つのウェルで平均化した。プラークを２日間形成させ、その時点で０．０５％グルタルアルデヒド又は４％ホルムアルデヒドでプレートを固定した。固定後、メーカーの指示書に従って適切な抗体又はＤＦＡ試薬でプレートを染色した。
【００４３】
プラークアッセイを用いたウイルス成長曲線（＋／−ＤＡＳ１８１）：ＤＡＳ１８１あり／なしでの経時的ウイルス放出を、感染前日に２４ウェルプレートに細胞を播種（３×１０６細胞／プレート）することにより評価した。翌日、細胞を低い感染多重度（ＭＯＩ）（０．０１〜０．１）で感染し、感染の２時間後、培地を除去し、ウイルスを抑制するのに必要な同定された濃度のＤＡＳ１８１と共に又はなしで新鮮な培地を補充した。対照処置ウェル中で約８０〜９０％の細胞死が明らかになるまでウイルス上清を２４時間毎に回収し、次いでＤＡＳ１８１を含む培地を補充した。上清を−８０℃で凍結した後、ＰＩＶの標準的プラークアッセイにより各サンプルのウイルス価を評価した。細胞をガラス製カバースリップ上で成長させ、次いでプラーク減少アッセイについて上記で記載したように固定及び染色したこと以外は同じ実験構成を用いて、ウイルスの拡散も評価した。
【００４４】
定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いたウイルス成長曲線：上記（セクション８．３）のアッセイの構成で更に、定量的リアルタイム逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）によるウイルス定量を試みた。ウイルス上清を上記と同様に回収し、次いでＲＮＡを調製した。等体積のウイルス上清を出発材料として用い、サンプル間での精製の差による各サンプルから単離されたＲＮＡ量の差の対照として対照ＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ）を各サンプルにスパイクした。次いで、１ステップＲＴ−ＰＣＲ反応でＲＮＡを分析した。
【００４５】
ＰＩＶ３サンプルの初回接種：培養液に０．０２又は０．２ｍＬの患者サンプル（ＢＡＬ又は以前に同定された陽性組織培養上清）を接種した。細胞を５日間成長させ、ＣＰＥ又はウイルス感染のその他の証拠について毎日観察した。感染後３日目及び５日目に、写真を撮り、組織培養上清を接種した細胞においてＣＰＥを観察した（図１）。ＢＡＬサンプルは増殖性ウイルス感染（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を生じず、一方、ウイルス培養上清は、感染の３日後には早くもＣＰＥの徴候を示した。０．２ｍＬのウイルス上清を接種した細胞は、０．０２ｍＬ接種した細胞よりも比例的に多くのＣＰＥを示した。感染後５日目までに、０．２ｍＬのウイルス上清を接種した細胞はかなり進行し、約５０％の細胞死を示し、これは培養全体へのウイルスの拡散を示している。０．０２ｍＬのウイルス上清を接種したサンプルはこの日までに更に進行したが、０．２ｍＬ接種サンプルと比べると感染はかなり少なかった。ＢＡＬサンプルはこの時点までに依然としてウイルス感染の徴候を示さなかった。更なる観察（１４日目まで延長）により、このサンプルでは増殖性ウイルス感染が単離されないことが確認された。ＤＦＡアッセイによりＰＩＶ３の存在を確認した（図２）。ＮＶ対照はＰＩＶ３抗原に対する陽性染色を示さず、一方、感染ＰＩＶ３サンプルは、視野中の全細胞がＰＩＶ３に陽性であることを示している。
【００４６】
タイターを決定するためのプラークアッセイ：この患者から単離したＰＩＶ３をＬＬＣ−ＭＫ２細胞上で最小限継代した後、改変プラークアッセイを用いてタイター測定した。このウイルスがＰＩＶ３参照株ほど容易且つ一定してプラーク形成しなかったことから、この標準アッセイの複数の変法を試験した。以前のＰＩＶ参照株プラークアッセイと比べて、このウイルスは、適切な抗体で染色した時に目に見えるプラークを形成するまではるかに長い時間がかかった。感染後６日目までに、プラークサイズは不定であり、多くは依然としてサイズがはるかに小さかったが、プラークを可視化することができた。７日目までに、サイズのばらつきが依然として見られたが、プラークは非常に容易に可視化することができた（非公開データ）。比較すると、参照株はこの方法で感染後３日目までに容易且つ一定に可視化された。プラークアッセイ及びプラーク減少アッセイの両方で正確且つ一定の結果を得るために、一定のプラーク数に必要な培養の時間が短縮され且つこの特定のウイルス単離株に固有のより小さなプラークの可視化能が向上するように両方のアッセイを改変した。改変アッセイは、標準的なプラークアッセイ／プラーク減少アッセイについて説明したのと同じ原理に基づく。しかし、ＰＩＶのプラーク形成は大きな表面積を必要としないので、アッセイフォーマットを２４ウェルプレートの構成で行うように変更した。ウイルスを段階希釈し（１０−１〜１０−６）、複製（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）ウェルをプラークアッセイのために感染させ、次いでウイルスを洗浄し、通常のプラークアッセイの手順で記載したように２×ＭＥＭ：アガロース混合物で覆った。感染を４８時間進行させ、次いで、細胞を固定し、ウイルスの種類の同定及び確認に用いたのと同じＤＦＡ試薬で染色した（図４）。
【００４７】
臨床ＰＩＶ３単離株のＤＡＳ１８１試験：標準プラーク減少アッセイでは、見えるプラークが発達するのに７日まで延長したＤＡＳ１８１処置が必要であった。培養中留まる時間が長くなり、ウェル中の薬理学的活性が失われるので、ウイルスの抑制に必要なＤＡＳ１８１の量が増加した。この時間は、一定で正確な抑制情報を得るには長すぎると見なした（図５）。改変プラーク減少アッセイには、ウイルスを希釈してＶＧＭ中５０ｐｆｕ／ウェルで細胞に感染させた。感染の２時間後、プレートを洗浄し、段階希釈されたＤＡＳ１８１（１０００ｎＭ〜０．１ｎＭ）を含む又は対照としてＤＡＳ１８１を含まない、２×ＶＧＭ：アガロースのオーバーレイで覆った。ウイルス感染を４８時間続け、その後、細胞を固定し、前述のＤＦＡ試薬で染色した。各希釈物の代表的プラークを図６に示す。プラークサイズもＤＡＳ１８１濃度の上昇と共に減少した。希釈物当たりの総数のグラフを示し、各グラフのＥＣ５０値を示す（図７）。プラーク減少アッセイは、複数の日数及び継代にわたる正確なＥＣ５０値を確実にするために、３つの異なる日数で３回行った。これらのデータから、このウイルスで得られた平均ＥＣ５０値は約４ｎＭである。
【００４８】
臨床ＰＩＶ３単離株のＴＣＩＤ５０のＤＡＳ１８１抑制：プラーク減少アッセイを用いてＤＡＳ１８１によりウイルス産生が強く抑制されたことから、本発明者らは更に、より高い感染多重度で薬物がウイルスを抑制する能力を調べた。そのために、ＰＩＶ３臨床単離株で同定されたおおよそのＴＣＩＤ５０で細胞への感染を行い、次いで、感染の２時間後に段階希釈ＤＡＳ１８１（０．１〜１００ｎＭ）で処置し、アガロースで覆った。感染の５日後、細胞を固定し、ＰＩＶ３特異的抗体で染色した。アルカリホスファターゼとコンジュゲートした二次抗体を用いてウイルス抗原を可視化し、次いでＴＢＰ／ＢＣＩＰ基質で染色した（図８）。ウイルス抗原は暗い紫色の染色で示されている。１〜１０ｎＭでウイルス感染の抑制が観察され、一方、０．１ｎＭ  ＤＡＳ１８１で処置された細胞は非薬物対照と同様なウイルス拡散を示した。プラーク減少アッセイを裏付けるように、これらの結果は、ウイルス感染の拡散を限定するのに必要なＤＡＳ１８１の抑制濃度が１〜１０ｎＭであったことを示唆している。感染させたウェルのそれぞれでピンポイントプラークの形成が観察されたが、０．１ｎＭを超える全試験濃度のＤＡＳ１８１で拡散はかなり抑制された。
【００４９】
ＤＡＳ１８１によるウイルスの拡散及び放出の抑制：ウイルス感染の抑制をより良く定量化するために、ウイルス成長分析を行った。最初に、ウイルス拡散をモニタリングするためのＤＦＡ分析を用いて感染の経過全体にわたり（７２時間）ウイルス拡散をモニタリングした。これを行うために、細胞をガラス製カバースリップ上で成長させ、０．１のＭＯＩで感染させた。感染の２時間後にウイルスを除去し、細胞をＤＡＳ１８１で処置し（又はＰＢＳで偽処置）、次いで２４時間毎にウイルス拡散についてアッセイした。カバースリップをＰＩＶ３用ＤＦＡ試薬で染色し、ウイルス感染の有無について評価した。感染後の全ての時点で、１０ｎＭ  ＤＡＳ１８１処置はウイルスの拡散を有意に抑制した（図９）。図９で用いたのと同じ細胞を、経時的なウイルス放出についても評価した。ＤＡＳ１８１処置又は偽処置されたウェルから２４時間毎に組織培養上清を回収し、その後、分析時まで−８０℃で凍結した。前述したようにプラークアッセイによりウイルス価（ＰＦＵ／ｍＬ）を評価し、次いで時間に対してグラフ化した。未処置細胞と比べて、ＤＡＳ１８１処置細胞から放出されるウイルスの量は時間と共に劇的に減少した（２ｌｏｇ超）（図１０）。
【００５０】
より長い感染期間にわたるウイルス放出を評価するために、より低いＭＯＩ（０．０１）で細胞に感染させ、上記と同様に評価した。ＤＡＳ１８１処置細胞が感染のタイムコース全体にわたり有意により少ない感染性ウイルスを産生したという同様な傾向が観察された（図１１）。感染後３日目までに、未処置細胞でのウイルス感染は大幅に進行し、全ての細胞がＣＰＥを示した。感染後４日目までに、未処置細部は死滅し始め（約５０％）、６日目までに、未処置ウェルは約９０〜９５％の細胞死を示した。ＤＡＳ１８１処置細胞では、ウイルス性ＣＰＥは感染後４日目まで観察されず、この時点で、ウイルス感染の徴候（円形化又は細胞死）を示した細胞の割合は少なかった。感染後６日目までに、ウイルス感染はわずかに拡散したが、大部分の細胞はまだ生きており、最小限のＣＰＥの徴候を示した。ＤＡＳ１８１処置サンプルでは感染後４日目までにウイルス放出も増加したが、これは依然として未処置サンプルよりかなり少なかった。
【００５１】
結論
ＤＡＳ１８１は１〜１０ｎＭの全ての濃度でこのＰＩＶ３臨床株を効果的に抑制する。確立されたＥＣ５０は約４ｎＭであり、これは、このアッセイで調べたほとんどのインフルエンザ株を抑制するのに必要なＥＣ５０より低い。細胞培養中の感染中のＤＡＳ１８１処置は、経時的ウイルス放出を効果的に２ｌｏｇ超低減する。低ＭＯＩで感染した場合、ＰＩＶ３感染により誘発される細胞毒性及び細胞死が感染後３日目までにかなり生じる。標準プラークアッセイ及びプラーク減少アッセイの改変により、これらのアッセイの一貫性及び実行可能性を向上させることができる。これらのデータは、現在知られているＤＡＳ１８１の能力を種々のＰＩＶ単離株の効果的抑制にまで拡張し、ＤＡＳ１８１によるＰＩＶ臨床単離株の抑制を実証している。
【００５２】
材料及び方法
細胞及びウイルス：元のＬＬＣ−ＭＫ２細胞をＡＴＣＣ（マナサス、バージニア州）から受け取り、最低限の回数継代（４回未満）して複数のソースバイアルを得た。細胞は、研究対象試料を受け取る前に解凍し、試験サンプル接種前に少なくとも２回継代した。
【００５３】
細胞培養維持及びウイルス成長培地：細胞を３〜４日毎に分割し、イーグルＭＥＭ（カタログ番号１１０９５−０９８、ライフテクノロジーズ社、カールズバッド、カリフォルニア州）、１０％ＦＢＳ（カタログ番号１４−５０２Ｆ、ロンザ社（Ｌｏｎｚａ）、リバーサイド、カリフォルニア州）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（カタログ番号３５０５０、ギブコ社（ＧＩＢＣＯ）、カールズバッド、カリフォルニア州）、及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ溶液（カタログ番号Ａ５９５５、シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）を２〜３日毎に供給した。細胞を標準的なプロトコールに従って充分な培地中に維持し、維持又は試験のために取り出さない限り、５％ＣＯ２を含む湿ったチャンバー内で３７℃で成長させた。細胞をＰＢＳ（カタログ番号１４０４０、ギブコ社、カールズバッド、カリフォルニア州）で洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（カタログ番号１２６０５−０１０、ギブコ社、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いてトリプシン処理した。細胞の個々のフラスコを標準的プロトコールに従って維持し、継代日、科学者のイニシャル、細胞継代数、及び細胞名をラベリングした。実験により決められた６ウェルプレート又は２４ウェルプレート（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ローエル、マサチューセッツ州）を含む適切な試験装置中でウイルス感染を行った。感染前の増幅中、細胞をポリスチレン製フラスコ（コーニング社、ローエル、マサチューセッツ州）中に維持した。ウイルス成長培地は、Ｅ−ＭＥＭ（前述）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（前述）、終濃度３．０μｇ／ｍＬに希釈した３．０ｍｇ／ｍＬのアセチル化トリプシン（カタログ番号Ｔ６７６３、シグマ社）、及び１％ＩＴＳ（カタログ番号４１４００、ギブコ社、カールズバッド、カリフォルニア州）からなる。プラークアッセイのオーバーレイ培地は、ｄＨ２Ｏ中で終濃度が１×培地及び０．９％アガロースである、前述のＥ−ＭＥＭ培地（２×濃度）と１．８％Ｎｏｂｌｅ  Ａｇａｒ（カタログ番号１０９０７、ＵＳＢ社（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．）、クリーブランド、オハイオ州）との１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）混合物からなる。これらの実験に用いたＤＡＳ１８１のロットは、濃度２５．５ｍｇ／ｍＬで２００９年１月２０日に調製されたＬｏｔ＃２００８０７１５であった。
【００５４】
ＲＮＡ抽出及び増幅：ＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ精製キット（カタログ番号５２９０４、キアゲン社、バレンシア、カリフォルニア州）又はＭａｇＭＡＸ（商標）−９６  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（カタログ番号ＡＭ１８３０、アンビオン社、フォスターシティー、カリフォルニア州）をメーカーの指示書に従って用いてＲＮＡ抽出を行った。ＴａｑＭａｎ（登録商標）  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  Ｋｉｔ（カタログ番号４３０９１６９）をメーカーの指示書に従って用いてウイルスＲＮＡの増幅及び定量を試みた。これらの分析を開始したが、現在確立されているアッセイフォーマットはこれらの実験に対して信頼性が高くないことが分かったので、これらのデータは本報告には含めなかった。
【００５５】
抗体及び染色試薬：ＴＣＩＤ５０プレート染色には、αＰＩＶ２／３（カタログ番号２０−ＰＧ９０、フィッツジェラルド社、アクトン社（Ａｃｔｏｎ）、マサチューセッツ州）抗体を用い、次いでロバ抗ヤギ二次抗体（カタログ番号Ｖ１１５１、プロメガ社、マディソン、ウィスコンシン州）を用いた。１−Ｓｔｅｐ  ＮＢＴ／ＢＣＩＰ基質（カタログ番号３４０４２、サーモサイエンティフィック社、ロックフォード、イリノイ州）を用いて抗体染色を可視化した。
【００５６】
実施例２−ＰＩＶ３臨床単離株
実験デザイン及び結果
別個の実験で、ＰＩＶ３の第２臨床単離株を試験した。参照（実験室適合）株と比べて、この臨床単離株は、培養中でより速く成長し、２４時間以内に培養全体にすぐに広がるプラークを形成した。このウイルスは更に、非常に高いタイターに成長し、このことは、この特定のＰＩＶ３株の病原性が高いことを示している。このウイルスに対して確立されたＥＣ５０は約２８ｎＭであった。
【００５７】
更に、ウイルス成長分析により、ＤＡＳ１８１なしで、０．０１のＭＯＩで感染した時に、ウイルスが細胞培養単層中を急速に進行することが示された。感染後３日目までに、ＤＡＳ１８１処置なしで有意なＣＰＥ及び細胞死が観察された。しかし、１００ｎＭ  ＤＡＳ１８１存在下では、細胞層は感染期間中主にインタクトなままであり、プラークアッセイにより測定されたウイルス放出はかなり低減した。総合すると、これらのデータは、ＤＡＳ１８１がこのＰＩＶ３臨床単離株に対して有効であり、ウイルスにより誘発される細胞毒性及び細胞死に対して保護的であることを示している。
【００５８】
試料は分析時まで−８０℃で保存した。分析の準備ができた時、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞を用いてサンプルをウイルスについて試験し、ウイルス感染を評価した（ウイルスの種類及び株）。感染が確認された場合、ウイルスストックのための増幅が充分になるまでウイルスを２回継代した。ウイルスの成長特性を特徴解析し、ＤＡＳ１８１の有効抑制用量を確立した。
【００５９】
2015508780.tif 000004
【００６０】
臨床試料の接種：短時間低速で遠心して細胞を除去して上清だけを得た後、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞への接種に試料（鼻腔スワブ）を用いた。ＤＡＳ１８１処置する前に回収した鼻腔スワブだけで増殖感染が行った。呼吸器系ウイルスＤＦＡスクリーンを用いて任意のウイルス種の最初の同定のためにＤＦＡを行った。分離したウイルス上清（０．０２又は０．２ｍＬ）を、適切なラベリング及び同定手順で６ウェルプレートに接種した。ウイルスの種類に特異的なＤＦＡ試薬を用いてＰＩＶ３抗原の存在を調べた。
【００６１】
初回接種材料の単離：初回ウイルス接種材料を含むウェルに由来する上清を、ウイルス成長培地（ＶＧＭ）を含む新鮮な細胞の複数のウェルに入れた。細胞を前述したようにＣＰＥについてモニタリングした。感染の３日後に、各単離株のウェルの１つをＤＦＡ用に回収した。
【００６２】
ウイルス増幅：ＬＬＣ−ＭＫ２細胞の初回ウイルス接種をＣＰＥについて数日間モニタリングした。細胞死、シンシチウム形成、細胞の円形化又は拡大、及び細胞成長の全体的変化等の観察結果を記録した。感染の約３〜５日後（又は細胞がＣＰＥを示した時）、細胞を−７０〜−８０℃で凍結してウイルスを放出させた。より大きな成長容器中へのウイルスの増幅後、ウイルスを小分けして−７０〜−８０℃で凍結して長期間保存した。
【００６３】
呼吸器系ウイルス抗原の確認：呼吸器系ウイルス病原体（アデノウイルス、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ、パラインフルエンザ１型、パラインフルエンザ２型、パラインフルエンザ３型、及び呼吸器多核体ウイルスを含む）の存在についてスクリーニングするために最初のＤＦＡを用いた。ＤＦＡ分析はメーカーの指示書（カタログ番号３１３７、ミリポア社、テメキュラ、カリフォルニア州）に従って行った。呼吸器系ウイルス抗原の存在を示すスクリーニング試験の陽性結果の後、個々のウイルスの株及びサブタイプに特異的な上記キットの構成要素を用いてウイルス株を確認した。ウイルス株の分析のために、メーカーの指示書に従って細胞をスライド上にスポットして（又はガラス製カバースリップ上で成長させて）適切な分析ができるようにした。
【００６４】
ウイルスストックの凍結及び組織化：ウイルス株を同定及び確認した後、元の単離株からウイルスストックを増幅し、確実に継代が少なくなるように複数に小分けして−７０℃で凍結した。元の単離株とできるだけ近い特徴（表現型及び遺伝子型の両方）を維持するために、その後の全ての分析に低継代ウイルスを用いた。
【００６５】
ウイルスストックのタイター測定：ウイルスストックをＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層上でタイターし、感染後２日目に、０．０５％グルタルアルデヒド又は４％ホルムアルデヒドで固定した後、ＰＩＶサブタイプ特異的ＤＦＡ試薬と一緒にインキュベートすることによりアッセイした。染色後、プラークを数え、カウント数に従ってタイターを決定した。
【００６６】
ＴＣＩＤ５０の抑制：感染の１日前に３×１０６細胞／プレートの密度でＬＬＣ−ＭＫ２細胞を６ウェルプレートにプレーティングした。翌日、細胞を１×ＰＢＳで１回洗浄した後、ウイルスストックに対して同定されたＴＣＩＤ５０で感染させた。感染の２時間後、１０００ｎＭ〜０．１ｎＭの種々の濃度のＤＡＳ１８１（１０倍の段階希釈）を含むアガロースで細胞を覆った。非薬物対照及び非ウイルス（ＮＶ）対照も評価した。感染の３〜５日後（細胞が実質的なＣＰＥを示した時）、細胞を固定し、次いでＰＩＶ３特異的ＤＦＡ試薬で染色した。抗体で染色した後、プレートを１×ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した。次いで、プレートをウイルスの拡散について分析した。代表的写真を撮り、ウイルスの拡散及びＤＡＳ１８１処置による抑制レベルに関して観察を行った。
【００６７】
プラーク減少アッセイ：改変プラーク減少アッセイ（ＰＲＡ）を行って、感染を５０％抑制するのに充分なＤＡＳ１８１レベル（ＥＣ５０）を決定した。感染前日に３×１０６細胞／プレートの密度で細胞を２４ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を１×ＰＢＳで洗浄した後、１００ＰＦＵ／ウェル以下で２時間感染させた。最初の２時間の後、培地を吸引し、細胞を再度１×ＰＢＳで洗浄した。適切な濃度のＤＡＳ１８１（１０００ｎＭ〜０．１ｎＭ）を含む２×ＥＭＥＭを含むアガロース（比率１：１）でプレートを覆った。各濃度のＤＡＳ１８１を２連のウェルでアッセイし、得られたプラーク数を２つのウェルで平均化した。プラークを２日間形成させ、その時点で０．０５％グルタルアルデヒド又は４％ホルムアルデヒドでプレートを固定した。固定後、メーカーの指示書に従って適切な抗体又はＤＦＡ試薬でプレートを染色した。
【００６８】
プラークアッセイを用いたウイルス成長曲線（＋／−ＤＡＳ１８１）：感染前日に２４ウェルプレートに細胞を播種（３×１０６細胞／プレート）することにより、ＤＡＳ１８１あり／なしでの経時的なウイルス放出を評価した。翌日、細胞を０．０１の感染多重度（ＭＯＩ）で感染し、感染の２時間後、培地を除去し、ウイルスを抑制するのに必要な同定された濃度（１００ｎＭ）のＤＡＳ１８１を含む又は含まない新鮮な培地を補充した。対照処置ウェル中で約８０〜９０％の細胞死が明らかになるまでウイルス上清を２４時間毎に回収し、次いでＤＡＳ１８１を含む培地を補充した。上清を−８０℃で凍結した後、プラークアッセイにより各サンプルのウイルス価を評価した。
【００６９】
ＰＩＶ３サンプルの初回接種：培養に０．０２又は０．２ｍＬの患者サンプル（ＢＡＬ又は以前に同定された陽性組織培養上清）を接種した。細胞を５日間成長させ、ＣＰＥ又はウイルス感染のその他の証拠について毎日観察した。感染後５日目に、写真を撮り、０．２ｍＬ組織培養上清を接種した細胞においてＣＰＥを観察した（図１２）。０．２ｍＬの上清を接種した細胞は、０．０２ｍＬ接種した細胞よりも比例的に多くのＣＰＥを示したので、これらのウェルでウイルス増殖を続けた。感染後５日目までに、０．２ｍＬウイルス上清を感染させた細胞はかなり進行し、約５０％の細胞死を示した。これは培養全体へのウイルスの拡散を示している。０．０２ｍＬウイルス上清を接種したサンプルはこの日までに幾分進行したが、０．２ｍＬの接種サンプルと比べると感染はかなり少なかった。
【００７０】
接種したウイルス培養物を、呼吸器系ウイルスの存在及びＰＩＶ３の存在についてＤＦＡにより特異的に試験した。感染細胞をスライドガラスにスポットし、呼吸器系ウイルスのパネルを認識する抗体又はＰＩＶ３に特異的な抗体で染色した（図１３）。
【００７１】
タイターを決定するためのプラークアッセイ：この患者から単離したＰＩＶ３をＬＬＣ−ＭＫ２細胞上で最小限継代した後、改変プラークアッセイを用いてタイターした。以前のＰＩＶ参照株プラークアッセイ及び別のＰＩＶ３臨床単離株と比べて、このウイルスは、はるかに速く成長し、適切な抗体／染色試薬で染色した時に目に見えるプラークを形成した。感染後２日目までに、プラークを可視化することができ、この時点までに多くは有意に拡散していた。このウイルスに用いた改変アッセイは、標準的なプラークアッセイ／プラーク減少アッセイで説明したのと同じ原理に基づく。しかし、ＰＩＶのプラーク形成は大きな表面積を必要としないので、アッセイフォーマットを２４ウェルプレートの構成で行った。ウイルスを段階希釈し（１０−１〜１０−６）、プラークアッセイのために複製ウェルを感染させ、次いでウイルスを洗浄し、通常のプラークアッセイの手順で記載したように２×ＭＥＭ：アガロース混合物で覆った。感染を３６〜４８時間進行させ、次いで、細胞を固定し、ウイルスの種類の同定及び確認に用いたのと同じＤＦＡ試薬を用いて染色した（図１４）。この接種から産生した感染性ウイルスで同定されたタイターは８×１０６ＰＦＵ／ｍＬであった。これは他のＰＩＶ３臨床単離株より実質的に高い（２×１０５ＰＦＵ／ｍＬと比べて）。
【００７２】
臨床ＰＩＶ３単離株のＤＡＳ１８１試験：プラーク減少アッセイのために、ウイルスを希釈してＶＧＭ中５０ＰＦＵ／ウェルで細胞に感染させた。感染の２時間後、プレートを洗浄し、段階希釈されたＤＡＳ１８１（１０００ｎＭ〜０．１ｎＭ）を含む又は対照としてＤＡＳ１８１を含まない２×ＶＧＭ：アガロースオーバーレイで覆った。ウイルス感染を４８時間続けた後、細胞を固定し、前述のＤＦＡ試薬で染色した。行った最初のプラーク減少アッセイでは、用量依存的なウイルス感染の減少により、その後のアッセイにおけるグラフとの比較でより低いＥＣ５０が示された点で、正確なＥＣ５０値が得られなかったため、平均ＥＣ５０の計算に含めなかった。このウイルスの成長特性は、これまで調べた他のＰＩＶ３株と大きく異なっているので、この最初の実験は異常値であると決定された。ウイルスの成長特性が確立された後、３つの異なるプラーク減少アッセイを行った。各実験のＥＣ５０値を示す（図１５）。複数の日数及び継代にわたる正確なＥＣ５０値を確実に得るために３つの異なる日にプラーク減少アッセイを３回行った。このウイルスで確立された平均ＥＣ５０値は約２８ｎＭである。
【００７３】
臨床ＰＩＶ３単離株のＴＣＩＤ５０のＤＡＳ１８１抑制：プラーク減少アッセイを用いてＤＡＳ１８１によってウイルス産生が大幅に抑制されたことから、本発明者らは更に、より高い感染多重度で薬物がウイルスを抑制する能力について調べた。そのために、ＰＩＶ３臨床単離株で同定されたおおよそのＴＣＩＤ５０で細胞を感染させ、次いで、感染の２時間後に段階希釈ＤＡＳ１８１（０．１〜１０００ｎＭ）で処置し、アガロースで覆った。感染の３日後、細胞を固定し、ＰＩＶ３に特異的な抗体で染色した（図１６）。ウイルス抗原は緑色で表されている。１０〜１００ｎＭでウイルス感染の抑制が観察され、一方、０．１〜１ｎＭ  ＤＡＳ１８１で処置された細胞は非薬物対照と同様なウイルス拡散を示した。プラーク減少アッセイを裏付けるように、これらの結果は、ウイルス感染の拡散を制限するために必要なＤＡＳ１８１の抑制濃度が１０〜１００ｎＭであることを示唆している。感染したウェルのそれぞれでピンポイントのプラークの形成が観察されたが、試験した１ｎＭを超える全濃度のＤＡＳ１８１で拡散が実質的に抑制された。ＤＡＳ１８１なし又は０．１ｎＭ  ＤＡＳ１８１を含むウェルでは、細胞単層は、より高い濃度のＤＡＳ１８１で処置されたウェルと比べてＣＰＥが有意に高まっており、このことは、ＤＡＳ１８１が更に細胞毒性に関して保護的な作用を有することを示している（非公開データ）。
【００７４】
ＤＡＳ１８１によるウイルスの拡散及び放出の抑制：ウイルス感染の抑制をより良く定量化するために、ウイルス成長分析を行った。最初に、ＤＦＡ及びプラークアッセイを用いて感染期間全体（７２時間）にわたりウイルスの拡散をモニタリングして、上清に放出されるウイルス量を決定した。これを行うために、細胞に０．０１のＭＯＩで感染させ、次いで、感染の２時間後にウイルスを除去し、細胞を１００ｎＭ  ＤＡＳ１８１で処置（又はＰＢＳで偽処置）した。２４時間毎に、細胞をＣＰＥについてモニタリングし、後でのタイター分析用にウイルス上清を回収及び凍結した。感染後の全ての時点で、１００ｎＭ  ＤＡＳ１８１による処置は、ウイルス感染の細胞毒性作用から細胞単層を保護した（非公開データ）。感染後３日目までに上清に放出されたウイルス価（ＰＦＵ／ｍＬ）は同程度であったが、ウイルス放出も感染期間中約１ｌｏｇ抑制された（図１７）。感染後３日目までに、偽処置した細胞は、ウイルス価の低下に示されるように約９５％の細胞死を示し、一方、ＤＡＳ１８１で処置したウェルは依然として約７０％の細胞単層生存を示した。これらの結果は、このアッセイでなぜウイルス価が最終的に同程度になったのかを説明していると考えられ、この特定の単離株のウイルス感染の急速な進行によるものであると考えられる。
【００７５】
結論
ＤＡＳ１８１は１０〜１０００ｎＭの全ての濃度でこのＰＩＶ３の臨床単離株を効果的に抑制する。確立されたＥＣ５０は２８ｎＭであった。細胞培養中の感染期間中のＤＡＳ１８１処置は、活性感染サイクル中に経時的ウイルス放出を約１ｌｏｇ効果的に低減した。低ＭＯＩで感染させてＤＡＳ１８１で処置しなかった場合、ＰＩＶ３感染により誘発される細胞毒性及び細胞死が感染後３日目までに実質的に見られ、ＤＡＳ１８１処置は、ウイルス誘発細胞毒性から細胞単層を保護する。これらのデータは、現在知られているＤＡＳ１８１の能力を種々のＰＩＶ単離株の効果的抑制に拡張し、更に、ＰＩＶ３の臨床単離株に対して、更には最も病原性の高い株と見なされるものに対してさえＤＡＳ１８１が有効であることを示している。
【００７６】
材料及び方法
細胞及びウイルス：元のＬＬＣ−ＭＫ２細胞をＡＴＣＣ（マナサス、バージニア州）から受け取り、複数のソースバイアルを得るために最低限の回数（４回未満）継代した。細胞は、研究対象試料を受け取る前に解凍し、試験サンプル接種前に少なくとも２回継代した。ＰＩＶ３を含む試料をＬＬＣ−ＭＫ２細胞に接種し、２回継代して大量のウイルス上清を得た。ウイルスの特徴を維持するために細胞培養中で最低限継代したウイルス上清を回収した。
【００７７】
細胞培養の維持及びウイルス成長培地：細胞を３〜４日毎に分割し、Ｅａｇｌｅｓ−ＭＥＭ（カタログ番号１１０９５−０９８、ライフテクノロジーズ社、カールズバッド、カリフォルニア州）、１０％ＦＢＳ（カタログ番号１４−５０２Ｆ、ロンザ社、リバーサイド、カリフォルニア州）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（カタログ番号３５０５０、ギブコ社、カールズバッド、カリフォルニア州）、及び１×Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ／Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ溶液（カタログ番号Ａ５９５５、シグマ社、セントルイス、ミズーリ州）を２〜３日毎に供給した。細胞を標準的なプロトコールに従って充分な培地中に維持し、維持又は試験のために取り出さない限り、５％ＣＯ２を含む湿ったチャンバー内で３７℃で成長させた。細胞をＰＢＳ（カタログ番号１４０４０、ギブコ社、カールズバッド、カリフォルニア州）で洗浄し、ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（カタログ番号１２６０５−０１０、ギブコ社、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いてトリプシン処理した。細胞の個々のフラスコを標準的プロトコールに従って維持し、継代日、科学者のイニシャル、細胞継代数、及び細胞名をラベリングした。実験により決められた６又は２４ウェルプレート（コーニング社、ローエル、マサチューセッツ州）を含む適切な試験装置中でウイルス感染を行った。感染前の増幅中、細胞をポリスチレン製フラスコ（コーニング社、ローエル、マサチューセッツ州）中に維持した。ウイルス成長培地はＥ−ＭＥＭ（前述）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（前述）、終濃度３．０μｇ／ｍＬに希釈した３．０ｍｇ／ｍＬアセチル化トリプシン（カタログ番号Ｔ６７６３、シグマ社）、及び１％ＩＴＳ（カタログ番号４１４００、ギブコ社、カールズバッド、カリフォルニア州）からなる。プラークアッセイのオーバーレイ培地は、、ｄＨ２Ｏ中で終濃度が１×培地及び０．９％アガロースである前述のＥ−ＭＥＭ培地（２×濃度）と１．８％Ｎｏｂｌｅ  Ａｇａｒ（カタログ番号１０９０７、ＵＳＢ社、クリーブランド、オハイオ州）との１：１（ｖｏｌ：ｖｏｌ）混合物からなる。これらの実験に用いたＤＡＳ１８１のロットは、濃度２５．５ｍｇ／ｍＬで２００９年１月２０日に調製されたＬｏｔ＃２００８０７１５であった。
【００７８】
抗体及び染色試薬：ＴＣＩＤ５０プレート染色では、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ分析キットをメーカーの指示書に従って用いた（カタログ番号３１３７、ミリポア社、テメキュラ、カリフォルニア州）。
【００７９】
以下の実施例３〜１０では、ネブライザー及びＤＡＳ１８１の液体製剤又はドライパウダー吸入器及びＤＡＳ１８１の乾燥製剤のいずれかを用いてＤＡＳ１８１処置したＥＩＮＤ患者のサブセットの結果を説明する。
【００８０】
実施例３−噴霧化ＤＡＳ１８１を用いた患者１の処置
ＰＩＶ３感染を診断された１８ヶ月の乳児（女性）でＤＡＳ１８１処置を開始した。この乳児は、同時に急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）も診断された。既存の動物毒性学データに基づいて最初の保存的投薬プランを作製した。患者の年齢のため、薬物は噴霧化形態でしか送達することができなかった。この症例で用いたネブライザーを表１に示す。
【００８１】
2015508780.tif 000005
【００８２】
患者に挿管している間に最初の投薬プランを作製した。利用可能な毒性学の情報に基づいて２分間の投薬で開始するように勧められた。０．３５ｍＬ／分のアウトプットで、呼吸可能（１〜５μｍ）な割合は０．２４ｍＬ／分であり、これは１分当たり０．１６ｍｇのＤＡＳ１８１の送達に相当する。２分間の投薬で、０．３２ｍｇのＤＡＳ１８１呼吸用エアゾールが送達されるように噴射された（合計０．４６ｍｇのＤＡＳ１８１が送達）。
【００８３】
フォローアップ投薬プラン：
有害作用の症状が観察されず、患者が臨床的に安定していた場合、噴霧化の時間を４分間に延ばし、その後の２日間、再度症状をモニタリングした。
【００８４】
最初の３日間の投薬後、ＰＩＶ３に特異的な定量ＰＣＲによる測定で、ＰＩＶウイルス量は実質的に低下していた。患者は最初ウイルス量が非常に高かったが（気管呼吸中１０９／ｍＬ）、投薬最終日の後の２日以内に、このレベルは５ｌｏｇ以上（１０４コピー／ｍＬに）低下した。しかし、最初の投薬を中止した後、患者のウイルス量はリバウンドし、このことは、最初の投薬が感染を排除するのに充分でなかったことを示している。この期間中、患者は臨床的に改善し、わずかによりクリアな胸部Ｘ線を示した。更に、これらの最初のＤＡＳ１８１投薬後に人工呼吸器サポートの改善が観察された。ウイルスの排除がなかったこと及び患者の臨床状態から、患者へのＤＡＳ１８１の投薬を続けることが推奨された。
【００８５】
患者に再度４分間投薬した。穏やかな臨床的改善が観察されたが、定性的ＤＦＡ及び定量的ＰＣＲ評価の両方で患者はまだＰＩＶ陽性であった。患者に５回目のＤＡＳ１８１投薬を行った。患者の臨床状態は改善し続け、５回投薬後に患者から抜管した。
【００８６】
ＤＡＳ１８１の１回の断続的投薬後には、臨床的改善が見られたものの、患者のＰＩＶウイルス量はわずかに低下しただけであった（約１ｌｏｇ）。患者をＤＡＳ１８１でもう１コース処置することが推奨された。上記のように患者から抜管したので、投薬プランを少し修正した。
【００８７】
挿管していない若い子供では、患者のコンプライアンス、使い易さ、及び患者の快適さの点から、噴霧化した薬物を送達する最も容易な方法はマスクである。適切な投薬を推定するために、マスクを用いた送達効率並びに口腔及び鼻腔への薬物のロスを検討した。送達効率の低下を補うためにより長い投薬が必要であった。
【００８８】
粒子サイズが３〜５μｍのＤＡＳ１８１ドライパウダーの開発データから、送達される薬物の約３０〜３５％が口腔及び中咽頭に堆積することが示された。文献データも、理想的状況で子供にネブライザー及びマスクを用いた場合、肺への堆積は放出される用量の約４８％であることを示している。乳児の肺への薬物堆積に関する文献はかなりばらつきがあり、流量、乳児の協力、マスクのフィット／デザイン、及び投薬時間に大きく依存することに留意すべきである。送達効率の寄与因子を総合すると、送達効率の少なくとも５０％の低下が予想された。これに基づき、標準的なネブライザーをマスク装備と共に用いて８分間の投薬で開始することが推奨された。挿管しながらの患者への投薬と比べて、追加的な投薬時間により、口腔／鼻腔及びマスク環境への潜在的ロスを補った。投薬溶液標品には何の変更も加えなかった。８分間の投薬で、１．８ｍｇの総ＤＡＳ１８１が送達されると予想され、１．２５ｍｇのＤＡＳ１８１が呼吸可能な形態であると予想された。
【００８９】
１日１回（８分間）のＤＡＳ１８１投薬で５回患者を処置した。このラウンドの投薬後、各投薬の直前及び投薬後の日に患者から採取した鼻洗浄液サンプル中のウイルス量の定量的評価により示されたように、ＰＩＶ３ウイルス量は再度実質的に低下した（３ｌｏｇ超）。図１８（投薬日を赤色で示す）に示されるように、ウイルス量の減少は、最後の投薬後５日間低下し続け、投薬のかなり後まで低下し続けた。最終的に患者は退院し、ウイルス量は検出不能になるまで低下した。
【００９０】
この症例の結果は、挿管された患者及びマスクを用いた患者の両方への噴霧化ＤＡＳ１８１溶液の可能な送達方法を実証している。推定された投薬プランは正確であり、両方の方法で同等な量のＤＡＳ１８１が送達された。更に、これらのデータは、若い乳児におけるＤＡＳ１８１の使用を支持しており、この送達方法で用いた時の安全性、効果的な薬物送達、及び薬物の抗ウイルス作用を実証している。
【００９１】
実施例４−噴霧化ＤＡＳ１８１を用いた患者２の処置
患者は、ＡＭＬで末梢血液幹細胞の移植を受けた６１歳の男性であった。移植後の経過は、皮膚のＧＶＨＤ、ＲＳＶ肺炎、病因不明の肺小結節、及びＧＶＨＤによるものと思われる膀胱の症状のエピソード（これに対して患者はステロイドで処置されている）を合併していた。翌年、患者は咳、呼吸困難、及び胸部痛により外部の病院に来た。患者はＢＡＬの経験があり、アデノウイルス肺炎の可能性に対してシドホビルを開始しており、進行性の呼吸不全で７月１日に病院を移った。患者は血中アデノウイルス（８６，０００コピー／ｍｌ）を有することが見出され、ＰＣＲにより上咽頭サンプル中にアデノウイルス（Ｃｔ＝３８．４）及びＰＩＶ−３（Ｃｔ＝３２．３）を有していた。シドホビルが続けられた（１ｍｇ／ｋｇ、週３回）。患者に挿管し、この時点でＢＡＬはアデノウイルス又は他の病原体を示さなかったが、ＤＦＡ及びＰＣＲによりＰＩＶ−３陽性であった（Ｃｔ＝１８．８）。処置前、患者の状態は徐々に悪化してきており、換気サポート（ＦＩＯ２＝約９０％、１０ｍｍ  ＰＥＥＰ）の必要性が増してきていた。気管吸引物はＣｔ＝１３でＰＩＶ３に陽性であり、おそらく非常に高いウイルス量であった。
【００９２】
インラインネブライザーを介して１日１回ＤＡＳ１８１を与えるものとした。溶液中のＤＡＳ１８１濃度は１．２９ｍｇ／ｍＬとした。１日目に１．５ｍｌを送達するものとし、２日目は用量を２．５ｍｌに増やすものとした。３〜５日目の推奨用量は２．５〜５ｍｌであり、最後の用量は患者の臨床反応に基づいて選択した。ウイルス量、検査室分析、及び臨床観察を毎日行うものとした。
【００９３】
噴霧化ＤＡＳ１８１（１．５ｍＬ）で１日処置した後、患者は薬物に良く耐え、ウイルス量は約１ｌｏｇ低下した。０．３５ｍＬ／分のアウトプット速度で、この量を約４分間投薬した。その結果の用量は、呼吸可能な範囲に約１．３ｍｇのＤＡＳ１８１であった。
【００９４】
２回目の投薬（２．５ｍＬ、呼吸可能な範囲に２．２ｍｇのＤＡＳ１８１）後、患者は生きており、患者の酸素化（ｏｘｙｇｅｎａｔｉｏｎ）がわずかに改善され、（ＦｉＯ２＝０．９、ＰＥＥＰが、飽和度９３％で１．０の代わりに１０、飽和度８８〜９０％で１２））、患者の肺コンプライアンスが改善された（１回呼吸量が、圧力調整２０で３８０から圧力調整１８で４３０へ）点でわずかに良いと記録された。患者の胸部Ｘ線写真は、びまん性の浸潤を有し続けていたが、肺の上側の両側で密度が低くなっていたかも知れない。以下の表２に示すように、２回の投薬後にウイルス量は１ｌｏｇ超低下していた。
【００９５】
2015508780.tif 000006
【００９６】
２回目のＤＡＳ１８１投薬後、患者の家族は全ての延命措置の中止を望むと決断した。したがって、これ以上ＤＡＳ１８１は投薬しなかった。
【００９７】
実施例５−噴霧化ＤＡＳ１８１を用いた患者３の処置
この患者は、間質性肺疾患の可能性があると評価された４７歳の女性であった。この患者は、過敏性肺炎の可能性が診断され、ステロイドで処置された。患者は呼吸不全で入院した。この患者から回収したＢＡＬは、定性的ＰＣＲ（呼吸器系ウイルスパネル）でＰＩＶ−３に陽性であった。他の診断検査は全て陰性であった。この患者でびまん性肺炎が観察され、患者は酸素化のためにＥＣＭＯに維持された。
【００９８】
この患者に提唱された投薬は、患者の肺機能状態の悪化のため、ネブライザーを介したＤＡＳ１８１の投与であった。最初の用量は、濃度１．３ｍｇ／ｍＬの１．５ｍＬのＤＡＳ１８１ストック溶液とし、総用量は呼吸可能範囲に１．３ｍｇ  ＤＡＳ１８１である。２回目の用量は、患者の状態及び検査室での読取から２．５ｍＬに増やすものとした（２．５ｍＬのストック溶液は、呼吸可能範囲の２．２ｍｇのＤＡＳ１８１に等しい）。３〜５日目の用量は２．５〜５．０ｍＬとした。エアロゲン社（Ａｅｒｏｇｅｎ）製Ｐｒｏ−Ｘネブライザーシステムをメーカーの指示書及び臨床現場の推奨に従って用いるものとした。
【００９９】
ＤＡＳ１８１を５日間投薬した後、患者は処置期間の大半でＥＣＭＯに維持されたままであった。患者の胸部Ｘ線は最初の３回の投薬後に改善しているようであった。何らかの急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）が起こっていることが疑われ、患者の肺状態の不良には複数の要因があると結論付けられた。処置コースの終了後、患者はＥＣＭＯを外し、マスクによる酸素補充を用いて呼吸できるようであった。これは患者の臨床状態の顕著な改善であった。
【０１００】
この患者から得られた実験結果を表３に要約する。ウイルス学的結果は、各日の投薬直前の対象から回収した咽喉スワブサンプルから得られた（２つのスワブを３ｍＬの標準コパン社（Ｃｏｐａｎ）製ウイルス輸送培地に接種した）。
【０１０１】
2015508780.tif 000007
【０１０２】
上記表に示したデータを図１９に示す。
【０１０３】
実施例６−噴霧化ＤＡＳ１８１を用いた患者４の処置
患者４は、７ヶ月の男性であり、基礎疾患としてＳＣＩＤＳ（Ｔ−／Ｂ＋ＮＫ−）を有し、骨髄移植後ＧＶＨＤを合併しており、持続性のＰＩＶ３感染で来院した。ＤＡＳ１８１処置前にＰＩＶ３感染は約６週間持続し、患者は全期間にわたり持続的に酸素を必要とした。患者は、機械的換気が必要なまで進行し、更に肺炎が診断され、これはステロイド及び抗生物質による２１日間の処置コースで処置された。患者はＩＶＩＧを受けたが、パラインフルエンザは持続した。胸部Ｘ線が異常で持続的に低酸素であり、持続的な酸素の補充が必要であったが、患者から抜管した。患者は、自家骨髄移植を受け骨髄移植後のＧＶＨＤに免疫抑制を受けた後、更に病気が悪化した。呼吸器系フィルムアレイＰＣＲによりＤＡＳ１８１処置の前にＰＩＶ３感染が確認された。更に、直接蛍光分析（ＤＦＡ）によりＰＩＶ３が確認された。
【０１０４】
追加的な５日間の投薬によるフォローアップ処置コースをオプションとする、ネブライザーにより送達される溶解したＤＡＳ１８１ドライパウダーの最初の５日間のコースが推奨された。このＥＩＮＤに対するＦＤＡの承認を得た。薬物はＡｅｒｏｎｅｂネブライザーを用いてマスクを介して投与された。
【０１０５】
最初のＤＡＳ１８１投薬（１．５ｍＬ；１．９ｍｇ  ＤＡＳ１８１）は有害作用なしになされた。その後、次の４回の投与を行った（１．５ｍＬ；１．９ｍｇ  ＤＡＳ１８１）。この最初の５日間の投薬中、患者は中程度の臨床的改善の徴候を示し始めた。肺のクラックルが存在したが、３回目のＤＡＳ１８１が投与されるまでに解消された。しかし、患者は、最初の５日間の投薬中、症候性のままであり、酸素補充（大流量鼻腔カニューレを介して４〜６Ｌ）が必要なままであった。処置経過中、試験薬に関連した有害作用は観察されなかった。医師は、もう１回の投薬ラウンド分、ＤＡＳ１８１処置を続けることを推奨した。
【０１０６】
マスクを用いて更に４回ＤＡＳ１８１を投与した（１．５ｍＬ、１．９ｍｇ  ＤＡＳ１８１）。アルカリホスファターゼレベルの上昇により、最後の３回のＤＡＳ１８１処置中はＤＡＳ１８１を隔日で投与した。この処置経過中、患者は実質的な臨床的改善を示しているようであった。酸素補充の必要量は改善し始め、処置の最後にはたったの０．５Ｌ／分に低下した。胸部Ｘ線及び一般的観察の両方で肺機能も実質的な改善が報告された。患者は更に、処置経過中、咳が減少し、患者の呼吸パターンはより正常になった。
【０１０７】
この患者のウイルス量の結果をＤＦＡ（半定量的）及びｑＰＣＲ（定量的）による評価から得た。上咽頭サンプルを毎日ｑＰＣＲで検査し、必要に応じてＤＦＡで検査するものとした。以下の表４に、各評価から得られたウイルス量の結果を要約する。ＤＦＡの結果は、陰性（感染が全く観察されない）から４＋（視野中の細胞の１００％がＰＩＶ陽性）の間で測定されている。ｑＰＣＲの結果はＲＮＡコピー／ｍＬで測定されている。上咽頭スワブを両方の評価に用いた。
【０１０８】
2015508780.tif 000008
【０１０９】
全体として、患者は処置の間ずっと顕著な臨床的改善を示し、アルカリホスファターゼの顕著な増加以外、薬物の有害作用は報告されなかった。ウイルス学的結果は幾分異なり、ＤＦＡの評価はウイルス感染の実質的な低減を示し、処置の終了までに陰性のＤＦＡ結果になったが、ｑＰＣＲの結果は、処置経過の最後にサンプル中にウイルスが依然として存在することを示している。この時点ではなぜ結果が異なるのかは分かっていない。この矛盾する結果はＤＦＡ評価が能動的に感染したインタクトな細胞を測定するのに対してＰＣＲは感染性であるかどうかに関わらずサンプル中の全ウイルスＲＮＡを測定するということによるものである可能性がある。
【０１１０】
実施例７：ドライパウダーＤＡＳ１８１を用いた患者５の処置
患者５は、左肺の移植を受けた、クローン病、糖尿病、及び間質性肺疾患の病歴がある５９歳の男性であった。患者は、重度のクローン病に対する毎月のアダリムマブ療法に加えて、毎日５ｍｇのタクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、及びプレドニゾンの慢性維持免疫抑制レジメンで維持されていた。患者の移植後の経過は、気管支軟化症並びに呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）肺炎及びクレブシエラ肺炎を含む複数の気道感染症を合併していた。患者は、これらの呼吸器系感染症の後、ほぼ自身のベースラインに戻った。
【０１１１】
患者は、発熱、悪寒、及び膿性痰を発症して入院した。患者は、バンコマイシン、セフタジジム、及びレバフロキサシンを用いた経験的治療により熱が下がり、膿性痰から回復したが、労作後の呼吸困難、喘鳴音、及び咳の改善は遅かった。患者は、無熱性であったが、２リットルの酸素要求並びに肺検査における喘鳴音及びクラックルを有していた。胸部のコンピュータ断層撮影スキャンを行い、左下葉に炎症性とみられる浸潤が示された。患者はバンコマイシン、セフタジジム、及びレボフロキサシンを受け続けた。患者は気管支鏡検査を受け、黄色がかった分泌物を有することが確認された。患者の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）試料の定性的ＰＣＲによる検査の結果、パラインフルエンザ−３（ＰＩＶ３）について陽性であった。全ての他の培養物及びウイルス実験からは何も明らかにならなかった。
【０１１２】
反応及び有害作用に応じて、３〜５日間、１０ｍｇ  ＤＡＳ１８１の投薬レジメンが提唱された。薬物はドライパウダー吸入器を介して投与するものとし、症候学及び安全性に基づいて追加的な処置経過を認めてもよい。上咽頭スワブを毎日回収してＰＩＶ−３の定量的ウイルス量を決定するものとした。毎日の実験（全血球計算、包括的化学、肝機能検査、ＰＴ、及びＰＴＴを含む）も行うものとした。ベースライン及び毎日の肺機能検査も行うものとした。
【０１１３】
処置直前に得られたバイタルサインから、患者が鼻腔カニューレによる２リットルの補充Ｏ２を必要とすることが示された。患者の最初のＤＡＳ１８１投薬の前に得られた肺機能検査から、ＦＥＶ１が１．５２リットル、ＦＶＣが１．７０リットルであることが示された。
【０１１４】
各投薬の前に以下のサンプルを回収した：ウイルス排出をモニタリングするための上咽頭（Ｎ／Ｐ）スワブ及び中咽頭（ＯＰ）洗浄液並びにＤＡＳ１８１レベルを調べるための血液サンプル。吸入訓練にＩｎ−Ｃｈｅｃｋ  ＤＩＡＬを用いた。Ｃｙｃｌｏｈａｌｅｒ及び空のカプセルを用いた吸入技術の更なる満足な訓練後、Ｃｙｃｌｏｈａｌｅｒを介してＤＡＳ１８１を投与した。患者はＤＡＳ１８１投与に対する即時反応を示さなかった。
【０１１５】
明らかな有害事象なしに、患者は連続５日処置を受けた。患者は、呼吸器系及び全身の点で処置経過中、臨床的に改善した。処置の２日目までに、患者は呼吸困難を感じることが少なくなり、咳がより乾燥した。処置の最終日までに、患者は、エネルギー及び呼吸の点で自身のベースラインの約９０％にまで戻っていると感じた。ＤＡＳ１８１開始後６日目に、気管支鏡検査を行い、ＢＡＬ液は再度、ＰＩＶ３陽性であり、ウイルス量は３．５０Ｅ＋０７であった。
【０１１６】
ＤＡＳ１８１処置終了の２日後、患者は退院した。患者の処置後のバイタルサインは全て改善を示しており、処置の２週間後に電話で接触した時、患者は再発の徴候がなく、気分が良いと報告した。患者の運動耐容能は、病気前の自身のベースラインレベルに戻った。全体として、患者は、処置後の酸素要求に関しても改善された。
【０１１７】
鼻咽頭スワブ及び上咽頭洗浄液サンプルをＰＩＶ３ウイルス量検査に送った。結果を以下の表に要約する。
【０１１８】
2015508780.tif 000009
【０１１９】
定量的ＰＩＶ３ウイルス量測定値は日によって幾分のばらつきがあったが、これは異なる供給者によるサンプル回収技術の差及びサンプル中のビリオンの小さな変動に対するアッセイ自体の優れた感度によるものと思われる。データは、サンプルの種類に関係なくウイルス量の１ｌｏｇ以上の低下を示唆している。
【０１２０】
実施例８：ドライパウダーＤＡＳ１８１を用いた患者６の処置
患者６は、乳癌の病歴及び同種ＨＳＣＴ後の処置に関連するＡＭＬがある５１歳の女性であった。白血病の寛解にも関わらず、患者は、ミコフェノール酸モフェチル、イマチニブ、及び慢性ステロイドによる処置が必要な慢性的な慢性移植片対宿主病及び閉塞性細気管支炎症候群を発症していた。患者は、日常生活の基本的活動を行えないほどに、呼吸困難の急激な増加を発症していた。患者は更に、新規に発熱及び持続性乾性咳嗽を発症した。患者は更なるケアのために入院した。胸部ＣＴにより、広汎なすりガラス様陰影及びいくつかの気管支血管の結節状陰影が示された。入院時の上咽頭スワブのＰＣＲは、パラインフルエンザ１（ＰＩＶ１）について陽性であり、インフルエンザ及びＲＳＶについて陰性であった。気管支肺胞洗浄を行い、ＰＩＶ１のＰＣＲは再度陽性であった。患者は持続性の乾性咳、労作時呼吸困難、及び２Ｌの補充酸素の要求を示した。
【０１２１】
提唱された投薬レジメンは、反応及び有害作用が確認されたかどうかに応じて最大５日間、ドライパウダー吸入器を介した毎日１０ｍｇのＤＡＳ１８１送達であった。定量的パラインフルエンザウイルスＰＣＲの決定及びウイルス培養のために上咽頭スワブサンプルを得るように計画した。全血球計算及び包括的化学を含む安全性実験を行うものとした。ベースライン及び治療中の毎日の肺機能検査を行うものとした。患者の症候学及び安全性が決定されるまで、追加的な５回のＤＡＳ１８１投薬を可能性として残した。
【０１２２】
各投薬の前に、上咽頭（ＮＰ）スワブ、中咽頭洗浄液（ＯＰ）、及び血中ＤＡＳ１８１のＰＫサンプルを含むサンプルを回収した。吸入の訓練にＩｎ−Ｃｈｅｃｋ  ＤＩＡＬを用いた。肺機能検査（ＰＦＴ）も行った。処置の１日目の結果は以下の通り：１秒量（ＦＥＶ１）＝０．７８；努力肺活量（ＦＶＣ）＝１．７８。充分であると見なされるまでＣｙｃｌｏｈａｌｅｒ及び空のカプセルを用いて吸入技術を更に訓練した後、臨床現場でＣｙｃｌｏｈａｌｅｒを用いたＤＡＳ１８１カプセルの投与へと進めた。患者は、カプセルの内容物を空にするのに３回の吸入を必要とした。患者が投与に対する即時反応を示さなかった。
【０１２３】
患者は、明らかな有害事象なしに連続５日間処置を受けた。患者は処置経過中に臨床的に改善した。処置２日目までに、患者は自覚的な息切れが少なくなり、退院した。患者は３〜４日目にＤＡＳ１８１処置を自己投与した。処置の最終日までに、患者は、運動耐容能がわずかに上昇して、はるかに気分良く感じるようになったが、自身の呼吸器系のベースラインまでは戻らなかった。分泌物及び咳は減少した。処置最終日のＰＦＴでは、ＦＥＶ１が０．８３Ｌ、ＦＶＣが１．９６Ｌであった。最後の投薬の４日後に患者を評価したところ、患者の症状は更に改善されていた。医師は数日後に患者に電話し、患者は、薬物に関連した有害作用もなく、気分が良いと述べた。患者の息切れは実質的に改善され、患者は自身の慢性肺移植片対宿主病及び閉塞性細気管支炎症候群を処置するためのステロイドの用量を減らすことができた。
【０１２４】
上咽頭及び中咽頭サンプルを、ＰＩＶ−１ウイルス量の検査に送り、以下の結果を得た。
【０１２５】
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【０１２６】
上咽頭及び中咽頭のどちらのＰＩＶウイルス量も、ＤＡＳ１８１処置後の実質的な低下を示し、これは患者の顕著な臨床的改善と並行していた。
【０１２７】
実施例９：ドライパウダーＤＡＳ１８１を用いた患者７の処置
患者７は、右肺移植を受けた特発性肺線維症（ＩＰＦ）の病歴がある６４歳の女性であった。患者の最初の移植後の経過は、プラズマフェレシス及びＩＶＩＧにより管理される急性体液性拒絶反応を合併しており、ＭＭＦ又はイムランに耐えることができず、そのためプレドニゾン及びタクロリムスで維持されていた。入院の数週間前、患者の夫は上気道感染症になり、順調に回復した。その後、患者は息切れ及び咳の増加を経験し始め、８０％の在宅酸素療法（ｈｏｍｅ  Ｏ２  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ）を受け、その後、臨床施設に入院した。気管支鏡検査（ＢＡＬ）では、細菌若しくは真菌感染症又はＰＪＰの証拠は示されなかったが、ＰＣＲではＰＩＶ３陽性であった。その後、患者は悪化する低酸素症を発症し、大流量酸素サポート及びモニタリングのために集中治療室に移された。患者は大流量酸素サポートを必要としつづけ、改善の証拠はなく、ＦｉＯ２は６５％のままであった。患者の免疫抑制は可能な限り最低限に抑えられていた。
【０１２８】
ＤＡＳ１８１の投薬を開始した。患者はＤＡＳ１８１を５回投薬された（ドライパウダー吸入器を用いて１０ｍｇ／日）。患者は薬物を投与され、非常に良く反応し、ウイルス学的パラメーター及び臨床的パラメーターの両方が急速に改善された。患者は薬物に関連する有意な有害作用を示さなかった。ＰＩＶ３ウイルス量の顕著な改善が観察された。これを図２０に示す。
【０１２９】
投薬、同時の関連する薬物適用、ウイルス量、及びサポート酸素要求の概要を図２１に示す。図に見られるように、ウイルス量及び必要な酸素サポートはＤＡＳ１８１投薬後に顕著に下がった。
【０１３０】
実施例１０：ドライパウダーＤＡＳ１８１を用いた患者８の処置
患者８は、再発性疾患に同種ＨＳＣＴを受けたホジキン病の病歴がある５７歳の男性であった。患者はその後再発し、ドナーリンパ球輸注を受けた。患者の臨床経過は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を合併していた。
【０１３１】
患者は、息切れ、咳、喀血、及び新たに発症したネフローゼ症候群を愁訴として入院した。気管支肺胞洗浄を伴う気管支鏡検査は、びまん性肺胞出血を示していた。胸部ＣＴスキャンは、広汎なすりガラス様陰影が顕著であり、患者は、ＢＡＬ液のＰＣＲによりパラインフルエンザ３型が確認された。患者の臨床状態は悪化しており、５リットル／分の酸素（Ｏ２）を必要とし、９３％の飽和度であった。患者の酸素飽和度は最低限の活動で８０台に低下した。
【０１３２】
この患者の症例におけるＤＡＳ１８１の使用はＦＤＡにより認証された。承認された投薬レジメンは、連続５日間のＤＡＳ１８１ドライパウダー投与であった。ウイルス量を評価するために各投薬の前に上咽頭スワブサンプルを回収した。Ｃｙｃｌｏｈａｌｅｒを用いた吸入技術の充分な訓練後、ＤＡＳ１８１を投与した。患者は投与に対する即時反応を示さなかった。患者は明らかな有害事象なしに連続５日間の処置を受けた。患者はＤＡＳ１８１の最後の投薬を受け、臨床的な改善後、退院した。
【０１３３】
上咽頭サンプルを１ｍＬ当たりのＰＩＶ３  ＲＮＡコピー数について評価し、ウイルス量の実質的な低下が示され、これは最終的に検出不可能なタイターになった。
【０１３４】
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【０１３５】
上の表に見られるように、５日間のＤＡＳ１８１ドライパウダー処置後にウイルス量は検出不能なまでに低下した。このウイルス量の低下は更に、臨床的改善及びその後のこの患者の退院とも関連していた。患者は更に、ＤＡＳ１８１処置の前には実質的な酸素補充サポートを必要としたが、これは処置後に軽減された。
【０１３６】
実施例１１−ＤＡＳ１８１の調製
エアゾール製剤中で用いるためのＤＡＳ１８１の調製
ＤＡＳ１８１（１．０〜１０．０ｍｇ／ｍＬ）のストック水溶液は少なくとも１週間２〜８℃で保存することができる。より低濃度の投薬溶液を毎日新たに調製し、使用時まで周囲条件で貯蔵するか冷蔵する。投薬溶液を得るために、ストック溶液を生理食塩水又は他の製薬用の好適な水溶液中に希釈することができる。
【０１３７】
ＤＡＳ１８１は、そのＮ末端を介してＡｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  Ｖｉｓｃｏｓｕｓの触媒ドメインのＣ末端に融合したヒトアンフィレギュリンに由来するヘパリン（グリソサミノグリカン、すなわちＧＡＧ）結合ドメインを含む、融合タンパク質である（アミノ末端Ｍｅｔを有するＤＡＳ１８１のアミノ酸配列を配列番号１に示し；アミノ末端Ｍｅｔを欠いたＤＡＳ１８１のアミノ酸配列を配列番号１に示す）。
【０１３８】
ＤＡＳ１８１タンパク質は、その全体を参照により本明細書に援用するＭａｌａｋｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  １４７０−１４７９に記載されているように調製及び精製することができる。簡潔に述べると、アミノ末端Ｍｅｔを有するＤＡＳ１８１をコードするＤＮＡ断片を、プラスミドベクターｐＴｒｃ９９ａ（ファルマシア社製）にＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）誘導プロモーターの制御下でクローニングした。得られたコンストラクトを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＢＬ２１株中で発現させた。ＤＡＳ１８１タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞を、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌバッファー１、ＵＦＰ−５００−Ｅ５５中空繊維カートリッジ（ＧＥヘルスケア社製）、及びＷａｔｓｏｎ−Ｍａｒｌｏｗ蠕動ポンプを用いた発酵回収洗浄ステップ中でダイアフィルトレーションにより洗浄した。組換えＤＡＳ１８１タンパク質は、その全体を参照により本明細書に援用する公開されている米国特許出願公開第２００５／０００４０２０号及び同第２００８／００７５７０８号に記載されているように細胞からバルク（ｂｕｌｋ）で精製することができる。
【０１３９】
他の実施形態
発明をその詳細な説明との関連で説明したが、上記の説明は例示であり、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の範囲を限定しないと理解されるべきである。他の態様、利点、及び変更例が添付の特許請求の範囲に含まれる。
【０１４０】
2015508780.tif 000012
【０１４１】
2015508780.tif 000013
【図１】
2015508780.tif 000014
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2015508780.tif 000024
【図１２】
2015508780.tif 000025
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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