(57)【要約】神経内分泌腫瘍を処置する新規の方法を提供する。1つの態様では、前記方法は、それを必要とする対象に、治療に有効な用量のWntアンタゴニストを投与する工程を含む。1つの態様では、Wntアンタゴニストは抗FZD抗体である。別の態様では、Wntアンタゴニストは可溶性FZD受容体ポリペプチドである。さらなる態様では、Wntアンタゴニストは抗Wnt抗体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)少なくとも1種のfrizzled(FZD)受容体に特異的に結合する抗体または(ii)可溶性FZD受容体である、神経内分泌癌の処置における使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項２】
(i)少なくとも1種のfrizzled(FZD)受容体に特異的に結合する抗体または(ii)可溶性FZD受容体である、神経内分泌癌の成長の阻害における使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項３】
抗体が、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される1種または複数種のヒトFZD受容体に特異的に結合する、請求項1または請求項2に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項４】
抗体が、
(a)
2015536933.tif 000147
を含む重鎖CDR1、
2015536933.tif 000148
を含む重鎖CDR2、および
2015536933.tif 000149
を含む重鎖CDR3、ならびに
2015536933.tif 000150
を含む軽鎖CDR1、
2015536933.tif 000151
を含む軽鎖CDR2、および
2015536933.tif 000152
を含む軽鎖CDR3;または
(b)
2015536933.tif 000153
を含む重鎖CDR1、
2015536933.tif 000154
を含む重鎖CDR2、および
2015536933.tif 000155
を含む重鎖CDR3、ならびに
2015536933.tif 000156
を含む軽鎖CDR1、
2015536933.tif 000157
を含む軽鎖CDR2、および
2015536933.tif 000158
を含む軽鎖CDR3を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項５】
抗体が、
(a)SEQ ID NO:37のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域;および/または
(b)SEQ ID NO:38もしくはSEQ ID NO:44のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域
を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項６】
抗体が、
(a)SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含む重鎖;および/または
(b)SEQ ID NO:40もしくはSEQ ID NO:45のアミノ酸配列を含む軽鎖
を含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項７】
抗体が、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、IgG1抗体、IgG2抗体、および/または抗体断片である、請求項3〜6のいずれか一項に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項８】
抗体がOMP-18R5である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項９】
可溶性FZD受容体がヒトFZD8のFriドメインを含む、請求項1または請求項2に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項１０】
可溶性FZD受容体がヒトFcドメインをさらに含む、請求項9に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項１１】
FZD8 FriドメインがSEQ ID NO:28のアミノ酸配列を含む、請求項9または請求項10に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項１２】
ヒトFcドメインがSEQ ID NO:95のアミノ酸配列を含む、請求項10または請求項11に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項１３】
可溶性FZD受容体がSEQ ID NO:117のアミノ酸配列を含む、請求項1または請求項2に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項１４】
可溶性FZD受容体がOMP-54F28である、請求項1または請求項2に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項１５】
神経内分泌癌が、膵神経内分泌癌、カルチノイド癌、胃腸膵神経内分泌癌、クロム親和性細胞腫、パラガングリオーマ、甲状腺髄様癌、肺神経内分泌癌、および胸腺神経内分泌癌からなる群より選択される、請求項1〜14のいずれか一項に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項１６】
神経内分泌癌が膵神経内分泌癌である、請求項15に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項１７】
神経内分泌癌がカルチノイドである、請求項15に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項１８】
Wntアンタゴニストと組み合わせて少なくとも1種のさらなる治療剤を使用する工程をさらに含む、請求項1〜17のいずれか一項に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項１９】
さらなる治療剤が化学療法剤である、請求項18に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項２０】
さらなる治療剤が、
(a)アルブミン結合パクリタキセル(ABRAXANE);
(b)ゲムシタビン;または
(c)アルブミン結合パクリタキセルおよびゲムシタビン
である、請求項18または請求項19に記載の使用のためのWntアンタゴニスト。
【請求項２１】
神経内分泌癌を処置するためのWntアンタゴニストを含む薬学的組成物であって、Wntアンタゴニストが、(i)少なくとも1種のfrizzled(FZD)受容体に特異的に結合する抗体または(ii)可溶性FZD受容体である、薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2012年10月23日に出願された米国特許仮出願第61/717,294号および2013年2月4日に出願された米国特許仮出願第61/760,529号の優先権の恩典を主張する。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明の分野は、概して、神経内分泌腫瘍を処置する方法に関する。1つの態様では、前記方法は、それを必要とする対象に、治療に有効な用量のWntアンタゴニストを投与する工程を含む。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
癌は、先進諸国の主要な死因の1つであって、米国だけでも毎年100万人以上が癌と診察され、500,000人が死亡する。通算して、3人のうち1人より多くが一生のうちになんらかの形の癌を発病するであろうと推測される。200種を上回る様々なタイプの癌が存在し、それらのうちの4つ、すなわち乳房、肺、結腸直腸、および前立腺の癌が全ての新患の半分以上を占める(Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26(非特許文献1))。
【０００４】
Wntシグナル伝達経路は、癌治療法の潜在的な標的として特定されている。Wntシグナル伝達経路は、胚パターン形成、後胚組織の維持、および幹細胞生物学機能のいくつかの重要な制御因子の1つである。より具体的には、Wntシグナル伝達は、幹細胞集団による自己複製を含む、細胞極性の発生および細胞運命の決定において重要な役割を果たしている。Wnt経路の無秩序な活性化は非常に多くのヒト癌と関連しており、腫瘍細胞の発生運命を変えて、腫瘍細胞を未分化かつ増殖性の状態に維持し得る。従って、発癌は、幹細胞による正常な発生および組織修復を制御するホメオスタシス機構に取って代わることで進行し得る(Reya & Clevers, 2005, Nature 434:843(非特許文献2); Beachy et al., 2004, Nature 432:324(非特許文献3)において概説されている)。
【０００５】
Wntシグナル伝達経路は、ショウジョウバエ(Drosophila)発生変異体であるwingless(wg)において、およびマウス癌原遺伝子int-1(現在はWnt1)から最初に解明された(Nusse & Varmus, 1982, Cell 31:99-109(非特許文献4); Van Ooyen & Nusse, 1984, Cell 39:233-40(非特許文献5); Cabrera et al., 1987, Cell 50:659-63(非特許文献6); Rijsewijk et al., 1987, Cell 50:649-57(非特許文献7))。Wnt遺伝子は分泌型脂質修飾型糖タンパク質をコードし、このうち19種が哺乳動物において同定されている。これらの分泌型リガンドは、Frizzled(Fzd)受容体ファミリーメンバーおよび低密度リポタンパク質(LDL)受容体関連タンパク質5または6(LPR5/6)からなる受容体複合体を活性化する。Fzd受容体はGタンパク質共役受容体(GPCR)スーパーファミリーの7回膜貫通ドメインタンパク質であり、システインリッチドメイン(CRD)またはFriドメインとして知られる10個の保存システインを有する大きな細胞外N末端リガンド結合ドメインを含有する。10種のヒトFZD受容体、FZD1〜10がある。異なるFzd CRDは、特定のWntに対して異なる結合親和性を有する(Wu & Nusse, 2002, J. Biol. Chem. 277:41762-9(非特許文献8))。Fzd受容体は、古典的β-カテニン経路を活性化するもの、および下記の非古典的経路を活性化するものにグループ分けされている(Miller et al., 1999, Oncogene 18:7860-72(非特許文献9))。FZDリガンドに結合する受容体複合体を形成するために、FZD受容体は、4つの細胞外EGF様ドメインが6個のYWTDアミノ酸反復で分けられている1回膜貫通タンパク質であるLRP5/6と相互作用する(Johnson et al., 2004, J. Bone Mineral Res. 19:1749(非特許文献10))。
【０００６】
Wnt/β-カテニンシグナル伝達経路は胃腸カルチノイド腫瘍の発症に結び付けられてきた。Fujimori et al., Cancer Res. 61(18):6656-9 (2001)(非特許文献11)。胃腸カルチノイド腫瘍においてβ-カテニンタンパク質が核移行するが、β-カテニンおよびAPC変異が存在しないことも観察されている。Su et al., Ann. Surg. Oncol. 33 (12):1604-9 (2006)(非特許文献12)。72症例の胃腸カルチノイド腫瘍が免疫組織化学的に、およびβ-カテニンの直接配列決定によって調べられた。細胞質および/または核におけるβ-カテニン蓄積が57症例(79.2％)において観察された。β-カテニンエキソン3変異が27症例(37.5％)において検出され、APC変異が1症例(1.4％)において検出された。Suらは、β-カテニンタンパク質の免疫組織化学的検出ならびにβ-カテニン遺伝子エキソン3およびAPC遺伝子エキソン15の直接配列決定による91件の胃腸カルチノイド腫瘍および比較のために26件の胃腸外カルチノイド腫瘍の調査も報告した。β-カテニンの細胞質蓄積および/または核移行は27件の胃腸カルチノイド腫瘍(29.7％)において見出されたが、どの胃腸外カルチノイド腫瘍においても見出されなかった。β-カテニン核発現のある全ての症例においてβ-カテニン変異もAPC遺伝子変異も検出されなかった。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Jemal et al., 2003, Cancer J. Clin. 53:5-26
【非特許文献２】Reya & Clevers, 2005, Nature 434:843
【非特許文献３】Beachy et al., 2004, Nature 432:324
【非特許文献４】Nusse & Varmus, 1982, Cell 31:99-109
【非特許文献５】Van Ooyen & Nusse, 1984, Cell 39:233-40
【非特許文献６】Cabrera et al., 1987, Cell 50:659-63
【非特許文献７】Rijsewijk et al., 1987, Cell 50:649-57
【非特許文献８】Wu & Nusse, 2002, J. Biol. Chem. 277:41762-9
【非特許文献９】Miller et al., 1999, Oncogene 18:7860-72
【非特許文献１０】Johnson et al., 2004, J. Bone Mineral Res. 19:1749
【非特許文献１１】Fujimori et al., Cancer Res. 61(18):6656-9 (2001)
【非特許文献１２】Su et al., Ann. Surg. Oncol. 33 (12):1604-9 (2006)
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、神経内分泌腫瘍を処置する方法を提供する。従って、1つの局面において、本発明は、神経内分泌腫瘍を有効量のWntアンタゴニストと接触させる工程を含む、神経内分泌腫瘍の成長を阻害する方法を提供する。別の局面において、本発明は、神経内分泌腫瘍細胞を有効量のWntアンタゴニストと接触させる工程を含む、神経内分泌腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。別の局面において、本発明は、神経内分泌腫瘍細胞を有効量のWntアンタゴニストと接触させる工程を含む、神経内分泌腫瘍細胞の腫瘍形成能を低下させる方法を提供する。別の局面において、本発明は、神経内分泌腫瘍細胞を有効量のWntアンタゴニストと接触させる工程を含む、神経内分泌腫瘍細胞が分化するように誘導する方法を提供する。別の局面において、本発明は、神経内分泌腫瘍の成長を阻害する方法であって、それを必要とする対象に治療的有効量のWntアンタゴニストを投与する工程を含む方法を提供する。別の局面において、本発明は、神経内分泌腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、それを必要とする対象に治療的有効量のWntアンタゴニストを投与する工程を含む方法を提供する。別の局面において、本発明は、神経内分泌癌を処置する方法であって、それを必要とする対象に治療的有効量のWntアンタゴニストを投与する工程を含む方法を提供する。ある特定の態様では、対象はヒト対象である。
【０００９】
上述の局面または態様ならびに本明細書の他の場所に記載した他の局面および/または態様それぞれのある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は、低悪性度、中悪性度、または高悪性度の神経内分泌腫瘍である。さらなる態様では、神経内分泌腫瘍は機能性神経内分泌腫瘍または非機能性神経内分泌腫瘍である。さらなる態様では、神経内分泌腫瘍は、胃腸膵神経内分泌腫瘍、カルチノイド腫瘍、クロム親和性細胞腫、パラガングリオーマ、甲状腺髄様癌、肺神経内分泌腫瘍、および胸腺神経内分泌腫瘍からなる群より選択される。さらなる態様では、神経内分泌腫瘍はカルチノイド腫瘍または膵神経内分泌腫瘍である。
【００１０】
上述の局面または態様ならびに本明細書の他の場所に記載した他の局面および/または態様それぞれのある特定の態様では、Wntアンタゴニストは抗体である。さらなる態様では、Wntアンタゴニストは、少なくとも1種のヒトWntに特異的に結合する抗体である。さらなる態様では、Wntアンタゴニストは、少なくとも1種のヒトfrizzled受容体(FZD)に特異的に結合する抗体である。さらなる態様では、Wntアンタゴニストは可溶性FZD受容体である。
【００１１】
上述の局面または態様ならびに本明細書の他の場所に記載した他の局面および/または態様それぞれのある特定の態様では、Wntアンタゴニストは、少なくとも1種のヒトfrizzled受容体(FZD)に特異的に結合する抗体である。さらなる態様では、前記抗体は、少なくとも1種のヒトFZDの細胞外ドメインに特異的に結合する。さらなる態様では、前記抗体は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択されるヒトFZDに特異的に結合する。さらなる態様では、前記抗体はFZD7に特異的に結合する。さらなる態様では、前記抗体は複数種のヒトFZDに特異的に結合する。さらなる態様では、前記抗体は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される3種以上のヒトFZDに特異的に結合する。さらなる態様では、前記抗体は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される複数種のヒトFZDに特異的に結合する。さらなる態様では、前記抗体は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8に特異的に結合する。
【００１２】
さらなる態様では、前記抗体はFZDに対するリガンド結合をブロックする。さらなる態様では、前記抗体はFZDに対するWnt結合をブロックする。さらなる態様では、前記抗体はFZD活性化をブロックする。
【００１３】
さらなる態様では、前記抗体は、
(1)
2015536933.tif 000002
を含む重鎖CDR1、
2015536933.tif 000003
を含む重鎖CDR2、および
2015536933.tif 000004
を含む重鎖CDR3;ならびに/または
(2)(a)
2015536933.tif 000005
を含む軽鎖CDR1、
2015536933.tif 000006
を含む軽鎖CDR2、および
2015536933.tif 000007
を含む軽鎖CDR3;もしくは
(b)
2015536933.tif 000008
を含む軽鎖CDR1、
2015536933.tif 000009
を含む軽鎖CDR2、および
2015536933.tif 000010
を含む軽鎖CDR3を含む。さらなる態様では、前記抗体は、SEQ ID NO:37のアミノ酸配列を含むVH;および/またはSEQ ID NO:38もしくは44のアミノ酸配列を含むVLを含む。さらなる態様では、前記抗体は、SEQ ID NO:39のアミノ酸配列を含む重鎖;および/またはSEQ ID NO:40もしくは45のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【００１４】
さらなる態様では、前記抗体はモノクローナル抗体である。さらなる態様では、前記抗体は、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、または抗体断片である。さらなる態様では、前記抗体は単一特異性抗体または二重特異性抗体である。さらなる態様では、前記抗体は、IgA、IgD、IgE、IgG、またはIgM抗体である。さらなる態様では、前記抗体はIgG1またはIgG2抗体である。
【００１５】
さらなる態様では、WntアンタゴニストはOMP-18R5(「バンチクツマブ(vantictumab)」としても知られる)である。
【００１６】
上述の局面または態様ならびに本明細書の他の場所に記載した他の局面および/または態様それぞれのある特定の態様では、Wntアンタゴニストは可溶性FZD受容体である。さらなる態様では、可溶性FZD受容体はWntに結合する。さらなる態様では、可溶性受容体はヒトFZD受容体の細胞外ドメインの断片を含む。さらなる態様では、ヒトFZD受容体の細胞外ドメインの断片はヒトFZD受容体のFriドメインを含む。
【００１７】
さらなる態様では、ヒトFZD受容体は、FZD4、FZD5、およびFZD8からなる群より選択される。さらなる態様では、ヒトFZD受容体はFZD8である。さらなる態様では、FZD8 FriドメインはSEQ ID NO:28のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
さらなる態様では、可溶性受容体はヒトFcドメインをさらに含む。さらなる態様では、ヒトFcドメインはSEQ ID NO:95のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
さらなる態様では、WntアンタゴニストはOMP-54F28である。
【００２０】
上述の局面または態様ならびに本明細書の他の場所に記載した他の局面および/または態様それぞれのある特定の態様では、前記方法は、腫瘍または腫瘍細胞を第2の治療剤と接触させる工程、または第2の治療剤を対象に投与する工程をさらに含む。さらなる態様では、第2の治療剤は化学療法剤である。さらなる態様では、第2の治療剤は、キナーゼ阻害剤、ソマトスタチン類似体、またはmTOR経路阻害剤である。さらなる態様では、第2の治療剤はスニチニブ、オクトレオチド、またはエベロリムスである。さらなる態様では、第2の治療剤は抗体である。さらなる態様では、第2の治療剤は血管形成阻害剤である。
【００２１】
本発明の局面または態様がマーカッシュグループまたは代替物の他のグループで説明された場合、本発明は、列挙されたグループ全体を全体として含む、グループの各メンバーを個々に含む、メイングループの全ての可能性のあるサブグループを含むだけでなく、グループのメンバーの1つまたは複数が存在しないメイングループも含む。本発明はまた、本発明においてグループのメンバーのいずれか1つまたは複数の明確な除外も想定する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】神経内分泌腫瘍の成長に対するWnt阻害剤の効果。OMP-18R5抗FZD7抗体投与後に、膵神経内分泌腫瘍患者にある腫瘍病変の大きさが縮小した。OMP-18R5抗FZD7抗体処置の56日目および112日目における標的(T)病変および非標的(NT)病変の大きさのX線撮影評価。BLはOMP-18R5投与前の病変のベースライン大きさを示す。
【図１Ｂ】神経内分泌腫瘍の成長に対するWnt阻害剤の効果。OMP-18R5投与前(ベースライン)およびOMP-18R5を投与して112日後の腫瘍病変のCT画像。
【図１Ｃ】神経内分泌腫瘍の成長に対するWnt阻害剤の効果。OMP-18R5投与前(ベースライン)およびOMP-18R5を投与して112日後の腫瘍病変のCT画像。112日目の腫瘍病変は石灰化の放射線学的徴候を示す。
【図２Ａ】OMP-18R5第1a相試験における患者の試験日数。2013年1月25日の時点で、OMP-18R5第1a相試験に登録した患者(n=18)一人一人が試験を続けていた日数を図に図示した。矢印は2013年1月25日の時点で試験を続けていた患者を示す。縦線は試験における腫瘍評価日を示す。神経内分泌腫瘍患者は、患者003(実施例1の患者3)、010(実施例1の患者10)、および012(実施例1の患者12)である。試験を受けた他の患者には、結腸直腸癌、乳癌、メラノーマ、および膵癌などの他のタイプの進行固形腫瘍があった。
【図２Ｂ】OMP-18R5第1a相試験における患者の試験日数。2013年10月4日の時点で、OMP-18R5第1a相試験に登録した患者(n=29)一人一人が試験を続けていた日数を図に図示した。矢印は2013年10月4日の時点で試験を続けていた患者を示す。縦線は試験における腫瘍評価日を示す。神経内分泌腫瘍患者は、患者003(実施例1の患者3)、010(実施例1の患者10)、012(実施例1の患者12)、025、および026である。試験を受けた他の患者には、他のタイプの進行固形腫瘍があった。
【図３Ａ】OMP-18R5第1a相試験における神経内分泌腫瘍患者の試験日数を、前治療法による処置日数と比較した。膵神経内分泌腫瘍をもつ69歳の女性である患者10は、(2013年1月25日の時点で)279日間、安定病態で試験を続けている。カルチノイド腫瘍をもつ77歳の女性である患者12は、(2013年1月25日の時点で)210日間、安定病態で試験を続けている。
【図３Ｂ】OMP-18R5第1a相試験における神経内分泌腫瘍患者の試験日数を前治療法による処置日数と比較した。患者10は448日目に試験を止めた。患者12は、(2013年10月4日の時点で)465日間、安定病態で試験を続けている。(前治療法の日数に関する一部の数字は図3Aの前のデータから修正されている)。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明は、神経内分泌腫瘍の成長を阻害する方法、神経内分泌腫瘍細胞の増殖を阻害する方法、神経内分泌癌を処置する方法、神経内分泌腫瘍の転移を阻害する方法、神経内分泌腫瘍細胞の分化を誘導する方法、神経内分泌腫瘍細胞の腫瘍形成能を低下させる方法、および神経内分泌腫瘍の中にある癌幹細胞または腫瘍開始細胞の頻度を小さくする方法を提供する。ある態様では、本明細書において提供される方法は、Wntアンタゴニストを対象に投与する工程を含む。ある態様では、Wntアンタゴニストは、1種または複数種のヒトFZD受容体に特異的に結合するFZD結合剤である。さらなる態様では、FZD結合剤は、1種のヒトFZD受容体に特異的に結合する抗体または1種もしくは複数種のヒトFZD受容体に特異的に結合する抗体である。ある態様では、Wntアンタゴニストは、1種または複数種のヒトWntポリペプチドに特異的に結合するWnt結合剤である。ある態様では、Wnt結合剤は可溶性FZD受容体である。ある態様では、Wnt結合剤は抗Wnt抗体である。
【００２４】
後期固形腫瘍患者を対象にした第I相臨床試験の状況において、後期神経内分泌腫瘍をもつヒト患者を低用量のOMP-18R5抗FZD抗体で処置した。(実施例1)。驚いたことに、OMP-18R5による112日間の処置後に、患者のうちの1人(膵神経内分泌腫瘍を有する患者)が腫瘍病変サイズの縮小を示し、(2013年1月25日時点で)279日間、疾患が進行する形跡がなく試験を続けていた。さらに、患者病変の1つに新しい石灰化が見られた。これは腫瘍細胞壊死および/または分化の可能性のある徴候を表している可能性がある。さらに、カルチノイド組織構造を有する神経内分泌腫瘍をもつ2人の患者も、OMP-18R5による処置中に、驚くほど長い期間にわたって安定病態で試験を続けることができた。(実施例1)。まとめると、これらの結果から、OMP-18R5は様々な神経内分泌腫瘍の処置において特に有用であり得ることが示唆される。
【００２５】
1.定義
本発明の理解を容易にするために、多くの用語および句を以下で定義する。
【００２６】
「アンタゴニスト」という用語は、タンパク質(例えば、癌幹細胞マーカー)の発現または生物活性を部分的または完全にブロックする、阻害する、または中和する任意の分子を含めるために本明細書において用いられる。生物活性のブロック、阻害、および/または中和は腫瘍成長の阻害を含むが、これに限定されない。「アンタゴニスト」という用語はまた、Wnt経路の生物活性を部分的または完全にブロックする、阻害する、または中和する任意の分子も含む。「Wntアンタゴニスト」という用語は、Wnt経路(例えば、古典的Wntシグナル伝達)のシグナル伝達を部分的もしくは完全にブロックする、阻害する、もしくは中和する任意の分子またはWnt経路の成分の生物活性を部分的もしくは完全にブロックする、阻害する、もしくは中和する任意の分子を含めるために本明細書において用いられる。Wntアンタゴニストは必ずしもWntに結合するとは限らない。例えば、ある特定の態様では、Wntアンタゴニストは、Wnt経路の1種または複数種の他の成分、例えば、1種または複数種のFZD受容体に結合する。適切なWntアンタゴニスト分子には、可溶性FZD受容体を含む天然FZD受容体タンパク質の断片および/またはアミノ酸配列変種、ならびに可溶性Frizzled関連タンパク質(SFRP)の誘導体、およびRORタンパク質の誘導体が含まれるが、これに限定されない。さらに、適切なWntアンタゴニスト分子には、1種または複数種のFZD受容体に特異的に結合する抗体および1種または複数種のWntポリペプチドに特異的に結合する抗体が含まれるが、これに限定されない。可溶性SFRPおよびROR受容体は、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2011/0305695号に記載されている。
【００２７】
薬剤(例えば、可溶性FZD受容体または抗FZD抗体)がWntシグナル伝達を阻害するかどうか確かめるためのインビボアッセイおよびインビトロアッセイが当技術分野において公知である。例えば、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に複数コピーのTCF結合ドメインを含有するTCF/Lucレポーターベクターを用いた、細胞をベースとするルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、インビトロで古典的Wntシグナル伝達レベルを測定することができる(Gazit et al., 1999, Oncogene 18; 5959-66)。1種または複数種のWnt(例えば、トランスフェクト細胞によって発現されたWnt、またはWnt培養上清によって提供されたWnt)と薬剤の存在下でのWntシグナル伝達レベルを、薬剤が存在しない状態でのシグナル伝達レベルと比較する。TCF/lucレポーターアッセイに加えて、古典的Wntシグナル伝達に対する薬剤(例えば、可溶性FZD受容体または抗FZD抗体)の作用は、β-カテニンにより調節される遺伝子、例えば、c-myc(He et al., Science, 281:1509-12(1998))、サイクリンD1(Tetsu et al., Nature, 398:422-6 (1999))、および/またはフィブロネクチン(Gradl et al., Mol. Cell Biol., 19:5576-87(1999))の発現レベルに対する前記薬剤の作用を測定することによってインビトロまたはインビボで測定することができる。ある特定の態様では、Wntシグナル伝達に対する前記薬剤の作用はまた、Dishevelled-1、Dishevelled-2、Dishevelled-3、LRP5、LRP6、および/またはβ-カテニンのリン酸化状態に対する前記薬剤の作用を測定することによって評価することもできる。なおさらなる態様では、Wntシグナル伝達に対する前記薬剤の作用は、Wntシグネチャーの1種または複数種の遺伝子の発現レベルに及ぼす前記薬剤の影響を評価することによって確かめられる。古典的Wntシグナル伝達の阻害を評価するための、このようなアッセイの使用の非限定的な例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2012/0027778号に開示される。
【００２８】
本明細書で使用する「可溶性受容体」という用語は、可溶型で細胞から分泌することができる、膜貫通ドメインの前にある受容体タンパク質のアミノ末端細胞外断片を指す。ある態様では、受容体タンパク質はFZD受容体である。ある態様では、受容体タンパク質はROR1またはROR2受容体である。ある特定の態様では、可溶性受容体は、可溶性受容体の半減期を長くするポリペプチドとインフレームで連結される。ある特定の態様では、半減期を長くするポリペプチドはヒトFcドメインである。
【００２９】
本明細書で使用する「FZD可溶性受容体」という用語は、可溶型で細胞から分泌することができる、受容体膜貫通ドメインの前にあるヒトFZD受容体タンパク質のアミノ末端細胞外断片を指す。アミノ末端細胞外ドメイン(ECD)(本明細書において「FZD ECD」と呼ばれる)全体ならびにECDの小さな断片を含むFZD可溶性受容体が想定される。Friドメイン(本明細書において「FZD Fri」と呼ばれる)を含むFZD可溶性受容体も開示される。可溶性FZD受容体は、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2011/0305695号に記載される。
【００３０】
FZD Fri可溶性受容体は、FZD ECD全体を含む可溶性受容体と比較して生物活性の変化(例えば、タンパク質半減期の延長)を示す場合がある。タンパク質半減期は、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリエチレンオキシド(PEO)による共有結合改変によってさらに延長することができる。FZD可溶性受容体には、ヒトFc領域(例えば、免疫グロブリンIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、もしくはIgMに由来するヒトFc);タンパク質タグ(例えば、myc、FLAG、GST);他の内因性タンパク質またはタンパク質断片;またはFZD ECDもしくはFriドメインと連結タンパク質との間にある任意のリンカー領域を含む他の任意の有用なタンパク質配列を含むが、これに限定されない他の機能タンパク質および構造タンパク質とインフレームで連結されたFZD ECDまたはFriドメインが含まれる。ある特定の態様では、FZD受容体のFriドメインはヒトFc領域に直接連結される。ある特定の態様では、FZD受容体のFriドメインはヒトIgG1 Fcに連結される(本明細書において「FZD Fri.Fc」、例えば、「FZD8 Fri.Fc」と呼ばれる)。ある態様では、FZD受容体のFriドメインは、ペプチドリンカーを用いてヒトFc領域に連結される。FZD可溶性受容体はまた、アミノ酸の挿入、欠失、置換、および/または保存的置換を含む変種タンパク質も含む。
【００３１】
本明細書で使用する「リンカー」または「リンカー領域」という用語は、第1のポリペプチド(例えば、FZD成分)と第2のポリペプチド(例えば、Fc領域)との間に挿入されるリンカーを指す。ある態様では、リンカーはペプチドリンカーである。リンカーは、ポリペプチドの発現、分泌、または生理活性に悪影響を及ぼしてはならない。好ましくは、リンカーは抗原性でなく、免疫応答を誘発しない。
【００３２】
「抗体」という用語は、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または上記の組み合わせなどの標的を、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位によって認識し、かつ特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で用いられる「抗体」という用語は、抗体が所望の生物活性を示す限り、無傷の(intact)ポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、抗体断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片)、単鎖Fv(scFv)変異体、少なくとも2つの無傷の抗体から生成された二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、ならびに抗原認識部位を含む他の任意の改変された免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、5つの主要なクラスの免疫グロブリン、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、またはそのサブクラス(アイソタイプ)(例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2)のいずれかであり得る。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造および三次元構造を有する。抗体は裸でもよく、毒素、放射性同位体などの他の分子にコンジュゲートされてもよい。
【００３３】
「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の一部を指し、かつ無傷の抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例には、Fab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片、直鎖状抗体、単鎖抗体、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これに限定されない。
【００３４】
「モノクローナル抗体」とは、単一の抗原決定基、すなわちエピトープの極めて特異的な認識および結合に関与する均一な抗体集団を指す。これは、典型的に、異なる抗原決定基に対して作られた異なる抗体を含むポリクローナル抗体とは対照的である。「モノクローナル抗体」という用語は、無傷でありかつ完全長であるモノクローナル抗体、ならびに抗体断片(例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、単鎖(scFv)変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む他の任意の改変免疫グロブリン分子を包含する。さらに、「モノクローナル抗体」とは、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え体発現、およびトランスジェニック動物による手法を含むが、これに限定されない多様な手法によって作製される抗体を指す。
【００３５】
「ヒト化抗体」という用語は、最小の非ヒト(例えば、マウス)配列を含む、特異的な免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリン、またはその断片である非ヒト(例えば、マウス)抗体の形を指す。典型的には、ヒト化抗体は、相補性決定領域(CDR)由来の残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種(例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター)のCDR由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリンである(Jones et al., 1986, Nature, 321:522-525; Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323-327; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536)。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク領域(FR)残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する非ヒト種由来の抗体中の対応する残基で置き換えられる。ヒト化抗体は、Fvフレームワーク領域中および/または置き換えられた非ヒト残基内のさらなる残基の置換によってさらに改変して、抗体の特異性、親和性、および/または能力を改良および最適化することができる。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに対応する全てまたは実質的に全てのCDR領域を含む、少なくとも1つ、典型的には2つまたは3つの可変ドメインの実質的に全てを含む。しかし一方で、全てまたは実質的に全てのFR領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のFR領域である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部、典型的には、ヒト免疫グロブリンの定常領域またはドメイン(Fc)の少なくとも一部を含むことができる。米国特許第5,225,539号に、ヒト化抗体を作製するために用いられる方法の例が述べられている。
【００３６】
「ヒト抗体」という用語は、ヒトによって産生された抗体、または当技術分野で公知の任意の技術を用いて作製された、ヒトによって産生された抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体を意味する。ヒト抗体のこの定義は、無傷もしくは完全長の抗体、その断片、ならびに/または、例えば、マウスの軽鎖およびヒトの重鎖ポリペプチドを含む抗体などの、少なくとも1つのヒト重鎖および/もしくは軽鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。
【００３７】
「エピトープ」または「抗原決定基」という用語は本明細書において同義に用いられ、かつ特定の抗体が認識し、特異的に結合することができる抗原の部分を指す。抗原がポリペプチドである場合、エピトープは、連続したアミノ酸、およびタンパク質の三次フォールディング(tertiary folding)によって近接して並べられた非連続アミノ酸の両方から形成することができる。連続するアミノ酸から形成されているエピトープは、タンパク質が変性した場合にも典型的には維持されるが、三次フォールディングによって形成されたエピトープは、タンパク質が変性すると典型的には失われる。エピトープは、独特の空間配置中に典型的には少なくとも3アミノ酸、より通常は少なくとも5または8〜10アミノ酸を含む。
【００３８】
ポリペプチドまたは他の薬剤(例えば、抗体または可溶性受容体)がタンパク質に「特異的に結合する」ということは、ポリペプチドまたは他の薬剤がタンパク質に対して、無関係のタンパク質を含む別の物質よりも高い頻度で、素早く、長い持続時間で、高い親和性で、または前記のいくつかの組み合わせで反応または結合することを意味する。ある特定の態様では、「特異的に結合する」とは、例えば、薬剤(例えば、抗体または可溶性受容体)が約0.1mM以下のKDでタンパク質に結合するが、通常、約1μM未満のKDでタンパク質に結合することを意味する。ある態様では、「特異的に結合する」とは、薬剤(例えば、抗体または可溶性受容体)が、ある時には、少なくとも約0.1μM以下のKDで、少なくとも約0.01μM以下のKDで、またある時には、少なくとも約1nM以下のKDでタンパク質に結合することを意味する。異なる種における相同タンパク質間には配列同一性があるので、特異的結合は、複数の種にある、ある特定のタンパク質、例えば、Wntタンパク質またはfrizzled受容体を認識する薬剤(例えば、抗体または可溶性受容体)を含み得る。同様に、異なるパラログ(例えば、異なるヒトWntタンパク質またはヒトfrizzledタンパク質)間には、これらの配列のある特定の領域に相同性があるので、特異的結合は、複数のパラログ(例えば、複数のヒトWntタンパク質または複数のヒトfrizzledタンパク質)を認識するポリペプチドまたは薬剤(例えば、抗体または可溶性受容体)を含み得る。第1の標的に特異的に結合する薬剤(例えば、抗体または可溶性受容体)は第2の標的に特異的に結合してもよく、特異的に結合しなくてもよいことが理解される。従って、「特異的結合」は、必ずしも、排他的な結合、すなわち、1種の標的のみとの結合を必要としない(だが、1種の標的のみとの結合を含み得る)。従って、薬剤(例えば、抗体または可溶性受容体)は、ある特定の態様では、複数種の標的(例えば、複数の異なるヒトWntタンパク質または複数の異なるfrizzledタンパク質、例えば、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および/またはFZD8)に特異的に結合する。ある特定の態様では、抗体の複数種の標的は、前記抗体上にある同じ抗原結合部位に結合してもよい。例えば、抗体は、ある特定の態様では、2つ同一の抗原結合部位を含んでもよく、これらの抗原結合部位はそれぞれ、2種以上のヒトfrizzled受容体(例えば、ヒトFZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および/またはFZD8)に特異的に結合する。ある特定の代替態様では、抗体は二重特異性でもよく、特異性の異なる少なくとも2種の抗原結合部位を含んでもよい。非限定的な例として、二重特異性抗体は、1つのfrizzled受容体上の、例えば、ヒトFZD5上のエピトープを認識する1つの抗原結合部位を含んでもよく、さらに、第2のfrizzled受容体上の、例えば、ヒトFZD8上の異なるエピトープを認識する第2の異なる抗原結合部位を含んでもよい。必ずしもそうとは限らないが、一般的に、結合についての言及は特異的結合を意味する。
【００３９】
「癌」および「癌性」という用語は、無秩序な細胞増殖を特徴とする細胞集団を含む哺乳動物における生理的状態を指す、または説明する。癌という用語はWnt依存性癌を含むことが理解される。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれるが、これに限定されない。
【００４０】
「腫瘍」および「新生物」とは、過度の細胞成長または増殖に起因する、前癌病変を含む良性(非癌性)病変または悪性(癌性)病変の任意の組織塊を指す。
【００４１】
「癌幹細胞」、「腫瘍幹細胞」、または「固形腫瘍幹細胞」という用語は本明細書で同義に用いられ、かつ、(1)高い増殖能を有し;(2)非対称細胞分裂を行って、増殖能力または発生能力の低下した1つまたは複数の種類の分化した後代細胞を産生することができ;かつ(3)自己複製または自己維持のための対称細胞分裂を行うことができる、固形腫瘍由来の細胞集団を指す。「癌幹細胞」、「腫瘍幹細胞」、または「固形腫瘍幹細胞」のこれらの特性によって、これらの癌幹細胞は易感染性マウスに累代移植されると、腫瘍を形成できない大多数の腫瘍細胞と比較して触診可能な腫瘍を形成することができる。癌幹細胞は、分化に対して無秩序な様式で自己複製を起こして、変異が生じるにつれて経時変化することができる異常細胞型を含む腫瘍を形成する。
【００４２】
「癌細胞」、「腫瘍細胞」という用語およびその文法上の等価物は、腫瘍細胞集団の大部分を構成する非腫瘍形成細胞および腫瘍形成性幹細胞(癌幹細胞)の両方を含む、腫瘍または前癌病変に由来する細胞の全集団を指す。本明細書で使用する「腫瘍細胞」という用語は、複製および分化する能力が無い腫瘍細胞のみを指している場合に、このような腫瘍細胞と癌幹細胞を区別するために「非腫瘍形成性の」という用語で修飾される。
【００４３】
「腫瘍形成性の」という用語は、(さらなる腫瘍形成性癌幹細胞を生じる)自己複製の特性、および固形腫瘍幹細胞が腫瘍を形成するのを可能にする(分化した、従って、非腫瘍形成性の腫瘍細胞を生じる)他の全ての腫瘍細胞を発生する増殖を含む、固形腫瘍幹細胞の機能特徴を指す。自己複製および他の全ての腫瘍細胞を発生する増殖のこれらの特性によって、癌幹細胞は易感染性マウスに累代移植されると、非腫瘍形成性腫瘍細胞と比較して触診可能な腫瘍を形成することができる。非腫瘍形成性腫瘍細胞は累代移植されても腫瘍を形成することができない。非腫瘍形成性腫瘍細胞は、固形腫瘍から腫瘍細胞を得た後に易感染性マウスに初代移植されると腫瘍を形成することがあるが、累代移植では腫瘍を生じないことが観察されている。
【００４４】
「対象」という用語は、特定の処置のレシピエントとなるべき、ヒト、非ヒト霊長類、齧歯類などを含むが、これに限定されない任意の動物(例えば、哺乳動物)を指す。典型的には、ヒト対象について本明細書では「対象」および「患者」という用語が同義に用いられる。
【００４５】
「治療的有効量」という用語は、対象または哺乳動物の疾患または障害を「処置する」のに有効な薬剤(例えば、抗体、可溶性受容体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、有機低分子、または他の薬剤)の量を指す。癌の場合には、治療的有効量の薬剤は、癌細胞の数を減少させること;腫瘍の大きさを縮小すること;例えば、軟組織および骨への癌の拡大を含む、末梢器官への癌細胞浸潤を阻害する、または停止させること;腫瘍転移を阻害する、および停止させること;腫瘍成長を阻害する、および停止させること;癌に関連した症状の1つまたは複数をある程度軽減させること;罹患率および死亡率を低下させること;生活の質を改善すること;腫瘍の腫瘍形成能、腫瘍形成頻度、もしくは腫瘍形成能力を減少させること;腫瘍内にある癌幹細胞の数もしくは頻度を低下させること;非腫瘍形成性状態に腫瘍形成細胞を分化させること、あるいは、このような効果の組み合わせが可能である。薬剤は既存の癌細胞の増殖を防止する、かつ/または死滅させる範囲内で細胞増殖抑制性および/または細胞傷害性であると言うことができる。
【００４６】
本明細書で使用する「腫瘍成長を阻害する」という用語は、腫瘍細胞増殖を阻害することができる任意の機構を指す。ある特定の態様では、腫瘍細胞増殖は、腫瘍細胞増殖を遅くすることによって阻害される。ある特定の態様では、腫瘍細胞増殖は、腫瘍細胞増殖を止めることによって阻害される。ある特定の態様では、腫瘍細胞増殖は、腫瘍細胞を死滅させることによって阻害される。ある特定の態様では、腫瘍細胞増殖は、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することによって阻害される。ある特定の態様では、腫瘍細胞増殖は、腫瘍細胞の分化を誘導することによって阻害される。ある特定の態様では、腫瘍細胞増殖は、腫瘍細胞から栄養分を奪うことによって阻害される。ある特定の態様では、腫瘍細胞増殖は、腫瘍細胞の移動を阻止することによって阻害される。ある特定の態様では、腫瘍細胞増殖は、腫瘍細胞の浸潤を阻止することによって阻害される。
【００４７】
例えば、「処置する」もしくは「処置」もしくは「処置するために」または「寛解する」もしくは「寛解するために」という用語は、1)診断された病理学的状態もしくは障害の症状を治癒する、診断された病理学的状態もしくは障害の症状を減速させる、診断された病理学的状態もしくは障害の症状を和らげる、および/または診断された病理学的状態もしくは障害の進行を止める治療的措置と、2)標的とされた病理学的状態または障害の発症を阻止する、および/または遅らせる予防的措置または防止的措置の両方を指す。従って、処置を必要とする者には、既に障害がある者;障害になりやすい者;および障害を予防しようとする者が含まれる。ある態様では、対象は、癌細胞の数が減少していること、もしくは癌細胞が完全に存在しないこと;腫瘍の大きさが縮小していること;例えば、軟組織および骨への癌の拡大を含む、末梢器官への癌細胞浸潤が阻害されていること、もしくは末梢器官への癌細胞浸潤が無いこと;腫瘍転移が阻害されていること、もしくは腫瘍転移が無いこと;腫瘍成長が阻害されていること、もしくは腫瘍成長が無いこと;特定の癌に関連する1つもしくは複数の症状が軽減していること;罹患率および死亡率が低下していること;生活の質が改善していること;腫瘍の腫瘍形成能、腫瘍形成頻度、もしくは腫瘍形成能力が低下していること;腫瘍内にある癌幹細胞の数もしくは頻度が低下していること;非腫瘍形成性状態に腫瘍形成細胞が分化していること;または効果のいくつかの組み合わせの1つまたは複数、を示すのであれば、本発明の方法に従って癌が首尾良く「処置されている」。
【００４８】
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を単独で、または組み合わせて指す。重鎖の可変領域および軽鎖の可変領域はそれぞれ、超可変領域としても知られる3つの相補性決定領域(CDR)でつながれた4つのフレームワーク領域(FR)からなる。各鎖内のCDRはFRによって近くにまとめられ、他の鎖からのCDRは抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。CDRの決定には少なくとも2種の技法がある:(1)異種間配列可変性に基づくアプローチ(すなわち、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest,(5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda Md.));および(2)抗原-抗体複合体の結晶学研究に基づくアプローチ(Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948))。さらに、CDRを決定するために、時として、これらの2つのアプローチの組み合わせが当技術分野において用いられる。
【００４９】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書において同義に用いられる。ポリマーは直鎖または分岐鎖でもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されてもよい。これらの用語はまた、天然に、あるいは介入によって、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲーションなどの他の任意の操作もしくは修飾によって改変されたアミノ酸ポリマーも含む。例えば、1つまたは複数のアミノ酸類似体(例えば、非天然アミノ酸などを含む)ならびに当技術分野において公知の他の修飾を含有するポリペプチドも、この定義に含まれる。本発明のポリペプチドは、ある特定の態様では抗体をベースとするので、単鎖または結合した鎖として生じでもよいことが理解される。
【００５０】
本開示および特許請求の範囲において用いられる単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、特に文脈によってはっきりと規定されていない限り複数形を含む。
【００５１】
本明細書において「を含む」という言葉で態様が説明された場合はいつでも、「からなる」および/または「から本質的になる」で説明される他の類似する態様も提供されることが理解される。
【００５２】
例えば、本明細書において「Aおよび/またはB」という句で用いられるような「および/または」という用語は、「AおよびB」、「AまたはB」、「A」、ならびに「B」を含むことが意図される。同様に、例えば、「A、B、および/またはC」という句で用いられるような「および/または」という用語は、以下の態様のそれぞれを含むことが意図される:A、B、およびC;A、B、またはC;AまたはC;AまたはB;BまたはC;AおよびC;AおよびB;BおよびC;A(のみ);B(のみ);ならびにC(のみ)。
【００５３】
2.処置方法
本発明は、神経内分泌腫瘍を処置する方法を提供する。神経内分泌腫瘍(NET)は、内分泌(ホルモン)系および神経系の細胞から生じた腫瘍である。神経内分泌腫瘍(NET)は、広範囲の形態特徴、機能特徴、および行動特徴を有する腫瘍のグループを含む。これらの腫瘍は、概して、ゆっくりと成長し、緩徐進行性の行動を取る。しかしながら、これらの腫瘍は転移する能力、主として肝臓に転移する能力を有し、転移したときに命にかかわる場合があり、現在の治療法で処置することが難しい場合がある。
【００５４】
神経内分泌腫瘍は発生部位によって分類される。ある特定の態様では、NETは、膵神経内分泌腫瘍(pNET)、ならびに肺、胃、十二指腸、空腸、回腸、結腸、および直腸のカルチノイド腫瘍からなる群より選択される。さらなる態様では、NETは、卵巣、胸腺、甲状腺髄質の神経内分泌腫瘍、副腎の神経内分泌腫瘍(例えば、クロム親和性細胞腫)、およびパラガングリオンの神経内分泌腫瘍(パラガングリオーマ)からなる群より選択される。ある特定の態様では、本明細書に記載の方法によって処置されるNETは小細胞肺癌(SCLC)である。ある特定の他の態様では、NETは小細胞肺癌でない。ある特定の態様では、NETは膵神経内分泌腫瘍(PET)またはカルチノイド腫瘍である。ある特定の態様では、NETは小細胞肺癌、膵癌、または甲状腺癌でない。
【００５５】
神経内分泌腫瘍はまた悪性度分類および分化によって分類される。例えば、Phan et al., Pancreas, 39(6):784-798(2012)を参照されたい。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は高分化型低悪性度腫瘍である。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は中分化型中悪性度腫瘍である。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は低分化型高悪性度腫瘍である。1つの態様では、低悪性度腫瘍は、10個のHPF(高倍率視野)につき有糸分裂が2未満であり、壊死がないことを特徴とする。1つの態様では、中悪性度腫瘍は、10個のHPF(高倍率視野)につき有糸分裂が2〜10であり、壊死病巣があることを特徴とする。1つの態様では、高悪性度腫瘍は、10個のHPF(高倍率視野)につき有糸分裂が10超であることを特徴とする。
【００５６】
神経内分泌腫瘍はまた機能性NETおよび非機能性NETに分類される。NETは、腫瘍細胞による過剰ホルモン産生が原因で特定の臨床症候群が誘導されたときに機能性とみなされる。機能性NETの例には、カルチノイド症候群の原因となり得るカルチノイド腫瘍、ならびに機能性pNET、例えば、インスリノーマ、ガストリノーマ、血管作動性腸管ペプチド(VIP)オーマ、グルカゴノーマ、およびソマトスタチノーマが含まれるが、これに限定されない。非機能性NETは、腫瘍細胞による過剰ホルモン産生が原因で臨床症候群と関連しないが、腫瘍の存在または腫瘍転移に関連した症状(例えば、腹痛または鼓脹)をなお生じる場合がある。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は機能性NETである。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は非機能性NETである。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は、機能性カルチノイド腫瘍、インスリノーマ、ガストリノーマ、血管作動性腸管ペプチド(VIP)オーマ、グルカゴノーマ、セロトニノーマ(serotoninoma)、ヒスタミノーマ(histaminoma)、ACTHオーマ(ACTHoma)、クロム親和性細胞腫、およびソマトスタチノーマからなる群より選択される。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍はSCLCでない。
【００５７】
ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は原発腫瘍である。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は転移腫瘍である。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は原発器官の壁の外側に転移していない。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は、原発器官の壁および近くの組織、例えば、脂肪、筋肉、またはリンパ節を通って転移している。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は、原発器官から離れて組織または器官に転移している、例えば、肝臓、骨、または肺に転移している。
【００５８】
ある特定の態様では、神経内分泌癌または腫瘍は処置に対して抵抗性がある。非限定的な例として、前記癌または腫瘍は化学療法抵抗性があってもよい(すなわち、1つまたは複数の種類の化学療法に対して耐性があってもよい)。ある特定の態様では、癌または腫瘍はソマトスタチン類似体による処置に対して耐性がある。ある特定の態様では、癌または腫瘍はキナーゼ阻害剤による処置に対して耐性がある。
【００５９】
ある特定の態様では、神経内分泌癌または腫瘍は肝臓に転移している。非限定的な例として、神経内分泌癌または腫瘍は、肝臓に転移したカルチノイドまたは膵神経内分泌腫瘍である。
【００６０】
1つの局面において、本発明は、神経内分泌腫瘍の処置におけるWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)の使用を提供する。ある特定の態様では、Wntアンタゴニストは、神経内分泌腫瘍細胞におけるWntシグナル伝達(例えば、古典的Wntシグナル伝達)の阻害、神経内分泌腫瘍の成長の阻害、神経内分泌腫瘍分化の誘導、神経内分泌腫瘍量の低下、および/または神経内分泌腫瘍の腫瘍形成能の低下に有用である。使用方法はインビトロ方法、エクスビボ方法、またはインビボ方法でもよい。ある特定の態様では、Wntアンタゴニストは抗体OMP-18R5である。ある特定の態様では、Wntアンタゴニストは可溶性受容体OMP-54F28である。
【００６１】
本発明は、神経内分泌腫瘍を処置する方法であって、治療的有効量のWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)を対象(例えば、処置を必要とする対象)に投与する工程を含む方法を提供する。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は膵神経内分泌腫瘍である。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍はカルチノイドである。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は肺の神経内分泌腫瘍である。非限定的な例として、肺にある神経内分泌腫瘍はSCLCでもよい。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍はSCLCでない。ある特定の態様では、対象はヒトである。ある特定の態様では、WntアンタゴニストはOMP-18R5である。ある特定の態様では、WntアンタゴニストはOMP-54F28である。
【００６２】
本発明は、本明細書に記載のWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体および可溶性FZD受容体)を用いて神経内分泌腫瘍の成長を阻害するための方法をさらに提供する。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍の成長を阻害する方法は、インビトロで腫瘍細胞をWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)と接触させる工程を含む。例えば、腫瘍成長を阻害するために、不死化された神経内分泌腫瘍細胞株は、Wntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)が添加された培地中で培養される。ある態様では、腫瘍成長を阻害するために、神経内分泌腫瘍細胞は患者試料、例えば、組織生検材料、胸水、または血液試料から単離され、Wntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)が添加された培地中で培養される。ある特定の態様では、WntアンタゴニストはOMP-18R5である。ある特定の態様では、WntアンタゴニストはOMP-54F28である。
【００６３】
ある態様では、神経内分泌腫瘍の成長を阻害する方法は、インビボで神経内分泌腫瘍または腫瘍細胞をWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)と接触させる工程を含む。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍または腫瘍細胞をWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)と接触させる工程が動物モデルにおいて企てられる。例えば、神経内分泌腫瘍の成長を阻害するために、易感染性マウス(例えば、NOD/SCIDマウス)において成長させた神経内分泌腫瘍異種移植片にWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)が投与されてもよい。ある態様では、神経内分泌腫瘍癌幹細胞が患者試料、例えば、組織生検材料、胸水、または血液試料から単離され、易感染性マウスに注射され、次いで、神経内分泌腫瘍細胞の増殖を阻害するためにWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)が投与される。ある態様では、神経内分泌腫瘍の成長を阻止するために、Wntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)は、腫瘍形成細胞が動物に導入されるのと同時に、または導入された直後に投与される。ある態様では、腫瘍形成細胞が特定の大きさまで増殖した後に、Wntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)は治療剤として投与される。ある特定の態様では、WntアンタゴニストはOMP-18R5である。ある特定の態様では、WntアンタゴニストはOMP-54F28である。
【００６４】
ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍の成長を阻害する方法は、治療的有効量のWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様では、対象はヒトである。ある特定の態様では、対象は神経内分泌腫瘍を有するか、または腫瘍が除去されている。
【００６５】
ある特定の態様では、腫瘍は、Wntシグナル伝達が活性化している腫瘍である。ある態様では、活性化しているWntシグナル伝達は古典的Wntシグナル伝達である。ある態様では、神経内分泌腫瘍はWnt依存性腫瘍である。例えば、ある態様では、腫瘍はアキシン(axin)過剰発現に対して感受性がある。ある態様では、腫瘍は、adenomatous polyposis coli(APC)腫瘍抑制遺伝子の不活化変異(例えば、切断変異)も、β-カテニン遺伝子の活性化変異も含まない。ある態様では、腫瘍は、Wnt遺伝子シグネチャーの1種または複数種の遺伝子、すなわち、Wntシグナル伝達経路によってアップレギュレートまたはダウンレギュレートされる1種または複数種の遺伝子を発現する。ある態様では、処置されている対象の神経内分泌腫瘍は、このような腫瘍を含む。
【００６６】
ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は、本明細書に記載のWntアンタゴニストFZD結合抗体が結合する1種または複数種のヒトfrizzled受容体を発現する。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍はヒトfrizzled受容体を過剰発現する。ある特定の態様では、WntアンタゴニストはOMP-18R5である。
【００６７】
ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は、本明細書に記載のWntアンタゴニスト可溶性FZD受容体が結合する1種または複数種のヒトWntポリペプチドを発現する。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍はヒトWntポリペプチドを過剰発現する。ある特定の態様では、WntアンタゴニストはOMP-54F28である。
【００６８】
ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は、本明細書に記載のWntアンタゴニスト抗Wnt抗体が結合する1種または複数種のヒトWntポリペプチドを発現する。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍はヒトWntポリペプチドを過剰発現する。
【００６９】
ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は膵神経内分泌腫瘍である。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍はカルチノイドである。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は肺の神経内分泌腫瘍である。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍はSCLCでない。
【００７０】
本発明はまた、神経内分泌腫瘍細胞におけるWntシグナル伝達を阻害する方法であって、前記細胞を有効量のWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)と接触させる工程を含む方法も提供する。ある特定の態様では、前記方法は、前記細胞をWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)と接触させる工程が、治療的有効量のWntアンタゴニストを対象に投与する工程を含むインビボ方法である。一部の代替態様では、前記方法はインビトロ方法またはエクスビボ方法である。ある特定の態様では、阻害されるWntシグナル伝達は古典的Wntシグナル伝達である。ある特定の態様では、Wntシグナル伝達は、Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3A、Wnt7a、Wnt7b、および/またはWnt10Bによるシグナル伝達である。ある特定の態様では、Wntシグナル伝達は、Wnt1、Wnt3A、Wnt7b、および/またはWnt10Bによるシグナル伝達である。
【００７１】
さらに、本発明は、対象において神経内分泌腫瘍の腫瘍形成能を低下させる方法であって、治療的有効量のWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)を対象に投与する工程を含む方法を提供する。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍は癌幹細胞を含む。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍にある癌幹細胞の頻度は前記薬剤の投与によって低下する。ある特定の態様では、WntアンタゴニストはOMP-18R5である。ある特定の態様では、WntアンタゴニストはOMP-54F28である。
【００７２】
従って、本発明はまた、神経内分泌腫瘍にある癌幹細胞の頻度を低下させる方法であって、前記腫瘍を有効量のWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)と接触させる工程を含む方法も提供する。
【００７３】
本発明は、腫瘍形成性神経内分泌腫瘍細胞を非腫瘍形成細胞に分化させる方法であって、Wntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)を、腫瘍形成細胞を含む神経内分泌腫瘍を有するか、またはこのような神経内分泌腫瘍が除去されている対象に投与することによって、腫瘍形成性神経内分泌腫瘍細胞をWntアンタゴニストと接触させる工程を含む方法をさらに提供する。
【００７４】
神経内分泌腫瘍細胞の分化を誘導するために、本明細書に記載のWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体および可溶性FZD受容体)の使用も提供される。例えば、細胞を有効量の本明細書に記載のWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)と接触させる工程を含む、細胞が分化するように誘導する方法が想定される。治療的有効量のWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)を対象に投与する工程を含む、対象の神経内分泌腫瘍にある細胞が分化するように誘導する方法も提供される。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍細胞の分化は腫瘍病変のX線撮影画像の変化と関連する。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍細胞の分化は腫瘍病変の石灰化と関連する。ある特定の態様では、WntアンタゴニストはOMP-18R5である。ある特定の態様では、WntアンタゴニストはOMP-54F28である。
【００７５】
神経内分泌腫瘍がWntシグナル伝達活性化に関連する、ならびに/または高レベルの幹細胞および/もしくは前駆細胞を特徴とする、対象において神経内分泌腫瘍を処置する方法がさらに提供される。ある態様では、前記処置方法は、治療的有効量のWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)を対象に投与する工程を含む。ある特定の態様では、Wntシグナル伝達は古典的Wntシグナル伝達である。
【００７６】
ある特定の態様では、本明細書に記載のWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)を投与する工程に加えて、前記方法または処置は、(Wntアンタゴニスト投与前に、Wntアンタゴニスト投与と同時に、および/またはWntアンタゴニスト投与後に)第2の抗癌剤を投与する工程をさらに含む。Wntアンタゴニストおよび第2の抗癌剤を含む薬学的組成物も提供される。ある特定の態様では、Wntアンタゴニストおよび第2の抗癌剤の組み合わせの投与には、相乗効果、例えば、癌幹細胞の頻度に対する相乗効果がある。
【００７７】
Wntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)および第2の抗癌剤の組み合わせは任意の順番で投与されてもよく、同時に投与されてもよいことが理解されるだろう。選択された態様では、Wntアンタゴニストは、第2の抗癌剤による処置を以前に受けたことのある患者に投与される。ある特定の他の態様では、Wntアンタゴニストおよび第2の抗癌剤は実質的に同時に、または同時に投与される。例えば、対象は、第2の抗癌剤(例えば、化学療法)による処置のコースを受けながらWntアンタゴニストが与えられてもよい。ある特定の態様では、Wntアンタゴニストは、第2の抗癌剤で処置して1年以内に投与される。ある特定の代替態様では、Wntアンタゴニストは、第2の抗癌剤で処置して10ヶ月以内、8ヶ月以内、6ヶ月以内、4ヶ月以内、または2ヶ月以内に投与される。ある特定の他の態様では、Wntアンタゴニストは、第2の抗癌剤で処置して4週間以内、3週間以内、2週間以内、または1週間以内に投与される。ある態様では、Wntアンタゴニストは、第2の抗癌剤で処置して5日以内、4日以内、3日以内、2日以内、または1日以内に投与される。さらに、2種の薬剤または処置が数時間または数分のうちに(すなわち、実質的に同時に)対象に投与されてもよいことが理解されるだろう。
【００７８】
抗癌剤の有用なクラスには、例えば、抗チューブリン剤、アウリスタチン(auristatin)、DNA副溝結合剤、DNA複製阻害剤、アルキル化剤(例えば、白金錯体、例えば、シスプラチン、モノ(白金)、ビス(白金)およびトリ-核白金錯体、ならびにカルボプラチン)、アントラサイクリン、抗生物質、葉酸代謝拮抗剤、代謝拮抗物質、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン(lexitropsin)、ニトロソ尿素、プラチノール、実施化合物、プリン代謝拮抗物質、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが含まれる。ある特定の態様では、第2の抗癌剤は、代謝拮抗物質、抗有糸分裂剤、トポイソメラーゼ阻害剤、または血管形成阻害剤である。
【００７９】
Wntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)と組み合わせて投与することができる抗癌剤には化学療法剤が含まれる。従って、ある特定の態様では、前記の方法または処置は、Wntアンタゴニストと、化学療法剤または複数の異なる化学療法剤のカクテルとの併用投与を伴う。Wntアンタゴニストによる処置は、化学療法の投与の前に、化学療法の投与と同時に、または化学療法の投与の後に行われてもよい。本発明により意図される化学療法には、当技術分野において公知であり、市販されている化学物質または薬物、例えば、ゲムシタビン、イリノテカン、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ara-C」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン(cytoxin)、TAXOL、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、およびカルボプラチンが含まれる。併用投与は、1種類の薬学的製剤に入れた、または別個の製剤を用いた同時投与を含んでもよく、どちらの順番でもよいが、活性薬剤の全てがその生物活性を同時に発揮できるように一般的にある期間内で行われる連続投与を含んでもよい。このような化学療法剤の調製および投与計画は、製造業者の説明書に従って、または当業者により経験的に決定されたように使用することができる。このような化学療法の調製および投与計画はまた、Chemotherapy Service Ed., M. C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, Md. (1992)に記載されている。
【００８０】
本発明において有用な化学療法剤には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロスホスファミド(cyclosphosphamide)(サイトキサン(CYTOXAN));アルキルスルホナート、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン;アジリジン、例えば、ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、およびウレドーパ(uredopa);アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、およびトリメチローロメラミン(trimethylolomelamime)を含む、エチレンイミンおよびメチルアメラミン(methylamelamine)、ナイトロジェンマスタード、例えば、クロランブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビシン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード;ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン;抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウスラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン(carabicin)、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、6-ジアゾ-5-オキソ-L-ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ユベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン;代謝拮抗物質、例えば、メトトレキセートおよび5-フルオロウラシル(5-FU);葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート;プリン類似体、例えば、フルダラビン、6-メルカプトプリン、チアミプリン(thiamiprine)、チオグアニン;ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、6-アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、5-FU;アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン;抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン;葉酸補充剤、例えば、フロリン酸(frolinic acid);アセグラトン;アルドホスファミドグリコシド;アミノレブリン酸;アムサクリン;ベストラブシル;ビサントレン;エダトレキサート(edatraxate);デフォファミン(defofamine);デメコルチン;ジアジクオン;エルフォルミチン(elformithine);酢酸エリプチニウム;エトグルシド;硝酸ガリウム;ヒドロキシウレア;レンチナン;ロニダミン;ミトグアゾン;ミトキサントロン;モピダモール;ニトラクリン;ペントスタチン;フェナメット;ピラルビシン;ポドフィリニック酸;2-エチルヒドラジド;プロカルバジン;PSK.;ラゾキサン;シゾフラン(sizofuran);スピロゲルマニウム;テヌアゾン酸;トリアジクオン;2,2',2''-トリクロロトリエチルアミン;ウレタン;ビンデ��ン;ダカルバジン;マンノムスチン;ミトブロニトール;ミトラクトール;ピポブロマン;ガシトシン(gacytosine);アラビノシド(「Ara-C」);シクロホスファミド;チオテパ;タキソイド、例えば、パクリタキセル(TAXOL、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ.)およびドキセタキセル(TAXOTERE、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France);クロランブシル;ゲムシタビン;6-チオグアニン;メルカプトプリン;メトトレキセート;白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン;ビンブラスチン;白金;エトポシド(VP-16);イホスファミド;マイトマイシンC;ミトキサントロン;ビンクリスチン;ビノレルビン;ナベルビン;ノバントロン;テニポシド;ダウノマイシン;アミノプテリン;ゼローダ;イバンドロン酸;CPT11;トポイソメラーゼ阻害剤RFS2000;ジフルオロメチルオルニチン(DMFO);レチノイン酸;エスペラミシン;カペシタビン;および前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれるが、これに限定されない。化学療法剤には、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように働く抗ホルモン剤、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)-イミダゾール、4-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン(Fareston)を含む抗エストロゲン、ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなどの抗アンドロゲン、ならびに前記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体も含まれる。
【００８１】
ある特定の態様では、化学療法剤はキナーゼ阻害剤である。ある特定の態様では、キナーゼ阻害剤は多標的受容体チロシンキナーゼ(multi-targeted receptor tyrosine kinase)阻害剤である。キナーゼ阻害剤には、スニチニブ(Pfizerによりスーテント(SUTENT)として販売されている)、パゾパニブ、クリゾチニブ(crizotinib)、ダサチニブが含まれるが、これに限定されない。ある特定の態様では、第2の抗癌剤はスニチニブである。
【００８２】
ある特定の態様では、化学療法剤は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質(mTOR)阻害剤である。mTOR阻害剤には、テムシロリムス、シロリムス、デフォロリムス、およびエベロリムスが含まれるが、これに限定されない。ある特定の態様では、第2の抗癌剤はエベロリムスである。
【００８３】
ある特定の態様では、化学療法剤はソマトスタチン類似体である。ソマトスタチン類似体は、ソマトスタチンの特異的高親和性膜受容体との相互作用を介して作用する。ソマトスタチン類似体には、オクトレオチド、ソマチュリン、およびRC160(オクタスタチン)が含まれるが、これに限定されない。ある特定の態様では、第2の抗癌剤はオクトレオチドである。
【００８４】
ある特定の態様では、化学療法剤はトポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ酵素(トポイソメラーゼIまたはII)の働きを妨害する化学療法剤である。トポイソメラーゼ阻害剤には、ドキソルビシンHCl、クエン酸ダウノルビシン、ミトキサントロンHCL、アクチノマイシンD、エトポシド、トポテカンHCl、テニポシド(VM-26)、およびイリノテカンが含まれるが、これに限定されない。ある特定の態様では、第2の抗癌剤はイリノテカンである。
【００８５】
ある特定の態様では、化学療法剤はアルキル化剤である。ある特定の態様では、化学療法剤はテモゾロミドである。
【００８６】
ある特定の態様では、化学療法剤は代謝拮抗物質である。代謝拮抗物質は、正常な生化学反応に必要な代謝産物に類似しているが、細胞の1つまたは複数の正常機能、例えば、細胞分裂を妨害するには足りる程度の異なる構造を有する化学物質である。代謝拮抗物質には、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキセートナトリウム、ラリトレキセド、ペメトレキセド、テガフール、シトシンアラビノシド、チオグアニン(GlaxoSmithKline)、5-アザシチジン、6-メルカプトプリン、アザチオプリン、6-チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビン、およびクラドリビン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれるが、これに限定されない。ある特定の態様では、第2の抗癌剤はゲムシタビンである。ある特定の態様では、処置される腫瘍は膵神経内分泌腫瘍であり、第2の抗癌剤は代謝拮抗物質(例えば、ゲムシタビン)である。
【００８７】
ある特定の態様では、化学療法剤は、チューブリンに結合する薬剤を含むが、これに限定されない有糸分裂阻害剤である。非限定的な例として、前記薬剤はタキサンを含む。ある特定の態様では、前記薬剤は、パクリタキセルもしくはドセタキセル、またはパクリタキセルもしくはドセタキセルの薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体を含む。ある特定の態様では、前記薬剤は、パクリタキセル(TAXOL)、ドセタキセル(TAXOTERE)、アルブミン結合パクリタキセル(例えば、ABRAXANE)、DHA-パクリタキセル、またはPG-パクリタキセルである。ある特定の他の態様では、有糸分裂阻害剤は、ビンカアルカロイド(vinka alkaloid)、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン(binblastine)、ビノレルビン、もしくはビンデシン、またはその薬学的に許容される塩、酸、もしくは誘導体を含む。ある特定の態様では、有糸分裂阻害剤は、Eg5キネシンの阻害剤または有糸分裂キナーゼ、例えば、AuroraAもしくはPlk1の阻害剤である。
【００８８】
ある特定の態様では、前記処置は、本明細書に記載のWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)および放射線療法の併用投与を伴う。Wntアンタゴニストによる処置は、放射線療法の投与の前に、放射線療法の投与と同時に、または放射線療法の投与の後に行ってもよい。当業者により決定されるように、このような放射線療法の任意の投与計画を使用することができる。
【００８９】
ある特定の態様では、第2の抗癌剤は抗体を含む。従って、処置は、Wntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)と、EGFR、ErbB2、HER2、DLL4、NOTCH、および/またはVEGFに結合する抗体を含むが、これに限定されない、腫瘍関連抗原に対する抗体との併用投与を伴ってもよい。例示的な抗DLL4抗体は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第US2008/0187532号に記載されている。ある特定の態様では、第2の抗癌剤は、血管形成阻害剤である抗体(例えば、抗VEGF抗体)である。さらなる抗DLL4抗体は、例えば、国際公開公報WO2008/091222およびWO2008/0793326、ならびに米国特許出願公開第US2008/0014196号、同第US2008/0175847号、同第US2008/0181899号、および同第US2008/0107648号に記載されている。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。例示的な抗NOTCH抗体は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第US2008/0131434に記載されている。ある特定の態様では、第2の抗癌剤は、血管形成阻害剤である抗体(例えば、抗VEGF抗体)である。ある特定の態様では、第2の抗癌剤はNOTCHシグナル伝達阻害剤である。ある特定の態様では、第2の抗癌剤は、アバスチン(ベバシズマブ)、ハーセプチン(トラスツズマブ)、ベクチビックス(VECTIBIX)(パニツムマブ)、またはエルビタックス(セツキシマブ)である。併用投与は、1種類の薬学的製剤に入れた、または別個の製剤を用いた同時投与を含んでもよく、どちらの順番でもよいが、活性薬剤の全てがその生物活性を同時に発揮できるように一般的にある期間内で行われる連続投与を含んでもよい。
【００９０】
さらに、処置は、1種または複数種のサイトカイン(例えば、リンホカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子、および/または増殖因子)の投与を含んでもよく、癌細胞の外科的除去、または処置を行っている医師により必要とみなされた他の任意の治療法により達成されてもよい。
【００９１】
疾患の処置のために、本明細書に記載のWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)の適切な投与量は、処置される神経内分泌腫瘍のタイプ、神経内分泌腫瘍の重篤度および経過、神経内分泌腫瘍の応答性、Wntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)が治療目的または予防目的で投与されるかどうか、以前の治療法、患者の病歴などによって、全て、処置を行っている医師の自由裁量で決まる。Wntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)は一回投与されてもよく、数日〜数ヶ月間続く一連の処置にわたって投与されてもよく、治癒するまで、または神経内分泌腫瘍が縮小するまで(腫瘍の大きさが小さくなるまで)投与されてもよい。最適な投与計画は、患者の身体における薬物蓄積を測定することによって計算することができ、個々のWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)の相対効力に応じて変化する。投与を行っている医師は、最適な投与量、投与方法、および反復率を容易に決定することができる。ある特定の態様では、投与量は0.01μg〜100mg/kg体重であり、1日に、1週間に、1ヶ月に、または1年に1回以上与えることができる。ある特定の態様では、Wntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)は2週間に1回または3週間に1回与えられる。ある特定の態様では、Wntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)の投与量は約0.1mg〜約20mg/kg体重である。処置を行っている医師は、測定された滞留時間および体液または組織中の薬物濃度に基づいて投薬のための反復率を評価することができる。ある特定の態様では、WntアンタゴニストはOMP-18R5である。ある特定の態様では、WntアンタゴニストはOMP-54F28である。
【００９２】
ある特定の態様では、OMP-18R5は約0.1mg/kg〜約20mg/kgの用量または約0.5mg/kg〜約10mg/kgの用量で静脈内投与される。このような用量は、ある態様では、ほぼ毎週、2週間ごとに、3週間ごとに、または4週間ごとに与えられてもよい。ある特定の態様では、OMP-18R5は約0.5mg/kg〜約10mg/kgの投与量で約2〜4週間ごとに静脈内投与される。ある特定の態様では、OMP-18R5は約1.0mg/kg〜約10mg/kgの投与量で約3週間ごとに静脈内投与される。ある特定の態様では、OMP-18R5は、(a)少なくとも約0.5mg/kgの投与量で約1〜2週間ごとに、または(b)少なくとも約1.0mg/kgの投与量で約3週間ごとに静脈内投与される。ある特定の態様では、前記抗体は約0.5mg/kg〜約1.0mg/kgの投与量で約1〜2週間ごとに投与される。一部の代替態様では、前記抗体は約1.0mg/kg〜約5.0mg/kgの投与量で約3週間ごとに投与される。
【００９３】
非限定的な例として、OMP-54F28は約0.1mg/kg〜約20mg/kgの用量で静脈内投与されてもよい。この用量は、ある態様では、毎週、2週間ごとに、3週間ごとに、または4週間ごとに与えられてもよい。ある特定の態様では、OMP-54F28は約0.5mg/kg〜約10mg/kgの投与量で2〜4週間ごとに静脈内投与される。ある特定の態様では、OMP-54F28は約0.5mg/kg〜約1Omg/kgの投与量で約3週間ごとに静脈内投与される。
【００９４】
3.FZD結合剤
本発明の方法の別の局面は、神経内分泌腫瘍の処置におけるFZD結合剤(例えば、抗FZD抗体)の使用である。ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤(例えば、抗FZD抗体)は1種または複数種のヒトfrizzled受容体(FZD)に特異的に結合する。ある特定の態様では、前記薬剤は2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、または10種のfrizzled受容体に特異的に結合する。前記薬剤が結合するヒトfrizzled受容体は、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10からなる群より選択することができる。ある特定の態様では、1種または複数種のヒトfrizzled受容体はFZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および/またはFZD8を含む。ある特定の態様では、1種または複数種のヒトfrizzled受容体はFZD7を含む。ある特定の態様では、1種または複数種のヒトfrizzled受容体はFZD5および/またはFZD8を含む。ある特定の態様では、前記薬剤はFZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8に特異的に結合する。ある特定の態様では、FZD結合剤はFZD7に特異的に結合する。ある特定の態様では、FZD結合剤はFZD5に特異的に結合する。FZD1〜10の完全長アミノ酸(aa)およびヌクレオチド(nt)配列は当技術分野において公知であり、SEQ ID NO:1(FZD1 aa)、SEQ ID NO:2(FZD2 aa)、SEQ ID NO:3(FZD3 aa)、SEQ ID NO:4(FZD4 aa)、SEQ ID NO:5(FZD5 aa)、SEQ ID NO:6(FZD6 aa)、SEQ ID NO:7(FZD7 aa)、SEQ ID NO:8(FZD8 aa)、SEQ ID NO:9(FZD9 aa)、SEQ ID NO:10(FZD10 aa)としても本明細書において提供される。
【００９５】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤(例えば、抗FZD抗体)は2種以上のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する。ある特定の態様では、2種以上のヒトfrizzled受容体は、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される。ある特定の態様では、2種以上のfrizzled受容体は、FZD1、ならびにFZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される第2のfrizzled受容体を含む。ある特定の態様では、2種以上のfrizzled受容体は、FZD2、ならびにFZD1、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される第2のfrizzled受容体を含む。ある特定の態様では、2種以上のfrizzled受容体は、FZD5、ならびにFZD1、FZD2、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される第2のfrizzled受容体を含む。ある特定の態様では、2種以上のfrizzled受容体はFZD5およびFZD8の両方を含む。ある特定の態様では、2種以上のfrizzled受容体は、FZD7、ならびにFZD1、FZD2、FZD5、およびFZD8からなる群より選択される第2のfrizzled受容体を含む。ある特定の態様では、前記薬剤は3種以上のヒトfrizzled受容体に特異的に結合する。ある特定の態様では、3種以上のヒトfrizzled受容体は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される3種以上のfrizzled受容体を含む。ある特定の態様では、さらに、前記薬剤は1種または複数種のさらなるヒトfrizzled受容体に特異的に結合する。
【００９６】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤(例えば、抗FZD抗体)は、それが結合する1種または複数種のヒトfrizzled受容体の中の細胞外ドメイン(ECD)に特異的に結合する。ヒトfrizzled受容体それぞれの細胞外ドメインの配列は当技術分野において公知であり、SEQ ID NO:11(FZD1 ECD)、SEQ ID NO:12(FZD2 ECD)、SEQ ID NO:13(FZD3 ECD)、SEQ ID NO:14(FZD4 ECD)、SEQ ID NO:15(FZD5 ECD)、SEQ ID NO:16(FZD6 ECD)、SEQ ID NO:17(FZD7 ECD)、SEQ ID NO:18(FZD8 ECD)、SEQ ID NO:19(FZD9 ECD)、およびSEQ ID NO:20(FZD10 ECD)としても提供される。特に有用な抗体は米国特許第7,982,013号および米国特許出願公開第2012/0027778号に記載されている。これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００９７】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤(例えば、抗FZD抗体)は、それが結合するヒトfrizzled受容体の中のFriドメイン(FRI)(システインリッチドメイン(CRD)としても知られる)に特異的に結合する。ヒトfrizzled受容体それぞれのFriドメインの配列は当技術分野において公知であり、これも本明細書において提供される。FZD1のFriドメインは、SEQ ID NO:11の約アミノ酸87〜237を含む。FZD2のFriドメインはSEQ ID NO:12の約アミノ酸24〜159を含む。FZD3のFriドメインはSEQ ID NO:13の約アミノ酸23〜143を含む。FZD4のFriドメインはSEQ ID NO:14の約アミノ酸40〜170を含む。FZD5のFriドメインはSEQ ID NO:15の約アミノ酸27〜157を含む。FZD6のFriドメインはSEQ ID NO:16の約アミノ酸19〜146を含む。FZD7のFriドメインはSEQ ID NO:17の約アミノ酸33〜170を含む。FZD8のFriドメインはSEQ ID NO:18の約アミノ酸28〜158を含む。FZD9のFriドメインはSEQ ID NO:19の約アミノ酸23〜159を含む。FZD10のFriドメインはSEQ ID NO:20の約アミノ酸21〜154を含む。ヒトFZD受容体それぞれの対応する予測FriドメインはSEQ ID NO:21〜30として提供される。ヒトFZD受容体(FZD1〜10)それぞれの最小コアFriドメイン配列はSEQ ID NO:73〜82として提供される。当業者は、様々なFriドメインに対応する正確なアミノ酸の理解の点では異なる可能性がある。従って、特定の態様では、前記および本明細書において概説したドメインのN末端またはC末端は、1アミノ酸、2アミノ酸、3アミノ酸、4アミノ酸、5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、さらには10アミノ酸長くてもよく、または短くてもよい。
【００９８】
ある特定の態様では、FZD結合抗体の個々の抗原結合部位は、1種、2種、3種、4種、もしくは5種の(またはそれより多い)ヒトfrizzled受容体に結合することができる(または結合する)。ある特定の態様では、FZD結合抗体の個々の抗原結合部位は、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8からなる群より選択される1種、2種、3種、4種、もしくは5種のヒトfrizzled受容体に特異的に結合することができる。ある特定の態様では、前記抗体の個々の結合部位は少なくともFZD5およびFZD8に特異的に結合する。
【００９９】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤(例えば、抗FZD抗体)は、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、または約10nM以下の解離定数(KD)で1種または複数種(例えば、2種以上、3種以上、または4種以上)のヒトfrizzled受容体に結合する。例えば、ある特定の態様では、複数種のFZDに結合するFZD結合剤または抗体は、約100nM以下、約20nM以下、または約10nM以下のKDでFZDに結合する。ある特定の態様では、FZD結合剤または抗体は、約40nM以下の解離定数で、以下のFZDの1つまたは複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ)のそれぞれに結合する:FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8。ある特定の態様では、FZD結合剤または抗体は、約10nM以下の解離定数で、以下のFZDの1つまたは複数のそれぞれに結合する:FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8。ある特定の態様では、FZD結合剤または抗体は、約10nM以下の解離定数で、以下のFZDのそれぞれに結合する:FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、およびFZD8。ある特定の態様では、前記薬剤または抗体とある特定のFZDとの解離定数は、Biacoreチップ上に固定化されたFZD細胞外ドメインまたはFriドメインを含むFZD-Fc融合タンパク質を用いて求められた解離定数である。
【０１００】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤(例えば、抗FZD抗体)は、前記薬剤が結合する少なくとも1種のヒトfrizzled受容体(すなわち、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、または10種のFZD)のアンタゴニストである。ある特定の態様では、前記薬剤は、結合したヒトfrizzled受容体の1つまたは複数の活性の少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％を阻害する。
【０１０１】
ある特定の態様では、FZD結合剤(例えば、抗FZD抗体)は、少なくとも1種のヒトfrizzled受容体に対するリガンドの結合を阻害する。ある特定の態様では、リガンドはヒトWntタンパク質である。19種のヒトWntタンパク質が特定されている:Wnt1、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、Wnt9A(以前はWnt14)、Wnt9B(以前はWnt15)、Wnt10A、Wnt10B、Wnt11、およびWnt16。ある特定の態様では、前記薬剤はFZD8に対するWnt3Aの結合を阻害する。ある特定の態様では、FZD結合剤によって得られる、特定のヒトfrizzledタンパク質に対する特定のリガンドの結合の阻害は、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％である。ある特定の態様では、FZDに対するリガンド、例えば、Wntの結合を阻害する薬剤はWntシグナル伝達をさらに阻害する(例えば、古典的Wntシグナル伝達を阻害する)。
【０１０２】
ある特定の態様では、FZD結合剤(例えば、抗FZD抗体)はWntシグナル伝達を阻害する。Wntシグナル伝達を阻害するFZD結合剤は、ある特定の態様では、1種または複数種のWntによるシグナル伝達を阻害することができるが、必ずしも全種のWntによるシグナル伝達を阻害しないことが理解される。ある特定の代替態様では、全種のヒトWntによるシグナル伝達が阻害されてもよい。ある態様では、Wnt1、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3、Wnt3A、Wnt4、Wnt5A、Wnt5B、Wnt6、Wnt7A、Wnt7B、Wnt8A、Wnt8B、Wnt9A(以前はWnt14)、Wnt9B(以前はWnt15)、Wnt10A、Wnt10B、Wnt11、およびWnt16からなる群より選択される1種または複数種のWntによるシグナル伝達が阻害される。ある特定の態様では、阻害されるWntシグナル伝達は、Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3A、Wnt7a、Wnt7b、および/またはWnt10Bによるシグナル伝達である。ある特定の態様では、前記薬剤は、(少なくとも)Wnt1、Wnt3A、Wnt7b、およびWnt10Bによるシグナル伝達を阻害する。特定の態様では、前記薬剤は、(少なくとも)Wnt3Aによるシグナル伝達を阻害する。ある特定の態様では、FZD結合剤により得られる、Wntによるシグナル伝達の阻害は、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％の、Wntによるシグナル伝達レベルの低下である。ある特定の態様では、阻害されるWntシグナル伝達は古典的Wntシグナル伝達である。
【０１０３】
FZD結合剤(または候補FZD結合剤)がWntシグナル伝達を阻害するかどうかを確かめるためのインビボアッセイおよびインビトロアッセイは当技術分野において公知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2012/0027778号を参照されたい。
【０１０４】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤(例えば、抗FZD抗体)は、以下の効果の1つまたは複数を有する:神経内分泌腫瘍細胞の増殖を阻害する、神経内分泌腫瘍にある癌幹細胞の頻度を低下させることによって神経内分泌腫瘍の腫瘍形成能を低下させる、神経内分泌腫瘍の成長を阻害する、生存率を高める、神経内分泌腫瘍細胞の細胞死を誘発する、腫瘍形成性神経内分泌腫瘍細胞を分化させて非腫瘍形成状態にする、または腫瘍細胞の転移を阻止する。
【０１０５】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤は神経内分泌腫瘍の成長を阻害することができる。ある特定の態様では、FZD結合剤はインビボで(例えば、異種移植片マウスモデルにおいて、および/または癌を有するヒトにおいて)神経内分泌腫瘍の成長を阻害することができる。
【０１０６】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤は神経内分泌腫瘍の腫瘍形成能を低下することができる。ある特定の態様では、前記薬剤または抗体は、動物モデル、例えば、マウス異種移植片モデルにおいて癌幹細胞を含む神経内分泌腫瘍の腫瘍形成能を低下することができる。ある特定の態様では、腫瘍にある癌幹細胞の数または頻度は、少なくとも約1/2、約1/3、約1/5、約1/10、約1/50、約1/100、または約1/1000になる。ある特定の態様では、癌幹細胞の数または頻度の低下は動物モデルを用いた限界希釈アッセイによって確かめられる。抗FZD抗体の効力を試験するのに用いられる限界希釈アッセイの一例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるUS2012/0027778の実施例8に提供される。腫瘍にある癌幹細胞の数または頻度の低下を確かめるための限界希釈アッセイの使用に関する、さらなる例およびガイダンスは、例えば、国際公開公報番号WO2008/042236、米国特許出願公開第2008/0064049号、および米国特許出願公開第2008/0178305号において見られる。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１０７】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤(例えば、抗体)はポリペプチドである。ある特定の態様では、前記薬剤またはポリペプチドは抗体である。ある特定の態様では、前記抗体はIgG1抗体またはIgG2抗体である。ある特定の態様では、前記抗体はモノクローナル抗体である。ある特定の態様では、前記抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。ある特定の態様では、前記抗体は抗体断片である。
【０１０８】
ある特定の態様では、本発明の方法のための抗FZD抗体は、18R5、18R8、および/または44R24ヒト抗体のCDR(以下の表1を参照されたい)のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、および/または6つを含み、1つのCDRにつき4個までの(すなわち、0個、1個、2個、3個、または4個の)保存的アミノ酸置換がある。ある特定の態様では、重鎖CDRは重鎖可変領域内に含まれる、および/または軽鎖CDRは軽鎖可変領域内に含まれる。
【０１０９】
（表１）18R8、18R5、および44R24ヒト抗体のCDR
2015536933.tif 000011
*N結合型グリコシル化部位を除去するためにCDR1に導入された部位特異的変化に下線を付けた。
【０１１０】
1つの態様では、本発明の方法において有用な抗FZD抗体は、
(a)
2015536933.tif 000012
を含む重鎖CDR1、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(b)
2015536933.tif 000013
を含む重鎖CDR2、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;および/あるいは
(c)
2015536933.tif 000014
を含む重鎖CDR3、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗FZD抗体は、
(a)
2015536933.tif 000015
を含む軽鎖CDR1、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(b)
2015536933.tif 000016
を含む軽鎖CDR2、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;および/あるいは
(c)
2015536933.tif 000017
を含む軽鎖CDR3、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種を含む軽鎖可変領域をさらに含む。ある特定の態様では、アミノ酸置換は保存的置換である。さらなる態様では、本発明の方法において有用な抗FZD抗体は、
(a)
2015536933.tif 000018
を含む重鎖CDR1、
2015536933.tif 000019
を含む重鎖CDR2、および
2015536933.tif 000020
を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域;ならびに/または
(b)
2015536933.tif 000021
を含む軽鎖CDR1、
2015536933.tif 000022
を含む軽鎖CDR2、および/もしくは
2015536933.tif 000023
を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１１１】
1つの態様では、本発明の方法において有用な抗FZD抗体は、
(a)
2015536933.tif 000024
を含む重鎖CDR1、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(b)
2015536933.tif 000025
を含む重鎖CDR2、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;および/あるいは
(c)
2015536933.tif 000026
を含む重鎖CDR3、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗FZD抗体は、
(a)
2015536933.tif 000027
を含む軽鎖CDR1、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;
(b)
2015536933.tif 000028
を含む軽鎖CDR2、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種;および/あるいは
(c)
2015536933.tif 000029
を含む軽鎖CDR3、または1個、2個、3個、もしくは4個のアミノ酸置換を含む、その変種を含む軽鎖可変領域をさらに含む。ある特定の態様では、アミノ酸置換は保存的置換である。さらなる態様では、本発明の方法において有用な抗FZD抗体は、
(a)
2015536933.tif 000030
を含む重鎖CDR1、
2015536933.tif 000031
を含む重鎖CDR2、および
2015536933.tif 000032
を含む重鎖CDR3
を含む重鎖可変領域;ならびに/または
(b)
2015536933.tif 000033
を含む軽鎖CDR1、
2015536933.tif 000034
を含む軽鎖CDR2、および
2015536933.tif 000035
を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１１２】
1つの態様では、本発明の方法において有用な抗FZD抗体は、
(a)
2015536933.tif 000036
を含む重鎖CDR1、または1個、2個、3個、もしくは4個の保存的アミノ酸置換を含む、その変種;
(b)
2015536933.tif 000037
を含む重鎖CDR2、または1個、2個、3個、もしくは4個の保存的アミノ酸置換を含む、その変種;および/あるいは
(c)
2015536933.tif 000038
を含む重鎖CDR3、または1個、2個、3個、もしくは4個の保存的アミノ酸置換を含む、その変種を含む重鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗FZD抗体は、
(a)
2015536933.tif 000039
を含む軽鎖CDR1、または1個、2個、3個、もしくは4個の保存的アミノ酸置換を含む、その変種;
(b)
2015536933.tif 000040
を含む軽鎖CDR2、または1個、2個、3個、もしくは4個の保存的アミノ酸置換を含む、その変種;および
(c)
2015536933.tif 000041
を含む軽鎖CDR3、または1個、2個、3個、もしくは4個の保存的アミノ酸置換を含む、その変種
を含む軽鎖可変領域をさらに含む。ある特定の態様では、前記抗体は、
(a)
2015536933.tif 000042
を含む重鎖CDR1、
2015536933.tif 000043
を含む重鎖CDR2、および
2015536933.tif 000044
を含む重鎖CDR3;ならびに/または
(b)
2015536933.tif 000045
を含む軽鎖CDR1、
2015536933.tif 000046
を含む軽鎖CDR2、および
2015536933.tif 000047
を含む軽鎖CDR3を含む。
【０１１３】
ある特定の態様では、本発明の方法に有用な抗FZD抗体は、(a)SEQ ID NO:37もしくはSEQ ID NO:52と少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、もしくは少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および/または(b)SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:38、もしくはSEQ ID NO:53と少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、もしくは少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、本発明の方法に有用な抗FZD抗体は、(a)SEQ ID NO:37と少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する重鎖可変領域;および(b)SEQ ID NO:38と少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約97％、または少なくとも約99％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、本発明の方法に有用な抗FZD抗体は、(a)SEQ ID NO:37もしくはSEQ ID NO:52のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;および/または(b)SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:38、もしくはSEQ ID NO:53のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗FZD抗体は、(a)SEQ ID NO:37のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;および/または(b)SEQ ID NO:44のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗FZD抗体は、(a)SEQ ID NO:37のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;および/または(b)SEQ ID NO:38のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の態様では、抗FZD抗体は、(a)SEQ ID NO:52のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域;および/または(b)SEQ ID NO:53のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【０１１４】
（表２）選択されたヒト抗FZD抗体のVHおよびVL
2015536933.tif 000048
【０１１５】
ある特定の態様では、本発明の方法に有用な抗FZD抗体は、(a)SEQ ID NO:39の重鎖およびSEQ ID NO:45の軽鎖;または(b)SEQ ID NO:39の重鎖およびSEQ ID NO:40の軽鎖を含む。
【０１１６】
（表３）選択されたヒト抗FZD抗体の重鎖および軽鎖
2015536933.tif 000049
【０１１７】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤は、18R8、18R5、および44R24 IgG抗体からなる群より選択される抗FZD抗体を含むか、該抗FZD抗体から本質的になるか、または該抗FZD抗体からなる。
【０１１８】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤は、(リーダー配列を有する、または有さない)18R8 IgG2抗体の重鎖および軽鎖を含む。ある特定の態様では、FZD結合剤は18R8 IgG2抗体である。18R8 IgG2抗体の重鎖および軽鎖をコードするDNAは、ブタペスト条約の規定に基づいて2008年9月29日にAmerican Type Culture Collection(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA, USAに寄託され、ATCC寄託指定番号PTA-9540が割り当てられた。ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤は、(リーダー配列を有する、または有さない)18R5 IgG2抗体の重鎖および軽鎖を含む。ある特定の態様では、FZD結合剤は18R5 IgG2抗体である。18R5 IgG2抗体は本明細書においてOMP-18R5とも呼ばれる。18R5 IgG2抗体の重鎖および軽鎖をコードするDNAは、ブタペスト条約の規定に基づいて2008年9月29日にATCCに寄託され、ATCC寄託指定番号PTA-9541が割り当てられた。OMP-18R5抗体に関するさらなる情報は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7,982,013号において見られる。米国特許第7,982,013号において、OMP-18R5抗体は、一般的に、「18R5」または「18R5 IgG2抗体」と呼ばれる。
【０１１９】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤は、2009年8月26日にATCCに寄託され、寄託指定番号PTA-10307、PTA-10309、またはPTA-10311が割り当てられたプラスミドによってコードされるIgG抗体である。
【０１２０】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤は、(例えば、競合的結合アッセイにおいて)FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、および/またはFZD8への特異的結合において、ATCC寄託指定番号PTA-9540、PTA-9541、PTA-10307、またはPTA-10309を有するプラスミドによってコードされる抗体と競合する薬剤である。ある特定の代替態様では、FZD結合剤は、FZD5および/またはFZD8への特異的結合において、ATCC寄託指定番号PTA-10311を有するプラスミドによってコードされる抗体と競合する薬剤である。
【０１２１】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤(例えば、抗体)は、18R5、18R8、または44R24抗体のエピトープと同じエピトープに結合するか、18R5、18R8、または44R24抗体のエピトープと重複するエピトープに結合する。
【０１２２】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤(例えば、抗体)は、ヒトfrizzled受容体への特異的結合において18R5、18R8、または44R24抗体と競合する。
【０１２３】
本発明の方法において有用なFZD結合剤のさらなる例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2012/0027778号に開示される。
【０１２４】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なFZD結合剤は、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間のマウス、カニクイザル(cynomolgous monkey)、またはヒトにおける循環半減期を有する。ある特定の態様では、FZD結合剤は、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間のマウス、カニクイザル、またはヒトにおける循環半減期を有するIgG(例えば、IgG1またはIgG2)抗体である。ポリペプチドおよび抗体などの薬剤の半減期を延ばす方法は当技術分野において公知である。例えば、IgG抗体の循環半減期を延ばす公知の方法には、pH6.0での抗体と新生児型Fc受容体(FcRn)とのpH依存性結合を高める、Fc領域への変異の導入が含まれる(例えば、米国特許出願公開第2005/0276799号、同第2007/0148164号、および同第2007/0122403号を参照されたい)。Fc領域を欠く抗体断片の循環半減期を延ばす公知の方法には、ペグ化のような技法が含まれる。
【０１２５】
ある特定の態様では、本発明の方法に有用な抗FZD抗体は、ヒトfrizzled受容体を特異的に認識する二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープを特異的に認識および結合することができる抗体である。1つの態様では、二重特異性抗FZD抗体は、同じヒトfrizzled受容体の中にある異なるエピトープを特異的に認識する。別の態様では、二重特異性抗FZD抗体は、ヒトfrizzled受容体の中にある異なるエピトープまたは異なるヒトfrizzled受容体上にある異なるエピトープを特異的に認識する。
【０１２６】
または、ある特定の代替態様では、本発明の方法に有用な抗FZD抗体は二重特異性抗体でない。
【０１２７】
ある特定の態様では、本発明の方法に有用な抗FZD抗体は単一特異性である。例えば、ある特定の態様では、抗体に含まれる1つまたは複数の抗原結合部位はそれぞれ、1種または複数種の同じヒトFZD受容体(例えば、FZD1、FZD2、FZD5、FZD7、またはFZD8、もしくはFZDの一部の組み合わせにある相同エピトープ)に結合することができる(または結合する)。ある特定の態様では、単一特異性抗FZD抗体の抗原結合部位は、1種、2種、3種、4種、もしくは5種の(またはそれより多い)ヒトfrizzled受容体に結合することができる(または結合する)。
【０１２８】
ある特定の態様では、本発明の方法に有用なFZD結合剤は、抗体でないポリペプチドである。タンパク質標的に高親和性で結合する非抗体ポリペプチドを特定および作製するための様々な方法が当技術分野において公知である。例えば、Skerra, Curr. Opin. Biotechnol., 18:295-304 (2007)、Hosse et al., Protein Science, 15:14-27 (2006)、Gill et al., Curr. Opin. Biotechnol, 17:653-658 (2006)、Nygren, FEES J. 275:2668-76 (2008)、およびSkerra, FEBS J., 275:2677-83 (2008)を参照されたい。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１２９】
ある特定の態様では、本発明の方法に有用なFZD結合剤は、プロテインA、リポカリン、フリブロネクチン(fribronectin)ドメイン、アンキリンコンセンサス反復ドメイン、およびチオレドキシンからなる群より選択されるタイプのタンパク質スキャフォールドを含む。
【０１３０】
ある特定の態様では、本発明の方法に有用なFZD結合剤は天然または非天然に改変されている。非限定的な例として、ポリペプチドは標識されてもよい。ある特定の態様では、ポリペプチドはグリコシル化される、ペグ化される、リン酸化される、またはアセチル化される、アミド化される。ある特定の態様では、改変はポリペプチドの安定性を高める、および/またはインビボ半減期を延ばす。ある特定の態様では、ポリペプチドは環状である。ある特定のさらなる態様では、ポリペプチドは1つまたは複数のN-メチルアミノ酸を含む。
【０１３１】
ある特定の態様では、本発明の方法に有用なFZD結合剤は、SEQ ID NO:54〜72からなる群より選択されるアミノ酸配列、もしくは(b)SEQ ID NO:54〜67または69〜72からなる群より選択される配列と少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約88％、または少なくとも約90％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドである(あるいは、これを含む)。ある特定の態様では、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:54〜72からなる群より選択される環状ペプチドを含む、該環状ペプチドから本質的になる、または該環状ペプチドからなる。ある特定の態様では、アミノ酸配列はSEQ ID NO:64である。ある特定の代替態様では、アミノ酸配列はSEQ ID NO:68である。
【０１３２】
ある特定の態様では、本発明の方法に有用なFZD結合ポリペプチドの長さは約500アミノ酸より短く、長さは約200アミノ酸より短く、長さは約100アミノ酸より短く、長さは約50アミノ酸より短く、長さは約20アミノ酸アミノ酸より短く、長さは約15アミノ酸より短い。ある特定の態様では、FZD結合ポリペプチドの長さは少なくとも約3、少なくとも約5、または少なくとも約7アミノ酸である。従って、ある特定の態様では、ポリペプチドの長さは約5〜約20アミノ酸である。ある態様では、ポリペプチドの長さは約7〜約15アミノ酸である。
【０１３３】
4.可溶性受容体
本発明の方法のさらなる局面は、神経内分泌腫瘍の処置におけるWntアンタゴニスト可溶性受容体の使用である。ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体はFZD受容体の細胞外ドメインを含む。ある態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体はFZD受容体のFriドメインを含む。ある特定の態様では、FZD受容体はヒトFZD受容体である。ある特定の態様では、ヒトFZD受容体は、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、またはFZD10である。ある特定の態様では、FZD受容体はFZD8である。ある特定の態様では、本明細書に記載の方法において用いられるWntアンタゴニストはヒトFZD8 FriドメインおよびヒトFc領域を含む。
【０１３４】
一部の代替態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体はSFRPの一部を含む。ある態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体はSFRPのFriドメインを含む。ある特定の態様では、SFRPはヒトSFRPである。ある態様では、ヒトSFRPは、SFRP1、SFRP2、SFRP3、SFRP4、またはSFRP5である。ヒトSFRP(SFRP1〜5)それぞれの最小コアFriドメイン配列はSEQ ID NO:83〜87として提供される。
【０１３５】
他の代替態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体はRORタンパク質の細胞外ドメインを含む。ある態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体はRORタンパク質のFriドメインを含む。ある特定の態様では、RORはヒトRORである。ある態様では、ヒトRORはROR1またはROR2である。ヒトROR1およびROR2の最小コアFriドメイン配列はSEQ ID NO:88およびSEQ ID NO:89として提供される。
【０１３６】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体(例えば、FZD8 Fri.Fc)は、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種以上のWntタンパク質に特異的に結合する。非限定的な例として、Wnt結合剤は、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、および/またはWnt10bに結合してもよい。ある特定の態様では、Wnt結合剤はWnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、およびWnt7bに結合する。ある特定の態様では、可溶性受容体はWntアンタゴニストである。ある特定の態様では、可溶性受容体はWntシグナル伝達を阻害する。ある態様では、可溶性受容体は古典的Wntシグナル伝達を阻害する。
【０１３７】
本発明の方法において有用な可溶性FZD受容体の非限定的な例は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第7,723,477号において見られる。さらなる可溶性受容体(例えば、可溶性FZD受容体)は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、US2011/0305695に開示される。
【０１３８】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体は、ヒトFZD受容体のFriドメイン、または1種または複数種のヒトWntタンパク質に結合するFriドメインの断片もしくは変種を含む。ある特定の態様では、ヒトFZD受容体はFZD4である。ある特定の代替態様では、ヒトFZD受容体はFZD5である。ある特定のさらなる代替態様では、ヒトFZD受容体はFZD8である。ある特定の態様では、FZDはFZD4であり、可溶性受容体はSEQ ID NO:76を含むか、またはSEQ ID NO:90の約アミノ酸40〜170を含む。ある特定の態様では、FZDはFZD5であり、可溶性受容体はSEQ ID NO:77を含むか、またはSEQ ID NO:91の約アミノ酸27〜157を含む。ある特定の態様では、FZDはFZD8であり、可溶性受容体はSEQ ID NO:80を含むか、またはSEQ ID NO:92の約アミノ酸28〜158を含む。
【０１３９】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体は、SEQ ID NO:73〜89からなる群より選択される最小Friドメイン配列を含む。ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体は、1つまたは複数の(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個などの)保存的置換を含み、Wntに結合することができる、上述のFriドメイン配列のいずれか1つの変種を含む。
【０１４０】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体、例えば、ヒトFZD受容体の最小Friドメインを含む可溶性受容体はヒトFc領域(例えば、ヒトIgG1 Fc領域)をさらに含む。FZD受容体のFriドメインおよびヒトIgG1 Fcを含む可溶性受容体は本明細書において「FZD Fri.Fc」(例えば、FZD8 Fri.Fc)と呼ばれる。Fc領域は、免疫グロブリンの任意のクラス、IgG、IgA、IgM、IgDおよびIgEから得ることができる。ある態様では、Fc領域は野生型Fc領域である。ある態様では、Fc領域は変異Fc領域である。ある態様では、Fc領域のN末端は、(例えば、ヒンジドメイン内の)1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個のアミノ酸分だけ切断されている。ある態様では、望ましくないジスルフィド結合形成を妨げるために、ヒンジドメイン内のアミノ酸が変えられる。ある態様では、望ましくないジスルフィド結合形成を妨げるために、システインがセリンと取り替えられる。ある特定の態様では、Fc領域はSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、もしくはSEQ ID NO:95を含むか、またはSEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、もしくはSEQ ID NO:95から本質的になる。
【０１４１】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体は、少なくとも最小Friドメイン(例えば、FZD受容体の最小Friドメイン)およびFc領域を含む融合タンパク質である。本明細書で使用する「融合タンパク質」は、少なくとも2種の遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質である。ある態様では、第1のポリペプチドのC末端は免疫グロブリンFc領域のN末端に連結される。ある態様では、第1のポリペプチド(例えば、FZD Friドメイン)はFc領域に直接(すなわち、介在ペプチドリンカーなく)連結される。ある態様では、第1のポリペプチドはペプチドリンカーを介してFc領域に連結される。
【０１４２】
本明細書で使用する、「リンカー」という用語は、第1のポリペプチド(例えば、FZD成分)と第2のポリペプチド(例えば、Fc領域)との間に挿入されるリンカーを指す。ある態様では、リンカーはペプチドリンカーである。リンカーは、ポリペプチドの発現、分泌、または生理活性に悪影響を及ぼしてはならない。リンカーは抗原性があってはならず、免疫応答を誘発してはならない。適切なリンカーは当業者に公知であり、グリシン残基およびセリン残基の混合物を含むことが多く、立体障害のないアミノ酸を含むことが多い。有用なリンカーに組み込むことができる他のアミノ酸にはスレオニン残基およびアラニン残基が含まれる。リンカーの長さは異なってもよく、例えば、長さは1〜50アミノ酸、長さは1〜22アミノ酸、長さは1〜10アミノ酸、長さは1〜5アミノ酸、または長さは1〜3アミノ酸でもよい。リンカーには、SerGly、GGSG、GSGS、GGGS、S(GGS)n、式中、nは1〜7である、GRA、ポリ(Gly)、ポリ(Ala)、
2015536933.tif 000050
が含まれ得るが、これに限定されない。本明細書で使用するリンカーは、第1のポリペプチドのC末端(例えば、FZD Friドメイン)に由来するアミノ酸残基も第2のポリペプチドのN末端(例えば、Fc領域)に由来するアミノ酸残基も含まない介在ペプチド配列である。
【０１４３】
ある特定の態様では、本発明の方法に有用な可溶性受容体は、タンパク質の輸送を誘導するシグナル配列を含有する。シグナル配列(シグナルペプチドまたはリーダー配列とも呼ばれる)は新生ポリペプチドのN末端に配置される。シグナル配列はポリペプチドを小胞体に標的化し、タンパク質は目的地に、例えば、細胞小器官の内部空間、内膜、細胞の外膜、または分泌を介して細胞外部に仕分けされる。タンパク質が小胞体に輸送された後に、ほとんどのシグナル配列はシグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。ポリペプチドからのシグナル配列の切断は、通常、アミノ酸配列中の特異的部位において起こり、シグナル配列内のアミノ酸残基に依存する。通常、一カ所の特異的切断部位があるが、複数の切断部位がシグナルペプチダーゼによって認識および/または使用されて、ポリペプチドの均質でないN末端が生じる場合がある。例えば、シグナル配列内の異なる切断部位を用いると、異なるN末端アミノ酸を有する発現ポリペプチドを生じることができる。従って、ある態様では、本発明の方法に有用な可溶性受容体は、異なるN末端を有するポリペプチドの混合物を含んでもよい。ある態様では、N末端の長さは1個、2個、3個、4個、または5個のアミノ酸分だけ異なる。ある態様では、可溶性受容体ポリペプチドは実質的に均質である、すなわち、ポリペプチドは同じN末端を有する。ある態様では、ポリペプチドのシグナル配列は、一カ所の切断部位が優勢になり、それによって、あるN末端を有する実質的に均質なポリペプチドを生じるのを可能にするアミノ酸置換および/または欠失を含む。ある態様では、ポリペプチドのシグナル配列は、表3に列挙した群より選択される配列を含むか、またはこれから本質的になる。ある態様では、シグナル配列はSEQ ID NO:101である。ある態様では、シグナル配列はSEQ ID NO:104である。ある態様では、シグナル配列はSEQ ID NO:106である。
【０１４４】
（表３）シグナル配列
2015536933.tif 000051
【０１４５】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体は、FZDドメイン成分およびFc領域を含む第1のポリペプチドを含む。ある態様では、FZDドメイン成分は、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、またはFZD10からのものである。ある態様では、Fc領域はIgG1免疫グロブリンからのものである。ある態様では、可溶性受容体は、(a)SEQ ID NO.11のX1〜Y1、SEQ ID NO:12のX2〜Y2、SEQ ID NO:13のX3〜Y3、SEQ ID NO:14のX4〜Y4、SEQ ID NO:15のX5〜Y5、SEQ ID NO:16のX6〜Y6、SEQ ID NO:17のX7〜Y7、SEQ ID NO:18のX8〜Y8、SEQ ID NO:19のX9〜Y9、およびSEQ ID NO:20のX10〜Y10からなる群より選択されるアミノ酸から本質的になる第1のポリペプチド;ならびに(b)SEQ ID NO:95のアミノ酸A〜Bから本質的になる第2のポリペプチドを含み、
式中、X1=アミノ酸69、70、71、72、73、74、75、または76
Y1=アミノ酸236、237、238、239、240、241、242、または243
X2=アミノ酸22、23、24、25、26、27、または28
Y2=アミノ酸158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、または172
X3=アミノ酸18、19、20、21、22、23、24、または25
Y3=アミノ酸141、142、143、144、145、146、147、148、または149
X4=アミノ酸38、39、40、41、または42
Y4=アミノ酸168、169、170、171、172、173、174、175、または176
X5=アミノ酸25、26、27、28、または29
Y5=アミノ酸155、156、157、158、159、160、161、162、163、または164
X6=アミノ酸19、20、21、22、23、または24
Y6=アミノ酸144、145、146、147、148、149、150、151、または152
X7=アミノ酸22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、または34
Y7=アミノ酸178、179、180、181、182、183、184、185、または186
X8=アミノ酸25、26、27、28、29、30、または31
Y8=アミノ酸156、157、158、159、160、161、162、163、または164
X9=アミノ酸21、22、23、または24
Y9=アミノ酸137、138、139、140、141、142、143、144、145、または146
X10=アミノ酸20、21、22、23、24、または25
Y10=アミノ酸152、153、154、155、156、157、158、159、または160
A=アミノ酸1、2、3、4、5、または6
B=アミノ酸231または232
である。
【０１４６】
ある態様では、第1のポリペプチドは第2のポリペプチドに直接連結される。ある態様では、第1のポリペプチドはペプチドリンカーを介して第2のポリペプチドに連結される。ある態様では、第1のポリペプチドはペプチドリンカーGRAを介して第2のポリペプチドに連結される。ある特定のアミノ酸「から本質的になる(consists essentially of)」またはある特定のアミノ酸「から本質的になる(consisting essentially of)」ポリペプチド(例えば、第1のポリペプチドまたは第2のポリペプチド)は、ある態様では、1つまたは複数の(例えば、1個、2個、3個、4個の、またはそれより多い)さらなるアミノ酸がWnt結合剤の機能に実質的に影響を及ぼさない限り、一端または両端にさらなるアミノ酸を含む。
【０１４７】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体は、(a)SEQ ID NO:18のアミノ酸X〜Yから本質的になる第1のポリペプチド;および(b)SEQ ID NO:95のアミノ酸A〜Bから本質的になる第2のポリペプチドを含み、第1のポリペプチドは第2のポリペプチドに直接連結され、
X=アミノ酸25、26、27、28、29、30、または31
Y=アミノ酸156、157、158、159、160、161、162、163、または164
A=アミノ酸1、2、3、4、5、または6
B=アミノ酸231または232
である。
【０１４８】
ある態様では、第1のポリペプチドはSEQ ID NO:18のアミノ酸25〜158から本質的になる。他の態様では、第1のポリペプチドはSEQ ID NO:18のアミノ酸25〜158からなる。ある態様では、第1のポリペプチドはSEQ ID NO:18のアミノ酸28〜158から本質的になる。他の態様では、第1のポリペプチドはSEQ ID NO:18のアミノ酸28〜158からなる。ある態様では、第1のポリペプチドはSEQ ID NO:18のアミノ酸31〜158からなる。ある態様では、第2のポリペプチドはSEQ ID NO:95のアミノ酸1〜232からなる。ある態様では、第2のポリペプチドはSEQ ID NO:95のアミノ酸3〜232からなる。ある態様では、第2のポリペプチドはSEQ ID NO:95のアミノ酸6〜232からなる。ある態様では、第1のポリペプチドはSEQ ID NO:28であり、第2のポリペプチドはSEQ ID NO:95である。ある態様では、第1のポリペプチドはSEQ ID NO:28であり、第2のポリペプチドはSEQ ID NO:94である。ある態様では、第1のポリペプチドはSEQ ID NO:28であり、第2のポリペプチドはSEQ ID NO:93である。
【０１４９】
ある態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体は、SEQ ID NO:109〜121からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の他の態様では、可溶性受容体は、1つまたは複数の(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個などの)保存的置換を含む、SEQ ID NO:109〜121からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、可溶性受容体は、SEQ ID NO:109〜121からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも約90％、約95％、または約98％の配列同一性を有する配列を含む。ある特定の態様では、変種可溶性受容体は、1種または複数種のヒトWntに結合する能力を維持している。
【０１５０】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体はSEQ ID NO:109の配列を含む。ある特定の態様では、可溶性受容体はSEQ ID NO:115の配列を含む。ある態様では、可溶性受容体は、SEQ ID NO:115からなるポリペプチドによって形成されるホモ二量体からなる。ある特定の態様では、可溶性受容体はSEQ ID NO:117の配列を含む。ある態様では、可溶性受容体は、SEQ ID NO:117からなるポリペプチドによって形成されるホモ二量体からなる。
【０１５１】
ある態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体(例えば、FZD8 Fri.Fc)は神経内分泌腫瘍または腫瘍細胞の成長を阻害する。ある態様では、可溶性受容体は神経内分泌腫瘍細胞が分化するように誘導する。ある態様では、可溶性受容体は、神経内分泌腫瘍上または腫瘍細胞上にある分化マーカーの発現を誘導する。ある特定の態様では、可溶性受容体は神経内分泌腫瘍にある癌幹細胞の頻度を低下させる。ある特定の態様では、可溶性受容体はWnt依存性神経内分泌腫瘍の成長を阻害する。ある態様では、SEQ ID NO:115を含む可溶性受容体は、SEQ ID NO:109を含む可溶性受容体より大きな程度で神経内分泌腫瘍の成長を阻害する。ある態様では、SEQ ID NO:117を含む可溶性受容体は、SEQ ID NO:109を含む可溶性受容体より大きな程度で神経内分泌腫瘍の成長を阻害する。ある態様では、可溶性受容体は、FZDドメイン成分、Fcドメイン、ならびにFZDドメイン成分およびFcドメインを接続するリンカー成分を含む可溶性受容体より大きな程度で腫瘍成長を阻害する。ある態様では、リンカー成分は介在ペプチドリンカーである。
【０１５２】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体(シグナル配列切断前)は、SEQ ID NO:115、およびSEQ ID NO:104〜108からなる群より選択されるシグナル配列を含む。ある態様では、可溶性受容体(シグナル配列切断前)は、SEQ ID NO:117、およびSEQ ID NO:104〜108からなる群より選択されるシグナル配列を含む。ある態様では、可溶性受容体はSEQ ID NO:105およびSEQ ID NO:115を含む。ある態様では、可溶性受容体はSEQ ID NO:105およびSEQ ID NO:117を含む。ある態様では、可溶性受容体はSEQ ID NO:106およびSEQ ID NO:115を含む。ある態様では、可溶性受容体はSEQ ID NO:106およびSEQ ID NO:117を含む。ある態様では、可溶性受容体はSEQ ID NO:133を含む。
【０１５３】
ある態様では、可溶性受容体(例えば、FZD8 Fri.Fc)は、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、およびSEQ ID NO:117からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む実質的に精製されたポリペプチドである。ある特定の態様では、実質的に精製された可溶性受容体ポリペプチドは、ASAのN末端配列を有する少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％のポリペプチドを含む。ある特定の態様では、実質的に精製された可溶性受容体ポリペプチドは、ASAのN末端配列を有するポリペプチドからなる。ある態様では、新生可溶性受容体ポリペプチドは、SEQ ID NO:101〜108からなる群より選択されるシグナル配列を含む。ある態様では、新生可溶性受容体ポリペプチドはSEQ ID NO:106のシグナル配列を含む。ある態様では、新生可溶性受容体ポリペプチドは、1個のN末端配列を有する実質的に均質なポリペプチド産物をもたらすシグナル配列を含む。
【０１５４】
ある特定の態様では、可溶性FZD受容体ポリペプチドはOMP-54F28である。OMP-54F28は、それぞれSEQ ID NO:117からなる2本のポリペプチド鎖によって形成されるホモ二量体である。OMP-54F28に関するさらなる情報は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2011/0305695号において見られる。OMP-54F28は米国特許出願公開第2011/0305695号において一般的に「54F28」と呼ばれる。
【０１５５】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体(例えば、FZD8 Fri.Fc)は免疫グロブリンのFc領域を含む。ある特定の態様では、Fc領域の少なくとも一部は、天然のまたは変化していないFc定常領域を含むほぼ同じ免疫原性の可溶性受容体と比較したときに望ましい生化学的特徴または生物学的特徴が得られるように、例えば、癌細胞局在化が増大する、腫瘍浸透性が増大する、血清中半減期が短くなる、または血清中半減期が長くなる、ADCC活性が低下する、または無くなる、補体依存性細胞傷害(CDC)が低下する、または無くなるように欠失されている、または他の方法で変えられている。Fc領域に対する改変には、1つまたは複数のドメイン中の1つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、または置換が含まれ得る。改変されたFc領域を含む、さらなる可溶性受容体(例えば、可溶性FZD受容体)は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、US2011/0305695に開示される。
【０１５６】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体(例えば、FZD8 Fri.Fc)は、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、または約10nM以下の解離定数(KD)で少なくとも1種のWntに結合する。可溶性受容体は、当技術分野において公知の任意の方法によって特異的結合についてアッセイすることができる。このようなアッセイは日常的なものであり、当技術分野において周知である(例えば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照されたい。これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる)。
【０１５７】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体(例えば、FZD8 Fri.Fc)は、可溶性受容体が結合する少なくとも1種のWnt(すなわち、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、または10種のWnt)のアンタゴニストである。ある特定の態様では、可溶性受容体は、結合したヒトWntの1つまたは複数の活性の少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％を阻害する。可溶性受容体がWntシグナル伝達を阻害するかどうか確かめるためのインビボアッセイおよびインビトロアッセイは当技術分野において公知である。適切な方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、US2011/0305695に開示される。
【０１５８】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体(例えば、FZD8 Fri.Fc)は水溶性ポリマーで誘導体化される。適切な水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/マレイン酸の無水物コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマー)、デキストラン、ポリ(n-ビニルピロリドン)-ポリエチレングリコール、プロプロピレン(propropylene)グリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド(prolypropylene oxide)/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、およびその混合物が含まれるが、これに限定されない。ある特定の態様では、水溶性ポリマーはポリエチレングリコール(PEG)である。
【０１５９】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な可溶性受容体(例えば、FZD8 Fri.Fc)は、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間のマウス、カニクイザル、またはヒトにおける循環半減期を有する。ある特定の態様では、可溶性受容体は、約2mg/kg〜約10mg/kgの用量で尾静脈を介して投与されたときにラットにおいて少なくとも約50時間の半減期を有する。ある特定の態様では、可溶性受容体は、ヒトFZD受容体のFriドメイン(または1種もしくは複数種のWntに結合するFriドメインの断片もしくは変種)およびヒトFc領域を含む可溶性FZD受容体であり、インビボで(例えば、マウスまたはラットにおいて)、FZD受容体の細胞外ドメインおよびヒトFc領域を含む可溶性FZD受容体より長い半減期を有する。
【０１６０】
5.抗Wnt抗体
本発明の方法のさらなる局面は、神経内分泌腫瘍の処置における抗Wnt抗体の使用である。ある特定の態様では、本発明の方法において有用な抗Wnt抗体は、1種または複数種のWntポリペプチドに特異的に結合する。ある特定の態様では、前記抗体は、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種以上のWntに特異的に結合する。前記抗体が結合するヒトWntは、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、およびWnt16からなる群より選択されてもよい。ある特定の態様では、前記抗体または他の抗体が結合する1種または複数種(または2種以上、3種以上、4種以上、5種以上など)のWntは、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt1Oa、およびWnt10bを含む。ある特定の態様では、1種または複数種(または2種以上、3種以上、4種以上、5種以上など)のWntは、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bを含む。
【０１６１】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なWnt結合抗体の個々の抗原結合部位は、1種、2種、3種、4種、もしくは5種の(またはそれより多い)ヒトWntに結合することができる(または結合する)。ある特定の態様では、Wnt結合抗体の個々の抗原結合部位は、Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10bからなる群より選択される1種、2種、3種、4種、または5種のヒトWntに特異的に結合することができる。
【０１６２】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なWnt結合抗体はヒトWntのC末端システインリッチドメインに結合する。ある特定の態様では、前記抗体は、SEQ ID NO:122〜132からなる群より選択される(前記抗体が結合する1種または複数種のWntタンパク質の中の)ドメインに結合する。ある態様では、Wnt結合抗体はSEQ ID NO:122の中に結合する。ある態様では、Wnt結合抗体はWnt1のアミノ酸288〜370の中に結合する。
【０１６３】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なWnt結合抗体は、約1μM以下、約100nM以下、約40nM以下、約20nM以下、または約10nM以下の解離定数(KD)で1種または複数種(例えば、2種以上、3種以上、または4種以上)のWntに結合する。例えば、ある特定の態様では、複数種のWntに結合する本発明の方法において有用なWnt結合抗体は、約100nM以下、約20nM以下、または約10nM以下KDでWntに結合する。ある特定の態様では、Wnt結合抗体は、約40nM以下の解離定数で、以下のWntの1つまたは複数(例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ)のそれぞれに結合する:Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt10a、およびWnt10b。
【０１６４】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な抗Wnt抗体はIgG1抗体またはIgG2抗体である。ある特定の態様では、前記抗体はモノクローナル抗体である。ある特定の態様では、前記抗体はヒト抗体またはヒト化抗体である。ある特定の態様では、前記抗体は抗体断片である。
【０１６５】
本発明の抗体または他の抗体は、当技術分野において公知の任意の方法によって特異的結合についてアッセイすることができる。このようなアッセイは日常的なものであり、当技術分野において周知である(例えば、Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照されたい。これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる)。
【０１６６】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なWnt結合抗体は、前記抗体が結合する少なくとも1種のWnt(すなわち、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、または10種のWnt)のアンタゴニストである。ある特定の態様では、前記抗体は、結合したヒトWntの1つまたは複数の活性の少なくとも約10％、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または約100％を阻害する。
【０１６７】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なWnt結合抗体は、少なくとも1種のヒトWntに対するリガンドの結合を阻害する。ある特定の態様では、Wnt結合抗体は、ヒトWntタンパク質リガンドの1つまたは複数に対するヒトWntタンパク質の結合を阻害する。19種のヒトWntタンパク質が特定されている:Wnt1、Wnt2、Wnt2B/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a(以前はWntl4)、Wnt9b(以前はWnt15)、Wnt10a、Wnt1Ob、Wnt11、およびWnt16。10種のヒトFZD受容体タンパク質(FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、およびFZD10)が特定されている。ある特定の態様では、Wnt結合抗体は、1種または複数種のWnt(例えば、Wnt3a)に対するFZD4、FZD5、および/またはFZD8の結合を阻害する。ある特定の態様では、Wnt結合抗体によって得られる、Wntに対する特定のリガンドの結合の阻害は少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％である。ある特定の態様では、FZDなどのリガンドに対するWntの結合を阻害する抗体はWntシグナル伝達をさらに阻害する(例えば、古典的Wntシグナル伝達を阻害する)。
【０１６８】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なWnt結合抗体はWntシグナル伝達を阻害する。Wntシグナル伝達を阻害するWnt結合抗体は、ある特定の態様では、1種または複数種のWntによるシグナル伝達を阻害することができるが、必ずしも全種のWntによるシグナル伝達を阻害しないことが理解される。ある特定の他の態様では、全種のヒトWntによるシグナル伝達が阻害されてもよい。ある特定の態様では、Wnt1、Wnt2、Wnt2b/13、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a(以前はWnt14)、Wnt9b(以前はWnt15)、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、およびWnt16からなる群より選択される1種または複数種のWntによるシグナル伝達が阻害される。ある特定の態様では、阻害されるWntシグナル伝達は、Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt7a、Wnt7b、および/またはWnt10bによるシグナル伝達である。ある特定の態様では、前記抗体は、(少なくとも)Wnt1、Wnt3a、Wnt7b、およびWnt10bによるシグナル伝達を阻害する。特定の態様では、前記抗体は、(少なくとも)Wnt3aによるシグナル伝達を阻害する。ある特定の態様では、Wnt結合抗体により得られる、Wntによるシグナル伝達の阻害は、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％の、Wntによるシグナル伝達レベルの低下である。ある特定の態様では、阻害されるWntシグナル伝達は古典的Wntシグナル伝達である。
【０１６９】
Wnt結合抗体がWntシグナル伝達を阻害するかどうか確かめるためのインビボアッセイおよびインビトロアッセイは当技術分野において公知である。例えば、ホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に複数コピーのTCF結合ドメインを含有するTCF/Lucレポーターベクターを用いた、細胞をベースとするルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて、インビトロで古典的Wntシグナル伝達レベルを測定することができる(Gazit et al., 1999, Oncogene 18; 5959-66)。1種または複数種のWnt(例えば、トランスフェクト細胞によって発現されたWnt、またはWnt培養上清によって提供されたWnt)とWnt結合抗体の存在下でのWntシグナル伝達レベルを、Wnt結合抗体が存在しない状態でのシグナル伝達レベルと比較する。TCF/lucレポーターアッセイに加えて、古典的Wntシグナル伝達に対する前記Wnt結合抗体(または候補抗体)の作用は、β-カテニンにより調節される遺伝子、例えば、c-myc(He et al., Science, 281:1509-12(1998))、サイクリンD1(Tetsu et al., Nature, 1999, 398:422-6 (1999))、および/またはフィブロネクチン(Gradl et al., Mol. Cell Biol., 19:5576-87(1999))の発現レベルに対する前記抗体の作用を測定することによってインビトロまたはインビボで測定することができる。ある特定の態様では、Wntシグナル伝達に対する前記抗体の作用はまた、Dishevelled-1、Dishevelled-2、Dishevelled-3、LRP5、LRP6、および/またはβ-カテニンのリン酸化状態に対する前記抗体の作用を測定することによって評価することができる。
【０１７０】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なWnt結合抗体は、以下の効果の1つまたは複数を有する:神経内分泌腫瘍細胞の増殖を阻害する、腫瘍にある癌幹細胞の頻度を低下させることによって神経内分泌腫瘍の腫瘍形成能を低下させる、神経内分泌腫瘍の成長を阻害する、神経内分泌腫瘍細胞の細胞死を誘発する、神経内分泌腫瘍形成細胞を分化させて非腫瘍形成状態にする、神経内分泌腫瘍細胞の転移を阻止する、または生存率を下げる。
【０１７１】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なWnt結合抗体は神経内分泌腫瘍の成長を阻害することができる。ある特定の態様では、Wnt結合抗体は、インビボで(例えば、異種移植片マウスモデルにおいて、および/または癌を有するヒトにおいて)神経内分泌腫瘍の成長を阻害することができる。
【０１７２】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なWnt結合抗体は神経内分泌腫瘍の腫瘍形成能を低下することができる。ある特定の態様では、前記抗体は、動物モデル、例えば、マウス異種移植片モデルにおいて癌幹細胞を含む神経内分泌腫瘍の腫瘍形成能を低下することができる。ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍にある癌幹細胞の数または頻度は、少なくとも約1/2、約1/3、約1/5、約1/10、約1/50、約1/100、または約1/1000になる。ある特定の態様では、癌幹細胞の数または頻度の低下は動物モデルを用いた限界希釈アッセイによって確かめられる。腫瘍にある癌幹細胞の数または頻度の低下を確かめるための限界希釈アッセイの使用に関する、さらなる例およびガイダンスは、例えば、国際公開公報番号WO2008/042236、米国特許出願公開第2008/0064049号、および米国特許出願公開第2008/0178305号において見られる。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１７３】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用なWnt結合抗体は、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間のマウス、カニクイザル、またはヒトにおける循環半減期を有する。ある特定の態様では、Wnt結合抗体は、少なくとも約5時間、少なくとも約10時間、少なくとも約24時間、少なくとも約3日、少なくとも約1週間、または少なくとも約2週間のマウス、カニクイザル、またはヒトにおける循環半減期を有するIgG(例えば、IgG1またはIgG2)抗体である。
【０１７４】
ある特定の態様では、本発明の方法に有用な抗Wnt抗体は、ヒトWntを特異的に認識する二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープを特異的に認識および結合することができる抗体である。1つの態様では、二重特異性抗Wnt抗体は、同じヒトWntの中にある異なるエピトープを特異的に認識する。別の態様では、二重特異性抗Wnt抗体は、異なるヒトWntの中にあるまたは異なるWnt上にある異なるエピトープを特異的に認識する。
【０１７５】
または、ある特定の他の態様では、本発明の方法に有用な抗Wnt抗体は二重特異性抗体でない。
【０１７６】
ある特定の態様では、本発明の方法に有用な抗Wnt抗体は単一特異性である。ある特定の態様では、抗体に含まれる1つまたは複数の抗原結合部位はそれぞれ、1種または複数種の同じヒトWntに結合することができる(または結合する)。ある特定の態様では、単一特異性抗体の抗原結合部位は、1種、2種、3種、4種、もしくは5種の(またはそれより多い)ヒトWntに結合することができる(または結合する)。
【０１７７】
本発明の方法に有用な抗Wnt抗体は、その全体が参照により組み入れられる、国際公開公報番号WO2011/088127に開示される。
【０１７８】
6.抗体およびその産生
本発明の方法において有用な抗体(例えば、抗FZD抗体および抗Wnt抗体)は、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって調製することができる。ポリクローナル抗体は公知の任意の方法によって調製することができる。任意で、キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)、血清アルブミンなどにコンジュゲートさせて、滅菌食塩水で希釈して、安定したエマルジョンを形成するためにアジュバント(例えば、完全フロイントアジュバントまたは不完全フロイントアジュバント)と組み合わせた関連抗原(精製されたペプチド断片、完全長組換えタンパク質、融合タンパク質など)を複数回、皮下注射または腹腔内注射することによって、動物(例えば、ウサギ、ラット、マウス、ロバなど)を免疫することによってポリクローナル抗体を産生する。次いで、ポリクローナル抗体を、このように免疫した動物の血液、腹水などから回収する。集めた血液を凝固させ、血清をデカントし、遠心分離によって遠心分離し、抗体価についてアッセイする。ポリクローナル抗体は、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析などを含む当技術分野において標準的な方法に従って血清または腹水から精製することができる。
【０１７９】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、例えば、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495に記載のハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法を用いて、マウス、ハムスター、または他の適切な宿主動物を上述のように免疫して、免疫に用いた抗原に特異的に結合する抗体のリンパ球による産生を誘発させる。リンパ球はまたインビトロで免疫することもできる。免疫化に続いてリンパ球を単離し、例えば、ポリエチレングリコールを用いて適切なミエローマ細胞株と融合させてハイブリドーマ細胞を形成させ、次に、融合していないリンパ球およびミエローマ細胞から分離して選択することができる。次いで、免疫沈降、免疫ブロッティング、またはインビトロ結合アッセイ(例えば、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素結合免疫測定法(ELISA))によって確かめられた。選択された抗原に対して特異的に作られたモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを、標準的な方法(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, 1986)を用いるインビトロ培養で、またはインビボで動物中の腹水腫瘍として増殖することができる。次いで、ポリクローナル抗体について上述したように、モノクローナル抗体を培地または腹水から精製することができる。
【０１８０】
または、モノクローナル抗体はまた、米国特許第4,816,567号に記載されているように組換えDNA法を用いて作製することもできる。モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを、成熟B細胞またはハイブリドーマ細胞から、例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子を特異的に増幅するオリゴヌクレオチドプライマーを用いるRT-PCRによって単離し、それらの配列を従来の手順を用いて決定する。次いで、重鎖および軽鎖をコードする単離されたポリヌクレオチドを、適切な発現ベクター中へクローニングし、トランスフェクションされていなければ免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、大腸菌(E. coli)細胞、サルCOS細胞、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、またはミエローマ細胞にトランスフェクションすると、宿主細胞はモノクローナル抗体を産生する。また、望ましい種の組換えモノクローナル抗体またはその断片を、望ましい種のCDRを発現するファージディスプレイライブラリーから、記載されたように(McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624-628;およびMarks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581-597)単離することができる。
【０１８１】
さらに、モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドは、組換えDNA技術を用いた多くの異なるやり方で、代わりの抗体を作製するように改変することができる。ある態様では、例えば、マウスモノクローナル抗体の軽鎖および重鎖の定常ドメインを、1)キメラ抗体を作製するために、例えば、ヒト抗体の領域で、または2)融合抗体を作製するために、非免疫グロブリンポリペプチドで置換することができる。ある態様では、モノクローナル抗体の望ましい抗体断片を作製するために、定常領域は切断または除去される。可変領域の部位特異的変異誘発または高密度変異誘発を用いて、モノクローナル抗体の特異性、親和性などを最適化することができる。
【０１８２】
ある態様では、本発明の方法において有用なモノクローナル抗体はヒト化抗体である。ある態様では、このような抗体は、ヒト対象に投与されたときの抗原性およびHAMA(ヒト抗マウス抗体)応答を低減するために治療的に用いられる。ヒト化抗体は、当技術分野において公知の様々な技法を用いて作製することができる。ある特定の代替態様では、本発明の方法において有用な前記抗体はヒト抗体である。
【０１８３】
当技術分野で公知の様々な技法を用いてヒト抗体を直接調製することができる。インビトロで免疫した、または標的抗原に対して作られた抗体を産生する免疫個体から単離した不死化ヒトBリンパ球を作製することができる(例えば、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boemer et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95;および米国特許第5,750,373号を参照されたい)。また、例えば、Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14:309-314、Sheets et al., 1998, Proc. Nat'l Acad. Sci., 95:6157-6162、Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol, 227:381、およびMarks et al., 1991, J. Mol. Biol, 222:581に記載のように、ヒト抗体を発現するファージライブラリーからヒト抗体を選択することができる。抗体ファージライブラリーの作製および使用のための技法はまた、米国特許第5,969,108号、同第6,172,197号、同第5,885,793号、同第6,521,404号;同第6,544,731号;同第6,555,313号;同第6,582,915号;同第6,593,081号;同第6,300,064号;同第6,653,068号;同第6,706,484号;および同第7,264,963;ならびにRothe et al., 2007, J. Mol. Bio., doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018にも記載されている(これらはそれぞれ、その全体が参照により組み入れられる)。親和性成熟戦略および鎖シャッフリング(chain shuffling)戦略(Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783, その全体が参照により組み入れられる)が当技術分野において公知であり、高親和性ヒト抗体を作製するのに使用することができる。
【０１８４】
ヒト化抗体はまた、免疫されると、内因性免疫グロブリンを産生せずにヒト抗体の全レパートリーを産生することができる、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するトランスジェニックマウスにおいて作ることもできる。このアプローチは、米国特許第5,545,807号;同第5,545,806号;同第5,569,825号;同第5,625,126号;同第5,633,425号;および同第5,661,016号に記載されている。
【０１８５】
ある特定の態様では、本発明の方法において有用な前記抗体は、ヒトfrizzled受容体またはヒトWntポリペプチドを特異的に認識する二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なるエピトープを特異的に認識および結合することができる抗体である。異なるエピトープが同じ分子(例えば、同じヒトfrizzled受容体または同じヒトWntポリペプチド)の中にあってもよく、異なる分子上にあってもよい。二重特異性抗体は無傷の抗体または抗体断片でもよい。
【０１８６】
または、ある特定の代替態様では、本発明に有用な抗体は二重特異性抗体でない。
【０１８７】
ある特定の態様では、本発明に有用な抗体は単一特異性である。例えば、ある特定の態様では、抗体に含まれる1つまたは複数の抗原結合部位はそれぞれ、同じヒトFZD受容体または同じヒトWntポリペプチドに結合することができる(または結合する)。ある特定の態様では、単一特異性抗体の抗原結合部位は、1種、2種、3種、4種、もしくは5種の(またはそれより多い)ヒトfrizzled受容体またはヒトWntポリペプチドに結合することができる(または結合する)。
【０１８８】
ある特定の態様では、本発明の方法に有用な抗体は抗体断片である。抗体断片は完全抗体と比べて高い腫瘍浸透性を示す場合がある。抗体断片の作製のための様々な技術が公知である。従来から、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク質消化によって得られる(例えば、Morimoto et al., 1993, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; Brennan et al., 1985, Science, 229:81)。ある態様では、抗体断片は組換えによって作製される。Fab、Fv、およびscFv抗体断片は全て大腸菌内または他の宿主細胞内で発現させ、分泌させることができ、従って、これらの断片の大量産生が可能である。このような抗体断片を、上で議論した抗体ファージライブラリから単離することもできる。抗体断片はまた、例えば、米国特許第5,641,870号に記載されているように直鎖状抗体でもよく、単一特異性もしくは二重特異性でもよい。本発明の方法において有用な単鎖抗体は、例えば、米国特許第4,946,778号に記載のように調製することができる。さらに、Fab発現ライブラリ(Huse, et al., Science 246:1275-1281(1989))の構築に方法を合わせて、FZD受容体またはWntポリペプチドに対して望ましい特異性を有するモノクローナルFab断片の迅速かつ有効な同定を可能にすることができる。抗体断片は、(a)抗体分子のペプシン消化によって作製されるF(ab')2断片;(b)F(ab')2断片のジスルフィド架橋を還元することによって生成されるFab断片;(c)抗体分子をパパインおよび還元剤で処理することによって生成されるFab断片、ならびに(d)Fv断片を含むが、これに限定されない当技術分野の技法によって作製することができる。抗体断片を作製するための他の技法は当業者に明白であろう。
【０１８９】
さらに、特に抗体断片の場合には、その血清中半減期を延ばすために抗体を改変することが望ましい場合がある。これは、例えば、抗体断片中の適切な領域の変異による抗体断片へのサルベージ受容体結合エピトープの組み込みにより、あるいはペプチドタグにエピトープを組み込み、次いで、抗体断片のいずれかの末端または中間に(例えば、DNA合成またはペプチド合成によって)融合することによって行うことができる。
【０１９０】
ある特定の態様では、本発明の方法に有用な抗体はヘテロコンジュゲート抗体である。ヘテロコンジュゲート抗体は、共有結合した2種の抗体からなる。例えば、免疫細胞を不必要な細胞に標的化するために、このような抗体が提案されている(米国特許第4,676,980号)。このような抗体は、架橋剤が関与する方法を含む、合成タンパク質化学において公知の方法を用いてインビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエテール結合を形成することによって免疫毒素を構築することができる。この目的に適した試薬の例には、イミノチオラートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミダートが含まれる。
【０１９１】
定常Fc領域はいくつかのエフェクター機能を媒介することが当技術分野において公知である。例えば、補体のC1成分と抗体が結合すると補体系が活性化される。補体活性化は、細胞病原体のオプソニン化および溶解において重要である。補体活性化はまた炎症応答も刺激し、自己免疫過敏にも関与する場合がある。さらに、抗体または可溶性受容体はFc領域を介して細胞に結合し、抗体Fc領域上のFc受容体部位は細胞上のFc受容体(FcR)に結合する。IgG(γ受容体)、IgE(ε受容体)、IgA(α受容体)、およびIgM(μ受容体)を含む異なるクラスの抗体に特異的な多くのFc受容体がある。抗体と、細胞表面上のFc受容体が結合すると、貪食および抗体コーティング粒子の破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体コーティング標的細胞の溶解(抗体依存性細胞性細胞傷害またはADCCと呼ばれる)、炎症メディエーターの放出、胎盤通過、および免疫グロブリン産生の制御を含む多くの重要かつ多様な生物学的応答が誘発される。
【０１９２】
ある態様では、本発明の方法に有用なWntアンタゴニストポリペプチド(抗体およびFcを含む可溶性受容体)はエフェクター機能の変化をもたらし、次に、これは、投与された抗体の生物学的プロファイルに影響を及ぼす。例えば、(点変異または他の手段によって)定常領域ドメインが欠失または不活性化すると、改変された循環抗体のFc受容体結合が低下し、それによって、腫瘍局在化が増大し得る。他の場合では、定常領域の改変は補体結合を緩和し、従って、血清中半減期を短くし、コンジュゲートされた細胞毒の非特異的結合を弱める可能性がある。ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分を無くすために、定常領域のさらに他の改変を使用することができる。ジスルフィド結合またはオリゴ糖部分が無くなると、抗原特異性または抗体可撓性が増大することにより局在化が増大する。同様に、定常領域の改変は、当業者の十分に範囲内で、周知の生化学的または分子的な操作法を用いて容易に行うことができる。
【０１９３】
ある特定の態様では、本発明の方法に有用なFc領域(抗体およびFcを含む可溶性受容体)を含むWntアンタゴニストポリペプチドには1つまたは複数のエフェクター機能がない。例えば、ある態様では、前記ポリペプチドには抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性がなく、および/または補体依存性細胞傷害(CDC)がない。ある特定の態様では、前記ポリペプチドはFc受容体および/または補体因子に結合しない。ある特定の態様では、前記抗体にはエフェクター機能がない。
【０１９４】
本発明はまた、細胞傷害剤とコンジュゲートされたWntアンタゴニストポリペプチド(例えば、抗FZD抗体および抗Wnt抗体)を含む免疫コンジュゲートの使用に関する。細胞傷害剤には、化学療法剤、増殖阻害剤、毒素(例えば、細菌、真菌、植物、もしくは動物に由来する酵素活性を有する毒素、またはその断片)、放射性同位体(すなわち、放射性コンジュゲート(radioconjugate))などが含まれる。このような免疫コンジュゲートの作製において有用な化学療法剤には、例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、ドキソルビシン、メルファラン、マイトマイシンC、クロラムブシル、ダウノルビシン、または他の挿入剤が含まれる。使用することができる酵素活性を有する毒素およびその断片には、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンA鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデシンA鎖、α-サルシン、シナアブラギリ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンシンタンパク質、アメリカヤマゴボウ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、およびPAP-S)、ニガウリ(Momordica charantia)阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ(sapaonaria officinalis)阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)、およびトリコテセン(tricothecene)が含まれる。放射性コンジュゲート抗体を産生するために、212Bi、131I、131In、90Y、および186Reを含む様々な放射性核種を利用することができる。前記抗体と細胞傷害剤のコンジュゲートは、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジジチオール(pyridyidithiol))プロピオナート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(例えば、アジプイミド酸ジメチルHCL)、活性エステル(例えば、ジスクシンイミジルスベラート)、アルデヒド(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアナート(例えば、トリエン2,6-ジイソシアナート)、および二活性フッ素化合物(例えば、1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン)などの様々な二官能基性タンパク質カップリング剤を用いて作製される。抗体と1種または複数種の低分子毒素、例えば、カリケアマイシン、マイタンシノイド、トリコテン(trichothene)、およびCC1065、ならびに毒素活性を有するこれらの毒素の誘導体とのコンジュゲートも使用することができる。
【０１９５】
コンジュゲート抗体は共有結合した2種の抗体からなる。例えば、免疫細胞を不必要な細胞に標的化するために、このような抗体が提案されている(米国特許第4,676,980号)。このような抗体は、架橋剤が関与する方法を含む、合成タンパク質化学において公知の方法を用いてインビトロで調製できることが考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いて、またはチオエーテル結合を形成することによって免疫毒素を構築することができる。この目的に適した試薬の例には、イミノチオラートおよびメチル-4-メルカプトブチルイミダートが含まれる。
【０１９６】
どれくらい有用な量が得られるかに関係なく、多くのコンジュゲート型(すなわち、免疫コンジュゲート)または非コンジュゲート型のいずれか1つにおいて、本発明の方法において有用なWntアンタゴニストポリペプチド(例えば、抗体および可溶性受容体)を使用することができる。または、前記ポリペプチドは非コンジュゲート型すなわち「裸」型で使用することができる。ある特定の態様では、前記ポリペプチドは、補体依存性細胞傷害(CDC)および抗体依存性細胞毒性(ADCC)を含む対象の天然防御機構を利用して悪性細胞を排除するために非コンジュゲート型で用いられる。ある態様では、前記ポリペプチドは、多くの周知のキレート剤または直接標識のいずれか1つを用いて放射性同位体、例えば、90Y、125I、131I、123I、111In、105Rh、153Sm、67Cu、67Ga、166Ho、177Lu、186Re、および188Reにコンジュゲートさせることができる。他の態様では、前記組成物は、薬物、プロドラッグ、または生物学的応答調節物質、例えば、メトトレキセート、アドリアマイシン、およびリンホカイン、例えば、インターフェロンとカップリングしたWntアンタゴニストポリペプチドを含んでもよい。さらに他の態様は、特定の生体毒素、例えば、リシンまたはジフテリア毒素とコンジュゲートされたWntアンタゴニストポリペプチドの使用を含む。さらに他の態様では、Wntアンタゴニストポリペプチドは、他の免疫学的に活性なリガンド(例えば、抗体またはその断片)と複合体化されてもよい。ここで、結果として生じる分子は、新生細胞およびエフェクター細胞、例えば、T細胞の両方に結合する。どのコンジュゲートWntアンタゴニストポリペプチドまたは非コンジュゲートWntアンタゴニストポリペプチドを使用するかという選択は、神経内分泌腫瘍のタイプおよび悪性度分類、補助的処置(例えば、化学療法または外部放射線)の使用、ならびに患者状態によって決まる。当業者であれば、本明細書の開示を考慮してこのような選択を容易に行うことができることが理解されるだろう。
【０１９７】
前記のポリペプチドおよび類似体は、通常、タンパク質の部分にはない、さらなる化学的部分を含有するようにさらに改変することができる。これらの誘導体化部分はタンパク質の溶解度、生物学的半減期、または吸収を改善することができる。これらの部分はまた、タンパク質の望ましい副作用などを低減する、または無くすこともできる。これらの部分の概説は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA (2000)に見られる。
【０１９８】
誘導体化に最も適した化学的部分には水溶性ポリマーが含まれる。水溶性ポリマーに取り付けられた前記タンパク質は水性環境、例えば、生理学的環境で沈殿しないので、水溶性ポリマーが望ましい。ある態様では、ポリマーは、治療用製品または治療用組成物の調製のために薬学的に許容される。当業者であれば、ポリマー/タンパク質コンジュゲートが治療的に用いられるかどうかという考察に基づいて、ポリマー/タンパク質コンジュゲートが治療的に用いられるのであれば、望ましい投与量、循環時間、タンパク質分解に対する耐性、および他の考察に基づいて望ましいポリマーを選択できるだろう。誘導体化の有効性は、誘導体を望ましい形で(すなわち、浸透圧ポンプ(osmotic pump)によって、または注射もしくは注入によって、または、経口経路用、肺経路用、または他の送達経路用にさらに処方されて)投与し、その有効性を確かめることによって突き止めることができる。適切な水溶性ポリマーには、ポリエチレングリコール(PEG)、エチレングリコール/プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ-1,3-ジオキソラン、ポリ-1,3,6-トリオキサン、エチレン/マレイン酸の無水物コポリマー、ポリアミノ酸(ホモポリマーまたはランダムコポリマー)、デキストラン、ポリ(n-ビニルピロリドン)-ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド/エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)、ポリビニルアルコール、およびその混合物が含まれるが、これに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドには水中で安定性があるために製造において利点がある場合がある。
【０１９９】
本発明の方法において有用な単離されたポリペプチド(例えば、抗体および可溶性受容体)は、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって作製することができる。このような方法は、直接的なタンパク質合成法から、単離されたポリペプチド配列をコードするDNA配列の構築、適切な形質転換宿主におけるこれらの配列の発現に及ぶ。ある態様では、DNA配列は、組換え技術を用いて、関心対象の野生型タンパク質をコードするDNA配列を単離または合成することによって構築される。任意で、この配列は、その機能類似体を得るために部位特異的変異誘発によって変異誘発することができる。例えば、Zoeller et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 81:5662-5066 (1984)および米国特許第4,588,585号を参照されたい。
【０２００】
ある態様では、関心対象のポリペプチドをコードするDNA配列は、オリゴヌクレオチド合成機を用いた化学合成によって構築される。このようなオリゴヌクレオチドは、望ましいポリペプチドのアミノ酸配列と、関心対象の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において好ましいコドンを選択することに基づいて設計することができる。標準的な方法を用いて、関心対象の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成することができる。例えば、完全なアミノ酸配列を用いて、逆翻訳(back-translate)した遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有するDNAオリゴマーを合成することができる。例えば、望ましいポリペプチドの一部をコードする、いくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いで、連結することができる。個々のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的に組み立てるための5'オーバーハングまたは3'オーバーハングを含有する。
【０２０１】
(合成、部位特異的変異誘発、または別の方法によって)組み立てられたら、関心対象の特定の単離されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は発現ベクターに挿入され、望ましい宿主におけるタンパク質の発現に適した発現制御配列に機能的に連結される。適切に組み立てられたことは、ヌクレオチド配列決定、制限酵素マッピング、および適切な宿主における生物学的に活性なポリペプチドの発現によって確かめることができる。当技術分野において周知のように、宿主におけるトランスフェクトされた遺伝子の高い発現レベルを得るために、遺伝子は、選択された発現宿主において機能する転写および翻訳発現制御配列に機能的に連結しなければならない。
【０２０２】
ある特定の態様では、Wntアンタゴニストポリペプチド(例えば、抗体または可溶性受容体)を増幅および発現するために組換え発現ベクターが用いられる。組換え発現ベクターは、関心対象のポリペプチドをコードする合成DNA断片またはcDNAに由来するDNA断片が、哺乳動物遺伝子、微生物遺伝子、ウイルス遺伝子、または昆虫遺伝子に由来する適切な転写調節エレメントまたは翻訳調節エレメントに機能的に連結されている複製可能なDNA構築物である。転写単位は、一般的に、下記に詳述するような、(1)遺伝子発現を調節する役割を有する遺伝因子またはエレメント、例えば、転写プロモーターまたはエンハンサー、(2)mRNAに転写され、タンパク質に翻訳される構造配列またはコード配列、ならびに(3)適切な転写および翻訳の開始配列および終結配列の集合を含む。このような調節エレメントは、転写を制御するオペレーター配列を含むことがある。通常、複製起点によって付与される、宿主において複製する能力、および形質転換体の認識を容易にする選択遺伝子をさらに組み込むことができる。DNA領域は、これらの機能が互いに関連しているときに機能的に連結されている。例えば、シグナルペプチド(分泌リーダー)のDNAは、ポリペプチド分泌に関与する前駆体としてポリペプチドが発現されるのであれば、ポリペプチドDNAに機能的に連結されている。プロモーターは、コード配列の転写を制御すれば、コード配列に機能的に連結されている。または、リボソーム結合部位は、コード配列が翻訳されるように配置されていれば、コード配列に機能的に連結されている。酵母発現系における使用を目的とした構造エレメントには、宿主細胞により翻訳されるタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列が含まれる。または、組換えタンパク質がリーダー配列も輸送配列もなく発現される場合、N末端メチオニン残基を含むことがある。この残基は、任意で、最終産物を得るために発現組換えタンパク質から後で切断されてもよい。
【０２０３】
発現制御配列および発現ベクターの選択は宿主の選択によって決まる。多種多様な発現宿主/ベクターの組み合わせを使用することができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターには、例えば、SV40、ウシパピローマウイルス、アデノウイルス(adenovims)、およびサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターが含まれる。細菌宿主に有用な発現ベクターには、公知の細菌プラスミド、例えば、pCR1、pBR322、pMB9およびその誘導体を含む大腸菌(Esherichia coli)に由来するプラスミド、さらに広い宿主域のプラスミド、例えば、M13、ならびに繊維状一本鎖DNAファージが含まれる。
【０２０４】
Wntアンタゴニストポリペプチド(例えば、抗体または可溶性受容体)の発現に適した宿主細胞には、適切なプロモーターの制御下にある、原核生物、酵母、昆虫、または高等真核細胞が含まれる。原核生物には、グラム陰性生物またはグラム陽性生物、例えば、大腸菌または桿菌が含まれる。高等真核細胞には、下記に記載の哺乳動物に由来する樹立細胞株が含まれる。無細胞翻訳系も使用することができる。細菌宿主、真菌宿主、酵母宿主、および哺乳動物細胞宿主と使用するのに適した適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、Pouwels et al.(Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y.,1985)に記載されている。この関連する開示は参照により本明細書に組み入れられる。抗体産生を含む、タンパク質を産生する方法に関するさらなる情報は、例えば、米国特許出願公開第2008/0187954号、米国特許第6,413,746号および同第6,660,501号、ならびに国際公開公報WO04009823に見られる。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０５】
組換えタンパク質を発現させるために、様々な哺乳動物培養系または昆虫細胞培養系も有利に用いられる。哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現は、このようなタンパク質がおおむね正しく折り畳まれ、適切に修飾され、かつ完全に機能するので実施可能である。適切な哺乳動物宿主細胞株の例には、Gluzman(Cell 23:175, 1981)に記載のサル腎臓細胞のCOS-7株、ならびに、例えば、L細胞、C127、3T3、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、HeLa、およびBHK細胞株を含む適切なベクターを発現することができる他の細胞株が含まれる。哺乳動物発現ベクターは、非転写エレメント、例えば、複製起点、発現させようとする遺伝子に連結される適切なプロモーターおよびエンハンサー、ならびに他の5'または3'隣接非転写配列、ならびに5'または3'非翻訳配列、例えば、必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー部位およびスプライスアクセプター部位、ならびに転写終結配列を含んでもよい。昆虫細胞において異種タンパク質を産生するためのバキュロウイルス系は、Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47(1988)に概説されている。
【０２０６】
形質転換宿主により産生されたタンパク質は任意の適切な方法に従って精製することができる。このような標準的な方法には、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、およびサイジング(sizing)カラムクロマトグラフィー)、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質精製のための他の任意の標準的な技法が含まれる。適切なアフィニティカラム上での通過による容易な精製を可能にするために、アフィニティタグ、例えば、ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列、およびグルタチオン-S-トランスフェラーゼをタンパク質に取り付けることができる。単離されたタンパク質はまた、タンパク質分解、核磁気共鳴、およびX線結晶学のような技法を用いて物理的に特徴付けることもできる。
【０２０７】
例えば、最初に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニットを用いて、組換えタンパク質を培地に分泌する系からの上清を濃縮することができる。濃縮工程後に、濃縮物を適切な精製マトリックスに適用することができる。または、陰イオン交換樹脂、例えば、ペンダントジエチルアミノエチル(DEAE)基を有するマトリックスまたは支持体を使用することができる。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース、またはタンパク質精製において一般に用いられる他のタイプでもよい。または、陽イオン交換工程を使用することができる。適切な陽イオン交換体には、スルホプロピル基またはカルボキシメチル基を含む様々な不溶性のマトリックスが含まれる。最後に、Wntアンタゴニストポリペプチド(例えば、抗体または可溶性受容体)をさらに精製するために、疎水性RP-HPLC媒体、例えば、ペンダントメチル基または他の脂肪族基を有するシリカゲルを用いた1つまたは複数の逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)工程を使用することができる。均質な組換えタンパク質を得るために、前述の精製工程の一部または全てを様々な組み合わせで使用することもできる。
【０２０８】
細菌培養において産生された組換えタンパク質は、例えば、最初に、細胞ペレットから抽出し、その後に、1回または複数回の濃縮、塩析、水性イオン交換クロマトグラフィー、またはサイズ排除クロマトグラフィー工程を行うことによって単離することができる。最後の精製工程には高速液体クロマトグラフィー(HPLC)を使用することができる。組換えタンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む任意の従来法によって破壊することができる。
【０２０９】
Wntアンタゴニストポリペプチド(例えば、抗体または可溶性受容体)を精製するための当技術分野において公知の方法には、例えば、米国特許出願公開第2008/0312425号、同第2008/0177048号、および同第2009/0187005号に記載の方法も含まれる。これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２１０】
7.薬学的組成物
Wntアンタゴニストポリペプチド(例えば、抗体および可溶性受容体)は、当技術分野において公知の任意の適切な方法によって薬学的組成物に処方することができる。ある特定の態様では、薬学的組成物は、薬学的に許容されるビヒクルを含む。薬学的組成物は、ヒト患者における神経内分泌腫瘍の成長の阻害および神経内分泌腫瘍の処置において有用である。
【０２１１】
ある特定の態様では、精製されたWntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)と薬学的に許容されるビヒクル(例えば、担体、賦形剤)(Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Edition Mack Publishing, 2000)を組み合わせることによって、保管および使用のための製剤が調製される。適切な薬学的に許容されるビヒクルには、無毒の緩衝液、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、および他の有機酸緩衝液;塩、例えば、塩化ナトリウム;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化物質;防腐剤(例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム;塩化ヘキサメトニウム;塩化ベンザルコニウム;塩化ベンゼトニウム;フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;およびm-クレゾール);低分子量ポリペプチド(例えば、約10未満のアミノ酸残基);タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン;炭水化物、例えば、単糖、二糖、グルコース、マンノース、またはデキストリン;キレート剤、例えば、EDTA;糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール;塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);および非イオン界面活性剤、例えば、TWEENまたはポリエチレングリコール(PEG)が含まれるが、これに限定されない。
【０２１２】
ある特定の態様では、薬学的組成物は凍結される。ある特定の代替態様では、薬学的組成物は凍結乾燥される。
【０２１３】
本発明の薬学的組成物は、局所処置または全身処置のための多様な手法で投与することができる。投与は、局所投与(例えば、腟送達および直腸送達を含む粘膜への投与)、例えば、経皮パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム、ゲル、ドロップ、坐剤、スプレー、液剤、および散剤;肺投与(例えば、ネブライザーによる投与を含む、散剤もしくはエアゾール剤の吸入もしくはガス注入による投与;気管内投与、鼻腔内投与、表皮投与、および経皮投与);経口投与;または静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、もしくは筋肉内の注射もしくは注入を含む非経口投与;あるいは頭蓋内投与(例えば、くも膜下腔内投与もしくは脳室内投与)でもよい。
【０２１４】
治療製剤は単位剤形でもよい。このような製剤には、経口投与、非経口投与、もしくは直腸投与のための、または吸入による投与のための、錠剤、丸剤、カプセル、散剤、顆粒剤、水もしくは非水性媒体に溶解した溶液もしくは懸濁液、または坐剤が含まれる。錠剤などの固形組成物では、主要な有効成分が薬学的担体と混合されている。本発明の化合物またはその無毒な薬学的に許容される塩の均質な混合物を含む固体の予備処方組成物を形成するために、従来の錠剤化成分には、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、またはゴム、および他の希釈剤(例えば、水)が含まれる。次いで、固体の予備処方組成物を、上述のタイプの単位剤形へさらに分ける。持続作用という利点を与える剤形を得るために、新規組成物の錠剤、丸剤などをコーティングするか、他の方法で調合することができる。例えば、錠剤または丸剤は内部組成物が外部成分によって覆われてもよい。さらに、崩壊に抵抗するよう働いて、内部成分がそのまま胃を通過するのを可能にする、またはその放出を遅らせることができる腸溶層によって、2つの成分を分離することができる。このような腸溶層またはコーティングには様々な材料を使用することができる。このような材料は、多くのポリマー酸、ならびにポリマー酸と、セラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースなどの材料との混合物を含む。
【０２１５】
Wntアンタゴニスト(例えば、抗FZD抗体または可溶性FZD受容体)をマイクロカプセルの中に封入することもできる。このようなマイクロカプセルは、例えば、コアセルベーション技法または界面重合法によって調製され、それぞれ、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルを、コロイド状薬物送達システム(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)中に、またはRemington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)に記載されているマクロエマルジョンの中に入れる。
【０２１６】
ある特定の態様では、薬学的製剤には、リポソームと複合体化されたWntアンタゴニスト (例えば、抗FZD抗体 または 可溶性FZD 受容体)が含まれる(Epstein, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang, et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030;ならびに米国特許第4,485,045号および第4,544,545号)。循環時間が長いリポソームが米国特許第5,013,556号に開示されている。リポソームの中には、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発によって作製できるものもある。規定された孔径のフィルターに通してリポソームを押し出すことにより、所望の直径を有するリポソームが得られる。
【０２１７】
さらに、徐放性製剤を調製することができる。徐放性製剤の適切な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは、成形された物品(例えば、フィルムまたはマイクロカプセル)の形をしている。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール)などのヒドロゲル、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸と7エチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT TM(乳酸-グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフェア)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ショ糖酢酸イソ酪酸エステル、およびポリ-D-(-)-3-ヒドロキシ酪酸が含まれる。
【実施例】
【０２１８】
本明細書に記載の実施例および態様は例示にすぎず、これらを考慮して、様々な変更および修正が当業者に示唆され、本願の精神および範囲の中に含まれることが理解される。
【０２１９】
実施例1
第1a相臨床研究におけるOMP-18R5に対する神経内分泌腫瘍応答
進行固形腫瘍患者におけるOMP-18R5ヒト抗FZD抗体の第I相臨床試験の状況において、以前に複数の他の治療法を受けたことがある後期神経内分泌腫瘍患者3人を、OMP-18R5を単剤として低用量で定期的に用いて処置した。これらの神経内分泌患者3人全員が長期間、安定病態を示したことから、OMP-18R5は低投与量で単剤として用いても、カルチノイド組織構造を有する神経内分泌腫瘍および膵神経内分泌腫瘍の両方を含む神経内分泌腫瘍に対して驚くべきレベルの効力を有し得ることが示唆される。
【０２２０】
患者3はOMP-18R5治験の登録時に59歳の女性であった。彼女は2004年に神経内分泌腫瘍(カルチノイド)と診断された。彼女は小腸切除を受け、肝臓病変のラジオ波焼灼療法によって処置された。彼女はOMP-18R5治験に登録する前にトラメチニブ(trametinib)(MEK1/2 MAPキナーゼ阻害剤)およびGSK2141795 Akt阻害剤の組み合わせによる前治療法の全身処置を受けたが、処置して1ヶ月後に疾患は進行した。OMP-18R5治験において、患者3に0.5mg/kg OMP-18R5を112日間にわたって毎週投与した。OMP-18R5処置中に彼女の病態は安定していたが、彼女は112日目に骨折した後に治験から離脱した。特に、以前の治療法を受けている間に疾患が急速に進行したことを考慮すると、OMP-18R5による処置中に、この患者の疾患が長期間抑制されたことから、前記抗体は単剤で低用量でも驚くべきレベルの臨床有効性を有し得ることが示唆される。
【０２２１】
患者10はOMP-18R5治験の登録時に膵神経内分泌腫瘍をもつ69歳の女性であった。彼女は2001年に診断され、80％膵尾側切除術、脾切除術、および胃後壁の楔状切除を含む外科手術によって処置された。彼女はOMP-18R5治験に登録する前に、(1)レゴラフェニブ(部分応答:3年);(2)抗LOXL2抗体(安定病態:5.5ヶ月);および(3)抗CSFR1抗体(試験して6週間後に進行性疾患)による全身処置を受けた。2013年1月25日の時点で、OMP-18R5治験の患者10には0.5mg/kg OMP-18R5が279日間にわたって隔週で与えられていた。患者10には0.5mg/kg OMP-18R5が448日間にわたって隔週で与えられ続けた。OMP-18R5で処置して112日後に患者10の標的腫瘍肝臓転移が21％縮小したことが治験責任医師によって確かめられた。腫瘍の縮小は、独立したX線撮影評価によって確かめられた(表4に示した)。図1A〜1Cを参照されたい。同じ処置期間中に対照非標的疾患病変は変化を示さなかった。さらに、OMP-18R5で処置して112日後のX線撮影検査から患者10の腫瘍病変に石灰化の徴候があることが明らかになった(図1C)。観察された腫瘍病変の石灰化はOMP-18R5が腫瘍細胞分化および/または腫瘍壊死を誘導したことを示し得る。その後に、168日目、224日目、280日目、336日目、および392日目にコンピュータ断層撮影(CT)スキャンを行うことによって、この患者には依然として進行性疾患が無いことが分かった。患者10は、進行性疾患の徴候後、448日目に処置を止めた。OMP-18R5による処置中に、この患者の疾患が長期間抑制されたことは、単剤、低用量の前記抗体が隔週で与えられたときでも驚くべきレベルの臨床有効性を有し得るというさらなる証拠であった。
【０２２２】
（表４）患者10:独立したX線撮影評価RECIST1.1
2015536933.tif 000052
*RECIST1.1につき:最短直径でLN≧15mmが測定可能である。
**RECIST1.1につき:最短直径でLN＜10mmが「正常」と見なされる。
Non-PD:非進行性疾患
【０２２３】
患者12はOMP-18R5治験の登録時に神経内分泌腫瘍(カルチノイド)をもつ77歳の女性であった。彼女は2006年に診断された。彼女は、OMP-18R5治験に登録する前に、 (1)サンドスタチン(安定病態:20ヶ月);(2)熱ショックタンパク質90阻害剤(安定病態:23ヶ月);および(3)サンドスタチンおよび抗アンジオポエチン-2抗体の組み合わせ(安定病態:4ヶ月)による全身処置を受けた。2013年1月25日の時点で、OMP-18R5治験の患者12には1mg/kg OMP-18R5が210日間にわたって3週間ごとに与えられていた。2013年10日4日の時点で、患者12には1mg/kg OMP-18R5が465日間にわたって3週間ごとに与えられていた。この患者は、56日目、112日目、168日目、224日目、280日目、336日目、392日目、および448日目に安定病態を有すると評価された。疾患進行なく、この患者の臨床試験が長期間続いたことから、神経内分泌腫瘍に対するOMP-18R5の臨床有効性がさらに裏付けられる。
【０２２４】
図2Aは、2013年1月25日の時点で、OMP-18R5第1a相試験に登録した各患者(n=18)がOMP-18R5第1a相試験を続けていた日数を示す。図2Bは、2013年10月4日の時点で、OMP-18R5第1a相試験に登録した各患者(n=29)がOMP-18R5第1a相試験を続けていた日数を示す。OMP-18R5によって処置された神経内分泌腫瘍患者は、他の腫瘍タイプ(結腸直腸癌、乳癌、メラノーマ、および膵癌を含む)を有する他の第1a相患者と比べて驚くほど長い期間にわたって試験を続けた。
【０２２５】
また、2013年1月25日の時点で、神経内分泌腫瘍患者3人のOMP-18R5処置時の安定病態期間は、以前に疾患が進行した前治療法を受けていた時より約2〜7倍長かった。観察された活性を評価するツールとしてGrowth Modulation Index(現行の治療法を受けた期間を進行性疾患前の前治療法を受けた期間で割ったもの;GMI≧1.33が良好とみなされる; Von Hoff; Clinical Cancer Research 4:1079-1086, 1998)を用いると、神経内分泌(NET)患者3人全員がこの点を有意に上回った(患者12:1.8;患者10:6.3;患者3、試験中止:3.8)。患者10の場合、最終GMIは10.7であり、2013年10月4日の時点で患者12のGMIは1.4であった。2013年1月25日の時点で、3人の神経内分泌腫瘍患者一人一人がOMP-18R5試験を続けていた期間と前治療法を受けた期間との比較を図3Aに示した。2013年10月4日の時点で、3人の神経内分泌腫瘍患者一人一人がOMP-18R5試験を続けていた期間と前治療法を受けた期間との比較を図3Bに示した。
【０２２６】
実施例2
インビボでのWntアンタゴニストを用いた神経内分泌腫瘍の成長の阻止
本実施例は、異種移植片モデルにおいて神経内分泌腫瘍の成長を阻止するためのWntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)の使用について述べる。ある特定の態様では、マウスにおいて異種移植片として継代された、患者試料(固形腫瘍生検材料または胸水)からの神経内分泌腫瘍細胞を実験動物に再継代するために調製する。神経内分泌腫瘍組織を無菌条件下で取り出し、小さな断片に切断し、滅菌したナイフを用いて完全に細かく切り刻み、酵素消化および機械的破壊によって単一細胞懸濁液を得る。具体的には、胸水細胞または結果として生じる腫瘍断片を、超高純度のコラゲナーゼIIIを含む培地(200〜250単位のコラゲナーゼ/mL)と混合し、15〜20分ごとに10mLピペットで上下にピペッティングしながら37℃で3〜4時間インキュベートする。消化された細胞を、45μMナイロンメッシュに通して濾過し、RPMI/20％FBSで洗浄し、HBSSで2回洗浄する。次いで、腫瘍成長を誘発するために、解離した神経内分泌腫瘍細胞をNOD/SCIDマウスの乳房脂肪パッドに皮下注射する。
【０２２７】
ある特定の態様では、最初に、解離した神経内分泌腫瘍細胞を細胞表面マーカーに基づいて腫瘍形成細胞および非腫瘍形成細胞に分別した後に、実験動物に注射する。具体的には、前記のように解離した神経内分泌腫瘍細胞を、2％熱失活仔ウシ血清(HICS)を含有するHEPES緩衝生理食塩溶液(HBSS)で2回洗浄し、100μlにつき106個の細胞で再懸濁する。抗体を添加し、細胞を氷上で20分間インキュベートした後に、HBSS/2％HICSで2回洗浄する。抗体には、抗ESA(Biomeda, Foster City, CA)、抗CD44、抗CD24、および細胞系マーカーである抗CD2、抗CD3、抗CDlO、抗CD16、抗CD18、抗CD31、抗CD64、および抗CD140b(総称してLinと呼ばれる;PharMingen, San Jose, CA)が含まれる。これらのマーカーを発現する細胞のポジティブセレクションまたはネガティブセレクションを行うために、抗体を蛍光色素に直接コンジュゲートさせる。マウス細胞は、H2Kd+細胞を選択することによって排除し、死細胞は、バイアビリティダイ7AADを使用することによって排除する。フローサイトメトリーは、FACSVantage(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ)によって行う。側方散乱光および前方散乱光プロファイルを用いて細胞凝集塊を排除する。次いで、腫瘍成長を誘発するために、単離されたESA+、CD44+、CD24-/low、Lin-腫瘍形成細胞をNOD/SCIDマウスに皮下注射する。
【０２２８】
一例として、神経内分泌腫瘍細胞の増殖を弱めることができるかどうかWntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)を分析する。解離した神経内分泌腫瘍細胞(動物1匹につき10,000個)を6〜8週齢NOD/SCIDマウスの側腹部領域に皮下注射する。腫瘍細胞注射の2日後に、動物に10mg/kgの抗FZD抗体または可溶性FZD受容体を週に2回、腹腔内(i.p.)注射する。成長が検出されるまで、腫瘍成長を毎週モニタリングする。この後に、腫瘍成長を計8週間、週2回、測定する。このように、PBS注射対照と比較して腫瘍成長を大幅に弱めたFZD結合抗体を特定する。
【０２２９】
実施例3
Wntアンタゴニストを用いた神経内分泌腫瘍のインビボ処置
本実施例は、異種移植片モデルにおいて神経内分泌癌を処置するためのWntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)の使用について述べる。ある特定の態様では、マウスにおいて異種移植片として継代された、患者試料(固形腫瘍生検材料または胸水)からの神経内分泌腫瘍細胞を実験動物に再継代するために調製する。神経内分泌腫瘍組織を取り出し、小さな断片に切断し、滅菌したナイフを用いて完全に細かく切り刻み、酵素消化および機械的破壊によって単一細胞懸濁液を得る。次いで、腫瘍成長を誘発するために、解離した神経内分泌腫瘍細胞を、乳房腫瘍の場合はNOD/SCIDマウスの乳房脂肪パッドに、または非乳房腫瘍の場合はNOD/SCIDマウスの側腹部に皮下注射する。または、ESA+、CD44+、CD24-/low、Lin-腫瘍形成腫瘍細胞を前記のように単離し、注射する。
【０２３０】
腫瘍細胞注射後に、動物の腫瘍成長をモニタリングする。神経内分泌腫瘍の平均サイズが約150〜200mmに達したら、Wntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)処置を開始する。各動物の腹腔内に、100μgのWntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5もしくはOMP-54F28)または対照薬剤を、計6週間、1週間に2〜5回与える。腫瘍の大きさを6週間、週2回、評価する。このように、対照薬剤と比較して、Wntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)がさらなる神経内分泌腫瘍の成長を阻止する、または神経内分泌腫瘍の大きさを縮小する能力を確かめる。
【０２３１】
抗体処置のエンドポイントで、さらなる分析のために腫瘍を採取する。ある態様では、腫瘍へのWntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)の浸透および腫瘍応答を評価するために、神経内分泌腫瘍の一部を免疫蛍光によって分析する。Wntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)で処置されたマウスおよび対照マウスから採取された各神経内分泌腫瘍の一部を液体窒素に入れて新鮮凍結し、O.C.T.に入れて包埋し、10μm切片としてクリオスタットで切断してガラススライドに載せる。ある態様では、各神経内分泌腫瘍の一部をホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、10μm切片としてミクロトームで切断してガラススライドに載せる。切片を後固定し、腫瘍生検材料に存在するWntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5もしくはOMP-54F28)または対照薬剤を検出するために、注射されたWntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)を特異的に認識する発色団標識抗体とインキュベートする。さらに、異なる腫瘍および腫瘍に補充される細胞タイプを検出する抗体、例えば、血管内皮細胞を検出する抗VEカドヘリン(CD144)または抗PECAM-1(CD31)抗体、血管平滑筋細胞を検出する抗平滑筋α-アクチン抗体、増殖細胞を検出する抗Ki67抗体、死にかけている細胞を検出するTUNELアッセイ、Wntシグナル伝達を検出する抗β-カテニン抗体、およびNotchシグナル伝達を検出する抗細胞内ドメイン(ICD)Notch断片抗体を用いて、例えば、血管形成、腫瘍成長、および腫瘍形態に対するWntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)処置の効果を評価することができる。
【０２３２】
ある特定の態様では、神経内分泌腫瘍細胞遺伝子発現に対するWntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)処置の効果も評価する。Wntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)で処置されたマウスおよび対照抗体で処置されたマウスから採取された各神経内分泌腫瘍の一部から総RNAを抽出し、定量RT-PCRに使用する。FZD受容体、例えば、Wnt1およびβ-カテニンを含むWntシグナル伝達経路の成分、ならびに以前に特定されたさらなる癌幹細胞マーカー(例えば、CD44)の発現レベルを、内部対照であるハウスキーピング遺伝子GAPDHと比較して分析する。このように、Wntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)処置時の神経内分泌腫瘍細胞遺伝子発現の変化を確かめる。
【０２３３】
さらに、神経内分泌腫瘍にある癌幹細胞の頻度に対するWntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)処置の効果を評価する。Wntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)で処置したマウスからの神経内分泌腫瘍試料と、対照薬剤で処置したマウスからの神経内分泌腫瘍試料を小さな断片に切断し、滅菌したナイフを用いて完全に細かく切り刻み、酵素消化および機械的破壊によって単一細胞懸濁液を得る。次いで、前記で詳述したように、腫瘍形成癌幹細胞が存在するかどうか、ESA+、CD44+、CD24-/low、Lin-表面細胞マーカー発現に基づいて、解離した神経内分泌腫瘍細胞をFACS分析によって分析する。
【０２３４】
次いで、Wntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)処置後にESA+、CD44+、CD24-/low、Lin-発現に基づいて単離した細胞の腫瘍形成能を評価することができる。Wntアンタゴニスト(例えば、OMP-18R5またはOMP-54F28)で処置したマウスから単離したESA+、CD44+、CD24-/low、Lin-癌幹細胞と、対照薬剤で処置したマウスから単離したESA+、CD44+、CD24-/low、Lin-癌幹細胞をNOD/SCIDマウスの乳房脂肪パッドに再度、皮下注射した。次いで、一貫した神経内分泌腫瘍形成に必要な注射細胞の数に基づいて癌幹細胞の腫瘍形成能を確かめる。
【０２３５】
実施例4
抗FZD受容体抗体または可溶性FZD受容体を用いたヒト神経内分泌腫瘍の処置
本実施例は、FZD受容体発現が検出されている癌幹細胞および/もしくは腫瘍細胞ならびに/またはWntシグナル伝達阻害に応答することを示すWnt遺伝子シグネチャーを有する腫瘍細胞を含む、神経内分泌腫瘍を標的とするFZD受容体に対する抗体を用いて神経内分泌腫瘍を処置するための、ある特定の方法について述べる。
【０２３６】
ある態様では、最初に、腫瘍生検材料から、癌幹細胞マーカーもしくはFZD受容体の存在またはWnt遺伝子シグネチャー中の1種もしくは複数種の遺伝子の発現を確かめることができる。神経内分泌腫瘍と診断された患者からの生検材料から腫瘍細胞を無菌条件下で取り出す。ある態様では、組織生検材料を液体窒素に入れて新鮮凍結し、O.C.T.に入れて包埋し、10μm切片としてクリオスタットで切断してガラススライドに載せる。ある態様では、組織生検材料をホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、10μm切片としてミクロトームで切断してガラススライドに載せる。
【０２３７】
FZDタンパク質発現を検出するために、切片を、FZD受容体に対する抗体とインキュベートする。または、Wnt遺伝子シグネチャー中の1種または複数種の遺伝子が存在するかどうか切片を分析することができる。
【０２３８】
癌幹細胞の存在も確かめることができる。組織生検試料を小さな断片に切断し、滅菌したナイフを用いて完全に細かく切り刻み、単一細胞懸濁液を得るために細胞を酵素消化および機械的破壊に供する。次いで、癌幹細胞を検出するために、解離した神経内分泌腫瘍細胞を抗ESA抗体、抗CD44抗体、抗CD24抗体、抗Lin抗体、および抗FZD抗体とインキュベートし、ESA+、CD44+、CD24-/low、Lin-、FZD+腫瘍幹細胞の存在を、前記で詳述したようにフローサイトメトリーによって確かめる。
【０２３９】
FZD受容体および/またはWnt遺伝子シグネチャー中の1種もしくは複数種の遺伝子を発現すると診断された神経内分泌腫瘍を有する癌患者を、抗FZD受容体抗体または可溶性FZD受容体を用いて処置する。ある特定の態様では、ヒト化したモノクローナル抗FZD受容体抗体もしくは可溶性FZD受容体またはヒトモノクローナル抗FZD受容体抗体もしくは可溶性FZD受容体が精製され、注射用の適切な薬学的ビヒクルを用いて処方される。ある態様では、患者は、FZD抗体または可溶性FZD受容体を用いて少なくとも10週間にわたって1ヶ月に少なくとも1回、処置される。ある態様では、患者は、FZD抗体または可溶性FZD受容体を用いて少なくとも約14週間にわたって1週間に少なくとも1回、処置される。抗体または可溶性FZD受容体の投与はそれぞれ薬学的に有効な用量でなければならない。ある態様では、約2〜約100mg/mlの抗FZD抗体または可溶性FZD受容体が投与される。ある態様では、約5〜約40mg/mlの抗FZD抗体または可溶性FZD受容体が投与される。抗体または可溶性FZD受容体は、標準的な放射線療法レジメンまたは1種もしくは複数種の化学療法剤を用いた化学療法レジメンの前に、これと同時に、あるいはこれの後に投与することができる。このような処置によって抗腫瘍応答が生じたかどうか確かめるために、患者は、例えば、腫瘍後退、新たな腫瘍の発生率の低下、腫瘍抗原発現の低下、癌幹細胞数の減少、または疾患予後を評価する他の手段に基づいてモニタリングされる。
【０２４０】
本明細書および2012年10月23日に出願された米国特許出願第61/717,294号において引用された全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、ならびにアクセッション番号/データベース配列(ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列の両方を含む)は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号/データベース配列が参照により本明細書に組み入れられるように詳細かつ個々に示されるのと同じ程度に、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２４１】
配列
ヒトFZD1完全長アミノ酸配列(SEQ ID NO:1;下線はECDを示す)
2015536933.tif 000053
ヒトFZD2完全長アミノ酸配列(SEQ ID NO:2;下線はECDを示す)
2015536933.tif 000054
ヒトFZD3完全長アミノ酸配列(SEQ ID NO:3;下線はECDを示す)
2015536933.tif 000055
ヒトFZD4完全長アミノ酸配列(SEQ ID NO:4;下線はECDを示す)
2015536933.tif 000056
ヒトFZD5完全長アミノ酸配列(SEQ ID NO:5;下線はECDを示す)
2015536933.tif 000057
ヒトFZD6完全長アミノ酸配列(SEQ ID NO:6;下線はECDを示す)
2015536933.tif 000058
ヒトFZD7完全長アミノ酸配列(SEQ ID NO:7;ECDに下線を引いた)
2015536933.tif 000059
ヒトFZD8完全長アミノ酸配列(SEQ ID NO:8;ECDに下線を引いた)
2015536933.tif 000060
ヒトFZD9完全長アミノ酸配列(SEQ ID NO:9;下線はECDを示す)
2015536933.tif 000061
ヒトFZD10完全長アミノ酸配列(SEQ ID NO:10;ECDに下線を引いた)
2015536933.tif 000062
シグナル配列を有するヒトFZD1 ECD(SEQ ID NO:11)
2015536933.tif 000063
シグナル配列を有するヒトFZD2 ECD(SEQ ID NO:12)
2015536933.tif 000064
シグナル配列を有するヒトFZD3 ECD(SEQ ID NO:13)
2015536933.tif 000065
シグナル配列を有するヒトFZD4 ECD(SEQ ID NO:14)
2015536933.tif 000066
シグナル配列を有するヒトFZD5 ECD(SEQ ID NO:15)
2015536933.tif 000067
シグナル配列を有するヒトFZD6 ECD(SEQ ID NO:16)
2015536933.tif 000068
シグナル配列を有するヒトFZD7 ECD(SEQ ID NO:17)
2015536933.tif 000069
シグナル配列を有するヒトFZD8 ECD(SEQ ID NO:18)
2015536933.tif 000070
シグナル配列を有するヒトFZD9 ECD(SEQ ID NO:19)
2015536933.tif 000071
シグナル配列を有するヒトFZD10 ECD(SEQ ID NO:20)
2015536933.tif 000072
ヒトFZD1 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:21;SEQ ID NO:1のアミノ酸87〜237)
2015536933.tif 000073
ヒトFZD2 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:22;SEQ ID NO:2のアミノ酸24〜159)
2015536933.tif 000074
ヒトFZD3 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:23;SEQ ID NO:3のアミノ酸23〜143)
2015536933.tif 000075
ヒトFZD4 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:24;SEQ ID NO:4のアミノ酸40〜170)
2015536933.tif 000076
ヒトFZD5 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:25;SEQ ID NO:5のアミノ酸27〜157)
2015536933.tif 000077
ヒトFZD6 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:26;SEQ ID NO:6のアミノ酸19〜146)
2015536933.tif 000078
ヒトFZD7 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:27;SEQ ID NO:7のアミノ酸33〜170)
2015536933.tif 000079
ヒトFZD8 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:28;SEQ ID NO:8のアミノ酸28〜158)
2015536933.tif 000080
ヒトFZD9 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:29;SEQ ID NO:9のアミノ酸23〜159)
2015536933.tif 000081
ヒトFZD10 Friドメインアミノ酸配列(SEQ ID NO:30;SEQ ID NO:10のアミノ酸21〜154)
2015536933.tif 000082
2015536933.tif 000083
18R5重鎖(IgG2)アミノ酸配列。下線はVHを示す(SEQ ID NO:39)
2015536933.tif 000084
18R5 LIGHT CHAIN軽鎖(λ)アミノ酸配列。下線はVLを示す(SEQ ID NO:40)
2015536933.tif 000085
18R8 VL CDR1(SEQ ID NO:41)
2015536933.tif 000086
2015536933.tif 000087
18R8 18R8軽鎖(λ)アミノ酸配列。下線はVLを示す(SEQ ID NO:45)
2015536933.tif 000088
2015536933.tif 000089
2015536933.tif 000090
最小FZDおよびSFRP Friドメイン配列
h-FZD1アミノ酸116〜227(SEQ ID NO:73)
2015536933.tif 000091
h-FZD2アミノ酸39〜150(SEQ ID NO:74)
2015536933.tif 000092
h-FZD3アミノ酸28〜133(SEQ ID NO:75)
2015536933.tif 000093
h-FZD4アミノ酸48〜161(SEQ ID NO:76)
2015536933.tif 000094
h-FZD5アミノ酸33〜147(SEQ ID NO:77)
2015536933.tif 000095
h-FZD6アミノ酸24〜129(SEQ ID NO:78)
2015536933.tif 000096
h-FZD7アミノ酸49〜160(SEQ ID NO:79)
2015536933.tif 000097
h-FZD8アミノ酸35〜148(SEQ ID NO:80)
2015536933.tif 000098
h-FZD9アミノ酸39〜152(SEQ ID NO:81)
2015536933.tif 000099
h-FZD10アミノ酸34〜147(SEQ ID NO:82)
2015536933.tif 000100
h-SFRP1アミノ酸57〜165(SEQ ID NO:83)
2015536933.tif 000101
h-SFRP2アミノ酸40〜152(SEQ ID NO:84)
2015536933.tif 000102
h-SFRP3アミノ酸35〜147(SEQ ID NO:85)
2015536933.tif 000103
h-SFRP4アミノ酸24〜136(SEQ ID NO:86)
2015536933.tif 000104
h-SFRP5アミノ酸53〜162(SEQ ID NO:87)
2015536933.tif 000105
h-ROR1最小Friドメイン(SEQ ID NO:88)
2015536933.tif 000106
h-ROR2最小Friドメイン(SEQ ID NO:89)
2015536933.tif 000107
ヒトFZD4 Friドメイン(予測シグナル配列に下線を引いた)(SEQ ID NO:90)
2015536933.tif 000108
ヒトFZD5 Friドメイン(予測シグナル配列に下線を引いた)(SEQ ID NO:91)
2015536933.tif 000109
ヒトFZD8 Friドメイン(予測シグナル配列に下線を引いた)(SEQ ID NO:92)
2015536933.tif 000110
ヒトIgG1 Fc領域(SEQ ID NO:93)
2015536933.tif 000111
ヒトIgG1 Fc領域(SEQ ID NO:94)
2015536933.tif 000112
ヒトIgG1 Fc領域(SEQ ID NO:95)
2015536933.tif 000113
リンカー(SEQ ID NO:96)
ESGGGGVT
リンカー(SEQ ID NO:97)
LESGGGGVT
リンカー(SEQ ID NO:98)
GRAQVT
リンカー(SEQ ID NO:99)
WRAQVT
リンカー(SEQ ID NO:100)
ARGRAQVT
シグナル配列(SEQ ID NO:101)
2015536933.tif 000114
シグナル配列(SEQ ID NO:102)
2015536933.tif 000115
シグナル配列(SEQ ID NO:103)
2015536933.tif 000116
シグナル配列(SEQ ID NO:104)
2015536933.tif 000117
シグナル配列(SEQ ID NO:105)
2015536933.tif 000118
シグナル配列(SEQ ID NO:106)
2015536933.tif 000119
シグナル配列(SEQ ID NO:107)
2015536933.tif 000120
シグナル配列(SEQ ID NO:108)
2015536933.tif 000121
FZD8-Fcアミノ酸配列-変種54F03(予測シグナル配列なし;融合タンパク質のFZD8配列とFc配列との間にある「GRA」リンカー配列に下線を引いた)(SEQ ID NO:109)
2015536933.tif 000122
FZD8-Fc変種
FZD8-Fc変種54F03アミノ酸配列(予測シグナル配列なし;代替型切断)(SEQ ID NO:110)
2015536933.tif 000123
FZD8-Fc変種54F09アミノ酸配列(予測シグナル配列なし)(SEQ ID NO:111)
2015536933.tif 000124
FZD8-Fc変種54F09アミノ酸配列(予測シグナル配列なし;代替型切断)(SEQ ID NO:112)
2015536933.tif 000125
FZD8-Fc変種54F15アミノ酸配列(予測シグナル配列なし)(SEQ ID NO:113)
2015536933.tif 000126
FZD8-Fc変種54F15アミノ酸配列(予測シグナル配列なし;代替型切断)(SEQ ID NO:114)
2015536933.tif 000127
FZD8-Fc変種54F16、54F17、54F18、54F23、54F25、54F27、54F29、54F31、および54F34アミノ酸配列(予測シグナル配列なし)(SEQ ID NO:115)
2015536933.tif 000128
FZD8-Fc変種54F16アミノ酸配列(予測シグナル配列なし;代替型切断)(SEQ ID NO:116)
2015536933.tif 000129
FZD8-Fc変種54F19、54F20、54F24、54F26、54F28、54F30、54F32、54F34、および54F35アミノ酸配列(予測シグナル配列なし)(SEQ ID NO:117)
2015536933.tif 000130
FZD8-Fc 変種54F19アミノ酸配列(予測シグナル配列なし;代替型切断)(SEQ ID NO:118)
2015536933.tif 000131
FZD8-Fc 変種54F20アミノ酸配列(予測シグナル配列なし;代替型切断)(SEQ ID NO:119)
2015536933.tif 000132
FZD8-Fc 変種54F34アミノ酸配列(予測シグナル配列なし)(SEQ ID NO:120)
2015536933.tif 000133
FZD8-Fc 変種54F33アミノ酸配列(予測シグナル配列なし)(SEQ ID NO:121)
2015536933.tif 000134
h-Wnt1 C末端システインリッチドメイン(aa288〜370)(SEQ ID NO:122)
2015536933.tif 000135
h-Wnt2 C末端システインリッチドメイン(aa267〜360)(SEQ ID NO:123)
2015536933.tif 000136
h-Wnt2b C末端システインリッチドメイン(aa298〜391)(SEQ ID NO:124)
2015536933.tif 000137
h-Wnt3 C末端システインリッチドメイン(aa273〜355)(SEQ ID NO:125)
2015536933.tif 000138
h-Wnt3a C末端システインリッチドメイン(aa270〜352)(SEQ ID NO:126)
2015536933.tif 000139
h-Wnt7a C末端システインリッチドメイン(aa267〜359)(SEQ ID NO:127)
2015536933.tif 000140
h-Wnt7b C末端システインリッチドメイン(aa267〜349)(SEQ ID NO:128)
2015536933.tif 000141
h-Wnt8a C末端システインリッチドメイン(aa248〜355)(SEQ ID NO:129)
2015536933.tif 000142
h-Wnt8b C末端システインリッチドメイン(aa245〜351)(SEQ ID NO:130)
2015536933.tif 000143
h-Wnt1Oa C末端システインリッチドメイン(aa335〜417)(SEQ ID NO:131)
2015536933.tif 000144
h-Wnt1Ob C末端システインリッチドメイン(aa307〜389)(SEQ ID NO:132)
2015536933.tif 000145
FZD8-Fc変種54F28。予測シグナル配列に下線を引いた(SEQ ID NO:133)
2015536933.tif 000146
【図１Ａ】
2015536933.tif 000159
【図１Ｂ】
2015536933.tif 000160
【図１Ｃ】
2015536933.tif 000161
【図２Ａ】
2015536933.tif 000162
【図２Ｂ】
2015536933.tif 000163
【図３Ａ】
2015536933.tif 000164
【図３Ｂ】
2015536933.tif 000165
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月30日(2015.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015536933000001.app
【国際調査報告】
2015536933.tif 000166
2015536933.tif 000167