(57)【要約】本明細書において、そのＮ末端またはＣ末端に金属イオンアフィニティクロマトグラフィータグおよびプロテアーゼ切断部位を含むプロ−ポリペプチドから固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーによってポリペプチドを得るための方法が報告され、前記方法は、結合したプロ−ポリペプチドをプロテアーゼと共にインキュベーションし、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料を尿素溶液を用いて少なくとも１回洗浄することによって、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーカラムから前記ポリペプチドを回収する工程を含む。
2015508664.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
−  金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に結合したプロ−ポリペプチドを変性させる工程、
−  金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に結合したプロ−ポリペプチドを再生する工程、および
−  結合したプロ−ポリペプチドをプロテアーゼと共にインキュベーションし、それにより前記ポリペプチドを産生する工程
を含む、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーカラム上でのプロテアーゼ切断部位のカラムでの酵素的切断によって、プロ−ポリペプチド（前記プロ−ポリペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端に、金属イオンアフィニティクロマトグラフィータグ、およびタグとポリペプチドとの間に位置するプロテアーゼ切断部位を含む）からポリペプチドを産生するための方法。
【請求項２】
以下の工程：
−  結合したプロ−ポリペプチドを、変性剤を含む溶液と接触させる工程、
−  場合により、前の工程で使用した変性剤を含む溶液が尿素もしくは尿素誘導体を含まないならば、結合したプロ−ポリペプチドを、尿素もしくは尿素誘導体を含む溶液と接触させるか、または、前の工程で使用した変性剤を含む溶液が尿素もしくは尿素誘導体と変性剤との混合物を含むならば、結合したプロ−ポリペプチドを、尿素もしくは尿素誘導体を含む溶液と接触させる工程、
−  結合したプロ−ポリペプチドをプロテアーゼと共にインキュベーションし、それによりポリペプチドを産生することによって、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーカラムから前記ポリペプチドを回収する工程
を含む、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーカラム上でのプロテアーゼ切断部位のカラムでの酵素的切断によって、プロ−ポリペプチド（前記プロ−ポリペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端に、金属イオンアフィニティクロマトグラフィータグ、およびタグとポリペプチドとの間に位置するプロテアーゼ切断部位を含む）からポリペプチドを産生するための方法。
【請求項３】
前記方法が、プロテアーゼとインキュベーションする直前に、変性剤を含まない溶液を用いての洗浄工程を含むことを特徴とする、請求項１〜２のいずれか一項記載の方法。
【請求項４】
前記ポリペプチドが天然形で回収されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記ポリペプチドが変性形で回収されることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記変性剤が、塩化グアニジニウム、尿素、チオ尿素、およびテトラメチル尿素から選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記変性剤が、０．５Ｍ〜６Ｍの濃度を有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記尿素または尿素誘導体が、０．５Ｍ〜８Ｍの濃度を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
プロ−ポリペプチドが、天然形または変性形で、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に適用されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
前記の固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料が、固定化亜鉛アフィニティクロマトグラフィー材料であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記プロテアーゼが、ＩｇＡプロテアーゼ、トリプシン、またはグランザイムＢから選択されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
前記の変性剤を含まない溶液が、約ｐＨ８のｐＨ値で０．５〜１．５Ｍのトリスを含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、非グリコシル化ポリペプチドであることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、またはアポリポタンパク質Ａ−Ｉもしくはヒトインシュリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）を含む融合ポリペプチド、またはインシュリン様成長因子ｉ（ＩＧＦ−１）を含む融合ポリペプチドであることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
以下の工程：
−  前記ポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞または真核細胞の培養の培養培地から得られたポリペプチドを、請求項１〜１４のいずれか一項記載の固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー法を用いて精製し、それにより前記ポリペプチドを産生する工程
を含む、ポリペプチドを産生するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カラムでの切断による金属イオンアフィニティクロマトグラフィータグの酵素的除去と組み合わせた、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーを使用した、ポリペプチドの精製およびポリペプチドの産生の分野に存する。従って、本明細書において、プロテアーゼを使用した金属イオンアフィニティクロマトグラフィータグを含むポリペプチドのカラムでの切断のための方法を報告する。
【０００２】
発明の背景
タンパク質は今日の医学ポートフォリオに重要な役割を果たしている。組換えポリペプチドの産生のための発現系は当技術分野の最新技術において周知である。薬学的適用に使用するためのポリペプチドは、主に、原核細胞、例えばE.coli、および哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞などで産生される。
【０００３】
ヒトへの適用のために、あらゆる薬学的物質が個別に異なる基準を満たさなければならない。ヒトへの生物学的製剤の安全性を確実にするために、例えば、深刻な害を引き起こすであろう核酸、ウイルスおよび宿主細胞のタンパク質は除去されなければならない。規制の仕様書に沿うために、１回以上の精製工程を、製造プロセス後に行わなければならない。とりわけ、純度、処理量、および収率は、適切な精製プロセスを決定する際に重要な役割を果たしている。
【０００４】
タンパク質の精製のための種々の方法が十分に確立されそして広く使用されており、例えば微生物タンパク質を用いてのアフィニティクロマトグラフィー（例えばプロテインＡまたはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー（例えば陽イオン交換クロマトグラフィー（スルホプロピルまたはカルボキシメチルレジン）、陰イオン交換クロマトグラフィー（アミノエチルレジン）および混合型イオン交換クロマトグラフィー、チオール基吸着クロマトグラフィー（例えばチオエーテルリガンドを用いて）、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリック（aza-arenophilic）レジン、またはｍ−アミノフェニルホウ酸）を用いて）、金属イオンキレートアフィニティクロマトグラフィー（例えばＮｉ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）に親和性の材料を用いて）、サイズ排除クロマトグラフィー、および電気泳動法（例えばゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法）がある（例えばVijayalakshmi, M.A., Appl. Biochem. Biotech. 75 (1998) 93-102参照）。
【０００５】
発明の要約
金属イオンアフィニティクロマトグラフィータグ（アフィニティタグ）およびプロテアーゼ切断部位を含むプロ−ポリペプチドは、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に基づいた方法を使用することによって精製および酵素的に切断することができることが判明した。より正確には、次のプロセス工程の実施を可能とするために、すなわち、切断されたポリペプチドを、次の大規模な下流（例えば精製）のプロセス工程の実施を可能とする濃度および純度で回収することができるようにするために、ＩＭＡＣカラムに結合したプロ−ポリペプチドを、尿素を含む溶液と少なくとも１回接触させる、例えばそれを用いて洗浄しなければならないことが判明した。
【０００６】
本明細書において報告された１つの局面は、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーカラム上でのプロテアーゼ切断部位のカラムでの酵素的切断によって、プロ−ポリペプチド（前記プロ−ポリペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端に、金属イオンアフィニティクロマトグラフィータグ、およびタグとポリペプチドとの間に位置するプロテアーゼ切断部位を含む）からポリペプチドを産生するための方法であって、以下の工程（以下の順序で）：
−  金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に結合したプロ−ポリペプチドを変性させる工程、
−  金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に結合したプロ−ポリペプチドを再生する工程、および
−  結合したプロ−ポリペプチドをプロテアーゼと共にインキュベーションし、それにより前記ポリペプチドを産生する工程
を含む。
【０００７】
１つの態様において、変性は、結合したプロ−ポリペプチドを、変性剤を含む溶液と接触させることによる。１つの態様において、プロ−ポリペプチドの再生は、変性したプロ−ポリペプチドを、変性剤を含まない溶液と接触させることによる。
【０００８】
本明細書において報告された１つの局面は、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーカラム上でのプロテアーゼ切断部位のカラムでの酵素的切断によって、プロ−ポリペプチド（前記プロ−ポリペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端に、金属イオンアフィニティクロマトグラフィータグ、およびタグとポリペプチドとの間に位置するプロテアーゼ切断部位を含む）からポリペプチドを産生するための方法であって、以下の工程：
−  結合したプロ−ポリペプチドを、変性剤を含む溶液と接触させる工程、
−  場合により、前の工程で使用した変性剤を含む溶液が尿素もしくは尿素誘導体を含まないならば、結合したプロ−ポリペプチドを、尿素もしくは尿素誘導体を含む溶液と接触させるか、または、前の工程で使用した変性剤を含む溶液が尿素もしくは尿素誘導体と変性剤との混合物を含むならば、結合したプロ−ポリペプチドを、尿素もしくは尿素誘導体を含む溶液と接触させる工程、
−  結合したプロ−ポリペプチドをプロテアーゼと共にインキュベーションし、それによりポリペプチドを産生することによって、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーカラムから前記ポリペプチドを回収する工程
を含む。
【０００９】
１つの態様において、前記方法は、プロテアーゼとインキュベーションする直前に、変性剤を含まない溶液を用いての洗浄工程を含む。
【００１０】
１つの態様において、前記の金属イオンアフィニティクロマトグラフィータグは、ポリペプチドのＮ末端にある。
【００１１】
１つの態様において、前記ポリペプチドは、回収工程前に再生される。１つの態様において、前記ポリペプチドは天然形で回収される。
【００１２】
１つの態様において、前記ポリペプチドは変性形で回収される。
【００１３】
１つの態様において、尿素または尿素誘導体は、約０．５Ｍ〜約８Ｍの濃度を有する。１つの態様において、尿素または尿素誘導体は、約２Ｍ〜約８Ｍの濃度を有する。１つの態様において、尿素または尿素誘導体は、約４Ｍの濃度を有する。
【００１４】
１つの態様において、変性剤は、塩化グアニジニウム、尿素、チオ尿素、およびテトラメチル尿素から選択される。１つの態様において、変性剤は塩化グアニジニウムである。
【００１５】
１つの態様において、変性剤は、約０．５Ｍ〜約６Ｍの濃度を有する。１つの態様において、変性剤は、約１．５Ｍ〜約３Ｍの濃度を有する。１つの態様において、変性剤は、約２Ｍの濃度を有する。
【００１６】
１つの態様において、変性剤は塩化グアニジニウムであり、そして約０．５Ｍ〜約６Ｍの濃度を有する。１つの態様において、濃度は約１．５Ｍ〜約３Ｍである。１つの態様において、濃度は約２Ｍである。
【００１７】
１つの態様において、プロ−ポリペプチドは、天然形または変性形で、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に適用される。
【００１８】
１つの態様において、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料は、固定化亜鉛アフィニティクロマトグラフィー材料である。
【００１９】
１つの態様において、プロテアーゼはＩｇＡプロテアーゼ、トリプシン、またはグランザイムＢから選択される。１つの態様において、プロテアーゼはＩｇＡプロテアーゼである。
【００２０】
１つの態様において、変性剤を含まない溶液は、約０．０１Ｍ〜約２Ｍの緩衝剤を含む。１つの態様において、変性剤を含まない溶液は、約０．５Ｍ〜約１．５Ｍの緩衝剤を含む。１つの態様において、変性剤を含まない溶液は、約１Ｍ〜約１．２Ｍの緩衝剤を含む。
【００２１】
１つの態様において、変性剤を含まない溶液は、約ｐＨ８のｐＨ値で約０．５Ｍ〜約１．５Ｍのトリスを含む。１つの態様において、変性剤を含まない溶液は、約ｐＨ８のｐＨ値で約１Ｍ〜約１．２Ｍのトリスを含む。
【００２２】
１つの態様において、前記ポリペプチドは、非グリコシル化ポリペプチドである。
【００２３】
１つの態様において、前記ポリペプチドは、ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉ、またはアポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む融合ポリペプチドである。１つの態様において、前記ポリペプチドは、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドである。１つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号０１〜配列番号０３から選択されたアミノ酸配列を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドである。
【００２４】
１つの態様において、前記ポリペプチドは、ヒトインシュリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、またはインシュリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）を含む融合ポリペプチドである。１つの態様において、前記ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を有するインシュリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）ポリペプチドである。
【００２５】
本明細書において報告された１つの局面は、以下の工程を含むポリペプチドを産生するための方法である：
−  前記ポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞または真核細胞の培養の培養培地から得られたポリペプチドを、本明細書において報告された固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー法を用いて精製し、それにより前記ポリペプチドを産生する工程。
【００２６】
１つの態様において、前記方法は、以下の工程の１つ以上を含む：
−  前記ポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞または真核細胞を培養する工程、および／または
−  細胞および／または培養培地から前記ポリペプチドを回収する工程、および／または
−  前記ポリペプチドが封入体の形態で回収された場合、前記ポリペプチドを可溶化および／またはリフォールディングする工程、および／または
−  前記ポリペプチドを、本明細書において報告された固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー法を用いて精製し、それにより前記ポリペプチドを産生する工程。
【００２７】
１つの態様において、原核細胞は、E.coli細胞、または桿菌細胞、または酵母細胞である。
【００２８】
１つの態様において、真核細胞は、ＣＨＯ細胞、またはＢＨＫ細胞、またはＨＥＫ細胞、またはＮＳ０細胞、またはＳｐ２／０細胞である。
【００２９】
発明の詳細な説明
本明細書において、プロテアーゼによるプロ−ポリペプチドのカラムでの切断により、プロ−ポリペプチドからポリペプチドを得るための固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー法を報告し、前記方法は、１つの態様において、変性条件下、例えば塩化グアニジニウム含有溶液などの変性剤を用いての第１の洗浄工程、および尿素または尿素誘導体を含む溶液を用いての第２の洗浄工程を含む。特に、本明細書において報告された方法によって得られたポリペプチドは、天然形でカラムから回収することができる。
【００３０】
ｉ）前記ポリペプチドは１mg/mlを超える濃度で得られ、そしてｉｉ）結合したプロ−ポリペプチドが、酵素的切断前に、尿素または尿素誘導体を含む溶液で洗浄されているならば、ＩＭＡＣに結合したプロ−ポリペプチドを洗浄するために使用された塩化グアニジニウムは除去されているので、前記ポリペプチドは、さらなるクロマトグラフィー工程においてさらに加工され得る形態でカラムから回収することができることが判明した。
【００３１】
「適用する」という用語およびその文法上の同義語は、精製しようとする対象の物質を含む溶液を固定相と接触させる、精製法の中の一部の工程を示す。これは、ａ）前記溶液を、固定相が配置されたクロマトグラフィー装置に加えるか、またはｂ）固定相を、対象の物質を含む溶液に加えることを示す。ａ）の場合、精製しようとする対象の物質を含む溶液は、固定相を通過し、これにより固定相と溶液中の物質との間での相互作用が可能となる。例えばｐＨ、伝導性、塩濃度、温度および／または流速などの条件に依存して、溶液のいくつかの物質は固定相に結合し、従って、前記溶液から除去される。他の物質は溶液中に残存する。溶液中に残存している物質は、通過画分に見出すことができる。「通過画分」は、その起源に関係なく、クロマトグラフィー装置の通過後に得られた溶液を示す。それは、対象の物質を含む適用された溶液、またはカラムを流すために使用されるもしくは固定相に結合した１つ以上の物質の溶出を引き起こすために使用される緩衝液のいずれかであり得る。１つの態様において、クロマトグラフィー装置はカラムまたはカセットである。対象の物質は、例えば沈降、塩析、限外濾過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥、アフィニティクロマトグラフィー、または溶媒の容量の低減などの当業者によく知られた方法によって精製工程後に溶液から回収して、精製された形態またはさらには実質的に均一な形態の対象の物質を得ることができる。ｂ）の場合、固定相を、例えば固体として、精製しようとする対象の物質を含む溶液に加え、これにより固定相と溶液中の物質との間の相互作用が可能となる。相互作用の後、固定相を、例えば濾過によって取り出し、そして対象の物質は、固定相に結合しそしてそれと共に溶液から除去されているか、または対象の物質は、固定相に結合しておらず、そして溶液中に残存している。
【００３２】
「緩衝化」または「緩衝剤を含む」という用語は、酸性または塩基性物質の添加または除去に因るｐＨの変化が緩衝物質によって同等となっている溶液を示す。このような効果をもたらすあらゆる緩衝物質または緩衝剤を使用することができる。１つの態様において、緩衝物質は、リン酸もしくはその塩、酢酸もしくはその塩、クエン酸もしくはその塩、モルホリン、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸もしくはその塩、イミダゾールもしくはその塩、ヒスチジンもしくはその塩、グリシンもしくはその塩、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）もしくはその塩から選択される。１つの態様において、緩衝物質は、イミダゾールもしくはその塩、またはヒスチジンもしくはその塩から選択される。場合により、緩衝溶液はまた、追加の無機塩を含み得る。１つの態様において、無機塩は、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、およびクエン酸カリウムから選択される。
【００３３】
「ポリペプチド」は、天然的に産生されたものであれ合成で作製されたものであれ、ペプチド結合によって接続されたアミノ酸からなるポリマーである。約２０個未満のアミノ酸残基のポリペプチドは「ペプチド」と称され得、一方、２つ以上のポリペプチドからなるまたは１００個を超えるアミノ酸残基の１つのポリペプチドを含む分子は「タンパク質」と称され得る。ポリペプチドはまた、炭水化物基、金属イオン、またはカルボン酸エステルなどの非アミノ酸成分を含み得る。非アミノ酸成分は、前記ポリペプチドが発現される細胞によって添加され得、そしてそれは細胞の型によって変化し得る。ポリペプチドは本明細書において、そのアミノ酸骨格構造またはそれをコードする核酸に関連して定義される。炭水化物基などの付加は、一般的に明記されないが、それにも関わらず存在し得る。
【００３４】
「結合および溶出モード」という用語は、クロマトグラフィー精製法を実施するための様式を示す。本明細書において、精製しようとする対象のポリペプチドを含む溶液は固定相に、特に固相に適用され、これにより対象のポリペプチドは、固定相と相互作用し、そしてその上に保持される。対象ではない物質は、それぞれ、通過画分または上清と共に除去される。対象のポリペプチドは、溶出溶液の適用によって、第２工程で固定相から後で回収される。
【００３５】
「カラムでの切断」という用語は、クロマトグラフィー精製法を実施するための様式を示す。その方法では、精製しようとするポリペプチドは、タグ（これを用いてプロ−ポリペプチドはクロマトグラフィー材料に結合することができる）を含みそしてタグとポリペプチドとの間にプロテアーゼ切断部位を含むプロ−ポリペプチドとして結合し、そして、切断部位を認識してタグの切断を起こすことによりポリペプチドを遊離する、プロテアーゼと共にインキュベーションすることによって、クロマトグラフィー材料から回収される。前記ポリペプチドは溶液中に見出すことができるが、タグは、クロマトグラフィー材料に依然として結合している。
【００３６】
「封入体」という用語は、原核細胞の全細胞成分を含む、全細胞タンパク質のかなりの部分を構成する、対象のポリペプチドの高密度な細胞内凝集塊を示す。
【００３７】
「リフォールディングされた」または「再生された」という用語は、変性形から得られたポリペプチドを指す。典型的には、リフォールディングの目標は、リフォールディング工程を経ずに産生された場合にタンパク質が有するであろう活性よりも高いレベルの活性を有するタンパク質を産生することである。フォールディングされたタンパク質分子は、最も低い自由エネルギーを有するコンフォメーションにおいて最も安定である。大半の水溶性タンパク質は、大半の疎水性アミノ酸が、水から離れて、分子の内側部分に存在するようにフォールディングする。タンパク質を互いに保持する弱い結合は、ポリペプチドのアンフォールディングを引き起こす、すなわち変性させる多くの処理によって破壊することができる。フォールディングされたタンパク質は、アミノ酸それ自体とその環境との間のいくつかの種類の相互作用（イオン結合、ファンデルワールス相互作用、水素結合、ジスルフィド結合および共有結合を含む）の産物である。
【００３８】
本明細書において使用された「変性した（denatured）」または「変性した（denaturized）」という用語は、その天然状態またはリフォールディングされた状態の分子に存在しているイオン結合および共有結合およびファンデルワールス相互作用が破壊されたポリペプチドを指す。ポリペプチドの変性は、例えば、８Ｍの尿素または６Ｍの塩化グアニジニウム、還元剤（例えばメルカプトエタノール）、加熱、ｐＨ、温度、および他の化学物質を用いての処理によって達成することができる。８Ｍの尿素または６Ｍの塩化グアニジニウムなどの試薬は、水素結合および疎水性結合の両方を破壊し、そしてメルカプトエタノールも添加されれば、システイン間に形成されているジスルフィド橋（Ｓ−Ｓ）は２つの−Ｓ−Ｈ基へと還元される。その天然状態またはリフォールディングされた状態のジスルフィド結合を含むポリペプチドのリフォールディングはまた、タンパク質がジスルフィド結合を再形成するための、システイン残基上に存在する−Ｓ−Ｈ基の酸化を含み得る。「変性した」ポリペプチドは、二次、三次および／または四次構造が天然の構造ではないポリペプチドである。この非天然形のポリペプチドは可溶性であり得るが、同時に生物学的に不活性なコンフォメーションであり得る。またはポリペプチドは不溶性であり得、そして例えば不一致のまたは未形成のジスルフィド結合を含む生物学的に不活性なコンフォメーションであり得る。この不溶性ポリペプチドは、封入体に含まれていてもよいが、含まれている必要はない。
【００３９】
「変性形」という用語は、ポリペプチドがその生物学的活性を有する二次、三次および／または四次構造を有さないポリペプチドの形態を示す。
【００４０】
「天然形」という用語は、ポリペプチドがその生物学的活性を有する二次、三次および／または四次構造を有するポリペプチドの形態を示す。「再生した」ポリペプチドはその天然形である。
【００４１】
「変性剤を含まない」という用語は、変性剤（denaturant）または変性剤（denaturing agent）が、適用した（洗浄）溶液中に存在しないことを示す。これは、変性剤を含まない溶液と接触させたポリペプチドがその天然形で存在することを意味する。
【００４２】
本出願において使用された「アフィニティクロマトグラフィー」という用語は、「アフィニティクロマトグラフィー材料」を使用するクロマトグラフィー法を示す。アフィニティクロマトグラフィーにおいては、前記ポリペプチドは、静電気的相互作用の形成、クロマトグラフィー官能基との疎水性結合および／または水素結合の形成に依存して、その生物学的活性または化学構造に基づいて分離される。特異的に結合したポリペプチドをアフィニティクロマトグラフィー材料から回収するために、競合性リガンドを加えるか、またはクロマトグラフィー条件、例えば緩衝液のｐＨ値、極性度もしくはイオン強度を変化させる。「アフィニティクロマトグラフィー材料」は、特定の種類のポリペプチドのみに結合するために異なる単一のクロマトグラフィー官能基が組み合わせられている、複雑なクロマトグラフィー官能基を含むクロマトグラフィー材料である。このクロマトグラフィー材料は、そのクロマトグラフィー官能基の特異性に依存して、特定の種類のポリペプチドに特異的に結合する。例示的な「アフィニティクロマトグラフィー材料」は、ヘキサヒスチジンタグを含む融合ポリペプチドまたは多数の表面に露出したヒスチジン、システインおよび／またはトリプトファン残基を有するポリペプチドの結合のための、Ｎｉ（ＩＩ）−ＮＴＡ（ＮＴＡ＝ニトリロ三酢酸）、Ｚｎ（ＩＩ）−ＩＤＡ（ＩＤＡ＝イミノ二酢酸）またはＣｕ（ＩＩ）−ＮＴＡ含有材料などの「固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料」、あるいはプロテインＡなどの「抗体結合クロマトグラフィー材料」、あるいは、酵素基質類似体、酵素補因子、または酵素阻害剤をクロマトグラフィー官能基として含むクロマトグラフィー材料などの「酵素結合クロマトグラフィー材料」、あるいは、多糖、細胞表面レセプター、糖タンパク質、またはインタクト細胞をクロマトグラフィー官能基として含むクロマトグラフィー材料などの「レクチン結合クロマトグラフィー材料」である。１つの態様において、アフィニティクロマトグラフィー材料はＺｎ（ＩＩ）−ＩＤＡである。
【００４３】
本出願において使用された「固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー」という用語は、「固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料」を使用するクロマトグラフィー法を示す。金属イオンアフィニティクロマトグラフィーは、クロマトグラフィー官能基としてのバルク材料に結合している金属イオン（例えばＣｕ（ＩＩ）、Ｎｉ（ＩＩ）またはＺｎ（ＩＩ）など）と、表面に露出したポリペプチドのアミノ酸側鎖（特にイミダゾール含有側鎖およびチオール基含有側鎖）の電子供与基との間のキレートの形成に基づく。キレートは、側鎖が少なくとも部分的にプロトン化されてないｐＨ値で形成される。結合したポリペプチドは、ｐＨ値の変化によって、すなわちプロトン化によってクロマトグラフィー材料から回収することができる。
【００４４】
例示的な「固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料」は、ＨｉＴｒａｐキレーティングＨＰ（GE Healthcare Europe GmbH, Germany）またはFractogel EMDキレート(Merck, Darmstadt, Germany)である。
【００４５】
ポリペプチドを精製するための方法は、十分に確立されそして広く使用されている。それらは、単独でまたは組み合わせて使用される。このような方法は、例えば、錯体形成した金属イオン（例えばＮｉ（ＩＩ）およびＣｕ（ＩＩ）に親和性の材料）を有するチオールリガンドまたは微生物由来タンパク質（例えばプロテインＡまたはプロテインＧアフィニティクロマトグラフィー）を使用したアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー（例えば陽イオン交換（カルボキシメチルレジン）、陰イオン交換クロマトグラフィー（アミノエチルレジン）および混合型交換クロマトグラフィー、チオール基吸着クロマトグラフィー（例えばチオエーテルリガンドを用いて）、疎水性相互作用クロマトグラフィーまたは芳香族吸着クロマトグラフィー（例えば、フェニル−セファロース、アザ−アレノフィリックレジン、またはｍ−アミノフェニルボロン酸）を用いて）、サイズ排除クロマトグラフィー、および分取電気泳動法（例えばゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法）である。
【００４６】
「酵素的切断部位」という用語は、プロテアーゼによって特異的に切断することのできるペプチド結合を介して互いに接続されたアミノ酸残基の配列を示す。１つの態様において、プロテアーゼ切断部位は、ＩｇＡ−プロテアーゼ切断部位、またはグランザイムＢ切断部位、またはＴｅｖプロテアーゼ切断部位、またはプレシジョンプロテアーゼ切断部位、またはトロンビン切断部位、または第Ｘａ因子切断部位、またはトリプシン切断部位、またはキモトリプシン切断部位、またはエンテロキナーゼ切断部位である。
【００４７】
１つの態様において、プロテアーゼは、ＩｇＡ−プロテアーゼ、グランザイムＢ、Ｔｅｖプロテアーゼ、プレシジョンプロテアーゼ、トロンビン、第Ｘａ因子、トリプシン、キモトリプシン、またはエンテロキナーゼである。
【００４８】
「ＩｇＡ−プロテアーゼ」という用語は、以下の配列の１つを含む認識部位を有する淋菌に由来するプロテアーゼであり、「↓」は、切断された結合の位置を示す：
Pro-Ala-Pro ↓ Ser-Pro              （配列番号０５）、
Pro-Pro ↓ Ser-Pro                  （配列番号０６）、
Pro-Pro ↓ Ala-Pro                  （配列番号０７）、
Pro-Pro ↓ Thr-Pro                  （配列番号０８）、
Pro-Pro ↓ Gly-Pro                  （配列番号０９）、
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Thr-Pro          （配列番号１０）、
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓ Ala-Pro      （配列番号１１）、
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓Ser-Pro      （配列番号１２）、
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓Thr-Pro      （配列番号１３）、
Val-Val-Ala-Pro-Pro ↓Gly-Pro      （配列番号１４）、
Ala-Pro-Pro-Ala ↓ Ala-Pro          （配列番号１５）、
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Ala-Pro          （配列番号１６）、
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Ser-Pro          （配列番号１７）、
Pro-Arg-Pro-Pro ↓ Gly-Pro          （配列番号１８）、
ただし、最初の３つがより頻繁に選択および切断される。
【００４９】
プロ−ポリペプチドのカラムでの切断を使用した本明細書において報告された方法において、すなわち、プロ−ポリペプチドからのポリペプチドの遊離を、プロ−ポリペプチドがクロマトグラフィーカラムに結合している間に行ない、そしてプロ−ポリペプチドを塩化グアニジニウム含有溶液で洗浄する方法においては、カラムを、尿素または尿素誘導体を含む溶液で少なくとも１回洗浄しなければならないことが判明した。
【００５０】
１つの態様において、カラムを、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に結合しているプロ−ポリペプチドをプロテアーゼと共にインキュベーションする前に尿素または尿素誘導体を含む溶液で洗浄する。
【００５１】
１つの態様において、カラムを、プロ−ポリペプチドをプロテアーゼと共にインキュベーションした後に、尿素または尿素誘導体を含む溶液で洗浄する。１つの態様において、尿素または尿素誘導体を含む溶液で洗浄することによって、前記ポリペプチドを、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーカラムから回収する。
【００５２】
１つの態様において、尿素または尿素誘導体を含む溶液を用いての洗浄の直後に、すなわち、プロテアーゼと共にインキュベーションする前に、変性剤を含まない緩衝溶液（緩衝剤を含む溶液）で洗浄する。
【００５３】
グアニジニウム塩または尿素などの変性剤を用いての洗浄中に、前記ポリペプチドがE.coliにおいて産生された場合には例えば内毒素を除去することができる。
【００５４】
変性剤を用いての洗浄工程中に、前記ポリペプチドをそれが天然形で存在する場合には洗浄工程前に変性させるか、またはそれがすでに変性形で存在している場合にはそれを変性形で維持する。
【００５５】
プロテアーゼを用いてのプロ−ポリペプチドのカラムでの切断前における、尿素または尿素誘導体以外の他の変性剤の除去は、プロ−ポリペプチドのカラムでの切断を改善し、そして次のプロセス工程を実施することを可能とする。
【００５６】
変性剤を含まない緩衝溶液を用いての洗浄中、すなわち天然条件下で、プロ−ポリペプチドは、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に結合したままでその天然状態に戻る。
【００５７】
それ故、本明細書において報告された１つの局面は、ポリペプチドを得るまたは精製するための方法であり、以下の工程：
−結合したプロ−ポリペプチドをプロテアーゼと共にインキュベーションすることによって、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーカラムから前記ポリペプチドを回収する工程
を含み、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に結合したプロ−ポリペプチドは、尿素または尿素誘導体を含む溶液を用いて少なくとも１回洗浄される。
【００５８】
１つの態様において、尿素を含む溶液を用いての洗浄は、プロテアーゼの適用前またはプロテアーゼとのインキュベーション後である。尿素含有溶液を用いての洗浄がプロテアーゼとのインキュベーション後である場合、洗浄工程は、ポリペプチドの回収工程と同時である。
【００５９】
従って、本明細書において報告された方法は、結合および溶出モードで操作され、すなわち、プロ−ポリペプチドをまず固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に結合させ、その後、さらなる工程において、前記ポリペプチドを金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料から、プロ−ポリペプチド中のプロテアーゼ切断部位の切断によって回収する。断続的な洗浄工程が本明細書において報告された方法に含まれ得る。
【００６０】
「変性剤（denaturant）」または「変性剤（denaturing agent）」という用語は、その天然形ポリペプチドから、非天然ポリペプチド、すなわち変性形ポリペプチドへと移行する化合物を示す。変性剤は、一般的に、カオトロピック剤である。例示的な変性剤は、尿素または尿素誘導体（例えばチオ尿素およびテトラメチル尿素）、グアニジンおよびグアニジン誘導体（例えば塩化グアニジニウム）、テトラアルキルアンモニウム塩、長鎖スルホン酸エステル、並びに過塩素酸リチウムである。「変性剤」という用語はまた、変性剤の混合物として理解され得る。
【００６１】
１つの態様において、変性剤は尿素または尿素誘導体である。
【００６２】
１つの態様において、変性剤は塩化グアニジニウムである。
【００６３】
１つの態様において、変性剤は尿素である。１つの態様において、尿素は２Ｍ〜８Ｍの濃度を有する。
【００６４】
１つの態様において、変性剤はチオ尿素である。１つの態様において、チオ尿素は１．５Ｍ〜３Ｍの濃度を有する。
【００６５】
本明細書において報告された局面の１つの態様において、ポリペプチドを精製または産生するための方法は以下の工程：
−  プロ−ポリペプチドを含む溶液を、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に適用し、それにより、プロ−ポリペプチドを固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に結合させる工程、
−  場合により、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料を、塩化グアニジニウムを含む溶液で洗浄し、それにより不必要なポリペプチドを除去する工程、
−  固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料を、尿素を含む溶液で洗浄し、それにより、酵素的切断のためのプロ−ポリペプチドおよびさらなる下流のプロセシングのためのポリペプチドを調整する工程、および
−  結合したプロ−ポリペプチドをプロテアーゼと共にインキュベーションすることによって、前記ポリペプチドを固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーカラムから回収する工程
を含む。
【００６６】
ポリペプチド（プロ−ポリペプチドを含む）は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、およびE.coli細胞などの真核細胞および原核細胞において組換え産生することができる。前記ポリペプチドが原核細胞で産生される場合、それは一般的に不溶性の封入体の形態で得られる。封入体は、原核細胞および培養培地から容易に回収することができる。封入体中で不溶形で得られた前記ポリペプチドは、精製前に可溶化しなければならないか、そして／またはリフォールディング手順を実施することができる。
【００６７】
従って、本明細書において報告された第２の局面は、以下の工程を含むポリペプチドを産生するための方法である：
−  前記ポリペプチドをコードする核酸を含む原核細胞または真核細胞を培養する工程、
−  前記ポリペプチドを、原核細胞または真核細胞または／および培養培地から回収する工程、
−  場合により、前記ポリペプチドが封入体の形態で回収される場合、前記ポリペプチドを可溶化および／またはリフォールディングする工程、
−  前記ポリペプチドを、本明細書において報告された固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー法で精製し、それによりポリペプチドを産生する工程。
【００６８】
１つの態様において、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー法は、以下の工程を含む：
−  プロ−ポリペプチドを含む溶液を、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に適用する工程（前記溶液は、変性剤を含むか、または変性剤を含まない）、
−  場合により、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料を、塩化グアニジニウムを含む溶液で洗浄する工程、
−  固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料を、尿素または尿素誘導体を含む溶液で洗浄する工程、
−  結合したプロ−ポリペプチドをプロテアーゼと共にインキュベーションすることによって、前記ポリペプチドを固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィーカラムから回収する工程。
【００６９】
１つの態様において、前記ポリペプチドはプロ−ポリペプチドである。
【００７０】
以下に、以前に報告された全ての局面の異なる態様が提示されている。
【００７１】
１つの態様において、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料は、第１の工程において、緩衝溶液で調整されている。この溶液は変性剤を含んでいても良いが、含む必要はない。調整溶液の緩衝剤は、プロ−ポリペプチドを含む溶液の緩衝剤と同じでも異なっていても良い。
【００７２】
その後、プロ−ポリペプチドを含む溶液は、調整された固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に適用される。この工程において、プロ−ポリペプチドは、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に保持（結合／吸着）している。この溶液は変性剤を含んでいても良いが、含む必要はない。ローディング溶液の緩衝剤は、続く洗浄溶液の緩衝剤と同じでも異なっていても良い。
【００７３】
場合により、プロ−ポリペプチドと共に固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料をローディングした後、洗浄溶液を、ローディングされた固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に適用することができる。この溶液は、（唯一の）変性剤として、塩化グアニジニウムを含む。
【００７４】
プロ−ポリペプチドの結合した固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に、洗浄溶液を適用する。この溶液は、唯一の変性剤として尿素または尿素誘導体を含む。
【００７５】
場合により、洗浄工程後、プロ−ポリペプチドは依然として固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に結合しているので、プロ−ポリペプチドの結合した固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料を、変性剤を含まない緩衝溶液で洗浄することによって天然形に移行する。
【００７６】
最後に、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料から前記ポリペプチドを回収するために、カラムを、固定化金属イオンクロマトグラフィーアフィニティタグと前記ポリペプチドとの間のプロテアーゼ切断部位を特異的に切断するプロテアーゼと共にインキュベーションする。インキュベーション後、切断されたプロ−ポリペプチド、すなわち前記ポリペプチドを、カラムの通過画分から回収する。回収は、場合により、変性剤を含む溶液によって行なうことができる。
【００７７】
１つの態様において、ポリペプチドを精製または得るための方法は、カラムクロマトグラフィー法である。
【００７８】
固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料に種々の工程で適用された、プロ−ポリペプチドを含む溶液（すなわちローディング溶液）を除く、種々の溶液の容量は、互いに独立して、１〜２０カラム容量であり、１つの態様において、１〜１０カラム容量である。
【００７９】
１つの態様において、洗浄溶液の適用は、３〜２０カラム容量である。１つの態様において、洗浄溶液の適用は３〜１０カラム容量である。
【００８０】
本明細書において報告された方法は、以下において、国際公開公報第２０１２／２８５２６号に報告されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合タンパク質および国際公開公報第２００８／０２５５２７号に報告されたＩＧＦ−１を用いて例示されている。
【００８１】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドは、（Ｎ末端からＣ末端の方向へ）ヒトテトラネクチン三量体形成構造エレメントおよび野生型ヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉを含む。ヒトテトラネクチン三量体構造エレメントのアミノ酸配列は、最初の９個のアミノ酸だけ短縮することができ、従って、天然の切断短縮部位である１０位のイソロイシン残基から始まる。この切断短縮の結果として、４位のトレオニン残基のＯ−グリコシル化部位が欠失する。テトラネクチン三量体構造エレメントとヒトアポリポタンパク質Ａ−Ｉの間の５個のアミノ酸残基ＳＬＫＧＳは除去された。
【００８２】
向上した発現および精製のために、Ｎ末端精製タグ（例えばヘキサヒスチジンタグ）および精製タグの除去のためのプロテアーゼ切断部位を含む構築物を作製することができる。１つの態様において、プロテアーゼはＩｇＡプロテアーゼであり、そしてプロテアーゼ切断部位は、ＩｇＡプロテアーゼ切断部位である。プロテアーゼの特異的な切断の結果、プロテアーゼ切断部位のいくつかのアミノ酸残基は、ポリペプチドのＮ末端に保持され、すなわち、ＩｇＡプロテアーゼ切断部位の場合には、２つのアミノ酸残基（１番目としてアラニンまたはグリシンまたはセリンまたはトレオニン、２番目としてプロリン）が、ポリペプチド（例えばテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド）のＮ末端に維持される。
【００８３】
テトラネクチン三量体形成構造エレメントは、個々のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ単量体の各々の間の非共有結合的相互作用によって構成されるテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉホモ三量体の形成を可能とするドメインを提供する。
【００８４】
１つの態様において、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドは、保存的アミノ酸置換を含む変異体である。
【００８５】
１つの態様において、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド（インターフェロンフラグメントおよびタグおよび切断部位を含むテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド）は、発現タグおよび精製タグを含み、そして
【化１】
2015508664.tif 000003
のアミノ酸配列を有する。
【００８６】
１つの態様において、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド（タグおよび切断部位を含むテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド）は、発現タグおよび精製タグを含み、そして
【化２】
2015508664.tif 000004
のアミノ酸配列を有する。
【００８７】
１つの態様において、テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド（タグおよび切断部位を含むテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチド）は、発現タグおよび精製タグを含み、そして
【化３】
2015508664.tif 000005
のアミノ酸配列を有する。
【００８８】
ポリペプチドがE.coli株において組換え産生されているならば、Ｎ末端メチオニン残基は、通常、E.coliプロテアーゼによって効率的に切断されないことを注記しなければならない。従って、Ｎ末端メチオニン残基は、一部、産生されたポリペプチドに存在する。
【００８９】
以下の実施例、配列表、および図面は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、示された手順に改変を行なうことができることが理解される。
【図面の簡単な説明】
【００９０】
【図１Ａ】天然条件下で切断および溶出する前に尿素含有溶液でＩＭＡＣカラムを洗浄することがなかった、カラムで切断されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドの溶出図。タンパク質は可溶化され、そして塩化グアニジニウム含有溶液中でカラムに適用される。
【図１Ｂ】ポリペプチドの図Ａの溶出図の拡大。その後の尿素を用いての洗浄により、シャープなピークが得られる。
【図２】プロ−ポリペプチドの酵素的なカラムでの切断前に、塩化グアニジニウム含有溶液、尿素含有溶液および緩衝溶液（トリス緩衝液）で洗浄する工程を含む、カラムで切断されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドの溶出図。
【図３】プロ−ポリペプチドの酵素的なカラムでの切断前に、塩化グアニジニウム含有溶液、尿素含有溶液および緩衝溶液（トリス緩衝液）で洗浄する工程を含む、カラムで切断されたＩＧＦ−１プロ−ポリペプチドの溶出図。
【００９１】
実施例
材料および方法
特記しない限り、クロマトグラフィー材料に関する製造業者のマニュアルに従って、種々のクロマトグラフィー法が実施される。
【００９２】
組換えＤＮＡ技術：
標準的な方法を使用して、Sambrook, J., et al., Molecular cloning: A laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, (1989)に記載されたようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬を、製造業者の説明書に従って使用した。
【００９３】
タンパク質の決定：
タンパク質濃度は、アミノ酸配列に基づいて計算されたモル吸光係数を使用して、３２０nmにおける基準波長を用いて、２８０nmにおける吸光度（ＯＤ）を決定することによって決定された。
【００９４】
サイズ排除ＨＰＬＣ：
クロマトグラフィーを、ASI-100 HPLCシステム（Dionex, Idstein, Germany）でTosoh Haas TSK 3000 SWXLカラムを用いて実施した。２８０nmの溶出ピークを、ＵＶダイオードアレイ検出器（Dionex）によってモニタリングした。濃縮試料を１mg/mlとなるまで溶解した後、カラムを、２００mMのリン酸二水素カリウムおよび２５０mMの塩化カリウム（ｐＨ７．０）からなる緩衝液で、安定な基線が得られるまで洗浄した。分析の実行は、室温で３０分間かけて流速０．５ml/分を使用して均一濃度の条件下でなされた。クロマトグラムをChromeleon (Dionex, Idstein, Germany)を用いて手作業で積分した。
【００９５】
逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）：
純度をＲＰ−ＨＰＬＣによって分析する。アッセイを、アセトニトリル／ＴＦＡ水の勾配を使用してPhenomenexＣ１８カラムで実施する。溶出プロファイルを２１５nmのＵＶ吸光度としてモニタリングする。溶出された物質の比率を、溶出タンパク質の全ピーク面積に基づいて計算する。
【００９６】
ＤＮＡ−閾値系：
例えば、Merrick, H., and Hawlitschek, G., Biotech Forum Europe 9 (1992) 398-403を参照されたい。
【００９７】
宿主細胞タンパク質の決定：
マイクロタイタープレートのウェルの壁を、血清アルブミンとストレプトアビジンとの混合物でコーティングする。ＨＣＰに対するヤギに由来するポリクローナル抗体を、マイクロタイタープレートのウェルの壁に結合させる。洗浄工程後、マイクロタイタープレートの種々のウェルを、種々の濃度のＨＣＰ検量シーケンスおよび試料溶液と共にインキュベーションする。インキュベーション後、結合していない試料材料を、緩衝溶液を用いて洗浄することによって除去する。検出のために、ウェルを、抗体ペルオキシダーゼコンジュゲートと共にインキュベーションして、結合した宿主細胞タンパク質を検出する。固定化ペルオキシダーゼの活性を、ＡＢＴＳとのインキュベーションおよび４０５nmにおける検出によって検出する。
【００９８】
ＤＮＡの決定：
ビオチンをマイクロタイタープレートに結合させた。ストレプトアビジン、一本鎖ＤＮＡおよびビオチニル化一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質の反応混合物を加えた。結合タンパク質はＤＮＡに結合することができ、そしてビオチニル化された。このように、試料混合物からＤＮＡを特異的に取り出すことが可能であった。ストレプトアビジンは、マイクロタイタープレート上のビオチンに並びに一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質に結合したビオチンに結合した。ウレアーゼに結合したＤＮＡ特異的抗体を、この全複合体に添加した。尿素の添加により、尿素が加水分解され、これはｐＨの局所的変化を引き起こした。この変化は、変化した表面電位として検出することができる。表面電位の変化は、結合したＤＮＡの量と比例していた。一本鎖ＤＮＡが、プロテイナーゼＫによる消化およびＳＤＳによる変性によって得られた。
【００９９】
封入体からのポリペプチドの単離、可溶化およびリフォールディングのための一般的な方法
引用した文献において実施された方法の他に、封入体の調製を、例えば、Rudolph, et al. (Rudolph, R., et al., Folding Proteins, In: Creighton, T.E., (ed.): Protein function: A Practical Approach, Oxford University Press (1997) 57-99)による方法に従って実施することができる。封入体を−７０℃で保存した。封入体の可溶化は、同様に、Rudolph, et al. (Rudolph, R., et al., Folding Proteins, In: Creighton, T.E., (ed.): Protein function: A Practical Approach, Oxford University Press (1997) 57-99)による方法に従って実施することができる。
【０１００】
実施例１
E.coli発現プラスミドの作製および説明
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドを組換え手段によって調製した。Ｎ末端からＣ末端方向へ発現されたプロ−ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下の通りである：
−  アミノ酸メチオニン（Ｍ）、
−  CDLPQTHSL（配列番号１９）のアミノ酸配列を有するインターフェロン配列のフラグメント、
−  ＧＳリンカー、
−  HHHHHH（配列番号２０）のアミノ酸配列を有するヘキサヒスチジンタグ、
−  ＧＳリンカー、
−  VVAPPAP（配列番号１１）のアミノ酸配列を有するＩｇＡプロテアーゼ切断部位、および
−  配列番号０４のアミノ酸配列を有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ。
【０１０１】
前記したようなテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドは、前駆体ポリペプチドであり、これから、成熟したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ融合ポリペプチドが、ＩｇＡプロテアーゼを使用したin vitroにおける酵素的なカラムでの切断によって遊離された。
【０１０２】
プロ−ポリペプチドをコードする融合遺伝子は、公知の組換え法および技術を用いて、適切な核酸セグメントとの接続によって構築された。化学合成によって作製された核酸配列は、ＤＮＡシークエンスによって確認された。配列番号０４の融合ポリペプチドをコードする配列番号０１のテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドの産生のための発現プラスミドは、以下のように調製された。
【０１０３】
E.coli発現プラスミドの作製
プラスミド４９８０（４９８０−ｐＢＲｏｒｉ−ＵＲＡ３−ＬＡＣＩ−ＳＡＣ）は、E.coliにおけるコア−ストレプトアビジンの発現のための発現プラスミドである。それは、プラスミド１９６６（１９６６−ｐＢＲｏｒｉ−ＵＲＡ３−ＬＡＣＩ−Ｔ−リピート；ＥＰ−Ｂ１４２２２３７において報告されている）に由来する３１４２ｂｐ長のＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩベクターフラグメントを、４３５ｂｐ長のコア−ストレプトアビジンをコードするＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩフラグメントとライゲーションすることによって生成された。
【０１０４】
コア−ストレプトアビジンE.coli発現プラスミドは、以下のエレメントを含む：
−  E.coliにおける複製のためのベクターｐＢＲ３２２の複製起点（Sutcliffe, G., et al., Quant. Biol. 43 (1979) 77-90によると、２５１７〜３１６０ｂｐ位に相当する）、
−  E.coliｐｙｒＦ突然変異株の補完（ウラシル栄養要求性）によるプラスミドの選択を可能とする、オロチジン５’−リン酸デカルボキシラーゼをコードするSaccharomyces cerevisiaeのＵＲＡ３遺伝子（Rose, M. et al. Gene 29 (1984) 113-124）、
−  以下を含むコア−ストレプトアビジン発現カセット
−  Stueber, D., et al., Immunol. Methods IV (1990) 121-152 による合成リボソーム結合部位を含む、Ｔ５ハイブリッドプロモーター（Bujard, H., et al. Methods. Enzymol. 155 (1987) 416-433およびStueber, D., et al.（前記参照）によるT5-PN25/03/04ハイブリッドプロモーター）、
−  コア−ストレプトアビジン遺伝子、
−  ２つのバクテリオファージ由来転写終結因子、すなわちλ−Ｔ０終結因子（Schwarz, E., et al., Nature 272 (1978) 410-414）およびｆｄ−終結因子（Beck, E.およびZink, B., Gene 1-3 (1981) 35-58）、
−  E.coli由来のｌａｃＩリプレッサー遺伝子（Farabaugh, P.J., Nature 274 (1978) 765-769）。
【０１０５】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドの発現のための最終発現プラスミドは、単一のフランキングしているＥｃｏＲＩおよびＣｅｌＩＩ制限エンドヌクレアーゼ切断部位を使用してベクター４９８０からコア−ストレプトアビジン構造遺伝子を切り出し、そして前駆体ポリペプチドをコードするＥｃｏＲＩＩ／ＣｅｌＩＩ制限酵素部位にフランキングしている核酸を、３１４２ｂｐ長のＥｃｏＲＩ／ＣｅｌＩＩ−４９８０ベクターフラグメントに挿入することによって調製された。
【０１０６】
実施例２
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドの発現
プロ−ポリペプチドの発現のために、E.coli栄養要求性（ＰｙｒＦ）の補完による抗生物質を用いないプラスミドの選択を可能とするE.coli宿主／ベクター系を使用した（欧州特許第０９７２８３８号および米国特許第６，２９１，２４５号を参照）。
【０１０７】
E.coliＫ１２ ＣＳＰＺ−２株（ｌｅｕＢ、ｐｒｏＣ、ｔｒｐＥ、ｔｈ−１、ΔｐｙｒＦ）を、発現プラスミドｐ（ＩＦＮ−Ｈｉｓ６−ＩｇＡ−テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉ）を用いての電気穿孔によって形質転換した。形質転換されたE.coli細胞をまず３７℃で寒天プレート上で増殖させた。
【０１０８】
発酵プロトコール１：
前発酵のために、約１g/lのＬ−ロイシン、約１g/lのＬ−プロリンおよび約１mg/lのチアミン−ＨＣｌの補充されたSambrook et al (Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press;第２版(１９８９年１２月))によるＭ９培地を使用した。
【０１０９】
前発酵のために、整流装置を有する１０００mlのエーレンマイヤーフラスコ中の３００mlのＭ９培地に、初代種子バンクアンプルからの２mlを接種した。培養を、１〜３の吸光度（５７８nm）が得られるまで、３７℃で１３時間回転振とう機で実施した。
【０１１０】
発酵のために、Riesenberg et al.によるバッチ培地を使用した（Riesenberg, D., et al., J. Biotechnol. 20 (1991) 17-27): ２７．６g/l グルコース＊Ｈ２Ｏ、１３．３g/l ＫＨ２ＰＯ４、４．０g/l （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、１．７g/l クエン酸塩、１．２g/l ＭｇＳＯ４＊７ Ｈ２Ｏ、６０mg/l クエン酸鉄(III)、２．５mg/l ＣｏＣｌ２＊６ Ｈ２Ｏ、１５mg/l ＭｎＣｌ２＊４ Ｈ２Ｏ、１．５mg/l ＣｕＣｌ２＊２ Ｈ２Ｏ、３mg/l Ｈ３ＢＯ３、２．５mg/l Ｎａ２ＭｏＯ４＊２ Ｈ２Ｏ、８mg/l Ｚｎ（ＣＨ３ＣＯＯ）２＊２ Ｈ２Ｏ、８．４mg/l チトリプレックスIII、１．３ml/l シンペロニック１０％消泡剤）。バッチ培地に、それぞれ５．４mg/lのチアミン−ＨＣｌ並びに１．２g/lのＬ−ロイシンおよびＬ−プロリンを補充した。フィード１溶液は、１９．７g/l ＭｇＳＯ４＊７ Ｈ２Ｏの補充された７００g/lのグルコースを含んでいた。ｐＨ調節のためのアルカリ溶液は、それぞれ５０g/lのＬ−ロイシンおよび５０g/lのＬ−プロリンの補充された１２．５％（ｗ／ｖ）ＮＨ３水溶液であった。全ての成分を脱イオン水に溶解した。
【０１１１】
１０リットルのバイオスタットＣ ＤＣＵ３発酵槽（Sartorius, Melsungen, Germany）で発酵を実施した。６．４リットルの無菌の発酵バッチ培地と前発酵からの３００mlの接種材料を用いて開始し、バッチ発酵を、３７℃、ｐＨ６．９±０．２、５００mbarおよび通気速度１０リットル/分で実施した。最初に補充したグルコースを枯渇させた後、温度を２８℃にシフトし、そして発酵はフェッドバッチモードに入った。ここで溶存酸素（ｐＯ２）の相対値を、一定して増加する撹拌速度（１０時間以内に５５０rpmから１０００rpmに、そして１６時間以内に１０００rpmから１４００pmに）および通気速度（１０時間以内に１０リットル/分から１６リットル/分に、そして５時間以内に１６リットル/分から２０リットル/分に）と組み合わせてフィード１に加えることによって５０％に維持した（DO-stat、例えば Shay, L.K., et al., J. Indus. Microbiol. Biotechnol. 2 (1987) 79-85参照）。追加のアミノ酸の供給は、約８時間の培養後にｐＨが調節下限（６．７０）に達した場合に、アルカリ溶液の添加からもたらされた。組換え治療タンパク質の発現は、吸光度７０で１mMのＩＰＴＧの添加によって誘導された。
【０１１２】
発酵槽から取り出した試料（１つは誘導前、そしてその他はタンパク質発現の誘導後の特定の時点でのもの）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析する。どの試料からも、同量の細胞（ＯＤターゲット＝５）を５mLのＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、そして超音波を介して氷上で破砕した。その後、１００μLの各懸濁液を遠心分離にかけ（１５，０００rpm、５分間）、そして各上清を取り出し、そして別々のバイアルに移す。これは、可溶性発現ターゲットタンパク質と、不溶性発現ターゲットタンパク質とを識別するためである。各上清（＝可溶性）画分に、ＳＤＳ試料緩衝液３００μLを、および各ペレット（＝不溶性）画分に、ＳＤＳ試料緩衝液４００μL（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685）を加える。試料を１５分間９５℃で振とう下で加熱し、試料中の全てのタンパク質を可溶化および還元する。室温まで冷却した後、５μLの各試料を４〜２０％のTGX Criterion Stain Freeポリアクリルアミドゲル（Bio-Rad）に移す。さらに既知の製品タンパク質濃度（０．１μg/μl）を有する５μlの分子量標準物質（Precision Plus Protein Standard, Bio-Rad）および３つの量の（０．３μl、０．６μl、および０．９μl）定量標準物質をゲル上に配置する。
【０１１３】
電気泳動を２００Ｖで６０分間行ない、その後、ゲルをGelDOC EZ Imager (Bio-Rad)に転写し、そしてＵＶ照射により５分間処理した。ゲルの画像を、Image Lab分析ソフトウェア（Bio-Rad）を使用して分析した。３つの標準物質を用いて、直線回帰曲線を、０．９９超の係数を用いて計算し、そして元の試料中のターゲットタンパク質の濃度を計算した。
【０１１４】
発酵終了時に、細胞質内および可溶性の発現テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドを、加熱工程（発酵槽中の全培養ブロスを収集前に１または２時間、５０℃まで加熱する）により、不溶性のタンパク質凝集物（いわゆる封入体）へと移行する（例えば、ＥＰ−Ｂ１４８６５７１参照）。その後、発酵槽の内容物を、フロースルー遠心機（１３，０００rpm、１３リットル/h）を用いて遠心分離し、そして収集したバイオマスをさらに処理するまで−２０℃で保存した。合成されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドは、不溶性のタンパク質凝集物、いわゆる封入体（ＩＢ）の形態で、不溶性細胞片画分においてのみ認められた。
【０１１５】
発酵プロトコール２：
前発酵のために、約１g/lのＬ−ロイシン、約１g/lのＬ−プロリンおよび約１mg/lのチアミン−ＨＣｌの補充されたSambrook et al. (Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press; 第２版(１９８９年１２月))によるＭ９培地を使用した。
【０１１６】
前発酵のために、整流装置を有する１０００mlのエーレンマイヤーフラスコ中の３００mlの改変Ｍ９培地に、寒天プレートから、または初代種子バンクアンプルからの１〜２mlを接種した。培養を、１〜３の吸光度（５７８nm）が得られるまで、３７℃で１３時間回転振とう機で実施した。
【０１１７】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの発酵および高収率での発現のために、以下のバッチ培地およびフィードを使用した。
【０１１８】
８．８５g/lのグルコース、６３．５g/lの酵母抽出物、２．２g/lのＮＨ４Ｃｌ、１．９４g/lのＬ−ロイシン、２．９１g/lのＬ−プロリン、０．７４g/lのＬ−メチオニン、１７．３g/lのＫＨ２ＰＯ４＊Ｈ２Ｏ、２．０２g/lのＭｇＳＯ４＊７ Ｈ２Ｏ、２５．８mg/lのチアミン−ＨＣｌ、１．０ml/lのシンペロニック１０％消泡剤。フィード１溶液は、１．６７g/lのＬ−メチオニン並びに各々５g/lのＬ−ロイシンおよびＬ−プロリンの補充された、３３３g/lの酵母抽出物および３３３g/lの８５％グリセロールを含んでいた。フィード２は、６００g/lのＬ−プロリン溶液であった。ｐＨ調節のためのアルカリ溶液は１０％（ｗ／ｖ）ＫＯＨ溶液であり、そして酸として７５％グルコース溶液を使用した。全ての成分を脱イオン水に溶解した。
【０１１９】
発酵を、１０リットルのバイオスタットＣ ＤＣＵ３発酵槽（Sartorius, Melsungen, Germany）で行なった。５．１５リットルの無菌の発酵バッチ培地と前発酵からの３００mlの接種材料を用いて開始し、フェッドバッチ発酵を、２５℃、ｐＨ６．７±０．２、３００mbarおよび通気速度１０リットル/分で実施した。最初に補充したグルコースが枯渇する前に、培養液は吸光度１５（５７８nm）に達し、そしてフィード１を７０g/hで開始した場合、発酵はフェッドバッチモードに入った。培養液中のグルコース濃度をモニタリングしながら、フィード１を、グルコース蓄積を回避しつつ、そしてｐＨを調節上限６．９付近に保持しながら、最大１５０g/hまで増加させた。吸光度５０（５７８nm）でフィード２を一定フィード速度１０ml/hで開始した。溶存酸素（ｐＯ２）の相対値を、撹拌速度（５００rpmから１５００rpmに）、通気速度（１０リットル/分から２０リットル/分に）および圧力（３００mbarから５００mbarに）を平行して増加させることによって５０％超に保持した。組換え治療タンパク質の発現は、吸光度９０で１mMのＩＰＴＧの添加によって誘導された。
【０１２０】
発酵槽から取り出した７つの試料（１つは誘導前、そしてその他はタンパク質発現の誘導後の特定の時点でのもの）を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分析する。どの試料からも、同量の細胞（ＯＤターゲット＝５）を５mLのＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、そして超音波を介して氷上で破砕した。その後、１００μLの各懸濁液を遠心分離にかけ（１５，０００rpm、５分間）、そして各上清を取り出し、そして別々のバイアルに移す。これは、可溶性発現ターゲットタンパク質と、不溶性発現ターゲットタンパク質とを識別するためである。各上清（＝可溶性）画分に、ＳＤＳ試料緩衝液３００μLを、および各ペレット（＝不溶性）画分に、ＳＤＳ試料緩衝液２００μL（Laemmli, U.K., Nature 227 (1970) 680-685）を加える。試料を１５分間９５℃で振とう下で加熱し、試料中の全てのタンパク質を可溶化および還元する。室温まで冷却した後、５μLの各試料を１０％ビス−トリスポリアクリルアミドゲル（Novagen）に移す。さらに既知の製品タンパク質濃度（０．１μg/μl）を有する５μlの分子量標準物質（Precision Plus Protein Standard, Bio-Rad）および３つの量の（０．３μl、０．６μl、および０．９μl）定量標準物質をゲル上に配置する。
【０１２１】
電気泳動を２００Ｖで３５分間行ない、その後、ゲルをクーマシーブリリアントブルーＲ色素で染色し、加熱した水で脱染し、そしてデジタル化のために吸光光度計に移す（GS710, Bio-Rad）。ゲル画像を、Quantity One 1-D分析ソフトウェア（Bio-Rad）を使用して分析した。３つの標準物質を用いて、直線回帰曲線を、０．９８超の係数を用いて計算し、そして元の試料中のターゲットタンパク質のその濃度を計算した。
【０１２２】
発酵終了時に、細胞質内および可溶性の発現テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドを、加熱工程（発酵槽中の全培養ブロスを収集前に１または２時間、５０℃まで加熱する）により、不溶性のタンパク質凝集物（いわゆる封入体（ＩＢ））へと移行する（例えば、ＥＰ−Ｂ１４８６５７１参照）。加熱工程後、合成されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドは、ＩＢの形態で不溶性細胞片画分においてのみ認められた。
【０１２３】
発酵槽の内容物を４〜８℃まで冷却し、フロースルー遠心機（１３，０００rpm、１３リットル/h）を用いて遠心分離し、そして収集したバイオマスをさらに処理するまで−２０℃で保存する。収集した全バイオマスは、発現構築物に依存して、３９g/lから９０g/lの乾燥物の範囲であった。
【０１２４】
実施例３
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドの封入体の調製
封入体の調製は、リン酸カリウム緩衝溶液またはトリス緩衝溶液（０．１Ｍ、１mMのＭｇＳＯ４が補充されている、ｐＨ６．５）中に収集された細菌細胞を再懸濁することによって実施された。ＤＮＡｓｅの添加後、細胞を、９００ｂａｒの圧力でホモジナイズすることによって破砕した。１．５ＭのＮａＣｌおよび６０mMのＥＤＴＡを含む緩衝溶液を、ホモジナイズされた細胞懸濁液に加えた。２５％（ｗ／ｖ）ＨＣｌを用いてｐＨ値を５．０に調整した後、最終の封入体スラリーがさらなる遠心分離工程の後に得られた。スラリーは、さらなる処理まで、単回使用の無菌プラスチックバッグに−２０℃で保存された。
【０１２５】
実施例４ａ
変性条件下におけるＨｉｓタグを有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドのＩＢの可溶化
実施例３からの封入体スラリーを、６Ｍの最終ＧｄｍＣｌ濃度の塩化グアニジニウム（ＧｄｍＣｌ）を用いて可溶化した。可溶化後、スラリーを、デプスフィルターの組合せによって濾過した。変性したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドのこの溶液を、３倍に希釈して、５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中２Ｍの最終ＧｄｍＣｌ濃度を得て、そして、再度濾過して、続くクロマトグラフィー工程（実施例５参照）に適した透明な溶液を得た。
【０１２６】
実施例４ｂ
非変性条件下におけるＨｉｓタグを有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドのＩＢの可溶化
実施例３からの封入体スラリーを、１時間かけて、約３０mMの水酸化カリウム溶液（ｐＨ１１．５に調整）を用いて可溶化した。その後、ｐＨ値をｐＨ８に調整し、そしてスラリーを、デプスフィルターの組合せによって濾過した。濾液は、続くクロマトグラフィー工程（実施例５参照）に適している。
【０１２７】
実施例５ａ
変性したＨｉｓタグを有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドをＩＭＡＣカラムにローディング
実施例４ａの溶液を、Ｚｎ２＋イオンが前以てローディングされ、そして変性ローディング緩衝液（２ＭのＧｄｍＣｌ、５０mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、４カラム容量）で平衡化された、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（IMAC; Fractogel（登録商標）EMDキレート、製造番号110338、Merck、Darmstadt、Germany、２３０mlのカラム容量、２４cmのベッド高さ、３．５cmの直径）カラムに、充填ゲルベッド１mlあたり１５〜２０mgのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドのロードでローディングした。タンパク質とカラムの結合は、Ｈｉｓ−タグと固定Ｚｎ２＋イオンとの相互作用によって行なわれた。
【０１２８】
実施例５ｂ
天然のＨｉｓタグを有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドをＩＭＡＣカラムにローディング
実施例４ｂの溶液を、Ｚｎ２＋イオンが前以てローディングされ、そして天然のローディング緩衝液（３０mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、４カラム容量）で平衡化された、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（IMAC; Fractogel（登録商標）EMDキレート、製造番号110338、Merck、Darmstadt、Germany、２３０mlのカラム容量、２４cmのベッド高さ、３．５cmの直径）カラムに、充填ゲルベッド１mlあたり１５〜２０mgのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドのロードでローディングした。タンパク質とカラムの結合は、Ｈｉｓ−タグと固定Ｚｎ２＋イオンとの相互作用によって行なわれた。
【０１２９】
実施例６
ＩＭＡＣカラムにローディングされたＨｉｓタグを有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドの洗浄
ローディング後、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料を含むカラムを、４〜６カラム容量の変性ローディング緩衝液（２ＭのＧｄｍＣｌ、５０mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）を用いて洗浄して、非特異的に結合したタンパク質および他の混入物を変性条件下で除去した。
【０１３０】
この洗浄工程に続いて、変性条件下で、２５０mMのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した４Ｍの尿素を３カラム容量用いて第２の洗浄工程を実施して、カラムから残存するＧｄｍＣｌを除去した。
【０１３１】
尿素による洗浄工程の直後に（結合したタンパク質のカルバモイル化を回避するために）、天然条件下での洗浄工程を行ない、変性させる尿素を除去し、そしてＩＭＡＣに結合したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドの再生を可能とした（結合したタンパク質の再生は、以下のタンパク質分解的切断および天然の溶出のための必要条件である）。天然の洗浄工程は、例えば、１Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ８．０を少なくとも３カラム容量用いて実施した。この洗浄工程の後に、１Ｍのトリスに加えて、例えばイミダゾールおよび／またはアルギニン（例示的なトリス／イミダゾール／アルギニン緩衝液は、１Ｍのトリス、７０mMのイミダゾール、および１８０mMのアルギニンの組成を有する）を含む他の天然の洗浄工程を行なって非特異的に結合した混入物をさらに除去し得、その後、１〜１．２Ｍのトリス、ｐＨ８．０を用いて最終的な洗浄工程を行なった。例えばイミダゾールおよび／またはアルギニンの濃度は、結合したタンパク質が固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料から溶出しないように選択されるべきである。
【０１３２】
実施例７
Ｈｉｓタグを有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドのカラムでの切断およびテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの溶出
ＩｇＡプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４．１３）を、最終の天然の洗浄緩衝液（１〜１．２Ｍのトリス、ｐＨ８．０）に、最初にローディングしたＨｉｓタグを有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドと比較して１：５００の濃度で（すなわち例えば、１５mg/mlのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉのロードの場合には３０μg/mlのＩｇＡプロテアーゼ）溶解した。この溶液から、１カラム容量をカラムにローディングし、その後、少なくとも１２時間流すのを止めることにより、プロテアーゼがカラムに結合したプロ−タンパク質を切断することができ、すなわち、Ｈｉｓタグを切断除去することができ、それによりカラムからテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを遊離させることができた。
【０１３３】
プロテアーゼとのインキュベーション後、Ｈｉｓタグから切断されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、カラムを天然の洗浄緩衝液（１〜１．２Ｍのトリス、ｐＨ８．０）で洗浄することによって溶出した。
【０１３４】
切断され回収されたポリペプチドの収率は、適用したプロ−ポリペプチドに対して約６０％〜７５％である。
【０１３５】
記載の実施例によって得られた溶出されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉは、さらなるクロマトグラフィー工程によってさらに精製することができ、その後、例えば国際公開公報第２０１２／２８５２４号に記載のように脂質化することができる。
【０１３６】
以下の表において、１つの例示的な実行について得られた結果を要約する。
【０１３７】
【表１】
2015508664.tif 000006
【０１３８】
実施例８
実施例６に記載されたような尿素による洗浄工程を省略した、ＩＭＡＣカラムにローディングされたＨｉｓタグを有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドの洗浄、並びにＨｉｓタグを有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドのカラムでの切断およびテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉの溶出
実施例５ａに従って変性条件下でローディングした後、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料を含むカラムを、４〜６カラム容量の変性ローディング緩衝液（２ＭのＧｄｍＣｌ、５０mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）で洗浄し、非特異的に結合したタンパク質および他の混入物を変性条件下で除去した。
【０１３９】
ＧｄｍＣｌによる洗浄工程の後に、天然条件下で洗浄工程を行ない、変性させるＧｄｍＣｌを除去し、そしてＩＭＡＣに結合したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドの再生を可能とした（結合したタンパク質の再生は、以下のタンパク質分解的切断および天然の溶出のための必要条件である）。天然の洗浄工程は、例えば、１Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ８．０を少なくとも３カラム容量用いて実施した。この洗浄工程の後に、１Ｍのトリスに加えて、例えばイミダゾールおよび／またはアルギニン（例示的なトリス／イミダゾール／アルギニン緩衝液は、１Ｍのトリス、７０mMのイミダゾール、および１８０mMのアルギニンの組成を有する）を含む他の天然の洗浄工程を行なって、非特異的に結合した混入物をさらに除去し得、その後、１〜１．２Ｍのトリス、ｐＨ８．０を用いて最終的な洗浄工程を行なった。例えばイミダゾールおよび／またはアルギニンの濃度は、結合したタンパク質が固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料から溶出しないように選択されるべきである。
【０１４０】
ＩｇＡプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４．１３）を、最終の天然の洗浄緩衝液（１〜１．２Ｍのトリス、ｐＨ８．０）に、最初にローディングしたＨｉｓタグを有するテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドと比較して１：５００の濃度で（すなわち例えば、１５mg/mlのテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉのロードの場合には３０μg/mlのＩｇＡプロテアーゼ）溶解した。この溶液から、１カラム容量をカラムにローディングし、その後、少なくとも１２時間流すのを止めることにより、プロテアーゼがカラムに結合したプロ−タンパク質を切断することができ、すなわち、Ｈｉｓタグを切断除去することができ、それによりカラムからテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを遊離させることができた。
【０１４１】
プロテアーゼとのインキュベーション後、Ｈｉｓタグから切断されたテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを、カラムを天然の洗浄緩衝液（１〜１．２Ｍのトリス、ｐＨ８．０）で洗浄することによって溶出した。
【０１４２】
尿素による洗浄工程を省略した場合の切断および回収されたポリペプチドの収率は、約２０カラム容量の天然の洗浄緩衝液で溶出した後でさえも、アプライしたプロ−ポリペプチドに対して５０％未満である。これらの条件下の溶出液中のタンパク質濃度は、実施例７に記載の条件下で得られた溶出液（約２mg/ml）と比較して非常に低い（約０．２mg/ml）。
【０１４３】
テトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉを天然の洗浄緩衝液で溶出した後に尿素による洗浄工程を実施した場合、さらに約４０％の切断されたポリペプチドを、約０．９mg/mlの濃度で回収することができる。
【０１４４】
実施例９
ＩＧＦ−１プロ−ポリペプチドの封入体の調製
封入体の調製は、リン酸カリウム緩衝溶液またはトリス緩衝溶液（０．１Ｍ、１mMのＭｇＳＯ４が補充されている、ｐＨ６．５）中に収集された細菌細胞を再懸濁することによって実施された。ＤＮＡｓｅの添加後、細胞を、９００ｂａｒの圧力でホモジナイズすることによって破砕した。１．５ＭのＮａＣｌおよび６０mMのＥＤＴＡを含む緩衝溶液を、ホモジナイズされた細胞懸濁液に加えた。２５％（ｗ／ｖ）ＨＣｌを用いてｐＨ値を５．０に調整した後、最終の封入体スラリーがさらなる遠心分離工程の後に得られた。スラリーは、さらなる処理まで、単回使用の無菌プラスチックバッグに−２０℃で保存された。
【０１４５】
実施例１０
変性条件下におけるＨｉｓタグを有するＩＧＦ−１プロ−ポリペプチドのＩＢの可溶化
実施例９からの４０ｇの封入体スラリーを、６Ｍの最終ＧｄｍＣｌ濃度の可溶化緩衝液（６．７Ｍの塩化グアニジニウム（ＧｄｍＣｌ）、１mMのＥＤＴＡ、１０mMの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．０）を用いて可溶化した。可溶化後、スラリーを、デプスフィルターの組合せによって濾過した。変性したＩＧＦ−１プロ−ポリペプチドのこの溶液を、３倍に希釈して、５０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）中２Ｍの最終ＧｄｍＣｌ濃度を得て、そして、再度濾過して、約４００mlの最終容量の透明な溶液を得た。
【０１４６】
実施例１１
変性したＨｉｓタグを有するＩＧＦ−１プロ−ポリペプチドの再生
４００mlの可溶化ＩＧＦ−１プロポリペプチドを、３．６リットルの再生緩衝液（１Ｍのアルギニン、２mMのＧＳＨ、０．１mMのＧＳＳＧ、ｐＨ８．０）に、３時間の時間をかけて加えた。ＩＧＦ−１プロ−ポリペプチドを、撹拌しながら５時間かけて、そしてその後、撹拌せずに１２時間かけて再生する。再生が完了した後、前記溶液を続くＩＭＡＣクロマトグラフィーの平衡緩衝液の容量のその７倍に対して透析し（２Ｍのグアニジニウム塩酸塩、５０mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）、全容量は２リットルとなった。
【０１４７】
実施例１２
変性したＨｉｓタグを有するＩＧＦ−１プロ−ポリペプチドをＩＭＡＣカラムにローディング
実施例１１の１リットルの溶液を、Ｚｎ２＋イオンが前以てローディングされ、そして変性ローディング緩衝液（２ＭのＧｄｍＣｌ、５０mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、２カラム容量）で平衡化された、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（IMAC; Fractogel（登録商標）EMDキレート、製造番号110338、Merck、Darmstadt、Germany、２３０mlのカラム容量、２４cmのベッド高さ、３．５cmの直径）カラムにローディングした。タンパク質とカラムの結合は、Ｈｉｓ−タグと固定Ｚｎ２＋イオンとの相互作用によって行なわれた。
【０１４８】
実施例１３
Ｈｉｓタグを有するＩＧＦ−１プロ−ポリペプチドのローディングされたＩＭＡＣカラムの洗浄
ローディング後、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー材料を含むカラムを、１０カラム容量の変性ローディング緩衝液（２ＭのＧｄｍＣｌ、５０mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０）を用いて洗浄して、非特異的に結合したタンパク質および他の混入物を変性条件下で除去した。
【０１４９】
この洗浄工程に続いて、変性条件下で、２５０mMのトリス緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解した４Ｍの尿素を３カラム容量用いて第２の洗浄工程を実施して、カラムから残存するＧｄｍＣｌを除去した。
【０１５０】
尿素による洗浄工程の直後に（結合したタンパク質のカルバモイル化を回避するために）、天然条件下での洗浄工程を行ない、変性させる尿素を除去し、そしてＩＭＡＣに結合したテトラネクチン−アポリポタンパク質Ａ−Ｉプロ−ポリペプチドの再生を可能とした（結合したタンパク質の再生は、以下のタンパク質分解的切断および天然の溶出のための必要条件である）。天然の洗浄工程は、例えば、１Ｍのトリス緩衝液、ｐＨ８．０を４カラム容量用いて実施した。この洗浄工程の後に、１Ｍのトリスに加えて、例えばイミダゾールおよび／またはアルギニン（例示的なトリス／イミダゾール／アルギニン緩衝液は、１Ｍのトリス、７０mMのイミダゾール、および１８０mMのアルギニンの組成を有する、ｐＨ８．０）を含む他の天然の洗浄工程を行なって、非特異的に結合した混入物をさらに除去し得、その後、１．２Ｍのトリス、ｐＨ８．０を用いて最終的な洗浄工程を行なった。
【０１５１】
実施例１４
Ｈｉｓタグを有するＩＧＦ−１プロ−ポリペプチドのカラムでの切断およびＩＧＦ−１の溶出
ＩｇＡプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２４．１３）を、最終の天然の洗浄緩衝液（１．２Ｍのトリス、ｐＨ８．０）に、最初にローディングしたＨｉｓ−ＩＧＦ−１プロ−ポリペプチドと比較して１：５００の濃度で溶解した。この溶液から、１．１カラム容量をカラムにローディングし、その後、１２時間流すのを止めることにより、プロテアーゼがカラムに結合したプロ−タンパク質を切断することができ、すなわち、Ｈｉｓタグを切断除去することができ、それによりカラムからＩＧＦ−１を遊離させることができた。
【０１５２】
プロテアーゼとのインキュベーション後、Ｈｉｓタグから切断されたＩＧＦ−１を、カラムを天然の洗浄緩衝液（１．２Ｍのトリス、ｐＨ８．０）で洗浄することによって溶出した。
【０１５３】
それぞれのクロマトグラムを図３に示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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