(57)【要約】本発明は、TMEMファミリーメンバーの調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法に関する：（１）TMEMファミリーメンバー発現細胞を、前記調節物質の候補物質で処理する工程、および（２）前記候補物質が、前記細胞の細胞膜における、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される脂質の分布を変化させるか否かを決定する工程、  ここで、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を増加させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を減少させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される、および  対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を増加させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を減少させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
TMEMメンバーの調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）TMEMファミリーメンバー発現細胞を、前記調節物質の候補物質で処理する工程、および
（２）前記候補物質が、前記細胞の細胞膜における、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される脂質の分布を変化させるか否かを決定する工程、
ここで、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を増加させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を減少させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される、および
対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を増加させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を減少させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される。
【請求項２】
TMEMファミリーメンバーがTMEM 16Cであり、脂質がホスファチジルコリンおよびガラクトシルセラミドから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
TMEMファミリーメンバーがTMEM 16Dであり、脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
TMEMファミリーメンバーがTMEM 16Gであり、脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
TMEMファミリーメンバーがTMEM 16Jであり、脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2012年4月16日出願の米国仮出願第61/624,491号（全体が参照により本明細書に含まれる）に基づく優先権を主張し、その利益を享受する。
【０００２】
本発明は、TMEMファミリーメンバーの調節物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
リン脂質およびスフィンゴ糖脂質は、細胞膜葉に非対称的に分布している。ホスファチジルセリン(PS)およびホスファチジルエタノールアミン(PE)は内葉に、ホスファチジルコリン(PC)、ガラクトシルセラミド(GalCer)、グルコシルセラミド(GluCer)は主に外葉に分布する(1,2)。脂質の非対称的分布は、アポトーシス細胞死(3)、血小板活性化(4)、赤血球老化(5)、最終的な赤血球産生におけるピレノサイト（pyrenocyte）形成(6)、マクロファージ、筋細胞、または栄養膜細胞の融合(7-9)、および精子受精能獲得(10)など、様々なプロセスにおいて崩壊する。
【０００４】
細胞膜における脂質の分布は、フリッパーゼ、フロッパーゼ、およびスクランブラーゼの、3タイプの脂質トランスポーターにより調節される。フリッパーゼは、ATP依存性アミノリン脂質トランスロカーゼとも呼ばれ、細胞外葉から細胞質側へアミノリン脂質を輸送する(1,11)。P4タイプATPアーゼ (P4-ATPアーゼ)は、多スパン膜貫通タンパク質であるPタイプATPアーゼのサブファミリーであり、フリッパーゼの有力な候補である(12)。フロッパーゼは、広範な脂質を細胞質側から細胞外葉へATP依存的に移動させるトランスポーターである。ATP結合カセット(ABC)ATPアーゼ、特にABCA1は、プロッパーゼとして提唱されているが(13)、ABCA1欠損細胞は二重膜間のリン脂質の移動に異常がなく(14)、その役割が議論となっている。
【０００５】
外葉および内葉間のリン脂質の分布は、一旦確立すると容易に崩壊しない。すなわち、ATP依存性トランスロカーゼの不活性化のみでは、アポトーシス細胞死および血小板活性化で観察される急速なPS露出の誘導には不十分である。それゆえ、Ca2+に応答して双方向かつ非特異的にリン脂質を輸送するリン脂質スクランブラーゼが提唱されている(15)。合成リン脂質を用いたリポソーム再構成システムを用いて、Basseら(16)は37kDaのタンパク質をヒト赤血球から精製し、リン脂質スクランブラーゼ (PLSCR)と命名した。その後、そのcDNAは単離された(17)。しかしながら、PLSCR1-/-細胞はCa2+の刺激により正常にPSを露出することから(18)、PLSCRのリン脂質スクランブラーゼとしての機能には疑問がもたれている(15,19)。
【０００６】
Ca2+イオノフォアに応答してPSを効率的に露出する細胞集団を繰り返し選択することにより、本発明者らは最近、構成的にPSを露出するマウスプロB細胞株(Ba/F3)のサブラインを樹立した(20)。Ba/F3サブラインは、8つの膜貫通領域を有し細胞質内にN末端およびC末端を有するタンパク質であるTMEM16Fタンパク質の変異体を発現している。このTMEM16Fの変異体を発現するBa/F3細胞は、構成的にPSおよびPEを露出し、PCおよびSMを取り込む。それゆえ、本発明者らは、TMEM16Fはリン脂質スクランブラーゼではないかと報告した(20)。TMEM16FがCa2+依存性リン脂質スクランブラーゼであることの裏付けとして、リン脂質スクランブリングの欠損により生じることが知られるスコット症候群のヒト患者においてTMEM16F遺伝子に劣性の変異が存在する(20,21)。この患者は、血液凝固障害を患う。しかしながら、TMEM16Fがアポトーシス細胞死や細胞融合などの他のプロセスに関与するかは不明である。10種類のTMEM16ファミリーメンバーのうちTMEM16Aおよび16Bの2種類は、Ca2+依存性Cl-チャネルである(22-24)。このことから、TMEM16Fも同様にCl-チャネルであるのか、また、他のTMEM16ファミリーメンバーもリン脂質スクランブラーゼであるのか、について疑問が生じている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明者らは、loxP配列に挟まれた（floxed）TMEM16Fアレルを有するマウスの胎児胸腺から、不死化胎児胸腺細胞(IFET)細胞株を樹立した。IFETは、TMEM16F、16H、および16Kを発現し、Ca2+イオノフォアに応答してPSを露出する。IFETにおいてTMEM16Fを欠失させると、Ca2+イオノフォアに応答したPS露出能が完全に消失した。一方、TMEM16F欠損細胞をFasリガンド(FasL)で処理すると、効率的にPS露出が誘導された。TMEM16C、16D、16F、16G、あるいは16Jの存在下では、TMEM16F-/-IFETはCa2+イオノフォアに応答してリン脂質およびガラクトシルセラミドをスクランブリングしたが、他のファミリーメンバーではそのようなことはおこらなかった。一方、TMEM16Aおよび16Bの2種類のファミリーメンバーはCa2+依存性Cl-チャネル活性を示したが、他のメンバーはかかる活性を示さなかった。これらの結果に基づき、本発明を完成した。
【０００８】
本発明は、以下を提供する。
１．TMEMファミリーメンバーの調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）TMEMファミリーメンバー発現細胞を、前記調節物質の候補物質で処理する工程、および
（２）前記候補物質が、前記細胞の細胞膜における、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される脂質の分布を変化させるか否かを決定する工程、
ここで、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を増加させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を減少させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される、および
対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を増加させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を減少させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される。
２．TMEMファミリーメンバーがTMEM16Cであり、脂質がホスファチジルコリンおよびガラクトシルセラミドから選択される、前記１に記載の方法。
３．TMEMファミリーメンバーがTMEM16Dであり、脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される、前記１に記載の方法。
４．TMEMファミリーメンバーがTMEM16Gであり、脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される、前記１に記載の方法。
５．TMEMファミリーメンバーがTMEM16Jであり、脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される、前記１に記載の方法。
【０００９】
別の態様において、本発明は、以下を提供する。
６．TMEMファミリーメンバーの調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）TMEMファミリーメンバー発現細胞を、前記調節物質の候補物質で処理する工程、および
（２）前記候補物質が、前記細胞の細胞膜における、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンから選択される脂質の分布を変化させるか否かを決定する工程、
ここで、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を増加させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を減少させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される、および
対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンの分布を増加させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンの分布を減少させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される。
７．TMEMファミリーメンバーがTMEM16Cであり、脂質がホスファチジルコリンである、前記６に記載の方法。
８．TMEMファミリーメンバーがTMEM16Dであり、脂質がホスファチジルセリンまたはホスファチジルコリンである、前記６に記載の方法。
９．TMEMファミリーメンバーがTMEM16Gであり、脂質がホスファチジルコリンである、前記６に記載の方法。
１０．TMEMファミリーメンバーがTMEM16Jであり、脂質がホスファチジルコリンである、前記６に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】TMEM16F-/- IFET細胞株の樹立。A, 野生型および変異体TMEM16Fアレルをターゲッティングベクターとともに示した図。エクソン２（黒四角）のフランキング領域におけるEco RI (E)、Eco RV (V)、Kpn I (K)、およびSma I (S)の認識部位を示す。ターゲットベクターにおいて、エクソン２およびそのフランキング領域を有する1.0-kbのDNAフラグメントを、2つのloxP配列 (黒矢じり)とFRT配列(灰色矢じり)に挟まれたPGK-neo (NeoR)とを有する2.7-kbのフラグメントで置換した。tkプロモーターにより動くジフテリア毒素Aフラグメント (DT-A)をベクターの5'部位に挿入した。NeoFRTアレルにおいて、TMEM16F染色体遺伝子はターゲッティングベクターにより置換された。Floxedアレルにおいて、FRTに挟まれたNeoR遺伝子はFLPeリコンビナーゼにより除去された。欠失アレルにおいて、loxP配列で挟まれたTMEM16F遺伝子のエクソン２は、Creリコンビナーゼにより欠失した。図１Ｃで用いたプライマーを矢印で示す。スケールバー、1.0 kb。B, IFETにおけるTMEM16ファミリーメンバーmRNAのリアルタイムPCR解析。IFET細胞株は、TMEM16Fflox/flox 胎児胸腺細胞より樹立した。TMEM16Fflox/flox IFETにおけるTMEM16A-16H、16J、および16K mRNAをリアルタイムPCRにより定量し、β-アクチンmRNAとの比較で表示した。実験は3回実施し、平均値をS.D. (バー)とともにプロットした。C, IFET細胞株におけるTMEM16Fエクソン2の欠失。TMEM16Fflox/flox IFETにCreを保有するアデノウイルスを感染させ、TMEM16F-/- IFET細胞を樹立した。TMEM16Fflox/floxIFETおよびTMEM16F-/- IFETからの染色体DNAを、図１Ａに示したプライマーを用いてPCRにより解析した。D, TMEM16Fflox/flox IFETおよびTMEM16F-/- IFETにおけるTMEM16Fのウェスタンブロッット。細胞溶解物 (10μg タンパク質) を7.5% SDS-PAGEにより分離し、ウサギ抗TMEM16F血清（上パネル）または抗αチューブリン抗体（下パネル）によりブロットした。分子量標準タンパク質(Precision Plus Standard, Bio-Rad) の分子量をkDaで左に示す。
【図２】TMEM16FはCa2+誘導性PS露出に不可欠であるがアポトーシス誘導性PS露出には必要でない。A, Ca2+イオノフォアによるPS露出。TMEM16Fflox/floxIFETおよびTMEM16F-/- IFETを、Cy5標識Annexin Vの存在下、20℃において3.0μM のA23187にて処理した。細胞へのAnnexin Vの結合をフローサイトメトリーにより10分間モニターし、MFI (mean fluorescence intensity)にて表示した。BおよびC, Ca2+イオノフォアによる脂質の取り込み。TMEM16Fflox/floxIFETおよびTMEM16F-/- IFETを15℃で100 nM NBD-PC (B)または250 nM NBD-GalCer (C)の存在下、250 nM A23187にて処理した。図中に示した時点で、反応混合物の一部を用いて、SytoxBlue陰性集団におけるBSAで抽出できないNBD-PCまたはNBD-GalCerのレベルをFACSAriaにて測定し、MFIにて表示した。D, マウスFasによるIFETの形質転換。TMEM16Fflox/floxIFETおよびTMEM16F-/- IFETに、マウスFasを有するレトロウイルスを感染させ、マウスFasに対するPE標識ハムスターmAbで染色した。親細胞の染色プロファイルを併せて示す。E-G, FasL誘導性アポトーシス。Fas発現TMEM16Fflox/floxIFETおよびTMEM16F-/- IFETを、37℃において2時間、60単位/ml FasLにて50μM Q-VD-OPhの存在下または非存在下に処理した。Eでは、細胞を90%メタノールで透過処理し、ウサギ抗活性化カスパーゼ3により染色し、続いてAlexa 488標識ヤギ抗ウサギIgGとともにインキュベートした。Fでは、細胞をCy5標識Annexin VおよびPIで染色し、FACSAriaにより解析した。Gでは、細胞をFasL処理の前後にFACSAriaにより解析した。FSCおよびSSCプロファイルを示す。
【図３】TMEM16ファミリーメンバーによるCa2+依存性PS露出。10種類のTMEM16ファミリーメンバーをC末端でFLAG標識し、TMEM16F-/- IFETに導入して安定な形質転換体を樹立した。A. ウェスタンブロッティング。各形質転換体におけるTMEM16タンパク質の発現を、FLAG mAbを用いてウェスタンブロッティングにより解析した。解析したTMEM16Kタンパク質溶解物の量は他の1/8。B, TMEM16ファミリーメンバーによるCa2+誘導性PS露出。図中に示したTMEM16ファミリーメンバーで形質転換したTMEM16F-/- IFETを、3.0μM A23187で刺激した。 20℃でのAnnexin Vの結合をFACSAriaで2分間モニターし、MFIにて表示した。実験は3回実施し、平均値をS.D. (バー)とともにプロットした。
【図４】TMEM16ファミリーメンバーによるNBD-PCおよびNBD-GalCerのCa2+依存性取り込み。AおよびC, TMEM16ファミリーメンバーのNBD-PCおよびNBD-GalCerの取り込み能。図中に示したTMEM16ファミリーメンバーで形質転換したTMEM16F-/- IFETを、15℃において、250 nM A23187あり (+)、 またはなし(-)で、100 nM NBD-PCの存在下に4分間 (A) または250 nM NBD-GalCerの存在下に5分間 (C) 処理し、細胞に取り込まれたNBD-PCまたはNBD-GalCer、すなわちBSAで抽出できないNBD-PCまたはNBD-GalCerをFACSAriaにより定量し、MFIにて表示した。B, TMEM16DによるNBD-PCの構成的取り込みへのCa2+要求性。TMEM16F-/- IFETのTMEM16D形質転換体を、Ca2+不含RPMIにおいて40μM BAPTA-AMで30分間処理し、15℃で8分間、1 mM CaCl2および100 nM NBD-PCを含有するHBSS中でインキュベートした。取り込まれたNBD-PCを上記のとおり測定し、BAPTA-AM処理なしの場合に取り込まれたNBD-PCに対する割合として表示した。図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃの実験はいずれも3回実施し、平均値をS.D. (バー)とともにプロットした。
【図５】TMEM16ファミリーメンバーのCa2+依存性Cl-チャネル活性。A, TMEM16ファミリーメンバーのHEK293T細胞における発現。HEK293T細胞にFLAG標識したTMEM16ファミリーメンバーのcDNAを有するpEF-BOS-EXベクターをトランスフェクトした。2日後、各TMEM16メンバーの発現レベルを、抗FLAG mAbおよび抗α-チューブリン mAbを用いてウェスタンブロッティングにより解析した。解析したTMEM16Kタンパク質溶解物の量は他の1/8。B, Ca2+イオノフォア誘導性のTMEM16Aおよび16BのCl-チャネル活性。HEK293T細胞に、TMEM16Aまたは16BのcDNAを有するpEF-BOS-EXベクターと、pMAX-EGFPとをトランスフェクトした。2日後、EGFP陽性細胞のCl-チャネル活性を電気生理学的に解析した。ピペット (細胞内) 溶液は500 nMの遊離Ca2+を含有している。-120 mVから+120 mVで10 mV間隔で電圧を変え、誘発した代表的なホールセル膜電流を、ベクター、TMEM16A、およびTMEM16Bを発現させた細胞について示した。保持膜電位は0 mVに維持した。C, TMEM16ファミリーメンバーによるCl-電流の外向き整流。HEK293T細胞に、pMAX-EGFPと図中に示したTMEM16ファミリーメンバーのためのpEF-BOS-EX ベクターをトランスフェクトし、上記のとおり電気生理学的解析を行った。膜電流は、図中に示した電圧パルス (Vm)で測定した。実験は独立して3-5回実施し、適用した膜電位に対する平均値をS.D. (バー)とともにプロットした。
【図６】種々のマウス組織におけるTMEM16ファミリーメンバーmRNAのリアルタイムPCR解析。図中に示したマウス組織よりRNAを調製し、各TMEM16ファミリーメンバーのmRNAをリアルタイムPCRにより定量し、β-アクチンmRNAに対する比として表示した。
【図７】マウスTMEM16Cについて設計したヌクレオチド配列。ATG開始コドンの前20ヌクレオチドには、Bam H1 (GGATCC)およびリボソーム結合のためのKozak配列 (CCACC) が存在する。コーディング配列に続いて、Eco R1認識配列(GAATTC)が挿入されている。
【図８】マウスTMEM16Dについて設計したヌクレオチド配列。ATG開始コドンの前20ヌクレオチドには、Bam H1 (GGATCC)およびリボソーム結合のためのKozak配列 (CCACC) が存在する。コーディング配列に続いて、Eco R1認識配列(GAATTC)が挿入されている。
【図９】マウスTMEM16Eについて設計したヌクレオチド配列。ATG開始コドンの前20ヌクレオチドには、Bam H1 (GGATCC)およびリボソーム結合のためのKozak配列 (CCACC) が存在する。コーディング配列に続いて、Eco R1認識配列(GAATTC)が挿入されている。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
「TMEM16ファミリーメンバー」は、８回膜貫通領域を有し、細胞質にN末端およびC末端を有するタンパク質である。10種類のTMEM16ファミリーメンバーが知られているが (35, 36)、本発明における「TMEM16ファミリーメンバー」は、TMEM16C、TMEM16D、TMEM16G、およびTMEM16Jから選択される。本発明のTMEM16ファミリーメンバーは、限定はされないが、ヒト、サル、マウス、またはウサギ由来である。ヒトTMEM16C、TMEM16D、TMEM16G、およびTMEM16Jのアミノ酸配列は、NCBI参照番号 NP_113606.2 (TMEM16C)、NP_849148.2 (TMEM16D)、NP_001001666.1 (TMEM16G)、およびNP_001012302.2 (TMEM16J)に開示されている。
【００１２】
「TMEM16ファミリーメンバーの調節物質の候補物質」は、天然物質であっても合成物質であってもよく、低分子化合物、タンパク質、核酸分子、ペプチド、抗体、微生物、植物、または動物の細胞抽出物または培養上清であってよい。候補物質は、低分子化合物、ペプチド、または抗体のライブラリーなどの、ライブラリーの形態で提供されてもよい。
【００１３】
本明細書において、「TMEMファミリーメンバー発現細胞」には、TMEMファミリーメンバーを本来そのゲノムから発現する細胞、および細胞に導入されたTMEMファミリーメンバーをコードする遺伝子からTMEMファミリーメンバーを発現する細胞が含まれる。細胞は、ヒト、サル、マウス、またはウサギ由来の細胞であってよく、またこれらに限定はされない。本発明においては、例えば、ヒトHeLa、ヒトEBV (Epstein Barr Virus)形質転換B細胞株、マウスMEF (胚性線維芽細胞)、およびマウスプロB細胞株であるBa/F3などを使用することができる。
【００１４】
「TMEMファミリーメンバーの調節物質」には、「TMEMファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質」と「TMEMファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質」が含まれる。本明細書において、「TMEMファミリーメンバーの機能を亢進する（または抑制する）」とは、細胞または動物におけるTMEMファミリーメンバーの脂質スクランブラーゼとしての生物学的機能を増強する（または阻害する）ことを意味する。「TMEMファミリーメンバーの調節物質」は、TMEMファミリーメンバータンパク質の機能に直接的に影響する物質であっても、TMEMファミリーメンバーの発現を増加または減少させる物質であってもよい。「TMEMファミリーメンバーの発現の増加または減少」には、TMEMファミリーメンバーをコードする遺伝子からのmRNAの発現の増加または減少、およびTMEMファミリーメンバーのタンパク質発現の増加または減少が含まれる。それゆえ、「TMEMファミリーメンバーの調節物質」には、TMEMファミリーメンバーをコードする遺伝子の、プロモーターまたはエンハンサーなどの調節配列に作用する物質、およびTMEMファミリーメンバーをコードする遺伝子の配列に基づき調製されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（DNAまたはRNA）、siRNA、miRNA、およびリボザイムが含まれる。
【００１５】
本発明の方法では、TMEMファミリーメンバーの脂質スクランブラーゼとしての酵素活性を測定する。脂質は、ホスファチジルセリン (PS)、ホスファチジルコリン (PC)、およびガラクトシルセラミド (GalCer)から選択される。通常の状態では、PSは細胞膜内葉に分布し、PCおよびGalCerは細胞膜外葉に分布する。TMEMファミリーメンバーは、PSを細胞膜外葉へ移動させ（すなわち、PSを露出させ）、PCおよびGalCerを細胞膜内葉に移動させる（すなわち、PCおよびGalCerを取り込む）。本発明のTMEMファミリーメンバーの酵素活性は、細胞膜における脂質の分布を調べることにより、測定することができる。
【００１６】
対照と比較してホスファチジルセリンの細胞膜外葉における分布を増加させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較してホスファチジルセリンの細胞膜外葉における分布を減少させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される。対照と比較してホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの細胞膜内葉における分布を増加させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較してホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの細胞膜内葉における分布を減少させる候補物質は、TMEMファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される。
【００１７】
TMEM16Cは、PCおよびGalCerのスクランブラーゼとして機能する。それゆえ、対照と比較してPCまたはGalCerの細胞膜内葉における分布を増加させる候補物質は、TMEM16Cの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較してPCまたはGalCerの細胞膜内葉における分布を減少させる候補物質は、TMEM16Cの機能を抑制する調節物質として選択される。
【００１８】
TMEM16Dは、PS、PC、およびGalCerのスクランブラーゼとして機能する。それゆえ、対照と比較してPSの細胞膜外葉における分布を増加させる候補物質は、TMEM16Dの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較してPSの細胞膜外葉における分布を減少させる候補物質は、TMEM16Dの機能を抑制する調節物質として選択される。また、対照と比較してPCまたはGalCerの細胞膜内葉における分布を増加させる候補物質は、TMEM16Dの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較してPCまたはGalCerの細胞膜内葉における分布を減少させる候補物質は、TMEM16Dの機能を抑制する調節物質として選択される。
【００１９】
TMEM16Gは、PS、PC、およびGalCerのスクランブラーゼとして機能する。それゆえ、対照と比較してPSの細胞膜外葉における分布を増加させる候補物質は、TMEM16Gの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較してPSの細胞膜外葉における分布を減少させる候補物質は、TMEM16Gの機能を抑制する調節物質として選択される。また、対照と比較してPCまたはGalCerの細胞膜内葉における分布を増加させる候補物質は、TMEM16Gの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較してPCまたはGalCerの細胞膜内葉における分布を減少させる候補物質は、TMEM16Gの機能を抑制する調節物質として選択される。
【００２０】
TMEM16Jは、PS、PC、およびGalCerのスクランブラーゼとして機能する。それゆえ、対照と比較してPSの細胞膜外葉における分布を増加させる候補物質は、TMEM16Jの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較してPSの細胞膜外葉における分布を減少させる候補物質は、TMEM16Jの機能を抑制する調節物質として選択される。また、対照と比較してPCまたはGalCerの細胞膜内葉における分布を増加させる候補物質は、TMEM16Jの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較してPCまたはGalCerの細胞膜内葉における分布を減少させる候補物質は、TMEM16Jの機能を抑制する調節物質として選択される。
【００２１】
「（１）TMEMファミリーメンバー発現細胞を、前記調節物質の候補物質で処理する工程」において、典型的には、候補物質は、Ca2+の存在下、細胞の培養培地に添加される。適切な場合、A23187などのカルシウムイオノフォアは、候補物質の培地への添加と同時に、または添加後に、添加すればよい。
【００２２】
細胞膜におけるPSの分布は、細胞表面に露出するPSと、PSに対する結合性を有する物質（例えば、Annexin VまたはMFG-E8 (ラクトアドヘリンともいう)）との間の結合を検出することにより、調べることができる。例えば、候補物質で処理したTMEMファミリーメンバー発現細胞を、蛍光標識したAnnexin Vで処理し、細胞表面に結合したAnnexin Vの量を測定する。
【００２３】
細胞膜におけるPSの分布は、血液凝固反応に基づき調べることもできる。例えば、TMEMファミリーメンバー発現細胞を候補物質とともにカルシウムイオノフォアで処理し、または候補物質の処理後にカルシウムイオノフォアで処理し、血液凝固に必要とされる物質（例えば、Xa因子、Va因子、およびプロトロンビン）と混合し、そしてトロンビンの生成を測定する。あるいは、フィブリノーゲンをさらに細胞培養物に添加して、フィブリンの生成を測定してもよい。
【００２４】
細胞膜におけるPCおよびGalCerの分布は、蛍光標識した脂質により測定することができる。蛍光標識としては、NBDおよびTopFluorを使用することができる。例えば、蛍光標識脂質を培養培地に添加すると、蛍光標識脂質がTMEMファミリーメンバー発現細胞の細胞膜外葉に取り込まれる。TMEMファミリーメンバーが脂質スクランブラーゼとして機能すると、蛍光標識脂質は細胞膜内葉に移動する（すなわち、取り込まれる）。よって、NBD-PCまたはNBD-GalCerのような蛍光標識脂質の存在下、TMEMファミリーメンバー発現細胞を調節物質の候補物質、および必要によりカルシウムイオノフォアで処理すればよい。次いで、細胞をBSAで処理して取り込まれなかったNBD-PCまたはNBD-GalCerを除去し、細胞に取り込まれたNBD-PCまたはNBD-GalCerをフローサイトメトリーにより測定する。
【００２５】
TMEMファミリーメンバーにおける異常（変異または過剰発現）は、様々なヒト疾患を引き起こすことが知られている(36)。例えば、TMEM16C、16E、16F、および16Kにおける遺伝子変異は、それぞれ、頭頸部ジストニア (58)、筋骨格障害 (49, 51)、出血性障害 (20)、および運動失調(52)に関連する。TMEM16Aおよび16Gは、それぞれ、ヒト消化管間質腫瘍／頭頸部扁平上皮がん、および前立腺がんにおいて過剰発現している(59, 60)。それゆえ、本発明の方法は、かかる疾患の治療薬または予防薬の開発に有用である。
【実施例】
【００２６】
実験方法
材料および細胞株
ロイシンジッパー付加ヒトFasLは、既報のとおりCOS7細胞において産生した(25)。1単位のFasLは、1.0 x 105細胞のFas発現マウスWR19L細胞(W3細胞)を4時間で死滅させる活性として定義した。カスパーゼインヒビターであるQ-VD-OPh (quinolyl-valyl-O- methylaspartyl- [-2,6-difluorophenoxy]-methyl ketone)は、R&D systems (Minneapolis, MN)より購入した。IFETは、10% FCS (Nichirei Bioscience, Tokyo, Japan)および50μM β-メルカプトエタノールを含有するRPMI培地中で維持した。HEK293TおよびPlat-E細胞(26)は、10% FCS含有DMEM中で培養した。
【００２７】
cDNAクローニング
マウスTMEM16F cDNA (NCBI: NM_175344)は報告されている (20)。マウスTMEM16A (GenBank: BC062959.1)、16B (GenBank: BC033409.1)、および16G (GenBank: BC116706.1)のcDNAは、DNAFORM (Yokohama, Japan)から得た。マウスTMEM16C (NCBI: NM_001128103.1)、16D (Ensemble: ENSMUST 00000070175)、および16K (NCBI: NM_133979.2) cDNAは、RT-PCRにより脳組織から単離し、TMEM16E (NCBI: NM_177694.5)、16H (NCBI: NM_001164679.1)、および16J (NCBI: NM_178381.3) cDNAは、それぞれ骨格筋、胸腺、および胃から得た。cDNAは全て配列決定によりその塩基配列を確認した。TMEM16 cDNAの単離には以下のプライマーを使用した (制限酵素のための追加配列を下線で示す)：
TMEM16A, 5'-ATATGGATCCACCATGAGGGTCCCCGAGAAGTA (配列番号１) 、および5'-ATATGAATTCCAGCGCGTCCCCATGGTACT (配列番号２); 
TMEM16B, 5'-ATATGAATTCCGCATGCACTTTCACGACAACCA (配列番号３) 、および5'-ATATGAATTCTACATTGGTGTGCTGGGACC (配列番号４); 
TMEM16C, 5'-ATATGGATCCAAAATGGTCCACCACTCAGGCTC (配列番号５) 、および5'-ATATCAATTGAGGCCATTCATGGTGAATAG (配列番号６); 
TMEM16D, 5'-ATATAGATCTAAAATGGAGGCCAGCTCTTCTGG (配列番号７) 、および5'-ATATCAATTGTGGCCACTCATTGTGATGTG (配列番号８); 
TMEM16E, 5'-ATATGGATCCGAGATGGTGGAGCAGGAAGGCTT (配列番号９) 、および5'-ATATCAATTGGACTGTAGTTTTAGCCTTCA (配列番号１０); 
TMEM16G, 5'-ATATAGATCTGACATGCTGCGGGGGCAAGCGCG (配列番号１１) 、および5'-ATATGAATTCGCCTCCGGTAACCCCTACTG (配列番号１２); 
TMEM16H, 5'-ATATAGATCTGCCATGGCCGAGGCGGCTTCGGG (配列番号１３) 、および5'-ATATGAATTCAGGCCTGTGACCTGCGTCCT (配列番号１４); 
TMEM16J, 5'-ATATGAATTCAGCATGCAGGATGATGAGAGTTC (配列番号１５) 、および5'-ATATCAATTGTACATCCGTGCTCCTGGAAC (配列番号１６); 
TMEM16K, 5'-ATATGGATCCAAGATGAGAGTGACTTTATCAAC (配列番号:１７) 、および5'-ATATCAATTGGGTAGCTTCCTTCCCATCTT (配列番号１８)。
【００２８】
TMEM16C、16D、および16Eの天然マウスcDNAは、哺乳類細胞でのタンパク質産生レベルが低いため、mRNAの安定性と翻訳効率の増強された配列をGENEART (Regensburg, Germany)に特注した(図Ｓ１−Ｓ３、配列番号１９−２１)。
【００２９】
TMEM16F-/- IFET細胞株の樹立
TMEM16Fコンディショナルターゲッテッドマウスは、UNITECH (Chiba, Japan)に 外注し、作成した。概略を説明すると、PGKプロモーター駆動neo遺伝子を有しFRTに挟まれたneo-loxPカセットをTMEM16F遺伝子のイントロン３に挿入した（図１Ａ）。エクソン２を含む1.0 kbのDNAプラグメントを、対応する配列とloxP 配列とを含むフラグメントに置き換えた。チミジンキナーゼ(tk)プロモーターにより動くジフテリア毒素Ａフラグメント(DT-A)をベクターの5'末端に挿入した。マウスBruce-4 ES細胞にこのターゲッティングベクターをエレクトロポレーションによりトランスフェクトし、PCRによりG418耐性クローンを相同組み換えについてスクリーニングした。陽性クローンを胚盤胞に注射し、TMEM16F+/NeoFRマウスを得た。
【００３０】
TMEM16F+/NeoFRTマウスをCAG-FLPeトランスジェニックマウスと交配してNeoカセットを除去した(27)。子孫を野生型C57BL/6マウスに戻し交配し、CAG-FLPe遺伝子を除去し、TMEM16F+/floxマウスを得た。マウスは京都大学の特別な無菌施設で飼育し、動物実験は全て京都大学に許可されたプロトコールにしたがい実施した。
【００３１】
IFET細胞株は既報のとおり樹立した(28)。説明すると、TMEM16F+/floxマウスを交配し、胎児胸腺細胞を胎生14.5日で得た。胸腺細胞は、DMEM（10% FCS、1 x 非必須アミノ酸、10 mM Hepes-NaOH バッファー (pH 7.4)、および50μM β-メルカプトエタノール含有）中で培養した。H-rasV12およびc-mycの遺伝子を有するレトロウイルスをpCX4ベクターを用いてPlat-E細胞中で産生し(29)、遠心分離により濃縮して、RetroNectinコートプレート(Takara Bio, Kyoto, Japan)に付着させた。胸腺細胞を400 x g、5分間の遠心分離により前記のレトロウイルスコートプレートに付着させ、5 ng/ml マウスIL-7 (PeproTech, Rocky Hill, NJ)を含有する培地で培養した(30)。得られたIFETに1 x 105 pfu/ml Adeno-Cre (Takara Bio) を感染させ、限界希釈によりクローン化した。TMEM16F-/-アレルを有するクローンを、以下のプライマーを用いてPCRにより選択した: 野生型特異的センスプライマー：CTCCAGAGTTTGTAAGTAACACAT (配列番号２２)、変異体特異的センスプライマー：CAGTCATCGATGAATTCATAACTT (配列番号２３)、および共通のアンチセンスプライマー：AAGACTGATTTCCAAGG TTATCGAA (配列番号２４)。
【００３２】
TMEM16F-/- IFETの形質転換
マウスTMEM16 cDNAをpMXs puro c-FLAG (20)に挿入し、C末端でFLAG標識されたタンパク質を発現させた。レトロウイルスをPlat-E細胞で産生させ、TMEM16F-/- IFETに感染させた。安定な形質転換体を2μg/mlピューロマイシンを含む培地で選択した。マウスFas cDNA (GenBank: NM_007987) を、レトロウイルスによる形質転換によりIFETに導入し、その発現を抗Fas mAb (Jo2) (MBL, Nagoya, Japan)を用いたフローサイトメトリーにより確認した。
【００３３】
リアルタイムPCR
全RNAを、Superscript III逆転写酵素 (Invitrogen, Carlsbad, CA) またはHigh Capacity RNA-to-cDNA（商標） Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて逆転写した。産物の一部を、LightCycler（登録商標）480 SYBR Green I Master (Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)を含む反応混合物中で増幅した。リアルタイムPCRに用いたプライマーは以下のとおりである：TMEM16A, 5'-ACCCCGACGCCGAATGCAAG (配列番号２５) 、および5'-GCTGGTCCTGCCTGACGCTG (配列番号２６); 16B, 5'-GAGGCGCACACCTGGGTCAC (配列番号２７) 、および5'-ATGGGGCGTGGATCCGGACA (配列番号２８); 16C, 5'-GCCAGCAATTGCCAACCCCG (配列番号２９) 、および5'-GCAGTCCGACTCCTCCAGCTCT (配列番号３０); 16D, 5'-ACAGGCATGCTCTTCCCCGC (配列番号３１) 、および5'-GCGATCACTGCTCGGCGTCT (配列番号３２); 16E, 5'-AGCAGCTCCAGCTTCGGCCT (配列番号３３) 、および5'-TTCACGCTCTGCAGGGTGGC (配列番号３４); 16F, 5'-CCCACCTTTGGATCACTGGA (配列番号３５) 、および5'-TCGTATGCTTGTCTTTTCCT (配列番号３６); 16G, 5'-ACATGTGCCCGCTGTGCTCC (配列番号３７) 、および5'-GGGCCGAGGCCTCTCCTCAA (配列番号３８); 16H, 5'-TGGAGGAGCCACGTCCCCAG (配列番号３９) 、および5'-GCGGGGCAGACCCTTCACAC (配列番号４０); 16J, 5'-GCTGTGGTGGTGACTGGGGC (配列番号４１) 、および5'-CCAGGCGCGTGGATTTCCCA (配列番号４２); 16K, 5'-TGGGGGCAGAAGCAGTCGGT (配列番号４３) 、および5'-GGCCTGTGGGTAGCCAGGGAT (配列番号４４); β-アクチン, 5'-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG (配列番号４５) 、および5'-TTTGATGTCACGCACGATTTCC (配列番号４６)。
【００３４】
それぞれの直鎖化プラスミドDNAをリファレンスとして、Light Cycler SystemがPCR産物の指数増殖期の立ち上がりを検出した時点でmRNAを定量した。
【００３５】
ウェスタンブロッティング
細胞をRIPAバッファー [50 mM Hepes-NaOHバッファー (pH 8.0)、1% NP-40、0.1% SDS、 0.5%デオキシコール酸ナトリウム、150 mM NaCl、およびプロテアーゼインヒビターカクテル (cOmplete Mini, Roche Diagnostics)含有]中で溶解した。不溶物を除去した後、細胞溶解物を5 x SDS サンプルバッファー [200 mM Tris-HCl (pH 6.8)、10% SDS、25%グリセロール、5% β-メルカプトエタノール、および0.05% ブロモフェノールブルー含有]と混合し、室温で30分インキュベートした後、10% SDS-PAGE (Bio Craft, Tokyo, Japan)により分離した。PVDF メンブレン (Millipore, Billerica, MA)にタンパク質を転写した後、メンブレンをHRP結合マウス抗FLAG M2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)と反応させ、ペルオキシダーゼ活性をWestern Lightning（登録商標）-ECL system (PerkinElmer, Waltham, MA)を用いて検出した。
【００３６】
マウスTMEM16Fに対するウサギ抗体を調製するため、マウスTMEM16FのN末端領域(1-289番目のアミノ酸)を、pGEX-5X-1 ベクター (GE Healthcare, Buckinghamshire, England)においてグルタチオン-S-トランスフェラーゼ (GST)に融合した。組換タンパク質を大腸菌で産生し、グルタチオン-セファロースで精製し、特注にてTakara Bioにおいてウサギに免疫した。ウサギ抗TMEM16FおよびHRP標識ヤギ抗ウサギIg (Dako, Copenhagen, Denmark) を用いたウェスタンブロッティングは、Immunoreaction Enhancer Solution (Can Get Signal（登録商標）, Toyobo Life Science, Tokyo, Japan)を用いて、前述のとおり実施した。
【００３７】
PS露出の解析
Ca2+誘導性PS露出は、既報のとおり試験した(20)。説明すると、5 x 105細胞を、500μlの10 mM Hepes-NaOH バッファー (pH 7.4) （140 mM NaCl、2.5 mM CaCl2、および5μg/ml ヨウ化プロピジウム (PI)、並びに1000倍希釈したCy5標識Annexin V (Bio Vision, Milpitas, CA)を含有）中で、20℃で3.0μM A23187にて刺激し、20℃に設定したFACSAria (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) のインジェクションチャンバーに挿入した。 
【００３８】
NBD-PCおよびNBD-GalCerの取り込み
細胞(106) を、1 ml のHank's Balanced Salt Solution (HBSS)(Gibco, Billings, MT) （1 mM CaCl2、および蛍光プローブ:100 nM 1-オレオイル-2-{6-[(7-ニトロ-2-1,3-ベンゾキサジアゾール-4-イル)アミノ] ヘキサノイル}-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (NBD-PC)(Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL)または250 nM N-[6-[(7-ニトロ- 2-1,3-ベンゾキサジアゾール-4-イル)アミノ]ヘキサノイル]-D-ガラクトシル-β1-1'-スフィンゴシン(C6-NBD ガラクトシルセラミドまたはNBD-GalCer) (Avanti Polar Lipids)含有）中にて、15℃において250 nM A23187にて刺激した。反応液の一部(150μl) を150μl のHBSS（5 mg/ml脂肪酸不含BSA (Sigma-Aldrich)および500 nM Sytoxblue (Molecular Probes, Eugene, OR)含有）と混合し、FACSAriaにて解析した。
【００３９】
アポトーシスの誘導
アポトーシスは、既報のとおりFasLを用いて誘導した(25)。説明すると、マウスFasを発現するIFETを60単位/mlのFasLで37℃において2時間処理し、PSの露出をCy5-Annexin Vを用いたフローサイトメトリーにより評価した。活性化カスパーゼ3の検出のため、細胞を37℃で10分間1%パラホルムアルデヒド含有PBSで固定し、-20℃において90%メタノールにて透過処理し、活性型カスパーゼ3に対するウサギmAb (Cell Signaling, Danvers, MA)で染色した。次いで、細胞をAlexa 488標識ヤギ抗ウサギIgG (Invitrogen)とともにインキュベートし、FACSAriaにより解析した。
【００４０】
電気生理学
C末端でFLAG標識したTMEM16配列をpEF-BOS-EX(31)に挿入した。HEK293T細胞 (2.5 x 105)に、1.0μgのTMEM16発現ベクターと0.1μgのpMAX-EGFP (Lonza Group, Basel, Switzerland)をFuGENE6 (Promega, Madison, WI)を用いて導入した。24時間後、細胞をフィブロネクチン(Sigma-Aldrich)でコートしたガラスカバースリップ上に再度播種した。再播種から24時間以内に、EGFP発現細胞のホールセルレコーディングを、パッチクランプ増幅器(Axopatch 200B, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)を用いて既報のとおり実施した(23, 32)。細胞外液は、140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl2、1 mM MgCl2、30 mMグルコース、および10 mM Hepes-NaOH (pH 7.4)を含有した。細胞内液は、140 mM NaCl、1.12 mM EGTA、1 mM CaCl2、30 mMグルコース、および10 mM Hepes-NaOH (pH7.4)を含有した。遊離のCa2+濃度(500 nM) は、WEBMAXCソフトウェア (http://www.stanford.edu/_cpatton/ maxc.html)を用いて算出した。
【００４１】
結果
TMEM16F-/-胎児胸腺細胞株の樹立
Ca2+依存性PS露出は、TMEM16F mRNAのノックダウンにより減少し、TMEM16Fの過剰発現により促進されることから、TMEM16Fがリン脂質スクランブラーゼであると考えられた (20)。TMEM16FがCa2+依存性リン脂質スクランブリングに関与することを確認し、また、TMEM16Fがアポトーシス細胞死における細胞表面へのPS露出に関与しているかを調べるため、胎児胸腺組織からTMEM16Fを含めTMEM16ファミリーメンバーをほとんど発現しないTMEM16F欠損マウス細胞株を樹立した（下記参照）。
【００４２】
ターゲッティングベクターを用いて、C57BL/6バックグラウンド由来のマウス胎児幹細胞 (ES) 株におけるTMEM16F遺伝子部位を、TMEM16F遺伝子のエクソン２がloxP配列に挟まれた配列に置き換えた（図１Ａ）。Floxedアレルを有するマウスを、ESクローンから産生し交配した。胎生14.5日に胎児の遺伝子型を決定し、胎児TMEM16Fflox/flox胸腺細胞にH-rasV12およびc-mycを有するレトロウイルスを感染させ、IFET細胞株を樹立した。フローサイトメトリー解析により、IFETは、Thy-1を弱く、CD44を強く発現し、CD4またはCD8を発現しないことを確認した。このことは、IFETが発生初期段階のT細胞系列に由来することを示唆する。リアルタイムRT-PCR解析により、IFETがTMEM16F、16H、および16Kを発現することが示された（図１Ｂ）。次に、IFETにCREリコンビナーゼ遺伝子を有するアデノウイルスを感染させ、TMEM16F遺伝子のエクソン２を欠損する細胞を単離した（図１Ｃ）。エクソン２の除去により、フレームシフトが起こりTMEM16Fタンパク質はN末端領域で終結する。それゆえ、抗TMEM16F抗体によるウェスタンブロッティングにおいて、TMEM16Fflox/floxでは約120 kDaにブロードなバンドが認められたが、TMEM16F-/- IFETでは観察されなかった（図１Ｄ）。SDS-PAGEで検出されたTMEM16Fの見かけの分子量は、TMEM16Fの予想分子量(106 kDa)よりも若干大きかった。マウスTMEM16Fは6つの推定N-グリコシル化部位 (Asn-X-Ser/Thr)を有することから、グリコシル化によるものと考えられる。
【００４３】
TMEM16FはCa2+誘導性PS露出に必要とされるがアポトーシス性PS露出には必要とされない
20℃においてCa2+イオノフォアA23187で処理したTMEM16Fflox/flox IFETは、迅速にPSを露出した（図２Ａ）。しかしながら、この露出は、TMEM16-/- IFETでは全く観察されなかった。同様に、TMEM16Fflox/floxIFETをA23187で処理すると、ROペプチド(20)の結合により検出されるPE露出が迅速に起こったが、TMEM16F-/- IFETでは起こらなかった（データ非提示）。次に、脂質取り込みにおけるTMEM16Fの役割を調べたところ、TMEM16Fflox/floxIFETではCa2+イオノフォアの処理によりNBD-PCおよびNBD-GalCerが取り込まれたが、TMEM16-/- IFETでは取り込まれなかった(図２Ｂおよび図２Ｃ)。これらの結果は、TMEM16FがIFETにおけるCa2+依存性の脂質スクランブリングに重要な役割を果たしていることを示している。
【００４４】
発生初期段階のT細胞はFasを発現しないという以前の報告(33)と一致して、IFETはFasを発現していない（図２Ｄ）。IFETをマウスFasで形質転換すると、FasLにより効率的にカスパーゼ３が活性化され（図２Ｅ）、その細胞は迅速にPSを露出した（図２Ｆ）。TMEM16F遺伝子の欠損は、FasL誘導性のPS露出にもカスパーゼの活性にも影響しなかった(図２Ｅおよび２Ｆ)。アポトーシスを起こしている細胞では、細胞のサイズが減少し、細胞内顆粒が増加する(34)。TMEM16Fflox/flox IFETおよびTMEM16F-/- IFETをFasLで処理すると、同程度に、細胞のサイズが減少し (前方散乱光、FSC)、細胞内顆粒が増加した (側方散乱光、SSC)(図２Ｇ)。それゆえ、カスパーゼ依存性のアポトーシス性PS露出と細胞収縮は、TMEM16Fとは無関係に起こると結論した。
【００４５】
TMEM16ファミリーメンバーのPS露出能
10種類のTMEM16ファミリーメンバーは類似のトポロジーを有し、そのアミノ酸配列は20-60%の範囲で同一である(35, 36)。TMEM16ファミリーメンバーにリン脂質をスクランブルする能力が存在するかどうか調べるため、Ca2+依存性の脂質スクランブラーゼ活性が完全に消失しているTMEM16F-/- IFETを、FLAG標識TMEM16ファミリーメンバーを有するマウスレトロウイルスベクターで形質転換した。内在性のDNA配列をもつTMEM16C、16D、および16Eの発現プラスミドは、IFETにおけるタンパク質発現レベルが非常に低かったことから、mRNAの安定性と翻訳効率を最適化するため、それらの配列を改変した。抗FLAG mAbを用いたウェスタンブロッティングにより、各TMEM16ファミリーメンバーに特異的なバンドが検出された（図３Ａ）。TMEM16Kを除き、SDS-PAGEで検出されたそれらの見かけの分子量は計算上の分子量よりも大きいが、これは、これらのメンバーが1-6個のN-グリコシル化部位を有することから、グリコシル化によるものと考えられる。一方、推定N-グリコシル化部位を有さないTMEM16Kの見かけの分子量(65 kDa)は、その推定分子量 (76 kDa)よりもかなり小さかった。一部の膜タンパク質はSDS-PAGEにおいて変則的な挙動をみせることが知られており(37)、TMEM16Kはこのカテゴリーに属する可能性がある。また、ウェスタンブロッティングにおいて、大部分のTMEM16ファミリーメンバーは同様のレベルで発現していたが、他のファミリーメンバーよりもTMEM16Eのレベルは3-5倍低く、TMEM16Kのレベルは5-10倍高かった（図３Ａ）。予想どおり、Ca2+イオノフォアの処理により、TMEM16Fを発現するTMEM16F-/- IFET形質転換体では効率的なPS露出が誘導された（図３Ｂ）。TMEM16D、並びにTMEM16Gおよび16Jの形質転換体もまたCa2+の処理によりPSを露出したが、TMEM16Gまたは16JのPSを露出させる能力は、TMEM16Fおよび16Dよりも弱かった。一方、TMEM16A、16B、16C、16E、16H、および16Kでは、PS露出活性は、検出されないか、または非常に弱かった。同様に、TMEM16F-/- IFETは、NBD-PSの取り込み能を消失しており、この活性は、TMEM16D、16F、および16Jで細胞を形質転換することにより強く、TMEM16Gにより弱く、回復した。一方、TMEM16Cおよび16Eを発現するIFET形質転換体は、NBD-PSを取り込まなかった（データ非提示）。
【００４６】
TMEM16ファミリーメンバーの脂質スルランブル能
TMEM16Fは、PSおよびPEだけでなく、他の脂質もスクランブルした（図２）。他のTMEM16ファミリーメンバーの脂質スクランブラーゼ活性を調べるため、TMEM16ファミリーメンバーを発現するTMEM16F-/- IFETを蛍光プローブであるNBD-PCまたはNBD-GalCerとインキュベートした。図４Ａに示すように、TMEM16Dを発現するTMEM16F-/- IFETは、構成的に、すなわちA23187処理なしで、NBD-PCを取り込み、この取り込みはA23187処理により強く増強された。TMEM16D形質転換体によるA23187誘導性のNBD-PC取り込みは、TMEM16F形質転換体で観察された取り込みよりも強かった。細胞透過性Ca2+キレーターであるBAPTA-AMによりTMEM16D形質転換体を前処理すると、Ca2+イオノフォアなしで観察されたNBD-PC取り込みが減少したことから（図４Ｂ）、TMEM16Dのスクランブリング活性には内在性の細胞内Ca2+レベルで十分であると考えられた。PS露出と同様に、TMEM16A、16B、16E、16H、または16Kを発現するIFETでは、A23187処理によりNBD-PC取り込みは誘導されなかった（図４Ａ）。一方、TMEM16C、16G、または16Jを発現する細胞は、Ca2+ イオノフォアで処理するとNBD-PCを取り込んだ。
【００４７】
同様の結果が、NBD-GalCerを基質として用いた場合に得られた。A23187で処理すると、TMEM16Fを発現するTMEM16F-/-形質転換体はNBD-GalCerを取り込んだが、TMEM16A、16B、16E、または16Kを発現する形質転換体は取り込まなかった（図４Ｃ）。TMEM16Dを発現する細胞は、構成的にNBD-GalCerを取り込み、この取り込みはA23187処理により増強された。TMEM16C、16G、または16Jを発現する細胞もまた、NBD-GalCerを取り込んだが、TMEM16CのNBD-GalCer取り込み能は、他と比べて弱かった。これらの結果は、TMEM16C、16D、16F、16G、および16Jが、各種のリン脂質およびスフィンゴ糖脂質を若干異なる基質選択性でスクランブルすることを示唆する。
【００４８】
TMEM16ファミリーメンバーのクロライドシャネル活性
TMEM16Aおよび16Bは、Ca2+依存性のCl-チャネルである(22-24)。他のTMEM16ファミリーメンバーがCl-チャネル活性を持つかどうか調べるため、また、TMEM16ファミリーメンバーのスクランブラーゼ活性がCl-チャネル活性に依存するかを調べるため、ヒト293T細胞にTMEM16発現プラスミドとGFP発現ベクターを導入した（図５Ａ）。次いで、GFP陽性細胞のCa2+依存性クロライドチャネル活性を、ホールセルパッチクランプ法により解析評価した(23)。293T細胞株を宿主細胞として選択したが、これは、この細胞がCa2+依存性のCl-チャネル活性をほとんど有さず（図５Ｂ）、また、この細胞を使用してTMEM16Aおよび16BがCl-チャネルとして機能することが示されているからである(22-24)。
【００４９】
パッチクランプ解析において、ピペット溶液における細胞内遊離Ca2+を500 nMまで増加すると、TMEM16Aまたは16Bを発現する細胞において大きな外向き整流電流が生じた（図５Ｂおよび５Ｃ）。一方、他のTMEM16ファミリーメンバーは、293T細胞においてCa2+依存性の電流をほとんど誘導せず、ピペット溶液のCa2+濃度を500 nMから5μMに増加させてもチャネル活性は認められなかった（データ非提示）。それゆえ、TMEM16ファミリーのうち、TMEM16Aおよび16BのみがCa2+依存性のCl-チャネルとして機能する、および、TMEM16C、16D、16F、16G、および16Jのリン脂質スクランブリング活性はCl-チャネル活性に依存しない、と結論した。
【００５０】
マウス組織におけるTMEM16ファミリーメンバーの発現
各種マウス組織におけるTMEM16 mRNAのリアルタイムPCR解析により、各組織は限られた数のTMEM16ファミリーメンバーしか発現しないことが示された（図６）。2つのTMEM16ファミリーのCl-チャネル、TMEM16Aおよび16Bのうち、TMEM16Bは脳および眼組織に強く発現しているが、TMEM16Aを強く発現する組織、膵臓、肝臓、唾液腺、胃、肺、皮膚、および乳腺では、ほとんど発現していなかった。TMEM16ファミリーの5つの脂質スクランブラーゼ、すなわち16C、16D、16F、16G、および16J、のうち、TMEM16Fは各種組織に広範に発現していた。一方、他のスクランブラーゼは、少数の組織にのみ存在した。すなわち、TMEM16Cおよび16Jは、それぞれ脳および皮膚に強く発現し、一方、16Dは、脳、卵巣、心臓、および眼などの少数の組織に低レベルで観察され、16Gおよび16Jは胃および腸で観察された。スクランブラーゼ活性またはCl-チャネル活性を示さなかったTMEM16タンパク質のうち、16Hおよび16Kは各種組織に広範に発現し、一方、16Eは筋肉および皮膚にのみ発現していた。
【００５１】
参考文献
1.            Balasubramanian, K., and Schroit, A. (2003) Aminophospholipid asymmetry: A matter of life and death, Annu. Rev. Physiol. 65, 701-734
2.            van Meer, G., Voelker, D., and Feigenson, G. (2008) Membrane lipids: where they are and how they behave, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 112-124
3.            Nagata, S., Hanayama, R., and Kawane, K. (2010) Autoimmunity and the clearance of dead cells, Cell 140, 619-630
4.            Zwaal, R. F., Comfurius, P., and Bevers, E. M. (1998) Lipid-protein interactions in blood coagulation, Biochim. Biophys. Acta 1376, 433-453
5.            Boas, F. E., Forman, L., and Beutler, E. (1998) Phosphatidylserine exposure and red cell viability in red cell aging and in hemolytic anemia., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3077-3081
6.            Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., and Nagata, S. (2005) Phosphatidylserine- dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells, Nature 437, 754-758
7.            Sessions, A., and Horwitz, A. (1983) Differentiation-related differences in the plasma membrane phospholipid asymmetry of myogenic and fibrogenic cells, Biochim. Biophys. Acta 728, 103-111
8.            Helming, L., and Gordon, S. (2009) Molecular mediators of macrophage fusion, Trends Cell Biol. 19, 514-522
9.            Adler, R., Ng, A., and Rote, N. (1995) Monoclonal antiphosphatidylserine antibody inhibits intercellular fusion of the choriocarcinoma line, JAR, Biol. Reprod. 53, 905-910
10.            Gadella, B., and Harrison, R. (2002) Capacitation induces cyclic adenosine 3',5'-monophosphate-dependent, but apoptosis-unrelated, exposure of aminophospholipids at the apical head plasma membrane of boar sperm cells, Biol. Reprod. 67, 340-350
11.            Leventis, P. A., and Grinstein, S. (2010) The Distribution and Function of Phosphatidylserine in Cellular Membranes, Annu. Rev. Biophys. 39, 407-427
12.            Folmer, D., Elferink, R., and Paulusma, C. (2009) P4 ATPases - lipid flippases and their role in disease, Biochim. Biophys. Acta 1791, 628-635
13.            Oram, J., and Vaughan, A. (2000) ABCA1-mediated transport of cellular cholesterol and phospholipids to HDL apolipoproteins, Curr. Opin. Lipidol 11, 253-260
14.            Williamson, P., Halleck, M., Malowitz, J., Ng, S., Fan, X., Krahling, S., Remaley, A., and Schlegel, R. (2007) Transbilayer phospholipid movements in ABCA1-deficient cells, PLoS ONE 2, e729
15.            Bevers, E., and Williamson, P. (2010) Phospholipid scramblase: an update, FEBS Lett. 584, 2724-2730
16.            Basse, F., Stout, J. G., Sims, P. J., and Wiedmer, T. (1996) Isolation of an erythrocyte membrane protein that mediates Ca2+-dependent transbilayer movement of phospholipid, J. Biol. Chem. 271, 17205-17210
17.            Zhou, Q., Zhao, J., Stout, J., Luhm, R., Wiedmer, T., and Sims, P. (1997) Molecular cloning of human plasma membrane phospholipid scramblase. A protein mediating transbilayer movement of plasma membrane phospholipids, J. Biol. Chem. 272, 18240-18244
18.            Zhou, Q., Zhao, J., Wiedmer, T., and Sims, P. J. (2002) Normal hemostasis but defective hematopoietic response to growth factors in mice deficient in phospholipid scramblase 1, Blood 99, 4030-4038
19.            Sahu, S., Gummadi, S., Manoj, N., and Aradhyam, G. (2007) Phospholipid scramblases: an overview, Arch. Biochem. Biophys. 462, 103-114
20.            Suzuki, J., Umeda, M., Sims, P. J., and Nagata, S. (2010) Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F, Nature 468, 834-838
21.            Castoldi, E., Collins, P. W., Williamson, P. L., and Bevers, E. M. (2011) Compound heterozygosity for 2 novel TMEM16F mutations in a patient with Scott syndrome, Blood 117, 4399-4400
22.            Caputo, A., Caci, E., Ferrera, L., Pedemonte, N., Barsanti, C., Sondo, E., Pfeffer, U., Ravazzolo, R., Zegarra-Moran, O., and Galietta, L. (2008) TMEM16A, a membrane protein associated with calcium-dependent chloride channel activity, Science 322, 590-594
23.            Schroeder, B., Cheng, T., Jan, Y., and Jan, L. (2008) Expression cloning of TMEM16A as a calcium-activated chloride channel subunit, Cell 134, 1019-1029
24.            Yang, Y., Cho, H., Koo, J., Tak, M., Cho, Y., Shim, W., Park, S., Lee, J., Lee, B., Kim, B., Raouf, R., Shin, Y., and Oh, U. (2008) TMEM16A confers receptor-activated calcium-dependent chloride conductance, Nature 455, 1210-1215
25.            Shiraishi, T., Suzuyama, K., Okamoto, H., Mineta, T., Tabuchi, K., Nakayama, K., Shimizu, Y., Tohma, J., Ogihara, T., Naba, H., Mochizuki, H., and Nagata, S. (2004) Increased cytotoxicity of soluble Fas ligand by fusing isoleucine zipper motif, Biochem. Biophys. Res. Commun. 322, 197-202
26.            Morita, S., Kojima, T., and Kitamura, T. (2000) Plat-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses, Gene Ther. 7, 1063-1066
27.            Kanki, H., Suzuki, H., and Itohara, S. (2006) High-efficiency CAG-FLPe deleter mice in C57BL/6J background, Exp. Anim. 55, 137-141
28.            Imao, T., and Nagata, S. (2012) Apaf-1- and Caspase-8-independent apoptosis, Cell Death Differ 
29.            Akagi, T., Sasai, K., and Hanafusa, H. (2003) Refractory nature of normal human diploid fibroblasts with respect to oncogene-mediated transformation, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 13567-13572
30.            Watson, J. D., Morrissey, P. J., Namen, A. E., Conlon, P. J., and Widmer, M. B. (1989) Effect of IL-7 on the growth of fetal thymocytes in culture, J. Immunol. 143, 1215-1222
31.            Murai, K., Murakami, H., and Nagata, S. (1998) Myeloid-specific transcriptional activation by murine myeloid zinc finger protein-2, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 3461-3466
32.            Kuba, H., Yamada, R., and Ohmori, H. (2003) Evaluation of the limiting acuity of coincidence detection in nucleus laminaris of the chicken, J. Physiol. 552, 611-620
33.            Ogasawara, J., Suda, T., and Nagata, S. (1995) Selective apoptosis of CD4 CD8 thymocytes by the anti-Fas antibody, J. Exp. Med. 181, 485-491
34.            Dive, C., Gregory, C. D., Phipps, D. J., Evans, D. L., Milner, A. E., and Wyllie, A. H. (1992) Analysis and discrimination of necrosis and apoptosis (programmed cell death) by multiparameter flow cytometry, Biochim. Biophys. Acta 1133, 275-285
35.            Galietta, L. (2009) The TMEM16 protein family: a new class of chloride channels?, Biophys. J. 97, 3047-3053
36.            Duran, C., and Hartzell, H. C. (2011) Physiological roles and diseases of tmem16/anoctamin proteins: are they all chloride channels?, Acta Pharmacolgica Sinica 32, 685-692
37.            Rath, A., Glibowicka, M., Nadeau, V. G., Chen, G., and Deber, C. M. (2009) Detergent binding explains anomalous SDS-PAGE migration of membrane proteins., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 1760-1765
38.            Segawa, K., Suzuki, J., and Nagata, S. (2011) Constitutive exposure of phosphatidylserine on viable cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108, 19246-19251
39.            Williamson, P., Christie, A., Kohlin, T., Schlegel, R., Comfurius, P., Harmsma, M., Zwaal, R., and Bevers, E. (2001) Phospholipid scramblase activation pathways in lymphocytes, Biochemistry 40, 8065-8072
40.            Schoenwaelder, S., Yuan, Y., Josefsson, E., White, M., Yao, Y., Mason, K., O'Reilly, L., Henley, K., Ono, A., Hsiao, S., Willcox, A., Roberts, A., Huang, D., Salem, H., Kile, B., and Jackson, S. (2009) Two distinct pathways regulate platelet phosphatidylserine exposure and procoagulant function, Blood 114, 663-666
41.            Martins, J. R., Faria, D., Kongsuphol, P., Reisch, B., Schreiber, R., and Kunzelmann, K. (2011) Anoctamin 6 is an essential component of the outwardly rectifying chloride channel, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 108, 18168-18172
42.            Hampton, M., Vanags, D., Porn-Ares, M., and Orrenius, S. (1996) Involvement of extracellular calcium in phosphatidylserine exposure during apoptosis, FEBS Lett. 399, 277-282
43.            Hartzell, H. C., Yu, K., Xiao, Q., Chien, L. T., and Qu, Z. (2009) Anoctamin/TMEM16 family members are Ca2+-activated Cl- channels, J. Physiol. 587, 2127-2139
44.            Schreiber, R., Uliyakina, I., Kongsuphol, P., Warth, R., Mirza, M., Martins, J., and Kunzelmann, K. (2010) Expression and function of epithelial anoctamins, J. Biol. Chem. 285, 7838-7845
45.            Duran, C., Qu, Z., Osunkoya, A. O., Cui, Y., and Hartzell, H. C. (2012) ANOs 3-7 in the anoctamin/Tmem16 Cl- channel family are intracellular proteins, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302, C482-493
46.            Palmgren, M. G., and Nissen, P. (2011) P-type ATPases, Annu. Rev. Biophys. 40, 243-266
47.            Chen, T.-Y., and Hwang, T.-C. (2008) CLC-0 and CFTR: chloride channels evolved from transporters, Physiol. Rev. 88, 351-387
48.            Ferrera, L., Caputo, A., Ubby, I., Bussani, E., Zegarra-Moran, O., Ravazzolo, R., Pagani, F., and Galietta, L. (2009) Regulation of TMEM16A chloride channel properties by alternative splicing, J. Biol. Chem. 284, 33360-33368
49.            Mizuta, K., Tsutsumi, S., Inoue, H., Sakamoto, Y., Miyatake, K., Miyawaki, K., Noji, S., Kamata, N., and Itakura, M. (2007) Molecular characterization of GDD1/TMEM16E, the gene product responsible for autosomal dominant gnathodiaphyseal dysplasia, Biochem. Biophys. Res. Commun. 357, 126-132
50.            Bolduc, V., Marlow, G., Boycott, K., Saleki, K., Inoue, H., Kroon, J., Itakura, M., Robitaille, Y., Parent, L., Baas, F., Mizuta, K., Kamata, N., Richard, I., Linssen, W., Mahjneh, I., de Visser, M., Bashir, R., and Brais, B. (2010) Recessive Mutations in the Putative Calcium-Activated Chloride Channel Anoctamin 5 Cause Proximal LGMD2L and Distal MMD3 Muscular Dystrophies, Am. J. Hum. Genet. 86, 213-221
51.            Tsutsumi, S., Kamata, N., Vokes, T., Maruoka, Y., Nakakuki, K., Enomoto, S., Omura, K., Amagasa, T., Nagayama, M., Saito-Ohara, F., Inazawa, J., Moritani, M., Yamaoka, T., Inoue, H., and Itakura, M. (2004) The novel gene encoding a putative transmembrane protein is mutated in gnathodiaphyseal dysplasia (GDD), Am. J. Hum. Genet. 74, 1255-1261
52.            Vermeer, S., Hoischen, A., Meijer, R. P. P., Gilissen, C., Neveling, K., Wieskamp, N., de Brouwer, A., Koenig, M., Anheim, M., Assoum, M., Drouot, N., Todorovic, S., Milic-Rasic, V., Lochmuller, H., Stevanin, G., Goizet, C., David, A., Durr, A., Brice, A., Kremer, B., Warrenburg, B. P. C. v. d., Schijvenaars, M. M. V. A. P., Heister, A., Kwint, M., Arts, P., van der Wijst, J., Veltman, J., Kamsteeg, E.-J., Scheffer, H., and Knoers, N. (2010) Targeted Next-Generation Sequencing of a 12.5 Mb Homozygous Region Reveals ANO10 Mutations in Patients with Autosomal-Recessive Cerebellar Ataxia, Am. J. Hum. Genet. 87, 813-819
53.            van den Eijnde, S., van den Hoff, M., Reutelingsperger, C., van Heerde, W., Henfling, M., Vermeij-Keers, C., Schutte, B., Borgers, M., and Ramaekers, F. (2001) Transient expression of phosphatidylserine at cell-cell contact areas is required for myotube formation, J. Cell Sci. 114, 3631-3642
54.            Stowell, S. R., Karmakar, S., Arthur, C. M., Ju, T., Rodrigues, L. C., Riul, T. B., Dias-Baruffi, M., Miner, J., McEver, R. P., and Cummings, R. D. (2009) Galectin-1 induces reversible phosphatidylserine exposure at the plasma membrane, Mol. Biol. Cell 20, 1408-1418
55.            Del Buono, B. J., White, S. M., Williamson, P. L., and Schlegel, R. A. (1989) Plasma membrane lipid organization and the adherence of differentiating lymphocytes to macrophages, J. Cell. Physiol. 138, 61-69
56.            Fischer, K., Voelkl, S., Berger, J., Andreesen, R., Pomorski, T., and Mackensen, A. (2006) Antigen recognition induces phosphatidylserine exposure on the cell surface of human CD8+ T cells, Blood 108, 4094-4101
57.            Ehlen, H. W., Chinenkova, M., Moser, M., Munter, H. M., Krause, Y., Gross, S., Brachvogel, B., Wuelling, M., Kornak, U., and Vortkamp, A. (2013) Inactivation of Anoctamin-6/Tmem16f, a regulator of phosphatidylserine scrambling in osteoblasts, leads to decreased mineral deposition in skeletal tissues, J. Bone Miner. Res. 28, 246-259
58.            Charlesworth, G., Plagnol, V., Holmstrom, K. M., Bras, J., Sheerin, U.-M., Preza, E., Rubio-Agusti, I., Ryten, M., Schneider, S. A., Stamelou, M., Trabzuni, D., Abramov, A. Y., Bhatia, K. P., and Wood, N. W. (2012) Mutations in ANO3 cause dominant craniocervical dystonia: ion channel implicated in pathogenesis., Am. J. Hum. Genet. 91, 1041-1050
59.            Kashyap, M. K., Marimuthu, A., Kishore, C. J. H., Peri, S., Keerthikumar, S., Prasad, T. S. K., Mahmood, R., Rao, S., Ranganathan, P., Sanjeeviah, R. C., Vijayakumar, M., Kumar, K. V. V., Montgomery, E. A., Kumar, R. V., and Pandey, A. (2009) Genomewide mRNA profiling of esophageal squamous cell carcinoma for identification of cancer biomarkers., Cancer Biol. Ther. 8, 36-46
60.            Das, S., Hahn, Y., Nagata, S., Willingham, M., Bera, T., Lee, B., and Pastan, I. (2007) NGEP, a prostate-specific plasma membrane protein that promotes the association of LNCaP cells, Cancer Res 67, 1594-1601
【図１Ｃ】
2015514961.tif 000002
【図１Ｄ】
2015514961.tif 000003
【図２Ｆ】
2015514961.tif 000004
【図２Ｇ】
2015514961.tif 000005
【図３Ａ】
2015514961.tif 000006
【図７Ａ】
2015514961.tif 000007
【図７Ｂ】
2015514961.tif 000008
【図７Ｃ】
2015514961.tif 000009
【図８Ａ】
2015514961.tif 000010
【図８Ｂ】
2015514961.tif 000011
【図８Ｃ】
2015514961.tif 000012
【図９Ａ】
2015514961.tif 000013
【図９Ｂ】
2015514961.tif 000014
【図９Ｃ】
2015514961.tif 000015
【図１Ａ】
2015514961.tif 000016
【図１Ｂ】
2015514961.tif 000017
【図２Ａ】
2015514961.tif 000018
【図２Ｂ】
2015514961.tif 000019
【図２Ｃ】
2015514961.tif 000020
【図２Ｄ】
2015514961.tif 000021
【図２Ｅ】
2015514961.tif 000022
【図３Ｂ】
2015514961.tif 000023
【図４Ａ】
2015514961.tif 000024
【図４Ｂ】
2015514961.tif 000025
【図４Ｃ】
2015514961.tif 000026
【図５Ａ】
2015514961.tif 000027
【図５Ｂ】
2015514961.tif 000028
【図５Ｃ】
2015514961.tif 000029
【図６Ａ】
2015514961.tif 000030
【図６Ｂ】
2015514961.tif 000031
【図６Ｃ】
2015514961.tif 000032
【配列表】
2015514961000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年12月24日(2014.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
TMEM16メンバーの調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）TMEM16ファミリーメンバー発現細胞を、前記調節物質の候補物質で処理する工程、および
（２）前記候補物質が、前記細胞の細胞膜における、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される脂質の分布を変化させるか否かを決定する工程、
ここで、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を増加させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を減少させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される、および
対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を増加させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を減少させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される。
【請求項２】
TMEM16ファミリーメンバーがTMEM 16Cであり、脂質がホスファチジルコリンおよびガラクトシルセラミドから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
TMEM16ファミリーメンバーがTMEM 16Dであり、脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
TMEM16ファミリーメンバーがTMEM 16Gであり、脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
TMEM16ファミリーメンバーがTMEM 16Jであり、脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される、請求項１に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
本発明は、TMEM16ファミリーメンバーの調節物質のスクリーニング方法に関する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
本発明は、以下を提供する。
１．TMEM16ファミリーメンバーの調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）TMEM16ファミリーメンバー発現細胞を、前記調節物質の候補物質で処理する工程、および
（２）前記候補物質が、前記細胞の細胞膜における、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される脂質の分布を変化させるか否かを決定する工程、
ここで、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を増加させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を減少させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される、および
対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を増加させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの分布を減少させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される。
２．TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Cであり、脂質がホスファチジルコリンおよびガラクトシルセラミドから選択される、前記１に記載の方法。
３．TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Dであり、脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される、前記１に記載の方法。
４．TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Gであり、脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される、前記１に記載の方法。
５．TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Jであり、脂質がホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、およびガラクトシルセラミドから選択される、前記１に記載の方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
別の態様において、本発明は、以下を提供する。
６．TMEM16ファミリーメンバーの調節物質のスクリーニング方法であって、以下の工程を含む方法：
（１）TMEM16ファミリーメンバー発現細胞を、前記調節物質の候補物質で処理する工程、および
（２）前記候補物質が、前記細胞の細胞膜における、ホスファチジルセリンおよびホスファチジルコリンから選択される脂質の分布を変化させるか否かを決定する工程、
ここで、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を増加させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜外葉におけるホスファチジルセリンの分布を減少させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される、および
対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンの分布を増加させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較して細胞膜内葉におけるホスファチジルコリンの分布を減少させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される。
７．TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Cであり、脂質がホスファチジルコリンである、前記６に記載の方法。
８．TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Dであり、脂質がホスファチジルセリンまたはホスファチジルコリンである、前記６に記載の方法。
９．TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Gであり、脂質がホスファチジルコリンである、前記６に記載の方法。
１０．TMEM16ファミリーメンバーがTMEM16Jであり、脂質がホスファチジルコリンである、前記６に記載の方法。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
本明細書において、「TMEM16ファミリーメンバー発現細胞」には、TMEM16ファミリーメンバーを本来そのゲノムから発現する細胞、および細胞に導入されたTMEM16ファミリーメンバーをコードする遺伝子からTMEM16ファミリーメンバーを発現する細胞が含まれる。細胞は、ヒト、サル、マウス、またはウサギ由来の細胞であってよく、またこれらに限定はされない。本発明においては、例えば、ヒトHeLa、ヒトEBV (Epstein Barr Virus)形質転換B細胞株、マウスMEF (胚性線維芽細胞)、およびマウスプロB細胞株であるBa/F3などを使用することができる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
「TMEM16ファミリーメンバーの調節物質」には、「TMEM16ファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質」と「TMEM16ファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質」が含まれる。本明細書において、「TMEM16ファミリーメンバーの機能を亢進する（または抑制する）」とは、細胞または動物におけるTMEM16ファミリーメンバーの脂質スクランブラーゼとしての生物学的機能を増強する（または阻害する）ことを意味する。「TMEM16ファミリーメンバーの調節物質」は、TMEM16ファミリーメンバータンパク質の機能に直接的に影響する物質であっても、TMEM16ファミリーメンバーの発現を増加または減少させる物質であってもよい。「TMEM16ファミリーメンバーの発現の増加または減少」には、TMEM16ファミリーメンバーをコードする遺伝子からのmRNAの発現の増加または減少、およびTMEM16ファミリーメンバーのタンパク質発現の増加または減少が含まれる。それゆえ、「TMEM16ファミリーメンバーの調節物質」には、TMEM16ファミリーメンバーをコードする遺伝子の、プロモーターまたはエンハンサーなどの調節配列に作用する物質、およびTMEM16ファミリーメンバーをコードする遺伝子の配列に基づき調製されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（DNAまたはRNA）、siRNA、miRNA、およびリボザイムが含まれる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
本発明の方法では、TMEM16ファミリーメンバーの脂質スクランブラーゼとしての酵素活性を測定する。脂質は、ホスファチジルセリン (PS)、ホスファチジルコリン (PC)、およびガラクトシルセラミド (GalCer)から選択される。通常の状態では、PSは細胞膜内葉に分布し、PCおよびGalCerは細胞膜外葉に分布する。TMEM16ファミリーメンバーは、PSを細胞膜外葉へ移動させ（すなわち、PSを露出させ）、PCおよびGalCerを細胞膜内葉に移動させる（すなわち、PCおよびGalCerを取り込む）。本発明のTMEM16ファミリーメンバーの酵素活性は、細胞膜における脂質の分布を調べることにより、測定することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１６】
対照と比較してホスファチジルセリンの細胞膜外葉における分布を増加させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較してホスファチジルセリンの細胞膜外葉における分布を減少させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される。対照と比較してホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの細胞膜内葉における分布を増加させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を亢進する調節物質として選択され、対照と比較してホスファチジルコリンまたはガラクトシルセラミドの細胞膜内葉における分布を減少させる候補物質は、TMEM16ファミリーメンバーの機能を抑制する調節物質として選択される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
「（１）TMEM16ファミリーメンバー発現細胞を、前記調節物質の候補物質で処理する工程」において、典型的には、候補物質は、Ca2+の存在下、細胞の培養培地に添加される。適切な場合、A23187などのカルシウムイオノフォアは、候補物質の培地への添加と同時に、または添加後に、添加すればよい。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２２】
細胞膜におけるPSの分布は、細胞表面に露出するPSと、PSに対する結合性を有する物質（例えば、Annexin VまたはMFG-E8 (ラクトアドヘリンともいう)）との間の結合を検出することにより、調べることができる。例えば、候補物質で処理したTMEM16ファミリーメンバー発現細胞を、蛍光標識したAnnexin Vで処理し、細胞表面に結合したAnnexin Vの量を測定する。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
細胞膜におけるPSの分布は、血液凝固反応に基づき調べることもできる。例えば、TMEM16ファミリーメンバー発現細胞を候補物質とともにカルシウムイオノフォアで処理し、または候補物質の処理後にカルシウムイオノフォアで処理し、血液凝固に必要とされる物質（例えば、Xa因子、Va因子、およびプロトロンビン）と混合し、そしてトロンビンの生成を測定する。あるいは、フィブリノーゲンをさらに細胞培養物に添加して、フィブリンの生成を測定してもよい。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
細胞膜におけるPCおよびGalCerの分布は、蛍光標識した脂質により測定することができる。蛍光標識としては、NBDおよびTopFluorを使用することができる。例えば、蛍光標識脂質を培養培地に添加すると、蛍光標識脂質がTMEM16ファミリーメンバー発現細胞の細胞膜外葉に取り込まれる。TMEM16ファミリーメンバーが脂質スクランブラーゼとして機能すると、蛍光標識脂質は細胞膜内葉に移動する（すなわち、取り込まれる）。よって、NBD-PCまたはNBD-GalCerのような蛍光標識脂質の存在下、TMEM16ファミリーメンバー発現細胞を調節物質の候補物質、および必要によりカルシウムイオノフォアで処理すればよい。次いで、細胞をBSAで処理して取り込まれなかったNBD-PCまたはNBD-GalCerを除去し、細胞に取り込まれたNBD-PCまたはNBD-GalCerをフローサイトメトリーにより測定する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
TMEM16ファミリーメンバーにおける異常（変異または過剰発現）は、様々なヒト疾患を引き起こすことが知られている(36)。例えば、TMEM16C、16E、16F、および16Kにおける遺伝子変異は、それぞれ、頭頸部ジストニア (58)、筋骨格障害 (49, 51)、出血性障害 (20)、および運動失調(52)に関連する。TMEM16Aおよび16Gは、それぞれ、ヒト消化管間質腫瘍／頭頸部扁平上皮がん、および前立腺がんにおいて過剰発現している(59, 60)。それゆえ、本発明の方法は、かかる疾患の治療薬または予防薬の開発に有用である。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
TMEM16C、16D、および16Eの天然マウスcDNAは、哺乳類細胞でのタンパク質産生レベルが低いため、mRNAの安定性と翻訳効率の増強された配列をGENEART (Regensburg, Germany)に特注した(図７−９、配列番号１９−２１)。
【国際調査報告】
2015514961.tif 000033