(57)【要約】  本発明は、一般式2015521667.tif 000023(式中、各Xは独立してポリマー鎖を表し、pは1から6までの整数を表し、Yはアミド基を表し、Zは-CH.(CH2L)2又は-C(CH2L)(=CH2)のいずれかを表し、式中各Lは独立して脱離基を表す)の化合物を提供する。この化合物はポリマーのタンパク質への複合体化に有用な試薬であり、得られる複合体は新規であって、本発明の一部を構成する。
2015521667.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式
【化１】
2015521667.tif 000019
(式中、各Xは独立してポリマー鎖を表し、pは1から6までの整数を表し、Yはアミド基を表し、Zは-CH.(CH2L)2又は-C(CH2L)(=CH2)のいずれかを表し、式中、各Lは独立して脱離基を表す)
の化合物。
【請求項２】
各Xがポリ(アルキレングリコール)、ポリビニルピロリドン、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、HPMAコポリマー、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ(オルトエステル)、ポリカルボナート、ポリ(イミノカルボナート)、ポリアミド、又は多糖を表す、請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
各Xがポリ(エチレングリコール)を表す、請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
Yが-NH-CO-を表す、請求項1から3のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
pが3である、請求項1から4のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
各Lが独立して-SR、-SO2R、-OSO2R、-N+R3、-N+HR2、-N+H2R、ハロゲン、又は-Oφを表し、式中、Rが水素原子又はアルキル、アリール若しくはアルキル-アリール基を表し、φが少なくとも1つの電子吸引基を含む置換アリール基を表す、請求項1から5のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
各Lが独立してフェニルスルホニル又はトシルを表す、請求項6に記載の化合物。
【請求項８】
式
【化２】
2015521667.tif 000020
を有する、請求項1に記載の化合物。
【請求項９】
各Xが独立して式CH3O-(CH2CH2O)m-のポリエチレングリコールを表し、式中、mがX中の酸化エチレン単位の数である、請求項8に記載の化合物。
【請求項１０】
一般式
【化３】
2015521667.tif 000021
(式中、X、p及びYは請求項1から9のいずれか一項に規定の意味を有し、AはCO、CHOH、CH.NH2、CH.NHR、CH.NR2、CH.ORCH.O.C(O)R、CH.NHC(O)R、又はCH.N(C(O)R)2基を表し、式中、各Rは水素原子又はアルキル、アリール若しくはアルキル-アリール基を表し、Pr1及びPr2のそれぞれが別々のタンパク質又はペプチド分子を表すか、Pr1及びPr2の両方が一緒になって別々の2点で結合している単一のタンパク質又はペプチドを表すかのいずれかである)
の化合物。
【請求項１１】
一般式
【化４】
2015521667.tif 000022
(式中、X、p、Y及びAは請求項10に規定の意味を有し、Prは別々の2点で結合している単一のタンパク質又はペプチドを表す)
を有する請求項10に記載の化合物。
【請求項１２】
Prが、前記タンパク質若しくはペプチド中のジスルフィド結合に由来する2つの硫黄原子に、又は前記タンパク質若しくはペプチドに付加したポリヒスチジンタグ中に存在する2つのヒスチジン残基に結合した単一のタンパク質又はペプチドを表す、請求項11に記載の化合物。
【請求項１３】
PrがIgGのFab断片、INF-α、IFN-β、又はコンセンサスIFNを表す、請求項11又は12に記載の化合物。
【請求項１４】
請求項10から13のいずれか一項に記載の化合物を調製する方法であって、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物をタンパク質又はペプチドと反応させる工程、及び場合により、得られる複合体中のケト基を還元する工程を含む、方法。
【請求項１５】
請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物を薬学的に許容される担体と共に含み、場合により、更なる有効成分も含有する、医薬組成物。
【請求項１６】
療法に使用される、請求項1から9のいずれか一項に記載の化合物又は請求項15に記載の組成物。
【請求項１７】
患者を治療する方法であって、請求項1から9及び請求項16のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項15に記載の医薬組成物の薬学的に効果的な量を前記患者に投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリマーをタンパク質及びペプチドに複合体化させるための新規な複合体化試薬、並びに新規な複合体を製造する新規な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療的に活性を有する分子、例えばタンパク質の多くが、臨床医学用途において有効性を実現するために求められる特性を有していない。例えば、天然タンパク質の多くは、患者への投与に際し、以下を含む固有の欠点がいくつかあるため、良好な医薬品とはならない。(1)タンパク質は、血液又は組織中に存在する多くのエンドペプチダーゼ及びエクソペプチダーゼによって分解される。(2)ほぼ全てのタンパク質は、ある程度免疫原性である。(3)タンパク質は、腎臓限外ろ過及びエンドサイトーシスによって迅速に排出されることがある。医学の分野で活性を有する治療薬として実用性が見出される可能性がある分子の中には、全身的に有毒であるか、最良の生物学的利用能及び薬物動態に欠けているものがある。タンパク質が血液循環から迅速に消失する場合、典型的にはそのタンパク質を頻繁に患者に投与する必要がある。頻繁に投与すると、毒性、殊に、免疫学的に生成された毒性のリスクを更に高めることになる。多くの場合、治療的有効量を実現することは困難であり、そのため、有効性は犠牲にされている。従って、急速クリアランスは、有効性の問題であると同時に安全性の問題でもある。
【０００３】
水溶性合成ポリマー、特にポリアルキレングリコールは、タンパク質などの治療的に活性を有する分子を複合体化させるのに広く使用されている。こうした治療用複合体は、循環時間を延長すると共にクリアランス率を低下させることによって薬物動態によい変化をもたらし、全身毒性を低下させ、場合によっては、臨床的有効性を発揮することが証明されている。ポリエチレングリコールPEGを共有結合によってタンパク質と複合体化させる方法は、「PEG化(PEGylation)」として一般に知られている。
【０００４】
有効性の最適化及び用量間の一貫性の確保にとって重要なのは、タンパク質ごとの複合体化されたポリマー分子の数が各分子について同じであること、及び、各ポリマー分子が、各タンパク質分子中の同じアミノ酸残基に共有結合によって特異的に複合体化していることである。タンパク質分子に沿った部位での非特異的複合体化は、複合体化生成物と、多くの場合、複合体化されていないタンパク質とを分散させ、精製が困難で費用がかさむ複雑な混合物を生じさせる。
【０００５】
WO2005/007197は、タンパク質中の求核基と反応させてタンパク質-ポリマー複合体を製造するのに使用できる一連の新規な複合体化試薬を記載する。これらの試薬は、タンパク質中のジスルフィド結合に由来する2つの硫黄原子両方と複合体化してチオエーテル複合体を生成する能力のために特に実用性が見出されており、他の求核基、例えば、2つのヒスチジン残基、例えばWO2009/047500に記載されているように、タンパク質に付加したポリヒスチジンタグ中に存在する2つのヒスチジン残基との複合体化にも使用できる。
【０００６】
一定の分子量の単一鎖を含む複合体の立体的特性は、例えば、それぞれ分子量が複合体の半分である2本の鎖を含む複合体の特性とは大きく異なる場合があるため、用途によっては、2本のポリマー鎖をタンパク質に複合体化させることが望ましい。このような複合体化が可能な試薬は、周知である。従って、例えばUS5,932,462(Harris)は、2本のPEG鎖をタンパク質に複合体化させることが可能な試薬を開示している。Congら、Bioconjugate Chemistry 23 (2012)、248〜263頁も、2本のPEG鎖をタンパク質に複合体化させることが可能な試薬、具体的には、249頁の図1の試薬3として示されているPEG-ビス-スルホン試薬を開示している。Congの試薬では、2本のPEG鎖が試薬の機能タンパク質反応基に対するリンカーとして作用するフェニル基上の異なる位置に付加している。Congの試薬は、2本のPEG鎖を、例えばタンパク質中のジスルフィド結合に由来する2つの硫黄原子に、又は、タンパク質に付加したポリヒスチジンタグ中に存在する2つのヒスチジン残基に複合体化させることが可能であり、それによってHarrisの試薬に比べて向上した複合体化を実現する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO2005/007197
【特許文献２】WO2009/047500
【特許文献３】US5,932,462
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Congら、Bioconjugate Chemistry 23 (2012)、248〜263頁
【非特許文献２】Dreborgら、Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990) 6 315〜365頁
【非特許文献３】Brocchiniら、Nat.Protoc. 2006、1(4)、2241〜2252頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明者らは、2本のポリマー鎖をタンパク質に複合体化させることができ、既知であるCongの試薬よりも向上した特性を示す新規な試薬を発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
従って、本発明は、一般式
【００１１】
【化１】
2015521667.tif 000003
【００１２】
(式中、各Xは独立してポリマー鎖を表し、pは1から6までの整数を表し、Yはアミド基を表し、Zは-CH.(CH2L)2又は-C(CH2L)(=CH2)のいずれかを表し、式中、各Lは独立して脱離基を表す)
の化合物を提供する。
【００１３】
式Iの試薬は、2本のポリマー鎖Xを含む。各ポリマーXは、例えば、ポリ(アルキレングリコール)、ポリビニルピロリドン、ポリアクリラート、例えばポリ(アクリロイルモルホリン)、ポリメタクリラート、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド若しくはポリメタクリルアミド、例えばポリカルボキシメタクリルアミド、又はHPMAコポリマーであってもよい。更には、ポリマーは、酵素分解又は加水分解を受けやすいものであってもよい。このようなポリマーとしては、例えば、ポリエステル、ポリアセタール、ポリ(オルトエステル)、ポリカルボナート、ポリ(イミノカルボナート)、及びポリ(アミノ酸)などのポリアミドが挙げられる。ポリマーは、ホモポリマー、ランダムコポリマー、又はブロックコポリマーなどの構造的に明確なコポリマーであってもよい。例えば、ポリマーは、2つ以上のアルキレンオキシドに由来する、又はポリ(アルキレンオキシド)とポリエステル、ポリアセタール、ポリ(オルトエステル)若しくはポリ(アミノ酸)のいずれかに由来するコポリマー、例えば、ブロックコポリマーであってもよい。いわゆるPluronicは、PEGブロックコポリマーの重要なクラスである。これらは、酸化エチレンブロック及び酸化プロピレンブロックから誘導される。使用してもよい多官能性ポリマーとしては、ジビニルエーテル-無水マレイン酸とスチレン-無水マレイン酸とのコポリマーが挙げられる。
【００１４】
天然に存在するポリマー、例えば、キチン、デキストラン、デキストリン、キトサン、デンプン、セルロース、グリコーゲン、ポリ(シアル酸)(poly(sialylic acid))、及びこれらの誘導体などの多糖を使用してもよい。ポリマーとしてタンパク質を使用してもよい。そうすると、あるタンパク質、例えば抗体又は抗体断片と、別のタンパク質、例えば酵素又は他の活性タンパク質との複合体化が可能になる。また、触媒配列を含むペプチド、例えばグリコシルトランスフェラーゼのためのO-グリカンアクセプター部位を使用すると、その後の酵素反応のための基質又は標的の取り込みが可能になる。ポリグルタミン酸又はポリグリシンなどのポリ(アミノ酸)も使用でき、サッカリド又はアミノ酸などの天然モノマーと酸化エチレン又はメタクリル酸などの合成モノマーに由来するハイブリッドポリマーも同様である。
【００１５】
好ましくは、本発明において使用される各ポリマーは、親水性又は水溶性の合成ポリマーである。ポリマーがポリ(アルキレングリコール)である場合、C2及び/又はC3単位を含むもの、殊にポリ(エチレングリコール)(PEG)であることが好ましい。文脈上他の意味に解すべき場合を除き、本明細書におけるポリマーへの言及はPEGへの具体的言及を含むものと理解すべきである。
【００１６】
ポリマーは、場合により任意所望の方法で誘導体化又は官能化されていてもよい。反応基は、ポリマー末端若しくは末端基のところで、又はポリマー鎖に沿ってペンダントリンカー(pendent linker)を介して連結されていてもよい。そのような場合、ポリマーは、例えばポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリラート、ポリメタクリラート、又は無水マレイン酸コポリマーである。このような機能性ポリマーは、多量体複合体(即ち、ポリマーが2つ以上の分子と複合体化されている複合体)を調製する更なる機会を与える。例えば、ポリマーは、その長さに沿った任意の点、例えば末端で1つ又は複数の薬物分子を担持していてもよい。必要な場合には、従来の方法を用いてポリマーを固体支持体に結びつけてもよい。
【００１７】
2つのポリマー鎖Xは、同一でも異なっていてもよい。具体的には、各Xは、同一の化学的ポリマーを表していてもよく、異なる化学的ポリマーを表していてもよい。例えば、各Xは、PEG鎖を表していてもよく、一方のXがPEG鎖を表し他方のXが別のポリマー、例えばPVP又はタンパク質鎖を表していてもよい。
【００１８】
各ポリマーXは、単一の直鎖を含んでいてもよく、多数の短鎖又は長鎖で構成される分岐形態を有していてもよい。一般に、ポリマー鎖は、適切な末端基が始端又は終端になっており、鎖の他端が式Iの分子の残りの部分に接続される。例えば、PEG鎖は、アルコキシ、例えば、メトキシ、アリールオキシ、カルボキシ又はヒドロキシルから選択される末端基を有していてもよい。鎖が分岐している場合、各自由分岐末端が末端基を担持することになる。
【００１９】
各ポリマー鎖Xは、任意適切な分子量を有していてもよく、各ポリマー鎖Xの分子量は、他方のポリマー鎖Xと同じであっても異なっていてもよい。例えば、各鎖は、分子量が少なくとも5、10、15、20、30、又は40kDaであってもよい。一般に、各鎖の好適な最大分子量は60kDaである。複合体が血液循環から離れて組織へ浸透することを意図している場合、例えば、悪性腫瘍、感染症若しくは自己免疫疾患によって、又は外傷によって引き起こされる炎症の治療に使用される場合、ポリマー(X+X)の全分子量が2000〜30,000g/molの範囲にある複合体を使用することが有利となり得る。複合体を血液循環内に残存させることを意図している用途では、これよりも全分子量が大きいポリマー、例えば20,000〜75,000g/molの範囲のポリマーを使用することが有利となり得る。
【００２０】
pは、1から6までの整数、例えば1、2、又は、殊に、3を表す。
【００２１】
本発明の試薬はアミド基Yを含み、Yは、式Iに描くように、-CO-NR'-、又は、好ましくは-NR'-CO-(式中、R'はC1〜4アルキル基、例えばメチル基、又は殊に水素原子を表す)であってもよい。この基は、式Iに示すフェニル基に任意の位置で連結していてもよいが、-CO.Z基に対してパラ位にあることが好ましい。式Iのフェニル基は、必要な場合、更なる置換基を担持していてもよいが、非置換であることが好ましい。
【００２２】
脱離基Lは、例えば、-SR、-SO2R、-OSO2R、-N+R3、-N+HR2、-N+H2R、ハロゲン、又は-OΦ
【００２３】
(式中、Rは上記の意味であり、Φは少なくとも1つの電子吸引基、例えば-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NRCO2R、-NO、-NHOH、-NROH、-C=N-NHCOR、-C=N-NRCOR、-N+R3、-N+HR2、-N+H2R、ハロゲン、例えば塩素、又は殊に臭素若しくはヨウ素、-C≡CR、-C=CR2及び-C=CHRを表し、式中、各Rは独立して上記いずれかの意味である)を含む置換アリール基、殊にフェニル基を表していてもよい。アルキル基又はアリールスルホニル基が特に好適な脱離基であって、フェニルスルホニル又は、殊にトシルが殊に好適である。Lが2つ存在する場合、これらは異なる基であってもよいが、同一の基であることが好ましい。
【００２４】
別段の記載がない限り、式Iの化合物に存在する場合により置換された任意のアリール基、例えばフェニル基、又はヘテロアリール基上に存在してもよい置換基としては、例えば、アルキル(好ましくは、場合によりOH又はCO2Hで置換されたC1〜4アルキル、殊にメチル)、-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR.CO2R、-NO、-NHOH、-NR.OH、-C=N-NHCOR、-C=N-NR.COR、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R、ハロゲン、例えばフッ素又は塩素、-C≡CR、-C=CR2、及び-C=CHR(式中、各Rは独立して上記いずれかの意味である)から選択される1つ又は複数の同一若しくは異なる置換基が挙げられる。置換基が存在する場合、好適な置換基としては、例えば-CN、-NO2、-OR、-OCOR、-SR、-NHCOR、-NR.COR、-NHOH、及び-NR.CORが挙げられる。
【００２５】
本発明による殊に好適な試薬は、式
【００２６】
【化２】
2015521667.tif 000004
【００２７】
を有する。これらの試薬において、好ましくはXはポリエチレングリコール、殊にメトキシ末端ポリエチレングリコール、即ち、CH3O-(CH2CH2O)m-(式中、mはPEGにおける酸化エチレン単位の数である)である。加えて、これらの試薬においては、各Lはトシル基であり、従って、
【００２８】
【化３】
2015521667.tif 000005
【００２９】
であることが好ましい。式Iの化合物は、タンパク質又はペプチドへの複合体化のために使用し得る。便宜上、本明細書を通じて「タンパク質」という用語を使用し、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「タンパク質」という用語の使用は、「ペプチド」への言及も含むものと理解すべきである。
【００３０】
従って、本発明は、ポリマー複合体を調製する方法であって、一般式Iの化合物をタンパク質又はペプチドと反応させる工程を含む方法を更に提供する。得られる複合体は、一般式
【００３１】
【化４】
2015521667.tif 000006
【００３２】
(式中、X、p及びYは上記の意味であり、Pr1及びPr2のそれぞれが別々のタンパク質又はペプチド分子を表すか、Pr1及びPr2が一緒になって別々の2点で結合している単一のタンパク質又はペプチドPrを表す)を有する、従って、
【００３３】
【化５】
2015521667.tif 000007
【００３４】
であるかのいずれかである。好ましくは、Pr1及びPr2が共にタンパク質中のジスルフィド結合に由来する2つの硫黄原子に、又はタンパク質に付加したポリヒスチジンタグに存在する2つのヒスチジン残基に結合した単一のタンパク質を表す(即ち、得られる複合体は一般式IIaを有する)。
【００３５】
式Iの試薬において、Zは-CH.(CH2L)2又は-C(CH2L)(=CH2)を表す。これらの2つの基は化学的に等価である。式IでZが-CH.(CH2L)2を表している試薬、即ち、式Ia
【００３６】
【化６】
2015521667.tif 000008
【００３７】
の試薬を本発明の方法においてタンパク質と反応させるために使用する場合、反応は1つの脱離基Lの喪失と、結果として生じる式IでZが-C(CH2L)(=CH2)を表している試薬、即ち、式Ib
【００３８】
【化７】
2015521667.tif 000009
【００３９】
の試薬の形成によって進行する。この試薬は、タンパク質中の1つの求核基、例えば、システイン残基、ヒスチジン残基、又はリジン残基と反応する。その後、残存する脱離基Lが失われ、第2の求核基(タンパク質の第2の分子の中の、又は第1の求核基と同じタンパク質分子の中の)との反応が起こり、所望の複合体が形成される。従って、本発明の方法は、式Iaの化合物を出発物質として用いて実施することができ、その場合、式Ibの化合物をin situで形成しても、予め形成した式Ibの化合物を出発物質として用いてもよい。
【００４０】
本発明による複合体化反応は、WO2005/007197及びWO2009/047500に記載の反応条件下で実施してもよい。方法は、例えば、全ての反応物質が可溶な溶媒又は溶媒混合物中で実施してもよい。例えば、タンパク質は、水性反応媒体中でポリマー複合体化試薬と直接反応させてもよい。この反応媒体は、求核基のpH要件に応じて緩衝化してもよい。反応にとって最適なpHは、一般に少なくとも4.5であり、典型的には約5.0と約8.5の間、好ましくは約6.0から7.5である。最良の反応条件は、当然ながら採用する具体的な反応物質によって決まる。
【００４１】
水性反応媒体を使用する場合、3〜37℃の間の反応温度が一般に適切である。有機媒体(例えばTHF、酢酸エチル、アセトン)中で行われる反応は、典型的には室温以下の温度で行われる。
【００４２】
タンパク質中のジスルフィド結合に由来する2つの硫黄原子を介してタンパク質に結合させる場合、方法は、ジスルフィド結合をin situで還元し、その後、還元した生成物を式Iの試薬と反応させることによって実施してもよい。好ましくは、ジスルフィド結合を還元し、複合体化試薬を導入する前に過剰な還元剤を例えば緩衝液交換によって除去する。ジスルフィドは、従来の方法を用い、例えば、ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、又はトリス-カルボキシエチルホスフィンで還元することができる。
【００４３】
タンパク質は、化学量論的当量又はわずかに過剰な複合体化試薬Iを用いて効果的に複合体化させることができる。しかし、化学量論的過剰量の複合体化試薬を用いて複合体化反応を行うことも可能であり、これは、ある種のタンパク質にとっては望ましいこともある。過剰な試薬は、その後の複合体の精製時に、例えばイオン交換クロマトグラフィーによって容易に除去できる。
【００４４】
一般式IでZが-CH.(CH2L)2を表している化合物は、一般式
【００４５】
【化８】
2015521667.tif 000010
【００４６】
の化合物を一般式
【００４７】
【化９】
2015521667.tif 000011
【００４８】
の化合物と反応させることによって、又は一般式
【００４９】
【化１０】
2015521667.tif 000012
【００５０】
の化合物を一般式
【００５１】
【化１１】
2015521667.tif 000013
【００５２】
の化合物と反応させることによって調製してもよい。どちらの場合も、アミド基が形成される。当技術分野ではよく知られているように、反応させるとアミド基を形成するCO2H基は、反応を促進するために、例えば活性エステル、塩化アシル、若しくは無水物の形成によって、又はカルボジイミドなどの活性化剤を使用することにより直接アミンで適切に活性化させる。
【００５３】
以上説明したように、一般式IでZが-C(CH2L)(=CH2)を表している化合物は、対応する一般式IでZが-CH.(CH2L)2基を表している化合物から脱離基Lを除去することによって調製してもよい。
【００５４】
本発明による方法の直接的な生成物は、式Iにおけるフェニル環に付加したケト基COをまだ含む複合体、即ち、上記式II、殊に式IIaの複合体である。しかし、本発明の方法は、適切な条件下では可逆である。これは、用途によっては、例えば、タンパク質の急速な放出が求められる場合には望ましいこともあるが、他の用途では、タンパク質の急速な放出は望ましくないこともある。従って、ケト基を還元してタンパク質の放出を防ぐ部分、典型的にはヒドロキシル基OHを与えることにより複合体を安定化させることが望ましい。ただし、アミン基CH.NH2、CH.NHR又はCH.NR2(式中、各Rは独立して上記の意味である)を与える還元的アミノ化も可能である。これらの基は、必要な場合、更に反応させてもよい。例えばヒドロキシ基はエーテル化剤との反応によってエーテル基CH.ORに変換してもよい。ヒドロキシ基のアシル化剤との反応によってエステル基CH.O.C(O)Rを得てもよい。或いは、アミンのアシル化によってアミドCH.NHC(O)R又はCH.N(C(O)R)2を形成してもよい。従って、本発明による方法は、複合体中のケト基を還元させる追加の工程を含んでもよい。ホウ化水素、例えば水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム又はトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを還元剤として使用することが特に好適である。使用してもよいその他の還元剤としては、例えば塩化スズ(II)、アルミニウムアルコキシドなどのアルコキシド、及び水素化アルミニウムリチウムが挙げられる。
【００５５】
本発明の方法によって調製可能な複合体は新規なものであり、従って、本発明それ自体の一部を構成する。本発明による新規な複合体は、一般式
【００５６】
【化１２】
2015521667.tif 000014
【００５７】
(式中、X、p及びYは上記の意味であり、AはCO、CHOH、CH.NH2、CH.NHR、CH.NR2、CH.ORCH.O.C(O)R、CH.NHC(O)R、又はCH.N(C(O)R)2基を表し、式中、各Rは上記の意味であり、Pr1及びPr2のそれぞれが別々のタンパク質又はペプチド分子を表すか、Pr1及びPr2の両方が共に別々の2点で結合している単一のタンパク質又はペプチドを表すかのいずれかである)を有する。好適な複合体は、一般式
【００５８】
【化１３】
2015521667.tif 000015
【００５９】
(式中、X、p、Y及びAは上記の意味であり、Prは別々の2点で結合している単一のタンパク質又はペプチドを表す)を有する。
【００６０】
当然ながら、式Iの複合体化試薬の2種以上をタンパク質に複合体化させることも可能であり、その場合、タンパク質は適切な付加点を十分含んでいる。例えば、2つの異なるジスルフィド結合を含むタンパク質において、又は、1つのジスルフィド結合を含むと共にポリヒスチジンタグを担持するタンパク質において、タンパク質の分子1つ当たり式Iの試薬の2つの分子を複合体化させることが可能である。
【００６１】
本発明の方法を用いて複合体化させ得る適切なタンパク質としては、例えば、ペプチド、ポリペプチド、抗体、抗体断片、酵素、サイトカイン、ケモカイン、受容体、血液因子、ペプチドホルモン、毒素、転写タンパク質、又は多量体タンパク質が挙げられる。
【００６２】
以下に本発明を用いて複合体化させ得る具体的なタンパク質を幾つか記載する。酵素としては、炭水化物特異性酵素、タンパク質分解酵素など、例えば、US4,179,337に開示されるオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ及びリガーゼが挙げられる。対象とされる特異性酵素としては、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセルブロシダーゼ、グルクロニダーゼ、及びグルタミナーゼが挙げられる。
【００６３】
血液タンパク質としては、アルブミン、トランスフェリン、第VII因子、第VIII因子又は第IX因子、フォンヴィレブランド因子、インスリン、ACTH、グルカゴン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、チモシン、副甲状腺ホルモン、色素ホルモン(pigmentary hormone)、ソマトメジン、エリスロポエチン、黄体形成ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、インターロイキン、インターフェロン、例えばIFN-α又はIFN-β、コロニー刺激因子、ヘモグロビン、サイトカイン、抗体、抗体断片、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、及び組織プラスミノゲン活性化因子が挙げられる。
【００６４】
その他の対象とされるタンパク質は、例えばポリ(アルキレンオキシド)などのポリマーと複合体化させるとアレルギー誘発性が低減し、結果として寛容誘導剤としての使用に適するようになるものとして、DreborgらによりCrit. Rev. Therap. Drug Carrier Syst. (1990) 6 315〜365頁に開示されるアレルゲンタンパク質である。開示されたアレルゲンの中には、ブタクサ抗原E、ミツバチ毒、ダニアレルゲンなどが含まれている。
【００６５】
IgG、IgE、IgM、IgA、IgD及びそれらの断片などの免疫グロブリンと同様、免疫グロブリン、オボアルブミン、リパーゼ、グルコセレブロシダーゼ、レクチン、組織プラスミノゲン活性化因子及びグルコシル化インターロイキンなどのグリコポリペプチド、インターフェロン、並びにコロニー刺激因子なども対象である。
【００６６】
特に対象とされているのは、臨床医学において診断及び治療目的で使用される、受容体及びリガンドを結合させるタンパク質、並びに抗体及び抗体断片である。抗体は、単独で使用されても、別の原子又は分子、例えば放射性同位体又は細胞毒性/抗感染症薬と共有結合によって複合体化(「ロード」)されていてもよい。免疫原性のポリマー-タンパク質複合体を製造するため、エピトープをワクチン接種に使用してもよい。
【００６７】
特に好適なタンパク質としては、抗体断片、例えばIgGのFab断片、及びIFN-α、IFN-β及びコンセンサスIFNなどのインターフェロンが挙げられる。
【００６８】
タンパク質は、必要な場合には誘導体化又は官能化されていてもよい。特に、複合体化に先立ち、タンパク質、例えば天然タンパク質を、タンパク質上の感応基を保護するために様々な保護基と反応させておいてもよく、或いは、本発明の方法又は代替的な方法を用いて1つ又は複数のポリマー又は他の分子と予め複合体化させておいてもよい。本発明の好適な一実施形態では、タンパク質はポリヒスチジンタグを含み、これが本発明の複合体化試薬の標的となり得る。
【００６９】
本発明は、本発明による複合体を薬学的に許容される担体と共に含み、場合により、本発明の複合体に加えて更なる有効成分を含有する医薬組成物、療法に使用される本発明による複合体、医薬品の製造方法における本発明による複合体の使用、及び本発明による複合体又は医薬組成物の薬学的に効果的な量を患者に投与することを含む患者を治療する方法を更に提供する。
【００７０】
本発明の複合体化試薬は極めて有用であり、タンパク質に対して高効率の部位特異的複合体化が可能であって、結果として得られる新規な複合体は、高レベルの安定性を示すことがわかっている。以下の実施例に説明するように、Congら、Bioconjugate Chemistry 23 (2012)、248〜263頁の相当する既知の試薬に対し、効率の劇的な向上が達成される。
【００７１】
添付図面は、以下に示す実施例において得られた結果を示している。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】実施例2で得られたSDS-PAGEゲルを示す。
【図２】実施例3で得られたSDS-PAGEゲルを示す。
【図３】実施例3で得られたSDS-PAGEゲルを示す。
【図４】実施例3で得られたSDS-PAGEゲルを示す。
【図５】実施例4で得られたSDS-PAGEゲルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
以下の実施例は、本発明を説明する。
【実施例】
【００７４】
(実施例1:PEG試薬1の調製)
【００７５】
【化１４】
2015521667.tif 000016
【００７６】
40(2×20)kDaの分岐PEGアミン3(MPEGはCH3O.CH2CH2O)m-である)を、NOF CORPORATION社から購入(SUNBRIGHT GL2-400PA、ロット:M7D902)した。4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)メチル]アセチル]安息香酸-NHSエステル4を、Brocchiniら、Nat.Protoc. 2006、1(4)、2241〜2252頁に従って調製した。
【００７７】
マグネチックスターラーバーを入れた一口丸底フラスコに、分岐PEGアミン3(300mg)と、トルエン(8mL)とを添加した。得られた均質な溶液をロータリーエバポレーターを用いて減圧下で2時間蒸発させ、固形残渣を残した。残渣をジクロロメタン(15mL)に溶解させ、フラスコをセプタムでシールし、混合物をアルゴン下で撹拌した。溶液に活性化リンカー4(27mg)を添加し、フラスコをセプタムで再度シールし、反応物を室温で一晩撹拌した。セプタムを除去し、ロータリーエバポレーターを用い、減圧下で揮発分を蒸発によって除去した。アセトン(20mL)を残渣に添加し、穏やかな加熱(30℃)によって固形物を溶解させた。得られた溶液を非吸収性脱脂綿でろ過して50mLファルコンチューブに入れた。溶液をドライアイス浴で冷却すると、粘度の高い析出物が得られた。30分間の遠心分離(-9℃、4000rpm)によって、析出物を沈降させた。上澄みをデカントし、30℃にてペレットを再度アセトン(20mL)に溶解させた。析出、沈降及びデカントを前述の通り行った。アセトン析出と沈降の三回目のサイクルを行い、上澄みをデカントした後にペレットを-80℃にて冷凍し、次いで高真空下で恒量まで乾燥させると、オフホワイト色の固体(227mg)としてPEG試薬1が得られた。
【００７８】
【数１】
2015521667.tif 000017
【００７９】
(実施例2:PEG試薬1及びPEG試薬2のヒトIgGのFab断片との反応性の比較)
本実施例では、実施例1のPEG試薬1を以下の試薬、即ち、上記CongらのMPEGがCH3O.(CH2CH2O)m-1-CH2CH2-であるPEG試薬2と比較した。
【００８０】
【化１５】
2015521667.tif 000018
【００８１】
ヒトIgGのFab断片溶液(4.0mg、0.909mL、Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.社、Cat.No.009-000-007)をpH7.4の50mMリン酸ナトリウム(150mMのNaClと20mMのEDTAを含有)で4.95mLに希釈した。PEG化が起こるよう、鎖間ジスルフィド結合を還元するためにこのFab断片溶液に1.0MのDTT(50μL)を添加し、最終DTT濃度を10mMとした。得られた溶液を穏やかに混合し、次いで4℃にて1時間放置した。この還元Fabの溶液をPD-10脱塩用カラムを用いてpH7.4の50mMリン酸ナトリウム(150mMのNaClと20mMのEDTAを含有)へと緩衝液交換した。還元Fab溶液を2等分した(3.5mL、およそ2mg)。2種類のPEG試薬、即ちPEG試薬1とPEG試薬2をpH7.4の50mMリン酸ナトリウム(150mMのNaClと20mMのEDTAを含有)に20mg/mLの割合で溶解させた。Fab溶液の一方にPEG試薬1(75μL、1.5mg)を添加し、他方にPEG試薬2(75μL、1.5mg)を添加した。両反応物を穏やかに混合し、次いで4℃にて20時間放置した。20時間後、粗反応混合物をSDS-PAGEによって分析した。ゲルをInstantBlue(商標)で染色し、IMAGEQUANT(商標)LAS 4010装置で画像化した。結果を図1に示す。図1では、レーンMはNovexタンパク質スタンダードを示し、レーン1はヒトIgGのFab断片を示し、レーン2は20時間時点のPEG試薬2からのPEG化生成物を示し、レーン3は20時間時点のPEG試薬1からのPEG化生成物を示している。このSDS-PAGE分析から、PEG試薬1及びPEG試薬2は両方ともFab断片への複合体化に成功したものの、PEG試薬1の場合の複合体化効率は26%であり、PEG試薬2の場合(10%)の2倍以上であったことがわかる。
【００８２】
(実施例3:PEG試薬1及びPEG試薬2を用いて調製したIFNα-2a複合体の安定性の比較)
複合体の調製:IFNα-2a(6.5mg、0.845mg/mL)のpH7.4の50mMリン酸ナトリウム緩衝液(150mMのNaClと20mMのEDTAを含有)溶液を調製した。このタンパク質溶液を緩衝液(313μL)で希釈し、次いで1.0mMのDTT水溶液(187.5mL)を添加して最終DTT濃度25mM及び反応物体積7.5mLとした。穏やかに混合した後、反応物を室温にて30分間放置した。還元したタンパク質をPD-10カラムを用いてpH7.4の50mMリン酸ナトリウム(150mMのNaClと20mMのEDTAを含有)へと緩衝液交換した。溶出したタンパク質溶液を遠心分離(3000g、4℃、5分)にかけ、次いで上澄みを280nm(0.532mg/mL)でのUV吸光度測定によって定量化した。このタンパク質溶液を緩衝液で0.10mg/mLに希釈した。PEG1及びPEG2を20mg/mLの割合でpH7.4の50mMリン酸ナトリウム(150mMのNaClと20mMのEDTAを含有)に溶解させた。2つのバイアルそれぞれに還元IFNα-2a(2.5mg、24.8mL)を充填し、一方のバイアルにPEG試薬1(4.9mg、0.245mL)を添加し、他方のバイアルにPEG試薬2(4.9mg、0.245mL)を添加した。反応物を穏やかに混合し、次いで4℃にて18時間放置した。最終反応混合物中の還元タンパク質を5mg/mLの硫酸銅(12.18μL)と50:50(mM)のGSH/GSSG(0.25mL)とを順次添加することによって全て酸化させた。再酸化反応を4℃にて一晩実施した。反応混合物をpH4の100mM酢酸ナトリウムで4倍に希釈し、次いで陽イオン交換クロマトグラフィー(Macrocap(商標)SP)により、0.60〜0.65MのNaClにて溶出する所望の複合体を用いたpH4の100mM酢酸ナトリウム(1.0MのNaCl)の段階的勾配溶出を使用して精製した。
【００８３】
安定性比較1.PEG試薬1及びPEG試薬2を用いて調製したIFNα-2a複合体に対するストレステスト:1及び2を用いて(フィルター滅菌PBS中で)PEG化したIFNα-2a試料それぞれに対し、4つのバイアルを用意した。各バイアルに20μLの複合体を濃度200μg/mLで充填した。試験試料それぞれについて2つのバイアルが10mMのDTTを含んでいた。DTTを含むバイアル1つとDTTを含まないバイアル1つを1時間50℃に加熱した。残りのバイアルは10分間90℃に加熱した。試料(非複合タンパク質及びストレス無負荷の複合体と共に)をSDS-PAGEによって分析した。ゲルはInstantBlue(商標)で染色し、IMAGEQUANT(商標)LAS 4010装置を用いて画像化した。PEG1-IFNα-2a及びPEG2-IFNα-2aの場合の結果をそれぞれ図2及び図3に示す。図2及び図3において、レーンMはNovexタンパク質スタンダードを示し、レーン1はIFNα-2aを示し、レーン2はPEG-IFNα-2aを示し、レーン3は50℃、1時間のPEG-IFNα-2aを示し、レーン4は50℃、DTT、1時間のPEG-IFNα-2aを示し、レーン5は90℃、DTT、10分間のPEG-IFNα-2aを示し、レーン6は90℃、DTT、10分間のPEG-IFNα-2aを示す。
【００８４】
図2及び図3によれば、試験を行った複合体は両方とも、1時間50℃としても安定していた。しかし、10mMのDTTの存在下で50℃にて1時間加熱した後は、PEG試薬2を用いて調製した複合体では、遙かに多量の遊離タンパク質及び凝集が観察される。2を用いてPEG化した複合体では、10分間の90℃での熱ストレスが遊離タンパク質の放出をもたらしたが、1を用いてPEG化した複合体ではそうならなかった。
【００８５】
安定性の比較2.PEG試薬1及びPEG試薬2を用いてPEG化したIFNα-2a複合体に対する28日間40℃加速安定性試験:2種類の試験試料のフィルター滅菌PBS(0.01%(w/v)NaN3を含有)溶液をタンパク質濃度200μg/mLで作成した。PEG1-IFNα-2a及びPEG2-IFNα-2aそれぞれについて、100μLの試験試料を4つのバイアルに充填した。各試料について1つのバイアルを-80℃にて即座に冷凍した(t=0日)。残りの3つはparafilm(登録商標)でシールし、次いで40℃にて保管した。7、14及び28日目に試料の保管をやめ、-80℃にて試験が完了するまで冷凍した。試験試料を37℃に自動温度調節した水浴で瞬間解凍し、SDS-PAGE(InstantBlue(商標)で染色しIMAGEQUANT(商標)LAS 4010装置で画像化)によって分析した。結果を図4に示す。図4では、レーンMはNovexタンパク質スタンダードを示し、レーン1はIFNα-2a(1μg)を示し、レーン2は0日目のPEG2-IFNα-2aを示し、レーン3は7日目のPEG2-IFNα-2aを示し、レーン4は14日目のPEG2-IFNα-2aを示し、レーン5は28日目のPEG2-IFNα-2aを示し、レーン6は0日目のPEG1-IFNα-2aを示し、レーン7は7日目のPEG1-IFNα-2aを示し、レーン8は14日目のPEG1-IFNα-2aを示し、レーン6は28日目のPEG1-IFNα-2aを示す。図4では、PEG2-IFNα-2aは、各時点で遊離タンパク質が多く、残っている複合体が少なくなっており、PEG1-IFNα-2aよりも安定性が低いことが明らかである。
【００８６】
(実施例4:IFN-β-1bのPEG試薬1との複合体化)
ジスルフィドを還元したpH7.3のIFN-β-1b(9.5mg、0.3mg/mL)に、pH7.3のPEG試薬1(1.7mL、20mg/mL)の溶液を添加した。得られた溶液を22℃にて4時間インキュベートし、直後に粗反応混合物をSDS-PAGEによって分析した。ゲルはInstantBlue(商標)で染色し、IMAGEQUANT(商標)LAS 4010装置を用いて画像化した。結果を図5に示す。図5では、レーンMはNovexタンパク質スタンダードであり、レーン1は開始時のIFN-β-1bであり、レーン2は還元したIFN-β-1bであり、レーン3はPEG試薬1とIFN-β-1bとの反応混合物である。SDS-PAGE分析から、生成物帯域可視レベルが110kDaタンパク質スタンダードと同じIFN-β-1bのPEG化が成功したことがわかる。
【図１】
2015521667.tif 000024
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2015521667.tif 000028
【国際調査報告】
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