(57)【要約】【解決手段】機能的ゲノム分析のクローン解析の方法が提供される。本発明の態様は、複数のエフェクタ構築体サブセットから構成されたパッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリで標的細胞の集団を形質導入することを含んでおり、ウイルスエフェクタライブラリのエフェクタ構築体サブセットは夫々、異なるクローンバーコードに結合した共通のエフェクタカセットを有する複数のエフェクタ構築体を含んでいる。エフェクタ構築体サブセットに異なるクローンバーコードを含むことにより、特異的表現型を示す形質導入された標的細胞内のエフェクタ構築体サブセットのクローン表示を決定することが可能になる。本発明の態様は、本方法の実行に使用される組成、例えばライブラリ及びライブラリの要素を更に含んでいる。
2015516163.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なるクローンバーコードに結合した共通のエフェクタカセットを含む複数のエフェクタ構築体を夫々有する複数のエフェクタ構築体サブセットを含むパッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリで標的細胞の集団を形質導入すること、及び
特異的表現型を示す形質導入された標的細胞を選択すること
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
(a) 前記エフェクタ構築体サブセットのエフェクタ構築体を識別し、
(b) 異なるクローンバーコードを夫々有するエフェクタ構築体サブセットの固有のクローン集団を識別し、
(c) 固有のクローン集団夫々の細胞の数を決定して
選択された標的細胞内の各エフェクタ構築体サブセットのクローン表示を定量化することを更に有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各エフェクタ構築体サブセットのクローン表示は表示配列分析によって測定されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
各エフェクタカセットは固有のエフェクタバーコードを有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
選択された形質導入細胞から、異なるバーコードに結合した複数のエフェクタカセットを分離することを更に有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記エフェクタカセットは、shRNA エフェクタカセット，siRNA エフェクタカセット，ミクロRNA エフェクタカセット，アンチセンスRNA エフェクタカセット，リボザイムエフェクタカセット，非コードRNA エフェクタカセット，小型RNA エフェクタカセット，デコイRNA エフェクタカセット，anti-mirRNA エフェクタカセット，生物活性ペプチドエフェクタカセット，タンパク質ドメインエフェクタカセット及びタンパク質エフェクタカセットから成る群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記パッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリは、レトロウイルスベクタライブラリ、レンチウイルスベクタライブラリ、アデノウイルスベクタライブラリ又はアデノ随伴ウイルスベクタライブラリであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
パッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリのエフェクタ構築体サブセットであって、
異なるクローンバーコードに結合した共通のエフェクタカセットを有する複数のエフェクタ構築体を含んでいることを特徴とするエフェクタ構築体サブセット。
【請求項９】
前記複数のエフェクタ構築体は、異なるクローンバーコードを有する10以上の構築体を含んでいることを特徴とする請求項８に記載のエフェクタ構築体サブセット。
【請求項１０】
前記エフェクタカセットは、CDKN2A，PTEN，EGFR，TP53，PIK3CA，RB1，NF1，MET，CDK4，ATM，PDGFRA，MDM2，APC，EP300，ERCC2，KRAS，PIK3CG，BRCA1，STK11，BRCA2，ERBB2，BRAF，FBXW7，MLH1，MSH2，SMAD4，CDKN2B，FGFR3，MSH6，PIK3CB，PIK3R1，ERCC3，JAK2，KIT，RET，AKT1，PLCG1，SMARCA4，CDH1，CDKN1A，DNMT1，ERBB3，NOTCH1，CCND2，MYC，NRAS，AKT2，CREBBP，NF2，NTRK1，PDGFRB，ABL1，CCND1，CDK6，HSP90AA1，TCF3，CTNNB1，FGFR1，FIGF，HRAS，NTRK3，WT1，CDC42，EXT1，FOXO3，MDM4，PDGFA，PMS2，RUNX1，VHL，WRN，ALK，AR，CDKN2C，CHEK1，CHEK2，ERCC5，FAS，FGFR2，HDAC1，KDR，NOS3，PTCH1，TERT，TSC2，BLM，CBL，COL1A1，EVI1，MAP2K4，PDGFB，SEPT9，TGFBR2，TRRAP，EGF，FLT3，GRB2，NCAM1，NOS2，BUB1B，CDKN1B，DIRAS3，DOT1L，EPHB1，EPHB6，GNAS，HIF1A，MRE11A，PLCG2，PRKDC，PTPN11，RAD50，RAD51，SPRY2，FANCA，FANCF，FGFR4，FLT1，FOXO1，MAP2K1，PPP2R1A，PTGS2，SHC1，TPO，XPA，XPC，BAI3，BARD1，BCL2，CARM1，CDK2，CERK，DGKZ，E2F1，EPHA3，EPO，ERBB4，FANCE，FH，FLT4，IRS1，MAPK1，NBN，PLCB1，PRKCZ，SMARCB1，TCF12，TPR，VEGFA，ABCC3，CD44，CDKN2D，CSF1R，DPYD，ESR2，EWSR1，FANCD2，FOS，LMO2，NOTCH3，PARP1，PRKCA，SMAD2，SMAD3，TSC1，ADCY9，AGAP2，BAX，BCL11A，BCR，BIRC5，CAV1，CCNE1，DGKB，EPHB4，ERCC6，ESR1，ETV1，FLNC，FN1，GSK3B，HDAC2，HOXA9，MEN1，MYH9，NCOA2，PCNA，PML，PPARG，PPARGC1A，RARA，SKP2，SOCS1，SOS1，SRC，TEK，TOP2A，TPM3，ABCA1，APC2，AURKA，CCND3，CD40LG，CDX2，CEBPA，CYP19A1，DNMT3B，ERCC1，ERCC4，ETV4，FES，GAB1，HGF，IFNG，IGF2R，INSR，KLF6，MPL，MUTYH，MYCL1，NR3C1，PIK3C3，PIK3CD，PIK3R2，PPP1R3A，PPP2R1B，PTPRB，RECQL4，ROS1，RPS6KA2，SDHB，SP1，THBS1，TP73，ANAPC5，ATR，BCL3，BIRC6，BRIP1，CBFA2T3，CDC73，CDK7，CLTC，CSMD3，CSNK1G2，CTNNA1，CYP1B1，DDB2，DGKI，ELOVL2，EP400l，EPHA8，EPHB2，ERG，EXT2，FANCC，FANCG，FRAP1，GATA1，GMPS，GPC3，HDAC4，HIPK2，HMGA1，HOXD11，IDH1，IGF1R，IGFBP3，KALRN，KAT2B，LAMA1，LAMP1，LDHA，LTBP1，MAPK3，MAPK8IP2，MINPP1，MLL，MLL3，MST1R，MUC1，MYST4，NAV3，NOTCH2，NSD1，PAFAH1B2，PAK7，PARP2，PIGS，POLE，PPP1R13L，PPP2CB，PPP2R2B，PTCH2，PTK2，PTPRD，RAD51L1，RHEB，RHOA，RPS6KA1，RPS6KB1，RUNX1T1，SDHC，SDHD，SNCG，SOCS2，SPEN，TFE3，TGFBR1，TLX1，TNK2及びZNF331から成る群から選ばれた少なくとも１つのタンパク質の機能を調整するように構成されていることを特徴とする請求項８に記載のエフェクタ構築体サブセット。  
【請求項１１】
前記エフェクタカセットは、shRNA エフェクタカセット，siRNA エフェクタカセット，ミクロRNA エフェクタカセット，アンチセンスRNA エフェクタカセット，リボザイムエフェクタカセット，非コードRNA エフェクタカセット，小型RNA エフェクタカセット，デコイRNA エフェクタカセット，anti-mirRNA エフェクタカセット，生物活性ペプチドエフェクタカセット，タンパク質ドメインエフェクタカセット及びタンパク質エフェクタカセットから成る群から選ばれることを特徴とする請求項８に記載のエフェクタ構築体サブセット。
【請求項１２】
複数のエフェクタ構築体サブセットを含むパッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリであって、
前記ウイルスエフェクタライブラリの各エフェクタ構築体サブセットは、異なるクローンバーコードに夫々結合した共通のエフェクタカセットを有する複数のエフェクタ構築体を含んでいることを特徴とするパッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリ。
【請求項１３】
前記エフェクタカセットは夫々固有のエフェクタバーコードを有することを特徴とする請求項１２に記載のパッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリ。
【請求項１４】
前記エフェクタカセットは、shRNA エフェクタカセット、siRNA エフェクタカセット、ミクロRNA エフェクタカセット、アンチセンスRNA エフェクタカセット、リボザイムエフェクタカセット、非コードRNA エフェクタカセット、小型RNA エフェクタカセット、デコイRNA エフェクタカセット、anti-mirRNA エフェクタカセット、生物活性ペプチドエフェクタカセット、タンパク質ドメインエフェクタカセット及びタンパク質エフェクタカセットから成る群から選ばれることを特徴とする請求項１２に記載のパッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリ。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれかに記載のパッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリで形質導入された細胞を含む形質導入された標的細胞の集団。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒトゲノム計画のような様々なゲノムワイドの配列決定プロジェクトの結果、研究者は現在、多くのヒト遺伝子の配列を知っている。しかしながら、これらの遺伝子各々の一又は複数の機能を明らかにするツールを開発するという差し迫った必要性がある。重要なことは、機能的ゲノム分析が、薬剤標的の発見及び検証を促進するということである。
【０００２】
遺伝子の機能を研究するために複数の技術が開発されており、このような研究は機能的ゲノム分析と総称される場合があり、インビトロ及びインビボの両方で遺伝子産物の選択的な不活性化又は活性化に基づいている。遺伝子産物を標的とすべく使用され得るエフェクタは、アンチセンスRNA 、リボザイム、マキシザイム（maxizyme）及びアプタザイム（aptazyme）のような触媒RNA （例えば、クワバラ，ティ．（Kuwabara,T.）等著，「Trends Biotechnol.」，18，p.462 −468 ，2000年、及びファモルク，エム（Famulok,M.），ヴェルマ，エス（Verma,S.）著，「Trends Biotechnol.」，20，p.462 −468 ，2002年参照）、アプタマ及びイントラマ（intramer）のようなタンパク結合RNA モチーフ（再度、例えばクワバラ，ティ．（Kuwabara,T.）等著，「Trends Biotechnol.」，18，p.462 −468 ，2000年参照）、並びに、生物活性ペプチド、タンパク質ドメイン又はアンチセンスRNA  に基づく遺伝抑圧要素（例えば、ロビンソン，アイ．ビー．（Robinson, I. B.）及びグドコフ，エー．ブイ（Gudkov, A. V）著，「Methods in Molecular Biology, Tumor Suppressor Genes: Pathways and Isolation Strategies」，ワフィック，エス．イー（Wafik,S.E）編，Humana Press Inc.，222 ，p.411 −434 ，2002年参照）を含んでいるがこれらに制限されない。更に、遺伝子構築体から発現して遺伝子構築体によって導入される全長タンパク質の発現は、細胞の遺伝子機能を研究するために非常に効果的な機能獲得方法であることが証明されている。  
【０００３】
RNAiは、二本鎖RNA による遺伝子の発現の配列特異的な転写後抑制である。RNAiは、短干渉RNA （siRNA ）と称される21〜25のヌクレオチドの二本鎖RNA 分子によって媒介される。siRNA は、細胞の遺伝子構築体又はミクロRNA 前駆体から発現した二本鎖前駆体のショートヘアピン型RNA （shRNA ）の酵素切断によって誘導され得る。siRNA は更に、細胞の外側で化学的又は酵素的に合成されて、その後、細胞に導入され得る（例えば、ファイア（Fire）等著，「Nature」，391 ，p.806 −11，1998年、トゥシュル（Tuschl）等著，「Genes and Dev.」，13，p.3191−97，1999年、及びエルバシュール（Elbashir）等著，「Nature」，411 ，p.494 −498 ，2001年参照）。
【０００４】
二本鎖siRNA は、一本鎖のsiRNA に少なくとも部分的に相補的な配列を有するメッセンジャRNA （mRNA）の合成、処理又は翻訳を標的破壊するか、切断するか又は阻止することにより遺伝子抑制を媒介する。哺乳類細胞に導入された（19〜29のヌクレオチド長さの）短いsiRNA は配列特異的遺伝子抑制を媒介するが、（約30を超えるヌクレオチドの）長い二本鎖RNA は、遺伝子抑制に加えて、インターフェロン応答のような非特異性な応答を引き起こすことが示されている。
【０００５】
従って、siRNA は、遺伝子産物の選択的な不活性化（抑制）に使用され得る。siRNA の使用における典型的な手法は、各標的遺伝子に対する様々なsiRNA の効果を研究することであり、すなわち、一度に１つの遺伝子を不活性化することにより機能的なスクリーンを行なうことである。複数の会社（例えば、Dharmacon，Qiagen及びAmbion）は、このような遺伝子ノックダウン実験に使用され得る予め作られたカスタムsiRNA 構築体を現在提供している。更に、連続的なsiRNA 発現を生じさせるプラスミド及びウイルスのshRNA 構築体又はミクロRNA 構築体を開発することによって、合成siRNA の遺伝子抑制効果の一時的性質を克服するという進歩を遂げた。これらのベクタは、RNA ポリメラーゼIII プロモータ（U6又はH1）から折り返しステムループ転写（ショートヘアピン型shRNA  ）の合成を導くか、又はRNA ポリメラーゼIIプロモータからミクロRNA の合成を導く。ショートヘアピン構造は、その後、細胞内処理の後に非ヘアピン型二本鎖siRNA 構造体に変換される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第03／022052号パンフレット
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
RNAi技術は、単一の遺伝子の一又は複数の機能をノックダウンするために有効に使用され得る。或いは、遺伝子スクリーン法が、アレイ型又はプール型の異なる遺伝子を各々標的にする一組の合成構築体又は遺伝子構築体の導入に基づいて、複数の遺伝子の機能を研究するために採用され得る。現在、RNAi遺伝子機能分析の研究は、細胞に基づいた表現型応答の複雑さによって主に制限されている。不均一な細胞集団の様々な異なる細胞応答に対処することができるRNAi遺伝子機能分析のための改善された技術を開発するという著しい必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
機能的ゲノム分析のクローン解析の方法が提供される。本発明の態様は、異なるクローンバーコードに結合した共通のエフェクタカセットを有する複数のエフェクタ構築体を夫々含む複数のエフェクタ構築体サブセットから構成されたパッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリで標的細胞の集団を形質導入することを含んでいる。エフェクタ構築体サブセットに異なるクローンバーコードを含むことにより、特異的表現型を示す形質導入された標的細胞内のエフェクタ構築体サブセットのクローン表示の決定が可能になる。本発明の態様は、本方法の実行に使用される組成、例えばライブラリ及びライブラリの要素を更に含んでいる。
【０００９】
ある実施形態によれば、本開示の方法の態様は、異なるクローンバーコードに結合した共通のエフェクタカセットを含む複数のエフェクタ構築体を夫々有する複数のエフェクタ構築体サブセットを含むパッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリで標的細胞の集団を形質導入すること、及び、特異的表現型を示す形質導入された標的細胞を選択することを含んでいる。本方法は、前記エフェクタ構築体サブセットのエフェクタを識別し、異なるクローンバーコードを夫々有するエフェクタ構築体サブセットの固有のクローン集団を識別し、固有のクローン集団夫々の細胞の数を決定することにより、選択された標的細胞内の各エフェクタ構築体サブセットのクローン表示を定量化することを更に含んでいる。ある態様では、各エフェクタ構築体サブセットのクローン表示は表示配列分析によって測定される。本方法によれば、各エフェクタカセットは固有のエフェクタバーコードを含んでもよい。
【００１０】
本開示の方法は、選択された形質導入細胞から、異なるバーコードに結合した複数のエフェクタカセットを分離することを更に含んでもよい。ある態様では、分離は増幅工程を含む。
【００１１】
ある実施形態によれば、前記ウイルスエフェクタライブラリは、形質導入細胞の数より大きい複雑度を有する。例えば、エフェクタライブラリの複雑度は、形質導入細胞の数の５倍以上であってもよい。ある実施形態によれば、前記ウイルスエフェクタライブラリは５以上の固有のエフェクタ構築体サブセットを含んでいる。ある態様では、各エフェクタ構築体サブセットは、異なるクローンバーコードを夫々有する100 以上の異なるエフェクタを含んでいる。
【００１２】
前記エフェクタカセットはRNAiエフェクタカセットであってもよい。対象のRNAiエフェクタカセットはshRNA エフェクタカセット、siRNA エフェクタカセット及びミクロRNA エフェクタカセットを含んでいる。ある態様では、前記エフェクタカセットは、アンチセンスRNA エフェクタカセット、リボザイムエフェクタカセット、非コードRNA エフェクタカセット、小型RNA エフェクタカセット、デコイRNA エフェクタカセット又はanti-mirRNA エフェクタカセットである。ある実施形態によれば、前記エフェクタカセットは、生物活性ペプチドエフェクタカセット、タンパク質ドメインエフェクタカセット又はタンパク質エフェクタカセットである。本方法によれば、前記パッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリは、レトロウイルスエフェクタライブラリ、レンチウイルスエフェクタライブラリ、アデノウイルスエフェクタライブラリ、又はアデノ随伴ウイルスベクタライブラリである。
【００１３】
上述したように、本開示の態様は、パッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリのエフェクタ構築体サブセットを含んでいる。ある実施形態によれば、パッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリのエフェクタ構築体サブセットが提供され、該エフェクタ構築体サブセットは、異なるクローンバーコードに結合した共通のエフェクタカセットを有する複数のエフェクタ構築体を含んでいる。ある態様では、前記複数のエフェクタ構築体は、異なるクローンバーコードを有する10以上の構築体を含んでいる。
【００１４】
ある実施形態によれば、前記エフェクタカセットは、CDKN2A，PTEN，EGFR，TP53，PIK3CA，RB1，NF1，MET，CDK4，ATM，PDGFRA，MDM2，APC，EP300，ERCC2，KRAS，PIK3CG，BRCA1，STK11，BRCA2，ERBB2，BRAF，FBXW7，MLH1，MSH2，SMAD4，CDKN2B，FGFR3，MSH6，PIK3CB，PIK3R1，ERCC3，JAK2，KIT，RET，AKT1，PLCG1，SMARCA4，CDH1，CDKN1A，DNMT1，ERBB3，NOTCH1，CCND2，MYC，NRAS，AKT2，CREBBP，NF2，NTRK1，PDGFRB，ABL1，CCND1，CDK6，HSP90AA1，TCF3，CTNNB1，FGFR1，FIGF，HRAS，NTRK3，WT1，CDC42，EXT1，FOXO3，MDM4，PDGFA，PMS2，RUNX1，VHL，WRN，ALK，AR，CDKN2C，CHEK1，CHEK2，ERCC5，FAS，FGFR2，HDAC1，KDR，NOS3，PTCH1，TERT，TSC2，BLM，CBL，COL1A1，EVI1，MAP2K4，PDGFB，SEPT9，TGFBR2，TRRAP，EGF，FLT3，GRB2，NCAM1，NOS2，BUB1B，CDKN1B，DIRAS3，DOT1L，EPHB1，EPHB6，GNAS，HIF1A，MRE11A，PLCG2，PRKDC，PTPN11，RAD50，RAD51，SPRY2，FANCA，FANCF，FGFR4，FLT1，FOXO1，MAP2K1，PPP2R1A，PTGS2，SHC1，TPO，XPA，XPC，BAI3，BARD1，BCL2，CARM1，CDK2，CERK，DGKZ，E2F1，EPHA3，EPO，ERBB4，FANCE，FH，FLT4，IRS1，MAPK1，NBN，PLCB1，PRKCZ，SMARCB1，TCF12，TPR，VEGFA，ABCC3，CD44，CDKN2D，CSF1R，DPYD，ESR2，EWSR1，FANCD2，FOS，LMO2，NOTCH3，PARP1，PRKCA，SMAD2，SMAD3，TSC1，ADCY9，AGAP2，BAX，BCL11A，BCR，BIRC5，CAV1，CCNE1，DGKB，EPHB4，ERCC6，ESR1，ETV1，FLNC，FN1，GSK3B，HDAC2，HOXA9，MEN1，MYH9，NCOA2，PCNA，PML，PPARG，PPARGC1A，RARA，SKP2，SOCS1，SOS1，SRC，TEK，TOP2A，TPM3，ABCA1，APC2，AURKA，CCND3，CD40LG，CDX2，CEBPA，CYP19A1，DNMT3B，ERCC1，ERCC4，ETV4，FES，GAB1，HGF，IFNG，IGF2R，INSR，KLF6，MPL，MUTYH，MYCL1，NR3C1，PIK3C3，PIK3CD，PIK3R2，PPP1R3A，PPP2R1B，PTPRB，RECQL4，ROS1，RPS6KA2，SDHB，SP1，THBS1，TP73，ANAPC5，ATR，BCL3，BIRC6，BRIP1，CBFA2T3，CDC73，CDK7，CLTC，CSMD3，CSNK1G2，CTNNA1，CYP1B1，DDB2，DGKI，ELOVL2，EP400l，EPHA8，EPHB2，ERG，EXT2，FANCC，FANCG，FRAP1，GATA1，GMPS，GPC3，HDAC4，HIPK2，HMGA1，HOXD11，IDH1，IGF1R，IGFBP3，KALRN，KAT2B，LAMA1，LAMP1，LDHA，LTBP1，MAPK3，MAPK8IP2，MINPP1，MLL，MLL3，MST1R，MUC1，MYST4，NAV3，NOTCH2，NSD1，PAFAH1B2，PAK7，PARP2，PIGS，POLE，PPP1R13L，PPP2CB，PPP2R2B，PTCH2，PTK2，PTPRD，RAD51L1，RHEB，RHOA，RPS6KA1，RPS6KB1，RUNX1T1，SDHC，SDHD，SNCG，SOCS2，SPEN，TFE3，TGFBR1，TLX1，TNK2及びZNF331から成る群から選ばれた少なくとも１つのタンパク質の機能を調整するように構成されている。
【００１５】
ある態様では、前記エフェクタ構築体サブセットは、shRNA エフェクタカセット、siRNA エフェクタカセット、ミクロRNA エフェクタカセット、アンチセンスRNA エフェクタカセット、リボザイムエフェクタカセット、非コードRNA エフェクタカセット、小型RNA エフェクタカセット、デコイRNA エフェクタカセット、anti-mirRNA エフェクタカセット、生物活性ペプチドエフェクタカセット、タンパク質ドメインエフェクタカセット及びタンパク質エフェクタカセットから選ばれたエフェクタカセットを含んでいる。前記エフェクタ構築体サブセットは、レトロウイルスエフェクタライブラリ、レンチウイルスエフェクタライブラリ、アデノウイルスエフェクタライブラリ、アデノ随伴ウイルスベクタライブラリから選ばれたパッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリであってもよい。
【００１６】
本開示によって、パッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリが更に提供される。ある実施形態によれば、異なるクローンバーコードに夫々結合した共通のエフェクタカセットを含む複数のエフェクタ構築体を夫々有する複数のエフェクタ構築体サブセットを含んでいるパッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリが提供される。ある態様では、各エフェクタカセットは固有のエフェクタバーコードを含んでいる。ある実施形態によれば、各エフェクタカセットは、形質導入細胞内のエフェクタの発現に十分な操作可能に結合したプロモータを含んでいる。ある態様では、主題のパッケージ化されたエフェクタライブラリのエフェクタ構築体は夫々、プロモータに操作可能に結合したリポータコード配列及び／又は薬剤選択マーカコード配列を含んでいる。
【００１７】
本開示のパッケージ化されたエフェクタライブラリは、５以上の固有のエフェクタ構築体サブセットを含んでもよい。ある実施形態によれば、各エフェクタ構築体サブセットは、異なるクローンバーコードを夫々有する100 以上の異なるエフェクタ構築体を含んでいる。ある態様では、前記エフェクタカセットは、RNAiエフェクタカセット、例えばshRNA エフェクタカセット、siRNA エフェクタカセット又はミクロRNA エフェクタカセットから選ばれたRNAiエフェクタカセットである。対象のエフェクタカセットは、アンチセンスRNA エフェクタカセット、リボザイムエフェクタカセット、非コードRNA エフェクタカセット、小型RNA エフェクタカセット、デコイRNA エフェクタカセット又はanti-mirRNA エフェクタカセットを含んでいる。ある実施形態によれば、前記エフェクタカセットは、生物活性ペプチドエフェクタカセット、タンパク質ドメインエフェクタカセット又はタンパク質エフェクタカセットである。ある態様では、前記パッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリは、レトロウイルスベクタライブラリ、レンチウイルスベクタライブラリ、アデノウイルスベクタライブラリ、又はアデノ随伴ウイルスベクタライブラリである。更に、本明細書に述べられているパッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリのいずれかで形質導入された細胞を含む形質導入された標的細胞の集団が更に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明の実施形態に係るRNAiエフェクタライブラリを生成するためのプロトコルを示す図である。
【図２】図１に示されているように調製されたエフェクタライブラリを使用した遺伝子スクリーニングプロトコルを示す図である。
【図３】本発明の実施形態に従って、クローンバーコードを有する複雑なエフェクタライブラリを用いて生存能力スクリーンで得られたエフェクタ毒性のクローン解析の例を示す図である。
【図４】以下に示す実験で採用されたshRNA レンチウイルスベクタのベクタマップを示す図である。
【図５】以下の実験の段落に報告されているように、3.2Kクローンバーコードライブラリの構成及び設計に関する詳細を示す図である。
【図６】以下の実験の段落に報告されているように、クローン27K Decipher shRNA ライブラリの構成及び設計に関する詳細を示す図である。
【図７】以下の実験の段落に報告されている陰性選択スクリーンの結果をグラフにより示す図である。
【図８】以下の実験の段落に報告されている陽性選択スクリーンの結果を示すプロット図である。
【図９】本発明の実施形態の態様に関する追加の詳細を示す図である。
【図１０】本発明の実施形態の態様に関する追加の詳細を示す図である。
【図１１】本発明の実施形態の態様に関する追加の詳細を示す図である。
【図１２】本発明の実施形態の態様に関する追加の詳細を示す図である。
【図１３】本発明の実施形態の態様に関する追加の詳細を示す図である。
【図１４】本発明の実施形態の態様に関する追加の詳細を示す図である。
【図１５】本発明の実施形態の態様に関する追加の詳細を示す図である。
【図１６】本発明の実施形態の態様に関する追加の詳細を示す図である。
【図１７】本発明の実施形態の態様に関する追加の詳細を示す図である。
【図１８】本発明の実施形態の態様に関する追加の詳細を示す図である。
【図１９】本発明の実施形態の態様に関する追加の詳細を示す図である。
【図２０】本発明の実施形態の態様に関する追加の詳細を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
用語「ベクタ」は、外来遺伝物質、例えばエフェクタ構築体を細胞内にクローニングして移すための媒体として使用されるDNA 分子を参照すべく従来の意味で使用される。ベクタの例として、プラスミド、ウイルス、コスミド及び人工染色体が含まれる。本発明の実施形態で使用されるベクタは、必要に応じて、直鎖状であっても環状であってもよく、RNA であってもDNA であってもよく、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００２０】
用語「エフェクタ」は、標的遺伝子若しくは標的遺伝子の産物のような別の一又は複数の分子の転写、翻訳、発現、処理又は機能に影響を及ぼし得る生化学的分子を参照すべく使用される。エフェクタは、全長タンパク質、タンパク質ドメイン、ペプチド、一本鎖若しくは二本鎖のデオキシオリゴヌクレオチド又はリボオリゴヌクレオチド、shRNA 、siRNA 、ミクロRNA 、小型RNA 及び非コードRNA を含む調節RNA 、又はこれらの擬似体若しくは類似体であってもよい。
【００２１】
用語「エフェクタ構築体」は、クローンバーコード及びベクタ領域に結合したエフェクタカセットを含む核酸構築体を参照すべく使用される。対象のエフェクタカセットは少なくともエフェクタ配列を含んでおり、エフェクタ配列は、例えばエフェクタ構築体を含む細胞にエフェクタ配列を発現させるために、プロモータに操作可能に結合してもよい。任意には、エフェクタカセットは、例えばエフェクタ配列の識別を容易にするためにエフェクタ特有のバーコードを含んでもよい。更に、エフェクタ構築体は、エフェクタ構築体を発現する細胞の選択又は標識付けのためにプロモータの制御下で、一又は複数のマーカ、例えばリポータ遺伝子又は薬剤耐性遺伝子を含んでもよい。以下により詳細に述べるように、本発明の方法で採用されるエフェクタライブラリは、共通のエフェクタカセットを共有するが異なるクローンバーコードを有する複数の、つまりプール型の異なるエフェクタ構築体から構成されたエフェクタ構築体サブセットを含んでもよい。
【００２２】
（本明細書ではプロモータとも称される）「プロモータ配列」は、RNA ポリメラーゼを細胞に結合して、コード配列の転写を開始することが可能なDNA 調節領域である。例えば、プロモータ配列は、バックグラウンドより高い検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基又は要素を含むために、転写開始部位によってその3'末端で結合されてもよく、上流側に（5'方向に）延びてもよい。プロモータ配列内に、転写開始部位、及びRNA ポリメラーゼ又は他の転写因子の結合に関与するタンパク結合領域があってもよい。真核生物プロモータは、「TATA」ボックス及び「CAT 」ボックスを含むことが多いが常に含むわけではない。本技術分野で周知の様々なプロモータ、例えばRNA ポリメラーゼII又はRNA ポリメラーゼIII によって認識されるプロモータ及び／又は誘導プロモータが、本発明の様々なベクタを機能させるために使用されてもよい。
【００２３】
用語「制限エンドヌクレアーゼ」又は「制限酵素」は、特定のヌクレオチド配列で又は特定のヌクレオチド配列の近くで二本鎖DNA を切断する細菌酵素を一般に指す。
【００２４】
このような一又は複数の遺伝子構築体が、例えばトランスフェクション薬剤を有する複合体として細胞の内部に導入されたとき、又はウイルス粒子にパッケージ化されたとき、細胞は、エフェクタ構築体又はエフェクタライブラリにより「形質転換されている」か、「形質導入されている」か、又は「形質移入されている」。形質転換エフェクタ構築体は、細胞のゲノムに（共有結合で）一体化されても、一体化されなくてもよい。例えば、原核生物、酵母及び哺乳類細胞では、形質転換DNA は、プラスミドのようなエピゾーム要素上で保持されてもよい。真核細胞に関して、安定して形質転換される細胞は、形質転換DNA が宿主細胞染色体に一体化される細胞、又は、形質転換DNA が細胞複製中に娘細胞に遺伝するように染色体外で保持される細胞である。場合によっては、形質転換細胞は、偽ウイルス粒子にパッケージ化された遺伝子構築体によって標的細胞に形質導入された単一のエフェクタ構築体を得る。このように安定して形質導入された真核細胞は、エフェクタ構築体を含む娘細胞の集団から構成されて、クローンに特異的なクローンバーコードが付された細胞系又はクローンを生成することができる。
【００２５】
用語「短干渉RNA 」又は「siRNA 」は、実質的な二本鎖RNA 分子が相同を共有する遺伝子の発現を抑制する二本鎖RNA 分子を一般に指す。
【００２６】
用語「マイクロアレイ」は、タンパク質、ペプチド又は核酸のような様々な標的の、スライド、膜、チップ、ビーズ又はマイクロウェルプレートのような固形支持体又は半固形支持体上での各標的の既知の位置又はアドレスにおける配列又は規則配置を指す。標的は、フォトリソグラフィ技術、ホスホルアミダイト化学、光化学、電気化学、共有結合固定、非共有結合固定又は本技術分野で公知の他の方法によって支持体に結合され得る。
【００２７】
用語「エフェクタライブラリ」は、一組の少なくとも２以上のエフェクタ構築体を指す。対象のエフェクタライブラリは、遺伝子スクリーンで、例えばプール型又はアレイ型で採用され得る。プール型では、エフェクタ構築体は混合され、同様の存在量レベルでエフェクタライブラリに存在してもよい。アレイ型では、エフェクタ構築体は、標的細胞に別々に形質導入されてもよい。
【００２８】
機能的ゲノム分析のクローン解析の方法が提供される。本発明の態様は、異なるクローンバーコードに結合した共通のエフェクタカセットを有する複数のエフェクタ構築体を夫々含む複数のエフェクタ構築体サブセットから構成されたパッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリで標的細胞の集団を形質導入することを含んでいる。エフェクタ構築体サブセットに異なるクローンバーコードを含めることにより、特異的表現型を示す形質導入された標的細胞内のエフェクタ構築体サブセットのクローン表示の決定が可能になる。本発明の態様は、本方法の実行に使用される組成、例えばライブラリ及びライブラリの成分を更に含んでいる。
【００２９】
本発明を更に詳細に説明する前に、本発明は、言うまでも無くそれ自体が変わり得るように、説明された特定の実施形態に限定されないことを理解されたい。更に、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書に使用されている用語は、単に特定の実施形態を説明するために用いられており、限定することを意図していないことを更に理解されたい。
【００３０】
ある範囲の値が与えられる場合、その範囲の上限及び下限の間の、文脈が別段に明示しない限りは下限の単位の１０分の１までの各介在値、及びその記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在する値が本発明に包含されることを理解されたい。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、記載された範囲内の任意の具体的に除外された限度を条件として本開示に包含される。記載された範囲が限度のうちの一方又は両方を含む場合、これらの含まれた限度の一方又は両方を除外した範囲も本開示に包含される。
【００３１】
ある範囲は、本明細書では用語「約」から始まる数値と共に示されている。用語「約」は、本明細書では「約」から始まる正確な数、及び「約」から始まる数に近い数又は「約」から始まる数に近似した数のための文字通りのサポートを提供するために用いられている。数が具体的に述べられた数に近いか否か又は近似しているか否かを判断する際に、述べられていない近い数又は近似した数は、その数が示されている文脈では、具体的に述べられた数に略相当する数であってもよい。
【００３２】
特に定義されていない限り、本明細書に使用されている全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様又は同等である全ての方法及び材料を、本発明の実施又は試験に使用することができるが、代表的な実例となる方法及び材料を本明細書に記載している。  
【００３３】
本明細書に引用されている全ての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許が、具体的に且つ個別に参照によって組み込まれると示されているかのように参照によって本明細書に組み込まれ、刊行物の引用に関連する方法及び／又は材料を開示して記載すべく、参照によって本明細書に組み込まれる。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示に関するものであって、先行発明を理由として、本開示がそのような刊行物に先行する権限がないことを認めるものであるとみなされるべきではない。更に、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる場合があり、個別に確認する必要があるかもしれない。
【００３４】
単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」が、本明細書及び請求項で用いられている場合、文脈が別段に明示しない限り、複数の指示対象を含むことを留意すべきである。更に、請求項がいかなる選択的な要素も排除して記載されていることを留意すべきである。従って、この記述は、請求項の要素の記載に関する「唯一の（solely）」、「のみの（only）」等の排他的用語の使用、又は「否定的な（negative）」限定の使用のための先行記載として機能すべく意図される。
【００３５】
当業者が本開示を読むと明らかであるように、本明細書に説明され例示された個々の実施形態は夫々、別々の構成要素及び特徴を有しており、別々の構成要素及び特徴は、本開示の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他の複数の実施形態のいずれかから容易に分離されてもよく、又はいずれかと容易に組み合わされてもよい。全ての記載された方法は、記載された事象の順序で、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。
【００３６】
上記に要約されているように、エフェクタ構築体又はエフェクタ構築体のエフェクタライブラリで形質導入された標的細胞のクローン解析を含む機能的ゲノム分析の方法が提供される。「クローン解析」という文言は、機能的ゲノム分析の結果が(a) 特異的なエフェクタ分子から生じる対象の表現型の変化又は特性（例えば、成長率、アポトーシスの誘導、分化、細胞周期の変化、特定のシグナル伝達経路の調整、特異的マーカの発現など）を示す全細胞集団、及び、(b) 特異的なエフェクタ構築体を示す全細胞集団の個々のクローン集団の両方に関して評価されることを意味する。言い換えれば、同一のエフェクタを発現する対象の細胞の全集団は等しいとみなされず、代わりに、このような全集団は全集団を構成する異なるクローン集団の差異を特定すべく分析され、（例えば各クローン集団の細胞の数に関する）クローン集団の差異はエフェクタの発現に起因してもよい。例えば、機能的ゲノム分析が生存能力スクリーンである場合（例えば、対象の表現型の変化が細胞の抑制又は成長の変化である場合）、対象の表現型を示す各クローン集団の細胞の数が、異なるクローン細胞集団の数の差を特定するために決定されてもよい。複雑なエフェクタライブラリの遺伝子スクリーンの場合、形質導入された標的細胞は、エフェクタライブラリに存在する各特異的なエフェクタ構築体の存在に応じてまずグループ化され、その後、クローン解析が上述したようなエフェクタに特異的な細胞集団毎に適用されてもよい。エフェクタライブラリを用いた遺伝子スクリーンの別の戦略では、対象の特性を示す細胞は、特異的なエフェクタ構築体毎のクローンの数に基づき分離されて分析される。従って、遺伝子スクリーンにおけるある観察された対象の特性では、対象の特性を示す２以上のクローン集団が夫々識別されてもよい。同一のエフェクタから生じる共通する対象の特性を有する複数の異なるクローン集団が識別される場合、これら複数のクローン集団は定性的に又は定量的に識別されてもよい。従って、本発明の方法により、エフェクタが対象の特性を生じさせる異なるクローン集団（つまり、形質導入された異なる始原標的細胞から生じるクローン集団）の数、ひいては、対象の特性を生じさせるエフェクタで形質導入された異なる始原標的細胞の数を決定することができる。更に、遺伝子スクリーンの定量的クローン解析を行うように、ある識別されたクローン集団内の細胞の数を容易に決定することができる。そのため、本発明の方法を実行することにより、異なるクローン集団の総数に関する情報、ひいては対象の特性を示す別個の細胞前駆体（つまり、形質導入された標的細胞）に関する情報が与えられる。例えば、共通のエフェクタを有する10のクローン集団がエフェクタライブラリスクリーンで対象の特性を示す場合、本発明の方法は、10の異なるクローン集団、ひいては10の異なる細胞源が対象の特性を示す情報を与える。更に、このような例における10の異なるクローン集団、ひいては10の異なる前駆細胞が夫々容易に識別されてもよい。更に、識別されたクローン集団夫々の細胞の総数が決定されてもよい。機能的ゲノム分析、つまり遺伝子スクリーンの結果として生じるクローン解析データが、例えば以下に更に詳細に述べるように、様々な異なる目的に使用されてもよい。
【００３７】
様々な異なるエフェクタ構築体又はエフェクタ構築体のエフェクタライブラリは、本発明の実施形態に従って遺伝子スクリーンに採用され、クローン的に分析され得る。上記に示したように、用語「機能的ゲノム分析」又は「遺伝子スクリーン」は、単一のエフェクタ又はエフェクタのライブラリの要素の活性が評価されるあらゆる手順を意味する。スクリーンされるエフェクタ（例えば、小分子と称される化合物）は、例えば上述したように大きく異なってもよい。ある実施形態では、スクリーンされるエフェクタは生体高分子のエフェクタであり、エフェクタは、例えば以下により詳細に述べるように、核酸によってコードされ、操作可能に結合したプロモータから細胞に発現されてもよい。対象のエフェクタは、核酸エフェクタ、例えばRNAiエフェクタ（例えばsiRNA 、shRNA 、ミクロRNA ）、リボザイムのようなリボ核酸エフェクタ、アンチセンスのようなデオキシリボ核酸エフェクタ、生物活性ペプチド、タンパク質ドメイン又は全長（ORF ）タンパク質のようなペプチドエフェクタ及びタンパク質のエフェクタなどを含んでいるが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明の方法で評価されてもよいエフェクタは、エフェクタライブラリのエフェクタ構築体サブセットに存在するエフェクタを含んでいる。エフェクタ構築体サブセットは、同一のエフェクタ核酸配列を有するが異なるクローンバーコードを有する複数の核酸又は核酸のプール型集合体であり、これらの要素は以下により詳細に述べられる。従って、あるサブセットでは、エフェクタ構築体は共通のエフェクタ核酸を共有するエフェクタ構築体であり、つまり、エフェクタ構築体のエフェクタ核酸は同一の配列を有しているが、クローンバーコードの点で互いに異なっており、つまり、サブセットの異なる要素のクローンバーコードは異なる配列を有する。あるサブセットに存在する異なるクローンバーコードの数、つまり異なる配列を有するクローンバーコードの数は100 以上など、10以上であってもよく、1,000 以上を含んでいる。言い換えれば、本発明の実施形態で採用されるエフェクタ構築体サブセットは、場合によっては、同一のエフェクタをコードする10以上の核酸構築体及び複数の（例えば10以上の）異なる配列の異なるクローンバーコードの内の１つの混合物（つまりサブライブラリ）である。対象のエフェクタライブラリは、同一タイプのエフェクタの複数の異なるエフェクタを有するエフェクタライブラリであり、つまり、複数の異なるエフェクタ構築体サブセットを有するエフェクタライブラリである。従って、あるエフェクタライブラリはRNAiエフェクタライブラリであってもよく、エフェクタライブラリの各エフェクタは同一タイプのRNAiエフェクタ（例えばshRNA 、ミクロRNA など）であり、エフェクタライブラリの異なるエフェクタは配列が互いに異なる。あるエフェクタライブラリの（例えば異なる配列の）異なるエフェクタの数は変わってもよく、場合によっては、異なるエフェクタの数は1000以上を含む５以上、100 以上など、２以上であり、ある実施形態では5,000 以上、10,000以上、50,000以上などである。対象のエフェクタライブラリの例は、カスナー（Kassner）著，「Q.K. Expert Opin. Ther. Targets 」，2009年，13，p.1027−1035（腫瘍標的を発見するためのRNA 干渉スクリーンについて述べている）、ルー（Luo ）等著，「Proc. Natl. Aced. Sci.」，2008年，105 ，p.20380 −20385 （癌細胞の必須遺伝子の並列識別について述べている）、ズュベール（Zuber）等著，「Nature Biotechnol.」，2011年，29，p.79−85（テトラサイクリンによって調整されたRNAiを使用した増殖及び生存に必要な遺伝子の評価について述べている）、シェルバッハ（Schlabach ）等著，「Science」，2008年，319(5863) ，620 −4 . ，「Science 」の誤字，2008年４月18日、320(5874) ，316 （癌増殖遺伝子を発見するための機能ゲノム方法について述べている）、シルヴァ（Silva ）等著，「Science」，2008年，319(5863) ，617 −20（多重RNAiスクリーニングによってヒトの乳腺細胞の必須遺伝子のプロファイリングについて述べている）、ゴー（Ngo ）等著、「Nature 」，2006年，441 ，p.106 −110 （癌の分子標的のための機能欠損RNAiスクリーンについて述べている）、スモーレン（Smolen）等著，「Genes Develop.」，2010年，24，p.2654−2665（細胞移動の複数のRSK依存の調節因子を識別するためにゲノムワイドなRNAiスクリーンについて述べている）、ホアン（Huang ）等著，「BMS Systems Biol.」，2008年，２，p.49−59���細胞接着の調節因子を識別するための定量的shRNA ライブラリスクリーンのシステム分析について述べている）、キーファー（Kiefer）等著，「Methods Mol. Biol.」，2009年，563 ，p.275 −287 （生物系を乱して化合物スクリーニングと関連した標的経路を識別する方法として高スループットsiRNA  スクリーニングについて述べている）、ブルーメルケンプ（Brummelkamp）等著，「Nat. Chem. Biol.」，2006年，２，p.202 −206 （MDM2阻害剤に対する癌細胞の脆弱性に関するshRNA バーコードスクリーンについて述べている）、ジー（Ji）等著，「Oncol. Reports」，2007年，18，p.1499−1505（A549パクリタキセル感受性に含まれる因子を識別するために癌抑制遺伝子を標的とするshRNA のスクリーンについて述べている）、ターナー（Turner）等著，「EMBO J.」，2008年，27，p.1368−1377（PARP阻害剤に対する感受性を媒介する遺伝子を識別する合成致死siRNA スクリーンについて述べている）、アゾルサ（Azorsa）等著，「J. Transl. Medicine」，2009年，７，p.43−55（膵臓癌のゲムシタビン療法のための標的を識別するための合成致死RNAiスクリーニングについて述べている）、ホワイトハースト（Whitehurst）等著，「Nature」，2007年，446 ，p.2815−819 （癌細胞内の化学療法増感剤の位置を識別するための合成致死スクリーンについて述べている）、キリングホファ（Klinghoffer）等著，「Assay Drug. Devel. Technol.」，2008年，６，p.105 −119 （キネシン−５阻害剤感受性の調節因子を識別するために、最適化されたレンチウイルス媒介のRNAiスクリーンについて述べている）、ウィルトシャー（Wiltshire）等著，「J. Biol. Chem.」，2010年，285 ，p.14565 −14571 （ポリ（ADP リボース）ポリメラーゼに対する感受性を介したDNA 二本鎖切断修復の調節因子としてユビキチンに特異的なペプチダーゼ11について述べている）、グレゴリー（Gregory ）等著，「Cancer Cell」，2010年，18，p.74-87（Wnt/Ca2+/NFATシグナル伝達がBcr-Abl の抑制の際にPh+ 白血病細胞の生存を維持することについて述べている）、アストサトロブ（Astsaturov）等著，「Cancer Biol.」，2010年，３，p.１−17（標的治療を改善するためにEGFR中心のネットワークの合成致死スクリーンについて述べている）、オコンネル（O'Connell）等著，「Molecular Cell」，2010年，40，p.645 −657 （ゲノムの安定性に必要な哺乳類のMMS22L−NFKBIL2 複合体を識別するためのゲノムワイドなカンプトセシン感受性スクリーンについて述べている）、フロヴ（Hurov ）等著，「Genes Develop.」，2010年，24，p.1939−1950（DNA 損傷シグナル伝達並びにATM 及びATR の安定性に必要な三倍Ｔ複合体を識別するための遺伝子スクリーンについて述べている）、バービー（Barbie）等著，「Nature」，2009年，462 ，p.108 −114 （発癌性KRASによる癌がTBK1を必要とすることを明らかにする系統的なRNA 干渉手法について述べている）、スコール（Scholl）等著，「Cell」，2009年，137 ，p.8210−834 （ヒト癌細胞における発癌性KRASの依存性及びSTK33 抑制間の合成致死相互作用について述べている）、ボミ−レディ（Bommi-Reddy ）及びカーリン（Kaelin）著，「Cell Research」，2010年，20，p.119 −121 （合成RAS 阻害剤について述べている）、ヴィセント（Vicent）等著，「J. Clin. Invest.」，2010年，120 ，p.3940−3952（ウィルムス腫瘍１（WT1 ）がマウスモデル及びヒトモデルでKRASによる腫瘍形成及び老化を調整することについて述べている）、ナイク（Naik）等著，「Hum. Cancer Biol.」，2009年，15，p.7529−7537（血管内皮成長因子受容体−１が結腸癌における異常なb-カテニンの活性化に対する合成致死であることについて述べている）、ゼンダー（Zender）等著，「Cell」，2008年，135 ，p.3911−3921（肝臓癌における腫瘍抑制因子を識別する腫瘍ゲノム解析に基づくインビボRNAiスクリーンについて述べている）、ラブジョイ（Lovejoy）等著，「Proc. Natl. Acad. Sci.」，2009年，106 ，p.19304 −19309 （CINPをゲノム保持タンパク質として識別するための機能的なゲノムエフェクタライブラリスクリーンについて述べている）、ヴァスデヴァン（Vasudevan）等著，「Cancer Cell」，2009年，16，p.21−32（ヒト癌における発癌性PIK3CA突然変異の下流のAKT 非依存シグナル伝達について述べている）、ブリック（Bric）等著，「Cancer Cell」，2009年，16，p.324 −335 （マウスリンフォーマモデルにおけるインビボRNA 干渉スクリーンによる癌抑制遺伝子の機能的識別について述べている）、タガヴィ（Taghavi ）等著，「Oncogene」，2008年，27，p.6806−6816（細胞形質転換におけるLPA シグナル伝達及びc-Myc の役割を識別するためのインビトロ遺伝子スクリーンについて述べている）、ボミ−レディ（Bommi-Reddy ）等著，「Proc. Natl. Acad. Sci.」，2008年，105 ，p.16484 −16489 （ヒト細胞のキナーゼ要件及びVHL 癌細胞のキナーゼ要件の変化を識別する合成致死スクリーニングについて述べている）、ガリャノヴァ（Guryanova）等著，「Mol. Biol.」，2006年，40，p.396 −405 （ゲノムワイドな変性レンチウイルスに基づくショートヘアピン型RNA ライブラリの最適化について述べている）、ハットリ（Hattori ）等著，「Blood」，2007年，110 ，p.640 −650 （ヒトの急性前骨髄球性NB4 細胞におけるオールトランス型レチノイン酸による細胞増殖阻止の媒介物質としてUBE2D3を識別するRNAiスクリーンについて述べている）、及びグミレディ（Gumireddy ）等著，「Nature Cell Biol.」，2009年，11，p.1297−1304（乳癌における上皮間葉移行及び転移の負の調節因子としてKLF17 の識別について述べている）に記載されているものを含んでいるが、これらに限定されない。
【００３９】
上記の参考文献に述べられている様々なタイプのエフェクタライブラリの開示及び記述は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【００４０】
対象のエフェクタライブラリの組成は異なってもよく、特定の研究によって定められてもよい。一タイプのエフェクタライブラリの組成では、最小のエフェクタライブラリは、生物分子（例えばp53 タンパク質、RAS 、NFkB、myc など）又はプロセス(例えばアポトーシスなど）を標的とする単一のエフェクタ構築体と、細胞のあらゆる分子、機能又はプロセスに影響しない陰性対照エフェクタ構築体とを含んでいる。陰性対照エフェクタ構築体の例は、対象の標的細胞に存在しない分子を標的にするエフェクタ構築体であり、例えば、蛍ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、スクランブル対照（哺乳類細胞に存在しないRNA 配列）などである。ある実施形態では、最小のエフェクタライブラリは余剰な組の各々特異的なエフェクタ及び陰性対照エフェクタ構築体を含んでおり、例えば、単一の標的分子を標的とする（異なる配列を有する）複数の固有のエフェクタ分子がライブラリに存在してもよい。所与の余剰な組は異なってもよいが、場合によっては、余剰な組は、10以上のエフェクタを含む５〜８など、２〜３のエフェクタを含んでいてもよい。
【００４１】
必要に応じて、エフェクタ構築体は機能的に確認されたエフェクタ配列を含んでもよく、例えば、以前の実験で生物学的活性が確認されたエフェクタ配列、又は特殊なプログラムを使用してある活性を有することを予測されたエフェクタ配列を含んでもよい。
【００４２】
場合によっては、遺伝子スクリーンで採用されるエフェクタライブラリは、細胞機能にとって重要な鍵分子を標的とするエフェクタ構築体（任意には機能的に確認されたエフェクタ構築体）から構成されている。場合によっては、エフェクタ構築体は、http://cbio.mskcc.org/tcga-generanker/index.jspに記載されている群、例えば、CDKN2A，PTEN，EGFR，TP53，PIK3CA，RB1，NF1，MET，CDK4，ATM，PDGFRA，MDM2，APC，EP300，ERCC2，KRAS，PIK3CG，BRCA1，STK11，BRCA2，ERBB2，BRAF，FBXW7，MLH1，MSH2，SMAD4，CDKN2B，FGFR3，MSH6，PIK3CB，PIK3R1，ERCC3，JAK2，KIT，RET，AKT1，PLCG1，SMARCA4，CDH1，CDKN1A，DNMT1，ERBB3，NOTCH1，CCND2，MYC，NRAS，AKT2，CREBBP，NF2，NTRK1，PDGFRB，ABL1，CCND1，CDK6，HSP90AA1，TCF3，CTNNB1，FGFR1，FIGF，HRAS，NTRK3，WT1，CDC42，EXT1，FOXO3，MDM4，PDGFA，PMS2，RUNX1，VHL，WRN，ALK，AR，CDKN2C，CHEK1，CHEK2，ERCC5，FAS，FGFR2，HDAC1，KDR，NOS3，PTCH1，TERT，TSC2，BLM，CBL，COL1A1，EVI1，MAP2K4，PDGFB，SEPT9，TGFBR2，TRRAP，EGF，FLT3，GRB2，NCAM1，NOS2，BUB1B，CDKN1B，DIRAS3，DOT1L，EPHB1，EPHB6，GNAS，HIF1A，MRE11A，PLCG2，PRKDC，PTPN11，RAD50，RAD51，SPRY2，FANCA，FANCF，FGFR4，FLT1，FOXO1，MAP2K1，PPP2R1A，PTGS2，SHC1，TPO，XPA，XPC，BAI3，BARD1，BCL2，CARM1，CDK2，CERK，DGKZ，E2F1，EPHA3，EPO，ERBB4，FANCE，FH，FLT4，IRS1，MAPK1，NBN，PLCB1，PRKCZ，SMARCB1，TCF12，TPR，VEGFA，ABCC3，CD44，CDKN2D，CSF1R，DPYD，ESR2，EWSR1，FANCD2，FOS，LMO2，NOTCH3，PARP1，PRKCA，SMAD2，SMAD3，TSC1，ADCY9，AGAP2，BAX，BCL11A，BCR，BIRC5，CAV1，CCNE1，DGKB，EPHB4，ERCC6，ESR1，ETV1，FLNC，FN1，GSK3B，HDAC2，HOXA9，MEN1，MYH9，NCOA2，PCNA，PML，PPARG，PPARGC1A，RARA，SKP2，SOCS1，SOS1，SRC，TEK，TOP2A，TPM3，ABCA1，APC2，AURKA，CCND3，CD40LG，CDX2，CEBPA，CYP19A1，DNMT3B，ERCC1，ERCC4，ETV4，FES，GAB1，HGF，IFNG，IGF2R，INSR，KLF6，MPL，MUTYH，MYCL1，NR3C1，PIK3C3，PIK3CD，PIK3R2，PPP1R3A，PPP2R1B，PTPRB，RECQL4，ROS1，RPS6KA2，SDHB，SP1，THBS1，TP73，ANAPC5，ATR，BCL3，BIRC6，BRIP1，CBFA2T3，CDC73，CDK7，CLTC，CSMD3，CSNK1G2，CTNNA1，CYP1B1，DDB2，DGKI，ELOVL2，EP400l，EPHA8，EPHB2，ERG，EXT2，FANCC，FANCG，FRAP1，GATA1，GMPS，GPC3，HDAC4，HIPK2，HMGA1，HOXD11，IDH1，IGF1R，IGFBP3，KALRN，KAT2B，LAMA1，LAMP1，LDHA，LTBP1，MAPK3，MAPK8IP2，MINPP1，MLL，MLL3，MST1R，MUC1，MYST4，NAV3，NOTCH2，NSD1，PAFAH1B2，PAK7，PARP2，PIGS，POLE，PPP1R13L，PPP2CB，PPP2R2B，PTCH2，PTK2，PTPRD，RAD51L1，RHEB，RHOA，RPS6KA1，RPS6KB1，RUNX1T1，SDHC，SDHD，SNCG，SOCS2，SPEN，TFE3，TGFBR1，TLX1，TNK2及びZNF331から選択される分子を標的にする。
【００４３】
上記に検討されているように、特異的なエフェクタ構築体のエフェクタライブラリ組成は別々に（アレイ型で）存在してもよく、又は（プール型で）混合されてもよい。アレイ型では、固有のエフェクタ複合体が標的細胞に形質導入され、形質導入細胞はインビトロで成長し、必要に応じて（例えば薬、放射線、熱ショックなどの刺激で）処理され、形質導入細胞は特異的表現型について分析される。アレイ型の利点は、細胞表現型を測定して機能的なエフェクタ構築体を識別するために、生物学的プロセスを測定するために開発された様々な異なる生物学的分析が適用されてもよいということである。プール型の手法では、エフェクタ構築体は、例えば最後のエフェクタライブラリにおける同様の量で混合され、標的細胞の大部分がライブラリの単一のエフェクタ構築体で形質導入されるような条件下で、標的細胞はエフェクタライブラリで形質導入される。場合によっては、所与の標的細胞への単一のエフェクタ構築体の導入は、形質導入される細胞の数が、形質導入に使用されるライブラリの異なるエフェクタ構築体の数より少なくとも５分の１以下など、少なくとも２分の１であるという形質導入条件下で達成される。所与の遺伝子スクリーン分析では、形質導入細胞はインビトロ（細胞培養物）で又はインビボ（モデル生物）で成長することができる。プール型の利点は、コスト効率の良いプロトコルと、インビトロ用途及びインビボ用途に遺伝子スクリーンを適用する能力とを含んでいることである。インビトロ遺伝子スクリーン用途では、プール型エフェクタライブラリは、標的細胞に形質導入され、形質導入細胞は宿主生物（例えばマウス、サル、ブタ、ヒトなど）に導入され、宿主生物は、必要な場合小分子（例えば薬）で処理され、一定期間後に、形質導入細胞は分離されて、エフェクタ組成が分離された細胞内で識別される。インビボプロトコルでは、エフェクタライブラリは標的細胞に（例えば顕微注射などによって）導入され、エフェクタライブラリは標的細胞（例えば癌細胞、異常細胞など）に形質導入され、生物（又は形質導入細胞／組織）は（必要な場合）薬で処理され、一定期間後に、形質導入細胞は分離されて、エフェクタ組成が識別される。機能的なエフェクタは、エフェクタライブラリに存在する（陰性対照エフェクタ構築体のような）他のエフェクタ構築体と比較して、欠乏又は濃縮によって識別されてもよい。
【００４４】
所与のエフェクタ構築体又はエフェクタ構築体のライブラリ、例えば複数のエフェクタ構築体から構成されたライブラリ、例えば複数のエフェクタ構築体サブセットから構成されたライブラリを評価するために使用される遺伝子スクリーンの特定のプロトコルは異なってもよい。所与の遺伝子スクリーンの詳細は、エフェクタ及びベクタの要素を含むエフェクタ構築体ライブラリの性質、採用される標的細胞の性質、対象の特性などに応じて少なくとも部分的に決まる。ある実施形態では、遺伝子スクリーンは哺乳類標的細胞に採用される。ある実施形態では、標的細胞はヒト由来又はマウス由来である。対象の遺伝子スクリーンは、例えば細胞増殖が時間で（例えば増殖、死亡率などを測定することにより）評価される陰性選択スクリーンであってもよく、例えば細胞マーカ、薬物耐性、移動などの特異的表現型が、細胞を識別するか分離するか選択するために、ひいては対象のエフェクタを識別するために採用される陽性選択スクリーンであってもよい。
【００４５】
本発明の態様に従ったエフェクタライブラリスクリーンのクローン解析は、例えば以下により詳細に述べるように、クローンバーコードに結合したエフェクタカセットを少なくとも含んでいるエフェクタ領域を有するエフェクタ構築体を含んでいるエフェクタライブラリを採用することにより提供される。本発明の実行方法では、一又は複数のエフェクタ構築体が標的細胞の集団の細胞要素に（例えば形質導入によって）入り込むのに十分な条件下で、エフェクタ構築体又はエフェクタ構築体のライブラリが標的細胞の集団と接触する。言い換えれば、標的細胞がエフェクタ構築体で形質導入されるのに十分な形質導入条件下で、一又は複数のエフェクタ構築体及び複数の標的細胞は互いに接触する。本発明の方法に採用されるエフェクタ構築体及びエフェクタ構築体のライブラリは大幅に異なってもよく、エフェクタライブラリのタイプは、ライブラリの要素を標的細胞に導入するために採用されるプロトコルに応じて少なくとも部分的に選択されてもよい。
【００４６】
本発明の方法に採用されるエフェクタライブラリは、複数のエフェクタ構築体から構成されており、各エフェクタ構築体はエフェクタ領域及びベクタ領域を含んでいる。エフェクタ領域は、例えば以下により詳細に述べるように、クローンバーコードに結合したエフェクタカセットを含んでいる。ベクタ領域は、エフェクタの標的細胞への侵入を可能にするあらゆる領域であってもよい。採用されてもよいベクタ領域は、単一のエフェクタ構築体の所与の標的細胞への侵入を可能にするベクタ領域を含んでいるが、これに限定されない。特定のタイプの対象のベクタ領域はウイルスベクタ領域を含んでいる。従って、ある実施形態では、ウイルスベクタ領域を採用するエフェクタライブラリの使用が特に興味深い。従って、記述を単に容易にするために、本発明の更なる態様はウイルスベクタの実施形態の点から述べられる。しかしながら、これらの実施形態のより詳細な記述は、他のタイプのベクタ領域が本発明の方法に採用され得ないことを意味すべく解釈されるべきでない。
【００４７】
エフェクタライブラリにウイルスベクタを採用するこれらの実施形態では、エフェクタライブラリの要素は、ウイルスゲノム核酸を収容するウイルス粒子として存在し、エフェクタライブラリの所与の粒子要素のウイルスゲノム核酸が、ベクタ領域及びエフェクタ領域の両方を含んでいる（つまり、核酸をコードするエフェクタがウイルスタンパク質シェルにキャプシッドで包まれるウイルス粒子エフェクタライブラリである）。このようなライブラリはパッケージ化されたウイルスエフェクタライブラリと称されてもよい。
【００４８】
本発明のウイルスエフェクタライブラリ内では、異なるライブラリ要素のウイルスゲノム核酸は共通のベクタ領域を共有する。従って、ライブラリのキャプシッドに包まれたウイルスゲノム核酸の配列が、ライブラリのエフェクタ領域を別にして完全ではないにしても略同一であるように、エフェクタ構築体の要素は共通のベクタ配列を共有する。ベクタ領域の配列はベクタの性質に応じて大幅に異なってもよい。場合によっては、ベクタ領域は、パッケージング細胞における組み換えレトロウイルスの生成、標的細胞におけるエフェクタ構築体の形質導入及び複製、エフェクタ分子、リポータ又は他の遺伝子の発現に必要な配列を含んでいる。ベクタ領域及びベクタ領域を含むエフェクタライブラリの生成は、あらゆる適切な遺伝子工学技術を使用して達成され得る。遺伝子工学技術は、PCR の標準的な技術、オリゴヌクレオチド合成、制限エンドヌクレアーゼ消化、部位特異的な消化、部位特異的な組換え、連結反応、形質転換、プラスミド精製及びDNA 配列決定を含んでいるが、これらに限定されない。
【００４９】
場合によっては、ベクタ領域は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、泡沫状ウイルスなどの群から選ばれたウイルスのウイルスゲノムから選択される。このようなウイルスは、遺伝子導入用途に一般に使用されている。場合によっては、ベクタ領域がレトロウイルスに由来した領域であるように、ベクタ領域はレトロウイルスベクタ領域である。レトロウイルスは、２つの固有の特徴によって特徴付けられる一本鎖RNA 動物ウイルスを含むレトロウイルス科に属するあらゆるウイルスである。最初、レトロウイルスのゲノムはRNA の２つのコピーから成る二倍体である。次に、このRNA は二本鎖DNA へのウイルス粒子関連酵素の逆転写酵素によって転写される。その後、この二本鎖DNA 又はプロウイルスは、宿主ゲノムに一体化され、宿主ゲノムの安定して一体化された要素として親細胞から子孫細胞に渡され得る。場合によっては、レトロウイルスベクタ領域は、レンチウイルスベクタ領域であり、例えばレンチウイルスに由来したベクタである。レンチウイルスはレトロウイルス科の要素である。レンチウイルスベクタはVSV-G で偽型化されてもよく、ヒト免疫不全ウイルス（HIV ）、ヒト後天性免疫不全症候群（AIDS）の病原体、ヒツジに脳炎（ビスナ）又は肺炎を引き起こすマエディ・ビスナ、ヤギに免疫欠損、関節炎及び脳障害を引き起こすヤギ関節炎脳炎ウイルス、ウマに自己免疫溶血性貧血及び脳障害を引き起こすウマ感染性貧血ウイルス（EIAV）、ネコに免疫欠損を引き起こすネコ免疫不全ウイルス（FIV ）、ウシにリンパ節腫脹及びリンパ球増加を引き起こすウシの免疫欠損ウイルス（BIV ）、ヒト以外の霊長類に免疫欠損及び脳障害を引き起こすサル免疫不全ウイルス（SIV ）に由来している。HIV に基づくベクタは、親ゲノムの５%未満を保持してもよく、ゲノムの25%未満はパッケージング構築体に組み入れられてもよく、このため、復帰突然変異体の複製可能なHIV の生成の可能性が最小限度に抑えられる。ベクタ領域は、レンチウイルスの5'LTR 及び3'LTR からの配列を含んでもよい。場合によっては、ベクタ領域は、レンチウイルスの5'LTR からのＲ及びU5の配列を含んでおり、レンチウイルスからの不活性3'LTR 又は自己不活性3'LTR を含んでいる。LTR 配列は、あらゆる種からのあらゆるレンチウイルスからのLTR 配列であってもよい。例えば、LTR 配列はHIV 、SIV 、FIV 又はBIV からのLTR 配列であってもよい。必要に応じて、エフェクタライブラリは、下流の長末端反復配列に調節要素の欠失を含んでいる自己不活性ベクタから構成され、ベクタ動員に必要なパッケージングシグナルの転写をなくしてもよい。そのため、ベクタ領域は不活性3'LTR 又は自己不活性3'LTR を含んでもよい。3'LTR はあらゆる便利な方法により自己不活性化されてもよい。例えば、3'LTR のU3要素は、TATAボックス、Sp1 及びNF−カッパＢ部位のようなエンハンサ配列の欠失を含んでもよい。自己不活性3'LTR の結果として、宿主細胞ゲノムに一体化されるプロウイルスは不活性5'LTR を含む。任意には、レンチウイルス5'LTR からのU3配列がウイルス構築体のプロモータ配列と置換されてもよい。このため、パッケージング細胞株から回収されるウイルスの力価が増加し得る。エンハンサ配列が更に含まれてもよい。
【００５０】
上記に要約されているように、ベクタ領域に加えて、本発明の方法に採用されるエフェクタライブラリのゲノム核酸はエフェクタ領域を更に含んでいる。エフェクタライブラリの所与の要素のエフェクタ領域は、クローンバーコードに結合した（エフェクタカセットに存在してもよい）対象のエフェクタのためのコード配列を少なくとも含んでいる領域である。本発明の方法で分析されてもよいエフェクタのタイプは大幅に異なってもよい。上記に検討されているように、対象のエフェクタは、リボ核酸エフェクタ、例えば（siRNA 、shRNA 、ミクロRNA などを含む）siRNA 、遺伝子抑制要素、非コードRNA 、長い非コードRNA 、小型RNA 、リボザイム、デオキシリボ核酸エフェクタ（例えば、アンチセンス）のような核酸エフェクタ、例えばペプチド、タンパク質ドメイン、タンパク質などのポリペプチドエフェクタ、全長タンパク質などを含んでいるが、これらに限定されない。所与のエフェクタライブラリは、異なる配列の異なるエフェクタ核酸領域の集合体を含んでおり、エフェクタライブラリの要素の配列はエフェクタライブラリの意図した性質に基づいて選択される。例えば、エフェクタライブラリがsiRNA エフェクタライブラリである場合、対象のRNA 標的がまず選択され、その後、様々なsiRNA 配列が選択され、異なるエフェクタ配列が設計されて合成される。標的RNA は、mRNA、ミクロRNA 、非コードRNA 、小型RNA 及び標的細胞で発現し、細胞機能に影響し得る他のタイプのRNA であり得る。所与のエフェクタカセットの所与のエフェクタ核酸配列の長さは、例えばエフェクタライブラリの性質などに応じて異なってもよい。場合によっては、エフェクタライブラリのエフェクタ配列の長さは、19〜50ntを含む10〜2000ntなど、５〜5000ntの範囲であってもよい。ある実施形態では、エフェクタ配列は、標的mRNAに実質的に相補的な領域のサイズが19〜30のヌクレオチドであるshRNA 又はミクロRNA である。所与のライブラリの異なる配列の異なるエフェクタ配列（ひいてはカセット）の数は異なってもよい。場合によっては、異なる配列の異なるエフェクタ配列の数は２以上、例えば５以上、100 以上、1000以上、5000以上、10000 以上、15,000以上、20000 以上、25000 以上などである。ある実施形態では、所与のライブラリの異なる配列の異なるエフェクタ配列の数は、20000 〜30000 を含み10000 〜40000 など、5000〜50000 の範囲であってもよい。２つのエフェクタ配列は、単一のヌクレオチドでも互いに異なる場合、別個であるとみなされる。所与のエフェクタライブラリでは、エフェクタ配列は夫々同一の長さを有してもよく、又は、ライブラリの異なるエフェクタ要素は異なる長さを有してもよい。エフェクタライブラリは、単一の固有のエフェクタ構築体を含んでもよく、同一の細胞標的（例えばmRNA）を標的とする余剰な組のエフェクタを含んでもよい。
【００５１】
エフェクタに加えて、例えば上述したように、エフェクタ領域はエフェクタに結合したクローンバーコードを更に含んでいる。用語「クローンバーコード」はバーコード核酸配列を意味する。用語「核酸バーコード」及び「バーコード」並びにこれらの変形例は、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列のような識別可能なヌクレオチド配列を指す。ある実施形態では、核酸バーコードは固有に識別可能である。ある実施形態では、核酸バーコードは、合成核酸配列、天然核酸配列、DNA 、RNA 又は他の核酸及び／若しくは誘導体を含み得る。例えば、核酸バーコードは、ヌクレオチド塩基アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、イノシン又はそれらの類似体を含み得る。バーコードの長さは必要に応じて異なってもよく、場合によっては、バーコードの長さは、５〜20ntなど、２〜100 ntであり、ある実施形態では８〜20ntを含んでいる。所与のバーコード配列は必要に応じて異なってもよい。必要に応じて、バーコードは２〜10（又はそれ以上の）ランダムなヌクレオチド（例えば、あらゆる位置のＡ，Ｇ，Ｃ若しくはＴ、又はこれらのヌクレオチドのあらゆるサブセット）のあらゆる配列であってもよい。場合によっては、採用されるバーコードは、少なくとも１又は２の突然変異の場合でさえ、互いに著しく異なる特定の固有の（つまり、異なる）配列で特別に設計されている。
【００５２】
所与のライブラリ内では、エフェクタライブラリに表わされる異なる配列の異なるクローンバーコードの数は異なってもよい。場合によっては、エフェクタライブラリに存在する異なる配列の異なるクローンバーコードの数は、エフェクタライブラリの別個のエフェクタ配列の数の一部であり、該一部は、別個の配列の数に基づいたライブラリの別個のエフェクタ配列の数の15％以下を含めて、20％以下など、25％以下であってもよい。場合によっては、ライブラリに存在する異なる配列の異なるクローンバーコードの数は、250 以上、例えば500 以上、1000以上など、100 以上であり、2000以上、2500以上、3000以上、3500 以上、例えば5000以上など、1500以上を含んでおり、10,000以上を含んでいる。
【００５３】
必要に応じて、エフェクタ領域のエフェクタカセットは「バーコード付きエフェクタカセット」であってもよく、用語「バーコード付きエフェクタカセット」は、例えば上述したように、エフェクタライブラリの別個のエフェクタカセットが夫々固有の識別配列を含んでおり、つまりクローンバーコードとは異なるエフェクタバーコードを含んでいることを意味する。上記の定義と一致して、用語「核酸バーコード」及び「バーコード」は、エフェクタバーコード及びその変形例と共に使用されるとき、オリゴヌクレオチド配列又はポリヌクレオチド配列のような識別可能なヌクレオチド配列を指す。ある実施形態では、核酸バーコードは固有に識別可能である。ある実施形態では、核酸バーコードは、合成核酸配列、天然核酸配列、DNA 、RNA 又は他の核酸及び／若しくは誘導体を含み得る。例えば、核酸バーコードは、ヌクレオチド塩基アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、イノシン又はそれらの類似体を含み得る。バーコードの長さは必要に応じて異なってもよく、場合によっては、バーコードの長さは、10〜30ntなど、12〜20ntを含む５〜100 ntである。所与のエフェクタバーコード配列は必要に応じて異なってもよいが、ライブラリのあらゆるエフェクタバーコード間に少なくとも１つのヌクレオチドの差異を有している。ある実施形態では、一組の内いずれかのエフェクタバーコード配列間の差異は少なくとも２つのヌクレオチドである。
【００５４】
一又は複数のエフェクタ分子の発現のために、エフェクタ配列がRNA ポリメラーゼIIプロモータ又はRNA ポリメラーゼIII プロモータのような適切なプロモータの制御下にあるように、必要に応じて、エフェクタ領域及び／又はエフェクタ領域のエフェクタカセットがプロモータを更に含んでもよい。プロモータは、場合によってはエフェクタバーコード配列が続く終結配列に結合してもよいエフェクタ配列に操作可能に結合してもよく、このようにして、例えばエフェクタ分子のクローニング及び発現のためのエフェクタカセットを形成する。更に、２以上のプロモータがエフェクタ分子を発現するために使用されてもよい。「内部」カセットは、ウイルス構築体の5'LTR 配列及び3'LTR 配列間に位置し、エフェクタに操作可能に結合したプロモータ／エンハンサである。別の実施形態では、エフェクタカセットは3'LTR に、任意には3'LTR のU3領域に位置する。別の実施形態では、内部領域は、構成的プロモータ又は調節的プロモータの制御下で、（例えばPuro、Hprt、Neo 若しくはHyg に対する抵抗力を与える）薬物耐性カセット又は（例えば、蛍光性GFP 、RFP 、細胞内マーカ、細胞表面マーカ、エピトープ、タンパク質、若しくはルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ホスファターゼ、CD81、H2Kk、NGF 受容体（細胞外ドメイン）のような酵素のためにコードする）リポータカセットを更に含んでもよい。
【００５５】
エフェクタカセット、薬物耐性カセット又はリポータカセットのためのプロモータ／エンハンサは、エフェクタの所望の発現パターン及びプロモータ／エンハンサの特異的性質に基づいて選択されてもよい。従って、プロモータは、RNA ポリメラーゼIIによって制御されるユビキチンプロモータ、CMV プロモータ、β−アクチンプロモータ、ヒストンH4プロモータ、EF−1alfa プロモータ若しくはpgk プロモータ、又はRNA ポリメラーゼIII によって制御されるU6 snRNAプロモータ、H1 snRNAプロモータ若しくはtRNAプロモータのような構成的プロモータであってもよい。或いは、プロモータは、Ick 、ミオゲニン又はthy1のような組織特異性のプロモータであってもよい。更に、プロモータはエフェクタの誘導性発現を可能にすべく選択されてもよい。テトラサイクリン応答システム及びラクトースオペレータリプレッサシステムを含む、このようなプロモータを使用する誘導性発現のための多くのシステムは本技術分野では周知である。一実施形態では、（siRNA のセンス鎖の5'末端及びアンチセンス鎖の5'末端の両方に結合した）対向するプロモータが使用される（国際公開第03／022052号パンフレット及び米国特許出願公開第2002／0162126 号明細書参照）。エンハンサが、エフェクタの発現を高めるために存在してもよい。例えば、CMV エンハンサがチキンβ−アクチンプロモータと組み合わせて使用されてもよい。
【００５６】
ある実施形態では、エフェクタカセットが、ポリメラーゼIII プロモータ及びエフェクタコーディング領域、つまりエフェクタ配列を含んでいる。このような実施形態のエフェクタコーディング領域は、特定のmRNA、一又は複数のタンパク質の発現レベルを下方制御するエフェクタ分子をコードしてもよい。コードされるエフェクタ分子は、例えば、二本鎖RNA 複合体であるsiRNA であってもよく、RNA 干渉と称されるプロセスにより二本鎖RNA 複合体の一本鎖に相補的なmRNA配列を有する遺伝子の遺伝子発現を抑制するステムループ構造若しくはいわゆる「ヘアピン型」構造を有するRNA 分子であってもよい。RNA の二本鎖部分は、下方制御されるべき標的遺伝子の配列と略同一であり、場合によっては15〜30ntの長さを有する。siRNA の場合には、二本鎖RNA はレンチウイルス構築体のような単一のレトロウイルス構築体から細胞内で発現され得る。一実施形態では、構築体の単一のRNA コーディング領域はセンス領域、ループ領域及びアンチセンス領域を含む。従って、siRNA エフェクタカセットは、センス領域、ループ又はヘアピン領域、及びアンチセンス領域を含むRNA コーディング領域に操作可能に結合したRNA ポリメラーゼIII プロモータを有してもよい。場合によっては、センス領域及びアンチセンス領域の長さは15〜30ntであってもよく、場合によっては、ループ領域の長さはで２〜15ntであってもよい。センス部分及びアンチセンス部分は、発現すると一端にループを有する二本鎖を形成する。センス領域及びアンチセンス領域は互いに相補的であってもよく、ステムループ構造を不安定化すべく複数のミスマッチを含んでもよい。siRNA エフェクタ構築体の別の実施形態では、レトロウイルス構築体は２つのRNA コーディング領域を含む。第１のコーディング領域は第１のRNA を発現するためのテンプレートであり、第２のコーディング領域は第２のRNA を発現するためのものである。発現後に、第１のRNA 及び第2のRNA は二本鎖を形成する。この構築体は、第１のRNA コーディング領域に操作可能に結合した第１のポリメラーゼIII プロモータと、第２のRNA 領域に操作可能に結合した第２のポリメラーゼIII プロモータとを更に含んでいる。コーディング領域は夫々終結配列によって3'末端で隣接してもよい。別の実施形態では、第１のRNA ポリメラーゼIII プロモータからのRNA コーディング領域の発現がセンス鎖として第１のRNA 分子の合成になり、 第２のRNA ポリメラーゼIII プロモータからのRNA コーディング領域の発現が第１のRNA 分子に略相補的なアンチセンス鎖として第２のRNA 分子の合成になるように、レトロウイルス構築体は、第１のRNA コーディング領域に操作可能に結合した第１のRNA ポリメラーゼIII プロモータと、同一の第１のRNA コーディング領域に反対鎖で反対方向に操作可能に結合した第２のRNA ポリメラーゼIII プロモータとを含んでいる。このような一実施形態では、各RNA ポリメラーゼIII プロモータは、５つの連続したＴ残基を有する終結配列のような終結配列を転写開始部位の直ぐ上流に含んでいる。従って、一本鎖では、ポリメラーゼIII プロモータは、転写開始部位及びRNA コーディング領域の直前で第１の終結配列に結合される。更に本実施形態では、発現カセットは、（第１のコーディング領域に略相補的な）第２のコーデ��ング領域に結合した第２の終結因子を含む第２のポリメラーゼIII プロモータを有する。従って、このような実施形態におけるsiRNA コード配列は、言及すべきほどの追加の非siRNA 配列無しで転写開始部位の両方の直ぐ下流に位置する。siRNA エフェクタ構築体のRNA コーディング領域は終結配列に操作可能に結合してもよい。ポリメラーゼIII 終結因子は、４以上のチミジン残基の伸展を含んでもよい。場合によっては、対向するプロモータのための終結因子として機能すべく、５つの連続したアデニンの配列がRNA コーディング領域の直ぐ上流に結合される。
【００５７】
必要に応じて、ゲノム領域は、一又は複数組のプライマ隣接領域を更に含んでもよく、プライマ隣接領域は、クローンバーコード及びエフェクタカセットのようなエフェクタ領域の一又は複数の要素に隣接してもよい。プライマ隣接領域は、増幅プロトコルにおけるプライマ結合部位として機能するのに十分なあらゆる便利な長さ及び配列を有してもよい。
【００５８】
エフェクタライブラリのウイルスゲノム核酸は追加の要素を更に含んでもよく、このような要素は大幅に異なってもよい。例えば、レポータ遺伝子は、蛍光マーカタンパク質のための遺伝子のような、内部プロモータとの機能的関係に置かれてもよい。マーカ遺伝子がエフェクタと共に含まれる場合、内部リボソーム感染部位（ＩＲＥＳ）配列が含まれ得る。或いは、追加の遺伝要素が非依存性プロモータ／エンハンサと操作可能に結合されて、非依存性プロモータ／エンハンサによって制御され得る。
【００５９】
本発明の方法で採用されるエフェクタライブラリがクローンバーコードを含んでいるので、所与のエフェクタサブライブラリでは、エフェクタ配列及びベクタ配列が共通であるが、クローンバーコードが異なる配列の異なるバーコードであるように、エフェクタライブラリは、異なるクローンバーコードと結合された同一のエフェクタ配列を夫々有するエフェクタサブライブラリ（つまりサブセット）の集合体としてみなされてもよい。エフェクタサブライブラリ内では、サブライブラリに存在する異なるクローンバーコードの数は、場合によっては50以上など、10以上であってもよく、100 以上、例えば500 以上、1000以上、2500以上、3500以上、5000以上を含んでおり、10000 以上を含んでいる。エフェクタライブラリ内の異なるエフェクタサブライブラリの数も異なってもよく、場合によっては、該数は、５以上、10以上など、２以上であり、例えば50以上、100 以上、1000以上、5000以上、10000 以上、15,000以上、20000 以上、25000 以上などである。ある実施形態では、所与のエフェクタライブラリ内の異なるエフェクタサブライブラリの数は、10000 〜40000 など、5000〜50000 であってもよく、20000 〜30000 を含んでもよい。従って、例えば固有のエフェクタ／クローンバーコードの組み合わせの点におけるエフェクタライブラリの複雑度は異なってもよい。場合によっては、エフェクタライブラリの複雑度は、エフェクタライブラリが100 以上を含む10以上など、２以上の固有のエフェクタ／クローンバーコードの組み合わせを含んでいるような複雑度である。場合によっては、所与のエフェクタライブラリの複雑度は、エフェクタライブラリの異なるエフェクタ毎に相当な数の異なるクローンの形質導入工程を提供するように選択されている。ある実施形態では、相当な数の異なるクローンは、エフェクタライブラリの異なるエフェクタ当たり、50以上の異なるクローンなど、25以上の異なるクローンであってもよく、100 以上の異なるクローンを含む例えば200 以上の異なるクローンを含んでもよい。
【００６０】
本発明の実施形態で採用されるライブラリは、あらゆる便利なプロトコルを使用して生成され得る。例えば、ウイルス領域及びエフェクタ領域は、多くの異なるプロトコルによって合成的に又は酵素的に生成され得る。また、適切なオリゴヌクレオチド構築体及びポリヌクレオチド構築体は、例えば組み換えDNA研究のための米国保健福祉省（HHS ）国立衛生研究所（NIH ）のガイドラインに述べられている規則の下で、例えばサムブルック（Sambrook）等著，「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」，第２版，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989年に述べられているような標準的な組換DNA技術を使用して精製されてもよい。必要に応じて、エフェクタ構築体はホスホルアミダイト化学を使用して合成的に合成されてもよい。場合によっては、エフェクタ構築体は（例えば、フォトリソグラフィ、インクジェット蒸着、電気化学的な手段を使用して表面上に）アレイベースのプロトコルを使用して合成される。例えば、このようなプロトコルの例の記述に関して米国特許第7588889 号明細書参照。
【００６１】
エフェクタライブラリを調製する際に、エフェクタ構築体のライブラリ（つまり、任意にはエフェクタバーコードに結合した及び／又はエフェクタ発現カセット内のエフェクタ配列を含むプロ−エフェクタライブラリ）が、トランスフェクションプラスミド産物の生成に十分な条件下でベクタ構築体のライブラリ（つまり、ベクタ配列のベクタ領域を含むプロ−ベクタライブラリ）と組み合わせられる。そのため、パッケージング細胞を形質移入する際に、ウイルスタンパク質シェル内にキャプシッドで包まれたゲノム核酸の一部としてエフェクタ領域を含むウイルス粒子が生成される。採用される特定の生成プロトコルに応じて、クローンバーコードは、例えば、以下に更に述べるように、プロ−エフェクタライブラリ又はプロ−ベクタライブラリに存在してもよい。形質移入に使用されるトランスフェクションプラスミド産物を調製するために、エフェクタ領域の核酸がベクタ核酸に挿入される。その際、あらゆる適切なプロトコルが採用されてもよい。適切なプロトコルの例は、In-Fusion（登録商標）PCR プロトコル（Clontech Laboratories，Mountain View，CA）などを使用したDNAリガーゼ媒介の結合、組換え酵素媒介の結合を含んでいるがこれらに限定されない。
【００６２】
エフェクタカセット及びクローンバーコードを含むエフェクタ領域がエフェクタ構築体を生成すべくベクタ領域に操作可能に確実に結合するために、あらゆる便利なプロトコルが採用されてもよい。第１のプロトコルでは、複数の異なるクローンバーコードがベクタライブラリに設けられるように、クローンバーコードがプロ−ベクタライブラリに設けられている。プロ−ベクタライブラリに表される異なるクローンバーコードの数は異なってもよく、場合によっては10以上である。そのため、プロ−ベクタライブラリは、共通のベクタ領域を有するが異なるクローンバーコードを有する核酸から構成されている。プロ−ベクタライブラリがクローンバーコードを含んでいるので、プロ−ベクタライブラリはクローン的にバーコードを付けられたプロ−ベクタライブラリと称されてもよい。その後、このクローン的にバーコードを付けられたプロ−ベクタライブラリは、例えばプロ−エフェクタライブラリの形態で単一のエフェクタカセット又はエフェクタカセットのプールをクローニングするために採用される。このプロトコルに従って生成されたエフェクタライブラリは、同数のクローンバーコードを有していることにより特徴付けられてもよい。対象の別の合成プロトコルは、（クローンバーコード及びエフェクタカセットを含んでいる）エフェクタ領域をまず合成し、次にクローンバーコードを含んでいないプロ−ベクタライブラリ、つまり非クローン的にバーコードを付けられたプロ−ベクタライブラリにクローニングするプロトコルである。この種のプロトコルでは、各エフェクタ領域は、必要に応じてもう１つのクローンバーコードに結合した一又は複数のエフェクタカセットを含んでもよい。例えば、エフェクタ領域が、化学式エフェクタ−Nt・・・によって表される構造を有する合成物によって述べられてもよく、ｔが２〜約10以上の整数であり、Ｎがランダムなヌクレオチド（例えばＡ，Ｇ，Ｃ又はＴ）である。或いは、エフェクタバーコード及びクローンバーコードの両方が対象の特異的配列を有する。ある実施形態では、各エフェクタは同数のクローンバーコード又は異なる数のクローンバーコードを有してもよい。（例えば、上述したようにクローンバーコード及びエフェクタカセットを含んでいる）合成されたエフェクタ領域はあらゆる便利なプロトコルを使用してベクタ領域にクローニングされ、従って所望のエフェクタライブラリを生成する。ある実施形態では、エフェクタ領域の構成要素、例えばクローンバーコード、エフェクタ配列、任意にはエフェクタバーコードが別々に合成されて、所望の合成されたエフェクタ領域を生成するのに十分な方法で共に混合される。或いは、異なる要素は、例えばマイクロアレイの表面にプール型として共に合成されてもよい。
【００６３】
エフェクタトランスフェクションプラスミドのライブラリを生成する一方法の具体例が図１に示されている。図１では、複数の、例えば27000 の異なるバーコード付きエフェクタ領域が、複数の、例えば3500の異なるバーコード付きベクタ領域に連結されて、複数の、例えば87750 の固有のエフェクタ／ベクタバーコードの組み合わせを含むトランスフェクションプラスミド産物が生成される。図１に示されているように、バーコード付きベクタは夫々、（ライブラリのクローンバーコードとして機能する）ベクタバーコード配列と、例えば上述したようにウイルスベクタ配列を含むベクタ配列とを含んでいる。バーコード付きエフェクタ領域は夫々、shRNA コード配列及びエフェクタバーコードとして図示されているエフェクタを含んでいる。エフェクタ領域をベクタ領域に連結する際に、トランスフェクションプラスミド産物は並置されたエフェクタ／ベクタバーコードを含んでいる。
【００６４】
その後、得られたトランスフェクションプラスミド産物は、エフェクタライブラリウイルス粒子を生成するために適切なパッケージング細胞株を形質移入するために使用されてもよい。パッケージング細胞株は、ウイルス粒子へのウイルスゲノムRNA のパッケージングのために形質移入に必要なウイルスタンパク質を与える。パッケージング細胞株は、293 、HeLa、D17 、MDCK、BHK 及びCf2Th を含むレトロウイルスタンパク質を発現することができるあらゆる細胞株であってもよい。ある実施形態では、エフェクタ構築体は、構成的プロモータ又は条件付（調節可能）プロモータの制御下で、一又は複数のレポータ遺伝子を含んでもよいウイルスリポータ構築体と共に使用される。一実施形態では、レポータ遺伝子の少なくとも１つはシグナル伝達経路に特有のプロモータ（条件付き）によって制御され、第２のレポータ遺伝子が構成的プロモータによって制御される。パッケージング細胞株は必要なウイルスタンパク質を安定して発現してもよい。このようなパッケージング細胞株は、例えば米国特許第6218181 号明細書に述べられている。或いは、パッケージング細胞株が、必要なウイルスタンパク質をコードする核酸を含むプラスミドで一時的に形質移入されてもよい。別の実施形態では、必要なウイルスタンパク質を安定して発現しないパッケージング細胞株が２以上のプラスミドで同時に形質移入される。プラスミドの内の１つは、エフェクタを有するウイルス構築体を含んでいる。細胞が、所望の宿主細胞に感染し得る機能的なウイルスを生成することを可能にするのに必要なタンパク質をコードする核酸を、一又は複数の他のプラスミドは含んでいる。パッケージング細胞株はエンベロープ遺伝子産物を発現しない場合もある。この場合、パッケージング細胞株は、エンベロープタンパク質を欠く粒子にウイルスゲノムをパッケージ化する。エンベロープタンパク質がウイルス粒子の宿主域にある程度関与しているので、ウイルスが偽型化されることが好ましい。「偽型」レトロウイルスは、RNA ゲノムが由来するウイルス以外のウイルスからのエンベロープタンパク質を有するレトロウイルス粒子である。エンベロープタンパク質は、異なるレトロウイルス又は非レトロウイルスからのものであってもよい。１つのエンベロープタンパク質が水泡性口内炎ウイルスG(VSV-G)タンパク質である。従って、パッケージング細胞株は、宿主細胞へのウイルスの侵入を可能にする、VSV-G のような膜結合性たんぱく質をコードする配列を有するプラスミドで形質移入されてもよい。本技術分野の当業者は、使用される宿主細胞に適切な擬似型を選ぶことができる。特定の宿主域を与えることに加えて、擬似型を選ぶことにより、ウイルスが非常に高い力価に濃縮され得る。或いは、ウイルスは、感染を特定の種に制限するエコトロピックなエンベロープタンパク質で偽型化され得る。
【００６５】
本発明の実行方法では、遺伝子スクリーンはあらゆる便利なプロトコルに従って行なわれる。一般に、エフェクタライブラリは、エフェクタライブラリの要素が標的細胞によって占められるのに十分な方法で標的細胞の集団と接触する。例えば、エフェクタライブラリがウイルス粒子エフェクタライブラリである場合、エフェクタライブラリは、適切な形質導入条件下で標的細胞の集団と接触してもよい。パッケージ化済みのウイルスエフェクタライブラリでの標的細胞の形質導入は、あらゆる便利なプロトコルによって達成されてもよく、標的細胞のタイプ及び採用されるウイルスベクタに応じて少なくとも部分的に決められてもよい。形質導入条件は、所与の標的細胞への単一の固有のエフェクタクローンバーコード構築体の導入及び発現を達成するために最適化されてもよい。標的細胞は、同一細胞又は同様の細胞の純粋且つ均質な集団であってもよく、又は様々なタイプの細胞の異質な集団であってもよい。標的細胞は培養されてもよく、又は組織、器官、生体液又は生物全体であってもよい。生物は（場合によっては）ヒト、マウス又はラットである。標的細胞の選択を様々なインビボ生物学的分析及びインビトロ生物学的分析に広げるために、エフェクタライブラリはリポータベクタで同時に形質導入されてもよい。
【００６６】
エフェクタライブラリと接触して形質導入される標的細胞の数は、エフェクタライブラリの複雑度を考慮して選択されるように、十分なクローン解析を提供すべく選択されてもよい。そのため、形質導入細胞の数がエフェクタライブラリのエフェクタ構築体の数より多いように、エフェクタライブラリで形質導入される標的細胞の数が最適化されてもよい。これらの条件下では、エフェクタ構築体は夫々余剰な数の標的細胞に形質導入される。場合によっては、エフェクタライブラリの各エフェクタ構築体で形質導入されて固有のクローンバーコードを夫々有する標的細胞の数は、100 倍以上など、10倍以上であり、200 倍以上を含んでいる。エフェクタ構築体毎に余剰な組の形質導入細胞を達成するために、形質導入細胞の数は、エフェクタ及びクローンバーコードの複雑度を含むエフェクタライブラリの複雑度全体と比較して100 倍以上など、10倍以上になるように最適化される。形質導入工程の一例が図２に示されている。本例では、エフェクタライブラリは、例えば100 万の細胞を形質導入すべく使用されてもよい100 万を超える（例えば8775万の）固有のエフェクタ構築体を含んでいる。形質導入により、例えばshRNA 毎に自身のバーコードを夫々有する約40のクローンが生成されてもよい。形質導入細胞は、自身のバーコードを夫々有するクローン集団を生成するために増えてもよい（例えば、８倍加により２億5000万の細胞になる）。例えば、１億リード（クローン当たり平均して100 リード（100M／1M）、shRNA 当たり40クローン（1M／27,000））を生成するために、核酸は分離されて配列決定されてもよい。
【００６７】
標的細胞は、形質導入されると、対象の特定の特性（例えば表現型）について分析され得る。分析プロトコルは、必要に応じてプール型であっても、アレイ型であってもよい。このような分析の選択戦略は必要に応じて異なってもよく、採用される特定の選択戦略は、対象の特性に応じて少なくとも部分的に決められる。上記に要約されているように、対象の特性は、成長率からリポータ構築体、特異的マーカなどの発現のような対象の特定の表現型の出現まで大幅に異なってもよい。必要に応じて、高スループットプロトコルが採用されてもよい。必要に応じて、分析は、細胞に刺激を与える工程、例えば活性剤、薬、物理的な刺激（例えば機械的歪み）及び電磁放射刺激などを与える工程を含んでもよい。形質導入細胞が特異的表現型について分析されてもよく、特異的表現型に基づいて分離（選択）されてもよい。
【００６８】
対象の特性を有する細胞を選択した後、プール型エフェクタライブラリを使用する実施形態では、細胞は、細胞に存在して対象の特性を少なくとも推定上生じさせるクローンバーコード及び特定のエフェクタの両方を識別するために更に分析されてもよい。クローンバーコード及びエフェクタはあらゆる便利なプロトコルを使用して識別されてもよい。対象のプロトコルは、配列決定プロトコル、例えば高スループット配列決定プロトコル、及びハイブリダイゼーションプロトコル、例えばアレイベースのハイブリダイゼーションプロトコルを含んでいるがこれらに限定されない。所与のプロトコルは、本技術分野の当業者に周知の様々な工程を含んでもよく、例えばエフェクタ領域のアンプリコンを生成するための核酸増幅、分離、ハイブリダイゼーション、ラベル付け、ラベル検出、配列決定などを含んでいるが、これらに限定されない。いかなるプロトコルが採用されても、プロトコルはエフェクタだけでなくクローンバーコードをも識別すべく適合される。例えば、配列決定プロトコルが採用される場合、配列決定プロトコルは、エフェクタ及び／又は（存在する場合）エフェクタのバーコードだけでなくクローンバーコードの配列をも決定する。ハイブリダイゼーションプロトコルが採用される場合、対象のエフェクタ領域（例えばエフェクタ配列及び／又はバーコード）及びクローンバーコードの両方を有する標的に結合するプローブが採用されてもよい。例えば、ライブラリの要素が縦一列に並んだクローンバーコード及びエフェクタバーコードを含んでいる場合、アレイは、最初のライブラリの可能なクローンエフェクタの縦並びの組み合わせ毎にプローブを有する。このように、クローンバーコードは容易に識別される。
【００６９】
場合によっては、遺伝子スクリーンは、高スループット選択及びクローンバーコード／エフェクタ識別プロトコルを含むスクリーンであり、例えばエフェクタライブラリがプール型でスクリーニングされる高スループットスクリーニング（ＨＴＳ）プロトコルとしてみなされてもよい。ある実施形態では、これらの実施形態は、ライブラリの特定の要素が検出可能なレポータ遺伝子の活性化によって識別される、特にFACSで選択された細胞分画で濃縮エフェクタ挿入を迅速に識別するために高スループット（ＨＴ）配列決定プラットフォームの利点を利用する。その後、分類済の集団のエフェクタの同一性が、細胞ゲノムに一体化されたベクタからエフェクタ挿入を回収することにより、特にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及びそのクローニングにより確認される。このために、本発明の構築体は、例えば上述したようにエフェクタ領域に隣接するプライマ結合部位を含んでもよい。
【００７０】
クローンバーコード及びエフェクタが識別されると、得られたデータが、例えば上述したように遺伝子スクリーンのクローン解析に採用されてもよい。異なる形質導入エフェクタ構築体が夫々クローン的にバーコードを付けられて、バーコードが識別されるので、様々なクローン集団（ひいては、エフェクタライブラリの要素で実際に形質導入された個々の前駆標的細胞）の数が容易に決定されてもよい。その後、この情報が様々な異なる目的に使用されてもよい。
【００７１】
例えば本明細書に述べられているようなクローン解析の方法は、様々な異なる目的のために様々な異なる遺伝子スクリーンに採用されてもよい。クローン解析が採用されてもよい適用例は、エフェクタ毒性の決定、薬の作用を阻止するか向上させるエフェクタの識別、理学療法の効果の調整、シグナル伝達経路、標的細胞における生物学的プロセスなどを含んでいるがこれらに限定されない。
【００７２】
場合によっては、本明細書に述べられている方法は、エフェクタライブラリ内の所与のエフェクタの固有の毒性を決定するために採用されてもよい。例えば、上記に検討されているように、所与のエフェクタライブラリは、共通のエフェクタ配列を有するが異なるクローンバーコードを有する要素を夫々含む複数の異なるエフェクタサブライブラリを含んでもよい。エフェクタライブラリの複雑度が最初に形質導入された標的細胞の数に比べて十分であることを確実にすることにより、感染の際の最初の形質導入細胞の数がライブラリのshRNA のような異なるエフェクタ毎に10〜100 の細胞で維持されるように、本方法は実行され得る。このような実施形態では、エフェクタ毎の10〜100 のクローン（つまり、個々の形質導入細胞から生じる細胞集団）は生物学的実験の独立の複製であり、従って、各エフェクタ（例えばshRNA ）の毒性作用の独立の測定に使用され得る。異なるデータ解析戦略はクローンエフェクタ計数データに適用され得る。毒性エフェクタを識別する一実施形態は、プール型エフェクタライブラリの単一の形質導入から統計的に著しく欠失したエフェクタを識別するためにクローン解析を採用する。中期的な８〜10の細胞集団倍加実験の間に、非毒性エフェクタのクローンサイズの試料が、非感染細胞のクローンサイズの値前後でランダム且つ対称的に分配されることが想定される。毒性エフェクタについては、初めに形質導入された細胞の大部分がより小さなサイズのクローンを生成するか、又は完全に消えてもよいことが想定される。開始細胞のごく一部が一体化された構築体から十分なエフェクタレベルを発現しないこと、又は変異した不活性なエフェクタ配列を発現しないことは一般的であるので、少数であるが無視できない数のクローンが非毒性エフェクタクローンに典型的なサイズ範囲内にあることが想定される。従って、毒性エフェクタについては、クローンサイズの非対称の右側への傾斜分布と、エフェクタライブラリの同様の開始濃度の非毒性エフェクタと比較して想定より少ない数のクローンとが想定される。ライブラリの同様の最終（実験の終了）表示を有する毒性エフェクタ及び非毒性エフェクタに関して、毒性エフェクタがより大きな数のクローンを有するように、想定より少ない数のクローンが調整され得る。事後ペア選択のこの方法は、プラスミドライブラリのエフェクタ構築体の分布の代わりに、基準点としてライブラリの複数の陰性対照エフェクタの使用を可能にする。プラスミドライブラリのエフェクタの最初の表示のあり得る変形に対する耐性で、スクリーンが少数の形質導入細胞で行われ得るので、この手法は大きなサイズのライブラリの使用を可能にする。
【００７３】
図３に示されている例は、典型的な二重バーコード付きエフェクタライブラリスクリーンの一毒性エフェクタ及び一非毒性対照エフェクタに関してクローンのサイズ及び数の観察された分布が理論的に予測された分布とどのように完全に一致するかを示している。２つの分布の比較は、集団中心傾向の差異だけでなく分布の形状の差異にも感受性を示すノンパラメトリック法（例えばコルモゴロフ−スミルノフ検定）の標準的な二試料手法を使用して行われ得る。従って、この新しい手法によって、単一のウイルス形質導入で50〜100 の独立の反復（クローン）の試料について統計的な方法が実行され得る。これは、標準的な単一バーコードエフェクタスクリーンで典型的に可能な数よりはるかに多い。生物学的プロセスのより最新の研究では、他の手法がクローンエフェクタデータ分析に使用され得るが、一般的なロバストノンパラメトリック検定を適用することにより、陰性選択スクリーンから毒性エフェクタが十分識別され得る。
【００７４】
以下の実施例は、制限のためではなく例証のために提示される。
【００７５】
実験
Ｉ．クローンレンチウイルスshRNA ライブラリの構造
クローンshRNA ライブラリの生成は、異なるクローンバーコードカセットを含むレンチウイルスベクタの集合体の構築に基づいており（工程１）、工程１の後、生成されたクローンバーコードレンチウイルスベクタへの（shRNA 特有のバーコードを有する）shRNA カセットのクローニング（工程２）が行われる。以下では工程１の後に工程２が続くと述べられているが、他の実施形態では、工程１及び工程２が二重shRNA クローンバーコードカセットをクローニングすることにより共に組み合わせられ得る。或いは、最初にshRNA カセットがクローニングされて、その後、クローンバーコードカセットがクローニングされ得る。
【００７６】
工程１．pRSIレンチウイルスベクタのクローンバーコードカセットのクローニング
既知の隣接配列によって隣接する（少なくとも２つのヌクレオチドによって互いに異なる）3,250 の固有の14ヌクレオチドロングバーコードを有するクローンバーコードカセット（図４参照）がカスタムマイクロアレイの表面で合成され、オリゴヌクレオチドプール（Agilent，Santa Clara，CA）として与えられた。オリゴヌクレオチドプール（0.2 pmol）は、１×Phusion GC緩衝剤、0.2 mMのdNTP、0.5 μＭの隣接するFwdBC1プライマ及びRevBC1プライマ（図５）並びに１ユニットのホットスタート融合DNA ポリメラーゼ（Finnzymes）を含有した100 μｌ反応液中でPE9700（Life Technologies）で増幅された。サイクルパラメータは、30秒間98℃、10秒間98℃２サイクル、２分間55℃、20秒間72℃、その後10秒間98℃12サイクル、10秒間65℃、20秒間72℃であった。増幅されたプール型クローンバーコードカセット（約２μｇのDNA ）は製造者の推奨に従ってPCR 精製キット（Qiagen）を使用して精製され、１×G+緩衝剤及び100uのBpil制限酵素（Fermentas）を含有する100 μｌ反応液中で２時間37℃で空気培養器内で消化された。その後、Bpi に消化されたクローンバーコードカセットは、3.5 ％のアガロース１×TAE ゲル中で電気泳動によって分離され、切り離され、QIAquickゲル精製キット（Qiagen）を使用してゲルから抽出された。
【００７７】
クローニングのためのベクタを調製すべく、５μｇのpRSI9-U6-UbiC-RF-2A-Puro（図４）の制限消化を、１×G+緩衝剤及び100uのBpil制限酵素（Fermentas）を含有する100 μｌの反応液中で２時間37℃で空気培養器内で行った。次に、Bpi に消化されたレンチウイルスベクタは、1.2 ％のアガロース１×TAE ゲル中で電気泳動によって分離され、その後、QIAquickゲル精製キット（Qiagen）を使用して精製された。
【００７８】
クローン3.2KレンチウイルスshRNA ライブラリが、200 ngのBpilに消化されたベクタ及び100 ngのクローンバーコードカセットの連結反応によって、１×リガーゼ緩衝剤及び200uのT4 DNAリガーゼ（ＮＥＢ）を含有する50μｌ反応液内で６時間16℃で培養器で調製された。その後、連結されたクローン3.2Kライブラリは、2.5 容積のエタノールを加えた後の遠心分離によって沈殿し、その後、80％のエタノールで洗浄した。その後、得られた産物は５μｌの水に溶かされ、単一の1.8kV パルス及び遺伝子パルサエレクトロポレータ（BioRad）を用いて１mmカセットの50μｌのSURE細胞（Stratagene）内で電気穿孔された。電気穿孔されたSURE細胞は、100 μg/mlのアンピシリンを有する500 mlのLB培地内で一晩37℃で成長し、回収された細胞ペレットは、製造者のプロトコルに従ってEndo-free Midiプラスミド精製キット（Qiagen）を用いて約200 μｇのプラスミドクローン3.2Kライブラリを精製すべく用いられた。
【００７９】
クローンバーコードライブラリの構造及び設計の一例が図５に示されている。本例では、pRSI9-U6wt-BC14-UbiC-tagRFP-2A-Puroの3.2 クローンバーコードライブラリが構築され設計された。3.2Kクローンバーコードライブラリ（図5C（3.2K BC14 ライブラリの設計））が、Agilentのマイクロアレイの表面上で合成された3,250 の固有の14n バーコード（図5A（クローンバーコードカセットの設計））のクローニングによって構築され、FwdBC1プライマ及びRevBC1プライマを使用して増幅され、BsmBI で消化され、Bpi に消化されたpRSI9 ベクタ（図5B（U6プロモータの下流のpRSI9 ベクタのクローニング部位の設計））でクローニングされた。Bpil／Bpilクローニング部位（ACCG及びTTCG）での個別のshRNA 構築体又はshRNA 構築体のライブラリのクローニングのために、3.2K BC14 ベクタ／ライブラリを使用することができる。（例えば細胞にバーコードを付けるために）クローンバーコードライブラリを現状のままで使用するために、BC14バーコードが、Fwd-U6-1プライマ及びRev-cPPT5プライマの組み合わせを用いた２段階のPCR を使用してゲノムDNA から増幅される必要があり、PCR の第１段階の後にGex1MS-U6-2プライマ及びGex2M プライマの組み合わせを用いた入れ子状のPCR の第２段階が続く。増幅されたBC14 PCR産物は、シングルリード(SR)フローセル（IlluminaのGAIIX又はHiSeq2000）と互換性を有するプライマ（Gex1MS及びGex2M）を含んでおり、GexSeqM 配列決定プライマで配列決定され得る。
【００８０】
工程２．クローンshRNA エフェクタライブラリの構造
工程２では、上述した3.2Kクローンバーコードライブラリへの27K shRNA バーコードカセットのクローニングによって、5,000 のヒト遺伝子を標的とする27K shRNA ライブラリが生成される。Broad Instituteのウェブサイト（http://www.broadinstitute.org/rnai/trc/lib）を通して自由に入手可能なRNAiコンソーシアムデータベースを使用して、5,000 の標的遺伝子毎に余剰な組の５つのshRNA が選択された。shRNA 及び標的遺伝子のリストがwww.decipherproject.orgのウェブサイトで入手可能である。その後、プール型スクリーンでの最大のノックダウン効果のために、得られたshRNA 配列が、ライブラリのshRNA 構築体の等しい表示ためにshRNA のセンス部分に延長された21〜25のヌクレオチドのロングステム、７のヌクレオチドのループ（ATAACAA ）及び１〜２のGUミスマッチを有する配列毎に132 のヌクレオチドshRNA カセットを設計するために変更された。得られたshRNA カセットは、HT配列決定によるshRNA 構築体の容易な識別のために、上流のFwdHTSプライマ結合部位及びGex2プライマ結合部位に（特異的shRNA 毎に）固有の18のヌクレオチドのバーコードを更に組み込み、レンチウイルスベクタクローン3.2Kレンチウイルスライブラリ（上記の工程１参照）へのBpilに消化されたプール型shRNA カセットの増幅及びクローニングのために共通のプライマ結合部位で隣接し、ヒトU6プロモータからの25のヌクレオチドのショートヘアピン型shRNA の構成的発現と、自己分解2Aペプチドによって分離されたtagRFPリポータ及びピューロマイシン耐性マーカタンパク質のヒトユビキチンＣプロモータ（図４）からの構成的発現とが行われる。shRNA カセットは、Agilent Technologies（Santa Clara，CA）によってカスタムマイクロアレイの表面で合成され、オリゴヌクレオチドプール（10pmol）として27,000のshRNA バーコードオリゴヌクレオチドの複雑さを有してもたらされた。
【００８１】
オリゴヌクレオチドプール（0.2 pmol）は、１×Phusion GC緩衝剤、0.2 mMのdNTP、0.5 μＭの隣接するFwdPool10プライマ及びRevPool10プライマ（図６）及び１ユニットのホットスタート融合DNA ポリメラーゼ（Finnzymes）を含有する100 μｌ反応液内でPE9700（Life Technologies）により増幅された。サイクルパラメータは、98℃30秒間、98℃10秒間２サイクル、55℃２分間、72℃20秒間、その後、98℃10秒間12サイクル、65℃10秒間、72℃20秒間であった。増幅されたプール型shRNA バーコードカセット（約２μｇのDNA ）は製造者の推奨に従ってPCR 精製キット（Qiagen）を使用して精製され、１×G+緩衝剤及び100uのBpil制限酵素（Fermentas）を含有する100 μｌの反応液内で37度で２時間空気培養器で消化された。その後、Bpi に消化されたshRNA カセットは、3.5 ％のアガロース１×TAE ゲル中で電気泳動によって分離され、切り離され、QIAquickゲル精製キット（Qiagen）を使用してゲルから抽出された。
【００８２】
クローニングのためのクローン3.2Kベクタ／ライブラリを調製すべく、工程１で生成されたクローン3.2Kライブラリ（５μｇ）の制限消化を、１×G+緩衝剤及び100uのBpil制限酵素（Fermentas）を含有する100 μｌの反応液中で37℃で２時間空気培養器で行った。その後、Bpi に消化されたレンチウイルス3.2Kライブラリは、1.2 ％のアガロース１×TAE ゲル中で電気泳動によって分離され、その後、QIAquickゲル精製キット（Qiagen）を使用して精製された。
【００８３】
１×リガーゼ緩衝剤及び200uのT4 DNAリガーゼ（NEB ）を含有する50μｌの反応液内での200 ngのBpilに消化されたクローン3.2Kライブラリ及び100 ngのshRNA バーコードカセットの連結反応によって、プール型レンチウイルスクローン27K shRNA shRNA ライブラリが調製され、16℃で６時間培養された。その後、連結されたクローンshRNA ライブラリは、2.5 容積のエタノールを加えた後の遠心分離によって沈殿し、80％のエタノールで洗浄し、５μｌの水に溶かされ、 単一の1.8 kVパルス及び遺伝子パルサエレクトロポレータ（BioRad）を用いて１mmカセットの50μｌのSURE細胞（Stratagene）内で電気穿孔された。電気穿孔されたSURE細胞は、100 μg/mlのアンピシリンを有する500 mlのLB培地内で一晩37℃で成長し、回収された細胞ペレットは、製造者のプロトコルに従ってEndo-free Midiプラスミド精製キット（Qiagen）を用いて約200 μｇのプラスミドクローン27K shRNA ライブラリを精製すべく用いられた。
【００８４】
クローン27K shRNA ライブラリの設計が図６に示されている。27K バーコード付きshRNA カセット（図6A）が、Agilentのマイクロアレイの表面上で合成され、隣接するFwdPool10プライマ及びRevPool10プライマを使用して増幅され、Bpilでの消化後、Bpi に消化された3.2Kクローンバーコードライブラリにクローニングされた（図6B)。生成されたクローン27K shRNA ライブラリは、shRNA 部分（図6A）及び18n のshRNA 特有のバーコードを含んでおり、各shRNA 構築体は約3.2K 14nクローンバーコードを有する。表現解析のために、18n shRNA に特有のクローンバーコード及び14n クローンバーコードは、FwdHTS2 プライマ及びRevcPPT5プライマを用いたPCR の第１段階、及び第１段階後のGex1MSプライマ及びGex2Mプライマを用いた入れ子状のPCR の第２段階で形質導入細胞のゲノムDNA から増幅され、GexSeqMプライマを用いて配列決定され得る。
【００８５】
図6Aに示されているように、バーコード付きshRNA カセットは、（25bpステム部分7nループ及びTTTTTT終結因子を有する）shRNA 部分、プライマ結合部分、18n shRNA特有バーコードを含んでおり、クローンバーコードライブラリのAACG部位及びTTCG部位での増幅及び（Bpil消化後の）クローニングに必要なBpi部位（GAAGAC）を有するプライマ結合部位配列に両側で隣接している。図6Bに示されているクローンバーコードライブラリの構造に関する詳細は、図２に示されている。図6Cに示されているように、クローンshRNA ライブラリは、下流のshRNA のRNA ポリメラーゼIII による発現を引き起こすU6プロモータ、RNA ポリメラーゼIII のための終結因子(TTTTTT)、プライマ結合領域、18n shRNA 特有バーコード、14n クローンバーコード及びプライマ結合領域を含んでいる。shRNA 特有バーコード及びクローンバーコードの両方の表現解析のために、PCR の第１段階と、第１段階後の、Gex1MSプライマ及びGex2Mプライマを用いた入れ子状のPCR の第２段階とで二重バーコード(18)−バーコード(14)領域がFwdHTS2プライマ及びRevcPPT5プライマによって増幅される。二重バーコードカセットは、GexSeqM配列決定プライマを使用してIlluminaプラットフォームで配列決定される。
【００８６】
II. 遺伝子スクリーン後の試料のゲノムDNAからのshRNA 特有バーコード及びクローンバーコードの増幅及びHT配列決定
遺伝子スクリーン後の約５〜10×107 細胞が遠心分離によって回収され、細胞ペレットが、１mlの0.1MTrisHCl ，１％SDS 緩衝液を加えることにより溶解した。ゲノムDNA は、22ゲージ注射器に５回通すことにより分解され、２段階のフェノール／クロロホルム抽出によって精製され、2.5 容積のエタノールを加えることにより沈殿し、80％のエタノールで洗浄され、TE緩衝液に溶かされた。プール型バーコードは、２段階のPCR によってゲノムDNA から増幅された。PCR の第１段階では、２×100 μｌ反応液は、（各試料からの）200 μｇのゲノムDNA 、１×チタン緩衝剤、0.2 mMのdNTP、0.3 μＭのFwdHTS2 プライマ、0.3 uMのRev-cPPT5プライマ、2uのチタンTaqDNAポリメラーゼ（Takara）を含有した。反応混合物に18サイクルのPCR を行い、サイクルパラメータは、94℃30秒間、65℃10秒間、72℃20秒間であった。その後、８つのPCR 反応が共に組み合わせられ、第１のPCR からの１μｌアリコートが入れ子状のプライマを用いたPCR の第２段階で１×チタン緩衝剤、0.2 mMのdNTP、0.5 μＭのGex1MSプライマ、0.5 μＭのGex2M プライマ、2uのチタンTaqDNAポリメラーゼ（Clontech）を含有する100 μｌ反応液内で増幅され、12サイクルのPCR を行い、サイクルパラメータは、94℃30秒間、65℃10秒間、72℃10秒間であった。その後、shRNA 特有バーコード及びクローンバーコード（図３参照）の両方を含む増幅されたプール型カセットは、3.5 ％のアガロース１×TAE ゲル中で電気泳動によって分離され、切り離され、QIAquickゲル精製キット（Qiagen）を使用してゲルから抽出され、10pMの濃度に調節された。増幅されたプール型バーコードのHT配列決定は、製造者のプロトコルに従って（１試料当たり）略100 ×106 リードでGexSeqMプライマを用いたIllumina Genome Analyzer 2000を使用して行なわれた。
【００８７】
III. 陰性選択スクリーン
ウイルスパッケージング形質導入及び力価が、Decipher Manual （Cellecta Inc; www.cellecta.com/resources/literature）に記載されているように行われた。（上述したように調製された）5,000 の遺伝子（５shRNA ／遺伝子）を標的とする二重バーコード27,000のshRNA ウイルスライブラリが使用された。３つの独立の形質導入が行なわれた。各形質導入は、約5,000,000 の細胞（平均して約200 細胞／shRNA ）が形質導入されるように、50％の効率で感染した10,000,000の細胞で行われた。独立して形質導入された細胞に由来し、同一のshRNA を発現する全ての異なるクローンは同一のshRNA に特有の一次バーコードを保持するが、独立クローンは夫々異なるクローン二次バーコードを更に保持する。注釈：ライブラリのshRNA の数、利用可能な二次（クローン）バーコードの数及び高スループット配列決定で利用可能なリード／試料の数に応じて、操作者は、（10のクローン／shRNA がクローンサイズ分布の統計解析のためのクローンの最小数であると仮定して）初めに形質導入された細胞／shRNA の平均数を10以上の値に設定することができる。これらの特定の実験では、200 クローン／shRNA の値が、(i) 利用可能な10,000の二次（クローン）バーコード（平均的なshRNA 毎の形質導入細胞に対する二次バーコードの50倍過剰）と、(ii)HT配列決定の２億リード／試料とに基づいて選ばれる。25,000のshRNA に対する200 クローン／shRNA は、合計500,000 クローンを意味し、これは、平均して40の利用可能なリード／クローンになり、正確なクローンサイズ測定のための十分なリードである。
【００８８】
Ａ．DU145ヒト前立腺癌細胞の生存能力にとって不可欠な遺伝子の識別：インビトロ及びインビボでの陰性選択ドロップアウトスクリーンのクローン解析
【００８９】
１．インビトロ実験
第１日
DU145ヒト前立腺癌細胞が10％のFBS及び５μg/mlのポリブレンで補われたD-MEM内でトリプシン処理され、200,000 の細胞／mlの密度に再懸濁された。25mlの細胞が６枚の15cmのプレート（10,000,000の細胞の独立の各実験複製毎に２枚のプレート）の各々に等分され、十分なウイルスが１枚のプレート当たり2,500,000の感染細胞（5,000,000 感染細胞／実験複製）を達成するために加えられた。細胞はCO2 培養器に戻され、標準的条件下で一晩成長した。
【００９０】
第２日
形質導入後の18時間後、ウイルス／ポリブレンを含む培地が、（ポリブレン無しの）新鮮な培地と置換された。
【００９１】
第４日
形質導入後の72時間後、プロマイシンが１μg/mlの最終濃度で試料に加えられた（約90％のRFP+細胞がRFP/PuroR 力価分析に基づいて更にプロマイシン耐性であると想定された）。プロマイシンの選択が48時間行なわれた。
【００９２】
第９日
試料が回収され、ゲノムDNA が抽出されて精製された（Decipher Manual参照）。shRNA 挿入バーコードはゲノムDNA から増幅され、HT配列決定によって列挙された。
【００９３】
２．インビボ実験
第１日
DU145ヒト前立腺癌細胞が 10％のFBS 及び５μg/mlのポリブレンで補われたD-MEM 内でトリプシン処理され、200,000 の細胞／mlの密度に再懸濁された。25mlの細胞が12枚の15cmのプレート（20,000,000の細胞の独立の各実験複製毎に４枚のプレート）の各々に等分され、十分なウイルスが１枚のプレート当たり2,500,000の感染細胞（10,000,000感染細胞／実験複製）を達成するために加えられた。細胞はCO2 培養器に戻され、標準的条件下で一晩成長した。
【００９４】
第２日
形質導入後の16時間後、細胞がトリプシン処理され、免疫不全マウスに皮下注射された（４注射／複製，約6,000,000 細胞／注射）。
【００９５】
第３週
注射後の３週間後、成長した腫瘍が回収されて細かく刻まれ、ゲノムDNA が、処理済の試料及び未処理の試料から抽出されて精製された（Decipher Manual参照）。二重バーコードがゲノムDNA から増幅され、HT配列決定によって列挙された。
【００９６】
３．陰性選択スクリーンのデータ分析
クローン解析法が、プール型shRNA 二重バーコード付きライブラリの独立の形質導入から統計的に著しく欠失した毒性shRNA を識別するために使用された。複数の細胞集団の倍加後、組織培養実験（インビトロ）又は異種移植片腫瘍成長実験（インビボ）のいずれかで、同一の非毒性shRNA を発現するクローン全てのサイズが、非shRNA 発現細胞の平均的なクローンサイズの値前後でランダムに且つ疑似対称的に分配される。毒性shRNA については、より高い割合の初めに形質導入された細胞は、より小さなサイズのクローンを生成するか、又は全くクローンを生成しない。従って、毒性shRNA については、プラスミドライブラリの同様の開始濃度の非毒性shRNA と比較して想定より少ない数のクローン全体、及び増加した数の小さいサイズのクローンに基づくクローンサイズの傾斜分布が想定される。図７は、インビトロ（組織培養）及びインビボ（腫瘍形成）での典型的な二重バーコード付きshRNA ライブラリスクリーンにおける１つの毒性shRNA 及び１つの非毒性対照shRNA に関するクローンサイズ及びクローンの分布の一例を示す。２つの分布の比較は、集団中心傾向の差異だけでなく分布の形状の差異にも感受性を示すノンパラメトリック法（例えばコルモゴロフ−スミルノフ検定）の標準的な二試料手法を使用して行われ得る。従って、この新しい手法によって、単一のウイルス形質導入で50〜100 の独立の反復（クローン）の試料について統計的な方法が実行され得る。これは、標準的な単一バーコードRNAiスクリーンで典型的に可能な数よりはるかに多い。生物学的プロセスのより最新の研究では、他の手法が10以上の独立のクローンの試料についてクローンshRNA データ分析に使用され得る。
【００９７】
IV. 陽性選択スクリーン
Decipher Manual (Cellecta Inc; www.cellecta.com/resources/literature)に述べられているように、ウイルスパッケージング形質導入及び力価が行なわれた。（上述したように調製された）5,000 の遺伝子を標的とする27,000の二重バーコード付shRNA ウイルスライブラリ（5shRNA ／遺伝子）が使用された。６の独立の形質導入が行なわれた。各形質導入は、約5,000,000の細胞（平均して約200 の細胞／shRNA ）が形質導入されるように、50％の効率で感染した10,000,000の細胞で行われた。独立して形質導入された細胞に由来し、同一のshRNA を発現する全ての異なるクローンは同一のshRNA に特有の一次バーコードを保持するが、独立クローンは夫々異なるクローン二次バーコードを更に保持する。ライブラリのshRNA の数、利用可能な二次（クローン）バーコードの数及び高スループット配列決定で利用可能なリード／試料の数に応じて、操作者は、（10のクローン／shRNA はクローンサイズ分布の統計解析のためのクローンの最小数であると仮定して）初めに形質導入された細胞／shRNA の平均数を10以上の値に設定することができる。これらの特定の実験では、200 クローン／shRNA の値が、(i) 利用可能な10,000の二次（クローン）バーコード（平均的なshRNA 毎の形質導入細胞に対する二次バーコードの50倍過剰）と、(ii)HT配列決定の２億リード／試料とに基づいて選ばれる。25,000のshRNA に対する200 クローン／shRNA は、合計500,000 クローンを意味し、これは、平均して40の利用可能なリード／クローンになり、正確なクローンサイズ測定のための十分なリードである。
【００９８】
Ａ．インビトロでのHep3B ヒト肝細胞癌細胞におけるTGF −β媒介のアポトーシスに対する耐性を与えるshRNA の識別
【００９９】
第１日
細胞は、10％のFBS 及び５μg/mlのポリブレンで補われたD-MEM 中でトリプシン処理され１×105 細胞/ml の密度に再懸濁された。25mlの細胞が15cmの各プレート（複製毎に６枚のプレート，複製毎に1.5 ×107 細胞）に等分され、十分なウイルスが１枚のプレート当たり〜９×105 の感染細胞を達成するために加えられた。細胞は、CO2 培養器に戻され、標準的な条件下で24時間成長した。
【０１００】
第２日
形質導入後の18時間後に、ウイルス／ポリブレンを含む培地が（ポリブレン無しの）新鮮な培地と置換された。
【０１０１】
第５日
形質導入後の96時間後に、３つの（３）試料が回収され、凍結した細胞ペレット（未処理の試料）として貯蔵された。３つの細胞試料が、アポトーシスを引き起こすためにTGF −β（１ng／ml）で補われたDMEM培地で処理された。
【０１０２】
第８日
TGF −β処理の３日後に、アポトーシスを生き延びた細胞がトリプシン処理され、回収され、遠心分離機にかけられ、各試料は、冷凍した細胞ペレット（TGF −β処理済み試料）として貯蔵された。
その後、ゲノムDNA が全ての６つの細胞集団（TGF −β処理済み試料及び未処理の試料の両方）から抽出され精製された。二重バーコードは分離されたゲノムDNA の全量から増幅され、HT配列決定によって列挙された。
【０１０３】
Ｂ．インビトロ及びインビボでのHeLa/NFKB-GFPリポータ細胞株におけるNFKB応答を引き起こすshRNA の識別
これらの実験では、NFKB依存プロモータの制御下で蛍光タンパク質GFP 遺伝子を保持するリポータ細胞株が使用された。この細胞株は、NFKBシグナル伝達経路の活性化の際にGFP を発現する。
【０１０４】
１．インビトロ実験
第１日
細胞は、10％のFBS 及び５μg/mlのポリブレンで補われたD-MEM中でトリプシン処理され、１×105細胞／mlの密度に再懸濁された。25mlの細胞が12枚の15cmのプレートの各々（複製毎に４枚のプレート，複製毎に10,000,000 の細胞，３複製）に等分され、十分なウイルスが約 5,000,000の感染細胞／実験複製を達成するために加えられた。細胞は、CO2 培養器に戻され、標準的な条件下で一晩成長した。
【０１０５】
第２日
形質導入後の18時間後に、ウイルス／ポリブレンを含む培地が（ポリブレン無しの）新鮮な培地と置換された。
【０１０６】
第５日
形質導入後の96時間後に、試料はFACSによって分類され、５%の最も明るい細胞（GFP+）が回収された。
その後、ゲノムDNA は分類されたGFP+試料から抽出され精製された。二重バーコードは、分離されたゲノムDNA の全量から増幅され、HT配列決定によって列挙された。
【０１０７】
２．インビボ実験
第１日
細胞は、10％のFBS 及び５μg/mlポリブレンで補われたD-MEM中でトリプシン処理され１×105細胞/mlの密度に再懸濁された。25mlの細胞が12枚の15cmのプレート（複製毎に４枚のプレート，複製毎に10,000,000 の細胞，３複製）の各々に等分され、十分なウイルスが約 5,000,000の感染細胞／実験複製を達成するために加えられた。細胞は、CO2 培養器に戻され、標準的な条件下で一晩成長した。
【０１０８】
第２日
形質導入後の16時間後に、細胞がトリプシン処理され、免疫不全マウスに皮下注射された（１複製／マウス，約6,000,000 細胞／注射，２注射／マウス）。
【０１０９】
第３週
注射後の３週間後に、成長した腫瘍が回収された。細胞は、機械的且つ酵素的な方法によって穏やかに分離され、FACSによって分類され、５%の最も明るい細胞（GFP+）が回収された。
その後、ゲノムDNA は分類されたGFP+試料から抽出され精製された。二重バーコードは分離されたゲノムDNA の全量から増幅され、HT配列決定によって列挙された。
【０１１０】
３．陽性選択スクリーンのデータ分析
クローン解析法は、プール型shRNA 二重バーコードライブラリの独立の形質導入から統計的に著しく濃縮されたshRNA の識別に使用された。濃縮されたshRNA は、選択後の検出可能なクローンの数をshRNA プラスミドライブラリの各shRNA 配列の相対存在量と比較することにより識別された。結果のプロットが図８に示された。
【０１１１】
IV. 追加のデータ
クローン分布（10,000バーコード）が図９に示されている。各構築体が異なるバーコード配列を有するレンチウイルスライブラリ（複雑なバーコードライブラリ）で細胞が形質導入された。細胞は、インビトロで約２週間成長するか、又は次の日注射され、異種移植腫瘍として成長した。ゲノムDNA 全体のバーコード配列決定が行なわれた。図９は、各バーコードに対する集団の分布（つまり、単感染から得られた各クローン集団のサイズ）を示す。例えば（矢印では）、インビトロにおいて、約64の単一細胞である細胞集団に対して2,500 のバーコードを僅かに超えている。これは、最初の細胞の約2,500の細胞（約１／４）が６倍に倍加したことを意味する。インビトロでは、細胞の大部分が５〜７倍に倍加した。インビボでは、ほとんどの細胞が成長しないか、又は数倍に倍加した。最初の細胞の約６%は例外的によく増殖して、クローン成長の長く延びる分布になった。
【０１１２】
細胞分布が図１０に示されており、グラフは、各集団分布での全てのクローンの細胞総数を示す。例えば、インビトロでは、６倍加の2500のクローン集団全体が約17,000の細胞を生成した。インビトロでは、細胞のほとんど全てが、５〜８倍に倍加したクローンから生成された。細胞数がクローン集団の倍加とよく一致するので、細胞総数は、特異的shRNA を有する細胞集団の成長率の適した尺度である。インビボでは、集団の細胞はほとんど全て、非常によく成長する僅かなクローン、つまり、分布のテール部分で生成された。細胞総数は、よく増殖する僅かなクローンと単に相関するだけであり、これらは集団全体を支配する。
【０１１３】
図１１は、細胞数（上部）及びクローン数（下部）のインビトロ分布に対するインビボ分布を示す。インビトロでは、ほとんどの細胞はおおよそ等価な成長率を有する。shRNA スクリーニングでは、shRNA を有する細胞の総数が、そのshRNA で形質導入された全ての細胞の成長率を正確に反映する。インビボでは、細胞総数は、集団全体を支配する僅かなクローンの成長率と単に相関するだけである。これらの僅かなクローンの子孫が、集団の細胞の90%を占める。従って、shRNA スクリーンでは、shRNA の計数から分かることは、該shRNA を有する細胞の内の１つが腫瘍内の選択群の支配クローンの内の１つとして成功したか否かのみである。この小さな典型的ではない集団は、複製間の非常に高度な無作為化を生じさせる。
【０１１４】
図１２に示されているように、特異的shRNA で形質導入された各クローンの成長率を追跡するために、ベクタ挿入連結反応が夫々、特定のshRNA 配列を未だ固有に識別する部分と共に自身の固有のバーコードを有する構築体を生成する変更済のshRNA ライブラリが構築された。
【０１１５】
二重バーコードライブラリを用いたスクリーニング手法の一例が図１３に示されている。各形質導入により、固有のバーコードを有する細胞が生成される。本例では、ライブラリは100 万を超える（例えば、8775万の）固有のエフェクタ構築体を含んでおり、これらのエフェクタ構築体は、例えば100 万の細胞を形質導入するために使用されてもよい。形質導入により、shRNA 毎に自身のバーコードを夫々有する例えば約40のクローンが生成されてもよい。自身のバーコードを夫々有するクローン集団を生成するために、形質導入細胞は増えてもよい（例えば、８倍加により２億5000万の細胞が得られる）。例えば、１億リード（クローン当り平均して100 リード（100M／1M），shRNA 当り40クローン（1M／27,000））を生成するために、核酸は分離されて配列決定されてもよい。
【０１１６】
図１４〜１６は、三倍体でのインビトロ二重バーコードスクリーンの結果を示す。図１４では、各グラフは、プール型スクリーンにおける同一のshRNA の約40〜70の形質導入に由来したクローン集団の分布を示す。上側３つの生物学的複製は、ライブラリの毒性shRNA のクローンの分布を示す。ほとんどのクローンは成長しないか、又は１〜２倍倍加するだけである。しかしながら、少数のクローンはshRNA に影響されない。分布は発生源に偏っている。図１４の下側３つのグラフは、同一のライブラリスクリーンに非毒性shRNA を含むクローンを示している。成長しないクローンもあるが、ほとんどのクローン集団は数倍倍加して、広い分布を生成する。図１５及び１６は、EIF3A （図１５）及びluc （図１６）に関するクローンサイズ及びクローン頻度の分布を示す。図１７は、図１４からの３つの生物学的複製の平均と共に、クローン分布を示している。
【０１１７】
毒性クローン対非毒性クローンのインビトロでの比較結果が図１８に示されている。インビトロ生存能力スクリーンからの、非毒性shRNA 対毒性shRNA の（200 の細胞に標準化された）分布では、非毒性shRNA に関して、ほとんどのクローンが成長し、細胞のほとんどを生成する。成長分布はクローン間で比較的一定であり、そのため、クローンのほとんどの一般的な成長又は抑制により、shRNA の総数によって定量化されるより多数の細胞又はより少数の細胞が直接生成される。
【０１１８】
毒性クローン対非毒性クローンのインビボ比較が図１９に示されている。典型的な複製変異と、以前のインビボバーコード細胞追跡データからの分布とを使用した、インビボ生存能力スクリーンにおける非毒性shRNA 対毒性shRNA の計算された分布では、毒性shRNA 及び非毒性shRNA 間の差異は、shRNA を有する全てのクローン集団の増殖速度を見ることにより明らかである。しかしながら、クローン成長は非常に分散するので、細胞のほとんど全ては、僅かな極めて高い増殖性クローン（クローンの優性）によって生成される。成長阻害が全ての細胞に亘って一定ではないので、これが毒性shRNA でも生じる。従って、毒性shRNA 及び非毒性shRNA の両方の細胞数、ひいてはshRNA 計数は非常に可変である。
【０１１９】
図２０は、インビトロ対インビボの総細胞／shRNA を示す。各棒は、図１８及び図１９に示されている各要素の全てのクローンからの細胞の総数を示している。インビトロでの毒性shRNA 又は非毒性shRNA を有する細胞の総数は一致している。しかしながら、腫瘍では、特異的shRNA を有する細胞の総数は大幅に異なる。十分な複製では、毒性shRNA を有する細胞の数と非毒性shRNA を有する細胞の数とのある統計的な差異を決定することが可能であってもよい。しかしながら、このような高い変動性では、最も効果的なshRNA であってもこの差異を確信して決定するために、多くの複製がどのように必要とされるのかを評価するのは困難である。インビボのノイズは非常に高く、シグナルの識別は難しく、複製はインビトロより困難である。
【０１２０】
インビボでの標準的なプール型スクリーンに関する問題は、(1) 異種移植片のインビボ成長は「クローンの優性」によって特徴付けられ、腫瘍のほとんどが僅かな移植細胞の子孫によって作られ、成長不均質性はshRNA によって引き起こされる成長結果を遥かに超過する、(2) 少数のshRNA は、shRNA 計数の残りのノイズが多い状態で非常に分散したバックグラウンドで優位である、(3) ほとんどの細胞毒性shRNA でも、全てのクローンの成長を完全には阻害しない、(4) 細胞毒性shRNA のための変異した要素又は低く発現する要素を保持する１つの優位なクローンは、そのshRNA を有する全ての残りのクローンでの成長抑制効果をマスクすることが可能である、及び(5) 各shRNA バーコードの表示は、複製内でどのクローンが優位であるかに応じて異なり、そのため、インビボ複製からのshRNA 計数は過度の変動性と一致しないことを含んでいる。上記の問題の解決策は、特異的shRNA によって形質導入された各細胞の成長率を分析することである。shRNA の注射後のクローンの成長率は追跡されることができ、特異的shRNA を有する細胞のクローン倍加率が比較され得る。
【０１２１】
インビボプール型shRNA スクリーンの問題の解決策は、以下の通りである。バーコードの一部がshRNA 配列を示して、他の部分が細胞クローンを区別する二重バーコードシステムを使用して、トラックが単一shRNA 配列を独立して形質導入した。二重バーコードスクリーンは、依然として標準的な遺伝子スクリーンから利用可能な情報を全て与える。バーコードのクローン部分が無視されてもよい。クローンバーコードを用いたスクリーニングは、(1) 特異的shRNA を有する腫瘍中のクローンの数、及び(2) 特異的shRNA を発現する各クローン集団の大きさの２つの更なる測定基準を与える。各クローン集団は、特異的shRNA がどのように成長に影響するかの一分析に等しいので、各腫瘍は、shRNA 毎に多発性増殖分析を可能にする。shRNA バーコード毎の複数のクローン集団の成長率は、複数の細胞に対するshRNA 効果の直接測定を可能にする。
【０１２２】
上記の発明は、理解の明瞭化のために、図示及び例示によりある程度詳しく説明されているが、ある変更及び調整が、添付の請求項の趣旨及び範囲から逸脱することなく本開示になされてもよいことが、本開示の教示を考慮すると当業者に容易に明らかとなる。
【０１２３】
従って、前述の内容は本開示の本質を単に示しているに過ぎない。本明細書に明示的に説明されていないか又は示されていないが、本発明の本質を具体化して本発明の趣旨及び範囲に含まれる様々な構成を当業者が考案することが可能であることが明らかである。更に、本明細書に述べられている全ての例及び条件的な用語は、本発明の本質と、本技術分野を進展させるために本発明者により与えられた概念とを理解する際に読者を支援することを本質的に意図するものであり、このように具体的に述べられた例及び条件に限定するものではないと解釈されるべきである。更に、本発明の本質、態様及び実施形態だけでなく、本発明の具体的な例を述べている本明細書における全ての記載は、本発明の構造的且つ機能的な等価物の両方を含むことを意図するものである。加えて、このような均等物は、現時点で既知の均等物及び今後開発される均等物の両方、すなわち構造に関わらず同一の機能を有する開発された全ての要素を含む。従って、本発明の範囲は、本明細書に示され説明された例示的な実施形態に制限されることを意図するものではない。むしろ、本発明の範囲及び趣旨は添付の請求項により具体化される。
【０１２４】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第119 条(e) に従って、2012年５月８日に出願された米国仮特許出願第61/644,324号明細書の優先権を主張しており、その開示は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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