(57)【要約】  本発明は、転写減衰されたｐｒｏＰ遺伝子を有する腸内細菌科の微生物の使用下でのＬ−アミノ酸の発酵による製造方法、この生産のために適したに微生物並びにトランスポータＰｒｏＰの変異体をコードするポリヌクレオチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐｒｏＰ遺伝子が転写減衰されている微生物を使用することを特徴とする、腸内細菌科の微生物の発酵によるＬ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸を有する飼料添加物の製造方法。
【請求項２】
前記ｐｒｏＰ遺伝子が停止されていることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｐｒｏＰ遺伝子が低い水準で発現すること特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記微生物が、Ｌ−アミノ酸を過剰生産することを特徴とする、請求項１から３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記微生物が、Ｌ−アミノ酸を培地中で増加させることを特徴とする、請求項１から４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記微生物が、Ｌ−アミノ酸を細胞内で増加させることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｌ−アミノ酸は、硫黄含有アミノ酸、好ましくはＬ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ホモシステイン又はＬ−ホモシスチンであることを特徴とする、請求項１から６までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記硫黄含有アミノ酸は、Ｌ−メチオニンであることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物は、転写減衰されたｐｒｏＰ遺伝子なしの微生物と比較して高められたメチオニン耐性を有することを特徴とする、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記腸内細菌科の微生物は、Escherichia属、Erwinia属、Providencia属又はSerratia属の細菌、特にEscherichia属の細菌、特に好ましくは大腸菌（Escherichia coli）であることを特徴とする、請求項１から９までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ｐｒｏＰ遺伝子は、SEQ ID NO:1、3、5又は7によるポリヌクレオチド配列を基準として、特に好ましくはSEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列を基準として、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、とりわけ少なくとも９８、９９又は１００％の配列同一性を有する遺伝子であることを特徴とする、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記転写減衰されたｐｒｏＰ遺伝子は、SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチドの配列を基準として、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、殊に少なくとも９８、９９又は１００％の配列同一性を有しかつ更にSEQ ID NO:1によるポリヌクレオチドと比較して、必然的に次の突然変異：
ｅ．  SEQ ID NO:2による位置３２４又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−アルギニンをコードするトリプレットが、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンの群から選択される１つのアミノ酸、好ましくはＬ−ロイシンをコードするトリプレットに置換される；
ｆ．  SEQ ID NO:2による位置４６７又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−チロシンをコードするトリプレットが、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジンの群から選択される１つのアミノ酸、好ましくはＬ−ヒスチジンをコードするトリプレットに置換される；
ｇ．  SEQ ID NO:2による位置４１２又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−グルタミン酸をコードするトリプレットが、停止コドンをコードするトリプレットに置換される；
ｈ．  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置８５４の核酸塩基のアデニンが欠失する；
ｉ．  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置１１７３〜１２２３の核酸塩基の１つ又はそれ以上が欠失する、好ましくは位置１１７３〜１２２３の全ての核酸塩基が欠失する；
ｊ．  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置８４２に核酸塩基のシトシンを挿入する；
ｋ．  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置９７３に１つ又はそれ以上の核酸塩基を挿入する、好ましくは位置９７３に１９の核酸塩基を挿入する；
ｌ．  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置１８３に１つ又はそれ以上の核酸塩基を挿入する、好ましくは位置１８３に１３５９の核酸塩基を挿入する、
の１つ又はそれ以上を有するポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記発酵を、無機硫黄源を含む培地中で行うことを特徴とする、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｌ−アミノ酸を、得られた発酵ブロス中で増加させ、引き続き、場合により単離、採集及び／又は精製することを特徴とする、請求項１から１３までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記Ｌ−アミノ酸を、構成成分と一緒に発酵ブロス及び／又はバイオマスから単離又は採集することを特徴とする、請求項１から１４までのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｌ−アミノ酸を生産し、かつ好ましくは培地中へ分泌することを特徴とする、転写減衰されたｐｒｏＰ遺伝子を有する、腸内細菌科の微生物。
【請求項１７】
前記Ｌ−アミノ酸を細胞内で増加させることを特徴とする、請求項１６に記載の微生物。
【請求項１８】
前記Ｌ−アミノ酸を培地中で増加させることを特徴とする、請求項１６に記載の微生物。
【請求項１９】
前記ｐｒｏＰ遺伝子が停止されていることを特徴とする、請求項１６から１８までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２０】
前記ｐｒｏＰ遺伝子が低水準で発現することを特徴とする、請求項１６から１８までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２１】
前記微生物が、Ｌ−アミノ酸を過剰生産することを特徴とする、請求項１６から２０までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２２】
前記Ｌ−アミノ酸は、硫黄含有アミノ酸、好ましくはＬ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ホモシステイン又はＬ−ホモシスチンであることを特徴とする、請求項１６から２１までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２３】
前記硫黄含有アミノ酸は、Ｌ−メチオニンであることを特徴とする、請求項２２に記載の微生物。
【請求項２４】
前記微生物は、転写減衰されたｐｒｏＰ遺伝子なしの微生物と比較して高められたメチオニン耐性を有することを特徴とする、請求項１６から２３までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２５】
前記腸内細菌科の微生物は、Escherichia属、Erwinia属、Providencia属又はSerratia属の細菌、特にEscherichia属の細菌、特に好ましくは大腸菌（Escherichia coli）であることを特徴とする、請求項１６から２４までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２６】
前記ｐｒｏＰ遺伝子は、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5又はSEQ ID NO:7によるポリヌクレオチド配列を基準として、特に好ましくはSEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列を基準として、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、とりわけ少なくとも９８、９９又は１００％の配列同一性を有する遺伝子であることを特徴とする、請求項１６から２５までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２７】
前記転写減衰されたｐｒｏＰ遺伝子は、SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチドの全体配列を基準として、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に好ましくは少なくとも９５％、とりわけ少なくとも９８、９９又は１００％の配列同一性を有しかつ更にSEQ ID NO:1によるポリヌクレオチドと比較して、必然的に次の突然変異：
ｍ．  SEQ ID NO:2による位置３２４又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−アルギニンをコードするトリプレットが、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンの群から選択される１つのアミノ酸、好ましくはＬ−ロイシンをコードするトリプレットに置換される；
ｎ．  SEQ ID NO:2による位置４６７又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−チロシンをコードするトリプレットが、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジンの群から選択される１つのアミノ酸、好ましくはＬ−ヒスチジンをコードするトリプレットに置換される；
ｏ．  SEQ ID NO:2による位置４１２又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−グルタミン酸をコードするトリプレットが、停止コドンをコードするトリプレットに置換される；
ｐ．  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置８５４の核酸塩基のアデニンが欠失する；
ｑ．  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置１１７３〜１２２３の核酸塩基の１つ又はそれ以上が欠失する、好ましくは位置１１７３〜１２２３の全ての核酸塩基が欠失する；
ｒ．  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置８４２に核酸塩基のシトシンを挿入する；
ｓ．  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置９７３に１つ又はそれ以上の核酸塩基を挿入する、好ましくは位置９７３に１９の核酸塩基を挿入する；
ｔ．  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置１８３に１つ又はそれ以上の核酸塩基を挿入する、好ましくは位置１８３に１３５９の核酸塩基を挿入する、
の１つ又はそれ以上を有するポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１６から２６までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２８】
アスパルタートキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼＴｈｒＡの高められた活性を有することを特徴とする、請求項１６から２７までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２９】
Ｏ−スクシニルホモセリントランスフェラーゼＭｅｔＡ及び／又はセリン  アセチルトランスフェラーゼＣｙｓＥの高められた活性を有することを特徴とする、請求項１６から２８までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項３０】
Ｌ−メチオニンバイオシンターゼＭｅｔＪ及び／又はＳ−アデノシルメチオニンシンターゼＭｅｔＫの転写レギュレータの低減された活性を有することを特徴とする、請求項１６から２９までのいずれか１項に記載の微生物。
【請求項３１】
SEQ ID NO:1による配列を基準として、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、とりわけ少なくとも９８、９９又は１００％の同一性を有するポリヌクレオチドにおいて、前記ポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチドと比較して、必然的に
ｕ．  SEQ ID NO:2による位置３２４又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−アルギニンをコードするトリプレットが、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンの群から選択される１つのアミノ酸、好ましくはＬ−ロイシンをコードするトリプレットに置換される；
ｖ．  SEQ ID NO:2による位置４６７又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−チロシンをコードするトリプレットが、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジンの群から選択される１つのアミノ酸、好ましくはＬ−ヒスチジンをコードするトリプレットに置換される；
ｗ．  SEQ ID NO:2による位置４１２又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−グルタミン酸をコードするトリプレットが、停止コドンをコードするトリプレットに置換される；
ｘ．  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置８５４の核酸塩基のアデニンが欠失する；
ｙ．  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置１１７３〜１２２３の核酸塩基の１つ又はそれ以上が欠失する、好ましくは位置１１７３〜１２２３の全ての核酸塩基が欠失する；
ｚ．  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置８４２に核酸塩基のシトシンを挿入する；
ａａ．  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置９７３に１つ又はそれ以上の核酸塩基を挿入する、好ましくは位置９７３に１９の核酸塩基を挿入する；
ｂｂ．  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置１８３に１つ又はそれ以上の核酸塩基を挿入する、好ましくは位置１８３に１３５９の核酸塩基を挿入する、
から選択される１つ又はそれ以上の突然変異を有することを特徴とする、ポリヌクレオチド。
【請求項３２】
SEQ ID NO:1に対して相補的なポリヌクレオチド、SEQ ID NO:3に対して相補的なポリヌクレオチド及びSEQ ID NO:5に対して相補的なポリヌクレオチド、好ましくはSEQ ID NO:1に対して相補的なポリヌクレオチドの群から選択されるポリヌクレオチドの１つ又は複数とハイブリダイズすることを特徴とする、請求項３１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項３１又は３２に記載のポリヌクレオチドを有する、ベクター。
【請求項３４】
SEQ ID NO:2による配列を基準として、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、とりわけ少なくとも９８、９９又は１００％の同一性を有するポリペプチドにおいて、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:2によるポリペプチドと比較して、必然的に
ｃｃ．  SEQ ID NO:2による位置３２４又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−アルギニンが、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンの群から選択される１つのアミノ酸、好ましくはＬ−ロイシンに置換される；
ｄｄ．  SEQ ID NO.2による位置４６７又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−チロシンが、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジンの群から選択される１つのアミノ酸、好ましくはＬ−ヒスチジンに置換される；
ｅｅ．  SEQ ID NO:2による位置３９２〜４０８又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置の１７のアミノ酸が欠失する；
ｆｆ．  SEQ ID NO:2による配列を基準として、Ｃ末端の４２０までのアミノ酸が欠失する、好ましくはSEQ ID NO:2によるアミノ酸配列のＣ末端の８８、１６３、２０２、２１２又は４２０のアミノ酸が欠失する
から選択される１つ又はそれ以上の突然変異を有することを特徴とする、ポリペプチド。
【請求項３５】
請求項３１又は３２に記載のポリヌクレオチド及び／又は請求項３３に記載のベクター及び／又は請求項３４に記載のポリペプチドを有する、組み換え微生物。
【請求項３６】
次の工程
ｇｇ．  硫黄含有Ｌ−アミノ酸を生産する能力がある腸内細菌科の微生物を、高められたメチオニン耐性に関してスクリーニングする工程、
ｈｈ．  ａ）で生じた変異体を単離及び増殖する工程；
ｉｉ．  場合により、ｂ）で得られた変異体から核酸を準備する工程；
ｊｊ．  場合により、ｃ）の核酸、及び、SEQ ID NO:38によるヌクレオチド配列の位置１〜１０００の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを有する第１のプライマーと、SEQ ID NO:38による相補的ヌクレオチド配列の位置２５０４〜３５０３の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを有する第２のプライマーとからなるプライマーペアから出発するポリメラーゼ連鎖反応の使用下での核酸分子を製造する工程；
ｋｋ．  場合により、ｄ）で得られた核酸分子のヌクレオチド配列を決定し、かつコード化されたアミノ酸配列を決定する工程；
ｌｌ．  場合により、ｅ）で決定されたアミノ酸配列を、SEQ ID NO:2と比較する工程；及び
ｍｍ．  得られたｐｒｏＰ変異体を同定する工程
を有する、硫黄含有Ｌ−アミノ酸の改善された生産が可能でかつ転写減衰されたｐｒｏＰ遺伝子を有する腸内細菌科の微生物の同定方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、転写減衰されたｐｒｏＰ遺伝子を有する腸内細菌科の微生物の使用下でのＬ−アミノ酸の発酵による製造方法、この生産のために適したに微生物並びにトランスポータＰｒｏＰの変異体をコードするポリヌクレオチドに関する。
【０００２】
有機化合物、特に硫黄含有Ｌ−アミノ酸は、経済的に極めて重要である。Ｌ−システインは、食品添加物として、医薬作用物質（例えばＮ−アセチルシステイン）のための出発物質として、及び化粧品のために使用される。アミノ酸のＬ−メチオニンは、動物飼料において傑出する役割がある。これは、脊椎動物の物質代謝で生合成によって製造することはできない必須アミノ酸に属する。従って、動物飼育の場合に、それぞれのアミノ酸を十分な量で飼料と一緒に摂取することが保証されなければならない。しかしながら、例えばＬ−メチオニンは、特にブタ又は家禽用の典型的な飼料植物（例えば大豆又は穀類）中では、最適な動物飼育を保証するためには少なすぎる量で存在していることがよくあるため、メチオニンを添加物として動物飼料中に加えるのが好ましい。Ｄ−メチオニンは、脊椎動物により、生物学的に活性のＬ−メチオニンに変えられる。従って、大抵は、動物飼料にＤ−メチオニン及びＬ−メチオニンのラセミ体が添加される。Ｌ−ホモシステインは、動物が、メチル基転移反応によりＬ−メチオニンに変換でき、従ってこれを代替できる。
【０００３】
以後、有機化合物に言及する場合には、従って、Ｌ−アミノ酸の群から選択された１つ又はそれ以上の化合物、好ましくは硫黄含有Ｌ−アミノ酸、特にＬ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ホモシステイン及びＬ−ホモシスチンを意味する。好ましいのはＬ−メチオニンである。
【０００４】
先行技術において、メチオニンのようなアミノ酸は化学合成によって製造される。この場合、まずアクロレインとメチルメルカプタンとを反応させて３−メチルチオプロピオンアルデヒドにし、これをさらにシアニド、アンモニア及び一酸化炭素でヒダントインにする。これを最終的に、ラセミ化合物（２つの立体異性体であるＤ−メチオニンとＬ−メチオニンとの等モル量の混合物）に加水分解することができる。この分子の生物学的活性形はＬ型だけが表すため、飼料中に含まれるＤ型は物質代謝の際に脱アミノ反応及びアミノ基転移反応によって初めて活性のＬ型に変換されなければならない。
【０００５】
メチオニンとは反対に、例えばＬ−トレオニンのような、タンパク質を形成する他の大抵の天然アミノ酸は、主に微生物による発酵によって製造される。この場合、微生物が天然アミノ酸の合成のために対応する生合成経路を使うことが利用される。更に、多くの発酵方法は、グルコース及び無機塩のような安価な出発材料を用いて極めて好都合な製造コストを達成し、かつ更にそれぞれのアミノ酸の生物学的に活性のＬ型を供給する。
【０００６】
有機化合物は、腸内細菌、特に大腸菌（E. coli）及び霊菌（Serratia mercescens）の菌株による発酵によって製造できることは公知である。多大な意義があるため、常にこの製造方法の改善が研究されている。方法の改善は、例えば撹拌及び酸素の供給のような発酵工学的手法、又は例えば使用される糖の選択又は発酵の間の糖濃度のような培地の組成、又は例えばイオン交換クロマトグラフィーによる生産物形状のための後処理、又は微生物自体の内因性の機能特性に関係することができる。
【０００７】
アミノ酸の生合成経路は、野生型菌株の場合には、アミノ酸を細胞の自己必要量のためだけに製造することを保証する厳格な代謝調整の下にある。従って、効率的な生産プロセスのための重要な前提条件は、野生型生物に対して、所望のアミノ酸の製造のために自己必要量を越えて極端に向上された生産能力（過剰生産）を有する適切な微生物が使用可能であることである。
【０００８】
このようなアミノ酸過剰生産型微生物は、典型的な突然変異／選択法及び／又は近代の、的確な組換技術（「metabolic engineering」、代謝工学）によって作製することができる。後者の組換技術の場合、まず、変更、活性化又は不活性化によってアミノ酸過剰生産を引き起こす遺伝子又は対立遺伝子を同定する。次いで、この遺伝子／対立遺伝子を分子生物学的技術により微生物株中に導入するか又は不活性化して、最適な過剰生産を達成する。しかしながら、異なる複数の手法の組合せが初めて実際に効果的な生産を引き起こすことがよくある。
【０００９】
Ｌ−メチオニンは、リシン及びトレオニンと一緒にアスパルタートに由来する。硫黄は、Ｌ−システインの形で（中間生成物としてシスタチオニンを経て）トランススルフレーションによってＬ−メチオニンに導入される。Ｌ−メチオニンのＣＨ3基はＣ１代謝に由来し、メチオニンシンターゼＭｅｔＥ又はＭｅｔＨによりＬ−ホモシステインに移される（Review: Greene RC (1996)、Neidhardt FC et al.(編)「Escherichia coli and Salmonella」、第２版、第542-560頁）。Ｌ−メチオニンの発酵による製造のための菌株及び方法は、大腸菌（E. coli）について、例えばWO 2006/001616又はWO 2009/043803に記載されていた。
【００１０】
ＰｒｏＰは、大腸菌のプロトン／適合溶質シンポーターであり、従って、大腸菌中の、高浸透圧条件下で活性のトランスポータの１つである（Grothe et al., Journal of Bacteriology 166, 253-259 (1986); Racher et al., Biochemistry 38, 1676-1684 (1999); Wood, Methods in Enzymology 428, 77-107 (2007)）。細胞を取り囲む媒体のオスモル濃度が上昇する場合、この水ポテンシャルは低下し、かつ水分子は細胞から浸透勾配に沿って拡散して出てくる。細胞膨圧は低下し、その結果、細胞質タンパク質はその機能的に重要な水和殻を奪われる。この脱水に基づいて細胞代謝及び細胞分裂は停止する。
【００１１】
これを避けるために、微生物は、進化の過程で、例えばいわゆる適合溶質（compatible solutes）の合成及び／又は吸収についての様々な戦略を発展させた。例えば、プロリン又はグリシンベタインのようなこの天然由来の保護物質の外部調達の場合に、自己合成と比べて、この迅速かつエネルギー的に好都合な吸収が優先される（Wood, Microbiology and Molecular Biology Reviews 63, 230-262 (1999)）。このシンポーターＰｒｏＰは、ＭＦＳファミリー（major facilitator superfamily）に属し、高浸透圧条件下で、プロトンを細胞内へ共輸送する際に、プロリン、グリシンベタイン、プロリンベタイン、エクトン及び構造が似た他の物質の吸収を触媒する。ＰｒｏＰは、再構成システムにおいて浸透圧感受特性及び浸透圧調節特性を検出することができた最初のトランスポータであった。このＣ末端ドメインは、いわゆるコイルドコイルモチーフを形成することができる。このドメインの形成は、浸透圧調節のために重要であり、場合によっては浸透圧刺激の感受のためにも重要である（Culham et al., Journal of Molecular Recognition 13, 309-322 (2000)）。ＰｒｏＰは、カリウムイオンの内部濃度上昇により及び高分子クラウディング（これはプロテオリポソーム中で多様な鎖長のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の使用によって模倣された）によって活性化される（Racher et al., Biochemistry 40, 7324-7333 (2001); Culham et al., Biochemistry 42, 410-420 (2003)）。確かに、ＰｒｏＰは付加的なファクターなしで、浸透圧ストレス刺激を感受することができるが、ただし、in vivoでのこのキャリアーの完全な活性のためには、細胞質タンパク質ＰｒｏＱの存在が必要である（Kunte et al., Journal of Bacteriology 181, 1537-43 (1999)）。
【００１２】
従って、大腸菌のトランスポータＰｒｏＰは、以前から既に、浸透圧調節におけるその機能について知られていた。
【００１３】
意外にも、本発明の場合に、腸内細菌科の微生物によるＬ−アミノ酸生産を、このｐｒｏＰ遺伝子の転写減衰によって向上できることが見出された。
【００１４】
本発明の課題は、硫黄含有アミノ酸、特にＬ−メチオニンの、より高い過剰生産を可能にする方法及び微生物を提供することであった。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】プラスミドｐＣＣ３のマップ。
【図２】プラスミドｐＭＥ−ＲＤＬ２ａのマップ。
【図３】プラスミドｐＭＡＫ＿ｐｒｏＰ−Ｍ８のマップ。
【００１６】
発明の記載
本発明の第１の主題は、ｐｒｏＰ遺伝子が転写減衰されている微生物を使用することを特徴とする、腸内細菌科の微生物による発酵による、Ｌ−アミノ酸又はＬ−アミノ酸を含む飼料添加物の製造方法である。
【００１７】
この微生物はＬ−アミノ酸を生産し、かつＬ−アミノ酸を好ましくは周囲の培地に分泌する。
【００１８】
この微生物は、Ｌ−アミノ酸を更に好ましくは培地中で及び／又は細胞内で増加させ（蓄積）、この際、培地中での増加が特に好ましい。
【００１９】
従って、本発明の他の主題は、同様に、Ｌ−アミノ酸を生産し、かつ好ましくは培地中に分泌し、好ましくはＬアミノ酸を培地中で及び／又は細胞内で、好ましくは培地中で増加させることを特徴とする、転写減衰されたｐｒｏＰ遺伝子を有する腸内細菌科の微生物である。
【００２０】
この微生物は、この場合、好ましくは、発酵プロセスにおいて、転写減衰されたｐｒｏＰ遺伝子なしの使用された出発菌株又は親菌株と比較して、所望のＬ−アミノ酸の高められた生産及び好ましくは分泌を示す。
【００２１】
「転写減衰された」とは、本発明の場合に、ｐｒｏＰ遺伝子が低い水準で発現されるか又は完全にスイッチオフされていると解釈される。
【００２２】
この「転写減衰」の概念は、この意味範囲で、本発明の場合には、例えば、対応する酵素若しくはタンパク質について組み換えられていない微生物又は親菌株よりも転写減衰されたプロモータ、又は活性の低い対応する酵素若しくはタンパク質をコードするか又は対応する酵素若しくはタンパク質又はオープンリーディングフレーム又は遺伝子を不活性化する遺伝子若しくは対立遺伝子を使用することにより、及び場合によりこれらの手法を組み合わせることにより、対応するＤＮＡ、この場合では特にｐｒｏＰ遺伝子によりコードされる、微生物内での１つ又は複数の酵素又はタンパク質、この場合では特にＰｒｏＰトランスポータの細胞内活性又は濃度の低下又は停止を意味する。
【００２３】
この転写減衰の手法により、対応するタンパク質の活性若しくは濃度は一般に、野生型タンパク質の活性若しくは濃度の又は対応する酵素若しくはタンパク質について組み換えられていない微生物若しくは親菌株の０〜７５％、０〜５０％、０〜２５％、０〜１０％又は０〜５％に低下する。組み換えられていない微生物又は親菌株（parent strain）とは、本発明により転写減衰又は停止が行われる微生物であると解釈される。
【００２４】
転写減衰は、例えば、遺伝子又はオープンリーディングフレームの発現又は酵素タンパク質の触媒特性の低減又は停止を達成することができる。場合により、両方の手法を組み合わせることができる。
【００２５】
遺伝子発現の低減は、適切な培養操作により、遺伝子発現のシグナル構造の遺伝的変更（突然変異）により又はアンチセンスＲＮＡ技術により行うことができる。遺伝子発現のシグナル構造は、例えばリプレッサ遺伝子、アクティベータ遺伝子、オペレータ、プロモータ、アテニュエータ、リボソーム結合サイト、開始コドン及びターミネータである。これについての記載は、当業者は、特に例えば、Jensen及びHammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191-195 (1998))、Carrier及びKeasling (Biotechnology Progress 15: 58-64 (1999))、Franch及びGerdes (Current Opinion in Microbiology 3: 159-164 (2000))、Kawano et al. (Nucleic Acids Research 33(19), 6268-6276 (2005))並びに遺伝学及び分子生物学の公知の教書、例えばKnippersの教書（「Molekulare Genetik」、第６版、Georg Thieme Verlag, Stuttgart, ドイツ国, 1995）又はWinnackerの教書（「Gene und Klone」, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, ドイツ国, 1990）で得られる。
【００２６】
酵素タンパク質の触媒特性の変更又は低減を引き起こす突然変異は、先行技術から公知である。例として、Qiu及びGoodman (Journal of Biological Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Yano et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 5511-5515 (1998)), Wente及びSchachmann (Journal of Biological Chemistry 266: 20833-20839 (1991))の研究が挙げられる。要約した記述は、例えばHagemann (「Allgemeine Genetik」, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986)のような遺伝学及び分子生物学の公知の教書から得ることができる。
【００２７】
突然変異として、少なくとも一つ（１）の塩基対又はヌクレオチドの転位、転換、挿入及び欠失が挙げられる。酵素活性に関する、突然変異により引き起こされるアミノ酸置換の影響に依存して、ミスセンス突然変異（missense mutations）又はナンセンス突然変異（nonsense mutations）といわれる。ミスセンス突然変異は、タンパク質中の所定のアミノ酸の、他のアミノ酸への置換が引き起こされ、これは特に非同類アミノ酸置換である。これにより、タンパク質の機能性又は活性は損なわれて、０〜７５％、０〜５０％、０〜２５％、０〜１０％又は０〜５％の値に低減される。ナンセンス突然変異は、遺伝子のコード領域中に停止コドンを生じさせ、それにより翻訳の早期の中断が生じる。遺伝子中での少なくとも１つの塩基対の挿入又は欠失は、フレームシフト突然変異（frame shift mutations）を引き起こし、これは、誤ったアミノ酸が組み込まれるか又は翻訳が早期に中断されることを引き起こす。突然変異の結果としてコード領域に停止コドンが生じると、同様に翻訳の早期の中断を引き起こす。少なくとも一つ（１）又はそれ以上のコドンの欠失は、典型的には、同様に酵素活性の完全な欠損を引き起こす。適切なｔＲＮＡサプレッサによるコード領域内での停止コドン突然変異の抑制による遺伝子発現の低下は、WO 03/074719に記載されている。
【００２８】
この種の突然変異を発生させる手法は先行技術に属し、例えばKnippers（「Molekulare Genetik」、第６版、Georg Thieme Verlag, Stuttgart, ドイツ国, 1995）、Winnacker（「Gene und Klone」, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, ドイツ国, 1990）又はHagemann（「Allgemeine Genetik」, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986）のような遺伝学及び分子生物学の公知の教書から得られる。
【００２９】
特にｐｒｏＰ遺伝子に関して、「転写減衰」及び「低い水準で発現」とは、ＰｒｏＰトランスポータの活性及び／又は濃度が上述された手法によって、野生型タンパク質の活性及び／又は濃度、又はＰｒｏＰトランスポータについて組み換えられていない微生物又は親菌株中のタンパク質の活性及び／又は濃度の０〜７５％、０〜５０％、０〜２５％、０〜１０％又は０〜５％に低減されることであると解釈される。
【００３０】
Ｌ−アミノ酸は、本発明の場合には、好ましくは微生物により過剰生産される。「過剰生産」とは本発明の場合に、Ｌ−アミノ酸に関して自己必要量を越えて極端に向上された生産能力が生じることであると解釈される。
【００３１】
Ｌ−アミノ酸とは、本発明の場合に、好ましくは硫黄含有アミノ酸、特にＬ−メチオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−シスチン、Ｌ−ホモシステイン又はＬ−ホモシスチン、特に好ましくはＬ−メチオニンである。
【００３２】
本発明による微生物及び本発明による方法で使用される微生物は、好ましくは、転写減衰されたｐｒｏＰ遺伝子を有しない微生物と比較して高められたメチオニン耐性を有することを特徴とする。この場合に、この微生物は、好ましくは１リットル当たり５０又は６０グラムのＬ−メチオニン濃度でも、特に好ましくは１リットル当たり７０、７５、８０、９０又は１００グラムのＬ−メチオニン濃度でも成長することができる、というのもこの微生物はこのようなメチオニン濃度に耐性であるためである。Ｌ−メチオニンに関する耐性の表示は、この場合好ましくは、相応するＬ−メチオニン濃度を有する最少寒天培地に関する。
【００３３】
この種のメチオニン耐性株は、既にＬ−メチオニン生産する大腸菌株から出発し、メチオニン含有の最少寒天培地での選択により単離することができる。
【００３４】
本発明による、メチオニン耐性細菌の作製のために、好ましくは先行技術に記載された選択法を使用し、この選択法は特にMiller（A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)）又はハンドブック「Manual of Methods for General Bacteriology」、American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA)で調べることができる。
【００３５】
従って、本発明の他の主題は、次の工程
ａ）  硫黄含有Ｌ−アミノ酸、好ましくはＬ−メチオニンを生産する能力がある腸内細菌科の微生物を、高められたメチオニン耐性に関してスクリーニングする工程；
ｂ）  ａ）で生じた変異体を単離及び増殖する工程；
ｃ）  場合により、ｂ）で得られた変異体から核酸を準備する工程；
ｄ）  場合により、ｃ）の核酸、及び、SEQ ID NO:38によるヌクレオチド配列の位置１〜１０００の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを有する第１のプライマーと、SEQ ID NO:38による相補的ヌクレオチド配列の位置２５０４〜３５０３の少なくとも１５の連続するヌクレオチドを有する第２のプライマーとからなるプライマーペアから出発するポリメラーゼ連鎖反応の使用下での核酸分子を製造する工程；
ｅ）  場合により、ｄ）で得られた核酸分子のヌクレオチド配列を決定し、かつコード化されたアミノ酸配列を決定する工程；
ｆ）  場合により、ｅ）で決定されたアミノ酸配列を、SEQ ID NO:2と比較する工程；及び
ｇ）  場合により、得られたｐｒｏＰ変異体を同定する工程
を有する、硫黄含有Ｌ−アミノ酸、好ましくはＬ−メチオニンの改善された生産が可能でかつ転写減衰されたｐｒｏＰ遺伝子を有する腸内細菌科の微生物の同定方法である。
【００３６】
ｐｒｏＰ遺伝子中で適切な突然変異を行うために、突然変異誘発性のオリゴヌクレオチドの使用下での指定部位突然変異誘発方法（T. A., Brown: Gentechnologie fuer Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993）又はGait: Oligonukleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984)又はNewton及びGraham (PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994)のハンドブックに記載されているようなポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を使用することができる。突然変異を構築するために、例えば、Stratagene社（Amsterdam、オランダ国）のQuick Change Site-Directed Mutagenesisキットを使用することができる。この方法を使用する際に、先行技術において記載されたｐｒｏＰ遺伝子を野生種菌株の単離された全体のＤＮＡから出発してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、適切なプラスミドベクター中にクローニングし、引き続きこのＤＮＡを突然変異誘発法で処理する。「GeneSOEing」（Gene Splicing by Overlap Extension, Horton, Molecular Biotechnology 3: 93-98 (1995)）を用いて、点突然変異を、ＰＣＲごとに既に得ることができる。ヌクレオチド配列のde novo遺伝子合成（例えばGENEART AG社(Regensburg、ドイツ国)による）も、ｐｒｏＰ遺伝子内の突然変異の製造のために使用することができる。この作製された突然変異は、例えばSanger et al.（Proceedings of the National Academy of Science USA 74 (12): 5463-5467 (1977)）による方法によるＤＮＡ配列決定により決定及び調査することができる。
【００３７】
この作製された対立遺伝子を、例えば形質転換により及び遺伝子置換又は対立遺伝子置換法により適切な菌株の染色体中に組み込むことができる。
【００３８】
慣用の方法は、Hamilton et al. (Journal of Bacteriology 174, 4617 - 4622 (1989))により記載された、条件的に繰り返すｐＳＣ１０１誘導体ｐＭＡＫ７０５を用いるか又はｐＫＯ３（Link et al., Journal of Bacteriology 179 : 6228-6237）を用いる遺伝子置換法である。例えばMartinez-Morales et al.（Journal of Bacteriology 1999, 7143-7148 (1999)）又はBoyd et al.（Journal of Bacteriology 182, 842-847 (2000)）によるような先行技術で記載された他の方法も、同様に利用することができる。
【００３９】
他の慣用の方法は、ＰＣＲ又は遺伝子合成により作製されたＤＮＡ断片を、短い均質なフランキング配列を介して、ラムダレッド−レコンビナーゼ（Lambda Red-Rekombinase）を用いて染色体に直接組み込むか、又は置換を行う（Proc Nati Acad Sei U S A.97(12), 6640-6645 (2000); Nature Genetics 20, 123 - 128 (1998)）ことにある。
【００４０】
同様に、作製された対立遺伝子を、接合又は形質導入により多様な菌株に導入することも可能である。
【００４１】
ｐｒｏＰの核酸配列は、国立医学図書館（Bethesda, MD, USA）の国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のデータバンク、欧州分子生物学研究所（ＥＭＢＬ、Heidelberg、ドイツ国又はCambridge、ＵＫ）の核酸配列データバンク又は日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ、Mishima、日本）から得ることができる。
【００４２】
説明のために、SEQ ID NO:1に、大腸菌（Escherichia coli）のｐｒｏＰ遺伝子の公知の配列を、及び、SEQ ID NO:3及びSEQ ID NO:5に、いずれも腸内細菌科に属するSalmonella enterica及びShigella sonneiのｐｒｏＰ遺伝子の公知の配列を示す。これらのリーディングフレームによりコードされたタンパク質を、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4及びSEQ ID NO:6として示す。ｐｒｏＰ遺伝子についての更なる核酸配列は、例えば次の腸内細菌から得られる：Shigella boydii（受け入れ番号：：NC_007613）；Shigella flexneri（受け入れ番号：：NC_004741）；Shigella dysenteriae（受け入れ番号：：NC_007606）;Citrobacter rodentium（受け入れ番号：：NC_013716）；Erwinia pyrifoliae（受け入れ番号：：NC_012214）；Klebsiella pneumoniae（受け入れ番号：：NC_011283）。
【００４３】
大腸菌Ｋ１２のｐｒｏＰ遺伝子によりコードされたタンパク質は、浸透圧感受性ＭＦＳトランスポータＰｒｏＰとも又はプロトン／適合溶質シンポーターとも表される（受け入れ番号：：11612（領域：4328525-4330027）；別の遺伝子名：b4111, ECK4104）；Grothe et al., Journal of Bacteriology 166, 253-259 (1986); Racher et al., Biochemistry 38, 1676-1684 (1999); Wood, Methods in Enzymology 428, 77-107 (2007)）。
【００４４】
本発明による好ましい実施態様の場合に、転写減衰されるべきｐｒｏＰ遺伝子は、好ましくはSEQ ID NO:1、3、5又は7による完全なポリヌクレオチド配列を基準として、特に好ましくはSEQ ID NO:1による完全なポリヌクレオチド配列を基準として、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、殊に少なくとも９８、９９又は１００％の配列同一性を有する遺伝子である。
【００４５】
ｐｒｏＰ遺伝子についての文献の指摘及びこのｐｒｏＰ遺伝子のオープンリーディングフレームは既に上述した。これらは、ｐｒｏＰ遺伝子を転写減衰するために、本発明により相応して使用することができる。更に、転写減衰されたｐｒｏＰ遺伝子を製造するために、遺伝子コードの退縮又は機能的に中立なセンス突然変異（「sense mutations」）により生じるこの遺伝子の対立遺伝子又はオープンリーディングフレームも使用することができる。内在性の遺伝子又は内在性のオープンリーディングフレームの使用が好ましい。
【００４６】
機能的に中立のセンス突然変異を含むｐｒｏＰ遺伝子の対立遺伝子には、特に、その遺伝子によりコードされるタンパク質中で、多くても４０又は多くても３０又は多くても２０、好ましくは多くても１０又は多くても５、特に好ましくは多くても３又は多くても２、又は正確に１つの同類アミノ酸置換を引き起こす対立遺伝子が挙げられる。
【００４７】
芳香族アミノ酸の場合には、同類置換は、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが相互に置換されている場合である。疎水性アミノ酸の場合には、同類置換は、ロイシン、イソロイシン及びバリンが相互に置換されている場合である。極性アミノ酸の場合には、同類置換は、グルタミン及びアスパラギンが相互に置換されている場合である。塩基性アミノ酸の場合には、同類置換は、アルギニン、リシン及びヒスチジンが相互に置換されている場合である。酸性アミノ酸の場合には、同類置換は、アスパラギン酸及びグルタミン酸が相互に置換されている場合である。ヒドロキシル基を含むアミノ酸の場合には、同類置換はセリン及びトレオニンが相互に置換されている場合である。
【００４８】
同様に、更にＮ末端又はＣ末端に更に少なくとも一つ（１）のアミノ酸の延長又は短縮を含む前記タンパク質の変異体をコードするヌクレオチド配列も使用することができる。この延長又は短縮は、１０以下、５以下、３以下又は２以下のアミノ酸又はアミノ酸基である。
【００４９】
この適切な変異体には、少なくとも一つ（１）のアミノ酸が挿入（Insertion）又は欠失（Deletion）されているタンパク質をコードする変異体も含まれる。この種のインデルともいわれる挿入欠失の最大数は、２、３、５個のアミノ酸が該当することがあるが、１０個のアミノ酸を越えることはない。
【００５０】
この適切な変異体には、更に、特にストリンジェントな条件下で、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3又はSEQ ID NO:5又はこれらの一部、特にコード領域又はこれに相補的な配列の使用下でハイブリダイズにより得られる変異体が属する。
【００５１】
ハイブリダイズを用いてＤＮＡ配列を同定するための手引きについて、当業者は、特にFirma Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim,ドイツ国, 1993)社のハンドブック「The DIG System Users Guide for Filter Hybridization」及びLiebl et al.著（International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)）で得られる。このハイブリダイズは、ストリンジェントな条件下で、つまり、このプローブと目標配列、つまりプローブで処理されるべきポリヌクレオチドとが少なくとも７０％同一である場合にだけハイブリッドを形成する条件下で行われる。洗浄工程を含めたハイブリダイズのストリンジェントとは、緩衝剤組成、温度及び塩濃度の変更により影響されるか又は決定されることは公知である。このハイブリダイズ反応は、一般に、洗浄工程と比較して、比較的低いストリンジェントで実施される（Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, UK, 1996）。
【００５２】
このハイブリダイズ反応のために、例えば５×ＳＳＣ緩衝剤を含む緩衝液が、約５０℃〜６８℃の温度で使用することができる。この場合、プローブは、プローブの配列に対して７０％未満の同一性を有するポリヌクレオチドともハイブリダイズすることができる。このようなハイブリッドはあまり安定でなく、ストリンジェントな条件下で洗浄により除去される。これは、例えば塩濃度を２×ＳＳＣに低下させかつ場合により引き続き０．５×ＳＳＣ（The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim、ドイツ国、1995）に低下させることによって達成することができ、その際、約５０℃〜６８℃、約５２℃〜６８℃、約５４℃〜６８℃、約５６℃〜６８℃、約５８℃〜６８℃、約６０℃〜６８℃、約６２℃〜６８℃、約６４℃〜６８℃、約６６℃〜６８℃の温度が調節される。約６４℃〜６８℃又は約６６℃〜６８℃の温度範囲が好ましい。場合により、塩濃度を相応して０．２×ＳＳＣ又は０．１×ＳＳＣの濃度にまで低下させることもできる。ハイブリダイズ温度を、約１〜２℃の段階で段階的に５０℃から６９℃まで高めることにより、使用したプローブの配列に対して又はSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3又はSEQ ID NO:5で示されたヌクレオチド配列に対して、少なくとも７０％又は少なくとも８０％又は少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の同一性を有するポリヌクレオチドフラグメントを単離することができる。ハイブリダイズの他の手引きは、いわゆるキットの形で市場で入手できる（例えば、Roche Diagnostics GmbH社のDIG Easy Hyb, Mannheim, ドイツ国, カタログ番号: 1603558）。
【００５３】
転写減衰されるｐｒｏＰ遺伝子は、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6又はSEQ ID NO:8によるアミノ酸配列と、好ましくはSEQ ID NO:2によるアミノ酸配列と、好ましくは少なくとも８５％が同一、特に少なくとも９０％が同一、好ましくは少なくとも９５％が同一、特に好ましくは少なくとも９８％が同一、少なくとも９９％が同一又は１００％が同一であるアミノ酸配列を有するトランスポータタンパク質ＰｒｏＰをコードし、この場合、この同一性は好ましくは記載された配列の全体の長さにわたって存在する。トランスポータタンパク質ＰｒｏＰは、好ましくは、主に５００のアミノ酸長さを含むか又は有していて、この場合、５００のアミノ酸長さが好ましい。特に極めて好ましくは、このＰｒｏＰタンパク質は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むか又は有し、この際、場合によりSEQ ID NO:2のアミノ酸配列中で最大４０、最大３０、好ましくは最大２０、最大１０、最大５、最大３、最大２、特に好ましくは最大１つの同類アミノ酸置換が含まれていてもよい。この同類アミノ酸置換により、トランスポータＰｒｏＰの活性は主に変化せず、つまり本発明の場合には、この活性が同類アミノ酸配列により、出発配列を基準として１０％より大きく変化しないことが好ましい。
【００５４】
「主に５００のアミノ酸長さ」の概念は、この関連で、ポリペプチド内で一つ（１）又はそれ以上の、最大１０、９、８、７、６、５、４、３又は２のアミノ酸の挿入又は欠失によるか、又はポリペプチドのＮ末端又はＣ末端で、コードされたポリペプチドの長さが、腸内細菌科の多様な種又は菌株の場合にわずかに変化するとの事実を考慮している。これについての例は、Erwinia pyrifoliaeのＰｒｏＰタンパク質である。このポリペプチド（SEQ ID NO:8参照）の長さは、この場合５０１のアミノ酸である。
【００５５】
本発明の好ましい実施態様の場合には、SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の転写減衰は、この遺伝子が次の突然変異の一つを有することにより達成される：
ａ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置９７１又は匹敵する位置の核酸塩基のグアニンが核酸塩基のチミンに置換される；
ｂ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置１３９９又は匹敵する位置の核酸塩基のチミンが核酸塩基のシトシンに置換される；
ｃ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置１２３４又は匹敵する位置の核酸塩基のグアニンが核酸塩基のチミンに置換される；
ｄ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置８５４の核酸塩基のアデニンが欠失する；
ｅ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置１１７３〜１２２３の核酸塩基の１つ又はそれ以上が欠失する、好ましくは位置１１７３〜１２２３の全ての核酸塩基が欠失する；
ｆ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置８４２に核酸塩基のシトシンを挿入する；
ｇ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置９７３に１つ又はそれ以上の核酸塩基を挿入する、好ましくは位置９７３に１９の核酸塩基を挿入する；
ｈ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置１８３に１つ又はそれ以上の核酸塩基を挿入する、好ましくは位置１８３に１３５９の核酸塩基を挿入する。
【００５６】
本発明による好ましい実施態様の場合に、従って、転写減衰されたｐｒｏＰ遺伝子は、SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチドを基準として、好ましくはSEQ ID NO:1によるポリヌクレオチドの完全な配列を基準として、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８、９９又は１００％の配列同一性を有し、かつ更にSEQ ID NO:1によるポリヌクレオチドと比べて必然的に、次の突然変異の１つ又はそれ以上を、好ましくは正確に次の突然変異の１つ又はそれ以上、好ましくは正確に１つを有するポリヌクレオチドである：
ａ）  SEQ ID NO:2による位置３２４又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−アルギニンをコードするトリプレットが、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンの群から選択される１つのアミノ酸、好ましくはＬ−ロイシンをコードするトリプレットに置換される；
ｂ）  SEQ ID NO:2による位置４６７又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−チロシンをコードするトリプレットが、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジンの群から選択される１つのアミノ酸、好ましくはＬ−ヒスチジンをコードするトリプレットに置換される；
ｃ）  SEQ ID NO:2による位置４１２又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−グルタミン酸をコードするトリプレットが、停止コドンをコードするトリプレットに置換される；
ｄ）  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置８５４の核酸塩基のアデニンが欠失する；
ｅ）  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置１１７３〜１２２３の核酸塩基の１つ又はそれ以上が欠失する、好ましくは位置１１７３〜１２２３の全ての核酸塩基が欠失する；
ｆ）  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置８４２に核酸塩基のシトシンを挿入する；
ｇ）  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置９７３に１つ又はそれ以上の核酸塩基を挿入する、好ましくは位置９７３に１９の核酸塩基を挿入する；
ｈ）  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置１８３に１つ又はそれ以上の核酸塩基を挿入する、好ましくは位置１８３に１３５９の核酸塩基を挿入する。
【００５７】
SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチドを基準とした同一性の記載は、この場合、それぞれ、上述の必然的な１つ又はそれ以上の突然変異なしのポリヌクレオチド配列に関する。
【００５８】
「匹敵する位置」とは、例えば、Clustal W-Programmes（Thompson et al., Nucleic Acids Research 22, 4637-4680 (1994)）を用いて又はMAFFT-Programmes（Katoh etz al.著, Genome Information 2005; 16 (l),22-33）を用いて、「アライメント」の形で、アミノ酸配列と比較により容易に同定することができる。
【００５９】
本発明による方法及び本発明による方法で使用する腸内細菌科の微生物は、好ましくはエシェリキア（Escherichia）属、エルウィニア（Erwinia）属、プロビデンシア（Providencia）属又はセラチア（Serratia）属の細菌、特にエシェリキア（Escherichia）属の細菌である。特に、大腸菌（Escherichia coli）が好ましい。
【００６０】
Ｌ−アミノ酸、特に硫黄含有Ｌ−アミノ酸の本発明による製造方法の場合に、発酵を、好ましくは無機硫黄源を有する培地中で行う。硫黄源として、ジチオ硫酸の塩（チオスルファート）を、場合により、例えばスルファート、スルフィット又はジチオニットのような他の硫黄源と一緒に使用することができる（ＥＰ出願番号１１１５１５２６．８も参照）。
【００６１】
Ｌ−アミノ酸は、好ましくは得られた発酵ブロス中で増加され、引き続き、場合により単離、採集及び／又は精製される。
【００６２】
同様に、Ｌ−アミノ酸を、構成成分と一緒に発酵ブロス及び／又はバイオマスから単離又は採集することが可能である。
【００６３】
この単離された細菌又はこの細菌の使用下での発酵プロセスの、生産物濃度（体積当たりの生産物）、生産物収率（消費された炭素源当たりの形成された生産物）及び生産物形成（体積及び時間当たりの形成された生産物）の群から選択される１つ又はそれ以上のパラメータ、又は他のプロセスパラメータ及びこれらの組み合わせに関する能力は、出発菌株又は親菌株又はこれらの菌株の使用下での発酵プロセスを基準として、好ましくは少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも１．５％又は少なくとも２％改善される。
【００６４】
本発明による方法の場合に、これらの細菌は、Ｌ−アミノ酸を製造する目的で、例えばＰＣＴ／ＥＰ２００４／００８８８２に記載されているように連続的に、又は、回分法（Satzkultivierung）又は流加回分法（Zulaufverfahren）又は反復流加回分法（repetitives Zulaufverfahren）で不連続的に培養することができる。公知の培養法に関する一般的な種類の要約は、Chmiel (Bioprozesstechnik l. Einfuehrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))の教書又はStorhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))の教書で得られる。
【００６５】
使用されるべき培養基又は発酵培地は、それぞれの菌株の要求を適切に満たさなければならない。多様な微生物の培養基の記載は、ハンドブック「Manual of Methods for General Bacteriology」、American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)で得られる。培養基及び発酵培地並びに培地の概念は相互に交換可能である。
【００６６】
炭素源として、糖及び炭水化物、例えばグルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、糖蜜、テンサイ製造又はサトウキビ製造からのサッカロース含有溶液、デンプン、デンプン水解物及びセルロース、油及び脂肪、例えば大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ脂肪、脂肪酸、例えばパルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸、アルコール、例えばグリセリン、メタノール及びエタノール、及び有機酸、例えば酢酸を使用することができる。これらの材料は、単独で又は混合物として使用することができる。
【００６７】
窒素源として、窒素含有有機化合物、例えばペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ膨潤水、大豆粉及び尿素又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムを使用することができる。これらの窒素源は、個別に又は混合物として使用することができる。
【００６８】
リン源として、リン酸、リン酸水素カリウム又はリン酸水素二カリウム又は相応するナトリウム含有塩を使用することができる。
【００６９】
この培養基は、更に、好ましくは塩を、例えば塩化物の形で、金属、例えばナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム及び鉄を、例えば成長のために必要な硫酸マグネシウム又は硫酸鉄を含有する。最後に、必須の成長材料、例えばアミノ酸、例えばホモセリン及びビタミン、例えばコバラミン、チアミン、ビオチン及びパントテン酸を、上述の材料に加えて更に使用することができる。
【００７０】
この培養基に、更に、それぞれのアミノ酸の適切な前駆体を添加することができる。
【００７１】
上述の使用材料は、培養に、１回のバッチの形で添加するか又は培養の間に適切に加えることもできる。
【００７２】
培養のｐＨ調節のために、塩基性化合物、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア若しくはアンモニア水又は酸性化合物、例えばリン酸又は硫酸が適切に使用される。このｐＨは、一般に、６．０〜９．０、好ましくは６．５〜８の値に調節される。起泡の調節は、消泡剤、例えば脂肪酸ポリグリコールエステルを使用することができる。プラスミドの安定性を維持するために、培地に、適切に選択作用する物質、例えば抗生物質を添加することができる。好気性条件を維持するために、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば空気を培養中へ導入する。過酸化水素の濃度が高められた液体を使用することも、同様に可能である。場合により、この発酵は、加圧で、例えば０．０３〜０．２ＭＰａの圧力で行われる。培養の温度は、通常では２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃から４０℃である。回分法の場合には、所望のアミノ酸の最大量が形成されるまで培養を行う。この目標は、通常では１０時間〜１６０時間の間で達成される。連続的方法の場合には、より長い培養時間が可能である。
【００７３】
適切な発酵培地は、特に、US 6,221,636、US 5,840,551、US 5,770,409、US 5,605,818、US 5,275,940及びUS 4,224,409に記載されている。
【００７４】
Ｌ−アミノ酸の決定方法は、先行技術から公知である。この分析は、例えばSpackman et al.（Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190）に記載されているように、ニンヒドリン誘導化を引き続き行うイオン交換クロマトグラフィーにより行うことができるか、又はLindroth et al.（Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174）に記載されているように逆相ＨＰＬＣにより行うことができる。
【００７５】
このように製造された発酵ブロスは、引き続き好ましくは固体又は液体の生産物に加工される。
【００７６】
発酵ブロスとは、微生物を所定の時間かつ所定の温度で培養した発酵培地であると解釈される。この発酵培地、又は発酵の間に使用された培地は、好ましくは、微生物の増殖及び所望なアミノ酸の形成を保証する全ての物質又は成分を含有する。
【００７７】
発酵の完了時に、生じる発酵ブロスは、従って、ａ）微生物の細胞の増殖の結果として生じる微生物のバイオマス、ｂ）発酵の過程で形成される所望のアミノ酸、ｃ）発酵の経過で形成される有機副生成物及びｄ）使用した１つ以上の発酵培地又は使用物質、例えばビタミン、例えばビオチン、アミノ酸、例えばホモセリン又は塩、例えば硫酸マグネシウムの、発酵により消費されない成分を有する。
【００７８】
有機副生成物には、発酵の際に使用された微生物により場合によりそれぞれ所望のＬ−アミノ酸の他に製造されかつ場合により分泌された材料が属する。これには、所望のアミノ酸と比較して３０％、２０％又は１０％未満のＬ−アミノ酸が数えられる。これには、更に、１〜３つのカルボキシル基を有する有機酸、例えば酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸又はフマル酸が属する。最後に、これには、糖、例えばトレハロースも属する。
【００７９】
工業的目的に適しかつ本発明により好ましい典型的な発酵ブロスは、４０ｇ／ｋｇ〜１８０ｇ／ｋｇ又は５０ｇ／ｋｇ〜１５０ｇ／ｋｇのアミノ酸含有率を有する。バイオマス（乾燥されたバイオマスとして）の含有率は、一般に２０〜５０ｇ／ｋｇである。
【００８０】
本発明の他の主題は、従って、SEQ ID NO:1による配列を基準にして、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、とりわけ少なくとも９８、９９又は１００％の同一性（その際、記載された同一性は、好ましくはSEQ ID NO:1による全体配列を基準とする）を有するポリヌクレオチドにおいて、前記ポリヌクレオチドは、必然的に、SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチドと比べて、
ａ）  SEQ ID NO:2による位置３２４又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−アルギニンをコードするトリプレットが、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンの群から選択される１つのアミノ酸、好ましくはＬ−ロイシンをコードするトリプレットに置換される；
ｂ）  SEQ ID NO:2による位置４６７又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−チロシンをコードするトリプレットが、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジンの群から選択される１つのアミノ酸、好ましくはＬ−ヒスチジンをコードするトリプレットに置換される；
ｃ）  SEQ ID NO:2による位置４１２又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−グルタミン酸をコードするトリプレットが、停止コドンをコードするトリプレットに置換される；
ｄ）  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置８５４の核酸塩基のアデニンが欠失する；
ｅ）  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置１１７３〜１２２３の核酸塩基の１つ又はそれ以上が欠失する、好ましくは位置１１７３〜１２２３の全ての核酸塩基が欠失する；
ｆ）  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置８４２に核酸塩基のシトシンを挿入する；
ｇ）  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置９７３に１つ又はそれ以上の核酸塩基を挿入する、好ましくは位置９７３に１９の核酸塩基を挿入する；
ｈ）  SEQ ID NO:1によるｐｒｏＰ遺伝子の位置１８３に１つ又はそれ以上の核酸塩基を挿入する、好ましくは位置１８３に１３５９の核酸塩基を挿入する
から選択される１つ又はそれ以上の突然変異を有することを特徴とするポリヌクレオチドでもある。
【００８１】
SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチドを基準とした同一性の記載は、この場合、それぞれ、上述の必然的な１つ又はそれ以上の突然変異なしのポリヌクレオチド配列に関する。
【００８２】
特に好ましくは、この場合、必然的な１つ又はそれ以上の突然変異は次のものから選択される：
ａ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置９７１又は匹敵する位置の核酸塩基のグアニンが核酸塩基のチミンに置換される；
ｂ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置１３９９又は匹敵する位置の核酸塩基のチミンが核酸塩基のシトシンに置換される；
ｃ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置１２３４又は匹敵する位置の核酸塩基のグアニンが核酸塩基のチミンに置換される；
ｄ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置８５４で核酸塩基のアデニンが欠失する；
ｅ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置１１７３〜１２２３の核酸塩基の１つ又はそれ以上が欠失する、好ましくは位置１１７３〜１２２３の全ての核酸塩基が欠失する；
ｆ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置８４２に核酸塩基のシトシンを挿入する；
ｇ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置９７３に１つ又はそれ以上の核酸塩基を挿入する、好ましくは位置９７３に１９の核酸塩基を挿入する；
ｈ）  SEQ ID NO:1によるポリヌクレオチド配列の位置１８３に１つ又はそれ以上の核酸塩基を挿入する、好ましくは位置１８３に１３５９の核酸塩基を挿入する。
【００８３】
上述の本発明によるポリヌクレオチドは、本発明の場合に好ましくは、SEQ ID NO:1、3又は5と相補的である、好ましくはSEQ ID NO:1と相補的であるポリヌクレオチドの１つ又は複数と、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズし、その際、このストリンジェントな条件は、好ましくは、温度が６４℃〜６８℃の範囲にわたりかつ緩衝剤の塩濃度が２×ＳＳＣ〜０．１×ＳＳＣの範囲にわたる洗浄工程により達成されることを特徴とする。
【００８４】
特に好ましい本発明によるポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21又はSEQ ID NO:23によるポリヌクレオチドに対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に少なくとも９８、９９又は１００％の配列同一性を有する。
【００８５】
特に極めて好ましい本発明によるポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21及びSEQ ID NO:23によるポリヌクレオチドであるか及び／又はこれらのヌクレオチドを有する。
【００８６】
本発明の他の主題は、本発明によるポリヌクレオチドを有するベクターである。
【００８７】
本発明の他の主題は、従って、SEQ ID NO:2による配列を基準にして、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、とりわけ少なくとも９８、９９又は１００％の同一性を有するポリペプチドにおいて、前記ポリペプチドは、SEQ ID NO:2によるポリペプチドと比較して、必然的に、
ａ．  SEQ ID NO:2による位置３２４又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−アルギニンが、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシン及びＬ−バリンの群から選択される１つのアミノ酸、好ましくはＬ−ロイシンに置換される；
ｂ．  SEQ ID NO:2による位置４６７又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置のＬ−チロシン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン及びＬ−ヒスチジンの群から選択される１つのアミノ酸、好ましくはＬ−ヒスチジンに置換される；
ｃ．  SEQ ID NO:2による位置３９２〜４０８又はこのアミノ酸配列の匹敵する位置の１７のアミノ酸が欠失する；
ｄ．  SEQ ID NO:2による配列を基準として、Ｃ末端の４２０までのアミノ酸が欠失する、好ましくはSEQ ID NO:2によるアミノ酸配列のＣ末端の８８、１６３、２０２、２１２又は４２０のアミノ酸が欠失する
から選択される１つ又はそれ以上の突然変異を有することを特徴とするポリペプチドでもある。
【００８８】
同一性の記載は、この際、ａ及びｂによる突然変異の場合には、SEQ ID NO:2による全体配列を基準とし、ｃ及びｄによる突然変異の場合には、前記の欠失の範囲なしのSEQ ID NO:2による配列の部分領域をそれぞれ基準とする。
【００８９】
好ましい本発明によるポリペプチドは、SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22又は24によるポリペプチドに対して、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、特に少なくとも９８、９９又は１００％の配列同一性を有するポリペプチドである。
【００９０】
特に好ましい本発明によるポリペプチドは、SEQ ID NO:10、12、14、16、18、20、22又は24によるポリペプチドであるか及び／又はこれらのポリペプチドを有する。
【００９１】
本発明による他の主題は、本発明によるポリヌクレオチド及び／又はベクター及び／又はポリペプチドを有する組み換え微生物である。
【００９２】
本発明による微生物及び本発明による方法で使用される微生物は、好ましくはアスパルタートキナーゼ（EC 2.7.2.4）の増強された酵素活性を有し、その際、フィードバック耐性対立遺伝子が好ましい。大腸菌（E. coli）の場合に、遺伝子ｔｈｒＡ、ｍｅｔＬ又はｌｙｓＣによりコードされる３つの異なるアスパルタートキナーゼが存在する。特に好ましくは、本発明の場合には、アスパルタートキナーゼＴｈｒＡの増強された活性が存在する。
【００９３】
本発明による微生物及び本発明による方法で使用される微生物は、更に好ましくは、この微生物が、ホモセリン  Ｏ−スクシニルトランスフェラーゼＭｅｔＡ（EC 2.3.1.46）及び／又はセリン  アセチルトランスフェラーゼＣｙｓＥ（EC 2.3.1.30）の高められた活性を有することを特徴とする。
【００９４】
更に、遺伝子ｍｅｔＪによりコードされるレギュレータタンパク質ＭｅｔＪの転写減衰又は欠失により、Ｌ−メチオニン生合成の向上を達成することができる。ＭｅｔＪは、大腸菌（E. coli）中でのＬ−メチオニン生合成の主要リプレッサである。従って、本発明の場合には、この遺伝子ｍｅｔＪが転写減衰されていることが更に好ましい。
【００９５】
本発明による微生物及び本発明による方法で使用される微生物は、更に好ましくは、この微生物がＳ−アデノシルメチオニン  シンターゼＭｅｔＫ（EC 2.5.1.6）の転写減衰された活性を有することを特徴とする。
【００９６】
更に、硫黄含有アミノ酸の生産のために、腸内細菌科の細菌を用いて、更に、公知のアミノ酸生合成経路の１つ又はそれ以上の酵素又はアナプレロティック物質代謝の酵素又は低減されたニコチンアミド−アデニン−ジヌクレオチド−ホスファートの生産のための酵素又は解糖の酵素又はＰＴＳ酵素又は硫黄物質代謝の酵素を増強するか若しくはこれらの活性を高めることが好ましい。
【００９７】
更に好ましい実施態様の場合に、Ｌ−メチオニンを生産する細菌は、次の群から選択される１つ又はそれ以上の特徴を有する：
ａ）  チオスルファート／スルファート輸送系ＣｙｓＰＵＷＡ（EC 3.6.3.25）の１つ又はそれ以上の成分をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｂ）  ３′−ホスホアデノシン  ５′−ホスホスルファート  レダクターゼＣｙｓＨ（EC 1.8.4.8）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｃ）  スルフィット  レダクターゼＣｙｓＪＩ（EC 1.8.1.2）の１つ又はそれ以上の成分をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｄ）  システイン  シンターゼＡ  ＣｙｓＫ（EC 2.5.1.47）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｅ）  システイン  シンターゼＢ  ＣｙｓＭ（EC 2.5.1.47）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｆ）  セリン  アセチルトランスフェラーゼＣｙｓＥ（EC 2.3.1.30）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｇ）  グリシン分割系ＧｃｖＴＨＰ−Ｌｐｄ（EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4）の１つ又はそれ以上の成分をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｈ）  リポイル  シンターゼＬｉｐＡ（EC 2.8.1.8）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｉ）  リポイルタンパク質リガーゼＬｉｐＢ（EC 2.3.1.181）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｊ）  ホスホグリセラート  デヒドロゲナーゼＳｅｒＡ（EC 1.1.1.95）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｋ）  ３−ホスホセリン  ホスファターゼＳｅｒＢ（EC 3.1.3.3）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｌ）  ３−ホスホセリン／ホスホヒドロキシトレオニン  アミノトランスフェラーゼＳｅｒＣ（EC 2.6.1.52）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｍ）  セリン  ヒドロキシメチルトランスフェラーゼＧｌｙＡ（EC 2.1.2.1）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｎ）  アスパルトキナーゼＩ及びホモセリン  デヒドロゲナーゼＩ  ＴｈｒＡ（EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｏ）  アスパルタートキナーゼＬｙｓＣ（EC 2.7.2.4）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｐ）  ホモセリン−デヒドロゲナーゼ  Ｈｏｍ（EC 1.1.1.3）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｑ）  ホモセリン  Ｏ−アセチルトランスフェラーゼＭｅｔＸ（EC 2.3.1.31）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｒ）  ホモセリン  Ｏ−スクシニルトランスフェラーゼＭｅｔＡ（EC 2.3.1.46）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｓ）  シスタチオニン  ガンマ−シンターゼＭｅｔＢ（EC 2.5.1.48）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｔ）  β−Ｃ−Ｓ−リアーゼＡｅｃＤ（EC 4.4.1.8、ベータ−リアーゼともいわれる）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｕ）  シスタチオニン  ベータ−リアーゼＭｅｔＣ（EC 4.4.1.8）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｖ）  Ｂ１２非依存性ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼＭｅｔＥ（EC 2.1.1.14）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｗ）  Ｂ１２依存性ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼＭｅｔＨ（EC 2.1.1.13）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｘ）  メチレンテトラヒドロフォラート  レダクターゼＭｅｔＦ（EC 1.5.1.20）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｙ）  Corynebacterium glutamicum由来のＬ−メチオニン  エクスポーターＢｒｎＦＥの１つ又はそれ以上の成分をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｚ）  Escherichia coli由来のバリン  エクスポータＹｇａＺＨ（b2682, b2683）の１つ又はそれ以上の成分をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ａａ）  Escherichia coli由来の推定トランスポータＹｊｅＨ（b4141）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｂｂ）  ピリジン  ヌクレオチド  トランスヒドロゲナーゼＰｎｔＡＢ（EC 1.6.1.2）の１つ又はそれ以上の成分をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｃｃ）  Ｏ−スクシニルホモセリン  スルフヒドリラーゼＭｅｔＺ（EC 2.5.1.48）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｄｄ）  ホスホエノールピルバート  カルボキシラーゼＰｙｃ（EC 4.1.1.31）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｅｅ）  チオスルファート−硫黄トランスフェラーゼＲＤＬ２（EC 2.8.1.1）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｆｆ）  チオスルファート−チオール  硫黄トランスフェラーゼ（EC 2.8.1.3）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｇｇ）  チオスルファート−ジチオール  硫黄トランスフェラーゼ（EC 2.8.1.5）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド。
【００９８】
この場合、好ましい特徴は、次の群から選択される１つ又は複数の特徴である：
ａ）  チオスルファート／スルファート輸送系ＣｙｓＰＵＷＡ（EC 3.6.3.25）の１つ又はそれ以上の成分をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｂ）  ３′−ホスホアデノシン  ５′−ホスホスルファート  レダクターゼＣｙｓＨ（EC 1.8.4.8）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｃ）  スルフィット  レダクターゼＣｙｓＪＩ（EC 1.8.1.2）の１つ又はそれ以上の成分をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｄ）  システイン  シンターゼＡ  ＣｙｓＫ（EC 2.5.1.47）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｅ）  システイン  シンターゼＢ  ＣｙｓＭ（EC 2.5.1.47）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｆ）  セリン  アセチルトランスフェラーゼＣｙｓＥ（EC 2.3.1.30）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｇ）  グリシン分割系ＧｃｖＴＨＰ−Ｌｐｄ（EC 2.1.2.10, EC 1.4.4.2, EC 1.8.1.4）の１つ又はそれ以上の成分をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｈ）  リポイル  シンターゼＬｉｐＡ（EC 2.8.1.8）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｉ）  リポイルタンパク質リガーゼＬｉｐＢ（EC 2.3.1.181）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｊ）  ホスホグリセラート  デヒドロゲナーゼＳｅｒＡ（EC 1.1.1.95）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｋ）  ３−ホスホセリン  ホスファターゼＳｅｒＢ（EC 3.1.3.3）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｌ）  ３−ホスホセリン／ホスホヒドロキシトレオニン  アミノトランスフェラーゼＳｅｒＣ（EC 2.6.1.52）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｍ）  セリン  ヒドロキシメチルトランスフェラーゼＧｌｙＡ（EC 2.1.2.1）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｎ）  アスパルトキナーゼＩ及びホモセリン  デヒドロゲナーゼＩ  ＴｈｒＡ（EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｏ）  アスパルタートキナーゼＬｙｓＣ（EC 2.7.2.4）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｐ）  ホモセリン−デヒドロゲナーゼＨｏｍ（EC 1.1.1.3）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｑ）  ホモセリン−アセチルトランスフェラーゼＭｅｔＸ（EC 2.3.1.31）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｒ）  ホモセリン  Ｏ−トランススクシニラーゼＭｅｔＡ（EC 2.3.1.46）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｓ）  シスタチオニン  ガンマ−シンターゼＭｅｔＢ（EC 2.5.1.48）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｔ）  β−Ｃ−Ｓ−リアーゼＡｅｃＤ（EC 4.4.1.8、ベータ−リアーゼともいう）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｕ）  シスタチオニン  ベータ−リアーゼＭｅｔＣ（EC 4.4.1.8）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｖ）  Ｂ１２非依存性ホモシステイン  Ｓ−メチルトランスフェラーゼＭｅｔＥ（EC 2.1.1.14）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｗ）  Ｂ１２依存性ホモシステイン  Ｓ−メチルトランスフェラーゼＭｅｔＨ（EC 2.1.1.13）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｘ）  メチレンテトラヒドロフォラート  レダクターゼＭｅｔＦ（EC 1.5.1.20）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｙ）  チオスルファート−硫黄トランスフェラーゼＲＤＬ２（EC 2.8.1.1）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド。
【００９９】
この場合、特に極めて好ましい特徴は、次の群から選択される特徴である：
ａ）  アスパルトキナーゼＩ及びホモセリン  デヒドロゲナーゼＩ  ＴｈｒＡ（EC 2.7.2.4, EC 1.1.1.3）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｂ）  セリン  アセチルトランスフェラーゼＣｙｓＥ（EC 2.3.1.30）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｃ）  アスパルタートキナーゼＬｙｓＣ（EC 2.7.2.4）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｄ）  ホモセリン−デヒドロゲナーゼ  Ｈｏｍ（EC 1.1.1.3）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｅ）  ホモセリン−アセチルトランスフェラーゼＭｅｔＸ（EC 2.3.1.31）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｆ）  ホモセリン  Ｏ−トランススクシニラーゼＭｅｔＡ（EC 2.3.1.46）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｇ）  シスタチオニン  ガンマ−シンターゼＭｅｔＢ（EC 2.5.1.48）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｈ）  β−Ｃ−Ｓ−リアーゼＡｅｃＤ（EC 4.4.1.8、ベータ−リアーゼともいう）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｉ）  シスタチオニン  ベータ−リアーゼＭｅｔＣ（EC 4.4.1.8）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｊ）  Ｂ１２非依存性ホモシステイン  Ｓ−メチルトランスフェラーゼＭｅｔＥ（EC 2.1.1.14）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｋ）  Ｂ１２依存性ホモシステイン  Ｓ−メチルトランスフェラーゼＭｅｔＨ（EC 2.1.1.13）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｌ）  メチレンテトラヒドロフォラート  レダクターゼＭｅｔＦ（EC 1.5.1.20）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド、
ｍ）  チオ硫酸−硫黄トランスフェラーゼＲＤＬ２（EC 2.8.1.1）をコードする、過剰発現されたポリヌクレオチド。
【０１００】
「過剰発現」、「増強」又は「高められた活性」の概念は、本発明の場合に、相応するＤＮＡによりコードされる、微生物中の１つ又は複数の酵素の細胞内酵素活性の向上を意味する。
【０１０１】
基本的に、酵素活性の向上は、例えば、酵素をコードする１つ又はそれ以上の遺伝子配のコピー数を高めること、強いプロモータを使用すること、又は高められた活性を有する相応する酵素をコードする遺伝子又は対立遺伝子を利用すること、及び場合によりこれらの手法を組み合わせることにより達成される。本発明により遺伝子工学的に変更された細胞は、例えば形質転換、形質導入、接合又はこれらの方法の組合せによりベクターを用いて作製され、このベクターは、所望の遺伝子、この遺伝子の対立遺伝子又はその一部及び遺伝子の発現を可能にするベクターを有する。異種発現は、特に、遺伝子又は対立遺伝子を細胞の染色体に組み込むか、又は染色体外で複製するベクターによって達成される。
【０１０２】
ピルバート−カルボキシラーゼの例について細胞中での酵素活性を高めるための方法についての概観はDE-A-10031999にあり、これは参照として導入されかつ、細胞中の酵素活性を高めるための方法に関するその開示内容は、本発明の開示の一部を形成する。
【０１０３】
酵素活性の向上は、例えば、相応するポリヌクレオチドのコピー数を染色体で又は染色体外で、コピーを少なくとも１つ高めることにより達成される。
【０１０４】
コピー数を高めるために広く知られた方法は、相応するポリヌクレオチドをベクター中に、好ましくはプラスミド中に組み込み、これを細菌により複製させることにある。
【０１０５】
腸内細菌に適したプラスミドベクターは、例えばｐＡＣＹＣ１８４から誘導されたクローニングベクター（Bartolome et al.; Gene 102: 75-78 (1991)）、ｐＴｒｃ９９Ａ（Amann et al.; Gene 69: 301-315 (1988)）又はｐＳＣ１０１誘導体（Vocke及びBastia; Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80 (21): 6557-6561 (1983)）を使用することができる。更に、ｐＣＬ１９２０（Lerner, C.G.及びnouye, M., Nucl. Acids Res. (1990) 18:4631 [PMID: 2201955]）から誘導されたプラスミドが特に適している。「Bacterial Artifical Chromosomes」（ＢＡＣ）から誘導されたプラスミドベクター、例えばｐＣＣ１ＢＡＣ（EPICENTRE Biotechnologies, Madison, U.S.A.）も同様に、相応するポリヌクレオチドのコピー数を大腸菌中で高めるために適している。
【０１０６】
更に、ベクターとしてトランスポゾン、インサーションエレメント（ＩＳ−エレメント）又はファージを使用することができる。この種の遺伝的系は、例えば特許文献US 4,822,738、US 5,804,414及びUS 5,804414に記載されている。同様に、WO92/02627に記載された、プラスミドｐＸＺ１０１４２のＩＳエレメントＩＳａＢｌ又はトランスポゾンＴｎ  ４５（「Handbook of Corynebacterlum glutamicum」(Herausgeber: L. Eggeling及びM. Bott)で引用）を使用することができる。
【０１０７】
過剰発現を達成するための他の知られた方法は、染色体遺伝子増幅法である。この方法の場合に、興味があるポリヌクレオチドの少なくとも１つの付加的なコピーを細菌の染色体中へ挿入する。この種の増幅法は、例えばWO 03/014330又はWO 03/040373に記載されている。
【０１０８】
過剰発現を達成するための他の方法は、相応する遺伝子又は対立遺伝子を、プロモータ又は発現カセットと機能的に結合（operably linked）させることにある。大腸菌（E. coli）のために適切なプロモータは、例えばAmann et al. (Gene 69(2), 301-315 (1988))及びAmann及びBrosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985))に記載のプロモータＴ３、Ｔ７、ＳＰ６、Ｍ１３、ｌａｃ、ｔａｃ及びｔｒｃが公知である。この種のプロモータは、例えば該当する遺伝子の上流で、一般に開始コドンから約１〜５００の核酸塩基の間隔で挿入することができる。US 5,939,307には、発現カセット又はプロモータ、例えば、ｔａｃ−プロモータ、ｔｒｐ−プロモータ、ｌｐｐ−プロモータ又はファージλのＰＬ−プロモータ及びＰＲ−プロモータを、例えば染色体のトレオニンオペロンの上流に組み込むことにより、発現の向上を達成できたことが記載されている。同様に、ファージＴ７のプロモータ、ギアボックスプロモータ、ｎａｒ−プロモータ又は遺伝子ｒｒｓＧ、ｒｎｐＢ、ｃｓｒＢ、ｏｍｐＡ、ｆｕｓＡ、ｐｅｐＱ、ｒｐｌＸ又はｒｐｓＧのプロモータが使用できる。この種の発現カセット又はプロモータは、EP 0593792に記載されているように、プラスミド結合遺伝子を過剰発現するために使用することもできる。ｌａｃＩＱ対立遺伝子を使用することにより、またプラスミド結合遺伝子の発現が調節される（Glascock及びWeickert, Gene 223, 221-231 (1998)）。更に、プロモータの活性は、１つ又はそれ以上のヌクレオチド置換、挿入及び／又は欠失によるこの配列の変更によって高めることも可能である。
【０１０９】
酵素活性の向上を内在性遺伝子の突然変異により行う場合には、この種の突然変異は、古典的方法により、例えばＵＶ照射又は突然変異誘発する薬品によって全方向で製造できるか、又は欠失、挿入及び／又はヌクレオチド置換のような遺伝子工学的方法によってねらいを定めて製造できる。この突然変異により、遺伝子工学的に変更された細胞が得られる。酵素の特に好ましい突然変異は、特に、野生型酵素と比較して、もはやフィードバック阻害可能でないか、又は少なくとも低減されてフィードバック阻害可能である酵素でもある。
【０１１０】
酵素の発現を高めることによる酵素活性の向上を行う場合に、例えば、相応する遺伝子のコピー数を高めるか、又は構造遺伝子の上流にあるプロモータ領域及びレギュレータ領域又はリボソーム結合領域を突然変異させる。同様に、構造遺伝子の上流に組み込まれた発現カセットが作用する。誘導可能なプロモータにより、更にその都度の任意の時点で発現を向上させることもできる。更に、レギュレータの配列として、この遺伝子には、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの間の改善された相互作用によって同様に高められた遺伝子発現を引き起こす、いわゆる「エンハンサ」も属することができる。ｍＲＮＡの寿命を延長する措置によっても、同様にこの発現は改善される。更に、酵素タンパク質の分解を抑制することによっても同様に酵素活性が高められる。この遺伝子又は遺伝子構造体は、この場合、多様なコピー数を有するプラスミド中に存在するか、又は遺伝子中に組み込まれ、かつ増幅される。これとは別に、更に、該当する遺伝子の過剰発現は、培地組成及び培養操作の変更によって達成できる。これについての手引きは、当業者は、特に、Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987))、Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994))、Tsuchiya及びMorinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988))、Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991))、EP-A-0 472 869、US 4,601,893、Schwarzer及びPuehler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991))、Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994))、LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993))、WO-A-96/15246、Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993))、JP-A-10-229891、Jensen及びHammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998))及び遺伝学及び分子生物学の公知の教書で得られる。上記された措置は、突然変異と同様に遺伝子工学的に変更された細胞を生じさせる。
【０１１１】
更に、遺伝子増幅の方法を染色体への組み込みにより用いることができるプラスミドベクターも適している。「クロスオーバー」イベントを用いた相同組換えによって、生じる菌株は、該当する遺伝子の少なくとも２つのコピーを有する。大腸菌（E. coli）のための方法は、例えばLink, A.J., Phillips, D. and Church, G.M. (1997), J. Bacteriology 179: 6228-6237に記載されている。
【０１１２】
染色体中のＤＮＡの挿入又は欠失のために、例えばDatsenko KA, Wanner BL., 2000, Proc Nati Acad Sei USA., 97 (12) : 6640-5に記載されたような、リコンビナーゼを用いる方法も使用できる。
【０１１３】
上述の及び後述の説明において使用された「野生型菌株又は出発菌株と比較して高められた酵素活性」の表現とは、好ましくは、それぞれの酵素の少なくとも２倍、特に好ましくは少なくとも１０倍、更に好ましくは少なくとも１００倍、更により好ましくは少なくとも１０００倍、最も好ましくは少なくとも１００００倍高められた酵素活性であると解釈される。更に、「野生型菌株又は出発菌株と比較して高められた酵素活性」を有する本発明による細胞は、特に野生型菌株又は出発菌株がこの酵素活性を有しないか又はこの酵素活性の少なくとも検出可能な活性を有さず、及び例えば過剰発現による酵素活性の向上後に初めてこの酵素の検出可能な活性を示す細胞も含む。この関係で、「過剰発現」の概念又は以後の説明において使用される「発現の向上」の文言は、出発細胞、例えば野生型細胞が、発現を有しないが又は少なくとも検出可能な発現を有さず、及び組換え法によって初めて酵素の検出可能な発現が誘導される場合を含む。
【０１１４】
多様な酵素の酵素活性の測定方法は文献から得ることができる。
【０１１５】
上述の酵素又は遺伝子の発現は、一次元又は二次元のタンパク質ゲル分離によって、及び引き続き、相応する評価ソフトウェアを用いたゲル中のタンパク質濃度の光学的同定によって検出可能である。酵素活性の向上が、もっぱら相応する遺伝子の発現の向上に基づく場合には、酵素活性の向上の定量化は、野生型と遺伝子工学的に変更された細胞との間の一次元又は二次元のタンパク質ゲル分離の比較によって簡単に決定することができる。細菌の場合のタンパク質ゲルを調製するため及びこのタンパク質を同定するための慣用の方法は、Hermann et al.（Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001)）に記載された手法である。このタンパク質濃度は、同様に検出されるべきタンパク質に対して特異的な抗原を用いるウェスタン・ブロット・ハイブリダイゼーション（Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Coid Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989）及び引き続き濃度決定のための相応するソフトウェアを用いた光学的評価（Lohaus及びMeyer (1989) Biospektrum, 5: 32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647）によって分析することができる。ＤＮＡ結合するタンパク質の活性は、ＤＮＡ−バンド−シフトアッセイ（ゲル遅延ともいわれる）を用いて測定することができる（Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155）。ＤＮＡ結合タンパク質の他の遺伝子の発現への作用は、リポーター遺伝子アッセイの多様な良好に記載された方法によって検出することができる（Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989）。細胞内酵素活性は、記載された多様な方法（Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8) : 2277-2284; Freed-berg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115 (3) : 816-823）によって決定することができる。以後の説明において、所定の酵素の活性を測定するための具体的な方法が示されていない場合、この酵素活性の向上の決定及び酵素活性の低減の決定は、好ましくはHermann et al., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 5 32-39 (1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111: 2630-2647 (1999)及びWilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001)に記載の方法により行われる。
【０１１６】
更に、Ｌ−アミノ酸、特にＬ−メチオニンの生産のために、望ましくない副反応を遮断することが好ましい（Nakayama: 「Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms」, Overproduction of Microbial Products, Krumphanzi, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982）。
【０１１７】
大腸菌（E. coli）中でＬ−メチオニンの生産を改善するために、場合により、次の群から選択される遺伝子の１つ又はそれ以上を弱めるか、場合により遮断するか、又は発現を低減することが好ましい：
ａ）  Ｌ−メチオニンバイオシンターゼ（ＭｅｔＪ）のトランスクリプションレギュレータをコードする遺伝子ｍｅｔＪ（ｂ３９３８、ＥＣＫ３９３０）、
ｂ）  グルコース−６−ホスファート−イソメラーゼ（Ｐｇｉ、ＥＣ番号５．３．１．９）をコードする遺伝子ｐｇｉ（ｂ４０２５、ＥＣＫ４０１７）、
ｃ）  ホモセリンキナーゼ（ＴｈｒＢ、ＥＣ  ２．７．１．３９）をコードする遺伝子ｔｈｒＢ（ｂ０００３、ＥＣＫ０００３）、
ｄ）  Ｓ−アデノシルメチオニン  シンターゼ（ＭｅｔＫ、ＥＣ番号２．５．１．６）をコードする遺伝子ｍｅｔＫ（ｂ２９４２、ＥＣＫ２９３７）、
ｅ）  ジヒドロジピコリナート  シンターゼ（ＤａｐＡ、ＥＣ番号４．２．１．５２）をコードする遺伝子ｄａｐＡ（ｂ２４７８、ＥＣＫ２４７４）、
ｆ）  ホスホエノールピルバート  カルボキシキナーゼ（Ｐｃｋ、ＥＣ番号４．１．１．４９）をコードする遺伝子ｐｃｋ（ｂ３４０３、ＥＣＫ３３９０）、
ｇ）  ホルミルテトラヒドロフォラート  ヒドロラーゼ（ＰｕｒＵ、ＥＣ番号３．５．１．１０）をコードする遺伝子ｐｕｒＵ（ｂ１２３２、ＥＣＫ１２２７）、
ｈ）  ピルバートキナーゼＩＩ（ＰｙｋＡ、ＥＣ番号２．７．１．４０）をコードする遺伝子ｐｙｋＡ（ｂ１８５４、ＥＣＫ１８５５）、
ｉ）  ピルバートキナーゼＩ（ＰｙｋＦ、ＥＣ２．７．１．４０）をコードする遺伝子ｐｙｋＦ（ｂ１６７６、ＥＣＫ１６７２）、
ｊ）  Ｌ−メチオニントランスポータ（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニットをコードする遺伝子ｍｅｔＱ（ｂ０１９７、ＥＣＫ０１９７）、
ｋ）  Ｌ−メチオニントランスポータ（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニットをコードする遺伝子ｍｅｔＩ（ｂ０１９８、ＥＣＫ０１９８）、
ｌ）  Ｌ−メチオニントランスポータ（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニットをコードする遺伝子ｍｅｔＮ（ｂ０１９９、ＥＣＫ０１９９）、
ｍ）  デオキシシチジン５′−トリホスファート  デアミナーゼ（Ｄｃｄ、ＥＣ番号３．５．４．１３）をコードする遺伝子ｄｃｄ（ｂ２０６５，ＥＣＫ２０５９）、
ｎ）  推定のＮ−アシルトランスフェラーゼ（ＹｎｃＡ、Metabolic Explorer WO2010/020681）をコードする遺伝子ｙｎｃＡ（ｂ１４４８、ＥＣＫ１４４２）、
ｏ）  調節ｓＲＮＡ  ＦｎｒＳをコードする遺伝子ｆｎｒＳ（ｂ４６９９、ＥＣＫ４５１１）、
ｐ）  シグマ因子ＲｐｏＳをコードする遺伝子ｒｏｐＳ（ｂ２７４１、ＥＣＫ２７３６）。
【０１１８】
この場合、特に好ましい特徴は、次の群から選択される：
ａ）  Ｌ−メチオニンバイオシンターゼ（ＭｅｔＪ）のトランスクリプションレギュレータをコードする遺伝子ｍｅｔＪ（ｂ３９３８、ＥＣＫ３９３０）、
ｂ）  Ｓ−アデノシルメチオニンシンターゼ（ＭｅｔＫ、ＥＣ番号２．５．１．６）をコードする遺伝子ｍｅｔＫ（ｂ２９４２、ＥＣＫ２９３７）、
ｃ）  ホスホエノールピルバート  カルボキシキナーゼ（Ｐｃｋ、ＥＣ番号４．１．１．４９）をコードする遺伝子ｐｃｋ（ｂ３４０３、ＥＣＫ３３９０）、
ｄ）  ホルミルテトラヒドロフォラート  ヒドロラーゼ（ＰｕｒＵ、ＥＣ番号３．５．１．１０）をコードする遺伝子ｐｕｒＵ（ｂ１２３２、ＥＣＫ１２２７）、
ｅ）  ピルバートキナーゼＩＩ（ＰｙｋＡ、ＥＣ番号２．７．１．４０）をコードする遺伝子ｐｙｋＡ（ｂ１８５４、ＥＣＫ１８５５）、
ｆ）  ピルバートキナーゼＩ（ＰｙｋＦ、ＥＣ２．７．１．４０）をコードする遺伝子ｐｙｋＦ（ｂ１６７６、ＥＣＫ１６７２）、
ｇ）  Ｌ−メチオニントランスポータ（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニットをコードする遺伝子ｍｅｔＱ（ｂ０１９７、ＥＣＫ０１９７）、
ｈ）  Ｌ−メチオニントランスポータ（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニットをコードする遺伝子ｍｅｔＩ（ｂ０１９８、ＥＣＫ０１９８）、
ｉ）  Ｌ−メチオニントランスポータ（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニットをコードする遺伝子ｍｅｔＮ（ｂ０１９９、ＥＣＫ０１９９）、
ｊ）  推定のＮ−アシルトランスフェラーゼ（ＹｎｃＡ、Metabolic Explorer WO2010/020681）をコードする遺伝子ｙｎｃＡ（ｂ１４４８、ＥＣＫ１４４２）、
ｋ）  シグマ因子ＲｐｏＳをコードする遺伝子ｒｏｐＳ（ｂ２７４１、ＥＣＫ２７３６）。
【０１１９】
この場合、特に極めて好ましい特徴は、次の群から選択される：
ａ）  Ｌ−メチオニンバイオシンターゼ（ＭｅｔＪ）のトランスクリプションレギュレータをコードする遺伝子ｍｅｔＪ（ｂ３９３８、ＥＣＫ３９３０）、
ｂ）  Ｓ−アデノシルメチオニンシンターゼ（ＭｅｔＫ、ＥＣ番号２．５．１．６）をコードする遺伝子ｍｅｔＫ（ｂ２９４２、ＥＣＫ２９３７）、
ｃ）  Ｌ−メチオニントランスポータ（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニットをコードする遺伝子ｍｅｔＱ（ｂ０１９７、ＥＣＫ０１９７）、
ｄ）  Ｌ−メチオニントランスポータ（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニットをコードする遺伝子ｍｅｔＩ（ｂ０１９８、ＥＣＫ０１９８）、
ｅ）  Ｌ−メチオニントランスポータ（ＭｅｔＱＮＩ）のサブユニットをコードする遺伝子ｍｅｔＮ（ｂ０１９９、ＥＣＫ０１９９）、
ｆ）  推定のＮ−アシルトランスフェラーゼ（ＹｎｃＡ、Metabolic Explorer WO2010/020681）をコードする遺伝子ｙｎｃＡ（ｂ１４４８、ＥＣＫ１４４２）、
ｇ）  シグマ因子ＲｐｏＳをコードする遺伝子ｒｏｐＳ（ｂ２７４１、ＥＣＫ２７３６）。
【０１２０】
転写減衰の手法は、場合により、メチオニン生産を向上する遺伝子を強化する記載の手法に対して付加的に又はその方法と適切に組み合わせて実施される。
【０１２１】
本発明による手法の前に、Ｌ−アミノ酸を生産する微生物には、本発明の場合に野生型菌株及び頻繁に利用される実験室菌株、例えば特にＤＨ５α、ＤＨ５αｍｃｒ、Ｗ３１１０、ＭＧ１６５５、ＭＣ４１００、Ｙ１０８９、Ｈ５６０、ＢＬ２１及びＭＭ１５２は属さない。
【０１２２】
これらのＬ−アミノ酸を生産する微生物は、しかしながら野生型菌株及び頻繁に利用された実験室菌株から誘導されていてもよい。
【０１２３】
よって、微生物の出発菌株は、好ましくは、大腸菌ＭＧ１６５５、大腸菌Ｗ３１１０、大腸菌ＤＨ５α、大腸菌ＤＨ１０Ｂ、大腸菌ＢＷ２９５２、大腸菌ＲＥＬ６０６からなる群から誘導される。
【０１２４】
本発明による好ましい、Ｌ−メチオニンを分泌する又は生産する菌株は、例えば、生産プラスミドｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ*１−ｃｙｓＥ−Ｐｇａｐ−ｍｅｔＡ*１１及びｐＣＣ１ＢＡＣ−ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡ−ｓｅｒＣを有する大腸菌生産菌株ＭＧ１６５５  ΔｍｅｔＪ  ｍｅｔＡ*１１  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  ΔｐｙｋＦ  ΔｐｙｋＡ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰ  ΔｐｕｒＵ  Ｐｔｒｃ３６−ＡＲＮｍｓｔ１７−ｍｅｔＦである（WO2009/043803）である。
【０１２５】
他の本発明による好ましい、Ｌ−メチオニンを分泌する又は生産する菌株は、例えば生産プラスミドｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ*１−ｃｙｓＥ−Ｐｇａｐ−ｍｅｔＡ*１１を有する大腸菌生産菌株ＭＧ１６５５  ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰである。
【０１２６】
大腸菌生産菌株ＭＧ１６５５ΔｍｅｔＪ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＨ  Ｐｔｒｃ−ｍｅｔＦ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＰＵＷＡＭ  ＰｔｒｃＦ−ｃｙｓＪＩＨ  Ｐｔｒｃ０９−ｇｃｖＴＨＰのクローニングは、特許出願WO2009/043803に記載されているように、一連のＰ１−形質導入及びキュアリング（Kurierung）によって行うことができる。この菌株は、野生型大腸菌Ｋ１２  ＭＧ１６５５に基づく。この菌株のゲノム中に次の変更を導入した：
・  Ｌ−メチオニンシンターゼｍｅｔＪのリプレッサについての遺伝子を欠失させた。
・  遺伝子ｍｅｔＨ（コバラミン依存性メチオニンシンターゼをコードする）の上流に、強いｔｒｃプロモータを挿入した。
・  遺伝子ｍｅｔＦ（５，１０−メチレンテトラヒドロフォラート−レダクターゼをコードする）の上流に、強いｔｒｃプロモータを挿入した。
・  オペロンｃｙｓＰＵＷＡＭの上流に、強いｔｒｃＦプロモータを挿入した。ｃｙｓＰＵＷＡは、スルファート／チオスルファート−取り込みトランスポータをコードする。ｃｙｓＭは、システイン−シンターゼＢをコードする。
・  オペロンｃｙｓＪＩＨの上流に、強いｔｒｃＦプロモータを挿入した。ｃｙｓＪＩは、スルフィット−レダクターゼをコードし、ｃｙｓＨは、３′−ホスホ−アデニルスルファート−レダクターゼをコードする。
・  オペロンｇｃｖＴＨＰの上流に、強いｔｒｃ０９プロモータを挿入した。ｇｃｖＴ、ｇｃｖＨ及びｇｃｖＰは、グリシン−分割系の３つの成分をコードする。
【０１２７】
大腸菌生産プラスミドｐＭＥ１０１−ｔｈｒＡ*１−ｃｙｓＥ−Ｐｇａｐ−ｍｅｔＡ*１１のクローニングは、特許出願WO2007/077041及びWO2009/043803に記載されている。このプラスミドは、ベクターｐＣＬ１９２０（Lerner, C.G.及びInouye, M., Nucl. Acids Res. (1990) 18:4631 [PMID: 2201955]）を基礎とする低コピー数のプラスミド（low copy plasmid）である。空のプラスミドｐＭＥ１０１は、ｌａｃＩq遺伝子を有し、この遺伝子はｌａｃリプレッサの強く発現された対立遺伝子をコードする。このＬａｃリプレッサにより強く抑制可能なｔｒｃプロモータの下流で、遺伝子ｔｈｒＡ*１がクローニングされた。これは、大腸菌由来のアスパルタートキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼＴｈｒＡのフィードバック耐性の変異体をコードする。同じ向きで、その後方に、この遺伝子ｃｙｓＥはその天然のプロモータと共にある。これは大腸菌由来のセリン−アセチルトランスフェラーゼをコードする。ｃｙｓＥの下流に、大腸菌由来の強いｇａｐＡプロモータが続き、このプロモータは遺伝子ｍｅｔＡ*１１の発現を調節する。ｍｅｔＡ*１１は、大腸菌由来のホモセリン  Ｏ−スクシニルトランスフェラーゼのフィードバック耐性変異体をコードする。
【０１２８】
本発明の他の好ましいＬメチオニンを分泌又は生産する微生物の例として、次の菌株を挙げることができる：
−  大腸菌ＴＦ４０７６ＢＪＦ  ｍｅｔＡ＃１０  ＋  ｍｅｔＹＸ（Ｌｍ）  （WO2008/127240;第４６頁）；
−  大腸菌Ｗ３１１０ΔＪ／ｐＫＰ４５１（EP1445310B1;第７頁、実施例４）；
−  大腸菌ＷΔｔｈｒＢＣΔｍｅｔＪｍｅｔＫ３２  ｐＭＷＰｔｈｒｍｅｔＡ４Δ５Δ９（Yoshihiro Usuda及びOsamu Kurahashi, 2005, Applied and Environmental Microbiology, Vol. 71, NO: 6, p. 3228-3234）；
−  Ｗ３１１０／ｐＨＣ３４（WO01/27307第１３頁、実施例３）；
−  大腸菌ＥＣＭ２（EP2205754A2、EP2326724A1及びEP12156052.8）。
【０１２９】
多様な適切な微生物の他の実施例は、Gomes et al.（Enzyme and Microbial Technology 37 (2005), 3-18）に記載されている。
【０１３０】
大腸菌の遺伝子又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のヌクレオチド配列は先行技術に属し、かつBlattner et al.（Science 277: 1453-1462 (1997)）により出版された大腸菌のゲノム配列から得られる。宿主独自の酵素（メチオニン−アミノペプチダーゼ）により、Ｎ末端アミノ酸のメチオニンが分離され得ることは公知である。
【０１３１】
遺伝学及び分子生物学に概念についての詳細な説明は、遺伝学及び分子生物学の公知の教書、例えばBirge（Bacterial and Bacteriophage Genetics, 4th ed., Springer Verlag, New York (USA), 2000）の教書又はBerg, Tymoczko及びStryer（Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company, New York (USA), 2002）の教書又はSambrook et al.（Molekular Cloning, A Laboratory Manual, (3-Volume Set), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (USA), 2001）のハンドブックから得られる。
【０１３２】
「遺伝子」の概念は、ここでは、まずはリボ核酸（ＲＮＡ）の製造（転写）のための情報を有しかつこのリボ核酸がタンパク質（ポリペプチド）の製造（翻訳）のための情報を有するデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の部分を意味し、ここでは（ｐ）ｐｐＧｐｐシンテターゼＩＩの活性を有するポリペプチドを意味する。遺伝子又はポリヌクレオチドがタンパク質の製造のための情報を有するという事実は、遺伝子又はＲＮＡによるタンパク質又はポリペプチドのコード化もいわれる。内在性の遺伝子又はポリヌクレオチドとは、ある種の個体群の形で存在するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、遺伝子若しくは対立遺伝子又はそのポリヌクレオチドであると解釈される。「遺伝子」及び「ＯＲＦ」（オープンリーディングフレーム）の概念は、本発明の範囲内で同義で使用される。
【０１３３】
「ポリヌクレオチド」の概念は、一般に、ポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドに関し、この場合、非修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡ又は修飾ＲＮＡ若しくはＤＮＡであることができる。
【０１３４】
「ポリペプチド」の概念は、ペプチド結合を介して結合した２又はそれ以上のアミノ酸を含むペプチド又はタンパク質を表す。ポリペプチド及びタンパク質の概念は同義語として使用されている。タンパク質は全ての細胞の基本構成成分に属する。これらは、細胞に、構造を付与するだけでなく、物質を輸送し、化学反応を触媒し及びシグナル物質を認識する分子の「装置」でもある。
【０１３５】
「タンパク質を構成するアミノ酸」とは、天然のタンパク質、つまり微生物、植物、動物及びヒトのタンパク質中に存在するアミノ酸であると解釈される。これには、特に、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−セリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−システイン、Ｌ−バリン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−チロシン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−リシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−プロリン及びＬアルギニンの群から選択されるＬ−アミノ酸、並びにセレノシステインが属する。この場合、タンパク質を構成するアミノ酸は、常にα−アミノ酸である。アミノ酸のグリシンを除いて、全てのタンパク質を構成するアミノ酸について、α−炭素は不斉である（この分子はキラルである）：これらのアミノ酸のいずれも２つのエナンチオマーが存在する。この場合、２つのエナンチオマーの一方だけ、特にＬ−アミノ酸だけがタンパク質を構成する：タンパク質を構成するために必要な機構（リボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（これはｔＲＮＡにアミノ酸を負わせる）等）はそれ自体もキラルであり、かつＬ型体だけを認識できる。
【０１３６】
「遺伝子発現」（省略して「発現」）の概念は、一般に、遺伝情報の表現系への顕在化を意味する。狭義には、遺伝子発現は、遺伝子のＲＮＡへの転写、引き続きＲＮＡの、酵素活性を有することができるポリペプチドへの翻訳を表す。
【０１３７】
「出発菌株」（親菌株）とは、１種又はそれ以上のアミノ酸、ペプチド又はタンパク質の生産性を高める措置又は１種又はそれ以上の酵素の活性を高める措置（例えば過剰発現を引き起こす措置）が実施される微生物株であると解釈される。出発菌株は野生型菌株であってもよいが、既に予め変更された菌株（例えば、Ｌ−アミノ酸生産微生物（生産菌株））であってもよい。
【０１３８】
細胞の「野生型」とは、好ましくは、ゲノムが進化によって自然に生じている状態にある細胞を表す。この概念は、細胞全体についても、ここの遺伝子についても使用される。「野生型」の概念には、特に、ヒトが組換え法によって遺伝子配列を少なくとも部分的に変更している細胞又は遺伝子は入らない。
【０１３９】
本発明を、次に実施例を用いて詳細に説明する。
【０１４０】
大腸菌（Escherichia coli）のために使用した最少培地（Ｍ９）及び完全培地（ＬＢ）は、J.H. Miller（A Short Course in Bacterial Genetics (1992), Cold Spring Harbor Laboratory Press）に記載されている。大腸菌からのプラスミドＤＮＡの単離並びに制限、ライゲーション、クレノウ処理及びアルカリホスファターゼ処理のための全ての技術は、他に記載がない限り、Sambrook et al.（Molecular Cloning - A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press）に従って実施される。大腸菌の形質転換は、他に記載がない限り、Chung et al.（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86: 2172-2175 (1989)）に従って実施される。
【０１４１】
他に記載がない限り、菌株及び形質転換体の製造の際の培養温度は３７℃である。
【０１４２】
実施例１
Ｌ−メチオニン耐性突然変異体のスクリーニング
Ｌ−メチオニン生産する大腸菌株ＥＣＭ２は、野生型Ｋ１２株ＭＧ１６５５を基礎とする。この菌株ＥＣＭ２は、EP2205754A2、EP2326724A1及びEP12156052.8に記載されているように、フィードバック耐性ｍｅｔＡ−対立遺伝子、遺伝子ｍｅｔＪ、ｙｎｃＡ、ｐｙｋＡ及びｐｙｋＦの欠失、ｓｐｏＴ遺伝子の変更、並びにそれぞれ遺伝子ｍｅｔＨ、ｍｅｔＦ、ｇｃｖＴ、ｃｙｓＰ及びｃｙｓＪの上流のプロモータ強化を有する。
【０１４３】
１．１  プラスミドｐＵＣ１８内へのｓｅｒＣ遺伝子のクローニング
大腸菌ＭＧ１６５５からの遺伝子ｓｅｒＣを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、引き続きプラスミドｐＵＣ１８（Fermentas GmbH, St. Leon-Rot、ドイツ国）内へクローニングした。
【０１４４】
ＰＣＲプライマーのｓｅｒＣＦ（ＸｂａＩ）及びｓｅｒＣＲ（ＨｉｎｄＩＩＩ）は、５′末端にそれぞれ、制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）又はＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）に続いて６つのランダムなヌクレオチドを有する。ｓｅｒＣＦ（ＸｂａＩ）のヌクレオチド１３〜３８は、位置９５６６１９〜９５６６４４の大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中に結合する。ｓｅｒＣＲ（ＨｉｎｄＩＩＩ）のヌクレオチド１３〜３７は、位置９５８０２８〜９５８００４の大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中に結合する。
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【０１４５】
遺伝子ｓｅｒＣを、プライマーｓｅｒＣＦ（ＸｂａＩ）及びｓｅｒＣＲ（ＨｉｎｄＩＩＩ）と一緒に、Phusion ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes Oy, Espoo、フィンランド国）によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適用のもとで増幅した。鋳型として、大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを利用した。生じたＤＮＡ断片は、１４３４ｂｐのサイズを有する。これを、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩにより切断し、QIAquik PCR Purificationキット（Qiagen, Hilden、ドイツ国）を用いて精製した。プラスミドｐＵＣ１８の非メチル化ＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで切断し、QIAquik PCR Purificationキット（Qiagen, Hilden、ドイツ国）を用いて精製した。引き続き、切断したプラスミドをＰＣＲ産物とライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α中に形質転換した。このｓｅｒＣ遺伝子を有するプラスミドクローンを、制限切断及びＤＮＡシークエンシングにより同定した。生じたプラスミドを、ｐＵＣ１８−ｓｅｒＣとした。
【０１４６】
１．２  プラスミドｐＵＣ１８−ｓｅｒＣ内へのｓｅｒＡ遺伝子のクローニング
大腸菌ＭＧ１６５５からの遺伝子ｓｅｒＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、引き続きプラスミドｐＵＣ１８−ｓｅｒＣ内へクローニングした。
【０１４７】
ＰＣＲプライマーのｓｅｒＡＦ（ＸｂａＩ）は、５′末端に、制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列ＸｂａＩ（ＴＣＴＡＧＡ）に続いて６つのランダムなヌクレオチドを有する。ヌクレオチド１２〜３３は、位置３０５５１９９〜３０５５２２０の大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中に結合する。ＰＣＲプライマーのｓｅｒＡＲ（ＳＨＳＳＮＢ）は、５′末端に、制限エンドヌクレアーゼＳａｃＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ、ＳｍａＩ、ＮｏｔＩ及びＢｇｌＩＩに対する認識配列に続いて６つのランダムなヌクレオチドを有する。ヌクレオチド４９〜５８は、位置３０５６８８０〜３０５６８６１の大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中に結合する。
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【０１４８】
この遺伝子ｓｅｒＡを、プライマーｓｅｒＡＦ（ＸｂａＩ）及びｓｅｒＡＲ（ＳＨＳＳＮＢ）と一緒に、Phusion ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes Oy, Espoo、フィンランド国）によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適用のもとで増幅した。鋳型として、大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを利用した。生じたＤＮＡ断片は、１７３１ｂｐのサイズを有していた。
【０１４９】
これを、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ及びＳａｃＩにより切断し、QIAquik PCR Purificationキット（Qiagen, Hilden、ドイツ国）を用いて精製した。プラスミドｐＵＣ１８−ｓｅｒＣを、同様に、制限エンドヌクレアーゼＸｂａＩ及びＳａｃＩにより切断し、QIAquik PCR Purificationキット（Qiagen, Hilden、ドイツ国）を用いて精製した。引き続き、切断したプラスミドをＰＣＲ産物とライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α中に形質転換した。このｓｅｒＡ遺伝子を有するプラスミドクローンを、制限切断及びＤＮＡシークエンシングにより同定した。生じたプラスミドを、ｐＵＣ１８−ｓｅｒＡＣとした。
【０１５０】
１．３  プラスミドｐＵＣ１８−ｓｅｒＡＣ内へのｓｅｒＢ遺伝子のクローニング
大腸菌ＭＧ１６５５からの遺伝子ｓｅｒＢを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、引き続きプラスミドｐＵＣ１８−ｓｅｒＡＣ内へクローニングした。
【０１５１】
ＰＣＲプライマーのｓｅｒＢ（ＳｐｈＩ）は、５′末端に、制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列ＳｐｈＩ（ＧＣＡＴＧＣ）に続いて６つのランダムなヌクレオチドを有する。ヌクレオチド１３〜３４は、位置４６２２８１６〜４６２２８３７の大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中に結合する。
【０１５２】
ＰＣＲプライマーのｓｅｒＢ（ＳｍａＩ）は、５′末端に、制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列ＳａｌＩ（ＧＴＣＧＡＣ）及びＳｍａＩ（ＣＣＣＧＧＧ）に続いて６つのランダムなヌクレオチドを有する。ヌクレオチド５４〜７５は、位置４６２３８８７〜４６２３８６６の大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中に結合する。
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【０１５３】
この遺伝子ｓｅｒＢを、プライマーｓｅｒＢ（ＳｐｈＩ）及びｓｅｒＢ（ＳｍａＩ）と一緒に、Phusion ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes Oy, Espoo、フィンランド国）によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適用のもとで増幅した。鋳型として、大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを利用した。生じたＤＮＡ断片は、１１３７ｂｐのサイズを有していた。
【０１５４】
これを、制限エンドヌクレアーゼＳｐｈＩ及びＳｍａＩにより切断し、QIAquik PCR Purificationキット（Qiagen, Hilden、ドイツ国）を用いて精製した。プラスミドｐＵＣ１８−ｓｅｒＡＣを、同様に、制限エンドヌクレアーゼＳｐｈＩ及びＳｍａＩにより切断し、アルカリホスファターゼで脱リン酸化し、QIAquik PCR Purificationキット（Qiagen, Hilden、ドイツ国）を用いて精製した。引き続き、切断したプラスミドをＰＣＲ産物とライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α中に形質転換した。このｓｅｒＢ遺伝子を有するプラスミドクローンを、制限切断及びＤＮＡシークエンシングにより同定した。生じたプラスミドを、ｐＵＣ１８−ｓｅｒＢＡＣとした。
【０１５５】
１．４  プラスミドｐＵＣ１８−ｓｅｒＢＡＣ内へのｇｌｙＡ遺伝子のクローニング
大腸菌ＭＧ１６５５からの遺伝子ｇｌｙＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、引き続きプラスミドｐＵＣ１８−ｓｅｒＢＡＣ内へクローニングした。
【０１５６】
ＰＣＲプライマーのｇｌｙＡダウンストリームは、５′末端に、制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列ＢｇｌＩＩ（ＡＧＡＴＣＴ）に続いて６つのランダムなヌクレオチドを有する。ヌクレオチド１３〜３５は、位置２６８２０６３〜２６８２０８５の大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中に結合する。
【０１５７】
ＰＣＲプライマーのｇｌｙＡアップストリームは、５′末端に、制限エンドヌクレアーゼに対する認識配列ＮｏｔＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）に続いて６つのランダムなヌクレオチドを有する。ヌクレオチド１５〜３３は、位置２６８３７６２〜２６８３７４４の大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中に結合する。
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【０１５８】
この遺伝子ｇｌｙＡを、プライマーｇｌｙＡダウンストリーム及びｇｌｙＡアップストリームと一緒に、Phusion ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes Oy, Espoo、フィンランド国）によるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適用のもとで増幅した。鋳型として、大腸菌ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを利用した。生じたＤＮＡ断片は、１７２６ｂｐのサイズを有していた。
【０１５９】
これを、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩにより切断し、QIAquik PCR Purificationキット（Qiagen, Hilden、ドイツ国）を用いて精製した。プラスミドｐＵＣ１８−ｓｅｒＢＡＣを、同様に、制限エンドヌクレアーゼＢｇｌＩＩ及びＮｏｔＩにより切断し、QIAquik PCR Purificationキット（Qiagen, Hilden、ドイツ国）を用いて精製した。引き続き、切断したプラスミドをＰＣＲ産物とライゲーションし、大腸菌ＤＨ５α中に形質転換した。このｇｌｙＡ遺伝子を有するプラスミドクローンを、制限切断及びＤＮＡシークエンシングにより同定した。生じたプラスミドを、ｐＵＣ１８−ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡＣとした。
【０１６０】
１．５  ｐＵＣ１８−ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡＣからの遺伝子ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡＣをｐＣＣ１−ＢＡＣによりクローニング
プラスミドｐＵＣ１８−ｓｅｒＢ−ｇｌｙＡ−ｓｅｒＡＣを、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩで切断し、このＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により分離した。５．９ｋｂのサイズのＤＮＡ断片を、このゲルから単離した。これは、遺伝子ｓｅｒＢ、ｇｌｙＡ、ｓｅｒＡ及びｓｅｒＣを含んでいた。この断片を、既にＨｉｎｄＩＩＩで切断されたプラスミドｐＣＣ１ＢＡＣ Cloning-Readyベクター（ＨｉｎｄＩＩＩ）（Epicentre社, Madison, USA）とライゲーションし、大腸菌ＥＰＩ３００により形質転換した。このｓｅｒＢ、ｇｌｙＡ、ｓｅｒＡ及びｓｅｒＣからなるＤＮＡ断片を有するプラスミドクローンを、制限切断及びＤＮＡシークエンシングにより同定した。生じた生産プラスミドを、ｐＣＣ３とした。
【０１６１】
１．６  生産プラスミドｐＭＥ−ＲＤＬ２ａのクローニング
生産プラスミドｐＭＥ−ＲＤＬ２ａのクローニングを、EP出願11151526.8に記載されたように行った。これは、大腸菌からの遺伝子ｃｙｓＥ、大腸菌からの遺伝子ｔｈｒＡ及びｍｅｔＡのフィードバック耐性対立遺伝子、並びにSaccharomyces cerevisiaeからのチオスルファート−硫黄トランスフェラーゼＲＤＬ２ｐをコードする遺伝子ＲＤＬ２ａを有していた。更に、これはストレプトマイシン耐性遺伝子を有していた。
【０１６２】
１．７  生産プラスミドを用いた菌株ＥＣＭ２の形質転換
菌株ＥＣＭ２を、実施例１．５からの生産プラスミドｐＣＣ３で形質転換し、この形質転換体をクロラムフェニコール２０ｍｇ／ｌで選択した。引き続き、この細胞を、実施例１．６からのプラスミドｐＭＥ−ＲＤＬ２ａで形質転換し、生じた形質転換体を、クロラムフェニコール２０ｍｇ／ｌ＋ストレプトマイシン１００ｍｇ／ｌで選択した。生じた菌株を、ＥＣＭ２／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａとした。
【０１６３】
１．８  Ｌ−メチオニン耐性変異体のスクリーニング及びシークエンシング
Ｌ−メチオニン耐性変異体の選択のために、菌株ＥＣＭ２／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａから、前培養を、Ｌ−メチオニン（Merck, Frankfurt、ドイツ国）７５ｇ／ｌを有するＰＣ１−最少培地プレート（表１、寒天１４ｇ／ｌ）上に平板培養した。前培養として、前培養基（グルコース２．５ｇ／ｌを有するＬＢ培地１０％及び最少培地ＰＣ１  ９０％）１０ｍｌに細胞培養１００μｌを接種し、３７℃で１０時間培養した。
【０１６４】
表１：最少培地ＰＣ１
【表１】
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【０１６５】
５日間のインキュベーションの後に、Ｌ−メチオニン耐性変異体の単一コロニーをプレートから単離できた。
【０１６６】
シークエンシングの準備のために、抗生物質不含のＬＢ培地中で約６世代増殖させた後に、プラスミドｐＣＣ３及びｐＭＥ−ＲＤＬ２ａをもはや有していない、菌株ＥＣＭ２／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａのＬ−メチオニン耐性変異体の誘導体を単離した。得られた菌株はストレプトマイシン及びクロラムフェニコールに感受性である。
【０１６７】
８つの変異体から、染色体ＤＮＡを単離した。このＤＮＡは、全体ゲノム配列決定（GATC, Konstanz、ドイツ国）のために使用した。
【０１６８】
出発菌株のＥＣＭ２と比較して、最終的にｐｒｏＰ遺伝子中で複数の突然変異が示された。次の表２中に、これらの突然変異が列挙されている。ｐｒｏＰ対立遺伝子の配列は、SEQ ID No:9〜SEQ ID No:24に示されている。
【０１６９】
表２：
【表２】
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【０１７０】
菌株ＤＭ２３２１、ＤＭ２３３３、ＤＭ２３２３、ＤＭ２３２４、ＤＭ２３２５、ＤＭ２３２６、ＤＭ２３２７及びＤＭ２３２８を、ブダペスト条約に従って２０１１年８月２３日に、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse 7 B, 38124 Braunschweig、ドイツ国）に、ＤＳＭ番号ＤＳＭ２５０９５（＝ＤＭ２３２１）、２５０９６（＝ＤＭ２３２２）、２５０９７（＝ＤＭ２３２３）、２５０９８（＝ＤＭ２３２４）、２５０９９（＝ＤＭ２３２５）、２５１００（＝ＤＭ２３２６）、２５１０１（＝ＤＭ２３２７）及び２５１０２（＝ＤＭ２３２８）で寄託した。
【０１７１】
実施例２
Ｌ−メチオニン耐性ｐｒｏＰ変異体の活性検出
ｐｒｏＰ変異体のｐｒｏＰ活性の決定のために、例示的に、出発菌株ＥＣＭ２と比較した菌株ＤＭ２３２８のプロリン吸収を分析した。このために、前培養１  １０ｍｌを、ＬＢ培地中で３７℃で１日にわたり振盪させてインキュベーションした。この前培養１ｍｌをＭ９培地２０ｍｌ中に前培養２として移し、一晩中培養した。前培養２を、０．２のＯＤ６００で、新鮮なＭ９培地５０ｍｌ中に接種した。この細胞を更に３〜４時間培養し、引き続き氷冷したＭ９緩衝液で３回洗浄し、２のＯＤ６００に調節し、氷上で保管した。
【０１７２】
プロリン吸収を、放射線標識された［１４Ｃ（Ｕ）］Ｌ−プロリン（比活性：１．８５ＭＢｑ；Hartman Analytic、ドイツ国）により決定した。その都度細胞懸濁液２．３ｍｌを、このために撹拌容器中に注ぎ込み、３７℃で２分間でグルコース１０ｍＭの添加によりエネルギー供給した。撹拌しながら、この輸送測定を、２４．５ｍＭの濃度を有するＬ−［１４Ｃ］−プロリン２０μｌの添加により開始した。多様な時点（０、１５、３０、４５、６０、７５、９０、１０５及び１２０ｓ）で、それぞれ２００μｌを取り出し、ガラス繊維フィルタ（ミリポア）上にピペットで移した。真空多重濾過装置により、周囲の培地を吸い取り、次いで細胞を０．１Ｍ  ＬｉＣｌ溶液２．５ｍｌで２回洗浄した。このフィルタにシンチレーション液（Roth, Karlsruhe、ドイツ国）３．８ｍｌを添加し、この放射能をシンチレーションカウンタ（LS 6500, Beckman Instruments, Muenchen、ドイツ国）を用いて測定した。反応バッチ中の全放射能を、濾過なしで試料を直接測定することにより決定した。全ての試料について、壊変毎分（ｄｐｍ）を測定した。この吸収放射能は、ｎｍｏｌ／ｍｉｎ（ｍｇ  ＴＧ）（０．３６＝大腸菌の乾燥質量関数［ｍｇ／ｍｌ  ＯＤ＝１］）で計算した。この吸収速度論の線形部分から、輸送速度をｎｍｏｌ／ｍｇ*ｍｉｎで導き出すことができた。次の表３中に、３つの並行する測定からの平均値が示されている。
【０１７３】
表３：
【表３】
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【０１７４】
実施例３
生産プラスミドによる菌株ＤＭ２３２１、ＤＭ２３２２、ＤＭ２３２３、ＤＭ２３２４、ＤＭ２３２５、ＤＭ２３２６、ＤＭ２３２７及びＤＭ２３２８の形質転換
菌株ＤＭ２３２１、ＤＭ２３２２、ＤＭ２３２３、ＤＭ２３２４、ＤＭ２３２５、ＤＭ２３２６、ＤＭ２３２７及びＤＭ２３２８を、実施例１．５からの生産プラスミドｐＣＣ３で形質転換し、この形質転換体をクロラムフェニコール２０ｍｇ／ｌで選択した。引き続き、この細胞を、実施例１．６からのプラスミドｐＭＥ−ＲＤＬ２ａで形質転換し、生じた形質転換体を、クロラムフェニコール２０ｍｇ／ｌ及びストレプトマイシン１００ｍｇ／ｌで選択した。生じる菌株を、ＤＭ２３２１／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａ、ＤＭ２３２２／ｐＣＣ／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａ、ＤＭ２３２３／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａ、ＤＭ２３２４／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａ、ＤＭ２３２５／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａ、ＤＭ２３２６／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａ、ＤＭ２３２７／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａ及びＤＭ２３２８／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａとした。
【０１７５】
実施例４
振盪フラスコ試験での能力試験
大腸菌Ｌ−メチオニン生産菌株の能力は、１００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中での生産試験により評価した。前培養として、それぞれ前培養基（グルコース２．５ｇ／ｌを有するＬＢ培地１０％及び最少培地ＰＣ１  ９０％）１０ｍｌに細胞培養１００μｌを接種し、３７℃で１０時間培養した。これと共に、引き続き、ＰＣ１−ミネラル培地（実施例１中の表１参照）１０ｍｌ毎に、０．２のＯＤ６００（Eppendorf Bio-Photometer; Eppendorf AG, Hamburg、ドイツ国）で接種し、３７℃で２４時間培養した。細胞外のＬ−メチオニン濃度は、アミノ酸分析装置（Sykam GmbH, Eresing、ドイツ国）で、イオン交換クロマトグラフィー及びニンヒドリン検出を用いたポストカラム誘導化によって測定した。細胞外のグルコース濃度は、YSI 2700 Select Glucose Analyzer（YSI Life Sciences, Yellow Springs, Ohio, USA）を用いて測定した。この結果は、表４中に示されている。２４時間後に、グルコースは両方の培地中で完全に消費されていた。
【０１７６】
表４：試験した大腸菌株の発酵ブロス中でのＬ−メチオニン濃度
【表４】
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【０１７７】
実施例５
Ｍ８、Ｍ４及びＭ６からのｐｒｏＰ対立遺伝子をプラスミドｐＭＡＫ７０５中へクローニング
ＤＭ２３２１からのｐｒｏＰ対立遺伝子Ｍ８、ＤＭ２３２３からのＭ４、ＤＭ２３２６からのＭ６を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて増幅し、引き続きプラスミドｐＭＡＫ７０５中へクローニングした。
【０１７８】
ｐｒｏＰ対立遺伝子について得られた配列（実施例１参照）を基礎として、それぞれの突然変異を有する断片をそれぞれ増幅できるプライマーペアをデザインした。引き続きこれをプラスミドｐＭＡＫ７０５（Hamilton CM, Aldea M, Washburn BK, Babitzke P, Kushner SR (1989); J Bacteriol.; 171(9): 4617-4622）中へクローニングすることができる。
【０１７９】
ＰＣＲプライマーのｐｒｏＰｍｕｔ１（ＮｏｔＩ）は、５′末端に制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩに対する認識配列に続いて、４つのランダムなヌクレオチドを有する。
【０１８０】
ＰＣＲプライマーのｐｒｏＰｍｕｔ２（ＢａｍＨＩ）は、５′末端に制限エンドヌクレアーゼＢａｍＨＩに対する認識配列に続いて、４つのランダムなヌクレオチドを有する。
【０１８１】
ｐｒｏＰｍｕｔ１（ＮｏｔＩ）のヌクレオチド１３〜３２は、位置４３２８８００〜４３２８８１９の大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中に結合する。ｐｒｏＰｍｕｔ２（ＮｏｔＩ）のヌクレオチド１３〜３７は、位置４３３０３０３〜４３３０３２２の大腸菌ＭＧ１６５５ゲノム中に結合する。
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【０１８２】
鋳型として、菌株ＤＭ２３２１、ＤＭ２３２３及びＤＭ２３２８のゲノムＤＮＡを利用した（実施例１参照）。
【０１８３】
それぞれ遺伝子ｐｒｏＰ中に相応する突然変異を有する断片を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の適用下でPhusion  ＤＮＡポリメラーゼ（Finnzymes Oy, Espoo、フィンランド国）を用いて増幅した。突然変異Ｅ４１２*を有するＤＭ２３２１からの断片（ｐｒｏＰ−Ｍ８を有する）は、１５６４ｂｐのサイズを有していた（SEQ ID NO: 35）。ヌクレオチド位置８５４の下流に「Ａ」の欠失を有するＤＭ２３２３からの断片（ｐｒｏＰ−Ｍ４を有する）は、１５４２ｂｐのサイズを有していた（SEQ ID NO:36）。ヌクレオチド位置９７３の下流に１９ｂｐの挿入を有するＤＭ２３２６からの断片（ｐｒｏＰ−Ｍ６を有する）は、１５６３ｂｐのサイズを有していた（SEQ ID No:37）。
【０１８４】
全ての３つの断片を、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し、QIAquik PCR Purificationキット（Qiagen, Hilden、ドイツ国）を用いて精製した。引き続き、これらの断片をプラスミドｐＭＡＫ７０５とライゲーションするために使用した。
【０１８５】
プラスミドｐＭＡＫ７０５を、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで切断し、アルカリホスファターゼ（Alkaline Phosphatase, Calf Intestinal, New England Biolabs社, Frankfurt a.M.）で脱リン酸化しかつQIAquick PCR Purificationキット（Qiagen社, Hilden）で精製した。引き続き、このプラスミドをそれぞれのｐｒｏＰ断片と混合し、Quick DNAリガーゼ（New England BioLabs, Frankfurt、ドイツ国）でライゲーションした。このライゲーションバッチを、大腸菌ＤＨ５α（Grant et al.; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649）中へ形質転換した。正確なプラスミドクローンを、クロラムフェニコール２０ｍｇ／ｌで選択し、制限切断及び引き続く挿入物の配列決定によって同定した。こうして得られたプラスミドを、ｐＭＡＫ＿ｐｒｏＰ−Ｍ４、ｐＭＡＫ＿ｐｒｏＰ−Ｍ６及びｐＭＡＫ＿ｐｒｏＰ−Ｍ８とした。例示的にｐＭＡＫ＿ｐｒｏＰ−Ｍ８が図３中に示されている。
【０１８６】
実施例６
大腸菌株ＥＣＭ２中のｐｒｏＰ遺伝子の突然変異生成
Ｌ−メチオニン生産大腸菌株ＥＣＭ２（実施例１参照）中で、染色体ｐｒｏＰ野生型対立遺伝子を、それぞれメチオニン耐性を媒介するｐｒｏＰ対立遺伝子Ｍ４、Ｍ６及びＭ８と交換した。このために、菌株をエレクトロポレーションによって、それぞれプラスミドｐＭＡＫ＿ｐｒｏＰ−Ｍ４、ｐＭＡＫ＿ｐｒｏＰ−Ｍ６及びｐＭＡＫ＿ｐｒｏＰ−Ｍ８（実施例５参照）で形質転換した。これらのｐＭＡＫプラスミドは、クロラムフェニコール耐性及び温度敏感性の増幅起点を有する。このプラスミドは、大腸菌により３０℃で増幅するが、４４℃では増幅しない。形質転換バッチを、それぞれクロラムフェニコール２０ｍｇ／ｌを有するＬＢ寒天培地で平板培養し、かつ３０℃で１〜４０時間インキュベーションした。引き続き、接種用ループで細胞を採取し、ＬＢ培地に再懸濁させ、ＬＢ培地で１００００倍に希釈した。この希釈物１００μｌを、クロラムフェニコール２０ｍｇ／ｌを有するＬＢ寒天培地上で平板培養し、かつ４４℃で更に２４時間インキュベーションした。それにより、プラスミドｐＭＡＫ＿ｐｒｏＰ−Ｍ４、ｐＭＡＫ＿ｐｒｏＰ−Ｍ６又はｐＭＡＫ＿ｐｒｏＰ−Ｍ８がそれぞれ染色体に組み込まれていたコロニーが選択された。このコロニーのそれぞれ１つを、クロラムフェニコール２０ｍｇ／ｌを有するＬＢ寒天培地上で、接種用ループで取り、４４℃で２４時間インキュベーションした。導入された突然変異の検出を、次のプライマーペア（実施例１１参照）を用いる標準ＰＣＲ法（Innis et al. (1990) PCR Pro-tocols. A guide to methods and applications, Academic Press）によって行った。
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【０１８７】
その都度生じるＰＣＲ産物を、両方のプライマーと共にＧＡＴＣ（Konstanz、ドイツ国）で配列決定した。３つの全てのｐｒｏＰ対立遺伝子は、それぞれ大腸菌株ＥＣＭ２中へ転写することができ、生じる菌株を、ＥＣＭ２＿ｐｒｏＰ−Ｍ４、ＥＣＭ２＿ｐｒｏＰ−Ｍ６及びＥＣＭ２＿ｐｒｏＰ−Ｍ８とした。
【０１８８】
実施例７
菌株ＥＣＭ２＿ｐｒｏＰ−Ｍ４、ＥＣＭ２＿ｐｒｏＰ−Ｍ６及びＥＣＭ２＿ｐｒｏＰ−Ｍ８を生産プラスミドで形質転換
菌株ＥＣＭ２＿ｐｒｏＰ−Ｍ４、ＥＣＭ２＿ｐｒｏＰ−Ｍ６及びＥＣＭ２＿ｐｒｏＰ−Ｍ８を、実施例１．５からの生産プラスミドｐＣＣ３で形質転換し、この形質転換体をクロラムフェニコール２０ｍｇ／ｌで選択した。引き続き、この細胞を、実施例１．６からのプラスミドｐＭＥ−ＲＤＬ２ａで形質転換し、生じた形質転換体を、クロラムフェニコール２０ｍｇ／ｌ及びストレプトマイシン１００ｍｇ／ｌで選択した。生じる菌株を、ＥＣＭ２＿ｐｒｏＰ−Ｍ４／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａ、ＥＣＭ２＿ｐｒｏＰ−Ｍ６／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａ及びＥＣＭ２＿ｐｒｏＰ−Ｍ８／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａとした。
【０１８９】
実施例８
振盪フラスコ試験での能力試験
大腸菌Ｌ−メチオニン生産菌株ＥＣＭ２＿ｐｒｏＰ−Ｍ４／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａ、ＥＣＭ２＿ｐｒｏＰ−Ｍ６／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａ及びＥＣＭ２＿ｐｒｏＰ−Ｍ８／ｐＣＣ３／ｐＭＥ−ＲＤＬ２ａの能力を、１００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ中で生産試験により評価した。前培養として、それぞれ前培養基（グルコース２．５ｇ／ｌを有するＬＢ培地１０％及び最少培地ＰＣ１  ９０％）１０ｍｌに細胞培養１００μｌを接種し、３７℃で１０時間培養した。これと共に、引き続き、ＰＣ１−ミネラル培地（実施例１中の表１参照）１０ｍｌ毎に、０．２のＯＤ６００（Eppendorf Bio-Photometer; Eppendorf AG, Hamburg、ドイツ国）で接種し、３７℃で２４時間培養した。細胞外のＬ−メチオニン濃度は、アミノ酸分析装置（Sykam GmbH, Eresing、ドイツ国）で、イオン交換クロマトグラフィー及びニンヒドリン検出を用いたポストカラム誘導化によって決定した。細胞外のグルコース濃度は、YSI 2700 Select Glucose Analyzer（YSI Life Sciences, Yellow Springs, Ohio, USA）を用いて決定した。この結果は、表５中に示されている。２４時間後に、グルコースは両方の培地中で完全に消費されていた。
【０１９０】
表５：試験した大腸菌株の発酵ブロス中でのＬ−メチオニン濃度
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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