(57)【要約】本発明は液体媒体中で複数の易変形性物、例えば生物学的細胞やＤＮＡ等の生物学的超分子、を、流体力学的流れを組み合わせた電気泳動技術の手段により分離する方法に関するものであり、該方法は、流れの軸（１４）と前記流れの軸（１４）に直交する断面とを有し、前記断面の最小寸法が５０ｐｍ以下であるチャネル（１）に、易変形性物を導入する工程；及び、前記チャネル（１）中に電場を印加すると共に前記チャネル（１）中に流体力学的流れを与えて、前記易変形性物を前記流れの軸（１４）に沿って前記チャネル（１）中で移動させ、前記流れの軸（１４）に沿って分離させる工程を含む。本発明はさらに、この方法の実施に適したデバイスにも関する。電気泳動分離に使用される電解液は粘弾性を有する非ニュートン流体であり得る。
2015523095.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
流れの軸（１４）と前記流れの軸（１４）に直交する断面とを有し、前記断面の最小寸法が５０μｍ以下であるチャネル（１）に、易変形性物を導入する工程；及び
前記チャネル（１）中に電場を印加すると共に前記チャネル（１）中に流体力学的流れを与えて、前記易変形性物を前記流れの軸（１４）に沿って前記チャネル（１）中で移動させ、前記流れの軸（１４）に沿って分離させる工程
を含む、液体媒体中で複数の易変形性物を分離する方法。
【請求項２】
前記易変形性物の導入が、前記チャネル（１）の導入ゾーン（９）中で行われ、前記易変形性物の移動が、前記導入ゾーン（９）から前記チャネル（１）の検出ゾーン（８）へと行われ、前記方法が更に、
前記検出ゾーン（８）に到達した易変形性物を検出する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記チャネル（１）の最小寸法が２５μｍ以下、１５μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下、又は２μｍ以下であり；かつ／又は
前記断面の最小寸法と前記最小寸法の方向に直交する方向における前記断面の寸法との比率が１／１０以下、好ましくは１／１５以下、更により好ましくは１／２０以下であり；かつ／又は
前記チャネル（１）の前記導入ゾーン（９）と前記検出ゾーン（８）との距離が５００μｍ〜２０ｃｍ、好ましくは１ｍｍ〜１０ｃｍ、更により好ましくは２ｍｍ〜１ｃｍである、
請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記液体媒体が非ニュートン流体である、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記液体媒体の粘度が、１〜１００ｃＰ、好ましくは１〜２０ｃＰ、更により好ましくは２〜１０ｃＰである、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記液体媒体が、ポリビニルピロリドン、ポリ（エチレングリコール）、ポリアクリルアミド、及びその混合物から選択されることが好ましい非荷電重合体を含む、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記非荷電重合体が０．１〜１０％、好ましくは０．５〜５％、更により好ましくは１〜４％の質量濃度で存在する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記非荷電重合体の平均分子量が１０〜１００，０００ｋＤａ、好ましくは５０〜１０，０００ｋＤａ、更により好ましくは１００〜１０００ｋＤａである、請求項６又は請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記易変形性物の弾性率が１０９Ｐａ以下、１０６Ｐａ以下、又は１０３Ｐａ以下である、請求項１〜請求項８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記易変形性物が、分子及び細胞から選択され、前記分子が好ましくは、核酸分子、特に一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、及びＲＮＡ分子、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、及び他の重合体から特に選択される、重合体分子である、請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
印加される前記電場は１０Ｖ／ｍ〜１０，０００Ｖ／ｍ、好ましくは１００Ｖ／ｍ〜５０００Ｖ／ｍ、更により好ましくは２００Ｖ／ｍ〜１０００Ｖ／ｍであり；かつ／又は
前記流体力学的流れは、平均速度が１〜１０，０００μｍ／ｓ、好ましくは５〜５０００μｍ／ｓ、更により好ましくは１０〜１０００μｍ／ｓであることを特徴とする、
請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
流れの軸（１４）と前記流れの軸（１４）に直交する断面とを有し、前記断面の最小寸法が５０μｍ以下であり、非ニュートン液体媒体が充填されている、チャネル（１）；
前記チャネル（１）中に流体力学的流れを与えるための手段（１３ａ、１３ｂ）；及び
前記チャネル（１）中に電場を印加するための手段（１０ａ、１０ｂ）
を含む、液体媒体中で易変形性物を分離するためのデバイス。
【請求項１３】
前記液体媒体の粘度が１〜１００ｃＰ、好ましくは２〜２０ｃＰ、更により好ましくは２〜１０ｃＰである、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
前記液体媒体が、ポリビニルピロリドン、ポリ（エチレングリコール）、ポリアクリルアミド、及びその混合物から選択されることが好ましい非荷電重合体を含む、請求項１２又は請求項１３に記載のデバイス。
【請求項１５】
前記非荷電重合体が、０．１〜１０％、好ましくは０．５〜５％、更により好ましくは１〜４％の質量濃度で存在する、請求項１４に記載のデバイス。
【請求項１６】
前記非荷電重合体の平均分子量が１０〜１００，０００ｋＤａ、好ましくは５０〜１０，０００ｋＤａ、更により好ましくは１００〜１０００ｋＤａである、請求項１４又は請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
流れの軸と前記流れの軸に直交する断面とをそれぞれが有し、前記断面の最小寸法が５０μｍ以下であり、非ニュートン液体媒体が充填されている、複数のチャネル；
前記チャネル中に流体力学的流れを与えるための手段；及び
前記チャネル中に電場を印加するための手段
を含む、請求項１２〜請求項１６のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１８】
前記チャネルが毛細管の内腔であるか、または
前記複数のチャネルが、平行に配置されていることが好ましい、毛細管の内腔である、
請求項１２〜請求項１７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１９】
前記流れの軸（１４）に沿って間隔をおいて並べられた、前記チャネル（１）中の導入ゾーン（９）及び検出ゾーン（８）；
前記検出ゾーン（８）に到達した易変形性物を検出するための手段
を含む、請求項１２〜請求項１８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２０】
前記チャネル（１）の最小寸法が２５μｍ以下、１５μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下、又は２μｍ以下であり；かつ／又は
前記断面の最小寸法と前記断面の前記最小寸法の方向に直交する方向における寸法との比率が１／１０以下、好ましくは１／１５以下、更により好ましくは１／２０以下であり；かつ／又は
前記チャネル（１）の前記導入ゾーン（９）と前記検出ゾーンとの距離が５００μｍ〜２０ｃｍ、好ましくは１ｍｍ〜１０ｃｍ、更により好ましくは２ｍｍ〜１ｃｍである、
請求項１２〜請求項１９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２１】
前記チャネル（１）の前記導入ゾーン（９）が、前記チャネル（１）と付加的チャネル（２）との交差部によって形成され、前記デバイスが、前記易変形性物（３）を前記付加的チャネル（２）中に運び込むための手段と、前記付加的チャネル（２）中に電場を印加するための手段（１１ａ、１１ｂ）及び／又は前記付加的チャネル（２）中に流体力学的流れを与えるための手段（１２ａ、１２ｂ）を含むことが好ましい、前記易変形性物を前記交差部に向かって移動させる手段と、を含む、請求項１２〜請求項２０のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項２２】
分離された前記易変形性物を回収するための供給手段及び／又は化学的反応若しくは生化学的反応を行うデバイスの出口に連結された請求項１２〜請求項２１のいずれか一項に記載の分離デバイスを含むラブオンチップシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、溶液中で分子及び易変形性物（ｏｂｊｅｔｓ  ｄｅｆｏｒｍａｂｌｅｓ）を分離する方法並びにこの方法を行うことができるデバイスに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸及びタンパク質等の生体分子をサイズにより分離する方法は研究及び診断活動の基礎である。
【０００３】
通常、分離は電気泳動によって、すなわち電場の作用下での分子の移動によって行われる。電気泳動は通常、ゲル又は重合体溶液であり得るマトリックス中で行われる。
【０００４】
しかし、従来のゲル電気泳動は、大量の材料を必要とし、時間がかかり、大きな分子サイズ（例えば、４０又は５０ｋｂを超えるＤＮＡ分子）の分解能は限定的である。パルスフィールドの使用により、大サイズの分子の分解能力を改善することができるが、これは更に長い時間（１０時間超）かけて行われる。
【０００５】
毛細管中で行われる電気泳動は従来のゲル電気泳動より迅速かつ効果的である。しかし、毛細管へのマトリックスの導入が問題である。ｉｎ  ｓｉｔｕにおけるゲルの架橋を再現することは困難であり、また高粘度の重合体溶液を使用するので、管に充填するため及び管を空にするためには非常に高い圧力を加える必要がある。
【０００６】
したがって、分離マトリックスを用いずにサイズによって生体分子を分離する利用可能な方法があることが望ましい。
【０００７】
Anal. Chem. 75:3675-3680 (2003)中のZheng & Yeungによる"Mechanism for the separation of large molecules based on radial migration in capillary electrophoresis"というタイトルの論文は、放射状泳動（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｒａｄｉａｌｅ）という現象に基づく、分離マトリックスを用いずに内径７５μｍの毛細管中でＤＮＡを分離する技術を記載している。この現象は、流体力学的流れ及び電場を一緒に適用することにより、流体力学的流れ及び電場の相対的方向に応じてキャピラリーの中央に向かって又はその末端部に向かってＤＮＡ分子を移動させることにある。著者らは、放射状泳動の速度は分子のサイズに依存すると述べている。したがって、彼らは、交互方向の流体力学的流れの周期的適用と組み合わせた電気泳動による約４８ｋｂ及び５ｋｂの２分子のサイズによる分離を提唱している。一方、一定の電場及び一定の流体力学的流れを使用した場合、満足な分解能が得られない。
【０００８】
J. Am. Chem. Soc. 133:6898-6901 (2011)中のLiu et al.による"Single molecule analysis enables free solution hydrodynamic separation using yoctomole levels of DNA"というタイトルの論文は、内径が２μｍの毛細管中におけるマトリックスを用いない溶液中におけるサイズによるＤＮＡ分子の分離を記載しており、これは純粋に流体力学的なものである。
【０００９】
Anal. Chem. 79:8316-8322 (2007)中のPennathur et al.による"Free-solution oligonucleotide separation in nanoscale channels"という論文は、電場の作用下、分離マトリックスを用いない、ナノチャネル中における小サイズ（１０〜１００ｂｐ）のＤＮＡ分子の分離方法を記載している。著者らは、分子の泳動が、特に電気的二重層と分子との相互作用、立体障害、及びフルオレセイン基（小サイズの分子の電気泳動移動度を変える）を用いた末端標識の存在に依存すると説明している。
【００１０】
Trends in Analytical Chemistry, 35:122-134 (2012)中のWang et al.による"Resolving DNA in free solution"というレビューは、マトリックスを用いずにサイズによってＤＮＡを分離するための複数のアプローチを記載している。前述のZheng & Yeungの技術に加えて、このレビューは、分子の末端標識を用いた電気泳動（これはＤＮＡ分子の末端に電荷が付加されることを必要とする）、エントロピートラッピング（ｄｅ  ｐｉ／ｅｇｅａｇｅ  ｅｎｔｒｏｐｉｑｕｅ）、及びＤＮＡプリズム等の技術を記載している。
【００１１】
しかし、上記の方法は全て、比較的長い分離時間及び場合によっては非常に低い特殊な食塩水濃度の使用を必要とし、より一般的には実施が複雑であり、広い分子サイズ範囲の分解能が不十分であるという欠点がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、先行技術の方法より分離時間が短く、より簡便であり、実施に柔軟性がある、分離マトリックスを用いずに分子又は他の易変形性物を分離する方法の開発に対するニーズがある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、第１の態様では、液体媒体中で複数の分子又は易変形性物を分離する方法であって、
・チャネル中に分子又は易変形性物を導入する工程であって、チャネルが流れの軸（ａｘｅ  ｄ’／ｅｃｏｕｌｅｍｅｎｔ）と流れの軸に直交する断面とを有し、前記断面の最小寸法が２５μｍ以下である、工程；及び
・チャネル中に電場を印加すると共にチャネル中に流体力学的流れを与えて、分子又は易変形性物を流れの軸に従ってチャネル中で移動させ、流れの軸に沿って分離させる工程
を含む方法に関する。
【００１４】
「易変形性物（ｏｂｊｅｔｓ  ｄ／ｅｆｏｒｍａｂｌｅｓ）」とは、流体力学的流れ等の機械的ストレスの作用下で変形し得る、超分子集合体（ａｓｓｅｍｂｌａｇｅｓ  ｓｕｐｒａｍｏｌ／ｅｃｕｌａｉｒｅｓ）又は細胞若しくは細胞断片等の分子又は他のより複雑な物と理解される。好ましくは、変形能は易変形性物のヤング率によって測定され、ヤング率は１０９Ｐａ以下でなければならず、実施形態では１０８Ｐａ以下、１０７Ｐａ以下、１０６Ｐａ以下、１０５Ｐａ以下、１０４Ｐａ以下、又は１０３Ｐａ以下である。
【００１５】
ヤング率は、機械的接触によって、例えば原子間力顕微法によって測定することができる。
【００１６】
例えば、ＤＮＡのヤング率は典型的には約３００ＭＰａであり、哺乳動物細胞のヤング率は約０．１〜１００ｋＰａである。
【００１７】
本願の範囲内では、易変形性物は特に以下のものと見なされる：少なくとも１００（例えば少なくとも１０００）塩基又は塩基対のＤＮＡ又はＲＮＡ分子；少なくとも１００（例えば少なくとも２００）アミノ酸単位のペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質；及び細胞。
【００１８】
ある実施形態では、分子又は易変形性物の導入はチャネルの導入ゾーン中で行われ、分子又は易変形性物の移動はチャネルの導入ゾーンから検出ゾーンへと行われ、方法は更に、
・検出ゾーンに到達した分子又は易変形性物を検出する工程
を含む。
【００１９】
ある実施形態では、
・チャネルの最小寸法は１５μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下、又は２μｍ以下であり；かつ／又は
・断面の最小寸法と、最小寸法の方向に直交する方向における断面の寸法と、の比率は、１／１０以下、好ましくは１／１５以下、更により好ましくは１／２０以下であり；かつ／又は
・チャネルの導入ゾーンと検出ゾーンとの距離は５００μｍ〜２０ｃｍ、好ましくは１ｍｍ〜１０ｃｍ、更により好ましくは２ｍｍ〜１ｃｍである。
【００２０】
ある実施形態では、分子は、核酸分子、特に一本鎖ＤＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、及びＲＮＡ分子、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、他の重合体、炭水化物、脂質、代謝物質、及び医薬品化合物から選択される。分子は好ましくは重合体である。
【００２１】
ある実施形態では、易変形性物は、分子及び細胞から選択され、分子は、好ましくは、核酸分子、特に一本鎖ＤＮＡ分子、二本鎖ＤＮＡ分子、及びＲＮＡ分子、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質、重合体である炭水化物、及び他の重合体から選択される。
【００２２】
ある実施形態では：
・印加される電場は１０Ｖ／ｍ〜１０，０００Ｖ／ｍ、好ましくは１００Ｖ／ｍ〜５０００Ｖ／ｍ、更により好ましくは２００Ｖ／ｍ〜１０００Ｖ／ｍであり；かつ／又は
・チャネル中の流体力学的流れは、特に導入ゾーンと検出ゾーンとの間においては、平均速度が１〜１０，０００μｍ／ｓ、好ましくは５〜５０００μｍ／ｓ、更により好ましくは１０〜１０００μｍ／ｓであることを特徴とする。
【００２３】
ある実施形態では、分離に用いられる液体媒体は非ニュートン流体である。
【００２４】
「ニュートン流体」とは、かかる機械的ストレス（単位面積当たりの流体に作用する力）と流体の剪断との間に直線関係（すなわち、流体の速度勾配）がある流体を意味すると理解される。したがって、「非ニュートン流体」とはニュートン流体でない流体である。
【００２５】
例えば、本発明に係る非ニュートン流体は、剪断に応じた粘度係数を有し得るか（静止流体）、弾性の挙動を示し得る。ある実施形態では流体は粘弾性である。ある実施形態では、流体は、流体がさらされる振動の周波数ｗと共に増大する貯蔵剪断弾性率Ｇ’（ｗ）（実施例で定義される）を有する。ある実施形態では、流体は、閾値ｗ０より大きい振動周波数ｗで、損失剪断弾性率Ｇ’（ｗ）’（実施例で定義される）より大きい貯蔵剪断弾性率Ｇ’（ｗ）を有する。閾値ｗ０は、例えば０．０１Ｈｚ〜１０，０００Ｈｚ、特に０．１Ｈｚ〜１０００Ｈｚ、例えば１Ｈｚ〜１００Ｈｚであり得る。
【００２６】
ある実施形態では、液体媒体の粘度は周囲温度で１〜１００ｃＰ（センチポアズ）、好ましくは２〜２０ｃＰ、更により好ましくは２〜１０ｃＰである。特に断りのない限り、本願中で言及される粘度の値は静粘度の値である。
【００２７】
ある実施形態では、液体媒体は、ポリビニルピロリドン、ポリ（エチレングリコール）、ポリアクリルアミド、及びその混合物から選択されることが好ましい、非荷電重合体を含む。
【００２８】
「非荷電（ｎｏｎ  ｃｈａｒｇ／ｅ）」という用語は、問題の重合体の総静電荷が前述の液体媒体中で実質的にゼロであることを意味する。
【００２９】
そのような重合体が例えば水溶液中に存在することで、液体媒体を非ニュートン性（例えば粘弾性）にすることができる。
【００３０】
ある実施形態では、非荷電重合体は、０．１〜１０％、好ましくは０．５〜５％、更により好ましくは１〜４％の質量濃度で存在する。
【００３１】
好ましくは、非荷電重合体の濃度は、臨界被覆濃度（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｉｑｕｅ  ｄｅ  ｒｅｃｏｕｖｒｅｍｅｎｔ：重合体が接触し始める濃度）以上である。
【００３２】
ある実施形態では、非荷電重合体の（質量）平均分子量は１０〜１００，０００ｋＤａ、好ましくは５０〜１０，０００ｋＤａ、更により好ましくは〜１００〜１０００ｋＤａである。
【００３３】
本発明は更に、液体媒体中で分子又は易変形性物を分離するためのデバイスであって、
・流れの軸と流れの軸に直交する断面とを有するチャネルであって、前記断面の最小寸法が２５μｍ以下である、チャネル；
・チャネル中に流体力学的流れを与えるための手段；及び
・チャネル中に電場を印加するための手段
を備えたデバイスに関する。
【００３４】
好ましくは、チャネルには非ニュートン液体媒体が充填されている。
【００３５】
ある実施形態では、液体媒体の粘度は周囲温度で１〜１００ｃＰ、好ましくは２〜２０ｃＰ、更により好ましくは２〜１０ｃＰである。
【００３６】
ある実施形態では、液体媒体は、ポリビニルピロリドン、ポリ（エチレングリコール）、ポリアクリルアミド、及びその混合物から選択されることが好ましい、非荷電重合体を含む。
【００３７】
ある実施形態では、非荷電重合体は０．１〜１０％、好ましくは０．５〜５％、更により好ましくは１〜４％の質量濃度で存在する。
【００３８】
ある実施形態では、非荷電重合体の（質量）平均分子量は１０〜１００，０００ｋＤａ、好ましくは５０〜１０，０００ｋＤａ、更により好ましくは１００〜１０００ｋＤａである。
【００３９】
ある実施形態では、デバイスは、
・流れの軸（１４）と流れの軸（１４）に直交する断面とをそれぞれが有する複数のチャネル（１）であって、前記断面の最小寸法が２５μｍ以下であり、各チャネル（１）に非ニュートン液体媒体が充填されている、チャネル；
・チャネル（１）中に流体力学的流れを与えるための手段（１３ａ、１３ｂ）；及び
・チャネル（１）中に電場を印加するための手段（１０ａ、１０ｂ）
を備える。
【００４０】
ある実施形態では、チャネルは毛細管の内腔であり、あるいは、複数のチャネルは、平行に配置されていることが好ましい、毛細管の内腔である。
【００４１】
ある実施形態では、デバイスは、
・流れの軸に沿って間隔をおいて配置された、チャネル中の導入ゾーン及び検出ゾーン；
・検出ゾーンに到達した分子又は易変形性物を検出するための手段
を備える。
【００４２】
ある実施形態では、
・チャネルの最小寸法は１５μｍ以下、１０μｍ以下、５μｍ以下、又は２μｍ以下であり；かつ／又は
・断面の最小寸法と、最小寸法の方向と直交する方向における断面の寸法と、の比率は１／１０以下、好ましくは１／１５以下、更により好ましくは１／２０以下であり；かつ／又は
・チャネルの導入ゾーンと検出ゾーンとの距離は５００μｍ〜２０ｃｍ、好ましくは１ｍｍ〜１０ｃｍ、更により好ましくは２ｍｍ〜５ｃｍ、又は２ｍｍ〜１ｃｍである。
【００４３】
ある実施形態では、チャネルの導入ゾーンは、チャネルと付加的チャネル（ｃａｎａｌ  ｓｕｐｐｌ／ｅｍｅｎｔａｉｒｅ）との交差部によって形成され、デバイスは、分子又は易変形性物を付加的チャネル中に運び込むための手段と、付加的チャネル中に電場を印加するための手段及び／又は付加的チャネル中に流体力学的流れを与えるための手段を含むことが好ましい、分子又は易変形性物を交差部へと移動させるための手段と、を備える。
【００４４】
本発明は更に、化学的反応若しくは生化学的反応を行うデバイスの出口及び／又は分離された分子若しくは易変形性物を回収するための供給手段に連結された前述の分離デバイスを含むラブオンチップシステムに関する。
【００４５】
本発明により先行技術の欠点を克服することができる。より具体的には、本発明は、先行技術の方法より分離時間が短く、より簡便であり、実施に柔軟性がある、分離マトリックスを用いずに分子及び他の易変形性物を分離する方法を提供する。
【００４６】
これは、小さな寸法、特に２５μｍ未満のチャネル中で流体力学的流れの適用と共に電場を印加することによって実現される。
【００４７】
電場の値及び流体の平均速度（及び場合によりチャネルの寸法）を調節することにより、これらの条件は、大きく異なるサイズ範囲の分子及び他の易変形性物を良好な分解能で短時間に分離することを可能にする。
【００４８】
理論により限定されるものではないが、本発明者らは、本発明で行われる分子又は他の易変形性物の分離は、分子又は易変形性物への静電力と剪断力との複合的作用に基づくものであり、これにより、チャネルの最小寸法に従って分子又は易変形性物がそれらの各サイズに応じて異なる分布を生じ、そのため、チャネル中でのこれらの分子又は易変形性物の移動速度がそれらの各サイズに依存し、比較的中央位置にある分子又は易変形性物は、比較的中央から外れた位置の分子又は易変形性物より大きな流速にさらされると考えている。より具体的には、大サイズの分子は小サイズの分子よりチャネルの最小寸法に沿って中央位置から外れているので、小サイズの分子が大サイズの分子より速く検出ゾーンに移動することが観察されている。
【００４９】
理論により限定されるものではないが、本発明者らは更に、チャネル中の液体媒体が非ニュートン性である場合、さらされる剪断に依存する分子又は易変形性物の横断的泳動が容易化されることにより、分子又は他の易変形性物の分離が改善されると考えている。上記の本発明の主な特徴とは別に、本発明に係る方法及びデバイスは更に、以下の他の特徴の１つ又は複数を有し得る。ある実施形態では、分離対象である分子又は易変形性物は、分離に用いられる液体媒体中で全体として正の電荷を有する分子又は易変形性物である。
【００５０】
ある実施形態では、分離対象である分子又は易変形性物は、分離に用いられる液体媒体中で全体として負の電荷を有する分子又は易変形性物である。
【００５１】
ある実施形態では、分離対象である分子又は易変形性物は、分離に用いられる液体媒体中で同じ（又は実質的に同じ、例えば約５、１０、又は２０％以内まで）電気泳動移動度を有する。
【００５２】
ある実施形態では、電場、流体力学的流れ、及び液体分離媒体の組成は、チャネルの断面中で、特に断面の最小寸法に相当する方向で、分子又は易変形性物が不均一に分布するように選択及び適合化され；より具体的には、チャネルの断面の最小寸法に対応する方向においてチャネルの壁からチャネルの中央へと分子又は易変形性物の濃度が減少するように選択及び適合化される。
【００５３】
ある実施形態では、分離対象である分子又は易変形性物は生体分子である。
【００５４】
本発明の方法に供される分子又は易変形性物は一般的に、複数（すなわち、少なくとも２つ）の異なる種類の分子又は易変形性物を含み、各種の分子又は易変形性物は、単一の分子／易変形性物又は好ましくは複数（特に多数）の分子／易変形性物を含んでよい。本発明は、分子をその種類に従って分離することができ、又は易変形性物をその種類に従って分離することができる。
【００５５】
「分子の種類」とは、特に同じ又は同様の（特に、定義される値の範囲に属し、別の種類の分子の分子量又はサイズとは異なる）分子量又はサイズを有する分子を意味すると理解される。
【００５６】
特に、分子が重合体（例えば、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質等）である場合、「分子の種類」は一般的に、所与のサイズ又は所与の範囲内のサイズ（すなわち、塩基、塩基対、又はアミノ酸の数等の、単量体単位の数）を有する重合体の１つを意味するものと理解される。したがって、この場合、異なる種類の分子は異なるサイズ（又はサイズ範囲）に相当する。
【００５７】
細胞との関連における「易変形性物の種類」とは特に、同じ又は同様の（特に、定義される値の範囲に属し、別の種類の細胞の移動度又はサイズのものとは異なる）サイズ又は電場の作用下での移動度（又は表面電荷密度）を有する細胞を意味すると理解される。
【００５８】
したがって、易変形性物が細胞（例えば線維芽細胞、骨芽細胞、内皮、又は上皮細胞等）である場合、「細胞の種類」は一般的に、同等又は同様の易変形性を有する細胞を意味すると理解される。
【００５９】
ある実施形態では、電場及び流体力学的流れは、導入ゾーンから検出ゾーンへの分子又は易変形性物の移動中、一定である。この実施形態は特に実施が簡便である。あるいは、分子又は易変形性物の移動中、流体力学的流れ及び／又は電場を、例えば周期的に、変化させることもできる。これにより、分離すべき特定の種類の分子又は易変形性物に特別に適応させた精巧なプログラムを定義することができる。
【００６０】
ある実施形態では、チャネル中に存在する液体媒体は、分離マトリックスを含まない溶液である。特に、その場合、ゲルは用いられず、液体媒体中に重合体は存在しない。但し、適切な場合、その上で分離が行われる重合体分子又は補助的機能を有する他の重合体（例えば、表面の不動態化、流体力学的相互作用のスクリーニング、又は液体媒体に望ましい非ニュートン特性を付与するポリビニルピロリドン等の重合体など）は例外である。
【００６１】
分離マトリックスは、事実上、分離操作中に前記マトリックスを動かさずに電場のみの作用下で電気泳動的分離の実施を可能にするゲル又は重合体溶液等の媒体である。
【００６２】
ある実施形態では、本発明の方法は、前述のチャネルを備えた分離デバイスに分子又は易変形性物を注入する工程を含む。好ましくは、注入工程は、体積が１ｍｌ以下、５００μｍ以下、３００μｌ以下、２００μｌ以下、又は１５０μｌ以下である液体試料を注入することを含む。
【００６３】
ある実施形態では、チャネル中の分子又は易変形性物の濃度は１０−１８〜１０−８ｍｏｌ／μｌ、１０−１８〜１０−１０ｍｏｌ／μｌ、１０−１７〜１０−１２ｍｏｌ／μｌ、又は１０−１６〜１０−１４ｍｏｌ／μｌである。
【００６４】
ある実施形態では、チャネルの壁は、分離対象である分子又は易変形性物とこれらの壁との間の相互作用を低減又は防止するように適合化されているコーティングを有する。このコーティングは、壁に化学的にグラフトされてもよく、導入される溶液によって提供されてもよい。好ましくは、コーティングは、ポリビニルピロリドン、ポリ（エチレングリコール）、ポリアクリルアミド等の合成重合体又はウシアルブミン若しくは卵アルブミン等の生物学的重合体から選択される。
【００６５】
したがって、本発明の方法は、チャネルの壁にコーティングを形成するために溶液をチャネルに注入する予備的工程及びその後チャネルをすすぐ工程を含み得る。
【００６６】
あるいは、コーティングを提供する重合体は、分離対象である分子又は易変形性物を含む液体媒体中に直接含まれてもよい。
【００６７】
換言すると、前述したように、分離の実施に非荷電重合体を含む液体媒体が用いられる場合、これらの非荷電重合体は、分離対象である分子又は易変形性物と壁との間の相互作用を防止する機能も発揮する。
【００６８】
検出ゾーンにおける分子又は易変形性物の検出は特に以下によって行われ得る：
・検出ゾーンを照らして、光検出器を用いて蛍光シグナルを検出すること；
・検出ゾーンを照らして、目的の分子又は目的の易変形性物の特異的波長（例えば、タンパク質では２８０ｎｍ、ＤＮＡでは２６０ｎｍ）における吸光シグナルを検出すること；
・検出ゾーンに電気化学的プローブを配置し、電気的検出器を用いてインピーダンスの変動を検出すること；又は
・光検出器を用いて、検出ゾーンの前を易変形性物が通過することに伴う光シグナルの変動を検出すること。
【００６９】
適切な場合、本発明に係る方法は、分子又は易変形性物をフルオロフォア等の着色剤と接触させる予備的工程を含む。
【００７０】
ある実施形態では、本発明に係る方法は、様々な時点で、検出ゾーンで（例えば光検出器を用いて）、個々の分子又は個々の易変形性物を検出することを含む。あるいは（又は組み合せて）、本発明に係る方法は、様々な時点で検出ゾーンで分子又は易変形性物の濃度を測定することを含む。
【００７１】
ある実施形態では、流体力学的流れは層流タイプである。
【００７２】
ある実施形態では、チャネル中の電場は、分子又は易変形性物の移動に抵抗する傾向がある。
【００７３】
ある実施形態では、チャネルはその内壁に構造を有さない。
【００７４】
ある実施形態では、チャネルの断面は流れの軸に沿って一定であり、好ましくは、チャネルの断面は実質的に長方形である。
【００７５】
ある実施形態では、チャネルは流れの軸に沿って一直線である。あるいは、チャネルは、湾曲部によって連結された直線部分を含んでよく、その場合、流れの軸は実質的に折れ線である。あるいは、チャネルは、流れの軸に沿って湾曲していてもよく、例えば、流れの軸は円弧、らせんの一部等であり得る。
【００７６】
いくつかの変形例では、チャネルは１又は複数の枝分かれを含み得る。
【００７７】
ある実施形態では、前述した断面の最小寸法はチャネルの高さ（垂直方向の寸法に従う）である。
【００７８】
ある実施形態では、チャネルの高さは２５μｍ以下、２０μｍ以下、１５μｍ以下、１０μｍ以下、８μｍ以下、７μｍ以下、６μｍ以下、５μｍ以下、４μｍ以下、３μｍ以下、２μｍ以下、１μｍ以下、又は８００ｎｍ以下である。
【００７９】
ある実施形態では、直交する方向の断面の寸法はチャネルの幅である。
【００８０】
ある実施形態では、断面の最小寸法は、液体媒体中で分離される分子又は易変形性物の最大サイズ又は平均サイズに応じて選択される。
【００８１】
ある実施形態では、この最小寸法は１００ｎｍ以上、２００ｎｍ以上、３００ｎｍ以上、又は５００ｎｍ以上である。したがって、好ましくは、本発明に係る分離方法は、壁の領域の大きな電荷作用に基づくものではない。
【００８２】
ある実施形態では、この最小寸法は、分離対象である分子もしくは易変形性物のうち最大である分子若しくは易変形性物の種類の、溶液中における最大寸法の；又は分離対象である分子若しくは易変形性物のうち最大である分子若しくは易変形性物の種類の、溶液中における最大寸法と、分離対象である分子若しくは易変形性物のうち最小である分子若しくは易変形性物の種類の、溶液中における最大寸法と、の平均の；２００倍以下、好ましくは１００倍以下、５０倍以下、又は２０倍以下である。
【００８３】
ある実施形態では、この最小寸法は、分離対象である分子のうち最大である分子の種類の回転半径の；又は分離対象である分子のうち最大である分子の種類の回転半径と、分離対象である分子のうち最小である分子の種類の回転半径と、の平均の；２００倍以下、好ましくは１００倍以下、５０倍以下、又は２０倍以下である。分子がコイル型の形態を有する場合、回転半径から溶液中の分子の最大寸法が推定される。
【００８４】
例えば、良好な溶媒中で、サイズが数ｋｂ以上の二本鎖ＤＮＡ分子の場合、回転半径はＡ０×Ｎｖ（式中、Ｎは塩基対数、Ａ０は代表長さ（ｌｏｎｇｕｅｕｒ  ｃａｒａｃｔ／ｅｒｉｓｔｉｑｕｅ）、ｖは溶媒の性質に応じた指数（貧溶媒では約１／３、良溶媒では０．５〜０．６）である）である。
【００８５】
タンパク質の場合、回転半径又は流体力学的半径は一般的に、ｎｍで表した場合、球状タンパク質では約０．７５×Ｍ０．３３、変性タンパク質では０．１９×Ｍ０．５４であると見なされる（式中、Ｍは分子量を意味する）。
【００８６】
ある実施形態では、細胞を分離する場合、最小寸法は、分離対象である細胞のうち最大である細胞の種類の平均直径の；又は分離対象である細胞のうち最大である細胞の種類の平均直径と、分離対象である細胞のうち最小である細胞の種類の平均直径と、の平均の；２００倍以下、好ましくは１００倍以下、５０倍以下、又は２０倍以下である。異方性細胞の場合、平均直径は、細胞の最大寸法の平均値を意味する。
【００８７】
ある実施形態では、分離対象である分子若しくは易変形性物の一部又は分離対象である分子若しくは易変形性物の全部は、
・１００以下の数の塩基（もしくは塩基対）を含む；
・１００〜１０００の範囲の数の塩基（もしくは塩基対）を含む；
・１０００〜１０，０００の範囲の数の塩基（もしくは塩基対）を含む；
・１０，０００〜１００，０００の範囲の数の塩基（又は塩基対）を含む；
・１００，０００〜１，０００，０００の範囲の数の塩基（もしくは塩基対）を含む；
・１，０００，０００〜１０，０００，０００の範囲の数の塩基（もしくは塩基対）を含む；又は
・１０，０００，０００〜１００，０００，０００の範囲の数の塩基（もしくは塩基対）を含む
核酸分子である。
【００８８】
ある実施形態では、分離対象である分子又は易変形性物は、１０００超の塩基（若しくは塩基対）又は１０，０００超の塩基（もしくは塩基対）を含む核酸分子である。
【００８９】
ある実施形態では、分離対象である分子又は易変形性物はゲノム核酸分子である。この場合、好ましくは、チャネルの断面の最小寸法は５〜２５μｍ、特に５〜２０μｍであり、好ましくは１０〜１５μｍである。
【００９０】
ある実施形態では、分離対象である分子又は易変形性物は、５０，０００以下の塩基（又は塩基対）を含む核酸分子である。好ましくは、この場合、チャネルの断面の最小寸法は５μｍ以下、特に３μｍ以下、又は２μｍ以下である。
【００９１】
ある実施形態では、分離対象である分子又は易変形性物はタンパク質である。好ましくは、この場合、チャネルの断面の最小寸法は１μｍ以下、特に５００ｎｍ〜１μｍ、例えば６００ｎｍ〜８００ｎｍである。
【００９２】
ある実施形態では、チャネル中に流体力学的流れを印加するための手段は、流れの軸に対してチャネルの各末端に配置された２つの液体リザーバーを含み、前記リザーバーは圧力制御手段に連結されている。
【００９３】
例えば、その内容が参照により取り込まれる国際公開第２００４／１０３５６６号に記載されている圧力制御手段を用いることができる。
【００９４】
あるいは、Science (2000), vol. 288, no. 5463, pp. 113-116中のUnger et al.による論文"Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography"に記載されているようなバルブ及びポンプのシステムを用いることができる。
【００９５】
ある実施形態では、チャネル中に電場を印加するための手段は、流れの軸に対してチャネルの各末端に配置された２つの電極を含む。
【００９６】
ある実施形態では、付加的チャネル中に流体力学的流れを与えるための手段は、付加的チャネルの各末端に配置された２つの液体リザーバーを含み、前記リザーバーは圧力制御手段に連結されている。
【００９７】
ある実施形態では、付加的チャネル中に電場を印加するための手段は、付加的チャネルの各末端に配置された２つの電極を含む。
【００９８】
ある実施形態では、チャネルは支持体上に封止された超微細加工チップに組み込まれている。好ましくは、支持体は透明である。支持体は特にスライドガラスであり得る。超微細加工チップは特にガラス若しくはケイ素又は任意のその他実質的に非易変形性の材料（例えばプラスチック材料）でできていてよい。「実質的に非易変形性の」という表現は、流体力学的流れを与えるために通常用いられる圧力条件に関する。例えば、非易変形性の基準圧力は１０ｂａｒであり得る。
【００９９】
あるいは、チャネルは毛細管の内腔であり得る。この場合、チャネルの断面は好ましくは円形又は正方形であり、断面の最小寸法はそれぞれ、円形部分の直径又は正方形部分の一辺の寸法に対応する。
【０１００】
毛細管を使用することで、例えばElectrophoresis, 32(2):223-229 (2011)のRogers et al.による論文"Bundled capillary electrophoresis using microstructured fibres "に記載されているもののように、本発明に係るチャネルを毛細管の束の形態で容易に多重化することができる。この場合、流体力学的流れを与えるための手段及び電場を印加するための手段は、全ての毛細管に共通であってもよく、全ての毛細管で別個であってもよい。
【０１０１】
本発明のある代替的形態では、チャネルの断面の最小寸法は、前述した２５μｍ以下ではなく、２００μｍ以下、１００μｍ以下、７５μｍ以下、又は５０μｍ以下である。本説明の全体が必要な変更を加えて本発明のこの代替的形態に適用され、その場合、「２５μｍ以下の断面の最小寸法」という表現は「２００μｍ以下の断面の最小寸法」（又は考慮されている変形例に応じて１００μｍ以下、７５μｍ以下、若しくは５０μｍ以下）と置き換えられなければならない、と読者によって理解される。
【０１０２】
この代替的形態は、分離対象である易変形性物が大きなサイズのもの、例えば細胞である場合、特に適切である。好ましくは、この場合、チャネルの断面の最小寸法は１００μｍ以下、特に１０〜７５μｍ、特に２５〜５０μｍである。
【０１０３】
この代替的形態は、使用される液体媒体が（流体力学的流れの適用を容易にするため、すなわち、必要な圧力差を低減するために）高粘度である場合にも適切である。
【０１０４】
本発明の別の対象は、液体媒体中で易変形性物を分離するためのデバイスと組み合わされた（前述の）易変形性物を含むセット（又はキット）であって、分離デバイスが（その種々の変形例及び実施形態において）上記で説明したデバイスである、セットである。このセットの分離デバイスは、チャネル中に（分離に適した）液体媒体を含んでもよく、あるいは（チャネル中に液体媒体がなく）空であって単にこの液体媒体（好ましくは非ニュートン性）を受け入れることが意図されてもよい。
【０１０５】
本発明のもう１つの対象は、易変形性物の分離に適した液体媒体と組み合せた、液体媒体中で易変形性物を分離するためのデバイスを含むセット（又はキット）である。分離デバイスは（その種々の変形例及び実施形態で）前述した通りであり、このセットでは、デバイスは空（すなわち、液体分離媒体なし）で提供される。液体媒体は（その種々の変形例及び実施形態で）前述した通りであり、特に非ニュートン性であり得る。
【０１０６】
本発明のもう１つの対象は、液体媒体中で易変形性物を分離するためのデバイスの使用であって、デバイスが、
・流れの軸と流れの軸に直交する断面とを有するチャネルであって、前記断面の最小寸法が２５μｍ以下であるチャネル；
・チャネル中に流体力学的流れを与えるための手段：及び
・チャネル中に電場を印加するための手段
を含む、使用。
【０１０７】
本発明のこの他の対象の実施形態では、易変形性物は、本発明の前述の対象に関連して上記で説明した特徴を有し；かつ／又は分離デバイスは、本発明の前述の対象に関連して上記で説明した特徴を有し；かつ／又は液体媒体は、本発明の前述の対象に関連して上記で説明した特徴を有する（かつ特に非ニュートン性である）。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１】本発明に係るデバイスの一実施形態の平面模式図である。
【図２】上記デバイスの断面Ａ−Ａ（拡大）を模式的に示す図である。
【図３】分離中のチャネル中の流体力学的及び電気泳動的力場を模式的に示す図である。
【図４】種々の電場及び流体力学的流れの条件で本発明の方法を用いた５００〜１０，０００ｂｐのＤＮＡ分子の分離結果を示す図である（以下の実施例１参照）。ｘ軸は、泳動開始からの時間（分）を示し、ｙ軸は検出器によって受け取られた光強度を示す。比較のために、従来のゲル電気泳動による試験ＤＮＡ集団の分離も左下に示す。
【図５】図４に示した分離の３つをより詳細に示す図である。
【図６】個々の分子の可視化の可能性を更に示す、それらの分離の１つ（５００ｍｂａｒ及び３０Ｖ）及び各最大強度で得られた画像を示す図である。
【図７】種々の電位差（図中に記載）及び１００ｍｂａｒの固定された圧力差での４８，０００ｂｐの個々のＤＮＡ分子の速度分布を示す図である（実施例２参照）。分子の速度はｘ軸にμｍ／ｓで示されており、事象のパーセンテージはｙ軸に示されている。
【図８】実施例２で説明されている、高さ２μｍのチャネル中（左側）及び高さ１２μｍのチャネル中（右側）における４８，０００ｂｐの蛍光ＤＮＡ分子の空間的分布を示す図である。μｍで表した高度（高度０がチャネルの中央に相当）をｙ軸、測定された光強度（任意単位）をｘ軸に示す。チャネルの壁の位置を点線で示す。種々の泳動条件、すなわち：  ・高さ２μｍのチャネルでは、１５．４Ｖ／５０ｍｂａｒ；２３．５Ｖ／１２０ｍｂａｒ；２９．４Ｖ／２００ｍｂａｒ；及び４５Ｖ／６００ｍｂａｒの電位差／圧力差の組み合わせ；  ・高さ１２μｍのチャネルでは、１５Ｖ／１０ｍｂａｒ；５９Ｖ／５０ｍｂａｒ；８３Ｖ／１００ｍｂａｒ；及び１１４Ｖ／２００ｍｂａｒの電位差／圧力差の組み合わせ  で得られた結果を図の２つの部分に重ねた。
【図９】種々の電場及び媒体中のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）濃度条件で本発明の方法を用いた５００〜１０，０００ｂｐのＤＮＡ分子の分離結果を示す図である（以下の実施例３参照）。ｘ軸は泳動開始からの時間（秒）を示し、ｙ軸は検出器によって受け取られた光強度を示す。上のグラフは０．１％ＰＶＰ、中央のグラフは２％ＰＶＰ、下のグラフは４％ＰＶＰで得られた。
【図１０】図１０及び図１１は２％ＰＶＰを含む溶液の流体力学的挙動を示す図である。図１０中、Ｐａで表した複素弾性率の成分（Ｇ’及びＧ’’）はｙ軸に、Ｈｚで表した流体の反応頻度はｘ軸に示されている。
【図１１】図１１中、定常状態条件下の、Ｐａで表した粘度はｙ軸に、ｓ−１で表した剪断速度はｘ軸に示されている（実施例３参照）。
【発明を実施するための形態】
【０１０９】
以下に本発明を非限定的に更に詳細に説明する。
【０１１０】
特に断りのない限り、本願中に示されている濃度は質量濃度である。
【０１１１】
図１及び図２を参照して、本発明に係るデバイスは、スライドガラス又はプレートであり得る支持体１６と、本質的に公知の方法で支持体１６に封止された、ケイ素でできていてよい、凹部を有する構造１５（例えば超微細加工された構造）と、を含む。例えば、膜蒸着、フォトリソグラフィ、エッチング（化学的又はプラズマ）、及び接着結合の技術を用いることができる。膜蒸着は遠心、熱酸化、化学的又は物理的蒸着（ＣＶＤ及びＰＶＤ）、低圧ＣＶＤ、プラズマ増強ＣＶＤ、噴霧化等によって行うことができる。
【０１１２】
構造１５（凹部を有する）及び支持体１６によってチャネル１が画定される。チャネル１は断面が長方形である中空シリンダーの形態を有する。シリンダーの主軸は、チャネル１中の流れの軸１４である。流れの軸１４に垂直に、ｈで表される高さ及びＬで表される幅によってチャネル１の断面が画定される。高さｈは、断面の最小寸法に相当し（これは支持体１６と構造１５の凹部の底部との距離でもある）、幅Ｌは高さの方向と直交する方向の寸法に相当する。
【０１１３】
一般的に、使用中、高さｈは垂直方向に相当し、幅Ｌ及び流れの軸１４は水平面にある。
【０１１４】
ｈの値は、分離対象である分子又は易変形性物のサイズに応じて選択され得る。一般的に、チャネル１の高さに応じた剪断が分子又は易変形性物に作用する必要があり、それには、使用される液体媒体中の分子又は易変形性物の寸法がチャネル１の高さの２００分の１以上、１００分の１以上、５０分の１以上、又は２０分の１以上である必要がある。
【０１１５】
チャネル１の２つの末端にはそれぞれ第１のリザーバー４及び第２のリザーバー６が備えられている。リザーバー４、６はそれぞれ圧力制御手段１３ａ、１３ｂを備える。チャネル１中に電場を発生させることができるように、リザーバー４、６の中に電極１０ａ、１０ｂが浸漬している。
【０１１６】
付加的チャネル２がチャネル１と交差している（直交していてもしていなくてもよい）。付加的チャネル２はチャネル１と同様に形成される。チャネル１と付加的チャネル２との交差部は導入ゾーン９を画定する。
【０１１７】
付加的チャネル２もその末端に第１のリザーバー３及び第２のリザーバー５を備える。リザーバー３、５はそれぞれ圧力制御手段１２ａ、１２ｂを備える。必要に応じて、リザーバー３、５は更に、付加的チャネル２中に電場を発生させるようになっている各電極１１ａ、１１ｂを備える。
【０１１８】
使用中、チャネル１及び付加的チャネル２には、電気泳動に適した溶液が充填されている。付加的チャネル２の第１のリザーバー３を介して分析対象の分子又は易変形性物の試料がデバイスに導入される。付加的チャネル２中で生成した流体力学的流れにより、及び／又は付加的チャネル２中で生成した電場により、分析対象の分子又は易変形性物は、付加的チャネルに沿って第２のリザーバー５の方向に導入ゾーン９まで泳動する。
【０１１９】
この第１の泳動工程により、導入ゾーン９に存在する分子又は易変形性物の実際の分離を開始する前に、導入ゾーン９中における分析対象の分子又は易変形性物の濃度を均一にすることができる。
【０１２０】
第２段階では、泳動を中断し、次いで、分析対象の分子又は易変形性物をチャネル１中で流れの軸１４に沿って第１のリザーバー４から第２のリザーバー６へと泳動させる。そのために、（特に、第１のリザーバー４及び第２のリザーバー６の圧力制御手段１３ａ、１３ｂによって、）チャネル１中で流体力学的流れを生じさせる。
【０１２１】
共同して、リザーバー４、６中の各電極１１ａ、１１ｂを用いてチャネル１中で電場を発生させる。好ましくは、電場は、分離対象である分子又は易変形性物に、流体力学的流れとは反対方向にこれらを移動させる傾向がある静電力を印加するのに適している。したがって、電場の方向は、分離対象である分子又は易変形性物の全体的電荷の兆候によって決まる。
【０１２２】
図３（図の上部は平面図であり、下部は側面図である）について、分離中、分離中のチャネル１中の電気泳動力場１７は、チャネルの壁のすぐ近傍（寸法ｈ及びＬと比べて無視できる代表長さにわたる）を除いて、チャネル１の流れの軸１４（ｙ軸）、高さｈ（ｚ軸）、及び幅Ｌ（ｘ軸）の方向で実質的に均一である。
【０１２３】
流体力学的力場１８について、これは、チャネルの壁のすぐ近傍（寸法Ｌと比べて無視できる代表長さにわたる）を除いて、流れの軸１４（ｙ軸）の方向及び幅Ｌに沿って均一である。対照的に、これは高さｈ（ｚ軸）に沿っては均一でない。一般的に、これはポワズイユの法則に特徴的な放物線型のプロファイルを示す。
【０１２４】
チャネル１のアスペクト比Ｌ／ｈは、この形状の流体力学的力場が得られるように選択され、そのため、アスペクト比は通常、１０、１５、又は２０以上である。高さに沿っての流体力学的力場１８の非均一性は分子又は易変形性物の分離の有効性に重要である。幅Ｌに沿っての均一性のため、検出が一般的に検出ゾーン８で流れの軸に沿った所与の位置において（又は所与の間隔にわたり）行われ、幅Ｌに沿った信号を総計することによるものであれば、分解能の低下を回避することができる。
【０１２５】
所望の流体力学的流れのプロファイル（特に所与の流れ及び平均速度の値によって特徴付けられる）は、１又は複数の入り口リザーバーと１又は複数の出口リザーバーとの間に圧力差が生じるように各圧力制御手段１３ａ、１３ｂ（及び場合により１２ａ、１２ｂ）を作動させることによって得られる。例えば、導入ゾーン９から検出ゾーン８への分離対象である分子又は易変形性物の泳動を確実にする流体力学的流れを生じさせるために、リザーバー３、４、５とリザーバー６との間で圧力差を生じさせる。例えば、チャネルの配置を考慮して、０．０１〜１０ｂａｒ、好ましくは０．０５〜４ｂａｒ、更により好ましくは０．１〜１ｂａｒの圧力差により、所望の流体力学的流れのプロファイルを得ることができる。
【０１２６】
２つのチャネル１、２中の流れを互いに独立させるバルブシステムを設けてもよい。
【０１２７】
検出手段は図示されていない。それらは、支持体１６のチャネル１とは反対の側にある顕微鏡対物レンズ及びそれに連結された検出器、例えばＣＣＤカメラを含み得る。このようにして、個々の分子又は個々の易変形性物を、取得された画像上で検出することができ、時間の関数としての検出ゾーン８又はその一部における全体的強度の測定を行うことができる。
【０１２８】
測定値を分析するため及び得られたデータを提示するための手段がこのデバイスに連結され得る。
【０１２９】
デバイスは更に、例えば前述したものと同様の別のチャネル、リザーバー、及び／又は電極を含む、ラブオンチップに組み込まれてもよい。例えば、ラブオンチップは、本発明に係る分離デバイスが下流に接続された化学的反応又は生化学的反応を行うデバイスを備え得る。したがって、本発明に係る分離方法の実施は、ラブオンチップ上で行われた化学的又は生化学的反応の生成物を分析することを可能にする。
【０１３０】
ラブオンチップは更に、分離された種々の分子又は易変形性物に対応する画分を回収するための手段を備え得る。これらの回収手段は検出ゾーン８の下流に設けられ得る。あるいは、これらが検出ゾーン８に取って代わってもよく、その場合、デバイスは調製目的にのみ用いられる。
【０１３１】
これらの回収手段は、前述した化学的反応又は生化学的反応を行うデバイスと組み合わされて、又は組み合わされずに、提供され得る。
【実施例】
【０１３２】
以下に実施例を用いて本発明を説明するが、これは発明を限定するものではない。
【０１３３】
実施例１−二本鎖ＤＮＡ分子集団の分離
本実施例中、本発明は、サイズが５００ｂｐ、１０００ｂｐ、１５００ｂｐ、２０００ｂｐ、３０００ｂｐ、４０００ｂｐ、５０００ｂｐ、６０００ｂｐ、８０００ｂｐ、及び１０，０００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ分子の集団の分離を達成するために行われる。
【０１３４】
分子集団は、１８０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタン、１８０ｍＭのホウ酸、４ｍＭのエチレンジアミン四酢酸、０．５μＭのジチオスレイトール、及び２質量％のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、３６０ｋＤａ）を含むバッファー溶液中に希釈され、核酸塩基の総濃度は５ｎｇ／μｌとし、これは各サイズを考慮するとそれぞれ５×１０−１２Ｍ（５００ｂｐ）、１．３×１０−１２Ｍ（１０００ｂｐ）、４．８×１０−１３Ｍ（１５００ｂｐ）、３．６×１０−１３Ｍ（２０００ｂｐ）、４．２×１０−１３Ｍ（３０００ｂｐ）、６．３×１０−１４Ｍ（４０００ｂｐ）、５．１×１０−１４Ｍ（５０００ｂｐ）、４．２×１０−１４Ｍ（６０００ｂｐ）、２×１０−１４Ｍ（８０００ｂｐ）、１．３×１０−１４Ｍ（１０，０００ｂｐ）のモル濃度に相当する。
【０１３５】
核酸は、４塩基対に１つのプローブの割合で挿入剤（ＹＯＹＯ（登録商標）、モレキュラープローブス社製）を用いて標識することにより蛍光化される。
【０１３６】
この分子集団の分離及び分析に用いられるデバイスは図１に示される通りである。チャネル１及び付加的チャネル２は、幅が１００μｍ、高さが２μｍである。導入ゾーン９と検出ゾーン８との間隔は５ｍｍである。
【０１３７】
生物学的試料を含まない２００μｌのバッファー溶液を、チャネル１のリザーバー３、４、５、及び６と付加的チャネル２に配置する。３０分間にわたってＰＶＰで表面を飽和させることができるように圧力を調節することにより、リザーバー３、４、５からリザーバー６への溶液の流れを作り出す。次いで、目的の試料を含む２００μｌの溶液を付加的チャネル２の第１のリザーバー３に配置する。
【０１３８】
チャネル１中の電位差及び圧力差をそれぞれ０〜４０Ｖ及び２００〜７００ｍｂａｒの複数の異なる値に調節することにより、複数の泳動試験を行う。
【０１３９】
検出ゾーン８における強度を、蛍光顕微鏡（拡大率１００倍）を用いてモニタリングし、ＣＣＤカメラを５Ｈｚの周波数で用いて画像化する。
【０１４０】
５００〜１０，０００ｂｐの範囲全体にわたる最良の分解能は、２０Ｖ及び２００ｍｂａｒ又は３０Ｖ及び５０ｍｂａｒで得られる（後者の構成は更に、確実に泳動時間を８分未満にする）。
【０１４１】
結果を図４〜６に示す。
【０１４２】
実施例２−単一分子のモニタリングによる分離メカニズムの説明
本実施例では、先の実施例と同じ実験デバイスを用いる。チャネル中における約４８，０００塩基対のＤＮＡ（ラムダファージＤＮＡ）の泳動を調べる。ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ、３６０ｋＤａ）の質量濃度は２％である。最初の段階では、圧力差１００ｍｂａｒを印加し、電位差０、５、１０、１５、及び２０Ｖで泳動を行う。これらの電位差のそれぞれについて、多数の個々の蛍光ＤＮＡ分子の速度を測定し、速度分布を調べる。
【０１４３】
結果を図７に示す。
【０１４４】
電位差が増すと速度のばらつきが減少することが見出され、これはチャネル中におけるＤＮＡ分子の空間的局在の作用の証拠である。
【０１４５】
第２段階では、チャネルの高さ方向におけるＤＮＡ分子の分布を分析する。そのために、対物レンズの圧電探査装置（ｐｏｓｉｔｉｏｎｎｅｕｒ  ｐｉ／ｅｚｏ／ｅｌｅｃｔｒｉｑｕｅ  ｄｅ  ｌ’ｏｂｊｅｃｔｉｆ）を用いて種々の焦平面で蛍光強度測定を行う。結果を図８の左側に示す。
【０１４６】
４組の圧力差及び電位差条件を用いて、実質的にゼロのＤＮＡ分子泳動速度（チャネルの軸に沿った）が得られた。これらの条件の組み合わせは以下の通りである：１５．４Ｖ／５０ｍｂａｒ；２３．５Ｖ／１２０ｍｂａｒ；２９．４Ｖ／２００ｍｂａｒ；及び４５Ｖ／６００ｍｂａｒ。４つの対応する光強度曲線は概ね重なり、ＤＮＡ分子が壁の近傍で濃縮されていることを示している。
【０１４７】
次いで、１２μｍのより大きなチャネル高さを有するデバイスを用いて実験を繰り返す。結果を図８の右側に示す。チャネルに沿った分子泳動速度を相殺できる、使用された条件の組み合わせは以下の通りである：１５Ｖ／１０ｍｂａｒ；５９Ｖ／５０ｍｂａｒ；８３Ｖ／１００ｍｂａｒ；及び１１４Ｖ／２００ｍｂａｒ。やはり、ＤＮＡ分子はチャネルの壁の近傍に位置していることが見出される。
【０１４８】
実施例３−液体媒体の性質の影響
本実施例では、実施例１と同じ実験デバイスを用い、同じＤＮＡ集団の分離を調べる。分離の有効性に対する液体媒体の非ニュートン特性の影響を調べる。
【０１４９】
そのために、バッファー溶液中のＰＶＰの濃度を０．１％、２％（実施例１と同じ）、及び４％の値に変えて泳動を行う。
【０１５０】
濃度０．１％では、媒体はニュートン流体である。濃度２及び４％では、媒体は非ニュートン流体である。
【０１５１】
印加される圧力差は、ＰＶＰ濃度０．１％、２％、及び４％のそれぞれについて５０ｍｂａｒ、１５０ｍｂａｒ、及び６００ｍｂａｒである。印加される電位差は、実験に応じて０、１０、２０、２３、３０、及び４０Ｖである。結果を図９に示す。非ニュートン特性を付与する特定の閾値である被覆濃度０．４％のＰＶＰ（３４０ｋＤａ）に近い値よりも高いＰＶＰ濃度を分離媒体が含む場合に、分離が大幅に改善されることが見出される。
【０１５２】
これらの非ニュートン特性は、Ｃｏｕｅｔｔｅレオメーターを用いた動力学的分析法により実証される。
【０１５３】
より正確には、流体を、半径Ｒの中央シリンダーと周辺シリンダーとの間に配置する（２つのシリンダー間の距離はΔＲで表され、シリンダーの高さはｈで表される）。中央シリンダーをある回転頻度（ｓ−１）で回転させ、周辺シリンダーで誘起された機械的モーメントＭを測定する。ストレスはσ＝Ｍ／（２πＲ２ｈ）として決定される。剪断速度はτ＝Ｒ・ｗ／ΔＲとして定義される。
【０１５４】
正弦的関数に従って経時的に可変なシリンダーの回転が加えられる時、ストレス及び剪断速度を複素数による時間の関数、すなわちσ（ｔ）=σ０（ｗ）・ｅｉｗｔ及びτ（ｔ）＝γ（ｗ）・ｅｉ（ｗｔ＋φ）として表すのが実用的である。これにより、流体の複素粘度μ（ｗ）＝μ’（ｗ）−ｉμ’’（ｗ）（式中、μ’（ｗ）及びμ’’（ｗ）は実数を表す）及びσ（ｔ）＝μ（ｗ）・τ（ｔ）を定義することができる。更に弾性率Ｇ’（ｗ）＝ｗ・μ’’（ｗ）（貯蔵弾性率）及びＧ’’（ｗ）＝ｗ・μ’（ｗ）（損失弾性率）が定義される。
【０１５５】
ニュートン流体の場合、Ｇ’（ｗ）＝０及びＧ’’（ｗ）＝ｗ・μ０であり、μ０は流体の（一定の）粘度である。
【０１５６】
対照的に、２％ＰＶＰを含む溶液は、高頻度（約３０Ｈｚ）で優勢になる、ゼロでない成分Ｇ’（ｗ）を有する（図１０）。一方、定常状態条件下では、剪断速度が変わっても粘度は一定である（図１１）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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