(57)【要約】本発明は、半翅目昆虫の阻害タンパク質、かかるタンパク質を使用する方法、かかるタンパク質をコードするヌクレオチド配列、かかるタンパク質を検出および単離する方法、ならびに農業システムにおけるそれらの使用を開示する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨格毒素タンパク質から操作されるｅＨＴＰであって、前記ｅＨＴＰは、前記骨格毒素の半翅目阻害活性よりも約２〜約２６０倍大きい、半翅目の有害生物種に対する半翅目昆虫種の阻害活性を呈し、任意に、前記ｅＨＴＰは、前記毒素タンパク質に対して、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を呈する、ｅＨＴＰ。
【請求項２】
請求項１に記載のｅＨＴＰであって、配列番号３４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号２０２、および配列番号２０４、またはこれらの昆虫阻害断片から成る群から選択されるタンパク質のいずれかに記載されるようなアミノ酸配列を有する、ｅＨＴＰ。
【請求項３】
前記骨格毒素タンパク質は、配列番号２（ＴＩＣ８０７）、配列番号８（ＴＩＣ８０７＿Ｍ２）、配列番号１８２（Ｃｒｙ５１Ａａ１）、配列番号１８４（ＴＩＣ８５３）、および配列番号２０６（ＡＸＭＩ−１７１）から成る群から選択される、請求項１に記載のｅＨＴＰ。
【請求項４】
配列番号２（ＴＩＣ８０７）、配列番号８（ＴＩＣ８０７＿Ｍ２）、配列番号１８２（Ｃｒｙ５１Ａａ１）、配列番号１８４（ＴＩＣ８５３）、および配列番号２０６（ＡＸＭＩ−１７１）から成る群から選択される前記骨格毒素タンパク質において、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸付加、または少なくとも１つのアミノ酸欠失をさらに含む、請求項１に記載のｅＨＴＰ。
【請求項５】
請求項４に記載のｅＨＴＰであって、代替的に、
（ｉ）前記アミノ酸置換、付加、もしくは欠失が、配列番号２の溶媒露出アミノ酸残基に存在するか、
（ｉｉ）前記アミノ酸置換、付加、もしくは欠失が、配列番号２の溶媒露出アミノ酸残基の３つの連続したアミノ酸残基内に存在するか、または、
（ｉｉｉ）前記ｅＨＴＰが、配列番号１８０に記載されるようなアミノ酸配列を有する、ｅＨＴＰ。
【請求項６】
請求項５に記載のｅＨＴＰであって、前記ｅＨＴＰは、１２位がアスパラギン酸によって置き換えられるアスパラギン、４６位がセリンによって置き換えられるフェニルアラニン、５２位がメチオニンによって置き換えられるイソロイシン、５４位がヒスチジンによって置き換えられるチロシン、６８位がアラニンによって置き換えられるトレオニン、７０位がアラニンによって置き換えられるグルタミン、８７位がセリンによって置き換えられるアラニン、９３位がアラニンによって置き換えられるトレオニン、９５位がアラニンによって置き換えられるセリン、１０５位がアラニンによって置き換えられるグリシン、１１７位がアラニンによって置き換えられるセリン、１１９位がアラニンによって置き換えられるセリン、１２５位がシステイン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、セリン、グルタミン、リジン、トレオニン、アスパラギン、アラニン、ロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、もしくはチロシンによって置き換えられるグルタミン酸塩、１２８位がアラニンによって置き換えられるグリシン、１３３位がグルタミン酸、チロシン、もしくはトリプトファンによって置き換えられるトレオニン、１３４位がアラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、リジン、システイン、もしくはメチオニンによって置き換えられるイソロイシン、１３５位がセリン、アラニン、バリン、トリプトファン、もしくはトレオニンによって置き換えられるグルタミン酸塩、１３７位がヒスチジン、チロシン、トレオニン、グルタミン酸、セリン、アラニン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、トリプトファン、リジン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、もしくはアルギニンによって置き換えられるアスパラギン、１３８位がバリンによって置き換えられるフェニルアラニン、セリンによって置き換えられるＡｌａ１３９、アラニンによって置き換えられるＴｈｒ１４５、セリン、バリン、トレオニン、システイン、ロイシン、アスパラギン酸、アラニン、グリシン、グルタミン酸、イソロイシン、チロシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン（ｈｙｓｔｉｄｉｎｅ）、アラニン、アルギニン、トリプトファン、もしくはプロリンによって置き換えられるＰｈｅ１４７、１４８位がアラニンによって置き換えられるグルタミン、１４９位がアスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アラニン、もしくはフェニルアラニンによって置き換えられるグルタミン、１５０位がセリン、ロイシン、バリン、グリシン、アスパラギン酸、トリプトファン、グルタミン酸、アスパラギン、チロシン、フェニルアラニン、プロリン、リジン、トレオニン、グルタミン、もしくはアルギニンによって置き換えられるアラニン、１５１位がアラニンによって置き換えられるセロイン（ｓｅｒｏｉｎｅ）、１５３位がアラニンによって置き換えられるアスパラギン酸塩、１５５位システイン、イソロイシン、リジン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、グルタミン、リジン、アスパラギン、トレオニン、アラニン、フェニルアラニン、アルギニン、メチオニン、プロリン、トリプトファン、セリン、もしくはバリンによって置き換えられるグルタミン酸塩、１５７位がシステイン、アスパラギン酸、トリプトファン、チロシン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、プロリン、グルタミン酸、トレオニン、グリシン、イソロイシン、もしくはアルギニンによって置き換えられるアスパラギン、１５８位がアラニンによって置き換えられるイソロイシン、１５９位がアラニンもしくはトレオニンによって置き換えられるセリン、１６７位がアルギニンもしくはアラニンによって置き換えられるセリン、１７５位がアラニンによって置き換えられるバリン、１７７位がアラニンによって置き換えられるメチオニン、１８０位がアスパラギン酸によって置き換えられるアスパラギン、１８２位がアラニンによって置き換えられるトレオニン、１８７位がアラニンによって置き換えられるロイシン、１９６位が欠失するヒスチジン、１９７位が欠失するチロシン、１９８位が欠失するセリン、１９９位が欠失するヒスチジン、２００位がアラニンによって置き換えられるチロシン、２００位が欠失するチロシン、アラニンによって置き換えられるＳｅｒ２０１、２０１位が欠失するセリン、２０８位がアラニンによって置き換えられるトリプトファン、２１７位がアスパラギンによって置き換えられるセリン、２１９位がアルギニンによって置き換えられるプロリン、２２３位がチロシンによって置き換えられるトリプトファン、２３５位がアラニンによって置き換えられるフェニルアラニン、２３９位がアラニンによって置き換えられるアスパラギン、２４１位がアラニンによって置き換えられるアスパラギン酸塩、２４３位がアラニンによって置き換えられるトレオニン、２４４位がイソロイシンによって置き換えられるバリン、２４５位がアラニンによって置き換えられるトレオニン、２４６位がフェニルアラニンによって置き換えられるチロシン、２４７位がアラニンもしくはリジンによって置き換えられるトレオニン、２４９位がアラニンもしくはアルギニンによって置き換えられるセリン、２５０位がアラニンによって置き換えられるバリン、２５１位がアラニンによって置き換えられるバリン、２５２位がアラニンによって置き換えられるセリン、２７３位がトリプトファンによって置き換えられるアルギニン、２７４位がアラニンによって置き換えられるトレオニン、２７５位がアラニンによって置き換えられるイソロイシン、２８２位がアラニンによって置き換えられるアルギニン、２８７位がアラニンもしくはフェニルアラニンによって置き換えられるヒスチジン、２９３位がアラニンによって置き換えられるセリン、２９５位がアラニンによって置き換えられるアスパラギン、２９９位がアラニンによって置き換えられるグルタミン酸塩、３００位がアラニンによって置き換えられるメチオニン、３０３位がアラニンによって置き換えられるトレオニン、３０５位がアラニンによって置き換えられるプロリン、３０６位がアラニンによって置き換えられるイソロイシン、および３０８位がアラニンによって置き換えられるトレオニンから成る群から選択される少なくとも１つの置換もしくは欠失を含み、
前記置換もしくは欠失は、配列番号２に記載されるような骨格毒素タンパク質ＴＩＣ８０７、または配列番号８に記載されるようなＴＩＣ８０７＿Ｍ２のＴＩＣ８０７の対応するアミノ酸残基位置、配列番号１８２に記載されるようなＣｒｙ５１Ａａ１、または配列番号１８４に記載されるようなＴＩＣ８５３に関して行われ、
前記ｅＨＴＰは、前記置換もしくは欠失の任意の組み合わせを含む、ｅＨＴＰ。
【請求項７】
前記ｅＨＴＰは、（ｉ）少なくとも約１５％〜約３６％の相対的溶媒露出度を有するアミノ酸残基、および（ｉｉ）少なくとも約１５％〜約３６％の相対的溶媒露出度を有するアミノ酸から約３つの連続した残基の距離内に位置するアミノ酸残基から選択される、配列番号２のアミノ酸残基において、少なくとも１つのアミノ酸置換、１つのアミノ酸付加、または１つのアミノ酸欠失を含む、請求項６に記載のｅＨＴＰ。
【請求項８】
請求項７に記載のｅＨＴＰであって、前記ｅＨＴＰは、任意に、
ａ．Ｔｈｒ９３、Ｓｅｒ９５、Ｓｅｒ９７、Ｐｈｅ１４７、Ｇｌｎ１４９、Ｓｅｒ１５１、Ａｓｎ１８０、Ｔｈｒ１８２、Ｖａｌ２５１、Ｇｌｎ２５３、およびＳｅｒ２５５から成る群から選択される配列番号２のアミノ酸残基における、少なくとも１つのアミノ酸置換、１つのアミノ酸付加、もしくは１つのアミノ酸欠失、
ｂ．Ｖａｌ１０、Ｉｌｅ１４、Ａｓｎ２２、Ａｓｎ２３、Ｇｌｙ２４、Ｉｌｅ２５、Ｇｌｎ２６、Ｇｌｙ２７、Ｐｈｅ３０、Ｇｌｎ３８、Ｉｌｅ３９、Ａｓｐ４０、Ｔｈｒ４１、Ｉｌｅ４３、Ｓｅｒ１９３、Ｔｈｒ１９４、Ｇｌｕ１９５、Ｈｉｓ１９６、Ｔｙｒ１９７、Ｓｅｒ１９８、Ｈｉｓ１９９、Ｔｙｒ２００、Ｓｅｒ２０１、Ｇｌｙ２０２、Ｔｙｒ２０３、Ｐｒｏ２０４、Ｉｌｅ２０５、Ｌｅｕ２０６、Ｔｈｒ２０７、Ｔｒｐ２０８、Ｉｌｅ２０９、Ｓｅｒ２１０、Ｔｙｒ２１６、Ｓｅｒ２１７、Ｇｌｙ２１８、Ｐｒｏ２１９、Ｐｒｏ２２０、Ｍｅｔ２２１、Ｓｅｒ２２２、Ｔｒｐ２２３、Ｔｙｒ２２４、Ｐｈｅ２２５、Ａｓｎ２３９、およびＶａｌ２４４から成る群から選択される配列番号２のアミノ酸残基における、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換、１つのアミノ酸付加、もしくは１つのアミノ酸欠失、
ｃ．Ｖａｌ１０、Ｉｌｅ１４、Ａｓｎ２２、Ａｓｎ２３、Ｇｌｙ２４、Ｉｌｅ２５、Ｇｌｎ２６、Ｇｌｙ２７、Ｐｈｅ３０、Ｇｌｎ３８、Ｉｌｅ３９、Ａｓｐ４０、Ｔｈｒ４１、Ｉｌｅ４３、Ｓｅｒ１９３、Ｔｈｒ１９４、Ｇｌｕ１９５、Ｈｉｓ１９６、Ｔｙｒ１９７、Ｓｅｒ１９８、Ｈｉｓ１９９、Ｔｙｒ２００、Ｓｅｒ２０１、Ｇｌｙ２０２、Ｔｙｒ２０３、Ｐｒｏ２０４、Ｉｌｅ２０５、Ｌｅｕ２０６、Ｔｈｒ２０７、Ｔｒｐ２０８、Ｉｌｅ２０９、Ｓｅｒ２１０、Ｔｙｒ２１６、Ｓｅｒ２１７、Ｇｌｙ２１８、Ｐｒｏ２１９、Ｐｒｏ２２０、Ｍｅｔ２２１、Ｓｅｒ２２２、Ｔｒｐ２２３、Ｔｙｒ２２４、Ｐｈｅ２２５、Ａｓｎ２３９、およびＶａｌ２４４から成る群から選択される配列番号２のアミノ酸残基における、少なくとも１つのアミノ酸置換、１つのアミノ酸付加、もしくは１つのアミノ酸欠失、
ｄ．Ｓ９５Ａ、Ｆ１４７Ａ、Ｑ１４９Ｅ、Ｖ２５１Ａ、Ｐ２１９Ｒから成る群から選択される配列番号２における１つ以上の変異、または
ｅ．残基範囲１９６〜２０１内の配列番号２における隣接する三重欠失を含む、ｅＨＴＰ。
【請求項９】
請求項８に記載のｅＨＴＰであって、配列番号２に記載されるような天然のバチルス・チューリンゲンシスタンパク質と比較して、増加した溶解度を呈するようにさらに修飾され、前記ｅＨＴＰは、配列番号２に対して少なくとも１つの修飾を含み、前記修飾は、以下のアミノ酸位置：５８、５９、１９８、１９９、２０１、もしくは２０２のうちの１つ以上におけるリジン置換、またはアミノ酸位置１９８、２４８、もしくは３０１のうちの１つ以上におけるグルタミン酸置換、またはアミノ酸位置２４６、２５０、もしくは２５３のうちの１つ以上におけるアルギニン置換を含む、ｅＨＴＰ。
【請求項１０】
前記半翅目の有害生物種は、リグス・ヘスペルス（Ｌｙｇｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、リグス・リネオラリス（Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）、およびアムラスカ・デバスタンス（Ａｍｒａｓｃａ  ｄｅｖａｓｔａｎｓ）から成る群から選択される、請求項９に記載のｅＨＴＰ。
【請求項１１】
請求項１０に記載のｅＨＴＰを含む、昆虫阻害組成物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の昆虫阻害組成物であって、前記ｅＨＴＰとは異なる少なくとも１つの昆虫阻害剤をさらに含み、前記昆虫阻害剤は、昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子、および昆虫阻害化学物質から成る群から選択され、
前記ｅＨＴＰとは異なる前記昆虫阻害タンパク質は、Ｃｒｙ１毒素、Ｃｒｙ２毒素、Ｃｒｙ５毒素、Ｃｒｙ７毒素、Ｃｒｙ９毒素、およびＶＩＰ３毒素から成る群から選択され、
前記昆虫阻害化学物質は、ピレトリンおよび合成ピレスロイド；オキサジアジン（ｏｘａｄｉｚｉｎｅ）誘導体；クロロニコチニル；ニトログアニジン誘導体；トリアゾール；有機リン酸；ピロール；ピラゾール；フェニルピラゾール；ジアシルヒドラジン；生物学的／発酵産物；ならびにカルバメートから成る群から選択される、昆虫阻害組成物。
【請求項１３】
半翅目の有害生物を制御する方法であって、前記有害生物を半翅目阻害量の請求項１０に記載のｅＨＴＰと接触させることを含み、前記半翅目の有害生物は、綿畑にいる、方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載のｅＨＴＰをコードする組み換えポリヌクレオチドであって、任意に、
ａ．配列番号３３、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、および配列番号２０３から成る群から選択されるヌクレオチド配列、または
ｂ．前記組み換えポリヌクレオチドによってコードされるｅＨＴＰとは異なる１つ以上の昆虫阻害剤をコードするヌクレオチド配列を含む、組み換えポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１４に記載の組み換えポリヌクレオチドを含む、トランスジェニック植物細胞、植物、または植物部分であって、任意に、
ａ．前記植物部分は、種子、実、葉、花、茎、根、もしくはこれらの任意の部分であるか、または
ｂ．前記植物部分は、前記種子、実、葉、花、茎、もしくは根の再生不可能な部分である、トランスジェニック植物細胞、植物、または植物部分。
【請求項１６】
半翅目の有害生物を制御する方法であって、前記有害生物を請求項１５に記載のトランスジェニック植物細胞、植物、または植物部分に曝露することを含み、前記植物細胞、植物、または植物部分は、半翅目阻害量の前記ｅＨＴＰを発現する、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の植物細胞、植物、または植物部分に由来する商品産物であって、前記産物は、検出可能な量の前記組み換えポリヌクレオチドを含み、前記産物は、植物バイオマス、油、食事、動物飼料、小麦粉、フレーク、ふすま、リント、外皮、および加工された種子から成る群から選択され、任意に、前記産物は、再生不可能である、商品産物。
【請求項１８】
植物を半翅目の有害生物の侵入に対して抵抗性にする方法であって、ｅＨＴＰをコードする組み換えポリヌクレオチドを植物細胞に導入するステップと、前記植物細胞から、昆虫阻害量のｅＨＴＰを発現するトランスジェニック植物を再生するステップと、半翅目の有害生物の侵入抵抗を前記トランスジェニック植物の特性として実証するステップと、を含み、
前記植物は、任意に、
ａ．双子葉植物および単子葉植物から成る群から選択されるか、
ｂ．アルファルファ、アーモンド（ａｌｍｏｎｔ）、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、ブロッコリ、キャベツ、アブラナ属、ナス（ｂｒｉｎｊａｌ）、ニンジン、キャッサバ、ヒマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、セロリ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバ、綿、ウリ、キュウリ、ダグラスファー、ナス（ｅｇｇｐｌａｎｔ）、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、グアー、ホップ、リーキ、マメ類、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ネクタリン、ナッツ、オートムギ、オクラ、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、パパイヤ、エンドウ、モモ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、コメ、台木、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、大豆、ホウレンソウ、スクオッシュ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、およびコムギから成る群から選択されるか、または
ｃ．前記ｅＨＴＰとは異なる昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子、および昆虫阻害化学物質から成る群から選択される補助的薬剤を含み、
前記ｅＨＴＰとは異なる前記昆虫阻害タンパク質は、Ｃｒｙ１毒素、Ｃｒｙ２毒素、Ｃｒｙ５毒素、Ｃｒｙ７毒素、Ｃｒｙ９毒素、およびＶＩＰ３毒素から成る群から選択され、
前記昆虫阻害化学物質は、ピレトリンおよび合成ピレスロイド；オキサジアジン（ｏｘａｄｉｚｉｎｅ）誘導体；クロロニコチニル；ニトログアニジン誘導体；トリアゾール；有機リン酸；ピロール；ピラゾール；フェニルピラゾール；ジアシルヒドラジン；生物学的／発酵産物；およびカルバメートから成る群から選択される、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記半翅目昆虫有害生物は、植物虫（カスミカメムシ科を含む）、セミ科からのセミ、ヨコバイ（例えば、エンポアスシニ（Ｅｍｐｏａｓｃｉｎｉ）族を含むオオヨコバイ科からのエムポアスカ（Ｅｍｐｏａｓｃａ）種、アムラスカ（Ａｍｒａｓｃａ）種、例えば、アムラスカ・ビグッチュラ（Ａｍｒａｓｃａ  ｂｉｇｕｔｔｕｌａ）、アムラスカ・デバスタンス、アウストロアスカ・ヴィリジグリセア（Ａｕｓｔｒｏａｓｃａ  ｖｉｒｉｄｉｇｒｉｓｅａ）、アシンメトラスカ・デセデンス（Ａｓｙｍｍｅｔｒａｓｃａ  ｄｅｃｅｄｅｎｓ）、エムポアスカ・デシピエンス（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｄｅｃｉｐｉｅｎｓ）、エムポアスカ・ディスティングエンダ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｅｎｄａ）、エムポアスカ・ドリチ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｄｏｌｉｃｈｉ）、エムポアスカ・ファバエ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ）、エムポアスカ・ケリ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｋｅｒｒｉ）、エムポアスカ・クラエメリ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｋｒａｅｍｅｒｉ）、エムポアスカ・オヌキイ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｏｎｕｋｉｉ）、エムポアスカ・サカイイ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｓａｋａｉｉ）、エムポアスカ・スミチ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｓｍｉｔｈｉ）、エムポアスカ・ビティス（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｖｉｔｉｓ）、ヤコビアスカ・リビカ（Ｊａｃｏｂｉａｓｃａ  ｌｙｂｉｃａ）、ソナサスカ・ソラナ（Ｓｏｎａｓａｓｃａ  Ｓｏｌａｎａ）、エリスロニューリニ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｕｒｉｎｉ）族、例えば、エムポアスカナラ・ナグプレンシス（Ｅｍｐｏａｓｃａｎａｒａ  ｎａｇｐｕｒｅｎｓｉｓ）、タイアアサメンシス（Ｔｈａｉａａｓｓａｍｅｎｓｉｓ）、ジグニディア・クユミ（Ｚｙｇｎｉｄｉａ  ｑｕｙｕｍｉ）、ニルバニアエ（Ｎｉｒｖａｎｉａｅ）族、ソフォニア・ルフォファスシア（Ｓｏｐｈｏｎｉａ  ｒｕｆｏｆａｓｃｉａ）、ウンカ科、例えば、ニラパルヴァータ・ルーゲンス（Ｎｉｌａｐｏａｒｖａｔａ  ｌｕｇｅｎｓ）、ソガテラ・フルシフェラ（Ｓｏｇａｔｅｌｌａ  ｆｕｒｃｉｆｅｒａ）、サッポロトビウンカ（Ｕｎｋａｎｏｄｅｓ  ｓａｐｐｏｒｏｎｕｓ）、およびアシブトウンカ科、例えば、ゾフィウマ・ロブラタ（Ｚｏｐｈｉｕｍａ  ｌｏｂｕｌａｔａ））、ウンカ（ビワハゴロモ上科およびウンカ科から）、ツノゼミ（ツノゼミ科から）、キジラミ（キジラミ科から）、コナジラミ（コナジラミ科から）、アブラムシ（アブラムシ科から）、ネアブラムシ（ネアブラムシ科から）、コナカイガラムシ（コナカイガラムシ科から）、カイガラムシ（カタカイガラムシ科、マルカイガラムシ科、およびワタフキカイガラムシ科から）、グンバイムシ（グンバイムシ科から）、カメムシ（カメムシ科から）、ナガカメムシ（例えば、ブリッサス（Ｂｌｉｓｓｕｓ）種、およびナガカメムシ科からの他の種子虫）、アワフキムシ（アワフキムシ科から）、ヘリカメムシ（ヘリカメムシ科から）、ツツガムシおよびアカホシカメムシ（ホシカメムシ科から）、アクロステルヌム・ヒラレ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ）（アオカメムシ）、アナサ・トリスティス（Ａｎａｓａ  ｔｒｉｓｔｉｓ）（ヘリカメムシ）、ブリッサス・ロイコプテルス・ロイコプテルス（Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）（ヒメコバネナガカメムシ）、コリスカ・ゴシピイ（Ｃｏｒｙｔｈｕｃａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（コットンレースバグ（ｃｏｔｔｏｎ  ｌａｃｅ  ｂｕｇ））、シルトペルティス・モデスタ（Ｃｙｒｔｏｐｅｌｔｉｓ  ｍｏｄｅｓｔａ）（トマトバグ（ｔｏｍａｔｏ  ｂｕｇ）、ディスデルクス・スツレルス（Ｄｙｓｄｅｒｃｕｓ  ｓｕｔｕｒｅｌｌｕｓ）（アカホシカメムシ）、ユースキスツス・セルバス（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｓｅｒｖｕｓ）（ブラウンスティンクバグ（ｂｒｏｗｎ  ｓｔｉｎｋ  ｂｕｇ））、ユースキスツス・バリオラリウス（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｖａｒｉｏｌａｒｉｕｓ）（ワンスポッテッドスティンクバグ（ｏｎｅ−ｓｐｏｔｔｅｄ  ｓｔｉｎｋ  ｂｕｇ））、グラプトステツス（Ｇｒａｐｔｏｓｔｅｔｈｕｓ）種（種子虫の複合）、レプトグロッスス・コルクルス（Ｌｅｐｔｏｇｌｏｓｓｕｓ  ｃｏｒｃｕｌｕｓ（リーフ・フッテッドパインシードバグ（ｌｅａｆ−ｆｏｏｔｅｄ  ｐｉｎｅ  ｓｅｅｄ  ｂｕｇ））、リグス・リネオラリス（ミドリメクラガメ）、リグス・ヘスペルス（ウエスタンターニッシュプラントバグ（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｔａｒｎｉｓｈ  ｐｌａｎｔ  ｂｕｇ））、ネザラ・ビリヅラ（Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ）（ミナミアオカメムシ）、オエバルス・プグナクス（Ｏｅｂａｌｕｓ  ｐｕｇｎａｘ）（イネカメムシ）、オンコペルツス・ファスシアツス（Ｏｎｃｏｐｅｌｔｕｓ  ｆａｓｃｉａｔｕｓ）（ラージミルクウィードバグ（ｌａｒｇｅ  ｍｉｌｋｗｅｅｄ  ｂｕｇ））、およびシューダトモスセリス・セリアツス（Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ  ｓｅｒｉａｔｕｓ）（ワタノミハムシ）から成る群から選択される、方法。
【請求項２０】
ｅＨＴＰ（操作された半翅目の毒性タンパク質）であって、配列番号３４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号２０２、および配列番号２０４、またはこれらの昆虫阻害断片から成る群から選択される、ｅＨＴＰ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１２年４月６日に出願された米国仮出願第６１／６２１，４３６号への優先権を主張する。
【０００２】
配列表の組み込み
サイズが５２９，７９４バイトであり（オペレーティングシステムＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓにおいて測定）、２０１３年４月４日に作成された、「３８＿２１＿５６１９１＿ＡＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称のファイルに含有される配列表は、電子提出（米国特許庁ＥＦＳ−Ｗｅｂ出願システムを使用）によって同時に出願され、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、概して、昆虫阻害タンパク質の分野に関する。具体的には、本発明は、作物植物および種子の農学的に関連する有害生物、特に、半翅目種の昆虫有害生物に対する昆虫阻害活性を呈するタンパク質に関する。
【背景技術】
【０００４】
バチルス・チューリンゲンシス（Ｂｔ）に由来する昆虫阻害タンパク質は、ヒト、脊椎動物、および植物に対しては非毒性である。これらのタンパク質はまた、生分解性であり、安全であり、かつ害虫を制御する上で有効である。これらのタンパク質のうちの一部は、これらのタンパク質を含有する製剤、もしくはそれらを発現する微生物を植物に噴霧すること、これらのタンパク質を含有する処理剤で種子を処理すること、または植物に組み込まれた保護剤として、作物植物および作物植物の種子においてこれらのタンパク質を発現させることによって、作物植物の農学的に関連する有害生物を制御するために使用されてきた、かつ使用されている。
【０００５】
ある半翅目種、特に、アムラスカ（Ａｍｒａｓｃａ）、エムポアスカ（Ｅｍｐｏａｓｃａ）、およびリグス（Ｌｙｇｕｓ）虫は、綿およびアルファルファの有害生物であり、典型的に、広域スペクトルの化学物質、例えば、エンドスルファン、アセフェート、およびオキサミルを使用して制御され、これらは、環境内に残存し得、かつ環境に有害である。少数のＢｔタンパク質が、鞘翅目および鱗翅目の有害生物種を制御するように、農業従事者による商業的使用のために、製剤において、または作物植物のトランスジェニック形質として開発されているが、半翅目の有害生物種の商業的制御における使用のために開発されたＢｔタンパク質はない。
【０００６】
半翅目に特異的な毒性タンパク質が、当該技術分野において報告されている。ＴＩＣ８０７は、半翅目の有害生物種に対して毒性であるとして、米国特許出願公開第ＵＳ２００８−０２９５２０７  Ａ１号において開示される、バチルス・チューリンゲンシスタンパク質である。ＴＩＣ８０７のアミノ酸配列に酷似する、鱗翅目種に対して毒性として報告されるＣｒｙ５１Ａａ１タンパク質もまた、開示されている（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）  Ｊ．Ｉｎｖｅｒｔｅｂｒ．Ｐａｔｈｏｌ．９５（３），１７５−１８０）が、半翅目に特異的な活性は報告されなかった。Ｂａｕｍらは、リグス有害生物種に対して毒性であることが報告されるタンパク質である、ＴＩＣ８５３を開示した（米国特許出願公開第ＵＳ２０１０−００６４３９４  Ａ１号）。ＡＸＭＩ−１７１と称されるタンパク質は、半翅目昆虫、特に、リグス・ヘスペルス（Ｌｙｇｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ）のいくらかの限られた阻害を呈することが報告された（米国特許出願公開第ＵＳ２０１０−０２９８２０７  Ａ１号、実施例１８）。
【０００７】
これらのタンパク質のすべては、リグス・ヘスペルスのみに対する狭い範囲の毒性を呈し、植物における発現によって達成可能であるとは考えられない高用量においてのみ、他のリグス有害生物種に対する毒性効果を呈する。先行技術における半翅目の毒性タンパク質と比較して、半翅目の有害生物種に対する広い宿主域を呈する植物上および内で、かつ低濃度の有効用量で使用することができる、毒素タンパク質の必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書において説明される組み換え操作された半翅目の毒性タンパク質（本明細書において、「操作された毒素タンパク質」、「操作された毒性タンパク質」、「操作された半翅目の毒性タンパク質」、または「操作された半翅目の毒素タンパク質」と称され、また、２つ以上のかかるタンパク質の群において言及される時、短縮形で「ｅＨＴＰ（ｅＨＴＰ’ｓ）」、および単数で言及される時、「ｅＨＴＰ」と称される）は、自然発生のバチルス・チューリンゲンシス殺虫毒素の誘導体であり、ＴＩＣ８０７（配列番号２）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ２（配列番号８）、Ｃｒｙ５１Ａａ１（配列番号１８２）、ＴＩＣ８５３（配列番号１８４）、およびＡＸＭＩ−１７１（配列番号２０６）が、半翅目の有害生物種、特に、リグス・ヘスペルス昆虫種を対象とする生物制御活性を呈することがこれまでに説明されている（参照は本明細書の他の箇所で引用される）。本発明の組み換え半翅目昆虫毒性タンパク質は、アムラスカ、エムポアスカ、およびリグス種の昆虫有害生物、ならびにこれらの種の昆虫有害生物の各々に系統発生学的に関連する他の昆虫有害生物種、ならびにさらに半翅目の有害生物種のアムラスカ、エムポアスカ、およびリグス種によって使用される突刺および吸汁機構を使用して、植物を摂食する、昆虫有害生物の昆虫に対して特に毒性である。それらが由来し、１つのリグス種において毒性効果を達成するために、およびリグスの２番目に密接に関連する種において非常に低いもしくは事実上検出不可能な毒性効果を呈するために、適度に高い〜高い用量のタンパク質を各々必要とする、前駆体殺虫毒素であるＴＩＣ８０７（配列番号２）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ２（配列番号８）、Ｃｒｙ５１Ａａ１（配列番号１８２）、ＴＩＣ８５３（配列番号１８４）、およびＡＸＭＩ−１７１（配列番号２０６）とは異なり、本発明のｅＨＴＰタンパク質は、半翅目内の有害生物のスペクトルに跨る宿主域の毒性効果を含む、該目の昆虫有害生物に対する、驚くべきかつ予想外の低用量の毒性効果を呈する。
【０００９】
本発明のｅＨＴＰは、各々、配列番号２、配列番号８、配列番号１８２、または配列番号１８４のうちのいずれかに記載される毒素タンパク質のうちの１つ以上の、１次アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、１つのアミノ酸付加、または１つのアミノ酸欠失を含有する。ある実施形態において、配列番号２（ＴＩＣ８０７）、配列番号８（ＴＩＣ８０７＿Ｍ２）、配列番号１８２（Ｃｒｙ５１Ａａ１）、配列番号１８４（ＴＩＣ８５３）、および／または配列番号２０６（ＡＸＭＩ−１７１）のうちのいずれかに記載される毒素の任意の１つ以上よりも、リグス有害生物種に対する少なくとも約２〜約２６０倍大きい阻害活性を含有する、ｅＨＴＰが提供される。任意に、ｅＨＴＰは、配列番号２（ＴＩＣ８０７）および配列番号１８２（Ｃｒｙ５１Ａａ１）から成る群から選択される毒素タンパク質に対して、少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を呈する。ある実施形態において、配列番号２、配列番号８、配列番号１８２、または配列番号１８４のうちのいずれかのアミノ酸配列と比較した時、少なくとも１つのアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸付加、または少なくとも１つのアミノ酸欠失を含有するｅＨＴＰが提供される。ｅＨＴＰは、配列番号２、配列番号８、配列番号１８２、および配列番号１８４に記載されるもののバチルス・チューリンゲンシスタンパク質の活性および標的有害生物種スペクトルと比較して、増加したまたはより大きいリグス阻害活性および標的有害生物種スペクトルを呈する。前述のｅＨＴＰの各々は、少なくとも、集合的に、または代替的に、（ｉ）配列番号２の溶媒露出アミノ酸残基におけるアミノ酸置換、付加、もしくは欠失、（ｉｉ）配列番号２の溶媒露出アミノ酸残基の３つの連続した残基内のアミノ酸置換、付加、もしくは欠失、または（ｉｉｉ）配列番号１８０に記載されるようなアミノ酸配列を含有する。前述のｅＨＴＰは、各々、少なくとも、ＴＩＣ８０７のアミノ酸位置に従って付番されるアミノ酸配列位置を参照して、１２位がアスパラギン酸によって置き換えられるアスパラギン、４６位がセリンによって置き換えられるフェニルアラニン、５２位がメチオニンによって置き換えられるイソロイシン、５４位がヒスチジンによって置き換えられるチロシン、６８位がアラニンによって置き換えられるトレオニン、７０位がアラニンによって置き換えられるグルタミン、８７位がセリンによって置き換えられるアラニン、９３位がアラニンによって置き換えられるトレオニン、９５位がアラニンによって置き換えられるセリン、１０５位がアラニンによって置き換えられるグリシン、１１７位がアラニンによって置き換えられるセリン、１１９位がアラニンによって置き換えられるセリン、１２５位がシステイン、ヒスチジン、アルギニン、フェニルアラニン、セリン、グルタミン、リジン、トレオニン、アスパラギン、アラニン、ロイシン、バリン、メチオニン、アスパラギン酸、もしくはチロシンによって置き換えられるグルタミン酸塩、１２８位がアラニンによって置き換えられるグリシン、１３３位がグルタミン酸、チロシン、もしくはトリプトファンによって置き換えられるトレオニン、１３４位がアラニン、バリン、ロイシン、フェニルアラニン、リジン、システイン、もしくはメチオニンによって置き換えられるイソロイシン、１３５位がセリン、アラニン、バリン、トリプトファン、もしくはトレオニンによって置き換えられるグルタミン酸塩、１３７位がヒスチジン、チロシン、トレオニン、グルタミン酸、セリン、アラニン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、トリプトファン、リジン、システイン、メチオニン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、もしくはアルギニンによって置き換えられるアスパラギン、１３８位がバリンによって置き換えられるフェニルアラニン、セリンによって置き換えられるＡｌａ１３９、アラニンによって置き換えられるＴｈｒ１４５、セリン、バリン、トレオニン、システイン、ロイシン、アスパラギン酸、アラニン、グリシン、グルタミン酸、イソロイシン、チロシン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン（ｈｙｓｔｉｄｉｎｅ）、アラニン、アルギニン、トリプトファン、もしくはプロリンによって置き換えられるＰｈｅ１４７、１４８位がアラニンによって置き換えられるグルタミン、１４９位がアスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アラニン、もしくはフェニルアラニンによって置き換えられるグルタミン、１５０位がセリン、ロイシン、バリン、グリシン、アスパラギン酸、トリプトファン、グルタミン酸、アスパラギン、チロシン、フェニルアラニン、プロリン、リジン、トレオニン、グルタミン、もしくはアルギニンによって置き換えられるアラニン、１５１位がアラニンによって置き換えられるセロイン（ｓｅｒｏｉｎｅ）、１５３位がアラニンによって置き換えられるアスパラギン酸塩、１５５位がシステイン、イソロイシン、リジン、アスパラギン酸、ヒスチジン、チロシン、グルタミン、リジン、アスパラギン、トレオニン、アラニン、フェニルアラニン、アルギニン、メチオニン、プロリン、トリプトファン、セリン、もしくはバリンによって置き換えられるグルタミン酸塩、１５７位がシステイン、アスパラギン酸、トリプトファン、チロシン、メチオニン、アラニン、フェニルアラニン、バリン、ロイシン、プロリン、グルタミン酸、トレオニン、グリシン、イソロイシン、もしくはアルギニンによって置き換えられるアスパラギン、１５８位がアラニンによって置き換えられるイソロイシン、１５９位がアラニンもしくはトレオニンによって置き換えられるセリン、１６７位がアルギニンもしくはアラニンによって置き換えられるセリン、１７５位がアラニンによって置き換えられるバリン、１７７位がアラニンによって置き換えられるメチオニン、１８０位がアスパラギン酸によって置き換えられるアスパラギン、１８２位がアラニンによって置き換えられるトレオニン、１８７位がアラニンによって置き換えられるロイシン、１９６位が欠失するヒスチジン、１９７位が欠失するチロシン、１９８位が欠失するセリン、１９９位が欠失するヒスチジン、２００位がアラニンによって置き換えられるチロシン、２００位が欠失するチロシン、アラニンによって置き換えられるＳｅｒ２０１、２０１位が欠失するセリン、２０８位がアラニンによって置き換えられるトリプトファン、２１７位がアスパラギンによって置き換えられるセリン、２１９位がアルギニンによって置き換えられるプロリン、２２３位がチロシンによって置き換えられるトリプトファン、２３５位がアラニンによって置き換えられるフェニルアラニン、２３９位がアラニンによって置き換えられるアスパラギン、２４１位がアラニンによって置き換えられるアスパラギン酸塩、２４３位がアラニンによって置き換えられるトレオニン、２４４位がイソロイシンによって置き換えられるバリン、２４５位がアラニンによって置き換えられるトレオニン、２４６位がフェニルアラニンによって置き換えられるチロシン、２４７位がアラニンもしくはリジンによって置き換えられるトレオニン、２４９位がアラニンもしくはアルギニンによって置き換えられるセリン、２５０位がアラニンによって置き換えられるバリン、２５１位がアラニンによって置き換えられるバリン、２５２位がアラニンによって置き換えられるセリン、２７３位がトリプトファンによって置き換えられるアルギニン、２７４位がアラニンによって置き換えられるトレオニン、２７５位がアラニンによって置き換えられるイソロイシン、２８２位がアラニンによって置き換えられるアルギニン、２８７位がアラニンもしくはフェニルアラニンによって置き換えられるヒスチジン、２９３位がアラニンによって置き換えられるセリン、２９５位がアラニンによって置き換えられるアスパラギン、２９９位がアラニンによって置き換えられるグルタミン酸塩、３００位がアラニンによって置き換えられるメチオニン、３０３位がアラニンによって置き換えられるトレオニン、３０５位がアラニンによって置き換えられるプロリン、３０６位がアラニンによって置き換えられるイソロイシン、および３０８位がアラニンによって置き換えられるトレオニンから成る群から選択される１つの置換もしくは欠失を含有するか、またはタンパク質は、言及される置換および／もしくは欠失の任意の組み合わせを含む。ｅＨＴＰは、配列番号２のアミノ酸残基、または（ｉ）少なくとも約１５％〜少なくとも約３６％の相対的溶媒露出度を有するアミノ酸残基、および（ｉｉ）少なくとも約１５％〜少なくとも約３６％の相対的溶媒露出度を有するアミノ酸からの約３つの連続した残基の距離内に位置するアミノ酸残基から成る群から選択される、配列番号８、配列番号１８２、もしくは配列番号１８４の対応するアミノ酸位置において、少なくとも１つのアミノ酸置換、１つのアミノ酸付加、もしくは１つのアミノ酸欠失を含有する。本発明のｅＨＴＰは、配列番号２のＴｈｒ９３、Ｓｅｒ９５、Ｓｅｒ９７、Ｐｈｅ１４７、Ｇｌｎ１４９、Ｓｅｒ１５１、Ａｓｎ１８０、Ｔｈｒ１８２、Ｖａｌ２５１、Ｇｌｎ２５３、およびＳｅｒ２５５から成る群から選択されるアミノ酸残基における、少なくとも１つのアミノ酸置換、付加、もしくは欠失を含有する。前述のｅＨＴＰのうちのいずれかは、配列番号２のＶａｌ１０、Ｉｌｅ１４、Ａｓｎ２２、Ａｓｎ２３、Ｇｌｙ２４、Ｉｌｅ２５、Ｇｌｎ２６、Ｇｌｙ２７、Ｐｈｅ３０、Ｇｌｎ３８、Ｉｌｅ３９、Ａｓｐ４０、Ｔｈｒ４１、Ｉｌｅ４３、Ｓｅｒ１９３、Ｔｈｒ１９４、Ｇｌｕ１９５、Ｈｉｓ１９６、Ｔｙｒ１９７、Ｓｅｒ１９８、Ｈｉｓ１９９、Ｔｙｒ２００、Ｓｅｒ２０１、Ｇｌｙ２０２、Ｔｙｒ２０３、Ｐｒｏ２０４、Ｉｌｅ２０５、Ｌｅｕ２０６、Ｔｈｒ２０７、Ｔｒｐ２０８、Ｉｌｅ２０９、Ｓｅｒ２１０、Ｔｙｒ２１６、Ｓｅｒ２１７、Ｇｌｙ２１８、Ｐｒｏ２１９、Ｐｒｏ２２０、Ｍｅｔ２２１、Ｓｅｒ２２２、Ｔｒｐ２２３、Ｔｙｒ２２４、Ｐｈｅ２２５、Ａｓｎ２３９、およびＶａｌ２４４から成る群から選択されるアミノ酸残基、または配列番号８、配列番号１８２、もしくは配列番号１８４の対応するアミノ酸残基位置において、少なくとも１つの追加のアミノ酸置換、付加、もしくは欠失を含有し得る。前述のｅＨＴＰのうちのいずれかは、Ｓ９５Ａ、Ｆ１４７Ａ、Ｑ１４９Ｅ、Ｖ２５１Ａ、Ｐ２１９Ｒから成る群から選択される１つ以上の修飾、および配列番号２に記載されるようなアミノ酸残基１９６〜２０１からの任意の３つの連続したアミノ酸の欠失を含有してもよい。本発明のｅＨＴＰのうちのいずれかは、配列番号２、配列番号８、配列番号１８２、もしくは配列番号１８４のうちのいずれかに記載されるような基本的な自然発生のバチルス・チューリンゲンシスタンパク質と比較して、増加した溶解度を呈するようにさらに修飾することができ、ｅＨＴＰは、配列番号２に記載されるようなアミノ酸配列に対して少なくとも１つ以上のアミノ酸配列修飾を含有する。修飾（複数を含む）は、少なくとも、配列番号２内の５８、５９、１９８、１９９、２０１、もしくは２０２として定義されるアミノ酸位置のうちの１つ以上におけるリジン置換；配列番号２内の１９８、２４８、もしくは３０１として定義されるアミノ酸位置のうちの１つ以上におけるグルタミン酸残基置換；または配列番号２内の２４６、２５０、もしくは２５３として定義されるアミノ酸位置のうちの１つ以上におけるアルギニン残基置換を含有する。配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号
６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号２０２、および配列番号２０４、またはこれらの昆虫阻害断片から成る群から選択されるアミノ酸配列を有するｅＨＴＰが、本発明の好ましい実施形態である。本発明のｅＨＴＰによって阻害される標的の半翅目有害生物種としては、少なくとも、リグス・ヘスペルス、リグス・リネオラリス（Ｌｙｇｕｓ  ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）、エムポアスカ・ファバエ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ）、およびアムラスカ・デバスタンス（Ａｍｒａｓｃａ  ｄｅｖａｓｔａｎｓ）、ならびに互いに系統発生学的に関連する、または植物を摂食するために突刺および吸汁手法を使用する、半翅目内の他の有害生物が挙げられる。
【００１０】
有害生物を半翅目阻害量の本発明のｅＨＴＰと接触させることによって、半翅目の有害生物を制御する方法、ならびに少なくとも、半翅目制御量（もしくは半翅目阻害量）の本発明のｅＨＴＰのうちの１つ以上を含有する、昆虫阻害組成物が提供される。ある実施形態において、本明細書において開示されるｅＨＴＰのうちのいずれかを含む昆虫阻害組成物が提供される。これらの方法のある実施形態において、半翅目の有害生物は、綿畑、大豆畑、またはアルファルファ畑にいる。半翅目毒性もしくは半翅目制御組成物は、少なくとも１つ以上のｅＨＴＰとともに、昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子、および昆虫阻害化学物質から成る群から選択される補助的薬剤を含有することができる。これらの薬剤の各々は、半翅目制御特性を呈することができるか、鱗翅目種もしくは鞘翅目種といった半翅目種に関連しない有害生物を制御するための特性を呈することができるか、または１つ以上の半翅目種および１つ以上の鱗翅目もしくは鞘翅目種が同時に制御される二重方式の作用特性を呈し得る。
【００１１】
本発明のｅＨＴＰをコードする組み換えポリヌクレオチドが提供される。本発明のポリヌクレオチドを含有する微生物もまた、提供され、かかる微生物内のかかるポリヌクレオチドは、動作的に連結された機能的な遺伝子調節要素から本発明のｅＨＴＰを発現するように設計される発現カセット内に機能的に位置付けられる。微生物は、細菌細胞、ならびにトランスジェニック植物細胞を含むことが意図される。かかるトランスジェニック植物細胞は、同様に組み換えポリヌクレオチドを含有する全植物、または植物部分へ再生させることができる。各々が半翅目阻害量のｅＨＴＰを発現する、細菌細胞、またはトランスジェニック植物細胞、植物、もしくは植物部分にかかわらず、微生物に有害生物を曝露することによって、半翅目の有害生物を制御する方法もまた、提供される。組み換えポリヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号２０１、および配列番号２０３、または本発明のタンパク質のうちの１つ以上をコードするように組み立てることができる他の配列から成る群から選択されるヌクレオチド配列を含有してもよい。ある実施形態において、組み換えポリヌクレオチドは、組み換えポリヌクレオチドによってコードされるｅＨＴＰとは異なる、１つ以上の昆虫阻害剤をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことができる。トランスジェニック植物部分は、種子、実、葉、花、花粉、茎、根、またはこれらの任意の部分である。トランスジェニック植物部分は、種子、実、葉、花、茎、または根の再生不可能な部分であってもよい。また、半翅目の有害生物を制御する方法も提供され、トランスジェニック微生物、細菌、植物細胞、植物、または植物部分を、標的有害生物に曝露することを含み、微生物、細菌、植物細胞、植物、または植物部分は、組み換えポリヌクレオチドによってコードされる、半翅目阻害量のｅＨＴＰを発現する。
【００１２】
検出可能な量のｅＨＴＰをコードする組み換えポリヌクレオチド、またはその任意の特徴的な半翅目制御部分を含有する、加工された植物産物もまた、提供される。かかる加工された産物としては、植物バイオマス、油、食事、動物飼料、小麦粉、フレーク、ふすま、リント、外皮、および加工された種子が挙げられるが、これらに限定されない。加工された産物は、再生不可能であってもよい。
【００１３】
組み換えポリヌクレオチドを植物細胞に導入すること、および組み換えポリヌクレオチドによってコードされる昆虫阻害量のｅＨＴＰを発現するトランスジェニック植物を選択することによって、トランスジェニック植物を作製する方法もまた、提供される。該方法は、本明細書において提供されるｅＨＴＰのうちのいずれかをコードする組み換えポリヌクレオチドを植物細胞に導入することと、組み換えポリヌクレオチドによってコードされる昆虫阻害量のｅＨＴＰを発現するトランスジェニック植物を選択することと、を含む。
【００１４】
本発明の他の実施形態、特性、および利点は、以下の発明を実施するための形態、実施例、および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ｅＨＴＰタンパク質濃度に対してプロットされるリグス種の致死率を例解する。図１Ａは、自然発生のＴＩＣ８０７タンパク質を含有する対照試料と比較した、種々の濃度の４つの異なるｅＨＴＰに応答する、リグス・ヘスペルス個体群の致死率を例解する。図１Ｂは、自然発生のＴＩＣ８０７タンパク質を含有する対照試料と比較した、種々のタンパク質濃度の３つの異なるｅＨＴＰに応答する、リグス・リネオラリス個体群の致死率を例解する。
【図２】ＴＩＣ８０７もしくは関連するタンパク質内の同じアミノ酸位置の相対位置と比較して、毒性効果を増加させる、および／または宿主域特異性を広げる、結果をもたらすのに有効な変化の相対位置を示す、本発明の半翅目毒性タンパク質の原子構造のリボン図を例解する。２つの表面パッチが、リボン図における原子構造内の特定の残基位置を囲む球体によって例解される：［１］１つの球体は、Ｓ９５（配列番号２に記載されるようなＳ９５位に対する）のベータ炭素原子からの約９．２〜約１２．２オングストロームの原子半径を有する；［２］別の球体は、Ｐ２１９（配列番号２に記載されるようなＰ２１９位に対する）のベータ炭素原子からの約９．２〜約１２．２オングストロームの原子半径を有する。これらの球体内にあるリボン構造内のアミノ酸への変化は、その特定の位置において自然発生のアミノ酸を有するタンパク質と比較して、増加した毒性特性およびより広い宿主域毒性効果を引き起こす結果をもたらすのに有効である。
【図３】互いに、および自然発生のＴＩＣ８０７タンパク質と比較した、１３の異なるｅＨＴＰに関するリグス種の個体群致死率を例解するチャート図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本出願は、ｅＨＴＰ（操作された半翅目種毒性タンパク質）を説明する。本発明のｅＨＴＰは、当該技術分野においては既知であり、先行技術のタンパク質は、１つ以上の半翅目の有害生物種を対象とする改善された毒性特性を呈するように操作されず、広い宿主域レベルの阻害活性を呈しないため、ｅＨＴＰという用語の範囲および定義内ではないと見なされる、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８５３、Ｃｒｙ５１Ａａ１、およびＡＸＭＩ−１７１といったタンパク質からは区別されるものとする。ｅＨＴＰは、驚くべきことに、かつ予想外に、半翅目および関連する有害生物種に対して高レベルの毒性活性を呈する。さらにより予想外であり、かつ驚くべき、これらのｅＨＴＰのさらなる特性は、これらのタンパク質が、本発明のｅＨＴＰに対する基本的基盤を提供する前駆タンパク質と比較して、より広い宿主域の毒性特性を呈するという発見である。ＴＩＣ８０７（配列番号２）、Ｃｒｙ５１Ａａ１（配列番号８）、ＴＩＣ８５３（配列番号１８４）、およびＡＸＭＩ−１７１（配列番号２０６）といった、基本的またはベースライン骨格毒素タンパク質は、本発明のｅＨＴＰタンパク質の生物学的な抗半翅目活性または宿主域の幅および範囲を呈しない。
【００１７】
バチルス・チューリンゲンシス種に由来する半翅目毒性タンパク質の２０００超の異なるアミノ酸配列変異体が試験されて、ベースライン骨格タンパク質であるＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８５３、およびＣｒｙ５１Ａａ１のスペクトルおよび活性と比較した時、拡大された半翅目種の宿主域阻害スペクトルをもたらし、また、劇的に増加した半翅目種の阻害活性も提供する、本明細書において説明される特異的なアミノ酸挿入、置換、または欠失を識別した。アミノ酸残基は、（ａ）骨格タンパク質のうちの１つ以上に対して、増強された半翅目阻害スペクトルおよび／もしくは改善されたリグス阻害活性をもたらすように修飾することができる、（ｂ）骨格タンパク質のうちの１つ以上の折り畳み構造を呈する、折り畳まれた昆虫阻害タンパク質の表面パッチにおいて蓄積する、ならびに／または（ｃ）半翅目種を制御する、およびｅＨＴＰタンパク質によって影響される半翅目種の範囲を広げるための、得られるｅＨＴＰタンパク質の平均有効用量を減少させる結果をもたらすのに有効な、骨格タンパク質アミノ酸配列のうちの１つ以上の特定の位置で生じる、ベースライン骨格タンパク質において、識別される。
【００１８】
半翅目の有害生物種は、標的植物の外側表面を切り裂くもしくは突刺することによって、植物および植物組織を摂食し、次いで、たまった滲出物を吸汁するもしくは吸い込むことによって、切り裂きもしくは突刺位置にたまる浸軟された植物滲出物を消費する昆虫を意味することが意図される。かかる昆虫としては、以下の植物虫の一覧を含むが、これらに限定されない、成虫および幼虫が挙げられる：カスミカメムシ科、セミ科からのセミ、オオヨコバイ科からのヨコバイ（例えば、エムポアスカ種、アムラスカ種）、ビワハゴロモ上科およびウンカ科からのウンカ、ツノゼミ科からのツノゼミ、キジラミ科からのキジラミ、コナジラミ科からのコナジラミ、アブラムシ科からのアブラムシ、ネアブラムシ科からのネアブラムシ、コナカイガラムシ科からのコナカイガラムシ、カタカイガラムシ科、マルカイガラムシ科、およびワタフキカイガラムシ科からのカイガラムシ、グンバイムシ科からのグンバイムシ、カメムシ科からのカメムシ、ナガカメムシ科からのナガカメムシ（例えば、ブリッサス（Ｂｌｉｓｓｕｓ）種）ならびに他の種子虫、アワフキムシ科からのアワフキムシ、ヘリカメムシ科からのヘリカメムシ、ならびにホシカメムシ科からのツツガムシおよびアカホシカメムシ。半翅目からの他の有害生物としては、アクロステルヌム・ヒラレ（Ａｃｒｏｓｔｅｒｎｕｍ  ｈｉｌａｒｅ）（アオカメムシ）、アナサ・トリスティス（Ａｎａｓａ  ｔｒｉｓｔｉｓ）（ヘリカメムシ）、ブリッサス・ロイコプテルス・ロイコプテルス（Ｂｌｉｓｓｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ  ｌｅｕｃｏｐｔｅｒｕｓ）（ヒメコバネナガカメムシ）、コリスカ・ゴシピイ（Ｃｏｒｙｔｈｕｃａ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ）（コットンレースバグ（ｃｏｔｔｏｎ  ｌａｃｅ  ｂｕｇ））、シルトペルティス・モデスタ（Ｃｙｒｔｏｐｅｌｔｉｓ  ｍｏｄｅｓｔａ）（トマトバグ（ｔｏｍａｔｏ  ｂｕｇ））、ディスデルクス・スツレルス（Ｄｙｓｄｅｒｃｕｓ  ｓｕｔｕｒｅｌｌｕｓ）（アカホシカメムシ）、ユースキスツス・セルバス（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｓｅｒｖｕｓ）（ブラウンスティンクバグ（ｂｒｏｗｎ  ｓｔｉｎｋ  ｂｕｇ））、ユースキスツス・バリオラリウス（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｖａｒｉｏｌａｒｉｕｓ）（ワンスポッテッドスティンクバグ（ｏｎｅ−ｓｐｏｔｔｅｄ  ｓｔｉｎｋ  ｂｕｇ））、グラプトステツス（Ｇｒａｐｔｏｓｔｅｔｈｕｓ）種（種子虫の複合）、レプトグロッスス・コルクルス（Ｌｅｐｔｏｇｌｏｓｓｕｓ  ｃｏｒｃｕｌｕｓ）（リーフ・フッテッドパインシードバグ（ｌｅａｆ−ｆｏｏｔｅｄ  ｐｉｎｅ  ｓｅｅｄ  ｂｕｇ））、リグス・リネオラリス（ミドリメクラガメ）、リグス・ヘスペルス（ウエスタンターニッシュプラントバグ（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｔａｒｎｉｓｈ  ｐｌａｎｔ  ｂｕｇ））、ネザラ・ビリヅラ（Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｉｄｕｌａ）（ミナミアオカメムシ）、オエバルス・プグナクス（Ｏｅｂａｌｕｓ  ｐｕｇｎａｘ）（イネカメムシ）、オンコペルツス・ファスシアツス（Ｏｎｃｏｐｅｌｔｕｓ  ｆａｓｃｉａｔｕｓ）（ラージミルクウィードバグ（ｌａｒｇｅ  ｍｉｌｋｗｅｅｄ  ｂｕｇ））、およびシューダトモスセリス・セリアツス（Ｐｓｅｕｄａｔｏｍｏｓｃｅｌｉｓ  ｓｅ��ｉａｔｕｓ）（ワタノミハムシ）が挙げられる。より具体的には、オオヨコバイ科としては、エンポアスシニ（Ｅｍｐｏａｓｃｉｎｉ）族、例えば、アムラスカ・ビグッチュラ（Ａｍｒａｓｃａ  ｂｉｇｕｔｔｕｌａ）、アムラスカ・デバスタンス、アウストロアスカ・ヴィリジグリセア（Ａｕｓｔｒｏａｓｃａ  ｖｉｒｉｄｉｇｒｉｓｅａ）、アシンメトラスカ・デセデンス（Ａｓｙｍｍｅｔｒａｓｃａ  ｄｅｃｅｄｅｎｓ）、エムポアスカ・デシピエンス（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｄｅｃｉｐｉｅｎｓ）、エムポアスカ・ディスティングエンダ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｄｉｓｔｉｎｇｕｅｎｄａ）、エムポアスカ・ドリチ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｄｏｌｉｃｈｉ）、エムポアスカ・ファバエ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ）、エムポアスカ・ケリ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｋｅｒｒｉ）、エムポアスカ・クラエメリ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｋｒａｅｍｅｒｉ）、エムポアスカ・オヌキイ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｏｎｕｋｉｉ）、エムポアスカ・サカイイ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｓａｋａｉｉ）、エムポアスカ・スミチ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｓｍｉｔｈｉ）、エムポアスカ・ビティス（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｖｉｔｉｓ）、ヤコビアスカ・リビカ（Ｊａｃｏｂｉａｓｃａ  ｌｙｂｉｃａ）、ソナサスカ・ソラナ（Ｓｏｎａｓａｓｃａ  Ｓｏｌａｎａ）、エリスロニューリニ（Ｅｒｙｔｈｒｏｎｅｕｒｉｎｉ）族、例えば、エムポアスカナラ・ナグプレンシス（Ｅｍｐｏａｓｃａｎａｒａ  ｎａｇｐｕｒｅｎｓｉｓ）、タイアアサメンシス（Ｔｈａｉａａｓｓａｍｅｎｓｉｓ）、ジグニディア・クユミ（Ｚｙｇｎｉｄｉａ  ｑｕｙｕｍｉ）、ニルバニアエ（Ｎｉｒｖａｎｉａｅ）族、例えば、ソフォニア・ルフォファスシア（Ｓｏｐｈｏｎｉａ  ｒｕｆｏｆａｓｃｉａ）、ウンカ科、例えば、ニラパルヴァータ・ルーゲンス（Ｎｉｌａｐｏａｒｖａｔａ  ｌｕｇｅｎｓ）、ソガテラ・フルシフェラ（Ｓｏｇａｔｅｌｌａ  ｆｕｒｃｉｆｅｒａ）、サッポロトビウンカ（Ｕｎｋａｎｏｄｅｓ  ｓａｐｐｏｒｏｎｕｓ）、およびアシブトウンカ科、例えば、ゾフィウマ・ロブラタ（Ｚｏｐｈｉｕｍａ  ｌｏｂｕｌａｔａ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
本発明のｅＨＴＰは、骨格タンパク質のうちの１つ以上と比較して、７２（７２）の異なるアミノ酸位置におけるアミノ酸残基の置換および欠失を含む、１つ以上のアミノ酸配列修飾を含有する。かかる修飾は、ＴＩＣ８０７（配列番号２）、またはＴＩＣ８０７＿Ｍ２（配列番号８）、Ｃｒｙ５１Ａａ１（配列番号１８２）、およびＴＩＣ８５３（配列番号１８４）といった、関連するタンパク質を含むが、これらに限定されない、骨格タンパク質のうちの１つ以上と比較した時、半翅目昆虫に対する増加した毒性および／または増強された阻害スペクトルを伴うｅＨＴＰを提供する。ｅＨＴＰは、限定されないが、配列番号１８０として記載されるアミノ酸配列において「Ｘ」として説明される、これらの７２の位置のうちのいずれかにおける、少なくとも１つのアミノ酸置換または１つのアミノ酸欠失の修飾を含むが、配列番号２、配列番号８、配列番号１８２、または配列番号１８４のアミノ酸配列を含まない。本発明のｅＨＴＰはまた、ベースラインもしくは骨格タンパク質のスペクトルおよび活性と比較した時、増強された半翅目阻害スペクトルおよび／または改善された半翅目阻害活性を呈する。
【００２０】
ｅＨＴＰは、段落［０００９］において上に記載されるように、ＴＩＣ８０７（配列番号２）の相対位置の少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。ｅＨＴＰはまた、これらの前述のアミノ酸置換および／または欠失のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、またはそれ以上を含むことができ、かつこれらのアミノ酸置換および／または欠失のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、またはそれ以上、ならびに配列番号２の残基１９６〜２０１内の任意の３つの隣接するアミノ酸の欠失を含むこともできる。したがって、ｅＨＴＰは、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３４、配列番号１３５、配列番号１３６、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４、配列番号１４５、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５１、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５５、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６０、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７４、配列番号１７５、配列番号１７６、配列番号１７７、配列番号１７８、配列番号１７９、配列番号２０２、および配列番号２０４として記載されるタンパク質、ならびにその昆虫阻害断片を含む。
【００２１】
本発明のｅＨＴＰは、少なくとも１つのアミノ酸位置において、異なるアミノ酸残基が、（ｉ）骨格タンパク質のうちの任意の１つ以上における同じ残基位置と比較して、少なくとも約１５％〜少なくとも約３６％の相対的アミノ酸溶媒露出度を有する、ならびに／または（ｉｉ）骨格タンパク質のうちの１つ以上の１次アミノ酸配列における対応するアミノ酸残基位置と比較して、少なくとも約１５％〜少なくとも約３６％の相対的溶媒露出度を有するアミノ酸から約３つの連続したアミノ酸残基の距離内に位置する、配列番号２（ＴＩＣ８０７）を含む、骨格タンパク質のうちの任意の１つ以上とは異なる任意のアミノ酸配列を呈し、骨格タンパク質のうちの１つ以上と相関する活性と比較した時、広がった半翅目阻害スペクトルおよび／もしくは増加した半翅目阻害活性を呈する。「増加したスペクトル」という語は、特定の単一の有害生物に対する毒性効果を呈する２つの異なるタンパク質に関して、増加したスペクトルを呈するタンパク質が、その特定の単一の有害生物、ならびに同じ系統発生学的な目内の１つ以上の他の有害生物、または特定の単一の有害生物が属する目以外の１つ以上の異なる系統発生学的な目内の１つ以上の他の有害生物に対する毒性効果を呈するということを意味することが意図される。「増加した半翅目阻害活性」という語は、かかる増加した活性を呈する特定のタンパク質が、標準化された条件下で、特定の単一の有害生物における致死率、発育阻止、有病率、摂食の停止、または別の測定可能な表現型効果といった特定の影響を達成するように、対照タンパク質よりも、より低い量のそのタンパク質を必要とするということを意味することが意図される。
【００２２】
ｅＨＴＰは、折り畳まれた昆虫阻害タンパク質の２つの異なる表面パッチのうちの少なくとも１つ内に位置する、少なくとも１つのアミノ酸残基において、特に、ＴＩＣ８０７を含む、骨格タンパク質のうちの１つ以上とは異なるアミノ酸配列を呈する（図２および表３のデータを参照されたい）。１つの表面パッチは、そのタンパク質が生理学的条件下で３次元構造に折り畳まれる時、配列番号２に記載されるようなＳｅｒ９５のベータ炭素（Ｃｂ）原子に対して、約９．２〜約１２．２オングストロームの原子半径を有する球体（図２、球体［１］）内に包含されるアミノ酸残基を含むとして定義され、これは、残基Ｔｈｒ９３、Ｓｅｒ９５、Ｓｅｒ９７、Ｐｈｅ１４７、Ｇｌｎ１４９、Ｓｅｒ１５１、Ａｓｎ１８０、Ｔｈｒ１８２、Ｖａｌ２５１、Ｇｌｎ２５３、およびＳｅｒ２５５を含む。本明細書において使用される際、「Ｃｂ原子」という句は、アミノ酸残基側鎖におけるベータ炭素原子を指す。このため、Ｃｂ原子は、グリシル残基を除いて、全てのアミノ酸残基に存在するタンパク質側鎖における最初の炭素である。図１を参照すると、ｅＨＴＰは、表面パッチ［１］のアミノ酸残基Ｔ９３、Ｓ９５、Ｓ９７、Ｆ１４７、Ｑ１４９、Ｓ１５１、Ｎ１８０、Ｔ１８２、Ｖ２５１、Ｑ２５３、およびＳ２５５、または骨格タンパク質のうちの１つ以上、特に、配列番号２（ＴＩＣ８０７）内の同等のアミノ酸の１つ以上の保存的もしくは非保存的置換を含むことができるが、これらに限定されない。ｅＨＴＰは、Ｔ９３Ａ；Ｓ９５Ａ、Ｓ９５Ｖ、Ｓ９５Ｌ、もしくはＳ９５Ｉ；Ｆ１４７Ｔ、Ｆ１４７Ｃ、Ｆ１４７Ｄ、Ｆ１４７Ｇ、Ｆ１４７Ｅ、Ｆ１４７Ｙ、Ｆ１４７Ｍ、Ｆ１４７Ｎ、Ｆ１４７Ｑ、Ｆ１４７Ｈ、Ｆ１４７Ｒ、Ｆ１４７Ｗ、Ｆ１４７Ｐ、Ｆ１４７Ａ、Ｆ１４７Ｖ、Ｆ１４７Ｌ、もしくはＦ１４７Ｉ；Ｑ１４９Ａ、Ｑ１４９Ｃ、Ｑ１４９Ｆ、Ｑ１４９Ｅ、もしくはＱ１４９Ｄ；Ｓ１５１Ａ；Ｎ１８０Ｄ；Ｔ１８２Ａ；Ｖ２５１Ｅ、もしくはＶ２５１Ａ、および／またはＱ２５３Ｒといった、表面パッチ［１］のアミノ酸残基の１つ以上の置換を含むことができるが、これらに限定されない。本発明のｅＨＴＰの形態において、改善された半翅目阻害生物活性を与える結果をもたらすのに効果的な、修飾に受容的である、アミノ酸残基として識別されている、他方のまたは第２の表面パッチは、適用可能な骨格タンパク質のうちのいずれか１つが生理学的条件下で３次元構造に折り畳まれる時、Ｐｒｏ２１９のベータ炭素原子、または、特に、配列番号２に記載されるような骨格タンパク質のうちの１つ以上における同等のアミノ酸位置に対して、約９．２〜約１２．２オングストロームの原子半径を有する球体（図２、球体［２］）内に包含されるアミノ酸残基を含むとして定義され、これは、残基Ｖａｌ１０、Ｉｌｅ１４、Ａｓｎ２２、Ａｓｎ２３、Ｇｌｙ２４、Ｉｌｅ２５、Ｇｌｎ２６、Ｇｌｙ２７、Ｐｈｅ３０、Ｇｌｎ３８、Ｉｌｅ３９、Ａｓｐ４０、Ｔｈｒ４１、Ｉｌｅ４３、Ｓｅｒ１９３、Ｔｈｒ１９４、Ｇｌｕ１９５、Ｈｉｓ１９６、Ｔｙｒ１９７、Ｓｅｒ１９８、Ｈｉｓ１９９、Ｔｙｒ２００、Ｓｅｒ２０１、Ｇｌｙ２０２、Ｔｙｒ２０３、Ｐｒｏ２０４、Ｉｌｅ２０５、Ｌｅｕ２０６、Ｔｈｒ２０７、Ｔｒｐ２０８、Ｉｌｅ２０９、Ｓｅｒ２１０、Ｔｙｒ２１６、Ｓｅｒ２１７、Ｇｌｙ２１８、Ｐｒｏ２１９、Ｐｒｏ２２０、Ｍｅｔ２２１、Ｓｅｒ２２２、Ｔｒｐ２２３、Ｔｙｒ２２４、Ｐｈｅ２２５、Ａｓｎ２３９、およびＶａｌ２４４を含む。かかるｅＨＴＰは、配列番号２（ＴＩＣ８０７）のＶａｌ１０、Ｉｌｅ１４、Ａｓｎ２２、Ａｓｎ２３、Ｇｌｙ２４、Ｉｌｅ２５、Ｇｌｎ２６、Ｇｌｙ２７、Ｐｈｅ３０、Ｇｌｎ３８、Ｉｌｅ３９、Ａｓｐ４０、Ｔｈｒ４１、Ｉｌｅ４３、Ｓｅｒ１９３、Ｔｈｒ１９４、Ｇｌｕ１９５、Ｈｉｓ１９６、Ｔｙｒ１９７、Ｓｅｒ１９８、Ｈｉｓ１９９、Ｔｙｒ２００、Ｓｅｒ２０１、Ｇｌｙ２０２、Ｔｙｒ２０３、Ｐｒｏ２０４、Ｉｌｅ２０５、Ｌｅｕ２０６、Ｔｈｒ２０７、Ｔｒｐ２０８、Ｉｌｅ２０９、Ｓｅｒ２１０、Ｔｙｒ２１６、Ｓｅｒ２１７、Ｇｌｙ２１８、Ｐｒｏ２１９、Ｐｒｏ２２０、Ｍｅｔ２２１、Ｓｅｒ２２２、Ｔｒｐ２２３、Ｔｙｒ２２４、Ｐｈｅ２２５、Ａｓｎ２３９、およびＶａｌ２４４を含む、表面パッチ［２］内の１つ以上の保存的もしくは非保存的アミノ酸残基置換および／または１つ以上のアミノ酸欠失を含むことができるが、これらに限定されない。ｅＨＴＰは、配列Ｈｉｓ１９６、Ｔｙｒ１９７、Ｓｅｒ１９８、Ｈｉｓ１９９、Ｔｙｒ２００、Ｓｅｒ２０１；Ｓｅｒ２１７Ａｓｎ、Ｓｅｒ２１７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ２１７Ａｒｇ；および／またはＰｒｏ２１９Ａｒｇ、Ｐｒｏ２１９Ａｓｎ、Ｐｒｏ２１９Ｇｌｎにおける、任意の３つの隣接するアミノ酸残基の欠失といった、表面パッチ［２］内に位置するアミノ酸残基内の１つ以上の置換および／または欠失を含むことができるが、これらに限定されない。ｅＨＴＰは、配列Ｈｉｓ１９６、Ｔｙｒ１９７、Ｓｅｒ１９８、Ｈｉｓ１９９、Ｔｙｒ２００、Ｓｅｒ２０１；Ｓｅｒ２１７Ａｓｎ、Ｓｅｒ２１７Ｇｌｎ、Ｓｅｒ２１７Ａｒｇ；および／またはＰｒｏ２１９Ａｒｇ、Ｐｒｏ２１９Ａｓｎ、Ｐｒｏ２１９Ｇｌｎにおける、任意の３つの隣接するＨｉｓＴｙｒＳｅｒ残基の欠失といった、表面パッチ［２］内の１つ以上のアミノ酸残基置換および／または欠失を含むことができるが、これらに限定されない。ｅＨＴＰは、折り畳まれた昆虫阻害タンパク質の２つの前述の表面パッチの各々において、少なくとも１つのアミノ酸修飾を有することができる。ｅＨＴＰは、配列番号２（ＴＩＣ８０７）に関する、残基Ｔ９３、Ｓ９５、Ｆ１４７、Ｑ１４９、Ｓ１５１、Ｎ１８０、Ｔ１８２、Ｈ１９６、Ｙ１９７、Ｓ１９８、Ｈ１９９、Ｙ２００、Ｓ２０１、Ｗ２０８、Ｓ２１７、Ｐ２１９、Ｗ２２３、Ｎ２３９、Ｖ２４４、もしくはＶ２５１において、１つ、または２つ以上の修飾の組み合わせを有することができる。保存的アミノ酸変化は、酸性、塩基性、中性極性、または中性非極性タイプのアミノ酸を、同じタイプの別のアミノ酸で置換することによって行うことができる。非保存的アミノ酸変化は、酸性、塩基性、中性極性、または中性非極性アミノ酸タイプを、異なるタイプのアミノ酸で置換することによって行うことができる。さらに、表４Ｂに列記されるｅＨＴＰタンパク質のうち、全ての２６７は、骨格タンパク質ＴＩＣ８０７を含む、骨格タンパク質のうちの１つ以上と比較した時、リグス種に対して増加した毒性を呈する、アミノ酸配列変異体である。これらのアミノ酸配列変異体のうちの１０のみが、２つの言及された表面パッチの外側に位置する骨格タンパク質のうちの１つ以上と比較して、修飾されたアミノ酸残基を呈する。
【００２３】
先行技術は、骨格タンパク質と関連付けられる溶解度問題を教示する。ｅＨＴＰは、骨格タンパク質のうちの１つ以上の観察された溶解度プロファイルとは対照的に、骨格タンパク質と比較して改善された溶解度を呈し、かつ概して、９．０未満のｐＨにおいて増加した溶解度を呈する。より生理学的なｐＨにおけるこの増加した溶解度は、ｅＨＴＰが、大腸菌において、植物細胞において、植物細胞細胞質、植物細胞アポプラストにおいて、または植物細胞の色素体において発現される、もしくは植物細胞の色素体への輸送のために標的化される時、顕著である。配列番号２（ＴＩＣ８０７）を含む、骨格タンパク質のうちの１つ以上に対して溶解度を改善するアミノ酸修飾としては、ＴＩＣ８０７、または他の骨格タンパク質のうちのいずれかにおける適用可能な残基における、以下のアミノ酸位置：５８、５９、１９８、１９９、２０１、もしくは２０２のうちの１つ以上における、リジンアミノ酸残基の置換；またはアミノ酸位置１９８、２４８、もしくは３０１のうちの１つ以上におけるグルタミン酸アミノ酸残基の置換；またはアミノ酸位置２４６、２５０、もしくは２５３のうちの１つ以上におけるアルギニンアミノ酸残基の置換が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２４】
上で説明されるｅＨＴＰを含む昆虫阻害組成物もまた、提供される。かかる組成物は、組成物に含まれるｅＨＴＰとは異なる、少なくとも１つの追加の昆虫阻害剤をさらに含んでもよい。昆虫阻害剤は、昆虫阻害タンパク質、昆虫阻害ｄｓＲＮＡ分子、および昆虫有害生物を制御する上で有用な１つ以上の化学的薬剤を含む、任意の数の昆虫阻害剤から選択される。追加の阻害剤の例としては、ＴＩＣ１４１５タンパク質、トビイロウンカの半翅目のオルソログを対象とするｄｓＲＮＡ、Ｖ−ＡＴＰａｓｅ−Ｅ、２１Ｅ０１、アクチンオルソログの半翅目のオルソログを対象とするｄｓＲＮＡ、ＡＤＰ／ＡＴＰトランスロカーゼ、α−チューブリン、リボソームタンパク質Ｌ９（ＲＰＬ９）、またはＶ−ＡＴＰａｓｅ  Ａサブユニット、ＡＸＭＩ−１７１（第ＵＳ２０１００２９８２０７Ａ１号）、Ｃｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ４Ａａ、Ｃｒｙ１１Ａａ、およびＣｙｔ１Ａａ、ＤＩＧ１１、ＤＩＧ５、Ｃｒｙ７、ｅＣｒｙ３．１Ａｂ、ｍＣｒｙ３Ａ、Ｃｒｙ８、Ｃｒｙ３４／Ｃｒｙ３５、Ｃｒｙ３、ＤＩＧ２、Ｃｒｙ１、Ｃｒｙ１Ａ．１０５、Ｃｒｙ２、Ｃｒｙ１Ｆ、ＶＩＰ３、５３０７、およびＣｒｙ９が挙げられるが、これらに限定されない。半翅目種を制御する上で有用な化学的薬剤としては、ピレトリンおよび合成ピレスロイド；オキサジジン（ｏｘａｄｉｚｉｎｅ）誘導体；クロロニコチニル；ニトログアニジン誘導体；トリアゾール；有機リン酸；ピロール；ピラゾール；フェニルピラゾール；ジアシルヒドラジン；生物学的／発酵産物；およびカルバメートが挙げられるが、これらに限定されない。これらのカテゴリ内の既知の駆除剤は、Ｔｈｅ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｍａｎｕａｌ，１１ｔｈ  Ｅｄ．，Ｃ．Ｄ．Ｓ．Ｔｏｍｌｉｎ，Ｅｄ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｒｏｐ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｃｉｌ，Ｆａｒｎｈａｍ，Ｓｕｒｒｙ，ＵＫ（１９９７）に列記される。
【００２５】
本組成物において有用であるピレスロイドとしては、ピレトリンおよび合成ピレスロイドが挙げられる。本方法における使用に好ましいピレトリンとしては、限定することなく、２，２−ジメチル−３−（２メチルプロペニル）−シクロプロパンカルボン酸の２−アリル−４−ヒドロキシ−３−メチル−２−シクロペンテン−１−オンエステル、ならびに／または（２−メチル−１−プロペニル）−２−メトキシ−４−オキソ−３−（２  プロペニル）−２−シクロペンテン−１−イルエステル、ならびにこれらのシスおよびトランス異性体の混合物が挙げられる（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  Ｎｕｍｂｅｒ（「ＣＡＳ  ＲＮ」）８００３−３４−７）。
【００２６】
本発明における使用に好ましい合成ピレスロイドとしては、（ｓ）−シアノ（３−フェノキシフェニル）メチル４−クロロアルファ（１−メチルエチル）ベンゼンアセテート（フェンバレレート、ＣＡＳ  ＲＮ５１６３０−５８−１）、（Ｓ）−シアノ（３−フェノキシフェニル）メチル（Ｓ）−４−クロロ−アルファ−（１−メチルエチル）ベンゼンアセテート（エスフェンバレレート、ＣＡＳ  ＲＮ６６２３０−０４−４）、（３−フェノキシフェニル）−メチル（＋）シス−トランス−３−（２，２−ジクロロ（ｄｉｃｈｏｒｏ）エテニル）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシレート（ペルメトリン、ＣＡＳ  ＲＮ５２６４５−５３−１）、（±）アルファ−シアノ−（３−フェノキシフェニル）メチル（＋）−シス，トランス−３−（２，２−ジクロロエテニル）−２，２−ジメチル−シクロプロパンカルボキシレート（シペルメトリン、ＣＡＳ  ＲＮ５２３１５−０７−８）、（ベータ−シペルメトリン、ＣＡＳ  ＲＮ６５７３１−８４−２）、（シータシペルメトリン、ＣＡＳ  ＲＮ７１６９７−５９−１）、Ｓ−シアノ（３−フェノキシフェニル）メチル（±）シス／トランス３−（２，２−ジクロロエテニル）２，２ジメチルシクロプロパンカルボキシレート（ゼータ−シペルメトリン、ＣＡＳ  ＲＮ５２３１５−０７−８）、（ｓ）−アルファ−シアノ−３−フェノキシベンジル（ＩＲ，３Ｒ）−３−（２，２−ジブロモビニル）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシレート（デルタメトリン、ＣＡＳ  ＲＮ５２９１８−６３−５）、アルファ−シアノ−３−フェノキシベンジル２，２，３，３，−テトラメチルシクロプロパン（ｐｒｏｐｏａｎｅ）カルボキシレート（フェンプロパトリン、ＣＡＳ  ＲＮ６４２５７−８４−７）、（ＲＳ）−アルファ−シアノ−３−フェノキシベンジル（Ｒ）−２−［２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）アニリノ］−３−メチルブタノエート（タウ−フルバリネート、ＣＡＳ  ＲＮ１０２８５１−０６−９）、（２，３，５，６−テトラフルオロ−４−メチルフェニル）−メチル−（１アルファ，３アルファ）−（Ｚ）−（±）−３−（２−クロロ−３，３，３−トリフルオロ−１−プロペニル）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシレート（テフルトリン、ＣＡＳ  ＲＮ７９５３８−３２−２）、（±）−シアノ（３−フェノキシフェニル）メチル（±）−４−（ジフルオロメトキシ）−アルファ−（１−メチルエチル）ベンゼンアセテート（フルシトリネート、ＣＡＳ  ＲＮ７０１２４−７７−５）、シアノ（４−フルオロ−３−フェノキシフェニル）メチル３−［２−クロロ−２−（４−クロロフェニル）エテニル］−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシレート（フルメトリン、ＣＡＳ  ＲＮ６９７７０−４５−２）、シアノ（４−フルオロ−３−フェノキシフェニル）メチル３−（２，２−ジクロロエテニル）−２，２−ジメチル−シクロプロパンカルボキシレート（ｄａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）（シフルトリン、ＣＡＳ  ＲＮ６８３５９−３７−５）、（ベータシフルトリン、ＣＡＳ  ＲＮ６８３５９−３７−５）、（トランスフルトリン、ＣＡＳ  ＲＮ１１８７１２−８９−３）、（Ｓ）−アルファ−シアノ−３−フェノキシベンジル（Ｚ）−（ＩＲ−シス）−２，２−ジメチル−３−［２−（２，２，２−トリフルオロ−トリフルオロメチル−エトキシカルボニル）ビニル］シクロプロパンカルボキシレート（アクリナトリン、ＣＡＳ  ＲＮ１０１００７−０６−１）、アルファ−シアノ−３−フェノキシベンジル−３−（２，２ジクロロビニル）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシレート（アルファ−シペルメトリン、ＣＡＳ  ＲＮ６７３７５−３０−８）の（ＩＲシス）Ｓおよび（ＩＳシス）Ｒエナンチオマー異性体対、［ＩＲ，３Ｓ）３（１’ＲＳ）（１’，２’，２’，２’−テトラブロモエチル）］−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボン酸（ｓ）−アルファ−シアノ−３−フェノキシベンジルエステル（トラロメトリン、ＣＡＳ  ＲＮ６６８４１−２５−６）、シアノ−（３−フェノキシフェニル）メチル２，２−ジクロロ−１−（４−エトキシフェニル）シクロプロパンカルボキシレート（シクロプロトリン、ＣＡＳ  ＲＮ６３９３５−３８−６）、［１α，３α（Ｚ）］−（±）−シアノ−（３−フェノキシフェニル）メチル３−（２−クロロ−３，３，３−トリフルオロ−１−プロペニル）−２，２−ジメチル（ｃｉｍｅｔｈｙｌ）シクロプロパンカルボキシレート（シハロトリン、ＣＡＳ  ＲＮ６８０８５−８５−８）、［１アルファ（ｓ），３アルファ（ｚ）］−シアノ（３−フェノキシフェニル）メチル−３−（２−クロロ−３，３，３−トリフルオロ−１−プロペニル）−２，２−ジメチルシクロプロパンカルボキシレート（ラムダシハロトリン、ＣＡＳ  ＲＮ９１４６５−０８−６）、（２−メチル［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル３−（２−クロロ−３，３，３−トリフルオロ−１−プロペニル）−２，２−ジメチル−シクロプロパンカルボキシレート（ビフェントリン、ＣＡＳ  ＲＮ８２６５７−０４−３）、５−１−ベンジル−３−フリルメチル−ｄ−シス（１Ｒ，３Ｓ，Ｅ）２，２−ジメチル−３−（２−オキソ，−２，２，４，５テトラヒドロチオフェニリデンメチル）シクロプロパンカルボキシレート（カデトリン、ＲＵ１５５２５、ＣＡＳ  ＲＮ５８７６９−２０−３）、［５−（フェニルメチル）−３−フラニル］−３−フラニル２，２−ジメチル−３−（２−メチル−１−プロペニル）シクロプロパンカルボキシレート（レスメトリン、ＣＡＳ  ＲＮ１０４５３−８６−８）、（１Ｒ−トランス）−［５−（フェニルメチル）−３−フラニル］メチル２，２−ジメチル−３−（２−メチル−１−プロペニル）シクロプロパンカルボキシレート（ビオレスメトリン、ＣＡＳ  ＲＮ２８４３４−０１−７）、３，４，５，６−テトラヒドロ−フタルイミドメチル−（ＩＲＳ）−シス−トランス−クリサンテメート（テトラメトリン、ＣＡＳ  ＲＮ７６９６−１２−０）、３−フェノキシベンジル−ｄ，１−シス，トランス２，２−ジメチル−３−（２−メチルプロペニル）シクロプロパンカルボキシレート（フェノトリン、ＣＡＳ  ＲＮ２６００２−８０−２）；（エンペントリン、ＣＡＳ  ＲＮ５４４０６−４８−３）；（シフェノトリン；ＣＡＳ  ＲＮ３９５１５−４０−７）、（プラレトリン、ＣＡＳ  ＲＮ２３０３１−３６−９）、（イミプロトリン、ＣＡＳ  ＲＮ７２９６３−７２−５）、（ＲＳ���−３−アリル−２−メチル−４−オキシクロペント（ｏｘｃｙｃｌｏｐｅｎｔ）−２−エニル−（１Ａ，３Ｒ；１Ｒ，３Ｓ）−２，２−ジメチル−３−（２−メチルプロプ−１−エニル）シクロプロパンカルボキシレート（アレトリン、ＣＡＳ  ＲＮ５８４−７９−２）、（ビオアレトリン、ＣＡＳ  ＲＮ５８４−７９−２）、および（ＺＸＩ８９０１、ＣＡＳ  ＲＮ１６０７９１−６４−０）が挙げられる。前述の合成ピレスロイドのうちの１つ以上の混合物もまた、本発明において使用することができると考えられる。特に好ましい合成ピレスロイドは、テフルトリン、ラムダシハロトリン、ビフェントリン、ペルメトリン、およびシフルトリンである。さらにより好ましい合成ピレスロイドは、テフルトリンおよびラムダシハロトリンであり、なおより好ましいのは、テフルトリンである。
【００２７】
オキサジアジン誘導体である殺虫剤は、主題発明において有用である。本発明における使用に好ましいオキサジアジン（ｏｘａｄｉｚｉｎｅ）誘導体は、米国特許第５，８５２，０１２号において識別されるものである。より好ましいオキサジアジン誘導体は、５−（２−クロロピリド−５−イルメチル）−３−メチル−４−ニトロイミノペルヒドロ−１，３，５−オキサジアジン、５−（２−クロロチアゾール−５−イルメチル）−３−メチル−４−ニトロイミノペルヒドロ−１，３，５−オキサジアジン、３−メチル−４−ニトロイミノ−５−（１−オキシド−３−ピリジノメチル）ペルヒドロ−１，３，５−オキサジアジン、５−（２−クロロ−１−オキシド−５−ピリジニオメチル）−３−メチル−４−ニトロイミノペルヒドロ−１，３，５−オキサジアジン（ｏｘｉｄｉａｚｉｎｅ）；および３−メチル−５−（２−メチルピリド−５−イルメチル）−４−ニトロイミノペルヒドロ−１，３，５−オキサジアジンである。さらにより好ましいのは、チアメトキサム（ＣＡＳ  ＲＮ１５３７１９−２３−４）である。
【００２８】
クロロニコチニル殺虫剤もまた、主題発明において有用である。主題組成物における使用に好ましいクロロニコチニルは、米国特許第５，９５２，３５８号に説明されており、それらとしては、アセタミプリド（（Ｅ）−Ｎ−［（６−クロロ−３−ピリジニル）メチル］−Ｎ’−シアノ−Ｎ−メチレンイミダミド（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｄａｍｉｄｅ）、ＣＡＳ  ＲＮ１３５４１０−２０−７）、イミダクロプリド（１−［（６−クロロ−３−ピリジニル）メトール］−Ｎ−ニトロ−２−イミダゾリジニミム（ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｉｍｉｍｅ）、ＣＡＳ  ＲＮ１３８２６１−４１−３）、およびニテンピラム（Ｎ−［（６−クロロ−３−ピリジニル）メチル］−Ｎ−エチル−Ｎ’−メチル−２−ニトロ−１，１−エテンジアミン、ＣＡＳ  ＲＮ１２０７３８−８９−８）が挙げられる。
【００２９】
ニトログアニジン殺虫剤は、本発明において有用である。かかるニトログアニジンとしては、米国特許第５，６３３，３７５号、第５，０３４，４０４号、および第５，２４５，０４０号において説明されるものが挙げられ得る。
【００３０】
本発明において有用であるピロール、ピラゾール、およびフェニルピラゾールとしては、米国特許第５，９５２，３５８号において説明されるものが挙げられる。好ましいピラゾールとしては、クロルフェナピル（４−ブロモ−２−（４−クロロフェニル）−１−エトキシメチル−５−トリフルオロメチルピロール−３−カルボニトリル、ＣＡＳ  ＲＮ１２２４５３−７３−０）、フェンピロキシメート（（Ｅ）−１，１−ジメチルエチル−４［［［［（１，３−ジメチル−５−フェノキシ−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）メチレン］アミノ］オキシ］メチル］ベンゾエート、ＣＡＳ  ＲＮ１１１８１２−５８−９）、およびテブフェンピラド（４−クロロ−Ｎ［［４−１，１−ジメチルエチル）フェニル］メチル］−３−エチル−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−カルボキサミド、ＣＡＳ  ＲＮ１１９１６８−７７−３）が挙げられる。好ましいフェニルピラゾールは、フィプロニル（５−アミノ−［２，６−ジクロロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−［（１Ｒ，Ｓ）−（トリフルオロメチル）スルフィニル］−１Ｈ−ピラゾール−３−カルボニトリル、ＣＡＳ  ＲＮ１２００６８−３７−３）である。
【００３１】
本発明において有用であるジアシルヒドラジンとしては、ハロフェノジド（４−クロロベンゾエート−２−ベンゾイル−２−（１，１−ジメチルエチル）−ヒドラジド、ＣＡＳ  ＲＮ１１２２２６−６１−６）、メトキシフェノジド（ＲＨ−２４８５；Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｎ’−（３−メトキシ−ｏ−トルオイル）−３，５−キシロヒドラジド、ＣＡＳ  ＲＮ１６１０５０−５８−４）、およびテブフェノジド（３，５−ジメチル安息香酸１−（１，１−ジメチルエチル）−２，（４−エチルベンゾイル）ヒドラジド、ＣＡＳ  ＲＮ１１２４１０−２３−８）が挙げられる。
【００３２】
アミトロール（ＣＡＳ  ＲＮ６１−８２−５）およびトリアザメートといったトリアゾールは、本発明の方法において有用である。好ましいトリアゾールは、トリアザメート（エチル［［１−［（ジメチルアミノ）カルボニル］−３−（１，１−ジメチルエチル）−１Ｈ−１，２，４−トリアゾール−５−イル］チオ］アセテート、ＣＡＳ  ＲＮ１１２１４３−８２−５）である。
【００３３】
エバーメクチン（アバメクチン、ＣＡＳ  ＲＮ７１７５１−４１−２）およびスピノサド（ＸＤＥ−１０５、ＣＡＳ  ＲＮ１３１９２９−６０−７）といった、生物学的／発酵産物は、本発明において有用である。
【００３４】
有機リン酸殺虫剤もまた、本発明の成分のうちの１つとして有用である。好ましい有機リン酸（ｏｒｇａｎｏｐｈｏｐｈａｔｅ）殺虫剤としては、アセフェート（ＣＡＳ  ＲＮ３０５６０−１９−１）、クロルピリホス（ＣＡＳ  ＲＮ２９２１−８８−２）、クロルピリホス−メチル（ＣＡＳ  ＲＮ５５９８−１３−０）、ダイアジノン（ＣＡＳ  ＲＮ３３３−４１−５）、フェナミホス（ＣＡＳ  ＲＮ２２２２４−９２−６）、およびマラチオン（ＣＡＳ  ＲＮ１２１−７５−５）が挙げられる。
【００３５】
加えて、カルバメート殺虫剤が、主題発明において有用である。好ましいカルバメート殺虫剤は、アルジカルブ（ＣＡＳ  ＲＮ１１６−０６−３）、カルバリル（ＣＡＳ  ＲＮ６３−２５−２）、カルボフラン（ＣＡＳ  ＲＮ１５６３−６６−２）、オキサミル（ＣＡＳ  ＲＮ２３１３５−２２−０）、およびチオジカルブ（ＣＡＳ  ＲＮ５９６６９−２６−０）である。
【００３６】
化学殺虫剤が本明細書において説明される時、説明は、殺虫剤の塩形態、ならびに説明される殺虫剤の形態と同じ殺虫活性を呈する殺虫剤のいずれの異性および／または互変異性形態も含むことが意図されるということが理解されるものとする。
【００３７】
本発明において有用である化学殺虫剤は、かかる殺虫剤としての取引において及第する任意の等級または純度のものとすることができる。不純物として商業的調製物において殺虫剤に付随する他の材料は、かかる他の材料が組成物を不安定にしないか、または殺虫剤成分のうちのいずれかの活性もしくは標的有害生物（複数を含む）に対するトランスジェニック事象を著しく低減もしくは破壊しない限り、主題発明および組成物において容認され得る。殺虫剤の生成に従事する当業者は、容認され得るそれらの不純物、および容認され得ないものを容易に識別することができる。
【００３８】
ｅＨＴＰは、修飾されたタンパク質が、親タンパク質、ＴＩＣ８０７と比較して、リグス種、エムポアスカ種、および／もしくはアムラスカ種に対する、増強された半翅目阻害スペクトルならびに／または改善された半翅目阻害活性を呈するように、アミノ酸修飾によって関連する。「より活性」、「改善された活性」、「増強された特異性」、「増加した毒性効力」、「増加した毒性」、「改善された半翅目阻害活性」、「増強された半翅目阻害活性」、「改善されたリグス、エムポアスカ、および／もしくはアムラスカ阻害活性」、「より大きいリグス、エムポアスカ、および／もしくはアムラスカ阻害活性」、「より大きい半翅目阻害活性」、ならびに「増強されたリグス、エムポアスカ、および／もしくはアムラスカ阻害スペクトル」、ならびに「増強された半翅目阻害スペクトル」という句は、ｅＨＴＰの活性と、半翅目昆虫に対するＴＩＣ８０７（配列番号２）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ２（配列番号８）、Ｃｒｙ５１Ａａ１（配列番号１８２）、ＴＩＣ８５３（配列番号１８４）、および／もしくはＡＸＭＩ−１７１（配列番号２０６）タンパク質の活性との比較を指し、本発明のｅＨＴＰに起因する活性は、ＴＩＣ８０７タンパク質（配列番号２）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ２（配列番号８）、Ｃｒｙ５１Ａａ１（配列番号１８２）、ＴＩＣ８５３（配列番号１８４）、および／もしくはＡＸＭＩ−１７１（配列番号２０６）タンパク質に起因する活性よりも大きい。本明細書において提供されるｅＨＴＰは、配列番号２、配列番号８、配列番号１８２、および配列番号１８４のバチルス・チューリンゲンシスタンパク質と比較した時、増強された半翅目阻害スペクトルおよび／または改善されたもしくはより大きい半翅目阻害活性を呈し、半翅目の有害生物種としては、リグス・ヘスペルス、リグス・リネオラリス、エムポアスカ・ファバエ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ）、およびアムラスカ・デバスタンスが挙げられる。アムラスカ・デバスタンスは、アムラスカ・ビグッチュラ・ビグッチュラ（Ａｍｒａｓｃａ  ｂｉｇｕｔｔｕｌａ  ｂｉｇｕｔｔｕｌａ）とも呼ばれる。ＴＩＣ８０７と比較して増強された昆虫阻害スペクトルおよび／または改善された昆虫阻害活性を呈するｅＨＴＰは、多くの異なる方法によって識別することができる。一般的に、ｅＨＴＰタンパク質を識別するための例示的かつ非限定的な方法は、
（１）制御されたアッセイ条件下で、試験昆虫に、同一量の試験ｅＨＴＰならびに対照ＴＩＣ８０７（配列番号２）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ２（配列番号８）、Ｃｒｙ５１Ａａ１（配列番号１８２）、ＴＩＣ８５３（配列番号１８４）、および／もしくはＡＸＭＩ−１７１（配列番号２０６）タンパク質を投与し、試験および対照タンパク質の効力を測定および比較すること、ならびに／または
（２）制御されたアッセイ条件下で同等の昆虫個体群応答を引き起こす、試験ｅＨＴＰ、ならびに対照ＴＩＣ８０７（配列番号２）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ２（配列番号８）、Ｃｒｙ５１Ａａ１（配列番号１８２）、ＴＩＣ８５３（配列番号１８４）、および／もしくはＡＸＭＩ−１７１（配列番号２０６）タンパク質のタンパク質用量（例えば、食餌中のタンパク質濃度）を判定する（即ち、用量応答曲線を得る）ことを含むことができる。
第２の手法において、比較のために使用される統計的に堅牢な用量応答値は、試験個体群の５０％を殺滅するために必要とされる中央致死濃度（ＬＣ５０）であろう。しかしながら、ある実施形態において、試験個体群の５０％成長阻害をもたらすために必要とされる中央阻害濃度（「ＩＣ５０」）を含むが、これに限定されない、他の値を使用することができる。この文脈において、「成長阻害」は、半翅目の生育の発育阻止および／または阻害を含むことができる。
【００３９】
本明細書において使用される際、「昆虫阻害量」という句は、昆虫の生存能力、成長、昆虫の生育、昆虫の生殖、昆虫の摂食挙動、昆虫の交配挙動の任意の測定可能な阻害、および／または薬剤を含有する組成物を摂食する昆虫によって引き起こされる有害効果の任意の測定可能な減少を達成する上で有効である、該薬剤を含有する組成物の量を指す。同様に、「半翅目阻害量」は、生存能力、成長、生育、生殖、摂食挙動、交配挙動に関連する半翅目に属する標的昆虫の任意の測定可能な阻害、および／または植物を摂食する半翅目昆虫によって引き起こされる有害効果の任意の測定可能な減少をもたらす、本発明のタンパク質単独、または制御するために適用可能な半翅目種を標的とする他の薬剤との量を指す。同様に、「リグス、エムポアスカ、および／もしくはアムラスカ阻害量」は、本発明の１つ以上のタンパク質、即ち、ｅＨＴＰ、あるいは任意の測定可能な阻害、生存能力、成長、生育、生殖、摂食挙動、交配挙動、ならびに／またはそのｅＨＴＰを含有する組成物を摂食するリグス、エムポアスカ、および／もしくはアムラスカによって引き起こされる有害効果の任意の測定可能な減少をもたらす、他の薬剤を含有する組成物の量を指す。ｅＨＴＰの文脈において本明細書において使用される際、「増強された半翅目阻害活性」または「より大きい増強された半翅目阻害活性」は、ＴＩＣ８０７、Ｃｒｙ５１Ａａ１（配列番号１８２）、ＴＩＣ８５３（配列番号１８４）、および／もしくはＡＸＭＩ−１７１（配列番号２０６）タンパク質を含む、骨格タンパク質のうちのいずれか１つ以上で観察される、対応する阻害活性に対する、半翅目の生存能力、成長、生育、生殖、摂食挙動、交配挙動の阻害の任意の測定可能な増加、ならびに／またはそのｅＨＴＰを含有する組成物を摂食する半翅目によって引き起こされる有害効果の任意の測定可能な減少を指す。同様に、「増強されたリグス、エムポアスカ、および／もしくはアムラスカ阻害活性」または「より大きい増強されたリグス、エムポアスカ、および／もしくはアムラスカ阻害活性」は、適用可能な量のＴＩＣ８０７（配列番号２）、Ｃｒｙ５１Ａａ１（配列番号１８２）、ＴＩＣ８５３（配列番号１８４）、および／もしくはＡＸＭＩ−１７１（配列番号２０６）タンパク質を含むが、これらに限定されない、骨格タンパク質のうちの１つ以上のみを含有する同等の組成物もしくは植物で観察される、対応する阻害活性に対する、阻害、生存能力、成長、生育、生殖、摂食挙動、交配挙動の任意の測定可能な増加、ならびに／またはリグス、エムポアスカ、および／もしくはアムラスカの食餌中に提供される組成物もしくは植物中の本発明の１つ以上のｅＨＴＰの存在によって引き起こされる有害効果の任意の測定可能な減少を指す。
【００４０】
ｅＨＴＰの文脈において本明細書において使用される際、「増強されたリグス、エムポアスカ、および／もしくはアムラスカ阻害スペクトル」は、ＴＩＣ８０７タンパク質で観察されるその特定のリグス種、エムポアスカ種、および／もしくはアムラスカ種の対応する阻害に対する、特定のリグス種、エムポアスカ種、および／もしくはアムラスカ種の生存能力、成長、生育、生殖、摂食挙動、交配挙動の阻害の任意の測定可能な増加、ならびに／または植物を摂食するそのリグス種、エムポアスカ種、および／もしくはアムラスカ種によって引き起こされる有害効果の任意の測定可能な減少を指す。ある実施形態において、本明細書において提供されるｅＨＴＰは、それらのｅＨＴＰがリグス・リネオラリスの増加した阻害を提供することができるという点で、ＴＩＣ８０７に対して、増強されたリグス阻害スペクトルを呈する。
【００４１】
本明細書において提供されるｅＨＴＰは、配列番号２（ＴＩＣ８０７）、配列番号８（ＴＩＣ８０７＿Ｍ２）、配列番号１８２（Ｃｒｙ５１Ａａ１）、配列番号１８４（ＴＩＣ８５３）、および配列番号２０６（ＡＸＭＩ−１７１）のタンパク質よりも、リグス、エムポアスカ、および／もしくはアムラスカ有害生物種に対する、約２〜約２６０倍大きいリグス、エムポアスカ、および／もしくはアムラスカ阻害活性を呈することができる。本明細書において提供されるｅＨＴＰは、配列番号２（ＴＩＣ８０７）、配列番号８（ＴＩＣ８０７＿Ｍ２）、配列番号１８２（Ｃｒｙ５１Ａａ１）、配列番号１８４（ＴＩＣ８５３）、および配列番号２０６（ＡＸＭＩ−１７１）のタンパク質よりも、リグス、エムポアスカ、および／もしくはアムラスカ有害生物種に対する、約３、４、５、７、８、１０、１２、１５、２０、２５、２７、３０、３８、４６、５０、５２、５４、６６、９１、１２２、１８６、２４３、または２６２倍大きいリグス、エムポアスカ、および／もしくはアムラスカ阻害活性を呈することができる。
【００４２】
ｅＨＴＰは、以下において致死率を引き起こすことによって、配列番号２（ＴＩＣ８０７）、配列番号８（ＴＩＣ８０７＿Ｍ２）、配列番号１８２（Ｃｒｙ５１Ａａ１）、配列番号１８４（ＴＩＣ８５３）、および／もしくは配列番号２０６（ＡＸＭＩ−１７１）に勝る、増強された標的有害生物阻害スペクトルならびに／または改善された標的有害生物阻害活性を呈することができる：
（ｉ）リグス・ヘスペルス昆虫種に対して、約０．３μｇ／ｍＬ〜約７０μｇ／ｍＬの用量で、
（ｉｉ）リグス・リネオラリス昆虫種に対して、約０．８５μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬの用量で、
（ｉｉｉ）リグス・ヘスペルスに対して、約０．３〜約７０μｇ／ｍＬのＬＣ５０値で測定、
（ｉｖ）リグス・リネオラリスに対して、約０．８５〜約１００μｇ／ｍＬのＬＣ５０値で測定、または
（ｖ）リグス種、エムラスカ（Ｅｍｒａｓｃａ）種、および／もしくはアムラスカ種に対して、ＴＩＣ８０７、配列番号８、配列番号１８２（Ｃｒｙ５１Ａａ１）、配列番号１８４（ＴＩＣ８５３）、および／もしくは配列番号２０６（ＡＸＭＩ−１７１）のＬＣ５０値よりも２倍超低いＬＣ５０値で測定、または
（ｖｉ）アムラスカ・デバスタンスもしくはエムポアスカ・ファバエ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ）昆虫種に対して、約０．６９μｇ／ｍＬ〜約５００μ／ｍＬの用量で、または
（ｖｉｉ）アムラスカ・デバスタンスおよび／もしくはエムポアスカ・ファバエ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ）に対して、約３．５〜約１５μｇ／ｍＬのＬＣ５０値で測定。
【００４３】
表４Ａおよび４Ｂは、アムラスカおよびリグス種致死率データとともに、例示的な本発明のｅＨＴＰを表にする。リグス種およびアムラスカ種に関して利用可能な致死率データは、（ａ）μｇ／ｍＬ  ＬＣ５０値として、または（ｂ）Ｌ．ヘスペルス（ｈｅｓｐｅｒｕｓ）に対しては、約１〜約３μｇ／ｍＬ、もしくはＬ．リネオラリス（ｌｉｎｅｏｌａｒｉｓ）に対しては、約１００μｇ／ｍＬのタンパク質、およびアムラスカ・デバスタンスに対しては、約０．６９〜５００μｇ／ｍＬの用量での致死率（％）としてのいずれかで報告される。ＴＩＣ８０７（配列番号２）およびＴＩＣ８０７＿Ｍ２（配列番号８）と比較して倍増した毒性は、ＬＣ５０値が判定された、例示的なｅＨＴＰのために提供される。
【００４４】
本発明のｅＨＴＰは、骨格タンパク質と比較して、半翅目の昆虫を制御する上で特に有用である。リグス・リネオラリスは、致死率を引き起こすために、高用量のＴＩＣ８０７タンパク質（例えば、１００μｇ／ｍＬを超過して）を必要とした。本発明の１つのｅＨＴＰ、ＴＩＣ８０７＿Ｍ８（配列番号１６）に関する用量応答曲線では、ｅＨＴＰは、Ｌ．リネオラリスおよびＬ．ヘスペルスの両方に対して、際立って改善された毒性効果を呈するが、Ｌ．リネオラリスに対しては、ｅＨＴＰは、２２３μｇ／ｍＬの計算されたＬＣ５０値を呈する。食餌中に１０００μｇ／ｍＬを超過する著しく大きい用量のＴＩＣ８０７およびＴＩＣ８０７＿Ｍ２タンパク質を提供することは、不可能であったため、Ｌ．リネオラリス種に対する５０％超の致死率を引き起こすことができるタンパク質濃度毒性用量を達成することは、これまで不可能であった。したがって、ＴＩＣ８０７およびＴＩＣ８０７＿Ｍ２（配列番号８）タンパク質に関する、Ｌ．リネオラリスに対するＬＣ５０値は、判定されなかったが、むしろ２２３μｇ／ｍＬ超（（＞）２２３μｇ／ｍＬ）として推定された（表１および３、実施例４、ならびに図１Ｂを参照されたい）。
【００４５】
反復的設計は、操作、試験、および選択の組み合わせ（かならずしもその順序ではない）を含むｅＨＴＰを開発および選択するための半ランダムな手法を指す（実施例１〜４を参照されたい）。「操作」という語は、関連する残基を識別して修飾することと、クローン作成することと、本明細書において説明されるｅＨＴＰを発現することを含むことが意図される。「試験」という語は、ｅＨＴＰの半翅目活性を、ＴＩＣ８０７（配列番号２）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ２（配列番号８）、Ｃｒｙ５１Ａａ１（配列番号１８２）、および／もしくはＴＩＣ８５３（配列番号１８４）といった骨格タンパク質の活性と比較すること、またはＡＸＭＩ−１７１（配列番号２０６）といった別のタンパク質に対して、本発明のｅＨＴＰを比較することを指すことが意図される。「選択」という語は、「操作」のために、本発明の改善された変異体タンパク質、即ち、ｅＨＴＰ、および適用可能なアミノ酸残基を識別する行為を指すことが意図される。
【００４６】
反復的設計は、本発明のタンパク質の原子構造（例えば、図２に記載されるような）の解明、ならびに「操作」のために修飾するように、アミノ酸残基の「選択」の半ランダムな手法を誘導および補完するための原子構造の使用を含み、この場合、昆虫阻害スペクトルおよび活性への改善をもたらすように修飾することができる、ＴＩＣ８０７、ＴＩＣ８５３、およびＣｒｙ５１Ａａ１といった、折り畳まれた昆虫阻害骨格タンパク質のループ、および表面露出領域における、アミノ酸残基の識別を含んだ。ループ、および表面露出領域における、かかるアミノ酸残基は、「操作」のために選択される。この場合、反復的設計は、自然発生の骨格タンパク質におけるそれらの位置に現れるもの以外のアミノ酸残基を含有するように修飾される時、本発明のｅＨＴＰタンパク質のうちの１つ以上をもたらす、関連するアミノ酸残基の蓄積を匿う、骨格タンパク質の３次元構造内の２つの異なる領域の識別を含んだ。
【００４７】
最初に、骨格タンパク質ＴＩＣ８０７と比較して、増加したリグス種阻害活性を呈した、反復的設計のこのプロセスで使用される骨格タンパク質ＴＩＣ８０７（配列番号２）、および２６７の異なるｅＨＴＰが発見された。ＴＩＣ８０７＿Ｍ８（配列番号１６）は、設計プロセスの初期段階で発見された。反復的操作・試験・選択のその後の段階は、骨格タンパク質と比較して、リグス種に対するなおより大きいレベルの毒性を呈し、また、毒性効果のより広い宿主域も呈した、他のｅＨＴＰタンパク質の発見につながった。７つの変異体（ｅＨＴＰ）は、ＴＩＣ８０７と比較した時、両方のリグス種（Ｌ．ヘスペルスおよびＬ．リネオラリス）に対する、著しくより高いレベルの増加した毒性を呈した。これらの７つ、および本明細書において構築される他のｅＨＴＰに関するＬＣ５０値は、リグス・ヘスペルスおよびリグス・リネオラリス種に対して判定され、骨格タンパク質、特に、ＴＩＣ８０７に関するＬＣ５０値と比較された。結果は、表１に示され、図３は、表１で表にされるように観察される結果をグラフで示す棒グラフである。
【表１】
2015514116.tif 000003
ＮＤ＝判定されず。ＬＣ５０値は、８〜１０の異なるタンパク質濃度を新たに孵化したリグス幼虫の個体群に提示し、幼虫に５日間摂食させ、次いで、提供される用量範囲にわたる致死率に関して採点することによって、判定される。
＊毒性、１のベースライン値として、ＴＩＣ８０７に関して観察されたＬＤ５０を使用して、リグス・ヘスペルスに対して観察されるレベルと比較した、増加した活性の倍数に関して表示される。１０００μｇ／ｍＬを超過する著しく大きい量のタンパク質は、リグス・リネオラリスへの高い範囲の毒性用量応答を完了させるために、リグスの食餌中に提供することは不可能であった。したがって、ＬＣ５０値は、ＴＩＣ８０７またはＴＩＣ８０７＿Ｍ２に関しては、判定されなかった。代わりに、低範囲における４つの用量のＬＣ５０推定が実施され、ＴＩＣ８０７およびＴＩＣ８０７＿Ｍ２に関して予想されたＬＣ５０値が、２２３μｇ／ｍＬ超であることを立証した。
【００４８】
表１を参照すると、反復的設計プロセスは、リグス・ヘスペルスだけでなく、リグス・リネオラリスにも改善された毒性特性を呈するタンパク質を識別するための手段を提供した。
【００４９】
ｅＨＴＰをコードする組み換えポリヌクレオチド組成物もまた、提供される。ある実施形態において、ｅＨＴＰは、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを伴うポリヌクレオチド分子が、プロモータ、および構築物が意図される系における発現のために機能的な任意の他の調節要素といった、要素に動作可能に連結される、組み換えＤＮＡ構築物で発現させることができる。例えば、植物機能性プロモータは、植物におけるタンパク質の発現を可能にするように、適用可能なｅＨＴＰコード配列に動作可能に連結させることができる。細菌において機能的なプロモータもまた、発現カセットにおける使用に対して企図される。適用可能な細菌、例えば、大腸菌、またはバチルス・チューリンゲンシス種において機能的なプロモータは、適用可能な細菌株における適用可能なタンパク質の発現のために、ｅＨＴＰコード配列に動作可能に連結させることができる。ｅＨＴＰコード配列に動作可能に連結させることができる、他の有用な要素としては、エンハンサ、イントロン、リーダ、コードされたタンパク質固定化タグ（ＨＩＳタグ）、コードされた細胞内転座ペプチド（即ち、色素体移行ペプチド、シグナルペプチド）、翻訳後修飾酵素のためのコードされたポリペプチド部位、リボソーム結合部位、および植物または特定の標的有害生物種のいずれかにおける１つ以上の遺伝子の抑制のためのＲＮＡｉトリガとしての使用のために設計されるセグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
本明細書において提供される例示的な組み換えポリヌクレオチド分子としては、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、配列番号３５、および配列番号２０１が挙げられるが、これらに限定されない。これらの配列は、配列番号４（ＴＩＣ８０７＿４）、配列番号６（ＴＩＣ８０７＿Ｍ１）、配列番号８（ＴＩＣ８０７＿Ｍ２）、配列番号１０（ＴＩＣ８０７＿Ｍ３）、配列番号１２（ＴＩＣ８０７＿Ｍ４）、配列番号１４（ＴＩＣ８０７＿Ｍ５）、配列番号１６（ＴＩＣ８０７＿Ｍ８）、配列番号１８（ＴＩＣ８０７＿Ｍ６）、配列番号２０（ＴＩＣ８０７＿Ｍ７）、配列番号２２（ＴＩＣ８０７＿２２）、配列番号２４（ＴＩＣ８０７＿２４）、配列番号２６（ＴＩＣ８０７＿２６）、配列番号２８（ＴＩＣ８０７＿Ｍ９）、配列番号３０（ＴＩＣ８０７＿Ｍ１０）、配列番号３２（ＴＩＣ８０７＿Ｍ１１）、配列番号３６（ＴＩＣ８０７＿Ｍ１２）、および配列番号３４（ＴＩＣ８０７＿Ｍ１３）に記載されるようなアミノ酸配列を各々有する、それぞれのタンパク質をコードする。遺伝子コードの冗長性により、本発明のタンパク質をコードするための組み換えポリヌクレオチド分子のコドンは、同義コドンに対して置換されてもよく（サイレント置換とも呼ばれる）、本発明の範囲内である。このため、本明細書において開示されるｅＨＴＰのうちのいずれかをコードする組み換えポリヌクレオチドが提供される。
【００５１】
ｅＨＴＰコード配列を含む組み換えＤＮＡ構築物はまた、適用可能なｅＨＴＰ、ｅＨＴＰとは異なるタンパク質、または昆虫もしくは植物遺伝子阻害ｄｓＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列とともに共発現させるように構成することができる、１つ以上の昆虫阻害剤をコードするＤＮＡの領域をさらに含むことができる。組み換えＤＮＡ構築物は、特定の構築物から発現されるように設計される全ての薬剤が、１つのプロモータから発現されるように、または別個の薬剤が各々、別個のプロモータ制御下にあるように、またはこれらのいくつかの組み合わせであるように、組み立てることができる。本発明のタンパク質は、１つ以上のタンパク質が、選択される発現系のタイプに依存して、他のオープンリーディングフレームおよび／またはプロモータが含有される、共通のヌクレオチドセグメントから発現される、多重遺伝子発現系から発現させることができる。
【００５２】
ｅＨＴＰコード配列を含む組み換えポリヌクレオチドまたは組み換えＤＮＡ構築物は、ベクター、例えば、プラスミド、バキュロウイルス、人工染色体、ビリオン、コスミド、ファージミド、ファージ、またはウイルスベクターによって、宿主細胞に送達することができる。かかるベクターは、宿主細胞におけるｅＨＴＰコード配列の安定したまたは一時的な発現、および、場合により、ポリペプチドへのその後の発現を達成するために使用することができる。ｅＨＴＰコード配列を含む、および宿主細胞に導入される、外因性組み換えポリヌクレオチドまたは組み換えＤＮＡ構築物はまた、本明細書において、「導入遺伝子」と称される。
【００５３】
任意の１つ以上のｅＨＴＰコード配列を発現する、任意の組み換えポリヌクレオチド（即ち、導入遺伝子）を含有する、トランスジェニック細菌、トランスジェニック植物細胞、トランスジェニック植物、およびトランスジェニック植物部分もまた、本明細書で提供される。「細菌細胞」または「細菌」としては、アグロバクテリウム、バチルス、エシェリキア、サルモネラ、シュードモナス、またはリゾビウム細胞が挙げられ得るが、これらに限定されないことが意図される。「植物細胞」または「植物」としては、アルファルファ、アーモンド（ａｌｍｏｎｔ）、バナナ、オオムギ、マメ、ビート、ブロッコリ、キャベツ、アブラナ属、ナス（ｂｒｉｎｊａｌ）、ニンジン、キャッサバ、ヒマ、カリフラワー、セロリ、ヒヨコマメ、ハクサイ、セロリ、柑橘類、ココナツ、コーヒー、トウモロコシ、クローバ、綿、ウリ、キュウリ、ダグラスファー、ナス（ｅｇｇｐｌａｎｔ）、ユーカリ、亜麻、ニンニク、ブドウ、グアー、ホップ、リーキ、マメ類、レタス、テーダマツ、キビ、メロン、ネクタリン、ナッツ、オートムギ、オクラ、オリーブ、タマネギ、観賞植物、ヤシ、牧草、パパイヤ、エンドウ、モモ、ピーナッツ、コショウ、キマメ、マツ、ジャガイモ、ポプラ、カボチャ、ラジアータマツ、ダイコン、ナタネ、コメ、台木、ライムギ、ベニバナ、低木、ソルガム、サザンパイン、大豆、ホウレンソウ、スクオッシュ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、スイートコーン、モミジバフウ、サツマイモ、スイッチグラス、茶、タバコ、トマト、ライコムギ、芝草、スイカ、およびコムギ植物細胞または植物が挙げられることが意図される。ある実施形態において、トランスジェニック植物細胞から再生されるトランスジェニック植物およびトランスジェニック植物部分が提供され、トランスジェニック植物は、トランスジェニック種子から得ることができ、トランスジェニック植物部分は、切断、折割、粉砕、または別様に植物からの部分を分離することによって得ることができ、植物部分は、種子、実、葉、花、茎、根、またはこれらの任意の部分であり得、本明細書において提供されるトランスジェニック植物部分は、トランスジェニック植物部分の再生不可能な部分である。この文脈において使用される際、トランスジェニック植物部分の「再生不可能な」部分は、全植物を形成するように誘導することができない、または有性および／もしくは無性生殖が可能である全植物を形成するように誘導することができない部分である。植物部分の再生不可能な部分は、トランスジェニック花粉、胚珠、種子、実、葉、花、茎、または根の部分である。
【００５４】
昆虫、またはリグスおよび／もしくはアムラスカ阻害量のｅＨＴＰを含有する、トランスジェニック植物を作製する方法もまた、本明細書において提供される。かかる植物は、本明細書において提供されるｅＨＴＰタンパク質のうちのいずれかをコードする組み換えポリヌクレオチドを植物細胞に導入することと、昆虫もしくは半翅目阻害量のｅＨＴＰを発現する当該植物細胞に由来する植物を選択することと、によって作製することができる。植物は、再生、種子、花粉、または分裂組織形質転換技術によって、植物細胞に由来することができる。
【００５５】
昆虫または半翅目の侵入を制御するように、昆虫または半翅目阻害量のｅＨＴＰを発現する、トランスジェニック植物および宿主細胞が提供される。前述の植物種のうちのいずれも、植物が、適用可能なｅＨＴＰを発現するように設計されるポリヌクレオチド構築物で形質転換される限り、本明細書において提供される昆虫または半翅目の侵入から植物を保護するために使用することができる。
【００５６】
本発明の追加の態様は、抗体、キット、ｅＨＴＰもしくはその特徴的な断片、またはｅＨＴＰもしくはその特徴的な断片をコードするポリヌクレオチドを検出するための方法、本発明のタンパク質属の追加の昆虫阻害メンバを識別するための方法、昆虫の成長および／もしくは侵入を制御するための製剤および方法、ならびに植物および他のレシピエント宿主にかかる制御を提供するための方法を含む。各組成物、構築物、細胞、植物、製剤、方法、またはキットは、例えば、昆虫を阻害するように、これらのタンパク質のうちのいずれかの商業的使用を通じて、植物生産性を増加することによって、本発明のタンパク質の産業的用途を提供する。
【００５７】
種子または果実もしくは野菜以外の植物産物は、商取引を経る、およびトランスジェニック植物もしくはトランスジェニック植物部分に由来する、商品または他の産物として意図され、該商品または他の産物は、本発明のｅＨＴＰに対応する、および商品または他の産物が得られた、植物または植物組織もしくは部分において産生または維持される、ヌクレオチドセグメント、ＲＮＡ、もしくはタンパク質を検出することによって、商取引を通じて追跡することができる。商取引のかかる商品または他の産物としては、植物部分、バイオマス、油、食事、糖、動物飼料、小麦粉、フレーク、ふすま、リント、加工された種子、および種子が挙げられるが、これらに限定されない。植物部分としては、植物種子、実、葉、花、茎、花粉、または根が挙げられるが、これらに限定されない。ある実施形態において、植物部分は、当該種子、実、葉、花、茎、花粉、または根の再生不可能な部分である。ｅＨＴＰを含有する綿および亜麻植物実、およびこれらの再生不可能な部分もまた、提供される。
【００５８】
検出可能な量のｅＨＴＰ、その昆虫阻害断片、またはその任意の特徴的な部分を含有する、加工された植物産物もまた、本明細書で提供される。理論によって限定されることを求めることなく、検出可能な量の本明細書において提供されるｅＨＴＰのうちの１つ以上を含有する、かかる加工された植物産物は、ある実施形態において、半翅目によって伝染され得る望ましくない微生物の低減および／またはかかる微生物の望ましくない副産物の低減を呈することができると考えられる。ある実施形態において、その特徴的な部分は、配列番号１８０に記載されるような少なくとも約２０〜約１００以上の隣接するアミノ酸の任意のポリペプチドを含むことができ、特に、該ポリペプチドは、配列番号２、配列番号８、配列番号１８２、または配列番号１８４に存在する隣接するアミノ酸の対応するポリペプチドを含有せず、該ポリペプチドは、配列番号２に記載されるような対応するアミノ酸配列における、少なくとも１つのアミノ酸置換、付加、または欠失を含む。かかる置換、欠失、または付加は、段落［０００９］で上に記載されるようなものである。
【００５９】
検出可能な量のｅＨＴＰをコードする組み換えポリヌクレオチド、ｅＨＴＰ、もしくはその昆虫阻害断片、またはその任意の特徴的な部分を含有する、加工された植物産物が提供される。加工された産物は、植物バイオマス、油、食事、動物飼料、小麦粉、フレーク、ふすま、リント、外皮、および加工された種子から成る群から選択される。
【００６０】
作物植物の半翅目の侵入は、作物植物に、本発明のｅＨＴＰのうちの１つ以上をコードする組み換えポリヌクレオチド配列を提供することによって制御される。かかるトランスジェニック作物は、昆虫または半翅目阻害量の適用可能なｅＨＴＰを含有するように産生または処理され、かかる作物は、（ｉ）ｅＨＴＰを含むもしくはコードする任意の組成物を、植物、もしくは植物を生じさせる種子に適用すること、および／または（ｉｉ）植物、もしくは種子および最終的には植物を生じさせる植物細胞を、ｅＨＴＰをコードするポリヌクレオチドで形質転換することによって、十分なｅＨＴＰを染み込ませる。植物は、昆虫または半翅目阻害量のｅＨＴＰを発現する導入遺伝子を含む、一時的にまたは安定して形質転換されたトランスジェニック植物であってもよい。植物は、ｅＨＴＰを含む組成物が適用された、非トランスジェニック植物であってもよい。かかる方法において、植物は、双子葉植物であり、より具体的には、綿、大豆、またはアルファルファ植物であってもよい。半翅目昆虫としては、限定されないが、段落［００１８］で上に記載される虫の一覧といった、成虫および幼虫が挙げられる。
【００６１】
好ましくは、リグス種は、リグス・ヘスペルスまたはリグス・リネオラリスであり、エムポアスカ種は、エムポアスカ・ファバエ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ）であり、アムラスカ種は、アムラスカ・デバスタンスである。
【００６２】
本発明の他の特性および利点は、以下の発明を実施するための形態、実施例、および特許請求の範囲から明らかとなろう。
【００６３】
実施例
上述を考慮して、当業者は、変更は、開示される特定の態様において行うことができ、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同様もしくは類似の結果を依然として得ることができることを理解するべきである。このため、本明細書において開示される特定の詳細は、制限として解釈されないものとする。本出願が優先権の利益を主張する米国仮特許出願第６１／６２１，４３６号、段落［０００２］で言及される配列表、ならびに開示および特許請求される本発明への参考資料、特に、本出願で引用される参考文献および公開特許出願は、それらの全体が参照することにより本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【００６４】
反復的操作・試験・選択手法
本実施例は、ＴＩＣ８０７（配列番号２）と比較して、鞘翅目および／もしくは殺線虫活性、または半翅目昆虫種に対する増加した毒性を呈する、昆虫阻害タンパク質を識別および説明するために使用される、反復的（「再帰的」とも称され得る）操作・試験・選択手法のランダムな、組み合わせの、および発明的な態様を例解する。いくつかの設計手法が、リグス種に対するより大きい阻害活性を有するｅＨＴＰを操作するために採用され、手法としては、半ランダムな修飾、他の天然Ｂｔタンパク質とのＴＩＣ８０７のアライメントにおける差異の特異的修飾、および構造／機能支援設計を含んだが、これらに限定されなかった。多数の段階の操作および試験を実行して（連続して、および同時にの両方）、増加した毒性を呈するＴＩＣ８０７タンパク質変異体を選択した。データが収集された際、設計手法は調節された。この反復的操作・試験・選択手法はまた、ｅＨＴＰと比較されるＴＩＣ８０７対照タンパク質のクローン作成、発現、精製、およびバイオアッセイ試験を含むステップを含んだが、これに限定されなかった。
【００６５】
ＴＩＣ８０７と比較して、増加したリグス毒性を呈した、約２６７の例示的なｅＨＴＰは、改善された昆虫阻害活性に関してアッセイされた、２０００超の群の候補ｅＨＴＰ（即ち、「試験」タンパク質）から得られた。試験は、選択プロセスにおいて配列決定されなかったライブラリ突然変異に由来するいくつかの候補ｅＨＴＰをコードする、組み換えヌクレオチドセグメントを含んだため、試験された候補ｅＨＴＰの実際の総数は、２０００よりもはるかに多かった。
【００６６】
種々の量および純度のタンパク質ストックは、試験の目的および所望される試験スループットに依存して、調製された。例えば、より低い量およびより低い純度のタンパク質調製物は、バイオアッセイにおいてより多い数の変異体を走査するために調製された。より大きい量およびより高い純度のタンパク質ストックは、高性能のバイオアッセイのために調製された。改善された変異体の主に関連する残基位置が解明されたため、試験は、高性能のバイオアッセイの傾向があった。最初に、約２０００の変異体を、リグス・ヘスペルスにおいて試験した。Ｌ．ヘスペルスからのデータに基づき、約６００の変異体が設計され、次いで、リグス・リネオラリスにおいてさらに試験された。これらのうち、約２６７の変異体（表４Ｂ）は、ＴＩＣ８０７と比較して、リグス・ヘスペルスおよび／またはリグス・リネオラリスに対する増加した毒性を実証した。これらの２６７の変異体は、両方のリグス種に対する増加した毒性を実証することが確認された、２２の変異体を含んだ。さらなる確認および用量応答試験は、両方のリグス種に対するＬＣ５０値を判定するために、８用量複製バイオアッセイを使用してその後特性評価された７つの変異体に選択を狭めた。
【００６７】
選択プロセスは、試験データの動的更新、操作手法を絶えず調節すること、および反復的段階を実施することを含んだ。同時に、労働集約的なクローン作成、タンパク質発現、タンパク質精製、およびバイオアッセイ実験が、候補ｅＨＴＰを試験するために採用された。
【実施例２】
【００６８】
操作手法
アライメントに基づく手法
Ｃｒｙ５１：Ｃｒｙ５１Ａａ１（配列番号１８２）、ＴＩＣ８５３（配列番号１８４）、およびＴＩＣ８０７（配列番号２）のタンパク質メンバの多重配列アライメントを使用して、配列番号２（ＴＩＣ８０７）に対する、変動の領域、例えば、１９５〜２０１位および２１１〜２１９位を識別した。これらの領域は、これらの領域におけるランダムなアミノ酸残基をコードする、縮重したオリゴヌクレオチドプライマーの使用を通じた飽和突然変異に対して標的化された。構築物ライブラリは、宿主細胞におけるその後のタンパク質発現のために調製された。
【００６９】
Ｃｒｙ５１Ａａ１（配列番号１８２）、ＴＩＣ８５３（配列番号１８４）、およびＴＩＣ８０７（配列番号２）の多重配列アライメントは、ＴＩＣ８０７に対する各位置の変異体に関する平均対距離を計算するために、ＢＬＯＳＵＭ８０置換マトリクスとの組み合わせで使用された。より低い平均対距離を有する残基位置は、代替的なアミノ酸残基、例えば、Ｇ２８Ｘ、Ｇ３１Ｘ、Ｆ４６Ｘ、Ｅ１２５Ｘ、Ｆ１３８Ｘ、Ｆ１４７Ｘ、Ｓ１６７Ｘ、Ｙ２１６Ｘ、Ｐ２１８Ｘ、Ｇ２３４Ｘ、Ｔ２４７Ｘ、Ｄ２６８Ｘ、およびＴ３０８Ｘに対してコードする縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、代替的なアミノ酸残基で置換された。構築物ライブラリは、宿主細胞におけるその後のタンパク質発現のために調製された。
【００７０】
走査手法
ポリヌクレオチド構築物は、配列番号２（ＴＩＣ８０７）の全長にわたる全ての可能な位置において、単一アラニン置換または二重アラニン置換（アラニン−＜親残基＞−アラニン）を発現するように操作された。仮説実施例に関しては、表２を参照されたい。
【表２】
2015514116.tif 000004
Ｘ＝親残基
ａ＝親残基はアラニン残基
Ａ＝アラニン残基に修飾
Ｓ＝セリン残基に修飾
【００７１】
アラニン残基が既にＴＩＣ８０７に存在した場合、セリンが代わりに置換された。ＴＩＣ８０７と比較して増加した毒性を呈したタンパク質変異体は、増加した毒性をもたらしたそれらのアラニン置換残基における、組み合わせおよび飽和突然変異によってさらに試験された。走査手法はまた、操作・試験・選択の先の反復的段階からの蓄積された修飾を有する、改善された組み合わせ変異体において実施され、例えば、変異Ｆ４６Ｓ、Ｙ５４Ｈ、Ｓ１６７Ｒ、Ｓ２１７Ｎ、および残基範囲１９６〜２０１内の隣接する三重欠失を有するＴＩＣ８０７＿Ｍ２（配列番号８）は、改善されたＴＩＣ８０７＿Ｍ２をさらに改善するために、単一のアラニン置換の追加の段階によってさらに操作された。主に関連する残基が識別され、組み合わせおよび飽和突然変異（例えば、Ａ１５０Ｘ、Ｅ１２５Ｘ、Ｅ１５５Ｘ、Ｆ１４７Ｘ、Ｉ１３４Ｘ、Ｎ１５７Ｘ、Ｑ１４９Ｘ、Ｔ１３３Ｘ、Ｅ１３５Ｘ、およびＮ１３７Ｘ）によってさらに試験された。これらの組み合わされた手法によって操作された変異体は、ＴＩＣ８０７と比較して、増加した毒性へのさらなる改善を呈し、かつＴＩＣ８０７（配列番号２）の原子構造を活用する他の設計手法とさらに組み合わされた。
【００７２】
表面露出残基
本発明のタンパク質の原子構造は、反復的操作・試験・選択手法の最中に判定され、各残基の相対的溶媒露出度（ＳＡ％）は、ＭｏｌｓｏｆｔのＩＣＭ−Ｂｒｏｗｓｅｒ（Ｍｏｌｓｏｆｔ  Ｌ．Ｌ．Ｃ．，１１１９９  Ｓｏｒｒｅｎｔｏ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｒｏａｄ，Ｓ２０９，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ９２１２１）を使用して判定された。表３中、（Ａ）および（Ｂ）の列に示される、実際のＳＡ％は、配列番号１８５（ＴＩＣ８０７＿Ｌ１１Ｍ）および配列番号８（ＴＩＣ８０７＿Ｍ２）として記載されるそれぞれのアミノ酸配列を有するタンパク質に関して計算された。ＴＩＣ８０７およびＴＩＣ８５３の残基に関して予想されたＳＡ％は、表３中、（Ａ）および（Ｃ）の列にそれぞれ列記される。ともに、表３に報告される％ＳＡ値は、原子構造の各位置における各残基に関して標準的な伸長配座（Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙ）における最大溶媒露出面積に対する、水分子によってプローブされる溶媒露出表面積のパーセンテージ（％）として計算される。表３は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアライメントにおいて並べられた残基ごとに、各タンパク質の残基を並べる。１００超のＳＡ％は、各残基に対する標準的な伸長配座（Ｇｌｙ−ＸＸＸ−Ｇｌｙ）における最大溶媒露出面積が、水分子によってプローブされる実際の溶媒露出面積未満である時に、生じ得る。１００超のＳＡ％は、１００％として表中に報告される。
【００７３】
本明細書において説明される、組み合された操作・試験・選択手法は、配列番号２（ＴＩＣ８０７）のＰ２１９のＣｂ原子周辺で約９．２〜１２．２オングストロームの半径を有する残基の表面パッチ（図２の［２］）内に蓄積する、いくつかの主に関連する残基をもたらした：配列番号２（ＴＩＣ８０７）のＶ１０、Ｉ１４、Ｎ２２、Ｎ２３、Ｇ２４、Ｉ２５、Ｑ２６、Ｇ２７、Ｆ３０、Ｑ３８、Ｉ３９、Ｄ４０、Ｔ４１、Ｉ４３、Ｓ１９３、Ｔ１９４、Ｅ１９５、Ｈ１９６、Ｙ１９７、Ｓ１９８、Ｈ１９９、Ｙ２００、Ｓ２０１、Ｇ２０２、Ｙ２０３、Ｐ２０４、Ｉ２０５、Ｌ２０６、Ｔ２０７、Ｗ２０８、Ｉ２０９、Ｓ２１０、Ｙ２１６、Ｓ２１７、Ｇ２１８、Ｐ２１９、Ｆ２２０、Ｍ２２１、Ｓ２２２、Ｗ２２３、Ｙ２２４、Ｆ２２５、Ｎ２３９、およびＶ２４４。これらの残基のうちの少なくとも半分は、１５超、またはそれに等しいＳＡ％値を呈する。
【表３−１】
2015514116.tif 000005
【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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Ｐ１は、図２の表面パッチ［１］におけるアミノ酸を示す。
Ｐ２は、図２の表面パッチ［２］におけるアミノ酸を示す。
＊は、本明細書において説明される７２の主に関連するアミノ酸のうちの１つを示す（図２を参照されたい）。
Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗによって並べられるＴＩＣ８０７＿Ｌ１１Ｍ、ＴＩＣ８０７＿Ｍ２、およびＴＩＣ８５３の残基が示される。
＃で印される数は、少なくとも約３６％のＳＡ％を表す。
【００７４】
受容体結合
３６％超のＳＡ％値を有する残基、または配列番号２（ＴＩＣ８０７）のＳ９５のＣｂ原子からの約９．２〜１２．２オングストロームの半径における、３６％超のＳＡ％を有する残基の約３つの残基内の表面パッチ（図２の［１］）は、増強されたリグス阻害スペクトルおよび／または改善されたリグス阻害活性を呈するｅＨＴＰを提供するように置換することができる、ＴＩＣ８０７タンパク質の残基を含む領域として識別された。この表面パッチ領域は、標的昆虫受容体結合活性と関連付けられ得、配列番号２（ＴＩＣ８０７）の残基Ｔ９３、Ｓ９５、Ｓ９７、Ｆ１４７、Ｑ１４９、Ｓ１５１、Ｎ１８０、Ｔ１８２、Ｖ２５１、Ｑ２５３、およびＳ２５５を含む。ｅＨＴＰは、Ｓ９５Ａ、Ｆ１４７Ａ、Ｑ１４９Ｅ、および／またはＶ２５１Ａといった、表面パッチ１のアミノ酸残基の１つ以上の置換を含むことができるが、これらに限定されない。
【００７５】
本明細書において説明される、組み合された操作・試験・選択手法は、置換または別様に修飾される時、ｅＨＴＰを提供することができる、表面パッチ１に位置する残基を識別した。これらの残基は、ＴＩＣ８０７と比較して、増強されたリグス阻害スペクトルおよび／または改善されたリグス阻害活性を提供するために、リグス昆虫腸における受容体へのｅＨＴＰの産生的結合にとって重要であり得る。ｅＨＴＰを提供することができる表面パッチ１のアミノ酸残基の修飾は、昆虫のグリコシル化された受容体上で見出される糖類への結合を好む芳香族基および／または水素結合基を提供する置換を含む。
【００７６】
膜結合
タンパク質のベータシート領域に位置するあるアミノ酸残基がＴＩＣ８０７の原子構造から識別され、芳香族残基で置換された。より具体的には、折り畳まれたＴＩＣ８０７ベータシート領域のアミノ酸Ｌ７８、Ｉ１２３、Ｈ２７０、Ｒ２７３、Ｉ２７５が、フェニル（Ｐｈｅｎｙ）アラニン、チロシン、またはトリプトファンで置換された。Ｒ２７３およびＩ２７５の芳香族アミノ酸置換が、増強されたリグス阻害スペクトルおよび／または改善されたリグス阻害活性を提供した、それらの残基間で行われた（表４、配列番号３２、３４、６８、９２、および１２２に関するデータを参照されたい）。これらの位置における残基のアミノ酸側鎖は、標的昆虫の膜と相互作用する可能性が高くあり得る。
【００７７】
タンパク質分解活性部位
概して、タンパク質分解に関与すると考えられるグリシン残基は、タンパク質分解開裂動力学を改変するように、セリンで置換された。ループ領域におけるグリシン残基の存在は、より多くの柔軟性、および、したがってタンパク質分解への感受性を付与することができ、これは、昆虫阻害活性を増加させ得るか、または昆虫阻害活性を減少させ得る。構造的に識別されたループ領域における残基は、グリシン残基で置換され、改善は全く観察されなかった。既にグリシンであるループ内の位置（例えば、Ｇ１８、Ｇ２４、Ｇ２７）は、タンパク質分解感受性を低減するための小さい残基であるセリンで置換され、改善は全く観察されなかった。
【００７８】
組み合わされた構造設計手法
ＴＩＣ８０７（配列番号２）の原子構造は、ライブラリ突然変異のためのループ領域を識別し、続いて、操作された変異体を試験するために使用された。配列番号２（ＴＩＣ８０７）のアミノ酸位置２１１〜２１６で、ループは、ライブラリ突然変異され、試験された。配列番号２（ＴＩＣ８０７）のアミノ酸位置７５〜８３、１６１〜１６７、および２６７〜２７６で、近接して連続したループは、ライブラリ突然変異され、試験された。
【００７９】
ＴＩＣ８０７の原子構造の分析は、構造的ループが配列番号２の残基１１３〜１３８に存在し、および変異体が、ループを安定させる、そして、不安定にするために操作されたことを示唆している。
【００８０】
短ループによって接続された２本のベータストランドに跨る別の領域において、２本のベータストランドは、孔を形成するループの特徴である、配列番号２に関して、１１６〜１２１位および１３３〜１３８位で疎水性アミノ酸残基および親水性アミノ酸残基の交互のパターンを示した。発現ライブラリは、両方のベータストランドセグメントを修飾するために操作され、ライブラリ中の計２８８の可能な変異体において、残基Ｖ１１６、Ｖ１１８、およびＩ１２０をそれぞれの組み合わせ１１６Ｖ／Ｙ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｄ、１１８Ｖ／Ｙ／Ｌ／Ｈ／Ｆ／Ｄ、および１２０Ｉ／Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｎ／Ｖ／Ｙで置き換えた。この手順は、２４３の可能な変異体において、残基Ｓ１１７、Ｓ１１９、およびＰ１２１をそれぞれの組み合わせ１１７Ｓ／Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｒ／Ｔ、１１９Ｓ／Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｒ／Ｔ、および１２１Ｐ／Ｓ／Ｔと；２５２の可能な変異体において、残基Ｉ１３３、Ａ１３５、およびＦ１３７をそれぞれの組み合わせ１３３Ｉ／Ｄ／Ｆ／Ｎ／Ｖ／Ｙ、１３５Ａ／Ｄ／Ｆ／Ｈ／Ｌ／Ｖ／Ｙ、および１３７Ｆ／Ｄ／Ｈ／Ｌ／Ｖ／Ｙと；ならびに４８６の可能な変異体において、残基Ｔ１３４、Ｅ１３６、およびＮ１３８をそれぞれの組み合わせ１３４Ｔ／Ａ／Ｄ／Ｅ／Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｒ／Ｓ、１３６Ｅ／Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｋ／Ｎ／Ｒ／Ｓ／Ｔ、および１３８Ｎ／Ａ／Ｄ／Ｇ／Ｓ／Ｔと、について繰り返された。増強されたリグス阻害スペクトルおよび／または改善されたリグス阻害活性は、表４に示されるこれらの置換のうちのいくつかと関連付けられた。
【００８１】
構造関数関係
ＴＩＣ８０７の変異体を発現する、総計で２０００超のクローン（混合ライブラリクローンを含む）が、ＴＩＣ８０７と比較して、リグス種に対して増強されたリグス阻害スペクトルおよび／または改善されたリグス阻害活性について試験された。半ランダムな修飾、特異的修飾、および予測構造関数修飾は、構造モデリング、受容体結合能、金属結合能、オリゴマー形成能、表面電荷分布の均一性、孔形成能、イオンチャネル機能、ならびにＴＩＣ８０７と比較して増強されたリグス阻害スペクトルおよび／または改善されたリグス阻害活性を有するｅＨＴＰを識別することを目的とする表面露出パッチの識別を含む。これらのクローンは、バイオアッセイ試験のために発現された。
【実施例３】
【００８２】
変異体および断片を含むＴＩＣ８０７のタンパク質発現および精製
対照タンパク質ＴＩＣ８０７は、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂｔ）において結晶形態または大腸菌において凝集形態で発現され得る３０９アミノ酸長さのタンパク質である。その試験変異体は、Ｂｔにおいて組み換え発現された。ＴＩＣ８０７およびＴＩＣ８０７の変異体の発現特性は、Ｂｔ細胞および大腸菌細胞からそれぞれ抽出された優勢な結晶形態および凝集形態である。リグス生物活性について試験するために、試験試料および対照試料は、２５ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液中に試料を可溶化し、遠心分離によって不溶化材料を除去することによって、リグスバイオアッセイに適合させた。試験試料および対照試料中のタンパク質の量は、総タンパク質法、例えば、ブラッドフォードアッセイ、ＥＬＩＳＡ法、または同等のものを使用して測定された。ゲル電気泳動は、可溶化組み換えタンパク質の純度およびストック濃度を決定するために使用された。Ｃ末端ＨＩＳタグＴＩＣ８０７タンパク質は、大量のＴＩＣ８０７対照タンパク質の検出、精製、および定量化を容易にするために操作された。Ｃ末端ＨＩＳタグＴＩＣ８０７および非タグＴＩＣ８０７試験試料は、別々にアッセイされ、リグスに対して同等の活性を有することが確認された（実施例４、５、および６を参照されたい）。
【００８３】
部位特異的アミノ酸置換は、可溶化形態の発現を高めるために、ＴＩＣ８０７＿Ｍ１３（配列番号３４）に対して行われた。発明者は、本発明のタンパク質のより容易に可溶な変異体が、発現および精製を促進することができ（例えば、大腸菌の宿主細胞において発現される）、植物の宿主細胞において発現された時、昆虫阻害の有効性を増加させることができると仮定する。ＴＩＣ８０７＿Ｍ１３（配列番号３４）をコードする組み換えＤＮＡ構築物は、ＴＩＣ８０７＿Ｍ１３に関して、修飾は、変異体＃１については、Ｉ５８ＫおよびＰ５９Ｋ、変異体＃２については、Ｓ１９８ＫおよびＧ１９９Ｋ、ならびに変異体＃３については、Ｓ２４６Ｒ、Ｖ２４８Ｅ、およびＱ２５０Ｒである、３つの異なる変異体を反映させるために３つの異なる方法で操作された。ＴＩＣ８０７（配列番号２）に関して、修飾は、変異体＃１については、Ｉ５８ＫおよびＰ５９Ｋ、変異体＃２については、Ｓ２０１ＫおよびＧ２０２Ｋ、ならびに変異体＃３については、Ｓ２４９Ｒ、Ｖ２５１Ｅ、およびＱ２５３Ｒであるように、代替として記載され得、ＴＩＣ８０７＿Ｍ１３（配列番号３４）において反映される配列番号２（ＴＩＣ８０７）の残基範囲１９６〜２０１内の隣接する三重欠失により、この位置相違が適合する。４つの操作された組み換えＤＮＡ構築物は、各々、クローン化され、大腸菌において発現された。４つの大腸菌調製物からの可溶性画分は、クーマシィー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価され、ＴＩＣ８０７＿Ｍ１３（配列番号３４）が可溶性画分において不検出であったが、対照的に、変異体＃１、２、および３は可溶性であったことを示した。同様のアミノ酸置換は、非Ｂｔまたは植物宿主細胞において、単独でまたは組み合わせて、それらの溶解度を高めるために本発明のタンパク質に対して行われる。組み換えＤＮＡ構築物は、ＴＩＣ８０７＿Ｍ１３変異体＃３（ＴＩＣ８０７＿Ｍ１４に改名；ヌクレオチド配列番号２０３およびアミノ酸配列番号２０４）をコードし、発現するように操作された。調製された大腸菌溶解物が浄化され、イオン交換およびゲル濾過法を含む、一連のカラムにおいて組み換えタンパク質が精製され、濃縮された。プールされたタンパク質画分が、定量化され、リグス昆虫に対して活性であることを決定した（実施例４、表４Ｂを参照されたい）。
【００８４】
配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、または配列番号３６として記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質等を含むが、これらに限定されない、本発明のタンパク質は、宿主細胞中に発現される、例えば、Ｂｔ、大腸菌中、または植物細胞もしくは植物細胞の区画内に発現される時、可溶性形態の発現を高めるために操作される。操作には、以下の位置５８、５９、１９８、１９９、２０１、もしくは２０２のうちの１つ以上における、リジンアミノ酸残基；または以下の位置１９８、２４８、もしくは３０１のうちの１つ以上におけるグルタミン酸、または以下の位置２４６、２５０、もしくは２５３のうちの１つ以上におけるアルギニンの置換が含まれる。
【００８５】
Ｃ末端領域は、タンパク質の単量体の中心部から離れて突出する（図２を参照されたい）。組み換えＤＮＡ構築物は、ＴＩＣ８０７＿Ｍ８（配列番号１６）のタンパク質断片（アミノ酸１〜３０１）である配列番号２０２のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、発現するように操作され、発現タンパク質は、精製され、定量化され、リグス昆虫に対して活性であることが判断された（実施例４、表４Ｂを参照されたい）。組み換えＤＮＡ構築物は、それぞれのＴＩＣ８０７位置Ａ２８１、Ｇ２８９、Ｓ２９３、Ａ３０１、およびＳ３０４で本発明のタンパク質のＣ末端部からの異なる切断を呈するＴＩＣ８０７断片をコードし、発現するように設計された。タンパク質断片は、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、および配列番号３６として記載されるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、発現するように操作され、発現タンパク質断片は、リグス昆虫に対して試験試料として使用される。
【実施例４】
【００８６】
操作されたタンパク質の半翅目活性
本実施例は、リグス属、例えば、リグス・ヘスペルスおよびリグス・リネオラリスを含む異翅目カスミカメムシ科、アムラスカ属、例えば、アムラスカ・デバスタンス、およびエムポアスカ、例えば、エムポアスカ・ファバエ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ）を含むオオヨコバイ科のメンバが含まれるが、これらに限定されない、半翅目の昆虫の食餌中に提供される時、半翅目の昆虫に対して改善された殺虫活性または増強された殺虫特異性を有するｅＨＴＰを例解する。表４Ｂを含む本実施例は、リグス・ヘスペルスおよびリグス・リネオラリスの両方に対して本発明のＢｔ発現組み換えタンパク質の増強されたリグス阻害スペクトルおよび／または改善されたリグス阻害活性を決定するために使用された摂食アッセイを例解する。組み換え細菌宿主細胞において発現されるタンパク質は、炭酸塩緩衝液中に可溶化され、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分析され、タンパク質濃度は、基準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を使用してデンシトメトリーによって決定された。この方法で調製されたタンパク質ストック（２Ｘ）は、摂食アッセイのための食餌と混合された。
【００８７】
半翅目の種リグス・ヘスペルスおよびリグス・リネオラリスを用いた摂食アッセイは、伸縮性のあるＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）シートとマイラーシートとの間にカプセル化されたリグス食餌を用いた９６ウェルマイクロタイタープレート形式に基づいた。人工的な食餌は、Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ（登録商標）（Ｂｉｏ−Ｓｅｒｖ（登録商標）食餌Ｆ９６４４Ｂ，Ｆｒｅｎｃｈｔｏｗｎ，ＮＪ）から得られた。加熱滅菌した沸騰水（５１８ｍＬ）を、表面が滅菌されたミキサー中で１５６．３グラムのＢｉｏ−Ｓｅｒｖ（登録商標）食餌Ｆ９６４４Ｂと混合した。４つの表面が滅菌された鶏卵の中身を添加し、混合物が滑らかになるまで混合し、次いで、１リットルの総体積になるように調整し、室温まで冷却し、これにより、２倍の食餌になった。２倍の食餌および２倍の試料を１：１の比率で混合することによって、試験試料は調製された。一枚のＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）（Ｐｅｃｈｉｎｅｙ  Ｐｌａｓｔｉｃ  Ｐａｃｋｉｎｇ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）シートを、９６ウェル形式のために設計された真空マニホールド（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ，ＦＬ）上に置き、ウェルへのＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）の押出が生じるのに十分である約−２０ミリメートルの水銀の真空が適用された。２０〜４０マイクロリットルの試験試料を、Ｐａｒａｆｉｌｍ（登録商標）の押出に加えた。一枚のマイラーフィルム（Ｃｌｅａｒ  Ｌａｍ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｅｌｋ  Ｇｒｏｖｅ  Ｖｉｌｌａｇｅ，ＩＬ）を、試料が充填されたＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）の押出上に置き、仮付けアイロン（Ｂｉｅｎｆａｎｇ  Ｓｅａｌｅｃｔｏｒ  ＩＩ，Ｈｕｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）を用いて密封され、それ故に、食餌が充填されたＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）サシェ剤を形成した。これらのＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）のサシェ剤を、希アガロース液中で懸濁されたリグスの卵が入っている平底９６ウェルプレート上に置いた。孵化後、リグスの幼虫は、食餌が充填されたＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）のサシェ剤を穿孔することによって食餌を摂取する。代替として、卵の代わりに新たに孵化させたリグスの幼虫を、各々のウェルに手作業で侵入させた。発育阻止および致死率スコアは、５日目に判定され、対照と比較した。データは、ＪＭＰ４統計ソフトウェアを使用して分析した。試験濃度での各々のタンパク質については、８匹の幼虫から成る３つの個体群を、このバイオアッセイに供し、致死率スコアを表４Ｂ中に報告した。
【００８８】
表１および表４Ｂに列記されるＬＣ５０の判定については、タンパク質を、８〜１０の濃度で新たに孵化させたリグスの幼虫に提示し、用量範囲を超える致死率に関して採点する前に５日間、幼虫に摂食させた。各々の濃度については、８匹の幼虫から成る３つの個体群を、このバイオアッセイに供し、表１および表４Ｂ中のすべてのＬＣ５０の判定は、少なくとも１回繰り返された。
【００８９】
ＬＣ５０の判定については、タンパク質を、４つの濃度で新たに孵化させたリグス・リネオラリスの幼虫に提示し、用量範囲を超える致死率に関して採点する前に５日間、幼虫に摂食させた。リグス・リネオラリスのＬＣ５０の推定が、リグス・リネオラリスへの広範囲の毒性用量応答を完了するために、１０００μｇ／ｍＬを超える非常に多量のこれらのタンパク質が、リグスの食餌に提供され得なかったため、ＴＩＣ８０７およびＴＩＣ８０７＿Ｍ２において行われ、そのため、ＬＣ５０値は、ＴＩＣ８０７またはＴＩＣ８０７＿Ｍ２については判定されなかった。代わりに、低範囲内の４用量のＬＣ５０の推定が行われ、表１および表４Ｂ中に報告された。ＴＩＣ８０７＿Ｍ１４について推定されたリグス・リネオラリスのＬＣ５０は、４．４μｇ／ｍＬであった。各々の濃度については、８匹の幼虫から成る３つの個体群が、このバイオアッセイに供された。
【００９０】
表４Ａおよび４Ｂを含む本実施例は、アムラスカ・デバスタンスに対して本明細書に開示されたＢｔが発現された組み換えタンパク質の増強された阻害スペクトルおよび／または改善された阻害活性を判定するために使用された摂食アッセイを例解する。リグス・ヘスペルスおよびリグス・リネオラリスに対して改善された殺虫活性または増強された殺虫特異性を有するＴＩＣ８０７変異体は、アムラスカ・デバスタンスに対して改善された殺虫活性を示す。
【００９１】
ＴＩＣ８０７およびＴＩＣ８０７＿Ｍ１３を、２５ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０中に溶解した。アムラスカ・デバスタンス卵がオクラ葉上で回収され、２％寒天が入っているペトリ皿中で培養された。孵化後、新生虫は、希釈された（１：５）リグス食餌を使用するバイオアッセイのために使用された。タンパク質および食餌は、同じ比率で混合され（タンパク質の最終濃度が５００μｇ／ｍＬになる）、試験容器に分注した。未処理対照は、緩衝液を食餌と混合することによって調製された。個々の新生虫を試験容器に侵入させ、このアッセイを２５℃、６０％相対湿度で培養した。２０匹の新生幼虫が、各々の濃度、タンパク質、および２回の複製において試験された。対照は、１：５で希釈されたリグス食餌において、２５ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ１０で維持された。昆虫の致死率は、５日目に判定された。致死率値は、以下の式：（処理における致死率（％）−制御における致死率（％））／（１００−制御における致死率（％））×１００によって計算された。表４Ａは、５つの異なる濃度で、ＴＩＣ８０７およびＴＩＣ８０７＿Ｍ１３に対するアムラスカ活性を示す。
【表４Ａ】
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【００９２】
ＬＣ５０値は、別々の試験においてＴＩＣ８０７およびＴＩＣ８０７＿Ｍ１３に対して決定された。配列番号２（ＴＩＣ８０７）は、１１６．７９μｇ／ｍＬのＬＣ５０値および４３７．２７μｇ／ｍＬのＬＣ９０を示した。配列番号３４（ＴＩＣ８０７＿Ｍ１３）は、７．５９μｇ／ｍＬのＬＣ５０値および２３９．８μｇ／ｍＬのＬＣ９０値を示した。
【００９３】
アムラスカ・デバスタンスについて記載された摂食アッセイは、エムポアスカ・ファバエ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ）に対して改善された殺虫活性および／または増強された殺虫特異性についてｅＨＴＰを試験するために使用される。リグス・ヘスペルスおよびリグス・リネオラリスに対して改善された殺虫活性または増強された殺虫特異性を有するＴＩＣ８０７変異体は、エムポアスカ・ファバエ（Ｅｍｐｏａｓｃａ  ｆａｂａｅ）に対して改善された殺虫活性を示す。
【００９４】
リグス・ヘスペルスおよびリグス・リネオラリスに対してＴＩＣ８０７（配列番号２）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ２（配列番号８）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ１０（配列番号３０）、およびＴＩＣ８０７＿Ｍ１３（配列番号３４）に対するＣｒｙ５１Ａａ１（配列番号１８２）のＬＣ５０値は、１つの試験セットにおいて決定された。ＴＩＣ８０７＿Ｍ２、ＴＩＣ８０７＿Ｍ１０、およびＴＩＣ８０７＿Ｍ１２は、Ｃｒｙ５１Ａａ１と比較して改善されたＬＣ５０値を示す。
【００９５】
この手順への変形であって、結果に影響が出るはずのない変形が、存在し得ることは、当業者には明らかであるべきである。
【表４Ｂ−１】
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【表４Ｂ−２】
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【表４Ｂ−３】
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【表４Ｂ−４】
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【表４Ｂ−５】
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【表４Ｂ−６】
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【表４Ｂ−７】
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【表４Ｂ−８】
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【表４Ｂ−９】
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【表４Ｂ−１０】
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【表４Ｂ−１１】
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【表４Ｂ−１２】
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【表４Ｂ−１３】
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【表４Ｂ−１４】
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【表４Ｂ−１５】
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【表４Ｂ−１６】
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【表４Ｂ−１７】
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【表４Ｂ−１８】
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【表４Ｂ−１９】
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【表４Ｂ−２０】
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【表４Ｂ−２１】
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【表４Ｂ−２２】
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【表４Ｂ−２３】
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【表４Ｂ−２４】
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【表４Ｂ−２５】
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【表４Ｂ−２６】
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【表４Ｂ−２７】
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【表４Ｂ−２８】
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【表４Ｂ−２９】
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【表４Ｂ−３０】
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【表４Ｂ−３１】
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【表４Ｂ−３２】
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【表４Ｂ−３３】
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【表４Ｂ−３４】
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【表４Ｂ−３５】
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【表４Ｂ−３６】
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【表４Ｂ−３７】
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【表４Ｂ−３８】
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【表４Ｂ−３９】
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【表４Ｂ−４０】
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【表４Ｂ−４１】
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【表４Ｂ−４２】
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【表４Ｂ−４３】
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ＮＤ＝決定されず；＊は、約５μｇ／ｍＬで試験した。
【実施例５】
【００９６】
本発明のタンパク質メンバの昆虫阻害活性
ＴＩＣ８０７＿Ｍ１（配列番号６）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ２（配列番号８）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ３（配列番号１０）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ４（配列番号１２）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ５（配列番号１４）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ６（配列番号１８）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ７（配列番号２０）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ８（配列番号１６）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ９（配列番号２８）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ１１（配列番号３２）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ１３（配列番号３４）、およびＴＩＣ８０７＿Ｍ１２（配列番号３６）等であるが、これらに限定されない、本発明のタンパク質が調製され、リグス以外の植物の有害生物に対する生物活性について試験された。
【００９７】
タンパク質ＴＩＣ８０７＿Ｍ１０（配列番号３０）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ１１（配列番号３２）、ＴＩＣ８０７＿Ｍ１２（配列番号３６）、およびＴＩＣ８０７＿Ｍ１３（配列番号３４）が調製され、他の鱗翅目、鞘翅目、異翅目、および同翅目からの有害生物に対する生物活性について試験された。タンパク質ＴＩＣ８０７＿Ｍ５（配列番号１４）が調製され、鞘翅目の有害生物に対する生物活性について試験された。バイオアッセイは、表５に示されるような、昆虫におけるこれらのタンパク質の効果を評価するために行われた。摂食アッセイは、殺虫タンパク質を含む人工食餌において行われた。殺虫タンパク質は、実施例３に記載されるように調製され、試験される昆虫に応じて、昆虫に特異的な人工食餌を使用して局所に適用された。毒素は、緩衝中で懸濁され、ウェルあたり試料の５００μｇ／ｍＬの割合で適用され、ＴＩＣ８０７＿Ｍ５については１０００μｇ／ｍＬで、そしてその後乾燥させた。平均発育阻止スコアおよび個体群の致死率は、試験された昆虫種あたり８匹の昆虫から成る３つの個体群において判定された。結果は、未処理対照と比較して統計的に有意であった発育阻止および致死率等の昆虫の反応に対して陽性（＋）として表された。結果は、昆虫が未処理対照（ＵＴＣ）、つまり、上記の緩衝液のみが適用される食餌を与えるのと同様であった場合、陰性（−）として表された。
【表５】
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ＵＴＣ＝未処理対照；ＮＤ＝判定されず
ＣＰＢ＝コロラドハムシ（Ｌｅｐｔｉｎｏｔａｒｓａ  ｄｅｃｅｍｌｉｎｅａｔａ）；ＷＣＲ＝西洋トウモロコシ根虫（Ｄｉａｂｒｏｔｉｃａ  ｖｉｒｇｉｆｅｒａ）；ＥＣＢ＝欧州アワノメイガ（Ｏｓｔｒｉｎｉａ  ｎｕｂｉｌａｌｉｓ）；南西アワノメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）；ＣＥＷ＝アメリカタバコガ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）；ＦＡＷ＝ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）；ＳＧＳＢ＝ミナミアオカメムシ（Ｎｅｚａｒａ  ｖｉｒｕｄｕｌａ）；ＮＢＳＢ＝亜熱帯ブラウンスティンクバグ（ｂｒｏｗｎ  ｓｔｉｎｋ  ｂｕｇ）（Ｅｕｓｃｈｉｓｔｕｓ  ｈｅｒｏｓ）；ＧＰＡ＝モモアカアブラムシ（Ｍｙｚｕｓ  ｐｅｒｓｉｃａｅ）。
【００９８】
本発明のタンパク質はまた、回虫由来の有害生物に対する生物活性について試験される。
【実施例６】
【００９９】
本発明のタンパク質を発現する植物は、昆虫阻害活性を呈する
本実施例は、植物における本発明のタンパク質の発現を例解し、本発明のタンパク質を発現する綿植物が昆虫阻害活性を呈することを実証する。
【０１００】
植物における本発明のタンパク質の発現で用いるポリヌクレオチドセグメントは、米国特許第７，７４１，１１８号で記載される方法に従って作製される。例えば、配列番号４（ＴＩＣ８０７＿４）、配列番号６（ＴＩＣ８０７＿Ｍ１）、配列番号８（ＴＩＣ８０７＿Ｍ２）、配列番号１０（ＴＩＣ８０７＿Ｍ３）、配列番号１２（ＴＩＣ８０７＿Ｍ４）、配列番号１４（ＴＩＣ８０７＿Ｍ５）、配列番号１６（ＴＩＣ８０７＿Ｍ８）、配列番号１８（ＴＩＣ８０７＿Ｍ６）、配列番号２０（ＴＩＣ８０７＿Ｍ７）、配列番号２２（ＴＩＣ８０７＿２２）、配列番号２４（ＴＩＣ８０７＿２４）、配列番号２６（ＴＩＣ８０７＿２６）、配列番号２８（ＴＩＣ８０７＿Ｍ９）、配列番号３０（ＴＩＣ８０７＿Ｍ１０）、配列番号３２（ＴＩＣ８０７＿Ｍ１１）、および配列番号３４（ＴＩＣ８０７＿Ｍ１３）に記載されるようなアミノ酸配列を有する毒素タンパク質は、植物における使用のために設計されたポリヌクレオチドセグメントから発現し、本発明のタンパク質をコードし、これには、配列番号１８６、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９２、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９５、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２００、および配列番号２０１に記載されるようなポリヌクレオチド配列がそれぞれ含まれる。
【０１０１】
変異体タンパク質またはその昆虫阻害断片の各々をコードするポリヌクレオチドセグメント（またはポリヌクレオチド分子）が、単独でまたは相互に組み合わせて、あるいは、ｄｓＲＮＡ媒介遺伝子抑制分子等の他の昆虫阻害タンパク質もしくは昆虫阻害剤と組み合わせて使用されることが意図される。そのような組み合わせは、相乗作用または適合機構において本発明のタンパク質と作用するように設計される。これらの組み合わせの目的は、有害生物、特に、昆虫有害生物の侵入からの植物および植物細胞の保護を達成することである。本発明の範囲内の特定の変異体タンパク質は、表４Ｂに列記され、出願されるように本願を通じて記載される配列番号に対応するタンパク質を含む。
【０１０２】
配列番号１８８（ＴＩＣ８０７＿Ｍ２、配列番号８をコードする）および配列番号１９２（ＴＩＣ８０７＿Ｍ８、配列番号１６をコードする）からのポリヌクレオチドセグメントは各々、綿形質転換のために発現構築物に組み換え操作された。
【０１０３】
トランスジェニック綿植物（組み換え綿植物）が、産生され、有効性について試験された。種々の定量的および半定量的方法、例えば、ＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、およびウェスタンによって判定される、それぞれの変異体タンパク質のコピー数が少なく、発現が高かった、再生成された（Ｒ０）トランスジェニック植物が選択された。Ｒ０綿葉組織における発現レベルは、典型的には、０．５〜５００ｐｐｍの生体重の範囲であった。高レベルのタンパク質を発現するＲ０植物は、土に移され、自家受粉された。自家受粉されたＲ０植物の各々から３０の種子が植えられ、導入遺伝子に対して同型の子孫が開花するように栽培された。本実施例の各々の構築物あたり４〜５事象あたり１１〜１８の植物が、リグスに対する有効性について試験された（表６Ａ、６Ｂ、および６Ｃ）。プールされた陰性の別々の個体群からの形質転換されない綿品種の植物（子孫は導入遺伝子を含まず）、およびＴＩＣ８０７親タンパク質を発現する植物は、陰性対照としての役割を果たした。開花期の綿植物の１本の枝は、通気性のあるプラスチック製の「授粉」スリーブから作製されるメッシュバッグ（Ｖｉｌｕｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃｏ．Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｋｆｏｒｔ，ＩＬ）に入れられ、複数本の枝は、同様の様式で設定された。各々のメッシュバッグは、ビニタイを使用して茎で固定された。約４〜６のリグス・ヘスペルス幼虫（孵化後２４時間未満）は、１．４ｍＬの円錐管（Ｍａｔｒｉｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．，ＮＨ）に入れられた。ふたが外された円錐管をメッシュバッグ中に滑らせることによって、メッシュバッグ中の枝に、幼虫が侵入した。メッシュバッグ中の全ての生存している昆虫がドライアイス上に回収される前の１０〜１１日間、昆虫に食餌を与えた。生存したものは、総質量を得るために計量された。致死率パーセントおよび生存したものの平均質量が計算された。行方不明の昆虫は、致死率パーセントの致死率計算に含まれた。表６Ａ、６Ｂ、および６Ｃに示されるように、変異体タンパク質ＴＩＣ８０７＿Ｍ２およびＴＩＣ８０７＿Ｍ８を発現する綿植物は、リグス・ヘスペルス幼虫の成長および生育に大いに影響を与えた。これらの結果に基づいて、これらの植物、種子、発現構築物は、さらなる生育を進めた。
【表６Ａ】
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【表６Ｂ】
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【表６Ｃ】
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Ｓｔｄ  Ｄｅｖ＝標準偏差
ＳＥＭ＝標準誤差
Ｌｏ  ９５％＝９５％信頼区間の下限
Ｕｐ  ９５％＝９５％信頼区間の上限
Ｔ分類＝最小有意差検定を用いた、Ｆ値＝１０１．１７５６、ｄｆ＝１５，４４、Ｐｒ＜０．０００１
【０１０４】
別の実施例において、ＴＩＣ８０７＿Ｍ１１を発現する５つのトランスジェニック事象からの綿植物は、天然のリグスの侵入圧を有する畑試験において試験された。これらの植物は、非トランスジェニックレシピエント株（形質転換のために使用されたＤＰ３９３遺伝資源）と比較して、畑の有効性を実証した。事象あたり５つの植物におけるリグス・リネオラリス昆虫の平均数は、非トランスジェニック対照由来の植物におけるリグス・リネオラリス昆虫の平均数よりも著しく低かった。５つの事象からの植物由来の実綿の産出量は、非トランスジェニック対照の実綿の産出量、例えば、栽培期にわたるスクエア保持（ｓｅａｓｏｎ−ｌｏｎｇ  ｓｑｕａｒｅ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）に統計的に同等であった。
【０１０５】
別の同様の畑試験において、ＴＩＣ８０７＿Ｍ１０を発現する７つのトランスジェニック事象由来の綿植物は、非トランスジェニック対照と比較して、畑の有効性を実証した。事象あたり５つの植物におけるリグス・リネオラリス昆虫の平均数は、非トランスジェニック対照由来の植物におけるリグス・リネオラリス昆虫の平均数よりも著しく低かった。７つのうちの３つの事象からの植物由来の実綿の収率は、非トランスジェニック対照の実綿の収率よりも統計的に高かった。
【０１０６】
別の実施例において、ＴＩＣ８０７＿Ｍ１３を発現する３４のトランスジェニック事象からの綿植物は、非トランスジェニック対照と比較して、栽培箱の有効性を実証した。メッシュバッグに、（本実施例の前半で記載された単一の枝を囲む代わりに）開花期に綿植物全体を囲むように入れた。事象あたり５つの植物が評価され、植物あたり回収されたリグス・リネオラリス昆虫（第二世代のリグスの幼虫から成虫）の平均数は、非トランスジェニック植物あたりリグス・リネオラリス昆虫の平均数よりも著しく低かった。
【０１０７】
同様の実験が、表１、表４Ａ、および４Ｂに列記されるタンパク質を発現する植物を用いて行われる。
【実施例７】
【０１０８】
昆虫阻害活性を呈する本発明のタンパク質を発現するアルファルファ植物由来の組織
本実施例は、アルファルファ植物における本発明のタンパク質の発現を説明し、本発明のタンパク質を発現するアルファルファ植物由来の組織が昆虫阻害活性を呈することを実証する。
【０１０９】
配列番号１９２（ＴＩＣ８０７＿Ｍ８、配列番号１６をコードする）からのポリヌクレオチドセグメントは、アルファルファ形質転換のために、３つの別々に構成された発現構築物に組み換え操作された。データを報告するために、３つの組み換え構築物が、［ＥＲ］、［ＥＳ］、および［ＥＴ］にコードされる。
【０１１０】
異系交配し、自家授粉されたトランスジェニックアルファルファ植物（組み換えアルファルファ植物）が、形質転換細胞から回収された。ＲＴ−ＰＣＲ法および半定量的ウェスタン法のそれぞれによって判定される、コピー数が少なく、ＴＩＣ８０７発現が高かった組み換えアルファルファ植物が選択された。別々の１０の事象からのアルファルファ植物組織が、プールされ、凍結乾燥され、細かくされ、ストック緩衝液、２５ｍＭ  ＮａＣａｒｂ、ｐＨ１０．５中で再懸濁された。導入遺伝子を発現するＴＩＣ８０７＿Ｍ８がないアルファルファ由来の植物組織は、対照として使用するために調製された。リグス食餌に組み込むために、ストック調製物を、１００、３００、および９００倍に連続的に希釈した。実施例４の摂食アッセイ法を使用して、致死率および発育阻止スコアが５日目に判定され、対照と比較した（表７Ａおよび７Ｂを参照されたい；データは、ＪＭＰ４統計ソフトウェアを使用して分析された）。各々の試験試料および各々の希釈のために、８匹の幼虫から成る３つの個体群がこのバイオアッセイに供された。発育阻止スコアは、０＝陰性対照に対する差がない、１＝約２５％少ない質量、２＝約５０％少ない質量、および３＝約７５％少ない質量である、視覚的な質量評価に相当する。８匹の幼虫から成る各々の個体群に関して発育阻止スコアの平均が報告される。
【表７Ａ】
2015514116.tif 000062
【表７Ｂ】
2015514116.tif 000063
【実施例８】
【０１１１】
リグス種の阻害活性を呈するｅＨＴＰおよび第二の昆虫阻害タンパク質を共発現する植物
ＴＩＣ１４１５およびＴＩＣ８０７＿Ｍ１３の種々の混合物を含むタンパク質試料が、調製され、バイオアッセイにおいて試験された。ＴＩＣ１４１５タンパク質および他のリグス阻害タンパク質は、ＰＣＴ特許出願公開国際公開第２０１２／１３９００４号に記載される。試料混合物が、リグス・リネオラリスに与えられ、生物活性アッセイを使用した。また、ＴＩＣ１４１５タンパク質のみおよびＴＩＣ８０７＿Ｍ１３のみを、陽性対照として調製した。緩衝液は、陰性対照として使用した。３つすべてのタイプの調製物からの試料は、リグス・リネオラリスに対して致死率を呈し、生存したものの発育を阻止した。致死率および発育阻止スコアは、緩衝液を与えられる昆虫の生物活性スコアと比較して有意であった（表８Ａを参照されたい）。データは、拮抗作用がないことを示唆している。追加のバイオアッセイ試験が、相乗および／または相加効果を実証するために、混合物に対して行われる。
【表８Ａ】
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†個体群あたり８匹の幼虫から成る５つの個体群の平均値（平均（ｍｅａｎ））
‡発育阻止スコアは、０＝陰性対照に対する差がない、１＝約２５％少ない質量、２＝約５０％少ない質量、および３＝約７５％少ない質量である、視覚的な質量評価に相当する。８匹の幼虫から成る各々の個体群に関して発育阻止スコアの平均が報告される。
＊９５％信頼区間で。
【０１１２】
トランスジェニックＤＮＡを有する事象を含む綿植物は、それぞれのタンパク質ＴＩＣ１４１５およびＴＩＣ８０７＿Ｍ１３を共発現するように設計された。そのような植物は、リグス・リネオラリスを侵入させたケージ化された全植物アッセイにおいて評価された。１０の事象から５つの植物が各々、ケージ化され、植物あたり２対の雄および雌のＬ．リネオラリスを侵入させた。このアッセイは、綿植物の生育のための正常な環境条件下、栽培箱において２１日間培養された。ＤＰ３９３陰性対照植物を、同様の様式で成長させた。３週間の期間の終了時、種々の生育期のリグスを計数した。生育における各々の段階でリグス・ヘスペルス昆虫の植物あたりの平均数を計算した（表８Ｂを参照されたい）。
【表８Ｂ】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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