(57)【要約】  本発明は、中和抗体に提示される表面ポリペプチドのランダム化改変体を含む組換えウイルスのライブラリーの結合に基づく免疫原の迅速選択（ＲＩＳ）法に関する。本発明はまた、ウイルスによって引き起こされる疾患の治療のための医薬における、および患者における中和抗体の同定のための診断における、本発明のＲＩＳ法によって単離される免疫原の使用にも関する。
2015508279.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０の改変体またはその免疫原性フラグメントを含む、ウイルスに対する中和抗体を誘発し得るポリペプチドであって、該ポリペプチドが、配列番号２の位置番号に関して、Ｃ１３１Ｙ、Ｔ１３２Ｎ、Ｄ１３８ＧおよびＮ１６０Ｙ変異を含むものであるか、または該ポリペプチドが、配列番号２の位置番号に関して、Ｎ２０３ＳおよびＧ６０４Ｅ変異を含むものである、ポリペプチド。
【請求項２】
ウイルスに対する中和抗体を誘発し得るポリペプチドであって、該ポリペプチドが、改変体ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０またはその免疫原性フラグメントを含み、該改変体ｇｐ１２０またはその免疫原性フラグメントが、配列番号２の位置番号に関して、位置８８、１３１、１３２、１３８、１６０、１９１、２０３、２２６、４７９、５０７、６０４および６４７からなる群から選択される位置に少なくとも変異を含むポリペプチドからなる群から選択されるものである、ポリペプチド。
【請求項３】
前記変異が、Ｎ８８Ｄ、Ｃ１３１Ｙ、Ｔ１３２Ｎ、Ｄ１３８Ｇ、Ｎ１６０Ｙ、Ｎ１９１Ｄ、Ｎ２０３Ｓ、Ａ２２６Ｖ、Ｍ４７９Ｉ、Ｒ５０７Ｗ、Ｇ６０４Ｅ、およびＹ６４７Ｎからなる群から選択されるものである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントが、配列番号４、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３１からなる群から選択される配列を含むものである、請求項３に記載のポリペプチドまたはその免疫原性フラグメント。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項６】
請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項７】
配列番号３の配列を有してなる、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
請求項７に記載のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクター。
【請求項９】
請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項５に記載のポリヌクレオチド、または請求項６に記載の発現ベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項５に記載のポリヌクレオチド、または請求項６に記載の発現ベクターを含んでなる、免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１１】
医薬に用いられる、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載の発現ベクター、または請求項１０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１２】
ＨＩＶ感染によって引き起こされる疾患の治療または予防に用いられる、請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項６に記載のポリヌクレオチド、請求項７に記載の発現ベクター、または請求項１０に記載の免疫原性組成物またはワクチン。
【請求項１３】
所定の病原体に対して特異的な中和抗体を試料中で検出する方法であって、該方法が：
（ｉ）前記試料を請求項１から４のいずれか一項に記載のポリペプチドと接触させる工程と、
（ｉｉ）前記ポリペプチドと前記中和抗体との間の免疫複合体の形成を検出する工程と
を含んでなる、方法。
【請求項１４】
被検体におけるウイルス感染に対する中和抗体応答の検出方法であって、
請求項１３に記載の方法を用いて中和抗体の存在を前記被検体において検出する工程を含んでなり、
コントロール被検体に対する前記被検体における中和抗体の存在を、前記被検体におけるウイルス感染に対する中和抗体応答の指標とする、方法。
【請求項１５】
前記ウイルスがＨＩＶであり、前記ポリペプチドが請求項１から４のいずれか一項に記載のｇｐ１２０改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントである、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料がＨＩＶ−１感染患者由来のものであるか、または前記試料がエイズワクチンレシピエント由来のものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ポリペプチドに対する中和抗体を誘発し得る免疫原の同定方法であって、該方法が：
（ｉ）前記ポリペプチドに特異的な中和抗体を組換えウイルスのライブラリーと接触させる工程であって、前記組換えウイルスの各々が、前記ポリペプチドの改変体をコードし、かつ前記ポリペプチドを発現するランダム化遺伝子を含むものである、工程と、
（ｉｉ）中和抗体への結合能に基づき、中和抗体に結合する組換えウイルスのライブラリーのメンバーを、あまり結合しないメンバーから分離する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で選択された組換えウイルスのライブラリーのメンバーに見出される改変体ポリペプチドの配列を決定する工程と
を含んでなる、方法。
【請求項１８】
前記中和抗体が固定化されてなるものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｉｉ）で選択されたライブラリーのメンバーに関する、ウイルスの表面に提示される前記改変体ペプチドの配列の決定が、中和抗体に結合するライブラリーのメンバー由来の遺伝物質を配列決定することにより行われる、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ライブラリーのメンバーの分離が、結合メンバーの集団由来のウイルスの少なくとも１つのポリペプチドを定量することにより決定される、請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスポリペプチドがウイルスカプシドのポリペプチドである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｉｉ）で選択されたライブラリーのメンバーに関する、ウイルスの表面に提示される前記改変体ペプチドの配列の決定が、中和抗体に結合するライブラリーのメンバー由来の遺伝物質を配列決定することにより行われる、請求項１７から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ウイルスがレトロウイルスである、請求項１７から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ランダム化遺伝子がｅｎｖ遺伝子である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記レトロウイルスがＨＩＶである、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
工程（ｉｉ）で決定されたウイルスカプシドのポリペプチドがｐ２４である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記中和抗体が４Ｅ１０  ｍＡｂ、２Ｆ５  ｍＡｂ、ｂ１２  ｍＡｂ、２Ｇ１２  ｍＡｂ、およびＰＧ１６  ｍＡｂからなる群から選択されるものである、請求項２５または２６のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高い中和抗体（ｎＡｂ）活性を誘発し得る免疫原の迅速な選択法に関する。ｎＡｂ活性を増強するこれらの免疫原のいくつかの例が開示および例示される。特に、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖエピトープに対する抗体親和性を増加させる免疫原が開示される。
【背景技術】
【０００２】
１９８２年以来、世界中で６０００万人を超える人々がヒト免疫不全ウイルスに感染していると推定される。これらの感染者のほぼ半数が、この期間内に、結果として発症した後天性免疫不全症候群（エイズ）で死亡している。このウイルス伝播は、最近は横ばいであるように見えるが、２００９年には２５０万人の新たなＨＩＶ感染者が報告された。ＨＩＶは今でも主要な公衆衛生問題である。ＵＮＡＩＤＳレポート「世界のエイズ流行２０１０年版」を参照のこと。
【０００３】
ＨＩＶ−１は、これまでに報告されている最も遺伝的に多様なウイルス性病原体の一つである。ＨＩＶ−１系統樹の３つの主要な枝、Ｍ（主系統）群、Ｎ（新型）群、およびＯ（分類外）群がある。Ｍ群のウイルスは最も広範に存在し、全世界の感染者の９９％より多くを占める。この群は現在、主に短いｅｎｖ（エンベロープ）遺伝子配列に基づき、９つの異なる遺伝的サブタイプまたはクレード（ＡからＫ）に分類されている。ＭｃＣｕｔｃｈａｎ  Ｆ，ＡＩＤＳ  ２０００；１４（Ｓ３）：Ｓ３１〜Ｓ４４およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ  Ｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００；２８８：５５〜５６を参照のこと。
【０００４】
Ｅｎｖは最も多様なＨＩＶ−１遺伝子であり、クレード間で最大３５％の配列多様性を示し、クレード内で２０％の配列多様性を示し、そして一人の感染者において最大１０％の配列多様性を示す。Ｋｕｉｋｅｎ  Ｃら，ＡＩＤＳ  １９９６；１０：３１〜３７およびＳｈａｎｋａｒａｐｐａ  Ｒら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９；７３：１０４８９〜１０５０２を参照のこと。クレードＢは、欧州、米州、およびオーストラリアで優勢である。Ｋｕｉｋｅｎ  Ｃら，ＡＩＤＳ  １９９６；Ａｍ．Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２０００；１５２：８１４〜８２２を参照のこと。クレードＣは、南アフリカ、中国、およびインドで一般的であり、現在は他のいかなるクレードよりも多くの世界中の人々に感染している。ＭｃＣｕｔｃｈａｎ，２０００（前出）を参照のこと。クレードＡおよびＤは、中央および東アフリカで顕著である。
【０００５】
しかしながら、多くのウイルスは、クレード間組換え体を生じる共流行ウイルスの一般的な混合のために、クレードに分類するのが難しい。Ｈｅｙｎｄｒｉｃｋｘ  Ｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００；７４：３６３〜３７０およびＭｃＣｕｔｃｈａｎ  Ｆら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９９；２５４：２２６〜２３４を参照のこと。いくつかの組換え型は実際に、組換え型流行株（ＣＲＦ）と呼ばれる重要な流行性系統を生じている。これらのうち最も一般的な２つは、ＣＲＦ０１（ＡＥ）（これはタイで発見され、当初はクレードＥに分類されていたが、後にｅｎｖのみがクレードＥでありゲノムの他の部分はクレードＡであることが分かった）およびＣＲＦ０２（西アフリカで一般的なＡＧ組換え型）である。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，２０００（前出）を参照のこと。世界的に、クレードＡからＤ、ならびにＣＲＦ０１  ＡＥおよびＣＲＦ０２  ＡＧ組換え体は、全世界の感染者の９０％より多くを占める。
【０００６】
ウイルスエンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）に対する中和抗体（ｎＡｂ）は、感受性細胞の感染を阻止することによる、ＨＩＶ−１曝露に対する適応免疫防御の最前線である。Ｋｗｏｎｇ  Ｐら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８；３９３：６４８〜６５９，Ｍｏｏｒｅ  Ｊら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９４；６８：４６９〜４８４，Ｍｏｏｒｅ  Ｐら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６；７０：１８６３〜１８７２、およびＰａｒｒｅｎ  Ｐら，ＡＩＤＳ  １９９９；１３：Ｓ１３７〜Ｓ１６２を参照のこと。それぞれのウイルスに対するワクチンの効力は、ｎＡｂを誘発するそれらのワクチンの能力による。Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００２；２：７０６〜７１３およびＺｉｎｋｅｒａｎｇｅｌ  Ｒら，Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；７９：１〜５３を参照のこと。しかし、莫大な労力にもかかわらず、有効なＨＩＶ−１免疫原の開発に向けた進展はわずかである。Ｂｕｒｔｏｎ，２００２（前出）、ＭｃＭｉｃｈａｅｌ  Ａ，Ｈａｎｋｅ  Ｔ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００３；９：８７４〜８８０、およびＭｏｏｒｅ，１９９６（前出）を参照のこと。これらの免疫原の設計には、より良好なｎＡｂ応答を誘導し得るエピトープの同定が必要である。残念ながら、広域ｎＡｂ応答を誘発する免疫原を開発しようとする全ての試みは、現在まで失敗に終わっている。
【０００７】
従って、より良好なｎＡｂ応答を誘導し得る新しいＨＩＶ−１免疫原が当該分野で必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、Ｂ細胞免疫原として用いられる場合に高いｎＡｂ活性を誘発し得る免疫原の迅速な選択（ＲＩＳ）法に関する。この方法は、ｉ）目的の野生型エピトープの配列をコードするヌクレオチドをランダムに変異させて、上記エピトープの改変体のライブラリーを作製する工程と、ｉｉ）このライブラリーを、野生型エピトープに対して親和性を有することが知られている抗体またはその一部を用いて試験する工程と、ｉｉｉ）抗体の親和性を高めるエピトープ改変体を選択する工程とを含む。好ましくは、エピトープはＨＩＶエピトープである。より好ましくは、エピトープはＥｎｖエピトープである。
【０００９】
第二の実施形態において、本発明は、配列番号１および配列番号３のヌクレオチド配列のような、ＲＩＳ法によって得られるヌクレオチド配列およびペプチドに関する。
【００１０】
第三の実施形態において、本発明は、疾患の予防および治療のために、目的の野生型エピトープの作用によって完全にまたは部分的に誘導される、ＲＩＳ法によって得られるヌクレオチド配列およびペプチドの使用に関する。好ましくは、疾患は、エイズまたはＨＩＶ感染によって引き起こされる疾患である。
【００１１】
第四の実施形態において、本発明は、ＲＩＳ法の診断的な使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】本発明のＲＩＳ法を用いて同定される変異体の配列である。最上の配列は、ＡＣ１０  ｇｐ１６０ポリペプチドのアミノ酸１２１〜１６０に対応する。分離クローンにおける対応する領域の配列は、アミノ酸がＡＣ１０  ｇｐ１６０のアミノ酸と同一である場合に点で示し、または変異体の配列が野生型の配列と異なる場合にそれらの位置に対応するアミノ酸で示す。
【図２】４Ｅ１０抗体とＬＲ１−Ｃ１特異的変異体との間に提唱されている相互作用である。ｅｎｖ遺伝子全体で、３つの潜在的なＮ結合型グリコシル化部位の欠失を含む１１個のアミノ酸置換が示される。Ｃ１３１Ｙ変異は、この置換がＣ１３１とＣ１５７との間の野生型のジスルフィド結合を除去してＶ１／Ｖ２ループの構造を破壊するため、特に関連性がある。
【図３】本発明によるＲＩＳ法を用いて同定されるＬＲ１−Ｃ１ビリオンは、広域中和抗体４Ｅ１０に対する親和性の増加を示す。グラフは、４Ｅ１０抗体でコートされたかまたは未処理のいずれかのプレートへのＡＣ１０野生型分離株およびＬＲ１−Ｃ１分離株の添加量を増加していくことによって決定される、４Ｅ１０抗体でコートされたプレートへのビリオンの結合の滴定を示す。図は、野生型改変体と比較して、ＬＲ１−Ｃ１に対する４Ｅ１０抗体の親和性が４倍増加していることを示す。
【図４】４Ｅ１０抗体を用いて、本発明によるＲＩＳ法を使用して同定されるＬＲ１−Ｃ１ビリオンは、他の広域中和抗体に対する親和性の増加を示さない。グラフは、抗体でコートされたかまたは未処理のいずれかのプレートへのＡＣ１０野生型分離株、ＬＲ１−Ｃ１分離株、またはｅｎｖ遺伝子に欠失のあるビリオンの添加量を増加していくことによって決定される、２Ｆ５（パネルＡ）、２Ｇ１２（パネルＢ）またはｂ１２（パネルＣ）抗体でコートされたプレートへのビリオンの結合の滴定を示す。
【図５】ＡＣ１０野生型ＨＸＢ２配列に対する配列番号３１のアラインメント。配列番号３１は、ＰＧ１６抗体に対して親和性を有する。改変配列は以下の２つの変異を示す：ｉ）潜在的なグリコシル化部位におけるＮ２０３Ｓ、およびｉｉ）ｇｐ４１免疫優勢領域におけるＧ６０４Ｅ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
Ａ．免疫原の迅速選択（ＲＩＳ）法
本発明は、ＨＩＶ−１エンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）を免疫原として最適化するための新しいアプローチに関する。このアプローチは、ビリオンへの曝露によって抗体を誘発するエピトープの能力を考慮している。この方法は、ランダムに変異したエンベロープタンパク質を有するビリオンのライブラリーからの、広域ｎＡｂに対してより高い親和性を有する改変体の選択に基づく。
【００１４】
本発明によれば、ＨＩＶ株ＡＣ１０由来の全長ｅｎｖ遺伝子を、ＰＣＲに基づく方法によってランダムに変異したエンベロープのライブラリーを作製するのに用いる。ｐＮＬ４−３構成物へクローニングを行い、２９３Ｔ細胞への一過性トランスフェクションによってビリオンを得た。広域ｎＡｂ  ４Ｅ１０に対してより高い親和性を有するウイルスの選択は、改良型の溶液中ビリオン捕捉アッセイによって行った。捕捉されたウイルス集団からＲＮＡを抽出し、さらに配列決定およびｐＮＬ４−３構成物へ再度クローニングするために、逆転写ＰＣＲを行って対応するウイルスからｅｎｖ遺伝子を得た。一回の選択の後、４Ｅ１０抗体への親和性が４倍増加したエンベロープが分離された。実施例を参照のこと。
【００１５】
従って、第一の態様において、本発明は、ポリペプチドに対する中和抗体を誘発し得る免疫原の同定方法であって、該方法が：
（ｉ）前記ポリペプチドに特異的な中和抗体を組換えウイルスのライブラリーと接触させる工程であって、前記組換えウイルスの各々が、前記ポリペプチドの改変体をコードし、かつ前記ポリペプチドを発現するランダム化遺伝子を含むものである、工程と、
（ｉｉ）中和抗体への結合能に基づき、中和抗体に結合する組換えウイルスのライブラリーのメンバーを、あまり結合しないメンバーから分離する工程と、
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）で選択された組換えウイルスのライブラリーのメンバーに見出される改変体ポリペプチドの配列を決定する工程と
を含んでなる、方法に関する。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「免疫原」という用語は、個体において適応免疫応答を誘導し得る物質を示すことを意図し、上記適応免疫応答は、免疫学的特徴が免疫原と共通する病原体に有意に結合する免疫応答を誘導し得る。
【００１７】
本発明で使用される場合、免疫応答に関して「誘発する」という用語は、免疫応答活性を特異的に制御するかまたはこれに影響を及ぼすことをいい、免疫応答を活性化すること、免疫応答を上方制御すること、免疫応答を増強すること、および／または免疫応答を変化させること（例えば、免疫応答の型を誘発することによって、被検体における免疫応答の流行型を有害または無効なものから有益または防御的なものへと順に変化させることなど）を包含する。
【００１８】
「中和抗体」という用語は、病原体に結合し、その病原体が細胞に感染するおよび／または被検体において疾患を引き起こす能力を妨げる、任意の抗体またはその抗原結合フラグメントをいう。典型的には、本発明の方法で使用される中和抗体は病原体の表面に結合し、その病原体による感染を、当該（複数の）抗体の非存在下またはネガティブコントロールの存在下での病原体による感染と比較して少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％だけ阻害または減少させる。次に、本明細書中に提供される任意の方法を用いて、これらのｎＡｂが中和活性またはＢＮＡｂ活性を有するか否かを決定するために試験され得る。非ヒト動物において中和抗体またはＢＮＡｂが増加した場合、ヒトへの投与に適した抗体を作製するために、非ヒトフレームワークからヒトフレームワークへＣＤＲ（相補性決定領域）を移動させ得る。抗体がｎＡｂであるか否かを決定する方法は、当該分野で記載されている。Ｌｉ  Ｍら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００５；７９：１０１０８〜１０１２５，Ｗｅｉ  Ｘら，Ｎａｔｕｒｅ  ２００３；４２２：３０７〜３１２、およびＭｏｎｔｅｆｉｏｒｉ  Ｄ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５；Ｊａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １２：Ｕｎｉｔ  １２．１１を参照のこと。これらの方法は、レポーター遺伝子をコードするウイルスを用いた受容細胞株を用いる１回のウイルス感染後のレポーター遺伝子発現の減少の決定に基づく。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「ウイルス」という用語は、生物体の生細胞内でのみ複製し得る小さな感染因子をいう。本発明の方法で用いられ得るウイルスファミリーの非限定的な例としては、アデノウイルス科、アフリカ豚コレラ様ウイルス、アレナウイルス科、アルテリウイルス、アストロウイルス科、バキュロウイルス科、ビルナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、サーコウイルス科、コロナウイルス科、デルタウイルス、フィロウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科、へぺウイルス科、ヘルペスウイルス科、オルトミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、ピコルナウイルス科（ｐｉｃｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）、ポックスウイルス科（ｐｏｘｙｖｉｒｉｄａｅ）、レオウイルス科、レトロウイルス科およびラブドウイルス科が挙げられる。
【００２０】
Ａ．１  接触工程
第一の工程において、本発明の方法は、上記ウイルスの表面に提示されるポリペプチドに特異的な中和抗体を組換えウイルスのライブラリーと接触させる工程を含み、上記組換えウイルスの各々は、ウイルスの表面に提示される上記ポリペプチドの改変体をコードするランダム化遺伝子を含む。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「ライブラリー」という用語は、異なる組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む多様なポリヌクレオチドの集合物または混合物をいう。本発明の方法で使用されるライブラリーのサイズおよび複雑度は異なっていてもよい。例えば、本発明の方法を用いて、５０００００までの異なるメンバーを有するライブラリー、あるいは１×１０６、１×１０８またはそれ以上のメンバーを有するライブラリーをスクリーニングし得る。典型的なウイルスライブラリーは１×１０８〜１×１０１３のメンバーを有し、このようなライブラリーは本発明の方法を用いてスクリーニングされ得る。実際に、このようなライブラリーが好ましいが、ずっと小さなライブラリー（例えば、１０００〜５０，０００、５０〜１０００、または１００〜５００、または１０〜１００、または５〜１００メンバーを有するライブラリー）をスクリーニングするために本方法を用いることも明らかに可能である。改変体ライブラリーの多様性は、ＤＮＡトリプレットレベルでの改変体をコードする遺伝子の変異誘発により形成することができ、その結果、個々のコドンが多様化される（例えば、ＰＣＲ反応において部分的にランダム化された配列のプライマーを用いることによって）。
【００２２】
本明細書で分子のライブラリーをいう場合、この用語は、核酸またはタンパク質レベル（すなわち、コードされるタンパク質の発現が起こる前または後）でこのようなライブラリーをいうために使用され得る。しかしながら、明確には、このような発現ライブラリーは、相互作用結合パートナーの選択が起こるようにタンパク質レベルで存在しなければならない。従って、接触工程（ａ）がうまく起こるように、このライブラリーはタンパク質レベルで存在しなければならない（もっとも、初めは核酸レベルで存在してもよい）。
【００２３】
好ましい実施形態において、ポリペプチドはウイルス中で発現され、このポリペプチドに対して中和抗体が工程（ｉ）で用いられる。好ましい実施形態において、ポリペプチドは「ウイルスの表面に」提示される。本明細書で使用される場合、この用語は、ウイルス構造を破壊する必要なく抗体などの試薬に到達し得る任意のポリペプチドをいう。当然のことながら、表面に提示されるポリペプチドは、非エンベロープウイルスではカプシドポリペプチドであっても、エンベロープウイルスではエンベロープポリペプチドであってもよい。好ましい実施形態において、ウイルスの表面に提示されるポリペプチドはエンベロープポリペプチドである。
【００２４】
組換えウイルス（該組換えウイルスの各々が、上記ポリペプチドの改変体をコードするランダム化遺伝子を含んでいる）のライブラリーを得るために、任意のウイルスエンベロープタンパク質が操作され得る。抗原の具体例としては、インフルエンザウイルス赤血球凝集素、ヒトＲＳウイルスＧ糖タンパク質、デングウイルスのコアタンパク質、基質タンパク質または他のタンパク質、麻疹ウイルス赤血球凝集素、単純ヘルペスウイルス２型糖タンパク質ｇＢ、ポリオウイルスＩ  ＶＰｌ、ＨＩＶ−１またはＨＩＶ−ＩＩのエンベロープもしくはカプシド糖タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原、ジフテリア毒素、連鎖球菌２４Ｍエピトープ、淋菌ピリン、仮性狂犬病ウイルスｇ５０（ｇｐＤ）、仮性狂犬病ウイルスＩＩ（ｇｐＢ）、仮性狂犬病ウイルスｇＩＩＩ（ｇｐＣ）、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｈ、仮性狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｅ、伝染性胃腸炎糖タンパク質１９５、伝染性胃腸炎基質タンパク質、ブタロタウイルス糖タンパク質３８、ブタパルボウイルスカプシドタンパク質、セルプリナ・ヒドジセンテリエ（Ｓｅｒｐｕｌｉｎａ  ｈｙｄｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）感染防御抗原、ウシウイルス性下痢症糖タンパク質５５、ニューカッスル病ウイルス赤血球凝集素ノイラミニダーゼ、ブタインフルエンザ赤血球凝集素、ブタインフルエンザノイラミニダーゼ、口蹄疫ウイルス、ブタコレラウイルス、ブタインフルエンザウイルス、アフリカブタコレラウイルス、マイコプラズマ・ハイオニューモニエ（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｌｉｙｏｐｎｅｕｔｉｉｏｎｉａｅ）、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス、ウシ伝染性鼻気管炎ウイルス糖タンパク質Ｅ、糖タンパク質Ｇ、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｇまたは糖タンパク質Ｉ、ラクロスウイルス（Ｌａ  Ｃｒｏｓｓｅ  ｖｉｒｕｓ）の糖タンパク質、新生仔ウシ下痢ウイルス、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウイルス、プンタトロウイルス、マウス白血病ウイルス、マウス乳癌ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質およびＢ型肝炎ウイルス表面抗原またはそのフラグメントもしくは誘導体、ウマインフルエンザウイルスまたはウマヘルペスウイルスの抗原（ウマインフルエンザウイルスＡ型／アラスカ９１ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスＡ型／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウイルスＡ型／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼ、ウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｂ、およびウマヘルペスウイルス１型糖タンパク質Ｄを含む）、ウシＲＳウイルスまたはウシパラインフルエンザウイルスの抗原、ウシＲＳウイルス付着タンパク質（ＢＲＳＶ  Ｇ）、ウシＲＳウイルス融合タンパク質（ＢＲＳＶ  Ｆ）、ウシＲＳウイルスヌクレオカプシドタンパク質（ＢＲＳＶ  Ｎ）、ウシパラインフルエンザウイルス３型融合タンパク質、ウシパラインフルエンザウイルス３型赤血球凝集素ノイラミニダーゼ、ウシウイルス性下痢症ウイルス糖タンパク質４８、および糖タンパク質５３から選択される抗原が挙げられる。
【００２５】
好ましくは、組換えウイルスのライブラリーはレトロウイルスのライブラリーである。「レトロウイルス」という用語は、そのＲＮＡゲノムからＤＮＡを生成するために逆転写酵素により宿主細胞内で複製される、レトロウイルス科に属する任意のＲＮＡウイルスを意味する。
【００２６】
「レトロウイルス」という用語は、本明細書で通常の意味で使用され、遺伝物質が一本鎖ＲＮＡであり、宿主においてウイルスＲＮＡをＤＮＡに転写するために逆転写酵素を用いるウイルスのクラスを一般に包含する。本明細書で意図されるレトロウイルスは、詳細にはウイルスファミリーレトロウイルス科に属してもよく、より詳細にはオンコウイルス亜科、レンチウイルス亜科またはスプマウイルス亜科に属してもよい。本明細書で意図されるレトロウイルスは病原性であってもよい。Ｅｎｖ配列は、ＨＩＶ、ＭｕＬＶ、ＳＭＲＶ、ＳＦＶ、ＨＰＶ、ＭＭＴＶ、ＳＲＶｓ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＢＬＶ、ＢＩＶ、ＳＩＶ、ビスナウイルス、ＥＩＡＶ、ＦＩＶ、およびＥＩＡＶを含むがこれらに限定されない任意の既知のレトロウイルス、および任意のレトロウイルス亜科（例えば、オンコウイルス亜科、レンチウイルス亜科、またはスプマウイルス亜科）に由来し得る。ＨＩＶ−１クローンを含む多くのレトロウイルスクローンは、十分に特徴付けされており、入手可能である。
【００２７】
本明細書で特に意図されるのは、動物に感染するレトロウイルスであり、より好ましくは温血動物のレトロウイルスであり、さらにより好ましくは脊椎動物のレトロウイルスであり、さらにより一層好ましくは哺乳動物のレトロウイルスであり、さらになお一層好ましくは霊長類のレトロウイルスであり、そして最も好ましくはヒトのレトロウイルスである。本明細書で特に好ましいのは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−２を含むがこれらに限定されないヒトレトロウイルスである。ＨＩＶ（および他のレトロウイルス）の配列情報の十分に確立されたリポジトリとしては、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪおよびＮＣＢＩが挙げられる。十分に特徴付けされたＨＩＶ−１クローンとしては、ＨＸＣＢ２、ＨＩＶ−１−ＭＮおよびＨＩＶ−１−ＭＮ−ＳＴ．１が挙げられる。Ｈａｌｌ  Ｌら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９２；６６（９）：５５５３〜５５６０を参照のこと。
【００２８】
好ましい実施形態において、組換えウイルスのライブラリーは、少なくとも１つの表面ポリペプチドのランダム化によって得られるＨＩＶウイルスのライブラリーである。本明細書で用いられる「ＨＩＶ」という頭字語は、一般にヒト免疫不全ウイルスをいい、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ−１）およびヒト免疫不全ウイルス２（ＨＩＶ−２）のすべてのクレードおよび／または株を包含し、例えばＨＴＬ  ＶＩＩＩおよびＬＡＶなどのＨＩＶについての古い用語と同義である。
【００２９】
より好ましい実施形態において、ＨＩＶライブラリーの異なるメンバーは、ｅｎｖ遺伝子においてランダム化される。本明細書で使用される場合、ｅｎｖ遺伝子という用語は、ＨＩＶのエンベロープタンパク質をコードするウイルスゲノムのポリヌクレオチドを示す。本明細書で使用される場合、「Ｅｎｖポリペプチド」または「エンベロープポリペプチド」という用語は、ＨＩＶエンベロープタンパク質に由来する分子をいう。ＨＩＶのエンベロープタンパク質は、約１６０ｋｄの糖タンパク質（ｇｐ１６０）である。宿主細胞のウイルス感染中、ｇｐｌ６０は宿主細胞のプロテアーゼにより切断されて、ｇｐ１２０および膜内在性タンパク質ｇｐ４１を形成する。
【００３０】
「ｇｐ１２０ポリペプチド」は、Ｅｎｖポリペプチドのｇｐ１２０領域由来の分子である。成熟ｇｐ１２０野生型ポリペプチドは、一次配列に約５００アミノ酸を有する。Ｇｐ１２０は高度にＮ−グリコシル化され、１２０ｋＤの見かけの分子量を生じる。ｇｐ１２０のアミノ酸配列は、およそ５１１アミノ酸である。Ｇｐｌ２０は、５つの可変ドメイン（Ｖｌ〜Ｖ５）が散在する５つの比較的保存されたドメイン（Ｃ１〜Ｃ５）を含む。これらの可変ドメインは、大規模なアミノ酸置換、挿入および欠失を含む。「ｇｐｌ２０ポリペプチド」は、単一サブユニットおよび多量体の両方を含む。ｇｐ４１タンパク質は、ビリオンの膜二重層に係留され（且つ、これを貫通し）、一方ｇｐｌ２０セグメントは周囲の環境に突出する。ｇｐ１２０のレセプター結合ドメインは、このタンパク質のＮ末端側の半分に局在している。この後に、融合機構に結合するレセプターに伝達するためのヒンジまたはトリガーのいずれかとして働くことが提唱されている、プロリンリッチ領域（ＰＲＲ）が続く。ｇｐ１２０のＣ末端は高度に保存されており、ｇｐ４１と相互作用する。ｗｔ  ｇｐ１６０ポリペプチドの具体的な配列は入手可能である。ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ０５６０４およびＡＡＤ１２１４２を参照のこと。
【００３１】
ｅｎｖ遺伝子のランダム化は、ｅｎｖ遺伝子の完全な配列にわたって行われてもよく、好ましくはｇｐ１２０のコード領域に相当するｅｎｖ遺伝子の一部にわたって行われてもよい。なぜならこれは、標的細胞上のレセプターと相互作用し、中和抗体に結合する最良の候補を構成する分子だからである。さらに、ｇｐ１２０をコードするｅｎｖ遺伝子の領域のランダム化は、ｇｐ１２０ポリペプチドの完全な配列にわたって行われてもよく、１つまたはそれ以上のドメインについて行われてもよい。従って、本発明によるＲＩＳ法は、ｇｐ１２０の任意の保存されたループ（Ｃ１〜Ｃ５）、ｇｐ１２０の任意の可変ループ（Ｖ１〜Ｖ５）、または保存領域と可変ループの好ましい組み合わせにおけるランダム化によって得られるＨＩＶライブラリーの使用が考慮される。好ましい実施形態において、ランダム化はｅｎｖ遺伝子全体にわたって行われる。別の実施形態において、ランダム化はｇｐ１２０に相当するｅｎｖ遺伝子の領域で行われる。別の実施形態において、ランダム化はｇｐ１２０のＶ１および／またはＶ２領域に相当するｅｎｖ遺伝子の領域で行われる。
【００３２】
任意の変異誘発技術を用いて、核酸分子に変異を導入し得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら，「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳ，１９８９），Ｂｉｓｈｏｐ  Ｔら，「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８７），Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ  Ｗ編，「Ｍａｘｉｍｉｚｉｎｇ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，ＭＡ，ＵＳ，１９８７），Ｄａｖｉｓ  Ｌら，「Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，１９８６），Ｓｃｈｌｅｅｆ  Ｍ編，「Ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ」（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ＧｍｂＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ  ２００１），Ａｄｅｒｅｔｈ  Ｙら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２００５，３８：８６４〜８６８，Ａｌｌａｎ  Ｊら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９５；１８：７４６〜７５０，Ｂｕｂｅｃｋ  Ａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４，７８：８０２６〜８０３５，Ｄｏｒａｎ  Ｂ、ＵＳ  Ｐａｔ．Ｐｕｂ．２００７０１１１２０１、Ｌｏｃｈｅｒ  Ｃら，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００５；２４：２５６〜２６３、Ｖａｓｌ  Ｊら，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２００４；３７：７２６〜７３０、Ｗｅｉｓｓ  Ｇら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２０００；９７：８９５０〜８９５４、およびＤｅｌｃｏｕｒｔ  Ｍ、ＵＳ６，９２４，１１２を参照のこと。変異誘発ストラテジーとしては、ランダム変異誘発、Ａｌａスキャン変異誘発、部位特異的変異誘発、およびキメラ組換えが挙げられる。変異誘発キットおよびサービスは、広く市販されている。
【００３３】
「中和抗体」という用語は、ＢＮＡｂのサブクラスを包含する。本明細書で使用される場合、「広域中和抗体」または「ＢＮＡｂ」は、有効量で送達される場合、７株より多いＨＩＶ、好ましくは８株、９株、１０株、１１株、１２株、１３株、１４株、１５株、１６株、１７株、１８株、１９株、２０株より多いかそれ以上の株のＨＩＶに対してＨＩＶ感染またはエイズの予防もしくは治療のための治療薬として用いられ得る、任意の方法によって得られる抗体と理解される。本発明によるＲＩＳ法に用いられるのに適した中和抗体としては、膜近位外部領域（ＭＰＥＲ）に対して直接作用する抗体、ＣＤ４結合部位に対して直接作用する抗体、および高マンノースグリカンに対して直接作用する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明によるＲＩＳ法に用いられるのに適した中和抗体としては、下記からなる群から選択される１つまたはそれ以上の抗体が挙げられる：
ａ）ウイルス膜に隣接したｇｐ４１外部ドメインのセグメントを認識する４Ｅ１０抗体。Ｃａｒｄｏｓｏ  Ｒら，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００５；２２：１６３〜１７３，ＰＨＳＬアクセッション番号９０．０９１７０３，ＮＩＨ  ＡＲＲＲＰカタログ番号１００９１、およびＫａｔｉｎｇｅｒ  Ｈら、ＵＳ５，７５３，５０３を参照のこと；
ｂ）ウイルス膜に隣接したｇｐ４１外部ドメインのセグメントを認識する２Ｆ５抗体。Ｏｆｅｋ  Ｇら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４；７８：１０７２４〜１０７３７，ＰＨＳＬアクセッション番号９０．０９１７０４，ＮＩＨ  ＡＲＲＲＰカタログ番号１４７５、およびＫａｔｉｎｇｅｒ（前出）を参照のこと；
ｃ）ＨＩＶ−１の２つの異なる抗原決定基に結合する、ＥＰ０８２２９４１に記載の抗体であって、これらの抗原決定基はｇｐ１６０のフラグメントであり、ＨＩＶ−１分離株ＢＨ１０のプロセシングされたｇｐ１２０のアミノ酸配列７９〜１８４および３２６〜４００に相当する。ＰＨＳＬアクセッション番号９５０３２２４０および９５０３２２４１を参照のこと；
ｄ）ｇｐｌ２０の表面外部に存在する糖質を認識する２Ｇ１２（ｍＡｂ  ２Ｇ１２）。Ｔｒｋｏｌａ  Ａら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９６；７０：１１００〜１１０８，ＥＡＣＣアクセッション番号９３０９１５１７、およびＮＩＨ  ＡＲＲＲＰカタログ番号１４７６を参照のこと；
ｅ）ＣＤ４結合部位を認識するｂ１２抗体。Ｂｕｒｔｏｎ  Ｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９４；２６６：１０２４〜１０２７，ＮＩＨ  ＡＲＲＲＰ  カタログ番号２６４０およびＢｕｒｔｏｎ  Ｄら，ＥＰ０６７５９０４を参照のこと；および
ｆ）中和抗体ＰＧ９、ＰＧ１６、ＰＧ２０、ＰＧＧ１４、およびＰＧＣ１４。Ｃｈａｎ−Ｈｕｉ  Ｐら，ＷＯ２０１０１０７９３９を参照のこと。
【００３４】
抗体がｎＡｂであるか否かを決定する方法は、当該技術分野で説明されている。これらの方法のいくつかは、レポーター遺伝子をコードする受容細胞株を用いた１回のウイルス感染後のレポーター遺伝子発現の、抗体の効果による減少の決定に基づく。Ｌｉ，２００５，Ｗｅｉ，２００３，Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ，２００５（前出）、およびＡｌｖｉｎ  Ｃ，ＷＯ２００９１１７６６１を参照のこと。
【００３５】
本発明により用いられる抗体の中和能は、ＩＣ５０（すなわち、標的細胞の感染を５０％減少させる抗体の濃度）によって特徴付けされ得る。好ましくは、本発明により用いられる中和抗体は、２μｇ／ｍｌ以下（０．１５μｇ／ｍＬ未満、０．１２５μｇ／ｍＬ未満、０．１０μｇ／ｍＬ未満、０．０７５μｇ／ｍＬ未満、０．０５μｇ／ｍＬ未満、０．０２５μｇ／ｍＬ未満、０．０２μｇ／ｍＬ未満、０．０１５μｇ／ｍＬ未満、０．０１２５μｇ／ｍＬ未満、０．０１μｇ／ｍＬ未満、０．００７５μｇ／ｍＬ未満、０．００５μｇ／ｍＬ未満または０．００４μｇ／ｍＬ未満（抗体濃度１０−８以下、好ましくは１０−９Ｍ以下、好ましくは１０−１０Ｍ以下、すなわち１０−１１Ｍ、１０−１２Ｍ、１０−１３Ｍ以下）のＩＣ５０を有する。これは、インビトロでのＨＩＶの臨床分離株の５０％中和には、非常に低濃度の抗体しか必要としないことを意味する。力価は、当該技術分野で記載される標準的な中和アッセイを用いて測定され得る。
【００３６】
接触工程は、中和抗体に特異的に結合し得る組換えウイルスのライブラリーのメンバーが、上記抗体に実際に結合するように、適切な条件下で行われる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」という用語（またはその派生語）は、結合ペア（例えば、２つのタンパク質または化合物）の間の相互作用をいう。いくつかの実施形態において、相互作用は、最大１０−６モル／リットル、最大１０−７モル／リットル、または最大１０−８モル／リットルの親和定数を有する。一般に、「特異的に結合する」というフレーズは、ある化合物と別の化合物との特異的結合をいい、任意の標準アッセイ（例えば、イムノアッセイ）によって測定される結合のレベルは、アッセイのバックグラウンドコントロールよりも統計学的に有意に高い。
【００３８】
接触工程中の条件は、当業者によって通例の方法で決定され得る。具体的な「接触」条件は、１５分から４時間まで（例えば、４℃、３７℃または室温で、１時間）のインキュベーションを含み得る。しかしながら、これらの条件は、例えば、相互作用する結合パートナーの性質などによって、適切に変動され得る。試料は、必要に応じておよび好ましくは、穏やかな振動、混合または回転に付され得る。さらに、非特異的結合を減少させるブロッキング剤のような他の適切な試薬が添加され得る。例えば、１〜４％ＢＳＡまたは他の適切なブロッキング剤（例えば、ミルク）が用いられ得る。しかしながら、接触条件は、スクリーニング法の目的に応じて、当業者によって変動および適合され得ることが理解される。例えば、インキュベーション温度が、例えば室温または３７℃である場合、これらの条件下で安定なバインダー（例えば、３７℃でのインキュベーションの場合、ヒトの体内で見出される条件下で安定なバインダー）を同定する可能性が高くなり得る。このような性質は、一方または両方の結合パートナーが何らかの治療用途に用いられる候補（例えば、抗体）である場合、極めて有利であり得る。このような適合は、当業者の範囲内である。
【００３９】
好ましい実施形態において、接触工程で用いられる中和抗体は、当業者に公知の種々の技術を用いて固体支持体上に固定化することができ、これらの技術は特許および科学文献に十分に記載されている。固体支持体は、抗体が付着され得る、当業者に公知の任意の物質であり得る。例えば、固体支持体は、マイクロタイタープレートのテストウェルまたはニトロセルロースフィルターもしくは他の適切な膜であってよい。あるいは、支持体は、ビーズまたはディスク（例えば、ガラス、ガラス繊維、ラテックス、またはポリスチレンもしくはポリ塩化ビニルのようなプラスチック材料）であってよい。支持体はまた、磁性粒子または光ファイバーセンサーであってもよい。Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ  Ｒら、ＵＳ５，３５９，６８１を参照のこと。
【００４０】
抗体は、当業者に公知の種々の技術を用いて固体支持体上に固定化することができ、これらの技術は特許および科学文献に十分に記載されている。本発明に関して、固定化は、非共有結合性会合（例えば、吸着）および共有結合（これは抗原と支持体上の官能基との間の直接結合であっても、架橋剤による結合であってもよい）の両方を包含する。マイクロタイタープレート中のウェルへのまたは膜への吸着による固定化が好ましい。このような場合、吸着は、抗体を、適切な緩衝液中で、固体支持体と適切な時間接触させることによって達成され得る。接触時間は温度によって変化するが、典型的には約１時間から１日の間である。一つの実施形態において、プラスチックマイクロタイタープレート（例えば、ポリスチレンまたはポリ塩化ビニル）のウェルと、約１０ｎｇ〜約１μｇ、好ましくは約１００〜２００ｎｇの範囲の量の抗体との接触は、適切な量のポリペプチドを固定化するのに十分である。
【００４１】
抗体の固体支持体への共有結合はまた、支持体を、支持体と抗体上の官能基（例えば、ヒドロキシル基またはアミノ基）の両方と反応する二官能性試薬と最初に反応させることによって達成されてもよい。例えば、抗体は、周知の技術を用いて、ベンゾキノンを用いるか、または支持体上のアルデヒド基と結合パートナー上のアミンおよび活性水素との縮合によって、適切なポリマーコーティングを有する支持体に共有結合的に付着され得る。
【００４２】
あるいは、共有結合的または非共有結合的のいずれかで支持体に中和抗体を固定化する代わりに、本発明は、Ｆｃまたは抗Ｆｃ抗体フラグメントに特異的な一次抗体（これは先に支持体に固定化されている）へ結合させることによって抗体を固定化する可能性を考慮する。抗体の捕捉を補助することに加え、一次抗体は、ウイルスライブラリーのメンバーへの結合に有効な固定化抗体の割合が増加するように中和抗体を方向付ける。例えば、固定化は、中和抗体試料への親和性を示すライブラリーのウイルスが固定化抗体に結合できるように、固体支持体（通常、マイクロタイタープレートのウェル）上に固定化されている抗体をライブラリーと最初に接触させることによって実施され得る。非結合の試料は、次いで固定化抗体−ウイルス複合体から除去される。より詳細には、一旦抗体が上記のように支持体上に固定化されると、支持体上の残りのタンパク質結合部位は通常ブロックされる。
【００４３】
Ａ．２  分離工程
第二の工程において、本発明のＲＩＳ法は、中和抗体への結合能に基づき、中和抗体に結合する組換えウイルスのライブラリーのメンバーを、あまり結合しないメンバーから分離する工程を含む。
【００４４】
上記分離工程は、反応混合物からの固相の物理的分離（例えば、ビーズまたはＦＡＣＳ）または除去を言ってもよく、あるいは反応混合物の他の成分を除去するために固相が一回以上の洗浄工程に付される工程を言ってもよい。固相の物理的分離または除去が行われる実施形態において、次いで、好ましくは、固相は一回以上の洗浄工程にも付される。
【００４５】
洗浄工程は、固相およびそれに付着している相互作用結合パートナーの性質に応じて、任意の適切な方法で行われ得る。粒子状固相の洗浄の適切な方法は、当業者に周知である。例えば、固相が粒子状である場合、洗浄工程は、上清が除去されつつ粒子がペレットを形成するような条件下で粒子を遠心分離することによって行われ得る。次いで、粒子は適切な水性媒体（例えば、接触工程で用いたものと同じ媒体）中に再懸濁され得る。洗浄（または実際には、接触工程）のストリンジェンシーは、例えばバックグラウンドまたは非特異的結合を減少させるために、当業者に周知の適切な試薬（例えば、Ｔｗｅｅｎ）を添加することによって変更され得る。このようなペレット形成および再懸濁の工程は、一回の洗浄を構成する。任意の適切な回数の洗浄が行われ得る。しかしながら、固相が磁性である場合、洗浄工程は、接触工程が行われている容器に磁場をかけ、上清を除去して固相を適切な水性媒体中に再懸濁することによって便宜的に行われ得る。このような磁気分離および再懸濁の工程は、一回の洗浄工程を構成し、任意の適切な回数の洗浄が行われ得る。固相が非粒子状である（例えば、プレート、ディッシュまたはフィルターのような平面である）場合、このような固相を洗浄する適切な方法もまた当業者に周知である。
【００４６】
上記の任意の洗浄工程と同様に、一回またはそれ以上の洗浄工程はまた、ＲＩＳ法における任意の他の適切な段階でも行われ得ることに留意すべきである。例えば、固相を洗浄する一回またはそれ以上の工程はまた、任意の固定化工程が行われた後に、例えば、固相に結合していない中和抗体を除去するために行われてもよい。実際に、このような洗浄工程は好ましい。また、一回またはそれ以上の洗浄工程は、例えば非結合物質を除去する方法の過程において、他の適切な時期に、固相上で行われ得る。必要な洗浄の回数は、当業者によって容易に決定され得る。
【００４７】
一旦、中和抗体に弱く結合するかまたは非特異的に結合する反応混合物の成分が除去されると、分離工程は最後に、中和抗体に特異的に結合する組換えウイルスのライブラリーのメンバーを溶出することによって行われる。固定化のタイプに応じて、上記溶出工程は、任意の適切な方法によって（例えば、アルカリ、界面活性剤、または非共有結合を破壊する同様の化学物質を用いることによって）行うことができ、続いて相互作用パートナーがリフォールディングされて互いに結合できるように中和される。ビオチン標識の場合、一般に、このような標識を含むライブラリー構築物は、プロテアーゼ部位、制限酵素部位、またはジチオスレイトール（ＤＴＴ）で開裂され得る切断可能なＳ−Ｓリンカー部分のような、ある種の切断部位を含むように操作される。ＴＥＡも用いられ得る。上記のような切断部位は、溶出を可能または容易にするために、任意の型の標識と共に用いられ得る。
【００４８】
溶出工程の結果として起こる中和抗体からのウイルスの遊離は、典型的には、上清中の一つまたはそれ以上のウイルスポリペプチドの存在を測定することによって行われ得る。好ましい実施形態において、アッセイされるポリペプチドはウイルスカプシドポリペプチドである。特にＨＩＶライブラリーが用いられる場合、本明細書に示される実施形態での使用に適切であり得るＨＩＶタンパク質の非限定的な例としては、ＨＩＶ  ｇａｇタンパク質ｐ５３、ｐ２４、ｐ１７、ｐ７、ｐ６、ｐ２またはｐ１、ＨＩＶ  ｅｎｖ糖タンパク質ｇｐ１２０、ｇｐ４１またはｇｐｌ６０、ＨＩＶ酵素（インテグラーゼ（ｐ３１）、逆転写酵素（ｐ５１またはｐ６６）、ＲＮａｓｅ  Ｈ（ｐ１５）、プロテアーゼ（ｐ１０）を含む）、ＨＩＶ  ｎｅｆタンパク質（ｐ２５／ｐ２７）、ＨＩＶ  ｖｉｆタンパク質ｐ２３、ＨＩＶ  ｒｅｖタンパク質ｐ１９、ＨＩＶ  ｖｐｒタンパク質（ｐ１２／ｐ１０）、ＨＩＶ  ｖｐｕタンパク質（ｐ１６）あるいはＨＩＶ  ｔａｔタンパク質（ｐ１６／ｐ１４）が挙げられる。好ましい実施形態において、選択されたウイルスが中和抗体から効率的に溶出されているか否かを立証するためにアッセイされるＨＩＶポリペプチドは、ｐ２４である。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「ＨＩＶ  ｐ２４」という用語は、約２４，０００ダルトンの見かけの相対分子量を有するとして特徴付けられるＨＩＶのｇａｇ領域の遺伝子産物をいう。「ＨＩＶ  ｐ２４」という用語はまた、ｐ２４の免疫学的活性を有するｐ２４の改変物およびフラグメントもいう。
【００５０】
Ｐ２４は酵素免疫アッセイで測定され得るのに対して、結合ｐ２４の検出は、複合体を解離するために酸による前処理を必要とする。手順は製造業者によって異なるが、ＨＩＶ  ｐ２４抗原試験は、抗体ではなく抗原を検出するように改変したＥＬＩＳＡ技術を用いる。例えば「抗体サンドイッチ」型のような代表的なアッセイにおいて、ＨＩＶ  ｐ２４に対する特異的モノクローナル抗体は固相（マイクロタイタープレートウェルまたはポリスチレンビーズ）に付着され、添加された試料中のウイルス抗原を「捕捉」するように働く。界面活性剤（例えば、トリトンＸ１００）を添加してビリオンを破壊し、そして抗原が媒体中に存在すれば、抗原は固相上のモノクローナル抗体に付着する。
【００５１】
Ａ．３  検出工程
第三の工程において、本発明によるＲＩＳ法は、工程（ｉｉ）で選択されるライブラリーのメンバーに関してウイルスの表面に提示される上記改変体ペプチドの配列を決定する工程を包含する。
【００５２】
一旦、ウイルスライブラリーの一組またはそれ以上の相互作用メンバーが、本発明の方法に従って選択または単離されると、これらはさらなる分析に付される。上記さらなる分析または使用には、一般に、中和抗体から脱離、除去、単離または溶出され、そしてさらに発現または生成されるための候補結合パートナーが必要である。従って、本発明の方法は、中和抗体と特異的に相互作用し得るウイルスライブラリーの上記メンバーが、互いからの単離において脱離、除去、溶出、または好ましくは単離、あるいは発現または生成される工程をさらに包含する。上記さらなる分析は、一般に、結合ウイルスからのＲＮＡの単離、ウイルスＲＮＡをｃＤＮＡへ逆転写すること、および上記ｃＤＮＡを適切な発現ベクターにクローニングすることによる、個々の相互作用ライブラリーメンバーの単離を含む。
【００５３】
一旦、結合パートナーをコードするＤＮＡが適切な発現ベクターにクローン化されると、結合パートナーをコードするＤＮＡが配列決定され得るか、またはタンパク質が可溶型で発現されて、タンパク質レベルで候補をさらに特徴付けするために適切な結合試験に付され得る。適切な結合試験は、結合パートナーの性質によって決まり、ＥＬＩＳＡ、フィルタースクリーニングアッセイ、ＦＡＣＳまたは免疫蛍光アッセイ、ＢｉａＣｏｒｅ親和性測定または結合定数を定量するための他の方法、組織スライドまたは細胞の染色および他の免疫組織化学的方法が挙げられるが、これらに限定されない。このような方法は文献において十分に確立されており、一つまたはそれ以上のこれらの方法は、選択されたエンベロープタンパク質改変体を分析するのに用いられ得る。
【００５４】
上記のように、個々の相互作用結合パートナーを分析するのに適した方法は、当該技術分野で公知である。一つの好ましい方法は、中和抗体に特異的に結合するライブラリーのウイルスの遺伝物質を配列決定することである。
【００５５】
典型的には、ＲＮＡを遺伝物質として有するレトロウイルスの場合、検出工程は、ＲＮＡの単離、一本鎖ｃＤＮＡを得るためのＲＮＡの逆転写、二本鎖ＤＮＡを得るための一本鎖ＤＮＡの処理、および最適ベクターへの二本鎖ｃＤＮＡのクローニング、およびｃＤＮＡの配列決定を含む。
【００５６】
逆転写は当業者に公知の方法を用いて行われ、等温的に、かつＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ＡＭＶ、クローン化ＡＭＶ、ＭＭＬＶ、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ、ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ、Ｔｔｈ逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、細菌逆転写酵素、およびＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔが挙げられるが、これらに限定されない）の存在下で耐熱性ＲＮＡポリメラーゼを用いることによって、行われ得る。本発明で利用される酵素としては、ＲＮａｓｅ  Ｈ活性が低減されたか、実質的に低減されたかまたは完全に除去された酵素が挙げられる。「実質的に低減されたＲＮａｓｅ  Ｈ活性」を有する酵素とは、対応する野生型またはＲＮａｓｅ  Ｈ＋酵素（例えば、野生型モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＬＶ）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）逆転写酵素）の約２０％未満、好ましくは約１５％未満、１０％未満または５％未満、そして最も好ましくは約２％未満のＲＮａｓｅ  Ｈ活性を有する酵素を意味する。任意の酵素のＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、多様な公知のアッセイによって決定され得る。Ｋｏｔｅｗｉｃｚ  Ｍら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８８；１６：２６５〜２７７，Ｇｅｒａｒｄ  Ｇら，Ｆｏｃｕｓ  １９９２；１４（５）：９１〜９３、およびＫｏｔｅｗｉｃｚ  Ｍら、ＵＳ５，２４４，７９７を参照のこと。本発明における使用に特に好ましいポリペプチドとしては、Ｍ−ＭＬＶ逆転写酵素、ＲＳＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＲＡＶ（ラウス関連ウイルス）逆転写酵素、ＭＡＶ（骨髄芽球症関連ウイルス）逆転写酵素、およびＨＩＶ逆転写酵素が挙げられるが、これらに限定されない。Ｋｏｔｅｗｉｃｚ  Ｍら、ＵＳ５，２４４，７９７、およびＧｅｒａｒｄ  Ｇら，ＷＯ１９９８０４７９１２を参照のこと。しかしながら、リボ核酸分子からＤＮＡ分子を生成し得る（すなわち、逆転写酵素活性を有する）任意の酵素が、本発明の組成物、方法およびキットに等しく用いられ得ることは当業者に理解される。
【００５７】
一本鎖ｃＤＮＡは、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて二本鎖ＤＮＡを得るために処理され得る。好ましくは、一本鎖ｃＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換は、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、分岐ＤＮＡ技術（ｂＤＮＡ）、リンカー補助ＤＮＡ増幅（ＬＡＤＡ）、Ｑベータレプリカーゼ増幅（Ｑベータ）、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）およびローリングサークル増幅技術（ＲＣＡＴ）のようなインビトロ増幅技術、または他のインビトロ酵素的増幅技術を用いて行われる。増幅工程は、アダプター領域の配列に対応するプライマーを用いて行われる。得られた二本鎖ＤＮＡは、精製カラム（プライマーが付着する電磁ビーズ）を用いるか、またはアガロースゲルでの電気泳動によって精製され得る。
【００５８】
得られた二本鎖ＤＮＡは、次いで、当該技術分野で公知の方法を用いて最適ベクターに挿入され得る。好ましい実施形態において、ＰＣＲ増幅工程で用いられるプライマーは、その５’領域内に、最適ベクターに存在する部位にコンパチブルな末端を生成する制限エンドヌクレアーゼ標的部位を含む。エンドヌクレアーゼ標的部位により、ポリヌクレオチドを適切なベクターにクローニングするのに用いられ得る付着末端の生成が可能になる。
【００５９】
配列決定工程は、例えば化学配列決定（Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ）、Ｓａｎｇｅｒジデオキシ配列決定、パイロシーケンシング、蛍光検出配列決定および質量分析ＤＮＡ配列決定のような任意の公知の配列決定手段を用いて行われ得る。
【００６０】
Ｂ．免疫原性ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
本発明による免疫原の迅速選択（ＲＩＳ）法により、ウイルスの表面に提示されるポリペプチドの改変体であり、中和抗体を生成するための（従って、免疫原性組成物またはワクチンとして用いるための）候補である、ポリペプチドの同定が可能になる。従って、別の態様において、本発明は、本発明の方法により同定されるポリペプチドに関する。
【００６１】
本明細書でタンパク質と同義的に使用される「ポリペプチド」という用語は、異なるアミノ酸がペプチド結合またはジスルフィド架橋によって互いに連結されている、任意の長さのアミノ酸の鎖をいう。
【００６２】
本発明の方法により選択されるウイルスがレトロウイルスである特定の場合において、ポリペプチドは、エンベロープタンパク質の改変体である。好ましい実施形態において、レトロウイルスはＨＩＶであり、本発明によるポリペプチドはｇｐ１２０改変体である。
【００６３】
本発明のＲＩＳ法により同定されるポリペプチドは、好ましくは、Ｃ１定常領域、Ｖ１可変領域、Ｖ２可変領域、Ｃ２定常領域、Ｃ５定常領域およびｇｐ４１外部ドメインからなる群から選択される領域に少なくとも１つの変異を含む。
【００６４】
より好ましい実施形態において、Ｃ１定常領域における変異は、位置８８での変異である。より好ましい実施形態において、位置８８での変異残基はＡｓｐである。さらにより好ましい実施形態において、Ｃ１定常領域における変異は、Ｎ８８Ｄ変異である。
【００６５】
より好ましい実施形態において、Ｖ１可変領域における変異は、位置１３１、１３２および１３８からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置での変異である。より好ましい実施形態において、Ｖ１領域における位置１３１、１３２および１３８での変異残基は、それぞれＹ、Ｎおよび／またはＧである。さらにより好ましい実施形態において、Ｖ１領域における変異は、Ｃ１３１Ｙ、Ｔ１３２Ｎおよび／またはＤ１３８Ｇである。
【００６６】
より好ましい実施形態において、Ｖ２可変領域における変異は、位置１６０および１８７からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置での変異である。より好ましい実施形態において、Ｖ２領域における変異残基は、位置１６０でＹおよび／または位置１８７でＡｓｐである。さらにより好ましい実施形態において、Ｖ２領域における変異は、Ｎ１６０Ｙおよび／またはＮ１９１Ｄである。
【００６７】
より好ましい実施形態において、Ｃ２定常領域における変異は、位置２１９での変異である。より好ましい実施形態において、Ｃ２領域における位置２１９での変異残基はＶａｌである。さらにより好ましい実施形態において、Ｃ２領域における変異は、Ｉ２１９Ｖである。
【００６８】
より好ましい実施形態において、Ｃ５定常領域における変異は、位置４７９および５０７からなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置での変異である。より好ましい実施形態において、Ｃ５領域における位置４７９および５０７での変異残基は、それぞれＩｌｅおよびＴｒｐである。さらにより好ましい実施形態において、Ｃ５領域における変異は、Ｍ４７５Ｉおよび／またはＲ５０７Ｗである。
【００６９】
より好ましい実施形態において、本発明変異体によるｇｐ１２０改変体またはそのフラグメントは、Ｃ１３１Ｙ、Ｔ１３２Ｎ、Ｄ１３８ＧおよびＮ１６０Ｙ変異を有する。
【００７０】
より好ましい実施形態において、本発明変異体によるｇｐ１２０改変体またはそのフラグメントは、Ｎ８８Ｄ、Ｃ１３１Ｙ、Ｔ１３２Ｎ、Ｄ１３８Ｇ、Ｎ１６０Ｙ、Ｎ１９１Ｄ、Ａ２２６Ｖ、Ｍ４７９Ｉ、Ｒ５０７ＷおよびＹ６４７Ｎ変異を有する。
【００７１】
別の実施形態において、本発明によるｇｐ１２０改変体またはそのフラグメントは、Ｎ２０３ＳおよびＧ６０４Ｅ変異を有する。
【００７２】
より好ましい実施形態において、ｇｐ４１外部ドメインにおける変異は、Ｔ６４３Ｎである。
【００７３】
上記の位置番号は、配列番号２に示される、ＨＩＶ  ＡＣ１０ＨＸｂ２分離株のｅｎｖ遺伝子（配列番号１）によってコードされるｇｐ１６０タンパク質前駆体の配列をいい、これは配列番号１に示されるｅｎｖ遺伝子によってコードされる。Ｌｉ，２００５（前出）およびＮＣＢＩアクセッション番号ＡＹ８３５４４６を参照のこと。
【００７４】
好ましい実施形態において、本発明による免疫原性ポリペプチドは、配列番号３のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントによってコードされる、ＬＲ１−Ｃ１分離株のｅｎｖポリペプチド（配列番号４）を含む。ＬＲ１−Ｃ１分離株は、配列番号２の位置番号に関して、Ｎ８８Ｄ、Ｃ１３１Ｙ、Ｔ１３２Ｎ、Ｄ１３８Ｇ、Ｔ１３２Ｎ、Ｎ１６０Ｙ、Ｎ１９１Ｄ、Ａ２２６Ｖ、Ｍ４７９Ｉ、Ｒ５０７ＷおよびＹ６４７Ｎ変異を含む。
【００７５】
好ましい実施形態において、本発明による免疫原性ポリペプチドは、ＰＧ１６抗体を用いて単離されたクローン１０のｅｎｖポリペプチド（配列番号３１）またはそのフラグメントを含む。改変配列は、Ｎ２０３ＳおよびＧ６０４Ｅ変異を示す。
【００７６】
好ましい実施形態において、本発明による免疫原性ｇｐ１２０改変体またはそのフラグメントは、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、および配列番号３１からなる群から選択される配列を含む。
【００７７】
中和抗体に対してより高い親和性を示すｇｐ１２０変異体が本明細書で決定されており、ＡＣ１０  ＨＩＶ分離株から誘導されているが（ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＹ８３５４４６および配列番号１で示されるｅｎｖ遺伝子）、本発明による免疫原性ポリペプチドは、他のＨＩＶ分離株から、該他のＨＩＶ分離株のｅｎｖ遺伝子の対応する位置を置換することによって誘導され得ることが理解される。他のＨＩＶ分離株の対応する位置は、任意の適切な配列アラインメントアルゴリズムを用いて苦もなく決定され得る。
【００７８】
比較のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野で周知である。比較のために最適な配列のアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ−Ｌｉｐｍａｎ類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行によって、または手動アラインメントおよび目視検査によって行われ得る。Ｓｍｉｔｈ  Ｔ，Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ｍ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１９８１；２：４８２〜４８９；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｓ，Ｗｕｎｓｃｈ  Ｃ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０；４８：４４３〜４５３；Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ，Ｌｉｐｍａｎ  Ｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８；８５：２４４４〜２４４８；ＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡプログラム，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ；Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆら編，「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，第４版（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ）を参照のこと。
【００７９】
「フラグメント」は、親配列よりも長さが短い本発明のＨＩＶ−１エンベロープポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのユニークな部分である。同様に、「フラグメント」という用語は、最大で規定のペプチド配列の全長よりも一アミノ酸残基少ないものを含む本発明のＨＩＶ−１エンベロープポリペプチドおよびそのコードヌクレオチド配列をいう。例えば、フラグメントは、５〜２５００個の近接ヌクレオチドまたはアミノ酸残基を含み得る。プローブ、プライマー、抗原、治療用分子として、または他の目的に用いられるフラグメントは、少なくとも５個、１０個、１５個、１６個、２０個、２５個、３０個、４０個、５０個、６０個、７５個、１００個、１５０個、２５０個、５００個もしくは少なくとも７００個の近接ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の長さであり得る。フラグメントは、分子の特定の領域から優先的に選択され得る。例えば、ポリペプチドフラグメントは、特定の規定の配列に示されるようなポリペプチドの最初の２５０または５００アミノ酸（あるいは最初の２５％または５０％）から選択される特定の長さの近接アミノ酸を含み得る。明確には、これらの長さは例示であり、本明細書（配列表、表、および図面を含む）によって支持される任意の長さが本実施形態に包含され得る。
【００８０】
本開示は、ＨＩＶ−１の抗原性ｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸構築物に関する。これらのポリヌクレオチドとしては、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびＲＮＡ配列が挙げられる。        
【００８１】
本発明で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、種々の数のモノマーによって形成されるポリマーをいい、ここでモノマーは、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの両方を含むヌクレオチドである。ポリヌクレオチドは、メチル化により修飾されたモノマーおよび未修飾形態を包含する。「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本発明で同義的に使用され、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡおよび組換えポリヌクレオチドを包含する。本発明で使用される場合、ポリヌクレオチドは、天然に存在するポリヌクレオチドに限定されず、非天然ヌクレオチド類似体およびヌクレオチド間結合を含むポリヌクレオチドを包含する。
【００８２】
ベクターへの本発明の核酸の操作および挿入の方法は、当該技術分野で周知である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９（前出）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  Ｆら編，「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」，第４版（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，２００２）を参照のこと。
【００８３】
典型的には、本発明のｇｐ１２０ポリペプチドをコードする核酸構築物はプラスミドである。しかしながら、他のベクター（例えば、ウイルスベクター、ファージ、コスミド）が、核酸を複製するために利用され得る。本発明に関して、核酸構築物は典型的には、挿入された遺伝子配列の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含む発現ベクターである。発現ベクターは典型的には、複製起点、プロモーター、および形質転換細胞の表現型選択を可能にする特定の核酸配列を含む。
【００８４】
より一般的には、本発明のｇｐ１２０ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、宿主細胞への導入後に核酸の発現を駆動できる任意のプロモーターおよび／またはエンハンサーに作動可能に連結され得る。プロモーターは、核酸の転写を指示する核酸制御配列のアレイである。プロモーターは、ポリメラーゼＩＩ型プロモーター（ＴＡＴＡ因子）の場合のように、転写開始部位近く（に存在し得る）に必要な核酸配列を含む。プロモーターは、転写開始部位からほぼ数千塩基対付近に位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサー因子も含み得る。構成性および誘導性プロモーターの両方が含まれる。Ｂｉｔｔｅｒ  Ｇら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７；１５３：５１６〜５４４を参照のこと。
【００８５】
このような核酸構築物を作製するために、ｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、プラスミド発現ベクターのような適切な発現ベクター中に挿入される。ｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を作製する手順およびそれらの配列をインビトロで操作する手順は、当業者に周知である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９、およびＡｕｓｕｂｅｌ，２００２（前出）を参照のこと。
【００８６】
免疫原性ｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列は、配列の挿入または組み込みができるように操作され得るプラスミド、ウイルスまたは他のビヒクルが挙げられるが、これらに限定されない発現ベクター中に挿入することができ、そして原核生物または真核生物のいずれかで発現され得る。宿主としては、微生物、酵母、昆虫、および哺乳類の生物体が挙げられ得る。原核生物中で真核生物またはウイルスの配列を有するＤＮＡ配列を発現させる方法は、当該技術分野で周知である。宿主中で発現および複製できる生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは、当該技術分野で公知である。
【００８７】
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の通常の技術によって行われ得る。宿主が大腸菌などの原核生物である場合、指数増殖期後に回収され、続いて当該技術分野で周知の手順を用いてＣａＣｌ２法により処理された細胞から、ＤＮＡ取り込みが可能なコンピテント細胞が調製され得る。あるいは、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを用いてもよい。形質転換は、必要に応じて宿主細胞のプロトプラスト形成後に行ってもよく、またはエレクトロポレーションによって行ってもよい。
【００８８】
宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈、通常の機械的手順（例えばマイクロインジェクション）、エレクトロポレーション、リポソーム封入プラスミドの挿入、またはウイルスベクターのようなＤＮＡのトランスフェクション方法が用いられ得る。免疫原性ｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列と共に、選別可能な表現型をコードする第二の外来ＤＮＡ分子（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子）を用いて、真核細胞を同時形質転換することもできる。別の方法は、真核生物ウイルスベクター（例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルス）を用いて、真核細胞を一過的に感染または形質転換させ、タンパク質を発現させる。Ｇｌｕｚｍａｎ  Ｙ編，「Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳ，１９８２）を参照のこと。
【００８９】
Ｃ．抗体
本発明によるｇｐ１２０改変体およびそのフラグメントは、ＨＩＶウイルスまたはその粒子が被検体の生体液中に存在する場合にＨＩＶを認識および中和することができる抗体を生成するために用いてもよい。従って、別の態様において、本発明は、本発明による免疫原性ポリペプチドに特異的に結合する抗体に関する。
【００９０】
本発明で使用される場合、「抗体」という用語は、所定の抗原に結合する能力を有し且つ免疫グロブリン分子の軽鎖または重鎖可変領域の全部または一部を含む少なくとも１つのポリペプチドを含む、単量体または多量体タンパク質に関する。本発明の抗体としては、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、四重特異性抗体（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ヒト抗体、ヒト化抗体、ラクダ化（ｃａｍｅｌｉｚｅｄ）抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、単一ドメイン抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２  フラグメント、Ｆｖフラグメント（すなわち、抗体の最小機能モジュール）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖα、Ｖβ、および抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗Ｉｄ抗体）、細胞内抗体、および上記の任意のエピトープ結合フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。他の実施形態において、抗体は、ＶＨおよびＶＬ領域を含むＦｖフラグメントである。
【００９１】
これらの抗体は、本発明のペプチドを用いて通常の手段で生成され得る。Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ  Ｔら、ＷＯ１９９１００４２７３を参照のこと。例えば、ポリクローナル抗体は、上記で同定されたペプチドの一方もしくは両方、または多価構築物を用いて選択された動物の免疫系を従来の方法で刺激し、それらに対する自然抗体を免疫系に産生させ、そしてこの動物の血液または他の生体液からこれらの抗体を収集することによって生成され得る。高力価ポリクローナル抗体は、抗原として上に記載した多価構築物を用いることによって得ることができる。得られた抗体は、感染被検体の生体液に選択されたＨＩＶ抗原が出現したとき、これを結合することができる。
【００９２】
さらに、本発明のペプチドを用いて、ペプチド配列中に含まれる中和エピトープ構造の内部イメージを有する抗イディオタイプ抗体を生成するための鋳型として用いられ得る抗体を生成してもよい。これらの抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル）は次に、ワクチン製剤または能動免疫療法に用いられ得る。従って、本発明はまた、ペプチドの内部イメージを有するモノクローナルまたはポリクローナル抗体、およびこれらの抗体を生成する方法も包含する。Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ（前出）を参照のこと。
【００９３】
本発明の組成物および方法のためのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を得ることおよび利用することが望ましい場合、周知の従来の技術を用い、入手可能な腫瘍細胞株を用いることによって所望のＭＡｂを発現するハイブリドーマ細胞株が生成され得る。Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ  １９７５；２５６（５５１７）：４９５〜４９７を参照のこと。
【００９４】
組換え抗体は、公知の産生技術を用いて生成され得る。Ｈｕｓｅ  Ｗら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９；２４６：１２７５〜１２８１を参照のこと。所望の高力価抗体はまた、これらの抗原に対して発現するモノクローナルまたはポリクローナル抗体に、公知の組換え技術を適用することによって生成されてもよい。Ａｍｉｔ  Ｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８６；２３３：７４７〜７５３、Ｑｕｅｅｎ  Ｃら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９８８；８６：１００２９〜１００３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌら，Ｎａｔｕｒｅ  １９８８；３３２：３２３〜３２７、およびＢａｒｂａｓ  Ｃら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９２；８９：４４５７〜４４６１およびＷｉｎｔｅｒ  Ｐ，ＧＢ  ２１８８６３８を参照のこと。
【００９５】
Ｄ．中和抗体を生成し得る免疫原性組成物
本明細書で開示されるｇｐ１２０改変体ポリペプチドおよび改変体ｇｐ１２０ポリペプチドをコードする核酸分子は、例えばＨＩＶ−１感染またはその関連症状を予防、軽減または制御するために、ｇｐ１２０またはｇｐ１２０発現ウイルスに対する免疫応答を誘発する免疫原（免疫原性組成物）としてまたは免疫原を産生するために用いられ得る。治療有効量の本開示の治療用組成物の投与後、被検体は、ＨＩＶ−１感染、ＨＩＶ−１感染に関連する症状、またはその両方についてモニターされ得る。従って、別の態様において、本発明は、本発明によるＨＩＶ−１  ｇｐ１２０改変体ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントを含む免疫原性組成物、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいは上記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関する。
【００９６】
免疫原性組成物における使用に適した適切なｇｐ１２０の免疫原性フラグメントとしては、約５〜１００個のアミノ酸サイズ（例えば、約５個、約６個、約７個、約８個、約９個、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約４０個、約５０個、約６０個、約７０個、約８０個、約９０個、または約１００個）のような、比較的小さなサイズのペプチドが挙げられる。従って、ｇｐ１２０ポリペプチドのフラグメント（例えば、エピトープまたは他の抗原性フラグメント）、例えば本明細書に記載される任意のｇｐ１２０ポリペプチドまたはそのフラグメントは、免疫原として用いられ得る。
【００９７】
「免疫原性組成物」という用語は、特定の免疫原に対して抗体を産生する免疫応答または細胞性免疫応答を誘発する組成物をいう。注射用組成物は、例えば、溶液、懸濁液、およびエマルジョンとして調製され得る。「抗原性組成物」という用語は、宿主免疫系によって認識され得る組成物をいう。例えば、抗原性組成物は、宿主免疫系の体液性（例えば抗体）および／または細胞性（例えばＴリンパ球）成分によって認識され得るエピトープを含む。
【００９８】
「ワクチン」という用語は、疾患、特にウイルス疾患に対する防御を付与するための、霊長類であり得る宿主（特にヒト宿主）へのインビボ投与のための免疫原性組成物をいう。
【００９９】
本発明による免疫原性組成物は、ＨＩＶ感染によって引き起こされる疾患の治療または予防に有用である。さらなる態様において、本発明は、ＨＩＶ−１感染によって生じる疾患の治療または予防に用いる本発明によるペプチド、核酸、ベクター、免疫原性組成物またはワクチンに関する。あるいは、本発明は、ＨＩＶ−１感染によって生じる疾患の治療または予防のための医薬の製造のための本発明によるペプチド、核酸、ベクター、免疫原性組成物またはワクチンの使用に関する。あるいは、本発明は、ＨＩＶ−１感染によって生じる疾患の被検体における治療または予防方法に関し、この方法は本発明によるペプチド、核酸、ベクター、または免疫原性組成物またはワクチンの上記被検体への投与を含む。
【０１００】
本明細書の任意の個所で使用される場合、「治療」という用語は、本明細書に記載されるような臨床状態に対する感受性を終結、予防、改善および／または軽減することを目的とする任意のタイプの治療を包含する。好ましい実施形態において、治療という用語は、予防的治療（すなわち、臨床状態、障害または本明細書で定義されるような状態の感受性を軽減するための療法）に関する。
【０１０１】
従って、本明細書で使用される場合、「治療」、「治療すること」などは、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることをいい、ヒトを含む哺乳類における病的状態または障害の任意の治療を包含する。効果は、その障害または症状を完全にまたは部分的に予防する点で予防的であり、そして／あるいは障害および／または障害に起因する悪影響の部分的なまたは完全な治癒の点で治療的であり得る。すなわち、「治療」は、（１）被検体において障害が生じるか再発するのを予防すること、（２）障害を阻害すること、例えばその進行を阻止すること、（３）宿主がもはや障害またはその症状で苦しむことのないように障害または少なくともそれに関連する症状を停止または終結させること（例えば、失われた、欠損したまたは不完全な機能を回復または修復すること、あるいは非効率的なプロセスを刺激することによって、障害またはその症状の退縮を引き起こすことなど）、あるいは（４）障害またはそれに関連する症状を解放、軽減、または改善すること（この場合の改善は、例えば炎症、疼痛、および／または免疫不全などのパラメータの大きさの少なくとも減少をいう広い意味で使用される）を包含する。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「予防する」、「予防すること」、および「予防」という用語は、動物における病的細胞の出現の減少をいう。予防は、完全（例えば、被検体における病的細胞の完全な非存在）であり得る。予防はまた、例えば被検体における病的細胞の出現が本発明を用いない場合に出現すると考えられるものよりも少ないというように、部分的であってもよい。予防はまた、臨床状態に対する感受性の低下もいう。
【０１０３】
本発明による免疫原性組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含み得る。
【０１０４】
本明細書で同義的に使用される「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される希釈剤」、または「薬学的に許容される賦形剤」、または「薬学的に許容されるビヒクル」は、無毒性の固体、半固体もしくは液体の充填剤、希釈剤、カプセル封入材料または任意の従来型の製剤助剤をいう。薬学的に許容される担体は、使用される投与量および濃度ではレシピエントに対して実質的に無毒性であり、製剤の他の成分と適合性がある。例えば、ポリペプチドを含む製剤のための担体は、酸化剤およびポリペプチドに有害であることが知られている他の化合物を通常含まない。適切な担体としては、水、ブドウ糖、グリセロール、生理食塩水、エタノール、およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。担体は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、または製剤の有効性を高めるアジュバントなどの薬剤をさらに含み得る。アジュバントは、例えば以下からなる群から選択され得る：ＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ＣＧＰ  １１６８７、ノル−ＭＤＰともいう）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミル−Ｌ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ  １９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥともいう）、２％スクワレン／Ｔｗｅｅｎ−８０（登録商標）エマルジョン中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、リピドＡを含めたリポ多糖およびその種々の誘導体、フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイントの不完全アジュバント、Ｍｅｒｃｋアジュバント６５、ポリヌクレオチド（例えば、ポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、結核菌由来のワックスＤ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、およびブルセラ菌属のメンバーに見られる物質、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＡＬＵＮ、リピドＡ誘導体、コレラ毒素誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチドマトリックスまたはＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１およびＱＳ−２１、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、ポリＩ：ＣおよびＧＭ−ＣＳＦ。Ｈｕｎｔｅｒ  Ｒ、ＵＳ５，５５４，３７２、およびＪａｇｅｒ  Ｅ，Ｋｎｕｔｈ  Ａ，ＷＯ１９９７０２８８１６を参照のこと。
【０１０５】
本発明による改変体ｇｐ１２０ポリペプチドは、抗原性分子が結合され得る免疫原性高分子である担体に共有結合的に連結され得る。担体に結合されると、結合ポリペプチドはより免疫原性になる。結合分子の免疫原性を高めるように、かつ／または診断的に、分析的に、および／もしくは治療的に有益な担体に対するより高い力価の抗体を誘発するように、担体が選択される。担体への分子の共有結合は、増強された免疫原性およびＴ細胞依存性を与え得る。Ｐｏｚｓｇａｙ  Ｖら，ＰＮＡＳ  １９９９；９６：５１９４〜５１９７，Ｌｅｅ  Ｓら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９７６；１１６：１７１１〜１７１８およびＤｉｎｔｚｉｓ  Ｒら，ＰＮＡＳ  １９７６；７３：３６７１〜３６７５を参照のこと。有用な担体としては、反応物部分が付着可能な１つまたはそれ以上の官能基を含む天然材料（例えば、細菌またはウイルス由来の多糖類、ポリペプチドまたはタンパク質）、半合成材料または合成材料であり得る高分子担体が挙げられる。キーホールリンペットヘモシアニン、カブトガニヘモシアニン、エデスチン、哺乳類血清アルブミン、および哺乳類免疫グロブリンなど高等生物由来のタンパク質だけでなく、細菌生成物およびウイルスタンパク質（例えば、Ｂ型肝炎の表面抗原およびコア抗原）もまた、担体として用いられ得る。担体として用いられるさらなる細菌生成物としては、細菌壁タンパク質および他の生成物（例えば、連鎖球菌またはブドウ球菌の細胞壁およびリポ多糖（ＬＰＳ））が挙げられる。
【０１０６】
本発明はさらに、ＨＩＶ感染に関連する症状を予防または軽減することに関する。これらの症状としては、例えば帯状疱疹、皮疹および爪の感染症、口腔痛、再発性の鼻咽頭感染症、および体重減少を含む、ＨＩＶ感染の軽度の症候性期に関連する症状が挙げられる。さらに、ＨＩＶ感染の重度の症候性期に関連するさらなる症状としては、例えば、口腔および膣の鵞口瘡（カンジダ）、持続性の下痢、体重減少、持続性の咳、再活性化結核、および口唇ヘルペス（単純ヘルペス）などの再発性ヘルペス感染が挙げられる。本発明によって治療され得る末期エイズの症状としては、例えば、下痢、悪心嘔吐、鵞口瘡および口腔痛、持続性の再発性膣感染および子宮頸癌、持続性全身性リンパ節腫（ＰＧＬ）、重篤な皮膚感染、疣贅および白癬、呼吸器感染、肺炎（特に、ニューモシスチスカリニ肺炎（ＰＣＰ））、帯状ヘルペス（または帯状疱疹）、神経系障害（手足における痛み、知覚麻痺または「しびれ」など）、神経学的異常、カポジ肉腫、リンパ腫、結核、および他の日和見感染が挙げられる。
【０１０７】
本発明のペプチド、核酸およびベクターの有益な効果としては、例えば、ＨＩＶが曝露された個体の初期感染を予防または遅延させること；ＨＩＶに感染した個体におけるウイルス負荷を減少させること；ＨＩＶ感染の無症候性期を延長すること；抗レトロウイルス療法（ＡＲＴ）によりウイルスレベルが低下しているＨＩＶ感染患者において低ウイルス負荷を維持すること；薬物未投与の患者およびＡＲＴで治療される患者においてＨＩＶ−１特異的および非特異的の両方のＣＤ４  Ｔ細胞のレベルを増加するかまたはＣＤ４  Ｔ細胞の減少を軽減すること、エイズに罹患している個体における健康全般または生活の質を向上させること；そしてエイズに罹患している個体の平均余命を延長することが挙げられる。臨床医は、治療前の患者の状態または未治療の患者の予期される状態と、免疫化の効果とを比較して、治療がエイズを抑制するのに有効であるか否かを決定することができる。
【０１０８】
免疫原性組成物は、例えば、筋肉内、皮下または静脈内注射、および経口、経鼻、または経肛門投与によるなど、当業者に公知の任意の手段によって投与され得る。Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  （Ｔｅｃｈｎｏｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ，ＵＳ，１９９５）のＢａｎｇａ  Ａ，「Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」を参照のこと。ペプチドまたはタンパク質が応答を刺激するために利用可能な期間を延長するために、ペプチドまたはタンパク質は、インプラント、油性注射剤として、または粒子系として提供され得る。粒子系は微粒子、マイクロカプセル、ミクロスフェア、ナノカプセル、または同様の粒子であり得る。Ｂａｎｇａ，１９９５（前出）を参照のこと。合成高分子に基づく粒子状担体は、制御された放出を提供することに加え、免疫応答を増強するためのアジュバントとして作用することが示されている。アルミニウム塩もまた、免疫応答を生じるためのアジュバントとして用いられ得る。
【０１０９】
免疫原性組成物は、正確な投薬量の個別投与に適した単位投薬形態で処方され得る。パルス用量では、開示された免疫原を含む免疫原性組成物のボーラス投与が提供され、その後に開示された免疫原が被検体に投与されない期間が続き、その後に２回目のボーラス投与が続く。治療的有効量の免疫原性組成物は、単回用量で、または複数回用量で、例えば毎日、治療過程中に投与され得る。特定の非限定的な例において、開示された免疫原を含む免疫原性組成物のパルス用量は、１日の治療の中で、１週間の治療の中で、または１ヶ月の治療の中で投与される。
【０１１０】
免疫原性組成物は、効果（例えば、ＨＩＶ−１感染の徴候、症状、または検査結果の低下）が所望される場合はいつでも投与され得る。一般に、用量は、被検体に許容できない毒性を生じることなく疾患の症状または徴候を治療するかまたは改善させるのに十分である。全身投与または局所投与が利用され得る。
【０１１１】
治療用途に有効な量は、疾患の重篤度および患者の年齢、体重、全身状態、および他の臨床学的因子に応じて変化し得る。従って、適切な治療レジメンの最終決定は、担当の臨床医によって行われるであろう。典型的には、インビトロで用いられる投薬量は、医薬組成物のインサイチュ投与に有用な量において有用なガイダンスを提供することができ、そして動物モデルを用いて特定の障害の治療に有効な投薬量が決定され得る。Ｇｉｌｍａｎ  Ｒら編，Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ：Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第８版（Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳ，１９９０）、およびＧｅｎｎａｒｏ  Ａ編，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳ，１９９０）を参照のこと。典型的には、ｇｐ１２０ポリペプチドのための用量範囲は、約０．１μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。他の適切な範囲としては、約１μｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。一つの例において、用量は約１．０μｇ〜約５０ｍｇ、例えば１μｇ〜１ｍｇ（例えば、被検体当り１ｍｇペプチドなど）である。投薬スケジュールは、ペプチドに対する被検体の感受性および疾患の速度などの臨床学的因子に応じて、毎日からわずか年一回まで変化し得る。従って、被検体は、開示された治療的分子の初回用量を受け、次いで、例えば少なくとも一日後（例えば少なくとも一週間後）など、その後のある時点で第二回用量（または、さらに多回の用量）を受ける。
【０１１２】
本明細書に開示される医薬組成物は、用量単位で調製および投与され得る。固体用量単位としては、錠剤、カプセル剤、経皮送達系、および坐薬が挙げられる。治療量の投与は、個別の用量単位または数個のより小さな用量単位の形態での単回投与、および特定の間隔での細分された用量の複数回投与の両方によって行われ得る。適切な単回または分割用量としては、約０．０１、０．１、０．５、１、３、５、１０、１５、３０、または５０μｇタンパク質／ｋｇ／日が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１３】
本明細書に記載される抗原ｇｐ１２０ポリペプチドをコードする核酸構築物は、治療、例えば、予防レジメン（ワクチンなど）に用いるための医薬組成物（医薬）として、例えば、組み合わせて用いられ、そして被検体（例えば、ヒト被検体などの霊長類被検体）に投与されて、ＨＩＶの一つまたはそれ以上のクレードまたは株に対する免疫応答を誘発する。例えば、本明細書に記載される組成物は、ＨＩＶによる感染の前にヒト（または非ヒト）被検体に投与されて、ウイルスによる感染またはウイルスの複製を抑制し得る。従って、上記の医薬組成物は、ＨＩＶに対する防御免疫応答を誘発するために被検体に投与され得る。免疫応答を誘発するために、治療的に有効な（例えば、免疫学的に有効な）量の核酸構築物が、ヒト（または非ヒト）被検体などの被検体に投与される。
【０１１４】
核酸構築物による免疫化は、当該技術分野で周知であり、例えば以下に教示される。Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｈら、ＵＳ５，６４３，５７８（細胞性または体液性応答を誘発するために所望の抗原をコードするＤＮＡを導入することによって脊椎動物を免疫化する方法を記載）；Ｗｅｉｎｅｒ  Ｄら、ＵＳ５，５９３，９７２およびＷｅｉｎｅｒ  Ｄら、ＵＳ５，８１７，６３７（抗原をコードする核酸配列を、発現を可能にする制御配列に操作可能に連結することを記載）、およびＵｒｂａｎ  Ｒら、ＵＳ５，８８０，１０３（生物体に対する免疫原性ペプチドまたは他の抗原をコードする核酸のいくつかの送達方法を記載）を参照のこと。これらの方法には、核酸（または合成ペプチド自体）のリポソーム送達、およびコレステロールとＱＵＩＬ  Ａ（登録商標）（サポニン）の混合の際に自然発生的に形成される３０〜４０ｎｍのサイズの負に荷電したケージ様構造である免疫刺激構築物またはＩＳＣＯＭＳ（登録商標）が含まれる。
【０１１５】
ｇｐ１２０核酸分子の投与について、核酸は、例えば、レトロウイルスベクターの使用によって、直接注入によって、微粒子衝撃（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ，Ｄｕｐｏｎｔ  Ｃｏｒｐ，Ｄｅｌｗａｒｅ，ＤＥ，ＵＳ）の使用、脂質、細胞表面レセプターまたはトランスフェクション剤でのコーティングによって、あるいは核に入ることが知られているホメオボックス様ペプチドに連結させて投与すること等によって、細胞内にあるように投与される適切な核酸発現ベクターからの発現により、細胞内に送達され得る。Ｍｏｒｇａｎ  Ｊら、ＵＳ４，９８０，２８６、およびＪｏｌｉｏｔ  Ａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９１；８８：１８６４〜１８６８を参照のこと。本発明は、ゲノム内に組み込まれるかまたは組み込まれない、合成オリゴ、ネイキッドＤＮＡ、プラスミドおよびウイルスを含めた、すべての形態の核酸送達を包含する。
【０１１６】
免疫化に核酸を用いる別のアプローチにおいて、免疫原性ｇｐ１２０ポリペプチドは、弱毒化ウイルスの宿主もしくはベクターまたは細菌ベクターによっても発現され得る。組換えワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、または他のウイルスベクターは、ペプチドまたはタンパク質を発現するために用いることができ、それによりＣＴＬ応答を誘発する。例えば、ＴＢ免疫化プロトコルに有用なワクシニアベクターおよび方法は、本発明のペプチドのための他の有望なビヒクルを提供する。Ｐａｏｌｅｔｔｉ  Ｅら、ＵＳ４，７２２，８４８、およびＳｔｏｖｅｒ  Ｃら，Ｎａｔｕｒｅ  １９９１；３５１：４５６〜４６０を参照のこと。
【０１１７】
一つの例において、ウイルスベクターが利用される。これらのベクターとしては、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニア、またはレトロウイルスのようなＲＮＡウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一つの例において、レトロウイルスベクターは、マウスまたはトリのレトロウイルス由来のものである。単一の外来遺伝子が挿入され得るレトロウイルスベクターの例としては、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、マウス乳癌ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。被検体がヒトである場合、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）などのベクターが利用され得る。さらに多数のレトロウイルスベクターが、複数の遺伝子を組み込み得る。これらベクターの全てが、形質導入細胞を同定および作製できるように、選択可能なマーカー遺伝子を移入または組み込み得る。ｇｐ１２０ポリペプチドをコードする核酸配列を、例えば、特定の標的細胞上のレセプターに対するリガンドをコードする別の遺伝子と共に、ウイルスベクターに挿入することによって、このベクターはその時点で標的特異的である。レトロウイルスベクターは、例えば、糖、糖脂質またはタンパク質を付着させることによって標的特異的にされ得る。レトロウイルスベクターを標的とする抗体を用いることによって標的化を行うことが好ましい。ｇｐ１２０ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターを標的特異的に送達できるようにレトロウイルスゲノム中に挿入され得るかまたはウイルスエンベロープに付着され得る特異的ポリヌクレオチド配列は、当業者に公知であるか、または過度の実験を行うことなく容易に確認できる。
【０１１８】
核酸構築物に適した製剤としては、水系および非水系溶液、等張滅菌溶液（これらは、抗酸化剤、緩衝剤、および静菌剤を含み得る）、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る水系および非水系滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、アンプルおよびバイアルなどの単位用量または複数用量を密封した容器で提示され、使用直前に、滅菌液体担体（例えば、水）の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存され得る。即席の溶液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。好ましくは、担体は緩衝化生理食塩水溶液である。より好ましくは、本発明の方法に用いられる組成物は、投与の前に核酸構築物を損傷から保護するように処方される。例えば、組成物は、発現ベクターを調製、保存または投与するために用いられるデバイス（ガラス器具、シリンジ、または針など）上でのアデノウイルスベクターの損失を低減するように処方され得る。組成物は、成分の光感受性および／または温度感受性を減少させるように処方され得る。この目的のために、組成物は、好ましくは、薬学的に許容される液体担体（例えば、上記のものなど）、ならびにポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロースおよびこれらの組合せからなる群から選択される安定剤を含む。
【０１１９】
治療用途において、治療有効量の組成物は、ＨＩＶへの曝露またはＨＩＶによる感染の前もしくは後に被検体に投与される。曝露の前に投与される場合、この治療用途は、予防投与（例えば、ワクチンの形態で）と呼ばれ得る。組成物の単回または複数回投与は、被検体が必要とし、かつ被検体に許容される投薬量および頻度に応じて施される。一つの実施形態において、投薬量は、ボーラスとして一回で投与されるが、別の実施形態において、防御免疫応答などの治療の結果が得られるまで定期的に適用されてもよい。一般に、用量は、被検体が許容できない毒性を生じることなく、疾患の症状または徴候を治療または改善させるのに十分である。全身投与または局所投与が利用され得る。
【０１２０】
核酸ワクチンに関して、自然免疫に関与するレセプターに結合しかつ刺激する、天然に存在するかまたは合成の免疫賦活性組成物が、ｇｐ１２０ポリペプチドをコードする核酸構築物と共に投与され得る。例えば、特定のＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ７、ＴＬＲ８およびＴＬＲ９など）を刺激する薬剤が、ｇｐ１２０ポリペプチドをコードする核酸構築物と組み合わせて投与され得る。いくつかの実施形態において、核酸構築物は、免疫賦活性ＣｐＧオリゴヌクレオチドと組み合わせて投与される。
【０１２１】
ｇｐ１２０ポリペプチドをコードする核酸構築物は、ネイキッドＤＮＡプラスミドとしてインビボで導入され得る。ＤＮＡベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション（例えば、経皮的エレクトロポレーション）、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、ＤＥＡＥデキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、遺伝子銃の使用、またはＤＮＡベクタートランスポーターの使用が挙げられるがこれらに限定されない当該技術分野で公知の方法によって、所望の宿主細胞に導入され得る。Ｗｕ  Ｃら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９２；２６７：９６３〜９６７、Ｗｕ  Ｃ  ａｎｄ  Ｗｕ  Ｇ，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９８８；２６３：１４６２１〜１４６２４、およびＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １９９１；８８：２７２６〜２７３０を参照のこと。ネイキッドＤＮＡを哺乳類筋肉組織に処方および投与する方法も公知である。Ｆｅｌｇｎｅｒ  Ｐら、ＵＳ５，５８０，８５９、およびＵＳ５，５８９，４６６を参照のこと。他の分子、例えばカチオン性オリゴペプチド、ＤＮＡ結合タンパク質に由来するペプチド、またはカチオン性ポリマーなども、インビボでの核酸のトランスフェクションを促進するのに有用である。Ｂａｚｉｌｅ  Ｄら，ＷＯ１９９５０２１９３１、およびＢｙｋ  Ｇら，ＷＯ１９９６０２５５０８を参照のこと。
【０１２２】
ｇｐ１２０免疫原をコードする核酸構築物を宿主細胞に導入するのに用いられ得る、別の周知の方法は、粒子衝撃（別名、バイオリスティック形質転換）である。バイオリスティック形質転換は、一般に、いくつかある方法のうちの一つで行われる。一つの一般的な方法は、細胞において不活性または生物学的に活性な粒子を発射する工程を含む。Ｓａｎｆｏｒｄ  Ｊら、ＵＳ４，９４５，０５０、ＵＳ５，０３６，００６、およびＵＳ５，１００，７９２を参照のこと。
【０１２３】
あるいは、ベクターは、リポフェクションによってインビボで導入され得る。カチオン性脂質の使用により、負に帯電した核酸のカプセル封入を促進することができ、そしてさらに負に帯電した細胞膜との融合も促進される。Ｆｅｌｇｎｅｒ  Ｐ，Ｒｉｎｇｏｌｄ  Ｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８９；３３７：３８７〜３８８を参照のこと。核酸の移入のための特に有用な脂質化合物および組成物が記載されている。Ｆｅｌｇｎｅｒ  Ｐら、ＵＳ５，４５９，１２７，Ｂｅｈｒ  Ｊら，ＷＯ１９９５０１８８６３、およびＢｙｋ  Ｇ，ＷＯ１９９６０１７８２３を参照のこと。
【０１２４】
免疫原性ポリペプチドと同様に、核酸組成物は、ＨＩＶに対する免疫応答を誘発するために、単回用量で投与され得るか、または複数回用量が時間間隔をあけて投与され得る。例えば、２回用量、または３回用量、または４回用量、または５回用量、または６回用量またはそれ以上が、数週間、数ヶ月間または数年間にもわたって、免疫応答を最適化するために被検体に投与され得る。
【０１２５】
本明細書で開示される免疫原性組成物を、タンパク質、ペプチド、抗体、および他の抗ＨＩＶ薬剤などの他の薬剤と共に投与することが有利であり得る。このような抗ＨＩＶ治療剤の例としては、ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（例えば、アバカビル、ＡＺＴ、ジダノシン、エムトリシタビン、ラミブジン、スタブジン、テノホビル、ザルシタビン、ジドブジンなど）、非ヌクレオシド逆転写酵素インヒビター（例えば、デラビルジン、エファビレンツ、ネビラピンなど）、プロテアーゼインヒビター（例えば、アンプレナビル、アタザナビル、インジナビル、ロピナビル、ネルフィナビル、ホスアンプレナビル（ｏｓａｍｐｒｅｎａｖｉｒ）、リトナビル、サキナビル、チプラナビルなど）、および融合タンパク質インヒビター（例えば、エンフビルチドなど）が挙げられる。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、他の抗ＨＩＶ治療剤と同時に投与される。特定の実施形態において、免疫原性組成物は、他の抗ＨＩＶ治療剤と連続的に（例えば、他の薬剤の前または後などに）投与される。当業者には、連続投与が直後または適切な期間の後（数時間、数日、数週間、数ヶ月、または数年もの後など）を意味し得ることが分かるであろう。
【０１２６】
Ｅ．生物試料中の抗ＨＩＶ抗体の検出方法および中和抗体応答の検出方法
本発明に記載される免疫原は、この免疫原に特異的な抗体を患者由来の試料中で同定するのに適している。本発明による免疫原は中和抗体を特異的に結合するので、この免疫原は、中和抗体を発現した患者の検出に用いられ得る。従って、これらの抗体は、患者が中和抗体を有するか否かに基づく個別治療の同定を補助し得る。従って、別の態様において、本発明は、ウイルスに対して特異的な中和抗体を試料中で検出する方法であって、
（ｉ）前記試料を本発明によるポリペプチドと接触させる工程と、
（ｉｉ）前記記ポリペプチドとの間の免疫複合体の形成を検出する工程と
を含む、方法に関する。
【０１２７】
「中和抗体」、「ウイルス」、「ポリペプチド」という用語および表現は、上記に詳述されている。
【０１２８】
好ましい実施形態において、ウイルスはＨＩＶであり、そしてポリペプチドは上記で定義されるようなｇｐ１２０改変体ポリペプチドまたはその免疫原性フラグメントである。より好ましい実施形態において、試料はＨＩＶ−１感染患者由来であるか、またはエイズワクチンレシピエント由来である。
【０１２９】
任意の多種多様なアッセイフォーマットが、本発明の方法によって用いられ得る。このようなフォーマットは、不均一であっても均一であってもよく、連続的であっても同時的であってもよく、競合的であっても非競合的であってもよい。Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｍら、ＵＳ５，５６３，０３６，Ｃｈｅｎｇ  Ａら、ＵＳ５，６２７，０８０，Ｌｅｅ  Ｊら、ＵＳ５，６３３，１４１，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  Ｍら、ＵＳ５，６７９，５２５，Ｄｒａｅｔｔａ  Ｇら、ＵＳ５，６９１，１４７，Ｌｕｃａｓ  Ｆら、ＵＳ５，６９８，４１１，Ｙａｎ  Ｃら、ＵＳ５，７４７，３５２，Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｒ、ＵＳ５，８１１，５２６，Ｏｈ  Ｃら、ＵＳ５，８５１，７７８およびＬａｎｄｒｕｍ  Ｅら、ＵＳ５，９７６，８２２を参照のこと。このようなアッセイは、抗ＨＩＶ抗体の濃度または量を測定するために定量的であるようにフォーマットされてもよいし、あるいは抗ＨＩＶ抗体の存在または非存在を測定するために定性的であるようにフォーマットされてもよい。本発明の原理による使用に適合され得るイムノアッセイのさらなる記載は、科学文献で入手可能である。Ｇｎａｎｎ  Ｊら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８９；１７８：６９３〜７１４，Ｄｏｐｅｌ  Ｓら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９１；２９：３３１〜３３７，Ｍａｎｏｃｈａ  Ｍら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２００３；８５（３）：２７５〜２７８），Ｂｒａｔｔｅｇａａｒｄ  Ｋら，ＡＩＤＳ  １９９５；９（６）：６５６〜６５７，Ｂｅｒｉｓｔａｉｎ  Ｃら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ａｎａｌ．１９９５；９：３４７〜３５０，Ｍｏｄｒｏｗ  Ｓら，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒ．Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃ．Ｓｙｎｄｒ．１９８９；２：１４１〜１４８，Ｇｕｅｙｅ−Ｎｄｉａｙｅ  Ａら，ＡＩＤＳ  １９９３；７：４７５〜４８１，Ｓａｂａｔｉｅｒ  Ｊら，ＡＩＤＳ  １９８９；３：２１５〜２２０，Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ  Ｍら，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００４；４：３４９〜３６１，Ａｌｃａｒｏ  Ｍら，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ．Ｓｃｉ．２００３；４：２８５〜２９０，Ｓｍｉｔｈ  Ｒら，Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．１９９０；１１４：２５４〜２５８，Ｐｅｔｒｏｖ  Ｒら，Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．１９９０；１：２３９〜２４４，Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ  Ｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；４：１９９〜２１０，Ｂａｉｌｌｏｕ  Ａら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９１；２９：１３８７〜１３９１、およびＭｃＧａｕｇｈｅｙ  Ｇら，Ｃｕｒｒ．ＨＩＶ  Ｒｅｓ．２００４；２：１９３〜２０４を参照のこと。
【０１３０】
不均一イムノアッセイ技術は、典型的には反応生成物が結合する固相材料の使用を含むが、非固定化抗原と抗体の結合（すなわち、溶液相イムノアッセイ）を含むように適合され得る。反応生成物は、固相を反応混合物から除去することにより（例えば、洗浄により）、過剰の試料、アッセイ試薬、および他の物質から分離される。本発明に従って用いられ得る固相イムノアッセイの一つのタイプは、サンドイッチイムノアッセイである。サンドイッチアッセイでは、試料中に存在する分析物が多いほど、固相上に存在する標識の量も多くなる。このタイプのアッセイフォーマットは、特に低い分析物濃度の可視化のために一般に好ましく、それは固相上の標識の出現がより容易に検出されるからである。
【０１３１】
本発明の好ましい実施形態によれば、抗ＨＩＶ抗体と特異的に反応する本発明のペプチドは、固体支持体に結合（すなわち、固定化）され、抗ＨＩＶ抗体の存在が試験される生物試料との接触下でインキュベートされる。非特異的結合を減少させるためにブロッキング剤を添加してもよい。
【０１３２】
理解されるように、ペプチドは、非結合状態で生物試料とインキュベートされた後、続いて固体支持体に結合（すなわち、固定化）され得る。支持体は次いで、存在するが結合ペプチドに結合し損ねた非ＨＩＶ抗体を実質的に除去するために、好ましくは徹底的に処理される（例えば、洗浄によって）。このような処理の結果、ペプチドと抗ＨＩＶ抗体との間で免疫複合体が形成される。
【０１３３】
次に、検出可能に標識された二次抗体（一次抗体に結合することができる（例えば、抗ヒトＩｇＧ抗体））を好ましくは添加し、存在し得る任意の抗ＨＩＶ抗体に二次抗体が結合可能となる十分な条件下で支持体をインキュベートする。支持体は次いで、任意の非結合二次抗体を実質的に除去するために、好ましくは徹底的に処理される（例えば、洗浄によって）。抗ＨＩＶ抗体が試験試料中に存在する場合、次いで２つの抗体は固定化ペプチドと免疫複合体（すなわち、二次抗体／抗ＨＩＶ抗体／固定化ペプチドサンドイッチ）を形成するであろう。このようなアッセイにおいて、支持体に結合した二次抗体の検出は、試験される試料中の抗ＨＩＶ抗体の指標となる。Ｓｃｈｕｕｒｓ  Ａら、ＵＳ３，７９１，９３２およびＵＳ４，０１６，０４３、およびＰａｎｋｒａｔｚ  Ｔら、ＵＳ５，８７６，９３５を参照のこと。二次抗体は、非ヒト種から単離された天然免疫グロブリン（例えば、抗ヒトＩｇＧマウス抗体、抗ヒトＩｇＧヤギ抗体、抗ヒトＩｇＭヤギ抗体）であり得るか、または組換え的にまたは合成的に生成され得る。二次抗体は、インタクトな免疫グロブリンまたは免疫グロブリンフラグメント（例えば、ＦＡｂ、Ｆ［Ａｂ］２）であり得る。所望により、他の結合分子（抗ＨＩＶ抗体に結合することができる）をこのような二次抗体と合わせてまたはその代わりに用いてもよい。例えば、抗ＨＩＶ抗体はビオチン化することができ、そして二次抗体は標識アビジンまたはストレプトアビジンと置き換えることができる。
【０１３４】
バウンド／フリー分離工程を削除し、化学的結合アッセイに必要な時間および器具を削減するために、均一アッセイフォーマットが代わりに用いられ得る。このようなアッセイにおいて、結合ペアの１つの成分は、固定化されたままであり得る；しかしながら、結合ペアの第二の成分の存在は、バウンド／フリー分離なしで検出される。均一光学的方法の例は、蛍光消光の検出によって機能するＥＭＩＴ法（Ｓｙｖａ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳ）；光散乱における変化を検出することにより機能するＢｅｈｒｉｎｇｗｅｒｋｅ（Ｍａｒｂｕｒｇ，ＤＥ）のレーザーネフェロメトリーラテックス粒子凝集法；ＬＰＩＡラテックス粒子凝集法（三菱化成工業株式会社，Ｔｏｋｙｏ，ＪＰ）；ＴＤＸ蛍光偏光解消法（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ，ＩＬ，ＵＳ）；および蛍光エネルギー移動法（Ｃｉｓ  Ｂｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｐａｒｉｓ，ＦＲ）である。任意のこのようなアッセイは、本発明の目的に従って用いるために適合され得る。
【０１３５】
本発明の結合アッセイは、競合的アッセイとして設定され得る。競合的アッセイでは、試験試料中に存在する抗ＨＩＶ抗体が多いほど、固相上に存在する標識の量は少なくなる。
【０１３６】
サンドイッチアッセイと同様の方法において、競合的アッセイは、規定量の標識抗ＨＩＶ抗体を提供し、そして試験される液体が、支持体への結合に対して標識抗体と競合するであろう抗ＨＩＶ抗体を含むか否かを決定することによって実施することができる。このような競合的アッセイにおいて、捕捉される標識抗体の量は、試験試料中に存在する分析物の量に反比例する。このようないくつかのアッセイは、当該技術分野で記載されている。Ｓｍｉｔｈ  Ｄら、ＵＳ４，４０１，７６４、Ｃｌａｇｅｔｔ  Ｊら、ＵＳ４，７４６，６３１、Ｌｉ  Ｃら、ＵＳ４，６６１，４４４、Ｃｈｉｅｒｅｇａｔｔ  Ｅら，ＧＢ２０８４３１７、Ｍｏｃｈｉｄａ  Ｅら、ＵＳ４，１８５，０８４、Ｓａｄｅｈ  Ｄら、ＵＳ４，２４３，７４９、Ｌｕｃａｓ  Ｆら、ＵＳ５，６９８，４１１、Ｌａｎｄｒｕｍ（前出）、Ｌｅｕｖｅｒｉｎｇ  Ｊ、ＵＳ４，３１３，７３４、Ｇｒｉｂｎａｕ  Ｔら、ＵＳ４，３７３，９３２、およびＢａｕｇｈｅｒ  Ｂら、ＵＳ５，５０１，９８５を参照のこと。検出可能な標識として、酵素（特に、アルカリホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、またはウレアーゼ）の使用（すなわち、酵素イムノアッセイまたはＥＩＡ）が好ましい。
【０１３７】
酵素標識の存在は、発色性基質（蛍光、ＵＶ、可視光を放出または吸収するものを含む）を用いて、酵素標識による触媒作用に応じて検出され得る。より好ましくは、化学標識が用いられ得る（例えば、コロイド金、ラテックスビーズ標識）。
【０１３８】
標識の検出は、多重検出器、マルチパスフィルター、格子、またはスペクトル的に異なる蛍光を用いて達成することができる。Ｗａｒｄ  Ｄら、ＵＳ５，７５９，７８１を参照のこと。酵素標識としてペルオキシダーゼを、特に発色性基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ＯＰＤまたはＡＢＴＳと合わせて用いることが、特に好ましい。酵素としてペルオキシダーゼで抗体を標識化する場合、過ヨウ素酸法またはパートナーがヘテロ二官能性試薬で連結されると報告されている方法を用いることが可能である。Ｎａｋａｎｅ  Ｐら，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．１９７４；２２：１０８４〜１０９０を参照のこと。任意の多種多様な固体支持体が、本発明のイムノアッセイにおいて用いられ得る。固体支持体に適切な材料は、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリアミド、または他の合成高分子などの合成物質、セルロースなどの天然高分子、および酢酸セルロースまたはニトロセルロースなどの誘導体化した天然高分子、およびガラス、特にガラス繊維である。支持体は、球、棒、チューブ、およびマイクロアッセイまたはマイクロタイタープレートの形態をとることができる。紙片、小板および膜のようなシート状の構造も同様に適切である。担体の表面は、水溶液に対して透過性および不透過性であり得る。
【０１３９】
前述の記載は、液体（例えば、血清、血液、尿、唾液、膵液、脳脊髄液、精液）である生物試料中の抗ＨＩＶ抗体の存在についてアッセイすることに関するが、任意の流体の生物試料（例えば、組織またはバイオプシー抽出物、便抽出物、痰）も同様に本発明のアッセイに用いられ得ることが理解されるであろう。最も好ましくは、アッセイされる生物試料は血清または血漿である。
【０１４０】
本発明による免疫原は、広域中和抗体の産生を誘導し得るので、これらの免疫原は、患者における病原体に対する中和抗体応答の検出にも用いられ得る。従って、別の態様において、本発明は、本発明による中和抗体を検出する方法を用いて中和抗体の存在を被検体において検出する工程を含む、被検体におけるウイルス感染に対する中和抗体応答の検出方法であって、ここで、コントロール被検体に対する前記被検体における中和抗体の存在を、前記被検体における前記ウイルス感染に対する中和抗体応答の指標とする、方法に関する。
【０１４１】
好ましい実施形態において、ウイルスはＨＩＶであり、ポリペプチドは本発明によるｇｐ１２０改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントである。より好ましい実施形態において、試料はＨＩＶ−１感染患者由来であるか、またはエイズワクチンレシピエント由来である。
【０１４２】
一般的手順
１．試薬
以下の試薬を用いた：
（ａ）プラスミド。ｐＮＬ４．３プラスミドは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ ＡＩＤＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＩＨ  ＡＲＲＲＰ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳ）から入手した。ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ，ＵＳ）から入手した。
（ｂ）ＨＩＶ−１分離株。クレードＢのＨＩＶ−１初代分離株（ＡＣ−１０）を用いた（ＮｅｕｔＮｅｔ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｍｉｌａｎ，ＩＴ）。
（ｃ）細胞株。ＴＺＭ−ｂｌ細胞（ＣＤ４＋  ＣＸＣＲ４＋  ＣＣＲ５＋）は、ＮＩＨリポジトリ（ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳ）から入手した。２９３ＴおよびＴＺＭ−ｂｌ細胞は、１０％ウシ胎仔血清、２０ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１００Ｕペニシリン／ｍｌ、および１００μｇストレプトマイシン／ｍｌを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。
（ｄ）抗体。広域中和活性を有する抗Ｅｎｖ−ＨＩＶ−１モノクローナル抗体（ＭＡｂ）（エピトープ特異性を括弧内に示した）を用いた（ＮＩＨ  ＡＲＲＲＰ，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳ；Ｐｏｌｙｍｕｎ  ＡＧ，Ｖｉｅｎｎａ，ＡＴ）。これらとしては、４Ｅ１０（膜近位外部領域；ＭＰＥＲ）、２Ｆ５（ＭＰＥＲ）、ｂ１２（ＣＤ４結合部位）、２Ｇ１２（ｇｐ１２０高マンノースグリカン）、およびＰＧ１６（ｇｐ１２０ウイルススパイク）が挙げられる。
【０１４３】
２．インビトロランダム変異誘発
変異は、Ｇｅｎｅｍｏｒｐｈ  ＩＩランダム変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳ）を用いてＨＩＶ−１  ＡＣ−１０  ｅｎｖ中に誘導した。キメラＨＩＶビリオンのライブラリーは、ランダムに変異したエンベロープをｐＮＬ４−３およびｐｃＤＮＡ３．１プラスミドに移入することによって作製した。移入は、ウイルス配列を保存している制限部位の導入と、酵素ＸｂａＩおよびＮｏｔＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳ）での消化を介して行った。
【０１４４】
３．クローニングおよびライブラリー作製
ＰＣＲ産物は、Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用い、製造業者の仕様書に従って、ベクターｐＮＬ４．３およびｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。ｐＮＬ４．３およびｐｃＤＮＡ３．１の組換えベクターを、ＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）Ｓｔｂｌ２（商標）コンピテントセルおよびＭＡＸ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５α（商標）コンピテントセル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｓｌｂａｄ，ＣＡ，ＵＳ）にそれぞれ導入し、３ｍＬの容量で攪拌しながら３０℃で一晩（ＯＮ）増幅した。多様性の損失を回避するためにいくつかの形質転換を同時に行い、そして増幅をアップスケールする状態において混ぜ合わせた（２５０ｍＬ、３０℃、攪拌しながら一晩）。インキュベーションの後、２０μＬをプレーティングし、プラスミドＤＮＡをＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ）を用いて精製した。ｅｎｖ遺伝子の存在を確認するために、両方の産物をさらにＸｂａＩおよびＮｏｔＩで消化した。陽性の場合、クローンを配列決定し、そして／またはトランスフェクションに用いた。ｐＮＬ４．３構築物を用いる２９３Ｔの一過性同時トランスフェクションによってウイルスを作製した。ビリオンを含む細胞培養上清を、トランスフェクション後２日で回収し、Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）超遠心フィルターユニットを用いてビリオンを濃縮した。ビリオンをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁した。
【０１４５】
４．ビリオン捕捉アッセイ
マイクロタイターウェルを、４℃で一晩、ポリクローナル抗Ｆｃ（１００μｌのＰＢＳ中５μｇ／ｍＬ）でコートした。ウェルを、３７℃で１時間、ＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロックした。ライブラリー由来のウイルス（１０００ｎｇ／ｍＬ）１００μｌをマイクロタイターウェルに添加した。５μＬの捕捉ＭＡｂ（１００ｎｇ／ｍＬ）を対応するウェルに添加し、プレートを攪拌（４５０ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベートした。２時間のインキュベーションの後、ウェルをＰＢＳで６回洗浄し、そしてウイルス当量をｐ２４酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって定量し、またはＲＮＡをＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳ）を用いて製造業者の使用説明書に従って抽出した。
【０１４６】
５．ネステッドＲＴ−ＰＣＲ  ＨＩＶ−１  ｅｎｖ  ＲＮＡ増幅
単離したＨＩＶ−１  ｅｎｖ  ＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅ  ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）Ｇｏｌｄ  ＲＮＡ  ＰＣＲ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳ）およびＥｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅した。８μＬ容量のＲＮＡ鋳型をＲＴ−ＰＣＲ反応に用い、ＲＮＡを５０℃で２０分間、プライマー１０２（逆方向）で逆転写した。５μＬ容量のｃＤＮＡからプライマー１０１（順方向）および１０４（逆方向）でｅｎｖ領域を増幅し、続いて２μＬ容量の鋳型を用いてプライマー１７９（順方向）および１８０（逆方向）でネステッドＰＣＲを行った。表１を参照のこと。両方のｅｎｖ  ＰＣＲ増幅の条件は以下のとおりであった：ｉ）９４℃で２分間を１サイクル、ｉｉ）９４℃で２分間、５５℃で１分間および７２℃で３分間を３５サイクル、ｉｉｉ）７２℃で７分間を１サイクル、そしてｉｖ）４℃で停止。得られた増幅産物（２５８３ｂｐ）を、ＳＹＢＲ（登録商標）Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｇｅｌ  ｓｔａｉｎで染色した１．０％アガロースゲル中で１Ｋｂ分子量マーカーと共に電気泳動した。
【０１４７】
６．ｅｎｖ遺伝子のクローニングおよび配列決定
前工程のＰＣＲ産物を、上記のようなｐＮＬ４．３およびｐｃＤＮＡ３．１ベクターにクローニングした。Ｓｔｂｌ２およびＤＨ５αコンピテント細胞を、先に示したようにこれらのプラスミドで形質転換した。プラスミドＤＮＡを、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳ）を用いて精製し、ｅｎｖ遺伝子の存在を確認するためにＸｂａＩおよびＮｏｔＩでさらに消化した。ｅｎｖ陽性クローンを、ＢｉｇＤｙｅ（登録商標）Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１ならびにプライマー１８３（順方向）、１８５（順方向）、１８６（順方向）、１９０（逆方向）、１９２（逆方向）および１９３（逆方向）を用いて配列決定した。表１を参照のこと。
【０１４８】
７．配列分析
ヌクレオチド配列のアラインメントを、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗプログラム（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ＦＴＰ／，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１１）およびＢｉｏＥｄｉｔ  ７．０．９．０バージョンに組み込まれたＣｏｎｔｉｇ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｐｒｏｇｒａｍ（ＣＡＰ）アプリケーションを用いて行い、次いで手動で編集した。Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４；２２（２２）：６７３〜４６８０およびＨｕａｎｇ  Ｘ，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １９９２；１４（１）：１８〜２５を参照のこと。
【０１４９】
【表１】
2015508279.tif 000003
【０１５０】
８．組換えウイルスの作製
該当する変異（潜在的なグリコシル化部位の欠失およびＶ１／Ｖ２ループ構造の変化）を有する４Ｅ１０特異的なエンベロープ糖タンパク質を発現するクローンを、２５０ｍＬの容量中３０℃で攪拌しながら一晩増幅した。プラスミドＤＮＡを、ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳ）を用いて精製し、そして２９３Ｔ細胞の一過性同時トランスフェクションに用いた。偽ウイルスを含む上清を、トランスフェクションの２日後に回収した。ｐ２４レベルをＥＬＩＳＡで定量した。
【０１５１】
９．結合アッセイ
インタクトなビリオンへのＭＡｂ（４Ｅ１０、２Ｆ５、２Ｇ１２、ｂ１２、およびＰＧ１６）の結合を、先に記載した捕捉アッセイで決定した。まず、ウイルス−ＢＭＡｂ結合を促進するために、ウイルスを溶液中でＢＭＡｂと共にインキュベートした。次いで、ウイルス−ＢＭＡｂ複合体を、先にプレートに固定化した抗ＦＣ抗体によって捕捉した。固定化ウイルス−ＢＭＡｂを、ＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘで溶解した。ウイルス溶解物中のｐ２４を、上記のようにＥＬＩＳＡで定量した。ΔＥｎｖ  ｐＮＬ４．３構築物をネガティブコントロールとして用いた。結合親和性の増加を、野生型ＡＣ−１０ウイルスとの比較によって決定した。
【０１５２】
本明細書中の上記すべての刊行物は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
前述の発明は、明瞭性および理解の目的で幾分詳細に記載されているが、本発明の真の範囲および添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、形態および詳細における種々の変更が行なわれ得ることは、本開示の解釈から当業者に理解されよう。
【図１】
2015508279.tif 000004
【図２】
2015508279.tif 000005
【図３】
2015508279.tif 000006
【図４Ａ】
2015508279.tif 000007
【図４Ｂ】
2015508279.tif 000008
【図４Ｃ】
2015508279.tif 000009
【図５−１】
2015508279.tif 000010
【図５−２】
2015508279.tif 000011
【配列表】
2015508279000001.app
【国際調査報告】
2015508279.tif 000012
2015508279.tif 000013
2015508279.tif 000014
2015508279.tif 000015
2015508279.tif 000016
2015508279.tif 000017
2015508279.tif 000018