(57)【要約】  本発明は、多能性幹細胞およびその使用方法に関する。また、本発明は、多能性幹細胞を産生する方法に関する。【選択図】図１Ａ
2015522257.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を産生する方法であって、
a.少なくとも1つのmRNAを標的細胞へ導入する工程と、
b.少なくとも1つのmiRNAを標的細胞へ導入する工程と、
c.前記標的細胞を培養して多能性幹細胞を産生する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
前記少なくとも1つのmRNAを前記細胞へ導入する前記工程および／または前記少なくとも1つのmiRNAを前記標的細胞へ導入する前記工程は、少なくとも1回繰り返される、請求項1の方法。
【請求項３】
工程（a）に先立って、少なくとも1つのmiRNAは、前記標的細胞へ導入される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項４】
工程（a）および（b）は、順次行われる、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項５】
工程（a）および（b）は、同時に行われる、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項６】
前記幹細胞は、工程（a）の開始から2週未満で産生される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項７】
前記幹細胞は、工程（a）の開始から2週を超えて産生される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項８】
前記幹細胞は、工程（a）の開始から2〜3週で産生される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項９】
前記幹細胞は、SSEA3、SSEA4、Tra-1-81、Tra-1-60、Rex1、Oct4、NanogおよびSox2からなる群から選択される表面マーカーの少なくとも1つを発現する、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１０】
前記幹細胞は、1年間を超えてインビトロで分裂することができ、および／または30継代を超えてインビトロで分裂することができ、および／またはアルカリホスファターゼもしくはヘキスト染色によりポジティブ染色することができ、および／またはテラトーマを形成することができる、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１１】
前記幹細胞は、胚様体を形成することができ、AFP、FOXA2およびGATA4からなる群から選択される1つまたは複数の内胚葉マーカー、および／またはCD34、CDH2（N-カドヘリン）、COL2A1、GATA2、HAND1、PECAM1、RUNX1、RUNX2からなる群から選択される1つまたは複数の中胚葉マーカー、および／またはALDH1A1、COL1A1、NCAM1、PAX6およびTUBB3（Tuj1）からなる群から選択される1つまたは複数の外胚葉マーカーを発現することができる、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１２】
少なくとも1個の幹細胞が産生される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも1つのmiRNAおよび前記少なくとも1つのmRNAの一方または両方が、修飾ヌクレオチドを含む、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも1つのmRNAは、前記幹細胞のゲノムへ組み込まれない、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１５】
工程（a）および（b）において前記標的細胞へ導入される前記mRNAおよびmiRNAは、前記幹細胞中に存在しない、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１６】
前記培養する工程は、フィーダー層の非存在下で実施される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１７】
5%以下のO2で実施される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１８】
5%〜21%のO2で実施される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１９】
21%のO2で実施される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項２０】
前記標的細胞は、線維芽細胞、内皮前駆細胞（L-EPC）を包含するが、限定されない末梢血由来細胞、臍帯血由来細胞型（CD34+）、上皮細胞およびケラチノサイトからなる群から選択される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも1つのmRNAは、リプログラミング因子をコードする、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも1つのmRNAは、OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28、Nanog、Glis1、Sal4およびEsrbb1の少なくとも1つをコードする、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも1つのmiRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-367、hsa-miR-200c、hsa-miR-369-3pおよびhsa-miR-369-5pからなる群から選択されるmiRNAに対して80%またはそれ以上同一である少なくとも1つのmiRNAを含む、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも1つのmiRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302dおよびhsa-miR-367の組み合わせを含む、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも1つのmiRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-200c、hsa-miR-369-3pおよびhsa-miR-369-5pの組み合わせを含む、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも1つのmiRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302dおよびhsa-miR-367またはhsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-200C、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-369-5pの組み合わせ、またはhsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-200C、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-369-5pの組み合わせを含む、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項２７】
前記細胞は、ヒト細胞である、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項２８】
標的細胞において多能性を誘発する方法であって、
a.少なくとも1つのmRNAを前記標的細胞へ導入する工程と、
b.少なくとも1つのmiRNAを前記標的細胞へ導入する工程と、
c.前記標的細胞を培養して多能性幹細胞を産生する工程と、
を含む、方法。
【請求項２９】
前述の請求項のいずれか1項の方法により産生される、少なくとも1つのmiRNAと組み合わせてリプログラミング因子をコードする少なくとも1つのmRNAを含む単離多能性幹細胞。
【請求項３０】
前記少なくとも1つのmRNAは、前記細胞のゲノムへ組み込まれない、前述の請求項のいずれか1項の方法により産生される単離多能性幹細胞。
【請求項３１】
工程（a）および（b）において前記標的細胞へ導入される前記mRNAおよびmiRNAは、前記幹細胞中に存在しない、前述の請求項のいずれか1項の方法により産生される単離多能性幹細胞。
【請求項３２】
前記少なくとも1つのmiRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-367、hsa-miR-200c、hsa-miR-369-3pおよびhsa-miR-369-5pからなる群から選択されるmiRNAに対して80%またはそれ以上同一である少なくとも1つのmiRNAを含む、請求項29〜31のいずれか1項の単離多能性幹細胞。
【請求項３３】
前記少なくとも1つのmRNAは、OCT4、SOX2、KLF4、c-MYCおよびLIN28の少なくとも1つをコードする、請求項29〜31のいずれか1項の単離多能性幹細胞。
【請求項３４】
請求項29〜33のいずれか1項の単離多能性幹細胞を含む配合物。
【請求項３５】
免疫応答を抑制する化合物をさらに含む、請求項34の配合物。
【請求項３６】
少なくとも1つのmRNAおよび少なくとも1つのmiRNAを含む多能性幹細胞を産生するためのキット。
【請求項３７】
培養培地およびトランスフェクション試薬をさらに含む、請求項36のキット。
【請求項３８】
免疫応答を抑制する化合物をさらに含む、請求項36のキット。
【請求項３９】
疾患を伴う被験体を治療する方法であって、前記被験体に請求項29〜33のいずれか1項の単離多能性幹細胞の分化により産生される細胞を投与することを含む、前記方法。
【請求項４０】
疾患を伴う被験体を治療する方法であって、前記被験体に請求項1〜28のいずれか1項の方法により産生される単離多能性幹細胞の分化により産生される細胞を投与することを含む、前記方法。
【請求項４１】
疾患の治療のための化合物を同定する方法であって、請求項1〜28のいずれか1項の方法により産生される幹細胞の分化により産生される細胞を、所定の化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４２】
疾患を治療するための化合物の活性を決定する方法であって、請求項1〜28のいずれか1項の方法により産生される幹細胞の分化により産生される細胞を、疾患を治療することで知られる化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４３】
疾患を治療するための化合物の毒性を決定する方法であって、請求項1〜28のいずれか1項の方法により産生される幹細胞の分化により産生される細胞を、疾患を治療することで知られる化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４４】
請求項1〜28のいずれか1項の方法により産生される幹細胞の分化により産生される前記細胞は、線維芽細胞、内皮前駆細胞（L-EPC）を包含するが、限定されない末梢血由来細胞、臍帯血由来細胞型（CD34+）、上皮細胞およびケラチノサイトからなる群から選択される、請求項40〜43のいずれか1項の方法。
【請求項４５】
疾患を伴う被験体を治療するための薬剤の製造のための、請求項1〜28のいずれか1項の方法により産生される幹細胞の分化により産生される細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、2013年6月13日に出願の米国仮出願第61/659,240号に対する優先権を主張し、その全体が本明細書において参照により援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、多能性幹細胞を調製する方法、およびそれらの使用方法に関する。
【発明の背景】
【０００３】
再生医療および薬物スクリーニング用途に関する人工多脳性幹（iPS）細胞技術の幅広い採用は、ゲノム摂動およびウイルス混入物の両方を含まないヒトiPS株化細胞を効率的に得ることができないことにより制限されてきた。
【０００４】
iPS細胞は、2006年に山中氏により初めて記載され（Cell 2006 126（4）:663-676）、その潜在性に関して即座に認識され、個別化医療の分野に革命をもたらした。山名氏は、まずマウスで実施して、続いてヒト細胞で実施した実験の結果について記載しており、そこでは線維芽細胞への4つの転写因子（リプログラミング因子）Oct4、Sox2、Klf4およびc-Mycの添加により、多能性状態にある細胞への体細胞線維芽細胞の脱分化が導かれた。
【０００５】
iPS細胞を作製する初期の方法は、リプログラミング因子を送達するためのレトロウイルスの使用に焦点を当てた。かかるウイルスは、取り扱う際にかなりの安全対策を必要とし、それらの作用機序は、コードされる転写因子を発現するために宿主細胞ゲノムへのウイルスの組込みを必要とする。iPS細胞を作製するDNAベースの方法もまた開発されており、これらの方法は、取り扱いに関しては、レトロウイルスベースの方法よりも安全であるが、これらの方法は、宿主細胞ゲノムとの相同組換えのリスクを保有する。したがって、iPS細胞を作製するウイルスベースの方法およびDNAベースの方法はともに、臨床等級の細胞を産生するのに使用することができない。さらに、ウイルスベースの方法およびDNAベースの方法により産生されるiPS細胞は、発生したかもしれない任意のゲノム修飾が細胞の機能に影響を及ぼさないことを保証するために、使用に先立って広範囲にわたってスクリーニングされなくてはならない。
【０００６】
人工多能性幹細胞（iPS）細胞を作製するためのメッセンジャーRNA（mRNA）を使用した最近の開発は、iPS細胞を産生する改善された方法につながった。しかしながら、ある特定の株化細胞が、mRNAによるリプログラミングに対して不応性のままである。さらに、iPS細胞を作製する方法は、培養あたりほんの少数のiPSコロニーを生成するに過ぎない。iPS細胞を産生するmRNAベースの方法は、多重トランスフェクションを必要とし（たとえば、培養液には、16〜18日間、毎日トランスフェクトしなくてはならない）、多くの場合は細胞のフィーダー層上での増殖を必要とする。
【０００７】
たとえば初代患者細胞から迅速に調製することができ、遺伝子操作に関するスクリーニングの工程を必要とせず、また臨床用途で使用するのに安全である多能性幹細胞を調製する方法が長年にわたって切実な需要がある。本発明の多能性幹細胞を調製する新規方法であって、mRNAおよびmiRNAの組み合わせが細胞へ導入される方法、並びに細胞自体は、この長年にわたる切実な需要を満たす。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、iPS細胞を作製する新規方法であって、細胞がmRNAおよびmiRNAの組み合わせと組み合わせられる方法に関する。本発明の方法は、miRNAを利用しないウイルスベースの方法、DNAベースの方法およびmRNAベースの方法を含む当該技術分野において公知のiPS細胞を産生する方法と比較した場合に、多数の驚くべきかつ予期せぬ利点を提供する。
【０００９】
mRNAと組み合わせたマイクロRNA（miRNA）の添加によりiPS細胞を産生する請求項に係る方法は、それが1）任意の公知の方法と比較する場合にリプログラミングプロセスに関してより速い反応速度論、および2）任意の公知の方法と比較する場合により高い生産性を提供するため、iPS細胞を産生する任意の公知の方法を改善する。
【００１０】
iPS細胞を産生するのに必要とされる時間の減少は、明らかに利点である。また、本発明のiPS細胞を産生する新規の請求項に係る方法は、iPS細胞を産生する任意の公知の方法と比較した場合に著しく数少ないトランスフェクションを必要とするという利点を提供する。
【００１１】
本発明の新規方法は、他の方法と比較した場合に典型的な患者系統からの増加数のiPS細胞コロニーを提供する。さらに、本発明のiPS細胞を産生する請求項に係る方法は、iPS細胞を産生する任意の公知の方法に付される場合にいかなるコロニーも生じなかった細胞からのiPS細胞の作製を可能にする。
【００１２】
iPS細胞を産生するウイルスベースの方法と異なり、新規の請求項に係る方法は安全であり、臨床用途に適したiPS細胞を産生する効率的な方法を提供する。本発明のiPS細胞に由来する分化子孫細胞もまた、臨床用途に適している。請求項に係る方法は、任意の有意な安全対策を必要とせずに実施することができる。ウイルスベクターを必要とする方法により調製されるiPS細胞と異なり、本発明の新規方法により産生されるiPS細胞は、ウイルス混入物を含まないという利点を提供し、したがって臨床用途に適している。請求項に係る方法により産生されるものなどのiPS細胞およびiPS細胞から産生される分化した子孫細胞は、それらが個人向け治療の開発に、また再生医療用途に使用することができるため、他の方法によって産生された細胞よりも好適である。
【００１３】
請求項に係る方法は、宿主細胞ゲノムとの相同組換えの発生のリスクのないiPS細胞を産生する方法を提供する。請求項に係る方法は、ゲノム組込みを有さず、したがって当該技術分野において公知の他の方法により調製されるiPS細胞が必要とするようなゲノム修飾を決定するためのプレスクリーニングを必要としないiPS細胞を産生する。
【００１４】
iPS細胞を産生する当該技術分野において受け入れられている方法と異なり、請求項に係る方法は、限定の異物を含まない細胞培養培地（すなわち、培地は非ヒト構成成分を含有しない）を多能性細胞培養接着基体と組み合わせることにより、フィーダーベースのリプログラミング方法に関連した固有の可変性を排除する。さらに、請求項に係る方法によれば、低減数のトランスフェクションが、iPS細胞コロニーを樹立するのに最終的に必要とされる。さらに、毎日のトランスフェクションにつき、低減された量のmRNAが必要とされる。
【００１５】
当該技術分野において現在公知の方法により産生されるiPS細胞と異なり、請求項に係る方法は、預けて、産生の4〜5週またはそれ以降の実験に使用することができるiPS細胞を産生するという利点を提供する。
【００１６】
さらに、他の方法と異なり、請求項に係る方法は、ゲノム組込みまたはウイルス混入物に関するコロニー単離後のスクリーニングを必要としない。
【００１７】
本発明の多能性細胞を調製する方法は、当該技術分野において公知の他の方法を上回る下記利点を少なくとも提供する：mRNAおよびmiRNAの使用により、化学量論および発現レベルの微調整を可能にすること；mRNAおよびmiRNAの使用により、化学量論および発現レベルの一過性の制御を可能にすること；mRNAもmiRNAもいずれも組込みが存在しないため、本発明の方法は、ウイルスを使用して、したがって臨床用途に関して安全性の懸念を生み出す当該技術分野において公知の方法と比較した場合に、臨床的に意義ある細胞の産生に適していること；コロニー形成、同定および単離に関するタイムラインが、多能性細胞の産生に関して40日またはそれ以上を必要とし得る従来技術の方法と比較した場合に、本明細書に記載した方法によれば、14日未満であり得ること；ウイルス形質導入後に再播種を必要とする当該技術分野において公知の方法に対比して、本明細書に記載した方法は、細胞を播種する必要はないが、播種を行うことはできること；および本方法は、フィーダー層の使用を必要とする当該技術分野において公知の方法と比較した場合に、フィーダー層の非存在下で実施されること。
【００１８】
細胞リプログラミングに対する効果は、リプログラミングを高めることである。本発明の方法は、細胞が胚細胞以外の任意の細胞型に分裂および分化することが可能になるように、細胞において多能性を誘発することを包含する。細胞リプログラミングはまた、細胞の脱分化を誘発する。細胞リプログラミングの変更は、mRNAおよびマイクロRNAの組み合わせ以外の作用物質により誘発された多能性または脱分化のレベルを高めることができる。幹細胞とも呼ばれる多能性または多分化能性細胞は、不定期間、多数の異なる表現型系列に分裂する（自己複製するか、または自己再生する）か、または分化する能力を有する。本発明の細胞は、特定の条件下で、または最適な調節シグナルの存在下で、生物体を構成する多くの異なる細胞型へそれら自体を分化させる。
【００１９】
本発明の多能性または多分化能性細胞は、毛包細胞、血液細胞、心臓細胞、眼細胞、皮膚細胞、膵臓細胞または神経細胞などの特徴的な属性および特殊な機能を有する細胞へ分化する能力を保有する。特に、本発明の多能性細胞は、心臓細胞、神経細胞（たとえば、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト）、肝細胞（たとえば、膵島細胞）、骨形成原細胞（osteogentic）、筋肉細胞、上皮細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、樹状細胞および造血細胞および網膜色素上皮（RPE）細胞を包含するが、限定されない内胚葉、中胚葉または外胚葉に由来する細胞を包含するが、限定されない多数の細胞型に分化することができる。
【００２０】
iPS細胞は、神経変性障害の治療のための前途有望なツールである。たとえば、障害を伴う患者由来の体細胞は、本発明の方法を使用してiPS細胞へ形質転換することができ、また所望の神経サブタイプにさらに分化させることができる。次いで、かかる細胞は、疾患を治療することが可能な新たな化合物または他の作用物質の発見のための、および／または療法に使用される治療用化合物に関する疾患モデルの開発において使用され得る。ある特定の場合において、分化細胞は、損傷を受けた組織を置換するための細胞療法に使用することができる。
【００２１】
神経サブタイプである運動ニューロンおよびドーパミン作動性ニューロンへの分化の方法、並びに新たな療法の開発へのそれらの応用の例は、下記参照文献に見出される:Saportaら「神経疾患の研究における人工多脳性幹細胞（Induced pluripotent stem cells in the study of neurological diseases）」 Stem Cell Research & Therapy 2011, 2:37；Lopez-Gonzalez, R.およびVelasco, I.「胚性幹細胞および人工多脳性幹細胞から分化した運動ニューロンの治療可能性（Therapeutic Potential of Motor Neurons Differentiated from Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells）」 Arch Med Res 2012, 43:1, 1-10；Cooperら「腹側中脳ドーパミン作動性ニューロンへのヒトＥＳおよびパーキンソン病iPS細胞の分化は、ＳＨＨ、ＦＧＦ８ａの高い活性形態およびレチノイン酸による特異的領域化を必要とする（Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid）」 Molecular and Cellular Neuroscience 45 （2010） 258-266；Dimosら「ALSを伴う患者から生成された人工多脳性幹細胞は、運動ニューロンへ分化させることができる（Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons）」 Science 2008 321, 1218；Huら「ヒト人工多脳性幹細胞の神経分化は発達原理に従うが、可変効力を伴う（Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency）」 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 2010, 107, 9, 4335；Mohamad O, Drury-Stewart D, Song M, Faulkner B, Chen D, et alら（2013） ウイルスを含まず、かつ導入遺伝子を含まないヒトiPS細胞は機能性ニューロンへ分化して、マウスにおいて虚血発作後の機能回復を高める（Vector-Free and Transgene-Free human iPS Cells Differentiate into Functional Neurons and Enhance Functional Recovery after Ischemic Stroke in Mice）. PLoS ONE 8（5）: e64160. doi:10.1371/journal.pone.0064160；Osadakaら「多脳性幹細胞からの神経分化の制御（Control of neural differentiation from pluripotent stem cells）」 Inflammation and Regeneration 2008 Vol.28 No.3 166；Marchetto etら「人工多脳性幹細胞（iPSC）および神経学的疾患モデリング：進歩と有望（Induced pluripotent stem cells （iPSCs） and neurological disease modeling: progress and promises）」 human Molecular Genetics, 2011, Vol. 20, Review Issue 2 R109-R115。
【００２２】
幹細胞を分化させる方法は、当該技術分野において周知であり、たとえば多能性幹細胞を適切な成長因子および／またはサイトカインと接触させることを包含する。
【００２３】
細胞プログラミングは、密接に関連した細胞または細胞型に対して部分的な脱分化および／または分化転換をさらに包含することができ、ここで本発明の細胞は、1つの分化細胞型から別の分化細胞型へ変換する。
【００２４】
さらに、人工多能性幹（iPS）細胞を樹立するための効率を高めるために、上述のmiRNAに加えて、下記サイトカインおよび／または小分子を、リプログラミングされるべき体細胞へさらに導入させてもよい：すなわち、サイトカインに関しては塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、幹細胞因子（SCF）等、および小分子に関してはバルプロ酸（valpronic acid）のようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤、5’−アザシチジンのようなDNAメチラーゼ阻害剤、BIX01294（BIX）のようなヒストンメチルトランスフェラーゼ（G9a）等（D. Huangfuら、Nat. Biotechnol., 26, pp. 795-797, 2008；S. Kubicekら、Mol. Cell, 25, pp. 473-481, 2007；Y. Shi etら、Cell Stem Cell, 3, 568-574, 2008、Yan Shiら、Cell Stem Cell, 2, pp. 525-528, 2008）。さらに、p53に関するshRNAもしくはsiRNAのようなp53阻害剤および／またはUTF1を体細胞に導入してもよい（Yang Zhaoら、Cell Stem Cell, 3, pp 475-479, 2008）。同様に、Wntシグナルの活性化（Marson A.ら、Cell Stem Cell, 3, pp 132-135, 2008）または分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼもしくはグリコーゲンシンターゼキナ−ゼ-3によるシグナル伝達の阻害（Silva J.ら、PloS Biology, 6, pp 2237-2247 2008）は、iPS細胞を作製する効率を増大させるための手段として役立ち得る。
【００２５】
本発明は、多能性幹細胞を産生する方法であって、少なくとも1つのmRNAを標的細胞へ導入する工程と、少なくとも1つのmiRNAを標的細胞へ導入する工程と、標的細胞を培養する工程であって、それにより多能性幹細胞を産生する工程を含む方法を提供する。
【００２６】
少なくとも1つのmRNAを上記細胞へ導入する工程および／または上記少なくとも1つのmiRNAを上記標的細胞へ導入する工程は、少なくとも1回繰り返され得る。
【００２７】
工程（a）に先立って、少なくとも1つのmiRNAを上記標的細胞へ導入することができる。
【００２８】
工程（a）および（b）は、順次行われ得る。
【００２９】
工程（a）および（b）は、同時に行われ得る。
【００３０】
幹細胞は、工程（a）の開始から2週未満、たとえば工程（a）の開始から13日、12日、11日、10日、9日、8日、7日、6日、5日またはそれ未満で産生され得る。あるいは、本発明の幹細胞は、工程（a）の開始から2週を超えて、たとえば2〜10週、2〜5週および2〜3週で産生される。
【００３１】
産生される幹細胞は、SSEA3、SSEA4、Tra-1-81、Tra-1-60、Rex1、Oct4、NanogおよびSox2からなる群から選択される表面マーカーの少なくとも1つを発現することができる。
【００３２】
幹細胞は、1年間を超えてインビトロで分裂することができ、および／または30継代を超えてインビトロで分裂することができ、および／またはアルカリホスファターゼもしくはヘキスト染色によりポジティブ染色することができ、および／またはテラトーマを形成することができる。
【００３３】
幹細胞は、胚葉体を形成することができ、AFP、FOXA2およびGATA4からなる群から選択される1つまたは複数の内胚葉マーカー、および／またはCD34、CDH2（N-カドヘリン）、COL2A1、GATA2、HAND1、PECAM1、RUNX1、RUNX2からなる群から選択される1つまたは複数の中胚葉マーカー、および／またはALDH1A1、COL1A1、NCAM1、PAX6およびTUBB3（Tuj1）からなる群から選択される1つまたは複数の外胚葉マーカーを発現することができる。
【００３４】
少なくとも1個の幹細胞、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、500、1000個またはそれ以上の幹細胞が産生される。
【００３５】
少なくとも1つのmiRNAおよび少なくとも1つのmRNAの一方または両方は、少なくとも1つの本明細書中で規定されるような修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【００３６】
少なくとも1つのmiRNAも少なくとも1つのmRNAもいずれも、DNAベクターまたはウイルスベクター中で供給されない。
【００３７】
少なくとも1つのmiRNAおよび少なくとも1つのmRNAの一方または両方は、修飾ヌクレオチド、たとえば5−メチルシトシンもしくはシュードウラシル、または本明細書中で規定されるような任意の修飾ヌクレオチドを含むことができる。
【００３８】
少なくとも1つのmRNAは、上記幹細胞のゲノムへ組み込まれない。
【００３９】
工程（a）および（b）において上記標的細胞へ導入される上記mRNAおよびmiRNAは、幹細胞中に存在しない。
【００４０】
培養する工程は、フィーダー層の非存在下で実施され得る。
【００４１】
方法は、5%以下のO2で実施され得る。
【００４２】
本方法は、5%〜21%、6、7、8、9、10、15、20および21%のO2で、たとえば21%のO2で実施され得る。
【００４３】
標的細胞として、線維芽細胞、末梢血由来細胞型（具体的には、後期内皮前駆細胞（L-EPC））、臍帯血由来の細胞型（CD34+）上皮細胞およびケラチノサイトを含むが、限定されない。
【００４４】
少なくとも1つのmRNAは、リプログラミング因子をコードする。
【００４５】
少なくとも1つのmRNAは、OCT4、SOX2、KLF4、c-MYCおよびLIN28の少なくとも1つをコードすることができる。
【００４６】
少なくとも1つのmiRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR367、hsa-miR-200c、hsa-miR-369-3pおよびhsa-miR-369-5pからなる群から選択されるmiRNAに対して80%またはそれ以上同一である少なくとも1つのmiRNAを含むことができる。
【００４７】
同様に、少なくとも1つのmiRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302dおよびhsa-miR367の組み合わせを含むことができる。
【００４８】
同様に、少なくとも1つのmiRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-200C、hsa-miR-369-3pおよびhsa-miR-369-5pの組み合わせを含むことができる。
【００４９】
同様に、少なくとも1つのmiRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-200c、hsa-miR-369-3pおよびhsa-miR-369-5pの組み合わせを含むことができる。
【００５０】
少なくとも1つのmiRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR-302dおよびhsa-miR-367またはhsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR-302d、hsa-miR-200C、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-369-5pの組み合わせ、またはhsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-hsa-miR-302c、hsa-miR-302d、hsa-miR-200C、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-369-5pの組み合わせを含むことができる。
【００５１】
標的細胞は、ヒト細胞を包含するが、限定されない哺乳動物細胞であり得る。
【００５２】
本発明は、標的細胞において多能性を誘発する方法であって、少なくとも1つのmRNAを標的細胞へ導入する工程と、少なくとも1つのmiRNAを標的細胞へ導入する工程と、標的細胞を培養して多能性幹細胞を産生する工程を含む方法を提供する。
【００５３】
また、本発明は、本明細書に記載した方法のいずれか1つに従って産生される少なくとも1つのmiRNAと組み合わせて、リプログラミング因子をコードする少なくとも1つのmRNAを含む単離多脳性幹細胞を提供する。
【００５４】
また、本発明は、たとえば医薬品担体と組み合わせた、本明細書中で規定され、かつ本明細書に記載した方法のいずれか1つにより産生されるような単離多脳性幹細胞、または本明細書で規定されるような単離多脳性幹細胞に由来する分化細胞を含む配合物を提供する。
【００５５】
上記配合物は、免疫応答を抑制する化合物をさらに含むことができる。
【００５６】
本明細書において使用される場合、化合物は、タンパク質、抗体、核酸、たとえばsiRNA、miRNA、アンチセンスRNA、mRNAおよび／または小分子のいずれか1つを包含する。
【００５７】
また、本発明は、少なくとも1つのmRNAおよび少なくとも1つのmiRNAを含む多能性幹細胞または分化子孫細胞を産生するためのキットを提供する。
【００５８】
記キットは、培養培地および／またはトランスフェクション試薬をさらに含むことができる。
【００５９】
キットは、免疫応答を抑制する化合物をさらに含むことができる。
【００６０】
また、本発明は、本明細書に記載した疾患のいずれかを伴う被験体を治療する方法であって、被験体に本発明の本明細書に記載した方法のいずれかにより産生される単離多脳性幹細胞を投与することを含む、方法を提供する。
【００６１】
また、本発明は、本明細書に記載した疾患のいずれかを伴う被験体を治療する方法であって、被験体に本発明の方法により得られる単離多能性幹細胞の分化により産生される子孫細胞を投与することを含む、方法を提供する。
【００６２】
また、本発明は、疾患の治療のための化合物を同定する方法であって、本発明の方法により産生される幹細胞の分化により産生される細胞を、所定の化合物と接触させることを含む、上記方法を提供する。
【００６３】
また、本発明は、疾患を治療するための化合物の活性を決定する方法であって、本発明の方法により産生される幹細胞の分化により産生される細胞を、疾患を治療することで知られる化合物と接触させることを含む、方法を提供する。
【００６４】
また、本発明は、疾患を治療するための化合物の毒性を決定する方法であって、本発明の方法により産生される幹細胞の分化により産生される細胞を、疾患を治療することが公知の化合物と接触させることを含む記方法を提供する。
【００６５】
本発明の方法によれば、幹細胞の分化により産生される上記細胞は、線維芽細胞、内皮前駆細胞（L-EPC）を包含するが、限定されない末梢血由来細胞、臍帯血由来細胞型（CD34+）、上皮細胞およびケラチノサイトからなる群から選択される。
【００６６】
また、本発明は、疾患を伴う被験体を治療するための薬剤の製造のための、本発明の方法により産生される幹細胞の分化により産生される細胞の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１Ａ】eGFP mRNAによる線維芽細胞のトランスフェクションの結果を示す（A：フローサイトメトリーにより決定される場合の蛍光強度；B：代表的なヒストグラム；C：eGFP mRNAでトランスフェクトされた細胞の蛍光画像）。
【図１Ｂ】eGFP mRNAによる線維芽細胞のトランスフェクションの結果を示す（A：フローサイトメトリーにより決定される場合の蛍光強度；B：代表的なヒストグラム；C：eGFP mRNAでトランスフェクトされた細胞の蛍光画像）。
【図１Ｃ】eGFP mRNAによる線維芽細胞のトランスフェクションの結果を示す（A：フローサイトメトリーにより決定される場合の蛍光強度；B：代表的なヒストグラム；C：eGFP mRNAでトランスフェクトされた細胞の蛍光画像）。
【図２Ａ】A：初代患者線維芽細胞からのiPS細胞の産生に関するタイムラインを示す。
【図２Ｂ】B：iPS細胞産生中の形態学の経過を示す。
【図３】iPS細胞生成に対する標的細胞数およびmRNA用量の影響を示す。
【図４】Tra-1-81（+）iPS細胞コロニーを作製するのに必要とされるmRNAトランスフェクションの数を実証するグラフを示す。
【図５】細胞が、低レベルのmRNAの存在下でmiRNAで処理される場合に、iPS細胞コロニーが形成され得ることを実証する結果を示す。
【図６】フィーダーを含まない条件下でクローンmRNA iPS株化細胞の継続した増殖およびその多能性の維持を実証する。
【図７】リプログラミングの他の方法に対して不応性の細胞由来のiPSコロニーの形態学の経過を示す。
【図８Ａ】OCT4のヌクレオチド配列（A）を示す。
【図８Ｂ】OCT4のアミノ酸配列（B）を示す。
【図９Ａ】SOX2のヌクレオチド配列（A）を示す。
【図９Ｂ】SOX2のアミノ酸配列（B）を示す。
【図１０】NANOGのアミノ酸配列を示す。
【図１１Ａ】LIN28のヌクレオチド配列（A）を示す。
【図１１Ｂ】LIN28のアミノ酸配列（B）を示す。
【図１２Ａ】KLF4のヌクレオチド配列（A）を示す。
【図１２Ｂ】KLF4アミノ酸配列（B）を示す。
【図１３Ａ−１】cMYCのヌクレオチド配列（A）を示す。
【図１３Ａ−２】cMYCのヌクレオチド配列（A）を示す。
【図１３Ｂ】cMYCのアミノ酸配列（B）を示す。
【図１４】GFPのヌクレオチド配列を示す。
【発明の詳細な説明】
【００６８】
定義
本明細書において使用される場合、「多能性」は、それが「多能性幹細胞」を指す場合、種々の条件下で、3つすべての生殖細胞層、すなわち内胚葉（たとえば、消化管組織）、中胚葉（血液、筋肉および血管を含む）および外胚葉（たとえば、皮膚および神経）に特徴的な細胞型へ分化する発達能力を有する細胞を意味する。多能性細胞は本明細書において使用される場合、3つすべての胚性胚葉の組織または細胞を含むテラトーマを形成することができるか、または3つすべての胚性胚葉（すなわち、内胚葉、中胚葉および外胚葉）の正常な誘導体に類似する細胞を包含する。また、本発明の多能性細胞は、胚様体（EB）を形成することができ、下記を包含するが、限定されない3つすべての胚葉に関するマーカーを発現することができる細胞を意味する：内胚葉マーカーAFP、FOXA2、GATA4；中胚葉マーカーCD34、CDH2（N-カドヘリン）、COL2A1、GATA2、HAND1、PECAM1、RUNX1、RUNX2；および外胚葉マーカーALDH1A1、COL1A1、NCAM1、PAX6、TUBB3（Tuj1）。
【００６９】
同様に、本発明の多能性細胞は、当該技術分野において公知の方法を使用して検出される場合に下記マーカーの少なくとも1つを発現するヒト細胞を意味する：SSEA3、SSEA4、Tra-1-81、Tra-1-60、Rex1、Oct4、Nanog、Sox2。本発明の多能性幹細胞は、アルカリホスファターゼまたはヘキスト染色でポジティブ染色する細胞を包含する。
【００７０】
多能性細胞は、全脳性細胞よりも低い発達能力を有する。細胞の3つすべての胚葉へ分化する能力は、たとえばヌードマウステラトーマ形成アッセイを使用して形成することができる。いくつかの態様において、多脳性はまた、胚性幹（ES）細胞マーカーの発現により裏付けすることができる。また、本明細書に記載した組成物および方法を使用して生成される細胞または細胞の集団の多脳性は、3つの胚葉それぞれの細胞へ分化する発達能力により決定される。
【００７１】
いくつかの態様において、多能性細胞は、「未分化細胞」と称される。したがって、用語「多脳性」または「多脳性状態」は、本明細書で使用する場合、細胞の3つすべての胚性胚葉（内胚葉、中胚葉および外胚葉）へ分化する能力を提供する細胞の発達能力をいう。当業者は、所定の細胞型を生じる胚性胚葉または系譜を理解している。多脳性状態の細胞は通常、長い期間、たとえば1年間を超えて、または30継代を超えてインビトロで分裂する能力を有する。
【００７２】
本明細書において使用される場合、用語「人工多脳性幹細胞（iPS細胞）」は、ES細胞の特性に類似した特性を有する細胞をいう。特に、「iPS」細胞は、本明細書において使用される場合、体細胞からリプログラミングされて、多脳性および増殖効力を有する未分化細胞を包含する。しかしながら、この用語は、いかなる意味においても限定されると解釈されるべきではなく、その最も広い意味を有するように解釈されるべきである。本明細書において使用される場合、用語「多脳性幹細胞」は、それが請求項に係る方法により産生される細胞を指す場合、用語「iPS」と同義である。本発明のiPS細胞は、線維芽細胞、末梢血由来細胞型（具体的には、後期内皮前駆細胞（L-EPC））、臍帯血由来細胞型（CD34+）、上皮細胞およびケラチノサイトを包含するが、限定されない様々な細胞型から作製される。
【００７３】
本発明は、たとえば非多脳性細胞（体細胞性）を供給すること、培地中でこの細胞を培養すること、表面上でこの細胞を培養すること、この細胞をフィーダー細胞（たとえば、NuFFまたはMEFマウス胚線維芽細胞）とともに培養すること、mRNAを導入すること、miRNAを導入すること、mRNAおよびmiRNAを導入すること、任意に細胞培養物液を分配すること、表面マーカーまたは形態学を使用して幹細胞コロニーを同定すること、コロニーを単離すること、および単離コロニーをサブクローニングすることにより産生されるiPS細胞のコロニーを提供する。多脳性幹細胞コロニーは、多脳性幹細胞に関して上述する特徴のいくつかまたはすべてを示す。
【００７４】
本明細書において使用される場合、用語「体細胞」はまた、生殖細胞、着床前の胚中に存在するか、または着床前の胚から得られる細胞、またはインビトロでかかる細胞の増殖から生じる細胞以外の任意の細胞をいう。換言すると、体細胞は、生殖系列細胞とは対照的であるような生物体の身体を形成する任意の細胞をいう。哺乳動物において、生殖系列細胞（「配偶子」としても知られている）は、精子および卵子であり、これらは受精中に融合して、接合体と呼ばれる細胞を産生して、それから哺乳動物の胚全体が発達する。精子および卵子、それらが作製される細胞（生殖母細胞）および未分化の多脳性胚性幹細胞とは別の哺乳動物身体におけるあらゆる他の細胞型が、体細胞であり、内臓、皮膚、骨、血液および結合組織はすべて、体細胞で構成される。
【００７５】
いくつかの態様において、「体細胞」は、「非胚性体細胞」であり、それは、胚中に存在しないか、または胚から得られず、インビトロでかかる細胞の増殖から生じない体細胞を意味する。いくつかの態様において、体細胞は、「成体体細胞」であり、それは、胚または胎児以外の生物体中に存在するか、またはその生物体から得られるか、またはインビトロでかかる細胞の増殖から生じる細胞を意味する。別記しない限り、本明細書に記載した体細胞をリプログラミングするための組成物および方法は、インビボおよびインビトロの両方で実施することができる（ここで、インビボは、体細胞が被験体内に存在する場合に実施され、インビトロは、培養液中に維持される単離体細胞を使用して実施される）。
【００７６】
本明細書において使用される場合、「リプログラミング因子」は、タンパク質、RNAまたは小分子のような細胞の発達能力を変更させることができる因子を指し、その発現が、細胞、たとえば体細胞の、あまり分化されていない状態または未分化状態への、たとえば多脳性状態または部分的に多能性状態の細胞へのリプログラミングに寄与する。リプログラミング因子は、たとえば多脳性状態に対して細胞をリプログラミングすることができる転写因子（たとえば、SOX2、OCT3/4、KLF4、NANOG、LIN-28、c-MYC、Glis1、Sal4、Esrbb等であるが、これらに限定されない）であってもよく、インビトロで細胞をリプログラミングする方法において、これらの転写因子の1つまたは複数を置換することができる任意の遺伝子、タンパク質、RNAまたは小分子を包含するが、限定されない。
【００７７】
用語「細胞リプログラミング」は、細胞が多脳性となり、胚性細胞以外の任意の細胞型へ分裂および分化することが可能であるように細胞の天然状態を変更することをいう。細胞プログラミングは、細胞の分化中の多脳性または細胞の脱分化を誘発することを包含し得る。また、細胞リプログラミングの変更は、マイクロRNA以外の作用物質により誘発された多脳性または脱分化のレベルを高めることを指すことができる。幹細胞とも呼ばれる多脳性または多分化脳性細胞は、無限期間、場合によっては生物体の一生全体にわたって、多数の異なる表現型系譜へ分裂する（自己複製するか、または自己再生する）か、または分化する能力を有する。幹細胞集団は、少なくとも1個の幹細胞を保有する集団である。多分化性幹細胞が、たとえば体細胞のような非多脳性細胞に由来する場合、それらは、人工多脳性幹細胞（iPSまたはiPSC）と称される。細胞リプログラミングは、密接に関連する細胞または細胞型への部分的脱分化をさらに包含し得る。同様に、細胞リプログラミングは、分化転換をさらに包含し得る。分化転換は、ある分化細胞型の別の細胞型への変換、たとえば外分泌細胞のベータ−島様細胞への変換として規定される（たとえば、Blellochら、細胞置換への近道（Short cut to cell replacement）、Nature, 455:604-605 （2008）を参照）。
【００７８】
用語「前駆細胞」は、それが分化により生じることができる細胞と比較して、より大きな発達能力を有する細胞、すなわちより原始的である（たとえば、発達経路または進行に沿ってより初期の工程にある）細胞表現型を指すのに本明細書で使用される。多くの場合、前駆細胞は、著しいか、または非常に高い増殖能力を有する。前駆細胞は、発達経路に応じて、および細胞が発達して分化する環境に応じて、より低い発達能力を有する多数の明確な細胞、すなわち分化細胞型または単一の分化細胞型を生じ得る。
【００７９】
本明細書において使用される場合、用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチド、および単鎖または二重鎖形態のそれらのポリマーをいう。この用語は、既知のヌクレオチド類縁体または修飾骨格残基もしくは結合を含有する核酸を包含し、これらは、合成であり、天然に存在し、また天然に存在せず、それらは、参照核酸配列と類似の結合特性を有し、またそれらは、参照ヌクレオチドと類似した様式で代謝される。かかる類縁体の例として、ホスホロチオエート、ホルホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（PNA）を含むが、限定されない。
【００８０】
本明細書において使用される場合、「ヌクレオチド」は、天然塩基（標準）を有するもの、および当該技術分野において周知の修飾塩基を包含すると当該技術分野において理解される場合に使用される。ヌクレオチドは、糖、リン酸塩および／または塩基部分で未修飾であり得るか、または修飾され得る（交換可能に、ヌクレオチド類縁体、修飾ヌクレオチド、非天然ヌクレオチド、非標準ヌクレオチドおよび他とも称される、たとえば、UsmanおよびMcSwiggen、上記；Ecksteinら、国際PCT公開WO 92/07065号；Usmanら、国際PCT公開WO 93/15187号；UhlmanおよびPeyman、上記、すべてが参照により本明細書に援用される）。核酸分子に導入することができる塩基修飾の非限定的な例のいくつかとして、ヒポキサンチン、プリン、ピリジン-4-オン、ピリジン-2-オン、フェニル、シュードウラシル、2,4,6-トリメトキシベンゼン、3-メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、5-アルキルシチジン（たとえば、5-メチルシチジン）、5-アルキルウリジン（たとえば、リボチミジン）、5-ハロウリジン（たとえば、5-ブロモウリジン）または6-アザピリミジンまたは6-アルキルピリミジン（たとえば、6-メチルウリジンおよびシュードウリジン）、プロピンおよび他を含む（Burginら、Biochemistry 35:14090, 1996；Uhlman & Peyman、上記）。この側面において「修飾塩基」とは、1位にあるアデニン、グアニン、シトシンおよびウラシル以外のヌクレオチド塩基、並びにそれらの等価体を意味する。
【００８１】
本明細書において使用される場合、用語「デオキシリボヌクレオチド」は、天然および合成の未修飾および修飾のデオキシリボヌクレオチドを包含する。修飾は、糖部分に対する、塩基部分に対する、および／またはオリゴヌクレオチドにおけるデオキシヌクレオチド間の結合に対する変更を包含する。
【００８２】
「RNA」とは、少なくとも1つのリボヌクレオチド残基を含む分子を意味する。「リボヌクレオチド」とは、αβ-D-リボフラノース部分の2’位に水酸基を有するヌクレオチドを意味する。用語RNAは、二重鎖RNA、単鎖RNA、部分的に精製されたRNAのような単離RNA、本質的に純粋なRNA、合成RNA、組換え的に産生されるRNA並びに1つまたは複数のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更により天然に存在するRNAと異なる変更RNAを包含する。本発明のRNA分子中のヌクレオチドはまた、天然に存在しないヌクレオチドまたは化学的に合成されるヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドのような非標準的なヌクレオチドを含むことができる。これらの変更RNAは、天然に存在するRNAの類縁体（単数または複数）と称することができる。
【００８３】
本明細書において使用される場合、「修飾ヌクレオチド」は、ヌクレオシド、核酸塩基、五炭糖環またはホスフェート基に対する1つまたは複数の修飾を有するヌクレオチドをいう。たとえば、修飾ヌクレオチドは、アデノシン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸およびシチジン一リン酸を含有するリボヌクレオチド、並びにデオキシアデノシン一リン酸、デオキシグアノシン一リン酸、デオキシチミジン一リン酸およびデオキシシチジン一リン酸を含有するデオキシリボヌクレオチドを排除する。修飾は、メチルトランスフェラーゼのようなヌクレオチドを修飾する酵素による修飾から生じる天然に存在するものを包含する。また、修飾ヌクレオチドは、合成または天然に存在しないヌクレオチドを包含する。ヌクレオチドにおける合成または天然に存在しない修飾は、2’修飾、たとえば、2’-O-メチル、2'-メトキシエトキシ、2'-フルオロ、2'-アリル、2'-O-[2-（メチルアミノ）-2-オキソエチル]、4'-チオ、4'-CH2-O-2'-架橋、4'-（CH2） 2-O-2'-架橋、2'-LNA、および2'-O-（N-メチルカルバメート）または塩基類縁体を含むものを含む。本開示に関して記載されるような2'-修飾ヌクレオチドに関連して、「アミノ」とは、2'-NH2または2'-O-NH2を意味し、これらは修飾され得るか、または未修飾であり得る。かかる修飾基は、たとえばEcksteinら、米国特許第5,672,695号およびMatulic-Adamicら、米国特許6,248,878号に記載されている。
【００８４】
本明細書において使用される場合、「マイクロRNA」または「miRNA」は、単鎖RNAを形成する核酸を指し、この単鎖RNAは、miRNAが遺伝子または標的遺伝子と同じ細胞で発現される場合に、遺伝子または標的遺伝子の発現を変更させる（発現を低減または阻害する、発現を調節する、発現を直接的または間接的に高める）能力を有する。1つの態様において、miRNAは、標的遺伝子に対して実質的または完全な同一性を有し、単鎖miRNAを形成する核酸をいう。いくつかの態様において、miRNAは、プレmiRNAの形態で存在してもよく、ここでプレmiRNAは、二重鎖RNAである。miRNAの配列は、完全長標的遺伝子、またはその部分配列に相当し得る。通常、miRNAは、少なくとも約15〜50ヌクレオチド長である（たとえば、単鎖miRNAの各配列は、15〜50ヌクレオチド長であり、二重鎖プレmiRNAは、約15〜50塩基対長である）。いくつかの態様において、miRNAは、20〜30塩基ヌクレオチドである。いくつかの態様において、miRNAは、20〜25ヌクレオチド長である。いくつかの態様において、miRNAは、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29または30ヌクレオチド長である。
【００８５】
本発明は、mRNAおよびmiRNA擬似体の組み合わせを細胞へ導入することにより産生される多脳性幹細胞を提供する。本明細書において使用される場合、用語「miRNA擬似体」は、修飾ヌクレオチドまたは構造的修飾（たとえば、バルジまたはループ）に起因して、高められた安定性を有する合成miRNAを意味する。本明細書において使用される場合、用語「miRNA擬似体」はまた、内因性miRNAを模倣して、miRNA活性のアップレギュレーションによりmiRNA機能性分析を可能にする小さな化学的に修飾された二重鎖RNAを意味する。それらは通常、たとえばヘアピンループである二重鎖部分を形成する単鎖miRNAにより形成されるヘアピンである。
【００８６】
用語「接触すること」または「接触」は本明細書において使用される場合、細胞を本明細書に記載したような1つまたは複数のmRNAまたはmiRNAと接触させることに関連して、少なくとも1回または複数回、1つまたは複数のmRNAまたはmiRNAを含む培養培地へ、あるいはかかるmRNAおよび／またはmiRNAを少なくとも1回または複数回接触させる方法、たとえばトランスフェクション系に付すことを包含する。好ましくは、mRNAおよびmiRNAは、細胞へ導入される場合、DNAまたはウイルスベクター中に存在しない。DNAまたはウイルスベクター中に存在しない本発明のmRNAおよびmiRNAは、当該技術分野において公知の方法、たとえば電気穿孔およびリポフェクションによって細胞へ導入またはトランスフェクションされ得る。
【００８７】
本明細書において使用される場合、用語「トランスフェクション試薬」は、合成mRNAまたはmiRNAの宿主細胞への取込みを誘発する任意の作用物質をいう。同様に、かかる試薬の非存在下で投与されるmRNAまたはmiRNAと比較して、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも25倍、少なくとも500倍、少なくとも100倍、少なくとも1000倍またはそれ以上分、取込みを高める作用物質が包含される。1つの態様において、組成物を調製するのに、またはmRNAもしくはmiRNAによる同時投与に有用な陽イオン性または非陽イオン性脂質分子が、トランスフェクション試薬として使用される。他の態様において、mRNAまたはmiRNAは、たとえばリガンド、ペプチド基、親油性基、ターゲッティング部分等を結合するための化学結合を含む。他の態様において、トランスフェクション試薬は、当該技術分野において公知であるような、または本明細書に記載したような荷電脂質、エマルジョン、リポソーム、陽イオン性または非陽イオン性脂質、陰イオン性脂質または浸透促進剤を含む。
【００８８】
本明細書において使用される場合、用語「繰り返されるトランスフェクション」は、複数回（たとえば、1回を上回るか、または少なくとも2回）の本発明のmRNAまたはmiRNAによる同じ細胞培養液の繰り返されるトランスフェクションをいう。いくつかの態様において、細胞培養液は、少なくとも2回、少なくとも3回、少なくとも4回、少なくとも5回、少なくとも6回、少なくとも7回、少なくとも8回、少なくとも9回、少なくとも10回、少なくとも11回、少なくとも12回、少なくとも13回、少なくとも14回、少なくとも15回、少なくとも16回、少なくとも17回、少なくとも18回、少なくとも19回、少なくとも20回、少なくとも25回、少なくとも30回、少なくとも35回、少なくとも40回、少なくとも45回、少なくとも50回またはそれ以上トランスフェクトされる。トランスフェクションは、細胞の所望の表現型が達成されるまで繰り返すことができる。
【００８９】
繰り返されるトランスフェクションそれぞれの間の時間は、本明細書において「トランスフェクションの頻度」と称される。いくつかの態様において、トランスフェクションの頻度は、本発明による多脳性幹細胞を産生する任意の方法または細胞において多脳性を誘発する任意の方法において所定の期間中、6時間毎、12時間毎、24時間毎、36時間毎、48時間毎、60時間毎、72時間毎、96時間毎、108時間毎、5日毎、7日毎、10日毎、14日毎、3週またはそれ以上毎に行われる。また、頻度は、各用量間の間隔が異なるように様々であり得る（たとえば、第1の間隔36時間、第2の間隔48時間、第3の間隔72時間等）。繰り返されるトランスフェクションのスケジュールおよび持続期間に応じて、多くの場合、トランスフェクション措置中に、細胞を分割もしくは継代培養させるか、または培地を変更もしくは交換して異常増殖を防止して、栄養素を交換することが必要であることが理解されるべきである。本明細書に記載した方法の目的で、初期にトランスフェクトされた培養液を継代培養することにより生じる培養液のトランスフェクションは、別記されない限り、「繰り返されるトランスフェクション」、「繰り返される接触」または「複数回接触させること」とみなされる。
【００９０】
用語「導入すること」は、miRNAまたはmRNAを細胞に「導入すること」という状況で使用される場合、外来ヌクレオチド配列を宿主細胞へ導入するための周知の手順のいずれかをいう。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、遺伝子銃、リポソーム、マイクロインジェクション、血漿ベクター、ウイルスベクターおよびクローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来遺伝子材料を宿主細胞へ導入するための他の周知の方法の使用を包含する（たとえば、Sambrookらを参照、上記）。使用される特定遺伝子操作手順が、少なくとも1つのmiRNAを宿主細胞へ首尾よく導入することが可能であればよい。
【００９１】
多種多様の型の細胞が、本発明の方法に利用され得る。本発明のmRNAおよび／またはmiRNAを発現し得る細胞は、たとえば線維芽細胞、内皮前駆細胞（L-EPC）を包含するが、限定されない末梢血由来細胞、臍帯血由来細胞型（CD34+）、上皮細胞およびケラチノサイトを含むことができる。
【００９２】
細胞は、組換え核酸構築物を保有する細胞を作製する際に通常利用される細胞のいずれかであり得る。本発明の方法により有用な細胞は、マウス胚線維芽細胞（MEF）を含むが、限定されない。細胞は、哺乳動物細胞、たとえばヒト、げっ歯類または霊長類であり得る。また、本発明の方法に利用される細胞型は、たとえば特定疾患であると診断されるか、または多脳性幹細胞を必要とする被験体に由来するような血液、骨、脳、腎臓、筋肉、脊髄、神経、内分泌系、子宮、耳、包皮、肝臓、腸、膀胱または皮膚を包含するが、限定されない組織試料由来の細胞を包含し得る。細胞は、神経細胞、リンパ球、表皮細胞、膵島細胞、腸細胞または線維芽細胞を包含し得る。本発明の細胞は、自己細胞または異種細胞であり得る。本発明の方法に有用な細胞は、動物細胞を包含し得る。いくつかの態様において、細胞は哺乳動物である。いくつかの態様において、細胞は、げっ歯類または霊長類に由来する。いくつかの態様において、細胞は、マウス細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ブタ細胞である。
【００９３】
本発明の多脳性幹細胞の形成に使用されるるか、または本発明の方法によりリプログラミングされる標的または体細胞の型は、具体的に限定されず、任意の体細胞を使用することができる。たとえば、（1）組織幹細胞、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞および歯幹細胞、（2）組織前駆細胞および（3）分化細胞、たとえばリンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞、毛髪（pilary）細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾臓細胞、膵臓細胞（膵臓外分泌細胞を含む）、脳細胞、肺細胞および腎臓細胞のような各種体細胞をリプログラミングすることができる。血小板、赤血球、白血球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球）および血小板を含む血液細胞を使用して、本発明の方法により多脳性幹細胞を産生することができる。疾患に対する療法における人工多脳性幹細胞またはiPS細胞から分化された子孫細胞の使用に関して、患者から単離された体細胞を使用することが望ましい。たとえば、同様に、疾患に関与する体細胞および疾患の療法に関連する体細胞も使用することができる。
【００９４】
本明細書において使用される場合、「培養すること」は、制御および規定された培地中で、制御された条件下で適切な期間維持することを意味する。
【００９５】
本明細書において使用される場合、「培養培地」は、ヒト細胞のmRNAベースの細胞リプログラミング用に最適化された培地、またはiPS株化細胞を増殖および維持するのに適した培地を意味する。1つの態様において、本発明による「培養培地」は、異物を含まない。本発明により有用な培養培地は、多脳性幹細胞の産生を提供するための当該技術分野において公知の任意の培地を包含する。また、本発明により有用な培養培地は、多脳性幹細胞の維持を支持するための当該技術分野において公知の任意の培地を包含する。本発明による培養培地は、iPS細胞の産生用のPluriton（商標）リプログラミング用培地（Stemgent）およびiPS細胞の維持用のNutristem（商標）XF/FF培養培地（Stemgent）を含むが、限定されない。
【００９６】
「被験体」とは、外植される体細胞もしくは多脳性細胞自体のドナーまたはレシピエントである生物体を意味する。また、「被験体」は、本発明の多脳性細胞または多脳性細胞の分化子孫が投与され得る生物体をいう。被験体は、ヒトまたはヒト細胞を含む哺乳動物または哺乳動物細胞であり得る。
【００９７】
「被験体」は、本明細書において使用される場合、ヒト被験体であることが好ましいが、必ずしもこれに限定されない。被験体は、男性または女性であり、いかなる人種または民族性であってもよい。また、被験体は本明細書において使用される場合、本発明の方法により治療され得るか、または獣医学もしくは医薬品開発の目的でスクリーニングされ得る動物、特にイヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ、ブタ、げっ歯類（たとえば、ラットおよびマウス）、ウサギ、霊長類（非ヒト霊長類を含む）等のような哺乳動物を包含し得る。本発明のいくつかの態様による被験体は、本発明による疾患の治療上の処置を必要とする患者（ヒトまたは他）を含む。
【００９８】
本明細書において使用される場合、「対照被験体」は、本発明による疾患であると診断されていない被験体を意味する。同様に、「対照被験体」は、本明細書中で規定されるような疾患を発症するリスクのない被験体を意味する。
【００９９】
語句「薬学的に許容可される担体」は、治療薬の投与のための担体をいう。例示的な担体は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせを含む。
【０１００】
本発明の様々な方法論は、値、レベル、特色、特徴、特性等を「適切な対照」として本明細書において交換可能に称される「適した対照」と比較することを包含する工程を含む。「適した対照」または「適切な対照」は、比較目的で有用な、当業者に熟知されている任意の対照または標準物質である。1つの態様において、「適した対照」または「適切な対照」は、本明細書中で記載するような多脳性幹細胞を産生する方法または多脳性を誘発する方法を実施する前に決定される値、レベル、特色、特徴、特性等である。たとえば、転写速度、mRNAレベル、翻訳速度、タンパク質レベル、生物活性、細胞の特徴または特性、遺伝子型、表現型等は、本発明のmRNAおよびmiRNAを細胞または生物体へ導入する前に決定することができる。別の態様において、「適した対照」または「適切な対照」は、たとえば正常な形質を示す細胞または生物体、たとえば、対照もしくは正常な細胞または体細胞または生物体で決定される値、レベル、特色、特徴、特性等である。さらに別の態様において、「適した対照」または「適切な対照」は、既定の値、レベル、特色、特徴、特性等である。
【０１０１】
用語「インビトロで」は、その技術分野において認識される意味を有し、たとえば精製された試薬または抽出物、たとえば細胞抽出物を包含する。用語「インビボで」もまた、その技術分野において認識される意味を有し、たとえば生細胞、たとえば不死化細胞、初代細胞、株化細胞および／または生物体中の細胞を包含する。
【０１０２】
「治療」または「治療すること」は本明細書において使用される場合、疾患もしくは障害、または疾患もしくは障害の症状を治療、治癒、緩和、軽減、変更、改善、回復、好転するか、またはそれらに影響を及ぼす目的で、障害を有する患者への本発明の多脳性幹細胞またはそれに由来する分化細胞の適用または投与として定義される。同様に、用語「治療」または「治療すること」は、予防的に作用物質を投与する状況において本明細書中で使用される。用語「有効な用量」または「有効な投与量」は、所望の効果を達成または少なくとも部分的に達成するのに十分な量として定義される。用語「治療上有効な用量」は、疾患および疾患をすでに患っている患者におけるその合併症を治療または少なくとも部分的に停止するのに十分な量として定義される。用語「患者」は、予防的または治療的処置のいずれかを受けるヒトおよび他の哺乳動物被験体を包含する。
【０１０３】
本明細書において使用される場合、用語「生物学的試料」は、組織；培養細胞、たとえば初代培養液、外植片および形質転換された細胞；細胞抽出物（たとえば培養細胞、組織、胚、細胞質抽出物、核抽出物に由来）；血液等を包含する。
【０１０４】
用語「自己」とは本明細書で使用する場合、宿主由来であり、核酸、タンパク質、細胞または組織が由来された宿主に再び挿入されて、再び投与されて、または戻されて移植されることをいう。
【０１０５】
所定のmiRNA配列は、参照されるmiRNAに対して構造的および機能的類似性を有するヒトおよびマウスのホモログまたはオルソログの両方を包含する。用語ホモログは、推測の事象により分離される遺伝子（オルソログ）間の関連性、または遺伝子重複の事象により分離される遺伝子（パラログ）間の関連性に適用する。オルソログmiRNAは、それらが共通祖先を起源とするため、互いに類似している異なる種におけるmiRNAである。ホモログは、共通祖先DNA配列を共有するか、またはかかる所定のそれらの高度の配列同一性を共有すると予測されてきた類似配列である。したがって、いくつかの態様において、オルソログまたはホモログは、多くても1つ、2つまたは3つのヌクレオチド残基が、参照されるmiRNAの配列と異なる任意の配列である。
【０１０６】
miRNAの阻害剤は、miRNAに相補的であるか、またはmiRNAと実質的な同一性を共有して、miRNAの機能を阻止することができるアンチセンス核酸またはsiRNAであり得る。
【０１０７】
本明細書において使用される場合、用語「実質的な同一性」は、ストリンジェントな条件下で参照配列にハイブリダイズする配列、または参照配列の指定領域にわたって指定パーセントの同一性を有する配列をいう。
【０１０８】
本明細書において使用される場合、語句「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、プローブが通常核酸の複雑な混合物中でその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件をいう。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる環境で異なる。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対するより広範な手引きは、Tijssen、Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes、「ハイブリダイゼーションの原理および核酸アッセイの戦略の概説（Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays）」（1993）に見出される。例示的なストリンジェントな条件は、下記の通りであり得る：50%ホルムアミド、5×SSCおよび1%SDS、42℃でインキュベートすること、または5×SSC、1%SDS、65℃でインキュベートすること、65℃での0.2×SSCおよび0.1%SDS中での洗浄を伴う。
【０１０９】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸は、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一である場合には依然として実質的に同一である。オルタナティブハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が、類似のストリンジェンシーの条件を提供するのに利用され得ることは、当業者に容易に理解されよう。ハイブリダイゼーションパラメータを決定することに関するさらなるガイドラインは、多数の参照文献、たとえばCurrent Protocols in Molecular Biology、Ausubelら著に提供されている。
【０１１０】
用語「実質的に同一な」または「実質的な同一性」は、2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の状況において、比較ウィンドウ、または下記配列比較アルゴリズムの1つを使用して、もしくは手動アラインメントおよび目視検査により測定される場合の指定領域にわたる最大の対応に関して比較および整列される場合に、同じであるか、または同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの指定パーセント（すなわち、指定領域にわたって少なくとも約60%、好ましくは65%、70%、75%、好ましくは80%、85%、90%または95%同一性）を有する2つまたはそれ以上の配列または部分配列をいう。この定義は、状況が示す場合、類似して配列の相補体も指す。好ましくは、実質的な同一性は、少なくとも約6〜7アミノ酸もしくは25ヌクレオチド長である領域、またはより好ましくは50〜100アミノ酸もしくはヌクレオチド長、または完全長である領域にわたって存在する。
【０１１１】
配列比較に関して、通常、1つの配列が、試験配列が比較される参照配列として機能を果たす。
【０１１２】
配列同一性および配列類似性パーセントを決定するのに適しているアルゴリズムの好ましい例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、それぞれAltschulら、Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 （1977）およびAltschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410 （1990）に記載されている。BLASTおよびBLAST 2.0は、本発明の核酸およびタンパク質に関して配列同一性パーセントを決定するために、本明細書に記載したパラメータを用いて使用される。
【０１１３】
用語「投与すること」は本明細書において使用される場合、本発明のiPS細胞またはiPSの分化子孫を被験体へ移行、送達、導入または輸送する任意の様式をさす。かかる様式は、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋内、皮内、鼻腔内および皮下投与を含むが、限定されない。好ましくは、投与は、（1）静脈内である（たとえば、ここではiPS細胞はIVバッグ中に含有される）か、または（2）医療用デバイス、たとえばステント、バルブ、バルーンまたはカテーテルを介するものである（ここで医療用デバイスは、本発明のiPS細胞またはiPS細胞集団と組み合わせられるか、またはそれらでコーティングされる）。
【０１１４】
一つの態様において、投与は、本発明のiPS細胞またはiPS細胞集団と組み合わせて移植可能または移植不可能な薬物送達デバイスを介し得るか、または本発明のiPS細胞に関連した送達デバイスを含み得る移植可能または移植不可能な持続放出型送達デバイスを介し得る。
【０１１５】
「回復する」とは、疾患の発症もしくは進行を減少、抑制、減弱、減退、停止または安定化することを意味する。
【０１１６】
「送達すること」とは、本発明の治療用iPS細胞またはそれに由来する分化細胞を、治療を必要とする被験体へ送達することを意味する。たとえば、本発明のiPSから分化された治療用細胞は、被験体の静脈、動脈、毛細血管、心臓または組織、並びに細胞の特定の集団または亜集団へ送達され得る。本発明の治療用細胞の送達は、細胞を取り込む組織のMRIによる同定を可能にするために、金、ガドリニウム等のような追跡剤をエキソソームへ添加することにより評価され得る。
【０１１７】
「有効な量」または「治療上有効な量」とは、疾患の症状を回復するのに必要とされるiPS細胞またはiPS細胞の集団またはiPS細胞に由来する分化細胞の量を意味する。同様に、「有効な量」または「治療上有効な量」とは、本発明による疾患を治療するための療法における使用のための治療効果または予防効果を誘発するのに必要とされるiPS細胞またはiPS細胞の集団またはそれらに由来する分化細胞の量を意味する。疾患の治療上の処置のために本発明を実施するのに使用される本発明の活性な化合物（複数可）、たとえば細胞の有効な量は、投与様式、被験体の年齢、体重および全体的な健康に応じて多様である。最終的には、主治医または担当獣医が、適切な量および投薬レジメンを決める。かかる量を「有効な」量と称する。
【０１１８】
「疾患」、「障害」および「状態」は、当該技術分野において一般的に認識されており、異常である、および／または望ましくないと一般的に認識される個体もしくは患者における兆候および／または症状の存在をいう。疾患または状態は、病理学的変化に基づいて診断および分類され得る。
【０１１９】
本明細書において使用される場合、用語「治療する」、「治療される」、「治療すること」、「治療」等は、障害および／またはそれに関連する症状を、低減または回復することをいう。障害または状態を治療することは、障害、状態またはそれらに関連する症状が完全に排除されることを必要としないが、除外されるわけではないことが理解されよう。
【０１２０】
被験体は、本発明の細胞の投与後に、疾患の1つまたは複数の症状が減少または排除される場合に、疾患に関して治療されているとされる。
【０１２１】
本発明のiPS細胞に由来する分化子孫を含む本発明の細胞は、疾患の治療に有用である。特に、細胞療法が適切である任意の疾患が、本発明のiPSまたはそれに由来する分化子孫を使用して治療され得る。細胞療法が適切な治療方法であると当該技術分野において公知である疾患は、自己免疫疾患、治療が神経細胞／組織の再生を包含する疾患、治療が心臓細胞／組織の再生を包含する疾患、パーキンソン病およびアルツハイマー病を含むが、限定されない。心筋細胞、インスリン産生細胞または神経細胞を含む本発明のiPS細胞から分化された細胞は、心不全、インスリン依存性真性糖尿病、パーキンソン病および脊髄損傷のような各種疾患の治療のための幹細胞移植療法で安全に利用することができる。iPS細胞またはそれに由来する分化細胞は、たとえば免疫応答を防止するために自己細胞療法（ここでこの療法は、特定被験体にとって特異的であり／個人向けである）に使用することができるか、または非自己的である。
【０１２２】
本明細書において使用される場合、用語「疾患」は、下記自己免疫疾患または障害：真性糖尿病、関節炎（関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節炎、乾癬性関節炎）、多発性硬化症、重症筋無力症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性甲状腺炎、皮膚炎（アトピー性皮膚炎および湿疹様皮膚炎）、乾癬、シェーグレン症候群（シェーグレン症候群に続発する乾性角結膜炎を含む）、円形脱毛症、節足動物咬傷反応に起因するアレルギー反応、クローン病、アフター性潰瘍、虹彩炎、結膜炎、角結膜炎、潰瘍性結腸炎、喘息、アレルギー性喘息、皮膚エリテマトーデス、強皮症、膣炎、直腸炎、薬疹、ハンセン病逆転反応、癩性結節性紅斑、自己免疫性ブドウ膜炎、アレルギー性脳脊髄炎、急性壊死性出血性脳症、特発性両側性進行性感音難聴、再生不良性貧血、赤芽球貧血、特発性血小板減少症、多発性軟骨炎、ウェゲナー肉芽腫症、慢性活動性肝炎、スティーブンス・ジョンソン症候群、特発性スプルー、扁平苔癬、グレーブス眼症、サルコイドーシス、原発性胆汁性肝硬変、後部ブドウ膜炎および間質性肺線維症の1つまたは複数を包含する。
【０１２３】
別の態様において、疾患は、ウィルソン病、脊髄小脳失調、プリオン病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、アミロイド症、アルツハイマー病、アレキサンダー病、アルコール性肝臓疾患、嚢胞性線維症、ピック病、脊髄性筋ジストロフィーまたはレビー小体認知症のいずれか1つをいう。
【０１２４】
また、「疾患」は、リウマチ様脊椎炎、虚血後灌流傷害、炎症性腸疾患、慢性炎症性肺疾患、湿疹、喘息、虚血／再灌流傷害、急性呼吸促迫候群、感染性関節炎、進行性慢性関節炎、変形性関節炎、外傷性関節炎、痛風性関節炎、ライター症候群、急性滑膜炎および脊椎炎、糸球体腎炎、溶血性貧血、再生不良性貧血、好中球減少症、移植片対宿主病、同種移植片拒絶反応、慢性甲状腺炎、グレーブス病、原発性胆汁性肝硬変、接触性皮膚炎、皮膚の日焼け、慢性腎不全、ギラン・バレー症候群、ブドウ膜炎、中耳炎、歯周病、間質性肺線維症、気管支炎、鼻炎、副鼻腔炎、塵肺症、肺機能不全症候群、肺気腫、肺線維症、珪肺症または慢性炎症性肺疾患のいずれか1つを包含する。
【０１２５】
また、「疾患」は、癌、腫瘍成長、結腸、胸部、骨、脳および他の癌（骨肉腫、神経芽細胞腫、結腸腺癌）、慢性骨髄性白血病（CML）、急性骨髄性白血病（AML）、急性前骨髄球性白血（APL）、噴門癌（たとえば、肉腫、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫）、肺癌（たとえば、気管支原性肺癌、肺胞癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫）、各種消化管癌（たとえば、食道、胃、膵臓、小腸および大腸の癌）、尿生殖路癌（たとえば、腎臓、膀胱および尿道、前立腺、精巣）、肝臓癌（たとえば、肝癌、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫）、骨癌（骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍脊索腫、骨軟骨腫（osteochronfroma）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液性線維腫、類骨骨腫および巨細胞腫）、神経系の癌（たとえば、頭蓋骨、髄膜、脳および脊髄の）、婦人科癌（たとえば、子宮、頸部、卵巣、外陰部、膣）、血液癌（血液に関連する癌、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫）、皮膚癌（たとえば、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポジ肉腫、モルズ異形成母斑（moles dysplastic nevi）、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、ケロイド、乾癬）および副腎の癌（たとえば、神経芽細胞腫）のいずれか1つをいう。
【０１２６】
本明細書において使用される場合、「診断すること」または「を有する患者または被験体を同定すること」は、個体が、疾患または病気、たとえば本明細書中で規定される疾患を患うかどうかを決定するプロセスをいう。
【０１２７】
本明細書中で提供される任意の組成物または方法は、本明細書中に提供される他の組成物および方法のいずれかの1つまたは複数と組み合わせることができる。
【０１２８】
本明細書において使用される場合、用語「含んでいる」または「含む」は、本質的であろうそうでなかろうと、指定されていない要素の包含に対して依然として開かれている本発明に本質的である組成物、方法およびそれらの各々の構成成分（複数可）に関連して使用される。
【０１２９】
本明細書において使用される場合、用語「から本質的になる」は、所与の態様に必要とされる要素をいう。この用語は、本発明のその態様の基本的および新規または機能的特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を可能にする。
【０１３０】
用語「からなる」は、本明細書に記載したような組成物、方法およびそれらの各々の構成要素を指し、態様のその記述で列挙されていない任意の要素を排除する。
【０１３１】
リプログラミング因子
本発明による用語「因子」は、RNAによるその「リプログラミング因子」という表現と併せて使用される場合、タンパク質およびペプチド、並びにそれらの誘導体および変異体を包含する。たとえば、用語「リプログラミング因子」は、OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、KLF4、c-MYC、L-Myc、Glis-1、Sal4、Esrbb1、LRH-1、RAR-ガンマおよび本明細書中で規定されるような細胞をリプログラミングする能力を有することが当該技術分野において公知の任意の因子を包含するが、限定されない。本発明は、単独、または任意の組み合わせのいずれかでの本明細書に記載したリプログラミング因子のいずれかの使用を意図する。
【０１３２】
また、本発明は、下記リプログラミング因子のいずれかの使用を意図する：Octファミリーに関してOct3/4（Oct3、Oct4またはPOU5F1とも称される）；Soxファミリーに関してSox1、Sox2、Sox3、Sox4、Sox11およびSox15；Mycファミリーに関してc-Myc、N-MycおよびL-Myc；Linファミリーに関してLin28およびLin28b；並びにNanogファミリーに関してNanogを包含するが、限定されないOctファミリー、Klfファミリー、Soxファミリー、Mycファミリー、LinファミリーおよびNanogファミリーのメンバー。
【０１３３】
因子は、任意の動物種、たとえば哺乳動物およびげっ歯類であり得る。
【０１３４】
OCT4は、真核生物POU転写因子の転写因子および胚性幹細胞の多脳性の指標である。OCT4は、母性発現されるOctomer結合タンパク質である。OCT4は、胚盤胞の内部細胞塊である卵母細胞に、また始原生殖細胞中に存在することが観察されている。遺伝子POU5F1は、OCT4タンパク質をコードする。遺伝子名称に対する同義語は、OCT3、OCT4、OTF3およびMGC22487を包含する。特定の濃度でのOCT4の存在は、胚性幹細胞が依然として未分化のままであるのに必要である。
【０１３５】
好ましくは、「OCT4タンパク質」または単に「OCT4」は、ヒトOCT4に関し、好ましくは図8Aに記載の核酸によりコードされるアミノ酸配列、好ましくは図8Bに記載のアミノ酸配列を含む。上述するようなOCT4のcDNA配列が、OCT4 mRNAに等価であること、およびOCT4を発現することが可能なRNAの生成に使用され得ることを当業者は理解されよう。
【０１３６】
Sox2は、単一のHMG DNA結合ドメインを有する転写因子をコードするSox（SRY関連HMGボックス）遺伝子ファミリーのメンバーである。Sox2は、神経前駆細胞を、それらの分化する能力を阻害することにより制御することがわかっている。因子の抑圧は、脳室帯からの剥離をもたらし、その後、細胞周期からの出口へと続く。また、これらの細胞は、前駆体および初期神経分化マーカーの損失によってそれらの前駆体形質を損失し始める。
【０１３７】
好ましくは、「SOX2タンパク質」または単に「SOX2」は、ヒトSOX2に関連し、好ましくは、図9Aに記載の核酸によりコードされるアミノ酸配列、好ましくは図9Bに記載のアミノ酸配列を含む。上述するようなSOX2のcDNA配列が、SOX2 mRNAに等価であること、およびSOX2を発現することが可能なRNAの生成に使用され得ることを当業者は理解されよう。
【０１３８】
NANOGは、NK-2型のホメオドメイン遺伝子であり、おそらく胚性幹細胞再生および分化にとって重大な遺伝子の発現を調節することにより幹細胞多脳性を維持するのに重要な役割を果たすと提唱されている。NANOGは、そのC末端に包埋される2つの異常に強力な活性化ドメインを有する転写活性化因子として挙動する。
【０１３９】
好ましくは、「NANOGタンパク質」または単に「NANOG」は、ヒトNANOGに関し、好ましくは図10に記載のアミノ酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む。上述するようなNANOGのcDNA配列が、NANOG mRNAに等価であること、およびNANOGを発現することが可能なRNAの生成に使用され得ることを当業者は理解されよう。
【０１４０】
LIN28は、RNA結合モチーフ：低温ショックドメインおよびレトロウイルス型CCHC亜鉛フィンガーの対の異常対形成を伴う保存細胞質ドメインである。哺乳動物では、LIN28は、多様な型の未分化細胞において豊富である。多脳性哺乳動物細胞では、LIN28は、ポリ（A）結合タンパク質を有するRNアーゼ感受性複合体において、およびショ糖勾配のポリソーム分画で観察され、LIN28がmRNAを翻訳することに関連付けられると示唆する。
【０１４１】
好ましくは、「LIN28タンパク質」または単に「LIN28」は、ヒトLIN28に関し、好ましくは図11Aに記載の核酸によりコードされるアミノ酸配列、好ましくは図11Bに記載のアミノ酸配列を含む。上述するようなLIN28のcDNA配列が、LIN28 mRNAに等価であること、およびLIN28を発現することが可能なRNAの生成に使用され得ることを当業者は理解されよう。
【０１４２】
クルッペル（Krueppel）様因子（KLF4）は、亜鉛フィンガー転写因子であり、これは、様々な組織、たとえば結腸、胃および皮膚の有糸分裂後の上皮細胞で強力に発現される。KLF4は、これらの細胞の最終分化に必須であり、細胞周期調節に関与する。
【０１４３】
好ましくは、「KLF4タンパク質」または単に「KLF4」は、ヒトKLF4に関し、好ましくは図12Aに記載の核酸によりコードされるアミノ酸配列、好ましくは図12Bに記載のアミノ酸配列を含む。上述するようなKLF4のcDNA配列が、KLF4 mRNAに等価であること、およびKLF4を発現することが可能なRNAの生成に使用され得ることを当業者は理解されよう。
【０１４４】
MYC（cMYC）はプロトオンコジーンであり、それは、広範囲のヒト癌で過剰発現される。それが特異的に突然変異されるか、または過剰発現される場合、MYCは、オンコジーンとして細胞増殖および機能を増大させる。MYC遺伝子は、エンハンサーボックス配列（E-ボックス）上で結合すること、およびヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）を漸増させることによって、すべての遺伝子の15%の発現を調節する転写因子をコードする。MYCは、MYCファミリーの転写因子に属し、これはまた、N-MYCおよびL-MYC遺伝子を包含する。MYCファミリー転写因子は、bHLH/LZ（塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックスロイシンジッパー）ドメインを含有する。
【０１４５】
好ましくは、「cMYCタンパク質」または単に「cMYC」は、ヒトcMYCに関し、好ましくは図13Aに記載の核酸によりコードされるアミノ酸配列、好ましくは図13Bに記載のアミノ酸配列を含む。上述するようなcMYCのcDNA配列が、cMYC mRNAに等価であること、およびcMYCを発現することが可能なRNAの生成に使用され得るを、当業者は理解されよう。
【０１４６】
OCT4、SOX2、NANOG、LIN28、KLF4もしくはc-MYCのような特定の因子またはそれらの特定の配列に対する本明細書中の言及は、本明細書に記載したようなこれらの特定の因子のすべての変異体またはそれらの特定の配列も同様に包含するように理解されるべきである。特に、細胞により天然に発現されるこれらの特定の因子／配列のすべてのスプライス変異体、翻訳後修飾変異体、立体配座、アイソフォームおよび種ホモログも同様に包含するように理解されるべきである。
【０１４７】
本発明により有用なリプログラミング因子または核リプログラミング因子は、本明細書中で列挙されるリプログラミング因子のいずれかを包含する。また、本発明により有用なリプログラミング因子は、国際公開WO2005/80598 A1号（その全体が参照により本明細書に援用される）に記載されるリプログラミング因子に関してスクリーニングする方法により同定される因子を包含する。当業者は、上記刊行物を参照することにより本発明の方法における使用に関してリプログラミング因子をスクリーニングすることが可能である。さらに、リプログラミング因子はまた、適切な修飾または変更が上記スクリーニング方法で成されている方法を使用することにより確認することができる。
【０１４８】
リプログラミング因子の組み合わせの例は、2008年11月6日に出願された「核リプログラミング因子および人工多脳性幹細胞(Nuclear Reprogramming Factor and Induced Pluripotent Stem Cells)」という表題の国際公開WO2007/069666 A1号、並びにその関連米国特許出願第12/213,035号および米国特許出願第12/289,873号（それらは、その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。当業者は、上記刊行物を参照することにより、本発明の方法に関して好ましく使用され得るリプログラミング因子を適切に選択することが可能である。さらに、リプログラミング因子の組み合わせの他の例は、たとえばYuら、Science 318:1917-20, 2007（それは、その全体が参照により本明細書に援用される）に開示されている。したがって、リプログラミング因子の任意の多様性および組み合わせが本発明の方法に使用され得ることを当業者は理解することが可能であり、その組み合わせは、国際公開WO2007/069666 A1号またはYuら、Science 318:1917-20, 2007には開示されていない。本発明に有用なリプログラミング因子は、国際公開WO2005/80598 A1号に記載されるリプログラミング因子のスクリーニング方法を使用することにより同定される。
【０１４９】
単独で、または本出願と組み合わせて使用可能な核リプログラミング因子、たとえば、Oct3/4、Nanog、Lin28、Lin28b、ECAT1、ECAT2、ECAT3、ECAT5、ECAT7、ECAT8、ECAT9、ECAT10、ECAT15-1、ECAT15-2、Fthl17、Sal14、Rex1、Utf1、Tcl1、Stella、β-カテニン、Stat3、Grb2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Sox1、Sox2、Sox3、Sox4、Sox11、Myb12、Klf1、Klf2、Klf4およびKlf5、およびFoxD3、ZNF206およびOtx2（それらはまた、国際公開WO2008/118820号に記載されている）のアミノ酸およびヌクレオチド配列が、GenBank（NCBI、米国）で利用可能である。ヒト、マウスまたはラットに関するそれらのアクセッション番号を以下に記載する。
【０１５０】
Oct3/4（ヒトNM_203289またはNM_002701、マウスNM_013633、ラットNM_001009178）、Nanog（ヒトNM_024865、マウスNM_028016、ラットNM_001100781）、Lin28（ヒトNM_024674、マウスNM_145833、ラットNM_001109269）、Lin28b（ヒトNM_001004317、マウスNM_001031772）、ECAT1（ヒトAB211062、マウスAB211060）、ECAT2（ヒトNM_001025290、マウスNM_025274）、ECAT3（ヒトNM_152676、マウスNM_015798）、ECAT5（ヒトNM_181532、マウスNM_181548）、ECAT7（ヒトNM_013369、マウスNM_019448）、ECAT8（ヒトAB211063、マウスAB211061）、ECAT9（ヒトNM_020634、マウスNM_008108）、ECAT10（ヒトNM_006942NM_009235、マウスNM_009235）、ECAT15-1（ヒトNM_018189、マウスNM_028610）、ECAT15-2（ヒトNM_138815NM_028615、マウスNM_028615）、Fthl17（ヒトNM_031894、マウスNM_031261）、Sal14（ヒトNM_020436、マウスNM_175303）、Rex1（ヒトNM_174900、マウスNM_609556）、Utf1（ヒトNM_003577、マウスNM_009482）、Tcl1（ヒトNM_021966、マウスNM_009337）、Stella（ヒトNM_199286、マウスNM_139218）、β-カテニン（ヒトNM_001904、マウスNM_007614）、Stat3（ヒトNM_139276、マウスNM_213659）、Grb2（ヒトNM_002086、マウスNM_008163）、FoxD3（ヒトNM_012183、マウスNM_010425）、ZNF206（ヒトNM_032805、マウスNM_001033425）、Myb12（ヒトNM_002466、マウスNM_008652）、Otx2（ヒトNM_172337、マウスNM_144841）、c-Myc（ヒトNM_002467、マウスNM_010849）、N-Myc（ヒトNM_005378、マウスNM_008709）、L-Myc（ヒトNM_005376、マウスNM_008506）、Sox1（ヒトNM_005986、NM_005986、NM_009233、マウスNM_005986、NM_009233）、Sox2（ヒトNM_003106、マウスNM_011443）、Sox3（ヒトNM_005634、マウスNM_009237）、Sox4（ヒトNM_003107、マウスNM_009238）、Sox11（ヒトNM_003108、マウスNM_009234）、Myb12（ヒトNM_002466、マウスNM_008652）、Klf1（ヒトNM_006563、マウスNM_010635）、Klf2（ヒトNM_016270、マウスNM_008452）、Klf4（ヒトNM_004235、マウスNM_010637）およびKlf5（ヒトNM_001730、マウスNM-009769）。
【０１５１】
本発明のリプログラミング因子は、Fbx15、Nanog、ERas、ECAT15-2、Tcl1およびβ-カテニンから選択される遺伝子（複数可）の1つまたは複数の遺伝子産物（複数可）とさらに組み合わせてもよい。さらに、これらの因子はまた、たとえばECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Sox15、ECAT15-1、Fthl17、Sal14、Rex1、UTF1、Stella、Stat3およびGrb2から選択される遺伝子（複数可）の1つまたは複数の遺伝子産物（複数可）と組み合わせてもよい。しかしながら、本発明のリプログラミング因子と一緒に含まれ得る遺伝子産物は、上記で具体的に記載する遺伝子の遺伝子産物に限定されない。本発明の核リプログラミング因子は、リプログラミング因子として機能し得る他の遺伝子産物、並びに分化、発達または増殖を含む1つまたは複数の因子、および他の生理学的活性を有する因子を包含し得る。また、上述の側面が、本発明の範囲内に包含され得ることは理解されるべきである。
【０１５２】
本発明によれば、用語「ペプチド」は、オリゴおよびポリペプチドを含み、2個またはそれ以上の、好ましくは3個またはそれ以上の、好ましくは4個またはそれ以上の、好ましくは6個またはそれ以上の、好ましくは8個またはそれ以上の、好ましくは10個またはそれ以上の、好ましくは13個またはそれ以上の、好ましくは16個またはそれ以上の、好ましくは21個またはそれ以上の、および最大好ましくは8、10、20、30、40または50個、特に100個のペプチド結合により共有結合されたアミノ酸を含む物質をいう。用語「タンパク質」は、大きなペプチド、好ましくは100個を上回るアミノ酸残基を有するペプチドを指すが、一般的に用語「ペプチド」および「タンパク質」は同義語であり、本明細書中では交換可能に使用される。
【０１５３】
本発明によるタンパク質およびペプチドは、組織または細胞ホモジネートのような生物学的試料から単離されてもよく、また、非常に多数の原核生物または真核生物発現系で同様に組換え的に発現されてもよい。
【０１５４】
本発明の目的で、タンパク質もしくはペプチドまたはアミノ酸配列の「変異体」は、アミノ酸挿入変異体、アミノ酸欠失変異体および／またはアミノ酸置換変異体を含む。
【０１５５】
アミノ酸挿入変異体は、アミノおよび／またはカルボキシ末端の融合、および同様に特定アミノ酸配列における単一、あるいは2つまたはそれ以上のアミノ酸の挿入を含む。挿入を有するアミノ酸配列変異体の場合、1つまたは複数のアミノ酸残基は、アミノ酸配列中の特定部位に挿入されるが、得られる産物の適切なスクリーニングを伴うランダム挿入も可能である。
【０１５６】
「保存的置換」は、たとえば関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性における類似性に基づいて行われ得る。好ましくは、本明細書に記載した特定のアミノ酸配列と上記特定のアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列との間の類似性、好ましくは同一性の度合いは、少なくとも70%、好ましくは少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、さらに好ましくは少なくとも90%または最も好ましくは少なくとも95%、96%、97%、98%または99%である。類似性または同一性の度合いは、少なくとも約20個、少なくとも約40個、少なくとも約60個、少なくとも約80個少なくとも約100個、少なくとも約120個、少なくとも約140個、少なくとも約160個、少なくとも約200個または少なくとも約250個のアミノ酸の領域に関して付与される。好ましい態様において、類似性または同一性の度合いは、参照アミノ酸配列の完全長に関して付与される。
【０１５７】
本発明によれば、タンパク質またはペプチドの変異体は、好ましくは、それが由来しているタンパク質またはペプチドの機能的特性を有する。かかる機能的特性は、それぞれOCT4、SOX2、NANOG、LIN28、KLF4およびc-MYCに関して上述されている。好ましくは、タンパク質またはペプチドの変異体は、動物分化細胞をリプログラミングする際に、それが由来しているタンパク質またはペプチドと同じ特性を有する。好ましくは、変異体は、動物分化細胞のリプログラミングを誘発するか、または高める。
【０１５８】
miRNA
本発明は、多脳性幹細胞を産生する方法であって、1つまたは複数のmiRNA（複数可）がmRNAと組み合わせて標的細胞に導入される方法を提供する。
【０１５９】
miR-290クラスターと称される1つのマイクロRNAクラスターは、マウスES細胞においてmiRNA集団全体の70%以上を構成する（Marson, Aら、胚性幹細胞のコア転写調節回路網へのマイクロRNA遺伝子の連結（Connecting micro RNA genes to the core transcriptional regulatory circuitry of embryonic stem cells）、Cell 134:521-533 （2008））。miR-290クラスターの発現は、ES細胞分化に対して迅速にダウンレギュレートされる（たとえば、Houbaviy, H. B., Murray, M. F. & Sharp, P. A、胚性幹細胞特異的マイクロRNA（Embryonic stem cell-specific Micro RNAs）、Dev Cell 5:351-358 （2003）を参照）。胚性幹細胞周期（ESCC）調節miRNAと呼ばれるmiR-290クラスターのサブセットは、特有の幹細胞周期を高め、miR-291-3p、miR-294およびmiR-295、並びにヒトホモログhsa-mir-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR-302d、hsa-miR-371-5p、hsa-miR-372、hsa-miR-373を包含する（たとえば、Wang, Y.ら、胚性幹細胞特異的マイクロRNAは、G1-S移行を調節して、迅速な増殖を促進する（Embryonic stem cell-specific microRNAs regulate the G1-S transition and promote rapid proliferation）、Nat Genet 40:1478-1483 （2008）を参照）。このサブセットは、miR-291-3p、miR-294およびmiR-295、並びにヒトホモログを包含する
【０１６０】
すべてのmiRNAの成熟に必要とされる遺伝子の除去により、miRNAが胚性幹細胞（ESC）の増殖および分化において必須の役割を果たすことが示されている（Wang, Y.ら、Nat Genet 39:380-5 2007）；Kanellopoulou, Cら、Genes Dev 19:489-501 （2005）；Murchison, E. P.ら、Proc Natl Acad Sci USA 102:12135-40 （2005））。たとえば、すべての標準miRNAの産生に必要とされるRNA結合タンパク質DGCR8の損失は、それらが分化誘発性の条件で配置される場合に、細胞周期欠陥およびESCの自己再生プログラムを発現停止させることができないということをもたらす（Wang, Y.ら、Nat Genet 39:380-5 （2007））。miRNAのファミリーであるESCC miRNAの個々のメンバーの、Dgcr8-/-ESCへの導入は、細胞周期欠陥を救済することができる（Wang, Y.ら、Nat Genet, 40:1478-1483 （2008））。
【０１６１】
本発明の方法によれば、miRNAは、以下の表に示されるmiRBaseデータベースの登録名もしくはアクセッション番号により指定されるRNA配列、または以下の表に示される配列もしくは配列の組み合わせ、または以下に示される配列の任意の考え得る組み合わせ中に含まれる1つまたは複数のmiRNA（複数可）を含む。登録名では、記号「hsa」および「mmu」は、それぞれホモサピエンスおよびハツカネズミを表す。
【０１６２】
本発明は、18〜25個のヌクレオチド、たとえば20〜25個のヌクレオチド、21〜23個のヌクレオチド、および19〜23個のヌクレオチドであるmiRNAを提供する。かかるmiRNAは、プリmiRNA（すなわち、ゲノムDNAからの転写産物）およびプレmiRNA（すなわち、プリmiRNAからのプロセシングされた産物）を含む前駆物質RNAから誘発され得る。
【０１６３】
本発明は、人工多脳性幹細胞の調製のための、miRNAの非存在下よりもmiRNAの存在下でより高いリプログラミング効率を提供するmiRNAの使用を含む方法を提供する。たとえば、添加されたmiRNAの存在は、miRNAの非存在下と比較した場合に、人工多脳性幹細胞の産生を支持する。さらに、同じ濃度で同じ構成成分を含有するリプログラミング因子の存在下で、miRNAを添加して、およびmiRNAを添加せずに、同数の体細胞に関してリプログラミングを実施する場合、効率の増大を観察することができ、ここでmiRNAを含まない試料と比較した場合に、miRNAを含む試料において、より多数の人工多脳性幹細胞が作製される。
【０１６４】
本発明による有用なmiRNAに関して、その分類およびインビボでの機能は、実験医学（Experimental Medicine）, 24, pp. 814-819, 2006；マイクロRNA実験プロトコル（microRNA Experimental Protocol）, pp. 20-35, 2008, YODOSHA CO., LTDに記載されている。目下、約1,000個のmiRNA配列に関するデータを保存しているデータベースが利用可能であり（たとえば、miRBase、Griffiths-Jonesら、Nucleic Acids Research 36:D154-D158, 2008 （2007年11月8日にオンラインで公開）、同様にhttp://microma.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml [オンライン]も参照）、当業者はそこから任意のmiRNAデータを獲得して、体細胞におけるレベルよりも高いレベルで、胚性幹細胞において発現されるmiRNAを容易に抽出することが可能である。さらに、同様に、miRNAマイクロアレイおよびリアルタイムPCR分析を包含するが、限定されない方法により、胚性幹細胞と体細胞との間のmiRNA発現の差を確認することにより、体細胞におけるレベルよりも高いレベルで、胚性幹細胞において発現されるmiRNAを容易に同定することも可能である。
【０１６５】
体細胞がリプログラミングされるべきである標的動物と同じ動物種に由来するmiRNAを使用することが好ましい。本発明により有用なmiRNAは、野生型miRNA、並びに1〜数個のヌクレオチド（たとえば、1〜6個のヌクレオチド、好ましくは1〜4個のヌクレオチド、より好ましくは1〜3個のヌクレオチド、さらに好ましくは1または2個のヌクレオチド、最も好ましくは1個のヌクレオチド）が置換、挿入および／または欠失されて、インビボで野生型miRNAの機能と等価な機能を発揮することが可能であるmiRNAを包含する。たとえば、本発明のmiRNAは、1〜数個のヌクレオチドが置換、挿入および／または欠失されて、iPS細胞産生の効率を増大するmiRNAを包含する。また、本発明のmiRNAは、1〜数個のヌクレオチドが置換、挿入および／または欠失されて、核リプログラミングの効率を改善するmiRNAを包含する。また、本発明のmiRNAは、1〜数個のヌクレオチドが置換、挿入および／または欠失されて、DNAメチル化を調節するmiRNAを包含する。同様に、本発明は、かかるmiRNAを包含し、ここでDNAメチル化はダウンレギュレートされる。また、本発明は、かかるmiRNAを包含し、ここでDNAメチル化はデノボDNAメチル化である
【０１６６】
本発明の方法によれば、上記様式でリプログラミング効率を改善することが確認されているmiRNAは、単独で、あるいは2つまたはそれ以上の型の組み合わせで使用することができる。さらに、クラスターを形成する複数のmiRNAも使用され得る。たとえば、miRNAクラスターとして利用可能であるhsa-miR-302-367、またはhsa-miR-302-367クラスター由来の個々のmiRNA等が使用され得る。これらのRNA配列の中でも、いくつかのRNA配列は、1つの配列内に複数のmiRNAを含んでもよい。かかるRNA配列の使用は、iPS細胞の効率的な産生を達成し得る。さらに、1つの配列内に複数のmiRNAを含むRNA配列、および1つまたは複数のmiRNA（複数可）を含む1つまたは複数の他のRNA配列（複数可）も、組み合わせて使用することができる。本発明において、好ましくは、miRNAは、以下で示される表に表されるRNAから選択される1つまたは2つ以上のRNA中に含有される1つまたは2つ以上のmiRNAである。
【０１６７】
miRNAは、タンパク質へ翻訳されない非コードRNAである。miRNAはまず、相当する遺伝子からプリmiRNAとして転写される。プリmiRNAは、約60〜約120個のヌクレオチドまたはそれ以上、たとえば約70個のヌクレオチドの特徴的なヘアピン構造を有するプレmiRNAを作製し、このプレmiRNAは、成熟miRNAへさらにプロセシングされ、それはダイサーにより媒介される。本発明において、本発明の効果が損なわれない限りは、成熟なmiRNAだけでなく、それらの前駆物質RNA（すなわち、プリmiRNAまたはプレmiRNA）、またはmiRNAもしくは前駆物質RNAをコードするDNAを含むベクターを使用することができる。さらに、本発明における使用のためのmiRNAは、天然型または非天然型のいずれかであり得る。したがって、本発明の効果が損なわれない限りは、任意の小RNAまたはRNA前駆物質が使用され得る。
【０１６８】
本発明における使用のためのmiRNAの産生方法は具体的に限定されないが、産生は、たとえば化学合成方法または遺伝子組換え技法を使用する方法により達成することができる。産生が遺伝子組換え技法を使用する方法により実行される場合、本発明における使用のためのmiRNAは、たとえば、DNA鋳型および遺伝子組換えを用いて得られるRNAポリメラーゼを用いて転写反応によって産生され得る。使用可能なRNAポリメラーゼの例は、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメラーゼおよびSP6 RNAポリメラーゼを含む。
【０１６９】
あるいは、miRNAを発現することが可能な組換えベクターは、発現制御配列（プロモーターおよびエンハンサー配列等）の調節下で、miRNAコードDNAまたは前駆物質RNA（プリmiRNAまたはプレmiRNA）コードDNAを適切なベクターへ挿入することにより産生することができる。本発明において使用されるベクターの型は具体的に限定されないが、DNAベクターが好ましい。それらの例として、プラスミドベクターを含むことができる。さらに、上記プラスミドに関して、当業者に周知の哺乳動物発現プラスミドを用いることができる。
【０１７０】
また、本発明は、mRNAと組み合わせて、本明細書中で規定されるようなmiRNA疑似体を使用して多脳性幹細胞を産生する方法を提供する。本発明はまた、少なくとも1つのmiRNA疑似体および少なくとも1つのmRNAを含む多脳性幹細胞を提供する。
【０１７１】
本発明の方法に有用なmiRNAは、細胞の多脳性または間葉から上皮への移行に関与することで知られる任意のmiRNAを包含する。本発明により有用なmiRNAは、下記を含むが、限定されない。
【０１７２】
【表１】
2015522257.tif 000003
【０１７３】
ある特定の態様において、miRNAの組み合わせは、多脳性幹細胞の産生を容易とするために体細胞へ導入される（たとえば、表2を参照）。
【０１７４】
【表２】
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【０１７５】
【表３】
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【０１７６】
【表４】
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【０１７７】
【表５−１】
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【表５−２】
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【０１７８】
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【０１７９】
さらに、人工多脳性幹（iPS）細胞を樹立する効率を高めるために、本発明のmiRNAおよびmRNAに加えて、下記サイトカインおよび／または小分子を、リプログラミングされるべき体細胞へさらに導入させてもよい：すなわち、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、幹細胞因子（SCF）等（サイトカイン）およびバルプロ（valpronic acid）酸のようなヒストンデアセチラーゼ阻害剤、5’−アザシチジンのようなDNAメチラーゼ阻害剤、BIX01294（BIX）のようなヒストンメチルトランスフェラーゼ（G9a）（小分子）（D. Huangfuら、Nat. Biotechnol., 26, pp. 795-797, 2008；S. Kubicekら、Mol. Cell, 25, pp. 473-481, 2007；Y. Shiら、Cell Stem Cell, 3, 568-574, 2008、Yan Shiら、Cell Stem Cell, 2, pp. 525-528, 2008）。さらに、p53に関するshRNAもしくはsiRNAのようなp53阻害剤および／またはUTF1を体細胞に導入してもよい（Yang Zhao et alら、Cell Stem Cell, 3, pp 475-479, 2008）。同様に、Wntシグナルの活性化（Marson A.ら、Cell Stem Cell, 3, pp 132-135, 2008）または分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼまたはグリコーゲンシンターゼキナーゼ−3によるシグナル伝達の阻害（Silva J.ら、PloS Biology, 6, pp 2237-2247 2008）は、iPS細胞を作製する効率を増大させるための手段として役立ち得る。
【０１８０】
iPS細胞の同定
本発明は、細胞が多脳性幹細胞であるかどうかを決定する方法を提供する。これらの方法は、テラトーマアッセイ；Oct4、NANOG、Rex-1、SSEA3、SSEA4、SSEA1（マウスのみ）、Tra-1-60、Tra-1-80に関する抗体染色；形態学的観察；多脳性因子に関するRT-PCR；hES細胞とのメチル化パターン比較（重硫酸塩シーケンシング）；3つすべての胚葉への自発的分化（RT-PCRまたはAb染色により分析される）；およびpluritest分析を含むが、限定されない。
【０１８１】
また、細胞は、たとえばRT-PCRによる未分化細胞に特異的な各種マーカーの存在または非存在の分析により多脳性幹細胞であると決定することができる。たとえば、いくつかの多脳性細胞マーカーとして、Oct3/4；Nanog；アルカリホスファターゼ（AP）；ABCG2；ステージ特異的胎児抗原-1（SSEA-1）；SSEA-3；SSEA-4；Tra-1-60；TRA-1-81；Tra-2-49/6E；ERas/ECAT5、E-カドヘリン；βIII-チューブリン;α-平滑筋アクチン（α-SMA）；線維芽細胞成長因子4（Fgf4）、Cripto、Dax1；亜鉛フィンガータンパク質296（Zfp296）；N-アセチルトランスフェラーゼ-1（Nat1）；（ES細胞関連転写物1（ECAT1））；ESG1/DPPA5/ECAT2；ECAT3；ECAT6；ECAT7；ECAT8；ECAT9；ECAT10；ECAT15-1；ECAT15-2；Fthl17；Sal14；未分化胚細胞転写因子（Utf1）；Rex1；p53；G3PDH；TERTを含むテロメラーゼ；サイレントX染色体遺伝子；Dnmt3a；Dnmt3b；TRIM28；Fボックス含有プロテイン15（Fbx15）；Nanog/ECAT4；Oct3/4；Sox2；Klf4；c-Myc；Esrrb；TDGF1；GABRB3；Zfp42；FoxD3；GDF3；CYP25A1；発達多脳性関連2（DPPA2）；およびT細胞リンパ腫切断点1（Tcl1）；DPPA3/Stella；DPPA4を含む。他のマーカーは、Dnmt3L；Sox15；Stat3；Grb2；SV40ラージT抗原；HPV16 E6；HPV16 E7；β-カテニン、およびBmi1を含むことができる。また、かかる細胞は、iPS細胞が誘発される分化細胞の特徴を示すマーカーのダウンレギュレーションを特徴とし得る。たとえば、線維芽細胞に由来するiPS細胞は、線維芽細胞マーカーThy1のダウンレギュレーションおよび／またはSSEA-3および4の上方制御を特徴とし得る。本発明は、本明細書中に列挙されるマーカーに限定されず、細胞表面マーカー、抗原、並びにEST、RNA（マイクロRNAおよびアンチセンスRNAを含む）、DNA（遺伝子およびcDNAを含む）を含む他の遺伝子産物およびそれらの一部を包含すると理解される。
【０１８２】
iPS細胞は、半永久的な細胞増殖、多脳性または細胞形態学によりさらに同定され得る（Takahashi, K.ら、Cell 131:861-872 （2007））。簡潔に述べると、半永久的な増殖に関して、細胞が指数関数的に増殖する能力は、約4〜6ヶ月にわたって細胞を培養することにより試験される。ヒトiPS細胞の場合、集団倍加時間が、たとえば約46.9±12.4時間、47.8+6.6時間または43.2±11.5時間であることがわかっているため、この値は、増殖の能力を示し得る。あるいは、iPS細胞が通常高いテロメラーゼ活性高いを有するため、高いテロメラーゼ活性は、テロメア反復増幅プロトコル（TRAP）により検出され得る。
【０１８３】
多脳性は、テラトーマを形成すること、および3つの胚性胚葉（すなわち、外胚葉、中胚葉および内胚葉）の組織または細胞を同定することにより確認することができる。具体的には、ヌードマウスにおいて皮内に（ここでは細胞は、マウス体細胞から誘発される）、またはSCIDマウスの精巣に（ここでは細胞は、ヒト体細胞から誘発される）細胞を注入し、続いて腫瘍の形成を確認し、次いで腫瘍組織が、神経ロゼット（外胚葉）、軟骨（中胚葉）、心筋細胞（中胚葉）、腸様上皮（内胚葉）、脂肪（中胚葉）等を含む組織で構成される。ことを確認する。
【０１８４】
ヒトまたはマウスiPS細胞コロニーが、ヒトまたはマウスES細胞コロニーの形態学に類似した形態を有することで知られているため、iPS細胞の形態学は、多脳性の指標として使用することができる。概して、ヒトiPS細胞が平坦なコロニーを形成する一方で、マウスiPS細胞は、膨潤コロニーを形成する傾向にある。
【０１８５】
医薬品系のキット
本発明は、本発明の多脳性幹細胞またはiPS細胞を含む医薬品組成物を産生するためのキットを提供する。本発明のこの側面によるキットは、本発明のmRNAおよびmiRNAと組み合わせてキャリア手段を含む。1つの態様において、本発明のキットは、本発明の多脳性細胞を産生するのに適した培養培地、本発明の多脳性細胞コロニーの成長および維持に適した培地、およびトランスフェクション試薬の1つまたは複数をさらに含む。キャリア手段は、中に厳重に閉じ込めた状態で、バイアル、チューブ、アンプル、ビン等のような1つまたは複数の容器手段を有する箱、カートン、チューブ等のいずれか1つを含んでもよい。
【０１８６】
望ましい場合、キットは、多脳性幹細胞を産生するためのキットを使用することに関する説明書と一緒に提供される。説明書は概して、多脳性幹細胞を産生する方法に関する情報を含む。
【０１８７】
本発明の多能性幹細胞または多脳性幹細胞に由来する分化細胞を含む配合物は、キャリア手段と組み合わせて提供されてもよく、概して疾患を有する被験体を治療するための細胞の使用に関する情報を含む説明書を包含し得る。他の態様において、説明書は、下記：治療薬（IPS細胞またはそれに由来する細胞）の記述、警告、適応症、反適応症、動物研究データ、臨床研究データおよび／または参考の少なくとも1つを包含する。説明書は、容器（存在する場合）上に直接的に、容器に貼り付けるラベルとして、または容器中にもしくは容器と一緒に供給される別個のシート、パンフレット、カードまたは折り畳み印刷物として印刷され得る。ある特定の態様において、本発明のキットはまた、免疫応答を抑制するためにB18Rまたは当該技術分野において公知の任意の他の構成成分を包含し得る。
【０１８８】
動物モデル
同様に、本発明のiPS細胞は、動物にも適用可能であり、また様々な動物モデル系において疾患の生物医学的研究を促進するのにも使用され得る。
【０１８９】
用途
本発明の方法は、疾患治療および防止を含む臨床的応用に使用することができる多脳性幹細胞の産生を提供する。特に、本発明のiPS細胞、または分化子孫細胞は、再生医療の分野における応用に使用することができる。また、本発明の細胞は、それを必要とする被験体に関する個人向け治療を設計する方法を提供する。
【０１９０】
また、本発明のiPS細胞およびそれらの分化子孫は、特定機能、たとえば疾患の治療または防止を伴う化合物を同定して、所定の化合物の活性を決定して、および／または所定の化合物の毒性を決定するのに使用することができる。さらに、本発明は、体細胞を患者に移植することを含む幹細胞療法を提供し、ここで体細胞は、患者から単離および収集された体細胞を使用することにより、本発明の方法により得られる人工多脳性幹細胞から分化を誘発することにより得られる。
【０１９１】
さらに、本発明は、本発明の方法により得られる人工多脳性幹細胞の分化を誘発することにより得られる各種細胞を用いた化合物、薬物または毒物の生理学的影響または毒性の評価に関する方法を提供する。
【０１９２】
本発明の方法により産生される人工多脳性幹細胞の応用は、具体的に限定されず、これらの細胞は、ES細胞を用いて実施されるべきあらゆる検査／研究に、およびES細胞を利用する任意の疾患療法に使用することができる。たとえば、本発明の方法により得られる人工多脳性細胞は、所望の分化細胞または前駆物質細胞（たとえば、神経細胞、心筋細胞、血液細胞およびインスリン産生細胞）を産生するように、またはレチノイン酸、EGF、グルココルチコイド、アクチビンA/BMP4（骨形成タンパク質4）またはVEGFのような成長因子を用いた処理により誘発することができ、その結果、適切な組織が形成され得る。自己細胞移植による幹細胞療法は、上記様式で得られるこれらの分化細胞または組織を患者に戻すことにより達成することができる。しかしながら、本発明の人工多脳性幹細胞（iPS細胞）の応用は、上述の特定の側面に限定されない。iPS細胞は、インビボで生殖細胞系列伝達の能力を有する。したがって、iPS細胞が、非ヒト哺乳動物由来の胚盤胞へ導入され、続いて同じ動物の代理母の子宮へ移植されると、iPS細胞の遺伝子型の一部が伝達されたキメラ動物（WO 2007/069666号）が産生される。また、iPS細胞は、遺伝子の修飾、遺伝子の導入（またはノックイン）または遺伝子のノックアウトに使用することができ、それにより遺伝子の機能の明確化、疾患を有する非ヒト動物モデルを創出すること、またはタンパク質のような物質を産生することが可能となる。
【０１９３】
治療方法
本発明は、本発明の多脳性幹細胞または分化前駆細胞の投与を介して治療が可能な疾患または障害のリスクがある（またはそれらにかかりやすい）被験体を治療する予防的方法および治療的療法の両方を提供する。
【０１９４】
1つの側面において、本発明は、本発明のiPSまたは分化前駆細胞を被験体へ投与することにより上述するような疾患または障害を、被験体において防止する方法を提供する。疾患のリスクがある被験体は、たとえば本明細書に記載したような診断もしくは予後アッセイのいずれかまたは組み合わせにより同定することができる。予防薬の投与は、疾患または障害を、その進行において防止させるか、あるいは遅延させるように、たとえば被験体における癌または疾患もしくは障害に特徴的な症状の兆候の検出に先立って行うことができる。
【０１９５】
本発明の別の側面は、被験体を治療上処置する方法、すなわち疾患または障害の症状の発症を変更させる方法に関する。これらの方法は、インビボで（たとえば、本発明の多脳性幹細胞または分化子孫を被験体へ投与することにより）実施することができる。
【０１９６】
治療薬（たとえば、本発明の多脳性細胞）は、適切な動物モデルにおいて試験することができる。たとえば、本明細書に記載したような多脳性幹細胞または分化子孫細胞は、細胞による治療の有効性、毒性または副作用を決定するために動物モデルにおいて使用することができる。あるいは、作用物質（たとえば、本発明の多脳性幹細胞）は、かかる作用物質の作用機序を決定するために動物モデルにおいて使用することができる。
【０１９７】
本発明の実施は、別記しない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えDNA、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の従来の技法を用い、それらは、当該技術分野の技術範囲内である。たとえば、Maniatisら、1982, Molecular Cloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）；Sambrookら、1989, Molecular Cloning, 2nd Ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）；SambrookおよびRussell、2001, Molecular Cloning, 3rd Ed.（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）；Ausubelら、1992, Current Protocols in Molecular Biology（John Wiley & Sons、定期的更新を含む）；Glover、1985, DNA Cloning（IRL Press, Oxford）；Anand、1992；GuthrieおよびFink、1991；HarlowおよびLane、1988, Antibodies,（Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.）；JakobyおよびPastan、1979；Nucleic Acid Hybridization（B. D. Hames & S. J. Higgins著、1984）；TranscriptionおよびTranslation（B. D. Hames & S. J. Higgins著、1984）；Culture Of Animal Cells（R. I. Freshney, Alan R.、Liss, Inc.、1987）；Immobilized Cells And Enzymes（IRL Press、1986）；B. Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning （1984）；論文Methods In Enzymology（Academic Press, Inc.、N.Y.）；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells（J. H. MillerおよびM. P. Calos著、1987, Cold Spring Harbor Laboratory）；Methods In Enzymology, Vols. 154および155（Wuら著）、Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology（MayerおよびWalker著、Academic Press、London、1987）；Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV（D. M. WeirおよびC. C. Blackwell著、1986）；Riott、Essential Immunology, 6th Edition、Blackwell Scientific Publications、Oxford、1988；Hoganら、Manipulating the Mouse Embryo,（Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1986）；Westerfield, M.、The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish（Danio rerio）,（4th Ed.、Univ. of Oregon Press、Eugene、2000）を参照されたい。
【０１９８】
別記しない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載したものに類似または等価な方法および材料は、本発明の実施または実験で使用することができるが、適した方法および材料を以下に示す。本明細書中で言及される刊行物、特許出願、特許および他の参照文献はすべて、それらの全体が参照により本明細書に援用される。不一致の場合は、定義を含めて本明細書が優先される。さらに、材料、方法および実施例は、単なる例示であり、限定的であると意図されない。
【実施例】
【０１９９】
本発明は、下記実施例を参照することにより記載され、実施例は、実例として提供されるものであり、いかなる場合でも本発明を限定するとは意図されない。当該技術分野において周知の標準的な技法または具体的に後述する技法を利用した。
【０２００】
実施例1
Stemfect（商標）RNAトランスフェクションキットを使用したeGFP mRNAのトランスフェクション
図1は、線維芽細胞がStemfect（商標）RNAトランスフェクションキットを使用してeGFP mRNAでトランスフェクトされる実験の結果を示す。BJ線維芽細胞（成熟していないヒト包皮に由来する線維芽細胞）を24ウェル型式で播種して、eGFP mRNA 250ngでトランスフェクトした。細胞を37℃および5%CO2で培養して、トランスフェクションの18〜24時間後にフローサイトメトリーにより分析した。図1Aは、フローサイトメトリーにより決定される場合の平均蛍光強度を示すグラフである。Stemfect（商標）RNAトランスフェクションキットは、RNAiMAX（商標）を使用して観察されるよりも2〜3倍高い平均タンパク質発現をもたらした。図Bは、トランスフェクトしていない細胞対照（赤色）に並行して、Stemfect（商標）RNAトランスフェクションキット（紫色）のトランスフェクション効率をRNAiMAX（商標）（緑色）と比較する代表的なヒストグラムを示す。Stemfect（商標）RNAトランスフェクションキットは、いかなる著しい毒性を伴わずに、タンパク質発現のより密着した分布を可能にしながら、eGFP mRNAの98%を上回るトランスフェクション効率を導いた。
【０２０１】
図1Cは、75,000個のBJ線維芽細胞を24ウェル型式で播種して、Stemfect（商標）RNAトランスフェクションキットを使用してeGFP mRNA 250ngでトランスフェクトした実験の結果を示す。トランスフェクションの18〜24時間後に捕らえた蛍光画像。
【０２０２】
実施例2
フィーダーを含まない環境における初代患者線維芽細胞からの組込みがないiPS細胞の誘導
本発明のiPS細胞は、フィーダーがない環境において初代患者線維芽細胞から作製される。
【０２０３】
フィーダーを含まない環境における初代患者線維芽細胞からのiPS細胞の産生に関する実験タイムラインを図2Aに示す。
【０２０４】
実験タイムライン：
1日目に、50,000個のヒト線維芽細胞を、Matrigel（商標）で予めコーティングした6ウェルプレートの単一ウェル中に播種して、細胞を37℃、5%CO2および21%O2で一晩培養した。0〜12日目の間に、標的線維芽細胞を、NuFF（ヒト新生児包皮線維芽細胞）で予め調整した培地中でトランスフェクトした。細胞を、下記の通りに本発明のmiRNAおよびmRNAカクテル（たとえば、クラスターAまたはクラスターB）でトランスフェクトした：
0日目−多脳性miRNAカクテル；
1〜3日目−mRNAカクテル（OSKML-Oct4、Sox2、Klf4、MycおよびLin28）1.5μg；
4日目−mRNAおよびmiRNAカクテルの両方（順次添加する）；
5〜12日目−mRNAカクテル1.5μg
【０２０５】
図2Bは、形態学の経過を示す。50,000個の罹患患者の皮膚線維芽細胞を6ウェルプレートの1つのウェル中に播種し、次いで上記で概要するようにトランスフェクトした。規定の時点で、画像を捕えた（図2Aの紫色の点）。2日目：線維芽細胞は、mRNAによる繰り返されるトランスフェクションに応答して、典型的な緊密な形態学を示す。5日目：細胞は、間葉から上皮への移行が開始され、小さくて緩いクラスターへと集合し始める。8日目：クラスター内の細胞の増殖速度は、コロニーの縁が出現するにつれて増大してきた。10日目：細胞のクラスターは増殖して、急成長しているコロニーの縁はより良好に明確化される。12日目：明確化された縁および密着した細胞クラスター形成を伴うTRA-1-81（+） iPS細胞コロニーが、初代培養液中に存在する。TRA-1-81は、多脳性に関する表面マーカーである。
【０２０６】
図3は、iPS細胞作製に対する標的細胞数およびmRNA用量の影響を示す。ヒト線維芽細胞を、Matrigel（商標）でコーティングした6ウェルプレート上にウェル1つ当たり25,000または50,000個の細胞のいずれかで播種して、一晩接着させた。細胞を毎日、300ng/ml B18Rタンパク質を含有するNuFF調整培地中でmRNA（Oct4、Sox2、Klf4、MycおよびLin28の少なくとも1つをコードする）1.0または1.5μgのいずれかで、10日間トランスフェクトした。培養液を37°C、5%CO2および5%O2でインキュベートした。ウェルは、11日目にTRA-1-81陽性コロニーの数に関して評価した。
【０２０７】
mRNAのトランスフェクションは、細胞培養液中で最終的にアポトーシスおよび死を招く細胞の免疫応答を誘発する。この応答は、修飾ヌクレオチドを使用することにより、または免疫応答を阻止するためのB18Rタンパク質を使用することにより抑止される（AngelおよびYannik、PLOS ONE, 2010を参照）。
【０２０８】
実施例3
iPS細胞コロニーを作製するのに必要とされるトランスフェクションの数
mRNAカクテルのみでトランスフェクトする際にiPS細胞コロニーを作製するのに必要とされるトランスフェクションの数を決定した。2つの患者由来のヒト皮膚線維芽細胞培養液をそれぞれ、Matrigel（商標）でコーティングした6ウェルプレートの1つのウェル中に50,000個の細胞で播種して、37°C、5%CO2および21%O2で一晩培養した。細胞を、表示した日数の間、Pluriton（商標）リプログラミング培地中でmRNAリプログラミングカクテル1.5μgで毎日トランスフェクトして（図4を参照）、37°C、5%CO、および21%O2で一晩インキュベートした。トランスフェクションを完了した後、培地を12日目まで毎日交換した。次いで、12日目にリプログラミング生産性を評価するためにiPS細胞コロニー同定に関してStemgent StainAlive（商標）（Stemgent）TRA-1-81抗体で各ウェルを個々に染色した。コロニーは、わずか6回のトランスフェクションを施したウェルで出現した。最大iPS細胞コロニー生産性は、初代患者線維芽細胞試料に8〜12回のmRNAトランスフェクションを施した際に観察された。
【０２０９】
実施例4
小型方式および大気中酸素圧におけるiPS細胞コロニー形成
図5に示されるように、miRNAの添加は、小型12ウェル型式および大気中酸素圧でのiPS細胞コロニー誘導を支持する。2つの患者由来のヒト皮膚線維芽細胞培養液を、Matrigel（商標）でコーティングした12ウェルプレートのウェル1つ当たり25,000個の細胞で播種して、37°Cおよび5%CO2で一晩培養した。次いで、培養液を、モル比3:1:1:1:1:1でmRNAカクテルOct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28およびnGFP 0.5μgまたは0.75μgのいずれか、およびmiRNAカクテル、たとえばクラスターAまたはクラスターBで、図2Aで概要されるタイムラインに従って、表示したO2圧下でトランスフェクトした。5%O2のウェルを13日目に計数した一方で、21%O2のウェルは、iPS細胞コロニーの出現の遅延に起因して16日目に計数した。リプログラミング生産性を評価するために、Stemgent StainAlive（商標）TRA-1-81抗体で各ウェルを個々にアッセイおよび計数した。miRNAカクテルの包含により、低減された（5%）酸素圧および大気中（21%）酸素圧の両方において12ウェル培養型式でiPS細胞コロニー生成が可能となる。
【０２１０】
実施例5
フィーダーを含まない条件下でクローンmRNA iPS株化細胞の多脳性の継続的拡張および維持
図6は、フィーダーを含まない条件下でクローンmRNA iPS株化細胞の多脳性の継続的拡張および維持を実証する。Matrige（商標）上のPluriton（商標）リプログラミング培地中で誘導される初代mRNA iPS細胞コロニーは、その後にそれをMatrige（商標）上のNutriStem（商標）XF/FF培養培地中で継代培養するために、13日目に手で単離されて、多脳性に関する表面マーカー（TRA-1-81）を発現させ続け、フィーダー層と接触させていない組込みを含まないウイルスを含まないiPS株化細胞を生じた。
【０２１１】
実施例6
不応性系統においてリプログラミングを可能にするためのmiRNAの使用
mRNAと併せてmiRNA擬似体を使用して、mRNA単独またはmiRNA単独を含む方法に不応性である株化細胞から、iPS細胞コロニーを作製した。これらの標的細胞は、5,000個の細胞／ウェルでフィーダー層上へ播種される初代患者線維芽細胞であった。通常、リプログラミング実験は、6ウェル型式で100,000個を上回る細胞／ウェルを必要とする。新規の請求項に係る方法によれば、かかる多数の標的細胞は必要とされない。1つの形態において、新規方法は、6ウェル型式中で1,000〜10,000個の細胞／ウェルからの多脳性幹細胞の産生を提供する。
【０２１２】
以下で提示するタイムラインで示されるように、細胞を0日目に、また任意のmRNAトランスフェクションに先立って、miRNA（クラスターAまたはB）で処理した。次いで、それらを3日目にmiRNAおよびmRNAで同時トランスフェクトし、ここで、mRNAは、Oct4、Sox2、Klf4、MycおよびLin28の少なくとも1つをコードする。16日目まで毎日、細胞をmRNA単独で処理した。並行して、対照細胞をmRNAのみで16日間連続してトランスフェクトして、同一条件下で成長させたmiRNA+mRNAでトランスフェクトした細胞と比較した。細胞はすべて、トリプシン処理して、7日目にNuFF上で、指定細胞密度で再びプレートに蒔いた。Oct4、Sox2、Klf4、MycおよびLin28の少なくとも1つをコードするmRNAに加えて、miRNAクラスターA（hsa-mir-302a、hsa-mir-302b、hsa-mir-302c、hsa-mir-302dおよびhsa-mir-367）またはmiRNAクラスターB（hsa-mir-302a、hsa-mir-302b、hsa-mir-302c、hsa-mir-302d、hsa-mir-200c、hsa-mir-369-3pおよびhsa-mir-369-5p）のいずれかで処理した細胞は、多脳性幹細胞マーカーであるTra-1-81に関してポジティブ染色する1〜2個のコロニーを産生した一方で、mRNA単独で処理した細胞は、いかなるiPS細胞コロニーも生じなかった。
【０２１３】
フィーダー：  Nuff 300k／ウェル
標的細胞：  初代患者線維芽細胞-5k/ウェル、LN0005×3ウェル、LN0013×3ウェル
培地：  最初の5日間はLN培地、続いてPluriton 2532
プロトコル：  RNAiMAX試薬を使用してmRNA単独またはmRNA+2×miRNAトランスフェクション、7日目に細胞を分割、各ウェルをNuff上で50kおよび20kc細胞でプレートに蒔いた
必要とされるmRNA：  1.2ug／ウェル（Oct4、Sox2、Klf4、MycおよびLin28の少なくとも1つをコードする）、LN細胞に関してはR1
【０２１４】
【表７】
2015522257.tif 000014
【０２１５】
-2日目に、NuFFを300,000個の細胞／ウェルで6ウェルプレート上へ播種した。-1日目にLNH初代患者線維芽細胞を5,000個の細胞／ウェルでフィーダー層上へ播種した。0日目に、2つのウェルをmRNAでトランスフェクトして、4つのウェルをmiRNAでトランスフェクトした（2つのウェルはクラスターAで、2つのウェルはクラスターBで）。3日目に、2つのウェルをmRNAでトランスフェクトして、4つのウェルをmRNA+miRNAで同時トランスフェクトした（2つのウェルはクラスターAで、2つのウェルはクラスターBで）。残りの日数で、18日目まで細胞すべてをmRNAでトランスフェクトした。5日目に、mRNA+miRNAで処理したウェル中の細胞は、mRNA単独によるウェルよりも大きい形態学変化を示す。7日目に、細胞を分割して計数する。ウェル1つ当たりの細胞計数は、以下の通りである：
LN005 mRNA対照=5.35×105個
LN005 mRNA+miRNAクラスターA=8.1×105個
LN005 mRNA+miRNAクラスターB=8.1×105個
LN013 mRNA対照=6.6×105個
LN013 mRNA+miRNAクラスターA=1.12×106個
LN005 mRNA+miRNAクラスターB=1.0×106個
【０２１６】
細胞を、各条件に関して100k/ウェルおよび50k/ウェルで再びプレートに蒔いた。
【０２１７】
14日目に、iPSコロニーは、LN0013-mRNA+miRNA-B 100K/ウェルの試料中に出現した。20〜22日目に、LiveStain Tra-1-81を実施した。4つの陽性iPSであるクラスターAおよびBによるLN0013同時トランスフェクションに由来する2つのiPS、およびクラスターAによるLN0005同時トランスフェクションに由来する2つのiPSが検出されて、各条件から1つのiPSを増殖させた。
【０２１８】
結果を図7に示す。
【０２１９】
これらのデータにより、LN株化細胞（初代患者線維芽細胞）は、mRNA単独（3×トランスフェクションを行った）を使用してリプログラミングさせることが困難であることをが実証される。また、これらのデータにより、miRNAは、mRNAと組み合わせて、LN細胞と称される患者初代線維芽細胞の細胞増殖およびiPSリプログラミングを高めることが実証される。
【０２２０】
実施例7
iPS細胞作製の増強に関するmiRNAとsiRNAとの比較
これらのデータは、iPS細胞作製を高めるmiRNAおよびsiRNAの能力が比較される実験を示す。
【０２２１】
p53の阻害は、細胞増殖を増大させることがわかっている。p53を補充したOct4、Sox2、Klf4、MycおよびLin28の少なくとも1つをコードするmRNAで処理したiPS細胞の作製を、mRNAおよびmiRNAクラスターAまたはクラスターBで処理したiPS細胞の作製と比較した（以下に示す詳述を参照）。先の実験と同様に、標的初代患者線維芽細胞を、実験の継続期間中、NuFF層上で播種および成長させた。iPS細胞コロニーの産出数に対する培養液の分割の影響も決定した。
【０２２２】
ある特定の初代患者線維芽細胞をmRNA単独でリプログラミングするこれまでの試みが失敗に終わった一方で、miクラスターAまたはクラスターBの添加により、mRNAリプログラミングの効率が増大した。5,000個の細胞／ウェルに始まる非分割プロトコルでは、クラスターAまたはクラスターBのいずれかの条件下で57個のコロニーが産生された。1%を超えるこの効率は、他のリプログラミング系において通常観察されるいかなる効率よりも高い。対比して、p53を標的とするsiRNAの添加は最小の効果を有し、同数の細胞に始まる場合、たった1個のコロニーを生じるに過ぎなかった。
【０２２３】
初代患者細胞に対するmRNA、siRNAおよびmiRNAトランスフェクション
フィーダー：  Nuff 300k/ウェル、3002M lot# 868
標的細胞：  非分割に関して、初代患者線維芽細胞：5k/ウェル×3ウェル（一方のプレート中で）
分割に関して、初代患者線維芽細胞：10k/ウェル×3ウェル（他方のプレート中で）
培地：  Lot# 2567 B18R lot#1633の補充を伴ってPluriton 2532
プロトコル：  6〜7回のトランスフェクション後に10kウェルを分割、50kおよび100k細胞／ウェルで各ウェル（条件）を再びプレートに蒔いた（10kウェルの3つから6つのウェル）
必要とされるmRNA：  Oct4、Sox2、Klf4、MycおよびLin28の少なくとも1つをコードする1.2ug/ウェル、R4
【０２２４】
mRNAトランスフェクションは、0日目を除いて毎日4時間実施した。miRNAおよびsiRNAを0日目に添加した。
【０２２５】
0日目および3日目に4時間細胞をトランスフェクトすることにより、4つのウェル／6ウェルプレートに関してmiRNAを細胞へ導入した（3日目-miRNAをmRNAと同時トランスフェクトした）。
miRNA-クラスターA：miRNA 302A、302B、302C、302D、367
miRNA-クラスターB：miRNA 302A、302B、302C、302D、200C、369-3p、369-5p。
【０２２６】
miRNA粉末（1.0OD）+RNアーゼを含まないTE 250ul=20uMストックの1つのバイアルを使用した。
【０２２７】
等量（ul）の各miRNAストックをカクテルへ混合して、分取した。
【０２２８】
トランスフェクションに関して、培地2ml中でウェル／6ウェルプレート1つ当たりクラスターカクテル3.5ulを添加した。
（20000nM×3.5ul=X ul×2000ul、X=35nM  miRNAクラスターAおよびクラスターB、ウェル中のmiRNAの最終濃度は35nMである）
Aチューブ：miRNA AまたはB 7ul+Opti-M 117ul
Bチューブ：RNAiMAX 10.25ul+Opti-M 117ul
【０２２９】
AおよびBを混合して、室温で15分間維持した。複合体120ulを各ウェルへ添加した。
【０２３０】
0日目および4日目の2つのウェル／6ウェルプレートに関するsiRNA（4日目-mRNAと同時トランスフェクト）：
p53 siRNAストック20pmol/ul
Aチューブ：siRNA 1.5ul+Opti-M 250ul
Bチューブ： RNAiMAX 5ul+Opti-M 250ul
【０２３１】
AおよびBを混合して、室温で15分間維持した。複合体250ulを各ウェルへ添加した。
【０２３２】
【表８】
2015522257.tif 000015
【０２３３】
-2日目：NuFFを300,000個の細胞／ウェルで6ウェルプレート上へ播種
-1日目：初代患者線維芽細胞を5,000または10,000個の細胞／ウェルでフィーダー層上へ播種
0日目：miRNAまたはsiRNAトランスフェクトを実施した。mRNAトランスフェクションは0日目には実施しなかった。
3日目：
2つのウェルをmRNAでトランスフェクトした；
4つのウェルをmRNA+miRNAでトランスフェクトした（2つのウェルはクラスターAで、2つのウェルはクラスターBで）；
4日目：
4つのウェルをmRNAトランスフェクションでトランスフェクトした（miRNAウェル）
2つのウェルをmRNA+siRNAでトランスフェクトした
他の日：
mRNAトランスフェクションを17日目まで毎日実施した
4〜5日目に、初期の形態学変化が、miRNAでトランスフェクトしたウェル中の細胞で見られ始めていた。より高い細胞密度の細胞が、siRNAで処理した細胞で観察されたが、これらの細胞は、より少ない形態学変化を示した。
6日目：培養液を分割して、細胞を10kでプレートに蒔いて（初代患者線維芽細胞）、細胞を計数した。細胞計数／ウェルは以下の通りであった：
mRNA+miRNA A=9.1×105個
mRNA+miRNA B=8.77×105個
mRNA+siRNA A=8.3×106個
細胞を各条件に関して、60k、40kおよび20k/ウェルで再びプレートに蒔いた
12日目:
ある特定の小さなiPSが、5k-miRNA AおよびBウェルで出現する
多くの「緩い」クラスターは、分割ウェルmiRNA AおよびBで観察された
【０２３４】
【表９】
2015522257.tif 000016
【０２３５】
【表１０】
2015522257.tif 000017
【０２３６】
これらのデータは、UTC細胞が、mRNA単独の添加によりリプログラミングされないことが実証している。同様に、これらのデータは、miRNAで処理したUTC細胞が、mRNA単独または組み合わせでのmRNAおよびsiRNAのいずれかで処理したUTC細胞と比較した場合に効率的にリプログラミングされることを実証している。
【０２３７】
本明細書中で言及される特許および刊行物はすべて、本発明が関連する技術分野における当業者の水準を示している。この開示で引用される参照文献はすべて、各参照文献がその全体が個々に参照により援用されたのと同じ程度まで、参照により援用される。
【０２３８】
本発明が、目的を実行して、言及される目標および利点、並びに本発明中の固有のものを獲得するように十分に適応されることは当業者に容易に理解されよう。目下好ましい態様を代表するものとして本明細書中に記載される方法および組成物は、例示的であり、本発明の範囲に対する限定とは意図されない。本発明中の変更および他の用途は、当業者に思い付くものであり、それらは、本発明の精神内に包含され、特許請求の範囲により規定される。
【０２３９】
各種置換および修正が、本発明の範囲および精神を逸脱することなく、本明細書中に開示される本発明に対して成され得ることは、当業者に容易に明らかである。
【０２４０】
実例として本明細書中で適切に記載される本発明は、本明細書中に具体的に開示されない任意の要素（単数または複数）、限定（単数または複数）の非存在下で実施することができる。したがって、たとえば、本明細書中のそれぞれの場合で、用語「を含む」、「から本質的になる」、および「からなる」のいずれかが、他の2つの用語のどちらかで置き換えられてもよい。用いられてきた用語および表現は、説明の用語として使用されており、限定の用語としては使用されず、かかる用語および表現の使用において、図示および記載される特色の任意の等価体またはその一部を排除するという意図はなく、様々な修正が、請求項に係る本発明の範囲内で可能であることが認識される。したがって、本発明は、好ましい態様により具体的に開示されてきたが、開示される本明細書中の概念の任意の特色、修正および変動が当業者により行使され得ること、並びにかかる修正および変動が、説明および併記の特許請求の範囲により規定されるような本発明の範囲内であるとみなされることは理解されるべきである。
【０２４１】
さらに、本発明の特色または側面が、代替物のマーカッシュ群または他の集団に関して記載される場合、本発明はまた、マーカッシュ群または他の群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群に関してもそれにより記載されることが認識されよう。
【０２４２】
本発明を記載する状況において（特に、下記特許請求の範囲の状況において）、用語「不定冠詞（a）」および「不定冠詞（an）」および「定冠詞（the）」、並びに類似の指示対象の使用は、本明細書中で別記しない限り、または状況により明らかに矛盾しない限りは、単数形および複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。用語「を含む」、「を有する」、「を包含する」および「を含有する」は、別記しない限り、制約のない用語（すなわち、「を包含するが、限定されない」という意味）として解釈されるべきである。本明細書中の値の範囲の列挙は、本明細書中で別記しない限り、範囲内に収まるそれぞれ別個の値に対して個々に言及する簡便な方法として役立つと意図されるに過ぎず、それぞれ別個の値は、それが本明細書中で個々に列挙されたかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載した方法はすべて、本明細書中で別記しない限り、または他の場合で状況により明らかに矛盾しない限りは、任意の適した順序で実施され得る。本明細書中で提供されるあらゆる実施例または例示的言語（たとえば、「のような」）の使用は、単に本発明をより良好に明らかにするものと意図され、他の場合で特許請求されない限りは、本発明の範囲に対する限定を課さない。本明細書中の言語は、本発明の実施に必須であるような任意の特許請求されない要素を示していると解釈されるべきではない。
【０２４３】
本発明を実施するための本発明者らに公知の最良の様式を含む本発明の態様が、本明細書中に記載されている。これらの態様の変動は、先述の説明に目を通すと、当業者に明らかとなり得る。
【０２４４】
本発明者らは、当業者が適切であるような変動を用いることを予測し、また本発明者らは、本発明が、本明細書中に具体的に記載されるのと異なるやり方で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法令により許可されるように、併記の特許請求の範囲で列挙される主題のすべての修正および等価体を包含する。さらに、本発明のすべての考え得る変動における上述の要素の任意の組み合わせは、本明細書中で別記しない限り、または他の場合で状況により明らかに矛盾しない限りは、本発明により包含される。当業者は、ほんの日常的な実験を使用して、本明細書に記載した本発明の特定の態様に対する多くの等価体を認識するか、または確かめることが可能である。かかる等価体は、下記特許請求の範囲により包含されると意図される。
【０２４５】
参照文献
1. Warren, L., Manos, P.D., Ahfeldt, T., Loh, Y.H., Li, H., Lau, F., Ebina, W., Mandal, P.K., Smith, Z.D., Meissner, A., Daley, D.Q., Brack, A.S., Collins, J.J., Cowan, C., Schlaeger, T.M., Rossi, D.J. （2010） Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell, 7:618-30. 
2. Angel, M., Yanik, M.F. （2010） Innate Immune Suppression Enables Frequent Transfection with RNA Encoding Reprogramming Proteins. PLoS One 5:e11756. 
3. Yakubov, E., Rechavi, G., Rozenblatt, S., Givol, D. （2010） Reprogramming of Human Fibroblasts to Pluripotent Stem Cells using mRNA of Four Transcription Factors. Biochem Biophys Res Commun. 394:189. 
4. Anokye-Danso, F., Snitow, M. and Morrisey, E.E. （2012） How microRNAs Facilitate Reprogramming to Pluripotency J. Cell Science 125, 1-9.
5. Subramanyam, D. Lamouille S., Judson, R.L., Liu, J.Y., Bucay, N., Derynck, R., Blelloch, R. （2011） Multiple Targets of miR-302 and miR-372 Promote Reprogramming of Human Fibroblasts to Induced Pluripotent Stem Cells Nature Biotechnology May; 29（5）: 443-8.
6. U.S. 2013/0102768
【図１Ａ】
2015522257.tif 000018
【図１Ｂ】
2015522257.tif 000019
【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
2015522257.tif 000032
【図１１Ａ】
2015522257.tif 000033
【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
2015522257.tif 000035
【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ−１】
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【図１３Ａ−２】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年3月10日(2015.3.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞を産生する方法であって、
a.少なくとも1つのmRNAを標的細胞へ導入する工程と、
b.少なくとも1つのmiRNAを標的細胞へ導入する工程と、
c.前記標的細胞を培養する工程であって、それにより多能性幹細胞を産生する、培養する工程と
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記少なくとも1つのmRNAを前記細胞へ導入する工程、および／または前記少なくとも1つのmiRNAを前記標的細胞へ導入する工程は、少なくとも1回繰り返される、請求項1の方法。
【請求項３】
工程（a）に先立って、少なくとも1つのmiRNAは、前記標的細胞へ導入される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項４】
工程（a）および（b）は、順次行われる、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項５】
工程（a）および（b）は、同日に行われる、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項６】
前記幹細胞は、工程（a）の開始から2週未満で、工程（a）の開始から2週を超えて、または工程（a）の開始から2〜3週で産生される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項７】
前記幹細胞は、SSEA3、SSEA4、Tra-1-81、Tra-1-60、Rex1、Oct4、NanogおよびSox2からなる群から選択される表面マーカーの少なくとも1つを発現する、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項８】
前記幹細胞は、1年間を超えてインビトロで分裂することができ、および／または30継代を超えてインビトロで分裂することができ、および／またはアルカリホスファターゼもしくはヘキスト染色によりポジティブ染色することができ、および／またはテラトーマを形成することができる、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項９】
前記幹細胞は、胚様体を形成することができ、AFP、FOXA2およびGATA4からなる群から選択される1つまたは複数の内胚葉マーカー、および／またはCD34、CDH2（N-カドヘリン）、COL2A1、GATA2、HAND1、PECAM1、RUNX1、RUNX2からなる群から選択される1つまたは複数の中胚葉マーカー、および／またはALDH1A1、COL1A1、NCAM1、PAX6およびTUBB3（Tuj1）からなる群から選択される1つまたは複数の外胚葉マーカーを発現することができる、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１０】
少なくとも1つの幹細胞が産生される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１１】
前記miRNAおよび前記mRNAの一方または両方が、修飾ヌクレオチドを含む、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１２】
前記mRNAは、前記幹細胞のゲノムへ組み込まれない、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１３】
工程（a）および（b）において前記標的細胞へ導入される前記mRNAおよびmiRNAは、前記幹細胞中に存在しない、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１４】
前記培養する工程は、フィーダー層の非存在下で実施される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１５】
5%未満のO2、5%〜21%のO2または21%のO2から選択されるO2%で実施される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１６】
前記標的細胞は、線維芽細胞、内皮前駆細胞（L-EPC）を包含するが、これに限定されない末梢血由来細胞、臍帯血由来細胞型（CD34+）、上皮細胞およびケラチノサイトからなる群から選択される、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１７】
前記mRNAは、リプログラミング因子をコードする、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１８】
前記mRNAは、OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28、Nanog、Glis1、Sal4およびEsrbb1の少なくとも1つをコードする、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項１９】
前記miRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-367、hsa-miR-200c、hsa-miR-369-3pおよびhsa-miR-369-5pからなる群から選択されるmiRNAに対して80%またはそれ以上同一である少なくとも1つのmiRNAを含む、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項２０】
前記miRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302dおよびhsa-miR-367の組み合わせを含む、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項２１】
前記miRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-200c、hsa-miR-369-3pおよびhsa-miR-369-5pの組み合わせを含む、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項２２】
前記miRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302dおよびhsa-miR-367またはhsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-200C、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-369-5pの組み合わせ、またはhsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-200C、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-369-5pの組み合わせを含む、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項２３】
前記細胞は、ヒト細胞である、前述の請求項のいずれか1項の方法。
【請求項２４】
標的細胞において多能性を誘発する方法であって、
a.少なくとも1つのmRNAを前記標的細胞へ導入する工程と、
b.少なくとも1つのmiRNAを前記標的細胞へ導入する工程と、
c.前記標的細胞を培養する工程であって、それにより多能性幹細胞を産生する、培養する工程と
を含む、前記方法。
【請求項２５】
前述の請求項のいずれか1項の方法により産生される、少なくとも1つのmiRNAと組み合わせてリプログラミング因子をコードする少なくとも1つのmRNAを含む単離多能性幹細胞。
【請求項２６】
前記少なくとも1つのmRNAは、前記細胞のゲノムへ組み込まれない、前述の請求項のいずれか1項の方法により産生される単離多能性幹細胞。
【請求項２７】
工程（a）および（b）において前記標的細胞へ導入される前記mRNAおよびmiRNAは、前記幹細胞中に存在しない、前述の請求項のいずれか1項の方法により産生される単離多能性幹細胞。
【請求項２８】
前記少なくとも1つのmiRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-367、hsa-miR-200c、hsa-miR-369-3pおよびhsa-miR-369-5pからなる群から選択されるmiRNAに対して80%またはそれ以上同一である少なくとも1つのmiRNAを含むか、または前記miRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302dおよびhsa-miR-367の組み合わせを含むか、または前記miRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-200c、hsa-miR-369-3pおよびhsa-miR-369-5pの組み合わせを含むか、または前記miRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302dおよびhsa-miR-367またはhsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-200C、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-369-5pの組み合わせ、またはhsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-200C、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-369-5pの組み合わせを含む、請求項25〜27のいずれか1項の単離多能性幹細胞。
【請求項２９】
前記少なくとも1つのmRNAは、OCT4、SOX2、KLF4、c-MYCおよびLIN28の少なくとも1つをコードする、請求項25〜28のいずれか1項の単離多能性幹細胞。
【請求項３０】
請求項25〜29のいずれか1項および請求項44〜51のいずれか1項の単離多能性幹細胞を含む配合物。
【請求項３１】
免疫応答を抑制する化合物をさらに含む、請求項30の配合物。
【請求項３２】
少なくとも1つのmRNAおよび少なくとも1つのmiRNAを含む多能性幹細胞を産生するためのキット。
【請求項３３】
培養培地およびトランスフェクション試薬をさらに含む、請求項32のキット。
【請求項３４】
免疫応答を抑制する化合物をさらに含む、請求項33のキット。
【請求項３５】
疾患を伴う被験体を治療する方法であって、前記被験体に請求項25〜29のいずれか1項の単離多能性幹細胞または請求項44〜51のいずれか1項の単離多能性幹細胞の分化により産生される細胞を投与することを含む、前記方法。
【請求項３６】
疾患を伴う被験体を治療する方法であって、前記被験体に請求項1〜24のいずれか1項の方法により産生される単離多能性幹細胞または請求項44〜51のいずれか1項の単離多能性幹細胞の分化により産生される細胞を投与することを含む、前記方法。
【請求項３７】
疾患の治療のための化合物を同定する方法であって、請求項1〜24のいずれか1項の方法により産生される幹細胞または請求項44〜51のいずれか1項の単離多能性幹細胞の分化により産生される細胞を、所定の化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３８】
疾患を治療するための化合物の活性を決定する方法であって、請求項1〜24のいずれか1項の方法により産生される幹細胞または請求項44〜51のいずれか1項の単離多能性幹細胞の分化により産生される細胞を、疾患を治療することで知られる化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３９】
疾患を治療するための化合物の毒性を決定する方法であって、請求項1〜24のいずれか1項の方法により産生される幹細胞または請求項44〜51のいずれか1項の単離多能性幹細胞の分化により産生される細胞を、疾患を治療することで知られる化合物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４０】
前記細胞は、線維芽細胞、内皮前駆細胞（L-EPC）を包含するが、これに限定されない末梢血由来細胞、臍帯血由来細胞型（CD34+）、上皮細胞およびケラチノサイトからなる群から選択される、請求項35〜49のいずれかの方法。
【請求項４１】
前記mRNAおよび／または前記miRNAは、組換えベクター中で供給されない、請求項1〜24のいずれかの方法。
【請求項４２】
前記mRNAおよび／または前記miRNAは、DNAベクターまたはウイルスベクター中で供給されない、請求項1〜24のいずれかの方法。
【請求項４３】
疾患を伴う被験体を治療するための薬剤の製造のための、請求項1〜24のいずれか1項の方法により産生される幹細胞または請求項44〜51のいずれか1項の単離多能性幹細胞の分化により産生される細胞の使用。
【請求項４４】
miRNAと組み合わせてmRNAを含み、ならびに／あるいは前記mRNAおよび／または前記miRNAは、組換えベクター中で供給されず、ならびに／あるいは前記mRNAおよび／または前記miRNAは、DNAベクターまたはウイルスベクター中で供給されず、ならびに／あるいは前記幹細胞は、SSEA3、SSEA4、Tra-1-81、Tra-1-60、Rex1、Oct4、NanogおよびSox2からなる群から選択される表面マーカーの少なくとも1つを発現し、ならびに／あるいは前記幹細胞は、1年間を超えてインビトロで分裂することができ、および／または30継代を超えてインビトロで分裂することができ、および／またはアルカリホスファターゼもしくはヘキスト染色によりポジティブ染色することができ、および／またはテラトーマを形成することができ、ならびに／あるいは前記幹細胞は、胚様体を形成することができ、AFP、FOXA2およびGATA4からなる群から選択される1つまたは複数の内胚葉マーカー、および／またはCD34、CDH2（N-カドヘリン）、COL2A1、GATA2、HAND1、PECAM1、RUNX1、RUNX2からなる群から選択される1つまたは複数の中胚葉マーカー、および／またはALDH1A1、COL1A1、NCAM1、PAX6およびTUBB3（Tuj1）からなる群から選択される1つまたは複数の外胚葉マーカーを発現することができ、ならびに／あるいは前記mRNAは、前記幹細胞のゲノムへ組み込まれず、ならびに／あるいは前記mRNAおよびmiRNAは外因性であり、ならびに／あるいは前記標的細胞は、線維芽細胞、内皮前駆細胞（L-EPC）を包含するが、これに限定されない末梢血由来細胞、臍帯血由来細胞型（CD34+）、上皮細胞およびケラチノサイトからなる群から選択され、ならびに／あるいは前記mRNAは、リプログラミング因子をコードし、ならびに／あるいは前記mRNAは、OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28、Nanog、Glis1、Sal4およびEsrbb1の少なくとも1つをコードする単離幹細胞。
【請求項４５】
前記miRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-367、hsa-miR-200c、hsa-miR-369-3pおよびhsa-miR-369-5pからなる群から選択されるmiRNAに対して80%またはそれ以上同一である少なくとも1つのmiRNAを含む、請求項44の単離幹細胞。
【請求項４６】
前記miRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302dおよびhsa-miR-367の組み合わせを含む、請求項44〜45の単離幹細胞。
【請求項４７】
前記miRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-200c、hsa-miR-369-3pおよびhsa-miR-369-5pの組み合わせを含む、請求項44〜46の単離幹細胞。
【請求項４８】
前記miRNAは、hsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302dおよびhsa-miR-367またはhsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-200C、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-369-5pの組み合わせ、またはhsa-miR-302a、hsa-miR-302b、hsa-miR-302c、hsa-miR302d、hsa-miR-200C、hsa-miR-369-3p、hsa-miR-369-5pの組み合わせを含む、請求項44〜47の単離幹細胞。
【請求項４９】
前記細胞は、ヒト細胞である、請求項44〜48のいずれか1項の単離幹細胞。
【請求項５０】
前記mRNAおよび／または前記miRNAは、組換えベクター中で供給されない、請求項44〜49のいずれか1項の単離幹細胞。
【請求項５１】
前記mRNAおよび／または前記miRNAは、DNAベクターまたはウイルスベクター中で供給されない、請求項44〜50のいずれか1項の単離幹細胞。
【請求項５２】
工程（b）は、工程（a）に先行する、請求項1の方法。
【請求項５３】
工程（b）は、少なくとも1回繰り返される、請求項1の方法。
【請求項５４】
工程（b）の第1の出現は、0日目〜1日目に起こり、工程（b）は、1日目〜工程（a）の開始から３週までで選択される時点で繰り返される、請求項53の方法。
【請求項５５】
工程（b）は、少なくとも1回繰り返され、工程（b）の第２の出現は、工程（a）と同日に起こる、請求項1の方法。
【請求項５６】
工程（b）は、0日目〜1日目に行われ、工程（b）は、4日目〜5日目に行われ、工程（a）は、1日目〜12日目に行われる、請求項1の方法。
【請求項５７】
前記miRNAは、表1〜6に提示される少なくとも2つのmiRNAを含む、請求項1の方法。
【請求項５８】
前記mRNAは、OCT4、SOX2、KLF4、c-MYC、LIN28、Nanog、Glis1、Sal4およびEsrbb1の少なくとも1つをコードする、請求項1の方法。
【国際調査報告】
2015522257.tif 000041
2015522257.tif 000042