(57)【要約】  本発明は、トランスジェニック植物用のベクターアセンブリのための方法及びシステムに関する。サイクル時間を低減するために、均一でモジュール式のプロセスが使用され、本明細書中に提供される方法及びシステムは、９６ウエルプレートなどのマルチウエルプレートを用いてクローニングスループットを増加させることができる。いくつかの実施態様において、ベクターアセンブリプロセスにＰＣＲが関与しないので、本明細書中に提供される方法及びシステムは配列確認の必要性を排除又は低減する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）Ｋｏｚａｋ配列を含む第１のＤＮＡ分子を用意するステップと；
（ｂ）一方の末端にＫｏｚａｋ配列及び他方の末端に６フレーム終止配列を含む第２のＤＮＡ分子を用意するステップと；
（ｃ）６フレーム終止配列を含む第３のＤＮＡ分子を用意するステップと；
（ｄ）直鎖状ベクター配列を含む第４のＤＮＡ分子を用意するステップと；
（ｅ）少なくとも１つのリコンビナーゼの存在下で、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）のＤＮＡフラグメントを用いて生成物ベクターをアセンブルするステップと
を含む、ＤＮＡフラグメントアセンブリのための方法。
【請求項２】
ＤＮＡフラグメントが、ＰＣＲ増幅又は直接的ＤＮＡ合成を用いて得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素で第１のＤＮＡ分子を消化するステップであって、第１のＤＮＡ分子の消化産物がＫｏｚａｋ配列を含む、ステップと；
（ｂ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素で第２のＤＮＡ分子を消化するステップであって、第２のＤＮＡ分子の消化産物が一方の末端にＫｏｚａｋ配列及び他方の末端に６フレーム終止配列を含む、ステップと；
（ｃ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素で第３のＤＮＡ分子を消化するステップであって、第３のＤＮＡ分子の消化産物が６フレーム終止配列を含む、ステップと；
（ｄ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素で第４のＤＮＡ分子を消化するステップであって、第４のＤＮＡ分子の消化産物がベクター配列を含む、ステップと；
（ｅ）少なくとも１つのリコンビナーゼの存在下で、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の消化産物を用いて生成物ベクターをアセンブルするステップと
を含む、ＤＮＡフラグメントアセンブリのための方法。
【請求項４】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の消化産物を処理するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＤＮＡ増幅技術が使用されない、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ポリメラーゼ連鎖反応が使用されない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＩＩ型制限酵素が、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＭｌｙＩ及びそれらの組合せから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
第４のＤＮＡ分子が致死遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
致死遺伝子が、ｃｃｄＢである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｋｏｚａｋ配列が、その５’末端に３フレーム終止配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ｋｏｚａｋ配列が、配列番号１〜４３，６４〜７４及びそれらの相補体から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
３フレーム終止配列が、配列番号４４〜６２及びそれらの相補体から成る群から選ばれる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
６フレーム終止配列が、配列番号７５〜８０及びそれらの相補体から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
リコンビナーゼが、Ｉｎｔ、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、γδ、Ｔｎ３レゾルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎ、Ｆｉｓ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ及びＲｅｓから成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
第４のＤＮＡ分子の消化産物が、選択マーカーを含み、選択マーカーが、カナマイシン及びアンピシリン抵抗性遺伝子から成る群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
（ａ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第１のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント１であって、Ｋｏｚａｋ配列を含む、ＤＮＡフラグメント１と；
（ｂ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第２のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント２であって、一方の末端にＫｏｚａｋ配列及び他方の末端に６フレーム終止配列を含む、ＤＮＡフラグメント２と；
（ｃ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第３のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント３であって、６フレーム終止配列を含む、ＤＮＡフラグメント３と；
（ｄ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第４のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント４であって、ベクター配列を含む、ＤＮＡフラグメント４と；
（ｅ）ＤＮＡフラグメント１、２、３及び４を用いて生成物ベクターをアセンブルするための少なくとも１つのリコンビナーゼと
を含む、ＤＮＡフラグメントアセンブリのためのシステム。
【請求項１７】
３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
ＩＩ型制限酵素が、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＭｌｙＩ及びそれらの組合せから成る群から選ばれる、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１９】
リコンビナーゼが、Ｉｎｔ、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、γδ、Ｔｎ３レゾルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎ、Ｆｉｓ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ及びＲｅｓから成る群から選ばれる、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２０】
ＤＮＡフラグメント４が、選択マーカーを含み、選択マーカーが、カナマイシン及びアンピシリン抵抗性遺伝子から成る群から選ばれる、請求項１６に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に、分子生物学の分野、より具体的には、トランスジェニック植物用ベクターを構築するためのＤＮＡフラグメントアセンブリの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子機能を研究するために植物に導入遺伝子を導入するための数種の方法が開発された。一般に、トランスジェニック植物を産生するためのこれらのシステムは、いくつかの共通した特徴を有する：（１）遺伝子デリバリーシステム、（２）形質転換されていないものから形質転換された細胞又は植物を識別するための選択システム、及び（３）（さらに、しばしば稔性である）完全な植物を産生するための再生手順。使用されたすべてのシステムの中でも、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を介する遺伝子移入及び（組織培養における）微粒子銃は、トランスジェニック植物を作製するために近年普及している。
【０００３】
従来、特異的なシス−及び／又はトランス−エレメントが異なる植物及びしばしば植物の異なる部分／組織のために必要であることもあって、制限酵素及びリガーゼを用いるトランスジェニック植物用ベクターのクローニングは時間がかかって労働集約的であった。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がクローニングのために広く使用されてきた。しかしながら、ＰＣＲを使用して作製されたベクターは、ＰＣＲのエラーを起こしやすい性質のために配列確認を必要とする。近年、部位特異的リコンビナーゼ及びトランスポサーゼが一般的なクローニングのために開発された。しかしながら、トランスジェニック植物用ベクターアセンブリへのそれらの応用の収めた成功は限定的であった。
【０００４】
したがって、トランスジェニック植物のためのハイスループットなベクターアセンブリ方法を提供する必要が依然としてある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、トランスジェニック植物用ベクターを構築するためのＤＮＡフラグメントアセンブリのための方法及びシステムに関する。サイクル時間を低減するために、均一でモジュール式の方向性のある正確なベクターアセンブリ用プロセスが使用され、本明細書中に提供される方法及びシステムは、９６ウエルプレートなどのマルチウエルプレートを用いてクローニングスループットを増加させることができる。いくつかの実施態様において、ベクターアセンブリプロセスにＰＣＲが関与しないため、本明細書中に提供される方法及びシステムは配列確認の必要性を排除又は低減する。
【０００６】
一態様において、方向性のあるＤＮＡフラグメントアセンブリのための方法が提供される。本方法は：
（ａ）ＰＣＲ増幅し、合成し、又は少なくとも１つのＩＩ型制限酵素でプラスミドを消化して、第１のＤＮＡ分子を得るステップであって、第１のＤＮＡ分子がＫｏｚａｋ配列を含む、ステップと；
（ｂ）ＰＣＲ増幅し、合成し、又は少なくとも１つのＩＩ型制限酵素でプラスミドを消化して、第２のＤＮＡ分子を得るステップであって、第２のＤＮＡ分子が一方の末端にＫｏｚａｋ配列及び他方の末端に６フレーム終止配列（a six frame stop sequence）を含む、ステップと；
（ｃ）ＰＣＲ増幅し、合成し、又は少なくとも１つのＩＩ型制限酵素でプラスミドを消化して、第３のＤＮＡ分子を得るステップであって、第３のＤＮＡ分子が６フレーム終止配列を含む、ステップと；
（ｄ）ＰＣＲ増幅し、合成し、又は少なくとも１つのＩＩ型制限酵素でプラスミドを消化して、第４のＤＮＡ分子を得るステップであって、第４のＤＮＡ分子がベクター配列を含む、ステップと；
（ｅ）少なくとも１つのリコンビナーゼの存在下で、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の消化産物を用いて生成物ベクターをアセンブルするステップと
を含む。
【０００７】
別の態様において、正確かつ方向性のあるＤＮＡフラグメントアセンブリのための方法が提供される。本方法は：
（ａ）ＰＣＲ増幅し、合成し又は少なくとも１つのＩＩ型制限酵素でプラスミドを消化して、ＤＮＡフラグメント１を作製するステップであって、ＤＮＡフラグメント１が５’ベクターホモロジー配列（5' vector homology sequence）及びＫｏｚａｋ配列に隣接する、ステップと；
（ｂ）ＰＣＲ増幅し、合成し又は少なくとも１つのＩＩ型制限酵素でプラスミドを消化して、ＤＮＡフラグメント２を作製するステップであって、ＤＮＡフラグメント２がＫｏｚａｋ配列及び６フレーム終止配列に隣接する、ステップと；
（ｃ）ＰＣＲ増幅し、合成し又は少なくとも１つのＩＩ型制限酵素でプラスミドを消化して、ＤＮＡフラグメント３を作製するステップであって、ＤＮＡフラグメント３が６フレーム終止配列及び３’ベクターホモロジー配列（3' vector homology sequence）に隣接する、ステップと；
（ｄ）ＰＣＲ増幅し、合成し又は少なくとも１つのＩＩ型制限酵素でプラスミドを消化して、ＤＮＡフラグメント４を作製するステップであって、ＤＮＡフラグメント４が３’ベクターホモロジー配列及び５’ベクターホモロジー配列に隣接するベクター配列を含む、ステップと；
（ｅ）少なくとも１つのリコンビナーゼの存在下で、ＤＮＡフラグメント１、２、３及び４を用いて生成物ベクターをアセンブルするステップと
を含む。
【０００８】
提供される方法の一実施態様において、本方法は、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素でステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の消化産物を処理するステップをさらに含む。別の実施態様において、ＤＮＡ増幅技術は使用されない。さらなる実施態様において、ポリメラーゼ連鎖反応は使用されない。
【０００９】
別の実施態様において、ＩＩ型制限酵素は、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＭｌｙＩ及びそれらの組合せから成る群から選ばれる。別の実施態様において、第４のＤＮＡ分子は、致死遺伝子を含む。さらなる実施態様において、致死遺伝子は、ｃｃｄＢである。別の実施態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号１〜４３、６４〜７４又はそれらの相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する。さらなる実施態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、配列番号１〜４３、６４〜７４及びそれらの相補体から成る群から選ばれる。別の実施態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、その５’末端に３フレーム終止配列を含む。さらなる実施態様において、３フレーム終止配列は、配列番号４４〜６２及びそれらの相補体から成る群からのものである。別の実施態様において、６フレーム終止配列は、配列番号７５〜８０又はそれらの相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する。さらなる実施態様において、６フレーム終止配列は、配列番号７５〜８０及びそれらの相補体から成る群から選ばれる。
【００１０】
別の実施態様において、リコンビナーゼは、Ｉｎｔ、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、γδ、Ｔｎ３レゾルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎ、Ｆｉｓ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ及びＲｅｓから成る群から選ばれる。別の実施態様において、リコンビナーゼは、部位特異的リコンビナーゼではない。別の実施態様において、リコンビナーゼは、バクテリオファージによりコードされるタンパク質を含まない。さらなる実施態様において、バクテリオファージは、ラムダ、ファイ８０、Ｐ２２、Ｐ２、１８６、Ｐ４及びＰ１から成る群から選ばれる。別の実施態様において、第４のＤＮＡ分子の消化産物は、選択マーカーを含む。さらなる実施態様において、選択マーカーは、抗生物質抵抗性遺伝子を含む。さらなる又は代替の実施態様において、選択マーカーは、カナマイシン及びアンピシリン抵抗性遺伝子から成る群から選ばれる。別の実施態様において、ステップ（ａ）〜（ｅ）は、インビトロで実施される。別の実施態様において、アセンブル生成物であるベクターは、トランスジェニック植物における使用のためのものである。さらなる又は代替の実施態様において、アセンブル生成物であるベクターは、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を介する形質転換のためのバイナリーベクターである。別の実施態様において、アセンブル生成物であるベクターは、ｌｏｘ部位、ｐｓｉ部位、ｄｉｆ部位、ｃｅｒ部位、ｆｒｔ部位、ａｔｔ部位及びそれらの組合せから成る群から選ばれる組換え部位を含まない。
【００１１】
別の態様において、ベクターを構築するために、ＤＮＡフラグメントアセンブリのためのシステムが提供される。システムは：
（ａ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第１のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント１であって、Ｋｏｚａｋ配列を含む、ＤＮＡフラグメント１と；
（ｂ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第２のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント２であって、一方の末端にＫｏｚａｋ配列及び他方の末端に６フレーム終止配列を含む、ＤＮＡフラグメント２と；
（ｃ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第３のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント３であって、６フレーム終止配列を含む、ＤＮＡフラグメント３と；
（ｄ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第４のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント４であって、ベクター配列を含む、ＤＮＡフラグメント４と；
（ｅ）ＤＮＡフラグメント１、２、３及び４を用いて生成物ベクターをアセンブルするための少なくとも１つのリコンビナーゼと
を含む。
【００１２】
別の態様において、ベクターアセンブリのためのシステムが提供される。システムは：
（ａ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第１のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント１であって、５’ベクターホモロジー配列及びＫｏｚａｋ配列に隣接する、ＤＮＡフラグメント１と；
（ｂ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第２のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント２であって、Ｋｏｚａｋ配列及び６フレーム終止配列に隣接する、ＤＮＡフラグメント２と；
（ｃ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第３のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント３であって、６フレーム終止配列及び３’ベクターホモロジー配列に隣接する、ＤＮＡフラグメント３と；
（ｄ）少なくとも１つのＩＩ型制限酵素を用いて第４のＤＮＡ分子から消化されたＤＮＡフラグメント４であって、３’ベクターホモロジー配列及び５’ベクターホモロジー配列に隣接するベクター配列を含む、ＤＮＡフラグメント４と；
（ｅ）ＤＮＡフラグメント１、２、３及び４を用いて生成物ベクターをアセンブルするための少なくとも１つのリコンビナーゼと
を含む。
【００１３】
提供されるシステムの一実施態様において、システムは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素をさらに含む。別の実施態様において、ＤＮＡ増幅技術は使用されない。さらなる実施態様において、ポリメラーゼ連鎖反応は使用されない。
【００１４】
一実施態様において、ＩＩ型制限酵素は、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＭｌｙＩ及びそれらの組合せから成る群から選ばれる。別の実施態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、ＣＣＡＣＣＡＴＧ、ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ又はそれらの相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する。さらなる実施態様において、Ｋｏｚａｋ配列は、ＣＣＡＣＣＡＴＧ、ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ及びそれらの相補体から成る群から選ばれる。別の実施態様において、６フレーム終止配列は、ＣＴＡＡＣＴＡＡＴＮＡＧ、ＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＣＴＡＧ又はそれらの相補体に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％の同一性を有する。さらなる実施態様において、６フレーム終止配列は、ＣＴＡＡＣＴＡＡＴＮＡＧ、ＣＴＡＧＡＣＴＡＧＴＣＴＡＧ及びそれらの相補体から成る群から選ばれる。
【００１５】
一実施態様において、リコンビナーゼは、Ｉｎｔ、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、ＩＨＦ、Ｘｉｓ、γδ、Ｔｎ３レゾルバーゼ、Ｈｉｎ、Ｇｉｎ、Ｃｉｎ、Ｆｉｓ、ＴｎｄＸ、ＸｅｒＣ、ＸｅｒＤ及びＲｅｓから成る群から選ばれる。別の実施態様において、リコンビナーゼは、部位特異的リコンビナーゼではない。別の実施態様において、リコンビナーゼは、バクテリオファージによりコードされるタンパク質を含まない。さらなる実施態様において、バクテリオファージは、ラムダ、ファイ８０、Ｐ２２、Ｐ２、１８６、Ｐ４及びＰ１から成る群から選ばれる。別の実施態様において、ＤＮＡフラグメント４は、選択マーカーを含む。さらなる実施態様において、選択マーカーは、抗生物質抵抗性遺伝子を含む。さらなる又は代替の実施態様において、選択マーカーは、カナマイシン及びアンピシリン抵抗性遺伝子から成る群から選ばれる。別の実施態様において、アセンブル生成物であるベクターは、トランスジェニック植物における使用のためのものである。さらなる又は代替の実施態様において、アセンブル生成物であるベクターは、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を介する形質転換のためのバイナリーベクターである。別の実施態様において、アセンブル生成物であるベクターは、ｌｏｘ部位、ｐｓｉ部位、ｄｉｆ部位、ｃｅｒ部位、ｆｒｔ部位、ａｔｔ部位及びそれらの組合せから成る群から選ばれる組換え部位を含まない。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】複数のクローニング部位を用いる伝統的なクローニング（ＭＣＳ；経路１）と本明細書中に提供されるハイスループットベクターアセンブリ（経路２）の間の比較を示す図である。
【図２Ａ】本明細書中に提供される方法及びシステムの代表的実施態様を示す図である。Ｋｏｚａｋ配列は、第１及び第２の両フラグメント中に存在し、６フレーム終止配列は、第２及び第３の両フラグメント中に存在する。これらのフラグメントは、ＰＣＲにより作製されたフラグメントを含む多様なアプローチを用いて得られ得る。
【図２Ｂ】フラグメントがＩＩ型制限酵素を用いて異なるプラスミドから作製される、本明細書中に提供される方法及びシステムの別の代表的実施態様を示す図である。Ｋｏｚａｋ配列は、第１及び第２の両フラグメント中に存在し、６フレーム終止配列は、第２及び第３の両フラグメント中に存在する。これらのフラグメントは、ＰＣＲを用いて作製されない。
【図３】代表的なＫｏｚａｋ配列のリストを示す図である（配列番号１〜４３）。
【図４】Ｋｏｚａｋ配列に連結可能な代表的３フレーム終止配列のリストを示す図である（配列番号４４〜６２）。配列番号６３は、代表的Ｋｏｚａｋ配列＋３フレーム終止配列を示す。
【図５Ａ】代表的な双子葉植物のＫｏｚａｋ配列のリストを示す図である。
【図５Ｂ】代表的な６フレーム終止配列のリストを示す図である（配列番号７５〜８０）。
【図６】第１のＤＮＡ分子（プロモーターベクター）から消化された代表的なフラグメント１（プロモーターフラグメント）を示す図である。フラグメント１は、Ｋｏｚａｋ配列をその３’末端に含む。
【図７】第２のＤＮＡ分子（ＣＤＳベクター）から消化された代表的なフラグメント２（コーディング配列フラグメント）を示す図である。フラグメント２は、Ｋｏｚａｋ配列をその５’末端に及び６フレーム終止配列をその３’末端に含む。
【図８】第３のＤＮＡ分子（３’ＵＴＲベクター）から消化された代表的なフラグメント３（３’ＵＴＲフラグメント）を示す図である。フラグメント３は、６フレーム終止配列をその５’末端に含む。
【図９】第４のＤＮＡ分子（バックボーンベクター）から消化された代表的なフラグメント４（３’ＵＴＲフラグメント）を示す図である。
【図１０Ａ−Ｂ】本明細書中に提供される方法及び／又はシステムを用いる別の代表的なベクターアセンブリを示す図である。プロモーター及びＣＤＳフラグメントは、３フレーム終止配列をその５’末端に含むＫｏｚａｋ配列を含有する。４つのフラグメントは、１つのステップで発現ベクター中にアセンブルされる。
【図１１】本明細書中に提供される方法及び／又はシステムを用いる代表的なベクターアセンブリを示す図である。４つのフラグメントは、１つのステップで発現ベクター中にアセンブルされる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
トランスジェニック植物の産生は、多くの植物種にとってルーチンとなっているが、現行の方法論は労働集約的である。したがって、開示された方法及びシステムの目標は、一貫性のある及び／又は正確な様式のハイスループットアプリケーションに好適なベクターアセンブリ方法を提供することである。
【００１８】
従来の遺伝子クローニングにおいて、好適な制限酵素は、それがベクタープラスミド中に挿入可能となる前に標的遺伝子の配列に基づいて同定される。ベクターＤＮＡ及び遺伝子挿入断片はどちらも典型的に、同じ制限酵素（複数可）で切断され、次いでＤＮＡリガーゼによって一緒に連結される。このプロセスは、ＤＮＡフラグメントの手動の取扱いを必要とし、これは、望ましくない複数のクローニング部位配列の挿入、より具体的には、遺伝子発現に影響しうるプロモーターとコーディング配列の間への挿入を必要とする。さらに、コーディング配列又は遺伝要素は、選ばれた酵素によっても認識される内部制限部位を含有する場合もあり、これらはクローニング前に修飾を必要とする。したがって、より効率的かつ有効なベクターアセンブリプロセスは、ハイスループットクローニング／アプリケーションに適応できることが必要とされる。
【００１９】
所与の生物のためのすべてのベクターの間で一定である特定の配列結合部を用いるベクターアセンブリのための方法及びシステムが提供される。提供される方法及びシステムの設計は、先に知られたクローニング方法とは対照的に、ハイスループットクローニング／アプリケーションを可能とする。例えば、コーディング配列の５’及び３’末端におけるＫｏｚａｋ／コンセンサス配列（Kozak M.,1991）及び（１つ超のフレーム中の）終止コドン並びにそれらに隣接するＤＮＡフラグメントの末端における同配列は、トランスジェニック植物用に設計されるベクターに使用可能である。これらの配列は、安定な遺伝子発現のための決定的な生物学的機能を提供する一方、ＤＮＡ組換え技術を用いる直鎖状ＤＮＡフラグメントアセンブリに必要とされる重要な配列相同性の役割をする。
【００２０】
いかなる望ましくない介在配列も含まない機能的転写単位中にＤＮＡフラグメントをアセンブルするファストトラックかつハイスループット（ＨＴＰ）プロセスが提供される。プロセスは、コーディング領域の５’及び３’結合部上の独特の生物特異的な小さな配列を利用した。これら独特の結合部のマイクロホモロジーは、プロモーター、コーディング配列及び３’ＵＴＲを所望の方向にアセンブルするために使用される。独特のＫｏｚａｋ／コンセンサス配列は、５’接合部に挿入可能である一方、６フレーム終止コドンはコーディング配列の３’に付加可能である。プロモーターの３’へのＫｏｚａｋ／コンセンサス配列の挿入及び３’ＵＴＲの５’への６フレーム終止コドンの付加は、ＤＮＡ組換え技術を用いてＨＴＰベクターを作るために必要な結合部相同性を提供する。
【００２１】
いくつかの実施態様において、本明細書中に提供されるベクターアセンブリ用にプラスミドからＤＮＡフラグメントを抽出するためのＩＩ型制限酵素の使用が提供される。平滑末端又は短い３’オーバーハングを与えるＩＩ型制限酵素（表１を参照のこと）が本発明のために使用される。シームレスクローニング又は類似の酵素の３’→５’エキソヌクレアーゼ活性は、クローニングプロセスの間にフラグメントを平滑末端化する。本発明は、ｃｃｄＢなどの致死遺伝子の、バックボーン抽出のために使用されるベクター中での使用も記述する。さらに、シームレスアセンブリ用のフラグメントを抽出するために使用されるベクターとは異なるバックボーン上で選択マーカーが使用される。バックボーンベクター上のネガティブ選択マーカーは、可能性のある未切断バックボーンベクターに関するバックグラウンドクローンを回避する一方、フラグメントベクター上の異なる選択マーカーは未切断のフラグメントベクター混入によるバックグラウンドを防ぐ。
【００２２】
クローニングに適合したＤＮＡフラグメントをプラスミドから直接抽出するためのＩＩ型制限酵素の使用は、ＰＣＲ増幅を不要とする。小さな３’オーバーハング又は平滑末端フラグメントがプラスミドの制限酵素による切断（plasmid restriction）後に放出されるように、ＤＮＡフラグメントは両末端でＩＩ型制限酵素部位に隣接する所望の生成物ベクターにアセンブルされることができる。技術をモジュール式で、ハイスループットかつ自動化されたものとするための適合性フラグメントのライブラリーを抽出し、構築するためのプラットフォームが提供される。いくつかの実施態様において、ドナーベクター／プラスミド中でのネガティブ選択マーカーの使用が提供され、生成物ベクターのベクターバックボーンはポジティブ選択マーカーを含みうる。これらの実施態様は、可能性のある未切断ベクターからのバックグラウンドを防止し、提供される方法及びシステムが特定の状況下でより効率的であることを可能とする。
【００２３】
本明細書中で使用されるとおり、句「ベクター」は、典型的に二重鎖であるＤＮＡ断片をさし、これは、その中に外来のＤＮＡ断片を挿入されることができる。ベクターは、例えば、プラスミド又はウイルス起源であることができ、これは典型的に、選択可能又はスクリーニング可能なマーカー又は導入遺伝子をコードする。ベクターは、外来又は異種ＤＮＡを好適な宿主細胞中に運ぶために使用される。いったん宿主細胞中に入ると、ベクターは宿主の染色体ＤＮＡとは独立して又は同時に複製可能である。或いは、ベクターは宿主染色体中への外来又は異種ＤＮＡの挿入を目標とすることができる。
【００２４】
本明細書中で使用されるとおり、句「導入遺伝子ベクター」は、挿入されたＤＮＡセグメント、ｍＲＮＡに転写されるか又は宿主細胞内でＲＮＡとして複製される「導入遺伝子」、を含有するベクターをさす。句「導入遺伝子」は、ＲＮＡに変換される挿入されたＤＮＡの部分だけでなく、ＲＮＡの転写又は複製に必要なベクターの部分もさす。導入遺伝子は典型的に、着目の遺伝子を含むが、タンパク質を産生することのできるオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチド配列を必ずしも含む必要はない。
【００２５】
本明細書中で使用されるとおり、句「形質転換された」又は「形質転換」は、細胞中へのＤＮＡの導入をさす。句「形質転換体」又は「トランスジェニック」は、形質転換された又は形質転換手順を受けた植物細胞、植物などをさす。導入されたＤＮＡは、通常、挿入されたＤＮＡ断片を含有するベクターの形態である。
【００２６】
本明細書中で使用されるとおり、句「選択マーカー」又は「選択マーカー遺伝子」は、例えば、選択剤から植物細胞を保護するため、又は選択剤に対する抵抗性／又は耐性を与えるための植物の形質転換において場合により使用される遺伝子をさす。機能的な選択マーカーを受容する細胞又は植物のみが、選択剤を含む条件下で分裂又は成長することができる。選択剤の例としては、例えば、スペクチノマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン及びヒグロマイシンを含む抗生物質が挙げられる。これらの選択マーカーは、抗生物質カナマイシンに対する抵抗性を与える酵素を発現するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｐｔ  ＩＩ）を含み、並びに関連する抗生物質ネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン及びＧ４１８遺伝子、又はヒグロマイシンに対する抵抗性を与える酵素を発現するヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｈｐｔ）を含む。他の選択マーカー遺伝子としては、Ｂａｒ（ＢＡＳＴＡ（登録商標）（グルホシネートアンモニウム）、又はホスフィノスリシン（ＰＰＴ）に対する抵抗性）、アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ、スルホニルウレア（ＳＵ）、イミダゾリノン（ＩＭＩ）、トリアゾロピリミジン（ＴＰ）、ピリミジニルオキシベンゾエート（ＰＯＢ）及び分岐鎖アミノ酸合成の最初のステップを防ぐスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンなどの阻害剤に対する抵抗性）、グリホサート、２，４−Ｄを含む除草剤に対する抵抗性並びに金属抵抗性又は感受性をコードする遺伝子が挙げられる。句「マーカー陽性」は、形質転換されて選択マーカー遺伝子を含む植物をさす。
【００２７】
選ばれた発現ベクター中に多様な選択可能又は検出可能なマーカーが組み込まれて、形質転換された植物又は形質転換体の同定及び選択を可能とする。形質転換された植物中での選択マーカーの発現を確認するために、例えば、ＤＮＡ配列決定及びＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、サザンブロッティング、ＲＮＡブロッティング、例えば、ホスフィノスリシン抵抗性を仲介する沈殿タンパク質又は他のタンパク質、例えば、レポーター遺伝子β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ルシフェラーゼ、緑色蛍光たんぱく質（ＧＦＰ）、ＤｓＲｅｄ，β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アルカリホスファターゼなどの、ベクターから発現されたタンパク質の検出のための免疫学的方法などを含む多くの方法が利用可能である（参照することにより、その全体が本明細書中に組み込まれる、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001を参照のこと）。
【００２８】
選択マーカー遺伝子は、形質転換細胞又は組織の選択のために利用される。選択マーカー遺伝子は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）及びヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードするものなどの抗生物質抵抗性をコードする遺伝子並びに除草性化合物に対する抵抗性を与える遺伝子を含む。除草剤抵抗性遺伝子は一般に、除草剤に対して非感受性の修飾標的タンパク質又は除草剤が作用できる前に植物中の除草剤を分解若しくは無毒化する酵素をコードする。DeBlockら、(1987) EMBO J., 6:2513-2518: DeBlockら、(1989) Plant Physiol., 91:691-704；Frommら、(1990) 8:833-839；Gordon-Kammら、(1990)2:603-618を参照のこと。例えば、グリホサート又はスルホニルウレア除草剤に対する抵抗性は、変異標的酵素、５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰＳ）及びアセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）をコードする遺伝子を用いて獲得されている。グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル及び２，４−ジクロロフェノキシアセテート（２，４−Ｄ）に対する抵抗性は、各除草剤を無毒化するホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ、ニトリラーゼ又は２，４−ジクロロフェノキシアセテートモノオキシゲナーゼをコードする細菌遺伝子を用いて獲得されている。２，４−Ｄ抵抗性のための酵素／遺伝子は、参照することによりその全体が本明細書中に組み込まれるＵＳ２００９／００９３３６６及びＷＯ２００７／０５３４８２に先に開示されている。
【００２９】
他の除草剤は、成長点又は分裂組織を阻害することができ、イミダゾリノン又はスルホニルウレアを含む。このカテゴリーの代表的遺伝子は、例えば、Leeら、EMBO J. 7:1241(1988)；及びMikiら、Theon. Appl. Genet. 80:449(1990)にそれぞれ記載されたとおり、変異ＡＬＳ及びＡＨＡＳ酵素をコードする。
【００３０】
グリホサート抵抗性遺伝子は、（組換え核酸の導入及び／又は天然のＥＰＳＰ遺伝子の様々な形態のインビボ突然変異誘発を介する）変異５−エノールピルビルシキメート−３−ホスフェートシンターゼ（ＥＰＳＰ）遺伝子、アロＡ遺伝子及びグリホサートアセチルトランスフェラーゼ（ＧＡＴ）遺伝子をそれぞれ含む。他のホスホノ化合物のための抵抗性遺伝子は、グルホシネート（ストレプトミセス・ヒグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）及びストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）を含むストレプトミセス種（Streptomyces species）由来のホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）遺伝子）及びピリジノキシ又はフェノキシプロピオン酸及びシクロヘキサン（ＡＣＣａｓｅ阻害剤をコードする遺伝子）を含む。例えば、植物にグリホサート抵抗性を与えることのできる形態のＥＰＳＰの核酸配列を開示するＳｈａｈらの米国特許第４，９４０，８３５号及びＢａｒｒｙらの米国特許第６，２４８，８７６号を参照のこと。変異アロＡ遺伝子をコードするＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ寄託番号３９２５６として得られることができ、変異遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌ−ホスフィノスリシンなどの除草剤に対する抵抗性を与えるグルタミンシンテターゼ遺伝子のヌクレオチド配列を開示する、Ｃｏｍａｉの米国特許第４，７６９，０６１号、Ｋｕｍａｄａらのヨーロッパ特許出願第０３３３０３３号及びＧｏｏｄｍａｎらの米国特許第４，９７５，３７４号に開示されている。ＰＡＴ遺伝子のヌクレオチド配列は、Ｌｅｅｍａｎｓらのヨーロッパ出願第０２４２２４６号中に提供される。DeGreefら、Bio/Technology 7:61(1989)も、ＰＡＴ活性をコードするキメラｂａｒ遺伝子を発現するトランスジェニック植物の産生を記載する。セトキシジム及びハロキシホップを含む、フェノキシプロピオン酸及びシクロヘキセンに対する抵抗性を与える遺伝子の代表例は、Marshallら、Theon. Appl. Genet. 83:435(1992)により記述されたＡｃｃｌ−Ｓｌ、Ａｃｃｌ−Ｓ２及びＡｃｃｌ−Ｓ３遺伝子である。グリホサート抵抗性を与えることのできるＧＡＴ遺伝子は、CastleらのＷＯ２００５０１２５１５に記載されている。２，４−Ｄ、ホップ及びピリジロキシオーキシン除草剤に対する抵抗性を与える遺伝子は、ＷＯ２００５１０７４３７及び米国特許出願第１１／５８７，８９３号に記載されている。
【００３１】
トリアジン（ｐｓｂＡ及び１ｓ＋遺伝子）又はベンゾニトリル（ニトリラーゼ遺伝子）を含む他の除草剤は、光合成を阻害することができる。Przibilaら、Plant Cell 3:169(1991)は、変異ｐｓｂＡ遺伝子をコードするプラスミドによるクラミドモナス（Chlamydomonas）の形質転換を記載する。ニトリラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列は、Stalkerの米国特許第４，８１０，６４８号に開示され、これらの遺伝子を含有するＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣ寄託番号５３４３５、６７４４１及び６７４４２により利用可能である。グルタチオンＳ−トランスフェラーゼをコードするＤＮＡのクローニング及び発現は、Hayesら、Biochem. J. 285:173(1992)に記載されている。
【００３２】
本発明の目的のために、選択マーカー遺伝子は：ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（Fraleyら、(1986) CRC Critical Reviews in Plant Science, 4:1-25）；シアナミドヒドラターゼ（Maier-Greinerら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:4250-4264）；アスパルテートキナーゼ；ジヒドロジピコリネートシンターゼ（Perlら、(1993) Bio/Technology, 11:715-718）；トリプトファンデカルボキシラーゼ（Goddijnら、(1993) Plant Mol. Bio., 22:907-912）；ジヒドロジピコリネートシンターゼ及び脱感作されたアスパルテートキナーゼ（Perlら、(1993) Bio/Technology, 11:715-718）；ｂａｒ遺伝子（Tokiら、(1992) Plant Physiol., 100:1503-1507及びMeagherら、(1996) Crop Sci., 36:1367）；トリプトファンデカルボキシラーゼ（Goddijnら、(1993) Plant Mol. Biol., 22:907-912）；ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）（Southernら、(1982) J. Mol. Appl. Gen., 1:327）；ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ又はＨＹＧ）（Shimizuら、(1986) Mol. Cell Biol., 6:1074）；ジヒドロフォレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）（Kwokら、(1986) PNAS USA 4552）；ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ（DeBlockら、(1987) EMBO J., 6:2513）；２，２−ジクロロプロピオニックアシッドデハロゲナーゼ（Buchanan-Wollatronら、(1989) J. Cell. Biochem. 13D:330）；アセトヒドロキシアシッドシンターゼ（Andersonら、米国特許第４，７６１，３７３号；Haughnら、(1988) Mol. Gen. Genet. 221:266）；５−エノールピルビル−シキメート−ホスフェートシンターゼ（ａｒｏＡ）（Comaiら、(1985) Nature 317:741）；ハロアリールニトリラーゼ（Stalkerら、ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ８７／０４１８１号）；アセチル−コエンザイムＡカルボキシラーゼ（Parkerら、(1990) Plant Physiol. 92:1220）；ジヒドロプテロエートシンターゼ（ｓｕｌ  Ｉ）（Guerineauら、(1990) Plant Mol. Biol. 15:127）；及び３２ｋＤフォトシステムＩＩポリペプチド（ｐｓｂＡ）（Hirschbergら、(1983) Science, 222:1346）をコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【００３３】
さらに含まれるのは：クロラムフェニコール（Herrera-Estrellaら、(1983) EMBO J., 2:987-992）；メトトレキセート（Herrera-Estrellaら、(1983) Nature, 303:209-213；Meijerら、(1991) Plant Mol Bio., 16:807-820 (1991)）；ヒグロマイシン（Waldronら、(1985) Plant Mol. Biol., 5:103-108；Zhijianら、(1995) Plant Science, 108:219-227及びMeijerら、(1991) Plant Mol. Bio. 16:807-820）；ストレプトマイシン（Jonesら、(1987) Mol Gen. Genet., 210:86-91）；スペクチノマイシン（Bretagne-Sagnardら、(1996) Transgenic Res., 5:131-137）；ブレオマイシン（Hilleら、(1986) Plant Mol. Biol., 7:171-176）；スルホンアミド（Guerineauら、(1990) Plant Mol. Bio., 15:127-136）；ブロモキシニル（Stalkerら、(1988) Science, 242:419-423）；２，４−Ｄ（Streberら、(1989) Bio/Technology, 7:811-816）；グリホサート（Shawら、(1986) Science, 233:478-481）；並びにホスフィノスリシン（DeBlockら、(1987) EMBO J., 6:2513-2518）に対する抵抗性をコードする遺伝子である。本開示に列挙されたすべての参考文献は、別段の定めのない限り、参照することによりその全体が本明細書中に組み込まれる。
【００３４】
選択マーカー及びレポーター遺伝子の上記リストは、限定的であることを意図されない。任意のレポーター又は選択マーカー遺伝子が本発明に包含される。必要に応じて、かかる遺伝子は、当技術分野において公知の方法によって配列決定される。
【００３５】
レポーター及び選択マーカー遺伝子は、植物中での最適の発現のために合成される。すなわち、遺伝子のコーディング配列は、植物中での発現を促進するために修飾されている。合成マーカー遺伝子は、より高い形質転換効率をもたらすより高いレベルにおいて植物中で発現されるように設計される。合成による遺伝子の最適化方法は、当技術分野で利用可能である。実際、植物中での遺伝子産物の発現を増加させるために、数種の遺伝子が最適化された。
【００３６】
マーカー遺伝子の配列は、特別な植物種中での発現のために最適化されることができ、或いは、植物群における最適の発現のために修飾されることができる。植物に好ましいコドンは、着目の特別な植物種において最大量で発現されるタンパク質中で最も頻度の高いコドンから決定されることができる。例えば、参照することにより本明細書中に組み込まれる、ＥＰＡ０３５９４７２；ＥＰＡ０３８５９６２；ＷＯ９１／１６４３２；Perlakら、(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:3324-3328；及びMurrayら、(1989) Nucleic Acids Research, 17:477-498；米国特許第５，３８０，８３１号；及び米国特許第５，４３６，３９1号を参照のこと。このように、ヌクレオチド配列は、任意の植物中での発現のために最適化されることができる。遺伝子配列のすべて又は任意の部分が最適化され又は合成によるものであってよいと認識される。すなわち、完全に最適化又は部分的に最適化された配列も使用されることができる。
【００３７】
さらに、アグロバクテリウム（Agrobacterium）を介する形質転換システムを利用する数種の形質転換ストラテジーが開発された。例えば、バイナリーベクターストラテジーは、残りのＴｉプラスミドとは異なるプラスミド中にＴ−ＤＮＡがあるツープラスミドシステム（two-plasmid system）に基づく。共組込み（co-integration）ストラテジーにおいては、Ｔ−ＤＮＡの小さな部分が外来遺伝子と同じベクター中に配置され、その後このベクターをＴｉプラスミドと組換える。
【００３８】
本明細書中で使用されるとおり、句「植物」は、双子葉植物及び単子葉植物を包含する。双子葉植物の例としては、タバコ、シロイヌナズナ、ダイズ、トマト、パパイヤ、カノーラ、ヒマワリ、ワタ、アルファルファ、ジャガイモ、ブドウ、キマメ、エンドウマメ、アブラナ、ヒヨコマメ、サトウダイコン、ナタネ、スイカ、メロン、コショウ、ピーナッツ、カボチャ（pumpkin）、ラディッシュ、ホウレンソウ、カボチャ（squash）、ブロッコリー、キャベツ、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハクサイ、キュウリ、ナス及びレタスが挙げられる。単子葉植物の例としては、トウモロコシ、コメ、コムギ、サトウキビ、オオムギ、ライムギ、ソルガム、ラン、タケ、バナナ、ガマ、ユリ、オートムギ、タマネギ、キビ及びライコムギが挙げられる。
【００３９】
本明細書中で使用されるとおり、句「宿主」は、組換えクローニング生成物のレシピエントとなりうる任意の原核生物又は真核生物をさす。したがって、「宿主」は、遺伝子操作されることのできる原核生物又は真核生物を包含する。かかる宿主の例については、Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982)を参照のこと。
【００４０】
本明細書中で使用されるとおり、句「挿入断片（単数）」又は「挿入断片（複数）」は、分子生物学の既知の方法によって操作されうる所望の核酸セグメント又は核酸セグメント集団をさす。したがって、挿入断片（複数可）という用語は、特別な核酸（好ましくはＤＮＡ）セグメント又はセグメントの集団を包含することを意図される。かかる挿入断片（複数可）は、１つ又は複数の遺伝子／要素を含むことができる。
【００４１】
本明細書中で使用されるとおり、句「挿入断片ドナー」は、挿入断片を担持する２つの親核酸分子（例えば、ＲＮＡ又はＤＮＡ）のうちの１つをさす。挿入断片ドナー分子は、両側が特定の部位と隣接する挿入断片を含む。挿入断片ドナーは、直鎖状又は環状であることができる。本発明の一実施態様において、挿入断片ドナーは、環状ＤＮＡ分子であり、クローニングベクター配列をさらに含む。挿入断片集団又は核酸セグメント集団が挿入断片ドナーを形成するために使用される場合、結果として挿入断片ドナーの集団が生じ、本明細書に提供される方法及び／又はシステムにしたがって使用されることができる。
【００４２】
本明細書中で使用されるとおり、句「生成物」又は「生成物ベクター」は、本明細書に記載のベクターアセンブリプロセス後の所望の娘分子をさす。生成物は、クローニング又はサブクローニングされる核酸を含有する。本発明によれば、挿入断片ドナーの集団が使用される場合、得られる生成物分子の集団は、挿入断片ドナーの挿入断片集団のすべて又は一部を含有し、好ましくは、挿入断片ドナーの元の分子の代表的な集団を含有する。
【００４３】
本明細書中で使用されるとおり、句「プロモーター」は一般に、開始コドンに近接して位置する遺伝子の５’領域として記述されるＤＮＡ配列をさす。隣接するＤＮＡセグメントの転写はプロモーター領域から開始する。抑制性プロモーターの転写速度は、抑制剤に応答して減少する。誘導性プロモーターの転写速度は、誘導剤に応答して増加する。構成的プロモーターの転写速度は、全身的な代謝状態の影響下で変化することができるが、特異的に制御されない。
【００４４】
本明細書中で使用されるとおり、句「部位特異的リコンビナーゼ」は、典型的に少なくとも以下の４つの活性（又はその組合せ）を有する種類のリコンビナーゼをさす：（１）１つ又は２つの特異的核酸配列の認識；（２）前記配列（単数又は複数）の切断；（３）鎖交換に関与するトポイソメラーゼ活性；及び（４）切断された核酸の鎖を再び封じるためのリガーゼ活性。Sauer, B., Current Opinions in Biotechnology 5:521-527(1994)を参照のこと。保存的部位特異的組換えは、両パートナーへの高度な特異性によって相同的組換え及び転位から識別される。鎖交換メカニズムは、ＤＮＡ合成非存在下での特異的ＤＮＡ配列の切断及び再結合に関与する。Landy, A. (1989) Ann. Rev. Biochem. 58:913-949を参照のこと。
【００４５】
本明細書中で使用されるとおり、句「ベクター」は、挿入断片に有用な生物学的又は生化学的性質を提供する核酸分子（好ましくはＤＮＡ）をさす。例として、プラスミド、ファージ、自己複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア及びインビトロ又は宿主細胞中で複製又は複製されることのできる、或いは所望の核酸セグメントを宿主細胞内の所望の場所に運搬することのできる他の配列が挙げられる。ベクターは、ベクターの本質的な生物学的機能を失うことなく、決定できる様式で配列がそこで切断されることができ、その複製及びクローニングを引き起こすために核酸フラグメントがそこまでスプライシングされる、１つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有することができる。ベクターはＰＣＲなどのためのプライマー部位、転写及び／又は翻訳開始及び／又は制御部位、組換えシグナル、複製点、選択マーカーなどをさらに提供することができる。クローニングベクターはさらに、クローニングベクターで形質転換された細胞の同定における使用のために好適な１つ又は複数の選択マーカーを含有することができる。
【００４６】
そのたびにＤＮＡフラグメントを再合成する必要なしに複数のＤＮＡフラグメントが混合され、マッチングされることができるように、それによってＤＮＡフラグメントのマイクロホモロジーにモジュール性が付加されうる方法及びシステムが提供される。同様の生物学的機能を提供する配列がＤＮＡの組合せのためのホモロジー領域として使用されることができる。いくつかの実施態様において、プロモーターと末端に隣接するコーディング配列の間のＫｏｚａｋコンセンサス配列ホモロジー及びコーディング配列と末端に隣接する３’ＵＴＲの間の（１つ超のフレーム中の）終止コドンホモロジーが、新しい植物転写単位（plant transcription unit）（ＰＴＵ）をアセンブルするために使用される。同様に、ＰＴＵの両末端における制限酵素認識部位のマイクロホモロジーの使用が提供されて、それを同時にプラスミド中にアセンブルする。提供される方法及びシステムは、導入遺伝子の発現に機能的に適合したベクターの構築のために、ＰＴＵの方向性のある正確なハイスループットアセンブリを可能とする。
【００４７】
提供される方法及びシステムは、ベクターにいかなる望ましくない又は余分な配列も加える必要のない、ベクターのアセンブリ／構築を可能とするハイスループットでフレキシブルなモジュール式のＤＮＡアセンブリプラットフォームを作り出すのに有用である。提供される方法及びシステムは、所望の遺伝要素を含むベクターを構築するために、現存するモジュール式のＤＮＡフラグメントの混合及びマッチングを可能とする。提供される方法及びシステムはさらに、導入遺伝子の発現に機能的に適合するベクターの構築のためのＰＴＵの方向性のある正確なハイスループットアセンブリを可能とする。
（実施例）
【実施例１】
【００４８】
ベクターアセンブリのためのモジュール式アプローチ
図１は、伝統的なクローニング方法（経路１）と本明細書中に提供されるモジュール式アプローチ（経路２）の違いを図示する。提供されるモジュール式アプローチは、関与するステップが本質的により少なく、ハイスループットフォーマットに適応可能である。
【００４９】
ＤＮＡフラグメントの同時の、正確かつ方向性のあるアセンブリのためのモジュール式で、その上、高効率のベクター構築アプローチが提供される。提供される代表的なアセンブリプロセスを、図２Ａに図示する。ＤＮＡフラグメントは、ＰＣＲ増幅するか、合成するか、又は現存するプラスミドから切り出すことができる。Ｋｏｚａｋ配列を５’に挿入する一方、アミノ酸終止コドンをコーディング配列の３’末端に付加する。プロモーターフラグメント（フラグメント１）は、Ｋｏｚａｋ配列をその３’末端に、ベクター結合部に一致する５’末端に小さな配列を含有する。コーディングフラグメント（フラグメント２）は、Ｋｏｚａｋ配列をその５’結合部に、（１つ超のフレーム中の）アミノ酸終止コドンの配列をその３’末端に含有する。同様に、３’ＵＴＲフラグメント（フラグメント３）は、その３’ＵＴＲの５’末端における（１つ超のフレーム中の）アミノ酸終止コドンの配列及び別のベクター結合部に一致する別の小さな配列を含有する。ベクターフラグメント（フラグメント４）は、フラグメント１及び３中の対応する配列と同一の２つの異なるベクター結合部配列を有する。好適なＤＮＡ組換えシステムの存在下でこれらのモジュール式の直鎖状フラグメントを結合することは、転写単位内にいかなる望ましくない配列も含まずに、これら４つのフラグメントを含有する最終的なベクターを正確にアセンブルする。
【００５０】
図２Ｂは、前駆体プラスミドによる制限酵素消化からＤＮＡフラグメントを作製し、ＰＣＲを含むＤＮＡ増幅をベクターアセンブリのために使用しない、別の実施態様をさらに示す。
【００５１】
いくつかの実施態様において、一致するプラスミド配列は制限酵素（ＲＥ）認識部位であり、これは、導入遺伝子を着目の生物中に挿入したら、下流側のＰＴＵ又は組込みのいずれかの解析のために使用することができる。ＲＥ部位は、ＤＮＡフラグメントのプラスミドからの回収及び他のベクターアセンブリにおけるその後の使用のためにも使用可能であった。
【００５２】
図６〜９及び１１は、図２Ｂによる具体的な実施態様を示す。直鎖状バックボーンを、カナマイシン選択遺伝子を含有するバックボーンベクターのＥｃｏＲＶ／ＸｍｎＩ消化を用いてｃｃｄＢ遺伝子を除去して得る（図９）。最小の１３ヌクレオチドＫｏｚａｋ配列を５’に挿入する一方、６フレーム終止コドンをコーディング配列の３’に付加する。プロモーターは、３’結合部におけるＫｏｚａｋ配列及びプラスミド結合部に一致する最小の１３ヌクレオチド配列（５’ベクターホモロジー）を含有する。同様に、６フレーム終止コドン配列を、３’ＵＴＲの５’末端に挿入する。３’ＵＴＲの３’末端は、プラスミドの別の末端に一致する１５ヌクレオチド配列（３’ベクターホモロジー）を含有する。フラグメント配列内に制限部位が存在しないように、フラグメントはＩＩ型制限部位に隣接する。ＩＩ型酵素は、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＭｌｙＩ及びそれらの組合せから選ぶことができる。具体的には、ベクターアセンブリのために必要な短いホモロジーを含むプロモーター、ＣＤＳ及び３’ＵＴＲは、ＩＩ型制限酵素ＭｌｙＩに隣接する。プラスミドを、ＭｌｙＩにより制限して、予測したサイズのアセンブルしたベクターを得る。これらのアセンブルしたベクターを、様々な制限酵素消化と、それに続いて、当技術分野において周知の方法を用いるゲル電気泳動によって確認する。好適なＤＮＡ組換えシステムの存在下でこれらのモジュール式の直鎖状フラグメントを結合することは、望ましくない配列を転写単位中に含むことなく、４つのフラグメントを所定の順番で含有する最終的なベクターを正確にアセンブルできる。アセンブルしたベクターの配列も、ＤＮＡ配列決定によって確認できる。
【００５３】
理解の明確さのために以上の発明が図解及び例示により詳細に記述されたが、一定の変更及び改変が添付したクレームの範囲内で実施可能であることは明らかである。
【実施例２】
【００５４】
図１０Ａ及び１０Ｂは、プロモーター及びＣＤＳが、３フレーム終止配列をその５’末端に含むＫｏｚａｋ配列を含有する別の実施態様を示す。直鎖状のバックボーンは、カナマイシン選択遺伝子を含有するバックボーンベクターのＥｃｏＲＶ／ＸｍｎＩ消化を用いてｃｃｄＢ遺伝子を除去して得る（例えば、図９）。１１ヌクレオチドの３フレーム終止配列を、コーディング配列（Ｃｒｙ３４Ａｂ１  ｖ２）の５’に挿入した１０ヌクレオチドのＫｏｚａｋ配列の５’末端に付加する一方、６フレーム終止コドン配列をコーディング配列の３’に付加する。
【００５５】
プロモーター（ＺｍＵｂｉ１  ｖ８）も、３’結合部における３フレーム終止配列及びプラスミド結合部に一致する最小の１３ヌクレオチド配列（５’ベクターホモロジー）を含有する同様のＫｏｚａｋ配列を含む。同様に、６フレーム終止コドン配列を３’ＵＴＲ（ＳｔＰｉｎＩＩ３’ＵＴＲ）の５’末端に挿入する。３’ＵＴＲの３’末端は、プラスミドの別の末端と一致する１５ヌクレオチド配列（３’ベクターホモロジー）を含有する。フラグメントは、制限部位がフラグメント配列内に存在しないように、ＩＩ型制限部位と隣接する。ＩＩ型酵素は、例えば、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｍｒＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｓＩ、ＭｌｙＩ及びそれらの組合せから選ばれることができる。これらのアセンブルしたベクターは、様々な制限酵素消化により確認可能であり、消化後のフラグメントパターンも当技術分野において周知のゲル電気泳動を用いて確認しうる。アセンブルしたベクターの配列も、当技術分野において公知のＤＮＡ配列決定によって確認しうる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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