(57)【要約】検出装置は、共通平面における複数個の広視野画像を同時に取得するよう配置した複数個の顕微蛍光測定器を有する読取りヘッドと、及び(b) 読取りヘッドを共通平面に存在する基板に沿って移動するよう構成した並進ステージとを備える。基板は、カートリッジ内に設けたフローセルとすることができ、カートリッジは、さらに、(i) サンプルリザーバ、(ii) サンプルリザーバとフローセルとの間の流体ライン、(iii) フローセルに流体連通する幾つかの試薬リザーバ、(iv) これらリザーバとフローセルとの間の流体連通を橋渡しする少なくとも１個のバルブ、及び(v) リザーバからフローセルに液体を移動させるよう構成した少なくとも１個の圧力源のためのハウジングを有する。検出装置及びカートリッジは一緒に又は互いに独立的に使用することができる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出装置において、
(a) 複数個の顕微蛍光測定器を有するキャリッジであって、
前記顕微蛍光測定器のそれぞれは広視野画像検出のために構成した対物レンズを含み、
前記複数個の顕微蛍光測定器は、共通平面における複数の広視野画像を同時に取得するよう配置し、また
前記広視野画像のそれぞれは前記共通平面の異なるエリアからのものとする、
該キャリッジと、
(b) 前記共通平面に平行である少なくとも１つの方向に前記キャリッジを移動するよう構成した並進ステージと、及び
(c) 前記共通平面内に基板を保持するよう構成したサンプルステージと、
を備える、検出装置。
【請求項２】
請求項１記載の検出装置において、前記顕微蛍光測定器のそれぞれは、さらに、専用の自動合焦モジュールを有する、検出装置。
【請求項３】
請求項２記載の検出装置において、前記自動合焦モジュールは、検出器及びアクチュエータを有し、前記アクチュエータは、前記共通平面に対する前記顕微蛍光測定器の焦点を変化させるよう構成し、また前記検出器は前記アクチュエータの移動を管理するよう構成する、検出装置。
【請求項４】
請求項３記載の検出装置において、前記検出器は、さらに、前記広視野画像を取得するよう構成する、検出装置。
【請求項５】
請求項４記載の検出装置において、前記検出器は、さらに、画像データを前記キャリッジの外部に配置した処理ユニットに出力するよう構成する、検出装置。
【請求項６】
請求項３記載の検出装置において、前記検出器は前記自動合焦モジュールに専用化し、また前記顕微蛍光測定器は、画像データを前記キャリッジの外部に配置した処理ユニットに出力するよう構成した第２検出器を有する、検出装置。
【請求項７】
請求項２記載の検出装置において、該検出装置における第１顕微蛍光測定器のための前記自動合焦モジュールは、該検出装置における第２顕微蛍光測定器のための第２自動合焦モジュールからのデータを統合化するよう構成し、これにより、前記自動合焦モジュールは、第１顕微蛍光測定器の焦点位置及び第２顕微蛍光測定器の焦点位置に基づいて、前記第１顕微蛍光測定器の焦点を変化させる、検出装置。
【請求項８】
請求項１又は２記載の検出装置において、前記顕微蛍光測定器それぞれは、さらに、ビームスリッタ及び検出器を有し、前記ビームスリッタは、励起放射源からの励起放射を前記対物レンズに指向させ、また前記対物レンズからの発光放射を前記検出器に指向させる、検出装置。
【請求項９】
請求項８記載の検出装置において、前記顕微蛍光測定器それぞれは、さらに、前記励起放射源を有する、検出装置。
【請求項１０】
請求項９記載の検出装置において、前記励起放射源は、前記励起放射を、前記複数個の顕微蛍光測定器における個別顕微蛍光測定器の前記対物レンズに指向させ、各顕微蛍光測定器は、別個の励起放射源を有する、検出装置。
【請求項１１】
請求項９記載の検出装置において、前記キャリッジは、さらに、前記励起放射源に熱接触するヒートシンクを有する、検出装置。
【請求項１２】
請求項１１記載の検出装置において、前記ヒートシンクは、前記キャリッジにおける単一放射源に熱接触する、検出装置。
【請求項１３】
請求項１１記載の検出装置において、前記ヒートシンクは、前記キャリッジにおける複数個の放射源に熱接触する、検出装置。
【請求項１４】
請求項８記載の検出装置において、前記励起放射源は、励起放射を、前記複数個の顕微蛍光測定器における２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器の対物レンズに指向させ、したがって、前記２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器は励起放射源を共有する、検出装置。
【請求項１５】
請求項８記載の検出装置において、前記顕微蛍光測定器のそれぞれは、さらに、少なくとも２個の励起放射源を有する、検出装置。
【請求項１６】
請求項８記載の検出装置において、前記励起放射源は、ＬＥＤを有する、検出装置。
【請求項１７】
請求項１，２又は８記載の検出装置において、前記顕微蛍光測定器それぞれにおける対物レンズは、０.２〜０.５の範囲内の開口数を有する、検出装置。
【請求項１８】
請求項１，２，８又は１７記載の検出装置において、前記顕微蛍光測定器それぞれは、５０ミクロン未満の距離で離間する特徴を区別するのに十分な解像度で検出するよう構成する、検出装置。
【請求項１９】
請求項１，２，８，１７又は１８記載の検出装置において、前記顕微蛍光測定器それぞれの広視野画像は、少なくとも１ｍｍ２の面積を有する、検出装置。
【請求項２０】
請求項１，２，８，１７，１８又は１９記載の検出装置において、前記キャリッジは、前記顕微蛍光測定器相互間の側方移動を防止する、検出装置。
【請求項２１】
請求項２０記載の検出装置において、前記顕微蛍光測定器は、前記キャリッジに共成形する、検出装置。
【請求項２２】
請求項１，２，８，１７，１８，１９又は２０記載の検出装置において、前記キャリッジは、少なくとも４個の顕微蛍光測定器を有し、前記少なくとも４個の顕微蛍光測定器の前記対物レンズは、少なくとも２列に配列する、検出装置。
【請求項２３】
請求項２２記載の検出装置において、前記少なくとも４個の顕微蛍光測定器の前記対物レンズは、六方密配列とする、検出装置。
【請求項２４】
請求項２２記載の検出装置において、前記基板は少なくとも４個の平行なチャネルを有し、また前記対物レンズそれぞれは、前記少なくとも４個の平行なチャネルのうち唯一のチャネルを画像化するよう配置する、検出装置。
【請求項２５】
請求項２４記載の検出装置において、前記対物レンズそれぞれは、前記唯一のチャネルの一部分を画像化するよう配置する、検出装置。
【請求項２６】
請求項２２記載の検出装置において、前記キャリッジは少なくとも６個の顕微蛍光測定器を有し、前記少なくとも６個の顕微蛍光測定器の前記対物レンズは、少なくとも２列に配列し、また前記少なくとも６個の顕微蛍光測定器の前記対物レンズは、六方密配列とする、検出装置。
【請求項２７】
請求項２６記載の検出装置において、前記基板は少なくとも６個の平行なチャネルを有し、また前記対物レンズそれぞれは、前記少なくとも６個の平行なチャネルのうち唯一のチャネルの一部分を画像化するよう配置する、検出装置。
【請求項２８】
請求項２２記載の検出装置において、前記顕微蛍光測定器それぞれは、さらに、放射源、ビームスリッタ及び検出器を有し、前記ビームスリッタは、励起放射源からの励起放射を前記対物レンズに指向させ、また前記対物レンズからの発光放射を前記検出器に指向させ、前記励起放射及び前記発光放射は互いに直交する方向に指向する、検出装置。
【請求項２９】
請求項２８記載の検出装置において、前記少なくとも４個の顕微蛍光測定器の前記放射源は、前記共通平面に対向する前記キャリッジの第１側面サイドに配置し、前記検出器のうち少なくとも２個の検出器は、前記第１側面サイドに直交しかつ前記共通平面に直交する前記キャリッジの第２側面サイドに配置し、また前記検出器のうち少なくとも２個の検出器は、前記第１側面サイドに直交しかつ前記共通平面に直交する前記キャリッジの第３側面サイドに配置する、検出装置。
【請求項３０】
請求項２８記載の検出装置において、前記少なくとも４個の検出器は、前記共通平面に対向する前記キャリッジの第１側面サイドに配置し、前記放射源のうち少なくとも２個の放射源は、前記第１側面サイドに直交しかつ前記共通平面に直交する前記キャリッジの第２側面サイドに配置し、また前記放射源のうち少なくとも２個の放射源は、前記第１側面サイドに直交しかつ前記共通平面に直交する前記キャリッジの第３側面サイドに配置する、検出装置。
【請求項３１】
請求項１，２，８，１７，１８，１９又は２０記載の検出装置において、前記キャリッジは、少なくとも４個の顕微蛍光測定器を有し、前記少なくとも４個の顕微蛍光測定器の前記対物レンズは、１列に配列する、検出装置。
【請求項３２】
請求項３１記載の検出装置において、前記基板は少なくとも４個の平行なチャネルを有し、また前記対物レンズそれぞれは、前記少なくとも４個の平行なチャネルのうち唯一のチャネルを画像化するよう配置する、検出装置。
【請求項３３】
請求項３２記載の検出装置において、前記対物レンズそれぞれは、前記唯一のチャネルの一部分を画像化するよう配置する、検出装置。
【請求項３４】
基板を画像化する方法において、
(a) 表面上に蛍光特徴を有する基板を準備するステップと、
(b) 複数個の顕微蛍光測定器を使用して前記表面における第１部分の複数の広視野画像を取得する画像取得ステップであって、
前記顕微蛍光測定器それぞれは、前記表面の異なる場所からの広視野画像を取得し、
前記複数個の顕微蛍光測定器はキャリッジに固定するものとした、該画像取得ステップと、
(c) 前記表面に平行な方向に前記キャリッジを並進移動させ、前記表面の第２部分のためにステップ(b)を繰返すステップと、
を有する、方法。
【請求項３５】
請求項３４記載の方法において、前記表面の前記第１部分は、前記表面における複数の隣接エリアを含む、方法。
【請求項３６】
請求項３４又は３５記載の方法において、さらに、合焦技術を使用して、前記複数個の顕微蛍光測定器における各顕微蛍光測定器を個別に合焦するステップを有する、方法。
【請求項３７】
請求項３６記載の方法において、前記合焦技術は、前記広視野画像を取得するのには用いない、少なくとも１個の専用検出器を使用する、方法。
【請求項３８】
請求項３６記載の方法において、前記顕微蛍光測定器それぞれは、個別の自動合焦モジュールを有する、方法。
【請求項３９】
請求項３８記載の方法において、前記顕微蛍光測定器それぞれは、広視野画像を取得し、また前記合焦技術の焦点を検出する画像検出器を有する、方法。
【請求項４０】
請求項３６記載の方法において、前記複数個の顕微蛍光測定器における第１顕微蛍光測定器に使用される前記合焦技術は、前記複数個の顕微蛍光測定器における第２顕微蛍光測定器に使用される合焦技術からのデータを統合化し、これにより、第１顕微蛍光測定器の焦点位置及び第２顕微蛍光測定器の焦点位置に基づいて、前記第１顕微蛍光測定器の焦点を調整する、方法。
【請求項４１】
請求項３４，３５又は３６記載の方法において、前記顕微蛍光測定器それぞれは、対物レンズ及び検出器を有し、前記広視野画像は、励起放射源からの励起放射を前記対物レンズ経由で前記表面に指向させ、また前記表面からの発光放射を前記対物レンズ経由で前記検出器に指向させることによって取得する、方法。
【請求項４２】
請求項４１記載の方法において、前記顕微蛍光測定器それぞれは、さらに、前記励起放射を発生する励起放射源を有する、方法。
【請求項４３】
請求項４１記載の方法において、単一励起放射源が、前記複数個の顕微蛍光測定器における少なくとも２個の顕微蛍光測定器に向けられる励起放射を発生する、方法。
【請求項４４】
請求項４１記載の方法において、前記顕微蛍光測定器それぞれは、さらに、前記励起放射及び前記発光放射を互いに直交する方向に指向させるビームスリッタを有する、方法。
【請求項４５】
請求項３４，３５，３６又は４１記載の方法において、前記顕微蛍光測定器それぞれは、前記ステップ(b)で前記表面における少なくとも２つの広視野画像を取得し、前記少なくとも２つの広視野画像それぞれは、互いに異なる励起又は発光の波長で蛍光を検出する、方法。
【請求項４６】
請求項４５記載の方法において、前記顕微蛍光測定器それぞれは、さらに、少なくとも２個の励起放射源を有し、前記少なくとも２つの広視野画像は、前記少なくとも２個の励起放射源からの互いに異なる波長の励起放射で前記表面を励起することによって取得する、方法。
【請求項４７】
請求項３４，３５，３６，４１又は４５記載の方法において、前記蛍光特徴は、最も近接する隣接部の中心−中心間の平均間隔が５０ミクロン未満であり、前記蛍光特徴は、広視野画像内で個別に解像される、方法。
【請求項４８】
請求項３４，３５，３６，４１，４５又は４７記載の方法において、前記顕微蛍光測定器それぞれは、少なくとも１ｍｍ２の面積の広視野画像を取得する、方法。
【請求項４９】
請求項３４，３５，３６，４１，４５，４７又は４８記載の方法において、前記複数個の顕微蛍光測定器は少なくとも４個の顕微蛍光測定器とする、方法。
【請求項５０】
請求項４９記載の方法において、前記顕微蛍光測定器それぞれは対物レンズを有し、前記対物レンズは少なくとも２列に配列し、また前記対物レンズは六方密配列とする、方法。
【請求項５１】
請求項５０記載の方法において、前記基板は少なくとも４個の平行なチャネルを有し、また前記ステップ(b)で各対物レンズが取得した前記広視野画像は、前記４個の平行なチャネルにおける唯一のチャネルからのものとする、方法。
【請求項５２】
請求項５０記載の方法において、前記少なくとも４個の顕微蛍光測定器は、前記少なくとも４個の平行なチャネルの広視野画像を同時に取得する、方法。
【請求項５３】
請求項４９記載の方法において、前記複数個の顕微蛍光測定器は、それぞれが対物レンズを有する少なくとも６個の顕微蛍光測定器とし、前記対物レンズは少なくとも２列に配列し、また前記対物レンズは六方密配列とし、前記基板は少なくとも６個の平行なチャネルを有し、また前記ステップ(b)で各対物レンズが取得した前記広視野画像は、前記６個の平行なチャネルにおける唯一のチャネルからのものとする、方法。
【請求項５４】
請求項４９記載の方法において、前記少なくとも４個の顕微蛍光測定器の前記対物レンズは、１列に配列する、方法。
【請求項５５】
請求項４９記載の方法において、前記基板は少なくとも４個の平行なチャネルを有し、また前記対物レンズそれぞれが前記ステップ(b)で取得する広視野画像は、前記少なくとも４個の平行なチャネルのうち唯一のチャネルからのものである、方法。
【請求項５６】
請求項３４，３５，３６，４１，４５，４７，４８又は４９記載の方法において、前記複数の広視野画像は、前記ステップ(b)で同時に取得する方法。
【請求項５７】
請求項３４，３５，３６，４１，４５，４７，４８，４９又は５６記載の方法において、前記ステップ(b)における各広視野画像の取得は、前記表面の第１部分の複数の広視野画像を取得するステップと、及び対応するピクセルからの信号を合算するステップとを含む、方法。
【請求項５８】
請求項３４，３５，３６，４１，４５，４７，４８，４９，５６又は５７記載の方法において、さらに、
(d) 前記表面の前記第１部分における第２複数広視野画像を取得する位置に前記キャリッジを復帰させるステップを有する、方法。
【請求項５９】
請求項５８記載の方法において、さらに、前記ステップ(c)後かつ前記ステップ(d)前に、前記蛍光特徴を変更するステップを有し、前記第２複数広視野画像は、前記第１複数広視野画像とは異なるものである、方法。
【請求項６０】
請求項５９記載の方法において、前記蛍光特徴は核酸を含み、前記変更ステップは、シークエンシング・バイ・シンセシス技術で核酸を変化させるステップを含む、方法。
【請求項６１】
請求項５８記載の方法において、さらに、前記ステップ(d)前に前記ステップ(c)を複数回繰返すステップを有し、これにより、前記表面の少なくとも第３部分及び第４部分を画像化する、方法。
【請求項６２】
透光性表面、流入口及び流出口を有するフローセルと、及び
不透光性及び水性液体に対する不浸透性を有する材料で構成するハウジングと
を備える流体カートリッジであって、前記ハウジングは、
(i)  サンプルリザーバと、
(ii) 前記サンプルリザーバと前記フローセルの前記流入口との間における流体ラインと、
(iii)前記フローセルの前記流入口を介して前記フローセルと流体連通する複数個の試薬リザーバと、
(iv) 前記リザーバと前記フローセルの前記流入口との間における流体連通を仲立ちするよう構成した少なくとも１個のバルブと、及び
(v)  前記サンプルリザーバ又は前記試薬リザーバからの液体を、前記フローセルの前記流入口経由で前記フローセルに移動させるよう構成した少なくとも１個の圧力源と、を保持し、
透光性の窓が前記ハウジングを中断し、かつ流入ポートが前記ハウジングを中断し、
前記流入ポートは前記サンプルリザーバに流体連通し、また
前記透光性表面は前記窓に配置する、
流体カートリッジ。
【請求項６３】
請求項６２記載の流体カートリッジにおいて、前記試薬リザーバは、シークエンシング・バイ・シンセシス技術のための試薬を含む、流体カートリッジ。
【請求項６４】
請求項６３記載の流体カートリッジにおいて、前記試薬は、ポリメラーゼ、蛍光ラベル付きヌクレオチド、ブロック解除剤、又は洗浄溶液のうち少なくとも１つとする、流体カートリッジ。
【請求項６５】
請求項６２又は６３記載の流体カートリッジにおいて、さらに、前記フローセルの前記流出口から前記試薬リザーバのうちの少なくとも１つに至る流体ラインを備える、流体カートリッジ。
【請求項６６】
請求項６５記載の流体カートリッジにおいて、前記少なくとも１個のバルブは、さらに、前記フローセルの前記流出口と前記試薬リザーバのうちの少なくとも１つとの間で流体連通の仲立ちをするよう構成する、流体カートリッジ。
【請求項６７】
請求項６５記載の流体カートリッジにおいて、さらに、前記フローセルの前記流出口と前記試薬リザーバのうちの少なくとも１つとの間で流体連通の仲立ちをするよう構成した少なくとも第２バルブを備える、流体カートリッジ。
【請求項６８】
請求項６５記載の流体カートリッジにおいて、前記少なくとも１個の圧力源は、さらに、前記フローセルの前記流出口から前記試薬リザーバのうちの少なくとも１つに液体を移動させるよう構成する、流体カートリッジ。
【請求項６９】
請求項６５記載の流体カートリッジにおいて、さらに、前記フローセルの前記流出口から前記試薬リザーバのうちの少なくとも１つに液体を移動させるよう構成した少なくとも第２圧力源を備える、流体カートリッジ。
【請求項７０】
請求項６２，６３又は６５記載の流体カートリッジにおいて、前記ハウジングは、さらに、
(vi) 廃棄リザーバ、及び
(vii)前記フローセルの前記流出口から前記廃棄リザーバへの流体ライン
を保持する、流体カートリッジ。
【請求項７１】
請求項６２，６３，６５又は７０記載の流体カートリッジにおいて、前記試薬リザーバは可撓性バッグとする、流体カートリッジ。
【請求項７２】
請求項６２，６３，６５，７０又は７１記載の流体カートリッジにおいて、前記ハウジングは、
(i)  前記サンプルリザーバと、
(ii) 前記サンプルリザーバと前記フローセルの前記流入口との間における前記流体ラインと、
(iii)前記フローセルの前記流入口を介して前記フローセルと流体連通する前記複数個の試薬リザーバと、
(iv) 前記リザーバと前記フローセルの前記流入口との間における流体連通を仲立ちするよう構成した前記少なくとも１個のバルブと、及び
(v)  前記サンプルリザーバ又は前記試薬リザーバからの液体を、前記フローセルの前記流入口経由で前記フローセルに移動させるよう構成した前記少なくとも１個の圧力源と、を完全に包囲する、流体カートリッジ。
【請求項７３】
請求項６２，６３，６５，７０，７１又は７２記載の流体カートリッジにおいて、前記フローセルは、それぞれが異なるポンプに流体連通する複数個のチャネルを有する、流体カートリッジ。
【請求項７４】
請求項７３記載の流体カートリッジにおいて、前記フローセルにおける前記チャネルの数は、前記流体カートリッジにおけるポンプの数と同一である、流体カートリッジ。
【請求項７５】
請求項７３記載の流体カートリッジにおいて、前記異なるポンプは単独のバルブによって動作させ、これにより、前記各チャネルは、互いに独立した流体制御下にある、流体カートリッジ。
【請求項７６】
請求項７３記載の流体カートリッジにおいて、前記試薬リザーバを少なくとも４個、前記サンプルリザーバを少なくとも４個設け、単一バルブにより、前記フローセルの各チャネルと前記各試薬リザーバとの間における独立支持体流体連通を生ずるようにし、また前記単一バルブにより、前記フローセルの各チャネルと前記各サンプルリザーバとの間における独立支持体流体連通を生ずるように流体カートリッジ。
【請求項７７】
請求項６２，６３，６５，７０，７１，７２又は７３記載の流体カートリッジにおいて、前記フローセルは、前記ハウジング内の受容空間を占有し、また前記受容空間は、前記フローセルを前記ハウジングに対して浮遊させることができるサイズ及び形状にする、流体カートリッジ。
【請求項７８】
請求項７７記載の流体カートリッジにおいて、前記窓は、少なくとも１個のフローセル整列構成要素のための取付け具を有する、流体カートリッジ。
【請求項７９】
請求項７７記載の流体カートリッジにおいて、前記流体ラインは、前記フローセルへの可撓性接続部を有し、これにより前記フローセルの浮遊を許容する、流体カートリッジ。
【請求項８０】
核酸をシークエンシングする方法であって、
(a) 流体カートリッジ準備ステップであって、前記流体カートリッジは、
(i)  透光性表面を有するフローセル、
(ii) 核酸サンプル、
(iii)シークエンシング反応のための複数の試薬、及び
(iv) 前記試薬を前記フローセルに配給する流体システム
を有するものとする、該流体カートリッジ準備ステップと、
(b) 検出装置準備ステップであって、前記検出装置は、
(i)  複数個の顕微蛍光測定器であり、それぞれがｘ次元及びｙ次元における画像平面で広視野画像検出を行うよう構成した対物レンズを有する、該複数個の顕微蛍光測定器、及び
(ii) サンプルステージ
を有するものとする、該検出装置準備ステップと、
(c) 前記透光性表面が画像平面内に位置するよう、前記流体カートリッジを前記サンプルステージに送給するステップと、及び
(d) 前記流体カートリッジ内で核酸シークエンシング手順の流体オペレーション、及び検出装置内で前記核酸シークエンシング手順の検出オペレーションを実施するオペレーション実施ステップであって、
(i)  前記試薬を前記流体システムによって前記フローセルに配給し、また
(ii) 核酸特徴の広視野画像を前記複数個の顕微蛍光測定器によって検出する、
該オペレーション実施ステップと、
を有する、方法。
【請求項８１】
請求項８０記載の方法において、前記複数個の顕微蛍光測定器は、前記核酸シークエンシング手順実施中に前記顕微蛍光測定器相互間のｘ及びｙ次元での相対移動を阻止するよう前記顕微蛍光測定器を固定する読取りヘッドを有する、方法。
【請求項８２】
請求項８１記載の方法において、前記検出装置は、さらに、
(iii)前記ｘ次元及びｙ次元の少なくとも一方で前記読取りヘッドを移動させるよう構成した並進ステージを有する、方法。
【請求項８３】
請求項８１記載の方法において、前記ステップ(d)は、さらに、前記読取りヘッドを前記ｙ次元で並進移動させるステップと、前記フローセルの複数部分のために前記ステップ(d)の(ii)を繰返すステップとを含む、方法。
【請求項８４】
請求項８１又は８２記載の方法において、前記流体カートリッジの前記流体システムは、前記試薬の前記フローセルへの配給を仲立ちする少なくとも１個のバルブ及び少なくとも１個の圧力源を有する、方法。
【請求項８５】
請求項８０、８１又は８４記載の方法において、前記核酸シークエンシング手順を実施するステップは、さらに、前記画像平面内で核酸特徴のアレイを形成する条件下で前記核酸サンプルを前記流体カートリッジにおけるリザーバから前記フローセルに配給するステップを含む、方法。
【請求項８６】
請求項８５記載の方法において、前記流体カートリッジの前記流体システムは、前記核酸サンプルの前記フローセルへの配給を仲立ちする少なくとも１個のバルブ及び少なくとも１個の圧力源を有する、方法。
【請求項８７】
請求項８０，８１，８４又は８５記載の方法において、さらに、
(e) 前記流体カートリッジを前記サンプルステージから取外すステップと、
(f) 第２流体カートリッジを前記サンプルステージに送給するステップと、及び
(g) 前記第２流体カートリッジ内で核酸シークエンシング手順の流体オペレーション、及び検出装置内で核酸シークエンシング手順の検出オペレーションを実施するステップと、
を有する、方法。
【請求項８８】
請求項８７記載の方法において、前記第２流体カートリッジは、前記ステップ(a)における前記流体カートリッジの前記核酸サンプルとは異なる第２核酸サンプルを有する、方法。
【請求項８９】
請求項８７記載の方法において、さらにステップ(e)，(f)及び(g)を数回繰返す、方法。
【請求項９０】
請求項８０，８１，８４，８５又は８７記載の方法において、ステップ(a)は、さらに、試薬の第１サブセットを有する第１サブカートリッジを取得するステップと、試薬の第２サブセットを有する第２サブカートリッジを取得するステップと、前記第１サブカートリッジ及び前記第２サブカートリッジを組合せて前記流体カートリッジにするステップとを含む、方法。
【請求項９１】
請求項９０記載の方法において、前記第１サブカートリッジは、０℃より暖かくない保存場所から取得し、前記第２サブカートリッジは０℃より暖かい保存場所から取得する、方法。
【請求項９２】
請求項９０記載の方法において、前記試薬の前記第１サブセットは冷凍固体である試薬であり、前記試薬の前記第２サブセットは液体である、方法。
【請求項９３】
請求項８０，８１，８４，８５，８７又は９０記載の方法において、前記流体カートリッジは、さらに廃棄リザーバを有し、また前記核酸シークエンシング手順の前記流体オペレーションは、さらに、前記試薬を前記フローセルから前記廃棄リザーバに取出すステップを含む、方法。
【請求項９４】
請求項８０，８１，８４，８５，８７，９０又は９３記載の方法において、前記流体カートリッジは、さらに混合リザーバを有し、また前記核酸シークエンシング手順の前記流体オペレーションは、さらに、同様な試薬を前記フローセルから前記混合リザーバに取出し、したがって、前記核酸シークエンシング手順の複数回サイクルからの同様な試薬よりなる混合試薬を形成するステップを含む、方法。
【請求項９５】
請求項９４記載の方法において、さらに、前記核酸シークエンシング手順の少なくとも１回のサイクルで、前記混合リザーバからの前記混合試薬を前記フローセルに配給するステップを有する、方法。
【請求項９６】
請求項８０，８１，８４，８５，８７，９０，９３又は９４記載の方法において、前記フローセルは複数個のチャネルを有し、前記ステップ(d)の(i)は前記チャネルの第１サブセットに対して実施し、前記ステップ(d)の(ii)は前記チャネルの第２サブセットに対して実施する、方法。
【請求項９７】
請求項９６記載の方法において、前記フローセルは、少なくとも４個の直線的なチャネルを有し、前記チャネルの少なくとも一部分は互いに平行に配列される、方法。
【請求項９８】
請求項９７記載の方法において、前記チャネルの前記第１サブセットは、前記少なくとも４個の直線的なチャネルにおける１つおきのチャネルとする、方法。
【請求項９９】
請求項９８記載の方法において、前記複数個の顕微蛍光測定器は、前記フローセルの１つおきのチャネルを同時に検出するよう前記顕微蛍光測定器を固定する読取りヘッドを有する、方法。
【請求項１００】
請求項９８記載の方法において、前記複数個の顕微蛍光測定器は、前記フローセルの数に対して半分の数の前記顕微蛍光測定器を有する、方法。
【請求項１０１】
請求項８０，８１，８４，８５，８７，９０，９３，９４又は９６記載の方法において、前記核酸シークエンシング手順は、合成によるシークエンシングステップを有し、また前記試薬は、ポリメラーゼ、蛍光ラベル付きヌクレオチド、ブロック解除剤又は洗浄溶液のうち少なくとも１つとする、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年４月３日に出願した米国仮特許出願第６１／６１９，７８４号（参照により本明細書に組込まれるもととする）に基づき、またその恩典を主張する。
【０００２】
本発明の実施形態は、概して、例えば、核酸シークエンシング手順におけるサンプルの流体的取扱い及び光学的検出のための装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
我々ヒトのゲノムは、我々の優先傾向、才能、疾患の罹りやすさ及び治療薬物に対する反応のような多くの固有性向を予見する設計図を提供する。個々のヒトゲノムは、３０憶個を超えるヌクレオチド配列を含む。これらヌクレオチドの画分における相違は我々の特徴の多くを与える。研究団体は、設計図を構成する特徴を解明する上で、また各設計図における情報がどのようにヒトの健康に関与するかをより完全に理解する上で素晴らしい進歩をみせている。しかし、我々の理解は完璧さからは遠く隔たっており、またこのことは、研究ラボから、いつの日か我々各人が我々自身の個人的ゲノムのコピーを持つであろうという希望を持ち、したがって、健康なライフスタイルの適切な選択又は適正な治療過程を決定する上で我々の医師と膝を交えて話し合うことができるクリニックへの情報伝達を阻害している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在のボトルネックは処理能力及び規模の問題である。任意の特定個人の設計図を解明する基礎的な要素は、ゲノムにおける３０億個のヌクレオチドの正確な配列（シークエンス）を決定することである。技術はこのことを行うのに利用可能であるが、これら技術は、一般的に実施に多くの日数と数１０００ドルもの費用を要する。さらに、任意の個人ゲノム配列の臨床的関連性は、そのゲノム配列の特有な特徴（すなわち、遺伝子型）を、既知の特徴（すなわち、表現型）に関連する基準ゲノムと比較する問題である。規模及び処理能力の問題は、調査研究から得られる遺伝子型の表現型に対する相関関係に基づいて基準ゲノムが生ずると考えるとき、概して統計的有効性を得るために何千人もの個人を使用して明らかになる。任意の臨床的に関連する遺伝子型対表現型の相関関係を同定するには、実質的には数千人に対して数１０億個のヌクレオチド配列を決定することが必要である。疾患、薬物反応及び他の臨床的関連特徴の数だけ問題が増幅されるため、極めて安価で迅速なシークエンシング（配列決定）技術に対する要望が益々はっきりとしてきている。
【０００５】
必要なことはシークエンシングのコスト低減であり、このコスト低減によれば、リサーチ科学者が行う膨大な遺伝子相関研究を促進し、人生を左右する決断をする個々の患者の治療に対する臨床的環境でアクセス可能なシークエンシングを行うことができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は検出装置を提供し、この検出装置は、(a) 複数個の顕微蛍光測定器を有するキャリッジであって、前記顕微蛍光測定器のそれぞれは広視野画像検出のために構成した対物レンズを含み、前記複数個の顕微蛍光測定器は、共通平面における複数の広視野画像を同時に取得するよう配置し、また前記広視野画像のそれぞれは前記共通平面の異なるエリアからのものとする、該キャリッジと、(b) 前記共通平面に平行である少なくとも１つの方向に前記キャリッジを移動するよう構成した並進ステージと、及び(c) 前記共通平面内に基板を保持するよう構成したサンプルステージと、を備える。
【０００７】
本発明は基板を画像化する方法を提供し、この方法は、(a) 表面上に蛍光特徴を有する基板を準備するステップと、(b) 複数個の顕微蛍光測定器を使用して前記表面における第１部分の複数の広視野画像を取得する画像取得ステップであって、前記顕微蛍光測定器それぞれは、前記表面の異なる場所からの広視野画像を取得し、前記複数個の顕微蛍光測定器はキャリッジに固定するものとした、該画像取得ステップと、(c) 前記表面に平行な方向に前記キャリッジを並進移動させ、前記表面の第２部分のためにステップ(b)を繰返すステップと、を有する。この方法は、本明細書の何れかの箇所で説明する装置のいずれかを使用することができるが、これら本明細書に記載のすべての実施形態に限定するものではない。
【０００８】
さらに、本発明は、透光性表面、流入口及び流出口を有するフローセルと、及び不透光性及び水性液体に対する不浸透性を有する材料で構成するハウジングとを備える流体カートリッジを提供し、前記ハウジングは、(i) サンプルリザーバと、(ii) 前記サンプルリザーバと前記フローセルの前記流入口との間における流体ラインと、(iii)前記フローセルの前記流入口を介して前記フローセルと流体連通する複数個の試薬リザーバと、(iv) 前記リザーバと前記フローセルの前記流入口との間における流体連通を仲立ちするよう構成した少なくとも１個のバルブと、及び(v) 前記サンプルリザーバ又は前記試薬リザーバからの液体を、前記フローセルの前記流入口経由で前記フローセルに移動させるよう構成した少なくとも１個の圧力源と、を保持し、透光性の窓が前記ハウジングを中断し、かつ流入ポートが前記ハウジングを中断し、前記流入ポートは前記サンプルリザーバに流体連通し、また前記透光性表面は前記窓に配置する。
【０００９】
本発明は核酸をシークエンシングする方法を提供し、この方法は、(a) 流体カートリッジ準備ステップであって、前記流体カートリッジは、(i) 透光性表面を有するフローセル、(ii) 核酸サンプル、(iii)シークエンシング反応のための複数の試薬、及び(iv) 前記試薬を前記フローセルに配給する流体システムを有するものとする、該流体カートリッジ準備ステップと、(b) 検出装置準備ステップであって、前記検出装置は、(i) 複数個の顕微蛍光測定器であり、それぞれがｘ次元及びｙ次元における画像平面で広視野画像検出を行うよう構成した対物レンズを有する、該複数個の顕微蛍光測定器、及び(ii) サンプルステージを有するものとする、該検出装置準備ステップと、(c) 前記透光性表面が画像平面内に位置するよう、前記流体カートリッジを前記サンプルステージに送給するステップと、及び(d) 前記流体カートリッジ内で核酸シークエンシング手順の流体オペレーション、及び検出装置内で前記核酸シークエンシング手順の検出オペレーションを実施するオペレーション実施ステップであって、(i) 前記試薬を前記流体システムによって前記フローセルに配給し、また(ii) 核酸特徴を前記複数個の顕微蛍光測定器によって検出する、
該オペレーション実施ステップと、を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】核酸シークエンシングに有用な光電子検出装置（左側）及び流体カートリッジ（右側）を示す。
【図２】互いに直交する励起ビーム経路及び発光ビーム経路を有する個別の顕微蛍光測定器の光学的レイアウトを示す。
【図３】顕微蛍光測定器の光学的レイアウトを示す。
【図４】２個のチャネルを有するフローセルに関連する４個の顕微蛍光測定器の配列を示す。
【図５】顕微蛍光測定器に使用できる自動合焦装置を示す。
【図６Ａ】フローセルにおける４個のチャネル（左側）及び１列に直線的に配列した対物レンズ（右側）を示す頂面図である。
【図６Ｂ】８個のチャネルを有するフローセル（左側）及び４個ずつ２列に配列した８個の対物レンズ（右側）を示す頂面図である。
【図７】フローセルにおける６個のチャネル（左側）及び２列六方密に配列した対物レンズ（右側）を示す頂面図である。
【図８】検出装置用に８個の顕微蛍光測定器を有する配列の斜視図である。
【図９】検出装置用に８個の顕微蛍光測定器を有する配列の底面図である。
【図１０】互いに平行な励起ビーム経路及び発光ビーム経路を有する個別の顕微蛍光測定器の光学的レイアウトを示す。
【図１１】検出装置用のＹステージの頂部から見た斜視図である。
【図１２】検出装置用のＹステージの底部から見た斜視図である。
【図１３】８個の顕微蛍光測定器配列を保持するＹステージの頂面から見た斜視図である。
【図１４】検出装置の電気的ブロック図である。
【図１５】フローセルを有する流体カートリッジの分解斜視図である。
【図１６】流体カートリッジ用の流体マップを示す。
【図１７】４サンプル注入回転バルブ
【図１８】一方向流及び２個のバルブを使用する試薬再利用システムのマップを示す。
【図１９】往復動作流及び単一バルブを使用する試薬再利用システムのマップを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、基板表面上に存在するような平面状エリアの高解像度検出を行う方法及び装置を提供する。特に有用な用途は、表面上に存在する生体サンプルの光に基づく画像化である。例えば、上述の方法及び装置を使用して、例えば、核酸シークエンシング用途で使用されるような核酸配列に存在する核酸特徴の画像を取得することができる。光検出可能なサンプル及び／又は試薬を用いる種々の核酸シークエンシング技術を使用することができる。これら技術は、とくに、本発明方法及び装置に適しており、したがって、本発明の特別な実験的では種々の利点が浮かび上がる。これら利点のうちいくつかを以下に説明目的のために述べ、また核酸シークエンシング用途は例示的なものであるが、利点は他の用途にも拡張できる。
【００１２】
上述した例の幾つかに関して、多くの核酸シークエンシング技術の際立った特徴は、(1) 多色検出の使用（例えば、しばしば４つの異なる蛍光色素分子を使用し、各個を核酸に存在するＡ，Ｃ，Ｇ及びＴ（又はＵ）の異なるヌクレオチドタイプに対して使用する）、(2) アレイ表面上の核酸サンプルからの異なる多数の断片（例えば、ゲノムサンプル、ＲＮＡサンプル、又はそれらの誘導体からの断片）の分布、(3) アレイの流体処理及び画像化の繰返しのサイクルである。本明細書に記載の方法及び装置は、とくに、核酸シークエンシングに有用であり、なぜなら多色かつ多頻度でアレイ表面の高解像度画像化能力を提供するからである。例えば、本明細書に記載の実施形態によれば、数百、数十又は一桁でさえものミクロンオーダー範囲内にある解像度で表面の画像を取得することができる。このように、最も近接充填核酸特徴部の平均中心−中心間隔が１００ミクロン、５０ミクロン、５ミクロン、又はそれより少ないミクロンで解像し得る。特別な実施形態において、表面の広視野画像を取得でき、例えば、アレイの１ｍｍ２又はそれ以上の面積にわたる画像を取得できる。画像は同時に又は順次に多色で取得でき、これにより、例えば、異なるヌクレオチドタイプに一意的に関連する蛍光ラベルを識別することができる。さらに、画像はシークエンシング技術の多数回サイクルにわたり順次に取得できる。アレイの或る領域からの画像は、各サイクルから信頼性高く比較でき、アレイ上における各核酸特徴に対して検出された色変化のシークエンス（配列）を決定することができる。次に、この色変化シークエンスを使用して各特徴における核酸断片のシークエンスを推察する。
【００１３】
特別な実施形態において、本発明装置は、１個又は複数個の顕微蛍光測定器を有する。各顕微蛍光測定器は、励起放射源、検出器及び対物レンズを有して、読取りヘッドの一体化サブユニットを形成する。他の光学的コンポーネントを各顕微蛍光測定器に設けることができる。例えば、ビームスリッタを設けてコンパクトな落射蛍光検出形態にし、これによりビームスリッタは励起放射を励起放射源から対物レンズに指向させ、また対物レンズからの発光放射を検出器に指向させるよう配置する。
【００１４】
一体化顕微蛍光測定器の設計を使用する利点は、例えば、スキャニング操作における移動が都合よくでき、顕微蛍光測定器の視野より大きい基板の画像化を可能にする。特別な実施形態において、数個の顕微蛍光測定器を組合せて読取りヘッドを形成する。読取りヘッドの組合せにおける種々の形態を以下に説明し、これら形態は、画像化すべき基板の特別なフォーマットに適合するとともに、読取りヘッド全体を比較的コンパクトなサイズに維持するよう選択することができる。本発明の幾つかの実施形態における読取りヘッドの比較的小さいサイズ及び少ない質量によれば、慣性を比較的少なくし、したがって、読取りヘッドは移動後即座に停止できるようになり、これにより核酸アレイ又は他の基板の迅速なスキャニングに有利に作用する。幾つかのケースにおいて、顕微蛍光測定器は、核酸シークエンシングのランのような解析用途の進行中に少なくとも若干の次元内で独立的に移動できないキャリッジに固定することができる。例えば、多重顕微蛍光測定器は、互いにｘ及びｙ次元（ｘ又はｙの少なくとも一方はスキャン方向である）に独立して移動できないよう恒久的に固定する。しかし、顕微蛍光測定器はｚ次元には独立して操作し、独立的合焦制御を行えるようにする。本発明装置における異なる顕微蛍光測定器の幾つかの間で自由度を減らすことにより、装置の輸送中、取扱い中、及び使用中におけるアラインメント喪失に対する防護をもたらす。
【００１５】
幾つかの実施形態において、読取りヘッド又はキャリッジに設ける多重顕微蛍光測定器は、各個に専用の合焦モジュールを有することができる。したがって、顕微蛍光測定器は独立的に合焦することができる。幾つかの実施形態において、読取りヘッドにおける特定合焦モジュールは特定顕微蛍光測定器の動作に専用化したものであるが、読取りヘッドにおける少なくとも１個の他の合焦モジュールからの情報を受取ることができ、また、その特定合焦モジュールからの情報、及び少なくとも１個の他の合焦モジュールからの情報を使用して、適切な動作を決定してその特定顕微蛍光測定器の望ましい合焦を達成できるようにする。このように、任意の所定顕微蛍光測定器の合焦は、同一読取りヘッド又はキャリッジに存在する２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器間の合意の下に決定することができる。
【００１６】
特別な実施形態において、本明細書に記載する方法又は装置で検出すべきサンプルは、カートリッジフォーマットにして設けることができる。例えば、カートリッジは、検出用の基板を処理するのに使用される他の流体成分とともに検出される基板を有することができる。核酸シークエンシング用途のより特別なサンプルをとることにより、カートリッジは、核酸特徴のアレイを検出装置に提示することができるフローセル、及び随意的にシークエンシング試薬を保持するリザーバ、サンプル分離試薬を保持するリザーバ、シークエンシング中に発生する廃棄物を保持するリザーバ、及び／又はポンプ、バルブ並びにフローセルに流体を流動させることができる他のコンポーネントを有することができる。このような流体カートリッジは、サンプル及び核酸シークエンシングのための試薬を貯蔵及び処理するのに使い勝手がよくコンパクトなフォーマットの利点をもたらすことができる。
【００１７】
特別な実施形態において、流体カートリッジは、１種類又は複数種類の試薬を再利用可能に構成することができる。例えば、流体カートリッジは、試薬をフローセルに配給し、次に試薬をフローセルから取出し、また次に試薬をフローセルに再導入するよう構成する。試薬を再利用する利点は、廃棄物を減らし、また高価な試薬及び／又は高い濃度で（又は大量に）配給される試薬を用いる処理コストを低減する点である。
【００１８】
本発明の流体カートリッジはモジュール方式の利点をもたらし、これにより異なるサンプルを第１モジュール（すなわち、流体カートリッジ）内で流体的に処理し、この第１モジュールは、第２モジュール（例えば、顕微蛍光測定器、読取りヘッド又は検出装置）に光学的に連通する。流体カートリッジは、サンプル、試薬、流体処理手順（例えば、核酸シークエンシング手順）を完遂するに十分な流体的ハードウェアを有することができ、また流体カートリッジは検出装置に送給することができる。流体及び検出手順が完了した後、流体カートリッジは取外して、検出装置が他の手順の準備ができるようにする。流体モジュール及び検出モジュールは分離可能であるため、このシステムは多くの異なるサンプルを評価できるとともに、サンプル間の交差汚染リスクを回避できる。このことにより、流体コンポーネント及び光学的コンポーネントがモジュール方式でないときに必要となる、不必要な保守、汚染除去、又は光学的コンポーネントの廃棄を回避することによって、検出コンポーネントが比較的高額であり、技術的に組立て困難である実施形態にとって、利点をもたらす。
【００１９】
図１は、本明細書に記載の幾つかの実施形態によってもたらされる一体化したオプトエレクトロニクス素子及びカートリッジベースの流体素子の利点を活用する例示的な光学的走査（スキャン）装置１を示す。この例示的な装置１は、例えば、光学的コンポーネント、計算コンポーネント、電源、ファン等の様々な固定コンポーネントを収納するハウジング２を有する。例えば、ハウジング２の前面に存在する画面３は、動作状態、実施している解析手順（例えば、シークエンシングのラン）の状態、装置１に対するデータの転送状態、使用のための指示、警告等の様々なタイプの情報を提供するグラフィカル・ユーザー・インタフェースとして機能する。カートリッジ受容部４もハウジングの前面に設ける。図示のように、カートリッジ受容部４は、保護ドア５を有するスロットとして構成することができる。この実施形態ではカートリッジ受容部のフレームにおけるインジケータ光の形態とした状態インジケータ６を設け、カートリッジの装置１内における有無を表示するよう構成することができる。例えば、インジケータ光６は、オンからオフに、又は１つの色から他の色に変化して、カートリッジの有無を表示することができる。この実施例においては、電源制御ボタン７をハウジング前面に設け、また製造業者名又は機器名のような識別印章８を設ける。
【００２０】
さらに図１には、サンプル及び試薬を装置１に供給するのに使用できる例示的流体カートリッジ１０を示す。流体カートリッジ１０は、リザーバ、流体接続部、ポンプ、バルブ等の様々な流体コンポーネントを保護するハウジング１１を有する。フローセル１２は、ハウジング内で試薬に流体連通する位置で流体カートリッジに一体化する。ハウジング１１は、フローセル１２の面が露出する開口１３を有し、流体カートリッジ１０をカートリッジ受容部４内に配置したとき、光学的走査装置１と光学的に相互作用できるようにする。カートリッジハウジング１１は、さらに、ターゲット核酸サンプルを導入するサンプルポート１４を有する。バーコード１５又は他のマシン可読印章を随意的にカートリッジハウジング１１に設け、例えば、サンプルの追跡及び管理を行うことができるようにする。他の印章１６もハウジングに設け、人的ユーザーが、都合よく製造業者、流体カートリッジによって支援される分析的な解析、ロット番号、有効期限、安全上の警告等を識別できるようにする。
【００２１】
図１に示す装置は例示的なものである。さらに、図１の実施形態に対して代替的又は付加的に使用できる本発明方法及び装置の他の例示的実施形態を以下に詳細に説明する。
【００２２】
本発明は検出装置を提供し、この検出装置は、(a) 複数個の顕微蛍光測定器を有するカートリッジであって、各顕微蛍光測定器は広視野画像検出用に構成した対物レンズを有し、複数個の顕微蛍光測定器は、共通平面における複数の広視野画像を同時に取得するよう配置し、また各広視野画像は、共通平面における異なり領域からの画像とする、該カートリッジ、(b) カートリッジを共通平面に平行な少なくとも１方向にカートリッジを移動するよう構成した並進ステージ、及び(c) 基板を共通平面上に保持するよう構成したサンプルステージを備える。
【００２３】
本発明の検出装置（又は個別顕微蛍光測定器）を使用して、特徴をミクロンスケールで区別するのに十分な解像度で１つ又は複数の画像を取得することができる。例えば、検出装置に使用される顕微蛍光測定器は大きくても５００μｍ、１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、４μｍ、３μｍ、２μｍ、又は１μｍで分離した特徴を区別するに十分な解像度を有することができる。より低い解像度も可能であり、例えば、５００μｍを超えて分離する特徴を区別する解像度にすることもできる。
【００２４】
本発明の検出装置（又は個別顕微蛍光測定器）は、表面の高解像度検出にも適する。したがって、ミクロンレンジの平均間隔を有する特徴があるアレイは、基板にとくに有用である。特別な実施形態において、検出装置又は顕微蛍光測定器を使用して、最も近接する隣接部の中心−中心間隔が平均で５００μｍ、１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、４μｍ、３μｍ、２μｍ、又は１μｍ、又はそれ未満の特徴があるアレイの画像を１つ又は複数を取得することができる。多くの実施形態において、アレイの特徴は、接触せずに、例えば、１００μｍ、５０μｍ、１０μｍ、５μｍ、４μｍ、３μｍ、２μｍ、１μｍ、又は０.５μｍ未満だけ分離しているものである。しかし、特徴は必ずしも分離していなくともよい。その代わり、アレイの特徴のうち幾つか又はすべてが互いに接触していることがあり得る。
【００２５】
従来既知の様々なアレイ（「マイクロアレイ」とも称する）のうち任意なものを使用することができる。代表的なアレイは特徴を有し、各特徴は個別のプローブ又はプローブ群を有する。後者の場合、それぞれの部位におけるプローブ群は、単一種のプローブを均質であるのが一般的である。例えば、核酸アレイのケースにおいて、各特徴はそれぞれが共通配列を持つ複数の核酸種を有する。しかし、幾つかの実施形態において、アレイの各特徴における集団は異質であり得る。同様に、タンパク質アレイは、単一のタンパク質又はタンパク質群を持つ特徴を有することができるが、必ずしも同一のアミノ酸配列を有している必要はない。プローブは、例えば、アレイ表面に対するプローブの共有結合により、又はアレイ表面に対するプローブの非共有結合的相互作用によりアレイ表面に対して付着し得る。幾つかの実施形態において、プローブ、例えば、核酸分子が、例えば、米国特許出願公開第２０１１／００５９８６５号（参照により本明細書に組入れられるものとする）に記載のようなゲル層を介して表面に付着することができる。
【００２６】
例示的アレイとしては、限定しないが、イルミナ社（カリフォルニア州サンディエゴ）から入手できるBeadChip Array、又は例えば、米国特許第６，２６６，４５９号、同第６，３５５，４３１号、同第６，７７０，４４１号、同第６，８５９，５７０号、若しくは同第７，６２２，２９４号、又は国際公開第００／６３４３７号（これら特許文献は参照により本明細書に組入れられるものとする）に記載のような、プローブが表面に存在するビード（例えば、表面におけるウェル内のビード）に取り付くような他のアレイがある。使用できる市場で入手可能なマイクロアレイの他の例としては、例えば、アフィメトリクス（Affymetrix：登録商標）社のGeneChip(登録商標)マイクロアレイ、又はしばしばＶＬＳＩＰＳ（Very Large Scale Immobilized Polymer Synthesis）技術と称される技術に従って合成された他のマイクロアレイがある。スポット付けしたマイクロアレイも、本発明の幾つかの実施形態による装置又はシステムに使用することができる。例示的なスポット付けマイクロアレイはアマーシャム・バイオサイエンシズ（Amersham Biosciences）社から入手可能なCodeLink（商標名）である。有用な他のマイクロアレイは、アジレント・テクノロジーズ社（Agilent Technologies）から入手可能なSurePrint（商標名）技術のようなインクジェット印刷方法を使用して製造するものがある。
【００２７】
他の有用なアレイには、核酸シークエンシング用途に使用されるものがある。例えば、ゲノム断片のアンプリコン（しばしばクラスタと称される）を有するアレイが特に有用であり、このようなアレイは、例えば、非特許文献（Bentley et al., Nature 456:53-59,2008）、以下の特許文献、すなわち、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、国際公開第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，２１１，４１４号、米国特許第７，３１５，０１９号、米国特許第７，４０５，２８１号、又は米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号（各文献は参照により本明細書に組入れられるものとする）に記載されている。核酸シークエンシングに有用な他のタイプのアレイは、エマルションＰＣＲ技術から生産される粒子アレイである。この例は、非特許文献であるDressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003)、特許文献である国際公開第０５／０１０１４５号、米国特許出願公開第２００５／０１３０１７３号、又は同第２００５／００６４４６０号（各文献は参照により全体が本明細書に組入れられるものとする）に記載されている。上述のアレイはシークエンシング用途の文脈で説明したが、例えば、シークエンシング技術を含まない他の実施形態にも使用することができる。
【００２８】
アレイ又は他のサンプルを検出する構成であろうとなかろうと、検出装置に設ける１個又は複数個の顕微蛍光測定器は、広視野検出ができるよう構成することができる。個別の顕微蛍光測定器の視野直径は、例えば、少なくとも０.５ｍｍ、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、５ｍｍ、又はそれより大きい直径とすることができる。適切な光学的コンポーネントを選択することにより、視野直径は最大面積に限定することができ、このように視野直径は、例えば、５ｍｍ、４ｍｍ、３ｍｍ、２ｍｍ、又は１ｍｍより大きくならないようにすることができる。したがって、幾つかの実施形態において、個々の顕微蛍光測定器によって取得される画像は、０.２５ｍｍ２〜２５ｍｍ２の範囲内の面積を有する。
【００２９】
広視野検出できるよう構成することの他に、顕微蛍光測定器は、０.２より大きい開口数（ＮＡ）を有するよう構成することができる。例えば、本発明の顕微蛍光測定器に使用される対物レンズのＮＡは、少なくとも０.２、０.３、０.４、又は０.５、とすることができる。代替的又は付加的に、０.８、０.７、０.６、又は０.５より大きくならないよう対物レンズのＮＡを制限するのが望ましい場合がある。本明細書に記載の方法及び装置は、とくに、０.２〜０.５の範囲内のＮＡを有する対物レンズを通して検出を生ずるときに有用である。
【００３０】
アレイ検出の実施形態において、検出装置（又は個々の顕微蛍光測定器）は、アレイのデジタル画像を取得するよう構成することができる。代表的には、デジタル検出装置（又は個々の顕微蛍光測定器）の各ピクセルは、任意の所定画像取得において、単に１つの特徴から信号を収集する。この構成によれば、画像における特徴間の望ましくない「クロストーク」を少なくする。各特徴から信号を検出するピクセルの数は、結像した特徴のサイズ及び形状に基づいて、またデジタル検出装置（又は顕微蛍光測定器）の構成に基づいて調整することができる。例えば、各特徴は、或る画像において、たったの約１６ピクセル、９ピクセル、４ピクセル、又は１ピクセルによって検出することができる。特別な実施形態において、各画像は、１特徴あたり平均６.５ピクセル、１特徴あたり平均４.７ピクセル、又は１特徴あたり平均１ピクセルを利用する。１特徴あたりに使用されるピクセルの数は、例えば、アレイのパターンにおける特徴の位置の変動性を減少し、またアレイに対する検出装置のアラインメント公差を厳密にすることによって減らすことができる。１特徴あたり４ピクセルより少ないピクセルを使用するよう構成したデジタル検出器を例にとると、画像品質は、ランダムに分布した核酸クラスタのアレイの代わりに、順序付けした核酸特徴のアレイを使用することによって、向上することができる。
【００３１】
多重顕微蛍光測定器を有する検出装置は、各顕微蛍光測定器が検出する広視野面積を顕微蛍光測定器の数に乗算した値にほぼ等しい共通平面の面積を検出できることは理解されるであろう。面積は必ずしも連続する必要はない。例えば、２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器は、共通平面における検出されない面積部によって分離した離散領域を検出するよう配置することができる。しかし、所望に応じて、多重顕微蛍光測定器は、連続するがオーバーラップしない面積を検出するよう配置することができる。代替的実施形態において、多重顕微蛍光測定器を有する検出装置は、各顕微蛍光測定器が検出する広視野面積を顕微蛍光測定器の数に乗算した値よりも相当少ない共通平面の面積を検出することができる。このことは、例えば、少なくとも部分的にオーバーラップする面積を検出するよう多重顕微蛍光測定器を配置するときに得られる。本明細書におけるいずれかの部分でさらに詳細に述べるように、多重画像は、アレイの完全画像を再構築するのに使用される、又は再構築の支援さえもするフォーマットで、又は検出した他の共通平面で取得する必要はない。
【００３２】
顕微蛍光測定器１００の例示的な光学的レイアウトを図２に示す。顕微蛍光測定器１００は、流体が充填されるチャネル１７５によって分離される上側層１７１及び下側層１７３を有するフローセル１７０に指向させる。図示の実施形態において、上側層１７１は光透過性であり、顕微蛍光測定器１００は上側層１７１の内側表面１７２における面積部１７６に合焦される。代替的実施形態において、顕微蛍光測定器１００は下側層１７３の内側表面１７４に合焦することができる。これら表面のうち一方又は双方は顕微蛍光測定器１００が検出すべきアレイ特徴を含む。
【００３３】
顕微蛍光測定器１００は、放射源１０２からの励起放射をフローセル１７０に指向させ、またフローセル１７０からの発光を検出器１０８に指向させる対物レンズ１０１を有する。例示的レイアウトにおいて、放射源１０２からの励起放射はレンズ１０５を通過し、次いでビームスリッタ１０６を通過し、次に経路上の対物レンズを経てフローセル１７０に至る。図示の実施形態において、放射源は、２個の発光ダイオード（ＬＥＤ）１０３，１０４を有し、これらＬＥＤは互いに異なる波長の放射を発生する。フローセル１７０からの発光放射を対物レンズ１０１によって捕捉し、またビームスリッタによって調整光学系１０７を経て検出器１０８（例えば、ＣＭＯＳセンサ）に向かうよう反射される。ビームスリッタ１０６は励起放射の経路に直交する方向に発光放射を指向させる。対物レンズの位置は、顕微蛍光測定器の焦点を変化させるｚ次元に移動することができる。顕微蛍光測定器１００はｙ方向に往復移動して、フローセル１７０の上側層１７１における内側表面１７２のうち若干エリアの画像を取得する。
【００３４】
図３は、様々な光学的コンポーネントの機能的配列を説明する目的として例示的顕微蛍光測定器の分解図を示す。２個の励起源は、緑ＬＥＤ（ＬＥＤＧ）及び赤ＬＥＤ（ＬＥＤＲ）として示す。それぞれからの励起光は、それぞれ緑ＬＥＤ集光レンズ（Ｌ６）及び赤ＬＥＤ集光レンズ（Ｌ７）を通過する。ＬＥＤ折畳みミラー（Ｍ１）は緑励起放射をコンバイナダイクロイック（Ｆ５）に反射させ、このコンバイナダイクロイック（Ｆ５）は、緑励起放射を励起フィルタ（Ｆ２）に、次にレーザーダイオードビームスリッタ（Ｆ３）、次に励起視野絞り（ＦＳ）、次に励起投射レンズ群（Ｌ２）を経て励起／発光ダイクロイック（Ｆ４）に反射させ、この励起／発光ダイクロイック（Ｆ４）は、緑励起放射を固定対物レンズ群（Ｌ３）及び並進対物レンズ群（Ｌ４）からフローセル（ＦＣ）の表面に反射させる。赤励起放射は、赤集光レンズ（Ｌ７）からコンバイナダイクロイック（Ｆ５）に通過し、この後赤励起放射は緑励起放射と同一経路を経てフローセル（ＦＣ）の表面に至る。図面に示すように、合焦は、並進対物レンズ群（Ｌ４）を上下に（すなわち、ｚ次元に沿って）移動することによって作動させる。フローセル（ＦＣ）表面からの発光は、並進対物レンズ群（Ｌ４）に、次いで固定対物レンズ群（Ｌ３）を通過して、励起／発光ダイクロイック（Ｆ４）に至り、この励起／発光ダイクロイック（Ｆ４）は、発光放射を発光投射レンズ群（Ｌ１）に通過させ、発光フィルタに、次いでＣＭＯＳ画像センサ（Ｓ１）に至らしめる。レーザーダイオード（ＬＤ）も、レーザーダイオード結合レンズ群（Ｌ５）を経由してレーザーダイオードビームスリッタ（Ｆ３）に指向させ、このレーザーダイオードビームスリッタ（Ｆ３）は、レーザーダイオード放射を、励起視野絞り（ＦＳ）、励起投射レンズ群（Ｌ２）、励起／発光ダイクロイック（Ｆ４）、固定対物レンズ群（Ｌ３）及び並進対物レンズ群（Ｌ４）に通過させてフローセル（ＦＣ）に向けて反射させる。
【００３５】
図２及び図３の例示的実施形態によって示すように、各顕微蛍光測定器は、ビームスリッタ及び検出器を有することができ、ビームスリッタは励起放射源からの励起放射を対物レンズに指向させ、また対物レンズからの発光放射を検出器に指向させる。図面に示すように、各顕微蛍光測定器は、随意的に、ＬＥＤのような励起放射源を有することができる。この場合、各顕微蛍光測定器は専用放射源を有し、読取りヘッドが数個の放射源を有し、これら放射源が個別の顕微蛍光測定器に向かうようにすることができる。幾つかの実施形態において、２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器は、共通放射源からの励起放射を受取ることができる。このように、２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器は放射源を共有する。例示的形態において、単独放射源は放射をビームスリッタに指向させることができ、このビームスリッタは、励起放射を２個又はそれ以上のビームに分離し、またこれらビームを２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器に指向させるよう配置することができる。付加的に又は代替的に、励起放射を放射源から１個、又は２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器に向けて１個又は複数個の光ファイバにより指向させることができる。
【００３６】
図示の特別な実施形態は例示的なものであり、同様の機能を持つコンポーネントで置換えることができる。例えば、種々の放射源のうちの任意な放射源をＬＥＤの代わりに使用できる。特に有用な放射源は、ランプ、レーザー、半導体光源（ＳＬＳ）、又はレーザーダイオードである。ＬＥＤは、例えば、ルミナス社（マサチューセッツ州ビルリカ）から購入できる。同様に、様々な検出器が有用であり、限定しないが、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）センサ、光電子増倍管（ＰＭＴ）、又は相補金属−酸化物−半導体（ＣＭＯＳ）センサがある。とくに有用な検出器は、アプティナ・イメージング社（カリフォルニア州サンホセ）から入手可能な５メガピクセルＣＭＯＳセンサ（ＭＴ９Ｐ０３１）である。
【００３７】
図２及び図３は、２個の励起放射源を有する顕微蛍光測定器の例示的実施形態を示す。この形態は、それぞれ異なる波長で励起する少なくとも２つの蛍光色素分子を検出するのに有用である。所望に応じて、顕微蛍光測定器は２個より多い励起放射源を有する構成にすることができる。例えば、顕微蛍光測定器は、少なくとも２個、３個、４個又はそれ以上の異なる励起放射源（すなわち、各放射源は互いに異なる波長を発生する）を有することができる。代替的に又は付加的に、ビームスリッタ及び光ファイバを使用して、個別放射源から得られる励起波長のレンジを拡張することができる。同様に、多重放射源及び／又は分割励起ビームの光学的フィルタリングを、幾つかの顕微蛍光測定器が１個又は複数個の放射源からの励起放射を共有する実施形態に使用することができる。本明細書のいずれかの箇所で詳細に説明するように、多重励起波長の利用可能性は、とくに、数種の蛍光色素分子ラベルを用いるシークエンシング用途に有用である。
【００３８】
図４は、単一読取りヘッド１５０における４個の顕微蛍光測定器の例示的配列を示す。４個の顕微蛍光測定器は、フローセル１６０の２つのチャネル１６１及び１６２に対して互い違いにしたレイアウトで配列する。図示の配列において、顕微蛍光測定器のうち２個（検出器１０８ａ及び１０８ｃに対応）が第１チャネル１６１における離れた領域を画像化するよう構成し、また顕微蛍光測定器のうち他の２個（検出器１０８ｂ及び１０８ｄに対応）が第２チャネル１６２における離れた領域を画像化するよう構成する。図示のように、顕微蛍光測定器（検出器１０８ａ及び１０８ｃに対応）は顕微蛍光測定器（検出器１０８ｂ及び１０８ｄに対応）に対してｘ次元に互い違いとなるように配列し、これにより２対の顕微蛍光測定器が隣接するチャネル１６１及び１６２をそれぞれ検出できるようにする。顕微蛍光測定器は、読取りヘッドと同一側に位置し、フローセル１６０とは反対側に位置する放射源１０２による、それぞれ互いに直交する（図２に示すような）発光経路及び励起経路を有する。２個の検出器１０８ａ及び１０８ｃは、読取りヘッドの第１側面サイドに配置し、また他の２個の検出器１０８ｂ及び１０８ｄは、読取りヘッドの反対側面サイドに配置し、双方の側面は励起放射源が位置する側面に対して直交する。図４に示す実施形態において、４個の放射源は単独の大型ヒートシンク１２０に熱接触する。単独の大型ヒートシンクは、各放射源用に個別のヒートシンクを使用する多くの形態に比べて、より大量の放熱を生ずる。しかし、所望に応じて、個別の放射源を個別のヒートシンクに熱的に結合させることもできる（例えば、以下に説明するような図８参照）。図４に示す顕微蛍光測定器配列の利点は、コンパクトな読取りヘッドを提供することである。同様の利点は、各顕微蛍光測定器における励起放射源及び検出器の相対位置を交換する実施形態（例えば、以下に説明するような図８参照）からも得られる。
【００３９】
図４に示す読取りヘッド１５０はｙ次元のスキャンをするよう配置する。ｙ次元はフローセル１６０の長さに平行であり、読取りヘッド１５０のスキャン動作における移動によりフローセル１６０の長さに沿うエリアを画像化する。検出器１０８ａ，１０８ｂ，１０８ｃ及び１０８ｄは読取りヘッド１５０の両側サイド及びフローセル１６０の両側サイドに配置し、フローセルの側面はスキャン方向に延在する。読取りヘッド１５０のフローセル１６０に対する向き及びスキャン方向は例示的なものである。例えば、検出器を読取りヘッドの両側ではあるが、スキャン方向に対して前後位置に配置する図１３に示す向きを含めて、他の向きも有用である。
【００４０】
顕微蛍光測定器又は数個の顕微蛍光測定器を有する読取りヘッドは、本明細書で説明する幾つかの実施形態として例示するように、フローセルの上方（重力に対して）に配置することができる。しかし、顕微蛍光測定器又は読取りヘッドをフローセルの下方に配置することもできる。したがって、フローセルは、頂面サイド、又は底面サイド、又はその双方サイドを使用する励起放射及び発光放射の波長に対して透過性にすることができる。実際、幾つかの実施形態において、顕微蛍光測定器をフローセルの頂面及び底面の両面サイドに配置する、又は読取りヘッドをフローセルの頂面及び底面の両面サイドに配置するのが望ましいことがある。例えば、フローセルと顕微蛍光測定器（又は読取りヘッド）との間の側−側（サイド・トゥ・サイド）の向きを含めて、重力に対する他の向きも可能である。
【００４１】
顕微蛍光測定器又は読取りヘッドは、フローセルの片側サイドからフローセルの互いにに対向する２つの内側表面を検出するよう構成することができる。例えば、顕微蛍光測定器又は読取りヘッドは、フローセルの表面を交互に検出するよう挿入及び取外しをする光学的補償器を使用することができる。光学的補償器を使用してフローセルの互いに対向する表面を検出する例示的方法及び装置は、米国特許第８，０３９，８１７号（参照により全体が本明細書に組入れられるものとする）に記載されている。補償器は随意的であり、例えば、ＮＡ及び／又は装置の光学的解像度に基づくものである。
【００４２】
本明細書に記載の装置又は方法に使用される顕微蛍光測定器は、自動合焦（オートフォーカス）モジュールを有することができる。したがって、読取りヘッドに設ける多重顕微蛍光測定器は、各個に専用自動合焦モジュールを有することができる。例示的自動合焦モジュール１６００を図５に示す。モジュールは、顕微蛍光測定器の対物レンズ（例えば、図３に示す並進対物レンズ）用の受容部１６０２を有する。受容部１６０２はレバーアーム１６０４を有する摺動支持体１６０３に固着する。レバーアーム１６０４は、レバーアームを上下動（ｚ方向に沿って）させるよう構成したモータ１６１０に摩擦的に相互作用する。このようにして、モータ１６１０は対物レンズをｚ方向に移動させ焦点を変化させる。モータ１６１０はリードねじを使用するリニアアクチュエータである。モータの回転力の下で内側のリードねじの回転により、リードねじがねじ係合するリードナット１６１３を上下動させる。リードナット１６１３は、２個の軸受１６１１ａ及び１６１１ｂ間に配置する。リードナットの移動はばね１６０８に抗してバイアスされる。リードナット１６１３はレバーアーム１６０４に物理的に接触し、これによりリードナットの上下動は摺動支持体１６０３及びひいては対物レンズの上下動を動作させる。センサ１６０９をスペーサ１６１２によってアクチュエータから離して自動合焦モジュールの下側サイドに配置する。
【００４３】
図５に示す自動合焦モジュール１６００には、さらに、サイド本体１６０７を有する構造支持体を設け、サイド本体１６０７は、後面１６１４に連結し、また頂部固定具１６０６及び底部固定具１６０５に連結する。剛性がサイド本体１６０７のボックス状フレーム構造によって得られる。さらに、剛性は、サイド本体１６０７と後面１６１４との間の２個の三角形支持体１６１５ａ及び１６１５ｂによって得られる。固定具１６０６及び１６０５は、摺動支持体と共成形し、摺動支持体とサイド本体１６０７との間に高い公差が得られるようにすることができる。
【００４４】
図５の例示的実施形態に示すように、顕微蛍光測定器に使用される自動合焦モジュールは検出器及びアクチュエータを有することができ、アクチュエータは顕微蛍光測定器の共通平面に対する焦点を変化させるよう構成し、また検出器はアクチュエータの移動を管理するよう構成する。このように、自動合焦モジュールは、アクチュエータの移動を管理する専用検出器を有することができる。専用検出器は、自動合焦を達成するため顕微蛍光測定器の外部又は検出ヘッドの外部とデータ通信をする必要なく、アクチュエータに対して閉ループで動作することができる。代替的に又は付加的に、広視野画像化に使用される画像化検出器のような、自動合焦モジュール外部の検出器がアクチュエータの移動を管理することができる。したがって、広視野画像化するため、及び顕微蛍光測定器又は読取りヘッドの外部の処理ユニットに画像データを出力するために使用される同一検出器を使用して、自動合焦を達成することもできる。
【００４５】
特別な実施形態において、読取りヘッドにおける２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器の自動合焦モジュールは、互いに通信し合うよう構成することができる。例えば、読取りヘッドの第１顕微蛍光測定器の自動合焦モジュールは、装置の第２顕微蛍光測定器の自動合焦モジュールからのデータを統合するよう構成することができる。このようにして、第１顕微蛍光測定器の自動合焦モジュールは、第１顕微蛍光測定器の把握した焦点位置及び第２顕微蛍光測定器の把握した焦点位置に基づいて、第１顕微蛍光測定器の焦点を変化させることができる。このように、自動合焦モジュールの検出器は、ほぼ読取りヘッドにわたる合焦を行うよう専用化して構成するとともに、解析用画像取得用には構成しないようにすることができる。２つの異なる自動合焦モジュールからの情報は、読取りヘッドの先端チルト（傾動）を決定するのに有用である。望ましくない先端チルトは、先端チルト情報に基づいて１個又は複数個の顕微蛍光測定器の補償的動作により補正することができる。
【００４６】
自動合焦は、リードねじモータにつき例示したが、他の動作モダリティを使用する自動合焦モジュールを使用することができ、例えば、圧電モータ、又はボイスコイルモータを上述の例示したリードねじモータの代わりに使用することも含まれる。
【００４７】
読取りヘッドは、２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器を、例えば、キャリッジに取付けて設けることができる。多重チャネルフローセルを使用する実施形態に関して、読取りヘッドは、フローセルのチャネル数に対応する数の顕微蛍光測定器を有することができる。図４の実施例で既に説明したように、フローセルチャネル１つあたり１個より多い数の顕微蛍光測定器を設けることができる。特別な実施形態において、読取りヘッドは１つのフローセルチャネルあたり単一の顕微蛍光測定器を設けることができる。図６に示す例示的構成において、フローセルは４個のチャネルを有し、また読取りヘッドは４個の顕微蛍光測定器を有する。この図面は、フローセル、及び顕微蛍光測定器の対物レンズの頂面図を示す。説明を分かり易くするため、顕微蛍光測定器の対物レンズ以外の他のコンポーネントは図示しないが、それら他のコンポーネントは、例えば、本明細書におけるいずれかの箇所で例示するように、コンパクトな設計となるよう配置することができる。図６Ａに示すように、４個の対物レンズは、対物レンズを密に詰め、また仮想ラインが各対物レンズの中心ポイントを通過する線形的関係となるよう配列することができる。仮想ラインはｙ次元に対して角度をなすようオフセットすることができ、ｙ次元はフローセルの最も長い次元（又はスキャン方向）に対応する。この角度は、ｘ−ｙ座標で０゜〜９０゜の範囲内の値とすることができ、またフローセルにおけるチャネルの間隔（及び読取りヘッドにおける対物レンズの間隔）に適合するよう選択することができる。図６Ａは、比較的密に詰めたチャネルに適合する、密に詰めた対物レンズを通過するラインのオフセット角度が比較的小さいものを示す。より大きいオフセット角度を使用して、互いにより大きい距離で離れるチャネル又はそれほど密には詰めない対物レンズに適合させることができる。
【００４８】
図６Ｂは、２ライン多重対物レンズを配列した状況を示す。この場合、フローセルは８チャネル有し、読取りヘッドは８個の顕微蛍光測定器を有する。２ラインにする対物レンズの全体的詰め合わせはほぼ直線的である。この配列は、密に詰めた対物レンズ及び密に詰めた２セットのチャネル（４個の密に詰めた第１セット及び４個の密に詰めた第２セット）に適合する。この実施例において、密に詰めた２セットのチャネルは、４個の各セットにおける個別チャネルを隔てる間隔よりも大きい間隔で離れる。２ラインにする対物レンズ詰め全体は、異なるチャネル配列に適合する直線からオフセットすることができる。単一対物レンズラインにつき上述したように、双方の対物レンズ中心ラインを通過する仮想ラインのオフセット角度は変化し得る及び／又は対物レンズ間距離は、異なるチャネル配列に適合するよう変化し得る。
【００４９】
図７は、対物レンズの中心を通過する仮想ラインがフローセルの最も長い次元（スキャン方向）に対して９０゜の角度をなす多重対物レンズの配列を示す。仮想ラインはｘ軸方向に沿って延在する。この実施例において、対物レンズは２列であり、また６個詰めである。６個詰めによれば、ｘ−ｙ平面で最大詰め合わせ利点が得られる。読取りヘッドは６個の対物レンズを有し、またフローセルは６個のチャネルを有する。同様の配列を、単に４個の対物レンズを有する読取りヘッド、又は６個より多い対物レンズ（例えば、図８、図９、及び図１３に示す８個の対物レンズ）を有する読取りヘッドに使用することができる。視覚的比較によって明らかなように、フローセルのチャネルは、図７の配列が図６の配列におけるよりも一層離れた間隔をとる。しかし、双方の場合においてチャネル間隔は、例えば、核酸シークエンシング用途に有用で都合のよい範囲内とする。
【００５０】
図６及び図７の実施例によって示すように、読取りヘッドにおける各対物レンズは、個別フローチャネルの少なくとも一部を画像化するよう配置することができる。各対物レンズは数個のチャネルを有するフローセルのうちただ１つのチャネルのみ画像化するよう配置することができる。個々の対物レンズは、例えば、特別なｙステージ位置にあるとき、ただ１つのチャネルのみの一部を画像化するよう配置することができる。ｙ次元におけるスキャンにより、対物レンズを通してチャネルのすべて又は一部を画像化することができる。幾つかのケースにおいて、例えば、対物レンズ（又は顕微蛍光測定器の他の制限光学的コンポーネント）の視野直径がチャネルの幅より小さいとき、対物レンズはｘ次元にもスキャンして、チャネルのすべて又は一部を画像化することができる。多重対物レンズ及びそれに対応する顕微蛍光測定器は、幾つかの対物レンズがそれぞれ単に１つのチャネルの少なくとも一部の画像を取得するよう配置されるよう、配置することができる。多重対物レンズ及びそれ他の顕微蛍光測定器を有する読取りヘッドの移動は、ｙ及び／又はｘ方向に生じて、それぞれに対応するチャネルのすべて又は一部を画像化することができる。これら特別な形態は、既に例示した多重チャネルフローセルに有用である。しかし、上述の形態及びそれらに内在する原理は、数個の個別フローセルであって、各フローセルが単独チャネルを有する適切な配列にも適用できることは理解されるであろう。さらに、本明細書で説明する方法及び装置に関し、概してこれら配列はフローセル以外の基板にも適用することができる。
【００５１】
８個の顕微蛍光測定器による配列を有する読取りヘッド１０００の斜視図を図８に示す。各顕微蛍光測定器は、図３に示すのと同様にコンパクトな設計を有する。説明を分かり易くするため、図８では顕微蛍光測定器のうち１つのみにおけるコンポーネントに対して参照符号を付けて示し、ここで説明する。しかし、図８で視認できるように、各顕微蛍光測定器は同様のコンポーネント及び形態を有する。２個の励起源、すなわち、緑ＬＥＤ１０４０及び赤ＬＥＤ１０３０を各顕微蛍光測定器に設ける。ＬＥＤからの励起光は緑ＬＥＤ集光レンズ１０７５及び赤ＬＥＤ集光レンズ１０７６をそれぞれ通過する。ＬＥＤ折畳みミラー１０７４は、緑励起放射をコンバイナダイクロイック１０７３に向けて反射し、このコンバイナダイクロイック１０７３は、緑励起放射をレーザーダイオードビームスリッタ１０７２、次に励起投射レンズ１０７１に通過させて励起／発光ダイクロイック１０６０に向かうよう反射し、この励起／発光ダイクロイック１０６０は、緑励起放射を対物レンズ１０１０に通過させるよう反射する。赤励起放射は赤ＬＥＤ集光レンズ１０７６からコンバイナダイクロイック１０７３に通過し、この後赤励起放射は緑励起放射と同一経路を辿る。対物レンズ１０１０は、発光放射を集光して励起／発光ダイクロイック１０６０に通過させるよう指向させ、この励起／発光ダイクロイック１０６０は、発光放射をＣＭＯＳ画像センサ１０８０に至らせる。レーザーダイオード１３０１は、放射をレーザーダイオード結合レンズ群１４０１経由でレーザーダイオードビームスリッタ１０７２に指向させるよう配置し、このレーザーダイオードビームスリッタ１０７２は、レーザーダイオード放射を、励起投射レンズ１０７１、励起／発光ダイクロイック１０６０、及び対物レンズ１０１０に通過させるよう反射する。自動合焦モジュール１６００は、対物レンズ１０１０の少なくとも一部に連結し、また対物レンズ１０１０を上下に（すなわち、ｚ次元に沿って）並進移動するよう構成する。自動合焦モジュールは、図５に例示した自動合焦装置のコンポーネントを有することができるが、図５と同様のものにする必要はない。追加の光学的コンポーネントを、限定しないが図８に例示するような読取りヘッド１０００に設けることができる。さらに、若干の光学的コンポーネントを読取りヘッド１０００から省く、又は変更して特別な用途に適合させることができる。プリント回路板１７０１及び１７０２は、検出器、自動合焦モジュール及び／又は励起源と通信し合うよう構成することができる。
【００５２】
図９は読取りヘッド１０００の底面図を示す。やはり説明を分かり易くするため、顕微蛍光測定器のうち１つのみにおけるコンポーネントに対して図９で参照符号を付けて示し、ここで説明する。赤ＬＥＤ１０３０はヒートシンク１２０１に熱連通し、赤ＬＥＤ集光レンズ１０７６と光学的に整列した状態を示す。緑ＬＥＤは赤ＬＥＤ１０３０で遮られて見えず、また励起経路の大部分は自動合焦モジュール１６００に遮られて見えない。対物レンズ１０１０はＣＭＯＳ画像センサ１０８０の一部とともに視認可能である。しかし、発光経路の大部分は遮られて見えない。図面から分かるように、対物レンズは２列に六方密に配列する。
【００５３】
上述の形態は読取りヘッドを例示するものであり、各顕微蛍光測定器は、少なくとも１個の放射源、ビームスリッタ及び検出器を有し、ビームスリッタは、励起放射源からの励起放射を対物レンズに指向させ、また対物レンズからの発光放射を検出器に指向させるよう配置し、励起放射及び発光放射を互いに直交する方向に指向させる。図８及び図９に例示した実施形態において、数個の顕微蛍光測定器用の検出器は、対物レンズが合焦する共通平面側とは反対側の第１サイドに配列し、放射源のサブセットは、読取りヘッドの第２サイドに配列し（第２サイドは、第１サイドに対して直交し、また共通平面に対して直交する）、また放射源の第２サブセットは、読取りヘッドの第３サイドに配列し（第３サイドは、第２サイドに対して対向し、第１サイドに対して直交し、また共通平面に対して直交する）。代案として、図４に例示するように、数個の顕微蛍光測定器の放射源は、読取りヘッドにおける対物レンズが合焦する共通平面側とは反対側の第１サイドに配列し、検出器の第１サブセットは読取りヘッドの第２サイドに配列位置し（第２サイドは、第１サイドに対して直交し、また共通平面に対して直交する）、検出器の第２サブセットはキャリッジの第３サイドに配列位置し（第３サイドは、第２サイドに対して対向し、第１サイドに対して直交し、また共通平面に対して直交する）。
【００５４】
励起経路及び発光経路が互いに直交する上述の実施形態に加えて、励起経路及び発光経路が互いに平行な形態も有用である。この場合、励起放射源及び検出器は読取りヘッドにおける同一サイドに設けることができる。顕微蛍光測定器８００の例示的レイアウトを図１０に示し、この場合、励起源８０５からの励起放射は、励起光学系８０６からプリズム表面８０７に至り、このプリズム表面８０７は、励起放射を対物レンズ８０１に向かうよう反射する。発光は、対物レンズ８０１、次いでビームスリッタ８０２を経て投射レンズ８０３に、次いで検出器８０４に至る。発光経路は励起経路の大部分に平行である。検出器及び励起放射源は顕微蛍光測定器の同一サイドで、検出器平面に平行に対向する。ガイド８１０は、フローセル又は基板が対物レンズと整列する仲立ちをするよう構成する。同様のガイドを本明細書に記載の他の実施形態に使用することができる。顕微蛍光測定器８００のレイアウトは、励起経路及び発光経路の平行配列を説明するための例示である。他の図面で示すような他のコンポーネント、例えば、限定しないが自動合焦モジュールを設けることができる。自動合焦モジュールのための励起源８０９を示し、この励起源８０９は、プリズム表面８０７を通過し、プリズム表面８０２によって反射し、対物レンズ８０１を経て通過する励起放射を発生する。数個の顕微蛍光測定器８００は図６及び図７で例示したように１ライン又は複数ラインに配列した対物レンズを有する構成することができる。
【００５５】
上述の例示的実施形態で説明したように、読取りヘッドは、複数個の対物レンズを有し、各対物レンズは、単一の顕微蛍光測定器に対して専用化する。したがって、本発明の顕微蛍光測定器は、様々な光学的コンポーネント、例えば、１個又は複数個の検出器、励起放射源、ビームスリッタレンズ、ミラー等を有することができ、これら光学的コンポーネントは、励起放射を単独の対物レンズに指向させ、及び／又は単独の対物レンズから発光放射を受取る光学的連鎖を形成する。このような実施形態において、対物レンズは、広視野を有するマクロレンズとして構成することができる。代案として、本発明の顕微蛍光測定器は、励起放射を数個の対物レンズに指向させる及び／又は数個の対物レンズから発光放射を受取る様々な光学的コンポーネントを有することができる。したがって、個別の顕微蛍光測定器は、数個の対物レンズを含む数個の光学的連鎖を有することができる。１つの顕微蛍光測定器あたり数個の対物レンズを有する実施形態において、対物レンズは、マイクロレンズのアレイとして構成することができる。特別な顕微蛍光測定器における各対物レンズ（例えば、マイクロレンズのアレイにおける各マイクロレンズ）は、随意的に、独立的に合焦するよう構成し、これにより各対物レンズは、同一顕微蛍光測定器における他の対物レンズとは独立的にｚ次元に移動することができる。代替的に又は付加的に、数個の対物レンズは、すべてが一斉にｚ次元で移動する一斉合焦をするよう構成することができる。
【００５６】
上述した読取りヘッドの様々なコンポーネントは、本明細書で例示したのと同様の機能を達成するよう種々のやり方で組合せ、また適合させることができることを理解されたい。例えば、上述の段落で示すように、読取りヘッドは数個の対物レンズを有し、各対物レンズは単独の顕微蛍光測定器に対して専用化することができ、又は代案として、数個の対物レンズを単独の顕微蛍光測定器が共有することができる。同様に、上述したように、各顕微蛍光測定器は、少なくとも１個の専用励起源を有する、又は代案として、２個又はそれ以上の顕微蛍光測定器が共有の放射源からの励起放射を受けるようにすることができる。このように、特定読取りヘッドにおける顕微蛍光測定器の数と、任意の顕微蛍光測定器の実施形態につき例示したコンポーネントの数との間で１対１に対応させる必要はない。その代わり、顕微蛍光測定器において有用であると本明細書に例示した１個又は複数個のコンポーネントは、特定読取りヘッドにおける数個の顕微蛍光測定器が共有することができる。
【００５７】
本発明の読取りヘッドは走査方法及び装置に特に有用であり、その理由は、例えば、比較的コンパクトなサイズ及び小さい慣性をもたらす低質量である。減少した慣性は、読取りヘッドを移動に続いてより迅速に休止させ、これによって、より高い慣性を有する読取りヘッドの場合よりも速く高解像度の画像を取得でき、高い慣性の読取りヘッドでは、読取りヘッドの残留移動が解像度のぼやけ及び損失を生ずる。読取りヘッドを移動させる構成は以下のより詳細に説明する。しかし、低慣性の利点は、本明細書に記載の装置又は方法を限定するものではなく、また必須要件でもない。むしろ、本発明の読取りヘッドは、検出プロトコルの全体又は一部にわたり静止状態に維持することができる。例えば、本明細書で説明する流体的ステップ及び画像化ステップを使用するようなシークエンシング方法は、シークエンシング方法におけるサイクルの少なくとも一部及びおそらくすべてにわたり静止している読取りヘッドを使用して実施することができる。
【００５８】
静止読取りヘッド実施形態の第１の実施例として、読取りヘッドは、表面及び他の対象物の所望部分を検出又は画像化する十分な数の顕微蛍光測定器を有することができる。したがって、読取りヘッドはｘ又はｙ次元で移動する必要はない。例えば、数個の顕微蛍光測定器を線形に配列し、フローセルチャネルの全長（又は有効ターゲット長さに沿う少なくとも一部）に沿って画像フレームを捕捉することができる。同様に、上述したような顕微蛍光測定器を数個の列に適切に詰める配列を使用して、数個のフローセルチャネル（１個又は複数個のフローセルに存在する）はその全長（又は有効ターゲット長さに沿う少なくとも一部）に沿って画像化することができる。上述したように、個別のチャネルに対して取得される画像フレームは、連続することができるが、必ずしも連続しなくともよい。
【００５９】
静止読取りヘッド実施形態の第２の実施例として、読取りヘッドは、ｘ及びｙ次元に対して固定位置に留めるとともに、読取りヘッドによって検出される基板をｘ又はｙ次元で並進移動させる。例えば、基板を読取りヘッドに提示するよう構成した並進ステージを有する装置を設けることができる。並進ステージはステップ・アンド・シュート動作又は連続動作で移動し、静止読取りヘッドによって基板をスキャンすることができる。特別な実施形態において、基板は並進ステージに固定できるフローセルとする。フローセルは、以下に例示するような流体カートリッジの一部として並進移動することができ、又は任意の流体カートリッジとは独立的に並進移動することができる。このように、並進ステージは、フローセルを取付ける流体カートリッジを固定し、また流体カートリッジをフローセルとともに移動するよう構成することができる、又は並進ステージは、フローセルのみを移動するとともに、流体カートリッジは静止又は固定位置に留めるよう構成することができる。
【００６０】
上述の実施例によれば、スキャンヘッド（又は顕微蛍光測定器）と基板との相対移動は、スキャンヘッド（又は顕微蛍光測定器）の物理的移動、基板の物理的移動、又は双方の物理的移動によって達成することができる。上述した第１及び第２の例示的実施形態で言及した静止読取りヘッドは、必ずしもｚ次元での移動に関して静的である必要はない。その代わり、静止読取りヘッドは自動合焦モジュールを有する１個又は複数個の顕微蛍光測定器を有することができる。代替的に又は付加的に、読取りヘッドは全体としてｚ次元で移動し、例えば、少なくとも粗接近する上での一斉合焦が得られるようにできる。
【００６１】
次に、読取りヘッドを並進させる実施形態に戻って、図１１及び図１２にはそれぞれ読取りヘッドのための例示的並進ステージ２００の頂面図及び底面図を示す。この例示的実施形態において、ステージは、ｘ次元ではなくｙ次元に並進移動するよう構成する。したがって、ｙ並進ステージ２００に担持した読取りヘッドは、ｙ次元に移動することができ、またこの並進ステージにおける読取りヘッド又は個別の顕微蛍光測定器はｚ次元（例えば、自動合焦により）に移動可能であるが、ｘ次元では移動できない。読取りヘッドはキャリッジ２０１に固定し、このキャリッジ２０１は、読取りヘッドの底面を支持するよう配置した底部領域２４１と、読取りヘッドの側方移動を抑止するよう構成したフレーム２４０とを有する。キャリッジ２０１は、さらに、フランジガイド２４３及びカラーガイド２４２を有する。底部領域２４１における開口２４４は、読取りヘッドと、読取りヘッドが検出すべき基板との間の窓をなす。キャリッジ２０１の上述のコンポーネントは、モノリシック構体を形成することができる。
【００６２】
キャリッジは、ｙステージフレーム２０７に沿って、カラーガイド２４２が走行する第１シャフト２０３を介して、またフランジガイド２４３が走行する第２シャフト２０４を介して移動するよう構成する。これらシャフトはｙ軸方向に指向させて、キャリッジ２０１がｙ次元に沿ってガイドを介して往復摺動する。第１シャフト２０３はｙステージフレーム２０７に保持し、この保持は、第１側壁２５０における基準面２１５及び第２側壁２５１における基準面２１８に挿入することによって行う。第１シャフト２０３は、支持部材２５２によって基準面２１５にクランプし、また支持部材２５３によって基準面２１８にクランプする。第２シャフト２０４はｙステージフレーム２０７に保持し、この保持は、第１側壁２５０における基準面２１４に、また第２側壁２５１における基準面２１７に挿入することによって行う。第２シャフト２０４は、シャフトクランプ２０６によって基準面２１４に、またシャフトクランプ２０５によって基準面２１７にクランプする。
【００６３】
キャリッジ２０１の移動は、リードねじ２０２の回転によって駆動し、このリードねじ２０２は、リードナット２６０に挿通し、また第１側壁２５０の基準面に挿入し、かつ第２側壁２５１の基準面２１９に挿入することによって、ｙステージフレーム２０７に固定する。リードねじ２０２は、第１シャフト２０３をクランプするのと同一の支持部材２５２及び２５３によって所定位置にクランプする。リードねじ２０２の回転は支持部材２５２に取付けたモータ２１２によって駆動する。エンコーダ２０８はベルト２１０を介してモータ２１２と相互作用するよう構成し、ベルト２１０は、エンコーダにおけるロータ２０８及びモータ２１２におけるロータ２１１と相互作用する。ベルト張力付与装置２２０はベルト２１０と相互作用する。
【００６４】
開口２３０はｙステージフレーム２０７のフロア２１６に貫通する。開口２３０は、キャリッジ２０１がｙステージフレームを横行するときキャリッジ２０１の底部領域２４１における開口２４４の軌跡を収容するよう配置する。読取りヘッドのキャリッジにおける位置決めは、対物レンズがキャリッジの横行軌跡に沿う開口２４４及び開口２３０に指向するよう行う。したがって、開口２３０はキャリッジに取付けた読取りヘッドの移動を介してｙ軸に沿う細長領域の画像化に適応する。
【００６５】
並進ステージ２００と読取りヘッド１０００との間の構造的及び機能的関係を図１３に示す。対物レンズ１０１０の並進ステージ２００におけるスキャン方向に対する向きは、図７に例示した向きと同様にする（読取りヘッド１０００が追加による２個の対物レンズを有する点で異なる）。フローセルは、図７に示すように、ｙ並進ステージ２００に対して指向させる。
【００６６】
先に例示したように、キャリッジは、例えば、スキャン方向に読取りヘッドを移動するよう構成することができる。代替的に又は付加的に、キャリッジは、読取りヘッドの個別の顕微蛍光測定器相互間でｘ及びｙ次元での相対移動を防止するよう構成することができる。キャリッジは、例えば、読取りヘッドが顕微蛍光測定器相互間の横方向相対移動を防止する他の構体素子を有する場合には、この機能をもる必要はない。例えば、読取りヘッドは共成形アセンブリから形成することができる。共成形アセンブリは、次にキャリッジに固定することができる。それにも係わらず、幾つかの実施形態において、キャリッジは、読取りヘッドの個別顕微蛍光測定器相互間の横方向相対移動を防止する少なくとも補助的な役割を果たすことができる。さらに、共成形アセンブリから形成した読取りヘッドを、キャリッジを用いない実施形態にも使用できることは理解できるであろう。
【００６７】
本明細書に記載の方法及び装置に使用するｙステージは、非連続動作又は連続動作でスキャンするよう構成することができる。非連続スキャンは、しばしばステップ・アンド・シュートスキャンと称され、顕微蛍光測定器又はスキャンヘッドのｙ（又はｘ）方向への漸進移動及び移動相互間での検出（例えば、画像取得）を含むとともに、顕微蛍光測定器又はスキャンヘッドは一時的に静止状態をとる。一方、連続スキャンは、概して微蛍光測定器又はスキャンヘッドが移動している間に検出又は画像取得を行う。特別な実施形態において、連続スキャンは時間遅延積分（ＴＤＩ：time delay integration）モードで実施することができる。したがって、スキャン次元に沿ってピクセル要素が取得する信号を共通ビンに集積し、また信号値として読出しをする。ＴＤＩモードは、信号処理レートが増大し、また精度が向上するという利点が得られる。顕微蛍光測定器又は読取りヘッドに設けてＴＤＩモード検出に適合するようにできる例示的光学的構成は、例えば、米国特許第７，３２９，８６０号（参照により本明細書に組入れられるものとする）に記載されている。
【００６８】
例えば、連続的又は非連続的なスキャンモダリティに適合するための、顕微蛍光測定器又はスキャンヘッドのｘ又はｙ次元での移動は、エンコーダ又は他のデバイスによって制御することができる。ｙステージ２００の実施例において、動作はエンコーダ２０８によって制御することができる。上述したように、スキャン（連続的又は非連続的ないずれの技術であろうとも）は、検出下にある基板又は他の対象物から連続的又は非連続的なフレームを取得する結果となるようにすることができる。したがって、スキャンによって画像化される部分の総和は、連続的なもの（しかし、オーバーラップしない）、非連続的なもの、又はオーバーラップするものとすることができる。システムは、基板又は対象物（例えば、アレイ表面）の全体の画像を取得するよう構成する必要はなく、また合成画像を生成できるようにする必要もない。
【００６９】
検出装置の電気的ブロック図を図１４に示す。読出し用プリント回路板（ＰＣＢ）は、読取りヘッドに設け（例えば図８におけるＰＣＢ１７０１及び１７０２参照）、また代表的には検出装置ハウジング内に収納する主ＰＣＢに接続する。代替的実施形態において、主ＰＣＢは機器の外部に配置することができる。データは、読出しＰＣＢと主ＰＣＢとの間でＬＶＤＳラインを介して通信することができる。例えば、０.５ｍｍピッチ、３６芯フラットフレックスケーブル（ＦＦＣ）をＬＶＤＳラインに使用することができる。ＬＶＤＳラインは、読出しＰＣＢから主ＰＣＢに画像データを、また主ＰＣＢから読出しＰＣＢにカメラ制御命令を通信するよう構成することができる。２つのＰＣＢは、例えば、１ｍｍピッチ、３０芯ＦＦＣのような電源ラインによって接続し、主ＰＣＢを経由して２４ボルト電源からの電力を送電する。ＦＦＣ接続は、十分な長さ及び可撓性を持たせ、主ＰＣＢが静止したままで、読出しＰＣＢが読取りヘッドと一緒に移動できるようにする。
【００７０】
図１４の実施例において、主ＰＣＢは、USB3.0 SS I/Fコネクタを介して外部一次解析パーソナルコンピュータ（ＰＣ）にも接続する。幾つかの実施形態において、一次解析コンピュータは、検出装置のハウジング内に配置することができる。しかし、機器外に一次解析コンピュータを配置すると、異なる用途向けの種々のコンピュータを互換的に使用でき、検出装置の動作を中断することなく一次解析コンピュータの交換による都合のよい保守が行え、また検出装置の占有面積を小さくすることができる。種々のコンピュータのうち任意なものを使用することができ、例えば、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、又はアクセス可能なメモリと運用上の通信するプロセッサ及びコンピュータが本明細書に記載の方法を実施する実装命令を含むサーバーとすることができる。主ＰＣＢは、さらに、人的ユーザーに通信するための液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）に接続する。他のユーザー・インタフェースも使用することができる。
【００７１】
幾つかの実施形態において、ユーザー・インタフェースは、ユーザー及びユーザー入力を受取るユーザー入力デバイス（例えば、キーボード）からの情報を表示又は要求するディスプレイ（例えば、ＬＣＤ）を有する。幾つかの実施形態において、ディスプレイ及びユーザー入力デバイスは同一デバイスとする。例えば、ユーザー・インタフェースは、個人のタッチの存在を検出し、またディスプレイ上のタッチ位置を識別するよう構成したタッチ感応ディスプレイを有することができる。しかし、他のユーザー入力デバイス、例えば、マウス、タッチパッド、キーボード、キーパッド、携帯スキャナ、音声認識システム、モーション認知システム等を使用することができる。
【００７２】
読出しＰＣＢは、８個のDS90CR217トランスミッタを有し、個別センサ（すなわち、検出器）からのデータを、ＬＶＤＳライン、３.３ボルト切替えレギュレータ、５ボルト切替えレギュレータ、及びＬＥＤ励起放射源のためのＬＥＤバックドライブに転送する。
【００７３】
主ＰＣＢは、ＬＶＤＳからの画像データを受取るよう構成したＦＰＧＡ＋プロセッサを有する。DDR3 DIMMフレームバッファを電子的にＦＰＧＡ＋プロセッサに接続する。主ＰＣＢは、さらに、熱制御レギュレータ、及びｙ軸モータ、キャリッジモータ、バルブモータ及びポンプモータのような各種駆動モータのための制御回路を有する。
【００７４】
本発明は、さらに、基板を画像化する方法を提供し、この方法は、(a) 表面に蛍光特徴部を有する基板を準備するステップと、(b) 複数個の顕微蛍光測定器を用いて表面における第１部分の広視野画像を複数取得する画像取得ステップであって、各顕微蛍光測定器は、表面の異なる位置から広視野画像を取得し、複数個の顕微蛍光測定器はキャリッジに固定するものとする、該画像取得ステップと、及び(c) 表面に平行な方向にキャリッジを並進移動させ、表面の第２の部分に対してステップ(b)を繰返す、ステップとを有する。この方法は本明細書の何れかの箇所で説明した任意の装置を使用するが、説明したすべての実施形態に限定する必要はない。
【００７５】
本発明方法の実施形態は、とくに、核酸シークエンシング技術に使用する。例えば、シークエンシング・バイ・シンセシス（ＳＢＳ：sequencing-by-synthesis）プロトコルはとくに、利用可能性がある。ＳＢＳにおいて、核酸テンプレートに沿う核酸プライマーの拡張をモニタリングして、テンプレートにおけるヌクレオチド配列を決定する。内在する化学的プロセスは、重合反応（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒作用を受ける）又は連結反応（例えば、リガーゼ酵素によって触媒作用を受ける）であり得る。特別なポリメラーゼベースのＳＢＳの実施形態において、蛍光ラベル付けしたヌクレオチドをテンプレート依存様態でプライマーに付加し（したがって、プライマーを拡張し）、プライマーに付加されたヌクレオチドの順序及びタイプの検出を使用してテンプレートの配列を決定することができる。異なるテンプレートで生ずるイベントを区別できる条件下にある表面上で、異なる複数のテンプレートに対してＳＢＳ技術を適用することができる。例えば、テンプレートは、異なるテンプレートを互いに空間的に区別できるようにアレイの表面上に設けることができる。代表的には、テンプレートは、それぞれが同一テンプレートの複数コピー（ときに「クラスタ」又は「コロニー」と称される）を有する特徴を生ずる。しかし、各特徴が単一テンプレート分子を持ち、単一テンプレート分子が互いに分解可能なアレイ（ときに「単一分子アレイ」と称される）上でＳＢＳを実施することもできる。
【００７６】
フローセルは核酸アレイを収容するのに都合のよい基板を提供する。フローセルは、その技術が概してサイクル毎に試薬を繰返し配給するのでシークエンシング技術として好都合である。例えば、第１ＳＢＳサイクルを開始するため、１つ又は複数のラベル付けしたヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ等を、核酸テンプレートのアレイを収容するフローセル内に流入させる／フローセルを通過させることができる。プライマー拡張によりラベル付けしたヌクレオチドを組入れさせるという特徴は、例えば、本明細書に記載の方法又は装置を使用して検出することができる。随意的に、ヌクレオチドは、ヌクレオチドがプライマーに付加された後に更なるプライマー拡張で終端する可逆終端特性を有することができる。例えば、可逆ターミネーター構成成分を有するヌクレオチド類似体をプライマーに付加し、ブロック解除試薬を配給して可逆ターミネーター構成成分を除去するまで、その後の拡張を生ずることができないようにすることができる。このようにして、可逆終端を使用する実施形態に関して、ブロック解除試薬はフローセルに（検出前又は後に）配給することができる。種々の配給ステップ相互間で洗浄を実施することができる。したがって、サイクルをｎ回繰返し、ｎ個のヌクレオチドによってプライマーを拡張し、長さｎの配列を検出することができる。例示的シークエンシング技術は、例えば、非特許文献（Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)）、特許文献（国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第０７／１２３７４４号、国際公開第９１／０６６７８号、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，２１１，４１４号、米国特許第７，３１５，０１９号、米国特許第７，４０５，２８１号及び米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号）に記載されており、これら文献は参照によって本明細書に組入れられるものとする。
【００７７】
ＳＢＳサイクルのヌクレオチド配給ステップに関して、１回につき単一タイプのヌクレオチドを配給する、又は複数の異なるタイプのヌクレオチド（例えば、Ａｋ，Ｃ，Ｔ及びＧを一緒に）を配給することができる。１回につき単一タイプのヌクレオチドのみ存在するヌクレオチド配給形態に関して、異なるヌクレオチドは個別配給での一時的分離に基づいて区別できるので、異なるヌクレオチドは明確なラベルを持つ必要はない。したがって、単一カラー検出を使用するシークエンシング方法又は装置が可能である。例えば、顕微蛍光測定器又は読取りヘッドは、単一波長の又は波長の単一レンジ内での励起を生ずるだけで済む。したがって、顕微蛍光測定器又は読取りヘッドは単一励起源を有するだけで済み、また複数帯域の励起フィルトレーションは不要である。１回の配給により複数の異なるヌクレオチドがフローセル内に存在する結果になるヌクレオチド配給形態に関して、異なるヌクレオチドタイプを組込む特徴は、各ヌクレオチドタイプに対して混ざった状態で付着する異なる蛍光ラベルに基づいて区別することができる。例えば、４個の異なるヌクレオチドを使用し、各ヌクレオチドは４つの異なる蛍光色素分子のうちの１つとすることができる。一実施形態において、４つの異なる蛍光色素分子は、スペクトルにおける４つの異なる領域における励起を使用して区別することができる。例えば、顕微蛍光測定器又は読取りヘッドは、４個の異なる励起放射源を有することができる。代案として、読取りヘッドは４個より少ない数の励起放射源を有するが、単一放射源からの励起放射に光学的フィルトレーションを利用して、フローセルで異なるレンジの励起放射を生成することができる。
【００７８】
幾つかの実施形態において、４つの異なるヌクレオチドをサンプル（例えば、核酸特徴のアレイ）内で４つより少ない数の異なるカラーを用いて検出することができる。第１の実施例として、１対のヌクレオチドタイプペアを同一波長で検出するが、ペアにおける一方の成分の他方の成分に対する強度の相違に基づいて、又はペアのうち一方の成分に対する変化（例えば、化学的変更、光化学変更、又は物理的変更による）であって、ペアにおける他方の成分に関して検出される信号と比較して出現する又は消失する明らかな信号を生ずる変化に基づいて、区別することができる。第２の実施例として、４つの異なるヌクレオチドタイプのうち３つは、特別な条件下で検出可能であるようにできるとともに、第４番目のヌクレオチドタイプはこれら条件下で検出できるラベルが欠如するもととする。この第２の実施例のＳＢＳ実施形態において、最初の３つのヌクレオチドタイプを核酸に組込むことは、それぞれに対応する信号の存在に基づいて決定することができ、また第４番目のヌクレオチドタイプを核酸に組込むことは、いかなる信号がないことに基づいて決定することができる。第２の実施例として、１つのヌクレオチドタイプは、２つの異なる画像、又は２つの異なるチャネルで検出することができる（例えば、同一塩基を有する２つの種の混合を使用できる、又は２つのラベルを有する単一の種を使用できる、又は双方のチャネルで検出されるラベルを有する単一の種を使用できる）が、他のヌクレオチドタイプは単に１つの画像又はチャネルでしか検出されないものとする。この第３の実施例において、２つの画像又は２つのチャネルの比較は、異なるヌクレオチドタイプを区別するのに供する。
【００７９】
上述の３つの例示的形態は互いに排他的なものではなく、様々な組合せで使用することができる。例示的実施形態は、蛍光ラベルを有する可逆ブロックヌクレオチド（ｒｂＮＴＰｓ）を用いるＳＢＳ方法である。このフォーマットにおいて、４つの異なるヌクレオチドタイプを、シークエンシングすべき核酸特徴のアレイに配給することができ、また可逆ブロッキング基に基づいて唯一の組込み事象を各特徴で生ずるようにする。この実施例でアレイに配給されるヌクレオチドとしては、第１チャネルで検出される第１ヌクレオチドタイプ（第１励起波長によって励起されるとき第１チャネルで検出されるラベルを有するｒｂＡＴＰ）、第２チャネルで検出される第２ヌクレオチドタイプ（第２励起波長によって励起されるとき第２チャネルで検出されるラベルを有するｒｂＣＴＰ）、第１及び第２チャネルで検出される第３ヌクレオチドタイプ（第１及び／又は第２の励起波長によって励起されるとき第１及び第２の双方のチャネルで検出される少なくとも１つのラベルを有するｒｂＴＴＰ）、及び何れかのチャネルで検出されるラベルが欠如している第４ヌクレオチドタイプ（外因性ラベルがないｒｂＧＴＰ）がある。
【００８０】
４つのヌクレオチドタイプが上述の実施例におけるアレイに接触した後、検出手順が実施され、例えば、アレイの２つの画像を取得することができる。画像は、別個のチャネルで取得することができ、また同時に又は逐次的に取得することができる。第１励起波長及び第１チャネルにおける発光を用いて取得した第１画像は、第１及び／又は第３のヌクレオチドタイプ（例えば、Ａ及び／又はＴ）を組込んだ特徴を示す。第２励起波長及び第２チャネルにおける発光を用いて取得した第２画像は、第２及び／又は第３のヌクレオチドタイプ（例えば、Ｃ及び／又はＴ）を組込んだ特徴を示す。各特徴で組込まれるヌクレオチドタイプの明確な同定は、以下の特徴に至るような２つの画像を比較することによって決定することができ、すなわち、第１チャネルのみで第１ヌクレオチドタイプが組込まれたことを示す特徴（例えば、Ａ）、第２チャネルのみで第２ヌクレオチドタイプが組込まれたことを示す特徴（例えば、Ｃ）、第１及び第２の双方のチャネルで第３ヌクレオチドタイプが組込まれたことを示す特徴（例えば、Ｔ）、及び何れのチャネルでも示されずに第４ヌクレオチドタイプが組込まれたことを表す特徴（例えば、Ｇ）を決定することができる。この実施例でＧが組込まれた特徴の場所は、他のサイクル（他の３つのヌクレオチドタイプのうち少なくとも１つが組込まれる）から決定できることに留意されたい。４つより少ない数のカラーによる検出を使用して異なるヌクレオチドを区別する例示的装置及び方法は、米国特許出願第６１／５３８，２９４号（参照により本明細書に組入れられるものとする）に記載されている。
【００８１】
シークエンシング方法において、顕微蛍光測定器は、各サイクル中に表面における同一エリアの少なくとも２つの広視野画像を取得し、これら少なくとも２つの広視野画像のそれぞれは、異なる励起波長又は発光波長を用いて取得することができる。例えば、各サイクル中顕微蛍光測定器は、表面における同一エリアの２つ、３つ又は４つの広視野画像を取得することができ、２つの広視野画像それぞれは、スペクトルの異なる領域での蛍光を検出する。代替的に又は付加的に、顕微蛍光測定器は、所定シークエンシングサリ中に表面の所定エリアに対してスペクトルのうち２つ、３つ又は４つより多くない異なる領域での蛍光を検出する広視野画像を取得する。例えば、顕微蛍光測定器は、所定サイクル中にスペクトルの２つ、３つ又は４つより多くない異なる領域での放射によるフローセル表面のエリアを励起する、及び／又は顕微蛍光測定器は、所定サイクル中にスペクトルの２つ、３つ又は４つより多くない異なる領域での表面の所定エリアから広視野画像を取得することができる。異なる広視野画像は、異なる時点で（例えば、順次に）取得でき、又は幾つかの実施形態において、２つ又はそれ以上の広視野画像を同時に取得することができる。
【００８２】
本明細書の文脈において、「エリアの広視野画像」は、異なる励起及び／又は発光条件の下で取得される同一エリアの２つ又はそれ以上の画像を意味する。代案として、同一エリアの２つ又はそれ以上の別個の広視野画像を、同一の又は少なくとも類似する励起及び発光条件の下で取得することができる。例えば、所定蛍光検出条件の下で所定対象物のエリアに対して複数フレームを取得することができ、またこれらフレームを同時付加することができる。同時付加によれば、同一条件下での単独フレームを取得するのに比べて信号対ノイズ比を向上するという利点が得られる。他の実施例において、同時付加をパルス励起と連動して実施し、長時間にわたりサンプルに対して連続励起するのと比較するとサンプルに対する光ダメージを軽減することができる（この場合、同様の信号強さ又は信号対ノイズ比が得られるかもしれないし、得られないかもしれない）。
【００８３】
幾つかの実施形態において、核酸は、シークエンシング前又はシークエンシング中に表面に付着させ、また増幅させることができる。例えば、増幅は、ブリッジ増幅を用いて実施し、表面上に核酸クラスタを形成することができる。有用なブリッジ増幅方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６５８号、米国特許出願公開第２００２／００５５１００号、米国特許第７，１１５，４００号、米国特許出願公開第２００４／００９６８５３号、同第２００４／０００２０９０号、同第２００７／０１２８６２４号、又は同第２００８／０００９４２０号に記載されており、これら特許文献のそれぞれは、参照により本明細書に組入れられるものとする。表面における核酸を増幅させる他の有用な方法としては、ローリング・サークル増幅（ＲＣＡ：rolling circle amplification）があり、これは例えば、非特許文献（Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)）、及び特許文献（米国特許出願公開第２００７／００９９２０８号）に記載されており、これら文献それぞれは、参照により本明細書に組入れられるものとする。ビードにおけるエマルションＰＣＲも使用することができ、これは例えば、非特許文献（Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003) ）、特許文献（国際公開第０５／０１０１４５号、米国特許出願公開第２００５／０１３０１７３号又は同第２００５／００６４４６０号）に記載されており、これら文献それぞれは、参照により本明細書に組入れられるものとする。
【００８４】
上述したシークエンシングの実施形態は反復プロセスの例である。本発明方法は反復プロセスにも適している。幾つかの実施形態を以下に説明する。
【００８５】
本発明は、(a) 表面上の蛍光特徴を有する基板を準備するステップと、(b) 複数個の顕微蛍光測定器を用いて表面における第１部分の複数の広視野画像を取得する画像取得ステップであって、各顕微蛍光測定器は表面の異なる場所から広視野画像を取得し、複数個の顕微蛍光測定器はキャリッジに固定したものとする、該画像取得ステップと、(c) 表面に平行な方向にキャリッジを並進移動させ、また表面の第２部分に対してステップ(b)を繰返すステップと、及び(d) 表面の第１部分における第２の複数広視野画像を取得する位置にキャリッジを復帰させるステップと、を有する。随意的に、本発明方法は、さらに、ステップ(c)の後であってステップ(d)の前に、第２複数広視野画像が第１複数広視野画像と異なるよう、蛍光特徴を変更するステップを有することができる。
【００８６】
特別な実施形態において、上述の方法におけるステップ(a)〜(c)は、シークエンシング技術の検出ステップである。関連の実施形態において、キャリッジを復帰させるステップ(d)は、シークエンシング技術の第２サイクルに対応する。この実施例において、表面における蛍光特徴を変更することは、シークエンシング技術における１つ又は複数の生化学的ステップである。上述の方法に使用することができる例示的シークエンシング技術は先に説明した通り、又は従来既知である。
【００８７】
本発明は、さらに流体カートリッジを提供し、この流体カートリッジは、(a) 透光性表面、流入口及び流出口を有するフローセル、並びに(b) 遮光性及び水性液体に対する不浸透性を有する材料で形成したハウジングを備え、このハウジングは、(i) サンプルリザーバ、(ii) サンプルリザーバとフローセルの流入口との間における流体ライン、(iii) フローセルの流入口を介してフローセルに流体連通する複数個の試薬リザーバ、(iv) これら試薬リザーバとフローセルの流入口との間における流体連通の仲立ちをするよう構成した少なくとも１個のバルブ、及び(v) フローセルの流入口を介してサンプルリザーバ又は試薬リザーバからフローセルに液体を移動させるよう構成した少なくとも１個の圧力源を収容し、透光性窓がハウジングを中断し、流入ポートがハウジングを中断し、流入ポートはサンプルリザーバに連通し、また透光性表面を窓に配置する。
【００８８】
例示的な流体カートリッジ１０の外観を図１に示し、先に説明した。図１５は流体カートリッジ２０００の分解斜視図を示す。流体カートリッジのハウジングはシェル２００１によって形成し、このシェル２００１はベース２００２に整合する。シェルは、図示のように流体カートリッジの上側に存在し、またフローセル２０２０のための受容エリア２００９を有する。フローセルは窓２０１０を通してハウジング外部に露出する。シェルにおける１個又は複数個のポートにより、サンプル又は他の試薬を流体カートリッジ２０００内部のリザーバに配給することができる。ベース２００２は、試薬トレイを受入れるよう構成した開口２０１２を有する。試薬トレイ２００３は、開口２０１２に挿入することにより流体カートリッジに係合することができ、この係合は、トレイにおける個別の試薬リザーバが、試薬をフローセルに配給する個別の流体ラインに流体連通するように行う。ハウジングは、さらに、試薬を流体ライン内で移動させるポンプとの仲立ちをするバルブ２００５及び２００６も収納する。さらに、ハウジング内には、フローセル２０２０からの流体ラインとの仲立ちをする流入口２０１１を有する廃棄バッグ２００４を収納する。
【００８９】
流体カートリッジのハウジング（例えば、流体カートリッジ２０００のシェル２００１及び／又はベース２００２）は、スペクトルの特別な部分における放射に対して不透過性を有する材料で形成することができる。例えば、ハウジングは、ＵＶ，ＶＩＳ及び／又はＩＲ放射に対して不透過性を有し、試薬がこれら波長の放射に起因する光ダメージから保護できるようにする。例えば、ＵＶ放射に対して不透過性を有する材料は、シークエンシング反応に使用される他の試薬のうち核酸に与える光ダメージを回避するのに有益である。他の実施例として、シークエンシング反応でラベルとして使用される蛍光が吸収する波長レンジの放射に対して不透過性を有する材料を使用するのが望ましい。
【００９０】
流体カートリッジのハウジングは、概して収容される液体に対して不浸透性を有するものとする。したがって、ハウジングは、内部に保持されるリザーバに加えて、第２バリヤをなすことができる。例示的材料としては、ポリカーボネート又はポリスチレンのようなプラスチック、アルミニウム又はステンレス鋼のような金属がある。流体カートリッジ内に収容される試薬に対して化学的不活性を有する材料が一般的に望ましい。流体カートリッジ内における個別のリザーバ又は他の流体コンポーネントは、同様の流体不浸透性を有し、また随意的に不透過性を有するものとすることができる。材料は剛性又は可撓性を有するものとすることができる。例えば、上述の又はそれ以外の流体カートリッジに使用される様々な試薬リザーバはすべて、廃棄リザーバ２００４で例示した可撓性バックとすることができる。
【００９１】
図１及び図１５で例示したように、流体カートリッジは、ハウジング内に種々のコンポーネントを収納するよう構成することができる。例えば、種々の実施形態において、本明細書で説明する１つ又は複数の流体コンポーネントは完全にハウジング内に収納することができる。実際、特別な実施形態において、特別な実施形態の流体コンポーネントのすべてを流体カートリッジ内に完全に収納することができる。例えば、カートリッジハウジングは、１個又は複数個のサンプルリザーバ、１個又は複数個の試薬リザーバ、１個又は複数個の廃棄リザーバ、１個又は複数個の混合リザーバ、リザーバとフローセルとの間における流体連通を仲立ちするよう構成した１個又は複数個のバルブ、リザーバからフローセルに液体を移動させるよう構成した１個又は複数個の圧力源、リザーバとフローセルとの間における１個又は複数個の流体ラインを収納することができる。しかし、幾つかの実施形態において、幾つかの流体コンポーネントのうち少なくとも一部をハウジングの外部に設けることができる。例えば、検出を行うフローセルの表面はカートリッジハウジングの外側に配置することができる。
【００９２】
特別な実施形態において、流体カートリッジは、フローセルを緊密に、例えば、圧縮嵌合によって保持するサイズにした受容エリアを有することができる。しかし、他の実施形態において、受容エリアは、流体カートリッジ内に存在するフローセルの占有面積よりも大きくすることができる。したがって、フローセルは、ハウジング内の受容空間であって、フローセルがハウジングに対して浮遊することができるサイズ及び形状の受容空間を占有することができる。フローセルの浮遊を許容する形態は、流体カートリッジを機器内に配置した後、フローセルを検出装置の光学的コンポーネントに整列させるという利点が得られる。この整列は、検出装置が１個又は複数個の整列ピンを受容エリア内に挿入することによって達成でき、この場合、ピンは検出装置の読取りヘッドにおける顕微蛍光測定器に対して予め整列させておく。したがって、受容エリアは、少なくとも１個の整列ピン又は他の整列部材のための装着部を有することができる。本発明の流体カートリッジに適合可能な浮遊フローセルを整列させる例示的形態は、米国特許出願公開第２０１２／０２７０３０５号（米国特許出願第１３／２７３，６６６号）に記載されており、この特許文献は参照により本明細書に組入れられるものとする。浮遊フローセルを利用する実施形態において、フローセルからカートリッジの他の流体コンポーネントに対する流体接続部は、概して可撓性にする。例えば、可撓性配管は、フローセルをカートリッジの流体コンポーネントに固定することができる。
【００９３】
本発明の流体カートリッジは、必ずしも本明細書に記載した検出装置又は他の検出コンポーネントを有する必要はない。例えば、流体カートリッジは、本明細書に記載するような、又は本明細書で記載する方法に有用な、検出器、顕微蛍光測定器又は読取りヘッドを省くよう構成することができる。核酸シークエンシングの実施形態において、流体カートリッジのフローセル内で核酸を検出するのに使用される検出器、顕微蛍光測定器又は読取りヘッドは、流体カートリッジのハウジング外部に配置することができる。同様に、他の実施形態において、基板の特別な特性を検出するのに使用される検出器、顕微蛍光測定器又は読取りヘッドは、流体カートリッジのハウジング内部から排除して、その代わりにハウジング外部に配置することができる。少なくとも幾つかの形態において、１つのタイプの検出器は流体カートリッジから排除し、他のタイプの検出器を設けることができる。例えば、流体カートリッジは、フローセルにおける核酸を検出するのに使用される検出装置を排除するが、カートリッジ内における流体の特性を評価する、又はカートリッジのコンポーネントを評価するのに使用される検出器を設けることができる。より具体的には、カートリッジは、温度、圧力、流量、又はカートリッジに使用される流体の他の特性のための検出器を設けることができる。流体カートリッジから排除できるコンポーネントの他の例としては、限定しないが、光学的フィルタ、レンズ、対物レンズ、カメラ（例えば、ＣＣＤカメラ又はＣＭＯＳカメラ）、励起放射源（例えば、ＬＥＤ）等がある。
【００９４】
例示的流体カートリッジの流体マップを図１６に示す。フローセル２０２０は８個のレーンを有し、これらレーンは各個に８個の個別流体レーン（集合的に２０４７の符号で示す）のうちの１つに流体接続し、これら流体レーン２０４７は流入バルブ２０４４によって個別に動作する。流入バルブ２０４４は４個のサンプルリザーバ２０３０〜２０３３からの流体流を制御する。流入バルブ２０４４は、さらに、数個のＳＢＳ試薬リザーバ２０３５及び数個の増幅試薬リザーバ２０３６からの流体流を制御する。ＳＢＳ試薬リザーバ２０３５からの分配及び流体流は、試薬選択バルブ２０４３によって制御する。増幅試薬リザーバ２０３６からの分配及び流体流は試薬選択バルブ２０４３の上流側に配置した試薬選択バルブ２０４２によって制御する。したがって、試薬選択バルブ２０４３は、ＳＢＳ試薬リザーバ２０３５及び増幅試薬リザーバ２０３６双方からの試薬分配及び流体流を制御するよう配置する。
【００９５】
図１６のシステムによる流体流は、８個の別個のシリンジポンプ２０５１〜２０５８によって駆動する。シリンジポンプは、流体システムに流体を引込むよう配置し、また各ポンプはバルブ２０４５によって個別に動作することができる。したがって、フローセルの各チャネルを経る流れは、専用圧力源によって個別に制御される。バルブ２０４５は、さらに、廃棄リザーバ２０６０への流体流を制御する。
【００９６】
図１６は、下流側シリンジポンプの動作によって流体を引込む流体システムを例示する。有用な流体システムは、シリンジポンプの代わりに他のタイプのデバイス、例えば、正圧又は負圧、蠕動ポンプ、ダイヤフラムポンプ、ピストンポンプ、ギアポンプ又はアルキメデスポンプを使用して流体を駆動することができる。さらに、これら及び他のデバイスは、フローセルに対して下流位置から流体を引込み、又は上流位置から流体を押出すよう構成することができる。
【００９７】
図１６は、さらに、フローセルの８チャネルに対して８個のシリンジポンプを使用することを例示する。したがって、流体システムは、使用するチャネルの数に等しい数のポンプを設ける。本発明の流体カートリッジに有用な流体システムは、使用するチャネル数よりも少ない数のポンプ（又は他の圧力源）を有することができると理解されたい。例えば、数個のチャネルを共有ポンプに流体接続することができ、またバルブを使用して個別チャネルに流体流を流すよう動作させることができる。
【００９８】
例示的回転バルブ４００を図１７に示す。回転バルブ４００の構造及び機能は、以下に説明するシークエンシング手順の文脈で理解できるであろう。勿論、バルブを他の用途と同様にして使用できることも理解されるであろう。４つの異なるサンプルを流体的に処理するシークエンシングプロトコルにおいて、回転バルブ４００は、４５゜ピッチを使用する４サンプル注入回転バルブとして機能でき、またシークエンシング試薬用の４対１マニホルドとして機能することもできる。図１７の頂面図において、回転バルブ４００ａは、共通試薬リザーバ４０１からの流れがフローセルの４つのレーンに流れるよう配置する。より具体的には、この位置においては、流体は、共通試薬リザーバ４０１からポート４０２を経て、レーン１に（ポート４１１経由で）、レーン２に（ポート４１２経由で）、レーン３に（ポート４１３経由で）、及びレーン４に（ポート４１４経由で）流れることができる。しかし、この位置では、流体はサンプルリザーバＳ１，Ｓ２，Ｓ３又はＳ４から流れず、なぜならポート４０２から流れるポート４２１，４２２，４２３及び４２４が閉じているからである。回転バルブ４００ｂを図１７の底面図に示す位置に４５゜転回することにより、ポート４１１，４１２，４１３及び４１４がそれぞれポート４２１，４２２，４２３及び４２４からの流れを開くので、サンプルＳ１，Ｓ２，Ｓ３及びＳ４を注入することができる。しかし、この位置ではポート４０２からの流れは閉じ、したがって、共通試薬はフローセルのレーンに流れるのを阻止する。
【００９９】
特別な実施形態において、流体カートリッジは、１つ又は複数の試薬を再利用するよう構成することができる。例えば、流体カートリッジは、試薬をフローセルに配給し、次に試薬をフローセルから除去し、また次に試薬をフローセルに再導入するよう構成することができる。図１８に例示する一実施形態において、カートリッジの流体素子は、試薬リザーバがフローセルの流入ポートと流体連通し、またフローセルの流出ポートも試薬リザーバに流体連通するよう構成する。１つ又は複数の試薬は、図１８に示す同様の試薬ループのマニホルドネットワーク内で再利用できる。例えば、バルブ５２２は、洗浄液リザーバ５２４、ＩＭＸリザーバ５２５、ＳＭＸリザーバ５２６、ＣＬＭリザーバ５２７、及びクリーブリザーバ５２８からフローセル５２０への流れを制御する。ポンプ５２１はフローセル５２０の下流かつバルブ５２３の上流に配置する。バルブ５２３は、フローセル５２０から、洗浄液リザーバ５２４、ＩＭＸリザーバ５２５、ＳＭＸリザーバ５２６、ＣＬＭリザーバ５２７、及びクリーブリザーバ５２８への流れを制御する。
【０１００】
図１８の上述のコンポーネントを接続する流体ラインは、シークエンシングサイクルの文脈で説明し、この場合、試薬はリザーバからフローセルに配給され、また利用した試薬はフローセルから各リザーバに配給される。以下に例示するサイクルのすべてのステップにおいて、流体はポンプ５２１により発生する圧力の下で移動する。サイクルの第１ステップにおいて、バルブ５２２をライン５０１に対して開き、かつバルブ５２３をライン５０５に対して開き、フローセル５２０を通過するバルブ５２２とバルブ５２３との間の経路を経由して流体が洗浄液リザーバ５２４から廃棄リザーバ５３５に流れるようにすることによって、フローセルを洗浄する。図１８につき説明するすべてのステップに対して、バルブ５２２とバルブ５２３との間の経路は、バルブ５２２からライン５０２、フローセル５２０の流入口５３０、フローセルのチャネル５３１、フローセル５２０の流出口５３２、ライン５０３、ポンプ５２１、及び次にライン５０４を経てバルブ５２３に至る。サイクルの第２ステップにおいて、バルブ５２２をライン５０６に対して開き、かつバルブ５２３をライン５０５に対して開き、フローセル５２０を通過するバルブ５２２とバルブ５２３との間の経路を経由して流体がＩＭＸリザーバ５２５から廃棄リザーバ５３５に流れるようにすることによって、ＩＭＸをフローセルに導入する。サイクルの第３ステップにおいて、バルブ５２２をライン５０１に対して開き、かつバルブ５２３をライン５１０に対して開き、フローセル５２０を通過するバルブ５２２とバルブ５２３との間の経路から洗浄流体がＩＭＸを変位させるようにすることによって、使用済みＩＭＸをフローセルから移動させる。サイクルの第４ステップにおいて、バルブ５２２をライン５０７に対して開き、かつバルブ５２３をライン５０５に対して開き、フローセル５２０を通過するバルブ５２２とバルブ５２３との間の経路を経由して流体がＳＭＸリザーバ５２６から廃棄リザーバ５３５に流れるようにすることによって、ＳＭＸをフローセルに導入する。サイクルの第５ステップにおいて、バルブ５２２をライン５０１に対して開き、かつバルブ５２３をライン５１１に対して開き、フローセル５２０を通過するバルブ５２２とバルブ５２３との間の経路から洗浄流体がＳＭＸを変位させるようにすることによって、使用済みＳＭＸをフローセルから移動させる。同様のステップ対を繰返し、(1) ＣＬＭ試薬をフローセルに導入し、また使用済みＣＬＭ試薬をＣＬＭリザーバに帰還させ、また(2) クリーブ試薬をフローセルに導入し、また使用済みクリーブ試薬をクリーブリザーバに帰還させる。
【０１０１】
試薬を再利用する流体構成の他の例を図１９に示す。この実施例において、カートリッジの流体素子は、各試薬リザーバがフローセルの単一ポートに流体連通するよう構成する。往復流により各試薬をリザーバからフローセル６２０に流し、またフローセル６２０からリザーバに戻すことができ、試薬のフローセル６２０内への流入及び試薬のフローセル６２０からの流出は、フローセル６２０の同一ポートで生ずる。４つの試薬の再利用を図１９で例示するが、流体システムは、より多い又はより少ない種類の試薬を、同様の往復動フォーマットで再利用するよう構成することができる。図１９に示すように、バルブ６２２は、フローセル６２０と、洗浄液リザーバ６２４、ＩＭＸリザーバ６２５、ＳＭＸリザーバ６２６、ＣＬＭリザーバ６２７及びクリーブリザーバ６２８のそれぞれとの間の流体流を制御する。流れの第１方向において、ポンプ６２１は、ライン６０３を介してフローセル６２０から流体を引込み、またライン６０５を介して流体を廃棄リザーバ６３５に押出すよう構成する。
【０１０２】
図１９の上述のコンポーネントを接続する流体ラインは、試薬をリザーバからフローセルに配給し、また使用済み試薬をフローセルから対応のリザーバに配給するシークエンシングサイクルの文脈で説明する。サイクルの第１ステップにおいて、バルブ６２２をライン６０１に対して開き、流体が洗浄液リザーバ６２４から廃棄リザーバ６３５に流れるようにすることによって、フローセルを洗浄する。バルブ６２２と廃棄リザーバ６３５との間の経路は、バルブ６２２から、フローセル６２０のポート６３０へのライン６０２、フローセル６２０のチャネル６３１、フローセル６２０のポート６３２、ポンプ６２１のライン６０３、及び次にライン６０５を経て廃棄リザーバ６３５に至る。サイクルの第２ステップにおいて、バルブ６２２をライン６０６に対して開き、流体がＩＭＸリザーバ６２５からバルブ６２２を経由して、ライン６０２、フローセル６２０のポート６３０、フローセル６２０のチャネル６３１、フローセル６２０のポート６３２、及び部分的にライン６０３に流入させることによって、ＩＭＸをフローセルに導入する（したがって、ライン６０３の下流部分からポンプ６２１にかけては洗浄溶液が残留する）。サイクルの第３ステップにおいて、使用済みＩＭＸ試薬をフローセル６２０からＩＭＸリザーバ６２５に帰還させ、この帰還は、バルブ６２２をライン６０６に対して開き、かつポンプ６２１の方向を逆転させ、使用済みＩＭＸ試薬がフローセル６２０からＩＭＸリザーバ６２５に、フローセル６２０のポート６３０、流体ライン６０２、バルブ６２２、次に流体ライン６０６を経由して帰還することによって行う。第３ステップ中、ポンプ６２１からＩＭＸリザーバ６２５への流れは、ＩＭＸ試薬の一部がＩＭＸリザーバ６２５に帰還するに十分な時間であるが、ライン６０３からの残留洗浄溶液の相当量がＩＭＸリザーバ６２５に流入しない程度の時間にわたり生ずる。サイクルの第４ステップにおいて、第１ステップで説明したように、フローセルを洗浄する。サイクルの第５ステップにおいて、バルブ６２２をライン６０７に対して開き、流体がＳＭＸリザーバ６２６からバルブ６２２を経由して、ライン６０２、フローセル６２０のポート６３０、フローセル６２０のチャネル６３１、フローセル６２０のポート６３２、及び部分的にライン６０３に流入させることによって、ＳＭＸをフローセルに導入する（したがって、ライン６０３の下流部分からポンプ６２１にかけては洗浄溶液が残留する）。サイクルの第６ステップにおいて、使用済みＳＭＸ試薬をフローセル６２０からＳＭＸリザーバ６２６に、フローセル６２０のポート６３０、流体ライン６０２、バルブ６２２、及び次に流体ライン６０７を経由して帰還させる。第３ステップ中と同様に、第６ステップ中に、ポンプ６２１からの流れは、ＳＭＸ試薬の一部をＳＭＸリザーバ６２６に帰還させるが、ライン６０３からの残留洗浄溶液がほとんど又は全くＳＭＸリザーバ６２６に流入しないようにする。これら３組によるステップを繰返し、(1) ＣＬＭ試薬をフローセル６２０に導入し、また使用済みＣＬＭ試薬をＣＬＭリザーバ６２７に帰還させ、フローセル６２０を洗浄し、また(2) クリーブ試薬をフローセル６２０に導���し、また使用済みクリーブ試薬をクリーブリザーバ６２８に帰還させ、またフローセル６２０を洗浄する。
【０１０３】
図１８及び図１９の実施例は、各試薬に対して単一のリザーバを有するものを示す。したがって、同一タイプの使用済み試薬の未使用試薬との混合が流体プロセス全体にわたり生ずる。この実施形態において、リザーバ内の再利用画分が流体サイクル毎に増大する。したがって、所望レベルの全体反応品質を維持しつつ、起こり得る希釈又は汚染に対処するよう相当大量の初期試薬を準備する。
【０１０４】
各試薬に対して単一のリザーバを使用する代替案として、流体システムは、各タイプの試薬のための数個のリザーバを有することができる。各リザーバは再利用のための構成とすることができる。しかし、各リザーバは、フローセルのサイクル数よりも少ない数の混合事象を受けることができる。したがって、各試薬タイプにとって適切な数のリザーバを用意し、フローセルのための所望サイクル数及び各試薬に対して許容可能な再利用サイクル限定数の双方に対処できるようにする。例えば、特定試薬に対して１０個のリザーバを用意し、１００サイクルの流体プロセス、及び１０回（すなわち、再利用は９回）のみ使用できる試薬に対処できるようにする。この実施例において、１０個のリザーバのうち１個から１０回引出した後、システムは１０個のリザーバのうち２番目のリザーバに切替えることができる。複数試薬リザーバは、図１８に示す例示的システムで再利用のための構成とすることができ、この構成は、例えば、追加のリザーバをバルブ５２２及びバルブ５２３に対して相互作用させる、又はリザーバのサブセットそれぞれをバルブ５２２の上流側及びバルブ５２３の下流側における専用バルブと相互作用させることによって行う。図１９の実施例の場合、複数試薬は、追加のリザーバをバルブ６２２に相互作用させる、又はリザーバのサブセットそれぞれをバルブ６２２の上流側の（フローセル出力方向の下流側にあるフローセル入力方向における）専用バルブと相互作用させることによって、再利用のための構成とすることができる。
【０１０５】
或る試薬の再利用における他の有用な形態は、試薬リザーバとは別個の補助リザーバを使用することである。図１８の形態を例にとると、ライン５１０，５１１，５１２及び５１３は対応の補助リザーバに向かって流動することができ、したがって、フローセルに接触した後には試薬リザーバ５２５，５２６，５２７及び５２８に戻る向きに流れないようにする。使用済み試薬は、次に対応の補助リザーバからバルブ５２２内の異なるポート又は別個のバルブを介してフローセルに配給することができる。図１９の流体システムの実施例では、補助リザーバをシステムに追加することができ、またポートをバルブ６２２に追加して、使用済み試薬を補助リザーバに向かわせるようにすることができる。したがって、バルブ６２２の動作を使用して、試薬がフローセルに接触した後の使用済み試薬を、試薬リザーバ６２５，６２６，６２７及び６２８の代わりに補助リザーバに向かわせることができる。図１８及び図１９につき例示した補助リザーバ（これには限定しない）を含めて補助リザーバを有する実施形態に関して、数回のサイクルからの使用済み試薬（特定タイプの）は、再利用前に補助リザーバ内で混合することができる。代案として、再利用試薬は補助リザーバ内での混合がほとんどなく再利用できるようにする。使用済み試薬を混合する、しないに係わらず、試薬が所定又は望ましい回数再利用された後、使用済み試薬は廃棄リザーバに送り、また補助リザーバを、使用済み試薬のその後のアリコート（分割単位）でその後のサイクルに対して使用することができる。
【０１０６】
図１８及び図１９に示す形態は例示的なものである。特定プロセスで使用された１つ又は複数の試薬を再利用するのに、他の形態も可能である。幾つかの試薬再利用形態において、試薬再利用の流体構成は、特定プロセスで使用した試薬サブセットに対してのみ使用可能とする。例えば、試薬の第１サブセットは再利用するのに十分な健全性を有するとともに、第２サブセットは１回使用後に汚染、劣化、又は他の望ましくない作用を受け易いことがあり得る。したがって、流体システムは、試薬の第１サブセットを再利用する構成とし、試薬の第２サブセットの流体素子は一回使用の構成とすることができる。
【０１０７】
特定試薬は、特定プロセスに適する任意な望ましい回数で再利用することができる。例えば、本明細書で例示する、本明細書で引用した参考文献に記載された、又は上述したプロセスに使用されるのが既知である、１つ又は複数の試薬は、少なくとも２，３，４，５，１０，２５，５０又はそれ以上の回数にわたり再利用することができる。実際、様々な望ましい試薬のいずれも、少なくとも多数回再利用できる。
【０１０８】
核酸シークエンシングプロセスに関して例示したが、試薬再利用の流体構成及び方法は、他のプロセス、とくに、試薬配給の繰返しサイクルを含むプロセスに適用できる。例示的プロセスとしては、ポリペプチド、多糖類、又は合成ポリマーのようなポリマーのシークエンシング、及びこのようなポリマーの合成がある。
【０１０９】
試薬再利用の方法及び装置に関する図１８及び図１９並びに本明細書に記載の他の実施例は、フローセルの単一チャネルの文脈で説明した。同様の方法及び装置は多重チャネルを有するフローセルにも適用することができる。したがって、本発明の流体カートリッジは、多重チャネルを有するフローセルを有し、さらにまたチャネルのすべて又はサブセットに対して試薬再利用を行うよう構成した流体システムを有することができる。例えば、個別のチャネルを、図１８及び図１９に示すように、又は本明細書何れかの箇所で説明したように構成した流体システムに接続することができる。
【０１１０】
本発明の流体カートリッジは、流体カートリッジと、この流体カートリッジを受容する検出装置との間における連通を可能にする流入／流出（Ｉ／Ｏ）接続部を有する。Ｉ／Ｏ接続部を使用して、流体カートリッジ内で生ずる流体オペレーションを検出装置内で生ずる検出オペレーションに協調動作させることができる。例えば、核酸シークエンシング手順において、フローセルに対するシークエンシング試薬の流体配給を、１回又は複数回のシークエンシング手順サイクルで検出装置によるフローセル検出に協調動作させることができる。図１４の実施形態において、Ｉ／Ｏコネクタにより、流体カートリッジと主ＰＣＢとの間における通信を可能にすることができる。
【０１１１】
上述した例示的核酸シークエンシングの実施形態から明らかなように、本発明の流体カートリッジにおけるリザーバは、核酸シークエンシング手順に有用な試薬を含むことができる。例えば、シークエンシング・バイ・シンセシス技術に有用な試薬としては、例えば、ポリメラーゼ、蛍光ラベル付きヌクレオチド、又は洗浄溶液があり得る。数種の異なる蛍光ラベル付きヌクレオチドは、単独のリザーバ内に混合物として、又は個別リザーバ内でそれぞれ単独に存在し得る。ラベル付きヌクレオチドは、可逆ターミネーターシークエンシングに使用するための可逆終端成分を有し、この場合、ブロック解除試薬を含むリザーバを設けることもできる。流体カートリッジ内に含めることができる他の核酸シークエンシング試薬としては、限定しないが、非特許文献（Bentley et al., Nature 456:53-59,2008）、以下の特許文献、すなわち、国際公開第０４／０１８４９７号、米国特許第７，０５７，０２６号、国際公開第９１／０６６７８号、国際公開第０７／１２３７４４号、米国特許第７，３２９，４９２号、米国特許第７，２１１，４１４号、米国特許第７，３１５，０１９号、米国特許第７，４０５，２８１号、又は米国特許出願公開第２００８／０１０８０８２号（各文献は参照により本明細書に組入れられるものとする）に記載されているものを含めて、上述したようなものがある。とくに、イルミナ社から入手可能な、例えば、TruSeq（登録商標）-ＳＢＳキットとして提供されている核酸シークエンシング試薬を流体カートリッジに設けることができる。
【０１１２】
流体カートリッジのリザーバは、シークエンシングすべき核酸サンプルを有することができる。数個のサンプルをそれぞれに対応の固有リザーバに設けることができる。幾つかの実施形態において、数個のサンプルを単独リザーバ内で混合することができ、この場合、サンプルには予め既知の核酸タグ配列でタグ付けし、また次にともに混合する。
【０１１３】
流体カートリッジは、さらに、核酸増幅に使用される試薬を含むリザーバを有することができる。例えば、ブリッジ増幅（クラスタ増幅とも称される）に使用される試薬を設けることができ、これは、例えば、米国特許第５，６４１，６５８号、米国特許出願公開第２００２／００５５１００号、米国特許第７，１１５，４００号、米国特許出願公開第２００４／００９６８５３号、同第２００４／０００２０９０号、同第２００７／０１２８６２４号、又は同第２００８／０００９４２０号に記載されており、これら特許文献のそれぞれは、参照により本明細書に組入れられるものとする。とくに、イルミナ社から入手可能な、例えば、TruSeq（登録商標）-ＲＮＡ又はＤＮＡキットとして提供されているブリッジ増幅試薬を流体カートリッジに設けることができる。ローリング・サークル増幅（ＲＣＡ）に有用な試薬を流体カートリッジに設けることができ、これは例えば、非特許文献（Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998)）、及び特許文献（米国特許出願公開第２００７／００９９２０８号）に記載されており、これら文献それぞれは、参照により本明細書に組入れられるものとする。エマルションＰＣＲ試薬も使用することができ、これは例えば、非特許文献（Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003) ）、特許文献（国際公開第０５／０１０１４５号、米国特許出願公開第２００５／０１３０１７３号又は同第２００５／００６４４６０号）に記載されており、これら文献それぞれは、参照により本明細書に組入れられるものとする。
【０１１４】
本発明の流体カートリッジは、異なる試薬を含む２つ又はそれ以上のサブコンポーネント部分を有することができる。サブコンポーネント部分は、例えば、ツールを使用することなく手で簡便に流体カートリッジに組合せるよう構成することができる。例えば、サブコンポーネント部分は、圧嵌、相補的雄雌型取付け具のスナップ結合、適切サイズの収容ポート内への挿入、クランプ等を使用して流体カートリッジに組合せることができる。所望に応じて、ツールを必要とする接続を使用することができ、例えば、ねじで連結するねじドライバ、又はボルト及び／又はナットを回すレンチを使用して接続する。
【０１１５】
流体カートリッジを構成するサブコンポーネント部分は、異なる条件下で予め輸送及び／又は保存された試薬を含むことができる。例えば、第１サブコンポーネントは、冷凍温度（例えば、０℃、−２０℃、又は−７０℃）で保存される試薬とする一方、第２サブコンポーネントは、それより高い温度（例えば、室温、又は２０℃、０℃、−２０℃、又は−７０℃よりも高い温度）で保存される試薬とすることができる。したがって、１つのサブコンポーネントのリザーバ内の試薬のうち少なくとも幾つかは冷凍固相とする一方、他のサブコンポーネントのリザーバ内における試薬のすべては液相とする場合があり得る。異なる温度で保存された２つ又はそれ以上のサブコンポーネント部分は、温度が外気温と平衡化する（又は他の共通温度になる）前又は後で流体カートリッジに組合せることができる。
【０１１６】
核酸シークエンシングプロセス以外の流体プロセスに有用な試薬を流体カートリッジのリザーバに設けることができる。例えば、流体カートリッジは、他のポリマー、例えば、ポリペプチド、多糖類、又は合成ポリマーをシークエンシングするのに有用な試薬を含むことができる。代替的又は付加的に、このようなポリマーの合成に有用な試薬を設けることができる。
【０１１７】
しかし、核酸シークエンシングに関する実施形態に戻って、本発明は、シークエンシング方法を提供し、この方法は、(a) 流体カートリッジ準備ステップであって、流体カートリッジは、(i) 透光性表面を有するフローセル、(ii) 核酸サンプル、(iii) シークエンシング反応のための複数の試薬、及び(iv) 試薬をフローセルに配給する流体システムを有するものとする、該流体カートリッジ準備ステップと、(b) 検出装置準備ステップであって、検出装置は、(i) 複数個の顕微蛍光測定器であり、それぞれがｘ次元及びｙ次元における画像平面で広視野画像検出を行うよう構成した対物レンズを有する、該複数個の顕微蛍光測定器、及び(ii) サンプルステージを有するものとする、該検出装置準備ステップと、(c) 透光性表面が画像平面内に位置するよう、流体カートリッジをサンプルステージに送給するステップと、及び(d) 流体カートリッジ内で核酸シークエンシング手順の流体オペレーション、及び検出装置内で核酸シークエンシング手順の検出オペレーションを実施するオペレーション実施ステップであって、(i) 試薬を流体システムによってフローセルに配給し、(ii) 核酸特徴を複数個の顕微蛍光測定器によって検出する、該オペレーション実施ステップと、を有する。
【０１１８】
本明細書に記載した種々の検出装置及び／又は流体カートリッジのいずれかを上述の方法に使用することができる。上述の装置の特別な利点は、単独の検出装置を使用して異なるサンプルを都合よくシークエンシングできるモジュール構成である。上述したように、サンプル、試薬及びシークエンシング手順全体のために十分な流体ハードウェアは、シークエンシング手順のための検出装置に送給できる流体カートリッジ内に自己収納することができる。シークエンシング手順が完了した後に、流体カートリッジを取外し、これにより検出装置は他のシークエンシングのランを準備することができる。検出装置及び流体システムを個別のモジュールに分離することによって、本発明システムは、複数の異なるサンプルをシークエンシングすることができるとともに、サンプル相互間の交差汚染のリスクを回避することができ、この交差汚染は、検出装置及び流体システムを恒久的に一体化する既存システムでは起こり得る。さらに、検出コンポーネントが比較的高価であり、また組立てが技術的に困難である実施形態に関して、上述のモジュール構成によれば、検出装置を繰返し使用のために維持することができるとともに、概して低価格で組立て容易な流体コンポーネントは単にエジェクトボタンを押すような簡単な行為で交換又は廃棄できることによって、コストを低減することができる。
【０１１９】
したがって、シークエンシング方法は、(a) 流体カートリッジ準備ステップであって、流体カートリッジは、(i) 透光性表面を有するフローセル、(ii) 核酸サンプル、(iii) シークエンシング反応のための複数の試薬、及び(iv) 試薬をフローセルに配給する流体システムを有するものとする、該流体カートリッジ準備ステップと、(b) 検出装置準備ステップであって、検出装置は、(i) 複数個の顕微蛍光測定器であり、それぞれがｘ次元及びｙ次元における画像平面で広視野画像検出を行うよう構成した対物レンズを有する、該複数個の顕微蛍光測定器、及び(ii) サンプルステージを有するものとする、該検出装置準備ステップと、(c) 透光性表面が画像平面内に位置するよう、流体カートリッジをサンプルステージに送給するステップと、 (d) 流体カートリッジ内で核酸シークエンシング手順の流体オペレーション、及び検出装置内で核酸シークエンシング手順の検出オペレーションを実施するオペレーション実施ステップであって、(i) 試薬を流体システムによってフローセルに配給し、(ii) 核酸特徴を複数個の顕微蛍光測定器によって検出する、該オペレーション実施ステップと、(e) 流体カートリッジをサンプルステージから取外すステップと、(f) 第２流体カートリッジをサンプルステージに送給するステップと、及び(g) 第２流体カートリッジ内で核酸シークエンシング手順の流体オペレーション、及び検出装置内で核酸シークエンシング手順の検出オペレーションを実施するステップと、を有する。
【０１２０】
第２流体カートリッジは、概して第１流体カートリッジ内の核酸サンプルとは異なる第２核酸サンプルを有する。しかし、所望に応じて、２つの流体カートリッジは複製サンプルとし、例えば、統計的分析又は他の技術的比較を行うことができるようにする。本発明のシークエンシングシステム又は方法は、多数の流体カートリッジに繰返し使用することができる。例えば、少なくとも２，５，１０，５０，１００、若しくは１０００個、又はそれ以上の数の流体カートリッジを使用することができる。
【０１２１】
特別な実施形態において、複数個のチャネルを有するフローセルは流体的に操作し、また光学的に検出することを互い違いにずらして行うことできる。より具体的には、流体的操作をフローセルにおけるチャネルの第１サブセットで実施するとともに、チャネルの第２サブセットに対して光学的検出を生ずる。例えば、一実施形態において、少なくとも４つの直線的チャネルをフローセルで互いに平行に配列することができる（例えば、チャネル１〜４は順次の列で順序付けることができる）。流体的操作は、１つおきのチャネル（例えば、チャネル１及び３）で実施するとともに、検出は他のチャネル（例えば、チャネル２及び４）で生ずる。この特別な形態は、数個の顕微蛍光測定器を互いに離れる形態で固定し、対物レンズがフローセルの１つおきのチャネルに指向する読取りヘッドを使用することによって、収容できる。この場合、読取りヘッドは、フローセルにおけるチャネル数の半分である数の顕微蛍光測定器を有することができる。さらに、バルブは、シークエンシングサイクル用の試薬を交互のチャネルに向かわせるよう動作することができるとともに、検出されるチャネルは検出状態に維持する。この実施例において、交互チャネルの第１セットは、第１シークエンシングサイクルの流体ステップを受け、また交互チャネルの第２セットは、第２シークエンシングサイクルの検出ステップを受ける。第１サイクルの流体ステップが完了し、また第２ステップの検出ステップが完了した後、読取りヘッドは、交互チャネルの第１セットに向けてステップ移行する（ｘ次元に沿って）ことができ、またバルブは、シークエンシング試薬をチャネルの第２セットに配給するよう動作することができる。この後、第１サイクルの検出ステップが完了することができ（チャネルの第１セットにおいて）、第３サイクルの流体ステップを生ずることができる（チャネルの第２セットにおいて）。これらのステップは、所望回数のサイクルが行われるまで、又はシークエンシング手順が完了するまで、数回繰り返すことができる。
【０１２２】
上述の互い違いにずらした流体ステップ及び検出ステップの利点は、より迅速な全体シークエンシングのランをもたらす点である。上述の実施例において、流体的操作に要する時間が検出に要する時間とほぼ同一である場合に、（すべてのチャネルを並列的に流体的操作するのに続いてすべてのチャネルを並列的に検出するのに比べて）より迅速なシークエンシングのランは、互い違いにずらした構成により得られる。勿論、検出時間が流体的ステップの時間と同一でない実施形態では、互い違いにずらした構成は、１つおきのチャネルからより適切なパターンに変更し、チャネルのサブセットに対する並列的スキャンに適合させるとともに、チャネルの他のサブセットに対して流体的ステップを受けさせることができる。
【０１２３】
上述した数個の実施形態によれば、比較的コンパクトな形態要因を有する検出装置を提供する。幾つかの実施形態において、検出装置は、約0.0929 ｍ２（約１平方フィート）の占有面積を有し、また約0.02832 ｍ３（約１立方フィート）の体積を有することができる。それより小さい面積及び／又は体積も可能である。それより僅かに大きい占有面積及び／又は体積も有用である。本明細書に例示したように、装置は、比較的小さい占有面積を有し、また完全機能状態にあるとき、例えば、内部に流体カートリッジを受入れた後で、比較的小さい空間体積を占めることができる。様々な所望手順のいずれをも実施できるスタンドアロン型ユニットとしての使用の文脈で数例の装置を例示してきた。しかし、これら実施例は限定を意図するものではなく、実際、上述の実施形態におけるコンパクト形態要因は、数例の装置を小さい空間内に配置することができる。例えば、数例の装置は、都合よく配置するためのキャビネット又はラック内に積み重ねる及び／又は配置することができる。キャビネット又はラックは、１つ又は複数の受容空間を画定する１つ又は複数の棚を有することができ、また各受容空間は、１個又は複数の検出装置を収容するよう構成することができる。
【０１２４】
したがって、数個の本発明検出装置を大型システムに一緒に使用でき、各検出装置はシステムのモジュール又はノードとして有効に機能する。例えば、数個の検出装置をラックに物理的に同所配置することができ、また電子的にネットワークを組むことができる。装置を同所配置するか又は分散場所に配置するかに係わらず、電子ネットワーキングによれば、大域的データ解析及び／又は機器機能の大域的制御が可能になる。核酸シークエンシング実施形態に関して、数個の異なる検出装置はシークエンシングシステムとして機能することができ、これにより、例えば、同一サンプル（又は同一サンプルのサブ画分）を並列的にシークエンシングすることができる。核酸シークエンシングシステムは各個別検出装置に命令を供給する制御コンピュータを有することができる。核酸シークエンシングシステムにおける任意な１つの検出装置は、その検出装置の外部に物理的に位置する制御コンピュータからの命令を受取ることができる。数個の検出装置からの核酸配列データは制御コンピュータ及び／又は別個の解析コンピュータで解析することができる。したがって、中央コンピュータを使用して、ネットワークシステムにおける数個の異なる検出装置からの核酸配列データを大域的に解析することができる。
【０１２５】
フィードバック機構を、大型システムにおけるモジュールを形成する数個の検出装置の制御に利用することができる。例えば、品質管理フィードバックループを使用して、核酸配列データ品質の決定的又は診断的パラメータを観測でき、また適切な応答的アクションをとることができる。本発明によるモジュール式シークエンシングシステムに使用するのに容易に適合できる例示的フィードバックループは、例えば、米国特許第７，８３５，８７１号に記載されており、この文献は参照により本明細書に組入れられるものとする。制御コンピュータは、このようなパラメータ及び応答に基づくフィードバックループを含むようプログラムし、検出装置ネットワークに対する出力品質（例えば、配列データ品質）を制御できるようにする。
【０１２６】
システムにおけるモジュール又はノードとして機能する１つ又は複数の検出装置から取得する核酸配列データはリアルタイムで解析することができる。配列データは、パラメータに対して評価することができ、この評価は、例えば、リアルタイムで取得した核酸配列を標準配列と比較することによって行う。比較の結果に基づいて、１つ又は複数の検出装置でのシークエンシング手順を続行するか否かに係わらず、決定を行うことができる。例えば、環境サンプル又は病理サンプルは、シークエンシングシステムにおける数個のモジュールを使用してシークエンシングを行うことができ、またモジュールからのデータ出力を疑いのある汚染物質又は病原体の既知の配列と比較することができる。特定汚染物質又は病原体の有無を決定する上で十分なデータが収集された後、シークエンシングは１つ又は複数のモジュールで停止することができる。本発明によるネットワークシステムに適合できるリアルタイム解析用の例示的プロトコルは、米国特許出願公開第２０１１／０２４６０８４号に記載されており、この文献は参照により本明細書に組入れられるものとする。例示として上述したデータ解析及び決定手順は、人的介入がなく完全自動で行うことができる。例えば、上述のネットワークシステムの一部である。制御コンピュータ又は他のコンピュータで手順を実行することができる。
【０１２７】
電子的ネットワーク化に対して代替的に又は付加的に、物理的にラックに同所配置した数個の検出装置を、サンプル及び／又は試薬の配給することに関してネットワーク化することができる。例えば、カートリッジは、オートローダ又はロボット装置を用いて適切な検出装置に送給することができる。とくに、流体カートリッジは、保管場所から自動的に取出し、適切な検出装置に送給することができる。自動送給は、シークエンシングシステムに対してネットワーク化した制御コンピュータ又は他のコンピュータの命令の下に行うことができる。さらに、幾つかの実施形態において、核酸シークエンシングプロセスに使用される試薬のすべては、シークエンシングシステムに使用される流体カートリッジに収容する必要はない。むしろ、数個の検出装置は、バルク試薬を収容する１つ又は複数のリザーバに流体連通させることができる。この場合、試薬は、中央流体保管場所から、例えば、中央流体配給システムを用いて数個の検出装置に配給することができる。試薬の配給は、中央流体配給システムにネットワーク化した、又はシークエンシングシステムにおける個別の検出装置にネットワーク化した、制御コンピュータ又は他のコンピュータの命令の下に行うことができる。
【０１２８】
本発明の幾つかの実施形態は、核酸シークエンシングの文脈で、又は例として核酸シークエンシング用途を例として用いて説明してきた。しかし、上述の装置及び方法は、核酸シークエンシング用途に限定されるものではない。他の用途も有用であり、これら用途としては、限定しないが、光学的に検出されるラベルを利用する核酸解析の他のタイプが含まれる。２例としては、核酸アレイで実施する発現解析及び核酸アレイで実施する遺伝子型決定解析がある。どちらの場合でも、上述の顕微蛍光測定器、読取りヘッド又は検出装置を使用してアレイの検出を行うことができる。さらに、アレイは、流体カートリッジ内に設けることができ、また上述した流体カートリッジ及び方法を適切に変更することによって流体的に操作することができる。本発明装置及び方法に使用するよう変更できる例示的なアレイベースの方法は、例えば、米国特許出願公開第２００３／０１０８９００号、同第２００３／０２１５８２１号、又は同第２００５／０１８１３９４号に記載されており、これら文献は参照により本明細書に組入れられるものとする。
【０１２９】
アレイ又は多重ウェル基板上で実施される他の固相分析、例えば、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）も上述の方法及び装置に使用することができる。蛍光ラベルを用いるフォーマットは特に有用であり、なぜならラベルは、上述の顕微蛍光測定器、読取りヘッド又は検出装置を使用して検出できるからである。さらに、ＥＬＩＳＡ又は他の固相分析に使用される試薬は、上述したのと同様に流体カートリッジ内で処理できる。
【０１３０】
上述の方法及び装置は、さらに、光学的に検出可能な分子、又は光学的に検出可能な試薬、中間体、若しくは副生物を使用して準備した分子の合成をモニタリングするのにも有用であるようにすることができる。例えば、核酸又はポリペプチドの合成は、双方ともに上述の顕微蛍光測定器、読取りヘッド又は検出装置を使用して検出できる光学的検出可能な保護基又は中間体を用いる。合成プロトコルに含まれる流体ステップは、上述したのと同様の流体カートリッジ内で実施することができる。
【０１３１】
上述の方法及び装置の他の有用な用途は、生体サンプルのような対象物の顕微鏡イメージング（画像化）である。特に適したサンプルは組織又は細胞である。サンプルは、基板上に配置し、また核酸アレイに関して例示したように検出する。生体サンプルのような対象物の蛍光特性の画像化は、上述した方法及び装置に適用可能である。顕微蛍光測定器をこのような用途に使用し、また随意的に流体操作、例えば、目標分子のための蛍光タグのような蛍光ラベル付き試薬を導入する操作を実施することができる。
【０１３２】
本明細書全体にわたり、種々の非特許文献及び特許文献につき言及してきた。これら文献の開示全体は、本発明に関連する技術の状態をより完全に記載するため、参照により本明細書に組入れられるものとする。
【０１３３】
用語「備える（comprising）」は、本明細書において、無制限であることを意図し、記載した要素だけでなく、任意な付加的要素をも包含する。
【０１３４】
本明細書で使用される用語「各／それぞれ（each）」は、アイテムの集合体に関連して用いられるとき、集合体における個々のアイテムを識別することを意図するものであるが、他に明記しない限り、必ずしも集合体におけるすべてのアイテムについて言及するものではない。
【０１３５】
本発明を上述の実施形態につき説明してきたが、本発明から逸脱することなく様々な変更を加えることができると理解されたい。したがって、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年3月17日(2015.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出装置において、
(a) 複数個の顕微蛍光測定器を有するキャリッジであって、
前記顕微蛍光測定器のそれぞれは広視野画像検出のために構成した対物レンズを含み、
前記複数個の顕微蛍光測定器は、共通平面における複数の広視野画像を同時に取得するよう配置し、また
前記広視野画像のそれぞれは前記共通平面の異なるエリアからのものとする、
該キャリッジと、
(b) 前記共通平面に平行である少なくとも１つの方向に前記キャリッジを移動するよう構成した並進ステージと、及び
(c) 前記共通平面内に基板を保持するよう構成したサンプルステージと、
を備える、検出装置。
【請求項２】
請求項１記載の検出装置において、前記顕微蛍光測定器のそれぞれは、さらに、専用の自動合焦モジュールを有し、
任意に、前記自動合焦モジュールは、検出器及びアクチュエータを有し、前記アクチュエータは、前記共通平面に対する前記顕微蛍光測定器の焦点を変化させるよう構成され、また前記検出器は前記アクチュエータの移動を管理するよう構成される、検出装置。
【請求項３】
請求項２記載の検出装置において、前記検出器は、さらに、前記広視野画像を取得するよう構成され、  任意に、前記検出器は、さらに、画像データを前記キャリッジの外部に配置した処理ユニットに出力するよう構成される、検出装置。
【請求項４】
請求項２記載の検出装置において、該検出装置における第１顕微蛍光測定器のための前記自動合焦モジュールは、該検出装置における第２顕微蛍光測定器のための第２自動合焦モジュールからのデータを統合化するよう構成し、これにより、前記自動合焦モジュールは、第１顕微蛍光測定器の焦点位置及び第２顕微蛍光測定器の焦点位置に基づいて、前記第１顕微蛍光測定器の焦点を変化させる、検出装置。
【請求項５】
請求項１又は２記載の検出装置において、前記顕微蛍光測定器それぞれは、さらに、ビームスリッタ及び検出器を有し、前記ビームスリッタは、励起放射源からの励起放射を前記対物レンズに指向させ、また前記対物レンズからの発光放射を前記検出器に指向させ、  任意に、前記顕微蛍光測定器それぞれは、さらに、前記励起放射源を有し、 さらに任意に、前記励起放射源は、前記励起放射を、前記複数個の顕微蛍光測定器における個別顕微蛍光測定器の前記対物レンズに指向させ、各顕微蛍光測定器は、別個の励起放射源を有する、検出装置。
【請求項６】
請求項５記載の検出装置において、前記顕微蛍光測定器のそれぞれは、さらに、少なくとも２個の励起放射源を有する、検出装置。
【請求項７】
請求項１，２又は５記載の検出装置において、前記顕微蛍光測定器それぞれにおける対物レンズは、０.２〜０.５の範囲内の開口数を有する、検出装置。
【請求項８】
請求項１，２，５又は７記載の検出装置において、前記顕微蛍光測定器それぞれは、５０ミクロン未満の距離で離間する特徴を区別するのに十分な解像度で検出するよう構成される、検出装置。
【請求項９】
請求項１，２，５，７又は８記載の検出装置において、前記顕微蛍光測定器それぞれの広視野画像は、少なくとも１ｍｍ２の面積を有する、検出装置。
【請求項１０】
請求項１，２，５，７，８又は９記載の検出装置において、前記キャリッジは、前記顕微蛍光測定器相互間の側方移動を防止し、任意に、前記顕微蛍光測定器は、前記キャリッジに共成形する、検出装置。
【請求項１１】
請求項１，２，５，７，８，９又は１０記載の検出装置において、前記キャリッジは、少なくとも４個の顕微蛍光測定器を有し、前記少なくとも４個の顕微蛍光測定器の前記対物レンズは、少なくとも２列に配列する、検出装置。
【請求項１２】
基板を画像化する方法において、
(a) 表面上に蛍光特徴を有する基板を準備するステップと、
(b) 複数個の顕微蛍光測定器を使用して前記表面における第１部分の複数の広視野画像を取得する画像取得ステップであって、
前記顕微蛍光測定器それぞれは、前記表面の異なる場所からの広視野画像を取得し、
前記複数個の顕微蛍光測定器はキャリッジに固定するものとした、該画像取得ステップと、
(c) 前記表面に平行な方向に前記キャリッジを並進移動させ、前記表面の第２部分のためにステップ(b)を繰返すステップと、を有する、方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、前記複数の広視野画像は、前記ステップ(b)で同時に取得する方法。
【請求項１４】
請求項１２又は１３記載の方法において、さらに、
(d) 前記表面の前記第１部分における第２複数広視野画像を取得する位置に前記キャリッジを復帰させるステップを有し、
さらに任意に、前記ステップ(c)後かつ前記ステップ(d)前に、前記蛍光特徴を変更するステップを有し、前記第２複数広視野画像は、前記第１複数広視野画像とは異なるものである、方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記蛍光特徴は核酸を含み、前記変更ステップは、シークエンシング・バイ・シンセシス技術で核酸を変化させるステップを含む、方法。
【国際調査報告】
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