(57)【要約】  本明細書には、活性３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）経路を有し、非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む組換え酵母細胞が提供される。また、前記組換え酵母細胞を用いて、３−ＨＰ及びアクリル酸を生産する方法も記載される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）β−アラニン中間体を経由する活性３−ＨＰ経路と、（２）非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする異種ポリヌクレオチドとを含む組換え酵母細胞であって、前記細胞が、３−ＨＰを産生することができる、組換え酵母細胞。
【請求項２】
前記細胞が、ＡＤＣをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の組換え酵母細胞。
【請求項３】
前記ＡＤＣが、配列番号１７、１８、１３３、１３５、１３７、又は１３９のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する、請求項２に記載の組換え酵母細胞。
【請求項４】
前記ＡＤＣが、配列番号１７、１８、１３３、１３５、１３７、又は１３９を含むか、又はこれからなるアミノ酸配列を有する、請求項２に記載の組換え酵母細胞。
【請求項５】
前記非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）が、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１８９、１９０、１９２、又は１９４のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞。
【請求項６】
前記非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）が、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１８９、１９０、１９２、若しくは１９４を含むか、又はこれからなるアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞。
【請求項７】
（１）活性３−ＨＰ経路と、（２）非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする異種ポリヌクレオチドとを含む組換え酵母細胞であって、前記ＧＡＰＮが、以下：
（ａ）配列番号１９２のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性；又は
（ｂ）配列番号１９４のアミノ酸配列と、少なくとも８０％、例えば、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％の配列同一性を有し；かつ、
前記細胞が、３−ＨＰを産生することができる、組換え酵母細胞。
【請求項８】
前記非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）が、配列番号１９２若しくは１９４を含むか、又はこれからなるアミノ酸配列を有する、請求項７に記載の組換え酵母細胞。
【請求項９】
前記非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする前記異種ポリヌクレオチドが、ＧＡＰＮコード配列に対して外来のプロモータを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、同一の条件下で培養したとき、前記非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含まない細胞と比較して、より多くの量の３−ＨＰを産生することができる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、同一の条件下で培養したとき、前記非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含まない細胞と比較して、少なくとも１０％多い（例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、又は少なくとも２００％多い）３−ＨＰを産生することができる、請求項１０に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１２】
前記細胞が、ＰＤＣ、ＡＤＨ、ＧＡＬ６、ＣＹＢ２Ａ、ＣＹＢ２Ｂ、ＧＰＤ、ＧＰＰ、ＡＬＤ、又はＰＣＫをコードする１つ又は複数の内在性遺伝子に対する破壊をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１３】
前記細胞が、ＰＤＣをコードする内在性遺伝子に対する破壊をさらに含む、請求項１２に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１４】
前記細胞が、ＧＰＤをコードする内在性遺伝子に対する破壊をさらに含む、請求項１２又は１３に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１５】
前記酵母細胞が、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、ジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、及びサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属から選択される属に属する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１６】
前記酵母細胞が、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）／ピキア・ファーメンタンス（Ｐ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）クレード及びサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属クレードから選択されるクレードに属する、請求項１５に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１７】
前記酵母細胞が、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、カンジダ・ランビカ（Ｃ．ｌａｍｂｉｃａ）、及びサッカロミセス・ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）から選択される、請求項１５に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１８】
前記酵母細胞が、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＣＮＢ１酵母細胞である、請求項１７に記載の組換え酵母細胞。
【請求項１９】
前記酵母細胞が、五炭糖を発酵させることができない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２０】
前記細胞が、７５ｇ／Ｌ以上の３−ＨＰを含有する培地において、４未満のｐＨで増殖することができる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２１】
前記細胞が、３−ＨＰ耐性酵母細胞である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２２】
前記細胞が、突然変異及び／又は選択を受けており、これにより、突然変異及び／又は選択された細胞が、同じ種の野生型細胞より高度の３−ＨＰ耐性を有する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２３】
前記細胞が、乳酸又は３−ＨＰの存在下で選択を受ける、請求項２２に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２４】
前記選択が、ケモスタット選択である、請求項２３に記載の組換え酵母細胞。
【請求項２５】
３−ＨＰを生産する方法であって、以下：
（ａ）３−ＨＰを産生するのに好適な条件下の発酵性培地において、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の組換え酵母細胞を培養するステップと；
（ｂ）３−ＨＰを回収するステップと
を含む方法。
【請求項２６】
前記発酵性培地が、スクロース、グルコース、及び／又はフルクトースを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記発酵性培地が、１％未満の五炭糖を含む、請求項２５又は２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１１月３０日に提出された米国仮特許出願第６１／７３１，７２２号明細書からの優先権を請求する。尚、この文献の内容は、全部を参照により本明細書に組み込むものとする。
【０００２】
配列表の参照
本出願は、コンピュータで読み取り可能な形態での配列表を含み、これは、参照により本明細書に組み込むものとする。
【背景技術】
【０００３】
将来の石油の供給に関する懸念のために、再生可能エネルギー及び再生可能な他の原料の供給源の分野での研究が押し進められてきた。エタノール及びバイオプラスチック（例えば、ポリ乳酸）などの生物燃料は、微生物を用いて農作物起源から直接製造することができる物質の例である。続いて、別の要望される物質を、非酵素的化学変換を用いて、例えば、エタノールからエチレンへの脱水により得ることができる。
【０００４】
３−ヒドロキシプロピオン酸（３−ＨＰ）は、発酵により製造することができる上位１２の非常に有望なビルディングブロック化学物質の１つとして米国エネルギー省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ）により特定された、三炭素カルボン酸である。乳酸（２−ヒドロキシプロピオン酸）の異性体である３−ＨＰの別名としては、エチレン乳酸及び３−ヒドロキシプロピオネートなどがある。３−ＨＰは、グルコースからの１００％の理論収率、様々な化学反応に加わることを可能にする複数の官能基、及び低毒性を有する魅力的な再生可能プラットフォーム化学物質である。３−ＨＰは、１，３−プロパンジオール、マロン酸、アクリルアミド、及びアクリル酸などの複数の汎用化学製品を形成するための基質として使用することができる。アクリル酸は、アクリル酸エステル及び高吸収性ポリマーを製造するのに用いられる大量化学物質（＞７０億ｌｂｓ／年）であり、現在、プロピレンの触媒酸化から得られている。３−ＨＰの発酵生産により、これらの商業的に重要な化学物質の供給原料として、石油化学製品に対する持続可能な代替品が提供されるようになることから、エネルギー消費量、海外の石油への米国の依存度、及び温室効果ガスの生成が低減するであろう。
【０００５】
糖を有機酸に発酵させるために細菌を用いることができる。しかし、細菌には、大規模な有機酸生産についていくつかの欠点がある。有機酸が生産されるに従い、発酵培地は酸性が強くなる。得られる産物は部分的又は完全に酸性型で存在するため、より低いｐＨ条件が実際に好ましい。しかし、有機酸を産生するほとんどの細菌は、強度に酸性の環境ではうまく機能せず、そのため、死滅するか、又は培地が酸性になるにつれ、あまりに緩徐に産生し始めるため、経済的に採算が取れなくなる。これを防止するために、より高いｐＨを維持するように培地を緩衝することが必要になる。しかし、このことは、有機酸産物の回収をさらに困難にし、しかも高価にする。
【０００６】
近年、糖を有機酸に発酵させるための酵母の使用について関心が高まっている。酵母は、生物触媒として多くの工業的発酵に使用され、細菌に対していくつかの利点を提供する。多くの細菌が、それらが増殖するのに必要な特定のアミノ酸又はタンパク質を合成したり、糖を効率的に代謝したりすることができないのに対し、ほとんどの酵母種は、それらに必要なアミノ酸又はタンパク質を無機窒素化合物から合成することができる。また酵母は、細菌の場合に生産性又は発酵工程全体の損失を招き得るバクテリオファージ感染を被りにくい。
【０００７】
酵母は、有機酸生産のための魅力的候補であるが、いくつかの問題を呈示する。第１に、酵母の経路改変操作は、一般に細菌の場合より困難である。酵母内の酵素は、細胞質、ミトコンドリア、又はペルオキシソーム内にコンパートメント化されるのに対し、細菌では、それらは細胞質中にプールされている。このことは、生合成経路の全ての酵素が１つの細胞における同じコンパートメント内に共存するのを確実にするために、標的シグナルを除去する必要があることを意味している。また、要望される製品への炭素流動を最大限にするために、コンパートメント間の経路中間体の輸送の制御も必要となり得る。第２に、全ての酵母種が大規模な経済的発酵に必要な基準を満たすわけではない。実際には、わずかな割合の酵母しか、十分に高い量的、かつ特異的糖利用と、低ｐＨ条件下で頑健に増殖する能力を兼ね備えてない。米国エネルギー省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ）は、３−ＨＰを含む数種の有機酸の経済的発酵に、約２．５ｇ／Ｌ／時の生産速度が必要であると推定している（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ１．ｅｅｒｅ．ｅｎｅｒｇｙ．ｇｏｖ／ｂｉｏｍａｓｓ／ｐｄｆｓ／３５５２３．ｐｄｆ）。
【０００８】
多くの酵母種は、ヘキソース糖をエタノールへと自然に発酵させるが、有意な収量の有機酸を自然に産生するものはあったとしてもごくわずかである。そのために、有機酸を産生するように様々な酵母種を遺伝子組換えする取組みがなされてきた。内在性ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ）遺伝子を破壊し、次に乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遺伝子を挿入して、エタノール産生を排除することにより、乳酸を産生する遺伝子組換え酵母株が既に開発されている（例えば、国際公開第９９／１４３３５号パンフレット、国際公開第００／７１７３８号パンフレット、国際公開第０２／４２４７１号パンフレット、国際公開第０３／０４９５２５号パンフレット、国際公開第０３／１０２１５２号パンフレット及び国際公開第０３／１０２２０１号パンフレットを参照）。この改変によって、糖代謝をエタノール産生から乳酸産生に転換する。酵母の発酵産物及び経路は、細菌のものとは異なるため、収量を最大限にするのに異なった操作手法が必要である。有機酸産物の収量又は純度を高めるために、除去又は低減の必要があると考えられる他の天然産物は、グリセロール、酢酸塩、及びジオールである。遺伝子改変された酵母株中のグリセロールの低減は、例えば、国際公開第０７／１０６５２４号パンフレットに記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
乳酸とは違って、３−ＨＰは、天然において既知のいずれの経路の主要な最終産物ではなく、一部の細菌及び真菌に微量にしか存在しない。従って、３−ＨＰを産生する酵母を作製するために、より多くの遺伝子改変操作が必要である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株は、以前、乳酸中間体を経て非常に低レベルの３−ＨＰを産生するように操作された（国際公開第０２／０４２４１８号パンフレットを参照）。しかし、野生型サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の許容レベルは、それを３−ＨＰ産生用の最適宿主とするには不十分である。３−ＨＰに対し高度に許容性の酵母細胞が、米国特許出願公開第２０１２／０１３５４８１号明細書に記載されている。しかし、当技術分野では、依然として、工業規模で費用効果的に優れた方式で３−ＨＰ産生をさらに改善する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書には、活性３−ＨＰ経路を有する組換え酵母細胞が記載され、この経路は、非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）活性を含む。ある態様では、組換え酵母細胞は、非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。
【００１１】
一態様では、（１）βアラニン中間体を経由する活性３−ＨＰ経路と、（２）非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換え酵母細胞であって、３−ＨＰを産生することができる組換え酵母細胞が提供される。ある実施形態では、上記細胞は、アスパラギン酸１−デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ＧＡＰＮは、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１８９、１９０、１９２、又は１９４のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する。
【００１２】
別の態様では、（１）活性３−ＨＰ経路と、（２）非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換え酵母細胞であって、ＧＡＰＮが、（ａ）配列番号１９２のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性；又は（ｂ）配列番号１９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有し；しかも、３−ＨＰを産生することができる組換え酵母細胞が提供される。
【００１３】
ある態様では、組換え酵母細胞は、同一の条件下で培養したとき、非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含まない細胞と比較して、より多くの量の３−ＨＰを産生する。
【００１４】
ある態様では、組換え酵母細胞は、ＰＰＣをコードする異種ポリヌクレオチド、ＰＹＣをコードする異種ポリヌクレオチド、ＡＡＴをコードする異種ポリヌクレオチド、ＡＤＣをコードする異種ポリヌクレオチド、ＢＡＡＴ又はｇａｂＴをコードする異種ポリヌクレオチド、及び３−ＨＰＤＨをコードする異種ポリヌクレオチドから選択される、１つ又は複数の（例えば、２つ、いくつかの）異種ポリヌクレオチドを含む。
【００１５】
ある実施形態では、組換え酵母細胞は、ＰＤＣ、ＡＤＨ、ＧＡＬ６、ＣＹＢ２Ａ、ＣＹＢ２Ｂ、ＧＰＤ、ＧＰＰ、ＡＬＤ、又はＰＣＫをコードする１つ又は複数の内在性遺伝子に対する破壊を含む。ある実施形態では、組換え酵母細胞は、ＰＤＣをコードする内在性遺伝子と、ＧＰＤをコードする内在性遺伝子の一方又は両方に対する破壊を含む。
【００１６】
ある実施形態では、酵母細胞は、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、ジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、又はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母細胞である。ある実施形態では、酵母細胞は、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＣＮＢ１酵母細胞である。ある実施形態では、組換え酵母細胞は、３−ＨＰ耐性酵母細胞である。ある実施形態では、細胞は、五炭糖を発酵させることができない。
【００１７】
また、３−ＨＰ及び関連化合物を生産する方法も記載される。一態様では、３−ＨＰを生産する方法であって、（ａ）３−ＨＰを生産するのに好適な条件下の培地において、本明細書に記載の組換え酵母細胞を培養するステップと；（ｂ）３−ＨＰを回収するステップとを含む方法が提供される。別の態様では、アクリル酸又はその塩を生産する方法であって、（ａ）３−ＨＰを生産するのに好適な条件下の培地において、本明細書に記載の組換え酵母細胞を培養するステップ；（ｂ）３−ＨＰを回収するステップ；（ｃ）アクリル酸又はその塩を産生するのに好適な条件下で３−ＨＰを脱水するステップ；及び（ｄ）アクリル酸又はその塩を回収するステップを含む方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】グルコースからの３−ＨＰ経路を選択する概略を示す。
【図２】３−ホスホグリセリン酸生産のための経路の概略を示す。
【図３】ｐＭＢｉｎ２２２のプラスミドマップを示す。
【図４】ｐＭｃＴｓ１０２のプラスミドマップを示す。
【図５】ｐＭｃＴｓ１２５のプラスミドマップを示す。
【図６】ｐＭｃＴｓ６５のプラスミドマップを示す。
【図７】ｐＣＫｌｅ７３のプラスミドマップを示す。
【図８】ｐＳＴＫ８のプラスミドマップを示す。
【図９】ｐＭｃＴｓ１２８のプラスミドマップを示す。
【図１０】ｐＭＢｉｎ２２７のプラスミドマップを示す。
【図１１】ｐＭｌＢａ１５７のプラスミドマップを示す。
【図１２】ｐＭｌＢａ１５８のプラスミドマップを示す。
【図１３】ｐＭｌＢａ１６２のプラスミドマップを示す。
【図１４】ｐＭｅＪｉ３２２のプラスミドマップを示す。
【図１５】ｐＭｅＪｉ３２３−３のプラスミドマップを示す。
【図１６】ｐＭｌＢａ１６３のプラスミドマップを示す。
【図１７】３−ＨＰ／ＤＣＷの発酵グラフを示す。
【図１８】消費グルコース／ＤＣＷの発酵グラフを示す。
【図１９】ｐＭＢｉｎ２４０のプラスミドマップを示す。
【図２０】ｐＭＢｉｎ２４１のプラスミドマップを示す。
【図２１】本明細書に記載する複数の株からのＧＡＰＮ活性グラフを示す。
【００１９】
定義
３−ＨＰ：用語「３−ＨＰ」は、「３−ヒドロキシプロピオン酸」の塩及び酸形態を包含する。
【００２０】
活性３−ＨＰ経路：本明細書で用いるとき、「活性３−ＨＰ経路」を有する宿主細胞は、発酵性糖から３−ＨＰを産生するのに十分な量で代謝経路の各反応を触媒する上で必要な活性酵素を産生するため、少なくとも１種の発酵性糖の存在下の発酵条件下で培養すると、測定可能な収量で３−ＨＰを産生することができる。活性３−ＨＰ経路を有する宿主細胞は、１つ又は複数の３−ＨＰ経路遺伝子を含む。「３−ＨＰ経路遺伝子」は、本明細書で用いるとき、活性３−ＨＰ経路に関与する酵素をコードする遺伝子を指す。
【００２１】
活性３−ＨＰ経路において各反応を触媒する上で必要な活性酵素は、本明細書でさらに詳述するように、内在性遺伝子発現の活性、異種遺伝子発現の活性により、又は内在性及び異種遺伝子発現の活性の組み合わせにより生じ得る。
【００２２】
非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）：用語「非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」、「ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ」又は「ＧＡＰＮ」は、本明細書では、グリセルアルデヒド−３−リン酸及びＮＡＤＰ＋から３−ホスホグリセリン酸及びＮＡＤＰＨへの化学反応を触媒する酵素として定義される（例えば、ＥＣ  １．２．１．９)。ＧＡＰＮ活性は、Ｔａｍｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１６，６８５−６９０に記載されているか；又は、本明細書の実施例に記載するように、無細胞抽出液から決定することができる。例えば、ＧＡＰＮ活性は、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＧＳＨ、５ｍＭ  ＡＴＰ、０．２ｍＭ  ＮＡＤＰＨ、２単位の３−ホスホグリセリンホスホキナーゼ、２ｍＭ  ３−ホスホグリセリン酸及び上記酵素を含む反応混合物において３４０ｎｍでのＮＡＤＰＨ酸化後の吸光度の変化をモニターすることにより、分光光度法で測定することができる。
【００２３】
破壊：用語「破壊」は、参照遺伝子のコード領域及び／又は制御配列が、部分的若しくは全体的に修飾され（例えば、１個又は複数のヌクレオチドの欠失、挿入及び／若しくは置換などにより）、それによって、コードされたポリペプチドの発現の非存在（不活性化）若しくは低減、及び／又はその酵素活性の非存在若しくは低減が起こることを意味する。破壊の作用は、本明細書で参照にした無細胞抽出液測定を用いる酵素活性の非存在若しくは低減を検出するなど、公知の技術を用いて；又は対応するｍＲＮＡの非存在若しくは低減（例えば、少なくとも２５％の低減、少なくとも５０％の低減、少なくとも６０％の低減、少なくとも７０％の低減、少なくとも８０％の低減、若しくは少なくとも９０％の低減）により；酵素活性を有する対応ポリペプチドの非存在若しくはその量の低減（例えば、少なくとも２５％の低減、少なくとも５０％の低減、少なくとも６０％の低減、少なくとも７０％の低減、少なくとも８０％の低減、若しくは少なくとも９０％の低減）により；又は酵素活性を有する対応ポリペプチド特異的活性の非存在若しくは低減（例えば、少なくとも２５％の低減、少なくとも５０％の低減、少なくとも６０％の低減、少なくとも７０％の低減、少なくとも８０％の低減、若しくは少なくとも９０％の低減）により測定することができる。目的とする具体的遺伝子の破壊は、当技術分野では公知の方法、例えば、位置指定相同組換え（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７  ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｄａｍｓ，Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ，Ｋａｉｓｅｒ，ａｎｄ  Ｓｔｅｍｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９９８）を参照）により実施することができる。
【００２４】
コード配列：用語「コード配列」又は「コード領域」は、ポリペプチドのアミノ酸配列を指定するポリヌクレオチド配列を意味する。コード配列の境界は、一般に、オープンリーディングフレームによって決定され、これは、通常、ＡＴＧ開始コドン又はＧＴＧ及びＴＴＧなどの代替開始コドンで開始し、ＴＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡなどの停止コドンで終結する。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ポリヌクレオチド、及び／又は組換えポリヌクレオチドであってもよい。
【００２５】
配列同一性：２つのアミノ酸配列同士又は２つのヌクレオチド配列同士の関連性は、パラメータ「配列同一性」により表される。
【００２６】
本明細書に記載する目的のために、２つのアミノ酸配列同士の配列同一性の度合いは、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  ２０００，１６，２７６−２７７）、好ましくはバージョン３．０．０以降のＮｅｅｄｌｅプログラムに実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９７０，４８，４４３−４５３）を用いて決定する。用いられる任意選択のパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長同一性」の出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）をパーセント同一性として使用し、これは、以下のようにして算出する。
（同一の残基×１００）／（参照配列の長さ−アラインメント中のギャップ総数）
【００２７】
本明細書に記載する目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列同士の配列同一性の度合いは、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、前掲）、好ましくはバージョン３．０．０以降のＮｅｅｄｌｅプログラムに実装されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、前掲）を用いて決定する。用いられる任意選択のパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、及びＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅ標識された「最長同一性」の出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを用いて得られる）をパーセント同一性として使用し、これは、以下のようにして算出する。
（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／（参照配列の長さ−アラインメント中のギャップ総数）
【００２８】
異種ポリヌクレオチド：用語「異種ポリヌクレオチド」は、本明細書において、宿主細胞に対してネイティブではないポリヌクレオチド；構造的改変がコード領域に実施されたネイティブポリヌクレオチド；その発現が、組換えＤＮＡ技術、例えば、異なる（外来の）プロモータによるＤＮＡの操作の結果、量的に改変されたネイティブポリヌクレオチド；又は、発現を量的に改変するポリヌクレオチドの１個又は複数のコピーを余分に有する宿主細胞中のネイティブポリヌクレオチドとして定義される。「異種遺伝子」は、異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子である。
【００２９】
内在性遺伝子：用語「内在性遺伝子」は、参照宿主細胞に対してネイティブである遺伝子を意味する。「内在性遺伝子発現」は、内在性遺伝子の発現を意味する。
【００３０】
核酸構築物：用語「核酸構築物」は、１つ又は複数（例えば、２つ、いくつか）の制御配列を含むポリヌクレオチドを意味する。このポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のいずれであってもよく、天然に存在する遺伝子から単離して、そうでなければ天然では存在しない様式で核酸のセグメントを含有するように修飾してもよいし、あるいは合成のものでもよい。
【００３１】
制御配列：用語「制御配列」は、ポリペプチドの発現に必要な核酸配列を意味する。制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにネイティブ又は外来のいずれであってもよく、互いにネイティブ又は外来であってもよい。このような制御配列として、限定はしないが、リーダ配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモータ配列、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネータ配列が挙げられる。制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域と制御配列の連結を容易にする、特定の制限部位を導入する目的で、リンカーを備えていてもよい。
【００３２】
作動可能に連結される：用語「作動可能に連結される」は、制御配列がコード配列の発現を指令するように、ポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に制御配列を配置する構成を意味する。
【００３３】
発現：用語「発現」は、ポリペプチドの生産に関与するあらゆるステップを包含し、限定するものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含む。発現は、例えば、発現の増大を検出するために、ｍＲＮＡ及び／又は翻訳されたポリペプチドのレベルの測定など、当技術分野では公知の技術により測定することができる。
【００３４】
発現ベクター：用語「発現ベクター」は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、制御配列に作動可能に連結されている線状又は環状ＤＮＡ分子を意味し、ここで、制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現をもたらす。最低でも、発現ベクターは、プロモータ配列、並びに転写及び翻訳停止シグナル配列を含む。
【００３５】
宿主細胞：用語「宿主細胞」は、核酸構築物又は発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けやすい任意の細胞型を意味する。用語「宿主細胞」は、複製中に起こる突然変異のために親細胞と同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。用語「組換え酵母細胞」は、本明細書において、１個又は複数の（例えば、２個、いくつかの）異種ポリヌクレオチドを含む天然には存在しない酵母宿主細胞として定義される。
【００３６】
対立遺伝子変異型：用語「対立遺伝子変異型」は、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の２つ以上の別の形態のいずれかを意味する。対立遺伝子変異は、突然変異により自然に発生し、集団内に多形を生じ得る。遺伝子変異は、サイレント（コードされたポリペプチドに変化なし）であるか、又は改変されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし得る。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされたポリペプチドである。
【００３７】
量的生産性：用語「量的生産性」は、時間の単位毎に使用された系の量（例えば、培地及びその内容物の総量）につき生産された参照産物の量（例えば、生産された３−ＨＰの量）を指す。
【００３８】
発酵性培地：用語「発酵性培地」又は「発酵培地」は、グルコース、フルクトース、スクロース、セロビオース、キシロース、キシルロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、及び／又は可溶性オリゴ糖などの１種又は複数（例えば、２種、いくつか）の糖を含む培地を指し、ここで、培地は、一部が、宿主細胞により、３−ＨＰなどの要望される産物に変換（発酵）され得る。場合によっては、発酵培地は、サトウキビ、デンプン、又はセルロースなどの天然の供給源から得られ、酵素的加水分解（糖化）により供給源を前処理して得ることもできる。
【００３９】
高度ストリンジェンシー条件：用語「高度ストリンジェンシー条件」は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続く、４２℃で、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの断片処理及び変性済みのサケ精子ＤＮＡ、及び５０％ホルムアミドにおけるプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。担体材料は最終的に、０．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用い、６５℃で１５分ずつ３回洗浄する。
【００４０】
低度ストリンジェンシー条件：用語「低度ストリンジェンシー条件」は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続く、４２℃で、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの断片処理及び変性済みのサケ精子ＤＮＡ、及び２５％ホルムアミドにおけるプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。担体材料は最終的に、０．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用い、５０℃で１５分ずつ３回洗浄する。
【００４１】
中度ストリンジェンシー条件：用語「中度ストリンジェンシー条件」は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続く、４２℃で、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの断片処理及び変性済みのサケ精子ＤＮＡ、及び３５％ホルムアミドにおけるプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。担体材料は最終的に、０．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用い、５５℃で１５分ずつ３回洗浄する。
【００４２】
中−高度ストリンジェンシー条件：用語「中−高度ストリンジェンシー条件」は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続く、４２℃で、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの断片処理及び変性済みのサケ精子ＤＮＡ、及び３５％ホルムアミドにおけるプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。担体材料は最終的に、０．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用い、６０℃で１５分ずつ３回洗浄する。
【００４３】
極めて高度のストリンジェンシー条件：用語「極めて高度のストリンジェンシー条件」は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続く、４２℃で、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの断片処理及び変性済みのサケ精子ＤＮＡ、及び５０％ホルムアミドにおけるプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。担体材料は最終的に、０．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用い、７０℃で１５分ずつ３回洗浄する。
【００４４】
極めて低度のストリンジェンシー条件：用語「極めて低度のストリンジェンシー条件」は、長さが少なくとも１００ヌクレオチドのプローブに関して、１２〜２４時間の標準的サザンブロッティング手順に続く、４２℃で、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌの断片処理及び変性済みのサケ精子ＤＮＡ、及び２５％ホルムアミドにおけるプレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションを意味する。担体材料は最終的に、０．２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用い、４５℃で１５分ずつ３回洗浄する。
【００４５】
略語：３−ＨＰＡ、３−ヒドロキシプロピオンアルデヒド；３−ＨＰＤＨ、３−ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ；ＡＡＭ、アラニン２，３アミノムターゼ；ＡＡＴ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ＡＣＣ、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ；ＡＤＣ、アスパラギン酸１−デカルボキシラーゼ；ＡＫＧ、α−ケトグルタル酸；ＡＬＤ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ；ＢＡＡＴ、β−アラニンアミノトランスフェラーゼ；ＢＣＫＡ、分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ；ｂｐ、塩基対；ＣＹＢ２、Ｌ−（＋）乳酸−シトクロームｃオキシドレダクターゼ；ＣＹＣ、イソ−２−シトクロームｃ；ＥＭＳ、エタンメチルスルホナーゼ；ＥＮＯ、エノラーゼ；ｇａｂＴ、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ；ＧＡＰＤＨ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ３；ＧＰＤ、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ；ＧＰＰ、グリセロール３−リン酸ホスファターゼ；ＨＩＢＡＤＨ、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ；ＩＰＤＡ、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ；ＫＧＤ、α−ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ；ＬＤＨ、乳酸デヒドロゲナーゼ；ＭＡＥ、リンゴ酸酵素；ＯＡＡ、オキサロ酢酸；ＰＣＫ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ；ＰＤＣ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ；ＰＤＨ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ；ＰＥＰ、ホスホエノールピルビン酸；ＰＧＫ、ホスホグリセリン酸キナーゼ；ＰＰＣ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ；ＰＹＣ、ピルビン酸カルボキシラーゼ；ＲＫＩ、リボース５−リン酸ケトール−イソメラーゼ；ＴＡＬ、トランスアルドラーゼ；ＴＥＦ１、翻訳伸長因子１；ＴＥＦ２、翻訳伸長因子２；ＴＫＬ、トランスケトラーゼ；ＸＤＨ、キシリトールデヒドロゲナーゼ；ＸＲ、キシロースレダクターゼ；ＹＰ、酵母抽出液／ペプトン。
【００４６】
本明細書において、数値又はパラメータの前に「約」というとき、その数値又はパラメータ自体に関する態様を包含する。例えば、「約Ｘ」という記載は、態様「Ｘ」を包含する。測定値と組み合わせて用いられる場合、「約」は、少なくとも特定の値を測定する方法に関連する不確実性を包含する範囲を含み、表記した値に前後する２つの標準偏差を足した、又は引いた範囲を含み得る。
【００４７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数形「１つの（ａ）」、「又は」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文面が明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示物を含む。本明細書に記載する態様は、態様「から構成されること」及び／又は態様「から実質的に構成されること」を包含する。
【００４８】
別途定義されるか、又は文面から明らかに示されるのでない限り、本明細書で使用する全ての技術及び化学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本明細書には、とりわけ、非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする異種ポリヌクレオチドをさらに含む、活性３−ＨＰ経路を有する組換え酵母細胞が記載される。本出願人は、驚くことに、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドを含まない細胞と比較して、ＧＡＰＮの発現が、β−アラニンを経由する活性３−ＨＰ経路と共に、代謝３−ＨＰの産生を増大することをみいだした。細胞外部での３−ＨＰ塩の輸送は、ＡＴＰを消費することがわかっている（ｖａｎ  Ｍａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２００４，６，２４５−２５５）。ゆえに、ＧＡＰＮは、ピルビン酸までの経路で３−ホスホグリセリン酸を産生するとき、ＡＴＰの生成を迂回することから、ＧＡＰＮを発現する細胞における細胞外３−ＨＰの増加は予想外である（図２参照）。
【００５０】
ＧＡＰＮの発現により３−ＨＰ産生を増大するという本出願人の発見は、ＧＡＰＮ活性が欠失していると考えられる酵母細胞に特に適用可能であろう。さらに、ＧＡＰＮは、ＮＡＤＨよりむしろＮＡＤＰＨを産生するため（図２参照）、ＧＡＰＮの発現は、ＮＡＤＰＨの増大により利益を受けることができる細胞（例えば、クラスＥＣ  １．１．１．２９８の３−ＨＰＤＨなどのＮＡＤＰＨを利用する酵素を過剰発現する細胞）又はＮＡＤＨの低減により利益を受けることができる細胞（例えば、ＮＡＤＨ蓄積をもたらす内在性ＧＰＤ又はＰＤＣ遺伝子の破壊を有する細胞）において３−ＨＰを生産するのにも適用が可能であろう。
【００５１】
一態様では、組換え酵母細胞は、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドを含み、同じ条件下で培養したとき、異種ポリヌクレオチドを含まない酵母細胞と比較して、より多くの量の３−ＨＰを産生する（又は産生することができる）。ある態様では、酵母細胞は、内在性ＧＡＰＮ遺伝子が欠失している。ある実施形態では、酵母細胞は、同じ条件下で培養したとき、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドを含まない細胞と比較して、少なくとも１０％多い（例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、又は少なくとも２００％多い）３−ＨＰを産生する（又は産生することができる）。
【００５２】
非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）
非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）は、本明細書に記載する宿主細胞又はその使用方法に好適な任意のＧＡＰＮであってよく、例えば、天然に存在するＧＡＰＮ（例えば、内在性ＧＡＰＮ若しくは別の種からのネイティブＧＡＰＮ）又はＧＡＰＮ活性を保持するその変異型であってよい。一態様では、ＧＡＰＮは、宿主細胞の細胞質ゾル中に存在する。
【００５３】
ある態様では、同じ条件下で培養したとき、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドを含む組換え酵母細胞は、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、増大したレベルのＧＡＰＮ活性を有する。ある態様では、酵母細胞は、同じ条件下で培養したとき、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドを含まない細胞と比較して、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、又は少なくとも５００％の増大したレベルのＧＡＰＮ活性を有する。
【００５４】
本明細書に記載する宿主細胞及び使用方法で用いることができる例示的ＧＡＰＮとしては、限定はしないが、表１に示すＧＡＰＮが挙げられる。
【００５５】
【表１】
2015536669.tif 000003
【００５６】
好適なＧＡＰＮをコードする別のポリヌクレオチドを、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベース（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）内で容易に入手可能なものなど、任意の好適な属の微生物から得ることができる。一態様では、ＧＡＰＮは、グラム陽性菌ＧＡＰＮ、又は光合成真核生物（植物及び緑藻類など）、若しくは古細菌など、本明細書に記載する微生物のいずれかから得られるＧＡＰＮである。
【００５７】
例えば、ＧＡＰＮは、以下に挙げる種のいずれか１つから得ることができる：アピウム・グラベオレンス（Ａｐｉｕｍ  ｇｒａｖｅｏｌｅｎｓ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ラッカセイ（Ａｒａｃｈｉｓ  ｈｙｐｏｇａｅａ）、アルム・イタリクム（Ａｒｕｍ  ｉｔａｌｉｃｕｍ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、テンサイ（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、緑藻クロミドモナス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、クロストリジウム・パステレイアヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、クロストリジウム・スポロゲネス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｇｅｎｅｓ）、ヒメリュウキンカ（Ｆｉｃａｒｉａ  ｖｅｒｎａ）、パラゴムノキ（Ｈｅｖｅａ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、メタノサーマス・フェルビダス（Ｍｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｅｒｖｉｄｕｓ）、エンドウ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）、トウゴマ（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）、ストレプトコッカス・アガラクティアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、ストレプトコッカス・エクイヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）、シネココッカス・エロンガタス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）ＰＣＣ  ７９４２、オオハマボウ（Ｔａｌｉｐａｒｉｔｉ  ｔｉｌｉａｃｅｕｍ）、サーモプロテウス・テナックス（Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｕｓ  ｔｅｎａｘ）、パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、又はトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）。
【００５８】
ＧＡＰＮは、以下：バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、乳酸桿菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、クロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属、ゲオバチルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、又はオセアノバチルス（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属ＧＡＰＮなどのグラム陽性菌ＧＡＰＮであってもよい。一態様では、ＧＡＰＮは、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアギュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・フィルムス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロテルモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、又はバチルス・チューリンゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ＧＡＰＮである。別の態様では、ＧＡＰＮは、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ウベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、又はストレプトコッカス・エクイ亜種ズーエピデミカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ  ｓｕｂｓｐ．Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）ＧＡＰＮである。別の態様では、ＧＡＰＮは、ストレプトマイセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトマイセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、又はストレプトマイセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＧＡＰＮである。
【００５９】
一態様では、ＧＡＰＮは、配列番号１５４のストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮ、又は配列番号１５８のストレプトコッカス・エクイヌス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｎｕｓ）ＧＡＰＮなどの連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属ＧＡＰＮである。一態様では、ＧＡＰＮは、配列番号１９０のクロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ＧＡＰＮなどのクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）属ＧＡＰＮである。一態様では、ＧＡＰＮは、配列番号１５９又は１９２のトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）ＧＡＰＮなどのトウモロコシ属（Ｚｅａ）ＧＡＰＮである。一態様では、ＧＡＰＮは、配列番号１９４のラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）ＧＡＰＮなどの乳酸桿菌属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ＧＡＰＮである。
【００６０】
前述した種の場合、完全及び不完全な状態、並びに他の分類学上の同等物、例えば、アナモルフが、それらが知られている種の名称とは関係なく包含されることは理解されよう。当業者であれば、適切な同等物の同一性を容易に認識するであろう。
【００６１】
これらの種の株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）、及びＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などのいくつかの微生物株保存機関において一般に容易に入手することができる。
【００６２】
ＧＡＰＮコード配列、又はそのサブ配列；並びに対応するアミノ酸配列、又はその断片；を用いて、当技術分野では公知の方法に従い、異なる属若しくは種の株からＧＡＰＮを同定し、クローン化するための核酸プローブを設計してもよい。特に、このようなプローブは、標準的サザンブロッティング手順の後、目的とする属若しくは種のゲノム又はｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに用いることにより、そこで対応する遺伝子を同定及び単離することができる。このようなプローブは、全配列よりかなり短くてよく、例えば、長さが少なくとも１４ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、少なくとも３５ヌクレオチド、少なくとも７０ヌクレオチドである。プローブは長くてもよく、例えば、長さが少なくとも１００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチドである。さらに長いプローブ、例えば、長さが少なくとも６００ヌクレオチド、少なくとも７００ヌクレオチド、少なくとも８００ヌクレオチド、少なくとも９００ヌクレオチドのプローブを用いてもよい。ＤＮＡ及びＲＮＡプローブのいずれを用いてもよい。プローブは、典型的に、対応する遺伝子を検出するために標識されている（例えば、32Ｐ、3Ｈ、35Ｓ、ビオチン、又はアビジンで）。
【００６３】
このような他の株から作製されるゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを、前述したプローブとハイブリダイズして、ＧＡＰＮ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡについてスクリーニングすることができる。こうした他の株からのゲノム又は他のＤＮＡをアガロース若しくはポリアクリルアミドゲル電気泳動、又は他の分離技術により分離することができる。ライブラリーからのＤＮＡ又は分離されたＤＮＡをニトロセルロース若しくは他の好適な担体材料に移し、その上に固定化することができる。ＧＡＰＮコード配列、又はそのサブ配列と相同性であるクローン若しくはＤＮＡを同定するために、担体材料をサザンブロットに用いてもよい。
【００６４】
前述したプローブの目的のために、ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドが、標識核酸プローブ、又はその完全長相補鎖、又はこれらのサブ配列と、極めて低度から極めて高度のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることを意味する。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルムを用いて、検出することができる。長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブに関して、極めて低度から極めて高度のストリンジェンシー及び洗浄条件は、上に記載したように定義される。長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短いプローブに関しては、ストリンジェンシー及び洗浄条件は、上に記載したように定義される。
【００６５】
ＧＡＰＮはまた、自然（例えば、土壌、堆肥、水、サイレージなど）から単離した微生物又は自然の材料（例えば、土壌、堆肥、水、サイレージなど）から直接得られるＤＮＡサンプルを含む他の起源から、前述したプローブを用いて同定し、取得することもできる。自然生息地から直接微生物及びＤＮＡを単離する技術は、当技術分野では公知である。次に、ＧＡＰＮをコードするポリヌクレオチドを、別の微生物又は混合ＤＮＡサンプルのゲノム又はｃＤＮＡライブラリーを同様にスクリーニングすることにより取得することができる。本明細書に記載する好適なプローブで、ＧＡＰＮをコードするポリヌクレオチドを検出したら、当業者には周知の技術を使用することにより、配列を単離又はクローン化することができる（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｕｓ，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。
【００６６】
ＧＡＰＮをコードするポリヌクレオチドを単離又はクローン化するのに用いられる技術としては、ゲノムＤＮＡからの単離、ｃＤＮＡからの作製、又はこれらの組み合わせがある。このようなゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローン化は、例えば、公知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は発現ライブラリーの抗体スクリーニングを用いて、共通の構造的特徴を有するクローン化ＤＮＡ断片を検出することにより、実施することができる。例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＰＣＲ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、連結活性化転写（ＬＡＴ）及びヌクレオチド配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）などの他の核酸増幅方法を用いてもよい。
【００６７】
一態様では、ＧＡＰＮは、本明細書に記載するいずれかのＧＡＰＮ（例えば、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１８９、１９０、１９２、若しくは１９４のいずれかのＧＡＰＮ）と、少なくとも５０％、例えば、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。一態様では、ＧＡＰＮ配列は、本明細書に記載するいずれかのＧＡＰＮ（例えば、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１８９、１９０、１９２、若しくは１９４のいずれかのＧＡＰＮ）と、１０個以下のアミノ酸、例えば、５個以下のアミノ酸、４個以下のアミノ酸、３個以下のアミノ酸、２個以下のアミノ酸、又は１個のアミノ酸が異なる。一態様では、ＧＡＰＮは、本明細書に記載するいずれかのＧＡＰＮ（例えば、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１８９、１９０、１９２、若しくは１９４のいずれかのＧＡＰＮ）、対立遺伝子変異型、又はＧＡＰＮ活性を有するこれらの断片のアミノ酸配列を含むか、又はこれから構成される。一態様では、ＧＡＰＮは、１個又は複数（例えば、２個、いくつか）のアミノ酸のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を有する。ある態様では、アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入の総数は、１０以下、例えば、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１以下である。
【００６８】
アミノ酸変化は、一般に、軽度のもの、すなわち、タンパク質の折り畳み及び／又は活性に有意に影響しない保存的アミノ酸置換若しくは挿入；典型的には１〜約３０個のアミノ酸の微小な欠失；アミノ末端メチオニン残基のような微小なアミノ末端若しくはカルボキシル末端伸長；約２０〜２５残基までの微小なリンカーペプチド；又は正味の電荷又はその他の機能を変化させることによって精製を容易にする、例えば、ポリ−ヒスチジン配列（ｐｏｌｙ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）、抗原エピトープ若しくは結合ドメインなどの微細な伸長である。
【００６９】
保守的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、並びに微小アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）の群に含まれる。一般に比活性を変化させないアミノ酸の置換は当技術分野において公知であり、例えば、１９７９年、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ及びＲ．Ｌ．ＨｉｌｌによってＴｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。最も一般的に起こる交換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【００７０】
あるいは、アミノ酸変化は、ポリペプチドの物理化学的特徴が改変されるような性質のものである。例えば、アミノ酸変化により、ＧＡＰＮの熱的安定性を改善する、基質特異性を改変する、ｐＨ最適値を変えるなどが可能である。
【００７１】
必須アミノ酸は、部位特異的突然変異誘発又はアラニンスキャニング突然変異誘発（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）などの当技術分野では公知の手順に従って同定することができる。後者の技術においては、単一のアラニン突然変異が分子のあらゆる残基で導入され、その結果得られる突然変異分子をＧＡＰＮ活性について試験することにより、分子の活性に不可欠なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８もまた参照のこと。ＧＡＰＮ又はその他の生物相互作用の活性部位は、推定接触部位のアミノ酸の突然変異と併せて、核磁気共鳴、結晶学、電子回折、又は光親和性標識などの技術によって決定されるように、構造の物理分析により決定することもできる。例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照のこと。また、参照ＧＡＰＮに関連する他のＧＡＰＮとの同一性の分析から、必須アミノ酸の同一性を推論することも可能である。
【００７２】
単一又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入は、突然変異誘発、組換え、及び／又はシャッフリングなどの公知の方法に続いて、関連するスクリーニング方法、例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；又は国際公開第９５／２２６２５号パンフレットにより開示されるものを用いて実施及び試験することができる。用いることができる他の方法としては、エラープローンＰＣＲ、ファージ提示法（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、及び領域指定突然変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）が挙げられる。
【００７３】
突然変異誘発／シャッフリングの方法を、ハイスループット、自動化スクリーニング方法と組み合わせて、宿主細胞によって発現される、クローン化、突然変異したポリペプチドの活性を検出することもできる（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ＧＡＰＮをコードする突然変異ＤＮＡ分子を宿主細胞から回収し、当技術分野で標準的な方法を用いて迅速に配列決定することができる。これらの方法により、ポリペプチド中の個々のアミノ酸残基の重要性を迅速に決定することが可能になる。
【００７４】
ある態様では、上記ＧＡＰＮは、同じ条件下で、本明細書に記載するいずれかのＧＡＰＮ（例えば、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１８９、１９０、１９２、若しくは１９４のいずれかのＧＡＰＮ）の少なくとも２０％、例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％のＧＡＰＮ活性を有する。
【００７５】
一態様では、ＧＡＰＮコード配列は、少なくとも低度のストリンジェンシー条件、例えば、中度のストリンジェンシー条件、中度−高度のストリンジェンシー条件、高度のストリンジェンシー条件、又は極めて高度のストリンジェンシー条件下で、本明細書に記載するいずれかのＧＡＰＮ（例えば、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１８９、１９０、１９２、若しくは１９４のいずれかのＧＡＰＮ）由来のコード配列の完全長相補鎖とハイブリダイズする（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｅ．Ｆ．Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｔ．Ｍａｎｉａｔｕｓ，１９８９、前掲を参照）。一態様では、ＧＡＰＮコード配列は、本明細書に記載するいずれかのＧＡＰＮ（例えば、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１８９、１９０、１９２、若しくは１９４のいずれかのＧＡＰＮ）由来のコード配列と、少なくとも６５％、例えば、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。
【００７６】
一態様では、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載するいずれかのＧＡＰＮ（例えば、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１８９、１９０、１９２、若しくは１９４のいずれかのＧＡＰＮ）のコード配列を含む。一態様では、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドは、本明細書に記載するいずれかのＧＡＰＮ由来のコード配列のサブ配列を含み、ここで、サブ配列は、ＧＡＰＮ活性を有するポリペプチドをコードする。一態様では、コードサブ配列におけるヌクレオチド残基の数は、参照コード配列の数の少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【００７７】
本明細書に記載する任意の関連態様の参照コード配列は、ネイティブコード配列（例えば、入手可能な配列データベースを用いて当業者により容易に決定される配列）又は、特定の宿主細胞のために設計されたコドン最適化コード配列などの変性配列であってよい。例えば、配列番号１５４のストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮのコード配列は、ネイティブストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮコード配列又はコドン最適化バージョン、例えば、配列番号１５４に示すコード配列であってよい。
【００７８】
ＧＡＰＮは、別のポリペプチドが、ＧＡＰＮのＮ末端又はＣ末端に融合した融合ポリペプチド又は切断可能な融合ポリペプチドであってもよい。融合ポリペプチドは、別のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、ＧＡＰＮをコードするポリヌクレオチドに融合することにより製造することができる。融合ポリペプチドを製造する技術は当技術分野では公知であり、ポリペプチドをコードするコード配列を、これらがフレーム内にあって、しかも、融合ポリペプチドの発現が同一のプロモータ及びターミネータの制御下にあるように連結することを含む。融合タンパク質は、融合物を翻訳後に作出するインテイン技術を用いて構築することもできる（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）。
【００７９】
活性３−ＨＰ経路
３−ＨＰを生産するために、異種ＧＡＰＮを有する組換え酵母細胞と一緒に、任意の好適な３−ＨＰ経路を用いることができる。３−ＨＰ経路、３−ＨＰ経路遺伝子及び３−ＨＰの発酵のための対応する操作された形質転換体は、当技術分野では公知である（例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１３５４８１号明細書；米国特許第６，８５２，５１７号明細書；米国特許第７，３０９，５９７号明細書；米国特許出願公開第２００１／００２１９７８号明細書；米国特許出願公開第２００８／０１９９９２６号明細書；国際公開第０２／４２４１８号パンフレット；及び国際公開第１０／０３１０８３号パンフレットを参照；尚、これら文献の内容は、その全体を本明細書に組み込むものとする）。複数の既知３−ＨＰ経路の概略を図１に示す。
【００８０】
特定の実施形態では、本明細書に記載する酵母細胞は、ＰＥＰ又はピルビン酸塩から、ＯＡＡ、アスパラギン酸塩、β−アラニン、及びマロン酸セミアルデヒド中間体を経由する活性３−ＨＰ経路を有する（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００２１９７８号明細書、図１を参照）。これらの実施形態では、酵母細胞は、ピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）、ＰＥＰカルボキシラーゼ（ＰＰＣ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＡＴ）、アスパラギン酸１−デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、β−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＢＡＡＴ）、アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ｇａｂＴ）、３−ＨＰデヒドロゲナーゼ（３−ＨＰＤＨ）、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＢＡＤＨ）、及び４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１つ又は複数を含む３−ＨＰ経路遺伝子のセットを含む。３−ＨＰ経路遺伝子はさらに、ＰＥＰからＯＡＡへの変換を好ましく触媒するポリペプチドを産生するように改変されたＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）遺伝子を含んでもよい（ネイティブＰＣＫ遺伝子は、一般に、ＯＡＡからＰＥＰへの逆反応を好ましく触媒するポリペプチドを産生する）。
【００８１】
特定の実施形態では、本明細書に記載する酵母細胞は、ＰＥＰ又はピルビン酸塩から、ＯＡＡ、及びリンゴ酸塩中間体を経由する活性３−ＨＰ経路を有する（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００２１９７８号明細書、図４を参照）。これらの実施形態では、酵母細胞は、ＰＰＣ、ＰＹＣ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、及びリンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子のうち１つ又は複数を含む３−ＨＰ経路遺伝子のセットを含む。３−ＨＰ経路遺伝子はまた、ＰＥＰからＯＡＡへの変換を好ましく触媒するポリペプチドを産生するように改変されたＰＣＫ遺伝子も含んでもよい。
【００８２】
特定の実施形態では、本明細書に記載する酵母細胞は、ＰＥＰ又はピルビン酸塩から、ＯＡＡ、及びマロン酸セミアルデヒド中間体を経由する活性３−ＨＰ経路を有する（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００２１９７８号明細書、図１を参照）。これらの実施形態では、酵母細胞は、ＰＰＣ、ＰＹＣ、２−ケト酸デカルボキシラーゼ、α−ケトグルタル酸（ＡＫＧ）デカルボキシラーゼ（ＫＧＤ）、分岐鎖−αケト酸デカルボキシラーゼ（ＢＣＫＡ）、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＩＰＤＡ）、３−ＨＰＤＨ、ＨＩＢＡＤＨ、及び４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１つ又は複数を含む３−ＨＰ経路遺伝子のセットを含む。３−ＨＰ経路遺伝子はまた、ＰＥＰからＯＡＡへの変換を好ましく触媒するポリペプチドを産生するように改変されたＰＣＫ遺伝子を含んでもよい。さらに、３−ＨＰ経路遺伝子は、ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒することができるポリペプチドをコードするように改変されたＰＤＣ遺伝子及び／又はベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ遺伝子を含んでもよい。
【００８３】
特定の実施形態では、本明細書に記載する酵母細胞は、ＰＥＰ又はピルビン酸塩から、ＯＡＡ、マロニル−ＣｏＡ、及びマロン酸セミアルデヒド中間体を経由する活性３−ＨＰ経路を有し、ここで、マロン酸セミアルデヒド中間体は任意選択である（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００２１９７８号明細書、図２を参照）。これらの実施形態において、酵母細胞は、ＰＰＣ、ＰＹＣ、ＯＡＡギ酸リアーゼ、マロニル−ＣｏＡレダクターゼ、ＣｏＡアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、３−ＨＰＤＨ、ＨＩＢＡＤＨ、及び４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の１つ又は複数を含む３−ＨＰ経路遺伝子のセットを含む。３−ＨＰ経路遺伝子はまた、ＰＥＰからＯＡＡへの変換を好ましく触媒するポリペプチドを産生するように改変されたＰＣＫ遺伝子を含んでもよい。さらに、３−ＨＰ経路遺伝子は、ＯＡＡからマロニル−ＣｏＡへの変換を触媒するポリペプチドを産生するように、２−ケト酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を改変することによって得られるＯＡＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を含んでもよい。
【００８４】
特定の実施形態では、本明細書に記載する酵母細胞は、ピルビン酸塩から、アセチル−ＣｏＡ、マロニル−ＣｏＡ、及びマロン酸セミアルデヒド中間体を経由する活性３−ＨＰ経路を有し、ここで、マロン酸セミアルデヒド中間体は任意選択である（例えば、国際公開第０２／０４２４１８号パンフレット、図４４を参照）。これらの実施形態では、酵母細胞は、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）、マロニル−ＣｏＡレダクターゼ、ＣｏＡアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、３−ＨＰＤＨ、ＨＩＢＡＤＨ、及び４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうちの１つ又は複数を含む３−ＨＰ経路遺伝子のセットを含む。
【００８５】
特定の実施形態では、本明細書に記載する酵母細胞は、ピルビン酸塩、アラニン、β−アラニン、β−アラニル−ＣｏＡ、アクリリル−ＣｏＡ、３−ＨＰ−ＣｏＡ、及びマロン酸セミアルデヒド中間体を経由する活性３−ＨＰ経路を有し、ここで、β−アラニル−ＣｏＡ、アクリリル−ＣｏＡ、３−ＨＰ−ＣｏＡ、及びマロン酸セミアルデヒド中間体は、任意選択である（β−アラニンは、マロン酸セミアルデヒド中間体を経て、又はβ−アラニル−ＣｏＡ、アクリリル−ＣｏＡ、及び３−ＨＰ−ＣｏＡ中間体を経て、３−ＨＰに変換され得る（例えば、米国特許第７，３０９，５９７号明細書、図１を参照）。これらの実施形態において、酵母細胞は、アラニンデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ、アラニン２，３アミノムターゼ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、ＣｏＡシンテターゼ、β−アラニル−ＣｏＡアンモニアリアーゼ、３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ、３−ＨＰ−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ、ＢＡＡＴ、３−ＨＰＤＨ、ＨＩＢＡＤＨ、及び４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のうち１つ又は複数を含む３−ＨＰ経路遺伝子のセットを含む。
【００８６】
特定の実施形態では、本明細書に記載する酵母細胞は、ピルビン酸塩から、乳酸塩、ラクチル−ＣｏＡ、アクリリル−ＣｏＡ、及び３−ＨＰ−ＣｏＡ中間体を経由する活性３−ＨＰ経路を有する（例えば、国際公開第０２／０４２４１８号パンフレット、図１参照）。これらの実施形態では、酵母細胞は、ＬＤＨ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、ＣｏＡシンテターゼ、ラクチル−ＣｏＡデヒドラターゼ、３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ、３−ＨＰ−ＣｏＡヒドロラーゼ、及び３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子のうち１つ又は複数を含む３−ＨＰ経路遺伝子のセットを含む。
【００８７】
特定の実施形態では、本明細書に記載する酵母細胞は、グリセロールから３−ＨＰＡ中間体を経由する活性３−ＨＰ経路を有する（例えば、米国特許第６，８５２，５１７号明細書を参照）。これらの実施形態では、酵母細胞は、グリセロールデヒドラターゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子のうち１つ又は複数を含む３−ＨＰ経路遺伝子のセットを含む。
【００８８】
特定の実施形態では、本明細書に記載する酵母細胞は、ＰＥＰ又はピルビン酸塩から、ＯＡＡ、アスパラギン酸塩、β−アラニン、β−アラニル−ＣｏＡ、アクリリル−ＣｏＡ、３−ＨＰ−ＣｏＡ、及びアラニン中間体を経由する活性３−ＨＰ経路を有し、ここで、ＯＡＡ、アスパラギン酸塩、及びアラニン中間体は、任意選択である（ＰＥＰ又はピルビン酸塩は、ＯＡＡ及びアスパラギン酸塩を経て、又はアラニンを経て、β−アラニンに変換され得る）（国際公開第０２／０４２４１８号パンフレット、図５４；米国特許第７，３０９，５９７号明細書、図１参照）。これらの実施形態では、酵母細胞は、ＰＰＣ、ＰＹＣ、ＡＡＴ、ＡＤＣ、ＣｏＡトランスフェラーゼ、ＣｏＡシンテターゼ、β−アラニル−ＣｏＡアンモニアリアーゼ、３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ、３−ＨＰ−ＣｏＡヒドロラーゼ、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドラーゼ、アラニンデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ、及びＡＡＭ遺伝子の１つ又は複数を含む３−ＨＰ経路遺伝子のセットを含む。３−ＨＰ経路遺伝子はまた、ＰＥＰからＯＡＡへの変換を好ましく触媒するポリペプチドを産生するように改変されたＰＣＫ遺伝子を含んでもよい。
【００８９】
特定の実施形態では、本明細書に記載する酵母細胞は、以下のものからなる群から選択される酵素をコードする１つ又は複数の３−ＨＰ経路遺伝子を発現する：ＡＣＣ（アセチル−ＣｏＡからマロニル−ＣｏＡへの変換を触媒する）、アラニン２，３アミノムターゼ（ＡＡＭ、アラニンからβ−アラニンへの変換を触媒する）、アラニンデヒドロゲナーゼ（ピルビン酸塩からアラニンへの変換を触媒する）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（３−ＨＰＡから３−ＨＰへの変換を触媒する）、ＫＧＤ（ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する）、ＡＡＴ（ＯＡＡからアスパラギン酸塩への変換を触媒する）、ＡＤＣ（アスパラギン酸塩からβ−アラニンへの変換を触媒する）、ＢＣＫＡ（ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する）、ＢＡＡＴ（β−アラニンからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する）、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ｇａｂＴ、β−アラニンからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する）、β−アラニル−ＣｏＡアンモニアリアーゼ（β−アラニル−ＣｏＡからアクリリル−ＣｏＡへの変換を触媒する）、Ｃｏ−Ａアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（マロニル−ＣｏＡからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する）、ＣｏＡシンテターゼ（β−アラニンからβ−アラニル−ＣｏＡへの変換、又は乳酸塩からラクチル−ＣｏＡへの変換を触媒する）、ＣｏＡトランスフェラーゼ（β−アラニンからβ−アラニル−ＣｏＡへの変換及び／又は乳酸塩からラクチル−ＣｏＡへの変換を触媒する）、グリセロールデヒドラターゼ（グリセロールから３−ＨＰＡへの変換を触媒する）、ＩＰＤＡ（ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する）、ＬＤＨ（ピルビン酸塩から乳酸塩への変換を触媒する）、ラクチル−ＣｏＡデヒドラターゼ（ラクチル−ＣｏＡからアクリリル−ＣｏＡへの変換を触媒する）、リンゴ酸デカルボキシラーゼ（リンゴ酸塩から３−ＨＰへの変換を触媒する）、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ＯＡＡからリンゴ酸塩への変換を触媒する）、マロニル−ＣｏＡレダクターゼ（マロニル−ＣｏＡからマロン酸セミアルデヒド又は３−ＨＰへの変換を触媒する）、ＯＡＡギ酸リアーゼ（また、ピルビン酸−ギ酸リアーゼ及びケト酸ギ酸−リアーゼとしても知られ、ＯＡＡからマロニル−ＣｏＡへの変換を触媒する）、ＯＡＡデヒドロゲナーゼ（ＯＡＡからマロニルＣｏＡへの変換を触媒する）；ＰＰＣ（ＰＥＰからＯＡＡへの変換を触媒する）、ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ（ピルビン酸塩からアラニンへの変換を触媒する）、ＰＹＣ（ピルビン酸塩からＯＡＡへの変換を触媒する）、ＰＤＨ（ピルビン酸塩からアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する）、２−ケト酸デカルボキシラーゼ（ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する）、３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ（また、アクリリル−ＣｏＡヒドラターゼとしても知られ、アクリリル−ＣｏＡから３−ＨＰ−ＣｏＡへの変換を触媒する）、３−ＨＰＤＨ（マロン酸セミアルデヒドから３−ＨＰへの変換を触媒する）、３−ＨＰ−ＣｏＡヒドラーゼ（３−ＨＰ−ＣｏＡから３−ＨＰへの変換を触媒する）、ＨＩＢＡＤＨ（マロン酸セミアルデヒドか���３−ＨＰへの変換を触媒する）、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドラーゼ（３−ＨＰ−ＣｏＡから３−ＨＰへの変換を触媒する）、及び４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ（マロン酸セミアルデヒドから３−ＨＰへの変換を触媒する）。これらの酵素活性の各々について、カッコ内の目的とする反応は、内在性又は異種活性の結果起こり得る。
【００９０】
選択した活性３−ＨＰ経路に関連する酵素を産生するのに十分な量で、任意の好適な３−ＨＰ経路遺伝子（内在性又は異種の）を用いて、発現させることができる。３９５の微生物ゲノム並びに多様な酵母、真菌、植物、及び哺乳動物ゲノムを含む５５０超の種（これらの過半数がＮＣＢＩなどの公式データベースで入手可能である）について入手可能な完全ゲノム配列を用いて、本明細書に教示する選択した３−ＨＰ経路酵素活性をコードする遺伝子の同定は、選択した宿主についてルーティンであり、当技術分野において公知である。例えば、既知遺伝子の好適な相同体、オーソログ、パラログ及び非オーソロガス遺伝子機能置換、並びに生物同士の遺伝子改変の交換を、選択宿主に関して近縁又は非近縁の宿主において同定することができる。
【００９１】
既知のゲノム配列を含まない酵母の場合、典型的には、当技術分野で公知の技術を用いて、目的とする遺伝子の配列（過剰発現候補又は挿入部位のいずれかとして）を得ることができる。ルーティンの実験設計を使用して、様々な遺伝子の発現を試験し、３−ＨＰ経路で機能する遺伝子及び酵素を含む様々な遺伝子の発現及び各種酵素の活性を試験することができる。酵素において各々の酵素を個別に、並びに全経路酵素までの、好ましくは全経路酵素を含む酵素のブロックとして発現させて、改善された３−ＨＰ生産に何が必要である（又は要望される）かを確立する実験を実施することができる。１つの例示的実験設計では、各々個別の酵素、並びに酵素の各々独特なペアの発現を試験し、さらに、必要な全ての酵素、又は各々独特な酵素の組み合わせの発現を試験することができる。理解されるように、いくつかの手法を採用することができる。
【００９２】
本発明の組換え宿主細胞は、以下に記載するように、３−ＨＰ経路に加わる酵素のうちの１つ又は複数をコードする異種ポリヌクレオチドを導入することにより、作製することができる。当業者には理解されるように、場合によっては（例えば、宿主の選択に応じて）、宿主細胞が、１つ又は複数の経路遺伝子からの内在性酵素活性を有するとすれば、３−ＨＰ経路に示される全ての遺伝子の異種発現が３−ＨＰ生産に必要なわけではないと考えられる。例えば、選択した宿主が、３−ＨＰ経路の１つ又は複数の酵素を欠失している場合、欠失酵素のための異種ポリヌクレオチドを宿主に導入し、後に発現させる。あるいは、選択した宿主は、いくつかの経路遺伝子の内在性発現を呈示するが、他のものが欠失している場合、３−ＨＰ生合成を達成するのに、欠失酵素のためのコードポリヌクレオチドが必要となる。このように、本発明の組換え宿主細胞は、異種ポリヌクレオチドを導入して、要望される生合成経路の酵素活性を得ることにより作製することができる。あるいは、要望される生合成経路は、１つ又は複数の内在性酵素と一緒に、３−ＨＰなどの要望される産物を産生する１つ又は複数の異種ポリヌクレオチドを導入することにより取得することができる。
【００９３】
選択した組換え宿主細胞の３−ＨＰ経路成分に応じて、本発明の宿主細胞は、ＧＡＰＮをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド、３−ＨＰ経路遺伝子の酵素をコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチド、及び３−ＨＰ経路のための全コード異種ポリヌクレオチドまでを含み得る。例えば、３−ＨＰ生合成は、３−ＨＰ経路酵素が欠失した宿主において、対応するポリヌクレオチドの異種発現によって確立することができる。３−ＨＰ経路の全酵素が欠失した宿主の場合、この経路における全酵素の異種発現を導入することができるが、宿主が経路酵素の少なくとも１つを含む場合であっても、経路の全酵素を発現させることができることは理解される。
【００９４】
本明細書で用いるとき、「ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＰＹＣ遺伝子」は、ピルビン酸塩、ＣＯ2、及びＡＴＰからＯＡＡ、ＡＤＰ、及びリン酸塩への変換を触媒する能力を意味する、ピルビン酸カルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。特定の実施形態では、ＰＹＣ遺伝子は、酵母起源から得てもよい。例えば、ＰＹＣ遺伝子は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列をコードするイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＰＹＣ遺伝子から得てもよい。別の実施形態では、上記遺伝子は、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来のＰＹＣ遺伝子は、配列番号１に記載されるヌクレオチド配列、又は配列番号１のヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。別の実施形態では、ＰＹＣ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、ＰＹＣ遺伝子は、補充反応のためにＰＹＣだけを用い、ＰＰＣ（以下を参照）は用いない数種類の細菌種（例えば、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ））の１つ、又はＰＹＣ及びＰＰＣの両方を有する細菌種（例えば、リゾビウム・エトリ（Ｒ．ｅｔｌｉ））から得てもよい。ロドバクター・スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）及びリゾビウム・エトリ（Ｒ．ｅｔｌｉ）のＰＹＣ遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号３及び４に記載されている。ＰＹＣ遺伝子は、配列番号３若しくは４のアミノ酸配列をコードする遺伝子、又は配列番号３若しくは４のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子から得てもよい。あるいは、ＰＹＣ遺伝子は、活性化のためにアセチル−ＣｏＡへの依存性を有していない酵素をコードするＰＹＣ遺伝子、例えば、配列番号５（カルボキシトランスフェラーゼサブユニット）若しくは配列番号６（ビオチンカルボキシラーゼサブユニット）に記載されるアミノ酸配列をコードするシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ＰＹＣ遺伝子、配列番号７に記載されるアミノ酸配列をコードするコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＰＹＣ遺伝子、又は配列番号５、６、若しくは７のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコー��する遺伝子から得てもよい。ＰＹＣ遺伝子はまた、アスパラギン酸によって阻害されない酵素をコードするＰＹＣ遺伝子、例えば、配列番号８に記載されるアミノ酸配列をコードするシノリゾビウム・メリロティ（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＰＹＣ遺伝子（Ｓａｕｅｒ  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ２９：７６５（２００５）から得ても、又は配列番号８のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子から得てもよい。
【００９５】
本明細書で用いるとき、「ＰＥＰカルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＰＰＣ遺伝子」は、ＰＥＰ及びＣＯ2からＯＡＡ及びリン酸塩への変換を触媒する能力を意味する、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。特定の実施形態では、ＰＰＣ遺伝子は、細菌ＰＰＣ遺伝子から得てもよい。例えば、ＰＰＣ遺伝子は、配列番号１０に記載されるアミノ酸配列、又は配列番号１０のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＰＰＣ遺伝子から得てもよい。特定の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＰＰＣ遺伝子は、配列番号９に記載されるヌクレオチド配列、又は配列番号９に記載されるヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。別の実施形態では、ＰＰＣ遺伝子は、多くの古細菌及び限られた数の細菌に存在する「Ａ」型ＰＰＣから得ることができ、これは、アセチル−ＣｏＡにより活性化されず、しかも、アスパラギン酸によってあまり阻害されない。例えば、ＰＰＣ遺伝子は、配列番号１１に記載されるアミノ酸配列をコードするメタン生成細菌（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）ＰＰＣ  Ａ遺伝子、配列番号１２に記載されるアミノ酸配列をコードするウェルシュ菌（Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）ＰＰＣ  Ａ遺伝子、又は配列番号１１若しくは１２のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子から得てもよい。これらの実施形態のいくつかにおいて、遺伝子は、改善された特徴を有する酵素を作製するために、ネイティブ遺伝子に対して１つ又は複数の突然変異を受けていてもよい。例えば、上記遺伝子は、ネイティブポリペプチドに対してアスパラギン酸フィードバックに対する耐性が増大したＰＰＣポリペプチドをコードするように突然変異させていてもよい。他の実施形態において、ＰＰＣ遺伝子は、植物起源から得られるものであってもよい。
【００９６】
本明細書で用いるとき、「アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ遺伝子」又は「ＡＡＴ遺伝子」は、ＯＡＡからアスパラギン酸塩への変換を触媒する能力を意味する、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ  ２．６．１．１として分類される。特定の実施形態では、ＡＡＴ遺伝子は、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの酵母起源から得てもよい。例えば、ＡＡＴ遺伝子は、配列番号１４に記載されるアミノ酸配列をコードするイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＡＡＴ遺伝子又は配列番号１５に記載されるアミノ酸配列をコードするサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＡＴ２遺伝子から得てもよい。別の実施形態では、上記遺伝子は、配列番号１４又は１５のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来のＡＡＴ遺伝子は、配列番号１３に記載されるヌクレオチド配列、又は配列番号１３に記載されるヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。別の実施形態では、ＡＡＴ遺伝子は、細菌起源に由来するものであってもよい。例えば、ＡＡＴ遺伝子は、配列番号１６に記載されるアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドをコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｓｐＣ遺伝子に由来するものであってよい。他の実施形態では、上記遺伝子は、配列番号１６のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。
【００９７】
本明細書で用いるとき、「アスパラギン酸デカルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＡＤＣ遺伝子」は、アスパラギン酸からβ−アラニンへの変換を触媒する能力を意味する、アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。アスパラギン酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ  ４．１．１．１１として分類される。特定の実施形態では、ＡＤＣ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。活性アスパラギン酸デカルボキシラーゼは、不活性プロ酵素のタンパク質分解プロセシングを必要とし得ることから、これらの実施形態では、酵母宿主細胞は、細菌ＡＤＣ遺伝子によりコードされる活性酵素の形成を支持するように、選択すべきである。
【００９８】
ある実施形態では、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１７に記載されるアミノ酸配列をコードするストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ｐａｎＤ遺伝子に由来するものであってよい。ある実施形態では、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１７のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）由来のＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３０、１４５、１４６、若しくは１４７のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列；又は配列番号１３０、１４５、１４６、若しくは１４７のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【００９９】
別の実施形態では、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列をコードするクロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）ｐａｎＤ遺伝子から得てもよい。ある実施形態では、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１８のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）由来のＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３１に記載のヌクレオチド配列、又は配列番号１３１に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【０１００】
別の実施形態では、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３３に記載されるアミノ酸配列をコードするヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）ＡＤＣ遺伝子から得てもよい。ある実施形態では、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３３のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）由来のＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３３に記載のヌクレオチド配列、又は配列番号１３３に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【０１０１】
別の実施形態では、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３５に記載されるアミノ酸配列をコードするバチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＴＳ２５  ＡＤＣ遺伝子に由来するものであってよい。ある実施形態では、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３５のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、バチルス種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）ＴＳ２５由来のＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３４に記載のヌクレオチド配列、又は配列番号１３４に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【０１０２】
別の実施形態では、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３７に記載されるアミノ酸配列をコードするコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＤＣ遺伝子から得てもよい。ある実施形態では、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３７のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）由来のＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３６に記載のヌクレオチド配列、又は配列番号１３６に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【０１０３】
別の実施形態では、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３９に記載されるアミノ酸配列をコードするバチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＤＣ遺伝子から得てもよい。ある実施形態では、ＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３９のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のＡＤＣ遺伝子は、配列番号１３８、１４８、１４９、１５０、若しくは１５１に記載のヌクレオチド配列、又は配列番号１３８、１４８、１４９、１５０、若しくは１５１に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【０１０４】
本明細書で用いるとき、「β−アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子」又は「ＢＡＡＴ遺伝子」は、β−アラニンからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する能力を意味する、β−アラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。β−アラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ  ２．６．１．１９として分類される。特定の実施形態では、ＢＡＡＴ遺伝子は、酵母起源から得てもよい。例えば、ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２０に記載されるアミノ酸配列をコードするｐｙｄ４遺伝子のイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）相同体から得てもよい。ある実施形態では、ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２０のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来のＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号１９に記載のヌクレオチド配列、又は配列番号１９に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。他の実施形態において、ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２１に記載されるアミノ酸配列をコードするサッカロミセス・クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ｐｙｄ４遺伝子から得てもよい。ある実施形態では、ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２１のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来のＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号１４２に記載のヌクレオチド配列、又は配列番号１４２に記載のヌクレオチド配列番号と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。別の実施形態では、ＢＡＡＴ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２２に記載されるアミノ酸配列をコードするストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ＢＡＡＴ遺伝子から得てもよい。ある実施形態では、ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）由来のＢ���ＡＴ遺伝子は、配列番号１４０に記載のヌクレオチド配列、又は配列番号１４０に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【０１０５】
ＢＡＡＴ遺伝子はまた、「４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ」又は「ｇａｂＴ遺伝子」であってもよく、これは、４−アミノ酪酸塩並びにβ−アラニンに対してネイティブな活性を有することを意味する。あるいは、ＢＡＡＴ遺伝子は、ＢＡＡＴ活性を有するポリペプチドをコードするように実施される細菌又は酵母起源由来のネイティブｇａｂＴ遺伝子のランダム若しくは部位指定操作によって得られるものでもよい。例えば、ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２３に記載されるアミノ酸配列をコードするストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）ｇａｂＴから得てもよい。ある実施形態では、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）由来のＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２３に記載のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。別の実施形態では、ＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２４に記載されるアミノ酸配列をコードするサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ｇａｂＴ遺伝子ＵＧＡ１から得てもよい。ある実施形態では、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号２４のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＢＡＡＴ遺伝子は、配列番号１４１に記載されるヌクレオチド配列、又は配列番号１４１に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【０１０６】
本明細書で用いるとき、「３−ＨＰデヒドロゲナーゼ遺伝子」又は「３−ＨＰＤＨ遺伝子」は、マロン酸セミアルデヒドから３−ＨＰへの変換を触媒する能力を意味する、３−ＨＰデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。３−ＨＰデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、これらが、ＮＡＤＰ（Ｈ）補因子を使用する場合には、ＥＣ  １．１．１．５９として、また、これらが、ＮＡＤ（Ｈ）補因子を使用する場合には、ＥＣ  １．１．１．２９８として分類される。また、ＥＣ  １．１．１．２９８として分類される酵素は、マロン酸セミアルデヒドレダクターゼとも称される。
【０１０７】
特定の実施形態では、３−ＨＰＤＨ遺伝子は、酵母起源から得てもよい。例えば、３−ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列をコードするＹＭＲ２２６Ｃ遺伝子のイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）相同体から得てもよい。ある実施形態では、３−ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号２６のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来の３−ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号２５に記載のヌクレオチド配列、又は配列番号２５に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。別の実施形態では、３−ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号１２９に記載のアミノ酸配列をコードするサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＭＲ２２６Ｃ遺伝子に由来するものであってよい。ある実施形態では、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の３−ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号１２９に記載のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の３−ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号１４４に記載のヌクレオチド配列、又は配列番号１４４に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【０１０８】
他の実施形態では、３−ＨＰＤＨ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、３−ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号２７に記載されるアミノ酸配列をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｙｄｆＧ遺伝子から得てもよい。ある実施形態では、上記遺伝子は、配列番号２７のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の３−ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号１４３に記載のヌクレオチド配列、又は配列番号１４３に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。別の実施形態において、３−ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号２９に記載されるアミノ酸配列をコードするメタッロスパエラ・セドゥラ（Ｍ．ｓｅｄｕｌａ）マロン酸セミアルデヒドレダクターゼ遺伝子に由来するものであってよい。ある実施形態では、３−ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号２９に記載のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。特定の実施形態では、メタッロスパエラ・セドゥラ（Ｍ．ｓｅｄｕｌａ）由来の３−ＨＰＤＨ遺伝子は、配列番号１５２に記載のヌクレオチド配列、又は配列番号１５２に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【０１０９】
本明細書で用いるとき、「３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子」又は「ＨＩＢＡＤＨ遺伝子」は、３−ヒドロキシイソ酪酸からメチルマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する能力を意味する、３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ  １．１．１．３１として分類される。いくつかの３−ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼは、３−ＨＰＤＨ活性も有する。特定の実施形態では、ＨＩＢＡＤＨ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、ＨＩＢＡＤＨ遺伝子は、配列番号２８に記載されるアミノ酸配列をコードするアルカリゲネス・フェーカリス（Ａ．ｆａｅｃａｌｉｓ）Ｍ３Ａ遺伝子、又は配列番号３０若しくは配列番号３１にそれぞれ記載されるアミノ酸配列をコードするシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ＫＴ２４４０若しくはＥ２３４４０ｍｍｓＢ遺伝子、又は配列番号３２に記載されるアミノ酸配列をコードする緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＰＡＯ１ｍｍｓＢ遺伝子から得てもよい。ある実施形態では、ＨＩＢＡＤＨ遺伝子は、配列番号２８、３０、３１、又は３２に記載のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。
【０１１０】
本明細書で用いるとき、「４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子」は、４−ヒドロキシ酪酸からコハク酸セミアルデヒドへの変換を触媒する能力を意味する、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ  １．１．１．６１として分類される。一部の４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼは、３−ＨＰＤＨ活性もさらに有する。特定の実施形態において、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号３３に記載されるアミノ酸配列をコードするラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）Ｈ１６  ４ｈｂｄ遺伝子、又は配列番号３４に記載されるアミノ酸配列をコードするクロストリジウム・クルイベリ（Ｃ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＤＳＭ５５５  ｈｂｄ遺伝子から得てもよい。別の実施形態では、上記遺伝子は、配列番号３３又は３４に記載のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードし得る。
【０１１１】
本明細書で用いるとき、「ＰＥＰカルボキシキナーゼ遺伝子」又は「ＰＣＫ遺伝子」は、ＰＥＰ、ＣＯ2、及びＡＤＰ若しくはＧＤＰからＯＡＡ及びＡＴＰ若しくはＧＴＰへの変換、又はその逆を触媒する能力を意味する、ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。ＰＥＰカルボキシキナーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ  ４．１．１．３２（ＧＴＰ／ＧＤＰ資化性）及びＥＣ  ４．１．１．４９（ＡＴＰ／ＡＤＰ資化性）として分類される。特定の実施形態において、ＰＣＫ遺伝子は、酵母起源から得てもよい。別の実施形態では、ＰＣＫ遺伝子は、細菌起源から得てもよく、これらの実施形態のいくつかにおいて、上記遺伝子は、ＰＣＫ反応が、脱炭酸が優勢である一般的な形態の反応よりもむしろＯＡＡの産生を促進する細菌から得てもよい。例えば、ＰＣＫ遺伝子は、配列番号３５に記載のアミノ酸をコードするマンヘミア・サクシニシプロデュセンス（Ｍ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）ＰＣＫ遺伝子、配列番号３６に記載のアミノ酸をコードするアナエロピオスピルリム・サクシニシプロデュセンス（Ａ．ｓｕｃｃｉｎｉｃｉｐｒｏｄｕｃｅｎｓ）ＰＣＫ遺伝子、配列番号３７に記載のアミノ酸をコードするアクチノバチルス・スクシノゲネス（Ａ．ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）ＰＣＫ遺伝子、又は配列番号３８に記載のアミノ酸配列をコードするラルストニア・ユートロファ（Ｒ．ｅｕｔｒｏｐｈａ）ＰＣＫ遺伝子から得てもよい。別の実施形態では、ＰＣＫ遺伝子は、得られる遺伝子が、ＰＥＰからＯＡＡへの変換を好ましく触媒するように、それが由来するネイティブ遺伝子に対して１つ又は複数の突然変異を受けている。例えば、ＰＣＫ遺伝子は、配列番号３９に記載のアミノ酸配列をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ１２株ＰＣＫ遺伝子から得てもよく、ここで、この遺伝子は、ＰＥＰからＯＡＡへの変換を好ましく触媒するように突然変異されている。他の実施形態では、ＰＥＰからＯＡＡへの変換は、ＡＴＰ／ＡＤＰ又はＧＴＰ／ＧＤＰよりむしろ無機リン酸塩及び二リン酸塩を使用するプロピオン酸菌（例えば、プロピオニバクテリウム・シャーマニイ（Ｐ．ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）、アセトバクテリウム・ウッディ（Ａ．ｗｏｏｄｉｉ）に存在するようなＰＥＰカルボキシトランスホスホリラーゼによって触媒される。
【０１１２】
本明細書で用いるとき、「リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子」は、ＯＡＡからリンゴ酸への変換を触媒する能力を意味する、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。特定の実施形態では、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は、細菌又は酵母起源から得てもよい。
【０１１３】
本明細書で用いるとき、「リンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子」は、リンゴ酸から３−ＨＰへの変換を触媒する能力を意味する、リンゴ酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。リンゴ酸デカルボキシラーゼ活性は、天然に存在しないことが知られている。従って、リンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする天然起源の遺伝子に１つ又は複数の突然変異を組み込むことによって得ることができる。アセト乳酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドは、２−ヒドロキシ−２−メチル−３−オキソブタノエートから２−アセトインへの変換を触媒し、ＥＣ  ４．１．１．５として分類される。特定の実施形態では、リンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、リンゴ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列をコードするラクトコッカス・ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ａｌｄＢ遺伝子、配列番号４１に記載のアミノ酸配列をコードするストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ａｌｄＢ遺伝子、配列番号４２に記載のアミノ酸配列をコードするバチルス・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）ａｌｄＢ遺伝子、配列番号４３に記載のアミノ酸配列をコードするエンテロバクター・アエロゲネス（Ｅ．ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）ｂｕｄＡ遺伝子から得てもよい。
【０１１４】
本明細書で用いるとき、「αケトグルタル酸（ＡＫＧ）デカルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＫＧＤ遺伝子」は、αケトグルタル酸塩（２−オキソグルタル酸塩）からコハク酸セミアルデヒドへの変換を触媒する能力を意味する、αケトグルタル酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。ＡＫＧデカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ  ４．１．１．７１として分類される。ＫＧＤ遺伝子を用いて、ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒することができるポリペプチドをコードする遺伝子を得ることができる。この活性は、ネイティブＫＧＤ遺伝子にみいだすことができるか、又はネイティブＫＧＤ遺伝子に１つ又は複数の突然変異を組み込むことによって得ることもできる。特定の実施形態において、ＫＧＤ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、ＫＧＤ遺伝子は、配列番号４４に記載のアミノ酸配列をコードする結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＫＧＤ遺伝子、配列番号４５に記載のアミノ酸配列をコードするダイズ根粒菌（Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＫＧＤ遺伝子、配列番号４６に記載のアミノ酸配列をコードするミヤコグサ根粒菌（Ｍ．ｌｏｔｉ）（別名：リゾビウム・ロティ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ））ＫＧＤ遺伝子から得てもよい。
【０１１５】
本明細書で用いるとき、「分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＢＣＫＡ遺伝子」は、分岐鎖α−ケト酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指し、これは、長さが３〜６炭素の様々なαケト酸を脱炭酸する役割を果たし得る。ＢＣＫＡ活性を有する酵素は、ＥＣ  ４．１．１．７２として分類される。ＢＣＫＡ遺伝子を用いて、ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒することができるポリペプチドをコードする遺伝子を得ることができる。この活性は、ネイティブＢＣＫＡ遺伝子にみいだすことができるか、又はネイティブＢＣＫＡ遺伝子に１つ又は複数の突然変異を組み込むことによって得ることもできる。特定の実施形態において、ＢＣＫＡ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、ＢＣＫＡ遺伝子は、配列番号４７に記載のアミノ酸配列をコードするラクトコッカス・ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）ｋｄｃＡ遺伝子に由来するものであってよい。
【０１１６】
本明細書で用いるとき、「インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＩＰＤＡ遺伝子」は、インドールピルビン酸塩からインドールアセトアルデヒドへの変換を触媒する能力を意味する、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。ＩＰＤＡ活性を有する酵素は、ＥＣ  ４．１．１．７４として分類される。ＩＰＤＡ遺伝子を用いて、ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒することができるポリペプチドをコードする遺伝子を得ることができる。この活性は、ネイティブＩＰＤＡ遺伝子にみいだすことができるか、又はネイティブＩＰＤＡ遺伝子に１つ又は複数の突然変異を組み込むことによって得ることもできる。特定の実施形態において、インドールピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、酵母、細菌、又は植物起源から得てもよい。
【０１１７】
本明細書で用いられるとき、「ピルビン酸デカルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＰＤＣ遺伝子」は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指し、ピルビン酸塩からアセトアルデヒドへの変換を触媒する能力を意味する。ＰＤＣ活性を有する酵素は、ＥＣ  ４．１．１．１として分類される。好ましい実施形態では、本明細書に記載するような改変酵母細胞に組み込まれるＰＤＣ遺伝子は、これによって得られる遺伝子が、ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒することができるポリペプチドをコードするように、それが由来するネイティブ遺伝子に対して１つ又は複数の突然変異を受けている。特定の実施形態において、ＰＤＣ遺伝子は、酵母起源から得てもよい。例えば、ＰＤＣ遺伝子は、配列番号４９に記載のアミノ酸配列をコードするイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＰＤＣ遺伝子、配列番号５０に記載のアミノ酸配列をコードするサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＰＤＣ１遺伝子、配列番号５１に記載のアミノ酸配列をコードするクルイベロミセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＰＤＣから得てもよい。特定の実施形態では、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＰＤＣ遺伝子由来のＰＤＣ遺伝子は、配列番号４８に記載のヌクレオチド配列、又は配列番号４８に記載のヌクレオチド配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。別の実施形態において、ＰＤＣ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、ＰＤＣ遺伝子は、配列番号５２に記載のアミノ酸配列をコードするザイモモナス・モビリス（Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓ）ＰＤＣ遺伝子、又は配列番号５３に記載のアミノ酸配列をコードするアセトバクター・パスツリアナス（Ａ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）ＰＤＣ遺伝子に由来するものであってよい。
【０１１８】
本明細書で用いるとき、「ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ」遺伝子は、ベンゾイルギ酸塩からベンズアルデヒドへの変換を触媒する能力を意味する、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ  ４．１．１．７として分類される。好ましい実施形態では、本明細書に記載するような改変酵母細胞に組み込まれるベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、これによって得られる遺伝子が、ＯＡＡからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒することができるポリペプチドをコードするように、それが由来するネイティブ遺伝子に対して１つ又は複数の突然変異を受けている。特定の実施形態において、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、ベンゾイルギ酸デカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列をコードするシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ｍｄｌＣ遺伝子、配列番号５５に記載のアミノ酸配列をコードする緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ｍｄｌＣ遺伝子、配列番号５６に記載のアミノ酸配列をコードするシュードモナス・スタッツェリ（Ｐ．ｓｔｕｔｚｅｒｉ）ｄｐｇＢ遺伝子、配列番号５７に記載のアミノ酸配列をコードするシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）ｉｌｖＢ−１遺伝子から得てもよい。
【０１１９】
本明細書で用いるとき、「ＯＡＡギ酸リアーゼ遺伝子」は、アシレートケト酸からその対応するＣｏＡ誘導体への変換を触媒する能力を意味する、ＯＡＡギ酸リアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。ＯＡＡギ酸リアーゼ遺伝子によりコードされたポリペプチドは、ピルビン酸又は別のケト酸に対する活性を有し得る。特定の実施形態では、ＯＡＡギ酸リアーゼ遺伝子は、ＯＡＡをマロニル−ＣｏＡに変換するポリペプチドをコードする。
【０１２０】
本明細書で用いるとき、「マロニル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子」は、マロニル−ＣｏＡからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒する能力を意味する、マロニル−ＣｏＡレダクターゼ活性（また、Ｃｏ−Ａアシル化マロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ活性とも呼ばれる）を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。特定の実施形態では、マロニル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子は、マロン酸セミアルデヒドから３−ＨＰへの変換を触媒する能力も有する二機能性マロニル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子から得てもよい。これら実施形態のいくつかにおいて、マロニル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、マロニル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列をコードするクロロフレクサス・アウランチアクス（Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）マロニル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子、配列番号５９に記載のアミノ酸配列をコードするロセイフレクス・カステンホルジイ（Ｒ．ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚｉｉ）マロニル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子、配列番号６０に記載のアミノ酸配列をコードするエリスロバクター属種（Ｅｒｙｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＮＡＰ１マロニル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子に由来するものであってよい。別の実施形態では、マロニル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子は、マロニル−ＣｏＡからマロン酸セミアルデヒドへの変換を触媒するだけのポリペプチドをコードするマロニル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子から得ることもできる。例えば、マロニル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子は、配列番号６１に記載のアミノ酸配列をコードするメタッロスパエラ・セドゥラ（Ｍ．ｓｅｄｕｌａ）Ｍｓｅｄ＿０７０９遺伝子、又は配列番号６２に記載のアミノ酸配列をコードするスルホロブス・トコダイイ（Ｓ．ｔｏｋｏｄａｉｉ）マロニル−ＣｏＡレダクターゼ遺伝子から得てもよい。
【０１２１】
本明細書で用いるとき、「ピルビン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子」又は「ＰＤＨ遺伝子」は、ピルビン酸塩からアセチル−ＣｏＡへの変換を触媒する能力を意味する、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。特定の実施形態において、ＰＤＨ遺伝子は、酵母起源から得てもよい。例えば、ＰＤＨ遺伝子は、配列番号６３〜６６にそれぞれ記載されるアミノ酸配列をコードするサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＬＡＴ１、ＰＤＡ１、ＰＤＢ１、又はＬＰＤ遺伝子から得てもよい。別の実施形態では、ＰＤＨ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、ＰＤＨ遺伝子は、配列番号６７〜６９にそれぞれ記載されるアミノ酸配列をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株Ｋ１２亜種ＭＧ１６５５ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、若しくはｌｐｄ遺伝子、又は配列番号７０〜７３にそれぞれ記載されるアミノ酸配列をコードする枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｐｄｈＡ、ｐｄｈＢ、ｐｄｈＣ、若しくはｐｄｈＤ遺伝子から得てもよい。
【０１２２】
本明細書で用いるとき、「アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子」又は「ＡＣＣ遺伝子」は、アセチル−ＣｏＡからマロニル−ＣｏＡへの変換を触媒する能力を意味する、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ  ６．４．１．２として分類される。特定の実施形態において、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子は、酵母起源から得てもよい。例えば、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号７４に記載されるアミノ酸配列をコードするサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＣＣ１遺伝子から得てもよい。別の実施形態では、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子は、配列番号７５〜７８にそれぞれ記載されるアミノ酸配列をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、若しくはａｃｃＤ遺伝子、又は配列番号７９〜８２にそれぞれ記載されるアミノ酸配列をコードするクロロフレクサス・アウランチアクス（Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）ａｃｃＡ、ａｃｃＢ、ａｃｃＣ、若しくはａｃｃＤ遺伝子から得てもよい。
【０１２３】
本明細書で用いるとき、「アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子」は、ピルビン酸のアラニンへのＮＡＤ依存性還元的アミノ化を触媒する能力を意味する、アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。アラニンデヒドロゲナーゼ活性を有する酵素は、ＥＣ  １．４．１．１として分類される。特定の実施形態において、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号８３に記載のアミノ酸配列をコードする枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アラニンデヒドロゲナーゼ遺伝子由来から得てもよい。
【０１２４】
本明細書で用いるとき、「ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子」は、ピルビン酸塩及びＬ−グルタミン酸塩からアラニン及び２−オキソグルタル酸塩への変換を触媒する能力を意味する、ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。特定の実施形態において、ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、酵母起源から得られる。例えば、ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号８４に記載のアミノ酸配列をコードするシゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ピルビン酸／アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、又は配列番号８５に記載のアミノ酸配列をコードするサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＬＴ２遺伝子から得てもよい。
【０１２５】
本明細書で用いるとき、「アラニン２，３アミノムターゼ遺伝子」又は「ＡＡＭ遺伝子」は、アラニンからβ−アラニンへの変換を触媒する能力を意味する、アラニン２，３アミノムターゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。アラニン２，３アミノムターゼ活性は、天然に存在しないことがわかっている。従って、アラニン２，３アミノムターゼ遺伝子は、リシン２，３アミノムターゼ活性などの類似活性を有するポリペプチドをコードする天然起源の遺伝子に１つ又は複数の突然変異を組み込むことによって得ることができる（例えば、米国特許第７，３０９，５９７号明細書を参照）。特定の実施形態では、天然起源の遺伝子は、配列番号８６に記載のアミノ酸配列をコードする枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）リシン２，３アミノムターゼ遺伝子、配列番号８７に記載のアミノ酸配列をコードするポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）リシン２，３アミノムターゼ遺伝子、配列番号８８に記載のアミノ酸配列をコードするフソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）（ＡＴＣＣ−１０９５３）リシン２，３アミノムターゼ遺伝子であってもよい。
【０１２６】
本明細書で用いるとき、「ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子」は、β−アラニンからβ−アラニル−ＣｏＡへの変換及び／又は乳酸塩からラクチル−ＣｏＡへの変換を触媒する能力を意味する、ＣｏＡトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。特定の実施形態において、ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子は、酵母起源から得てもよい。別の実施形態では、ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子は、配列番号８９に記載のアミノ酸配列をコードするメガスファエラ・エルスデニイ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ）ＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子に由来するものであってよい。
【０１２７】
本明細書で用いられるとき、「ＣｏＡシンテターゼ遺伝子」は、ＣｏＡシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。一実施形態において、これは、β−アラニンからβ−アラニル−ＣｏＡへの変換を触媒する能力を含む。別の実施形態では、これは、乳酸塩からラクチル−ＣｏＡへの変換を触媒する能力を含む。特定の実施形態において、ＣｏＡシンテターゼ遺伝子は、酵母起源から得てもよい。例えば、ＣｏＡシンテターゼ遺伝子は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣｏＡシンテターゼ遺伝子から得てもよい。別の実施形態では、ＣｏＡシンテターゼ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、ＣｏＡシンテターゼ遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＣｏＡシンテターゼ、ロドバクター・スフェロイデス（Ｒ．ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）、又はサルモネラ・エンテリカ（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）ＣｏＡシンテターゼ遺伝子から得てもよい。
【０１２８】
本明細書で用いるとき、「β−アラニル−ＣｏＡアンモニアリアーゼ遺伝子」は、β−アラニル−ＣｏＡからアクリリル−ＣｏＡへの変換を触媒する能力を意味する、β−アラニル−ＣｏＡアンモニアリアーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。特定の実施形態では、β−アラニル−ＣｏＡアンモニアリアーゼ遺伝子は、配列番号９０に記載のアミノ酸配列をコードするクロストリジウム・プロピオニクム（Ｃ．ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）などの細菌起源から得てもよい。
【０１２９】
本明細書で用いるとき、「３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子」又は「アクリリル−ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子」は、アクリリル−ＣｏＡから３−ＨＰ−ＣｏＡへの変換を触媒する能力を意味する、３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ活性を有する酵素は、ＥＣ  ４．２．１．１１６として分類される。特定の実施形態において、３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子は、配列番号９１に記載のアミノ酸配列をコードするフィトフトラ・ソヤエ（Ｐ．ｓｏｊａｅ）３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子から得てもよい。別の実施形態では、３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子は、配列番号９２に記載のアミノ酸配列をコードするクロロフレクサス・アウランチアクス（Ｃ．ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子、配列番号９３に記載のアミノ酸配列をコードするロドスピラム・ルブルム（Ｒ．ｒｕｂｒｕｍ）３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子、又は配列番号９４に記載のアミノ酸配列をコードするロドバクター・カプスラテス（Ｒ．ｃａｐｕｓｕｌａｔｅｓ）３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子から得てもよい。さらに別の実施形態では、３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子は、哺乳動物起源から得てもよい。例えば、３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子は、配列番号９５に記載のアミノ酸配列をコードするホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）３−ＨＰ−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子から得てもよい。
【０１３０】
本明細書で用いるとき、「３−ＨＰ−ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子」は、３−ＨＰ−ＣｏＡから３−ＨＰへの変換を触媒する能力を意味する、３−ＨＰ−ＣｏＡヒドロラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。特定の実施形態において、３−ＨＰ−ＣｏＡ遺伝子は、酵母又は真菌起源から得てもよい。別の実施形態では、３−ＨＰ−ＣｏＡ遺伝子は、細菌又は哺乳動物起源から得てもよい。
【０１３１】
本明細書で用いるとき、「３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子」は、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指し、これは、一例において、３−ＨＰ−ＣｏＡから３−ＨＰへの変換を触媒する能力を含む。特定の実施形態では、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子は、配列番号９６に記載のアミノ酸配列をコードするシュードモナス・フルオレッセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子、又は配列番号９７に記載のアミノ酸配列をコードするセレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子などの細菌起源から得てもよい。別の実施形態では、３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子は、配列番号９８に記載のアミノ酸配列をコードするホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）３−ヒドロキシイソブチリル−ＣｏＡヒドロラーゼ遺伝子などの哺乳動物起源から得てもよい。
【０１３２】
本明細書で用いるとき、「乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子」又は「ＬＤＨ遺伝子」は、ピルビン酸塩から乳酸塩への変換を触媒する能力を意味する、乳酸デヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。特定の実施形態において、ＬＤＨ遺伝子は、真菌、細菌、又は哺乳動物起源から得てもよい。
【０１３３】
本明細書で用いるとき、「ラクチル−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子」は、ラクチル−ＣｏＡからアクリリル−ＣｏＡへの変換を触媒する能力を意味する、ラクチル−ＣｏＡデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。特定の実施形態では、ラクチル−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子は、細菌起源から得てもよい。例えば、ラクチル−ＣｏＡデヒドラターゼ遺伝子は、配列番号９９〜１０１に記載されるアミノ酸配列をコードするメガスファエラ・エルスデニイ（Ｍ．ｅｌｓｄｅｎｉｉ）ラクチル−ＣｏＡデヒドラターゼＥ１、ＥＩＩａ、又はＥＩＩｂサブユニット遺伝子から得てもよい。
【０１３４】
本明細書で用いるとき、「アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子」は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指し、これは、一例において、３−ＨＰＡから３−ＨＰへの変換及びその逆を触媒する能力を含む。特定の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号１０２に記載のアミノ酸配列をコードするサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子、又は配列番号１２２、１２４、若しくは１２６に記載のアミノ酸配列をコードするイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子から得てもよい。別の実施形態では、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子は、配列番号１０３に記載のアミノ酸配列をコードする大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ａｌｄＨ遺伝子、又は配列番号１０４に記載のアミノ酸配列をコードする肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子などの細菌起源から得てもよい。
【０１３５】
本明細書で用いるとき、「グリセロールデヒドラターゼ遺伝子」は、グリセロールから３−ＨＰＡへの変換を触媒する能力を意味する、グリセロールデヒドラターゼ活性を有するポリペプチドをコードする任意の遺伝子を指す。特定の実施形態において、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子は、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａ）又はシトロバクター・フロインディイ（Ｃ．ｆｒｅｕｎｄｉｉ）グリセロールデヒドラターゼ遺伝子などの細菌起源から得てもよい。
【０１３６】
選択した活性３−ＨＰ経路の酵素、及びその活性は、当技術分野において公知の、又は本明細書に記載する方法を用いて検出することができる。これらの検出方法は、特定の抗体、酵素産物の形成、又は酵素基質の消失の使用を含み得る。例えば、以下の文献を参照されたい：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａＩ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａＩ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）；ａｎｄ  Ｈａｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７３：７８１４−７８１８（２００７））。
【０１３７】
宿主、発現ベクター及び核酸構築物
組換え酵母細胞は、活性３−ＨＰ経路を有することができる任意の酵母細胞であってよい。当業者であれば、本明細書に例示する代謝改変などの遺伝子改変が、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）などの好適な宿主細胞及びそれらの対応する代謝反応物、又は目的とする代謝経路のための遺伝子などの要望される遺伝子材料に好適な由来生物を参照にして説明され得ることを理解されよう。しかし、極めて多様な生物の完全なゲノム配列決定及びゲノミクスの分野の高度な技術があれば、当業者は、本明細書に提供する教示内容及びガイダンスを他の酵母生物に適用することができる。例えば、本明細書に例示するイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）代謝改変は、参照種以外の種からの同一又は類似コード核酸を組み込むことにより、他の種に容易に適用することができる。
【０１３８】
本明細書で用いられるとき、「酵母」は、有子嚢胞子酵母（エンドミセス（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）目）、有担子胞子酵母、及び不完全菌類（Ｆｕｎｇｉ  Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ）（ブラストミセス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）属）に属する酵母が含まれる。酵母の分類は、将来変わる可能性があることから、本明細書に記載する目的のために、酵母は、Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ（Ｓｋｉｎｎｅｒ，Ｆ．Ａ．，Ｐａｓｓｍｏｒｅ，Ｓ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ，Ｒ．Ｒ．，ｅｄｓ，Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｎｏ．９，１９８０）に記載されている通りに定義するものとする。
【０１３９】
酵母宿主細胞は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、又はイサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属細胞、例えば、カンジダ・ソノレンシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｏｎｏｒｅｎｓｉｓ）、カンジダ・メタノソルボサ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｍｅｔｈａｎｏｓｏｒｂｏｓａ）、カンジダ・エタノリカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、クルベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルベロミセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、ピキア・ファーメンタンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）、ピキア・ガレイフォルミス（Ｐｉｃｈｉａ  ｇａｌｅｉｆｏｒｍｉｓ）、ピキア・メンブラニファシエンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、ピキア・デセルティコラ（Ｐｉｃｈｉａ  ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ）、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ディアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ブルデリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂｕｌｄｅｒｉ）、サッカロミセス・ドウグラシ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クリイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、ヤロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又はイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）細胞であってよい。
【０１４０】
酵母宿主細胞は、該細胞が、高い乳酸力価を産生し、酸性ｐＨに対する耐性の増大を示し、エタノール若しくはプロパノールに対する耐性の増大を示し、及び／又は五炭糖を発酵する能力の増大を呈示するように遺伝子改変されている細胞から、又はそのように操作された細胞に由来するものでよい（しかし、実施形態によっては、酵母細胞は五炭糖を発酵させる能力がない）。例示的な遺伝子改変酵母は、国際公開第００／７１７３８号パンフレット、国際公開第０３／０４９５２５号パンフレット、国際公開第０３／１０２２０１号パンフレット、国際公開第０３／１０２１５２号パンフレット、国際公開第０２／４２４７１号パンフレット、国際公開第２００７／０３２７９２号パンフレット、国際公開第２００７／１０６５２４号パンフレット、国際公開第２００７／１１７２８２号パンフレットに記載されており、これら文献の内容は、前記細胞に関して、参照により本明細書に組み込むものとする。上に挙げた出願に記載されるいずれの酵母細胞の改変も、本明細書に記載する活性３−ＨＰ経路に関して考慮される。
【０１４１】
酵母宿主細胞は、クラブトリー陽性表現型又はクラブトリー陰性表現型のいずれであってもよい。クラブトリー陰性生物は、増大した発酵状態に誘導される能力を特徴とする。天然に存在する生物及び組換え生物のいずれも、クラブトリー陰性としてみなされ得る。クラブトリー効果は、高濃度のグルコース（例えば、＞５ｍＭグルコース）の存在下、好気的条件下で微生物を培養するとき、微生物中の酸素消費阻害として定義される。クラブトリー陽性生物は、グルコースの存在下で酸素利用性に関係なく（呼吸よりも）発酵し続けるのに対し、クラブトリー陰性生物は、グルコース媒介による酸素消費の阻害を呈示しない。この特性は、高い基質濃度で細胞を増殖させ、しかも、酸化的リン酸化の有益なエネルギー効果を保持することを可能にするため、有機生成物の合成に有用である。一態様では、酵母は、クラブトリー陰性表現型を有する。
【０１４２】
特定の実施形態では、本明細書に記載する酵母細胞は、米国特許出願公開第２０１２／０１３５４８１号明細書に記載のように、３−ＨＰ耐性酵母細胞である。本明細書で用いるとき、「３−ＨＰ耐性酵母細胞」は、４．０未満のｐＨで７５ｇ／Ｌ以上の３−ＨＰを含有する培地中で少なくとも２．５ｇ／Ｌ／時の平均解糖速度を示す酵母細胞を指す。このような速度及び条件は、３−ＨＰを産生する経済的方法を提供するものである。これら実施形態のいくつかにおいて、酵母細胞は、そのネイティブ形態で３−ＨＰ耐性を示し得る。別の実施形態では、上記細胞は、活性３−ＨＰ経路に関する遺伝子改変の導入前、導入中、又は導入後に、突然変異及び／又は選択（例えば、ケモスタット選択若しくは頻回連続継代培養）を受けていてもよく、これによって、突然変異及び／又は選択された細胞が、同じ種の野生型と比較して高度の３−ＨＰに対する耐性を有するようにする。例えば、ある実施形態では、上記細胞は、１つ又は複数の３−ＨＰ経路遺伝子で遺伝子改変される前に、３−ＨＰ又は乳酸の存在下で突然変異及び／又は選択を受けている。特定の実施形態では、突然変異及び／又は選択は、ネイティブ形態で３−ＨＰ耐性を示す細胞に対して実施してよい。３−ＨＰ生産のための工業用宿主としてのその潜在能力を決定するために、突然変異及び／又は選択を受けた細胞を、様々なレベルの３−ＨＰの存在下で糖消費及びその他の特性について試験することができる。３−ＨＰ耐性以外にも、本明細書に記載する酵母細胞は、１種又は複数の別の有機酸（例えば、乳酸）又は発酵産物、副産物、若しくは培地成分に対する耐性についての突然変異及び／又は選択を受けていてもよい。
【０１４３】
３−ＨＰ又はその他の成分に対する耐性についての選択などの選択は、当技術分野では公知の方法を用いて達成することができる。例えば、前述したように、選択は、ケモスタット選択であってよい。ケモスタット選択では、微生物（例えば、酵母）の連続的培養を可能にするケモスタットを使用し、この場合、比増殖速度及び細胞数を独立して制御することができる。連続的培養は、主として、一定容量の流動系であり、そこに培地が連続的に添加されると共に、そこからあらゆるオーバーフローの連続的除去を行うことができる。こうした系がいったん平衡状態になると、細胞数及び栄養状態は一定にのままであるため、その系は定常状態となる。ケモスタットは、炭素又は窒素原などの制限栄養素の希釈速度及びその濃度の変更により、培養物の集団密度及び比増殖速度の両方の制御を可能にする。培養物が増殖するに従って条件を変更する（例えば、中でも接種株の増殖に必要な二次炭素源の濃度を低減する）ことにより、変更した条件で、より高速に増殖することができる集団中の微生物が選択されて、新しい条件下でうまく機能しない微生物より速く増殖することになる。典型的に、このような選択には、ケモスタット培養物の増殖過程にわたって少なくとも１つの培養成分の漸進的増加若しくは減少が必要である。ケモスタットの操作及び微生物の定向進化におけるその利用は、当技術分野では公知である（例えば、Ｎｏｖｉｃｋ  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ３６：７０８−７１９（１９５０），Ｈａｒｄｅｒ  Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  ４３：１−２４（１９７７）を参照。選択のための他の方法としては、限定はしないが、例えば、米国特許第７，６２９，１６２号明細書に記載されているような選択条件下での頻回連続継代培養が挙げられる。このような方法は、前述したグルコース制限ケモスタット方法の使用に代わり、又はこれに加えて用いることができる。
【０１４４】
例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１３５４８１号明細書に開示されているような３−ＨＰ培地における増殖及びグルコース消費の最良の組み合わせを示す酵母株が、３−ＨＰ経路に関する様々な遺伝子改変のための好ましい宿主細胞である。ｐＨが４未満、７５ｇ／Ｌ以上の３−ＨＰの存在下での増殖により示されるように、比較的高度の３−ＨＰ耐性の可能性を有する酵母属としては、例えば、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、及びジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられる。３−ＨＰ耐性を示す種としては、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）（別名：カンジダ・クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ））、カンジダ・ランビカ（Ｃ．ｌａｍｂｉｃａ）（別名：ピキア・ファーメンタンス（Ｐｉｃｈｉａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ））、及びサッカロミセス・ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）（別名：カザチスタニア・ブルデリ（Ｋａｚａｃｈｓｔａｎｉａ  ｂｕｌｄｅｒｉ））が挙げられる。イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）及びカンジダ・ランビカ（Ｃ．ｌａｍｂｉｃａ）は、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）／ピキア・ファーメンタンス（Ｐ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）クレードに由来するのに対し、サッカロミセス・ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属クレードに由来する。３−ＨＰ耐性示す具体的な株としては、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）株２４２１０、ＰＴＡ‐６６５８、６０５８５、及びＣＤ１８２２、サッカロミセス・ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）株ＭＹＡ−４０２及びＭＹＡ−４０４、並びにカンジダ・ランビカ（Ｃ．ｌａｍｂｉｃａ）株ＡＴＣＣ  ３８６１７が挙げられる。
【０１４５】
他の野生型酵母又は真菌を同様に試験して、本明細書中に記載する高レベルの３−ＨＰの存在下で許容可能なレベルの増殖及びグルコース利用率を有するものをみいだすこともできる。例えば、Ｇｒｏｓｓ及びＲｏｂｂｉｎｓ（Ｈｙｄｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ  ４３３（１０３）：９１−１０９）は、潜在的な生産宿主としての試験に有意となり得る低ｐＨ（＜４）環境で同定された８１の真菌種からなるリストを編集している。
【０１４６】
特定の実施形態では、本明細書中に規定する改変酵母細胞は、クラブトリー陰性の宿主酵母細胞に１つ又は複数の遺伝子改変を組み込むことによって作製する。これらの実施形態のいくつかにおいて、宿主酵母細胞は、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、又はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属に属し、これらの実施形態のいくつかにおいて、宿主細胞は、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）／ピキア・ファーメンタンス（Ｐ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）又はサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属クレードに属する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、カンジダ・ランビカ（Ｃ．ｌａｍｂｉｃａ）、又はサッカロミセス・ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）である。
【０１４７】
イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）／ピキア・ファーメンタンス（Ｐ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）クレードは、少なくとも以下の種：イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、ピキア・ガレイフォルミス（Ｐ．ｇａｌｅｉｆｏｒｍｉｓ）、Ｐ．ｓｐ．ＹＢ−４１４９（ＮＲＲＬ指定番号）、カンジダ・エタノリカ（Ｃ．ｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・デセルティコラ（Ｐ．ｄｅｓｅｒｔｉｃｏｌａ）、ピキア・メンブラニファシエンス（Ｐ．ｍｅｍｂｒａｎｉｆａｃｉｅｎｓ）、及びピキア・ファーメンタンス（Ｐ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）を含む最も末端のクレードである。イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）／ピキア・ファーメンタンス（Ｐ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）クレードのメンバーは、“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ  ｏｆ  Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｏｕｓ  Ｙｅａｓｔｓ  ｆｒｏｍ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ（２６Ｓ）Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ＤＮＡ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，”  Ａｎｔｏｎｉｅ  ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ  ７３：３３１−３７１，１９９８（参照により本明細書中に組み込まれる）（特に第３４９頁を参照のこと）においてＫｕｒｔｚｍａｎ及びＲｏｂｎｅｔｔにより記載された方法を用いて、酵母種の２６ＳリボソームＤＮＡの可変Ｄ１／Ｄ２ドメインの分析によって同定される。何百もの子嚢菌からの２６ＳリボソームＤＮＡの可変Ｄ１／Ｄ２ドメインの分析から、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）／ピキア・ファーメンタンス（Ｐ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）クレードが非常に近い近縁種を含むことが明らかになった。イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）／ピキア・ファーメンタンス（Ｐ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）クレードのメンバーは、このクレード外部の酵母種より、このクレードの他のメンバーに対して２６ＳリボソームＤＮＡ可変のＤ１／Ｄ２ドメインに高い類似性を示す。従って、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）／ピキア・ファーメンタンス（Ｐ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）クレードの他のメンバーは、それらのそれぞれのリボソームＤＮＡのＤ１／Ｄ２ドメインを比較し、さらに、Ｋｕｒｔｚｍａｎ及びＲｏｂｎｅｔｔの方法を用いて、上記クレードの他のメンバーのものと上記クレード外部の近縁種のものを比較することによって同定することができる。
【０１４８】
特定の実施形態では、本明細書に記載する組換え酵母細胞は、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属に属し、これらの実施形態のいくつかにおいて、酵母細胞はイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）である。最初に特定されたとき、菌種イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）は、ピキア・クドリアブゼビイ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）と命名された。イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）のアナモルフ（無性形態）は、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）として知られている。菌種イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）の多数のさらなる同義語は、別の文献に記載されている（Ｋｕｒｔｚｍａｎ  ａｎｄ  Ｆｅｌｌ，Ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔｓ，ａ  Ｔａｘｏｎｏｍｉｃ  Ｓｔｕｄｙ．Ｓｅｃｔｉｏｎ  ３５．Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  Ｋｕｄｒｙａｖｔｓｅｖ，ｐｐ２２２−２２３（１９９８））。
【０１４９】
特定の実施形態では、酵母細胞は、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＣＮＢ１酵母細胞である。イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＣＮＢ１酵母細胞は、国際公開第２０１２／０７４８１８号パンフレット（その内容は、参照により本明細書中に組み込まれる）に記載されており、そこに記載されるイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＣＮＢ１酵母細胞、及びそこに記載されるイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＣＮＢ１酵母細胞由来の任意の酵母細胞を含む。
【０１５０】
３−ＨＰ生産に理想的な酵母細胞は、低ｐＨレベルで増殖することができる。低ｐＨで発酵を行う能力は、下流での回収コストを低減することから、より経済的な生産をもたらす。従って、特定の実施形態では、酵母宿主細胞は低ｐＨレベル（例えば、７、６、５、４、又は３より低いｐＨレベル）で増殖することができる。
【０１５１】
好適な宿主細胞は、３−ＨＰ耐性及び／又は低ｐＨ増殖能力に加えて、１つ又は複数の好都合な特徴を有し得る。例えば、３−ＨＰ耐性を示す潜在的宿主細胞は、解糖速度、比増殖速度、熱耐性、バイオマス加水分解物阻害剤に対する耐性、全体的工程ロバスト性などに基づいてさらに選択することができる。これらの基準は、３−ＨＰ経路に関連するいずれかの遺伝子改変前に評価してもよいし、あるいは、１つ又は複数のこうした改変が行われた後に評価してもよい。
【０１５２】
ほとんどの酵母がエタノールを自然に産生するため、ピルビン酸塩（ＰＤＣ）からのエタノール産生における第１ステップを触媒する酵素の排除又は大幅な低減は、十分な収量の代替産物には好都合である。サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属などのクラブトリー陽性の酵母では、破壊されたＰＤＣ遺伝子が、宿主に、エタノール又は酢酸塩などの二炭素化合物に対する栄養要求性を獲得させ、グルコース含有培地での増殖不足を引き起こす。これらの制限事項を解消することができる突然変異体は、酢酸塩独立性及び耐糖性について段階的な選択を用いて、取得することができる（例えば、ｖａｎ  Ｍａｒｉｓ  ＡｐｐＩ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７０：１５９（２００４）を参照のこと）。そのため、特定の実施形態において、好ましい酵母宿主細胞は、クラブトリー陰性の酵母細胞であり、そこで、ＰＤＣ破壊株は、グルコースで増殖することができ、しかも、Ｃ２原栄養性を維持する。遺伝子破壊についてより詳細な説明は以下に示す。
【０１５３】
ある実施形態では、酵母細胞は、本明細書に記載する活性３−ＨＰ経路の１つ又は複数（例えば、２つ、いくつか）の異種ポリヌクレオチド（例えば、ＰＰＣをコードする異種ポリヌクレオチド；ＰＹＣをコードする異種ポリヌクレオチド；ＡＡＴをコードする異種ポリヌクレオチド；ＡＤＣをコードする異種ポリヌクレオチド；ＢＡＡＴ又はｇａｂＴをコードする異種ポリヌクレオチド；及び／又は３−ＨＰＤＨをコードする異種ポリヌクレオチド）を含み、ここで、酵母細胞は、同じ条件下で培養したとき、活性３−ＨＰ経路の１つ又は複数の異種ポリヌクレオチドを含まない宿主細胞と比較して、増大したレベルの３−ＨＰを分泌する（及び／又は分泌することができる）。ある実施形態では、酵母細胞は、同じ条件下で培養したとき、活性３−ＨＰ経路の１つ又は複数の異種ポリヌクレオチドのない宿主細胞と比較して、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、又は少なくとも５００％の増大したレベルの３−ＨＰを分泌する、及び／又は分泌することができる。好適な培養条件の例を以下に記載するが、これらは、本明細書に記載する教示に基づき、当業者には容易に明らかであろう。
【０１５４】
これらの態様のいずれかにおいて、組換え酵母細胞は、理論量の少なくとも１０％、例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の収率で、３−ＨＰを産生する（及び／又は産生することができる）。
【０１５５】
これらの態様のいずれかにおいて、組換え酵母細胞は、毎時約０．１ｇ／Ｌ超、例えば、毎時約０．２ｇ／Ｌ、毎時０．５ｇ／Ｌ、毎時０．６ｇ／Ｌ、毎時０．７ｇ／Ｌ、毎時０．８ｇ／Ｌ、毎時０．９ｇ／Ｌ、毎時１．０ｇ／Ｌ、毎時１．１ｇ／Ｌ、毎時１．２ｇ／Ｌ、毎時１．３ｇ／Ｌ、毎時１．５ｇ／Ｌ、毎時１．７５ｇ／Ｌ、毎時２．０ｇ／Ｌ、毎時２．２５ｇ／Ｌ、毎時２．５ｇ／Ｌ、又は毎時３．０ｇ／Ｌ超；あるいは、毎時約０．１ｇ／Ｌ〜毎時約２．０ｇ／Ｌ、例えば、毎時約０．３ｇ／Ｌ〜毎時約１．７ｇ／Ｌ、毎時約０．５ｇ／Ｌ〜毎時約１．５ｇ／Ｌ、毎時約０．７ｇ／Ｌ〜毎時約１．３ｇ／Ｌ、毎時約０．８ｇ／Ｌ〜毎時約１．２ｇ／Ｌ、又は毎時約０．９ｇ／Ｌ〜毎時約１．１ｇ／Ｌの３−ＨＰ容量生産率を有する。
【０１５６】
組換え酵母細胞は、当技術分野では公知の方法を用いて、活性３−ＨＰ経路の１つ又は複数のポリヌクレオチドの生産に好適な栄養培地中で培養することができる。例えば、細胞は、振盪フラスコ培養、並びに好適な培地において、かつ目的のポリペプチドを発現及び／又は単離することを可能にする条件下で実施される実験室又は工業用発酵タンク内での小規模又は大規模発酵（例えば、連続、バッチ、流加、若しくは固相発酵など）により培養することができる。培養は、本明細書に記載するように、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む好適な栄養培地中で、当技術分野では公知の手順を用いて実施する。好適な培地は、供給業者から入手可能であり、公開されている組成（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログにおいて）に従って調製してもよいし、あるいは、市販されている材料から調製してもよい。
【０１５７】
本明細書に記載する組換え酵母細胞はまた、３−ＨＰ生合成をさらに増大するために、例えば、理論上の最大増殖にほぼ等しい条件下などの、適応進化に付すこともできる。
【０１５８】
本明細書に記載する組換え酵母細胞はさらに、例えば、リパーゼ又はエステラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドの発現によって、リパーゼ又はエステラーゼ活性を含有し得る（ＥＣ  ３．１．１．−）。このような細胞を用いて、３−ヒドロキシプロピオン酸メチル、３−ヒドロキシプロピオン酸エチル、３−ヒドロキシプロピオン酸プロピル、３−ヒドロキシプロピオン酸ブチル、又は３−ヒドロキシプロピオン酸２−エチルヘキシルなどの３−ＨＰのエステルを生産することができる。細胞はさらに、例えば、エステラーゼをコードする異種ポリヌクレオチドの発現によって、エステラーゼ活性も含有し得る。このような細胞を用いて、重合３−ＨＰを生産することができる。細胞は、例えば、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、又はその両方をコードする異種ポリヌクレオチドの発現によって、アルコールデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ  １．１．１．１．）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ活性（ＥＣ  １．２．１．−）、又はその両方をさらに含有し得る。このような細胞を用いて、１，３−プロパンジオールを生産することができる。
【０１５９】
本明細書に記載する組換え酵母細胞は、制御配列と適合可能な条件下で、好適な酵母細胞において発現を指令する１つ又は複数の制御配列に連結した１つ又は複数（例えば、２つ、いくつか）の異種３−ＨＰ経路遺伝子のコード配列（例えば、本明細書に記載するＰＰＣ、ＰＹＣ、ＡＡＴ、ＡＤＣ、ＢＡＡＴ、ｇａｂＴ、及び／又は３−ＨＰＤＨのコード配列）を含む発現ベクターを使用してもよい。このような発現ベクターは、本明細書に記載する酵母細胞及び方法のいずれに用いてもよい。本明細書に記載するポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドの発現を達成するように様々な方法で操作してもよい。発現ベクターに応じて、ベクターへの挿入前のポリヌクレオチドの操作が望ましいか、又は必要な場合もある。組換えＤＮＡ方法を使用し、ポリヌクレオチドを改変する技術は、当技術分野において公知である。
【０１６０】
既述したように、１つ又は複数（例えば、２つ、いくつか）の異種３−ＨＰ経路遺伝子を含む構築物若しくはベクター（又は複数の構築物若しくはベクター）を酵母細胞に導入して、上記構築物若しくはベクターが、染色体インテグラント（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）として、又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるようにすることもできる。
【０１６１】
様々なヌクレオチド及び制御配列を一緒に結合して、当該部位でのポリヌクレオチドの挿入又は置換を可能にする１つ又は複数（例えば、２つ、いくつか）の好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターを作製することができる。あるいは、当該配列を含むポリヌクレオチド又は核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することにより、ポリヌクレオチドを発現させることもできる。発現ベクターを作出する際には、コード配列が、発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるように、コード配列をベクター中に配置する。
【０１６２】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ方法に好都合に供することができ、しかも、ポリヌクレオチドの発現をもたらすことができる任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であってよい。ベクターの選択は、一般に、ベクターと、ベクターが導入される宿主細胞との適合性に応じて変わり得る。ベクターは、線状又は閉環状プラスミドのいずれであってもよい。
【０１６３】
一態様では、異種ポリヌクレオチドの各々を独立のベクターに含有させる。一態様では、少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドを単一のベクターに含有させる。一態様では、少なくとも３つの異種ポリヌクレオチドを単一のベクターに含有させる。一態様では、少なくとも４つの異種ポリヌクレオチドを単一のベクターに含有させる。一態様では、全ての異種ポリヌクレオチドを単一のベクターに含有させる。タンパク質複合体のヘテロマーサブユニットをコードするポリヌクレオチドを単一のベクターの単一の異種ポリヌクレオチドに含有させるか、あるいは、個別のベクターの個別の異種ポリヌクレオチドに含有させてもよい。
【０１６４】
ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、その複製が、染色体複製とは独立している染色体外実体、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体として存在するベクターであってもよい。ベクターは、自己複製を確実にする任意の手段を含んでもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれて、それが組み込まれた染色体と一緒に複製されるものであってもよい。さらに、酵母細胞のゲノムに導入しようとする全ＤＮＡを一緒に含有する単一のベクター若しくはプラスミド又は２つ以上のベクター若しくはプラスミド、又はトランスポゾンを用いてもよい。
【０１６５】
発現ベクターは、本明細書に記載するＧＡＰＮ遺伝子又は任意の３−ＨＰ経路遺伝子の発現用の酵母細胞によって認識される任意の好適なプロモータ配列を含有してもよい。プロモータ配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモータは、突然変異型、末端切断型、及びハイブリッドプロモータを含む選択酵母細胞において転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってよく、細胞に対し相同性又は異種のいずれかである細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【０１６６】
本明細書に記載する異種ポリヌクレオチドの各々を、ポリヌクレオチドに対し外来であるプロモータに作動可能に連結することができる。例えば、一態様では、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチドに対し外来のプロモータに作動可能に連結する。別の態様では、本明細書に記載する３−ＨＰ経路のポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド（例えば、ＰＰＣ、ＰＹＣ、ＡＡＴ、ＡＤＣ、ＢＡＡＴ、ｇａｂＴ、又は３−ＨＰＤＨ）を、ポリヌクレオチドに対し外来のプロモータに作動可能に連結する。プロモータは、選択されたネイティブプロモータと同一であるか、又はこれと高度（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％）の配列同一性を有し得る。
【０１６７】
酵母細胞における核酸構築物の転写を指令するのに好適なプロモータの例として、限定はしないが、以下：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ１、ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）メタロチオネイン（ＣＵＰ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ＰＤＣ１、キシロースレダクターゼ（ＸＲ）、キシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）、Ｌ−（＋）−乳酸−シトクロムｃオキシドレダクターゼ（ＣＹＢ２）、翻訳伸長因子１（ＴＥＦ１）、翻訳伸長因子２（ＴＥＦ２）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の遺伝子、及びオロチジン５’−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＵＲＡ３）遺伝子が挙げられる。酵母宿主細胞に有用な他のプロモータは、Ｒｏｍａｎｏｓらにより１９９２，Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８に記載されている。
【０１６８】
制御配列は、好適な転写ターミネータ配列であってもよく、これは、宿主細胞により認識されて、転写を終結する。ターミネータ配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結される。選択酵母細胞において機能性である任意のターミネータを用いてよい。ターミネータは、選択されたネイティブターミネータと同一であるか、又はこれと高度（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％）の配列同一性を有するものでもよい。特定の実施形態では、３−ＨＰ経路遺伝子は、宿主細胞に固有のネイティブＧＡＬ１０遺伝子の機能性部分、又はネイティブＧＡＬ１０ターミネータと、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有する配列を含むターミネータに連結される。
【０１６９】
酵母宿主細胞に好適なターミネータは、以下：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）シトクロムＣ（ＣＹＣ１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄ）、ＰＤＣ１、ＸＲ、ＸＤＨ、トランスアルドラーゼ（ＴＡＬ）、トランスケトラーゼ（ＴＫＬ）、リボース５−リン酸ケトール−イソメラーゼ（ＲＫＩ）、ＣＹＢ２の遺伝子、及びガラクトースファミリーの遺伝子（特に、ＧＡＬ１０ターミネータ）から得られる。酵母宿主細胞に有用な他のターミネータは、Ｒｏｍａｎｏｓらにより（１９９２年前掲）記載されている。
【０１７０】
制御配列はまた、好適な転写リーダ配列であってもよく、これは、転写されると、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である。リーダ配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’−末端に作動可能に連結される。選択酵母細胞において機能性である任意のリーダ配列を使用してよい。
【０１７１】
酵母宿主細胞に好適なリーダは、以下：サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）エノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子、及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）アルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１７２】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列；ポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結された配列であってもよく、これは、転写されると、宿主細胞によって、転写ｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして認識される。選択酵母細胞において機能性である任意のポリアデニル化配列を使用してよい。酵母細胞に有用なポリアデニル化配列は、Ｇｕｏ及びＳｈｅｒｍａｎにより、１９９５年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌ．１５：５９８３−５９９０に記載されている。
【０１７３】
さらに、宿主細胞の増殖に関するポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することが望ましい場合もある。調節系の例として、調節化合物の存在などの化学的又は物理的刺激に応答して、遺伝子の発現をオン又はオフに切り換えるものがある。原核系統の場合の調節系としては、ｌａｃ、ｔａｃ、及びｔｒｐオペレータ系が挙げられる。酵母の場合、ＡＤＨ２系又はＧＡＬ１系を用いてよい。調節配列の他の例として、遺伝子増幅を可能にするものがある。真核系統の場合、これらの調節配列としては、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、並びに、重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調節配列と作動可能に連結させる。
【０１７４】
ベクターは、形質転換、トランスフェクト、形質導入した細胞などの容易な選択を可能にする１つ又は複数（例えば、２つ、いくつか）の選択マーカを含有してもよい。選択マーカは、その産物が、殺生作用又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養能などを付与する遺伝子である。酵母宿主細胞に好適なマーカとしては、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、及びＵＲＡ３が挙げられる。
【０１７５】
ベクターは、宿主細胞ゲノムへのベクターの組込み、又はゲノムとは独立した細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする１つ又は複数（例えば、２つ、いくつか）のエレメントを含有していてもよい。
【０１７６】
宿主細胞ゲノムへの組込みの場合、ベクターは、相同若しくは非相同組換えによるゲノムへの組込みのために、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列、又はベクターのいずれか他のエレメントに依存し得る。あるいは、ベクターは、染色体における厳密な位置で、宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組込みを指令するための別のポリヌクレオチドを含有してもよい。厳密な位置での組込みの可能性を高めるために、組込みエレメントは、十分な数の核酸、例えば、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対、及び８００〜１０，０００塩基対を含有すべきであり、これは、相同組換えの確率を高めるために、対応する標的配列に対し高度の配列同一性を有する。組込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同性である任意の配列であってよい。さらに、組込みエレメントは、非コード又はコードポリヌクレオチドのいずれであってもよい。これに対し、ベクターは、非相同組換えによる宿主細胞のゲノムに組み込むことができる。
【０１７７】
自律的複製のために、ベクターは、酵母細胞においてベクターが自律的に複製することを可能にする複製起点をさらに含んでもよい。複製起点は、１細胞中で機能する、自律的複製を媒介する任意のプラスミドレプリケータであってもよい。用語「複製起点」又は「プラスミドレプリケータ」は、プラスミド又はベクターがｉｎ  ｖｉｖｏで複製することを可能にするポリヌクレオチドを意味する。酵母宿主細胞で用いるための複製起点の例として、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ６の組み合わせ、及びＡＲＳ４とＣＥＮ３の組み合わせがある。
【０１７８】
本明細書に記載するポリヌクレオチドの２個以上のコピーを宿主細胞に挿入して、ポリヌクレオチドの生産を増大することもできる。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、配列の少なくとも１個の追加コピーを酵母細胞ゲノムに組み込むことにより、又はポリヌクレオチドを含む増幅可能な選択マーカを含有させることにより達成することができ、この場合、適切な選択因子の存在下で、細胞を培養することにより、選択マーカ遺伝子の増幅されたコピー、ひいてはポリヌクレオチドの追加コピーを含む細胞を選択することができる。
【０１７９】
本明細書に記載する組換え発現ベクターを構築するために前述のエレメントを連結するのに用いられる方法は、当業者には周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、前掲を参照）。
【０１８０】
１つ又は複数の３−ＨＰ経路遺伝子を含む酵母細胞の調製については、米国特許出願公開第２０１２／０１３５４８１号明細書に記載されており、その内容は、参照により本明細書に組み込むものとする。
【０１８１】
遺伝子破壊
組換え酵母細胞は、例えば、糖代謝を不要の産物から３−ＨＰに転換するために、１つ又は複数（例えば、２つ、いくつか）の遺伝子破壊も含んでもよい。ある態様では、組換え宿主細胞は、同一の条件下で培養するとき、１つ又は複数の破壊を含まない細胞と比較して、より多くの量の３−ＨＰを産生する。ある態様では、破壊された内在性遺伝子の１つ又は複数は、不活性化される。
【０１８２】
特定の実施形態では、本明細書に記載する組換え酵母細胞は、例えば、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ＰＤＣ、ピルビン酸塩をアセトアルデヒドに変換する）、及び／又はアルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ、アセトアルデヒドをエタノールに変換する）遺伝子など、エタノール発酵に関与する酵素をコードする１つ又は複数の内在性遺伝子の破壊を含む。これらの改変は、エタノールを産生する酵母細胞の能力を低減し、それによって、３−ＨＰ産生を最大化する。しかし、特定の実施形態では、本明細書に記載する組換え酵母細胞は、３−ＨＰとエタノールを同時産生するように設計してもよい。そのような実施形態において、エタノール発酵に関与する酵素をコードする内在性遺伝子は、好ましくは破壊されず、また特定の実施形態では、酵母細胞は、エタノール産生を増大する１つ又は複数の異種遺伝子を含んでもよい。
【０１８３】
ある実施形態では、組換え酵母細胞は、配列番号１８６と、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するＰＤＣをコードする内在性遺伝子に対する破壊を含む。ある実施形態では、内在性遺伝子は、配列番号１８６を含むか、又は配列番号１８６からなるアミノ酸配列を有するＰＤＣをコードする。ある実施形態では、ＰＤＣをコードする内在性遺伝子のコード配列は、配列番号１８５と、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。ある実施形態では、ＰＤＣをコードする内在性遺伝子のコード配列は、配列番号１８５を含むか、又は配列番号１８５からなる。ある実施形態では、ＰＤＣをコードする内在性遺伝子は、不活性化されている。
【０１８４】
特定の実施形態では、本明細書に記載する組換え酵母細胞は、例えば、グリセロール、又は、例えば、酢酸塩若しくはジオールのような他の副産物などの別の発酵産物を産生するのに関与する酵素をコードする１つ又は複数の内在性遺伝子の破壊を含む。例えば、本明細書に記載する細胞は、グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ、ジヒドロキシアセトンリン酸からグリセロール３−リン酸への反応を触媒する）、グリセロール３−ホスファターゼ（ＧＰＰ、グリセロール−３リン酸からグリセロールへの変換を触媒する）、グリセロールキナーゼ（グリセロール３−リン酸からグリセロールへの変換を触媒する）、ジヒドロキシアセトンキナーゼ（ジヒドロキシアセトンリン酸からジヒドロキシアセトンへの変換を触媒する）、グリセロールデヒドロゲナーゼ（ジヒドロキシアセトンからグリセロールへの変換を触媒する）、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＡＬＤ、例えば、アセトアルデヒドを酢酸塩又は３−ＨＰを３−ＨＰＡに変換する）、又はブタンジオールデヒドロゲナーゼ（ブタンジオールからアセトインへの変換又はその逆を触媒する）遺伝子のうちの１つ又は複数の破壊を含み得る。
【０１８５】
ある実施形態では、組換え酵母細胞は、配列番号１８８と、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するＧＰＤをコードする内在性遺伝子に対する破壊を含む。ある実施形態では、内在性遺伝子は、配列番号１８８を含むか、又は配列番号１８８からなるアミノ酸配列を有するＧＰＤをコードする。ある実施形態では、ＧＰＤをコードする内在性遺伝子のコード配列は、配列番号１８７と、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。ある実施形態では、ＧＰＤをコードする内在性遺伝子のコード配列は、配列番号１８７を含むか、又は配列番号１８７からなる。ある実施形態では、ＧＰＤをコードする内在性遺伝子は、不活性化されている。
【０１８６】
特定の実施形態では、本明細書に記載する組換え酵母細胞は、例えば、ＰＥＰカルボキシキナーゼ（ＰＣＫ）、ＯＡＡデカルボキシラーゼ活性を有する酵素、又はＣＹＢ２Ａ若しくはＣＹＢ２Ｂ（乳酸塩からピルビン酸塩への変換を触媒する）など、３−ＨＰ経路において逆反応を触媒する酵素をコードする１つ又は複数の内在性遺伝子の破壊を含む。ＰＣＫは、ＰＥＰからＯＡＡへの変換又はその逆を触媒するが、ＯＡＡからＰＥＰへの反応の優先を示す。ＯＡＡからＰＥＰへの変換を低減するために、ネイティブＰＣＫ遺伝子の１つ又は複数のコピーを破壊してもよい。特定の実施形態において、１つ又は複数のネイティブＰＣＫ遺伝子が破壊されている酵母細胞は、ＰＥＰからＯＡＡへの変換を優先するポリペプチドをコードするように突然変異させた１つ又は複数の異種ＰＣＫ遺伝子を発現し得る。ＯＡＡデカルボキシラーゼは、ＯＡＡからピルビン酸塩への変換を触媒する。ＯＡＡデカルボキシラーゼ活性を有する酵素がみいだされており、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でｅｄａ遺伝子によりコードされるもの、並びに酵母及び真菌中のリンゴ酸酵素（ＭＡＥ）などがある。ＯＡＡデカルボキシラーゼ活性を低減するために、ＯＡＡデカルボキシラーゼ活性を有する酵素をコードするネイティブ遺伝子の１つ又は複数のコピーを破壊してもよい。特定の実施形態において、１つ又は複数のネイティブＯＡＡ脱炭酸遺伝子が破壊されている酵母細胞は、ピルビン酸塩からＯＡＡへの変換を触媒するポリペプチドをコードするように突然変異させた１つ又は複数の異種ＯＡＡ脱炭酸遺伝子を発現し得る。
【０１８７】
特定の実施形態では、本明細書に記載する組換え酵母細胞は、３−ＨＰ経路産物又は中間体との望ましくない反応に関与する酵素をコードする１つ又は複数の内在性遺伝子の破壊を含む。このような遺伝子の例としては、３−ＨＰを３−ＨＰのアルデヒドに変換する酵素をコードするものが挙げられ、これは、特定の細胞に毒性であることがわかっている。
【０１８８】
特定の実施形態では、本明細書に記載する組換え酵母細胞は、例えば、ＧＡＬ６（ガラクトースをグルコースに変換するＧＡＬシステムの負の調節因子）など、３−ＨＰ経路に中立的効果を有する酵素をコードする１つ又は複数の内在性遺伝子の破壊を含む。中立遺伝子の破壊は、ネイティブ経路に影響することなく、１つ又は複数の異種遺伝子の挿入を可能にする。
【０１８９】
モデリングを用いて、経路の利用をさらに最適化する遺伝子破壊を設計することもできる（例えば、米国特許出願公開第２００２／００１２９３９号明細書、米国特許出願公開第２００３／０２２４３６３号明細書、米国特許出願公開第２００４／００２９１４９号明細書、米国特許出願公開第２００４／００７２７２３号明細書、米国特許出願公開第２００３／００５９７９２号明細書、米国特許出願公開第２００２／０１６８６５４号明細書及び米国特許出願公開第２００４／０００９４６６号明細書、並びに米国特許第７，１２７，３７９号明細書を参照のこと）。モデリング解析により、代謝をより効率的な３−ＨＰの産生にシフトする、細胞増殖への効果の信頼できる予測を可能にする。目的生成物の生合成を促進する代謝改変をみいだして、設計するための１つの例示的計算方法は、ＯｐｔＫｎｏｃｋ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ，Ｂｕｒｇａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８４：６４７−６５７（２００３）である。
【０１９０】
遺伝子破壊を含む組換え酵母細胞は、本明細書に記載の方法など、当技術分野において公知の方法を用いて構築することができる。コード領域又はコード領域の発現に必要な制御配列などの遺伝子の一部を破壊することができる。こうした遺伝子の制御配列は、プロモータ配列又はその機能性部分、すなわち、遺伝子の発現に影響を与えるのに十分な部分であってよい。例えば、プロモータ配列を不活性化して、発現が起こらないようにすることもできるし、又はネイティブプロモータ配列をより弱いプロモータで置換して、コード配列の発現を低減することもできる。考えられる改変のための他の制御配列としては、限定しないが、リーダ、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネータ、及び転写アクチベータが挙げられる。
【０１９１】
遺伝子破壊を含む組換え酵母細胞は、当該遺伝子の発現を排除又は低減する遺伝子欠失技術により構築することもできる。遺伝子欠失技術は、当該遺伝子の部分的若しくは完全な除去により、その発現を排除することを可能にする。このような方法において、遺伝子の欠失は、この遺伝子とフランキングする５’及び３’領域を隣接して含むように構築されたプラスミドを用いる相同組換えにより達成する。
【０１９２】
また、遺伝子破壊を含む組換え酵素細胞は、当該遺伝子の１つ又は複数（いくつか）のヌクレオチド又はその転写若しくは翻訳に必要な制御配列を導入、置換、及び／又は除去することにより、構築することもできる。例えば、停止コドンの導入、開始コドンの除去、又はオープンリーディングフレームのフレームシフトのために、ヌクレオチドを挿入又は除去することができる。このような改変は、当技術分野において公知の部位指定突然変異誘発又はＰＣＲによる突然変異誘発により達成することができる。例えば、以下を参照されたい：Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８５，２２９，４７１９；Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８５，８１，２２８５；Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １９８８，１６，７３５１；Ｓｈｉｍａｄａ，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９６，５７，１５７；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９８９，７７，６１；Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １９８９，７７，６１；Ｓａｒｋａｒ  ａｎｄ  Ｓｏｍｍｅｒ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １９９０，８，４０４。
【０１９３】
遺伝子破壊を含む組換え酵素細胞は、当該遺伝子と相同性の核酸断片を含む破壊的核酸構築物をこの遺伝子に挿入し、これにより、相同性の領域の重複を形成し、構築物ＤＮＡを重複領域の間に組み込むことよって構築することもできる。このような遺伝子破壊は、挿入された構築物が、コード領域から遺伝子のプロモータを分離するか、又はコード配列を分断することにより、非機能性遺伝子産物が生じるようにすれば、遺伝子発現を排除することができる。破壊構築物は、単純に、当該遺伝子と相同性の５’及び３’領域を伴う選択マーカであってもよい。選択マーカは、破壊された遺伝子を含む形質転換体の同定を可能にする。
【０１９４】
また、遺伝子破壊を含む組換え酵素細胞は、遺伝子変換の方法によって構築することもできる（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｕｔｎｅｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １９８３，１８９，７３−７６を参照）。例えば、遺伝子変換方法では、遺伝子に対応するヌクレオチド配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏで突然変異させることにより、欠陥ヌクレオチド配列を産生させ、次にこれを組換え株に形質転換して、欠陥遺伝子を産生させる。相同組換えにより、欠陥ヌクレオチド配列で内在性遺伝子を置換する。欠陥ヌクレオチド配列はまた、欠陥遺伝子を含有する形質転換体の選択のためのマーカも含むことが望ましい。
【０１９５】
遺伝子破壊を含む組換え酵素細胞は、さらに、当技術分野では公知の方法を用いて、ランダム又は特異的突然変異誘発によっても構築することができ、このような方法として、限定しないが、化学的突然変異誘発がある（例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄ，Ｔｈｅ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｒ．Ｎｏｒｒｉｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｒｉｂｂｏｎｓ，ｅｄｓ．）ｐｐ．３６３−４３３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７０を参照）。遺伝子の改変は、親株を突然変異誘発に付し、遺伝子の発現が低減又は不活性化された突然変異株をスクリーニングすることにより実施することができる。突然変異誘発は、特異的又はランダムのいずれでもよく、例えば、好適な物理的若しくは化学的突然変異誘発因子の使用、好適なオリゴヌクレオチドの使用、又はＰＣＲによる突然変異誘発にＤＮＡ配列を供することにより、実施することができる。さらには、突然変異誘発は、これらの突然変異誘発方法の任意の組み合わせの使用によって実施することもできる。
【０１９６】
本発明の目的に好適な物理的若しくは化学的突然変異誘発因子の例としては、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、メタンスルホン酸エチル（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、ギ酸、及びヌクレオチド類似体が挙げられる。このような因子を使用する場合、突然変異誘発は、典型的に、突然変異誘発させようとする親株を、好適な条件下、選択した突然変異誘発因子の存在下でインキュベートし、遺伝子の発現低減を示すか、又は発現を全く示さない突然変異体を選択することにより実施する。
【０１９７】
本明細書に記載する遺伝子と相同的又は相補的なヌクレオチド配列を他の細菌起源から用いて、選択した組換え株における対応遺伝子を破壊することができる。
【０１９８】
一態様では、組換え酵母細胞中の遺伝子の改変は、選択マーカでマークされていない。選択マーカ遺伝子の除去は、対抗選択培地で突然変異体を培養することにより、達成することができる。選択マーカ遺伝子がその５’及び３’末端にフランキングする反復配列を含む場合、これらの反復配列は、突然変異株を対抗選択に付すとき、相同組換えによる選択マーカ遺伝子のループアウトを容易にする。また、選択マーカ遺伝子は、欠陥遺伝子の５’及び３’領域を含むが、選択マーカ遺伝子が欠失した核酸断片を突然変異株に導入した後、対抗選択培地で選択することにより、除去することもできる。相同組換えにより、選択マーカ遺伝子を含有する欠陥遺伝子を、選択マーカ遺伝子が欠失した核酸断片で置換する。当技術分野で公知の他の方法を用いてもよい。
【０１９９】
３−ＨＰ及び関連化合物を生産する方法
本明細書に記載する組換え酵母細胞は、３−ＨＰの生産のために使用することができる。一態様では、３−ＨＰを生産する方法であって、（ａ）３−ＨＰを生産するのに好適な条件下の培地において本明細書に記載する組換え酵母細胞（例えば、活性３−ＨＰ経路と、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドとを含む組換え酵母細胞）のいずれか１つを培養するステップ；及び（ｂ）３−ＨＰを回収するステップを含む方法が提供される。
【０２００】
活性３−ＨＰ経路を含む組換え酵母細胞は、当技術分野では公知の方法を用いて、３−ＨＰ生産に好適な栄養培地中で培養することができる。例えば、振盪フラスコ培養、並びに３−ＨＰ生産を可能にする条件下、好適な発酵培地中で実施される実験室又は工業用発酵タンク内での小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、流加、若しくは固相発酵）により、細胞を培養することができる。
【０２０１】
組換え酵母細胞は、グルコース、フルクトース、スクロース、セロビオース、キシロース、キシルロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、及び／又は可溶性オリゴ糖などの１種又は複数の（例えば、２種、いくつかの）糖を含む発酵性培地中で３−ＨＰを産生することができる。炭素源は、例えば、スクロースなどの十二炭素糖、例えば、グルコース若しくはフルクトースなどのヘキソース糖、グリカン又は他のグルコースのポリマー、例えば、マルトース、マルトトリオース及びイソマルトトリオースなどのグルコースオリゴマー、パノース、並びにフルクトースオリゴマーであってよい。五炭糖を発酵させる能力を付与するように細胞を改変する場合、発酵培地は、例えば、キシロース、キシラン若しくはキシロースのその他のオリゴマー、及び／又はアラビノースなどの五炭糖を含み得る。このような五炭糖は、好適には、ヘミセルロース含有バイオマスの加水分解物である。ある実施形態では、細胞は、五炭糖を発酵させることができず、及び／又は発酵性培地は、１％未満の五炭糖を含む。場合によっては、発酵性培地は、サトウキビ、デンプン、若しくはセルロースなどの天然源から得られ、酵素的加水分解（糖化）により原料を前処理して得られたものでよい。ある態様では、発酵性培地は、サトウキビ糖汁を含む。好適な培地は、供給業者から入手可能であり、公開されている組成（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログにおいて）に従って調製してもよいし、あるいは、市販されている材料から調製してもよい。
【０２０２】
１種又は複数の（例えば、２種、いくつかの）糖からの適切な炭素源以外に、発酵性培地は、多量栄養素（例えば、窒素源）及び微量栄養素（例えば、ビタミン、無機塩、及び金属補因子）など、当業者には周知の他の栄養素又は刺激因子を含有してもよい。ある態様では、炭素源は、優先的に、酵母抽出液、Ｎ2、ペプトン（例えば、Ｂａｃｔｏ（商標）Ｐｅｐｔｏｎｅ）、又はソイトン（例えば、Ｂａｃｔｏ（商標）Ｓｏｙｔｏｎｅ）などの少なくとも１種の窒素源を補充することができる。ビタミンの非制限的例として、マルチビタミン、ビオチン、パントテン酸塩、ニコチン酸、メソ−イノシトール、チアミン、ピリドキシン、パラ−アミノ安息香酸、葉酸、リボフラビン、及びビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥが挙げられる。無機塩及び金属補因子の例としては、限定しないが、Ｎａ、Ｐ、Ｋ、Ｍｇ、Ｓ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｃｏ、及びＣｕが挙げられる。
【０２０３】
ある実施形態では、本明細書の組換え酵母細胞は、化学的に定義された培地中で培養することができる。一例において、培地は、約５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウム、約３ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウム、約０．５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム、微量元素、及びビタミン、並びに約１５０ｇ／Ｌのグルコースを含有する。ｐＨは、培養中、自由に変動させてもよいし、ｐＨが所定のレベルより下がるか若しくはそれを超えるのを防ぐために、必要であれば緩衝してもよい。特定の実施形態において、発酵培地には、約１．０のＯＤ600を生じるのに十分な（評価の対象である）酵母細胞を接種する。別途明瞭に注記されていない限り、本明細書で使用されるＯＤ600は、モデルＤＵ６００分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて１ｃｍの路程で６００ｎｍの波長にて計測された光学密度を指す。
【０２０４】
３−ＨＰ生産の方法に用いられる具体的条件は、本明細書の教示に照らして当業者が決定することができる。本方法のある態様では、酵母細胞を約１２時間〜約２１６時間、例えば、約２４時間〜約１４４時間、又は約３６時間〜９６時間培養する。温度は、典型的に、約２６℃〜約６０℃、例えば、約３４℃〜約５０℃である。
【０２０５】
培養は、必要に応じて、嫌気的、実質的に嫌気的（微好気的）、又は好気的条件下で実施することができる。手短には、嫌気的条件は、酸素のない環境を指し、実質的に嫌気的（微好気的）条件は、酸素濃度が空気より低い環境を指し、好気的条件は、酸素濃度が空気とほぼ等しいか、それより高い環境を指す。実質的に嫌気的条件としては、例えば、培地中の溶存酸素濃度が、飽和の１０％未満を維持するような培養、バッチ発酵又は連続発酵が挙げられる。実質的に嫌気的条件には、酸素１％未満の雰囲気を維持する密封チャンバー内の液体培地中若しくは固体寒天上での細胞の増殖又は休眠も含まれる。酸素の割合は、例えば、培地にＮ2／ＣＯ2混合物又は他の好適な１種又は複数の非酸素ガスを注入することによって維持することができる。ある実施形態では、培養は、嫌気的条件又は実質的に嫌気的条件下で実施する。
【０２０６】
一例では、発酵培地中の細胞の濃度は、典型的に、産生期の間、発酵培地１リットル当たり約０．１〜２０、好ましくは約０．１〜５、さらに好ましくは１〜３ｇの乾燥細胞の範囲である。必要であれば、酸素摂取速度（ＯＵＲ）は、工程管理として、発酵全体を通して変更することができる（例えば、国際公開第０３／１０２２００号パンフレットを参照）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載する組換え酵母細胞は、２〜４５ｍモル／Ｌ／時、例えば、２〜２５、２〜２０、２〜１５、２〜１０、１０〜４５、１５〜４０、２０〜３５、又は２５〜３５ｍモル／Ｌ／時の酸素摂取速度を特徴とする微好気性条件下で培養する。特定の実施形態では、本明細書に記載する酵母細胞は、２〜２５ｍモル／Ｌ／時の酸素摂取速度を特徴とする微好気性条件下で培養するとき、特に良好に機能し得る。培地は、産生期の間、ｐＨが約３．０〜約７．０、又は約４．０〜約６．０の範囲内に維持されるように緩衝してもよい。好適な緩衝剤は、それが形成される際に酸を中和する塩基性物質であり、例えば、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸アンモニウム、アンモニア、水酸化アンモニウムなどが挙げられる。一般に、従来の発酵工程で使用されている緩衝剤もまた、この場合好適である。
【０２０７】
緩衝した発酵を使用する実施形態において、酸性発酵産物は、それらが形成される際、対応する塩へと中和される。これらの実施形態において、酸の回収は、遊離酸の再生を伴う。これは、細胞を除去し、例えば、硫酸などの強酸で発酵ブロスを酸性化することによって行うことができる。これは、塩副産物の形成をもたらす。例えば、カルシウム塩を中和剤として使用し、硫酸を酸性化剤として使用する場合、塩副産物として石膏が生成される。この副産物をブロスから分離した後、例えば液体−液体抽出、蒸留、吸収などの技術を用いて、酸を回収する（例えば、Ｔ．Ｂ．Ｖｉｃｋｒｏｙ，Ｖｏｌ．３，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３８  ｏｆ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（ｅｄ．Ｍ．Ｍｏｏ−Ｙｏｕｎｇ)，Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５；Ｒ．Ｄａｔｔａ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，１９９５，１６：２２１−２３１；米国特許第４，２７５，２３４号明細書、米国特許第４，７７１，００１号明細書、米国特許第５，１３２，４５６号明細書、米国特許第５，４２０，３０４号明細書、米国特許第５，５１０，５２６号明細書、米国特許第５，６４１，４０６号明細書、及び米国特許第５，８３１、１２２号明細書、並びに国際公開第９３／００４４０号パンフレットを参照のこと）。
【０２０８】
別の実施形態では、発酵培地のｐＨは、培養中、開始ｐＨ、すなわち、３−ＨＰのｐＫａ以上、典型的には４．５以上から、酸性発酵産物のｐＫａ以下、例えば、４．５若しくは４．０未満、例えば、約１．５〜約４．５の範囲内、約２．０〜約４．０の範囲内、又は約２．０〜約３．５の範囲内で降下させてもよい。
【０２０９】
さらに別の実施形態では、発酵工程の開始前又は開始時に産物の酸のｐＫａ以下に発酵ブロスのｐＨを調節することによって、発酵を実施して、産物の酸を生産することができる。ｐＨはその後、培養全体を通して産物の酸のｐＫａ以下に維持してよい。特定の実施形態において、ｐＨは、４．５又は４．０未満、例えば、約１．５〜約４．５の範囲内、約２．０〜約４．０の範囲内、又は約２．０〜約３．５の範囲内に維持してよい。
【０２１０】
本明細書に記載する方法は、任意の好適な発酵操作方式を使用することができる。例えば、バッチ式発酵は、発酵の開始時に設定された培地及び組換え酵母が、特定の試薬、例えば、ｐＨ制御剤、消泡剤又は工程維持に必要なその他の薬剤を除いて、それ以上の投入を加えない閉鎖系で使用することができる。本明細書に記載する方法はまた、前述したように、流加又は連続方式で使用することも可能である。
【０２１１】
本明細書に記載する方法は、複数のバイオリアクター構成、例えば、撹拌タンク、気泡塔、エアリフト反応器、及び当業者には周知の他の構成で実施することができる。本方法は、必要に応じて、無細胞培養又は固定化細胞培養で実施してもよい。固定化細胞培養には任意の材料支持体を用いてよく、このような材料として、例えば、アルギン酸塩、繊維層、又はクリソタイル、モンモリロナイトＫＳＦ及びモンモリロナイトＫ−１０などのアーガイル材料などがある。
【０２１２】
本方法の一態様では、３−ＨＰは、約５ｇ／Ｌ超、例えば、１０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、１６０ｇ／Ｌ、１７０ｇ／Ｌ、１８０ｇ／Ｌ、１９０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、２１０ｇ／Ｌ、２２５ｇ／Ｌ、２５０ｇ／Ｌ、２７５ｇ／Ｌ、３００ｇ／Ｌ、３２５ｇ／Ｌ、３５０ｇ／Ｌ、４００ｇ／Ｌ、若しくは５００ｇ／Ｌ超；又は約１０ｇ／Ｌ〜約５００ｇ／Ｌ、例えば、約５０ｇ／Ｌ〜約３５０ｇ／Ｌ、約１００ｇ／Ｌ〜約３００ｇ／Ｌ、約１５０ｇ／Ｌ〜約２５０ｇ／Ｌ、約１７５ｇ／Ｌ〜約２２５ｇ／Ｌ、若しくは、約１９０ｇ／Ｌ〜約２１０ｇ／Ｌの力価で生産される。一態様では、３−ＨＰは、炭水化物グラム当たり約０．０１グラム超、例えば、炭水化物グラム当たり約０．０２、０．０５、０．７５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１．０グラム超の力価で生産される。
【０２１３】
本方法の一態様では、生産される３−ＨＰの量は、同じ条件下で培養したとき、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドを含まない組換え酵母細胞を培養するのと比較して、少なくとも５％、例えば、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも５０％、又は少なくとも１００％多い。
【０２１４】
本明細書に記載する方法の特定の実施形態では、組換え酵母細胞は、比較的低レベルのエタノールを産生する。特定の実施形態において、エタノールは、１０％以下の収率、好ましくは２％以下の収率で産生され得る。これらの実施形態のいくつかでは、エタノールは検出可能なほど生産されない。しかし、別の実施形態では、３−ＨＰ及びエタノールは、同時に産生され得る。これらの実施形態において、エタノールは、１０％超、２５％超、又は５０％超の収率で生産され得る。
【０２１５】
３−ＨＰは、任意選択で、当技術分野では公知の任意の方法を用いて、発酵培地から回収することができ、このような方法として、限定はしないが、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー）、電気泳動法、溶解度差、浸透、蒸留、抽出（例えば、液体−液体抽出）、浸透蒸発、抽出濾過、膜濾過、膜分離、リバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）、又は限外濾過などが挙げられる。一態様では、他の発酵材料から３−ＨＰを分離し、従来の蒸留方法により精製する。従って、一態様では、本方法は、回収された３−ＨＰを蒸留により精製するステップをさらに含む。
【０２１６】
組換え３−ＨＰはまた、前述した方法（例えば、クロマトグラフィー、電気泳動法、溶解度差、蒸留、又は抽出）を用いて、３−ＨＰからさらに容易に取り出した産物への不純物（混入物）の化学変換により、及び／又は不純物から３−ＨＰへの直接化学変換によって精製することもできる。例えば、一態様では、本方法はさらに、当技術分野では公知の化学的技術を用いて、β−アラニン混入物を３−ＨＰに変換することにより、回収した３−ＨＰを精製するステップも含む。
【０２１７】
本方法のある態様では、任意選択で精製される前及び／又は後の組換え３−ＨＰ調製物は、実質的に純粋である。３−ＨＰを生産する方法に関して、「実質的に純粋な」は、１５％以下の不純物を含有する回収調製物を意味し、ここで、不純物とは、３−ＨＰ以外の化合物を意味する。一変形では、２５％以下の不純物、又は２０％以下の不純物、又は１０％以下の不純物、又は５％以下の不純物、又は３％以下の不純物、又は１％以下の不純物、又は０．５％以下の不純物を含有する、実質的に純粋な調製物が提供される。
【０２１８】
β−アラニン中間体を経由する３−ＨＰ経路は、β−アラニン生産に応用できる（例えば、β−アラニンをマロン酸セミアルデヒドに変換する下流遺伝子が破壊されている場合；図１を参照）ことが理解される。この場合、組換え酵母細胞は、３−ＨＰの代わりにβ−アラニンを産生するか、又はβ−アラニンと３−ＨＰの混合物を産生する。さらに、必要であれば、本明細書に記載の組換え酵母細胞により発現されるβ−アラニンは、前述したように、当技術分野では公知の方法により３−ＨＰに化学的に変換することができる。
【０２１９】
本明細書に開示する方法を用いて生産される３−ＨＰは、他の有機化合物に化学的に変換することができる。例えば、３−ＨＰに水素添加して、貴重なポリエステルモノマーである１，３プロパンジオールを形成することができる。プロパンジオールはまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでオキシドレダクターゼ活性を有するポリペプチドを用いて３−ＨＰから作出することができる。３−ＨＰなどの有機酸の水素添加は、コハク酸及び／又は乳酸への水素添加に用いられるものなど、任意の方法を用いて実施することができる。例えば、金属触媒を用いて、３−ＨＰを水素添加することができる。
【０２２０】
本明細書に記載する方法のいずれかにより生産される３−ＨＰは、アクリル酸に変換することもできる。アクリル酸は、当技術分野では公知の技術、例えば、触媒（チタニア又はアルミナなどの固体酸化物脱水触媒）の存在下での加熱を用いた３−ＨＰの化学的脱水により生成することができる。
【０２２１】
一態様では、アクリル酸又はその塩を生産する方法であって、（ａ）３−ＨＰを生産するのに好適な条件下の培地において本明細書に記載する組換え酵母細胞（例えば、活性３−ＨＰ経路と、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドとを含む組換え酵母細胞）を培養するステップ；（ｂ）３−ＨＰを回収するステップ；（ｃ）アクリル酸又はその塩を生産するのに好適な条件下で３−ＨＰを脱水させるステップ；及び（ｄ）アクリル酸又はその塩を回収するステップを含む方法が提供される。
【０２２２】
本明細書に記載する生産方法及び酵母細胞に関して、３−ＨＰ及びアクリル酸の生産を試験するための好適なアッセイを、当技術分野では公知の方法を用いて実施することができる。例えば、最終３−ＨＰ産物及び中間体（例えば、β−アラニン）、並びにその他の有機化合物は、ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）、ＧＣ−ＭＳ（ガスクロマトグラフィー質量分析）及びＬＣ−ＭＳ（液体クロマトグラフィー−質量分析）などの方法、又は当技術分野では公知の常法を用いるその他の好適な分析方法により、分析することができる。また、発酵ブロス中の３−ＨＰの放出も、培養物上清を用いて試験することができる。発酵培地中の副産物及び残留糖（例えば、グルコース）は、例えば、グルコース及びアルコールの場合は屈折率検出器、及び有機酸の場合はＵＶ検出器を用いて（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．９０：７７５−７７９（２００５））、又は当技術分野において公知であるその他の好適なアッセイ及び検出方法を用いて、ＨＰＬＣにより定量することができる。
【０２２３】
以下の実施例は例示のために記載するものであり、本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０２２４】
緩衝液及び基質として用いられる化学薬品は、少なくとも試薬グレードの市販の製品である。
【０２２５】
培地及び溶液
ＴＥは、１０ｍＭのＴｒｉｓ塩基及び１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０から構成された。
【０２２６】
２×ＹＴ＋ａｍｐプレートは、１６ｇ／Ｌのトリプトン、１０ｇ／Ｌの酵母抽出液、５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１００ｍｇ／Ｌのアンピシリン、及び１５ｇ／ＬのＢａｃｔｏ寒天から構成された。
【０２２７】
ｕｒａ選択プレートは、６．７ｇの硫酸アンモニウム含有酵母窒素原礎培地、５ｇのカザミノ酸、１００ｍＬの０．５Ｍコハク酸（ｐＨ５）、２０ｇのＮｏｂｌｅ寒天、及び８５５ｍＬの脱イオン水から構成された。オートクレーブ滅菌後に、４０ｍＬの無菌５０％グルコース及び２ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬクロラフェニコール（ｃｈｌｏｒａｐｈｅｎｉｃｏｌ）を添加してから、プレートに注ぎ込んだ。
【０２２８】
ｕｒａ選択培地は、６．７ｇの硫酸アンモニウム含有酵母窒素原礎培地、５ｇのカザミノ酸、１００ｍＬの０．５Ｍコハク酸（ｐＨ５）、及び８５５ｍＬの脱イオン水から構成された。オートクレーブ滅菌後に、４０ｍＬの無菌５０％グルコース及び２ｍＬの１０ｍｇ／ｍＬクロラフェニコール（ｃｈｌｏｒａｐｈｅｎｉｃｏｌ）を添加した。
【０２２９】
ＹＰ＋１０％グルコース培地は、５００ｍＬのＹＰブロスと１００ｍＬの無菌の５０％グルコースから構成された。
【０２３０】
ＹＰブロスは、１０ｇ／Ｌの酵母抽出液、２０ｇ／Ｌのペプトンから構成された。
【０２３１】
ＹＰＤプレートは、１０ｇの酵母抽出液、２０ｇのペプトン、２０ｇのバクト（ｂａｃｔｏ）寒天、及び９６０ｍＬまでの脱イオン水から構成された。オートクレーブ滅菌後に、４０ｍＬの無菌５０％グルコースを添加してから、プレートに注ぎ込んだ。
【０２３２】
ＴＡＥは、４．８４ｇ／ＬのＴｒｉｓ塩基、１．１４ｍＬ／Ｌの氷酢酸、及び２ｍＬ／Ｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）から構成された。
【０２３３】
ＴＢＥは、１０．８ｇ／ＬのＴｒｉｓ塩基、５．５ｇ／Ｌのホウ酸、及び４ｍＬ／Ｌの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）から構成された。
【０２３４】
ＬｉＯＡｃ／ＴＥ溶液は、８部の滅菌水、１部の１Ｍ  ＬｉＯＡｃ、及び１部の１０×ＴＥから構成された。
【０２３５】
１０×ＴＥ（２００ｍＬ）は、２．４２ｇのＴｒｉｓ塩基、４ｍＬの０．５Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０から構成された。５ＭのＨＣｌを用いて、ｐＨを７．５に調節した後、溶液をオートクレーブで滅菌した。
【０２３６】
ＰＥＧ／ＬｉＯＡｃ／ＴＥ溶液は、８部の５０％ＰＥＧ３３５０、１部の１Ｍ  ＬｉＯＡｃ、及び１部の１０×ＴＥから構成された。
【０２３７】
５０％ＰＥＧ３３５０は、１００ｇのＰＥＧ３３５０を１５０ｍＬの水に添加し、加熱した後、溶解するまで撹拌することによって調製した。次に、水で容量を２００ｍＬにしてから、オートクレーブで滅菌処理した。
【０２３８】
ＳｃＤ  ＦＯＡプレートは、２７５ｍＬの２×−ＳｃＤ  ２×ＦＯＡ液体培地及び２７５ｍＬの２×−ＳｃＤ  ２×ＦＯＡプレート培地から構成され、これを融解させた後、６５℃に冷却した。
【０２３９】
２×−ＳｃＤ  ２×ＦＯＡ液体培地は、６．６６ｇのアミノ酸非含有酵母窒素原礎培地、１．５４ｇのｕｒａ−ＤＯサプリメント（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、２０ｇのデキストロース、５０ｍｇのウラシル、２ｍｇのウリジン、及び２ｇの５−ＦＯＡ（５−フルオロオロチン酸、一水和物；Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｙｏｒｋ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）、並びに１Ｌまでの水から構成された。得られた溶液を濾過することにより滅菌した。
【０２４０】
２×−ＳｃＤ  ２×ＦＯＡプレート培地は、１１ｇのバクト（ｂａｃｔｏ）寒天と２７５ｍＬの水から構成された。得られた溶液を、オートクレーブ処理することにより滅菌した。
【０２４１】
ＤＭ２培地は、硫酸アンモニウム（５．０ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、リン酸一カリウム（３．０ｇ／Ｌ）、微量元素溶液（１ｍＬ／Ｌ）及びビタミン溶液（１ｍＬ／Ｌ）から構成された。すべての培地成分を溶解した後に、適当な塩基（例えば、ＫＯＨ）を用いて、培地のｐＨを要望される初期ｐＨに調節した。
【０２４２】
微量元素溶液は、ＥＤＴＡ（１５．０ｇ／Ｌ）、硫酸亜鉛７水和物（４．５ｇ／Ｌ）、無水塩化マンガン（１．０ｇ／Ｌ）、塩化コバルト（ＩＩ）六水和物（０．３ｇ／Ｌ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（０．３ｇ／Ｌ）、無水モリブデン二ナトリウム（０．４ｇ／Ｌ）、無水塩化カルシウム（４．５ｇ／Ｌ）、硫酸鉄七水和物（３ｇ／Ｌ）、ホウ酸（１．０ｇ／Ｌ）、及びヨウ化カリウム（０．１ｇ／Ｌ）から構成された。
【０２４３】
ビタミン溶液は、ビオチン（Ｄ−；０．０５ｇ／Ｌ）、パントテン酸カルシウム（Ｄ＋；１ｇ／Ｌ）、ニコチン酸（５ｇ／Ｌ）、ミオ−イノシトール（２５ｇ／Ｌ）、塩酸ピリドキシン（１ｇ／Ｌ）、ｐ−アミノ安息香酸（０．２ｇ／Ｌ）、及び塩酸チアミン（１ｇ／Ｌ）から構成された。
【０２４４】
ＤＭ１Ｘ−α−ガルプレートは、ＤＭ１塩、２０ｇ／Ｌのグルコース、微量元素溶液、ビタミン溶液、２ｍＬ／ＬのＸ−α−ガル（１６ｍｇ／ｍＬ）、及び２０ｇ／Ｌの寒天から構成された。
【０２４５】
ＤＭ１塩溶液は、２．２８ｇ／Ｌの尿素、３ｇ／Ｌのリン酸一カリウム、及び０．５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物から構成された。
【０２４６】
Ｂｕｔｔｅｒｆｉｅｌｄｓリン酸緩衝液は、１．２５ｍＬ／Ｌの原液（２６．２２ｇ／Ｌのリン酸二水素カリウムと７．７８ｇ／Ｌの炭酸ナトリウム）及び５ｍＬ／Ｌの塩化マグネシウム溶液（８１．１ｇ／ＬのＭｇＣｌ2−６Ｈ2Ｏ）から構成された。得られた溶液をオートクレーブ処理により滅菌した後、ｐＨを７．２に調節した。
【０２４７】
ＣＮＢ１振盪フラスコ培地は、尿素（２．３ｇ／Ｌ）、硫酸マグネシウム七水和物（０．５ｇ／Ｌ）、リン酸一カリウム（３．０ｇ／Ｌ）、微量元素溶液（１ｍＬ／Ｌ）及びビタミン溶液（１ｍＬ／Ｌ）、グルコース（１２０．０ｇ／Ｌ）、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（９７．６ｇ／Ｌ）から構成された。全ての培地成分を溶解させた後、培地のｐＨを、適当な塩基（例えば、ＫＯＨ）を用いて５．８の初期ｐＨに調節した。
【０２４８】
【表２】
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【０２４９】
実施例１：酵母ゲノムへのＤＮＡの形質転換方法
以下の実施例に記載する組換え酵母株を作製するための酵母宿主細胞へのＤＮＡ形質転換を以下の具体的手順に基づいて実施した。
【０２５０】
３ｍＬのＹＰ＋１０％グルコース培地を１４ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに添加し、滅菌ループを用いて、この培地に所望の株を接種した。培養物を３７℃で一晩（約１６時間）２５０ｒｐｍでの振盪により増殖させた。０．５ｍＬの一晩培養物を、２５ｍＬの液体ＹＰ＋１０％グルコース培地を含む１２５ｍＬバッフル付フラスコに添加した。フラスコを３７℃で２５０ｒｐｍでの振盪により増殖させた。培養物の少量アリコートを約１時間おきに採取し、ＯＤ600を測定した。ＯＤ600が０．６〜１．０となるまで、培養物を増殖させた。
【０２５１】
室温にて、２２７９×ｇでの遠心分離により細胞を回収し、ペレットを２５ｍＬの滅菌水に再懸濁させた後、室温にて２２７９×ｇで遠心分離した。ペレットを１ｍＬの滅菌水中に再懸濁し、再懸濁細胞を１．５ｍＬチューブに移した後、１６，１００×ｇでペレット化した。細胞を１ｍＬのＬｉＯＡｃ／ＴＥ溶液中に再懸濁した後、１６，１００×ｇでペレット化した。次に、細胞を２５０μＬのＬｉＯＡｃ／ＴＥ溶液中に再懸濁した。
【０２５２】
以下の成分を１．５ｍＬチューブに添加した：１００μＬの上記細胞、１０μＬの新しく煮沸した後氷冷したサケ精子ＤＮＡ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ，ＵＳＡ）、及び１０μＬの所望の線状化形質転換ＤＮＡ。ＤＮＡの代わりに水を含む対照反応物も調製した。各形質転換反応物に、６００μＬのＰＥＧ／ＬｉＯＡｃ／ＴＥ溶液を添加し、続いて４０μＬのＤＭＳＯを添加した後、反応物を数回反転させて混合した。形質転換反応物を４２℃の水浴中で１５分インキュベートした後、細胞を５，４００×ｇで１分間ペレット化した。細胞を水に再懸濁させてから、２つに分け、形質転換反応物を半分ずつｕｒａ選択培地プレートに塗布した。プレートを３７℃で静置した。２日の増殖後、コロニーを肉眼で認めることができた。
【０２５３】
実施例２：活性３−ＨＰ経路を含む酵母株の構築
この実施例は、活性３−ＨＰ経路を含む酵母株の構築を記載し、ここで、酵母株は、ａｄｈ１２０２遺伝子座でバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＤＣ（配列番号１３９）をコードするポリヌクレオチドの４つのコピーを、ｐｄｃ遺伝子座でイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＰＹＣ（配列番号２）をコードするポリヌクレオチドの１つのコピーを、ｐｙｃ遺伝子座でイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＰＹＣ（配列番号２）をコードする内在性ポリヌクレオチドの上方調節と共にバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＤＣ（配列番号１３９）をコードするポリヌクレオチドの３つのコピーを、ａｄｈ９０９１遺伝子座でバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＤＣ（配列番号１３９）をコードするポリヌクレオチドの４つのコピーを発現し、かつ内在性グリセロール３−リン酸デヒドロゲナーゼＧＰＤ遺伝子の破壊を有する。
【０２５４】
ａｄｈ１２０２遺伝子座の４つのポリヌクレオチド配列からアスパラギン酸１−デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）と、ｐｄｃ遺伝子座のピルビン酸カルボキシラーゼ（ＰＹＣ）を発現するイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＣＮＢ１酵母株ＭｃＴｓ２５３のｕｒａ誘導体（米国特許第２０１２／０１３５４８１号明細書）を、以前記載されている（米国特許第２０１２／０１３５４８１号明細書）ように単離した。ＭｃＴｓ２５３の複数のＦＯＡ耐性コロニーを、ｕｒａマイナス選択プレート上での増殖の不足について、また要望されるループアウト事象についてはＰＣＲによりスクリーニングした。プライマー０６１４２３３及び０６１１５５４を用いて、ゲル電気泳動による４．６ｋｂｐのバンドの出現は、要望されるように、ｕｒａ３ｓｃａｒ部位（親株における２つのＵＲＡ３プロモータ同士の相同組換え後に残った単一のＵＲＡ３プロモータ）のみの存在を示したのに対し、約５．９ｋｂｐのバンドは、インタクトなＵＲＡ３プロモータ−ＵＲＡ３  ＯＲＦ−ＵＲＡ３ターミネータ−ＵＲＡ３プロモータカセットの存在を示したが、これは、要望の組換え事象が起こらなかったことを意味した。Ｐｈｉｒｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を使用してＰＣＲ反応を製造者の指示に従い実施した。要望のループアウト事象を有した親株ＭｃＴｓ２５３由来の１つのＦＯＡ耐性コロニーをＭｃＴｓ２５８と名付けた。
【０２５５】
株ＭｃＴｓ２５８（前掲）をＰｖｕＩ／ＳａｃＩＩ消化ｐＭｌＢａ１５７（図１１）、及びＨｐａＩ／ＳａｃＩＩ消化ｐＭｌＢａ１５８（図１２）で形質転換して、ｐｙｃ遺伝子座でバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＤＣをコードするポリヌクレオチドの３つのコピーを組み込み、ネイティブＰＹＣプロモータをＰＤＣプロモータで置換した（同様の実験手順については、米国特許第２０１２／０１３５４８１号明細書を参照）。正しい遺伝子ターゲティング及び形質転換を、プライマー０６１４３０８及び０６１５１１８（ゲル電気泳動により約４．４ｋｂｐのバンドをもたらすように設計されている）及び０６１１２４７及び０６１４２３５（ゲル電気泳動により約４．７ｋｂｐのバンドをもたらすように設計されている）と一緒に、Ｐｈｉｒｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて、ＰＣＲにより確認した。ｐｙｃ遺伝子座でのカセットの適正な組込みについて予測したバンドを付与した株をＭｌＢａ４００と名付けた。
【０２５６】
ＭｌＢａ４００（前掲）のｕｒａ誘導体を米国特許第２０１２／０１３５４８１号明細書に記載のように単離した。ＭｌＢａ４００の複数のＦＯＡ耐性コロニーを、プライマー０６１２３６２及び０６１１７１７を用い、要望されるループアウトについてＰＣＲによりスクリーニングした。ゲル電気泳動による０．７０ｋｂｐのバンドの出現は、要望されるように、ｕｒａ３ｓｃａｒ部位（親株における２つのＵＲＡ３プロモータ同士の相同組換え後に残った単一のＵＲＡ３プロモータ）のみの存在を示すのに対し、約２．１ｋｂｐのバンドは、インタクトなＵＲＡ３プロモータ−ＵＲＡ３  ＯＲＦ−ＵＲＡ３ターミネータ−ＵＲＡ３プロモータカセットの存在を示すが、これは、要望の組換え事象が起こらなかったことを意味する。要望のループアウト事象を有した親株ＭｌＢａ４００由来の１つのＦＯＡ耐性コロニーをＭｌＢａ４０４と名付けた。
【０２５７】
対応する同型接合株を構築するために、ＭｌＢａ４０４（前掲）をＰｖｕＩ／ＳａｃＩＩ消化ｐＭｌＢａ１５７（前掲）、及びＨｐａＩ／ＳａｃＩＩ消化ｐＭｌＢａ１６２（図１３）で形質転換し、Ｐｈｉｒｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて、ＰＣＲにより正しい遺伝子座ターゲティング及び形質転換を確認した。両方の野生型ｐｙｃ遺伝子座の欠失を確認するために、インタクトなｐｙｃ遺伝子座は、ゲル電気泳動により約０．４５ｋｂｐのバンドをもたらすが、発現カセットの導入によって６．４ｋｂｐの産物が得られるように、プライマー０６１４３０９及び０６１１６２２を設計した。野生型遺伝子座をもはや含まない株については、プライマーセット０６１４２３４及び０６１２３６２を用いて、第１組込みの存在を確認し、プライマーセット０６１４２３４及び０６１２３６６を用いて、第２組込みの存在を確認した。これらのプライマーセットは、ｐｙｃ遺伝子座のイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＰＹＣプロモータに代わってＰＤＣプロモータを含むバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＤＣをコードするヌクレオチドの３つのコピーに対し同型接合の株についてそれぞれ１．９８及び１．８８ｋｂｐの産物をもたらすように設計した。同型接合体についてゲル電気泳動により決定されるように、予測されたバンドをもたらした１つの株をＭｌＢａ４０８と名付けた。
【０２５８】
ＭｌＢａ４０８（前掲）のｕｒａ誘導体を米国特許第２０１２／０１３５４８１号明細書に記載のように単離した。ＭｌＢａ４０８の複数のＦＯＡ耐性コロニーを、プライマー０６１２３６６及び０６１１７１７を用い、要望されるループアウトについてＰＣＲによりスクリーニングした。ゲル電気泳動による０．６０ｋｂｐのバンドの出現は、要望されるように、ｕｒａ３ｓｃａｒ部位（親株における２つのＵＲＡ３プロモータ同士の相同組換え後に残った単一のＵＲＡ３プロモータ）のみの存在を示すのに対し、約２．０ｋｂｐのバンドは、インタクトなＵＲＡ３プロモータ−ＵＲＡ３  ＯＲＦ−ＵＲＡ３ターミネータ−ＵＲＡ３プロモータカセットの存在を示すが、これは、要望の組換え事象が起こらなかったことを意味する。要望のループアウト事象を有した親株ＭｌＢａ４０８由来の１つのＦＯＡ耐性コロニーをＭｌＢａ４１３と名付けた。
【０２５９】
株ＭｌＢａ４１３（前掲）をＨｐａＩ／ＳａｃＩＩ消化ｐＭｅＪｉ３２２（図１４）、及びＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩＩ消化ｐＭｅＪｉ３２３−３（図１５）で形質転換して、ａｄｈ９０９１遺伝子座でバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＤＣをコードするポリヌクレオチドの４つのコピーを組み込んだ（同様の実験手順については、米国特許第２０１２／０１３５４８１号明細書を参照）。正しい遺伝子座ターゲティング及び形質転換を、プライマー０６１５１１８及び０６１４６２７（ゲル電気泳動により約４．２ｋｂｐのバンドをもたらすように設計されている）及び０６１１２４７及び０６１４６２６（ゲル電気泳動により約４．６ｋｂｐのバンドをもたらすように設計されている）と一緒に、Ｐｈｉｒｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いてＰＣＲにより確認した。予測したバンドをもたらした１株をＭｌＢａ４１８と名付けた。
【０２６０】
ＭｌＢａ４１８（前掲）のｕｒａ誘導体を米国特許第２０１２／０１３５４８１号明細書に記載のように調製した。ＭｌＢａ４１８の複数のＦＯＡ耐性コロニーを、プライマー０６１２３６６及び０６１４６２７を用い、要望されるループアウトについてＰＣＲによりスクリーニングした。ゲル電気泳動による４．４ｋｂｐのバンドの存在は、要望されるように、ｕｒａ３ｓｃａｒ部位（親株における２つのＵＲＡ３プロモータ同士の相同組換え後に残った単一のＵＲＡ３プロモータ）のみの存在を示すのに対し、約５．８ｋｂｐのバンドは、インタクトなＵＲＡ３プロモータ−ＵＲＡ３  ＯＲＦ−ＵＲＡ３ターミネータ−ＵＲＡ３プロモータカセットの存在を示すが、これは、要望の組換え事象が起こらなかったことを意味する。要望のループアウト事象を有した親株ＭｌＢａ４１８由来の１つのＦＯＡ耐性コロニーをＭｌＢａ４２２と名付けた。
【０２６１】
対応する同型接合株を構築するために、ＭｌＢａ４２２（前掲）をＨｐａＩ／ＳａｃＩＩ消化ｐＭｅＪｉ３２２（図１４）及びＥｃｏＲＩ／ＳａｃＩＩ消化ｐＭｌＢａ１６３（図１６）で形質転換し、Ｐｈｉｒｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて、ＰＣＲにより正しい遺伝子座ターゲティング及び形質転換を確認した。両方の野生型ａｄｈ９０９１遺伝子座の欠失を確認するために、インタクトなａｄｈ９０９１遺伝子座は、ゲル電気泳動により約１．３ｋｂｐのバンドをもたらすが、発現カセットの導入により、増幅断片が生じないように、プライマー０６１５１５８及び０６１４６２６を設計した。野生型遺伝子座をもはや含まない株については、プライマーセット０６１１７１８及び０６１４６２６を用いて、第１組込みの存在を確認し、プライマーセット０６１２３６６及び０６１４６２６を用いて、第２組込みの存在を確認した。各々のプライマーセットは、ａｄｈ９０９１遺伝子座のバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＤＣをコードするヌクレオチドの４つのコピーに対し同型接合の株について約１．２ｋｂｐの産物をもたらすように設計した。同型接合体について予測されたバンドをもたらした１株をＭｌＢａ４２５と名付けた。
【０２６２】
ＭｌＢａ４２５（前掲）のｕｒａ誘導体を前述のように単離した。ＭｌＢａ４２５の複数のＦＯＡ耐性コロニーを、ａｄｈ９０９１遺伝子座の第１及び第２組込みカセットの存在に関するＰＣＲにより、ｕｒａマイナス選択プレート上での増殖の不足についてスクリーニングした。プライマーセット０６１１７１８及び０６１４６２６を用いて、第１組込みの存在を確認し、プライマーセット０６１２３６６及び０６１４６２６を用いて、第２組込みの存在を確認した。各々のプライマーセットは、ａｄｈ９０９１遺伝子座のバチルス・リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＤＣをコードするヌクレオチドの４つのコピーに対し同型接合のｕｒａマイナス株について約１．２ｋｂｐの産物をもたらすように設計した。同型接合体について予測されたバンドをもたらした１株をＭｌＢａ４２９と名付けた。
【０２６３】
ＡｐａＩ／ＳｐｈＩ／ＳａｃＩ消化ｐＨＪＪ５６で、ＭｌＢａ４２９（前掲）を形質転換して（米国特許第２０１２／０１３５４８１号明細書）、ＧＰＤ遺伝子を破壊した。ＧＰＤ遺伝子を破壊したとき、プライマー０６１４８９１及び０６１２９０８（ゲル電気泳動により約１．９ｋｂｐのバンドをもたらすように設計されている）及びプライマー０６１２９０９及び０６１４８９２（ゲル電気泳動により約２．０ｋｂｐのバンドをもたらすように設計されている）と一緒に、Ｐｈｉｒｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いてＰＣＲにより、正しい遺伝子座ターゲティング及び形質転換を確認した。予測したバンドをもたらした１株をＭｃＴｓ４０３と名付けた。
【０２６４】
ＭｃＴｓ４０３（前掲）のｕｒａ誘導体を米国特許第２０１２／０１３５４８１号明細書に記載のように単離した。ＭｃＴｓ４０３の複数のＦＯＡ耐性コロニーを、プライマー０６１４８９１及び０６１１７１８を用い、要望されるループアウトについてＰＣＲによりスクリーニングした。ゲル電気泳動による１．４ｋｂｐのバンドの存在は、要望されるように、ｕｒａ３ｓｃａｒ部位（親株における２つのＵＲＡ３プロモータ同士の相同組換え後に残った単一のＵＲＡ３プロモータ）のみの存在を示すのに対し、約２．９ｋｂｐのバンドは、インタクトなＵＲＡ３プロモータ−ＵＲＡ３  ＯＲＦ−ＵＲＡ３ターミネータ−ＵＲＡ３プロモータカセットの存在を示すが、これは、要望される組換え事象が起こらなかったことを意味する。要望のループアウト事象を有した親株ＭｌＢａ４１８由来の１つのＦＯＡ耐性コロニーをＭｅＪｉ４５７と名付けた。
【０２６５】
対応する同型接合株を構築するために、ＭｅＪｉ２５７（前掲）を消化ｐＨＪＪ５７で形質転換し（米国特許第２０１２／０１３５４８１号明細書）、Ｐｈｉｒｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用い、ＰＣＲにより、正しい遺伝子座ターゲティング及び形質転換を確認した。プライマーセット０６１４８９１及び０６１１７１８（ゲル電気泳動により約１．４ｋｂｐのバンドをもたらすように設計されている）を用いて、第１遺伝子座でのＧＰＤ欠失カセットの存在を確認し、また、プライマーセット０６１２９０８及び０６１４８９２（ゲル電気泳動により約２ｋｂｐのバンドをもたらすように設計されている）を用いて、第２遺伝子座でのＧＰＤ欠失カセットの存在を確認した。予測されたバンドをもたらした１株をＭｅＪｉ４６１と名付けた。
【０２６６】
ＭｅＪｉ４６１（前掲）のｕｒａ誘導体を米国特許第２０１２／０１３５４８１号明細書に記載のように単離した。ＭｅＪｉ４６１の複数のＦＯＡ耐性コロニーを、プライマー０６１１７１８及び０６１４８９２を用い、要望されるループアウトについてＰＣＲによりスクリーニングした。ゲル電気泳動による１．６ｋｂｐのバンドの存在は、要望されるように、ｕｒａ３ｓｃａｒ部位（親株における２つのＵＲＡ３プロモータ同士の相同組換え後に残った単一のＵＲＡ３プロモータ）のみの存在を示すのに対し、約２．９ｋｂｐのバンドは、インタクトなＵＲＡ３プロモータ−ＵＲＡ３  ＯＲＦ−ＵＲＡ３ターミネータ−ＵＲＡ３プロモータカセットの存在を示すが、これは、要望される組換え事象が起こらなかったことを意味する。要望のループアウト事象を有した親株ＭｅＪｉ４６１由来の１つのＦＯＡ耐性コロニーをＭｅＪｉ４６５と名付けた。
【０２６７】
実施例３：酵母ｓｃｗ１１遺伝子座で異種非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）を発現するための挿入ベクターの構築
ｐＭＢｉｎ２２７（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮ）
選択マーカとしてＵＲＡ３を用いて、ＰＤＣプロモータ及びターミネータの制御下で、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ｓｃｗ１１遺伝子座でのストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮコード配列の組込みを可能にするように、プラスミドｐＭＢｉｎ２２７を設計し、以下のように構築した。
【０２６８】
ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）由来のＧＡＰＮコード配列のコドン最適化バージョン（配列番号１５４のＧＡＰＮをコードする、配列番号１５３）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）により合成し、付加したＴＡＡＡコザック配列を含み、５’Ｘｂａｌ及び３’Ｐａｃｌ部位とフランキングするベクターｐＵＣ５７内に取得した。Ｘｂａｌ及びＰａｃｌでの消化により、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮコード配列をｐＵＣ５７プラスミドから除去し、ＴＡＥ緩衝液中の１．０％アガロースゲル上で分離し、そこで約１．４ｋｂｐ断片（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮコード配列を含有する）をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の指示に従い精製した。
【０２６９】
プラスミドｐＭＢｉｎ２０４（米国特許第２０１２／０１３５４８１号明細書）をＸｂａｌ及びＰａｃｌで消化した後、ＴＡＥ緩衝液中のアガロースゲル電気泳動により精製した。約８．４ｋｂｐのバンドをゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の指示に従い精製した。１μＬの８．４ｋｂｐベクター、４μＬの１．４ｋｂｐ挿入片、１０ｍＭ  ＡＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む１μＬの１０×連結緩衝液、３μｌのｇｄＨ2Ｏ及び１μＬのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）から構成される総量１０μＬの反応物中のＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮコード配列（前掲）を含有する１．４ｋｂｐのＸｂａｌ／Ｐａｃｌ断片を８．４ｋｂｐのｐＭＢｉｎ２０４（前掲）線状化ベクターに連結した。反応物を２２℃で１８時間インキュベートした後、反応物の４μＬアリコートを、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に、製造業者の指示に従い形質転換した。回収時間の後、形質転換反応物からの２つの１００μＬアリコートを、１ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを添加した１５０ｍｍ２×ＹＴプレートに塗布した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。推定組換えクローンを選択プレートから選択した後、各クローンから、ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。制限消化物によりクローンを分析し、正しい制限消化物パターンを有するプラスミドをｐＭＢｉｎ２２２（図３）と名付けた。プラスミドｐＭＢｉｎ２２２は、ＰＤＣプロモータ及びターミネータの制御下のストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮコード配列を含有し、ＵＲＡ３選択マーカが、ａｄｈ９０９１遺伝子座に対する相同性の領域によってフランキングされている。
【０２７０】
選択マーカとしてＵＲＡ３を用い、ＰＤＣプロモータ及びターミネータの制御下で、ｓｃｗ１１遺伝子座でのシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ｍｍｓＢコード配列を組み込むために、プラスミドｐＭｃＴｓ１２８を作出した。シュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｉｄａ）ｍｍｓＢ  ３−ＨＰＤＨのコード配列（配列番号３１の３−ＨＰＤＨをコードする）をイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）についてコドン最適化し、５’Ｘｂａｌ及び３’Ｐａｃｌ制限部位によってフランキングさせた後、プラスミド内にＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）により取得し、次に、これをＸｂａｌ及びＰａｃｌで消化し、前述したように、得られた８９８ｂｐの断片を、やはりＸｂａｌ及びＰａｃｌで消化したｐＭＢｉｎ２０４（米国特許第２０１２／０１３５４８１号明細書）の８．４ｋｂｐ断片にクローン化した。複数の組換えクローンを制限消化物によりスクリーニングし、配列決定した。正しい配列を有する１クローンをｐＭｃＴｓ１０２と名付けた（図４）。
【０２７１】
プラスミドｐＭｃＴｓ１０２（前掲）をＮｏｔｌで消化し、ＰＤＣプロモータ、ｍｍｓＢ  ３−ＨＰＤＨコード配列、ＰＤＣターミネータ及びＵＲＡ３選択マーカを含有する３．６ｋｂｐの断片をｐＭｃＴｓ６５のＮｏｔｌ部位に連結させて（図６；米国特許第２０１２／０１３５４８１号明細書も参照）、ｐＭｃＴｓ１２５を作出した（図５）。プラスミドｐＭｃＴｓ１２５をＮｏｔｌで消化して、ＰＤＣプロモータ、ｍｍｓＢ、ＰＤＣターミネータ及びＵＲＡ３選択マーカを含有する３．６ｋｂｐ断片をｐＡＣＮ６２のＮｏｔｌ部位に連結させて（米国特許第２０１２／０１３５４８１号明細書）、ｐＣＫｌｅ７３を作出した（図７）。
【０２７２】
プラスミドｐＳＴＫ８（図８）は、ｓｃｗ１１遺伝子座での遺伝子組込みを可能にする相同性を含んでいる。プラスミドｐＳＴＫ８をＮｏｔｌで消化して、ｓｃｗ１１相同性配列の内部に存在するＵＲＡ３選択マーカ及びＰＤＣターミネータを除去した。プラスミドｐＣＫｌｅ７３（前掲）をＮｏｔｌで消化して、ＰＤＣプロモータ、ｍｍｓＢ、ＰＤＣターミネータ及びＵＲＡ３選択マーカを含有する３．６ｋｂｐ断片をｐＳＴＫ８（前掲）のＮｏｔｌ部位に連結させて、ｐＭｃＴｓ１２８を作出した（図９）。
【０２７３】
プラスミドｐＭｃＴｓ１２８（前掲）をＸｂａｌ及びＰａｃｌで消化して、ｍｍｓＢ遺伝子を除去した後、プラスミドをＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲル電気泳動により分離した。ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の指示に従い、約８ｋｂｐの線状化断片をアガロースから取り出した。
【０２７４】
Ｘｂａｌ及びＰａｃｌでの消化により、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ。ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮ遺伝子をｐＭＢｉｎ２２２プラスミド（前掲）から除去し、ＴＡＥ緩衝液中の１．０％アガロースゲルで分離したが、そこで、約１．４ｋｂｐの断片（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮ遺伝子を含有する）をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の指示に従い精製した。２μＬの８ｋｂｐベクター、６μＬの１．４ｋｂｐ挿入片、１０ｍＭ  ＡＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む１μＬの１０×連結緩衝液、及び１μＬのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）から構成される総量１０μＬの反応物中のＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮ遺伝子を含有する１．４ｋｂｐのＸｂａｌ／Ｐａｃｌ消化断片を、８ｋｂｐ  ｐＭｃＴｓ１２８（前掲）線状化ベクターのＸｂａｌ及びＰａｃｌ部位に連結した。反応物を１６℃で１８時間インキュベートした後、反応物の４μＬアリコートを、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造業者の指示に従い形質転換した。反応物を２２℃で１８時間インキュベートした後、反応物の４μＬアリコートをＯｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造業者の指示に従い形質転換した。回収時間の後、形質転換反応物からの２つの１００μＬアリコートを、ｍｌ当たり５０μｇのカナマイシンを添加した１５０ｍｍ２×ＹＴプレートに塗布した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。推定組換えクローンを選択プレートから選択した後、各クローンから、ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。制限消化物によりクローンを分析し、正しい制限消化物を含むプラスミドをｐＭＢｉｎ２２７（図１０）と名付けた。
【０２７５】
プラスミドｐＭＢｉｎ２２７は、ＰＤＣプロモータ及びターミネータの制御下の配列番号１５３のストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮコード配列（配列番号１５４のＧＡＰＮをコードする）を含有し、ＵＲＡ３選択マーカが、ｓｃｗ１１遺伝子座に対する相同性の領域によってフランキングされている。
【０２７６】
ｐＭＢｉｎ２４０（ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）ＧＡＰＮ）及びｐＭＢｉｎ２４１（トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）ＧＡＰＮ）
選択マーカとしてＵＲＡ３を用いて、ＰＤＣプロモータ及びターミネータの制御下で、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ｓｃｗ１１遺伝子座でのラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）又はトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）いずれか由来のＧＡＰＮコード配列の組込みを可能にするように、プラスミドｐＭＢｉｎ２４０及びｐＭＢｉｎ２４１を設計し、以下のように構築した。
【０２７７】
ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）（配列番号１９３、配列番号１９４のＧＡＰＮをコードする）及びトウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）（配列番号１９１、配列番号１９２のＧＡＰＮをコードする）由来のＧＡＰＮコード配列のコドン最適化バージョンをＧｅｎｅＡｒｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により合成した。これらの各々は、付加ＴＡＡＡコザック配列を含み、５’Ｘｂａｌ及び３’Ｐａｃｌ部位とフランキングするベクターｐＭＫ−ＲＱ内に取得した。Ｘｂａｌ及びＰａｃｌでの消化により、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）及びトウモロコシ（Ｚ．ｍａｙｓ）ＧＡＰＮコード配列をｐＭＫ−ＲＱプラスミドから除去し、ＴＢＥ緩衝液中の１．０％アガロースゲルで分離したが、そこで、約１．５ｋｂｐの断片（ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）又はトウモロコシ（Ｚ．ｍａｙｓ）ＧＡＰＮコード配列を含有する）をゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の指示に従い精製した。
【０２７８】
プラスミドｐＭＢｉｎ２２７（前掲）をＸｂａｌ及びＰａｃｌで消化した後、ＴＢＥ緩衝液中のアガロースゲル電気泳動により精製した。約８．０ｋｂｐのバンドをゲルから切除した後、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の指示に従い精製した。１μＬの８．０ｋｂｐベクター、４μＬの１．５ｋｂｐ挿入片、１０ｍＭ  ＡＴＰ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む１μＬの１０×連結緩衝液、３μｌのｇｄＨ2Ｏ及び１μＬのＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）から構成される総量１０μＬの反応物中のＴ４リガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）又はトウモロコシ（Ｚ．ｍａｙｓ）ＧＡＰＮコード配列（前掲）含有の１．５ｋｂｐＸｂａｌ／Ｐａｃｌ断片を８．０ｋｂｐ  ｐＭＢｉｎ２２７（前掲）線状化ベクターに連結した。反応物を２２℃で１８時間インキュベートした後、反応物の４μＬアリコートを、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、製造業者の指示に従い形質転換した。回収時間の後、形質転換反応物からの２つの１００μＬアリコートを、ｍｌ当たり１００μｇのアンピシリンを添加した１５０ｍｍ２×ＹＴプレートに塗布した。プレートを３７℃で一晩インキュベートした。推定組換えクローンを選択プレートから選択した後、各クローンから、ＢＩＯＲＯＢＯＴ（登録商標）９６００（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。制限消化物によりクローンを分析し、正しい制限消化物を含むプラスミドをｐＭＢｉｎ２４０（図１９）及びｐＭＢｉｎ２４１（図２０）と名付けた。
【０２７９】
プラスミドｐＭＢｉｎ２４０は、ＰＤＣプロモータ及びターミネータの制御下の配列番号１９３のラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）ＧＡＰＮコード配列（配列番号１９４のＧＡＰＮをコードする）を含有し、ＵＲＡ３選択マーカが、ｓｃｗ１１遺伝子座に対する相同性の領域によってフランキングされている。プラスミドｐＭＢｉｎ２４１は、ＰＤＣプロモータ及びターミネータの制御下の配列番号１９１のトウモロコシ（Ｚ．ｍａｙｓ）ＧＡＰＮコード配列（配列番号１９２のＧＡＰＮをコードする）を含有し、ＵＲＡ３選択マーカが、ｓｃｗ１１遺伝子座に対する相同性の領域によってフランキングされている。
【０２８０】
実施例４：活性３−ＨＰ経路を含み、かつ酵母ｓｃｗ１１遺伝子座で異種非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）を発現する酵母株の構築
ＭＢｉｎ５５８／５５９／５６０（ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮ）
実施例３からの約１８μｇのｐＭＢｉｎ２２７をＡｐａｌ及びＳａｃｌで消化した後、ＴＡＥ緩衝液を用いて、１％アガロースゲル上で分離した。約５．６ｋｂｐ断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の指示に従い精製した。約９００ｎｇのｐＭＢｉｎ２２７断片を前述のようにイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）株ＭｅＪｉ４６５（前掲）に形質転換した。形質転換体をｕｒａ選択培地に塗布し、３７℃でインキュベートし、ｕｒａ選択培地に再度接種した後、３７℃で一晩インキュベートした。ＵＲＡ３＋形質転換体をｓｃｗ１１でのＧＡＰＮの組込みについてＰＣＲにより調べた。
【０２８１】
ＰＣＲは、Ｐｈｉｒｅ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲ  ｋｉｔ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて、製造業者の指示に従い実施した。プライマー０６１１７１７及び０６１５９１０は、ゲル電気泳動により約１．４ｋｂｐのバンドをもたらすように設計したのに対し、プライマー０６１２９０８及び０６１５９１１は、約１．９ｋｂｐのバンドをもたらすように設計した。発現カセットの適正な組込みについて予測されたバンドをもたらした３つの株をＭＢｉｎ５５８、ＭＢｉｎ５５９及びＭＢｉｎ５６０と名付けた。これらの株は、配列番号１５３のストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮコード配列（配列番号１５４のＧＡＰＮをコードする）についてｓｃｗ１１遺伝子座で異型接合であり、その発現は、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来のＰＤＣプロモータ及びターミネータによって駆動される。
【０２８２】
ＭＢｉｎ５９６／５９７（ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）ＧＡＰＮ）及びＭＢｉｎ５９８／５９９（トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）ＧＡＰＮ）
実施例３からの各々約１０μｇのｐＭＢｉｎ２４０又はｐＭＢｉｎ２４１をＡｐａｌ及びＳａｃｌで消化した後、ＴＡＥ緩衝液を用いて、１％アガロースゲル上で分離した。要望される約５．７ｋｂｐの断片をゲルから切除し、ＱＩＡＱＵＩＣＫ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造業者の指示に従い精製した。約９００ｎｇのｐＭＢｉｎ２４０又はｐＭＢｉｎ２４１断片（Ａｐａｌ及びＳａｃｌで消化した）を前述のようにイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＣＮＢ１  ＭｅＪｉ４６５（前掲）に形質転換した。形質転換体をｕｒａ選択培地に塗布し、３７℃で２日間インキュベートし、ｕｒａ選択培地に再度接種した後、３７℃で一晩インキュベートした。ＵＲＡ３＋形質転換体をｓｃｗ１１でのＧＡＰＮの組込みについて、ＰＣＲにより調べた。
【０２８３】
ＰＣＲは、Ｐｈｉｒｅ（登録商標）Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲキット（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いて、製造業者の指示に従い実施した。プライマー０６１１７１７及び０６１５９１０は、ゲル電気泳動により約１．４ｋｂｐのバンドをもたらすように設計したのに対し、プライマー０６１２９０８及び０６１５９１１は、約１．９ｋｂｐのバンドをもたらすように設計した。ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）発現カセットの適正な組込みについて予測されたバンドをもたらした２つの株をＭＢｉｎ５９６及びＭＢｉｎ５９７と名付けた。トウモロコシ（Ｚ．ｍａｙｓ）発現カセットの適正な組込みについて予測されたバンドをもたらした２つの株をＭＢｉｎ５９８及びＭＢｉｎ５９９と名付けた。これらの株は、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）又はトウモロコシ（Ｚ．ｍａｙｓ）ＧＡＰＮ遺伝子についてｓｃｗ１１遺伝子座で異型接合であり、その発現は、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）由来のＰＤＣプロモータ及びターミネータにより駆動される。
【０２８４】
実施例５：ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）遺伝子を発現する組換え酵母株の酵素活性
組換え酵母株ＭＢｉｎ５５８（実施例４）及びＭｅＪｉ４６１（実施例２）を各々遠心分離により回収し、上清を廃棄し、細胞ペレットを−２０℃で保存した。１６、３０及び４０時間の各時点で発酵タンクをサンプリングし、酵素活性についてアッセイした。粗無細胞抽出液（ＣＦＥ）の調製のために、各細胞ペレットを解凍し、１％プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ）、０４６９３１５９００１  Ｒｏｃｈｅ）を含有する１×ＰＢＳで、２５の同等ＯＤ６００まで再懸濁させた。各細胞懸濁液を、２．４ｇのＬｙｓｉｎｇ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｙ（０．５ｍｍのイットリア安定化ジルコニウムスフィア、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を含む２．０ｍＬマイクロ遠心チューブに移し、細胞溶解をＦａｓｔＰｒｅｐ（登録商標）−２４破砕機（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）により６．５／５０秒の設定で３ラウンド実施した。ラウンド同士の間に、サンプルチューブを氷上で３分間冷却した。溶解後、マイクロ遠心チューブにおいて最大速度で、サンプルを４℃で１０分遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、氷上で維持するか、又は後の使用のために−２０℃で保存した。ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ（ビシンコニン酸アッセイ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び標準としてのウシ血清アルブミンを用い、製造業者により提供される指示に従って溶解物中の全タンパク質濃度を決定した。
【０２８５】
本明細書に記載する細胞のＣＦＥ中のＮＡＤＰ＋依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）活性を下記のように決定した：反応混合物原液を調製するが、これは、アッセイ反応混合物中のＣＦＥと合わせて、以下を提供した：１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）；１．５ｍＭ  ＮＡＤＰ＋；及び８ｍＭグリセルアルデヒド−３−リン酸。１９０μＬの上記混合物を９６ウェルマイクロプレートのウェルに添加し、１０μＬの適切に希釈した希釈ＣＦＥを添加して反応を開始した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ３４０ＰＣプレートリーダを用いて、３４０ｎｍでＮＡＤＰ＋の低減をモニターした。
【０２８６】
異なる時点で酵母株ＭＢｉｎ５５８及びＭｅＪｉ４６１ＣＦＥから測定したＧＡＰＮ活性を以下の表３に示す。株ＭＢｉｎ５５８（活性３−ＨＰ経路と、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドを含む）は、対応する株ＭｅＪｉ４６１（同じ活性３−ＨＰ経路を含むが、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドは含まない）と比較して、有意に高いＧＡＰＮ活性を示した。
【０２８７】
【表３】
2015536669.tif 000005
【０２８８】
酵母株ＭｅＪｉ４６１、ＭＢｉｎ５５８、ＭＢｉｎ５９７及びＭＢｉｎ５９９を用いて実施した実験から得られた更なるＧＡＰＮ活性結果を図２１に示す。ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮ（ＭＢｉｎ５５８）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）ＧＡＰＮ（ＭＢｉｎ５９７）又はトウモロコシ（Ｚ．ｍａｙｓ）ＧＡＰＮ（ＭＢｉｎ５９９）を発現する酵母株は、各々、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドのない対応する株（ＭｅＪｉ４６１）と比較して有意に高いＧＡＰＮ活性を示した。
【０２８９】
実施例６：ＮＡＤＰ＋依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）遺伝子を発現する組換え酵母株における３−ＨＰ産生
組換え酵母株ＭｅＪｉ４６１（実施例２）と、組換え酵母株ＭＢｉｎ５５８、ＭＢｉｎ５５９及びＭＢｉｎ５６０（実施例４）を、シード繁殖段階を用いて培養した後、３Ｌバイオリアクター（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）において一段階発酵を実施した。
【０２９０】
シード段階調製のために、２５ｍＬの１×ＤＭ２培地（ＫＯＨで要望のｐＨに調節した）を１２５ｍＬバッフル付フラスコに添加した後、滅菌ループを用いて目的の株を接種した。培養物を２５０ｒｐｍで振盪しながら、要望の温度で一晩約１６時間増殖させた。次に、約１時間おきに培養物の少量アリコートを採取し、ＯＤ600が４〜６に達するまで、ＯＤ600を測定した。
【０２９１】
存在する残留グルコースを、Ｕｒｉｓｔｉｘ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｔｒｉｐ（Ｂａｙｅｒ，Ｅｌｋｈａｒｔ，ＩＮ，ＵＳＡ）を用いて測定した。１２ｍＬの培養物を４ｍＬの滅菌冷却した７５％グリセロールに添加し、入念に混合した後、氷上で１０分間インキュベートした。次に、培養物及びグリセロール混合物を再度混合してから、１．０ｍＬのアリコートを１０個の滅菌１．８ｍＬクリオバイアル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）の各々に採取して、−８０℃で保存した。
【０２９２】
２５ｍＬのシードフラスコ培養物を用いて、１．５ＬのＤＭ２培地を含む３Ｌバイオリアクターに接種した。バイオリアクター内での発酵は、約３０℃〜４０℃の温度で、ｐＨを約２．０〜７．０の範囲内で制御しながら、酸素摂取速度（ＯＵＲ）を２〜４５ｍモル／Ｌ／時の範囲に到らせる撹拌及び曝気条件下で実施した。本明細書に示す実施例では、バイオリアクター内の培養のための温度、ｐＨ及びＯＵＲは、それぞれ、３０℃、４．０及び１０〜２５である。
【０２９３】
３−ＨＰ及びβ−アラニンの分析のために、培養物サンプルを採取し、０．４５μｍの９６ウェルフィルタープレートを通して濾過し、０．２％ＮＨ4ＯＨでさらに１０×希釈した。サンプル中の被検体濃度に応じて、水でさらに希釈を実施した。２０％ＭｅＯＨ、１ｍＭ  ＮＨ4Ａｃ、０．１％ＮＨ4ＯＨ及び１５ｍｇ／Ｌの13Ｃで均質標識した３−ＨＰ（３−ＨＰの内標準として）、又は２０％ＭｅＯＨ、１％ギ酸及び３ｍｇ／Ｌの13Ｃで均質標識したβ−アラニン（β−アラニンの内標本として）のサンプル緩衝液で、さらに１０×希釈を実施した。合計希釈倍率は、β−アラニン又は３−ＨＰの濃度に応じて、約１００〜１０００であった。
【０２９４】
表４に記載する計器設定及びカラムを用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４１０  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄ  ＭＳ／ＭＳ検出器でＭａｓｓＨｕｎｔｅｒプログラムにより制御されるＡｇｉｌｅｎｔ  １２００ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）に２μＬのサンプルを注入した。定量イオンフラグメントピーク面積とその安定な同位体対応部分（内標準から）との比を定量に使用して、イオン化抑制効果及び計器ドリフトを排除した。標準偏差は、日ごとのアッセイで５％未満であった。
【０２９５】
【表４】
2015536669.tif 000006
【０２９６】
消費されたグルコースを市販のキット：“Ｌｉｑｕｉｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｏｘｉｄａｓｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｓｅｔ”（Ｐｏｉｎｔｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ）のプロトコルに従って測定した。
【０２９７】
異なる時点で、株ＭｅＪｉ４６１、ＭＢｉｎ５５８、ＭＢｉｎ５５９、及びＭＢｉｎ５６０について得られた発酵を図１７（３−ＨＰ／ＤＣＷ）及び１８（消費グルコース／ＤＣＷ）に示す。４１時間及び４６時間の時点での３−ＨＰ発酵及びグルコース消費の具体的結果を表５及び６にそれぞれ示す。酵母株ＭＢｉｎ５５８、ＭＢｉｎ５５９、及びＭＢｉｎ５６０（活性３−ＨＰ経路と、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドとを含む）は、対応する株ＭｅＪｉ４６１（同じ活性３−ＨＰ経路を含むが、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドは含まない）と比較して、３−ＨＰ発酵及びグルコース消費の両方において有意な改善を示した。
【０２９８】
【表５】
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【０２９９】
【表６】
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【０３００】
４６時間後に、組換え酵母株ＭｅＪｉ４６１、ＭＢｉｎ５５８、ＭＢｉｎ５５９、ＭＢｉｎ５６０、ＭＢｉｎ５９６、ＭＢｉｎ５９７、ＭＢｉｎ５９８、及びＭＢｉｎ５９９について前述のように実施した発酵実験の更なる比較を以下の表７に示す。
【０３０１】
【表７】
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【０３０２】
活性３−ＨＰ経路を含み、かつストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧＡＰＮを発現する酵母株（ＭＢｉｎ５５８／５５９／５６０）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）ＧＡＰＮを発現する酵母株（ＭＢｉｎ５９６／５９７）又はトウモロコシ（Ｚ．ｍａｙｓ）ＧＡＰＮを発現する酵母株（ＭＢｉｎ５９８／５９９）は、各々、対応する株ＭｅＪｉ４６１（同じ活性３−ＨＰ経路を含むが、ＧＡＰＮをコードする異種ポリヌクレオチドは含まない）と比較して、３−ＨＰ発酵及びグルコース消費の両方において有意な改善を示した。
【０３０３】
以上のことは、理解を明瞭にする目的で、説明及び例としてある程度詳細に記載してきたが、当業者には、あらゆる任意の同等の態様又は変更が実施され得ることは明らかである。従って、説明及び実施例を本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。
【０３０４】
ある態様では、本発明は、以下の番号付けしたパラグラフによって表すことができる。
【０３０５】
［１］活性３−ＨＰ経路を含む組換え酵母細胞であって、細胞が、非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含み；かつ、細胞が、３−ＨＰを産生することができる、組換え酵母細胞。
【０３０６】
［２］非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする前記異種ポリヌクレオチドが、ＧＡＰＮコード配列に対して外来のプロモータを含む、パラグラフ［１］に記載の組換え酵母細胞。
【０３０７】
［３］前記細胞が、同一の条件下で培養したとき、非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含まない細胞と比較して、より多くの量の３−ＨＰを産生する、パラグラフ［１］又は［２］に記載の組換え酵母細胞。
【０３０８】
［４］前記細胞が、同一の条件下で培養したとき、非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含まない細胞と比較して、少なくとも１０％多い（例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、又は少なくとも２００％多い）３−ＨＰを産生することができる、パラグラフ［３］に記載の組換え酵母細胞。
【０３０９】
［５］前記非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）が、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１８９、１９０、１９２、若しくは１９４のアミノ酸配列と、少なくとも５０％、例えば、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する、パラグラフ［１］〜［４］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３１０】
［６］前記非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）が、配列番号１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１８９、１９０、１９２、若しくは１９４を含むか、又はこれからなるアミノ酸配列を有する、パラグラフ［１］〜［４］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３１１】
［７］前記細胞が、以下：
ＰＰＣをコードする異種ポリヌクレオチド；
ＰＹＣをコードする異種ポリヌクレオチド；
ＡＡＴをコードする異種ポリヌクレオチド；
ＡＤＣをコードする異種ポリヌクレオチド；
ＢＡＡＴ又はｇａｂＴをコードする異種ポリヌクレオチド；及び
３−ＨＰＤＨをコードする異種ポリヌクレオチド
から選択される１つ又は複数の異種ポリヌクレオチドを含む、パラグラフ［１］〜［６］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３１２】
［８］前記細胞が、ＰＹＣをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、パラグラフ［７］に記載の組換え酵母細胞。
【０３１３】
［９］前記ＰＹＣが、配列番号２、３、４、５、６、７、又は８のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する、パラグラフ［７］に記載の組換え酵母細胞。
【０３１４】
［１０］前記ＰＹＣが、配列番号２、３、４、５、６、７、又は８を含むか、又はこれからなるアミノ酸配列を有する、パラグラフ［７］に記載の組換え酵母細胞。
【０３１５】
［１１］前記細胞が、ＡＡＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、パラグラフ［７］〜［１０］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３１６】
［１２］前記ＡＡＴが、配列番号１４、１５、又は１６のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する、パラグラフ［１１］に記載の組換え酵母細胞。
【０３１７】
［１３］前記ＡＡＴが、配列番号１４、１５、又は１６を含むか、又はこれからなるアミノ酸配列を有する、パラグラフ［１１］に記載の組換え酵母細胞。
【０３１８】
［１４］前記細胞が、ＡＤＣをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、パラグラフ［７］〜［１３］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３１９】
［１５］前記ＡＤＣが、配列番号１７、１８、１３３、１３５、１３７、又は１３９のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する、パラグラフ［１４］に記載の組換え酵母細胞。
【０３２０】
［１６］前記ＡＤＣが、配列番号１７、１８、１３３、１３５、１３７、又は１３９を含むか、又はこれからなるアミノ酸配列を有する、パラグラフ［１４］に記載の組換え酵母細胞。
【０３２１】
［１７］前記細胞が、ＢＡＡＴ又はｇａｂＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、パラグラフ［７］〜［１６］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３２２】
［１８］前記ＢＡＡＴ又はｇａｂＴが、配列番号２０、２１、２２、２３、又は２４のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する、パラグラフ［１７］に記載の組換え酵母細胞。
【０３２３】
［１９］前記ＢＡＡＴ又はｇａｂＴが、配列番号２０、２１、２２、２３、又は２４を含むか、又はこれからなるアミノ酸配列を有する、パラグラフ［１７］に記載の組換え酵母細胞。
【０３２４】
［２０］前記ＢＡＡＴ又はｇａｂＴが、ｇａｂＴでもあるＢＡＡＴである、パラグラフ［１７］〜［１９］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３２５】
［２１］前記細胞が、３−ＨＰＤＨ（例えば、ＮＡＤＰＨを利用する３−ＨＰＤＨ）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む、パラグラフ［７］〜［２０］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３２６】
［２２］前記３−ＨＰＤＨが、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は１２９のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する、パラグラフ［２１］に記載の組換え酵母細胞。
【０３２７】
［２３］前記３−ＨＰＤＨが、配列番号２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は１２９を含むか、又はこれからなるアミノ酸配列を有する、パラグラフ［２１］に記載の組換え酵母細胞。
【０３２８】
［２４］前記３−ＨＰＤＨが、ＨＩＢＡＤＨでもある、パラグラフ［２１］〜［２３］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３２９】
［２５］前記３−ＨＰＤＨが、４−ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼでもある、パラグラフ［２１］〜［２３］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３３０】
［２６］前記細胞が、ＰＰＣをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、パラグラフ［７］〜［２５］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３３１】
［２７］前記ＰＰＣが、配列番号１０、１１、又は１２のアミノ酸配列と、少なくとも６０％、例えば、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有する、パラグラフ［２６］に記載の組換え酵母細胞。
【０３３２】
［２８］前記ＰＰＣが、配列番号１０、１１、又は１２を含むか、又はこれからなるアミノ酸配列を有する、パラグラフ［２６］に記載の組換え酵母細胞。
【０３３３】
［２９］前記酵母細胞が、クラブトリー陰性である、パラグラフ［１］〜［２８］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３３４】
［３０］前記酵母細胞が、イサタケンキア（Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ）属、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、トルラスポラ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ）属、ジゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、及びサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属から選択される属に属する、パラグラフ［１］〜［２９］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３３５】
［３１］前記酵母細胞が、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）／ピキア・ファーメンタンス（Ｐ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）クレード及びサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属クレードから選択されるクレードに属する、パラグラフ［３０］に記載の組換え酵母細胞。
【０３３６】
［３２］前記酵母細胞が、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）、カンジダ・ランビカ（Ｃ．ｌａｍｂｉｃａ）、及びサッカロミセス・ブルデリ（Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ）から選択される、パラグラフ［３０］に記載の組換え酵母細胞。
【０３３７】
［３３］前記酵母細胞が、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）酵母細胞である、パラグラフ［３２］に記載の組換え酵母細胞。
【０３３８】
［３４］前記酵母細胞が、イサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＣＮＢ１酵母細胞である、パラグラフ［３３］に記載の組換え酵母細胞。
【０３３９】
［３５］前記酵母細胞が、五炭糖を発酵させることができない、パラグラフ［１］〜［３４］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３４０】
［３６］前記細胞が、ＰＤＣ、ＡＤＨ、ＧＡＬ６、ＣＹＢ２Ａ、ＣＹＢ２Ｂ、ＧＰＤ、ＧＰＰ、ＡＬＤ、又はＰＣＫをコードする１つ又は複数の内在性遺伝子に対する破壊をさらに含む、パラグラフ［１］〜［３５］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３４１】
［３７］前記細胞が、ＰＤＣをコードする内在性遺伝子に対する破壊をさらに含む、パラグラフ［３６］に記載の組換え酵母細胞。
【０３４２】
［３８］前記細胞が、配列番号１８６と、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するＰＤＣをコードする内在性遺伝子に対する破壊を含む、パラグラフ［３７］に記載の組換え酵母細胞。
【０３４３】
［３９］前記細胞が、配列番号１８６を含むか、又はこれからなるアミノ酸配列を有するＰＤＣをコードする内在性遺伝子に対する破壊を含む、パラグラフ［３７］に記載の組換え酵母細胞。
【０３４４】
［４０］前記ＰＤＣをコードする遺伝子のコード配列が、配列番号１８５と、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、パラグラフ［３６］〜［３９］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３４５】
［４１］前記ＰＤＣをコードする内在性遺伝子のコード配列が、配列番号１８５含むか、又はこれからなる、パラグラフ［３６］〜［３９］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３４６】
［４２］前記ＰＤＣをコードする内在性遺伝子に対する破壊が、ＰＤＣをコードする遺伝子のコード配列内で起こる、パラグラフ［３７］〜［４１］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３４７】
［４３］前記ＰＤＣをコードする内在性遺伝子に対する破壊が、ＰＤＣをコードする遺伝子のプロモータ配列内で起こる、パラグラフ［３７］〜［４１］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３４８】
［４４］前記細胞が、同一の条件下で培養したとき、前記破壊を含まない細胞と比較して、少なくとも２５％少ない（例えば、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、又は少なくとも９０％少ない）ＰＤＣを産生する、パラグラフ［３７］〜［４３］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３４９】
［４５］前記ＰＤＣをコードする内在性遺伝子が、不活性化されている、パラグラフ［３７］〜［４４］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３５０】
［４６］前記細胞が、同一の条件下で培養したとき、前記ＰＤＣをコードする内在性遺伝子に対する破壊を含まない細胞と比較して、低減した量の（例えば、少なくとも２５％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、又は少なくとも９０％少ない）エタノールを産生する、パラグラフ［３７］〜［４５］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３５１】
［４７］前記細胞が、同一の条件下で培養したとき、前記ＰＤＣをコードする内在性遺伝子に対する破壊を含まない細胞と比較して、より多くの量の３−ＨＰを産生する、パラグラフ［３７］〜［４６］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３５２】
［４８］前記細胞が、同一の条件下で培養したとき、前記ＰＤＣをコードする内在性遺伝子に対する破壊を含まない細胞と比較して、少なくとも１０％多い（例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、又は少なくとも２００％多い）３−ＨＰを産生することができる、パラグラフ［３７］〜［４７］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３５３】
［４９］前記細胞が、ＧＰＤをコードする内在性遺伝子に対する破壊をさらに含む、パラグラフ［３７］〜［４８］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３５４】
［５０］前記細胞が、配列番号１８８と、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、ＧＰＤをコードする内在性遺伝子に対する破壊をさらに含む、パラグラフ［４９］に記載の組換え酵母細胞。
【０３５５】
［５１］前記細胞が、配列番号１８８を含むか、又はこれからなるアミノ酸配列を有するＧＰＤをコードする内在性遺伝子に対する破壊を含む、パラグラフ［４９］に記載の組換え酵母細胞。
【０３５６】
［５２］前記ＧＰＤをコードするコード配列が、配列番号１８７と、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、パラグラフ［４９］〜［５１］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３５７】
［５３］前記ＧＰＤをコードする内在性遺伝子のコード配列が、配列番号１８７を含むか、又はこれからなる、パラグラフ［４９］〜［５１］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３５８】
［５４］前記ＧＰＤをコードする内在性遺伝子に対する破壊が、ＧＰＤをコードする遺伝子のコード配列内に起こる、パラグラフ［４９］〜［５３］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３５９】
［５５］前記ＧＰＤをコードする内在性遺伝子に対する破壊が、ＧＰＤをコードする遺伝子のプロモータ配列内に起こる、パラグラフ［４９］〜［５３］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３６０】
［５６］前記細胞が、同一の条件下で培養したとき、前記破壊を含まない細胞と比較して、少なくとも２５％少ない（例えば、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、又は少なくとも９０％少ない）ＧＰＤを産生する、パラグラフ［４９］〜［５５］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３６１】
［５７］前記ＧＰＤをコードする内在性遺伝子が、不活性化されている、パラグラフ［４９］〜［５６］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３６２】
［５８］前記細胞が、同一の条件下で培養したとき、前記ＧＰＤをコードする内在性遺伝子に対する破壊を含まない細胞と比較して、低減した量の（例えば、少なくとも２５％少ない、少なくとも５０％少ない、少なくとも６０％少ない、少なくとも７０％少ない、少なくとも８０％少ない、又は少なくとも９０％少ない）グリセロールを産生する、パラグラフ［４９］〜［５７］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３６３】
［５９］前記細胞が、同一の条件下で培養したとき、前記ＰＤＣをコードする内在性遺伝子に対する破壊を含まない細胞と比較して、より多くの量の３−ＨＰを産生する、パラグラフ［４９］〜［５８］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３６４】
［６０］前記細胞が、同一の条件下で培養したとき、前記ＰＤＣをコードする内在性遺伝子に対する破壊を含まない細胞と比較して、少なくとも１０％多い（例えば、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、又は少なくとも２００％多い）３−ＨＰを産生することができる、パラグラフ［４９］〜［５９］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３６５】
［６１］前記細胞が、７５ｇ／Ｌ以上の３−ＨＰを含有する培地において、４未満のｐＨで増殖することができる、パラグラフ［１］〜［６０］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３６６】
［６２］前記細胞が、３−ＨＰ耐性酵母細胞である、パラグラフ［１］〜［６１］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３６７】
［６３］前記細胞が、突然変異及び／又は選択を受けており、これにより、突然変異及び／又は選択された細胞が、同じ種の野生型細胞より高度の３−ＨＰ耐性を有する、パラグラフ［１］〜［６２］のいずれかに記載の組換え酵母細胞。
【０３６８】
［６４］前記細胞が、非リン酸化ＮＡＤＰ依存性グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＮ）をコードする異種ポリヌクレオチドで遺伝子改変される前に、突然変異及び／又は選択を受けている、パラグラフ［６３］に記載の組換え酵母細胞。
【０３６９】
［６５］前記細胞が、乳酸又は３−ＨＰの存在下での選択を受けている、パラグラフ［６３］又は［６４］に記載の組換え酵母細胞。
【０３７０】
［６６］前記選択が、ケモスタット選択である、パラグラフ［６５］に記載の組換え酵母細胞。
【０３７１】
［６７］パラグラフ［１］〜［６６］のいずれかに記載の組換え酵母細胞を含む組成物。
【０３７２】
［６８］前記組成物が、発酵性培地を含む、パラグラフ［６７］に記載の組成物。
【０３７３】
［６９］前記発酵性培地が、スクロース、グルコース、及び／又はフルクトースを含む、パラグラフ［６８］に記載の組成物。
【０３７４】
［７０］前記発酵性培地が、１％未満の五炭糖を含む、パラグラフ［６７］〜［６９］のいずれかに記載の組成物。
【０３７５】
［７１］さらに３−ＨＰを含む、パラグラフ［６７］〜［７０］のいずれかに記載の組成物。
【０３７６】
［７２］前記３−ＨＰが、約１ｇ／Ｌ超、例えば、約２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、又は２５０ｇ／Ｌ超の力価である、パラグラフ［７１］に記載の組成物。
【０３７７】
［７３］前記培地が、５未満、例えば、約１．５〜約４．５、約２．０〜約４．０、又は約２．０〜約３．５の範囲のｐＨである、パラグラフ［６８］〜［７２］のいずれかに記載の組成物。
【０３７８】
［７４］３−ＨＰを生産する方法であって、以下：
（ａ）３−ＨＰを産生するのに好適な条件下の発酵性培地において、パラグラフ［１］〜［６６］のいずれかに記載の組換え酵母細胞を培養するステップと；
（ｂ）３−ＨＰを回収するステップと
を含む方法。
【０３７９】
［７５］前記発酵性培地が、スクロース、グルコース、及び／又はフルクトースを含む、パラグラフ［７４］に記載の方法。
【０３８０】
［７６］前記発酵性培地が、１％未満の五炭糖を含む、パラグラフ［７４］又は［７５］に記載の方法。
【０３８１】
［７７］生産される３−ＨＰが、約１ｇ／Ｌ超、例えば、約２ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、２０ｇ／Ｌ、２５ｇ／Ｌ、３０ｇ／Ｌ、３５ｇ／Ｌ、４０ｇ／Ｌ、４５ｇ／Ｌ、５０ｇ／Ｌ、５５ｇ／Ｌ、６０ｇ／Ｌ、６５ｇ／Ｌ、７０ｇ／Ｌ、７５ｇ／Ｌ、８０ｇ／Ｌ、８５ｇ／Ｌ、９０ｇ／Ｌ、９５ｇ／Ｌ、１００ｇ／Ｌ、１２５ｇ／Ｌ、１５０ｇ／Ｌ、２００ｇ／Ｌ、又は２５０ｇ／Ｌ超の力価である、パラグラフ［７４］〜［７６］のいずれかに記載の方法。
【０３８２】
［７８］得られる３−ＨＰが、実質的に純粋である、［７４］〜［７７］のいずれかに記載の方法。
【０３８３】
［７９］前記発酵性培地が、５未満、例えば、約１．５〜約４．５、約２．０〜約４．０、又は約２．０〜約３．５の範囲のｐＨである、パラグラフ［７７］〜［７８］のいずれかに記載の方法。
【０３８４】
［８０］アクリル酸又はその塩を生産する方法であって、以下：
（ａ）３−ＨＰを産生するのに好適な条件下の培地において、パラグラフ［１］〜［６６］のいずれかに記載の組換え酵母細胞を培養するステップ；
（ｂ）３−ＨＰを回収するステップ；
（ｃ）アクリル酸又はその塩を産生するのに好適な条件下で３−ＨＰを脱水するステップ；及び
（ｄ）アクリル酸又はその塩を回収するステップ
を含む方法。
【０３８５】
［８１］前記組換え酵母細胞が、１％未満の五炭糖を含む発酵性培地において培養されるイサタケンキア・オリエンタリス（Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ）ＣＮＢ１酵母細胞である、パラグラフ［７４］〜［８０］のいずれか１つに記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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