(57)【要約】例えば、免疫反応、自己免疫性障害、炎症性疾患、代謝障害、血管機能、神経変性疾患または腫瘍に関連する天然の内因性タンパク質などの抗原を認識するヒト起源の新規な結合分子、特にヒト抗体ならびにその断片、誘導体および変異体が提供される。より具体的には、ヒト自己イムノソームおよび対応するモノクローナル抗体リザーバが提供される。加えて、診断および治療に使用するための医薬組成物、キットおよび方法が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の抗原特異性を有するモノクローナル抗体を単離する方法であって、中枢性および／もしくは末梢性寛容の異常または自己寛容の喪失に罹患している哺乳動物から得られた試料から、前記モノクローナル抗体を発現するＢ細胞が単離される、方法。
【請求項２】
前記障害が、自己寛容の発生障害または無秩序な発生に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記障害が単一遺伝子性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記障害が、自己免疫調節因子（ＡＩＲＥ：Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）遺伝子の少なくとも１つの突然変異に関連する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物がヒト患者である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記障害が自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィ（ＡＰＥＣＥＤ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記哺乳動物が、慢性粘膜皮膚カンジダ症（ＣＭＣ）、副甲状腺機能低下症および自己免疫性副腎不全（アディソン病）からなる群より選択される１つ以上の症候を患っている、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記哺乳動物がマウスである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記マウスがＡＩＲＥ欠損マウスである、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が記憶Ｂ細胞を含むか、または記憶Ｂ細胞に由来する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料が、炎症、自己免疫性障害、細胞の成長および分化、筋肉機能、ならびに神経変性に関与する分泌型タンパク質または膜貫通型タンパク質の少なくとも１つのメンバーを含む抗原パネルに対して血清反応性を示す、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料が、図１に示されているものと実質的に同じ血清反応性を示す、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が立体構造エピトープを認識する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がヒト抗原を認識する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗体がマウス抗原を実質的に認識しない、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体が抗原の生物学的活性を中和することができる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
（ｉ）所望の特異性の抗体を含有すると同定された試料から、Ｂ細胞またはＢ記憶細胞を精製する工程；および
（ｉｉ）Ｂ細胞を培養し、モノクローナル抗体を単離する工程；または
（ｉｉｉ）前記Ｂ細胞またはＢ記憶細胞から、前記抗体の免疫グロブリン遺伝子レパートリを得る工程；および
（ｉｖ）前記レパートリを使用して、宿主細胞で前記抗体または抗原結合断片を発現させ、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を単離する工程
をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｉｉｉ）が、
（ｉｖ）前記Ｂ細胞または記憶Ｂ細胞からｍＲＮＡを得る工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）のｍＲＮＡからｃＤＮＡを得る工程；および
（ｖｉ）プライマー伸長反応を使用して、前記ｃＤＮＡから、前記抗体の重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）に対応する断片を増幅する工程
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記宿主が、酵母細胞、植物細胞または動物細胞である、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗原が、分泌型、膜会合型もしくは膜結合型、または膜貫通型の、細胞外タンパク質およびタンパク質、多糖、リポポリタンパク質ならびにリポ多糖からなる群より選択される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗原が、ロイコトリエン、リンホカイン、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロンおよびケモカインからなる群より選択される、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離されたモノクローナル抗体を薬学的に許容し得る担体と混合する工程をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
好ましくは、ＡＩＲＥ遺伝子における少なくとも１つの突然変異を特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項で定義されたＢ細胞。
【請求項２５】
慢性炎症および免疫性疾患の治療または診断に使用するための、抗体、またはそれらの可変領域および前記抗体のＣＤＲの少なくとも１つをコードする核酸をそれぞれ単離するためのＡＰＥＣＥＤ患者由来のＢ細胞の使用。
【請求項２６】
組換え細胞を調製するための方法であって、
（ｉ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法によって、Ｂ細胞クローンを調製する工程；
（ｉｉ）前記Ｂ細胞クローンから、目的の抗体をコードする核酸を得る工程；および
（ｉｉｉ）前記核酸を発現宿主に挿入して、その宿主で目的の抗体を発現させる工程
を含む、方法。
【請求項２７】
組換え細胞を調製するための方法であって、
（ｉ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法によって、Ｂ細胞クローンを調製する工程；
（ｉｉ）前記Ｂ細胞クローンから、目的の抗体をコードする核酸を配列決定する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）からの配列情報を使用して、発現宿主に挿入するための核酸を調製して、その宿主で目的の抗体を発現させる工程
を含む、方法。
【請求項２８】
前記発現宿主が、酵母細胞、植物細胞または動物細胞である、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
目的の抗体をコードする核酸分子を調製するための方法であって、
（ｉ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法によって、Ｂ細胞クローンを調製する工程；
（ｉｉ）前記Ｂ細胞クローンから、目的の抗体をコードする核酸を得る工程
を含む、方法。
【請求項３０】
目的の抗体をコードする核酸配列を得るための方法であって、
（ｉ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法によって、Ｂ細胞クローンを調製する工程；
（ｉｉ）前記Ｂ細胞クローンから、目的の抗体をコードする核酸を配列決定する工程
を含む、方法。
【請求項３１】
医薬用途用の、または治療介入標的としての抗体を調製するための方法であって、
（ｉ）請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法によって、目的の抗体を産生するＢ細胞を選択する工程；
（ｉｉ）選択されたＢ細胞から、目的の抗体をコードする核酸を得、および／またはこれを配列決定する工程；
（ｉｉｉ）前記核酸を挿入するか、または前記核酸を使用して、目的の抗体を発現することができる発現宿主を調製する工程；
（ｉｖ）目的の抗体が発現される条件下で、前記発現宿主を培養または継代培養する工程；および場合により、
（ｖ）目的の抗体を精製する工程
を含む、方法。
【請求項３２】
工程（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間において前記核酸を操作して、制限部位を導入し、コドン使用頻度を変化させ、および／または転写および／または翻訳調節配列を付加または最適化する、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
抗体が、
（ｉ）インターロイキン−１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）、および／またはインターロイキン−１７Ｆ（ＩＬ−１７Ｆ）；
（ｉｉ）インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）；または
（ｉｉｉ）ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロ二量体
に対するものである、請求項１〜２３または２６〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１〜２２または３１〜３３のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３５】
ヒト抗体である、請求項３４に記載の抗体。
【請求項３６】
（ｉ）ＡＩＲＥ遺伝子の突然変異に関連する障害に罹患しているヒト被験体の試料から、目的の抗体を産生するＢ細胞を選択すること；
（ｉｉ）選択されたＢ細胞から、目的の抗体をコードする核酸を得、および／またはこれを配列決定すること；
（ｉｉｉ）前記核酸を挿入するか、または前記核酸を使用して、目的の抗体を発現することができる発現宿主を調製すること；
（ｉｖ）目的の抗体が発現される条件下で、前記発現宿主を培養または継代培養すること；および、
（ｖ）目的の抗体を精製すること
によって得られる、請求項３４または３５に記載の抗体。
【請求項３７】
立体構造エピトープを特異的に認識し、抗原の生物学的活性を中和することができるヒト抗体である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３８】
その可変領域に、
（ａ）  （ｉ）図１５（ＶＨ）（配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５）；および
（ｉｉ）図１５（ＶＬ）（配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９、５７）
に示されているＶＨおよび／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）；
（ｂ）図１５に示されているＶＨおよび／またはＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的な変化から生じるアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的な変化から生じるアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽可変領域；
（ｅ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｆ）（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列
を含む、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項３９】
表１７に示されているＣＨおよびＣＬアミノ酸配列（配列番号１１、１３、１９、２１、２７、２９、３５、３７、４３、４５、５１、５３、５９、６１）から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＣＨおよび／またはＣＬ定常領域を含む、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４０】
請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片の一方の免疫グロブリン鎖の少なくとも可変領域をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４１】
場合により、前記抗体の他方の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードする請求項４０に記載のポリヌクレオチドと組み合わせて、請求項４０に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクタ。
【請求項４２】
請求項４０に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４１に記載のベクタを含む、宿主細胞。
【請求項４３】
検出可能に標識されているか、または薬物に結合している、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４４】
検出可能な標識が、酵素、放射性同位体、フルオロフォアおよび重金属からなる群より選択される、請求項４３に記載の抗体または抗原結合断片。
【請求項４５】
請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の抗体の抗イディオタイプ抗体。
【請求項４６】
請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の抗体によって特異的に認識されるエピトープを含む、合成ペプチドまたはペプチド系化合物。
【請求項４７】
請求項１〜９のいずれか一項で定義された障害の処置に使用するための、請求項４５に記載の抗イディオタイプ抗体または請求項４６に記載のペプチドもしくはペプチド系化合物。
【請求項４８】
請求項３４〜３９、４３または４４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、請求項４０に記載のポリヌクレオチド、請求項４１に記載のベクタ、請求項４２に記載の細胞、請求項４５に記載の抗イディオタイプ抗体または請求項４６に記載のペプチドもしくはペプチド系化合物を含む、組成物。
【請求項４９】
好ましくは異なる特異性を有する少なくとも２種の前記抗体を含む、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記少なくとも２種の抗体が、好ましくは異なるエピトープで同じ抗原を認識する、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
医薬組成物であり、薬学的に許容し得る担体をさらに含む、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド、抗ヒスタミンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、炎症または自己免疫性障害を処置するのに有用なさらなる薬剤をさらに含む、請求項５１に記載の医薬組成物。
【請求項５３】
診断組成物であり、免疫診断法または核酸ベースの診断法に通常使用される試薬をさらに含む、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
炎症もしくは自己免疫性障害の進行を処置または予防するうえで使用するための、炎症もしくは自己免疫性障害に関連する症候を改善するための、炎症もしくは自己免疫性障害の存在について被験体を診断またはスクリーニングするための、または炎症もしくは自己免疫性障害を発症する被験体のリスクを決定するための、請求項３４〜３９、４３または４４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、請求項４５に記載の抗イディオタイプ抗体または請求項４６に記載のペプチドもしくはペプチド系化合物。
【請求項５５】
静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、非経口投与、またはエアロゾルとして投与されるように設計されている、請求項３４〜３９、４３または４４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、請求項４５に記載の抗イディオタイプ抗体または請求項４６に記載のペプチドもしくはペプチド系化合物。
【請求項５６】
炎症または自己免疫性障害に関連する障害を処置する方法であって、治療有効量の請求項３４〜３９、４３または４４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、請求項４５に記載の抗イディオタイプ抗体または請求項４６に記載のペプチドもしくはペプチド系化合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【請求項５７】
前記障害が、尋常性座瘡；関節炎、例えば、痛風性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、変形性関節症、乾癬性関節炎、関節リウマチ；喘息；セリアック病；慢性前立腺炎；皮膚炎；真性糖尿病１型；糸球体腎炎；過敏症；心筋炎；多発性硬化症；炎症性腸疾患；骨盤内炎症性疾患；多発性筋炎；乾癬；サルコイドーシス；血管炎；間質性膀胱炎または再灌流障害もしくは移植拒絶反応により生じる炎症からなる群より選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
静脈内的に、筋肉内的に、皮下的に、腹腔内的に、鼻腔内的に、非経口的に、局所的に、経皮的にまたはエアロゾルとして投与を実施する、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
炎症または自己免疫性障害に関係する障害を診断および／または処置する方法であって、
（ｉ）請求項３４〜３９、４３または４４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片の少なくとも１つのＣＤＲ；または
（ｉｉ）少なくとも１つの請求項４５に記載の抗イディオタイプ抗体または請求項４６に記載のペプチドもしくはペプチド系化合物
を含む治療有効量のリガンド結合分子を被験体に投与することを含む、方法。
【請求項６０】
ペプチドの請求項のいずれか１つで定義された障害関連タンパク質の存在を伴う障害を診断するためのキットであって、請求項３４〜３９、４３〜４４のいずれか一項に記載の抗体もしくは抗原結合断片、請求項４５に記載の抗イディオタイプ抗体または請求項４６に記載のペプチドもしくはペプチド系化合物を、場合により使用のための試薬および／または説明書と共に含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、例えば、免疫反応、自己免疫性障害、炎症性疾患、代謝障害、血管機能、神経変性疾患または腫瘍に関連する天然の内因性タンパク質などの抗原を認識する哺乳動物（好ましくは、ヒト）起源の新規な結合分子、特にヒトモノクローナル抗体ならびにその断片、誘導体および変異体に関する。加えて、このような結合分子およびその模倣体を含む組成物、障害の処置および診断に有用な新規な結合分子（これは抗体でもよいし、または抗体でなくてもよい）、標的および薬物をスクリーニングする方法が記載されている。さらに、本発明は、免疫療法に使用するための薬剤としての、ならびに自己免疫性障害および自己炎症性障害および悪性腫瘍の治療介入標的としての自己抗体に関する。より具体的には、本発明は、免疫調節に関与する遺伝子における突然変異に通常起因する中枢性および／もしくは末梢性寛容の異常または自己寛容の喪失に罹患している被験体由来のＢ細胞から単離されたモノクローナル自己抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の不適切な反応は、関連生物にストレス症候を引き起こし得る。動物またはヒトの健康に対して通常は有意な影響を与えない外来物質または物理的状態に対する過剰な免疫応答は、皮膚炎などの軽度な反応から、アナフィラキシーショックまたは様々な種類の血管炎などの生命を脅かす状況に及ぶ症候を伴うアレルギーにつながり得る。内因性抗原に対する免疫応答は、自己免疫性障害、例えば、全身性エリテマトーデス、特発性自己免疫性溶血性貧血、悪性貧血、１型真性糖尿病、水疱性皮膚疾患および様々な種類の関節炎を引き起こし得る。
【０００３】
免疫反応は協調的に起こるものであり、いくつかの細胞が関与し、関与する細胞間のシグナル伝達分子（例えば、サイトカイン）による情報伝達を必要とする。この情報伝達は、例えば、シグナルの妨害または各受容体の遮断によって影響され得るかまたは阻害され得る。
【０００４】
サイトカインは、ナノモル濃度〜ピコモル濃度で体液性調節因子として作用する分泌型可溶性タンパク質、ペプチドおよび糖タンパク質であり、全身レベルで作用し、正常または病理学的条件下のいずれかで個々の細胞および組織の機能活性を調節するという点で、古典的なホルモンのように振る舞う。サイトカインは、特殊な腺内の組織化された特殊な細胞によって産生されないという点で、ホルモンとは異なる。すなわち、それらは、先天性免疫および適応免疫に関与する実質的にすべての細胞、例えば、上皮細胞、マクロファージ、樹状細胞（ＤＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって、特にＴ細胞（その中でもとりわけＴヘルパー（Ｔｈ）リンパ球）によって発現されるので、これらのメディエータの単一の器官または細胞源は存在しない。現時点では、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７およびｉＴｒｅｇのＴ細胞サブクラスは、発現されるサイトカインの特定のスペクトル、およびそれらによって調節される各免疫反応に応じて定義されている。
【０００５】
これに関して、Ｔｈ１細胞の主要サイトカイン産物は、ＩＦＮ−γ、リンホトキシン−αおよびインターロイキン−２（ＩＬ−２）である。Ｔｈ１細胞は、細胞内病原体に対する免疫反応を媒介し、いくつかの自己免疫性疾患の一因である（非特許文献１、非特許文献２）。Ｔｈ２細胞は、主にＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−２５およびアンフィレグリンを産生する。Ｔｈ２細胞は、細胞外寄生虫に対する免疫反応を媒介し、自己免疫およびアレルギー、例えば、喘息、１型真性糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）および関節リウマチ（ＲＡ）に関与する（例えば、前掲の非特許文献１および非特許文献２を参照のこと）。
【０００６】
いくつかのリンパ球、例えば、ガンマデルタＴ細胞およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞のサブセットは、Ｔｈ１およびＴｈ２サイトカインの両方を産生する。誘導された制御性（ｉＴｒｅｇ）細胞の主要産物は、ＩＬ−１０、ＩＬ−３５およびＴＧＦ−βである。ｉＴｒｅｇ細胞は、免疫寛容、リンパ球のホメオスタシスおよび免疫反応の調節に関与する。
【０００７】
Ｔｈ１７細胞の主要サイトカイン産物は、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２である；Ｔｈ１
７細胞は、細胞外の細菌および真菌に対する免疫反応を媒介し、炎症の媒介および乾癬などの自己免疫性疾患にも関与する（非特許文献３、非特許文献４）。サイトカイン産生病態生理学的活性のこのスペクトルは、ガンマデルタＴ細胞のサブセットで非常に類似している。
【０００８】
サイトカインは、それらの各機能に応じて、３つの機能カテゴリー：先天性免疫反応の調節、適応免疫反応の調節、および造血の刺激に分類することができる。例えば、細胞活性化、増殖、分化、動員、または他の生理学的応答（例えば、標的細胞による炎症に特徴的なタンパク質の分泌）に関する、前記３つのカテゴリー内に含まれるそれらの多面的活性により、サイトカイン産生の異常調節によって媒介される細胞シグナル伝達障害が、免疫反応不全に関連する多くの障害、例えば、炎症および癌の原因であることが判明している。炎症および自己免疫性疾患の中心は、サイトカインＩＬ−１７ＡおよびＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２２、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３ならびにＩＦＮ−αおよびＩＦＮ−ωのサブタイプである。ＩＬ−１２、ＩＬ−２３およびＩＦＮを除いて、前記サイトカインは、いくつかの自己免疫性障害およびアレルギー性障害ならびに腫瘍免疫学において十分に説明されている役割を有するエフェクタＴ細胞サブセットＴｈ１７によって発現される。
【０００９】
無秩序なＴｈ１７反応は、慢性炎症および重度の免疫病理学的症状に関連する。動物モデルおよび罹患患者の組織における研究により、Ｔｈ１７経路が、慢性炎症性疾患、例えば、尋常性座瘡；関節炎、例えば、痛風性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、変形性関節症、乾癬性関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）；喘息；セリアック病；クローン病（ＣＤ）；慢性前立腺炎；皮膚炎（例えば、アトピー性皮膚炎）；真性糖尿病１型；糸球体腎炎；過敏症；心筋炎；多発性硬化症；炎症性腸疾患；骨盤内炎症性疾患；多発性筋炎；乾癬（ＰＳ）；サルコイドーシス；血管炎；間質性膀胱炎または再灌流障害もしくは移植拒絶反応により生じる炎症に関与することが確認された。ＩＬ−１７Ａは、炎症促進性サイトカイン、ケモカインおよびマトリックスメタロプロテインの産生を誘導する。これは、炎症性細胞の浸潤および細胞外マトリックスの破壊を引き起こす。ＩＬ−１７Ａに加えて、ＩＬ−１７Ａとヘテロ二量体化することができる関連サイトカインＩＬ−１７Ｆは、ＲＡおよびＣＤの病因であると最近では暗示されている。
【００１０】
第３のＴｈ−１７関連サイトカインであるＩＬ−２２（非特許文献５）は、上皮細胞上で主に作用するサイトカインである。皮膚では、それは、ケラチノサイトの増殖および表皮過形成を媒介し、乾癬などの炎症性疾患において中心的な役割を果たす。ＩＬ−２２はＴｈ１７細胞の特徴的産物であり、ＩＬ−２３刺激後に、他の免疫細胞、特にＮＫｐ４４／ＮＫｐ４６を発現するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびリンパ組織インデューサ細胞によっても機能的に有意なレベルで分泌される。インターロイキン２２（ＩＬ−２２）は、上皮性免疫を媒介する抗炎症性サイトカインのＩＬ−１０ファミリーのメンバーである。ＩＬ−２２の発現は、炎症性腸疾患を有する個体の炎症を起こした性結腸粘膜で増強されている。重要なことに、ＩＬ−２２は、免疫細胞間の情報伝達には役立たない。それは上皮細胞（例えば、肝細胞）上で主に作用し、そこで、抗菌防御、再生、および損傷に対する保護を支援し、急性期反応物質およびいくつかのケモカインを誘導する（非特許文献６）。
【００１１】
ＩＬ−２３は慢性炎症の促進に重要なサイトカインであり、マクロファージおよび樹状細胞のような活性化炎症細胞から分泌される（総説については、非特許文献７、非特許文献８、さらに非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１を参照のこと）。最初、ＩＬ−２３は、Ｔｈ１７細胞の増殖および維持を支持する役割を有することが見出された（非特許文献１２、非特許文献１３）。しかしながら、それは、Ｆｏｘｐ３陽性制御性Ｔ細胞の活性（腸蓄積）の抑制（非特許文献１４、非特許文献１５、非特許文献１６）、および非Ｔ細胞源由来のＴｈ１７型サイトカインの発現の誘導（非特許文献１７、非特許文献１８）を含め、免疫反応に対する複数の効果を有することが示された。それは、例えば、乾癬および炎症性腸疾患における炎症に寄与している（前掲の刊行物および非特許文献１９を参照のこと）。ＩＬ−２３は、２つのサブユニットｐ１９およびｐ４０から構成される。後者のサブユニットは、ＩＬ−１２と共通している。
【００１２】
ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、オンコスタチンＭ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１αは、皮膚浸潤性免疫細胞および／またはケラチノサイトによって産生される強力なサイトカインであり、皮膚炎症を誘導する（非特許文献２０、非特許文献２１、非特許文献２２）。
【００１３】
重度のＲＡおよびＰＳなどの慢性炎症性疾患に対する最近の治療アプローチは、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）の遮断を含む。この方法はいくつかの症例では非常に有効であるが、多くの患者は「非応答者」である。さらに、ＴＮＦ−αの持続的中和は、微生物感染に対する感受性を増強し得るものであり、このことは、代替的かつより特異的な治療アプローチの必要性を強調している。これまでに、Ｔｈ−１７細胞の機能および／または分化の調節は、ＩＬ−１２のｐ４０に対するモノクローナル抗体（これは、ＩＬ−１２（ｐ３５とｐ４０とのヘテロ二量体）およびＩＬ−２３（ｐ１９とｐ４０とのヘテロ二量体、Ｔｈ１７細胞の成長因子）の両方を標的とする）を用いて最も成功している。ＩＬ−１２のｐ４０を標的とするこのような抗体、ウステキヌマブおよびＡＢＴ−８７４により、重度の慢性尋常性乾癬およびＣＤの緩和に成功している（非特許文献２３、非特許文献２４）。
【００１４】
Ｔｈ１７細胞および関連特性を有する細胞（例えば、ＩＬ−１７産生ガンマデルタＴ細胞）の生物学的作用を制御する最も実行可能な方法は、それら、およびそれらが産生するエフェクタサイトカインの選択を標的とすることであろう。この新規なアプローチは、病原体と闘うための（ＩＬ−２２の場合は、その組織修復および抗菌機能を発揮するための）他の非病原性アームをインタクトな状態にしつつ、ＰＳにおけるＩＬ−２２、ならびにＲＡおよびＣＤにおけるＩＬ−１７Ａ（およびＩＬ−１７Ｆ）の遮断を可能にする。また、何人かの初期応答者では、抗ＴＮＦ治療薬の有効性は経時的に弱まる。したがって、単剤療法に反応しない重度の症例は、２つ以上の生物学的薬物による併用療法を必要とし得る。ＩＬ−１７Ａに対するモノクローナル抗体が、臨床応用のために開発されている。ＰＳ、ＣＤおよび乾癬性関節炎のためのＩＬ−１７Ａに対するモノクローナル抗体（ＡＩＮ４５７）の第２相試験が進行中である。これまでに、ＩＬ−２２の阻害剤は、自己免疫性疾患の前臨床モデルでのみ試験されている（非特許文献２３、非特許文献２４）。
【００１５】
ヒトにおけるマウス抗体のような外来抗体に対する免疫反応により（ＨＡＭＡ反応；非特許文献２５、非特許文献２６）、現在の治療アプローチでは、大部分がヒト化されたバージョンの抗体が使用されている（非特許文献２７、非特許文献２８）。このような抗体を得るための１つのアプローチは、相補性決定領域（ＣＤＲ）を完全ヒトフレームワークに移植すること（これは、抗体のヒト化として公知の工程である）であった（非特許文献２９）。このアプローチは、マウスＣＤＲがヒト可変ドメインフレームワークに容易に移行しないという事実によって複雑であることが多く、その結果、ヒト化抗体親和性はそれらの親マウス抗体よりも低くなる。したがって、そのように人為操作された抗体の親和性を増加させるためには、多くの場合、さらなるおよび複雑な突然変異誘発実験が必要とされる。ヒト化抗体を達成するための別のアプローチは、その本来の抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子で置換したマウスに免疫付与し、これらの動物によって産生される抗体を単離することである。しかしながら、この方法には抗原による免疫付与が依然として必要であり、いくつかの抗原には毒性があるので、すべての抗原で可能ではない。さらに、この方法は、特異株のトランスジェニックマウスによる産生に限定されている。
【００１６】
別の方法は、例えば、ＩＬ−１３特異的抗体の作製について特許文献１に記載されているように、ファージディスプレイなどのヒト抗体ライブラリを使用することである。ここでは、ヒト抗体遺伝子をファージ集団に挿入することによって、ヒトｓｃＦｖ／Ｆａｂ断片をその表面上に提示するようにバクテリオファージを人為操作する。残念ながら、多価ディスプレイの場合にはタンパク質配列のサイズ制限があること、細菌からタンパク質（すなわち、抗体のｓｃＦｖ／Ｆａｂ断片）を分泌させる必要があること、ライブラリのサイズ制限があること、産生および試験可能な抗体の数が限られること、自然免疫付与によって生じる体細胞超変異を有する抗体の割合が減少すること、ファージによってコードされるすべてのタンパク質が融合タンパク質であること（これは、いくつかのタンパク質の結合に関する活性またはアクセス性を制限し得る）を含め、この方法にも多数の欠点がある。同様に、特許文献２には、ファージ上に提示された抗体セグメントレパートリからの自己抗体の産生が記載されている。これに関して、ファージライブラリは、免疫付与されていないヒトから作製されている（例えば、実施例１；第１６頁４３〜５１行目；実施例２、第１７頁、段落［０１５８］、５７〜５８行目）。しかしながら、この特許出願に記載されている方法は、哺乳動物、すなわちヒトの体内で産生および成熟された抗体と比較して、ファージライブラリから作製された抗体の上記一般的な欠点に悩まされている。
【００１７】
上記を考慮すると、単剤療法または組み合わせアプローチのいずれかのために、ヒトで許容可能な高特異性結合分子のようなさらなるおよび新たな化合物の必要性が依然として存在する。
【００１８】
特許請求の範囲に特徴が記載されており、本明細書に開示されており、さらに以下の実施例で例証されている本発明の実施形態によって、この問題の解決手段が提供される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第２００５／００７６９９号
【特許文献２】欧州特許出願公開第０６１６６４０号明細書
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Ｍｏｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９８９），１４５−１７３
【非特許文献２】Ｐａｕｌ  ａｎｄ  Ｓｅｄｅｒ，Ｃｅｌｌ  ７６（１９９４），２４１−２５１
【非特許文献３】Ｚｈｕ  ａｎｄ  Ｐａｕｌ，Ｂｌｏｏｄ  １１２（２００８），１５５７−１５６９
【非特許文献４】Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２５（２００６），１９５−２０１
【非特許文献５】Ｚｅｎｅｗｉｃｚ  ａｎｄ  Ｆｌａｖｅｌｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３８（２００８），３２６５−３２６８
【非特許文献６】Ｗｏｌｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．３２（２０１０），１７−３１
【非特許文献７】Ｌａｎｇｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２０２（２００４），９６−１０５
【非特許文献８】Ｆｅｒｒａｃｃｉｏｌｉ  ａｎｄ  Ｚｉｚｚｏ，Ｄｉｓｃｏｖ．Ｍｅｄ．６０（２０１１），４１３−２４
【非特許文献９】Ｌａｎｇｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１（２００５），２３３−４０
【非特許文献１０】Ｖａｋｎｉｎ−Ｄｅｍｂｉｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１９５（２００８），１４０−１４５
【非特許文献１１】Ｍｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．６９（２０１０），６１８−２３
【非特許文献１２】Ａｇｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（２００３），１９１０−１９１４
【非特許文献１３】Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５（２００７），８２１−８５２
【非特許文献１４】Ｂａｒｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｗｒｉｅ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３１（２００９），４０１−４１１
【非特許文献１５】Ｉｚｃｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２８（２００８），５５９−５７０
【非特許文献１６】Ａｈｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３３（２０１０），２７９−８８
【非特許文献１７】Ｂｕｏｎｏｃｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６４（２０１０），１３７１−１３７５
【非特許文献１８】Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３３（２０１１），３９７−４０８
【非特許文献１９】Ｄｕｖａｌｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｍｅｄ．４３（２０１１），５０３−５１１
【非特許文献２０】Ｂｏｎｉｆａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８（２００７），４６１５−４６２２
【非特許文献２１】Ｎｏｇｒａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１５９（２００８），１０９２−１１０２
【非特許文献２２】Ｇｕｉｌｌｏｔｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４（２０１０），５２６３−５２７０
【非特許文献２３】Ｍｉｏｓｓｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６１（２００９），８８８−８９８
【非特許文献２４】Ｓｔｅｉｎｍａｎ，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１（２０１０），４１−４４
【非特許文献２５】ＨＡＭＡ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ；Ｓｃｈｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．４５（１９８５），８７９−８８５
【非特許文献２６】Ｓｈａｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５（１９８５），１５３０−１５３５
【非特許文献２７】Ｃｈａｎ  ｅｔ  Ｃａｒｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０（２０１０），３０１−３１６
【非特許文献２８】Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ９（２０１０），７６７−７７４
【非特許文献２９】Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１（１９８６），５２２−５２５
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、一般に、自己寛容の発生障害または無秩序な発生に起因または関連し得る、好ましくは、単一遺伝子性自己免疫性障害によって引き起こされる中枢性および／もしくは末梢性寛容の異常または自己寛容の喪失に罹患している哺乳動物（特に、ヒト）から、自己抗原結合分子（すなわち、抗体）を単離するための手段および方法に関する。本発明にしたがって特に適切な自己抗体源を提供する哺乳動物の例は、ＡＩＲＥ（自己免疫調節）遺伝子における突然変異に関連する障害、例えば、自己免疫性多腺性内分泌不全症候群１型（ＡＰＳ１）（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８（２００８），９４８−９５７）を有する哺乳動物（例えば、ヒト）である。
【００２２】
本発明は、一般に、自己免疫性多腺性内分泌不全症候群１型（ＡＰＳ１）を有する患者が、上記各サイトカインまたは他の分子が病原性免疫反応の開始および維持に大きく関与する自己免疫性疾患または自己炎症性疾患、例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節炎、１型真性糖尿病（Ｔ１ＤＭ）または上記および下記に詳細に示されている他のものに、単独でまたは共同して関与し、および／またはこの自己免疫性疾患または自己炎症性疾患に関連する、タンパク質に対するモノクローナル自己抗体源を提供するという驚くべき知見に基づくものである。また、本発明は、原則としてあらゆる自己抗原に対して哺乳動物（特に、ヒト）で誘導されるモノクローナル抗体の完全なリザーバを提示および単離する手段を初めて提供するものであり、これらについて、本発明は、それぞれ「自己イムノソーム」および「Ｍａｂ−自己−イムノソーム」という用語を作った（以下、「Ｍａｂ自己−イムノソーム」、「Ｍａｂ自己イムノソーム」、「Ｍａｂ−自己イムノソーム」または「ＭＡＩ」とも称される）。したがって、本発明によって提供される抗体の血清活性に関して表１〜１４および図１〜４に詳細に示されているように、本発明にしたがって「Ｍａｂ−自己−イムノソーム」を提供することによって、代謝障害、血管機能、神経変性疾患または腫瘍を含む自己免疫および炎症に関連する障害を処置するための新たな手段が想定される。上記観察結果に基づく本発明の基本概念（すなわち、自己寛容の発生障害または無秩序な発生に起因または関連し得る中枢性および／もしくは末梢性寛容の異常または自己寛容の喪失に罹患しているヒトからの、治療上有用なヒト抗体の単離）は、自己免疫性多腺性内分泌不全症候群２型（ＡＰＳ２）およびＸ連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症候群（ＩＰＥＸ）を有する患者由来の試料を用いて確認することができた（実施例１７および表２９〜３１を参照のこと）。
【００２３】
一態様では、本発明は、いくつかのサイトカインに対する高親和性中和モノクローナル抗体に関する。したがって、本発明の方法によって、以下に詳細に記載されるいくつかのサイトカインに対するモノクローナルヒト抗体（ｍＡｂ、またはＭＡＢ）であって、所定の被験体の自然成熟体液性免疫反応に由来するモノクローナルヒト抗体が提供され、これらは、そのサイトカインが関与する障害の安全かつ有効な治療薬であると考えられる。
【００２４】
特に、実施例に示されている抗体について概説されている免疫学的結合特性および／または生物学的特性を示す抗ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２２抗体ならびにそれらの抗原結合断片が提供される。存在する場合、抗体の抗原との「免疫学的結合特性」または他の結合特性という用語は、そのすべての文法の形式で、抗体の特異性、親和性、交差反応性および他の結合特性を指す。
【００２５】
当然のことながら、本発明は、抗体産生細胞株および組換え細胞に及ぶ。本発明はさらに、本発明にしたがって単離された抗体によって認識される結合分子またはペプチドを含む医薬組成物、診断アッセイおよびキット、ならびにそれらに基づく治療方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】Ａ：組織の生理学的機能またはヒト疾患の病態生理に関与している細胞外タンパク質に対するＡＰＳ１患者の血清反応性（少なくとも１人の患者で測定された反応性の示された総数の割合）。Ｂ：組織の生理学的機能またはヒト疾患の病態生理に関与している細胞外タンパク質に対するＡＰＳ１患者の血清反応性（少なくとも１人の患者の血清によって認識される異なるタンパク質の総数）。
【図２】Ａ：組織の生理学的機能に関与している細胞外タンパク質に対するＡＰＳ１患者の血清反応性（少なくとも１人の患者で測定された反応性の示された総数の割合）。血清反応性は、図１ＡおよびＢに示されているものに無関係である。Ｂ：組織の生理学的機能に関与している細胞外タンパク質に対するＡＰＳ１患者の血清反応性（少なくとも１人の患者の血清によって認識される異なるタンパク質の総数）。血清反応性は、図１ＡおよびＢに示されているものに無関係である。
【図３】Ａ：炎症および自己免疫関連経路に関与している細胞外タンパク質に対するＡＰＳ１患者の血清反応性（少なくとも１人の患者で測定された反応性の示された総数の割合）。Ｂ：炎症および自己免疫関連経路に関与している細胞外タンパク質に対するＡＰＳ１患者の血清反応性（少なくとも１人の患者の血清によって認識される異なるタンパク質の総数）。
【図４】Ａ：神経変性疾患に関与している細胞外タンパク質に対するＡＰＳ１患者の血清反応性（少なくとも１人の患者で測定された反応性の示された総数の割合）。Ｂ：神経変性疾患に関与している細胞外タンパク質に対するＡＰＳ１患者の血清反応性（少なくとも１人の患者の血清によって認識される異なるタンパク質の総数）。
【図５】本発明の組換え抗体のインビトロ中和能。Ａ：ヒトＩＬ−２２に対する中和能。０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２２を使用すると、組換え抗体３０Ｇ１のＩＣ５０は２．５ｎｇ／ｍｌであり、組換え抗体３５Ｇ１１のＩＣ５０は４ｎｇ／ｍｌである。組換え抗体４１Ｄ１１および５１Ｇ４は、試験濃度で中和していない。Ｂ：マウスＩＬ−２２に対する中和能。０．３ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−２２を使用すると、組換え抗体３０Ｇ１のＩＣ５０は１．５ｎｇ／ｍｌである。組換え抗体３５Ｇ１１、４１Ｄ１１および５１Ｇ４は、試験濃度で中和していない。Ｃ：ＩＬ１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロ二量体に対する中和能。１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロ二量体を使用すると、組換え抗体２４Ｄ３のＩＣ５０は６ｎｇ／ｍｌであり、組換え抗体１７Ｅ３のＩＣ５０は１２ｎｇ／ｍｌである。組換え抗体９Ａ２は、試験濃度で中和していない。Ｄ：ＩＬ１７Ｆに対する中和能。１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ１７Ｆを使用すると、組換え抗体２４Ｄ３のＩＣ５０は１２ｎｇ／ｍｌであり、組換え抗体１７Ｅ３のＩＣ５０は１５ｎｇ／ｍｌであり、組換え抗体９Ａ２のＩＣ５０は４５ｎｇ／ｍｌである。
【図６】ＡＰＳ１患者におけるＩＦＮ−α１に対する抗体反応（Ａ：ＡＰＳ患者１−０１〜１−０７、Ｂ：患者１−０８〜１−１４、Ｃ：患者１−１５〜１−１７）。Ｘ軸に示されているように、１：５０〜１：１５６２５０の範囲の異なる希釈のＥＬＩＳＡアッセイで、遺伝的症状ＡＰＳ１／ＡＰＥＣＥＤを患っている患者から得られた試験血清をＩＦＮ−α１抗体の存在について試験した。患者と年齢がマッチしている健康な研究所員から対照血清を得た。Ｙ軸はＯＤ値を示す。
【図７】インターフェロンα１ｂ（ＩＦＮａ１ｂ）およびＣＣＬ２（Ａ）；ＩＦＮａ２ｂ（Ｂ）；ＩＬ−１７Ｆ（Ｃ）；ＩＬ−１７Ａ（Ｄ）；ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド２１（ＣＣＬ２１）、ＣＣＬ２およびケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンド１１（ＣＸＣＬ１１）（Ｅ）；ＩＦＮ−ω（Ｆ）およびＩＬ−５（Ｇ）に対する、選択ＡＰＳ１患者から単離した血清のＥＬＩＳＡ滴定。Ｘ軸は試験血清の希釈を示し、Ｙ軸はＯＤ値を示す。
【図８】ＩＬ−２２に対する、ＡＰＳ１患者（ＡＰＳ１−１〜ＡＰＳ１−２２；黒ひし形）および対照者（健常被験者；Ｃ１〜Ｃ８；黒四角）から単離した血清のＥＬＩＳＡ力価。Ｘ軸は被験者の年齢を示し、Ｙ軸は対数１０のスケールで見た力価を示す。大きな白ひし形および白四角は、２つの被験者群の平均力価を示す。対照者および患者の年齢の中央値は類似しているが、患者の力価は、対照者のものよりも約１００倍高いことに留意する。各個体の年齢はＸ軸上に示されており、力価（常用対数１０のスケール）はＹ軸上に示されている。
【図９】ＩＬ−１７Ｆに対する、ＡＰＳ１患者（ＡＰＳ１−１〜ＡＰＳ１−２２；黒ひし形）および対照者（健常被験者；Ｃ１〜Ｃ６；黒四角）から単離した血清のＥＬＩＳＡ力価。Ｘ軸は被験者の年齢を示し、Ｙ軸は（常用対数１０のスケールで）見た力価を示す。大きな白四角および白ひし形は、２つの被験者群の平均力価を示す。対照者および患者の年齢の中央値は類似しているが、患者の力価は、対照者のものよりも約２０倍高いことに留意する。
【図１０】ＩＦＮ−α１ｂに対する、ＡＰＳ１患者（ＡＰＳ１−１〜ＡＰＳ１−２２；黒ひし形）および対照者（健常被験者；Ｃ１〜Ｃ６；黒四角）から単離した血清のＥＬＩＳＡ力価。Ｘ軸は被験者の年齢を示し、Ｙ軸は（常用対数１０のスケールで）見た力価を示す。大きな白ひし形および白四角は、２つの被験者群の平均力価を示す。対照者および患者の年齢の中央値は類似しているが、患者の力価は、対照者のものよりも約１００倍高いことに留意する。
【図１１】ＡＰＳ１血清によって認識されるいくつかの抗原の存在を示す、ＡＰＳ１／ＡＰＥＣＥＤ患者由来の血清を用いた正常な腺様組織に対するウエスタンブロット反応。
【図１２】組換えヒトおよびマウスＩＬ１７Ｆに対する９Ａ２抗体の反応性。ヒトＩＬ１７Ｆに対する９Ａ２抗体の反応性について非常に強い選択性を観察することができる。
【図１３】組換えヒトおよびマウスＩＬ１７Ｆに対するＡＰＳ１−２２血清の交差反応性。マウス抗原に対する交差反応性はない。
【図１４】ｐＰＫ−ＣＭＶ−Ｆ４（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｅｒｍａｎｙ）哺乳動物発現ベクタを使用して、全長ＩＬ−２２（３４−１７９ａａ）、Ｎ末端短縮（７４−１７９ａａ）またはＣ末端短縮（３４−１１６ａａ）ＩＬ−２２配列をクローニングし、そのＣ末端でホタルルシフェラーゼと融合させた。ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションの後、免疫沈降アッセイにおいて、粗タンパク質抽出物を抗原として使用した。この図は、ＩＬ−２２に対して特異的な組換え抗体が全長ＩＬ−２２に最も効率的に結合していることを示しており、立体構造エピトープの優位性を示す。ＬＵ−光単位。
【図１５】本発明のＩＬ−１７Ａ、ＩＬ１７ＦまたはＩＬ−２２特異的ヒト抗体の可変領域（すなわち、重鎖およびカッパ／ラムダ軽鎖（ＶＨ、ＶＬ））のアミノ酸配列。Ａ：ＩＬ−１７Ｆ特異的抗体９Ａ２：ＩｇＧ１、カッパ（ＶＨ３；Ｇ１ｍ１７；ＶＫ１、Ｋｍ３）。Ｂ：ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−１７Ａ特異的抗体１７Ｅ３：ＩｇＧ１、カッパ（ＶＨ１、Ｇ１ｍ１７；ＶＫ１、Ｋｍ３）。Ｃ：ＩＬ−１７Ｆ特異的抗体２４Ｄ３：ＩｇＧ１、ラムダ（ＶＨ３、Ｇ１ｍ１７；ＶＬ３）。Ｄ：ＩＬ−２２特異的抗体３０Ｇ１：ＩｇＧ１、カッパ（ＶＨ３、Ｇ１ｍ１７；ＶＫ３、Ｋｍ３またはＫｍ１、２）。Ｅ：ＩＬ−２２特異的抗体３５Ｇ１１：ＩｇＧ４、ラムダ（ＶＨ７、ＩＧＨＧ４＊０１；ＶＬ１）、Ｆ：ＩＬ−２２特異的抗体４１Ｄ１１：ＩｇＧ１、ラムダ（ＶＨ４、Ｇ１ｍ３  Ｌ４１０Ｆ；ＶＬ４）およびＧ：ＩＬ−２２特異的抗体５１Ｇ４：ＩｇＧ２、ラムダ（ＶＨ１、ＩＧＨＧ２＊０１；ＶＬ３）。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）が示されており、ＣＤＲには下線が付されている。クローニング戦略により、重鎖および軽鎖のＮ末端のアミノ酸配列は、ＦＲ１におけるプライマー誘導性変化を潜在的に含有し得るが、これは抗体の生物学的活性に実質的な影響を与えない。コンセンサスヒト抗体を提供するために、元のクローンのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を、データベース内の適切なヒト生殖系列可変領域配列とアライメントし、それにしたがって調整する；例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）が提供するＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ）を参照のこと。
【図１６】インビボ研究における抗ＩＬ−２２＋イミキモドの乾癬病変。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの抗ＩＬ−２２抗体およびイミキモド（ＩＭＱ）処置の実験プロトコールおよびタイムライン。剃毛時の年齢は９週間、非処置対照ＤＯＢ：１０週間。Ａ：４つの動物群の処置組成物を示す表。Ｂ：動物に適用した対照および抗ＩＬ−２２抗体の量。Ｃ：実験のタイムライン。ＶＡＳ＝ワセリン
【図１７】５日間にわたるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの発赤臨床スコア（０〜４の尺度で盲検でスコア化）。スコアのグラフ形式−実線（赤／ピンク）はＩｇＧ＋ＩＭＱマウスであり、点（青）線は抗ＩＬ−２２＋ＩＭＱであり、非ＩＭＱ処置マウスのスコアはすべて一貫して０である。
【図１８】５日間にわたるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの硬度臨床スコア（０〜４の尺度でスコア化した）。スコアのグラフ形式−実（赤／ピンク）線はＩｇＧ＋ＩＭＱマウスであり、点（青）線は抗ＩＬ−２２＋ＩＭＱであり、非ＩＭＱ処置マウスのスコアはすべて一貫して０である。
【図１９】５日間にわたるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの累計臨床スコア（発赤＋硬度＋鱗屑）（合計して０〜４の尺度でスコア化した）。スコアのグラフ形式−実（赤／ピンク）線はＩｇＧ＋ＩＭＱマウスであり、点（青）線は抗ＩＬ−２２＋ＩＭＱであり、非ＩＭＱ処置マウスのスコアはすべて一貫して０である。
【図２０】５日間にわたるＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの皮膚厚み臨床測定結果（２回の測定結果の平均を、０日目の時点と比較した増加倍率として表した）。スコアのグラフ形式−実（赤／ピンク）線はＩｇＧ＋ＩＭＱマウスであり、点（青）線は抗ＩＬ−２２＋ＩＭＱである。
【図２１】処置の４日目。Ａ：ワセリン＋ＩｇＧ対照。Ｂ：ＩＭＱ＋ＩｇＧ対照。Ｃ：ワセリン＋抗ＩＬ−２２。Ｄ：ＩＭＱ＋抗ＩＬ−２２
【図２２】処置の５日目。Ａ：ワセリン＋ＩｇＧ対照。Ｂ：ＩＭＱ＋ＩｇＧ対照。Ｃ：ワセリン＋抗ＩＬ−２２。Ｄ：ＩＭＱ＋抗ＩＬ−２２
【図２３】０日目からスタートの実験中の動物の体重推移。Ａ：すべての実験群における体重推移。Ｂ：ワセリン対照のみを用いないＩＭＱ群の体重推移。すべての時点で非有意（ｎｓ）。
【図２４】ＩｇＧ＋ＩＭＱ投与マウスは、４日目における皮膚が抗ＩＬ−２２＋ＩＭＱと比較して有意に厚い。動物の背部の厚みを経時的にｍｍ単位で示す。＊ｐ＜０．０５（２元配置分散分析；他のすべての時点でｎｓ）
【図２５】ａＩＬ−２２（３０Ｇ１）による処置は、ＩＭＱ処置マウスにおける臨床乾癬スコアを有意に減少させる。乾癬面積重症度指数（ＰＡＳＩ）スコアにしたがって、プラークの発赤、硬度および鱗屑を評価した。４を最悪として０〜４の数字を乾癬の三徴にそれぞれ割り当てた。（Ａ）および（Ｂ）において、＊＊＊ｐ＜０．００１（２元配置分散分析）。（Ｃ）すべての時点でｎｓ（２元配置分散分析）。
【図２６】ａ−ＩＬ−２２＋ＩＭＱ投与マウスは、４日目および５日目における臨床重症度、特に皮膚紅斑（盲検でスコア化）および硬度が有意に異なる（減少している）。＊＊＊ｐ＜０．００１（２元配置分散分析）
【図２７】ＩＭＱ投与マウスは、脾臓がワセリン処置マウスと比較して有意に大きい。ＩｇＧ＋ＩＭＱ処置マウスと抗ＩＬ−２２＋ＩＭＱ処置マウスとの間には有意差がない。Ａ：異なる処置群および対照群の脾臓重量；対応のない両側ｔ検定。Ｂ：異なる処置群および対照群の脾臓サイズの概要。
【図２８】ＩＭＱ処置マウス由来のリンパ節（ＬＮ：Ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅ）細胞は、生存能力がワセリン処置マウスよりも低い。ＩｇＧ＋ＩＭＱ処置マウスと抗ＩＬ−２２＋ＩＭＱ処置マウスとの間には、ＬＮ細胞の生存率に有意差がある；対応のない両側ｔ検定、＊＊ｐ＜０．００５。
【図２９】ＩｇＧ＋ＩＭＱ処置マウスと抗ＩＬ−２２＋ＩＭＱ処置マウスとの間には、生存能力のある生ＬＮ細胞の総数に有意差がある。対応のない両側ｔ検定；＊＊ｐ＜０．００５。
【図３０】ＡＰＥＣＥＤ患者の血清は、ＩＬ−２２（Ａ）、ＩＦＮ−ω（Ｂ）およびＩＦＮ−α（Ｃ）と強く反応する。ＩＦＮ−αサブユニット（ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５およびＩＦＮＡ６）、ＩＦＮ−ωおよびＩＬ−２２サイトカインについて、Ｐｒｏｔｏａｒｒａｙの結果を示す。このデータは、フィンランド人ＡＰＥＣＥＤ患者２３人（ＡＰＥＣＥＤ）の血清および健常対照者７人（Ｃｔｒｌ）の血清でプローブした、本明細書で提供されるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｒｏｔｏａｒｒａｙの蛍光値を示す（対数スケール）。各患者／対照者群のＳＥＭ付きの平均値を示す。
【図３１】ＡＰＥＣＥＤ患者由来の血清と以下のものとの自己免疫反応性：列（Ａ）−以前に報告されているＡＰＥＣＥＤ自己抗原ＧＡＤ２（グルタミン酸デカルボキシラーゼ２）、ＤＤＣ（ドーパデカルボキシラーゼ）（芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ）およびＧＡＤ１（グルタミン酸デカルボキシラーゼ１）；列（Ｂ）−新規な（未報告の）自己抗原ＳＵＬＴ４Ａ１（スルホトランスフェラーゼファミリー４Ａメンバー１）、ＣＣＤＣ４０（コイルドコイルドメイン含有４０）、ＮＡＰ１Ｌ（ヌクレオソームアセンブリタンパク質１様１）；ならびに列（Ｃ）−癌抗原ＡＢＬ１（ｃ−ａｂｌ癌遺伝子１）、非受容体チロシンキナーゼ）、ＭＡＧＥＡ３（黒色腫抗原ファミリーＡ３）およびＳＳＸ４（滑膜肉腫Ｘブレークポイント４）。フィンランド人ＡＰＥＣＥＤ患者２３人（ＡＰＥＣＥＤ）の血清および健常対照者７人（Ｃｔｒｌ）の血清でプローブした、本明細書で提供されるＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｒｏｔｏａｒｒａｙの蛍光値として、Ｐｒｏｔｏaｒｒａｙの結果を示す。各患者／対照者群のＳＥＭ付きの平均値を示す。
【図３２】ＡＰＥＣＥＤ抗原の細胞内局在。認識されたタンパク質は、主に核タンパク質（３８％）または細胞質タンパク質（３２）、続いて分泌タンパク質（７％）および細胞膜タンパク質（５％）である。
【図３３】インビボ研究における抗ＩＬ−２２（３０Ｇ１）＋ＩＭＱの乾癬病変。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスでのＩＭＱ誘導の前後（２４時間後）両方における抗ＩＬ−２２抗体投与についての詳細な実験プロトコールおよびタイムライン。剃毛時の年齢は９週間、非処置対照ＤＯＢ（出生日）：１０週間。Ａ：動物群Ａ〜Ｇの処置組成物を示す表。Ｂ：動物に適用した対照および抗ＩＬ−２２抗体の量。Ｃ：実験のタイムライン。ＶＡＳ＝ワセリン。ＬＮ  ｓｔｉｍ＝リンパ節刺激。動物＃１９の臨床データは、重度の体重減少により分析から除外した。ここに示されている兆候は、図１６に示されている実験と同じものである。
【図３４】例示的なａＩＬ−２２抗体３０Ｇ１の投与は、イミキモドで処置したマウスにおいて皮膚厚みを有意に減少させ、ＩＭＱ誘導後に３０Ｇ１  ＩＬ−２２抗体を投与したマウスでは、臨床乾癬スコアの減少によって暗示されているように、治療効果を観察することができる。より読みやすくするために、図中ではグラフの線をナンバリングしている。
【図３５】インビボ研究における抗ＩＬ−２２（３０Ｇ１）＋ＩＭＱの乾癬病変。Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスでのＩＭＱ誘導後（２４時間後）における抗ＩＬ−２２抗体投与についての詳細な実験プロトコールおよびタイムライン。−試験動物の数を増加させた。副図Ａ、ＢおよびＣは、図３４について上記に記載されているとおりである。
【図３６】例示的なａＩＬ−２２抗体３０Ｇ１の投与は、「治療的に」（ＩＭＱ誘導前ではなくＩＭＱ誘導の２４時間後に）投与した場合でも、ＩＭＱで誘導したマウスにおいて皮膚厚みを有意に減少させる。４日目において、ＩｇＧ＋ＩＭＱ処置群とａＩＬ−２２＋ＩＭＱ処置群との間に、皮膚厚みの有意差を観察することができた。Ａ：処置動物の背部の皮膚厚みの２回反復測定結果（ｍｍ単位）。Ｂ：前記動物の皮膚厚みの変化倍率。より読みやすくするために、図中ではグラフの線をナンバリングしている。
【図３７】例示的なａＩＬ−２２抗体３０Ｇ１の投与は、「治療的に」投与した場合でも、ＩＭＱで誘導したマウスにおいて皮膚紅斑臨床乾癬スコアを有意に減少させる。（Ａ〜Ｃ）４日目および５日目において、ＩｇＧ＋ＩＭＱ処置群とａＩＬ＋ＩＭＱ処置群との間に、皮膚紅斑の有意差を観察することができた。乾癬面積重症度指数（ＰＡＳＩ）スコアにしたがって、プラークの発赤（Ａ）、鱗屑（Ｂ）および硬度（Ｃ）を評価した。４を最悪として０〜４の数字を乾癬の三徴にそれぞれ割り当てた。（Ａ）において、＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５（２元配置分散分析）。（Ｂ）および（Ｃ）すべての時点でｎｓ（２元配置分散分析）。（Ｄ）４日目において、累計臨床スコアの有意差を観察することができた。より読みやすくするために、図中ではグラフの線をナンバリングしている。線１および２はＸ軸と一致している。
【図３８】ＩＭＱ誘導性乾癬における本発明の例示的な抗ＩＬ−２２抗体３０Ｇ１の用量依存的効果。３つの異なる用量−２００μｇ、２０μｇおよび２μｇをＩＭＱ誘導後に投与した。先の図に記載されているように、プラークの（Ａ）皮膚紅斑および（Ｂ）硬度を評価した。（Ｃ）および（Ｄ）は、それぞれａＩＬ−２２または対照処置の値を示す。（Ｅ）は、異なる処置の累計スコアを示す。本発明の例示的なマウス交差反応性抗ＩＬ−２２抗体３０Ｇ１は用量依存的な兆候を示しており、初期用量の１／１００に減らして滴定すると有効性が低くなることを証明している。
【図３９】２回の独立したＣｙｔｏＥａｒ実験の統合結果−耳の厚みの経時的な測定結果は、本発明の例示的なａＩＬ−１７  ２４Ｄ３抗体の注射によるＩＬ１７Ｆ誘導性耳炎表現型の軽減を示す。（Ａ）結果の概要。（Ｂ）対照実験−ＰＢＳの注射。（Ｃ）ＩＬ１７Ａ注射による炎症の誘導。（Ｄ）ＩＬ１７Ｆ注射による炎症の誘導−２４Ｄ３注射による誘導の軽減。（Ｅ）は、図ＢおよびＣを統合したグラフを示す。（Ｆ）は図ＢおよびＤを統合したグラフを示す。ＩＬ−１７Ｆを投与しＩｇＧまたは２４Ｄ３で処置したマウスでは、Ｃ群とＦ群との間に、耳の厚みの有意差（８日目）を観察することができた（Ｄ、Ｆ）。（ＤおよびＦ）２元配置ＡＮＯＶＡ、ｎｓ（０日目〜７日目）、＊＊ｐ＜０．０１（８日目）。図Ｇ〜Ｌは、ＰＢＳに対して標準化した後の対応する図Ａ〜Ｆのデータを示す。（ＪおよびＬ）２元配置分散分析：ｎｓ（７日目）；＊ｐ＜０．１（３〜５日目）；＊＊ｐ＜０．０１（８日目）；＊＊＊ｐ＜０．００１（１日目および２日目）。
【図４０】ＣｙｔｏＥａｒ実験−本発明の例示的な抗ＩＬ−１７抗体２４Ｄ３を用いた処置による耳炎表現型の軽減について試験した動物の体重のモニタリング。（Ａ）実験結果の概要。（Ｂ）予備データは、Ｃ群およびＦ群で観察された体重差に基づいて処置効果の可能性を示唆している。
【図４１】エピトープマッピング。異なる結合部位に対する本発明の例示的なＩＬ−１７およびａＩＬ−２２  ＭＡＢのデファレンシャルな結合。交差競合実験は、抗ＩＬ−１７抗体１７Ｅ３および２４Ｄ３が互いに競合するが、抗体９Ａ２に対しては競合しないこと示しており、後者の結合部位が異なることを示している（Ａ）。同様に、抗ＩＬ−２２抗体３０Ｇ１、３５Ｇ１１および４１Ｄ１１は互いに競合するが、抗体５１Ｇ４に対しては競合せず、このことは同様に２つの結合部位（１つ目は最初の抗体群のもの、および２つ目は抗体５１Ｇ４のもの）を示している（Ｂ）。本発明の例示的な抗ＩＬ−２２抗体についての結果を、サンドイッチＥＬＩＳＡ実験によって検証した（Ｃ）。抗体９Ａ５は、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２と非反応性のＭＡＧＥＡ３特異的抗体であり、ここでは陰性対照として使用している（Ａ、Ｂ）。
【図４２】各抗原−ＩＬ１７Ｆに対するＭＡＢの結合領域のＰｅｐＳｔａｒ（商標）分析の結果。マイクロアレイ上にスポットした２０ｍｅｒのオーバーラップペプチド（１５アミノ酸のオーバーラップ）に対する結合が示されており、すべての公知の変異体と全長ＩＬ−１７Ｆ（最後のカラム）を含むＩＬ−１７Ｆが網羅されている。低いシグナル強度またはシグナルの欠如は、抗原を固定化するための表面リシンの方向および使用によっても起こり得るので、全長抗原に対する結合に関して観察された低いシグナル強度は、結合の欠如と必ずしも相関しない。しかしながら、全長ＩＬ−１７Ｆに対する観察された結合は、立体構造エピトープに対する例示的な抗体２４Ｄ３（Ａ）、９Ａ２（Ｂ）および１７Ｅ３（Ｃ）の選択的結合を示唆している。Ｘ軸の左から右に：１〜２３とナンバリングされたペプチドおよび全長ＩＬ−１７Ｆ
【図４３】各抗原−ＩＬ−２２に対するＭＡＢの結合領域のＰｅｐＳｔａｒ（商標）分析の結果。すべての抗体が、マイクロアレイ結合ペプチドに対して非常に弱い結合パターンを示しており、このことは、それらの特定の抗原に由来する線状ペプチドを認識することができないことを示す。観察された低いシグナル強度は、図４２に示されているのと同じ原因を有し得る。試験した抗ＩＬ−２２抗体はすべて、立体構造エピトープに選択的に結合すると思われる。抗ＩＬ−２２抗体について、予備的な結合結果を示す：（Ａ）３０Ｇ１、（Ｂ）３５Ｇ１１、（Ｃ）４１Ｄ１１および（Ｄ）５１Ｇ４。Ｘ軸の左から右に：１〜２７とナンバリングされたペプチドおよび全長ＩＬ−２２。Ｙ軸−１００００ステップで１００００〜６００００の強度分布。
【図４４】抗体親和性についてのＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６ベースの分析結果。ＩＬ−２２の注入濃度は、Ａ１：１００ｎＭ、Ａ２：３３．３３ｎＭ、Ａ３：１１．１１ｎＭ  Ａ４：３．７０ｎＭ  Ａ５：１．２３ｎＭおよびＡ６：０ｎＭ（ランニング緩衝液のみ）。識別子Ａ１〜Ａ６の前に接頭辞Ｌ１〜Ｌ６を付す（Ｌ１Ａ１など）。以下の図４５〜４６では、同じ濃度を使用した。センサーチップのインタースポット領域を使用して、データを参照した。本発明の例示的なａＩＬ−２２抗体３０Ｇ１および３５Ｇ１１でコーティングした表面は、特異的な濃度依存的リガンド結合反応を示す。
【図４５】本発明のａＩＬ−２２  ３０Ｇ１抗体に対するＩＬ−２２の結合に関するセンサグラムの詳細な分析。（Ａ）ラングミュアフィットのオーバーレイグラフおよび結合反応の実験データは、１．１ラングミュアモデルに対する優れたフィットを示す。残差プロット（Ｂ）は、ノイズレベルの大きさによるランダム散乱を示しており、優れた残差フィットを示している。図の下にある表は、会合（ｋａ）、解離（ｋｄ）、Ｒｍａｘおよび計算解離定数ＫＤの近似曲線から導き出された動態パラメータを示す。
【図４６】図４５に記載されているような、本発明のａＩＬ−２２  ３５Ｇ１１抗体に対するＩＬ−２２の結合に関するセンサグラムの詳細な分析。
【図４７】試料セット全体について評価したタンパク質アレイ上での抗体反応。３０個の試料および各試料について最大５４回の測定を使用した対数正規化データによる階層的クラスタリング。距離計算では、欠測値（０プローブはそれらを含む）を除外した。距離メトリックは、ユークリッドである。平均連結法による凝集クラスタリングを使用して、クラスタリングを行う。
【図４８】女性患者の対数正規化データによるクラスタリング。２４個の試料および各試料について最大３９回の測定を使用した階層的クラスタリング。距離計算では、欠測値（０プローブはそれらを含む）を除外した。距離メトリックは、ユークリッドである。完全連結法による凝集クラスタリングを使用して、クラスタリングを行う。
【図４９】（Ａ）男性患者の対数正規化データによるクラスタリング。１３個の試料および各試料について最大２５回の測定を使用した階層的クラスタリング。距離計算では、欠測値（０プローブはそれらを含む）を除外した。距離メトリックは、ユークリッドある。平均連結法による凝集クラスタリングを使用して、クラスタリングを行う。（Ｂ）共通集合：試料の統合、女性および男性。
【図５０】抗体分泌細胞の短期オリゴクローナル培養物を提供するための本発明の方法を含む、中枢性および／もしくは末梢性寛容の異常または自己寛容の喪失に罹患している患者、特に、ヒト自己抗原に結合し、および／またはこれを中和するＩｇＧ抗体を分泌するＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者から得られたヒト記憶Ｂ細胞由来の組換えヒトモノクローナル抗体を単離および産生するための一般的な好ましい方法の概略図。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、一般に、所望の抗原特異性を有するモノクローナル自己抗体を単離する方法であって、中枢性および／もしくは末梢性寛容の異常または自己寛容の喪失（これは、自己寛容の発生障害または無秩序な発生に通常関連する障害である）に罹患している哺乳動物から得られた試料から、該モノクローナル抗体を発現するＢ細胞を単離する方法に関する。
【００２８】
ヒト抗体をクローニングする主な試みは、当技術分野において公知である。例えば、Ｔｒａｇｇｉａｉ  ｅｔ  ａｌを参照すると、ＳＡＲＳコロナウイルスを中和することができる記憶Ｂ細胞から、ヒトモノクローナル抗体を作製する効率的な方法が記載されており（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｔｒａｇｇｉａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１０（２００４），８７１−８７５））、国際公開第２００８／０８１００８号、国際公開第２０１０／０６９６０３号および国際公開第２００８／１１０３７２号には、ヒト抗体、特に、β−アミロイドペプチド、α−シヌクレインおよび腫瘍特異的抗原ＮＹ−ＥＳＯタンパク質を認識するヒト抗体のクローニングが記載されている。これらのアプローチのすべておよび他の過去の試みにおいて、健常ボランティア、または感染性病原体によって引き起こされるか、またはある特定の抗原に関連する疾患を患っているが、保護的自己抗体の存在の指標として異常に安定した軽度の疾患状態を有する患者が、ヒト抗体源として使用されている。
【００２９】
このアプローチは、原則として、目的の各抗原について、適切な抗体を産生する対応する患者のプールを同定しなければならないが、このような患者が常に利用可能であるとは限らないという欠点に悩まされている。さらに、このようにして同定された抗体は、それらが単離された患者では保護的であり得るが、異なる患者集団では、例えば、異なるネオエピトープが存在するという理由から、それらは有効ではない場合もあるし、または抗原を認識しない場合さえある。さらに、上記に示されているようないくつかの障害または臨床像では、各抗原または抗原群が依然として不明な場合がある。
【００３０】
このような状況において、本発明にしたがって実施した実験により、驚くべきことに、ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者は、自己イムノソーム（すなわち、その多様性が顕著な自己抗体プロファイルであって、自己免疫反応を誘導する傾向があり、および／または望ましくない自己免疫反応に関係する障害に潜在的に関連するタンパク質に特異的な結合分子の広範なスペクトルをその多様性が表す自己抗体プロファイル）を示すことが明らかになった。したがって、本発明にしたがって同定された自己イムノソームの分子メンバーを提供することは、このような障害の治療介入および診断のための新規な標的および手段についての道を切り開き得る。ＡＰＳ１は、自己免疫調節因子（ＡＩＲＥ）遺伝子における突然変異によって引き起こされる珍しい自己免疫性疾患である。ＡＩＲＥタンパク質は、胸腺髄質上皮におけるＭＨＣによって提示される多くの末梢自己抗原（例えば、インスリン）の発現を支配して、発達中の胸腺細胞を寛容化する。ＡＰＳ１では、ＡＩＲＥ突然変異は、自己反応性Ｔ細胞が末梢に逃れることを可能にする陰性選択異常を引き起こす。
【００３１】
ＡＰＳ１における臨床的特徴のスペクトルは非常に変わりやすいが、通常は、内分泌組織のいくつかの自己免疫性障害である。ＡＰＳ１の定義的三徴には、慢性粘膜皮膚カンジダ症、副甲状腺機能低下症および副腎不全が含まれる（Ｐｅｒｈｅｅｎｔｕｐａ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．３１（２００２），２９５−３２０）。ＡＰＥＣＥＤ患者で見られる他の臨床症状としては、甲状腺自己免疫性疾患、真性糖尿病、性腺機能不全、白斑、脱毛症、慢性肝炎、慢性胃炎および悪性貧血ならびに様々な形態の他の消化器症候が挙げられる。重要なことに、患者は、いくつかの自己免疫性の臨床症候および疾患を示したが、多数の患者の報告調査により、患者は、いくつかの一般的な自己免疫性または炎症性疾患を示さなかったことが明らかになった。したがって、ＡＰＥＣＥＤ患者で独自に発達した本発明の自己抗体の生物学的活性は、これらの自己抗体が以下の疾患から保護するという観察結果と一致する。
−エリテマトーデス（すべてのサブタイプ）；
−シェーグレン症候群；
−強皮症（局所型または全身型）；
−多発性硬化症（ＭＳ）および他の自己免疫性神経疾患；
−関節リウマチ；
−乾癬；
−グルテン不耐症（セリアック病）；
−炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；
−水疱性自己免疫性皮膚疾患（天疱瘡；類天疱瘡）；
−口腔癌を除く癌；および
−アトピー性湿疹、喘息、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎のようなアレルギー性疾患。
【００３２】
驚くべきことに同様の高力価の自己抗体を伴うことが見出された別の胸腺関連障害は、胸腺上皮細胞の腫瘍である胸腺腫であり、これは多くの場合、おそらくは胸腺細胞の機能障害により、ＡＰＳ１と同様に自己抗体の陰性選択が障害され得る自己免疫性疾患重症筋無力症（ＭＧ）に関連する。全胸腺腫症例のうち、患者の３０〜４５％がＭＧを有する。さらなる関連自己免疫性症状としては、赤芽球癆およびグッド症候群（複合型免疫不全および低ガンマグロブリン血症を伴う胸腺腫）が挙げられる。他には、急性心膜炎、アジソン病、無顆粒球症、円形脱毛症、潰瘍性大腸炎、クッシング病、溶血性貧血、辺縁脳障害、心筋炎、ネフローゼ症候群、汎下垂体機能低下症、悪性貧血、多発性筋炎、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、感覚神経根障害、全身硬直症候群、全身性エリテマトーデスおよび甲状腺炎との疾患関連性が報告されている。
【００３３】
以下にさらに記載される本発明の知見を考慮して、理論に縛られるものではないが、本発明者らは、関連障害、特にＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者で観察された自己抗体の高力価および多様性プロファイルが、それぞれ中枢性および／もしくは末梢性寛容の異常または自己寛容の喪失に起因するものであり、体液性免疫反応（すなわち、このような患者の感染症（例えば、カンジダ症）に対する感受性の一因になり得る「自己攻撃的」自己抗体、しかし同時に、一般的な自己免疫性または炎症性起源の障害ならびに腫瘍疾患（例えば、癌）に対する一種の自己ワクチンを提供する「保護的」抗体の産生の両方を含む）と仮説した。加えて、本発明の範囲内で実施した実験により、驚くべきことに、ＡＰＥＣＥＤ患者で観察された自己抗体（これは、同時に、カンジダ感染症に対する適切な免疫反応を抑制する一因であると思われる）は、慢性炎症性疾患および免疫学的疾患の処置において治療有用性を有することが明らかになった（実施例５、６および１２を参照のこと）。
【００３４】
本発明にしたがって、自己抗体の存在が既に説明されているインターフェロンおよびインターロイキンなどの免疫反応のメディエータだけではなく、代謝障害、血管機能、神経変性疾患および腫瘍に関連する抗原に対する自己抗体について、ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者の血清をスクリーニングすることによって仮説を実証することができた。これらの実験により、驚くべきことに、ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者はまた、例えば、腫瘍細胞または細胞の腫瘍性成長を媒介するタンパク質に対する自己抗体の存在により、疾患の臨床経過が安定している腫瘍患者でむしろ予想される自己抗体を産生することが明らかになった。
【００３５】
特に、本発明にしたがって、タンパク質マイクロアレイ（ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＵＳＡ）を、ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者の血清に対してスクリーニングし、３０００個ほどの自己抗原の完全なセット（これは、「自己イムノソーム」とも称され得る）を同定した（実施例７および表１〜１３を参照のこと）。特に、ＡＰＥＣＥＤ患者２３人および健常対照被験者７人由来の血清を、合計９０００個の組換えタンパク質を含むタンパク質アレイに対して試験した。対照と比較したＡＰＥＣＥＤ血清の抗体活性は、３０００個の標的抗原に対して陽性であった。実施例で実証されているように、本発明にしたがって実施した実験により、公知の自己抗原候補が血清反応性を示したことも確認した。
【００３６】
本発明にしたがって実施したさらなる実験では、選択した自己抗原、すなわち、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２２に対する自己抗体のクローニングに成功した（実施例２を参照のこと）。特に、すなわち、上記自己イムノソームの同定した自己抗原のいずれかに対する所望の特異性の自己抗体をクローニングするための方法が開示され、それにより、一般的な「ＭＡＢ自己イムノソーム」、すなわち、自己抗体の完全なセット、そしてそれ故に、自己免疫性障害、ならびに自己抗原の異常発現または存在によって引き起こされるかまたはこれらに関連する疾患の治療および診断に有用な抗体および結合分子のリザーバを初めて提供する。
【００３７】
これまで、ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者は幅広い血清反応性を示すことが公知であったが、これは、むしろ非特異的免疫反応、そしてそれ故に、いかなる特定の顕著な生物学的活性、特異性および親和性も有さないポリクローナル抗体に起因するとも推測され得る。これは、好ましくは本発明にしたがって選択され、実施例で例証されている患者のプールについて特に当てはまり、これらの患者は、一般的な自己抗体障害の臨床像から公知の症候だけではなく、歯のエナメル質欠損、爪および髪の異常、皮膚色素の消失（白斑）、脱毛（脱毛症）、精神の抑鬱によって示される一般的な身体的および／または精神的健康状態不良を患っている。
【００３８】
したがって、ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者のむしろ深刻な健康状態にもかかわらず、これらの患者はそれでもなお、実施例で抗ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２２抗体について例証されているように高特異性中和モノクローナル抗体の供給源を提供し、そしてさらにより驚くべきことに、非常に多くの自己抗原に対するモノクローナル自己抗体のリザーバを提供することは驚くべきことであった。
【００３９】
本文脈では、ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者は、インターフェロン（ＩＦＮ）α／ωならびにインターロイキンＩＬ−１７Ａ／ＦおよびＩＬ−２２などの免疫反応のメディエータに対する体液性反応を示すので、本発明の一実施形態では、慢性炎症性障害および免疫障害、例えば限定されないが、慢性炎症性疾患、例えば、尋常性座瘡；関節炎、例えば、痛風性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、変形性関節症、乾癬性関節炎、関節リウマチ（ＲＡ）；喘息；セリアック病；クローン病（ＣＤ）；慢性前立腺炎；皮膚炎；真性糖尿病１型；糸球体腎炎；過敏症；心筋炎；多発性硬化症；炎症性腸疾患；骨盤内炎症性疾患；多発性筋炎；乾癬（ＰＳ）；サルコイドーシス；血管炎；間質性膀胱炎、家族性地中海熱（ＦＭＦ）、化膿性関節炎・壊疽性膿皮症・座瘡（ＰＡＰＡ）、クリオピリン関連周期性症候群（ＣＡＰＳ）、高ＩｇＤ症候群（ＨＩＤＳ）、成人性および若年性スティル病、シュニッツラー症候群、ＴＮＦ受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、ブラウ症候群；スウィート症候群、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト欠乏症（ＤＩＲＡ）、再発性特発性心膜炎、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）、蕁麻疹血管炎、抗シンテターゼ症候群、再発性軟骨炎、ベーチェット病、エルドハイム−チェスター症候群（組織球症）、滑膜炎・座瘡・膿疱症・過骨症・骨炎（ＳＡＰＨＯ）、関節リウマチ、周期熱・アフタ性口内炎・咽頭炎・腺炎症候群（ＰＦＡＰＡ）、尿酸結晶性関節炎（痛風）、２型糖尿病、くすぶり型多発性骨髄腫、心筋梗塞後心不全、変形性関節症または再潅流傷害もしくは移植拒絶により生じる炎症の治療または診断において、または自己寛容の発生障害もしくは無秩序な発生に関連する疾患（例えば、ＡＰＳ１）の処置において使用するために、モノクローナル抗体は、このような患者から得られたＢ細胞から単離される。
【００４０】
本文脈では、臨床症状の類似性にもかかわらず、自己免疫の調節および／または発達に関与する遺伝子（例えば、ａｉｒｅ遺伝子）における突然変異によって引き起こされるものと、いわゆるリスク−ＨＬＡハプロタイプを有する個体に影響を与える環境因子の共同作用によって引き起こされる疾患（例えば、アジソン病および真性糖尿病）の孤立性成分との間には明確な区別があることに留意する。例えば、ＡＰＳ１は、その粘膜皮膚カンジダ症、副甲状腺機能低下症およびアジソン病と共に、自己免疫調節因子遺伝子（ＡＩＲＥ）の突然変異に起因する単一遺伝子性障害であるが、対照的に、ＡＰＳ２は、最も一般的な自己免疫性障害と同様に、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）内の６番染色体上の優性感受性遺伝子座による多遺伝子性疾患である。ＡＰＳ２は、クラス１のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）対立遺伝子Ｂ８に関連することが報告された。クラスＩＩ  ＨＬＡ対立遺伝子およびそれらの１型糖尿病との強い関連性、ならびにＨＬＡ−ＤＲ３とＨＬＡ−Ｂ８との連鎖不平衡が発見されて、ＨＬＡ−Ｂ８とアジソン病との関連性は、１型糖尿病およびセリアック病の場合のように、ＨＬＡ−ＤＲ３とＤＱＢ１＊０２０１との会合に主に起因すると推測された（総説については、例えば、Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．９５（２０１０），Ｅ２６３−Ｅ２７０を参照のこと）。
【００４１】
それぞれリスク−ＨＬＡハプロタイプおよび多遺伝子性障害による自己免疫性障害を有する患者の試料は、本発明にしたがって使用することができるが、自己免疫調節因子（ＡＩＲＥ）またはフォークヘッドボックスタンパク質３（ＦＯＸＰ３）遺伝子などの特定の遺伝子における１つ以上の突然変異による障害を患っている患者の試料を使用することが好ましい。
【００４２】
上記で説明したように、および実施例で実証されているように、ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１、すなわち、ＡＩＲＥ遺伝子における突然変異によって引き起こされる珍しい単一遺伝子性自己免疫性疾患を患っている患者由来のＢ細胞試料を用いて、本発明の基礎をなす概念を実証した。本文脈では、単一遺伝子性により、患者間における障害の臨床像は非常に信頼できるものになり、本発明の方法を容易に再現可能にするので、中枢性および／もしくは末梢性寛容の異常または自己寛容の喪失の一因である単一遺伝子性障害を患っている患者由来のＢ細胞試料を使用することは、例えば、多遺伝子性障害（例えば、ＡＰＳ２）または胸腺腫を患っている患者由来の試料よりも有利であり好ましい。さらに、単一遺伝子性障害は、例えば、対応する遺伝子（例えば、ＡＩＲＥ）における実質的に同じ突然変異を誘導することによって、対応する動物モデル（例えば、マウス）をより容易に作製することを可能にする。したがって、本発明の方法の好ましい一実施形態では、生物学的試料を提供する患者の障害は単一遺伝子性であり、好ましくは、自己免疫調節因子（ＡＩＲＥ）遺伝子の少なくとも１つの突然変異に関連する障害である（上記も参照のこと）。あるいは、または加えて、単一遺伝子性障害は、フォークヘッドボックスタンパク質３（ＦＯＸＰ３）遺伝子における少なくとも１つの突然変異に関連し得る（下記も参照のこと）。それにもかかわらず、本発明の方法は、特定の状況下では、単一遺伝子性障害に罹患している患者から得られたＢ細胞試料を用いて実施されることが好ましいが、胸腺腫患者は、特にａｉｒｅ欠損表現型を示す場合には、目的の抗体を発現するＢ細胞の等価な供給源として使用することができる。しかしながら、本発明による腫瘍の性質による体液性免疫反応は様々であるので、胸腺腫などの腫瘍に関連するいかなる障害も患っていない哺乳動物を選択することが好ましい。
【００４３】
いくつかの場合では、例えば、動物実験における研究ツールとして、または所定の疾患の動物モデルにおける前臨床試験のために、ヒト以外の哺乳動物由来のモノクローナル自己抗体を提供することが望ましい場合がある。したがって、本発明の方法の一実施形態では、哺乳動物は、ヒトではなく動物、好ましくは、実験調査および動物試験で一般的に使用される動物、例えば、イヌ、ネコ、ウマ、好ましくは齧歯類、例えばラット、スナネズミおよびマウスである。最も好ましくは、非ヒト動物は、マウス、好ましくはＡＩＲＥまたはＦＯＸＰ３欠損マウスである（ＡＩＲＥ：Ｒａｍｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１（２００２），３９７−４０９；Ｋｕｒｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４（２００５），１８６２−１８７０；ＦＯＸＰ３：Ｂｒｕｎｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２７（２００１），６８−７３；Ｗｉｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２７，（２００１）１８−２０）。本出願で仮定し、一方でＫａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２）；ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃｅｉ．１２０２４（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）によって確認されているように、ａｉｒｅ欠損マウスは、ＡＰＥＣＥＤ患者のように、Ｔｈ１７関連サイトカインに結合して中和するＡｂ（抗体）を生成するが、このことは、ヒトおよびマウスにおけるＡＩＲＥ欠損との病原的関連性を実証している。特に、高齢のａｉｒｅ欠損ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＩＬ−１７Ａに対する中和自己抗体は、ヒトおよびマウスの両方のＡＩＲＥ−欠損状態に特徴的であることが見出された。
【００４４】
それにもかかわらず、実施例で例証されているように、好ましくは、本発明の方法における哺乳動物は、ヒト患者、好ましくは、自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィ（ＡＰＥＣＥＤ）またはＸ連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸疾患（ＩＰＥＸ）のような自己免疫疾患を患っている患者である。ＩＰＥＸ（Ｘ連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症候群は、攻撃的自己免疫および早期死亡をもたらす珍しいＸ連鎖劣性疾患であり、以下のセクション「定義および実施形態」により詳細に記載されている。ＡＰＥＣＥＤの場合、哺乳動物は、典型的には、慢性粘膜皮膚カンジダ症（ＣＭＣ）、副甲状腺機能低下症および自己免疫性副腎不全（アジソン病）からなる群より選択される１つ以上の症候を患っている（上記も参照のこと）。
【００４５】
実施例で例証されているように、本発明の方法によれば、目的の抗体を単離するための試料は、可能な抗体反応性の検出のために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および血清を含むか、またはこれらからなる。被験体由来の試料は、例えば、所望の抗原の１つ以上に対する血清反応性を試験するのに直接使用してもよいし、またはさらに加工してもよい（例えば、Ｂリンパ球について濃縮してもよい）。特に、試料は、目的の抗体を産生するＢ細胞、最も好ましくは記憶Ｂ細胞を含むか、またはこれらに由来することが好ましい。
【００４６】
以下のセクション「Ｂ細胞の不死化」に詳細に記載されているように、原則として、抗体を産生するＢ細胞を不死化し、抗体をクローニングすることができる。しかしながら、好ましい実施形態では、本発明の方法は、Ｂ細胞の不死化の工程を含まない。むしろ、実施例に記載されているように、ボランティア被験体の末梢血由来の末梢血単球細胞から記憶Ｂ細胞を単離し、所望の抗原に対して反応性であるＢ細胞培養物から細胞を選び出すまで、一定寿命のＢ細胞のみを可能にする条件下で、典型的には１〜２週間以下にわたって培養し、続いて、前記抗体の免疫グロブリン遺伝子レパートリを得るために単一選別細胞のＲＴ−ＰＣＲを行う（実施例、特に実施例２も参照のこと）。
【００４７】
実施例に示されているように、最初に、第１のポリクローナルＢ細胞活性化因子を用いて（すなわち、Ｂ９５−８細胞から得られた上清を含有するＥＢＶと共にインキュベートすることによって）、記憶Ｂ細胞を刺激し、次いで、第２ポリクローナルＢ細胞活性化因子（すなわち、ＣｐＧ２００６）を含む様々な培地に播種することによって分離した。
【００４８】
実際、本発明の範囲内で実施した実験中に、目的の抗体を産生するＢ細胞クローンを提供するためのＢ細胞の不死化を目的とするこれまでの方法（例えば、国際公開第２００４／０７６６７７号に記載されているもの）は、ＡＰＥＣＥＤまたは他の自己免疫性疾患を患っている患者のＢ細胞の場合には、全く上手く機能しないことが判明した。理論に縛られるものではないが、これは免疫系の寛容の異常または自己寛容の喪失により、Ｂ細胞（特に、本発明による目的であるもの）が、アポトーシスを誘導するかまたはアポトーシスの誘導に関連するシグナル伝達経路を介して予備活性化またはトリガーされたためであると考えられ、この理由により、それらの細胞は限られた寿命しか有さず、少なくともＥＢＶ媒介性不死化についてこれまでに報告されている条件下にない場合は、もはや不死化に効果的に適したものではない。本発明にしたがって実施した実験で得られた知見を考慮して、理論に縛られるものではないが、ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者で観察されたようなサイトカインおよび抗サイトカイン抗体の同時発生は、Ｂ細胞に結合してそれらを活性化することができる免疫複合体の形成をもたらすと考えられ、それにより、ＡＰＳ１患者由来のＢ細胞が活性化状態であること、およびそれらが老化に対して脆弱であることが説明される。
【００４９】
しかしながら、実施例で例証されているように、および上述のように、本発明にしたがって、活性化中に、一定寿命のＢ細胞のみを可能にする短期オリゴクローナル培養条件下で、記憶Ｂ細胞を処理および培養し、続いて目的の抗体を産生するオリゴクローナル培養物をオリゴまたは単一細胞回収し、抗体の可変領域のｃＤＮＡをクローニングすることによって、ヒト抗体を単離する方法が提供される。本発明のヒト抗体を単離するための好ましい方法の概略図を図５０に示す。
【００５０】
したがって、好ましい実施形態および特定の態様では、本発明は、所望の抗原特異性を有するヒト抗体またはその結合断片を生産する方法であって、ＩｇＧアイソタイプ抗体を分泌する活性化Ｂ細胞の短期オリゴクローナル培養物から、Ｂ細胞を単離することを特徴とし、連続で以下の工程：
（ａ）１つ以上の生物学的試料から、目的のタンパク質に対する抗体を発現するＢ細胞を選択すること；
（ｂ）細胞培養条件下で、第１のポリクローナルＢ細胞活性化因子を用いて、選択された細胞を刺激すること；
（ｃ）前記活性化因子から細胞を分離すること；
（ｄ）細胞培養条件下で、第２のポリクローナルＢ細胞活性化因子を用いて、刺激された細胞を活性化すること；
（ｅ）目的のＩｇＧアイソタイプ抗体を発現する活性化細胞をスクリーニングすること、および好ましくは；
（ｅ’）目的の抗体を産生するオリゴクローナル培養物を単一細胞回収すること；
（ｆ）目的の抗体の少なくとも可変軽鎖および重鎖領域ならびに場合により定常領域のｃＤＮＡを配列決定および／またはクローニングすること
を含む方法に関する。
【００５１】
用語「オリゴクローナル培養物」は、活性化された１つまたは少数の細胞に由来する目的の抗体を産生する細胞の培養物を指す。好ましくは、オリゴクローナル培養物は、１つの単一Ｂ細胞（これは、「Ｂ細胞クローン」とも称され得る）に由来する。上述のように、特に指定がない限り、用語「オリゴクローナル」および「クローン」は、不死化細胞を暗示または意味しない。実施例で例証されているように、生物学的試料は、好ましくは、目的のタンパク質に対する自己抗体の存在について血清をスクリーニングした患者の末梢血単核細胞に由来する。
【００５２】
典型的には、目的のタンパク質に対する抗体を発現するＢ細胞は、少なくとも１つのＢ細胞表面膜マーカ（例えば、好ましくはＣＤ２２）の発現に基づいて選択される。しかしながら、加えてまたはあるいは、Ｂ細胞は、例えばＥＬＩＳＰＯＴに使用して、抗原に対するそれらの結合に基づいて選択される。
【００５３】
好ましくは、Ｂ細胞は、記憶Ｂ細胞、特にヒト記憶Ｂ細胞であり、例えば、適切なＢ細胞表面膜マーカ特異的抗体を使用したＦＡＣＳによって、第１のポリクローナル活性化因子に曝露する前に、既にＩｇＭおよび／またはＩｇＤアイソタイプを除去する（実施例も参照のこと）。
【００５４】
抗体産生細胞を単離し、刺激し、本発明の方法にしたがって、バルク培養物中で、様々な時間（例えば１〜最大６時間、またはあまり好ましくないがより長い時間、例えば、６〜１２時間）にわたって増殖させてから、第２のポリクローナル活性因子による刺激のために、培養物あたり約１０個の細胞のいくつかのプール（それぞれが、別個に培養される細胞の集団を表す）に細分化する（例えば、９６−、３８４−または１５３６ウェルプレート）。細胞の存在を確認するために、ドナーを選択するために血清で既に実施したアッセイ、または細胞の将来の使用に関連する任意の他のアッセイを使用して、細胞培養条件下で維持された細胞のバルクポリクローナル集団を試験することができる。さらに、細胞のポリクローナル集団のいくつかのアリコートをバイアルに入れ、凍結細胞として保存して（通常は、確立された哺乳動物細胞株の場合に行う）、その後で再度解凍および培養することができる。本文脈では、いくつかの異なる抗原で、可能であれば、例えばｐｒｏｔｏａｒｒａｙにおいて生物学的試料の血清反応性が決定されたすべての抗原で、同じ培養上清を試験することができることを意図する。
【００５５】
並列実験において、可能であれば、系列希釈された培養上清または部分的に精製された抗体調製物（例えば、プロテインＡカラムでのアフィニティクロマトグラフィによって得られたもの）を用いた用量反応分析を使用して、所望の活性を示す陽性ウェルを同定するために、細胞培養上清のアリコートを、それらの結合および／または機能活性をについてハイスループット様式でスクリーニングすることができる。場合により、次いで、スクリーニングを単一細胞培養物のレベルにさらに制限するために、陽性の細胞プール（すなわち、所望の抗原特異性および／または生物学的活性を示すもの）を使用して新たな一連の細胞プールを作製し、その結果として、少なくとも最初のスクリーニングアッセイのレベルで、所望の特異性および活性を有するモノクローナル抗体を分泌する選択された細胞から、抗体可変領域のｃＤＮＡを単離することができる。次いで、Ｂ細胞に適用可能な組換えＤＮＡ技術を使用してそれらを単離した後、他のより厳しい機能アッセイを使用して、選択されたモノクローナル抗体を再評価し、アイソタイプおよびＶＨ／ＶＬ配列のレベルで特性決定するべきである。
【００５６】
実施例でさらに例証されているように、第１のポリクローナルＢ細胞活性化因子は、好ましくは、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）であり、および／または第２のポリクローナルＢ細胞活性化因子は、好ましくは、ＣｐＧベースのオリゴヌクレオチドである。
【００５７】
ＥＢＶおよびＣｐＧ、特にＣｐＧ２００６（Ｈａｒｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００），１６１７−１６２４によればＯＤＮ２００６）は、それぞれ好ましい第１および第２のポリクローナルＢ細胞活性化因子として使用されるが、他のポリクローナルＢ細胞活性化因子が当業者に公知である；例えば、欧州特許第１９７４０２０号明細書、特に、本発明による第１のポリクローナルＢ細胞活性化因子については第１３頁の段落［０１１５］〜第１４頁の段落［０１２６］（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）、ＣｐＧと同様の特性を有する第２のポリクローナルＢ細胞活性化因子（例えば、ＴＬＲアゴニスト）については第１２頁の段落［００９６］〜第１３頁の段落［０１０４］、特に、段落［０１７７］で配列番号１によって示されているＣｐＧ２００６、および欧州特許第１５９７２８０号明細書の第５頁の段落［００１４］〜［００２２］（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００５８】
本文脈では、ＥＢＶは、Ｂ細胞を不死化するために従来技術で使用されているが、ＥＢＶおよび類似のウイルス不死化剤は、二重活性（すなわち、適切な細胞培養条件下でＢ細胞を不死化するのに加えて、増殖およびＩｇ分泌の両方を誘導するＢ細胞を独立して活性化する能力）を有することに留意する。Ｔｓｕｃｈｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ８（１９９７），４３−４７によって示されているように、ＥＢＶのこの初期機能は、Ｂ細胞株を不死化するその後期機能とは異なるものである。したがって、本発明は、ＥＢＶおよび同様のウイルス不死化剤のポリクローナルＢ細胞活性化因子としての初期機能のみを使用し、細胞培養液中で数カ月間維持可能な不死化Ｂ細胞株を作製することができる形質転換ウイルスとしての後期機能を使用せず、それにより、以下にさらに記載されているように、限られた寿命の活性化Ｂ細胞の短期オリゴクローナル培養物のみを提供および使用する。ＥＢＶおよび類似薬剤の初期機能のみを使用することは、ＥＢＶのみの存在下で細胞を培養する時間を、細胞の刺激（すなわち、細胞の増殖および抗体の分泌）を達成するのに必要な程度に調整し、続いて、ＥＢＶおよび類似薬剤から細胞を分離する（その逆もまた同様である）ことによって達成することができる。
【００５９】
本発明の範囲内で実施した実験でさらに判明したように、および実施例で例証されているように、欧州特許第１９７４０２０号明細書および欧州特許第１５９７２８０号明細書で教示されているようなインターロイキン−２（ＩＬ−２）などのサイトカイン、またはトランスフェリンなどの他の共刺激分子の存在は必要ない。むしろ、おそらくはＢ細胞における前記予備活性化またはシグナル伝達により、本発明の方法では、Ｂ細胞培養物中にサイトカインが存在することには有益な効果が実質的にないことが判明した。したがって、本発明の方法の好ましい実施形態では、工程（ｂ）および／または工程（ｄ）における培養条件は、サイトカインを含まない。
【００６０】
典型的には、第１ポリクローナルＢ細胞活性化因子による選択された細胞の刺激を８時間未満、好ましくは６時間未満持続し、本発明の方法の特に好ましい実施形態では、工程（ｂ）において、選択された細胞を約３〜５時間刺激する。
【００６１】
活性化後、工程（ｃ）において、第１のポリクローナルＢ細胞活性化因子からＢ細胞を分離し、ここで、例えば、希釈または洗浄することによって活性化因子を除去する。本文脈では、本発明にしたがって実施した実験により、刺激された細胞を第２のポリクローナルＢ細胞活性化因子に供する前に、複数の洗浄工程を使用してそれらを確実に完全に除去することによって、第１のポリクローナルＢ細胞活性化因子の存在は実際にはもはや必要ないことが確認された。それにもかかわらず、本発明の方法の目的のためには、希釈する（すなわち、新鮮な培養培地にＢ細胞を播種する）ことによって、第１のポリクローナルＢ細胞活性化因子を除去することが、通常は効率的である。したがって、第１のポリクローナルＢ細胞活性化因子に供した細胞培養物を、第２のポリクローナル活性因子を含有する新鮮な培養培地に入れ、それにより、第１のポリクローナル活性化因子を含む培地を最大約１０％、好ましくは５％、より好ましくは１％、最も好ましくは実質的に１％未満、例えば、０．５％、０．１％またはそれ以下に希釈し得る。
【００６２】
典型的には、第２のポリクローナル活性化因子の存在下での培養中に、培養物あたり低細胞濃度で、例えば、マイクロタイター培養プレートのウェルにＢ細胞を播種する。好ましくは、１ウェルあたりの細胞濃度は、５〜２０個、より好ましくは５〜１５個、最も好ましくは１０個である。
【００６３】
上記のように、および実施例で例証されているように、工程（ｄ）において、所望の抗原に対して反応性であるＢ細胞培養物から細胞を選び出すまで、第２のポリクローナルＢ細胞活性化因子（例えば、ＣｐＧ）の存在下で、刺激されたＢ細胞を１〜２週間以下にわたって培養する。本発明の方法の好ましい実施形態では、工程（ｄ）において、移された選択された細胞を第２のポリクローナル活性化因子に約８〜１４日間曝露する。好ましくは、工程（ｄ）および／または（ｅ）において、オリゴクローナル条件下、１ウェルあたり約１０個の細胞、８〜１４日間の短期培養で、細胞を培養する。
【００６４】
目的のヒトモノクローナル抗体を単離および生産するための本発明の方法において、Ｂ細胞を単離および培養する上記本発明の方法は有利でありしたがって好ましいが、当業者はそれでもなお、従来技術に記載されているものなどの代替的な手段および方法を、たとえそれらが非効率的であり、本明細書に開示されている好ましい方法ほど多くの目的の抗体を産生するＢ細胞クローンを提供することができないとしても使用することができる。
【００６５】
ハイブリドーマ技術、末梢Ｂ細胞のクローン性増殖、単一細胞ＰＣＲ、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイおよび哺乳動物細胞ディスプレイに基づく方法を使用してヒトモノクローナル抗体を単離するさらなる方法が当業者に公知であり、例えば、Ｂｅｅｒｌｉ  ａｎｄ  Ｒａｄｅｒ，Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２（２０１０），３６５−３７８に概説されている。単一細胞ＲＴ−ＰＣＲおよび発現ベクタのクローニングによって単一ヒトＢ細胞からモノクローナル抗体を効率的に作製する方法は、Ｔｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３２９（２００８），１１２−１２４によって記載されている。
【００６６】
本発明によれば、ＥＬＩＳＡなどの当技術分野において公知の技術を用いて、目的の抗原に対する血清反応性について、個体から採取された試料を個別にまたはバッチで合わせて試験する（実施例も参照のこと）。特定の抗原またはいくつかの抗原に対する血清反応性について、試料を一度にまたは連続的に試験することができ、特定の分子群を表すように抗原を選択することができる前記分子群は、例えば、発生、分化、成体組織の維持または疾患などの特定の生物学的過程における分子の関与に応じて選択することができる。本発明の一実施形態では、表１〜１４および図１〜４に示されているように、試料は、炎症、自己免疫性障害、細胞の成長および分化、筋肉機能ならびに神経変性に関与する分泌型または膜貫通型タンパク質の少なくとも１つのメンバーを含む抗原パネルに対して実質的に同じ血清反応性を示す。好ましくは、本発明の方法にしたがって抗体を得るための試料または試料プールは、図１に示されているのと実質的に同じ血清反応性を示す。
【００６７】
好ましくは、本発明の方法にしたがって単離するべき抗体は、ｐｒｏｔｏａｒｒａｙアッセイにおける抗体反応の頻度、結合強度および／または抗体の力価に基づいて、好ましくはその潜在的な生理学的効果について選択される。例えば、被験体の試料の＞１０％で、所定の標的タンパク質に対する血清反応性が観察される場合、推定モノクローナル抗体をさらに追求することを決定することができる。好ましくは、異なる被験体の試料の＞２０％、より好ましくは＞３０％、さらにより好ましくは４０％、さらにより好ましくは＞５０％、特に好ましくは＞７５％、最も好ましくは＞９０％が、所望の標的抗原に対する血清反応性を示す。典型的には、試料プールは、１０人の異なる被験体、より好ましくは少なくとも１５人の被験体、最も好ましくは少なくとも２０人の被験体由来の試料を少なくとも含む。本発明の知見を考慮して、試料の血清反応性は、ＡＰＥＣＥＤ患者などの被験体に見られる珍しい臨床症状に対応する（上記も参照のこと）。
【００６８】
一方、本発明の好ましい実施形態のように、上記単一遺伝子性自己免疫性障害（特に、ＡＰＥＣＥＤ）を患っている患者から得られた試料を使用することは、定義された表現型および症候により、対応する患者が明確に定義されるがそれでもなお、遺伝的背景、発達、環境、感染性病原体への負荷についての個体差により抗体の多様性をもたらすというさらなる利点を提供する。このため、特定の症状を有する１人の患者または複数の患者によってのみ特異的に産生される抗体であって、個体のみを試験する場合には別の方法で得ることができない抗体を決定および単離するために、患者由来の試料プールを試験する。したがって、本発明の方法の好ましい一実施形態では、目的の抗原に対する血清反応性について、患者由来の試料プールを試験する。所望の抗原に対する血清反応性について試料プールを試験した後、所望の抗体を単離するために、対応するプールをさらに加工することもできるし、または試料プールの血清反応性に実際に寄与する試料の患者を同定するために、試料プールを絞り込むこともできる。対応するプールを作製する患者のサブグループは、患者の異なる臨床状態基準、例えば、性別、年齢、疾患症候の量および／または重症度に応じて選択することができる。実施例１６に例示的に示されているように、抗体反応における性差が、ＡＰＥＣＥＤ患者から得られたｐｒｏｔｅｏａｒｒａｙデータで観察することができた。表２８に示されているように、いくつかの抗体は、女性または男性患者のみから特異的に得ることができた。さらに、男性患者では、これらの差次的に発現された抗体から、可溶性タンパク質に対する抗体を実質的には観察することができなかった。したがって、一実施形態では、所望の抗原特異性を有するモノクローナル抗体を単離するための本発明の方法が提供され、ここで、中枢性および／もしくは末梢性寛容の異常または自己寛容の喪失を有する被験体であって、異なる臨床状態基準、例えば、性別、年齢、疾患症候の量および／または重症度に応じて選択された被験体から、抗体が特異的に単離される。一実施形態では、被験体は、その性別に応じて選択される。すなわち、抗体は、男性または女性被験体のみから単離される。
【００６９】
添付の実施例に記載されているように、本発明の方法にしたがって単離された抗体は、好ましくは、立体構造エピトープを認識する。したがって、これは、体液性免疫反応がその生理学的および細胞環境で天然抗原に対して誘導されたという事実により、抗原の立体構造エピトープを認識する自己抗体が通常産生され、例えば他の細胞成分によるその提示、細胞表面膜上での提示、および／または受容体との結合により単離することができるという点において、本発明の方法のさらなる利点である。対照的に、マウスモノクローナル、そのヒト化バージョン、またはファージディスプレイから得られた抗体などのモノクローナル抗体を作製する従来の方法は、典型的には、それぞれ非ヒト哺乳動物の免疫感作および検出のために標的タンパク質の抗原性断片を用いるが、これにより通常は、その生理学的および細胞環境における天然タンパク質の存在ではなく、直線状エピトープまたは免疫原の二次構造に限定された立体構造エピトープを認識する抗体が得られる。したがって、本発明の方法にしたがって単離された自己抗体は、そのエピトープ特異性の点で固有であると予想するのが賢明である。したがって、本発明はまた、本発明の方法にしたがって単離された自己抗体と実質的に同じ結合特異性を示す抗体および類似結合分子に関する。例えば、競合ＥＬＩＳＡによって、またはより適切には参照抗体として本発明の自己抗体およびそのモノクローナル誘導体をそれぞれ使用した細胞ベースの中和アッセイにおいて、および実施例に記載されているかもしくは当業者に公知の免疫学的試験において、このような抗体を容易に試験することができる。
【００７０】
実施例でさらに例証されているように、好ましくはヒトのドナーから本発明の方法にしたがって単離された自己抗体は、好ましくは、ヒト抗原のみを認識するか、またはマウスなどの他の種由来の対応する抗原よりも少なくとも選択的にヒト抗原を認識する。したがって、本発明の一実施形態では、所望の抗体は、それが由来する種（特に、ヒト抗原）に対して特異的であり、好ましくは、別種（例えばマウス起源、例えばヒト抗体の場合にはマウス）の対応する抗原を実質的に認識しない。実施例７、８、１１、１３および１４に詳細に記載されているように、いくつかの実験的アッセイにおいて、本発明の抗体の結合特性（例えば、特異性および親和性）を試験した。例えば、誘導性乾癬様皮膚炎（実施例６）および誘導性耳炎（実施例１２）における本発明の例示的な抗体の治療潜在力についての試験のインビボ実験データから、さらなる示唆を得ることができた。これに関連して、実施例１２に記載されているように、ヒトＩＬ−１７Ｆ注射によって誘導される耳炎実験で観察された治療効果、および実施例７に示されているように、ＩＭＱ誘導性乾癬様皮膚炎における有意な効果の欠如によって（マウスＩＬ−１７Ｆによって媒介される炎症に対しては有意な効果がない）、本発明の例示的な抗ＩＬ−１７抗体２４Ｄ３のヒトＩＬ−１７Ｆに対する特異性を確認することができた。比較では、マウス交差反応性の例示的な抗ＩＬ−２２抗体３０Ｇ１は、ＩＭＱ誘導性乾癬病変の臨床症候を軽減することによってその治療効果を示した。
【００７１】
加えて、実施例９で例証されているように、ＡＰＥＣＥＤ関連自己抗原では、コイルドコイル構造が、健常ボランティアの抗原レパートリよりも多く存在する。コイルドコイル構造は、２〜７本のａ−ヘリックスが共にらせん状になっている構造的なモチーフであり、最も一般的には二量体および三量体である。それは、ヘプタッド反復ＨｘｘＨＣｘＣ（Ｈ−疎水性；Ｃ−荷電アミノ酸（ａａ））の反復パターンを含有する。コイルドコイルドメインタンパク質は、主に細胞内酵素である。本発明のｐｒｏｔｅｏａｒｒａｙアッセイにおいてＡＰＥＣＥＤ関連自己抗原であることが見出されたコイルドコイルドメインを含む例示的なタンパク質は、実施例９の表２１で特定されており、それらのうちの２つに関するＰｒｏｔｏａｒｒａｙの結果は図３１にある（ＣＣＤＣ４０およびＮＡＰ１Ｌ）。一実施形態では、本発明の抗体は、コイルドコイル構造を示す抗原を認識する。
【００７２】
本発明の方法にしたがって単離された抗体についてさらに実証されているように、それらは、それらの標的タンパク質の生物学的活性を中和することができる。本文脈では、用語「中和」は、本発明の主題抗体の存在下で各アッセイを実施することによって評価することができるように、本発明の抗体が、生化学的または細胞ベースのアッセイにおいて、その標的タンパク質の生物学的活性に干渉することができることを意味し、ここで、標的タンパク質の生物学的活性は、アッセイに供した本発明の抗体のレベルを増加させるにつれて、本発明の抗体の非存在下における、および標的タンパク質の生物学的活性に同じく影響を与えないことが公知の化合物（例えば、対照抗体）の存在下におけるタンパク質の生物学的活性と比較して減少する。このような生化学的およびインビトロベースのアッセイはまた、本発明の抗ＩＬ−１７およびＩＬ−２２抗体について示されているような標的タンパク質の生物学的活性を中和することができることが公知の参照抗体を使用して、候補抗体を試験試料に供することによって実施することができ、ここで、参照および候補抗体の複合活性に起因する相加的中和効果が観察され得るか、またはいずれかの抗体を標識することによって決定され得る候補抗体および参照抗体の競合が観察される。加えて、本発明の方法は、内因性タンパク質および細胞構造に対する自己抗体を単離するのに特に適切であるが、それにもかかわらず、有効な抗ウイルス免疫を提供する自己抗体を得ることも可能である。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明の方法によって得られた抗体は、その抗原（例えば、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２）の生物学的活性を中和することができる。
【００７３】
実施例で例証されているように、本発明の方法は、典型的には、
（ｉ）所望の特異性の抗体を含有すると同定された試料から、Ｂ細胞またはＢ記憶細胞を精製する工程；および
（ｉｉ）Ｂ細胞を培養し、該モノクローナル抗体を単離する工程；または好ましくは
（ｉｉｉ）前記Ｂ細胞またはＢ記憶細胞から、前記抗体の免疫グロブリン遺伝子レパートリを得る工程；および
（ｉｖ）前記レパートリを使用して、宿主細胞で前記抗体または抗原結合断片を発現させ、該モノクローナル抗体またはその抗原結合断片を単離する工程
を含む。
【００７４】
より具体的には、本発明の上記方法は、工程（ｉｉｉ）において、
（ｉｖ）前記Ｂ細胞または記憶Ｂ細胞からｍＲＮＡを得る工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）のｍＲＮＡからｃＤＮＡを得る工程；および
（ｖｉ）プライマー伸長反応を使用して、前記ｃＤＮＡから、前記抗体の重鎖（ＨＣ）およびカッパ軽鎖（ＬＣ）に対応する断片を増幅する工程
を含む。
【００７５】
不死化ヒトＢ細胞およびＢ記憶リンパ球のクローンを生産する方法であって、ポリクローナルＢ細胞活性化因子の存在下で、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を使用したヒトＢ記憶リンパ球を形質転換する工程を含む方法は、国際公開第２００４／０７６６７７号に要約されており、さらに以下のセクション「Ｂ細胞の不死化」により詳細に記載されている。しかしながら、同定された抗原に特異的なＥＢＶ形質転換ヒト記憶Ｂ細胞を細胞クローニングする最初の試みは成功せず、このことは、細胞の大部分が形質転換および不死化されていないことを示唆している。したがって、前記抗体の免疫グロブリン遺伝子レパートリを得るために、好ましくは、単一選別細胞のＲＴ−ＰＣＲが用いられる（実施例も参照のこと）。とりわけ単一細胞ＲＴ−ＰＣＲを使用してヒト抗体を得る別の方法は、例えば、国際公開第２００８／１１０３７２号（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）の特に補足方法のセクションおよび実施例２に記載されている。加えて、不死化ヒトＢ記憶リンパ球のクローンを生産するための改善された方法であって、ポリクローナルＢ細胞活性化因子の存在下でＢリンパ球内のテロメラーゼ活性を誘導または増強する工程を含む方法は、国際公開第２０１０／００３５２９号（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００７６】
上記のように、本発明の抗体または抗原結合断片、例えば、ペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質は、例えば、宿主細胞またはインビトロの無細胞翻訳系における発現によって提供され得る。宿主細胞でペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質を発現させるために、前記ペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸分子を、適切な発現ベクタ（すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクタ）に挿入することができる。当業者に周知の方法を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列ならびに適切な転写および翻訳制御要素を含む発現ベクタを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが挙げられる。このような技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８９）に記載されている；これに関するさらなる詳細については、さらに以下のセクション「ポリヌクレオチド」および「発現」、ならびに実施例のセクションで引用されている文献も参照のこと。
【００７７】
産物の発現に適切な宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞；例えば、細菌細胞、例えば、大腸菌または枯草菌、昆虫細胞（バキュロウイルス）、酵母細胞、植物細胞または動物細胞であり得る。しかしながら、効率的な処理のためには、哺乳動物細胞が好ましい。この目的に有用な典型的な哺乳動物細胞株としては、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞およびＮＳＯ細胞が挙げられる。
【００７８】
公知のまたは推定上の病態生理学的な機能にしたがって分析し、表１〜１３に示されている治療上興味深い分泌型膜結合型／会合型化合物を本発明の範囲内の目的の分子として絞り込んだところ、ＡＰＳ１の患者において、様々な抗原に対する血清反応性が見出された。さらなる実験セットにおいて、ＡＰＳ１患者に関して、およびＡＰＳ２およびＩＰＥＸ患者に関して、様々な抗原に関するさらなるデータが見出された（実施例１７および表２９〜３１を参照のこと）。本発明の方法の一実施形態では、抗原は、分泌型、膜会合型もしくは膜結合型、または膜貫通型の、細胞外タンパク質およびタンパク質、多糖、リポポリタンパク質ならびにリポ多糖からなる群より選択される。しかしながら、原則として、本発明の方法は、任意の所望の抗原に対する自己抗体を提供することができる。前に既に説明したように、これは、本発明にしたがって使用されるのが好ましい被験体、すなわち、その中枢性および／もしくは末梢性寛容の異常または自己寛容の喪失が特定の遺伝子型によって引き起こされている者（すなわち、それぞれ一方ではそれらの体液性免疫反応の一般的な反応性、ならびに遺伝性障害、毒素、感染症、加齢性障害などの素因を含む異なる内部および外部刺激および条件へのそれらの曝露による単一遺伝子性自己免疫性障害）は、一方では、すべての被験体ではないが大部分に共通する自己抗体から、個々の疾患または症状に対して特異的な自己抗体に及ぶ自己抗体プールを提供するからである。本発明の方法の一実施形態における試料プールで一般的に見られる自己抗体について、抗原は、ロイコトリエン、リンホカイン、サイトカイン、インターロイキン、インターフェロンおよびケモカインからなる群より選択される。
【００７９】
自己抗体の抗原標的の別の興味深いクラスは、三モチーフ含有タンパク質（ＴＲＩＭ）であり、ウイルス制限因子として、またはウイルスＲＮＡの下流経路の調節因子およびＤＮＡセンサーおよびインフラマソームとして、抗ウイルス免疫において重要な役割を有するものとして登場した。特に、自己炎症性障害の範囲の病原におけるインフラマソーム過活性化の役割を考慮すると、これらの標的に対する本発明の方法にしたがって同定された抗体は、インフラマソーム活性に関連する疾患の治療介入および処置に有用なツールを提供する予想することが賢明である。したがって、一実施形態では、本発明の方法にしたがって単離するべき自己抗体が血清反応性を示す抗原は、アミノ末端ＲＩＮＧドメイン（これは、Ｅ３リガーゼ活性に重要である）、中央Ｂボックスおよびコイルドコイルドメインならびに可変カルボキシル末端ドメイン（これは、基質相互作用に重要である）を通常含有するいわゆるＴＲＩＭファミリーメンバーに属する；総説については、例えば、Ｊｅｆｆｅｒｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １１（２０１１），６１７−６２５（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）、特に、自己免疫性障害および自己炎症性障害におけるＴＲＩＭの関与に関する第６１９頁の表１およびそこで引用されている参考文献を参照のこと。
【００８０】
さらに、本発明の方法に使用するための非ヒト動物モデルに関して、ＡＩＲＥ欠損マウスなどの被験体動物を試験化合物、放射線、非生物的または生物的ストレスなどの外部刺激に曝露して、前記外部刺激に対して特異的な自己抗体を単離することも考えられる。例えば、ストレス特異的自己抗体または食品もしくは医薬品に反応して誘導される自己抗体を同定および単離するために、本発明の方法を、このような曝露が倫理および道徳の法律に準拠している程度に、ヒト被験体で同様に実施することができる。
【００８１】
当然のことながら、単離された本発明の抗体をそれ自体で患者に適用することはできず、通常は、例えば、患者におけるその安定性、受容性およびバイオアベイラビリティを保証するために、薬学的に製剤化しなければならない。したがって、一実施形態では、単離されたモノクローナル抗体を薬学的に許容され得る担体と混合する工程をさらに含む本発明の方法が提供される。薬学的に許容される担体は、以下でさらに詳細に説明する。
【００８２】
上記のように、本発明は、例えば、ＡＩＲＥ遺伝子における突然変異により、自己免疫の発生障害または無秩序な発生に関連する障害を患っている哺乳動物が常に、いくつかの目的の分子に対する高力価の特異的抗体を産生するという知見に基づくものである。これに関して、本発明によれば、前記抗体を産生するＢ細胞は、このような哺乳動物から単離される。したがって、一実施形態では、好ましくは、ＡＩＲＥ遺伝子における少なくとも１つの突然変異を特徴とする上記に定義されたＢ細胞が提供される。
【００８３】
本発明の結合分子の安定的かつ恒久的な供給源を得るための方策として、直接クローニング、ＰＣＲ増幅または人工合成によって、これらの結合分子をコードする異種遺伝子を単離し、適切な宿主細胞または生物に導入して発現させることができる。したがって、一実施形態では、本発明の目的はまた、組換え細胞を調製するための方法であって、
（ｉ）上記本発明の方法によって、Ｂ細胞クローンを調製する工程；
（ｉｉ）該Ｂ細胞クローンから、目的の抗体をコードする核酸を得る工程；および
（ｉｉｉ）該核酸を発現宿主に挿入して、その宿主で目的の抗体を発現させることを可能にする工程
を含む方法を提供することである。
【００８４】
別の実施形態では、組換え細胞を調製するための方法であって、
（ｉ）上記本発明の方法によって、Ｂ細胞クローンを調製する工程；
（ｉｉ）該Ｂ細胞クローンから、目的の抗体をコードする核酸を配列決定する工程；および
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）からの配列情報を使用して、発現宿主に挿入するための核酸を調製して、その宿主で目的の抗体を発現させることを可能にする工程
を含む方法が提供される。
【００８５】
本明細書のセクション「宿主」で詳細に記載されているように、上記宿主細胞は、前記２つの方法で同様に使用することができる。これに関して、一実施形態では、発現宿主が酵母細胞、植物細胞または動物細胞である上記２つの方法が提供される。組換え細胞の他に、一実施形態では、目的の抗体をコードする核酸分子を調製するための方法であって、
（ｉ）上記本発明の方法によって得られるＢ細胞クローンを調製する工程；
（ｉｉ）核酸を配列決定し、および／または該Ｂ細胞クローンから、目的の抗体をコードする核酸を得る工程
を含む方法を提供することも本発明の範囲内である。
【００８６】
一実施形態では、本発明の目的はまた、医薬用途用の、または治療介入標的としての抗体を調製するための方法であって、
（ｉ）上記本発明の方法によって、目的の抗体を産生するＢ細胞を選択する工程；
（ｉｉ）選択されたＢ細胞から、目的の抗体をコードする核酸を得、および／またはこれを配列決定する工程；
（ｉｉｉ）該核酸を挿入するか、または該核酸を使用して、目的の抗体を発現することができる発現宿主を調製する工程；
（ｉｖ）目的の抗体が発現される条件下で、該発現宿主を培養または継代培養する工程；および場合により、
（ｖ）目的の抗体を精製する工程
を含む方法を提供することである。
【００８７】
目的の各抗体を生産するための上記方法に関して、一実施形態では、本発明は、上記工程（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の間において核酸を操作して、制限部位を導入し、コドン使用頻度を変化させ、ならびに／または転写および／もしくは翻訳調節配列を付加または最適化する方法を提供する。
【００８８】
本発明の方法の代替的な実施形態では、国際公開第９２／１３０６５号にしたがって、
（ａ）上記に定義されたドナー個体由来のリンパ球を免疫不全哺乳動物投与すること、（ｂ）前記哺乳動物の少なくとも１つにおいて免疫細胞の再構成を可能にするのに十分な時間が経過した後、所望の自己抗体を産生する再構成哺乳動物を選択すること、（ｃ）そこからリンパ球を単離する前または後に、選択された哺乳動物のＢリンパ球を不死化すること、および（ｄ）それらが所望の自己抗体を産生するのを可能にする条件下で、不死化Ｂリンパ球を培養し、得られた自己抗体を回収し、得られた自己抗体を培養物から回収すること、を含む方法によって、患者の試料由来の血清反応性自己抗体を生産する。
【００８９】
本発明の方法のさらなる代替的な実施形態では、欧州特許出願公開第１３９４１８３号明細書（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているような固体支持体に結合したリガンドでアフィニティクロマトグラフィを使用して患者試料から得られた静脈内免疫グロブリン調製物（ＩＶＩｇ）から、自己抗体を精製することができる。
【００９０】
上記で説明したように、目的の特定の抗原に特異的に結合する結合分子を提供することは本発明の範囲内であった。このような結合分子に関して、上記のように、および実施例に詳細に記載されているように、本発明はさらに、本発明の方法によって得ることができる抗体またはその抗原結合断片を提供する。特に好ましい実施形態では、この抗体は、ヒト抗体である。本発明の一実施形態では、抗体は、（ｉ）インターロイキン−１７Ａ（ＩＬ−１７Ａ）および／またはインターロイキン−１７Ｆ（ＩＬ−１７Ｆ）；（ｉｉ）インターロイキン２２（ＩＬ−２２）；または（ｉｉｉ）ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロ二量体に対するものである。
【００９１】
添付の実施例４および６で実証されているように、低阻害濃度（ＩＣ５０）で、試験サイトカインＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２２に対して特に高いインビトロ中和活性を示す結合分子（すなわち、抗体）を同定およびクローニングした。これに関して、本発明の一実施形態では、各標的分子（例えば、ＩＬ−１７またはＩＬ−２２）に対する高親和性を有する抗体であって、１００ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは１０ｎｇ／ｍｌ未満の濃度でＥＤ５０を示す抗体が提供される。本発明の抗体の結合親和性に関するさらなる詳細については、例えば、さらに以下のセクション「結合特性」を参照のこと。
【００９２】
本発明は、それらの可変領域（すなわち、結合ドメイン）に、図１５に示されているアミノ酸配列（ＶＨ）（配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５）および（ＶＬ）（配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９、５７）を含む可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことを特徴とし得るこのような結合分子（すなわち、抗体およびその結合断片）を例示する。図１５で下線が付されている例示的なＣＤＲ配列を参照のこと。しかしながら、以下で議論されているように、当業者であれば、加えてまたはあるいは、特にＣＤＲ２およびＣＤＲ３の場合には、アミノ酸配列が図１５に示されているものとは１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸またはそれ以上異なるＣＤＲを使用することができるという事実を十分に認識している。したがって、一実施形態では、その可変領域に、
（ａ）図１５（ＶＨ）（配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５）；および
（ｂ）図１５（ＶＬ）（配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９、５７）
に示されているアミノ酸配列のいずれか１つを含む可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む本発明の抗体または抗原結合断片が提供される。
【００９３】
さらに、一実施形態では、本発明の抗体または抗原結合断片は、図１５に示されているＶＨおよび／またはＶＬ領域のアミノ酸配列を含む。あるいは、本発明の抗体は、ＩＬ−１７またはＩＬ−２２抗体に対する結合について、図１５に示されているかまたは表１７に示されている対応する核酸によってコードされるＶＨおよび／またはＶＬ領域を有する抗体の少なくとも１つと競合する抗体またはその抗原結合断片である。
【００９４】
したがって、本発明は、一般に、上記機能特性の１つ以上を有し、その可変領域に、
（ａ）（ｉ）図１５（ＶＨ）（配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５）；および
（ｉｉ）図１５（ＶＬ）（配列番号９、１７、２５、３３、４１、４９、５７）
に示されているＶＨおよび／またはＶＬ可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）；
（ｂ）図１５に示されているＶＨおよび／またはＶＬ領域のアミノ酸配列；
（ｃ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つの部分的な変化から生じる（ａ）由来のアミノ酸配列からなる少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｄ）（ｂ）のアミノ酸配列の部分的な変化から生じる（ｂ）由来のアミノ酸配列を含む重鎖および／または軽可変領域；
（ｅ）（ａ）のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％の同一性を有する（ａ）由来のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのＣＤＲ；
（ｆ）（ｂ）のアミノ酸配列と少なくとも６０％の同一性を有する（ｂ）由来のアミノ酸配列
を含む抗体、好ましくはヒト抗体およびその抗原結合断片に関する。
【００９５】
完全ヒト抗体およびそのネイティブなＦａｂ断片を提供するために、本発明のヒト抗体は、好ましくは、表１７に示されているＣＨおよびＣＬアミノ酸配列（配列番号１１、１３、１９、２１、２７、２９、３５、３７、４３、４５、５１、５３、５９、６１）から選択されるアミノ酸配列、または少なくとも６０％の同一性を有するそれら由来のアミノ酸配列を含むＣＨおよび／またはＣＬ定常領域をさらに含む。
【００９６】
誘導体配列の場合、前記配列は、配列表で特定されている上記配列からなる群の配列と少なくとも６０％の同一性、より好ましくは（以下の順序で）少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、最も好ましくは９５％、少なくとも９６〜９９％、またはさらに１００％の同一性を示す。２つの配列間の％同一性は、２つの配列を最適にアライメントするために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮した、これらの配列が共有する同一位置の数の関数である。配列の比較および２つの配列間の％同一性の決定は、当業者に周知の数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。本明細書で以下にさらに言及されているように、本明細書で言及される同一性は、ＢＬＡＳＴプログラムを使用して決定されるべきものである。
【００９７】
上記で説明したように、これらの抗体もマウスのものであり得るが、治療用途には、ヒト化、異種またはキメラヒト−マウス抗体、特に完全ヒト抗体が好ましい。抗体の抗原結合断片は、例えば、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片または単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡＢ）であり得る。
【００９８】
前述のように、好ましい実施形態では、本発明は、ラムダまたはカッパと組み合わせて、少なくとも定常重鎖Ｉ（ＣＨ１）および対応する定常領域軽鎖（すなわちγ−１、γ−２、γ−３またはγ−４）を含む実質的に完全なヒト抗体、好ましくはＩｇＧに関する。特に好ましい実施形態では、以下の表１７および配列番号１０〜１３、１８〜２１、２６〜２９、３４−３７、４２〜４５、５０〜５３および５８〜６１に示されているように、実施例で例証されている主題抗体の単離されたこれらの定常領域のヌクレオチドおよびアミノ酸配列が使用される。
【００９９】
上記にしたがって、一実施形態では、本発明はまた、本発明の抗体または抗原結合断片の一方の免疫グロブリン鎖の少なくとも可変領域をコードするポリヌクレオチドを提供する。典型的には、ポリヌクレオチドによってコードされる前記可変領域は、前記抗体の可変領域のＶＨおよび／またはＶＬの少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。抗体の可変領域および定常領域は、以下のセクション「ＩｇＧの構造」により詳細に記載されている。本発明の好ましい実施形態では、ポリヌクレオチドは、以下の表１７に示されている本発明の抗体のＶＨまたはＶＬ領域のポリヌクレオチド配列を有する核酸を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。これに関して、当業者であれば、軽鎖および／または重鎖の少なくとも可変ドメインをコードするポリヌクレオチドは、免疫グロブリン鎖またはそれらの一方のみのいずれかの可変ドメインをコードし得ることを容易に認識するであろう。
【０１００】
【表１７−１】
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【表１７−２】
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【表１７−３】
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【表１７−４】
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【表１７−５】
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【表１７−６】
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【表１７−７】
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【表１７−８】
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【表１７−９】
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【表１７−１０】
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【表１７−１１】
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【表１７−１２】
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【表１７−１３】
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【表１７−１４】
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【０１０１】
当業者であれば、所望の特異性および生物学的機能の他のポリペプチドまたは抗体を構築するために、上記可変ドメインを有する抗体の可変ドメインを使用することができることを容易に認識するであろう。したがって、本発明はまた、上記可変ドメインの少なくとも１つのＣＤＲを含むポリペプチドおよび抗体であって、有利には、添付の実施例に記載されている抗体と実質的に同じかまたは類似の結合特性を有するポリペプチドおよび抗体を包含する。当業者であれば、該可変ドメインまたはＣＤＲを使用して、例えば、欧州特許出願公開第０４５１２１６号明細書および欧州特許出願公開第０５４９５８１号明細書に記載されている当技術分野において公知の方法にしたがって、本明細書に記載される抗体を構築することができることを容易に認識するであろう。さらに、当業者であれば、Ｋａｂａｔによって定義されているＣＤＲと部分的にオーバーラップするＣＤＲ内または超可変ループ内にアミノ酸置換を作ることによって（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１−９１７）、結合親和性を増強することができることを理解している。したがって、本発明はまた、上記ＣＤＲの１つ以上が、１つ以上、好ましくは２つ以下のアミノ酸置換を含む抗体に関する。好ましくは、本発明の抗体は、その免疫グロブリン鎖の一方または両方に、配列番号７、９、１５、１７、２３、２５、３１、３３、３９、４１、４７、４９、５５または５７に示されているか、または図１５に示されている可変領域の２つまたは全３つのＣＤＲを含む。
【０１０２】
上記抗体をコードする本発明のポリヌクレオチドは、例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成的に生産されたＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはそれらのポリヌクレオチドのいずれかを単独でまたは組み合わせて含む組換え的に生産されたキメラ核酸分子であり得る。好ましい実施形態では、場合により、前記抗体の他方の免疫グロブリン鎖の可変領域をコードする前記ポリヌクレオチドと組み合わせて、上記ポリヌクレオチドを含むベクタが提供される。このようなベクタは、適切な宿主細胞中、適切な条件下で前記ベクタの選択を可能にするマーカ遺伝子などのさらなる遺伝子を含み得る。
【０１０３】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、原核細胞または真核細胞における発現を可能にする発現制御配列に機能的に連結される。前記ポリヌクレオチドの発現は、翻訳可能なｍＲＮＡへのポリヌクレオチドの転写を含む。真核細胞、好ましくは、哺乳動物細胞における発現を確実にする調節要素は、当業者に周知である。それらは、通常、転写開始を確実にする調節配列と、場合により、転写終止および転写産物の安定化を確実にするポリＡシグナルとを含む。さらなる調節要素は、転写および翻訳エンハンサ、ならびに／または本来的に結合しているプロモータ領域もしくは異種プロモータ領域を含み得る。
【０１０４】
これに関して、当業者であれば、軽鎖および／または重鎖の少なくとも可変ドメインをコードするポリヌクレオチドは、両方の免疫グロブリン鎖または一方の鎖のみの可変ドメインをコードし得ることを容易に認識するであろう。
【０１０５】
同様に、前記ポリヌクレオチドは同じプロモータの制御下にあってもよいし、または別個に発現制御されてもよい。原核生物宿主細胞における発現を可能にする有望な調節要素は、例えば、大腸菌の場合にはＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐまたはｔａｃプロモータを含み、真核生物宿主細胞における発現を可能にする調節要素の例は、酵母の場合にはＡＯＸ１またはＧＡＬ１プロモータ、または哺乳動物および他の動物細胞の場合にはＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモータ、ＣＭＶ−エンハンサ、ＳＶ４０−エンハンサまたはグロビンイントロンである。
【０１０６】
転写開始に関与する要素に加えて、このような調節要素は、ポリヌクレオチドの下流に、ＳＶ４０−ポリＡ部位またはｔｋ−ポリＡ部位などの転写終止シグナルも含み得る。さらに、使用される発現系に応じて、ポリペプチドを細胞区画に方向付けるかまたはそれを培地に分泌させることができるリーダ配列を本発明のポリヌクレオチドのコード配列に付加することができ、当技術分野において周知である。リーダ配列は、翻訳、開始および終止配列と適切な段階で会合し、好ましくは、リーダ配列は、翻訳されたタンパク質またはその一部を周辺腔または細胞外培地に分泌させることができる。場合により、異種配列は、所望の特徴、例えば、発現された組換え産物の安定化または簡単な精製を付与するＣ末端またはＮ末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。本文脈では、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクタｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＳＰＯＲＴ１（ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ）などの適切な発現ベクタが当技術分野において公知である。
【０１０７】
好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができるベクタ中の真核生物プロモータ系であるが、原核生物宿主用の制御配列も使用し得る。ベクタが適切な宿主に組み込まれたら、ヌクレオチド配列の高レベルの発現に適切な条件下で宿主を維持し、所望により、免疫グロブリン軽鎖、重鎖、軽鎖／重鎖二量体またはインタクトな抗体、結合断片または他の免疫グロブリン形態を回収および精製する；Ｂｅｙｃｈｏｋ，Ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．，（１９７９）を参照のこと。
【０１０８】
さらに、本発明は、場合により、本発明の抗体の他方の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードする本発明のポリヌクレオチドと組み合わせて、抗原または好ましくは本発明の抗体の免疫グロブリン鎖の可変ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子工学で通常使用されるベクタ、特にプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージに関する。好ましくは、前記ベクタは、発現ベクタおよび／または遺伝子導入もしくは標的化ベクタである。
【０１０９】
レトルウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルスまたはウシ乳頭腫ウイルスなどのウイルス由来の発現ベクタを、標的細胞集団への本発明のポリヌクレオチドまたはベクタの送達に使用することができる。組換えウイルスベクタを構築するために、当業者に周知の方法を使用することができる；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）に記載されている技術を参照のこと。あるいは、標的細胞への送達のために、本発明のポリヌクレオチドおよびベクタをリポソームに再構成することができる。本発明のポリヌクレオチドを含有するベクタ（例えば、免疫グロブリン鎖の重および／または軽可変ドメインをコードする配列および発現制御配列）を、周知方法（これは、細胞宿主の種類に応じて変化する）によって宿主細胞に導入することができる。例えば、原核細胞の場合には塩化カルシウムトランスフェクションが一般的に用いられるのに対して、他の細胞宿主の形質転換の場合にはリン酸カルシウム処理またはエレクトロポレーションが使用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照のこと）。
【０１１０】
上記に関して、本発明はさらに、前記ポリヌクレオチドまたはベクタを含む宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。宿主細胞中に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクタは、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得るか、または染色体外で維持され得る。宿主細胞は、細菌、昆虫、真菌、植物、動物またはヒト細胞などの任意の原核細胞または真核細胞であり得る；本発明の抗体を生産するのに適切な宿主細胞および方法は、以下のセクション「宿主細胞」により詳細に記載されている。
【０１１１】
結合分子、抗体またはその断片は、治療薬として直接使用することができる。しかしながら、一実施形態では、本発明によって提供される抗体または抗原結合断片は、検出可能に標識されるか、または薬物に結合され、ここで、検出可能な標識は、酵素、放射性同位体、フルオロフォア、ペプチドおよび重金属からなる群より選択される。標識された本発明の抗体または抗原結合断片は、「免疫化学／免疫標識」のようなインビトロアッセイを含め、インビボまたはインビトロで特定の標的を検出するのに使用することができる。インビボにおいて、それらは、目的の抗原を発現する組織、細胞または他の物質を検出するために、核医学イメージング技術と同様の方法で使用することができる。標識、それらの診断での使用、およびそれらと本発明の結合分子とのカップリングは、さらに以下のセクション「標識および診断」により詳細に記載されている。
【０１１２】
本発明の抗体は、自己免疫性障害に罹患している動物またはヒトから単離される。内因性分子（例えば、表１〜１４または表２９〜３１に含まれるタンパク質）に結合することによって、それらのいくつかは、腫瘍または神経変性疾患の処置に使用することができる。一方、本発明で同定された抗体は、上記および下記により詳細に記載されているように、炎症を誘導に関与し得るか、または例えば、ＡＰＥＣＥＤ患者で観察される症候に関連する罹患個体の免疫系を重度に障害し得る。したがって、本発明のさらなる態様は、罹患ヒト患者または動物における自己抗体の数および／またはその作用を最小限に抑えるための手段および方策を提供することによって、自己免疫性障害を患っている被験体の病理学的反応を消滅または少なくとも軽減することである。したがって、一実施形態では、本発明はまた、本発明の自己抗体の抗イディオタイプ抗体を提供する。競合抗原を適用し、それにより、自己抗体とそれらの各標的とを隔絶してその結合を防止することよって、同様の効果を得ることができる。したがって、一実施形態では、本発明はまた、すなわち、本発明の方法にしたがって単離された本発明の自己抗体によって特異的に認識されるエピトープを含む合成ペプチドまたはペプチド系化合物に関する。
【０１１３】
既に上述したように、本発明はまた、上記に定義された障害（すなわち、自己寛容の発生障害または無秩序な発生に関連する障害）の処置に使用するための、本発明の抗イディオタイプ抗体またはペプチドもしくはペプチド系化合物に関する。これらの単離された本発明の抗体またはその断片は、モノクローナル抗イディオタイプのパネルを作製するために免疫原として使用することができる。抗イディオタイプ抗体を作製するのに適切な方法については、Ｒａｙｃｈａｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１９８６），１７４３を参照し、Ｔ細胞については、Ｅｒｔｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５９（１９８５），１７７６を参照のこと。Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（１９８６），１７４３によって詳細に記載されているように、当技術分野においてルーチンに実施される標準的なアッセイを使用すれば、抗イディオタイプ抗体は、内部イメージおよび非内部イメージイディオトープの表示を特徴とするであろう。抗イディオタイプ抗体が、それが結合するかまたは結合される抗体の抗原を構造的に模倣する場合、その抗原の「内部イメージ」と称される。
【０１１４】
自己免疫性疾患関連自己抗体（複数の自己抗体）のイディオタイプを模倣する分子を提供する方法は、当技術分野において説明されている；例えば、国際公開第０３／０９９８６８号（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。例えば、このような方法は、以下の工程：（ａ）本発明の方法にしたがって自己抗体を提供すること；（ｂ）該自己抗体を固相に結合してアフィニティマトリックスを形成すること；（ｃ）免疫グロブリンを含むプールした血漿もしくはＢ細胞を該アフィニティマトリックスと接触させ、次いで未結合の血漿成分を除去すること；（ｄ）自己抗体に対する抗イディオタイプ抗体（抗Ｉｄ）である結合した免疫グロブリンをマトリックスから溶出すること；（ｅ）複数の分子メンバーを含む分子ライブラリを提供すること；ならびに（ｅ）該抗Ｉｄを該分子ライブラリと接触させ、該抗Ｉｄが結合した結合分子を単離すること（該結合分子は、自己抗体のイディオタイプを模倣する分子である）を含み得る。自己抗体を単離する方法は、国際公開第２０１０／１３６１９６号（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されており、自己免疫性疾患および免疫系障害を処置するための、正常ヒト血清（ＮＨＳ）から単離された天然ポリクローナルＩｇＧ反応性抗体（Ａｂ）を含有する免疫グロブリン調製物が記載されている。ＩｇＧ反応性Ａｂは、抗原結合部位内またはその付近（例えば、オーバーラップしている）のいずれかに位置するそれらの抗原決定基に結合することよって、自己免疫性疾患を患っている患者の血清中に存在する疾患関連または病原性自己抗体を強力に中和する。
【０１１５】
さらに、本発明はまた、上記抗体もしくは抗原結合断片、ポリヌクレオチド、ベクタ、細胞、抗イディオタイプ抗体またはペプチドもしくはペプチド系化合物を含む組成物に関する。一実施形態では組成物は医薬組成物であり、薬学的に許容し得る担体をさらに含む、薬学的に許容し得る担体、投与経路および投与計画は、当業者に公知の対応する文献から選ぶことができ、さらに以下のセクション「薬学的に許容し得る担体」および「投与計画」にもより詳細に記載されている。
【０１１６】
生化学的および細胞ベースのインビトロアッセイの他に、本発明の抗体の治療有用性は、乾癬、ＩＢＤ、カンジダ症などの適切な動物モデルで検証することができる；実施例５および６、ならびに炎症性腸疾患ＩＢＤ（ＤＳＳ大腸炎）モデルについてはＷｉｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ２（２００７），５４１−５４６；乾癬（イミキモド）モデルについてはｖａｎ  ｄｅｒ  Ｆｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８２（２００９），５８３６−５８４５；多発性硬化症（実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルについてはＭｉｌｌｅｒ，Ｓ．Ｄ．ａｎｄ  Ｋａｒｐｕｓ，Ｗ．Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．７８（２００７．），１５．１．１−１５．１．１８およびｈｔｔｐ：／／ｈｏｏｋｅｌａｂｓ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｅａｅ／；関節リウマチ（コラーゲン誘導性関節炎）モデルについてはＪｕｌｉａ  Ｊ  Ｉｎｇｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ３（２００８），６１２−６１８を参照のこと。
【０１１７】
一実施形態では、医薬組成物は、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、コルチコステロイド、抗ヒスタミンおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、炎症または自己免疫性障害を処置するのに有用なさらなる薬剤をさらに含む。加えてまたはあるいは、さらなる実施形態では、医薬組成物は、免疫抑制薬および抗炎症または「抗リウマチ」薬からなる群より選択される、炎症関連疾患を処置するのに有用なさらなる薬剤をさらに含む。
【０１１８】
別の実施形態では、組成物は診断組成物であり、免疫診断法または核酸ベースの診断法に通常使用される試薬をさらに含む。
【０１１９】
さらに、本発明は、炎症もしくは自己免疫性障害の進行を処置または予防するのに使用するための；炎症もしくは自己免疫性障害に関連する症候を改善するための；炎症もしくは自己免疫性障害の存在について被験体を診断またはスクリーニングするための、または炎症もしくは自己免疫性障害を発症する被験体のリスクを決定するための、上記抗体もしくは抗原結合断片、抗イディオタイプ抗体またはペプチドもしくはペプチド系化合物を提供する。
【０１２０】
これに関して、いくつかの適用経路を用いることができる。本発明の一実施形態では、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、非経口投与、またはエアロゾルとして投与されるように設計されている、上記抗体もしくは抗原結合断片、抗イディオタイプ抗体またはペプチドもしくはペプチド系化合物が提供される。
【０１２１】
例えば、炎症に関連する障害の処置に適切な多数の分子により、本発明はまた、このような障害のいくつかの処置方法を提供する。一実施形態では、炎症または自己免疫性障害に関連する障害を処置する方法であって、治療有効量の上記抗体もしくは抗原結合断片、抗イディオタイプ抗体またはペプチドもしくはペプチド系化合物を、それを必要とする被験体に投与することを含む方法が提供される。
【０１２２】
この方法の一実施形態では、前記障害は、尋常性座瘡；関節炎、例えば、痛風性関節炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、変形性関節症、乾癬性関節炎、関節リウマチ；喘息；セリアック病；慢性前立腺炎；皮膚炎；真性糖尿病１型；糸球体腎炎；過敏症；心筋炎；多発性硬化症；炎症性腸疾患；骨盤内炎症性疾患；多発性筋炎；乾癬；サルコイドーシス；血管炎；ＡＰＳ１；間質性膀胱炎または再灌流障害もしくは移植拒絶反応により生じる炎症からなる群より選択される（上記を参照のこと）。
【０１２３】
さらに、一実施形態では、本発明は、炎症または自己免疫性障害に関係する障害を診断および／または処置する方法であって、
（ｉ）上記抗体もしくは抗原結合断片の少なくとも１つのＣＤＲ；または
（ｉｉ）少なくとも１つの上記抗イディオタイプ抗体および／またはペプチドもしくはペプチド系化合物
を含む治療有効量のリガンド結合分子を被験体に投与することを含む方法に関する。
【０１２４】
疾患に関係するかまたはこれを引き起こしている特定の抗原のエピトープに対して特異的な１つのモノクローナル抗体のみの使用に基づく処置方法は、いくつかの欠点に悩まされる場合がある。例えば、処置の困難性およびおそらくは非効率性は、いくつかの抗原を同時に標的化することを必要とする特定の障害を引き起こす病原性機構の多様性に起因し得る。さらに、異なるまたは１人の患者のいずれかでは、例えば、多型、グリコシル化の不均一性、または所定の抗原のわずかな変性に関して患者集団の固有の多様性を考慮しなければならず、これらは、少なくとも使用されるモノクローナル抗体の結合効率の低下につながり得る。これらの欠点のいくつかは、例えば、処置しようとする患者に抗原が免疫学的に関連しているか、および特定の患者において任意のエピトープ変化があるかを決定する前処理スクリーニングによって回避することができる。しかしながら、このようなスクリーニングは、処置の緊急性またはコスト的な制約のいずれかにより省略されることが多い。したがって、本発明はさらに、２種以上の結合分子を患者に同時に適用することに基づく方法に関する。これらの結合分子は、異なるエピトープで１つの抗原に特異的に結合し得るか、または適用される結合分子はそれぞれ、別の疾患関連抗原に特異的に結合する。本発明の結合分子が１つの抗原に対するものである（特異的に結合する）場合、それらの結合特異性は、前記抗原の異なるエピトープに対するものである。自己免疫性障害（例えば、ＡＰＳ１）を患っている患者であって、約３０００種の内因性抗原に対する自己抗体の存在を考慮すると、１つ特定の抗体による単剤療法が多くの場合に適さない患者を処置するために、このようなカクテルの使用が特に想定される。このような場合において、同じかまたは異なる抗原特異性を有する２つ以上の本発明のモノクローナル抗体ならびに／またはペプチドおよびペプチド系化合物による併用療法は、症候の少なくともいくらかの軽減を達成すると予想される。
【０１２５】
したがって、一実施形態では、障害を処置するさらなる方法であって、
−表１〜１４および２９〜３１ならびに図１〜４に示されているような、炎症、自己免疫性障害、細胞の成長および分化、筋肉機能、ならびに神経変性に関与する分泌型タンパク質または膜貫通型タンパク質の群の抗原に特異的に結合する本発明の抗体またはその抗原結合断片；および／または
−本発明の抗イディオタイプ抗体、および／または本発明の抗体もしくはその抗原結合断片によって特異的に認識されるエピトープを含む本発明のペプチドもしくはペプチド系化合物
からなる群より選択される少なくとも２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の成分から本質的になる治療有効量のカクテルを被験体に投与することを含む方法が提供される。
【０１２６】
別の実施形態では、本発明は、ペプチドの請求項のいずれか１つで定義された障害関連タンパク質の存在を伴う障害を診断するためのキットであって、上記抗体もしくは抗原結合断片、抗イディオタイプ抗体またはペプチドもしくはペプチド系化合物、ポリヌクレオチド、ベクタまたは細胞を、場合により使用のための試薬および／または説明書と共に含むキットに関する。例えば、キットを含む容器内には、薬学的製品または生物学的製品の製造、使用または販売を監督する官庁が規定する形態の通知書を本発明のキットに付随させることができ、その通知書は製造、使用または販売についての上記官庁によるヒトへの投与に対する認可を反映する。加えてまたはあるいは、キットは、適切な診断アッセイでの使用のための試薬および／または説明書を含む。当然のことながら、組成物（すなわち、本発明のキット）は、上記に定義された炎症関連抗原の存在を伴う障害の診断、予防および処置に特に適切であり、上記疾患の処置に特に適用可能である。
【０１２７】
別の実施形態では、本発明は、上記本発明の結合分子、抗体、抗原結合断片、ペプチドもしくはペプチド系化合物、ポリヌクレオチド、ベクタまたは細胞のうちのいずれか１つ、および場合により、免疫診断法または核酸ベースの診断法で通常使用される試薬などの検出に適切な手段を含む診断組成物に関する。本発明の抗体は、例えば、それらを液相でまたは固相担体に結合して利用することができるイムノアッセイで使用するのに適切である。本発明の抗体を利用することができるイムノアッセイの例は、直接または間接フォーマットのいずれかの競合および非競合イムノアッセイである。このようなイムノアッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、サンドイッチ（イムノメトリックアッセイ）、フローサイトメトリおよびウェスタンブロットアッセイである。本発明の抗原および抗体を多くの異なる担体に結合させ、それらに特異的に結合した細胞を単離するのに使用することができる。周知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート、デキストラン、ナイロン、アミロース、天然および改変セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースおよびマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本発明の目的のために、可溶性または不溶性のいずれかであり得る。当業者に公知の多くの異なる標識および標識方法がある。本発明に使用することができる標識の種類の例としては、酵素、放射性同位体、コロイド状金属、蛍光化合物、化学発光化合物および生物発光化合物が挙げられる（上記実施形態も参照のこと）。
【０１２８】
本文脈では、本発明はまた、この目的のために特別に設計される手段に関する。例えば、自己免疫性疾患、特に関節炎、Ｉ型糖尿病またはＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１を患っている患者内に存在し得る自己抗体を検出するためには、炎症関連抗原を含有する上記障害関連タンパク質由来の抗原、またはそれらの炎症関連抗原のいずれか１つを特異的に認識する本発明の自己抗体もしくは同等の抗原結合分子のいずれかが負荷されたタンパク質または抗体ベースのアレイを使用することができる。マイクロアレイイムノアッセイの設計は、Ｋｕｓｎｅｚｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５（２００６），１６８１−１６９６に要約されている。したがって、本発明はまた、本発明にしたがって同定された結合分子または抗原が負荷されたマイクロアレイに関する。
【０１２９】
定義および実施形態
特に指定がない限り、本明細書で使用される用語には、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７、２０００年改編および２００３年再版、ＩＳＢＮ０１９８５０６７３２で提供されている定義が与えられる。
【０１３０】
用語「ａ」または「ａｎ」の実体は、その実体の１つ以上を指すことに留意する；例えば、「抗体」は、１つ以上の抗体を表すと理解される。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書で互換的に使用され得る。
【０１３１】
用語「中和する」および「中和抗体」はそれぞれ、当技術分野では共通して、抗原または生きている微生物の生物学的活性を減少させるか、または少なくともいくらかの消失させる抗体を意味するものとして使用されている。例えば、本発明の抗ＩＬ−１７Ｆ抗体は、例えば実施例に記載されているアッセイにおいて、適切な量でサイトカイン活性を消失させる場合には中和抗体である。中和は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）によって一般に定義され、中和滴定曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいて統計的に評価することができる。腫瘍疾患の場合、中和は、例えば、腫瘍成長の阻害を測定することによって評価することができる。例えば、発癌性移植片誘導性のインターロイキン−６分泌が腫瘍形成に必要であること、および対応する癌治療に抗ＩＬ−６抗体を使用することができることが公知である；例えば、Ａｎｃｒｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」２１（２００７），１７１４−１７１９を参照のこと。ウイルスなどの感染性病原体の中和は、例えば、ウイルスの受容体を遮断して感染細胞を減少させることによって、ウイルスまたはその標的細胞の反応を介した感染性を喪失させることと定義され、当業者に公知の適切な細胞ベースのアッセイで容易に決定することができる。当業者であれば、本発明の抗体によって「中和」され得る他の生物学的活性を容易に確認することができる。
【０１３２】
中枢性および末梢性寛容
自己寛容は、免疫系が、その生物の構成成分である抗原に反応しない過程である。自己寛容は、自己反応性Ｔ細胞およびＢ細胞の死滅または不活性化によって達成され、中心的（生成的）な免疫器官（胸腺または骨髄）における中枢性寛容の一部として、または最も一般的に二次免疫組織とみなされるもの（例えば、脾臓、リンパ節、腸）における末梢性寛容として起こり得る。自己寛容は、正常な免疫系の中心的な特徴である。自己寛容を確立および／または維持することができないと自己免疫になり、宿主生物の健康に深刻な影響を及ぼす自己免疫性疾患をもたらし得る。
【０１３３】
中枢性寛容は、胸腺および骨髄などの中心的な免疫器官で誘導される自己寛容の一形態である。中枢性寛容の過程において、自己抗原を認識する新たに発達したＴ細胞およびＢ細胞は、細胞死によって、不活性化の他の形態によって、または免疫抑制調節リンパ球への発達的変換によって自己抗原非反応性になる。Ｔ細胞の中枢性寛容は胸腺で誘導され、そこで、高親和性で自己ペプチド−ＭＨＣ複合体を認識する発達中の胸腺細胞（胸腺内のＴ細胞）の大部分が除かれる。Ｂ細胞の中枢性寛容は、骨髄で誘導される。胸腺および骨髄における分化の間に、Ｔ細胞およびＢ細胞は、Ｔ細胞受容体遺伝子およびＢ細胞受容体遺伝子をそれぞれ含有するそれらのゲノム領域を再編成する。Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えとも称される体細胞遺伝子再編成は、Ｔ細胞受容体および抗体の多様性を生み出す。この多様性は、Ｔ細胞およびＢ細胞クローンのレパートリの基礎となる。Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えの後、成熟Ｔ細胞および成熟Ｂ細胞は、抗原を認識することができる。この段階で抗原を認識することによって、その抗原受容体が生成的な免疫器官内に存在する自己抗原に強く結合する発達中のＴ細胞およびＢ細胞を排除または改変する陰性選択が可能になる。Ｔ細胞およびＢ細胞は両方とも、Ｔ細胞受容体およびＢ細胞受容体がそれぞれ細胞表面上に最初に現れた後短期間内に陰性選択を受けやすい。
【０１３４】
Ｔ細胞およびＢ細胞は、生成的な免疫器官内に存在する抗原に対して中枢性寛容を発達させることができる。骨髄では、Ｂ細胞は、遍在的に発現している骨髄特異的抗原に対して、および血液の循環によって取り込まれた抗原に対して寛容を発達させる。胸腺では、胸腺髄質上皮細胞は、発達中のＴ細胞に提示される数百の自己抗原を発現することができる。胸腺髄質上皮細胞における自己抗原の広範な発現に関与する遺伝子は、ＡＩＲＥ（自己免疫調節因子）である。ＡＩＲＥは、特定の末梢器官でのみ通常発現している複数の組織特異的遺伝子（例えば、膵臓のランゲルハンス島におけるインスリン）を活性化する。機能的ＡＩＲＥ遺伝子の非存在下では、抗原が提示されず、Ｔ細胞が不活性化されず、自己抗原に対する自己免疫が発達して、ＡＰＥＣＥＤ患者およびＡｉｒｅ欠損マウスでは病変をもたらす。
【０１３５】
中枢性寛容は、細胞が依然として生成的な免疫器官内に存在する間に、末梢に移行する前に、細胞が末梢に到達してから末梢性寛容が生じる間に起こるという点で末梢性寛容と区別される。
【０１３６】
末梢性寛容は、Ｔ細胞およびＢ細胞が末梢組織内の抗原に反応しない自己寛容の一形態である。末梢性寛容は、リンパ球活性化に必要な共刺激シグナルの非存在下、もしくは共阻害シグナルの存在下における抗原の認識によって、またはこれらの抗原によって繰り返される永続的な刺激によって誘導される。これらの抗原は、直接的な免疫学的監視下にない免疫学的特権組織、例えば、脳、眼、精巣および胎児で発現されるので、末梢性寛容は、自己反応性リンパ球が活性化されない免疫学的無視を含む。末梢性寛容はまた、制御性Ｔ細胞による自己反応性細胞の抑制を含む。
【０１３７】
ＡＩＲＥ発現は、胸腺外で、リンパ節におけるＡＩＲＥ発現細胞の小集団で報告されている。したがって、ＡＩＲＥは、末梢における自己反応性Ｔ細胞の削除を介して、自己寛容において重要な役割を果たし得る。リンパ節における珍しいＡＩＲＥ発現細胞は、プロフェッショナル抗原提示細胞として作用し、組織特異的抗原を発現するように、胸腺髄質上皮細胞といくつかの特徴を共有する。これにもかかわらず、リンパ節におけるＡＩＲＥ調節組織特異的抗原のセットは、胸腺のＡＩＲＥ調節抗原とほとんどオーバーラップしない。オーバーラップの欠如は、胸腺とリンパ節との間の組織特異的抗原発現について、様々な順序のＡＩＲＥ依存性転写調節が存在し得ることを示唆している。
【０１３８】
寛容の誘導に重要な別の遺伝子は、ｆｏｘｐ３である。これは、胸腺およびおそらくは末梢における自己抗原と会合するＴリンパ球の免疫抑制調節的な方向付けを誘導する転写因子をコードする。機能的ｆｏｘｐ３遺伝子をコードすることができないのは、その結果として幅広い自己免疫性疾患も患っているＩＰＥＸ患者の特徴である。
【０１３９】
ペプチドおよびポリペプチド：
用語「ペプチド」は、用語「ポリペプチド」および「タンパク質」（これは、本明細書では時には互換的に使用され得る）、ならびにその意味の範囲内で、任意のアミノ酸配列、例えば、本発明の重鎖および軽鎖可変領域ならびに定常領域のアミノ酸配列を含むと理解される。同様に、タンパク質およびポリペプチドの断片も意図され、本明細書では「ペプチド」と称され得る。それにもかかわらず、用語「ペプチド」は、好ましくは、少なくとも５個の連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも１０個の連続するアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５個の連続するアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２０個の連続するアミノ酸、特に好ましくは少なくとも２５個の連続するアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味する。加えて、本発明によるペプチドは、典型的には、１００個以下の連続するアミノ酸、好ましくは８０個未満の連続するアミノ酸、より好ましくは５０個未満の連続するアミノ酸を有する。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、単数の「ポリペプチド」および複数の「ポリペプチド」、例えば、本発明の抗体を包含することを意図し、（ペプチド結合としても公知である）アミド結合によって直線的に連結したモノマー（アミノ酸）から構成される分子を指す。用語「ポリペプチド」は、２個以上のアミノ酸からなる任意の１つまたは複数の鎖を指し、特定の長さの産物を指さない。したがって、「ペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「オリゴペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」または２個以上のアミノ酸からなる１つまたは複数の鎖を指すのに使用される他の任意の用語が「ポリペプチド」の定義内に含まれ、用語「ポリペプチド」は、これらの用語のいずれかに代えてまたはこれと互換的に使用され得る。
【０１４１】
用語「ポリペプチド」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による切断、または天然に存在しないアミノ酸による改変を含むポリペプチドの発現後修飾産物を指すことを意図する。ポリペプチドは天然の生物学的供給源に由来するものでもよいし、または組換え技術によって生産されるものでもよいが、必ずしも指定の核酸配列から翻訳されるものではない。それは、化学合成を含む任意の方法で作製され得る。
【０１４２】
本発明のポリペプチドは、約３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、２５個以上、５０個以上、７５個以上、１００個以上、２００個以上、５００個以上、１，０００個以上または２，０００個以上のアミノ酸のサイズであり得る。それにもかかわらず、用語「ポリペプチド」は、好ましくは、少なくとも１００個のアミノ酸を含むアミノ酸ポリマーを意味する。ポリペプチドは一定の三次元構造を有し得るが、それらは必ずしもこのような構造を有するものではない。一定の三次元構造を有するポリペプチドは折り畳まれていると称され、一定の三次元構造を持たず、むしろ多数の異なる立体構造をとり得るポリペプチドは折り畳まれていないと称される。本明細書で使用される場合、糖タンパク質という用語は、アミノ酸残基、例えば、セリン残基またはアスパラギン残基の酸素含有側鎖または窒素含有側鎖を介してタンパク質に結合する少なくとも１つの炭水化物部分に結合したタンパク質を指す。
【０１４３】
「単離された」ポリペプチドまたはその断片、変異体もしくは誘導体は、その自然環境下にないポリペプチドを意図する。特定の精製レベルは必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、その天然または自然の環境から取り出され得る。宿主細胞で発現された組換的に生産されたポリペプチドおよびタンパク質は、任意の適切な技術によって分離、分画または部分的もしくは実質的に精製された天然ポリペプチドまたは組換えポリペプチドがそうであるように、本発明の目的のために単離されたとみなされる。
【０１４４】
「組換えペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質」は、組換えＤＮＡ技術によって生産された（すなわち、所望のペプチドを含む融合タンパク質をコードする外因性の組換えＤＮＡ発現構築物によって形質転換された細胞、微生物または哺乳動物から産生された）ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質を指す。ほとんどの細菌培養物で発現されたタンパク質またはペプチドは、典型的には、グリカンを含まないであろう。酵母で発現されたタンパク質またはポリペプチドは、哺乳動物細胞で発現されたものとは異なるグリコシル化パターンを有し得る。
【０１４５】
本発明のポリペプチドには、上記ポリペプチドの断片、誘導体、類似体および変異体ならびにそれらの任意の組み合わせも含まれる。用語「断片」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」は、天然ペプチドのアミノ酸配列と十分に類似のアミノ酸配列を有するペプチドおよびポリペプチドを含む。用語「十分に類似の」は、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有するように、第１のアミノ酸配列が、第２のアミノ酸配列と同一または同等のアミノ酸残基の十分数または最小数を含有することを意味する。例えば、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％同一の共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列が、本明細書では十分に類似のものと定義される。好ましくは、変異体は、本発明の好ましいペプチドのアミノ酸配列と、特に抗体もしくは抗体断片と、または本発明の抗体もしくはそれらのいずれかの断片、変異体、誘導体もしくは類似体よって認識されるエピトープを含む合成ペプチドもしくはペプチド系化合物と十分に類似である。このような変異体は、一般に、本発明のペプチドの機能活性を保持する（すなわち、本発明の抗体によって結合される）。変異体は、１個以上のアミノ酸の欠失、付加、および／または置換によって、アミノ酸配列がそれぞれ天然および野生型（ｗｔ）ペプチドとは異なるペプチドを含む。これらは、天然に存在する変異体および人工的に設計されたものであり得る。
【０１４６】
用語「断片」、「変異体」、「誘導体」および「類似体」は、本発明の抗体または抗体ポリペプチドに言及する場合、対応する天然結合分子、抗体またはポリペプチドの抗原結合特性の少なくとも一部を保持する任意のポリペプチドを含む。本発明のポリペプチド断片は、本明細書の他の箇所で議論される特定の抗体断片に加えて、タンパク質分解断片および欠失断片を含む。本発明の抗体および抗体ポリペプチドの変異体は、上記断片、およびさらにアミノ酸の置換、欠失または挿入によりアミノ酸配列を改変したポリペプチドを含む。変異体は天然に存在するものでもよいし、または天然に存在しないものでもよい。天然に存在しない変異体は、当技術分野において公知の突然変異誘発技術を使用して生産され得る。変異体ポリペプチドは、保存的または非保存的なアミノ酸置換、欠失または付加を含むことができる。本発明の結合分子、例えば、本発明の抗体および抗体ポリペプチドの誘導体は、天然ポリペプチドでは見られないさらなる特徴を示すように改変されたポリペプチドである。例としては、融合タンパク質が挙げられる。変異体ポリペプチドは、本明細書では「ポリペプチド類似体」とも称され得る。本明細書で使用される場合、結合分子もしくはその断片、抗体または抗体ポリペプチドの「誘導体」は、官能側基の反応によって化学的に誘導体化された１つ以上の残基を有する主題ポリペプチドを指す。「誘導体」としては、２０種の標準的アミノ酸の１個以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するペプチドも挙げられる。例えば、プロリンを４−ヒドロキシプロリンに置換することができる；リシンを５−ヒドロキシリシンに置換することができる；ヒスチジンを３−メチルヒスチジンに置換することができる；セリンをホモセリンに置換することができる；そして、リシンをオルニチンに置換することができる。
【０１４７】
抗イディオタイプ抗体：
用語「抗イディオタイプ抗体」は、抗体または他の結合分子に言及する場合、抗原結合部位付近におけるまたは抗原結合部位における抗体の可変領域上に位置する固有の抗原性ペプチド配列に結合して、これによって、所定の自己抗体により別の方法で引き起こされる特異的免疫反応を阻害する分子を含む。同様に、本発明の抗体によって特異的に認識されるエピトープを含む合成ペプチドまたはペプチド系化合物を使用することができる。
【０１４８】
抗イディオタイプ抗体は、他の抗体と同様の方法で得ることができる。特定の抗イディオタイプ抗体は、凝集（比濁法アッセイまたは比濁分析アッセイ）、沈殿（放射免疫拡散）、またはサンドイッチイムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡによって、任意の種類の架橋により検出される。米国特許出願公開第２００２０１４２３５６号明細書は、高濃度高分子量の標的抗原に対して特異的な抗体に対する抗イディオタイプモノクローナル抗体集団を得るための方法であって、前記抗イディオタイプ抗体集団が、前記標的抗原に対して特異的な選択抗体に対して多種多様な結合親和性を有し、特定の用途に必要な親和性を有する前記抗イディオタイプ抗体集団のサブセットが選択され得る方法を提供する。
【０１４９】
米国特許出願公開第２００２０１４２３５６号明細書には、抗体をコートとしておよび抗イディオタイプ抗体を検出として使用した（その逆もまた同様である）抗原の競合イムノアッセイが記載されている。抗イディオタイプ抗体を代理抗原として使用することが開示されている他の参考文献としては、Ｌｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５５（１９９５）（２３  ｓｕｐｐｌ．Ｓ）：Ｓ５９７８−Ｓ５９８２；Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９２（１９９６），７３−８５；Ｂａｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，９２（２００１），８８−９５；およびＫｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２（２０００），１９３−２０１が挙げられる。疾患の処置においてまたは寄生虫に対して抗イディオタイプ抗体を使用することは、当技術分野において公知である；例えば、Ｓａｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐｅｒ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５５（１９８２），１１０８−１１１９を参照のこと。
【０１５０】
分子の類似性および／または同一性の決定：
２つのペプチド間の「類似性」は、第１のペプチドのアミノ酸配列を第２のペプチドの配列と比較することによって決定される。第１のペプチドのアミノ酸は、それが同一または保存的アミノ酸置換である場合、第２のペプチドの対応するアミノ酸と類似する。保存的置換としては、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｄ．，Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８）、およびＡｒｇｏｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．８（１９８９），７７９−７８５に記載されているものが挙げられる。例えば、以下の群の１つに属するアミノ酸は、保存的変化または置換を表す：−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ；および−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
【０１５１】
２つの配列間の％同一性または類似性の決定は、好ましくは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７の数学的アルゴリズムを使用して達成される。このようなアルゴリズムは、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｅ）で利用可能なＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐプログラム中に組み込まれている。
【０１５２】
％同一性または類似性の決定は、ＢＬＡＳＴｎおよびＢＬＡＳＴｐプログラムの標準的パラメータを用いて実施される。
【０１５３】
ＢＬＡＳＴポリヌクレオチド検索は、ＢＬＡＳＴｎプログラムを用いて実施される。一般的パラメータについて、「最大標的配列」のボックスを１００に設定し得、「ショートクエリ」のボックスにチェックマークを付け得、「予測閾値」のボックスを１０に設定し得、「ワードサイズ」のボックスを２８に設定し得る。スコアリングパラメータについて、「一致／不一致スコア」を１，−２に設定し得、「ギャップコスト」のボックスを線形に設定し得る。フィルタおよびマスキングパラメータについて、「低複雑度領域」のボックスにチェックマークを付け得、「種特異的反復」のボックスにはチェックマークを付けなくてもよく、「ルックアップテーブルのみについてマスク」のボックスにチェックマークを付け得、「小文字をマスク」のボックスにはチェックマークを付けなくてもよい。
【０１５４】
ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴｐプログラムを用いて実施される。一般的パラメータについて、「最大標的配列」のボックスを１００に設定し得、「ショートクエリ」のボックスにチェックマークを付け得、「予測閾値」のボックスを１０に設定し得、「ワードサイズ」のボックスを「３」に設定し得る。スコアリングパラメータについて、「マトリックス」のボックスを「ＢＬＯＳＵＭ６２」に設定し得、「ギャップコスト」のボックスを「存在：１１  伸長：１」に設定し得、「組成調整」のボックスを「条件的組成スコアマトリックス調整」に設定し得る。フィルタおよびマスキングパラメータについて、「低複雑度領域」のボックスにはチェックマークを付けなくてもよく、「ルックアップテーブルのみについてマスク」のボックスにはチェックマークを付けなくてもよく、「小文字をマスク」のボックスにはチェックマークを付けなくてもよい。
【０１５５】
ポリヌクレオチド：
用語「ポリヌクレオチド」は、単数の核酸および複数の核酸を包含することを意図し、単離された核酸分子または構築物、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を指す。ポリヌクレオチドは、通常のホスフォジエステル結合または非通常型結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）に見られるようなアミド結合）を含むことができる。用語「核酸」は、ポリヌクレオチド中に存在する任意の１つ以上の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。「単離された」核酸またはポリヌクレオチドは、その天然環境から取り出された核酸分子、ＤＮＡまたはＲＮＡを意図する。例えば、ベクタに含まれる抗体をコードする組換えポリヌクレオチドは、本発明の目的のために単離されたとみなされる。単離されたポリヌクレオチドのさらなる例としては、異種宿主細胞で維持される組換えポリヌクレオチドまたは溶液中の（部分的または実質的に）精製されたポリヌクレオチドが挙げられる。単離されたＲＮＡ分子としては、本発明のポリヌクレオチドのインビボまたはインビトロＲＮＡ転写産物が挙げられる。本発明にしたがって単離されたポリヌクレオチドまたは核酸としてはさらに、合成的に生産されたこのような分子が挙げられる。加えて、ポリヌクレオチドまたは核酸は、プロモータ、リボソーム結合部位または転写ターミネータなどの調節要素でもよいし、またはこれらを含んでもよい。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないがコード領域の一部とみなされ得るが、例えば、プロモータ、リボソーム結合部位、転写ターミネータ、イントロンなどの任意の隣接配列はコード領域の一部ではない。本発明の２つ以上のコード領域が単一のポリヌクレオチド構築物内に、例えば、単一のベクタ上に、または別々のポリヌクレオチド構築物内に、例えば、別々の（異なる）ベクタ上に存在することができる。また、任意のベクタは、単一のコード領域を含有することもできるし、または２つ以上のコード領域を含むことができ、例えば、単一のベクタは、免疫グロブリン重鎖可変領域および免疫グロブリン軽鎖可変領域を別々にコードすることができる。加えて、本発明のベクタ、ポリヌクレオチドまたは核酸は、結合分子、抗体またはそれらの断片、変異体もしくは誘導体をコードする核酸に融合しているかまたは融合していない異種コード領域をコードすることができる。異種コード領域は、限定されないが、分泌シグナルペプチドまたは異種機能性ドメインなどの特別な要素またはモチーフを含む。
【０１５７】
ある実施形態では、ポリヌクレオチドまたは核酸は、ＤＮＡである。ＤＮＡの場合では、ポリペプチドをコードする核酸を含むポリヌクレオチドは、通常、１つ以上のコード領域と機能的に結合されたプロモータおよび／または他の転写もしくは翻訳制御要素を含むことができる。機能的な結合は、遺伝子産物（例えば、ポリペプチド）のコード領域が、遺伝子産物の発現を調節配列の影響下または制御下に置くような方法で１つ以上の調節配列と結合している場合である。プロモータ機能の誘導が所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写をもたらす場合、および２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が遺伝子産物の発現を指令する発現調節配列の能力を妨害しないか、または鋳型ＤＮＡの転写される能力を妨害しない場合、２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域およびそれと結合するプロモータ）は、「機能的に結合されている」かまたは「機能的に連結されている」。したがって、プロモータがポリペプチドをコードする核酸の転写をもたらすことができる場合、プロモータ領域はその核酸と機能的に結合されているであろう。プロモータは、所定の細胞でのみＤＮＡの実質的な転写を指令する細胞特異的プロモータであり得る。プロモータの他に、例えば、エンハンサ、オペレータ、リプレッサおよび転写終結シグナルなどの他の転写制御要素が、細胞特異的転写を指令するためにポリヌクレオチドと機能的に結合され得る。適切なプロモータおよび他の転写制御領域は、本明細書で開示される。
【０１５８】
様々な転写制御領域が当業者に公知である。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞で機能する転写制御領域、例えば限定されないが、サイトメガロウイルス（イントロン−Ａを含む前初期プロモータ）、シミアンウイルス４０（初期プロモータ）および（ラウス肉腫ウイルスなどの）レトロウイルス由来のプロモータおよびエンハンサセグメントが挙げられる。他の転写制御領域としては、アクチン、熱ショックタンパク質、ウシ成長ホルモンおよびウサギβグロビンなどの脊椎動物遺伝子由来のもの、ならびに真核細胞での遺伝子発現を制御することができる他の配列が挙げられる。他の適切な転写制御領域としては、組織特異的プロモータおよびエンハンサ、ならびにリンホカイン誘導性プロモータ（例えば、インターフェロンまたはインターロイキンによって誘導可能なプロモータ）が挙げられる。
【０１５９】
同様に、様々な翻訳制御要素が当業者に公知である。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始および停止コドン、ならびにピコルナウイルス由来の要素（特に、ＣＩＴＥ配列とも称される内部リボソーム侵入部位またはＩＲＥＳ）が挙げられる。
【０１６０】
他の実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物の形態のＲＮＡである。
【０１６１】
本発明のポリヌクレオチドコード領域および核酸コード領域は、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指令する分泌またはシグナルペプチドをコードするさらなるコード領域と結合することができる。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されたタンパク質は、成長中のタンパク質鎖が粗面小胞体通って輸送され始めると成熟タンパク質から切断されるシグナルペプチドまたは分泌リーダ配列を有する。当業者であれば、脊椎動物細胞によって分泌されたポリペプチドは、一般に、前記ポリペプチドのＮ末端に融合したシグナルペプチドを有し、これが完全または「全長」ポリペプチドから切断されて分泌型または「成熟」型ポリペプチドが産生されることを理解している。ある実施形態では、天然のシグナルペプチド、例えば、免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖のシグナルペプチド、またはその配列の機能性誘導体であって、それと機能的に結合されたポリペプチドの分泌を指令する能力を保持している機能性誘導体が使用される。あるいは、異種哺乳動物シグナルペプチドまたはその機能性誘導体を使用することができる。例えば、野生型リーダ配列をヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（ＴＰＡ）またはマウスβ−グルクロニダーゼのリーダ配列で置換することができる。
【０１６２】
発現：
用語「発現」は、本明細書で使用される場合、遺伝子が生化学物質、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを生成する過程を指す。この過程は、限定されないが、遺伝子ノックダウンならびに一過性発現および安定発現の両方を含む、細胞内における遺伝子の機能的存在の任意の顕在化を含む。それとしては、限定されないが、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または任意の他のＲＮＡ産物への転写、およびこのようなｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳が挙げられる。所望の最終産物が生化学物質である場合、発現は、その生化学物質および任意の前駆体の作製を含む。遺伝子の発現は、「遺伝子産物」を生成する。本明細書で使用される場合、遺伝子産物は、核酸、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、遺伝子の転写によって生成されるメッセンジャーＲＮＡ、または転写産物から翻訳されるポリペプチドのいずれかであり得る。本明細書に記載される遺伝子産物としてはさらに、転写後修飾、例えば、ポリアデニル化を受けた核酸、または翻訳後修飾、例えば、メチル化、グリコシル化、脂質付加、他のタンパク質サブユニットとの会合、タンパク質分解切断などを受けたポリペプチドが挙げられる。
【０１６３】
様々な発現ベクタ／宿主系を用いて、ポリヌクレオチド配列を含有および発現させることができる。これらとしては、限定されないが、組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクタで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクタで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクタ（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクタ（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ：）もしくは細菌発現ベクタ（例えば、ＴｉもしくはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系が挙げられる。
【０１６４】
ペプチド、ポリペプチドまたは融合タンパク質（以下、「産物」と称される）を宿主細胞中で発現させるために、以下のような手順を使用することができる。前記産物をコードするＤＮＡ配列を含有する制限断片を、宿主細胞で機能する複製起点および適切な選択可能マーカを含有する適切な組換えプラスミドにクローニングすることができる。プラスミドは、産物の誘導性発現用のプロモータ（例えば、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  ６９（１９８８），３０１  ３１５）およびｐＥＴｌ  Ｉｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０），６０  ８９）を含むことができる。組換えプラスミドを、例えば、エレクトロポレーションによって宿主細胞に導入することができ、組換えプラスミドを含有する細胞を、プラスミド上のマーカについて選択することによって特定することができる。産物に対して特異的なアッセイを使用して、産物の発現を宿主細胞で誘導および検出することができる。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、産物／ペプチドをコードするＤＮＡを宿主細胞での発現のために最適化することができる。例えば、ＤＮＡは、１つ以上のアミノ酸に対するコドンであって、この同じアミノ酸に対する他のコドンと比べて宿主細胞において優勢なコドンを含むことができる。
【０１６６】
あるいは、産物の発現は、無細胞抽出物中でのインビトロタンパク質合成によって実施することができ、これは、機能的研究のための改変または非天然アミノ酸の導入にも特に適している（下記も参照のこと）。過剰発現産物が宿主細胞に対して毒性である場合、産物が不溶性であるかまたは封入体を形成する場合、またはタンパク質が細胞内プロテアーゼによって急速なタンパク質分解を受ける場合、インビトロ翻訳系の使用は、インビボ遺伝子発現よりも利点を有し得る。最も頻繁に使用される無細胞翻訳系は、ウサギ網状赤血球、コムギ胚芽および大腸菌由来の抽出物からなる。すべてが、外因性ＲＮＡの翻訳に必要なすべての高分子成分（７０Ｓまたは８０Ｓリボソーム、ｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素、開始、伸長および終結因子など）を含む粗抽出物として調製される。効率的な翻訳を確実にするためには、アミノ酸、エネルギー源（ＡＴＰ、ＧＴＰ）、エネルギー再生系（真核生物系の場合にはクレアチンリン酸およびクレアチンホスホキナーゼ、ならびに大腸菌溶解物の場合にはホスホエノールピルビン酸およびピルビン酸キナーゼ）、および当技術分野において公知の他の補因子（Ｍｇ２＋、Ｋ＋など）を各抽出物に補充しなければならない。適切な転写／翻訳系は、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、およびＡｍｂｉｏｎ、すなわち、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１（１９８３），６３５−６４４；Ａｒｄｕｅｎｇｏ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｉｎ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｉｎ，Ｋｕｄｌｉｃｋｉ，Ｋａｔｚｅｎ  ａｎｄ  Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｄｓ．，Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｏｌ．２００７．Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｘ：Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｐｐ．１−１８；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｚｕｂａｙ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１（１９８３），６７４−９０；Ｅｚｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２２（２００６），１５７０−１５７７）。
【０１６７】
宿主細胞：
本発明に関して、宿主細胞は、細菌、昆虫、真菌、植物、動物またはヒト細胞などの原核細胞または真核細胞であり得る。好ましい真菌細胞は、例えば、サッカロマイセス属のもの、特に、Ｓ．セレビシエ種のものである。用語「原核生物の」は、本発明の抗体または対応する免疫グロブリン鎖の発現のためのＤＮＡまたはＲＮＡ分子で形質転換またはトランスフェクトされ得るすべての細菌を含むことを意味する。原核生物宿主としては、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ネズミチフス菌、セラチア・マルセッセンスおよび枯草菌などのグラム陰性ならびにグラム陽性細菌が挙げられ得る。用語「真核生物の」は、酵母、高等植物、昆虫および好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはＨＥＫ２９３、ＮＳＯ、ＣＳＯおよびＣＨＯ細胞を含むことを意味する。組換え生産手順で用いられる宿主に応じて、本発明のポリヌクレオチドによってコードされる抗体または免疫グロブリン鎖は、グリコシル化され得るか、または非グリコシル化され得る。本発明の抗体、または対応する免疫グロブリン鎖も、最初のメチオニンアミノ酸残基を含み得る。本発明のポリヌクレオチドは、当業者に一般に公知の技術のいずれかを使用して、宿主を形質転換またはトランスフェクトするのに使用され得る。さらに、機能的に連結された融合遺伝子を調製し、それらを、例えば、哺乳動物細胞および細菌で発現させるための方法は、当技術分野において周知である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）。そこに記載されている遺伝子構築物および方法は、真核生物または原核生物の宿主における本発明の抗体または対応する免疫グロブリン鎖の発現に用いられ得る。一般に、挿入されたポリヌクレオチドの効率的な転写を促進するプロモータ配列を含有する発現ベクタが、宿主と併せて使用される。発現ベクタは、典型的には、複製起点、プロモータ、およびターミネータ、ならびに形質転換細胞の表現型選択を提供することができる特定の遺伝子を含む。ＤＮＡ配列に適切な細胞源ならびに免疫グロブリンの発現および分泌用の宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ」，Ｆｉｆｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８５）Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ．（これは、参照により本明細書に組み込まれる））などの多数の供給源から得ることができる。さらに、本発明の細胞を含むトランスジェニック動物、好ましくは哺乳動物は、本発明の抗体の大規模生産に使用され得る。
【０１６８】
発酵槽で形質転換宿主を成長させ、当技術分野において公知の技術にしたがって培養して、最適な細胞成長を達成し得る。発現されたら、本発明の全抗体、それらの二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態を、硫酸アンモニウム沈降法、アフィニティカラム、カラムクロマトグラフィ、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準手順にしたがって精製し得る；Ｓｃｏｐｅｓ，「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ」，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと。次いで、本発明の抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖を、成長培地、細胞溶解物、または細胞膜画分から単離し得る。例えば、本発明の組換え発現された抗体または免疫グロブリン鎖の単離および精製は、任意の従来の手段、例えば、本発明の抗体の定常領域に対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含むものなどの分取クロマトグラフィ分離および免疫学的分離によるものであり得る。例えば、薬物標的化およびイメージング用途のために、本発明の抗体を他の部分にさらにカップリングし得ることは、当業者に明らかである。結合部位に対する抗体または抗原の発現後にこのようなカップリングを化学的に行ってもよいし、またはカップリング産物をＤＮＡレベルで本発明の抗体または抗原に人為操作してもよい。次いで、ＤＮＡを適切な宿主系で発現させ、必要な場合、発現タンパク質を収集および変性させる。
【０１６９】
医薬用途の場合、少なくとも約９０〜９５％の同質性の実質的に純粋な免疫グロブリンが好ましく、９８〜９９％またはそれ以上の同質性が最も好ましい。部分的にまたは所望により同質性まで精製したら、次いで、抗体を治療的（体外的を含む）に使用してもよいし、またはアッセイ手順の開発および実施に使用してもよい。
【０１７０】
本発明はまた、本発明の抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖を発現することができる細胞を生産するための方法であって、本発明のポリヌクレオチドまたはベクタを用いて、細胞を遺伝子操作することを含む方法に関する。本発明の方法によって得ることができる細胞は、例えば、本発明の抗体とその抗原との相互作用を試験するのに使用され得る。
【０１７１】
ＥＬＩＳＡアッセイ：
様々な抗原のための酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）としては、比色分析、化学発光および蛍光測定ベースのものが挙げられる。ＥＬＩＳＡは、薬物、ならびに血漿および尿試料中の他の抗原性成分が低量の検出に上手く適用されており、抽出工程を伴わず、実施が簡単である。タンパク質抗原に対する抗体の検出のためのＥＬＩＳＡでは、短い合成ペプチドをマイクロタイタープレートのプラスチック表面に直接結合する使用が多い。ペプチドは、一般に、それらの合成的性質および高速液体クロマトグラフィを使用した効率的な精製方法により非常に純粋である。短いペプチドの欠点は、それらが通常は、立体構造または不連続エピトープではなく直鎖状エピトープを表すことである。立体構造エピトープを提示するためには、長いペプチドまたは完全な天然タンパク質のいずれかを使用する。タンパク質抗原をプレートの疎水性ポリスチレン支持体に直接結合すると、結合したタンパク質が部分的または完全に変性し、立体構造エピトープが失われ得る。抗原の固定化（捕捉ＥＬＩＳＡ）を媒介する抗体でプレートをコーティングすることにより、この影響を回避することができる。
【０１７２】
しかしながら、多くの場合、過剰発現された組換えタンパク質は不溶性であり、立体構造エピトープに対する抗体を分析しようとする場合には変性条件下での精製および復元を必要とする。例えば、コートタンパク質として組換え融合タンパク質を使用した一般的なＥＬＩＳＡについては、米国特許出願公開第２００３００４４８７０号明細書を参照のこと。
【０１７３】
結合分子：
本発明との関連で使用される場合、「結合分子」は主に、抗体およびその断片に関するが、表１〜１４および２８〜３１に含まれる本発明の「目的の分子」に結合する他の非抗体分子を指す場合もあり、ここで、目的の分子は、タンパク質、ペプチド、多糖、リポポリタンパク質およびリポ多糖、例えば限定されないが、ロイコトリエン、リンホカインおよびサイトカイン、例えば、インターロイキンおよびインターフェロンである。本発明の目的の分子は、以下の本発明の特定の実施形態の説明内でさらに詳細に定義される。本発明の結合分子としては、限定されないが、ホルモン、受容体、リガンド、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、シャペロン、例えば、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）および細胞間接着分子、例えば、カドヘリン、インテグリン、Ｃ型レクチンおよび免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリのメンバーが挙げられる。したがって、単に明確にするために、本発明の範囲を限定するものではないが、以下の実施形態の大部分では、治療剤および診断剤の開発に好ましい結合分子の代表的なものである抗体および抗体様分子に関して議論する。
【０１７４】
抗体：
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、本明細書では互換的に使用される。抗体または免疫グロブリンは、上記および下記に定義される本発明の目的の分子に結合する分子であって、少なくとも重鎖の可変ドメインを含み、通常、少なくとも重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む分子である。脊椎動物系における基本的な免疫グロブリンの構造は、比較的よく理解されている；例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）を参照のこと。用語「結合する」および「認識する」は、本発明の結合分子（例えば、抗体）の結合親和性に関して互換的に使用される。
【０１７５】
上記および下記に定義されているように、目的の分子に特異的に結合するのに十分な構造を含む任意の抗体または免疫グロブリン断片は、本明細書では、「結合分子」、「結合断片」または「免疫特異的断片」と互換的に表される。
【０１７６】
本発明の抗体またはその抗原結合断片、免疫特異的断片、変異体もしくは誘導体としては、限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多重特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、マウス化抗体またはキメラ抗体、単鎖抗体、エピトープ結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ＶＬドメインまたはＶＨドメインのいずれかを含む断片、Ｆａｂ発現ライブラリによって生産された断片、ならびに抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、本明細書で開示される抗体に対する抗Ｉｄ抗体を含む）が挙げられる。ＳｃＦｖ分子は当技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号明細書に記載されている。これに関して、抗体の抗原結合断片は、単一ドメイン抗体（ｓｄＡＢ）またはｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（商標）（Ａｂｌｙｎｘ，Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）としても公知のドメイン抗体（ｄＡｂ）でもあり得る。例えば、Ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８７（２００５），４５３１−４５４１；Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（２００３），４８４−４９０を参照のこと。以下により詳細に議論されるように、用語「免疫グロブリン」は、生化学的に区別することができる様々な広いクラスのポリペプチドを含む。当業者であれば、重鎖はガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロン（γ、μ、α、δ、ε）に分類され、それらの中にいくつかのサブクラスがある（例えば、γ１〜γ４）ことを認識するであろう。この鎖の性質が抗体の「クラス」をそれぞれＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹと決定するものである。免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１などはよく特徴付けられており、機能分化を付与することが公知である。本発明の免疫グロブリンまたは抗体分子は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２など）またはサブクラスの免疫グロブリン分子であり得る。当業者であれば、本開示を考慮して、これらのクラスおよびアイソタイプのそれぞれの改変型を容易に識別可能であり、したがってこれらは本発明の範囲内である。すべての免疫グロブリンのクラスが明らかに本発明の範囲内にあり、以下の議論は、一般に、ＩｇＧクラスの免疫グロブリン分子を対象とする。ＩｇＧに関して、標準的な免疫グロブリン分子は、分子量約２３，０００ダルトンの２つの同一の軽鎖ポリペプチド、および分子量５３，０００〜７０，０００の２つの同一の重鎖ポリペプチドを含む。典型的には、４本の鎖がジスルフィド結合によって「Ｙ」構造で結合され、ここで、「Ｙ」の入り口で始まり可変領域を通じて継続する重鎖と軽鎖がひとまとまりに繋がっている。上記表１７に含まれる本発明の例示的な抗ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２２抗体の分類から明らかなように（例えば、ＩｇＧ１クラスのＩＬ−２２特異的抗体３０Ｇ１およびＩｇＧ４クラスの３５Ｇ１１���、本発明の抗体の主要サブタイプはＩｇＧ１およびＩｇＧ４であると思われ、おそらくは、制御性Ｔ細胞反応および／または上皮がこれらのＡＩＲＥ欠損状態の開始に関与している。これらの知見は、Ｋａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２）；ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃｅｉ．１２０２４（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されているＡＩＲＥ欠損マウスで見られる対応する自己抗体の分類によって裏付けられている。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明のヒト抗体は、ＩｇＧ型、特にＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。
【０１７７】
ＩｇＧの構造：
軽鎖は、カッパまたはラムダ（κ、λ）のいずれかに分類される。各重鎖クラスは、カッパまたはラムダ軽鎖のいずれかと結合することができる。一般に、ハイブリドーマ、Ｂ細胞または遺伝子操作した宿主細胞のいずれかによって免疫グロブリンが産生される場合、軽鎖および重鎖は互いに共有結合し、２本の重鎖の「テール」部分は共有結合性ジスルフィド結合または非共有結合によって互いに結合する。重鎖では、アミノ酸配列は、Ｙ構造のフォークヘッド末端にあるＮ末端から各鎖の下部にあるＣ末端へと延びている。
【０１７８】
軽鎖および重鎖の両方が、構造的および機能的相同性の領域に分けられる。用語「定常」および「可変」は、機能的に使用される。これに関して、軽鎖部分および重鎖部分の両方の可変ドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は、抗原認識および抗原特異性を決定することが認識されよう。反対に、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）および重鎖の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２またはＣＨ３）は、分泌、経胎盤移動性、Ｆｃ受容体結合、補体結合などの重要な生物学的特性を付与する。慣例では、定常領域ドメインが抗体の抗原結合部位またはアミノ末端から遠ざかるにつれて、定常領域ドメインのナンバリングが増加する。Ｎ末端部分は可変領域であり、定常領域はＣ末端部分にある；ＣＨ３およびＣＬドメインは、実際には、それぞれ重鎖および軽鎖のカルボキシ末端を含む。
【０１７９】
上記のように、可変領域は、抗体が抗原上のエピトープを選択的に認識し、特異的に結合することを可能にする。すなわち、抗体のＶＬドメインおよびＶＨドメインまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）のサブセットが組み合わさって、三次元の抗原結合部位を規定する可変領域を形成する。この四要素の抗体構造が、Ｙの各アームの末端に存在する抗原結合部位を形成する。より具体的には、抗原結合部位は、ＶＨ鎖およびＶＬ鎖それぞれの３つのＣＤＲによって規定される。本発明の目的の分子に特異的に結合するのに十分な構造を含有する任意の抗体または免疫グロブリン断片は、本明細書では「結合断片」または「免疫特異的断片」と互換的に表される。
【０１８０】
天然に存在する抗体では、抗体は、各抗原結合ドメイン中に存在する「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも称される６つの超可変領域を含み、それらは、水性環境での抗体の三次元構造を想定して、抗原結合ドメインを形成するように特別に配置されている短い非連続的なアミノ酸配列である。「ＣＤＲ」は、より少ない分子間の多様性を示す４つの比較的保存された「フレームワーク」領域または「ＦＲ」に隣接する。フレームワーク領域は主としてβシート立体構造をとり、ＣＤＲは、βシート構造と連結し、いくつかの場合では、その一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間非共有結合性相互作用によってＣＤＲの正しい方向での配置を提供する足場を形成するように作用する。配置されたＣＤＲによって形成された抗原結合ドメインは、免疫反応性抗原上のエピトープに対して相補的な表面を規定する。この相補性表面は、抗体のその同種エピトープへの非共有結合を促進する。それぞれＣＤＲおよびフレームワーク領域を含むアミノ酸は、正確に定義されているので、当業者であれば、任意の所定の重鎖または軽鎖可変領域についてそれらを容易に同定することができる；「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，Ｋａｂａｔ，Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，（１９８３）；およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１−９１７（これらは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【０１８１】
当技術分野において使用されており、および／または認められている用語の定義が２つ以上ある場合、本明細書で使用される用語の定義は、特に明確な反対の指定がない限り、すべてのこのような意味を含むことを意図する。具体例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見られる非連続的な抗原結合部位を説明する用語「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）の使用である。この特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）およびＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６（１９８７），９０１−９１７（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）によって記載されており、ここで、これらの定義は、互いに比較するとアミノ酸残基のオーバーラップまたはサブセットを含む。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のＣＤＲを指すいずれかの定義の適用は、本明細書で定義および使用される用語の範囲内にあることを意図する。上記で引用した各参考文献によって定義されるＣＤＲを包含する適切なアミノ酸残基を、比較として以下の表１６に示す。特定のＣＤＲを包含する正確な残基数は、ＣＤＲの配列およびサイズに応じて変化する。当業者であれば、どの残基がヒトＩｇＧサブタイプの抗体の特定の超可変領域またはＣＤＲを含むかを、その抗体の可変領域のアミノ酸配列を考慮してルーチンに決定することができる。
【表１６】
2015505244.tif 000016
【０１８２】
Ｋａｂａｔらはまた、任意の抗体に適用可能な可変ドメイン配列のナンバリングシステムを定義した。当業者であれば、配列それ自体以外のいかなる実験データにも頼ることなく、任意の可変ドメイン配列にこの「Ｋａｂａｔナンバリング」システムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔナンバリング」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）によって示されるナンバリングシステムを指す。特に明記されない限り、本発明の抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体における特定のアミノ酸残基の位置のナンバリングについての言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従うものであるが、それは理論上のものであり、本発明のあらゆる抗体に等しく適用することはできない。例えば、最初のＣＤＲの位置に応じて、以降のＣＤＲがいずれかの方向にシフトする場合がある。
【０１８３】
一実施形態では、本発明の抗体は、ＩｇＭまたは５価構造を有するその誘導体ではない。特に、本発明の特定の用途、特に治療用途では、ＩｇＭは、その５価構造および親和性成熟の欠如のために非特異的な交差反応性および非常に低い親和性を示すことが多いので、ＩｇＭは、ＩｇＧおよび他の２価抗体または対応する結合分子よりも有用ではない。
【０１８４】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ポリクローナル抗体ではない。すなわち、それは、血漿免疫グロブリン試料から得られる混合物ではなく１つの特定の抗体種から実質的になる。
【０１８５】
抗体断片、動物化：
単鎖抗体を含む抗体断片は、可変領域を単独で、または以下のものの全部もしくは一部と組み合わせて含むことができる：ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメイン。本発明の目的の分子に結合する断片であって、可変領域と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインとの任意の組み合わせをまた含む断片も本発明に含まれる。本発明の方法にしたがって単離されたモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体と同等の本発明の抗体またはその免疫特異的断片は、鳥類および哺乳動物を含む任意の動物起源であり得る。好ましくは、抗体は、ヒト、マウス、ロバ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、リャマ、ウマまたはニワトリ抗体である。別の実施形態では、可変領域は、起源がコンドリクトイド（例えば、サメ由来）であり得る。
【０１８６】
本発明の特に好ましい実施形態では、抗体は、ヒト被験体からクローニングされた天然に存在するヒトモノクローナル抗体またはその結合断片、誘導体および変異体であって、以下の表１〜１４、２８〜３１、図１〜４および実施例で詳細に定義される本発明の分子に特異的に結合するものである。
【０１８７】
場合により、ヒト抗体のフレームワーク領域を、データベース内の適切なヒト生殖系列可変領域配列とアライメントし、それにしたがって採用する。例えば、ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）が提供するＶｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）を参照のこと。例えば、真の生殖系列配列から潜在的に逸脱しているとみなされるアミノ酸は、クローニング工程の間に組み込まれたＰＣＲプライマーの配列によるものであり得る。したがって、本発明によれば、用語「ヒトモノクローナル抗体」、「ヒトモノクローナル自己抗体」、「ヒト抗体」などは、本発明の目的の分子に結合するヒト起源の結合分子（すなわち、Ｂ細胞またはそのハイブリドーマなどのヒト細胞から単離されたものであるか、またはそのｃＤＮＡがヒト細胞、例えば、ヒト記憶Ｂ細胞のｍＲＮＡから直接クローニングされたものである）を表すのに使用される。ヒト抗体は、例えば、結合特性を改善するためにアミノ酸置換をその抗体に行った場合でも、依然として「ヒト」である。
【０１８８】
下記の、および例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉらによる米国特許第５，９３９，５９８号明細書に記載されているように、ヒト免疫グロブリンライブラリ由来の抗体、または内在性免疫グロブリンを発現しない１つ以上のヒト免疫グロブリンについてトランスジェニックな動物由来の抗体は、それらを本発明の真のヒト抗体から区別するためにヒト様抗体と表される。
【０１８９】
例えば、典型的にはファージディスプレイから単離された合成および半合成抗体などのヒト様抗体の重鎖および軽鎖の対合は、それらが元のヒトＢ細胞で生じたような元の対合を必ずしも反映しない。したがって、従来技術で一般的に使用されている組換え発現ライブラリから得られたＦａｂおよびｓｃＦｖ断片は、免疫原性および安定性に対するすべての可能な関連効果に関して人工的であるとみなされ得る。
【０１９０】
対照的に、本発明は、ヒトにおけるその治療有用性およびその許容性を特徴とする、選択されたヒト被験体から単離された親和性成熟抗体を提供する。
【０１９１】
移植抗体（等価物）
本発明はまた、それぞれＩＬ−１７およびＩＬ−２２抗体などの本発明の抗体由来のＣＤＲを含む移植抗体（互換的に、等価物と称される）を提供する。このような移植ＣＤＲとしては、本発明の抗体のＣＤＲが移植されたか、または１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＤＲが移植される動物化抗体が挙げられる。ＣＤＲは、上記のように、ヒトフレームワークまたは動物起源由来の抗体フレームワークに直接移植され得る。所望により、フレームワークライブラリを作製することによって、フレームワーク変化も組み込まれ得る。以下により詳細に記載されるように、ＣＤＲおよび／またはフレームワーク配列の最適化を独立しておよび連続的に組み合わせて実施することもできるし、または同時に実施することもできる。
【０１９２】
移植抗体を作製するために、本発明の抗体のドナーＣＤＲを、抗体アクセプタ可変領域フレームワークに移植する。活性を最適化するために抗体を移植してＣＤＲ変異体作製するための方法は、以前に記載されている（例えば、国際公開第９８／３３９１９号；国際公開第００／７８８１５号；国際公開第０１／２７１６０号を参照のこと）。この手順を実施して、ドナーＣＤＲの移植および親和性の再獲得を同時プロセスで達成し得る。可変領域の結合親和性を改変または最適化するために、この方法を単独でまたはＣＤＲ移植と組み合わせて同様に使用することができる。ドナーＣＤＲの結合親和性をアクセプタ可変領域に付与するための方法は、重鎖および軽鎖可変領域の両方に適用可能であり、それ自体を使用して抗体可変領域を移植し、それと同時に抗体可変領域の結合親和性を最適化することができる。
【０１９３】
ドナーＣＤＲ内の全位置または選択位置に複数の異なるアミノ酸残基変化を含むように、ドナーＣＤＲを改変することができる。ＣＤＲ種の様々な集団を生産するために、例えば、２０種の天然に存在するアミノ酸残基または予め選択されたサブセットのランダムな組み込みまたは偏った組み込みをドナーＣＤＲに導入することができる。ＣＤＲ変異体種を可変領域の様々な集団に含めることにより、所定の抗原に対して最適化された結合親和性を示す変異体種の作製が可能になる。一定範囲の可能な変化をドナーＣＤＲの位置で行うことができる。変化のために選択され得る可能な変化の一部または全部を、移植ドナーＣＤＲの集団に導入することができる。変化を導入するためにＣＤＲ内の単一位置を選択することもできるし、またはアミノ酸を改変した様々な位置が組み合わせて活性についてスクリーニングすることもできる。
【０１９４】
１つのアプローチは、例えば、全２０種の天然に存在するアミノ酸を各位置で置換することによって、ＣＤＲに沿ってすべてのアミノ酸位置を変化させることである。ＣＤＲの大部分が基準のドナーＣＤＲ配列を維持し、したがってドナーＣＤＲの結合親和性を維持するように、他のドナーＣＤＲアミノ酸位置との関連で各位置の置換を行うことができる。例えば、アクセプタ可変領域フレームワーク（天然または改変フレームワークのいずれか）に、ＣＤＲ内の各位置に単一位置の置換を含むＣＤＲの集団を移植することができる。同様に、全２０種のアミノ酸残基またはアミノ酸のサブセットを組み込むように変化させた２個以上の位置を含むＣＤＲの集団による移植のために、アクセプタ可変領域フレームワークを標的とすることができる。移植するべきＣＤＲ内またはＣＤＲ群内の１つ以上のアミノ酸位置を改変し、アクセプタ可変領域フレームワークに移植して移植抗体の集団を作製することができる。１つ以上の改変位置を有するＣＤＲは、所望により、１つ以上の改変位置を有する１つ以上の他のＣＤＲと組み合わせることができると理解される。
【０１９５】
１つ以上の改変位置を有するＣＤＲ変異体種の集団を、可変領域の結合ポケットを構成するＣＤＲのいずれかまたはすべてと組み合わせることができる。したがって、重鎖または軽鎖における１つ、２つまたは全３つのレシピエントＣＤＲ位置にドナーＣＤＲ変異体集団を同時に組み込むために、アクセプタ可変領域フレームワークを標的とすることができる。アミノ酸位置変化で標的とするためのＣＤＲまたはＣＤＲの数の選択は、例えば、アクセプタへの完全なＣＤＲ移植が望ましいか、または結合親和性の最適化のためにこの方法が実施されるかに依存するであろう。
【０１９６】
ドナーＣＤＲの結合親和性を抗体アクセプタ可変領域フレームワークに付与するために変化のためのドナーＣＤＲアミノ酸を選択するための別のアプローチは、公知のまたは容易に同定可能なＣＤＲ位置であって非常に変わりやすいものを選択することである。例えば、可変領域ＣＤＲ３は、一般に、非常に変わりやすい。したがって、結合親和性の再獲得もしくは増強を単独でまたは関連アクセプタ可変フレームワーク変化と一緒に確実にする移植手順では、この領域をアミノ酸位置変化の選択的な標的とすることができる。
【０１９７】
マウス化抗体：
上記のように、移植によって作製される抗体の例は、マウス化抗体である。本明細書で使用される場合、用語「マウス化抗体」または「マウス化免疫グロブリン」は、本発明のヒト抗体由来の１つ以上のＣＤＲ、およびマウス抗体配列に基づくアミノ酸置換および／または欠失および／または挿入を含有するヒトフレームワーク領域を含む抗体を指す。ＣＤＲを提供するヒト免疫グロブリンは「親」または「アクセプタ」と称され、フレームワーク変化をもたらすマウス抗体は「ドナー」と称される。定常領域は存在する必要がないが、存在する場合、それらは、通常、マウス抗体の定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、好ましくは約９５％またはそれ以上同一である。したがって、いくつかの実施形態では、全長マウス化ヒト重鎖免疫グロブリンまたは軽鎖免疫グロブリンは、マウス定常領域、ヒトＣＤＲ、および多数の「マウス化」アミノ酸置換を有する実質的にヒトのフレームワークを含有する。典型的には、「マウス化抗体」は、マウス化可変軽鎖および／またはマウス化可変重鎖を含む抗体である。例えば、キメラ抗体の可変領域全体は非マウスであるため、マウス化抗体は典型的なキメラ抗体を包含しないであろう。「マウス化」の工程によって「マウス化」された改変抗体は、ＣＤＲを提供する親抗体と同じ抗原に結合し、マウスでは親抗体と比較して免疫原性が通常低い。
【０１９８】
抗体断片：
本明細書で使用される場合、用語「重鎖部分」は、免疫グロブリン重鎖に由来するアミノ酸配列を含む。重鎖部分を含むポリペプチドは、ＣＨ１ドメイン、ヒンジ（例えば、上部、中部および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインまたはその変異体もしくは断片の少なくとも１つを含む。例えば、本発明に使用される結合ポリペプチドは、ＣＨ１ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部およびＣＨ２ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖；ＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部およびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖、またはＣＨ１ドメイン、ヒンジドメインの少なくとも一部、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含むことができる。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、ＣＨ３ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。さらに、本発明に使用される結合ポリペプチドは、ＣＨ２ドメインの少なくとも一部（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠くことができる。上記のように、当業者であれば、これらのドメイン（例えば、重鎖部分）のアミノ酸配列が天然に存在する免疫グロブリン分子と異なるように、これらのドメインを改変することができると理解するであろう。
【０１９９】
本明細書で開示される特定の抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体では、多量体の１つのポリペプチド鎖の重鎖部分は、多量体の第２のポリペプチド鎖上の重鎖部分と同一である。あるいは、本発明の重鎖部分含有単量体は同一ではない。例えば、各単量体は、異なる標的結合部位を含むことができ、例えば、二重特異性抗体または二特異性抗体を形成する。
【０２００】
別の実施形態では、本明細書で開示される抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体は、ｓｃＦｖなどの単一ポリペプチド鎖から構成され、潜在的なインビボ治療用途および診断用途のために細胞内に発現され得る（細胞内抗体）。
【０２０１】
本明細書で開示される診断方法および治療方法に使用される結合ポリペプチドの重鎖部分は、様々な免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、ポリペプチドの重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ１ドメイン、およびＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に部分的に由来するヒンジ領域、およびＩｇＧ３分子に部分的に由来するヒンジ領域を含むことができる。別の例では、重鎖部分は、ＩｇＧ１分子に部分的に由来するキメラヒンジ、およびＩｇＧ４分子に部分的に由来するキメラヒンジを含むことができる。
【０２０２】
したがって、実施例にも例示されているように、一実施形態では、本発明の抗体の定常領域またはその一部、特にＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン、しかし場合によりＣＨ１ドメインは、本発明の方法にしたがって単離されたネイティブなヒトモノクローナル抗体の可変領域に対して異種性である。本文脈では、異種定常領域は、本発明の抗体の治療用途の場合には、好ましくはヒト起源のものであるが、動物研究の場合には、例えば齧歯類起源のものであり得る（実施例も参照のこと）。
【０２０３】
本明細書で使用される場合、用語「軽鎖部分」は、免疫グロブリン軽鎖由来のアミノ酸配列を含む。好ましくは、軽鎖部分は、ＶＬまたはＣＬドメインの少なくとも１つを含む。
【０２０４】
先に示したように、様々な免疫グロブリンクラスの定常領域のサブユニット構造および三次元構造が周知である。本明細書で使用される場合、用語「ＶＨドメイン」は免疫グロブリン重鎖のアミノ末端可変ドメインを含み、用語「ＣＨ１ドメイン」は免疫グロブリン重鎖の第１の（最もアミノ末端の）定常領域ドメインを含む。ＣＨ１ドメインはＶＨドメインに隣接し、免疫グロブリン重鎖分子のヒンジ領域に対してアミノ末端側にある。
【０２０５】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＨ２ドメイン」は、例えば、従来のナンバリングスキームを使用すれば抗体の約残基２４４〜残基３６０（Ｋａｂａｔナンバリングシステムでは残基２４４〜３６０；およびＥＵナンバリングシステムでは残基２３１〜３４０、Ｋａｂａｔ  ＥＡ  ｅｔ  ａｌ．前掲書を参照のこと）に及ぶ重鎖分子の部分を含む。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと密接に対合していないという点が固有である。どちらかといえば、２つのＮ−結合分岐状炭水化物鎖が、インタクトな天然ＩｇＧ分子の２つのＣＨ２ドメイン間に挿入される。ＣＨ３ドメインはＣＨ２ドメインからＩｇＧ分子のＣ末端に及び、約１０８個の残基を含むこともまた詳細に記載されている。
【０２０６】
本明細書で使用される場合、用語「ヒンジ領域」は、ＣＨ１ドメインをＣＨ２ドメインに結合する重鎖分子の部分を含む。このヒンジ領域は約２５個の残基を含み、柔軟であり、したがって２つのＮ末端抗原結合領域が独立して動くことを可能にする。ヒンジ領域を３つの異なるドメイン：上部、中部および下部ヒンジドメインに細分化することができる；Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１（１９９８），４０８３を参照のこと。
【０２０７】
本明細書で使用される場合、用語「ジスルフィド結合」は、２個の硫黄原子間に形成される共有結合を含む。アミノ酸システインは、ジスルフィド結合を形成することができるか、または第２のチオール基と架橋することができるチオール基を含む。天然に存在するＩｇＧ分子の大部分では、ＣＨ１およびＣＬ領域はジスルフィド結合によって連結され、２本の重鎖は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムを使用すれば２３９位および２４２位に対応する位置で（ＥＵナンバリングシステムでは、２２６位または２２９位）２つのジスルフィド結合によって連結される。
【０２０８】
本明細書で使用される場合、用語「連結された」、「融合された」または「融合」は、互換的に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含むあらゆる手段によって２つ以上の要素または部分を一緒に結合することを指す。「インフレーム融合」は、元のＯＲＦの正しい翻訳上の読み枠が維持されるように、２つ以上のポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を結合してより長い連続的なＯＲＦを形成することを指す。したがって、組換え融合タンパク質は、元のＯＲＦによってコードされるポチペプチドに対応する２つ以上のセグメント（このセグメントは、天然では通常そのように結合していない）を含有する単一タンパク質である。したがって、融合セグメント全体を通して読み枠を連続的にするが、例えば、インフレームリンカ配列によってセグメントを物理的または空間的に分離してもよい。例えば、免疫グロブリン可変領域のＣＤＲをコードするポリヌクレオチドをインフレームで融合してもよいが、「融合」ＣＤＲが連続的なポリペプチドの一部として共翻訳される限り、少なくとも１つの免疫グロブリンフレームワーク領域またはさらなるＣＤＲ領域をコードするポリヌクレオチドによって分離してもよい。
【０２０９】
エピトープ：
抗体のペプチドエピトープまたはポリペプチドエピトープの最小サイズは、約４〜５個のアミノ酸であると考えられている。ペプチドエピトープまたはポリペプチドエピトープは、好ましくは少なくとも７個、より好ましくは少なくとも９個、最も好ましくは少なくとも約１５〜約３０個のアミノ酸を含有する。ＣＤＲは、その三次形態の抗原性ペプチドまたはポリペプチドを認識することができるので、エピトープを含むアミノ酸は連続的である必要はなく、いくつかの場合では、同じペプチド鎖上に存在していなくてもよい。本発明では、本発明の抗体によって認識されるペプチドエピトープまたはポリペプチドエピトープは、表１〜１４、２８〜３１、図１〜４および実施例で定義される本発明の目的の分子の少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、より好ましくは少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、または約１５〜約３０個の連続的または非連続的なアミノ酸からなる配列を含有する。
【０２１０】
結合特性：
本明細書で互換的に使用される「結合する」または「認識する」は、一般に、結合分子、例えば、抗体がその抗原結合ドメインを介して所定のエピトープに結合すること、およびその結合が抗原結合ドメインとエピトープとの間のある程度の相補性を必要とすることを意味する。この定義によれば、抗体がランダムな無関係のエピトープに結合するよりも容易に、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する場合、その抗体はそのエピトープに「特異的に結合する」と言われる。用語「特異性」は、本明細書では、ある特定の抗体がある特定のエピトープに結合する相対的親和性を特定するのに使用される。例えば、抗体「Ａ」が抗体「Ｂ」よりも所定のエピトープに対して高い特異性を有するとみなしてもよいし、または抗体「Ａ」が、関連エピトープ「Ｄ」に対して有するよりも高い特異性でエピトープ「Ｃ」に結合すると言うこともできる。無関係のエピトープは、通常、所定の結合分子の結合特異性の評価に使用され得る非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼインまたは任意の他の特定のポリペプチド）の一部である。これに関して、用語「特異的結合」は、抗体が、非特異的抗原に対する結合のそのＫＤよりも少なくとも２倍低いＫＤで、所定の抗原に結合することを指す。本明細書で使用される場合、用語「高特異的」結合は、特定の標的エピトープに対する抗体の相対ＫＤが、他のリガンドに対するその抗体の結合のＫＤよりも少なくとも１０倍低いことを意味する。
【０２１１】
存在する場合、抗体の抗原との「免疫学的結合特性」または他の結合特性という用語は、そのすべての文法の形式で、抗体の特異性、親和性、交差反応性および他の結合特性を指す。「選択的に結合する」は、結合分子、例えば、抗体が、関連する、同様の、相同な、または類似のエピトープに結合する場合よりも容易にエピトープに特異的に結合することを意味する。したがって、所定のエピトープに「選択的に結合する」抗体は、このような抗体が関連エピトープと交差反応することができる場合でも、関連エピトープよりもそのエピトープに結合する可能性が高いであろう。
【０２１２】
非限定的な例として、結合分子、例えば、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対する解離定数（ＫＤ）よりも低いＫＤで第１のエピトープに結合する場合、それは第１のエピトープに選択的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対するＫＤよりも少なくとも１桁低い親和性で第１のエピトープに結合する場合、抗体は前記第１の抗原に選択的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対するＫＤよりも少なくとも２桁低い親和性で第１のエピトープに結合する場合、抗体は前記第１のエピトープに選択的に結合するとみなされ得る。
【０２１３】
別の非限定的な例では、結合分子、例えば、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対する解離速度（ｋ（ｏｆｆ））よりも低いｋ（ｏｆｆ）で第１のエピトープに結合する場合、それは第１のエピトープに選択的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対するｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも１桁低い親和性で第１のエピトープに結合する場合、抗体は第１のエピトープに選択的に結合するとみなされ得る。別の非限定的な例では、抗体が、その抗体の第２のエピトープに対するｋ（ｏｆｆ）よりも少なくとも２桁低い親和性で第１のエピトープに結合する場合、抗体は第１のエピトープに選択的に結合するとみなされ得る。
【０２１４】
本明細書で開示される結合分子、例えば、抗体または抗原結合断片、変異体または誘導体は、５×１０−２秒−１、１０−２秒−１、５×ｌ０−３秒−１またはｌ０−３秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、本発明の目的の分子またはその断片もしくは変異体と結合すると言うことができる。より好ましくは、本発明の抗体は、５×１０−４秒−１、１０−４秒−１、５×１０−５秒−１、または１０−５秒−１５×１０−６秒−１、１０−６秒−１、５×１０−７秒−１または１０−７秒−１以下の解離速度（ｋ（ｏｆｆ））で、本発明の目的の分子またはその断片もしくは変異体と結合すると言うことができる。
【０２１５】
本明細書で開示される結合分子、例えば、抗体または抗原結合断片、変異体または誘導体は、１０３Ｍ−１秒−１、５×１０３Ｍ−１秒−１、１０４Ｍ−１秒−１または５×１０４Ｍ−１秒−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で、本発明の目的の分子またはその断片もしくは変異体と結合すると言うことができる。より好ましくは、本発明の抗体は、１０５Ｍ−１秒−１、５×１０５Ｍ−１秒−１、１０６Ｍ−１秒−１、または５×１０６Ｍ−１秒−１または１０７Ｍ−１秒−１以上の結合速度（ｋ（ｏｎ））で、本発明の目的の分子またはその断片もしくは変異体と結合すると言うことができる。
【０２１６】
結合分子、例えば、抗体が、所定のエピトープに対する基準抗体の結合をいくらか遮断する程度にそのエピトープに選択的に結合する場合、所定のエピトープに対する基準抗体の結合を競合的に阻害すると言われる。当技術分野において公知の任意の方法、例えば、競合ＥＬＩＳＡアッセイによって競合的阻害を判定することができる。抗体は、所定のエピトープに対する基準抗体の結合を少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、または少なくとも５０％競合的に阻害すると言うことができる。
【０２１７】
本明細書で使用される場合、用語「親和性」は、結合分子、例えば、個々のエピトープと、免疫グロブリン分子のＣＤＲとの結合強度の程度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．（１９８８）の第２７頁〜第２８頁を参照のこと。本明細書で使用される場合、用語「結合活性」は、免疫グロブリンの集団と抗原との間の複合体の総合的な安定性、すなわち、免疫グロブリン混合物と抗原との機能的結合強度を指す。例えば、Ｈａｒｌｏｗの第２９頁〜第３４頁を参照のこと。結合活性は、集団中の個々の免疫グロブリン分子と特異的エピトープとの親和性、およびさらに免疫グロブリンおよび抗原の結合価の両方に関連する。例えば、２価のモノクローナル抗体と、ポリマーなどの高頻度反復エピトープ構造を有する抗原との間の相互作用は、高い結合活性の１つであろう。任意の適切な方法を使用して抗原に対する抗体の親和性または結合活性を実験的に決定することができる。例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、および本明細書に記載される方法を参照のこと。抗原に対する抗体の親和性を測定するための一般的な技術としては、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡおよび表面プラズモン共鳴が挙げられる。異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定する場合、特定の抗体抗原間相互作用の測定された親和性は変化し得る。したがって、標準化した抗体抗原溶液および標準化した緩衝液を用いて、親和性および他の抗原結合パラメータ、例えば、ＫＤ、ＩＣ５０を測定することが好ましい。
【０２１８】
本発明の結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体はまた、それらの交差反応性に関して記載または明示され得る。本明細書で使用される場合、用語「交差反応性」は、第１の抗原に対して特異的な抗体の第２の抗原と反応する能力；２つの異なる抗原性物質間の関連性の程度を指す。したがって、抗体が、その抗体の形成を誘導したエピトープと異なるエピトープに結合する場合、その抗体は交差反応性である。交差反応性エピトープは、一般に、抗体を誘導したエピトープと同じ相補的な構造的特徴の多くを含み、いくつかの場合では、実際には元のエピトープよりも適合する可能性がある。
【０２１９】
例えば、ある特定の抗体が、関連するが同一ではないエピトープ、例えば、基準エピトープに対して少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、および少なくとも５０％の（当技術分野において公知の、および本明細書に記載される方法を使用して計算されるような）同一性を有するエピトープに結合するという点で、それらはある程度の交差反応性を有する。抗体が基準エピトープに対して９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満の（当技術分野において公知の、および本明細書に記載される方法を使用して計算されるような）同一性を有するエピトープに結合しない場合、それは交差反応性をほとんど、または全く持たないと言うことができる。抗体があるエピトープの他の任意の類似体、オーソログまたは相同体に結合しない場合、それはそのエピトープに対して「非常に特異的である」とみなすことができる。
【０２２０】
本発明の結合分子、例えば、抗体またはその抗原結合断片、変異体もしくは誘導体はまた、本発明の目的の分子に対する結合親和性に関して記載または明示され得る。好ましい結合親和性には５×１０−２Ｍ、１０−２Ｍ、５×１０−３Ｍ、１０−３Ｍ、５×１０−４Ｍ、１０−４Ｍ、５×１０−５Ｍ、１０−５Ｍ、５×１０−６Ｍ、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、１０−１３Ｍ、５×１０−１４Ｍ、１０−１４Ｍ、５×１０−１５Ｍ、または１０−１５Ｍ未満の解離定数またはＫＤを有するものが含まれる。典型的には、抗体は、１０−７Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で、その所定の抗原に結合する。好ましくは、抗体は、１０−９Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で、さらにより好ましくは１０−１１Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で、その同種抗原に結合する。
【０２２１】
抗体の改変：
免疫グロブリンまたはそれをコードするｃＤＮＡをさらに改変することができる。したがって、さらなる実施形態では、本発明の方法は、キメラ抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、二重特異性抗体、融合抗体、標識抗体またはこれらのいずれか１つの類似体を生産する工程のいずれか１つを含む。対応する方法が当業者に公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」，ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８８に記載されている。ファージディスプレイ技術によって前記抗体の誘導体を得る場合、本発明に提供される抗体のいずれか１つのものと同じエピトープに結合するファージ抗体の効率性を上昇させるために、ＢＩＡｃｏｒｅシステムにおいて用いられるように、表面プラズモン共鳴を使用することができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５），７−１３）。例えば、国際公開第８９／０９６２２号には、キメラ抗体の生産が記載されている。欧州特許出願公開第０２３９４００号明細書および国際公開第９０／０７８６１号には、ヒト化抗体の生産方法が記載されている。本発明にしたがって用いられる抗体のさらなる供給源は、いわゆるゼノジニック抗体である。例えば、国際公開第９１／１０７４１号、国際公開第９４／０２６０２号、国際公開第９６／３４０９６号および国際公開第９６／３３７３５号には、マウスにおけるヒト抗体などのゼノジニック抗体の生産についての一般的原理が記載されている。上記のように、本発明の抗体は、完全抗体の他に、例えば、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２を含む様々な形態で、ならびに単鎖形態で存在し得る。例えば、国際公開第８８／０９３４４号を参照のこと。
【０２２２】
当技術分野において公知の従来の技術を使用して、例えば、アミノ酸の欠失、挿入、置換、付加、および／または組換えおよび／または当技術分野において公知の任意の他の改変を単独でまたは組み合わせて使用することによって、本発明の抗体またはそれらの対応する免疫グロブリン鎖をさらに改変することができる。免疫グロブリン鎖アミノ酸配列の基礎となるＤＮＡ配列にこのような改変を導入する方法は当業者に周知である；例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）Ｎ．Ｙ．およびＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）を参照のこと。本発明の抗体の改変としては、アセチル化、ヒドロキシル化、メチル化、アミド化、および炭水化物もしくは脂質部分、補因子などの結合を含む、側鎖改変、骨格改変、ならびにＮ末端およびＣ末端改変を含む、１つ以上の構成アミノ酸における化学的および／または酵素的誘導体化が挙げられる。同様に、本発明は、標識または薬物などの異種性分子がアミノ末端に融合された記載される抗体またはそのいくつかの断片を含むキメラタンパク質の生産を包含する。このようにして作製された抗原結合分子は、それぞれ罹患細胞および組織の適切な表面構造を発現する細胞への薬物局在化に使用することができる。この標的化および細胞への結合は、治療的または診断的に活性な薬剤の送達および遺伝子治療／遺伝子送達に有用であり得る。本発明の抗体を有する分子／粒子は、目的の特定の抗原を発現する細胞／組織に特異的に結合するので、診断用途および治療用途を有し得る。
【０２２３】
試料：
本明細書で使用される場合、用語「試料」は、被験体または患者から得られる任意の生物学的物質を指す。一態様では、試料は、血液、脳脊髄液（「ＣＳＦ」）または尿を含み得る。他の態様では、試料は、全血、血漿、末梢血から濃縮された単核細胞（ＰＢＭＣ）、例えば、リンパ球（すなわち、Ｔ細胞、ＮＫ細胞またはＢ細胞）、単球、マクロファージ、樹状細胞および好塩基球；および培養細胞（例えば、被験体由来のＢ細胞）を含み得る。試料はまた、腫瘍組織を含む生検または組織試料を含み得る。さらに他の態様では、試料は、全細胞および／または細胞溶解物を含み得る。一実施形態では、試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。当技術分野において公知の方法によって試料を採取することができる。
【０２２４】
Ｂ細胞の同定および単離：
表１〜１４に含まれており、ＩＬ１７またはＩＬ−２２について例示的に示されている本発明の目的の特定の分子に対して特異的なＢ細胞の同定、ならびに目的の特異性を示す抗体の分子クローニング、ならびにそれらの組換え発現および機能特性決定は、特に実施例２に記載されているように一般に実施することができる。目的の特異性の抗体を発現するＢ細胞の同定方法、ならびに目的の特異性を示す抗体の分子クローニング、ならびにそれらの組換え発現および機能特性決定が、本出願内で提供される。以下に詳細に記載されているように、本発明の一実施形態では、単一またはオリゴクローナルＢ細胞の培養物を培養し、前記Ｂ細胞によって産生された抗体を含有する培養物の上清を、本発明の目的の分子（例えば、表１〜１４に含まれており、実施例に記載されている分子）、または被験体における炎症に関与するかもしくは自己免疫性疾患に関係する特定の分子（例えば、ＩＬ１７またはＩＬ−２２）に対して特異的な新たな抗体の存在および親和性についてスクリーニングする。別の実施形態では、Ｂ細胞培養物ではなく患者の血清を、目的の分子に対する自己抗体の存在について最初にスクリーニングし、次いで、高力価のものを末梢血単核細胞の単離のために選択する（実施例２を参照のこと）。スクリーニング工程は、目的の特定の分子の断片、ペプチドまたは誘導体に対する結合についてスクリーニングすることを含む。続いて、結合が検出された抗体または前記抗体を産生する細胞を単離する（実施例３を参照のこと）。したがって、予備スクリーニングは、抗体分泌細胞を含有する試料（例えば、全末梢血または血清）を使用して、候補ドナーのパネルで行うことができる。特に、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するための標準的な分離技術（例えば、勾配遠心分離）を使用して、血液またはリンパ組織から単核細胞を単離することができる。この分離工程の後および／または前に、抗体および抗体分泌細胞の存在を検出するための標準的な技術（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＢＩＡＣＯＲＥ、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ、ＳＥＲＰＡ、抗原アレイ、細胞培養系におけるウイルス感染の中和、またはＥＬＩＳＰＯＴアッセイ）を使用して、血清（または血漿）、細胞培養上清または細胞の試料（異なる患者から、異なる組織からおよび／または異なる時点で得られたもの）をプレスクリーニングすることができる。文献には、これらの技術のいくつかの例が提供されており、例えば、ワクチン接種したドナーの免疫反応を特性決定するためにＥＬＩＳＰＯＴを使用すること（Ｃｒｏｔｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．２８６（２００４），１１１−１２２）、新たに感染した患者用の診断ツールとして抗原マイクロアレイを使用すること（Ｍｅｚｚａｓｏｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．４８（２００２），１２１−１３０）、および抗原特異的免疫反応を測定するための他の技術（Ｋｅｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（２００５），４７７−４８４）が示されている。
【０２２５】
Ｂ細胞の不死化：
発癌性エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４（２００４），３３６１−３３６４；Ｃｏｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８（１９９４），３４１０−３４１４）などのウイルスを感染させるか、またはＣＤ４０リガンド／ＩＬ−４刺激（Ｗｉｅｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．３（２００８），ｅ１４６４．）を長期間反復することによって、抗体を産生するＢ細胞を不死化することができる。不死化ヒトＢ細胞およびＢ記憶リンパ球のクローンを生産する方法であって、ポリクローナルＢ細胞活性化因子の存在下で、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）を使用してヒトＢ記憶リンパ球を形質転換する工程を含む方法は、国際公開第２００４／０７６６７７号に要約されている。この国際出願には、目的の抗体をコードする核酸配列を得るための方法であって、不死化Ｂ細胞クローンを調製する工程、および目的の抗体をコードするＢ細胞クローンから核酸を得る／配列決定する工程、および該核酸をさらに挿入するかまたは該核酸を使用して、目的の抗体を発現することができる発現宿主を調製する工程、目的の抗体が発現される条件下で発現宿主を培養または継代培養する工程、および場合により、目的の抗体を精製する工程を含む方法も記載されている。その間において核酸を操作して、制限部位を導入し、コドン使用頻度を変化させ、ならびに／または転写および／もしくは翻訳調節配列を付加または最適化することができることは言うまでもない。これらの技術はすべて技術水準であり、当業者であれば、過度の負担なく実施することができる。例えば、重鎖定常領域を異なるアイソタイプのものに交換することもできるし、または完全に排除することもできる。単鎖Ｆｖ領域をコードするように、可変領域を連結することができる。複数のＦｖ領域を連結して２つ以上の標的への結合能を付与することもできるし、またはキメラ重鎖および軽鎖の組み合わせを用いることもできる。遺伝物質が利用可能になると、所望の標的へのそれらの結合能の両方を保持する上記類似体の設計は簡単である。抗体可変領域のクローニングおよび組換え抗体の作製の方法は当業者に公知であり、例えば、Ｇｉｌｌｉｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ４７（１９９６），１−２０；Ｄｏｅｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １１（１９９７），１７８７−１７９２に記載されている。
【０２２６】
疾患および障害：
特に指定がない限り、用語「障害」および「疾患」は、本明細書では互換的に使用される。本明細書で使用される場合、用語「自己免疫性障害」は、個体自身の組織または器官またはその同時分離体または徴候またはそれらから生じる症状から生じるかまたそれらに対する疾患または障害である。自己免疫性疾患は適応免疫反応の脱調節によって主に引き起こされ、自己構造に対する自己抗体または自己反応性Ｔ細胞が形成される。ほぼすべての自己免疫性疾患は、炎症性成分を有する。自己炎症性疾患は主に炎症性であり、いくつかの古典的な自己炎症性疾患は、先天性炎症経路の遺伝的欠陥によって引き起こされる。自己炎症性疾患では、自己反応性Ｔ細胞または自己抗体は見られない。これらの自己免疫性および自己炎症性障害の多くにおいて、限定されないが、高ガンマグロブリン血症、高レベルの自己抗体、組織中の抗原抗体複合体沈着、副腎皮質ステロイドまたは免疫抑制性処置から恩恵を受けるもの、および罹患組織中のリンパ系細胞凝集塊を含む多くの臨床用および研究用のマーカが存在し得る。Ｂ細胞媒介性自己免疫性障害に関する理論に限定されないが、Ｂ細胞は、自己抗体産生、免疫複合体形成、樹状およびＴ細胞活性化、サイトカイン合成、ケモカインの直接放出、および異所性新リンパ形成に対しての病巣の提供を含む、多くの機構的な経路によりヒト自己免疫性疾患において病原性効果を示すことが考えられる。これらの経路のそれぞれが、自己免疫性疾患の病状に異なった度合いで寄与し得る。
【０２２７】
本明細書で使用される場合、「自己免疫性障害」は、器官特異的疾患（すなわち、免疫反応が、内分泌系、造血系、皮膚、循環器系、胃腸および肝臓系、腎臓系、甲状腺、耳、神経筋系、中枢神経系などの器官系に対して特異的である）または複数の器官系に影響し得る全身性疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、多発性筋炎、自己免疫性多腺性内分泌不全症症候群１型（ＡＰＳ１）／自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィ（ＡＰＥＣＥＤ）など）であり得る。好ましい前記疾患としては、自己免疫性リウマチ学疾患（例えば、関節リウマチ、シェーグレン症候群、強皮症、ＳＬＥおよびループス腎炎などの狼瘡、多発性筋炎／皮膚筋炎、クリオグロブリン血症、抗リン脂質抗体症候群、および乾癬の関節炎など）、自己免疫性胃腸および肝臓疾患（例えば、炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎およびクローン病）、自己免疫性胃炎および悪性貧血、自己免疫性肝炎、原発性胆管萎縮症、原発性硬化性胆管炎、および小児脂肪便病など）、血管炎（例えば、チャング−シュトラウス血管炎、ウェゲナー肉芽腫症および多発動脈炎を含むＡＮＣＡ陰性血管炎およびＡＮＣＡ関連血管炎）、自己免疫性神経学的疾患（例えば、多発性硬化症（ＭＳ）、眼球クローヌスミオクローヌス症候群、重症筋無力症、視神経脊髄炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、および自己免疫性多発性神経炎など）、腎臓疾患（例えば、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、およびベルガー病など）、自己免疫性皮膚科疾患（例えば、乾癬、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、尋常性天疱瘡、天疱瘡群疾患、および皮膚紅班性狼瘡疾患など）、血液系疾患（例えば、血小板減少性紫斑病、血栓性血小板減少性紫斑病、輸血後の紫斑病、および自己免疫溶血性貧血など）、アテローム性動脈硬化、ブドウ膜炎、自己免疫性聴覚疾患（例えば、内耳疾患および聴力障害など）、ベーチェット病、レイノー症候群、器官移植および自己免疫性内分泌系疾患（例えば、インスリン依存型真性糖尿病（ＩＤＤＭ）などの糖尿病関連の自己免疫性疾患、アジソン病、自己免疫性甲状腺疾患（例えばグレーブス病および甲状腺炎）など）および自己免疫性の発生に影響を与える疾患、例えば、自己免疫性多腺性内分泌不全症症候群１型（ＡＰＳ１）／自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィ（ＡＰＥＣＥＤ）重症筋無力症（ＭＧ／胸腺腫が挙げられる。好ましい疾患としては、例えば、ＲＡ、ＩＢＤ、例えばクローン病および潰瘍性大腸炎、ＡＮＣＡ関連血管炎、狼瘡、ＭＳ、シェーグレン症候群、グレーブス病、ＩＤＤＭ、悪性貧血、甲状腺炎および糸球体腎炎、およびＡＰＳ１が挙げられる。またより好ましくはＲＡ、ＩＢＤ、狼瘡、およびＭＳ、より好ましくはＲＡおよびＩＢＤ、最も好ましくはＲＡである。
【０２２８】
場合により上記のものを包含する本明細書で定義される他の自己免疫性障害の具体例としては、限定されないが、関節炎（急性および慢性の関節リウマチ、例えば若年発症関節リウマチおよび段階、例えば関節リウマチ関節滑膜炎、痛風または痛風性関節炎、急性の免疫学的な関節炎、慢性炎症性関節炎、変形性関節症、ＩＩ型コラーゲン誘導性の関節炎、感染性関節炎、ライム関節炎、増殖性関節炎、乾癬の関節炎、スティル病、椎骨関節炎、骨関節炎、慢性関節炎プログレディエンテ、変形性関節炎、慢性多発性関節炎プリマリア、反応性関節炎、閉経期の関節炎、エストロゲン枯渇関節炎、および強直性脊椎炎／リウマチ様脊椎炎）、自己免疫性リンパ系増殖性疾患、炎症性過剰増殖性皮膚病、乾癬、例えばプラーク乾癬、滴状乾癬、膿疱性乾癬および爪乾癬、アトピー、例えばアトピー性疾患、例えば花粉症およびジョブ症候群、アトピー性皮膚炎、アレルギー性および毒性接触皮膚炎（急性および慢性）、剥脱性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、蕁麻疹、疱疹状皮膚炎、貨幣状皮膚炎、脂漏性皮膚炎、非特異的皮膚炎、ｘ連鎖過剰ＩｇＭ症候群、アレルギー性眼内炎症性疾患、蕁麻疹、例えば慢性アレルギー性蕁麻疹および慢性特発性蕁麻疹、寒冷蕁麻疹、例えば慢性自己免疫性蕁麻疹、筋炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、若年性皮膚筋炎、中毒性上皮性表皮壊死症、強皮症（局所型および全身型の強皮症を含む）、多発性硬化症（ＭＳ）、例えば脊髄視神経ＭＳ、原発性進行性ＭＳ（ＰＰＭＳ）、および再発性寛解型ＭＳ（ＲＲＭＳ）、進行性全身性硬化症、アテローム性動脈硬化、動脈硬化症、皮膚硬化症、失調性硬化症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、自己免疫媒介性胃腸疾患、胃腸炎症、大腸炎、例えば潰瘍性大腸炎、大腸炎潰瘍、顕微鏡的大腸炎、膠原性大腸炎、多発性大腸炎、壊死性全腸炎、および経壁性大腸炎、および自己免疫性炎症性腸疾患）、腸炎症、膿皮症壊疽、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、呼吸窮迫症候群、例えば、成人または急性の呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、髄膜炎、葡萄膜の全部または一部の炎症、虹彩炎、脈絡膜炎、自己免疫性血液疾患、移植片対宿主病、遺伝性血管性浮腫などの血管性浮腫、髄膜炎の脳神経損傷、妊娠ヘルペス、妊娠性類天疱瘡群疾患、天疱瘡群疾患、陰嚢掻痒、自己免疫性早期卵巣機能不全、自己免疫性症状による急性聴力損失、ＩｇＥ媒介性疾患、例えばアナフィラキシーおよびアレルギー性鼻炎およびアトピー性鼻炎、様々な形態の喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、脳炎、例えばラスマッセンの脳炎および辺縁および／または脳幹脳炎、ブドウ膜炎、例えば、前部ブドウ膜炎、急性前ブドウ膜炎、肉芽腫ブドウ膜炎、非顆粒性ブドウ膜炎、水晶体抗原性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎または自己免疫ブドウ膜炎、ネフローゼ症候群を有するまたは有さない糸球体腎炎（ＧＮ）、例えば、慢性または急性の糸球体腎炎、例えば原発性ＧＮ、免疫媒介性ＧＮ、膜性ＧＮ（膜性ネフロパシ）、特発性膜性ＧＮまたは特発性膜性ネフロパシ、膜または膜性増殖性ＧＮ（ＭＰＧＮ）（タイプＩおよびタイプＩＩを含む）、急速進行性ＧＮ（ＲＰＧＮ）、増殖性腎炎、自己免疫性多腺性内分泌不全、亀頭炎、例えば形質細胞限局性亀頭炎、亀頭包皮炎、遠心性環状紅斑、色素異常性固定性紅斑、多形性紅斑、環状肉芽腫、光沢苔癬、硬化性萎縮性苔癬、慢性単純性苔癬、棘状苔癬、扁平苔癬、表皮剥離性角質増殖症、前癌性角化症（例えば、光線性角化症）、膿皮症壊疽、アレルギー性状態および応答、食物アレルギー、薬剤アレルギー、昆虫アレルギー、希なアレルギー性疾患、例えば様々な形態の肥満細胞症、アレルギー性応答、湿疹、例えばアレルギー性またはアトピー性湿疹、乾皮性湿疹、異常発汗剤湿疹、掌蹠膿疱症、小胞の掌蹠湿疹、喘息、例えば喘息気管支炎、気管支喘息および自己免疫喘息、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状および慢性炎症反応、妊娠中の胎児のＡＢＯ式血液型など外来性抗原に対する免疫反応、慢性肺炎症性疾患、自己免疫心筋炎、白血球粘着力欠損、エリテマトーデス（ＬＥ）、慢性および急性皮膚型の両方（例えば、慢性皮膚ＬＥ（ＣＣＬＥ）、円板状エリテマトーデス（ＤＬＥ）、亜急性皮膚ＬＥ（ＳＣＬＥ）および全身型（例えば、ＳＬＥ）、例えばループス腎炎、ループス脳炎、小児ループス、非腎性ループス、腎外ループス、新生児期ループス症候群（ＮＬＥ）、若年性開始型（Ｉ型）真性糖尿病、例えば小児ＩＤＤＭ、成人発症型真性糖尿病（ＩＩ型糖尿病）、自己免疫性糖尿病、特発性の尿崩症、糖尿病性網膜症、糖尿病性ネフロパシ、糖尿病性大腸炎、糖尿病性大動脈疾患、サイトカインおよびＴリンパ球によって媒介される急性および遅発性過敏症と関係する免疫反応、結核、サルコイドーシス、肉芽腫症、例えばリンパ腫肉芽腫症、無顆粒球症、血管炎（例えば大脈管脈管炎、例えばリウマチ性多発性筋痛および巨細胞（高安）動脈炎、中脈管脈管炎、例えば川崎病および結節性多発動脈炎／結節性動脈周囲炎、免疫血管炎、ＣＮＳ血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、全身性壊死性血管炎などの壊死性血管炎、ＡＮＣＡ陰性脈管炎、およびＡＮＣＡ関連脈管炎、例えばチャーグ−ストラウス症候群（ＣＳＳ）、ウェゲナー肉芽腫症、および顕微鏡的多発血管炎）、白血球破砕性血管炎、側頭動脈炎、無形成性貧血、自己免疫無形成性貧血、クームズ陽性貧血症、ダイアモンドブラックファン貧血症、溶血性貧血または免疫溶血性貧血、例えば自己免疫溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、悪性貧血（貧血症悪性熱）、アジソン病、純粋な赤血球貧血症または形成不全（ＰＲＣＡ）、第ＶＩＩＩ因子欠損症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、例えば汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出を伴う疾患、ＣＮＳ炎症性疾患、アルツハイマー病、パーキンソン病、多器官損傷症候群、例えば敗血症、外傷または出血の二次症状、抗原抗体複合体関連疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、単神経炎、アレルギー性神経炎、ベーチェット病／症候群、カールスマン症候群、グッドパスチャー症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス−ジョンソン症候群、類天疱瘡または天疱瘡、例えば水疱性類天疱瘡、瘢痕性（粘膜）類天疱瘡、皮膚類天疱瘡、尋常性天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、落葉状天疱瘡、ペンフィグス粘液膜類天疱瘡、および天疱瘡エリテマトーデス、後天性表皮水疱症、眼炎症、好ましくはアレルギー性結膜炎などのアレルギー性眼炎症、線上水疱性疾患、自己免疫誘導結膜炎症、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター病または症候群、自己免疫性状態による熱性損傷、子癇前症、免疫複合体疾患、例えば免疫複合体腎炎、抗体が媒介する腎炎、神経炎症性疾患、多発性神経炎、慢性神経障害、例えばＩｇＭ多発性神経炎またはＩｇＭ媒介性神経障害、血小板減少（例えば心筋梗塞患者によるもの）、例えば血栓性血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、輸血後紫斑病（ＰＴＰ）、ヘパリン誘導性血小板減少および自己免疫性または免疫媒介性血小板減少、例えば慢性および急性のＩＴＰを含む特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、強膜炎、例えば特発性のセラト強膜炎、上強膜炎、自己免疫性精巣炎および卵巣炎を含む精巣および卵巣の自己免疫性疾患、一次甲状腺機能低下症、副甲状腺機能低下症、自己免疫内分泌性疾患、例えば甲状腺炎、例えば自己免疫性甲状腺炎、橋本病、慢性甲状腺炎（橋本甲状腺炎）または亜急性の甲状腺炎、自己免疫甲状腺性疾患、特発性甲状腺機能低下症、グレーブス病、グレーブス眼症（眼疾患または甲状腺眼症）、多腺性症候群、例えば自己免疫多腺性症候群、例えばタイプＩ（または、多腺性内分泌障害症候群）、腫瘍随伴症候群、例えば神経系新生物関連症候群、例えばランバート−イートン筋無力症症候群またはイートン―ランバート症候群、スティッフマンまたはスティッフマン症候群、脳脊髄炎、例えばアレルギー性脳脊髄炎または脳脊髄炎性アレルギーおよび実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、重症筋無力症、例えば胸腺腫関連の重症筋無力症、小脳性退化、神経ミオトニ、眼球クローヌスまたは眼球クローヌス筋硬直症候群（ＯＭＳ）、および感覚系神経障害、多病巣性運動神経障害、シーハン症候群、自己免疫肝炎、慢性肝炎、類狼瘡肝炎、巨細胞肝炎、慢性活動性肝炎または自己免疫慢性活動性肝炎、間質性肺炎、例えばリンパ系間隙間質性肺炎（ＬＩＰ）、閉塞性細気管支炎（非移植）対ＮＳＩＰ、ギラン‐バレー症候群、ベルガー病（ＩｇＡネフロパシ）、特発性ＩｇＡネフロパシ、線状ＩｇＡ皮膚病、急性発熱性好中性皮膚病、角層下膿疱症、一過性棘融解皮膚病、肝硬変、例えば原発性胆管萎縮症および肺線維症、自己免疫腸疾患症候群、セリアックまたはコエリアック病、脂肪便症（グルテン腸疾患）、抵抗性スプルー、特発性スプルー、クリオグロブリン血症、例えば混合性クリオグロブリン血症、アミロトロフィック側索硬化症（ＡＬＳ；ルーゲーリック病）、冠状動脈疾患、自己免疫性耳疾患、例えば自己免疫内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫聴力障害、多発性軟骨炎、例えば抵抗性または再発性または再発する多発性軟骨炎、肺胞状蛋白症、角膜炎、例えばコーガン症候群／非梅毒性間質性角膜炎、ベル麻痺、スウィート病／症候群、自己免疫性酒さ、帯状ヘルペス関連疼痛、アミロイドーシス、非癌性リンパ球増多症、一次リンパ球増多症、これにはモノクローナルＢ細胞リンパ球増多症（例えば良性モノクローナル免疫グロブリン症および意義不明の単クローン性γグロブリン血症、ＭＧＵＳ）が含まれる、末梢性神経障害、腫瘍随伴症候群、チャネル病、例として、癲癇、片頭痛、不整脈、筋疾患、難聴、盲目、周期性麻痺およびＣＮＳのチャネル病、自閉症、炎症性ミオパシ、局所性または分節性または限局���分節性糸球体硬化症（ＦＳＧＳ）、内分泌性眼障害、ブドウ膜網膜炎、脈絡網膜炎、自己免疫性肝臓病、線維症、多内分泌性不全、シュミット症候群、副腎炎、胃萎縮、初老期痴呆、脱髄性疾患、例として、自己免疫脱髄性病および慢性炎症性脱髄性多発性神経炎、ドレスラー症候群、円形脱毛症、完全脱毛症、ＣＲＥＳＴ症候群（石灰沈着、レイノー現象、食道運動障害、強指症および毛細管拡張症）、雌雄自己免疫性不妊性、例えば、抗精子抗体によるもの、混合性結合組織病、シャーガス病、リウマチ熱、再発性中絶、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、クッシング症候群、愛鳥家肺、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、良性リンパ球血管炎、アルポート症候群、肺胞炎、例えばアレルギー性肺胞炎および繊維化肺胞炎、間隙肺疾患、輸血反応、ハンセン病、マラリア、寄生虫病、例としてリーシュマニア症、トリパノソーマ症、住血吸虫症、蛔虫症、アスペルギルス症、サンプター症候群、カプラン症候群、デング熱、心内膜炎、心内膜心筋線維形成、広汎性間隙肺線維形成、間質性肺線維形成、繊維化縦隔炎、肺線維形成、特発性の肺線維形成、嚢胞性線維症、眼内炎、持久性隆起性紅斑、胎児赤芽球症、好酸性筋膜炎、シャルマン症候群、フェルティー症候群、フィラリア症、毛様体炎、例えば慢性毛様体炎、ヘテロ慢性毛様体炎、虹彩毛様体炎（急性または慢性）またはＦｕｃｈの毛様体炎、ヘーノホ−シェーンライン紫斑病、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、ＳＣＩＤ、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、エコーウィルス感染、敗血症（全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、内毒血症、膵炎、甲状腺炎、パルボウィルス感染、風疹ウイルス感染、種痘後症候群、先天性風疹感染、エプスタインバーウイルス感染、耳下腺炎、エヴァンス症候群、自己免疫性腺機能不全、シドナム舞踏病、連鎖球菌感染後腎炎、閉塞性血栓性血管炎、甲状腺中毒症、脊髄癆、脈絡膜炎、巨細胞多発性筋痛、慢性過敏性肺炎、結膜炎、例として、春季カタル、乾性角結膜炎、および流行性角結膜炎、特発性腎臓症候群、微小変化ネフロパシ、良性家族性および乏血−再灌流障害、移植器官再灌流、網膜自己免疫、関節炎症、気管支炎、慢性閉塞性気道／肺性疾患、珪肺症、アフタ、アフタ性口内炎、動脈硬化症疾患（大脳血管性不足）、例として動脈硬化脳症および動脈硬化症網膜症、アスペルマトジェネシス（ａｓｐｅｒｍａｔｏｇｅｎｅｓｉｓ）、自己免疫性溶血、
ベック病、クリオグロブリン血症、デュピュイトラン拘縮、水晶体過敏性眼内炎、腸炎アレルギー、癩性結節性紅斑、特発性顔麻痺、慢性疲労症候群、リウマチ性熱、ハンマンリッチ病、感音性聴力障害、血色素尿症発作、性機能低下、回腸炎領域、白血球減少症、単核細胞増加症感染、横移動脊髄炎、一次特発性の粘液水腫、ネフローゼ、交感性眼炎、新生児眼球炎、視神経炎、精巣炎肉芽腫症、膵炎、多発性神経根炎急性、膿皮症壊疽、ケルバン甲状腺炎、後天性脾臓萎縮、非悪性胸腺腫、リンパ濾胞性胸腺炎、白斑、毒性ショック症候群、食中毒、Ｔ細胞の浸潤を伴う症状、白血球−粘着力欠損、サイトカインおよびＴリンパ球に媒介される急性および遅発性過敏症関連免疫反応、白血球血管外遊出を伴う疾患、多器官損傷症候群、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、自己免疫多腺性内分泌障害、卵巣炎、原発性粘液水腫、自己免疫萎縮性胃炎、リウマチ性疾患、混合性結合組織病、ネフローゼ症候群、膵島炎、多内分泌性不全、自己免疫多腺性症候群、例えば多腺性症候群Ｉ型、成人発症型特発性副甲状腺機能低下症（ＡＯＩＨ）、心筋症、例えば拡張型心筋症、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、ヘモクロマトーシス、心筋炎、ネフローゼ症候群、原発性硬化性胆管炎、化膿性または非化膿性副鼻腔炎、急性または慢性副鼻腔炎、篩骨、正面、上顎骨または蝶形骨副鼻腔炎、アレルギー性副鼻腔炎、好酸球性関連疾患、例えば好酸球増加症、肺浸潤好酸球増加症、好酸球増加症−筋肉痛症候群、レフラー症候群、慢性好酸性肺炎、熱帯肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギロームまたは好酸球性を含む肉芽腫、アナフィラキシー、脊椎関節症、血清陰性脊椎関節炎疹、多内分泌性自己免疫性疾患、硬化性胆管炎、強膜、上強膜、慢性皮膚粘膜カンジダ症、ブルトン症候群、乳児期の一過性低ガンマグロブリン血症、ウィスコット‐アルドリッチ症候群、毛細血管拡張性運動失調症候群、血管拡張症、膠原病と関係する自己免疫性疾患、リウマチ、例えば慢性関節リウマチ、リンパ節炎、血圧応答の減退、血管機能不全、組織損傷、心血管乏血、痛覚過敏、腎虚血、脳虚血、および脈管化を伴う疾患、アレルギー性過敏症疾患、糸球体腎炎、再灌流障害、虚血性再灌流障害、心筋または他の組織の再灌流損傷、リンパ腫気管気管支炎、炎症性皮膚病、急性炎症性成分を有する皮膚病、多器官不全、水疱性疾患、腎皮質壊死、急性化膿性髄膜炎または他の中枢神経系炎症性疾患、眼性および眼窩の炎症性疾患、顆粒球輸血関連症候群、サイトカイン誘導性毒性、ナルコレプシ、急性重症炎症、慢性難治性炎症、腎盂炎、動脈内過形成、消化性潰瘍、弁膜炎、および子宮内膜症が挙げられる。
【０２２９】
単一遺伝子性障害
ＡＰＥＣＥＤ
【表３２】
2015505244.tif 000017
【０２３０】
【表３３】
2015505244.tif 000018
【０２３１】
ＩＰＥＸ：
Ｘ連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症候群（ＩＰＥＸ）は、珍しいＸ連鎖劣性疾患である。臨床表現型を有する男性の２５％において、ＦＯＸＰ３遺伝子（フォークヘッドボックスＰ３）；転写調節因子のフォークヘッド／ウイング−ヘリックスファミリーのメンバー）における突然変異が見られ得るが、同定された突然変異を有しないいくつかの症例では、ＦＯＸＰ３発現細胞による発現が低いかまたはＦＯＸＰ３発現細胞の数が少ないことが認められたことから（Ｔｏｒｇｅｒｓｏｎ、未発表の結果−ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ；ＮＣＢＩ  Ｂｏｏｋｓｈｅｌｆ）、おそらくは同じ経路からの少なくとも１つのさらなる常染色体遺伝子座がＦＯＸＰ３機能障害に関与し得ることを示唆するデータ（Ｏｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．２００３；８８：６０３４−６０３９）が示されている。ＩＰＥＸ症候群は、末梢性寛容障害によって引き起こされる疾患のプロトタイプとみなされ得る。ＦｏｘＰ３遺伝子における突然変異は、制御性Ｔ細胞の抑制、およびそれに続いて自己攻撃性Ｔ細胞の過活性化および自己抗体の形成につながる。臨床所見としては、以下を含む基本的な臨床三徴（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１００（１９８２），７３１−７３７；Ｏｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２０３（２００５），１５６−１６４）が挙げられる：
甲状腺機能低下症または甲状腺機能亢進症につながる１型真性糖尿病または自己免疫性甲状腺疾患を最も多く伴う内分泌障害（Ｗｉｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３９（２００２），５３７−５４５；Ｇａｍｂｉｎｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２２（２００８），１１０５−１１１２）
慢性水様性下痢を伴う腸疾患
最も一般的には湿疹、爪ジストロフィ、紅皮症、乾癬病変および全身性脱毛症を伴う皮膚炎も報告されている。処置しなければ、ほとんどの患者は生後１２〜２４カ月以内に死亡し、免疫抑制レジメンおよび骨髄移植は生存を延長するが、軽度の疾患症例では生後２０年または３０年を超えない（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１００（１９８２）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．３８（２００１），８７４−８７６；Ｌｅｖｙ−Ｌａｈａｄ  ａｎｄ  Ｗｉｌｄｉｎ，Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１３８（２００１），５７７−５８０；Ｔａｄｄｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｅｄｉａｔｒ．１６６（２００７），１１９５−１１９７）。
【０２３２】
胸腺腫：
胸腺腫は胸腺の腫瘍であり、胸骨のすぐ後ろの上縦隔に位置する。それは前縦隔の最も一般的な腫瘍であり、胸腺由来の上皮細胞から生じる。この腫瘍は、皮質および髄質上皮細胞の両方から生じ得るか、またはこれらの細胞型の両方から生じた細胞を含み得る。組織学に基づいて、この腫瘍をこれらのカテゴリーに分けることができる：
Ａ型は、上皮細胞が楕円形または紡錘状の形状を有する場合である；（リンパ球数はより少ない）
Ｂ型は、それらが上皮様形態を有する場合である（Ｂ型は、３つのサブタイプＢ１（リンパ球リッチ）、Ｂ２（皮質）およびＢ３（上皮）を有する。）
ＡＢ型は、この腫瘍が両方の細胞型の組み合わせを含有する場合である。
（Ｄａｄｍａｎｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｓｔ  Ｓｕｒｇ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍ  １１（２００１），４０７−４２０。）この腫瘍の３分の１〜半分は無症候性であり、最も一般的な症候は、腫瘍増殖による隣接器官の圧迫によって引き起こされる。胸腺腫のごく一部は悪性であり、局所浸潤を示すが、転移は稀である。
【０２３３】
胸腺腫の重要な特徴は、この腫瘍に関連する様々な全身性疾患である。これらの胸腺腫関連症状のほとんどは、自己免疫に関連している。最も周知なのは、シナプス後神経筋接合部に位置するアセチルコリン受容体に対する自己抗体によって引き起こされる比較的珍しい神経筋疾患の重症筋無力症である。これらの抗体は、神経伝達物質アセチルコリンの作用を遮断するので、筋肉疲労を引き起こすであろう。胸腺腫を有する患者の半分近く（３０〜４５％）は、重症筋無力症を有する。胸腺腫に関連する他の自己免疫性疾患は、急性心膜炎、アジソン病（副腎皮質不全）、円形脱毛症、潰瘍性大腸炎、溶血性貧血、悪性貧血、関節リウマチ、強皮症、全身性エリテマトーデスおよび甲状腺炎である。
【０２３４】
標識および診断：
標識剤は、本発明の抗体または抗原に直接的または間接的のいずれかでカップリングされ得る。間接的カップリングの一例は、スペーサ部分の使用によるものである。さらに、本発明の抗体は、共有結合または非共有結合によって連結されているさらなるドメインを含み得る。この連結は、当技術分野において公知の上記方法による遺伝的融合に基づくものでもよいし、または例えば国際公開第９４／０４６８６号に記載されている化学的架橋によって実施することもできる。本発明の抗体を含む融合タンパク質中に存在するさらなるドメインは、好ましくは、可撓性リンカー、有利にはポリペプチドリンカーによって連結され得、前記ポリペプチドリンカーは、前記さらなるドメインのＣ末端と本発明の抗体のＮ末端との間（またはその逆も同様である）の距離に及ぶのに十分な長さの、複数の親水性ペプチド結合アミノ酸を含む。治療的または診断的に活性な薬剤が、様々な方法によって、本発明の抗体またはその抗原結合断片にカップリングされ得る。これとしては、例えば、共有的な方法、例えばペプチド結合によって、治療的または診断的に活性な薬剤にカップリングされた、本発明の抗体の可変領域を含む単鎖融合タンパク質が挙げられる。さらなる例としては、さらなる分子に共有結合または非共有結合によってカップリングされた抗原結合断片を少なくとも含む分子が挙げられ、以下の非限定的な例示的リスト中のものが挙げられる。Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｒｐ．ＳｕＤＰ  ７（１９９２），５１−５２には、ＣＤ３に対するＦｖ領域が、可溶性ＣＤ４または他のリガンド、例えばＯＶＣＡおよびＩＬ−７にカップリングされている、二重特異性試薬ヤヌシンが記載されている。同様に、本発明の抗体の可変領域をＦｖ分子に構築して、引用文献に示されている代替的リガンドにカップリングすることができる。Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅ  １６６（１９９２），１９８−２０２には、ＧＰ１２０のＶ３領域中の特定の配列に対する抗体に架橋されたＯＫＴ３からなるヘテロコンジュゲート抗体が記載されている。このようなヘテロコンジュゲート抗体はまた、本発明の方法の抗体中に含まれる少なくとも可変領域を使用して構築され得る。特異的抗体のさらなる例としては、Ｆａｎｇｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｓ．６８（１９９３），１８１−１９４およびＦａｎｇｅｒ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２（１９９２），１０１−１２４に記載されている抗体が挙げられる。従来の抗体を含む免疫毒素であるコンジュゲートは、当技術分野において広く記載されている。従来のカップリング技術によって毒素を抗体にカップリングしてもよいし、またはタンパク質毒素部分を含む免疫毒素を融合タンパク質として生産してもよい。本発明の抗体は、このような免疫毒素を得るための対応する方法で使用され得る。このような免疫毒素の例示は、Ｂｙｅｒｓ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（１９９１），５９−７０およびＦａｎｇｅｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １２（１９９１），５１−５４によって記載されているものである。
【０２３５】
上記融合タンパク質は、プロテアーゼにより切断可能なリンカーまたは切断部位をさらに含み得る。これらのスペーサ部分は順に不溶性でもよいしまたは可溶性でもよく（Ｄｉｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１（１９８６），１４８）、標的部位における抗原からの薬物放出を可能にするように選択され得る。免疫療法のための本発明の抗体および抗原にカップリングされ得る治療剤の例は、ケモカイン、ホーミング分子、薬物、放射性同位体、レクチンおよび毒素である。本発明の抗体および抗原にコンジュゲートされ得る薬物は、コンジュゲート分子を使用しようとする疾患状況に依存する。例えば、腫瘍疾患の処置に有用な標的に対して特異的な抗体を、古典的には抗腫瘍薬物と称される化合物、例えば、マイトマイシンＣ、ダウノルビシンおよびビンブラスチンにコンジュゲートすることができる。例えば、腫瘍免疫療法のために、放射性同位体とコンジュゲートした本発明の抗体または抗原を使用する際には、特定の同位体が、白血球分布ならびに安定性および放射などの因子に応じて、他の同位体よりも好ましい場合がある。自己免疫反応に応じて、いくつかの放射体が、他の放射体よりも好ましい場合がある。一般に、α粒子およびβ粒子を放射する放射性同位体が、免疫療法では好ましい。ショートレンジの高エネルギー放射体、例えば２１２Ｂｉが好ましい。治療目的では、本発明の抗体または抗原に結合され得る放射性同位体の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、２１２Ｂｉ、２１２Ａｔ、２１１Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄおよび１８８Ｒｅである。本発明の抗体または抗原にカップリングされ得る他の治療剤、ならびにエクスビボおよびインビボの治療プロトコールは公知であるか、または当業者であれば容易に確認することができる。標識するのに適切な放射性核種の非限定的な例は、１９８Ａｕ、２１２Ｂｉ、１１Ｃ、１４Ｃ、５７Ｃｏ、６７Ｃｕ、１８Ｆ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、３Ｈ、１９７Ｈｇ、１６６Ｈｏ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１７７Ｌｕ、１５Ｏ、１３Ｎ、３２Ｐ、３３Ｐ、２０３Ｐｂ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、３５Ｓ、１５３Ｓｍおよび９９ｍＴｃである。標識するのに適切な他の分子は、蛍光色素または発光色素、磁気粒子、金属、および二次的な酵素または結合工程によって検出可能な分子、例えば、酵素またはペプチドタグである。本発明で標識として使用するのに適切な市販の蛍光プローブは、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に列挙されている。磁気粒子ベースのアッセイ（ＭＰＡ）に使用するのに適切な磁気粒子は、常磁性物質、反磁性物質、強磁性物質、強磁性物質および超常磁性物質から選択され得る。
【０２３６】
診断目的に有用な分子および細胞生化学の一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９６）などの標準的な教科書に見られ得る。診断目的用の試薬、検出手段およびキットは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、およびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈなどの商業ベンダー、ならびに本明細書で引用されている参考文献、特に特許文献のいずれか１つに示されている供給源から市販されている。
【０２３７】
処置および薬物：
本明細書で使用される場合、用語「処置する」または「処置」は、自己免疫性疾患および／または自己炎症性疾患の発症などの望ましくない生理的変化または障害を防止するか、または遅延（減少）させることを目的とする治療的処置および予防的または防止的手段の両方を指す。有益なまたは所望の臨床結果としては、限定されないが、検出可能であるかまたは検出不可能であるかにかかわらず、症候の軽減、疾患の程度の縮小、安定化した（すなわち、悪化していない）疾患状態、疾患進行の遅延または緩慢化、疾患状態の寛解または緩和、および（部分的であるかまたは完全であるかにかかわらず）寛解が挙げられる。「処置」はまた、処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長させることを意味し得る。処置を必要とする者としては、症状または障害を既に有する者、ならびに症状または障害を有する傾向がある者、または症状または障害の徴候を防止するべき者が挙げられる。
【０２３８】
特に指定がなければ、用語「薬物」、「医薬」または「医薬品」は、本明細書では互換的に使用され、限定されないが、（Ａ）内用または外用の物品、医薬および調製物、ならびにヒトまたは他の動物のいずれかの疾患の診断、治癒、緩和、処置または予防に使用することを目的とする任意の物質または物質の混合物；ならびに（Ｂ）ヒトまたは他の動物の体の構造または任意の機能に影響を与えることを目的とする物品、医薬および調製物（食品を除く）；ならびに（Ｃ）項目（Ａ）および（Ｂ）で指定された任意の物品の成分として使用することを目的とする製品を含むものである。用語「薬物」、「医薬」または「医薬品」は、１つ以上の「薬剤」、「化合物」、「物質」または「（化学）組成物」、ならびにいくつかの他の文脈ではさらに充填剤、崩壊剤、潤滑剤、流動促進剤、結合剤のような他の薬学的に不活性な賦形剤、またはヒトもしくは他の動物の体内の目的の標的部位（例えば、皮膚、胃または腸内）における「薬物」、「医薬」もしくは「医薬品」の容易な運搬、崩壊、分解、溶解および生物学的アベイラビリティを確保するものを含有する、ヒトまたは他の動物のいずれかで使用することを目的とする調製物の製剤一式を含むものである。用語「薬剤」、「化合物」または「物質」は、本明細書では互換的に使用され、より具体的な文脈では、限定されないが、すべての薬理学的に活性な薬剤（すなわち、所望の生物学的または薬理学的効果を誘導するか、または本発明の方法によってこのような可能な薬理学的効果を誘導する能力について調査または試験される薬剤）を含むものである。
【０２３９】
「抗リウマチ薬」および免疫抑制薬の例としては、クロロキン、ヒドロキシクロロキノン、ミオクリシン、オーラノフィン、スルファサラジン、メトトレキセート、レフルノミド、エタネルセプト、インフリキシマブ（プラス経口および皮下用メトトレキセート）、アダリムマブなど、アザチオプリン、Ｄ−ペニシラミン、ゴールド塩類（経口）、ゴールド塩類（筋肉内）、ミノサイクリン、シクロスポリンＡおよび局所性シクロスポリンを含むシクロスポリン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、シクロホスファミド、ブドウ球菌プロテインＡ（Ｇｏｏｄｙｅａｒ  ａｎｄ  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１９７（２００３），１２５−３９）が挙げられ、これらの塩および誘導体などを含む。
【０２４０】
「非ステロイド系抗炎症薬」または「ＮＳＡＩＤ」の例としては、アスピリン、アセチルサリチル酸、イブプロフェンおよびイブプロフェン遅延剤、フェノプロフェン、ピロキシカム、フルルビプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、ナプロキセン、テノキシカム、ベノリレート、ジクロフェナク、ナプロキセン、ナブメトン、インドメタシン、ケトプロフェン、メフェナム酸、ジクロフェナク、フェンブフェン、アザプロパゾン、アセメタシン、チアプロフェン酸、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、フェニルブタゾン、ジクロフェナクおよびジクロフェナク遅延剤、ＧＲ２５３０３５などのシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２インヒビター、ＭＫ９６６、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（登録商標）；４−（５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−ピラゾロ−１−イル）ベンゼンスルホンアミドおよびバルデコキシブ（ＢＥＸＴＲＡ（登録商標））、およびメロキシカム（ＭＯＢＩＣ（登録商標））が挙げられ、これらの塩および誘導体などを含む。好ましくは、これらは、アスピリン、ナプロキセン、イブプロフェン、インドメタシンまたはトルメチンである。このようなＮＳＡＩＤは、場合により、鎮痛剤、例えば、コデイン、トラマドール、および／またはジヒドロコデインまたは麻酔剤、例えば、モルヒネと共に使用される。
【０２４１】
「被験体」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳動物」は、診断、予後予測、予防または治療に望ましい任意の被験体、特に哺乳動物被験体、例えば、ヒト患者を意味する。
【０２４２】
医薬担体：
薬学的に許容し得る担体および投与経路は、当業者に公知の対応文献から採用することができる。当技術分野において周知の方法にしたがって本発明の医薬組成物を製剤化することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００）ｂｙ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＩＳＢＮ  ０−６８３−３０６４７２，Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳＡ，２００３；Ｂａｎｇａ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ．（２００６），ＩＳＢＮ：０−８４９３−１６３０−８を参照のこと。適切な医薬担体の例は当技術分野において周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。周知の従来の方法によってこのような担体を含む組成物を製剤化することができる。適切な用量で被験体にこれらの医薬組成物を投与することができる。様々な方法で、適切な組成物の投与をもたらすことができる。例としては、薬学的に許容し得る担体を含有する組成物を、経口、鼻腔内、直腸、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮下、経皮、くも膜下および頭蓋内の方法により投与することが挙げられる。点鼻薬製剤などのエアロゾル製剤は、保存剤および等張剤を有する、活性薬剤の精製した水溶液または他の溶液を含む。このような製剤は、好ましくは、鼻粘膜に適合するｐＨおよび等張状態に調節される。経口投与用医薬組成物、例えば、単一ドメイン抗体分子（例えば、「ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）」なども本発明で想定される。このような経口製剤は、錠剤、カプセル剤、粉末、液体または半固体形態であり得る。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含むことができる。直腸投与用または経膣投与用の製剤は、適切な担体を有する坐剤として提供され得る；Ｏ’Ｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ２（９）（２００３），７２７−７３５も参照のこと。様々な種類の投与に適切な製剤に関するさらなる指針は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，１７ｔｈ  ｅｄ．（１９８５）および対応する最新版に見ることができる。薬物送達方法の簡単な総説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９（１９９０），１５２７−１５３３を参照のこと。
【０２４３】
投与計画：
投与計画は、担当の医師および臨床的要因によって決定される。医学分野で周知であるように、任意のある患者への投与量は、その患者のサイズ、体表面、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与時間および経路、一般的健康状態、同時に投与されている他の薬物を含む多数の要因に依存する。典型的な用量は、例えば、０．００１〜１０００μｇの範囲内であり得る（すなわち、この範囲内の、発現のためのまたは発現阻害のための核酸）；しかしながら、この例示的な範囲よりも少ないかまたは多い用量が、特に前述の要因を考慮して想定される。一般に、医薬組成物の定期投与としての計画は、１μｇ〜１０ｍｇ単位／日の範囲内とするべきである。計画が持続注入である場合も、それぞれ１μｇ〜１０ｍｇ単位／キログラム体重／分の範囲内とするべきである。定時的評価によって経過をモニタリングすることができる。非経口投与用の製剤は、滅菌水性または非水性溶液、懸濁液およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびエチルオレエートなどの注射可能な有機エステルである。水性担体としては、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。非経口投与用のビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖液、ブドウ糖および塩化ナトリウム、乳酸化リンゲル液、または固定化油が挙げられる。静脈内投与用のビヒクルとしては、体液および栄養補充液、（リンゲルブドウ糖液に基づくものなどの）電解質補充液などが挙げられる。例えば、抗微生物薬、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの保存剤および他の添加物も存在し得る。さらに、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の目的用途に応じて、抗腫瘍剤および細胞毒性薬物などの薬剤をさらに含むことができる。
【０２４４】
加えて、他の薬剤の同時投与または連続投与が望ましい場合がある。治療有効用量または治療有効量は、症候または症状を改善するのに十分な有効成分の量を指す。細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）によって、このような化合物の治療有効性および毒性を決定することができる。治療効果と毒性効果との間の用量比が治療指数であり、それはＬＤ５０／ＥＤ５０の比と表すことができる。
【０２４５】
好ましくは、組成物中の治療薬は、炎症の予防または免疫反応の抑制に十分な量で存在する。
【０２４６】
これらおよび他の実施形態は、本発明の記載および実施例によって開示および包含される。本発明にしたがって用いられる材料、方法、使用法および化合物のうちのいずれか１つに関するさらなる文献は公開ライブラリおよびデータベースから、例えば、電子機器を使用して検索され得る。例えば、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎおよび／またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈが主催する公開データベース「Ｍｅｄｌｉｎｅ」を活用することができる。Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）の一部であるＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＥＢＩ）のデータベースとアドレスなどのさらなるデータベースとウェッブアドレスが当業者に公知であり、インターネットの検索エンジンを用いてそれらを得ることもできる。遡及的な検索および現状の認識に有用な生物工学の特許情報の概要、および関連する特許情報の供給源の調査は、Ｂｅｒｋｓ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １２（１９９４），３５２−３６４において与えられる。
【０２４７】
上記開示は、一般に、本発明を説明する。特に指定がない限り、本明細書で使用される用語には、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７、２０００年改編および２００３年再版、ＩＳＢＮ０１９８５０６７３２で提供されている定義が与えられる。いくつかの文書が本明細書の本文を通して引用される。本明細書の末尾、特許請求の範囲の直前に、完全な書誌引用を見出すことができる。引用されているすべての参考文献（本出願を通して引用されている参考文献、発行特許、公開特許出願、および製造業者の仕様書、説明書などを含む）の内容は、参照により本明細書に明確に組み込まれる；しかしながら、引用されているいかなる文書も実に本発明に対する従来技術であると認めるものではない。
【０２４８】
以下の具体的な実施例を参照することにより、さらに完全な理解を得ることができるが、これらは例証のみを目的として本明細書に提供するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０２４９】
以下の実施例１〜１７および対応する図１〜５０は本発明をさらに例証するが、本発明の範囲を何ら限定するものと解釈するべきではない。本明細書で用いられるものなどの従来の方法についての詳細な説明は、引用されている文献に見出すことができる；「Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ」Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ．ｅｄ．ｂｙ  Ｂｅｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｅｒｋｏｗ（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，２００３）も参照のこと。
【０２５０】
本発明の実施は、特に指示がない限り、当技術分野の技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、遺伝子導入生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来の技術を用いる。
【０２５１】
分子遺伝学および遺伝子工学の方法は、一般に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ  ａｎｄ  Ａｌａｎ，Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）；およびＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（Ｗｕ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）．Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）の最新版に記載されている。この開示で言及されている遺伝子操作のための試薬、クローニングベクタおよびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎおよびＣｌｏｎｔｅｃｈなどの商業ベンダーから入手可能である。細胞培養および培地回収の一般的な技術は、Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（１９９７），１４８）；Ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｋｉｔａｎｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １��（１９９１），７３）；Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２（１９９１），３７５）；およびＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｂｉｒｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９（１９９０），２５１に概説されている。
【０２５２】
材料および方法
本発明の患者選択および疾患関連性
自己抗体について研究し、本発明に関する特異的Ｂリンパ球クローニングの供給源となるフィンランド人ＡＰＥＣＥＤ患者３３人の群は、以下の特徴を有する。患者のうち２１人が女性であり、１２人が男性であり、平均年齢は３８歳であった（女性３８．３歳；男性３７．８歳）。最初のＡＰＥＣＥＤ症候時の平均年齢は、６．２歳であった。男性の平均体重は６９．７５ｋｇであり、女性の平均体重は５９，４ｋｇであった。これら３３人の患者は、患者らの臨床症候に関するアンケートに回答した。一般的な症候としては、患者の３０％が発熱期間を経験し、６７％が無力症を経験した。患者のうち３０人が血液を提供し、図６〜１０に示されているように、患者らの血清をＥＬＩＳＡによって分析した。これらの患者２３人および健常対照者７人（Ｃ１〜Ｃ７）の血清をｐｒｏｔｏａｒｒａｙスクリーニングのために選択した。
【０２５３】
器官特異的症候および疾患
ＡＩＲＥ遺伝子欠損の結果としてのＡＰＥＣＥＤ患者における器官特異的症候および疾患は以前に記載されており、組織特異的自己抗原の大部分が公知である（Ｂｅｔｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８３（１９９８）１０４９−１０５５；Ｈｕｓｅｂｙｅ，Ｅ．Ｓ．，Ｐｅｒｈｅｅｎｔｕｐａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２６５（２００９），５１４−５２９；Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８９（２００４），５５７−５６２；Ｕｉｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．７８（１９９４），３２３−３２８）。本患者コホートは、以下の器官特異的自己免疫症候を示した（カッコ内は公知の自己抗原）：
【０２５４】
８１％でアジソン病（副腎２１ヒドロキシラーゼ；１７α−ヒドロキシラーゼ；側鎖切断酵素（ＳＣＣ）、７９％で随伴性副甲状腺機能低下症（副甲状腺、ＮＡＬＰ５（ＮＡＣＨＴロイシンリッチ反復タンパク質５）および４５％で甲状腺機能低下症（甲状腺ペルオキシダーゼ；チログロブリン）。後者の患者１５人のうち１２人は、副甲状腺機能低下症およびアジソン病も有していた。３０％で不妊症（男性１人および女性１０人で精巣／卵巣不全／萎縮症；１７α−ヒドロキシラーゼおよびＳＣＣ）、２４％で無脾症、１８％で下垂体／ＧＨ欠損症（ほとんどが男性；チューダードメイン含有タンパク質６（ＴＤＲＤ６）、１２％で真性糖尿病（膵臓ＧＡＤ６５；インスリン；チロシンホスファターゼＩＡ２）、１２％で悪性貧血（自己抗原として胃粘膜、内因子、胃壁細胞）、９％で自己免疫性肝炎（抗ＬＫＭ１＋しかし異なる抗原：シトクロムＰ４５０  １Ａ２、Ｐ４５０  ２Ａ６、Ｐ４５０  １Ａ１、Ｐ４５０  ２Ｂ６）および９％で腎炎（女性全員）が記録された。
【０２５５】
４２％で抜け毛（女性ではより少ない）、３３％で脱毛症（女性ではより少ない；自己抗原候補は、チロシンヒドロキシラーゼである）が起こった。１５％で白斑が存在した（抗メラノサイト；ＳＯＸ９；ＳＯＸ１０；ＡＡＤＣ）
【０２５６】
原因不明の臨床徴候：
ＡＰＥＣＥＤ患者はまた、その病態生理が依然として不明の外胚葉欠損症を有する。このようなものとして、歯ジストロフィ（７２％）および爪ジストロフィ（３３％）が本患者コホートに存在していた。６４％で眼感染症、７９％でドライアイ、および５５％で光過敏性が見られた。
【０２５７】
大部分が機能的および吸収不良である腸症候は、本ＡＰＥＣＥＤコホートでは一般的である。５６％で腹痛エピソード、３９％で下痢エピソード、３９％で便秘エピソードが報告され、１８％が腹痛＋下痢＋便秘を有していた。３３％で胸骨後面痛／高嚥下障害が報告された。
【０２５８】
腸細胞によるＩＬ−７発現は、インサイチュー（腸上皮内）におけるＴＣＲ−ガンマデルタ細胞の胸腺外発達、および粘膜リンパ組織の組織化に必須であるので（Ｌａｋｙ  ｅｔ  ａｌ，ＪＥＭ  ２０００）、患者の抗ＩＬ７自己抗体またはＥＴ−１変換酵素（ＥＣＥ１：）に対する自己抗体は、観察された腸症候に寄与している可能性がある。
【０２５９】
ＡＰＥＣＥＤ患者では見られない疾患（すなわち、これらの疾患に対する保護）
ＡＰＥＣＥＤ患者で固有に発生し、大部分が本研究で初めて同定された抗サイトカインおよび抗ケモカインおよび他の自己抗体（表２〜表１４を参照のこと）は、以下の疾患から患者を保護する可能性がある：
【０２６０】
本ＡＰＥＣＥＤ患者では見られない自己免疫性および自己炎症性の器官非特異的疾患：
エリテマトーデス；シェーグレン症候群；強皮症（局所型または全身型）；抗リン脂質症候群；多発性硬化症（ＭＳ）；関節リウマチ。フィンランドでは、ＲＡの全国的な有病率は０．８％である；乾癬。フィンランドでは、乾癬の全国的な有病率は２〜４％である；グルテン不耐症（セリアック病）。フィンランドでは、セリアック病の全国的な有病率は２％である；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；水疱性自己免疫性皮膚疾患（天疱瘡；類天疱瘡）；グッドパスチャー症候群；溶血性貧血；自己免疫性血小板減少症；後天性血友病；自己免疫性神経障害
【０２６１】
理論に縛られるものではないが、本明細書で同定されたようにＡＰＥＣＥＤ患者で自然に誘発され、上記疾患に対して保護的なヒト抗体について、以下のように予想するのが賢明である：
−抗インターフェロン抗体：エリテマトーデスに対して保護的。
−抗ＩＬ１７：乾癬および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）に対して保護的
−抗ＩＬ−５、ＩＬ−７（胸腺、皮膚、腸）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１：アトピー性疾患に対して保護的
−抗ＩＬ−１０抗体：（様々な種類の癌で）抗腫瘍免疫反応を増強するのに使用することができる
−抗ＩＬ−７抗体：ヒトＴ細胞急性リンパ性白血病に対して保護的
−抗ＩＬ−２８、ＩＬ−２９：特にＤＣで広く産生、抗ウイルスおよび細胞増殖抑制、上皮細胞および肝細胞を標的、ＴＬＲ２および３をアップレギュレート、ＴＬＲ−誘導性ＩＬ−１２
−抗ＣＣＬ−１７、ＣＣＬ−２２（好酸球、基底細胞、Ｔｈ−２によって発現）：喘息、ＲＡ、ＣＮＳ炎症に対して保護的。
−抗ＩＬ−１７Ａ／Ｆ、ＩＬ−２２、またＣＣＬ−２０および抗ＩＬ−３６：乾癬に対して保護的
【０２６２】
アレルギー性疾患
アレルギー性疾患の発生率はＡＰＥＣＥＤ患者で減少しているが、本発明者らは、このことが部分的には、ＡＰＥＣＥＤ患者で自然に誘発され、アレルギー性疾患の中心的な炎症媒介経路を標的とする自己抗体に起因すると提案する。フィンランドでは、一般集団における様々なアレルギー性疾患の有病率は、以下のとおりである：アトピー性湿疹：（ＡＥ）の有病率は子供では１５〜２０％であり、成人の２５〜３０％が一生涯のある時点でＡＥを経験している。一方、ＡＰＥＣＥＤ患者コホートでは、症例のわずか１２％でアトピー性発疹、１２％で鼻アレルギー、１５％で眼アレルギー、１０％で気道アレルギー／喘息、および６％で接触アレルギーが見られた。例えば、ＣＣＬ１７およびＣＣＬ２２はＡＥ（参照）でアップレギュレートしていることが公知であり、同様にＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１は喘息：ｉＢＡＬＴ（感染／慢性感染症）でアップレギュレートしていることが公知であるので、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１およびＣＣＬ２２に対する本発明にしたがって見出された自己抗体は、アレルギー徴候に対して保護的である。
【０２６３】
微生物感染症
上記自己免疫反応を有するＡＰＥＣＥＤ患者は、カンジダ酵母の粘膜異常増殖を除いて一般的な微生物感染症に対して抵抗性である。本患者コホートでは、２７％で蹄（爪）カンジダ感染症、５０％で爪感染症に関連する蹄ジストロフィ、６４％で口腔カンジダ症（確認済）、３０％で食道カンジダ症（ほとんどが口腔カンジダ症も有していた）、３６％で歯肉炎が示された。
【０２６４】
癌
ＡＰＥＣＥＤでは、癌は、口腔扁平上皮細胞癌を除いて稀である。本発明の基礎となる実験内で試験した患者コホートでは、患者の９％で口腔癌が見られた。ＣＲＬＦ３、ＣＣＬ７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２およびＣＣＬ１７に対する患者の自己抗体は、この関連では保護的であり得る。
【０２６５】
ＡＩＲＥ遺伝子の突然変異解析：
国際公開第９９／１５５５９号の第１２頁〜第１３頁の実施例２（この開示内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＡＩＲＥ（ＡＰＥＣＥＤ）遺伝子における各突然変異の遺伝子型決定を実施する。特に、突然変異分析のために、（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓにしたがって）ＡＰＥＣＥＤ患者、およびＡＰＥＣＥＤ保因者と疑われる者、および正常健常対照者由来の末梢血単核細胞から、ＤＮＡ試料を精製し、同定されたすべてのエクソンに対して特異的なプライマーを使用したＰＣＲに供する。
【０２６６】
突然変異エクソンを配列決定するために、以下の条件のＰＣＲによって、ＰＣＲ断片、エクソン６の６Ｆ／６Ｒおよびエクソン２の４９３００Ｆ／４９６２２Ｒを増幅する：それぞれ、９５℃で９分間、そして９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間および７２℃で３０秒間を３５サイクル、ならびに９４℃で３分間、そして９４℃で３０秒間、６０℃で３０  ２５秒間および６８℃で３０秒間を３５サイクル。特異的プライマーを使用して、ＰＣＲ産物を配列決定する：
６Ｆ：５’−ＴＧＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧＡＡＣＴＣＣＡ−３’（配列番号１）
６Ｒ：５’−ＡＧＡＡＡＡＡＧＡＧＣＴＧＴＡＣＣＣＴＧＴＧ−３’（配列番号２）
３Ｒ：５’−ＴＧＣＡＡＧＧＡＡＧＡＧＧＧＧＣＧＴＣＡＧＣ−３’（配列番号３）
４９３００Ｆ：５’−ＴＣＣＡＣＣＡＣＡＡＧＣＣＧＡＧＧＡＧＡＴ−３’（配列番号４）
および４９６２２Ｒ：５’−ＡＣＧＧＧＣＴＣＣＴＣＡＡＡＣＡＣＣＡＣＴ−３’（配列番号５）。
【０２６７】
国際公開第９９／１５５５９号の第１３頁５行目〜第１４頁１３行目の実施例３（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＡＩＲＥ遺伝子のエクソン２および６における突然変異を確認するために、各領域のＰＣＲ増幅産物の制限酵素分析を実施する。
【０２６８】
Ｐｒｏｔｏａｒｒａｙチップ：
血清活性試験用のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｐｒｏｔｏａｒｒａｙチップ：ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ（登録商標）Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｖ５．０  ｓｌｉｄｅｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をブロッキングし、次いで、ＰＢＳＴ緩衝液で希釈した各血清試料の１：５００希釈物でプローブした。次いで、アレイを穏やかに撹拌しながら４℃で９０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰＢＳＴ緩衝液でスライドを５回洗浄した。次いで、ＰＢＳＴ緩衝液で希釈したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を各アレイに追加し、穏やかに振盪しながら４℃で９０分間インキュベートした。インキュベーション後、二次抗体を除去し、上記のようにアレイを洗浄し、回転させることによって乾燥した。最後に、Ａｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ  ４０００Ｂ蛍光マイクロアレイスキャナを使用して、アレイをスキャンした。
【０２６９】
記憶Ｂ細胞の培養
フィコエリトリンコンジュゲートｍＡｂ抗ヒトＩｇＤ、ＡＰＣコンジュゲートｍＡｂ抗ヒトＩｇＭ、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ８およびＦＩＴＣコンジュゲートｍＡｂ抗ヒトＣＤ２２（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した一段階プロトコールによって、自己免疫性多腺性内分泌不全症症候群１型（ＡＰＳ１）とも称される自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィ（ＡＰＥＣＥＤ，ＯＭＩＭ  ２４０３００）を有するボランティアフィンランド人患者の末梢血由来のヒト末梢血単球細胞から、記憶Ｂ細胞を単離した。ＭｏＦｌｏ  ＸＤＰセルソータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、細胞選別を行った。次いで、（１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０を含有するＢ細胞培地で）ＣＤ２２陽性−およびＩｇＭ−、ＩｇＤ陰性Ｂ細胞を、Ｂ９５−８細胞から得られた上清を含有するＥＢＶと共に３〜５時間（好ましくは、３．５時間）インキュベートした。ボランティアドナーから調製した３０．０００個の照射フィーダＰＢＬ上で、ＣｐＧ２００６を補充したＩＭＤＭ培地に、１ウェルあたり細胞１０個で細胞を播種した。培養の８〜１４日後に、ＥＬＩＳＡによって、目的の抗原（例えば、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２）に特異的な抗体の存在について、記憶Ｂ細胞培養物の馴化培地をスクリーニングした。
【０２７０】
ＩＬ−１７、ＩＬ−２２のＥＬＩＳＡ
９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ，ＵＳＡ）を、ヒトＩＬ−１７ＡもしくはＩＬ−１７Ｆ（両方ともＢｉｏＬｅｇｅｎｄ製）、またはＩＬ−２２（ＩｍｍｕｎｏＴｏｏｌｓ）でコーティングした。ＰＢＳ−Ｔでプレートを洗浄し、２％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有するＰＢＳを用いて室温で１時間ブロッキングした。患者の血清、Ｂ細胞馴化培地、または組換え抗体調製物を室温で２時間インキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃ−γ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、目的の抗原に対するヒトＩｇＧの結合を決定し続いて、ＴＭＢ基質溶液（ＴＭＢ，Ｓｉｇｍａ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、ＨＲＰ活性を測定した。
【０２７１】
実施例１：ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者からのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離
完全ヒト抗体のクローニングのための出発物質として、自己免疫性多腺性内分泌不全症症候群１型（ＡＰＳ１）とも称される自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィ（ＡＰＥＣＥＤ，ＯＭＩＭ  ２４０３００）を有するボランティアフィンランド人患者２３人から得られたヒトリンパ球を使用した。フィンランドのＡＰＥＣＥＤおよびアジソン患者会を通じて供血のためにこれらのボランティアを募集した。患者全員から書面によるインフォームドコンセントを得て、Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  ｏｆ  ＨｅｌｓｉｎｋｉおよびＵｕｓｉｍａａ  ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｄｉｓｔｒｉｃｔによって研究が承認された。ＡＰＥＣＥＤは、２１番染色体（２１ｑ２２．３）に位置するＡＩＲＥ（自己免疫調節因子）遺伝子における突然変異によって引き起こされる常染色体劣性障害であり、ＡＰＥＣＥＤは、創始者効果によりフィンランドで流行している（１／２５，０００）。ＡＰＥＣＥＤ患者は、主に副腎不全および副甲状腺機能低下症を含む様々な内分泌免疫機能障害を示すが、様々な性腺機能低下症、真性糖尿病、甲状腺炎および下垂体炎も示す。他の主な症候は、慢性粘膜皮膚カンジダ症、脱毛症および白斑である（上記も参照のこと）。血清中の抗原特異的ＩｇＧレベルと、末梢血単核細胞の記憶プールにおける抗原特異的Ｂ細胞の頻度との間の強い相関関係が報告されているので（Ｂｅｒｎａｓｃｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．２００６）、最初に、（ＩＦＮ、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２のような）目的のタンパク質に対する自己抗体の存在について患者の血清をスクリーニングし、次いで、以下のように、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離するために、高力価（＞１：５０００）のＡＰＥＣＥＤ症例を選択した。ヘパリン添加末梢血を得て、２容量の１×ＰＢＳを用いて室温で希釈し、Ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ  Ｈ上に細胞をオーバーレイし、２０００ｒｐｍ（８０５ｒｃｆ）、室温で２０分間遠心分離した。間期に細胞を回収し、洗浄緩衝液フィル中で混合し、１，５００ｒｐｍ（４５３ｒｃｆ）、４℃で１５分間遠心分離し、１０ｍｌの洗浄緩衝液と共に穏やかにフリックすることによって再懸濁した。その後、１，０００ｒｐｍ（２０１ｒｃｆ）、４℃で細胞を１０分間遠心分離し、洗浄緩衝液でもう１回洗浄した。次いで、氷上で、細胞を適切な容量のＦＢＳに穏やかに再懸濁した。ＦＢＳを追加して容量を２０ｍｉｏ／ｍｌに調整した後、１容量の凍結培地（８０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃおよび２０％ＤＭＳＯ，＃１５４９３８，Ｓｉｇｍａ）を撹拌しながらゆっくりと追加し、再懸濁し、氷上に置いたクライオバイアルに分注した。クライオバイアルをＭｒ．Ｆｒｏｓｔｙボックス内に置き、−８０℃の冷凍庫に最大５日間移してから、実施例２に記載されているようにさらに処理した。あるいは、クライオバイアルを液体窒素中に保存した。
【０２７２】
実施例２：ＩＬ−１７またはＩＬ−２２に対して特異的なヒト抗体の分子クローニング
好ましくは、目的の抗体を産生する活性化記憶Ｂ細胞の短期オリゴクローナル培養物由来の単一細胞選別細胞から得られた免疫グロブリン遺伝子の分子クローニングによって、ＩＬ−１７またはＩＬ−２２に対して特異的な抗体を単離した。
【０２７３】
フィコエリトリンコンジュゲートｍＡｂ抗ヒトＩｇＤ、ＡＰＣコンジュゲートｍＡｂ抗ヒトＩｇＭ、ＣＤ３、ＣＤ５６、ＣＤ８およびＦＩＴＣコンジュゲートｍＡｂ抗ヒトＣＤ２２（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用した一段階プロトコールによって、ＡＰＥＣＥＤを有するボランティアフィンランド人患者の末梢血由来のＰＢＭＣから、記憶Ｂ細胞を単離した。ＭｏＦｌｏ  ＸＤＰセルソータ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、細胞選別を行った。（１０％ウシ胎児血清を補充したＲＰＭＩ１６４０を含有するＢ細胞培地で）ＣＤ２２陽性−およびＩｇＭ−、ＩｇＤ陰性Ｂ細胞を、Ｂ９５−８細胞から得られた上清を含有するＥＢＶで刺激した。ボランティアドナーから調製した３０．０００個の照射フィーダＰＢＭＣ上で、１ウェルあたり細胞１０個で、ＣｐＧ２００６を補充したＩＭＤＭ培地に細胞を播種した。刺激の１０〜１４日後に、目的の標的（例えば、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２）に対して特異的な抗体の存在について、培養物の上清をスクリーニングした。スクリーニング工程には、例えば、ＥＬＩＳＡによって、目的の特定の分子の断片、ペプチドまたは誘導体に対する結合についてスクリーニングすることが含まれていた。続いて、結合が検出された抗体または前記抗体を産生する細胞を単離する。
【０２７４】
ＩＬ−１７／ＩＬ−２２反応性記憶Ｂ細胞培養物から得られた単一細胞を、第１鎖緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬｕＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含有する９６ウェルＰＣＲプレートに置く。ランダムヘキサマープライマ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬｕＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、ｃＤＮＡを調製する。標準的なプロトコール（Ｗａｒｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１，２００３，１３７４−１３７７）にしたがって、免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域のＰＣＲ増幅を実施する。ネストＰＣＲ法を使用して、免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域を増幅する。ＩｇＧ定常領域に対して特異的なプライマーと、重鎖および軽鎖Ｉｇ可変領域ファミリーのすべてのシグナルペプチドに対して特異的なプライマーミックスとを用いて、第１ラウンドのＰＣＲを実施する（Ｗａｒｄｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１，２００３，１３７４−１３７７）。続いて、免疫グロブリンＪ領域ならびに重鎖および軽鎖Ｉｇ可変領域ファミリーのフレームワーク１の５’領域に対して特異的なプライマーミックスを使用して、ネストＰＣＲを実施する。選択されたＢ細胞培養物中に存在する個々の抗体クローンを同定するために、配列分析を行う。続いて、各抗体クローンのＩｇ可変重領域および軽領域を発現ベクタにクローニングして、ヒトＩｇＧ１の定常領域、ヒトＩｇ−カッパまたはヒトＩｇ−ラムダを得る。Ｉｇ重および軽発現ベクタをＨＥＫ２９３細胞にコトランスフェクトすると、抗体クローンが産生される。ＩＬ−１７／ＩＬ−２２−および対照ＥＬＩＳＡで組換え抗体クローンを再スクリーニングすることによって、親Ｂ細胞培養物のＩＬ−１７／ＩＬ−２２反応性に関与すると思われる抗体クローンの同定を実施する。
【０２７５】
プライマーがコードするＩｇ可変領域内の配列ミスマッチを同定および訂正するために、Ｉｇ重鎖および軽鎖定常領域の保存領域に対して特異的な２つのプライマー対を３’プライマーとして、ならびにＩｇシグナルペプチドに対して特異的なプライマーミックスを５’プライマーとして用いて、半ネストプロトコールを使用したさらなるＰＣＲ増幅を実施する。ＰＣＲ産物をＴＯＰＯ（商標）ベクタ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＬｕＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｌｕｃｅｒｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にクローニングする。完全Ｉｇ可変領域の配列決定を行い、この情報を使用して、オーセンティックなヒト抗体配列を抗体発現ベクタにクローニングするための特異的プライマーを設計する。このアプローチは、患者内で生じたＩｇ可変領域の完全抗体配列の同定を可能にする。この配列をこれらの抗体の組換え生産に使用し、次いで、これらの抗体をこの後の特性決定工程で使用する。
【０２７６】
実施例３：抗体の生産および精製
ポリエチレンイミントランスフェクション法（ＰＥＩ，Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）を使用して、抗体発現ベクタを２９３−Ｔヒト胎児腎臓細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）にトランスフェクトすることによって、ヒト抗体の一過性遺伝子発現を達成する。トランスフェクションの後、無血清培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ−Ｉ  Ｇｉｂｃｏを補充したＯＰＴＩ−ＭＥＭＩ）で細胞を培養する。培養の３〜６日後に上清を収集し、高速タンパク質液体クロマトグラフィ装置（ＦＰＬＣ）（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）でプロテインＡカラム（ＧＥ  ＨｅａｌｔｈＣａｒｅ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用してＩｇＧを精製する。
【０２７７】
実施例４：インビトロ細胞ベースの中和アッセイ
試験サイトカインに反応する（すなわち、必要な受容体を有する）細胞株で中和アッセイを行う。受容体へのリガンド結合は、対応するシグナル伝達経路、転写因子の核移行を活性化し、応答遺伝子の転写、翻訳および該当する場合には産物の分泌をアップレギュレートする。アッセイの感度を最大にするために、使用するサイトカイン濃度を、用量反応曲線の直線開始部分から選択する。抗体の中和能を試験するために、最適濃度の標的サイトカインを、系列希釈の血清、上清または精製抗体試料と共にプレインキュベートする。陽性対照と陰性対照との間の中間値を示す抗体の力価または濃度として、結果を表す。
【０２７８】
ＩＬ−２２中和アッセイ
９６ウェル組織培養プレート中、３７℃で、系列希釈の血清試料、培養上清または精製抗体を、０．５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２２と共にコインキュベートする。コインキュベーションの２時間後に、Ｃｏｌｏ２０５細胞株を、細胞３×１０４個／ウェルで、１０％熱不活性化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０に追加する。３７℃で１６〜２０時間インキュベートした後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによってＩＬ−１０産生について分析した。陽性対照と陰性対照との間の中間値をもたらす血清または上清力価または抗体濃度として、ＥＬＩＳＡ吸光度のグラフから結果を評価する。ＥＤ５０は、試験試料のサイトカイン活性を半減させるのに必要な濃度または力価と定義する。
【０２７９】
ＩＬ−１７Ａ中和アッセイ
１０％不活性化ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で、ＩＬ−１７−Ａ（２ｎｇ／ｍｌ）を系列希釈した血清、上清または抗体試料に予め２時間曝露したものに対して、細胞１×１０４個／ウェルで、１ＢＲ．３．Ｇヒト皮膚線維芽細胞を播種する。３７℃で１６〜２０時間インキュベートした後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって成長関連癌遺伝子（ＧＲＯ）−α産生について分析する。陽性対照と陰性対照との間の中間値をもたらす血清または上清力価または抗体濃度として、ＥＬＩＳＡ吸光度のグラフから結果を評価する。ＥＤ５０は、試験試料のサイトカイン活性を半減させるのに必要な濃度または力価と定義する。
【０２８０】
ＩＬ−１７Ｆ中和アッセイ
１０％不活性化ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で、ＮＣＴＣ２５４４ケラチノサイトをＴＮＦ−α（０．１ｎｇ／ｍｌ）で３時間前処理する。９６ウェル組織培養プレート中、３７℃で、系列希釈の血清試料、培養上清または精製抗体を、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１７Ｆと共にコインキュベートする。コインキュベーションの２時間後に、ケラチノサイトを、細胞１×１０４個／ウェルで追加する。３７℃で１６〜２０時間インキュベートした後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって成長関連癌遺伝子（ＧＲＯ）−α産生について分析する。陽性対照と陰性対照との間の中間値をもたらす血清または上清力価または抗体濃度として、ＥＬＩＳＡ吸光度のグラフから結果を評価する。ＥＤ５０は、試験試料のサイトカイン活性を半減させるのに必要な濃度または力価と定義する。
【０２８１】
ＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロ二量体中和アッセイ
１０％不活性化ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で、ＮＣＴＣ２５４４ケラチノサイトをＴＮＦ−α（０．１ｎｇ／ｍｌ）で３時間前処理する。９６ウェル組織培養プレート中、３７℃で、系列希釈の血清試料、培養上清または精製抗体を、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１７Ａ／ＩＬ−１７Ｆヘテロ二量体と共にコインキュベートする。コインキュベーションの２時間後に、ケラチノサイトを、細胞１×１０４個／ウェルで追加する。３７℃で１６〜２０時間インキュベートした後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡによって成長関連癌遺伝子（ＧＲＯ）−α産生について分析する。陽性対照と陰性対照との間の中間値をもたらす血清または上清力価または抗体濃度として、ＥＬＩＳＡ吸光度のグラフから結果を評価する。ＥＤ５０は、試験試料のサイトカイン活性を半減させるのに必要な濃度または力価と定義する。
【０２８２】
実施例５：主題抗体の検証
１．選択動物モデルにおけるイミキモド誘導性乾癬様皮膚炎のためのプロトコール
イミキモド誘導性乾癬様皮膚炎に対するＡＰＥＣＥＤ由来抗ＩＬ−１７、抗ＩＬ−２２自己抗体および他のＡＰＥＣＥＤ由来自己抗体の効果をアッセイするために、マウスモデルを使用した。処置の４８〜７２時間前に、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの背部を麻酔下で剃毛した。イミキモド適用の２４時間前または後に、抗ＩＬ−１７、抗ＩＬ−２２および他のＡＰＥＣＥＤ由来自己抗体をマウスに腹腔内注射し、２日間隔でさらに投与した。対照マウスには、ヒトＩｇ対照を注射した。１日局所用量６２．５ｍｇの市販ＩＭＱクリーム（５％）（Ａｌｄａｒａ；３Ｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を処置マウスに５日間連続で投与した。対照マウスをワセリンで処置した。臨床的な乾癬面積重症度指数（ＰＡＳＩ）に基づく客観的なスコアリングシステムを使用して、マウスを毎日スコア化した。０〜４の尺度（０、なし；１、軽度；２、中度；３、顕著；４、非常に顕著）で、紅斑、鱗屑および厚みを別々にスコア化した。脾臓を計量し、フローサイトメトリによる分析のためにリンパ節由来のＴ細胞を一晩刺激した。
【０２８３】
２．抗ＩＬ−７および抗ＩＦＮ抗体で同時処置したＡｉｒｅ欠損マウスにおけるＥＡＥ誘導
ＭＯＧ３５−５５ＣＦＡエマルジョン（ＭＯＧを発現する神経細胞の自己免疫破壊を誘導する免疫原性ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド断片；完全フロイントアジュバント）によるＥＡＥ（実験的アレルギー性脳脊髄炎）誘導に対する抗ＩＬ−１７、抗ＩＦＮおよび他のＡＰＥＣＥＤ患者由来自己抗体の潜在的保護効果を調査するために、Ａｉｒｅタンパク質をコードする能力が破壊された（これは、自己免疫を引き起こすと予測される）Ａｉｒｅ−／−マウスモデルを使用した。例えば、これに関して、１ｍｇのＭＯＧ３５−５５／ｍＬエマルジョンおよび２ｍｇの死菌マイコバクテリウム・ツベルクローシスＨ３７Ｒａ／ｍＬエマルジョンを含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）エマルジョンプレフィルシリンジを使用した。ＥＡＥ誘導開始の２４時間前に、抗体（例えば、抗ＩＬ−７および抗ＩＦＮ抗体）の腹腔内注射によって、Ａｉｒｅ−／−および野生型対照雌性マウスを前処置し、２日間隔でさらに投与した。対照マウスには、対照免疫グロブリンを注射した。初回抗体投与の２４時間後に、ストレスを最小限に抑えた（少なくとも７日間の馴化、静的ケージ、静かな環境）Ａｉｒｅ−／−および野生型対照雌性マウスに、ＭＯＧ３５−５５ＣＦＡエマルジョンを（上背部および下背部に）皮下注射して、ＥＡＥを引き起こした。２時間以内に、百日咳毒素を処置マウスに腹腔内注射してＥＡＥ誘導を増幅し、２２〜２６時間の時点で、百日咳毒素をさらに皮下投与した。ＥＡＥ表現型の重症度を０〜５の尺度でスコア化する標準的なＨｏｏｋｅ  Ｌａｂ臨床観察尺度を使用して、開始の７日後およびそれ以降に、ＥＡＥ誘導をスコア化した。スコア０の表現型は明らかな変化がないことを表し、後肢および前脚の完全麻痺を示すスコア５の表現型に及ぶ。
【０２８４】
３．マウスモデルでＥＡＥを誘導するためのプロトコール
ＭＯＧ３５−５５（ＭＯＧを発現する神経細胞の自己免疫破壊を引き起こす免疫原性ＭＯＧペプチド）ＣＦＡエマルジョンによるＥＡＥ誘導に対する抗ＩＬ−１７、抗ＩＬ−２２および他のＡＰＥＣＥＤ由来自己抗体の効果を調査するために、マウスモデルを使用した。ＥＡＥ誘導開始の２４時間前に、抗ＩＬ−１７、抗ＩＬ−２２抗体の腹腔内注射によって、Ａｉｒｅ−／−および野生型対照雌性マウスを前処置し、２日間隔でさらに投与した。対照マウスには、Ｉｇ対照を注射した。初回抗体投与の２４時間後に、ストレスを最小限に抑えた（少なくとも７日間の馴化、静的ケージ、静かな環境）Ａｉｒｅ−／−および野生型対照雌性マウスに、ＭＯＧ３５−５５ＣＦＡエマルジョンを（上背部および下背部に）皮下注射して、ＥＡＥを引き起こした。２時間以内に、百日咳毒素を処置マウスに腹腔内注射してＥＡＥ誘導を増幅し、２２〜２６時間の時点で、百日咳毒素をさらに皮下投与した。ＥＡＥ表現型の重症度を０〜５の尺度でスコア化する標準的なＨｏｏｋｅ  Ｌａｂ臨床観察尺度を使用して、開始の７日後およびそれ以降に、ＥＡＥ誘導をスコア化した。スコア０の表現型は明らかな変化がないことを表し、後肢および前脚の完全麻痺を示すスコア５の表現型に及ぶ。
【０２８５】
４．マウスモデルでコラーゲン誘導性関節炎を誘導するためのプロトコール
コラーゲン誘導性関節炎（ＣＩＡ）の誘導に対する抗ＩＬ−１７、抗ＩＬ−２２および他のＡＰＥＣＥＤ由来自己抗体の効果を調査するために、マウスモデルを使用した。ＣＩＡ誘導の２４時間前に、ＡＰＥＣＥＤ由来自己抗体の腹腔内注射によって、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを前処置し、２日間隔でさらに投与した（Ｉｇを対照として使用した）。ニワトリ胸骨の軟骨から抽出したニワトリＩＩ型コラーゲン（ＣＦＡで１：１調製したもの）の皮内注射（尾の基部に２回注射）によって、コラーゲン誘導性関節炎を引き起こした。誘導の１４日後に、追加免疫用（ｆｕｒｔｈｅｒ  ｂｏｏｓｔ）のニワトリＩＩ型コラーゲン１：１  ＩＦＡを皮内注射した。マウスをモニタリングし、一次免疫の２週間後から関節炎について毎日スコア化し（典型的な関節炎の発症は、免疫の３〜６週間後に起こる）、臨床モニタリング（キャリパーを使用して腫れている後脚をスコア化）、抗コラーゲン抗体の測定（コラーゲンをコーティングしたプレートを使用したＥＬＩＳＡ）、Ｔ細胞反応（［３Ｈ］チミジンの取り込みを使用して測定した場合のニワトリコラーゲンに対するＴ細胞増殖）、またはサイトカインＥＬＩＳＡのいずれかによってスコア化した。
【０２８６】
５．マウスモデルでＤＳＳ大腸炎を誘導するためのプロトコール
ＤＳＳ大腸炎の誘導に対する抗ＩＬ−１７、抗ＩＬ−２２および他のＡＰＥＣＥＤ由来自己抗体の効果をアッセイするために、マウスモデルを使用した。ＤＳＳ大腸炎誘導の２４時間前に、ＡＰＥＣＥＤ由来自己抗体の腹腔内注射によって、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを前処置し、２日間隔でさらに投与した（Ｉｇを対照として使用した）。２％ＤＳＳを含有する飲料水を５日間、続いてＤＳＳを含まない加熱滅菌飲料水を１４日間のサイクルを３サイクル反復することによって、慢性ＤＳＳ大腸炎を誘導した。対照マウスには、加熱滅菌飲料水のみを投与した。組織学的評価（パラフィン切片上でのヘマトキシリンおよびエオシン染色）、全層器官培養（サイトカイン分析のために２４時間の時点で上清を収集）、またはｑＰＣＲもしくはイムノブロッティングのための直接的な組織サンプリングによって、ＤＳＳ誘導性大腸炎の誘導および重症度を測定した。また、大腸炎は消耗性疾患に強く関連しているので、体重減少の程度を決定するために、ＤＳＳ誘導性大腸炎に供したマウスを毎日計量した。
【０２８７】
例えば、Ｓａｇｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ３（２０１１）：８３ｒａ４２によって記載されているように、ヒト組織を移植した免疫不全マウス系統における炎症に対するこのような抗体（例えば、抗ＩＬ−１７Ｆおよび抗ＩＬ−２２）の効果によって、サイトカインまたは他の関連分子に対するヒト由来抗体の有効性も評価する。
【０２８８】
実施例６：イミキモド誘導性乾癬様皮膚炎の結果
イミキモドで局所処置して乾癬様皮膚炎を誘導したマウスでは（実験のタイムラインおよび処置スキームについては、図１６を参照のこと）、ＡＰＥＣＥＤ由来３０Ｇ１抗ＩＬ−２２［ＨＤ−ＭＡＢ］抗体は、乾癬面積重症度指数（ＰＡＳＩ）のスコアを対照ＩｇＧ抗体と比べて有意に減少させる。０〜４の尺度（０、なし；１、軽度；２、中度；３、顕著；４、非常に顕著）で、紅斑（発赤）、鱗屑および厚み（硬度）を別々にスコア化した。図１７、１８、２０〜２２に見られるように、紅斑（発赤）、鱗屑および皮膚厚み（硬度）のＰＡＳＩスコアによって測定した場合、イミキモド処置は、対照抗体で処置したマウスと比べて、乾癬様皮膚炎を誘導する。例示的な３０Ｇ１抗体などの本発明の抗ＩＬ−２２  ＨＤＭＡＢで処置したマウスは、対照ＩｇＧで処置したマウスと比較して、測定の累計スコアおよび個々のスコアの両方について減少を示した（実線で示されているデータ（ＩｇＧ＋ＩＭＱ）と、点線で示されているデータ（ａＩＬ２２＋ＩＭＱ）とを比較（図１７、１８、２０）。背部の皮膚は、ＩｇＧ＋ＩＭＱで処置した動物の病変および赤い皮膚領域（スポット）の拡大を示す（図２０〜２１（Ｂ））。３０Ｇ１抗ＩＬ−２２およびＩＭＱで処置した動物の背部では、このような病変の拡大が存在しないかまたはより小さい（図２０〜２１（Ｃ））。ＩｇＧ＋ＩＭＱの各値とａＩＬ２２＋ＩＭＱの各値との対比（以下の表１８および１９）。さらに、リンパ節由来のＴ細胞のフローサイトメトリ分析により、抗ＩＬ−２２  ＨＤＭＡＢ処置マウスでは、エフェクタの活性化状態が、対照ＩｇＧで処置したマウスと比較して減少していることが示された。
【０２８９】
イミキモド処置の５日後に、対照ヒトＩｇＧで処置したマウスは、発赤＝３．７５（スコア０〜４）、硬度＝３および鱗屑＝２．２５の平均臨床スコアを示したが、ＩＭＱおよび抗ＩＬ−２２  ３０Ｇ１抗体で処置したマウスは、発赤＝１．７５、硬度＝１．７５および鱗屑＝２のスコアを有していた（以下の表１８および１９を参照のこと）。これらは有意差であると思われる。ＩｇＧ＋ＩＭＱで処置したマウスはまた、抗ＩＬ−２２＋ＩＭＱで処置したマウスと比較して増加した皮膚厚みを示した。
【０２９０】
【表１８】
2015505244.tif 000019
【０２９１】
【表１９】
2015505244.tif 000020
【０２９２】
ＩｇＧおよび抗ＩＬ−２２（３０Ｇ１）の両方で処置したマウスは、時間経過の２日目までに発熱症候、および５日目に脾臓サイズの増加を示した（図２７を参照のこと）。しかしながら、１日目において、抗ＩＬ−２２で処置したマウスにおける発熱症候は、対照ヒトＩｇＧで処置したマウスよりもはるかに少なかった。このデータは、例えば、抗体３０Ｇ１に関して示されているように、本発明の抗ＩＬ−２２抗体が、Ｃ５７．ＢＬ／６マウスにおけるイミキモド誘導性乾癬状病変の臨床症候の重症度を軽減することを示している。
【０２９３】
抗ＩＬ−２２  ３０Ｇ１抗体による処置が処置マウスで治療効果を示したことは、ヒト抗原に加えてマウスに対するこの抗体の交差反応性を示すが、例示的なヒト特異的抗ＩＬ−１７抗体２４Ｄ３を用いて同様に実施した実験では、イミキモド誘導性乾癬病変に対して効果がなく、このことは、ヒト抗原に対する２４Ｄ３抗体の特異性を立証している。
【０２９４】
さらに、本発明の抗ＩＬ−２２抗体の治療有効可能性を調査するために、イミキモド誘導の前後両方に抗体を投与したイミキモド誘導性乾癬アッセイで、および誘導後のみの第２の実験で、例示的な抗体３０Ｇ１を試験した（実験のタイムラインおよび処置スキームについては、図３３を参照のこと）。
【０２９５】
ＩＭＱ処置の前後いずれかに投与した場合、ＡＰＥＣＥＤ由来３０Ｇ１抗ＩＬ−２２抗体は、乾癬面積重症度指数（ＰＡＳＩ）スコアを、対照ＩｇＧ抗体と比べて有意に減少させる。例示的な３０Ｇ１抗体などの本発明の抗ＩＬ−２２  ＨＤＭＡＢで処置したマウスは、予防的処置および治療的処置のいずれの状況においても、対照ＩｇＧで処置したマウスと比較して、対照ＩｇＧ抗体と比べて、皮膚厚みスコアの指標である皮膚厚みの減少を示した；予防的処置については図３８Ａ（前）、およびＩＭＱ誘導の２４時間後の治療的処置については図３８Ｂに示されている皮膚厚みの測定結果を参照のこと。動物の数を増加させた第２の実験で、治療効果をさらに検証した（実験のタイムラインおよび処置スキームについては、図３５を参照のこと）。例示的な３０Ｇ１抗体などの本発明の抗ＩＬ−２２  ＨＤＭＡＢで処置したマウスは、対照ＩｇＧで処置したマウスと比較して、測定の累計スコアおよび個々のスコアの両方について減少を示した（図３６および３７を参照のこと）。また、ＩＭＱ誘導性乾癬におけるその用量依存性の観点から、マウス交差反応性の例示的な抗ＩＬ−２２抗体３０Ｇ１の治療効果を試験した。３つの異なる用量、２００μｇ、２０μｇおよび２μｇをＩＭＱ誘導後に投与し、プラークの皮膚紅斑および硬度を上記のように評価した。図３８に見られるように、例示的な抗ＩＬ−２２抗体３０Ｇ１による処置は、個々のスコアおよび累計スコアが用量依存的である傾向を示しており、初期用量の１／１００に減らして滴定すると有効性が低くなることを証明している。
【０２９６】
その後、表皮厚み測定のために、光干渉断層撮影（ＯＣＴ：）イメージング（Ｍｏｒｓｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．３０２（２０１０），１０５−１１１；Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｏｐｔ．１６（２０１１），０４０５０３．）などのさらなるスクリーニングを実施し、動物の皮膚からＲＮＡを単離し、例えば、組織炎症反応の疾患特異的パターンを同定するために、この試料の遺伝子発現を分析する。さらに、乾癬性皮膚ＤＣ（樹状細胞）または末梢血単核細胞集団などの異なる細胞型を分類および／または表現型特性決定するために、動物から単離された皮膚単一細胞懸濁液、全血または血清で、ＦＡＣＳ解析を実施する。
【０２９７】
実施例７：ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１の患者で同定した血清活性のデータ分析
ＡＰＥＣＥＤ／ＡＰＳ１患者２３人において、患者らの血清をＰｒｏｔｏａｒｒａｙチップ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にアプライした後に、以下の表２〜１３の血清反応性を同定した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎが提供する血清反応性のデータ（ｅｘｃｅｌ表計算シート）を、以下の分析の基準として用いた。
【０２９８】
各タンパク質スポットの生データを、各カットオフ（バックグラウンド）値に対して再計算した。この結果を、バックグラウンドと比較した「倍差」と称する。
フィルタ＃１：次いで、バックグラウンドよりも５倍超の値のみを選択することによって、倍差をフィルタリングした。
フィルタ＃２：次いで、タンパク質が（ａ）分泌型、（ｂ）膜結合型または（ｃ）細胞質型であるかに基づいて、５倍超の血清反応性のリストを再検討した。
【０２９９】
いくつかの例外を除いて、さらなる分析から細胞質タンパク質を除外した。
【０３００】
次いで、フィルタ１および２の後に残った３７２の血清反応性（表２〜１３）を、公知または推定病態生理学的機能にしたがって分析した。得られたリストは本明細書に示されており、表１に含まれている病態生理学的兆候に関与する分子一般から構成されている。
【０３０１】
【表１】
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【０３０２】
【表２−１】
2015505244.tif 000022
【表２−２】
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【表２−３】
2015505244.tif 000024
【０３０３】
【表３】
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【０３０４】
【表４】
2015505244.tif 000026
【０３０５】
【表５】
2015505244.tif 000027
【０３０６】
【表６−１】
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【表６−２】
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【０３０７】
【表７】
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【０３０８】
【表８】
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【０３０９】
【表９】
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【０３１０】
【表１０】
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【０３１１】
【表１１】
2015505244.tif 000034
【０３１２】
【表１２】
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【０３１３】
【表１３】
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【０３１４】
【表２４−１】
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【表２４−２】
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【表２４−３】
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【０３１５】
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【０３１６】
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
2015505244.tif 000045
【表１５−５】
2015505244.tif 000046
【表１５−６】
2015505244.tif 000047
【表１５−７】
2015505244.tif 000048
【表１５−８】
2015505244.tif 000049
【表１５−９】
2015505244.tif 000050
【表１５−１０】
2015505244.tif 000051
【表１５−１１】
2015505244.tif 000052
【表１５−１２】
2015505244.tif 000053
【表１５−１３】
2015505244.tif 000054
【０３１７】
実施例８：ＥＬＩＳＡによる患者の血清中のサイトカイン特異的抗体の検出
自己免疫性多腺性内分泌不全症症候群１型（ＡＰＳ１）とも称される遺伝的症状ＡＰＥＣＥＤ（自己免疫性多腺性内分泌不全症・カンジダ症・外胚葉ジストロフィ）を患っている患者の血清中の様々なサイトカイン特異的抗体の存在および相対濃度を試験するために、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）を使用した。全体で、ＡＰＳ１−１〜ＡＰＳ１−２３のコードによって示されている患者２３人由来の血清をアッセイで使用した。患者と年齢がマッチしている健康な研究所員から対照血清８種を入手し、Ｃ１〜Ｃ８のコードを付けた。加えて、ＡＰＳ１−２４〜ＡＰＳ１−３３のコードによって示されているさらなる患者１０人の血清もアッセイで使用した。
【０３１８】
機器
ＥＩＡ／ＲＩＡ  ＰＬＡＴＥ（酵素−／ラジオイムノアッセイ）、９６ウェルハーフエリアプレート、高結合フラットボトム（Ｃｏｓｔａｒ  ｃａｔ．３６９０）；デジタルマルチチャンネルピペット５０〜１２００μｌ（Ｂｉｏｈｉｔ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）；デジタルマルチチャンネルピペット１０〜２５０μｌ（Ｂｉｏｈｉｔ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）；オービタルシェーカーＥｌｉｓａリーダ（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＦＣ）。
【０３１９】
試薬：
ペルオキシダーゼコンジュゲートヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｃａｔ．１０９−０３５−０９８）；コーティング緩衝液（炭酸−重炭酸緩衝液、Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ．Ｃ３０４１−５０ＣＡＰ）；洗浄緩衝液（ｔｗｅｅｎ  ２０を含むリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７，４  Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ．Ｐ−３５６３）；ＢＳＡ、ウシ血清由来アルブミン（Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ．Ａ７０３０−５０Ｇ）；ブロッキング緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水中、２％ＢＳＡ、ｐＨ７，４）；希釈緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水中、０，５％ＢＳＡ、ｐＨ７，４）；１−ｓｔｅｐ  ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  ｃａｔ．３４０２８）；ＴＭＰ基質用の停止試薬（Ｓｉｇｍａ  ｃａｔ．Ｓ５８１４）；２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４
【０３２０】
試験抗原
組換えサイトカイン、リンホカイン、ケモカインおよび他の抗原は、商業的供給源から入手した（表１４を参照のこと）。
【０３２１】
手順
−コーティング緩衝液中、０．７５、１．０または２．０μｇ／ｍｌの濃度で試験抗原溶液を調製する
−３０μｌの抗原溶液を９６ウェルＣｏｓｔａｒ  ＥＩＳ／ＲＩＡプレートの各ウェルに追加し、＋４℃で一晩（１６時間）インキュベートする。
−抗原溶液を除去し、１５０μｌ／ウェルの洗浄緩衝液でプレートを３回洗浄する。
−１００μｌ／ウェルの２％ＢＳＡ／ＰＢＳブロッキング緩衝液を追加し、１５０ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間インキュベートする。
−ブロッキング緩衝液を除去する。
−３０μｌ／ウェルの患者血清を追加し、１５０ｒｐｍで混合することによってプレートを室温で２時間インキュベートする。
−血清希釈溶液を除去し、１５０μｌ／ウェルの洗浄緩衝液でプレートを４回洗浄する。
−０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液で１：５００００希釈した３０μｌ／ウェルのヤギ抗ヒト−ＨＲＰ二次抗体を追加し、１５０ｒｐｍで振盪することによって室温で１時間インキュベートする。
−溶液から二次抗体を除去し、１５０μｌ／ウェルの洗浄緩衝液でプレートを４回洗浄する。
−３０μｌ／ウェルの室温ＴＭＢ溶液を追加し、室温で１５分間インキュベートする。
−３０μｌ／ウェルの停止溶液または２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液を追加することによって発色を停止し、ＥＬＩＳＡリーダで吸光度４５０ｎｍを読む。
【０３２２】
抗体力価
抗体価は、同じ希釈の対照血清が示すＯＤの３倍以上のＯＤ（光学密度）値を示す最高希釈（最低濃度）の試験血清と定義する。これまでに、表１４に示されている患者の試験血清は、各指示標的に対する免疫反応性を示している。
【０３２３】
実施例９：自己抗原タンパク質種の存在に関する統計異常の分析
本発明者の実験で提供されたＰｒｏｔｏａｒｒａｙデータの分析により、ＡＰＥＣＥＤ患者で見られる抗体によって認識されるタンパク質の細胞局在（図３２を参照のこと）は、均一に分布していないことが示された。加えて、様々な経路に関係するタンパク質も均一に発現しておらず、特定の経路で過剰発現していることが見出された（上記表１および以下の表２０も参照のこと）。
【０３２４】
【表２０】
2015505244.tif 000055
【０３２５】
さらなる分析のために、ＡＰＥＣＥＤ関連の自己抗原における特定の構造モチーフの存在を評価した。コイルドコイル構造は、２〜７本のａ−ヘリックスが共にらせん状になっている構造的なモチーフであり、最も一般的には二量体および三量体である。それは、ヘプタッド反復ＨｘｘＨＣｘＣ（Ｈ−疎水性；Ｃ−荷電アミノ酸（ａａ））の反復パターンを含有する。例示的なコイルドコイルドメイン含有タンパク質の染色体局在を表２４に示す。
【０３２６】
コイルドコイル含有タンパク質の存在に関して、本発明の実験で得られたデータを以下のように分析した。フィンランド人ＡＰＥＣＥＤ患者２３人および健常対照者７人由来の血清のＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｐｒｏｔｏａｒｒａｙの結果の蛍光シグナルを使用した。（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎが示しているように）反応性をＰ値にしたがってリスト化した。少なくとも１種のＡＰＥＣＥＤ患者血清によって認識される推定抗原であって、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎが提供している）カットオフ値よりも少なくとも１０倍高いシグナル値を有するものを含めた（全体では１７９７種のタンパク質）。このリストから、重複（いくつかのタンパク質はアレイ上で二重または三重に重複していた）を排除してＳｗｉｓｓｐｒｏｔアクセッション番号を有していたもののみを含め、１型ＩＦＮおよびＩＬ−２２を非定型自己抗原として除外した。ＧｅｎｅＴｒａｉｌプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｔｒａｉｌ．ｂｉｏｉｎｆ．ｕｎｉ−ｓｂ．ｄｅ／−［４９、５１］を初期設定で用いて、コイルドコイルタンパク質分析を行った。ＧｅｎｅＴｒａｉｌプログラムにより、固有のヒトタンパク質１５１７種をアノテーションする（これらのタンパク質とのマッチを見出す）ことができた。上位１５００種のリストからは１６．７％が、および上位２５０種のリストからは２４．４％がコイルドコイル構造を含有していた。本発明のｐｒｏｔｅｏａｒｒａｙアッセイで試験したＡＰＥＣＥＤ患者の血清によって認識される例示的なコイルドコイルタンパク質の上位６０種のリストを以下の表２１に示し、例示的なＣＣＤＣ４０（コイルドコイルドメイン含有４０）およびＮＡＰ１Ｌ１（ヌクレオソームアセンブリタンパク質１様１）タンパク質に対する免疫反応性を図３１に示す（Ｂ列、上および中央のチャート）。
【０３２７】
【表２１−１】
2015505244.tif 000056
【表２１−２】
2015505244.tif 000057
【０３２８】
比較では、固有のおよびＳｗｉｓｓＰｒｏｔでアノテーションされているＰｒｏｔｏａｒｒａｙタンパク質すべてを並行して分析した；これら（固有のおよびＳｗｉｓｓｐｒｏｔでアノテーションされている７０１０種）のうち、１２．５％のタンパク質がコイルドコイル構造を含有していた（以下の表２２を参照のこと）。
【０３２９】
【表２２】
2015505244.tif 000058
【０３３０】
理論によって縛れるものではないが、ＡＰＥＣＥＤ血清によって認識されるタンパク質のリストには、コイルドコイル構造を有するタンパク質が、健常ボランティアにおける分布を表すＰｒｏｔｏａｒｒａｙ上のすべてのタンパク質のリストよりも多く含まれると結論付けることができる。比較では、すべてのヒトゲノムタンパク質（２３２５３種のタンパク質のうち約１１．４％）がコイルドコイル構造を含むとすると、すべてのＰｒｏｔｏａｒｒａｙタンパク質（１２．５％）のリストに近似する。このデータは、自己抗原タンパク質が、ランダムに予想されるよりも多くの頻度でコイルドコイル構造を含有するという、自己抗原におけるコイルドコイル構造の過剰発現に関する先の推論（Ｐｌｏｔｚ  ＰＨ．「Ｔｈｅ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ：ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｆｏｒ  ｏｒｄｅｒ．」Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３（２００３），７３−７８を参照のこと）を立証および拡大するものである。
【０３３１】
実施例１０：ＡＰＥＣＥＤにおけるサイトカインを中和する主要Ｉｇサブクラスの同定
実施例１０および１１に記載されている実験については、特に指示されていないかまたは追加で拡大されていない場合には、上記実施例に記載されている対応する方法に加えてまたはこれに代えて、以下の材料および方法を使用するかまたはこれらを使用した。実質的に同じ方法を使用したが、これは、Ｋａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２）；ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃｅｉ．１２０２４（この開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）によって、ＡＰＥＣＥＤ患者と比較するためのａｉｒｅ欠損マウスにおける抗サイトカイン自己抗体の調査について詳細に記載されている。
【０３３２】
患者および対照者
上記に定義された中枢性および／もしくは末梢性寛容の異常または自己寛容の喪失に罹患している患者（例えば、ＡＰＥＣＥＤ、ＡＰＳ２またはＩＰＥＸ患者）由来のならびに適合健常対照者由来の血清を平行して採取し、使用まで−２０℃、−８０℃または液体窒素中で保存する。上記実施例に記載されているように、患者および対照者の血清から免疫グロブリンを単離する。対応する遺伝子の突然変異分析および所定の疾患に関連することが公知の自己抗体の存在によって、遺伝性疾患の診断を確認する（例えば、ＡＩＲＥ遺伝子の変異分析およびこの疾患に関連する特定のタンパク質（例えば、表３２または３３に定義されているタンパク質）に対する自己抗体の存在によって、ＡＰＥＣＥＤを確認する）。好ましくは、高頻度に見られる自己抗体の存在をマーカとして使用する（例えば、ＡＰＥＣＥＤの場合には、ＩＦＮ−ωに対する自己抗体の存在を試験する）。
【０３３３】
免疫グロブリンの精製
プロテインＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）を使用した高速タンパク質液体クロマトグラフィを用いて全ＩｇＧ画分を分離し、ｉＣｏｎ（商標）濃縮器７ｍｌ／２０Ｋチューブ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）を用いて濃縮してＰＢＳに緩衝液交換する。アガロース結合ジャカリンレクチン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して全ＩｇＡを分離し、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ透析膜（分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）１２〜１４０００）（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して１×ＰＢＳに対して透析する。ウシγグロブリンを標準として使用するＢｒａｄｆｏｒｄ法に基づくＢｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって、タンパク質濃度を測定する。
【０３３４】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって、単離したＩｇＧおよびＩｇＡの純度を評価する。特異的Ａｂを用いて、ＩｇＨバンドの同一性を確認する。Ｃｏｂａｓ  Ｉｎｔｅｇｒａ  ４００  Ｐｌｕｓ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いた免疫比濁法によって、単離したＩｇＡ調製物中のＩｇＧの混入を検出する。
【０３３５】
ウエスタンブロット
ウエスタンブロットによって、患者または対照者の血清中の目的のタンパク質に対する自己抗体の存在を試験するために、ヒトＩＦＮ−α２について例示的に記載されている以下の実験手順を使用する。還元試料緩衝液（３％ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．１Ｍ  ＤＴＴ、０．０２％ブロモフェノールブルおよび６．２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８）中で、ヒトＩＦＮ−α２（ＰＢＬ  ＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎＳｏｕｒｃｅ）を５分間煮沸し、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ってＰＶＤＦフィルタ上にブロットした。ブロッキング後、フィルタのストリップを、患者もしくは対照者の血清（１：１００）またはマウス抗ＩＦＮ−α２ｂ抗体（１：１０００，Ａｂｃａｍ）と共にインキュベートし、続いて、二次抗体（抗ヒトＨＲＰ  １：１００，０００および抗マウスＨＲＰ  １：３０，０００，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ）と共にインキュベートする。製造業者のプロトコール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して増強化学発光（ＥＣＬ）によって、反応を可視化する。
【０３３６】
細胞ベースのサイトカイン中和アッセイ
以前に記載されているように［１３］、抗ウイルス中和アッセイ（ＡＶＩＮＡ）を行う。簡潔に言えば、系列希釈のＩｇＧまたはＩｇＡ試料（１２．５μｇ／ｍｌから開始）と共に２時間プレインキュベートした目的の免疫調節サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−α２ａ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ）またはＩＦＮ−ω（Ｂｅｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ））の希釈調製物（１０研究室単位／ｍｌ）と共に、ヒト神経膠芽腫細胞株２Ｄ９をプレインキュベートする。次いで、脳心筋炎ウイルスで細胞を２４時間負荷してから０．０５％アミドブラックで染色し、酢酸緩衝液中、４％ホルムアルデヒドで固定し、０．１５ｍｌの０．０５Ｍ水酸化ナトリウム水溶液で洗浄してから、吸光度を６２０ｎｍで読む。
【０３３７】
ヒトＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２２中和アッセイ
以前に記載されているように［１９］、アッセイを行う。簡潔に言えば、ＩＬ−１７Ａの場合、ＩＬ−１７Ａ（２ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）を系列希釈のＩｇＧまたはＩｇＡと共に２時間プレインキュベートしたものに、ＨＦＢ４ヒト包皮線維芽細胞（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ，ＵＳＡ）を細胞１×１０４個／ウェルで播種する。ＩＬ−１７Ｆの場合、０．１ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）と共にプレインキュベートしたＮＣＴＣ２５４４ケラチノサイト（Ｉｎｔｅｒｌａｂ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｇｅｎｏｖａ，Ｉｔａｌｙ）をＨＦＢ４の代わりに使用する。３７℃で１６〜２０時間インキュベートした後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）によってＣＸＣＬ１についてアッセイする。ヒトＩＬ−２２の場合、細胞株Ｃｏｌｏ２０５を使用する。ＩＬ−２２（２ｎｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を系列希釈の患者血清またはＩｇＧまたはＩｇＡと共に２時間プレインキュベートしたものに、細胞を細胞３×１０４個／ウェルで播種する。３７℃で２４〜３０時間インキュベートした後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）によってＩＬ−１０について分析する。ＥＤ５０値（試験試料のサイトカイン活性を半減させるのに必要なＩｇ濃度）として、すべてのサイトカイン中和アッセイの結果をＥＬＩＳＡ吸光度のグラフから評価し、タンパク質１μｇあたりのサイトカイン中和単位（ＮＵ）としてグラフで表す。
【０３３８】
目的の全長または短縮組換えタンパク質に融合したルシフェラーゼ（ＬＵＣ）をコードする構築物（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）
２つの例示的なサイトカインについて以下に記載されているように、目的の全長または短縮組換えタンパク質に融合したルシフェラーゼ（ＬＵＣ）をコードする構築物を作製することができる。使用したすべての全長および短縮ヒトＩＦＮ−α２ａおよびＩＬ−２２タンパク質ならびにプライマー配列の概要を以下の表２３に示す。
【０３３９】
シグナル配列を用いないポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ヒトＩＦＮ−α２ａおよびＩＬ−２２をコードする配列を増幅した。Ｔ４リガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、ｐＰＫ−ＣＭＶ−Ｆ４（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｅｒｍａｎｙ）哺乳動物発現ベクタのＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩ部位に、ＰＣＲ産物をライゲーションした。従来の方法を使用して、正しいインサート（ＤＮＡの配列決定によって確認）を含むすべてのプラスミドを大腸菌ＮＯＶＡ  ＸＧ細胞で増殖させ、増幅し、抽出し、精製した。最後に、ＨＥＫ２９３細胞をこのプラスミドでトランスフェクトした；４８時間後、１×受動溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を使用して、粗タンパク質抽出物を調製した。
【０３４０】
【表２３−１】
2015505244.tif 000059
【表２３−２】
2015505244.tif 000060
【０３４１】
ルシフェラーゼ免疫沈降システム（ＬＩＰＳ）アッセイ
Ｂｕｒｂｅｌｏらにしたがって、９６ウェルマルチスクリーンフィルタＨＴＳプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）中、室温で、すべての希釈に緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を使用して［３０］、ＬＩＰＳアッセイを行った。試験血清由来のＩｇ（１：２５希釈、２つ平行して試験）をプロテインＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗビーズ（２５μｌの４％懸濁液；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に捕捉し、次いでこれを、発現サイトカインまたはそれらの断片を含む抽出物と共にインキュベートした。例えば、上記のように作製したＩＬ−２２、ＩＦＮ−α２ａなどのサイトカインまたはそれらの断片（１０５発光単位（ＬＵ）を使用した。１時間後、洗浄し、ルシフェラーゼ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）と共にインキュベートし、１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ＴｒｉＬｕｘ液体シンチレーションカウンタおよび照度計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で発光強度を測定した。自己抗体のサブタイプを検出するために、ビーズ（１μｌのストレプトアビジンアガロース樹脂、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ビオチンコンジュゲートヒトサブタイプ特異的Ａｂ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、現在はＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ（現在はＢｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙの一部）の抗ＩｇＧ１、抗ＩｇＧ２、抗ＩｇＧ４、抗ＩｇＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＵＳＡの抗ＩｇＧ３）と共にインキュベートする。同時に、ＡＰＥＣＥＤまたは対照者の血清（１：２５）を、抗原調製物（１０５ＬＵのルシフェラーゼ結合ＩＬ−２２またはＩＦＮ−α２ａ）と共にインキュベートした。最後に、免疫複合体をコーティングビーズ上に捕捉してから、上記のようにＬＵを読んだ。あるいはまたは加えて、抗ヒトＩｇＡアガロース（Ｓｉｇｍａ）を捕捉に使用してから、ＬＵを読む。
【０３４２】
ＥＬＩＳＡ
以前に記載されているように［１３］、ヒト画分／抗体について実施例１の前に記載されているのと同様に、マウス由来の精製画分中のＩ型ＩＦＮ特異的ＩｇＧを検出するための結合ＥＬＩＳＡを行う。ＩｇＧ調製物を２５μｇ／ｍｌで試験する。好ましくは、１〜２μｇタンパク質／ｍｌ（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）の無担体組換えマウスＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦまたはＩＬ−２２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて、マイクロタイターウェルを４℃で一晩コーティングする。ブロッキング後、１：１０希釈したマウス血清を４℃で一晩インキュベートしてから洗浄し、抗マウスＩｇＧ［γ鎖特異的］−アルカリホスファターゼコンジュゲート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）または抗マウスＩｇＧサブクラス特異的（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３）ビオチン化抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）のいずれか、続いて、ストレプトアビジンコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼおよび適切な酵素基質を用いて現像し、ＯＤを読む。対照群（野生型（ｗｔ）およびヘテロ接合体マウス）の平均を２標準偏差以上上回る任意の値を陽性であるとみなす。
【０３４３】
統計分析
スピアマン相関係数を計算するために、ＧｒａｐｈＰａｄ  ソフトウェア（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を使用する。群間の中央値を比較するために、マン・ホイットニーまたはクラスカル・ワリス検定を使用する。Ｐ＜０．０１を統計学的に有意とみなした。
【０３４４】
中枢性および／もしくは末梢性寛容の異常または自己寛容の喪失に罹患している患者におけるサイトカインを中和する主要サブクラスの同定
最初に、罹患（例えば、ＡＰＥＣＥＤ）患者におけるサイトカインを中和する主要Ｉｇサブクラスを同定するために、患者および対照者の血清由来のＩｇＧおよびＩｇＡを単離する。上記のように、ＥＬＩＳＡによって、Ｉｇサブクラスの同定を実施する。自己免疫環境をさらに特性決定するために、次に、抗サイトカイン自己抗体のうちの主なＩｇＡおよび／またはＩｇＧサブクラスを決定する。
【０３４５】
実施例１１：目的のタンパク質の免疫優性エピトープのマッピング
Ｋａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１２），ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃｅｉ．１２０２４において、ＩＬ−２２などのサイトカインに対する自己抗体について記載されているように、自己抗体の中和能をよく理解するために、目的のタンパク質のいくつかのｃＤＮＡ断片をクローニングして、それらの免疫優性エピトープをマッピングすることができる。
【０３４６】
例えば、上記に定義された中枢性および／もしくは末梢性寛容の異常または自己寛容の喪失を有する患者由来の、またはこれらの疾患の各マウスモデル由来の血清中の自己抗体が全長または短縮ポリペプチドに対して結合する能力の比較を使用して、これらの抗体によって認識されるエピトープが立体構造的であるかを決定する。このような選択性が観察される場合、変性全長構築物を用いてウエスタンブロットによってさらなる試験を実施する。
【０３４７】
それらの中和能を予測／確認するために、標的タンパク質の特定の領域に対する試験抗体の結合特異性を使用する。例えば、ＩＦＮ−α２ａおよびＩＬ−２２のＣ末端領域は、よりβ−ターンを作る傾向があり親水性のアミノ酸を含有する。これらは、インタクトなタンパク質を認識する特異的Ａｂを誘導するのに重要な２つの性質である［４５］。これらの領域に対する任意の自己抗体は、中和する可能性がある。
【０３４８】
実施例１２：誘導性耳炎表現型の結果
ヒトサイトカインＩＬ−１７ＡもしくはＩＬ−１７ＦまたはＰＢＳを各耳に隔日で（１日目、３日目、５日目および７日目日に）皮内注射することによって［２０ｕｌ／耳、５００ｎｇ／耳、１μｇ／マウス／日］、８週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（野生型（ＷＴ））マウスで耳炎表現型を誘導した。誘導性耳炎表現型を軽減するその中和能に関して、本発明の例示的な抗ＩＬ−１７  ２４Ｄ３抗体による処置をこれらの動物で試験した。耳炎誘導前の０日目に１回目の腹腔内注射（ＩＰ）を開始して、２４Ｄ３または対照ヒトＩｇＧの４回の腹腔内（ＩＰ）注射［２００μｇ／腹腔内注射（ＩＰ）］を隔日で８日間にわたって動物に施した。本発明の抗体の潜在的な治療効果を試験するために、抗体投与の間に、動物の体重および耳の厚みをモニタリングした。さらに、耳のＨ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン；［５２，５３］）組織学的染色を実施した。
【０３４９】
２回の独立した実験の組み合わせは、ヒトＩＬ−１７Ｆの皮内注射による耳腫脹の誘導が２４Ｄ３中和抗体の存在下では軽減され、これは８日目において有意であることを示している（図３９Ａ、ＤおよびＦを参照のこと）。ヒトＩＬ−１７Ａの皮内注射による耳腫脹の誘導は、２４Ｄ３処置によって影響を受けておらず、このことは、ヒトＩＬ−１７Ｆに対するこの抗体の特異性をさらに立証している（図３９ＡおよびＣならびに図３９Ｅを参照のこと）。ＰＢＳ対照を連続皮内注射した後の耳腫脹レベルは、ＩｇＧまたは２４Ｄ３の存在によって影響を受けていない（図３９Ａ、ＢおよびＦを参照のこと）。得られたデータをＰＢＳ対照で得られた値に対して標準化することにより、例示的な抗ＩＬ−１７Ｆ抗体の治療効果を示す値に関する有意性がより高くなる（特に、図３９ＪおよびＬを参照のこと）。ＩＬ−１７Ｆ注射による炎症誘導後の体重減少がほぼ無いかまたは少なくとも大きく軽減している２４Ｄ３処置動物の体重をモニタリングすることにより得られた予備データによって、本発明の例示的な抗ＩＬ−１７Ｆ抗体の治療効果がさらに裏付けられている（図４０を参照のこと）。
【０３５０】
実施例１３：例示的なａ−ＩＬ１７およびａＩＬ−２２抗体のエピトープマッピング
マッピングの最初の工程として、異なる結合部位の数を決定するために、区別可能な抗原結合部位に対するａ−ＩＬ１７およびａ−ＩＬ−２２  ＭＡＢの差次的結合を調べた。
【０３５１】
この目的のために、２つのアプローチを使用した。第１のアプローチでは、ヒト（ｈＭＡＢ）またはマウス（ｈｍＭＡＢ）Ｆｃのいずれかと共にＭＡＢを発現させ、抗原をプレート上にコーティングし、大過剰のヒトＭＡＢの存在下でｈｍＭＡＢの結合を検出することによって、交差競合実験を行った。一次抗体のＦｃ部分に対するＨＲＰコンジュゲート二次抗体によって、リガンドに結合したｈｍＭＡＢの検出を行った。図４１Ａから分かるように、本発明の例示的なａ−ＩＬ−１７抗体１７Ｅ３および２４Ｄ３は互いに競合するが、抗体９Ａ２とは競合せず、このことは、９Ａ２が１７Ｅ３および２４Ｄ３とは別の部位に結合することを示している。第１のアプローチの結果はまた、本発明のａ−ＩＬ−２２抗体３０Ｇ１、３５Ｇ１１および４１Ｄ１１が互いに競合するが、抗体５１Ｇ４とは競合しないことを示している（図４１Ｂを参照のこと）。
【０３５２】
第２のアプローチではサンドイッチＥＬＩＳＡ実験を実施したところ、ｈｍＭＡＢについては第１のアプローチのように構築したが、交差競合実験については、ヒトＭＡＢをプレート上にコーティングし、抗原を捕捉し、ヒトＭＡＢに結合した抗原をｈｍＭＡＢで検出することによって行った（結果については、図４１Ｃを参照のこと）。この第２のアプローチも同様に、抗体３０Ｇ１、３５Ｇ１１および４１Ｄ１１が互いに競合するが、５１Ｇ４とは競合しないことを示しており、ａ−ＩＬ−２２抗体３０Ｇ１、３５Ｇ１１および４１Ｄ１１ならびにａ−ＩＬ−２２抗体５１Ｇ４が２つの異なる部位に結合することを裏付けている。続いて、ＰｅｐＳｔａｒ（商標）分析を使用して、各抗原に対するＭＡＢの結合領域をマッピングすることを試みた。ここで、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７ＦおよびＩＬ−２２（公知の変異体すべてを含む）を包含するように２０ｍｅｒのオーバーラップペプチド（１５個のアミノ酸のオーバーラップ）を設計し、ペプチドおよび全長抗原（陽性対照として）をマイクロアレイ上にスポットし、ペプチドマイクロアレイを一次抗体と共にインキュベートし、続いて、一次抗体のＦｃ部分に対する蛍光標識二次抗体と共にインキュベートした。立体障害によって引き起こされる偽陰性を回避するために、最適化された親水性リンカー部分を、ガラス表面と抗原由来ペプチド配列との間に挿入した。
【０３５３】
例示的なａ−ＩＬ−１７  ＭＡＢのマッピング結果を図４２に示し、ａ−ＩＬ−２２  ＭＡＢの結果を図４３に示す。同時にスポットした全長抗原は、一般に、ペプチドマイクロアレイ（ＩＬ−２２のカラム）上でよく認識されていた。すべてのａ−ＩＬ−１７およびａ−ＩＬ−２２  ＭＡＢが明らかな結合を示しているわけではないが、ペプチドとは異なり、抗原を固定化する表面リシンの方向および使用により、低いシグナル強度またはシグナルの欠如は、結合の欠如に必ずしも相関していない。特定のペプチドへの結合時に観察されるべき予想結合強度は、６０，０００の範囲内である。すべての抗体が、ペプチド結合マイクロアレイに対して非常に弱い結合パターンを示しているが、このことは、それらの特定抗原由来の直線状ペプチドを認識することができないことを示している。これらのデータは、ＩＬ１７およびＩＬ−２２  ＭＡＢが立体構造エピトープに結合することを示唆している（抗体の特性の概要については、実施例１４の表２５および２６を参照のこと）。
【０３５４】
実施例１４：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用した抗体親和性測定
本発明の抗体の親和性を測定するために、製造業者（ＢＩＯ−ＲＡＤ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  ＣＡ，ＵＳＡ）の説明書にしたがってＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ３６機器を使用して、ＳＰＲ測定を実施した。最初に、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応によって、ＧＬＣセンサーチップからなる６×６相互作用アレイの５面上に抗ヒトＩｇＧを同時にカップリングし、第６面上には抗体を固定化しなかったが、他の５面と同じ活性化および非活性化プロトコールで処理した。その後、試験するべきＭＡＢ（リガンド）をチップの６つのチャネルに（垂直方向に）注入し、よく似た捕捉効率および活性割合で同時に捕捉した。次いで、チップを９０度回転させ、試験するべき分析物を、１００ｎＭ〜１．２３ｎＭの範囲の異なる濃度で水平方向に注入した（図４４〜４６において、各会合／解離曲線は、異なる濃度（Ａ１−赤、１００ｎＭ、Ａ２−シアン３３．３３ｎＭ、Ａ３−青１１．１１ｎＭ、Ａ４−緑３．７０ｎＭ、Ａ５−ピンク１．２３ｎＭ、Ａ６−オレンジ  ランニング緩衝液のみ）を表す）。図４４のセンサグラムは、ＩＬ−２２に対する本発明の例示的な抗ＩＬ−２２抗体３０Ｇ１および３５Ｇ１１の結合特異性を裏付けている。フローチャネル間のインタースポット領域を使用して、データを参照した。図４５および４６に示されているセンサグラムの詳細な分析は、得られたデータが１：１ラングミュアモデルによく合致することを示している。結合実験を２回反復し、データを２回の独立した実験の平均として表す。ＳＰＲデータから計算した抗体の親和性は、ピコモル範囲（すなわち、それぞれａＩＬ−２２抗体３０Ｇ１、およびａ−ＩＬ−２２抗体３５Ｇ１１について、ＫＤ＝３６．５±１．５ｐＭおよび３９±７ｐＭ）であることが示された。
【０３５５】
ＩＬ−１７Ｆの注射は、抗体９Ａ２、１７Ｅ３および２４Ｄ３を固定化した表面上で濃度依存的反応を示し、このことは、ＩＬ−１７に対するそれらの結合特異性を裏付けているのに対して、ａＩＬ−２２抗体３０Ｇ１および３５Ｇ１１を固定化した表面は非特異的リガンド結合を示さないか、または多くとも最小限の非特異的リガンド結合（これは、抗ヒトＩｇＧ捕捉抗体を表面上に固定化せずにリガンドとして２４Ｄ３で処理した対照チャネルと同程度である）を示した。解離段階では、反応の「増加」を観察することができたが、これは、この段階における同時会合および解離を反映していると思われる。この潜在的な原因は、抗体表面上への抗原の凝集、または機器チューブからの抗原の補充である。解離段階のデータが複雑であるため、ｋｄそしてそれ故に動態を正確に決定することは不可能であるが、「解離」データの大部分を除外すると親和性は非常に高いと思われ、約３×１０Ｅ＋０５（１７Ｅ３）から約６×１０Ｅ＋０５  １／Ｍｓ（２４Ｄ３）を超えて約８×１０Ｅ＋０５  １／Ｍｓ（９Ａ２）までの範囲のｋａを算出することができる。挙動が１：１ではない証拠は存在しない（すなわち、不均一なリガンドの証拠はない）。
【０３５６】
【表２５】
2015505244.tif 000061
【０３５７】
【表２６】
2015505244.tif 000062
【０３５８】
実施例１５：ＬＩＰＳアッセイにおけるガウシア抗原構築物
海洋カイアシ類ガウシア・プリンケプス由来のガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）を目的の全長または短縮組換え抗原（例えば、ＩＬ−２２、ＩＬ−１７ＡまたはＩＬ−１７Ｆ）に融合したものをコードする構築物を作製し、（フォティナス・ピラリス由来の）ホタルルシフェラーゼを含有する構築物について実施例１０に記載されているように、ルシフェラーゼアッセイに使用した。以下の説明に加えて、対応する遺伝子を有する融合構築物の作製に使用したプライマー配列に関する表２３、および実施例１の対応するクローニング戦略（ここでは、サイトカイン遺伝子断片をガウシアベクタにクローニングするために同様に使用した）の説明を参照のこと。
【０３５９】
ガウシア全長遺伝子は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ＴａｒｔｕのＡｎｄｒｅｓ  Ｍｅｒｉｔｓ教授から贈与されたものであり、Ｔ４リガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、これをｐＰＫ−ＣＭＶ−Ｆ４（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ；Ｇｅｒｍａｎｙ）哺乳動物発現ベクタのＥｃｏＲＩ部位にクローニングし、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を置換した。サイトカイン遺伝子の全長断片（シグナルペプチド配列を除く）を、ガウシアベクタのＢａｍＨＩおよびＮｏｔＩ部位にクローニングした。セレンテラジンを基質として使用した以外は、ホタルルシフェラーゼ構築物を用いるのと本質的には同様にＬＩＰＳアッセイを実施した。簡潔に言えば、Ｂｕｒｂｅｌｏらにしたがって、９６ウェルマルチスクリーンフィルタＨＴＳプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）中、室温で、すべての希釈に緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を使用して［３０］、ＬＩＰＳアッセイを行った。試験血清由来のＩｇ（１：２５希釈、２つ平行して試験）をプロテインＧ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗビーズ（２５μｌの４％懸濁液；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上に捕捉し、次いでこれを、発現サイトカイン（１０５発光単位（ＬＵ）を含む抽出物と共にインキュベートした。１時間後、洗浄し、ルシフェラーゼ基質セレンテラジン（ＴａｒｇｅｔｉｎｇＳｙｓｔｅｍｓ；Ｅｌ  Ｃａｊｏｎ，ＣＡ，ＵＳＡ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍｓ．ｎｅｔ／）と共にインキュベートし、１４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ＴｒｉＬｕｘ液体シンチレーションカウンタおよび照度計（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で発光強度を測定した。以下の表２７は、ホタルおよび／またはガウシアルシフェラーゼを使用したＬＩＰＳアッセイで観察された血清反応性を示す。
【０３６０】
【表２７】
2015505244.tif 000063
【０３６１】
実施例１６：タンパク質アレイデータの分析
全試料セット（図４７）について、ならびに女性患者および男性患者について別々に（図４８および４９）、タンパク質アレイ上における抗体反応を評価した。３つの分析すべてにおいて、反応タンパク質は、対照者を保因者と区別している。
【０３６２】
保因者を対照者と区別するタンパク質の７５％が、より高量の女性試料の代わりに女性患者によって駆動される。３つの分析すべてにおいて、１１種のタンパク質がオーバーラップしている。１４種のタンパク質が男性特異的であることを示し、２８種のタンパク質が女性特異的であると判定することができる（表２８および図４９Ｂを参照のこと）。
【０３６３】
全試料セットにおいて、単語「可溶性」を含む遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語に２種のタンパク質をアノテーションすることができ、ＧＯ用語「膜」に１６種のタンパク質をアノテーションすることができた。２種の可溶性タンパク質および１種のさらなるタンパク質は、女性のみの分析でも明らかであった。男性特異的タンパク質には、可溶性にアノテーションされるものはなかった；男性では明らかに、膜にアノテーションされる反応タンパク質の選好性がある。
【０３６４】
この予備分析によって、抗体反応と患者の年齢との間に明確な関係性を認めることはできなかった。
【０３６５】
【表２８】
2015505244.tif 000064
【０３６６】
実施例１７：ＡＰＳ１およびＩＰＥＸ患者からのヒトリンパ球の単離
完全ヒト抗体のクローニング用の出発物質として、実施例１に記載されている３３人のフィンランド人ＡＰＥＣＥＤ患者群に加えて、Ｘ連鎖自己免疫アレルギー性調節異常症候群（ＸＬＡＡＤ）またはＩＤＤＭ分泌性下痢症候群（ＤＭＳＤ）とも称されるＸ連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症候群（ＩＰＥＸ，ＯＭＩＭ  ３０４７９０）と診断されたフィンランド人患者１人；およびシュミット症候群または多腺性自己免疫症候群ＩＩ型（ＰＧＡ  ＩＩ）とも称される自己免疫性多内分泌（または多腺）不全症症候群２型（ＡＰＳ２、ＯＭＩＭ  ２６９２００））と診断されたフィンランド人患者３１人の末梢血から得られたヒトのリンパ球を使用する；Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｅｔｈｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ  ａｎｄ  Ｕｕｓｉｍａａ  Ｊｏｉｎｔ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ（ｄｎｒｏ  ８／１３／０３／０１／２００９、研究許可ＩＡＳ０９  ＡＰＳ１  ６２０９／Ｔ１０１０６００７１）から研究の承認が得られ、各参加者がインフォームドコンセントに署名した。
【０３６７】
ＡＰＥＣＥＤ患者群は、以下の特徴を有していた。患者のうち２１人が女性であり、１２人が男性であり、平均年齢は３８歳であった（女性３８．３歳；男性３７．８歳）。最初のＡＰＥＣＥＤ症候時の平均年齢は、６．２歳であった。男性の平均体重は６９．７５ｋｇであり、女性の平均体重は５９，４ｋｇであった。これら３３人の患者は、患者らの臨床症候に関するアンケートに回答した。一般的な症候としては、患者の３０％が発熱期間を経験し、６７％が無力症を経験した。
【０３６８】
ＩＰＥＸ（Ｘ連鎖免疫調節異常・多発性内分泌障害腸症候群）は、攻撃的自己免疫および早期死亡をもたらす珍しいＸ連鎖劣性疾患であり、上記セクション「定義および実施形態」内の段落「ＩＰＥＸ」により詳細に記載されている。
【０３６９】
ＡＰＳ２は、上記により詳細に記載されている主要組織適合複合体（ＭＨＣ：ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）内の６番染色体上に優性感受性遺伝子座がある多遺伝子性疾患である；総説については、例えば、Ｂａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．９５（２０１０），Ｅ２６３−Ｅ２７０を参照のこと。ＡＰＳ  ＩＩの有病率は、１００，０００人あたり１．４〜２．０人と推定されている（Ｂｅｔｔｅｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ．２３（２００２），３２７−６４）。それは３０〜４０歳の患者で最も多く発生し、女性は、男性よりも３倍多く罹患している（Ｓｃｈａｔｚ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．３１（２００２），３３９−５２）。
【０３７０】
ＡＰＳ１／ＡＰＥＣＥＤで単離された抗体に関して対応する実施例に記載されているように、目的のタンパク質に対する自己抗体の存在についての患者の血清のスクリーニング、高力価のＩＰＥＸ／ＡＰＳ２症例の事前選択、ＰＢＭＣ単離、ならびに例えば、抗体の生産および精製、インビトロ細胞ベースの中和アッセイ、検証アッセイに関するさらなる手順を実施する（特に、ＰＢＭＣ単離のための高力価患者血清の事前選択については実施例１を、血清のさらなる加工については実施例２を参照のこと）。
【０３７１】
上記実施例８に記載されているように、ＥＬＩＳＡによって、ＡＰＳ２、各ＩＰＥＸ患者の血清中のサイトカイン特異的抗体の検出を実施した。ＡＰＳ２患者をＡＰＳ２−１〜ＡＰＳ２−３１とコードし、ＩＰＥＸ患者をＩＰＥＸヘルシンキとコードした。
【０３７２】
抗体スクリーニングの結果。
約１００種の選択抗原のアセットに対して患者および対照被験者の血清をスクリーニングすることによって得られた結果を、ＡＰＳ１については表２９に、各ＡＰＳ２については表３０に、ＩＰＥＸ患者については表３１において以下に示す。
【０３７３】
【表２９−１】
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【表２９−２】
2015505244.tif 000066
【０３７４】
【表３０】
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【０３７５】
【表３１】
2015505244.tif 000068
【０３７６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図３９−３】
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【図３９−４】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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