(57)【要約】本発明は、一般には、バイオマーカーの分野に関する。特に、本発明は、例えば、内臓脂肪過多及び／又は内臓脂肪過多の変化を検出及び／又は定量するために使用され得るＰＣ−Ｏ  ４４：４などのバイオマーカーに関する。このバイオマーカーは、生活様式の変化が対象の内臓脂肪過多に与える影響を診断するのに使用されてもよい。【選択図】  図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣ−Ｏ  ４４：４である、バイオマーカー。
【請求項２】
内臓脂肪過多及び／又は内臓脂肪過多の変化を検出及び／又は定量するためのバイオマーカーとしての、ＰＣ−Ｏ  ４４：４の使用。
【請求項３】
対象の内臓脂肪過多を診断する方法であって、
試験される対象から前もって得た体液試料中のＰＣ−Ｏ  ４４：４のレベルを決定するステップと、
前記対象のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルを事前に決定された参照値と比較するステップとを含み、
前記事前に決定された参照値が、対照集団の同じ体液中の平均ＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルに基づいており、
前記事前に決定された参照値と比較して前記試料中のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルが低下している場合、内臓脂肪過多の増大が示唆される、方法。
【請求項４】
対象の内臓脂肪過多の変化を診断する方法であって、
試験される対象から前もって得た体液試料中のＰＣ−Ｏ  ４４：４のレベルを決定するステップと、
前記対象のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルを事前に決定された参照値と比較するステップとを含み、
前記事前に決定された参照値が、同じ対象から前もって得た同じ体液中のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルに基づいており、
前記事前に決定された参照値と比較して前記試料中のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルが低下している場合、内臓脂肪過多の増大が示唆される、方法。
【請求項５】
対象の内臓脂肪過多に対する生活様式の変化の効果を診断する方法であって、
試験される対象から前もって得た体液試料中のＰＣ−Ｏ  ４４：４のレベルを決定するステップと、
前記対象のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルを事前に決定された参照値と比較するステップとを含み、
前記事前に決定された参照値が、同じ対象から前もって得た同じ体液中のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルに基づいており、
前記事前に決定された参照値と比較して前記試料中のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルが上昇している場合、生活様式の変化が内臓脂肪過多に対して良い効果を与えたことが示唆される、方法。
【請求項６】
生活様式の変化が食事の変化である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
食事の変化が、以前に摂取されていないか、又は異なる量が摂取されていた少なくとも１つの栄養製品の使用である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
新しい栄養学的レジメンの有効性を試験するための、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
体液試料中のグルタミン、チロシン、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：４、及びＰＣ−Ｏ  ４０：３からなる群から選択される少なくとも１つの別のバイオマーカーのレベルを決定するステップと、
対象のグルタミン、チロシン、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：４、及びＰＣ−Ｏ  ４０：３の内の少なくとも１つのレベルを事前に決定された参照値と比較するステップとをさらに含み、
前記事前に決定された参照値が、正常な健康対照集団の体液試料中のグルタミン、チロシン、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：４、及び／若しくはＰＣ−Ｏ  ４０：３の平均レベル、又は同じ対象から前もって得た同じ体液中のグルタミン、チロシン、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：４、及び／若しくはＰＣ−Ｏ  ４０：３のレベルに基づいており、
前記事前に決定された参照値と比較して前記体液試料中のグルタミン及び／若しくはチロシンのレベルが上昇している場合、並びに／又はＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４４：４、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：４、及び／若しくはＰＣ−Ｏ  ４０：３のレベルが低下している場合、内臓脂肪過多の増大が示唆される、
請求項３〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
試料中及び参照中のバイオマーカーのレベルが、１Ｈ−ＮＭＲ及び／又は質量分析によって決定される、請求項３〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
体液が血漿又は血清である、請求項３〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
内臓脂肪過多の程度が、過剰な内臓脂肪に関連する障害を発症する可能性を示す、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
過剰な内臓脂肪に関連する障害が、心代謝疾患及び／又は代謝調節不全である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
正常な対象、過体重対象又は肥満対象において実施される、請求項３〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
対象がヒト又はネコ若しくはイヌなどの伴侶動物である、請求項３〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、一般には、バイオマーカーの分野に関する。特に、本発明は、例えば、内臓脂肪過多及び／又は内臓脂肪過多の変化を検出及び／又は定量するために使用され得る１−Ｏ−アルキル−２−アシルグリセロホスホコリン（ＰＣ−Ｏ）４４：４などのバイオマーカーに関する。また、このバイオマーカーは、生活様式の変化が対象の内臓脂肪過多に与える効果を診断するのに使用されてもよい。
【０００２】
特に子供の間で、過体重及び肥満の流行が継続的に拡大しているため、過体重及び肥満に関連するゲノム及びメタボロームの表現型の解読が、公衆衛生に関する最大級の課題となっている。栄養失調及び肥満は、ボディマス指数（ＢＭＩ）に基づいて定義され、平均余命にかなりの悪影響を与えるが、ＢＭＩは、体組成を評価するにあたって相当な制限があり、疾患リスクを評価するための感度を欠いていることが明白である（Ｄｕｌｌｏｏ，Ａ．Ｇ．ら（２０１０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．（Ｌｏｎｄ）３４  補遺２、Ｓ４〜１７）。Ｄｕｌｌｏらは、（ｉ）体脂肪量（ＦＭ）指数（ＦＭ／Ｈ２）及び除脂肪量（ＦＦＭ）指数（ＦＦＭ／Ｈ２）へのＢＭＩの分割、（ｉｉ）器官量及び骨格筋量へのＦＦＭの分割、（ｉｉｉ）有害脂肪及び保護的脂肪へのＦＭの分割、並びに（ｉｖ）除脂肪体重を構成する器官／組織の内部又は周囲の脂肪組織の拡大能力と異所性脂肪沈着との相互作用を含めて、体組成表現型に関係する健康リスクに関する概念の最近の進歩を、最近、再調査した（Ｄｕｌｌｏｏ，Ａ．Ｇ．ら（２０１０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．（Ｌｏｎｄ）３４  補遺２、Ｓ４〜１７）。
【０００３】
ここ数十年の間に、最新技術を用いた多数の調査により、脂肪貯蔵及び肥満に関連する遺伝子及び転写因子（Ｖｉｇｕｅｒｉｅ，Ｎら（２００５）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４８、１２３〜１３１；Ｖｉｇｕｅｒｉｅ，Ｎら（２００５）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８７、１１７〜１２３；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｔ．Ｉ．ら（２００６）ＰＬｏＳ．Ｃｌｉｎ．Ｔｒｉａｌｓ  １、ｅ１２；Ｋｌａｎｎｅｍａｒｋ，Ｍ．ら、（１９９８）Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４１、１５１６〜１５２２；Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｋ．ら（２００７）Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．２６２、４２２〜４３０）、遺伝的に受け継がれる性質（ｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｎｈｅｒｉｔａｂｉｌｉｔｙ）（Ｔｅｒａｎ−Ｇａｒｃｉａ，Ｍ．ら（２００７）Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ  ３２、８９〜１１４）が特定されており、ヒト腸内微生物叢の肥満発生への影響を提唱している（Ｂａｃｋｈｅｄ，Ｆ．ら（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  １０４、９７９〜９８４；Ｌｅｙ，Ｒ．ら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４４、１０２２〜１０２３；Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ，Ｐ．ら（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４４、１０２７〜１０３１）。
【０００４】
しかし、類似した肥満誘発性環境下及び糖尿病誘発性環境下で、多くの個体が依然として、代謝的に健康であり、肥満に関連した心血管疾患（ＣＶＤ）リスクに耐性があるままである。肥満に関連付けられている疾患リスクはいつも一定ではないことがあるという認識に加えて（Ｗｉｌｄｍａｎ，Ｒ．Ｐ．ら（２００８）Ａｒｃｈ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１６８、１６１７〜１６２４）、過体重状態及び肥満状態に固有であると以前は考えられていた心代謝異常を示す正常体重（ボディマス指数、ＢＭＩ＜２５）の個体の数が増えている。より最近の証拠から、位置特異的な体組成が代謝疾患に対する個人的素因をどのように決定することができるかが示されており、体脂肪、特に内臓脂肪の分布と、心代謝障害、糖尿病、高血圧、非アルコール性脂肪性肝疾患、及び死亡のリスクの上昇との相互関係が示されている。
【０００５】
内臓脂肪過多は、ウエスト測定値及びヒップ測定値を用いて臨床的に観察されており（例えば、男性の場合０．９より大きく、女性の場合０．８５より大きく）、他方で、特に肥満集団において同様の制限を受けている。磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）及びコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンを含めて、至適基準（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）の画像化技術により、内臓脂肪蓄積物の位置特異的且つ高精度の定量が現在は作り出されている。しかし、内臓脂肪に関連する代謝の評価は、疫学的研究において使用できる非侵襲性で、迅速で、且つ信頼性が高いバイオマーカーがないこと、及び代謝の全体論的分析に適していない従来の分析手法の制限が原因で、特に困難なままである。
【０００６】
体幹領域又はアンドロイド（ａｎｄｒｏｉｄ）領域に貯蔵される過剰脂肪は、ガイノイド（ｇｙｎｏｉｄ）部分に貯蔵される脂肪よりも代謝的に不健康である場合があり、インスリン抵抗性が、重要な原因となる機序である。したがって、個別化された栄養及び治療管理のために患者層別化が必要であるが、対象のウエスト・ヒップ比が同様であり、画像化施設の利用機会が限られている場合、患者層別化の適用は困難である。したがって、内臓脂肪の存在、内臓脂肪に関連する代謝、及び／又は内臓脂肪の変化を単純且つ信頼性が高い方法で評価することを可能にするバイオマーカーが切実に必要とされている。
【０００７】
本発明者らは、このニーズに取り組んだ。
【０００８】
したがって、最新技術を改善すること、並びに本発明の目的をかなえる、及び／又は本発明の最新技術の不都合な点の内の少なくとも１つを克服することを可能にするバイオマーカーを提供することが、本発明の目的であった。
【０００９】
適切なバイオマーカーを同定するために、本発明者らは、メタボノミクス手法を用いた。
【００１０】
メタボノミクスは、代謝表現型を特徴づけるための十分に確立されたシステム手法と現在考えられており、環境、薬物、食事、生活様式、遺伝的性質、及びミクロビオーム因子などの様々な因子の影響を含む。生理学的変化の潜在的可能性を示唆する遺伝子発現データ及びプロテオミクスデータとは違って、代謝産物並びに細胞、組織、及び器官内での代謝産物の動的濃度変化は、生理学的調節プロセスの本当の終点を表す。
【００１１】
最近、メタボロミクス及びリピドミクスに基づく発見によって、疾患プロセスの理解が加速しており、代謝症候群に関連した無症状障害の予防及び栄養学的管理のための新規な手段が提供されるであろう。
【００１２】
本発明者らは、位置特異的な体組成：内臓脂肪過多の包括的代謝表現型を提供することを目指した。これにより、内臓脂肪過多に特異的な生物学的マーカーを同定することが可能になった。
【００１３】
本発明の研究において、内臓脂肪過多に関連する代謝は、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）を用いた体組成及びコンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンを用いた腹部脂肪分布のｉｎ  ｖｉｖｏ定量と組み合わせて様々な代謝終点の測定を用いて、健康な肥満女性４０名のコホートにおいて調査された。
【００１４】
プロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）分光法並びに血漿及び経時的に採取された２４時間の尿試料のターゲット（ｔａｒｇｅｔｅｄ）ＬＣ−ＭＳ／ＭＳプロファイルの組み合わせを用いて、本発明者らは、内臓脂肪沈着パターンが異なるこの明確に定義された肥満コホートにおいて、内臓脂肪分布の新規な代謝バイオマーカーを同定した。
【００１５】
したがって、本発明者らは、新規なバイオマーカーであるＰＣ−Ｏ  ４４：４を同定した。
【００１６】
ＰＣ−Ｏは、１−Ｏ−アルキル−２−アシルグリセロホスホコリンである。
【００１７】
個々の脂質種に次のようにコメントを付けた：［脂質クラス］［炭素原子の総数］：［二重結合の総数］。例えば、ＰＣ  ３４：１とは、炭素原子３４個及び二重結合１個を含むホスファチジルコリン種を示す。
【００１８】
したがって、ＰＣ−Ｏ  ４４：４は、１−Ｏ−アルキル−２−アシルグリセロホスホコリン４４：４である。
【００１９】
本発明者らは、ＰＣ−Ｏ  ４４：４が内臓脂肪過多及び／又は内臓脂肪過多の変化を検出及び／又は定量するためのバイオマーカーとして使用されてもよいことをさらに発見した。この診断法は、ヒト又は動物の体外で実践される。
【００２０】
バイオマーカーのこの検出及び／又は定量は、生体液中で実施されてもよい。生体液は、例えば、血液、血漿、血清、又は尿であることができる。
【００２１】
典型的には、バイオマーカーの検出及び／又は定量のステップは、試験される対象から前もって得た体液試料中で実施される。
【００２２】
内臓脂肪は、腹部脂肪、器官脂肪、又は腹腔内脂肪としても公知であり、器官の中間の腹腔内部に位置している。
【００２３】
内臓脂肪は、心外膜脂肪組織並びに肝臓及び胃の周辺の脂肪だけでなく、腸間膜、精巣上体白色脂肪組織（ＥＷＡＴ）、及び腎周囲の蓄積物を含むいくつかの脂肪性蓄積物から構成されることができる。典型的には、腹部の脂肪は主に内臓のものであり、有名な「ビール腹」が結果として起こることが多い。
【００２４】
内臓脂肪が多すぎると中心性肥満になり、中心性肥満はさらには、例えば、心血管障害、２型糖尿病、インスリン抵抗性、又は炎症性疾患に関係があるとされている。これらは、過剰な内臓脂肪に関連付けられている障害の例である。
【００２５】
また、本発明は、対象の内臓脂肪過多を診断する方法であって、試験される対象から前もって得た体液試料中の１−Ｏ−アルキル−２−アシルグリセロホスホコリン（ＰＣ−Ｏ）４４：４のレベルを決定するステップと、対象のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルを事前に決定された参照値と比較するステップとを含み、事前に決定された参照値が、対照集団の同じ体液中の平均ＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルに基づいており、事前に決定された参照値と比較して試料中のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルが低下している場合、内臓脂肪過多の増大が示唆される、方法にも関する。
【００２６】
内臓脂肪過多は、心外膜脂肪組織並びに肝臓及び胃の周辺の脂肪だけでなく、腸間膜、精巣上体白色脂肪組織及び／又は腎周囲の脂肪を含むことがある。
【００２７】
体液は、例えば、血液、血清、血漿、又は尿であることができる。
【００２８】
血清及び／又は血漿は、試験されるバイオマーカーに関する信号対雑音比が特に高いという利点を有している。
【００２９】
尿は、非侵襲的に体液試料を得ることができるという利点を有している。
【００３０】
選択された体液にかかわらず、本発明の方法は、対象に由来するそのような体液を得ることが十分に確立された手順であるという利点を有している。
【００３１】
次いで、実際の診断方法が、体外の体液試料中で実施される。
【００３２】
試料中のＰＣ−Ｏ  ４４：４のレベルは、当技術分野において公知である任意の手段によって検出及び定量することができる。例えば、質量分析法、例えばＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳが使用されてもよい。他の分光学的方法、クロマトグラフィー法、標識技術、又は定量的化学的方法などの他の方法も同様に使用することができる。
【００３３】
理想的には、試料中のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベル及び参照値は、同じ方法によって決定される。
【００３４】
事前に決定された参照値は、対照集団の試験された体液中の平均ＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルに基づいていてもよい。対照集団は、遺伝的背景、年齢、及び平均的健康状態が類似している少なくとも３名、好ましくは少なくとも１０名、より好ましくは少なくとも５０名の人からなる群であり得る。
【００３５】
また、対照集団は同じ人であることもでき、したがって、事前に決定された参照値は、同じ対象から前もって得られる。このようにすることにより、例えば、内臓脂肪過多に対する影響について現在の生活様式と以前の生活様式を直接的に比較することが可能になり、改善を直接的に評価することができる。
【００３６】
内臓脂肪肥満の決定により、内臓脂肪肥満の存在及び関連障害を生じるリスクについて推断することが可能になる。
【００３７】
また、本発明の主題は、対象の内臓脂肪過多の変化を診断する方法であって、試験される対象から前もって得た体液試料中のＰＣ−Ｏ  ４４：４のレベルを決定するステップと、対象のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルを事前に決定された参照値と比較するステップとを含み、事前に決定された参照値が、同じ対象から前もって得た同じ体液中のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルに基づいており、事前に決定された参照値と比較して試料中のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルが低下している場合、内臓脂肪過多の増大が示唆される、方法にも関する。
【００３８】
この方法により、経時的に内臓脂肪の蓄積又は減少を追跡することが可能になり、その結果として、内臓脂肪過多に関連する障害を発症するリスクの上昇又は低下に関する推断が可能になる。
【００３９】
リスクの推断が可能になることには、例えば、内臓脂肪の実際の増加又は減少を決定できるようになるずっと前に、即時の結果が入手可能であるという利点がある。この利点は、内臓脂肪を減少させることを目指している人々の動機付けのために特に好適である。とりわけ、内臓脂肪の減少は、激しい運動をしばしば必要とする難しい作業である。Ｏｈｋａｗａｒａらは、有効な内臓脂肪減少のためには、少なくとも１０代謝当量（ＭＥＴ）時間／週の有酸素運動が必要とされると提唱している（Ｏｈｋａｗａｒａ，Ｋ．ら、（２００７）、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｏｂｅｓｉｔｙ（２００５）３１（１２）：１７８６〜１７９７）。
【００４０】
また、本発明は、対象の内臓脂肪過多に対する生活様式の変化の効果を診断する方法であって、試験される対象から前もって得た体液試料中のＰＣ−Ｏ  ４４：４のレベルを決定するステップと、対象のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルを事前に決定された参照値と比較するステップとを含み、事前に決定された参照値が、同じ対象から前もって得た同じ体液中のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルに基づいており、事前に決定された参照値と比較して試料中のＰＣ−Ｏ  ４４：４レベルが低下している場合、生活様式の変化が内臓脂肪過多に対して良い効果を与えたことが示唆される、方法にも関する。
【００４１】
この方法には、内臓脂肪量及び関連障害のリスクに対する生活様式変化の効果を観察することを可能にするという効果がある。
【００４２】
生活様式の変化は、新しい仕事、異なるストレスレベル、新しい関係、身体活動の増加若しくは減少、及び／又は全体的な幸福感（ｗｅｌｌｂｅｉｎｇ）の変化など任意の変化であることができる。
【００４３】
例えば、生活様式の変化は、食事の変化であってもよい。
【００４４】
食事の変化は、炭水化物、脂質、及び／又はタンパク質の含有量の増加又は減少であってもよい。例えば、食事の変化は、地中海沿岸特有の食事など異なる地域の食事への切り換えであってもよい。また、食事の変化は、カロリーの総摂取量の変化であってもよい。
【００４５】
したがって、本発明の方法は、新しい栄養学的レジメン、栄養製品、及び／又は医薬の有効性を試験するのに使用されることができる。
【００４６】
栄養製品は、例えば、体脂肪、体重管理、及び／又は内臓脂肪に対して効果を有していると主張する製品であってもよい。
【００４７】
典型的には、栄養製品は、食料製品、飲料、ペット用食料製品、栄養補助食品、機能性食品、食品添加物、又は栄養学的配合物（ｆｏｒｍｕｌａ）であることができる。
【００４８】
例えば、食事の変化は、以前は摂取されなかったか、又は異なる量が摂取されていた少なくとも１つの栄養製品の使用であってもよい。
【００４９】
したがって、本発明の方法は、新しい栄養学的レジメン及び／又は栄養製品の有効性を試験するのに使用されることができる。
【００５０】
ＰＣ−Ｏ  ４４：４は、本発明の目的のためのただ１つのマーカーとして使用されることができる。
【００５１】
唯一のマーカーとしてのＰＣ−Ｏ  ４４：４は、本発明の診断方法のための道具として有効であるが、ただ１つではない複数のマーカーに診断が依拠する場合、前記診断の質及び／又は予知力は改善されると考えられる。
【００５２】
したがって、対象の内臓脂肪過多及び／又は関連障害に対するリスクを診断するための１つ又は複数の他のマーカーが、ＰＣ−Ｏ  ４４：４と組み合わせて使用されてもよい。
【００５３】
本発明者らは、他のバイオマーカーもまた、内臓脂肪過多及び／又は関連障害に対するリスクの診断を検出するのに使用できることがわかり驚いた。
【００５４】
したがって、本発明者らは、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４４：４、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：４、及び／若しくはＰＣ−Ｏ  ４０：３の体液中濃度の低下；並びに／又はチロシン及び／若しくはグルタミンの体液中濃度の上昇から、内臓脂肪量の増加及び／又は過剰な内臓脂肪に関連する障害を発症するリスクの上昇を診断できることを特定した。
【００５５】
逆に、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４４：４、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：４、及び／若しくはＰＣ−Ｏ  ４０：３の体液中濃度の上昇；並びに／又はチロシン及び／若しくはグルタミンの体液中濃度の低下から、内臓脂肪量の減少及び／又は過剰な内臓脂肪に関連する障害を発症するリスクの低下を診断することができる。
【００５６】
したがって、本発明の方法は、体液試料中のグルタミン、及び／又はチロシン、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：４、及び／又はＰＣ−Ｏ  ４０：３からなる群から選択される少なくとも１つの別のバイオマーカーのレベルを決定するステップと、対象のグルタミン、及び／又はチロシン、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：４、及び／又はＰＣ−Ｏ  ４０：３の内の少なくとも１つのレベルを事前に決定された参照値と比較するステップとをさらに含んでもよく、事前に決定された参照値が、正常な健康対照集団の体液試料中のグルタミン、チロシン、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：４、及び／若しくはＰＣ−Ｏ  ４０：３の平均レベル、又は同じ対象から前もって得た同じ体液中のグルタミン、チロシン、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：４、及び／若しくはＰＣ−Ｏ  ４０：３のレベルに基づいており、事前に決定された参照値と比較して体液試料中のグルタミン及び／若しくはチロシンのレベルが上昇している場合、並びに／又はＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４４：４、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：４、及び／若しくはＰＣ−Ｏ  ４０：３のレベルが低下している場合、内臓脂肪過多の増大が示唆される。
【００５７】
本発明の方法は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、又は少なくとも７個のバイオマーカーの評価を含んでもよい。
【００５８】
例えば、ＰＣ−Ｏ  ４４：４は、ＰＣ−Ｏ  ４４：６と一緒に評価されてもよい。
【００５９】
また、ＰＣ−Ｏ  ４４：４は、ＰＣ−Ｏ  ４２：４と一緒に評価されてもよい。
【００６０】
また、ＰＣ−Ｏ  ４４：４は、ＰＣ−Ｏ  ４０：４と一緒に評価されてもよい。
【００６１】
また、ＰＣ−Ｏ  ４４：４は、ＰＣ−Ｏ  ４０：３と一緒に評価されてもよい。
【００６２】
また、ＰＣ−Ｏ  ４４：４は、ＰＣ−Ｏ  ４４：６及びＰＣ−Ｏ  ４２：４と一緒に評価されてもよい。
【００６３】
また、ＰＣ−Ｏ  ４４：４は、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、及びＰＣ−Ｏ  ４０：４と一緒に評価されてもよい。
【００６４】
また、ＰＣ−Ｏ  ４４：４は、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、及びＰＣ−Ｏ  ４０：３と一緒に評価されてもよい。
【００６５】
また、ＰＣ−Ｏ  ４４：４は、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：３、及びＰＣ−Ｏ  ４０：４と一緒に評価されてもよい。
【００６６】
また、ＰＣ−Ｏ  ４４：４は、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：３、ＰＣ−Ｏ  ４０：４、及びグルタミンと一緒に評価されてもよい。
【００６７】
また、ＰＣ−Ｏ  ４４：４は、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：３、ＰＣ−Ｏ  ４０：４、グルタミン、及びチロシンと一緒に評価されてもよい。
【００６８】
複数のバイオマーカーを評価する利点は、判断されるバイオマーカーの数が多いほど、診断の信頼性が高くなることである。例えば、１、２、３、４、５、６、又は７個より多いバイオマーカーが前述した濃度の上昇又は低下を呈する場合、内臓肥満の有無及び程度、並びに関連障害に対するリスクの予知力は、より強い。
【００６９】
このことに基づき、本発明者らは、内臓脂肪過多及び関連障害を発症するリスクを予測するのに使用され得るさらに別のバイオマーカーを同定した。
【００７０】
例えば、前もって得た対応する参照値と比較して、体液中のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、パルミトイルカルニチン（Ｃ１６）、カプロイルカルニチン（Ｃ１０）  オクテノイルカルニチン（Ｃ８：１）  リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）２４：０、ホスファチジルコリン（ＰＣ）ＰＣ  ３０：０、及び／若しくはＰＣ  ３４：４の濃度が上昇している場合、又は体液中のＰＣ−Ｏ  ３４：１、ＰＣ−Ｏ  ３４：２、ＰＣ−Ｏ  ３６：２、ＰＣ−Ｏ  ３６：３、ＰＣ−Ｏ  ４０：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：２、ＰＣ−Ｏ  ４２：３、ＰＣ−Ｏ  ４４：３、ＰＣ−Ｏ  ４４：５、ＰＣ  ４２：０、及び／若しくはＰＣ  ４２：２の濃度が低下している場合、内臓脂肪過多の増大及び関連障害に対するリスクの上昇が示唆されることが判明した。
【００７１】
ＰＣは、ホスファチジルコリンである。ＬＰＣは、リゾホスファチジルコリンである。Ｃは、アシルカルニチンである。
【００７２】
逆に、前もって得た対応する参照値と比較して、体液中のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、Ｃ１０（デカノイルカルニチン）、Ｃ１６（パルミトイルカルニチン）、Ｃ８：１（オクテノイル−カルニチン）  ＬＰＣ  ２４：０、ＰＣ  ３０：０、及び／若しくはＰＣ  ３４：４の濃度が低下している場合、又は体液中のＰＣ−Ｏ  ３４：１、ＰＣ−Ｏ  ３４：２、ＰＣ−Ｏ  ３６：２、ＰＣ−Ｏ  ３６：３、ＰＣ−Ｏ  ４０：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：２、ＰＣ−Ｏ  ４２：３、ＰＣ−Ｏ  ４４：３、ＰＣ−Ｏ  ４４：５、ＰＣ  ４２：０、及び／若しくはＰＣ  ４２：２の濃度が上昇している場合、内臓脂肪過多の低減及び関連障害に対するリスクの低下が示唆される。
【００７３】
したがって、本発明の方法は、体液試料中のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、Ｃ１０（デカノイルカルニチン）、Ｃ１６（パルミトイルカルニチン）、Ｃ８：１（オクテノイル−カルニチン）、ＬＰＣ  ２４：０、ＰＣ  ３０：０、ＰＣ  ３４：４、ＰＣ−Ｏ  ３４：１、ＰＣ−Ｏ  ３４：２、ＰＣ−Ｏ  ３６：２、ＰＣ−Ｏ  ３６：３、ＰＣ−Ｏ  ４０：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：２、ＰＣ−Ｏ  ４２：３、ＰＣ−Ｏ  ４４：３、ＰＣ−Ｏ  ４４：５、ＰＣ  ４２：０、及び／又はＰＣ  ４２：２からなる群から選択される少なくとも１つの別のバイオマーカーのレベルを決定するステップと、対象のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、Ｃ１０、Ｃ１６、Ｃ８：１、カルニチン、ＬＰＣ  ２４：０、ＰＣ  ３０：０、ＰＣ  ３４：４、ＰＣ−Ｏ  ３４：１、ＰＣ−Ｏ  ３４：２、ＰＣ−Ｏ  ３６：２、ＰＣ−Ｏ  ３６：３、ＰＣ−Ｏ  ４０：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：２、ＰＣ−Ｏ  ４２：３、ＰＣ−Ｏ  ４４：３、ＰＣ−Ｏ  ４４：５、ＰＣ  ４２：０、及び／又はＰＣ  ４２：２の内の少なくとも１つのレベルを事前に決定された参照値と比較するステップとをさらに含んでもよく、事前に決定された参照値が、正常な健康対照集団の体液試料中のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、Ｃ１０、Ｃ１６、Ｃ８：１、カルニチン、ＬＰＣ  ２４：０、ＰＣ  ３０：０、ＰＣ  ３４：４、ＰＣ−Ｏ  ３４：１、ＰＣ−Ｏ  ３４：２、ＰＣ−Ｏ  ３６：２、ＰＣ−Ｏ  ３６：３、ＰＣ−Ｏ  ４０：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：２、ＰＣ−Ｏ  ４２：３、ＰＣ−Ｏ  ４４：３、ＰＣ−Ｏ  ４４：５、ＰＣ  ４２：０、及び／若しくはＰＣ  ４２：２の平均レベル、又は同じ対象から前もって得た同じ体液中のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、Ｃ１０（デカノイルカルニチン）、Ｃ１６（パルミトイルカルニチン）、Ｃ８：１（オクテノイル−カルニチン）、ＬＰＣ  ２４：０、ＰＣ  ３０：０、ＰＣ  ３４：４、ＰＣ−Ｏ  ３４：１、ＰＣ−Ｏ  ３４：２、ＰＣ−Ｏ  ３６：２、ＰＣ−Ｏ  ３６：３、ＰＣ−Ｏ  ４０：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：２、ＰＣ−Ｏ  ４２：３、ＰＣ−Ｏ  ４４：３、ＰＣ−Ｏ  ４４：５、ＰＣ  ４２：０、及び／若しくはＰＣ  ４２：２のレベルに基づいており、事前に決定された参照値と比較して体液中のフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、Ｃ１０、Ｃ１６、Ｃ８：１、カルニチン、ＬＰＣ  ２４：０、ＰＣ  ３０：０、及び／若しくはＰＣ  ３４：４のレベルが上昇している場合、並びに／又は体液試料中のＰＣ−Ｏ  ３４：１、ＰＣ−Ｏ  ３４：２、ＰＣ−Ｏ  ３６：２、ＰＣ−Ｏ  ３６：３、ＰＣ−Ｏ  ４０：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：２、ＰＣ−Ｏ  ４２：３、ＰＣ−Ｏ  ４４：３、ＰＣ−Ｏ  ４４：５、ＰＣ  ４２：０、及び／又はＰＣ  ４２：２のレベルが低下している場合、内臓脂肪過多の増大が示唆される。
【００７４】
内臓脂肪過多が増大すると、過剰な内臓脂肪に関連する障害を発症するリスクが上昇する。
【００７５】
その結果として、本発明の方法において、内臓脂肪過多の程度が、過剰な内臓脂肪に関連する障害を発症する可能性の指標として使用されることができる。
【００７６】
また、内臓脂肪過多の変化は、過剰な内臓脂肪に関連する障害を発症する可能性の上昇又は低下の指標として使用されることもできる。
【００７７】
内臓脂肪過多に関連する障害は、例えば、心代謝障害である。
【００７８】
したがって、本発明の方法は、心代謝障害を発症するリスクを決定するのに使用されることができる。
【００７９】
内臓脂肪過多に関連するその他の障害は、例えば、代謝調節不全（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）である。典型的な代謝調節不全は、下記の肥満、インスリン抵抗性、２型糖尿病、代謝症候群、血管疾患（高血圧、冠動脈心疾患）、代謝性肝疾患における脂肪性肝炎、リポジストロフィー、肺機能、炎症性障害、及び肥満に関係した他の障害である。
【００８０】
本発明の方法は、任意の対象を用いて実施することができる。
【００８１】
本発明の方法は、内臓脂肪過多及び／又は内臓脂肪過多に関連する障害を発症するリスクがある対象において実施できることが有利である。
【００８２】
例えば、本発明の方法は、正常な対象、過体重対象又は肥満対象を用いて実施されることができる。
【００８３】
成人のヒトの場合、ＢＭＩが２５〜３０の間である場合に「過体重」と定義される。「ボディマス指数」又は「ＢＭＩ」とは、体重（単位：ｋｇ）を身長（単位：ｍ）の２乗で割った比率を意味する。「肥満」とは、動物、特にヒト及び他の哺乳動物の脂肪組織中に貯蔵される、天然のエネルギーの蓄えが、特定の健康状態又は死亡率上昇に関連する点まで増加している状態である。成人のヒトの場合、３０より大きいＢＭＩを有する場合に「肥満」と定義される。
【００８４】
ＰＣ−Ｏ  ４４：４及び場合によっては他のバイオマーカーの参照値は、試験対象から得られるＰＣ−Ｏ  ４４：４及び場合によっては他のバイオマーカーのレベルを特徴づけるのに使用されるのと同じ単位を用いて測定されることが好ましい。しがって、ＰＣ−Ｏ  ４４：４及び場合によっては他のバイオマーカーのレベルが、μｍｏｌ／ｌ（μＭ）で表されるＰＣ−Ｏ  ４４：４単位のような絶対値（ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｖａｌｕｅ）である場合、参照値も、一般集団又は対象の選択された対照集団の個体においてμｍｏｌ／ｌ（μＭ）で表されるＰＣ−Ｏ  ４４：４単位に基づいている。
【００８５】
さらに、参照値は、中央値又は平均値などの単一のカットオフ値であってもよい。平均レベル、中央値レベル、又は「カットオフ」レベルなど、得られた体液試料中のＰＣ−Ｏ  ４４：４及び場合によっては他のバイオマーカーの参照値は、参照により本明細書に組み入れられるＫｎａｐｐ，Ｒ．Ｇ．及びＭｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｃ．（１９９２）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．Ｗｉｌｌｉａｍ及びＷｉｌｋｉｎｓ、Ｈａｒｕａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．  Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｐａ．において説明されているようにして、一般集団又は選択された集団の個体の大量試料を分析し、陽性判定基準を選択するための予測値による方法又は最適な特異性（真陰性率が最大）及び最適な感度（真陽性率が最大）を定める受信者動作特性曲線などの統計学的モデルを用いることによって、確立することができる。
【００８６】
参照値は、例えば、性別、人種、遺伝形質、健康状態、又は年齢によって変動するが、当業者（ｓｋｉｌｌｅｄ  ａｒｔｅｓｉａｎｓ）なら、正確な参照値を割り付ける方法を知っていると考えられる。
【００８７】
例として、本発明者らは、例えば血漿（ｂｏｏｄ  ｐｌａｓｍａ）などの体液において、肥満ヒト成人対象及び正常ヒト成人対象の典型的な参照値を決定した。
【００８８】
その結果として、肥満対象の事前に決定された平均参照値は、以下であり得る：
チロシンについては、体液中約６８．７１μＭ、
グルタミンについては、体液中約６６２．６７μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４４：６については、体液中約１．４７μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４４：４については、体液中約０．８４μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４２：４については、体液中約１．２７μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４０：４については、体液中約２．６５μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４０：３については、体液中約１．３７μＭ、
フェニルアラニンについては、体液中約５２．９７μＭ、
ロイシン＋イソロイシンについては、体液中１９３．５６μＭ、
Ｃ１０については、体液中約０．１９μＭ、
Ｃ１６については、体液中約０．０６μＭ、
Ｃ８：１については、体液中約０．０３μＭ、
ＬＰＣ  ２４：０については、体液中約０．２５μＭ、
ＰＣ  ３０：０については、体液中約４．１８μＭ、
ＰＣ  ３４：４については、体液中約１．１１μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ３４：１については、体液中約９．８４μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ３４：２については、体液中約１１．４９μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ３６：２については、体液中約１１．７９μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ３６：３については、体液中約７．２０μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４０：６については、体液中約３．６８μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４２：２については、体液中約０．５６μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４２：３については、体液中約０．８９μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４４：３については、体液中約０．２１μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４４：５については、体液中約２．１７μＭ、
ＰＣ  ４２：０については、体液中約０．５６μＭ、
ＰＣ  ４２：２については、体液中約０．２２μＭ。
【００８９】
正常対象において、事前に決定された平均参照値は、以下であり得る：
チロシンについては、体液中約７５．００μＭ、
グルタミンについては、体液中約７４８．２７μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４４：６については、体液中約１．２１μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４４：４については、体液中約０．５０μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４２：４については、体液中約１．１２μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４０：４については、体液中約３．２４μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４０：３については、体液中約２．１０μＭ、
フェニルアラニンについては、体液中約４９．１７μＭ、
ロイシン＋イソロイシンについては、体液中１９７．５２μＭ、
Ｃ１０については、体液中約０．２９μＭ、
Ｃ１６については、体液中約０．０９μＭ、
Ｃ８：１については、体液中約０．０４μＭ、
ＬＰＣ  ２４：０については、体液中約０．７７μＭ、
ＰＣ  ３０：０については、体液中約４．１０μＭ、
ＰＣ  ３４：４については、体液中約１．４２μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ３４：１については、体液中約８．２０μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ３４：２については、体液中約９．２６μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ３６：２については、体液中約１２．６７μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ３６：３については、体液中約５．８３μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４０：６については、体液中約４．４５μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４２：２については、体液中約０．８２μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４２：３については、体液中約１．０８μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４４：３については、体液中約０．２２μＭ、
ＰＣ−Ｏ  ４４：５については、体液中約１．８２μＭ、
ＰＣ  ４２：０については、体液中約０．６５μＭ、
ＰＣ  ４２：２については、体液中約０．３５μＭ。
【００９０】
本発明の方法を用いて試験される対象は、例えば、ヒト又は動物、特に哺乳動物であることができる。典型的な動物は、例えば、愛玩動物のネコ又はイヌなどの伴侶動物であることができる。
【００９１】
当業者は、開示される本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書において説明する本発明のすべての特性を自由に組み合わせることができることを理解するであろう。特に、本発明の方法に関して説明される特性は、本発明の他の方法及び使用に適用されることができ、逆もまた同様である。
【００９２】
本発明の他の利点及び特性は、以下の実施例及び図面から明らかである。
【００９３】
表１は、コンピューター断層撮影によって測定された腹腔内脂肪／腹部脂肪比の常用対数（ｌｏｇ１０）値に基づいて評価される内臓脂肪含有量に基づいて４つの四分位数に層別化された募集コホートの臨床的特徴を示す。値は、平均値（±ＳＤ）として提示されている。ＡＬＡＴ＝アラニンアミノトランスフェラーゼ、ＡＳＡＴ＝アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ＢＭＩ＝ボディマス指数、ＧＧＴ＝γ−グルタミルトランスペプチダーゼ、ＨＤＬ−Ｃ＝高比重リポタンパク質コレステロール、ＨＯＭＡ−ＩＲ＝インスリン抵抗性のホメオスタシスモデル評価、ＬＤＬ−Ｃ＝低密度リポタンパク質コレステロール、ＭＡＰ＝平均動脈圧、ＮＥＦＡ＝非エステル型脂肪酸、ＴＧ＝トリグリセリド。
【００９４】
表２は、コンピューター断層撮影によって測定された腹腔内脂肪／腹部脂肪比の常用対数（ｌｏｇ１０）値に基づいて評価された内臓脂肪含有量に基づく４つの四分位数のそれぞれについて平均値（±ＳＤ）として提示された代謝産物濃度を示す。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】（四角印を用いて特定したように）内臓脂肪過多に関連する代謝パターンを特定するためにランダムフォレスト解析を用いた、１Ｈ  ＮＭＲ血漿プロファイルの統計学的再構成（ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を示す図である。ＧＰＣ＝グリセロリン脂質、ＰＵＦＡ＝多価不飽和脂肪酸、ＵＦＡ＝不飽和脂肪酸。
【図２】ランダムフォレスト解析によって評価された、内臓脂肪肥満を予測するにあたっての代謝産物の重要性及び頑健性を示す図である。ｎ＝１００００のランダムフォレスト生成の後の、統合平均（ｐｏｏｌｅｄ  ｍｅａｎ）精度の低下。変数の重要度が高いほど、対応する統合平均精度の低下の値は大きい。
【図３−１】選択された各代謝産物について、内臓脂肪が多い対象と内臓脂肪が少ない対象とでの代謝産物の差を示す図である。データは、コンピューター断層撮影によって測定された腹腔内脂肪体積の常用対数（ｌｏｇ１０）値によって評価された内臓脂肪含有量に基づく各四分位数についてプロットされている。１＝四分位数１、２＝四分位数２、３＝四分位数３、４＝四分位数４。
【図３−２】選択された各代謝産物について、内臓脂肪が多い対象と内臓脂肪が少ない対象とでの代謝産物の差を示す図である。データは、コンピューター断層撮影によって測定された腹腔内脂肪体積の常用対数（ｌｏｇ１０）値によって評価された内臓脂肪含有量に基づく各四分位数についてプロットされている。１＝四分位数１、２＝四分位数２、３＝四分位数３、４＝四分位数４。
【図３−３】選択された各代謝産物について、内臓脂肪が多い対象と内臓脂肪が少ない対象とでの代謝産物の差を示す図である。データは、コンピューター断層撮影によって測定された腹腔内脂肪体積の常用対数（ｌｏｇ１０）値によって評価された内臓脂肪含有量に基づく各四分位数についてプロットされている。１＝四分位数１、２＝四分位数２、３＝四分位数３、４＝四分位数４。
【実施例】
【００９６】
対象及び実験計画
臨床試験は、Ｃｅｎｔｒｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌｉｅｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｉｒｅ  Ｖａｕｄｏｉｓ（ＣＨＵＶ、Ｌａｕｓａｎｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において健康な肥満白人女性４０名に対して実行した観察研究であった。研究プロトコールは、ＣＨＵＶに設置された独立の倫理委員会によって承認された。参加者は、ＢＭＩが２８〜４０の間であり、年齢が２５〜４５歳の間であり、代謝疾患の特徴（２型糖尿病、心血管疾患、又は代謝症候群）を示していなかった。結果として生じる生物試料（血漿及び２４時間の尿試料）を、メタボローム解析を行うまで−８０℃で貯蔵した。
【００９７】
体組成評価
全身スキャンを行って、腹部脂肪分布及び全身組成の両方を測定した。全身スキャンは、装置によって自動的に決定されるスキャンモードを用いてＧＥ  Ｌｕｎａｒ  ｉＤＸＡシステム（ソフトウェアのバージョン：ｅｎＣＯＲＥバージョン１２．１０．１１３）において行った。ＤＸＡ測定のために、対象は全員、病衣を着用し、金属加工品はすべて取り外していた。ｉＤＸＡユニットは、ＧＥ  Ｌｕｎａｒ較正用ファントムを用いて毎日較正した。訓練された操作者が、患者位置決め及びデータ取得のための操作者用マニュアルに従って、すべてのスキャンを行った。１時間の予約時間の間に、各対象の全身スキャンを２回、各スキャンの間に再度位置決めして行った。ｅｎＣＯＲＥソフトウェア（バージョン１４．００．２０７）を用いて、スキャン画像を解析した。全身、腕、脚、胴、アンドロイド領域、及びガイノイド領域のＲＯＩは、ｅｎＣＯＲＥソフトウェアによって自動的に決定された（自動ＲＯＩ）。また、経験を積んだＤＸＡ操作者は、ＲＯＩ配置を検証し、必要である場合には、再度位置決めした（熟練者ＲＯＩ）。ｉＤＸＡスキャンに加えて、ウエスト及びヒップの測定も行った。
【００９８】
ＣＴ測定は、６４列多検出器ＣＴスキャナー（ＶＣＴ  Ｌｉｇｈｔｓｐｅｅｄ、ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＵＳＡ）を用いて行った。対象は、腕を頭上に伸ばし脚をクッションで持ち上げて、仰臥位で横になった。Ｌ４−Ｌ５椎骨のレベルで腹部の１つのスキャン画像（１０ｍｍ）を取得し、平方センチメートルで示される脂肪組織断面積を解析した。次の取得パラメーターを用いた：１２０Ｋｖ、１００〜２００ｍＡ、ｚ軸線量調節、及び視野５００ｍｍ。標準カーネルを用いて、スライス厚５ｍｍの体軸横断画像を再構成する。定量プロセスは、Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｗｉｎｄｏｗワークステーション（ＧＥ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）上で、皮下脂肪及び腹腔内脂肪を区分するための市販の半双方向アルゴリズムを使用する。
【００９９】
臨床化学。
通常の実験室的方法を用いて、血漿全体、ＨＤＬコレステロール及びＬＤＬコレステロール、トリグリセリド、尿酸塩、クレアチニン、ナトリウム濃度及びカリウム濃度、ＡＬＡＴ、ＡＳＡＴ、ＧＧＴ、グルコース、非エステル型脂肪酸、インスリン、並びに平均動脈血圧（ＭＡＰ）を決定した。以前に説明されている式（Ｍａｔｈｅｗｓら、１９８５）、すなわち、インスリン（μＵ／ｍＬ）×グルコース（ｍｍｏｌ／Ｌ）／２２．５に従って、インスリン抵抗性のホメオスタシスモデル評価（ＨＯＭＡ−ＩＲ）としてインスリン抵抗性状態を評価した。
【０１００】
試料調製及び１Ｈ−ＮＭＲ分光学的解析
重水素化リン酸緩衝液（最終濃度０．２ＭのＫＨ２ＰＯ４）２００μＬを入れた５ｍｍ  ＮＭＲチューブにヘパリン血漿試料（４００μＬ）を導入した。重水素は、ロック物質として使用した。代謝プロファイルは、３００Ｋで、５ｍｍ極低温インバースプローブを装備されたＢｒｕｋｅｒ  Ａｖａｎｃｅ  ＩＩＩ  ６００ＭＨｚ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ、Ｒｈｅｉｎｓｔｅｔｔｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて測定した。水抑制を用いた標準的な１Ｈ−ＮＭＲ一次元パルスシーケンス（ＲＤ＝４秒）、水抑制を用いたカー・パーセル・マイボーム・ギル（ＣＰＭＧ）スピンエコーシーケンス（ＲＤ＝４秒）、及び拡散修正（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ−ｅｄｉｔｅｄ）シーケンス（ＲＤ＝４秒）を、各血漿試料について取得した。各一次元実験について、９８Ｋのデータポイントを用いてスキャン画像３２枚を集めた。フーリエ変換の前に、ＴＯＰＳＰＩＮ（バージョン２．１、Ｂｒｕｋｅｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）ソフトウェアパッケージを用いて、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを処理した。取得したＮＭＲスペクトルを手動で位相補正（ｐｈａｓｅｄ）及びベースライン補正し、血漿スペクトルの場合、δ５．２３９６でのα−グルコースのアノマープロトンの化学シフトを基準とした。特定の代謝産物への１Ｈ−ＮＭＲ共鳴の割付は、施設内で作成した本発明者らの純粋化合物ＮＭＲデータベースと照合し、文献データ（Ｆａｎ，Ｔ．Ｗ．（１９９６）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ２８、１６１〜２１９；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．ら（１９９５）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６７、７９３〜８１１）を用いることによって達成した。代謝産物同定は、２Ｄ  １Ｈ−１Ｈ相関分光法（ＣＯｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐＹ）（ＣＯＳＹ）（Ｈｕｒｄ，Ｒ．Ｅ．（１９９０）Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．８７、４２２〜４２８）、１Ｈ−１Ｈ全相関分光法（ＴＯｔａｌ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ＳｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐＹ）（ＴＯＣＳＹ）（Ｂａｘ，Ａ．及びＤａｖｉｓ（１９８５）Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．６５、３５５〜３６０）、及び１Ｈ−１３Ｃ異核種単一量子相関（Ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ）（ＨＳＱＣ）（Ｂｏｄｅｎｈａｕｓｅｎ，Ｇ．及びＲｕｂｅｎ（１９８０）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ６９、１８５〜１８９）ＮＭＲ技術によって確認した。
【０１０１】
Ｂｉｏｃｒａｔｅｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ＩＤＱ（商標）キットによる解析のための試料調製
以前に公開されているようにして（Ｒｏｍｉｓｃｈ−Ｍａｒｇｌ，Ｗ．、Ｃ．Ｐｒｅｈｎ、Ｒ．Ｂｏｇｕｍｉｌ、Ｃ．Ｒｏｈｒｉｎｇ、Ｋ．Ｓｕｈｒｅ、Ｊ．Ａｄａｍｓｋｉ、Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ．  Ｍｅｔａｂｏｎｏｍｉｃｓ、２０１１。最初にオンライン出版）、Ｂｉｏｃｒａｔｅｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ製Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ＩＤＱ（商標）キットをＥＤＴＡ血漿試料のために使用した。ウェルプレートの準備並びに試料の適用及び抽出は、製造業者の取扱い説明書に従って実施した。最終体積１０μｌの血漿を、同位体で標識した内部標準を含有する用意された９６ウェルプレートに載せた。エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）モードで作働するＴｕｒｂｏＶイオンソースを取り付けられた３２００  Ｑ  ＴＲＡＰ質量分析計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）に連結されたＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００超高圧液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）システム（Ｄｉｏｎｅｘ  ＡＧ、Ｏｌｔｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、液体クロマトグラフィーを実現した。０〜２．４分：３０μｌ／分、２．４〜２．８分：２００μｌ／分、２．９〜３分：３０μｌ／分という流速勾配を用いて直接的に注入することによって、試料抽出物（２０μｌ）を２回（正のＥＳＩモード及び負のＥＳＩモードで）注入した。ＭＳソースパラメーターは次のように設定した：脱溶媒和温度（ＴＥＭ）：２００℃、高電圧：−４５００Ｖ（ＥＳＩ−）、５５００Ｖ（ＥＳＩ＋）、カーテン（ＣＵＲ）ガス及びネブライザーガス（ＧＳ１及びＧＳ２）：窒素；それぞれ２０、４０、及び５０ｐｓｉ、窒素衝突ガス圧：５ｍＴｏｒｒ。ＭＳ／ＭＳ取得は、アッセイでスクリーニングした１６３種の代謝産物に対して最適化されたデクラスタリング電位の値を用いて、スケジュール化された反応モニタリング（ＳＲＭ）モードで実現した。生データファイル（Ａｎａｌｙｓｔソフトウェア、バージョン１．５．１；ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、提供される解析ソフトウェアＭｅｔＩＱに取り込ませて、代謝産物濃度を算出した。検出可能な代謝産物すべてのリストは、Ｂｉｏｃｒａｔｅｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｕｓｔｒｉａ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｃｒａｔｅｓ．ｃｏｍ）から入手可能である。
【０１０２】
多変量データ解析
血漿ＮＭＲスペクトルを、施設内で開発したＭＡＴＬＡＢルーチンを用いて、δ４．６８〜５．１０の間の水残基シグナルを除いてδ０．２〜１０．０の範囲に渡る２２Ｋのデータポイントに変換した。計量化学解析の前に、化学シフト強度を指定範囲内の全強度の合計に対して標準化した。ソフトウェアパッケージＳＩＭＣＡ−Ｐ＋（バージョン１２．０．１、Ｕｍｅｔｒｉｃｓ  ＡＢ、Ｕｍｅａ、Ｓｗｅｄｅｎ）及び施設内で開発したＭＡＴＬＡＢ（Ｔｈｅ  ＭａｔｈＷｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ、ＵＳＡ）ルーチンを用いて、計量化学解析を行った。代謝プロファイル間の類似性の存在を検出するために、主成分分析（ＰＣＡ）（Ｗｏｌｄ，Ｓ．ら（１９８７）Ｃｈｅｍｏｍ．Ｉｎｔｅｌｌ．Ｌａｂ．Ｓｙｓｔ．２、３７〜５２）、潜在的構造投影方法（Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌａｔｅｎｔ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）（ＰＬＳ）（Ｗｏｌｄ，Ｓ．ら（１９８７）ＰＬＳ  Ｍｅｅｔｉｎｇ、Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ）、及び潜在的構造垂直投影方法（Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｌａｔｅｎｔ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）（Ｏ−ＰＬＳ）（Ｔｒｙｇｇ，Ｊ．及びＷｏｌｄ（２００３）Ｊ．Ｃｈｅｍｏｍ．１７、５３〜６４）を使用した。七重交差検証を用いて、モデルの妥当性を評価した（Ｃｌｏａｒｅｃ，Ｏ．ら（２００５）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７７、５１７〜５２６）。七重交差検証サイクルにおいて、予測される試料からＯ−ＰＬＳ−ＤＡモデルの分類精度を確立した。
【０１０３】
ターゲットＭＳのデータは、Ｒ環境（Ｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｅ  Ｔｅａｍ（２０１１）．Ｒ：  Ａ  ｌａｎｇｕａｇｅ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．  Ｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ．  ＩＳＢＮ  ３−９０００５１−０７−０、ＵＲＬ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．Ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ／．）で動くパッケージ「ランダムフォレスト（ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔ）」（Ａ．Ｌｉａｗ及びＭ．Ｗｉｅｎｅｒ（２００２）．Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍＦｏｒｅｓｔ．  Ｒ  Ｎｅｗｓ２（３）、１８〜２２．）を用いることにより、ランダムフォレストによって解析した。確認のための単変量有意性検定も、Ｒにおいて行った。
【０１０４】
内臓脂肪過多の分布が正常ではないため、後続のメタボロミクス解析には次のパラメーターを使用した：内臓脂肪含有量、腹腔内脂肪／皮下脂肪比（比１）、又は腹腔内脂肪／腹部脂肪比（比２）の対数変換値。
【０１０５】
コホートの人体計測的特徴及び生化学的特徴は、ＣＴを用いて測定された腹腔内脂肪／腹部脂肪比（比２）の常用対数（ｌｏｇ１０）値に基づく４つの四分位数（Ｑ１〜４、ｎ＝１０）への層別化に従って、表１に示している。（Ｑ１）と比較して、内臓脂肪過多の程度が元も高い（Ｑ４）対象の方が、空腹時血糖（ｐ＜０．１０）及びインスリン（ｐ＜０．０５）、並びにＨＯＭＡ−ＩＲ（ｐ＜０．０５）が高かった。内臓脂肪過多に基づいて対象を層別化するには、腹腔内脂肪／皮下脂肪比又は腹腔内脂肪／腹部脂肪比の対数変換値を使用することが好ましかった。その理由は、これらのパラメーターがＢＭＩ、ヒップ、ウエスト、ＡＬＡＴ、ＭＡＰ、及び熱量測定指数から独立していることが示されていたが、腹腔内脂肪体積の対数変換値は独立していなかったためであった。このコホートにおいて、ＨＤＬ、ＬＤＬ、及び総コレステロールは、群間で統計学的に異なっていなかったことが興味深い。
【０１０６】
内臓脂肪沈着の表現型的徴候を特定するために、１Ｈ−ＮＭＲ及びターゲットＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるメタボローム手法を用いて、血漿試料を解析した。解析は、空腹時血漿試料を用いて実行した。採取した試料のＯＰＬＳ解析により、血漿脂質と内臓脂肪沈着との間にかすかではあるが有意ないくつかの関連が示された（Ｒ２Ｘ：０．６８；Ｒ２Ｙ：０．５０６；Ｑ２Ｙ：０．１６７）。ランダムフォレスト解析も使用して、特定の血漿脂質と内臓脂肪状態との統計学的関連を確認した（図１）。図１により、グリセロリン脂質及び脂肪酸飽和パターンの変化が顕著な特定の血漿脂質リモデリングが提唱された。
【０１０７】
したがって、ターゲットＬＣ−ＭＳ／ＭＳメタボノミクスを使用して、アミノ酸、糖、アシルカルニチン、スフィンゴ脂質、及びグリセロリン脂質を含む１６３種の代謝産物の構造情報及び定量的測定を提供した。ＯＰＬＳ解析を用いることによって、内臓脂肪肥満の代謝徴候を決定することが可能であった（Ｒ２Ｘ：０．２９；Ｒ２Ｙ：０．６８；Ｑ２Ｙ：０．３２）。
【０１０８】
頑健性のより高いマーカーを選択するために、変数重要度の特性として「アウトオブバッグ」データの平均精度低下率（％  Ｍｅａｎ  ｄｅｃｒｅａｓｅ  ａｃｃｕｒａｃｙ）を使用した。このようにして、内臓脂肪状態（Ｑ１対Ｑ４）に基づいて対象をよりうまく区別する変数を決定することができた。Ｑ１、Ｑ４の両方とも、腹腔内脂肪体積、比１、及び比２のいずれかの対数変換値を用いて評価した。また、各来診を別々に考えることによって、代謝の日間変動を評価するためにモデリングを試験した（データ不掲載）。最終的に、２６種類の代謝産物を、内臓脂肪肥満によって対象を分類するための重要なものとして確保した（図２、３−１、３−２、３−３）。内臓脂肪過多は、グルタミン、ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン、及びチロシンを含めて、循環血中のアミノ酸の濃度上昇と関連していた。これらのパターンは、パルミトイルカルニチン（Ｃ１６）、カプロイルカルニチン（Ｃ１０）  オクテノイルカルニチン（Ｃ８：１）を含むアシルカルニチン、並びにリゾホスパチジルコリンＬＰＣ  ２４：０、及びＰＣ  ３０：０、ＰＣ  ３４：４を含むジアシルリン脂質の高濃度に関連していた。さらに、内臓脂肪過多は、アシルエーテルＰＣ−Ｏ  ３６：３、ＰＣ−Ｏ  ４０：３、ＰＣ−Ｏ  ４０：４、ＰＣ−Ｏ  ４０：６、ＰＣ−Ｏ  ４２：２、ＰＣ−Ｏ  ４２：３、ＰＣ−Ｏ  ４２：４、ＰＣ−Ｏ  ４４：３、ＰＣ−Ｏ  ４４：４、ＰＣ−Ｏ  ４４：６、並びに２種のジアシルホスホコリン（ＰＣ  ４２：０及びＰＣ  ４２：２）の喪失が顕著であった。上記の特徴を有する（ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ）各成分の個々の判別能力を評価するために、内臓脂肪肥満群間でウィルコクソン順位和検定を行った（代謝産物はすべて、試験された記述子（ｄｅｓｃｒｉｐｔｏｒ）、すなわち比２の常用対数（ｌｏｇ１０）値に基づいて、表２に挙げている）。
【０１０９】
図２は、内臓脂肪含有量の常用対数（ｌｏｇ１０）値、比１の常用対数（ｌｏｇ１０）値、又は比２の常用対数（ｌｏｇ１０）値を用いて、内臓脂肪過多の分類において選択されたバイオマーカーをそれらの重みと共に要約したものである。これらのマーカーは、交差検証モードで内臓脂肪に対して０．９０の感度及び特異性（Ｓｅｎｃｖ、Ｓｐｅｃｖ）を示した。
【０１１０】
【表１】
2015521730.tif 000003
【０１１１】
【表２】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【国際調査報告】
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