(57)【要約】  都市固形廃棄物（MSW）を処理する方法が提供され、それにより、同時に行なわれる廃棄物の酵素的加水分解および微生物発酵が、生分解性構成要素の液化ならびに微生物代謝生成物の蓄積を生じさせる。続いて、液化された生分解性構成要素が分解可能でない固形物から分離されて、バイオ液体をもたらし、該バイオ液体は、そのうちの大部分が酢酸塩、エタノール、酪酸塩、乳酸塩、ギ酸塩またはプロピオン酸塩のいずれかの組み合わせを含む、大きな割合の溶存固形物を含むことを特徴とする。このバイオ液体はそれ自体、新規なバイオメタン基質組成物であり、バイオメタンへの非常に速い変換を可能にする。このバイオ液体を用いる、ならびに有機材料の同時に行なわれる酵素的加水分解および微生物発酵により生成される他のバイオメタン基質組成物を用いる、バイオメタン製造の方法がさらに提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
(i)微生物発酵により予備調整され、それにより非水含量の少なくとも40重量％が溶存揮発性固形物として存在し、該溶存揮発性固形物は少なくとも25重量％の酢酸塩、酪酸塩、エタノール、ギ酸塩、乳酸塩および/またはプロピオン酸塩のいずれかの組みわせを含む、有機液体バイオメタン基質を準備するステップ、
(ii)該液体基質を、嫌気的消化システムに移すステップ、それに続く
(iii)該液体基質の嫌気的消化を行い、バイオメタンを生成させるステップ
を含む、バイオメタンを製造する方法。
【請求項２】
前記微生物発酵が、pH5.5より低い条件で行なわれる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記有機液体バイオメタン基質が、未分類MSWの、同時に行なわれる酵素的加水分解および微生物発酵により生成される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記有機液体バイオメタン基質が、前処理されたリグノセルロース系バイオマスの、同時に行なわれる酵素的加水分解および微生物発酵により生成される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記有機液体バイオメタン基質が、オートクレーブ処理により未分類MSWから得られる液化された有機材料の、同時に行なわれる酵素的加水分解および微生物発酵により生成される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
前記有機液体バイオメタン基質が、少なくとも8％の総固形物を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記嫌気的消化システムが、固定化フィルター嫌気的消化装置である、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
前処理されたリグノセルロース系バイオマスの酵素的加水分解および微生物発酵により生成される有機液体バイオメタン基質であって、
非水含量の少なくとも40重量％が溶存揮発性固形物として存在し、該溶存揮発性固形物は少なくとも25重量％の酢酸塩、酪酸塩、エタノール、ギ酸塩、乳酸塩および/またはプロピオン酸塩のいずれかの組みわせを含む
ことを特徴とする、上記液体バイオメタン基質。
【請求項９】
少なくとも8％の総固形物含量を有する、請求項7に記載の液体バイオメタン基質。
【請求項１０】
25℃にて15mg/L未満の溶存メタン含量を有する、請求項7に記載の液体バイオメタン基質。
【請求項１１】
少なくとも10％の総固形物含量を有する、請求項7に記載の液体バイオメタン基質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオメタン製造のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
特に一般家庭廃棄物、レストランおよび食品加工施設からの廃棄物、ならびにオフィスビルからの廃棄物を含む都市固形廃棄物（MSW）は、エネルギー、燃料および他の有用な生成物へとさらに加工することができる、非常に大きな構成要素の有機物質を含む。現在のところ、利用可能なMSWのうちの低い割合のみがリサイクルされ、大部分はゴミ埋立地へと捨てられる。
【０００３】
その内在するエネルギー潜在力の回収、およびまた、リサイクル可能な材料の回収を最大化するために、固形廃棄物を処理する効率的かつ環境に優しい方法の開発に多大な関心が生じている。「廃棄物発電」（waste to energy）処理での1つの目立った困難は、MSWの不均一性であった。固形廃棄物は、典型的に、プラスチック、ガラス、金属および他の分解可能でない物質と混ぜられた、有機的な分解可能材料の多量の構成要素を含む。未分類廃棄物は、地域暖房システムに頼っているデンマークおよびスウェーデンなどの国で広く実践されているように、焼却に直接用いることができる（Strehlik 2009）。しかしながら、焼却法は、環境的にマイナスの結果を伴い、原材料の有効なリサイクルを達成しない。リサイクルと組み合わせたMSWの分解可能な構成要素のクリーンかつ効率的な利用は、典型的に、分解可能な材料を分解可能でない材料から分離するための何らかの仕分け法を必要とする。
【０００４】
MSWの分解可能な構成要素は、熱化学的方法および生物学的方法の両方を用いて「廃棄物発電」処理で利用することができる。MSWは、熱分解または他の様式の熱化学的ガス化に供することができる。極端に高い温度で熱分解された有機廃棄物は、タールおよびメタンなどの揮発性成分ならびに直接的焼却に関連するものよりも毒性の低い結果を伴って燃やすことができる固形残留物または「コークス」を生成する。あるいは、有機廃棄物は、合成燃料にさらに変換することができる、一酸化炭素、二酸化炭素および水素を含む「合成ガス」（syngas）に熱的に変換することができる。例えば、総説としてMalkow 2004を参照されたい。
【０００５】
MSWの分解可能な構成要素の変換のための生物学的方法としては、エタノールなどの特定の有用な最終生成物を生成するための発酵が挙げられる。例えば、WO2009/150455；WO2009/095693；WO2007/036795；Ballesteros et al. 2010；Li et al 2007を参照されたい。
【０００６】
あるいは、生物学的変換は、バイオメタンまたは「バイオガス」を生成するための嫌気的消化により達成することができる。例えば、総説として、Hartmann and Ahring 2006を参照されたい。事前分類されたMSWの有機構成要素は、直接的にバイオメタンに変換できるか（例えば、US2004/0191755を参照されたい）、または追加の水の存在下で細かく刻むことを含む、比較的単純な「パルプ化」処理後に変換することができる（例えば、US2008/0020456を参照されたい）。
【０００７】
しかしながら、有機構成要素を得るためのMSWの事前分類は、典型的に、コストがかかり、非効率的であり、かつ実現困難である。廃棄源分類（source-sorting）は、大型のインフラ施設および運営費ならびに廃棄物が回収されるコミュニティからの積極的な参加および支援を必要とし、そのような参加は近代的な都市化社会では達成するのが難しいことが証明されている活動である。機械的分類は、典型的に資本集約的であり、かつ少なくとも30％および多くの場合にはもっと大きな程度での有機材料の大幅なロスをさらに伴う。例えば、Connsonni 2005を参照されたい。
【０００８】
分類システムに伴うこれらの課題の一部は、未分類の廃棄物中の有機的な分解可能構成要素の液化の使用を介して成功裏に回避されてきた。液化された有機材料は、分解可能でない材料から容易に分離することができる。ポンプで汲み上げ可能なスラリーへと液化されれば、有機構成要素は熱化学的プロセスまたは生物学的変換プロセスで容易に用いることができる。分解可能構成要素の液化は、高圧高温「オートクレーブ」処理を用いて広く報告されてきた。例えば、US2013/0029394；US2012/006089；US20110008865；WO2009/150455；WO2009/108761；WO2008/081028；US2005/0166812；US2004/0041301；US 5427650；US 5190226を参照されたい。
【０００９】
分解可能有機構成要素の液化に対する根本的に異なるアプローチは、生物学的プロセスを用いて、具体的には酵素的加水分解を介して達成できるものである。Jensen et al. 2010；Jensen et al. 2011；Tonini and Astrup 2012；WO2007/036795；WO2010/032557を参照されたい。
【００１０】
酵素的加水分解は、分解可能有機構成要素の液化のための「オートクレーブ」法に対して固有の利点を提供する。酵素的液化を用いると、MSW処理は、比較的安価な設備および比較的低い温度で行なわれる非加圧反応を用いて、連続的な様式で実施することができる。対照的に、「オートクレーブ」処理は、バッチ様式で実施しなければならず、一般的にずっと高い資本コストを伴う。
【００１１】
MSWに含まれる（MSW-bourne）病原性微生物により引き起こされる考えられる健康リスクを低減するための「滅菌」に対する認識されている必要性は、「オートクレーブ」液化法の優位を支持する一般的な論題であった。例えば、WO2009/150455；WO2000/072987；Li et al. 2012；Ballesteros et al. 2010；Li et al. 2007を参照されたい。同様に、酵素的液化は少なくとも90〜95℃の比較的高温までの熱的前処理を必要とすると以前に信じられていた。この高温は、部分的には未分類MSWの「滅菌」を行なうために、また分解可能有機構成要素を柔軟化し、紙製品を「パルプ化」することができるように、必須であると考えられていた。Jensen et al. 2010；Jensen et al. 2011；Tonini and Astrup 2012を参照されたい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】国際公開第2009/150455号
【特許文献２】国際公開第2009/095693号
【特許文献３】国際公開第2007/036795号
【特許文献４】米国特許出願公開第2004/0191755号
【特許文献５】米国特許出願公開第2008/0020456号
【特許文献６】米国特許出願公開第2013/0029394号
【特許文献７】米国特許出願公開第2012/006089号
【特許文献８】米国特許出願公開第20110008865号
【特許文献９】国際公開第2009/150455号
【特許文献１０】国際公開第2009/108761号
【特許文献１１】国際公開第2008/081028号
【特許文献１２】米国特許出願公開第2005/0166812号
【特許文献１３】米国特許出願公開第2004/0041301号
【特許文献１４】米国特許第5427650号
【特許文献１５】米国特許第5190226号
【特許文献１６】国際公開第2010/032557号
【特許文献１７】国際公開第2000/072987号
【発明の概要】
【００１３】
本発明者らは、高温の前処理を行なわずに、未分類MSWの安全な酵素的液化を達成できることを見出した。実際には、予想とは反対に、高温の前処理は不必要であるだけでなく、廃棄物中で繁殖している環境微生物を殺すので、積極的に有害であり得る。45℃超の好熱性条件での酵素的加水分解と同時に微生物発酵を促進することは、「環境」微生物を用いるかまたは選択的に「接種された」生物を用いて、「有機物捕捉」（organic capture）を改善する。つまり、同時に行なわれる好熱性微生物発酵は、「バイオ液体」（bioliquid）（酵素的加水分解により取得される液化された分解可能な構成要素に対する本発明者らの用語である）の有機物収量を安定に増加させる。これらの条件下で、MSW中で典型的に見出される病原性微生物は繁殖しない。例えば、Hartmann and Ahring 2006；Deportes et al. 1998；Carrington et al. 1998；Bendixen et al. 1994；Kubler et al. 1994；Six and De Baerre et al. 1992を参照されたい。これらの条件下では、典型的なMSWに含まれる（MSW-bourne）病原体は、どこにでも存在する乳酸菌および他の安全な生物により容易に打ち負かされる。
【００１４】
酵素的加水分解からの「有機物捕捉」を改善することに加えて、乳酸菌、または酢酸、エタノール、ギ酸、酪酸、乳酸、ペンタン酸（pentanoate）またはヘキサン酸（hexanoate）産生微生物のいずれかの組み合わせを用いた、同時に行なわれる微生物発酵は、バイオ液体を「予備調整」（pre-condition）して、バイオ液体をバイオメタン生成のための基質としてさらに効率的にする。微生物発酵は、酵素的液化のみにより生成されたバイオ液体と比較して、懸濁された固形物よりも溶解された固形物が概ね増大した割合（％）で含まれるバイオ液体を生成させる。比較的長鎖の多糖は、一般的に、微生物「予備調整」により、より徹底的に分解される。同時に行なわれる微生物発酵および酵素的加水分解は、バイオポリマーを容易に利用可能な基質へと分解し、さらに、一次基質から短鎖カルボン酸および/またはエタノールへの代謝的変換を達成する。高い割合（％）の微生物代謝生成物を含む、結果として得られるバイオ液体は、バイオメタン基質をもたらし、バイオメタン基質は、律速的「加水分解」ステップを有効に回避し（例えば、Delgenes et al. 2000; Angelidaki et al. 2006; Cysneiros et al. 2011を参照されたい）、かつ特に非常に速い「固定化フィルター」嫌気的消化システムを用いて、メタン製造に対してさらなる利点を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】実施例5からのEC12Bバイオ液体を接種することにより刺激される、同時に行なわれる酵素的加水分解および微生物発酵での総乾物の割合（％）としての上清中に回収された乾物として表した乾物の変換率を表す図である。
【図２】実施例5からのバイオ液体の添加により誘導される、同時に行なわれる酵素的加水分解および発酵後に上清中に回収される細菌代謝生成物を表わす図である。
【図３】REnescience試験反応器の図示的表示である。
【図４】実証用プラント設定の模式図である。
【図５】処理されたMSW 1kg当たりのVS kgとして表される種々の時間の間のバイオ液体中の有機物捕捉を表わす図である。
【図６】バイオ液体中の溶存VSの割合（％）として、ならびに実験中の様々な時点での好気性細菌カウントとして表わされる細菌代謝生成物を表わす図である。
【図７】実施例3からのバイオ液体中で同定された細菌種の分布を表わす図である。
【図８】実施例5に記載される試験からサンプリングされたEC12B中の13種類の優勢な細菌の分布を表わす図である。
【図９】実施例5からのバイオ液体を用いた、バイオメタン製造上昇（ramp up）および下降（ramp down）を表わす図である。
【図１０】実施例2からの「高乳酸塩」バイオ液体のバイオメタン製造の「上昇」（ramp up）および「下降」（ramp down）特性決定を表わす図である。
【図１１】実施例2からの「低乳酸塩」バイオ液体のバイオメタン製造の「上昇」および「下降」特性決定を表わす図である。
【図１２】加水分解されたコムギワラバイオ液体のバイオメタン製造の「上昇」特性決定を表わす図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一部の実施形態では、本発明は、以下のステップを含む、都市固形廃棄物（MSW）を処理する方法を提供する：
(i) 5〜40％の非水含量（non-water content）、かつ45〜75℃の温度にてMSWを準備するステップ、
(ii)廃棄物の生分解可能な部分の液化および微生物代謝生成物の蓄積をもたらす45〜75℃の温度での、微生物発酵と同時に行なわれるMSWの生分解可能な部分の酵素的加水分解ステップ、それに続く
(iii)廃棄物の液化された生分解可能な部分を生分解可能でない固形物から分類して、そのうちの少なくとも25重量％が酢酸塩、酪酸塩、エタノール、ギ酸塩、乳酸塩および/またはプロピオン酸塩のいずれかの組みわせを含む、溶存揮発性固形物を含むことを特徴とするバイオ液体を生成させるステップ、それに続く
(iv)バイオ液体の嫌気的消化によりバイオメタンを生成させるステップ。
【００１７】
一部の実施形態では、本発明は、
非水含量の少なくとも40重量％が溶存揮発性固形物として存在し、該溶存揮発性固形物は、少なくとも25重量％の酢酸塩、酪酸塩、エタノール、ギ酸塩、乳酸塩および/またはプロピオン酸塩のいずれかの組みわせを含む
ことを特徴とする、都市固形廃棄物（MSW）の酵素的加水分解および微生物発酵により生成される有機液体バイオガス基質を提供する。
【００１８】
一部の実施形態では、本発明は、以下のステップを含む、バイオガスの製造方法を提供する：
(i)微生物発酵により予備調整され、それにより非水含量の少なくとも40重量％が溶存揮発性固形物として存在し、該溶存揮発性固形物は少なくとも25重量％の酢酸塩、酪酸塩、エタノール、ギ酸塩、乳酸塩および/またはプロピオン酸塩のいずれかの組みわせを含む、有機液体バイオガス基質を準備するステップ、
(ii)該液体基質を、嫌気的消化システムに移すステップ、それに続く
(iii)該液体基質の嫌気的消化を行い、バイオメタンを生成させるステップ。
【００１９】
嫌気的消化に従事する微生物群落の代謝動態は複雑である。Supaphol et al. 2010；Morita and Sasaki 2012；Chandra et al. 2012を参照されたい。メタンバイオガスの生成のための典型的な嫌気的消化（AD）では、微生物により媒介される生物学的プロセスは、4つの主要なステップを実現する：生物学的高分子から構成モノマーまたは他の代謝生成物への加水分解；それにより短鎖炭化水素酸およびアルコールが生成される、酸生成（acidogenesis）；それにより利用可能な栄養素が酢酸、水素および二酸化炭素へと異化される、酢酸生成（acetogenesis）；ならびにそれにより酢酸および水素が特殊な古細菌によりメタンおよび二酸化炭素へと異化される、メタン生成（methanogenesis）。加水分解ステップは、典型的に、律速的である。例えば、Delgenes et al. 2000；Angelidaki et al. 2006；Cysneiros et al. 2011を参照されたい。
【００２０】
したがって、バイオメタン製造のための基質の準備では、何らかの形態の前処理を通して、これらが事前に加水分解されていることが有利である。一部の実施形態では、本発明の方法は、最終的なバイオメタン製造のための迅速な生物学的前処理として、ならびにそれでなければ未分類であるMSWから分解可能な有機的構成要素を分類する方法としての両方で、MSWの微生物発酵と酵素的加水分解とをを組み合わせる。
【００２１】
生物学的前処理は、廃棄源分類されたMSWの有機構成要素を含む固形バイオメタン基質を用いて報告されてきた。例えば、Fdez-Guelfo et al. 2012；Fdez-Guelfo et al. 2011 A；Fdez-Guelfo et al. 2011 B；Ge et al. 2010；Lv et al. 2010；Borghi et al. 1999を参照されたい。嫌気的消化からの最終的なメタン収量の改善は、複合バイオポリマーの分解の増大および揮発性固形物の可溶化の増大の結果として報告されている。しかしながら、これらの従前に報告されている方法により達成される揮発性固形物の可溶化のレベルおよび揮発性脂肪酸への変換のレベルは、本発明の方法により達成されるレベルに近づいてさえいない。例えば、Fdez-Guelfo et al. 2011 Aには、MSWから事前分類された有機物区分の様々な生物学的前処理を介して達成された、揮発性固形物の可溶化での10〜50％の相対的改善が報告され、これは、揮発性固形物の約7〜10％の可溶化の最終的な絶対レベルに相当する。対照的に、本発明の方法は、少なくとも40％の溶存揮発性固形物を含む液体バイオメタン基質を生成する。
【００２２】
二段階の嫌気的消化システムもまた報告されており、その中の第1段階プロセスは、MSWの廃棄源分類された有機構成要素を含むバイオメタン基質および他の特殊化された生物起源基質を加水分解する。典型的には好熱性である第1の嫌気的段階の間、長鎖ポリマーが分解され、揮発性脂肪酸が生成される。これに、メタン生成および酢酸生成が優位を占める、物理的に分離された反応器中で行なわれる第2段階嫌気的段階が続く。報告された二段階嫌気的消化システムは、典型的に、7％未満の総固形物を有する、廃棄源分類された、特殊化した生物起源基質を利用してきた。例えば、Supaphol et al. 2011；Kim et al. 2011；Lv et al. 2010；Riau et al. 2010；Kim et al. 2004；Schmit and Ellis 2000；Lafitte-Trouque and Forster 2000；Dugba and Zhang 1999；Kaiser et al. 1995；Harris and Dague 1993を参照されたい。より最近になって、いくつかの二段階ADシステムが報告され、これらは、10％もの総固形物レベルでの、廃棄源分類された、特殊化した生物起源基質を利用する。例えば、Yu et al. 2012；Lee et al. 2010；Zhang et al. 2007を参照されたい。確かに、報告された二段階嫌気的消化システムは、基質として未分類MSWの使用をこれまで企図しておらず、ましてや高固形物液体バイオメタン基質を製造するためではない。二段階嫌気的消化は、追加の固形物を継続的に供給し、かつ第1段階の反応器からの揮発性脂肪酸を継続的に除去しながら、固形物基質を変換しようとしている。
【００２３】
いずれの好適な固形廃棄物も、本発明の方法を実施するために用いることができる。当業者には理解されるであろう通り、「都市固形廃棄物」（MSW）との用語は、都市で典型的に入手可能な廃棄物区分を意味するが、これは実際にいずれかの地方自治体からもたらされる必要はない。MSWは、セルロース系、植物、動物、プラスチック、金属、またはガラス廃棄物のいずれかの組み合わせであり得、限定するものではないが、以下のもののいずれか1種以上が挙げられる：任意により何らかの中央分類、細断またはパルプ化デバイス（Dewaster(登録商標)またはreCulture(登録商標)など）で処理された、通常の地方自治体収集システムで収集されたゴミ；有機物区分と紙を多く含む区分との両方を含む、一般家庭からの分類された固形廃棄物；レストラン産業、食品加工業、一般産業などの産業由来の廃棄物区分；製紙産業からの廃棄物区分；リサイクル施設からの廃棄物区分；食品または飼料産業からの廃棄物区分；医薬品産業からの廃棄物区分；農業または農業関連セクター由来の廃棄物区分；糖またはデンプンを多く含む製品の加工からの廃棄物区分；汚染されたかまたは他の様式で悪くなった、食品または飼料目的には利用できなくなった穀物、イモ類およびビートなどの農業生産物；庭園ゴミ。
【００２４】
MSWは本来、典型的に不均一である。国家間の比較に対する確固たる基盤を与える廃棄物材料の組成に関する統計は、広く知られていない。正しいサンプリングおよび特性決定のための基準および操作手順は、標準化されていない。実際には、わずかな数の標準化されたサンプリング法のみは報告されている。例えば、Riber et al., 2007を参照されたい。少なくとも一般家庭廃棄物の場合には、組成は季節ごとおよび地域による変動を示す。例えば、Dahlen et al., 2007；Eurostat, 2008；Hansen et al., 2007b；Muhle et al., 2010；Riber et al., 2009；Simmons et al., 2006；デンマーク環境保護庁（The Danish Environmental Protection agency）, 2010を参照されたい。一般家庭廃棄物の組成での地域的な変動は、地方自治体間の200〜300kmの短い距離にわたってさえも、報告されている（Hansen et al., 2007b）。
【００２５】
一部の実施形態では、MSWを「未分類の」廃棄物として処理する。「未分類の」との用語は、本明細書中で用いられる場合、MSWが別個の区分に実質的に分別されず、それによって生物起源材料がプラスチックおよび/または他の無機材料から実質的に分離されないプロセスを意味する。一部の大型物体または金属物体の除去にもかかわらず、かつプラスチックおよび/または無機材料のいくぶんかの分離にかかわらず、廃棄物は、本明細書中で用いられる場合、「未分類」であり得る。本明細書中で用いる場合、「未分類の」廃棄物とは、乾燥重量の15％未満が非生物起源材料である、生物起源区分をもたらすように、実質的に分別されていない廃棄物を意味する。乾燥重量のうちの15％超が非生物起源材料である生物起源材料と非生物起源材料との混合物を含む廃棄物は、本明細書中で用いられる場合、「未分類」である。典型的には、未分類MSWは、生物起源廃棄物を含み、生物起源廃棄物とは、生物学的に変換可能な物質に分解することができる廃棄物を意味し、食品および台所廃棄物、紙および/または段ボール含有材料、食品廃棄物など；ガラス、瓶、缶、金属、および一部のプラスチックをはじめとするリサイクル可能な材料；実際にはそれ自体リサイクル可能ではないが、ゴミ固形燃料（refuse derived fuel）の形態で発熱量を与え得る他の可燃性材料；ならびにセラミック、岩、および様々な形態のがれきをはじめとする不活性材料が挙げられる。
【００２６】
一部の実施形態では、MSWは、「分類済の」廃棄物として処理できる。「分類済の」との用語は、本明細書中で用いる場合、MSWが別個の区分へと実質的に分別され、それによって生物起源材料がプラスチックおよび/または他の無機材料から実質的に分離されるプロセスを意味する。乾燥重量の15％未満が非生物起源材料である、生物起源材料と非生物起源材料との混合物を含む廃棄物は、本明細書中で用いられる場合、「分類済」である。
【００２７】
一部の実施形態では、MSWは、主に果実、野菜および/または動物廃棄物を含む、廃棄源分離有機廃棄物であり得る。様々な異なる分類システムを、一部の実施形態で用いることができ、一般家庭が異なる廃棄物材料を別々に処分する廃棄源分類が含まれる。廃棄源分類システムは、オーストリア、ドイツ、ルクセンブルク、スウェーデン、ベルギー、オランダ、スペインおよびデンマークの一部の地方自治体で、現在実施されている。あるいは、業務分類システムを用いることができる。機械的な分類および分離の手段としては、限定するものではないが、US2012/0305688；WO2004/101183；WO2004/101098；WO2001/052993；WO2000/0024531；WO1997/020643；WO1995/0003139；CA2563845；US5465847に記載されるシステムをはじめとする、当技術分野で公知のいずれかの方法が挙げられる。一部の実施形態では、廃棄物は、軽く分類されるが、本明細書中で用いる場合に「未分類」である廃棄物区分をなお未だもたらす場合がある。一部の実施形態では、乾燥重量の15％超、または18％超、または20％超、または21％超、または22％超、または23％超、または24％超、または25％超が非生物起源材料である、未分類MSWが用いられる。
【００２８】
本発明の方法を実施する際に、MSWは、10〜45％の非水含量で、一部の実施形態では12〜40％、または13〜35％、または14〜30％、または15〜25％の非水含量で提供されるべきである。MSWは、典型的には、相当な含水量を含む。MSWを構成するすべての他の固形物は、本明細書中で用いる場合、「非水含量」と称される。本発明の方法の実施で用いられる含水量のレベルは、数種類の相互に関連する変数に関連する。本発明の方法は、液体生物起源スラリーを生成する。当業者には容易に理解されるであろう通り、固形構成要素を液体スラリーにする能力は、含水量の増大に伴って増加する。典型的なMSWの相当な部分を構成する紙および段ボールの有効なパルプ化は、典型的には、含水量が増大した場合に改善される。さらに、当技術分野で周知である通り、酵素活性は、低い含水量を有する条件下で加水分解が行なわれる場合、活性の減少を示し得る。例えば、セルラーゼは、典型的に、約10％超の非水含量を有する加水分解混合物中で、活性の減少を示す。紙および段ボールを分解するセルラーゼの場合、基質濃度と1グラムの基質当たりの酵素反応からの収量との間に、有効な線形逆関係が報告されている。Kristensen et al. 2009を参照されたい。リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販の単離された酵素調製物を用いて、本発明者らは、明らかな有害作用に気づくことなく、非水含量は15％程度に高くすることができることを、パイロット規模研究で観察している。
【００２９】
一部の実施形態では、適切な非水含量を達成するために、通常はいくらかの含水量を廃棄物に添加するべきてある。例えば、未分類のデンマーク一般家庭廃棄物の区分を考慮されたい。表1は、Riberらにより報告された未分類MSWの特徴的組成を示す（Riber et al. (2009), “Chemical composition of material fractions in Danish household waste,” Waste Management 29: 1251）。Riberらは、2001年の1日にデンマークで2220軒の家庭から得られた一般家庭廃棄物の組成区分を特性決定した。この報告された組成は、本発明の方法を説明するのに有用な、単なる代表例であることが、当業者には容易に理解されるであろう。表1に示された例では、弱い加熱の前にいかなる含水量の添加も伴わずに、野菜、紙および動物廃棄物を含む有機的分解可能区分が、平均で約47％の非水含量を有することが予測されたであろう。[(絶対的％非水)/(％湿重量)＝(7.15＋18.76＋4.23)/(31.08＋23.18＋9.88)＝47％非水含量]。処理される廃棄物区分の1当量に対応する体積の水の添加は、廃棄物自体の非水含量を約29.1％（58.2％/2）まで低下させ、一方で、分解可能構成要素の非水含量を約23.5％（47％/2）まで低下させるであろう。処理される廃棄物区分の2当量に対応する体積の水の添加は、廃棄物自体の非水含量を19.4％（58.2％/3）まで低下させ、一方で、分解可能構成要素の非水含量を約15.7％（47％/3）まで低下させるであろう。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
当業者は、本発明の方法を実施する際に廃棄物に添加される含水量（もしあれば）の適切な量を容易に決定することができるであろう。典型的には、実際問題として、処理されるMSWの組成のいくぶんかの変動性にもかかわらず、比較的一定の体積比の水を添加することが便利であり、一部の実施形態では0.8〜1.8kg水/kg MSW、または0.5〜2.5kg水/kg MSW、または1.0〜3.0kg水/kg MSWである。結果として、処理中のMSWの実際の非水含量は、適切な範囲内で変化し得る。酵素的加水分解を達成するために用いられる手段に応じて、非水含量の適切なレベルは変化し得る。
【００３２】
酵素的加水分解は、様々な異なる手段を用いて達成することができる。一部の実施形態では、酵素的加水分解は、単離された酵素調製物を用いて達成することができる。本明細書中で用いる場合、「単離された酵素調製物」との用語は、生物学的供給源から抽出され、分泌され、または他の様式で取得され、かつ任意により部分的もしくは十分に精製されている、酵素活性を含む調製物を意味する。
【００３３】
様々な異なる酵素活性を、本発明の方法を実施するために有利に用いることができる。例えば、表1に示されたMSWの組成を考慮して、紙含有廃棄物は、生物起源材料の最大の単一構成要素（乾燥重量による）を占めることが、容易に明らかになるであろう。したがって、当業者には容易に明らかになるであろう通り、典型的な一般家庭廃棄物に関して、セルロース分解活性が特に有利であろう。紙含有廃棄物では、セルロースは、以前から処理されており、リグニンおよびヘミセルロースが混合されたリグノセルロース系バイオマスの構成要素としてその天然の存在場所から分離されている。したがって、紙含有廃棄物は、比較的「単純な」セルラーゼ調製物を用いて、有利に分解することができる。
【００３４】
「セルラーゼ活性」とは、セルロース中の1,4-B-D-グルコシド結合の酵素的加水分解を意味する。細菌、真菌または他の供給源から取得された単離されたセルラーゼ酵素調製物では、セルラーゼ活性は、典型的に、エンドグルカナーゼおよびエキソグルカナーゼ（セロビオヒドロラーゼとも称される）（それぞれ、1,4-B-D-グルコシド結合のエンド型加水分解およびエキソ型加水分解を触媒する）、ならびにB-グルコシダーゼ（エキソグルカナーゼ加水分解のオリゴ糖生成物を単糖へと加水分解する）をはじめとする異なる酵素活性の混合を含む。不溶性セルロースの完全な加水分解は、典型的に、異なる活性の間の相乗作用を必要とする。
【００３５】
実際問題として、比較的低価格で容易に入手可能であるので、リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された市販の単離されたセルラーゼ調製物を単純に用いることが、一部の実施形態では有利であり得る。これらの調製物は、本発明の方法を実施するために確実に好適である。「リグノセルロース系バイオマス変換に最適化された」との用語は、前処理されたリグノセルロース系バイオマスから発酵可能な糖への加水分解での、加水分解収量を改善し、かつ/または酵素消費を低減する具体的な目的のために、酵素混合物が選択および改変される、製品開発プロセスを意味する。
【００３６】
しかしながら、リグノセルロース系バイオマスの加水分解に対して最適化された市販のセルラーゼ混合物は、典型的に、高レベルの追加の、および特殊化された酵素活性を含む。例えば、本発明者らは、リグノセルロース系バイオマス変換に最適化され、かつCELLIC CTEC2TMおよびCELLIC CTEC3TMの商品名でNOVOZYMESTMから供給される市販のセルラーゼ調製物、ならびにACCELLERASE 1500TMの商品名でGENENCORTMから供給される類似の調製物中に存在する酵素活性を測定し、これらの調製物のそれぞれが、200U/g超のエンドキシラナーゼ活性、85U/g超のレベルのキシロシダーゼ活性、9U/g超のレベルでB-L-アラビノフラノシダーゼ活性、15U/gのレベルでアミログルコシダーゼ活性、および2U/g超のレベルでa-アミラーゼ活性を含むことを見出した。
【００３７】
より単純な単離されたセルラーゼ調製物もまた、本発明の方法を実施するために効果的に用いることができる。好適なセルラーゼ調製物は、好気性および嫌気性細菌、白色腐朽菌、軟腐病菌および嫌気性真菌をはじめとする様々な微生物から、当技術分野で周知の方法により取得することができる。参考文献13（R. Singhania et al., "Advancement and comparative profiles in the production technologies using solid-state and submerged fermentation for microbial cellulases," Enzyme and Microbial Technology (2010) 46:541-549；その全体で参照により明示的に本明細書中に組み入れられる）に記載されている通り、セルラーゼを産生する生物は、典型的に、リグノセルロース系基質の加水分解に好適であるように、適切な割合で種々の酵素の混合物を産生する。リグノセルロース系バイオマスの変換のために好適なセルラーゼ調製物の好ましい供給源としては、トリコデルマ属、ペニシリウム属、フザリウム属、ヒューミコラ属（Humicola）、アスペルギルス属およびファネロカエテ属（Phanerochaete）の菌種をはじめとする真菌が挙げられる。
【００３８】
セルラーゼ活性に加えて、本発明の方法を実施する際に有利であると判明し得る一部の追加の酵素活性は、プロテアーゼ、グルコアミラーゼ、エンドアミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチンエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、およびリパーゼなどの、食品廃棄物に作用する酵素、ならびにキシラナーゼ、およびキシロシダーゼなどの庭園廃棄物に作用する酵素を含む。一部の実施形態では、ラミナラーゼ、ケタチナーゼまたはラッカーゼなどの他の酵素活性を含むことが有利であり得る。
【００３９】
一部の実施形態では、細胞外セルラーゼ活性を示す選択された微生物は、同時に行なわれる酵素的加水分解および微生物発酵を実施する際に直接的に接種することができ、限定するものではないが、以下の好熱性セルロース分解性（cellulytic）生物のいずれかの1種以上を、単独で、または他の生物と組み合わせて接種することができる：パエニバチルス・バルシノネンシス（Paenibacillus barcinonensis、Asha et al 2012を参照されたい）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum、Blume et al 2013およびLv and Yu 2013を参照されたい）、ストレプトマイセス属、ミクロビスポラ属（Microbispora）、およびパエニバチルス属（Paenibacillus）からの選択された菌種（Eida et al 2012を参照されたい）、クロストリジウム・ストラミニソルベンス（Clostridium straminisolvens、Kato et al 2004を参照されたい）、フィルミクテス門（Firmicutes）、放射菌門（Actinobacteria）、プロテオバクテリア門（Proteobacteria）およびバクテロイデス門（Bacteroidetes）の菌種（Maki et al 2012を参照されたい）、クロストリジウム・クラリフラブム（Clostridium clariflavum、Sasaki et al 2012を参照されたい）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）およびクロストリジウム・ストラミニソルベンス（Clostridium straminisolvens）に系統発生学的および生理学的に近縁であるクロストリジウム目（Clostridiales）の新規菌種（Shiratori et al 2006を参照されたい）、クロストリジウム・クラリフラブムsp. nov.（Clostridium clariflavum sp. nov.）およびクロストリジウム・カエニコラ（Clostridium Caenicola）（Shiratori  et al 2009を参照されたい）、ゲオバチルス・サーモレオボランス（Geobacillus Thermoleovorans、Tai et al 2004を参照されたい）、クロストリジウム・ステルコラリウム（Clostridium stercorarium、Zverlov et al 2010）、または好熱性真菌であるスポロトリクム・サーモフィレ（Sporotrichum thermophile）、シタリジウム・サーモフィルム（Scytalidium thermophillum）、クロストリジウム・ストラミニソルベンス（Clostridium straminisolvens）およびサーモノスポラ・クルバタ（Thermonospora curvata）のうちのいずれか1種以上（総説として、Kumar et al. 2008）。一部の実施形態では、同時に行なわれる酵素的加水分解および微生物発酵に寄与するために、他の有用な細胞外酵素活性を示す生物を接種することができ、そのような生物とは例えば、タンパク質分解性およびケラチン分解性真菌（Kowalska et al. 2010を参照されたい）、または細胞外リパーゼ活性を示す乳酸菌（Meyers et al. 1996）である。
【００４０】
酵素的加水分解は、上述のもののいずれかをはじめとする様々な酵素調製物のうちのいずれか1種以上を含む1種以上の単離された酵素調製物を用いて当技術分野で周知の方法により、あるいは、所望の酵素的加水分解に影響を及ぼすことができる1種以上の選択された生物を処理MSWに接種することにより、行なうことができる。一部の実施形態では、酵素的加水分解は、セルラーゼ、B-グルコシダーゼ、アミラーゼ、およびキシラナーゼ活性を含む、有効量の1種以上の単離された酵素調製物を用いて実施することができる。集合的に、用いられる酵素調製物が、用いられる条件下で18時間の加水分解反応時間内にMSW中に存在する分解可能な生物起源材料の乾燥重量のうち少なくとも40％の可溶化を達成する場合、量は「有効量」である。一部の実施形態では、集合的に、種々の酵素活性の相対的割合が以下の通りである、1種以上の単離された酵素調製物が用いられる：1 FPUのセルラーゼ活性が少なくとも31 CMC Uのエンドグルカナーゼ活性を伴い、1 FPUのセルラーゼ活性が少なくとも7pNPG Uのβ-グルコシダーゼ活性を伴うように、酵素活性の混合物を用いる。CMC Uがカルボキシメチルセルロース単位を意味することは、当業者には容易に理解されるであろう。1 CMC Uの活性は、50℃およびpH4.8の特異的アッセイ条件下で1分間に1μmolの還元糖（グルコース当量として表される）を遊離させる。pNPG UがpNPG単位を意味することは、当業者には容易に理解されるであろう。1 pNPG Uの活性は、50℃およびpH4.8にてパラ-ニトロフェニル-B-D-グルコピラノシドから1分間に1μmolのニトロフェノールを遊離させる。さらに、「ろ紙分解活性単位」（filter paper unit）のFPUがセルラーゼ活性の指標を与えることは、当業者には容易に理解されるであろう。本明細書中で用いる場合、FPUとは、Adney, B. and Baker, J., Laboratory Analytical Procedure #006, "Measurement of cellulase activity", August 12, 1996, the USA National Renewable Energy Laboratory (NREL)（その全体で参照により明示的に本明細書中に組み入れられる）の方法により測定された場合のろ紙分解活性単位を意味する。
【００４１】
本発明の実施形態を実施する際に、酵素的加水分解の開始前にMSWの温度を調整することが有利であり得る。当技術分野で周知である通り、セルラーゼおよび他の酵素は、典型的に、至適温度範囲を示す。60℃または70℃までもの程度の至適温度を有する超好熱性生物から単離された酵素の例は確かに知られている一方で、酵素の至適温度範囲は典型的には35〜55度の範囲に入る。一部の実施形態では、酵素的加水分解は、30〜35℃、または35〜40℃、または40〜45℃、または45〜50℃、または50〜55℃、または55〜60℃、または60〜65℃、または65〜70℃、または70〜75℃の温度範囲内で行なわれる。一部の実施形態では、MSWに含まれる病原体の増殖を阻止するのに有利であるので、少なくとも45℃の温度で酵素的加水分解および同時に行なわれる微生物発酵を実行するのが有利である。例えば、Hartmann and Ahring 2006；Deportes et al. 1998；Carrington et al. 1998；Bendixen et al. 1994；Kubler et al. 1994；Six and De Baerre et al. 1992を参照されたい。
【００４２】
セルラーゼ活性を用いた酵素的加水分解は、典型的に、セルロース系材料を糖化（sacchartify）するであろう。したがって、酵素的加水分解の間、固形廃棄物は糖化および液化の両方を受け、すなわち、固形物から液状スラリーへと変換される。
【００４３】
以前には、生物起源構成要素の液化を達成するために酵素的加水分解を用いてMSWを処理する方法は、具体的には廃棄物の「滅菌」を達成するために、酵素的加水分解のために必要とされるよりも顕著に高い温度までMSWを加熱するステップ、およびそれに続く、加熱された廃棄物を酵素的加水分解に適切な温度まで下げ戻すための必須の冷却ステップに対する必要性が想定されてきた。本発明の方法を実施する際は、MSWを酵素的加水分解に適切な温度にするだけで十分である。一部の実施形態では、MSWを酵素的加水分解のために適切な温度にするように加えられる、加熱した水を用いてMSWを単に適切な非水含量に調整することが有利であり得る。一部の実施形態では、加熱された含水量、もしくは蒸気を添加することにより、または他の加熱手段のいずれかにより、MSWが反応容器内で加熱される。一部の実施形態では、30℃超から85℃未満の温度まで、または84℃以下の温度まで、または80℃以下の温度まで、または75℃以下の温度まで、または70℃以下の温度まで、または65℃以下の温度まで、または60℃以下の温度まで、または59℃以下の温度まで、または58℃以下の温度まで、または57℃以下の温度まで、または56℃以下の温度まで、または55℃以下の温度まで、または54℃以下の温度まで、または53℃以下の温度まで、または52℃以下の温度まで、または51℃以下の温度まで、または50℃以下の温度まで、または49℃以下の温度まで、または48℃以下の温度まで、または47℃以下の温度まで、または46℃以下の温度まで、または45℃以下の温度まで、反応容器内でMSWが加熱される。一部の実施形態では、酵素的加水分解が行なわれる最高温度の10℃高い温度以下まで、MSWが加熱される。
【００４４】
本明細書中で用いる場合、MSWの平均温度がその温度まで反応器内で上昇する場合、MSWは「ある温度まで加熱される」。本明細書中で用いる場合、MSWが加熱される温度は、反応器内で達成されるMSWの最高平均温度である。一部の実施形態では、最高平均温度は、全期間、維持されなくてよい。一部の実施形態では、加熱反応器が異なる区画（複数）を含むことができ、それにより、加熱が異なる温度での段階（複数）で生じることができる。一部の実施形態では、加熱は、酵素的加水分解が行なわれる同一の反応器を用いて達成することができる。加熱の対象は、単純に、酵素的加水分解に最適な条件で、セルロース系廃棄物の大部分および植物廃棄物の相当な部分になる。酵素的加水分解に最適な条件であるために、廃棄物は、理想的には、酵素的加水分解に用いられる酵素活性に対して適切な温度および含水量を有するべきである。
【００４５】
一部の実施形態では、均一に加熱された廃棄物を実現するように、加熱の間、撹拌することが有利であり得る。一部の実施形態では、撹拌は、実質的に水平な軸に沿って回転するチャンバーを有する反応器中での、またはMSWを持ち上げる回転軸を有する混合器中での、またはMSWを持ち上げる水平シャフトまたはパドルを有する混合器中での混合などの、自由落下混合を含み得る。一部の実施形態では、撹拌は、振盪、掻き混ぜまたは輸送スクリューコンベヤーを介した運搬を含むことができる。一部の実施形態では、撹拌は、所望の温度までMSWが加熱された後に継続する。一部の実施形態では、撹拌は、1〜5分間、または5〜10分間、または10〜15分間、または15〜20分間、または20〜25分間、または25〜30分間、または30〜35分間、または35〜40分間、または40〜45分間、または45〜50分間、または50〜55分間、または55〜60分間、または60〜120分間行われる。
【００４６】
酵素的加水分解は、単離された酵素調製物が添加される時点で開始される。あるいは、単離された酵素調製物は添加されないが、所望の細胞外酵素活性を示す微生物が代わりに用いられる事象では、酵素的加水分解は、所望の微生物が添加される時点で開始される。
【００４７】
本発明の方法を実施する際に、酵素的加水分解は、微生物発酵と同時に行なわれる。同時に行なわれる微生物発酵は、種々の方法を用いて達成することができる。一部の実施形態では、MSW中に天然に存在する微生物は、「滅菌」を生じさせるのに十分な温度まで処理MSWが事前に加熱されていない場合、反応条件中で単に繁殖できる。典型的にMSW中に存在する微生物は、地域の環境に適合した生物を含むであろう。同時に行なわれる微生物発酵の一般的に有益な効果は、比較的堅牢であり、つまり、非常に広範囲の様々な生物が、個々にまたは集合的に、MSWの酵素的加水分解を介する有機物捕捉に貢献することができる。理論に拘泥することを望まないが、本発明者らは、同時発酵する微生物は、個別に、セルラーゼ酵素により必ずしも加水分解されない食品廃棄物の分解に対する何らかの直接的な作用を有すると考える。同時に、セルラーゼ加水分解により放出される炭水化物モノマーおよびオリゴマーは、特に、実際的にいずれかの微生物種により容易に消費される。このことは、おそらくは酵素活性の生産物阻害の解除を介して、かつまたおそらくはすぐに明らかにならない他の理由のために、セルラーゼ酵素との有益な相乗効果を与える。いずれの場合にも、微生物代謝の最終生成物は、典型的に、バイオメタン基質に適切である。酵素的に加水分解されたMSWが微生物代謝生成物を豊富に含むことは、つまり、既にそれ自体で、およびそれ自体の、結果として生じるバイオメタン基質の量の改善である。特に、乳酸菌は天然に広く存在し、MSWが45〜50の温度範囲内で10〜45℃の非水含量にて酵素的に加水分解される場合に、乳酸産生が典型的に観察される。より高い温度では、おそらく天然に存在する微生物のうちの他の菌種が優位を占める場合があり、乳酸以外の他の代謝生成物がより一般的になる場合がある。
【００４８】
一部の実施形態では、微生物発酵は、1種以上の微生物種を用いた直接的接種により達成できる。MSWの同時の酵素的加水分解および発酵をもたらすために接種に用いられる1種以上の細菌種は、該細菌種が、用いられる酵素活性に最適またはそれに近い温度で繁殖できる場合に、有利に選択できることが、当業者には容易に理解されるであろう。
【００４９】
微生物発酵を誘導するための加水分解混合物の接種は、様々な手段により達成できる。
【００５０】
一部の実施形態では、酵素活性の添加の、もしくは細胞外セルラーゼ活性を示す微生物の添加の前、後、またはそれと同時にMSWを接種するのが有利であり得る。一部の実施形態では、限定するものではないが、以下のものまたは以下のものから遺伝学的に改変された変異体のうちのいずれか1種以上をはじめとするLABの1種以上の菌種を用いて接種するのが有利であり得る：ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ストレプトコッカス・ラクティス（Streptococcus lactis）、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus casei）、ラクトバチルス・ラクティス（Lactobacillus lactis）、ラクトバチルス・クルバツス（Lactobacillus curvatus）、ラクトバチルス・サケ（Lactobacillus sake）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Lactobacillus helveticus）、ラクトバチルス・ジュグルティ（Lactobacillus jugurti）、ラクトバチルス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ラクトバチルス・カルニス（Lactobacillus carnis）、ラクトバチルス・ピシコーラ（Lactobacillus piscicola）、ラクトバチルス・コリニフォルミス（Lactobacillus coryniformis）、ラクトバチルス・ラムノサス（Lactobacillus rhamnosus）、ラクトバチルス・マルタロミクス（Lactobacillus maltaromicus）、ラクトバチルス・シュードプランタラム（Lactobacillus pseudoplantarum）、ラクトバチルス・アジリス（Lactobacillus agilis）、ラクトバチルス・ババリクス（Lactobacillus bavaricus）、ラクトバチルス・アリメンタリウス（Lactobacillus alimentarius）、ラクトバチルス・ヤマナシエンシス（Lactobacillus uamanashiensis）、ラクトバチルス・アミロフィラス（Lactobacillus amylophilus）、ラクトバチルス・ファルシミニス（Lactobacillus farciminis）、ラクトバチルス・シャルペ（Lactobacillus sharpeae）、ラクトバチルス・ディベルゲンス（Lactobacillus divergens）、ラクトバチルス・アラクトサス（Lactobacillus alactosus）、ラクトバチルス・パラカゼイ（Lactobacillus paracasei）、ラクトバチルス・ホモヒオキイ（Lactobacillus homohiochii）、ラクトバチルス・サンフランシスコ（Lactobacillus sanfrancisco）、ラクトバチルス・フルクチボランス（Lactobacillus fructivorans）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ポンティ（Lactobacillus ponti）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・ブクネリ（Lactobacillus buchneri）、ラクトバチルス・ビリデッセンス（Lactobacillus viridescens）、ラクトバチルス・コンフスス（Lactobacillus confusus）、ラクトバチルス・ミノール（Lactobacillus minor）、ラクトバチルス・カンドレリ（Lactobacillus kandleri）、ラクトバチルス・ハロトレランス（Lactobacillus halotolerans）、ラクトバチルス・ヒルガルディイ（Lactobacillus hilgardi）、ラクトバチルス・ケフィール（Lactobacillus kefir）、ラクトバチルス・コリノイデス（Lactobacillus collinoides）、ラクトバチルス・バクシノステリクス（Lactobacillus vaccinostericus）、ラクトバチルス・デルブルエッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Lactobacillus bulgaricus）、ラクトバチルス・レイクマンニ（Lactobacillus leichmanni）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Lactobacillus acidophilus）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ラクトバチルス・サリシヌス（Lactobacillus salicinus）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）、ラクトバチルス・スエビクス（Lactobacillus suebicus）、ラクトバチルス・オリス（actobacillus oris）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・バギナリス（Lactobacillus vaginalis）、ラクトバチルス・ペントサス（Lactobacillus pentosus）、ラクトバチルス・パニス（Lactobacillus panis）、ラクトコッカス・クレモリス（Lactococcus cremoris）、ラクトコッカス・デクストラニクム（Lactococcus dextranicum）、ラクトコッカス・ガルビエ（Lactococcus garvieae）、ラクトコッカス・ホルドニエ（Lactococcus hordniae）、ラクトコッカス・ラフィノラクティス（Lactococcus raffinolactis）、ストレプトコッカス・ディアセチラクティス（Streptococcus diacetylactis）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、ロイコノストック・デクストラニクム（Leuconostoc dextranicum）、ロイコノストック・クレモリス（Leuconostoc cremoris）、ロイコノストック・オエノス（Leuconostoc oenos）、ロイコノストック・パラメセンテロイデス（Leuconostoc paramesenteroides）、ロイコノストック・シュードメセンテロイデス（Leuconostoc pseudoesenteroides）、ロイコノストック・シトレウム（Leuconostoc citreum）、ロイコノストック・ゲリドゥム（Leuconostoc gelidum）、ロイコノストック・カルノスム（Leuconostoc carnosum）、ペディオコッカス・ダムノサス（Pediococcus damnosus）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Pediococcus acidilactici）、ペディオコッカス・セレビシエ（Pediococcus cervisiae）、ペディオコッカス・パルブルス（Pediococcus parvulus）、ペディオコッカス・ハロフィルス（Pediococcus halophilus）、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus pentosaceus）、ペディオコッカス・インテルメディウス（Pediococcus intermedius）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、オエノコッカス・オエニ（Oenococcus oeni）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、およびプロピオニバクテリウム・フレウデンレイキイ（Propionibacterium freudenreichii）、あるいはLABの一部の後に発見された菌種または乳酸を産生する代謝プロセスのための有用な能力を示すエンテロコッカス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ペディオコッカス属（Pediococcus）、もしくはカルノバクテリウム属（Carnobacterium）由来の他の菌種。
【００５１】
接種のために用いられる細菌調製物が様々な生物の群落を含み得ることは、当業者には容易に理解されるであろう。一部の実施形態では、いずれかの所与の地理的領域に存在し、かつ当該領域からのMSW中での繁殖に適合している天然に存在する細菌を用いることができる。当技術分野で周知である通り、LABはどこにでも存在し、MSW内のいずれかの天然に存在する細菌群落の主要な構成要素を典型的に占めるであろう。
【００５２】
一部の実施形態では、分解可能でない固形物から残留有機材料を回収するために用いられる洗浄水または処理溶液の連続的な再利用により、MSWに、天然に存在する細菌を接種することができる。洗浄水または処理溶液を再利用する場合、これらは徐々に高い微生物レベルを獲得する。一部の実施形態では、特に、代謝生成物が、ギ酸塩、酢酸塩、酪酸塩、プロピオン酸塩、または乳酸塩などの短鎖カルボン酸/脂肪酸を含む場合、微生物発酵はpH低下作用を有する。したがって、一部の実施形態では、同時に行なわれる酵素的加水分解および微生物発酵混合物のpHをモニタリングし、かつ調整することが有利であり得る。酵素的加水分解の前に、流入するMSWの含水量を増加させるために洗浄水または処理溶液が用いられる場合、単離された酵素調製物として、または細胞外セルラーゼ活性を示す微生物としてのいずれかでの酵素活性の添加前に、接種が有利に行なわれる。一部の実施形態では、特定の領域からのMSW上で増殖することに適合した天然に存在する細菌を、MSW上で、またはMSWの酵素的加水分解により取得される液化された有機構成要素上で培養することができる。一部の実施形態では、培養された天然に存在する細菌を、続いて、別々に、または再利用された洗浄水もしくは処理溶液を用いた接種に対して補完的に、接種物として添加することができる。一部の実施形態では、細菌調製物は、単離された酵素調製物の添加前もしくはそれと同時に、または事前加水分解の最初のいくらかの時間の後に、添加することができる。
【００５３】
一部の実施形態では、酵素的加水分解反応条件下で繁殖するために、かつ/または特定の代謝プロセスを重視するかもしくは軽視するために、特別に改変されているかまたは「訓練」されている菌株をはじめとする、特異的な菌株を、接種のために培養することができる。一部の実施形態では、単一炭素源としてフタル酸エステルを用いて生存することが可能であると特定されている細菌株を用いてMSWに接種することが有利であり得る。そのような菌株としては、限定するものではないが、以下のものまたは以下のものの遺伝学的に改変された変異体のうちいずれか1種以上が挙げられる：クリセオミクロビウム・インテケンセMW10T（Chryseomicrobium intechense MW10T）、リジニバチルス・フシフォルミスNBRC 157175（Lysinibaccillus fusiformis NBRC 157175）、トロピシバクター・フタリクス（Tropicibacter phthalicus）、ゴードニア属JDC-2（Gordonia JDC-2）、アルスロバクター属JDC-32（Arthrbobacter JDC-32）、枯草菌3C3（Bacillus subtilis 3C3）、コマモナス・テストステロニイ（Comamonas testosteronii）、コマモナスsp E6（Comamonas sp E6）、デルフチア・ツルハテンシス（Delftia tsuruhatensis）、ロドコッカス・ジョスティイ（Rhodoccoccus jostii）、ブルクホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、ミコバクテリウム・バンバアレニイ（Mycobacterium vanbaalenii）、アルスロバクター・ケイセリ（Arthobacter keyseri）、バチルス属sb 007（Bacillus sb 007）、アルスロバクターsp. PNPX-4-2（Arthobacter sp. PNPX-4-2）、ゴルドニア・ナミビエンシス（Gordonia namibiensis）、ロドコッカス・フェノリクス（Rhodococcus phenolicus）、シュードモナスsp. PGB2（Pseudomonas sp. PGB2）、シュードモナスsp. Q3（Pseudomonas sp. Q3）、シュードモナスsp. 1131（Pseudomonas sp. 1131）、シュードモナスsp. CAT1-8（Pseudomonas sp. CAT1-8）、シュードモナスsp.ニトロレデュセンス（Pseudomonas sp. Nitroreducens）、アルスロバクターsp AD38（Arthobacter sp AD38）、ゴードニアsp CNJ863（Gordonia sp CNJ863）、ゴードニア・ルブリペルチンクツス（Gordonia rubripertinctus）、アルスロバクター・オキシダンス（Arthobacter oxydans）、アシネトバクター属遺伝種（Acinetobacter genomosp）、およびアシネトバクター・カルコアセティクス（Acinetobacter calcoaceticus）。例えば、Fukuhura et al 2012；Iwaki et al. 2012A；Iwaki et al. 2012B；Latorre et al. 2012；Liang et al. 2010；Liang et al. 2008；Navacharoen et al. 2011；Park et al. 2009；Wu et al. 2010；Wu et al. 2011を参照されたい。多数の市販のポリ塩化ビニル調製物で可塑剤として用いられるフタル酸エステルは、浸出可能であり、本発明者らの経験では、望ましくないレベルで液化された有機的構成要素中に多くの場合に存在する。一部の実施形態では、限定するものではないが、グルコース、キシロースまたはアラビノースを消費するプロセスをはじめとする代謝プロセスを重視し、かつ/または他の代謝プロセスを軽視するように、当技術分野で周知の方法により遺伝学的に改変されている菌株を有利に用いることができる。
【００５４】
一部の実施形態では、リグニンを分解することが可能であると特定されている細菌株を用いてMSWに有利に接種することができる。そのような菌株としては、限定するものではないが、以下のものまたは以下のものの遺伝学的に改変された変異体のうちいずれか1種以上が挙げられる：コマモナスsp B-9（Comamonas sp B-9）、シトロバクター・フロインディイ（Citrobacter freundii）、シトロバクターsp FJ581023（Citrobacter sp FJ581023）、パンドレア・ノルインベルゲンシス（Pandorea norimbergensis）、アミコラトプシスsp ATCC 39116（Amycolatopsis sp ATCC 39116）、ストレプトミセス・ビリドスポルス（Streptomyces viridosporous）、ロドコッカス・ジョスティ（Rhodococcus jostii）、およびスフィンゴビウムsp. SYK-6（Sphingobium sp. SYK-6）。例えばBandounas et al. 2011；Bugg et al. 2011；Chandra et al. 2011；Chen et al. 2012；Davis et al. 2012を参照されたい。本発明者らの経験では、MSWは典型的に無視できないリグニン含量を含み、これは典型的には、AD後に未分解残留物として回収される。
【００５５】
一部の実施形態では、限定するものではないが、以下のものまたは以下のものの遺伝学的に改変された変異体のうちいずれか1種以上をはじめとする酢酸産生細菌株を用いてMSWに接種することが有利であり得る：アセチトマクルム・ルミニス（Acetitomaculum ruminis）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、アセトアナエロビウム・ノテラエ（Acetoanaerobium noterae）、アセトバクテリウム・カルビノリクム（Acetobacterium carbinolicum）、アセトバクテリウム・ウィエリンガエ（Acetobacterium wieringae）、アセトバクテリウム・ウーディイ（Acetobacterium woodii）、アセトゲニウム・キブイ（Acetogenium kivui）、アシダミノコッカス・ファーメンタンス（Acidaminococcus fermentans）、アナエロビブリオ・リポリティカ（Anaerovibrio lipolytica）、バクテロイデス・コプロスイス（Bacteroides coprosuis）、バクテロイデス・プロピオニシファシエンス（Bacteroides propionicifaciens）、バクテロイデス・セルロソルベンス（Bacteroides cellulosolvens）、バクテロイデス・キシラノリティクス（Bacteroides xylanolyticus）、ビフィドバクテリウム・カテヌラータム（Bifidobacterium catenulatum）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ビフィドバクテリウム・アングラツム（Bifidobacterium angulatum）、ビフィドバクテリウム・ブレベ（Bifidobacterium breve）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（Bifidobacterium gallicum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Bifidobacterium infantis）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（Bifidobacterium pseudolongum）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Butyrivibrio fibrisolvens）、クロストリジウム・アセチクム（Clostridium aceticum）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・アシドゥリシ（Clostridium acidurici）、クロストリジウム・ビファーメンタンス（Clostridium bifermentans）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ブチリシウム（Clostridium butyricium）、クロストリジウム・セロビオパルム（Clostridium cellobioparum）、クロストリジウム・フォルミカセティクム（Clostridium formicaceticum）、クロストリジウム・ヒストリティクム（Clostridium histolyticum）、クロストリジウム・ロクヘアディイ（Clostridium lochheadii）、クロストリジウム・メチルペントサム（Clostridium methylpentosum）、クロストリジウム・パステウリアヌム（Clostridium pasteurianum）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・プロピオニクム（Clostridium propionicum）、クロストリジウム・プトレファシエンス（Clostridium putrefaciens）、クロストリジウム・スポロゲネス（Clostridium sporogenes）、破傷風菌（Clostridium tetani）、クロストリジウム・テタノモルフム（Clostridium tetanomorphum）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、デスルフォトマクルム・オリエンティス（Desulfotomaculum orientis）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、大腸菌（Escherichia coli）、ユーバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、ユーバクテリウム・ルミナンティウム（Eubacterium ruminantium）、フィブロバクター・スクシノゲネス（Fibrobacter succinogenes）、ラクノスピラ・ムルチパルス（Lachnospira multiparus）、���ガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、モオレラ・サーモアセティカ（Moorella thermoacetica）、ペロバクター・アセチレニクス（Pelobacter acetylenicus）、ペロバクター・アシディガリシ（Pelobacter acidigallici）、ペロバクター・マシリエンシス（Pelobacter massiliensis）、プレボテラ・ルミノコラ（Prevotella ruminocola）、プロピオニバクテリウム・フレウデンレイキイ（Propionibacterium freudenreichii）、ルミノコッカス・フラベファシエンス（Ruminococcus flavefaciens）、ルミノバクター・アミロフィラス（Ruminobacter amylophilus）、ルミノコッカス・アルブス（Ruminococcus albus）、ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）、ルミノコッカス・シャンパネレンシス（Ruminococcus champanellensis）、セレノモナス・ルミナンティウム（Selenomonas ruminantium）、スポロムサ・パウシボランス（Sporomusa paucivorans）、スクシニモナス・アミロリティカ（Succinimonas amylolytica）、スクシニビブリオ・デクストリノソルベン（Succinivibrio dextrinosolven）、シントロフォモナス・ウォルフェイ（Syntrophomonas wolfei）、シントロフス・アシディトロフィクス（Syntrophus aciditrophicus）、シントロフス・ゲンティアネ（Syntrophus gentianae）、トレポネマ・ブリアンティイ（Treponema bryantii）およびトレポネマ・プリミティア（Treponema primitia）。
【００５６】
一部の実施形態では、限定するものではないが、以下のものまたは以下のものの遺伝学的に改変された変異体のうちいずれか1種以上をはじめとする酪酸産生細菌株を用いてMSWに接種することが有利であり得る：アシダミノコッカス・ファーメンタンス（Acidaminococcus fermentans）、アナエロスティペス・カカエ（Anaerostipes caccae）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、ブチリビブリオ・クロソツス（Butyrivibrio crossotus）、ブチリビブリオ・フィブリソルベンス（Butyrivibrio fibrisolvens）、ブチリビブリオ・フンガテイ（Butyrivibrio hungatei）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・アウランティブティリクム（Clostridium aurantibutyricum）、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム・ブチリシウム（Clostridium butyricium）、クロストリジウム・セロビオパルム（Clostridium cellobioparum）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、クロストリジウム・イノクウム（Clostridium innocuum）、クロストリジウム・クルイベリ（Clostridium kluyveri）、クロストリジウム・パステウリアヌム（Clostridium pasteurianum）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・プロテオクラスティクム（Clostridium proteoclasticum）、クロストリジウム・スポロスフェロイデス（Clostridium sporosphaeroides）、クロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）、クロストリジウム・テルティウム（Clostridium tertium）、クロストリジウム・チロブチリクム（Clostridium tyrobutyricum）、コプロコッカス・ユータクツス（Coprococcus eutactus）、コプロコッカス・コメス（Coprococcus comes）、大腸菌（Escherichia coli）、ユーバクテリウム・バルケリ（Eubacterium barkeri）、ユーバクテリウム・ビフォルメ（Eubacterium biforme）、ユーバクテリウム・セルロソルベンス（Eubacterium cellulosolvens）、ユーバクテリウム・シリンドロイデス（Eubacterium cylindroides）、ユーバクテリウム・ドリクム（Eubacterium dolichum）、ユーバクテリウム・ハドルム（Eubacterium hadrum）、ユーバクテリウム・ハリイ（Eubacterium halii）、ユーバクテリウム・リモサム（Eubacterium limosum）、ユーバクテリウム・モニリフォルメ（Eubacterium moniliforme）、ユーバクテリウム・オキシドレドゥセンス（Eubacterium oxidoreducens）、ユーバクテリウム・ラムルス（Eubacterium ramulus）、ユーバクテリウム・レクタレ（Eubacterium rectale）、ユーバクテリウム・サブレウム（Eubacterium saburreum）、ユーバクテリウム・トルツオスム（Eubacterium tortuosum）、ユーバクテリウム・ベントリオスム（Eubacterium ventriosum）、フェカリバクテリウム・プラウスニツィイ（Faecalibacterium prausnitzii）、フソバクテリウム・プラウスニツィイ（Fusobacterium prausnitzii）、ペプトストレプトコッカス・バギナリス（Peptostreptoccoccus vaginalis）、ペプトストレプトコッカス・テトラジウス（Peptostreptoccoccus tetradius）、シュードブチリビブリオ・ルミニス（Pseudobutyrivibrio ruminis）、シュードブチリビブリオ・キシラニボランス（Pseudobutyrivibrio xylanivorans）、ロゼブリア・セシコラ（Roseburia cecicola）、ロゼブリア・インテスティナリス（Roseburia intestinalis）、ロゼブリア・ホミニス（Roseburia hominis）およびルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）。
【００５７】
一部の実施形態では、限定するものではないが、以下のものまたは以下のものの遺伝学的に改変された変異体のうちいずれか1種以上をはじめとするプロピオン酸産生細菌株を用いてMSWに接種することが有利であり得る：アナエロビブリオ・リポリティカ（Anaerovibrio lipolytica）、バクテロイデス・コプロスイス（Bacteroides coprosuis）、バクテロイデス・プロピオニシファシエンス（Bacteroides propionicifaciens）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Bifidobacterium adolescentis）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ブチリシウム（Clostridium butyricium）、クロストリジウム・メチルペントサム（Clostridium methylpentosum）、クロストリジウム・パステウリアヌム（Clostridium pasteurianum）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・プロピオニクム（Clostridium propionicum）、大腸菌（Escherichia coli）、フソバクテリウム・ヌクレアツム（Fusobacterium nucleatum）、メガスファエラ・エルスデニイ（Megasphaera elsdenii）、プレボテラ・ルミニコラ（Prevotella ruminocola）、プロピオニバクテリウム・フレウデンレイキイ（Propionibacterium freudenreichii）、ルミノコッカス・ブロミイ（Ruminococcus bromii）、ルミノコッカス・シャンパネレンシス（Ruminococcus champanellensis）、セレノモナス・ルミナンティウム（Selenomonas ruminantium）およびシントロフォモナス・ウォルフェイ（Syntrophomonas wolfei）。
【００５８】
一部の実施形態では、限定するものではないが、以下のものまたは以下のものの遺伝学的に改変された変異体のうちいずれか1種以上をはじめとするエタノール産生細菌株を用いてMSWに接種することが有利であり得る：アセトバクテリウム・カルビノリクム（Acetobacterium carbinolicum）、アセトバクテリウム・ウィエリンガエ（Acetobacterium wieringae）、アセトバクテリウム・ウーディイ（Acetobacterium woodii）、バクテロイデス・セルロソルベンス（Bacteroides cellulosolvens）、バクテロイデス・キシラノリティクス（Bacteroides xylanolyticus）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Clostridium acetobutylicum）、クロストリジウム・ベイジェリンキイ（Clostridium beijerinckii）、クロストリジウム・ブチリシウム（Clostridium butyricium）、クロストリジウム・セロビオパルム（Clostridium cellobioparum）、クロストリジウム・ロクヘアディイ（Clostridium lochheadii）、クロストリジウム・パステウリアヌム（Clostridium pasteurianum）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム・サーモヒドロスルフリクム（Clostridium thermohydrosulfuricum）、クロストリジウム・サーモサッカロリティクム（Clostridium thermosaccharolyticum）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumonia）、ラクノスピラ・ムルチパルス（Lachnospira multiparus）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）、パエニバチルス・マセランス（Paenibacillus macerans）、ペロバクター・アセチレニクス（Pelobacter acetylenicus）、ルミノコッカス・アルブス（Ruminococcus albus）、サーモアナエロバクター・マスラニイ（Thermoanaerobacter mathranii）、トレポネマ・ブリアンティイ（Treponema bryantii）およびザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）。
【００５９】
一部の実施形態では、異なる菌種の細菌および/または真菌を任意により含む、異なる微生物集団（consortium）を用いて、同時に行なわれる微生物発酵を実現することができる。一部の実施形態では、好適な微生物を、意図する反応条件で所望の代謝結果をもたらすために選択し、続いて天然に存在する菌株を打ち負かすように高用量レベルで接種することができる。例えば、一部の実施形態では、異種発酵性乳酸産生株（heterofermentive lactate producer）により与えられ得るよりも、得られるバイオメタン基質中の高い最終的メタン潜在力を与えるので、同種発酵性乳酸産生株（homofermentive lactate producer）を用いて接種することが有利であり得る。
【００６０】
一部の実施形態では、酵素的加水分解および同時に行なわれる微生物発酵は、WO2006/056838およびWO2011/032557に記載される通りの自由落下混合による撹拌をもたらす加水分解反応器を用いて行なわれる。
【００６１】
いくらかの期間の酵素的加水分解および同時に行なわれる微生物発酵の後に、10〜45％の非水含量で提供されるMSWが変換され、それにより、生物起源または「発酵可能」な構成要素が液化され、微生物代謝生成物が水相中に蓄積する。いくらかの期間の酵素的加水分解および同時に行なわれる微生物発酵の後に、廃棄物の液化された発酵可能な部分が、発酵可能でない固形物から分離される。液化された材料は、発酵可能でない固形物から分離されると、本発明者らが「バイオ液体」と称するものになる。一部の実施形態では、このバイオ液体の非水含量のうちの少なくとも40％、または少なくとも35％、または少なくとも30％、または少なくとも25％が、溶存揮発性固形物を含む。一部の実施形態では、バイオ液体中の溶存揮発性固形物の少なくとも25重量％が、酢酸塩、酪酸塩、エタノール、ギ酸塩、乳酸塩、および/またはプロピオン酸塩のいずれかの組み合わせを含む。一部の実施形態では、溶存揮発性固形物の少なくとも70重量％、または少なくとも60％、または少なくとも50％、または少なくとも40％、または少なくとも30％、または少なくとも25％が、乳酸塩を含む。
【００６２】
一部の実施形態では、そのうちの少なくとも25重量％が酢酸塩、酪酸塩、エタノール、ギ酸塩、乳酸塩、および/またはプロピオン酸塩のいずれかの組み合わせを含む溶存揮発性固形物を含むことを特徴とするバイオ液体を生成するように、MSWの液化された発酵可能な部分からの発酵可能でない固形物の分離が、酵素的加水分解の開始後16時間未満で、または18時間未満で、または20時間未満で、または22時間未満で、または24時間未満で、または30時間未満で、または34時間未満で、または36時間未満で行なわれる。
【００６３】
発酵可能でない固形物からの廃棄物の液化された発酵可能な部分の分離は、種々の手段により遂行することができる。一部の実施形態では、これは、限定するものではないが、スクリュー押圧操作、加速度分離機操作、振動ふるい操作、または当技術分野で公知の他の分離操作をはじめとする、少なくとも2種の異なる分離操作のいずれかの組み合わせを用いて実現することができる。一部の実施形態では、廃棄物の発酵可能部分から分離された発酵可能でない固形物は、MSWの乾燥重量のうちの少なくとも約20％、または少なくとも25％、または少なくとも30％を占める。一部の実施形態では、廃棄物の発酵可能部分から分離された発酵可能でない固形物は、リサイクル可能な材料の乾燥重量のうちの少なくとも20％、または少なくとも25％、または少なくとも30％、または少なくとも35％を占める。一部の実施形態では、少なくとも2種類の分離操作を用いる分離は、処理されたMSW 1kg当たり少なくとも0.15kg、または少なくとも0.10の揮発性固形物を含むバイオ液体を生成する。MSWに内在する生物起源組成物は様々であることが、当業者には容易に理解されるであろう。それにもかかわらず、処理されたMSW 1kg当たり0.15kgの揮発性固形物という数字は、少なくとも80％の典型的な未分類MSW中の生物起源材料の合計捕捉量を反映する。処理されたMSW 1kg当たりのバイオ液体中に捕捉された揮発性固形物（kg）の算出は、総収量および処理された総MSWを測定する期間にわたって推定することができる。
【００６４】
一部の実施形態では、バイオ液体を生成するためのMSWの液化された発酵可能部分からの発酵可能でない固形物の分離後に、バイオ液体は、異なる温度またはpHをはじめとする異なる条件下での後発酵に供すことができる。
【００６５】
本明細書中で用いる場合、「溶存揮発性固形物」との用語は、以下の通りに算出される単純な測定値を意味する：バイオ液体のサンプルを、50mL Falconチューブ中で10分間、6900gにて遠心し、ペレットおよび上清を生成させる。上清をデカントし、ペレットの湿重量を液体サンプルの当初の合計重量の割合（％）として表わす。上清のサンプルは60度にて48時間乾燥させ、乾物含量を決定する。上清サンプルの揮発性固形物含量を、550℃での炉燃焼後に残る灰分を乾物測定値から差し引くことにより決定し、溶存揮発性固形物として体積パーセントで表わす。溶存揮発性固形物の独立した測定を、ペレットの揮発性固形物含量に基づく計算により決定する。ペレットの湿重量部分は、当初の合計体積の溶解されていない固形物体積比（割合）の部分推定値として適用する。ペレットの乾物含量は、60℃にて48時間乾燥させることにより決定する。ペレットの揮発性固形物含量は、550℃での炉燃焼後に残る灰分を乾物測定値から差し引くことにより決定する。ペレットの揮発性固形物含量は、(1-湿部分ペレット)×(測定された上清揮発性固形物％)により与えられる上清液体からの推定される寄与分によって補正する。元の液体サンプル中で測定される合計揮発性固形物（％）から、(ペレットの補正済揮発性固形物％)×(当初の合計体積の溶解していない固形物体積割合の部分推定値)を差し引いて、溶存揮発性固形物の独立した推定値を％として与える。細菌代謝生成物により代表される溶存揮発性固形物の割合（％）を過大評価しないために、2つの推定値のより高い方を用いる。
【００６６】
一部の実施形態では、本発明は、バイオメタン製造のための組成物および方法を提供する。MSWを処理する方法の実施形態に関する上記の詳細な議論は、任意により、バイオメタン製造のための方法および組成物を提供する実施形態に適用することができる。一部の実施形態では、バイオメタンを製造する方法は、以下のステップを含む：
(i)微生物発酵により予備調整され、それにより非水含量の少なくとも40重量％が溶存揮発性固形物として存在し、該溶存揮発性固形物は少なくとも25重量％の酢酸塩、酪酸塩、エタノール、ギ酸塩、乳酸塩および/またはプロピオン酸塩のいずれかの組みわせを含む、有機液体バイオメタン基質を準備するステップ、
(ii)該液体基質を嫌気的消化システムに移すステップ、それに続く
(iii)該液体基質の嫌気的消化を行い、バイオメタンを生成させるステップ。
【００６７】
一部の実施形態では、本発明は、都市固形廃棄物（MSW）の、または前処理されたリグノセルロース系バイオマスの酵素的加水分解および微生物発酵により生成されたか、あるいは、酵素的に加水分解されかつ微生物発酵されたMSWを含むか、または酵素的に加水分解されかつ微生物発酵された前処理されたリグノセルロース系バイオマスを含む、有機液体バイオメタン基質を提供し、該基質は、非水含量の少なくとも40重量％が溶存揮発性固形物として存在し、該溶存揮発性固形物は、少なくとも25重量％の酢酸塩、酪酸塩、エタノール、ギ酸塩、乳酸塩および/またはプロピオン酸塩のいずれかの組み合わせを含むことを特徴とする。
【００６８】
本明細書中で用いる場合、「嫌気的消化システム」との用語は、該システムを構成する各反応器中でメタンガスが生成される、制御された通気条件下で稼働される1個以上の反応器を含む発酵システムを意味する。「嫌気的消化システム」内の発酵混合物の水相中の、代謝的に生成され、溶存するメタンの濃度が、用いた条件で飽和し、かつメタンガスがシステムから排出される程度まで、メタンガスが生成される。
【００６９】
一部の実施形態では、「嫌気的消化システム」は、固定化フィルターシステムである。「固定化フィルター嫌気的消化システム」とは、物理的支持マトリクス上に、任意によりバイオフィルム内に、嫌気的消化集団が固定化されているシステムを意味する。
【００７０】
一部の実施形態では、液体バイオメタン基質は、少なくとも8％の総固形物、または少なくとも9％の総固形物、または少なくとも10％の総固形物、または少なくとも11％の総固形物、または少なくとも12％の総固形物、または少なくとも13％の総固形物を含む。本明細書中で用いる場合、「総固形物」とは、可溶性固形物および不溶性固形物の両方を意味し、実際的には「非水含量」を意味する。総固形物は、一定重量が達成されるまで60℃で乾燥することにより測定される。
【００７１】
一部の実施形態では、微生物発酵は、例えば、pH 6.0未満、またはpH 5.8未満、またはpH 5.6未満、またはpH 5.5未満にて、メタン細菌（methanogen）によるメタン生成を阻止する条件下で行なわれる。一部の実施形態では、液体バイオメタン基質は、飽和濃度未満の溶存メタンを含む。一部の実施形態では、液体バイオメタン基質は、15mg/L未満、または10mg/L未満、または5mg/L未満の溶存メタンを含む。
【００７２】
一部の実施形態では、バイオメタンを生成させるための嫌気的消化の前に、溶存揮発性固形物の1種以上の構成要素を、蒸留、ろ過、電気透析、特異的結合、沈殿または当技術分野で周知の他の手段により、液体バイオメタン基質から除去することができる。一部の実施形態では、エタノールおよび乳酸塩は、バイオメタンを生成させるための嫌気的消化の前に、液体バイオメタン基質から除去することができる。
【００７３】
一部の実施形態では、MSWまたは前処理されたリグノセルロース系バイオマス由来の繊維画分などの固形基質を、微生物発酵と同時に酵素的加水分解に供して、微生物発酵により予備調整された液体バイオメタン基質を生成し、それにより非水含量の少なくとも40重量％が溶存揮発性固形物として存在し、該溶存揮発性固形物は、少なくとも25重量％の酢酸塩、酪酸塩、エタノール、ギ酸塩、乳酸塩および/またはプロピオン酸塩のいずれかの組み合わせを含む。一部の実施形態では、上述の特性を有する液体バイオメタン基質は、オートクレーブ処理により未分類MSWから取得される液化された有機的材料の同時に行なわれる酵素的加水分解および微生物発酵により生成される。一部の実施形態では、前処理されたリグノセルロース系バイオマスは、任意によりMSW由来のバイオ液体からの酵素活性が、MSWおよび前処理されたリグノセルロース系バイオマスの両方に由来する複合液体バイオメタン基質を生成するためのリグノセルロース系基質の加水分解のための酵素活性を提供する様式で、酵素的に加水分解されかつ微生物発酵されたMSWと混合することができる。
【００７４】
「軟質リグノセルロース系バイオマス」とは、セルロース、ヘミセルロースおよびリグニンを含む、木材以外の植物バイオマスを意味する。少なくともコムギワラ、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ軸、空の果房、イネワラ、オートムギワラ、オオムギワラ、キャノーラワラ、ライムギワラ、ソルガム、スイートソルガム、ダイズ茎葉、スイッチグラス、ギョウギシバ（Bermuda grass）および他の草、バガス、ビートパルプ、トウモロコシ繊維、またはそれらのいずれかの組み合わせなどのバイオマスをはじめとする、いずれかの好適な軟質リグノセルロース系バイオマスを用いることができる。リグノセルロース系バイオマスは、紙、新聞用紙、段ボール、または他の都市廃棄物もしくはオフィス廃棄物などの他のリグノセルロース系材料を含むことができる。リグノセルロース系バイオマスは、種々の供給原料に由来する材料の混合物として用いることができ、新鮮であるか、部分的に乾燥しているか、完全に乾燥しているか、またはそれらのいずれかの組み合わせであり得る。一部の実施形態では、本発明の方法は、少なくとも約10kg、または少なくとも100kg、または少なくとも500kgのバイオマス供給原料を用いて実施することができる。
【００７５】
リグノセルロース系バイオマスは、一般的に、酵素的加水分解および微生物予備調整を行なう前に、当技術分野で公知の方法により前処理されるべきである。一部の実施形態では、バイオマスは、熱水前処理により前処理される。「熱水前処理」とは、酸もしくは他の化学物質の添加ありまたはなしで、120℃以上の温度で、バイオマスに「火を通す」ために、高温液体もしくは蒸気またはその両方を含む高温液体、蒸気スチーム（vapor steam）または加圧蒸気のいずれかとしての、水の使用を意味する。一部の実施形態では、リグノセルロース系バイオマス供給原料は、自己加水分解（autohydrolysis）により前処理される。「自己加水分解」とは、前処理中にヘミセルロース加水分解により遊離された酢酸が、ヘミセルロース加水分解をさらに触媒する前処理プロセスを意味し、pH 3.5〜9.0で行なわれるリグノセルロース系バイオマスのいずれかの熱水前処理に当てはまる。
【００７６】
一部の実施形態では、熱水により前処理されたリグノセルロース系バイオマスは、液体画分および固体画分に分離することができる。「固体画分」および「液体画分」とは、固体/液体分離での前処理されたバイオマスの分画化を意味する。分離された液体は、集合的に、「液体画分」と称される。顕著な不溶性固形物含量を含む残りの画分は、「固体画分」と称される。固体画分もしくは液体画分または組み合わせられたそれら両方のいずれかを、本発明の方法を実施するために、または本発明の組成物を生成するために用いることができる。一部の実施形態では、固体画分は洗浄することができる。
【実施例】
【００７７】
［実施例１］同時に行なわれる微生物発酵は、未分類MSWの酵素的加水分解による有機物捕捉を改善する
実施例5に記載の試験からのバイオ液体サンプルを用いて、実験台規模の反応を行なった。
【００７８】
実験室規模反応のためのモデルMSW基質は、都市固形廃棄物の有機的区分（セルロース性、動物および野菜区分として定義される）を含むために新鮮な農産物を用いて調製した（Riber et al. 2009に基づいてJensen et al., 2010に記載された通りに調製した）。
【００７９】
モデルMSWは、−20℃にてアリコートで保存され、4℃にて一晩解凍された。反応は50mL遠心管中で行ない、総反応量は20gであった。モデルMSWを、5％乾物（DM）（60℃での2日間後に残る乾物含量として測定される）に添加した。
【００８０】
加水分解に適用されるセルラーゼは、Cellic CTec3（VDNI0003, Novozymes A/S, Bagsvaerd, Denmark）（CTec3）であった。pHをpH5に調整および維持するために、クエン酸塩バッファー（0.05M）を用いて、総量を20gとした。
【００８１】
反応物を、加熱オーブン（Binder GmBH, Tuttlingen, Germany）中に配置したStuart Rotator SB3（4RPMに調整）にて24時間インキュベートした。インキュベーション中の基質からの乾物のバックグラウンド放出を評価するために、陰性対照を並行して行なった。インキュベーション後、遠心管を4℃にて10分間、1350gで遠心した。次に上清をデカントで除去し、1mLをHPLC分析のために取り出し、残りの上清およびペレットを60℃にて2日間乾燥させた。乾燥した物質の重量を記録し、乾物の分布を算出するために用いた。モデルMSW中のDMの変換率をこれらの数字に基づいて算出した。
【００８２】
有機酸およびエタノールの濃度を、屈折率検出器（Shodex(登録商標) RI-101）および250nmでのUV検出器を装着したUltiMate 3000 HPLC（Thermo Scientific Dionex）を用いて測定した。分離は、0.6mL/分の流速にて、5mM H2SO4を溶出液として用いて、80℃でRezex RHM単糖カラム（Phenomenex）上で行なった。結果を、Chromeleonソフトウェアプログラム（Dionex）を用いて解析した。
【００８３】
同時に行なわれる発酵および加水分解の効果を明らかにするために、実施例5に記載される試験からの2mL/20gのバイオ液体（12月15日および16日にサンプリング）を、CTec3（24mg/g DM）を含むかまたは含まずに、反応物に添加した。
【００８４】
MSW中のDMの変換率
固形物の変換率は、総乾物の割合（％）として上清中に見出される固形物の含有量として測定した。図1は、MSWブランク、単離された酵素調製物、微生物接種物のみ、および微生物接種物と酵素との組み合わせについての変換率を示す。結果は、実施例5からのEC12Bの添加が、反応ブランク（MSWブランク）中の乾物のバックグラウンド放出と比較して、有意に高い乾物の変換率をもたらしたことを示す（スチューデントt検定、p＜0.0001）。EC12Bサンプルの添加により誘導される同時に行なわれる微生物発酵およびCTec3を用いた酵素的加水分解は、CTec3のみを用いて加水分解された反応物およびEC12Bのみを添加された反応物と比較して、有意に高い乾物の変換率をもたらした（p＜0.003）。
【００８５】
グルコース、乳酸塩、酢酸塩およびEtOHのHPLC分析
上清中で測定されたグルコースおよび微生物代謝生成物（乳酸塩、酢酸塩およびエタノール）の濃度は、図2に示される。示されている通り、モデルMSWブランク中にはこれらの低いバックグラウンド濃度があり、乳酸含量はおそらくは、基質を作製するために用いた材料がまったく無菌でなく、または細菌を殺すために加熱されていないので、モデルMSWに元々含まれる細菌により生じている。CTec3の添加の効果は、上清中のグルコースおよび乳酸の増加をもたらした。グルコースおよび細菌代謝生成物の最高濃度は、実施例5からのEC12Bバイオ液体をCtec3と同時に加えた場合の反応物中で見出された。つまり、同時に行なわれる発酵および加水分解は、モデルMSWでの乾物の変換率を改善し、液体中の細菌代謝生成物の濃度を増大させる。
参考文献：Jacob Wagner Jensen, Claus Felby, Henning Jorgensen, Georg Ornskov Ronsch, Nanna Dreyer Norholm. Enzymatic processing of municipal solid waste. Waste Management. 12/2010; 30(12):2497-503.
Riber, C., Petersen, C., Christensen, T.H., 2009. Chemical composition of material fractions in Danish household waste. Waste Management 29, 1251-1257。
【００８６】
［実施例２］同時に行なわれる微生物発酵は、未分類MSWの酵素的加水分解による有機物捕捉を改善する
試験は、実験室規模実験で得られた結果を確認するために、未分類MSWを用いて、図3に示される特別に設計したバッチ反応器中で行なった。実験は、同時に行なわれる微生物発酵および酵素的加水分解を達成するために、実施例3の細菌から得られたバイオ液体を含む微生物の接種物を添加することの効果を試験した。試験は、未分類MSWを用いて行なった。
【００８７】
小規模トライアルのために用いられたMSWは、REnescienceでの研究開発の中心であった。有効なトライアル結果のために、廃棄物は代表的であり、かつ再現性のあるものである必要があった。
【００８８】
廃棄物は、2012年3月に、Nomi I/S Holstebroから収集した。廃棄物は、それぞれの地区からの未分類都市固形廃棄物（MSW）であった。小規模トライアルのために、およびトライアルのための代表的サンプルの収集のために、廃棄物を30×30mmに細断した。22リットルバケツ中で細断した廃棄物を部分サンプリングすることにより、サンプリングの理論を細断した廃棄物に適用した。バケツは、使用まで−18℃の冷凍容器に保管した。「現実の廃棄物」は、収集からの廃棄物の8個のバケツから構成された。これらのバケツの内容物を、反復間の変動性をできる限り低くすることを確実にするために、再混合および再サンプリングした。
【００８９】
すべてのサンプルを、水、温度、回転および機械的効果に関して同様の条件下で試験した。6個のチャンバーを用いた：3個は接種なし、3個は接種あり。トライアル中に指定された非水含量は、水の添加により15％非水含量に設定された。接種材料中の乾物が考慮に入れられ、したがって、接種されたチャンバーでの新鮮な水の添加は、より少なくなった。6kgのMSWを各チャンバーに加え、市販のセルラーゼ調製物であるCTEC3は84gであった。2リットルの接種物を、添加される水の対応する減少を伴って、接種されるチャンバーに加えた。
【００９０】
pHは、pHを上昇させるための20％NaOHおよびpHを低下させるための72％H2SO4のそれぞれの添加を用いて、接種チャンバーではpH5.0に保たれ、非接種チャンバーではpH4.2に保たれた。非接種チャンバー中の比較的低いpHは、内在する細菌が繁殖しないことを確実にするのを助けた。本発明者らは、用いられる酵素調製物であるCTEC3 Tmを用いて、MSW加水分解の状況で、pH4.2とpH5.0との間では活性の差異は認識できないことを以前に示している。反応は、一定の回転撹拌を与えるパイロット反応器を用いて50℃にて3日間継続された。
【００９１】
反応の最後に、同時に行なわれるMSWの酵素的加水分解および微生物発酵により生成される液化材料を含むバイオ液体ならびに篩を介して、チャンバーを空にした。
【００９２】
乾物（TS）および揮発性固形物（VS）を、乾物（DM）法により決定した：
サンプルを60℃にて48時間乾燥させた。乾燥の前後でのサンプルの重量を用いて、DMパーセンテージを算出した。
【００９３】
【数１】
2015521533.tif 000003
【００９４】
揮発性固形物法：
揮発性固形物を算出し、灰分含量を差し引いたDMパーセンテージとして表わす。サンプルの灰分含量は、最小で4時間、炉内で550℃にて予め乾燥させたサンプルを燃焼させることにより見出された。次に、灰分は以下の通りに算出した：
【００９５】
【数２】
2015521533.tif 000004
【００９６】
結果は以下に示した通りであった。示される通り、接種チャンバーで取得されたバイオ液体で、より高い総固形物含量が得られ、このことは、同時に行なわれる微生物発酵および酵素的加水分解が、酵素的加水分解のみよりも優れていたことを示した。
【００９７】
【表２】
2015521533.tif 000005
【００９８】
［実施例３］同時に行なわれる微生物発酵は、未分類MSWの酵素的加水分解による有機物捕捉を改善する
実験は、Amager ressource center（ARC, Copenhagen, Denmark）に置かれたREnescience実証用プラントにて行なわれた。プラントの主要な特徴を示す模式図を、図4に示す。ARC REnescience Waste Refineryのコンセプトは、MSWを4種類の生成物に分類することである。バイオガス製造のためのバイオ液体、リサイクル用の不活性材料（ガラスおよび砂）ならびに金属、プラスチックおよび樹木のRDF製造またはリサイクルに好適な無機材料の2D区分および3D区分。
【００９９】
大都市からのMSWは、ポリ袋に入れられた形で収集される。MSWは、REnescience Waste Refineryに輸送され、ここで、処理までサイロ中で保存される。MSWの特性に応じて、大きすぎる粒子（600mm超）を除去するために、REnescienceシステムの前に、分類ステップを組み込むことができる。
【０１００】
本実施例で試験されるREnescience技術は、3つのステップを含む。 
【０１０１】
第1ステップは、20〜60分間の時間、40〜75℃の範囲の温度までの、温水によるMSWの弱い加熱（前処理、図4に示される通り）である。この加熱および混合期は、ポリ袋を開け、分解可能な構成要素の適切なパルプ化をもたらして、酵素の添加前に、より均一な有機相を調製する。温度およびpHは、酵素的加水分解のために用いられる単離された酵素調製物の最適値へと、加熱期中に調整される。温水は、きれいな水道水として、または、図4に示される通り、洗浄ドラムで最初に用いられ、次に弱い加熱に再循環される洗浄水として添加することができる。
【０１０２】
第2ステップは、酵素的加水分解および発酵（液化、図4に示される通り）である。REnescience処理の第2ステップでは、酵素が加えられ、任意により選択された微生物が加えられる。酵素的液化および発酵は、酵素性能に最適な温度およびpHにて、約16時間の滞留時間に、連続的に行なわれる。この加水分解および発酵により、MSWの生物起源部分は、分解可能でない材料の間で、乾物が多いバイオ液体へと液化される。pHは、CaCO3の添加により制御される。
【０１０３】
本実施例中で実施されるREnescience技術の第3ステップは、バイオ液体が分解可能でない区分から分離される分離ステップである。分離は、加速度分離機（ballistic separator）、洗浄ドラムおよび液圧プレスで行なわれる。加速度分離機は、酵素的に処理されたMSWを、バイオ液体、2D非分解可能材料の区分および3D非分解可能材料の区分へと分離する。3D区分（缶およびプラスチック瓶などの物理的に3次元の物体）は多量のバイオ液体とは結合しないので、3D区分を清浄にするためには1回の洗浄ステップで十分である。2D区分（例えば、布地およびホイル）は、相当量のバイオ液体と結合する。したがって、2D区分は、スクリュープレスを用いて押圧され、洗浄および再押圧されて、バイオ液体の回収を最適化し、および「清浄」かつ乾燥した2D区分が得られる。砂およびガラスである不活性材料は、バイオ液体から篩分けされる。すべての洗浄ドラム中で用いられる水を再循環させ、加熱し、続いて加熱のために第1ステップで温水として用いることができる。
【０１０４】
本実施例に記録されるトライアルは、表1に示される通り、3つの区分に分けられた。
【０１０５】
【表３】
2015521533.tif 000006
【０１０６】
7日間のトライアルで、デンマークのコペンハーゲンから取得された未分類MSWを、335kg/hまでREnescience実証用プラントに連続的に投入した。弱い加熱では、弱加熱反応器に入る前に約75℃まで加熱された536kg/hの水（水道水または洗浄水）が添加された。それにより、温度は、MSW中で約50℃に調整され、pHはCaCO3の添加により約4.5に調整される。
【０１０７】
第1区画では、界面活性抗細菌剤であるRodalonTM（ベンジルアルキルアンモニウムクロリド）を、1kgのMSW当たり3gの活性成分で、添加される水に含めた。
【０１０８】
液化反応器には、1湿トンのMSW当たり約14kgのCellic Ctec3（Novozymesから市販されているセルラーゼ調製物）を加える。温度は45〜50℃の範囲で保たれ、CaCO3の添加によりpHは4.2〜4.5の範囲に調整された。酵素反応器保持時間は約16時間である。
【０１０９】
加速度分離機、プレスおよび洗浄ドラムの分離システムでは、バイオ液体（液化された分解可能材料）を分解可能でない材料から分離する。
【０１１０】
洗浄水は、選択的に注ぎ出し、有機物含量を記録し、または弱い加熱中に投入されるMSWを湿らせるために再循環および再使用された。洗浄水の再循環は、当初存在したよりも高レベルまで50℃の反応条件で繁殖している生物を用いて細菌接種を実現する作用を有する。用いられる処理スキームでは、流入するMSWを、この場合は約50℃である酵素的加水分解に適切な温度にするために、再循環された洗浄水は、まず約70℃まで加熱された。乳酸菌の場合には特に、70℃までの加熱は、熱耐性発現の選択および「誘導」をもたらすことが以前に示されている。
【０１１１】
サンプルは、下記の箇所で、選択された時点にて取得された：
・「EC12B」と名付けられた、目の細かい篩から離れるバイオ液体
・貯蔵タンク中のバイオ液体
・ホエー篩後の洗浄水
・2D区分
・3D区分
・両方の洗浄ユニットからの不活性な底部分
バイオ液体の生成は、貯蔵タンク上のロードセルを用いて測定した。新鮮な水の入力流を流量計を用いて測定し、再利用または排出された洗浄廃棄物をロードセルを用いて測定した。
【０１１２】
細菌カウントを、以下のように検討した：バイオ液体の選択されたサンプルをSPO（ペプトン塩溶液）中で10倍希釈し、希釈液の1mLを牛肉エキス寒天（beaf Extract Agar）（3.0g/Lの牛肉エキス（Fluka製、Cas：B4888）、10.0g/Lトリプトン（Sigma製、カタログ番号 T9410）、5.0g/L NaCl（Merck製、カタログ番号7647-14-5）、15.0g/L寒天（Sigma製、カタログ番号9002-18-0））上の播種深度に撒く。プレートを、それぞれ好気的雰囲気および嫌気的雰囲気で、50度にてインキュベートした。嫌気的培養は、Anoxymatを用いたガス抜き（gassing）およびiltfjernende letter（AnaeroGen、Oxoid製、カタログ番号AN0025A）の添加により嫌気的に保たれた適切な容器中で行なった。好気性コロニーは、16時間後、および24時間後に再び、計数した。嫌気的増殖細菌は、64〜72時間後に定量した。
【０１１３】
図5は、処理されたMSW 1kg当たりのkgとしての、EC12Bでのバイオ液体サンプル中の総揮発性固形物含量を示す。別個の期間としての3つの別個の実験期間のそれぞれを考慮することにより、実験中の様々な時点で点推定値を取得した。つまり、期間1（Rodalon）中の点推定値は、期間1の間の質量収支および物質流と比較して表わした。表5に示される通り、プラントでの複雑な事態による長時間の停止後に開始された期間1の間に、バイオ液体中で捕捉された総固形物は、徐々に低下し、このことはRodalonTMのわずかな抗細菌作用と合致する。期間2の間、捕捉された総固形物は若干高いレベルまで戻る。再循環が、流入するMSWの有効な「接種」をもたらす期間3の間、バイオ液体kg VS/kg廃棄物（affald）は、12％付近の著明に高いレベルまで上昇する。
【０１１４】
図5に示される10箇所の時点のそれぞれについて、バイオ液体（EC12B）サンプルが採取され、総固形物、揮発性固形物、溶存揮発性固形物、ならびに推定される細菌代謝生成物である酢酸塩、酪酸塩、エタノール、ギ酸塩、およびプロピオン酸塩の濃度をHPLCにより測定した。グリセロール濃度を含むこれらの結果は、以下の表1に示される。
【０１１５】
【表４】
2015521533.tif 000007
【０１１６】
10箇所の各時点で採取されたバイオ液体サンプルに関して、図6は、好気的条件下で測定された生存細菌カウント、およびまた溶存揮発性固形物のうちの割合（％）として表わされた重量パーセント「細菌代謝生成物」（酢酸塩、酪酸塩、エタノール、ギ酸塩、およびプロピオン酸塩の合計を意味する）の両方を示す。示されている通り、重量パーセント細菌代謝生成物は、細菌活性が増大すると明らかに増加し、バイオ液体中の固形物捕捉の増加と関連する。
【０１１７】
［実施例４］実施例3での同時に行なわれる発酵に寄与する微生物の同定
実施例3から取得されたバイオ液体のサンプルを、微生物組成に関して分析した。
【０１１８】
サンプル中に存在する微生物種は、それらの16S rRNA遺伝子配列を、十分に特性決定されている菌種（参照菌種）の16S rRNA遺伝子配列と比較することにより同定した。菌種同定の通常のカットオフ値は、参照菌種との97％の16S rRNA遺伝子配列類似性である。類似性が97％未満である場合、大概は異なる菌種である。
【０１１９】
得られる配列を、NCBIデータベースに対して、BlastNで問い合わせした。データベースは、少なくとも1200bp長およびNCBI分類学的関連付けを有する良質の配列を含む。95％以上の同一性のBLASTヒットのみを含めた。
【０１２０】
サンプリングされたバイオ液体を、DNA抽出前に凍結させることなく、分析へと直接移した。
【０１２１】
合計で7種類の細菌種が同定され（図7）、7種の古細菌（Archea）が同定された。一部の細菌種の場合には、 サブスピーシーズ は特定できなかった（L.アシドフィルス（L. acidophilus）、L.アミロボラス（L. amylovorus）、L.ソブリウス（L. sobrius）、L.ロイテリ（L. reuteri）、L.フルメンティ（L. frumenti）、L.ファーメンタム（L. fermentum）、L.ファビファーメンタンス（L. fabifermentans）、L.プランタラム（L. plantarum）、L.ペントサス（L. pentosus））。
【０１２２】
［実施例５］未分類MSWの、同時に行なわれる微生物発酵および酵素的加水分解を用いた有機物捕捉の詳細分析
実施例1に記載されるREnescience実証用プラントを用いて、未分類MSWの、同時に行なわれる細菌発酵および酵素的加水分解を用いた総有機物捕捉の詳細研究を行なった。
【０１２３】
コペンハーゲンからのゴミをEconetにより特性決定して、その内容物を測定した。
【０１２４】
廃棄物分析は、内容物および変動を決定するために分析した。MSWの大規模サンプルを、廃棄物分析を行なうEconet A/Sに送った。一次サンプルを、50〜200kg程度の部分サンプルに縮小した。この部分サンプルは、熟練された人材により15種類の異なる廃棄物区分へと分類された。各区分の重量を記録し、分布を算出した。
【０１２５】
【表５】
2015521533.tif 000008
【０１２６】
廃棄物の組成は時によって異なり、表2に提示されているのは、300時間にわたって収集された種々のサンプルからの廃棄物分析結果である。捕捉され得る有機材料の含有量に影響を与えるすべての区分であるオムツ、プラスチックおよび段ビール容器および食品廃棄物の区分で、大きな変動が見られる。
【０１２７】
「300時間試験」の全経過にわたって、処理されたMSW 1kg当たりのkg VSとして表わされた平均「捕捉」生分解性材料は、0.156kg VS/kg MSW投入量であった。
【０１２８】
バイオ液体の代表的サンプルは、プラントが安定的稼働期にある際の実験の経過中の種々の時点で採取した。HPLCによりサンプルを分析し、実施例3に記載された通りに揮発性固形物、総固形物、および溶存固体を測定した。結果を以下の表2に示す。
【０１２９】
【表６】
2015521533.tif 000009
【０１３０】
［実施例６］実施例5での同時に行なわれる発酵に寄与する微生物の同定
バイオ液体「EC12B」のサンプルは、2012年12月15日および16日に実施例5に記載される試験中に回収され、サンプル中の微生物を同定するために16S rDNA分析を行なう目的で、−20℃にて保存した。16S rDNA分析は、リボソーム小サブユニットの16S成分に基づいて原核生物の同定および系統発生学分析に対して広く用いられる。凍結サンプルはドライアイス上でGATC Biotech AB（Solna, SE）に輸送され、ここで16S rDNA分析が行なわれた（GATC_Biotech）。分析は、以下のステップを含んだ：ゲノムDNAの抽出、ユニバーサルプライマー（超可変領域V1〜V3にまたがるプライマー対、27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/534R：ATTACCGCGGCTGCTGG；507bp長）を用いるアンプリコンライブラリー調製、GS FLXアダプターを用いたPCRタグ付け、サンプル当たり104,000〜160,000の読み出し数を与えるGenome Sequencer FLX装置での配列決定。得られた配列を次に、リボソームデータベースプロジェクトからのrDNAデータベースに対してBlastNで問い合わせた（Cole et al., 2009）。データベースは、少なくとも1200bp長およびNCBI分類学的関連付けを有する良質の配列を含む。現行リリース（RDPリリース10、2012年9月19日に更新）は、9,162種の細菌および375種の古細菌配列を含む。BLAST結果をフィルタリングして、短く低い品質のヒットを除いた（配列同一性90％以上、アライメント範囲90％以上）。
【０１３１】
合計226種の異なる細菌が同定された。
【０１３２】
EC12Bサンプル中の優勢な細菌は、パルディバクター・プロピオニシゲネスWB4（Paludibacter propionicigenes WB4）であり、これは、プロピオン酸産生細菌であり（Ueki et al. 2006）、同定された細菌の合計のうち13％を占めた。13種類の同定された優勢な細菌（パルディバクター・プロピオニシゲネスWB4（Paludibacter propionicigenes WB4）、プロテイニフィルム・アセタティゲネス（Proteiniphilum acetatigenes）、アクチノミセス・エウロペウス（Actinomyces europaeus）、レビリネア・サッカロリティカ（Levilinea saccharolytica）、クリプタネロバクター・フェノリクス（Cryptanaerobacter phenolicus）、セディメンティバクター・ヒドロキシベンゾイクス（Sedimentibacter hydroxybenzoicus）、クロストリジウム・フィトファーメンタンスISDg（Clostridium phytofermentans ISDg）、ペトリモナス・スルフリフィラ（Petrimonas sulfuriphila）、クロストリジウム・ラクタティファーメンタンス（Clostridium lactatifermentans）、クロストリジウム・カエニコラ（Clostridium caenicola）、ガルシエラ・ニトラティレデュセンス（Garciella nitratireducens）、デハロバクター・レストリクツスDSM 9455（Dehalobacter restrictus DSM 9455）、マリノバクター・ルタオエンシス（Marinobacter lutaoensis））の分布が、図8に示されている。
【０１３３】
属レベルでの同定された細菌の比較は、クロストリジウム属（Clostridium）、パルディバクター属（Paludibacter）、プロテイニフィルム属（Proteiniphilum）、アクチノミセス属（Actinomyces）およびレビリネア属（Levilinea）（すべて嫌気性）が同定された属のおよそ半分に当たることを示した。ラクトバチルス属は、同定された細菌の2％を占めた。優勢な細菌種であるP.プロピオニシゲネスWB4（P. propionicigenes WB4）は、EC12Bサンプル中の2番目に優勢な属（パルディバクター属（Paludibacter））に属する。
【０１３４】
EC12Bサンプル中の優勢な病原性細菌は、ストレプトコッカス属の種（Streptococcus spp.）であり、同定された細菌の合計のうち0.028％を占めた。バイオ液体中には、芽胞形成性細菌は見出されなかった。
【０１３５】
ストレプトコッカス属の種は、実施例5でのバイオ液体中に存在する唯一の病原性細菌であった。ストレプトコッカス属の種は、最大の温度許容性（非芽胞形成性細菌のうち）およびD値を有する細菌であり、このことは、生存中のストレプトコッカス属種細胞の量を10分の1に減少させるために所与の温度で必要とされる時間は、MSW中でDeportesら（1998）により報告された他の病原性細菌のいずれよりも大きいことを示す。これらの結果は、実施例5で適用された条件が、ストレプトコッカス属の種のみが存在する場合に、一定レベルまでREnescience処理での分類中にMSWを消毒することができることを示す。
【０１３６】
栄養に関する生物同士の競合、および処理中の温度の上昇が、病原性生物の数を著明に減少させ、上記で示された通り、REnescience処理で分類されたMSW中の病原体の存在を排除するであろう。pH、aw、酸素耐性、CO2、NaCl、およびNaNO2などの他の因子もまた、バイオ液体中の病原性細菌の増殖に影響する。上述の因子同士の相互作用により、処理中に生存細胞量を減少させるために必要とされる時間および温度が低下する場合がある。
【０１３７】
［実施例７］離れた地理的位置から得られた未分類MSWの、同時に行なわれる微生物発酵および酵素的加水分解を用いた有機物捕捉の詳細分析
実施例3に記載されたREnescience実証用プラントを用いて、オランダから輸入されたMSWを処理した。MSWは以下の組成を有することが見出された：
【０１３８】
【表７】
2015521533.tif 000010
【０１３９】
材料を、実施例3および5に記載された通りに同時に行なわれる酵素的加水分解および微生物発酵に供し、3日間のプラント操業に関して試験した。種々の時点で得られたバイオ液体のサンプルを取得し、特性決定した。結果を表3に示す。
【０１４０】
【表８】
2015521533.tif 000011
【０１４１】
［実施例８］未分類MSWの、同時に行なわれる細菌発酵および酵素的加水分解から得られたバイオ液体を用いるバイオメタン製造
実施例5に記載された実験で得られたバイオ液体を20リットルバケツ中で凍結させ、後の使用のために−18℃で保存した。この材料を、フィルター支持体上に固定化されたバイオフィルム内の嫌気的消化集団を含む、2つの同一の十分調整された固定化フィルター嫌気的消化システムを用いて、バイオメタン製造に関して試験した。
【０１４２】
当初のサンプルを、供給物および反応器内の液体の両方について回収した。VFA、tCOD、sCOD、およびアンモニア濃度を、DR2800分光光度計を用いるHACH LANGEキュベット試験を用いて測定し、詳細なVFAはHPLCにより毎日測定した。TSVS測定値はまた、重量法により決定される。GC分析用の気体サンプルは毎日採取される。供給速度の確認は、供給タンク中の上部空間体積およびまた反応器から出てくる流出物の量を測定することにより行なう。処理中のサンプリングは、シリンジを用いて液体または流出物を回収することにより行なった。
【０１４３】
安定したバイオガス生成が、10週間の期間で両方の消化システムを用いて観察され、これは0.27〜0.32L/g COD、またはR〜Z L/g VSに相当した。
【０１４４】
バイオ液体の供給を、続いて2つのシステムのうちの一方で停止させ、図9に示される通り、ベースラインへの復帰をモニタリングした。安定したガス生成レベルが、2と示される水平の線により表わされる。供給が停止された時点は、3と示される垂直の線で表わされる。示される通り、数ヵ月の定常稼働後、3および4と示される垂直の線の間で示される期間の間に変換された残留する弾性物質が残った。ベースラインへの復帰または「下降」（ramp down）は、4と示される垂直の線に続く期間で示される。ベースライン期間後、1と示される垂直の線により示される時点で、供給が再び開始された。定常状態ガス生成への増大または「上昇」（ramp up）は、1と示される垂直な線に続く期間で示される。
【０１４５】
記載された通りに測定された「上昇」および「下降」を含むバイオ液体からのガス生成のパラメータを、以下に示す。
【０１４６】
【表９】
2015521533.tif 000012
【０１４７】
［実施例９］同時に行なわれる微生物発酵ありおよびなしでの未分類MSWの酵素的加水分解から得られたバイオ液体を用いるバイオメタン製造の比較
実施例2で得られた「高乳酸塩」バイオ液体および「低乳酸塩」バイオ液体を、実施例8に記載された固定化フィルター嫌気的消化システムを用いてバイオメタン生成について比較した。測定値が取得され、実施例8に記載された通りに「上昇」時間および「下降」時間が決定された。
【０１４８】
図10は、「高乳酸塩」バイオ液体の「上昇」および「下降」特性決定を示す。安定したガス生成レベルが、2と示される水平の線により表わされる。供給が開始された時点は、1と示される垂直の線で表わされる。定常状態ガス生成への増大または「上昇」（ramp up）は、1と示される垂直な線に続く期間で示される。供給が停止された時点は、3と示される垂直の線で表わされる。ベースラインへの復帰または「下降」（ramp down）は、3と示される垂直の線に続く期間から4により示される垂直の線の期間で示される。
【０１４９】
図11は、図11に関して記載した通りに、示される関連する点を含む、「低乳酸塩」バイオ液体の同様の特性決定を示す。
【０１５０】
記載された通りに測定される「上昇」および「下降」を含む、「高乳酸塩」バイオ液体および「低乳酸塩」バイオ液体からのガス生成の比較パラメータを、以下に示す。
【０１５１】
「上昇」/「下降」時間での差異は、生分解性の容易さでの差異を示す。最も速く生体変換可能なバイオマスは、バイオガス生成用途での最も高い総有機物変換率を最終的に有するであろう。さらに、「より速い」バイオメタン基質は、固定化フィルター消化装置などの非常に速い嫌気的消化システムによる変換に、より理想的に好適である。
【０１５２】
示される通り、「高乳酸塩」バイオ液体は、バイオメタン生成でのずっと速い「上昇」および「下降」時間を示す。
【０１５３】
【表１０】
2015521533.tif 000013
【０１５４】
［実施例１１］熱水前処理したコムギワラの同時に行なわれる微生物発酵および酵素的加水分解から得られたバイオ液体を用いるバイオメタン製造
コムギワラを、前処理し、繊維画分および液体画分へと分離し、続いて繊維画分を別個に洗浄した。続いて、5kgの洗浄された繊維を、実施例3から得られたバイオ液体（biovaeske）からなる発酵性微生物の接種を伴って、Cellic CTEC3の投入と共に、水平回転ドラム反応器中でインキュベートした。コムギワラを、50度にて3日間、同時の加水分解および微生物発酵に供した。
【０１５５】
このバイオ液体を、続いて、実施例8に記載された固定化フィルター嫌気的消化システムを用いるバイオメタン生成について試験した。実施例8に記載された通りに、「上昇」時間についての測定値が得られた。
【０１５６】
図12は、加水分解されたコムギワラバイオ液体の「上昇」特性決定を示す。安定したガス生成レベルが、2と示される水平の線により表わされる。供給が開始された時点は、1と示される垂直の線で表わされる。定常状態ガス生成への増大または「上昇」（ramp up）は、1と示される垂直な線に続く期間で示される。
【０１５７】
コムギワラ加水分解生成物バイオ液体からのガス生成のパラメータは、以下に示される。
【０１５８】
示される通り、前処理されたリグノセルロース系バイオマスは、バイオガス製造の方法を実施するためにおよび本発明の新規なバイオメタン基質を生成するためにも、容易に用いることができる。
【０１５９】
【表１１】
2015521533.tif 000014
【０１６０】
［実施例１２］選択された生物を用いたMSWの同時に行なわれる微生物発酵および酵素的加水分解
特定の単独培養細菌を用いる、同時に行なわれる微生物および酵素的加水分解反応を、モデルMSW（実施例1に記載される）を用いて、実施例1に記載された手順に従って、実験室規模で行なった。反応条件および酵素投入量を表4に特定する。
【０１６１】
ラクトバチルス・アミロフィラス（Lactobaccillus amylophiles）（DSMZ No. 20533）およびプロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（propionibacterium acidipropionici）（DSMZ No. 20272）（DSMZ, Braunsweig, Germany）の生存細菌株（使用まで16時間、4℃にて保存）を接種物として用いて、CTec3の添加ありまたはなしでのモデルMSW中の乾物の変換に対するそれらの影響を測定した。これらにより産生される主要な代謝生成物は、それぞれ乳酸およびプロピオン酸である。これらの代謝生成物の濃度を、HPLC手順（実施例1に記載されている）を用いて検出した。
【０１６２】
プロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（propionibacterium acidipropionici）は嫌気性であるので、この菌株が適用された反応に用いられるバッファーは、気体窒素を用いてパージし、生存培養物を、これもまた気体窒素を用いてパージされた可動性嫌気性チャンバー（Atmos Bag, Sigma Chemical CO, St. Louis, MO, US）の内部の反応チューブに接種した。P.プロピオニシ（P. propionici）を含む反応チューブは、インキュベーターに移す前に閉じた。反応物には、P.プロピオニシ（P. propionici）またはL.アミロフィラス（L. amylophilus）のいずれかの1mLを接種した。
【０１６３】
表4に示される結果は、予測された代謝生成物が生成されたことを明らかに示し；P.アシドプロピオニシ（p. acidipropionic）を接種された反応物中ではプロピオン酸が検出されたが、CTec3を含むかまたは含まないモデルMSWを含有する対照ではプロピオン酸は検出されなかった。モデルMSWのみを添加された対照反応物中の乳酸濃度は、L.アミロフィラス（L. amylophilus）のみを添加された反応物中とほぼ同じであった。この対照反応物中での乳酸の生成は、モデルMSWに元々含まれる細菌に起因する。モデル廃棄物の個々の構成要素は、新鮮に生成され、凍結されたが、モデルMSWの調製前にいずれの方法でもさらに滅菌しなかったので、いくぶんかのバックグラウンド細菌が予測された。L.アミロフィラス（L. amylophilus）にCTec3が同時に加えられた場合、乳酸濃度はほぼ2倍であった（表4）。
【０１６４】
加水分解後の上清へのDMの放出に対する陽性作用が、CTec3と共にL.アミロフィラス（L. amylophilus）またはP.プロピオニシ（P. propionici）のいずれかを添加された反応物中でのより高いDM変換率として実証された（CTec3のみを添加された反応と比較して30〜33％増加）。
【０１６５】
【表１２】
2015521533.tif 000015
【０１６６】
［実施例１３］実施例7での同時に行なわれる発酵に寄与する微生物の同定
バイオ液体「EC12B」および再循環水「EA02」のサンプルを、実施例7に記載された試験の間に採取した（サンプリングは、3月21日および22日に行なわれた）。リボソーム小サブユニットの16S成分に基づく原核生物の同定および系統発生学分析に対して広く用いられる、微生物を同定するための16S rDNA分析を行なう目的のために、液体サンプルを10％グリセロール中で凍結し、−20℃で保存した。凍結サンプルはドライアイス上でGATC Biotech AB（Solna, SE）に輸送され、ここで16S rDNA分析が行なわれた（GATC_Biotech）。分析は、以下のステップを含んだ：ゲノムDNAの抽出、ユニバーサルプライマー（超可変領域V1〜V3にまたがるプライマー対、27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/534R：ATTACCGCGGCTGCTGG；507bp長）を用いるアンプリコンライブラリー調製、GS FLXアダプターを用いたPCRタグ付け、サンプル当たり104,000〜160,000の読み出し数を与えるGenome Sequencer FLX装置での配列決定。得られた配列を次に、リボソームデータベースプロジェクトからのrDNAデータベースに対してBlastNで問い合わせた（Cole et al., 2009）。データベースは、少なくとも1200bp長およびNCBI分類学的関連付けを有する良質の配列を含む。現行リリース（RDPリリース10、2012年9月19日に更新）は、9,162種の細菌および375種の古細菌配列を含む。BLAST結果をフィルタリングして、短く低い品質のヒットを除いた（配列同一性90％以上、アライメント範囲90％以上）。
【０１６７】
EC12B-21/3、EC12B-22/3およびEA02B 21/3、EA02-22/3のサンプル中で、 合計452種、310種、785種、594種の異なる細菌が同定された。
【０１６８】
分析は、菌種レベルで、ラクトバチルス・アミロリティクス（Lactobacillus amylolyticus）が、検出された微生物相全体の26％〜48％を占めてはるかに最も優勢な細菌であったことを明らかに示した。EC12Bサンプル中の微生物相は類似であり；13種類の同定された優勢な細菌（ラクトバチルス・アミロリティクスDSM 11664（Lactobacillus amylolyticus DSM 11664）、ラクトバチルス・デルブルエッキイ サブスピーシーズ デルブルエッキイ（Lactobacillus delbrueckii subsp. delbrueckii）、ラクトバチルス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・デルブルエッキイ サブスピーシーズ インディクス（Lactobacillus delbrueckii subsp indicus）、ラクトバチルス・シミリスJCM 2765（Lactobacillus similis JCM 2765）、ラクトバチルス・デルブルエッキイ サブスピーシーズ ラクティスDSM 20072（Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis DSM 20072）、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）、ラクトバチルス・ハムステリ（Lactobacillus hamsteri）、ラクトバチルス・パラブキネリ（Lactobacillus parabuchneri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）、ラクトバチルス・ポンティス（Lactobacillus pontis）、ラクトバチルス・ブキネリ（Lactobacillus buchneri））の分布は、2回の異なるサンプリング日を比較して実質的に同じであった。
【０１６９】
EA02サンプルはEC12Bと類似であったが、L.アミロリティクス（L. amylolyticus）はそれほど優勢でなかった。13種類の優勢な細菌（ラクトバチルス・アミロリティクスDSM 11664（Lactobacillus amylolyticus DSM 11664）、ラクトバチルス・デルブルエッキイ サブスピーシーズ デルブルエッキイ（Lactobacillus delbrueckii subsp delbrueckii）、ラクトバチルス・アミロボラス（Lactobacillus amylovorus）、ラクトバチルス・デルブルエッキイ サブスピーシーズ ラクティスDSM 20072（Lactobacillus delbrueckii subsp. Lactis DSM 20072）、ラクトバチルス・シミリスJCM 2765（Lactobacillus similis JCM 2765）、ラクトバチルス・デルブルエッキイ サブスピーシーズ インディクス（Lactobacillus delbrueckii subsp. indicus）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）、ワイセラ・ガネンシス（Weissella ghanensis）、ラクトバチルス・オリゴファーメンタンスLMG 22743（Lactobacillus oligofermentans LMG 22743）、ワイセラ・ベニネンシス（Weissella beninensis）、ロイコノストック・ガシコミタツムLMG 18811（Leuconostoc gasicomitatum LMG 18811）、ワイセラ・ソリ（Weissella soli）、ラクトバチルス・パラプランタラム（Lactobacillus paraplantarum）)の分布もまた類似であったが、13種類の優勢な細菌種中のシュードモナス・エクストレマウストラリス14-3（Pseudomonas extremaustralis 14-3）の発生を除く存在を除く。EA02 (21/3)で見出されたこのシュードモナス属は、南極大陸の一時的な池（temporary pond）から以前に単離されており、オクタノエートおよびグルコースの両方からポリヒドロキシアルカノエート（PHA）を産生できるはずである（Lopez et al. 2009; Tribelli et al., 2012）。
【０１７０】
属レベルでの結果の比較により、ラクトバチルス属が、サンプル中で同定された細菌の56〜94％を占めることが示された。属にわたる分布もまた、EC12BおよびEA02の2回のサンプリング日の間で極めて似通っている。興味深いことに、EA02サンプルでは、ワイセラ属（Weisella）、ロイコノストック属（Leuconostoc）およびシュードモナス属がかなりの程度まで存在するが（1.7〜22％）これらはEC12Bサンプルでは微量の構成要素としてのみ見出される（＞0.1％）。ワイセラ属（Weisella）およびロイコノストック属（Leuconostoc）は共に、ラクトバチルス目（lactobacillales）に属し、ラクトバチルス属と同様である。
【０１７１】
実施例7に記載された試験の間にサンプリングされたEC12BおよびEA02中の優勢な病原性細菌は、同定された全細菌の0.281〜0.539％および0.522〜0.592％をそれぞれ含んだ。EC12Bサンプル中の優勢な病原性細菌は、アエロモナス属の種（Aeromonas spp.）、セレウス菌（Bacillus cereus）、ブルセラ属の種（Brucella sp.）、シトロバクター属の種（Citrobacter spp.）、ウェルシュ菌（Clostridium perfrigens）、クレブシエラ属の種（Klebsiells sp.）、プロテウス属の種（Proteus sp.）、プロビデンス属の種（Providencia sp.）、サルモネラ属の種（Salmonella spp.）、セラチア属の種（Serratia sp.）、シゲラ属の種（Shigellae spp.）および黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）であった。実施例7に記載されたEC12BおよびEA02では芽胞形成性病原性細菌は同定されなかった。EC12BおよびEA02の両方で、同定される病原性細菌の総量は時間と共に減少し、EC12B中の総細菌量は1日でほぼなくなった。
【０１７２】
Deportes et al. (1998)には、MSW中に存在することが知られている病原体が要約されている。実施例3、5および7に記載されたMSW中に存在する病原体を、表5に示す（Deportes et al. (1998)および16S rDNA分析）。Deportes et al. (1998)に記載されている病原体に加えて、実施例7に記載された試験の間にサンプリングされたEC12BおよびEA02中で、プロテウス属の種（Proteua sp.）およびプロビデンシア属の種（Providencia sp.）の両方が見出された。一方で、実施例5のバイオ液体中に存在する唯一の病原性細菌であったストレプトコッカス属の種（Streptococcus spp.）は、ここには存在しなかった。このことは、実施例7のEC12BおよびEA02中には別の細菌群落が存在することを示し、これは栄養に関する生物同士の競合、および別の細菌群落の増殖に好ましいであろう処理中のわずかな温度低下によるものであり得る。
【０１７３】
【表１３】
2015521533.tif 000016
【０１７４】
菌株同定およびDSMZ寄託
実施例7に記載された試験から回収された3月21日および22日からのEA02のサンプルを、同定および単離された細菌の単独培養物を取得する目的のために、Novo Nordic Centre for Biosustainability（NNセンター）（Hoersholm, Denmark）でのプレート播種のために送付した。NNセンターに到着すると、サンプルを50℃にて一晩インキュベートし、続いて種々のプレート上に撒き（GM17、トリプシンダイズ培地（tryptic soy broth）、および牛肉エキス（GM17寒天：48.25g/L m17アガー、20分間のオートクレーブ後、グルコースを0.5％の最終濃度まで添加する、トリプシンダイズ寒天（Tryptic soy agar）：30g/Lトリプシンダイズ培地（Tryptic soy broth）、15g/L寒天、牛肉培地（Beef broth）（Statens Serum Institute, Copenhagen, Denmark）、15g/Lアガロースを添加）、50℃にて好気的に増殖させた。
【０１７５】
1日後、プレートを目視検査し、選択されたコロニーを対応するプレート上に再ストリークし、同定のためにDSMZに送った。
【０１７６】
EA02由来の再循環水から単離された以下の菌株は、DMSZ（DSMZ, Braunsweig, Germany）に特許寄託されている：
同定されたサンプル
サンプルID：13-349（バチルス・サフェンシス（Bacillus safensis））（EA02-21/3）由来、DSM 27312
サンプルID：13-352（ブレビバチルス・ブレビス（Brevibacillus brevis））（EA02-22/3）由来、DSM 27314
サンプルID：13-353（バチルス・サブティリスsp.サブティリス（Bacillus subtilis sp. subtilis））（EA02-22/3）由来、DSM 27315
サンプルID：13-355（バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis））（EA02-21/3）由来、DSM 27316
サンプルID：13-357（アクチノミセス・ボビス（Actinomyces bovis））（EA02-22/3）由来、DSM 27317
同定されなかったサンプル
サンプルID：13-351（EA02-22/3）由来、DSM 27313
サンプルID：13-362A（EA02-22/3）由来、DSM 27318
サンプルID：13-365（EA02-22/3）由来、DSM 27319
サンプルID：13-367（EA02-22/3）由来、 DSM 27320。
【０１７７】
参考文献：
Cole, J. R., Wang, Q., Cardenas, E., Fish, J., Chai, B., Farris, R. J., & Tiedje, J. M. (2009). The Ribosomal Database Project: improved alignments and new tools for rRNA analysis. Nucleic acids research, 37 (suppl 1), (D141-D145).
GATC_Biotech supporting material. Defining the Microbial Composition of Environmental Samples Using Next Generation Sequencing. Version 1.
Tribelli, P. M., Iustman, L. J. R., Catone, M. V., Di Martino, C., Reyale, S., Mendez, B. S., Lopez, N. I. (2012). Genome Sequence of the Polyhydroxybutyrate Producer Pseudomonas extremaustralis, a Highly Stress-Resistant Antarctic Bacterium. J. Bacteriol. 194(9):2381.
Nancy I. Lopez, N. I., Pettinari, J. M., Stackebrandt, E., Paula M. Tribelli, P. M., Potter, M.,  Steinbuchel, A., Mendez, B. S. (2009). Pseudomonas extremaustralis sp. nov., a Poly(3-hydroxybutyrate) Producer Isolated from an Antarctic Environment. Cur. Microbiol. 59(5):514-519。
【０１７８】
実施形態および実施例は単に代表的なものであり、特許請求の範囲の範囲を限定することを意図しない。
【図１】
2015521533.tif 000017
【図２】
2015521533.tif 000018
【図３】
2015521533.tif 000019
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2015521533.tif 000023
【図８】
2015521533.tif 000024
【図９】
2015521533.tif 000025
【図１０】
2015521533.tif 000026
【図１１】
2015521533.tif 000027
【図１２】
2015521533.tif 000028
【配列表】
2015521533000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年1月29日(2015.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
都市固形廃棄物（MSW）または未分類MSWを処理する方法であって、以下のステップ：
(i)MSWを準備するステップ、
(ii)廃棄物の生分解可能な部分の液化をもたらす酵素的加水分解および微生物代謝生成物の蓄積に適切な温度での、微生物発酵と同時にセルラーゼ活性を用いたMSWの生分解可能な部分の酵素的加水分解を行うステップ、それに続く
(iii)廃棄物の液化された生分解可能な部分を生分解可能でない固形物から分類して、バイオ液体を生成させるステップであって、該バイオ液体中の非水含量の少なくとも25または40重量％が溶存揮発性固形物として存在し、該溶存揮発性固形物は、少なくとも25重量％の酢酸塩、酪酸塩、エタノール、ギ酸塩、乳酸塩および/またはプロピオン酸塩のいずれかの組みわせを含む、上記ステップ、場合により、それに続く
(iv)バイオ液体の嫌気的消化によりバイオメタンを生成させるステップ
を含み、同時に行われる微生物発酵が、乳酸菌、酢酸産生菌、エタノール産生菌、プロピオン酸産生菌、酪酸産生菌、またはMSW中に天然に存在する細菌を含む群からの1種以上の種を用いたMSWの接種によって行われる、上記方法。
【請求項２】
廃棄物の液化された生分解可能な部分の生分解可能でない固形物からの分類が、処理されたMSW 1kg当たり少なくとも0.10kgの揮発性固形物を含むバイオ液体を生成するのに十分な少なくとも2種類の分離操作を用いて行われる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
接種が、分解可能でない固形物から残留有機材料を回収するために用いられる洗浄水または処理溶液の再利用により提供される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
以下のステップ：
(i)酵素的加水分解に適切な温度での、都市固形廃棄物（MSW）、未分類MSWおよび/または前処理されたリグノセルロース系バイオマスの、同時に行われるセルラーゼ活性を用いた酵素的加水分解および微生物発酵により生成された液体バイオメタン基質を準備するステップであって、同時に行われる微生物発酵が、乳酸菌、酢酸産生菌、エタノール産生菌、プロピオン酸産生菌および酪酸産生菌を含む群からの1種以上の種を用いた接種によって行われ、該バイオメタン基質中の非水含量の少なくとも25または40重量％が溶存揮発性固形物として存在し、該溶存揮発性固形物は少なくとも25重量％の酢酸塩、酪酸塩、エタノール、ギ酸塩、乳酸塩および/またはプロピオン酸塩のいずれかの組みわせを含む、上記ステップ、
(ii)該液体基質を、嫌気的消化システムに移すステップ、それに続く
(iii)該液体基質の嫌気的消化を行い、バイオメタンを生成させるステップ
を含む、バイオメタンを製造する方法。
【請求項５】
都市固形廃棄物の非水含量が10〜45％である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
接種が、酵素活性の添加の、または細胞外セルラーゼ活性を示す微生物の添加の前またはそれと同時に行われる、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
セルラーゼ活性が、(i)細胞外セルラーゼ活性を示す選択された微生物の接種により、および/または(ii)単離されたセルラーゼ調製物として、添加される、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
微生物発酵が、乳酸菌の1種以上の種を用いた接種により行われる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
酵素的加水分解および微生物発酵が、30〜75℃または45〜50℃の温度範囲内で行われる、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記同時に行われる酵素的加水分解および微生物発酵が、pH6.0未満のpHで行われる、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオメタン基質または前記バイオ液体の溶存揮発性固形物の少なくとも40重量％が乳酸塩を含み、前記液体バイオメタン基質またはバイオ液体が、25℃にて15mg/L未満の溶存メタン含量を含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記液体バイオメタン基質が、熱水前処理されたリグノセルロース系バイオマスを用いて生成される、および/または前記リグノセルロース系バイオマスが、pH3.5〜9.0にて120℃以上の温度で前処理されたものである、請求項4〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項1〜3および5〜12のいずれか1項に記載の方法により得ることができるバイオ液体、または請求項4〜12のいずれか1項に記載の方法により得ることができる液体バイオメタン基質。
【請求項１４】
酵素的加水分解に適切な温度での、都市固形廃棄物（MSW）、未分類MSWおよび/または前処理されたリグノセルロース系バイオマスの、同時に行われるセルラーゼ活性を用いた酵素的加水分解および微生物発酵の方法により得ることができる液体バイオメタン基質であって、
該バイオメタン基質中、非水含量の少なくとも25または40重量％が溶存揮発性固形物として存在し、該溶存揮発性固形物は少なくとも25重量％の酢酸塩、酪酸塩、エタノール、ギ酸塩、乳酸塩および/またはプロピオン酸塩のいずれかの組みわせを含み、
同時に行われる微生物発酵が、乳酸菌、酢酸産生菌、エタノール産生菌、プロピオン酸産生菌および酪酸産生菌を含む群からの1種以上の種を用いた接種によって行われる、
上記液体バイオメタン基質。
【請求項１５】
都市固形廃棄物の非水含量が10〜45％である、および/または同時に行われる酵素的加水分解および微生物発酵がpH6.0未満のpHで行われる、および/または同時に行われる酵素的加水分解および微生物発酵が30〜75℃の温度範囲内で行われる、および/または溶存揮発性固形物の少なくとも40重量％が乳酸塩を含む、請求項14に記載のバイオメタン基質。
【国際調査報告】
2015521533.tif 000029
2015521533.tif 000030
2015521533.tif 000031