(57)【要約】  本発明は、概して、Ａｄ３６組成物およびＡＫＴ１阻害剤を投与することにより血糖コントロールを改善するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個人における血糖コントロールを改善する方法であって、それを必要とする個人に、治療上効果的な量のＡｄ３６組成物およびＡＫＴ１阻害剤を投与することを含み、血糖コントロールは、脂質生成の実質的な増加なしに改善される方法。
【請求項２】
個人における血糖コントロールを改善する方法であって、それを必要とする個人に、治療上効果的な量のＡｄ３６組成物およびＡＫＴ１阻害剤を投与することを含み、インスリン感受性は、脂質生成の実質的な増加なしに増加される方法。
【請求項３】
個人における糖尿病の症状を処置または予防する方法であって、それを必要とする個人に、治療上効果的な量のＡｄ３６組成物およびＡＫＴ１阻害剤を投与することを含み、前記個人の症状は、脂質生成の実質的な増加なしに改善する方法。
【請求項４】
前記Ａｄ３６組成物は、アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質またはその機能性変異体を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記Ａｄ３６組成物は、アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１またはその機能性変異体をコードする核酸を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記Ａｄ３６組成物は、アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１の類似体を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質が投与され、アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２またはその機能性変異体である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質をコードする核酸は、アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質の発現を可能とする様式で、アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質をコードする核酸配列を哺乳動物に導入することにより投与される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸配列は、電気穿孔、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、カチオン性リポソーム融合、原形質融合、インビボ電場の形成、ＤＮＡ被覆微粒子銃、組み換え複製欠損ウイルスの注入、相同的組み換え、インビボ遺伝子治療、エキソビボ遺伝子治療、ウイルスベクター、および裸のＤＮＡ移入からなる群から選択される方法により導入される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ａｄ３６組成物は、配列番号１を含む核酸配列またはその機能性変異体を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記個人は、人間である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＡＫＴ１阻害剤は、２−アミノチアジアゾール（２−ＡＴＤ）である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許
本出願は、２０１２年１月２０日出願の米国仮特許出願第６１／５８８，９５９号の利益を主張し、その出願の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
インスリンのその細胞表面受容体に対する結合は、インスリン受容体基質（ＩＲＳ）を介したホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性化に関与する細胞シグナリングのカスケードを開始する（図１）。一方、ＰＩ３Ｋは、酵素ＡＫＴを活性化し、グルコース輸送体（Ｇｌｕｔ４）の細胞表面への転移をもたらす。グルコース輸送体は、細胞内のグルコースを持ち出す。グルコースの細胞取り込みの欠陥は、細胞外（循環内）のグルコースの蓄積をもたらし、高血糖または糖尿状態を引き起こす可能性がある。対照的に、細胞グルコース取り込みの増加は、循環からそれを排除することができ、従って高血糖または糖尿病を改善する。
【０００３】
Ａｄ３６は、実験的に感染させた動物における脂肪症を増加させたヒトアデノウイルスであるが、その血糖コントロールを改善する（１、２）。人間において、Ａｄ３６への自然感染は、より良好な血糖コントロールに関連する（１）。細胞シグナリングの研究では、Ａｄ３６が、従来のインスリン−ＩＲＳ経路を介してではなく、代わりにＲａｓの活性化を介してＰＩ３Ｋ活性化を上方制御し（図１）、これが脂肪細胞および筋細胞内のグルコース取り込みの向上をもたらすことが示されている（３〜５）。脂肪細胞およびその前駆細胞では、Ａｄ３６は、脂質生成を開始する重要な遺伝子であるＰＰＡＲγを上方制御し、これが脂肪細胞のより大きな分化、および脂質蓄積、および結果的により重い脂肪症をもたらす（６、７）。一方、Ａｄ３６は、脂肪組織および脂肪細胞におけるグルコース取り込みを増加させる（８）。したがって、Ａｄ３６は、脂肪症を増加させるが血糖コントロールを改善する二重の特性を有する。
【０００４】
Ａｄ３６の脂質生成および血糖作用は、ＰＰＡＲγを上方制御し、脂肪症を増加させ、細胞グルコース取り込みを増加させるそのＥ４ｏｒｆ１タンパク質により媒介される（９、１０）。ＰＰＡＲγの上方制御はまた、改善された血糖コントロールと関連する。チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）クラスの抗糖尿病薬は、ＰＰＡＲγを上方制御し、血糖コントロールを改善すると同時に、脂肪症を増加させる（１１、１２）。Ａｄ３６またはそのＥ４ｏｒｆ１タンパク質の二重作用は、チアゾリジンジオン（ＴＺＤ）薬の二重作用と同様である。残念ながら、過度の脂肪症は、不健康および血糖コントロールの不良に関連する。
【０００５】
多くのＡＫＴ阻害剤が、当該技術分野において知られており、がん治療に提案されている。（Ｌｉｎｄｓｌｅｙ，  Ｃ．Ｗ．，  Ｃｕｒｒ，  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ；．，  １０（４）：４５８−４７７  （２０１０）。）
【０００６】
したがって、脂質生成とは無関係に血糖コントロールを改善することができる新たな治療法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、個人における血糖コントロールを改善する方法であって、それを必要とする個人に、治療上効果的な量のＡｄ３６組成物およびＡＫＴ１阻害剤を投与することを含み、血糖コントロールは、脂質生成の実質的な増加なしに改善される方法に関する。
【０００８】
本発明はまた、個人における糖尿病を処置または予防する方法であって、それを必要とする個人に、治療上効果的な量のＡｄ３６組成物およびＡＫＴ１阻害剤を投与することを含み、個人の症状は、脂質生成の実質的な増加なしに改善する方法に関する。
【０００９】
Ａｄ３６組成物は、アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質もしくはその機能性変異体、アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１もしくはその機能性変異体をコードする核酸、またはアデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１の類似体もしくは誘導体を含んでもよい。例えば、アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２またはその機能性変異体であってもよい。別の例において、Ａｄ３６組成物は、配列番号１またはその機能性変異体を含む核酸配列を含んでもよい。
【００１０】
一態様において、アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質をコードする核酸は、アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質の発現を可能とする様式で、アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質をコードする核酸配列を個人に導入することにより投与される。例えば、核酸配列は、電気穿孔、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、カチオン性リポソーム融合、原形質融合、インビボ電場の形成、ＤＮＡ被覆微粒子銃、組み換え複製欠損ウイルスの注入、相同的組み換え、インビボ遺伝子治療、エキソビボ遺伝子治療、ウイルスベクター、および裸のＤＮＡ移入からなる群から選択される方法により導入される。
【００１１】
一態様において、個人は、人間等の哺乳動物であってもよい。
【００１２】
一態様において、ＡＫＴ１阻害剤は、２−アミノチアジアゾール（２−ＡＴＤ）であってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】インスリンがその細胞表面受容体に結合した後に開始されるホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の活性化が関与する、細胞シグナリングのカスケードを示す概略図である。
【図２】図２Ａ、アデノウイルスＡｄ３６またはＡｄ２（陰性対照ウイルス）による感染から２０週間後に致死させたＨＦ負荷マウスの脂肪組織から単離された、全ての、およびリン酸化した（活性化した）ＡＫＴ２タンパク質のレベルを示すウェスタンブロットである。図２Ｂ、Ａｄ２感染マウスではなくＡｄ３６感染マウスが、模擬感染と比較してより高いＡＫＴ２活性化を有していた（より高いリン酸化により示されるように）ことを示すグラフである（＊ｐ＜０．０５）。
【図３】図３Ａ、Ａｄ３６もしくはＡｄ２による感染または模擬感染から１２週間後に致死させた給餌マウスの脂肪組織から単離された、全ての、およびリン酸化したＡＫＴ１およびＡＫＴ２タンパク質のレベルを示すウェスタンブロットである。図３ＢおよびＣ、Ａｄ２感染マウスではなくＡｄ３６感染マウスが、模擬感染と比較して、それぞれより高いＡＫＴ１およびＡＫＴ２活性化を有していた（より高いリン酸化により示されるように）ことを示すグラフである（＊ｐ＜０．０５またはそれより良好）。
【図４】図４Ａ、脂肪細胞に分化するように誘導された３Ｔ３Ｌ１細胞からの、全ての、およびリン酸化したＡＫＴ１およびＡＫＴ２タンパク質のレベルを示すウェスタンブロットである。図４ＢおよびＣ、Ａｄ３６が、模擬と比較して、それぞれＡＫＴ１およびＡＫＴ２活性化の増加を有意に誘導したことを示すグラフである（＊ｐ＜０．０５またはそれより良好）。ＡＫＴに対するＡｄ３６の効果は、インスリンの効果と同様であるか、またはそれより良好である。
【図５】図５Ａ、分化した３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞から単離された、全ての、およびリン酸化したＡＫＴ２タンパク質のレベルを示すウェスタンブロットである。図５Ｂ、Ａｄ３６が、模擬と比較して、有意にＡＫＴ２活性化を増加させたことを示すグラフである（＊ｐ＜０．０５）。
【図６】ｓｉＲＮＡによるＡＫＴノックダウン後のグルコース取り込みを示すグラフである。データは、Ａｄ３６が細胞グルコース取り込みを向上させるためには、ＡＫＴ１ではなくＡＫＴ２が必要であることを示している。
【図７】３Ｔ３−Ｌ１細胞の顕微鏡写真である。図７Ａ〜Ｃは、空ベクター（ｐＴＲＥ）を有し、ドキシサイクリンに応答してＥ４ｏｒｆ１を発現しない３Ｔ３−Ｌ１細胞を示す。図７Ｄ〜Ｆは、ドキシサイクリンに暴露されるとＡｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１を発現する、それぞれ０、１、または５μΜの２ＡＴＤ（ＡＫＴ１シグナリングの特異的阻害剤）で処理された３Ｔ３−Ｌ１細胞を示す。結果は、２−ＡＴＤが脂質生成および脂質蓄積を遮断したことを示している（染色は脂質蓄積を示す）。
【図８】図８Ａ、２−ＡＴＤを使用したＡＫＴ１の化学的阻害の、誘導可能なＥ４ｏｒｆ１安定性細胞株におけるＰＰＡＲγ発現に対する効果を示すグラフである。図８Ｂ、２−ＡＴＤを使用したＡＫＴ１の化学的阻害の、アディポネチン発現に対する効果を示すグラフである。図ＡおよびＢは、２−ＡＴＤに暴露された際の、脂質生成遺伝子、ＰＰＡＲγおよびアディポネクチンのｍＲＮＡ発現の下方制御を示す。
【図９】２−ＡＴＤの存在下での基礎取り込みおよびインスリン刺激グルコース取り込みを示すグラフである。グラフは、２−ＡＴＤに暴露されると、Ｅ４ｏｒｆ１発現がグルコース摂取を増加し続けることを示している。
【図１０】ＡＴＤがＰＰＡＲγタンパク質の存在量を阻害することを示すグラフである。３Ｔ３-Ｌ１脂肪細胞をヌルベクター（Ｖ５）でトランスフェクトして１０μΜ  ＴＺＤに暴露するか、またはＥ４ｏｒｆ１タンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。両方の群を、０、１、または５μΜ  ＡＴＤに暴露した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
概説
人間における自然Ａｄ３６感染は、より良好な血糖コントロールに関連するが、Ａｄ３６感染はまた脂肪症を増加させる。本明細書に記載のように、ＡＫＴ１阻害剤を使用した研究の結果は、ＡＫＴ１阻害剤と組み合わされたＡｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質またはその類似体もしくは誘導体が、脂質生成を誘導することなく血糖コントロールを向上させることを実証している。
【００１５】
本発明者らは、さらに、ＡＫＴ１阻害剤が、前脂肪細胞における脂質生成および脂質蓄積を遮断することができ、脂質生成タンパク質ＰＰＡＲγおよびアディポネクチンをコードするｍＲＮＡのレベルを低減することを発見した。ＡＫＴ１が阻害されると、脂質生成が遮断されるが、Ｅ４ｏｒｆ１はグルコース取り込みを増加し続ける。Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒ１構造およびある特定の代謝機能が、２００７年６月７日に国際特許公開第ＷＯ２００７／０６４８３６号として公開された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０４５９１９号に記載されている。
【００１６】
本発明は、血糖コントロールを改善するための方法であって、効果的な量のＡｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１またはその機能性変異体、類似体もしくは誘導体、およびＡＫＴ１阻害剤を、それを必要とする個人に投与することを含む方法に関する。本発明者らの発見に基づき、高血糖、インスリン耐性、前糖尿病、１型糖尿病および２型糖尿病が、効果的な量のＡｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１またはその機能性変異体、類似体もしくは誘導体、およびＡＫＴ１阻害剤を、それを必要とする個人に投与することにより、処置またはさらに予防され得る。
【００１７】
本明細書において使用される場合、「血糖コントロール」とは、グルコースレベルを正常範囲内に維持する身体の能力を指す。血糖コントロールは、インスリン感受性が増加すると改善される。インスリン耐性は、血糖コントロールに対して反対の効果を有する。
【００１８】
本明細書において使用される場合、「グルコース取り込み」は、細胞がその周囲から取り込むグルコースの量を指す。一般に、筋肉細胞または脂肪細胞（脂肪細胞および前脂肪細胞）によるより高いグルコース取り込みは、循環からグルコースを排除して高血糖（血中正常グルコースより高い）を改善するため有益である。
【００１９】
本明細書において使用される場合、「類似体」とは、Ａｄ−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質またはその断片と構造が同様であり、インスリン感受性に対しＡｄ−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質と質的に同様の効果を示す小分子（例えば１ｋＤａ未満）を指す。
【００２０】
本明細書において使用される場合、「誘導体」は、修飾されたＡｄ−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質または機能性変異体を指す。例えば、誘導体は、Ａｄ−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質または１つ以上のＤ−アミノ酸もしくは非自然発生アミノ酸を含有する機能性変異体、ペグ化Ａｄ−３６  Ｅ４ｏｒｆ１、あるいは、インスリン感受性に対してＡｄ−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質と質的に同様の効果を示す、タンパク質またはその機能性変異体における他のいくつかの変化型であってもよい。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「選択的ＡＫＴ１阻害剤」とは、ＡＫＴ２を実質的には阻害しないＡＫＴ１阻害剤である。例えば、選択的ＡＫＴ阻害剤は、ＡＫＴ２のＩＣ５０よりも少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、または少なくとも５０倍低いＡＫＴ１のＩＣ５０を有し得る（例えば、ＡＫＴ１阻害剤のＩＣ５０は４．６であり、ＡＫＴ２のＩＣ５０は＞２５０である（参考文献（８）を参照されたい））。好ましくは、選択的ＡＫＴ１阻害剤は、ＡＫＴ２を全く阻害しない。
【００２２】
治療方法
本発明は、脂質生成の増加なしに血糖コントロールを改善するための治療方法を提供する。したがって、本発明は、脂質生成の増加なしに、高血糖、インスリン耐性、前糖尿病または糖尿病（１型もしくは２型）を処置するための方法を提供する。
【００２３】
一態様において、本発明は、個人（例えば、人間または他の霊長類等の哺乳動物）における血糖コントロールを改善するための方法を提供する。治療上効果的な量のＡｄ３６組成物およびＡＫＴ１阻害剤が、それを必要とする個人における血糖コントロールを改善するために、その個人に投与される。
【００２４】
一態様において、本発明は、高血糖、インスリン耐性、前糖尿病または糖尿病（１型もしくは２型）の症状の処置および予防のための方法を提供する。治療上効果的な量のＡｄ３６組成物およびＡＫＴ１阻害剤が、高血糖、インスリン耐性、前糖尿病または糖尿病（１型もしくは２型）を処置または予防するために、それを必要とする個人（例えば、人間または他の霊長類等の哺乳動物）に投与される。
【００２５】
一態様において、本発明は、インスリン耐性を処置または予防するための方法を提供する。治療上効果的な量のＡｄ３６組成物およびＡＫＴ１阻害剤が、インスリン耐性を処置または予防するために、それを必要とする個人（例えば、人間または他の霊長類等の哺乳動物）に投与される。
【００２６】
投与されるＡｄ３６組成物は、単離された、または組み換えＡｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質またはその機能性変異体であってもよい。Ａｄ３６組成物はまた、Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質の類似体または誘導体であってもよい。投与されるＡｄ３６組成物は、Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質またはその機能性変異体をコードする、単離された、または組み換え核酸であってもよい。
【００２７】
ＡＫＴ１阻害剤は、Ａｄ３６組成物の投与の前に、それと実質的に同時に、またはその後に投与され得る。好ましくは、Ａｄ３６組成物およびＡＫＴ１阻害剤は、それらの薬理学的活性の実質的な重複を提供するように、および脂質生成の実質的な増加なしに（例えば、５％未満、好ましくは１０％未満の脂質生成の増加）改善された血糖コントロールを提供するように投与される。例えば、ＡＫＴ１阻害剤およびＡｄ３６組成物は、一緒に製剤化されて同時に投与され得る。
【００２８】
Ａｄ３６組成物
本発明に従い投与されるＡｄ３６組成物は、様々な形態を有し得る。好ましくは、組成物は、Ｅ４ｏｒｆ１またはその機能性変異体を含む。例えば、Ａｄ３６組成物は、Ａｄ３６ウイルスもしくは弱毒変異体、またはＡｄ３６の不活性化形態、例えば熱殺菌もしくは漂白殺菌されたＡｄ３６、または複製欠損組み換えＡｄ３６であってもよい。Ａｄ３６組成物は、単離された、または組み換えＡｄ３６タンパク質、好ましくはＥ４ｏｒｆ１タンパク質またはその機能性変異体を含んでもよい。Ａｄ３６組成物は、Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質またはその機能性変異体をコードする核酸を含んでもよい。Ａｄ３６組成物は、Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質の類似体または誘導体、例えば化学的類似体または構造的類似体を含んでもよい。
【００２９】
タンパク質およびペプチド
Ａｄ３６組成物は、単離された、または組み換えＡｄ３６タンパク質、好ましくはＥ４ｏｒｆ１タンパク質またはその機能性変異体を含んでもよい。本明細書において「単離された」と言及されるタンパク質またはポリペプチドは、それらが感染した哺乳動物細胞において存在する状態を超える状態まで精製されたタンパク質またはポリペプチドである。Ｅ４ｏｒｆ１およびその機能性変異体を含むＡｄ３６タンパク質は、周知の方法を使用して、例えば組み換え発現および精製、化学合成（例えば合成ペプチド）、または生物学的および化学的方法の組合せにより、ならびに単離された組み換えタンパク質またはポリペプチドを使用して生成され得る。タンパク質は、少なくとも約５０重量％、好ましくは少なくとも約７５重量％、より好ましくは本質的に純粋な形態の単離された状態で得ることができる。本明細書において「組み換え」と言及されるタンパク質またはポリペプチドは、組み換え核酸の発現により生成されるタンパク質またはポリペプチドである。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１」とは、アデノウイルス３６からの自然発生または内因性Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、自然発生または内因性の対応するＡｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１のアミノ酸配列と同じアミノ酸配列を有するタンパク質（例えば、組み換えおよび合成タンパク質）、ならびに前記タンパク質のそれぞれの機能性変異体（例えば、突然変異誘発および／または組み換え技術により生成された機能性断片および／または変異）を指す。したがって、本明細書において定義されるように、この用語は、成熟Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１、グリコシル化または非グリコシル化Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質、多型または対立遺伝子変異体、およびＡｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１の他のアイソフォーム（例えば、代替的なスプライシングまたは他の細胞プロセスにより生成される）、ならびに機能性断片を含む。
【００３１】
Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１の「機能性変異体」は、機能性断片および機能性変異タンパク質を含む。一般に、本発明に包含されるＡｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１の断片または一部は、欠失（すなわち、１つ以上の欠失）を有するものを含む。例えば、１個から約７５個、例えば１個から約５０個、または１個から約２５個、または１個から約１０個の連続または非連続アミノ酸が、Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１から欠失してもよい。ＰＤＺドメイン結合モチーフ（配列番号２の最後の４つのアミノ酸）は、改変されるべきではない重要な領域であるため、その完全性が維持されるべきである。成熟Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１に対して連続アミノ酸のみが欠失した、または非連続アミノ酸が欠失した断片または一部もまた想定される。一般に、本発明に包含されるＡｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１の変異または誘導体は、１つ以上の連続もしくは非連続アミノ酸残基の追加、欠失および／もしくは置換により異なる自然もしくは人工変異体、または１つ以上の残基が修飾された修飾ポリペプチド、および１つ以上の修飾残基を含む変異を含む。好ましい変異は、１つ以上の連続または非連続アミノ酸残基の追加、欠失および／または置換により異なる、Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１の自然もしくは人工変異体である。
【００３２】
Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１の「機能性断片または部分」とは、肝脂肪変性の減衰、グルコース処理の向上、および／または血糖コントロールの改善等のＡｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１の少なくとも１つの特性、活性および／または機能特性を有する、単離された、および／または組み換えタンパク質またはオリゴペプチドを指す。
【００３３】
Ａｄ３６組成物はまた、異種アミノ酸配列を有するＥ４ｏｒｆ１またはその機能性断片もしくは変異体を含む機能性融合タンパク質を含有し得る。
【００３４】
一般に、Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１または機能性変異体は、変異体の長さにわたり、配列番号２または配列番号４と少なくとも約８５％類似した、少なくとも約９０％類似した、少なくとも約９５％類似した、少なくとも約９６％類似した、少なくとも約９７％類似した、少なくとも約９８％類似した、または少なくとも約９９％類似したアミノ酸配列を有する。
【００３５】
いくつかの実施形態において、例えば現在利用可能な組み換えタンパク質生成を使用して、Ａｄ−３６  Ｅ４ｏｒｆ１の精製されたタンパク質を作製するために、配列番号１または配列番号３が使用される。アミノ酸配列同定は、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ等の好適なアミノ酸配列アラインメントアルゴリズムを使用し、初期設定パラメータを用いて決定され得る。（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：４６７３−４６８０  （１９９４）。）
【００３６】
核酸およびベクター
Ａｄ３６組成物は、Ａｄ３６のタンパク質、好ましくはＥ４ｏｒｆ１タンパク質またはその機能性変異体をコードする単離された、または組み換え核酸を含み得る。
【００３７】
Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質またはその機能性変異体をコードする、単離された、および／または組み換え（例えば本質的に純粋なものを含む）核酸は、ｉｎ  ｓｉｔｕでＡｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１生成を引き起こすために投与され得る。本明細書において「単離された」と言及される核酸は、その起源のゲノムＤＮＡまたは細胞ＲＮＡ（例えば、細胞内またはライブラリ等の核酸の混合物中に存在するため）の核酸から分離された核酸であり、さらなる処理を受けていてもよい。「単離された」核酸は、本質的に純粋な核酸、化学合成により、生物学的および化学的方法の組合せにより生成される核酸、ならびに単離された組み換え核酸を含む、本明細書に記載の方法、同様の方法または他の好適な方法により得られる核酸を含む。本明細書において「組み換え」と言及される核酸は、人工的組み換えの方法、例えばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）および／または制限酵素を使用したベクターへのクローニングに依存する手順により生成される核酸を含む、組み換えＤＮＡ法により生成された核酸である。「組み換え」核酸はまた、細胞の自然のメカニズムにより生じる組み換え事象から生じるものであるが、所望の組み換え事象を許容し可能とするように設計された核酸の細胞への導入後に選択される。
【００３８】
これらの基準を満たす単離された、および／または組み換え核酸は、自然発生Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１およびその一部をコードする配列と同一の配列、または自然発生配列の機能性変異体を有する核酸を含む。そのような機能性変異体は、本明細書においてさらに説明されるような１つ以上の残基の追加、欠失または置換により異なる変異を含み、例えば、１つ以上のヌクレオチドが修飾された修飾核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ類似体）によりコードされ得る。配列は、個人における発現のために、コドン最適化またはコドン非最適化されてもよい。
【００３９】
一態様において、Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１または機能性変異体は、変異体の長さにわたり、配列番号１または配列番号３と少なくとも約８５％類似した、少なくとも約９０％類似した、少なくとも約９５％類似した、少なくとも約９６％類似した、少なくとも約９７％類似した、少なくとも約９８％類似した、または少なくとも約９９％類似した核酸配列を有する核酸によりコードされる。核酸配列同定は、ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ等の好適な核酸配列アラインメントアルゴリズムを使用し、初期設定パラメータを用いて決定され得る。（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：４６７３−４６８０  （１９９４）。）
【００４０】
核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡの形態であってもよく、また一本鎖または二本鎖であってもよい。一般に、核酸は、複製源、プロモーター、およびエンハンサー等の発現制御配列に作用可能に結合している（例えば、Ｑｕｅｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  ８９：４９−６８，  １９８６を参照されたい）。所望の細胞における組み換えタンパク質の発現のためのいくつかの好適なベクターは、当該技術分野において周知であり、従来的である。好適なベクターは、以下の１つ以上を含むがこれらに限定されないいくつかの成分を含有し得る：複製源；選択可能マーカー遺伝子；１つ以上の発現制御要素、例えば転写制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、および／または１つ以上の翻訳シグナル；ならびに、選択された宿主細胞における分泌経路への標的化のためのシグナル配列またはリーダー配列。所望される場合、ベクターは、検出可能なマーカーを含み得る。
【００４１】
ある特定の実施形態において、発現ベクターが遺伝子治療において使用される。発現には、宿主細胞における対象遺伝子の発現を推進する、エンハンサー／プロモーター等の適切な制御要素がベクターに提供されることが必要である。宿主細胞におけるメッセンジャーＲＮＡ安定性および翻訳可能性を最適化するように設計された要素もまた知られている。
【００４２】
発現ベクターが細胞内に導入され得るいくつかの手法がある。本発明のある特定の実施形態において、発現コンストラクトは、ウイルスまたはウイルスゲノムから得られた改変コンストラクトを含む。受容体媒介エンドサイトーシスにより細胞に進入する、宿主細胞ゲノムに一体化する、ならびに安定および効率的にウイルス遺伝子を発現する、ある特定のウイルスの能力によって、それらは、哺乳動物細胞への外来遺伝子の移入のための魅力的な候補となった（Ｒｉｄｇｅｗａｙ，  １９８８：  Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ，  Ｉｎ：  Ｖｅｃｔｏｒｓ：  Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ，  ｅｄｓ．，  Ｓｔｏｎｅｈａｍ：  Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ，  ｐｐ．  ４９４−５１３，  １９８８．；  Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，  Ｂａｉｃｈｗａｌ，  Ｉｎ：  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，  Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  Ｒ，  ｅｄ．，  Ｎｅｗ．  Ｙｏｒｋ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．  １１７−１４８，  １９８６．  １９８６；  Ｔｅｍｉｎ，  Ｉｎ：  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，  Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，  Ｒ．  ｅｄ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｐ．  １４９−１８８，  １９８６）。好ましい遺伝子治療ベクターは、一般にウイルスベクターである。
【００４３】
ＡＫＴ１阻害剤
Ａｄ３６組成物は、２−ＡＴＤ；ＡＫＴ−Ｉ−１（８）；２，３−ジフェニルキノキサリン（９）；５，６−ジフェニルピラジン−２（１Ｈ）−オン（ピラジノン）の位置異性体（９）；または８−［４−（１−アミノシクロブチル）フェニル］−９−フェニル［１，２，４］トリアゾロ［３，４−ｆ］−１，６−ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン（米国特許第７，５７６，２０９号）を含む、任意のＡＫＴ１阻害剤を含み得る。好ましくは、ＡＫＴ１阻害剤は、２−ＡＴＤである。
【００４４】
Ａｄ３６組成物およびＡＫＴ１阻害剤の投与
必ずしもこれらに限定されないが、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下注射）、経口（例えば、食事）、局所、吸入（例えば、気管支内、鼻腔内、もしくは経口吸引、点鼻）、または経直腸を含む、様々な投与経路が可能である。
【００４５】
アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質またはその断片は、アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質の発現を可能とする様式で、アデノウイルス−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質をコードする核酸配列を哺乳動物に導入することにより投与され得る。そのような方法において、核酸配列は、電気穿孔、ＤＥＡＥデキストラントランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、カチオン性リポソーム融合、原形質融合、インビボ電場の形成、ＤＮＡ被覆微粒子銃、組み換え複製欠損ウイルスの注入、相同的組み換え、インビボ遺伝子治療、エキソビボ遺伝子治療、ウイルスベクター、裸のＤＮＡ移入、ならびにナノ技術送達システムの使用からなる群から選択される方法により導入され得る。
【００４６】
投与されるＡｄ３６組成物およびＡＫＴ１阻害剤の製剤は、選択される投与経路（例えば、溶液、エマルジョン、カプセル）および処置される個人によって変動する。投与される化合物を含む適切な組成物は、生理学的に許容されるビヒクルまたは担体中で調製され得る。溶液またはエマルジョンの場合、好適な担体は、例えば、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水性またはアルコール／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁液を含む。非経口ビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース（Ｒｉｎｇｅｒ'ｓ  ｄｅｘｔｒｏｓｅ）、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発性油を含み得る。静脈内ビヒクルは、様々な添加剤、保存料、または流体、栄養物もしくは電解質補給物を含み得る（一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  １６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｍａｃｋ，  Ｅｄ．  １９８０を参照されたい）。吸引の場合、化合物は、可溶化されて、好適な投与用ディスペンサー（例えば、噴霧器、ネブライザーもしくは加圧エアロゾルディスペンサー）内に装填されるか、または呼吸可能な乾燥粉末として製剤化される。Ａｄ３６組成物およびＡＫＴ１阻害剤は、別個に製剤化されても、または一緒に製剤化されてもよい。
【００４７】
Ａｄ３６組成物およびＡＫＴ１阻害剤は、単回用量または複数回用量で投与され得る。治療上効果的な量が投与される。治療上効果的な量は、投与条件下で意図される効果を生成するのに十分な量である。例えば、脂肪酸化を増加させる、肝臓から脂肪を輸送する、肝臓内のＧｌｕｔ２存在量を低下させる、肝臓内のＧ６Ｐａｓｅを低減する、アディポネクチンおよび／もしくはＧｌｕｔ４を向上させる、血糖コントロールを改善する、ならびに／または肝機能を改善するのに十分なＡｄ３６組成物の量が投与され得る。脂質生成を阻害する、ＰＰＡＲγのｍＲＮＡレベルおよび／またはアディポネクチン機能を低減するのに十分なＡＫＴ１阻害剤の量が投与され得る。適切な用量は、個人の年齢、薬物感受性、薬物耐性、疾患の重症度および全体的な健康状態、ならびに他の因子を考慮した、当該技術分野において知られている方法を使用して、通常の技術を有する臨床医学者により決定され得る。好適な用量は、処置当たり約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０．０ｍｇ／ｋｇ（体重）であってもよい。
【００４８】
本明細書において引用される全ての文書の全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１配列
Ａｄ−３６  Ｅ４ｏｒｆ１  ＤＮＡ配列（配列番号１）
ＡＴＧＧＣＴＧＡＡＴＣＴＣＴＧＴＡＴＧＣＴＴＴＣＡＴＡＧＡＴＡＧＣＣＣＴＧＧＡＧＧ
ＧＡＴＣＧＣＴＣＣＣＧＴＣＣＡＧＧＡＡＧＧＧＧＣＴＡＧＣＡＡＴＡＧＡＴＡＴＡＴＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＣ
ＣＣＧＡＡＴＣＴＴＴＣＣＡＣＡＴＴＣＣＴＣＣＧＣＡＴＧＧＧＧＴＧＡＴＡＴＴＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＡＧＡ
ＧＴＧＡＧＣＧＴＧＣＴＧＧＴＴＣＣＴＡＣＴＧＧＡＴＡＴＣＡＧＧＧＣＡＧＡＴＴＴＡＴＧＧＣＣＴＴＧＡＡ
ＴＧＡＣＴＡＣＣＡＴＧＣＣＡＧＧＧＧＣＡＴＡＣＴＡＡＣＣＣＡＧＴＣＣＧＡＴＧＴＧＡＴＡＴＴＴＧＣＣＧ
ＧＧＡＧＡＡＧＡＣＡＴＧＡＴＣＴＣＴＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＴＡＡＣＣＡＣＡＣＧＧＡＣＣＧＡＴＴＴ
ＴＴＧＴＡＴＧＴＣＣＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＧＡ
ＧＴＧＡＴＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡＧＴＧＡＧＡＡＴＡＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＴＴＡＧ
Ａｄ−３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質翻訳（配列番号２）
ＭＡＥＳＬＹＡＦＩＤＳＰＧＧＩＡＰＶＱＥＧＡＳＮＲＹＩＦＦＣＰＥＳＦＨＩＰＰＨＧＶ
ＩＬＬＨＬＲＶＳＶＬＶＰＴＧＹＱＧＲＦＭＡＬＮＤＹＨＡＲＧＩＬＴＱＳＤＶＩＦＡＧＲＲＨＤＬＳＶＬＬＦ
ＮＨＴＤＲＦＬＹＶＲＥＧＨＰＶＧＴＬＬＩＥＲＶｌＦＰＳＶＲＩＡＴＬＶ
【実施例】
【００４９】
実施例
本明細書において開示される試験の結果は、人間におけるＡｄ３６感染とより良好な血糖コントロールとの間に関連性があることを明らかにした。また、結果は、Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１タンパク質が、ＡＫＴ１阻害剤と組み合わされた場合、脂質生成の増加なしにグルコース処理を改善することを実証している。したがって、本明細書において開示されるこれらの試験は、ＡＫＴ１と組み合わされたＡｄ３６、Ａｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１、および機能性変異体が、脂質生成の増加なしに、高血糖、インスリン耐性、前糖尿病、糖尿病（１型または２型）を処置または予防するために、および血糖コントロールを改善するために使用され得ることを示している。
【００５０】
Ａｄ３６のＡＫＴとの相互作用を調査した。ＡＫＴ１、ＡＫＴ２およびＡＫＴ３は、この酵素のアイソフォームである。ＡＫＴ１の活性化は、ＰＰＡＲγの上方制御および結果的な脂質生成をもたらし、一方、ＡＫＴ２の活性化は、グルコース取り込みの増加をもたらす。ＡＫＴ３は、主として脳内で発現される。
【００５１】
Ａｄ３６感染は、マウスにおいてＡＫＴ１およびＡＫＴ２の活性化を上方制御した（図２および３）。Ａｄ３６に感染した給餌マウスは、感染に応答して脂質生成を増加させたが、その血糖コントロールを改善した。これは、Ａｄ３６感染給餌マウスにおけるＡＫＴ１およびＡＫＴ２のより高い活性化に反映されている。一方、高脂肪負荷マウスはすでに太っており、Ａｄ３６感染に応答して脂質生成をそれ以上増加させなかった。しかしながら、それらのマウスは、Ａｄ３６感染に応答して血糖コントロールを改善する。これは、非感染対照と比較して、これらのマウスにおけるより高いＡＫＴ２活性化に反映されている（但しＡＫＴ１活性化に差はない）。また、Ａｄ３６が分化している前脂肪細胞（３Ｔ３−Ｌ１細胞）においてＡＫＴ１およびＡＫＴ２の活性化を有意に増加させ、分化した３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞においてＡＫＴ２活性化を増加させる（図４および５）ことが発見された。３Ｔ３−Ｌ１細胞は、本明細書においてさらに説明されるように、ＡＫＴ酵素を研究するためのモデルとして使用された。さらに、ｓｉＲＮＡを使用してＡＫＴ１またはＡＫＴ２を選択的にノックダウンすることにより、Ａｄ３６が細胞グルコース取り込みを向上させるためにはＡＫＴ１ではなくＡＫＴ２が必要であることが示された（図６）。
【００５２】
実施例１
Ａｄ３６は、高脂肪（ＨＦ）負荷マウスにおいてＡＫＴ２を活性化する
アデノウイルスＡｄ３６もしくはＡｄ２（陰性対照ウイルス）による感染または模擬感染から２０週間後に致死させたＨＦ負荷マウスの脂肪組織から、タンパク質を単離した（ｎ＝３匹のマウス／群）。ＡＫＴ２タンパク質を、免疫沈降法により、アイソフォーム特異的ＡＫＴ抗体を使用して単離した。全ての、およびリン酸化したＡＫＴ２のレベルを、ウェスタンブロットにより決定した（図２Ａ）。密度測定分析を使用して、タンパク質存在量を定量し、平均±ＳＥと比較した。Ａｄ２感染群ではなく、Ａｄ３６感染マウスが、模擬感染と比較して、より高いＡＫＴ２活性化を有していた（より高いリン酸化により示されるように）（＊ｐ＜０．０５）（図２Ｂ）。
【００５３】
実施例２：
Ａｄ３６は、給餌マウスにおいてＡＫＴ１およびＡＫＴ２を活性化する
Ａｄ３６もしくはＡｄ２による感染または模擬感染から１２週間後に致死させた給餌マウスの脂肪組織から、タンパク質を単離した（ｎ＝３匹のマウス／群）。ＡＫＴ１およびＡＫＴ２タンパク質を、免疫沈降法により、アイソフォーム特異的ＡＫＴ抗体を使用して単離した。全ての、およびリン酸化したＡＫＴ１およびＡＫＴ２のレベルを、ウェスタンブロットにより決定した（図３Ａ）。密度測定分析を使用して、タンパク質存在量を定量し、平均±ＳＥと比較した。Ａｄ２感染マウスではなく、Ａｄ３６感染マウスが、模擬感染と比較して、より高いＡＫＴ１およびＡＫＴ２活性化を有していた（より高いリン酸化により示されるように）（＊ｐ＜０．０５またはそれ以上）（図３Ｂおよび３Ｃ）。
【００５４】
実施例３：
Ａｄ３６は、分化中の３Ｔ３Ｌ１細胞においてＡＫＴ１およびＡＫＴ２を活性化する
３Ｔ３Ｌ１前脂肪細胞を、Ａｄ３６または模擬感染させた（ｎ＝３／群）。３Ｔ３Ｌ１細胞を脂肪細胞に分化するように誘導した。感染から２４、４８および７２時間後に、タンパク質を採取した。ＡＫＴ１およびＡＫＴ２タンパク質を、免疫沈降法により、アイソフォーム特異的ＡＫＴ抗体を使用して単離した。全ての、およびリン酸化したＡＫＴ１およびＡＫＴ２のレベルを、ウェスタンブロットにより決定した（図４Ａ）。密度測定分析を使用して、タンパク質存在量を定量し、平均±ＳＥと比較した。Ａｄ３６は、模擬感染と比較して、ＡＫＴ１およびＡＫＴ２活性化の増加を有意に誘導した（＊ｐ＜０．０５またはそれより良好）（図４Ｂおよび４Ｃ）。ＡＫＴに対するＡｄ３６の効果は、インスリンの効果と同様であるか、またはそれより良好である。
【００５５】
実施例４：
Ａｄ３６は、脂肪細胞中の３Ｔ３Ｌ１においてＡＫＴ２を活性化する
分化した３Ｔ３Ｌ１脂肪細胞を、Ａｄ３６または模擬感染させた（ｎ＝３／群）。感染から２４時間後に、タンパク質を採取した。ＡＫＴ２タンパク質を、免疫沈降法により、アイソフォーム特異的ＡＫＴ抗体を使用して単離した。全ての、およびリン酸化したＡＫＴ２のレベルを、ウェスタンブロットにより決定した（図５Ａ）。密度測定分析を使用して、タンパク質存在量を定量し、平均±ＳＥと比較した。Ａｄ３６は、模擬感染と比較して、ＡＫＴ２活性化を有意に増加させた（＊ｐ＜０．０５）（図５Ｂ）。
【００５６】
実施例５：
ｓｉＲＮＡによるＡＫＴノックダウン後のグルコース取り込み
３Ｔ３−Ｌ１前脂肪細胞において、トランスフェクションから３日後に、基礎およびインスリン刺激条件下で２−デオキシグルコース（２ＤＧ）取り込みを決定した。ＮＴ：非標的化ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞。Ａｋｔ１およびＡｋｔ２：Ａｋｔ１およびＡｋｔ２  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞。ＮＴ＋Ａｄ３６：非標的化ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされ、Ａｄ３６に感染した細胞。Ａｋｔ１＋３６およびＡｋｔ２＋３６：Ａｋｔ１およびＡｋｔ２  ｓｉＲＮＡで別個にトランスフェクトされ、Ａｄ３６に感染した細胞。Ｎｔ−Ｉｎｓ：非標的化ｓｉＲＮＡ＋インスリンでトランスフェクトされた細胞。Ａｋｔ１＋ＩｎｓおよびＡｋｔ２＋Ｉｎｓ：Ａｋｔ１およびＡｋｔ２  ｓｉＲＮＡ＋インスリンでトランスフェクトされた細胞。予期されるように、Ａｄ３６はグルコース取り込みを有意に増加させた。結果は、ＡＫＴ１ではなくＡＫＴ２のノックダウンが、Ａｄ３６誘導グルコース取り込みを減少させたことを示している（＊ｐ＜０．０５）（図６）。
【００５７】
実施例６：
誘導可能なＥ４ｏｒｆ１安定細胞株における２−ＡＴＤを使用したＡＫＴ１の化学的阻害
ドキシサイクリン（１０）に暴露されるとＡｄ３６  Ｅ４ｏｒｆ１を発現する３Ｔ３−Ｌ１細胞を生成した。空ベクター（ｐＴＲＥ）を有し、ドキシサイクリンに応答してＥ４ｏｒｆ１を発現しない細胞を、対照として使用した。コンフルエントなＥ４ｏｒｆ１およびｐＴＲＥ細胞を、脂質生成培地に暴露し、分化を誘導した。さらに、細胞を、０、１または５μΜの２ＡＴＤ（ＡＫＴ１シグナリングの特異的阻害剤）で処理した。この培地を、最長９日間、２日おきに補充した。脂質生成分化を、オイルレッドＯ染色により検証した（図７Ａ〜Ｆ）。
【００５８】
実施例７：
誘導可能なＥ４ｏｒｆ１安定細胞株における２−ＡＴＤを使用したＡＫＴ１の化学的阻害
コンフルエントなＥ４ｏｒｆ１およびｐＴＲＥ細胞を、脂質生成培地に暴露し、分化を誘導した。さらに、細胞を、０または５μΜの２ＡＴＤ（ＡＫＴ１シグナリングの特異的阻害剤）で処理した。この培地を、最長９日間、２日おきに補充した。１０００ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンの存在下でのＰＰＡＲγおよびアディポネクチン（脂質生成のマーカー）の発現の誘導から２４時間後に、基礎およびインスリン刺激２ＤＧ取り込みをｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。予期されるように、Ｅ４ｏｒｆ１発現は、ＰＰＡＲγおよびアディポネクチンの発現を有意に増加させ、２−ＡＴＤ処理は、ｐＴＲＥおよびＥ４ｏｒｆ１発現細胞におけるＰＰＡＲγ発現（図８Ａ）、ならびにＥ４ｏｒｆ１発現細胞（図８Ｂ）におけるアディポネクチン発現を有意に低減した。
【００５９】
実施例８
２−ＡＴＤの存在下での基礎およびインスリン刺激グルコース取り込み
Ｅ４ｏｒｆ１およびｐＴＲＥ誘導可能な安定な細胞を、脂質生成培地に暴露して分化を誘導し、０または５μΜの２−ＡＴＤで処理した。基礎およびインスリン刺激２ＤＧを、インスリンの存在下または非存在下で、ドキシサイクリン（１０００ｎｇ／ｍｌ）への暴露から２４時間後に決定した（＊ｐ＜０．０５）。Ｅ４ｏｒｆ１発現は、ｐＴＲＥの場合と比較して、グルコース取り込みを増加させた。２−ＡＴＤ処理にもかかわらず、Ｅ４ｏｒｆ１発現細胞は、有意により高いグルコース取り込みを示し続けた（図９）。
【００６０】
実施例９
ＡＴＤはＰＰＡＲγタンパク質存在量を阻害する
３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞をヌルベクターでトランスフェクトして１０μΜ  ＴＺＤに暴露するか、またはＥ４ｏｒｆ１タンパク質を発現するプラスミドでトランスフェクトした。両方の群を、０、１、または５μΜ  ＡＴＤに暴露した。ＡＴＤは、ＰＰＡＲγタンパク質存在量を低減した。ＡＴＤ濃度の増加は、ＴＺＤの存在下でグルコース取り込みを有意に低減したが、Ｅ４ｏｒｆ１でトランスフェクトされた場合有意に低減しなかった（図１０）。脂肪細胞におけるグルコース取り込みは、ＴＺＤの存在下ではＰＰＡＲγ依存性であったが、Ｅ４ｏｒｆ１により誘導された場合ＰＰＡＲγ依存性ではなかった。したがって、ＡＫＴ−１シグナリングを下方制御することにより、Ｅ４ｏｒｆ１を使用して、それ以上脂質蓄積を増加させることなく脂肪細胞によるグルコース取り込みを向上させることができる。これらのデータは、脂質生成作用のないＥ４ｏｒｆ１の抗糖尿病薬としての可能性を利用する手法を示している。
【００６１】
参考文献
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【図１】
2015505535.tif 000002
【図２】
2015505535.tif 000003
【図３】
2015505535.tif 000004
【図４】
2015505535.tif 000005
【図５】
2015505535.tif 000006
【図６】
2015505535.tif 000007
【図７】
2015505535.tif 000008
【図８】
2015505535.tif 000009
【図９】
2015505535.tif 000010
【図１０】
2015505535.tif 000011
【配列表】
2015505535000001.app
【国際調査報告】
2015505535.tif 000012
2015505535.tif 000013