(57)【要約】本発明は呼吸器疾患の予防または治療に有用に使用することができる高効率のアンフィレギュリンの発現阻害剤であるアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴＲＮＡに関するものである。また、本発明は上記のアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴＲＮＡの生体内の安定性の向上及び細胞伝達の効率を改善するために親水性及び疎水性の物質を単純共有結合またはリンカ−媒介の共有結合させてアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴＲＮＡの構造体及びこれらでなっているナノ粒子に関するものである。
2015532100.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜２３０で選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は１９〜３１個のヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１に記載のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。  
【請求項３】
配列番号８、９、２８、３９〜４１、４３〜４５、４７、４９及び５０からなる群より選択されるいずれか一つの配列を含むセンス鎖とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含む請求項１に記載のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は一つ以上の化学的な変形を含むことを特徴とする請求項１〜３の中いずれか一項に記載のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。  
【請求項５】
前記化学的な変形はヌクレオチド内の糖構造の２´炭素位置で−ＯＨ基が-ＣＨ３（メチル）、−ＯＣＨ３（ｍｅｔｈｏｘｙ）、−ＮＨ２、−Ｆ（フッ素）、−Ｏ−２−メトキシエチル−Ｏ−プロピル、−Ｏ−２−メチルチオエチル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ）、−Ｏ−３−アミノプロピル、−Ｏ−３−ジメチルアミノプロピル、−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミドまたは−Ｏ−ジメチルアミドオキシエチルへの置換；
ヌクレオチド内の糖構造内の酸素が硫黄に置換された変形；
ヌクレオチド結合のホスホロチオエートまたはボラノリン酸、メチルホスホン酸ｔｅ）結合への変形；
ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）またはＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）形態への変形で選択された一つ以上の変形；
から選択される一つ以上の変形であることを特徴とする請求項４に記載のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５‘末端に一つ以上の燐酸基が結合されていることを特徴とする請求項１〜５の中いずれか一項に記載のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
次の構造式（１）の構造を含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体：
Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ      構造式（１）
上記の構造式（１）でＡは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹは各々の独立的に単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味し、Ｒはアンフィレギュリンに特異的ｓｉＲＮＡを意味する。
【請求項８】
次の構造式（２）の構造を含む請求項７に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体：
【化３】
2015532100.tif 000005
上記の構造式（２）でＳ及びＡＳは各々請求項７によるｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を意味し、Ａ，Ｂ，Ｘ及びＹは請求項７の正義と同じである。
【請求項９】
次の構造式（３）の構造を含む請求項８に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体：
【化４】
2015532100.tif 000006
上記の構造式（３）でＡ，Ｂ，Ｘ、Ｙ、Ｓ及びＡＳは請求項８の正義と同じで、５‘及び３’はｓｉＲＮＡのセンス鎖の５‘末端及び３’末端を意味する。
【請求項１０】
前記アンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡは請求項１〜６の中いずれか一項によるｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項７〜９の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１１】
前記親水性物質の分子量は２００〜１０，０００であることを特徴とする請求項７〜１０の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１２】
前記親水性物質はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンからなる群より選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項１１に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１３】
前記疎水性物質の分子量は２５０〜１，０００であることを特徴とする請求項７〜１０の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１４】
前記疎水性物質はステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質及びリポポリアミンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１３に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１５】
前記ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）の誘導体はコレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コレスタニルホルマート及びコレスタニルアミンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１４に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１６】
前記グリセリドの誘導体はモノ−、ジ−及びトリ−グリセリドから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１７】
前記Ｘ及びＹで表す共有結合は非分解性または分解性結合であることを特徴とする  請求項７〜１６の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１８】
前記非分解性結合はアミド結合または燐酸化結合であることを特徴とする請求項１７に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１９】
前記分解性結合はジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とする請求項１７に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項２０】
請求項７〜１９の中いずれか一項による二重鎖オリゴＲＮＡの構造体を含むナノ粒子。
【請求項２１】
互いに違う配列を含むｓｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体が混合されて構成されることを特徴とする請求項２０に記載のナノ粒子。
【請求項２２】
請求項１〜６の中いずれか一項によるｓｉＲＮＡ、請求項７〜１９の中いずれか一項による二重鎖オリゴＲＮＡの構造体または、請求項２０〜２１の中いずれか一項によるナノ粒子を有効成分として含む薬学的な組成物。
【請求項２３】
呼吸器疾患の予防または治療のための請求項２２に記載の薬学的な組成物。
【請求項２４】
前記呼吸器疾患は慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺繊維症（ＩＰＦ）、  喘息、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、へんとう炎または喉頭炎の中選択されることを特徴とする請求項２３に記載の薬学的な組成物。
【請求項２５】
請求項２２〜２４の中いずれか一項による組成物を含む凍結乾燥された形態の製剤。
【請求項２６】
請求項１〜６の中いずれか一項によるｓｉＲＮＡ、請求項７〜１９の中いずれか一項による二重鎖オリゴＲＮＡの構造体または、請求項２０〜２１の中いずれか一項によるナノ粒子または請求項２２〜２５の中いずれか一項による組成物または製剤を予防または治療を要する個体に投与することを特徴とする呼吸器疾患の予防または治療方法。
【請求項２７】
前記呼吸器疾患は慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺繊維症（ＩＰＦ）、喘息、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、  細気管支炎、咽喉炎、へんとう炎または喉頭炎の中選択される疾患であることを特徴とする請求項２６に記載の呼吸器疾患の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は呼吸器疾患の連関遺伝子の特異的な二重鎖オリゴＲＮＡ及びこれを含む高効率の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体に関するもので、上記の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体は細胞内へ効率的に伝達されるようにするために二重鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の両末端に親水性の物質及び疎水性の物質を単純共有結合またはリンーカ‐媒介（ｌｉｎｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）の共有結合を用いて接合された形態の構造を持ち、水溶液で上記の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体らの疎水性の相互作用によりナノ粒子の形態に転換されることができる。上記の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体に含まれた二重鎖オリゴＲＮＡは呼吸器疾患の連関遺伝子であるアンフィレギュリン（Ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ）に特異的であることが望ましく、特にアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡであることが望ましい。
【０００２】
また、本発明は上記の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体の製造方法及び上記の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体を含む呼吸器疾患、特に慢性閉鎖性肺疾患（ＣＰＯＰＤ）及び／または特発性肺繊維症（ＩＰＦ）を予防または治療するための薬剤学的の組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００３】
背景技術
遺伝子の発現を抑制する技術は疾病治療のための治療剤の開発及び標的検証で重要な道具である。標的遺伝子の発現を抑制する従来の技術としては標的遺伝子に対する転移遺伝子を導入する技術が開示されており、プロモーターを基準にして逆方向（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）へ転移遺伝子を導入する方法（Ｓｈｅｅｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ８５：８８０５−８８０８，  １９８８；  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４：７２４−７２６，  １９８８）とプロモーターを基準にして正方向（ｓｅｎｓｅ）へ移植の  遺伝子を導入する方法（Ｎａｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  ２：２７９−２８９，  １９９０；  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  ２：２９１−２９９，  １９９０；  米国特許第  ５，０３４，３２３号；  米国特許第５，２３１，０２０号；及び、米国特許第５，２８３，１８４号）で  ある。
【０００４】
一方、最近に２０ないし２５塩基対を持つ二重鎖のＲＮＡ断片の蓄積により転写後遺伝子の抑制またはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の現象が起こり、上記の二重鎖のＲＮＡはＲＮＡの鋳型から合成されるという事実が報告されたことがあった（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＆  Ｂａｕｌｃｕｍｂｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２８６：９５０−９５２，  １９９９）。上記の二重鎖のＲＮＡ断片は゛小さい干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ，  以下  ｓｉＲＮＡという）”と命名された。この後、哺乳動物を含んだ多様な生命体でｓｉＲＮＡは遺伝子の発現を抑制する重要な要素であるという事実が明らかになっている（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１：８０６−８１１，  １９９８；  Ｔｉｍｍｏｎｓ  ＆  Ｆｉｒｅ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９５：８５４，  １９９８；  Ｋｅｎｎｅｒｄｅｌｌ  ＆  Ｃａｒｔｈｅｗ，  Ｃｅｌｌ，  ９５：１０１７−１０２６，  １９９８；  Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１１：４９４−  ４９７，  ２００１；  ＷＯ  ９９／３２６１９）。また、二重鎖のｓｉＲＮＡは細胞内でＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ）タンパク質複合体により単一鎖のＲＮＡに転換され、この後ターゲット  ｍＲＮＡと結合してｍＲＮＡを不活性化させることとして知られている（Ｎｏｖｉｎａ  ＆  Ｓｈａｒｐ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４３０：１６１−１６４，  ２００４）。上記したようにｓｉＲＮＡを用いた遺伝子の発現抑制技術は標的細胞で標的遺伝子の発現を抑制させて、これによる変化を観察することで、標的細胞での標的遺伝子の機能を究明する研究に有用に用いられる。特に、感染性のウィルスまたは癌細胞などで標的遺伝子の機能を抑制するものは該当の疾病の治療方法を開発するのに有用に活用されることとして予測される。生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での研究及び実験動物を用いた生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の研究を行った結果、ｓｉＲＮＡによる標的遺伝子の発現抑制が可能であると報告されたことである（ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２１：６３９−６４４，  ２００３；  Ｇｉｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ８：７６９−７７６，  ２００３；  Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｐａｔｏｌｏｇｙ，  ３８：８４２−８５０，  ２００３；  Ｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ９６：２７−３５，  ２００３；  Ｙｏｋｏｔａ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ４：６０２−６０８，  ２００３；  Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ９：３４７−３５１，  ２００３；  ＭｃＣａｆｆｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４１８：３８−３９，  ２００２）。一例で、国際特許公開公報ＷＯ  ０３／０７０９６９号にはｓｉＲＮＡを用いて癌細胞でＢｃｌ２タンパク質の発現を抑制させることによって、癌細胞を治療する方法が開示されており、ＷＯ  ０４／００９７６９号にはｓｉＲＮＡを用いて血管新生を誘発するＶＥＧＦタンパク質の発現を抑制させることによって、癌細胞を治療する方法が開示されている。
【０００５】
また、ｓｉＲＮＡの作用機序はターゲットｍＲＮＡと相補的に結合して配列特異的にターゲット遺伝子の発現を調節するために、既存の抗体基盤の医薬品か化学物質（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｒｕｇ）に比べて適用できる対象が画期的に拡大できるという長所を持つ（Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  Ｔｏｗａｒｄｓ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡｓ．  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ．  ２００６  １３（４）：６６４−６７０）。
【０００６】
ｓｉＲＮＡの優れた効果及び多様な使用範囲にも関わらず、ｓｉＲＮＡが治療剤で開発されるためには体内でのｓｉＲＮＡの安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）の改善と細胞伝達の効率改善を通じてｓｉＲＮＡがターゲットの細胞へ効果的に伝達されなければならない（Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ．  ２００６  Ｊａｎ；  １１（１−２）：６７−７３）。
【０００７】
上記の体内安定性の向上及びｓｉＲＮＡの非特異的な細胞免疫反応（ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）の問題解決のために、ｓｉＲＮＡの一部ヌクレオチドまたは  骨格  （ｂａｃｋｂｏｎｅ）を核酸分解酵素の抵抗性を持つように変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）するか、ウィルス性のベクター（ｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）、リポソームまたはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などの伝達体の利用などに対する研究が活発に試みられている。  
【０００８】
アデノウィルスかレトロウィルスなどのウィルス性のベクターを用いた伝達システムは形質注入の効率（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）が高いが、免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）及び発癌性（ｏｎｃｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）が高い。もう一方、ナノ粒子を含む非ウィルス性（ｎｏｎ−ｖｉｒａｌ）の伝達システムはウィルス性の伝達システムに比べて細胞伝達の効率は低い方であるが、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での安全性が高く、ターゲット特異的に伝達が可能で、内包されているＲＮＡｉオリゴヌクレオチドを細胞または組織へ吸収（ｕｐｔａｋｅ）及び内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）などの改善された伝達効果が高いだけではなく、細胞毒性及び免疫誘発（ｉｍｍｕｎｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）が殆どないという長所を持っており、現在はウィルス性の伝達システムに比べて有力な伝達方法として評価されている（Ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉＲＮＡｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  ２００７  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ３；  １１７（１２）：  ３６２３-３６３２）。  
【０００９】
上記の非ウィルス性の伝達システムの中でナノ伝達体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）を用いる方法はリポソーム、陽イオンの高分子の複合体などの多様な高分子を用いることでナノ粒子を形成して、ｓｉＲＮＡをこのようなナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、即ちナノ伝達体（ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ）に担持して細胞へ伝達する形態を持つ。ナノ伝達体を用いる方法の中主に活用される方法は高分子のナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、高分子のミセル（ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｅｌｌｅ）、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）などがあり、この中でリポプレックスを用いた方法は陽イオン性の脂質で構成されて細胞のエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）の陰イオン性の脂質と相互作用してエンドソームの脱安定化効果を誘発して細胞内へ伝達する役割をする（Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  １５；  ９３（２１）：１１４９３−８，  １９９６）。
【００１０】
また、ｓｉＲＮＡのパッセンジャー  （ｐａｓｓｅｎｇｅｒ；センス（ｓｅｎｓｅ））鎖の末端部位に化学物質などを連結して増進された薬動力学（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）的の特徴を持つようにして生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で高い効率を誘導できるということが知られている（Ｎａｔｕｒｅ  １１；  ４３２（７０１４）：１７３−８，  ２００４）。この時ｓｉＲＮＡのセンス（ｓｅｎｓｅ；パッセンジャー（ｐａｓｓｅｎｇｅｒ））またはアンチセンス（ａｎｔｉｓｅｎｃｅ；ガイド（ｇｕｉｄｅ））鎖の末端に結合された化学物質の性質に従ってｓｉＲＮＡの安定性が異なる。例えば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，  ＰＥＧ）のような高分子の化合物が接合された形態のｓｉＲＮＡは陽イオン性の物質が存在する条件でｓｉＲＮＡの陰イオン性のリン酸基と相互作用して複合体を形成することによって、改善されたｓｉＲＮＡの安定性を持った伝達体になる（Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １２９（２）：１０７−１６，  ２００８）。特に高分子の複合体で構成されたミセル（ｍｉｃｅｌｌｅ）らは薬物伝達の運搬体として用いられるほかのシステムであるマイクロスフィア（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）またはナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）などに比べ、その大きさが極めて小さくても分布が非常に一定で、自発的に形成される構造なので製剤の品質管理及び再現性の確保が容易であるという長所がある。
【００１１】
また、ｓｉＲＮＡの細胞内伝達の効率性を向上させるために、ｓｉＲＮＡに生体適合性の高分子である親水性の物質（たとえば、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，  ＰＥＧ））を単純共有結合またはリンカー−媒介（ｌｉｎｋｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ）の共有結合で接合させたｓｉＲＮＡの接合体を通じて、ｓｉＲＮＡの安定性の確保及び効率的な細胞膜の透過性のための技術が開発された（大韓民国登録特許第８８３４７１号）。しかしながら  ｓｉＲＮＡの化学的な変形及びポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ，  ＰＥＧ）を接合させること（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）だけでは生体内での低い安定性とターゲット臓器への伝達が円滑でないという短所は依然として持っている。このような短所を解決するためにオリゴヌクレオチド、特にｓｉＲＮＡのような二重鎖オリゴＲＮＡに親水性及び疎水性の物質が結合された二重鎖オリゴＲＮＡの構造体が開発されて、上記の構造体は疎水性物質の疎水性の相互作用によりＳＡＭｉＲＮＡＴＭ（Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  Ｍｉｃｅｌｌｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ＲＮＡ）と命名された自家組立のナノ粒子を形成することになり（大韓民国登録特許第１２２４８２８号参照）、ＳＡＭｉＲＮＡＴＭ技術は既存の伝達技術と比べて非常にサイズが小さくても均一な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）ナノ粒子を収得できるという長所を持つ。
【００１２】
一方、アンフィレギュリンは上皮細胞の成長因子の受容体に結合して上皮細胞の受容体の経路（ＥＧＦＲ  ｐａｔｈｗａｙ）を活性化させて、細胞増殖に関与するという事実が知られており、アンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡによりアンフィレギュリンンの発現を阻害させることができ、これは特定タイプの乳房癌で治療効果を示すと開示された（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ２００８；  ６８：２２５−２２６５）。また、アンフィレギュリンに対するｓｈＲＮＡを用いて炎症性の乳房癌での細胞浸透を抑制できて（Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２０１１  ２２６（１０）：２６９１−２７０１）、アンフィレギュリンに特異的なｓｈＲＮＡを用いてアンフィレギュリンの発現を抑制するとタバコ煙に露出されたねずみでの肺動脈の再形成（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）が抑制されたという事実が開示されている（Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ，  １；５０８（１）：９３−１００）。気道平滑筋（ａｉｒｗａｙ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ；  ＡＳＭ）の過形成（ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ）と血管新生にアンフィレギュリンの関連があり、特に喘息患者の気道再形成（ａｉｒｗａｙ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を促進するということ（Ｊ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ  ２００８；  ２３：  ８５７−８６３）と急性喘息に従う組織の再形成で過多分泌される表皮細胞の成長因子（ＥＧＦ）とアンフィレギュリンが関与するということが開示されている（Ｊ  Ａｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９；１２４：９１３−９２０）。
【００１３】
喘息をともに代表的な肺疾患のひとつである慢性閉鎖性肺疾患（Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ、以下、  ‘ＣＯＰＤ’という）は非可逆的な気道の閉鎖を伴うという点で喘息と異なり、繰返される感染、有害な粒子とかガスの吸入とか喫煙により発生する肺の非正常的な炎症反応とこれに伴って完全に可逆的ではなく徐々に進行する気流制限を示す呼吸器の疾患である（Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，  １６３：１２５６−１２７６，  ２００１）。全世界的にＣＯＰＤの深刻性が強調されていてこれはＣＯＰＤが１９９０年全体の死亡疾患の中６位であったが２０２０年には３位になると予測され、１０大疾患の中唯一にその発病率が増加する重要な疾患である。また、疾患による障害の原因としては４位になると予測されるのでＣＯＰＤによる社会、経済的な疾病の負担が急激に増加することと予想される（Ｌａｎｃｅｔ，  ３４９：１４９８−１５０４，  １９９７）。慢性閉鎖性肺疾患は気道及び肺実質の炎症による細気管支及び肺実質の病理学的な変化により発生する病気で、閉鎖性細気管支炎及び肺気腫（肺実質の破壊）を特徴にする。慢性閉鎖性肺疾患の種類には慢性閉鎖性気管支炎（Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ）、慢性細気管支炎（Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｂｒｏｎｃｈｉｏｌｉｔｉｓ）及び肺気腫（Ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）などがある。慢性閉鎖性肺疾患の場合好中球の数が増加して、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−８、ＭＩＰ−２のようなサイトカインが分泌される。気道に炎症が起こり、筋肉壁が厚くなって、粘液の分泌が増加して気管支の閉鎖が現れる。気管支が閉鎖されると肺胞は拡張されて損傷になり酸素と二酸化炭素の交換能力が損傷を受けることになり、呼吸不全の発生が高くなる。すでに国内４５歳以上の成人の８％が慢性閉鎖性肺疾患の患者であるにもかかわらず肺ガンだけに関心が偏っていて、慢性閉鎖性肺疾患を治療する従来の方法は抗炎症作用を持つ治療剤か気管支拡張の効果を持つ治療剤を利用する程で、遺伝子治療剤による本質的な慢性閉鎖性肺疾患の予防及び治療はかすかな実情である。上記の抗炎症作用を持つ代表的な治療剤はグルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）、ロイコトリエンモディファイヤー（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）、テオフィリン（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）などがある。しかしながら、上記のグルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ）は効果面では強力だが薬物副作用が問題になり吸入治療を行っており、治療効果も選択的に作用するものではなくすべての免疫反応と抗炎症の反応を抑制するために場合によって、必要な免疫反応まで抑制する問題点がある。上記のロイコトリエンモディファイヤー（ｌｅｕｋｏｔｒｉｅｎｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ）は副作用は少ないが効果面で限界があり、単独で使用するときには喘息を調節することができない。従って大部分補助的に使用している問題点がある。上記のテオフィリン（ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎｅ）は効果面でも優れてないし副作用の恐れがあるという問題点がある。従って、慢性閉鎖性肺疾患を予防して治療できる効果が優れて副作用の少ない新し���治療剤に対する需要が切実な状況である。
【００１４】
一方、特発性肺繊維症（Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ、以下‘ＩＰＦ’という）は肺胞  （気胞）の壁に慢性炎症の細胞らが浸透しながら肺を固くさせる色々な変化が発生しながら肺組織のひどい構造的な変化を引き起こして徐々に肺機能が低下されて結局には死亡になる疾患で、  今のところは効果的な治療方法がなくて大抵に症状が現れて診断を受けると生存期間中央値が３〜５年程度しかならないとても予後が悪い疾病である。発生頻度は外国の場合人口１０万名当たり約３−５名程度で報告されており  大抵に５０代以後に発病率が高く男子が女子より２倍ぐらい発生率が高いことで知られている。
【００１５】
ＩＰＦの発病の原因はまだ明確に究明されてはないが、喫煙者で頻度が高く、抗うつ剤、胃−食道逆流による慢性的な肺吸入、金属粉塵、木材粉塵、または溶媒剤吸入などがＩＰＦの発生と連関がある危険因子と報告されたこともあるが、大部分の患者らにおいては確実な因果関係がある因子らを探すことができない。
【００１６】
ＩＰＦは治療をしないとき、継続的に悪化され患者の約５０％以上が３−５年内に死亡すると知られており、また、一応病気が進行されて完全に繊維化で固められた後にはどのような治療を行っても好転にならないために治療するならば早期に治療する場合に効果がある可能性が高いと予測している。現在使用している治療剤としてはステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）とアザチオプリン（ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ）、またはシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅの併合療法を使用する方法が知られているが、特別な効果を示したと判断するには難しく、色々な繊維化抑制剤らが動物実験及び小規模の患者らに試みられたが明らかな効果が立証されたことがない状態である。特に末期ＩＰＦ患者では肺移植以外の他の効果的な治療方法がない実情である。従って、より効率的なＩＰＦの治療剤の開発が切実な状況である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】米国特許第５，０３４，３２３号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２３１，０２０号明細書
【特許文献３】米国特許第５，２８３，１８４号明細書
【特許文献４】大韓民国登録特許公報第８８３４７１号明細書
【特許文献５】大韓民国公開特許第２００９−００４２２９７号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ，  ８５：８８０５−８８０８，  １９８８
【非特許文献２】Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４：７２４−７２６，  １９８８
【非特許文献３】Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  ２：２７９−２８９，  １９９０
【非特許文献４】Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  ２：２９１−２９９，  １９９０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
発明の要約
本発明の目的は上記のような既存の問題点を解決しようとアンフィレギュリンに特異的でありながら非常に高い効率でその発現を阻害できる新規の二重鎖オリゴＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡ及びこれを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体、そしてそのような二重鎖オリゴＲＮＡの構造体の製造方法を提供することである。
【００２０】
また、本発明の別の目的は上記のアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴＲＮＡ、またはそのような二重鎖オリゴＲＮＡを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体を有効成分に含む呼吸器の疾患、特にＣＯＰＤ及び／またはＩＰＦの予防または治療用の薬剤学的な組成物を提供することである。    
【００２１】
本発明のまた別の目的は上記のアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴＲＮＡ、またはそのような二重鎖オリゴＲＮＡを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体を用いて呼吸器の疾患、特にＣＯＰＤ及び／またはＩＰＦの予防または治療する方法を提供することである。
【００２２】
本発明の別の特徴及び具現の例は次の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からさらに明白になるはずだ。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は配列番号１ないし３０を各々のセンス鎖として有する３０種のｓｉＲＮＡを２０ｎＭの濃度で処理した場合、形質転換された細胞株でのアンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。ＮＣ：アンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡが処理されてない細胞株（対照群）で獲得された総ＲＮＡでのアンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現量として、これを１００％で基準にして各ｓｉＲＮＡに従うアンフィレギュリンの相対的な発現量を測定。
【図２】図２は配列番号８、９及び２８を各々のセンス鎖として有するｓｉＲＮＡの処理濃度別（０．２、１及び５ｎＭ）の繊維母細胞の細胞株でのアンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。
【図３】図３は配列番号３１ないし５０を各々のセンス鎖として有する２０  ｎＭのｓｉＲＮＡで処理した場合の形質転換された細胞株でのアンフィレギュリンｍＲＮＡの相対的な発現量（％）を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
発明の詳細な説明及び望ましい具現の例
別に定義されてない限り、本明細書で使用されたすべての技術的及び科学的な用語らは本発明の属する技術分野で熟練された専門家によって通常的に理解されるものと同一な意味を持つ。一般的に、本発明書で使用された命名法は本技術分野でよく知られており、通常的に使用されるものである。
【００２５】
本発明はアンフィレギュリンの発現を抑制できる二重鎖オリゴＲＮＡを提供する。本発明に従う二重鎖オリゴＲＮＡの形態ではｓｉＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）  およびｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）などが望ましいがこれに限られるものではない。
【００２６】
また、  ｍｉＲＮＡに対する拮抗剤（ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ）の役割ができる単一鎖のｍｉＲＮＡの阻害剤も本発明に従う二重鎖オリゴＲＮＡに含まれるものと解釈される。
【００２７】
以下、本発明で提供される二重鎖オリゴＲＮＡをｓｉＲＮＡを中心に説明することにする。しかしながら、本発明で提供される二重鎖オリゴＲＮＡはｓｉＲＮＡに限定になるものではないことは通常の技術者には自明なことで、同一な特性が  ｓｉＲＮＡを除いたほかの二重鎖オリゴＲＮＡにも適用できるという点も通常の技術者には自明なことである。
【００２８】
具体的に本発明では配列番号１ないし配列番号２３０で選択されたいずれかの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）である第１オリゴヌクレオチドとその相補的な配列を含むアンチセンス鎖である第２オリゴヌクレオチドを含むアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡを提供する。
【００２９】
５′−ｇｇａｇｕａｕｇａｕａａｕｇａａｃｃａ−３′（配列番号  １），
５′−ｃａｇｕａｇｕａｇｃｕｇｕｃａｃｕａｕ−３′（配列番号  ２），
５′−ａｇａｃｕｃａｃａｇｃｇａｇｇａｕｇａ−３′（配列番号  ３），
５′−ｃａｃａａａｕａｕｃｃｇｇｃｕａｕａｕ−３′（配列番号  ４），
５′−ｃａｃｃａｕａａｇｃｇａａａｕｇｃｃｕ−３′（配列番号  ５），
５′−ｇａｕｕａｃｕｕｕｇｇｕｇａａｃｇｇｕ−３′（配列番号  ６），
５′−ｃａｇｕｕｇｕｃａｃｕｕｕｕｕａｕｇａ−３′（配列番号  ７），
５′−ｇｇａｃｃｕａｕｃｃａａｇａｕｕｇｃａ−３′（配列番号  ８），
５′−ｃｇｕｕａｕｃａｃａｇｕｇｃａｃｃｕｕ−３′（配列番号  ９），
５′−ｃｃｕａｇｃｕｇａｇｇａｃａａｕｇｃａ−３′（配列番号  １０），
５′−ｇｇａａｇａｇａｇｇｕｕｕｃｃａｃｃａ−３′（配列番号  １１），
５′−ｃｕｃａｇａｇｇａｇｕａｕｇａｕａａｕ−３′（配列番号  １２），
５′−ｃｇｇｕｇｇａｃｕｕｇａｇｃｕｕｕｃｕ−３′（配列番号  １３），
５′−ｇｇｕｇｇｕｇａｃａｕｇｃａａｕｕｇｕ−３′（配列番号  １４），
５′−ｃａｇｇｇａａｕａｕｇａａｇｇａｇａａ−３′（配列番号  １５），
５′−ｇｇａｇｇｃｕｕｃｇａｃａａｇａａａａ−３′（配列番号  １６），
５′−ｃｃｇｇｕｇｇａａｃｃａａｕｇａｇａａ−３′（配列番号  １７），
５′−ｃｃｇｇｃｕａｕａｕｕａｕａｇａｕｇａ−３′（配列番号  １８），
５′−ａｇａａｕｃｃａｕｇｃａｃｕｇｃｃａａ−３′（配列番号  １９），
５′−ｃａａｇｇａｃｃｕａｕｃｃａａｇａｕｕ−３′（配列番号  ２０），
５′−ｃａａａｕａｕｃｃｇｇｃｕａｕａｕｕａ−３′（配列番号  ２１），
５′−ｇｇｇａｃｕａｃｇａｃｕａｃｕｃａｇａ−３′（配列番号  ２２），
５′−ｇｃｇａａｕｇｃａｇａｕａｃａｕｃｇａ−３′（配列番号  ２３），
５′−ｇｃｃａｃａｃｃｇｇａａａｕｇａｃａｕ−３′（配列番号  ２４），
５′−ａｇａｇｕｕｇａａｃａｇｇｕｇａｕｕａ−３′（配列番号  ２５），
５′−ｇａａｃｃａｃａａａｕａｕｃｃｇｇｃｕ−３′（配列番号  ２６），
５′−ｃａｕａａｇｃｇａａａｕｇｃｃｕｕｃｕ−３′（配列番号  ２７），
５′−ｇｕｕｕｃｃａｃｃａｕａａｇｃｇａａａ−３′（配列番号  ２８），
５′−ｃａｇｇｕｇａｕｕａａｇｃｃｃａａｇａ−３′（配列番号  ２９），
５′−ｃｃａｃａｃｃｇｇａａａｕｇａｃａｕｕ−３′（配列番号  ３０），
５′−ｇａｇｕｇａａａｕｇｃｃｕｕｃｕａｇｕ−３′（配列番号  ３１），
５′−ｃａｇａｇｕｕｇａａｃａｇｇｕａｇｕｕ−３′（配列番号  ３２），
５′−ｃｕｇｇａｕｕｇｇａｃｃｕｃａａｕｇａ−３′（配列番号  ３３），
５′−ｇａａａａｃｕｃａｃａｇｃａｕｇａｕｕ−３′（配列番号  ３４），
５′−ｇａａａｃｕｕｃｇａｃａａｇａｇａａｕ−３′（配列番号  ３５），
５′−ｃａｇｇａａａｕａｕｇａａｇｇａｇａａ−３′（配列番号  ３６），
５′−ｇｃａａａｕａｕａｕａｇａｇｃａｃｃｕ−３′（配列番号  ３７），
５′−ｇｇｕｇｃｕｇｕｃｇｃｕｃｕｕｇａｕａ−３′（配列番号  ３８），
５′−ｕｃａｇａｇｕｕｇａａｃａｇｇｕａｇｕ−３′（配列番号  ３９），
５′−ｇａａａｇａａａｃｕｕｃｇａｃａａｇａ−３′（配列番号  ４０），
５′−ｇａｃａａｕａｃｇｕｃａｇｇａａａｕａ−３′（配列番号  ４１），
５′−ｃｇｇｃｕｃａｇｇｃｃａｕｕａｕｇｃｕ−３′（配列番号  ４２），
５′−ｇｇａｃｃａｃａｇｕｇｃｕｇａｕｇｇａ−３′（配列番号  ４３），
５′−ｇｃｕｇｃｕｇｇａｕｕｇｇａｃｃｕｃａ−３′（配列番号  ４４），
５′−ｇｕｕａｕｕａｃａｇｕｃｃａｇｃｕｕａ−３′（配列番号  ４５），
５′−ｕｇｇａｃｃｕｃａａｕｇａｃａｃｃｕａ−３′（配列番号  ４６），
５′−ｃｕｇｇｃｕａｕａｕｕｇｕｃｇａｕｇａ−３′（配列番号  ４７），
５′−ｇａｃｇｇａａａｇｕｇａａａａｕａｃｕ−３′（配列番号  ４８），
５′−ｇｃａｇｃｃａｕａｇｃｕｇｃｃｕｕｕａ−３′（配列番号  ４９），
５′−ｇｇａｇｃｃｇａｃｕａｕｇａｃｕａｃｕ−３′（配列番号  ５０），
５′−ｇｕａｕｇａｕａａｃｇａａｃｃａｃａａ−３′（配列番号  ５１），
５′−ａｇｕｇａａａｕｇｃｃｕｕｃｕａｇｕａ−３′（配列番号  ５２），
５′−ｇａｕａａｃｇａａｃｃａｃａａａｕａｃ−３′（配列番号  ５３），
５′−ｕｇｃａｕｕａｇｃａｇｃｃａｕａｇｃｕ−３′（配列番号  ５４），
５′−ｃｇｇｇａｇｃｃｇａｃｕａｕｇａｃｕａ−３′（配列番号  ５５），
５′−ｃｃｇａｃｕａｕｇａｃｕａｃｕｃａｇａ−３′（配列番号  ５６），
５′−ｇｃａｕｕｃａｃｇｇａｇａａｕｇｃａａ−３′（配列番号  ５７），
５′−ｃｃａｕｇａａａａｃｕｃａｃａｇｃａｕ−３′（配列番号  ５８），
５′−ｃａｇｃａｕｇａｕｕｇａｃａｇｕａｇｕ−３′（配列番号  ５９），
５′−ｃｕｕａｇａａｇａｃａａｕａｃｇｕｃａ−３′（配列番号  ６０），
５′−ｕｇａｃｕａｃｕｃａｇａａｇａｇｕａｕ−３′（配列番号  ６１），
５′−ａｇａｇｕｕｇａａｃａｇｇｕａｇｕｕａ−３′（配列番号  ６２），
５′−ａｕａｕａｕａｇａｇｃａｃｃｕｇｇａａ−３′（配列番号  ６３），
５′−ａｇｃａｇｃｃａｕａｇｃｕｇｃｃｕｕｕ−３′（配列番号  ６４），
５′−ｇａｇｕｕｇａａｃａｇｇｕａｇｕｕａａ−３′（配列番号  ６５），
５′−ｃａｕｕｃａｃｇｇａｇａａｕｇｃａａａ−３′（配列番号  ６６），
５′−ｕｃａｇｇａａａｕａｕｇａａｇｇａｇａ−３′（配列番号  ６７），
５′−ｃａｇａａｇａｇｕａｕｇａｕａａｃｇａ−３′（配列番号  ６８），
５′−ｇｃｕｇｕｕａｕｕａｃａｇｕｃｃａｇｃ−３′（配列番号  ６９），
５′−ｇｇｇａａｇｃｇｕｇａａｃｃａｕｕｕｕ−３′（配列番号  ７０），
５′−ａｇｃｕｇｃｃｕｕｕａｕｇｕｃｕｇｃｕ−３′（配列番号  ７１），
５′−ｃａｃａｇｕｇｃｕｇａｕｇｇａｕｕｕｇ−３′（配列番号  ７２），
５′−ａｇｕｃａｇａｇｕｕｇａａｃａｇｇｕａ−３′（配列番号  ７３），
５′−ｕｇｇａａｇｃａｇｕａａｃａｕｇｃａａ−３′（配列番号  ７４），
５′−ａｇａａｇａｇｕａｕｇａｕａａｃｇａａ−３′（配列番号  ７５），
５′−ｇａａｇｃｇｕｇａａｃｃａｕｕｕｕｃｕ−３′（配列番号  ７６），
５′−ｇｇｃｕａｕａｕｕｇｕｃｇａｕｇａｕｕ−３′（配列番号  ７７），
５′−ｇａｃａａｇａｇａａｕｇｇａａａｕｇｕ−３′（配列番号  ７８），
５′−ｕｇａａａｕｇｃｃｕｕｃｕａｇｕａｇｕ−３′（配列番号  ７９），
５′−ｇｕｇａｇｕｇａａａｕｇｃｃｕｕｃｕａ−３′（配列番号  ８０），
５′−ｇａｃｃｕｃａａｕｇａｃａｃｃｕａｃｕ−３′（配列番号  ８１），
５′−ｃｃｕｃａａｕｇａｃａｃｃｕａｃｕｃｕ−３′（配列番号  ８２），
５′−ｇｃｕｇａｕｇｇａｕｕｕｇａｇｇｕｕａ−３′（配列番号  ８３），
５′−ｇｇａａｇｃａｇｕａａｃａｕｇｃａａａ−３′（配列番号  ８４），
５′−ｃａｇｕａａｃａｕｇｃａａａｕｇｕｃａ−３′（配列番号  ８５），
５′−ｇｇａｃｃｕｃａａｕｇａｃａｃｃｕａｃ−３′（配列番号  ８６），
５′−ｃａｇｃｃａｕａｇｃｕｇｃｃｕｕｕａｕ−３′（配列番号  ８７），
５′−ｕｃｃａｕｇａａａａｃｕｃａｃａｇｃａ−３′（配列番号  ８８），
５′−ｇｃｕｇｃｃｕｕｕａｕｇｕｃｕｇｃｕｇ−３′（配列番号  ８９），
５′−ｇｃｕｃｕｕｇａｕａｃｕｃｇｇｃｕｃａ−３′（配列番号  ９０），
５′−ｕｇｃｕｇｃｕｇｇａｕｕｇｇａｃｃｕｃ−３′（配列番号  ９１），
５′−ｇａａｃｃａｃａａａｕａｃｃｕｇｇｃｕ−３′（配列番号  ９２），
５′−ａｇａｇｃａｃｃｕｇｇａａｇｃａｇｕａ−３′（配列番号  ９３），
５′−ｃａｃｃｕｇｇａａｇｃａｇｕａａｃａｕ−３′（配列番号  ９４），
５′−ｃｕｇａｇｇａａｃｇａａａｇａａａｃｕ−３′（配列番号  ９５），
５′−ｇｕｇａａａｕｇｃｃｕｕｃｕａｇｕａｇ−３′（配列番号  ９６），
５′−ｃｕａｃｕｃｕｇｇｇａａｇｃｇｕｇａａ−３′（配列番号  ９７），
５′−ｃｕｇｇｇａａｇｃｇｕｇａａｃｃａｕｕ−３′（配列番号  ９８），
５′−ａｃｕａｃｕｃａｇａａｇａｇｕａｕｇａ−３′（配列番号  ９９），
５′−ｃａｕｇｃａａａｕｇｕｃａｇｃａａｇａ−３′（配列番号  １００），
５′−ｕｇａｇｇｕｕａｃｃｕｃａａｇａａｇｕ−３′（配列番号  １０１），
５′−ａｃｕｃｇｇｃｕｃａｇｇｃｃａｕｕａｕ−３′（配列番号  １０２），
５′−ｕｕｃａｃｇｇａｇａａｕｇｃａａａｕａ−３′（配列番号  １０３），
５′−ｃｕｇｃｕｇｇａｕｕｇｇａｃｃｕｃａａ−３′（配列番号  １０４），
５′−ｕｇａｕｕｃａｇｕｃａｇａｇｕｕｇａａ−３′（配列番号  １０５），
５′−ｕｃｇａｃａａｇａｇａａｕｇｇａａａｕ−３′（配列番号  １０６），
５′−ｃｕｃａａｇａａｇｕｇａｇａｕｇｕｃｕ−３′（配列番号  １０７），
５′−ｕｕｃｕｇｃａｕｕｃａｃｇｇａｇａａｕ−３′（配列番号  １０８），
５′−ａｇｇｕｕａｃｃｕｃａａｇａａｇｕｇａ−３′（配列番号  １０９），
５′−ａａｕｇｃｃｕｕｃｕａｇｕａｇｕｇａａ−３′（配列番号  １１０），
５′−ａｕｇａｕｕｃａｇｕｃａｇａｇｕｕｇａ−３′（配列番号  １１１），
５′−ａａａｃａａｇａｃｇｇａａａｇｕｇａａ−３′（配列番号  １１２），
５′−ｕｕｕｃｕｇｃａｕｕｃａｃｇｇａｇａａ−３′（配列番号  １１３），
５′−ｃａａａｕａｃｃｕｇｇｃｕａｕａｕｕｇ−３′（配列番号  １１４），
５′−ｇａａｇｃａｇｕａａｃａｕｇｃａａａｕ−３′（配列番号  １１５），
５′−ｇａｃｕａｃｕｃａｇａａｇａｇｕａｕｇ−３′（配列番号  １１６），
５′−ｇａｕｇａｕｕｃａｇｕｃａｇａｇｕｕｇ−３′（配列番号  １１７），
５′−ｕｇｃａｕｕｃａｃｇｇａｇａａｕｇｃａ−３′（配列番号  １１８），
５′−ｇｃｕｇａｇｇａａｃｇａａａｇａａａｃ−３′（配列番号  １１９），
５′−ｕｇｇａｕｕｕｇａｇｇｕｕａｃｃｕｃａ−３′（配列番号  １２０），
５′−ａｇｕｇａｇａｕｇｕｃｕｕｃａｇｇｇａ−３′（配列番号  １２１），
５′−ｇａｇｇｕｕａｃｃｕｃａａｇａａｇｕｇ−３′（配列番号  １２２），
５′−ｃｕｕｃｇａｃａａｇａｇａａｕｇｇａａ−３′（配列番号  １２３），
５′−ｃｕｃｕｕｇａｕａｃｕｃｇｇｃｕｃａｇ−３′（配列番号  １２４），
５′−ｇｕｃａｇａｇｕｕｇａａｃａｇｇｕａｇ−３′（配列番号  １２５），
５′−ｃａｕｇａａａａｃｕｃａｃａｇｃａｕｇ−３′（配列番号  １２６），
５′−ｇｇａａａｕｇｕａｃａｕｇｃｕａｕａｇ−３′（配列番号  １２７），
５′−ｃａｕｇｕａａｕｇｃａｇａａｕｕｕｃａ−３′（配列番号  １２８），
５′−ｇａｕｕｇａｃａｇｕａｇｕｕｕａｕｃａ−３′（配列番号  １２９），
５′−ｇｕｃｃａｇｃｕｕａｇａａｇａｃａａｕ−３′（配列番号  １３０），
５′−ｕｇｃｕｇｇａｕｕｇｇａｃｃｕｃａａｕ−３′（配列番号  １３１），
５′−ｇａａｇａｃａａｕａｃｇｕｃａｇｇａａ−３′（配列番号  １３２），
５′−ａａｇａｃａａｕａｃｇｕｃａｇｇａａａ−３′（配列番号  １３３），
５′−ｕｇａｇｇａａｃｇａａａｇａａａｃｕｕ−３′（配列番号  １３４），
５′−ｕｕｃｇａｃａａｇａｇａａｕｇｇａａａ−３′（配列番号  １３５），
５′−ｕｇｃｕｇｕｕａｕｕａｃａｇｕｃｃａｇ−３′（配列番号  １３６），
５′−ｇａｕｇｇａｕｕｕｇａｇｇｕｕａｃｃｕ−３′（配列番号  １３７），
５′−ｃｕｃａａｕｇａｃａｃｃｕａｃｕｃｕｇ−３′（配列番号  １３８），
５′−ｇｇｕｕａｃｃｕｃａａｇａａｇｕｇａｇ−３′（配列番号  １３９），
５′−ｇｃｃｇａｃｕａｕｇａｃｕａｃｕｃａｇ−３′（配列番号  １４０），
５′−ｃａａａｕａｕａｕａｇａｇｃａｃｃｕｇ−３′（配列番号  １４１），
５′−ａｇｃｃｇａｃｕａｕｇａｃｕａｃｕｃａ−３′（配列番号  １４２），
５′−ａｃｃｕｇｇｃｕａｕａｕｕｇｕｃｇａｕ−３′（配列番号  １４３），
５′−ｃｃｕａｃｕｃｕｇｇｇａａｇｃｇｕｇａ−３′（配列番号  １４４），
５′−ｇｃａｕｕａｇｃａｇｃｃａｕａｇｃｕｇ−３′（配列番号  １４５），
５′−ａｕｇａｕａａｃｇａａｃｃａｃａａａｕ−３′（配列番号  １４６），
５′−ｇｃｇｕｇａａｃｃａｕｕｕｕｃｕｇｇｇ−３′（配列番号  １４７），
５′−ｕｇｇｇａａｇｃｇｕｇａａｃｃａｕｕｕ−３′（配列番号  １４８），
５′−ａｇｃａｇｕａａｃａｕｇｃａａａｕｇｕ−３′（配列番号  １４９），
５′−ｕｇａａａａｃｕｃａｃａｇｃａｕｇａｕ−３′（配列番号  １５０），
５′−ａｇａｃａａｕａｃｇｕｃａｇｇａａａｕ−３′（配列番号  １５１），
５′−ａｕａｃｕｃｇｇｃｕｃａｇｇｃｃａｕｕ−３′（配列番号  １５２），
５′−ａｕｕａｕｇｃｕｇｃｕｇｇａｕｕｇｇａ−３′（配列番号  １５３），
５′−ｕｇｃｕｇａｕｇｇａｕｕｕｇａｇｇｕｕ−３′（配列番号  １５４），
５′−ｕｇｕｇａｇｕｇａａａｕｇｃｃｕｕｃｕ−３′（配列番号  １５５），
５′−ａｕｕｃａｇｕｃａｇａｇｕｕｇａａｃａ−３′（配列番号  １５６），
５′−ａａｇｇｇａｇｇｃａａａａａｕｇｇａａ−３′（配列番号  １５７），
５′−ｕｇｕｕａｕｕａｃａｇｕｃｃａｇｃｕｕ−３′（配列番号  １５８），
５′−ａｃｇａａａｇａａａｃｕｕｃｇａｃａａ−３′（配列番号  １５９），
５′−ｃｕｇｃａｕｕｃａｃｇｇａｇａａｕｇｃ−３′（配列番号  １６０），
５′−ａｇａｇａａｕｇｇａａａｕｇｕａｃａｕ−３′（配列番号  １６１），
５′−ｃｇｕｃａｇｇａａａｕａｕｇａａｇｇａ−３′（配列番号  １６２），
５′−ａｕｇｃｕｇｃｕｇｇａｕｕｇｇａｃｃｕ−３′（配列番号  １６３），
５′−ａｇｕａｕｇａｕａａｃｇａａｃｃａｃａ−３′（配列番号  １６４），
５′−ａａｃｃａｃａａａｕａｃｃｕｇｇｃｕａ−３′（配列番号  １６５），
５′−ａａｕａｕａｕａｇａｇｃａｃｃｕｇｇａ−３′（配列番号  １６６），
５′−ａａａｕｕｇｃａｕｕａｇｃａｇｃｃａｕ−３′（配列番号  １６７），
５′−ａｃｇａａｃｃａｃａａａｕａｃｃｕｇｇ−３′（配列番号  １６８），
５′−ａａｇｃａｇｕａａｃａｕｇｃａａａｕｇ−３′（配列番号  １６９），
５′−ｃｇｃｕｃｕｕｇａｕａｃｕｃｇｇｃｕｃ−３′（配列番号  １７０），
５′−ｇｕａａｃａｕｇｃａａａｕｇｕｃａｇｃ−３′（配列番号  １７１），
５′−ａａｕｇｕａｃａｕｇｃｕａｕａｇｃａｕ−３′（配列番号  １７２），
５′−ｃａｃｇｇａｇａａｕｇｃａａａｕａｕａ−３′（配列番号  １７３），
５′−ｃｕｇｕｕａｕｕａｃａｇｕｃｃａｇｃｕ−３′（配列番号  １７４），
５′−ｃｇａｃａａｇａｇａａｕｇｇａａａｕｇ−３′（配列番号  １７５），
５′−ａａａａｃａａｇａｃｇｇａａａｇｕｇａ−３′（配列番号  １７６），
５′−ｃｕａｕａｕｕｇｕｃｇａｕｇａｕｕｃａ−３′（配列番号  １７７），
５′−ａｇｕｃｃａｕｇａａａａｃｕｃａｃａｇ−３′（配列番号  １７８），
５′−ｇｃｕｇｕｃｇｃｕｃｕｕｇａｕａｃｕｃ−３′（配列番号  １７９），
５′−ｇｃｕａｕａｕｕｇｕｃｇａｕｇａｕｕｃ−３′（配列番号  １８０），
５′−ｃｇａａａｇａａａｃｕｕｃｇａｃａａｇ−３′（配列番号  １８１），
５′−ａｇｃｇｕｇａａｃｃａｕｕｕｕｃｕｇｇ−３′（配列番号  １８２），
５′−ａｕｇａａａａｃｕｃａｃａｇｃａｕｇａ−３′（配列番号  １８３），
５′−ａｃｕｕｃｇａｃａａｇａｇａａｕｇｇａ−３′（配列番号  １８４），
５′−ｃａｇｕｃｃａｇｃｕｕａｇａａｇａｃａ−３′（配列番号  １８５），
５′−ｕｇｃａａａｕａｕａｕａｇａｇｃａｃｃ−３′（配列番号  １８６），
５′−ａｇａａｇａｃａａｕａｃｇｕｃａｇｇａ−３′（配列番号  １８７），
５′−ｇｇｇａｇｃｃｇａｃｕａｕｇａｃｕａｃ−３′（配列番号  １８８），
５′−ａｕｇｇａａａｕｇｕａｃａｕｇｃｕａｕ−３′（配列番号  １８９），
５′−ｃａａａａａｕｕｇｃａｕｕａｇｃａｇｃ−３′（配列番号  １９０），
５′−ｇｕｇｃｕｇｕｃｇｃｕｃｕｕｇａｕａｃ−３′（配列番号  １９１），
５′−ｕｇｃｕｇｕｃｇｃｕｃｕｕｇａｕａｃｕ−３′（配列番号  １９２），
５′−ｕａｃｕｃｇｇｃｕｃａｇｇｃｃａｕｕａ−３′（配列番号  １９３），
５′−ｕｇｇｃｕａｕａｕｕｇｕｃｇａｕｇａｕ−３′（配列番号  １９４），
５′−ａｕｕｃａｃｇｇａｇａａｕｇｃａａａｕ−３′（配列番号  １９５），
５′−ａａａｃｕｃａｃａｇｃａｕｇａｕｕｇａ−３′（配列番号  １９６），
５′−ａｕｕａｃａｇｕｃｃａｇｃｕｕａｇａａ−３′（配列番号  １９７），
５′−ｕｇａｕｇｇａｕｕｕｇａｇｇｕｕａｃｃ−３′（配列番号  １９８），
５′−ｕｃａｇａａｇａｇｕａｕｇａｕａａｃｇ−３′（配列番号  １９９），
５′−ａｇａｇｕａｕｇａｕａａｃｇａａｃｃａ−３′（配列番号  ２００），
５′−ｕｇａｕａａｃｇａａｃｃａｃａａａｕａ−３′（配列番号  ２０１），
５′−ａｃｇｇａｇａａｕｇｃａａａｕａｕａｕ−３′（配列番号  ２０２），
５′−ｃｕａｇｕａｇｕｇａａｃｃｇｕｃｃｕｃ−３′（配列番号  ２０３），
５′−ｇａａｇａｇｕａｕｇａｕａａｃｇａａｃ−３′（配列番号  ２０４），
５′−ａａａｕｇｃｃｕｕｃｕａｇｕａｇｕｇａ−３′（配列番号  ２０５），
５′−ｕａａｃｇａａｃｃａｃａａａｕａｃｃｕ−３′（配列番号  ２０６），
５′−ａｕｕｇｕｃｇａｕｇａｕｕｃａｇｕｃａ−３′（配列番号  ２０７），
５′−ａｃａｕｇｃａａａｕｇｕｃａｇｃａａｇ−３′（配列番号  ２０８），
５′−ｕｇｕｕｇｃｕｇｕｕａｕｕａｃａｇｕｃ−３′（配列番号  ２０９），
５′−ｕａｇａｇｃａｃｃｕｇｇａａｇｃａｇｕ−３′（配列番号  ２１０），
５′−ａａｃｇａａａｇａａａｃｕｕｃｇａｃａ−３′（配列番号  ２１１），
５′−ａａａｕａｃｃｕｇｇｃｕａｕａｕｕｇｕ−３′（配列番号  ２１２），
５′−ａａｕａｃｇｕｃａｇｇａａａｕａｕｇａ−３′（配列番号  ２１３），
５′−ｕｇｇａａａｕｇｕａｃａｕｇｃｕａｕａ−３′（配列番号  ２１４），
５′−ａｃｇｕｃａｇｇａａａｕａｕｇａａｇｇ−３′（配列番号  ２１５），
５′−ｕｕｇｇａｃｃｕｃａａｕｇａｃａｃｃｕ−３′（配列番号  ２１６），
５′−ｕａａｃａｕｇｃａａａｕｇｕｃａｇｃａ−３′（配列番号  ２１７），
５′−ａｕｇａｃｕａｃｕｃａｇａａｇａｇｕａ−３′（配列番号  ２１８），
５′−ａａａｕｃｃａｕｇｕａａｕｇｃａｇａａ−３′（配列番号  ２１９），
５′−ｇｇａａｇｃｇｕｇａａｃｃａｕｕｕｕｃ−３′（配列番号  ２２０），
５′−ｕｃｕｇｇｇａａｇｃｇｕｇａａｃｃａｕ−３′（配列番号  ２２１），
５′−ｕａｕｕｇｕｃｇａｕｇａｕｕｃａｇｕｃ−３′（配列番号  ２２２），
５′−ａｇｕａａｃａｕｇｃａａａｕｇｕｃａｇ−３′（配列番号  ２２３），
５′−ｕｕａｇａａｇａｃａａｕａｃｇｕｃａｇ−３′（配列番号  ２２４），
５′−ａａａａｕｃｃａｕｇｕａａｕｇｃａｇａ−３′（配列番号  ２２５），
５′−ｇｃｕｇｇａｕｕｇｇａｃｃｕｃａａｕｇ−３′（配列番号  ２２６），
５′−ｃｕｇａｕｇｇａｕｕｕｇａｇｇｕｕａｃ−３′（配列番号  ２２７），
５′−ｃｃｕｃａａｇａａｇｕｇａｇａｕｇｕｃ−３′（配列番号  ２２８），
５′−ｇａｇｃｃｇａｃｕａｕｇａｃｕａｃｕｃ−３′（配列番号  ２２９），  
５′−ｇａｕｕｃａｇｕｃａｇａｇｕｕｇａａｃ−３′（配列番号  ２３０）
本発明での“アンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ（ｓ）”はアンフィレギュリンのタンパク質をエンコーディングする遺伝子に特異的なｓｉＲＮＡ（ｓ）を意味する。また、アンフィレギュリンに対する特異性が維持される限り、上記の配列番号１ないし配列番号２３０に従う配列を含むセンス鎖またこれに相補的なアンチセンス鎖で、一つ以上の塩基が置換、欠失、または挿入された配列を含むセンス鎖及びアンチセンス鎖を含むアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡも本発明の権利の範囲に含まれるということは本発明の属する技術分野で通常の知識を持っている者には自明なことである。
【００３０】
本発明で提供されるアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡはアンフィレギュリンを暗号化するｍＲＮＡと相補的に結合できるように設計された塩基配列だから、アンフィレギュリンの発現を効果的に抑制できるというのが特徴で、上記のｓｉＲＮＡは一つなたは両方鎖の３′末端に一つまたは二つ以上の非結合（ｕｎｐａｉｒｅｄ）されたヌクレオチドを含む構造のオーバハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含むことができる。
【００３１】
また、上記のｓｉＲＮＡの生体内の安定性の向上のために、核酸分解酵素の抵抗性の付与及び非特異的な免疫反応の減少のための多様な変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含むことができる。上記のｓｉＲＮＡを構成する第１または第２のオリゴヌクレオチドの変形は一つ以上のヌクレオチド内の糖構造の２´炭素位置で  −ＯＨ基が-ＣＨ３（メチル）、−ＯＣＨ３（ｍｅｔｈｏｘｙ）、−ＮＨ２、−Ｆ（フッ素）、  −Ｏ−２−メトキシエチル−Ｏ−プロピル、  −Ｏ−２−メチルチオエチル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ）、−Ｏ−３−アミノプロピル、−Ｏ−３−ジメチルアミノプロピル、−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミドまたは−Ｏ−ジメチルアミドオキシエチルへの置換による変形；ヌクレオチド内の糖（ｓｕｇａｒ）構造内の酸素が硫黄に置換された変形；またはヌクレオチド結合のホスホロチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）またはボラノリン酸（ｂｏｒａｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、メチルホスホン酸（ｍｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ）結合への変形で選択された一つ以上の変形が組合されて用いることができて、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）またはＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）形態への変形も使用するこ  とができる（Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｍｅｄ．  ５５，  ６１−６５  ２００４；  ＵＳ  ５，６６０，９８５；  ＵＳ  ５，９５８，６９１；  ＵＳ  ６，５３１，５８４；  ＵＳ  ５，８０８，０２３；  ＵＳ  ６，３２６，３５８；  ＵＳ  ６，１７５，００１；  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  １４：１１３９−１１４３，  ２００３；  ＲＮＡ，  ９：１０３４−１０４８，  ２００３；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ３１：５８９−５９５，  ２００３；  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３８（１７）  ５７６１-５７７３，  ２０１０；    Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ３９（５）  １８２３-１８３２，  ２０１１）。
【００３２】
本発明で提供されるアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡの中で、配列番号１ないし３０に従う配列を含むセンス鎖を有するｓｉＲＮＡはマウスのアンフィレギュリンに特異的なもので、配列番号３１ないし２３０に従う配列を含むセンス鎖を有するｓｉＲＮＡは人間のアンフィレギュリンに特異的なものである。本発明の配列番号１ないし２３０に従う配列を含むセンス鎖を有するｓｉＲＮＡはすべてアンフィレギュリンの発現を効果的に抑制できる効能があるもので確認された。
【００３３】
本発明のほかの様態はアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡの生体内への効率的な伝達及び安定性の向上のためのｓｉＲＮＡの両末端に各々の一つ以上の親水性の高分子及び疎水性の高分子が接合された形態のｓｉＲＮＡの接合体である二重鎖オリゴＲＮＡの構造体に対するもである。本発明での‘二重鎖オリゴＲＮＡの構造体’はｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの両末端に各々の一つ以上の親水性の高分子及び疎水性の高分子が接合された二重鎖形態のオリゴＲＮＡの構造体を意味する。
【００３４】
上記の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体の場合疎水性物質の疎水性の相互作用によって自己組立のナノ粒子を形成することになって（大韓民国公開特許公報第２０１０−１２３２１４号参照）、このような接合体は体内への伝達効率及び体内での安定性が非常に優れることだけではなく、粒子の大きさの均一性が優れてＱＣ（Ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ）が容易なので薬物としての製造工程が簡単であるという長所がある。
【００３５】
具体的に本発明に従うアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴＲＮＡの構造体は下記の構造式（１）のような構造を持つのが望ましい。
【００３６】
Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ        構造式  （１）
上記の構造式（１）でＡは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹは各々の独立的に単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味し、Ｒはアンフィレギュリンに特異的ｓｉＲＮＡを意味する。
【００３７】
より望ましいのは本発明に従うアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴＲＮＡの構造体は下記の構造式（２）の構造を持つ。
【００３８】
【化１】
2015532100.tif 000003
【００３９】
上記の構造式（２）でＡは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹは各々の独立的に単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味し、Ｓはアンフィレギュリンに特異的ｓｉＲＮＡのセンス鎖、ＡＳはアンフィレギュリンに特異的ｓｉＲＮＡのアンチセンスの鎖を意味する。
【００４０】
より望ましいのはアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体は下記の構造式（３）の構造を持つ。
【００４１】
【化２】
2015532100.tif 000004
【００４２】
上記の構造式（３）でＡは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹは各々の独立的に単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味し、Ｓはアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡのセンス鎖、ＡＳはアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡのアンチセンスの鎖を意味する。
【００４３】
上記、構造式（１）ないし構造式（３）での上記のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体のアンチセンス鎖  ５´末端に燐酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｇｒｏｕｐ）が一つないし三つ結合することができる。
【００４４】
また、上記の構造式（１）ないし（３）でｓｉＲＮＡの代わりにｓｈＲＮＡが用いることができるということも本発明の属する技術分野で通常の知識を持っている者には自明なことである。
【００４５】
上記の構造式（１）ないし構造式（３）での親水性物質は分子量が２００ないし１０，０００である陽イオン性または非イオン性の高分子の物質であることが望ましく、より望ましいことには１，０００ないし２，０００の非イオン性の高分子の物質である。たとえば、親水性の高分子の物質としてはポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリンなどの非イオン性の親水性の高分子化合物を用いるのが望ましいが、必ずこれに限られるものではない。  
【００４６】
上記の構造式（１）ないし構造式（３）での疎水性の物質（Ｂ）  は疎水性の相互作用を通じて構造式（１）に従うオリゴヌクレオチドの構造体で構成されたナノ粒子を形成する役割を遂行する。上記の疎水性物質は分子量が２５０ないし１，０００であるのが望ましく、ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）誘導体、グリセリド（ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ）誘導体、グリセロールエーテル（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリプロピレングリコール（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、  Ｃ１２ないしＣ５０の不飽和または飽和炭化水素（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎ）、ジアシルホスファチジルコリン（ｄｉａｃｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、脂肪酸（ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ）、リン脂質（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ）、リポポリアミン（ｌｉｐｏｐｏｌｙａｍｉｎｅ）などが使用できるが、これに制限されるものではなく、本発明の目的に符合することならばどのような疎水性の物質でも使用できるという点は本発明の属する技術分野で通常の知識を持っている者には自明なことである。
【００４７】
上記のステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）の誘導体はコレステロール、コレスタノール、コール酸、  コレステリルホルマート、  コレスタニルホルマート及びコレスタニルアミンで構成された群から選択することができて、上記のグリセリドの誘導体はモノ−、ジ−及びトリ−グリセリドなどで選択することができてこの時、グリセリドの脂肪酸はＣ１２ないしＣ５０の不飽和または飽和脂肪酸が望ましい。  
【００４８】
特に、上記の疎水性の物質の中でも飽和または不飽和炭化水素かコレステロールが本発明に従うオリゴヌクレオチド構造体の合成段階で容易に結合させることができるという長所を持っている点で望ましい。上記の疎水性の物質は親水性の物質の反対方の末端（ｄｉｓｔａｌ  ｅｎｄ）に結合され、ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖のどの位置に結合されても構わない。
【００４９】
本発明に従う構造式（１）ないし構造式（３）での親水性の物質または疎水性の物質とアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡは単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合（ＸまたはＹ）によって結合される。上記の共有結合を媒介するリンカーは親水性の物質、または疎水性の物質とアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡの末端で共有結合して、必要に従って特定の環境で分解の可能な結合を提供する限り特別に限定されることではない。従って、上記のリンカーは本発明に従う二重鎖オリゴＲＮＡの構造体の製造過程中アンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ及び／または親水性の物質（または疎水性の物質）を活性化するために結合させるどのような化合物も使用することができる。上記の共有結合は非分解性の結合または分解性の結合中どんなものでも構わない。この時、非分解性の結合ではアミド結合またはリン酸化結合があり、分解性の結合ではジスルフィド結合、酸分解性の結合、エステル結合、無水物の結合、生分解性の結合または酵素分解性結合などがあるが、これに限られるものではない。
【００５０】
また、上記の構造式（１）ないし構造式（３）でのＲ（またはＳ及びＡＳ）で表示されるアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡはアンフィレギュリンと特異的に結合できるという特性を持っているｓｉＲＮＡであればすべてが制限なしに使用可能で、望ましいことには本発明では配列番号１ないし配列番号２３０で選択されたどの一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖で構成される。
【００５１】
本発明のまた別の様態として、アンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴＲＮＡの構造体を含むナノ粒子を提供する。
【００５２】
すでに前で説明したようにアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体は疎水性及び親水性の物質をすべて含んでいる両親媒性で、親水性の部分は体内に存在する水分子らと水素結合などの相互作用を通じて親和力を有しており、外側の方に向けるようになり、疎水性の物質らはそれらの間で疎水性の相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）を通じて内側の方に向けるようになり、熱力学的に安定なナノ粒子を形成するようになる。即ち、ナノ粒子の中心に疎水性の物質が位置するようになり、アンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡの外側の方向に親水性の物質が位置してアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡを保護する形態のナノ粒子を形成する。このように形成されたナノ粒子はアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡの細胞内伝達向上及びアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡの効能を向上させる。
【００５３】
本発明に従うナノ粒子は同一な配列を有するｓｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体だけで形成されることもあり、互いに異なる配列を含むｓｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体で構成されることもありえるという特徴にする。即ち、同一なアンフィレギュリンに対する特異性を持ちながらその配列が違う場合も含まれることに解釈される。また、アンフィレギュリンの以外に別のガン特異的なターゲット遺伝子の特異的なｓｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体が本発明に従うナノ粒子に含まれることもできる。  
【００５４】
上記の本発明に従うナノ粒子を構成する二重鎖オリゴＲＮＡの構造体に含まれるアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡは配列番号１ないし２３０で選択されたされたどの一つの配列をセンス鎖として有し、これに相補的な配列をアンチセンス鎖として有するのが望ましいが、これに限定されるものではなく、アンフィレギュリンに特異性を有しながら本発明の目的に符合するどのようなｓｉＲＮＡも使用できるということは通常の技術者には自明なことである。
【００５５】
また、本発明は上記のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ、またはこれを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体及び／または上記の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体でなっているナノ粒子を含む呼吸器疾患の予防または治療用の組成物を提供する。
【００５６】
本発明のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ、またはこれを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体及び／または上記の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体でなっているナノ粒子を含む組成物は肺動脈の再形成（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）及び気道再形成（ａｉｒｗａｙ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）を抑制して呼吸器疾患の予防または治療に効果を示すことである。従って本発明に従う組成物は呼吸器疾患である喘息、慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺繊維症（ＩＰＦ）、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、急性下気道感染症（気管支炎及び細気管支炎）、咽喉炎、へんとう炎、喉頭炎のような急性上気道感染症などの予防または治療に効果があることである。
【００５７】
本発明の組成物には投与のために上記の記載された有効成分の他に追加で薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含めて製造することができる。薬剤学的に許容可能な担体は本発明の有効成分と両立可能でなければならないことで、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれら成分の中、一つの成分または二つ以上の成分を混合して使用することができ、必要に従って抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など他の通常の添加剤を加えることができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用の製剤で製剤化することができる。特に、凍結された（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）形態の製剤で製剤化して提供することが望ましい。凍結乾燥の製剤の製造のために本発明の属する技術分野で通常的に知られている方法を使用することができて、凍結乾燥のための安定化剤が追加されることもできる。さらに、当分野の適正な方法でまたはレミントンの薬学科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ）に開示されている方法を用いて各疾病に従ってまたは成分に従って望ましく製剤化することができる。
【００５８】
本発明の組成物は通常の患者の症候と疾病の深刻度に基づいて本技術分野の通常の専門家が決定することができる。また、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの多様な形態に製剤化することができて、単位−投与量または多−投与量の容器、例えば密封されたアンプル及び瓶などで提供することができる。
【００５９】
本発明の組成物は経口または非経口の投与ができる。本発明に従う組成物の投与経路はこれらに限定されることではないが、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下または局所投与ができる。特別に呼吸器疾患の治療のために気管支内の点滴注入を通じた肺への投与も可能である。本発明に従う組成物の投与量は患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、方法、排泄率または疾病の重症度などに従い、その範囲が多様で、本技術分野の通常の専門家が容易に決定することができる。また、臨床投与のため公知の技術を用いて本発明の組成物を適合な製剤に製剤化することができる。
【００６０】
また、本発明では本発明に従うアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ、上記のｓｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体、これを含む組成物またはナノ粒子を呼吸器疾患の予防または治療のための薬剤の製造に利用する用途を提供して、また、本発明では本発明に従う二重鎖オリゴＲＮＡの構造体、これを含む組成物またはナノ粒子を予防または治療を必要にする患者に投与することを含む呼吸器疾患の予防及び治療方法を提供する。
【００６１】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例により制限されるものではないことは当該の技術分野で通常の知識をもっている者において自明なことである。
【実施例】
【００６２】
実施例１．  目標の塩基配列のデザイン及びｓｉＲＮＡの製造
マウスのアンフィレギュリンｍＲＮＡの配列（ＮＭ＿００９７０４）でｓｉＲＮＡが結合できる目標の塩基配列（センス鎖）をデザインして、上記目標の塩基配列の相補的な配列であるアンチセンス鎖のｓｉＲＮＡを製造した。まず、バイオニア（株）で開発された遺伝子のデザインプログラム（Ｔｕｒｂｏ  ｓｉ−Ｄｅｓｉｇｎｅｒ）を用いて、アンフィレギュリンのｍＲＮＡの配列（ＮＭ＿００９７０４）でｓｉＲＮＡが結合できる目標の塩基配列をデザインした。本発明のアンフィレギュリンのｓｉＲＮＡは１９個のヌクレオチドで構成されたセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖で構成された二重鎖の構造である。上記のｓｉＲＮＡはβ−シアノエチルホスホラミダイト（β−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を用いてＲＮＡの骨格構造を構成するホスホジエステル結合を連結して製造した（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：４５３９−４５５７，  １９８４）。具体的に、ＲＮＡ合成器（３８４  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ，  ＢＩＯＮＥＥＲ，韓国）を用いて、ヌクレオチドが付着された固形支持体の上で、遮断除去（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）、結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）及びキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）でなっている一連の過程を繰返して、望む長さのＲＮＡを含む反応物を収得した。上記の反応物をＤａｉｓｏ  ｇｅｌ  Ｃ１８（Ｄａｉｓｏ，  Ｊａｐａｎ）カラムが装着された  ＨＰＬＣ  ＬＣ９１８（Ｊａｐａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，  Ｊａｐａｎ）でＲＮＡを分離及び精製してこれをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，  Ｊａｐａｎ）を用いて目標の塩基配列と符合するかを確認した。その後、センスとアンチセンスのＲＮＡ鎖を結合させて目的する配列番号１ないし配列番号３０で選択されたどの一つの配列をセンス鎖として有するｓｉＲＮＡを製造した。
【００６３】
実施例２．  繊維母細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株でｓｉＲＮＡを用いたアンフィレギュリンの発現抑制
上記の実施例１で製造された配列番号１ないし配列番号３０を各々のセンス鎖として有するアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡを用いて繊維芽細胞株のマウスの繊維母細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）を形質転換させて、上記の形質転換された繊維母細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株でアンフィレギュリンの発現様相、即ち上記のｓｉＲＮＡによる発現抑制の程度を分析した。
【００６４】
２−１：繊維母細胞の細胞株の培養
アメリカ合衆国種菌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  ＡＴＣＣ）から  入手したマウスの繊維母細胞の細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）をＲＰＭＩ−１６４０培養培地  （ＧＩＢＣＯ／  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＵＳＡ，  １０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ及びスト  レプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）  ＣＯ２の条件下で培養した。
【００６５】
２−２：  繊維母細胞の細胞株で目標ｓｉＲＮＡの形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）
上記の実施例２−１で培養された１×１０５繊維母細胞の細胞株を３７℃で５  ％（ｖ／ｖ）  ＣＯ２の条件下で１２−ウェルプレートで１８時間の間ＲＰＭＩ  １６４０で培養した後、培地を除去した後各のウェル当たり５００μｌの  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、米国）を分注した。
【００６６】
一方、リポフェクタミン２０００（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM  ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）  ２μｌと  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４８μｌを混合して混合液を製造して室温で５分間反応させた後、上記の実施例１で製造した各々の配列番号１ないし３０の中どの一つの配列をセンス鎖として有するｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ／μｌ）  ２０μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μｌに添加して最終濃度が２０ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。上記のリポフェクタミン２０００（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM  ２０００）混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で２０分間反応させて形質注入用の溶液を製造した。
【００６７】
その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各ウェルに形質注入用の溶液を各々５００μｌずつ分注して６時間の間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。ここに  ＲＰＭＩ  １６４０培養培地１ｍｌずつ分注した後２４時間の間３７℃で  ５％（ｖ／ｖ）  ＣＯ２の条件下で培養した。
【００６８】
２−３：アンフィレギュリンのｍＲＮＡの定量分析
上記の実施例２−２で形質注入された細胞株から全体のＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を用いてアンフィレギュリン遺伝子のｍＲＮＡの発現量を相対定量した。
【００６９】
２−３−１：形質注入された細胞からＲＮＡの分離及びｃＤＮＡの製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ＢＩＯＮＥＥＲ、  韓国）を用いて、上記の実施例２−２で形質注入された細胞株から全体のＲＮＡを抽  出して、抽出されたＲＮＡはＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  Ｃｙｃｌｅ  ＳｃｒｉｐｔＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０，  Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）  を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡを製造した。具体的に、０．２５ｍｌのエッペンチューブに入っているＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０  （Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）に一つのチューブ当たり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れて総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）  で処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅTM  ９６  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）で３０℃で１分間ＲＮＡとプライマーを混成化して、５２℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を６回繰返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
【００７０】
２−３−２：アンフィレギュリンのｍＲＮＡの相対定量の分析
上記の実施例２−３−１で製造されたｃＤＮＡを鋳型にしてリアルタイムＰＣＲを通じてアンフィレギュリンのｍＲＮＡの相対的な量を下記のような方法で定量した。９６−ウェルプレートの各ウェルに上記の実施例２−３−１で製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈して、アンフィレギュリンの  ｍＲＮＡの発現量の分析のために希釈されたｃＤＮＡ  ３μｌと２×ＧｒｅｅｎＳｔａｒTM  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１０μｌ、蒸留水６μｌ、アンフィレギュリンｑＰＣＲプライマーｒ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ各々、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１μｌ  入れ、混合液を作った。一方、アンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピングの遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ、以下ＨＫ遺伝子）である  ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を標準遺伝子とした。上記の混合液の入った９６−ウェルプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒTM９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて下記のような反応を行った；  ９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４  ℃で３０秒の変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、  ５８℃で３０秒のアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒の延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｓｃａｎ）の四つの過程を４２回繰返して行い、７２℃で３分間の最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持して、５５℃から９５℃まで融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を分析した。ＰＣＲが終了された後、各々の収得したアンフィレギュリンのＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）値はＧＡＰＤＨ遺伝子を通じて正規化されたｍＲＮＡ値（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、ＮＦ）を計算して補正されたアンフィレギュリンのＣｔ値を求めた後、形質注入の物質だけで処理された実験群を対照群にしてΔＣｔ値の差を求めた。上記のΔＣｔ値と計算式２（−ΔＣｔ）×１００を用いて配列番号１ないし配列番号３０を各々のセンス鎖として有するアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡに従うアンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現量を相対定量した（図１参照）。
【００７１】
高効率のｓｉＲＮＡを選別するために最終濃度２０ｎＭの濃度でアンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現量が対照群と対比して７０％以上の発現量の減少を示し、配列番号２、６ないし９、１１、１７ないし２１、２３、２４、２８及び２９を各々のセンス鎖として有するｓｉＲＮＡの１５種を選別した。
【００７２】
実施例３．  繊維母細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株で選別されたｓｉＲＮＡを用いたアンフィレギュリンの発現抑制
上記の実施例２で選別された配列番号２、６ないし９、１１、１７ないし２１、２３、２４、２８及び２９を各々のセンス鎖として有するｓｉＲＮＡを用いて繊維雅細胞株であるマウスの繊維母細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）を形質転換させて、上記の形質転換された繊維母細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株でアンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現様相を分析した。
【００７３】
３−１：繊維母細胞の細胞株の培養
アメリカ合衆国種菌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から入手したマウスの繊維母細胞の細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）をＲＰＭＩ−１６４０培養培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【００７４】
３−２：繊維母細胞の細胞株で目標ｓｉＲＮＡの形質注入
上記の実施例２−１で培養された１×１０５繊維母細胞の細胞株を３７℃で５  ％（ｖ／ｖ）  ＣＯ２の条件下で１２−ウェルプレートで１８時間の間ＲＰＭＩ  １６４０で培養した後、培地を除去した後各のウェル当たり５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、米国）を分注した。
【００７５】
一方、リポフェクタミン２０００（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM  ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）  ２μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４８μｌを混合して混合液を製造して、室温で５分間反応させた後、上記の実施例２で選別された配列番号２、６ないし９、１１、１７ないし２１、２３、２４、２８及び２９を各々のセンス鎖として有するｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ／μｌ）  ５μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４５μｌに添加して最終濃度が５ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。上記のリポフェクタミン２０００（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM  ２０００）混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で２０分間反応させて形質注入用の溶液を製造した。
【００７６】
その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各のウェルに形質注入用の溶液を各々５００μｌずつ分注して６時間の間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。ここにＲＰＭＩ  １６４０培養培地１ｍｌずつ分注した後２４時間の間３７℃で５％（ｖ／ｖ）  ＣＯ２の条件下で培養した。
【００７７】
３−３：アンフィレギュリンのｍＲＮＡの定量分析
上記の実施例３−２で形質注入された細胞株から全体のＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を用いてアンフィレギュリンの遺伝子のｍＲＮＡの発現を相対定量した。
【００７８】
３−３−１：形質注入された細胞からＲＮＡの分離及びｃＤＮＡの製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて、上記の実施例２−２で形質注入された細胞株  から全体のＲＮＡを抽出して、抽出されたＲＮＡはＲＮＡ逆転写酵素（ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０，  Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、下記のような方法  でｃＤＮＡを製造した。具体的に、０．２５ｍｌのエッペンチューブに入っているＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０  （Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）に一つのチューブ当たり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れて総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）で処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅTM  ９６  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）で３０℃で１分間ＲＮＡとプライマーを混成化して、５２℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を６回繰返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
【００７９】
３−３−２：アンフィレギュリンのｍＲＮＡの相対定量の分析
上記の実施例３−３−１で製造されたｃＤＮＡを鋳型にしてリアルタイムＰＣＲを通じてアンフィレギュリンのｍＲＮＡの相対的な量を下記のような方法で定量した。９６−ウェルプレートの各ウェルに上記の実施例３−３−１で製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈して、アンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現量の分析のために希釈されたｃＤＮＡ  ３μｌと２×ＧｒｅｅｎＳｔａｒTM  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１０μｌ、蒸留水６μｌ、アンフィレギュリンｑＰＣＲプライマーｒ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ各々、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１μｌ入れ、混合液を作った。一方、アンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ、以下ＨＫ遺伝子）であるＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を標準遺伝子とした。上記の混合液が入った９６−ウェルプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒTM９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて下記のような反応を行った；  ９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃で３０秒の変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒のアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒の延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｓｃａｎ）の四つの過程を４２回繰返して行い、７２℃で３分間の最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持して、５５℃から９５℃まで融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を分析した。ＰＣＲが終了された後、各々の収得したアンフィレギュリンのＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）値はＧＡＰＤＨ遺伝子を通じて正規化されたｍＲＮＡ値（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、ＮＦ）を計算して補正されたアンフィレギュリンのＣｔ値を求めた後、形質注入の物質だけ処理された実験群を対照群にしてΔＣｔ値の差を求めた。上記のΔＣｔ値と計算式２（−ΔＣｔ）×１００を用いて配列番号２、６ないし９、１１、１７ないし２１、２３、２４、２８及び２９を各々のセンス鎖として有するアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡによるｍＲＮＡの発現量の変化を相対定量した。  
【００８０】
高効率のｓｉＲＮＡを選別するためにｓｉＲＮＡを処理した後ターゲット遺伝子の発現が５０％抑制される値であるＩＣ５０を確認するために最終濃度５ｎＭの濃度でアンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現量が対照群と対比して最も大きな発現量の減少を示す配列番号８、９及び２８を各々のセンス鎖として有するｓｉＲＮＡの３種を選別した。
【００８１】
実施例４。繊維母細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株で選別されたｓｉＲＮＡを用いたアンフィレギュリンの発現抑制
上記の実施例３で選別された配列番号８、９及び２８を各々のセンス鎖として有するｓｉＲＮＡを用いて繊維雅細胞株であるマウスの繊維母細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）を形質転換させて、上記の形質転換された繊維母細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株でアンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現様相を分析してｓｉＲＮＡのＩＣ５０値を確認した。
【００８２】
４−１：繊維母細胞の細胞株の培養
アメリカ合衆国種菌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から入手したマウスの繊維母細胞の細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）をＲＰＭＩ−１６４０培養培地（ＧＩＢＣＯ／  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＳＡ、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【００８３】
４−２：繊維母細胞の細胞株で目標ｓｉＲＮＡの形質注入
上記の実施例２−１で培養された１×１０５繊維母細胞の細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）  ＣＯ２の条件下で１２−ウェルプレートで１８時間の間ＲＰＭＩ  １６４０で培養した後、培地を除去した後各のウェル当たり５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、米国）を分注した。
【００８４】
一方、リポフェクタミン２０００（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM  ２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）  ２μｌと  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４８μｌを混合して混合液を製造し、室温で５分間反応させた後、上記の実施例３で選別された配列番号８、９及び２８を各々のセンス鎖として有するｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ／μｌ）０．２、１、５μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４９．８、２４９、２４５μｌに添加して最終濃度が０．２、１、５ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。上記のリポフェクタミン２０００（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM  ２０００）混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で２０分間反応させて形質注入用の溶液を製造した。
【００８５】
その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各のウェルに形質注入用の溶液を各々５００μｌずつ分注して６時間の間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。ここに  ＲＰＭＩ  １６４０培養培地１ｍｌずつ分注した後２４時間の間３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【００８６】
４−３：アンフィレギュリンのｍＲＮＡの定量分析
上記の実施例４−２で形質注入された細胞株から全体のＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を用いてアンフィレギュリンの遺伝子のｍＲＮＡの発現量を相対定量した。
【００８７】
４−３−１：形質注入された細胞からＲＮＡの分離及びｃＤＮＡの製造
ＲＮＡ抽出キット（ＡｃｃｕＰｒｅｐ  Ｃｅｌｌ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ、ＢＩＯＮＥＥＲ、  韓国）を用いて、上記の実施例２−２で形質注入された細胞株全体のＲＮＡを  抽出して、抽出されたＲＮＡはＲＮＡ逆転写酵素  （ＡｃｃｕＰｏｗｅｒ      ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０，  Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）を用いて、下記のような方法でｃＤＮＡを製造し  た。具体的に、０．２５ｍｌのエッペンチューブに入っているＡｃｃｕＰｏｗｅｒ  ＣｙｃｌｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｐｒｅｍｉｘ／ｄＴ２０  （Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）に一つのチューブ当たり抽出された１μｇずつのＲＮＡを入れて総体積が２０μｌになるようにＤＥＰＣ（ｄｉｅｔｈｙｌ  ｐｙｒｏｃａｒｂｏｎａｔｅ）で処理された蒸留水を添加した。これを遺伝子増幅器（ＭｙＧｅｎｉｅTM  ９６  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）で３０℃で１分間ＲＮＡとプライマーを混成化して、５２℃で４分間ｃＤＮＡを製造する二つの過程を６回繰返した後、９５℃で５分間酵素を不活性化させて増幅反応を終了した。
【００８８】
４−３−２：アンフィレギュリンのｍＲＮＡの相対定量の分析
上記の実施例４−３−１で製造されたｃＤＮＡを鋳型にしてリアルタイムＰＣＲを通じてアンフィレギュリンのｍＲＮＡの相対的な量を下記のような方法で定量した。９６−ウェルプレートの各ウェルに上記の実施例４−３−１で製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈して、アンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現量の分析のために希釈されたｃＤＮＡ  ３μｌと２×ＧｒｅｅｎＳｔａｒTM  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１０μｌ、蒸留水６μｌ、アンフィレギュリンｑＰＣＲプライマーｒ（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ各々、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１μｌ入れ、混合液を作った。一方、アンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ、以下ＨＫ遺伝子）である  ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）を標準遺伝子とした。上記の混合液が入った９６−ウェルプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒTM９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて下記のような反応を行った；  ９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃で３０秒の変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒のアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒の延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｓｃａｎ）の四つの過程を４２回繰返して行い、７２℃で３分間の最終延長を遂行した後、５５℃で１分間温度を維持して、５５℃から９５℃まで融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を分析した。ＰＣＲが終了された後、各々の収得したアンフィレギュリンのＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）値はＧＡＰＤＨ遺伝子を通じて正規化されたｍＲＮＡ値（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、ＮＦ）を計算して補正されたアンフィレギュリンのＣｔ値を求めた後、形質注入の物質だけ処理された実験群を対照群にしてΔＣｔ値の差を求めた。上記のΔＣｔ値と計算式２（−ΔＣｔ）×１００を用いて各アンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡの濃度別の処理に従うｍＲＮＡの発現量の変化を相対定量した（図２参照）。
【００８９】
その結果、配列番号８、９及び２８を各々のセンス鎖として有するアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡのすべて０．２ｎＭの低濃度でも５０％以上のアンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現量の減少を示し非常に高効率でアンフィレギュリンの発現を阻害する効果を示したことを確認した。
【００９０】
実施例５：目標の塩基配列のデザイン及びｓｉＲＮＡの製造
人のアンフィレギュリンのｍＲＮＡの配列（ＮＭ＿００１６５７）でｓｉＲＮＡが結合できる目標の塩基配列（センス鎖）をデザインして、上記の目標の塩基配列の相補的な配列であるアンチセンス鎖のｓｉＲＮＡを製造した。まず、バイオニア（株）で開発された遺伝子のデザインプログラム（Ｔｕｒｂｏ  ｓｉ−Ｄｅｓｉｇｎｅｒ）を用いて、アンフィレギュリンのｍＲＮＡの配列（ＮＭ＿００１６５７）でｓｉＲＮＡが結合できる目標の塩基配列をデザインした。本発明のアンフィレギュリンのｓｉＲＮＡは１９個のヌクレオチドで構成されたセンス鎖とこれに相補的なアンチセンス鎖で構成された二重鎖の構造である。また、如何な遺伝子の発現を阻害しない配列のｓｉＲＮＡであるｓｉＣＯＮＴ（５’−ＣＵＵＡＣＧＣＵＧＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡ−３’をセンス鎖として有する）を製造した。上記のｓｉＲＮＡはβ−シアノエチルホスホラミダイト（β−ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を用いてＲＮＡの骨格構造を構成するホスホジエステル結合を連結して製造した（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１２：４５３９−４５５７，  １９８４）。具体的にＲＮＡ合成器（３８４  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ，  ＢＩＯＮＥＥＲ，韓国）を用いて、ヌクレオチドが付着された固形支持体の上で、遮断除去（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ）、結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）、酸化（ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）及びキャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）からなっている一連の過程を繰返して、望む長さのＲＮＡを含む反応物を収得した。上記の反応物をＤａｉｓｏ  ｇｅｌ  Ｃ１８（Ｄａｉｓｏ，  Ｊａｐａｎ）カラムが装着された  ＨＰＬＣ  ＬＣ９１８（Ｊａｐａｎ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，  Ｊａｐａｎ）でＲＮＡを分離及び精製してこれをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，  Ｊａｐａｎ）を用いて目標の塩基配列と符合するかを確認した。この後、センスとアンチセンスのＲＮＡ鎖を結合させて配列番号３１ないし２３０を各々のセンス鎖として有するｓｉＲＮＡ及びｓｉＣＯＮＴを製造した。
【００９１】
実施例６．人間の肺癌細胞の細胞株でｓｉＲＮＡを用いたアンフィレギュリンの発現抑制
上記の実施例５で製造された配列番号３１ないし２３０を各々のセンス鎖として有するｓｉＲＮＡを用いて人間の肺癌細胞の細胞株（Ａ５４９）を形質転換させて、上記の形質転換された細胞株でｓｉＲＮＡの処理に従うアンフィレギュリンの発現様相を分析した。
【００９２】
６−１：人間の肺癌細胞の細胞株の培養
アメリカ合衆国種菌協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、ＡＴＣＣ）から  入手した人間の肺癌細胞（Ａ５４９）の細胞株はＤＭＥＭ培養培地（ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、  ＵＳＡ、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌ及びストレプトマイシン  １００μｇ／ｍｌ）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。
【００９３】
６−２：人間の肺癌細胞の細胞株で目標ｓｉＲＮＡの形質注入
上記の実施例５−１で培養された１．２×１０５繊維母細胞（ＮＩＨ３Ｔ３）の細胞株を３７℃で５％（ｖ／ｖ）  ＣＯ２の条件下で６−ウェルプレートで１８時間の間ＤＭＥＭで培養した後、培地を除去した後各ウェル（ｗｅｌｌ）当たり５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、米国）を分注した。        
【００９４】
一方、リポフェクタミンＲＮＡｉマックス（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅTM  ＲＮＡｉ  Ｍａｘ、  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、  ＵＳＡ）  ３．５μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２４６．５μｌを混合して混合液を製造し、室温で５分間反応させた後、上記の実施例１で製造した配列番号３１ないし５０番の配列をセンス鎖として有するｓｉＲＮＡ（１ｐｍｏｌｅ／μｌ）５または２０μｌをＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地２３０μｌに添加して最終濃度が２０ｎＭであるｓｉＲＮＡ溶液を製造した。上記のリポフェクタミンＲＮＡｉマックス混合液とｓｉＲＮＡ溶液を混合して室温で１５分間反応させて形質注入用の溶液を製造した。
【００９５】
その後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各ウェル（ｗｅｌｌ）に形質注入用の溶液を各々５００μｌずつ分注して６時間の間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。ここに  ＲＰＭＩ  １６４０培養培地１ｍｌずつ分注した後２４時間の間３７℃で５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件下で培養した。      
【００９６】
６−３：アンフィレギュリンのｍＲＮＡの定量分析
上記の実施例６−２で形質注入された細胞株から上記の実施例２−３−１と同一な方法で全体のＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを製造した後、リアルタイムＰＣＲ（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を用いてアンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現量を相対定量した。
【００９７】
６−３−１：アンフィレギュリンのｍＲＮＡの相対定量の分析
上記の実施例６−２で形質注入された細胞株から上記の実施例２−３−１と同一な方法で製造されたｃＤＮＡを鋳型にしてリアルタイムＰＣＲを通じてアンフィレギュリンのｍＲＮＡの相対的な量を下記のような方法で定量した。９６−ウェルプレートの各ウェルに製造されたｃＤＮＡを蒸留水で５倍希釈して、アンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現量の分析のために希釈されたｃＤＮＡ  ３μｌと２×ＧｒｅｅｎＳｔａｒTM  ＰＣＲ  ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１０μｌ、蒸留水６μｌ、人間アンフィレギュリンｑＰＣＲプライマー（ｈＡＲＥＧ−Ｆ，  ＡＣＡＣＣＴＡＣＴＣＴＧＧＧＡＡＧＣＧＴ；  ｈＡＲＥＧ−Ｒ，  ＧＣＣＡＧＧＴＡＴＴＴＧＴＧＧＴＴＣＧＴ  １０ｐｍｏｌｅ／μｌ  各々、ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を１μｌ入れ、混合液を作った。一方、アンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現量を正規化するためにハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ  ｇｅｎｅ、以下ＨＫ遺伝子）である  ＧＡＰＤＨ（Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ  ３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；  ｈＧＡＰＤＨ−Ｆ，  ＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧ；  ｈＧＡＰＤＨ−Ｒ，  ＡＣＣＡＴＧＴＡＧＴＴＧＡＧＧＴＣＡＡＴＧＡＡＧＧ）を標準遺伝子とした。上記の混合液が入った９６−ウェルプレートをＥｘｉｃｙｃｌｅｒTM９６  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＩＯＮＥＥＲ、韓国）を用いて下記のような反応を行った；  ９５℃で１５分間反応して酵素の活性化及びｃＤＮＡの二次構造をなくした後、９４℃で３０秒の変性（ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ）、５８℃で３０秒のアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）、７２℃で３０秒の延長（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）、ＳＹＢＲグリーンスキャン（ＳＹＢＲ  ｇｒｅｅｎ  ｓｃａｎ）の四つの過程を４２回繰返して行い、７２℃で３分間の最終延長を行った後、５５℃で１分間温度を維持して、５５℃から９５℃まで融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を分析した。ＰＣＲが終了された後、各々の収得したアンフィレギュリンのＣｔ（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｃｙｃｌｅ）値はＧＡＰＤＨ遺伝子を通じて正規化されたｍＲＮＡ値（ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ、ＮＦ）を計算して補正されたアンフィレギュリンのＣｔ値を求めた後、アンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡが処理されてない細胞株の発現量を対照群にしてΔＣｔ値の差を求めた。上記のΔＣｔ値と計算式２（−ΔＣｔ）×１００を用いて配列番号３１ないし５０の配列をセンス鎖として有するアンフィレギュリンに特異的なアンフィレギュリンｓｉＲＮＡの処理に従うアンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現量を相対定量した（図３参照）。上記のアンフィレギュリンのｓｉＲＮＡの殆どがアンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現を抑制したが、対照群に比べアンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現量が大きく減少することが確認できた。その中でも特に配列番号３９ないし４１、４３ないし４５、４７、４９及び５０で選択されたどの一つの配列をセンス鎖として有するｓｉＲＮＡが最も優秀なアンフィレギュリンのｍＲＮＡの発現の阻害能力を示した。
【００９８】
また、配列番号５１ないし２３０番に従う配列を各々のセンス鎖として有するｓｉＲＮＡを用いた場合でも配列番号３１ないし５０番に記載された配列と類似にとても効率的にアンフィレギュリンの発現が抑制できるということを確認した。
【００９９】
産業上の利用可能性
本発明に従うアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴＲＮＡはアンフィレギュリンの発現を非常に効率的に抑制することができて、本発明に従うアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴＲＮＡ、これを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体、及び／または上記の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体で構成されたナノ粒子を含む組成物は呼吸器疾患の予防または治療に有用に使用できる。
【０１００】
以上で、本発明の内容の特定な部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を持っている者において、このような具体的な記述は単に望ましい実施の様態だけで、これにより本発明の範囲が制限されることではない点は明白なことである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項らとそれらの等価物によって定義されることである。
【図１】
2015532100.tif 000007
【図２】
2015532100.tif 000008
【図３】
2015532100.tif 000009
【配列表】
2015532100000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年5月26日(2015.5.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜２３０で選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は１９〜３１個のヌクレオチドからなることを特徴とする請求項１に記載のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。  
【請求項３】
配列番号８、９、２８、３９〜４１、４３〜４５、４７、４９及び５０からなる群より選択されるいずれか一つの配列を含むセンス鎖とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含む請求項１に記載のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は一つ以上の化学的な変形を含むことを特徴とする請求項１〜３の中いずれか一項に記載のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。  
【請求項５】
前記化学的な変形はヌクレオチド内の糖構造の２´炭素位置で−ＯＨ基が-ＣＨ３（メチル）、−ＯＣＨ３（ｍｅｔｈｏｘｙ）、−ＮＨ２、−Ｆ（フッ素）、−Ｏ−２−メトキシエチル−Ｏ−プロピル、−Ｏ−２−メチルチオエチル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ）、−Ｏ−３−アミノプロピル、−Ｏ−３−ジメチルアミノプロピル、−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミドまたは−Ｏ−ジメチルアミドオキシエチルへの置換；
ヌクレオチド内の糖構造内の酸素が硫黄に置換された変形；
ヌクレオチド結合のホスホロチオエートまたはボラノリン酸、メチルホスホン酸ｔｅ）結合への変形；
ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）またはＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）形態への変形で選択された一つ以上の変形；
から選択される一つ以上の変形であることを特徴とする請求項４に記載のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５‘末端に一つ以上の燐酸基が結合されていることを特徴とする請求項１〜５の中いずれか一項に記載のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
次の構造式（１）の構造を含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体：
Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ      構造式（１）
上記の構造式（１）でＡは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹは各々の独立的に単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味し、Ｒはアンフィレギュリンに特異的ｓｉＲＮＡを意味する。
【請求項８】
次の構造式（２）の構造を含む請求項７に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体：
【化３】
2015532100.tif 000010
上記の構造式（２）でＳ及びＡＳは各々請求項７によるｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を意味し、Ａ，Ｂ，Ｘ及びＹは請求項７の正義と同じである。
【請求項９】
次の構造式（３）の構造を含む請求項８に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体：
【化４】
2015532100.tif 000011
上記の構造式（３）でＡ，Ｂ，Ｘ、Ｙ、Ｓ及びＡＳは請求項８の正義と同じで、５‘及び３’はｓｉＲＮＡのセンス鎖の５‘末端及び３’末端を意味する。
【請求項１０】
前記アンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡは請求項１〜６の中いずれか一項によるｓｉＲＮＡであることを特徴とする請求項７〜９の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１１】
前記親水性物質の分子量は２００〜１０，０００であることを特徴とする請求項７〜１０の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１２】
前記親水性物質はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンからなる群より選択されるいずれか一つであることを特徴とする請求項１１に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１３】
前記疎水性物質の分子量は２５０〜１，０００であることを特徴とする請求項７〜１０の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１４】
前記疎水性物質はステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質及びリポポリアミンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１３に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１５】
前記ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）の誘導体はコレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コレスタニルホルマート及びコレスタニルアミンからなる群より選択されることを特徴とする請求項１４に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１６】
前記グリセリドの誘導体はモノ−、ジ−及びトリ−グリセリドから選択されることを特徴とする請求項１４に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１７】
前記Ｘ及びＹで表す共有結合は非分解性または分解性結合であることを特徴とする  請求項７〜１６の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１８】
前記非分解性結合はアミド結合または燐酸化結合であることを特徴とする請求項１７に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項１９】
前記分解性結合はジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とする請求項１７に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
【請求項２０】
請求項７〜１９の中いずれか一項による二重鎖オリゴＲＮＡの構造体を含むナノ粒子。
【請求項２１】
互いに違う配列を含むｓｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体が混合されて構成されることを特徴とする請求項２０に記載のナノ粒子。
【請求項２２】
請求項１〜６の中いずれか一項によるｓｉＲＮＡ、請求項７〜１９の中いずれか一項による二重鎖オリゴＲＮＡの構造体または、請求項２０〜２１の中いずれか一項によるナノ粒子を有効成分として含む薬学的な組成物。
【請求項２３】
呼吸器疾患の予防または治療のための請求項２２に記載の薬学的な組成物。
【請求項２４】
前記呼吸器疾患は慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺繊維症（ＩＰＦ）、  喘息、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、へんとう炎または喉頭炎の中選択されることを特徴とする請求項２３に記載の薬学的な組成物。
【請求項２５】
請求項２２〜２４の中いずれか一項による組成物を含む凍結乾燥された形態の製剤。
【請求項２６】
呼吸器疾患の予防または治療のための医薬の調製における、請求項１〜６の中いずれか一項に記載のアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴＲＮＡ、請求項７〜１９の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体、請求項２０もしくは２１に記載のナノ粒子、または請求項２２〜２５の中いずれか一項に記載の組成物もしくは製剤の使用。
【請求項２７】
前記呼吸器疾患は慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺繊維症（ＩＰＦ）、喘息、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、へんとう炎または喉頭炎の中選択される疾患であることを特徴とする請求項２６に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
本発明のまた別の目的は上記のアンフィレギュリンに特異的な二重鎖オリゴＲＮＡ、またはそのような二重鎖オリゴＲＮＡを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体を用いて呼吸器の疾患、特にＣＯＰＤ及び／またはＩＰＦの予防または治療する方法を提供することである。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）  配列番号１〜２３０で選択されたいずれか一つの配列を含むセンス鎖（ｓｅｎｓｅ  ｓｔｒａｎｄ）とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含むアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。
（項目２）  前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は１９〜３１個のヌクレオチドからなることを特徴とする項目１に記載のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。  
（項目３）  配列番号８、９、２８、３９〜４１、４３〜４５、４７、４９及び５０からなる群より選択されるいずれか一つの配列を含むセンス鎖とそれに相補的な配列を含むアンチセンス鎖を含む項目１に記載のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。
（項目４）  前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖は一つ以上の化学的な変形を含むことを特徴とする項目１〜３の中いずれか一項に記載のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。  
（項目５）  前記化学的な変形はヌクレオチド内の糖構造の２´炭素位置で−ＯＨ基が-ＣＨ３（メチル）、−ＯＣＨ３（ｍｅｔｈｏｘｙ）、−ＮＨ２、−Ｆ（フッ素）、−Ｏ−２−メトキシエチル−Ｏ−プロピル、−Ｏ−２−メチルチオエチル（ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｅｔｈｙｌ）、−Ｏ−３−アミノプロピル、−Ｏ−３−ジメチルアミノプロピル、−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミドまたは−Ｏ−ジメチルアミドオキシエチルへの置換；
ヌクレオチド内の糖構造内の酸素が硫黄に置換された変形；
ヌクレオチド結合のホスホロチオエートまたはボラノリン酸、メチルホスホン酸ｔｅ）結合への変形；
ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）またはＵＮＡ（ｕｎｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）形態への変形で選択された一つ以上の変形；
から選択される一つ以上の変形であることを特徴とする項目４に記載のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。
（項目６）  前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５‘末端に一つ以上の燐酸基が結合されていることを特徴とする項目１〜５の中いずれか一項に記載のアンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡ。
（項目７）  次の構造式（１）の構造を含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体：
Ａ−Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｂ      構造式（１）
上記の構造式（１）でＡは親水性物質、Ｂは疎水性物質、Ｘ及びＹは各々の独立的に単純共有結合またはリンカーが媒介された共有結合を意味し、Ｒはアンフィレギュリンに特異的ｓｉＲＮＡを意味する。
（項目８）  次の構造式（２）の構造を含む項目７に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体：
【化３】
2015532100.tif 000012
上記の構造式（２）でＳ及びＡＳは各々項目７によるｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を意味し、Ａ，Ｂ，Ｘ及びＹは項目７の正義と同じである。
（項目９）  次の構造式（３）の構造を含む項目８に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体：
【化４】
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上記の構造式（３）でＡ，Ｂ，Ｘ、Ｙ、Ｓ及びＡＳは項目８の正義と同じで、５‘及び３’はｓｉＲＮＡのセンス鎖の５‘末端及び３’末端を意味する。
（項目１０）  前記アンフィレギュリンに特異的なｓｉＲＮＡは項目１〜６の中いずれか一項によるｓｉＲＮＡであることを特徴とする項目７〜９の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
（項目１１）  前記親水性物質の分子量は２００〜１０，０００であることを特徴とする項目７〜１０の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
（項目１２）  前記親水性物質はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンからなる群より選択されるいずれか一つであることを特徴とする項目１１に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
（項目１３）  前記疎水性物質の分子量は２５０〜１，０００であることを特徴とする項目７〜１０の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
（項目１４）  前記疎水性物質はステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ１２〜Ｃ５０の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質及びリポポリアミンからなる群より選択されることを特徴とする項目１３に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
（項目１５）  前記ステロイド（ｓｔｅｒｏｉｄ）の誘導体はコレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルマート、コレスタニルホルマート及びコレスタニルアミンからなる群より選択されることを特徴とする項目１４に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
（項目１６）  前記グリセリドの誘導体はモノ−、ジ−及びトリ−グリセリドから選択されることを特徴とする項目１４に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
（項目１７）  前記Ｘ及びＹで表す共有結合は非分解性または分解性結合であることを特徴とする  項目７〜１６の中いずれか一項に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
（項目１８）  前記非分解性結合はアミド結合または燐酸化結合であることを特徴とする項目１７に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
（項目１９）  前記分解性結合はジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合または酵素分解性結合であることを特徴とする項目１７に記載の二重鎖オリゴＲＮＡの構造体。
（項目２０）  項目７〜１９の中いずれか一項による二重鎖オリゴＲＮＡの構造体を含むナノ粒子。
（項目２１）  互いに違う配列を含むｓｉＲＮＡを含む二重鎖オリゴＲＮＡの構造体が混合されて構成されることを特徴とする項目２０に記載のナノ粒子。
（項目２２）  項目１〜６の中いずれか一項によるｓｉＲＮＡ、項目７〜１９の中いずれか一項による二重鎖オリゴＲＮＡの構造体または、項目２０〜２１の中いずれか一項によるナノ粒子を有効成分として含む薬学的な組成物。
（項目２３）  呼吸器疾患の予防または治療のための項目２２に記載の薬学的な組成物。
（項目２４）  前記呼吸器疾患は慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺繊維症（ＩＰＦ）、  喘息、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、細気管支炎、咽喉炎、へんとう炎または喉頭炎の中選択されることを特徴とする項目２３に記載の薬学的な組成物。
（項目２５）  項目２２〜２４の中いずれか一項による組成物を含む凍結乾燥された形態の製剤。
（項目２６）  項目１〜６の中いずれか一項によるｓｉＲＮＡ、項目７〜１９の中いずれか一項による二重鎖オリゴＲＮＡの構造体または、項目２０〜２１の中いずれか一項によるナノ粒子または項目２２〜２５の中いずれか一項による組成物または製剤を予防または治療を要する個体に投与することを特徴とする呼吸器疾患の予防または治療方法。
（項目２７）  前記呼吸器疾患は慢性閉鎖性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺繊維症（ＩＰＦ）、喘息、急慢性気管支炎、アレルギー鼻炎、鎮咳去痰、気管支炎、  細気管支炎、咽喉炎、へんとう炎または喉頭炎の中選択される疾患であることを特徴とする項目２６に記載の呼吸器疾患の予防または治療方法。
【国際調査報告】
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