(57)【要約】  【解決手段】  肺表面活性物質機能障害の治療のための、メチル−β−シクロデキストリンのようなコレステロール捕捉剤の使用を開示する。肺表面活性物質への酸化的損傷が活性酸素種とコレステロールとの間の相互作用に起因し生じることを発見した。このように、肺表面活性物質からコレステロール捕捉剤の添加を用いてコレステロールを除去することにより、表面活性物質への酸化的損傷は、軽減される。メチル−β−シクロデキストリンが通常の機能を、嚢胞性線維症および非嚢胞性線維症細気管支炎に罹患する小児の肺から機能不全の表面活性物質が除去され、回復することが可能であることがまた示された。  【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺表面活性物質への酸化的損傷に起因する肺表面活性物質機能障害を有する患者を治療する方法であって、
前記表面活性物質を酸化的分解反応の悪影響から保護するために、コレステロール捕捉剤の表面活性物質保護量を前記患者に投与する工程
を有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記患者は、ショック性、細菌性、ウイルス性および院内性の肺炎、人工呼吸器により誘発された肺損傷（ＶＩＬＩ）、誤嚥、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、または毒性ガス、蒸気、煙霧および微粒子の吸入を含む原因による急性肺損傷（ＡＬＩ）または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）を患っている方法。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、前記患者は、喘息、嚢胞性線維症（ＣＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、または毒性ガス、蒸気、煙霧および微粒子の吸入、治療に対し反応を示さない乳児呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）、またはニーマンピック病を含む気道損傷を患っている方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記コレステロール捕捉剤はシクロデキストリンまたはその誘導体である方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記シクロデキストリンはメチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）またはその誘導体である方法。
【請求項６】
請求項４記載の方法において、前記シクロデキストリンは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンまたはその誘導体である方法。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、前記酸化的損傷は活性酸素種（ＲＯＳ）またはそれら誘導体の存在に起因するものである方法。
【請求項８】
請求項７記載の方法において、前記ＲＯＳは過酸化物またはヒドロキシルラジカルである方法。
【請求項９】
請求項７記載の方法において、前記ＲＯＳの誘導体はペルオキシ亜硝酸である方法。
【請求項１０】
肺表面活性物質への酸化的損傷を軽減する方法であって、
表面活性物質保護量のコレステロール捕捉剤を前記表面活性物質に添加する工程
を有する方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の方法において、前記コレステロール捕捉剤はシクロデキストリンまたはその誘導体である方法。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法において、前記シクロデキストリンはメチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）またはその誘導体である方法。
【請求項１３】
請求項１１記載の方法において、前記シクロデキストリンは２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンまたはその誘導体である方法。
【請求項１４】
表面活性物質を強化する方法であって、
患者に投与される場合に表面活性物質の能力が強化されるように、コレステロールを捕捉するように構成される表面活性物質強化剤を前記表面活性物質に添加する工程
を有する方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記表面活性物質は、酸化の影響から当該表面活性物質を保護することで強化されるものである方法。
【請求項１６】
請求項１４記載の方法において、前記表面活性物質は不飽和リン脂質を有し、前記表面活性物質は酸化の影響から前記不飽和リン脂質を保護することで強化されるものである方法。
【請求項１７】
請求項１４記載の方法において、前記表面活性物質強化剤はシクロデキストリンまたはその誘導体である方法。
【請求項１８】
請求項１４記載の方法において、前記表面活性物質強化剤はメチルβ−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）またはその誘導体である方法。
【請求項１９】
請求項１４記載の方法において、前記表面活性物質強化剤は２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンまたはその誘導体である方法。
【請求項２０】
請求項１４記載の方法において、前記表面活性物質の表面張力は、強化前の当該表面活性物質と比較して、前記表面活性物質強化剤と結合した場合に減少するものである方法。
【請求項２１】
請求項１４記載の方法において、前記表面活性物質強化剤は脂質またはコレステロールを水溶液に溶解するものである方法。
【請求項２２】
呼吸窮迫症候群を有する患者を治療する方法であって、
多価不飽和リン脂質と、当該多価不飽和リン脂質が酸化した場合に当該多価不飽和リン脂質からコレステロールを捕捉するのに十分な量のコレステロール捕捉剤とを有する治療的に有効な量の肺表面活性物質を有する組成物を患者に投与する工程
を有する方法。
【請求項２３】
請求項２２記載の方法において、前記表面活性物質強化剤はシクロデキストリンまたはその誘導体である方法。
【請求項２４】
請求項２２記載の方法において、前記表面活性物質強化剤はメチルβ−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）またはその誘導体である方法。
【請求項２５】
請求項２２記載の方法において、前記表面活性物質強化剤は２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンまたはその誘導体である方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、表面活性物質、特に肺表面活性物質を強化する方法、ならびに表面活性物質強化剤、特に肺表面活性物質強化剤を生産する方法に関するものである。本発明はまた、表面活性物質強化剤および表面活性物質、特に肺表面活性物質を強化するための強化剤の使用に関するものである。さらに、本発明は、シクロデキストリンのようなコレステロール捕捉剤を添加することにより肺表面活性物質への酸化的損傷を軽減する方法に関するものである。最後に、酸化的分解反応の悪影響から表面活性物質を保護するために表面活性物質保護量のコレステロール捕捉剤を投与することにより肺表面活性物質への酸化的損傷に起因する表面活性物質機能障害を有する患者を治療するための方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
肺表面活性物質は肺の呼吸器系の内側を覆っている表面活性物質であることが知られている。ＩＩ型肺胞上皮細胞  は表面活性物質を産生し、層状体としてそれを保存し、肺胞液相で最後にそれを発現する。そこから、それは空気／水境界面上の分子薄膜として拡散する。それは、呼吸周期において、境界面の表面張力を境界面のその時点での張力に動的に順応することにより、その影響を示す。
【０００３】
肺表面活性物質は呼気終末に肺胞虚脱および肺胞洪水を予防し、抹消気道の開存性を提供し、呼吸に要する労力を軽減する。肺表面活性物質は、不飽和化されるジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を多く含んだ（〜３０〜４５％）、８０〜９０（重量）％のリン脂質から成る。表面活性物質はまた、全リン脂質の多価不飽和種が１０％以上である報告されたレベルで、５０〜６０％の不飽和リン脂質を含む。表面活性物質はまた４つの表面活性物質関連のタンパク質−ＳＰ−Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤを含む。肺表面活性物質の極めて高い界面活性状態は、大きな凝集体画分を指し、疎水性タンパク質ＳＰＢおよびＳＰＣに富む。中性脂肪、主にコレステロールは、表面活性物質の残りの２〜１０％を作り出す。
【０００４】
１９５９年に、早産児の肺における肺表面活性物質の欠乏が呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）の原因となることが示され、当時は早産児の最も多い死因であった。過去約１５年間、ウシまたはブタの肺からの抽出物が、ＲＤＳを治療する薬剤として用いられてきた。動物製剤は高価であり、感染症を伝播する危険性を伴う。
【０００５】
表面活性物質は、グリセロリン脂質、特定のタンパク質、中性脂肪およびコレステロールから成る。表面活性物質は肺胞表面を覆い、表面張力を減少させ、そのため、生後、肺胞は呼気の間、人体において虚脱することはない。
【０００６】
表面活性物質の不十分な機能は呼吸不全の原因となる可能性があり、早産児および新生児における乳児呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）として、または成人における成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）として知られている。これらの肺の疾患は表面活性物質欠乏の結果であり、肺胞の虚脱後の肺の拡張不全（無気肺）を引き起こす。
【０００７】
肺表面活性物質は、９０％の脂質および１０％のタンパク質から成る。表面活性物質特異的タンパク質と脂質との間の協調が完全な機能的呼吸プロセスに必要であるが、脂質は極めて重要な表面張力の減少に不可欠である。
【０００８】
肺表面活性物質の機能および肺感染症および肺疾患によるそれらの阻害された機能は、多数の出版物において記述された。これに関する参照は出版物によってなされる。
【０００９】
Ｔ．Ｒ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ａｃｕｔｅ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｄｉｓｔｒｅｓｓ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ（ＡＲＤＳ）：ａ  ｑｕｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂａｌａｎｃｅ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．３（１９９７），ｐｐ．２７２．
Ａｒｔｉｇａｓ，Ｇ．Ｒ．Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｊ．Ｃａｄｅｔ，Ｄ．Ｄｒｅｙｆｕｓｓ，Ｌ．Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  ＡＲＤＳ，ｐａｒｔ  ２：ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒｙ，ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ，ｓｕｐｐｏｒｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，ｓｔｕｄｙ  ｄｅｓｉｇｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，  ａｎｄ  ｉｓｓｕｅｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ．Ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５７（Ｐｔ１）（１９９８），ｐｐ．１３３２．
Ｇ．Ｒ．Ｂｅｒｎａｒｄ，Ａ，Ａｒｔｉｇａｓ，Ｋ．Ｌ．Ｂｒｉｇｈａｍ，Ｊ．Ｃａｒｌｅｔ，Ｋ．Ｆａｌｋｅ，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ−Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  ＡＲＤＳ：ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎｓ，ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｒｅｌｅｖａｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ，ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１４９（１９９４），ｐｐ．８１８．
Ａ．Ｂ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｍ．Ａ．Ｓｔａｇｅｒ，Ｃ．Ｊ．Ｃａｒｒｉｃｏ，Ｅ．Ｄ．Ｈｕｄｓｏｎ，Ｃａｕｓｅｓ  ｏｆ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ，Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１３２（１９８５），ｐｐ．４８５．
Ｇ．Ｋａｒａｇｉｏｒｇａ，Ｇ．Ｎａｋｏｓ，Ｅ．Ｇａｌｉａｔｓｏｕ，Ｍ．Ｅ．Ｌｅｋｋａ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｏｆ  ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ  ｉｎ  ｆａｔ  ｅｍｂｏｌｉｓｍ，Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３２（２００６），ｐｐ．１１６−１２３．
Ｌ．Ｄ．Ｈｕｄｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ＡＲＤＳ，Ｃｈｅｓｔ  １１６（１９９９），ｐｐ．７４Ｓ．
Ｇ．Ｄｅｖｅｎｄｒａ，Ｒ．Ｇ．Ｓｐｒａｇｇ，Ｌｕｎｇ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｎ  ｓｕｂａｃｕｔｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ，Ｒｅｓｐｉｒ．Ｒｅｓ．３（２００２），ｐｐ．１９．
Ｍ，Ｇｒｉｅｓｅ，Ｒ．Ｅｓｓｌ，Ｒ．Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｅ．Ｒｉｅｔｓｃｈｅｌ，Ｆ．Ｒａｔｊｅｎ，Ｍ．Ｂａｌｌｍａｎｎ，Ｋ．Ｐａｕｌ，Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ，ｌｕｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｅｎｄｏｂｒｏｎｃｈｉａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ａｎｄ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７０（２００４），ｐｐ．１０００−１００５．
Ｍ．Ｇｒｉｅｓｅ，Ｌ．Ｆｅｌｂｅｒ，Ｋ．Ｒｅｉｔｅｒ，Ｒ．Ｓｔｒｏｎｇ，Ｋ．Ｒｅｉｄ，Ｂ．Ｈ．Ｂｅｌｏｈｒａｄｓｋｙ，Ｇ．Ｊａｇｅｒ，Ｔ．Ｎｉｃｏｌａｉ，Ａｉｒｗａｙ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｔｒａｃｈｅｏｓｔｏｍｙ，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｐｕｌｍｏｎｏｌ．３７（２００４），ｐｐ．３５６−３６１
Ｂａｃｈｏｆｅｎ  Ｈ  &  Ｓｃｈｔｉｒｃｈ  Ｓ（２００１）Ａｌｖｅｏｌａｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｏｒｃｅｓ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｐａｒｔ  Ａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  &  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２９：１８３−１９３．
Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  Ｊ（１９６２）Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｈｅｎｏｍｅｎａ  ｉｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｓｔ  ５：１１．
Ｙｕ  Ｓ，Ｈａｒｄｉｎｇ  ＰＧ，Ｓｍｉｔｈ  Ｎ  &  Ｐｏｓｓｍａｙｅｒ  Ｆ（１９８３）Ｂｏｖｉｎｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｌｉｐｉｄｓ  １８：５２２−９．
Ｖｅｌｄｈｕｉｚｅｎ  Ｒ，Ｎａｇ  Ｋ，Ｏｒｇｅｉｇ  Ｓ  &  Ｐｏｓｓｍａｙｅｒ  Ｆ（１９９８）Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄｓ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  （ＢＢＡ）−Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ  １４０８：９０−１０８．
Ｙｕ  Ｓ，Ｈａｒｄｉｎｇ  ＰＧＲ，Ｓｍｉｔｈ  Ｎ  &  Ｐｏｓｓｍａｙｅｒ  Ｆ（１９８３）Ｂｏｖｉｎｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｌｉｐｉｄｓ  １８：５２２−５２９．
Ｐｏｓｔｌｅ  ＡＤ，Ｈｅｅｌｅｙ  ＥＬ  &  Ｗｉｌｔｏｎ  ＤＣ（２００１）Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｌｕｎｇ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｐａｒｔ  Ａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  &  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２９：６５−７３．
Ｐｏｓｓｍａｙｅｒ  Ｆ，Ｎａｇ  Ｋ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｋ，Ｑａｎｂａｒ  Ｒ  &  Ｓｃｈｕｒｃｈ  Ｓ（２００１）Ｓｕｒｆａｃｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ：  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ａ  Ｍｏｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １２９：２０９−２０．
【００１０】
肺表面活性物質は錯体膜を形成し、水和した空気／肺界面で気道における表面張力の減少において重要な役割に関与する、または役割を果たす。炎症性肺疾患では、肺胞および気道における肺表面活性物質の分子プロファイルは変化し、従って肺表面活性物質膜が表面張力を減少するために極めて効果的でないまたは効果がなくなり、それはガス交換のため利用可能な面積の著しい減少を伴う。
【００１１】
さらにまた、表面活性物質中の高濃度のコレステロールが表面活性物質機能障害の主な原因であることが知られている。これに関する参照はまた下記の出版物によってなされる。
【００１２】
Ｌ．Ｇｕｎａｓｅｋａｒａ，Ｓ．Ｓｃｈｕｒｃｈ，Ｗ．Ｍ．Ｓｃｈｏｅｌ，Ｋ．Ｎａｇ，  Ｚ．Ｌｅｏｎｅｎｋｏ，Ｍ．Ｈａｕｆｓ，Ｍ．Ａｍｉｅｉｎ，Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ａｂｏｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １７３７（２００５），２７−３５．
【００１３】
さらにまた、活性化白血球からの反応酸素種（ＲＯＳ）の放出、またはそれに続く環境汚染物質への曝露が、肺の内部で高度に酸化している環境をもたらす可能性があることが示された。反応酸素種およびそれらの副産物の増加した濃度は、数ある他の病態の中でも特に、ＡＲＤＳ、喘息、ＣＦ、人工呼吸器により誘発された肺損傷（ＶＩＬＩ）または慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を患った患者から集められる気管支肺胞洗浄液から検出された。いくつかの研究は様々な肺表面活性物質の酸化が、インビトロおよびインビボでの機能を非常に阻害することを示し、ＳＰ−ＢおよびＳＰ−Ｃにおいて、これまで主に感受性残留物の酸化変化によるものとされたのに対して、リン脂質の過酸化および加水分解はさほど需要ではないものと考えられた。これに関する参照はまた下記の出版物によってなされる。
【００１４】
Ｋ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃａｐｏｔｅ，Ｄ．Ｍａｎｚａｎａｒｅｓ，Ｔ．Ｈａｉｎｅｓ，Ｆ．Ｐｏｓｓｍａｙｅｒ，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＳＰ−Ｂ  ａｎｄ  ＳＰ−Ｃ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ９０（２００６），２８０８．
Ｓ．Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，Ａ．Ｋｈｅｉｔｅｒ，Ｔ．Ａ．Ｍｅｒｒｉｔｔ，Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ，Ｌｕｎｇ  １７７（１９９９），１７９．
Ｌ．Ｍａｒｋ，Ｅ．Ｐ．Ｉｎｇｅｎｉｔｏ，Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｍｅｔａｌｓ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．−ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７６（１９９９），Ｌ４９１．
Ｎ．Ｇｉｌｌｉａｒｄ，Ｇ．Ｐ．Ｈｅｌｄｔ，Ｊ．Ｌｏｒｅｄｏ，Ｈ．Ｇａｓｓｅｒ，Ｈ．Ｒｅｄｌ，Ｔ．Ａ．Ｍｅｒｒｉｔｔ，Ｒ．Ｇ．Ｓｐｒａｇｇ，Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｌｕｎｇ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｔｏ  ｏｘｉｄａｎｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｌｔｅｒｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ９３（１９９４），２６０８．
Ｌａｎｇ  ＪＤ，ＭｃＡｒｄｌｅ  ＰＪ，Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ＰＪ  &  Ｍａｔａｌｏｎ  Ｓ（２００２）Ｏｘｉｄａｎｔ−ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｂａｌａｎｃｅ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ＊．Ｃｈｅｓｔ  １２２：３１４Ｓ−３２０Ｓ．
Ｃｉｅｎｃｅｗｉｃｋｉ  Ｊ，Ｔｒｉｖｅｄｉ  Ｓ  &  Ｋｌｅｅｂｅｒｇｅｒ  ＳＲ  （２００８）Ｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２２：４５６−４６８．
Ｌａｍｂ  ＮＪ，Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ  Ｊ，Ｂａｋｅｒ  Ｃ，Ｅｖａｎｓ  ＴＷ  &  Ｑｕｉｎｌａｎ  ＧＪ（１９９９）Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｄａｍａｇｅ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ，ｎｉｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈｌｏｒｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２７：１７３８．
Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  Ｓ，Ｋｈｅｉｔｅｒ  Ａ  &  Ｍｅｒｒｉｔｔ  Ｔ（１９９９）Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ．Ｌｕｎｇ  １７７：１７９−１８９．
Ｂａｉｌｅｙ  ＴＣ，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｔｉｄａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２９１：Ｌ７０３−Ｌ７０９．
Ｇｉｌｌｉａｒｄ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｌｕｎｇ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｔｏ  ｏｘｉｄａｎｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｌｔｅｒｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９３：２６０８．
Ｈａｄｄａｄ  ＩＹ，ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｔｏ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２６５：Ｌ５５５−Ｌ５６４．
Ｍａｒｋ  Ｌ  &  Ｉｎｇｅｎｉｔｏ  Ｅ（１９９９）Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｍｅｔａｌｓ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２７６：Ｌ４９１  −Ｌ５００．
Ｓｔｅｎｇｅｒ  ＰＣ，  ｅｔ  ａｌ（２００９）Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｓｍｏｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｌｕｎｇ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｆｉｌｍ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  １７８８：３５８−３７０．
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃａｐｏｔｅ  Ｋ，Ｍａｎｚａｎａｒｅｓ  Ｄ，Ｈａｉｎｅｓ  Ｔ  &  Ｐｏｓｓｍａｙｅｒ  Ｆ（２００６）Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＳＰ−Ｂ  ａｎｄ  ＳＰ−Ｃ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ９０：２８０８−２８２１．
Ｍａｎｚａｎａｒｅｓ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｂ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４６：５６０４−５６１５．
Ｋｅａｔｉｎｇ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ（２００７）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ９３：１３９１−１４０１．
【００１５】
本発明は、酸化誘導の表面活性物質機能障害に対するコレステロールの寄与に関して、これまで取り組まれていない問題について述べる。特に、本発明まで不明であった、表面活性物質に対する酸化変化が、表面活性物質の機能に悪影響を及ぼすことにコレステロールの正常または増加した濃度と相互作用するかどうかという問題である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明の１態様は、単純な方法で表面活性物質、例えばコレステロールにより阻害される機能障害を示す、特に肺表面活性物質を強化することに関するものであり、特に阻害された表面活性物質の表面張力は治療により改善する。
【００１７】
より詳しくは、表面活性物質を強化する方法が提供され、特に肺表面活性物質で、表面活性物質がコレステロール捕捉表面活性物質強化剤で強化されるという点で、さらに確立され、そこで投与される、コレステロールの表面活性物質に対する影響が減少または回復し、このようにまた表面活性物質の機能障害がコレステロールにより引き起こされるような、特に表面活性物質のコレステロールは表面活性物質強化剤により選択的に捕捉される。
【００１８】
別の態様において、活性酸素種（ＲＯＳ）およびそれらの誘導体への曝露に起因する表面活性物質機能障害を有する患者を治療する方法が、ＲＯＳによる酸化的損傷の悪影響から表面活性物質を保護するために表面活性物質保護量のコレステロール捕捉剤を患者に投与する工程を有し、提供される。ＲＯＳの例は、これに限定されるものではないが過酸化物およびヒドロキシルラジカルを含む。ＲＯＳ誘導体の１つの例はペルオキシ亜硝酸である。別の態様において、肺表面活性物質への酸化的損傷に起因する肺表面活性物質機能障害を有する患者を治療する方法が、酸化的分解反応の悪影響から表面活性物質を保護するために表面活性物質保護量のコレステロール捕捉剤を患者に投与する工程を有し、提供される。
【００１９】
またさらなる態様において、シクロデキストリンのようなコレステロール捕捉剤を添加することにより肺表面活性物質への酸化的損傷を軽減する方法が提供される。１実施態様において、多価不飽和リン脂質の酸化に起因する遊離基の損傷から表面活性物質を保護する工程が、表面活性物質保護量のコレステロール捕捉剤を表面活性物質に添加する工程を有し、提供される。
【００２０】
本明細書で用いたコレステロール捕捉剤の濃度で、酸化したコレステロール劣化表面活性物質は界面活性においてほとんど異常を示さなかったということが発見された。しかしながら、そのような表面活性物質が生理的濃度のコレステロールを含む場合、圧縮時に低い表面張力に達する能力、膨張と同時に再度広がる効果的な膜、および迅速な界面膜形成に関して重度の機能障害が観察される。表面活性物質酸化の多くの生化学影響の中で、脂質過酸化は、機能障害のために必要不可欠であった。ＲＯＳは、多くの炎症性肺疾患の一部である。これらのほとんどの場合、コレステロール値は増加しないまたは実質的に増加しない。したがって、ＲＯＳによるコレステロール依存的な表面活性物質機能障害の治療は、表面活性物質コレステロールの上昇の治療より非常に幅広い患者集団に適用可能である。
【００２１】
例えば、これに限定されるものではないが、本発明は、ショック性、細菌性、ウイルス性および院内性の肺炎、人工呼吸器により誘発された肺損傷（ＶＩＬＩ）、誤嚥、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）または毒性ガス、蒸気、煙霧および微粒子の吸入を含む原因からの急性肺損傷（ＡＬＩ）または急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）に苦しむ患者を治療するのに有用である可能性がある。また、本発明は、喘息、嚢胞性線維症（ＣＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）または毒性ガス、蒸気、煙霧および微粒子の吸入を含む気道損傷に苦しむ患者または治療に対し反応を示さない乳児呼吸窮迫症候群（ＩＲＤＳ）またはニーマンピック病患者において有用である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａは、０％（白色）、５％（灰色）、または１０％（黒色）のコレステロールを有する酸化ＢＬＥＳのサイクルにおいて、最小の表面張力を示す。このモデルシステムは、コレステロール非存在下において、酸化が通常の表面活性物質の機能に影響を及ぼさないことを示す。コレステロール存在下において機能は失われ、酸化表面活性物質により表面張力は高くなる。＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．０１。    図１Ｂは、ｏｘＢＬＥＳ＋１０％ｗ／ｗコレステロールコントロールバッファー（白色）または３０ｍＭのΜβＣＤを含むバッファー（黒色）の動的な圧縮拡張サイクルにおける最小（円）および最大（三角形）表面張力を示す。このように、酸化コレステロールを含有する表面活性物質はインビトロで機能不全であり、その機能はコレステロール捕捉剤により回復させることが可能である。
【図２】図２Ａは、ＣＦ患者のＢＡＬ溶液の肺胞マクロファージの光学マイクロ写真である（棒線＝１０μｍ）。多数の脂質を含むリソソームが細胞質の中に存在する。    図２Ｂは、表面活性物質の過剰な鬱滞が非運動性マクロファージおよび最終的に原形質膜の破裂を誘導すること示す。    図２Ｃは、表面活性物質テストを示す。ＣＦサンプルは機能的なコントロールと対比して高い表面張力（機能障害）を示す（結果はＣＢＳの連続的な拡張−圧縮サイクルの間に達する最小の表面張力で示される）。    図２Ｄは、ＭβＣＤがインビトロでＣＦ患者の表面活性物質機能を回復させることを示す。＊ｐ<０．０５、＊＊ｐ<０．０１。
【図３】図３Ａは、損傷したマウスでエラスタンスが増加し、酸素供給が減少したことを示す。    図３Ｂは、表面活性物質は無治療の損傷したマウスでは機能不全（最小表面張力>１０ｍＮ／ｍ）であるが、損傷したマウスがＭβＣＤ−エアゾールで治療がなされた場合は正常（最小張力<１０ｍＮ／ｍ）となること示す。    図３Ｃは、表面活性物質コレステロールが損傷したマウスで上昇しないこと示す。    図３Ｄは、損傷における好中球の顕著な流入を示す組織学的肺切片を示す。    図３Ｅは、損傷によりＩＩ型肺胞上皮細胞で増加した表面活性物質（膜包接）を示すＥＭ顕微鏡写真を示す。    従って、図３Ａ〜Ｅは、ＡＬＩの動物モデルの表面活性物質機能障害およびインビボでエアゾールとして投与されるコレステロール捕捉剤によるその回復を示す。
【図４】図４Ａは、ＢＬＥＳ＋１０％ｗ／ｗコレステロール、加えて２０％ｗ／ｗのｏｘＤＰＰＣ、ｏｘＰＯＰＣ、ｏｘＰＬＰＣ、ｏｘＤＰＰＧ、またはｏｘＣＬを含むＢＬＥＳを用いた動的なサイクル２０における、最小および最大の表面張力を示す。    示されるように、図４Ｂは、表面活性物質膜のラングミュア−等温線、左、蛍光顕微鏡写真（中央、５０μｍ×５０μｍ）およびＡＦＭトポグラフィー、右、（蛍光顕微鏡写真での輪郭線描写として、１５μｍ×１５μｍ）を示す。蛍光における黒色およびＡＦＭ画像における濃い栗色は脂質単分子層の領域を表し、同質の灰色または淡い栗色は脂質二分子層の領域を示す。酸化ＢＬＥＳの場合、主に通常の等温線は、脂質二分子層（それぞれ灰色および淡い栗色）の領域が散在した脂質単分子層（蛍光においては黒色、ＡＦＭでは濃い栗色）の大部分は通常の膜構造と一致する。等温線（矢印）で認められるいくつかの膜虚脱は、蛍光ではブライトスポットとして、ＡＦＭでは不規則な突起として見られる不規則な脂質ミセルと一致する。    図４Ｃは、コレステロールをまた含む酸化表面活性物質が等温線（矢印）で虚脱プラトーを示すことを示す。蛍光およびＡＦＭ解析において、二分子層領域は不十分であり、大きな脂質虚脱構造（白色）に富む。    このように、図４Ａ〜Ｃは、表面活性物質の中の多価不飽和リン脂質が前述の機能障害の原因となることを示す。それはまた、構造レベルで障害の機序を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明の文脈において、用語「脂質捕捉」または「コレステロール捕捉」は、脂質またはコレステロールが特にそれら機能不全の影響において表面活性物質から除去されるおよび／または表面活性物質のそれら影響で阻害されるおよび／または脂質および／またはコレステロールの前記の阻害作用を減少または逆にするために脂質を可溶性にする媒体として表面活性物質に対し作用することを意味することと理解される。表面活性物質のコレステロール値が増加した場合、表面活性物質機能障害が特に生じる。
【００２４】
捕捉表面活性物質強化剤の作用を利用して、表面活性物質におけるコレステロールの対応する正常濃度より増加したコレステロール含有量の結果としてコレステロールにより引き起こされる表面活性物質の機能障害を、少なくとも部分的に完全に逆に戻すことのみならず、少なくとも部分的に完全にないものにすることである。
【００２５】
本明細書で考慮される脂質捕捉またはコレステロール捕捉強化剤は、表面活性物質および／または肺表面活性物質において、特にシクロデキストリン、特にメチル−β−シクロデキストリンの作用または活性物質クラスと一致するそれらの媒体である。この方法により、例えば、コレステロールの表面活性物質に対する阻害効果は、弱化するまたは無くなる。
【００２６】
表面活性物質強化の本発明を利用し、特に内在性表面活性物質において、例えば、表面活性物質に対しコレステロールにより誘導される、またはコレステロール依存的な阻害効果が診断されることが可能であることはさらに可能性がある。それに加え、表面活性物質の特性はまた、表面活性物質強化剤により結果的に影響されるまたは修飾される可能性があり、それは、肺疾患、特に急性肺疾患および慢性肺疾患が治療されるのを可能にする。急性肺疾患の例は、急性肺損傷（ＡＬＩ）、ＡＲＤＳ、急性呼吸不全、肺炎、特に人工呼吸器により誘発された肺損傷、ＡＬＩおよび細気管支炎に関連する院内感染または全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）である。慢性肺疾患は、例えば、嚢胞性線維症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）およびニーマンピック病である。
【００２７】
コレステロール捕捉表面活性物質強化剤を用いることにより、表面活性物質はその表面活性の特性においてそれに応じて影響され、そのため、内在性の治療した肺表面活性物質の界面活性は、例えばキャプティブ気泡サーファクトメーターを用い例えば測定される事が可能である。
【００２８】
さらに、シクロデキストリンを含んでいる表面活性物質強化剤を用い、または作用において、シクロデキストリンを含有する表面活性物質強化薬剤またはシクロデキストリンの活性クラスと一致する表面活性物質強化剤を用いて、表面活性物質が強化されるという点で、方法は区別される。
【００２９】
さらにまた、実施形態は想定され、そこで表面活性物質強化剤の活性物質、メチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）またはシクロデキストリン、特に２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、または特に２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを有するシクロデキストリン誘導体、またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）または前記の物質または言及した物質の混合物に対応する誘導体または少なくとも脂質選択性および脂質非活性化物質または少なくとも脂質捕捉物質が用いられる。
【００３０】
特に、表面活性物質の表面張力は、非強化の表面活性物質と比較して、または強化する前の表面活性物質と比較して、表面活性物質強化剤により減少する。
【００３１】
それに加えて、実施形態において、表面活性物質のコレステロールが溶液、特に水溶液で表面活性物質強化剤により溶解および／または不動態化されることが想定される。このように、表面活性物質のコレステロールの阻害効果は、例えばその界面活性において、それに応じて治療される。それ故に、表面活性および／または表面活性物質の表面張力は、測定することが可能であり、強化の後で容易に診断することが可能である。
【００３２】
さらに、１実施形態では、表面活性物質強化剤が表面活性物質の特性、特に非強化表面活性物質に影響、特に阻害の影響を及ぼす、またはその特性を制限する表面活性物質のコレステロールを捕捉すると想定される。
【００３３】
それに加えて、対象物を表面活性物質強化剤、特に肺表面活性物質強化剤を生産する方法により溶解し、少なくとも一部の少なくともコレステロール選択制および少なくともコレステロールを捕捉する物質が表面活性物質強化剤と混合される可能性があるまたは混合されるという点においてさらに開発される。
【００３４】
望ましくは、少なくとも１つの物質が、表面活性物質の応用によって、表面活性物質強化剤と混合される可能性があるまたは混合され、望ましくは内在性表面活性物質、表面活性物質の特性において影響を及ぼすコレステロール、特に阻害するもの、特に非強化表面活性物質、またはその特性を制限するものが捕捉される。
【００３５】
さらにまた、本発明に従って、表面活性物質強化剤は、メチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）またはシクロデキストリン、特に２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンにより構成される活性物質、または特に２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを有するシクロデキストリン誘導体、またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）または前記の物質または言及した物質の混合物に対応する誘導体または少なくともコレステロール選択性およびコレステロール非活性化物質または少なくともコレステロール捕捉物質と混合される。
【００３６】
それに加えて、表面活性物質強化剤はまた、捕捉物質の前記の作用を失わずに他の材料および／または活性物質を含有することが可能であり、すなわち、この捕捉物質の影響は維持される可能性があるまたは維持される。  例えば、薬剤または医薬品としての投与において、別の表面活性物質、例えば外因的に働く表面活性物質を、表面活性物質強化剤に添加することが可能である。
【００３７】
さらにまた、対象物は表面活性物質強化剤により溶解され、少なくとも脂質選択性および脂質非活性化物質または少なくとも脂質を捕捉物質またはコレステロール捕捉物質が表面活性物質強化剤と混合される可能性または混合されるという少なくとも一部の点において、それはさらに開発される。
【００３８】
さらにまた、表面活性物質強化剤の使用、すなわち表面活性物質を強化する場合、その使用という点において、表面活性物質強化剤は区別され、活性物質としてメチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）またはシクロデキストリン、特に２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、または特に２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを有するシクロデキストリン誘導体、またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）または前記の物質または言及した物質の混合物に対応する誘導体または少なくともコレステロール選択性およびコレステロール非活性化物質または少なくともコレステロール捕捉物質を有する表面活性物質強化剤を用い、表面活性物質が強化される可能性があるまたは強化される。
【００３９】
特に、表面活性物質の表面張力は、非強化表面活性物質と比較して、または強化前の表面活性物質と比較して、表面活性物質強化剤の使用により減少する可能性があるまたは減少する。
【００４０】
望ましくは、表面活性物質のコレステロールは、溶液中、特に水溶液中で、表面活性物質強化剤により溶解および／または不動態化される。
【００４１】
それに加えて、表面活性物質強化剤を用い、表面活性物質、特に非強化表面活性物質の特性に影響、特に阻害の影響を及ぼす、またはその特性を制限する、特に内在性表面活性物質のコレステロールが表面活性物質強化剤により捕捉される可能性があるまたは捕捉されるものと想定される。
【００４２】
さらに、本発明は表面活性物質、特に内在性表面活性物質、特に肺表面活性物質を強化するための強化剤の使用により溶解され、それにおいて、強化剤は上述の工程に従って作られる可能性があるまたは作られる、またはそれにおいて、表面活性物質強化剤は上述の成分から作られる。この目的のために、繰り返しを避けるため、上記の情報について明確に述べる。
【００４３】
好都合なことに、強化剤が、生物、特にヒトにおける肺の疾患を治療するための治療剤または医薬品として用いられるという点で、応用は区別される。例えば、強化剤は、噴気性投与のための粉末形態の、または気管内または気管支内投与のための液体状態の医薬品として示される可能性がある。その上、さらなる開発において、強化剤がエアゾールの形態で患者に用いられる可能性がある。望ましくは溶液または懸濁液の気管内点滴により、または噴霧化した溶液または懸濁液の形態で、または粉末剤の噴霧化により、投与は、専門家に既知の方法で後に続いてなされる。
【００４４】
さらにまた、ヒトにおける肺疾患、特に急性肺疾患の治療または早期治療のための、特に薬剤の生産のため、メチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）またはシクロデキストリン、特に２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、または特に２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを有するシクロデキストリン誘導体、またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）または前記の物質または言及した物質の混合物に対応する誘導体または少なくともコレステロール選択性およびコレステロール非活性化物質または少なくともコレステロール捕捉物質を用い対象物を溶解し、それにより表面活性物質のコレステロールを捕捉する。
【００４５】
さらにまた、表面活性物質、特に肺表面活性物質の特に研究、特に診断のため、メチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）またはシクロデキストリン、特に２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、または特に２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを有するシクロデキストリン誘導体、またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）または前記の物質または言及した物質の混合物に対応する誘導体または少なくともコレステロール選択性およびコレステロール非活性化物質または少なくともコレステロール捕捉物質を用い対象物を溶解し、それにより表面活性物質のコレステロールを捕捉する。
【００４６】
本発明において、さらに、表面活性物質強化剤の捕捉効果により、表面活性物質、特に内在性表面活性物質の表面張力に関して機能障害が減少する可能性があり、それにより表面活性物質の一致する強化の後、表面活性物質におけるコレステロールまたは脂質の濃度の増加による機能障害は減少またはなくなる可能性がある。
【００４７】
本発明は、コレステロールによりもたらされたまたは誘導された表面活性物質の阻害の診断または測定のみならず、前述した症状を有する患者または人々、またはコレステロールによりもたらされたまたは誘導された表面活性物質の阻害を有するそれらの方々において、コレステロールによりもたらされたまたは誘導された表面活性物質の阻害の治療することを可能にする薬剤として、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）を含むシクロデキストリンの活性クラスまたは活性物質クラスにおけるメチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）または他のシクロデキストリンまたは他のコレステロール捕捉物質の使用、およびビタミンＥを含む他の方法によりコレステロールの影響を逆にするまたは無くするシクロデキストリンの活性クラスに一致する物質を使用するという考えに基づく。
【００４８】
記述される症状の強化のため、物質または活性物質は、エアゾールの形態で肺に送達すること、または少なくとも１つの外因性のもの、すなわち外部から作用する表面活性物質とともに物質として肺に注入すること、または別の方法で肺に送達することが可能である。
【００４９】
診断の手段として、本発明の物質は患者からの表面活性物質のサンプルと混合させることが可能であり、それの機能は表面平衡でその後確認される。あるいは、物質は、表面活性物質の機能を測定するために、水溶液または表面平衡の水相に添加することが可能である。
【００５０】
これらの結果および知見は、モデル表面活性物質のシステムおよびＣＦ患者およびＡＲＤＳ患者の肺表面活性物質に基づき得られた。それらは、２つの実施例に基づき、以下で説明する。
【００５１】
別の態様において、本応用は、酸化による表面活性物質の深刻な阻害がコレステロール依存的であることを示す。理論の束縛を受けることなく、インビトロで本明細書において示される表面活性物質機能障害の機序が病気に関連すると考えられる。酸化表面活性物質を様々な動物モデルに注入する研究は、インビトロの成績とインビボ活性との間の十分な関連性を示した（Ｂａｉｌｅｙ  ＴＣ，ｅｔ  ａｌ（２００６）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｈｉｇｈ  ｔｉｄａｌ  ｖｏｌｕｍｅ  ａｎｄ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２９１：Ｌ７０３−Ｌ７０９；Ｇｉｌｌｉａｒｄ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｌｕｎｇ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｔｏ  ｏｘｉｄａｎｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｌｔｅｒｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９３：２６０８）。
【００５２】
さらに、複数の呼吸病理学におけるインビトロで見られる機能障害の条件は満たされる。肺胞酸化的ストレスは、他の疾患の中でも特に、ＡＲＤＳ、喘息、ＣＦ、およびＣＯＰＤの病因と関係している（Ｃｉｅｎｃｅｗｉｃｋｉ  Ｊ，Ｔｒｉｖｅｄｉ  Ｓ  &  Ｋｌｅｅｂｅｒｇｅｒ  ＳＲ（２００８）Ｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２２：４５６−４６８）。これらの疾患において、ＲＯＳは活性化された免疫細胞および／または環境要因におそらくかなりの程度由来する（Ｃｉｅｎｃｅｗｉｃｋｉ  Ｊ，  Ｔｒｉｖｅｄｉ  Ｓ  &  Ｋｌｅｅｂｅｒｇｅｒ  ＳＲ（２００８）Ｏｘｉｄａｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２２：４５６−４６８；Ｌａｍｂ  ＮＪ，Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ  Ｊ，Ｂａｋｅｒ  Ｃ，Ｅｖａｎｓ  ＴＷ  &  Ｑｕｉｎｌａｎ  ＧＪ（１９９９）Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｄａｍａｇｅ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｘｙｌａｔｉｏｎ，ｎｉｔｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｈｌｏｒｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  ２７：１７３８）。その上、炎症性肺疾患におけるコレステロールの減少の報告はない。それとは反対に、表面活性物質の中のコレステロールがＡＲＤＳ（Ｐａｎｄａ  Ａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ  ｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｆｉｌｍｓ．  Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，３０：６４１−６５０；Ｔａｍｍｉ  Ｒ，Ｒｉｐｅｌｌｉｎｏ  ＪＡ，  Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ＲＵ  &  Ｔａｍｍｉ  Ｍ（１９８８）Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ａｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｂｅ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ９０：４１２−４１４）およびＣＦ（我々の未発表の結果）において増加する。これらの病理学において、コレステロールの増加した濃度はそれ自体で機能障害を説明することさえ可能である（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａ  ＬＣ，ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｍｅｔｈｙｌ−［ｂｅｔａ］−ｃｙｃｌｏｄｅｘｔｒｉｎ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｆｉｌｍｓ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｂｙ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  １７９８：９８６−９９４；Ｖｏｃｋｅｒｏｔｈ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ（２０１０）Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｐｈｙ��ｉｃａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｎ  ｖｅｎｔｉｌａｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２９８：Ｌ１１７−Ｌ１２５）。
【００５３】
病態への関連を確認するために、表面活性物質濃度、圧縮拡張の率、表面活性物質組成、および酸化剤酸化体曝露のレベルを既知の生理的または病理学的パラメータと一致させ、下記の実施例において、試みがなされた。しかしながら、脂質抽出した表面活性物質を用いて、我々はこれらを酸化に対しさらに耐性を示す可能性のある天然表面活性物質に存在する水溶性内在性酸化防止剤分子を除去した（Ｈａｄｄａｄ  ＩＹ，ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｔｏ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２６５：Ｌ５５５−Ｌ５６４）。例えば、肺胞液の中のヒアルロン酸は遊離基を除去する特性を有する（Ｔａｍｍｉ  Ｒ，Ｒｉｐｅｌｌｉｎｏ  ＪＡ，Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ＲＵ  &  Ｔａｍｍｉ  Ｍ（１９８８）Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ａｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｂｅ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ９０：４１２−４１４）。他方で、炎症を起こした肺の中の表面活性物質は、十分に界面活性でない小さな凝集体への肺胞性浮腫およびＬＡ物質の変換により希釈の物質となる可能性があり（Ｚｕｏ  ＹＹ，Ｖｅｌｄｈｕｉｚｅｎ  ＲＡＷ，Ｎｅｕｍａｎｎ  ＡＷ，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ＮＯ  &  Ｐｏｓｓｍａｙｅｒ  Ｆ（２００８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ−ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ，ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  （ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  １７７８：１９４７−１９７７；Ｔａｍｍｉ  Ｒ，Ｒｉｐｅｌｌｉｎｏ  ＪＡ，Ｍａｒｇｏｌｉｓ  ＲＵ  &  Ｔａｍｍｉ  Ｍ（１９８８）Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｙａｌｕｒｏｎａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ａｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｂｅ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ９０：４１２−４１４においてレビューされている）、酸化性機能障害を強化する可能性がある。活性酸素種はまたインビボで認められる反応窒素種の反応性を強化する可能性があり、さらに有害な表面活性物質脂質およびタンパク質にダメージを与えることが可能である（Ｈａｄｄａｄ  ＩＹ，ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｔｏ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２６５：Ｌ５５５−Ｌ５６４；Ｈａｄｄａｄ  ＩＹ，ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ  ｇｅｎｅｒａ��ｉｏｎ  ｏｆ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ａｎｄ  ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄａｍａｇｅｓ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２６７：Ｌ２４２−Ｌ２４９）。
【実施例１】
【００５４】
モデル研究において、どのようにその誘導体を機能不全にするかという例として、通常の（生理的な）量のコレステロールでも、ＲＯＳに曝露した表面活性物質を与え、０、５および１０重量パーセントのコレステロールをＲＯＳ曝露したウシ脂質表面活性物質抽出物に添加した。表面活性物質モデルの機能は、キャプティブ気泡サーファクトメーター（ＣＢＳ）で測定した。
【００５５】
メチル−β−シクロデキストリン（ΜβＣＤ）非存在下において（図１Ａ）、すなわち非強化表面活性物質で、表面張力は、深刻な表面活性物質が機能障害であることを示す２３ｍＮ／ｍで平衡の近くでほぼ変化のないままであった。
【００５６】
メチル−β−シクロデキストリン（ＭβＣＤ）（２０ｍｍｏｌ）存在下において（図１Ｂ）、すなわち強化表面活性物質で、水相において、表面活性物質はその通常の機能を回復し、表面張力はほぼ０まで減少した。
【実施例２】
【００５７】
小児ＣＦ表面活性物質サンプル（ｎ＝１０、図２Ａ〜Ｄ）による本研究において、我々は高レベルの表面活性物質機能障害を見出した。気管支肺胞洗浄ＢＡＬのコレステロールは、健常肺コントロールサンプル（５．５±０．９重量％；ｎ＝５）と比較して１７．６±６．２重量％に増加し、また正常の表面活性物質機能を示した（図２Ｃ）。ＣＦ表面活性物質を、ＭβＣＤ存在下において再テストした場合、サンプルの大多数（８／１０）が今度は機能回復を示し（図２Ｄ）、コレステロールが機能障害の原因となったことを示唆する。高いコレステロールは、ＣＦに特有のコレステロール恒常性の欠陥により説明される（Ｗｈｉｔｅ，Ｎ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａｌｔｅｒｅｄ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２９２，Ｌ４７６−Ｌ４８６（２００７））。他方で、小児の非ＣＦ細気管支炎表面活性物質の５つのサンプルはまた機能不全であり、それら機能はまた通常のコレステロール値（５．６±０．５重量％）にもかかわらずＭβＣＤにより回復した。後者は我々の発明、すなわち、正常レベルのコレステロール存在下においてさえ、表面活性物質を機能不全にする活性酸素種（ＲＯＳ）によるその劣化により説明がなされる可能性がある。ＲＯＳは主に好中球により炎症を起こした肺で産生される（Ｃｈａｂｏｔ，Ｆ．，Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．，Ｇｕｔｔｅｒｉｄｇｅ，Ｊ．&  Ｅｖａｎｓ，Ｔ．Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １１，７４５−７５７（１９９８））。表面活性物質機能障害における好中球の役割と一致し、機能障害のあるＣＦおよび非ＣＦ細気管支炎症例はそれらのＢＡＬ溶液において増加した好中球を有した。我々は炎症性の環境が主に非ＣＦ細気管支炎表面活性物質に影響を及ぼすものと結論づける。対照的にＣＦにおいては炎症性のものに加えて遺伝的要素であるように思われる。我々の予備データによれば、両方の種類の異常はコレステロール結合性剤ＭβＣＤで修正することが可能である。
【実施例３】
【００５８】
本研究において、ＡＲＤＳの最も初期段階である、急性肺損傷（ＡＬＩ）のマウスモデルは、発表された方法（Ａｌｌｅｎ，Ｇ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｉｔｈｅｒ  ｆｉｂｒｉｎ  ｎｏｒ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−１  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｌｕｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２９６，Ｌ２７７−Ｌ２８５（２００９））に従い肺の酸損傷により作製し、肺機能、酸素供給、肺組織学、肺超微細構造、表面活性物質機能および組成に関して解析した（図３Ａ〜Ｅ）。ＡＬＩ／ＡＲＤＳにおける肺機能を評価するために、エラスタンス（またはその逆、適合性）および圧容量曲線は一般的に用いられる（ＪＯＮＳＯＮ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｖｏｌｕｍｅ  ｃｕｒｖｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｎｇ  ｉｎｊｕｒｙ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｃａｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １５９，１１７２−１１７８（１９９９））。ヒトの非ＣＦ細気管支炎症例と同様で、炎症の酸化環境に曝露された表面活性物質がコレステロール存在下で機能しなくなるメカニズムをさらに支持して、コレステロールは生理的に正常な濃度（であり、さもなければ通常の脂質プロフィール）であるにもかかわらず、このモデルを用いた我々の最初のデータはコレステロール依存的な表面活性物質の機能障害を示す。重要なことに、我々はＭβＣＤがエアゾールとして投与される場合、肺においてインビトロでのみならずインビボでも表面活性物質機能を回復させることが可能であること示す（図３Ｂ）。
【実施例４】
【００５９】
この実施例において、コレステロール依存的な表面活性物質機能障害の誘発における酸化多価不飽和リン脂質の役割が研究された。フェントン様反応による、または炎症を起こした肺におけるＲＯＳ存在下での、表面活性物質の酸化は、主要目標である多価不飽和リン脂質を有する脂質−過酸化物の形成をもたらす。さもなければ不変であるが、脂質過酸化物はそれらの脂肪族末端においてヒドロペルオキシド基を有する。元は疎水性であった領域における親水基のこの誘導は、脂質充填を阻害する。２０％のｗ／ｗ  ｏｘＰＬＰＣまたはｏｘＣＬのＢＬＥＳ＋１０％コレステロールへの添加は、表面活性の実質的な劣化を引き起こした（図４Ａ）。ｏｘＰＬＰＣまたはｏｘＣＬ単独では天然のＢＬＥＳの表面活性を阻害しなかったため、この影響はコレステロール依存的であった。コレステロールおよびＰＬＰＣまたはＣＬの一方のみを含むＢＬＥＳは、最初は阻害しなかったが、おそらく外気への曝露による自然酸化の結果として数時間後に機能不全になった。これはコレステロールと共に機能障害を引き起こしている表面活性物質において存在する過酸化物化ＰＬＰＣ、ＣＬおよび他の多価不飽和リン脂質と一致する。これらの結果は肺炎を伴う表面活性物質機能障害においてＣＬの重要な役割の発見が得られる、さらなる関心である。この解釈の支持で、酸化にさらされた非多価不飽和リン脂質種の添加により生じる阻害はなく、ＢＬＥＳ＋１０％のコレステロールへのｏｘＤＰＰＣ、ｏｘＤＰＰＧまたはｏｘＰＯＰＣの添加は、コントロールと比較して動的な界面活性に悪影響を及ぼさなかった。脂質の過酸化は脂肪族末端で複数の二重結合に依存し、したがって、ＤＰＰＣ、ＤＰＰＧまたはＰＯＰＣはこの分子改変のターゲットではない。
【００６０】
過酸化物を形成することに加え、多価不飽和リン脂質種はまた、酸化剤開始の加水分解に非常に影響を受けやすい。コントロールとして、ｏｘＰＬＰＣまたはｏｘＣＬを含んでいるＢＬＥＳ＋１０％のコレステロールからの（先述したように）リン脂質加水分解産物の除去は、界面活性を改善せず（図示せず）、それにより、阻害が多量のリゾリン脂質およびＦＦＡの生成および取り込みに起因したという可能性を排除した。要約すると、コレステロールと併用した、最も可能性が高い有害な分子種である酸化多価不飽和リン脂質は、影響を受けた脂質のそれぞれの過酸化物で表面活性物質を機能不全にする。
【実施例５】
【００６１】
表面活性物質膜の構造における酸化の影響はまた研究された。低い表面張力は、空気−バッファー界面で圧縮不可能な膜を形成している表面活性物質から生じる。力学的類似性において、表面張力はプレートを圧縮している外側部の圧力に等しく、界面の分子膜は連続体プレートである。機能的である場合、膜は側部の圧力に屈せず、このように表面張力を相殺しない。機能不全である場合、膜は流体膜のため界面からバッファーに流れ去ることにより虚脱する。延性のある場合は座屈または脆性のある場合は亀裂により、柔軟性に欠ける機能不全の膜は圧力に影響を受ける。
【００６２】
ラングミュア−ブロジェットの膜（空気−バッファー界面で形成され、それから固体支持体に移動する膜）の顕微鏡解析は、肺表面活性物質がその機能を果たす方法およびそれが機能しなくなる方法の重要な態様を明らかにする。原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）において、ｏｘＢＬＥＳ膜は、単分子層領域および脂質二分子層領域のパターンを示す（図４Ｂ、右）。図４Ｂ、中央はＡＦＭ−領域を線画した膜の蛍光光学マイクロ写真である。比較から、明るい領域が脂質二分子層である。我々および他のグループはこのパターンが機能的な膜の特徴であり、圧縮において単分子層−二分子層転換に起因するものであることをこれまでに見出した（Ｌｅｏｎｅｎｋｏ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｎｔｏ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｉｌｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９３，６７４−６８３（２００７）；Ｂａｏｕｋｉｎａ，Ｓ．，Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｉ，Ｌ．，Ｒｉｓｓｅｌａｄａ，Ｈ．Ｊ．，Ｍａｒｒｉｎｋ，Ｓ．Ｊ．&  Ｔｉｅｌｅｍａｎ，Ｄ．Ｐ．Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｍｏｎｏｌａｙｅｒ  ｃｏｌｌａｐｓｅ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０５，１０８０３（２００８）；Ｓｅｒｒａｎｏ，Ａ．Ｇ．，Ｃｒｕｚ，Ａ．，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃａｐｏｔｅ，Ｋ．，Ｐｏｓｓｍａｙｅｒ，Ｆ．&  Ｐｅｒｅｚ−Ｇｉｌ，Ｊ．Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｍａｔｕｒｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳＰ−Ｂ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４４，４１７−４３０（２００５）；Ｎａｈｍｅｎ  ｖｏｎ，Ａ．，Ｓｃｈｅｎｋ，Ｍ．，Ｓｉｅｂｅｒ，Ｍ．&  Ａｍｒｅｉｎ，Ｍ．Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｍｏｄｅｌ  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ａｓ  Ｒｅｖｅａｌｅｄ  ｂｙ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７２，４６３−４６９（１９９７）。二分子層領域は液体に必要な物を供給し、別の面では不飽和脂質は低い表面張力と不適合である。従って単分子層は、高密度パッキングおよび低表面張力を生じる飽和脂質（大部分はＤＰＰＣ）の領域において豊富となる。
【００６３】
二分子層スタックは表面活性物質タンパク質ＢおよびＣにより単分子層とクロスリンクされる。膜の座屈または亀裂を阻害している力学的再強化としてのこれらの作用を我々は以前に提案した（Ｌｅｏｎｅｎｋｏ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｎｔｏ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｉｌｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９３，６７４−６８３（２００７））。ｏｘＢＬＥＳは、無処理のＢＬＥＳと対照的に、マイクロメートル以下の寸法のさらなる多量の球状押出を示し、おそらく、その全体的な能力を損なうことなく活性膜から絞り出された不完全脂質のミセルを示す。
【００６４】
図４Ｂ、左は、膜の面積−表面圧等温線であり、３５〜４０ｍＮ／ｍにおいて膜圧で肩形状を示し、その後、高い表面圧への増加が続いた。ここで留意すべきは、ラングミュアトラフについて、膜圧ΠがＣＢＳと対照的に記録される点であり、そこで表面張力γを測定した。２つの存在は、＝７０ｍＮ／ｍの自由な空気−水界面の表面張力であるγ０とΠ＝γ０−γとして相関する。単分子層−二分子層転換に起因している肩形状を有する等温線もまた機能的な表面活性物質に特有である（Ｌｅｏｎｅｎｋｏ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｉｍｐａｉｒｓ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｎｔｏ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｉｌｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９３，６７４−６８３（２００７））。未酸化の膜では認められない約５０ｍＮ／ｍ（矢印）の不安定な領域は、ＡＦＭトポグラフィーで小さな突起として見られる損害を受けた脂質の放出を示す可能性がある。コレステロールを含むｏｘＢＬＥＳにおいてはまた、二分子層領域は、常に、この機能不全の膜の虚脱構造であるマイクロメートルサイズの球状物質と関与する（図４Ｃ）。蛍光画像は二分子層により覆われた界面のはるかに狭い面積を示す。５０ｍＮ／ｍでの連続的な虚脱プラトーの等温線は膜の機能障害を示す。
【００６５】
要約すると、コレステロール非存在下において、酸化表面活性物質は、脂質二分子層に富む領域で、脂質単分子層の機能的な構造を維持する。ＡＦＭは酸化表面活性物質におけるコレステロールが最も顕著に二分子層のアセンブリに影響を及ぼすことを示し、この領域で大きな球状虚脱構造をもたらす。この知見は、二分子層領域は力学的に膜を再強化することはできないが、むしろ、脂質が水相に失われる部位であるため注目の対象となることと一致する。
【実施例６】
【００６６】
方法および実験の手順
材料―ＢＬＥＳは、ＢＬＥＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（カナダオンタリオ州Ｌｏｎｄｏｎ）より贈与された。１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１−パルミトイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＬＰＣ）、およびウシ心臓カルジオリピン（ＣＬ、主に１’，３’−ビス［１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−リン酸］−ｓｎ−グリセロール）はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．（米国アラバマ州Ａｌａｂａｓｔｅｒ）より購入した。他の全ての化学製品はシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（米国ミズーリ州Ｓｔ，Ｌｏｕｉｓ）より購入した。Ｈａａｇｓｍａｎらにより記述されるように（Ｈａａｇｓｍａｎ  ＨＰ，ｅｔ  ａｌ（１９８９）Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＳＰ−Ａ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ２５７：Ｌ４２１−Ｌ４２９）、ヒトＳＰ−Ａ（ｈＳＰ−Ａ）はブタノール抽出を用い肺胞性蛋白症患者の全肺洗浄から単離した。この調製物の純度はポリアクリルアミドゲル電気泳動後のクマシー青染色によって評価した。すべての脂質は−２０℃窒素下にて保存した。表面活性物質混合物は４℃窒素下にて保存し、調製後３日中に使用した。ＨＥＰＥＳを含んでいるバッファーはＨ２０２を不注意に産生するこのを避けるため４℃で暗所にて保存した（Ｈａｄｄａｄ  ＩＹ，ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｐｅｒｏｘｙｎｉｔｒｉｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｊｕｒｙ  ｔｏ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ２６５：Ｌ５５５−Ｌ５６４）。
【００６７】
インビトロの酸化―（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃａｐｏｔｅらにより記述されるように、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃａｐｏｔｅ  Ｋ，Ｍａｎｚａｎａｒｅｓ  Ｄ，Ｈａｉｎｅｓ  Ｔ  &  Ｐｏｓｓｍａｙｅｒ  Ｆ（２００６）  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ＳＰ−Ｂ  ａｎｄ  ＳＰ−Ｃ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ９０：２８０８−２８２１；およびＣａｐｏｔｅ  ＫＲ，ＭｃＣｏｒｍａｃｋ  ＦＸ  &  Ｐｏｓｓｍａｙｅｒ  Ｆ（２００３）Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ（ＳＰ−Ａ）ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ａｆｔｅｒ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｔｈａｔ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｔｈｅ  Ｃｙｓ６  ｉｎｔｅｒｃｈａｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：２０４６１）酸化ＢＬＥＳ（ｏｘＢＬＥＳ）を産生するため２４時間フェントン様の化学反応から発生するヒドロキシルラジカルにＢＬＥＳを曝露した。ＤＰＰＣ、ＰＯＰＣ、ＰＬＰＣ、ＤＰＰＧおよびＣＬは１．５ｍＭのＣａＣｌ２を含んだ生理食塩水中に懸濁し、同一の酸化条件に曝露し、酸化性条件への曝露のみを示すためにｏｘＤＰＰＣ、ｏｘＰＯＰＣ、ｏｘＰＬＰＣ、ｏｘＤＰＰＧおよびｏｘＣＬとして示した。１．０ｍｇ／ｍＬのｏｘＢＬＥＳ（ＢＩＯＸＹＴＥＣＨ  ＬＰＯ−５８６、ＯｘｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ、米国カリフォルニア州Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）で脂質過酸化の副産物であるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）および４−ヒドロキシアルケナール（４−ＨＡＥ）の形成を測定することにより、表面活性物質リン脂質の酸化を確認した。ｏｘＢＬＥＳはコントロールＢＬＥＳと比較して有意に多くのＭＤＡおよび４−ＨＡＥを含有し（それぞれ６．６９±１．１６および２．６９±０．６３ｎｍｏｌのＭＤＡおよび４−ＨＡＥ／ｍｇリン脂質、ｎ＝６、ｐ＝０．０１４）、このフェントン反応様の酸化を用いたこれまでの研究と一致した。
【００６８】
表面活性物質の調製―正確な混合を確実に行うため、さらに脂質を有機溶液としてＢＬＥＳまたはｏｘＢＬＥＳの脂質抽出に添加した。それから、混合物を窒素下で乾燥させ、濃度２７ｍｇ／ｍＬのリン脂質に、ＣＢＳバッファー（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ６．９）で再懸濁した。リン脂質濃度は、遊離リン酸基の遊離の後、リン酸塩分析法（Ｇｅｎｔａｕｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、ベルギーＫａｍｐｅｎｈｏｕｔ）を用い評価した（Ｄｕｃｋ−Ｃｈｏｎｇ  ＣＧ（１９７９）Ａ  ｒａｐｉｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｍａｇｎｅｓｉｕｍ  ｎｉｔｒａｔｅ．Ｌｉｐｉｄｓ  １４：４９２−４９７）。総リン脂質濃度は、脂質抽出後９６．８±６．８％（ｎ＝６）および酸化後９８．６±１１．１％（ｎ＝１２）であった。コレステロールの酵素的分析（Ａｍｐｌｅｘ  Ｒｅｄコレステロールアッセイ、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を用いた測定によると、ＢＬＥＳは２．６０％のコレステロール（ｗ／ｗリン脂質）を含んだ。最終濃度が５％（ｗ／ｗリン脂質）を示したとき、ｈＳＰ−Ａを乾燥膜に添加した。実験の一部において、リン脂質加水分解の水溶性産物（Ｇｉｌｌｉａｒｄ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｏｆ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ｌｕｎｇ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｔｏ  ｏｘｉｄａｎｔ  ｓｔｒｅｓｓ  ａｌｔｅｒｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９３：２６０８；Ａｒｎｈｏｌｄ  Ｊ，Ｏｓｉｐｏｖ  ＡＮ，Ｓｐａｌｔｅｈｏｌｚ  Ｈ，Ｐａｎａｓｅｎｋｏ  ＯＭ  &  Ｓｃｈｉｌｌｅｒ  Ｊ（２００２）Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｆｒｏｍ  ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｐｏｃｈｌｏｒｏｕｓ  ａｃｉｄ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  １５７２：９１−１００）を、低濃度の表面活性物質混合物の高速遠心分離（４００００ｇ×３０分×４℃）により除去した。上清液を捨て、ペレットを最初の量の濃縮表面活性物質に再懸濁した。高速遠心分離の後、ｏｘＢＬＥＳのリン脂質の濃度は、処理したＢＬＥＳと同様に６１．９±９．７％>であった（ｎ＝３，ｐ＝０．０３４）。
【００６９】
生理的濃度のコレステロールを含む表面活性物質を得るために、カルガリー健康科学センター大学の無菌の動物管理施設に飼育される５匹の雌、１２週齢のＣ５７ＢＬ６マウス（ジャクソン研究所、米国メイン州Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｕｒ）を、過量の腹腔内のナトリウムペントバルビタールで人道的に安楽死させた。気管カニューレを外科的に取り付け、一定分量の通常の生理食塩水０．５ｍＬを３度、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）に用いた。ＢＡＬ溶液は細胞残屑を除去するためにすぐに遠心分離し（４００ｇ×１０分×４℃）、その後、大きな凝集体画分は先述したように高速遠心分離により上清から分離した。これらの画分をプールし、マウス脂質抽出物表面活性物質（ＭＬＥＳ）を得るために脂質を抽出した。乾燥後、このプールした画分をリン脂質の最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるよう１．５ｍＭのＣａＣｌ２を含む生理食塩水に再懸濁し、先述したように、ｏｘＭＬＥＳを得るために、その後酸化に曝露した。ＭＬＥＳは７．３±１．６％のコレステロール（ｗ／ｗリン脂質）を含んだ。
【００７０】
表面活性評価―表面活性物質の界面活性は、２つの重要な変更を加え、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａら（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａ  Ｌ，Ｓｃｈｏｅｌ  ＷＭ，Ｓｃｈｉｉｒｃｈ  Ｓ  &  Ａｍｒｅｉｎ  ＭＷ（２００８）Ａ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．ＢＢＡ−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ  １７７８：４３３−４４４）により詳細に記述されるようにコンピュータ制御のキャプティブ気泡サーファクトメーター（ＣＢＳ）を用い測定した。１）空気−バッファー界面の近位に２７ｍｇ／ｍＬの表面活性物質〜１．０μＬのボラースをデポジットするのに透明な毛細管を用いた。表面活性物質の量および濃度は、不十分な表面活性物質またはバルク相吸着に起因する影響を最小にするよう選択した。この量の天然ＢＬＥＳを、機能的な予備容量および総肺気量（それぞれ<１ｍＮ／ｍおよび〜３０ｍＮ／ｍ）でｉｎ  ｓｉｔｕ測定し、最小および最大の表面張力を正確に再現させる（Ｂａｃｈｏｆｅｎ  Ｈ  &  Ｓｃｈｉｉｒｃｈ  Ｓ（２００１）Ａｌｖｅｏｌａｒ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｆｏｒｃｅｓ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ．Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｐａｒｔ  Ａ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  &  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １２９：１８３−１９３）。実験の一部において、濃度に起因する表面活性物質機能の相違を評価するために０．５ｍｇ／ｍＬの表面活性物質５４．０μＬをデポジットするのに透明な毛細管を用いた。２）調整の工程は、以降の圧縮−拡張サイクルに一貫性のある表面活性を保証するために行った。気泡は、最初に準静的に最大量の−２０％まで圧縮し、その後最小量および最大量を設定するため拡張した。その後、気泡の量を、膜を調整するために、２０サイクル／分の率で、同じ量範囲で動的に循環させた。その後、４回の準静的サイクルおよび第２セット目の動的なサイクルを行った。表面張力および表面面積の測定は、この第２の一連のサイクルで行った。２０ｍＮ／ｍ（Ｃ２０）の圧縮率は、以下の式を用いて計算した。Ｃ２０＝（δΑ／δγ）／Ａ、そこでＡ＝面積およびγ＝表面張力。
【００７１】
ＭβＣＤの影響を評価するために、粉末状のＭβＣＤ（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、カタログ−Ｎｒ．Ｃ４５５５）を、最終濃度３０ｍＭにまでバッファーに溶解し、表面活性物質の追加の前に、ＣＢＳチャンバーに添加した。カルシウムを含まない実験は、カルシウムを添加せず、１５ｍＭのＥＤＴＡを添加したＣＢＳバッファーを用い行った。これらの実験で用いた表面活性物質は、使用の前にＥＤＴＡを含むバッファーで一晩インキュベートした。
【００７２】
等温線および膜蒸着―原子間力および蛍光顕微鏡検査により演繹されるように、ウシ脂質抽出物表面活性物質（ＢＬＥＳ）の懸濁をラングミュアトラフおよび表面活性物質構造における表面活性に関して比較した。ａ）ｏｘＢＬＥＳ、ｂ）１０％ｗ／ｗコレステロールを含むｏｘＢＬＥＳ、およびｃ）１０％ｗ／ｗコレステロールおよびｈＳＰ−Ａを含むｏｘＢＬＥＳのサンプルは、先述したように調製した。蛍光脂質の類似体（ローダミン―ＤＨＰＥ、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を、水性懸濁液より前に０．１％  ｍｏｌ／ｍｏｌ  ＤＰＰＣの濃度にまで添加した。
【００７３】
表面活性物質懸濁液を、界面で（２７ｍｇ／ｍｌの濃度で）およそ１０μｌの滴下を静置することにより、３７℃でラングミュアトラフ（Ｎｉｍａ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、英国Ｃｏｖｅｎｔｒｙ）の空気−バッファー界面（７５０ｃｍ２）で、膜に拡散させた。膜面積を６００ｃｍ２から１００ｃｍ２まで１００ｃｍ２／分の率で減少させ、再び広げた。その後、このサイクルを２度繰り返した。表面張力を連続的にモニターし、面積−表面張力等温線を記録した。次に、表面圧が４５ｍＮ／ｍに達するまで、面積を再度減少させた。この時点で、顕微鏡検査のための膜を、ラングミュア−ブロジェット技術により、丸い（２５ｍｍ）顕微鏡カバーガラス上に付着させた。蒸着において、表面張力が一定にされる間、すでに浸したカバースリップは２５ｍｍ／分の速度で空気−バッファー界面全体で垂直に移動した。
【００７４】
顕微鏡検査―ＡＦＭトポグラフィー画像を、２１〜７８Ｎ／ｍの典型的なバネ定数および２６０〜４６０ｋＨｚの共振周波数で、ノンコンタクトモードシリコンカンチレバーＮＣＨ−２０（Ｎａｎｏ  Ｗｏｒｌｄ，スイスＮｅｕｃｈａｔｅｌ）を用い、Ｎａｎｏ  Ｗｉｚａｒｄ  ＩＩ  ＡＦＭ（ＪＰＫ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ドイツＢｅｒｌｉｎ）で、断続的な接触モードにて空気中で収集した。ＡＦＭをＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ（Ｚｅｉｓｓ、ドイツＪｅｎａ）に取り付けた。光学蛍光画像をＺｅｉｓｓ  ４０ｘ  Ａｐｏｐｌａｎ油浸対物レンズ（開口数：１．４）およびＡｎｄｏｒ  ｉＸｏｎ  ＥＭＣ  ＣＤカメラ（Ａｎｄｏｒ、アイルランドＢｅｌｆａｓｔ）を用いＡＦＭ走査領域を含むサンプル領域を捕捉した。光学画像は（ＡＦＭソフトウェアの「光学オーバーレイ」の特性を用い）基準点を確立するため、ＡＦＭスキャナを利用することにより正確に調整し光学的ひずみおよび倍率を補正した。これにより２つの画像モードの正確なオーバーレイを可能にした。
【００７５】
統計解析―すべてのＣＢＳ実験は、平均±ＳＥＭ（ｎ＝４〜７）として報告される。各々のユニークな脂質混合物を、少なくとも２回独立して準備した。２つのグループ間の分散分析（ＳＰＳＳ  １９．０）の後に、有意性のための基準として用いられるｐ<０．０５で、多重比較のためにテューキーのＨＳＤを続け行った。図中における同じ文字およびケースによる平均値は、そのサイクルにおいて統計的に相違でない。
【００７６】
要約すると、コレステロール非存在下において、酸化表面活性物質は、脂質二分子層に富む領域で、脂質単分子層の機能的な構造を維持する。ＡＦＭは酸化表面活性物質におけるコレステロールが最も顕著に二分子層のアセンブリに影響を及ぼすことを示し、この領域で大きな球状虚脱構造をもたらす。この知見は、二分子層領域は力学的に膜を再強化することはできないが、むしろ、脂質が水相に失われる部位であるため注目の対象となることと一致する。
【００７７】
理論の束縛を受けることなく、表面活性物質機能障害は酸化およびコレステロールの組合せに起因するものと考えられている。我々は、ＲＯＳが表面活性物質膜の二分子層領域において不安定性を引き起こすためにコレステロールと相互作用する脂質過酸化物を誘導することを初めて示す。図および等温線（図４）のプラトーにおいて認められる虚脱構造は、二分子層領域が高い膜圧で表面活性物質原料を連続的に放出することを示唆する。酸化はまた不飽和リン脂質の表面活性物質を減少させ、コレステロールの凝縮の影響により、十分に変形可能でない膜をもたらす。このことは、等温線（図４）において、機能的な膜の４０ｍＮ／ｍとは対照的に、５０ｍＮ／ｍを上回る膜圧で単分子層−二分子層転換プラトーが始まることから明らかである。この点で、膜は脆性である可能性があり破壊の傾向がある可能性があり、続く圧縮サイクルで低い表面張力に達することが不可能となる進行性の原因の一つとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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