(57)【要約】  本発明は、プロピオニバクテリウム・アクネスに対する抗バイオフィルム剤として使用される、ギンバイカ抽出物を０．０１重量％以上の濃度で含有する皮膚用組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
浮遊性プロピオニバクテリウム・アクネス菌に対する抗付着剤として、および／またはバイオフィルム構造をとる固着性プロピオニバクテリウム・アクネス菌を根絶もしくは破壊するための薬剤として使用される、ギンバイカ抽出物を０．０１重量％〜１重量％の濃度で含有する、皮膚用組成物。
【請求項２】
使用が、自由浮遊を促進するための、浮遊性細菌に対する抗付着剤としての使用であることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
使用が、浮遊性細菌の付着に対する予防的抗バイオフィルム使用であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
使用が、一度バイオフィルムが破壊された場合の、浮遊性細菌のバイオフィルムへの再構成に対する予防的使用であることを特徴とする、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
抽出物量が０．０１％重量以上０．１重量％以下であることを特徴とする、請求項１〜４に記載の組成物。
【請求項６】
ギンバイカ抽出物が、ミルツコンムロン類およびウルソル酸からなる非極性画分であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
ミルツコンムロン類が、主に、ミルツコンムロンＡ、ミルツコンムロンＢ’、ミルツコンムロンＤ、ミルツコンムロンＢ、イソセミミルツコンムロンおよびセミミルツコンムロンからなり、有利には、総ミルツコンムロン含有量が、ギンバイカ抽出物の総重量に対して３重量％〜１０重量％の間であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ウルソル酸含有量が、ギンバイカ抽出物の総重量に対して１０重量％〜３０重量％の間であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
ウルソル酸含有量が、ギンバイカ抽出物の総重量に対して１５重量％未満であることを特徴とする、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｐ．アクネスに作用する、好ましくは、局所形態で投与される抗生物質に対する耐性を低下させるために局所使用されるものである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
アクネの処置において用いられる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
禿髪性毛包炎の処置において用いられる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
アクネまたは禿髪性毛包炎の処置において、同時に、別々にまたは逐次に用いられる、ギンバイカ抽出物を０．０１重量％〜１重量％の濃度で含有する皮膚用組成物と、少なくとも１つの抗生物質を含有する皮膚用組成物とからなる、組合せ物。
【請求項１４】
皮膚用組成物が、０．０１重量％以上０．１重量％以下のある量のギンバイカ抽出物を含有することを特徴とする、請求項１３に記載の組合せ物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
本発明は、プロピオニバクテリウム・アクネス(Propionibacterium acnes)に関する抗バイオフィルム剤としてのギンバイカ(myrtle、フトモモ科の各種低木)抽出物の、皮膚用組成物における使用に関する。
【０００２】
有利には、本発明は、浮遊性プロピオニバクテリウム・アクネス菌に対する抗付着剤として、および／またはバイオフィルム構造をとる固着性プロピオニバクテリウム・アクネス菌を根絶もしくは破壊するための薬剤としてのギンバイカ抽出物の、皮膚用組成物における使用に関する。
【０００３】
抗バイオフィルム剤としてのこのギンバイカ抽出物はまた、アクネまたは禿髪性毛包炎の処置中に古典的に投与される抗生物質に対する耐性を低下させるのに効果的であることも判明している。
【０００４】
アクネは、毛包脂腺毛包の炎症によって起こるよく見られる皮膚病変である。この毛包の炎症は、大部分が、毛漏斗部にプロピオニバクテリウム・アクネスが定着したことによるものである。
【０００５】
禿髪性毛包炎(folliculitis decalvans)は、残存性瘢痕性脱毛症(residual scarring alopecia)の原因となる慢性炎症性頭皮膿疱症である。禿髪性毛包炎は、生理病理学がほとんど解明されていない希少疾患であるが、細菌、おそらくは、プロピオニバクテリウム・アクネス菌に対する好中球を主体とした炎症反応と関係がありそうである。
【０００６】
Ｐ．アクネス菌は、リパーゼによって皮膚のトリグリセリドを代謝して刺激性脂肪酸に変え、これらの脂肪酸が毛包壁およびその周囲の真皮の壁を攻撃する。さらに、この菌は、この炎症を悪化させる様々な酵素や免疫系食細胞の化学誘引物質を産生する。
【０００７】
従って、この細菌種を制御することがアクネまたは禿髪性毛包炎の処置の際の優先事項である。現在では、様々な局所用抗菌剤が広く使用されている（過酸化ベンゾイル、クリンダマイシン、エリスロマイシン、トリクロサン）。
【０００８】
実際には長期にわたる全身抗生物質療法は、病気の重篤度に応じて組み合わせて使用することができる（テトラサイクリン類、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、エリスロマイシン）。
【０００９】
近年は、１以上の抗生物質に耐性を示すＰ．アクネス株の割合が高くなっているためにこれらの処置が頻繁に失敗していることに着目した。
【００１０】
浮遊性細菌（浮遊状態）の集団がバイオフィルムへ組織化すると、この耐性増加が起こり得る。バイオフィルムは、微生物によって排泄された、グリコカリックスと呼ばれる糖ポリマー（細胞外高分子物質、またはＥＰＳ）からなる細胞外マトリックスの内部に存在する細菌細胞のコミュニティーである。従って、バイオフィルムは、細菌とその周囲環境とを隔てる多糖外皮である。細菌は、代謝を遅くすることで代謝を適応させる。従って、バイオフィルムは、細菌が、
・毛包脂腺毛包の上皮ケラチノサイトに付着し、それにより、ケラチノサイトの分化および増殖に対する調節作用を促進すること、
・毛包脂腺毛包内でコロニーへと発展すること、および
・アクネに対して使用される抗生物質、特に、サイクリン類およびマクロライド類に対して耐性を示すようになること
を可能にする。
【００１１】
細菌のバイオフィルム生活様式は、単細胞生物の２つの生活様式の１つである。これは、特に、適さない環境での、大部分の微生物の自然な生活様式である。第２の生活様式では、細菌は液体環境中を自由に浮遊する。自由浮遊性生活様式と関係している細菌は、浮遊性細菌と呼ばれている。バイオフィルムと関係している細菌は、固着性細菌として知られている。
【００１２】
図１で示されるように、毛包脂腺毛包内でのＰ．アクネスバイオフィルムの形成は、４段階で進行する：
１）毛包脂腺毛包の内壁への浮遊性Ｐ．アクネスの移動
２）毛包壁へのＰ．アクネスの初期付着
３）固着性Ｐ．アクネスの定着および構造化
４）Ｐ．アクネスの脱離および再定着。
【００１３】
（バイオフィルムと関係している）固着性細菌は、浮遊性（自由な）細菌と表現型上も生理学上も異なる。
【００１４】
バイオフィルムへのこの構成が発表され、アクネ処置の処置失敗の説明がなされた(Burkart C.N., Burkart C.G., 2003. Microbiology’s principle of biofilms as a major factor in the pathogenesis of acne vulgaris. Int. J. Dermatol. 42. 925-927)。
【００１５】
最近の研究により、
・in vitroでも(Bayston R., Ashraf W., Barker-Davis R., Tucker E., Clement R., Clayton J., Freeman B.J., Nuradeen B. 2007. Biofilm formation by Propionibacterium acnes on biomaterials in vitro and in vivo: impact on diagnosis and treatment. J. Biomed. Mast. Res. A81, 705-709) (Coneye T., Peeters E., Nelis H.J. 2007a. Biofilm formation by Propionibacterium acnes is associated with increased resistance against antimicrobial agents and increased production of putative virulence factors. Res. Microbiol. 158. 386-392) (Holmberg A., Lood R., Morgelin M., Soderquist B., Holst E., Collin M., Christensson B., Rasmussen M. 2009. Biofilm formation by Propionibacterium acnes is a characteristic of invasive isolates. Clin. Microbiol. Infect. 15, 787-795)
・in vivoで医療装置上でも(Coneye T., Honraet K., Rossel B., Nelys H.J., Biofilm in skin infection: Propionibacterium acnes and acne vulgaris. Infect Disord Drug Target 2008. 14. 649-659) (Ramage G., Tunney M.M., Patrick S., Gorman S.P. and Nixon J.R. 2003. Formation of Propionibacterium acnes biofilms on orthopedic biomaterials and their susceptibility to antimicrobials. Biomaterials; 24: 3221-3227) (Craig G., Burkhart M.D., Craig N. 2007. Expanding the microcomedone theory and acne therapeutics: Propionibacterium acnes biofilm produces biological glue that holds corneocytes together to form plug. J Am Acad Dermatol. October)
バイオフィルムを形成するＰ．アクネスの能力が確認された。
【００１６】
最新の技術でも毛包内のバイオフィルムをin situで可視化することはできないが、最近の研究では、皮膚生検組織から毛包脂腺毛包内のＰ．アクネスマクロコロニー／バイオフィルムの存在を検出することができた(Jahns A.C., Lundskog B., Ganceviciene R., Palmer R.H., Golovleva I., Zouboulis D.C., McDowell A., Patrick S., Alexeyev O.A. 2012. An increased incidence of Propionibacterium acnes biofilms in acne vulgaris: a case-control study. Br J Dermatol. Feb 22)。
【００１７】
現在、一般に受け入れられているＰ．アクネスバイオフィルムについての概念は、バイオフィルムの形成抑制、または既に形成されているバイオフィルムの拡大抑制もしくはその化学的もしくは機械的根絶などの新たな処置標的への道を開く。
【００１８】
これらのアプローチは、微生物の定着を防ぐために古典的に利用されている殺菌活性に代わるものである。これらの２種類の活性、すなわち、殺菌性および抗バイオフィルム性の活性は、異なる特性を利用し、互いに誘発し合わない。
【発明の概要】
【００１９】
本発明は、一方で、Ｐ．アクネスバイオフィルムの形成を抑制し、もう一方で、既に形成されているバイオフィルムの拡大を抑制し、またはそれを根絶する（もしくは破壊する）ギンバイカ抽出物の活性を示すことを目的としている。
【００２０】
本発明は、ギンバイカ(Myrtus communis)種に関して行われた研究に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【発明の具体的説明】
【００２２】
好ましくは、前記抽出物は、ギンバイカ(Myrtus communis)の葉から調製される。
【００２３】
好ましくは、前記抽出物は、ギンバイカ地上部由来の非極性画分である。
【００２４】
本発明の抽出物は、以下：
・エタノール、メタノール、イソプロパノールなどのアルコール
・アセトンおよびメチルエチルアセトンを含むケトン
・ヘキサン
・塩化メチレン
・イソプロピルエーテル
・酢酸エチル；
から選択される溶媒もしくは溶媒の混合物を用いるかまたは超臨界ＣＯ２による抽出によって得ることができる。
【００２５】
前記抽出物はまた、ブチルヒドロキシトルエンまたはα−トコフェロールなどの酸化防止剤を、例えば、乾燥抽出物１００ｇ当たり０．０５〜１ｇの間の量で添加することにより安定させることができる。
【００２６】
本発明の抽出物は、ミルツコンムロン類(myrtucommulones)およびウルソル酸が豊富であるという特徴を有する。存在する主なミルツコンムロン類は、ミルツコンムロンＡ、ミルツコンムロンＢ’、ミルツコンムロンＤ、ミルツコンムロンＢ、ｉｓｏＳ（イソセミミルツコンムロン(isosemimyrtucommulone)）およびＳ（セミミルツコンムロン(semimyrtucommulone)）である。
【００２７】
有利には、前記抽出物中の総ミルツコンムロン含有量は、３〜１０重量％の間である。
【００２８】
ウルソル酸含有量は、１０〜３０重量％の間、好ましくは、≧１５重量％である。
【００２９】
これらの分子は、本発明に関連して記載された活性を有する。
【００３０】
本発明の特定の実施形態では、前記ギンバイカ抽出物は、好ましくは、欧州特許第１１２０７９号に記載のとおりのものである。この文献には、ギンバイカ(Myrtus communis)抽出物の抗菌性および、化粧料用または皮膚用組成物におけるその用途が記載されている。
【００３１】
本発明の全体で顕著な側面は、本発明の組成物の抗バイオフィルム活性が、非常に低い濃度のギンバイカ抽出物、すなわち、該組成物の総重量に対して０．０１重量％ほどの低い濃度でも認められることである。
【００３２】
前記組成物中の抽出物の量は０．０１％〜１％の間であり、好ましくは、０．０３％〜１％の間である。
【００３３】
有利には、抽出物の量は０．１％以下である。
【００３４】
より具体的には、抽出物の量は０．０１％以上０．１％以下である。より一層好ましくは、抽出物の量は０．０３％以上０．１％以下である。
【００３５】
「プロピオニバクテリウム・アクネスに関する抗バイオフィルム剤」とは、本発明の文脈において、
・（プロピオニバクテリウム・アクネスバイオフィルムの形成を回避するために）プロピオニバクテリウム・アクネスバイオフィルムの付着を抑制し、かつ／または
・既に形成されているプロピオニバクテリウム・アクネスバイオフィルムを根絶する（破壊、脱離）
薬剤を意味する。
【００３６】
前記抗バイオフィルム剤の活性を示すために、他の研究分野で既に使用されている不活性支持体上でのバイオフィルム形成動的モデル(Campanac C., Pineau L., Payard M., Baziard-Mouysset G., Roques C. 2002. Interaction between biocide cationic agents and bacterial biofilms. Antimicrob. Ag. Chemother. May 46 (5) 1469-1474)を、Ｐ．アクネスに具体的に適用した。従って、記述する２つの側面を調査した：
・Ｐ．アクネスバイオフィルム生成に及ぼす前記抽出物の作用：この活性は、表面への細胞の付着およびバイオフィルムの構造化に関与する機構を利用する。
・他の特性（清浄など）を利用した、既に形成されているバイオフィルムの根絶。
【００３７】
本発明のギンバイカ抽出物は、バイオフィルムへの構成を制限することで、Ｐ．アクネスと闘う助けとなる。浮遊性Ｐ．アクネス菌の付着を防ぎ、かつ既に形成されているＰ．アクネスバイオフィルムを破壊するこの作用は、アクネ肌および／またはアクネができやすい油性肌からのアクネ病変の消滅を促す。
【００３８】
本出願者は、抗バイオフィルム剤としてのギンバイカ抽出物の使用についての調査を行い、驚くべき予期しない方法で、ギンバイカ抽出物が、Ｐ．アクネス株、好適的にはバイオフィルム構造をとるＰ．アクネス株の、Ｐ．アクネスに作用する、好ましくは、局所形態で投与される抗生物質に対する耐性を低下させることを見出した。
【００３９】
従って、本発明は、プロピオニバクテリウム・アクネスに関する抗バイオフィルム剤として使用される、ギンバイカ抽出物を０．０１重量％以上の濃度で含有する皮膚用組成物に関する。
【００４０】
有利には、本発明は、浮遊性プロピオニバクテリウム・アクネス菌に対する抗付着剤として、および／またはバイオフィルム構造をとる固着性プロピオニバクテリウム・アクネス菌を根絶もしくは破壊するための薬剤として使用される、ギンバイカ抽出物を０．０１重量％以上の濃度で含有する皮膚用組成物に関する。
【００４１】
特に、本発明は、自由浮遊を促進するための、浮遊性細菌に対する抗付着剤として使用される、ギンバイカ抽出物を０．０１重量％以上の濃度で含有する皮膚用組成物に関する。
【００４２】
より具体的には、本発明は、浮遊性細菌の付着を予防するための抗バイオフィルム剤として使用される、ギンバイカ抽出物を０．０１重量％以上の濃度で含有する皮膚用組成物に関する。
【００４３】
より具体的には、本発明は、一度バイオフィルムが破壊された場合に、浮遊性細菌のバイオフィルムへの再構成に対して予防的に使用される、ギンバイカ抽出物を０．０１重量％以上の濃度で含有する皮膚用組成物に関する。
【００４４】
本発明の別の側面は、ギンバイカ抽出物を０．０１重量％〜１重量％の濃度で含有する組成物に関する。
【００４５】
本発明の別の側面によれば、抽出物の量は０．０１％重量以上０．１重量％以下である。
【００４６】
本発明の別の側面によれば、前記ギンバイカ抽出物は、ミルツコンムロン類およびウルソル酸からなる非極性画分である。
【００４７】
本発明の組成物の局所使用は、好ましくは、局所形態で投与される、Ｐ．アクネスに作用する抗生物質に対する耐性を低下させることを目的とする。
【００４８】
本発明の別の側面によれば、前記組成物は、アクネまたは禿髪性毛包炎の処置において用いられる。
【００４９】
別の側面によれば、本発明は、アクネまたは禿髪性毛包炎の処置において、同時に、別々にまたは逐次に用いられる、ギンバイカ抽出物を０．０１重量％〜１重量％の濃度で含有する皮膚用組成物と、少なくとも１つの抗生物質、特に、Ｐ．アクネスに対して活性を有する局所用抗生物質を含有する皮膚用組成物とからなる組合せ物に関する。
【００５０】
本発明の組合せ物の皮膚用組成物は、０．０１％重量以上０．１重量％以下のある量のギンバイカ抽出物を含有する。
【００５１】
本発明の別の側面によれば、前記ギンバイカ抽出物は０．１重量％の濃度である。
【００５２】
古典的に使用される前述の抗生物質は、エリスロマイシン、ドキシサイクリンおよびクリンダマイシンである。
【００５３】
本発明の抗バイオフィルム剤は前記抗生物質の処置効力を向上させる。
【００５４】
上述の抗生物質とギンバイカ抽出物との組合せは、抗生物質単独の場合より低い最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を有する。
【００５５】
ＭＩＣは、細菌の増殖を阻止する、製品（物）の最小濃度である。
【００５６】
アクネ処置に関連して、抗生物質療法と、抗バイオフィルム剤としてギンバイカ抽出物を含有する組成物の適用とを組み合わせることには重要な利点がある。実際には、これにより特定のＰ．アクネス株の、エリスロマイシンまたはクリンダマイシンに対する耐性が低下する。
【００５７】
処方物／調製
本発明の組成物は、局所適用に適したどのような形態でも提供され得る：クリーム、ゲル、スティック、血清。
【００５８】
以下の薬理実施例および評価によって、本発明をよりよく理解することができる。
【実施例】
【００５９】
１−抽出物の調製
１．１−実施例１：
砕粉したギンバイカ葉１ｋｇを、１０容量の酢酸イソプロピルを用いて、還流状態で撹拌しながら抽出する。撹拌しながら還流状態で１時間抽出する。絞りかすを濾過し、洗い流した後、活性炭を添加することにより抽出液を脱色する。濾過後、脱色させた濾液を２リットルまで濃縮し、その後、酢酸イソプロピルが除去されるまで水で乾燥させる。その後、得られた水相を凍結乾燥させる。
【００６０】
ギンバイカ葉１ｋｇから乾燥ギンバイカ抽出物の約２５ｇが得られる。
【００６１】
乾燥ギンバイカ抽出物は、７％のミルツコンムロン類および２５％のウルソル酸を含有する。
【００６２】
１．２−実施例２
砕粉したギンバイカ葉１ｋｇを、５容量の酢酸イソプロピルを用いて、還流状態で撹拌しながら１時間抽出する。絞りかすを濾過し、洗い流した後、活性炭を添加することにより抽出液を脱色する。濾過後、脱色させた濾液を２リットルまで濃縮し、その後、酢酸イソプロピルが除去されるまでエタノールで乾燥させる。次いで、得られた水相を、熱処理により脱臭し、その後、凍結乾燥させる。
【００６３】
ギンバイカ葉１ｋｇから乾燥ギンバイカ抽出物の約２５ｇが得られる。
【００６４】
乾燥ギンバイカ抽出物は、７％のミルツコンムロン類および２５％のウルソル酸を含有する。
【００６５】
２−処方物
２．１−実施例３：クレンジングゲル用処方
コセス硫酸亜鉛（Ｚｅｔｅｓｏｌ  Ｚｎ(商標)、Zchimmer&Schwarz社製）、５〜２０％
デシルグルコシド
ラウリルベタイン
ポリソルベート２０、０．５〜４％
エチルヘキサン酸ＰＥＧ−５、１〜３％
セテアレス−６０ミリスチルグリコール、０．５〜３％
サリチル酸亜鉛、０．１〜０．５％
ノコギリヤシ(SERENOA REPENS)抽出物、０．１〜０．３％
親油性乾燥ギンバイカ抽出物、０．０１〜０．１％
安息香酸ナトリウム／クエン酸／水酸化ナトリウム  適量
【００６６】
２．２−実施例４：クリーム
ギンバイカ抽出物、０．０３〜０．１％
ＡＨＡ  ＢＨＡ、１〜８％
キサンタンガム、０．１％
ジメチコン、１％
イソノナン酸セトステアリル、１２％
ステアリン酸グリセリル、２％
セテアリルアルコール＆セテアレス−３３、６％
ポリメチルメタクリレート、２％
水  適量（１００％にする）
【００６７】
評価
・連続流でのＰ．アクネスバイオフィルムの獲得
バイオフィルムの形成に使用する装置を図２に示す。
【００６８】
使用する２つのポンプはそれぞれ、
・ループへの基質の供給（ポンプ１番）、
・システムの内容物の撹拌（ポンプ２番）
を行う役割を果たす。
【００６９】
図２に記載する実験装置全体を層流フード下に置く。
【００７０】
システムに培養培地を供給する。次いで、培地に、Ｂ地点で、ある量のＰ．アクネスＣＩＰ  ５３１１７菌浮遊液を注入植菌して、微生物の終濃度約１０７ＣＦＵ／ｍｌを得る。
【００７１】
接種物の微生物をループ全体に分布させ、すなわち、均質化相とし、その後、ポンプ１番による基質の供給を行う。
【００７２】
４８時間形成させた後、Ｐ．アクネスＣＩＰ  ５３１１７バイオフィルムを得る。
【００７３】
図２に示す実験装置では、図面中の参照記号は以下の意味を有する：
Ｐ１：基質供給用ポンプ
Ｐ２：システム撹拌用ポンプ
Ａ−Ｂ、下部：チューブ部分のサンプリングエリア
Ｂ：ループへの植菌エリア。
Ａ−Ｂ、上部：ポンプＰ２を含むチューブ部分
【００７４】
Ｐ．アクネスバイオフィルムの形成におけるギンバイカ抽出物の付着抑制の評価。
実施例２に従って調製した乾燥ギンバイカ抽出物についての、Ｐ．アクネスＣＩＰ  ５３１１７バイオフィルム形成における付着抑制効果を評価するために、前段落で記載したとおりに２つの装置を準備した。第１の装置を対照とする。第２の装置には、乾燥ギンバイカ抽出物を、終濃度０．１％（非致死濃度）で添加した培養培地を供給する。試験は２回実施する。
【００７５】
「処理実施」支持体と未処理対照において、以下のプロトコールに従って、５時間、２４時間および４８時間の時点で付着細菌および浮遊性細菌を計数した。チューブサンプルを４等分に縦断し、これらの部分の各内表面を、滅菌メス刃を用いて１０ｍｌの希釈液中へ擦り取る。
【００７６】
次いで、チューブ部分および液体を試験管に移し、約１分間振盪する。
【００７７】
その後、細菌を寒天培養培地上に画線し、計数する。
【００７８】
同時に、浮遊性細菌を計数するために、同じプロトコールに従って、流出物のサンプルを回収する。
【００７９】
プレートは、嫌気性条件下、３７±２℃でインキュベートする。
【００８０】
９６時間のインキュベーションの後、ＣＦＵを計数する。
【００８１】
付着細菌についてはＣＦＵ／ｃｍ２で、浮遊性細菌については流出物１ｍｌ当たりのＣＦＵ（ＣＦＵ／ｍｌ）で結果を表す。
【００８２】
結果
得られた結果を表１に示す。
【００８３】
培養可能な付着集団の推定値をチューブ１ｃｍ２当たりのｌｏｇ  ＣＦＵで表し、培養可能な浮遊性集団の推定値をｌｏｇ  ＣＦＵ／ｍｌで表す。
【００８４】
【表１】
2015522054.tif 000002
【００８５】
ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｃｍ２で表した、付着集団について得られた結果の平均を下記図３に示す。
【００８６】
乾燥ギンバイカ抽出物を用いた装置では、植菌の５時間後にＰ．アクネス付着抑制が認められる。この抑制はおよそ１．２ｌｏｇである。どちらの装置の場合も（処理実施および対照）、浮遊性集団の推定値は同程度である。２４時間の形成後もこの現象は続き、抑制はおよそ２．７ｌｏｇである。４８時間後もこの抑制は変わらず、およそ２．６ｌｏｇであった。どちらの装置の場合も（処理実施および対照）、この期間中に、培養可能な浮遊性集団の大幅な減少が認められる。
【００８７】
これらの結果は、０．１％（ｗ／ｖ）乾燥ギンバイカ抽出物によってもたらされた、試験条件下での付着抑制を示している。
【００８８】
脱離活性の評価
実施例２に従って調製した乾燥ギンバイカ抽出物の脱離活性を、前記した、４８時間の形成後に得られたＰ．アクネスＣＩＰ  ５３１１７バイオフィルムにおいて評価した。
【００８９】
試験条件（図４参照）は以下のとおりである：
・０．１％（ｗ／ｖ）乾燥ギンバイカ抽出物と滅菌蒸留水の脱離活性、
・接触時間：１．５分および１０分の接触、
・室温。
【００９０】
各規定接触時間経過後、様々なサンプルを採取する：
・残留細菌を計数するためのチューブ（２ｃｍ）のサンプル、
・浮遊細菌を計数するための循環液のサンプル。
【００９１】
図４に示す実験装置では、参照記号は以下の意味を有する：
ａ＝残留細菌を計数するためのチューブのサンプル
ｂ＝循環液
Ｐ＝ポンプ。
【００９２】
試験は、乾燥ギンバイカ抽出物については二反復で、滅菌蒸留水については１回実施する。
【００９３】
様々な処理を開始する前（対照）に付着している微生物の数を計数した。
【００９４】
結果
得られた結果を表２に示す。培養可能な付着集団の推定値をチューブ１ｃｍ２当たりのｌｏｇ  ＣＦＵで表し、培養可能な浮遊性集団の推定値を２００ｍｌ（循環液の容量）当たりのｌｏｇ  ＣＦＵで表す。
【００９５】
【表２】
2015522054.tif 000003
【００９６】
培養可能な付着集団の著しい減少が認められないため（１ ｌｏｇ未満の減少＝バイオフィルムの第１表面層の除去）、滅菌蒸留水を用いて準備した一連の対照により試験を検証した。
【００９７】
０．１％（ｗ／ｖ）乾燥ギンバイカ抽出溶液と滅菌蒸留水についての、Ｐ．アクネスバイオフィルム（４８時間の形成後のもの）における脱離活性を、ｌｏｇ（ＣＦＵ／ｃｍ２）で表し、図５に示す。
【００９８】
０．１％（ｗ／ｖ）乾燥ギンバイカ抽出物の存在下では、付着集団の大幅な減少が認められる。この減少は、１分の接触後におよそ３ ｌｏｇである。
【００９９】
溶液の循環時間を１分から５分に延ばすことにより、脱離の約０．７ ｌｏｇのさらなる増加がもたらされる。
【０１００】
Ｐ．アクネスバイオフィルムにおけるエリスロマイシン／ギンバイカ抽出物の組合せの活性の評価
実施例２に従ってギンバイカ抽出物を調製する。
【０１０１】
株の確認
４つのプロピオニバクテリウム・アクネス株を選択した：
２つのエリスロマイシン耐性株（ＥＲＹ  Ｒ）
・プロピオニバクテリウム・アクネスＣＩＰ  １１０３７１
・臨床分離株Ｒ４
２つのエリスロマイシン感受性株（ＥＲＹ  Ｓ）
・プロピオニバクテリウム・アクネスＣＩＰ  ５３１１７Ｔ
・臨床分離株Ｂ８７２
【０１０２】
プロトコール
細菌増殖が起こらない最小培養液へのＰ．アクネスの力価測定済懸濁液（約１０６ＣＦＵ／ｍｌ）を、２４ウェルマイクロプレートのウェルに付着させた。
【０１０３】
マイクロプレートを嫌気性条件下、３７±２℃で４８時間（バイオフィルム形成の設定時間）おく。
【０１０４】
４８時間後に、各ウェルの上清を廃棄し、その後、ウェルを洗い流す。エリスロマイシンと様々な濃度のギンバイカ抽出物を、付着細胞との接触時間２４時間の間添加する（合計７２時間の付着）。
【０１０５】
選択したエリスロマイシン濃度は１０００μｇ／ｍｌである。この濃度で、この抗生物質は、２つのエリスロマイシン感受性株（ＥＲＹ  Ｓ）に関して殺菌活性を有している（２４時間での減少が４ｌｏｇ〜５ｌｏｇの間）が、２つのエリスロマイシン耐性株（ＥＲＹ  Ｒ）に関して殺菌活性は有していないことが単離細菌において確かめられた。
【０１０６】
７２時間の付着後：
・浮遊性細胞を計数する
・ウェルを洗い流し、その後、トリプトン塩中へ擦り取った後、付着している（固着性）細胞を計数する
【０１０７】
同時に、対照を準備した（付着細胞＋浮遊性細胞）
・７２時間のバイオフィルム対照（４８時間の時点で培地を変更）
・様々な濃度のギンバイカ対照（４８時間後に添加／２４時間の接触）
・１０００μｇ／ｍｌのエリスロマイシン対照（４８時間の時点で添加／２４時間の接触）
・試験濃度のギンバイカ抽出物対照
【０１０８】
エリスロマイシンと接触させた総てのウェルについては、各希釈物１ｍｌをメンブレン（Ｍｉｃｒｏｆｉｌ(商標)、Millipore社製）で濾過し、その後、フィルターを滅菌蒸留水５０ｍｌで３回洗い流す。メンブレンをコロンビア寒天培地＋５％ヒツジ血液上に置く。プレートを嫌気性条件下、３７±２℃でインキュベートする。７２時間〜９６時間のインキュベーション後に、コロニー形成単位（ＣＦＵ）を計数する。
【０１０９】
総てのバイオフィルム対照およびギンバイカ抽出物単独については、各希釈物１００μｌを、コロンビア寒天培地＋５％ヒツジ血液上に画線植菌する。プレートを嫌気性条件下、３７±２℃でインキュベートする。７２時間〜９６時間のインキュベーション後に、ＣＦＵを計数する。
【０１１０】
結果
この試験は、エリスロマイシン（１０００μｇ／ｍｌ）と、０．０３％、０．００１％および０．０００１％の濃度のギンバイカ抽出物との組合せの活性を評価することにあった。
【０１１１】
結果を、集団の計数値のｌｏｇで示す。
【０１１２】
【表３】
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【０１１３】
ＥＲＹ  Ｓ−コレクション株の結果
エリスロマイシン（１０００μｇ／ｍｌ）と、０．０３％、０．００１％および０．０００１％の濃度のギンバイカ抽出物との組合せの活性を図６に示す。
【０１１４】
ＥＲＹ  Ｒ−コレクション株の結果
エリスロマイシン（１０００μｇ／ｍｌ）と、０．０３％、０．００１％および０．０００１％の濃度のギンバイカ抽出物との組合せの活性を図７に示す。
【０１１５】
【表４】
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【０１１６】
ＥＲＹ  Ｓ−分離株の結果
エリスロマイシン（１０００μｇ／ｍｌ）と、０．０３％、０．００１％および０．０００１％の濃度のギンバイカ抽出物との組合せの活性を図８に示す。
【０１１７】
ＥＲＹ  Ｒ−分離株の結果
エリスロマイシン（１０００μｇ／ｍｌ）と、０．０３％、０．００１％および０．０００１％の濃度のギンバイカ抽出物との組合せの活性を図９に示す。
【０１１８】
全体としての結論：
・抽出物単独：
ギンバイカ抽出物単独では、０．０３％の濃度で、ｅｒｙＳ株およびｅｒｙＲ株の両方に関して高い活性を有することが認められる。
【０１１９】
また、得られた結果より、ギンバイカ抽出物単独で、浮遊性細菌に対してはもちろんのこと、付着しているＰ．アクネス菌に対しても顕著な活性（用量依存効果）を有することも示される。
【０１２０】
より活性の低いギンバイカ抽出物濃度（０．００１％および０．００１％）を選択して、ギンバイカ抽出物／エリスロマイシン系抗生物質組合せ処理の効果を示した。
【０１２１】
・エリスロマイシン単独：
結果より、Ｐ．アクネス菌がバイオフィルムへと構成される（ｅｒｙＳおよびｅｒｙＲ）と、エリスロマイシンに対するそれらの感受性が低下することが確認される。
【０１２２】
さらに、ｅｒｙＲ浮遊性株がエリスロマイシンに対する耐性を示すことが確かめられた。
【０１２３】
最後に、エリスロマイシンの殺菌活性はｅｒｙＳ株に対して高い。
【０１２４】
・ギンバイカ抽出物およびエリスロマイシンの組合せ：
バイオフィルムの破壊（バイオフィルム構造をとるＰ．アクネス菌数の減少）および浮遊性集団の一部（バイオフィルムから脱離した細菌）の消滅が、評価した３組で認められる。エリスロマイシンと組み合わせたギンバイカ抽出物の最も低い濃度（０．００１％および０．０００１％）では、エリスロマイシン単独または抽出物単独と比べて、付着集団の少なくとも１ ｌｏｇのさらなる減少が認められる。ギンバイカ抽出物の高い濃度（０．０３％）では、この抽出物の活性が高いことで相乗作用は隠れている。
【０１２５】
従って、ギンバイカ抽出物を関連抗生物質と組み合わせることにより作用の増強が実際に認められた。実際には、ギンバイカ抽出物によって、抗生物質療法の関連分子に対する、バイオフィルム形態のＰ．アクネス株の耐性は低下する。ギンバイカ抽出物によって、Ｐ．アクネス菌に関するエリスロマイシンの作用は最適化される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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