(57)【要約】  水性細胞培養培地組成物は、哺乳類細胞の培養を支持するように構成された細胞培養水溶液を含む。この組成物は、細胞培養水溶液中に溶解したポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーをさらに含む。ポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーは、細胞培養条件下で細胞培養物品の表面に接着するように構成されている。細胞培養条件下で細胞培養表面上において水性細胞培養培地組成物をインキュベーションすると、ポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーが前記表面に接着することになる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性細胞培養培地組成物において、
哺乳類細胞の培養を支持するように構成された細胞培養水溶液、および
前記細胞培養水溶液中に溶解したポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーであって、細胞培養条件下で細胞培養物品の表面に接着するように構成されたポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマー、
を含み、
細胞培養条件下で細胞培養表面上において前記水性細胞培養培地組成物をインキュベーションすると、前記ポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーが前記表面に接着することを特徴とする水性細胞培養培地組成物。
【請求項２】
コンジュゲートしたポリペプチドを含む少なくとも１つのモノマーがメタクリル酸である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記ポリマーが、（ｉ）前記ポリペプチドにコンジュゲートしたメタクリル酸および（ｉｉ）ヒドロキシエチルメタクリレートの重合から形成される、請求項１または２記載の組成物。
【請求項４】
前記ポリマーが、ヒドロキシエチルメタクリレートおよびＭＡＡ−ＰＥＯ4−ポリペプチドの重合から形成され、ここで、ＭＭＡがメタクリル酸であり、ＰＥＯがポリエチレンオキシドである、請求項３記載の組成物。
【請求項５】
前記ポリペプチドが配列番号２７のアミノ酸配列を含む、請求項４記載の組成物。
【請求項６】
前記ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーが、１０キロダルトンと１０００キロダルトンの間の分子量を有する、請求項１から５いずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物が７と８の間のｐＨを有し、グルコースおよび１種類以上のアミノ酸をさらに含む、請求項１から６いずれか１項記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【優先権】
【０００１】
本出願は、その内容が依拠され、ここに全て引用される、２０１２年２月２日に出願された米国仮特許出願第６１／５９４０１６号の米国法典第３５編第１１９条の下での優先権の恩恵を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、細胞培養に関し、より詳しくは、合成既知組成ポリマーを含有する細胞培養のための培地、およびそのような培地を使用した細胞培養方法と基体被覆方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
疾病の治療のために人に導入してよい細胞である治療用細胞が開発されている。治療用細胞の例としては、人体内で様々な細胞タイプに分化する能力を有する、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）およびヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）などの幹細胞が挙げられる。幹細胞のこの性質により、糖尿病、脊髄損傷、心臓病などの多数の重症の細胞変性疾患のための新たな治療法を開発するための可能性が提供される。しかしながら、そのような細胞に基づく治療法の開発にはまだ障害がある。
【０００４】
治療用細胞培養物を開発し、制御する上で、細胞と組織の培養において適切な数の治療用細胞を得て維持すること、およびこれらの細胞が細胞培養中に望ましくない様式で変化しないことを確実にすることが重要である。例えば、幹細胞培養では、典型的に、細胞銀行またはストックからの少数の細胞が播種され、次いで、所定の治療用途にとって分化が望ましくなるまで、未分化状態または部分的分化状態で増幅される。このことを行うために、幹細胞またはその分化した細胞は、典型的に、支持細胞層、血清、またはニュージャージー州、フランクリン・レイクス所在のBD Biosciences社から市販されているＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）などの、動物由来成分を含有する表面または培地の存在下で培養される。培養環境にこれらの動物由来成分が加わると、細胞が潜在的に有害なウイルスまたは他の病原菌に曝露され、これらは患者に移る可能性があり、またこれにより、ｈＥＳＣの一般培養と維持が損なわれ得る。その上、そのような生物学的製品は、バッチ間のばらつき、免疫応答および限られた貯蔵寿命を受けやすい。
【０００５】
最近、動物由来成分を含まない合成表面が、既知組成培地における幹細胞の培養に成功し、動物由来成分の存在下での細胞の培養から生じる組織の多くに対処することが示されてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、そのような合成表面は、高濃度の組換えポリペプチドにより製造されており、これらは製造するのが高価になり得る。ある場合には、水溶性被覆材料では大抵、細胞培養条件下で表面に適切に結合したままでいられないので、合成表面には、被覆目的のために有機溶媒を使用する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
特に、本開示には、既知組成培地中で幹細胞の増殖および接着を支持できるペプチドポリマーであって、未被覆表面への細胞の接着を向上させるための補助物質として細胞培養培地に添加してよいペプチドポリマーが記載される。このペプチドポリマーは、細胞培養培地への補助物質として導入されたときに、細胞培養基体表面上に安定な被覆を形成することが分かった。
【０００８】
ここに記載された様々な実施の形態において、水性細胞培養培地組成物は、（ｉ）哺乳類細胞の培養を支持するように構成された細胞培養水溶液；および（ｉｉ）この細胞培養水溶液中に溶解したポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーを含み、ここで、ポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーは、細胞培養条件下で細胞培養物品の表面に接着するように構成されており、細胞培養条件下で細胞培養表面上においてこの水性細胞培養培地組成物をインキュベーションすると、ポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーが前記表面に接着することになる。細胞培養培地は、既知組成の組成物であっても、または有機溶媒を実質的に含まなくてもよい。実施の形態において、そのポリマーは、直鎖の主鎖を有し、ポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーは２０℃以下で水溶性である。実施の形態において、細胞培養培地はグルコースおよび１種類以上のアミノ酸を含む。
【０００９】
実施の形態において、ここに記載された方法は、（ｉ）共有結合したポリペプチドを有する合成ポリマーであって、ポリペプチドにコンジュゲートされており、細胞培養条件下で細胞培養物品の表面に接着するように構成された合成ポリマーを、水性細胞培養培地に導入して、ポリマー含有細胞培養培地を生成する工程；（ｉｉ）このポリマー含有細胞培養培地を細胞培養物品の表面に配置して、被覆物品を生成する工程；および（ｉｉｉ）この被覆物品を前記培地中において細胞培養条件下（例えば、３７℃）でインキュベーションして、ポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーを細胞培養物品の表面に接着する工程を有してなる。その基体の表面は、０°と５０°の間の水接触角を有してよい。実施の形態において、その基体の表面は、プラズマ処理済みポリスチレン表面である。前記方法は、被覆物品上の細胞（幹細胞など；例えば、ヒト間葉系幹細胞またはヒト胚性幹細胞）を培地中において培養条件下でインキュベーションする工程をさらに含んでよい。この方法は、ポリマー含有細胞培養培地を細胞培養物品の表面に接触させる前に、このポリマー含有細胞培養培地中に細胞を導入する工程をさらに含んでよい。
【００１０】
ここに記載された細胞培養物品、組成物、または方法の１つ以上の実施の形態は、従来の細胞培養物品、組成物、または被覆細胞培養物品を製造する方法に勝る１つ以上の利点を提供する。例えば、前記被覆は完全に合成のものであるので、バッチ間のばらつき、免疫応答、限られた貯蔵寿命、および潜在的に有害なウイルスまたは患者に移り得る他の病原菌への細胞の曝露の恐れを被らない。これらと他の利点は、添付図面と共に読んだときに、以下の詳細な説明から容易に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】コンジュゲートされた細胞接着ポリペプチドを有するポリ（ＭＡＡ−ＰＥＧ４−ＶＮ）ホモポリマーを製造するための反応スキームの説明図
【図２】コンジュゲートされた細胞接着ポリペプチドを有するポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＧ４−ＶＮ）コポリマーを製造するための反応スキームの説明図
【図３Ａ】被覆物品の側面図
【図３Ｂ】被覆物品の側面図
【図４Ａ】未被覆のウェルを有する細胞培養物品の断面図
【図４Ｂ】表面が被覆されたウェルを有する細胞培養物品の断面図
【図４Ｃ】表面と側壁が被覆されたウェルを有する細胞培養物品の断面図
【図５】接着補助物質を含む場合と含まない場合の既知組成培地中の異なる表面上で培養されたヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の画像：（ａ）ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ−ＸＦ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＣ−ＡＳＢ）でプレコートされたＴＣＴ表面上；（ｂ）０．０３７ｍｇ／ｍｌのＭＣ−ＡＳＢが補給された培地中のＴＣＴ表面上；（ｃ）０．００７４ｍｇ／ｍｌのＭＣ−ＡＳＢが補給されたＴＣＴ表面上
【図６】接着補助物質を含む場合と含まない場合の既知組成培地中の異なる表面上で培養されたｈＭＳＣの画像：（ａ）ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮがプレコートされたＣｅｌｌＢｉｎｄ（登録商標）表面上；（ｂ）接着補助物質を含まない「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上；（ｃ）０．００６ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが補給された培地中の「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上；（ｄ）０．０１２ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが補給された培地中の「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上；（ｅ）０．０２５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが補給された培地中の「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上；（ｆ）０．０５０ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが補給された培地中の「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上
【図７】接着補助物質を含む場合と含まない場合の既知組成培地中の異なる表面上で培養されたクリスタルバイオレットで染色されたｈＭＳＣの画像：（ａ）ＭＣ−ＡＳＢでプレコートされたＴＣＴ表面上；（ｂ）０．０３７ｍｇ／ｍｌのＭＣ−ＡＳＢが補給された培地中のＴＣＴ表面上；（ｃ）０．０７４ｍｇ／ｍｌのＭＣ−ＡＳＢが補給された培地中のＴＣＴ表面上；（ｄ）ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮがプレコートされた「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上；（ｅ）補助物質を含まない「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上；（ｆ）０．００６ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが補給された培地中の「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上；（ｇ）０．０１２ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが補給された培地中の「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上；（ｈ）０．０２５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが補給された培地中の「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上；（ｉ）０．０５０ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが補給された培地中の「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上
【図８】既知組成培地中の様々な表面上で培養された生存ｈＭＳＣの百分率を示す棒グラフ
【図９】既知組成培地中の様々な表面上で培養された生存ｈＭＳＣの細胞密度（細胞数／ｃｍ2）を示す棒グラフ
【図１０】接着補助物質を含む場合と含まない場合の既知組成培地中で２日間に亘り異なる表面上で培養されたヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の画像：（ａ）０．０２５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが補給された培地中の「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上；（ｂ）０．００６ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが補給された培地中の「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上；（ｃ）「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」被覆対照表面
【図１１】接着補助物質を含む場合と含まない場合の既知組成培地中で４日間に亘り異なる表面上で培養されたｈＥＳＣの画像：（ａ）０．０２５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが補給された培地中の「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上；（ｂ）０．００６ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが補給された培地中の「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上；（ｃ）「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」被覆対照表面
【図１２】様々な表面上で培養されたｈＥＳＣの平均細胞数を示す棒グラフ  図面は、必ずしも一定の縮尺で描かれていない。図面に使用した同様の数字は、同様の構成要素、工程などを称する。しかしながら、所定の図面におけるある構成要素を称するためにある数字を使用することは、同じ数字が付された別の図面の構成要素を制限することを意図していないことが理解されよう。その上、構成要素を称するために異なる数字を使用することは、異なる数字の構成要素が同じまたは類似であり得ないことを示すことは意図されていない。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下の詳細な説明において、その一部を形成し、例として、デバイス、システムおよび方法のいくつかの特別な実施の形態が示されている、添付図面を参照する。他の実施の形態が考えられ、本開示の範囲または精神から逸脱せずに、作製されるであろうことが理解されよう。したがって、以下の詳細な説明は、制限を意味するものと解釈すべきではない。
【００１３】
ここに使用した全ての科学用語と技術用語は、別記しない限り、当該技術分野に一般に使用されている意味を有する。ここに提供された定義は、ここに頻繁に使用される特定の用語の理解を容易にするものであり、本開示の範囲を制限することは意味しない。
【００１４】
本明細書および付随の特許請求の範囲に使用されているように、単数形は、そうではないと明白に示されていない限り、複数の対象を有する実施の形態を包含する。本明細書および付随の特許請求の範囲に使用されているように、「または」という用語は、そうではないと明白に示されていない限り、「および／または」を含む意味で一般に使用される。
【００１５】
ここに用いたように、「有する(have, having)」、「含む(include, including, comprise, comprising)」などの用語は、範囲を制限しない意味で使用されており、一般に、「含む(including)が、制限されない」ことを意味する。「から実質的になる」、「からなる」などの用語は、「含む(comprising)」などに包含されることが理解されよう。
【００１６】
ここに用いたように、「コンジュゲートした(conjugated)」は、モノマーまたはポリマーおよびポリペプチドに関するように、ポリペプチドが、ポリマーまたはモノマーに直接的または間接的（例えば、スペーサを介して）に共有結合していることを意味する。
【００１７】
ここに用いたように、「モノマー」は、別のモノマーと重合できる化合物を意味する（「モノマー」が、他のモノマーと同じまたは異なる化合物であるか否かにかかわらず）。
【００１８】
ここに用いたように、「（メタ）アクリレートモノマー」は、メタクリレートモノマーまたはアクリレートモノマーを意味する。ここに用いたように、「（メタ）アクリルアミドモノマー」は、メタクリルアミドモノマーまたはアクリルアミドモノマーを意味する。（メタ）アクリレートモノマーおよび（メタ）アクリルアミドモノマーは、少なくとも１つのエチレン性不飽和部分を有する。「ポリ（メタ）アクリレート」は、ここに用いたように、少なくとも１つの（メタ）アクリレートモノマーを含む１種類以上のモノマーから形成されたポリマーを意味する。「ポリ（メタ）アクリルアミド」は、ここに用いたように、少なくとも１つの（メタ）アクリルアミドモノマーを含む１種類以上のモノマーから形成されたポリマーを意味する。
【００１９】
ここに用いたように、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーと「実質的に類似の」、コンジュゲートしたポリペプチドを含まないポリマーは、そのポリペプチドが含まれないことを除いて、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーと同じ様式で形成されたポリマーである。例えば、ポリペプチドは、ポリマーが形成された後にグラフトによってポリマーにコンジュゲートされてもよい。そのような場合、ポリペプチドにコンジュゲートしていない実質的に類似のポリマーは、グラフトされていないポリマーである。さらに別の例として、モノマーをポリペプチドで誘導体化してもよく、ポリペプチドは、モノマーが重合または共重合されるときに、ポリマーに取り込まれてもよい。そのような場合、ポリペプチドにコンジュゲートしていない実質的に類似のポリマーは、モノマーがポリペプチドで誘導体化されていないことを除いて、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーと同じ反応条件下で形成されたポリマーである。
【００２０】
ポリペプチド配列は、ここでは、１文字のアミノ酸コードまたは３文字のアミノ酸コードにより称される。これらのコードは交換可能に使用してよい。
【００２１】
ここに用いたように、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、化学合成されても、または組換え由来であってもよいが、動物源から完全なタンパク質として単離されない、アミノ酸の配列を意味する。本開示の目的に関して、ペプチドおよびポリペプチドは総タンパク質ではない。ペプチドおよびポリペプチドは、タンパク質の断片であるアミノ酸配列を含んでよい。例えば、ペプチドおよびポリペプチドは、ＲＧＤなどの細胞接着配列として知られている配列を含んでもよい。ポリペプチドは、長さが３と３０の間のアミノ酸などの、任意の適切な長さのものであってよい。ポリペプチドは、それらが、例えば、エクソペプチダーゼにより分解されるのを防ぐために、アセチル化（例えば、Ａｃ−ＬｙｓＧｌｙＧｌｙ）またはアミド化（例えば、ＳｅｒＬｙｓＳｅｒ−ＮＨ2）されていてもよい。これらの修飾は、ある配列が開示された場合に考えられることが理解されよう。
【００２２】
ここに用いたように、「既知組成培地」は、未知の組成の成分を含有しない細胞培養培地を意味する。既知組成培地は、様々な実施の形態において、タンパク質または加水分解物を含有しないであろう。
【００２３】
実施の形態において、ここに記載されたポリマーおよびポリペプチドは「合成」のものである。すなわち、それらは、動物または動物抽出物に由来する成分を含まない。ポリマーまたはモノマーは、ポリペプチドにコンジュゲートされてよい（「ポリマー−ポリペプチド」または「モノマー−ポリペプチド」）。ポリペプチドは、合成しても、またはそれらを合成の非動物由来物質とする組換え技法により得てもよい。
【００２４】
本開示は、特に、細胞を培養するための、または細胞培養物品を被覆するための組成物および方法を記載する。この組成物および方法は、コンジュゲートしたポリペプチドを有する合成ポリマーを含む。この合成ポリマー−ペプチドは、水溶性であるが、約３７℃での培地中でのインキュベーションなどの、典型的な哺乳類細胞の培養条件下で細胞培養物品の表面に接着する。細胞培養条件は、バックグラウンドまたは周囲レベルより高いレベルでの紫外線照射などの照射線への曝露を含まないことが理解されよう。
【００２５】
ポリマー−ペプチドは、接着補助物質として細胞培養培地に加えられても、またはその培地の一部であってもよい。細胞は、そのポリマー−ペプチドを含有する細胞培養培地に加えても、または細胞が播種された培地が、細胞培養物品上に配置されても、またはそれと接触させられてもよい。細胞培養条件下で、例えば、約３７℃での培地中でのインキュベーションにより、ポリマー−ペプチドは、細胞培養物品の表面に接着し、細胞がそのポリマー−ペプチドのペプチドに接着する。それゆえ、細胞は、ポリマー−ペプチドを介して、細胞培養物品の表面に接着する。
【００２６】
ここに記載された実施の形態において、細胞培養物品の表面への細胞の接着は、培地にポリマー−ペプチドを加え、未被覆の細胞培養物品に接触させることによって、ポリマー−ペプチドを含まない培地中の細胞をポリマー−ペプチドでプレコートされた物品に接触させることに対して向上している。
【００２７】
合成ポリマー−ペプチド
典型的な細胞培養条件下で培地中においてインキュベーションされたときに、ポリマーが細胞培養物品の表面に接着するという前提で、細胞培養培地接着補助物質として、コンジュゲートしたポリペプチドを有するどのような適切な水溶性ポリマーを用いてもよい。実施の形態において、ここに記載された合成ポリマーおよびコンジュゲートしたポリペプチドは、低温（例えば、２０℃未満）または室温（２５℃）の水中に可溶性であるが、典型的な細胞培養条件下（例えば、約３７℃）に曝されると、基体にしっかりと接着されるようになる。実施の形態において、合成ポリマーおよびコンジュゲートしたポリペプチドは、室温（例えば、約２５℃）辺りの温度で基体にしっかりと接着されるようになる。合成ポリマーおよびコンジュゲートしたポリペプチドは、どのような所望の温度でも基体に接着するように修飾されてもよい。実施の形態において、このポリマーは、架橋剤を含まない、または架橋がないが、それらは、細胞培養培地などの水性培地中で細胞培養基体と接触したときに、その基体と接着する。ポリマー−ペプチドのその基体への接着は、典型的なバックグラウンドの照射レベルより高い照射レベル、例えば、紫外線照射に曝露されずに起こる。
【００２８】
ここに記載されたポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーは、室温以下で水溶性であってよい。しかしながら、実施の形態において、ポリペプチドにコンジュゲートしていない実質的に類似のポリマーは、室温以下で水溶性ではない。そのような実施の形態において、ポリペプチドは、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーを水溶性にする働きをする。実施の形態において、ポリペプチドにコンジュゲートしていない実質的に類似のポリマーは、典型的に３７℃であるが、室温（２５℃）のように低くてもよい、細胞培養温度で水溶性ではない。細胞培養のための適切な弾性率を提供するために、そのポリマーが、３７℃または細胞培養に所望の温度で水中において膨潤性であることも望ましいであろう。
【００２９】
ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーは、どのような適切なモノマーを使用してどのような適切なプロセスによって形成してもよい。実施の形態において、ポリマーを形成するために使用される１種類以上のモノマーおよびポリマーを形成するために使用される反応機構（例えば、逐次重合または縮重合、もしくは連鎖重合または付加重合）は、直鎖ポリマー主鎖を有するポリマーを形成するように選択される。実施の形態において、ポリマーを形成するために使用される１種類以上のモノマーおよびポリマーを形成するために使用される反応機構は、分岐鎖ポリマー主鎖を有するポリマーを形成するように選択される。分岐鎖ポリマーは、架橋がないであろう。実施の形態において、ポリマーを形成するために使用される１種類以上のモノマーおよびポリマーを形成するために使用される反応機構は、星形を形成するように選択される。分岐鎖または星形ポリマーを形成するために、単官能性モノマーと組み合わせて、多官能性モノマーを使用してよい。分岐鎖または樹状または星形ポリマーを形成するための適切な反応スキームが、例えば、Konkolewicz, et al., Dendritic and hyperbranched polymers from macromolecular units:  Elegant Approaches to the Synthesis of Functional Polymers, Macromolecules, 2011, 44:7067-7087に論じられている。もちろん、どのような他の適切な技法を用いてもよい。
【００３０】
多くの実施の形態において、ポリマーを形成するために使用されるモノマーは、（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、マレイミド、フマレート(fumarate)、ビニルスルホンなどのエチレン性不飽和基を含有する。そのポリマーはホモポリマーまたはコポリマーであってよい。モノマーは、ポリマーが、３７℃、２５℃などで水中に不溶性であるまたはそれほど可溶性ではないが、ポリペプチドにコンジュゲートされたときに、４℃から２５℃、４℃から１５℃または２０℃の範囲で水溶性であるように選択してよい。
【００３１】
様々な実施の形態において、使用されるモノマーは、式（Ｉ）：
【００３２】
【化１】
2015505473.tif 000003
【００３３】
の（メタ）アクリレートモノマーであり、式中、ＡはＨまたはメチルであり、ＢはＨ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分岐鎖アルコールまたはエーテル、もしくはカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で置換されたＣ１〜Ｃ６直鎖または分岐鎖アルキルである。いくつかの実施の形態において、Ｂは、Ｃ１〜Ｃ４直鎖または分岐鎖アルコールである。いくつかの実施の形態において、Ｂは、カルボキシル基で置換された直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３である。例として、２−カルボキシエチルメタクリレート、２−カルボキシエチルアクリレート、アクリル酸、メタクリル酸、ヒドロキシプロピルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、２−ヒドロキシエチルアクリレート、グリセロールメタクリレート、ヒドロキシプロピルアクリレート、４−ヒドロキシブチルアクリレートなどを使用してよい。
【００３４】
様々な実施の形態において、使用してよいモノマーは、式（ＩＩ）：
【００３５】
【化２】
2015505473.tif 000004
【００３６】
の（メタ）アクリルアミドモノマーであり、式中、Ａは水素またはメチルであり、ＢはＨ、Ｃ１〜Ｃ６直鎖または分岐鎖アルコールまたはエーテル、もしくはカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で置換されたＣ１〜Ｃ６直鎖または分岐鎖アルキルである。いくつかの実施の形態において、Ｂはカルボキシル基で置換された直鎖または分岐鎖Ｃ１〜Ｃ３である。いくつかの実施の形態において、ＢはＣ１〜Ｃ４直鎖または分岐鎖アルコールである。例として、２−カルボキシエチルアクリルアミド、アクリルアミドグリコール酸、Ｎ−（ヒドロキシメチル）アクリルアミド、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アクリルアミド、３−アクリロイルアミノ−１−プロパノール、Ｎ−アクリルアミド−エトキシエタノール、Ｎ−ヒドロキシエチルアクリルアミドなどを使用してよい。
【００３７】
ポリマーを形成するために使用される１種類以上のモノマーは、所望の特徴（例えば、弾性率、膨潤性、水溶性）を有するポリマーを得るように選択してよい。例えば、２種類以上のモノマーから形成されるコポリマーは、モノマーのいずれか１種類のみから形成されるホモポリマーよりも、膨潤性の程度が大きいであろう。一般に、より長い鎖長のアルキル基を有するモノマーが、ポリマーを、コンジュゲートしたポリペプチドがポリマー−ペプチドを適切な温度で水溶性にできないほど水不溶性にする傾向にある。その上、水素結合を好む、または選択されたｐＨレベルで帯電する部分を有するモノマーは、ポリマーをより水溶性にする傾向があるであろう。当業者には、所望の特徴を有するポリマーを調製するための適切なモノマーとモノマー比を選択することが容易にできるであろう。
【００３８】
適切な量の適切なモノマーが一旦選択されたら、重合反応によりポリマーを形成してよい。ポリマーを形成するモノマーに加えて、組成物は、界面活性剤、湿潤剤、光開始剤、熱開始剤、触媒、および活性化剤などの１種類以上の追加の化合物を含んでもよい。
【００３９】
どのような適切な重合開始剤を使用してもよい。当業者には、そのモノマーに使用するのに適した開始剤、例えば、ラジカル開始剤またはカチオン開始剤を選択することが容易にできるであろう。様々な実施の形態において、連鎖重合を開始するためのフリーラジカルモノマーを生成するために、ＵＶ光が使用される。重合開始剤の例としては、有機過酸化物、アゾ化合物、キノン、ニトロソ化合物、ハロゲン化アシル、ヒドラゾン、メルカプト化合物、ピリリウム化合物、イミダゾール、クロロトリアジン、ベンゾイン、ベンゾインアルキルエーテル、ジケトン、フェノン、またはそれらの混合物が挙げられる。適切な市販の紫外線活性化光開始剤および可視光活性化光開始剤の例には、ニューヨーク州、タリタウン所在のCiba Specialty Chemicals社から市販されている、ＩＲＧＡＣＵＲＥ  ６５１、ＩＲＧＡＣＵＲＥ  １８４、ＩＲＧＡＣＵＲＥ  ３６９、ＩＲＧＡＣＵＲＥ  ８１９、ＤＡＲＯＣＵＲ  ４２６５およびＤＡＲＯＣＵＲ  １１７３、並びにBASF社（ノースカロライナ州、シャーロット所在）から市販されているＬＵＣＩＲＩＮ  ＴＰＯ−Ｌなどの商標名がある。
【００４０】
光増感剤が適切な開始剤系に含まれてもよい。代表的な光増感剤は、カルボニル基または第三級アミノ基もしくはその両方を有する。カルボニル基を有する光増感剤としては、ベンゾフェノン、アセトフェノン、ベンジル、ベンズアルデヒド、ｏ−クロロベンズアルデヒド、キサントン、チオキサントン、９，１０−アントラキノン、および他の芳香族ケトンが挙げられる。第三級アミノ基を有する光増感剤としては、メチルジエタノールアミン、エチルジエタノールアミン、トリエタノールアミン、フェニルメチルエタノールアミン、および安息香酸ジメチルアミノエチルが挙げられる。市販の光増感剤としては、Biddle Sawyer Corp.からのＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ  ＩＴＸ、ＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ  ＱＴＸ、ＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ  ＰＴＸ、ＱＵＡＮＴＩＣＵＲＥ  ＥＰＤが挙げられる。
【００４１】
概して、光増感剤系または光開始剤系の量は、約０．０１から１０質量％まで様々であってよい。
【００４２】
使用してよいカチオン開始剤の例としては、アリールスルホニウム塩などのオニウムカチオンの塩、並びにイオンアレーン系などの有機金属塩が挙げられる。
【００４３】
使用してよいフリーラジカル開始剤の例としては、２，２’−アゾビス（ジメチル−バレロニトリル）、アゾビス（イソブチロニトリル）、アゾビス（シクロヘキサン−ニトリル）、アゾビス（メチル−ブチロニトリル）などのアゾタイプの開始剤、並びにベンゾイルペルオキシド、ラウロイルペルオキシド、メチルエチルケトンペルオキシド、イソプロピルペルオキシカーボネート、２，５−ジメチル−２，５−ビス（２−エチルヘキサノイル−ペルオキシ）ヘキサン、ジ−ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、クメンヒドロペルオキシド、ジクロロベンゾイルペルオキシド、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、重硫酸ナトリウム、過硫酸カリウム、重硫酸ナトリウムなどの組合せなどの過酸化物開始剤、およびそれらの混合物が挙げられる。もちろん、どのような他の適切なフリーラジカル開始剤を使用してもよい。開始剤の効果的な量は、一般に、反応混合物の０．１質量パーセントから約１０質量パーセントまたは約０．１質量パーセントから約８質量パーセントなどの、反応混合物の約０．１質量パーセントから約１５質量パーセントの範囲内にある。
【００４４】
様々な実施の形態において、１種類以上のモノマーは、重合を行う前に、希釈される。
【００４５】
重合反応から生じるポリマーは、どのような適切な分子量を有してもよい。様々な実施の形態において、そのポリマーは、１０，０００と２５０，０００ダルトンの間などの、１０，０００と１，０００，０００ダルトンの間の平均分子量（Ｍｗ）を有する。当業者には、結果として生じるポリマーの分子量を調節するために、開始剤の量、反応時間、反応温度などを変えてもよいことが理解されよう。
【００４６】
（メタ）アクリレートモノマー、（メタ）アクリルアミドモノマー、または他の適切なモノマーは、当該技術分野に公知のように合成しても、Polysciences, Inc.、Sigma Aldrich, Inc.、およびSartomer, Inc.などの製造供給元から得てもよい。
【００４７】
このポリペプチドは、どのような適切な様式でポリマーにコンジュゲートしてもよい。いくつかの実施の形態において、モノマーは、ポリペプチドを含むように誘導体化されており、それゆえ、ポリペプチドは、ポリマーが形成されているときにポリマーに取り込まれる。いくつかの実施の形態において、ポリペプチドは、ポリマーが形成された後にポリマーにグラフトされる。
【００４８】
ここで図１〜２を参照すると、形成されているときにポリマーにポリペプチドを取り込むための反応スキームの例が示されている。図１において、ビトロネクチンポリペプチド（ＶＮ）は、繰り返しのポリエチレングリコール（ＰＥＧ4）スペーサを介してメタクリレート（ＭＡＡ）にコンジュゲートされている。ホモポリマーは、ポリペプチド（ＶＮ）にコンジュゲートされたモノマー（ＭＭＡ）を適切な条件下で重合することによって生成される。図示された実施の形態において、エタノールは溶媒であり、２，２’−アゾジ（２−メチルブチロニトリル）（ＡＭＢＮ）は熱開始剤であり、反応温度は６８℃であり、反応はアルゴン雰囲気下で行われる。
【００４９】
ここに提示された実施例１に記載されたような、どのような適切なプロセスを使用して、モノマーを、ポリペプチドを含むように誘導体化してもよい。ポリペプチド−モノマーを調製するためのよく知られたプロセスが、発明者としてKizilel, S.等を挙げている、２００７年８月１６日に発行された米国特許出願公開第２００７／０１９００３６号明細書に記載されている。もちろん、モノマーをポリペプチドで誘導体化する他の方法を使用してもよい。
【００５０】
図２に示された実施の形態において、コポリマーは、先の図１に関して記載されたものと類似の反応条件下で、２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）およびＭＭＡ−ＰＥＧ4−ＶＮから形成される。ポリマーを生成するために多種類のモノマーを使用すると、ポリマーが形成されているときに、ポリペプチドがポリマー中に取り込まれるか否かにかかわらず、結果として得られるポリマーの性質を要望どおりにより容易に調整することができる。
【００５１】
実施の形態において、ペプチドモノマーのペプチドが、式１：
式１：  Ｒm−Ｓp−Ｃap
により記載され、式中、Ｒは重合部分であり、「ｍ」は１以上の整数であり、Ｓpは随意的なスペーサであり、Ｃapは細胞接着ポリペプチド（例えば、下記に記載されるような）である。Ｒは、外部エネルギー源の存在下で重合できる、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、マレイミドまたはフマレートを含むα，β−不飽和基すなわちエチレン性不飽和基であってよい。実施の形態において、官能化ペプチドは、光重合性部分または熱重合性部分であってよい重合部分Ｒを有する。
【００５２】
実施の形態において、Ｓpは、例えば、式（Ｏ−ＣＨ2ＣＨＲ’）m2により表されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）（式中、Ｒ’はＨまたはＣＨ3であり、ｍ２は、０から１００または０から２０などの０から２００までの整数である）を含むポリアルキレンオキシドであってよい。このスペーサは、親水性スペーサ、例えば、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）であってよい。実施の形態において、スペーサはＰＥＯ4である。実施の形態において、比較的短い鎖のポリアルキレンオキシドが望ましい。例えば、実施の形態において、Ｓpは、ＰＥＧ2、ＰＥＧ4、ＰＥＧ6、ＰＥＧ8、ＰＥＧ10、ＰＥＧ12、またはＰＰＧ2、ＰＰＧ4、ＰＰＧ6、ＰＰＧ8、ＰＰＧ10、ＰＰＧ12またはＰＰＧ20であってよい。実施の形態において、スペーサは、２０以下の反復単位（すなわち、ＰＥＧ4、ＰＥＧ6、ＰＥＧ8、ＰＥＧ10、ＰＥＧ12、ＰＥＧ14、ＰＥＧ16、ＰＥＧ18またはＰＥＧ20）を有するポリエチレンオキシドである。実施の形態において、Ｓpは、官能基を有するＰＰＧまたはＰＥＧである。例えば、そのＰＥＧまたはＰＰＧスペーサは、マレイミド、チオール、アミン、シラン、アルデヒド、エポキシド、イソシアネート、アクリレートまたはカルボキシル基を有してよい。実施の形態において、ＰＥＧスペーサは、アミン官能基を有するＰＥＧである、Ｊｅｆｆａｍｉｎｅ（登録商標）である。追加の実施の形態において、そのＰＥＧまたはＰＰＧスペーサは分岐していてよい。例えば、分岐ＰＥＧまたはＰＰＯは、Ｙ分岐または星形ＰＥＧまたはＰＰＧであってよい。実施の形態において、これらの分岐ＰＥＧまたはＰＰＯスペーサは、多数のペプチドを、１つの官能ペプチドを通じて基材にコンジュゲートさせられるであろう。
【００５３】
細胞培養表面が一度形成されたら（以下により詳しく論じられている）、スペーサは、ペプチド（Ｃap）を細胞培養表面から離して延ばし、そのペプチドを培養されている細胞に一層アクセス可能にし、細胞培養のための表面の効率を改善するように働くであろう。その上、親水性スペーサは、タンパク質を寄せ付けず、細胞またはタンパク質の官能化ペプチドへの非特異的吸収を防ぐように働くであろう。実施の形態において、細胞培養物品を調製する際のＰＥＯ（ポリエチレンオキシド）などのスペーサを有する細胞接着ペプチドを使用すると、全体的に低い濃度の接着ペプチドを使用して、そのような物品を調製することが可能になる。
【００５４】
実施の形態において、Ｓpはアミノ酸Ｘａａnであってよく、式中、Ｘａａは、独立して任意のアミノ酸であり、ｎは、０から３０まで、０から１０まで、０から６まで、または０から３までの整数である。例えば、実施の形態において、Ｓpはアミノ酸Ｘａａnであってよく、式中、ＸａａはＧであり、ｎ＝１から２０であり、またはＳpはアミノ酸Ｘａａnであってよく、式中、ＸａａはＫであり、ｎ＝１から２０であり、またはＳpはアミノ酸Ｘａａnであってよく、式中、ＸａａはＤであり、ｎ＝１から２０であり、またはＳpはアミノ酸Ｘａａnであってよく、式中、ＸａａはＥであり、ｎ＝１から２０である。実施の形態において、スペーサＳpは、ＬｙｓＧｌｙＧｌｙまたはＬｙｓＴｙｒＧｌｙなどの３つのアミノ酸配列であってよい。実施の形態において、Ｘａａnは、一連の同じアミノ酸である。実施の形態において、スペーサＳpは、Ｘａａnとポリエチレンオキシドまたはポリプロピレンオキシドとの組合せであってよい。Ｘａａnは、リシン、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはアルギニンアミノ酸などの親水性アミノ酸を含んでよい。実施の形態において、Ｘａａnは末端リシンまたはアルギニンを有してもよい。もしくは、実施の形態において、スペーサＳpは、任意の組合せで、ポリエチレンオキシドスペーサとアミノ酸スペーサとを含んでもよい。実施の形態において、Ｓpは、パルミチン酸、ステアリン酸、ラウリン酸またはヘキサエチレンジアミンなどの疎水性スペーサであってよい。実施の形態において、Ｓpはメタクリル酸カルボキシエチルであってよい。
【００５５】
重合部分は、ポリエチレンオキシドを通じて、リシンなどのアミノ酸の側鎖を通じて、またはアミノ酸のＮ末端で、などのようにどのような適切な様式でスペーサＳpに結合してよい。アミノ酸Ｘａａnは、それ自体を分解から保護するために、アセチル化および／またはアミド化されてもよい。しかしながら、Ｘａａnがアセチル化されている場合、重合部分は、アミノ酸のＮ末端を通じてＸａａnに結合され得ない。例えば、メタクリル酸は、ＳpがＸａａnであり、Ｘａａがリシンであり、ｎ＝１、およびＲmがメタクリル酸である場合、リシンアミノ酸の側鎖を通じて、リシンアミノ酸に結合されるであろう。
【００５６】
実施の形態において、スペーサＳpはＸａａnであり、Ｘａａは末端のリシンを有する。実施の形態において、Ｘａａnは重合部分Ｒmに結合されていてよい。例えば、Ｘａａnは、（ＭＡＡ）ＬｙｓＧｌｙＧｌｙまたは（ＭＡＡ）ＬｙｓＴｙｒＧｌｙであってよく、式中、ＭＡＡは、末端のリシンアミノ酸の側鎖を通じてＸａａnに結合した重合部分であるメタクリル酸（ＭＡＡ）である。追加の実施の形態において、重合部分は、Ｎ末端がアセチル化されていなければ、Ｘａａnアミノ酸またはアミノ酸鎖のＮ末端に結合されていてよい。各官能化ペプチドは、少なくとも１つの重合部分を有し、複数有していてもよい。
【００５７】
様々な実施の形態において、ポリペプチドは、既に形成されたポリマーにグラフトされる。ポリペプチドが、ポリマーのペンダント反応性基にコンジュゲートできるアミノ酸を含むことが好ましい。ポリマーがポリペプチドとの反応のために有することのある反応性基の例としては、マレイミド、グリシジル、イソシアネート、イソチオシアネート、活性化エステル、活性化カーボネート、無水物などが挙げられる。一例として、例えば、アミド結合の形成により、求核付加反応を可能にする官能基を有する任意の天然アミノ酸またはバイオミメティックアミノ酸が、適切な反応性基を有するポリペプチドにコンジュゲートする目的のために、ポリペプチドに含まれてもよい。リシン、ホモリシン、オルニチン、ジアミノプロピオン酸、およびジアミノブタン酸が、カルボキシル基などの、ポリマーの反応性基にコンジュゲーションするための適切な性質を有するアミノ酸の例である。その上、Ｎ末端アミンがキャッピングされていない場合、カルボキシル基にコンジュゲートするために、ポリペプチドのＮ末端アルファアミンを使用してもよい。様々な実施の形態において、前記ポリマーとコンジュゲートするポリペプチドのアミノ酸は、ポリペプチドのカルボキシル末端位置またはアミノ末端位置にある。
【００５８】
ポリペプチドは、どのような適切な技法によりポリマーにコンジュゲートされてもよい。ポリペプチドは、アミノ末端のアミノ酸、カルボキシル末端のアミノ酸、または内部のアミノ酸によりポリマーにコンジュゲートされてもよい。適切な技法の１つには、当該技術分野に一般に知られているような、１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）／Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学反応がある。ＥＤＣおよびＮＨＳまたはＮ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ−ＮＨＳ）が、ポリマーの自由なカルボキシル基と反応して、アミン反応性ＮＨＳエステルを生成できる。ＥＤＣはポリマーのカルボキシル基と反応して、加水分解を受けやすいアミン反応性Ｏ−アシルイソウレア中間体を生成する。ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳの付加は、アミン反応性Ｏ−アシルイソウレア中間体をアミン反応性ＮＨＳまたはスルホ−ＮＨＳエステルに転化することによって、アミン反応性Ｏ−アシルイソウレア中間体を安定化させて、二段階工程を可能にする。ポリマーの活性化後、次いで、ポリペプチドが加えられ、ポリペプチドの末端アミンがアミン反応性エステルと反応して、安定したアミド結合を形成し、このように、ポリペプチドをポリマー層にコンジュゲートすることができる。ポリペプチドをポリマーにコンジュゲートするために、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応が使用される場合、Ｎ末端アミノ酸は、リシン、オルニチン、ジアミノ酪酸、またはジアミノプロピオン酸などのアミン含有アミノ酸であることが好ましい。もちろん、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、ヒドロキシルなどの、許容されるどのような求核試薬を使用してもよい。
【００５９】
ＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応により、ポリマーへのポリペプチドのゼロ長架橋が生じる。末端アミンを有する、ポリ（エチレングリコール）リンカー（例えば、Quanta BioDesign, Ltd.から得られる）などのリンカーまたはスペーサをポリペプチドのＮ末端アミノ酸に加えてもよい。Ｎ末端アミノ酸にリンカーを加える場合、そのリンカーはＮ−ＰＧ−アミド−ＰＥＧX−酸であることが好ましく、式中、ＰＧは、Ｆｍｏｃ基、ＢＯＣ基、ＣＢＺ基またはペプチド合成を受けやすい任意の他の基などの保護基であり、Ｘは、２、４、６、８、１２、２４または利用してよいいずれかの他の別個のＰＥＧである。もちろん、ポリペプチドをポリマーにグラフトするためのどの他の適切な機構を使用してもよい。
【００６０】
ポリペプチドがポリマーにどのようにコンジュゲートされているかにかかわらず、例えば、ポリペプチドにコンジュゲートした誘導体化されたモノマーの取り込みにより、またはグラフト反応により、ポリペプチドが結合していないまたは結合することになっていないモノマー（非ペプチド−モノマー）に対する、ポリペプチドが結合したまたは結合することになっているモノマー（ペプチド−モノマー）の比は、膨潤性、水溶性、弾性率などの所望の性質を達成するために変えてもよい。実施の形態において、ペプチドモノマー対非ペプチドモノマーのモル比は、約１：５から１：２０、約１：１０、約１：９などの約１：１から約１：５０である。
【００６１】
実施の形態において、ポリペプチドは、リンカーまたはスペーサを介してポリマーにコンジュゲートされる。ポリペプチドからポリマーの表面への距離を増加させるために、繰り返しポリ（エチレングリコール）リンカー、または任意の他の適切なリンカーなどのリンカーまたはスペーサを使用してもよい。そのリンカーはどのような適切な長さのものであってもよい。例えば、リンカーが繰り返しポリ（エチレングリコール）リンカーである場合、そのリンカーは、２と１０の間の繰り返しエチレングリコール単位を含有してよい。いくつかの実施の形態において、リンカーは、約４の繰り返しエチレングリコール単位を有する繰り返しポリ（エチレングリコール）リンカーである。ポリペプチドの全て、いくつかがリンカーを介してポリマーにコンジュゲートしていても、全くしていなくてもよい。使用してよい他の可能性のあるリンカーとしては、ポリ（グリシン）やポリ（β−アラニン）などのポリペプチドリンカーが挙げられる。
【００６２】
リンカーは、細胞培養に使用された場合、ポリペプチドの細胞へのより良好な近づきやすさを提供するように働くであろう。その上、ポリペプチドがモノマーにコンジュゲートされる実施の形態においてリンカーを使用すると、モノマーのホモポリマーまたはコポリマーへの重合の効率が増加するであろう。
【００６３】
ポリペプチドは、環化されていても、環状部分を含んでもよい。環状ポリペプチドを形成するどのような適切な方法を使用してもよい。例えば、適切なアミノ酸側鎖の自由なアミノ基および適切なアミノ酸側鎖の自由なカルボキシル基を環化させることによって、アミド結合を形成してもよい。また、ペプチド配列における適切なアミノ酸側鎖の自由なスルフヒドリル基の間でジスルフィド結合を形成してもよい。環状ポリペプチド（またはその部分）を形成するために、どのような適切な技法を使用してもよい。一例として、例えば、国際公開第１９８９／００５１５０号に記載されている方法を使用して、環状ポリペプチドを形成してもよい。ポリペプチドがカルボキシ末端とアミノ末端との間にアミド結合を有する、頭−尾結合環状ポリペプチドを使用してもよい。ジスルフィド結合の代わりは、例えば、Koide et al, 1993, Chem. Pharm. Bull. 41(3):502-6; Koide et al.,1993, Chem. Pharm. Bull. 41(9):1596-1600; またはBesse and Moroder, 1997, Journal of Peptide Science, vol. 3, 442-453に記載されているような、２つのセレノシステインを使用したジセレニド結合または混合セレニド／スルフィド結合であってもよい。
【００６４】
ポリペプチドは、当該技術分野に公知のように合成しても（あるいは分子生物学技法により産生しても）、またはAmerican Peptide Company、CEM Corporation、またはGenScript Corporationなどの製造供給元から得てもよい。リンカーは、当該技術分野に公知のように合成しても、またはQuanta BioDesign, Ltd.から市販されている個別ポリエチレングリコール（ｄＰＥＧ（登録商標））リンカーなどのように、製造供給元から得てもよい。
【００６５】
様々な実施の形態において、ポリペプチド、またはその一部は、細胞接着活性を有する、すなわち、ポリペプチドがポリマーにコンジュゲートされるときに、ポリペプチドにより、細胞がポリペプチド含有ポリマーの表面に接着することができる。一例として、ポリペプチドは、インテグリン群からのタンパク質により認識される、または細胞接着を維持できる細胞分子との相互作用をもたらすアミノ酸配列、またはその細胞接着部分を含んでもよい。例えば、ポリペプチドは、コラーゲン、ケラチン、ゼラチン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）などに由来するアミノ酸配列、またはその一部を含んでよい。様々な実施の形態において、ポリペプチドは、ＡｒｇＧｌｙＡｓｐ（ＲＧＤ）のアミノ酸配列を含む。
【００６６】
ここでの実施の形態に使用してよいペプチドの例が表１に列挙されている。
【００６７】
【表１】
2015505473.tif 000005
【００６８】
ここに論じられたポリペプチドのいずれについても、具体的に特定されたアミノ酸または公知のアミノ酸を保存アミノ酸で置き換えてもよいことが理解されよう。「保存アミノ酸」は、ここに用いたように、第２のアミノ酸と機能的に類似のアミノ酸を称する。そのようなアミノ酸は、公知の技法により、ポリペプチドの構造または機能への妨害を最小にして、ポリペプチドにおいて互いに置き換えられてもよい。以下の５種類の基の各々は、互いに保存置換基であるアミノ酸を含有する：脂肪族：グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）；芳香族：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；硫黄含有：メチオニン（Ｍ）、システイン（Ｃ）；塩基性：アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）；酸性：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）。
【００６９】
ポリマーの形成中にグラフトされるかまたは取り込まれるか否かにかかわらず、１つ以上のポリペプチドをポリマーに任意の適切な量でコンジュゲートしてもよい。ポリペプチドの比率は、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーを水溶性にするのに十分に高いことが好ましい。様々な実施の形態において、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーに対するポリペプチドの質量百分率は、１０％以上、２０％以上、４０％以上、６０％以上などである。１５００ダルトン以上の分子量を有するポリペプチドについて、良好な水溶性、固定化効率および許容される細胞接着を達成するための、そのような質量百分率が決定されてきた。
【００７０】
ここに記載されたポリマーは、任意の適切な接着ポリペプチドまたはポリペプチドの組合せがコンジュゲートされ得る合成表面を提供し、未知の成分を有する生体基質または血清の代替物を提供する。現在の細胞培養の実施において、ある細胞のタイプは、細胞が培養表面に接着し、持続的に培養されるために、その表面上に生体ポリペプチドまたはペプチドの組合せを必要とすることが知られている。例えば、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ肝細胞は、血清の存在下でプラスチック製培養製品に接着できる。血清は、特定の細胞が付着できる表面を提供するために、プラスチック製培養製品に接着できるポリペプチドを提供できることも知られている。しかしながら、生物学的に誘導された基質および血清は、未知の成分を含有する。細胞接着を生じる血清または生物学的に誘導された基質の特定の成分または成分（ペプチド）の組合せが公知である細胞について、それらの公知のポリペプチドは、合成でき、ここに記載されたようなポリマーに施して、未知の起源または組成の成分がないか非常に少ない合成表面上で細胞を培養することができる。
【００７１】
細胞培養培地組成物
ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーは、細胞培養物品の被覆または細胞の培養に使用するために、水溶液中に溶解されてもよい。実施の形態において、その水溶液は、有機溶媒を含まない、または実質的に含まない。例えば、重合後のポリマー中に残留するある程度の有機溶媒の結果として、その水溶液中に微量の有機溶媒が存在するかも知れないことが理解されよう。ここに用いたように、「実質的に含まない」とは、水溶液中の有機溶媒に関して、その水溶液が２質量％未満しか有機溶媒を含まないことを意味する。多くの実施の形態において、水溶液は、１％未満、０．５％未満、０．２％未満、または０．１％未満しか有機溶媒を含有しない。水溶液が含まない有機溶媒の例としては、メタノール、エタノール、ブタノール、プロパノール、オクタノール、ヘキサン、ヘプタン、アセトン、酢酸アセチル、酢酸エチル、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられる。
【００７２】
ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーは、被覆または培養の目的のためにどのような適切な濃度で水溶液中に溶解されてもよい。例えば、その水溶液は、０．００３ｍｇ／ｍｌと０．０５ｍｇ／ｍｌの間のポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーなどの、０．００１ｍｇ／ｍｌと１ｍｇ／ｍｌのポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーを含有してよい。
【００７３】
実施の形態において、水溶液は細胞培養培地溶液であり、これは、その溶液が哺乳類細胞などの細胞の培養を支持するように構成されていることを意味する。実施の形態において、細胞は、ヒト胚性幹細胞またはヒト間葉系幹細胞などの幹細胞である。細胞培養培地溶液は、約７．２と７．５の間などの、約７と約８の間のｐＨを有してよく、このｐＨは、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液などのｐＨ緩衝液によって緩衝されてもよい。この細胞培養培地溶液は、グルコース、アミノ酸、ビタミン類、無機塩などの、細胞培養に適切などのような成分を含んでもよい。細胞培養成分よび濃度は当該技術分野で公知である。例えば、Burgener A, Butler. “Medium Development”. In Cell Culture Technology For Pharmaceutical and Cell-Based Therapies. Edited by Ozturk SS and Hu WS. 2006を参照のこと。実施の形態において、細胞培養培地はｄ−グルコースを含む。
【００７４】
細胞培養培地に含んでよい様々な成分および培地中のそれらの成分の濃度の例が以下に与えられている。一例として、細胞培養培地は、約２ｍＭから約３０ｍＭのｄ−グルコースなどの、約１ｍＭのｄ−グルコースから約５０ｍＭのｄ−グルコースを含んでよい。細胞培養培地に含んでもよいアミノ酸の例としては、１−アルギニン、１−システイン、１−ヒスチジン、１−イソロイシン、１−ロイシン、１−リシン、１−メチオニン、１−フェニルアラニン、１−スレオニン、１−トリプトファン、１−チロシン、１−バリンなどが挙げられる。アミノ酸は、約１×１０-3ｍＭから約２０ｍＭなどの、どのような適切な濃度で存在してもよい。アミノ酸の濃度は、アミノ酸に応じて様々であってよいことが理解されよう。細胞培養培地中に、無機塩が適切な濃度で含まれてもよい。適切な無機塩の例としては、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、硫酸銅、硝酸第二鉄、硫酸第一鉄、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。
【００７５】
実施の形態において、ポリマー−ポリペプチドは、GIBCO社から市販されているものなどのＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）；Invitrogen社から市販されている、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の増殖および展開のために特別に配合された、ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）既知組成の無血清かつフィーダー細胞を含まない培地（ＳＦＭ）；StemCell Technologies, Inc.社から市販されている、ヒト胚性幹細胞のためのｍＴｅＳＲ（商標）１維持培地；StemCell Technologies, Inc.社から市販されている、ヒト間葉系幹細胞の培養のための標準化された異種由来成分を含まない無血清培地である、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ（登録商標）−ＸＦ培地などの市販の細胞培養培地中に溶解される。
【００７６】
実施の形態において、細胞培養培地は既知組成培地である。既知組成培地の全ての成分は、公知の化学構造を有するか、または公知の構造の成分（例えば、公知の構造のモノマーから形成された合成ポリマー）から形成されているので、培養条件における変動性およびそれゆえの細胞応答を減少させ、再現性を増加させることができる。その上、汚染の可能性が減少する。さらに、拡大する能力が、少なくとも一部には、先に論じられた要因のために、容易になる。既知組成培養培地は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の増殖および展開のために特別に配合された、既知組成の無血清かつフィーダー細胞を含まない培地である「ＳｔｅｍＰｒｏ」としてInvitrogen社（郵便番号９２００８、カリフォルニア州、カールスバッド、１６００ファラデーアヴェニュー、ＰＯボックス６４８２所在のInvitrogen Corporation）から、またヒト胚性幹細胞の「ｍＴｅＳＲ」１維持培地としてStemCell Technologies, Inc.社から市販されている。「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」−ＸＦ培地は、StemCell Technologies, Inc.社から市販されている既知組成培地の別の例である。
【００７７】
実施の形態において、細胞培養培地は、ポリマー−ポリペプチドが加えられるならし培地である。
【００７８】
実施の形態において、細胞培養培地溶液などの水溶液は、架橋剤を含まないか、実質的に含まない。ここに用いたように、「架橋剤」は、ポリマー−ポリペプチドのポリマー部分における架橋を誘発できるまたはそれを架橋できる化学物質を称する。ここに用いたように、「実質的に含まない」とは、架橋剤に関するように、微量の架橋剤が存在した結果として、ポリマーにおいて知覚できる架橋が生じないことを意味する。ポリマー部分が実質的に含まない架橋剤の例としては、“Bioconjugate Techniques, Second Edition by Greg T. Hermanson”に記載されているものなどの、ホモ多官能性またはヘテロ多官能性架橋剤などのよく知られた架橋剤が挙げられる。実施の形態において、前記組成は、相互貫入網目構造または半相互貫入網目構造の形成をもたらし得る多官能性オリゴマーおよびポリマーも「実質的に含まない」。
【００７９】
コンジュゲートしたポリペプチドを有するポリマーを含有する細胞培養培地は、どのような適切な様式で殺菌しても差し支えない。実施の形態において、ポリマー−ポリペプチドは、ガンマ線により殺菌され、例えば、乾燥粉末として、無菌法を使用して、殺菌済み細胞培養培地に加えられる。天然に生じるまたは動物由来の細胞外基質タンパク質に使用されるような濾過滅菌ではなく、ガンマ線または電子ビームが、ここに記載された合成ポリマー−ポリペプチドに有益に使用されるであろう。もちろん、所望であれば、濾過滅菌を利用してもよい。
【００８０】
コンジュゲートしたポリペプチドを有するポリマーを含有する細胞培養培地は、溶液中にポリマー−ポリペプチドを維持するために、室温（２５℃）以下で貯蔵してよい。一例として、その培地は、貯蔵のために冷蔵（約５℃）してもよい。冷蔵は、培地の貯蔵寿命を長くするように働くであろう。
【００８１】
被覆プロセス
ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーは、どのような適切な様式で細胞培養物品上に被覆してもよい。一般に、先に記載したような、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーを含有する、細胞培養培地などの水溶液が、細胞培養物品の表面上に配置される。次いで、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーが細胞培養物品の表面に接着するまで、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーは、３７℃、２５℃などの細胞培養条件下で水溶液中の細胞培養物品と共にインキュベーションされる。実施の形態において、接着プロセスは、数秒または数分以内に直ちに始まる。
【００８２】
ポリマーはその物品の表面に共有結合することも可能であるが、そのポリマーは、典型的に、非共有相互作用によって、その物品に接着する。そのポリマーを基質に接着するであろう非共有相互作用の例としては、化学吸着、水素結合、表面相互貫入、イオン結合、ファンデルワールス力、疎水性相互作用、双極子間相互作用、機械的連結、およびそれらの組合せが挙げられる。
【００８３】
ポリマーが、３７℃での細胞培養培地の存在下などの、細胞培養条件中に、物品の表面に結合し、被覆することが好ましい。ポリマー−ポリペプチドは、細胞培養培地中で安定であり、それと相溶性であるので、ポリマー−ポリペプチドのある程度が培地中に残っている、または結合したポリマー−ポリペプチドと未結合のポリマー−ポリペプチドとの間の平衡が存在することが容認できる。培地を補充した際、例えば、使用済み培地の除去および新たな培地（例えば、ポリマー−ポリペプチドを含まない）の取替えの際に、結合したポリマー−ポリペプチドが基体に結合したままであることが好ましい。実施の形態において、以前に結合したポリマー−ポリペプチドの９５％以上または９９％以上などの９０％以上が、培地の取替え中に結合したままである。実施の形態において、取替え培地は、基体上に所望の平衡したポリマー−ポリペプチド被覆を維持するために、適切な濃度のポリマー−ポリペプチドを含んでよい。
【００８４】
どの特定の理論にも拘束することを意図するものではないが、ポリマーに対するポリペプチドの高い比率は、水溶液からの適切な基体上のポリマーの意外な吸着および吸着後の非水溶性に役立つと考えられる。高いポリペプチド含有量は、ポリペプチド間の高密度の水素結合をもたらし、物理的架橋または凝集を誘発するかもしれず、これは、天然に生じるタンパク質と類似の挙動である。いくつかの特定のポリペプチドが、それらの転移温度未満で水溶液中に可溶性であるが、それらは、温度が転移温度より高く上昇したときに、疎水的に壊れ凝集する。そのような疎水的崩壊は、３７℃などの細胞培養条件に曝されるポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーの吸着にある役割を果たすであろう。
【００８５】
ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーで被覆される細胞培養物品の表面は、どのような適切な材料から形成されてもよい。例えば、細胞培養物品の表面は、セラミック物質、ガラス、プラスチック、ポリマーまたはコポリマー、それらの任意の組合せ、またはある材料の別の材料上の被覆から形成されてもよい。そのような基礎材料としては、ソーダ石灰ガラス、パイレックス（登録商標）ガラス、バイコール（登録商標）ガラス、石英ガラスなどのガラス材料；シリコン；ポリ（塩化ビニル）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（メタクリル酸メチル）、酢酸ビニル・無水マレイン酸の共重合体、ポリ（ジメチルシロキサン）モノメタクリレート、環状オレフィンポリマー、フルオロカーボンポリマー、ポリスチレン、ボルプロピレン、ポリエチレンイミンなどの樹枝状ポリマーを含むプラスチックまたはポリマー；酢酸ビニル・無水マレイン酸の共重合体、スチレン・無水マレイン酸の共重合体、エチレン・アクリル酸の共重合体、またはこれらの誘導体などのコポリマーが挙げられる。
【００８６】
実施の形態において、ポリマー−ポリペプチドが接着する細胞培養物品の表面は、約０°から約５０°、約０°から約３０°、約１２°から約８５°、約２５°から約７０°、約３０°から約６０°などの約０°から約１００°の水接触角（液滴測定）を有する。基体が、適切な接触角を示すように処理されてもよいことが理解されよう。例えば、基体は、コロナ処理またはプラズマ処理されてもよい。真空または大気圧プラズマの例としては、一次と二次の両方のＲＦおよびマイクロ波プラズマ、誘電体バリア放電、および空気、酸素、窒素、アルゴン、二酸化炭素、亜酸化窒素、または水蒸気を含む分子または混合ガス中に生成されるコロナ放電が挙げられる。一例として、ＴＣＴポリスチレンまたは「ＣｅｌｌＢＩＮＤ」処理ポリスチレンなどのプラズマ処理ポリスチレンが、ポリマー−ポリペプチド付着ための良好な基体を提供する。天然に生じる動物由来の生物学的接着タンパク質も、そのような表面に対して良好な結合を示す。したがって、天然に生じるタンパク質が容易に付着する表面も、ポリマー−ポリペプチド付着のための良好な基体を提供するであろう。
【００８７】
細胞培養物品
ここに記載されたポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーは、６，１２，９６，３８４および１５３６ウェルプレートなどのシングルおよびマルチウェルプレート、瓶、ペトリ皿、フラスコ、ビーカー、プレート、ガラスまたはポリマービーズなどのマイクロキャリア、ローラーボトル、区画および多区画培養スライドなどのスライド、試験管、カバースリップ、バッグ、膜、中空繊維、ビーズおよびマイクロキャリア、カップ、スピナーボトル、潅流チャンバ、バイオリアクタ、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）および発酵槽などの任意の適切な細胞培養物品の表面に結合させてもよい。
【００８８】
図３Ａを参照すると、細胞を培養するための物品１００の側面図が示されている。物品１００は、表面１５を有する基礎材料基体１０を備えている。ポリペプチド７０にコンジュゲートしたポリマー２０が、基礎材料基体１０の表面１５上に配置されている。図示したように、ポリペプチド７０は、先に説明したように、直接的にまたはリンカー８０を介して間接的に、ポリマー２０にコンジュゲートまたは共有結合されてよい。図示されていないが、ポリペプチド７０にコンジュゲートしたポリマー２０は、基礎材料基体１０の一部の上に配置されてもよい。その基礎材料は、先に記載されたものなどの、細胞を培養するのに適したどのような材料であってもよい。
【００８９】
図３Ｂに示されるように、基礎材料基体１０とポリペプチド７０にコンジュゲートした被覆ポリマー２０との間に中間層３０が配置されてもよい。中間層３０は、ポリペプチド７０にコンジュゲートした被覆ポリマー２０の基体１０への結合を改善するように、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーを含有する水溶液の拡散を促進するように、未被覆の表面１５の部分を疎細胞性(cytophobic)にして被覆区域上での細胞の増殖を促進するように、例えば、パターン印刷などにより、所望であれば、地形的特徴を提供するように構成されてもよい。例えば、基体１０がガラス基板である場合、ガラス基板の表面をエポキシ被覆またはシラン被覆で処理することが望ましいであろう。様々なポリマー基礎材料基体１０について、ポリアミド、ポリイミド、ポリプロピレン、ポリエチレン、またはポリアクリレートの中間層３０を提供することが望ましいであろう。図示されていないが、ポリペプチド７０にコンジュゲートした被覆ポリマー２０は、中間層３０の一部に配置されてもよいことが理解されよう。中間層３０は、基礎材料基体１０の一部の上に配置されてもよいことがさらに理解されよう。
【００９０】
物品１００は、数多くの実施の形態において、ペトリ皿、マルチウェルプレート、フラスコ、ビーカーまたはウェルを有する他の容器などの、ウェルを有する細胞培養物品である。ここで図４を参照すると、基礎材料１０から形成された物品１００は、１つ以上のウェル５０を含んでよい。ウェル５０は、側壁５５および表面１５を備えている。
【００９１】
図４Ｂ〜Ｃを参照すると、ポリペプチド７０にコンジュゲートしたポリマー２０が表面１５または側壁５５（または、図１に関して先に論じたように、表面１５または側壁５５とポリペプチド７０にコンジュゲートした被覆ポリマー２０との間に、１つ以上の中間層３０が配置されてもよい）またはその一部に配置されてもよい。図４Ｃに示されるように、側壁５５が、ポリペプチド７０にコンジュゲートしたポリマー２０により被覆されてもよい。
【００９２】
様々な実施の形態において、基礎材料１０の表面１５は、表面１５に所望の性質または特徴を与えるために、物理的または化学的のいずれかで、処理されている。例えば、上述したように、表面１５は、コロナ処理またはプラズマ処理されていてもよい。
【００９３】
実施の形態において、ポリペプチド７０にコンジュゲートした被覆ポリマー２０は、中間層３０または基礎材料１０上に配置されているか否かにかかわらず、下の基体を均一に被覆することが好ましい。「均一に被覆された」は、所定の区域、例えば、培養プレートのウェルの表面の層２０が、約５ｎｍ以上の厚さで、その区域を完全に被覆していることを意味する。均一に被覆された表面の厚さは、表面に亘り様々であってよいが、下の層（中間層３０または基礎材料１０のいずれか）が曝露される、均一に被覆された表面の区域はない。不均一な表面に亘る細胞応答は、均一な表面に亘る細胞応答よりもばらつきがある傾向にある。
【００９４】
様々な実施の形態において、物品１００は、約５ｍｍ2超の面積を有する表面２５を備えた均一に被覆された層２０を含む。表面１５の面積が小さすぎる場合、ヒト胚性幹細胞などのいくつかの細胞が、細胞のコロニーまたは群集（例えば、約０．５ｍｍの直径を有する）として播種され、定量的な細胞応答を生成するのに十分な数のコロニーの結合を確実にするために適切な表面が望ましいので、信頼できる細胞応答が容易に観察できないであろう。数多くの実施の形態において、物品１００は、均一に被覆された表面１５を有するウェル５０を有し、ここで、表面１５は、約０．１ｃｍ2超、約０．３ｃｍ2超、約０．９ｃｍ2超、または約１ｃｍ2超の面積を有する。
【００９５】
コンジュゲートしたポリペプチドを含有する合成ポリマー上の細胞のインキュベーション
上述したようなコンジュゲートしたポリペプチドを含有するポリマーを有する細胞培養物品に細胞を播種してよい。実施の形態において、細胞は、上述したようなポリマー−ポリペプチドを含む細胞培養培地中に導入される。細胞培養プロセス中、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーは、細胞培養物品の表面を被覆する。
【００９６】
理論により拘束することを意図するものではないが、細胞間相互作用は、細胞播種培地中にポリマー−ポリペプチドを含ませることによって、向上するであろうと考えられる。すなわち、細胞間相互作用は、培地中で生じるであろうし、ポリマー−ポリペプチドが細胞培養物品の表面に付着する前に、培地中のポリマー−ポリペプチドにより促進されるであろう。
【００９７】
ここに提示された教示にしたがって、どのようなタイプの細胞を使用してもよい。例えば、細胞は、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、腸細胞、腎臓細胞、または他の臓器からの細胞、幹細胞、島細胞、血管細胞、白血球、癌細胞などの結合組織細胞であってよい。細胞は、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞であってよいが、細菌、酵母、または植物細胞などの非哺乳類細胞であってもよい。
【００９８】
数多くの実施の形態において、細胞は、当該技術分野で一般に理解されているように、連続的に分裂する（自己再生）能力を有し、多種多様な特殊な細胞に分化できる細胞を称する幹細胞である。いくつかの実施の形態において、幹細胞は、検体の臓器または組織から単離される多能性(multipotent)、全能性、または多能性(pluripotent)幹細胞である。そのような細胞は、完全に分化したまたは成熟した細胞タイプを生じることができる。幹細胞は、自己またはそうではない骨髄由来幹細胞、神経幹細胞、または胚性幹細胞であってよい。幹細胞はネスチン陽性であってよい。幹細胞は造血幹細胞であってよい。幹細胞は、上皮組織、脂肪組織、臍帯血液、肝臓、脳または他の臓器に由来する多分化能細胞であってよい。様々な実施の形態において、幹細胞は、未分化胚性幹細胞などの未分化幹細胞である。
【００９９】
細胞を播種する前に、細胞を収穫し、細胞を表面に一旦播種したらその中で培養すべき増殖培地などの、適切な培地中に懸濁させてよい。上述したように、培地は、細胞培養条件下で培地中の細胞培養表面上でインキュベーションされたときに、被覆を形成するポリマー−ポリペプチドを含んでもよい。例えば、細胞は、血清含有培地、ならし培地、または既知組成培地中に懸濁させ、培養してもよい。ここに用いたように、「既知組成培地」は、未知の組成の成分を含有しない細胞培養培地を意味する。既知組成培地は、様々な実施の形態において、未知の組成のタンパク質、加水分解物、またはペプチドを含有しない。いくつかの実施の形態において、ならし培地は、組換え成長ホルモンなどの、既知の組成のポリペプチドまたはタンパク質を含有する。既知組成培地の全成分は既知の化学構造を有するので、培養条件におけるばらつき、それゆえ、細胞応答を減少させ、再現性を増加させることができる。その上、汚染の可能性が減少する。
【０１００】
その中で細胞がインキュベーションされる培地に、１種類以上の成長因子または他の因子を加えてもよい。これらの因子は、細胞増殖、接着、自己再生、分化などを促進させるものであってよい。培地に加えてよいまたは含ませてよい因子の例としては、筋肉形成因子（ＭＭＰ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン、神経成長因子（ＮＧＦ）、エリスロポエチン、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）、アクチビンＡ（ＡＣＴ）、造血成長因子、レチノイン酸（ＲＡ）、インターフェロン、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）などの線維芽細胞成長因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ペプチド成長因子、ヘパリン結合性増殖因子（ＨＢＧＦ）、肝細胞増殖因子、腫瘍壊死因子、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）ＩおよびＩＩ、形質転換成長因子−β１（ＴＧＦβ１）などの形質転換成長因子、およびコロニー刺激因子が挙げられる。
【０１０１】
細胞は、どのような適切な濃度で播種してもよい。典型的には、細胞は、基体１ｃｍ2当たり約１０，０００細胞／ｃｍ2から約５００，０００細胞／ｃｍ2の濃度で播種される。例えば、細胞は、基体１ｃｍ2当たり約５０，０００細胞／ｃｍ2から約１５０，０００細胞／ｃｍ2の濃度で播種してよい。しかしながら、これよりも高濃度および低濃度で難なく使用できる。インキュベーションの時間および、温度、ＣＯ2レベルとＯ2レベル、成長培地などの条件は、培養されている細胞の性質に応じて決まり、容易に変更することができる。細胞を前記表面上でインキュベーションする期間は、所望の細胞応答に応じて変わりうる。
【０１０２】
培養される細胞は、（ｉ）調査研究または治療用途の開発に使用するために、既知組成培地の合成表面上で培養される十分な量の未分化の幹細胞の入手、（ｉｉ）培養される細胞の調査研究、（ｉｉｉ）治療用途の開発、および（ｉｖ）治療目的を含む、どのような適切な目的に使用してもよい。
【０１０３】
態様
組成物、方法、および物品の多種多様な態様がここに記載されている。そのような組成物、方法、および物品のいくつかの選り抜きの実施例の纏めが、下記に提供されている。
【０１０４】
第１の態様において、水性細胞培養培地組成物は、（ｉ）哺乳類細胞の培養を支持するように構成された細胞培養水溶液、および（ｉｉ）その細胞培養水溶液中に溶解したポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーを含み、ここで、ポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーは、細胞培養条件下で細胞培養物品の表面に接着するように構成されており、細胞培養条件下で細胞培養表面上において水性細胞培養培地組成物をインキュベーションすると、ポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーが前記表面に接着する。
【０１０５】
第２の態様は、細胞培養培地組成物が既知組成の組成物である、第１の態様の組成物である。
【０１０６】
第３の態様は、細胞培養培地が動物由来の成分を含まない、第１または第２の態様の組成物である。
【０１０７】
第４の態様は、（ｉ）哺乳類細胞の培養を支持するように構成された細胞培養水溶液、および（ｉｉ）その細胞培養水溶液中に溶解したポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーを含む水性細胞培養培地組成物であって、そのポリマーが、直鎖の主鎖を有しかつ架橋を含まないポリマー、分岐鎖の主鎖を有しかつ架橋を含まないポリマー、および架橋を含まない星形ポリマーからなる群より選択され、ポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーが２０℃以下で水溶性であり、前記組成物が有機溶媒を実質的に含まず、細胞培養条件下で細胞培養表面上において水性細胞培養培地組成物をインキュベーションすると、ポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーが前記表面に接着する、水性細胞培養培地組成物である。
【０１０８】
第５の態様は、ポリペプチドにコンジュゲートしていない実質的に類似のポリマーが、３７℃で水に不溶性である、第４の態様の組成物である。
【０１０９】
第６の態様は、ポリマーが直鎖の主鎖を有し、架橋を含まない、第４または第５の態様の組成物である。
【０１１０】
第７の態様は、細胞培養培地が動物由来の成分を含まない、第４から第６の態様いずれかの組成物である。
【０１１１】
第８の態様は、細胞培養培地組成物が既知組成の組成物である、第４から第７の態様いずれかの組成物である。
【０１１２】
第９の態様は、ポリマーが、二官能性以上のモノマーから形成されない、第４から第８の態様いずれかの組成物である。
【０１１３】
第１０の態様は、ポリマーが、コンジュゲートしたポリペプチドを含む少なくとも１種類のモノマーから形成された、第４から第９の態様いずれかの組成物である。
【０１１４】
第１１の態様は、コンジュゲートしたポリペプチドを含む少なくとも１種類のモノマーがメタクリル酸である、第１０の態様の組成物である。
【０１１５】
第１２の態様は、ポリマーが、（ｉ）ポリペプチドにコンジュゲートしたメタクリル酸および（ｉｉ）ヒドロキシエチルメタクリレートの重合から形成される、第４から第１１の態様いずれかの組成物である。
【０１１６】
第１３の態様は、ポリペプチドにコンジュゲートしたメタクリル酸対ヒドロキシエチルメタクリレートのモル比が、１対１５と１対５の間である、第１２の態様の組成物である。
【０１１７】
第１４の態様は、ポリペプチドにコンジュゲートしたメタクリル酸対ヒドロキシエチルメタクリレートのモル比が、約１対９である、第１２の態様の組成物である。
【０１１８】
第１５の態様は、ポリマーが、ヒドロキシエチルメタクリレートおよびＭＡＡ−ＰＥＯ4−ポリペプチドの重合から形成され、ここで、ＭＭＡがメタクリル酸であり、ＰＥＯがポリエチレンオキシドである、第４から第１４の態様いずれかの組成物である。
【０１１９】
第１６の態様は、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーに対するポリペプチドの質量百分率が１０％超である、第４から第１５の態様いずれかの組成物である。
【０１２０】
第１７の態様は、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーに対するポリペプチドの質量百分率が４０％超である、第４から第１５の態様いずれかの組成物である。
【０１２１】
第１８の態様は、ポリペプチドが細胞接着ポリペプチドである、第４から第１７の態様いずれかの組成物である。
【０１２２】
第１９の態様は、ポリペプチドがＲＧＤ配列を含む、第４から第１８の態様いずれかの組成物である。
【０１２３】
第２０の態様は、ポリペプチドが、ビトロネクチンポリペプチド、コラーゲンポリペプチド、ラミニンポリペプチド、骨シアロタンパク質ポリペプチド、およびフィブロネクチンポリペプチドからなる群より選択される、第４から第１９の態様いずれかの組成物である。
【０１２４】
第２１の態様は、ポリペプチドがビトロネクチンポリペプチドである、第４から第２０の態様いずれかの組成物である。
【０１２５】
第２２の態様は、ポリペプチドが配列番号２７のアミノ酸配列を含む、第４から第２１の態様いずれかの組成物である。
【０１２６】
第２３の態様は、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーが、１０キロダルトンと１０００キロダルトンの間の分子量を有する、第４から第２２の態様いずれかの組成物である。
【０１２７】
第２４の態様は、７と８の間のｐＨを有し、グルコースおよび１種類以上のアミノ酸をさらに含む、第４から第２３の態様いずれかの組成物である。
【０１２８】
第２５の態様は、細胞をさらに含む、第４から第２４の態様いずれかの組成物である。
【０１２９】
第２６の態様は、細胞が幹細胞である、第２５の態様の組成物である。
【０１３０】
第２７の態様は、細胞がヒト胚性幹細胞またはヒト間葉系幹細胞である、第２５の態様の組成物である。
【０１３１】
第２８の態様は、マイクロキャリアを含まない、第４から第２７の態様いずれかの組成物である。
【０１３２】
第２９の態様は、細胞培養表面がマイクロキャリアの表面である、第４から第２７の態様いずれかの組成物である。
【０１３３】
第３０の態様は、細胞培養物品の表面を被覆する方法において、（ｉ）共有結合したポリペプチドを有する合成ポリマーであって、ポリペプチドにコンジュゲートされており、細胞培養条件下で細胞培養物品の表面に接着するように構成された合成ポリマーを、水性細胞培養培地に導入して、ポリマー含有細胞培養培地を生成する工程；（ｉｉ）このポリマー含有細胞培養培地を細胞培養物品の表面に配置して、被覆物品を生成する工程；および（ｉｉｉ）この被覆物品を前記培地中において細胞培養条件下でインキュベーションして、ポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーを細胞培養物品の表面に接着する工程を有してなる方法である。
【０１３４】
第３１の態様は、細胞培養培地の組成物が既知組成の組成物である、第３０の態様の方法である。
【０１３５】
第３２の態様は、細胞培養培地が動物由来成分を含まない、第３０または３１の態様の方法である。
【０１３６】
第３３の態様は、細胞培養物品の表面を被覆する方法において、（ｉ）共有結合したポリペプチドを有するポリマーを水性細胞培養培地に導入して、ポリマー含有細胞培養培地を生成する工程であって、前記ポリマーが、直鎖の主鎖を有しかつ架橋を含まないポリマー、分岐鎖の主鎖を有しかつ架橋を含まないポリマー、および架橋を含まない星形ポリマーからなる群より選択され、共有結合したポリペプチドを有するポリマーが２０℃以下で水溶性であり、水溶液が有機溶媒を実質的に含まない工程；（ｉｉ）このポリマー含有細胞培養培地を細胞培養物品の表面に配置して、被覆物品を生成する工程；および（ｉｉｉ）この被覆物品を前記培地中において細胞培養条件下でインキュベーションして、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーを細胞培養物品の表面に接着する工程を有してなる方法である。
【０１３７】
第３４の態様は、ポリマーが直鎖の主鎖を有する、第３３の態様の方法である。
【０１３８】
第３５の態様は、細胞培養培地が動物由来成分を含まない、第３１または３２の態様の方法である。
【０１３９】
第３６の態様は、細胞培養培地の組成物が既知組成の組成物である、第３３から第３５の態様いずれかの方法である。
【０１４０】
第３７の態様は、被覆物品を培地中において細胞培養条件下でインキュベーションする工程が、被覆物品を培地中において約３７℃でインキュベーションする工程を含む、第３３から第３６の態様いずれかの方法である。
【０１４１】
第３８の態様は、ポリペプチドにコンジュゲートしていない実質的に類似のポリマーが、２５℃で水に不溶性である、第３３から第３４の態様いずれかの方法である。
【０１４２】
第３９の態様は、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーに対するポリペプチドの質量百分率が１０％超である、第３３から第３８の態様いずれかの方法である。
【０１４３】
第４０の態様は、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーに対するポリペプチドの質量百分率が４０％超である、第３３から第３８の態様いずれかの方法である。
【０１４４】
第４１の態様は、ポリペプチドが細胞接着ポリペプチドである、第３３から第４０の態様いずれかの方法である。
【０１４５】
第４２の態様は、ポリペプチドがＲＧＤ配列を含む、第３３から第４１の態様いずれかの方法である。
【０１４６】
第４３の態様は、ポリペプチドが、ビトロネクチンポリペプチド、コラーゲンポリペプチド、ラミニンポリペプチド、骨シアロタンパク質ポリペプチド、およびフィブロネクチンポリペプチドからなる群より選択される、第３３から第４２の態様いずれかの方法である。
【０１４７】
第４４の態様は、ポリペプチドがビトロネクチンポリペプチドである、第３３から第４３の態様いずれかの方法である。
【０１４８】
第４５の態様は、ポリペプチドが配列番号２７のアミノ酸配列を含む、第３３から第４４の態様いずれかの方法である。
【０１４９】
第４６の態様は、ポリマーが、コンジュゲートしたポリペプチドを含む少なくとも１種類モノマーから形成される、第３３から第４５の態様いずれかの方法である。
【０１５０】
第４７の態様は、コンジュゲートしたポリペプチドを含む少なくとも１種類モノマーがメタクリル酸である、第４６の態様の方法である。
【０１５１】
第４８の態様は、ポリマーが、（ｉ）ポリペプチドにコンジュゲートしたメタクリル酸および（ｉｉ）ヒドロキシエチルメタクリレートの重合から形成される、第４６の態様の方法である。
【０１５２】
第４９の態様は、ポリマーが、（ｉ）メタクリル酸官能基を含むモノマーおよび（ｉｉ）ヒドロキシエチルメタクリレートの重合から形成される、第３３から第４５の態様いずれかの方法である。
【０１５３】
第５０の態様は、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーが、１０キロダルトンと１０００キロダルトンの間の分子量を有する、第３３から第４９の態様いずれかの方法である。
【０１５４】
第５１の態様は、細胞培養物品の表面が、０°と５０°の間の水接触角を有する、第３３から第５０の態様いずれかの方法である。
【０１５５】
第５２の態様は、細胞培養物品の表面が、０°と３０°の間の水接触角を有する、第３３から第５０の態様いずれかの方法である。
【０１５６】
第５３の態様は、細胞培養物品の表面が、プラズマ処理済みポリスチレン表面である、第３３から第５２の態様いずれかの方法である。
【０１５７】
第５４の態様は、細胞を培養する方法において、（ｉ）共有結合したポリペプチドを有する合成ポリマーであって、ポリペプチドにコンジュゲートされており、細胞培養条件下で細胞培養物品の表面に接着するように構成された合成ポリマーを含むポリマー含有細胞培養培地に細胞を導入する工程；（ｉｉ）このポリマー含有細胞培養培地および細胞を細胞培養物品の表面に接触させて、被覆物品を生成する工程；および（ｉｉｉ）この被覆物品上の細胞を培地中において細胞培養条件下でインキュベーションする工程であって、この被覆物品の培地中における細胞培養条件下でのインキュベーションにより、ポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーが細胞培養物品の表面に接着される工程を有してなる方法である。
【０１５８】
第５５の態様は、細胞培養培地が動物由来成分を含まない、第５４の態様の方法である。
【０１５９】
第５６の態様は、細胞培養培地の組成物が既知組成の組成物である、第５４または５５の態様の方法である。
【０１６０】
第５７の態様は、細胞を培養する方法において、（ｉ）共有結合したポリペプチドを有するポリマーを含むポリマー含有細胞培養培地に細胞を導入する工程であって、前記ポリマーが、直鎖の主鎖を有しかつ架橋を含まないポリマー、分岐鎖の主鎖を有しかつ架橋を含まないポリマー、および架橋を含まない星形ポリマーからなる群より選択され、共有結合したポリペプチドを有するポリマーが２０℃以下で水溶性であり、水溶液が有機溶媒を実質的に含まない工程；（ｉｉ）このポリマー含有細胞培養培地および細胞を細胞培養物品の表面に接触させて、被覆物品を生成する工程；および（ｉｉｉ）この被覆物品上の細胞を培地中において細胞培養条件下でインキュベーションする工程であって、この被覆物品の培地中における細胞培養条件下でのインキュベーションにより、ポリペプチドにコンジュゲートした合成ポリマーが細胞培養物品の表面に接着される工程を有してなる方法である。
【０１６１】
第５８の態様は、ポリマーが直鎖の主鎖を有する、第５７の態様の方法である。
【０１６２】
第５９の態様は、細胞培養培地が動物由来成分を含まない、第５７または５８の態様の方法である。
【０１６３】
第６０の態様は、細胞培養培地の組成物が既知組成の組成物である、第５７から第５９の態様いずれかの方法である。
【０１６４】
第６１の態様は、被覆物品を培地中において細胞培養条件下でインキュベーションする工程が、被覆物品を培地中において約３７℃でインキュベーションする工程を含む、第５７から第６０の態様いずれかの方法である。
【０１６５】
第６２の態様は、ポリペプチドにコンジュゲートしていない実質的に類似のポリマーが、２５℃で水に不溶性である、第５７から第６１の態様いずれかの方法である。
【０１６６】
第６３の態様は、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーに対するポリペプチドの質量百分率が４０％超である、第５７から第６２の態様いずれかの方法である。
【０１６７】
第６４の態様は、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーに対するポリペプチドの質量百分率が６０％超である、第５７から第６３の態様いずれかの方法である。
【０１６８】
第６５の態様は、ポリペプチドが細胞接着ポリペプチドである、第５７から第６４の態様いずれかの方法である。
【０１６９】
第６６の態様は、ポリペプチドがＲＧＤ配列を含む、第５７から第６５の態様いずれかの方法である。
【０１７０】
第６７の態様は、ポリペプチドが、ビトロネクチンポリペプチド、コラーゲンポリペプチド、ラミニンポリペプチド、骨シアロタンパク質ポリペプチド、およびフィブロネクチンポリペプチドからなる群より選択される、第５７から第６６の態様いずれかの方法である。
【０１７１】
第６８の態様は、ポリペプチドがビトロネクチンポリペプチドである、第５７から第６７の態様いずれかの方法である。
【０１７２】
第６９の態様は、ポリペプチドが配列番号２７のアミノ酸配列を含む、第５７から第６８の態様いずれかの方法である。
【０１７３】
第７０の態様は、ポリマーが、コンジュゲートしたポリペプチドを含む少なくとも１種類モノマーから形成される、第５７から第６９の態様いずれかの方法である。
【０１７４】
第７１の態様は、コンジュゲートしたポリペプチドを含む少なくとも１種類モノマーがメタクリル酸である、第７０の態様の方法である。
【０１７５】
第７２の態様は、ポリマーが、（ｉ）ポリペプチドにコンジュゲートしたメタクリル酸および（ｉｉ）ヒドロキシエチルメタクリレートの重合から形成される、第７０の態様の方法である。
【０１７６】
第７３の態様は、ポリマーが、（ｉ）メタクリル酸官能基を含むモノマーおよび（ｉｉ）ヒドロキシエチルメタクリレートの重合から形成される、第５７から第６９の態様いずれかの方法である。
【０１７７】
第７４の態様は、ポリペプチドにコンジュゲートしたポリマーが、１０キロダルトンと１０００キロダルトンの間の分子量を有する、第５９から第７３の態様いずれかの方法である。
【０１７８】
第７５の態様は、細胞培養物品の表面が、０°と５０°の間の水接触角を有する、第５７から第７４の態様いずれかの方法である。
【０１７９】
第７６の態様は、細胞培養物品の表面が、０°と３０°の間の水接触角を有する、第５７から第７５の態様いずれかの方法である。
【０１８０】
第７７の態様は、細胞培養物品の表面が、プラズマ処理済みポリスチレン表面である、第５７から第７６の態様いずれかの方法である。
【０１８１】
第７８の態様は、細胞が幹細胞である、第５７から第７７の態様いずれかの方法である。
【０１８２】
第７９の態様は、細胞がヒト胚性幹細胞またはヒト間葉系幹細胞である、第７８の態様の方法である。
【０１８３】
ここに記載された組成物、方法、および物品の非限定的実施例が、例示のために以下に提示される。
【実施例】
【０１８４】
実施例１：  培地中でのプレコートされた基体対ポリマー上の培養
「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」−ＸＦ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＭＣ−ＡＳＢ）（StemCell Technologies、カタログ番号０５４２）、ポリ（ＨＥＭＡ−ｃｏ−ＭＡＡ−ＰＥＯ４−ＶＮ）（「ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮ」）でプレコートされたか、もしくは未被覆のコーニング「ＣｅｌｌＢＩＮＤ」プレート（コーニングカタログ番号３３３５）またはＣｏｓｔａｒ（登録商標）ＴＣ−処理プレート（コーニングカタログ番号３５１６）のいずれかである６ウェルプレート内で細胞を培養した。手短に言えば、ペプチドモノマーＭＡＡ−ＰＥＧ４−ＶＮ（メタクリル酸−［ポリエチレングリコール］4−ビトロネクチン、ここで、ビトロネクチンは、配列番号２７のアミノ酸配列を有する）をAmerican Peptide Company Inc.社から購入した。この会社では、固相ペプチド合成装置を使用してその分子を合成した。このモノマーは、フリーラジカル熱重合を使用して、エタノール中においてヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）と１：９のモル比を使用して共重合し、最終的なｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮペプチドコポリマーを得た。
【０１８５】
未被覆のプレートについては、細胞培養培地にＭＣ−ＡＳＢまたはｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮを加えて、細胞と共に平板培養した。細胞培養培地は、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」−ＸＦ完全培地（「ＭＣ−ＸＦ」）基礎培地（StemCell Technologies、カタログ番号０５４０２０）であり、これは、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」−ＸＦ基礎培地（StemCell Technologies、カタログ番号０５４２１）、「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」−ＸＦ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（５Ｘ）（StemCell Technologies、カタログ番号０５４２２）および２ｍＭのＬ−グルタミン（StemCell Technologies、カタログ番号０７１００）を含んでいた。
【０１８６】
Ａ．  プレコート容器の調製
ｉ．  「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ
ＭＣ−ＡＳＢを、製造業者の指示にしたがってプレコートした。手短に言えば、ＭＣ−ＡＳＢを、保存溶液として１ｍｇ／ｍｌの濃度で水中に溶解させた。被覆のために、このＭＣ−ＡＳＢ保存溶液を、Ｃａ＋＋またはＭｇ＋＋を含まない無菌ＰＢＳ（Life Technologiesカタログ番号１４１９０）中で１：２８に希釈し、ＴＣＴプレートにウェル当たり０．８ｍｌを加えた。このプレートを、タンパク質吸着のために４℃で一晩、蓋をしたＮａｌｇｅｎｅ容器内で貯蔵した。細胞培養の前に、プレートを２０〜３０分間で室温まで暖まらせ、ウェルの縁に無菌細胞培養水をかけて洗浄した。この水を回しかけて、全表面を濯ぎ、次いで、吸引した。
【０１８７】
ｉｉ．  ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮ
ガンマ線滅菌したｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮ粉末を無菌組織培養水中において２ｍｇ／ｍｌの濃度に無菌で戻して、保存溶液を生成した。この保存溶液を前後に穏やかに揺り動かし、室温で５分間に亘り溶解させた。「ＣＥＬＬＢｉｎｄ」６ウェルプレートにおいて、各ウェル内で２５μｌのポリマー保存溶液を１ｍｌの無菌水で希釈し、１時間に亘り３７℃でインキュベーションした。プレートの各ウェルの縁に無菌細胞培養水をかけてプレートを洗浄した。この水を回しかけて、全表面を濯ぎ、次いで、吸引した。
【０１８８】
ｉｉｉ．  Ｍａｔｒｉｇｅｌ
Ｍａｇｒｉｇｅｌ（登録商標）を１：３０で希釈し、ｈＥＳＣ播種とその後の培養のために対照表面としてのＴＣＴ  ６ウェルプレート上に被覆した。
【０１８９】
Ｂ．  細胞培養
ｉ．  ｈＭＳＣ
骨髄由来幹細胞供与者番号２６３７、ｐ４細胞を、ＭＣ−ＸＦ中においてＭＣ−ＡＳＢプレコート表面上で増殖させた。細胞が８０％のコンフルエンシーに到達したときに、細胞を継代培養した。細胞をｄＰＢＳ（Life Technologiesカタログ番号１４１９０）で手短に濯ぎ、次いで、約２分間に亘り「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」−ＡＣＦ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ溶液（StemCell Techカタログ番号０５４２７）と共にインキュベーションした。この細胞を表面から穏やかに採取し、ピペットで数回上下に吸い込んだり出したりし、次いで、１５ｍｌの遠心分離管に移した。次いで、フラスコを「ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ」−ＡＣＦ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ溶液（StemCell Techカタログ番号０５４２８）で濯ぎ、次いで、細胞を含有する管に加えた。細胞は６分間に亘り１２００〜１５００ｒｐｍで遠沈させた。細胞数と生存率は、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ自動細胞生存分析器（Beckman-Coulter）から得た。プレコートしたＭＣ−ＡＳＢプレート、「ＣｅｌｌＢＩＮＤ」およびプレコートしたｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮプレートに、３５００細胞／ｃｍ2の細胞密度でＭＣ−ＸＦ中においてｈＭＳＣ細胞を播種した。未被覆プレートについて、細胞懸濁液に、対応する保存溶液を使用して、０．０５ｍｇ／ｍｌ、０．０２５ｍｇ／ｍｌ、０．０１２ｍｇ／ｍｌおよび０．００６ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮまたは０．３７ｍｇ／ｍｌおよび０．００７４ｍｇ／ｍｌのＭＣ−ＡＳＢを補給した。接着補助物質を含むものと含まない細胞混合物懸濁液４ｍｌを各ウェルに加えた。培養中、２〜３日毎に培地を取り替えた。
【０１９０】
ａ．  細胞数および染色
各条件下で培養した細胞を、６ウェルプレートの４から５ウェルから収穫し、一緒に貯留し、１ｍｌのウシ胎児血清（Life Technologiesカタログ番号１６０００）を含有する１５ｍｌの遠心分離管に移した。次いで、全てのウェルをｄＰＢＳで濯ぎ、１５ｍｌの試験管内の細胞懸濁液に加えた。細胞を５〜６分間に亘り１２００〜１５００ｒｐｍで遠沈し、次いで、３〜５ｍｌのＭＣ−ＸＦ中に再び懸濁させた。細胞数および生存率は、Ｖｉ−Ｃｅｌｌから得た。細胞の被覆率の均一性を示すために、各プレート上の１つのウェルをクリスタルバイオレット染色溶液で染色した。
【０１９１】
ｉｉ．  ｈＥＳＣ
ヒトＥＳＣ−ＢＧＯ１ｖをLife Technologies社から購入し、対照条件または実験条件における試験に使用した。既知組成培地の「ｍＴｅＳＲ」１をStemCell Technology社から購入し、ここに報告した全てのｈＥＳＣ培養実験について標準培地として使用した。「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」はBD Scienences社から購入した。「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」およびＴＣＴ  ６ウェルプレートはCorning Life Sciences社から購入した。
【０１９２】
ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮを０．００６ｍｇ／ｍｌから０．０２５ｍｇ／ｍｌの濃度で「ｍＴｅＳＲ」１に加え、「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」６ウェルプレート内での播種のためにＢＧＯ１ｖ細胞と混合した。
【０１９３】
細胞は、ウェル当たり０．８×１０6で播種し、２日後から毎日補給した。再補給中に、培地にポリマーは添加しなかった。光学顕微鏡を使用して、細胞形態を毎日観察した。細胞数および生存率は、４日後にＶｉ−Ｃｅｌｌから得た。
【０１９４】
Ｃ．  結果および議論
ｉ．  ｈＭＳＣ
図５は、６ウェルＴＣＴプレートのウェル上で培養された細胞の画像を表しており、ここで、ウェルは、（ａ）ＭＣ−ＡＳＢでプレコートされており、（ｂ）未被覆であるが、播種細胞培養培地は０．０３７ｍｇ／ｍｌのＭＣ−ＡＳＢを含有しており、（ｃ）未被覆であるが、播種細胞培養培地は０．００７４ｍｇ／ｍｌのＭＣ−ＡＳＢを含有していた。図から分かるように、プレコートされたＭＣ−ＡＳＢは、ｈＭＳＣの正常な接着と増殖を支持した（図５（ａ））。対照的に、ＭＣ−ＡＳＢの細胞培養培地への添加および未被覆表面上への平板培養では、０．０３７ｍｇ／ｍｌ（図５（ｂ））または０．００７４ｍｇ／ｍｌ（図５（ｃ））の試験濃度で、ｈＭＳＣの同様の接着支持は提供しなかった。
【０１９５】
ＭＣ−ＡＳＢの濃度に０．０３７ｍｇ／ｍｌおよび０．００７４ｍｇ／ｍｌを選択したのは、０．０３７ｍｇ／ｍｌが、ＭＣ−ＡＳＢをプリコートする（細胞性能がうまくいった）のに使用したＭＣ−ＡＳＢ溶液の濃度であり、０．００７４ｍｇ／ｍｌでは、プレコートしたウェルにおける各ウェル内の材料と同じ量を提供したからである。プレコートプロセスに使用した０．８ｍｌに対して、細胞培養に使用した培地の４ｍｌのより大きい体積のために、５倍の希釈を適用した。
【０１９６】
ＭＣ−ＡＳＢとは対照的に、培地中に添加されたｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮは、ｈＭＳＣの成長を効果的に支持した。この成長は、ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮをプレコートした表面に匹敵した。ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮがなければ、培地のみでは、そのようにうまくいかなかった。図６を参照すると、ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮを含む場合と含まない場合の「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上で培養したｈＭＳＣの画像が示されている。プレコートされたｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮ（図６（ａ））、播種細胞培養培地にｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが加えられていない未被覆「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」（図６（ｂ））、播種細胞培養培地に０．００６ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが加えられた未被覆「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」（図６（ｃ））、播種細胞培養培地に０．０１２ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが加えられた未被覆「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」（図６（ｄ））、播種細胞培養培地に０．０２５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが加えられた未被覆「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」（図６（ｅ））、および播種細胞培養培地に０．０５０ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが加えられた未被覆「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」（図６（ｆ））上で培養された細胞が示されている。
【０１９７】
ここで、図７を参照すると、様々な表面で培養されたクリスタルバイオレット染色されたｈＭＳＣの画像が示されている。これらの画像は、（ａ）ＭＣ−ＡＳＢがプレコートされたＴＣＴ表面、（ｂ）０．０３７ｍｇ／ｍｌのＭＣ−ＡＳＢが加えられた播種培地を有する非プレコートＴＣＴ表面、（ｃ）０．００７４ｍｇ／ｍｌのＭＣ−ＡＳＢが加えられた播種培地を有する非プレコートＴＣＴ表面、（ｄ）ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮがプレコートされた「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面、（ｅ）非プレコート「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面、（ｆ）０．００６ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが加えられた播種培地を有する非プレコート「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面、（ｇ）０．０１２ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが加えられた播種培地を有する非プレコート「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面、（ｈ）０．０２５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが加えられた播種培地を有する非プレコート「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面、（ｉ）０．０５０ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが加えられた播種培地を有する非プレコート「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」表面上で培養されたｈＭＳＣのものである。
【０１９８】
図７に示されるように、プレコートされたＭＣ−ＡＳＢプレート（ａ）は、ｈＭＳＣ接着を支持するが、播種培地にＭＣ−ＡＳＢが加えられた非プレコートプレートでは、接着を支持しなかった（ｂ〜ｃ）。対照的に、プレコートされたｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮプレート（ｄ）および播種細胞培養培地にｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが加えられた非プレコートｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮ（ｆ〜ｇ）は、ｈＭＳＣ接着を支持した。播種培地にｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが加えられなかった未被覆「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」プレートは、ｈＭＳＣ接着にとって十分には機能しなかった（ｅ）。
【０１９９】
ここで図８を参照すると、ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮおよびＭＣ−ＡＳＢ表面の各々に観察された生存細胞の百分率を示すグラフが示されている。様々な表面に接着した細胞の数は様々であったが、接着した細胞の生存率は、試験した全ての表面について、１００％に近かった。
【０２００】
ここで図９を参照すると、ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮおよびＭＣ−ＡＳＢ表面の各々に接着した細胞の数を示すグラフが示されている。これらの結果により、先に示され、図７に関して論じられた結果が確認される。すなわち、プレコートされたＭＣ−ＡＳＢは接着と成長を支持したが、ＭＣ−ＡＳＢが播種培地に加えられた非プレコートウェルは接着を支持しなかった。対照的に、ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが播種培地に加えられた非プレコートウェルおよびプレコートされたｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮ表面の両方とも、ｈＭＳＣの接着を支持した。
【０２０１】
これらの結果は、ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮは、培地から基体表面に効率的に吸着され、ｈＭＳＣの接着と成長を迅速に提供できるが、ＭＣ−ＡＳＢはそうではないことを示唆している。ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮのポリマー濃度が増加すると、細胞形態および表面被覆率に影響せずに、細胞数が減少した。吸収後に溶液中に残された余分なポリマーが、細胞の接着を低減させるかもしれないが、その影響は最小であった。このことは、このポリマーには、培地中のｈＭＳＣに対する副作用はほとんどなく、細胞培養にとって安全であることを示唆している。
【０２０２】
結論として、ｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮは、従来の細胞培養基体の直接上でｈＭＳＣの接着と成長を可能にする培地の補助物質として使用できる。このポリマーは、細胞治療用途にとって合成の既知組成培地を製造するための新たな方法を提供するであろう。
【０２０３】
ｉｉ．  ｈＥＳＣ
ｈＭＳＣに関するように、播種細胞培養培地へのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮの添加は、非プレコート表面上のｈＥＳＣの接着と成長を支持した。
【０２０４】
ここで図１０を参照すると、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」被覆ＴＣＴプレート（ｃ）上および細胞播種培地に０．００６ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮ（ｂ）または０．０２５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮ（ａ）が加えられた非プレコート「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」プレート上の２日目のｈＥＳＣの画像が示されている。図から分かるように、０．００６ｍｇ／ｍｌの濃度のｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮ中で、ｈＥＳＣは非常に良好に接着し、広がった。これは、図１０（ｂ）および図１０（ｃ）に示されるように、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」表面に匹敵した。播種培地に０．０２５ｍｇ／ｍｌが加えられた場合、細胞のより多くのクラスターが観察された。これは、図１０（ａ）に示されるように、細胞間により多くの相互作用があることを示唆している。
【０２０５】
ここで図１１を参照すると、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」被覆ＴＣＴプレート（ｃ）上および細胞播種培地に０．００６ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮ（ｂ）または０．０２５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮ（ａ）が加えられた非プレコート「ＣｅｌｌＢｉｎｄ」プレート上の４日目のｈＥＳＣの画像が示されている。播種培地を補給するために、より低い濃度のｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮを使用した場合、細胞は、図１１（ｂ）および図１１（ｃ）に示されるように、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」被覆表面に匹敵する良好な形態を維持し続けた。より高い濃度のｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮ（図１１（ａ））でも、継続した接着および成長が観察された。
【０２０６】
ここで図１２を参照すると、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」上、播種培地に０．０２５ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが加えられた非プレコート表面、および播種培地に０．００６ｍｇ／ｍｌのｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮが加えられた非プレコート表面上での培養の４日後の細胞数のグラフが示されている。図１２に示されるように、最終的な細胞数は、「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」対照と、補給されたｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮとの間で匹敵する。
【０２０７】
全体として、より高濃度のｐｏｌｙＨＥＭＡ−ｃｏ−ＶＮにより、より多くの細胞のクラスター化およびより膿疱性の形態が生じた。しかしながら、細胞数は影響を受けなかった。これらの結果は、培地中のポリマーの濃度は、加えられたペプチドポリマーが細胞と細胞クラスターとどのように相互作用するかには影響しないであろうと示唆される。
【０２０８】
それゆえ、細胞培養のための合成接着培地の実施の形態が開示されている。ここに記載された組成物、被覆、物品、方法などは、開示された実施の形態以外の実施の形態により実施できることが、当業者により認識される。開示の実施の形態は、制限ではなく、説明の目的で提示される。
【符号の説明】
【０２０９】
１０    基礎材料基体
１５    表面
２０    ポリマー
３０    中間層
５０    ウェル
５５    側壁
７０    ポリペプチド
８０    リンカー
１００    細胞を培養するための物品
【図１】
2015505473.tif 000006
【図２】
2015505473.tif 000007
【図３Ａ】
2015505473.tif 000008
【図３Ｂ】
2015505473.tif 000009
【図４Ａ】
2015505473.tif 000010
【図４Ｂ】
2015505473.tif 000011
【図４Ｃ】
2015505473.tif 000012
【図５（ａ）】
2015505473.tif 000013
【図５（ｂ）】
2015505473.tif 000014
【図５（ｃ）】
2015505473.tif 000015
【図６（ａ）】
2015505473.tif 000016
【図６（ｂ）】
2015505473.tif 000017
【図６（ｃ）】
2015505473.tif 000018
【図６（ｄ）】
2015505473.tif 000019
【図６（ｅ）】
2015505473.tif 000020
【図６（ｆ）】
2015505473.tif 000021
【図７（ａ）】
2015505473.tif 000022
【図７（ｂ）】
2015505473.tif 000023
【図７（ｃ）】
2015505473.tif 000024
【図７（ｄ）】
2015505473.tif 000025
【図７（ｅ）】
2015505473.tif 000026
【図７（ｆ）】
2015505473.tif 000027
【図７（ｇ）】
2015505473.tif 000028
【図７（ｈ）】
2015505473.tif 000029
【図７（ｉ）】
2015505473.tif 000030
【図８】
2015505473.tif 000031
【図９】
2015505473.tif 000032
【図１０（ａ）】
2015505473.tif 000033
【図１０（ｂ）】
2015505473.tif 000034
【図１０（ｃ）】
2015505473.tif 000035
【図１１（ａ）】
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【図１１（ｂ）】
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【図１１（ｃ）】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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