(57)【要約】【課題】Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（2012年7月、24-26）は、チロシン誘導体に言及しているが、局所適用した場合の比較的短い時間にわたって、皮膚基質中で容積を著しく増加させることが見出されている誘導体の性質を開示していない。さらなる情報は、提供されていない。【解決手段】  非天然吸湿性アミノ酸は、皮膚の水分の保持及び取込特性を強化するために有用である。特に、このようなアミノ酸は、Ｎ−ヒドロキシセリン、Ｎ−ヒドロキシグリシン、Ｌ−ホモセリン、α−ヒドロキシグリシン、２−（アミノオキシ）−２−ヒドロキシ酢酸、２−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシアミノ）酢酸、２−（アミノオキシ）酢酸、及びこれらの組合せである。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物の外部ケラチン様構造の水和及び／又は水分の保持及び／又は取込特性を強化するための使用のための非天然吸湿性アミノ酸。
【請求項２】
前記構造が皮膚である、請求項１に記載の使用のための非天然吸湿性アミノ酸。
【請求項３】
３２℃、相対湿度（RH）≦５０％で、大気から水分を吸収し保持することができる、請求項１又は２に記載の使用のための非天然吸湿性アミノ酸。
【請求項４】
３２℃、相対湿度（RH）≦４０％で、大気から水分を吸収し保持することができる、請求項３に記載の使用のための非天然吸湿性アミノ酸。
【請求項５】
前記宿主が哺乳類である、前記請求項のいずれかに記載の使用のための非天然吸湿性アミノ酸。
【請求項６】
前記宿主がヒトである、請求項５に記載の使用のための非天然吸湿性アミノ酸。
【請求項７】
請求項１から４のいずれかに記載の少なくとも１つのアミノ酸を含む、眼用を含めた局所用の配合物。
【請求項８】
１つ又は複数の追加的な保湿成分をさらに含む、請求項７に記載の配合物。
【請求項９】
１つ又は複数の追加的なさらなるアミノ酸をさらに含む、請求項７又は８に記載の配合物。
【請求項１０】
ＮＭＦの１つ又は複数のアミノ酸成分を使用することによってＮＭＦを模倣する、請求項７から９のいずれかに記載の配合物。
【請求項１１】
ＮＭＦの前記１つ又は複数のアミノ酸成分が、ＮＭＦに見られるものに近似する量及び／又は比で存在する、請求項１０に記載の配合物。
【請求項１２】
ＮＭＦの１つ又は複数の非アミノ酸成分を使用することによってＮＭＦを模倣する、請求項７から１１のいずれかに記載の配合物。
【請求項１３】
ＮＭＦ中の前記１つ又は複数の非アミノ酸成分が、ＮＭＦに見られるものに近似する量及び／又は比で存在する、請求項１２に記載の配合物。
【請求項１４】
ＮＭＦの前記１つ又は複数の非アミノ酸成分が１つ又は複数の塩を含む、請求項１２又は１３に記載の配合物。
【請求項１５】
前記１つ又は複数の塩が、ナトリウム、カリウム、ＨＣｌ及びジエチルアミン塩から選択される、請求項１４に記載の配合物。
【請求項１６】
前記アミノ酸が、Ｎ−ヒドロキシセリン、Ｎ−ヒドロキシグリシン、Ｌ−ホモセリン、α−ヒドロキシグリシン、２−（アミノオキシ）−２−ヒドロキシ酢酸、２−ヒドロキシ−２−（ヒドロキシアミノ）酢酸、２−（アミノオキシ）酢酸、及びこれらの組合せから選択される、前記請求項のいずれかに記載の使用のためのアミノ酸又は組成物。
【請求項１７】
α−ヒドロキシグリシン若しくはＬ−ホモセリンから選択される、又は両方である、請求項１６に記載のアミノ酸。
【請求項１８】
動物の外部ケラチン様構造の美容的処置で使用するための、前記請求項のいずれかに記載のアミノ酸又は前記アミノ酸を含む組成物。
【請求項１９】
前記構造が皮膚である、請求項１８に記載のアミノ酸。
【請求項２０】
以下の群
ａ）皮膚軟化剤配合物での使用；
ｂ）ドライアイの治療のための眼用配合物での使用；
ｃ）肥厚の皮膚を保湿するための使用；
ｄ）爪及び／又はひづめの柔軟化での使用；
ｅ）除毛技術との併用；
ｆ）フェイスパックでの使用；
ｇ）皮膚症状の治療における皮膚の水和のための使用；並びに
ｈ）及びバリア製剤の適用前の皮膚の水和での使用
ｉ）創傷の回復での使用
からなる群から選択される使用のための、請求項１８又は１９に記載のアミノ酸。
【請求項２１】
薬物の経皮吸収を促進させるための使用のための、請求項１から１７のいずれかに記載のアミノ酸。
【請求項２２】
抗炎症剤として、任意選択によりさらなる抗炎症剤と組合せて使用するための、請求項１から１７のいずれかに記載のアミノ酸又は前記アミノ酸を含む組成物。
【請求項２３】
前記炎症における寄与因子がＧＭ−ＣＳＦである、請求項２２に記載のアミノ酸又は組成物。
【請求項２４】
前記アミノ酸が、Ｎ−ヒドロキシセリン、Ｌ−ホモセリン、Ｎ−ヒドロキシグリシン、並びにこれらの１つ又は複数を含有する組合せから選択される、請求項２２又は２３に記載のアミノ酸又は組成物。
【請求項２５】
抗刺激物として使用するための、請求項１から１７のいずれかに記載のアミノ酸又は前記アミノ酸を含む組成物。
【請求項２６】
前記アミノ酸が、Ｎ−ヒドロキシセリン、Ｌ−ホモセリン、Ｎ−ヒドロキシグリシン、並びにこれらの１つ又は複数を含有する組合せから選択される、請求項２５に記載のアミノ酸又は組成物。
【請求項２７】
薬物の皮膚透過を助ける、請求項１から１７のいずれかに記載のアミノ酸を含む、薬物の経皮投与のための組成物。
【請求項２８】
薬物の刺激性を低減するための、請求項１から１７のいずれかに記載のアミノ酸を含む、薬物の経皮投与のための組成物。
【請求項２９】
前記アミノ酸が、３２℃で８０％以下の潮解相対湿度（DRH）を有する、前記請求項のいずれかに記載のアミノ酸又は前記アミノ酸を含む組成物。
【請求項３０】
前記アミノ酸が、少なくとも０．７のＯ／Ｃ比を有する、前記請求項のいずれかに記載のアミノ酸又は前記アミノ酸を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、皮膚の水和及び保湿を強化するのに適した物質及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
乾燥症、又は乾燥肌は、ほとんどの人々が人生のある時点で経験する一般的な症状である。季節性の乾燥症は、寒く乾燥した冬期中に一般的なものであり、乾燥症が、年齢と共にさらによくみられるようになるという証拠がある（Whit-Chu、2011）。アトピー性皮膚炎、刺激性接触皮膚炎及び乾癬などの多くの炎症性皮膚症状によって、皮膚に局所的な乾燥性の領域が生じる。加えて、一部の患者は、魚鱗癬などの遺伝性疾患を有し、それによって慢性的な乾燥肌が引き起こされる。
【０００３】
天然保湿因子（NMF）の重要な役割は、皮膚の適切な水和を維持することである。角質層の適切な水和は、以下の３つの主要な機能を果たす：（１）皮膚の柔軟性を維持し、損傷から皮膚を保護する；（２）加水分解酵素が落屑の過程で機能することを可能にする（Rawlings、1994）；及び（３）角質層のバリア機能を最適化することに寄与する。
【０００４】
ＮＭＦは、主に、遊離アミノ酸、及びピロリドンカルボン酸（ピログルタミン酸、２−オキソ−ピロリドンカルボン酸、又はPCA）ナトリウム、ウロカニン酸（紫外［UV］光の天然の吸収剤）、無機塩類、糖類並びに乳酸及び尿素など、これらのアミノ酸の様々な誘導体からなる（表２）（Clar、1981）。これまでのところ、ＮＭＦに関連する無機塩として、ナトリウム、カリウム、カルシウム及びマグネシウムの塩化物、リン酸塩及びクエン酸塩が挙げられる。ＮＭＦは、角質細胞内に包含され、角質細胞の質量のおよそ１０パーセント、及び角質層の乾燥重量の２０パーセント〜３０パーセントを構成する。
【０００５】
ＮＭＦの構成成分は、大気から、又は皮膚のより深い層から水を引き付けて結合して角質細胞に水を引き込む、高効率の湿潤剤である。このプロセスは、相対湿度が５０パーセントの低さでさえ生じることができ、角質細胞が低湿度環境で適切なレベルの水を維持することを可能にする。この吸水は非常に効率が良いので、ＮＭＦは、本質的に、ＮＭＦが吸収した水の中で溶解する（Rawlings、1994）。水和したＮＭＦ、特定すれば中性及び塩基性アミノ酸は、ケラチン繊維とのイオン相互作用を形成し、繊維間の分子間力を低減し、したがって、角質層の弾性を増加させる。この弾性は、皮膚を健康でしなやかに見せ、機械的ストレスによるひび割れ又は剥離を防ぐことを助ける役割を果たす。加えて、ＮＭＦは、角質細胞がこれらを包囲する細胞内の「セメント」によってかけられる浸透圧のバランスをとることを可能にする。
【０００６】
溶質濃度のバランスを保つことは、長時間の入浴後のしわのよった皮膚に見られる過剰な水の浸入及び角質細胞を収縮させる水の流出の両方を防ぐために、重要である。
【０００７】
伝統的に、角質層は、成長できない組織であると考えられている。このことは、技術的に真実であるが、角質層は、多数の酵素がいまだ機能している動的構造であり、これらの酵素は、一定量の自由水又は液体水が機能することを必要とする。ＮＭＦ結合水は、この必要な水の大部分を供給し、これらの酵素の多くは、落屑の過程に関与し、皮膚の最も表層に角質細胞を結びつけている様々な結合及び力を破壊する。これらの落屑酵素の活動が、組織内の水レベルによって影響を受けることが、研究によって示されている（Harding、2000）。
【０００８】
ＮＭＦの低減又は欠乏は、臨床的に、落屑、剥離、又は亀裂及びひび割れさえ伴う乾燥肌の領域として現れる様々な角質層の異常と相関している。これらの症状として、アトピー性皮膚炎、乾癬、尋常性魚鱗癬及び乾燥症が挙げられる。アトピー性皮膚炎では、皮膚中のＮＭＦの量が低減することが多い（Palmer、2006）が、乾癬皮膚及び魚鱗癬では、ＮＭＦが本質的に存在しない（Harding、2000）ことが示されてきた。低減したＮＭＦレベルは、乾燥症などの、より一般的な皮膚症状においても見られる。皮膚を日常的に石鹸で洗浄することによって、角質層の表層からＮＭＦが除去されることが示されてきた。実際には、主に入浴又はＵＶ光への暴露によるＮＭＦレベルの低減は、典型的に、最外層に現れる。加えて、加齢によって、角質層中のアミノ酸含有量は劇的に低減するように思われる。皮膚の水和とそのアミノ酸含有量との間の有意な相関が研究によって示されてきた（Horri、1989）。これらの症状のすべては、乾燥肌の目に見える乾き、荒れ、落屑及び剥離特性をもたらす角質細胞の蓄積を伴う異常な落屑の特徴を示している（Harding、2000）。
【０００９】
ＮＭＦの供給源は、かなりの時間にわたって、集中的な研究の主題であった。これらの化合物が、上述のとおり、活性酵素を含有しないと考えられてきた角質層中のアミノ酸から由来していたことが、ウロカニン酸及びＰＣＡに対する多数の研究によって立証された。この研究の結果、角質層は、生物学的には死滅しているが、生化学的には非常に活性であることが、今や認められている。角質層のアミノ酸組成の分析が、最終的に、ＮＭＦの構成成分がフィラグリンタンパク質のタンパク質分解から生じる分解生成物であることの発見につながった（Scott、1982）。
【００１０】
フィラグリンは、新規に形成された角質細胞中に局在する巨大なヒスチジンリッチプロテインであり、果粒層の上の角質細胞層中に存在する。フィラグリンの機能は、フィラメントを凝集すること、具体的には表皮の及び内毛根鞘のケラチンフィラメントを、又はマクロフィブリルを、高秩序の線形配列に整列させることである。
【００１１】
フィラグリンは、果粒層のケラトヒアリン果粒に由来する高分子量の前駆体であるプロフィラグリンを有する。顆粒細胞は、角化細胞に分化するので、プロフィラグリンは、脱リン酸化し、高塩基性の、低分子量のフィラグリンに分解される。フィラグリンが、フィラメントを凝集するために働き、ケラチン繊維間のジスルフィド結合の形成を触媒するのは、この段階である。これらの凝集した繊維は、角質層に入る細胞を取り巻くエンベロープの一部を形成し、これらの繊維が、極めて扁平な形状である角質細胞の特徴を維持することを可能にする（Scott、1982）。
【００１２】
フィラグリンは、ケラチン繊維が形成されると、ほぼ即時にタンパク質分解及び分解攻撃を受ける。この分解プロセスの第１のステップの１つは、フィラグリンアルギニン残基のシトルリン残基への変換である。このプロセスは、フィラグリン分子の酸性度を増加させて、フィラグリン／ケラチン複合体の弛緩及びタンパク質分解酵素の接近の増加をもたらす。この時点で、フィラグリン分子は、それらのそれぞれのアミノ酸及び誘導体に完全に分解され、角質層中に存在する遊離アミノ酸及びそれらの誘導体の７０〜１００パーセントを構成するようになる（Scott、1982）。
【００１３】
フィラグリンのＮＭＦへの変換は、角質細胞が角質層のより表層に移行しているために生じる。角質層中のフィラグリン生成のタイミング及び正確な深さは、角質細胞内の水分活性及び外部の相対湿度によって決まる。乾燥作用のない湿潤環境において、フィラグリンの加水分解は、ほぼ最外部の表面で生じる。低湿度では、タンパク質分解はより深い層で生じ、ＮＭＦが皮膚の乾燥を防ぐように働く（Harding、2000）。皮膚に適用される閉塞パッチが完全にフィラグリンの分解を防ぎ得ることが実証されている。
【００１４】
フィラグリンのＮＭＦへの変換は、角質細胞内の水分活性によっても制御され、狭い範囲内でのみ生じる−水分活性が高すぎる場合、フィラグリンは安定するが、水分活性が低すぎる場合、加水分解酵素は機能することができなくなり、フィラグリンを分解できなくなる（Harding、2000）。したがって、皮膚の水和状態は、フィラグリンの分解プロセスに影響を及ぼす。
【００１５】
重要なことには、ＮＭＦの産生は、角質細胞内のかなりの浸透圧を作り出す。したがって、角質細胞が成熟し、増強し、周辺脂質及びその他の細胞外の構成成分が、得られた浸透圧のバランスを取っている角質層のより表層に向かって移動するまで、分解プロセスは生じない（Harding、2000）。
【００１６】
ＮＭＦは、一般に、アセトン／エーテル処理した角質層の３０分の水処理によって放出される水抽出可能な材料を含むと考えられる（Jokura、1995）。水抽出可能な材料は、角質層内に見られる総天然保湿因子であると考えられる。典型的に、ＮＭＦの組成は、およそ以下のとおりである：アミノ酸４８．３％；ＰＣＡ１０．２％；尿酸２．１％；乳酸１０．１％；クエン酸７．９％；その他の有機酸２％；尿素１４％、及び無機イオン５．２％。ＮＭＦの５％を占める無機イオンとして、カリウム、ナトリウム及びカルシウムが挙げられる。カルシウムイオン及びカリウムイオンは、表皮の末端分化において重要であり、バリアの乱れ後に消失するが、一方、マグネシウムイオンは、角質層中の皮膚バリア回復を加速させる（Nakagawa、2004）。ピロリドンカルボン酸カルシウム（PCA）及び乳酸は、共に含水性が高く、効率のよい湿潤剤として作用し、共にＮＭＦのおよそ１０％を占める。ＮＭＦの最大の割合は、４８％でアミノ酸であり、中性アミノ酸が３４．５％を占め、酸性アミノ酸が５％を占め、塩基性アミノ酸が、残りの８％を構成する。
【００１７】
セリンは、ＮＭＦ内で見られる最大の遊離アミノ酸であり、ＮＭＦに見られるすべての遊離アミノ酸の３６％を占める。グリシンは、２２％で２番目に大きな遊離アミノ酸であり、続いて、アラニンが、ＮＭＦ中の遊離アミノ酸の１３％を占める。ヒスチジン（８％）、オルニチン（７％）、シトルリン（６％）、アルギニン（６％）及びプロリン（２％）も、すべてＮＭＦ中に存在する。
【００１８】
皮膚の水和におけるＮＭＦの重要性は、１９６０年代から一部の皮膚の研究者らによって理解され、ＮＭＦのフィラグリン生成との関係は、１９８０年代に究明されているが、その関連性の十分な重要性は、フィラグリンの機能欠損変異の近年の証明によって理解されているだけであった。
【００１９】
フィラグリン遺伝子（FLG）中の遺伝的な機能欠損変異は、中等度から重度の尋常性魚鱗癬を生じさせ、患者に、成人期に再発する又は成人期まで続く早期発症型のアトピー性湿疹を含めたアトピー性皮膚炎を生じさせ易くすることが示されてきた。アトピー性皮膚炎において、ＰＣＡ、ウロカニン酸及びヒスチジンのレベルは、ＦＬＧ遺伝子型に相関していることが示され、様々なＦＬＧ変異を保有している患者を低減することが示されてきた。ＦＬＧ遺伝子における多様な変異は、識別されており；これらの変種の２つだけが、ヨーロッパを起源とする人々のおよそ９％によって保有されており、一定の人口におけるフィラグリン変異の蔓延を示唆している。機能欠損フィラグリン変異を保有する患者は、角質層中のすべての深さでのＮＭＦのレベルを著しく低減した。加えて、フィラグリン変異の保有者は、非保有者と比較して増加した経表皮水分蒸散量を呈している。
【００２０】
フィラグリンタンパク質分解の異常は、環境要因に応じて生じ得る。上述のとおり、低湿度は、フィラグリンをＮＭＦに分解するための加水分解酵素の能力を損ない、したがって、皮膚の表面を乾燥させる。加えて、ＵＶ照射は、フィラグリンのそのＮＭＦ構成成分への自然な分解を損なうことが示されてきた。さらに、年齢による皮膚の衰えにおけるＮＭＦレベル、及びこの衰えは、高齢者におけるプロフィラグリンの合成を減少させ、バリア機能を低下させることに起因している。
【００２１】
上述のとおり、角質層中に含有される水のおよそ３分の１は結合し、残余は、自由水である。自由水のレベルが増加しても、角質層の弾性には効果はなく、弾力性を皮膚にもたらすのは、ＮＭＦ結合水である。ＮＭＦを含有する保湿剤の外用によって皮膚中のＮＭＦの供給量を補う又は補給することは、乾燥状態の皮膚の治療へ成功に近づいていると証明されてきた（Weber、2012）。
【００２２】
いくつかのＮＭＦ構成成分は、なぜこれらがいずれかの効果を有しているかの知識なしに、保湿ビヒクルに数１０年間使用されてきた。例えば、尿素は、１９４３年以来、保湿クリームに含まれている（Harding、2000）。しかし、アトピー性皮膚炎に罹患した患者及び高齢者の皮膚において低減していると今や知られている皮膚の尿素レベルは、１９６６年まで、通常の患者及びアトピーの患者において測定されていなかった。尿素又はその前駆体であるアルギニンの局所適用は、尿素の不足を補正することが示されている。乳酸塩は、１９４６年に、魚鱗癬の治療として保湿剤に使用されることが、初めて報告された。乳酸塩を含まない保湿剤と比較して、乾燥肌の兆候の再発を改善し、防ぐことが示されてきた。Ｌ−乳酸及びＤ、Ｌ−乳酸は、角質層におけるセラミドの合成を刺激することによって働くように思われる。ＰＣＡは、ＮＭＦの最もよく見られる単一の構成成分であり、一連の石鹸洗浄及び／又は年齢によって、皮膚の最外層で低減することが示されている。ＰＣＡの局所適用によって、乾燥肌の兆候が緩和されることが、広く報告されてきた（Harding、2000）。
【００２３】
皮膚中で、水は、受動拡散によって角質層から大気に移行し得る。水のこの通常の移行は、経表皮水分蒸散量（TEWL）として知られている。これは、水浸透に対する絶対的なバリアがないために生じる。健康な表皮において、含水量は、顆粒層／角質層の相互作用で約４０％及び皮膚の表面で１５％〜２５％であるはずである。皮膚の目に見える落屑は、含水量が約１０％以下である場合に生じる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２４】
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（2012年7月、24-26）は、チロシン誘導体に言及しているが、局所適用した場合の比較的短い時間にわたって、皮膚基質中で容積を著しく増加させることが見出されている誘導体の性質を開示していない。さらなる情報は、提供されていない。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
驚くべきことに、非天然吸湿性アミノ酸が、水和に有用であり、その他に皮膚及びケラチン様構造の水分の保持及び取込特性を強化することが、今や見出された。これらの特性によって、これらのアミノ酸は、その他の浸透エンハンサーと相乗的に作用し得る浸透エンハンサーとしての役割を果たすこともできる。
【００２６】
したがって、第１の態様において、本発明は、動物の外部ケラチン様構造の水和及び／又は水分の保持及び／又は取込特性を強化するための使用のための非天然吸湿性アミノ酸を提供する。このような好ましい構造は皮膚であるが、本発明のアミノ酸は、爪、角、髪及び目に使用することができる。
【００２７】
本発明は、動物の外部ケラチン様構造の水和及び／又は水分の保持及び／又は取込特性を強化するための非天然吸湿性のアミノ酸の使用も提供する。
【００２８】
本発明は、動物の外部ケラチン様構造の水和及び／又は水分の保持及び／又は取込特性を強化するための方法であって、有効量の非天然吸湿性アミノ酸を前記皮膚に投与することを含む方法をさらに提供する。
【００２９】
本発明の個々のアミノ酸が、増加する親油性に見られる作用の増加と共に、実質的に親油性の薬物の透過、又は経皮吸収を強化することができることは、驚くべき発見である。当技術の従来の浸透エンハンサーは、皮膚にあまり浸透しないこれらの薬物に対して最大の効果を示す。しかし、本発明のアミノ酸の強化作用は、この作用が、より親水性の特性を有するこれらの薬物に対してはそれほど大きくないが、親油性の増加と共に増加するように、ｌｏｇＰと共に増加するように見える。
【００３０】
本明細書で使用する、用語「薬物」は、局所的又は経皮的に投与することが望まれ得るいずれかの薬理学的活性剤のことを言う。
【００３１】
したがって、局所投与を意図した薬物のための浸透エンハンサーとしての非天然アミノ酸の使用が、さらに提供される。例示的なこれらの薬物として、そこに付着する又はケラチンに結合するステロイド及び角質層中に留まるその他の分子、並びにｌｏｇＰ＞３であるものが挙げられるが、浸透強化作用は、局所投与のための、好ましくは親水性の性質より親油性の性質を有するもののための、すべての薬物に適用可能である。
【００３２】
３つの好ましい薬物及びアミノ酸の組合せは、以下の通りである：メトロニダゾール及びＮ−ヒドロキシセリン；ジクロフェナクジエチルアミン（DDEA）及びＮ−ヒドロキシグリシン；並びにアシクロビル及びＬ−ホモセリン。しかし、一般に、本発明の好ましいアミノ酸は、特に、少なくとも０．７のＯ／Ｃ比を有する本発明の多くのアミノ酸に見られる有利な作用を有する浸透エンハンサーとしても好ましい。１以上のＯ／Ｃ比が、有利である。
【００３３】
浸透エンハンサーとしての使用に好ましいアミノ酸として、Ｎ−ヒドロキシセリン、Ｎ−ヒドロキシグリシン、Ｌ−ホモセリン及びα−ヒドロキシグリシンが挙げられる。
【００３４】
その他の適した薬剤は、以下のとおりである：
【００３５】
【表１−１】
2015536971.tif 000002
【００３６】
【表１−２】
2015536971.tif 000003
【００３７】
【表１−３】
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【００３８】
【表１−４】
2015536971.tif 000005
【００３９】
【表１−５】
2015536971.tif 000006
【００４０】
【表１−６】
2015536971.tif 000007
【００４１】
皮膚は、一般に、以下で言及されるが、この用語には、文脈から明白でない限り、爪などのいずれのその他のケラチン様構造、及び角膜などのその他の外部膜への言及が含まれることが、理解される。
【００４２】
本明細書で使用する、非天然アミノ酸は、治療される皮膚の宿主によって合成されない、又はそのための専用の宿主ｔＲＮＡに関連しないものである。例えば天然由来の酵素によって異化されにくいことは、このようなアミノ酸、特に宿主によって合成されないものの利点であり、そのため天然由来のアミノ酸より長く皮膚に留まり、いずれかの保湿又は透過強化作用を延ばすことができる。
【００４３】
用語「保湿」、「水分保持」及び「水分取込」並びに関連する用語は、本発明を例示する場合、本明細書において区別しないで使用され、文脈から明白でない限り、１つへの言及は、その他への言及を含む。個々に、用語は、明確な意味を有する。用語「保湿」は、包括的な用語であり、乾燥肌における保湿レベルのバランスを取ること、又はバランスを取るための向上につながる物質又は状態を指す。強化された「水分保持」は、皮膚が水を逃がす傾向を低減したことを指し、「水分保持」は、皮膚が水を保持する傾向を指す。「水分取込」は、皮膚が湿度の高い空気などの環境から水を吸収する特性である。用語「水和」は、皮膚の水のレベル、及び例えば水分取込における上記の皮膚への水の取込のプロセスの両方を含む。
【００４４】
本明細書で使用する、用語「吸湿性の」は、３２℃での、相対湿度（RH）が≦５０％、好ましくは４０％以下で、大気から水分を吸収し保持することができるアミノ酸を指す。
【００４５】
化合物を吸湿性とするために、その化合物は、水と非結合性の会合を形成することができなければならない。硫酸マグネシウムは、吸湿性が高く、水中の酸素原子とマグネシウム原子との間に非結合相互作用を形成する。化合物を吸湿性にするものに対するさらなる調査は、土壌試料及びエアロゾルに対して実行される取り組みにつながる。エアロゾル内で見られる最も豊富な遊離アミノ酸は、グリシン、セリン及びアラニンである。これらは、ＮＭＦ中で見られる３種の最も豊富な遊離アミノ酸でもある。大気エアロゾル実験におけるフミン材料の吸湿性特性は、観測された吸湿性特性及びフミン物質の化学構造の間の調査につながる（Sasaki、2007）。この取り組みを通して、より高い酸素／炭素比（O/C）を有する化合物は、一般に、より大きな吸湿性特性を呈すことが究明された（Sasaki、2007）。例えば、Ｌ−セリンは、３個の酸素原子及び３個の炭素原子を有するので、Ｏ／Ｃ＝１．０となる。
【００４６】
本発明のアミノ酸は、３２℃で潮解することができる。好ましくは、本発明のアミノ酸は、３２℃で、８０％以下の潮解相対湿度（DRH）を有する。本発明の好ましいアミノ酸は、３２℃で、８０％以下のＤＲＨ及び少なくとも０．７のＯ／Ｃ比を有する。
【００４７】
天然由来のアミノ酸は、動物におけるＬ−アミノ酸であり、本発明で治療される好ましい動物は、哺乳類である。好ましい哺乳類は、全体的に又は部分的に暴露している、又は無毛の皮膚を有するものであり、特定すれば、好ましくはヒトである。
【００４８】
非天然アミノ酸は、一般に、Ｄ−アミノ酸であるが、治療される動物において合成されないＬ−アミノ酸として、α−ヒドロキシグリシン及びＬ−ホモセリンなどの一般的でないＬ−アミノ酸を挙げることができる。
【００４９】
本発明のアミノ酸が新規である場合、その際、これらは、本発明の態様及び実施形態として提供される。
【００５０】
本発明のアミノ酸は、１個又は２個、好ましくは１個の炭素原子を介して１つのイミド、又はより好ましくはアミン基に結合しているＣＯＯＨ基を含む任意の分子である。本発明のアミノ酸は、遊離の双性イオン性の形態であることが好ましいが、これらは、溶液中で塩の形態で、又はイオン対として提供することもできる。
【００５１】
本発明のアミノ酸は、クリーム、ローション、ゲル、膏薬、軟膏、ムース、フォーム、溶液、注射液、懸濁液、コロイド系又はスプレー（プロペラント又はポンプ）などの任意の適した形態で、アミノ酸に対して溶媒として作用し得るものなどの水性の構成成分を含む担体で、又は、アミノ酸を溶解又はアミノ酸と同調することができる有機ビヒクルを含む担体で、皮膚に塗布することができる。このような形態として、別法として、又はさらに、１つ又は複数の局所投与のための薬物を挙げることができ、薄膜形成剤、抗菌剤、抗酸化剤、安定剤、乳化剤、滅菌剤、増粘剤、及び着色剤などの任意のさらなる物質をさらに含むことができる。
【００５２】
適用形態は、本発明の１つのアミノ酸をさらに含むことができ、又は本発明の２つ以上のアミノ酸を含有することができる。それとは関係なく、投与形態は、当技術分野で教示されるとおりの１つ又は複数の追加的な保湿剤成分をさらに含むことができ、天然の吸湿性アミノ酸、又は本発明のアミノ酸ほどの吸湿性はない天然の及び非天然アミノ酸などのアミノ酸をさらに含むことができる。好ましい天然由来のアミノ酸は、Ｌ−ホモセリンである。
【００５３】
１つの態様において、好ましくはＮＭＦ中に見られるものに近い量及び／又は比で、ＮＭＦの１つ又は複数のアミノ酸成分を使用することによって、ＮＭＦを模倣することが好ましい。ＮＭＦ中のアミノ酸の量及び比率は、上で詳細に述べたとおりである。
【００５４】
好ましくはＮＭＦ中に見られるものに近い量及び／又は比で、ＮＭＦの１つ又は複数の非アミノ酸成分を含むことによって、ＮＭＦを模倣することがさらに好ましい。これらは、１つ又は複数の塩、特にナトリウム塩及びカリウム塩を含むことが好ましい。
【００５５】
任意の投与形態のすべての成分は、薬学的に許容されることが好ましい。
【００５６】
本発明の好ましいアミノ酸のＯ／Ｃ比は、少なくとも１である。より好ましい比は、少なくとも１．５：１及び２：１の比であり、さらに２：１より高いことが好ましい。
【００５７】
以下の化合物は、本発明の好ましい化合物である：
【００５８】
【化１】
2015536971.tif 000008
【００５９】
本発明のアミノ酸を含む組成物は、防止能力又は予防能力の点から、冬期などの特に寒い気候で適用できることが理解される。
【００６０】
本発明の組成物は、炎症性皮膚疾患、アトピー性皮膚炎、湿疹、魚鱗癬（乾燥肌状態）、冬期の乾燥症、局在する苔癬化及び湿疹の発症のような状態の治療又は予防のために使用することもできる。
【００６１】
本発明の組成物は、特に局所膜の、好ましくは皮膚の創傷の治療に有用である。
【００６２】
本発明の組成物は、化粧品配合物としてとりわけ有用であることが理解される。このような配合物は、皮膚をふっくらさせることによるしわの処置などの皮膚の外観、及び皮膚の弾性の強化用とすることができ、アミノ酸は、例えばコラーゲンによる処置と併用することができる。爪に使用される、美容的処置は、爪を切るために柔らかくする、又は爪を水和させて欠けるのを防ぐことを助けるために使用することができる。ヘアトリートメントにおいて、水和することによって、髪のしなやかさを増加させ、裂けるのを防ぐことを助けるために使用することができる。
【００６３】
本発明のアミノ酸は、皮膚の保湿特性からの恩恵を受けるその他の適用において使用することもできることが理解される。したがって、本発明は、局所用配合物中の賦形剤としての本発明のアミノ酸の使用を想定している。これは、エタノールなどのその他の賦形剤の脱水作用を弱めること、又は単に皮膚軟化剤として又は抗脱水剤として存在すること、又は薬物吸収の強化を可能にすることができる。
【００６４】
特に前記炎症の一因がＧＭ−ＣＳＦである場合、本発明のアミノ酸の抗炎症剤としての使用が提供される。このような使用にとりわけ好ましいアミノ酸は、Ｎ−ヒドロキシセリン、Ｌ−ホモセリン、Ｎ−ヒドロキシグリシン及びこれらの１つ又は複数を含有する組合せである。
【００６５】
抗刺激剤としての本発明のアミノ酸の使用が提供される。このような使用にとりわけ好ましいアミノ酸は、Ｎ−ヒドロキシセリン、Ｌ−ホモセリン、Ｎ−ヒドロキシグリシン及びこれらの１つ又は複数を含有する組合せである。
【００６６】
本発明のアミノ酸は、皮膚軟化剤としての使用、又は皮膚軟化剤中での使用を見出すことができる。
【００６７】
本発明のアミノ酸は、点眼薬、又はドライアイの治療のためのその他の眼用配合物で使用することができる。
【００６８】
本発明のアミノ酸は、肥厚の皮膚を保湿するために使用して、例えば皮膚硬結の除去を容易にすることもできる。
【００６９】
本発明のアミノ酸は、爪及び／又はひづめを柔軟化することを助けるために使用することができる。
【００７０】
本発明のアミノ酸は、除毛技術と併用することもできる。
【００７１】
本発明の組成物の水和性質を考えると、これらは、フェイスパックでの使用も見出される。
【００７２】
本発明のアミノ酸は、乾癬、いぼ及び疣贅を含めた皮膚症状の治療において皮膚を水和するために使用することもでき、これによって、標的部位への薬物送達をより効果的にすることができる。
【００７３】
本発明のアミノ酸は、特に、その目的が、皮膚の乾燥などの乾ききった状態を防ぐためである場合、バリア製剤の適用前に皮膚に適用することができることが理解される。
【００７４】
一般に、本発明のアミノ酸は、化粧品調製物、特に皮膚を乾燥させ得るものにおいて、及び皮膚の保湿剤及び抗しわクリームなどの皮膚の健康及び外観を強化することを目的としたものにおいての使用が見出される。ヘアコンディショナーなどのヘア製品も、その恩恵を受ける。
【００７５】
以下の合成経路は、本発明のアミノ酸がどのように共役し得るかを例示している。このような共役は、熟練の医師が別のものに決定した場合以外、例えば、角質層への取込の速度を理由に、共役があまり好ましくない場合以外は、任意選択により、本明細書で示したいずれかの使用において、本発明のアミノ酸に加えて、又はその代わりに使用することができる。
【００７６】
【化２】
2015536971.tif 000009
【００７７】
本発明は、ここで、添付の図面に関してさらに例示される。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】飽和溶液のＲＨを測定するための実験用の設定を示す図である。
【図２】同じ化合物のＤＲＨ（潮解相対湿度）に対して水と比較した、ＲＨ４０％で２４時間後の平均重量増加率を示す図である。
【図３】各試験アミノ酸に対する、１．３３Ｍのアミノ酸溶液での処理の２４時間に続いて、ＲＨ４０％で２４時間後の平均重量増加率を示す図である。
【図４】４８時間の実験期間にわたる表皮膜を介したジクロフェナクの累積透過量を示す図であり；各バーは、平均透過量＋ＳＥＭ、ｎ＝５〜６を表す。
【図５】４８時間後の表皮膜を介したジクロフェナクの累積透過量を示す図であり；各バーは、平均透過量＋ＳＥＭ、ｎ＝５〜６を表す。
【図６】４８時間の実験期間にわたる表皮膜を介したメトロニダゾールの累積透過量を示す図であり；各バーは、平均透過量＋ＳＥＭ、ｎ＝５〜６を表す。
【図７】４８時間後の表皮膜を介したメトロニダゾールの累積透過量を示す図であり；各バーは、平均透過量＋ＳＥＭ、ｎ＝５〜６を表す。
【図８】４８時間の実験期間にわたる表皮膜を介したアシクロビルの累積透過量を示す図であり；各バーは、平均透過量＋ＳＥＭ、ｎ＝５〜６を表す。
【図９】４８時間後の表皮膜を介したアシクロビルの累積透過量を示す図であり；各バーは、平均透過量＋ＳＥＭ、ｎ＝５〜６を表す。
【図１０】各試験アミノ酸に対する、１．３３Ｍのアミノ酸溶液での処理の２４時間に続いて、ＲＨ７５％で２４時間後の平均重量増加率を示す図である。
【図１１】３種の薬物に対する薬物吸収強化因子のプロットを示す図である。
【図１２】４２分の暴露後及び４２の暴露後インキュベーションのＲＨＥ組織の生存率を示す図であり；各点は、組織の生存率平均値を表し、エラーバーは、範囲；ｎ＝４を表す。
【図１３】２４時間の暴露後のＲＨＥ組織の生存率を示す図であり；各点は、組織の生存率平均値を表し、エラーバーは、範囲；ｎ＝３を表す。
【図１４】ｔ＝２、６及び２４時間での１０％ｗ／ｖのＮ−Ｈ−Ｇ、１％ｗ／ｖのＮ−Ｈ−Ｇ、１０％ｗ／ｖのＬ−セリン及び１０％ｗ／ｖのグリシンの溶液並びに陽性対照（１％ｗ／ｖのTriton（商標）X-100、ｔ＝３及び７時間）の暴露後の組織生存率を示す。各時点は、組織の生存率平均値を表し、エラーバーは、範囲、ｎ＝３を表す。
【図１５】乾癬組織からのＧＭ−ＣＳＦの放出を示す図であり；各点は、２、４及び６日で行った測定による６日にわたるＧＭ−ＣＳＦの平均累積放出を表し、エラーバーは、範囲ｎ＝２〜３を表す。
【図１６】ＧＭ−ＣＳＦの総放出を示す図である。各バーは、乾癬モデル及び対照ＲＨＥ組織の両方からの６日にわたるＧＭ−ＣＳＦの総放出を表す；エラーバーは、範囲ｎ＝２〜３を表す。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
本発明は、ここで、以下の非限定的な実施例によって例示される。
【実施例】
【００８０】
実施例１
実験
５−ブロモペンタル：
【００８１】
【化３】
2015536971.tif 000010
【００８２】
エチル５−ブロモペンタノエート（３．９２９５ｇ、１８ｍｍｏｌ）の無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）中溶液を、−７８℃の窒素雰囲気下で撹拌し、ＤＩＢＡＬ−Ｈ（３１ｍＬ、３１ｍｍｏｌ、１．７当量、ヘキサン中１Ｍ）を添加した。生じたオレンジ色の溶液を、−７８℃の窒素雰囲気下で撹拌したままにしながら、続いて、反応物をＴＬＣにかけた。８時間の撹拌後、反応物を、ＨＣｌ（１Ｍ、５０ｍＬ）及び水（１００ｍＬ）を添加してクエンチした。無色の混合物を、窒素雰囲気から取り出し、終夜撹拌したままにし、徐々に室温に戻した。混合物を、ＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で抽出し、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、真空中で濃縮し、淡黄色の油として粗製の表題生成物（２．７６６ｇ、８０％、２１ｍｍｏｌ）を得て、さらなる精製を行わずに使用する。Ｒｆ＝０．３０  ジエチルエーテル／ヘキサン（２／５）。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．７６〜１．８３（２Ｈ，ｍ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，Ｈ−３）、１．８７〜１．９４（２Ｈ，ｍ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，Ｈ−２）、２．４８〜２．５２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−４）、３．４１〜３．４４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−１）、９．７９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，Ｈ−５）ｐｐｍ。
１３Ｃ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）２０．６（Ｃ−３）、３１．９（Ｃ−２）、３３．０（Ｃ−４）、４２．９（Ｃ−１）、２０１．８（Ｃ−５）ｐｐｍ。
νｍａｘ（ＦＴ  ＩＲ，ＣＣＣｌ３，ＫＢｒプレート）／ｃｍ−１  ２９３８（Ｃ−Ｈ）、２７２５（Ｃ−Ｈアルデヒド）、１７２１（Ｃ＝Ｏ）、１４３７（Ｃ−Ｈ）、１３９０（Ｎ−Ｏ）、１２５３、１０４２、９１３、７４３。
【００８３】
（Ｅ）−エチル−７−ブロモヘプタ−２−エノエート：
【００８４】
【化４】
2015536971.tif 000011
【００８５】
粗製の５−ブロモペンタル（２．７６６ｇ、１６ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（１００ｍＬ）中撹拌懸濁液に、（カルベトキシメチレン）トリフェニルホスホラン（８．０９８ｇ、２３ｍｍｏｌ、１．４当量）を一度に添加した。混合物を、２２時間室温で撹拌したままにした後、飽和塩化アンモニウム（５０ｍＬ）でクエンチした。混合物を、ＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機抽出物を、水（５０ｍＬ）で洗浄した。有機層を、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、真空中で濃縮して、粗製の黄色の液体（１０．３２０ｇ）を得た。次いで、粗製の生成物を、ジエチルエーテル／ヘキサン（１／３）で溶出するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによって精製し、表題生成物（２．７２３ｇ、７２％、１１．５ｍｍｏｌ）を得た；Ｒｆ＝０．３９  ジエチルエーテル／ヘキサン（１／３）；
δＨ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．２７〜．１３２（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ  Ｈ−７）、１．５５〜１．６０（２Ｈ，ｍ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−３）、２．０２〜１．０６（２Ｈ，ｍ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｈ−２）、２．２７〜２．２９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｈ−４）、４．１６〜４．２２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝３２．０Ｈｚ，Ｈ−１）、４．３８〜４．４２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｈ−６）ｐｐｍ。
δＣ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１４．２８（Ｃ−９）、２６．５２（Ｃ−３）、３１．２０（Ｃ−２）、３２．０２（Ｃ−４）、３３．２６（Ｃ−８）、６０．２５（Ｃ−１）、１２１．９０（Ｃ−６）、１４８．１４（Ｃ−５）、１６６．５５（Ｃ−７）ｐｐｍ。
νｍａｘ（ＦＴ  ＩＲ，ＣＣＣｌ３，ＫＢｒプレート）／ｃｍ−１  ２９３８（Ｃ−Ｈ）、１７１４（Ｃ＝Ｏ）、１６５４（Ｃ＝Ｃ）、１４４５、１３６７（Ｎ−Ｏ）、１２６６、１１８５、１１３４（Ｃ−Ｏ）、１０９５、１０３９、９７９（Ｃ−Ｈ）、９１３（Ｃ−Ｈ）、８４８、７４２。
【００８６】
（Ｅ）−エチル−７−ニトロヘプタ−２−エノエート：
【００８７】
【化５】
2015536971.tif 000012
【００８８】
エチル−７−ブロモヘプタ−２−エノエート（２．６４８６ｇ、１１．３ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（１３ｍＬ）中溶液を、０℃で撹拌し、亜硝酸ナトリウム（１．１６５７ｇ、１６．９ｍｍｏｌ、１．５当量）を、一度に添加した。生じた溶液を、０℃で撹拌したままにしながら、続いて反応物をＴＬＣにかけた。８時間後、ＴＬＣは、出発物質の大半の消費を示した。反応物を、氷水（２０ｍＬ）に添加して、ジエチルエーテル（２５ｍＬ）で抽出した。次いで、有機層を、ブライン（飽和２５ｍＬ）で洗浄した。有機抽出物を、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、真空中で濃縮して、黄色の液体（１．９３９０ｇ）を得た。次いで、粗製の生成物を、ジエチルエーテル／ヘキサン（１／４）で溶出するシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによって精製し、表題生成物（０．５２８３ｇ、２３％、２．６ｍｍｏｌ）を得た；
Ｒｆ＝０．２９  ジエチルエーテル／ヘキサン（１／４）；
δＨ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．２７〜．１３１（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ  Ｈ−９）、１．５４〜１．６２（２Ｈ，五重線，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｈ−３）、２．００〜２．０８（２Ｈ，五重線，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｈ−２）、２．２５〜２．３０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｈ−４）、４．１６〜４．２２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝１６．０Ｈｚ，Ｈ−８）、４．３８〜４．４２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−１）、５．８３〜５．８５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，Ｈ−６）、６．８８〜６．９５（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｊ’＝１６．０Ｈｚ）ｐｐｍ。
δＣ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１４．２８（Ｃ−９）、２６．５２（Ｃ−３）、３１．２０（Ｃ−２）、３２．０２（Ｃ−４）、３３．２６（Ｃ−８）、６０．２５（Ｃ−１）、１２１．９０（Ｃ−６）、１４８．１４（Ｃ−５）、１６６．５５（Ｃ−７）ｐｐｍ。
νｍａｘ（ＦＴ  ＩＲ，ＣＣＣｌ３，ＫＢｒプレート）／ｃｍ−１  ２９３６（Ｃ−Ｈ）、２８６５、１７１６（Ｃ＝Ｏ）、１６４４（ＮＯ２）、１４４５（Ｃ−Ｈ，１４１５，１３８８，１２８８（Ｃ＝Ｃ）、１２２９、１１７０（Ｃ−Ｏ）、１１３４、１０９６、１０３３、９１２（＝Ｃ−Ｈ）、８２３、７３４、６４９。
【００８９】
ｔｅｒｔ−ブチル（２−クロロ−２−オキソエチル）カルバメート
【００９０】
【化６】
2015536971.tif 000013
【００９１】
Ｂｏｃ−Ｇｌｙ（２．８３３ｇ、１６．２ｍｍｏｌ）を、室温で、窒素雰囲気下で無水ＤＣＭ（３０ｍＬ）中に溶解した。Ｂｏｃ−Ｇｌｙ溶液を、塩化オキサリル（３．１０ｍＬ、２．２当量、３５．６ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（３滴）中溶液に移した。生じた溶液を、室温で、窒素雰囲気下で撹拌したままにしながら、続いて、反応物をＴＬＣにかけた。３．５時間後、ＴＬＣは、出発物質の消費を示した。混合物を、真空中で濃縮し、酸塩化物（３．４６３４ｇ、１１１％、１８ｍｍｏｌ）を得た。
Ｒｆ＝０．１５  ジエチルエーテル／ヘキサン（４／１）；
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．４９（９Ｈ，ｓ，Ｈ−６）、３．６９（２Ｈ，ｓ，Ｈ−２）、５．９５（１Ｈ，ｂｒ  ｓ，Ｈ−３）ｐｐｍ。
１３Ｃ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）３９．７７（Ｃ−６）、６６．７７（Ｃ−２）、１０６．３５（Ｃ−５）、１３８．３４（Ｃ−４）、１８３．２９（Ｃ−１）ｐｐｍ。
νｍａｘ（ＦＴ  ＩＲ，ＣＣＣｌ３，ＫＢｒプレート）／  ２９８９（Ｃ−Ｈ）、１７６６（Ｃ＝Ｏ）、１７４２（Ｃ＝Ｏ）、１３７５、１３１４、１２６４、１１８９、１１５８、１００９（Ｃ−Ｎ）、９１９、８５２、７４７ｃｍ−１。
【００９２】
ｔｅｒｔ−ブチル（２−（（４Ｒ，５Ｓ）−４−メチル−２−オキソ−５−フェニルオキサゾリジン−３−イル）−２−オキソエチル）カルバメート：
【００９３】
【化７】
2015536971.tif 000014
【００９４】
ＬｉＨＭＤＳ（２．５４７４ｇ、１５ｍｍｏｌ、１．２当量）を、（４Ｒ、５Ｓ）−（＋）−４−メチル−５−フェニル−２−オキサゾリドン（２．２１０４ｇ、１２ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中冷却溶液に、−７８℃で添加した。無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）中のＢｏｃ−Ｇｌｙ−Ｃｌ（２．４６３４ｇ、１．５当量、１８ｍｍｏｌ）の添加の前に、混合物を３０分間撹拌した後、室温に暖めた。室温での１４時間の撹拌後、ＴＬＣが酸塩化物の消費を示したので、反応物を、ＮＨ４Ｃｌ（飽和  ３０ｍＬ）を添加してクエンチした。混合物を、酢酸エチル（５０ｍＬ）で抽出した。有機層を、重炭酸ナトリウム（飽和、５０ｍＬ）でさらに抽出した。有機層を、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、真空中で濃縮して、濃い赤褐色の液体（２．２９６４ｇ）を得た。粗製の生成物を、室温で、終夜そのままにして、茶色／赤色の固体を得た。ジエチルエーテル／ヘキサン（４／１）の溶液を、固体に添加し、濾過して、澄んだ茶色の固体の表題生成物（１．２７０２ｇ、３２％、３．８ｍｍｏｌ）を得た。
Ｒｆ＝０．４３  ジエチルエーテル／ヘキサン（４／１）；
Ｍｐｔ＝１０６〜１１１℃。
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）０．００（９Ｈ，ｓ，Ｈ−１０）、０．８２（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ，Ｈ−５）、１．５５（２Ｈ，ｓ，Ｈ−６）、４．２０（１Ｈ，五重線，Ｊ＝８Ｈｚ，Ｈ−４）、４．９２（１Ｈ，ｂｒ  ｓ，Ｈ−７）、５．７２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，Ｈ−２）、７．５２〜７．２６（５Ｈ，ｍ，Ｈ−１）ｐｐｍ。
１３Ｃ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）０．０６（Ｃ−１０）、３．６６（Ｃ−５）、７．６６（Ｃ−６）、４７．９２（Ｃ−４）、５１．５３（Ｃ−２）、５４．５７（Ｃ−９）、１２６−  １２８（Ｃ−１）、１６９．２２（Ｃ−３）、１７９．３５（Ｃ−８）、１８３．０５（Ｃ−５）ｐｐｍ。
νｍａｘ（ＦＴ  ＩＲ，ＣＣＣｌ３，ＫＢｒプレート）／３２００（Ｎ−Ｈ）、１７５４（Ｃ＝Ｏ）、１５００（Ｃ＝Ｏアミド）、９１３（Ｃ＝Ｃ曲げ）、７４４ｃｍ−１。
【００９５】
（４Ｒ，５Ｓ）−３−（２−ブロモアセチル）−４−メチル−５−フェニルオキサゾリジン−２−オン：
【００９６】
【化８】
2015536971.tif 000015
【００９７】
ｎ−ＢｕＬｉ（１ｍＬ、１０ｍｍｏｌ、１．１当量）を、オキサゾリジン−２−オン（１．５９３０ｇ、９ｍｍｏｌ、１．０当量）の乾燥ＴＨＦ（８ｍＬ）中撹拌溶液に、窒素下で、−７８℃で添加した。１５分後、臭化ブロモアセチル（０．５７ｍＬ、１２ｍｍｏｌ、１．３当量）を、ＴＨＦ（９．６ｍＬ）中溶液として滴下添加し、−７８℃で１５分間撹拌した後、周囲温度に暖めた。２時間後、反応物を、ＮＨ４Ｃｌ（飽和  １５ｍＬ）及び酢酸（５ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）で抽出し、ＮａＨＣＯ３（飽和  ２０ｍＬ）及びブライン（飽和  ２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水して、真空中で濃縮した。粗製の生成物を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３／１７）で溶出するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、表題生成物（０．２５９３ｇ、１０％、０．９ｍｍｏｌ）を得た。
Ｒｆ＝０．４１  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３／１７）；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）０．９３〜０．９４（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，Ｈ−５）、４．５１〜４．５９（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝２０．０Ｈｚ，Ｈ−７）、４．７７〜４．８３（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，Ｈ−４）、５．７４〜５．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，Ｈ−２）、７．２６〜７．４６（５Ｈ，ｍ，Ｈ−１）ｐｐｍ。
１３Ｃ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１４．２９（Ｃ−５）、２８．２３（Ｃ−７）、５５．２４（Ｃ−４）、７９．５３（Ｃ−２）、１２５．６４（Ｃ−１）、１２９．０３（Ｃ−１）、１３４．５９（Ｃ−３）、１５０．２０（Ｃ−６）ｐｐｍ。
νｍａｘ（ＦＴ  ＩＲ，ＣＣＣｌ３，ＫＢｒプレート）／２９６４（Ｃ−Ｈ）、２９１７、２８４９、１７７６（Ｃ＝Ｏ）、１７００（Ｃ＝Ｏ）、１４９６（Ｐｈ）、１４５５、１４１５、１３４０（Ｃ−Ｎ）、１３１７、１２６０、１２１７、１１９６（Ｃ−Ｏ）、１１６９、１１４６、１１２０、１０８９、１０６６、１０３７、１００１、９９０、９７０  ９１１、８８３、８０３、７６５、７３０、７００、６６１、６３９、６１８ｃｍ−１。
【００９８】
（４Ｒ，５Ｓ）−３−（ジベンジルグリシル）−４−メチル−５−フェニルオキサゾリジン−２−オン：
【００９９】
【化９】
2015536971.tif 000016
【０１００】
ジベンジルアミン（０．４８５ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ、２．２当量）を、Ｎ−アシル−オキサゾリジン−２−オン（０．４０８１ｇ、１．３７ｍｍｏｌ、１．０当量）の無水ＤＣＭ（１ｍＬ）中撹拌溶液に、室温で添加した。反応混合物を、窒素下で１８時間撹拌した。得られた混合物を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）及び水（１０ｍＬ）の間で分割する。水層を、ＤＣＭ（１０ｍＬ）で洗浄した。合わせた有機層を、水（１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で脱水して、真空中で濃縮する。粗製の生成物を、ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３／１７）で溶出するシリカゲル上のフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、表題生成物（０．３８８４４ｇ、７３％、１．０ｍｍｏｌ）を得た。
Ｒｆ＝０．３０  ＥｔＯＡｃ／ヘキサン（３／１７）；
１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）０．８７〜０．８９（３Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，Ｈ−５）、３．８３〜３．９１（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝２０．０Ｈｚ，Ｈ−７）、３．９５（２Ｈ，ｓ，Ｈ−８）、４．６４〜４．７０（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝１２．０Ｈｚ，Ｈ−４）、５．６１〜５．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，Ｈ−２）、７．２３〜７．４２（１５Ｈ，ｍ，Ｈ−１）ｐｐｍ。
１３Ｃ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１４．６７（Ｃ−５）、５４．５６（Ｃ−７）、５５．２４（Ｃ−８）、５８．１８（Ｃ−４）、７９．５０（Ｃ−２）、１２５．６４〜１２９．０３（Ｃ−１）、１６７．２３（Ｃ−３）、１８４．４９（Ｃ−６）ｐｐｍ。
νｍａｘ（ＦＴ  ＩＲ，ＣＣＣｌ３，ＫＢｒプレート）／３０２７（＝Ｃ−Ｈ）、２３６０、２３４１、１７９０（Ｐｈ）、１７０５（Ｃ＝Ｏ）、１４９４（Ｐｈ）、１４５４（Ｃ−Ｈ）、１３６７、１３４４（Ｃ−Ｎ）、１２４５、１２１８、１１９７（Ｃ−Ｏ）、１１５０、１１２０、１０８９、１０６７、１０２８、９８４、９５４、９１７、７９１、７６６、７４７、６９８、６６８、６４３ｃｍ−１。
【０１０１】
２−アミノ−２−ヒドロキシ酢酸：
【０１０２】
【化１０】
2015536971.tif 000017
【０１０３】
氷水（１０ｍＬ）中の酢酸アンモニウム（９．４７２５ｇ、０．１ｍｏｌ、２当量）を、グリオキシル酸一水和物（４．６０１５ｇ、０．０５ｍｏｌ、１当量）の氷水（１０ｍＬ）中撹拌溶液に添加した。白色の沈殿物が、撹拌の数分以内に出現した。４５分の撹拌及び２時間の０℃での静止後、反応混合物を濾過した。白色の沈殿物を、水（２０ｍＬ）及びメタノール（２×１０ｍＬ）で洗浄して、粗製の表題生成物（４．６９５１ｇ、０．０５１ｍｏｌ、１０３％）を得た。粗製の生成物（４．１６９７ｇ）を、５時間高真空ポンプで乾燥して、表題生成物（４．０５７１ｇ、９７％）を得た。
δＨ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）４．９３（１Ｈ，ｓ，Ｈ−１）ｐｐｍ。
δＣ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）２６．８１（Ｃ−１）、１７５．８３（Ｃ−２）ｐｐｍ。
νｍａｘ（ＦＴ  ＩＲ，ＣＣＣｌ３，ＫＢｒプレート）／ｃｍ−１  ３０５６（Ｏ−Ｈ，Ｃ−Ｈ）、１６３７（Ｃ＝Ｏ）、１５６１（Ｎ−Ｈ）、１４４９、１３９４、１３５２、１３０５（Ｃ−Ｏ）、１１９４、１１２９、１０７１（Ｃ−Ｎ）、８８１、８２７、６１６、５６４、５３６。
【０１０４】
Ｎ−ヒドロキシグリシン
【０１０５】
【化１１】
2015536971.tif 000018
【０１０６】
水（１００ｍＬ）中のグリオキシル酸（１．６３０ｇ、２２ｍｍｏｌ）及びＮＨ３ＯＨ．ＨＣｌ（１．１５４０ｇ、２２ｍｍｏｌ）を、室温で撹拌する。１ＭのＮａＯＨを使用して、ｐＨを５に上げた後、シアノ水素化ホウ素ナトリウム（３．３０６ｇ、５２ｍｍｏｌ、２．５当量）を添加した。反応物を、４８時間撹拌したままにした後、１ＭのＨＣｌを滴下添加して、ｐＨを１に下げた。混合物を濾過し、濾物を真空中で濃縮した。水を、白色の残渣に添加して、再度、混合物を真空中で濃縮し、白色の固体を得た（７．７２８９ｇ）。白色の残渣を、水に溶解して、アンバーライト２００Ｃナトリウムを通過させた。生成物を、２％のアンモニア溶液を添加することによって、アンバーライトから取り出した。濾物を、真空中で濃縮し、熱いエタノールから再結晶化させて、黄色の表題生成物（０．６５６２ｇ、３３％、７．２ｍｍｏｌ）を得る。
融点＝１３７〜１３９℃。
δＨ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）１．１８（１Ｈ，ｂｒ  ｓ，Ｎ−Ｈ）、３．６２（２Ｈ，ｂｒ  ｓ，Ｈ−１）ｐｐｍ。
δＣ（４００ＭＨｚ，Ｄ２Ｏ）１７．７２（Ｃ−１）、１８５．００（Ｃ−２）ｐｐｍ。
【０１０７】
ベンズアルドキシム
【０１０８】
【化１２】
2015536971.tif 000019
氷：水：エタノール（２：１：１、２０ｍＬ）の混合物中のベンズアルデヒド（２．００ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を、室温で撹拌した。塩酸ヒドロキシルアミン（１．３８６０ｇ、２０ｍｍｏｌ）、続いて、５０％の水酸化ナトリウム水溶液（４ｍＬ、４０ｍｍｏｌ）を、温度を３０℃より低く保ちながら、撹拌懸濁液に添加した。室温で１時間撹拌した後、混合物を、ジエチルエーテル（２×２５ｍＬ）で抽出した。水性抽出物を、温度は３０℃より低く保ちながら、濃ＨＣｌを使用してｐＨ６に酸性化した後、再度、ジエチルエーテル（２×２５ｍＬ）で抽出した。合わせた有機抽出物を、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過し、真空中で濃縮して、無色の液体（２．４２４６ｇ、１００％、２０ｍｍｏｌ）を得た。δＨ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）７．３８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−５，Ｈ−３）、７．５８（２Ｈ，ｍ，Ｈ−２，Ｈ−６）、７．８８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１．４Ｈｚ，Ｈ−４）、８．１５（１Ｈ，ｓ，Ｈ−７）ｐｐｍ。δＣ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１２７．０（Ｃ−５及びＣ−３）、１２８．８（Ｃ−６及びＣ−２）、１３０．０（Ｃ−４）、１３１．８（Ｃ−１）、１５０．４（Ｃ−７）ｐｐｍ。νｍａｘ（ＦＴ  ＩＲ，ＣＣＣｌ３，ＫＢｒプレート）／ｃｍ−１  ３２８０、３０６１（Ｃ−Ｈ）、３０２８（Ｃ−Ｈ）、２９８５（Ｃ−Ｈ）、２８９８、２３５８、２３４１、１８９６、１８１０、１６９７（Ｃ＝Ｎ）、１６３１（Ｎ−Ｈ）、１５９８（Ｃ＝Ｃ）、１５７７（Ｃ＝Ｃ）、１４９２（Ｎ−Ｏ）、１４４３、１３０３、１２８８、１２０９、１１７６、１１５８、１１０２、１０７４、９４６、８６８、７５２、７０２、６４４。ｍ／ｚ（ＦＴＭＳ＋ＥＳＩ）実測値１２２．０５９７（［Ｍ＋Ｈ］＋、１００％）Ｃ７Ｈ８ＮＯ計算値１２２．０６００。
【０１０９】
２−ブロモ−３−ヒドロキシプロパン酸
【０１１０】
【化１３】
2015536971.tif 000020
【０１１１】
２．５Ｍの硫酸水溶液（１．８Ｌ）中の臭化カリウム（３５０．６３４ｇ、２．９４ｍｏｌ）及びＬ−セリン（１００．０ｇ、０．９５ｍｏｌ）を、０℃で撹拌した。亜硝酸ナトリウム（９２．０ｇ、１．３３ｍｏｌ）を、ゆっくり添加して、温度が５℃より低く保持されていることを確実にした。亜硝酸ナトリウムの半分を、最初の８時間かけて添加し、混合物を、終夜撹拌したままにした後、残存する亜硝酸ナトリウムを、次の３０分かけて添加した。０℃で２．５時間の撹拌後、混合物を、ジエチルエーテル（３×２５０ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせて、ＭｇＳＯ４で脱水し、濾過して、真空中で濃縮する。次いで、残渣を、８時間かけて、高真空でさらに濃縮して、表題生成物（１５４．６９６９ｇ、９６％、０．９１５ｍｏｌ）を得た。δＨ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）３．９７〜４．０９（２Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，Ｊ’＝１２．１Ｈｚ，Ｊ’’＝２５．８Ｈｚ，Ｈ−２）、４．４０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．３Ｈｚ，Ｈ−３）ｐｐｍ。δＣ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）４３．８（Ｃ−２）、６３．７（Ｃ−３）、１７２．８（Ｃ−４）ｐｐｍ。νｍａｘ（ＦＴ  ＩＲ，ＣＣＣｌ３，ＫＢｒプレート）／ｃｍ−１  ３４０７（Ｏ−Ｈ）、２９３１（Ｃ−Ｈ）、２３５５、１７２２、１６１５（Ｃ＝Ｏ）、１４５２、１３９８、１２９０、１２６９、１２４５、１１９１（Ｃ−Ｏ）、１１６０（Ｃ−Ｏ）、１０６８、１０２６、９０９。
【０１１２】
エチル２−ブロモ−３−ヒドロキシプロパノエート
【０１１３】
【化１４】
2015536971.tif 000021
【０１１４】
濃縮硫酸（２．８ｍＬ、ｍｍｏｌ当たり０．００３ｍＬ）を、２−ブロモ−３−ヒドロキシプロピオン酸（１５４．６９６９ｇ、０．９２ｍｏｌ）の無水エタノール（１．８３Ｌ、ｍｍｏｌ当たり２ｍＬ）中撹拌混合物にゆっくり添加した後、１．５時間加熱還流した。混合物を、冷却し、氷水（１．８３Ｌ）を添加し、ジエチルエーテル（２×１．８ｍＬ）で抽出した。有機抽出物を合わせ、氷水（１．８Ｌ）、５％Ｍの炭酸ナトリウム水溶液（２×１．８Ｌ）及び飽和ブライン（１．８Ｌ）で洗浄した。有機抽出物を、硫酸マグネシウムで脱水し、濾過し、真空中で濃縮して表題生成物（１７９．２７ｇ、９９．５％、０．９１ｍｏｌ）を得た。δＨ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．３０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｈ−６）、２．４１（１Ｈ，ｂｒ  ｓ，Ｈ−１）、３．９２〜４．０７（２Ｈ，ｄｄｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，Ｊ’＝１２．０Ｈｚ，Ｊ’’＝４０．０Ｈｚ，Ｈ−２）、４．２５（２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｈ−５）、４．３０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝１．６Ｈｚ，Ｈ−３）ｐｐｍ。δＣ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１３．９２（Ｃ−６）、４４．６１（Ｃ−３）、６２．４３（Ｃ−５）、６３．８５（Ｃ−２）、１６６．７（Ｃ−４）ｐｐｍ。νｍａｘ（ＦＴ  ＩＲ，ＣＣＣｌ３，ＫＢｒプレート）／ｃｍ−１  ３４３４（Ｏ−Ｈ）、２９８７（Ｃ−Ｈ）、２９３９（Ｃ−Ｈ）、１７３６（Ｃ＝Ｏ）、１４６４、１３７３、１２９８、１２６９、１２４４、１１８４、１１５２、１０９８（Ｃ−Ｏ）、１０８０（Ｃ−Ｏ）、１０４１（Ｃ−Ｏ）、９５１、８５７、７９７、６７８、６１５。
【０１１５】
Ｎ−ヒドロキシグリシン（代替の合成）
【０１１６】
【化１５】
2015536971.tif 000022
【０１１７】
ナトリウム（０．４６２６ｇ、０．０２ｍｏｌ）を、ベンズアルドキシム（２．３９９９ｇ、０．０２ｍｏｌ）の無水エタノール（４０ｍＬ）中撹拌混合物に添加した。ブロモ酢酸エチル（２．４４ｍＬ、０．０２２ｍｏｌ、１．１当量）を添加し、混合物を、ｐＨが７に到達するまで、３時間かけて撹拌した。混合物を濾過し、固体を、クロロホルム（２×４０ｍＬ）で洗浄した。合わせた濾物を、真空中で濃縮した。残渣を、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）中に溶解し、終夜冷蔵庫に入れた。混合物を濾過し、冷たいジエチルエーテルで洗浄し、固体を、吸引下で乾燥させた（３．１５８０ｇ）。ニトロン（１．５ｇ）の固体を、濃ＨＣｌ（２０ｍＬ）中で撹拌し、０．５時間加熱還流した。混合物を、真空中で濃縮した。残渣を、水に溶解し、水酸化アンモニウム溶液を使用してｐＨを６に上げた。混合物を、４８時間冷蔵庫で冷却し、濾過し、固体を、熱い水性エタノール（７５％）から再結晶化して、（０．８０９５ｇ、８．９０ｍｍｏｌ、７６％）を得た。融点＝１３７〜１３９℃。νｍａｘ（ＦＴ  ＩＲ，ＣＣＣｌ３，ＫＢｒプレート）／ｃｍ−１  ３３７５、３２３４、３０９４、２９０８、１６４５、１５９２、１５４９、１５０８、１４０６、１３０５、１２１４、１１７８。
【０１１８】
Ｎ−ヒドロキシセリン
【０１１９】
【化１６】
2015536971.tif 000023
【０１２０】
ナトリウム（０．４６００ｇ、０．０２ｍｏｌ）を、ベンズアルドキシム（２．４２０１ｇ、０．０２ｍｏｌ）の無水エタノール（４０ｍＬ）中撹拌混合物に添加した。エチル２−ブロモ−３−ヒドロキシプロパノエート（４．３３４ｇ、０．０２２ｍｏｌ、１．１当量）を添加し、混合物を、ｐＨが７に到達するまで、３時間かけて撹拌した。混合物を濾過し、固体を、クロロホルム（２×４０ｍＬ）で洗浄した。合わせた濾物を、真空中で濃縮した。残渣を、ジエチルエーテル（５０ｍＬ）に溶解し、終夜冷蔵庫に入れた。混合物を濾過し、冷たいジエチルエーテルで洗浄し、固体（２．４１３１ｇ）を吸引下で乾燥させた。ニトロン（１．５ｇ）の固体を、濃ＨＣｌ（２０ｍＬ）中で撹拌し、０．５時間加熱還流した。混合物を、真空中で濃縮した。残渣を、水（１０ｍＬ）中に溶解し、水酸化アンモニウム溶液を使用して、ｐＨを６に上げた。混合物を、４８時間冷蔵庫で冷却し、濾過し、固体を、熱い水性エタノール（７５％）から再結晶化した。アセトンを添加して、表題生成物が溶液から降下することを促進させて表題生成物（０．６７２４ｇ、５．５６ｍｍｏｌ、８８％）を得た。融点＝１５９〜１６３℃。δＨ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）３．１２（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８）、３．５６（１Ｈ，ｍ，Ｈ−８）、４．５９（１Ｈ，ｍ，Ｈ−３）ｐｐｍ。νｍａｘ（ＦＴ  ＩＲ，ＣＣＣｌ３，ＫＢｒプレート）／ｃｍ−１  ３３０８（Ｏ−Ｈ）、３０３２（ＣＯＯＨ）、２９０８（ＣＨ）、１６４８（Ｎ−Ｈ）、１５９１（Ｃ＝Ｏ）、１５４０（Ｎ−Ｏ）、１５１１、１４０２、１３０６、１２２９、１１７４。
【０１２１】
エチル２−ブロモ−２−ヒドロキシアセテート
【０１２２】
【化１７】
2015536971.tif 000024
Ｎ−ブロモスクシンイミド（１１．５３４３ｇ、６５ｍｍｏｌ）を、８０℃で、四塩化炭素（８０ｍＬ）中で撹拌した。グリコール酸エチル（６．１５ｍＬ、６５ｍｍｏｌ）中の過酸化ベンゾイル（０．０５２１ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を混合物に滴下添加した後、３０分間、加熱還流し、この時までに、発熱反応が弱まった。混合物を、室温に冷却し、濾過して、真空中で濃縮した。残渣を、沈殿物が形成されるまで、約３日間、そのままにした。混合物を濾過し、ジクロロメタンで洗浄して、無色の固体（０．８５４４ｇ、４．７ｍｍｏｌ、７％）を得た。融点＝１０７〜１１０℃。δＨ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１．０７（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，Ｈ−５）、２．６６（１Ｈ，ｂｒ  ｓ，Ｈ−１）、３．４４（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｈ−４）、４．０１（１Ｈ，ｓ，Ｈ−２）ｐｐｍ。δＣ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）１６．７（Ｃ−５）、５７．３（Ｃ−４）、８６．０（Ｃ−２）、１７２．９（Ｃ−３）ｐｐｍ。νｍａｘ（ＦＴ  ＩＲ，ＣＣＣｌ３，ＫＢｒプレート）／ｃｍ−１  ３４７９（Ｏ−Ｈ）、３４０６（Ｃ−Ｈ）、１６９７（Ｃ＝Ｏ）、１６１４、１４３９（Ｃ−Ｈ）、１３９３、１２２８（Ｃ−Ｏ）、１１９１（Ｃ−Ｏ）、１０８３（Ｃ−Ｏ）、９０４、８０８、７７６、７１９。
【０１２３】
実施例２
実験の要約：
この実験は、３２℃で、密封容器中の飽和アミノ酸溶液によって引き起こされる潮解相対湿度（DRH）を測定するためであった；ＤＲＨが低くなるほど、測定される溶液の保水容量は大きくなる。潮解相対湿度は、化合物が潮解する相対湿度、即ち、その化合物が非常に多くの水を吸収するので、化合物が吸収された水中で溶解する相対湿度である。
【０１２４】
設備：
設備の設定の図表示は、飽和溶液のＲＨを測定するための実験用の設定を示す図１に示されている。
【０１２５】
装置は３２℃で維持する。３２℃の温度を選び、外側の角質層の温度とした。アミノ酸は、最終的に皮膚の外層に送達されるはずであるので、次いで、これらの化合物の３２℃での保水容量は、重要である。
【０１２６】
方法
飽和溶液は、旋回させながら、アミノ酸を水（１ｍＬ、３２℃）に添加することによって、上記のように調製する。使用される化合物の質量を求めることができるように、水及び残りのアミノ酸に添加する前にすべてのアミノ酸を計量する。次いで、再度、アミノ酸の水への添加によって体積の変化を生じさせる部分モル体積のために、飽和溶液（１ｍＬ、３２℃）を、バイアルに移す。
【０１２７】
％ＲＨが一定に保たれるまで、温湿度計に示した温度及び％ＲＨ（％相対湿度）を、３０分毎に記録する。温度は、試料が受ける温度が３２℃であることを、確認する。
【０１２８】
２４時間での結果は、表１に要約されており、ここでＳ．Ｄ．は、標準偏差である。
【０１２９】
【表２】
2015536971.tif 000025
【０１３０】
これらの試験において、α−ヒドロキシグリシン及びＬ−ホモセリンは、相対湿度のとりわけ有利なレベルを実証したことがわかる。より特定すれば、本発明のアミノ酸は、有利には、３２℃で８０％以下のＤＲＨを有する。加えて、本発明のアミノ酸は、少なくとも０．７のＯ／Ｃ比を有することもわかる。
【０１３１】
上記の表から、３つの実験の平均から、２４時間後の水の相対湿度は１００％であり、予想通り、対照としての役割を果たした。Ｌ及びＤ−セリンは、光学異性体であるので、予想通り、同様の％ＲＨを有した。ヒドロキシグリシンは、セリンよりも良好な、７９．７％のＲＨを有した。Ｌ−ホモセリンは、２４時間で、７１．４％のＲＨを有し、これによって、優れた潮解相対湿度（DRH）測定を示した。
【０１３２】
実施例３
ヘビによる研究
プロトコル
・  すべての実験を３通り（即ち、別々の３つの溶液、３つの皮膚片を溶液毎に１つ）で実施した。使用した皮膚は、アカダイショウ（Elaphe guttata）のアメリカンコーンスネークの背面からであった。
・  水（１ｍＬ）中でアミノ酸（グリシン０．１００８ｇ、Ｌ−セリン０．１３９５ｇ、Ｄ−セリン０．１４００ｇ、Ｌ−ホモセリン０．１５８２ｇ、α−ヒドロキシ−グリシン０．１２１３ｇ）を撹拌することによって、各アミノ酸の１．３３Ｍの濃縮溶液を作製した。
・  同じドナーの上部（背面）からのヘビの皮膚を、約１ｃｍ２片に切断した。各片を計量し、１つの溶液毎に１片のヘビの皮膚を、アミノ酸溶液の１つに直接入れた。
・  １時間後、ヘビの皮膚を溶液から取り出し、濾紙上で拭き取って乾かした。ヘビの皮膚の重量を記録した後、同じヘビの皮膚をアミノ酸溶液に戻した。
・  さらに２３時間後（合計２４時間）、ヘビの皮膚を再度濾紙上で拭き取って乾かして、計量した。
・  次いで、試験アミノ酸を現在吸収し終えたヘビの皮膚を、４８時間、シリカ上の真空デシケータ（RH０％）に入れた後、計量した。皮膚は、現在乾燥しており、試験アミノ酸を含有していた。
・  次いで、ヘビの皮膚をＲＨ４０％のデシケータに入れ（硝酸亜鉛の飽和溶液を使用して制御）、皮膚が、この湿度のレベルでの大気からどれぐらいの水を吸収することができるかを立証した。
・  次いで、各皮膚試料を再計量した。
【０１３３】
添付の図２は、同じ化合物のＤＲＨ（潮解相対湿度）に対して水と比較した、ＲＨ４０％で２４時間後の平均重量増加率を示す。図２は、皮膚を試験アミノ酸で飽和し、乾燥させ、次いで４０％の湿度に暴露した２４時間後のＤＲＨを示す。
【０１３４】
添付の図３は、各試験アミノ酸について、１．３３Ｍのアミノ酸溶液での処理の２４時間に続いて、ＲＨ４０％で２４時間後の平均重量増加率を示す。
【０１３５】
やはり、これらの試験において、α−ヒドロキシグリシン及びＬ−ホモセリンが、とりわけ有利な特性を明示したことがわかる。
【０１３６】
プロトコルＢ
・  各化合物の１０％ｗ／ｗの濃縮溶液は、水（１ｍＬ）中で化合物（１００ｍｇ）を撹拌することによって作製する。実験を同時に３通り実行できるように、各化合物の別々の３つの溶液を別々に作製する。市販のクリームを使用する場合、試料のクリーム（１００ｍｇ）をバイアルに入れる。
・  同じドナーの上部からのヘビの皮膚を１ｃｍ２片に切断する。各片を計量し、化合物の溶液の１つに直接入れる。溶液毎にヘビの皮膚１片。ヘビの皮膚を、１面のみが溶液と接触するように、溶液の上部に直接いれる。ヘビの皮膚を溶液に入れる際、皮膚が溶液表面上に平らに置かれるように、注意する必要がある。
・  １時間後、ヘビを溶液から取り出し、濾紙上で拭き取って乾かす。ヘビの皮膚の重量を記録した後、同じヘビの皮膚を同じ化合物の溶液に戻す。
・  さらに２３時間後（合計２４時間）、ヘビの皮膚を、再度、濾紙上で拭き取って乾かし、計量する。
・  次いで、ヘビの皮膚を、４８時間、シリカ上の真空デシケータに入れた後（相対湿度（RH）０％）、計量した。シリカは、真空デシケータに入れる前に、２４時間乾燥させるべきである。
・  次いで、ヘビの皮膚を、一定のＲＨでデシケータに入れる（４０％のRHを、硝酸亜鉛の飽和溶液を使用して制御する；７０％のＲＨを、１：１のＮａＣｌ：Ｎａ２ＣＯ３の飽和溶液によって制御する；１００％のＲＨを、水を使用して制御する）。各チャンバーを、ヘビの皮膚試料をチャンバーに入れる４８時間前に準備し、ＲＨを、湿度計を使用して確認するべきである。
【０１３７】
添付の図１０は、各試験アミノ酸についての、１０％ｗ／ｗのアミノ酸溶液での２４時間の処理に続いて、７０％のＲＨで２４時間後の平均重量増加率の結果を示す。
【０１３８】
実施例４
異なる物理化学的特性を有する３つの化合物の透過を強化するための、本発明のアミノ酸配合物による皮膚の前処理の効果を、調査した。３つの化合物は、以下のとおりであった：
アシクロビル
メトロニダゾール、及び
ジクロフェナクジエチルアミン
【０１３９】
方法
アシクロビル（ＡＣＶ）、メトロニダゾール及びジクロフェナクジエチルアミン（ＤＤＥＡ）を、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ及びＷａｔｅｒｓ検出器を使用するＨＰＬＣを使用して、分析した。カラム及び試料の温度を、それぞれ４５±２℃及び５．０±２℃で維持した。ガードカラム（Phenomenex USA、C-18 ４．０×３．０ｍｍ）を備えたＫｉｎｅｔｉｘ（商標）Ｃ−１８（Phenomenex、USA）カラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、粒径５μｍ）を、固定相として用いた。移動相は以下の３つの部分であった；移動相Ａ、水；移動相Ｂ、メタノール；及び移動相Ｃ、１０ｍＭのリン酸アンモニウム緩衝液、ｐＨ２．５。移動相を、流量０．８ｍＬ／分での勾配流（表２）を使用して流した。試料を、注入量１０μＬで、１２分間流した。アシクロビル、メトロニダゾール及びＤＤＥＡを、それぞれ４．７、６．５、及び８．７分の概算保持時間で、波長２７６ｎｍで処理した。別々に準備した品質対照と併せて、段階希釈によって調製した一連の標準品から較正曲線を作図した。基準品及びＱＣを、レシーバー液（リン酸緩衝生理食塩水）で希釈した。データを、Ｅｍｐｏｗｅｒ  Ｐｒｏ３  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して記録し、分析した。
【０１４０】
【表３】
2015536971.tif 000026
【０１４１】
Ｎ−ヒドロキシセリン、Ｌ−ホモセリン、Ｎ−ヒドロキシグリシンの前処理用の溶液、及びＮ−ヒドロキシセリン、Ｌ−ホモセリン、Ｎ−ヒドロキシグリシンの１：１：１の比での組合せを、１０％ｗ／ｖで脱イオン水中で調製した。
【０１４２】
ＡＣＶ、メトロニダゾール及びＤＤＥＡのドナー溶液をおよそ１６時間、ＡＰＩを使用して、溶媒系（５０：５０、PEG-400：水）を飽和することによって調製した。ドナー溶液は、インビトロ透過実験における投与前に、遠心分離した。
【０１４３】
ヒトの表皮膜を、美容減少手術（腹部形成手術）後の皮膚から調製した。全層皮膚を、可鍛性を持つまで周囲温度で解凍した。皮下脂肪を、鈍的切開によって機械的に除去した。脂肪の除去の際、皮膚を、４５秒間、熱い脱イオン水（６０±３℃）に浸した。表皮膜（角質層及び表皮を含む）を、手袋をはめた指を使用して下部の真皮から除去し、真皮を廃棄した。次いで、表皮膜を、濾紙上で、（角質層側を上にして）脱イオン水中に浮かべた。過剰水を、表面から除去し、組織を、フランツ型拡散セル中に載せた。各セルの平均表面積はおよそ０．６０ｃｍ２、及び容量はおよそ２．０ｍＬであった。水浴の温度を設定し、３２℃で皮膚の表面温度を維持し、皮膚をインビボで表した。
【０１４４】
各ＡＰＩ（アシクロビル、メトロニダゾール及びDDEA）に対して１つの、３つの実験を実施した。各実験中、ＡＰＩ毎に合計３２のセルを準備した。表皮膜が無傷であることを確実にするために、電気抵抗を使用して、表皮膜の完全性を評価した。セルを、Ｎ−ヒドロキシセリン（n=6）、Ｌ−ホモセリン（n=6）、Ｎ−ヒドロキシグリシン（n=6）の１０％ｗ／ｖの溶液１００μＬ、及び組合せ前処理溶液（n=6）で、終夜（およそ１６時間）、それぞれ前処理し、ｎ＝６セルは、前処理しなかった。加えて、ブランク（前処理なし）及びプラシーボセル（組合せ前処理溶液で前処理した）も、分析アッセイとのいずれかの潜在的な干渉を評価するために、調製した。前処理期間に続いて、前処理溶液を、表皮膜の表面から除去し、表面を乾燥させた。下部のチャンバーを、レシーバー液（リン酸緩衝生理食塩水）で満たし、セルに、ブランク及びプラシーボセルを除いて、予較正した陽性ディスプレイスメントピペットを使用して、各ＡＰＩ飽和ドナー溶液の用量６ｍｇ（即ち１０ｍｇ／ｃｍ２）を投与した。レシーバー液（２００μＬ）の試料を、０、１、２、４、６、２４、３０及び４８時間の時点で、サンプリングアームから除去した。各試料を除去した後、等容積の余熱したレシーバー液を置き換えた。試料を、ＨＰＬＣを使用して分析し、透過した各ＡＰＩのレベルを、定量化した。
【０１４５】
結果
本発明のアミノ酸で前処理しておいたすべてのセルからのジクロフェナクの透過量は、著しく高いことが観測された（図４及び５）。透過したジクロフェナクの最も高い量が、ｔ＝２４時間の場合に、Ｎ−ヒドロキシグリシンによる表皮膜の前処理に続いて観測され、ジクロフェナクの透過量の最大の強化が、前処理をしていない表被膜の透過量の１８．７９倍で観測された。
【０１４６】
図４は、４８時間の実験期間にわたる表皮膜を介したジクロフェナクの累積透過量を示す。各バーは、平均透過量＋ＳＥＭ、ｎ＝５〜６を表す。
【０１４７】
図５は、４８時間後の表皮膜を介したジクロフェナクの累積透過量を示す。各バーは、平均透過量＋ＳＥＭ、ｎ＝５〜６を表す。
【０１４８】
【表４】
2015536971.tif 000027
【０１４９】
表４において、ｔ＝２時間の時点に続いて本発明のアミノ酸で前処理しておいたすべてのセルからのメトロニダゾール透過量は、著しく高いことが観測された（図６及び７）。透過したメトロニダゾールの最も高い量が、ｔ＝３０時間の場合に、Ｎ−ヒドロキシセリンによる表皮膜の前処理に続いて観測され、メトロニダゾール透過量の最大の強化が、前処理をしていない表被膜の透過量の１４．７２倍で観測された。
【０１５０】
図６は、４８時間の実験期間にわたる表皮膜を介したメトロニダゾールの累積透過量を示す。各バーは、平均透過量＋ＳＥＭ、ｎ＝５〜６を表す。
【０１５１】
図７は、４８時間後の表皮膜を介したメトロニダゾールの累積透過量を示す。各バーは、平均透過量＋ＳＥＭ、ｎ＝５〜６を表す。
【０１５２】
【表５】
2015536971.tif 000028
【０１５３】
表５において、アシクロビルの透過量は、本発明のアミノ酸で前処理しておいたセル中でより早くレシーバー液において観測された（図８及び９）。透過したアシクロビルの最も高い量が、ｔ＝４８時間の場合に、Ｌ−ホモセリンによる表皮膜の前処理に続いて観測され、アシクロビルの透過量の最大の強化が、前処理をしていない表皮膜の透過量の１１．７２倍で観測された。ｔ＝４８時間の前の増感比は、この点の前の未処理の皮膚からのアシクロビル透過量の不足のため、算出することができなかった。
【０１５４】
図８は、４８時間の実験期間にわたる表皮膜を介したアシクロビルの累積透過量を示す。各バーは、平均透過量＋ＳＥＭ、ｎ＝５〜６を表す。
【０１５５】
図９は、４８時間後の表皮膜を介したアシクロビルの累積透過量を示す。各バーは、平均透過量＋ＳＥＭ、ｎ＝５〜６を表す。
【０１５６】
【表６】
2015536971.tif 000029
【０１５７】
要約
本発明のアミノ酸による表皮膜の前処理は、その薬物透過を強化する。
【０１５８】
本発明の異なるアミノ酸は、薬物の物理化学的特性に応じて異なる強化作用を有する。
【０１５９】
薬物吸収強化因子のプロットは、図１１に示されている。このことから、強化は、ＬｏｇＰの増加と共に増加することがはっきりとわかる。この点における強化因子及びＬｏｇＰは、以下のとおりである。
【０１６０】
【表７】
2015536971.tif 000030
【０１６１】
実施例５
混合物及び組合せを使用した、ヘビの皮膚への水分取込
通常の配合物及びベースとの組合せ
ヘビの皮膚がＲＨ約７５％で溶液（１：１のＮａＣｌ：Ｎａ２ＣＯ３飽和溶液を使用して調製）全体で最終的に再水和されるということ以外は、実施例３に記載のプロトコルを使用。すべての試料は１０％であった（１つの試料を１％で使用し、ビヒクルを単独で試験したヒアルロン酸を除く）。結果を、図１０に示す。
【０１６２】
この結果から、本発明のアミノ酸のオイラタムとの組合せは、その保湿能にとりわけ有益であることがわかる。
【０１６３】
実施例６
ＲＨＥ刺激性評価法１
１．１  序論
この実験の目的は、皮膚刺激性を引き起こすα−ヒドロキシグリシン（α-H-G）及びＬ−ホモセリン（L-h-S）の可能性を調査することであった。方法は、ＯＥＣＤガイドライン、試験番号４３９：インビトロ皮膚刺激性に準じて、「Ｔｈｅ  ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ  Ｓｋｉｎ  Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔ−４２  ｂｉｓ  ａｓｓａｙ」に対して認証されたＳＯＰに基づいていた。プロトコルは、セクション１．２で提供される。この方法に対するさらなる詳細は、ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ（商標）ＲＨＥ  ＳＯＰ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１（2009年7月）、化学物質の急性皮膚刺激性の予測のためのＳｋｉｎＥｔｈｉｃ皮膚刺激性試験−４２条２項試験法：４２分の適用＋インキュベーション後４２時間で見ることができる。［ｈｔｔｐ：／／ｅｃｖａｍ．ｊｒｃ．ｅｃ．ｅｕｒｏｐａ．ｅｕ］で入手可能。このプロトコルにおいて、組織生存率が陰性対照の５０％未満であったことは、試験溶液が刺激物であることを示唆している。
【０１６４】
加えて、試験溶液の組織との接触時間が、２４時間まで増加される場合、さらなる実験が実施された。この点に続いて、ＭＴＴアッセイを使用して、組織生存率及び試験溶液が刺激性を生じさせる可能性を求めた。
【０１６５】
１．２  ＳｋｉｎＥｔｈｉｃ  皮膚刺激性試験−４２条２項アッセイプロトコル
１．２．１  ＲＨＥ  刺激試験プロトコル
１．２．１．１．１  プレインキュベーションステップ
以下のステップを、組織の受領時に完了した：
（ｉ）  ６ウェルプレートのウェルを、成長培地１ｍＬで満たした。
（ｉｉ）  組織を、梱包から取り出し、輸送用アガロースを除去してきれいにし、損傷の形跡を調べ；損傷した組織を廃棄した。
（ｉｉｉ）  組織を、成長培地に移し、次いで、試験溶液の適用まで、ＣＯ２５％、３７℃でインキュベートした。
【０１６６】
１．２．１．１．２  リン酸緩衝生理食塩水（PBS）の調製
（ｉ）  ＰＢＳタブレット（五倍）を、５００ｍＬのメスフラスコに添加した。
（ｉｉ）  ステップ（ｉ）からのメスフラスコを、脱イオン水（１８．２ＭΩ）で一定の容量にし、ＰＢＳタブレットが溶解したことが観測されるまで、ＰＴＦＥマグネチックスターラーを使用して撹拌した。
（ｉｉｉ）  ＰＢＳを、適宜使用した。
【０１６７】
１．２．１．１．３  ＭＴＴ溶液の調製
（ｉ）  ３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）（１００．０±５．０ｍｇ）を計量して、２０ｍＬのメスフラスコに入れた。生成した溶液の名目上のＭＴＴ濃度は、５ｍｇ／ｍＬであった。
（ｉｉ）  ステップ（ｉ）からのメスフラスコを、ＰＢＳで一定の容量にした。
（ｉｉｉ）  ＰＴＦＥマグネチックスターラーを、ステップ（ｉｉ）からのメスフラスコに添加し、溶液を、完全に溶解するまで撹拌したままにした。
（ｉｖ）  ステップ（ｉｉｉ）からの溶液を、０．２μｍのフィルターを使用してフィルター殺菌し、直接滅菌チューブに入れた。
（ｖ）  このストックを、光から保護し、必要になるまで、−２０℃で保管した。
（ｖｉ）  必要の際、ＭＴＴ溶液を解凍し、余熱した維持培養液で希釈して、最大１ｍｇ／ｍＬの濃度を達成した。
【０１６８】
１．２．１．１．４  陽性対照（SDS５％）溶液の調製
（ｉ）  ドデシル硫酸ナトリウム（SDS、１００±５．０ｍｇ）を計量して、２０ｍＬのメスフラスコに入れ、脱イオン水（１８．２ＭΩ）で一定の容量にした。
（ｉｉ）  ステップ（ｉ）からのメスフラスコを、脱イオン水（１８．２ＭΩ）で一定の容量にし、ＳＤＳが完全に溶解するまで、ＰＴＦＥマグネチックスターラーを使用して撹拌した。
（ｉｉｉ）  溶液を、０．２μｍの滅菌フィルターであるＰＥＳフィルターを使用してフィルター殺菌した。
【０１６９】
１．２．１．１．５  ５及び１％ｗ／ｖのα−Ｈ−Ｇ及び１０及び１％ｗ／ｖのＬ−ｈ−Ｓの適用並びにすすぎ
【０１７０】
１．２．１．１．６  ５及び１％ｗ／ｖのα−Ｈ−Ｇ並びに１０及び１％ｗ／ｖのＬ−ｈ−Ｓ並びに対照の適用
（ｉ）  試験溶液（水中５％ｗ／ｖのα-ヒドロキシグリシン（α-H-G）、水中１％ｗ／ｖのα-ヒドロキシグリシン（α-H-G）、水中１０％ｗ／ｖのL-ホモセリン（L-h-S）、水中１％ｗ／ｖのL-ホモセリン（L-h-S））１６μＬ±０．５μＬ、並びに陰性（PBS）対照及び陽性（SDS５％）対照を、陽性ディスプレイスメントピペットを使用して、表皮組織の上部に分注した。試験溶液又は対照を、ピペットの先端を使用して表皮全体に分配した。
（ｉｉ）  ナイロンメッシュを、鉗子を使用して組織の表面全体に配置し、プレートの蓋を、置き換えた。
（ｉｉｉ）  ステップ（ｉｉ）からのプレートを、室温で４２分間、ラミナーフローキャビネット中で保持した、又はＣＯ２５％で２４時間、３７℃でインキュベートした。
【０１７１】
１．２．１．１．７  すすぎ及び乾燥ステップ
（ｉ）  処理に続いて、ナイロンメッシュを、組織の表面から除去した。
（ｉｉ）  組織を、インサートから５〜８ｃｍの距離で、ＰＢＳ（１ｍＬ）で２５回すすぎ、表皮の表面から残存するすべての試験品目を除去した。
（ｉｉｉ）  ステップ（ｉｉ）からのインサートを空にして、滅菌吸収紙上で乾燥させた。
（ｉｖ）  角質層の表面を、コットンチップで乾燥させた。
（ｖ）  ステップ（ｉｖ）からの洗浄済みの組織を、暖めた成長培地２ｍＬで予め満たした未使用の６ウェル培養プレート中に移した。
【０１７２】
１．２．１．１．８  処理後のインキュベーション：４２時間
（ｉ）  処理後、組織を、ＣＯ２５％、湿度９５％の環境で４２時間、３７℃でインキュベートした。
（ｉｉ）  培養期間の終了時、処理済みのＲＨＥ組織の下の浮上分離液を、確保した。
（ｉｉｉ）  維持培地を、２分間、３００ＲＰＭで撹拌して、均質化した。
（ｉｖ）  インキュベーション培地を、遠心管に配置し、分析に必要になるまで、−２０℃で保管した。
【０１７３】
１．２．１．１．９  ＭＴＴアッセイ
（ｉ）  ２４ウェルプレートの所要のウェルを、ＭＴＴ溶液３００μＬで満たし、光から保護した。
（ｉｉ）  組織を、処理後のインキュベーションプレートから取り出し、過剰の培地を、吸収紙で除去した。
（ｉｉｉ）  処理した組織を、ＭＴＴ溶液で予め満たした２４ウェルプレート中のウェルに移した。
（ｉｖ）  プレートを、ＣＯ２５％、湿度９５％の環境で３時間（＋／−５分）、３７℃でインキュベートした。
（ｖ）  新しいプレートを、イソプロパノール８００μＬで満たし、処理した組織を、プレートに移した。さらなるイソプロパノール７００μＬを、各組織の頂部に添加した。
（ｖｉ）  プレートを、蒸発を止めるためにパラフィルムで覆い、ホイルを使用して光から保護した後、抽出するために終夜冷蔵保存（２〜８℃）した。
（ｖｉｉ）  抽出に続いて、組織を、ウェルに抽出溶液すべてを添加するために、ピペットチップを使用して穴をあけた。溶液を、ピペットで混合することによって均質にした。
（ｖｉｉｉ）  ウェル毎の抽出溶液３×２００μＬを、９６ウェルプレートにピペットで移し、光学密度を、μＱｕａｎｔ分光計を使用して、５７０ｎｍで測定した。
【０１７４】
１．３  結果及び考察
４２分及び２４時間の暴露での組織生存率評価の結果を、それぞれ図１２２及び図に例示する。すべての試験溶液の暴露後の組織の生存率が、陰性対照の５０％を超えて保持されていることが観測され、溶液（５％ｗ／ｖのα-H-G、１％ｗ／ｖのα-H-G、１０％ｗ／ｖのL-h-S、１％ｗ／ｖのL-h-S）が刺激性のないものであることを示唆していた。
【０１７５】
図１２は、４２分の暴露後及び４２の暴露後インキュベーションのＲＨＥ組織の生存率を示す。各点は、組織の生存率平均値を表し、エラーバーは、範囲；ｎ＝４を表す。
【０１７６】
図１３は、２４時間の暴露後のＲＨＥ組織の生存率を示す。各点は、組織の生存率平均値を表し、エラーバーは、範囲；ｎ＝３を表す。
【０１７７】
２  ＲＨＥ刺激性評価方法２
２．１  序論
方法１を、皮膚刺激性を引き起こすα−ヒドロキシグリシン（α-H-G）及びＬ−ホモセリン（L-h-S）に対する可能性を調査するために使用した。プロトコルは、溶液よりもむしろ単一の化合物に対して主に設計及び認証されている。したがって、皮膚刺激性を引き起こすＮ−ヒドロキシセリン及びＮ−ヒドロキシグリシンの可能性をさらに洞察するために、第２のプロトコルは、化合物の試験混合物に対して設計されているＭａｔｔｅｋ’ｓ  ＭＴＴ影響時間（ET-50）アッセイを使用して調査した。加えて、市販の２つのアミノ酸関連化合物（L-セリン及びグリシン）を選択し、Ｎ−ヒドロキシセリン及びＮ−ヒドロキシグリシンに対する比較物として試験した。
【０１７８】
Ｍａｔｔｅｋ’ｓ  ＭＴＴ影響時間（ET-50）アッセイは、化学物質が生存率を対照の５０％に低減する（即ち、ET-50値）のに必要な暴露時間を求めるための用量反応曲線を作図するために、最低でも３回の暴露時間（各暴露時間において、組織生存率を、ＭＴＴアッセイによって求めた）を使用した。一般的なガイドラインとして、以下のグループ化は、得られたＥＴ−５０の結果に基づいて予想されるインビボ刺激性反応を決定するのに使用することができる。
【０１７９】
【表８】
2015536971.tif 000031
【０１８０】
２．２  ＭＴＴ  ＥＴ−５０アッセイプロトコル
溶液の刺激性評価を、以下に記載したプロトコルを使用して実施した。各試験溶液；Ｎ−ヒドロキシセリン（水中１０％ｗ／ｖのN-H-S）、Ｎ−ヒドロキシグリシン（水中１％ｗ／ｖのN-H-G）、Ｌ−セリン（水中、１０％ｗ／ｖ）及びグリシン（水中、１０％ｗ／ｖ）、陽性対照（１％ｖ／ｖのPBS中Triton X-100、）及び陰性対照（未処理）を、異なる投与時間（溶液に対して２、６及び２４時間、陰性対照に対して５時間、及び陽性対照に対して３及び７時間、ｎ＝３）で組織に適用した。
【０１８１】
２．２．１  ＲＨＥ組織のプレインキュベーションステップ
組織を、到着時に２〜８℃で保管し、その後、以下の手順を実施した：
（ｉ）  ６ウェルプレートのウェルを、自動ピペットを使用して、余熱した（３７℃）アッセイ培地（０．９ｍＬ、組織を補充）で満たした。
（ｉｉ）  組織を、梱包から取り出し、綿棒を使用して輸送用アガロースを除去してきれいにし、損傷の形跡を調べた。損傷した組織を廃棄した。
（ｉｉｉ）  組織を、アッセイ培地に移し、翌日、試験溶液；Ｎ−ヒドロキシセリン（水中１０％ｗ／ｖのN-H-S）、Ｎ−ヒドロキシグリシン（水中１％ｗ／ｖのN-H-G）、Ｌ−セリン（水中、１０％ｗ／ｖ）及びグリシン（水中、１０％ｗ／ｖ）の適用まで、ＣＯ２５％、３７℃でインキュベートした。
【０１８２】
２．２．２  標準ＭＴＴ溶液の調製
標準ＭＴＴ溶液を、以下の手順を使用して調製した：
（ｉ）  ＭＴＴ濃縮物を、フリーザーから取り出し、解凍した。濃縮物を、ＭＴＴ希釈溶液（MTT希釈溶液４ｍＬに対して濃縮物１ｍＬ）で希釈した。
（ｉｉ）  ステップ（ｉ）からのＭＴＴ溶液を、５分間、３００の重力で遠心分離し、いずれの微粒子も除去した。
（ｉｉｉ）  ステップ（ｉｉ）からのＭＴＴ溶液の上清を、最大期間２４時間、４℃の暗室に保管し、適宜使用した。
【０１８３】
２．２．３  溶液及び対照の適用
（ｉ）溶液及び対照の適用の前に、ＲＨＥ組織のプレインキュベーション培地を、自動ピペットを使用して、未使用の余熱した（３７℃）のアッセイ培地（０．９ｍＬ、組織を補充）で置き換えた６ウェルプレートから除去した。
（ｉｉ）  陽性ディスプレイスメントピペットを使用して、Ｎ−ヒドロキシセリン（水中１０％ｗ／ｖのN-H-S）、Ｎ−ヒドロキシグリシン（水中１％ｗ／ｖのN-H-G）、Ｌ−セリン（水中、１０％ｗ／ｖ）及びグリシン（水中、１０％ｗ／ｖ）の溶液又は対照（陰性対照及び陽性対照）を、ＲＨＥ組織の頂部に分注した（１００±０．５μＬ）。次いで、溶液又は対照を、滅菌ガラスロッドを使用してＲＨＥ組織の表面全体に分配した。
（ｉｉｉ）  蓋を、ＲＨＥ組織を含有するウェルプレート上に配置して、組織を、所要の投与期間（溶液に対して２、６及び２４時間、陽性対照に対して３及び７時間、及び陰性対照に対して５時間）、インキュベーター（３７℃、ＣＯ２５％）に戻した。
【０１８４】
２．２．４  ＭＴＴアッセイ
溶液及び対照の適用後のＲＨＥ組織の生存率を求めるために、以下の手順を使用した：
（ｉ）  ２４ウェルプレートの所要のウェルを、ＭＴＴ溶液３００μＬで満たし、光から保護した。
（ｉｉ）  組織を、処理後インキュベーションプレートから取り出し、過剰の溶液及び対照を、滅菌綿棒で除去した。
（ｉｉｉ）  続いて、ＲＨＥ組織を、残存する溶液を表皮の表面から除去するために、ＰＢＳ１０００μＬで５回すすいだ。
（ｉｖ）  ステップ（ｉｉｉ）からの組織を綿棒で拭き取って乾かした。
（ｖ）  ステップ（ｉｖ）からの処理した組織をＭＴＴ溶液（３００μＬ）で予め満たした２４ウェルプレート中のウェルに移した。プレートをＣＯ２５％、湿度９５％の環境で３時間（＋／−５分）、３７℃でインキュベートした。
（ｖｉ）  続いて、処理した組織を抽出剤溶液１ｍＬで満たした新しいプレートに移した。
（ｖｉｉ）  プレートを蒸発を止めるためにＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）を使用して密閉し、ホイルを使用して光から保護した後、２〜８℃で抽出して、蒸発を最小限に抑えた。
（ｖｉｉｉ）  抽出に続いて、ＲＨＥ組織をウェルから取り出し、さらに抽出剤溶液１ｍＬを添加した。ピペットを使用して、抽出溶液を混合し、視覚的に均質にした。
（ｉｘ）  ステップ（ｖｉｉｉ）からの溶液を９６ウェルプレートの自動ピペットを使用してｎ＝３ウェルに移し（ウェル毎に２００μＬ）、光学密度を波長５７０ｎｍで測定した。
【０１８５】
２．３  結果及び考察
２、６及び２４時間での組織生存率評価を図１４に例示する。用量反応曲線は、１％ｗ／ｖのＮ−Ｈ−Ｇ、１０％ｗ／ｖのＬ−セリン及び１０％ｗ／ｖのグリシンが、３つの投与期間（t=２、６及び２４時間）の間、ＲＨＥ組織の生存率に有意な影響を及ぼさなかったことを実証している。このように及びＥＴ−５０ガイダンス文書の値に従って、１％ｗ／ｖのＮ−Ｈ−Ｇ、１０％ｗ／ｖのＬ−Ｈ−Ｓ及び１０％ｗ／ｖのグリシンは、刺激性のないものと考えられる。
【０１８６】
２２．８時間でのＥＴ−５０を、非常に穏やかな刺激物として分類される１０％ｗ／ｖのＮ−Ｈ−Ｓに対して算出した。市販のアミノ酸関連化合物（L-セリン及びグリシン）の両方を、非刺激物として示した。
【０１８７】
図１４は、ｔ＝２、６及び２４時間での１０％ｗ／ｖのＮ−Ｈ−Ｇ、１％ｗ／ｖのＮ−Ｈ−Ｇ、１０％ｗ／ｖのＬ−セリン及び１０％ｗ／ｖのグリシンの溶液並びに陽性対照（１％ｗ／ｖのTriton（商標）X-100、t=３及び７時間）の暴露後の組織生存率を示す。各時点は、組織の生存率平均値を表し、エラーバーは、範囲、ｎ＝３を表す。
【０１８８】
３  乾癬組織のインビトロ評価。方法３
３．１  序論
乾癬線維芽細胞及び通常のケラチノサイトからなるヒト細胞ベースのインビトロ乾癬組織モデルを、この研究で使用した。通常のＲＨＥ組織と比較した場合、乾癬組織モデルは、通常のＲＨＥ組織（例えばGM-CSF）のものと比較して、基底上皮細胞の過剰増殖及び乾癬マーカーの発現増加を呈した。ＧＭ−ＣＳＦは、マクロファージ、顆粒球、好中球、好酸球及び樹状細胞が組織の損傷及び疾病進行に寄与し得る（Krinner 2007）、乾癬を含めた慢性炎症及び自己免疫疾患に関与する自然免疫系の主要な活性化因子である（Lontzら1995）。ＧＭ−ＣＳＦは、幹細胞を刺激して、顆粒球及びその他のマクロファージを生成し、続いて、これらの分化した免疫細胞を活性化する。ＧＭ−ＣＳＦは、レベルの上昇したＧＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ、又はアレルギー及び乾癬患者、関節炎及び喘息の患者を含めた様々な炎症部位において測定されるタンパク質による自己免疫異常における炎症仲介物質としても同定されている（Plater-Zyberkら2008）。過去数年にわたる多数のインビボ研究は、中和抗体を介したＧＭ−ＣＳＦの遮断が、関節炎実験的自己免疫性脳炎、乾癬（Schonら2000）、及び肺病（Plater-Zyberkら2008）を含めた様々な炎症のモデルにおける炎症誘発性疾患を予防し得る又は治癒さえし得ることを示している。加えて、組み換えＧＭ−ＣＳＦによる治療は、慢性炎症疾患を悪化させることが見出されており、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ治療を受けている、慢性乾癬に罹患した患者は、悪化した乾癬性病巣を有することが示されている（Kellyら2007）。乾癬におけるＧＭ−ＣＳＦの重要性のために、この研究における分析に、ＧＭ−ＣＳＦが選択された。
【０１８９】
３．２  方法
この調査において、ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ashland、MA）から供給された健康な組織及び乾癬性組織である２つのタイプのＲＨＥ組織を使用した。わかりやすくするために、以下のプロトコルは、両方の組織が、同様に処理されていたので、ＲＨＥ組織としての組織タイプ及びアッセイ培地としてのすべての培地の両方に言及する。唯一の例外は、異なる２つのタイプの培地が、異なるタイプの組織（健康な組織及び乾癬性組織）に対して必要とされたことである。この実験で使用したこの健康な組織の対照は、乾癬組織におけるＧＭ−ＣＳＦのレベルが、製造元によって既に実証されている通りに審査されていたことを実証している。
【０１９０】
３．２．１  ＲＨＥ組織のプレインキュベーションステップ
組織を、到着時に２〜８℃で保管し、その後、以下の手順を実施した：
（ｉ）  ６ウェルプレートのウェルを、自動ピペットを使用して、余熱した（３７℃）アッセイ培地（０．９ｍＬ、組織を補充）で満たした。
（ｉｉ）  組織を、梱包から取り出し、綿棒を使用して輸送用アガロースを除去してきれいにし、損傷の痕跡を調べた。損傷した組織を廃棄した。
（ｉｉｉ）  組織を、成長培地に移し、翌日、溶液の適用まで、ＣＯ２５％、３７℃でインキュベートした。
【０１９１】
３．２．２  ＭＴＴ溶液の調製
（ｉ）  ３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）（１００．０±５．０ｍｇ）を計量して、グレードＡの２０ｍＬのメスフラスコに入れた。生成した溶液の名目上のＭＴＴ濃度は、５ｍｇ／ｍＬであった。
（ｉｉ）  ステップ（ｉ）からのメスフラスコを、ＰＢＳを加えて一定の容量にした。
（ｉｉｉ）  ＰＴＦＥマグネチックスターラーを、ステップ（ｉｉ）からのメスフラスコに添加し、溶液を、完全に溶解するまで撹拌したままにした。
（ｉｖ）  ステップ（ｉｉｉ）からの溶液を、０．２μｍのフィルターを使用してフィルター殺菌して、直接滅菌チューブに入れた。
（ｖ）  このストックを、光から保護し、必要になるまで、−２０℃で保管した。
（ｖｉ）  必要の際に、ＭＴＴ溶液を解凍し、余熱した維持培養液で希釈して、最大１ｍｇ／ｍＬの濃度を達成した。
【０１９２】
３．２．３  組織の設定及び試験溶液の適用
（ｉ）  平衡化時間の終了時、各ウェル用の培地を除去し、次いで、組織を持ち上げ、培地スタンドに配置し、未使用の余熱した（３７℃）アッセイ培地（５ｍＬ）を、ウェルに添加した。
（ｉｉ）  陽性ディスプレイスメントピペットを使用して、試験溶液の、水中１０％ｗ／ｖのＮ−Ｈ−Ｓ（N-ヒドロキシセリン）、水中１０％ｗ／ｖのＮ−Ｈ−Ｇ（N-ヒドロキシグリシン）、水中１０％ｗ／ｖのＬ−ｈ−Ｓ（L-ホモセリン）及び水中１０％ｗ／ｖの１：１：１（N-H-S:N-H-G:L-h-S）の組合せを、ＲＨＥ組織の頂部に分注した（５０±０．５μＬ）。次いで、溶液又は対照を、滅菌ガラスロッドを使用してＲＨＥ組織の表面全体に分配した。
（ｉｉｉ）  蓋を、ＲＨＥ組織を含有するウェルプレート上に配置し、組織を、適用の間に、４８時間インキュベーター（３７℃、ＣＯ２５％）に戻した。
【０１９３】
３．２．４  培地の変更及び溶液の再適用
（ｉ）  ４８時間毎に、ＲＨＥ組織用の培地を６ウェルプレートから除去し、サイトカイン分析用に保管したチューブ（−２０℃）に移した。
（ｉｉ）  未使用の余熱した（３７℃）アッセイ培地（５ｍＬ）を、自動ピペットを使用して各組織に添加した。
（ｉｉｉ）  各処理から１つの組織を生存率評価用に取り出した。
（ｉｖ）  続いて、ＲＨＥ組織を、ＰＢＳ１００μＬですすぎ、残存する溶液を表皮の表面から除去した。
（ｖ）  陽性ディスプレイスメントピペットを使用して、溶液の、水中１０％ｗ／ｖのＮ−Ｈ−Ｓ、水中１０％ｗ／ｖのＮ−Ｈ−Ｇ、水中１０％ｗ／ｖのＬ−ｈ−Ｓ及び１０％ｗ／ｖ（N-H-S:N-H-G:L-h-S）の１：１：１の組合せを、ＲＨＥ組織の頂部に分注した（５０±０．５μＬ）。次いで、溶液又は対照を、滅菌ガラスロッドを使用してＲＨＥ組織の表面全体に分配した。
（ｖｉ）  蓋を、ＲＨＥ組織を含有するウェルプレート上に配置し、組織を、ｔ＝０、４８及び９６時間での適用の間に、４８時間インキュベーター（３７℃、ＣＯ２５％）に戻した。
【０１９４】
３．２．５  ＭＴＴアッセイ
溶液及び対照の適用後のＲＨＥ組織の生存率を求めるために、以下の手順を使用した：
（ｉ）  ２４ウェルプレートの所要のウェルを、ＭＴＴ溶液３００μＬで満たし、光から保護した。
（ｉｉ）  組織を、処理後インキュベーションプレートから取り出し、過剰の溶液及び対照を、滅菌綿棒で除去した。
（ｉｉｉ）  続いて、ＲＨＥ組織を、残存する溶液を表皮の表面から除去するために、ＰＢＳ１０００μＬで５回すすいだ。
（ｉｖ）  ステップ（ｉｉｉ）からの組織を、綿棒で拭き取って乾かした。
（ｖ）  ステップ（ｉｖ）からの処理した組織を、ＭＴＴ溶液（３００μＬ）で予め満たした２４ウェルプレート中のウェルに移した。プレートを、ＣＯ２５％、湿度９５％の環境で３時間（＋／−５分）、３７℃でインキュベートした。
（ｖｉ）  続いて、処理した組織を、抽出剤溶液１ｍＬで満たした新しいプレートに移した。
（ｖｉｉ）  プレートを、蒸発を止めるためにＰａｒａｆｉｌｍ（登録商標）を使用して密閉し、ホイルを使用して光から保護した後、２〜８℃で抽出して、蒸発を最小限に抑えた。
（ｖｉｉｉ）  抽出に続いて、ＲＨＥ組織を、ウェルから取り出し、さらに抽出剤溶液１ｍＬを添加した。ピペットを使用して、抽出溶液を混合し、視覚的に均質にした。
（ｉｘ）  ステップ（ｖｉｉｉ）からの溶液を、９６ウェルプレートの自動ピペットを使用してｎ＝３ウェルに移し（ウェル毎に２００μＬ）、光学密度を、波長５７０ｎｍで測定した。
【０１９５】
３．２．６  サイトカイン放出の分析
条件培地を、放出したＧＭ−ＣＳＦの濃度を求めるために分析した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ヒトＧＭ−ＣＳＦキット（固相サンドイッチ酵素結合免疫吸着法（ELISA））を使用して、ＧＭ−ＣＳＦの濃度を定量化した。ヒトＧＭ−ＣＳＦに特異的な抗体を、マイクロタイタープレートのウェル上に被覆する。ヒトＧＭ−ＣＳＦの標準品を含めた各試料を、被覆ウェルに直接ピペットで移し、続いてビオチン化した第２の抗体を添加した。プレートを、０．５時間、周囲条件下でインキュベートし、その間、ヒトＧＭ−ＣＳＦ抗原は、同時に、第１の部位の固定化（捕捉）抗体、及び第２の部位の溶液相ビオチン化抗体に結合する。過剰の第２の抗体を除去し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ（酵素）を添加した。この酵素は、ビオチン化抗体に結合し、４つの要素からなるサンドイッチを完成する。このサンドイッチを、０．５時間、周囲条件下で、２回でインキュベートし、任意の非結合酵素を、洗浄することによって除去し、その後、基質溶液を添加し、この結果、μＱｕａｎｔ分光計を使用して４５０ｎｍで溶液の吸収を測定することによって定量化された着色生成物の形成をもたらした。この着色生成物の強度は、最初の試料中に存在するヒトＧＭ−ＣＳＦの濃度に正比例し、提供されたＧＭ−ＣＳＦ標準品から定量化される。
【０１９６】
３．３  結果及び考察
図１５及び１６は、水中１０％ｗ／ｖのＮ−Ｈ−Ｓ、水中１％ｗ／ｖのＮ−Ｈ−Ｇ、水中１０％ｗ／ｖのＬ−ｈ−Ｓ、及び１：１：１（N-H-S:N-H-G:L-h-S）の組合せ溶液で、乾癬及び対照の再建したヒト皮膚モデルの両方における６日間にわたる処理の効果を例示している。このことは、乾癬組織からのＧＭ−ＣＳＦの放出が、未処理の乾癬組織と比較して、Ｎ−Ｈ−Ｓ、Ｌ−ｈ−Ｓ、Ｎ−Ｈ−Ｇ及び組合せ溶液での処理によって低減されることを実証している。ＧＭ−ＣＳＦ放出の低減は、Ｎ−ヒドロキシセリン（N-H-S）、Ｌ−ホモセリン（L-h-S）、Ｎ−ヒドロキシグリシン（N-H-G）及び１：１：１の組合せが、乾癬の治療に有益であり得ることを示唆していた。
【０１９７】
試験溶液である水中１０％ｗ／ｖのＮ−Ｈ−Ｓ、水中１％ｗ／ｖのＮ−Ｈ−Ｇ、水中１０％ｗ／ｖのＬ−ｈ−Ｓ、及び１０％ｗ／ｖの１：１：１（N-H-S:N-H-G:L-h-S）の組合せ溶液のいずれも、６日間の実験期間にわたって、組織生存率に対して強い負の影響を及ぼさなかった。このデータは、溶液が刺激性のないものである、即ち、組織生存率が、実験の間、５０％を超えて保持されていたことが、刺激性評価からの結論を裏付けている（表６）。
【０１９８】
【表９】
2015536971.tif 000032
【０１９９】
図１５は、乾癬組織からのＧＭ−ＣＳＦの放出を示す。各点は、２、４及び６日で行った測定による６日にわたるＧＭ−ＣＳＦの平均累積放出を表し、エラーバーは、範囲ｎ＝２〜３を表す。
【０２００】
図１６は、ＧＭ−ＣＳＦの総放出を示す。各バーは、乾癬モデル及び対照のＲＨＥ組織の両方からの６日にわたるＧＭ−ＣＳＦの総放出を表す。エラーバーは、範囲ｎ＝２〜３を表す。
【０２０１】
４  要約
４．１  ＲＨＥ刺激性評価（方法１）
Ｌ−ホモセリン（L-h-S）及びα−ヒドロキシグリシン（α-H-G）の皮膚刺激性の可能性を、２４時間の増加した投与期間を追加して、４２条２項アッセイプロトコルを使用して調査した。両方のインキュベーション期間（４２分及び２４時間）の後の組織生存率の分析によって、組織生存率が５０％を超えて保持されることが実証され、このことは、Ｌ−ホモセリン（L-h-S）及びα−ヒドロキシグリシン（α-H-G）が共に非刺激物であることを示唆していた。
【０２０２】
４．２  ＲＨＥ刺激性評価（方法２）
Ｎ−ヒドロキシグリシン（N-H-G）及びＮ−ヒドロキシセリン（N-H-S）に反応する皮膚刺激性の可能性に対してさらに調査するために、ＥＴ−５０皮膚刺激性プロトコル（MatTek）を使用した。これは、配合物及び混合物に適しているので、選択された。このアッセイにおいて、試験品目であるＮ−ヒドロキシグリシン（N-H-G）及びＮ−ヒドロキシセリン（N-H-S）に加えて、２つの市販のアミノ酸関連化合物（L-セリン及びグリシン）を、比較のために選択した。この研究において、α−ヒドロキシグリシン（α-H-G）は非刺激物（即ち、ET-50＜２４時間であった）であることが見出され、１０％ｗ／ｖのＮ−ヒドロキシセリン（N-H-S）は、非常に穏やかな刺激物（即ち、ET-50が１２〜２４時間の間であった）として分類された。市販のアミノ酸関連化合物（L-セリン及びグリシン）の両方は、非刺激物として示された。
【０２０３】
４．３  乾癬組織のインビトロ評価
乾癬のＲＨＥモデルにおけるＧＭ−ＣＳＦの放出に対するＮ−ヒドロキシセリン（N-H-S）、Ｌ−ホモセリン（L-h-S）、Ｎ−ヒドロキシグリシン（N-H-G）の効果を調査した。Ｎ−ヒドロキシセリン（N-H-S）、Ｌ−ホモセリン（L-h-S）、Ｎ−ヒドロキシグリシン（N-H-G）及び組合せの処理が、ＧＭ−ＣＳＦの生成を低減したことが観測され、このことは、Ｎ−ヒドロキシセリン（N-H-S）、Ｌ−ホモセリン（L-h-S）、Ｎ−ヒドロキシグリシン（N-H-G）が、乾癬の治療に有益であり得ることを示唆している。従って、特に前記炎症の一因がＧＭ−ＣＳＦである場合、本発明のアミノ酸の抗炎症剤としての使用が提供される。このような使用にとりわけ好ましいアミノ酸は、Ｎ−ヒドロキシセリン、Ｌ−ホモセリン、Ｎ−ヒドロキシグリシン、及びこれらの１つ又は複数を含有する組合せである。
【０２０４】
Ｎ−ヒドロキシセリン（N-H-S）、Ｌ−ホモセリン（L-h-S）、Ｎ−ヒドロキシグリシン（N-H-G）を投与した乾癬のＲＨＥモデルの組織生存率は、Ｌ−ホモセリン（L-h-S）、Ｎ−ヒドロキシグリシン（N-H-G）の両方に対する以前の研究と一致しており、ＲＨＥ生存率が、６日間の投与期間にわたって、未処理の対照の５０％を超えて保持されていたので、これらが非刺激物としてさらに確証された。この研究は、Ｎ−ヒドロキシセリン（N-H-S）が非刺激物であることも示唆していた。
【０２０５】
したがって、本発明のアミノ酸の抗刺激剤としての使用が、提供される。このような使用のためにとりわけ好ましいアミノ酸は、Ｎ−ヒドロキシセリン、Ｌ−ホモセリン、Ｎ−ヒドロキシグリシン、及びこれらの１つ又は複数を含有する組合せである。
【０２０６】
参照文献
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【図１】
2015536971.tif 000033
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2015536971.tif 000042
【図１１】
2015536971.tif 000043
【図１２】
2015536971.tif 000044
【図１３】
2015536971.tif 000045
【図１４】
2015536971.tif 000046
【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
2015536971.tif 000049
2015536971.tif 000050
2015536971.tif 000051
2015536971.tif 000052
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