(57)【要約】  本発明は、細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を備えた、少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を含むインプラント又はゲルに関する。本発明はまた、細胞外マトリクスの再生に関与する酵素活性をモニターするべくインプラント又はゲルを製造するための、細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子、好ましくは表面にコーティング又は修飾を有さないあるいはカルボキシル基で官能化されている磁気微粒子を備えた、磁気機能性を有する化合物に関する。基質は好ましくはコラーゲン、硫酸コンドロイチン及びヒアルロン酸を含む群から選択され、磁気微粒子は超常磁性微粒子である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を備えた、少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を含むインプラント又はゲル。
【請求項２】
磁気微粒子が共有結合によって基質に結合される、請求項１記載のインプラント又はゲル。
【請求項３】
磁気微粒子が超常磁性微粒子である、請求項１又は２のいずれかに記載のインプラント又はゲル。
【請求項４】
基質がタンパク質、修飾されたタンパク質、ポリペプチド、修飾されたポリペプチド、糖タンパク質、グリコサミノグリカンおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１から３のいずれかに記載のインプラント又はゲル。
【請求項５】
基質がコラーゲン、フィブリリン、エラスチン、ラミニン、オステオカルシン、硫酸コンドロイチン、ヒアルロン酸、オステオネクチン、オステオポンチン、ゼラチンおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項４記載のインプラント又はゲル。
【請求項６】
基質がコラーゲン、硫酸コンドロイチンおよびヒアルロン酸からなる群から選択される、請求項５記載のインプラント又はゲル。
【請求項７】
細胞外マトリクスの再生に関与する酵素活性をモニターするべくインプラント又はゲルを製造するための、細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を含む、磁気機能性を有する化合物。
【請求項８】
磁気微粒子が共有結合によって基質に結合される、請求項７記載の磁気機能性を有する化合物。
【請求項９】
磁気微粒子が超常磁性微粒子である、請求項７又は８のいずれかに記載の磁気機能性を有する化合物。
【請求項１０】
基質がタンパク質、修飾されたタンパク質、ポリペプチド、修飾されたポリペプチド、糖タンパク質、グリコサミノグリカンおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項７乃至９のいずれかに記載の磁気機能性を有する化合物。
【請求項１１】
基質がコラーゲン、フィブリリン、エラスチン、ラミニン、オステオカルシン、硫酸コンドロイチン、ヒアルロン酸、オステオポンチン、ゼラチンおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１０記載の磁気機能性を有する化合物。
【請求項１２】
基質がコラーゲン、硫酸コンドロイチンおよびヒアルロン酸からなる群から選択される、請求項１１記載の磁気機能性を有する化合物。
【請求項１３】
細胞外マトリクスの再生に関与する酵素活性をモニターするべくインプラント又はゲルを製造するための、請求項７乃至１２のいずれかに記載されているような磁気機能性を有する化合物の使用。
【請求項１４】
結合組織の再生をモニターするための請求項１３記載の磁気機能性を有する化合物の使用。
【請求項１５】
ヒトまたは別の生物におけるインプラントの生物学的統合をモニターするための請求項１３に記載の磁気機能性を有する化合物の使用。
【請求項１６】
少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を含む、磁気機能性を有する化合物であって、
ｉ）磁気微粒子が表面に任意のコーティングまたは修飾を有さず、又は
ｉｉ）磁気微粒子がカルボキシル基で官能化されている、化合物。
【請求項１７】
磁気微粒子が超常磁性微粒子である、請求項１６記載の磁気機能性を有する化合物。
【請求項１８】
磁気微粒子が表面に任意のコーティング又は修飾を有さない、請求項１６又は１７のいずれかに記載の磁気機能性を有する化合物。
【請求項１９】
基質がタンパク質、修飾されたタンパク質、ポリペプチド、修飾されたポリペプチド、糖タンパク質、グリコサミノグリカンおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１６乃至１８のいずれかに記載の磁気機能性を有する化合物。
【請求項２０】
基質がコラーゲン、フィブリリン、エラスチン、ラミニン、オステオカルシン、硫酸コンドロイチン、ヒアルロン酸、オステオネクチン、オステオポンチン、ゼラチンおよびその組み合わせからなる群から選択される、請求項１９記載の磁気機能性を有する化合物。
【請求項２１】
基質がコラーゲン、硫酸コンドロイチンおよびヒアルロン酸からなる群から選択される、請求項２０記載の磁気機能性を有する化合物。
【請求項２２】
磁気微粒子が生理学的ｐＨで凝集する傾向にある、請求項１６又は１７のいずれかに記載の磁気機能性を有する化合物。
【請求項２３】
磁気微粒子がその表面の一部分に修飾を有する、請求項１６又は１７のいずれかに記載の磁気機能性を有する化合物。
【請求項２４】
請求項１８乃至２１のいずれかに記載されているような磁気機能性を有する化合物を得る方法であって、
ａ）少なくとも１つの酵素の基質を修飾する工程、及び
ｂ）工程ａ）で得られた修飾された化合物に、表面に任意のコーティング又は修飾を有さない複数の磁気微粒子を固定する工程、を含む方法。
【請求項２５】
工程ａ）において、最大２％の水分を有する有機溶媒中でアミノシランと基質が反応する、請求項２４記載の磁気機能性を有する化合物を得る方法。
【請求項２６】
工程ａ）において、有機溶媒中で（３−アミノプロピル）−トリエトキシシランであるアミノシランと基質が反応する、請求項２５記載の磁気機能性を有する化合物を得る方法。
【請求項２７】
工程ａ）の前に、有機溶媒中のグルタル酸無水物及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンでアミノシランのアミノ基を活性化させるさらなる工程を含む、請求項２５又は２６のいずれかに記載の磁気機能性を有する化合物を得る方法。
【請求項２８】
請求項１６乃至２４のいずれかに記載されているような少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を含む製品であって、インプラント、ゲル、医薬組成物及び造影剤からなる群から選択される、製品。
【請求項２９】
請求項１乃至６のいずれかに記載されているような製品がインプラント又はゲルである、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
１つ以上の酵素の酵素活性を確立又は識別するべく請求項２８又は２９のいずれかに記載されているような製品を製造するための、請求項１６乃至２３のいずれかに記載されているような磁気機能性を有する化合物の使用。
【請求項３１】
少なくとも１つの酵素の酵素活性に関連した疾患または障害を検出する適切な造影剤を製造するための、請求項３０記載の磁気機能性を有する化合物の使用。
【請求項３２】
疾患または障害が、リウマチ病、関節炎、病変、結合組織と関係する疾患、デュピュイトラン病 、ペーロニー病、コラーゲンと関係する疾患、脂肪症、線維症、硬変、転移、組織再生、癌、冠疾患、肝臓疾患、代謝疾患、感染症および炎症性疾患から成る群から選択される、請求項３１記載の磁気機能性を有する化合物の使用。
【請求項３３】
細胞基質の再生をモニターするべくインプラントまたはゲルを製造するための、請求項１６乃至２３のいずれかに記載されているような磁気機能性を有する化合物の使用。
【請求項３４】
軟骨の再生をモニターするべくインプラントまたはゲルを製造するための、請求項３３記載の磁気機能性を有する化合物の使用。
【請求項３５】
酵素反応が超常磁性又は常磁性の少なくとも部分的な変化を引き起こす、請求項１３乃至１５又は３０乃至３４のいずれかに記載されている磁気機能性を有する化合物の使用。
【請求項３６】
酵素活性によって引き起こされた磁性の変化の決定は、磁気共鳴画像法、核磁気共鳴法、電子常磁性共鳴法、磁力測定法、メスバウアー分光法、超電導量子干渉計の磁力測定法、震動の磁力測定法、Ｘ線磁気円二色性法、強磁性共鳴法、磁気光学カー効果、ブリルアン散乱、電磁誘導法、原子間力顕微鏡法、磁気反射法及びその組み合わせからなる群から選択される技術によって行われる、請求項３５記載の磁気機能性を有する化合物の使用。
【請求項３７】
酵素活性によって引き起こされた磁性における変化の決定は、磁気共鳴画像法によって行われる、請求項３６記載の磁気機能性を有する化合物の使用。
【請求項３８】
酵素反応によって引き起こされた磁性における変化が、シグナル強度、縦方向の緩和時間（Ｔ１）、横方向の緩和時間（Ｔ２）、分散パラメータ、第一の一連のパルスに対する応答シグナル、飽和シグナル及びその組み合わせからなる群から選択されるパラメータによって決定される、請求項３７記載の磁気機能性を有する化合物の使用。
【請求項３９】
酵素反応によって引き起こされた磁性における変化が、酵素反応前後に前記パラメータを分析することにより決定される、請求項３８記載の磁気機能性を有する化合物の使用。
【請求項４０】
磁性における変化が、以下からなる群から選択される、少なくとも１つの物理的な現象を示す、請求項３５乃至３９のいずれかに記載の磁気機能性を有する化合物の使用。
−磁気微粒子の凝集、
−磁気機能性を有する化合物又はその反応産物の少なくとも１つの凝集、
−磁気微粒子の大きさの変化、及び
−本発明の対象である磁気機能性を有する化合物、その反応産物の少なくとも１つ及びその組み合わせからなる群から選択される、少なくとも１つの微粒子の大きさの変化。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に磁気機能性を有する化合物を少なくとも１つ含むインプラントまたはゲルに関する。これらのインプラントまたはゲルは、少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物の磁性、その１つ以上の分解産物の磁性、又はその両方の変化を測定することによって、細胞マトリクスの再生に関与する酵素活性を測定するために使用され得る。
【０００２】
さらに、本発明は、好ましくはコラーゲン、硫酸コンドロイチン又はヒアルロン酸である少なくとも１つの酵素の基質、及び表面にコーティング又は修飾を有さない、あるいはカルボキシル基で官能化されていない多数の磁気微粒子を含む、磁気機能性を有する新しい化合物にも関する。
【背景技術】
【０００３】
酵素は化学反応を触媒するタンパク質である。酵素反応において、酵素が作用する分子は基質と呼ばれ、基質は酵素によって代謝物と呼ばれる異なる分子に変換される。酵素は、それらが触媒する反応および基質には一般的に非常に特異的である。
【０００４】
酵素の重要性は、身体中に１０００種類存在する酵素の中の１種類の酵素の機能不全によって致命的疾患が引き起こされ得るという事実によって示されている。
【０００５】
組織再生における不安定なプラーク、転移又は変化のようないくつかの臨床症状は、酵素障害と関係がある。
【０００６】
ほとんどの生体試料は反磁性である；言いかえれば、ほとんどの生体試料は負の磁気感受性を有する。生物由来の高分子に結合した磁気微粒子は、生物由来の高分子とは異なる磁気的な特徴の原因となる場合がある。この磁気的な特徴は、微粒子の組成、大きさおよび形状に基づく。ある材料の磁化は、１つの容積単位当たりの磁気モーメントの平均として定義され、この材料の内部構造および組成によって決定される。磁気微粒子の例は、常磁性微粒子、超常磁性微粒子および強磁性微粒子を含み、これらは造影剤として一般に個々の微粒子がマトリクス中でマイクロカプセル化された又は他の分子と結合した形態で使用される。これらの磁気造影剤は、測定の間磁性が一定に保持され、身体中の異なる組織及び部分におけるその濃度及び分布に基づいて影像効果（ｉｍａｇｅ  ｅｆｆｅｃｔ）を引き起こすように設計されている。表面における凝集またはコーティングのような磁気微粒子の分布におけるいくつかの因子は、それらが引き起こす対比効果に影響する場合がある。
【０００７】
現在、障害または疾患と関係がありうる酵素プロセスの検出および／または追跡は、生検、抽出、又は酵素と代謝物の値の評価のような間接法によって通常行なわれる。本日、研究下の身体からサンプルを取る必要がなく、身体に触れる必要のない非侵襲性の検出方法を使用した、インサイツの酵素活性の追跡を可能とする製品を開発する必要がある。
【０００８】
本出願において「磁気機能性を有する化合物」は、その磁性、その分解産物の１つ以上の磁性、またはその両方の測定可能な変化につながる立体または構造変化を受ける能力を備えたものとして定義される。
【０００９】
米国特許出願第２０１１／０１８２８１５Ａ１号（Ｄａｉｃｈ、Ｊ．）には、磁気機能性を有するために修飾された基質を使用した診断法が記載されている。前記基質は磁気機能性を有するため、これらの基質は磁気微粒子との組み合わせから得られ、目的の酵素によって消化され、磁気微粒子の分布において測定可能な変化が生じる。しかしながら、米国特許出願第２０１１／０１８２８１５Ａ１号では、様々な関節軟骨のようないくつかのタイプの結合組織に達することに効果的でない、磁気機能性を備えるために修飾されたこれらの基質の送達形態として静脈内投与およびカプセル化方法を含む医薬製剤について言及しているだけである。この特許出願の実施例は、水和、柔軟性及び細胞外マトリクスの再生の促進のような機能に関与し、その機能を果たすグリコサミノグリカンのような他の要素の使用は除外し、いくつかのタンパク質の、磁気機能性を有する化合物を得るための基質としての使用について言及しているだけである。これらの機能は、細胞外マトリクスおよび結合組織にとっても著しく重要である。本出願の化合物を得るための基質を修飾する方法は、前者におけるカルボキシル基の存在に限定され、それにより修飾に利用可能な前記カルボキシル基を備えていない多くの基質を除外する。後者は、上記のグリコサミノグリカンを含む。
【００１０】
これに対し、米国特許出願第２０１１／０１８２８１５Ａ１号に記載されている磁気機能性を備えた化合物およびそれらを得るための方法は、表面修飾を備えた磁気微粒子の使用に基づいており、これは目的の基質への前記磁気微粒子の固着を増強する。前記表面修飾は反磁性の材料を使って行われ、これは表面修飾を備えたこれらの粒子がそれらの状況において生じさせる磁場の強度および範囲の減少につながる。したがって、磁気微粒子に前記表面修飾を加えた場合、異なる微粒子の磁気モーメント間の相互作用を減少させる場合があり、これらの現象は、前述の米国特許出願で提案された磁気共鳴画像法のような検出方法で使用される測定方法には不利である。
【００１１】
国際公開第２０１１／０７５４７６Ａ１号（Ｂｅｎｎｅｔ  Ｋ．，２０１１年）には、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）技術を使用して、生物学的に適合なヒドロゲルの分子構造を評価する方法が記載されている。これを受けて、この出願には生物学的に適合な水素および磁気造影剤を含むゲルが記載されている。このゲルは生体内で注入することができ、これにより細胞外マトリクス細胞とのヒドロゲルの相互作用又は酵素活性の結果として、造影剤に含まれる磁気微粒子の分解をＭＲＩによって測定することができる。この文献においては、造影剤として具体的にはカチオン化したフェリチンの使用が開示されている。この化合物は、前述のヒドロゲルの構造中に存在するアニオン基によってヒドロゲルに結合する。この特許出願では、本出願と異なり、用語「凝集」はゲルにおける微粒子の固定化または固着化を定義するために反復的に使用され、微粒子凝集体の形成は伴わない。
【００１２】
更に、ゲル分解速度を上げるためのゲルへの酵素前駆体の追加が記載されている。しかしながら、この分解は標的酵素ではなくあらかじめ注入された酵素の前駆体の活性化のカスケード反応の結果であるため、この方法は、研究の対象である酵素活性の強度および持続時間における精度を欠く。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、細胞マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素及び複数の磁気微粒子を備えた、少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を含むインプラント又はゲルに関する。
【００１４】
米国特許出願第２０１１／０１８２８１５Ａ１号において、インプラント又はゲルを製造するための修飾された基質の使用は記載又は示唆されておらず、結合組織における酵素活性をモニターする際の前記インプラントの使用も記載又は示唆されていない。この米国特許出願に含まれる開示とは異なり、本出願におけるインプラントまたはゲルの使用は、酵素活性が同じインプラント又はゲル、すなわち局在化された所定の基準（ｌｏｃａｌｉｓｅｄ  ｐｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ  ｂａｓｉｓ）で起こることを可能にする。
【００１５】
いくつかのタイプの結合組織インプラントが今日存在する。これらのインプラントは通常生体適合性材料を含み、生物からの組織の抽出物でも良く、培養技術によって作製されても良い。これらインプラントの治療における適用は多様で、例えば関節又は歯列矯正における結合組織の再生における置換を含む。これらのインプラントの主な治療上の作用は、受容者組織を支持する、置換する、又は再生を引き起こすことである。今日、内部インプラントの置換（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）又は受容者の身体から生成した成分によるその構成成分の再生の、インサイツ追跡のための非侵襲性の方法はない。
【００１６】
一方、本出願に記載されている、少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を含むゲルは、インビトロ分析に適しており、さらにインプラントとして同じ生体適合性材料を含みうる。前記ゲルは、細胞外マトリクスの環境を模倣するために一般的に利用され、研究及び診断において多様な応用性がある。
【００１７】
別の態様において、本発明は、ヒト又は他の生物における細胞外マトリクスの再生に関与する酵素活性をモニターするべく、インプラント又はゲルを製造するための、細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を含む、磁気機能性を有する化合物に関する。
【００１８】
さらに、本発明はまたヒトまたは生物における細胞外マトリクスの再生プロセスに関与する酵素活性をモニターするべくインプラントまたはゲルを製造するための、前記磁気機能性を有する化合物の使用に関する。本発明に記載されているインプラントを設置した後、設置された磁気機能性を有する化合物は、細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素と反応でき、その磁性、１つ以上のその分解産物の磁性、又はその両方において測定可能な変化を引き起こす。したがって、本発明は生検を行なう必要がなく、インプラントにおける細胞外マトリクスの再生をモニターすることを可能にする前記インプラントを提供する。
【００１９】
本発明はまた、少なくとも１つの酵素の基質および複数の磁気微粒子を含む磁気機能性を有する化合物に関し、
ｉ）磁気微粒子は表面の任意のコーティングまたは修飾を有さず、あるいは
ｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基で官能化されている、化合物である。
【００２０】
本発明の磁気機能性を有する化合物の投与の後、この化合物はその磁気機能性の測定可能な変化につながる少なくとも１つの酵素と反応することができる。したがって、本発明の磁気機能性を有する化合物は、酵素活性を検出するために、特に細胞外マトリクスの再生に関与する酵素活性の検出に使用できる。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、磁気機能性を有する化合物を得るのに有利な方法を提供することであり、磁気微粒子は表面に任意のコーティング又は修飾を有さず、この方法は以下を含む：
ａ）少なくとも１つの酵素の基質を修飾する工程、および
ｂ）工程ａ）で修飾して得られた化合物における表面に任意のコーティング又は修飾を有さない複数の磁気微粒子を固定化する工程。
【００２２】
磁気微粒子の表面がコーティングされている又はいくつかの修飾を有する、公知の最新の他の方法とは異なり、本発明の磁気機能性を有する化合物を得るためのこの方法は、酵素の基質がほぼ完全に磁性核である磁気微粒子に結合することを可能にする。
【００２３】
この発明の好ましい実施形態において、磁気微粒子は超常磁性微粒子である。
【００２４】
本発明の他の好ましい実施形態において、基質はタンパク質、修飾されたタンパク質、ポリペプチド、修飾されたポリペプチド、糖タンパク質、グリコサミノグリカンおよびその混合物からなる群から選択することができ、より好ましくは前記基質はコラーゲン、硫酸コンドロイチンおよびヒアルロン酸から成る群から選択される。
【００２５】
さらに、本発明はまた、少なくとも１つの酵素の基質及び表面にコーティング又は修飾を有さない複数の磁気微粒子を含む磁気機能性を有する化合物に関し、前記磁気機能性を有する化合物は本出願に記載されている方法で得られる。好ましくは、磁気微粒子はマグネタイトナノ微粒子であり、基質はコラーゲン、硫酸コンドロイチン及びヒアルロン酸からなる群から選択することができる。
【００２６】
本発明はまた、少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を含み、さらに少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を備えた基質を含む製品に関し、本出願に記載されているように、
ｉ）磁気微粒子は表面にコーティング又は修飾を有さず、又は
ｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基によって官能化され、
前記製品はインプラント、ゲル、医薬組成物及び造影剤からなる群から選択される。
【００２７】
好ましくは、本発明はインプラント及びゲルからなる群から選択される製品に関し、これは細胞の再生プロセスに関与する少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を備えた、少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を含み、本出願に記載されているように、ｉ）磁気微粒子は表面にコーティング又は修飾を有さず、又はｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基によって官能化されている。さらに好ましい実施形態において、基質はコラーゲン、硫酸コンドロイチンおよびヒアルロン酸から成る群から選択され、磁気微粒子は表面にコーティング又は修飾を有さないマグネタイトナノ微粒子である。
【００２８】
本発明はまた、１つ以上の酵素活性を確立するべく、本出願に記載されているような製品を製造するための、少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を含む、磁気機能性を有する化合物の使用に関し、本出願に記載されているように、ｉ）磁気微粒子は表面にコーティング又は修飾を有さず、又はｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基によって官能化されている。好ましくは、少なくとも１つの酵素の酵素活性と関連した疾患または障害を検出するためである。
【００２９】
さらに、本発明はまた、ヒト又は他の生物における細胞外マトリクスの再生に関与する酵素活性をモニターするべく、本出願に記載されているようなインプラント又はゲルを製造するための、少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を含む、磁気機能性を有する化合物の使用に関し、本出願に記載されているように、ｉ）磁気微粒子は表面にコーティング又は修飾を有さず、又はｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基によって官能化されている。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】図１は、本発明の実施形態に基づいた、微粒子の大きさまたは凝集状態を有する核磁気緩和の展開（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）を示す。磁気緩和は異なる濃度でｍｓ−１として提供され、１リットル当たりの鉄のｍＭにおいて測定され、３つの異なる微粒子の懸濁液によって作成された：超音波処理によって分散した１０ｎｍ（三角形）、超音波処理によって分散した５０ｎｍ（正方形）および１０ｎｍ凝集体（ひし形）。
【図２】図２は、本発明の実施形態に基づいた、アガロースに固定された、１０ｍｌの生理食塩水の懸濁液中の、直径１０ｎｍであるマグネタイトの超常磁性ナノ微粒子で修飾されたＩＶ型コラーゲンのＭ−Ｈ磁化曲線を示す。横軸は適用されたＨ磁場を表し、縦軸は１メーター当たりの１回転当たりのアンペアで測定されたＭ磁化を表す。
【図３】図３は、本発明の実施形態に基づいた、図２で示すように調製され、３７℃で１２時間コラゲナーゼとともにインキュベーションした後アガロースに固定された懸濁液のＨ−Ｍ磁化曲線を示す。横軸は適用されたＨ磁場を表し、縦軸は磁化Ｍを表し、両方とも１メーター当たりの１回転当たりのアンペアで測定された。
【図４】図４は、本発明の実施形態に基づいた、マグネタイトナノ微粒子（Ｂ）で官能化され、修飾されたコラーゲン（Ａ）の三重らせん領域の構造を示す。
【図５】図５は、本発明の実施形態に基づいた、コラーゲンをコラゲナーゼによって消化した後、コラーゲンにおいて最初に固定された磁気ナノ微粒子の分布に対するコラーゲン溶解性の活性の効果を示す。
【図６】図６は、２つのサンプル管（Ｃ）及び（Ｄ）の軸の軸（ａｘｉａｌ  ａｘｉｓ）を通して見られた、Ｔ２のマップの比較を示し、ここで０．５ｍｇのコラーゲンは、そのリジンの１０％において表面を変化させることなく、直径１０ｎｍの磁気微粒子を固定することで磁気機能性を有するように修飾された。両方のサンプル管において、前記修飾されたコラーゲンは、１０ｍＭ塩化カルシウム及び４００ｍＭ塩化ナトリウム中に１０％アガロースを含むｐＨ７．４の１ｍｌの懸濁液中で固定され、１ｍｇのコラゲナーゼはサンプル管Ｃにおいてのみ加えられた。サンプル管Ｄは対照である。両方のサンプル管を３７℃で１時間インキュベーションした。本発明の実施形態に基づいて、両方のサンプル管のＴ２のマップの平均は、（Ｃ）で１６８ｍｓおよび（Ｄ）で１５０ｍｓであった。
【図７】図７は、２つの試料管（Ｅ）及び（Ｆ）の軸の軸を通して見られたＴ２の地図の比較を示し、ここで０．５ｍｇは対照として未修飾のコラーゲンである。両方のサンプル管において、前記コラーゲンは、ｐＨ７．５の１０ｍＭ塩化カルシウム及び４００ｍＭ塩化ナトリウム中に１０％アガロースを含む懸濁液の１ｍｌの溶液中で固定され、１ｍｇのコラゲナーゼはサンプル管（Ｅ）においてのみ加えられた。サンプル管（Ｆ）は対照である。両方のサンプル管は３７℃で１時間インキュベーションされた。本発明の実施形態に基づいて、両方のサンプル管のＴ２のマップの平均は、（Ｅ）で１９１ｍｓおよび（Ｆ）で１８９ｍｓであり、これらの緩和時間は図６の修飾されたコラーゲンでみられたものとは異なる。Ｔ２マップにおける緩和時間の違いは、この図において示されるように視覚的に気づくことが困難である。
【図８】図８は、本発明の実施形態に基づいた、コラーゲンのリジンに属するアミノ基への結合を向上させるための、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）（Ｉ）で媒介された、グルタル酸無水物（Ｈ）を有する（３−アミノプロピル）−トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）（Ｇ）の活性を概略的に示す。
【図９】図９は、本発明の実施形態に基づいた、修飾されたコラーゲン（Ｍ）における表面の修飾をすることなくマグネタイト微粒子を固定するための、図８に示すようにカルボジイミドジイソプロピル（ＤＩＰＣＤ）（Ｌ）によって媒介されて修飾されたＡＰＴＥＳ（Ｊ）を結合することによる、コラーゲンのリジン（Ｋ）に属するアミノ基の修飾を概略的に示す。
【図１０】図１０は、本発明の実施形態に基づいた、ナノ微粒子への固定を向上させるために、ＡＰＴＥＳ（Ｎ~）で修飾されたポリリジンを生成するための、ＤＩＰＣＤ（Ｌ）によって媒介され、図８に示されているように活性化されたＡＰＴＥＳ（Ｊ）を有するポリリジンモノマー（Ｎ）に属するアミノ基の結合を概略的に示す。
【図１１】図１１は、本発明の実施形態に基づいて、図１０に示されているように、ポリリジン（Ｒ）で修飾された磁気微粒子を生成するための、表面（Ｏ）の修飾を有さず、内在性コラーゲンリジンへのカルボジイミドの介入によって結合され得る少なくとも１つの修飾されたポリリジン（Ｎ）を有するマグネタイト微粒子の修飾を示す。
【図１２】図１２は、本発明の実施形態に基づいて、表面がジメルカプトコハク酸（Ｕ）で修飾されている磁気微粒子の固定を可能にするための、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（Ｔ）を結合させることによる硫酸コンドロイチン（Ｓ）モノマーのｎ−アセチルアミン基の修飾を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明は、他の原理とも共通して、磁気材料の特性はその成分の分布と形状に由来するという事実を利用する。これら２つの特性のいずれかが酵素活性によって修飾され得る場合、それは磁性の測定に基づいて検出できる。これを行う形態は、酵素活性の結果として微粒子凝集物を刺激することである。磁気微粒子凝集の効果を理解するためには、まずはそれを形成し得る磁気材料の異なるタイプの特性の一般的な説明が定められる。
【００３２】
一般的な強磁性材料は、例えば例えば鉄（Ｆｅ）、マグネシウム（Ｍｇ）、マンガン（Ｍｎ）、コバルト（Ｃｏ）、ニッケル（Ｎｉ）、亜鉛（Ｚｎ）及び銅（Ｃｕ）のような遷移金属を含む。強磁性材料は、それら全てが同じ方向を指す磁気モーメント（又はスピン占有数）を有する、磁区と呼ばれる約１０１７から１０２１原子の群によって形成されるという点で特徴づけられる。この磁区の磁気モーメントは、非磁化材料において無作為に方向づけられ、磁化材料において好ましい方向を指す。外部の磁界が除去された場合、磁化された状態を維持する強磁性材料の能力は、同様の状況で好ましい磁化配向を失う常磁性、超常磁性及び反磁性の材料と比較して独特の因子である。
【００３３】
いくつかの常磁性体は、いわゆるキュリー温度（スピンが磁界とともに又は磁界に対して安定した様式で整列する転移温度）未満である場合、磁界を除去した後永久的な安定した磁化を示すことができる。これらの材料は反強磁性と呼ばれ、スピンの両方の配向が取り消されないため、結果として生じる磁化を示す。キュリー温度を超えると、外部磁界を除去する際スピンの相互作用が弱いため、熱運動はスピンが無作為な配向を取得するのに十分であり、よって永久的な磁化を排除する。すべての鉄微粒子は、生理的温度（鉄微粒子の転移温度は８５０ケルビンに近い）でフェリ磁性又は強磁性特性を有するマグネタイトに基づいて形成される。
【００３４】
超常磁性材料は、強磁性特性を有する大量の（ｂｕｌｋ）材料の個別のドメインによって形成され得る。これらの磁気感受率（磁場に応じた材料の磁化度）は、強磁性および常磁性材料のそれの間にある。超常磁性材料は、外部磁界の効果の下で強磁性体として作用するが、それらは外部磁界の欠如の中では常磁性の特徴を有している。これらの超常磁性材料は、ナノメートルの結晶の粒子によって一般に形成され、巨視的に強磁性特性又はナノコンポジット磁石の特性を有する。
【００３５】
異方性の概念は超常磁性を理解するのに重要である。順に並んだ多くの常磁性イオンのスピンは相互作用し、その結果、外部磁場に設置された際、結果として生じる磁化は全方向に配向する、すなわち等方性である。スピンカップリングが外部磁場に関連して任意の方向に並ぶ場合、磁化は異方性であるとされる。例えば、マグネタイト結晶は６つの配向軸がある。したがって、磁場の効果の下では、結果は各々異なるエネルギー価を有する６つの配向になる。配向が外部磁場と平行の場合最小のエネルギーが生じ、配向が逆平行の場合最大のエネルギーが生じる。
【００３６】
温度は超常磁性材料の磁性を不安定にする効果がある。熱エネルギーは、超常磁性粒子の中にある磁気モーメントの整列を回避する。適用した磁場の除去の後、超常磁性材料の磁気モーメントはまだ存在するが、温度によって引き起こされた速い運動（ｍｏｔｉｏｎ）はそれらを誤って並べる。生物系の温度において、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）中に適用された磁場では、超常磁性材料はそれらの強磁性ホモログより磁化可能性が低い（ｌｅｓｓ  ｍａｇｎｅｔｉｓａｂｌｅ）。
【００３７】
いくつかの磁性、例えば強磁性またはフェリ磁性は巨視的なスケールにおけるドメインの協力的な挙動から発生し、それらは材料を形成する分子またはイオンに固有のものではない。これらの特性は分子またはイオンの間の相互作用の結果であり、したがって、固体構造を予想し、制御し、かつ調節する方法は、この挙動の理解および管理と関係する。
【００３８】
コロイド懸濁液中のマグネタイトナノ粒子のようないくつかのナノ材料は、大量の場合又は個別の微粒子の場合のいずれかにおいて、巨視的なスケールで固体構造中のそれとは異なる特性を示す。直径が１５ｎｍを越える大きな結晶によって形成された材料については、スピンはワイスドメインと呼ばれる小さな磁区内で整列し細分化される。異なるスピンの方向は、異方性の軸に沿った同じ方向に整列する傾向があり、これが異方性エネルギーの最小値に達するように導き、系は異方性であると考えられる。これが、永久的な磁化を獲得する目的のために、例えば何故マグネタイトのような強磁性の結晶が外部の磁場に設置することで磁化されなければならないのかを説明している。磁気性材料の結晶がワイスドメインより小さい場合、超常磁性を観察することができる。スピンが１つの異方性の軸から別の軸へと通過するために、所望の遷移（ｔｒａｎｓｉａｔｉｏｎ）と等しい突入エネルギーが必要である。Ｋが異方性定数でＶが結晶の体積である場合、異方性エネルギーはＫＶとして知られている。互いに非常に接近している結晶がＫＶ増加を引き起こすスピン間の相互作用を可能にするため、いくつかの結晶の粒子の間の距離はＫＶ値に影響を及ぼす。適用した外部磁場の軸に沿ったスピンの配向の変化は、ニール緩和時間として定義され、結晶の熱擾乱（ｔｈｅｒｍａｌ  ａｇｉｔａｔｉｏｎ）の結果である。ニール緩和（ＴＮ）は以下のように表わされる：
【００３９】
【数１】
2015522568.tif 000003
【００４０】
ｋがボルツマン定数である場合、Ｔは溶媒の一定温度であり、Ｔ０は定数である。大きな結晶についてはニール緩和時間が非常に長く、磁気モーメントは容易な異方性の軸にブロックされたと考慮することができる。直径６ｎｍ未満の結晶については伝導が速く、ナノ秒オーダーである。液体溶媒中の小さな強磁性結晶については、ニール緩和時間が変動を調節するだけではなく、また、結晶の動き（ｍｏｖｅｍｅｎｔ）も調節する。系のブラウン又は平均回転時間は、以下に等しい。
【００４１】
【数２】
2015522568.tif 000004
【００４２】
αが粒子の半径である場合、ηは液体の粘度である。常磁性結晶の系については、結果として生じる磁化は以下の関係によって定められる：
【００４３】
【数３】
2015522568.tif 000005
【００４４】
Ｂ０が外部磁場である場合、μは結晶の合計の磁気モーメントであり、Ｍｓａｔは、低エネルギーの軸に沿った、磁化または飽和の閉鎖磁場を定義する。超常磁性微粒子は、外部磁場が欠如している場合、結晶のニール緩和の平均及び微粒子回転の結果、微粒子の平均磁気モーメントがゼロという事実から、結晶を形成するイオンを伴う個別のモーメントと比較してより高い磁気モーメントを有する。
【００４５】
本発明は、磁気ナノ微粒子の磁気挙動がそれらの間の距離に依存し、その差を実験的に測定することができるという事実に基づく。マトリクス又は高分子中で固定されたこれらの磁気ナノ微粒子の間の距離は、この支持の完全性に依存する。例えば、この完全性が加水分解効果の効果によって影響されれば、および前記効果によって磁気微粒子が凝集されれば、これはマトリクスまたは不変の分子中に存在する微粒子から得られたそれとは異なる磁気シグナルを結果として生じさせる。本発明は、少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を含み、細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子も含むインプラント又はゲルに関し、インプラント又はゲルが２つ以上の磁気機能性を有する化合物を含む場合、これらの物質は異なる領域に設置されるインプラント又はゲルに関する。
【００４６】
好ましくは、インプラントまたはゲルが本出願に記載されているように磁気機能性を有する化合物を２つ以上に含む場合、これらはインプラントまたはゲルの別々の領域に並べられる。各々異なる基質を含む、磁気機能性を有する化合物を２つ以上に含むインプラントまたはゲルの使用は、異なる酵素の同時追跡を可能とする。
【００４７】
本発明の目的において、「複数の磁気微粒子」は２つ以上の非反磁性微粒子として定義され、「微粒子」は、好ましくは結晶として並んでいる、マイクロメートル又はそれより小さいサイズの、好ましくは直径で１００ｎｍ未満の分子又はイオンの組み合わせとして定義される。
【００４８】
一方、本発明において「磁気機能性を有する化合物」は、その磁性、その１つ以上の分解産物の磁性、又はその両方の測定可能な変化へと導く、立体又は構造変化を引き起こす能力を有する化合物として定義される。
【００４９】
磁気機能性を有する化合物は、ゲルの調製中又は生理学的条件に曝されている間、機能的な特性を保持しなければならない。これは、前記磁気機能性を有する化合物の調製中における、磁気微粒子（より好ましくは磁気ナノ微粒子）の、共有結合による基質との結合によって達成することができる。本発明のいくつかの好ましい実施形態において、前記磁気微粒子が凝集する傾向にある場合、共有結合による磁気機能性を有する化合物の調製は特に有利である。
【００５０】
好ましい実施形態において、本発明のインプラントまたはゲルは、磁気機能性を有する化合物を含み、細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質と共有結合した複数の磁気微粒子も含む。
【００５１】
別の好ましい実施形態において、本発明は本出願に記載されているように、磁気機能性を有する化合物を含み、同様に細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質と複数の磁気微粒子を含むインプラントまたはゲルに関する。
【００５２】
別の好ましい実施形態において、本発明は本出願に記載されているように、少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を含み、同様に細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質と複数の磁気微粒子を含み、磁気微粒子が超常磁性微粒子であるインプラント又はゲルに関する。好ましくは、超常磁性微粒子は、例えばマグネタイト、マグヘマイト、コバルトフェライト、銀又はマグネシウムのようなフェライトのナノ微粒子であり得る。
【００５３】
これらの好ましい磁気微粒子は、基質との共有結合を可能にする。さらに、それらは生理的ｐＨで凝集し得る。
【００５４】
さらに好ましい実施形態において、超常磁性微粒子はマグネタイトナノ微粒子であり、マグネタイトナノ微粒子の直径が１５ｎｍ未満であることは特に望ましい。
【００５５】
別の好ましい実施形態において、本発明は本出願に記載されているように、少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を含み、同様に細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質と複数の磁気微粒子を含み、基質はタンパク質、修飾されたタンパク質、ポリペプチド、修飾されたポリペプチド、糖タンパク質、グリコサミノグリカンおよびその組み合わせからなる群から選択されるインプラント又はゲルに関する。
【００５６】
好ましくは、この基質は金属依存性酵素である少なくとも１つの酵素と反応する。もっと好ましい実施形態において、この酵素はプロテアーゼ、オキシダーゼおよびスルファターゼからなる群から選択される。さらに好ましくは、この酵素はヒアルロニダーゼ及びメタロプロテアーゼから成る群から選択される。
【００５７】
特に好ましい実施形態において、本出願に記載されている磁気機能性を有する化合物に含まれる基質は、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）である少なくとも１つの酵素で反応し、この酵素がコラゲナーゼとゼラチナーゼからなる群から選択されることが特に望ましい。
【００５８】
さらに好ましい実施形態において、本発明は本出願に記載されているように、少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を含み、同様に細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質と複数の磁気微粒子を含み、基質はコラーゲン、フィブリリン、エラスチン、ラミニン、オステオカルシン、硫酸コンドロイチン、ヒアルロン酸、オステオネクチン、オステオポンチン、ゼラチンおよびその組み合わせからなる群から選択できる。好ましくは、基質はコラーゲン、硫酸コンドロイチンおよびヒアルロン酸からなる群から選択される。
【００５９】
特に望ましい実施形態において、インプラントまたはゲルは、磁気機能性を有する化合物を含み、磁気微粒子は超常磁性微粒子（好ましくはマグネタイトナノ微粒子）で、基質はコラーゲン、硫酸コンドロイチンおよびヒアルロン酸からなる群から選択することができる。
さらにより好ましくは、マグネタイトナノ微粒子は共有結合によって基質に結合する。
【００６０】
本発明は、細胞外マトリクスの再生に関与する酵素活性をモニターするべくインプラントまたはゲルを製造するための、細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を含む、磁気機能性を有する化合物に関する。製造された生成物がインプラントである場合、これは人間または別の生物中の細胞外マトリクスの再生に関与する酵素活性をモニターするために使用することができる。一方、製造された生成物がゲルである場合、インビトロで細胞外マトリクスの再生に関与する酵素活性をモニターするために使用することができる。
【００６１】
好ましくは、磁気微粒子は超常磁性微粒子になり得、さらに好ましくはマグネタイトナノ微粒子である。
【００６２】
好ましい実施形態において、記載されているようにインプラントまたはゲルの製造のために使用された磁気機能性を有する化合物は、共有結合によって細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質に結合された複数の磁気微粒子も含む。
【００６３】
別の好ましい実施形態において、上の段落に記載されているようなインプラント又はゲルを製造するために磁気機能性を有する化合物に含まれた基質は、タンパク質、修飾されたタンパク質、ポリペプチド、修飾されたポリペプチド、糖タンパク質、グリコサミノグリカンおよびその組み合わせからなる群から選択することができる。
【００６４】
もっとさらに好ましい実施形態において、本発明は本出願に記載されているように、細胞外マトリクスの再生における少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を含む磁気機能性を有する化合物に関し、基質はコラーゲン、フィブリリン、エラスチン、ラミニン、オステオカルシン、硫酸コンドロイチン、ヒアルロン酸、オステオネクチン、オステオポンチン、ゼラチンおよびその組み合わせからなる群から選択することができる。好ましくは、基質はコラーゲン、硫酸コンドロイチンおよびヒアルロン酸からなる群から選択することができる。
【００６５】
特に望ましい実施形態において、磁気微粒子は超常磁性微粒子（できればマグネタイトナノ微粒子）であり、基質はコラーゲン、硫酸コンドロイチンおよびヒアルロン酸からなる群から選択することができる。さらにより好ましくは、マグネタイトナノ微粒子は共有結合によって基質に結合される。
【００６６】
コラーゲンは複雑な構造を有する。その前駆体タンパク質（モノマー）はトロポコラーゲンと呼ばれ、長さは約３００ナノメートルで直径１．４ｎｍである。トロポコラーゲンはα鎖と呼ばれる３つのポリペプチド鎖によって形成され、三重らせん構造を形成するために架橋結合する。α鎖はそれぞれ、全面的にグリシンアミノ酸を含む、トリプレットの反復によって形成されたポリペプチドで、プロリンとヒドロキシプロリンに非常に富んでいる。
ヒドロキシプロリンは、コラーゲン残基の組成物の合計の１０〜１２％に相当し、この割合はコラーゲンの型に依存する。それぞれの鎖は約１００，０００Ｄａの分子量を有する。
【００６７】
それらのα鎖の組成の差によって決定される異なる型のコラーゲンは以下の通りである：
Ｉ型コラーゲン：真皮、硬骨、腱および角膜において豊富である。より大きなコラーゲン線維を形成するためにグループ化され、直径２０〜１００ｎｍの線状繊維（ｓｔｒａｉｔｅｄ  ｆｉｂｒｉｌｓ）として生じる。より大きなサブユニットは２つの型のα鎖によって形成され、それらはアミノ酸組成とシーケンスにおいて若干異なる。それらのうちの１つはアルファ１鎖として、他方はアルファ２鎖として規定される。それは繊維芽細胞、軟骨芽細胞および骨芽細胞によって合成される。それらの主な機能は伸張抵抗性である。
ＩＩ型コラーゲン：特に軟骨に局在するが、胚の角膜、脊索、歯髄（ｐｕｌｐａｒ）核及び眼のガラス体にも局在する。軟骨において１０〜２０ナノメートルの薄い原繊維を形成するが、他の微環境においてはより大きな原繊維を形成することができ、Ｉ型コラーゲンと形態学的に識別することができない。これらは単一型の３つのアルファ２鎖によって形成される。それは軟骨芽細胞によって合成される。その主な機能は断続的な圧力に対する耐性である。
ＩＩＩ型コラーゲン：疎性結合組織、血管の壁、皮膚真皮およびいくつかの腺の間質において豊富である。それは、従来から細網線維と呼ばれる５０ナノメートルの線維の重要な成分と考えられている。それは単一の分類（ｃｌａｓｓ）のアルファ３鎖によって形成される。それは平滑筋細胞、繊維芽細胞、膠によって合成される。その機能は拡張可能な臓器を支持することである。
ＩＶ型コラーゲン：上皮の基礎となる基底膜を形成するコラーゲンである。原繊維中で重合されないが、プロテオグリカン類および構造タンパク質ラミニンおよびフィブロネクチンを伴って、無作為に配向させた分子のフィルタを形成するコラーゲンである。それは上皮および内皮細胞によって合成される。その主な機能は支持とろ過である。
Ｖ型コラーゲン：ほとんどの間質組織中に存在する。このコラーゲンはＩ型と関連する。
ＶＩ型コラーゲン：ほとんどの間質組織中に存在する。このコラーゲンはその環境における細胞の固着剤である。このコラーゲンはＩ型と関連する。
ＶＩＩ型コラーゲン：基底膜に局在する。
ＶＩＩＩ型コラーゲン：いくつかの内皮細胞中に存在する。
ＩＸ型コラーゲン：成熟した関節軟骨に局在する。このコラーゲンはＩＩ型と相互作用する。
Ｘ型コラーゲン：肥大しミネラル化した軟骨中に存在する。
ＸＩ型コラーゲン：軟骨に局在する。このコラーゲンはＩＩ型およびＩＸ型と相互作用する。
ＸＩＩ型：腱と靭帯のような高いストレスに曝される組織に存在する。このコラーゲンはＩ型およびＩＩＩ型と相互作用する。
ＸＩＩＩ型コラーゲン：細胞膜と関連するタンパク質として広くみられる。このコラーゲンはＩ型およびＩＩＩ型と相互作用する。
ＸＩＶ型コラーゲン：非線維であり、ＸＩＩ型と非常に類似していて胎児の上皮および腱の中に存在する。
【００６８】
要するにコラーゲンは、組織の構築及び再生におけるいくつかの主要な機能を満たすマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのいくつかの酵素の基質である。したがって、しばしばコラゲナーゼと呼ばれる前記酵素のインビボでのコラーゲン分解活性の測定には、大きな臨床的及び科学的な関心が寄せられている。いくつかのＭＭＰのコラーゲン分解活性は、カルシウムと亜鉛に依存するそれらの三次構造に部分的に由来する。それらはトロポコラーゲンより小さく、３つの異なる領域を有する。プロペプチドと呼ばれるものはコラーゲン鎖に結合する能力がある。触媒として知られている別のものは、三重コラーゲンヘリックスの配置を増強する。第３の領域はカルボキシル末端であり、αへリックス中の３つの鎖を分離する間に酵素を推進するらせん櫂（ｈｅｌｉｘ  ｐａｄｄｌｅｓ）として働く４つのβ層を含む。放出されたα鎖は、ペプシン及びトリプシンのような他の酵素によって消化される感受性を有する。
【００６９】
これらの目的の酵素、つまりコラーゲン分解活性を有する酵素の活性を検出する目的において、磁気微粒子を残基表面上に固定化するプロセスの間、及び磁気機能性を有する化合物を含むインプラント又はゲルを製造する間、基質として用いられるコラーゲンが三重コラーゲンの三次構造を維持することが必要不可欠である。
【００７０】
硫酸コンドロイチンおよびヒアルロン酸の両方は、結合組織中に存在するグリコサミノグリカンであり、それらの異化は結合組織の再生のシグナルである。硫酸コンドロイチン又は硫酸コンドロイチン（ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎｅ  ｓｕｌｐｈａｔｅ）は、Ｎ−アセチルガラクトースアミドおよびＮ−グルクロン酸が交互である二糖類の鎖によって形成される。これは、プロテオグリカン類と呼ばれる、高分子量を有する凝集体を形成するタンパク質に通常関係している。コンドロイチン鎖は１００以上の個別の糖によって形成することができ、その各々は多様な位置および数で硫酸化され得る。硫酸コンドロイチンは軟骨に力学的および弾性特性を提供し、その組織に圧縮抵抗性の多くを提供する。これはスルファターゼと呼ばれる酵素群によって消化される。
【００７１】
ヒアルロン酸は硫酸コンドロイチンのように、構造の機能を示す。粘着性の構造を有し、多数の生物の滑膜、ガラス体および結合組織の中に存在し、関節の恒常性にとって重要な糖タンパク質である。ヒトにおいては主に関節、軟骨および皮膚に集中している。重さ７０ｋｇの平均的なヒトにおいて、身体中に合計で１５ｇのヒアルロン酸が存在し得、その三分の一が毎日分解され、合成されている。糖鎖複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｃｈａｉｎｓ）、具体的には１分子当たり約５０，０００の二糖類のＮ−アセチルグルコサミン及びグルクロン酸によって形成され、アミノ糖類とウロン酸の結合に由来する。この鎖は、２〜４００万の平均分子量を有し、スパイラルを形成するように並べられる。それは多量の水を保持し、溶解物における拡張形態を選択する（ａｄｏｐｔｉｎｇ）特性を示すため、クッション材として又は円滑にすることに役立つ。これらの特性は、多数のヒドロキシル基及び分子の負電荷によって達成され、これらは抵抗力を構築することによって炭水化物鎖が互いに比較的離れている状態を維持することを可能にする。
【００７２】
ヒアルロニダーゼは細胞外マトリクスにおけるヒアルロン酸を加水分解する酵素である。
【００７３】
本発明はまた、細胞外マトリクスの再生に関与する酵素活性をモニターするべくインプラントまたはゲルを製造するための、本出願に記載されているような磁気機能性を有する化合物の使用に関する。好ましくは、結合組織、骨又は器官組織の細胞外マトリクスの再生をモニターするためである。
【００７４】
別の好ましい実施形態において、磁気機能性を有する化合物は、ヒトまたは別の生物におけるインプラントの生物学的完全性（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）をモニターするためのインプラントまたはゲルを製造するために使用することができる。磁気機能性を有する化合物が、本出願に記載されているようなゲルに包含されている場合、これはインプラントの生物学的完全性をモニターするために使用することができる。一方、磁気機能性を有する化合物が本出願に記載されているようなインプラントに包含されている場合、前記インプラントの生物学的完全性をモニターするために好ましくは使用することができる。
【００７５】
さらに、本発明はまた、結合組織の再生及び／又はインプラントの生物学的完全性をモニターするための、本出願に記載されているように少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を含み、細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を含むインプラントに関する。好ましくは、基質はコラーゲン、硫酸コンドロイチンおよびヒアルロン酸からなる群から選択され、磁気微粒子は超常磁性微粒子である。さらにより好ましくは、マグネタイトナノ微粒子は共有結合によって基質に結合される。
【００７６】
さらに本発明はまた、結合組織の再生をモニターするための、本出願に記載されているように少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を含み、細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を含むゲルに関する。好ましくは、基質はコラーゲン、硫酸コンドロイチンおよびヒアルロン酸からなる群から選択され、磁気微粒子は超常磁性微粒子である。さらにより好ましくは、マグネタイトナノ微粒子は共有結合によって基質に結合される。
【００７７】
本出願に記載されているような磁気機能性を有する化合物を含むインプラントの使用は、細胞外マトリクスが新たに（ｄｅ  ｎｏｖｏ）生成されることが期待される場合、結合組織再生の評価だけでなく、治療用インプラントの追跡にも役立つ。本発明の対象であり、結合組織の再生をモニターするための使用に適したインプラントは、注射用のゲル、再生させる組織上の又は移植組織としてのパッチ又は包帯（ｄｒｅｓｓｉｎｇ）であっても良い。臨床上日常的に使用されている又は開発中の結合組織インプラントのいくつかのタイプが存在する。これらのインプラントは、一般に永久的な生物学的適合性の及び生物分解性の材料の組み合わせを含む。これらの生物分解性材料は、通常培養、遺伝子組み換え又は抽出の技術によって生産された細胞外マトリクスの成分を含む。受容者の体内で生成された内在性の材料によるインプラントの成分の分解、完全性及び適切な置換は、通常間充織細胞と繊維芽細胞の侵襲に関係する。
【００７８】
上記のように、本発明の対象であるゲルは、インビトロで結合組織の再生をモニターするために使用するのに適しており、インプラントについての上の段落に記載されているのと同じ材料を含みうる。
【００７９】
そのような生物学的適合性がある生分解性材料の例は、ポリラクチド、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン、ポリ無水物、ポリアミド、ポリウレタン、ポリエステルアミド、ポリオルトエステル、ポリジオキサノン、ポリアセタール、ポリセタール（ｐｏｌｙｃｅｔａｌｓ）、ポリカーボネート、ポリオルトカーボネート、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリヒドロキシバレラート、シュウ酸ポリアルキレン、コハク酸ポリアルキルエン、ポリ（リンゴ酸）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（ビニルメチルエーテル）、ポリ（無水マレイン酸）、キチン、キトサンおよびコポリマー、ターポリマー又はより高いポリモノマーまたはその組み合わせ、あるいはその混合物である。
【００８０】
本発明のインプラントまたはゲルを構成することができる他のポリマーは、直鎖状（シロキサニル）アルキルメタクリレート、分枝状（シロキサニル）アルキル（メタ）クリレート、環状（シロキサニル）アルキル（メタ）クリレート、シリコーンを含む（メタ）クリレートエステル、フッ化物を含む（メタ）クリレート、ヒドロキシルを含む（メタ）クリレート、（メタ）クリル酸、Ｎ−（メタ）クリロリルピロリドン、（メタ）クリルアミド、アミノアルキル（メタ）クリレート、アルコキシ基を含む（メタ）クリレート、芳香族基を含む（メタ）クリレート、グリシジル（メタ）クリレート、テトラヒドロフルフリル（メタ）クリレート、シリコーンを含むスチレン誘導体、スチレン誘導体、フッ化物を含むスチレン誘導体、及びビニルモノマーである。
【００８１】
生物学的適合性材料の好ましい例は、他の材料を除外することなく、フィブリン接着剤、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレンオキシドゲル、アルギン酸塩またはアルギン酸カルシウムゲル、ポリ−（２−ヒドロキシエチルのメタクリレート）、ポリ−オルトエステル、ポリ無水物、キトサン、ゼラチン、アガロース、および他の生体吸収性がある生物学的適合性材料である。実施形態の他の形態において、インプラントまたはゲルは、寒天、アガロース、ゲランガム、アラビアゴム、キサンタンガム、カラギーナン、アルギン酸塩、ベントナイト、フィコール、プルロニックポリオール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキトサンポリ−２−ヒドロキシエチル−メタクリレート、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ゼラチン、プラスチックまたはこれらのいずれかの組み合わせを含み得る。ポリ（メタクリレート２−ヒドロキシエチル）（ｐＨＥＭＡ）のヒドロゲルは当業者に知られており、生物学的適合性のゲルとして既に使用されている。多糖類は、一般的な化学式（ＣＨ２Ｏ）ｎの高分子の分類であり、本発明のインプラントまたはゲルの材料として有用である。多糖類は、天然由来のいくつかの化合物、例えばアガロース、アルギン酸塩、キトサンを含む。アガロースは、主として１，４結合、及び３，６−無水、アルファ−Ｌ−ガラクトース並びに１，３結合ベータＤガラクトースが交互のコポリマーである多糖類から構成された透明な熱可逆性のヒドロゲルである。
【００８２】
インプラントまたはゲルを調製するのに好ましい形態は、細胞外マトリクスの要素の糖化または架橋による。好ましい実施形態において、Ｉ型、ＩＩ型コラーゲン、又はその両方の組み合わせは、リボース又はデキストロースと混合し、ｐＨ７．４で安定化され、１％から５％の範囲内の濃度の酢酸に溶解され、４℃のリン酸食塩水中でインキュベートされ、３７℃でゼリー状にして使用される。本出願に記載されている磁気機能性を有する化合物の安定した懸濁液は、ゼリー状になる前の任意の工程の間に加えることができる。本発明のもっとさらに好ましい実施形態において、ゼリー状にする工程の前に、硫酸コンドロイチン又はヒアルロン酸が１％から５％の濃度で加えられ、ヒアルロン酸は架橋によって予め安定化される。
【００８３】
本発明の特定の実施形態において、ゲルはアルギン酸塩、架橋アルギン酸塩、フィブリン接着剤、血餅、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、アガロース、キチン、キトサン、セルロース、多糖類、ポリ（オキシアルキレン、（ポリ（エチレンオキシド−ポリ（プロピレンオキシド）のコポリマー）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリレート、多血小板血漿（ＰＲＰ）凝集塊、血小板乏血漿（ＰＰＰ）凝集塊又はその混合物を含む生物学的又は合成ヒドロゲルも含みうる。
【００８４】
さらに、本発明はまた、ヒト又は他の生物中のインプラントにおいて細胞外マトリクス再生に関与する酵素活性をモニターするべく、本出願に記載されているようにインプラントを製造するための、細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を含む磁気機能性を有する化合物にも関する。好ましくは、結合組織の再生及び／又はインプラントの生物学的完全性をモニターするためである。
【００８５】
好ましい実施形態において、本発明はヒト又は他の生物におけるインプラントの細胞外マトリクスの再生に関与する酵素活性をモニターするための、コラーゲン、硫酸コンドロイチン及びヒアルロン酸からなる群から選択される基質及び複数の磁気微粒子を含む磁気機能性を有する化合物に関する。好ましくは、結合組織の再生及び／又はインプラントの生物学的完全性をモニターするためである。
【００８６】
本発明は、細胞外マトリクスの再生をモニターする方法、好ましくは本出願に記載されているような、細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子も含む少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を備えたインプラント又はゲルを使用する工程を含む、結合組織の再生をモニターする方法にも関する。好ましくは、磁気微粒子は共有結合によって基質に結合される。
【００８７】
好ましい実施形態において、本発明は細胞外マトリクスの再生をモニターするための方法、好ましくはコラーゲン、硫酸コンドロイチン及びヒアルロン酸からなる群から選択される基質及び複数の超常磁性微粒子を同様に備えた少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を含むインプラント又はゲルを使用する工程を含む、結合組織の再生をモニターするための方法に関する。
【００８８】
本発明は、本出願に記載されているような、細胞外マトリクスの再生に関与する少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を備えた少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を備えたインプラント又はゲルを使用する工程を含む、本出願に記載されているようなヒト又は他の生物におけるインプラントの生物学的完全性をモニターするための方法にも関する。好ましくは、磁気微粒子は共有結合によって基質に結合される。
【００８９】
さらに、本発明は少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を含む磁気機能性を有する化合物にも関し、
ｉ）磁気微粒子は表面にコーティング又は修飾を有さず、又は
ｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基で官能化される。
【００９０】
本発明の磁気機能性を有する化合物は、酵素活性がその磁性、その１つ以上の分解産物の磁性、又はその両方において測定可能な変化を引き起こすため、１つ以上の酵素の酵素活性を測定することを可能にする。
【００９１】
好ましくは、ｉ）またはｉｉ）に記載されているような磁気微粒子は共有結合によって基質に結合される。
【００９２】
好ましい実施形態において、本発明は、本出願に記載されているような少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を含む磁気機能性を有する化合物であって、磁気微粒子が超常磁性微粒子である化合物に関する。好ましくは、超常磁性微粒子は、例えばマグネタイト、マグヘマイト、コバルトフェライト、銀、マグネシウムのようなフェライトナノ微粒子であり得る。
【００９３】
もっとさらに好まれた実施形態において、超常磁性微粒子はマグネタイトナノ微粒子であり、マグネタイトナノ微粒子の直径が１５ｎｍ未満であることが特に望ましい。
【００９４】
本出願に記載されているような、カルボキシル基で官能化された複数の磁気微粒子、好ましくは超常磁性微粒子、及び少なくとも１つの酵素の基質を含む磁気機能性を有する化合物は、少なくとも１つの酵素の基質において存在するアミノ基への磁気微粒子の結合を促進する。この磁気機能性を有する化合物は、アミノ基を含むモノマーを有する本発明の２つの好ましい基質である硫酸コンドロイチン及びヒアルロン酸のように、基質がかなりの数のアミノ基を含む場合、特に興味深いものである。
【００９５】
別の好ましい実施形態において、本発明は少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を含む磁気機能性を有する化合物に関し、磁気微粒子が表面にコーティング又は修飾を有さない化合物に関する。
【００９６】
表面のコーティング及び修飾は、測定が現在医療用に使用されている磁気共鳴の基礎である、横方向（ｔｒａｎｓｖｅｒｓａｌ）（Ｔ２）及び縦方向（ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ）（Ｔ１）緩和時間におけるフェライト微粒子のようないくつかの磁気微粒子の効果を減少させる。微粒子の凝集中において、緩和時間に対する効果には２つの要因がある。１つは異なる微粒子の磁区中の磁気モーメントのカップリングであり、もう一つは水分子による磁気微粒子間の空間の洗浄（ｉｒｒｉｇａｔｉｏｎ）である。磁気微粒子の凝集体の洗浄は、その水和作用に明らかに依存し、同じ磁気微粒子の接近度（ｐｒｏｘｉｍｉｔｉｅｓ）における水分子の拡散及び取込によって決定される。両方の事象はＴ２に効果があるが、磁区間のカップリングのみがＴ１に効果がある。表面修飾の存在は、通常凝集内の水分子の拡散と取込の同じメカニズムを通してＴ１を短くするのと同様に、凝集したことの結果であるＴ１の短縮による効果を遮蔽する。本発明の開発中に、コラゲナーゼによるインビトロでの処理前及び処理後の磁気機能性を有する修飾されたコラーゲンにおいて観察されたＴ２の違いは、表面コーティングによって官能化された微粒子を使用した場合と比較して、表面に修飾を有さない微粒子を使用した場合の方が３０％高かったことが最後に見られた。両方の場合において、１０ｎｍのマグネタイト微粒子が使用された。表面の修飾及びその凝集の結果として単離された磁気微粒子の特性への効果のより詳細な記載は、それぞれＣｏａｔｉｎｇ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｒｏｎ  ｏｘｉｄｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｆｆｅｃｔｓ  Ｒ２  ｒｅｌａｘｉｖｉｔｙ，  ＬａＣｏｎｔｅ  ＬＥ，  Ｎｉｔｉｎ  Ｎ，  Ｚｕｒｋｉｙａ  Ｏ，  Ｃａｒｕｎｔｕ  Ｄ，  Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ＣＪ，  Ｈｕ  Ｘ，  Ｂａｏ  Ｇ．；  Ｊ  Ｍａｇｎ  Ｒｅｓｏｎ  Ｉｍａｇｉｎｇ．  ２００７  Ｄｅｃ；  ２６（６）：  １６３４−４１及びＷａｔｅｒ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｏｌｌｏｉｄ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ：  Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｏｎ，  Ａ．  Ｒｏｃｈ，  Ｆ．  Ｍｏｎｋｙ，  Ｒ．Ｎ．  Ｍｕｌｌｅｒ，  Ｐ．  Ｇｉｌｌｉｓ；  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｊ．  Ｆｒａｉｓｓａｒｄ，  Ｏ．  Ｌａｐｉｎａ，  ｐ．  ３８３−９２にある。磁気微粒子が、本出願に記載されている表面に任意のコーティング又は修飾を有さず、磁気機能性を有する化合物中に含有するという事実は、磁気機能性を有する化合物の酵素消化前及び後の結果である磁気微粒子の凝集後に測定された緩和時間のより大きな違いを得ることを可能にする。
【００９７】
別の好ましい実施形態において、本発明は少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を含む磁気機能性を有する化合物に関し、本出願に記載されているようにｉ）磁気微粒子は表面に任意のコーティング又は修飾を有さず、又はｉｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基によって官能化されており、基質がタンパク質、修飾されたタンパク質、ポリペプチド、修飾されたポリペプチド、糖タンパク質、グリコサミノグリカンおよびその組み合わせからなる群から選択される化合物に関する。好ましくは、基質はコラーゲン、フィブリリン、エラスチン、ラミニン、オステオカルシン、硫酸コンドロイチン、ヒアルロン酸、オステオネクチン、オステオポンチン、ゼラチンおよびその組み合わせから成る群から選択することができる。
【００９８】
もっとさらに好ましい実施形態において、本発明は少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子、好ましくは超常磁性微粒子を含む磁気機能性を有する化合物に関し、本出願に記載されているようにｉ）磁気微粒子は表面に任意のコーティング又は修飾を有さず、又はｉｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基によって官能化されており、基質がコラーゲン、硫酸コンドロイチン及びヒアルロン酸からなる群から選択される化合物に関する。
【００９９】
特に好ましい実施形態において、本発明は少なくとも１つの酵素の基質及び複数のマグネタイトナノ微粒子を含む磁気機能性を有する化合物に関し、磁気微粒子は表面に任意のコーティング又は修飾を有さず、基質をコラーゲン、硫酸コンドロイチン及びヒアルロン酸からなる群から選択することができる化合物に関する。より好ましくは、マグネタイトナノ微粒子は共有結合によって基質に結合される。
【０１００】
別の好ましい実施形態において、本発明はカルボキシル基によって官能化されている磁気微粒子、好ましくは超常磁性微粒子を含み、磁気機能性を有する化合物に関し、磁気微粒子は通常生理学的なｐＨで凝集する化合物に関する。
【０１０１】
別の好ましい実施形態において、本発明はカルボキシル基によって官能化されている磁気微粒子、好ましくは超常磁性微粒子を含み、磁気機能性を有する化合物に関し、磁気群（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｇｒｏｕｐｓ）は表面の一部にのみ修飾を有する化合物に関する。
【０１０２】
別の好ましい実施形態において、本発明は少なくとも１つの酵素の基質に固定化された複数の磁気微粒子を含む磁気機能性を有する化合物に関し、磁気微粒子は表面に任意のコーティング又は修飾を有さず、前記化合物が本出願の以下に記載されている方法で得られる化合物に関する。
【０１０３】
本発明はまた、本出願に記載されているような、少なくとも１つの酵素の基質及び表面にコーティング又は修飾を有さない複数の磁気微粒子を含む磁気機能性を有する化合物を得るための方法に関し、
ａ）少なくとも１つの酵素の基質を修飾する工程、及び
ｂ）表面に任意のコーティング又は修飾を有さない複数の磁気微粒子を工程ａ）で得られた修飾された化合物に固定化する工程、を含む。好ましくは、磁気微粒子は共有結合によって基質に結合される。
【０１０４】
基質の修飾の工程ａ）では、次に磁気微粒子の表面へ結合することができる物質が使用される。この結合反応は、磁気微粒子の表面における水のイオン解離によって通常促進され、基質の修飾に使用された物質は、水性溶媒において反応性が高い。
【０１０５】
したがって、基質の修飾は好ましくは無水条件下および有機溶媒中で行なわれ、それは基質の修飾のために使用された物質の、水を伴う反応を最小化する又は防ぐことを可能にする。
【０１０６】
磁気微粒子の表面がコーティングされている又は修飾を有する当該技術分野において知られている他の方法とは異なり、本方法はほぼ完全に磁性核である磁気微粒子への酵素の基質の結合を可能にするため、酵素活性を決定するための感度がはるかに高い磁気機能性を有する化合物を得ることを可能にする。
【０１０７】
好ましくは、本発明は、本出願に記載されているように、表面にコーティング又は修飾を有さない複数の磁気微粒子、より好ましくは超常磁性微粒子を、少なくとも１つの酵素の基質に固定化する工程を含む、磁気機能性を有する化合物を得るための方法に関し、工程ａ）において基質は好ましくはアミノシラン、芳香族ジアゾニウム塩、ポリマー、高分子電解質及び二配座複合体からなる群から選択され、好ましくは化合物と有機溶媒中で反応する。
【０１０８】
本出願に記載されているように、磁気機能性を有する化合物を得るための方法の工程ａ）は、ポリアミン、ポリエチレン、ポリアミド及びポリスチレンからなる群から選択されるポリマーを使用して行われ得る。これはこの工程１）においてポルフィリン及びピリミジンからなる群から選択される基質である二配座複合体の修飾においても使用され得る。さらに、方法のこの工程において、水性溶媒中のコハク酸と結合したドーパミンが使用されても良い。本発明のさらに好ましい実施形態において、方法の工程ａ）は水の含有量の最大値が２％、好ましくは１％である有機溶媒中のアミノシランとともに行われ得、これは水とのアミノシランの接触を防ぐ又は最小化することを可能にし、よってアミノシラン分子間のシリル化反応または架橋を回避する。アミノシランはアルコキシシランの群に属する。雲母、グラスまたは酸化皮膜のような化合物は、シランのアルコキシ基によって置換され得るヒドロキシル基を含むため、シラン化され得、これは−Ｓｉ−Ｏ−Ｓｉ−共有結合の形成を誘発する。アミノシランの使用は有機要素が無機要素へ結合することを可能にする。アルコキシシランは次の３つの群に分けられる：第二又は第三のアミノ基を有するアミノシラン；エポキシドを有するグリシドキシシラン；及びチオールを有するメルカプトシラン。
【０１０９】
さらにより好ましい実施形態において、本出願に記載されているような磁気機能性を有する化合物を得るための方法の工程ａ）において使用されるアミノシランは、（３−アミノプロピル）−トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）（３−アミノプロピル）−ジエトキシ−メチルシラン（ＡＰＤＥＭＳ）、（３−アミノプロピル）−ジメチル−エトキシシラン（ＡＰＤＭＥＳ）及び（３−アミノプロピル）−トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）からなる群から選択することができる。
【０１１０】
特に好ましい実施形態において、本発明の方法の工程ａ）中で使用されるアミノシランは、有機溶媒中の（３−アミノプロピル）−トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）である。
【０１１１】
工程ａ）のアミノシランの、好ましくはＡＰＴＥＳの、基質との、好ましくはタンパク質との反応は、基質の構造上の完全性を維持及びその分散を向上させるのに適切な条件下で、無水有機溶媒中で生じる。前記条件は基質の構造によって変わり得、その条件は通常溶媒の極性及びプロトン性（ｐｒｏｔｉｃｉｔｙ）の機能である。コラーゲンについては、プロリンとヒドロキシプロリンの間の結合を保護するために、溶媒が極性であることが好ましい。発明の好ましい実施形態において、この工程中で使用される溶媒はアセトニトリルである。本発明の幾つかの実施形態において、基質の構造上の完全性は、分光写真法、クロマトグラフィまたは円偏光二色性のような実験的技術によってのみ決定できる。
【０１１２】
本発明の方法の工程ａ）において得られた、官能化された化合物は、ある容量の溶解された水とともに有機溶媒に懸濁された、表面にコーティング又は修飾を有さない酸化鉄又は他のフェライトの微粒子を固定でき、これは前記微粒子の表面上の−ＯＨイオンの出現を向上させる。
【０１１３】
別のもっとさらに好ましい実施形態において、磁気機能性を有する化合物を得るための方法は、工程ａ）の前にアミノシランのアミノ基を活性化させるさらなる工程を含み、好ましくはアミノシランはＡＰＴＥＳであり、最大２％、好ましくは１％までの水の含有量を有する有機塩基中の酸無水物及び有機塩基を伴う。したがって、無水物としての活性化されたアミノシランのアミノ基は、基質の中に存在するアミノ基と、本発明の方法の工程ａ）において反応することができる。
【０１１４】
好ましくは、アミノシランのアミノ基の活性化は、クロロホルム、アセトニトリル、ペンタン、シクロペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、１，４−ジオキサン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトン、ジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシドのような有機溶媒中にグルタル酸無水物およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンが存在する状態で生じ得る。
【０１１５】
別のさらにより好ましい実施形態において、本発明の磁気機能性を有する化合物を得るための方法は、工程ａ）の前にアミノシランのアミノ基を活性化させるさらなる工程を含み、好ましくはアミノシランはＡＰＴＥＳであり、最大２％、好ましくは１％までの水の含有量を有する有機溶媒中のアルデヒドを伴う。したがって、アミノシランのアミノ基の活性化も達成され、基質の中に存在するカルボキシル基を伴う本発明の方法の工程ａ）中のその反応を促進する。
【０１１６】
さらに、本発明は磁気機能性を有する化合物を得るための方法が、本出願に記載されているように磁気機能性を有する化合物が、カルボキシル基で官能化された複数の磁気微粒子、好ましくは超常磁性微粒子、及び少なくとも１つの酵素の基質を含み、該方法がカルボキシル基で官能化された磁気微粒子の、アルデヒド及び／又はカルボジイミドによる基質との反応を含む場合にも言及する。同様に、カルボキシル基で官能化された前記微粒子の表面に、例えばジメルカプトコハク酸を使用して固定化するために、基質の、好ましくはタンパク質のアミノ基は修飾することができる。
【０１１７】
カルボキシル基で磁気微粒子を修飾するいくつかの方法は、Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｂｏｘｙｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｉｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，  Ｍｉｎ−Ｊｕｎｇ  Ｋｉｍ，  Ｄａｅ−Ｈｗａｎ  Ｊａｎｇ，  Ｙｏｎｇ−Ｈｏ  Ｃｈｏａｅ；  Ｐｈｙｓｉｃａ  Ｓｃｒｉｐｔａ  Ｔ，  ２０１０，  ｖｏｌｕｍｅ  １３９，  ｐａｇｅ  １４０２４に記載されている。この方法は２つの工程で実行される：ａ１）３−チオフェノ酢酸（ｔｈｉｏｐｈｅｎｏａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）及び磁気微粒子の、好ましくは磁気ナノ微粒子の間の結合が、酸化鉄の表面における過マンガン酸カリウムとの相互作用を通して、溶媒としてのアセトニトリル中で８０℃で生じる工程、ｂ１）この最初の修飾の後、前記微粒子が、その表面に固定化されるメソ−２，３−ジメルカプトコハク酸（ｍｅｓｏ−２，３−ｄｉｅｒｃａｐｔｏｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）の溶解物中に置かれる工程。
【０１１８】
本発明を実行するための好ましい方法において、カルボキシル基で官能化された磁気微粒子は、以下の２つの工程を含むプロセスによって、その表面を、アルデヒドで予め活性化させたアミノシランで修飾することによって得られる：
ａ２）アルデヒドを有するアミノシランのアミノ基を活性化する工程；及び
ｂ２）工程ａ２）に基づいてアルデヒドで活性化させたアミノシランを、シラン基及びヒドロキシル基を酸化鉄表面で相互作用させることによって、磁気微粒子に結合させる工程。
【０１１９】
次に、カルボキシル基で官能化されたこれらの微粒子は、具体的には前記基質中に存在するアミノ基に共有結合によって結合し得る。好ましくは、アミノシランのアミノ基の活性化は、クロロホルム、アセトニトリル、ペンタン、シクロペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、１，４−ジオキサン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、アセトン、ジメチルホルムアミドまたはジメチルスルホキシドのような有機溶媒中にグルタル酸無水物およびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンが存在する状態で生じ得る。別のさらにより好ましい実施形態において、アミノシランのアミノ基の活性化は、好ましくはアミノシランはＡＰＴＥＳであり、最大２％、好ましくは１％までの水の含有量を有する有機溶媒中のアルデヒドを伴う。
【０１２０】
磁気微粒子表面の修飾は、好ましくは磁気ナノ微粒子を、０．１％から１％の活性化されたアミノシランと、最終的に０％から５％までとなる１０％から５０％までのＮＨ３溶液とを有するエタノール又はメタノール溶液中に混合することによって行われる。このプロトコルに従えば、２４時間でナノ微粒子の表面の完全な被覆が得られると予想され、部分的な被覆であればより短い時間で得られると予想される。
【０１２１】
別の好ましい実施形態において、磁気微粒子は、カルボキシル基で単に部分的に官能化される。これは、生理的なｐＨで前記微粒子の凝集を増強する。
【０１２２】
本発明の好ましい実施形態において、工程ａ１）は、３０分より短い時間、または８０℃より低い温度で行なわれる。本発明のもっとさらに好ましい実施形態において、この時間は１分から１５分までの範囲で変動する。本発明の別の好ましい実施形態において、この時間は５分より短い。本発明の別の好ましい実施形態において、温度は１０℃から６０℃までの範囲で変動する。
【０１２３】
本発明の別の好ましい実施形態において、工程ａ２）は２４時間よりも短い時間で行なわれる。別のもっとさらに好ましい実施形態において、この時間は１２時間未満である。本発明の別の好ましい実施形態において、この時間は１時間から５時間までの範囲で変動する。
【０１２４】
本発明の別の好ましい実施形態において、工程ａ２）は、１０％未満のＮＨ３の容積濃度で行なわれる。
【０１２５】
さらに、本発明は、少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を備えた少なくとも１つの磁気機能性を有する化合物を含む製品にも関し、本出願に記載されているようにｉ）磁気微粒子は表面に任意のコーティング又は修飾を有さず、又はｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基で官能化され、前記製品はインプラント、ゲル、医薬組成物及び造影剤からなる群から選択される。
【０１２６】
好ましい実施形態において、本出願に記載されているような磁気機能性を有する化合物を含む製品は、医薬組成物であり得て、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含み得る。
【０１２７】
本出願に記載されているような磁気機能性を有する化合物の好ましい投与経路は、投与の他の可能な方法を除外することなく、静脈内投与、好ましくは局所投与である。本発明に由来する可能な製剤の可能な投与方法の詳細なリストは、Ｊｏｈｎ  Ｍ．  Ｗａｌｋｅｒ，  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ４８０，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓで得られる。
【０１２８】
もっとさらに好ましい実施形態において、本発明は、本出願に記載されているような磁気機能性を有する化合物及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含むカプセル化した医薬組成物に関し、この賦形剤は磁気機能性を有する化合物を、修飾された基質及びそれと反応する少なくとも１つの酵素の間の反応を起こる場所への放出を可能とすることに適切なものであるカプセル化した医薬組成物に関する。
【０１２９】
もっとさらに好ましい実施形態において、本発明は、活性成分、本出願に記載されているような磁気機能性を有する化合物及び少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含むカプセル化された組成物に関する。したがって、このカプセル化された組成物は、前記活性成分の投与の効果を評価するために使用することができる。
【０１３０】
具体的に好ましくは、本発明は、コラーゲン、硫酸コンドロイチン及びヒアルロン酸からなる群から選択される基質に固定化された、好ましくは表面にコーティング又は修飾を有さない複数の磁気微粒子も含み、磁気機能性を有する化合物を含みうる医薬組成物に関する。より好ましくは、マグネタイトナノ粒子が共有結合によって基質に結合される。
【０１３１】
別の好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を備えた磁気機能性を有する化合物を含むインプラント又はゲルに関し、本出願に記載されているようにｉ）磁気微粒子は表面に任意のコーティング又は修飾を有さず、又はｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基で官能化されているインプラント又はゲルに関する。
【０１３２】
好ましくは、インプラント又はゲルは磁気機能性を有する化合物を含み、本出願に記載されているような細胞外マトリクス再生に関与する基質、及び本出願に記載されているような表面に任意のコーティング又は修飾を有さない複数の磁気微粒子を含む。
【０１３３】
もっとさらに好ましい実施形態において、本発明は、本出願に記載されているように、コラーゲン、硫酸コンドロイチン及びヒアルロン酸からなる群から選択される基質及び表面に任意のコーティング又は修飾を有さない複数の磁気微粒子、好ましくはマグネタイトナノ微粒子を備えた磁気機能性を有する化合物を含むインプラント又はゲルに関する。より好ましくは、マグネタイトナノ微粒子は共有結合によって基質に結合される。別のもっとさらに好ましい実施形態において、インプラント又はゲルは、本出願に記載されているように細胞外マトリクスに関与する基質及び表面に任意のコーティング又は修飾を有さない複数の磁気微粒子を同様に含む磁気機能性を有する化合物を含み、前記磁気機能性を有する化合物は本出願に記載されている方法で得られる。
【０１３４】
さらに、本発明はまた、少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子も含む磁気機能性を有する化合物の使用に関し、１つ以上の酵素の酵素活性を構築又は識別するために、本出願に記載されているような製品を製造するための、本出願に記載されているようにｉ）磁気微粒子は表面に任意のコーティング又は修飾を有さず、又はｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基で官能化されている、磁気機能性を有する化合物の使用に関する。
【０１３５】
好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも１つの酵素の酵素活性に関連する疾患又は障害を検出するべく本出願に記載されているような製品を製造するための、本出願に記載されているような少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子も含む磁気機能性を有する化合物の使用に関する。
【０１３６】
好ましくは疾患または障害は、リウマチ病、関節炎、病変、結合組織と関係する疾患、デュピュイトラン病、ペーロニー病、コラーゲンと関係する疾患、脂肪症、繊維症、硬変、転移、組織再生、癌、冠疾患、肝臓疾患、代謝疾患、感染症および炎症性疾患から成る群から選択することができる。
【０１３７】
ＭＭＰの活性は、関節炎のような疾患、リウマチ病、デュピュイトラン病またはペーロニー病と同様に結合組織増殖と関係する疾病、肝臓繊維症につながる疾病、硬変または心疾患、不安定型の狭心症の閉塞において重要な役割を果たす。これらの疾患の酵素活性機能のより完全な記載は、Ｗｏｅｓｓｎｅｒ  ＪＦ  Ｊｒ．，  ｉｎ  Ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  １９９１  Ｍａｙ；  ５（８）：２１４５−５４  ａｎｄ  ｂｙ  Ｓｏｍｅｒｓ  ＫＤ，  Ｄａｗｓｏｎ  ＤＭ  ｉｎ  Ｆｉｂｒｉｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｅｙｒｏｎｉｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｌａｑｕｅ  Ｊ．  Ｕｒｏｌ．  １９９７  Ｊａｎ；  １５７（１）：３１１−５から得られる。
【０１３８】
さらに、本発明はまた、少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子も含む磁気機能性を有する化合物の使用に関し、少なくとも１つの酵素の酵素活性に関連する疾患又は障害を検出するべく本出願に記載されているような医薬組成物を製造するための、本出願に記載されているようなｉ）磁気微粒子は表面に任意のコーティング又は修飾を有さず、又はｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基で官能化されている、磁気機能性を有する化合物の使用に関する。好ましくは、疾患または障害は上記に含まれるリストから選択される。
【０１３９】
ＭＰの活性の追跡は、細胞外マトリクスの異化において特別な注目をする価値があり、不安定な冠疾患と関係がある。
【０１４０】
細胞外マトリクスおよび厚い線維層は、アテロームプラークに安定性を提供する。一般に、不安定なプラークは薄い線維層、多くの炎症細胞、大きな脂質核を有し、血栓の形成を引き起こし得る。平滑筋細胞によるコラーゲン合成は、ベータ形質転換増殖因子（β−ＴＧＦ）のような増殖因子によって刺激される。マクロファージとＴ細胞の蓄積を伴うプラーク中の炎症は、コラーゲンを消化し繊維層を薄くする、ＭＭＰの放出を引き起こす。壊死した脂質核は、細胞外マトリクス中の脂質の蓄積、脂質で充填されたマクロファージの死、及び場合によっては脈管の血管のプラーク内出血後の赤血球膜の蓄積の結果として増殖する。
【０１４１】
酸素ラジカルはＮＡＤＰＨオキシダーゼと炎症細胞を含む様々なソースから生成され、低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）を酸化し、細胞壊死を引き起こす。臨床的に無症状であり得る、繰り返されるプラークの分解及び治癒のサイクルは、プラーク内に層を生じさせる。リソソームと呼ばれる細胞小器官に局在する細胞内タンパク質分解酵素と異なり、ＭＭＰは細胞外液腔内および生理的なｐＨで作用する。マトリクスのメタロプロテアーゼのスーパーファミリーは、ＭＭＰ１または間質性コラゲナーゼ（線維性コラーゲンの最初の分裂に特異的な酵素で、一般的にプロテアーゼに耐性があり、これがアテロームの線維層に耐性を与える）を含む。ゼラチナーゼのようなマトリクスメタロプロテアーゼのファミリーの他のメンバーは、コラーゲン断片のさらなる分裂を触媒し得る。ストロメリシンは、ＭＭＰのファミリーの他のメンバーを活性化することができ、プロテオグリカン分子のタンパク質の基幹ネットワークを含む広範囲のマトリクス成分を分解することができる。ストロメリシン及びゼラチナーゼの１つ（９２ｋＤａゼラチナーゼＢまたはゼラチナーゼ）もエラスチン（細胞外血管マトリクスの構造上重要なさらなる成分）を分解できる。
【０１４２】
分子モデルに支持された臨床上の証拠は、閉塞、脳卒中または急性心筋梗塞のような冠疾患における深刻な事象のリスクが、閉塞の大きさによってではなくＬＤＬコレステロールの前述の免疫学的排出によって誘導されたＭＭＰＳによるプラークの切断によって引き起こされることを示す。
【０１４３】
別の好ましい実施形態において、本発明はまた、少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子を含む、磁気機能性を有する化合物の使用に関し、冠動脈プラーク中のＭＭＰの酵素活性を確立するべく造影剤を製造するための、本出願に記載されているようなｉ）磁気微粒子は表面に任意のコーティング又は修飾を有さず、又はｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基で官能化されている、磁気機能性を有する化合物の使用に関する。好ましくは、基質はタンパク質であってもよく、これはコラーゲン、フィブリリンおよびエラスチンから成る群から選択することができる。
【０１４４】
ＭＭＰも、いくつかの肝臓疾患と密接に関係がある。肝線維症は、多数の細胞および分子の事象が関与しており、過剰な細胞外マトリクスタンパク質の堆積物および正常な肝臓構造の変形を引き起こす。病因は、慢性ウイルス性肝炎、アルコール乱用による脂肪肝、非アルコール性の脂肪症および薬物関連の毒性を含む。ＭＭＰの過剰発現は、脂肪肝を線維症または硬変から区別できる分子マーカーのうちの１つである。さらに、コラゲナーゼの一種（ＭＭＰ−１３）及び他のＭＭＰは、肝線維症の最初の段階における一時的に増強された活性及び進行した線維症における減少した活性を有する。
【０１４５】
Ｉ型及びＩＩＩ型コラーゲンの正味の進行性の堆積は、線維症の進行の間に見られた。ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−８およびＭＭＰ−１３に加えて、一般的なＭＭＰはＩ型コラーゲンを分解することができない。ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３およびＭＭＰ−９は、ＩＶ型コラーゲンを消化でき、これらのＭＭＰの酵素活性は硬変の出願によって次第に減少する。これらの酵素（コラーゲン溶解性の活性を有するものを含む）のｍＲＮＡの発現の分子学的研究は、これらが肝臓で、硬変においてさえ発現されるが、これらの活性はその大部分が阻害剤（メタロプロテアーゼの組織阻害剤（ＴＩＭＰ）１及び２）の制御下にあるままであることを示した。
マトリクスの分解の可能性は依然として存在し、重度の硬変においてでさえ存在するが、ＴＩＭＰの分泌に包含されている。
【０１４６】
肝線維症の回復はＴＩＭＰ発現の減少によって媒介され、間質性のコラゲナーゼに加えて、ＭＭＰ−１とゲラチナーゼＡの組み合わせによる線維状コラーゲンの分解が関与する。クッパー細胞と脂肪細胞はＭＭＰとＴＩＭＰの合成に重要な役割を果たす。ナノ微粒子およびミクロ微粒子は、通常肝臓におけるクッパー細胞によって顕著に保持される。
【０１４７】
本出願に記載されているような磁気機能性を有するために修飾されたコラーゲンの投与は、肝臓におけるＭＭＰのコラーゲン溶解性の活性を測定することにより、いくつかの肝臓の疾病を評価するのに有用である。この修飾されたコラーゲンは、修飾されたコラーゲンに固定された磁気微粒子に近接した水プロトンと、その離れたの同等物との異なる緩和時間によって引き起こされる対比効果を誘発する。緩和のこの効果は、酵素分解の結果として磁気微粒子が凝集していた場合さらに大きい。磁気微粒子の表面が修飾されていなければ、その差はさらに顕著である。
【０１４８】
したがって、前記効果（磁気共鳴画像におけるより大きな対比）の程度は、ＭＭＰの発現のシグナルである。磁気共鳴のシグナルの対比効果のこの向上は、本出願にリストされていない他のＭＲＩパラメータを除外することなく、シグナル強度、Ｔ１又はＴ２に重みづけした画像、拡散パラメータの算出、飽和の画像又はその組み合わせのような磁気共鳴画像の測定において使用される異なるパラメータによって時間ごとに測定することができる。これらのパラメータの内いくつかについて短い説明は以下の通りである。ＭＲＩパラメータおよびそれらの原理のより完全な説明は、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．による「ＭＲＩ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ」という本の中で提供される。
【０１４９】
上記のように磁気微粒子を固定することによって、磁気機能性を有するために修飾されたコラーゲンが、脂肪症又は肝臓脂肪症及び線維症の原理（ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ）の最終段階において肝臓に投与された場合、正常な肝臓と比較して、より大きな対比効果が、磁気共鳴のような分析的な技術によってみられる。しかしながら、繊維症または硬変に続く段階では、この対比効果はより穏やかである。
【０１５０】
ＭＭＰの発現は、肝転移を持った患者においても著しく高い。癌において、ＴＩＭＰによるＭＭＰおよびそれらの阻害の生成と活性化の間のバランスは、侵襲と転移の主要因である。ＭＭＰは組織で合成され、血流によってろ過される。結腸直腸癌、乳癌、前立腺癌及び膀胱癌において、重篤な疾患を有するほとんどの患者がゲラチナーゼＢの血漿レベルの増加を有するのが観察された。
【０１５１】
具体的には、進行した結腸直腸癌の患者において、ゲラチナーゼＢの高い値又は短い生存率に関連したＴＩＭＰ複合体との相関が見られた。したがって、発現及び／又は酵素活性及び癌における重要さ、及び一般的に器官、組織又は他の体の区画におけるＭＭＰ及び他の酵素の活性を評価するために、磁気機能性を有する化合物を基質として使用することは本発明の範囲内である。
【０１５２】
別の好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子も含む磁気機能性を有する化合物の使用に関し、細胞外マトリクスの再生、好ましくは軟骨の再生に関与する酵素活性をモニターするべくインプラント又はゲルを製造するための、本出願に記載されているようなｉ）磁気微粒子は表面に任意のコーティング又は修飾を有さず、又はｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基で官能化されている、磁気機能性を有する化合物の使用に関する。
【０１５３】
別のもっとさらに好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子も含む磁気機能性を有する化合物の使用に関し、ヒト又は他の生物におけるインプラントの生物学的完全性をモニターするべくインプラントを製造するための、本出願に記載されているようなｉ）磁気微粒子は表面に任意のコーティング又は修飾を有さず、又はｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基で官能化されている、磁気機能性を有する化合物の使用に関する。
【０１５４】
好ましくは、本出願に記載されているような磁気機能性を有する化合物は、カルボキシル基で官能化され、硫酸コンドロイチンに固定されたマグネタイトナノ微粒子を含み、この化合物は、軟骨インプラントを製造するのに適切である、硫酸コンドロイチン又は他のグリコサミノグリカン、あるいは糖タンパク質のさらなる量を含む水性混合物に加えられる。したがって、軟骨インプラントに加えることができるゲルが得られ、軟骨再生において役割を担う硫酸コンドロイチン又はコンドロイチンスルファターゼのヒドロラーゼ活性のレポーターとして作用する。さらに、このゲルも、硫酸コンドロイチン又はコンドロイチンスルファターゼのヒドロラーゼ活性のレポーターとしてインビトロで使用することができる。
【０１５５】
硫酸コンドロイチンと同様に及び代替的に、本発明の他の実施形態においてヒアルロン酸も使用することができる。
【０１５６】
本出願に記載されているように、少なくとも１つの酵素の基質に固定化された複数の磁気微粒子を含む磁気機能性を有する化合物を、生物、好ましくはヒトに投与した場合、この化合物は前記基質と反応する１つ以上の酵素の酵素活性を測定することを可能にする。この測定は、磁気機能性を有する化合物、その反応生成物の少なくとも１つ、またはその両方の組み合わせの磁性に関連したパラメータにおけるこの酵素反応によって引き起こされた変化を測定することで行なわれる。
【０１５７】
別の好ましい実施形態において、本発明は次のものの使用に関する：
−本出願に記載されているようなインプラント又はゲルを製造するための、細胞再生方法に関与する少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子も含む磁気機能性を有する化合物；または、
−少なくとも１つの酵素の基質及び複数の磁気微粒子も含む磁気機能性を有する化合物であって、本出願に記載されているようなｉ）磁気微粒子は表面に任意のコーティング又は修飾を有さず、又はｉｉ）磁気微粒子はカルボキシル基で官能化されており、酵素活性が少なくとも超常磁性から常磁性への変化を引き起こす、化合物。
【０１５８】
本出願に記載されている磁気機能性を有する化合物を使用した酵素活性の効果を確立するために使用することができるいくつかの分析技術がある。したがって、別の好ましい実施形態において、本発明は、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、電子常磁性共鳴法（ＥＰＲ）、震動の磁力測定（ＭＶＳ）を含む磁力測定法、超電導量子干渉計（ＳＱＵＩＤ）、メスバウアー分光法、Ｘ線磁気円二色性法（ＸＭＣＤ）、強磁性共鳴法（ＦＭＲ）、磁気光学カー効果（ＭＯＫＥ）、ブリルアン散乱（ＢＬＳ）、電磁誘導法、原子間力顕微鏡法、磁気反射法及びその組み合わせからなる群から選択される技術によって、酵素活性によって引き起こされた磁性の変化を確立するための、本出願に記載されているような磁気機能性を有する化合物の使用に関する。
【０１５９】
これらの技術の内いくつかは、磁気機能性を有するように修飾された基質を含む、予め乾燥させた又は凍結乾燥させたサンプルのスペクトル及び曲線を確立し、生物学的製剤に曝す前と後の、磁気機能性を有するために修飾された基質において存在する磁気微粒子の凝集状態に基づいて前記スペクトル又は曲線における変化を観察することでインビトロ又はエキソビボでの酵素活性の存在を確立するために使用されてもよい。その簡単な説明は以下の通りである。
【０１６０】
ＥＰＲ分光法は、不対電子系を外部磁界（ゼーマン磁界）に置いた時に生じた分裂によって引き起こされた状態間のエネルギーの違いを測定する。ｇがランデ因子、μＢがボーア磁界及びＨが適用した磁界である場合、２つの状態間のエネルギーの違いはｇμＢＨＺの式になる。スペクトル中で共鳴ピークを得るためのいわゆる共鳴状態は次のとおりであり：
【０１６１】
【数４】
2015522568.tif 000006
【０１６２】
ここで磁界Ｈｚは共鳴場である。この式は、ランデ因子ｇを得るために使用することができる。この因子ｇは、サンプルを同定する時に結果的にとても有用だが、特有ではなく、照射のために選択された周波数に依存する。中でも強度、線の数、その間の距離、その形状及び幅のようなスペクトルによって提供される他のデータは、サンプルを同定し、特徴づけるのにとても有用な情報の他のソースである。したがって、特にその表面に近い磁気微粒子の電子は、スペクトルの変化に変換される磁気微粒子の凝集状態に基づいた異なる共鳴シグナルを生成する。
【０１６３】
ＭＶＳとＳＱＵＩＤは、サンプルの磁化に基づいて磁界を直接測定し、その変異曲線を決定する。
【０１６４】
メスバウアー分光法は、固体へのγ線の放射および共鳴吸収に基づいた分光学的技術である。メスバウアー分光法は、核遷移を探索し、よって化学的ＮＭＲ転位によって引き起こされる類似の電子−核相互作用に対して高感度である点で磁気共鳴画像（ＭＲＩ）分光法に似ている。Ｆｅ５７を備えた組成物を特徴づける放射素子は通常Ｃｏ５７である。典型的には、異性体転位、四極子分裂および超微細分裂の３つの型の核相互作用がある。超微細分裂（ゼーマン分裂）は、核と任意の周囲の磁場の間の相互作用の結果である。典型的に、これは単一のピークを６つの変性した（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）ピークに分裂させる。超微細分裂は、これらの６つのピークの最も外側の領域間の距離として通常測定される。超微細分裂は、鉄を包含している化合物のメスバウアー分光法において特に重要であり、それらは強力な内部磁場において結果として、多くの場合強磁性又は反強磁性である。同定に加えて、様々なピークの相対的な強度は、サンプルにおける化合物の相対的な集中を示し、半定量分析に使用することができる。また、強磁性現象が大きさに依存するため、スペクトルは鉄を包含している材料の結晶および粒状構造の大きさについてのデータを提供することができる。
【０１６５】
Ｘ線磁気円二色性法（ＸＭＣＤ）は、磁界を適用したとみなした、１つが右円偏向であってもう一つが左円偏向（ＬＣＰ）である２つのＸ線吸収スペクトル間の差である。この技術の最も大きな利点は、各要素へのその感受性であり、それは磁気的に特異的な要素を特徴付け、少数の要素の又はマトリクス中に希釈された磁気モーメントを検出することを可能にする。Ｘ線による吸収の測定が、特異的な要素の吸収の端に対応するエネルギーのために行われた際、この要素の実際の貢献はほとんど観察されなかった。この特徴は、それが他の要素の貢献又は全ての磁化において含まれ得る不純物を分離することを可能にするため、ナノ微粒子を扱う際に特に興味深い。この効果は、材料によるＸ線吸収は電子の光偏向、スピン及び軌道モーメントに依存するという事実に基づく。両方の円偏向（左又は右）のためにサンプル吸収を測定し、両方のスペクトルを差し引いて、ＸＭＣＤシグナルが得られる。いわゆる総和則によって電子の磁気モーメントを計算することがその後可能である。この技術はまた、磁気モーメントへスピンおよび軌道成分を分離することを可能にする。
【０１６６】
強磁性共鳴技術（ＦＭＲ）において、磁場はサンプルを包含しているフィルムの計画と平行して適用される。サンプルは、磁界の方向からその計画を変えることを可能にするゴニオメーターに置かれる。共鳴場、ＨＲ、ピークからピークの線の幅、ΔＨは、面における磁場の角度の関数（ｆｕｎｃｔｉｏｎ）として得られ、温度及びフィルムの厚さが得られる。
【０１６７】
偏向光線が磁化された材料の表面に反射した場合、分裂面をわずかに回転することができる。この効果は磁気光学カー効果またはＭＯＫＥとして知られており、強磁性体の薄膜の特徴付けの中で広く使用される。ＦＭＲにおいても同様に、サンプルはゴニオメーターに置かれ、その面を磁界の方向から回転させることを可能にするが、それとは異なり、ヒステリシス曲線の面積の推定が、サンプルの異なる配向角のための屈折率の測定から得られる。
【０１６８】
ブリュアン散乱は、入射光線が通過するフィルムまたは溶媒に磁気異常がある場合、見ることができる視覚現象である。
【０１６９】
本発明の別の好ましい実施形態において、これらの分析技術はインビボの酵素活性を検出することを可能にし、磁力測定と磁気共鳴画像からなる群から選ぶことができる。もっとさらに本発明の中で好まれる実施形態において、この分析技術は磁気共鳴画像である。
【０１７０】
別の好ましい実施形態において、本発明は、本出願に記載されているような磁気機能性を有する化合物の使用に関し、酵素活性は磁性の変化、好ましくは超常磁性から常磁性への少なくとも部分的な変化、を引き起こし、これはシグナル強度、縦方向の緩和時間（Ｔ１）、横方向の緩和時間（Ｔ２）、分散パラメータ、第一の一連のパルスに対する応答シグナル、飽和シグナルＩ及びその組み合わせからなる群から選択されるパラメータの決定によって検出可能である。好ましくは、酵素反応によって引き起こされた磁性における変化は、縦方向の緩和時間（Ｔ１）、横方向の緩和時間（Ｔ２）、およびＴ２に対するＴ１の割合からなる群から選択されるパラメータで測定することができる。好ましくは、前述の変化は、Ｔ２に対するＴ１の比率によって決定することができる。
【０１７１】
好ましくは、酵素反応によって引き起こされた磁性における変化は、前記パラメータを、本出願に記載されているように生じた酵素反応の前と後で分析することで決定し得る。具体的には、前記パラメータは、本発明の対象である１つ以上の酵素の基質を含む磁気機能性を有する化合物と、１つ以上のそれらの酵素間で起こる酵素反応の前と後に分析される。
【０１７２】
磁気共鳴に基づいた測定法、例えば磁気共鳴画像法または電子常磁性共鳴法（ＥＰＲ）は、磁気機能性を有する化合物、少なくとも１つのその分解産物又はその組み合わせの磁性の変化を測定するのに適切な間接的な方法である。磁気共鳴画像法の場合には、強い磁場に垂直な高周波（ＲＦ）の適用による効果に対する反応の緩和時間が測定される。これらの緩和時間はＴ１とＴ２と呼ばれ、前記ＲＦの除去の結果として、それぞれ適用されたＲＦに対して縦方向の面における磁場の消失の結果として、及びＲＦが適用された面に垂直な磁場の力の再出現の結果として、水プロトンの緩和の固有時間を表す。ほとんどの組織および体液としての反磁性体と比較して、Ｔ１とＴ２は、強磁性体、常磁性及び超常磁性材料の存在下で著しく短い。長い間、常磁性の溶質の追加が、水水素プロトンのパラメータＴ１の測定において減少を引き起こすことも知られている。
【０１７３】
磁気共鳴法は、臨床応用において使用されているように、プロトンの極めて小さい磁気モーメント及び生物組織において存在する多くのプロトンの間のバランスに基づき、大きな磁場の存在下で測定可能な効果を引き起こす。軸ｚと平行なＢ０については、これらの緩和シグナルは次のとおりである：
【０１７４】
【数５】
2015522568.tif 000007
【０１７５】
ここでｍｚが軸ｚに沿った磁化である場合、ｍｘｙは軸ｚに垂直な磁化であり、Ｔ１Ｔ２はそれぞれ縦方向及び横方向の緩和時間であり、ω０は歳差の振動数であってφは位相定数である。縦方向の緩和は、系からその周辺のネットワークへの、熱さ（ｈｏｔ）のようなエネルギー喪失を反映し、これは特にプロトンモーメントの、それらの環境への双極子カップリングの大きさ（ｍｅａｓｕｒｅ）である。面ｘｙにおける緩和は比較的速く、プロトン同士及びプロトンと組織中の磁気モーメントの他の変動の磁気的相互作用による、プロトンの歳差における相の一貫性の喪失によって促進される。遅延（ｌａｇ）も、縦方向の適用の範囲における局所的な非均一性の影響を受け得、これは第二の式中のＴ２の、より短い緩和時間であるＴ２＊への置換を起こす：
【０１７６】
【数６】
2015522568.tif 000008
【０１７７】
ここでΔＢ０は、適用された磁場の均一性のゆがみ（ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎｓ）又は系の磁化率の局所的な変化のいずれかを通じて生じる磁場の変化である。このΔＢ０変化は、磁気微粒子によって正確に引き起こされ得、Ｂ０磁場の非均一性の、有り得る局所因子上の著しい優位を引き起こす。
【０１７８】
本発明のいくつかの実施形態において、最初に基質又は他の目的の高分子に固定された磁気微粒子の分布又は凝集状態における変化によって引き起こされた、ΔＢ０に結果としてつながるこれらの違いは、前記基質又は目的の高分子の分解又は代謝的な使用の結果として検出されるシグナルを引き起こす。
【０１７９】
別の好ましい実施形態において、本発明は、本出願に記載されているような磁気機能性を有する化合物の使用に関し、ここで磁性における変化は、以下からなる群から選択される物理的な現象を示す：
−磁気微粒子の凝集、
−磁気機能性を有する化合物又は少なくとも１つのその反応産物の凝集、
−磁気微粒子の大きさの変化、
−本発明の対象である磁気機能性を有する化合物、少なくとも１つのその反応産物及びその組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つの微粒子の大きさの変化。
【０１８０】
ここで強調されなければならないのは、磁気微粒子の磁気モーメントを並べることの効果は、それらの群化（ｇｒｏｕｐｉｎｇ）又は分布の結果として著しく変化し得ることである。
これは、１）上で説明したような熱擾乱又は動的撹拌（ｋｉｎｅｔｉｃ  ａｇｉｔａｔｉｏｎ）の効果、及び２）上で説明したような適用された外部磁場に反応するのに必要な平均時間及びエネルギー、の２つの因子から理解できる。
【０１８１】
特別に興味深い場合は、磁気微粒子が超常磁性であり、そのような立体構造の変化の結果として凝集する傾向にある場合である。その後、結果として生じた磁気凝集体（必ずしも超常磁性であってはならない）は、元の磁気微粒子の磁性とは測定可能に異なる磁性を有する。したがって、磁性における変化を決定する場合、酵素効果のシグナルを検出することができる。直径１５ｎｍ未満のマグネタイトナノ微粒子の場合には、これらの微粒子は生物学的な温度の水溶液に懸濁した際超常磁性として振る舞うが、より大きな直径の凝集を形成した堆積物（ｐｉｌｅ）であれば、その振る舞いは常磁性のものになる。
【０１８２】
図１は、磁気相関性（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｌａｔｉｖｉｔｙ）Ｒ２と呼ばれる、Ｔ２の反対を測定した上でのマグネタイトの超常磁性及び常磁性のナノ微粒子の大きさおよび凝集の効果を示す。一度凝集した超常磁性ナノ微粒子は、常磁性微粒子と似た振る舞いをすることを示す。
【０１８３】
磁気材料が強度Ｈの磁場に置かれた場合、材料中の個別の原子モーメントは、その方向にそれらを並べる反応に貢献する。これは磁気誘導と呼ばれる：
【０１８４】
【数７】
2015522568.tif 000009
【０１８５】
ここでμ０が溶媒の透磁率で、磁化Ｍ＝ｍ／Ｖが１つの容量単位当たりの磁気モーメントであり、ｍは体積Ｖを有する材料における磁気モーメントであり、全ての材料が、それらの原子構造と温度に基づく磁気反応を有している。それらは、容積磁化率（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）χの観点から適切に分類することができ、Ｍ＝χＨはＨによって材料において引き起こされた磁化を示す。ＩＳユニットにおいて、χは無次元（ａｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ）であり、ＭとＨはＡｍ−１において表わされる。
【０１８６】
材料の感受性は、温度だけではなく磁場の強度（Ｈ）にも依存しており、高いＨ値においてＭが飽和値に接近する、Ｍ−Ｈ曲線の特徴的なＳ字曲線を起こす。一方、強磁性およびフェリ磁性材料において、結晶のネットワークの磁気異方性のような固有の効果と同様に、材料の内部の造粒の不純物または限界の壁（ｗａｌｌｓ  ｏｆ  ｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓ  ｏｒ  ｌｉｍｉｔｓ）における磁区のスピンと関係する磁化プロセスにおける不可逆性を示す、ヒステリシス曲線がしばしば現われる。これはＭ−Ｈ曲線がヒステリシスループを生じさせるという事実につながる。これらのサイクルの形状は、部分的に粒子の大きさによって決定される：大きな粒子（マイクロメートル又はそれを超えるオーダー）において、いくつかの領域の基本の状態であり、領域の壁を動かすには比較的低い磁場エネルギーを必要とするため、これが狭いヒステリシスのサイクルにつながる。より小さな粒子において、単一領域の基本状態は、ヒステリシスから存在を決定する。さらに小さなサイズ（又はナノメートルの十分の一、あるいはより小さいサイズ）において、相対的な個別の原子モーメントがこれらの整然とした状態を維持すると同時に、微粒子の磁気モーメントが熱エネルギーへの反応として自由に変動できる時に、超常磁性が見られる。
【０１８７】
これはヒステリシスを欠いた、Ｓ字状のＭ−Ｈ曲線をもたらす。バルク中に配置された超常磁性微粒子においてさえ、それらの磁気モーメント相互作用は緩和時間と同様にＭ−Ｈ曲線（幾つかの場合において、ヒステリシスさえ見ることができる）にも影響し、他の磁気効果および光学効果を生じさせる。
【０１８８】
この効果は、例えば磁気震動の分光測定（ＭＶＳ）で見ることができる。図２は、アガロースにおいて固定化された１０ｍｌの生理食塩水の懸濁液における直径１０ｎｍのマグネタイトの超常磁性ナノ微粒子で官能化されたＩ型コラーゲンのＭ−Ｈ曲線を示す。
【０１８９】
図３は、３７℃で１２時間Ｉ型コラゲナーゼとともにインキュベーションした後の、アガロースに固定化された同様の懸濁液のＨ−Ｍ曲線を示す。図３はわずかに開いた曲線を示すが、図２のＨ−Ｍ曲線はヒステリシスを示さない。この磁気的な振る舞いは、コラゲナーゼのコラーゲン溶解性活性の結果として、その凝集の後に全体としてナノ微粒子の磁気モーメント間の相互作用による。コラゲナーゼが修飾されたコラーゲンを加水分解する場合、アルファ鎖は分離し、熱の移動を引き起こして凝集すると起こる同じ磁気の磁区間の磁気カップリングの結果として、固定された磁気ナノ微粒子は凝集する傾向にある。
【０１９０】
測定を行うのに好ましい技術は磁気共鳴法であり、ここで磁気微粒子の蓄積又は分散は、緩和時間の変化によって測定でき、したがってそのような磁気微粒子の差異の効果によっても測定できる。発明のいくつかの好ましい実施形態において、コラーゲンは、単離したアルファ鎖またはプロトコラーゲンの断片のいずれかとして提供することができ、単離されたα鎖又はモノマーにおいて行うことができる磁気微粒子の同様の固定プロセス後に両方とも自然発生又は合成したものである。α鎖は、三重らせん構造を採用するために誘導され、ペプシンのような酸性溶媒処理における懸濁又は分散、洗浄、ろ過、洗浄、ろ過及び沈殿物の回収によって誘導される。図４は、マグネタイトナノ微粒子（Ｂ）で官能化され、修飾されたコラーゲントリペプチド（Ａ）の構成を示す。図の縮尺は一定ではなく（ｎｏｔ  ｉｎ  ｓｃａｌｅ）、マグネタイトナノ微粒子の分布は実際の分布と必ずしも一致していない。図５は、コラーゲンをコラゲナーゼによって消化した後、コラーゲンにおいて最初に固定された磁気ナノ微粒子の分布に対するコラーゲン溶解性の活性の効果を示す。
【実施例】
【０１９１】
以下の実施例は例示する手段として提供され、本発明を限定することを意図するものではない。
【０１９２】
＜実施例１−コラーゲンを、表面に修飾を有さない磁気微粒子で修飾することによる、磁気機能性を有する化合物の調製＞
市販のウシの腱からのコラーゲンは、コラーゲン溶解性の活性の基質として三重らせん構造および証明された特性を有している。三重らせん構造を有するコラーゲン断片の選択は、ペプシンおよびその後のフィルタろ過による処理を通じて行なうことができる。後のプロセスの効率は、円偏光二色性法によって確認することができる。
【０１９３】
このタイプのコラーゲンを修飾するために、まずＡＰＴＥＳはそのリジンに結合された。ＡＰＴＥＳは複合体を形成するためにグルタル酸無水物で活性化された。この反応はＮ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）で行なわれた。ＡＰＴＥＳ、グルタル酸無水物およびＩＤＥＡは、１：１：３の比率でアセトニトリルに溶解され、２４時間乾燥した雰囲気中で撹拌下に置かれた。コラーゲンは、マンニトールのような回析（ｄｉｆｆｒａｃｔｉｖｅ）を有する酸性溶媒に溶解され、凍結乾燥に曝された。凍結乾燥されたコラーゲンは、アセトニトリルに懸濁し、均質化し、結果として生じた混合物を活性化したＡＰＴＥＳに２８：１の比率で加え、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＰＣＤ）を１：１の比率で加え、乾燥した雰囲気下でさらに４８時間混合した。アセトニトリルは、蒸発によってエタノールに置換し、余分なＡＰＴＥＳ、コラーゲン以外の化合物は遠心分離を繰り返すことで除去し、調製物は再度エタノールに懸濁した。磁気微粒子は塩基性溶媒に懸濁した際に直径１５ｎｍ未満で、一般的に水性で、エタノール／水の比率が少なくとも９８：１となるようにエタノールに混合し、超音波処理に曝した。それらを混合物に加え、さらに４８時間乾燥した雰囲気下で混合に曝した。エタノールはｐＨ３．５で安定化した水の蒸発によって酢酸に置換され、４℃で８時間撹拌に曝した。結果として生じる懸濁液を、ヨードキシナドール（ｉｏｄｏｘｉｎａｄｏｌ）ベッド上で１４時間超遠心分離機にかけた。上部のベッドを除去し、３０ＫＤの孔を有する膜チューブ中で４℃で２４時間透析に曝した。一度調製物を透析したら、マンニトール又は他の代替的な界面活性剤を加えることができ、調製物は凍結乾燥される。
【０１９４】
余剰分は、カラム、遠心分離勾配又は磁気分離によって除去することができ、透析し凍結乾燥された。結果として生じた製剤は、インビボ、インビトロ又はエキソビボでコラーゲン溶解性の活性を検出するのに有用である。コラーゲンの三重らせん構造により、一度磁気機能性のために修飾されたコラーゲンがコラゲナーゼによって分解されると、それに元から固定されていた磁気微粒子は、コラーゲン鎖に沿った基準分布に基づいて凝集又は分散する傾向にある。
【０１９５】
本実施例に記載されているように磁気機能性を有するために修飾されたコラーゲンの調製物３ｍｇを、ｐＨ７．５の１０ｍＭ塩化カルシウム及び４００ｍＭ塩化ナトリウム溶液中の１０％アガロースの１ｍＬ懸濁液に固定し、１ｍｇのコラゲナーゼを加えた後、緩和時間Ｔ２が１７０ｍｓであったことが、４．７ＴのＭＲＩ機器を使用して測定したことで観察された。コラゲナーゼ欠如下では、Ｔ２値は１５０ｍｓであった。未修飾のコラーゲンが使用した場合、緩和時間はコラゲナーゼを有するまたはコラゲナーゼを有さないサンプルにおいてそれぞれ１９１ｍｓおよび１８９ｍｓだった。
【０１９６】
＜実施例２−インプラントの製造における磁気機能性を有する化合物の調製＞
この最初の実施例において、ＡＰＴＥＳをポリリジンに結合して、その後修飾された微粒子を結合された。この修飾されたポリリジンは、リジルオキシダーゼ酵素によって媒介された架橋結合によってコラーゲンに結合することができる。ポリリジンはＡＰＴＥＳに結合する前にグルタル酸無水物で活性化される。この活性化反応は、ＡＰＴＥＳ、グルタル酸無水物及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を１：１：３の比率でアセトニトリル中に溶解することで行われた。次に、乾燥した雰囲気下で２４時間撹拌した。アセトニトリル中にポリリジンを懸濁し、活性化したＡＰＴＥＳに１：１比率で、１：１の比率でＤＩＰＣＤとともに、結果として生じた混合物を加え、さらに４８時間乾燥した環境下で混合した。アセトニトリルは蒸発によってエタノールに置換され、余剰のＡＰＴＥＳ及び修飾されたポリリジンとは異なる他の化合物は遠心分離を繰り返すことで除去し、エタノールに再懸濁した。水性の塩基性溶媒への懸濁液において直径１５ｍｍ未満のマグネタイト微粒子は、少なくとも９８：１のエタノール／水の比率でエタノールと混合された。超音波で処理し、以前に得られたエタノール中で修飾された、修飾されたポリリジンの混合物に加え、さらに４８時間乾燥した環境下で再度混合した。エタノールは蒸発によって水に置換され、修飾された微粒子の安定性を維持するために、塩基性ｐＨで安定化された。
【０１９７】
１０×Ｄ−ＰＢＳ及び２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中の０．４Ｍ  ＮａＯＨを有する、ｐＨ７．４で安定化された０．１酢酸中の１．５ｍｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンの溶液に、ｐＨ８．０の２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ中の０．０２ｍｇ／ｍｌのリジルオキシダーゼ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、２０％グリセロール及び３ｎＭ  ＤＴＴ、最終濃度１ｍＭのポリリジンで官能化された磁気微粒子、最終濃度１％未満のヒアルロン酸を加え、その混合物をｐＨ７．４で再び安定化させ、４℃で７２時間インキュベーションさせた。インキュベーションの後に洗浄し、ｐＨ８のＮａＯＨ溶液を用いて４℃で超音波処理した。最後に、ゲルを４５分間３７℃でインキュベーションするために置いた。
【０１９８】
ポリリジンで修飾された磁気微粒子は、アリジン−アリジン結合も向上させる酵素リジルオキシダーゼによってリジンをアリジンに変換することでコラーゲンに結合した。結果として生じたゲルは半固体で、一度移植されれば結合組織を置換できる。前述のインプラントの移植は、コラゲナーゼを分泌する線維芽細胞によるそれへの侵襲を伴い、それはインプラントのコラーゲンを分解し、周辺組織のコラーゲンに形態学的に類似するコラーゲンで置換する。先のコラーゲンの分解は、重みづけされた磁気共鳴画像のマップによって検出できる磁気微粒子の凝集を引き起こす。
【０１９９】
＜実施例３−軟骨インプラントに含まれる、カルボキシル基で官能化された磁気微粒子による硫酸コンドロイチン鎖の修飾＞
２００ミリリットルのアセトニトリル中で３００マイクロリットルのＡＰＴＥＳ、４１４マイクロリットルのＤＩＥＡ及び１６ｍｇのグルタル酸無水物を２４時間混合した。２５０ｍｌの最低限９９％の純度のエタノール、１６ｍｇ／ｍｌの適切な鉄濃度を有する酸性溶液に懸濁された際１０ｎｍである２ｍｌのマグネタイト微粒子及び１０ｍｌの３０％のＮＨ３溶液を加えた。混合物を３時間撹拌させ、２回洗浄することでエタノールをｐＨ２の酢酸に置換した。したがって、カルボキシル基で部分的に修飾された表面を有する磁気ナノ微粒子が得られる。
【０２００】
硫酸コンドロイチン硫酸の塩は、１０ｍＭの４−（２−ヒドロキシエチル）―１−ピペラジノタノ硫酸（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｏｔａｎｏｓｕｌｐｈｏｎｉｃ）  ａｃｉｄ）ＨＥＰＥＳ溶液に溶解された。以前に得られた、硫酸コンドロイチンのモノマーからの鉄濃度が約１モーラーである、表面を部分的に修飾されたマグネタイトナノ微粒子を、同じく硫酸コンドロイチンのモノマーから１．２１：１の過剰なＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）とともに加えた。結果として生じた懸濁液はｐＨ７．４で安定化され、２４時間４℃で撹拌し、かつろ過または透析によって余剰分を除去した。硫酸コンドロイチンで官能化されたナノ微粒子を、軟骨インプラント中で使用される付加的なコンドロイチン硫酸、他のグリコサミノグリカンまたは糖タンパク質の水性混合物に加えた。その混合物をゲルを形成するために撹拌した。前記ゲルは軟骨インプラントに含まれていても良く、軟骨の再生において役割を果たす硫酸コンドロイチンの加水分解酵素又はスルファターゼの活性のレポーターとして作用する。
【０２０１】
＜実施例４−磁気機能性を有するコラーゲンを含むゲルの製造＞
１０×Ｄ−ＰＢＳ及び２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中の０．４Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．４で安定化された０．１％酢酸中の１．５ｍｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンの溶液に、２５０ｍＭに達するようにリボースを、１．５ｍｇ／ｍｌの濃度の磁気機能性を有するコラーゲンの懸濁液を、及び最終濃度が１％未満のヒアルロン酸を加え、混合物をｐＨ７．４で再度安定化させ、４℃で７２時間インキュベートした。インキュベーションの後に洗浄し、ｐＨ８のＮａＯＨ溶液を用いて４℃で超音波処理した。最後に、ゲルを４５分間３７℃でインキュベーションに曝された。
【０２０２】
結果として生じたゲルは半固体で、インビトロでのアッセイに使用でき又はインプラントを形成でき、一度移植されれば結合組織を置換できる。ヒアルロン酸を含むことにより、コラゲナーゼを分泌する線維芽細胞によるそれへの侵襲が促進され、それはインプラントのコラーゲンを分解し、周辺組織のコラーゲンに形態学的に類似するコラーゲンで置換する。先のコラーゲンの分解は、重みづけされた磁気共鳴画像マップによって検出できる磁気微粒子の凝集を引き起こす。
【０２０３】
＜実施例５：磁気機能性を有するヒアルロン酸を含むインプラントの製造＞
実施例４に記載されている条件の後に、磁気機能性を有するコラーゲンは、ｐＨ７．４で安定化された磁気機能性を有するヒアルロン酸の２％溶液で置換された。得られたインプラントは、ヒアルロニダーゼの活性によって前述のインプラントの分解を検出することを可能にする。
【０２０４】
いくつかのタイプのインプラントも、同心円状に組み合わせることもでき、以前に調製したインプラント上に新たに４℃でインキュベーションすることでゼリー状にすることにつながり、異なる機能を持つ化合物を有する。したがって、同じインプラントにおいて、酵素活性が起こる領域に依存して、２つ以上の酵素活性を検出することができる。
【０２０５】
＜実施例６：磁気機能性を有するヒアルロン酸を含む注射インプラントの製造＞
０．１％酢酸中の磁気機能性を有する４ｍｇ／ｍｌのＩ型コラーゲンの懸濁液を、０．１％酢酸中で３％濃度のコラーゲン溶液と混合した。混合物は１０×Ｄ−ＰＢＳ及び２５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中の０．４Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．４に安定化され、ｐＨ７．４で磁気機能性を有するＩ型コラーゲンの１ｍｇ／ｍｌの最終濃度及び１％ヒアルロン酸という結果をもたらした。
【０２０６】
結果として生じたゲルは一度移植されれば融通性（ｅｌａｓｔｉｃｉｔｙ）を提供し、一度注入されれば結合組織と置換される。ヒアルロン酸の存在は、コラゲナーゼを分泌する線維芽細胞によるその侵襲が促進し、それはインプラントのコラーゲンを分解し、自らのコラーゲンで置換する。先のコラーゲンの分解は、重みづけされた磁気共鳴画像マップによって検出できる磁気微粒子の凝集を引き起こす。
【０２０７】
＜実施例７：カルボキシル基で官能化された磁気ナノ微粒子を用いた修飾による磁気機能性を有する化合物の調製＞
１０から２０ｍｇ  Ｆａ／ｍｌの範囲内の濃度である、カルボキシル基で修飾された、１０ｎｍの１００マイクロリットルの磁気微粒子を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを備えた３０ｍｌ酢酸溶液中に溶解された５０ｍｇコラーゲンの懸濁液に加えた。それはＮａＯＨでｐＨ８に安定化され、最後に１０ｍｇのＥＤＣを加え、１２時間撹拌した。結果として生じる混合物を、ｐＨ３で再び安定化させ、４℃で７２時間撹拌し、その後５分間超音波処理し、ヨードキシナドール（ｉｏｄｏｘｉｎａｄｏｌ）ベッド上で１０時間２５０００ＲＰＭで超遠心分離機にかけた。上清を抽出し、透析し、最後に凍結乾燥した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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