(57)【要約】  本開示は、Pichia pastorisからのソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターの単離および同定方法に関する。さらに、本開示は、ソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターの調節下のPichia pastorisにおけるヘテロローガスなタンパク質の発現にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1に記載のヌクレオチド配列。
【請求項２】
ソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターである請求項1記載のヌクレオチド配列。
【請求項３】
P.pastorisから単離および同定される請求項1記載のヌクレオチド配列。
【請求項４】
a)P.pastorisからゲノムDNAを単離し；
b)該単離したゲノムDNA内の配列番号1を含む領域を増幅し；および
c)該増幅した生成物を常套的ゲル溶出法にかけて該配列番号1を単離する処置を含む配列番号1の単離方法。
【請求項５】
配列番号1の増幅が配列番号2に記載のフォワードプライマーおよび配列番号3に記載のリバースプライマーにより行われる請求項4記載の方法。
【請求項６】
a)配列番号1の下流の発現構築物中に該遺伝子をクローニングし、
b)宿主を該発現構築物で形質転換し、および
c)ヘテロローガスなタンパク質を誘導するための非特異的インデューサーを含む培地中で該配列番号1の調節下で該遺伝子を発現させる処置を含む、非特異的インデューサーを含む培地中で配列番号1の調節下で遺伝子を発現させる方法。
【請求項７】
該宿主がメチロトロフィック酵母、好ましくはP.pastorisである請求項６記載の方法。
【請求項８】
該ヘテロローガスなタンパク質がヒトアルブミンおよびエリスリナトリプシンインヒビターを含む群から選ばれる請求項６記載の方法。
【請求項９】
該発現が非特異的インデューサーにより行われる請求項6記載の方法。
【請求項１０】
該非特異的インデューサーが、ソルビトール、グルコース、グリセロール、フルクトース、マンニトール、乳酸、ショ糖、デンプン、メタノール、またはそのあらゆる組み合わせを含む群から選ばれる請求項6記載の方法。
【請求項１１】
請求項1記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１２】
請求項11記載のベクターを含む形質転換宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、P.pastorisからのソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターの単離および同定、および該単離されたプロモーターの影響下のP.pastorisにおけるヘテロローガスなタンパク質の発現、具体的には、ヒトアルブミン(HA)およびエリスリナトリプシンインヒビター(ETI)の発現に関する。
【背景技術】
【０００２】
Pichia pastorisは、治療的組換えタンパク質を製造するための非常に広く用いられる確立された工業用宿主である。治療的組換えタンパク質の製造には、N末端(Prabha et.al. 2009)またはC末端の切り取り、目的とする糖型の誘導(Wouter Vervecken et.al. 2004)などの種々の問題がある。増大する市場の要求および増大する生物学的類似性に関する規制問題にかなうタンパク質の生産性および品質の向上が必要である。これは、分子シャペロンの同時発現(Wei Zhang et.al. 2006)、目的とする最終産物を得るためのプロテアーゼの同時発現により達成することができる。これらすべての場合で、組換えタンパク質の品質と量を改善する遺伝子操作を行うためのさらなるプロモーターが必要である。
【０００３】
米国特許No.6033898は、ヘテロローガスなポリペプチドの産生を増加させるのに利用するSaccharomyces cerevisiae ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子から単離したDNA断片を開示している。米国No.5,139,936は、外来遺伝子および酵母ガラクトシダーゼ(GAL1)調節領域およびプロモーターを外来遺伝子の発現を増加させる位置に含むクローニングベクターを開示している。米国No.5,089,398は、酵母における外来ポリペプチドの発現を調節するためのグリセルアルデヒド-3-ホスフェートデヒドロゲナーゼ由来のプロモーター領域の使用を開示している。
【０００４】
種々の構成的または誘導性プロモーターがPichia発現系に利用可能であるが、ほとんどの研究および応用でAOX1が用いられている。AOX1プロモーターは強力な誘導性プロモーターであり、炭素源により厳格に調節されており、Pichia pastorisをメタノール以外の他のほとんどの炭素源の存在下で増殖させると発現が著しく抑制される。メタノールは、AOX1プロモーターのインデューサーであり、メタノールは、引火性と毒性が高いため危険物質であり、メタノールで増殖する細胞は酸素消費量が非常に高く、通常、培養に純酸素を加える必要があるため、該方法のコストを増加させ、大規模での培養可能性が制限される(Monika Bollok et.al.、Recent Patents on biotechnology、3(2009) 192-201)。また、メタノールで増殖したP.pastorisからの宿主細胞タンパク質(HCP)の放出は著しいが（主に細胞溶解中に誘導される）、グルコースを炭素源として増殖するとその程度ははるかに低い。その結果、細胞はより高い生存性と分泌タンパク質のより高い純度を維持する。
【０００５】
さらに、S.cerevisiaeで同定されたソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターは750bpsである。塩基対サイズが大きいため、ベクターサイズが大きくなり、遺伝子操作を行うのがそう簡単ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、上記問題を克服することを目的とする。また、タンパク質発現にいかなる特異的な誘導も必要としないPichia pastorisにおいてヘテロローガスな組換えタンパク質を発現させるためのさらなるプロモーターを同定する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（開示の要約）
したがって、本開示は、配列番号1に記載のヌクレオチド配列；a)P.pastorisからゲノムDNAを単離し、b)該単離されたゲノムDNA内の配列番号1を含む領域を増幅し、およびc)増幅した生成物を常套的ゲル溶出法にかけて該配列番号1を単離する処置を含む配列番号1の単離方法；a)配列番号1の下流の発現構築物中の遺伝子をクローニングし、b)宿主を該発現構築物で形質転換し、およびc)ヘテロローガスなタンパク質を製造するための非特異的インデューサーを含む培地中、該配列番号1の調節下で該遺伝子を発現させる処置を含む、非特異的インデューサーを含む培地中、配列番号1の調節下で遺伝子を発現させる方法；上記ヌクレオチド配列を含むベクター；上記ベクターを含む形質転換宿主細胞に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】SDPHA/pMBL208の制限分析を示す。すべての消化は予期したパターンを生じる。
【図２】SDPHA/pMBL208のベクターマップを示す。
【図３】G418抗生物質を用いて組換えタンパク質の高産生株を選択するためのクローンのスクリーニングを示す。矢印で示すコロニーはより高抵抗性のクローンを示す。
【図４】P.pastorisゲノム中に統合された遺伝子のPCRによる確認を示す。選択したすべてのクローンは、目的とする遺伝子を有することがわかる。
【図５】ソルビトールを唯一の炭素源として用いて増殖させた時のHAの発現分析を示す。
【図６】メタノールを唯一の炭素源として用いて増殖させた時のHAの発現分析を示す。
【図７】グルコースを唯一の炭素源として用いて増殖させた時のHAの発現分析を示す。
【図８】いかなる誘導もない（細胞を拡大培地中で増殖させる）無細胞上清の発現分析を示す。
【図９】ETI発現構築物の図。A) ETIをソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターの調節下でXhoIおよびE.coRI制限部位にクローンする。B)上流プロモーターのないETI。
【図１０】ソルビトールを唯一の炭素源として用いて増殖させた時のETIの発現分析を示す。
【図１１】種々の炭素源下のETI産生性の測定
【０００９】
（開示の詳細な説明）
本開示は、配列番号1に記載のヌクレオチド配列に関する。本開示のある態様において、該ヌクレオチド配列はソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターである。本開示の別の態様において、該ヌクレオチド配列は、P.pastorisから単離および同定される。
【００１０】
本開示は、a)P.pastorisからゲノムDNAを単離し、b)該単離されたゲノムDNA内の配列番号1を含む領域を増幅し、およびc)該増幅した生成物を常套的ゲル溶出法にかけて該配列番号1を単離する処置を含む配列番号1の単離方法に関する。
【００１１】
本開示のある態様において、配列番号1の増幅は配列番号2に記載のフォワードプライマーおよび配列番号3に記載のリバースプライマーにより行われる。
【００１２】
本開示は、a)配列番号1の下流の発現構築物中に該遺伝子をクローニングし、b)宿主を該発現構築物で形質転換し、およびc)ヘテロローガスなタンパク質を誘導するための非特異的インデューサーを含む培地中で該配列番号1の調節下で該遺伝子を発現させる処置を含む、非特異的インデューサーを含む培地中で配列番号1の調節下で遺伝子を発現させる方法に関する。
【００１３】
本開示のある態様において、該宿主はメチロトロフィック酵母、好ましくはP.pastorisである。
【００１４】
本開示の別の態様において、該ヘテロローガスなタンパク質はヒトアルブミンおよびエリスリナトリプシンインヒビターを含む群から選ばれる。
【００１５】
本開示のさらに別の態様において、該発現は非特異的インデューサーにより行われる。
【００１６】
本開示のさらに別の態様において、該非特異的インデューサーは、ソルビトール、グルコース、グリセロール、フルクトース、マンニトール、乳酸、ショ糖、デンプン、メタノール、またはそのあらゆる組み合わせを含む群から選ばれる。
【００１７】
本開示は、上記クレオチド配列を含むベクターに関する。
【００１８】
本開示は、上記ベクターを含む形質転換宿主細胞に関する。
【００１９】
本開示は、発現のいかなる特異的な誘導も必要とせずにP.pastorisにおいてヘテロローガスな組換えタンパク質を発現させるための潜在的ツールとしてのソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターの同定に関する。
【００２０】
本開示のある態様において、210bpsプロモーターはP.pastorisの染色体1に位置する。
【００２１】
本開示の別の態様において、ソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターはP.pastorisにおいて最も小さいプロモーターである。
【００２２】
本開示のある態様において、ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の上流の利用可能なプロモーター領域は、該領域内にCAATおよびGCボックスを有することが同定されている。
【００２３】
本開示の別の態様において、該プロモーターは、ヒトアルブミン(HA)およびエリスリナトリプシンインヒビター(ETI)などの組換えタンパク質を発現させるために有効に用いられる。
【００２４】
本開示の別の態様において、ヒトアルブミンおよびエリスリナトリプシンインヒビターなどのヘテロローガスなタンパク質は、ソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターの調節下で発現する。
【００２５】
本開示の別の態様において、該ソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターは、あらゆるタイプの炭素源下でヘテロローガスなタンパク質を発現させることができる。
【００２６】
本開示の別の態様において、該ソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターは、ソルビトール、グルコース、グリセロール、フルクトース、マンニトール、乳酸、ショ糖、デンプン、およびメタノールを炭素源として利用するヘテロローガスなタンパク質の発現を可能にする。
【００２７】
本開示の別の態様において、P.pastoris由来のソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子は、以下の工程により同定される：a)ソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子オルソログを多ヒットをもたらすNCBIブラストにかけ、b)Pichia pastorisの染色体1に位置するソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子を同定し、c)同定したソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子の上流の配列を分析する。
【００２８】
本開示の別の態様において、本発明のキメラプロモーターの影響下で目的とするタンパク質を得るための標的遺伝子の発現は用いる炭素源により制限されない。言い換えれば、本発明のキメラプロモーターを用いることにより、目的とするタンパク質を、限定されるものではないが、ソルビトール、グルコース、グリセロール、フルクトース、マンニトール、乳酸、ショ糖などのあらゆる炭素源を用いて発現させることができる。しかしながら、当業者は、特定種のタンパク質をより高発現させるための最も強力なインデューサーを認識し、残りのインデューサーより高発現させる高い能力または可能性を有するあらゆるインデューサーを用いることができるだろう。
【００２９】
本開示の別の態様において、用語、非特異的インデューサーおよび炭素源は、本明細書において互換性に用いる。
【００３０】
本開示の別の態様において、組換え発現系は、原核性宿主および真核性宿主から選ばれる。真核性宿主には、酵母細胞(例えば、Saccharomyces cerevisiaeまたはPichia pastoris)、哺乳動物細胞、または植物細胞が含まれる。細菌細胞および真核細胞は、当業者に商業的供給源を含む多くの種々の供給源から利用可能である（例えばAmerican Type Culture Collection (ATCC； Rockville、Md.)）。組換えタンパク質発現に用いる細胞の商業的供給源は、細胞の使用説明書も提供する。発現系の選択は、発現するポリペプチドにとって望ましい特徴に依存する。
【００３１】
本開示の別の態様において、最も好ましい宿主細胞はメチロトロフィック酵母である。本開示を用いて修飾することができるメチロトロフィック酵母の菌株には、限定されるものではないが、メタノールで増殖することができる酵母株、例えばPichia、Candida、Hansenula、またはTorulopsis属の酵母が含まれる。好ましいメチロトロフィック酵母はPichia属である。本方法を用いて修飾することができるメチロトロフィック酵母株には、目的とする1またはそれ以上のヘテロローガスなタンパク質を発現するように操作されたメチロトロフィック酵母株も含まれる。
【００３２】
本開示の別の態様において、用語「プロモーター」は、当該分野の通常の意味（例えばRNAポリメラーゼ結合部位）に用いられる。用語「ベクター」には、発現ベクター、複製可能なベクター、形質転換ベクター、およびシャトルベクター（それらのベクターの組み合わせを含む）が含まれる。
【００３３】
本開示の別の態様において、用語「発現ベクター」はin vivoまたはin vitroで発現することができる構築物を意味する。
【００３４】
本開示の別の態様において、該発現ベクターは該生物のゲノムに選択的に組み込まれる。用語「組み込まれる」は、好ましくはゲノム内に安定に組み込まれることを含む。
【００３５】
本開示の別の態様において、「ポリペプチドを発現させる」は、ポリペプチドをコードするDNA配列の発現を意味する。「ポリペプチド」は、ペプチド結合により共有結合している「α」アミノ酸のポリマーである。ポリペプチドには、低分子量ポリマーとタンパク質としてより好ましい高分子量ポリマーが含まれる。さらに、ポリペプチドは、ホスホポリペプチド、グリコポリペプチド、またはメタロポリペプチドでありうる。さらに、1またはそれ以上のポリマー鎖を結合してポリペプチドを形成することができる。本明細書で用いている「ヘテロローガスなポリペプチド」は、特定ポリペプチドを発現させるのに用いる糸状菌により通常発現せず、分泌されないポリペプチドである。ヘテロローガスなポリペプチドには、原核性供給源由来のポリペプチド（例えば、Bacillus種由来の[α]-アミラーゼ、Bacillus種由来のアルカリホスファターゼ、およびPseudomonas由来の種々の加水分解酵素など)、真核性供給源由来のポリペプチド(例えば、ウシチモシン、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子、ヒト成長ホルモン、ヒトインターフェロン、ウロキナーゼ、ヒト血清アルブミン、第VIII因子など)、および発現宿主以外の真菌供給源由来のポリペプチド(例えば、A.niger由来のグルコアミラーゼ)が含まれ、また、ヘテロローガスなポリペプチドには、真菌発現宿主に対してそれぞれホモローガスまたはヘテロローガスである少なくとも2の異なるポリペプチド由来の部分または完全ポリペプチド配列の組み合わせを含むハイブリッドポリペプチドも含まれる。そのようなハイブリッドポリペプチドの例には以下のものが含まれる：1) A.nigerグルコアミラーゼシグナルおよびプロ配列を単独または種々の量のアミノ末端成熟グルコアミラーゼコドンと共にコードするDNA配列と融合したプロチモシンをコードするDNA配列、および2)機能的シグナル配列を単独、または種々の量の、機能的シグナルと結合したアミノ末端プロペプチドコドンまたは成熟コドンと共にコードするDNA配列と融合した真菌グルコアミラーゼまたはあらゆる真菌カルボキシプロテアーゼ、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子またはヒト成長ホルモンをコードするDNA配列。
【００３６】
本発明をさらに下記実施例により説明する。下記実施例は単に例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００３７】
Pichia pastoris ソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーター(SDP)の単離およびクローニング
P.pastorisの第1染色体に位置するソルビトールデヒドロゲナーゼ遺伝子のコーディング配列を同定する。同定した遺伝子のコーディング配列の5’領域の上流領域を試験する。試験した遺伝子を210bpを含むソルビトールデヒドロゲナーゼのプロモーター領域として同定する。P.pastorisのゲノムDNAを常套的遺伝子単離技術を用いて単離する。該単離された遺伝子をポリメラーゼ連鎖反応にかけて試験した210bp領域を増幅する。
【００３８】
試験した遺伝子を増幅するのに用いるプライマーは、
SORFP= 5’ AGA TAT CAA GTT GTA TAT TAT TAA TGG CGG GGC A 3’ (5’末端にEcoRV)
SORRP = 5’ TCA TAT GTT GGA TAA TAG TGA GTG TAA TGA 3’ (5’末端にNdeI)
である。
【００３９】
下記クロマトグラムは、P.pastorisから単離したソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターについて得られたシーケンシングの結果を示す。領域37〜246bp由来のプロモーター領域を角括弧内に強調する。
【００４０】
【化１】
2015531238.tif 000002
【００４１】
アンプリコンを適切なマーカーに対するアガロースゲル電気泳動にかける。ゲル上の増幅した210bp領域をQiagenスピンカラムを用いて溶出する。ゲル精製産物にポリメラーゼ連鎖反応下でAテール化する。Aテール化PCR生成物を16℃で一夜、TAベクター(pTZ57R)と結合させる。結合生成物を熱ショック法でE coli DH5αに形質転換し、次いでLBA100に接種し、プレートを37℃で一夜インキュベーションする。
【実施例２】
【００４２】
SDPHA/pMBL208のクローニングおよび制限分析
AOX1プロモーターおよびヒトアルブミン遺伝子(HA)を有するプラスミドpMBL208を選ぶ。AOX1プロモーターを、rHA/pMBL HisプラスミドからEcoRVおよびNdeI制限酵素消化により除去する。同じ制限酵素を用いて、pTZ57Rからソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーター (SDP)を放出させる。放出SDPをAOX1除去ベクターと結合させる(図2)。結合生成物をE coli DH5αに形質転換し、次いでLBA100に接種し、プレートを37℃で一夜インキュベーションし、次いで形質転換コロニーをコロニーPCRによりスクリーニングし、正しいプラスミドを得る。陽性クローンを単離し、Luriaブロス(LB)に接種し、37℃で一夜増殖させ、次いでプラスミドをQiagen mini prepスピンカラムを用いて一夜増殖培養から単離する。単離したプラスミドを、以下の消化酵素、EcoRVおよびNdeI、EcoRVおよびEcoRI、EcoRIおよびNdeIおよびEcoRVを用いる制限消化により確認する（図１）。
【実施例３】
【００４３】
P.pastorisのSDPHA/pMBL208による形質転換
プラスミドSDPHA/pMBL208をEcoRVで線状化し、P.pastorisに形質転換する。形質転換細胞を、選択用のいかなるアミノ酸も含まない酵母窒素基礎(YNB)寒天プレートに塗布する。プレートをコロニーが出現するまで30℃で2日間インキュベーションする。
【実施例４】
【００４４】
より高いジェネティシン(G418)耐性のコロニーのスクリーニング
YNB寒天プレートにコロニーの増殖が観察されたら、コロニーを拾い、96ウェルプレート中の酵母エキスペプトンデキストロース(YPD)に接種し、30℃で一夜インキュベーションする。96ウェルプレートから得た培養を、0.5mg/mlのG418を含むYPD寒天プレート上にスタンプし、プレートを30℃で2日間インキュベーションする。2日後に、図3に示すようにより高いG418耐性を示すコロニーを選び、YPD寒天プレートに線状に塗布する。矢印で示すコロニーがより高耐性のクローンを示す。
【００４５】
G418に対する耐性に基づいて選んだクローンは、3G11、4F11、5F5、6F10、4B1、4F10、5A1、7A10である。これらの選んだクローンから、ゲノムDNAをフェノールクロロホルム法により単離する。ベクターSDPHA/pMBL208組換えをプライマーSORFPおよびHSAintRPを用いるPCRにより確認する。これは約750bpsの増幅をもたらす(図4)。図4は、クローン3G11、4F11、5F5、6F10、4B1、4F10、5A1、7A10のP.pastorisゲノム中に統合された遺伝子をPCR確認するゲルを示し、すべてのクローンで宿主ゲノム中に遺伝子が適切に統合されたことが示された。
【実施例５】
【００４６】
SDPHA/P.pastorisの発現試験
振盪フラスコ誘導試験を、選んだ4クローン(5F5、6F10、5A1、および7A10)について行い、ソルビトールプロモーターがヒトアルブミン(HA)を産生することができるか否かを検討する。細胞塊を成長させ、グルコース、メタノール、およびソルビトールの3炭素源で誘導を行う。振盪フラスコ誘導試料をSDS PAGEを用いて分析する（図5、6、7、および8に示す）。図5は、細胞をソルビトールを炭素源として含む培地に増殖させた時のヒトアルブミンの発現を示す：レーン1はタンパク質分子マーカーを示し、レーン2はソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターを有するPichia pastorisを示し、レーン3、4、5、および6は、それぞれクローン5F5、6F10、5A1、および7A10のHAを示す。同様に図6および7は、細胞をそれぞれメタノールおよびグルコースを含む培地で増殖させた時のPichia pastorisにおけるHAタンパク質の発現を示す。図8は、いかなる誘導もなしに拡大培地中で増殖させたクローン5F5、6F10、5A1、および7A10の無細胞上清の発現分析を示す。
【００４７】
結果および結論
a)HA発現レベルは良好であり、すべての3炭素源；ソルビトール、メタノール、およびグルコースと同様であることがわかる。すべての場合で得られたSDS PAGEバンド強度は、2μgsと同等またはそれ以上であり、そのようなバンド強度は良好な発現と考えられる。
b)発現は細胞塊蓄積中に観察される。
c)発現レベルは用量依存性に増加し、G418耐性がより高いと増加し、クローン5F5が最も高く、選んだクローン中で7A10が最も低い。
【実施例６】
【００４８】
エリスリナトリプシンインヒビターの発現
より多くのヘテロローガスなタンパク質発現についてソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターの構造安定性をみいだすために、エリスリナトリプシンインヒビター(ETI)を選ぶ。ETIは〜20KDaの小タンパク質であり、レタプラーゼのアフィニティ精製に有用である。ベクターSDPHA/pMBL208をXhoIおよびEcoRIで消化し、ベクターからHA遺伝子を除去する。合成ETI遺伝子をHA遺伝子の代わりにpMBL208中にサブクローニングする。結合した生成物をE coli DH5αに形質転換し、LBA100に接種し、プレートを37℃で一夜インキュベーションし、次いで形質転換コロニーについて正しいプラスミドをコロニーPCRでスクリーニングする。陽性クローンを単離し、Luriaブロス(LB)に接種し、37℃で一夜増殖させてプラスミドを単離する。該プラスミドをQiagen mini prepスピンカラムを用いて一夜増殖培養から単離する。単離したプラスミドを下記制限酵素EcoRV/NdeI、EcoRV/ EcoRI、EcoRI/NdeI、およびEcoRVで制限消化することにより確認する。ETI遺伝子を、ソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターを含むか含まないpMBL208にクローンする(図9Aおよび9B)。そうすることで、ETIの産生は、210bps ソルビトールプロモーターによるものであり、いかなる上流プロモーター活性によるものではないことを証明する。
【実施例７】
【００４９】
振盪フラスコ発現試験
プラスミドSDPETI/pMBL208をEcoRVで線状化し、P.pastorisに形質転換する。形質転換細胞を、選択用のいかなるアミノ酸も含まない酵母窒素基礎(YNB)寒天プレート上に塗布する。プレートをコロニーが出現するまで30℃で2日間インキュベーションする。YNB寒天プレートにコロニーの増殖がみられたら、コロニーを拾い、96ウェルプレート中の酵母エキスペプトンデキストロース(YPD)に接種し、30℃で一夜インキュベーションする。96ウェルプレートの培養を0.5mg/mlのG418を含むYPD寒天プレート上にスタンプし、30℃で2日間インキュベーションする。2日後、G418により高い耐性を示すコロニーを選択し、YPD寒天プレート上に線状に塗布する。
【００５０】
高G418耐性に基づいて選んだコロニーはクローン1、2、3、および4であり、これらコロニーを培地を含む振盪フラスコに接種し、振盪フラスコにおけるETIの発現を12％SDS PAGE (ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動)で分析する。種々の炭素源下の発現ETIの産生を図10および11に示す。矢印はゲル上の発現ETIを示す。
【００５１】
結果および結論
ソルビトール、グルコース、グリセロール、フルクトース、マンニトール、ショ糖、乳酸、デンプン、およびメタノールなどの炭素源のいずれかで増殖させると、ソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターは20kDa ETIを産生することができる。ETIの上流にソルビトールプロモーターがないと発現はみられない。発現タンパク質の産生は、グリセロールを炭素源に用いるとより高いことがわかる。乳酸も、単糖、二糖、および多糖などの他の糖類を炭素源に用いたときに比べてETIを産生することができる。
ソルビトールデヒドロゲナーゼプロモーターの影響下で産生されたヘテロローガスなタンパク質の比較発現状態を下記表1に示す。
【００５２】
【表１】
2015531238.tif 000003
【図１】
2015531238.tif 000004
【図２】
2015531238.tif 000005
【図３】
2015531238.tif 000006
【図４】
2015531238.tif 000007
【図５】
2015531238.tif 000008
【図６】
2015531238.tif 000009
【図７】
2015531238.tif 000010
【図８】
2015531238.tif 000011
【図９】
2015531238.tif 000012
【図１０】
2015531238.tif 000013
【図１１】
2015531238.tif 000014
【配列表】
2015531238000001.app
【国際調査報告】
2015531238.tif 000015
2015531238.tif 000016
2015531238.tif 000017