(57)【要約】  無充填カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルを提供し；活性化剤でカラムまたはチャネルの内壁を活性化し；モノマーの混合物、少なくとも１種のポロゲンおよび少なくとも１種の重合開始剤を含む重合溶液でカラムを満たし；そして混合物を重合化させて、カラムまたはチャネルに剛性かつ多孔性のモノリシックポリマープラグを形成させる工程を含む、分離カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルを製造する方法。本方法はモノマーが主モノマーとしてのジビニルベンゼンおよびアクリル酸イソデシルの混合物を含み、少なくとも１種のポロゲンがイソブタノールを含むことを特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
無充填カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルを提供し；活性化剤でカラムまたはチャネルの内壁を活性化し；モノマーの混合物、少なくとも１種のポロゲンおよび少なくとも１種の重合開始剤を含む重合溶液でカラムを満たし；そして混合物を重合化させて、カラムまたはチャネルに剛性かつ多孔性のモノリシックポリマープラグを形成させる工程を含む分離カラムまたは微細加工デバイスにおける分離チャネルを製造する方法であって、
該モノマーが主モノマーとしてのジビニルベンゼンおよびアクリル酸イソデシルの混合物を含み、少なくとも１種のポロゲンがイソブタノールを含むことを特徴とする、方法。
【請求項２】
少なくとも無充填カラムの内壁がガラス、セラミック、金属および有機ポリマーから選択される材料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
無充填カラムがキャピラリー石英ガラスカラムである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
カラムまたはチャネルの内壁の表面の活性化がモノリシックポリマーと結合できる活性化剤の結合により、好ましくはシラン処理剤でのシラン処理を含む、請求項１、２または３に記載の方法。
【請求項５】
表面の活性化前に表面をエッチング剤でエッチングする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルが約０.０５mm以下の内径を有する、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
アクリル酸イソデシル対ジビニルベンゼンの比が約１：６〜約１：１００(ｖ／ｖ)、好ましくは約１：１０〜約１：３０(ｖ／ｖ)の範囲である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１種のポロゲンがイソブタノールおよびイソブタノールとオクタノールの混合物から選択される、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
重合溶液中の総モノマー濃度が約２０〜約５０％(ｖ／ｖ)の範囲である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
重合溶液中のアクリル酸イソデシルの濃度が約０.１〜約１５％(ｖ／ｖ)、好ましくは約１〜約５％(ｖ／ｖ)の範囲である、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
ポロゲンがさらにクロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエンおよびキシレンから選択される少なくとも１種のミクロポロゲンを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
シラン処理を約４０〜７０℃の温度で約２〜約３０分行う、請求項４〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
シラン処理剤が１〜２０％(ｖ／ｖ)γ−(トリメトキシ−シリル)プロピルメタクリレート(γＭＡＰＳ)を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
無充填カラムの内壁またはチャネルがガラス、好ましくは石英ガラスを含み、エッチング剤がアルカリ溶液、好ましくは０.５〜２Ｍ濃度の水酸化ナトリウム水溶液であり、エッチングを約４０〜約７０℃の温度で行う、請求項５〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
重合を約６０〜約８０℃および約１〜約１０barの陽圧で行う、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
重合を約２０〜約３００分、好ましくは約２０〜約１８０分行う、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１種の重合開始剤が熱的またはＵＶ開始剤であり、好ましくは２,２’−アゾビスイソブチロニトリル(ＡＩＢＮ)および過酸化ラウロイル(ＬＰＯ)から選択される、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれかの方法により得られる、分離カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネル。
【請求項１９】
カラムまたは微細加工デバイスにおける少なくとも１個のチャネルが請求項１〜１７のいずれかの方法によりモノリシックポリマーで充填されている、分離カラムまたは１個以上のチャネルを含む微細加工デバイス。
【請求項２０】
ナノスケール分離のための請求項１８または１９に記載の分離カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルの使用。
【請求項２１】
分取分離のための、請求項１８または１９に記載の分離カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルの使用。
【請求項２２】
分析分離のための、請求項１８または１９に記載の分離カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルの使用。
【請求項２３】
請求項１８または１９に記載の分離カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルを提供し、
検出器にカラムまたはチャネルを連結させ；そして
化学分析方法を行う
工程を含む、化学分析方法を実施するための方法。
【請求項２４】
２０〜４０％(ｖ／ｖ)、好ましくは２５〜３５％(ｖ／ｖ)ジビニルベンゼン、
１〜１５％(ｖ／ｖ)、好ましくは１〜５％(ｖ／ｖ)アクリル酸イソデシル、
２０〜４０％(ｖ／ｖ)、好ましくは２５〜３５％(ｖ／ｖ)イソブタノール、
２０〜４０％(ｖ／ｖ)、好ましくは２５〜３５％(ｖ／ｖ)オクタノール、
１〜１０％(ｖ／ｖ)クロロホルムまたはキシレンまたはトルエンまたはクロロホルムおよび／またはキシレンおよび／またはトルエンの混合物
を含む、重合組成物。
【請求項２５】
さらに０.１５〜１.５％(ｗ／ｗ)２,２'−アゾビスイソブチロニトリル(ＡＩＢＮ)または０.３〜４％(ｗ／ｗ)過酸化ラウロイル(ＬＰＯ)を含む、請求項２４に記載の重合組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、特にペプチドおよび他の分子のナノスケール分離のための、液体クロマトグラフィー用カラム、より具体的にポリマーモノリシックカラムに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
プロテオミクスはタンパク質の大規模分析として定義でき、臨床研究における将来的なバイオマーカー発見に有望である。ボトムアップのプロテオミクスにおいては、分析するプロテオームのタンパク質が同定され、そのアミノ酸配列および翻訳後修飾が、タンパク質分解酵素消化により得られたペプチドの質量分析(ＭＳ)により特徴付けられる。タンパク質の数が多いならば、多くのタンパク質がトリプシンのような特定の酵素で切断したとき、１０を超えるペプチドを生じるため、対応するペプチドはさらに多くなる。それゆえに、プロテオミクス実験が成功するために、分離および検出の強力なツールを適用しなければならない。エレクトロスプレー質量分析と組み合わせた液体クロマトグラフィー(ＬＣ−ＭＳ)またはタンデム質量分析(ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ)は、このような圧倒的量のペプチドの分離および選択的検出の解決法を提供する。分子イオンは、濃度感受性プロセスであると考えられるエレクトロスプレーイオン化(ＥＳＩ)により大気圧で産生される。
【０００３】
感受性は、小さい内径(ＩＤ)のクロマトグラフィーカラムを使用することにより、ペプチドが低体積で溶出し、それゆえに高濃度で存在するために、改善できる。理論上、この濃度の相対的上昇は対応するシグナル増加を提供する。こうして、より鋭敏な分析が、極小ＩＤのカラムで可能となる。それゆえに、例えば、理論上、ペプチドの液体クロマトグラフィー分離におけるカラムＩＤの４.６mmから０.０２mmへの小型化は、分離ペプチドの濃度の約５２,９００倍の相対的増加(そしてそれにより対応する感受性向上がエレクトロスプレー質量分析で得られる)を与える。このタイプの小型化は今日行われているプロテオミクスで極めて一般的であり、通常０.０７５mmのＩＤのカラムを用い、移動相流は１分あたり数百ナノリットルに減少する。
【０００４】
他の研究者が示しているとおり、極めて鋭敏なＬＣ−ＭＳ分析を達成するために、液体クロマトグラフィーをさらに小型化することさえ可能である。しかしながら、極めて細い毛細管に粒子を充填することが困難であるため、市販の充填カラムは、現在のところ技術的に０.０７５mmのＩＤが限界である。理論上、モノリシックカラムの製造に付随するこの種の限界および困難はない。
【０００５】
モノリシックカラムにおいて、分離媒体は、粒子間間隙を含まない１個の大きな“粒子”に例えることができる形質であり、換言すると連続的媒体である。その結果、移動相の全てが固定相を通って流れる。この対流は物質移動の割合を大きく加速する。クロマトグラフプロセス中の粒子固定相孔内の物質移動の一般的駆動力である拡散とは対照的に、孔を通る対流は、分離速度の実質的増加を可能にする。
【０００６】
充填カラムを超える利点を提供するため、連続的分離媒体の開発は近年相当な注目を集めている。基本的に、２タイプのモノリシック材が使用されており、その一つは修飾シリカゲルに基づき、他は有機ポリマーに基づく。しかしながら、連続的シリカゲル媒体は重合過程で縮むため、小内径の実用上有用なシリカゲルベースのモノリシックカラムの製造は困難となり、かかる困難は、内径が０.１mmほどの溶融石英キャピラリー内での適切な有機モノマーのインサイチュ重合によるモノリシックカラムの製造時には観察されない。
【０００７】
重合混合物は広範なモノマーを使用して製造でき、保持および分離特異性変動に対応するマトリクス化学および界面化学上ほぼ無限の選択を可能にする。アクリルアミド、ポリスチレンおよびメタクリレートモノリシックカラムはしばしば使用される例と言える。ポロゲン(porogen)またはポロジェニック(porogenic)溶媒を、得られたモノリスの多孔性を制御するために通常添加する。
【０００８】
細いＩＤのキャピラリーカラムを含む多数のポリマーモノリシックカラムおよびその製造法が先行文献に記載されている。
【０００９】
ＷＯ２００７／１４９４９８Ａ２は、ポリマーマトリクスの強度を増強する機能性モノマーと架橋モノマーのインサイチュ共重合により製造した、分離キャピラリーカラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルを開示する。スチレンおよびジビニルベンゼンのようなスチレンベースのモノマーまたはブチルまたステアリルメタクリレートおよびエチレングリコールジメタクリレートのようなメタクリル酸／アクリル酸ベースのモノマーが好ましい。エタノール、メタノール、プロパノールまたはアセトニトリルのような極性ポロジェニック溶媒(またはポロゲン)を反応に使用する。カラムは、極めて細いＩＤ、例えば、５〜１５μmで強固な形式で製造でき、超微量ＬＣ／ＭＳプロテオーム分析での使用に適するものとなる。
【００１０】
ＷＯ２００４／０６４９７４Ａ２は、キャピラリーカラムまたは微細加工デバイス(マイクロチップ)におけるチャネルにおいて使用するための超ナノスケールＬＣモノリシック分離媒体の製造法および該方法で製造したキャピラリーを開示する。モノリス重合プロセス中のキャピラリー両端への適度な陽圧の適用が、増強された物質移動特性および低背圧ならびに優れたカラム間保持時間再現性を有する、極めて小さいＩＤ、例えば、２５μm以下を有する、モノリシックキャピラリーカラムの製造を可能にする。好ましい態様において、スチレンをモノマーとして選択し、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)およびｎ−オクタノールを不活性ポロゲンとして選択し、ジビニルベンゼン(ＤＶＢ)は架橋剤であった。アゾビスイソブチロニトリル(ＡＩＢＮ)は、ラジカル開始剤として働いた。他の適切な架橋可能モノマーはメタクリレートを含む。
【００１１】
ＵＳ７,４７３,３６７Ｂ２は、ポロゲン含有重合混合物をチャンバーに添加し、チャンバー内の重合混合物を重合させてクロマトグラフィーカラムの形のモノリシッククロマトグラフィーポリマープラグをチャンバー内で形成させ、少なくとも重合化の部分は、重合モノリシックポリマープラグにおける壁チャネル開口を阻止するのに十分な圧を重合混合物に適用し、同時に重合混合物を制御された高温で加熱することにより実施する方法を開示する。逆相媒体の例は、ポリ(スチレン−コ−ジビニルベンゼン)、ポリ(ステアリルメタクリレート−コ−ジビニルベンゼン)またはポリ(ブチルメタクリレート−コ−エチレングリコールジメタクリレート)に基づく。
【００１２】
類似のモノリシックカラムおよびその製造法がＷＯ２００６／０１７６２０Ａ２、ＵＳ２０１０／００３８２９８Ａ１、ＷＯ００／１５７７８Ａ１、ＥＰ２３３５８２０Ａ１、ＵＳ２０１１／００８６４０９Ａ１およびＷＯ００／４６２８１Ａ２に開示されている。
【００１３】
なお、極めて限られた数のモノリシック製品が市販されているに過ぎず、一般にこれらのＩＤは０.１mm以上である。細いＩＤモノリシックカラムの製造は、重合プロセスおよび毛細管のプレコーティングがキャピラリーＩＤに依存するように見えるため、困難である。それゆえに、バイアル中や０.１mmのＩＤの毛細管中でも十分に使えるように見える溶液が、０.０５mm以下のＩＤのキャピラリーで全く使えないことがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、０.０５mm以下のＩＤを有し、ペプチドおよび他の分子の鋭敏な分離に好都合に使用できる、改良されたモノリシックカラムの製造法を提供することである。他の目的および利点は、以下の記載から明らかである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の概要
上記目的は、好ましくは細い内径を有し(しかしそれに限らない)、内部に均一モノリシック構造を有し、生物学的および非生物学的化合物の鋭敏な分離に使用できる、カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルを製造する本発明の方法により達成される。
本発明によって、これは、重合方法全体の細心の最適化により達成された。
【００１６】
より具体的に、本発明は、好ましくは０.０５mmより小さくできるＩＤを有するモノリシックカラム(またはチャネル)の製造のために完成されたものであり、(ｉ)モノマーの特異的組み合わせ、すなわちジビニルベンゼン(ＤＶＢ)およびイソ−デシルアクリレート(ＩＤＡ)；および(ii)特異的マクロポロゲンまたはマクロポロゲン混合物、すなわちイソブタノールまたはイソブタノール／オクタノール混合物の選択的使用に基づく。
【００１７】
一つの面において、本発明は、それゆえに、無充填カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルを提供し；活性化剤でカラムまたはチャネルの内壁を活性化し；モノマーの混合物、少なくとも１種のポロゲンおよび少なくとも１種の重合開始剤を含む重合溶液でカラムを満たし；そして混合物を重合化させて、カラムまたはチャネルに剛性かつ多孔性のモノリシックポリマープラグを形成させる工程を含む、分離カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルを製造する方法に関する。本方法はモノマーが主モノマーとしてのジビニルベンゼンおよびアクリル酸イソデシルの混合物を含み、少なくとも１種のポロゲンがイソブタノールを含むことにより特徴付けられる。
【００１８】
通常、カラムまたはチャネル内に形成された剛性モノリシックポリマープラグは、残った未反応成分を除去するために洗浄する。
【００１９】
ここで使用する用語“分離”は広義に解釈すべきであり、分析および分取クロマトグラフ分離ならびに固相微量抽出(ＳＰＭＥ)を含む固相抽出(ＳＰＥ)を含む。通常のクロマトグラフ操作は、分析液体クロマトグラフィー(ＬＣ)、分取ＬＣ、ナノＬＣ、ＨＰＬＣを含む。
【００２０】
カラムまたはチャネルの材料は広範な種々の材料から選択され得る。通常のカラム材料はガラス(石英ガラスを含む)、ステンレス鋼のような金属、プラスチック(例えばポリエーテルエーテルケトン−ＰＥＥＫ)、ステンレス鋼またはプラスチックのガラス内張り(例えばホウケイ酸内張り)または石英ガラス内張り管を含む。
【００２１】
ラボオンチップ(ＬＯＣ)デバイスのような微細加工デバイスのための一般的材料は、ガラス、セラミック、金属および、例えば、ポリオレフィン、ポリイミド、ＰＤＭＳ(ポリジメチルシロキサン)のような有機ポリマーを含む。
【００２２】
好ましい(現時点で)本方法の態様において、カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルは、約０.０５mm以下の内径(ＩＤ)を有する。このようなキャピラリーカラムは好ましくは石英ガラス製である。
【００２３】
内壁表面にポリマーモノリスを固着または結合させるために、無充填カラムまたはチャネルの内壁表面を活性化または前機能化させるのに適切な材料および方法はカラムまたはチャネルの表面材料の材質により選択され、当業者がそれぞれの場合または状況で選択できる。一般に、活性化は、重合時にポリマーネットワークにさらに結合できる、表面に共有結合により結合した分子または基を含む。
【００２４】
例えば、ガラスおよび金属表面(例えばステンレス鋼)は、好ましくは、ポリマーモノリスに結合できるシラン処理剤を用いるシラン処理(silanization)により前機能化され得る。シラン処理剤の例は、γ−(トリメトキシ−シリル)プロピルメタクリレート(γＭＡＰＳ)、例えば１〜２０％(ｖ／ｖ)を含む。γＭＡＰＳは、ポリマーの固着を可能にする重合可能二重結合を含むシラン処理剤である。
【００２５】
表面の活性化の前に、好ましくは、エッチング剤でのエッチングを行い、続く活性化を容易化または改善する。ガラス表面(石英ガラスを含む)に関して、エッチングは、例えば、水酸化ナトリウム水溶液を用いて行い、表面を粗化し、それにより表面積を増やし、より多くの活性化部位を提供する。鋼表面は、例えば、塩化水素酸またはシュウ酸でエッチングして、表面上に金属酸化物を生成させ、その後表面をシラン処理するかまたは他に活性化する。通常、ステンレス鋼表面は、エッチング前に表面保護機械加工油を除去するために溶媒(例えばアセトン)で浄化しなければならない。
【００２６】
好ましくは、カラムまたはチャネル壁のエッチングおよびシラン処理、特にキャピラリー石英ガラスカラムまたはガラス内張りプラスチックまたは金属管の内部表面のようなガラス表面のシラン処理に“温和な”または“穏やかな”方法を使用する。
【００２７】
その後、エッチングをアルカリ溶液、好ましくは０.５〜２Ｍ濃度の水酸化ナトリウム水溶液で、約４０〜７０℃の温度で行い、シラン処理を好ましくは約４０〜７０℃の温度で約２〜約３０分、例えば約２〜約１５分行う。
【００２８】
重合溶液中のアクリル酸イソデシル対ジビニルベンゼン比(ｖ／ｖ)は、好ましくは約１：６〜約１：１００、より好ましくは約１：６〜約１：４０、特に約１：１０〜約１：３０、例えば約１：１０〜約１：２０の範囲である。
【００２９】
少なくとも１種のポロゲンは、好ましくはイソブタノールおよびイソブタノールとオクタノールの混合物から選択されるマクロポロゲンである。
好ましくは、ポロゲンは、クロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエンおよびキシレンから選択される少なくとも１種のミクロポロゲンを含む。
【００３０】
一つの態様において、ミクロポロゲンはクロロホルムおよびキシレンから選択される。
他の態様において、ミクロポロゲンはトルエンおよびテトラヒドロフランから選択される。
【００３１】
重合溶液中の総モノマー濃度が約２０〜約５０％(ｖ／ｖ)、例えば約３０〜約４０％(ｖ／ｖ)の範囲であるのが好ましい。
【００３２】
重合溶液中のアクリル酸イソデシルの濃度は、好ましくは約０.１〜約１５％(ｖ／ｖ)、より好ましくは約１〜約１５％(ｖ／ｖ)、特に約１〜約５％(ｖ／ｖ)の範囲である。
【００３３】
重合反応は、好適には約６０〜約８０℃および約１〜約１０barの陽圧で、好ましくは約２０〜約３００分、より好ましくは約２０〜約１８０分、例えば２０〜１２０分行う。
【００３４】
重合開始剤または開始剤類は、多様な開始剤類から選択し得るが、好適には熱的開始剤(熱開始剤)またはＵＶ開始剤であり、通常は２,２’−アゾビスイソブチロニトリル(ＡＩＢＮ)、過酸化ラウロイル(ＬＰＯ)および過酸化ベンゾイル(ＢＰＯ)から選択され、特にＡＩＢＮおよび／またはＬＰＯである。
【００３５】
他の面において、本発明は、本発明の方法により得られる分離(好ましくはキャピラリー)カラムまたは微細加工デバイスにおける分離チャネルに関する。
【００３６】
本発明のさらに別の面は、分離(好ましくはキャピラリー)カラムまたは１個以上のチャネルを含む微細加工デバイス(例えばＬＯＣ)に関し、ここで、カラムまたは微細加工デバイスにおける少なくとも１個のチャネルは、本発明の方法によりモノリシックポリマーが充填されている。
【００３７】
本発明のさらに他の面は、ナノスケール分離のための上記のような分離カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルの使用に関する。
【００３８】
本発明の他の面は、分取分離のための上記のような分離カラムまたはチャネルの使用に関する。
本発明のさらに別の面は、分析分離のための上記のような分離カラムまたはチャネルの使用に関する。
【００３９】
本発明のさらに他の面は、
上記面に従う分離カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルを提供し；
検出器にカラムまたはチャネルを連結させ；そして
化学分析方法を行う
工程を含む、化学分析方法を実施するための方法に関する。
【００４０】
他の面において、本発明は、
２０〜４０％(ｖ／ｖ)、好ましくは３０〜４０％(ｖ／ｖ)、より好ましくは２５〜３５％(ｖ／ｖ)ジビニルベンゼン、
１〜１５％(ｖ／ｖ)、好ましくは１〜５％(ｖ／ｖ)アクリル酸イソデシル、
２０〜４０％(ｖ／ｖ)、好ましくは２５〜３５％(ｖ／ｖ)イソブタノール、
２０〜４０％(ｖ／ｖ)、好ましくは２５〜３５％(ｖ／ｖ)オクタノール、
１〜１０％(ｖ／ｖ)クロロホルムまたはキシレンまたはトルエンまたはクロロホルムおよび／またはキシレンおよび／またはトルエンの混合物
を含む、重合組成物に関する。
【００４１】
好ましい態様において、上記のような重合組成物は、さらに０.１５〜１.５％(ｗ／ｗ)  ２,２’−アゾビスイソブチロニトリル(ＡＩＢＮ)または０.３〜４％(ｗ／ｗ)過酸化ラウロイル(ＬＰＯ)を含む。
【００４２】
本発明の分離カラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルを使用して分離し得る生物学的化合物の例は、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド、ホルモン、神経伝達物質、糖ペプチド、糖タンパク質、アミノ酸、炭水化物、脂質、多糖、脂肪酸およびリン脂質を含む。非生物学的有機化合物の例は、有機医薬品、薬物、着色剤、毒物、汚染物質、食品添加物およびこれらの代謝物を含む。
【００４３】
次に、本発明をさらに詳細に記載する。添付する図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】本発明に従うポリマーモノリスの製造におけるキャピラリーカラムを液体で充填するための社内製造実験用装置の模式図である。
【図２】サンプル注入時間を短縮するために高流速でのサンプル注入を可能とする捕捉カラムとして使用する、０.０５mmのＩＤのポリマーモノリスの短片を有するクロマトグラフィー機器装置の模式図である。
【図３】Ａ：市販カラム、Acquity nanoUPLC(Waters, USA)；およびＢ：本発明の方法により製造したポリマーモノリシックカラムでの、脳脊髄液(ＣＳＦ)サンプルからのトリプシンペプチドの分離において得られた２個の基準ピーク強度(ＢＰＩ)クロマトグラムＡおよびＢを示す。
【図４】注入時間を速くするために捕捉カラム(図２に示す)として０.０５mmのＩＤのポリマーモノリスの短片を使用した、本発明の方法により製造した６００mm長および０.０５mmのＩＤのポリマーモノリシックカラム上での、ＣＳＦからのトリプシンペプチドの図３におけるクロマトグラムＢにおける対応するＢＰＩクロマトグラムである。
【図５】Ａ：市販カラム、Acquity nanoUPLC(Waters, USA)；およびＢ：本発明の方法により製造したポリマーモノリシックカラム上で分離したｍ／ｚ  ４１６.２を有する２個の単一帯電種の分離のためのイオンクロマトグラムを示す。
【図６】Ａ：市販カラム、Acquity nanoUPLC(Waters, USA)；およびＢ：本発明の方法により製造したポリマーモノリシックカラム上で分離したｍ／ｚ  ６１３を有する単一帯電種の分離のためのクロマトグラムを示す。
【図７】捕捉カラムを有する装置を使用した本発明の方法により製造した６００mm長および０.０５mmのＩＤのポリマーモノリスカラム上での果実エキスからの多様なプロシアニジン類の分離のためのクロマトグラムを示す。
【図８】移動相流速Ａ)１００nL／分およびＢ)２００nL／分での、本発明の方法により製造した６００mm長および０.０３mmのＩＤのポリマーモノリシックカラム上のＣＳＦからのトリプシンペプチドの基準ピーク強度(ＢＰＩ)クロマトグラムを示す。
【図９】本発明の方法により製造した１５０mm長および２.１mmのＩＤのポリマーモノリスカラムを使用したアセトニトリル沈殿血液血漿タンパク質の上清からのトリプシンペプチドのＬＣ−ＭＳ分離のための基準ピーク強度(ＢＰＩ)クロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
発明の詳細な記載
上記のとおり、本発明はモノリシックカラム、好ましくはキャピラリーカラムまたは微細加工デバイスにおけるチャネルの製造方法に関し、これは、ペプチドおよび他の分子の高度に感受性のナノスケール分離を可能にし、好ましくは、０.０５mm以下の細い内径(ＩＤ)を有する。
【００４６】
本発明はカラムまたはチャネルの内径または材料について限定されないが、以下の記載は、大部分石英ガラスキャピラリーカラムに関する。
さらに本発明を記載する前に、モノリシックカラムおよびその製造についての一般的な説明をしておく。
【００４７】
ポリマーモノリシックカラム
モノリシッククロマトグラフ固定相は、充填クロマトグラフ床に一般的な粒子間間隙を含まない、一体成形の高度に多孔性の材料からなる。モノリス内の孔の大部分は開放され、相互接続したチャネルのネットワークを形成する。
【００４８】
有機ポリマーキャピラリーモノリシックカラムまたは微少流体チップにおけるチャネルを製造するために、石英ガラスキャピラリーに、通常、適当な量のモノマー、架橋モノマー、重合の開始剤およびポロジェニック溶媒の混合物を含む重合混合物を充填する。キャピラリーの両端を密閉し、重合を加熱または紫外線(ＵＶ)照射により開始する。通常、フリーラジカルを形成するために加熱したとき分解する(熱的開始剤)、ＡＩＢＮのようなジニトリル開始剤またはアゾ開始剤またはＬＰＯもしくはＢＰＯのような過酸化物開始剤を使用する。重合混合物中の架橋剤を含むモノマーが最終モノリシック材の極性を制御するが、孔径分布は非反応性ポロジェニック溶媒混合物の組成物を含む、いくつかの条件の結果である。
【００４９】
標準的懸濁重合と対照的に、モノリシックカラムの合成は不撹拌モードで進行する。ポロジェニック溶媒の存在下、架橋プロセスおよび溶媒混合物へのポリマーの不溶性の両者の結果として、ポリマー核が混合物から沈殿し始める。最終的に、モノリシックシステムが、ポロゲンの体積率にほぼ対応する孔体積率で形成される。
【００５０】
孔の径および形態は、重合温度、重合時間および得られたポリマーに対するポロゲンの溶解力を含む、数因子による。ポリマーに対する良好な溶解性を有する溶媒は、微小孔およびメソ細孔の形成に好都合であり、一方大孔は、ポリマーとわずかしか相互作用しない溶媒を用いて製造する。
【００５１】
モノリシックポリマー体を石英ガラス壁に固着させるために、重合混合物導入前に毛細管またはチャネルをエッチングおよびシラン処理する必要がある。そうでなければ、カラムは、高圧で移動相適用で使用したときに押し出される危険性がある。エッチングは、粗化により表面上の反応性基の数を増やし、一方シラン処理は、モノリスのための固着部位を提供する。通常、内壁を水酸化ナトリウム水溶液で処理後、シラン処理をγ−トリメトキシ−シリルプロピルメタクリレート(γＭＡＰＳ)で行う。
【００５２】
本発明
本発明によって、上に略記した重合方法全体の細心の最適化が、ペプチドおよび他の分子の分離を可能にする高い感受性を有する、０.０３mmまたは０.０２mmのような０.０５mm以下のＩＤを有するポリマーモノリシックカラムの製造を可能とした。本発明の方法は、しかしながら、このようなナノスケールタイプモノリシックカラムに限定されず、通常１０〜１００mmのＩＤほども大きなＩＤを有する分取規模カラムを含む、大直径モノリシックカラムの製造も包含する(これらのカラム中の多孔性モノリシック構造の鋳造は、粒子の充填よりも安価である可能性がある)。
【００５３】
カラム材の例は、ガラス、特に石英ガラス、ガラス内張り鋼またはプラスチック、プラスチック、例えばＰＥＥＫ、鋼(好ましくはステンレス鋼)のような金属を含む(しかしこれらに限定されない)。細径カラムに関して、石英ガラスキャピラリーカラムが現時点では好ましい。
【００５４】
本発明の方法は、主モノマーとしてのジビニルベンゼン(ＤＶＢ)と組み合わせたコモノマーとしての少量のイソ−デシルアクリレートおよびマクロポロゲンとしてのイソブタノールまたはイソブタノールとオクタノールの混合物を含む重合混合物を、好ましくは相対的に“温和な”方法によるキャピラリーカラム壁のシラン処理後、カラムに充填することを含み、全ての予定された条件下である。それにより、鋭敏な分離特性を有する均一モノリシック構造を製造できる。
【００５５】
いかにして本発明方法を実施するかの非限定的例を次に記載する。
【００５６】
ポリマーモノリシックカラムの製造
液体充填装置
石英ガラスキャピラリーに液体を充填するために、図１に記載し、実験部分でさらに詳細に記載するタイプの装置を有利に使用する。簡単に説明すると、この装置は、液体を含む１０mmガラス管の取り付けのためにテフロンフェルールを使用し、キャピラリーの密閉のためにＰＥＥＫスリーブ(０.３８mmのＩＤ)を使用することによる、スウェージロック高圧継ぎ手の社内製造連結器を含む。圧力(０.２〜６bar)を、Ｔ字コネクタの使用により、側面からの窒素流により適用する。この装置は、通常使用されている、キャピラリーの密閉のための隔壁を有するガラスバイアルの使用よりも丈夫で、再現性がある。
【００５７】
０.０５mmのＩＤおよび０.３６mmのＯＤを有する石英ガラスキャピラリー管を好ましい長さ、例えば１０００mmに切断する。石英ガラスキャピラリー壁の処理およびシラン処理は文献に記載されたとおりであるが、下に記載するとおり、本発明において相当修飾される。
【００５８】
シラン処理法
１. キャピラリーに２Ｍ  ＮａＯＨを充填し、キャピラリーを温水に、一般に約６５℃で約５分浸漬する。
２. 水および／または酸(例えば２Ｍ  塩酸または硫酸)で、中性ｐＨになるまで濯ぎ、水およびアセトンで濯ぐ。
３. キャピラリーに１０％γ−(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレート(γＭＡＰＳ)のキシレン溶液を充填し、キャピラリーを温水に、一般に約６５℃で約２０分、例えば７分浸漬する。
４. アセトンで濯ぐ。
【００５９】
ビニル基の内壁への結合により、モノリスがキャピラリーに密着でき、それゆえに、液体クロマトグラフィー分析で必要な高圧移動相によるモノリスの押出を阻止する。
【００６０】
重合法
シラン処理後、キャピラリーに、次のものを含む重合溶液を充填する。
１. モノマー(ジビニルベンゼン(ＤＶＢ)およびアクリル酸イソデシル(ＩＤＡ))
２. マクロポロゲン(イソブタノール、オクタノール)
３. ミクロポロゲン(クロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエンまたはキシレンまたはこれらの２種以上の組み合わせ)
４. 開始剤(２,２’−アゾビスイソブチロニトリル(ＡＩＢＮ)、過酸化ラウロイル(ＬＰＯ)または過酸化ベンゾイル(ＢＰＯ)。
【００６１】
充填後、出口をゴムの小片で蓋し、そうして好ましい内圧を維持する。その後、キャピラリーを温水(６５〜７０℃)に３０〜１２０分浸漬して、熱誘導重合を誘導する。全てのパラメータを極めて注意深く最適化し、制御する。重合後、モノリシックカラムを、アセトニトリルの高圧流を使用して濯ぐことができる。その後、カラムを、好ましくは質量分析(ＭＳ)検出を備えた、ナノスケール液体クロマトグラフィーペプチド分離に使用できる。
【００６２】
シラン処理および重合工程を次にさらに詳細に記載する。
【００６３】
シラン処理
上記のとおり、高圧で移動相を適用したときの押出を阻止するために、モノリシック構造を石英ガラス壁に固着させる必要がある。これは、一般に毛細管内壁のエッチング／シラン処理により達成される。エッチングは、表面積を増やすために表面を粗化し、シラン処理は重合中のポリマーネットワークの共有結合による結合のために反応性基を導入する。
【００６４】
本発明の好ましい態様において、エッチングおよびシラン処理の操作は、石英ガラス壁を活性化されているが、なお滑面であるように維持し、シラン処理剤であるγ−トリメトキシ−シリルプロピルメタクリレート(γＭＡＰＳ)の重合を阻止し、最終的に壁付近の厚シートとの重合を阻止するために、顕著に改善されている。通常使用されている高温(１２０℃)で長時間(２時間)の代わりに、本発明方法では、通常使用される１Ｍ  ＮａＯＨに替えて、約４０〜７０℃、例えば約６５℃および約２〜１５分、例えば約５分以下の２Ｍ  ＮａＯＨ水溶液でのエッチングを使用する。これは、壁の許容されない粗化を阻止する。キャピラリーのフラッシングは通常水およびアセトンで行う。
【００６５】
シラン処理は、キシレンに溶解した約１〜２０％(ｖ／ｖ)、好ましくは約１０％(ｖ／ｖ)γＭＡＰＳで行うが、一般に先行技術で使用されているようなフリーラジカル阻害剤(ＤＰＰＨ)の添加はしない。シラン処理を約６０〜７０℃で、好ましくは約６５℃で、約２〜３０分、一般に約２〜１５分、例えば約７分行う。これは、一般に先行技術のシラン処理で使用されている１２０℃および６時間と対照的である。フラッシングはアセトンで行う。
【００６６】
これにより、γＭＡＰＳの重合が阻止され、より制御され、限定されたシラン処理が可能となる。さらに、多孔性ポリマーモノリシック構造が壁に厚シートを形成することを阻止し、ゆえに、壁の形態はモノリスの残りの部分と類似する。最も重要なことは、しかしながら、この穏やかなシラン処理方法はモノリスを効率的に固着させるのに十分なことである。このことは、１０,０００psiの圧を適用したときでも、モノリスがキャピラリーから押し出されないことで証明された。
【００６７】
重合
上記のとおり、熱的開始剤としてのＡＩＢＮ、ＬＰＯまたはＢＰＯを使用するフリーラジカル重合は、一般に多孔性ポリマーモノリスの製造に使用し得る。
【００６８】
ジビニルベンゼン(ＤＶＢ)は工業化学物質として８０％純度(約１９％エチルビニルベンゼンを含む)で容易に入手可能であり、液体クロマトグラフィー分離用ポリマーモノリスの製造に従来使用されている。特に断らない限り、ここで使用する用語ＤＶＢは、この８０％純度の工業規格ＤＶＢをいう。
【００６９】
多孔性ポリマーモノリシックカラムに関して報告されているほとんどの研究は、一般にＤＶＢおよびスチレンを含む、モノマーを約４０％(ｖ／ｖ)の濃度で使用する。本発明においては、重合混合物の大部分にＤＶＢを使用することにより、総モノマー濃度を約３０〜３５％(ｖ／ｖ)またはそれより低くすることが可能である。
【００７０】
当初バイアル中での重合を試験したとき、このような低ＤＶＢ濃度を使用することにより、沈殿および不均一ポリマーの形成が観察された。これはまたキャピラリー内の間隙および不均一モノリス構造ももたらした。それゆえに、より均一な重合物を製造するために種々のポロゲンを試験した。
【００７１】
オクタノールのみをマクロポロゲンとして使用したときには、沈殿および不均一重合が観察された。イソブタノールを重合混合物に添加することにより、より不透明な、均一重合がバイアル中で観察された。イソブタノールが理論上はポリジビニルベンゼンの良好な溶媒ではないため、これは予想外であった。オクタノールとイソブタノールの濃度および比を使用して、モノリスの形態およびマクロ多孔性を調節できる。一般に、２０〜４０％(ｖ／ｖ)、好ましくは２５〜３５％(ｖ／ｖ)オクタノールおよび２０〜４０％(ｖ／ｖ)、好ましくは２５〜３５％(ｖ／ｖ)イソブタノールの混合物を使用する。イソプロパノールおよびシクロヘキサノールも、所望によりマクロポロゲンとして含めてよい。
【００７２】
一般に、約１〜１０％(ｖ／ｖ)、特に５〜１０％(ｖ／ｖ)濃度のクロロホルム、テトラヒドロフラン、トルエンまたはキシレンの形態のミクロポロゲンを使用する。
【００７３】
ミクロポロゲンの濃度を使用して、モノリスのメソ多孔性を調節できることは文献により知られている。本発明によって、第二のモノマーであるアクリル酸イソデシル(ＩＤＡ)の添加が、モノリスの多孔性の制御に有用であることが判明した。アクリル酸イソデシルがなければ、大きな大孔が観察され、モノリスはペプチドの分離に適さなかった。しかしながら、ＤＶＢ濃度に対して約１：１０程度を含む、０.１〜１５％(ｖ／ｖ)、一般に１〜５％(ｖ／ｖ)程度の少量のアクリル酸イソデシルを添加することにより、孔径が顕著に低下した。
【００７４】
それゆえに、本発明においてアクリル酸イソデシルは重要なミクロポロゲンである。ＤＶＢ自体が液体であり、ミクロポロゲンとして作用することは注目される。さらに、ＤＶＢとアクリル酸イソデシルの共重合は、ポリマー表面上にアルキル鎖を導入し、それにより、ペプチドの分離の改善に貢献する。ＤＶＢがアクリル酸イソデシルより速く反応し、そのことにより架橋された内部構造の大部分を形成し、一方アクリル酸イソデシルは表面に存在する傾向にあると考えられる。
【００７５】
観察された重要なことは、アクリル酸イソデシルの使用濃度がより高ければ、より多くの粒子形成と共に重合物が形成され、所望のモノリシック構造ではなく糊状のゲルまたは粒子の懸濁液または溶解されたゴムが形成されることである。それゆえに、アクリル酸イソデシルは、テトラヒドロフランまたはクロロホルムのような他のミクロポロゲンと異なる態様でモノリスの形態を変化させるのに有効であると思われる。
【００７６】
アクリル酸イソデシルを使用する他の興味深い面は、他のアクリレートと比較して、単味(neat)アクリル酸イソデシルホモポリマーの例外的に低いガラス遷移温度(−６０℃)である。これは、アクリル酸イソデシルが、全体ポリマー構造の鎖剛性の低下により、ゴム様共重合を導入することを示唆する。それゆえに、ポリマー中の少量のアクリル酸イソデシルは、いわゆるゴム強化のプロセスにより、モノリスにさらなる強度および安定性を提供する可能性がある。ゴム強化により、ポリマーは圧力を加えられたとき壊れにくくなり、キャピラリーを湾曲させるときモノリスの破壊を避けるために有益である。
【００７７】
本発明において使用するための一般的重合組成物は次のものを含む(重量パーセント、ｗ／ｗ)。
【表１】
2015531070.tif 000002
(１〜１０(ｖ／ｖ)％の範囲となるクロロホルム以外、体積(ｖ／ｖ)ベースで同様のパーセント範囲が適用される。)
【００７８】
上記組成物に、ＡＩＢＮを０.１５〜１.５％(ｗ／ｗ)の濃度で添加し、ＡＩＢＮ対モノマー比を０.５〜５％(ｗ／ｗ)とする。あるいは、０.３〜４％ＬＰＯを添加してよい。
【００７９】
極めて細い石英ガラスキャピラリーの制限内で多孔性ポリマーモノリスを充填および重合させる条件は、平凡ではない。本発明の方法は、上記のとおり、好ましくは、この目的のために設計され、下の実験部分でさらに詳細に記載する、上に簡単に記載した(“液体充填装置”のタイトルの下)特殊なデバイスを使用して、キャピラリーに重合混合物を充填するために高圧を使用する。重合のための圧の最適な選択は、当然、重合混合物の粘度に依存する。
【００８０】
他の重要な観察は、重合混合物上に作用する毛管力および静電気の可能性であった。高圧では、液滴反発力がキャピラリー出口で観察され、すなわち液滴が外側で上に向かって引き上げられ、シラン処理キャピラリーを流れる重合液体への電荷移動が示唆される。粘性の増加によりまたは充填中低圧を使用することにより、反発力は減少する。液体上に作用する毛管力のために、充填中に相分離も起こり得ると推測された。
【００８１】
それゆえに、キャピラリーに均一に充填するために必要な時間は重要であると考えられた。一般に、内部の均一内容物を確実にするために、キャピラリーを充填するために、少なくとも３０分、場合によっては６０〜１８０分またはさらには６０〜３００分を使用し得る。温水槽に浸漬しながらのキャピラリーの充填も、調製プロセスの加速に有用であり得る。充填中の時間、温度、圧およびキャピラリーの軽打または振盪でさえ、重合前の均一かつ泡のない充填を確実にするために、本発明の方法において重要なパラメータとされた。未溶解開始剤、石英ガラスの破片または他の残骸がキャピラリーに入らないようにすることも重要である。
【００８２】
充填圧は、キャピラリーカラムのＩＤによって変わる。例えば、２barを５０μm毛細管の充填に使用できるが、４barが３０μm管の充填にそして５barが２０μm管の充填に必要となり得る。
【００８３】
キャピラリーを充填し、出口を閉じた後、温度の上昇により重合を誘発する前に圧を上げることができる。一般に、重合は、充填したキャピラリーのみを、好ましくは温度６５〜６９℃の温水(６０〜８０℃)に、約１bar〜約１０barの圧で浸漬することにより行う。
【００８４】
上記のとおり、調製したポリマーモノリスは、石英ガラスキャピラリー内に制限されるように結合しておらず、例えばラボオンチップ(ＬＯＣ)デバイスを含むチップベースのシステムのような他のタイプのナノスケール分離デバイスに導入することも可能である。
【００８５】
次は、本発明をいくつかの非限定的実施例により説明する。
【実施例】
【００８６】
実験部分
実験装置
液体を石英ガラスキャピラリーに充填するために、図１に示す装置を使用した。この装置において、コイル状石英ガラスキャピラリー１を、スウェージロックＴＭ高圧継ぎ手の社内製造連結器を介して、液体３を含む、ここでは１００×１０mm  ＯＤの試薬ガラス管２に取り付ける。具体的に、管２をスウェージロックＴＭ１０mm−１／８インチコネクタ４に取り付け、１０mm  テフロンＴＭフェルールで縛る。このコネクタ４を、続いて、１／８インチＯＤステンレス鋼管５を介して、スウェージロックＴＭＴ字コネクタ６に取り付ける。後者は、０.３６mmのＯＤの石英ガラスキャピラリー１をスウェージロックＴＭ１／８インチ−１／１６インチコネクタを介して取り付け、密封し、それに１／１６インチのＯＤおよび０.３８mmのＩＤのＰＥＥＫスリーブを１／１６インチＰＥＥＫフェルールにより接続する(示していない)。導管７は、停止および通気弁８を介してＴ字コネクタ６を圧縮窒素源(示していない)に接続し、これを介して０〜１０barの窒素圧を適用し得る。図説例においては、石英ガラスキャピラリー１をゴム栓９で蓋し、恒温水槽１０に浸漬する。
【００８７】
ポリマーモノリシックカラムの製造
６００mm長および０.０５mmのＩＤのカラム
６００mm長および０.０５mmのＩＤのポリマーモノリシックカラムを下記方法に従い製造した。
・ 約９４０mm長の石英ガラスキャピラリーを切断し、ＰＥＥＫスリーブに入れ、圧継ぎ手を介して押し進める。入口側(ガラス管側)を残骸について顕微鏡で検査し、もしあれば、新たに切断をする。
【００８８】
・ ２Ｍ  ＮａＯＨを含む試薬管をテフロンＴＭフェルールの締め付けにより接続し、キャピラリーを浸漬する。圧を適用し(ゲージで２bar)、５分フラッシング後、コイル状キャピラリーを恒温水槽(６５〜６８℃)に５分浸漬し、流量はそのままでよい。コイル状キャピラリーを次いで水槽から上げ、圧継ぎ手を通気し、ガラス管を除き、精製水を含む管と替える(１８MOhm)。キャピラリーを５分、２barでフラッシングし、次いで通気し、同様にアセトン含有ガラス管を使用して５分、２barでフラッシングする。
【００８９】
・ 圧継ぎ手を次いで通気し、１０％γＭＡＰＳのキシレン溶液を含むガラス管を接続する。キャピラリーを５分、２barでフラッシングし、コイル状キャピラリーを恒温水槽(６５〜６８℃)に７分浸漬し、流量はそのままでよい。コイル状キャピラリーを水槽から上げ、圧継ぎ手を通風し、ガラス管を除き、アセトン含有管と変える。キャピラリーを５分、２barでフラッシングする。
【００９０】
・ 重合混合物を１５.５mg  ＡＩＢＮをガラス管に入れ、次いで８５０μL  ジビニルベンゼン、９０μL  アクリル酸イソデシル、９０μL  クロロホルム、８００μL  オクタノールおよび８００μL  イソブタノールを添加することにより製造する。添加の間の秤量により、正確な作業組成物のドキュメンテーションを可能にする。ガラス管を１分ボルテックスにより混合し、５分超音波処理し、最後に１分ボルテックスにより混合する。
【００９１】
・ 圧継ぎ手を次いで通気し、重合混合物含有ガラス管を接続する。キャピラリーを５分、２barで室温でフラッシングし、効率的熱フラッシングのために、コイル状キャピラリーを恒温水槽(６８℃)に１０分浸漬する(流量はそのまま)。キャピラリー出口を次いで水槽から上げ、キャピラリーをゴム栓または隔壁内に４〜５mm差し込むことにより硬く蓋をする。全てのコイル状キャピラリーを次いで水槽に浸漬し、重合を４０分にわたり行わせる。重合に要する時間は、ＡＩＢＮの濃度にかなり依存することが判明している。指針として、モノマーに対するＡＩＢＮの濃度が１.２５％(ｗ／ｗ)、１.７５％(ｗ／ｗ)または２％(ｗ／ｗ)で、それぞれ、８０分、４０分または２０分の重合時間を要する。しかしながら、この相関は、重合混合物および温度、ＡＩＢＮの純度、石英ガラスキャピラリーＩＤまたは他のパラメータが変わることによって変わる可能性がある。
【００９２】
・ 重合後、キャピラリーを水槽から出し、圧継ぎ手を通風し、キャピラリーを浸漬レベルより下で切断する。約６５０mmのキャピラリーが重合化すべきである。このキャピラリーを、２０μmのＩＤおよび３６０μmのＯＤの石英ガラスキャピラリーによる注射器から供給されたナノ流液体と共に３６０μm石英ガラス高圧継ぎ手に接続する。ポリマーモノリスカラムをアセトニトリルで約３０分、６０００psi、次いで約３０分、４００nL／分の流速を使用してフラッシングする。次いでポリマーモノリスは、液体クロマトグラフィーカラムとしていつでも使用でき、６００mm長に切断できる。５０mm長を捕捉カラムとして使用できる。
【００９３】
６００mm長および０.０３mm  ＩＤカラム
６００mm長および０.０３mmのＩＤのポリマーモノリシックカラムを、全操作について圧を相応して２barから４barに上げた以外、０.０５mmのＩＤのカラムについて上記のものと同じ方法で製造した。
【００９４】
上記方法により、下記表１の実施例１〜５に示す組成および条件を使用して、５個のポリマーモノリシックカラム、すなわち６個の０.０５mmのＩＤのカラム(実施例１−３)、１個の０.０３mmのＩＤのカラム(実施例４)および１個の０.０２mmのＩＤのカラム(実施例５)を製造した。
【００９５】
【表２】
2015531070.tif 000003
【００９６】
１５０mm長および２.１mmのＩＤのカラム
１５０mm長および２.１mmのＩＤのポリマーモノリシックカラムを下記方法に従い製造した。
・ １／８インチのＯＤ、２.１mmのＩＤおよび１５０mm長のステンレス鋼管をアセトンで脱脂し、続いて３５％発煙塩酸で６０分活性化し、続いて水でフラッシングし、９５℃で一夜乾燥した。
【００９７】
・ シラン処理を１０％γＭＡＰＳのキシレン溶液で６０分、７５℃で行い、続いてキシレンおよびアセトンでフラッシングした。
【００９８】
・ 重合混合物は２９.７％オクタノール、２９.４％イソブタノール、１０.７％クロロホルム、２.５％アクリル酸イソデシル、２６.３％ジビニルベンゼンおよび１.４％過酸化ラウロイルからなった。
【００９９】
・ シラン処理ステンレス鋼管に重合混合物を満たし、両端に蓋をし、続いて７５℃で９０分重合させた。
【０１００】
・ ポリマーモノリシックカラムを、次いで、２個のステンレス鋼１／８インチ〜１／１６インチ異径ユニオンで固定し、約３０分、０.４mL／分の流速で未反応成分および溶媒を洗い出すためにアセトニトリルの高圧供給と接続した。
【０１０１】
・ 次いでカラムを化学分析を実施するために検出器、例えば質量分析計と連結した液体クロマトグラフに導入する。
【０１０２】
分離実験
脳脊髄液(ＣＳＦ)からのトリプシンペプチドの分離
表１の実施例２に示すものに準じた組成および条件を使用して上記のとおり製造した６００×０.０５mmのＩＤのポリマーモノリシックカラムを、脳脊髄液(ＣＳＦ)からのトリプシン消化ペプチドの分離に適用した。サンプルを、市販ナノＵＰＬＣシステム(Waters, USA)に標準的装備として装着されたループ注射器(ループサイズ２μl)を使用して注入した。
【表３】
2015531070.tif 000004
結果を図３のクロマトグラムＢに示す。
【０１０３】
比較のために、同一サンプルを１.７μm粒子が充填された市販の１５０mm長および０.０７５mmのＩＤのC18 nanoAcquityカラムでも分離した(Waters, USA)。この場合、捕捉カラムを注入の加速のために使用し、それゆえにペプチドの排出が、ポリマーモノリス上への直接注入より約２０分早く起こった。
【表４】
2015531070.tif 000005
結果を図３のクロマトグラムＡに示す。
【０１０４】
サンプル注入中高流速を使用して、図２におけるクロマトグラムＢでの分離のための注入時間を短縮するために(約２０分)、捕捉カラムを含む図２に示す装置を構築した。
【０１０５】
ここで、分析カラムとして使用した０.０５mmのＩＤのポリマーモノリスの短片の形のポリマーモノリス捕捉カラム２０を注射器２１と分析キャピラリーカラム２２の間に、キャピラリー２３(２０μmのＩＤ)、ユニオン２９およびＴ字連結器２４を介して提供し、これはまた通気孔２５に２０μmのＩＤキャピラリー２６(２０μmのＩＤ)を介して接続する。分析カラム２２をさらにナノエレクトロスプレーエミッター２７(Pico-Tip(登録商標))を介してＱ−ＴＯＦ質量分析計に接続する。高電圧をＴ字連結器３０により液体流に導入する。通気孔２５を廃棄物２８に、３〜５μl／分(４０００〜６０００psi)で注入時に接続し、注入後栓をして、流れを分析カラム２２に導く。
【０１０６】
これは、市販Acquity nanoUPLCカラム(Waters, USA)の標準的装置に類する。異なる低体積継ぎ手を使用し、デッドボリュームを全ての点で最小化した。移送キャピラリーおよびポリマーモノリスキャピラリーの両者の切り口を接続前に顕微鏡で観察した。
【０１０７】
ＣＳＦからのトリプシンペプチドを大流量で、この捕捉カラムに注入し、６００mm長および０.０５mmのＩＤのポリマーモノリス上でさらに分離した。分析流速が２００nL／分ほども低かったため、勾配がカラムに達する時間がかなり長かった。それゆえに、勾配を高流速(４００nL／分)を使用して９分で開始し、そうして、居住体積における勾配を、２００nL／分の流速設定前にカラムの先端に留めた。
【０１０８】
【表５】
2015531070.tif 000006
結果を図４に示す。
【０１０９】
ピークプロファイルの比較
ピークプロファイルの比較のために、イオンクロマトグラムを種々のペプチド質量について引用した。図５は、Ａ)市販Acquity nanoUPLC(Waters, USA)およびＢ)上記のとおり製造したポリマーモノリスで分離した２個のｍ／ｚ  ４１６.２を有する２個の単一帯電種の分離を示す。図６は、Ａ)市販Acquity nanoUPLCおよびＢ)上記のとおり製造したポリマーモノリスで分離したｍ／ｚ  ６１３.８を有する単一帯電種の対応する分離を示す。
【０１１０】
プロシアニジン類の分離
上記のとおり製造した６００mm長および０.０５mmのＩＤのポリマーモノリスカラムを使用して、果実から抽出した種々のプロシアニジン類を捕捉カラムを有する装置を使用して、分離し、質量分析により検出した。結果を図７に示す。
【０１１１】
６００mm長および０.０３mmのＩＤのポリマーモノリスカラムでの脳脊髄液(ＣＳＦ)からのトリプシンペプチドの分離
ＣＳＦの分離を、上記表１の実施例４のとおり製造した６００mm長および０.０３mmのＩＤのポリマーモノリスカラムで行った。上記のＣＳＦからのトリプシンペプチドからの同一サンプルの分離を、１００nL／分および２００nL／分の移動相流速で行った。結果を図８のクロマトグラムＡおよびＢとしてそれぞれ示す。
【０１１２】
１５０mm長および２.１mmのＩＤのポリマーモノリスカラムでの血漿からのトリプシンペプチドの分離
血漿からのトリプシンペプチドの分離を、上記のとおり製造した１５０mm長および２.１mmのＩＤのポリマーモノリスカラムで行った。分離を、０.１％ギ酸およびアセトニトリル混合物の２から５０％アセトニトリルへの勾配を使用した０.４mL／分の移動相流速で行った。結果を図９に示す。
【０１１３】
本発明は上記の好ましい態様に限定されない。種々の代替物、修飾および均等物を使用し得る。それゆえに、上記態様は、添付する特許請求の範囲により規定される本発明の範囲を限定すると解釈してはならない。
【図１】
2015531070.tif 000007
【図２】
2015531070.tif 000008
【図３】
2015531070.tif 000009
【図４】
2015531070.tif 000010
【図５】
2015531070.tif 000011
【図６】
2015531070.tif 000012
【図７】
2015531070.tif 000013
【図８】
2015531070.tif 000014
【図９】
2015531070.tif 000015
【国際調査報告】
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2015531070.tif 000017
2015531070.tif 000018