(57)【要約】  本発明は、ガラクトオリゴ糖を含有する組成物の製造方法と、ガラクトオリゴ糖含有組成物それ自体と、に関する。【選択図】図５
2015508291.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上のガラクトオリゴ糖を含む組成物の製造方法において、
ａ）
・脱離基に結合されたガラクトシル基を含むガラクトシルドナーであって、多くとも３５０ｇ／ｍｏｌのモル重量を有するガラクトシルドナーと、
・前記ガラクトシルドナーとは異なるガラクトシルアクセプターであって、糖または糖アルコールであるガラクトシルアクセプター、を含む混合物を提供するステップであって、前記ガラクトシルアクセプターと前記ガラクトシルドナーとのモル比は、少なくとも１：１０であり、かつ前記混合物は、少なくとも０．０５ｍｏｌ／Ｌの前記ガラクトシルアクセプターを含む提供するステップ、
ｂ）第１の酵素を提供するステップであって、前記第１の酵素は、β−ガラクトシダーゼ活性とガラクトシル転移活性とを有するとともに、前記第１の酵素は、前記混合物に接触する提供するステップ、および
ｃ）前記混合物と前記第１の酵素とをインキュベートして、前記第１の酵素により前記ガラクトシルドナーの脱離基を放出させるとともに、前記ガラクトシルドナーのガラクトシル基を前記ガラクトシルアクセプターに転移することにより、前記ガラクトオリゴ糖を形成するステップであって、ステップｃ）は、前記ガラクトシルドナーから放出された脱離基をインキュベート中の混合物から除去することにより、１種以上のガラクトオリゴ糖を含む組成物を取得することをさらに含む形成するステップ、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記ガラクトシルドナーの脱離基がグリコシル基であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、前記ガラクトシルドナーがラクトースまたはラクチトールであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法において、前記第１の酵素が多くとも０．９のＴ値を有することを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項に記載の方法において、前記第１の酵素が、
・配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｍｅｔ（１）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｙ（９５０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｕ（９１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法において、前記第１の酵素が、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の方法において、前記第１の酵素が、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｕ（９１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１乃至７の何れか１項に記載の方法において、前記第１の酵素が、
・表１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性、または
・表２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性、または
・表３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性、または
・表４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性、または
・表５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性、または
・表６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性
を有することを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載の方法において、前記ガラクトシルドナーから放出された遊離脱離基を変換可能な微生物を提供するステップと、前記ガラクトシルドナーから放出された脱離基をインキュベーション時に前記微生物により除去するステップと、をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法において、
ａ）前記微生物による前記遊離脱離基の除去速度が、それによる前記ガラクトシルアクセプターの除去速度の少なくとも１０倍であるか、
ｂ）前記微生物による前記遊離脱離基の除去速度が、それによる前記ガラクトシルドナーの除去速度の少なくとも１０倍であるか、または
ｃ）前記微生物による前記遊離脱離基の除去速度が、それによるモノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターの除去速度の少なくとも１０倍である
ことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載の方法において、前記ガラクトシルドナーから放出された遊離脱離基を変換可能な第２の酵素を提供するステップと、前記ガラクトシルドナーから放出された脱離基をインキュベーション時に前記第２の酵素により変換するステップと、をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法において、前記第２の酵素がグルコースオキシダーゼ活性を有することを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１１または１２に記載の方法において、
ａ）前記遊離脱離基に対する前記第２の酵素の特異性定数が、前記ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０倍であるか、
ｂ）前記遊離脱離基に対する前記第２の酵素の特異性定数が、前記ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも１０倍であるか、または
ｃ）前記遊離脱離基に対する前記第２の酵素の特異性定数が、前記モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０倍である
ことを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１乃至１３の何れか１項に記載の方法において、前記第２の酵素がグルコースオキシダーゼ活性を有し、かつ前記ガラクトシルドナーの脱離基がグルコースであることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１２乃至１４の何れか１項に記載の方法において、カタラーゼ活性を有する酵素をさらに提供することを含み、この酵素がインキュベート中の混合物に接触することを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１１乃至１５の何れか１項に記載の方法において、前記第２の酵素により前記脱離基を変換することにより得られた変換生成物の少なくとも一部を除去可能な除去剤を提供するステップと、前記除去剤により前記変換生成物の少なくとも一部をインキュベーション時に除去するステップと、をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法において、前記除去剤が二価イオンまたは三価金属イオンの塩を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１３に記載の方法において、前記除去剤が陰イオン交換材料を含むか、さらにはそれからなることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法において、前記陰イオン交換材料の全結合容量が、インキュベーション時に生成される変換生成物の全量を基準にして少なくとも３０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であることを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１乃至１９の何れか１項に記載の方法において、ステップｃ）がさらなるガラクトシルドナーの添加を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１乃至２０の何れか１項に記載の方法において、ステップｃ）での前記混合物のガラクトシルドナーの濃度が０．０１〜１ｍｏｌ／Ｌの範囲内の濃度に維持されることを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項１乃至２１の何れか１項に記載の方法において、
ｄ）ステップｃ）の組成物のガラクトオリゴ糖を富化するステップ
をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法において、ステップｄ）が、除去剤および／または前記除去剤に結合された変換脱離基をステップｃ）の組成物から除去することをさらに含むことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ガラクトオリゴ糖含有組成物さらにはその効率的な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト母乳は、母乳栄養乳児の健康への有益な効果のいくつかに寄与するとみなされるいくつかの異なるオリゴ糖を含有することが知られている（Ｋｕｎｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０００））。たとえば、ＦＯＳ、ＧＯＳ、イヌリンなどのいくつかのオリゴ糖は、いわゆるプレバイオティクスである。つまり、胃腸系の有益な細菌を賦活し、有害な細菌を抑制する。オリゴ糖は、健康増進効果があるので、乳児用栄養食品製品や臨床用栄養食品製品などの機能性食品製品で頻繁に使用される。
【０００３】
オリゴ糖の製造方法はいくつか存在する。一方法は、天然存在源からオリゴ糖を単離することに基づく。フルクトースオリゴ糖（ＦＯＳ）およびイヌリンは、たとえば、キクイモ、ゴボウ、チコリー、リーキ、タマネギ、およびアスパラガス中に天然に見いだされ、これらの作物から単離されうる。チコリーの根からイヌリンを調製することについては、たとえば、Ｆｒａｎｋ（２００２）に記載されている。オリゴ糖のこの製造方法は、好適な作物の入手可能性により制限され、より複雑なオリゴ糖では実現できない可能性がある。
【０００４】
他の方法は、酵素がオリゴ糖の合成を触媒する酵素的合成に基づく。Ｙｕｎ（１９９６）は、フルクトシルトランスフェラーゼ活性を有する酵素を用いたかつ酵素の基質としてスクロースを用いたフルクトオリゴ糖の酵素的製造を記載している。
【０００５】
そのほかに、国際公開第０１／９０，３１７Ａ２号パンフレットには、酵素的合成の例が記載されており、そこには、特別なβ−ガラクトシダーゼ酵素と基質としてラクトースとを用いた式Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃで示されるガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の製造方法が開示されている。
【０００６】
欧州特許出願公開第２１３８５８６Ａ１号明細書には、少なくとも１種のジアルキルアミドの存在下のグリコシダーゼの存在下で炭水化物ドナー分子およびグリコシルアクセプター分子をグリコシル転移または加水分解することによる二糖またはオリゴ糖のレギオ選択的製造プロセスが開示されている。しかしながら、欧州特許出願公開第２１３８５８６Ａ１号明細書には、グリコシルドナーから放出された遊離脱離基をインキュベーション時に除去することは開示されてない。
【０００７】
国際公開第２００９／１１３，０３０Ａ２号パンフレットには、クロスフロー中空繊維精密濾過系を備えた反応器内での微生物全細胞を用いた純粋なラクトース系ガラクトオリゴ糖の製造プロセスが記載されている。しかしながら、国際公開第２００９／１１３，０３０Ａ２号パンフレットには、ドナーに関連しないガラクトシルアクセプターを用いたヘテロガラクトオリゴ糖の製造に関する教示はなんら含まれていない。
【０００８】
国際公開第２０１２／０１０，５９７Ａ１号パンフレットには、ガラクトオリゴ糖含有組成物の製造方法さらにはガラクトオリゴ糖含有組成物それ自体が記載されている。しかしながら、国際公開第２０１２／０１０，５９７Ａ１号パンフレットには、ガラクトシルドナーから放出された遊離脱離基をインキュベーション時に除去することは開示されていない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の目的は、ガラクトオリゴ糖、とくに、製造時に使用されるガラクトシルドナーとは異なる還元末端を有するガラクトオリゴ糖の改良された製造方法を提供することである。
【００１０】
本発明者らは、驚くべきことに、ガラクトオリゴ糖の合成時にドナーから放出された脱離基が競合ガラクトシルアクセプターとして作用し、以上に挙げたガラクトオリゴ糖の収率を低減することを見いだした。これは、とくに驚くべきことである。なぜなら、本発明者らにより行われた初期試験から、脱離基とくにグルコースは、弱いガラクトシルアクセプターであることが示唆されたからである。本発明者らは、ガラクトシルドナー、ガラクトシルアクセプター、およびβ−ガラクトシダーゼ酵素のインキュベーション時に放出された脱離基を反応混合物から除去することにより、以上に挙げたガラクトオリゴ糖（ガラクトシルドナーとは異なる還元末端を有する）の収率を増加させうることをさらに発見した。
【００１１】
図１、２、および３により、このことをさらに詳細に説明する。
【００１２】
図１は、ガラクトシル転移時に起こる主要な反応のタイプを示す概略図である。反応ａ）は、所望の反応であり、ドナー（この例ではラクトース）からアクセプター（たとえばフコース）へのガラクトシル基の転移を含む。この反応の生成物は、遊離脱離基（この例ではグルコース）と、ガラクトシルドナーとは異なる還元末端を有する小さいオリゴ糖（たとえばＧａｌ−Ｆｕｃ）と、である。
【００１３】
反応ｂ）は、ドナーのいわゆる自己ガラクトシル化をもたらす望ましくない副反応であり、たとえば、ドナーがラクトースの場合、さらにガラクトシル化されたラクトースを生じる。この副生成物は、オリゴ糖生成物から除去するのが困難でありかつ経費がかかる。本発明者らは、高ガラクトシル転移効率（低Ｔ値）を有する第１の酵素を比較的低濃度のガラクトシルドナーと組み合わせて使用することにより、自己ガラクトシル化レベルを有意に低減できることを発見した。
【００１４】
図１の反応ｃ）は、本発明者らが最近発見した他の望ましくない副反応である。本発明者らは、ガラクトオリゴ糖組成物中に驚くほど高レベルのアロラクトースを観測し、遊離脱離基とくにグルコースは、その濃度が十分に高い場合、アクセプターとしても作用するという結論に達した。
【００１５】
図２は、遊離脱離基がインキュベーション時に除去されない場合にガラクトオリゴ糖組成物中に存在する分子種のいくつかを示す概略図である。ガラクトシルアクセプターから誘導された所望のオリゴ糖生成物に加えて、組成物は、遊離脱離基のガラクトシル化から誘導された望ましくないオリゴ糖、たとえば、アロラクトースおよびさらにガラクトシル化されたアロラクトースをさらに含有する。
【００１６】
図３は、遊離脱離基がインキュベーション時に除去された場合にガラクトオリゴ糖組成物中に存在する分子種のいくつかを示す概略図である。図２に例示されたガラクトオリゴ糖組成物とは対照的に、本ガラクトオリゴ糖組成物は、遊離脱離基、アロラクトース、およびアロラクトースから誘導されたオリゴ糖が欠如している（または少なくとも有意により低濃度である）。
【００１７】
したがって、本発明の態様は、１種以上のガラクトオリゴ糖を含む組成物の製造方法に関する。この方法は、
ａ）
・脱離基に結合されたガラクトシル基を含むガラクトシルドナーであって、多くとも３５０ｇ／ｍｏｌのモル重量を有するガラクトシルドナーと、
・ガラクトシルドナーとは異なるガラクトシルアクセプターであって、糖または糖アルコールであるガラクトシルアクセプター、を含む混合物を提供するステップであって、ガラクトシルアクセプターとガラクトシルドナーとのモル比は、少なくとも１：１０であり、かつ混合物は、少なくとも０．０５ｍｏｌ／Ｌのガラクトシルアクセプターを含む提供するステップ、
ｂ）第１の酵素を提供するステップであって、前記第１の酵素は、β−ガラクトシダーゼ活性を有するとともに、前記第１の酵素は、混合物に接触する提供するステップ、および
ｃ）混合物と第１の酵素とをインキュベートして、第１の酵素によりガラクトシルドナーの脱離基を放出させるとともに、ガラクトシルドナーのガラクトシル基をガラクトシルアクセプターに転移することにより、ガラクトオリゴ糖を形成するステップであって、ステップｃ）は、インキュベート中の混合物から、すなわち、インキュベーション時に、ガラクトシルドナーから放出された脱離基を除去することにより、１種以上のガラクトオリゴ糖を含む組成物を取得することをさらに含む形成するステップ、
を含む。
【００１８】
「ガラクトシルドナーから放出された脱離基を除去する」という用語は、インキュベート中の混合物から遊離脱離基を物理的に除去することおよび／または遊離脱離基をインキュベート中の混合物中に依然として存在しうる１種以上の他の化学種に変換することと理解すべきである。そのような化学種は、ガラクトシルアクセプターとして作用しないか、または少なくとも遊離脱離基よりも低効率のガラクトシルアクセプターであることが好ましい。
【００１９】
本発明は、複雑なガラクトオリゴ糖組成物を高収率で安価かつ効率的に製造する道を開く。本発明はさらに、ガラクトシルドナーから放出された遊離脱離基のガラクトシル化さらにはガラクトシルドナーの自己ガラクトシル化を低減するように思われる。これらは両方とも、組成物から除去するのに経費がかかる望ましくない副生成物を生じる。
【００２０】
好ましくは、第１の酵素は、β−ガラクトシダーゼ活性に加えてガラクトシル転移活性を有する。また、第１の酵素は、多くとも０．９のＴ値を有することが好ましいこともありうる。
【００２１】
本発明との関連では、β−ガラクトシダーゼ酵素の「ガラクトシル転移活性」という用語は、ガラクトシル基をドナー分子たとえばラクトース分子から非水分子たとえば他のラクトース分子に転移する酵素の性能を意味する。
【００２２】
Ｔ値は、ラクトースをガラクトシルドナーおよびガラクトシルアクセプターの両方として用いたときのβ−ガラクトシダーゼ酵素のガラクトシル転移効率の尺度である。β−ガラクトシダーゼ酵素のＴ値の決定は、実施例３に記載のアッセイおよび式に従って行われる。Ｔ値は、式：
2015508291.tif 000003
を用いて計算される。
【００２３】
ガラクトシル転移活性をなんら有していないラクターゼ酵素は、使用されたラクトース１ｍｏｌあたり１ｍｏｌのガラクトースを生成して、Ｔ値が１になるであろう。きわめて高いガラクトシル転移活性を有するβ−ガラクトシダーゼは、ラクトースのガラクトシル基をほぼすべてガラクトシル転移に使用して、ガラクトースを生成しないであろう。したがって、Ｔ値が０に近くなるであろう。
【００２４】
そのほかに、本発明の態様は、１種以上のガラクトオリゴ糖を含む組成物に関する。この組成物は、本明細書に記載の方法により取得可能である。
【００２５】
本発明のそのほかの目的および利点は、以下に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ガラクトシル転移に関与する反応のタイプの概略図を示している。
【図２】図２は、遊離脱離基が使用されない場合に得られる反応生成物の概略図を示している。
【図３】図３は、遊離脱離基が使用されない場合に得られる反応生成物の概略図を示している。
【図４】図４は、インキュベーション時に遊離脱離基を除去した場合と除去しない場合とで、４時間インキュベーション後のガラクトシル化フコースの二糖、三糖、および四糖の積分応答のプロットを示している。遊離脱離基（グルコース）は、酵素変換により除去される。ガラクトシル化フコースの含有率は、インキュベーション時に遊離脱離基を除去した場合に増加することがわかる。
【図５】図５は、インキュベーション時に遊離脱離基を除去した場合と除去しない場合とで、５時間インキュベーション後のガラクトシル化フコースの二糖、三糖、および四糖の積分応答のプロットを示している。この場合も、ガラクトシル化フコースの含有率は、インキュベーション時に遊離脱離基を除去した場合に増加することがわかる。
【図６】図６は、インキュベーション時に遊離脱離基を除去した場合と除去しない場合とで、ガラクトシル化ドナー／脱離基の全積分応答と比較して、ガラクトシル化フコースの全積分応答のプロットを示している。ガラクトシル化ドナー／脱離基の全積分応答は、Ｇａｌ−Ｇｌｃ分子、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ分子、およびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ分子の積分応答の和である。ガラクトシル化フコースの全積分応答は、Ｇａｌ−Ｆｕｃ分子、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ分子、およびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ分子の応答の和である。ガラクトシル化フコースの全積分応答は、インキュベーション時に遊離脱離基を除去した場合に有意に増加するが、ガラクトシル化ドナー／脱離基の全積分応答は、ほとんど変化しないことがわかる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
記載のごとく、本発明の態様は、１種以上のガラクトオリゴ糖を含む組成物の製造方法に関する。この方法は、
ａ）
・脱離基に結合されたガラクトシル基を含むガラクトシルドナーであって、多くとも３５０ｇ／ｍｏｌのモル重量を有するガラクトシルドナー
・ガラクトシルドナーとは異なるガラクトシルアクセプターであって、糖または糖アルコールであるガラクトシルアクセプター
を含む混合物を提供するステップであって、ガラクトシルアクセプターとガラクトシルドナーとのモル比は、少なくとも１：１０であり、かつ混合物は、少なくとも０．０５ｍｏｌ／Ｌのガラクトシルアクセプターを含む提供するステップ、
ｂ）第１の酵素を提供するステップであって、前記第１の酵素は、β−ガラクトシダーゼ活性を有するとともに、前記第１の酵素は、混合物に接触する提供するステップ、および
ｃ）混合物と第１の酵素とをインキュベートして、第１の酵素によりガラクトシルドナーの脱離基を放出させるとともに、ガラクトシルドナーのガラクトシル基をガラクトシルアクセプターに転移することにより、ガラクトオリゴ糖を形成するステップであって、ステップｃ）は、インキュベート中の混合物から、すなわち、インキュベーション時に、ガラクトシルドナーから放出された脱離基を除去することにより、１種以上のガラクトオリゴ糖を含む組成物を取得することをさらに含む形成するステップ、
を含む。
【００２８】
本発明との関連では、「グリコシル基」という用語は、単糖もしくは二糖や三糖などの低級オリゴ糖または対応する糖アルコールから１個または２個のヒドロキシル基を除去することにより得られる基を意味する。この用語は、本明細書では、ガラクトシルドナー、ガラクトシルアクセプター、およびオリゴ糖の種々のビルディングブロックを記述するために用いられる。
【００２９】
最も一般的な糖およびそれらの対応するグリコシル基の略号は、以下に示される。
2015508291.tif 000004
【００３０】
本発明との関連では、「オリゴ糖」という用語は、同一タイプであっても異なるタイプであってもよい少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個のグリコシル基を含む分子を意味する。少なくとも２個のグリコシル基は、好ましくは、Ｏ−グリコシル結合を介して結合される。オリゴ糖は、直鎖状グリコシル基でありうるか、または分岐状構造を有しうる。オリゴ糖は、たとえば、（Ｇａｌ）３Ｇｌｃなどの化学量論式として、またはＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ−Ｇａｌ、Ｇａｌ−（Ｇａｌ−）Ｇｌｃ−Ｇａｌなどの一般式として、表されうる。化学量論式は、オリゴ糖または一群のオリゴ糖がどのグリコシル基を含有するかに関する情報を提供するが、それらの相対位置に関する情報を提供しない。一方、一般式は、グリコシル基の相対位置に関する一般的情報も含有する。
【００３１】
本発明との関連では、「ホモオリゴ糖」という用語は、１つのタイプのグリコシル基のみを含有するオリゴ糖を意味する。ホモオリゴ糖の例は、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧａｌおよびＧｌｃ−Ｇｌｃ−Ｇｌｃである。
【００３２】
本発明との関連では、「ヘテロオリゴ糖」という用語は、異なるグリコシル基を含有するオリゴ糖、たとえば、Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃまたはＧａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃを意味する。
【００３３】
本発明との関連では、「オリゴ糖」という用語と共に用いられる「ガラクト」という接頭辞は、オリゴ糖がガラクトシル基を繰返し単位として含有することを意味する。「ホモ」または「ヘテロ」という接頭辞は、「ガラクト」という接頭辞と共に用いられうる。Ｇａｌ−Ｇａｌ−ＧｌｃおよびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌは両方とも、ガラクトオリゴ糖である。Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃは、ヘテロガラクトオリゴ糖であり、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌは、ホモガラクトオリゴ糖である。
【００３４】
本発明との関連では、「Ｘ」は、本明細書に定義されるガラクトシルアクセプターを表す。「−Ｘ」は、ガラクトシルアクセプターに対応するグリコシル基、とくに、他の基に結合されたグリコシル基を表す。「−」は、結合を表す記号である。グリコシル基は、好ましくはグリコシル基の３、４、５、または６位を介してかつ好ましくはＯ−グリコシル結合を介して結合される。本発明との関連では、「Ｇａｌ−」は、好ましくはガラクトシル基の１位を介してかつ好ましくはＯ−グリコシル結合を介して他の基に結合されたガラクトシル基を表す。
【００３５】
本発明との関連では、「−Ｇａｌ−」は、２個の他の基に結合されたガラクトシル基を表す。左の結合は、好ましくはガラクトシル基の４位または６位を介してかつ好ましくはＯ−グリコシル結合を介して行われる。右の結合は、好ましくはガラクトシル基の１位を介してかつ好ましくはＯ−グリコシル結合を介して行われる。
【００３６】
２個のガラクトシル基間の結合は、典型的には１−４結合または１−６結合であり、かつ通常はＯ−グリコシル結合である。ガラクトシル基と窒素含有アクセプターとの間の結合は、他の選択肢としてＮ−グリコシル結合であってもよい。
【００３７】
本発明に係る方法は、好ましくは、ガラクトシルドナーとガラクトシルアクセプターとを用いた１種以上のガラクトオリゴ糖を含む組成物の製造方法である。ただし、この１種以上のガラクトオリゴ糖は、その還元末端としてガラクトシルアクセプターを有する。
【００３８】
本発明との関連では、「方法」および「プロセス」という用語は、同義的に用いられる。
【００３９】
ステップａ）は、オリゴ糖を生成する混合物の提供を含む。
【００４０】
混合物は、好ましくは、液体混合物であり、たとえば、ガラクトシルアクセプターとガラクトシルドナーとを含有する水性溶液でありうる。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態では、ステップａ）の混合物のガラクトシルアクセプターとガラクトシルドナーとのモル比は、少なくとも１：５、好ましくは少なくとも１：１、さらにより好ましくは少なくとも５：１である。たとえば、ステップａ）の混合物のガラクトシルアクセプターとガラクトシルドナーとのモル比は、少なくとも１０：１、たとえば少なくとも１５：１でありうる。
【００４２】
ステップａ）の混合物のガラクトシルアクセプターとガラクトシルドナーとのモル比は、たとえば、１：１０〜１００：１の範囲内でありうる。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態では、ステップａ）の混合物のガラクトシルアクセプターとガラクトシルドナーとのモル比は、１：１０〜５０：１の範囲内、好ましくは１：５〜３０：１の範囲内、さらにより好ましくは１：１〜２０：１の範囲内である。たとえば、ステップａ）の混合物のガラクトシルアクセプターとガラクトシルドナーとのモル比は、たとえば２：１〜４０：１の範囲内、好ましくは４：１〜３０：１の範囲内、さらにより好ましくは１０：１〜２５：１の範囲内でありうる。
【００４４】
記載のごとく、ガラクトシルドナーは、脱離基に共有結合されたガラクトシル基を含有する。ガラクトシル基は、好ましくはβ−Ｄ−ガラクトピラノシル基である。さらに、ガラクトシル基は、好ましくは、ガラクトシル基の１位からＯ−グリコシド結合を介して脱離基に結合される。
【００４５】
ガラクトシルドナーの脱離基は、たとえば、グリコシル基および／または糖アルコール基である。ガラクトシルドナーの脱離基は、グルコシル基すなわちグルコース残基であることがとくに好ましい。
【００４６】
脱離基が単糖もしくは二糖または対応する糖アルコールのグリコシル基である場合、ガラクトシル基は、好ましくは、ガラクトシル基の１位からＯ−グリコシド結合を介して脱離基に結合され、この結合は、単糖型脱離基の４位または二糖型脱離基の４’位に結合する。
【００４７】
本発明との関連では、「Ｙおよび／またはＸ」という表現は、「Ｙ」または「Ｘ」または「ＹおよびＸ」を意味する。同一の論理手順に沿って、「Ｘ１、Ｘ２、…、Ｘｉ−１、および／またはＸｉ」という表現は、「Ｘ１」または「Ｘ２」または「Ｘｉ−１」または「Ｘｉ」または成分：Ｘ１、Ｘ２、…、Ｘｉ−１、およびＸｉの任意の組合せを意味する。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態では、ガラクトシルドナーは、多くとも１０００ｇ／ｍｏｌのモル重量を有する。たとえば、ガラクトシルドナーは、多くとも５００ｇ／ｍｏｌのモル重量を有しうる。さらに、ガラクトシルドナーは、多くとも３５０ｇ／ｍｏｌのモル重量を有することが好ましいこともありうる。
【００４９】
二糖は、現在のところ好ましいタイプのガラクトシルドナーである。他の選択肢としてまたは追加として、三糖もまた、ガラクトシルドナーとして使用されうる。したがって、混合物は、異なるガラクトシルドナーの組合せを含有しうると考えられる。
【００５０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ガラクトシルドナーはラクトースである。有用なガラクトシルドナーの他の例は、ラクツロースである。そのほかに、有用なガラクトシルドナーの例は、ラクチトールである。
【００５１】
本発明との関連では、「ラクトース」という用語は、二糖のβ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−グルコースを意味する。これはまた、乳糖としても参照され、ウシ乳の最も主要な糖である。
【００５２】
ガラクトシルドナーは、精製ラクトースなどの工業精製源および／またはホエー透過液（すなわち、ホエーの限外濾過により調製される脱タンパク質化ホエー）などの天然源の両方の任意の有用なガラクトシルドナー源を介して提供されうる。
【００５３】
ガラクトシルアクセプターは、第１の酵素によりもたらされるガラクトシル基を受容可能な任意の分子でありうる。典型的には、ヒドロキシル基、好ましくはアルコール性ヒドロキシル基を含有する。「アクセプト」という用語は、ドナーのガラクトシル基がたとえばＯ−グリコシル結合を介してアクセプターに共有結合されなければならないことを意味する。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態では、ガラクトシルアクセプターは、１個以上のアルコール性ヒドロキシル基を含む。たとえば、ガラクトシルアクセプターは、ポリオールでありうる。
【００５５】
本発明との関連では、「ポリオール」という用語は、少なくとも２個のアルコール性ヒドロキシル基を含む分子を意味する。
【００５６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ガラクトシルアクセプターは、ラクトースではない。ガラクトシルアクセプターは、グルコースでないことがさらに好ましいこともありうる。
【００５７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ガラクトシルアクセプターは、ガラクトシルドナーとは異なる。ガラクトシル源としてラクトースなどの比較的安価なガラクトシルドナーと、ガラクトシルアクセプターとしてフコースなどの生物学的に興味深いアクセプターと、を使用することがとくに好ましい。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態では、ガラクトシルアクセプターは、ラクトースでもなく、ガラクトースでもなく、グルコースでもない。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態では、ガラクトシルアクセプターは、グルコースでもなく、一般式Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｉ−Ｇｌｃ（式中、ｉは、非負の整数、すなわち、たとえば、０、１、２、３、または４である）で示されるオリゴ糖でもない。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態では、ガラクトシルアクセプターは、ガラクトースでもなく、一般式Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｉ−Ｇａｌ（式中、ｉは、非負の整数である）で示されるオリゴ糖でもない。
【００６１】
種々のモル重量を有するガラクトシルアクセプターを使用しうるが、少なくとも１００ｇ／ｍｏｌのモル重量を有するガラクトシルアクセプターが現在のところ有利である。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態では、ガラクトシルアクセプターは、多くとも１０００ｇ／ｍｏｌのモル重量を有する。たとえば、ガラクトシルアクセプターは、多くとも５００ｇ／ｍｏｌのモル重量を有しうる。さらに、ガラクトシルアクセプターは、多くとも３５０ｇ／ｍｏｌのモル重量を有することが好ましいこともありうる。ガラクトシルアクセプターは、たとえば、多くとも２００ｇ／ｍｏｌのモル重量を有する。
【００６３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ガラクトシルアクセプターは糖である。ガラクトシルアクセプターは、たとえば、単糖でありうる。他の選択肢として、ガラクトシルアクセプターは二糖でありうる。
【００６４】
たとえば、ガラクトシルアクセプターはペントースでありうる。ガラクトシルアクセプターは、たとえば、アラビノースでありうる。有用なペントースの他の例はキシロースである。そのほかに、有用なペントースの例はリボースである。ガラクトシルアクセプターは、たとえば、アラビノース、キシロース、およびリボースからなる群から選択されるペントースである。
【００６５】
ヘキソースは、有用なガラクトシルアクセプターの他の群である。ガラクトシルアクセプターは、たとえば、マンノースでありうる。有用なヘキソースの他の例はガラクトースである。そのほかに、有用なヘキソースの例はタガトースである。有用なヘキソースのさらなる例はフルクトースである。ガラクトシルアクセプターは、たとえば、マンノース、ガラクトース、タガトースはおよびフルクトースからなる群から選択されるヘキソースである。
【００６６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ガラクトシルアクセプターはデオキシヘキソースである。ガラクトシルアクセプターは、たとえば、フコース、たとえば、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、それらの混合物などでありうる。
【００６７】
他の選択肢として、ガラクトシルアクセプターは、オリゴ糖、たとえば、二糖、三糖などでありうる。有用な二糖の例は、マルトースである。有用な二糖の他の例は、ラクツロースである。
【００６８】
そのほかに、ガラクトシルアクセプターの有用な群は、糖誘導体である。
【００６９】
本発明との関連では、「糖誘導体」という用語は、１個以上の非ヒドロキシル官能基を含有する糖を意味する。そのような官能基の例は、カルボキシル基、アミノ基、Ｎ−アセチルアミノ基、および／またはチオール基である。１位にアルデヒド基または２位にケトン基を含有する糖は、糖が以上に挙げた非ヒドロキシル官能基のいくつかを含まないかぎり、それ自体では糖誘導体とはみなされない。
【００７０】
有用な糖誘導体の例は、Ｎ−アセチルガラクトサミンである。有用な糖誘導体の他の例は、シアル酸である。そのほかに、有用な糖誘導体の例は、シアリルラクトースである。したがって、ガラクトシルアクセプターは、Ｎ−アセチルガラクトサミン、シアル酸、およびシアリルラクトースからなる群から選択される糖誘導体でありうる。
【００７１】
有用なガラクトシルアクセプターの他の群は、糖アルコールである。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、ガラクトシルアクセプターは、糖アルコールである。有用な糖アルコールの例は、ソルビトール、キシリトール、ラクチトール、および／またはマルチトールである。
【００７２】
以上に挙げたガラクトシルアクセプターとは対照的に、本発明者らは、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびグルコースがより低効率のガラクトシルアクセプターであることを見いだした。したがって、本発明のいくつかの実施形態では、ガラクトシルアクセプターは、グルコースでもなく、Ｎ−アセチルグルコサミンでもない。
【００７３】
混合物は、第１のタイプのガラクトシルアクセプターとは異なる１種以上のさらなるガラクトシルアクセプターを含有しうる。混合物の異なるタイプのガラクトシルアクセプターは、たとえば、本明細書に挙げられたガラクトシルアクセプターのタイプの中から選択されうる。
【００７４】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、生成されたガラクトシル化アクセプターは、新しいタイプのガラクトシルアクセプターとして作用し、これもまたガラクトシル化されうる。このようにして、化学量論式Ｇａｌｉ＋１Ｘ（式中、ｉは、非負の整数である）を有するガラクトオリゴ糖が生成されうる。通常、最も主要な種は、ＧａｌＸ、Ｇａｌ２Ｘ、およびＧａｌ３Ｘである。
【００７５】
本発明の他の好ましい実施形態では、生成されたガラクトシル化アクセプターは、新しいタイプのガラクトシルアクセプターとして作用し、これもまたガラクトシル化されうる。このようにして、一般式Ｇａｌ−（Ｇａｌ）ｉ−Ｘ（式中、ｉは、非負の整数である）を有するガラクトオリゴ糖が生成されうる。通常、最も主要な種は、Ｇａｌ−Ｘ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘ、およびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘである。
【００７６】
本発明のいくつかの実施形態では、ステップａ）の混合物は、多くとも０．７ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは多くとも０．４ｍｏｌ／Ｌ、さらにより好ましくは多くとも０．２ｍｏｌ／Ｌの濃度でガラクトシルドナーを含む。混合物は、たとえば、０．００１〜０．７ｍｏｌ／Ｌの範囲内、好ましくは０．０１〜０．５ｍｏｌ／Ｌの範囲内、さらにより好ましくは０．０２〜０．２ｍｏｌ／Ｌの範囲内の濃度でガラクトシルドナーを含みうる。
【００７７】
他の選択肢として、ステップａ）の混合物は、多くとも０．３ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは多くとも０．１ｍｏｌ／Ｌ、さらにより好ましくは多くとも０．０５ｍｏｌ／Ｌの濃度でガラクトシルドナーを含みうる。混合物は、たとえば、０．００１〜０．２ｍｏｌ／Ｌの範囲内、好ましくは０．００５〜０．１ｍｏｌ／Ｌの範囲内、さらにより好ましくは０．０１〜０．０５ｍｏｌ／Ｌの範囲内の濃度でガラクトシルドナーを含みうる。
【００７８】
ガラクトシル化ガラクトシルアクセプターおよびガラクトシル化ガラクトシルドナーは、限られた範囲内でガラクトシルドナーとして作用しうるが、本発明との関連では、ガラクトシル化ガラクトシルアクセプターおよびガラクトシル化ガラクトシルドナーは、ガラクトシルドナーとはみなされず、本明細書に挙げられたガラクトシルドナーの濃度にも比にも寄与しないことに留意すべきである。
【００７９】
ガラクトシルアクセプターは、一群の異なる濃度で使用可能である。しかしながら、過剰のガラクトシルアクセプターは、通常、本発明に係るガラクトオリゴ糖含有組成物から除去しなければならないので、ガラクトシルアクセプターで混合物を飽和することは避けたほうがよい。
【００８０】
本発明のいくつかの実施形態では、ステップａ）の混合物は、少なくとも０．０５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは少なくとも０．１０ｍｏｌ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも０．３０ｍｏｌ／Ｌの量でガラクトシルアクセプターを含む。さらに高濃度のガラクトシルアクセプターが好ましいこともありうるので、ステップａ）の混合物は、たとえば、少なくとも０．５ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは少なくとも０．７ｍｏｌ／Ｌ、さらにより好ましくは少なくとも１ｍｏｌ／Ｌの量でガラクトシルアクセプターを含みうる。
【００８１】
混合物は、たとえば、０．０５ｍｏｌ／Ｌ〜５ｍｏｌ／Ｌの範囲内、好ましくは０．１ｍｏｌ／Ｌ〜２ｍｏｌ／Ｌの範囲内、さらにより好ましくは０．３ｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌの範囲内の濃度でガラクトシルアクセプターを含みうる。
【００８２】
しかしながら、いくつかの実施形態では、比較的低濃度のガラクトシルアクセプターが好ましく、その場合、混合物は、たとえば、多くとも２ｍｏｌ／Ｌ、好ましくは多くとも０．５ｍｏｌ／Ｌ、さらにより好ましくは多くとも０．２ｍｏｌ／Ｌの濃度でガラクトシルアクセプターを含みうる。たとえば、混合物は、０．０５ｍｏｌ／Ｌ〜２ｍｏｌ／Ｌの範囲内、好ましくは０．０６ｍｏｌ／Ｌ〜１ｍｏｌ／Ｌの範囲内、さらにより好ましくは０．０８ｍｏｌ／Ｌ〜０．８ｍｏｌ／Ｌの範囲内の濃度でガラクトシルアクセプターを含みうる。
【００８３】
ガラクトシルアクセプターおよびガラクトシルドナーに加えて、混合物は、酵素反応の条件を最適化のために、種々の添加剤をさらに含有しうる。
【００８４】
混合物は、たとえば、混合物のｐＨを第１の酵素の最適ｐＨ値に調整するために、１種以上のｐＨ緩衝剤を含有しうる。他の選択肢としてまたは追加として、混合物は、１種以上の金属イオンを含有する水溶性塩を含みうる。特定の第１の酵素に依存して、たとえば、Ｃａ２＋、Ｚｎ２＋、Ｍｇ２＋などの金属イオンを使用しうる。しかしながら、いくつかの第１の酵素は、混合物中の金属イオンの存在に対して非感受性であることに留意されたい。
【００８５】
オリゴ糖の従来の合成方法では、多くの場合、たとえば、グリセロール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水分活性低下剤が利用される。本発明によれば、有利なことに、そのような水分活性低下剤を用いることなくガラクトオリゴ糖の効率的な合成を行うことが可能になる。したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、混合物は、混合物の重量を基準にして多くとも５重量％、好ましくは多くとも１重量％、さらにより好ましくは多くとも０．１重量％の量で水分活性低下剤を含有する。たとえば、混合物は、混合物の重量を基準にして多くとも０．０５重量％の量で水分活性低下剤を含有しうる。
【００８６】
ステップａ）の混合物または混合物を形成する成分は、反応時の微生物増殖を回避するために、第１の酵素による反応前に熱処理されたものであってもよい。低温殺菌（たとえば、７２℃で１５秒間）、高温殺菌（たとえば、９０℃で１５秒間）、ＵＨＴ処理（たとえば、１４０℃で４秒間）などの通常の熱処理プロセスを使用することが可能である。温度不安定性酵素を熱処理する場合、注意を払うべきである。
【００８７】
ステップｂ）は、好ましくはβ−ガラクトシダーゼ活性を有する第１の酵素の提供を含む。好ましくは、第１の酵素は、β−ガラクトシダーゼ活性に加えてガラクトシル転移活性を有する。また、第１の酵素は、多くとも０．９のＴ値を有することが好ましいこともありうる。本方法は、追加の酵素、たとえば、β−ガラクトシダーゼ活性またはガラクトシル転移活性とは異なる酵素活性を有する酵素の使用をさらに含みうることに留意すべきである。
【００８８】
本発明との関連では、「β−ガラクトシダーゼ活性」という用語は、ラクトースなどのβ−Ｄ−ガラクトシド中の末端の非還元性β−Ｄ−ガラクトース残基を加水分解する酵素触媒作用を意味する。本発明で使用される第１の酵素は、好ましくは、クラスＥＣ３．２．１．２３に属する。
【００８９】
第１の酵素は、Ｔ値が多くとも０．９であることが好ましい。本発明のいくつかの実施形態では、第１の酵素のＴ値は、多くとも０．８、好ましくは多くとも０．７、さらにより好ましくは多くとも０．６である。たとえば、第１の酵素のＴ値は、多くとも０．５でありうる。好ましくは、第１の酵素のＴ値は、多くとも０．４でありうる。さらに、第１の酵素のＴ値は、多くとも０．３であることがより好ましいこともありうる。
【００９０】
多くとも０．２などのようなさらに低いＴ値が好ましいこともありうる。
【００９１】
有用な第１の酵素は、たとえば、配列番号１のＤＮＡ配列によりコードされるペプチドから誘導されうる。たとえば、有用な第１の酵素を誘導しうるそのようなペプチドの例は、配列番号２のアミノ酸配列を有するペプチドである。
【００９２】
配列番号１および配列番号２は、ＰＣＴ出願国際公開第０１／９０，３１７Ａ２号パンフレットに見いだされうる。そこでは、それらは、配列番号１および配列番号２として参照されている。そのほかにも、国際公開第０１／９０，３１７Ａ２号パンフレットには、さらなる有用な第１の酵素が見いだされうる。
【００９３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の酵素は、配列番号２のペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。たとえば、第１の酵素は、配列番号２のペプチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。いくつかの場合、第１の酵素は、配列番号２のペプチドに対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
【００９４】
本発明との関連では、「配列同一性」という用語は、等しい長さの２つのアミノ酸配列間または等しい長さの２つの核酸配列間の同一度の定量的尺度を意味する。比較される２つの配列が等しい長さでない場合、それらは、できる限り最良の当てはめになるようにアライメントされなければならない。配列同一性は、
（Ｎｒｅｆ−Ｎｄｉｆ）×１００）／（Ｎｒｅｆ）
（ここで、Ｎｄｉｆは、２つの配列中の同一でない残基の全数であり、かつＮｒｅｆは、１つの配列中の残基の数である）
として計算可能である。したがって、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣに対して７５％の配列同一性（Ｎｄｉｆ＝２およびＮｒｅｆ＝８）を有するであろう。ギャップは、特定の残基の非同一物としてカウントされる。すなわち、ＤＮＡ配列ＡＧＴＧＴＣは、ＤＮＡ配列ＡＧＴＣＡＧＴＣに対して７５％の配列同一性（Ｎｄｉｆ＝２およびＮｒｅｆ＝８）を有であろう。配列同一性は、たとえば、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）により提供されるＢＬＡＳＴｐアルゴリズムなどの適切なＢＬＡＳＴプログラムを用いて計算可能である。
【００９５】
本発明の他の好ましい実施形態では、第１の酵素のアミノ酸配列は、配列番号２のペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。たとえば、第１の酵素のアミノ酸配列は、配列番号２のペプチドに対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有しうる。いくつかの場合、第１の酵素のアミノ酸配列は、配列番号２のペプチドに対して少なくとも９９％の配列同一性を有しうる。
【００９６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｙ（９５０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。たとえば、第１の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｙ（９５０）に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。いくつかの場合、第１の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｙ（９５０）に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
【００９７】
本発明の他の好ましい実施形態では、第１の酵素のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｙ（９５０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。たとえば、第１の酵素のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｙ（９５０）に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有しうる。いくつかの場合、第１の酵素のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｙ（９５０）に対して少なくとも９９％の配列同一性を有しうる。したがって、第１の酵素は、たとえば、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｙ（９５０）を有しうる。
【００９８】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｕ（９１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。たとえば、第１の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｕ（９１７）に対して少なくとも９０％の配列同一性、好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７．５％を有するアミノ酸配列を含みうる。いくつかの場合、第１の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｕ（９１７）に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
【００９９】
本発明の他の好ましい実施形態では、第１の酵素のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｕ（９１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。たとえば、第１の酵素のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｕ（９１７）に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有しうる。いくつかの場合、第１の酵素のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｕ（９１７）に対して少なくとも９９％の配列同一性を有しうる。したがって、第１の酵素は、たとえば、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｕ（９１７）を有しうる。
【０１００】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列Ｍｅｔ（１）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。たとえば、第１の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列Ｍｅｔ（１）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。いくつかの場合、第１の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列Ｍｅｔ（１）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
【０１０１】
本発明の他の好ましい実施形態では、第１の酵素のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列Ｍｅｔ（１）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。たとえば、第１の酵素のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列Ｍｅｔ（１）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有しうる。いくつかの場合、第１の酵素のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列Ｍｅｔ（１）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも９９％の配列同一性を有しうる。
【０１０２】
本発明のいくつかの現在のところ好ましい実施形態では、第１の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列Ｍｅｔ（１）〜Ｉｌｅ（１１７４）を有する。
【０１０３】
本発明のいくつかの実施形態では、第１の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。たとえば、第１の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。いくつかの場合、第１の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
【０１０４】
本発明の他の実施形態では、第１の酵素のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有しうる。たとえば、第１の酵素のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９７．５％の配列同一性を有しうる。いくつかの場合、第１の酵素のアミノ酸配列は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも９９％の配列同一性を有しうる。したがって、第１の酵素は、たとえば、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）を有しうる。
【０１０５】
本発明のいくつかの現在のところ好ましい実施形態では、第１の酵素は、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）を有する。
【０１０６】
第１の酵素は、たとえば、
・配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｍｅｔ（１）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｙ（９５０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含みうる。
【０１０７】
他の選択肢として、第１の酵素は、たとえば、
・配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｍｅｔ（１）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｙ（９５０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなりうる。
【０１０８】
第１の酵素は、たとえば、
・配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｍｅｔ（１）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｙ（９５０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｕ（９１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含みうる。
【０１０９】
他の選択肢として、第１の酵素は、たとえば、
・配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｍｅｔ（１）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｙ（９５０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｕ（９１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
からなりうる。
【０１１０】
本発明のいくつかの実施形態では、第１の酵素は、たとえば、表１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。第１の酵素は、たとえば、表１に示されるアミノ酸配列を含む。他の選択肢として、第１の酵素のアミノ酸配列は、表１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有しうる。第１の酵素は、たとえば、表１に示されるアミノ酸配列を有する。
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【０１１１】
本発明のいくつかの実施形態では、酵素は、たとえば、表２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。酵素は、たとえば、表２に示されるアミノ酸配列を含む。他の選択肢として、酵素のアミノ酸配列は、表２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有しうる。酵素は、たとえば、表２に示されるアミノ酸配列を有する。
2015508291.tif 000006
【０１１２】
本発明のいくつかの実施形態では、酵素は、たとえば、表３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。酵素は、たとえば、表３に示されるアミノ酸配列を含む。他の選択肢として、酵素のアミノ酸配列は、表３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有しうる。酵素は、たとえば、表３に示されるアミノ酸配列を有する。
2015508291.tif 000007
【０１１３】
本発明のいくつかの実施形態では、酵素は、たとえば、表４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。酵素は、たとえば、表４に示されるアミノ酸配列を含む。他の選択肢として、酵素のアミノ酸配列は、表４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有しうる。酵素は、たとえば、表４に示されるアミノ酸配列を有する。
2015508291.tif 000008
【０１１４】
本発明のいくつかの実施形態では、第１の酵素は、たとえば、表５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。第１の酵素は、たとえば、表５に示されるアミノ酸配列を含む。他の選択肢として、第１の酵素のアミノ酸配列は、表５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有しうる。第１の酵素は、たとえば、表５に示されるアミノ酸配列を有する。
2015508291.tif 000009
【０１１５】
本発明のいくつかの実施形態では、第１の酵素は、たとえば、表６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。第１の酵素は、たとえば、表６に示されるアミノ酸配列を含む。他の選択肢として、第１の酵素のアミノ酸配列は、表６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性を有しうる。第１の酵素は、たとえば、表６に示されるアミノ酸配列を有する。
2015508291.tif 000010
【０１１６】
ガラクトシル転移活性を有する有用な第１の酵素の他の例は、国際公開第２０１１／１２０９９３Ａ１号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に見いだされうる。
【０１１７】
本発明のいくつかの実施形態では、第１の酵素は、１個以上のグリコシル化アミノ酸を含有しうる。他の選択肢としてまたは追加として、第１の酵素は、１個以上のリン酸化アミノ酸を含有しうる。他の選択肢として、第１の酵素のアミノ酸はいずれも、グリコシル化もリン酸化もされない。
【０１１８】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の酵素は、少なくとも２つのサブユニットを含み、各サブユニットは、以上に定義された第１の酵素からなる。
【０１１９】
第１の酵素は、好ましくは、混合物に接触することにより、ガラクトシルアクセプターとガラクトシルドナーとの両方に接触する。
【０１２０】
本発明のいくつかの実施形態では、混合物は、第１の酵素および／または第２の酵素を含む。第１の酵素および／または第２の酵素は、たとえば、溶解形態で、たとえば、単一の酵素分子としてまたは酵素分子の可溶性アグリゲートとして存在しうる。
【０１２１】
本発明の他の実施形態では、第１の酵素および／または第２の酵素は、混合物から分離されているが、第１の酵素および／または第２の酵素を混合物に接触させることにより、ガラクトシルドナーおよびガラクトシルアクセプターに接触する。たとえば、固定固相上に固定された第１の酵素および／または第２の酵素を使用しうる。有用な固定固相の例は、たとえば、フィルター、第１の酵素を含有する粒子の充填床、または類似の構造である。
【０１２２】
他の選択肢として、固相は、たとえば、混合物の一部を形成する自由流動性粒子状固相、たとえば、有機または無機のビーズでありうる。
【０１２３】
固定化技術および好適な固相タイプをはじめとする酵素の工業的使用に関する詳細は、Ｂｕｃｈｈｏｌｚ（２００５）（参照によりあらゆる目的で本明細書に組み込まれる）に見いだされうる。
【０１２４】
第１の酵素は、好ましくは、ガラクトオリゴ糖の許容可能な収率を得るのに十分な活性で使用される。最適な活性は、プロセスの特定の実施形態に依存し、当業者により容易に決定可能である。
【０１２５】
ガラクトシルドナーの高い代謝回転およびガラクトオリゴ糖の高い収率が必要とされる場合、第１の酵素を比較的高い活性で使用することが好ましいこともありうる。たとえば、第１の酵素の活性は、ガラクトシルドナーの代謝回転が少なくとも０．０２ｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）、好ましくは少なくとも０．２ｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）、さらにより好ましくは少なくとも２ｍｏｌ／（Ｌ・ｈ）になるようにするものでありうる。
【０１２６】
酵素反応は、ステップｃ）のインキュベーション時に行われる。ガラクトシル転移は、通常、混合物を適正条件に暴露したらできる限り早く（ガラクトシルアクセプターおよびガラクトシルドナーを第１の酵素に接触させたほぼ直後でありうる）開始され、本発明のいくつかの実施形態では、ステップｂ）およびｃ）は、同時に行われる。
【０１２７】
第１の酵素は、ガラクトシルドナーの脱離基を放出させて、ガラクトシル基をガラクトシルドナーからガラクトシルアクセプターに転移することが可能である。たとえば、ガラクトシルドナーがラクトースである場合、グルコースが放出されて、ガラクトシル基がアクセプターに転移される。第１の酵素は、酵素反応時に触媒として作用する。
【０１２８】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、第１の酵素は、ガラクトシル基をすでにガラクトシル化されたガラクトシルアクセプターにさらに転移することにより、２個、３個、さらにはそれ以上のガラクトシル基を含有するガラクトシルアクセプターを生成する。
【０１２９】
インキュベート中の混合物のｐＨは、好ましくは、第１の酵素の最適ｐＨの近傍である。本発明のいくつかの実施形態では、ステップｃ）でのインキュベート中の混合物のｐＨは、ｐＨ３〜９の範囲内である。たとえば、ステップｃ）でのインキュベート中の混合物のｐＨは、ｐＨ４〜８の範囲内、たとえばｐＨ５〜７．５の範囲内でありうる。
【０１３０】
ｐＨと同様に、インキュベート中の混合物の温度は、好ましくは、使用される第１の酵素の最適温度に調整される。本発明のいくつかの実施形態では、ステップｃ）のインキュベート中の混合物の温度は、１０〜８０℃の範囲内である。インキュベート中の混合物の温度は、たとえば、２０〜７０℃の範囲内、好ましくは２５〜６０℃の範囲内、さらにより好ましくは３０〜５０℃の範囲内でありうる。
【０１３１】
本発明との関連では、「第１の酵素の最適ｐＨ」という用語は、第１の酵素が最大ガラクトシル転移活性を有するｐＨを意味する。同一の手順に沿って、「第１の酵素の最適温度」という用語は、第１の酵素が最大ガラクトシル転移活性を有する温度を意味する。
【０１３２】
ステップｃ）は、インキュベート中の混合物を撹拌することをさらに含みうる。
【０１３３】
遊離脱離基の除去は、ステップｃ）のインキュベーション時に行われる。除去は、たとえば、ステップｃ）の開始直後に開始されうるか、または有意量の遊離脱離基がインキュベート中の混合物中に蓄積し始めるまで延期されうる。
【０１３４】
遊離脱離基は、たとえば、インキュベート中の混合物中に存在する微生物によりインキュベート中の混合物から除去されうる。
【０１３５】
したがって、本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、ガラクトシルドナーから放出された遊離脱離基を変換可能な微生物を提供することと、ガラクトシルドナーから放出された脱離基をインキュベーション時に前記微生物により除去することと、をさらに含む。
【０１３６】
有用な微生物は、好ましくは、インキュベート中の混合物から遊離脱離基を選択的に除去可能であり、たとえば、これを代謝可能であるか、またはガラクトオリゴ糖の合成を脱離基ほど妨害しない変換生成物に変換可能である。
【０１３７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、微生物による遊離脱離基の除去速度は、それによるガラクトシルアクセプターの除去速度の少なくとも１０倍である。
【０１３８】
たとえば、微生物による遊離脱離基の除去速度は、それによるガラクトシルアクセプターの除去速度の少なくとも１０２倍、好ましくは少なくとも１０３倍、さらに好ましくはそれによるガラクトシルアクセプターの除去速度の少なくとも１０４倍でありうる。微生物による遊離脱離基の除去速度は、たとえば、それによるガラクトシルアクセプターの除去速度の少なくとも１０５倍でありうる。さらに、微生物による遊離脱離基の除去速度は、それによるガラクトシルアクセプターの除去速度の少なくとも１０６倍であることが好ましいこともありうる。さらに好ましくは少なくとも１０７倍でありうる。
【０１３９】
本発明との関連では、「除去速度」という用語は、微生物によりインキュベート中の混合物から１分間あたりに除去可能な遊離脱離基、ドナー、アクセプター、またはモノガラクトシル化アクセプターのモル数を意味する。
【０１４０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、微生物による遊離脱離基の除去速度は、それによるガラクトシルドナーの除去速度の少なくとも１０倍である。
【０１４１】
たとえば、微生物による遊離脱離基の除去速度は、それによるガラクトシルドナーの除去速度の少なくとも１０２倍、好ましくは少なくとも１０３倍、さらに好ましくはそれによるガラクトシルドナーの除去速度の少なくとも１０４倍でありうる。微生物による遊離脱離基の除去速度は、たとえば、それによるガラクトシルドナーの除去速度の少なくとも１０５倍でありうる。さらに、微生物による遊離脱離基の除去速度は、それによるガラクトシルドナーの除去速度の少なくとも１０６倍であることが好ましいこともありうる。さらに好ましくは少なくとも１０７倍でありうる。
【０１４２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、微生物による遊離脱離基の除去速度は、それによるモノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターの除去速度の少なくとも１０倍である。
【０１４３】
たとえば、微生物による遊離脱離基の除去速度は、それによるモノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターの除去速度の少なくとも１０２倍、好ましくは少なくとも１０３倍、さらに好ましくはそれによるモノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターの除去速度の少なくとも１０４倍でありうる。微生物による遊離脱離基の除去速度は、たとえば、それによるモノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターの除去速度の少なくとも１０５倍でありうる。さらに、微生物による遊離脱離基の除去速度は、それによるモノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターの除去速度の少なくとも１０６倍であることが好ましいこともありうる。さらに好ましくは少なくとも少なくとも１０７倍でありうる。
【０１４４】
微生物は、好ましくは、酵母または細菌である。
【０１４５】
サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、有用酵母の例であり、有用細菌は、たとえば、ＬａｃＺ陰性Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株またはグルコースを代謝可能であるがラクトースを代謝可能でない他の細菌でありうる。
【０１４６】
他の選択肢としてまたは追加として、遊離脱離基は、脱離基を他の化学種に変換する特異的酵素を利用してインキュベート中の混合物から除去されうる。
【０１４７】
したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本方法は、ガラクトシルドナーから放出された遊離脱離基を変換可能な第２の酵素を提供することと、ガラクトシルドナーから放出された脱離基をインキュベーション時に前記第２の酵素により変換することと、をさらに含む。
【０１４８】
「遊離脱離基を変換する」という用語は、遊離脱離基を好ましくは遊離脱離基それ自体よりも弱いガラクトシルアクセプターである化学種に変換するプロセスを意味する。変換は、遊離脱離基をいくつかのより小さい化学種に分解することを含みうるか、または単に遊離脱離基を異なる化学種に変換することを含みうる。
【０１４９】
本発明は、たとえば、１種以上のガラクトオリゴ糖を含む組成物の製造方法に関する。この方法は、
ａ）
・脱離基に結合されたガラクトシル基を含むガラクトシルドナーであって、多くとも３５０ｇ／ｍｏｌのモル重量を有するガラクトシルドナーと、
・ガラクトシルドナーとは異なるガラクトシルアクセプターであって、糖または糖アルコールであるガラクトシルアクセプター、
を含む混合物を提供するステップであって、ガラクトシルアクセプターとガラクトシルドナーとのモル比は、少なくとも１：１０であり、かつ混合物は、少なくとも０．０５ｍｏｌ／Ｌのガラクトシルアクセプターを含む提供するステップ、
ｂ）第１の酵素と第２の酵素とを提供するステップであって、前記第１の酵素は、β−ガラクトシダーゼ活性を有しかつＴ値が多くとも０．９であり、前記第２の酵素は、ガラクトシルドナーから放出された遊離脱離基を変換可能であり、かつ前記第１および第２の酵素は、混合物に接触する提供するステップ、および
ｃ）第１の酵素によりガラクトシルドナーの脱離基を放出させてガラクトシルドナーのガラクトシル基をガラクトシルアクセプターに転移することによりガラクトオリゴ糖を形成するとともに、ガラクトシルドナーから放出された脱離基を第２の酵素により変換することにより、ガラクトオリゴ糖を含む組成物を取得するステップ、
を含む。
【０１５０】
第２の酵素は、たとえば、ヘキソースオキシダーゼ活性を有しうる。すなわち、酵素クラスＥＣ１．１．３．５に属し、Ｏ２によるβ−Ｄ−グルコースの酸化を触媒してＤ−グルコノ−１，５−ラクトンと過酸化水素とを形成する能力を有しうる。
【０１５１】
第２の酵素は、グルコースオキシダーゼ活性を有することがさらにより好ましい。すなわち、酵素クラスＥＣ１．１．３．４に属し、Ｏ２によるβ−Ｄ−グルコースの酸化を触媒してラクトースなどのグルコース含有二糖の有意な酸化を伴うことなくＤ−グルコノ−１，５−ラクトンと過酸化水素とを形成する能力を有する。
【０１５２】
水性酸性環境では、Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトンは、典型的には、加水分解してグルコン酸を形成する。
【０１５３】
他の選択肢として、第２の酵素は、ヘキソキナーゼ活性（ＥＣ２．７．１．１）またはグルコキナーゼ活性（ＥＣ２．７．１．２）を有しうる。
【０１５４】
他の有用な第２の酵素は、たとえば、当業者であれば入手可能なハンドブック中に見いだされうる。
【０１５５】
第２の酵素は、それによる遊離脱離基の変換に関して選択的であり、ガラクトシルドナー、ガラクトシルアクセプター、および／またはガラクトオリゴ糖を限られた範囲内でのみ変換し、好ましくはまったく変換しないことが好ましい。
【０１５６】
したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０倍である。
【０１５７】
たとえば、遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０２倍、好ましくは少なくとも１０３倍、さらにより好ましくはガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０４倍でありうる。遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、たとえば、ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０５倍でありうる。さらに、遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０６倍であることが好ましいこともありうる。さらにより好ましくは少なくとも１０７倍でありうる。
【０１５８】
「特異性定数」という用語は、ｋｃａｔ／Ｋｍとして決定され、反応のすべてのステップの速度定数を内包する。特異性定数は、親和性および触媒能力の両方を反映するので、異なる酵素を互いに比較したり、同一の酵素で異なる基質を比較したりするのに有用である。特異性定数の理論最大値は、限界と呼ばれ、約１０８〜１０９（Ｍ−１ｓ−１）である。この点では、酵素とその基質との衝突はすべて、触媒作用をもたらすであろう。また、生成物生成速度は、反応速度が律速ではなく、拡散速度が律速となる。
【０１５９】
第２の酵素のｋｃａｔおよびＫｍは、ｐＨ６．５に調整された５０ｍＭ  Ｎａ３ＰＯ４緩衝液を用いて３７度で決定される。緩衝液は、酵素の最適性能に必要とされる塩および補因子をさらに含有する。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも１０倍である。
【０１６０】
たとえば、遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも１０２倍、好ましくは少なくとも１０３倍、さらにより好ましくはガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも１０４倍でありうる。遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、たとえば、ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも１０５倍でありうる。さらに、遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも１０６倍であることが好ましいこともありうる。さらにより好ましくは少なくとも１０７倍でありうる。
【０１６１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプター（Ｇａｌ−Ｘ）に対するその特異性定数の少なくとも１０倍である。
【０１６２】
たとえば、遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０２倍、好ましくは少なくとも１０３倍、さらにより好ましくはモノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０４倍でありうる。遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、たとえば、モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０５倍でありうる。さらに、遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０６倍であることが好ましいこともありうる。さらにより好ましくは少なくとも１０７倍でありうる。
【０１６３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、
・ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも１０倍、
・ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０倍、かつ
・モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０倍
である。
【０１６４】
たとえば、遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、
・ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも１０２倍、
・ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０２倍、かつ
・モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０２倍
でありうる。
【０１６５】
好ましくは、遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、
・ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも１０３倍、
・ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０３倍、かつ
・モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０３倍
でありうる。
【０１６６】
他の選択肢として、遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、
・ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも１０４倍、
・ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０４倍、かつ
・モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０４倍
でありうる。
【０１６７】
遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、
・ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも１０５倍、
・ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０５倍、かつ
・モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０５倍
でありうる。
【０１６８】
遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、
・ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも１０６倍、
・ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０６倍、かつ
・モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０６倍
であることがさらにより好ましい。
【０１６９】
遊離脱離基に対する第２の酵素の特異性定数は、たとえば、
・ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも１０７倍、
・ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０７倍、かつ
・モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０７倍
である。
【０１７０】
第２の酵素は、グルコースオキシダーゼ活性を有し、かつガラクトシルドナーの脱離基は、グルコシル基であることがとくに好ましい。その場合、遊離脱離基は、グルコースである。第２の酵素がグルコースオキシダーゼ活性を有する場合、ラクトースは、好ましいガラクトシルドナーである。
【０１７１】
グルコースオキシダーゼは、酸化剤としてＯ２を必要とするので、水中の溶存Ｏ２の通常量が不十分な場合、インキュベート中の混合物に追加のＯ２（ｇ）を添加することが必要なこともありうる。また、所要により、インキュベート中の混合物にＦＡＤ（フラビンアデニンジヌクレオチド）やＮＡＤ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）などの補因子を添加することも可能である。
【０１７２】
以上に述べたように、グルコースオキシダーゼがグルコースからＤ−グルコノ−１，５−ラクトンへの酸化を触媒するときにＨ２Ｏ２が形成され、高レベルのＨ２Ｏ２が、たとえば、使用される酵素の望ましくない酸化に起因して、プロセスの問題になりうる。本発明のいくつかの実施形態では、本方法は、インキュベート中の混合物に接触する、かつＨ２Ｏ２からたとえばＨ２ＯおよびＯ２への分解を触媒する、ペルオキシダーゼまたはカタラーゼを提供することをさらに含む。グルコースオキシダーゼおよびカタラーゼは両方とも、先行技術では周知であり、市販されている。有用なグルコースオキシダーゼの例は、Ｇｌｙｚｙｍｅ  ＢＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）である。有用なカタラーゼ酵素の例は、Ｃａｔａｚｙｍｅ  ２５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）である。他の例は、ミクロコッカス・リソデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来のカタラーゼ酵素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｅｎｍａｒｋ）である。
【０１７３】
本方法は、インキュベート中の混合物と、ラクトナーゼ、好ましくはグルコノラクトナーゼ、すなわち、Ｄ−グルコノ−１，５−ラクトンをグルコン酸またはその対応する塩基グルコン酸塩に加水分解可能な酵素（ＥＣ３．１．１．１７）と、を接触させることをさらに含みうる。
【０１７４】
したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、インキュベート中の混合物は、グルコースオキシダーゼ活性を有する酵素、グルコースオキシダーゼ活性カタラーゼ活性を有する酵素、およびグルコノラクトナーゼ活性を有する酵素に接触させる。
【０１７５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本方法は、第２の酵素により脱離基を変換することにより得られた変換生成物の少なくとも一部を除去可能な除去剤を提供することと、除去剤により変換生成物の少なくとも一部をインキュベーション時に除去することと、をさらに含む。
【０１７６】
本発明との関連では、「除去剤」という用語は、変換生成物を捕獲して、インキュベート中の混合物からたとえば沈殿によりそれを除去可能な粒子状または分子状の作用剤を意味する。
【０１７７】
除去剤は、たとえば、二価または三価の金属イオンの塩を含みうるか、さらにはそれらからなりうる。有用な金属イオンの例は、Ｃａ２＋、Ｆｅ２＋、Ａｌ３＋、またはＺｎ２＋である。
【０１７８】
本発明の好ましい実施形態では、除去剤は、ＣａＣＯ３を含むか、さらにはそれからなる。
【０１７９】
負荷電変換生成物、たとえば、グルコン酸イオン、すなわち、脱プロトン化された形態のグルコン酸は、陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて除去されうる。
【０１８０】
したがって、除去剤は、陰イオン交換材料を含みうるか、さらにはそれからなりうる。
【０１８１】
本発明のいくつかの実施形態では、陰イオン交換材料は、固相と１つ以上の陽イオン性基とを含む。
【０１８２】
好ましくは、陽イオン性基の少なくともいくつかは、固相の外表面におよび／または固相の表面を通って到達可能な細孔の表面に結合される。
【０１８３】
本発明のいくつかの実施形態では、陰イオン交換材料の固相は、複数の粒子、フィルター、および膜からなる群から選択される１つ以上の要素を含む。
【０１８４】
固相は、たとえば、多糖を含みうるか、さらにはそれからなりうる。架橋多糖は、とくに好ましい。有用な多糖の例は、セルロース、アガロース、および／またはデキストランである。他の選択肢として、固相は、非炭水化物ポリマーを含みうるか、さらにはそれからりうる。有用な非炭水化物ポリマーの例は、メタクリレート、ポリスチレン、および／またはスチレン−ジビニルベンゼンである。
【０１８５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、陽イオン性基は、アミノ基を含むか、さらにはそれからなる。第三級アミノ基は、とくに好ましく、適切なｐＨ条件下で第四級アンモニウム基を生じる。第四級アンモニウム基は、陰イオン交換材料に強力な陰イオン交換特性を提供する。
【０１８６】
他の選択肢としてまたは追加として、陽イオン性基は、１つ以上の第一級または第二級のアミノ基を含みうる。実質的量の第一級または第二級のアミノ基は、典型的には、弱いアニオン交換特性を有する陰イオン交換材料を提供する。陰イオン交換クロマトグラフィーおよびその工業的実施形態に関するより詳細な内容は、Ｓｃｏｐｅｓ（参照によりあらゆる目的で本明細書に組み込まれる）に見いだされうる。
【０１８７】
変換生成物の捕獲のために陰イオン交換材料を使用する場合、陰イオン交換材料の全結合容量は、インキュベーション時に生成される変換生成物の全量を基準にして、たとえば、少なくとも３０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）でありうる。たとえば、陰イオン交換材料の全結合容量は、インキュベーション時に生成される変換生成物の全量を基準にして、少なくとも５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）でありうる。他の選択肢として、陰イオン交換材料の全結合容量は、インキュベーション時に生成される変換生成物の全量を基準にして、少なくとも８０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）でありうる。
【０１８８】
利用時、除去剤は、好ましくは、合成プロセス時に形成された変換脱離基の理論量を沈殿または捕獲するのに十分な量で存在する。
【０１８９】
したがって、陰イオン交換材料の全結合容量は、インキュベーション時に生成される変換生成物の全量を基準にして、たとえば、少なくとも１００％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）でありうる。たとえば、陰イオン交換材料の全結合容量は、インキュベーション時に生成される変換生成物の全量を基準にして、少なくとも１５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）でありうる。他の選択肢として、陰イオン交換材料の全結合容量は、インキュベーション時に生成される変換生成物の全量を基準にして、少なくとも２００％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）でありうる。
【０１９０】
インキュベーション時に生成される変換生成物の全量は、たとえば、使用される酵素に対して計画されたプロセス条件および速度論的データから推定されうる。
【０１９１】
他の選択肢として、放出される脱離基の予想量は、陰イオン交換材料の投入のための指針として使用されうる。したがって、陰イオン交換材料の全結合容量は、インキュベーション時に放出される脱離基の全量を基準にして、たとえば、少なくとも３０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）でありうる。たとえば、陰イオン交換材料の全結合容量は、インキュベーション時に放出される脱離基の全量を基準にして、少なくとも５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）でありうる。他の選択肢として、陰イオン交換材料の全結合容量は、インキュベーション時に放出される脱離基の全量を基準にして、少なくとも８０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）でありうる。
【０１９２】
陰イオン交換材料の全結合容量は、インキュベーション時に放出される脱離基の全量を基準にして、たとえば、少なくとも１００％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）でありうる。たとえば、陰イオン交換材料の全結合容量は、インキュベーション時に放出される脱離基の全量を基準にして、少なくとも１５０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）でありうる。他の選択肢として、陰イオン交換材料の全結合容量は、インキュベーション時に放出される脱離基の全量を基準にして、少なくとも２００％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）でありうる。
【０１９３】
本発明者らは、本方法が、驚くべきことに、比較的低濃度のガラクトシルドナーを使用したとしても、ガラクトオリゴ糖の高い収率を提供することを発見した。比較的低濃度のガラクトシルドナーは、ドナーの自己ガラクトシル化（すなわち、第１のガラクトシルドナーのガラクトシル基が、ガラクトシルアクセプターにではなく、第２のガラクトシルドナーに転移される場合）の度合いを追加的に低減する。
【０１９４】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｃ）は、混合物へのさらなるガラクトシルドナーの添加を含む。これは、比較的低濃度のガラクトシルドナーを使用する場合、とくに好ましい。より多くのガラクトシルドナーを添加することにより、混合物中のガラクトシルドナーの枯渇が回避され、酵素反応時にガラクトシルドナーの濃度が制御されうる。
【０１９５】
さらなるガラクトシルドナーの添加は、ガラクトシルドナーの個別添加、たとえば、酵素反応時の少なくとも１回の添加を含みうる。他の選択肢としてまたは追加として、さらなるガラクトシルドナーの添加は、酵素反応時の連続添加でありうる。さらなるガラクトシルドナーは、好ましくは、ステップａ）で使用されるものと同一のタイプである。
【０１９６】
ステップｃ）は、たとえば、インキュベーション時にガラクトシルドナーの濃度を測定して、濃度が低すぎる場合に追加のガラクトシルドナーを添加することを含む。
【０１９７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｃ）での混合物のガラクトシルドナーの濃度は、０．０１〜１ｍｏｌ／Ｌの範囲内、好ましくは０．０１〜０．５ｍｏｌ／Ｌの範囲内、好ましくは０．０３〜０．３ｍｏｌ／Ｌの範囲内の濃度に維持される。
【０１９８】
たとえば、ステップｃ）での混合物のガラクトシルドナーの濃度は、０．０２〜０．１ｍｏｌ／Ｌの範囲内の濃度に維持されうる。
【０１９９】
ステップｃ）は、さらなるガラクトシルアクセプターの添加をさらに含みうる。これにより、ステップｃ）で混合物のガラクトシルアクセプター濃度を制御ことが可能になる。たとえば、所望により、ガラクトシルアクセプター濃度を実質的に一定に維持することが可能になる。
【０２００】
２個または３個の転移ガラクトシル基を含有する有意量のガラクトオリゴ糖を生成するために、ガラクトシルアクセプターよりも多くのガラクトシルドナーをプロセスで消費するべきである。それにより、ガラクトシルアクセプターが多くなれば、２倍または３倍ガラクトシル化されるようになるであろう。したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、消費されるガラクトシルドナーと消費されるガラクトシルアクセプターとのモル比は、少なくとも１：１、好ましくは少なくとも５：１、さらにより好ましくは少なくとも１０：１である。
【０２０１】
ステップｃ）は、典型的には、酵素を不活性化することにより、たとえば、熱処理で第１の酵素を変性させることにより、または第１の酵素とインキュベート混合物の炭水化物との接触を回避することにより、終了する。第１の酵素が固相に固定された酵素である場合、接触は、たとえば、固相とインキュベート混合物とを分離することにより解除可能である。第１の酵素を混合物中に溶解した場合、第１の酵素は、第１の酵素を保持するがオリゴ糖を通過させるフィルターを用いた限外濾過により、インキュベート混合物から分離可能である。
【０２０２】
多くの場合、組成物のガラクトオリゴ糖を富化および／または精製したり、ガラクトシルアクセプター、ガラクトシルドナー、および放出された脱離基の濃度を低減したりすることが必要とされる。
【０２０３】
したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、本方法は、
ｄ）ステップｃ）の組成物のガラクトオリゴ糖を富化するステップ
をさらに含む。
【０２０４】
本発明との関連では、「ガラクトオリゴ糖を富化する」という用語は、乾燥重量基準で組成物のガラクトオリゴ糖の相対量を増加させることを意味する。これは、典型的には、所要により、組成物の他の固形分のいくつか、たとえば、低級糖と、さらには任意選択で第１の酵素と、を除去するにより、行われる。
【０２０５】
ステップｄ）の富化は、たとえば、クロマトグラフィー分離および／またはナノ濾過を含みうる。そのようなプロセスに関する詳細は、Ｗａｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）（参照によりあらゆる目的で本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２０６】
本発明のいくつかの実施形態では、富化は、多くとも２００ｇ／ｍｏｌのモル重量を有する分子の少なくとも５０％（乾燥重量基準ｗ／ｗ）をステップｃ）の組成物から除去することを含む。たとえば、富化は、多くとも２００ｇ／ｍｏｌのモル重量を有する分子の少なくとも８０％（乾燥重量基準ｗ／ｗ）をステップｃ）の組成物から除去することを含みうる。
【０２０７】
本発明の他の実施形態では、富化は、多くとも３５０ｇ／ｍｏｌのモル重量を有する分子の少なくとも５０％（乾燥重量基準ｗ／ｗ）をステップｃ）の組成物から除去することを含む。たとえば、富化は、多くとも３５０ｇ／ｍｏｌのモル重量を有する分子の少なくとも８０％（乾燥重量基準ｗ／ｗ）をステップｃ）の組成物から除去することを含みうる。
【０２０８】
富化に代わる他の選択肢としてまたはそれに加えて、ステップｄ）は、組成物中のガラクトオリゴ糖の濃度を増加させる１つ以上のプロセスを含むことが好ましいこともありうる。有用な濃縮ステップの例は、たとえば、逆浸透、蒸発、および／またはスプレー乾燥である。
【０２０９】
ステップｄ）は、除去剤および／または除去剤に結合された変換脱離基をステップｃ）の組成物から除去することをさらに含みうる。そのような除去は、たとえば、濾過、沈降、または遠心分離により行われうる。
【０２１０】
本方法により提供されるガラクトオリゴ糖含有組成物は、たとえば、乾燥粉末の形態またはシロップの形態をとりうる。
【０２１１】
乾燥粉末の製造は、典型的には、１つ以上のプロセスステップ、たとえば、濃縮、蒸発、および／またはスプレー乾燥を必要とする。したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｄ）は、粉末形態の組成物を得るために、液体形態の組成物を濃縮、蒸発、および／またはスプレー乾燥することをさらに含む。粉末状組成物を得るために、ステップｄ）の液体組成物をスプレー乾燥することがとくに好ましい。ステップｄ）は、たとえば、富化ステップと、それに続く濃縮ステップ、たとえば、ナノ濾過、逆浸透、または蒸発と、それに続くスプレー乾燥ステップと、を含む。他の選択肢として、ステップｄ）は、濃縮ステップと、それに続く富化ステップと、それに続くスプレー乾燥ステップと、を含みうる。富化前に組成物のガラクトオリゴ糖を濃縮することにより、後続の富化プロセスをより費用効率的にしうる。
【０２１２】
効率的なスプレー乾燥を行うには、１種以上の助剤、たとえば、マルトデキストリン、乳タンパク質、カゼイネート、ホエータンパク質濃縮物、および／またはスキムミルク粉末を添加することが必要になりうる。
【０２１３】
本プロセスは、たとえば、バッチプロセスとして実施されうる。本プロセスは、他の選択肢として、フェドバッチプロセスとして実施されうる。本プロセスは、他の選択肢として、連続プロセスとして実施されうる。
【０２１４】
本プロセスは、第１の酵素および／または未使用のガラクトシルアクセプターを再循環させて混合物に戻すことをさらに含みうる。再循環は、たとえば、ステップｄ）の一部を形成しうる。たとえば、ステップｄ）は、ガラクトシルアクセプターおよび／または第１の酵素をガラクトオリゴ糖含有組成物から分離することと、ガラクトシルアクセプターおよび／または第１の酵素をステップａ）またはｃ）に再循環させることと、を含みうる。バッチプロセスまたはフェドバッチプロセスの場合、ガラクトシルアクセプターおよび／または第１の酵素は、その次のバッチの混合物に再循環させうる。
【０２１５】
連続プロセスの場合、ガラクトシルアクセプターは、再循環させてステップａ）またはステップｃ）に対応するプロセスラインの一部に戻しうる。第１の酵素は、再循環させてステップｂ）またはステップｃ）に対応するプロセスラインの一部に戻しうる。
【０２１６】
ステップａ）およびｂ）に関連付けられる詳細および特徴は、製造プロセスの実際の開始に関連する必要はないが、少なくともプロセス時のどこかで生じるはずであることに留意すべきである。しかしながら、本発明のいくつかの実施形態では、ガラクトシルドナーの濃度は、ステップｃ）の全継続時間にわたりステップａ）に記載の範囲内に維持される。
【０２１７】
本方法をバッチプロセスまたはフィードバッチプロセスとして実施する場合、ステップａ）は、好ましくは、合成開始時の混合物の組成に関連する。本方法が連続プロセスである場合、ステップａ）は、好ましくは、定常状態運転下の合成時の混合物の組成に関連する。
【０２１８】
ガラクトシル化ガラクトシルドナーは、ガラクトシル化ガラクトシルアクセプターから分離するのが厄介な望ましくない不純物として認識されうるので、所望により、ガラクトシル化ガラクトシルドナーのレベルは、できる限り低く維持されると認識されうる。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｃ）のインキュベート中の混合物は、多くとも０．５ｍｏｌ／Ｌのガラクトシル化ガラクトシルドナーを含有する。ステップｃ）のインキュベート中の混合物は、たとえば、多くとも０．１ｍｏｌ／Ｌのガラクトシル化ガラクトシルドナーを含有しうる。さらにより好ましくは、ステップｃ）のインキュベート中の混合物は、多くとも０．０１ｍｏｌ／Ｌのガラクトシル化ガラクトシルドナーを含有し、好ましくはガラクトシル化ガラクトシルドナーを実質的にまったく含有しない。
【０２１９】
ドナーがラクトースである本発明のいくつかの好ましい実施形態では、アロラクトースおよびガラクトシル化アロラクトースの全濃度は、これらの化合物もまた、ガラクトシル化ガラクトシルアクセプターから分離するのが困難な望ましくない不純物として認識されるので、できる限り低く維持される。
【０２２０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ステップｃ）のインキュベート中の混合物は、多くとも０．５ｍｏｌ／Ｌの全量でアロラクトースとガラクトシル化アロラクトースとを含有する。ステップｃ）のインキュベート中の混合物は、たとえば、多くとも０．１ｍｏｌ／Ｌの全量でアロラクトースとガラクトシル化アロラクトースとを含有しうる。さらにより好ましくは、ステップｃ）のインキュベート中の混合物は、多くとも０．０１ｍｏｌ／Ｌの全量でアロラクトースとガラクトシル化アロラクトースとを含有し、好ましくは、アロラクトースおよびガラクトシル化アロラクトースをまったく含有しない。
【０２２１】
そのほかに、本発明の態様は、ガラクトオリゴ糖を含む組成物に関する。この組成物は、本明細書に定義される方法により取得可能である。
【０２２２】
本発明のさらなる態様は、ガラクトオリゴ糖含有組成物、たとえば、以上に挙げた組成物である。前記ガラクトオリゴ糖含有組成物は、
・一般式Ｇａｌ−Ｘを有する第１のガラクトオリゴ糖と、
・化学量論式（Ｇａｌ）２Ｘ、たとえば、一般式Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘなどを有する第２のガラクトオリゴ糖と、
・化学量論式（Ｇａｌ）３Ｘ、たとえば、一般式Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘなどを有する第３のガラクトオリゴ糖と、
を含む。ただし、Ｘは、ラクトシルでもグルコシルでもないグリコシル基である。
【０２２３】
本明細書に記載のガラクトオリゴ糖含有組成物は、たとえば、食品成分でありうる。
【０２２４】
以上に記載したように、「Ｘ」または「−Ｘ」は、好ましくは、本明細書に挙げられたガラクトシルアクセプターの１つのグリコシル基である。
【０２２５】
本発明のいくつかの実施形態では、「Ｘ」または「−Ｘ」は、グルコースではない単糖のグリコシル基である。本発明の他の実施形態では、「−Ｘ」は、ラクトースではない二糖のグリコシル基である。
【０２２６】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、「Ｘ」または「−Ｘ」は、フコシル基である。本発明の他の好ましい実施形態では、「Ｘ」または「−Ｘ」は、ガラクトシル基である。
【０２２７】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、
・ガラクトオリゴ糖Ｇａｌ−Ｘ、（Ｇａｌ）２Ｘ、および（Ｇａｌ）３Ｘの全量と、
・ガラクトオリゴ糖Ｇａｌ−Ｇｌｃ、Ｇａｌ２Ｇｌｃ、Ｇａｌ３Ｇｌｃの全量と、
のモル比が少なくとも５：９５である。たとえば、以上に挙げたモル比は、少なくとも１：４、好ましくは少なくとも１：１、さらにより好ましくは少なくとも２：１でありうる。さらに、以上に挙げたモル比は、少なくとも５：１、好ましくは少なくとも１０：１、さらにより好ましくは少なくとも２０：１であることが好ましいこともありうる。
【０２２８】
本発明の他の好ましい実施形態では、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、
・ガラクトオリゴ糖Ｇａｌ−Ｘ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘ、およびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｘの全量と、
・ガラクトオリゴ糖Ｇａｌ−Ｇｌｃ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃの全量と、
のモル比が少なくとも５：９５である。たとえば、以上に挙げたモル比は、少なくとも１：４、好ましくは少なくとも１：１、さらにより好ましくは少なくとも２：１でありうる。さらに、以上に挙げたモル比は、少なくとも５：１、好ましくは少なくとも１０：１、さらにより好ましくは少なくとも２０：１であることが好ましいこともありうる。
【０２２９】
さらに、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、式Ｇａｌ−Ｇｌｃ、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ、およびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃで示されるいずれのガラクトオリゴ糖もまったく含有しないことが可能である。
【０２３０】
本発明のいくつかの実施形態では、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、第１のガラクトオリゴ糖と第２のガラクトオリゴ糖と第３のガラクトオリゴ糖とのモル比が、５０〜９９：１〜４５：０．５〜２５の範囲内である。
【０２３１】
本発明の他の実施形態では、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、第１のガラクトオリゴ糖と第２のガラクトオリゴ糖と第３のガラクトオリゴ糖とのモル比が、２０〜４５：２０〜４５：２０〜４５の範囲内である。
【０２３２】
本発明のさらなる実施形態では、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、第１のガラクトオリゴ糖と第２のガラクトオリゴ糖と第３のガラクトオリゴ糖とのモル比が、０．５〜２５：１〜４５：５０〜９８の範囲内である。
【０２３３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、ガラクトオリゴ糖含有組成物の全重量を基準にして少なくとも１０重量％の全量で、第１のガラクトオリゴ糖と第２のガラクトオリゴ糖と第３のガラクトオリゴ糖とを含む。たとえば、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、ガラクトオリゴ糖含有組成物の全重量を基準にして少なくとも２０重量％、好ましくは少なくとも３０重量％、さらにより好ましくはガラクトオリゴ糖含有組成物の全重量を基準にして少なくとも４０％の全量で、第１のガラクトオリゴ糖と第２のガラクトオリゴ糖と第３のガラクトオリゴ糖とを含みうる。
【０２３４】
さらに高レベルの第１のガラクトオリゴ糖、第２のガラクトオリゴ糖、および第３のガラクトオリゴ糖が好ましいこともありうる。したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、ガラクトオリゴ糖含有組成物の全重量を基準にして少なくとも５０重量％の全量で、第１のガラクトオリゴ糖と第２のガラクトオリゴ糖と第３のガラクトオリゴ糖とを含む。たとえば、ガラクトオリゴ糖含有組成物は、ガラクトオリゴ糖含有組成物の全重量を基準にして少なくとも６０重量％、好ましくは少なくとも７０重量％、さらにより好ましくはガラクトオリゴ糖含有組成物の全重量を基準にして少なくとも８０％の全量で、第１のガラクトオリゴ糖と第２のガラクトオリゴ糖と第３のガラクトオリゴ糖とを含みうる。
【０２３５】
そのほかに、本発明の態様は、本明細書に記載のガラクトオリゴ糖含有組成物を含む食品製品に関する。
【０２３６】
本発明のいくつかの実施形態では、食品製品は、乳児用栄養食品製品や臨床用栄養食品製品などの機能性食品製品である。
【０２３７】
本発明の他の実施形態では、食品製品は、焼成製品、たとえば、パン製品や類似製品などの焼成生地を含むものである。
【０２３８】
本発明のさらなる実施形態では、食品製品は、乳製品、たとえば、牛乳などの新鮮乳製品またはヨーグルトなどの発酵乳製品である。
【０２３９】
本発明のそのほかのさらなる実施形態では、食品製品は、ペットフード製品である。
【０２４０】
本発明の態様の１つとの関連で記載した実施形態および特徴はまた、本発明の他の態様にも当てはまることに留意すべきである。
【０２４１】
次に、本発明を以下の実施例でさらに詳細に説明するが、これらの実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０２４２】
実施例１：ガラクトシル転移活性を有するβ−ガラクトシダーゼの調製
１２時間増殖させた３．０のＯＤ６００を有する１００ｍｇ／Ｌアンピシリン入りの溶原性ブロス（ＬＢ）培地の２ｍＬのスターター培養物を７５０ｍＬの実効体積の発酵培地に接種した。２％（ｗ／ｖ）酵母エキスと２％（ｗ／ｖ）ダイズペプトンと１％（ｗ／ｖ）グルコースと１００ｍｇ／Ｌアンピシリンとを含有するＥＣ培地中で発酵を行った。ＯＬＧＡ３４７β−ガラクトシダーゼ（配列番号２の配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）を有する）を発現するＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、以前に記載されたように調製した（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎらの米国特許第６，５５５，３４８Ｂ２号明細書の実施例１および２）。発酵槽は、全容積２Ｌのガラス皿状底槽を含むＡｐｐｌｉｋｏｎ製のものであり、２つのＲｕｓｈｔｏｎインペラーを備えていた。発酵時、２Ｍ  ＮａＯＨおよび２Ｍ  Ｈ３ＰＯ４の適切な添加によりｐＨをｐＨ６．５に維持し、かつ温度を３７℃に制御した。１〜２Ｌ／ｍｉｎの速度で空気をバブリングすることにより酸素を供給し、かつ撹拌速度を増加させることによりｐＯ２を３０％に維持した。オフラインＯＤ６００読取りにより、増殖を追跡した。約１０時間の増殖後、２９．７のＯＤ６００値で培養物を遠心分離により採取した。６５０ｍＬの培養上清を−２０℃で貯蔵した。細胞ペレットを２００ｍＬのスクロース緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、４０％スクロース、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中に再懸濁させて、室温で１０分間インキュベートすることにより、ペリプラズムタンパク質を浸透圧ショックにより細胞ペレットから単離した。遠心分離後、上清を廃棄して、ペレットを２００ｍＬの冷水中に再懸濁させた。８３μＬの飽和ＭｇＣｌ２溶液を添加して、ペリプラズムタンパク質を含有する上清を遠心分離ステップにより捕集した。ペリプラズム画分を０．２μｍのＭｉｌｌｉｐａｋ  ４０フィルターに通して濾過滅菌し、そして−２０℃で貯蔵した。
【０２４３】
プロトコル（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１），ｐｐ．１７．４８−１７．５１）に従って基質としてｏ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＰＮＧ）を用いて、２００ｍＬのペリプラズム画分および６５０ｍＬの培養上清のβ−ガラクトシダーゼ活性を決定した。活性の大部分は、ペリプラズム画分（９８％に対応する５２５単位）中に見いだされた。
【０２４４】
実施例２：ガラクトシル転移活性を有する第２のβ−ガラクトシダーゼの調製
実施例１に記載の手順に沿って、ただし、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｕ（９１７）の発現に基づいて、第２のβ−ガラクトシダーゼ（ＯＬＧＡ９１７）を調製した。
【０２４５】
実施例３：β−ガラクトシダーゼ酵素のＴ値の決定
β−ガラクトシダーゼ酵素のＴ値は、以下に与えられるアッセイおよび式に従って決定される。
【０２４６】
アッセイ：
試験されるβ−ガラクトシダーゼ酵素、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、１ｍＭクエン酸マグネシウム、１ｍＭクエン酸カルシウム、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＳＡ）からなるｐＨ６．５の３．３ｍＬの酵素溶液を調製する。酵素溶液は、添加された３３％（ｗ／ｗ）のラクトースを存在するアッセイ条件下で１時間以内に使用するのに十分な量でβ−ガラクトシダーゼ酵素を含有すべきである。酵素溶液の温度は、３７℃にすべきである。
【０２４７】
時間＝Ｔ０で、８２．５ｍｇのラクトース一水和物（生化学用、Ｍｅｒｃｋ  Ｇｅｒｍａｎｙ）を酵素溶液に添加混合し、続いて、混合物を３７℃で４時間インキュベートする。正確にＴ０の１時間後、１００μＬのサンプルを捕集し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で１：５希釈し、そして８５℃に１０分間加熱することにより不活性化させる。特徴付けまで不活性化混合物を−２０℃に維持する。
【０２４８】
特徴付け：
生成されたガラクトースの量（ｍｏｌ単位）および使用されたラクトース（ｍｏｌ単位）の量の決定は、任意の好適な分析技術を用いて行われうる。たとえば、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）およびＳｉｍｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）に記載の方法に従って、希釈混合物をＨＰＬＣにより分析しうる。他の有用な分析技術は、Ｅｌ  Ｒａｚｚｉ（２００２）に記載されている。
【０２４９】
好適な分析技術の他の例は、ＩＳＯ５７６５−２：２００２（ＩＤＦ７９−２：２００２）「ドライミルク、乾燥アイスミックス、およびプロセスチーズ（ラクトース含有率の決定）、第２部：ラクトースのガラクトース部分を利用した酵素法」である。
【０２５０】
Ｔ値の計算：
Ｔ値は、アッセイの希釈混合物の特徴付けから得られるデータを用いて、以下の式に従って計算される。
2015508291.tif 000011
【０２５１】
例−ＯＬＧＡ３４７酵素のＴ値：
実施例１のＯＬＧＡ３４７酵素を用いて、以上に述べたアッセイを行った。
【０２５２】
変換された（すなわち、使用された）ラクトースおよび生成されたガラクトースに関して、アッセイから得られた希釈混合物を分析ＨＰＬＣにより分析した。ＨＰＬＣ装置は、Ｗａｔｅｒｓ製のものであり、示差屈折計（ＲＩ検出器）およびＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｃカラム（３００×７．８ｍｍ、１２５−００５５）を備えていた。０．０５ｇ／Ｌの酢酸Ｃａ、０．３ｍＬ／ｍｉｎの流量、および２０μＬの注入量を用いて、アイソクラチックに糖の溶出を行った。
【０２５３】
得られたデータを自動ソフトウェアにより適切にベースライン補正し、ピークを個別に同定して積分した。ラクトース一水和物（生化学用、Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｄ−（＋）−グルコース一水和物（生化学用、Ｍｅｒｃｋ  Ｅｕｒｏｌａｂ、Ｆｒａｎｃｅ）、およびＤ−（＋）−ガラクトース（≧９９％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｉｔａｌｙ）の外部標準を用いて、定量を行った。
【０２５４】
各時間Ｔに対するラクトースの変換およびガラクトースの形成を定量データから計算した。時間Ｔ＝１ｈで、捕集された１００μＬのサンプル中でラクトースの２９％が変換された。これは、２．３μｍｏｌのラクトースに対応する。時間Ｔ＝１で、捕集された１００μＬのサンプル中で０．５μｍｏｌのガラクトースが形成された。したがって、Ｔ値は、０．５μｍｏｌ／２．３μｍｏｌ＝０．２であると計算されうる。
【０２５５】
また、変換された（すなわち、使用された）ラクトースおよび生成されたガラクトースに関して、アッセイから得られた希釈混合物を酵素法ＩＳＯ５７６５−２により分析した。Ｒ−Ｂｉｏｐｈａｒｍ製のＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍラクトース／Ｄ−ガラクトース試験キット（Ｃａｔ．Ｎｏ．１０１７６３０３０３５）を使用し、プロトコルに従って試験を行った。酵素法によりＯＬＧＡ３４７酵素のＴ値が０．２であることが確認された。
【０２５６】
例−ＯＬＧＡ９１７酵素のＴ値：
実施例２で生成されたＯＬＧＡ９１７酵素を用いて、以上に述べたＴ値アッセイを行い、以上に説明した手順に従って、Ｔ値を決定した。
【０２５７】
ＯＬＧＡ９１７酵素のＴ値は、０．３と決定された。
【０２５８】
例−従来のラクターゼ酵素のＴ値：
市販の従来のラクターゼ酵素Ｌａｃｔｏｚｙｍ  Ｐｕｒｅ２６００Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、以上に述べたアッセイを行った。ＯＬＧＡ３４７酵素に関連して記載したように、アッセイから得られた希釈混合物を分析した。三糖および四糖は、検出可能量で存在しなかった。また、等量のグルコースおよびガラクトースが見られた。対応するＴ値は、１である。
【０２５９】
また、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）由来の市販のβ−ガラクトシダーゼ（製品番号：Ｇ６００８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびアスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）由来の市販のβ−ガラクトシダーゼ（製品番号：Ｇ５１６０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＴ値を決定した。両方の酵素は、約１．０のＴ値を有する。
【０２６０】
実施例４：ドナー分子の逐次添加およびグルコース脱離基の変換によるＬ−フコシル含有ヘテロガラクトオリゴ糖の合成
表７に見いだされる量のＬ−（−）フコースおよびラクトース一水和物を１００ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水中に溶解させた。各サンプルを３７℃の温度に維持した。また、ＮａＯＨの連続添加によりｐＨを６．５に維持する。１００Ｌ／ｍｉｎの速度で空気を混合物中に連続的にポンプ注入した。グルコースオキシダーゼ酵素ＧＯＸ（ＤｕＰｏｎｔ、Ｄｅｎｍａｒｋ）をサンプル２に添加した。グルコースオキシダーゼ酵素Ｇｌｕｚｙｍｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）をサンプル３に添加した。ミクロコッカス・リソデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来のカタラーゼ酵素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｅｎｍａｒｋ）をサンプル２および３に添加した。実施例２のＯＬＧＡ９１７酵素を各サンプルに添加した。２５０ｍＬの全プロセス体積になるようにＭｉｌｌｉＱ水を添加した。この時間をＴ＝０として定義した。ラクトース一水和物を３０分間隔で５時間にわたりサンプルに添加した。
2015508291.tif 000012
【０２６１】
Ｔ＝４ｈおよびＴ＝５ｈからの試験サンプルを実施例７に従ってＨＰＬＣにより分析したところ、有意量のガラクトシル化フコースを含有することが判明した。
【０２６２】
実施例５：Ｌ−フコシル含有ヘテロガラクトオリゴ糖の合成ならびにグルコース脱離基の変換および除去、ただし、ドナー分子の逐次添加なし
表８に見いだされる量のＬ−（−）フコースおよびラクトース一水和物を１００ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水中に溶解させた。各サンプルを３７℃の温度に維持し、ＮａＯＨの連続添加によりｐＨを６．５に維持した。１００Ｌ／ｍｉｎの速度で空気を混合物中に連続的にポンプ注入した。陰イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ６６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を用意し、サンプル３に添加した。グルコースオキシダーゼ酵素ＧＯＸ（ＤｕＰｏｎｔ、Ｄｅｎｍａｒｋ）をサンプル２および３に添加した。ミクロコッカス・リソデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来のカタラーゼ酵素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｅｎｍａｒｋ）をサンプル２および３に添加した。実施例２のＯＬＧＡ９１７酵素を各サンプルに添加した。表８に見いだされる全プロセス体積になるようにＭｉｌｌｉＱ水を添加した。この時間をＴ＝０として定義した。
2015508291.tif 000013
【０２６３】
Ｔ＝４ｈおよびＴ＝５ｈからの試験サンプルを実施例７に従ってＨＰＬＣにより分析したところ、この場合も、有意量のガラクトシル化フコースを含有することが判明した。
【０２６４】
実施例６：ドナー分子の逐次添加、グルコース脱離基の変換、および変換脱離基の除去によるＬ−フコシル含有ヘテロガラクトオリゴ糖の合成
表９に見いだされる量のＬ−（−）フコースおよびラクトース一水和物を１００ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水中に溶解させた。各サンプルを３７℃の温度に維持し、ＮａＯＨの連続添加によりｐＨを６．５に維持した。１００Ｌ／ｍｉｎの速度で空気を混合物中に連続的にポンプ注入した。陰イオン交換樹脂Ｄｏｗｅｘ６６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を用意し、各サンプルに添加した。グルコースオキシダーゼ酵素ＧＯＸ（Ｄａｎｉｓｃｏ／ＤｕＰｏｎｔ、Ｄｅｎｍａｒｋ）をサンプル２に添加した。グルコースオキシダーゼ酵素Ｇｌｕｚｙｍｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ、Ｄｅｎｍａｒｋ）をサンプル３に添加した。ミクロコッカス・リソデイクティカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ）由来のカタラーゼ酵素（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｅｎｍａｒｋ）をサンプル２および３に添加した。実施例２のＯＬＧＡ９１７酵素を各サンプルに添加した。２５０ｍＬの全プロセス体積になるようにＭｉｌｌｉＱ水を添加した。この時間をＴ＝０として定義した。ラクトース一水和物を３０分間隔で５時間にわたりサンプルに添加した。
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【０２６５】
時間Ｔ＝４および５ｈで、１５００μＬの試験サンプルを採取し、実施例７に従ってＨＰＬＣおよび質量分析により分析した。サンプルは、有意量のガラクトシル化フコースを含有することが判明した。質量分析の結果、図４〜６に例示される。
【０２６６】
図４は、インキュベーション時に遊離脱離基を除去した場合と除去しない場合とで、４時間インキュベーション後のガラクトシル化フコースの二糖、三糖、および四糖の積分応答のプロットを示している。遊離脱離基（グルコース）は、酵素変換により除去される。ガラクトシル化フコースの含有率は、インキュベーション時に遊離脱離基を除去した場合に増加することがわかる。
【０２６７】
図５は、インキュベーション時に遊離脱離基を除去した場合と除去しない場合とで、５時間インキュベーション後のガラクトシル化フコースの二糖、三糖、および四糖の積分応答のプロットを示している。この場合も、ガラクトシル化フコースの含有率は、インキュベーション時に遊離脱離基を除去した場合に増加することがわかる。
【０２６８】
図６は、インキュベーション時に遊離脱離基を除去した場合と除去しない場合とで、ガラクトシル化ドナー／脱離基の全積分応答（全ＧＯＳ）と比較して、ガラクトシル化フコースの全積分応答（全ＨＯＳ）のプロットを示している。ガラクトシル化ドナー／脱離基の全積分応答は、Ｇａｌ−Ｇｌｃ分子、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ分子、およびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｇｌｃ分子の積分応答の和である。ガラクトシル化フコースの全積分応答は、Ｇａｌ−Ｆｕｃ分子、Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ分子、およびＧａｌ−Ｇａｌ−Ｇａｌ−Ｆｕｃ分子の応答の和である。ガラクトシル化フコースの全積分応答は、インキュベーション時に遊離脱離基を除去した場合に有意に増加するが、ガラクトシル化ドナー／脱離基の全積分応答は、ほとんど変化しないことがわかる。
【０２６９】
結論：
この実施例では、インキュベーション時に遊離脱離基を除去した場合、ガラクトシル化アクセプター（意図された生成物）とガラクトシル化ドナー／脱離基（副生成物）との比が有意に増加することが実証される。
【０２７０】
実施例７：Ｌ−フコシル含有ヘテロガラクトオリゴ糖を含有するサンプルの特徴付け
捕集されたサンプルをＭｉｌｌｉ−Ｑ水で１：１０希釈し、８５℃で１５分間加熱することにより不活性化させた。特徴付けまで不活性化混合物を−２０℃に維持した。
【０２７１】
分析ＨＰＬＣを用いてサンプルを特徴付けした。０．２２μｍフィルターを用いてサンプルを濾過した。ＨＰＬＣ装置は、Ｗａｔｅｒｓ製のものであり、示差屈折計（ＲＩ検出器）およびＢｉｏＲａｄ  Ａｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ−８７Ｃカラム（３００×７．８ｍｍ、１２５−００５５）を備えていた。０．０５ｇ／Ｌの酢酸Ｃａ、０．３ｍＬ／ｍｉｎの流量、および２０μＬの注入量を用いて、アイソクラチックに糖の溶出を行った。
【０２７２】
Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＡＰＩ−ＥＳ  ＬＣ／ＭＳＤ  Ｑｕａｄｒｏｐｏｌｅ  ６４１０を用いて、１００〜１０００ａｍｕの質量で走査することにより、質量分析を行った（ガス温度：３５０℃、乾燥ガス流量：１３．０Ｌ／ｍｉｎ、ネブライザー圧力：４０ｐｓｉｇ）。ＬＣ分離に使用したカラムは、２５℃で操作されるＨｙｐｅｒＣａｒｂ  ２．１×１５０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｅｎｍａｒｋ）である。５ｍＭ  ＡｃＮＨ４水性溶液およびアセトニトリルを用いて、溶出を行った。
【０２７３】
エレクトロスプレイインターフェイスからの共通のイオン化パターンに基づいて、イオンクロマトグラムを抽出した。抽出されたクロマトグラム中のピークを質量スペクトルに基づいて評価し、続いて、積分することにより、試験サンプルの種々の炭水化物種の積分応答を提供した。
【０２７４】
参照文献
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Ｗａｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）“Ｄａｉｒｙ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，Ｗａｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００６
Ｓｃｏｐｅｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ；Ｒｏｂｅｒｔ  Ｋ．Ｓｃｏｐｅｓ；３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｉｎｃ．，ＩＳＢＮ  ０−３８７−９４０７２−３
国際公開第０１／９０，３１７Ａ２号パンフレット
欧州特許出願公開第２１３８５８６Ａ１号明細書
国際公開第２００９／１１３，０３０Ａ２号パンフレット
国際公開第２０１２／０１０，５９７Ａ１号パンフレット
【図１】
2015508291.tif 000015
【図２】
2015508291.tif 000016
【図３】
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【図４】
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【図５】
2015508291.tif 000019
【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年4月29日(2014.4.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種以上のガラクトオリゴ糖を含む組成物の製造方法において、
ａ）
・脱離基に結合されたガラクトシル基を含むガラクトシルドナーであって、多くとも３５０ｇ／ｍｏｌのモル重量を有するガラクトシルドナーと、
・前記ガラクトシルドナーとは異なるガラクトシルアクセプターであって、糖または糖アルコールであるガラクトシルアクセプター、
を含む混合物を提供するステップであって、前記ガラクトシルアクセプターと前記ガラクトシルドナーとのモル比は、少なくとも１：１０であり、かつ前記混合物は、少なくとも０．０５ｍｏｌ／Ｌのガラクトシルアクセプターを含む提供するステップ、
ｂ）第１の酵素を提供するステップであって、前記第１の酵素は、β−ガラクトシダーゼ活性とガラクトシル転移活性とを有するとともに、前記第１の酵素は、前記混合物に接触する提供するステップ、および
ｃ）前記混合物と前記第１の酵素とをインキュベートして、前記第１の酵素により前記ガラクトシルドナーの脱離基を放出させるとともに、前記ガラクトシルドナーのガラクトシル基を前記ガラクトシルアクセプターに転移することにより、前記ガラクトオリゴ糖を形成するステップであって、ステップｃ）は、前記ガラクトシルドナーから放出された脱離基をインキュベート中の混合物から除去することをさらに含み、かつ前記ガラクトシルドナーから放出された脱離基の除去は、遊離脱離基をインキュベート中の混合物から物理的に除去することおよび／または遊離脱離基をインキュベート中の混合物中に依然として存在しうる１種以上の他の化学種に変換することを含み、それにより、１種以上のガラクトオリゴ糖を含む組成物を取得する形成するステップ、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法において、前記ガラクトシルドナーの脱離基がグリコシル基であることを特徴とする方法。
【請求項３】
請求項１または２に記載の方法において、前記ガラクトシルドナーがラクトースまたはラクチトールであることを特徴とする方法。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載の方法において、前記第１の酵素が、
・配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｍｅｔ（１）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｙ（９５０）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、または
・配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｕ（９１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
を含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項に記載の方法において、前記第１の酵素が、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｉｌｅ（１１７４）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載の方法において、前記第１の酵素が、配列番号２のアミノ酸配列Ｖａｌ（３３）〜Ｇｌｕ（９１７）に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする方法。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか１項に記載の方法において、前記第１の酵素が、
・表１に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性、または
・表２に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性、または
・表３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性、または
・表４に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性、または
・表５に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性、または
・表６に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９９％の配列同一性
を有することを特徴とする方法。
【請求項８】
請求項１乃至７の何れか１項に記載の方法において、前記ガラクトシルドナーから放出された遊離脱離基を変換可能な微生物を提供するステップと、前記ガラクトシルドナーから放出された脱離基をインキュベーション時に前記微生物により除去するステップと、をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法において、
ａ）前記微生物による前記遊離脱離基の除去速度が、それによる前記ガラクトシルアクセプターの除去速度の少なくとも１０倍であるか、
ｂ）前記微生物による前記遊離脱離基の除去速度が、それによる前記ガラクトシルドナーの除去速度の少なくとも１０倍であるか、または
ｃ）前記微生物による前記遊離脱離基の除去速度が、それによるモノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターの除去速度の少なくとも１０倍である
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項に記載の方法において、前記ガラクトシルドナーから放出された遊離脱離基を変換可能な第２の酵素を提供するステップと、前記ガラクトシルドナーから放出された脱離基をインキュベーション時に前記第２の酵素により変換するステップと、をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法において、前記第２の酵素がグルコースオキシダーゼ活性を有することを特徴とする方法。
【請求項１２】
請求項１０または１１に記載の方法において、
ａ）前記遊離脱離基に対する前記第２の酵素の特異性定数が、前記ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０倍であるか、
ｂ）前記遊離脱離基に対する前記第２の酵素の特異性定数が、前記ガラクトシルドナーに対するその特異性定数の少なくとも１０倍であるか、または
ｃ）前記遊離脱離基に対する前記第２の酵素の特異性定数が、前記モノガラクトシル化ガラクトシルアクセプターに対するその特異性定数の少なくとも１０倍である
ことを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１０乃至１２の何れか１項に記載の方法において、前記第２の酵素がグルコースオキシダーゼ活性を有し、かつ前記ガラクトシルドナーの脱離基がグルコースであることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１１乃至１３の何れか１項に記載の方法において、カタラーゼ活性を有する酵素をさらに提供することを含み、この酵素がインキュベート中の混合物に接触することを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１０乃至１４の何れか１項に記載の方法において、前記第２の酵素により前記脱離基を変換することにより得られた変換生成物の少なくとも一部を除去可能な除去剤を提供するステップと、前記除去剤により前記変換生成物の少なくとも一部をインキュベーション時に除去するステップと、をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法において、前記除去剤が二価イオンまたは三価金属イオンの塩を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法において、前記除去剤が陰イオン交換材料を含むか、さらにはそれからなることを特徴とする方法。
【請求項１８】
請求項１７に記載の方法において、前記陰イオン交換材料の全結合容量が、インキュベーション時に生成される変換生成物の全量を基準にして少なくとも３０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１乃至１８の何れか１項に記載の方法において、ステップｃ）がさらなるガラクトシルドナーの添加を含むことを特徴とする方法。
【請求項２０】
請求項１乃至１９の何れか１項に記載の方法において、ステップｃ）での前記混合物のガラクトシルドナーの濃度が０．０１〜１ｍｏｌ／Ｌの範囲内の濃度に維持されることを特徴とする方法。
【請求項２１】
請求項１乃至２０の何れか１項に記載の方法において、
ｄ）ステップｃ）の組成物のガラクトオリゴ糖を富化するステップ
をさらに含むことを特徴とする方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法において、ステップｄ）が、除去剤および／または前記除去剤に結合された変換脱離基をステップｃ）の組成物から除去することをさらに含むことを特徴とする方法。
【国際調査報告】
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