(57)【要約】バキュロウイルスベクターを用いて核酸分子を膀胱細胞へ送達することに関する方法および使用が提供される。膀胱細胞は、さらに導入遺伝子を含みうるバキュロウイルスベクターと接触させられる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱細胞をバキュロウイルスベクターと接触させるステップを含む、核酸分子を膀胱細胞に送達する方法。
【請求項２】
膀胱細胞が膀胱癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
膀胱細胞がin vitroである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
膀胱細胞がin vivoである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
膀胱細胞が、膀胱癌の治療を必要とする被験者に存在し、前記接触が膀胱内滴下注入による被験者へのバキュロウイルスベクターの投与を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
バキュロウイルスベクターが、膀胱癌における導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターと機能可能に連結された、膀胱細胞における発現のための導入遺伝子をさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
導入遺伝子が膀胱癌を治療するための治療導入遺伝子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
治療導入遺伝子がCD40LまたはIL-15をコードする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターを含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターが、配列番号1に記載の配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
バキュロウイルスベクターが、導入遺伝子の3'非翻訳領域に、ウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節エレメントをさらに含む、請求項６〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節エレメントが、配列番号2に記載の配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
バキュロウイルスベクターが、導入遺伝子の5'非翻訳領域に、ヒトT細胞白血病ウイルス1型由来の長末端反復のRセグメントおよびU5配列の少なくとも一部をさらに含む、請求項６〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ヒトT細胞白血病ウイルス1型由来の長末端反復のRセグメントおよびU5配列の少なくとも一部が、配列番号3に記載の配列を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記接触の前にまたは同時にトランスフェクション剤を添加するステップをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
トランスフェクション剤が、ポリ-L-リシン、クロルパクチン（Clorpactin）WCS-90、ドデシル-B-dd-マルトシド（DDM）、もしくはドデシル硫酸ナトリウム（SDS）またはそれらのいずれかの組み合わせである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
膀胱癌の治療を必要とする被験者における膀胱癌の治療における使用のためのバキュロウイルスベクターであって、該使用が被験者におけるバキュロウイルスベクターの膀胱内滴下注入を含む、前記バキュロウイルスベクター。
【請求項１８】
バキュロウイルスベクターの膀胱内滴下注入による、膀胱癌の治療を必要とする被験者における膀胱癌の治療のためのバキュロウイルスベクターの使用。
【請求項１９】
バキュロウイルスベクターの膀胱内滴下注入による、膀胱癌の治療を必要とする被験者における膀胱癌の治療のための薬剤の製造のためのバキュロウイルスベクターの使用。
【請求項２０】
被験者の膀胱における膀胱内滴下注入における使用のためのバキュロウイルスベクター。
【請求項２１】
バキュロウイルスベクターの、被験者の膀胱における膀胱内滴下注入のための使用。
【請求項２２】
被験者の膀胱における膀胱内滴下注入のための薬剤の製造のためのバキュロウイルスベクターの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の交互参照
本願は、その内容が参照により本明細書に組み込まれる米国仮特許出願第61/622,376号（2012年4月10日出願）による優先権を主張する。
【０００２】
本発明はバキュロウイルスベクターを用いて膀胱癌を治療または予防する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
膀胱癌は尿路における最もありふれた悪性の腫瘍の型である。米国では2011年に69,000件の新症例と15,000人近くの死亡が予測された（Siegel Rら, 2011）。シンガポールにおいて、膀胱癌は男性において第9位の最もありふれた癌である。
【０００４】
ほとんどすべての膀胱癌は移行上皮から生じ、従って移行上皮癌（TCC：transitional cell carcinoma）として知られる。膀胱のTCCのほとんどは初期診断時には表在性かつ非筋肉侵襲性である。しかし、経尿道切除術後の表在TCCの再発率は70％と高く、再発と進行を抑制するためにアジュバント療法を必要とする。
【０００５】
癌再発の中程度または高いリスクを有する患者に対して、しばしばBacillus-Calmette-Cuerin（BCG）を用いる膀胱内免疫療法の形でアジュバント療法が施される。BCGは弱毒化した生ウシ結核菌から生産され、CD4+Thlサイトカイン、例えば、インターロイキン-2（IL-2）、IL-12、IL-18およびインターフェロン-γ（INF-γ）が媒介する自然免疫反応を活性化することができる。しかし、BCG不応性、耐性、再発、または不寛容のために、患者の40％以下において最初の一年以内でBCG免疫療法は失敗する（Zlotta ARら、2009; Chiong ＆ Esuvaranathan、2010）。従って、表在膀胱癌の患者に対する治療成果を改善する新しいアジュバント療法の開発が必要である。
【０００６】
膀胱癌用に可能なアジュバント治療として研究されているウイルスベクターベースの遺伝子療法には、ワクシニアウイルス（Lee SSら、1994；Gomella LGら、2001 ； Siemens DRら、2003；Fodor Iら、2005）、アデノウイルス（Morris BDら、1994；Sutton MAら、2007；Kuball Jら、2002；Siemens DRら、2003；Pagliaro LCら、2003；Malmstrom PUら、2010）、カナリア痘ウイルス （Siemens DRら、2003）、レオウイルス （Hanel EGら、2004）、レトロウイルス（ShiauA Lら、2001；Kimura Tら、2003；Dumey Nら、2005；Kikuchi Eら、2007）、レンチウイルス（Kikuchi Eら、2004）および水疱性口内炎ウイルス（Hadaschik BAら、2008）が含まれる。少なくとも5件の臨床試験が膀胱癌を治療する複製可能ワクシニアウイルスおよびアデノウイルスベクターの使用について報じられている（Gomella LGら、2001；Kuball Jら、2002；Pagliaro LCら、2003；Burke J、2010；Malmstrom PUら、2010）。
【０００７】
癌遺伝子療法のために試験された様々なウイルスベクターの中にレトロウイルスがある。レトロウイルスの生活環は宿主ゲノムに組み込まれた状態を含み、従って、長期間にわたる治療遺伝子の安定な発現が可能になる。レトロウイルスベクター使用に対する一つの大きな懸念は、これらのベクターによるゲノムの転写活性領域中への優先的組込みが挿入による突然変異誘発、癌遺伝子活性化および細胞の形質転換を生じうることである。フランスおよびイギリスにおけるSCID-X 1に対する遺伝子療法後のいくつかの小児における白血病の発症は（Hacein-Bey-Abinaら、2003）、ウイルスベクターに関連する潜在的リスクの徹底的調査をもたらした。
【０００８】
アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）由来のウイルスベクターは挿入による突然変異誘発のリスクが遥かに低く、癌遺伝子療法についても試験されている（Cross ＆ Burmester、2006；Palmerら、2006）。アデノウイルスベクターはまた、動物モデルおよび少なくとも４件の初期段階の臨床試験において膀胱癌の遺伝子療法のために、広く試験されている（Kuball Jら、2002；Pagliaro LCら、2003；Burke J、2010；Malmstrom PUら、2010）。しかし、感染性ヒトウイルスとして、アデノウイルスおよびAAVはヒト免疫系を活性化する（Calcedo Rら、2009；Huang ＆ Yang、2009；Nayak ＆Herzog,2010）。AAVベクターはB細胞を効率的に活性化し（Huang ＆ Yang、2009）、またAAV2特異的抗体は年齢層および地理学的位置によって35〜80%の個人において検出される（Calcedo Rら、2009）。AAVカプシド特異的CD8+メモリーT細胞は非常に低頻度であるがヒトに存在し、AAV形質導入時に再活性化されうる（Nayak ＆ Herzog、2010）。アデノウイルスに対する既存免疫はそれよりさらに行き渡っている（Bessis Nら、2004；Nayak ＆ Herzog、2010）。C群アデノウイルスに対する既存抗体はヒトの97％より多く、またアデノウイルスベクターを作製するために通常用いられる血清型2アデノウイルスに対する抗体はヒトのおよそ50％に検出される（Nayak ＆ Herzog、2010）。T細胞を介する免疫については、様々なアデノウイルス血清型に対するCD4+およびCD8+交差反応性T細胞がヒト末梢血において検出された（Nayak ＆ Herzog、2010）。
【０００９】
望ましくない拒絶反応の可能性の観点から、既存免疫は遺伝子療法におけるヒト感染性ウイルス由来のベクターの使用に対する懸念事項である。既存の抗ウイルス免疫が重篤な病理学的変化を引き起こさない条件下でも、それはまだウイルスベクターを不活化し、それ故に、形質導入効率に影響を及ぼしうる。アデノウイルスは免疫原性が強力であるので、既存免疫の無い患者では、アデノウイルスベクターは最初の投与後に強力な抗ウイルス免疫を速やかに誘発しうる。この反応はこのベクターのさらなる使用を妨げるか、またはその後の使用の効果を低下させるだろう。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Siegel Rら, 2011
【非特許文献２】Zlotta ARら、2009; Chiong ＆Esuvaranathan、2010
【非特許文献３】Lee SSら、1994
【非特許文献４】Gomella LGら、2001
【非特許文献５】Siemens DRら、2003
【非特許文献６】Fodor Iら、2005
【非特許文献７】Morris BDら、1994
【非特許文献８】Sutton MAら、2007
【非特許文献９】Kuball Jら、2002
【非特許文献１０】Pagliaro LCら、2003
【非特許文献１１】Malmstrom PUら、2010
【非特許文献１２】Hanel EGら、2004
【非特許文献１３】ShiauA Lら、2001
【非特許文献１４】Kimura Tら、2003
【非特許文献１５】Dumey Nら、2005
【非特許文献１６】Kikuchi Eら、2007
【非特許文献１７】Kikuchi Eら、2004
【非特許文献１８】Hadaschik BAら、2008
【非特許文献１９】Burke J、2010
【非特許文献２０】Hacein-Bey-Abinaら、2003
【非特許文献２１】Cross ＆ Burmester、2006
【非特許文献２２】Palmerら、2006
【非特許文献２３】Calcedo Rら、2009
【非特許文献２４】Huang ＆ Yang、2009
【非特許文献２５】Nayak ＆ Herzog,2010
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
ウイルス、複製可能ウイルスまたは複製欠損性組換えウイルスベクターが、腫瘍モデルで膀胱癌療法について試験された。しかし、膀胱療法としてのヒト感染性ウイルスは、既存免疫および強力な免疫原性に関連する問題を含む重大な欠点を有する。それに対して、本発明者らは、昆虫バキュロウイルスベースのベクターが膀胱癌療法のための好適なビヒクルを提供しうることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
従って、本明細書に記載の方法は、表面腫瘍切除後の膀胱癌の再発リスクを予防または軽減するアジュバント療法を含む、膀胱癌を治療するためのバキュロウイルスの使用に関する。現行のウイルスベクター系の有効性と安全性の限界を考えると、バキュロウイルスベクターは、免疫を誘発するアジュバント療法としてまたは治療用核酸の送達のためのベクターとして使用するための、実行可能な代替手段を提供するものである。
【００１３】
本発明者らは、膀胱内送達したバキュロウイルスベクターが正常な（癌を有しない）マウス膀胱に効果的に形質導入できることを実証した。ヒトサイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント、ならびに、ヒトT細胞白血病ウイルス1型由来の長末端反復のRセグメントおよびU5配列の一部を含有する哺乳動物発現カセットを、ウイルスゲノム中に組み込むバキュロウイルスベクターは、高レベルのin vivo形質導入効率を提供することができる。
【００１４】
その上、本発明者らはバキュロウイルスベクター内にいかなる治療導入遺伝子も含まないバキュロウイルスの形質導入だけで抗腫瘍免疫を刺激できることを発見した。いかなる導入遺伝子も含まないバキュロウイルスの膀胱内投与を受けたマウスから採集した膀胱組織抽出物を、マウスサイトカイン／ケモカイン抗体アレイを用いて解析すると、アレイ中のタンパク質の59％は2倍超の発現増加を示し、これには顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、および皮膚T細胞誘因ケモカインの上方制御が含まれる。バキュロウイルスによる治療は、同所性膀胱癌を有するマウスの生存を延長し、該動物の50％が6か月を超えて生存することを見出した。
【００１５】
CD40リガンド遺伝子の悪性同所性膀胱腫瘍が進行するマウスの膀胱中への膀胱内送達のためにバキュロウイルスベクターを用いると、腫瘍の優先的形質導入後に腫瘍増殖および平均膀胱重量の低下が観察された。
【００１６】
従って、バキュロウイルスおよびバキュロウイルス遺伝子導入ベクターの直接膀胱内滴下注入は膀胱癌に対する新規の治療様式を提供しうる。
【００１７】
一態様において、本発明は、膀胱細胞をバキュロウイルスベクターと接触させるステップを含む、核酸分子を膀胱細胞に送達する方法を提供する。
【００１８】
細胞は膀胱癌細胞または健常な、非癌膀胱細胞であってもよく、また、in vitroもしくはin vivoの細胞であってもよく、膀胱癌の治療を必要とする被験者の細胞を含む。細胞が被験者中の細胞である場合、接触は膀胱内滴下注入による被験者へのバキュロウイルスベクターの投与を含んでもよい。
【００１９】
バキュロウイルスベクターはさらに、膀胱細胞における導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターと機能可能に連結された膀胱細胞における発現のための導入遺伝子を含む。例えば、導入遺伝子は膀胱癌治療のための治療導入遺伝子であってもよく、例えば、CD40LまたはIL-15をコードする治療導入遺伝子を含む。
【００２０】
バキュロウイルスベクターにおいて、プロモーターは、配列番号1に記載の配列を含むものを包含するヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターを含んでもよい。
【００２１】
バキュロウイルスベクターはさらに、例えば配列番号2に記載の配列を含むものを包含するウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節エレメントを導入遺伝子の3'非翻訳領域に含んでもよい。
【００２２】
バキュロウイルスベクターはさらに、例えば配列番号3に記載の配列を含むものを包含するヒトT細胞白血病ウイルス1型由来の長末端反復のRセグメントおよびU5配列の少なくとも一部を、導入遺伝子の5'非翻訳領域に含んでもよい。
【００２３】
本方法はさらに、膀胱細胞をバキュロウイルスベクターと接触させる前にまたは同時にトランスフェクション剤を加えるステップを含んでもよい。トランスフェクション剤は、例えば、ポリ-L-リシン、クロルパクチン（Clorpactin）WCS-90、ドデシル-B-dd-マルトシド（DDM）、もしくはドデシル硫酸ナトリウム（SDS）またはそれらのいずれかの組み合わせであってもよい。
【００２４】
本明細書に記載の方法に従い、本発明はバキュロウイルスベクターの様々な使用を提供する。
【００２５】
従って、他の態様において、本発明はかかる治療を必要とする被験者における膀胱癌の治療における使用のためのバキュロウイルスベクターであって、該使用が被験者におけるバキュロウイルスベクターの膀胱内滴下注入を含む前記バキュロウイルスベクターを提供する。
【００２６】
他の態様において、本発明は被験者の膀胱内の膀胱内滴下注入における使用のためのバキュロウイルスベクターを提供する。
【００２７】
他の態様において、本発明は、バキュロウイルスベクターの膀胱内滴下注入による、かかる治療を必要とする被験者における膀胱癌を治療するためのバキュロウイルスベクターの使用を提供する。
【００２８】
他の態様において、本発明は、バキュロウイルスベクターの膀胱内滴下注入による、かかる治療を必要とする被験者における膀胱癌を治療するための薬剤の製造のためのバキュロウイルスベクターの使用を提供する。
【００２９】
他の態様において、本発明は被験者の膀胱での膀胱内滴下注入のためのバキュロウイルスベクターの使用を提供する。
【００３０】
他の態様において、本発明は被験者の膀胱での膀胱内滴下注入のための医薬品の製造のためのバキュロウイルスベクターの使用を提供する。
【００３１】
以下の本発明の具体的な実施形態の説明ならびに添付の図および表を概観すると、本発明の他の態様および特徴は当業者に明らかであろう。
【００３２】
単なる例示として本発明の実施形態を説明する図および表は次の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】balb/cヌードマウスにおける、膀胱内滴下注入後のマウス膀胱のバキュロウイルス形質導入。(A)3つの異なるバキュロウイルスベクターを形質導入した代表的な動物における、ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の生物発光画像。熱地図（heat map）は導入遺伝子発現域を表し、色は強度を表す。バキュロウイルスベクター発現カセットの構造の模式図を左に示す。略語：CMV：ヒトサイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーターおよびエンハンサー；WPRE：ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント；RU5：ヒトT細胞白血病ウイルス1型由来の長末端反復のRセグメントおよびU5配列の一部。(B)ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の経時的解析。in vivo遺伝子発現レベルを生物発光シグナルを測定することにより定量した。データは平均＋s.d.を表し、1グループ当たりn=3である。
【図２】C57BL/6マウスにおける、膀胱内滴下注入後のマウス膀胱のバキュロウイルス形質導入。(A)代表的な動物におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の生物発光画像。マウスに、バキュロウイルスベクターBV-RU5-Luc-WPREをマウス当たり108または107ウイルス粒子の用量で形質導入した。(B)ルシフェラーゼレポーター遺伝子発現の経時的解析。in vivo遺伝子発現レベルを生物発光シグナルを測定することにより定量した。データは平均＋s.d.、1グループ当たりn=3である。(C)膀胱におけるバキュロウイルスの形質導入を実証するための、ルシフェラーゼタンパク質に対する抗体による免疫染色。バキュロウイルス形質導入の24時間後に組織切片を採集した。低倍率の画像と高倍率の画像を示す。バキュロウイルスの形質導入後の正常な膀胱の構造を示すためのヘマトキシリンおよびエオシン染色を含む。
【図３】バキュロウイルスの形質導入は膀胱におけるサイトカイン／ケモカイン発現を上方制御する。(A)膀胱内滴下注入を受けていない（正常な）ならびにそれぞれPBSおよびBacPAK6の膀胱内滴下注入を受けたC57BL/6マウスから採集したサンプルの代表的ブロット画像。膀胱を滴下注入の48時間後に回収してホモジナイズした。上清を、サイトカイン／ケモカイン抗体アレイを探索するために用いた。(B)バキュロウイルスの形質導入時のマウス膀胱におけるサイトカインおよびケモカインの相対的上方制御。濃度測定データをRayBio(登録商標)解析ツールにより解析した。倍数変化（平均シグナル強度差）を示す。データは平均＋s.d.を表し、1グループ当たりn＝3である。
【図４】バキュロウイルスの形質導入の抗腫瘍効果。(A)マウス膀胱癌細胞の膀胱内接種後の膀胱における腫瘍成長。2つの型のマウス膀胱癌細胞、MB49およびMB49S1（MB49細胞のサブクローン）を1動物当たり105癌細胞にて試験した。膀胱を接種14日後に回収した。H＆E染色は、親MB49細胞の接種により形成した腫瘍と比較して、MB49S1腫瘍は遅い成長速度を有することを示す。(B)BacPAK6形質導入は膀胱腫瘍を有するマウスの生存を延長する。105MB49S1細胞の接種7日後に、哺乳動物の遺伝子発現カセットを有しないバキュロウイルスベクターであるBacPAK6の膀胱内滴下注入を行った。95日までの生存曲線を示す。1グループ当たりn＝10である。統計解析はログランク検定を用いて行った。
【図５】バキュロウイルスベクターは膀胱癌細胞におけるCD40L発現を媒介する。膀胱癌モデルにおけるバキュロウイルスベクターの形質導入の効力。(A)バキュロウイルスはin vitroおよびin vivoで膀胱癌細胞に形質導入することができる。バキュロウイルスベクターBV-RU5-Luc-WPREを、マウスMB49膀胱癌細胞、ヒトT24膀胱癌細胞、およびMB49細胞の接種により形成したマウス同所性膀胱腫瘍に形質導入するのに用いた。バキュロウイルスの形質導入24時間後に回収した細胞および組織切片において、ルシフェラーゼタンパク質に対する抗体を用いる免疫染色によってルシフェラーゼレポーター遺伝子発現を実証した。H＆E染色は膀胱腫瘍増殖を示す。(B)CD40Lに対するバキュロウイルスベクター発現カセットの構造の模式図。(C)RT-PCRは、in vitro BV-CD40L形質導入の24時間後のMB49細胞におけるCD40L発現を実証する。(D)ウェスタンブロットにより実証したマウスMB49膀胱腫瘍におけるCD40L発現。BV-CD40Lの膀胱内滴下注入を、105 MB49細胞の接種3日後に行った。膀胱をBV-CD40Lの形質導入24時間後に回収した。
【図６】バキュロウイルスが媒介するCD40L発現の抗腫瘍効果。BV-CD40Lの膀胱内滴下注入を2 x 104 DiR-標識MB49細胞の接種3日後に行った。BackPAK6の膀胱内滴下注入を形質導入対照として含めた。分析のために、膀胱をバキュロウイルス形質導入の1週間後に採集した。(A)CD40L発現は腫瘍増殖を遅らせる。DiR蛍光画像は各動物における最初の腫瘍負荷を示し、H＆E染色は腫瘍成長を示す。(B)膀胱重量差。データは平均＋s.d.を表し、1グループ当たりn＝5である。*は、スチューデントt検定による、BacPAK6グループに対するp＜0.05。
【図７】膀胱癌を有するマウスの生存に対するCD40LおよびIL-15の共送達の効果。(A)バキュロウイルスベクターによるCD40LおよびIL-15の共送達は膀胱腫瘍を有するマウスの生存を延長する。バキュロウイルスベクターの膀胱内滴下注入を、105 MB49細胞の接種2日後に実施した。100日までの生存曲線を示す。(B)H＆E染色は、CD40LおよびIL-15を発現するバキュロウイルスベクターを用いて処理した1匹のマウスにおいて、MB49腫瘍が全面的に停止したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
本明細書に記載の方法および使用は、バキュロウイルスベクターが、膀胱癌を有したことのある被験者における再発癌を低減または予防することを含む膀胱癌療法に使用できるという発見に関するものである。バキュロウイルスベクターはいかなる導入遺伝子の挿入がなくても、抗腫瘍免疫反応を刺激するように作用しうる。抗腫瘍反応を増加または補充するために、治療用核酸がバキュロウイルスベクターに含まれてもよい。小胞内送達を含む、ある特定の条件下においては、バキュロウイルスベクターは健常な非癌膀胱細胞に形質導入せずに、優先的に膀胱腫瘍細胞に形質導入しうる。
【００３５】
従って、バキュロウイルスベクターを用いて核酸分子を膀胱細胞に送達する方法が提供される。本方法は、ベクターによって形質導入された膀胱細胞をもたらす、膀胱細胞をバキュロウイルスベクターと接触させるステップを含む。
【００３６】
理解されるように、細胞のウイルスまたはウイルスベクターによる形質導入はウイルスベクターまたはウイルスゲノムの細胞への送達、すなわち、ウイルス核酸物質による細胞の感染を意味する。バキュロウイルスベクターによる哺乳動物細胞の形質導入の場合、形質導入は産物の感染または細胞内でウイルスゲノムが複製される能力を意味しない。
【００３７】
接触させる膀胱細胞はいかなる膀胱細胞であってもよい。膀胱細胞はin vitro膀胱細胞であってもよく、組織培養の細胞、例えば、確立された膀胱細胞株由来の細胞、組織培養の初代膀胱細胞、被験者由来の外植膀胱細胞、形質転換もしくは不死化した膀胱細胞を含む。膀胱細胞はヒト被験者を含む哺乳動物被験者を含む被験者のin vivo膀胱細胞であってもよい。例えば、膀胱細胞は膀胱癌の治療を必要とする被験者のものであってもよい。膀胱細胞はトランスジェニック膀胱細胞であってもよく、in vitroまたはin vivo環境のものを含み、例えば、トランスジェニック膀胱細胞を含む動物モデルを含む。
【００３８】
膀胱細胞は健常な、すなわち、非癌性の膀胱細胞であってもよく、または腫瘍の膀胱癌細胞または腫瘍から切除した膀胱癌細胞であってもよく、または癌化する素因を有する膀胱細胞であってもよく、例えば、膀胱細胞が癌化する素因になる突然変異を有する膀胱細胞を含む。
【００３９】
膀胱細胞と接触させるバキュロウイルスベクターはいかなるバキュロウイルスベクターであってもよい。バキュロウイルスベクターは当技術分野で公知であり、最もよく用いられるバキュロウイルスベクターはAutographa californica核多角体病ウイルス（AcMNPV）由来である。バキュロウイルスは、形質導入した細胞での複製または毒性を生じることなく哺乳動物細胞に進入する能力がある昆虫DNAウイルスである。バキュロウイルスは増殖性と非増殖性の両方の静止状態の細胞に対する広い指向性（tropism）を有し、哺乳動物の活性プロモーターの支援を受けて様々な哺乳動物細胞にin vitroおよびin vivoで目的の遺伝子を効率的に導入することができる。該ウイルスは哺乳動物細胞に進入できるが、昆虫特異的プロモーターからそれ自体の遺伝子を発現することはできない；従って、バキュロウイルスは脊椎動物細胞において複製およびウイルスタンパク質を発現することはできない、従って、ウイルスにコードされた遺伝子のin vivo発現の結果として免疫反応を誘発することも、既存のウイルス物質と組換わることも、ヒト体内の他のウイルスの複製を補助することもないであろう。哺乳動物細胞におけるバキュロウイルスの感染は、高いMOIにおいても可視的な細胞変性効果を生じることはない（Shojiら、1997）。
【００４０】
例えば、送達ベクターとしてバキュロウイルスAcMNPVを用いる他の魅力ある利点は、単一ベクターからの大きな機能性遺伝子または複数の遺伝子を送達するために有利に用いうる、130kbのウイルスゲノムにより得られる大きなクローニング能力である。ヒト細胞において、トランスジェニックベクターは典型的に形質導入される細胞のゲノム中に組み込まれないので、哺乳動物発現カセットを有するバキュロウイルスベクターは一過性発現を媒介するのに有効でありうる。従って、バキュロウイルスベクターは、短期間、高レベルの導入遺伝子発現を必要とする適用に好適であって、挿入による突然変異誘発により課せられるリスクは低い。
【００４１】
バキュロウイルスベクター形質導入の他の重要な利点は、昆虫ウイルスはヒトに非感染性であるので、該ウイルスに対する既存免疫がヒトに存在しない点である（Wang Sら、2010）。Straussらは、ヒト血清サンプルにおける5型アデノウイルスに対する中和抗体の保有率は65％であったが、バキュロウイルス中和抗体に対して陽性のヒト血清は無かったと報じている（Strauss Rら、2007）。同じ研究で、ヒトにおいて既存のアデノウイルス特異的T細胞の検出は可能であったが、既存バキュロウイルス特異的T細胞は存在しなかった。アデノウイルスと比較すると、より少数のウイルス特異的T細胞数が誘導されることにより示される様に、バキュロウイルスは相対的に免疫原性が低い（Strauss Rら、2007）。
【００４２】
その上、他の遺伝子療法ウイルスベクターと異なり、バキュロウイルスベクターは、無血清培地で生産され得、これは血清供与動物からのウイルスおよびプリオン病原体による血清汚染の潜在的危険を排除する。
【００４３】
いかなる導入遺伝子も含まないバキュロウイルスベクターそれ自体が膀胱細胞に送達される核酸であってもよい。すなわち、送達によって、バキュロウイルスベクター核酸物質により形質導入した、または、取り込んだ細胞を得ることができる。
【００４４】
他の実施形態において、ウイルスベクターは膀胱細胞で発現される発現産物をコードする導入遺伝子コード配列を含んでもよい。膀胱細胞内で発現産物の所望の発現プロフィールをもたらすために、発現産物をコードする導入遺伝子配列はプロモーター領域を含む全ての必要な調節配列と機能可能に連結されることは理解されるであろう。配列が機能的関係で配置される場合、第1の核酸配列は第2の核酸配列と機能可能に連結される。例えば、プロモーターがコード配列の転写を活性化しかつ駆動する場合、コード配列はプロモーターと機能可能に連結されている。従って、膀胱細胞と接触させるバキュロウイルスベクターはさらに、膀胱細胞での導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターと機能可能に連結された、膀胱細胞における発現のための導入遺伝子を含みうる。
【００４５】
いくつかの実施形態において、導入遺伝子コード配列と機能可能に連結されたプロモーターはヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは配列番号1に記載の配列を有するヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターを含む。
【００４６】
TTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATC［配列番号1］
いくつかの実施形態において、バキュロウイルスベクターは、配列番号1に記載の配列を有するヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターから本質的に成るプロモーターを含む。いくつかの実施形態において、プロモーターは配列番号1に記載の配列を有するヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターから成る。
【００４７】
本明細書で使用する表現「から本質的に成る」は、その核酸配列が配列内または配列の一端もしくは両端を含む一以上のヌクレオチド塩基を含むが、該追加のヌクレオチド塩基は、例えば、膀胱細胞中の機能可能に連結されたコード配列の発現を駆動するプロモーターとして機能するための核酸配列の機能に実質的に影響を与えないことを意味する。
【００４８】
他の実施形態において、プロモーターは配列番号1と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の配列同一性を有し、依然として膀胱細胞における遺伝子発現を指示する能力を維持しているヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターである。
【００４９】
バキュロウイルスベクターはさらに、導入遺伝子の3'非翻訳領域に、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節エレメントを含む転写後調節エレメントを含んでもよい。いくつかの実施形態において、バキュロウイルスベクターは配列番号2に記載の配列を含むウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節エレメントを含む。
【００５０】
CGATAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTG［配列番号2］
いくつかの実施形態において、バキュロウイルスベクターは配列番号2に記載の配列から本質的に成るウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節エレメントを含む。いくつかの実施形態において、バキュロウイルスベクターは配列番号2に記載の配列から成るウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節エレメントを含む。
【００５１】
他の実施形態において、バキュロウイルスベクターは、配列番号2と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の配列同一性を有し、依然として膀胱細胞における遺伝子発現を指示する能力を維持しているウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節エレメントを含む。
【００５２】
バキュロウイルスベクターはさらに、導入遺伝子の5'非翻訳領域に、ヒトT細胞白血病ウイルス1型由来の長末端反復のRセグメントおよびU5配列の少なくとも一部を含むものであってもよく、ここで、例えば、該ヒトT細胞白血病ウイルス1型由来の長末端反復のRセグメントおよびU5配列の少なくとも一部は配列番号3に記載の配列を含む。
【００５３】
GGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCCAAGCTGTGACCGGCGCCTAC［配列番号3］。
【００５４】
いくつかの実施形態において、バキュロウイルスベクターは、配列番号3に記載の配列から本質的に成るヒトT細胞白血病ウイルス1型由来の長末端反復のRセグメントの上流5'領域およびU5配列の少なくとも一部を含む。いくつかの実施形態において、バキュロウイルスベクターは、配列番号3に記載の配列から成るヒトT細胞白血病ウイルス1型由来の長末端反復のRセグメントの上流5'領域およびU5配列の少なくとも一部を含む。
【００５５】
他の実施形態においては、バキュロウイルスベクターは配列番号3と少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の配列同一性を有し、依然として膀胱細胞における遺伝子発現を指示する能力を維持しているヒトT細胞白血病ウイルス1型由来の長末端反復のRセグメントおよびU5配列の少なくとも一部を含む。
【００５６】
バキュロウイルスベクターは当業者に公知でありうる標準技術、例えば、PCRおよび分子クローニング技術を用いてそのように改変することができる。例えば、バキュロウイルスベクターは市販のクローニングおよび発現系、例えば、BAC-TO-BACTMバキュロウイルス発現系（Gibco BRL、Life Technologies、USA）を用いて容易に改変することができる。
【００５７】
バキュロウイルスは、調節領域に加えて、導入遺伝子のコード配列を含んでもよい。用語「導入遺伝子」は、バキュロウイルスにとって外来の遺伝子を意味し、例えば、バキュロウイルスによる導入遺伝子の発現への言及はバキュロウイルスのゲノムにとって外来である遺伝子の発現を意味する。導入遺伝子のコード配列は、膀胱細胞での発現されることが所望されるいかなる発現産物をコードしてもよい。例えば、導入遺伝子は治療用のタンパク質もしくはRNA、選択可能なタンパク質もしくはRNAマーカー、検出可能なレポータータンパク質もしくはRNA、または膀胱細胞の選択環境条件に対する耐性を与えるタンパク質をコードしてもよい。導入遺伝子は、調節RNA、例えば膀胱細胞の遺伝子の発現を調節するためのmiRNAをコードしてもよい。
【００５８】
例えば、導入遺伝子は膀胱癌を治療するための治療用発現産物をコードしてもよい。従って、導入遺伝子は、臨床上の有用性を有する任意の遺伝子を含む治療用導入遺伝子、例えば、癌予防もしくは治療に関わるRNAもしくはタンパク質などの遺伝子産物をコードする遺伝子、または癌予防もしくは治療に関わる細胞調節効果を有する遺伝子であってよい。遺伝子産物は被験者における欠失もしくは喪失した遺伝子産物、タンパク質または細胞調節効果を代替し、それにより膀胱癌の予防または治療を可能にすることができる。
【００５９】
従って治療用の発現産物は、膀胱細胞において発現した場合、細胞に治療効果を有する、または膀胱細胞内で所望の効果を与えるタンパク質またはペプチドを含む。
【００６０】
治療用の発現産物は、臨床上有用な調節を提供する膀胱細胞における遺伝子発現の調節をもたらすRNA分子、例えば、アンチセンスRNA、miRNAまたは低分子干渉RNA（siRNA）分子であってもよい。アンチセンスRNA、miRNAまたはsiRNAは腫瘍原性または腫瘍増殖に関わる遺伝子の発現の下方制御または阻害または低減に関わってもよい。
【００６１】
例えば、限定されるものでないが、治療導入遺伝子はCD40LまたはIL-15であるタンパク質をコードしてもよい。一例として、治療効果のために、CD40LおよびIL-15をコードする治療導入遺伝子を同じ被験者において一緒に用いることができる。CD40LとIL-15導入遺伝子は一緒に同じバキュロウイルスベクターに含まれてもよく、または、次に同じ被験者に送達される異なるバキュロウイルスベクターに含まれてもよい。
【００６２】
核酸分子を膀胱細胞に送達するためには、膀胱細胞をバキュロウイルスベクターと接触させる。接触は、例えば、膀胱細胞がバキュロウイルスベクターにより形質導入されるように膀胱細胞を含有する組織培地にバキュロウイルスベクターを加えるステップを含んでもよい。接触はバキュロウイルスベクターを被験者に投与するステップを含んでもよい。
【００６３】
従って、核酸分子が送達される膀胱細胞は、膀胱癌の治療または予防を必要とするヒトを含む哺乳動物を含む被験者におけるin vivoであってもよい。
【００６４】
従って、本方法は、癌である、腫瘍の一部である、癌化する素因を有する、または癌化を防止しようとするin vivo膀胱細胞の環境で実施してもよい。
【００６５】
従って、膀胱細胞をバキュロウイルスベクターに接触させるステップは、有効量のバキュロウイルスベクターを被験者に投与するステップを含む。本明細書で使用する用語「有効量」は、例えば、TCCを含む表在膀胱癌を含む膀胱癌を以前に有したことがある被験者における膀胱癌の再発リスクを阻止または軽減することを含む、膀胱癌を治療または予防する所望の結果を達成するのに必要な用量および時間についての有効量を意味する。
【００６６】
本明細書で使用する膀胱癌に関する「治療する」または「治療」は、臨床結果を含む有利なまたは所望の結果を得るためのアプローチを意味する。有利なまたは所望の臨床結果には、限定されるものでないが、１以上の症状または状態の軽減もしくは改善、疾患の程度の軽減、疾患状態の安定化、疾患発症の予防、疾患拡大の予防、疾患の再発の予防、疾患進行または再発の遅延または緩徐化、疾患発症の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または緩和、および（部分的または全体的な）緩解が含まれる。「治療」はまた、治療しない場合の予測を超える被験者の生存の延長も意味しうる。「治療」はまた、疾患の進行または再発の阻止、疾患の進行または再発の一時的緩徐化も意味しうるが、疾患の進行または再発の永久的な阻止に関わることがより好ましい。
【００６７】
昆虫バキュロウイルスであるAutographa californica核多角体病ウイルス（AcMNPV）由来の組換えベクターは、癌遺伝子療法を含む遺伝子療法に有用なベクターとして提案されている（Hofmann Cら、1995；Kost TAら、2005；Hu YC、2008、2010；Wang Sら、2010）。TakakuらはバキュロウイルスによるNK細胞に依存する抗腫瘍免疫の活性化を記載している（KitajimaMら、2008a）。バキュロウイルスが誘導する抗腫瘍作用は、おそらく腫瘍特異的な細胞傷害性Tリンパ球（CTL）反応および腫瘍特異的な抗体産生を誘発することによる獲得免疫に関わりうる（KitajimaMら、2008b；SuzukiTら、2010）。従って、このバキュロウイルスの免疫刺激特性は、記載された癌免疫療法の方法に使用することができる。
【００６８】
バキュロウイルスベクターは、当技術分野で公知の標準技術を用いて被験者に投与してもよい。バキュロウイルスベクターを全身に投与してもよいし、または膀胱内滴下注入により膀胱中に投与してもよい。
【００６９】
理解されるように、膀胱は中空器官であるので、尿道カテーテルを通しての非外科的膀胱内薬物投与および内視鏡による治療効力の評価が可能である。膀胱内送達した治療薬は全身曝露が限られ、局所的に作用し、表面膀胱癌を容易に到達可能であるという利点がある。
【００７０】
哺乳動物細胞のin vivoバキュロウイルス形質導入によって、自然免疫系の主要成分である血清補体タンパク質によるウイルス認識の結果として、全身送達されたバキュロウイルスベクターの不活化が生じうる（HofmannCら、1998）。免疫応答性動物においては、全身送達されたバキュロウイルスベクターが発現されないことがありうる。ウイルスを中和する補体の能力を克服するために高力価のバキュロウイルスが用いられたが、この手法でもなおバキュロウイルスの媒介する導入遺伝子発現をもたらさないことがありうる（Kitajima Mら、2008a）。従って、血清補体によるウイルス不活化などの全身ウイルス投与の多くの欠点を避けるために、尿路を介する膀胱内カテーテル処置による膀胱癌療法が行われうる。
【００７１】
本明細書に記載した方法で示したように、膀胱内投与したバキュロウイルスベクターは、炎症性サイトカインの発現を誘発するかまたは放出を促進する強い免疫刺激能力を発揮することができる。この発見は、動物の身体に注射した後にバキュロウイルスが保護性の自然免疫反応を誘発しうることを見出した従来の研究と一貫性がある。その上、バキュロウイルスは、ウイルス遺伝子の産物を特異的に指向する免疫反応として特徴付けられる適応免疫も誘導することができる（Pieroniら2001；Abeら2005）。
【００７２】
理論により限定されるものではないが、上記の免疫刺激効果は腫瘍増殖を阻止する治療におそらく利用することができる。この仮説は、膀胱内に送達されたいかなる導入遺伝子も発現しないバキュロウイルスが、確立された同所性膀胱癌を有する免疫応答性マウスの生存を延長できるという観察により支持される。この同系モデル系はインタクトな免疫機能を提供し、膀胱癌に対する治療用バキュロウイルスベースの治療の研究を可能にする。
【００７３】
バキュロウイルスベクターの膀胱内滴下注入時の膀胱細胞による摂取効率を高めるために、本方法にさらに形質導入剤の使用を含んでもよい。例えば、膀胱を最初にトランスフェクション剤で所与の時間処理した後に、バキュロウイルスベクターを膀胱内滴下注入を介して膀胱細胞と接触させる。
【００７４】
トランスフェクション剤は当技術分野で公知であり；例えば、トランスフェクション剤はポリ-L-リシン、クロルパクチン（Clorpaction）WCS-90、ドデシル-B-dd-マルトシド（DDM）もしくはドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、またはそれらのいずれかの組み合わせであってもよい。
【００７５】
しかし、膀胱細胞をトランスフェクション剤によって前処理せずに本方法を実施すると、膀胱癌細胞と比較して健常な（非癌性）膀胱細胞によるバキュロウイルスベクターの取込みが変わりうることが観察された。そこで、いくつかの実施形態においては、本方法は、健常な膀胱細胞よりも膀胱細胞を優先的に標的化するために、トランスフェクション剤の使用を省略する。
【００７６】
投与されるバキュロウイルスベクターの濃度と量は、治療される膀胱癌、バキュロウイルスベクターに含まれる導入遺伝子の型、投与様式、他の同時治療、ならびに被験者の年齢および健康に応じて変わりうる。生存および癌予防または治療は膀胱内滴下注入の頻度を変えることにより改善しうる。
【００７７】
上記のように、バキュロウイルスベクターの効力はバキュロウイルスベクターに治療導入遺伝子を含むことにより改善されうる。
【００７８】
投与の助けとして、バキュロウイルスベクターを医薬組成物中の一成分として製剤化してもよい。
【００７９】
従って、上記のバキュロウイルスベクター、および任意に製薬上許容される希釈剤を含む医薬組成物も提供される。かかる医薬組成物は、上記のような膀胱癌の治療における使用のためのものであってもよい。
【００８０】
組成物は通常、製薬上許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤および様々な適合しうる担体を含有しうる。あらゆる送達の剤形に対して、バキュロウイルスベクターは生理学的塩溶液で製剤化される。
【００８１】
製薬上許容される希釈剤の比率と同一性は、選んだ投与経路、生細胞および生ウイルス粒子との適合性、ならびに標準医薬品プラクティスによって決定することができる。一般に、医薬組成物はバキュロウイルスベクターの生物学的特性を消さないかまたは有意に害さない成分を用いて製剤されるであろう。
【００８２】
医薬組成物は被験者への投与に好適な製薬上許容される組成物を調製するための公知の方法により調製することができ、例えば、バキュロウイルスベクターおよびさらなる活性物質の有効量を、製薬上許容されるビヒクルとの混合物において組み合わせる。好適なビヒクルは、例えば、レミントンの薬学（Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985）に記載されている。これに基づくと、医薬組成物は、限定されるものでないが、１以上の製薬上許容されるビヒクルもしくは希釈剤と組み合わせたバキュロウイルスベクターの溶液を含み、好適なpHでかつ生理学的溶液と等張なのバッファー溶液に含有される。
【００８３】
用いる医薬組成物の用量は、治療する特定の症状、症状の重篤度、個々の被験者のパラメーター、例えば、年齢、身体条件、サイズおよび体重、治療期間、同時に行われる治療法（もし存在すれば）、具体的な投与経路、ならびに健康管理医の知見および専門知識内である他の類似の因子に応じて決定される。これらの因子は当業者には公知であり、かつ最小限の日常的な実験から求めることができる。
【００８４】
また、記載のバキュロウイルスベクターの様々な使用が考えられる。すなわち、膀胱癌を治療する必要のある被験者における膀胱内滴下注入における使用のためのバキュロウイルスベクター、バキュロウイルスベクターの膀胱内滴下注入による、かかる治療を必要とする被験者における膀胱細胞を治療するためのバキュロウイルスベクターの使用、バキュロウイルスベクターの膀胱内滴下注入による、かかる治療を必要とする被験者における膀胱細胞を治療するための薬剤の製造のためのバキュロウイルスベクターの使用、膀胱癌を治療する必要のある被験者における膀胱内滴下注入のためのバキュロウイルスベクターの使用、および膀胱癌を治療する必要のある被験者における膀胱内滴下注入のための薬剤の製造のためのバキュロウイルスベクターの使用が提供される。
【００８５】
本方法および使用を、次の非限定的実施例を用いてさらに例示する。
【実施例】
【００８６】
実施例１
膀胱癌治療のための昆虫バキュロウイルスベースのベクターの使用を調べた。最初に、膀胱内に送達したバキュロウイルスベクターは正常なマウス膀胱に効果的に形質導入できることを実証した。ウイルスゲノム中に、ヒトサイトメガロウイルス最初期遺伝子プロモーター、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント、ならびに、ヒトT細胞白血病ウイルス1型由来の長末端反復のRセグメントおよびU5配列の一部を含有する哺乳動物発現カセットを組み込むことにより構築した新しい組換えバキュロウイルスベクターは、試験した3つの異なるバキュロウイルスベクターの中で最高のin vivo形質導入効率を与えた。次に、ウイルス形質導入のみで抗腫瘍免疫を刺激しうるかどうかを調べた。いかなる導入遺伝子も含まないバキュロウイルスベクターの膀胱内投与を受けたマウスから回収した膀胱組織抽出物を分析するためにマウスサイトカイン／ケモカイン抗体アレイを用いると、アレイ中の59％（32個のうち19個）のタンパク質が発現の＞2倍の増加を示し、上方制御されたタンパク質のトップ3は顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、および皮膚T細胞誘因性ケモカインであった。さらに重要なこととして、この治療は同所性膀胱癌を有するマウスの生存を有意に延長し、50％の動物が6か月を超えて生存した。悪性の同所性膀胱腫瘍が進行するマウスの膀胱中にCD40リガンド遺伝子を膀胱内送達するのにバキュロウイルスベクターを用いたとき、腫瘍の優先的形質導入に続いて腫瘍増殖および平均膀胱重量の低下が検出された。
【００８７】
材料と方法
バキュロウイルス調製：組換えバキュロウイルスベクターであるCMV-Luc、CMV-Luc-WPREおよびCMV-RU5-Luc-WPREを製造業者（Invitrogen）のマニュアルに従ってBAC-to-BACTMバキュロウイルス発現系を用いて構築した。CMV-Lucはヒトサイトメガロウイルス（CMV）初期プロモーターの調節下のルシフェラーゼ遺伝子を含有する。CMV-Luc-WPREは3'非翻訳領域（UTR）にエキストラのウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（WPRE）を有する。CMV-RU5-Luc-WPREは5'UTRに他の調節配列RU5、すなわちヒトT細胞白血病ウイルス1型由来の長末端反復のRセグメントおよびU5配列の一部を有する。これらのルシフェラーゼ発現ウイルスは対応するバクミド（bacmid）を用いるSf9昆虫細胞のトランスフェクションにより生産した。5'UTRのRU5および3'UTRのWPREと共に、CMVプロモーター調節下のマウスCD40L遺伝子（Invivogen）を有するBV-CD40L（CD40リガンド）ウイルスを、発現カセットおよび線形化AcMNPVウイルスDNA（Clonetech）を含有するpBacPAK9トランスファーベクターを用いるSf9昆虫細胞の共トランスフェクション後の相同組換えにより生産した。BV-IL-15（インターロイキン15）ウイルスをBV-CD40Lに類似した方法（但し、マウスIL-15遺伝子を用いる）で構築した。ポリヘドリンプロモーターにより駆動するlacZ遺伝子をもつ親ウイルスであるBacPAK6はClonetechより得た。組換えバキュロウイルスベクターをSf9細胞において0.1のMOIにて増幅し、ウイルスを含有する上清をウイルス感染3日後に回収した。ウイルスを28,000g、1時間でペレット沈降させPBSに再懸濁した。
【００８８】
細胞株およびin vitroバキュロウイルスの形質導入：Sf9昆虫細胞（Invitrogen）をsf-900 III無血清培地（Invitrogen）に維持した。マウス膀胱癌細胞株MB49はDr. Esuvaranathan（National University Hospital、Singapore）から得て、ヒト膀胱癌細胞株T24はATCCから購入した。これらの細胞株を、10%ウシ胎児血清（Hyclone、Logan、UT）、2 mM L-グルタミン、1%ペニシリンおよびストレプトマイシン（Sigma）を補充したRPMI 1640に、37℃および5％C02にて維持した。膀胱癌増殖の根底にある分子機構をさらに理解するために、改変された増殖挙動を有するクローンのMB49変異体を得るために、野生型MB49細胞を、CMVプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼ遺伝子およびSV40プロモーターの調節下にあるネオマイシン耐性遺伝子をもつプラスミドであるpRC2/CMV-Lucによりトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞をG418を用いて700μg/mlの濃度にて2週間選抜した。マウス膀胱において高い腫瘍確立比率および比較的遅い増殖速度をもつサブクローンであるMB49S1も現行の研究で用いた。in vitroバキュロウイルスの形質導入実験については、腫瘍細胞をバキュロウイルスベクターと共に100のMOIにて一晩37℃にて培養した。形質導入24時間後に導入遺伝子発現レベルを測定した。
【００８９】
動物、動物モデルおよびin vivoバキュロウイルスの形質導入：成熟雌C57BL/6マウスおよび成熟雌balb/cヌードマウス（体重20g、5〜6週齢）を用いた。C57BL/6マウスにおいて同系MB49細胞の膀胱内滴下注入により、膀胱の内腔表面上に同所性膀胱腫瘍を作製した。腫瘍接種の前に、MB49細胞を親油性の近赤外蛍光色素DiR（20ng/ml、一晩、Caliper Life Sciences）で予め標識し、腫瘍の生着率をin vivoでモニタリングできるようにした。膀胱内滴下注入のために、24ゲージカテーテル（BDMedical）を、麻酔した雌マウスの膀胱中に尿道を介して導入した。残尿を絞り出した後に、膀胱に100μlの10μg/mlポリ-L-リシン（PLL、分子量70,000〜150,000、Sigma）を注入した。PLL溶液を膀胱内に30分間保持した後、絞り出した。次に、膀胱を100mlのPBSで洗浄した。前処理の後に、100μlのPBS中のMB49S1またはMB49膀胱癌細胞を滴下注入し、1時間膀胱内に保持した。動物当たり2 x 104細胞の低用量を用いたCD40Lおよび／またはIL-15治療の研究を除くと、ほとんどの実験において動物当たりl x 105癌細胞の用量を用いた。その後、カテーテルを取り外し、膀胱を自発的な排尿で排泄させた。腫瘍生着率を、膀胱内滴下注入24時間後、冷却カメラおよびICGフィルターを備えたIVIS 100 in vivoイメージングシステム（Caliper Life Sciences）を用いて試験した。イメージおよび蛍光シグナルを取得し、Xenogen生体イメージング・ソフトウエアv2.5を用いて解析した。MB49細胞が首尾よく移植されて同様の腫瘍負荷を有する動物を選択し、次の実験に用いた。膀胱内in vivoバキュロウイルス形質導入のために、マウスを麻酔してカテーテル処置した。ポリ-L-リシン処理30分後に、PBS中のバキュロウイルスベクター（100μl中に1 x 108pfuウイルスの粒子）を滴下注入し、1時間保持した。
【００９０】
膀胱におけるin vivo形質導入効率を評価するために、同所性腫瘍移植を有するまたは有さないマウスに、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を持つバキュロウイルスベクターを形質導入し、そして150mg/kgルシフェリン（Promega）のi.p.（腹腔内）注入15分後に、冷却CCDカメラおよび560mlの放出フィルターを備えたIVIS100イメージングシステム（Caliper Life Sciences）を用いて仰臥位で撮影した。イメージおよび発光シグナルを取得してXenogen生体イメージングソフトウエアv2.5により解析し、毎秒当たりの光子として定量した。
【００９１】
治療効力を評価するために、同所性腫瘍移植の7日後に、膀胱のin vivoバキュロウイルス形質導入を行った。対照もしくは治療グループのマウスを無作為化した。マウスを再麻酔し再カテーテル処置した後に、BacPAK6またはBV-CD40LまたはをBV-IL-15ウイルスを滴下注入した。動物を7日後に組織分析のために安楽死させるかまたは6か月間、膀胱癌の徴候および症状（血尿および体重減少）ならびに生存状態を観察した。
【００９２】
動物の取扱いと世話は、シンガポール実験動物研究国家諮問委員会（National Advisory Committee for Laboratory Animal Research、Singapore）の発行した科学的目的のための動物の世話と使用に関するガイドライン（Guidelines on the Care and Use of Animals for Scientific Purposes）に従って実施した。
【００９３】
組織分析と免疫染色：組織試験のために膀胱を回収し、4%PFAにて一晩固定し、30％スクロース中に懸濁し、組織凍結培地に包埋した。10μmのクリオスタット切片を調製し、ヘマトキシリンとエオシン（H＆E）で染色した。免疫染色のために、組織切片を2回Tris緩衝生理食塩水Tween-20（TBST）で2回洗浄し、0.025% Triton X-100中で10分間インキュベートした。次に組織切片を5% BSAにて1時間培養して非特異的結合をブロックした。ウサギポリクローナル抗ルシフェラーゼ抗体（Abeam、1：100）を一晩4℃にて適用した。TBSTで3回洗浄した後、スライドを二次抗体、FITC結合ヤギ抗ウサギIgG（1：200）と共に、1時間室温にてインキュベートした。
【００９４】
サイトカイン／ケモカイン発現：マウスをPBSまたはBacPAK6の膀胱内滴下注入の48時間後に安楽死させた。膀胱を回収して重量を測定した。プロテアーゼインヒビターカクテル（Calbiochem、Merck、Darmstadt、Germany）を含む組織溶解バッファー（Fermentas、Maryland、USA）を1ml当たり50mg組織にて加え、膀胱を超音波処理によりホモジナイズした。次に膀胱ホモジネート16,000 x gで30分間4℃にて遠心分離し、上清を回収した。上清のタンパク質濃度をBioradタンパク質アッセイ法（Biorad、California、USA）により決定した。80μgの全タンパク質濃度を含有する上清のアリコートをマウスサイトカインアレイ2.1（Raybiotech、Norcross、GA）に注いで、製造業者の取扱説明書に従ってサイトカインおよびケモカインの発現レベルを測定した。RayBioTM解析ツール（Raybiotech）を用いて、平均シグナル強度とサイトカインの相対的発現レベルとを関係づけた。
【００９５】
結果
バキュロウイルスベクターは膀胱内滴下注入後にマウス膀胱に効果的に形質導入する：最初に、バキュロウイルスが免疫不全ヌードマウスの膀胱を形質導入できるかどうかを評価した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子を含有する3つの異なる組換えバキュロウイルスベクターを膀胱に膀胱内滴下注入した後に試験し、IVIS生体動物イメージングシステムを用いてin vivo形質導入効率をモニタリングした（図1A）。3つのベクターは全て、ポリ-L-リシンによる器官の前処理後のマウス膀胱を形質導入するのに有効であった。バキュロウイルスベクターの1つ、2つのウイルス転写調節エレメントWPREとRU5を含有するバキュロウイルスベクターであるBV-RU5-Luc-WPREが膀胱において最高の導入遺伝子発現レベルをもたらした。経時的に減少するものの、3つのベクターによりもたらされた発現レベルは少なくとも35日間、バックグランドより有意に高いままであった（図1B）。
【００９６】
免疫応答性C57BL/6マウス（図2A、2B）において、BV-RU5-Luc-WPREによりもたらされた初期の発現レベルは免疫不全ヌードマウスで観察されたものと類似したが、そのレベルは速やかに低下し、検出可能な導入遺伝子発現はおよそ2週間だけ続いた。2つの型のマウス間における導入遺伝子発現の差は、バキュロウイルスベクター形質導入に対する免疫反応が強いことを示す。マウス当たり107ウイルス粒子で処理したC57BL/6マウスにおける第1日目のルシフェラーゼ発現がマウス当たり108ウイルス粒子で処理したもののおよそ1/4であったという観察により実証されたように、バキュロウイルスベクターが媒介する膀胱における導入遺伝子発現は用量に依存した（図2A、B）。ルシフェラーゼタンパク質に対する抗体による免疫組織染色により、バキュロウイルスが媒介する導入遺伝子発現が表面の膀胱上皮に限定されたことを確かめた（図2C）。
【００９７】
バキュロウイルスの形質導入のみで膀胱腫瘍増殖を遅延させることができる：
免疫応答性C57BL/6マウスにおけるバキュロウイルスの形質導入時の、器官におけるサイトカインおよびケモカインの発現を調べた。導入遺伝子発現による干渉の可能性を避けるために、哺乳動物の遺伝子発現カセットを含まないバキュロウイルスベクターであるBacPAK6をこの目的に用いた。抗体アレイ法を用いると、PBS滴下注入を受けた膀胱における発現レベルと比較して、2日前にBacPAK6の膀胱内滴下注入を受けた膀胱におけるマウスアレイにおいて、59%のサイトカインおよびケモカイン（32のうちの19）の上方制御（＞2倍の発現増加として定義した）が検出された（図3A、B）。上方制御されたタンパク質のトップ5は顆粒球-マクロファージコロニー-刺激因子（GM-CSF、123倍増加）、顆粒球コロニー-刺激因子（G-CSF、35倍増加）、皮膚のT細胞誘因型ケモカイン（CTACK、10倍増加）、トロンボポエチン（TPO、7倍増加）、および腫瘍壊死因子α（TNF-α、7倍増加）であった。無処理の正常マウス膀胱とPBS滴下注入を受けた膀胱の間の比較は、サイトカインおよびケモカインの発現レベルに有意な差異を示さなかった。
【００９８】
次に、バキュロウイルスの形質導入時のサイトカインおよびケモカインの発現レベルの変化が膀胱腫瘍増殖に影響を与えるかどうかを調べた。その効果を研究するための同系同所性マウス膀胱癌モデルを確立する過程で、MB49細胞は速やかに増殖し、低用量の接種（動物当たりl x 105癌細胞）であっても2週間で膀胱の全内腔を占めることが認められた（図4A）。マウスはまた、悪性の腫瘍増殖に因って速やかに死亡し、動物の最初の死亡は10〜14日で、およそ4週間で全動物が死亡した（Giinther JH,ら、1999）。MB49細胞のこれらの特徴は、正確な膀胱内滴下注入の実施と実験治療薬、とりわけ確立された膀胱腫瘍の治療を標的化した免疫治療薬の試験の両方を困難にしてきた。従って、より遅い増殖速度を示すが高い腫瘍確立比率を示したMB49マウス膀胱癌株のサブクローンであるMB49S1細胞（図4A）を用いて、C57BL/6マウスにおけるポリ-L-リシン前処理した膀胱への細胞の膀胱内滴下注入による膀胱癌モデルを確立した。
【００９９】
1 x 105MB49S1細胞の接種1週間後に、確立した腫瘍を有するC57BL/6マウスを2グループに無作為に分けた（グループ当たりn=10）。1つのグループは108 BacPak6ウイルス粒子の単独滴下注入を受け、他のグループは滴下注入対照としてPBSを受けた。膀胱腫瘍を有するマウスの生存の有意な延長が膀胱におけるバキュロウイルス刺激後に観察された。対照グループの全動物は70日以内に死亡したが、治療グループの動物の50％は腫瘍接種後6か月生存した（図4B、ログランク試験でp＜0.01）。この発見は膀胱におけるバキュロウイルス形質導入時のサイトカインおよびケモカインの上方制御が抗腫瘍効果を媒介する機能を有し、確立された膀胱腫瘍を治療するように作用しうることを示す。
【０１００】
バキュロウイルスベクターは膀胱癌細胞への高能率の遺伝子導入および膀胱癌に対するCD40L遺伝子療法を媒介することができる：バキュロウイルスベクターを用いて導入遺伝子を膀胱癌中に送達できるかどうかを評価するために、培養マウスMB49膀胱癌細胞およびヒトT24膀胱癌細胞をin vitroでBV-RU5-Luc-WPREにより形質導入した。ルシフェラーゼタンパク質に対する抗体による免疫染色により、これらの腫瘍細胞における高レベルのルシフェラーゼ発現を確かめた（図5A）。同所性MB49腫瘍を有するC57BL/6マウスにおいて、BV-RU5-Luc-WPREの膀胱内滴下注入は腫瘍における、ならびに正常膀胱上皮における明らかな導入遺伝子発現をもたらした（図5）。腫瘍において、ポジティブ染色が腫瘍の表面層だけでなく内部腫瘍領域においても観察され、腫瘍へのウイルスの浸透が示唆された。
【０１０１】
BV-RU5-Luc-WPRE発現カセット中のルシフェラーゼ遺伝子を、強力なTヘルパー1免疫刺激因子として機能するII型膜貫通タンパク質をコードする遺伝子であるマウスCD40リガンド（CD40L）遺伝子で置き換えることにより、バキュロウイルスベクターBV-CD40Lを構築した。in vitroのMB49細胞およびin vivo同所性MB49腫瘍におけるバキュロウイルスベクターの形質導入時のCD40L発現を、それぞれRT-PCR（図5C）およびウェスタンブロット（図5D）を用いて確かめた。
【０１０２】
BV-CD40Lの治療効果を試験するために、2 x 104 DiR標識したMB49細胞のC57BL/6マウス膀胱への接種により膀胱腫瘍モデルを確立した。腫瘍確立の成功をIVIS生体動物イメージングシステムを用いてDiR赤外蛍光シグナルをモニタリングすることにより確かめた（図6A）。腫瘍接種の4日後に、マウスを2グループに無作為に分け（グループ当たりn=5）、動物当たり108 BV-CD40Lウイルス粒子、または対照として108 BacPAK6ウイルス粒子の膀胱内滴下注入により処置した。2つのグループにおける第2および第3の処置を、腫瘍接種の6日後および8日後に行った。マウスを14日目に屠殺して、膀胱の腫瘍増殖段階をH＆E染色膀胱組織切片を試験することにより評価した（図6A）。対照グループでは、腫瘍が後期段階まで進行し、5匹の動物のうち4匹の動物において重篤な腫瘍壊死および筋肉層中への腫瘍侵襲が起こった（#1、2、4、5）。これらのマウスにおいて、膀胱尿路上皮は全体に損傷し、組織が破壊された。処置グループでは、腫瘍塊は相対的に小さくかつ尿路上皮に有意な損傷は存在しなかった。いくつかの腫瘍（#1および3）はまだ表面に存在しそして他の腫瘍（#2,4および5）はマウス膀胱の内腔を覆う細胞の層から結合組織下まで増殖していたがまだ筋肉層には到達していなかった。このグループの平均膀胱重量は対照グループより統計的に有意に低かった（p＜0.05、図6B）。これらの発見は、悪性の増殖性膀胱癌を治療するための治療遺伝子を送達するin vivo遺伝子療法ベクターとして、おそらくバキュロウイルスベクターを利用できることを示す。
【０１０３】
膀胱癌を有するマウスの生存に対するCD40LとIL-15の共送達の効果：BV-CMV-RU5-Luc-WPREおよびBV-CD40Lウイルスに加えて、BV-RU5-Luc-WPRE発現カセット中のルシフェラーゼ遺伝子を、自然免疫系の一部を構成する細胞であるナチュラルキラー細胞の増殖を誘発するサイトカインをコードする遺伝子であるマウスインターロイキン15（IL-15）遺伝子により置換することによってBV-IL-15を構築した。BV-CD40LウイルスおよびBV-IL-15ウイルスの治療効果を別々に試験して治療遺伝子の発現を確認し、次に膀胱癌を有するマウスの膀胱中に共送達した。バキュロウイルスベクターの膀胱内滴下注入は105 MB49細胞の接種2日後に実施した。
【０１０４】
結果を図7に示す。バキュロウイルスベクターによるCD40LおよびIL-15の共送達は膀胱腫瘍を有するマウスの生存を延長できることが観察された（図7A）。CD40LおよびIL-15を発現するバキュロウイルスベクターの組み合わせで処理したマウスの1匹ではMB49腫瘍が全面的に停止した（図7B）。
【０１０５】
考察
哺乳動物におけるバキュロウイルスの免疫刺激効果はおそらく膀胱腫瘍増殖を阻止するために治療に利用されうる。この仮説は、いかなる導入遺伝子も発現しない膀胱内に送達されたバキュロウイルスが確立された同所性膀胱癌を有する免疫応答性マウスの生存を延長できるという観察により支持される。この同系のモデル系はインタクトな免疫機能を提供し、膀胱癌に対する治療ワクチンの研究を可能にする。非トランスジェニックバキュロウイルスベクターを1回だけ注入した後に、腫瘍を有する動物の半分のみが治癒されたが、膀胱内滴下注入の頻度を増加させれば、この生存を改善することができる。この効力はまた、バキュロウイルスベクターに治療遺伝子を含ませることによっても改善できる。これに関連して、バキュロウイルスベクターが媒介するCD40L発現の抗腫瘍効果を、悪性の増殖膀胱癌を有する動物モデルにおいて実証した。
【０１０６】
そして、膀胱癌の同系同所性動物モデルを用いる上記結果は、昆虫バキュロウイルスが治療ワクチン接種および治療遺伝子送達の2つの機能を有する膀胱癌治療のための新しい薬剤として利用できることを実証した。
【０１０７】
本明細書で引用した全ての刊行物および特許出願は、それぞれの個々の刊行物または特許出願が具体的にかつ個々に参照により組み込まれることが示されているように、その全てが参照により本明細書に組み込まれる。いずれかの刊行物の引用は出願日の前のその開示についてであって、本発明が前の発明を理由としてかかる刊行物に先行する資格を与えられないことの承認と解釈してはならない。
【０１０８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する、単数形は、文脈が特に断らない限り、複数への言及を含む。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する用語「含む」およびこの用語の他の型は限定されない包含の意味、すなわち、いずれかの他の要素または成分を排除することなく特に記載した要素または成分を含むことを意図する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する、記載された全ての範囲または表は、それに含まれるあらゆる中間値または範囲またはサブリストを包含することを意図する。他に定義しない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。
【０１０９】
上記の発明を、明確な理解を目的として説明および例示によりいくらか詳しく記載したが、添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく、いくつかの変化および改変を行うことができることは、本発明の教示を考慮すれば当業者には直ちに明らかである。
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月7日(2014.2.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膀胱細胞をバキュロウイルスベクターと接触させるステップを含む、核酸分子を膀胱細胞に送達する方法であって、該バキュロウイルスベクターが、（i）導入遺伝子を有さないか、または（ii）抗腫瘍反応を増加または補充するために、膀胱細胞における治療導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターと機能可能に連結された導入遺伝子のみを含む、前記方法。
【請求項２】
膀胱細胞が膀胱癌細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
膀胱細胞がin vitroである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
膀胱細胞がin vivoである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
膀胱細胞が、膀胱癌の治療を必要とする被験者に存在し、前記接触が膀胱内滴下注入による被験者へのバキュロウイルスベクターの投与を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
導入遺伝子が膀胱癌を治療するための治療導入遺伝子である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
治療導入遺伝子がCD40LまたはIL-15をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
プロモーターが、ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ヒトサイトメガロウイルス最初期プロモーターが、配列番号1に記載の配列を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
バキュロウイルスベクターが、導入遺伝子の3'非翻訳領域に、ウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節エレメントをさらに含む、請求項１および６〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ウッドチャック肝炎ウイルス由来の転写後調節エレメントが、配列番号2に記載の配列を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
バキュロウイルスベクターが、導入遺伝子の5'非翻訳領域に、ヒトT細胞白血病ウイルス1型由来の長末端反復のRセグメントおよびU5配列の少なくとも一部をさらに含む、請求項１および６〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ヒトT細胞白血病ウイルス1型由来の長末端反復のRセグメントおよびU5配列の少なくとも一部が、配列番号3に記載の配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記接触の前にまたは同時にトランスフェクション剤を添加するステップをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
トランスフェクション剤が、ポリ-L-リシン、オキシクロロセンナトリウム、ドデシル-B-dd-マルトシド（DDM）、もしくはドデシル硫酸ナトリウム（SDS）またはそれらのいずれかの組み合わせである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
膀胱癌の治療を必要とする被験者における膀胱癌の治療における使用のためのバキュロウイルスベクターであって、該バキュロウイルスベクターが、（i）導入遺伝子を有さないか、または（ii）抗腫瘍反応を増加または補充するために、膀胱細胞における治療導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターと機能可能に連結された導入遺伝子のみを含み、該使用が被験者におけるバキュロウイルスベクターの膀胱内滴下注入を含む、前記バキュロウイルスベクター。
【請求項１７】
バキュロウイルスベクターの膀胱内滴下注入による、膀胱癌の治療を必要とする被験者における膀胱癌の治療のためのバキュロウイルスベクターの使用であって、該バキュロウイルスベクターが、（i）導入遺伝子を有さないか、または（ii）抗腫瘍反応を増加または補充するために、膀胱細胞における治療導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターと機能可能に連結された導入遺伝子のみを含む、前記使用。
【請求項１８】
バキュロウイルスベクターの膀胱内滴下注入による、膀胱癌の治療を必要とする被験者における膀胱癌の治療のための薬剤の製造のためのバキュロウイルスベクターの使用であって、該バキュロウイルスベクターが、（i）導入遺伝子を有さないか、または（ii）抗腫瘍反応を増加または補充するために、膀胱細胞における治療導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターと機能可能に連結された導入遺伝子のみを含む、前記使用。
【請求項１９】
被験者の膀胱における膀胱内滴下注入における使用のためのバキュロウイルスベクターであって、該バキュロウイルスベクターが、（i）導入遺伝子を有さないか、または（ii）抗腫瘍反応を増加または補充するために、膀胱細胞における治療導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターと機能可能に連結された導入遺伝子のみを含む、前記バキュロウイルスベクター。
【請求項２０】
バキュロウイルスベクターの、被験者の膀胱における膀胱内滴下注入のための使用であって、該バキュロウイルスベクターが、（i）導入遺伝子を有さないか、または（ii）抗腫瘍反応を増加または補充するために、膀胱細胞における治療導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターと機能可能に連結された導入遺伝子のみを含む、前記使用。
【請求項２１】
被験者の膀胱における膀胱内滴下注入のための薬剤の製造のためのバキュロウイルスベクターの使用であって、該バキュロウイルスベクターが、（i）導入遺伝子を有さないか、または（ii）抗腫瘍反応を増加または補充するために、膀胱細胞における治療導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターと機能可能に連結された導入遺伝子のみを含む、前記使用。
【国際調査報告】
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