(57)【要約】  ＴＮＦファミリー（ＢＡＦＦ）およびインターロイキン−１７Ａ（ＩＬ−１７）のＢ細胞活性化因子に特異的に結合し、ＢＡＦＦおよびＩＬ−１７の両方に対して高い親和性および強力な中和特性を有すると特徴付けられる二重特異性抗体が提供される。本発明の二重特異性抗体は、ループス腎炎（ＬＮ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬（Ｐｓ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬性関節炎（ＰＡ）、原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）、または多発性骨髄腫（ＭＭ）を治療するのに有用であると考えられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体であって、前記第１のポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１であり、前記第２のポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２である、二重特異性抗体。
【請求項２】
配列番号１のシステイン残基５０７と配列番号１のシステイン残基７０７との間に鎖内ジスルフィド結合が形成されている、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
【請求項４】
配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
【請求項６】
請求項３に記載のＤＮＡ分子および請求項４に記載のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドおよび配列番号２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体を発現できる、哺乳動物細胞。
【請求項７】
請求項５に記載のＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞であって、前記細胞は、アミノ酸配列が配列番号１である第１のポリペプチドおよびアミノ酸配列が配列番号２である第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体を発現できる、哺乳動物細胞。
【請求項８】
前記哺乳動物細胞はＣＨＯである、請求項６および７に記載の哺乳動物細胞。
【請求項９】
アミノ酸配列が配列番号１である第１のポリペプチドおよびアミノ酸配列が配列番号２である第２のポリペプチドを含む、二重特異性抗体を産生する方法であって、（１）前記二重特異性抗体が発現されるような条件下で請求項８に記載の哺乳動物細胞を培養することと、（２）発現した二重特異性抗体を回収することとを含む、方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法によって産生される二重特異性抗体。
【請求項１１】
全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、関節リウマチ、乾癬、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、原発性シェーグレン症候群、または多発性骨髄腫を治療する方法であって、請求項１、２または１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項１２】
治療に使用するための請求項１、２または１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１３】
全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、関節リウマチ、乾癬、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、原発性シェーグレン症候群、または多発性骨髄腫の治療に使用するための請求項１、２または１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体。
【請求項１４】
請求項１、２または１０のいずれか一項に記載の二重特異性抗体と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
本発明は、医薬の分野、特にＴＮＦファミリー（ＢＡＦＦ）およびインターロイキン−１７Ａ（ＩＬ−１７）のＢ細胞活性化因子に対する二重特異性抗体の新規分野である。本発明の二重特異性抗体は、ループス腎炎（ＬＮ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬（Ｐｓ）、強直性脊椎炎（ＡＳ）、乾癬性関節炎（ＰＡ）、原発性シェーグレン症候群（ｐＳＳ）、または多発性骨髄腫（ＭＭ）を治療するのに有用であると考えられる。
【０００２】
高レベルのＩＬ−１７は、気道炎症、関節リウマチ、骨関節炎、骨浸食、腹腔内膿瘍および癒着、炎症性腸疾患、同種移植片拒絶、乾癬、特定の種類の癌、血管形成、アテローム性動脈硬化症および多発性硬化症を含む、いくつかの病態、疾患または障害に関連している。ＩＬ−１７およびＩＬ−１７受容体は関節リウマチ患者の滑膜組織において上方制御される。ＩＬ−１７生物活性を遮断することにより、様々な動物関節炎モデルにおいて炎症および骨侵食が減少する。さらに、ＩＬ−１７は炎症を増幅するようにＴＮＦ−αとの相乗効果を有しながら、ＩＬ−１７はコラーゲンマトリクス分解および炎症および関節障害に対してＩＬ−１βとは独立した効果を有する。したがって、炎症部位におけるその局在分布を考慮して、ＩＬ−１７は、ＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインの体循環を標的とする薬物より潜在的に高い安全性プロファイルで関節リウマチおよび他の炎症または自己免疫疾患を治療するための可能な標的であるように見える。
【０００３】
自己免疫疾患の発症におけるＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）の関与は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスおよび原発性シェーグレン症候群を模倣する自己免疫疾患を生じ、Ｂ細胞リンパ腫の発生を２倍増加する、マウスモデルにおいてＢＡＦＦ過剰発現により示される。ヒトにおいて、多数の報告により、ＳＬＥ、ＲＡ、ｐＳＳおよび全身性硬化症患者において上昇した血清ＢＡＦＦレベルが示されている。ＢＡＦＦはＴｈ１７細胞の増殖を促進し、ＩＬ−１７はコラーゲン誘導性関節炎発症の間のＢＡＦＦ媒介性炎症誘発効果についての重要なエフェクターサイトカインであることが証明されている。ＩＬ−１７はまた、Ｂ細胞生態およびＳＬＥの病態生理学に影響を与えるようにＢＡＦＦとの相乗効果において作用することが示される。また、ＢＡＦＦおよびＩＬ−１７の両方が、ＬＮに関連する病理において役割を果たすことが証明されており、実際にＬＮを有する患者がＩＬ−１７およびＢＡＦＦの上昇したレベルを有することが報告されている。
【０００４】
ＳＬＥは、高度に不均質であり、自己抗体の発生および免疫複合体の形成により特徴付けられる多系統自己免疫疾患である。ＳＬＥを有する推定３０〜６０％の患者は、それらの疾患の過程の間、ある段階において腎臓に関与する。ＬＮは複雑な多因子自己免疫疾患である。未処置のままである場合、ＬＮを有する患者の５年生存率は０〜２０％である。免疫抑制療法の導入はこの状況を大いに改善し、現在の１０年生存率は８８％である。しかしながら、これらの治療の多くが重度の有害事象を有する場合、この改善は患者にとってコストがかかる。なぜならそれらは特に長期間必要とされるからである。さらに、反応はゆっくりであり、しばしば不完全であり、患者の２５〜５０％のみが寛解に達する。
【０００５】
ＢＡＦＦ抗体およびＩＬ−１７抗体の同時投与は、２つの別々の製剤の注射または２つの異なる抗体の共製剤の単回注射を必要とする。２回の注射は投与量およびタイミングの柔軟性を可能にするが、コンプライアンスおよび痛みの両方のために患者にとって不都合である。共製剤もまた、投与量のいくらかの柔軟性を提供し得るが、多くの場合、２つの異なる抗体の異なる分子特性に起因して両方の抗体の化学および物理的安定性を可能にする製剤条件を見つけることはかなり課題があるかまたは不可能である。
【０００６】
国際公開第１９９５０９９１７号は、異なる特異性を有する完全な抗体に融合した一本鎖断片可変抗体を生産することによって組換えＤＮＡ技術を使用して二重特異性、四価抗体（ＭＡｂ−ｓｃＦＶ）を生産する方法を開示している。この遺伝子融合は、二重特異性を有する四価抗体を生じるトランスフェクションによって発現される。国際公開第２００３０１６４６８号は、ヒトＢＡＦＦの可溶性および膜結合形態の両方に結合し、中和する抗ＢＡＦＦ抗体を開示している。国際公開第２００７０７０７５０号は、ヒトＩＬ−１７に結合し、中和する抗ＩＬ−１７抗体を開示している。
【０００７】
しかしながら、国際公開第２００３０１６４６８号の抗ＢＡＦＦ抗体および国際公開第２００７０７０７５０号の抗ＩＬ−１７抗体を含む開始二重特異性抗体を作製するために国際公開第１９９５０９９１７号における教示に従って、本発明者らは化学および物理的安定性に関連する重要な問題を発見した。多くのアミノ酸変化がこれらの問題を十分に克服するために開始二重特異性抗体に必要とされた。実際の変化についての必要性は当該分野において示唆されていない。さらに、いくつかの変化は慣用でもなく、一般的な見解からも導かれない。同様に、単一抗体自体はこれらの問題を有さず、これらの領域付近の局所環境が二重特異性抗体に関して異なっていることが示唆されている。したがって、ＢＡＦＦおよびＩＬ−１７の両方を中和する二重特異性抗体を用いた薬理学的介入が必要とされる。
【０００８】
本発明は、２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体を提供する。
【０００９】
本発明はまた、第１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。
【００１０】
本発明はまた、第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。
【００１１】
本発明はまた、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を提供する。
【００１２】
本発明はまた、細胞が第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体を発現できるＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞を提供する。
【００１３】
本発明はまた、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体を産生する方法であって、二重特異性抗体が発現されるような条件下で哺乳動物細胞を培養することを含む、方法を提供する。
【００１４】
本発明はまた、前記方法によって産生される二重特異性抗体を提供する。
【００１５】
本発明はまた、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、関節リウマチ、乾癬、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、原発性シェーグレン症候群、または多発性骨髄腫を治療する方法であって、二重特異性抗体の有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を含む、方法を提供する。
【００１６】
本発明はまた、治療に使用するための二重特異性抗体を提供する。
【００１７】
本発明はまた、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、関節リウマチ、乾癬、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、原発性シェーグレン症候群、または多発性骨髄腫の治療に使用するための二重特異性抗体を提供する。
【００１８】
本発明はまた、二重特異性抗体と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む、医薬組成物を提供する。
【００１９】
ヒトＩＬ−１７は、２つのヒトＩＬ−１７Ａタンパク質を含むホモ二量体タンパク質を意味すると理解される。ヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体はヒトＩＬ−１７Ａタンパク質およびヒトＩＬ−１７Ｆタンパク質である。
【００２０】
二重特異性抗体は、ＭＡｂ−ｓｃＦＶ形態において各抗原に対する特異性で２つの異なる抗原に結合する、４つの抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子を意味すると理解される。二重特異性抗体は、各抗原に単独でまたは各抗原に同時に結合できる。
【００２１】
本発明の二重特異性抗体は、２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含む。第１のポリペプチドの各々は第２のポリペプチドの各々と鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドは他の第１のポリペプチドと２つの鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドの各々はいくつかの鎖内ジスルフィド結合を形成する。ポリペプチドとジスルフィド結合の関係は以下の概略図に示される：
【化１】
2015514423.tif 000002
【００２２】
第１のポリペプチドのアミノ酸配列は
【化２】
2015514423.tif 000003
である。
【００２３】
第２のポリペプチドのアミノ酸配列は
【化３】
2015514423.tif 000004
である。
【００２４】
第１のポリペプチドの各々と第２のポリペプチドの各々の鎖間ジスルフィド結合は、配列番号１のシステイン残基１３７と配列番号２のシステイン残基２１４との間に形成する。第１のポリペプチドは他の第１のポリペプチドと２つの鎖間ジスルフィド結合を形成する。第１の鎖間ジスルフィド結合は、配列番号１の第１のポリペプチドのシステイン残基２２９と配列番号１の他の第１のポリペプチドのシステイン残基２２９との間に形成する。第２の鎖間ジスルフィド結合は配列番号１の第１のポリペプチドのシステイン残基２３２と配列番号１の他の第１のポリペプチドのシステイン残基２３２との間に形成する。
【００２５】
ｓｃＦｖ内に、操作された鎖内ジスルフィド結合が、配列番号１のシステイン残基５０７と配列番号１のシステイン残基７０７との間に形成される。また、鎖内ジスルフィド結合は、配列番号１のシステイン残基６２５と配列番号１のシステイン残基６９５との間に形成される。ＭＡｂ内で、ＩｇＧ４抗体において通常生じる鎖内ジスルフィド結合は、配列番号１のシステイン残基２２と配列番号１のシステイン残基９５との間、配列番号１のシステイン残基１５０と配列番号１のシステイン残基２０６との間、配列番号１のシステイン残基２６４と配列番号１のシステイン残基３２４との間、配列番号１のシステイン残基３７０と配列番号１のシステイン残基４２８との間、配列番号１のシステイン残基４８５と配列番号１のシステイン残基５５９との間、配列番号２のシステイン残基２３と配列番号２のシステイン残基８８との間、および配列番号２のシステイン残基１３４と配列番号２のシステイン残基１９４との間に形成される。
【００２６】
第１のポリペプチドは、第１の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ１）、重鎖定常領域（ＣＨ）、第２の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ２）および第２の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ２）を含む。第２のポリペプチドは、第１の軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ１）および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域に細分され得る。ＨＣＶＲおよびＬＣＶＲの各々は、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシル末端に配置される。
【００２７】
ＨＣＶＲ１の３つのＣＤＲは、ＣＤＲＨ１−１、ＣＤＲＨ１−２およびＣＤＲＨ１−３と称され、ＨＣＶＲ２の３つのＣＤＲは、ＣＤＲＨ２−１、ＣＤＲＨ２−２およびＣＤＲＨ２−３と称され、ＬＣＶＲ１の３つのＣＤＲは、ＣＤＲＬ１−１、ＣＤＲＬ１−２およびＣＤＲＬ１−３と称され、ＬＣＶＲ２の３つのＣＤＲは、ＣＤＲＬ２−１、ＣＤＲＬ２−２およびＣＤＲＬ２−３と称される。
【００２８】
ＣＨはアミノ酸リンカー（Ｌ１）によってＨＣＶＲ２に融合される。ＨＣＶＲ２はアミノ酸リンカー（Ｌ２）によってＬＣＶＲ２に融合される。
【００２９】
種々の領域とリンカーの関係は以下の通りである：
【表Ａ】
2015514423.tif 000005
【００３０】
二重特異性抗体操作
ｓｃＦｖ構造において抗ＩＬ−１７結合部分を有するＭＡｂ−ｓｃＦＶ形式において二重特異性抗体を構築する場合、化学的および物理的安定性に関連する重大な問題に遭遇した。化学的修飾を二重特異性抗体のＣＤＲＬ２−１およびＣＤＲＨ２−２部分において行い、物理的安定性を改善し、濃度依存性凝集を減少させた。広範なタンパク質安定性および溶解度研究により、ＣＤＲＬ２−１およびＣＤＲＨ２−２において化学的に不安定な残基を識別した。これらの不安定な残基を、コドン欠損によって構築した標的ライブラリーを使用して電荷中性アミノ酸と置き換えた。さらに、二重特異性抗体の静電表面を算出し、荷電パッチを識別した。ｓｃＦｖにおけるこれらの荷電パッチの崩壊はタンパク質自己会合の減少を導く。しかしながら、表面静電分布を再平衡化し、高濃度にて物理的安定性および溶解度を改善した二重特異性抗体のＣＤＲＨ２−１部分において変異を識別した。親単一抗体において上記の問題のどれも遭遇しなかった。これらの問題はＭＡｂ−ｓｃＦｖ形式において二重特異性抗体を構築することに関してのみ遭遇し、単一抗体の変異領域周囲の局所環境が二重特異性に関して異なっていたことが示唆される。
【００３１】
さらなる化学的修飾を、二重特異性抗体のＩＬ−１７部分におけるＨＣＶＲ２／ＬＣＶＲ２インターフェースを安定化し、二重特異性抗体凝集を減少させるために行った。凝集を測定するために行った研究により、観察されたタンパク質自己会合が、個々のＨＣＶＲ２またはＬＣＶＲ２ドメインの立体構造不安定性によって駆動されないが、むしろＨＣＶＲ２／ＬＣＶＲ２インターフェースの開口または呼吸により、分子間タンパク質相互作用を導くことが示された。したがって、種々の鎖内ジスルフィド結合を、二重特異性抗体のＩＬ−１７部分のＨＣＶＲ２／ＬＣＶＲ２インターフェース内に導入した。１つのこのような鎖内ジスルフィド結合は、配列番号１のシステイン残基５０７と配列番号１のシステイン残基７０７との間の第１のポリペプチドの各々において生じる。このジスルフィド結合は、二重特異性抗体のＩＬ−１７部分におけるＨＣＶＲ２／ＬＣＶＲ２インターフェースを共有結合し、ＨＣＶＲ２／ＬＣＶＲ２インターフェースを安定化し、物理的不安定性および望ましくない製剤制限を導き得る分子間タンパク質相互作用を減少させる。試験した９個の異なるジスルフィド結合の中で、８個は機能タンパク質を発現し、親和性損失の大きさは約２倍から約３５倍の範囲であった。配列番号１のシステイン残基５０７と配列番号１のシステイン残基７０７との間の第１のポリペプチドの各々における鎖内ジスルフィド結合は、ＩＬ−１７に対する最適な結合親和性維持しながら、ＨＣＶＲ２／ＬＣＶＲ２インターフェースを最適に安定化した。
【００３２】
さらに、研究により、Ｌ１についてのリンカー長さは結合キネティクスに影響を与えたことが示された。（表面プラズモン共鳴による）動力学的分析により、１０アミノ酸リンカーが１５アミノ酸および２０アミノ酸リンカーと比較して２倍遅いＫｏｎ速度を引き起こしたことが示された。したがって、１５のリンカー長さを本発明の二重特異性抗体内に導入した。
【００３３】
二重特異性抗体結合
本発明の二重特異性抗体はヒトＢＡＦＦおよびヒトＩＬ−１７の両方に結合し、インビトロまたはインビボで少なくとも１つのヒトＢＡＦＦ生物活性および少なくとも１つのヒトＩＬ−１７生物活性を中和する。本発明の二重特異性抗体はインビトロでＢＡＦＦの存在および非存在下でのＩＬ−１７の有効な阻害剤である。本発明の二重特異性抗体はインビトロでＩＬ−１７の存在または非存在下での可溶性および膜結合ＢＡＦＦの両方の有効な阻害剤である。本発明の二重特異性抗体はさらに、１５０ｐＭ〜１ｐＭの範囲でヒトＢＡＦＦおよび５０ｐＭ〜１ｐＭの範囲でヒトＩＬ−１７に対する結合親和性（ＫＤ）を有すると特徴付けられる。二重特異性抗体は約９０ｐＭのヒトＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロダイマーに対する結合親和性を有する。
【００３４】
二重特異性抗体は可溶性および膜結合ＢＡＦＦを効果的に中和し、この中和は飽和量のヒトＩＬ−１７の存在による影響を受けない。二重特異性抗体はヒトＩＬ−１７を効果的に中和し、この中和は飽和量のヒトＢＡＦＦの存在による影響を受けない。
【００３５】
二重特異性抗体発現
作動可能に連結される遺伝子の発現を誘導できる発現ベクターは当該分野において周知である。発現ベクターは宿主細胞からのポリペプチドの分泌を促進するシグナルペプチドをコードできる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチドであってもよい。第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、１つのベクター内に作動可能に連結される異なるプロモーターから独立して発現されてもよいか、あるいは第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドは、２つのベクター内に作動可能に連結される異なるプロモーターから独立して発現されてもよく、１つは第１のポリペプチドを発現し、１つは第２のポリペプチドを発現する。
【００３６】
宿主細胞は、本発明の第１のポリペプチド、第２のポリペプチドまたは第１のポリペプチドと第２のポリペプチドの両方を発現する１つ以上の発現ベクターにより安定的または一時的にトランスフェクトされた、形質転換された、形質導入されたまたは感染された細胞を含む。本発明の二重特異性抗体を産生する宿主細胞株の作製および単離は、当該分野において公知の標準的技術を使用して達成され得る。哺乳動物細胞は二重特異性抗体を発現するための好ましい宿主細胞である。特定の哺乳動物細胞はＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＤＧ−４４およびＣＨＯである。好ましくは、二重特異性抗体は宿主細胞が培養される培地内に分泌され、その培地から二重特異性抗体が回収または精製され得る。
【００３７】
抗体の哺乳動物発現の結果、グリコシル化が生じることは当該分野において周知である。典型的に、グリコシル化は高度に保存されたＮ−グリコシル化部位にて抗体のＦｃ領域において起こる。Ｎ−グリカンは典型的にアスパラギンに結合する。第１のポリペプチドの各々は配列番号１のアスパラギン残基３００においてグリコシル化される。
【００３８】
配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドをコードする特定のＤＮＡポリヌクレオチド配列は、
【化４】
2015514423.tif 000006
である。
【００３９】
配列番号２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドをコードする特定のＤＮＡポリヌクレオチド配列は、
【化５】
2015514423.tif 000007
である。
【００４０】
二重特異性抗体が分泌される培地は従来の技術によって精製され得る。例えば、培地は、従来の方法を使用してプロテインＡまたはＧカラムに適用され、それらから溶出され得る。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的技術によって効果的に除去され得る。生成物は例えば−７０℃にて即座に凍結され得るかまたは凍結乾燥され得る。
【００４１】
培地中に存在するミスフォールドした二重特異性抗体のレベルを減少させる必要性があり得る。ミスフォールドした二重特異性抗体はまた、ダイアボディとしても知られている。１つ以上のジスルフィド結合が不正確に形成する場合、ミスフォールディングは鎖間または鎖内のいずれかで生じる。ミスフォールドした二重特異性抗体は従来の技術によって精製され得る。例えば、ミスフォールドした二重特異性抗体を含有する培地は強カチオン交換樹脂に適用され、それから溶出される。例えば、ＳＰ−セファロースＨＰ強カチオン交換樹脂は、ダイアボディから正確に折り畳まれた二重特異性抗体を精製するために使用される。ダイアボディを含有する培地のｐＨは１Ｍのトリス塩基を使用してｐＨ８に調整される。培地はＳＰ−セファロースＨＰカラム上に充填され、２カラム体積の２０ｍＭトリス、ｐＨ８で洗浄され、３０カラム容積（０〜７０ｍＭのＮａＣｌ）にわたって２０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８で溶出される。回収したプールは高分子量対主要ピークを評価できる。典型的な結果は７１％の回収率で１０％のダイアボディから１％のダイアボディまで改善する。
【００４２】
別の例において、Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ５０強カチオン交換樹脂がダイアボディから正確に折り畳まれた二重特異性抗体を精製するために使用される。ダイアボディを含有する培地のｐＨは１Ｍのトリス塩基を使用してｐＨ８に調整される。培地はＳＰ−セファロースＨＰカラム上に充填され、１５カラム容積（１５〜５０ｍＭのＮａＣｌ）にわたって２０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８で溶出される。回収したプールは高分子量対主要ピークを評価できる。典型的な結果は５７％回収率で１０％のダイアボディから１％のダイアボディまで改善する。
【００４３】
治療的使用
患者は、減少したレベルのＢＡＦＦおよび／もしくはＩＬ−１７またはＢＡＦＦおよび／もしくはＩＬ−１７の減少した生物活性から利点を受ける疾患、障害または病態を有する哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【００４４】
治療および／または治療しているとは、全ての障害症状を全て排除することを必ずしも示すことは必要とせずに、本明細書に記載される障害の進行を遅延、干渉、停止、抑制または中断し得る全てのプロセスを指すことを意図する。本発明の二重特異性抗体は、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、関節リウマチ、乾癬、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、原発性シェーグレン症候群、または多発性骨髄腫を治療することが予想される。
【００４５】
医薬組成物
本発明の二重特異性抗体は患者への投与に適切な医薬組成物内に組み込まれ得る。このような医薬組成物は、選択される投与様式に適するように設計され、分散剤、緩衝剤、界面活性剤、防腐剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などの薬学的に許容可能な希釈剤、担体および／または賦形剤が必要に応じて使用される。前記組成物は、例えば、実務者に一般的に知られている製剤技術の概要を提供しているＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版、Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｅｄ．、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ１９９５に開示されている従来技術に従って設計され得る。医薬組成物のための適切な担体は、本発明の二重特異性抗体と組み合わされる場合、分子の活性を保持し、患者の免疫系と反応しない任意の物質を含む。本発明の医薬組成物は、二重特異性抗体と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む。
【００４６】
本発明の二重特異性抗体を含む医薬組成物は、標準的な投与技術を使用して、危険性のあるまたは本明細書に記載されている疾患もしくは障害を示す患者に投与され得る。
【００４７】
本発明の医薬組成物は、本発明の有効量の二重特異性抗体を含有する。有効量とは、所望の治療結果を達成するのに必要な量（用量ならびに投与期間および手段）を指す。二重特異性抗体の有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重などの要因、個体において所望の反応を引き出す抗体または抗体部分の能力に応じて変化してもよい。有効量はまた、治療的に有益な効果が二重特異性抗体のいずれかの毒性または有害な効果を上回る量である。
【００４８】
特性の発現および実証の以下の例の二重特異性抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を有する２つの第１のポリペプチドおよび配列番号２のアミノ酸配列を有する２つの第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドの各々は、配列番号１のシステイン残基１３７と配列番号２のシステイン残基２１４との間で第２のポリペプチドの各々と鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドは、配列番号１の第１のポリペプチドのシステイン残基２２９と配列番号１の他の第１のポリペプチドのシステイン残基２２９との間、配列番号１の第１のポリペプチドのシステイン残基２３２と配列番号１の他の第１のポリペプチドのシステイン残基２３２との間で他の第１のポリペプチドと２つの鎖間ジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドの各々は、配列番号１のシステイン残基２２とシステイン残基９５との間、配列番号１のシステイン残基１５０と配列番号１のシステイン残基２０６との間、配列番号１のシステイン残基２６４と配列番号１のシステイン残基３２４との間、配列番号１のシステイン残基３７０と配列番号１のシステイン残基４２８との間、配列番号１のシステイン残基４８５と配列番号１のシステイン残基５５９との間、配列番号１のシステイン残基５０７と配列番号１のシステイン残基７０７との間、配列番号１のシステイン残基６２５と配列番号１のシステイン残基６９５との間で鎖内ジスルフィド結合を形成し、第２のポリペプチドの各々は、配列番号２のシステイン残基２３と配列番号２のシステイン残基８８との間、配列番号２のシステイン残基１３４と配列番号２のシステイン残基１９４との間で鎖内ジスルフィド結合を形成し、第１のポリペプチドの各々は配列番号１のアスパラギン残基３００でグリコシル化される。正確に折り畳まれる二重特異性抗体対ミスフォールドしたダイアボディの比は９０：１０のオーダーである。
【００４９】
二重特異性抗体の発現
二重特異性抗体は実質的に以下のように発現および精製され得る。配列番号３（配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドをコードする）および配列番号４（配列番号２の軽鎖アミノ酸配列をコードする）のＤＮＡを含有するグルタミン合成酵素（ＧＳ）発現ベクターは、エレクトロポレーションによってチャイニーズハムスター細胞株、ＣＨＯＫ１ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ＰＬＣ、Ｓｌｏｕｇｈ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）をトランスフェクトするために使用される。発現ベクターは、ＳＶ早期（シミアンウイルス４０Ｅ）プロモーターおよびＧＳについての遺伝子をコードする。ＧＳの発現は、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞によって必要とされるアミノ酸であるグルタミンの生化学的合成を可能にする。トランスフェクション後、細胞は５０μＭのＬ−メチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）によるバルク選択を受ける。ＭＳＸによるＧＳの阻害は選択のストリンジェンシーを増加させるために利用される。発現ベクターｃＤＮＡを宿主細胞ゲノムの転写活性領域内に組み込んだ細胞は、ＧＳの内因性レベルを発現する、ＣＨＯＫ１ＳＶ野生型細胞に対して選択され得る。トランスフェクトされたプールは、安定発現細胞のクローンに近い（ｃｌｏｓｅ−ｔｏ−ｃｌｏｎａｌ）産物を可能にする低密度で播種される。マスターウェルは二重特異性抗体発現についてスクリーニングされ、次いで精製に使用するために無血清懸濁培地中でスケールアップされる。二重特異性抗体が分泌される無菌培地が、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）などの適合緩衝液で平衡化されるプロテインＡアフィニティーカラムに適用される。カラムは非特異的結合成分を除去するために洗浄される。結合した二重特異性抗体は、例えば、ｐＨ勾配（０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ６．８から０．１Ｍのクエン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ２．５など）によって溶出される。二重特異性抗体画分は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたは分析的サイズ排除などによって検出され、次いでプールされる。可溶性凝集体および多量体は、サイズ排除、疎水性相互作用、イオン交換、またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーを含む、一般的な技術によって効果的に除去され得る。二重特異性抗体は、一般的な技術を使用して濃縮および／または濾過滅菌され得る。これらのクロマトグラフィー工程後の二重特異性抗体の純度は９８％超である。二重特異性抗体は−７０℃にて即座に凍結または数ヶ月間、４℃にて保存され得る。
【００５０】
ＩＬ−１７およびＢＡＦＦに対する結合親和性
ヒトＩＬ−１７およびヒトＢＡＦＦに対する二重特異性抗体の結合親和性および結合化学量論は、ＨＢＳ−ＥＰ＋（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１０ｍＭのＨｅｐｅｓ  ｐＨ７．４＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋３ｍＭのＥＤＴＡ＋０．０５％界面活性剤Ｐ２０）ランニング緩衝液および２５℃の分析温度設定で準備したＢｉａｃｏｒｅ２０００機器で表面プラズモン共鳴アッセイを使用して求められる。全ての４つのフローセル（Ｆｃ）上に固定したプロテインＡ（標準的なＮＨＳ−ＥＤＣアミンカップリングを使用して生成した）を含有するＣＭ５チップを使用して、捕捉方法を利用する。抗体試料はランニング緩衝液内での希釈によって１０ｍｃｇ／ｍＬで調製する。ヒトＩＬ−１７またはヒトＢＡＦＦを、ランニング緩衝液内で希釈することによって２０．０、１０．０、５．０、２．５、１．２５および０（ブランク）ｎＭの最終濃度で調製する。各分析サイクルは、（１）別個のフローセル（Ｆｃ２、Ｆｃ３およびＦｃ４）上で抗体試料を捕捉すること、（２）５０ｍｃＬ／分にて全てのＦｃに対するヒトＩＬ−１７またはヒトＢＡＦＦの２５０ｍｃＬ（３００秒）の注射、（３）解離相をモニタするために２０分間、緩衝液フローへ戻す、（４）グリシン、ｐＨ１．５の５ｍｃＬ（３０秒）注射によるチップ表面の再生、（５）ＨＢＳ−ＥＰ＋の１０ｍｃＬ（６０秒）注射によるチップ表面の平衡からなる。会合速度（ｋｏｎ、Ｍ−１ｓ−１単位）、解離速度（ｋｏｆｆ、ｓ−１単位）およびＲｍａｘ（ＲＵ単位）を求めるために、標準的な二重参照およびＢｉａｃｏｒｅ  ２０００評価ソフトウェア、バージョン４．１を使用する１：１結合モデルへの適合を使用してデータを処理する。平衡解離定数（ＫＤ）を関係ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎからモル単位で算出する。
【００５１】
【表１】
2015514423.tif 000008
【００５２】
これらの結果により、本発明の二重特異性抗体がヒトＩＬ−１７およびヒトＢＡＦＦに結合することが実証される。
【００５３】
ＩＬ−１７およびＢＡＦＦの同時結合
ＢＩＡｃｏｒｅ２０００機器を使用して、ヒトＩＬ−１７およびヒトＢＡＦＦが二重特異性抗体に同時に結合できるかどうかを決定する。記載していることを除いて、全ての試薬および材料はＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ（Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）から購入する。全ての測定は２５℃で実施する。ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液（１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０および１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）をランニング緩衝液および試料緩衝液として使用する。プロテインＡを、アミン結合キットを使用してＣＭ４センサチップのフローセル１および２に固定する。二重特異性抗体をフローセル２に最初に捕捉し、続いて２０ｎＭにて５分間ヒトＩＬ−１７を注入してＩＬ−１７結合部位を飽和する。ＩＬ−１７の結合後、２０ｎＭにてヒトＢＡＦＦを次いで５分間注入し、さらなる結合シグナルを観察する。次いでチップ表面を、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．５を使用して再生する。異なるオーダーのヒトＩＬ−１７およびヒトＢＡＦＦを用いることを除いて同じプロセスを繰り返す。化学量論を計算して、二重特異性抗体に対するヒトＩＬ−１７またはヒトＢＡＦＦの完全な飽和を確実にする。二重特異性抗体に対するヒトＩＬ−１７の化学量論は典型的に結合キネティクス実験に基づいて約１．３である。同様に、二重特異性抗体に対するヒトＢＡＦＦの化学量論は典型的に結合キネティクス実験に基づいて約１．０である。対照ＢＡＦＦ  Ａｂは米国特許第７，３１７，０８９号の４Ａ５−３．１．１−Ｂ４である。対照ＩＬ−１７  Ａｂは米国特許第７，８３８，６３８号のＦａｂ  １２６である。
【００５４】
【表２】
2015514423.tif 000009
【００５５】
これらの結果により、本発明の二重特異性抗体は、二重特異性抗体に対する２つのリガンド結合からの反応単位（ΔＲＵ）の増加により示されるようにヒトＩＬ−１７およびヒトＢＡＦＦに同時に結合できることが実証される。
【００５６】
ＨＴ−２９細胞からのインビトロでのＩＬ−１７により誘導されるＣＸＣＬ１産生の阻害
ＨＴ−２９細胞はＩＬ−１７受容体を天然に発現するヒト結腸直腸腺癌上皮細胞である。ヒトＩＬ−１７とのＨＴ２９細胞のインキュベーションの結果、市販のＥＬＩＳＡを使用して測定され得る、ＣＸＣＬ１の産生が起こる。
【００５７】
４１２００〜２．６４ｐＭの用量範囲の二重特異性抗体が評価される（二重特異性抗体の単量体ＭＷ（＝１００ｋＤａ）に基づいた最終濃度）。次いで二重特異性抗体の各試験濃度を、組換え体ＩＬ−１７を含有するウェルに加える（５０ｍｃｌ）（ウェル中の最終ＩＬ−１７濃度は３．７５ｎＭである（ＩＬ−１７の単量体ＭＷ（＝１６ｋＤａ）に基づく））。試験は１つの処理につき３連のウェルで実施する。アッセイ培地は、「培地単独」および「ＩＬ−１７単独」対照のために使用する。ＩＬ−１７中和抗体（米国特許第７，８３８，６３８号のＦａｂ１２６）をアッセイにおいて陽性対照として使用する。ＩＬ−１７および抗体混合物を含有するプレートを、組織培養処理した９６ウェルプレートの内側ウェルにおいて３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２にて６０〜９０分間、インキュベートする。このアッセイのバリエーションにおいて、ヒトＢＡＦＦの飽和濃度を加え（ＢＡＦＦの単量体ＭＷ（＝２０ｋＤａ）に基づいて１．２５ｎＭの最終濃度）、二重特異性抗体がＢＡＦＦに同時に結合する場合、ＩＬ−１７を依然として中和できるかどうかを決定することを目標とする。ＨＴ−２９細胞を、アッセイ培地（１０％ＦＢＳ、ペニシリンＧ（０．２Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（０．２ｍｃｇ／ｍＬ）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ）において通常通りに培養する。アッセイの日に、細胞をＨＢＳＳでリンスし、トリプシン＋ＥＤＴＡを用いて培養フラスコから解離する。トリプシンはアッセイ培地で不活性化する。次いでＨＴ−２９細胞を５００×ｇにて５分間室温で遠心分離する。細胞ペレットをアッセイ培地中で再懸濁する。血球計を用いて細胞密度を測定し、２０，０００ＨＴ−２９細胞（１００ｍｏｌ）を、抗体／ＩＬ−１７混合物を含有する９６ウェルプレートに加える。２００ｍｃｌのＰＢＳを、蒸発から生じる端部効果を減少させるために使用していない端部ウェル（細胞を有さない）の各々に加える。９６ウェルプレートを約４８時間、組織培養インキュベータ（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２）内に入れる。
【００５８】
アッセイの終わりに、プレートを遠心分離し（室温にて５分間、５００×ｇ）、細胞培養培地をポリプロピレン９６ウェルプレートに移し、それを密閉し、−８０℃にて凍結する。ＥＬＩＳＡによってＣＸＣＬ１を測定する日に、プレートを室温にて解凍する。培地（未希釈または１：３希釈のいずれか）中のＣＸＣＬ１レベルを、以下の緩衝液および修飾を使用して、製造業者の指示書に従って、ＣＸＣＬ１サンドイッチＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤｕｏＳｅｔ＃ＤＹ２７５）により測定する：ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｓ製（１０×、＃ＷＳＨＷ−１０００−０１）の１×ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液；５０ｍｃＬ／ウェルの試料および標準体積；ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｓ製の基質（１成分ＨＲＰ基質、＃ＴＭＢＷ−１０００−０１）；ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｓ製の停止溶液（＃ＬＳＴＰ−１０００−０１；１００ｍｃｌ／ウェル）。ＥＬＩＳＡ反応の終わりにおいて、プレートをマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０）で４５０ｎｍにて読み取った。データは産生したＣＸＣＬ１の最大量の％として回収した（ＩＬ−１７単独は１００％である）。ＩＬ−１７により誘発される反応の５０％が二重特異性抗体または陽性対照のいずれかにより阻害される濃度（ＩＣ５０）を、データの４パラメータＳ字状フィット（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）を使用して算出する。
【００５９】
この結果により、本発明の二重特異性抗体は濃度依存的にＨＴ−２９細胞によってＣＸＣＬ１のＩＬ−１７により誘導される分泌を阻害したことが実証される。この阻害は陽性対照抗体で観察されたもの（２．００±０．２１ｎＭの二重特異性抗体についてのＩＣ５０対１．８６±０．２２ｎＭの陽性対照抗体についてのＩＣ５０（３回の独立した実験の平均±ＳＥＭ））に匹敵するのに対して、陰性対照抗体は増殖を阻害しなかった。さらに、同様の阻害が飽和量のＢＡＦＦの存在下で観察され、１．５７±０．４５ｎＭの二重特異性抗体についてのＩＣ５０対１．４１±０．５０ｎＭの陽性対照抗体についてのＩＣ５０（３回の独立した実験の平均±ＳＥＭ）。本発明の二重特異性抗体はＩＬ−１７を効果的に中和し、この中和は飽和量のＢＡＦＦの存在によって影響を受けない。
【００６０】
Ｔ１１６５細胞のインビトロでのＢＡＦＦにより誘導される増殖の阻害
Ｔ１１６５．１７は生存および成長のための外因因子（ＩＬ−１ベータまたはＢＡＦＦ）に依存するマウス形質細胞腫細胞株である。これらの細胞はＢＡＦＦについての受容体を天然に発現し、ヒトＢＡＦＦに対するそれらの反応を増殖をモニタリングすることによって測定する。
【００６１】
１ｎＭ〜４．１ｐＭ（二重特異性抗体の単量体ＭＷ（＝１００ｋＤａ）に基づいた最終濃度）の用量範囲の二重特異性抗体を、可溶性ＢＡＦＦ（アッセイにおける最終可溶性ＢＡＦＦ濃度はＢＡＦＦの単量体ＭＷ（＝２０ｋＤａ）に基づいて１５０ｐＭである）を中和する能力について評価する。種々の濃度の二重特異性抗体を、５０ｍｃｌの全体積において平底９６ウェル組織培養プレートの内側ウェル中で３７℃にて３０〜６０分間、可溶性ＢＡＦＦとインキュベートする。ＢＡＦＦ中和抗体（米国特許第７，３１７，０８９号の４Ａ５−３．１．１−Ｂ４）をアッセイにおける陽性対照として使用する。各条件は３連で試験する。このアッセイのバリエーションにおいて、膜ＢＡＦＦを中和する二重特異性抗体の能力を試験する。種々の濃度の二重特異性抗体を、ＢＡＦＦの非切断形態（細胞膜上でＢＡＦＦの恒久的発現を生じる、ＢＡＦＦにおけるフリン切断部位を変異することによって達成される）を発現するＨＥＫ２９３細胞の膜画分とインキュベートする。このアッセイの別のバリエーションにおいて、飽和濃度のヒトＩＬ−１７を加え（ＩＬ−１７の単量体ＭＷ（＝１６ｋＤａ）に基づいた１５．６ｎＭの最終濃度）、二重特異性抗体がＩＬ−１７に同時に結合する場合、依然として可溶性または膜ＢＡＦＦのいずれかを中和できるかどうかを決定することを目標とする。
【００６２】
Ｔ１１６５細胞を、２ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ−１βを補足したアッセイ培地（１０％ＦＢＳ、ＨＥＰＥＳ、Ｌ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５×１０−５Ｍの２−メルカプトエタノール、１×抗生物質−抗真菌薬）を含有するＲＰＭＩ１６４０）において通常通りに培養する。アッセイの日に、細胞をアッセイ培地で３回洗浄し、アッセイ培地中で１×１０５個の細胞／ｍＬに再懸濁する。５０ｍｃｌの細胞懸濁液を、抗体とＢＡＦＦの混合物を含有する９６ウェルプレートに加える。１００ｍｃｌのアッセイ培地を、蒸発から生じる端部効果を減少させるために未使用の端部ウェル（細胞を有さない）の各々に加える。プレートを約４４時間、組織培養インキュベータ（３７℃、９５％相対湿度、５％ＣＯ２）に入れる。アッセイの終わりに、２０ｍｃｌのＰｒｏｍｅｇａ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ９６Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎを各ウェルに加え、３７℃にて１〜４時間インキュベートする。プレートをマイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  １９０）で４９０ｎｍにて読み取る。最小反応としてＢＡＦＦを有さないウェルおよび最大反応として１５０ｐＭのＢＡＦＦを有するウェルを使用して、データを阻害％として収集する。ＢＡＦＦにより誘発される反応の５０％が二重特異性抗体または陽性対照のいずれかによって阻害される濃度（ＩＣ５０）を、データの４パラメータＳ字状フィット（ＳｉｇｍａＰｌｏｔ）を使用することによって算出する。
【００６３】
この結果により、二重特異性抗体は濃度依存的に可溶性ＢＡＦＦにより誘導されるＴ１１６５細胞の増殖を阻害することが実証される。この阻害は陽性対照抗体で観察されたもの（０．０６４±０．０２１ｐＭの二重特異性抗体についてのＩＣ５０対０．０７１±０．００２ｐＭの陽性対照抗体についてのＩＣ５０（２回の独立した実験の平均±ＳＥＭ））に匹敵するのに対して、陰性対照抗体は増殖を阻害しなかった。さらに、同様の阻害が飽和量のＩＬ−１７の存在下で観察され、０．０６０±０．０１４ｐＭの二重特異性抗体についてのＩＣ５０対０．０７３±０．０１２ｐＭの陽性対照抗体についてのＩＣ５０（２回の独立した実験の平均±ＳＥＭ）であった。この二重特異性抗体はＢＡＦＦを効果的に中和し、この中和は飽和量のＩＬ−１７の存在によって影響を受けない。
【００６４】
膜結合ＢＡＦＦにより誘導されるＴ１１６５細胞の増殖を阻害する二重特異性抗体の能力もまた、実証される。本発明の二重特異性抗体は、陽性対照ＢＡＦＦ抗体（米国特許第７，３１７，０８９号の４Ａ５−３．１．１−Ｂ４）と同様に膜結合ＢＡＦＦによって誘導される増殖を効果的に阻害する。さらに、同様の阻害が飽和量のＩＬ−１７の存在において観測される。
【００６５】
インビボでＣＸＣＬ１のヒトＩＬ−１７により誘導される産生の阻害
ヒトＩＬ−１７の注射はマウスＣＸＣＬ１において循環中の迅速かつ一過性の増加を生じる。通常のメスのＣ５７Ｂｌ６マウス（ｎ＝８／群）に、二重特異性抗体（６６ｍｃｇ／マウス）または陽性対照抗ＩＬ−１７抗体（米国特許第７，８３８，６３８号のＦａｂ１２６、５０ｍｃｇ／マウス）または陰性対照抗体（ｈｕＩｇＧ４、５０ｍｃｇ／マウス）のいずれかをＳＣで注射した。２日後、マウスにヒトＩＬ−１７（３ｍｃｇ／マウス）の単回のＩＰ注射を与え、２時間後、血清を採取し、分析するまで−８０℃に保存する。ＣＸＣＬ１の濃度をＥＬＩＳＡによって求める。マイクロタイタープレートをヒトＦｃを捕捉する抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ１０９−００５−０９８、１ｍｇ／ｍＬ）でコーティングし、４℃にて一晩インキュベートする。プレートを洗浄し、カゼインで遮断し、１００ｍｃｌの血清（１：１０００希釈）を加える。プレートを室温にて２時間インキュベートし、洗浄し、ＨＲＰ標識した検出抗体（抗ヒトＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ７０９−０３５−１４９）を加える。プレートを室温にて１時間インキュベートし、洗浄し、ＴＭＢ基質を使用して発展させ、プレートリーダーを使用して読み取る。濃度を適切な標準曲線に基づいて算出する。
【００６６】
【表３】
2015514423.tif 000010
【００６７】
これらのデータにより、ヒトＩＬ−１７が血清ＣＸＣＬ１レベルの増加を生じることが確認される。しかしながら、二重特異性抗体の存在下で、これらの結果により、ＣＸＣＬ１のＩＬ−１７により誘導される増加が、陰性対照抗体を受けた動物と比較して減少する（Ｐ＜０．０１、ＡＮＯＶＡ）ことが実証される。二重特異性抗体によるＣＸＣＬ１の減少は陽性対照抗ＩＬ−１７抗体で観察されるものに匹敵する。各群内の二重特異性抗体、陽性および陰性対照抗体のいずれかに対する等価の曝露は定量的ＥＬＩＳＡによって確認される。したがって、本発明の二重特異性抗体はマウスにおけるヒトＩＬ−１７によって誘導される生物学的効果を効果的に中和する。Ｐ値の測定は陰性対照／ＩＬ−１７群に匹敵する。
【００６８】
インビボでのヒトＢＡＦＦの阻害
可溶性ヒトＢＡＦＦをコードする導入遺伝子を保有するマウスは脾臓において異常に多い数のＢリンパ球を有する。
【００６９】
ヒトＢＡＦＦについてのマウストランスジェニック（ｎ＝５／群）に、単回用量の二重特異性抗体（６６０ｍｃｇ／マウス）または陽性対照抗ＢＡＦＦ抗体（４Ａ５−３．１．１−Ｂ４米国特許第７，３１７，０８９号、５００ｍｃｇ／マウス）または陰性対照抗体（ｈｕＩｇＧ４、５００ｍｃｇ／マウス）のいずれかをＩＰ注射する。８日後、血清および脾臓を採取する。脾臓細胞の単一細胞懸濁液を調製し、赤血球を溶解した後に白血球の総数を求める。フローサイトメトリーにより細胞表面マーカーＢ２２０を使用してＢリンパ球の相対的割合を求める。１つの脾臓当たりのＢ細胞の総数を、Ｂ２２０陽性細胞の割合を脾臓中のリンパ球の総数と掛けることによって算出する。マイクロタイタープレートを、ヒトＦｃを捕捉する抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  １０９−００５−０９８、１ｍｃｇ／ｍＬ）でコーティングし、４℃にて一晩インキュベートする。プレートを洗浄し、カゼインで遮断し、１００ｍｃｌの血清（１：５０００希釈）を加える。プレートを室温にて２時間インキュベートし、洗浄し、ＨＲＰにより標識した検出抗体（抗ヒトＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ７０９−０３５−１４９）を加える。プレートを室温にて１時間インキュベートし、洗浄し、ＴＭＢ基質を使用して発展させ、プレートリーダーを使用して読み取る。適切な標準曲線に基づいて濃度を算出する。
【００７０】
【表４】
2015514423.tif 000011
【００７１】
これらの結果により、二重特異性抗体の単回投与によってヒトＢＡＦＦについてのマウストランスジェニックの脾臓中のＢ細胞の数は減少する（ｐ＜０．０００１、ＡＮＯＶＡ）ことが実証される。Ｂ細胞数のこの正規化は陽性対照ＢＡＦＦ抗体で観察されるものと等価である。各群内の二重特異性抗体、陽性および陰性対照抗体のいずれかに対する等価の曝露は定量的ＥＬＩＳＡによって確認される。したがって、本発明の二重特異性抗体はマウスにおいてヒトＢＡＦＦによって誘導される生物学的効果を効果的に中和する。Ｐ値測定は陰性対照に匹敵する。
【００７２】
可溶性および安定性分析
二重特異性抗体はｐＨ７．４にてＰＢＳ中で製剤化される。二重特異性抗体はＡｍｉｃｏｎ濃縮器を使用して１〜２ｍｇ／ｍＬから５２ｍｇ／ｍＬ〜５８ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度に濃縮される。濃縮した試料は４週間にわたって２５℃にて保存する。初期濃度にて、１日、１週間および４週間のインキュベーションでサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いてパーセント高分子量（％ＨＭＷ）について試料を分析する。ＴＳＫ  Ｇ３０００ＳＷ−ＸＬ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）カラムを使用してＡｇｉｌｅｎｔ１１００システムでＳＥＣを実施する。ＰＢＳ＋０．３５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４を、０．５ｍＬ／分にて３５分間流す移動相として使用する。１μＬの濃縮した抗体の体積をカラム内に注射して、検出を２８０ｎｍにて測定する。ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎおよび％高分子量（ＨＭＷ）を使用してクロマトグラムを分析し、モノマーピークの前に溶出されるピークのＡＵＣ対全ＡＵＣの比を使用して算出する。異なる時点にて２５℃で保存した試料を％ＨＭＷについて分析し、その結果を表５にまとめる。
【００７３】
【表５】
2015514423.tif 000012
【００７４】
国際公開第２００３０１６４６８号のＢＡＦＦ抗体および国際公開第２００７０７０７５０号のＩＬ−１７抗体を含む開始二重特異性抗体による予備研究により、６ｍｇ／ｍＬのみの濃縮後、％ＨＭＷ種の２５％の増加が、４℃でのＰＢＳ中の３週間の保存後、ＳＥ−ＨＰＬＣによって検出され、３０ｍｇ／ｍＬにて％ＨＭＷ種の増加が４℃でのＰＢＳ中の保存のちょうど２日後に１５％であったことが実証される。これらの結果により、本発明の二重特異性抗体が、開始二重特異性抗体より、減少した凝集および増加した物理的安定性を含む、非常に改善された特性を有することが実証される。
【配列表】
2015514423000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月5日(2014.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体であって、前記第１のポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１であり、前記第２のポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２である、二重特異性抗体。
【請求項２】
配列番号１のシステイン残基５０７と配列番号１のシステイン残基７０７との間に鎖内ジスルフィド結合が形成されている、請求項１に記載の二重特異性抗体。
【請求項３】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列および配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
【請求項４】
配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子、および配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドおよび配列番号２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体を発現できる、哺乳動物細胞。
【請求項５】
請求項３に記載のＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞であって、前記細胞は、アミノ酸配列が配列番号１である第１のポリペプチドおよびアミノ酸配列が配列番号２である第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体を発現できる、哺乳動物細胞。
【請求項６】
前記哺乳動物細胞はＣＨＯである、請求項４または５に記載の哺乳動物細胞。
【請求項７】
アミノ酸配列が配列番号１である第１のポリペプチドおよびアミノ酸配列が配列番号２である第２のポリペプチドを含む、二重特異性抗体を産生する方法であって、前記二重特異性抗体が発現されるような条件下で請求項４に記載の哺乳動物細胞または請求項５に記載の哺乳動物細胞を培養することと、発現した二重特異性抗体を回収することとを含む、方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法によって産生される二重特異性抗体。
【請求項９】
全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、関節リウマチ、乾癬、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、原発性シェーグレン症候群、または多発性骨髄腫を治療する方法であって、請求項１または８に記載の二重特異性抗体の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
【請求項１０】
治療に使用するための請求項１または８に記載の二重特異性抗体。
【請求項１１】
全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、関節リウマチ、乾癬、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、原発性シェーグレン症候群、または多発性骨髄腫の治療に使用するための請求項１または８に記載の二重特異性抗体。
【請求項１２】
請求項１または８に記載の二重特異性抗体と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７４】
国際公開第２００３０１６４６８号のＢＡＦＦ抗体および国際公開第２００７０７０７５０号のＩＬ−１７抗体を含む開始二重特異性抗体による予備研究により、６ｍｇ／ｍＬのみの濃縮後、％ＨＭＷ種の２５％の増加が、４℃でのＰＢＳ中の３週間の保存後、ＳＥ−ＨＰＬＣによって検出され、３０ｍｇ／ｍＬにて％ＨＭＷ種の増加が４℃でのＰＢＳ中の保存のちょうど２日後に１５％であったことが実証される。これらの結果により、本発明の二重特異性抗体が、開始二重特異性抗体より、減少した凝集および増加した物理的安定性を含む、非常に改善された特性を有することが実証される。
以下に、本願の当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  ２つの第１のポリペプチドおよび２つの第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体であって、前記第１のポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１であり、前記第２のポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号２である、二重特異性抗体。
［２］  配列番号１のシステイン残基５０７と配列番号１のシステイン残基７０７との間に鎖内ジスルフィド結合が形成されている、［１］に記載の二重特異性抗体。
［３］  配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
［４］  配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
［５］  配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子。
［６］  ［３］に記載のＤＮＡ分子および［４］に記載のＤＮＡ分子を含む哺乳動物細胞であって、前記細胞は、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１のポリペプチドおよび配列番号２のアミノ酸配列を有する第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体を発現できる、哺乳動物細胞。
［７］  ［５］に記載のＤＮＡ分子で形質転換された哺乳動物細胞であって、前記細胞は、アミノ酸配列が配列番号１である第１のポリペプチドおよびアミノ酸配列が配列番号２である第２のポリペプチドを含む二重特異性抗体を発現できる、哺乳動物細胞。
［８］  前記哺乳動物細胞はＣＨＯである、［６］および［７］に記載の哺乳動物細胞。
［９］  アミノ酸配列が配列番号１である第１のポリペプチドおよびアミノ酸配列が配列番号２である第２のポリペプチドを含む、二重特異性抗体を産生する方法であって、（１）前記二重特異性抗体が発現されるような条件下で［８］に記載の哺乳動物細胞を培養することと、（２）発現した二重特異性抗体を回収することとを含む、方法。
［１０］  ［９］に記載の方法によって産生される二重特異性抗体。
［１１］  全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、関節リウマチ、乾癬、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、原発性シェーグレン症候群、または多発性骨髄腫を治療する方法であって、［１］、［２］または［１０］のいずれかに記載の二重特異性抗体の有効量を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法。
［１２］  治療に使用するための［１］、［２］または［１０］のいずれかに記載の二重特異性抗体。
［１３］  全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、関節リウマチ、乾癬、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、原発性シェーグレン症候群、または多発性骨髄腫の治療に使用するための［１］、［２］または［１０］のいずれかに記載の二重特異性抗体。
［１４］  ［１］、［２］または［１０］のいずれかに記載の二重特異性抗体と、１つ以上の薬学的に許容可能な担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物。
【国際調査報告】
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