(57)【要約】  脳脊髄液のサンプル中の抗ベータアミロイドタンパク質抗体の定量化に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法及びキットであって、ａ）上記サンプルの上記抗体の量を、上記抗体を結合することが可能な高分子でコーティングした磁気マイクロビーズを用いて濃縮する工程、ｂ）工程ａ）で得られた濃縮サンプルを、免疫酵素アッセイにより、又はラジオイムノアッセイにより分析する工程、ｃ）工程ｂ）で使用するのと同じアッセイを用いて、既知の力価を有する抗ベータアミロイドタンパク質抗体を含むサンプルを分析して、関連較正曲線を作成する工程を含む上記方法及びキット（ここで、既知の力価を有する上記抗体が、ＩｇＧ２ａ若しくはＩｇＧｂクラスに属するマウス抗体、又はＩｇＧ２ｂ若しくはＩｇＧｉクラスに属するヒト若しくはヒト化抗体である）。
2015514206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳脊髄液のサンプル中の抗ベータアミロイドタンパク質抗体の定量化に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ）前記サンプルの前記抗体の量を、前記抗体を結合することが可能な高分子でコーティングした磁気マイクロビーズを用いて濃縮する工程、
ｂ）工程ａ）で得られた濃縮サンプルを、免疫酵素アッセイにより、又はラジオイムノアッセイにより分析する工程、
ｃ）工程ｂ）で使用するのと同じアッセイを用いて、既知の力価を有する抗ベータアミロイドタンパク質抗体を含むサンプルを分析して、関連較正曲線を作成する工程であって、既知の力価を有する前記抗体が、ＩｇＧ２ａ若しくはＩｇＧ２ｂクラスに属するマウス抗体、又はＩｇＧ２ｂ若しくはＩｇＧ１クラスに属するヒト若しくはヒト化抗体である、上記工程
を含む、上記方法。
【請求項２】
前記濃縮工程ａ）が、前記マイクロビーズ上での前記脳脊髄液サンプルの吸収工程、及び前記マイクロビーズからの前記抗体の溶出工程を含み、
前記分析工程ｂ）が、
Ｉ）ベータアミロイドタンパク質及び／又はそのアイソフォームでコーティングした固相を準備する工程、
ＩＩ）前記固相を、工程ａ）から得られた濃縮材料とともにインキュベートし、このようにして前記固相上のベータアミロイドタンパク質への前記自己抗体の結合を可能にして、続いてすすいで、未結合の材料を除去する工程、
ＩＩＩ）工程ＩＩ）で得られた固相を、ヒト抗体を結合することが可能な、酵素又は放射性標識にコンジュゲートされたタンパク質とともにインキュベートし、続いてすすいで、前記未結合のコンジュゲート型タンパク質を除去する工程、
ＩＶ）前記コンジュゲート型タンパク質のシグナルを検出する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記濃縮工程ａ）が、前記マイクロビーズ上での前記マイクロビーズからの前記抗体の溶出を伴わない前記脳脊髄液サンプルの吸収工程を含み、ここで、前記高分子がベータアミロイドタンパク質であり、
前記分析工程ｂ）が、
Ｉ）工程ａ）で得られた濃縮材料を、ヒト抗体を結合することが可能な、酵素又は放射性標識にコンジュゲートされたタンパク質とともにインキュベートし、続いてすすいで、前記未結合のコンジュゲート型タンパク質を除去する工程、
ＩＩ）前記コンジュゲート型タンパク質のシグナルを検出する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
既知の力価を有する前記抗体が、４Ｇ８、６Ｅ１０、Ｇ２−１１、３Ｄ６、ｍ２６６、ソラネズマブ、ポネズマブ、バピネオズマブ、ガンテネルマブ、ＢＡＮ２４０１、ＢＩＩＢ０３７、静脈内投与される免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、ガンマガード、オクタガム、ニューガム（Ｎｅｗｇａｍ）から選択される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
既知の力価を有する前記抗体が、ベータアミロイドタンパク質の１位〜２８位におけるアミノ酸配列に含まれるエピトープに特異的である、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
既知の力価を有する前記抗体が、ベータアミロイドタンパク質の１７位〜２４位におけるアミノ酸配列に相当するエピトープを認識する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記コンジュゲート型タンパク質が、ＨｒｐにコンジュゲートされたプロテインＡ、ＨｒｐにコンジュゲートされたプロテインＧ、コンジュゲート型ビオチン、コンジュゲート型ストレプトアビジン、Ｈｒｐ酵素にコンジュゲートされた抗体、又はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）にコンジュゲートされた抗体、又はベータガラクトシダーゼにコンジュゲートされた抗体、又は蛍光標識された分子にコンジュゲートされた抗体、又は発光分子にコンジュゲートされた抗体を含む群において選択される、酵素にコンジュゲートされたタンパク質である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
放射性標識にコンジュゲートされた前記タンパク質が、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１又はＩ−９９にコンジュゲートされたプロテインＧ、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１又はＩ−９９にコンジュゲートされたＡ、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１又はＩ−９９にコンジュゲートされた抗ＩｇＧ抗体を含む群において選択される、請求項１から６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
アルツハイマー病の能動及び／又は受動免疫処置をモニタリングするｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法の工程が、前記処置の種々の時点で収集されたより多くのＣＳＦサンプルに関して実施され、各サンプルから得られる定量化データが互いに比較されて、このようにしてＣＳＦ中のベータアミロイドタンパク質に対する抗体の濃度の時間経過を構築する上記方法。
【請求項１０】
前記サンプルそれぞれに関して、１つ又は複数の内皮損傷マーカーの濃度を決定する工程を更に含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記内皮損傷マーカーが、組織因子経路阻害剤（ＴＦＰＩ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
炎症及び血管原性浮腫（ＣＡＡ−ｒｉ）にも関連する脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ）の、患者のＣＳＦサンプルからの診断又は治療上のモニタリングに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法の工程、及び抗ベータアミロイドタンパク質抗体の決定された濃度を標準参照値と比較する更なる工程を含む上記方法。
【請求項１３】
前記標準参照値が、健常な個体及びＣＡＡ又はＣＡＡ−ｒｉを患う個体からの一連のサンプルの濃度を作成することにより得られるＲＯＣ曲線により決定される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記参照値が、３０〜４０ｎｇ／ｍＬを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者のＣＳＦサンプル中のＴＦＰＩの濃度を決定して、決定された値を標準参照値と比較する更なる工程を含む、請求項１２から１４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ＴＦＰＩの前記標準参照値が、健常な個体及びＣＡＡ又はＣＡＡ−ｒｉを患う個体からの一連のサンプルの濃度を作成することにより得られるＲＯＣ曲線により決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＴＦＰＩの前記標準参照値が、０．７０〜０．９０ｎｇ／ｍＬを含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
放射線学的異常（ＡＲＩＡ）の、患者のＣＳＦサンプルからの診断又は治療上のモニタリングに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法の工程、及び抗ベータアミロイドタンパク質抗体の決定された濃度を標準参照値と比較する更なる工程を含む上記方法。
【請求項１９】
前記患者のＣＳＦサンプル中のＴＦＰＩの濃度を決定して、決定された値を標準参照値と比較する更なる工程を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＴＦＰＩの前記標準参照値が、健常な個体及びＣＡＡ又はＣＡＡ−ｒｉを患う個体からの一連のサンプルの濃度を作成することにより得られるＲＯＣ曲線により決定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＴＦＰＩの前記標準参照値が、０．７０〜０．９０ｎｇ／ｍＬを含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
ベータアミロイドタンパク質の抗体の検出のためのキットであって、前記抗体を結合することが可能な高分子でコーティングした磁気マイクロビーズ、及びベータアミロイドタンパク質に対して既知の力価を有する抗体の１つ又は複数のアリコート（ａｌｉｑｕｏｔｓ）を含み、既知の力価を有する前記抗体が、ＩｇＧ２ａ若しくはＩｇＧ２ｂクラスに属するマウス抗体、又はＩｇＧ２ｂ若しくはＩｇＧ１クラスに属するヒト抗体である上記キット。
【請求項２３】
ベータアミロイドタンパク質でコーティングした１つ又は複数の固相支持体、免疫酵素アッセイのための試薬の１つ又は複数のアリコート、並びに／又はヒト抗体及び／若しくは既知の力価を有する前記抗体を特異的に結合することが可能な、酵素にコンジュゲートされたタンパク質の１つ又は複数のアリコートを更に含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
ＴＦＰＩタンパク質の免疫酵素計量のための試薬を更に含む、請求項２２又は２３に記載のキット。
【請求項２５】
ＴＦＰＩタンパク質の免疫酵素計量のための前記試薬が、ＴＦＰＩタンパク質に特異的な抗体でコーティングした１つ又は複数の固相支持体、及び／又は標準曲線の構築のための標準物質、陽性対照及び陰性対照を含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記固相支持体が、ＴＦＰＩタンパク質及び／又はベータアミロイドタンパク質に特異的な抗体でコーティングされる、請求項２５に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、脳脊髄液のサンプル中の抗ベータアミロイドタンパク質抗体及び内皮損傷の決定（バイオマーカー組織因子経路阻害剤、ＴＦＰＩの計量による）に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法並びにキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ベータ−Ａｍｉｌｏｙｄ（Ａベータ）又はベータアミロイドタンパク質と称される４ｋＤａのペプチドの脳及び脳血管の蓄積は、アルツハイマー病（ＡＤ）における重要な神経病理学的事象として広く受け入れられている。ＡＤの主な特徴は、実際には、主としてＡベータ凝集体（Ａベータ４０及びＡベータ４２）により形成されるアミロイド斑、並びにベータ及びガンマ−セクレターゼによるアミロイド前駆物質タンパク質（ＡＰＰ）のタンパク質分解により導かれる脳アミロイド血管障害とも称される血管レベルでのＡベータ堆積である。
【０００３】
様々なメカニズム、その中でも、有毒な凝集体クリアランス系の異常機能又は脳レベルでの細胞防御系の異常機能が、これらの蓄積の形成に関与し得ると思われる。「アミロイド修飾療法（Ａベータ−ＤＭＴ）」と定義される治療上のアプローチ、特に能動及び受動免疫に基づいているものは、これらのメカニズムの考え得る回復及び増強に正確に基づいている。
【０００４】
これらの療法の使用における強力な刺激は、トランスジェニック動物モデルにおける過去の証拠に続いて起こり、ここで、免疫は、ベータアミロイド斑の存在を防止し、また場合によっては低減させることが可能であることが実証されている。最初に、能動免疫アプローチは、ベータアミロイドタンパク質を投与することにより、及びそれにより、注射した抗原に対して誘導される自発的な内因性抗体生産を助長することにより、患者に行われた。ベータアミロイドタンパク質は、身体で偏在的に分布されており、また堆積及び循環レベルに関して、ある患者から別の患者まで極めて一様ではないという事実に加えて、この戦略により患者において抗体生産をモニタリングすることが不可能であることに起因して、これらの臨床試験は、急性髄膜脳炎のエピソードの発生に起因して、第１相又は第２相で中止された。
【０００５】
医薬品製剤に関する顕著な進捗のおかげで、また抗ベータアミロイドタンパク質抗体の生産及び特徴付けの分野での科学的知見の顕著な進歩のおかげで、臨床−医薬品研究は今日、全身経路によるヒト化抗体の注射に基づく臨床試験にほぼ例外なく関与している。「受動」と称されるこの免疫技法は、循環抗体力価をより良好に制御し、また必要な場合には薬理学的活性を仮説上は中断させることが可能であるという利点を伴う。
【０００６】
実際には、これらの治療戦略のより大きな安全性にも関わらず、幾つかの副次的な危険性が存続し、その中でも最も関連性のあるものは、血管原性浮腫（ＶＥ）の発症である。
【０００７】
動物モデルでは、血管原性浮腫及び神経炎症性（ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ）応答のようなこれらの有害な現象は、投与される抗体の治療用量に厳密に関連することが証明されている。現に、低投与量で処置した動物は、上述の有害な影響の発生を示さなかった。更に、情動不安の兆候を示し始めた動物において治療用量を減少させることにより、有害な影響自体を取り消すことができるという事実は特に興味深い。
【０００８】
したがって、脳脊髄液（ＣＳＦ）中に脳レベルで存在する抗体のレベル、即ち大脳区域に到達して、その結果として中枢の薬理学的効果を有することを現に成功させた抗体のレベルを計量することが可能であることが重要である。ＣＳＦ中のかかるレベルの上昇を効果的に評価することが可能であるためには、非常に感度が高く、及び基底状態で、即ち処置前に自発的に存在する自己抗体の存在も検出することが可能な計量を利用することが重要である。更に、臨床研究及び薬理学的試行から導かれるごく最近の証拠により、内皮損傷の多発性を有する対象又は脳血管危険因子（例えば、ＡＰＯＥ４ハロタイプの存在）のキャリアは、３％〜５％高いＶＥを発症する割合、その結果として更には死を被り得るため、療法を始める対象における脳血管障害の正確な状況を知ることは根本的なことであると知られている。
【０００９】
ベータアミロイド堆積及び脳内皮損傷の存在を評価することが可能な一般的な技法は、ＰＥＴ及びＭＲＩを用いた画像化技法である。しかしながら、これらの技法は非常に高価であり、臨床ルーチンでいまだに完全には確証及び承認されておらず、非常に有能なスタッフ及び特定の機器を要し、実際の生物学的応答を示さず、その結果として特殊なケースでのみ使用され、化学的−物理的研究を伴う。更に、これらの技法が、ＣＳＦ中に自発的に存在する抗体（自己抗体）の濃度、又はそれらが処置後にどれだけ多く増加したか、又は、更には、脳血管障害とのそれらの関係性に関して何も示さないことは、指摘されなくてはならない。
【００１０】
しかしながら、近年、かかる証拠が再検討されて、アルツハイマー協会研究ワークグループ（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｗｏｒｋｇｒｏｕｐ）が、ＡＲＩＡの概念、即ちＦＬＡＩＲシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を使用した血管原性浮腫及び／又は溝滲出（ｓｕｌｃａｌ  ｅｆｆｕｓｉｏｎ）の発症により表される「アミロイド関連画像化異常」（ＡＲＩＡ−Ｅ）、及びモノクローナル抗体バピネオズマブで処置し、続いて他の処置（例えばセマガセスタット及びソラネズマブを用いるような）でも確認されたアルツハイマー患者におけるエコーグラジエントにおけるＴ２＊シーケンス（Ｔ２＊−ＧＲＥ）でのヘモジデリン堆積（ＡＲＩＡ  Ｈ）のシグナルのＡＲＩＡの概念を定義した後に、更に大きな関連性を獲得した。
【００１１】
このことは、これらのＡＤ患者に存在するＡＲＩＡと、脳アミロイド血管障害関連炎症（ＣＡＡ−ｒｉ）を患う患者の非常に特定のサブクラスとの間で共有される多くの類似性を考慮すると、更に一層興味深いことがわかり、ここで、ベータアミロイドタンパク質に対する自己抗体による特定の自己免疫メカニズムは、これらの対象においては病原病理学的メカニズム及びＡＲＩＡ出現を明確に示すようである。しかしながら、今日に至るまで、ＡＤ及びＣＡＡ−ｒｉの両方においてＡＲＩＡを明確に示す病原メカニズムは、依然として大部分が未知であることを重視しなくてはならない。今日に至るまで、急性期の的確な処置に重要なＣＡＡ−ｒｉの確定診断は、脳バイオプシー（即ち、研究により、病理学に特徴的な出血の多発性の増加を考慮すると、患者にとって非常に侵襲的及び危険である）、及び精密なＮＭＲ研究に関してのみ可能である。自己抗体は、疾患の急性期を特徴付け、またＣＳＦ中のそれらの濃度に直接相関される実際のメカニズムであることが結果的にわかるはずであり、したがって、本発明者らは明らかに、ＣＡＡ−ｒｉの診断に関してはるかに危険性が少なく及び低侵襲的な代替的診断ツールを利用し得る。
【００１２】
ベータアミロイドタンパク質に対して誘導される抗体の計量に関して、今日まで、Ａベータ４０タンパク質に対して誘導される自己抗体（即ち、血漿中で自然に発生するもの）の血漿計量に関する方法について記載しているＮｅｕｒｏｌｏｇｙ  ｊｏｕｒｎａｌで２００１年に出版された文献（Ｄｕ  Ｙら）における事実上１つの研究が存在する。この方法は、単なるＥＬＩＳＡ方法論に専ら基づいており、ＡＤ及びダウン症を患う患者の血漿中のＡベータタンパク質に対する抗体力価の計量に関して文献で見出され得る事実上唯一の方法を表す。
【００１３】
しかしながら、今日に至るまで、健常な集団と比較してＡＤ対象における血漿抗体力価の正確な分布を示す最終的な証拠は、依然として数少なく、及びはっきりしないままである。実際には、自己抗Ａベータタンパク質抗体の血漿力価は、ある文献（Ｄｕ  Ｙら、Ｗｅｋｓｌｅｒ  ＭＥら、Ｓｏｎｇ  ＭＳら）によると減少されるようであり、他の文献（Ｈｙｍａｎ  ＢＴら、Ｂａｒｉｌ  Ｌら）によると変化がないようであり、又は、更には、更なる他の文献（Ｎａｔｈ  Ａら）によると増加されるようである。
【００１４】
このことは確かに真実であり、ＣＳＦレベルでの自己抗体計量に関して強調されている（Ｄｕ  Ｙら）。実際には、血漿中にも関わらず、抗体力価は、比較的直接的に計量するには十分高く、Ｄｕ  Ｙらにより記載される方法は、ＣＳＦ中の計量に関しては、ほぼ無用であり、ＣＳＦ中では、自己抗体は、極めて低い濃度で存在し、その結果としてＤｕ  Ｙらにより使用されるＥＬＩＳＡ方法論による十分な感度及び信頼性では計量不可能である。Ｄｕ  Ｙらによる２つの表題の論述セクションでは、同著者らは、非常に大量を要する場合には、血漿からのみ自己抗体を単離及び精製することができ、ＣＳＦからは自己抗体を単離及び精製することができないことを明記している。
【００１５】
特許出願である国際公開第２０１１００９４３５号では、血漿、及び同様にＣＳＦサンプル中の自己抗体の検出に関するＥＬＩＳＡ方法が記載されているが、ＣＳＦ中の計量に関して、従来技術で記載されるものと比較して、この方法のより大きな感度を強調するデータを報告していない。
【００１６】
したがって、ＣＳＦサンプル中の抗ベータアミロイドタンパク質抗体の計量に関して、主な問題は、存在する自己抗体が非常に低濃度のままであり、全てがゼロ（即ち、ブランク）と、較正曲線標準物質の１点目との間に全てが包含されることを実証可能であるほど低い値であり、即ち、背景ノイズと非常に容易に間違えられる。しかしながら、より一層効果的及び安全な治療抗体を特定する際の、医薬品産業及び一般的に研究の非常に重い責務にも関らず、一般的にＡＤ及びＣＡＡを患う患者における脳レベルで自発的に発生する自己抗体の濃度に関して、ほとんど又は全く何も知られていないという証拠が関係している。今日まで続行されている論拠は、ＡＤ患者における抗体の存在の減少を前提とするということであり、その結果として病理学の減速を実証することが可能な治療抗体の全身経路による外因性投与にのみ、焦点が向けられている。今日に至るまで、動物ＡＤモデルでは、かかる療法が脳レベルでＡベータ堆積を現に減少させるという実証によってのみ、かかる証拠が支持されている。しかしながら、ＣＳＦレベルで非常に低濃度で存在する自己抗体を計量する際の技術的−実験的困難性に起因して、ＡＤ対象が療法前に抗体力価の減少を現に示すかどうかは、いまだ正確にはわかっておらず、とりわけ、どれだけ多くの治療抗体が、血液脳関門を通過することに現に成功しているか、その結果として脳区域で治療効果を有することに成功しているかはわかっておらず、又は更には治療投与中のそれらの濃度の動向、又はより一層重要なことには、放射線学的異常（ＡＲＩＡ）の出現中のそれらの濃度は知られていない。ＣＡＡ−ｒｉの急性期中に自然に生産される抗体のＣＳＦ濃度、免疫抑制療法後の抗体のＣＳＦ濃度、寛解期における症状の臨床的−放射線学的消散（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）に続く抗体のＣＳＦ濃度にも、同じことが当てはまる。
【００１７】
したがって、ＣＳＦサンプル中に存在する抗ベータアミロイドタンパク質抗体の濃度を高感度で計量する方法及びキットを提供するという問題に非常に興味が抱かれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明の方法は、脳脊髄液のサンプル中に元々存在する抗ベータアミロイドタンパク質抗体を濃縮する工程の選択及び開発、並びに免疫酵素アッセイ又はラジオイムノアッセイにおける、このようにして濃縮された抗体の続く検出に基づいている。
【００１９】
ベータアミロイドタンパク質に対して誘導される抗体を結合することが可能な、高分子で適切にコーティングした磁気マイクロベースビーズを用いて、濃縮サンプルが得られ、この濃度が極めて低い場合でさえも、そこから出発サンプル中に存在する抗体の濃度を定量的に検出することが可能であることを、本発明者らが発見した。マイクロビーズ上で濃縮する工程が、抗体濃度を決定するのに利用される免疫酵素アッセイ又はラジオイムノアッセイの感度の増加を決定することを、本発明者らは実証している。磁気性であるマイクロビーズは、マグネットを用いて容易に除去することができ、その結果としてサンプル損失を引き起こし得るデッドボリュームがない。
【００２０】
また、本明細書中に記載される方法の特に有効な工程が開発されており、それは、発明を実施するための形態で詳細に記載されている。
【００２１】
本発明の方法により最先端で初めて、能動及び／又は受動免疫療法による処置の下で対象のＣＳＦ中に存在する抗体、一般的にはＡベータ−ＤＭＴの実際の濃度を計量することができ、それにより療法のより有効なモニタリングを可能とし、また患者におけるＡＲＩＡ出現を防ぐことが可能となる。更にまた、処置前及び／又は診断スクリーニングとして、改善された治療上のカスタマイゼーションに沿って、考え得る療法に関する患者候補のＣＳＦ中に自発的に発生する抗体濃度を計量することができる。
【００２２】
本発明の第１の目的は、脳脊髄液のサンプル中の抗ベータアミロイドタンパク質抗体の検出に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ）上記サンプルの上記抗体の量を、上記抗体を結合することが可能な高分子でコーティングした磁気マイクロビーズを用いて濃縮する工程、
ｂ）工程ａ）で得られた濃縮サンプルを、免疫酵素アッセイにより、又はラジオイムノアッセイにより分析する工程
を含む上記方法である。
【００２３】
本発明の別の目的は、ＣＳＦサンプル中の抗ベータアミロイドタンパク質抗体の定量化に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ）上記サンプルの上記抗体の量を、上記抗体を結合することが可能な高分子でコーティングした磁気マイクロビーズを用いて濃縮する工程、
ｂ）工程ａ）で得られた濃縮サンプルを、免疫酵素アッセイにより、又はラジオイムノアッセイにより分析する工程、
ｃ）工程ｂ）で使用するのと同じアッセイを用いて、既知の力価を有する抗ベータアミロイドタンパク質抗体を含むサンプルを分析して、関連較正曲線を作成する工程
を含む上記方法である。
【００２４】
本発明の更なる目的は、アルツハイマー病を患う患者のＣＳＦサンプルから、アルツハイマー病の能動及び／又は受動免疫処置をモニタリングするｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、請求項１から８までのいずれか一項に記載の工程を含む上記方法である。
【００２５】
本発明の更に別の目的は、脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ）及びＣＡＡ関連の炎症、自己免疫並びに血管原性浮腫（ＣＡＡ−ｒｉ）の、患者のＣＳＦサンプルからの診断に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、請求項１から８までのいずれか一項に記載の工程を含む上記方法である。
【００２６】
本発明の更に別の目的は、放射線学的異常（ＡＲＩＡ）の、患者のＣＳＦサンプルからの診断又は治療上のモニタリングに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、請求項１から８までのいずれか一項に記載の方法の工程、及び抗ベータアミロイドタンパク質抗体の決定された濃度を標準参照値と比較する更なる工程を含む上記方法である。
【００２７】
本発明の目的はまた、抗ベータアミロイドタンパク質抗体の検出のためのキットであって、上記抗体を結合することが可能な高分子でコーティングした磁気マイクロビーズ、ベータアミロイドタンパク質に対して既知の力価を有する抗体の１つ又は複数のアリコート（ａｌｉｑｕｏｔｓ）を含む上記キットであり、それは、個別に使用される場合の個別のバイオマーカーの使用と比較して、より感度が高く、及びより特異的な診断、予後及びテルアグノスティックな（ｔｅｒａｇｎｏｓｔｉｃ）ツールを提供するために、内皮損傷マーカーとしてのＴＦＰＩタンパク質及び相関される脳炎症現象の免疫酵素計量のための手段を任意に含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】本発明の方法の実施形態によるサンプルを濃縮する工程ａ）の概略図。
【図２】本発明の方法の実施形態による免疫酵素アッセイによりサンプルを分析する工程ｂ）の概略図。
【図３】磁気マイクロビーズを用いたいかなる濃縮も実施せずに、同じ既知濃度０．２５μｇ／ｍｌでのＡベータに対する３つの市販されている異なる抗体クローン（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙにより分配されたクローンＧ２−１１、Ｃｏｖａｎｃｅにより分配されたクローン６Ｅ１０及び４Ｇ８）を分析することにより見出される吸光度（ＯＤ）間の比較を報告する。左側の欄では、背景技術に記載されるＥＬＩＳＡ手順により試験した３つの市販の抗体に関するＯＤ値が報告されている。右側の欄は、本発明者らの新たなＥＬＩＳＡ方法により得ることが可能なＯＤ値を報告している。二次抗体として、ヤギで生産されたＨｒｐコンジュゲート型抗ヒトＩｇＧ、（ヤギで生産された抗ヒトＩｇＧ（全分子）ペルオキシダーゼ抗体、ＳＩＧＭＡ  ＃Ａ８６６７）又はＨｒｐコンジュゲート型プロテインＡ（ＨｒｐにコンジュゲートされたプロテインＡ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃１８−１６０）を使用した。
【図４ａ】較正曲線。背景技術で教示されるものとは異なって、較正曲線用の抗体として抗体Ｇ２−１１を、また二次抗体としてヤギで生産されたＨｒｐコンジュゲート型抗ヒトＩｇＧを利用している、背景技術で記載されるＥＬＩＳＡ手順（Ｃｏｎｔｉら、２０１０年）を用いて得られた結果（標準物質は、前富化（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）なしで使用した）。背景技術での方法を用いた較正曲線は、未処理サンプル、及び本発明者らにより記載される方法に従ってマイクロビーズを用いて濃縮したＣＳＦの両方に関して、ＣＳＦサンプルの計量に関して十分に感度が高く、及び精密ではなかったことが理解され得る。実際に、ＣＳＦサンプルは非常に低いＯＤ値を示し、ゼロ（ブランク）と曲線の１点目との間に含まれる較正曲線の点内に収まり、即ち、実際の問題として全体的に測定不可能であることが観察され得る。
【図４ｂ】較正曲線。較正曲線用の抗体として抗体４Ｇ８を、また二次抗体としてＨｒｐコンジュゲート型プロテインＡを利用しているが、本発明者らにより実行され、及び背景技術には記載されていない検出のための試薬の特定の選択及び組合せを用いた結果（曲線標準物質は常に、前富化なしで利用した）。図は、クローン４Ｇ８＋ｐｒｏｔＡ−ＨＲＰのどのような選択が、とりわけ、非常に低くて背景技術では使用不可能であると判明している標準物質の濃度値に関して、背景に記載される方法と比較してより高い感度を有するかを示している。  更に、ＡＤ、ＣＡＡ−ｒｉを患う患者、及び対照から得られるＣＳＦサンプルを分析することにより得られる典型的な値が報告されている。示される３つ全ての場合に関して、ＯＤは、標準曲線の直線性範囲内に完璧に含まれる。
【図４ｃ】較正標準物質の典型的な濃度及び関連吸光度値（ＯＤ）である。  １）背景技術に記載されるＥＬＩＳＡ手順（Ｇ２−１１＋抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ、Ｃｏｎｔｉら、２０１０年）、  ２）本発明者らにより実行されるＥＬＩＳＡ（４Ｇ８＋ｐｒｏｔＡ−ＨＲＰ）を用いて得られる典型的な結果を示す。  通常通りに、標準物質は、磁気ビーズによる富化プロセスを受けていない。  図は、典型的な較正曲線に関して、本発明者らの新規ＥＬＩＳＡ方法が、ＣＳＦ中の抗Ａベータ抗体の定量化に期待される検出範囲（０．１４〜０．０４μｇ／ｍＬ）でいかに超高感度であるかを判明しているかを示す。更に、０．１３４μｇ／ｍＬの同濃度で、抗体Ｇ２−１１を用いた背景技術に記載される旧式ＥＬＩＳＡ方法と比較して、本発明者らの新たなＥＬＩＳＡ方法を用いて検出可能なＯＤ値が、背景技術に記載されるＥＬＩＳＡ方法を用いて検出可能な０．１４２と比較して１．０７２であることが示される。このことは、本発明者らの新たな方法が、かかる濃度値に対して約１０倍も感度が高いことを実証する。更に、全ての標準物質に関して、０．１３４μｇ／ｍＬよりも低い濃度を用いた場合、従来法は、いかなる未知の値もブランクと識別することが不可能であったことが観察される。
【図５】健常な対照（ＣＴＬ）及び血管成分を伴わない神経変性病理学を患う他の患者（神経変性対照）と比較した、アルツハイマー病（ＡＤ）を患う患者からのＣＳＦサンプルにおけるＴＦＰＩ計量。結果は、Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  ＴＦＰＩ  ＥＬＩＳＡ  ＫＩＴ−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓに記載される実験手順を修飾することにより得られた。特に、ＣＳＦ中の計量に関しても上記ＫＩＴを利用するために、製造会社により提供されるプロトコルを、アッセイ及び修飾した（使用した方法の説明は、実施例の部の例７で見られる）。図中で記述され得るように、４４人のＡＤ患者のＣＳＦ中のＴＦＰＩ値は、３０人の健常な対照及び５人の神経変性病理学（例えば、脳血管損傷との関連が報告されていない病理学である筋萎縮性側索硬化症）を患う対象の群と比較して有意に増加されることが判明した。
【図６】ＣＡＡ−ｒｉ患者の核磁気共鳴フレーム（ケース６）。脳ＭＲＩコロナルＦＬＡＩＲは、疾患の急性期中の皮質下白質の両側性病巣を示し（Ａ）、症状の自然寛解を伴って３ヶ月後に低減し（Ｂ）、Ｔ２−スターシーケンス又はグラジエントエコーの軸方向セッションでの脳ＭＲ（白質における多重及び両側性の微小出血の存在を検出する）を示す（Ｃ）。コントラスト強調は、ガドリニウム注射後には存在しなかった（データは示していない）。
【図７】右側側頭葉のバイオプシー分析での神経病理学的証拠（ケース＃６）。Ｈ＆Ｅ（Ａ、Ｄ）及びマッソントリクローム（Ｂ）染色は、内腔の低減を伴う軟髄膜及び実質血管床の肥厚を示す。更に、リンパ単球浸潤が、血管周囲腔で、及び血管床肥厚で強調された（ＣＤ４５免疫染色、Ｆ）。血管床から出現した材料は、アミロイドタンパク質に典型的な光学特性及び染色（チオフラビンＳ処置後に黄色い蛍光、Ｅ）を伴ってタンパク質Ａβに関して、極めて免疫反応性であることが判明した（モノクローナル抗体４Ｇ８、Ｃ）。更に、抗Ａβ抗体は、神経原線維変化の非存在下で（データは示していない）、皮質ニューロパイル（ｎｅｕｒｏｐｉｌｕｍ）を検出した（４Ｇ８、矢印、Ｃ）。更に、重篤なアストログリオーシス及びマイクログリア活性化が、大脳皮質で、及び皮質下白色物質で見出された。  バーは、Ａ＝５０μｍで表される。他の図は全て、同じ倍率度を有する。Ｄ、Ｅ及びＦは、隣接する区域で実施された。
【図８】ＣＳＦ中の抗Ａβ抗体の濃度。  Ａ）健常な対象（ＣＴＬ、ｎ＝２５）、脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ、ｎ＝８）、多発性硬化症（ＭＳ、ｎ＝１４）、急性期中のＣＡＡ関連炎症（ａｐＣＡＡ−ｒｉ、ｎ＝１０）及び寛解期におけるＣＡＡ−ｒｉ（ｒｐＣＡＡ−ｒｉ、ｎ＝７）のＣＳＦ中の抗Ａβ自己抗体の濃度。＊ｐ＜０．０００１  ａｐＣＡＡ−ｒｉ対ＣＴＬ及びＭＳ。§ｐ＜０．００２５  ａｐＣＡＡ−ｒｉ対ＣＡＡ。＃ｐ＜０．０００６  ａｐＣＡＡ−ｒｉ対ｒｐＣＡＡ−ｒｉ。値は、平均値±標準偏差として表される。  Ｂ）ａｐＣＡＡ−ｒｉ及びｒｐＣＡＡ−ｒｉ患者における症状の寛解期の前及び後の抗体の動向の個別的表示（ｐ＝０．０００９）。ケース６及び８が図中で示され、症状の自発的寛解がいかなる医薬品処置も伴わずに観察された２人の患者を表している。
【図９】健常な対照で見出すことができる平均値に達するまでの各静脈内注射後（矢印）、及びステロイドを用いた経口処置中（線）のＣＡＡ−ｒｉ患者のＣＳＦ中の抗Ａβ抗体の経時的な漸減（点線は、健常な対照対象で見出すことができる平均値並びに上部平均値及び下部平均値の９５％を表す）。
【図１０】急性期中（ａｐＣＡＡ−ｒｉ）中、及び症状の寛解期後（ｒｐＣＡＡ−ｒｉ）の脳アミロイド血管障害関連炎症を患う患者（ＣＡＡ−ｒｉ、ｎ＝７）のＣＳＦ中のＡβ４０、Ａβ４２、タウ及びＰ−１８１タウ濃度並びにレベルの関連経過。Ａ）Ａβ４０（ｐ＝０．００９、ａｐＣＡＡ−ｒｉ対ｒｐＣＡＡ−ｒｉ、ｐ＝０．０３２  ｒｐＣＡＡ−ｒｉ対ＣＴＬ）、Ｂ）Ａβ４２（ｐ＝０．０１５、ａｐＣＡＡ−ｒｉ対ｒｐＣＡＡ−ｒｉ、ｐ＝０．００２、ｒｐＣＡＡ−ｒｉ対ＣＴＬ）、Ｃ）タウ（ｐ＝０．００４、ａｐＣＡＡ−ｒｉ対ｒｐＣＡＡ−ｒｉ、ｐ＝０．０１２、ａｐＣＡＡ−ｒｉ対ＣＴＬ）、及びＤ）Ｐ−１８１  タウ（ｐ＝０．００７、ａｐＣＡＡ−ｒｉ対ｒｐＣＡＡ−ｒｉ、ｐ＝０．０４４、ａｐＣＡＡ−ｒｉ対ＣＴＬ）。ケース６及び８が図中に示され、症状の自然寛解がいかなる薬理学的処置も伴わずに観察された２人の患者を表している（破線は、健常な対照対象で見出すことができる平均値並びに上部平均値及び下部平均値の９５％を表す）。
【図１１】１０人のａｐＣＡＡ−ｒｉの総集団におけるＡβ４０（Ａ、ピアソンｒ＝０．８５、ｐ＝０．００２）及びＡβ４２（Ｂ、ピアソンｒ＝０．６５、ｐ＝０．０４２）の抗Ａβ抗体とリカー（ｌｉｑｕｏｒ）（ＣＳＦ）との間での強力な相関の存在の実証。実線及び破線は、それぞれ、回帰線及び９５％信頼区間を表す）。
【図１２】ＴＦＰＩのＣＳＦ値。説明文：健常な対象、脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ、ｎ＝８）、筋萎縮性側索硬化症（ＯＮＤ）及びＣＡＡ関連炎症（ＣＡＡ−ｒｉ、ｎ＝１０）のＣＳＦ中のＴＦＰＩ濃度。＊ｐ＜０．０００１  ＣＴＬ対ＣＡＡ−ｒｉ、ＣＡＡ及びＡＤ。値は、平均値±標準偏差として表される。
【図１３】タウ、Ｐ−１８１タウのＣＳＦ値及びＴＦＰＩ値を用いた関連相関分析。説明文：ＡＤ患者及び健常な対照のＣＳＦ中のタウ並びにＰ−１８１タウの値（上部の四画）。下部の四画は、ＴＦＰＩのＣＳＦ濃度と、タウ及びＰ−１８１タウのＣＳＦ濃度との間に現れる相関について報告している（それぞれ、ｐ＜０．００５１、ｒ＝０．４７、ｐ＜０．００４１、ｒ＝０．４９）。
【図１４】ａｐＣＡＡ−ｒｉ及びｒｐＣＡＡ−ｒｉ中の患者のＣＳＦ中のＴＦＰＩ値の動向。説明文：ａｐＣＡＡ−ｒｉ及びｒｐＣＡＡ−ｒｉ患者における症状の寛解期の前及び後のＣＳＦ  ＴＦＰＩの動向の個別的表示（ｐ＝０．０１）。（点線は、健常な対照対象で見出すことができる平均値並びに上部平均値及び下部平均値の９５％を表す）。
【図１５】図中で示されるように、アルツハイマー患者のＣＳＦ中に存在する抗Ａβ抗体のレベルを本発明の方法により評価して、遺伝的危険因子ＡｐｏＥエプシロン４の患者キャリア（ＡＰＯＥ４キャリア）が、自発的に、及びＡβ−ＤＭＡＴ投与後の両方で、ＡＰＯＥ４キャリアによるＡＲＩＡを発症するより大きな傾向を支持して、ＮＯＮ−ＡＰＯＥ４キャリア患者（２．８７４ｎｇ／ｍＬ±３．０６３、ｐ＜０．００１）と比較して、より大きな生理学的濃度の自己抗体（１２．８４ｎｇ／ｍＬ±２１．２３）を有することが観察された。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は、脳脊髄液のサンプル中の抗ベータアミロイドタンパク質抗体の検出用に意図される高感度方法を初めて提供する。
【００３０】
本説明の最後まで、「ベータアミロイドタンパク質に対する抗体」とは、文献では、Ａベータ、又は例えばＡベータ４０、Ａベータ４２、Ａベータ４３のようなそのアイソフォーム、又はその任意の考え得る切断形態、ラセミ形態若しくは異性体形態（例えば、Ａベータ１１−４２、Ａベータ１７−４２、Ａベータ９−４２、Ａベータ１−２８、Ａベータ２５−３５、Ａベータ１０−２０、又はより一般的にはＡベータＸ−４０若しくはＡベータＸ−４２）、又はそれら各々の各種モノマー、ダイマー若しくはオリゴマー、可溶性形態、不溶性形態、フィブリル形態又はプロトフィブリル形態のような文献中でＡベータ又はそのアイソフォームとも称されるベータアミロイドタンパク質の任意の１つの部分を選択的に結合することが可能である任意の抗体を意味する。
【００３１】
検出される抗体は、自己抗体、即ち、脳脊髄液が収集された患者の免疫系により生産される抗体、又は例えば患者に投与される治療上の使用のための抗体のような患者の免疫系により生産されない抗体（例えば、ソラネズマブ、ポネズマブ、バピネオズマブ、ガンテネルマブ、ＢＡＮ２４０１、ＢＩＩＢ０３７、静脈内投与される免疫グロブリン（ＩＶＩＧ（例えば、ガンマガード、オクタガム、ニューガム（Ｎｅｗｇａｍ））のような）であり得る。したがって、検出される抗体は、内因性及び外因性の両方であり得る。
【００３２】
分析されるべき脳脊髄液（リカー、脳脊髄液、脊柱髄液（ｒａｃｈｉｄｉａｌ−ｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ）、頭蓋脊柱液（ｃｅｐｈａｌｏｒａｃｈｉｄｉａｎ  ｆｌｕｉｄ）（液体）とも称されるか、又は頭文字語ＣＳＦを用いる）は、ＣＳＦ収集に一般的に使用される各種技法に従って得ることができる。すでに利用しているように、本発明による方法は、それぞれ、ＣＳＦサンプルの上記抗体の量を、上記抗体を結合することが可能な高分子でコーティングした磁気マイクロビーズを用いて濃縮する工程ａ）、及びこのようにして得られた濃縮サンプルを、免疫酵素アッセイにより、又はラジオイムノアッセイにより分析する工程ｂ）の２つの工程を含む。
【００３３】
ａ）磁気マイクロビーズを用いて濃縮する工程
本明細書中に記載する方法に適した磁気マイクロビーズは、典型的に直径が０．５〜５００μｍの一様な粒子であり得る。その表面は、ベータアミロイドタンパク質に対して誘導される抗体を結合することが可能な高分子（例えば、プロテインＧ、プロテインＡ、ビオチン、ストレプトアビジン、Ａベータタンパク質のいずれか１つの部分及び／又はそのアイソフォーム（例えば、Ａベータ４０、Ａベータ４２、Ａベータ４３のような）、又はその任意の考え得る切断形態、ラセミ形態若しくは異性体形態（例えば、Ａベータ１１−４２、Ａベータ１７−４２、Ａベータ９−４２、Ａベータ１−２８、Ａベータ２５−３５、Ａベータ１０−２０、又はより一般的には、ＡベータＸ−４０若しくはＡｂｅｔａＸ−４２）又はそれら各々の各種モノマー、ダイマー若しくはオリゴマー、可溶性形態、不溶性形態、フィブリル形態又はプロトフィブリル形態のような）でコーティングされる。
【００３４】
高分子によるマイクロビーズのコーティングは、当業者に既知であるように、吸着又は結合により実施することができる。
【００３５】
適切なマイクロビーズのタイプは、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌ  ＡＳ  ＤｙｎａｂｅａｄｓプロテインＧ、プロテインＡ又はプロテインＡ／Ｇ、ＭａｇＳｉ−プロテインＡ及び／又はプロテインＧビーズ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ磁気ビーズ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＭＡＣＳ（登録商標）テクノロジービーズ、又は上記に記載されるのと同じ特徴を有し、及び手動手順を用いても、全ての考え得るロボット化及び自動化プラットフォーム（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎｎ（登録商標）、Ｔｅｃａｎ（登録商標）、ＩＤＳ（登録商標）、Ｘｙｒｉｌ（登録商標）、Ｓｔｒａｔｅｋ（登録商標）、Ｈａｍｉｌｔｏｎ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ（登録商標）、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）により生産及び／又は販売される）によっても使用されることが可能な任意の他のタイプである。
【００３６】
本発明のある実施形態では、ビーズとして、アガロースＡ／Ｇビーズ又はセファロースビーズも使用することができるが、しかしながらそれらは、自動化プラットフォームで容易に使用することが不可能であり、サンプルの幾らかの部分の考え得る損失を伴って、より少ない濃縮収率を付与し得る。
【００３７】
ある実施形態では、分析されるべきＣＳＦサンプルの少なくとも２００μｌ、例えば４００又は５００μｌの容量が、例えば同じ試験チューブ中で、サンプル及び適切な量のマイクロビーズ（例えば、７５μｌ）を攪拌下で、サンプル中に存在する抗体をマイクロビーズに結合させるのに適した期間（例えば、３０秒、４０秒、５０秒、６０秒）インキュベートすることにより、マイクロビーズ上に吸着させる。
【００３８】
吸着の工程後、従来技術を用いて、ピペット若しくは吸引によるように、所定の基質を損失せずに、又は自動化及びロボット化プラットフォームにより、上清を廃棄することが可能であるように、サンプル及びマイクロビーズを含有する試験チューブをマグネット付近に配置させる。上清は、続く免疫酵素アッセイ又はラジオイムノアッセイにおける対照材料として保管及び利用され得る。
【００３９】
概して、マイクロビーズ上のサンプルの吸着の工程及び上清を廃棄する工程は、従来の技法に従って、洗浄緩衝液（例えば、ＰＢＳ＋ツイーンのような）によるマイクロビーズの１回又は複数の洗浄を先行させることができ、及び／又はそれらを追随させることができる。
【００４０】
上清を廃棄する際、及び望ましい場合には、マイクロビーズを適切に洗浄した際、結合された抗体は、例えば、続く抗体検出のために適切なエピトープを遊離させる必要がある場合に、適切な溶出緩衝液を用いてマイクロビーズから溶出させることができる。
【００４１】
マイクロビーズがプロテインＡ又はプロテインＧでコーティングされている場合、溶出緩衝液は、ｐＨ３．２の０．１Ｍクエン酸塩を３０〜５０μｌ含む容量で構成され得る。サンプルを溶出させる際、酸性ｐＨは、濃塩基性緩衝液（例えば、１Ｍトリス塩基、ｐＨ９）で容易に中和される。中和緩衝液の添加は、溶出相で使用される酸性ｐＨが、濃度が決定されるべきベータアミロイドタンパク質に対して誘導される抗体を変性し得ること、又は続く免疫酵素アッセイ中に偽陽性を発生させ得るそれらの人工産物を創出し得ることを回避するのに重要である。
【００４２】
マイクロビーズが、ベータアミロイドタンパク質及び／又はそのアイソフォーム（例えば、Ａベータ４０、Ａベータ４２、Ａベータ４３のような）、又はその任意の考え得る切断形態、ラセミ形態若しくは異性体形態（例えば、Ａベータ１１−４２、Ａベータ１７−４２、Ａベータ９−４２、Ａベータ１−２８、Ａベータ２５−３５、Ａベータ１０−２０、又はより一般的には、ＡベータＸ−４０又はＡベータＸ−４２）又はそれら各々の各種モノマー、ダイマー若しくはオリゴマー、可溶性形態、不溶性形態、フィブリル形態又はプロトフィブリル形態のような）でコーティングされ、その結果として分析されるべきＣＳＦサンプル中に含有される抗ベータアミロイドタンパク質抗体のみを特異的に結合する代替的な実施形態では、マイクロビーズは、免疫酵素アッセイ又はラジオイムノアッセイを用いた分析の続く工程で、溶出工程を回避して、したがってより迅速で、より高感度で及びより高価でない方法で直接利用することができる。
【００４３】
磁気マイクロビーズを用いて濃縮したサンプル（同じ事により溶出されるか、又は溶出されない）は続いて、ｂ）免疫酵素アッセイにより、又はラジオイムノアッセイにより分析する第２の工程に付される。
【００４４】
免疫酵素アッセイによる分析
上述するような工程ａ）溶出が実施される実施形態では、上記免疫酵素アッセイは、下記工程を提供する：
【００４５】
Ｉ）ベータアミロイドタンパク質でコーティングした固相を準備する工程、
上記固相は、免疫酵素アッセイで、又はイムノアッセイで従来使用される固相（例えば、ウェルが上記で定義するようにベータアミロイドタンパク質でコーティングされて、１％ウシアルブミン、５％血清及び０．０５％ツイーンを有するリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）を用いた処理によるような、同様に従来の方法により背景ノイズを回避するように適正にブロックしたマイクロプレートのような）であり得る。
【００４６】
ブロッキング溶液のインキュベーション時間は、当業者により容易に特定可能であり、例えば、約３０、４０、５０、６０、９０分であり得る。未結合の材料を除去するために、固相は、適切な従来の洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ツイーンのような）で一度又は複数すすぐことができる。
【００４７】
ＩＩ）上記固相を、工程ａ）から得られた濃縮材料とともにインキュベートする工程
工程ＩＩ）では、磁気マイクロビーズを用いて濃縮したサンプルを固相に添加して、したがって、固相上でのベータアミロイドタンパク質及び／若しくはそのアイソフォーム（例えば、Ａベータ４０、Ａベータ４２、Ａベータ４３のような）、又はその任意の考え得る切断形態、ラセミ形態若しくは異性体形態（例えば、Ａベータ１１−４２、Ａベータ１７−４２、Ａベータ９−４２、Ａベータ１−２８、Ａベータ２５−３５、Ａベータ１０−２０、又はより一般的には、ＡベータＸ−４０若しくはＡベータＸ−４２）又はそれら各々の各種モノマー、ダイマー若しくはオリゴマー、可溶性形態、不溶性形態、フィブリル形態又はプロトフィブリル形態）への抗体の結合を可能にする。インキュベート時間は、当業者により容易に特定可能であり、例えば、約３０、４０、５０、６０分、また最大一晩のインキュベーションであり得る。未結合の材料を除去するために、固相は、適切な従来の洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ツイーンのような）で一度又は複数すすぐことができる。
【００４８】
ＩＩＩ）工程ＩＩ）で得られた固相を、ヒト抗体を結合することが可能な酵素に、又は放射性標識にコンジュゲートさせたタンパク質とともにインキュベートして、続いてすすいで、上記未結合のコンジュゲート型タンパク質を除去する工程
免疫酵素アッセイが、本発明に従って実施される場合、酵素にコンジュゲートされたタンパク質は、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素にコンジュゲートされたプロテインＡ、Ｈｒｐ酵素にコンジュゲートされたプロテインＧ、Ｈｒｐ酵素に、又はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に、又はベータガラクトシダーゼに、又は蛍光標識された分子に、又は任意の種のｌｑｓに選択的に結合することが可能な発光分子（例えば、ルミノール）、更にはｌｑｓを結合し、及び可視ＵＶスペクトルで又は蛍光下で検出可能なシグナルを生じることが可能な任意の試薬にコンジュゲートされた抗体であり得、抗体及びコンジュゲート型タンパク質だけでなく、適切に官能基化されたナノ粒子又はリポソームもまた、利用することができる。
【００４９】
代わってラジオイムノアッセイが使用される場合は、放射性標識にコンジュゲートされたタンパク質、例えば、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１又はＩ−９９にコンジュゲートされたＧタンパク質、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１又はＩ−９９にコンジュゲートされたＡ、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１又はＩ−９９にコンジュゲートされた抗ＩｇＧ抗体を利用することができる。
【００５０】
したがって、サンプル中に存在する特異的な抗体はそれぞれ、放射性作用物質に結合して、インキュベーションの第２段階中に、抗原−抗体複合体は、沈殿剤により沈殿させてもよく（溶液中の場合）、又は適切な洗浄緩衝液で洗浄してもよい。
【００５１】
ＩＶ）上記コンジュゲート型タンパク質のシグナルを検出する工程
免疫酵素アッセイの場合、過剰の未結合のコンジュゲート型タンパク質を除去するための洗浄後に、続いて標準的な技法に従って定量化することができるシグナルの発生を可能にするために、タンパク質にコンジュゲートされた酵素に基づく従来の手順に従って選択される適切な基質の溶液をウェルに添加する。シグナルは、例えば、酵素のタイプ及び使用される関連基質に応じて、適切なツールによる吸光度又は蛍光読取りにより定量化することができる。シグナル強度は、分析されるべきサンプル中に存在する抗体の量に比例する。
【００５２】
ラジオイムノアッセイでは、遠心分離及び上清沈降（ｓｅｔｔｌｉｎｇ）後に、又は固相に付着している抗体を用いたＲＩＡ若しくはＩＲＭＡアッセイの場合での洗浄の工程後に、沈殿物の放射能を、ガンマカウンターによって計数する。放射能強度は、患者から得られるサンプル中に存在する特異的な抗体の濃度に比例する。続いて、抗体濃度は、較正曲線によって定量的に測定することができる。
【００５３】
ある実施形態では、コンジュゲート型タンパク質は、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされたプロテインＡ（Ａ−ＨＲＰ）であり得る。背景技術で記載される免疫酵素アッセイでは、２つの異なる二次抗体が使用され、一方は、既知の力価を有するサンプルに関するもの（例えば、標準曲線を作成するのに使用されるもの、例えば抗マウスＩｇＧ抗体）であり、一方は、未知のサンプルに関するもの（抗ヒトＩｇＧ抗体）である。本発明の方法におけるＨＲＰコンジュゲート型プロテインＡの使用は、通常マウス起源の既知の力価を有するサンプルに関するもの、及び分析されるべき未知のサンプルに関するもの両方の同じ検出系を有すること、抗体の種特異性により付与される感度の観点での差を防ぐこと、その結果としてヒト起源並びにマウス起源、ラット又は他の種のサンプルで使用可能であるように、上記方法をより万能にさせることの更なる利点を伴う。実際に、ＨＲＰコンジュゲート型プロテインＡは、ヒト及びマウスＩｇＧの両方に非常に特異的な様式で結合し、２つの異なる二次抗体を有するという問題（その結果として、種々の感度及び種特異性を生じる可能性があり、したがって標準曲線からの未知のサンプル濃度の外挿中に、より信頼性に乏しい結果をもたらす）を防ぐ。更に、プロテインＡ−ＨＲＰの選択は、シグナルを検出する工程ＩＶ）で、蛍光放出性基質を使用することを可能する（その結果として、必要となる場合には、例えば、ＨＲＰシグナルを増幅する赤外Ａｍｐｌｅｘ技術を利用することによって、吸光度放出性基質と比較してより高感度で）。
【００５４】
本発明はまた、ＣＳＦサンプル中の抗ベータアミロイドタンパク質抗体の定量化に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法に関する。
【００５５】
ＣＳＦ中のこれらの抗体の定量化を可能にする方法は、文献では知られておらず、かかる定量化は明らかに、診断及び予後の結果の両方に根本的に関連され、並びにアルツハイマー病及びＣＡＡの処置に関する治療経過をモニタリングするためのものである。
【００５６】
本発明の目的はまた、ＣＳＦサンプル中の抗ベータアミロイドタンパク質抗体の定量化に関する高感度のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、
ａ）上記サンプルの上記自己抗体の量を、上記自己抗体を結合することが可能な高分子でコーティングした磁気マイクロビーズを用いて濃縮する工程、
ｂ）工程ａ）で得られた濃縮サンプルを、免疫酵素アッセイにより、又はラジオイムノアッセイにより分析する工程、
ｃ）工程ｂ）で使用するのと同じアッセイを用いて、既知の力価を有する抗ベータアミロイドタンパク質抗体を含むサンプルを分析して、関連較正曲線を作成する工程
を含む上記方法である。
【００５７】
工程ａ）及びｂ）は、上述の実施形態のいずれか１つに従って実施することができる。
【００５８】
本発明の方法によれば、工程ｃ）では、ベータアミロイドタンパク質のいずれか１つの部分を選択的に結合することが可能な、既知の力価を有する抗体は、従来技術に従って較正曲線を作成するために工程ｂ）で使用するのと同じ手順に従って分析される。
【００５９】
例えば、既知の力価を有する抗体のより濃縮された溶液から開始して、逐次希釈に関連した較正曲線の様々な点を準備することができる。上記抗体は、既知の力価を有し、及びベータアミロイドタンパク質に特異的な、その結果としてベータアミロイドタンパク質の特異的なエピトープに対して誘導されるいずれか１つのモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、免疫学的に活性な抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、ｓｃＦｖ）であり得る。
【００６０】
ある実施形態では、上記抗体又はそのフラグメントは、ベータアミロイドタンパク質のＮ−末端又は中心領域（アミノ酸配列１〜２８の内部のような）に含まれるエピトープに対して誘導させることができ、例えばそれは、そのアミノ酸配列に相当するか、又はアミノ酸１〜５、１〜１６、１７〜２４、１３〜２８に含まれるエピトープを認識することができる。また、Ｃ末端領域（例えば、アミノ酸３３〜４２又は３３〜４０に含まれる配列）も認識を受けることができる。較正曲線の作成に使用することができる市販の抗体の例は、４Ｇ８、６Ｅ１０、Ｇ２−１１、３Ｄ６、ｍ２６６、ソラネズマブ、ポネズマブ、バピネオズマブ、ガンテネルマブ、ＢＡＮ２４０１、ＢＩＩＢ０３７、静脈内投与される免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）（例えば、ガンマガード、オクタガム、ニューガム）である。
【００６１】
本発明の実現に関して、既知の力価を有する抗体は、任意の種に属する抗体、例えば、ＩｇＧ２ａ又はＩｇＧｂ２クラスに属するマウス抗体、ＩｇＧクラスに属するヒト抗体又はヒト化抗体であり得る。ある実施形態では、このヒト又はヒト化抗体は、クラスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＯｇＧ１のうちの１つに属することができる。較正曲線の作成のためのこれらのクラスに属する抗体の使用は、プロテインＡ／ＧがそれらのＦｃ領域に関してより大きな親和性を有するため、二次抗体としてプロテインＡ又はプロテインＧを利用する場合には特に興味深いことがわかっている。
【００６２】
続いて、既知の濃度の抗体を用いて作成された較正曲線を使用して、未知の力価を有するサンプル中の抗体濃度抗体を決定することができる。例えば、種々の濃度で既知の力価を有するサンプルを用いて得られる吸光度又は蛍光シグナルの読取りにより、当業者に既知の従来方法に従って分析される未知の力価のＣＳＦサンプル中の抗体の濃度を外挿するための回帰曲線を作成することが可能となる。
【００６３】
したがって、ある実施形態では、本発明は、アルツハイマー病を患う患者における能動又は受動免疫療法に対する応答をモニタリングするｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法を提供することができる。
【００６４】
アルツハイマー病の処置に関する戦略の１つは、この疾患を患う患者の能動及び／又は受動免疫である。能動免疫は、患者へのＡベータペプチド（又はその類縁体）の投与を想定するのに対して、受動免疫は、ベータアミロイドタンパク質に対するヒト化抗体の投与を想定している。このタイプの療法で得られる治療上の効果をモニタリングすることが可能であるためには、処置前、処置後及び処置中のＣＳＦ中の自己抗体の量を、極めて正確及び精密に計量することが必要であり得る。
【００６５】
臨床研究では、ＣＳＦ中の自己抗体計量は、臨床試験に対する候補物として適切な対象の選択に極めて有用であることが判明し、入院時のより良好な分類、及び試験中の患者自体のより良好なモニタリングを可能にし得る。予め及び／又は治療上の方法を適用している間にかかる抗体を計量し得ることにより、脳レベル（ＣＳＦ中で）それらの薬理学的効果をモニタリングすることが可能となるだけでなく、治療戦略のモニタリングの改善に関する有用な情報を、かかるモニタリングから引き出すことも可能であり、より良好な処置カスタマイゼーション及び安全性を可能にする。かかるカスタマイゼーションは、例えば、ＣＳＦ中の抗体濃縮の経過に応じて、治療上の免疫処置の治療投与量を変更することにより実施され得る（今日までのメカニズムは、治療効果に関与するとみなしたが、ＡＲＩＡのような有害な影響の考え得る出現にも関与するとみなした）。
【００６６】
ＣＳＦ中の抗ベータアミロイドタンパク質抗体の検出及び計量は確かに、アルツハイマー病に対する処置の考え得る有効性をモニタリングして、それらの治療上の安全性を増加させる第１の基礎工程である。
【００６７】
したがって、本発明は、患者からのＣＳＦサンプルから、アルツハイマー病の能動及び／又は受動免疫処置の、及び一般に例えばＡベータ生産に関与するセクレターゼの阻害剤のような全てのＡベータ−ＤＭＴの、又はタウタンパク質に対して取り組まれる療法のモニタリングに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、上述の工程を含む上記方法を提供する。
【００６８】
したがって、本発明によるアルツハイマー病の能動及び／又は受動免疫処置のモニタリングに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法は、例えば上記処置の種々の時点で収集される複数のＣＳＦサンプルに関して実施される本明細書中に記載されるような発明の定量的方法の工程（その実施形態のいずれか１つに従う）を実施することを含む。例えば、サンプルは、免疫処置前、免疫処置中（ｎ回）及び／又は免疫処置後に収集することができ、各サンプルに関して本発明の定量的方法により得られる定量化データは、互いと比較することができ、このようにしてＣＳＦ中のベータアミロイドタンパク質に対する抗体の濃縮に際して経過を構築する。
【００６９】
本発明の定量的方法はまた、脳アミロイド血管障害（ＣＡＡ及びＣＡＡ−ｒｉの両方）の診断に関する方法として、同様に例えばそれらのステロイド処置の有効性を評価するための、これらの病理学における治療経過のモニタリング用の有効なツールとしても利用することができる。
【００７０】
脳アミロイド血管障害関連炎症（ＣＣＡ−ｒｉ）は、特に脳血管Ａベータ堆積の観点で、アルツハイマー疾患と多くの側面を共有する稀な病理学である。ＣＡＡ−ｒｉを患う患者において、Ａベータに対する自己免疫現象が、Ａベータに対する抗体のレベルの考え得る急性上昇、場合によっては致死的上昇を伴って検出され得ることが実証されている（Ｄｉ  Ｆｒａｎｃｅｓｃｏら、２０１１年）。したがって、本発明の方法は、これらの対象において、ＲＭＮと関連して病理学を診断するのに極めて有用であり、それにより脳バイオプシーのような高侵襲性介入を回避する。
【００７１】
本発明の更なる目的は、患者のＣＳＦサンプルからの脳アミロイド血管障害関連炎症（ＣＡＡ−ｒｉ）の診断又は治療上のモニタリングに関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、上述の実施形態のいずれか１つの工程を含む上記方法である。
【００７２】
診断の方法は、決定された濃度値を標準参照値（例えば、健常な個体の有意な組から得られる）と比較する工程を提供することができ、この域値を超えると、疾患が存在することを示している。
【００７３】
抗Ａβ抗体の標準参照値又は閾（カットオフ）値は、例えば、健常な個体及びＣＡＡ−ｒｉを患う個体からのサンプルの（統計学的に有意な）組の濃度を作成することにより得られるＲＯＣ（受信者動作特性）曲線により決定することができる。上記作成により、例えば、３０〜４０ｎｇ／ｍＬの範囲、例えば３２、３３、３４、２２、３５ｎｇ／ｍＬのような域値が決定された。
【００７４】
更に、抗ベータアミロイドタンパク質（例えば、ヒト化抗体バピネオズマブのような）によるアルツハイマー病の処置に関する臨床試験は、臨床研究で登録された対象の数名が、治療薬の投与後に血管原性浮腫（ＶＥ）を発症したことを強調した。したがって、ＶＥは非常に重症の副作用であるように思われ、高用量の抗体で処置し、ＡＰＯＥ−４対立遺伝子キャリアである対象ではより一般的に発生し、それが治療上のプロトコル中止及び再検査を招いた。抗Ａベータ抗体投与と、ＶＥとの間の病原性関連を説明するための仮説の１つは、ＣＡＡ−ｒｉに関して同様に記載されるものに類似し得るメカニズムに従って、脳血管Ａベータ堆積に対する、特に脳血管損傷に対する傾向を有する患者における異例の免疫応答であるようである。
【００７５】
したがって、本発明は、アルツハイマー病の能動及び／又は受動免疫処置をモニタリングする方法であって、上述するようにＣＳＦ中の抗ベータアミロイド抗体の測定及び定量的比較の工程を含み、ＣＳＦ中のＴＦＰＩもまた測定される上記方法を提供する。
【００７６】
上記に類似して、本発明は、ＣＡＡ及びＣＡＡ−ｒｉの診断に対する助長の、及びＣＡＡ及びＣＡＡ−ｒｉの処置のモニタリングのための方法であって、上述するようにＣＳＦ中の抗ベータアミロイド抗体の測定及び定量的比較の工程、並びにＣＳＦ中のＴＦＰＩも測定される類似工程を含む上記方法を提供する。ＴＦＰＩタンパク質は実際に、モニタリングされる患者のＣＳＦ中の経時的な増加が、アルツハイマーに対する療法中のＶＥリスクの増加を示し得る内皮損傷マーカーである。したがって、かかる増加の存在は、上述する極めて危険な副作用に関する警告灯であり得る。
【００７７】
ＣＡＡ及びＣＡＡ−ｒｉの診断方法はまた、ＴＦＰＩの決定された濃度値が標準参照値と比較される工程を提供することができ、この域値を超えると、疾患が存在することを示す。また、ＴＦＰＩの域（カットオフ）値は、例えば、健常な個体及びＣＡＡ−ｒｉを患う個体からのサンプルの（統計学的に有意な）組の濃度を作成することにより得られるＲＯＣ（受信者動作特性）曲線により決定することができる。上記作成により、例えば、０．７０〜０．９０ｎｇ／ｍＬの範囲、例えば０．７５、０．８０、０．８２、０．８５ｎｇ／ｍＬのような域値が決定された。
【００７８】
本発明の定量的方法はまた、放射線学的異常（ＡＲＩＡ）の診断又は出現のモニタリングに関する方法として利用することができる。図１５及び実験の部で示されるように、患者のＣＳＦ中のベータアミロイドタンパク質に対する自己抗体の濃度が、ＡＲＩＡと一般的に称されるＡＤ及びＣＡＡ−ｒｉに関連した放射線学的異常の発達に関連することを今回発見した。決定された濃度値を標準参照値（例えば、健常な個体の有意な組から得られる）と比較する工程を提供することができ、この域値を超えると、放射線学的異常（ＡＲＩＡ）が発症していることを示している。特に、上記方法は、より大きなＡベータ堆積を有する人々のような高危険性対象、又はＡｐｏＥイプシロン４遺伝子型キャリアにおいて、又は更には他の危険性要因（例えば、生体内皮損傷マーカーＴＦＰＩの濃度の増加）を伴う患者において使用することができる。アルツハイマーのような他の病理学におけるＣＡＡ−ｒｉ及びＡＲＩＡの診断の方法の実施形態では、抗Ａβ抗体及びＴＦＰＩの両方の濃度が決定されて、上述するように域値と比較される。この実施形態では、両方のパラメータをモニタリングすることにより、ＲＯＣ分析による診断予測及びカットオフの決定により実証されるように、１００％感度及び診断特異性を得ることができた。
【００７９】
ＣＳＦ中のＴＦＰＩ計量は、下記工程を含む免疫酵素アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡサンドイッチのような）により実施することができる：
【００８０】
Ｉ）ヒトＴＦＰＩに特異的な抗体でコーティングした固相を準備する工程
上記固相は、ヒトＴＦＰＩの配列全体、代替的配列、切断配列又は一部を認識する抗体でコーティングした免疫酵素アッセイ又はイムノアッセイで従来使用される固相であり得る。
【００８１】
免疫後、背景ノイズを回避するために、固相は、１％ウシアルブミン、５％血清及び０．０５％ツイーンを有するリン酸緩衝溶液（ｐＨ７．４）を用いた処理のような、同様に従来の方法により適正にブロックされる。
【００８２】
ブロッキング溶液のインキュベーション時間は、当業者により容易に特定可能であり、例えば、約３０、４０、５０、６０、９０分であり得る。未結合の材料を除去するために、固相は、適切な従来の洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ツイーンのような）で一度又は複数すすぐことができる。
【００８３】
ＩＩ）上記固相を、分析されるべきＣＳＦサンプルとともにインキュベートする工程
インキュベーション時間は、当業者により容易に特定可能であり、例えば、約３０、４０、５０、６０、９０分であり得る。未結合の材料を除去するために、固相は、適切な従来の洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％ツイーンのような）で一度又は複数すすぐことができる。
【００８４】
ＩＩＩ）工程ＩＩ）で得られた固相を、ヒト抗体を結合することが可能な、酵素又は放射性標識にコンジュゲートさせたタンパク質とともにインキュベートして、続いてすすいで、上記未結合のコンジュゲート型タンパク質を除去する工程
ＥＬＩＳＡアッセイが、本発明に従って実施された場合、タンパク質は、例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼに（ＡＬＰ）又はベータガラクトシダーゼのような酵素にコンジュゲートされ得る。
【００８５】
ＩＶ）上記コンジュゲート型タンパク質のシグナルを検出する工程
免疫酵素アッセイの場合、過剰の未結合のコンジュゲート型タンパク質を除去するための洗浄後に、続いて標準的な技法に従って定量化することができるシグナルの発生を可能にするために、タンパク質にコンジュゲートされた酵素に基づく従来の手順に従って選択される適切な基質の溶液をウェルに添加する。シグナルは、例えば、酵素のタイプ及び使用される関連基質に応じて、適切なツールによる吸光度又は蛍光読取りにより定量化することができる。シグナル強度は、分析されるべきサンプル中に存在する抗体の量に比例する。
【００８６】
ラジオイムノアッセイでは、遠心分離及び上清沈降後に、又は固相に付着している抗体を用いたＲＩＡ若しくはＩＲＭＡアッセイの場合での洗浄の工程後に、沈殿物の放射能を、ガンマカウンターによって計数する。放射能強度は、患者から得られるサンプル中に存在する特異的な抗体の濃度に比例する。続いて、抗体濃度は、較正曲線によって定量的に測定することができる。
【００８７】
ある実施形態では、本発明の方法は、ＣＳＦサンプル中に存在するタンパク質ＴＦＰＩに対する抗体及び抗ベータアミロイドタンパク質抗体の同時定量化を提供する（ＣＯ−ＥＬＩＳＡアッセイ）。
【００８８】
この実施形態では、固相は、ベータアミロイドタンパク質、及びＴＦＰＩタンパク質に対して誘導される抗体の両方でコーティングされ、工程ｉｉｉ）で利用されるコンジュゲート型タンパク質は、ベータアミロイドタンパク質を結合するＩｇ、及びＴＦＰＩの同時読取りを可能にするように種々の波長を保有すべきである。
【００８９】
本発明の目的はまた、抗ベータアミロイドタンパク質の抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの検出のためのキットであって、上記抗体を結合することが可能な高分子でコーティングした磁気マイクロビーズ、ベータアミロイドタンパク質に対して既知の力価を有する抗体の１つ又は複数のアリコートを含む上記キットである。
【００９０】
初めて、ＣＳＦサンプル中の抗ベータアミロイドタンパク質抗体を、精密及び超高感度な様式で検出するのに利用することができる有益なツールが提供される。
【００９１】
本説明の最後まで、例えば上記で例示されるもののようなベータアミロイドタンパク質を特異的に結合することが可能な任意の抗体が、ここで特許請求されるキット中に含まれ得る。
【００９２】
キットは、
−ベータアミロイドタンパク質でコーティングした１つ又は複数の固相支持体、例えば、ウェルがベータアミロイドタンパク質でコーティングされているＥＬＩＳＡアッセイ用の１つ又は複数のマイクロプレート、
−洗浄緩衝液、ブロッキング溶液、曲線の構築用の標準物質、任意の陽性対照及び陰性対照のような免疫酵素アッセイのための試薬の１つ又は複数のアリコート、
−ヒト抗体及び／又はキット中に含有される既知の力価を有する抗体を特異的に結合することが可能な、酵素にコンジュゲートされたタンパク質の１つ又は複数のアリコート
を更に含むことができる。
【００９３】
酵素にコンジュゲートされた上記タンパク質は、プロテインＡ−Ｈｒｐ、プロテインＧ−Ｈｒｐ、ヒト、マウス、ラット免疫グロブリン又は任意の他の種の免疫グロブリンの定常部を特異的に認識することが可能な二次抗体−Ｈｒｐ（又は、同じ蛍光性又は発光性タンパク質）であり得る。
【００９４】
ある実施形態では、キットは、例えば、
−ＴＦＰＩに特異的な、好ましくはモノクローナル抗体でコーティングした１つ又は複数の固相支持体、例えば、ウェルが上記抗体でコーティングされているＥＬＩＳＡアッセイ用の１つ又は複数のマイクロプレート、
−洗浄緩衝液、ブロッキング溶液、曲線の構築用の標準物質、任意の陽性対照及び陰性対照のような免疫酵素アッセイのための試薬の１つ又は複数のアリコート、
−ＴＦＰＩ及び／又はキット中に含まれる既知の力価を有する標準物質を特異的に認識することが可能な、蛍光性又は発光性のいずれかである酵素にコンジュゲートされたタンパク質若しくは二次抗体の１つ又は複数のアリコート
のようなＴＦＰＩタンパク質の免疫酵素計量のための手段を更に含むことができる。
【００９５】
酵素にコンジュゲートされた上記タンパク質は、ＨｒｐにコンジュゲートされたＴＦＰＩを認識する抗体であり得る。
【００９６】
ある実施形態では、ＣＳＦサンプル中に存在するタンパク質ＴＦＰＩに対する抗体及び抗ベータアミロイドタンパク質抗体の同時定量化のためのキットは、
−ベータアミロイドタンパク質及びＴＦＰＩに特異的なモノクローナル抗体の両方でコーティングした１つ又は複数の固相支持体、例えば、ウェルがベータアミロイドタンパク質、又はＴＦＰＩに関して上述した抗体でコーティングされているＥＬＩＳＡアッセイ用の１つ又は複数のマイクロプレート、
−洗浄緩衝液、ブロッキング溶液、曲線の構築用の標準物質、任意の陽性対照及び陰性対照のような免疫酵素アッセイのための試薬の１つ又は複数のアリコート、
−ヒトＩｇ及び／又はキット中に含まれる既知の力価を有する抗体を特異的に結合することが可能な、酵素にコンジュゲートされたタンパク質の１つ又は複数のアリコート
を含む。
【００９７】
キットのこの実施形態は、診断を容易にするために特異的な酵素の濃度を評価することを可能にするだけでなく、ＴＦＰＩのような炎症性及び内皮損傷パラメータの初期モニタリングも可能にし、それにより、
１．治療上の追跡をモニタリングするために、
２．合併症の兆候（時には、致死的でさえ）に先立って、関連の有害な現象に対して予防的に介入するために、
３．任意に、薬理学的処置の投与を中断するために、
４．非常に特異的な場合、例えばＣＡＡ−ｒｉでは、場合によっては脳バイオプシーによる研究を回避するために、
患者においてカスタマイズされた治療上の介入を可能にする。
【００９８】
この説明で報告してきたことをより良好に説明することを目的とした実験及び実施例を、以下で報告する。かかる実施例はいかなる場合でも、この説明及び続く特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００９９】
本発明はまた、アルツハイマー病に関する療法及び／又はモニタリングの方法に関し、処置されるべき患者（単数又は複数）からの脳脊髄液のサンプル中の及び／又は本説明に従う処置における抗ベータアミロイドタンパク質抗体の定量化の１つ又は複数の工程を提供し、上記方法は、上記サンプルそれぞれに関して、１つ又は複数の内皮損傷マーカー（例えば、ＴＦＰＩのような）の濃度が、本明細書中に記載されるＣＳＦに適用される標準的な方法に従って決定される１つ又は複数の工程を任意に含む。
【０１００】
脳脊髄液のサンプル中の抗ベータタンパク質抗体及び１つ又は複数の内皮損傷マーカー（例えば、ＴＦＰＩのような）の定量化の方法に関連して上述したものは全て、本発明の療法及び／又は（予後）モニタリングの方法に当てはまる。
【実施例】
【０１０１】
（例１）磁気マイクロビーズを用いて濃縮するための手順
１）ＰＢＳ（ｐＨ７．４＋０．０２％ツイーン）で二度、分析されるべき各サンプルに関してプロテインＡにコンジュゲートされた磁気マイクロビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｌ  ＡＳ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）プロテインＧ）７５μｌを洗浄する。
【０１０２】
２）洗浄した磁気マイクロビーズへ、患者からのＣＳＦ  ２００〜５００μｌを含むサンプル容量を添加して、攪拌下で室温で４０分間インキュベートする。
【０１０３】
３）マグネット中に磁気マイクロビーズを２分間置いて、別の試験チューブ中に上清を任意に保管する（それは、プロセス効率に関する対照として機能を果たす）。
【０１０４】
４）マグネットを除去して、クエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５＋０．０２％ツイーン）５００μｌで洗浄して、二度繰り返す。
【０１０５】
５）続いて、ｐＨ３．１の０．１Ｍクエン酸３０μｌを、磁気マイクロビーズに添加することにより、溶出期に移る。
【０１０６】
６）２分間攪拌する。
【０１０７】
７）マグネット中にチューブを１分間置いて、１Ｍトリス塩基（ｐＨ９）（緩衝溶液）４０μｌを含有する透明な試験チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆポリプロピレン低親和性チューブ）中に上清を即座に移す。
【０１０８】
８）工程５）、６）を繰り返して、７）で使用したのと同じ試験チューブへ溶出物を添加する（総容量：１００μｌ）。
【０１０９】
９）溶出物１００μｌ全てをＥＬＩＳＡに使用する。
【０１１０】
（例２）Ａベータ４２タンパク質によるマイクロプレートのコーティング
１）濃度１μｇ／μｌになるように、Ａベータ４２タンパク質を１Ｍトリス塩基緩衝液（ｐＨ９）中に溶解させる。
【０１１１】
２）濃度０．０１μｇ／μｌになるように、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．６）中でＡベータのコーティング溶液を調製する。
【０１１２】
３）氷上で１分間超音波処理して、１分間待機して、再び１分間超音波処理する。
【０１１３】
４）ＥＬＩＳＡプレートウェル１つ当たりコーティング溶液１００μｌを添加する（最終濃度：１μｇ／μｌ）。
【０１１４】
５）一晩インキュベートする。
【０１１５】
（例３）免疫酵素的計量
１）例２で記載するように実施したコーティングの翌日に、ＰＢＳ＋０．０５％ツイーン（ＰＢＳＴ）２００μｌ／ウェルによる３回の洗浄を実施する。
【０１１６】
２）非特異的（ａｓｐｅｃｉｆｉｃ）結合を排除するために、ＰＢＳＴ中に５％血清及び１％ＢＳＡを含む溶液を使用することにより、振動下で室温で１．５時間、ブロッキングを実施する。
【０１１７】
３）１）で記載する洗浄工程を繰り返す。
【０１１８】
４）一次抗体４Ｇ８（Ａベータタンパク質のアミノ酸部分１７〜２４に対して誘導される）を含有する溶液１００μｌを添加して、標準曲線を作る。標準物質は、一次抗体の逐次希釈により実施される。ＣＳＦ中の抗体計量に関する標準曲線に提唱される範囲は、０．２４〜０．０３μｇ／ｍｌである。ブランクとして使用されるべきウェル中には、ＰＢＳ  １００μｌのみを添加する。更に、０．１Ｍクエン酸塩（ｐＨ３．１）６０μｌ＋１Ｍトリス塩基（ｐＨ９）４０μｌを含む溶出物に関する更なるブランクが供給される。
【０１１９】
５）実施例１で濃縮されるようなＣＳＦサンプル１００μｌをウェルへ添加する。攪拌下で４℃で一晩放置する。
【０１２０】
６）１）で記載される洗浄工程を繰り返す。
【０１２１】
７）０．２μｇ／ｍＬの濃度でプロテインＡ−ＨＲＰを含有する溶液１００μｌを添加する。攪拌下で室温で２時間放置する。
【０１２２】
８）１）で記載される洗浄工程を繰り返す。
【０１２３】
９）ウェル１つ当たりＴＭＢ１００μｌを添加する。暗所で室温で約５〜１０分間、インキュベートする。
【０１２４】
１０）ウェル１つ当たり、酸性ｐＨを有する溶液（例えば、０．５Ｎ  ＨＣｌ）１００μｌを添加する。
【０１２５】
１１）４５０ｎｍで各ウェルの吸光度を読取り、続いてブランク（標準物質も未知のサンプルも添加されなかったウェル）の値を差し引く。標準曲線からの未知のサンプルの外挿後に、初期希釈及び／又は濃縮計数に応じて値を調節する。
【０１２６】
（例４）ＥＬＩＳＡ標準物質及び試薬の調製
Ａベータタンパク質（Ａベータ４０若しくはＡベータ４２、又はそれらの各々異なるオリゴマー形態）を含む抗原を、ＥＬＩＳＡマイクロプレートのウェルの底部上に吸着（コーティング）させる。第１のインキュベーション中に、既知の濃度のマウス起源の抗Ａベータ抗体を含む標準物質、対照及び分析されるべき未知のＣＳＦサンプルを、Ａベータを有するウェル中に分配させて、一晩インキュベートさせる。
【０１２７】
続いて、ＰＢＳ緩衝液による洗浄後に、第１のインキュベーション中に特異的に結合した抗体に関する検出因子として機能を果たすＨＲＰにコンジュゲートされたプロテインＡ（ｐｒｏｔＡ−ＨＲＰ）を添加する。
【０１２８】
過剰の未結合のプロテインＡ−ＨＲＰを除去するための洗浄後に、続く吸光度読取りにより、又は場合によっては蛍光読取りにより定量化される染色の発色を可能にするために、基質溶液をウェルへ添加する。実際に、この染色された生成物の強度は、元のサンプル中に存在する抗Ａベータ抗体の濃度に正比例し、既知の濃度で標準較正曲線から外挿される。
【０１２９】
（例５）比較試験
本発明者らは、本発明の方法の実施形態と比較して、Ｄｏｄｅｌら（２００１年）若しくはＣｏｎｔｉら（２０１０年）の刊行物における一次抗体としてクローンＧ２−１１、又はクローン３Ｄ６を使用する公開されているＥＬＩＳＡの血漿計量に関する種々の感度を試験した。
【０１３０】
具体的に、どれが本発明者らのＥＬＩＳＡ方法に結び付けるのに最良であり得るかを特定するために、クローンＧ２−１１、６Ｅ１０及び４Ｇ８の抗体を一次抗体として試験した。
【０１３１】
既知の濃度（０．２５μｇ／ｍＬ）の抗Ａベータ４Ｇ８抗体を有する溶液を試験することにより、本発明者らの新たなＥＬＩＳＡが、曲線の最高点に関する吸光度の観点で、例えば従来公開されているクローンＧ２−１１の使用と比較して、３．５倍感度が高いことが判明した（１．４６９対０．４２６）（図３を参照）。
【０１３２】
クローン４Ｇ８が最良の結果をもたらし、とりわけ新規検出系（プロテインＡ−ＨＲＰ）と結び付けた場合に最良であることが判明した。
【０１３３】
例として、図３では、本発明の方法の実施形態（ＨＲＰにコンジュゲートされたプロテインＡを使用することにより、右側の欄）と比較して、旧式ＥＬＩＳＡ（即ち、抗ヤギＩｇＧ（抗ヒトＩｇＧ（全分子）ペルオキシダーゼ抗体  ＳＩＧＭＡ＃Ａ８６６７）を用いた検出系を使用することにより）（左側の欄）を用いて、既知濃度の抗体を有する同じサンプルを計量することにより得られる吸光度（ＯＤ）に関する結果を示す表が報告されている。
【０１３４】
図４Ａ及び図４Ｂは、低濃度の抗体を有するサンプルの検出における標準曲線の種々の感度を示す。実際に、本発明者らに記載されるようなマイクロビーズを用いて濃縮することの適切な処置後のＡＤ患者、ＣＡＡ−ｒｉ患者及び対照から得られるＣＳＦの３個の異なるサンプルの計量は、背景技術で記載される方法を使用することにより総合的に有効でないことが判明したのに対して、本発明者らの新規ＥＬＩＳＡ方法（４Ｇ８＋ｐｒｏｔＡ−ＨＲＰ）は、非常に感度が高く、及び有効であることが判明した。実際に、ＣＳＦ中の抗Ａベータ抗体の計量に関して「超高感度な」方法としての本発明者らの新規技法の有効性の証拠として、分析した３つのサンプル全てが、標準較正曲線の直線範囲内に完全に収まった。
【０１３５】
更に、図４Ｃは、典型的な較正曲線に関して、本明細書中に記載される新規ＥＬＩＳＡ方法が、ＣＳＦ中の抗Ａベータ抗体の計量に関して期待される検出範囲（０．１４〜０．００４μｇ／ｍＬの範囲）では、旧式ＥＬＩＳＡ方法と比較して、現に１０倍も感度が高いことを示す。
【０１３６】
実際に、本発明は、０．１８〜０．０３μｇ／ｍＬの曲線直線範囲において抗体濃度を検出することが可能な較正曲線を示すのに対して、抗体Ｇ２−１１を用いる背景技術で記載される旧式ＥＬＩＳＡ方法は、はるかに高い濃度でサンプルを定量化することが可能であることがわかり、したがってＣＳＦ中では有効ではない。
【０１３７】
吸光度の観点で、０．１３４μｇ／ｍＬの同等濃度では、背景技術で記載されるＥＬＩＳＡ方法で検出可能な０．１４２と比較して、本発明者らの新規ＥＬＩＳＡ方法で検出可能なＯＤ値は１．０７２であり、即ち約１０倍感度も高いことが推論され得るのに対して、０．１３４μｇ／ｍＬよりも低い標準物質全てに関しては、先の方法は、いかなる値もブランクと識別することが不可能であった。
【０１３８】
更に、本発明者らは、マトリックス効果により付与される本発明者らの考え得る干渉を試験及び除外した。実際に、未処理のＣＳＦ及びマイクロビーズを用いた濃縮後のＣＳＦは、Ａベータタンパク質が吸着されず、及びいずれにせよブランクに匹敵するＥＬＩＳＡウェルの吸光度と一致した吸光度値を戻した。
【０１３９】
同様に、ＡベータコーティングによるＨＲＰ−コンジュゲート型プロテインＡの干渉の欠如に関して試験して、確認した。更に、予めの富化段階は、背景低減の観点でも有用であることが判明し、低い値を「ブランク」として明らかに戻した（旧式ＥＬＩＳＡを用いた場合の１．１１と比較して、吸光度０．０７７）。次に、正常圧水頭症のような対照対象のＣＳＦ中の抗Ａベータ４２自己抗体を計量するのに不可欠な最小容量（ここで、抗体濃度は、生理学的に最も低い予測可能なもののうちの１つであるべきである）を試験した。対照における濃縮段階に利用されるＣＳＦ容量は、４００〜５００μｌであった。
【０１４０】
続いて、上記初期ＣＳＦ容量５００μｌを、プロテインＡとコンジュゲートされた磁気マイクロビーズ７５μｌで処理して、０．１Ｍクエン酸溶液（ｐＨ３．２）６０μｌで溶出させて（ＣＳＦ  Ｉｇ特異的富化の段階）、Ｉｇ自然状態を保存するために、緩衝溶液（１Ｍトリス塩基、ｐＨ９）４０μＬを即座に添加した。次に、得られた容量全体（１００μｌ）を、本発明者らが発明した超高感度ＥＬＩＳＡ計量に利用した。
【０１４１】
したがって、濃縮計数により調節された対照対象におけるＡベータタンパク質に対する自己抗体の平均濃度は、約１６ｎｇ／ｍｌであることがわかった。
【０１４２】
（例６）ある実施形態による方法の精度パラメータ及び回収試験
アッセイ内精度パラメータ、即ち、繰り返される読取りに関して匹敵する値を戻す同じマイクロプレート内部の可変性を、先の例１、例２及び例３で記載される手順の正確な再現によりアッセイした。
【０１４３】
アッセイ内精度（３人の対象に由来するＣＳＦの３つの異なるサンプルの三重での計量により得られる平均値）＝ＣＶ  ３．２７％。
【０１４４】
アッセイ間精度パラメータ、即ち異なる日数で実施した複数のアッセイ中の繰り返される読取りに関して匹敵する値を戻す方法可変性を、先の例１、例２及び例３で記載される手順の正確な再現によりアッセイした。
【０１４５】
アッセイ間精度（同じ患者に由来するＣＳＦの同じサンプルの、５つの異なるＥＬＩＳＡで７回繰り返した計量により得られる平均値）＝ＣＶ  ３．６９％。
【０１４６】
更に、磁気マイクロビーズを用いて濃縮する単独工程のアッセイ内精度は、連続した日数で実施した同じサンプルの３つの異なる富化を用いて試験し（即ち、実施例１で記載される手順の正確な再現により）、−２０℃で凍結させて、続いて実施例２）及び３）で記載する手順の正確な再現後に同じＥＬＩＳＡで計量した（＝ＣＶ  ２．３３％）。
【０１４７】
回収試験（例１）、２）及び３）で記載されるように全ての富化工程に付されるＣＳＦ  ５００μｌ中の０．１２５μｇ／ｍｌの抗体４Ｇ８の添加（スパイキング）により実施される）は、９８％であることがわかった。
【０１４８】
陰性対照として、例１）「磁気マイクロビーズを用いて濃縮するための手段」の３）で記載されるように得られる上清（廃棄）を試験した。その手順は、０に等しい濃度値、即ちブランクに等しい濃度値に毎度戻す実施した試験全て（２０回を超えて繰り返した試験）に関して１００％有効であることがわかった。
【０１４９】
最終的に、検査の特異性も、ＥＬＩＳＡプレートの幾つかのウェルを、標準較正曲線に利用されるのと同じ濃度で（ここでは、Ａベータ４２は、組換えＡベータ４２（Ａｎａｓｐｅｃｔ）、即ち、Ａベータ４２タンパク質を作り上げるのと同じアミノ酸を正確に含む）、しかし、オープンオーダーでは１Ｍトリス塩基緩衝液（ｐＨ９）中でコーティングすることにより試験した（上記を参照）。上述の試験により、Ａベータ４０及びＡベータ４２に対して本発明者らの方法の１００％特異性という証拠として、上記ウェルではシグナルは検出不可能であることが実証された。
【０１５０】
（例７）ＡＤ患者からのＣＳＦサンプル中のＴＦＰＩの免疫酵素アッセイによる測定
この特定の実施例では、ＴＦＰＩに特異的なマウス抗体でコーティングした９６ウェルプレートを含む免疫酵素アッセイＥＬＩＳＡ（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  Ｈｕｍａｎ  ＴＦＰＩ  ＥＬＩＳＡ−Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用した。例えばＴＦＰＩの種々の切断形態又はアイソフォームに特異的な種々のＥＬＩＳＡは、社内で構築され得る。具体的に、本キットは、ＴＦＰＩ計量に関しては市販されていない。したがって、その特異性及び感度（結果は示していない）を承認した後に、本発明者らは、製造業者により示されるプロトコルを修飾することにより下記の通りに進めた：
【０１５１】
１）供給される標準物質を、標準曲線を構築するのに供給される適切な希釈剤で希釈して（製造業者の指示に従って）、その後、その希釈剤は、未知の値のサンプルを外挿するのに役立つ。
【０１５２】
２）キット中に供給される希釈剤緩衝液１００μｌを各ウェル中へ添加した。
【０１５３】
３）１：２で希釈した標準物質又はサンプル（ＣＳＦ）５０μｌを即座に添加した。
【０１５４】
４）室温で２時間インキュベートした。
【０１５５】
５）洗浄緩衝液３００μｌを用いて、４回の洗浄を行い、ブロッティング紙上にプレートを逆さにして、毎度液体を完全に排除した。
【０１５６】
６）二次抗体（コンジュゲート、キット中に供給される）２００μｌを添加して、室温で１２０分間インキュベートした。
【０１５７】
７）洗浄緩衝液３００μｌを用いて、４回の洗浄を行い、ブロッティング紙上にプレートを逆さにして、毎度液体を完全に排除した。
【０１５８】
８）基質溶液（キット中に供給される基質溶液）２００μｌを添加して、暗所で室温で３０分間インキュベートした。
【０１５９】
９）停止溶液５０μｌを各ウェルへ添加した。色彩は青色から黄色になった。即座に、４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。続いて、サンプル吸光度に２（サンプルを希釈した係数）を乗じた。
【０１６０】
８  ＣＡＡ−ｒｉ発症における抗Ａβ自己抗体関与に関連した研究
８．１  材料及び方法  患者の登録
ＣＡＡ−ｒｉを患う１０人の患者（イタリア人７名、ブラジルから２ケース、日本から１名）に由来するＣＳＦサンプルを、国際共同研究を通じて募集した。文献中で既知の臨床的及び神経画像の特徴に基づいて（但し、抗Ａβ自己抗体のＣＳＦ濃度に関しては盲検で）、推定ＣＡＡ−ｒｉ診断を実施した。
【０１６１】
ＣＡＡ−ｒｉ患者は全て、神経錯乱、痙攣及び限局的神経障害を含む急性又は亜急性神経学的症状を示した。急性期中に評価される脳磁気共鳴は、血管原性浮腫（ＦＬＡＩＲシーケンス）及び大脳皮質全体にわたってより多く散在したマイクロビーズの存在（Ｔ２＊−ＧＲＥ）と一致した白質炎症の兆候を示した。更に、ケース５及び６はまた、脳血管周囲のＡβ堆積及び神経炎症の兆候を示す定位脳バイオプシーにより確認された。ＡＰＯＥ遺伝子型分析は、各募集センターで採用される標準的な手順に従って、全ての対象に対して実施した。
【０１６２】
ＣＡＡ−ｒｉ患者からのＣＳＦサンプルは、疾患の急性期中に収集され（ａｐＣＡＡ−ｒｉ）、即座に−２０℃で保管した。７人の患者からのＣＳＦアリコートを、ステロイド処置後にも収集した（ｒｐＣＡＡ−ｒｉ）のに対して、ケース６及び８に関しては、ＣＳＦサンプルは、症状の自然寛解後にも、したがって任意の薬理学的処置の非存在下で収集した。
【０１６３】
脳アミロイド血管障害の存在に関するが、神経炎症の兆候を伴わない対照対象として、本発明者らは、非炎症性ＣＡＡ（ボストン基準、Ｋｎｕｄｓｅｎ  ２００１年に従って診断した）を患う８人の患者からＣＳＦを収集した。自己免疫及び炎症性であるが、ＣＡＡに相関される疾患の対照群として、本発明者らは、ＭｃＤｏｎａｌｄの基準に従って診断される陽性のオリゴクローナルバンド（ＯＣＢ＋）を伴う多発性硬化症（ＭＳ）を患う１４人の未処置の（ｎａｉｖｅ）患者を抱えた。非ＣＡＡ、非炎症性対照として、本発明者らは、１２人の正常圧水頭症対象、及び転換性障害を伴う１３人の患者に由来する２５個のＣＳＦを包含した。
【０１６４】
ＣＳＦ収集、並びにＡβ４０、Ａβ４２、タウ及びＰ−１８１タウ計量モード
ＣＳＦは全て、Ｌ４／Ｌ５又はＬ３／Ｌ４椎骨レベルでの腰部穿刺により収集して、ポリプロピレンチューブ中にそれぞれ０．５ｍＬアリコートへと分割して、分析時まで即座に−２０℃で保管した。ＣＳＦ中に存在する細胞、グルコース及び総タンパク質の計数を評価した。Ａβ４０、Ａβ４２、タウ及びＰ−１８１タウ濃度は、製造業者の指示書に従って、市販のＥＬＩＳＡキット（それぞれ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ及びＩｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）により評価した。
【０１６５】
抗Ａβ自己抗体計量
自己抗体計量に関して、本明細書中に記載する脳脊髄液のサンプル中の抗ベータアミロイドタンパク質抗体の定量化に関するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法が使用された。上記方法により、Ａβに対して自然に生産される抗体の濃度は、磁気ビーズを用いた前富化、続くＥＬＩＳＡ方法による抗体計量により評価した。ＥＬＩＳＡ技法の感度を増加させるために、総ＩｇＧ含有量を富化するように、磁気ビーズを用いた前処理により、サンプルを濃縮した。簡潔に述べると、ＣＳＦ約２００〜３００μｌを、プロテインＧとコンジュゲートさせた磁気ビーズ（ＤｙｎｅｂｅａｄｓプロテインＧ）とともに、連続攪拌下で室温（ｒ．ｔ．）で４０分間インキュベートして、０．１Ｍクエン酸塩（ｐＨ３．１）によるわずかな酸性化により溶出させた。磁気富化後に、本発明者らの新規ＥＬＩＳＡ方法により、溶出物を直接試験した。９６ウェルプレートのウェルは、５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）中に溶解させたＡβ４２（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ベルモント、ＣＡ、ＵＳＡ）（１ｐｇ／ウェル）で、４℃で一晩コーティングした。次に、プレートをＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０（ＰＢＳＴ）で洗浄して、ＰＢＳＴ中の５％ＦＣＳ、１％ＢＳＡで室温で９０分間ブロックして、再度洗浄した。標準曲線の生成のため、マウスで生産され、及びＡベータのＮ末端に関して選択的な抗ヒトＡβ４２抗体（クローン４Ｇ８、Ｃｏｖａｎｃｅ）を、逐次希釈により種々の濃度（０．４μｇ／ｍｌ〜０．０３μｇ／ｍＬ）で利用した。続いて、サンプル及び標準物質を負荷した後、ＥＬＩＳＡプレートを４℃で一晩インキュベートした。翌日、ウェルをＰＢＳＴで洗浄して、ＨＲＰコンジュゲート型プロテインＡ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）とともに、室温で２時間インキュベートした。次に、プレートをＴＢＳＴで再び洗浄して、暗所で１０分間ＴＭＢとともにインキュベートした。停止溶液の添加後に、４５０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレートリーダー（ＢＩＯＲＡＤ  Ｍｏｄｅｌ  ５５０）を使用することにより読み取った。自己抗体濃度は、標準曲線から外挿した。
【０１６６】
サンプルは全て、盲検で、診断を知る操作者なしで分析した。磁気ビーズによる富化のプロセスの品質管理として、ビーズによるＩｇＧの総欠乏を確認するために、上清（プロセス廃棄物）全てを試験した。ヒトＡβに対するＥＬＩＳＡ特異性は、ペプチド１μｇのコーティングにより、組換えＡβ１〜４２ペプチド（ＡＮＡＳＰＥＣ、フレモント、ＣＡ、ＵＳＡ）に対する交差反応性の排除により検証された。ＣＳＦマトリックス中の抗Ａβ抗体回収は、ＥＬＩＳＡの標準曲線を生成するために使用される種々濃度での種々の濃度の市販の抗体４Ｇ８のスパイキング試験により評価して、９８％回収率が得られた。アッセイ内精度は、変動計数（ＣＶ）３．３％であることが判明し、アッセイ間精度は、ＣＶ３．７％であることが判明した。
【０１６７】
統計学的分析
統計学的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ−Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ  ３．０、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．）を用いて実施した。群間の差を評価するために、一元配置分散分析検定を使用した後、テューキー多重比較検定を行うか、又は対応のないｔ検定を、正規性検定を通過したデータ群の分析に使用した。対応のあるｔ検定を使用して、臨床的寛解前及び後の抗体濃度における差を評価した。ｐ＜０．０５を有する値は有意であるとみなした。連続変数は、平均値±標準偏差（ＭＥＡＮ±ＳＤ）として表される。
【０１６８】
８．２  結果、患者の特徴及び病理組織学的分析
年齢は、異なる群の対象間で同等であることがわかった：健常な対照（５９．０歳±２０．０）、ＣＡＡ（５９．６歳±１１．４）、ＭＳ（５２．５歳±１２．２）、ＣＡＡ−ｒｉ（６８．５歳±５．６）。男性／女性の数は、健常な対照１２／１３、ＣＡＡ  ５／３、ＭＳ  １１／３、ＣＡＡ−ｒｉ  ３／７であることがわかった。
【０１６９】
ＣＡＡ−ｒｉ患者の社会人口的分析を表１に報告する一方で、全てのＣＡＡ−ｒｉ患者の臨床的特徴及び採用した薬理学的処置をこれ以降で報告する。
【０１７０】
ケース１：進行性行動障害及び認知症。メチルプレドニゾロン１ｇ／日で５日間処置。わずかな有益性を伴う。
【０１７１】
ケース２：進行性認識低下及び全身発作。メチルプレドニゾロン１ｇ／日で５日間、続いて１ｇ／週で７週間処置。緩やかな臨床的改善を伴う。
【０１７２】
ケース３：記憶の進行性喪失及び気分障害。デキサメタゾン２４ｍｇ／日で２０日間処置。これまでに記載されるように顕著な臨床的改善を伴う。
【０１７３】
ケース４：急速及び進行性左側不全麻痺及び見当識障害。デキサメタゾン２４ｍｇ／日で１ヶ月間処置、続いて肺炎の発症に起因して中断。その後、感染合併症により死亡。
【０１７４】
ケース５：部分的同側性発作を伴う進行性左側片側症候群。最初はメチルプレドニゾロン１ｇ／日で３日間、６回処置、続くメチルプレドニゾロンによる経口療法。これまでに記載されるように顕著な臨床的改善。
【０１７５】
ケース６：進行性認識低下及び精神錯乱。いかなる薬理学的処置も伴わない症状の自然寛解。
【０１７６】
ケース７：緩やかな一過性認識低下。いかなる薬理学的処置も伴わない症状の自然寛解。
【０１７７】
ケース８：一過性精神錯乱。いかなる薬理学的処置も伴わない症状の自然寛解。
【０１７８】
ケース９：一過性精神錯乱及び全身発作。プレドニゾン８０ｍｇ／日で１０日間処置。症状の寛解を伴う。
【０１７９】
ケース１０：進行性認識低下及びパーキンソン症。デキサメタゾン１２ｍｇ／日で１５日間処置、続いてもう２週間、漸減。いかなる有意な改善も伴わない。
【０１８０】
【表１】
2015514206.tif 000003
【０１８１】
ＡＰＯＥ、即ちアポリポタンパク質Ｅ；ａ．ｏ．、疾患発症時の年齢；ｒｐＣＡＡ−ｒｉ、寛解期の脳アミロイド血管障害を伴う患者。
【０１８２】
【表２】
2015514206.tif 000004
【０１８３】
病理組織学的分析
図６で報告するように、ＣＡＡ−ｒｉ診断は、２人の患者において免疫組織学的に確認された。免疫抑制剤で処置していない患者であるケース＃６に関して、脳血管周囲のＡβ堆積及びＣＡＡ−ｒｉに典型的な神経炎症の兆候の存在が確認された。ケース＃５は、Ｓａｋａｇｕｃｈｉら（２０１０年）で過去に報告されているように、バイオプシー分析におけるＣＡＡ−ｒｉの病理学的写真の存在がすでに確認されている。
【０１８４】
抗Ａβ自己抗体のＣＳＦ計量
図８ａで示されるように、急性期中のＣＡＡ−ｒｉを患う患者のＣＳＦ中の抗Ａβ自己抗体濃度（５２．８ｎｇ／ｍＬ±２１．９）は、健常な対照（１８．１ｎｇ／ｍＬ±５．７、ｐ＜０．０００１）、非炎症性ＣＡＡ対照（２４．０ｎｇ／ｍＬ±６．６、ｐ＜０．００２５）及びＭＳ患者（１９．７ｎｇ／ｍＬ±２．５、ｐ＜０．０００１）と比較して有意に増加することが判明した。更に、ＣＡＡ−ｒｉ患者の自己抗体の濃度は、病理学の寛解期後に正常な値（即ち、対照に匹敵する）に戻ることが判明した（１４．５ｎｇ／ｍＬ±８．８、ｐ＜０．０００６（ａｐＣＡＡ−ｒｉに対して））。対照群とＣＡＡ又はｒｐＣＡＡ−ｒｉとの間には、統計学的に有意な差は出現しなかった（図８ａ）。更に、ステロイド療法処置後、及び症状の自然寛解後（即ち、処置なしで）の両方で、抗体濃度の同じ低減が観察されたという事実は注目に値する。実際に、ケース１〜５は、（静脈内）ステロイド処置後に抗体低減を示したのに対して、ケース６及び８に関しては、抗体濃度の減少は自発的であることがわかった。図８ｂは、ケースごとに示されるＣＳＦ中の抗体の濃度の寛解前／後の減少の特定の傾向を示す。
【０１８５】
ステロイド処置中の抗Ａβ抗体の時間経過
脳バイオプシーにより診断が確認された患者＃５における抗Ａβ抗体の濃度の変化の時間経過をモニタリングした。図９で示されるように、抗体濃度は、疾患の急性期中の第１の計量と比較して、対照対象で検出可能な濃度レベルに到達するまで、ステロイドの各ＩＶ投与後に進行性低減を示した。各ＣＳＦ収集に対して状況から得られる本発明者らのＭＲＩ研究を同様に確認した場合に、抗体低減はまた、臨床像の並行的な改善に続く。
【０１８６】
Ａβ４０、Ａβ４２、タウ及びＰ−１８１タウの動向
ａｐＣＡＡ−ｒｉ及びｒｐＣＡＡ−ｒｉ患者におけるＡβ４０、Ａβ４２、タウ並びにＰ−１８１タウのＣＳＦプロフィールを比較した。ａｐＣＡＡ−ｒｉ群におけるＡβ４０及びＡβ４２濃度は、ｒｐＣＡＡ−ｒｉ群と比較して有意に高いことが判明し（それぞれ、２１０７．０ｐｇ／ｍＬ±４４６．４対１２０２．０ｐｇ／ｍＬ±６１８．３、ｐ＝０．００９、及び６４０．０ｐｇ／ｍＬ±３３８．３対２３４．５ｐｇ／ｍＬ±１６８．８、ｐ＝０．０１５）、健常な対照で検出可能なレベルに達し（それぞれ、１８６４．０ｐｇ／ｍＬ±６６９．２、ｐ＝０．０３２、及び７４７．０ｐｇ／ｍＬ±３４２．２、ｐ＝０．００２（ｒｐＣＡＡ−ｒｉに対して））、また文献中に存在するデータと合致した。ａｐＣＡＡ−ｒｉ患者におけるタウ（３３５．９ｐｇ／ｍＬ±３１２．７）は、図５ｂに示されるように、ｒｐＣＡＡ−ｒｉ（８５．２ｐｇ／ｍＬ±７０．０、ｐ＝０．００４１）及び健常な対照（１３１．４ｐｇ／ｍＬ±１１５．４、ｐ＝０．０１２）と比較して高いことがわかった。ａｐＣＡＡ−ｒｉ期中のＰ−１８１タウ（４７．０ｐｇ／ｍＬ±３０．５）は、ｒｐＣＡＡ−ｒｉ（２２．８ｐｇ／ｍＬ±７．６、ｐ＝０．００７）及び対照（２９．０ｐｇ／ｍＬ±１６．１、ｐ＝０．０４４）と比較して高いことがわかった。ａｐＣＡＡ−ｒｉ及びｒｐＣＡＡ−ｒｉ中のそれぞれ個々の患者に関するＡβ４０、Ａβ４２、タウ並びにＰ−１８１タウの濃度の動向を、図１０ａ、１０ｂ、１０ｃ及び１０ｄで報告する。
【０１８７】
抗Ａβ抗体の濃度と、それぞれＡβ４０及びＡβ４２のＣＳＦレベルとの間の相関関係
ａｐＣＡＡ−ｒｉにおける相関分析は、図１１で表されるように、抗体の濃度と、Ａβ４０（ｒ＝０．８５、ｐ＝０．００２）及びＡβ４２（ｒ＝０．６５、ｐ＝０．０４２）の循環形態との間で明白な相関を示した。
【０１８８】
アルツハイマー対象のＣＳＦ中の自己抗体の生理学的レベル
図１５で示されるように、アルツハイマー患者のＣＳＦ中に存在する抗Ａβ抗体のレベルを評価して、遺伝的危険因子ＡｐｏＥイプシロン４の患者キャリア（ＡＰＯＥ４キャリア）が、自発的に、及びＡベータ−ＤＭＴ投与後の両方で、ＡＲＩＡを発現するそれらのより大きな傾向を支持して、ＡＰＯＥ４非キャリア患者（２．８７４ｎｇ／ｍＬ±３．０６３、ｐ＜０．００１）と比較してより高い生理学的濃度の抗体を有する（１２．８４ｎｇ／ｍＬ±２１．２３）ことを観察した。
【０１８９】
８．３  考察
ＣＡＡ−ｒｉの原因病理論は依然として未知のままであるが、炎症プロセスを招くメカニズムは、ＣＮＳ中に存在するタンパク質Ａβに対する自己免疫反応に続発するようである。散発的な観察は、これらの観察が個々の臨床ケースのみで行われ、及び抗Ａβ抗体の濃度の計量は広い誤差の余地がある旧式の方法で実施されたにも関わらず、Ａβ堆積部位における特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の動員及びＣＳＦ中の抗Ａβ抗体の増加を伴って、この仮説を裏付ける傾向にある。
【０１９０】
近年、ＡＤにおいても、同様の推測が進んでいるが、この病理学でさえ、自己抗Ａβ抗体の計量は、乏しく及び相反する結果を招いており、まさにＣＳＦ中の抗体計量における技術的な実験の困難性により、主に血漿レベルに制限されている。現に、ＡＤ患者における抗Ａβ自己抗体の計量は、ある著者らに関しては低減されたことが判明しており、他者らに関しては変化がないことが判明し、更には別の研究では増加したことが判明している。上述するように、この相反する結果の主な問題は、上述の研究の設計及び力に関連した問題以外には、ヒトＣＳＦ中のこれらの抗体の非常に低濃度に起因した。
【０１９１】
抗体の濃度及び計量に関して本明細書中に記載される方法により、本発明者らは、１０人の患者を含むケース記録において、ＣＡＡ−ｒｉの過程でこれらの抗Ａβ抗体の直接的な関与を確認するのに初めて成功した。更に、抗体濃度が、臨床的及び放射線学的寛解期中に、「正常である」とみなすことができるレベル、即ち対照中に存在するレベルに匹敵するレベルに達するまで、健常な対照対象、ＭＳ対象及び非炎症性ＣＡＡを患う患者と比較して、疾病の急性期中に現に増加することを本発明者らは実証した。
【０１９２】
更に、ステロイド処置中に抗Ａβ抗体の時間経過を追跡することにより、疾患の急性期の決定における抗Ａβ抗体の濃度の上昇の特別な役割の更なる証拠として、本発明者らは、療法後だけでなく、自然寛解後にもその減少を実証した。この事象は薬理学的処置の非特異的な効果に続発されず、疾患進行に厳密に相関されることを、本発明者らが決定的に証明し得るように、このことは特に関連がある。この証拠は、ＯＣＢ＋ＭＳにより表される非ＣＡＡ相関自己免疫及び炎症性疾患を患う患者において抗Ａβ抗体の増加の非存在により更に支持される。
【０１９３】
全体として、本明細書に開示されるデータは、ＣＡＡ−ｒｉの病因は、抗Ａβ自己抗体により直接媒介されるＡβタンパク質に対する特異的な自己免疫プロセスにより引き起こされるという概念を強力に支持している。
【０１９４】
更に、同じ病原メカニズムは、バピネオズマブと称されるＡβに対して誘導されるモノクローナル抗体を用いた臨床試験で登録したＡＤ患者の約５〜１０％で見出すことができる可逆性血管原性浮腫（進行中に治療上のプロトコルの中断さえも伴う有害な影響）の決定において基本となり得る。したがって、ＡＲＩＡ−Ｅ（血管原性浮腫を示唆するアミロイド関連放射線学的（画像）異常）と称されるシーケンスを用いたＭＲＩ研究により得られる最近の証拠により、バピネオズマブで処置した患者の最大１７％が臨床的相関物の非存在下でさえ、並びに治療投与量及び血管危険因子ＡＰＯＥε４の存在に直接関係して、ＶＥの兆候を示すことが強調された。
【０１９５】
支持して、Ｓｃｈｒｏｅｔｅｒらは、ＰＤＡＰＰマウスにおける受動免疫が、微小出血の発生率と厳密に関連し、血管周囲レベルで限局的Ａβ堆積に限定されることを更に実証した。この現象がどのようにして、ＣＡＡの度合いに密接に関連し得るか、及び抗Ａβ抗体の用量の濃度により調節され得る（及び、調節可能である）ことが明らかのようである。このことは、「安全である」とみなすことができる値内でその濃度を維持することが可能な、投与される抗Ａβ抗体の濃度の適切な調節が、ＶＥ（ＡＲＩＡ）及び内皮損傷のような列挙した有害な影響を被ることなく、脳及び脳血管レベルでのＡβ堆積を排除し得るか、又は少なくとも遅延し得ることを、このことは意味し得る。
【０１９６】
更に、ＡＤ及びＣＡＡにより共有される病原的影響は、バピネオズマブを用いた臨床試験中のＡＤ患者のＣＮＳからのＡβタンパク質の実証されるクリアランスにより強調され、実質堆積形態及び／又は血管形態から循環形態までの、特に処置の第１期中及びアミロイド斑の完全消失前の大規模ドレナージ（ｄｒａｉｎａｇｅ）を示唆した。このことは、本発明者らが、ＣＡＡ−ｒｉを患う患者において観察したことと完璧に合致しており、そこでは、Ａβ４０及びＡβ４２の循環レベルが、健常な対照において検出可能なレベルに、及びａｐＣＡＡ−ｒｉ対象に匹敵することが判明した一方で、上記レベルは、更にＡＤ患者において一般的に検出可能な濃度に達するまで、疾患の寛解期中に有意に低減されるように戻る。同様に、軸索変性用のマーカー（タウ及びＰ−１８１タウ）は、抗Ａβ自己抗体の劇的な増加とともに、ＣＡＡ−ｒｉで増えることがわかり、続いてｒｐＣＡＡ−ｒｉでは健常な対照の範囲内に戻る。このことは、抗Ａβ抗体が、単にＣＡＡ−ｒｉの急性期中の主な関与物質（ａｃｔｏｒ）であるだけでなく、ＣＳＦ中のＡβ４０及びＡβ４２のレベルの増加は、かかる抗体が作用して、斑及び／又は血管からＡβを除去するメカニズムであるが、アミロイドタンパク質のレベルと抗体自体のレベルとの間で検出可能な強力な相関により更に支持されるメカニズムであるようであることを決定的に証明している。更に、ハプロタイプＡＰＯＥε４の患者キャリアの高い罹患率は、ＡＤに関してもこれまでに記載されているように、内皮損傷に対する傾向に対するこれらの患者のより大きな感受性を更に強化する。Ａβに対する受動免疫に関して進行中の臨床試験で向けられた高い期待を考慮して、考え得る最も安全及び最も有効な様式で臨床試験の有益な効果全てを保証するためには、ＣＡＡ及びＡＤにより共有される病原性メカニズムのより良好な理解が基本である。この状況で、ＣＡＡ−ｒｉは、バピネオズマブによる処置中にＶＥを示したＡＤ対象で検出可能な病態生理学的メカニズムの自発的ヒトモデルを表し得る。
【０１９７】
本発明者らのデータは、ＣＡＡ−ｒｉ中に現れる炎症反応に基づく病原性メカニズムの理解、開示、更にはアミロイド前駆物質タンパク質の異常プロセシング並びにＣＡＡ及びＡＤのようなＣＮＳ中のＡβ堆積に相関される全ての病理学の処置に対する興味深い視点への有意な工程を表す。続いて、ＣＳＦ中の抗Ａβ抗体の計量に関する本発明者らの新規方法から予測できる結果は、これらの病理学の基礎となる病原性メカニズムの研究に関しての、及び新たなアミロイド修飾療法の有効性をモニタリングするための次世代の及び到達可能なモデルの確証を導き得る。
【０１９８】
更に、本発明者らの考察を発端として、抗アミロイド抗体の計量（本発明者らが発明した技法に従って）と、関連ＭＲＩデータ（ＡＲＩＡ特定に適した配列を用いて）とを相関させ、またベータアミロイドタンパク質の堆積をＰＥＴと、例えば患者の脳におけるＣ１１ピッツバーグ化合物Ｂに対するＰＥＴデータと相関させる今後の研究を推測することが可能であり、それにより脳ベータアミロイドタンパク質の除去及び堆積に関するｉｎ  ｖｉｖｏでの有意な考察を直接得る。
【０１９９】
最終的に、ＣＡＡ−ｒｉの最終的な診断が依然として、脳バイオプシーのような高侵襲性及び危険な方法の使用を必要とするため、ＣＳＦ中の抗Ａβ自己抗体濃度の計量に関する本発明者らの方法の使用が、臨床的放射線学的証拠に関連して、診断を支持して有効及び代替的なバイオマーカーとしてじきに提唱され得ることを本発明者らは望んでいる。
【０２００】
９  内皮損傷に関する指数としてのＣＳＦ中のＴＦＰＩレベルの計量
アルツハイマー病（ＡＤ、０．８４ｎｇ／ｍＬ±０．１９）及び脳アミロイド血管障害関連炎症（ＣＡＡ−ｒｉ、１．１０ｎｇ／ｍＬ±０．３８）を患う患者のＣＳＦ中のＴＦＰＩレベルの研究は、健常な対照対象（ＣＴＬ、０．４８ｎｇ／ｍＬ±０．２９）の群、筋萎縮性側索硬化症を伴う患者のような血管の合併症を伴わない神経変性疾患を患う対照（ＯＮＤ、０．３０ｎｇ／ｍＬ±０．１５）の群、及び炎症性成分を伴わない脳アミロイド血管障害を患う患者（ＣＡＡ、１．０４ｎｇ／ｍＬ±０．５７）の群で検出可能なレベルと比較して拡張された。
【０２０１】
図１２から推論され得るように、ＡＤ、ＣＡＡ及びＣＡＡ−ｒｉ患者におけるＴＦＰＩ濃度は、内皮損傷の存在を特定する際の本発明者らのバイオマーカーの有効性だけでなく、同様にアミロイド脳血管堆積レベルとのそれらの考え得る直接的な相関の証拠として、ＣＴＬ及びＯＮＤの両方に関して有意に増加されることがわかった（それぞれ、ｐ＜０．００１）。
【０２０２】
実際に、分析される患者の３つのカテゴリー（ＡＤ、ＣＡＡ及びＣＡＡ−ｒｉ）全てが、実質レベル及び脳血管レベルの両方で強力なベータアミロイド堆積により病理学的に特徴付けられる。
【０２０３】
更に、ＴＦＰＩがアミロイド堆積（ＣＡＡ）の度合いに続発するニューロン死に関する指数（それぞれ、ｐ＜０．００５１、ｒ＝０．４７、ｐ＜０．００４１、ｒ＝０．４９）を表し得るという証拠として、ＴＦＰＩはまた、患者ＡＤにおける神経変性及び軸索損傷に関するマーカー、タウ及びＰ−１８１タウに直接相関されることがわかった（図１３）。
【０２０４】
ＣＴＬ及びＡＤの臨床的及び社会人口的データを表２で報告するのに対して、ＣＡＡ及びＣＡＡ−ｒｉ患者の各々の値は、表１及び表２ですでに報告した。
【０２０５】
【表３】
2015514206.tif 000005
【０２０６】
１０．ＣＡＡ−ｒｉ患者のＣＳＦ中のＴＦＰＩ濃度の計量
疾患の寛解期中でのＣＡＡ−ｒｉ患者のＣＳＦ中の抗Ａβ抗体の濃度における減少の動向を検出して（図８ｂ）、本発明者らは、かかる動向がまた、それらの内皮損傷バイオマーカーＴＦＰＩに関しても確認されるかどうかを確証した。
【０２０７】
図１４で見られ得るように、ＴＦＰＩ値は、これまでに記載される作用メカニズムの更なる証拠として、自己抗体に関してこれまでに見出されたのと同じ動向を正確に追跡する（ｐ＝０．０１３、ａｐＣＡＡ−ｒｉ対ｒｐＣＡＡ−ｒｉ）。即ち、自己抗体は、Ａβタンパク質を除去することにより疾患の急性期中に作動し（図１０ａ及び１０ｂ）、治療上の免疫を受けたＡＤ患者におけるＶＥ（ＡＲＩＡ）の出現中に推測され得るものと類似して、ａｐＣＡＡ−ｒｉ中に検出可能な高い抗体濃度により引き起こされる全ての可能性において血管及び実質Ａβの迅速な除去に起因して有害な現象を誘発する。
【０２０８】
かかる証拠は全体として、ＴＦＰＩが、神経変性疾患におけるアミロイド堆積の結果生じる新規有効内皮損傷バイオマーカーとして、またＣＡＡ−ｒｉのような疾患の自発的モデルにおいて、及びＡＤ又は一般に疾患修飾療法における免疫試行中の治療作用の追跡のため、抗Ａβ抗体によるＡβ除去の結果生じる内皮損傷に関する指数として、利用することができることを実証している。
【０２０９】
１１．ＲＯＣ分析及びカットオフ決定による診断予測（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｉｔｙ）の分析
最終分析として、疾患の診断を行うための本発明者らのマーカーの有効性を評価するために、本発明者らに利用可能なＣＡＡ−ｒｉを患う１０人の患者と比較して、２５人の健常な対照に対する提唱されるバイオマーカーの両方（抗Ａβ抗体及びＴＦＰＩ）に関するＲＯＣの比較により、統計学的予測試験を実施した。
【０２１０】
本発明者らは、２つのモデルを用いて行動した：
１）個々のバイオマーカーに関する予測を確定するためのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線分析
バイオマーカー１：抗Ａβ抗体
この試験は、ａｐＣＡＡ−ｒｉ患者のＣＳＦ中の抗Ａβ抗体の計量が、病理学を識別する際に高度に予測的であることを、本発明者らが実証するのを可能にした（ＡＵＣ＝０．９７）。分析から、抗体濃度の観点で、カットオフ値を定義することが更に可能であり、それ以下では、対象はＣＡＡ−ｒｉを患うとは分類されない。試験による１００％感度及び９０％特異性の組に関して上記カットオフは、３４．２２ｎｇ／ｍｌ未満であることが判明した。
【０２１１】
バイオマーカー２：ＴＦＰＩ
この試験は、ａｐＣＡＡ−ｒｉ患者のＣＳＦ中のＴＦＰＩの計量が、病理学を識別する際に高度に予測的であることを、本発明者らが実証するのを可能にした（ＡＵＣ＝０．９９）。分析から、ＴＦＰＩ濃度の観点で、カットオフ値を定義することが更に可能であり、それ以下では、対象はＣＡＡ−ｒｉを患うとは分類されない。試験による１００％感度及び８９％特異性の組に関して上記カットオフは、０．８２ｎｇ／ｍｌ未満であることが判明した。
【０２１２】
２）両方のＲＯＣ曲線を併用して利用することによる予測分析
同じ患者においてバイオマーカー１及びバイオマーカー２に関して検出可能な値を併用して考慮に入れる分析により、１００％に近い感度及び特異性が見出され、２つのバイオマーカーの併用した使用により、ＣＡＡ−ｒｉ患者と健常な対象を識別するためのほぼ絶対的な能力が可能となることを確認した。簡潔に述べると、ＴＦＰＩのレベル及び抗Ａβ抗体のレベルを併用して評価することにより、問題となるケース記録が、より多い数のケースに関して、必ず拡大及び再確認されなくてはならないことを含めるが、高度に予測的な診断試験を提供することが可能であり、その結果としてＣＡＡ−ｒｉの確定診断に依然として本質的である脳バイオプシーに代替して、有効診断ツールとして適している。
【０２１３】
性別、年齢、タウ及びＰ−１８１タウのような、試験に影響を及ぼし得る他の考え得る変数を本発明者らが考慮した多変量分析後にも、特異性及び感度の同じ値が検出された。
【０２１４】
2015514206.tif 000006
【図６】
2015514206.tif 000007
【図７】
2015514206.tif 000008
【図１２】
2015514206.tif 000009
【図１４】
2015514206.tif 000010
【図１】
2015514206.tif 000011
【図２】
2015514206.tif 000012
【図３】
2015514206.tif 000013
【図４Ａ】
2015514206.tif 000014
【図４Ｂ】
2015514206.tif 000015
【図４Ｃ】
2015514206.tif 000016
【図５】
2015514206.tif 000017
【図８】
2015514206.tif 000018
【図９】
2015514206.tif 000019
【図１０】
2015514206.tif 000020
【図１１】
2015514206.tif 000021
【図１３】
2015514206.tif 000022
【図１５】
2015514206.tif 000023
【国際調査報告】
2015514206.tif 000024
2015514206.tif 000025
2015514206.tif 000026
2015514206.tif 000027