(57)【要約】  がんを予防する、がんを処置する、腫瘍増殖を阻害する、患者の転帰を予測する、投与量を最適化する、および処置の有効性を監視する方法を本明細書において記述する。特に、特定のマイクロＲＮＡおよびメッセンジャーＲＮＡはリンチ症候群または遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がんを有する患者のＮＳＡＩＤ化学予防および療法に対する応答の有用な指標である。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法であって、以下の工程：
ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；
ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３７７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−２９６−３ｐからなる群から選択される少なくとも１種類の活性化ｍｉＲのｍｉＲＮＡ発現を測定し；
前記試料中で測定された前記活性化ｍｉＲが活性化されている場合、前記ＮＳＡＩＤ処置が有効であると決定する；
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種類の活性化ｍｉＲにｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１９３、およびｍｉＲ−１２８が含まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法であって、以下の工程：
ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；
ｍｉＲ−３４１、ｍｉＲ−２９７ｃ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ７６２；ｍｉＲ−２１３５、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−２９７ｃからなる群から選択される少なくとも１種類の阻害ｍｉＲのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）発現を測定し；
前記試料中で測定された前記阻害ｍｉＲが阻害されている場合、前記ＮＳＡＩＤ処置が有効であると決定する；
を含む、前記方法。
【請求項４】
ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法であって、以下の工程：
ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；
ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−３７７、ｍｉＲ−１１９６からなる群から選択される少なくとも１種類の活性化ｍｉＲのｍｉＲＮＡ発現を測定し；
前記試料中で測定された前記活性化ｍｉＲが活性化されている場合、前記ＮＳＡＩＤ処置が有効であると決定する；
を含む、前記方法。
【請求項５】
ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法であって、以下の工程：
ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；
ｍｉＲ−３７５−Ａ、ｍｉＲ−６１５−Ｐ、ｍｉＲ−７０６−Ｐ、ｍｉＲ−４８５−３ｐ−Ａ、ｍｉＲ−２９０−Ｐ、ｍｉＲ−５４３−Ａ、ｍｉＲ−４２５−３ｐ−Ａ、ｍｉＲ−３２６−Ａ、ｍｉＲ−５８９−Ａ、ｍｉＲ−１２９−２−Ａ、ｍｉＲ−５５３−Ａ、ｍｉＲ−９６−Ａ、ｍｉＲ−７−２−Ａ、ｍｉＲ−５１９ｅ＊−５ｐ−Ａ、ｍｉＲ−２９３−Ａ、ｍｉＲ−５５１ａ−Ａ、ｍｉＲ−５９４−Ｐ、ｍｉＲ−６０１−Ａ、ｍｉＲ−４８７ｂ−Ａ、ｍｉＲ−６７６−３ｐ−Ａ、ｍｉＲ−５００−Ｐからなる群から選択される少なくとも１種類の活性化ｍｉＲのｍｉＲＮＡ発現を測定し；
前記試料中で測定された前記活性化ｍｉＲが活性化されている場合、前記ＮＳＡＩＤ処置が有効であると決定する；
を含む、前記方法。
【請求項６】
ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法であって、以下の工程：
ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；
ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３７７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−３７７、ｍｉＲ−１１９６、ｍｉＲ−３７５−Ａ、ｍｉＲ−６１５−Ｐ、ｍｉＲ−７０６−Ｐ、ｍｉＲ−４８５−３ｐ−Ａ、ｍｉＲ−２９０−Ｐ、ｍｉＲ−５４３−Ａ、ｍｉＲ−４２５−３ｐ−Ａ、ｍｉＲ−３２６−Ａ、ｍｉＲ−５８９−Ａ、ｍｉＲ−１２９−２−Ａ、ｍｉＲ−５５３−Ａ、ｍｉＲ−９６−Ａ、ｍｉＲ−７−２−Ａ、ｍｉＲ−５１９ｅ＊−５ｐ−Ａ、ｍｉＲ−２９３−Ａ、ｍｉＲ−５５１ａ−Ａ、ｍｉＲ−５９４−Ｐ、ｍｉＲ−６０１−Ａ、ｍｉＲ−４８７ｂ−Ａ、ｍｉＲ−６７６−３ｐ−Ａ、ｍｉＲ−５００−Ｐ、ｍｉＲ−７０６、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−３３８、およびｍｉＲ−４８３からなる群から選択される少なくとも１種類の活性化ｍｉＲのｍｉＲＮＡ発現を測定し；
前記試料中で測定された前記活性化ｍｉＲが活性化されている場合、前記ＮＳＡＩＤ処置が有効であると決定する；
を含む、前記方法。
【請求項７】
ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法であって、以下の工程：
ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；
ＲＰＬ１３Ａ、Ｎｐａｓ２、Ａｒｎｔｌ、Ｋｉｔｌ、Ｍａｌａｔ１、Ｅｐｔ１、１８１００１４Ｂ０１Ｒｉｋ、Ａｅｓ、Ｓｅｐｗ１、Ｒａｂ４ａ、ｂａｋ１、ｍａｌｌ、Ｚｆａｎｄ５、Ｎｆｉｌ３、Ｎｐａｓ２、およびＩｒｆ２ｂｐ２１７００１１０Ｋ１７Ｒｉｋからなる群から選択される少なくとも１種類の活性化ｍＲＮＡのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現を測定し；
前記試料中で測定された前記活性化ｍＲＮＡが活性化されている場合、前記ＮＳＡＩＤ処置が有効であると決定する；
を含む、前記方法。
【請求項８】
少なくとも１種類の活性化ｍＲＮＡにＫｉｔｌが含まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法であって、以下の工程：
ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；
Ｓｌｃ３８ａ１０、Ａｅｓ、Ｒａｂ５ｃ、Ｃｆｌ１、ＰＰＡＲＤ、Ａｃｔｂ、Ｐｔｔｇ１ｉｐ、Ｅｓｐｎ、Ｅｌｏｖｌ１、Ａｎｇｐｔｌ２、Ｈｌｆ、Ｐｅｒ２、Ｔｅｆ、Ｐｅｒ３、Ｄｂｐ；Ｓｔｅ２０ａ１、およびＧｍ１２９からなる群から選択される少なくとも１種類の阻害ｍＲＮＡのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現を測定し；
前記試料中で測定された前記阻害ｍＲＮＡが阻害されている場合、前記ＮＳＡＩＤ処置が有効であると決定する；
を含む、前記方法。
【請求項１０】
さらにＡｎｇ４；Ｂａｍｂｉ、Ｃｄ２４ａ、Ｃｃｌ６、Ｅｎｔｐｄ５、Ｗｅｅ１、Ａｎｋ３、Ｔｒｐ５３、Ｓｅｌ１ｌ、Ｕｂｅ４ｂ、Ａｒｉｄ５ｂ、Ｐｒｋａｂ２、Ｐｅｒ１、Ｂａｃｅ１、およびＳｔｏｘ２からなる群から選択される少なくとも１種類の阻害ｍＲＮＡを測定することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法であって、以下の工程：
ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；
少なくとも１種類のｍＲＮＡおよび／またはｍｉＲバイオマーカーを測定し；
前記少なくとも１種類のｍＲＮＡおよび／またはｍｉＲバイオマーカーの発現に基づいて前記ＮＳＡＩＤ処置が有効であるかどうかを決定する；
を含む、前記方法。
【請求項１２】
前記試料が組織、血液、腫瘍、便、粘液、形成異常組織、結腸直腸組織、卵巣組織、尿路上皮組織、子宮内膜組織、結腸直腸管腫瘍、結腸直腸癌腫、結腸直腸腺腫、結腸直腸ポリープ、胃腸管腫瘍、小腸癌腫、小腸ポリープ、子宮内膜腫瘍、子宮内膜癌腫、子宮内膜増殖症、およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群の少なくとも１種類から抽出される、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記測定がハイブリダイゼーションアッセイ、マイクロアレイチップ、ｎ−ｃｏｕｎｔｅｒ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）分析、ｍｉＲ−Ｓｅｑ分析、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、マイクロ流体カード、オリゴヌクレオチドプローブ、およびノーザンブロットからなる群から選択される１種類又はこれ以上の方法により実施される、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記決定がさらに前記試料の発現を対照レベルと比較することを含み、前記対照レベルががん性組織、健康な組織、およびより早い時点において前記対象から採取された組織からなる群から選択される組織における対照発現レベルの測定から決定され、前記より早い時点が１週間、１ヶ月、６ヶ月、２００日、１年、４００日、１８ヶ月、６００日、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、および１１年のいずれかより大きい、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
有効なＮＳＡＩＤを５年を超える期間の間投与することを含む、ヒト対象または動物対象においてマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示す腫瘍を阻害する方法。
【請求項１６】
前記ＮＳＡＩＤがナプロキセンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
以下の工程：
療法上有効用量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し、ここで前記ＮＳＡＩＤはナプロキセンおよび／またはナプロキセンナトリウムである；
を含む、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がんまたはリンチ症候群（ＬＳ／ＨＮＰＣＣ）において腫瘍発生率を抑制する方法。
【請求項１８】
以下の工程：
療法上有効用量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し；そして
処置の有効性を活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、および阻害ｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを測定することにより監視する；
を含む、ＬＳ／ＨＮＰＣＣにおいて腫瘍発生率を抑制する方法。
【請求項１９】
以下の工程：
療法上有効用量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し；そして
処置の有効性を活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、および阻害ｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを測定することにより監視する；
を含む、ＬＳ／ＨＮＰＣＣにおいて腫瘍進行を抑制する方法。
【請求項２０】
以下の工程：
療法上有効用量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し、ここで前記ＮＳＡＩＤはナプロキセンおよび／またはナプロキセンナトリウムである；
を含む、ＬＳ／ＨＮＰＣＣにおいて腫瘍進行を抑制する方法。
【請求項２１】
以下の工程：
療法上有効用量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し、；そして
処置の有効性を活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、および阻害ｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを測定することにより監視する；
を含む、ＬＳ／ＨＮＰＣＣを処置する方法。
【請求項２２】
前記ＮＳＡＩＤがナプロキセンおよび／またはナプロキセンナトリウムである、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＮＳＡＩＤがナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、一酸化窒素供与アセチルサリチル酸、スリンダク、一酸化窒素供与スリンダク、フェノプロフェン、ケトプロフェン、オキサプロジン、インドメタシン、エトドラク、ジクロフェナク、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロモキシカム（ｌｏｍｏｘｉｃａｍ）、イソキシカム、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、セレコキシカブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｃａｂ）、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブ（ｅｔｏｒｉｃｏｘｉｂ）、ニメスリド、およびニフルム酸（ｎｉｆｌｕｍｉｃ  ａｃｉｄ）、およびリコフェナク（ｌｉｃｏｆｅｎａｃ）からなる群から選択される、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも２種類のＮＳＡＩＤが投与される、上記の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
以下の工程：
ある用量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し；
処置の有効性を、活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、および阻害ｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを測定することにより監視し；そして
その後前記用量を療法上有効レベルまで増大または減少させて、それにより前記少なくとも１種類のバイオマーカーを対照と比較することにより療法上有効レベルを決定する；
を含む、ＬＳ／ＨＮＰＣＣを処置するためのＮＳＡＩＤの投与量を決定する方法。
【請求項２６】
以下の工程：
試験ＮＳＡＩＤ化合物を動物対象に投与し；
活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、および阻害ｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを測定し；そして
前記試験化合物のバイオマーカーの発現プロファイルを試験された有効性のＮＳＡＩＤ化合物に関するバイオマーカーの発現プロファイルと比較する；
を含む、ＮＳＡＩＤ化合物をスクリーニングするための方法。
【請求項２７】
以下の工程：
ａ）対象から試料を得て；
ｂ）がんのバイオマーカーとしての１種類又はこれ以上のｍｉＲＮＡおよび内部対照ＲＮＡの発現レベルを決定し；
ｃ）がんのバイオマーカーとしての前記１種類以上のｍｉＲＮＡの相対発現レベルを計算し；
ｄ）１個以上の変数を用いることにより予測モデルを計算し、ここで前記変数にはがんのバイオマーカーとしての前記１種類以上のｍｉＲＮＡの相対発現レベルが含まれ；そして
ｅ）前記予測モデルによりがん進行リスク発生確率を計算し、ここで前記疾患リスク発生確率が０．５より大きい場合、前記対象はがんの進行の危険にさらされていると診断される；
を含む、がんのインビトロ診断のための患者のがんに関する臨床状態の評価のための方法。
【請求項２８】
以下の工程：
試料中の少なくともバイオマーカーレベルのレベルを対照と比較し、ここで前記少なくとも１種類のバイオマーカーは活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、および阻害ｍＲＮＡ、ならびにそれらの組み合わせから選択され；そして
前記試料において前記対照と比較して少なくともバイオマーカーの前記レベルが低減しているかどうか、または前記少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルが変化しているかどうかを決定し、それによりＬＳ／ＨＮＰＣＣを有する対象において生存に関する予後を特性付ける；
を含む、ＬＳ／ＨＮＰＣＣを有する対象において生存に関する予後を提供するための方法。
【請求項２９】
以下の工程：
試料中の少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルを対照と比較し、ここで前記少なくとも１種類のバイオマーカーは活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、阻害ｍＲＮＡ、およびそれらの組み合わせから選択され；そして
前記試料において前記対照と比較して前記少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルが低減しているかどうか、または前記少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルが上昇しているかどうかを決定し、それにより前記対象におけるＬＳ／ＨＮＰＣＣの進行を決定する；
を含む、対象においてＬＳ／ＨＮＰＣＣの進行を決定するための方法。
【請求項３０】
上記の方法のいずれかに従ってＬＳ／ＨＮＰＣＣを有する対象の低い生存率に関する予後を提供するための分子マーカーの診断キットであって、前記キットが複数の核酸分子を含み、それぞれの核酸分子がマイクロＲＮＡおよび／またはメッセンジャーＲＮＡ配列をコードしており、
ここで少なくとも１個のｍｉＲＮＡ配列はｍｉＲ−１０３であり；かつ
ここで前記複数の核酸分子の１種類又はこれ以上は標的細胞においておよび１種類又はこれ以上の対照細胞において差次的に発現しており、かつここで前記１種類以上の差次的に発現している核酸分子は一緒にＬＳ／ＨＮＰＣＣを有する対象における低い生存率の予後の指標となる核酸発現シグネチャーを表す、前記キット。
【請求項３１】
以下の工程：
試料中の少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルを対照と比較し、ここで該少なくとも１種類のバイオマーカーは活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、阻害ｍＲＮＡ、およびそれらの組み合わせから選択され；そして、
前記試料中で前記対照と比較して前記少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルが低減しているかどうか、または前記少なくとも１種類のｍｉＲのレベルが上昇しているかどうかを決定し、それにより前記対象の疾患を特性付ける；
を含む、ＬＳ／ＨＮＰＣＣを有する、または有することが疑われる対象の疾患を特性付けるための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明者：Richard Fishel, Carlo M. Croce, Levy Kopelovich, Bruce Aronow, Juana Martin-Lopez
関連出願への相互参照
[0001]  この出願は２０１１年１２月１日に出願された米国仮特許出願第６１／５６５，５４０号の利益を主張し、その開示を全ての目的に関して参照により本明細書に援用する。
【０００２】
連邦政府により資金提供を受けた研究に関する記載
[0002]  この発明は、国立がん研究所により与えられた助成金番号ＮＯ１−ＣＮ−４３３０２およびＮＯ１−ＣＮ−５３３０１の下での米国政府援助によりなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
[0003]  この出願は、医学、特に腫瘍学の分野における。本発明はまた、分子生物学、特にマイクロＲＮＡおよびｍＲＮＡの分野における。
【背景技術】
【０００４】
[0004]  リンチ症候群または遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がん（ＬＳ／ＨＮＰＣＣ）は、結腸直腸がん（ＣＲＣ）の３〜５％ならびに子宮内膜がんおよび卵巣がんの５〜７％を占める、最も一般的なヒトのがん素因症候群（ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）である。ＬＳ／ＨＮＰＣＣはヒトのミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子における欠陥により引き起こされる。加えて、散発性結腸直腸大腸腫瘍、子宮内膜腫瘍、卵巣腫瘍、および上部尿路腫瘍の１５〜４０％がＭＭＲ欠陥の診断指標となる単純反復配列における遺伝的不安定性（マイクロサテライト不安定性またはＭＳＩ）を示す。
【０００５】
[0005]  非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、結腸直腸がんが含まれるいくつかのタイプのヒトのがんの予防において有効であり得る構造的に多様な化合物のファミリーである。一般にアスピリンとして知られるアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）は、ＮＳＡＩＤファミリーの原型である。多くの疫学研究がＡＳＡの使用およびＣＲＣの発生率の間の逆相関を実証してきた。最近の臨床分析は、定期的なＡＳＡの使用は既にＣＲＣと診断された個体においてより低いがん特異的死亡の危険性と関連していることを示した。
【０００６】
[0006]  証拠は非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）への長期曝露はＣＲＣの発生率を低減することを示唆している。注目すべきことに、ＬＳ／ＨＮＰＣＣの患者を用いた最近のランダム化された試験は、アスピリンへの長期曝露は腫瘍発生率を少なくとも２倍低減することを示唆した。
【０００７】
[0007]  ＮＳＡＩＤであるアスピリン（ＡＳＡ）およびスリンダクは、遺伝子的に安定なＭＭＲ欠陥細胞に関して逆説的に選択する遺伝学的機序によりＭＳＩを抑制する。ＭＳＩ抑制は、ＣＲＣ化学予防研究の一般的な焦点であるシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）遺伝子１および２とは無関係である。一酸化窒素供与ＡＳＡ（ＮＯ−ＡＳＡ）は、ＡＳＡよりも３００〜３０００倍低い用量でＭＳＩを抑制する。
【０００８】
[0008]  蓄積しつつある証拠がＮＳＡＩＤはがんに対する強力な道具であることを示している。しかし、あらゆる特定のＮＳＡＩＤ化合物の有効性および投与量は、他のＮＳＡＩＤと比較してかなり異なり得る。ＮＳＡＩＤ化学予防療法は、大規模な試験に基づいて有効な腫瘍阻害を示すために数年を要し得る。分子および細胞レベルで有効性を測定および評価するための追加の手段および方法に関する必要性が存在する。さらに、ＮＳＡＩＤのがん化学予防の機序の理解を助けるための手段および方法に関する必要性が存在する。
【０００９】
[0009]  本発明は、がんを処置する、転帰を予測する、投与量を最適化する、そして処置の有効性を監視する代替法を提供する。開示される方法は従来の療法的方法の限界を克服し、下記の詳細な記述から明らかになるであろう追加の利点も提供する。
【発明の概要】
【００１０】
[0010]  患者の転帰を予測する、ＮＳＡＩＤの投与量を最適化する、処置の有効性を監視する、ＮＳＡＩＤ化合物を有効性に関してスクリーニングする、がんを予防する、がんを処置する、および腫瘍増殖を阻害する方法を提供する。特に、特定のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）およびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）はリンチ症候群または遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がん（ＬＳ／ＨＮＰＣＣ）を有する患者のＮＳＡＩＤ化学予防および療法に対する応答の有用な指標である。
【００１１】
[0011]  以下の工程を含む、ＬＳ／ＨＮＰＣＣを有する、または有することが疑われる対象において疾患を特性付けるための方法を提供する：試料中の少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルを対照と比較し、ここでその少なくとも１種類のバイオマーカーは活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、阻害ｍＲＮＡ、およびそれらの組み合わせから選択され；そしてその試料中で対照と比較してその少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルが低減しているかどうか、または少なくとも１種類のｍｉＲのレベルが上昇しているかどうかを決定し、それによりその対象においてその疾患を特性付ける。
【００１２】
[0012]  以下のｍｉＲが含まれる活性化ｍｉＲを提供する：ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３７７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−２９６−３ｐ；ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ１２６−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−２９ａ、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−３７７、ｍｉＲ−１１９６；；ｍｉｒ−３７５−Ａ、ｍｉｒ−６１５−Ｐ、ｍｉＲ−７０６−Ｐ、ｍｉｒ−４８５−３ｐ−Ａ、ｍｉｒ−２９０−Ｐ、ｍｉＲ−５４３−Ａ、ｍｉｒ−４２５−３ｐ−Ａ、ｍｉｒ−３２６−Ａ、ｍｉｒ−５８９−Ａ、ｍｉｒ−１２９−２−Ａ、ｍｉｒ−５５３−Ａ、ｍｉｒ−９６−Ａ、ｍｉｒ−７−２−Ａ、ｍｉｒ−５１９ｅ＊−５ｐ−Ａ、ｍｉｒ−２９３−Ａ、ｈａｓ、ｍｉｒ−５５１ａ−Ａ、ｍｉｒ−５９４−Ｐ、ｍｉｒ−６０１−Ａ、ｍｉＲ−４８７ｂ−Ａ、ｍｉＲ−６７６−３ｐ−Ａ、ｍｉＲ−５００−Ｐ；；ｍｉＲ−７０６、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−３３８、およびｍｉＲ−４８３。
【００１３】
[0013]  以下のｍｉＲが含まれる阻害ｍｉＲを提供する：ｍｉＲ−３４１、ｍｉＲ−２９７ｃ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ７６２；ｍｉＲ−２１３５、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−２９７ｃ；；ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−１３０、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１００、ｍｉＲ−１８４、ｍｉＲ−１３５、ｍｉＲ−１４１、ｍｉＲ−１９９、ｍｉＲ−１０２、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ１９３、およびｍｉＲ−９。
【００１４】
[0014]  以下のｍｉＲが含まれる活性化ｍＲＮＡを提供する：ＲＰＬ１３Ａ、Ｎｐａｓ２、Ａｒｎｔｌ、Ｋｉｔｌ、Ｍａｌａｔ１、Ｅｐｔ１、１８１００１４Ｂ０１Ｒｉｋ、Ａｅｓ、Ｓｅｐｗ１、Ｒａｂ４ａ、ｂａｋ１、ｍａｌｌ、Ｚｆａｎｄ５、Ｎｆｉｌ３、Ｎｐａｓ２、Ｉｒｆ２ｂｐ２１７００１１０Ｋ１７Ｒｉｋ；Ｂｍｐｒ１ａ、Ｓｕｈｗ４、Ｍｓｉ２、Ｓｍｃ１ａ、２、５、ｊｍｊｄ１ｃ、Ｂｌｒｃ６、ＣｄｋＮ１ｂ、ｊａｒｉｄ１ａ、およびＢｃｌａｆ１。
【００１５】
[0015]  以下のｍｉＲが含まれる阻害ｍＲＮＡを提供する：Ｓｌｃ３８ａ１０、Ａｅｓ、Ｒａｂ５ｃ、Ｃｆｌ１、ＰＰＡＲＤ、Ａｃｔｂ、Ｐｔｔｇ１ｉｐ、Ｅｓｐｎ、Ｅｌｏｖｌ１、Ａｎｇｐｔｌ２、Ｈｌｆ、Ｐｅｒ２、Ｔｅｆ、Ｐｅｒ３、Ｄｂｐ；Ｓｔｅ２０ａ１、Ｇｍ１２９；Ａｎｇ４；Ｂａｍｂｉ、Ｃｄ２４ａ、Ｃｃｌ６、Ｅｎｔｐｄ５、Ｗｅｅ１、Ａｎｋ３、Ｔｒｐ５３、Ｓｅｌ１ｌ、Ｕｂｅ４ｂ、Ａｒｉｄ５ｂ、Ｐｒｋａｂ２、Ｐｅｒ１、Ｂａｃｅ１、およびＳｔｏｘ２。
【００１６】
[0016]  ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法を提供し、その方法は以下の工程を含む：ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；以下のｍｉＲからなる群から選択される少なくとも１種類の活性化ｍｉＲのｍｉＲＮＡ発現を測定し：ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３７７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−２９６−３ｐ；その試料中で測定された活性化ｍｉＲが活性化されている場合、そのＮＳＡＩＤ処置が有効であると決定する。
【００１７】
[0017]  その少なくとも１種類の活性化ｍｉＲに以下のｍｉＲが含まれる方法を提供する：ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１９３、およびｍｉＲ−１２８。
【００１８】
[0018]  ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法を提供し、その方法は以下の工程を含む：ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；以下のｍｉＲからなる群から選択される少なくとも１種類の阻害ｍｉＲのマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）発現を測定し：ｍｉＲ−３４１、ｍｉＲ−２９７ｃ、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ７６２；ｍｉＲ−２１３５、ｍｉＲ−４２３−５ｐ、ｍｉＲ−２９７ｃ；その試料中で測定された阻害ｍｉＲが阻害されている場合、そのＮＳＡＩＤ処置が有効であると決定する。
【００１９】
[0019]  ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法を提供し、その方法は以下の工程を含む：ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；以下のｍｉＲからなる群から選択される少なくとも１種類の活性化ｍｉＲのｍｉＲＮＡ発現を測定し：ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−３７７、ｍｉＲ−１１９６；その試料中で測定された活性化ｍｉＲが活性化されている場合、そのＮＳＡＩＤ処置が有効であると決定する。
【００２０】
[0020]  ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法を提供し、その方法は以下の工程を含む：ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；以下のｍｉＲからなる群から選択される少なくとも１種類の活性化ｍｉＲのｍｉＲＮＡ発現を測定し：ｍｉＲ−３７５−Ａ、ｍｉＲ−６１５−Ｐ、ｍｉＲ−７０６−Ｐ、ｍｉＲ−４８５−３ｐ−Ａ、ｍｉＲ−２９０−Ｐ、ｍｉＲ−５４３−Ａ、ｍｉＲ−４２５−３ｐ−Ａ、ｍｉＲ−３２６−Ａ、ｍｉＲ−５８９−Ａ、ｍｉＲ−１２９−２−Ａ、ｍｉＲ−５５３−Ａ、ｍｉＲ−９６−Ａ、ｍｉＲ−７−２−Ａ、ｍｉＲ−５１９ｅ＊−５ｐ−Ａ、ｍｉＲ−２９３−Ａ、ｍｉＲ−５５１ａ−Ａ、ｍｉＲ−５９４−Ｐ、ｍｉＲ−６０１−Ａ、ｍｉＲ−４８７ｂ−Ａ、ｍｉＲ−６７６−３ｐ−Ａ、ｍｉＲ−５００−Ｐ；その試料中で測定された活性化ｍｉＲが活性化されている場合、そのＮＳＡＩＤ処置が有効であると決定する。
【００２１】
[0021]  ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法を提供し、その方法は以下の工程を含む：ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；以下のｍｉＲからなる群から選択される少なくとも１種類の活性化ｍｉＲのｍｉＲＮＡ発現を測定し：ｍｉＲ−１０３、ｍｉＲ−１９３、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−１３６、ｍｉＲ−１９９ａ−３ｐ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−３７７、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−２９６−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−１２６−５ｐ、ｍｉＲ−２９ｂ、ｍｉＲ−３０１ａ、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−２１８、ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１９０、ｍｉＲ−１４４、ｍｉＲ−３３、ｍｉＲ−３７７、ｍｉＲ−１１９６、ｍｉＲ−３７５−Ａ、ｍｉＲ−６１５−Ｐ、ｍｉＲ−７０６−Ｐ、ｍｉＲ−４８５−３ｐ−Ａ、ｍｉＲ−２９０−Ｐ、ｍｉＲ−５４３−Ａ、ｍｉＲ−４２５−３ｐ−Ａ、ｍｉＲ−３２６−Ａ、ｍｉＲ−５８９−Ａ、ｍｉＲ−１２９−２−Ａ、ｍｉＲ−５５３−Ａ、ｍｉＲ−９６−Ａ、ｍｉＲ−７−２−Ａ、ｍｉＲ−５１９ｅ＊−５ｐ−Ａ、ｍｉＲ−２９３−Ａ、ｍｉＲ−５５１ａ−Ａ、ｍｉＲ−５９４−Ｐ、ｍｉＲ−６０１−Ａ、ｍｉＲ−４８７ｂ−Ａ、ｍｉＲ−６７６−３ｐ−Ａ、ｍｉＲ−５００−Ｐ、ｍｉＲ−７０６、ｍｉＲ−５４３、ｍｉＲ−３２８、ｍｉＲ−２０２、ｍｉＲ−３３８、およびｍｉＲ−４８３；その試料中で測定された活性化ｍｉＲが活性化されている場合、そのＮＳＡＩＤ処置が有効であると決定する。
【００２２】
[0022]  ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法を提供し、その方法は以下の工程を含む：ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；以下のｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種類の活性化ｍＲＮＡのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現を測定し：ＲＰＬ１３Ａ、Ｎｐａｓ２、Ａｒｎｔｌ、Ｋｉｔｌ、Ｍａｌａｔ１、Ｅｐｔ１、１８１００１４Ｂ０１Ｒｉｋ、Ａｅｓ、Ｓｅｐｗ１、Ｒａｂ４ａ、ｂａｋ１、ｍａｌｌ、Ｚｆａｎｄ５、Ｎｆｉｌ３、Ｎｐａｓ２、およびＩｒｆ２ｂｐ２１７００１１０Ｋ１７Ｒｉｋ；その試料中で測定された活性化ｍＲＮＡが活性化されている場合、そのＮＳＡＩＤ処置が有効であると決定する。
【００２３】
[0023]  その少なくとも１種類の活性化ｍＲＮＡにＫｉｔｌが優先的に含まれる方法を提供する。
【００２４】
[0024]  ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法を提供し、その方法は以下の工程を含む：ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；以下のｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種類の阻害ｍＲＮＡのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）発現を測定し：Ｓｌｃ３８ａ１０、Ａｅｓ、Ｒａｂ５ｃ、Ｃｆｌ１、ＰＰＡＲＤ、Ａｃｔｂ、Ｐｔｔｇ１ｉｐ、Ｅｓｐｎ、Ｅｌｏｖｌ１、Ａｎｇｐｔｌ２、Ｈｌｆ、Ｐｅｒ２、Ｔｅｆ、Ｐｅｒ３、Ｄｂｐ；Ｓｔｅ２０ａ１、およびＧｍ１２９；その試料中で測定された阻害ｍＲＮＡが阻害されている場合、そのＮＳＡＩＤ処置が有効であると決定する。
【００２５】
[0025]  さらに以下のｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種類の阻害ｍＲＮＡを測定することを含む方法を提供する：Ａｎｇ４；Ｂａｍｂｉ、Ｃｄ２４ａ、Ｃｃｌ６、Ｅｎｔｐｄ５、Ｗｅｅ１、Ａｎｋ３、Ｔｒｐ５３、Ｓｅｌ１ｌ、Ｕｂｅ４ｂ、Ａｒｉｄ５ｂ、Ｐｒｋａｂ２、Ｐｅｒ１、Ｂａｃｅ１、およびＳｔｏｘ２。
【００２６】
[0026]  ヒト対象または動物対象においてＮＳＡＩＤがん化学予防処置の有効性を評価する方法を提供し、その方法は以下の工程を含む：ＮＳＡＩＤ処置を受けている対象から核酸を含有する試料を得て；少なくとも１種類のｍＲＮＡおよび／またはｍｉＲバイオマーカーを測定し；その少なくとも１種類のｍＲＮＡおよび／またはｍｉＲバイオマーカーの発現に基づいてそのＮＳＡＩＤ処置が有効であるかどうかを決定する。
【００２７】
[0027]  その試料が組織、血液、腫瘍、便、粘液、形成異常組織、結腸直腸組織、卵巣組織、尿路上皮組織、子宮内膜組織、結腸直腸管腫瘍、結腸直腸癌腫、結腸直腸腺腫、結腸直腸ポリープ、胃腸管腫瘍、小腸癌腫、小腸ポリープ、子宮内膜腫瘍、子宮内膜癌腫、子宮内膜増殖症、およびそれらのあらゆる組み合わせからなる群の少なくとも１種類から抽出される方法を提供する。
【００２８】
[0028]  その測定がハイブリダイゼーションアッセイ、マイクロアレイチップ、ｎ−ｃｏｕｎｔｅｒ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）分析、ｍｉＲ−Ｓｅｑ分析、ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、マイクロ流体カード（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｃａｒｄｓ）、オリゴヌクレオチドプローブ、およびノーザンブロットからなる群から選択される１種類以上の方法により実施される方法を提供する。
【００２９】
[0029]  その決定がさらにその試料の発現を対照レベルと比較することを含み、その対照レベルががん性組織、健康な組織、およびより早い時点においてその対象から採取された組織からなる群から選択される組織における対照発現レベルの測定から決定され、そのより早い時点が１週間、１ヶ月、６ヶ月、２００日、１年、４００日、１８ヶ月、６００日、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、および１１年のいずれかより大きい方法を提供する。
【００３０】
[0030]  有効なＮＳＡＩＤを５年を超える期間の間投与することを含む、ヒト対象または動物対象においてマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を示す腫瘍を阻害する方法を提供する。
【００３１】
[0031]  そのＮＳＡＩＤがナプロキセンである方法を提供する。
【００３２】
[0032]  以下の工程を含む、遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がんまたはリンチ症候群において腫瘍発生を抑制する方法を提供する：療法上有効用量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し；そしてその処置の有効性を活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、および阻害ｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを測定することにより監視する。
【００３３】
[0033]  以下の工程を含む、リンチ症候群または遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がん（ＬＳ／ＨＮＰＣＣ）において腫瘍進行を抑制する方法を提供する：療法上有効用量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し；そしてその処置の有効性を活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、および阻害ｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを測定することにより監視する。
【００３４】
[0034]  以下の工程を含む、ＬＳ／ＨＮＰＣＣを処置する方法を提供する：療法上有効用量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し；そしてその処置の有効性を活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、および阻害ｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを測定することにより監視する。
【００３５】
[0035]  そのＮＳＡＩＤがナプロキセンおよび／またはナプロキセンナトリウムである方法を提供する。
【００３６】
[0036]  そのＮＳＡＩＤがナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、一酸化窒素供与アセチルサリチル酸、スリンダク、一酸化窒素供与スリンダク、フェノプロフェン、ケトプロフェン、オキサプロジン、インドメタシン、エトドラク、ジクロフェナク、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロモキシカム（ｌｏｍｏｘｉｃａｍ）、イソキシカム、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、セレコキシカブ（ｃｅｌｅｃｏｘｉｃａｂ）、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブ（ｅｔｏｒｉｃｏｘｉｂ）、ニメスリド、およびニフルム酸（ｎｉｆｌｕｍｉｃ  ａｃｉｄ）、およびリコフェナク（ｌｉｃｏｆｅｎａｃ）からなる群から選択される方法を提供する。
【００３７】
[0037]  少なくとも２種類のＮＳＡＩＤが投与される方法を提供する。
【００３８】
[0038]  以下の工程を含む、ＬＳ／ＨＮＰＣＣを処置するためのＮＳＡＩＤの投与量を決定する方法を提供する：ある用量の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を投与し；その処置の有効性を活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、および阻害ｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを測定することにより監視し；そしてその後その用量を療法上有効レベルまで増大または減少させて、それによりその少なくとも１種類のバイオマーカーを対照と比較することにより療法上有効レベルを決定する。
【００３９】
[0039]  以下の工程を含む、ＮＳＡＩＤ化合物をスクリーニングするための方法を提供する：試験ＮＳＡＩＤ化合物を動物対象に投与し；活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、および阻害ｍＲＮＡからなる群から選択される少なくとも１種類のバイオマーカーを測定し；そしてその試験化合物のバイオマーカーの発現プロファイルを試験された有効性のＮＳＡＩＤ化合物に関するバイオマーカーの発現プロファイルと比較する。
【００４０】
[0040]  以下の工程を含む、がんのインビトロ診断のための患者のがんに関する臨床状態の評価のための方法を提供する：対象から試料を得て；がんのバイオマーカーとしての１種類以上のｍｉＲＮＡおよび内部対照ＲＮＡの発現レベルを決定し；そのがんのバイオマーカーとしての１種類以上のｍｉＲＮＡの相対発現レベルを計算し；１個以上の変数を用いることにより予測モデルを計算し、ここでその変数にはがんのバイオマーカーとしての１種類以上のｍｉＲＮＡの相対発現レベルが含まれ；そしてその予測モデルによりがん進行リスク発生確率を計算し、ここでその疾患リスク発生確率が０．５より大きい場合、その対象はがんの進行の危険にさらされていると診断される。
【００４１】
[0041]  以下の工程を含む、ＬＳ／ＨＮＰＣＣを有する対象において生存に関する予後を提供するための方法を提供する：試料中の少なくともバイオマーカーレベルのレベルを対照と比較し、ここでその少なくとも１種類のバイオマーカーは活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、および阻害ｍＲＮＡ、ならびにそれらの組み合わせから選択され；そしてその試料において対照と比較してその少なくともバイオマーカーのレベルが低減しているかどうか、またはその少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルが変化しているかどうかを決定し、それによりＬＳ／ＨＮＰＣＣを有する対象において生存に関する予後を特性付ける。
【００４２】
[0042]  以下の工程を含む、対象においてＬＳ／ＨＮＰＣＣの進行を決定するための方法を提供する：試料中の少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルを対照と比較し、ここでその少なくとも１種類のバイオマーカーは活性化ｍｉＲ、阻害ｍｉＲ、活性化ｍＲＮＡ、阻害ｍＲＮＡ、およびそれらの組み合わせから選択され；そしてその試料において対照と比較してその少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルが低減しているかどうか、またはその少なくとも１種類のバイオマーカーのレベルが上昇しているかどうかを決定し、それによりその対象においてＬＳ／ＨＮＰＣＣの進行を決定する。
【００４３】
[0043]  上記の方法のいずれかに従ってＬＳ／ＨＮＰＣＣを有する対象の低い生存率に関する予後を提供するための分子マーカーの診断キットを提供し、そのキットは複数の核酸分子を含み、それぞれの核酸分子はマイクロＲＮＡおよび／またはメッセンジャーＲＮＡ配列をコードしており、ここで少なくとも１個のｍｉＲＮＡ配列はｍｉＲ−１０３であり；かつここでその複数の核酸分子の１種類以上は標的細胞においておよび１種類以上の対照細胞において差次的に発現しており、かつここでその１種類以上の差次的に発現している核酸分子は一緒にＬＳ／ＨＮＰＣＣを有する対象における低い生存率の予後を示す核酸発現シグネチャーを表す。
【００４４】
[0044]  この発明の様々な目的および利点は、添付の図面を考慮して読んだ際に、以下の好ましい態様の詳細な記述から当業者に明らかになるであろう。
【００４５】
[0045]  本特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１個の図面を含有する。カラーの図面（単数または複数）を有するこの特許または特許出願公開のコピーは、要請して必要な料金を払えば特許庁により提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】[0046]  図１．ＬＳ／ＨＮＰＣＣ患者におけるアスピリン化学予防のランダム化された試験。結腸直腸腺腫−癌予防プログラム（ＣＡＰＰ）からのデータ。ＬＳ／ＨＮＰＣＣ患者をランダム化し、プラセボまたは６００ｍｇのアスピリンのどちらかを毎日与えた。腫瘍の位置および数を結腸内視鏡検査により年１回を基本として決定した。ハザード比（ＨＲ）＝０．６１（０．１９、０．８６）およびｐ＝０．０２。アスピリン、６００ｍｇ／日を下の赤線で示し；プラセボを上の青線により示す。
【図２−１】[0047]  図２Ａ。ＮＳＡＩＤ処置はＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスの生存日数を増大させる。Ｍｓｈ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ、ＶｐＣ＋／＋（ＬＳ／ＨＮＰＣＣ）およびＶｐＣ＋／＋（野生型）を８種類のＮＳＡＩＤを用いて２回投与で処置した。代表的な生存データを示し、（図２Ａ）作用なし（スリンダクスルホンおよびＮＯ−スリンダクスルホン）、（図２Ｂ）中程度の作用（寿命における２０〜５０％の増大；アスピリン、スリンダク、ＮＯ−スリンダク）、および（図２Ｃ）ナプロキセン（寿命における約１００％の増大）に分ける。未処置のＭｓｈ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＶｐＣ＋／＋動物の生存を正方形（赤）で示す。アスピリン処置を比較のために黒点で示す。選択された野生型対照の処置を三角形（紫）で示す。注釈：スリンダク処置はアスピリンと同様に寿命を増大させるが、それはまた野生型対照において腫瘍を誘発する（図２Ｂ）。
【図２−２】[0047]  図２Ｂ、Ｃ。ＮＳＡＩＤ処置はＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスの生存日数を増大させる。Ｍｓｈ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ、ＶｐＣ＋／＋（ＬＳ／ＨＮＰＣＣ）およびＶｐＣ＋／＋（野生型）を８種類のＮＳＡＩＤを用いて２回投与で処置した。代表的な生存データを示し、（図２Ａ）作用なし（スリンダクスルホンおよびＮＯ−スリンダクスルホン）、（図２Ｂ）中程度の作用（寿命における２０〜５０％の増大；アスピリン、スリンダク、ＮＯ−スリンダク）、および（図２Ｃ）ナプロキセン（寿命における約１００％の増大）に分ける。未処置のＭｓｈ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＶｐＣ＋／＋動物の生存を正方形（赤）で示す。アスピリン処置を比較のために黒点で示す。選択された野生型対照の処置を三角形（紫）で示す。注釈：スリンダク処置はアスピリンと同様に寿命を増大させるが、それはまた野生型対照において腫瘍を誘発する（図２Ｂ）。
【図３】[0048]  図３Ａ〜３Ｅ．アスピリンで処置したＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスにおける腫瘍の大きさ、数および病理。（図３Ａ）処置されたマウスからの代表的な腸の病巣全体。（図３Ｂ〜Ｅ）異常陰窩巣、胃腸上皮内新生物および腺癌を示すＭｓｈ２ｆ１ｏｘ／ｆｌｏｘ、ＶｐＣ＋／＋マウスからの腫瘍の代表的な例。いくつかの症例で我々は腫瘍浸潤白血球に気付いた；それはＬＳ／ＨＮＰＣＣ腫瘍における一般的な病理学的観察である。
【図４】[0049]  図４Ａ〜Ｂ．ＡＳＡ処置後のＭｓｈ２ｆ１ｏｘ／ｆｌｏｘＶｐＣ＋／＋マウスからの腸腫瘍の比較ＭＳＩのまとめ。耳（Ｅ）、腸腫瘍（Ｔ）、およびその腫瘍に隣接する正常な腸組織（Ｎ）をマイクロサテライト変化に関して調べた。平均アレル分布を色付きで示す。（図４Ａ）未処置のＬＳ／ＨＮＰＣＣマウス。（図４Ｂ）アスピリンで処置したＬＳ／ＨＮＰＣＣマウス。予想されたように、Ｍｓｈ２ノックアウトは腸組織に限られるため、Ｅ組織は全ての条件下でマイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）である。未処置のマウスは腫瘍が増大している腸組織においてＭＳＩを示し（図４Ｂ）、一方でアスピリンで処置したマウスは腫瘍および隣接する正常組織の両方においてＭＳＩの減少を示す。
【図５】[0050]  図５．ナプロキセン、変異体が影響を及ぼす１１５種類のＳａ  ｍｉＲのマイクロアレイおよびスリンダクスルホン−ＮＯスリンダクスルホンに対する差異を示すヒートマップ。黄色は増大した発現を示し；青は低減した発現を示す。
【図６】[0051]  図６．ナプロキセン、変異体が影響を及ぼす１１５種類のＳａ  ｍｉＲのマイクロアレイおよびスリンダクスルホン−ＮＯスリンダクスルホンに対する差異を示すヒートマップ（大）。
【図７】[0052]  図７．６１  ｍｉＲ  Ａｆｆｙシグネチャーナプロキセンｖｅｓスルホンａｖｅヒートマップを示すヒートマップ。
【図８】[0053]  図８．２９  ｍｉＲＧＥ  ８４  ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ調査ＭＳＨ変異体療法薬作用を示すヒートマップ。
【図９】[0054]  図９．１５  ｍｉＲ  ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ２４大ライブラリー調査研究ナプロキセンＯｎ１Ｖ３を示すヒートマップ。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
[0055]  リンチ症候群または遺伝性非ポリポーシス結腸直腸がん（ＬＳ／ＨＮＰＣＣ）はヒト集団における最も一般的ながん素因症候群であり、ほぼ３００人中１人において見られる。ＬＳ／ＨＮＰＣＣはミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子の変化により引き起こされる。通常はＭＭＲにより抑制されている変異の増大から腫瘍が発現する。自然発生結腸直腸腫瘍（１５％）、子宮内膜腫瘍（３０％）、および上部尿路腫瘍（４０％）の大きな割合が、ＭＭＲ欠陥の診断指標である通常は安定な短いＤＮＡ配列の反復における長さの変化（マイクロサテライト不安定性またはＭＳＩ）も示す。ＬＳ／ＨＮＰＣＣの９０％より多くがヒトのＭＭＲ遺伝子における明確な変異により引き起こされる。
【００４８】
[0056]  結腸直腸腺腫−癌予防プログラム（ＣＡＰＰ）は、アスピリン（アセチルサリチル酸：ＡＳＡ）のＬＳ／ＨＮＰＣＣ保因者において結腸直腸新生物を低減する可能性をランダム化された試験において調べた（図１）。これらの試験に関する評価項目は、毎年の結腸内視鏡検査スクリーニングの間のＬＳ／ＨＮＰＣＣがんの検出であった。注目すべきことに、ＬＳ／ＨＮＰＣＣ患者に関する利益はＡＳＡ曝露の５年後に始まり、結果としてプラセボで処置されたコホートと比較した腫瘍形成率の少なくとも２倍の低下をもたらす。
【００４９】
[0057]  炎症性プロスタグランジン類の産生に関わっているシクロオキシゲナーゼ−１（ＣＯＸ１）またはＣＯＸ２活性の阻害は、過去において、一般にＮＳＡＩＤによるがん化学予防に関する機序であると考えられていた。しかし、後にＭＭＲ欠陥のヒトの結腸腫瘍細胞のＡＳＡへの長期曝露は非常に不安定な細胞においてアポトーシスを増進する遺伝子選択によりＭＳＩを抑制することが実証された。最終的には、ＡＳＡ処置は結果として、持続性のＭＭＲ欠陥を有するが大部分はマイクロサテライト安定性（ＭＳＳ）である表現型を逆説的に獲得した細胞集団をもたらした。そのＭＳＳ細胞に関する選択は、ＣＯＸ１またはＣＯＸ２遺伝子と無関係であった。
【００５０】
[0058]  ＭＭＲ欠陥細胞のＡＳＡまたはスリンダクを用いた処置は、アポトーシス促進性の遺伝子選択機序によりＭＳＩを抑制した。これらの結果は、ＡＳＡおよびスリンダクはＬＳ／ＨＮＰＣＣ保因者に関する有用ながん化学予防薬であることを示している。加えて、一酸化窒素（ＮＯ）供与基を含有するＡＳＡはＡＳＡよりも３００〜３０００倍低い用量でＭＳＩ細胞を抑制した（図２）。ＬＳ／ＨＮＰＣＣ腸がんに関するマウスモデルを用いて、結果はＡＳＡおよび低用量ＮＯ−ＡＳＡは腫瘍発生を抑制し、生存を増大させることを示した。
【００５１】
[0059]  ８種類の異なるＮＳＡＩＤの複数回投与でのＬＳ／ＨＮＰＣＣ細胞およびマウスモデル系における作用を本明細書において記述する。作用なしから実質的な作用までに及ぶ結果を含む広い範囲の化学予防効能が示されている。注目すべきことに、ＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスモデルのナプロキセン（ｎａｐｒｏｓｙｎとしても知られている）による処置は、これらの動物が未処置の動物の寿命のほぼ２倍を生きるように、生存日数を実質的に増大させる。そのナプロキセンで処置されたＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスはほぼ通常の寿命を生きる。これは、化学予防薬のマウスがんモデルに関する生存への著しく大きな作用を表している。
【００５２】
[0060]  ＬＳ／ＨＮＰＣＣに関するマウスモデルは、ヒトのＬＳ／ＨＮＰＣＣと類似した腸腫瘍病理を示す。同様に、ＡＳＡおよびＮＯ−ＡＳＡのＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスモデルへの長期投与はヒトの患者と類似して生存日数を増大させた。そのマウスモデルからヒトの疾患へと再現される（ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｄ）がんの共通の遺伝的原因への実質的なＮＳＡＩＤの化学予防作用は、ＮＳＡＩＤのがん化学予防効能の原因である分子機序を細かく調べることができる他にない手段を提供する。
【００５３】
[0061]  そのような広い範囲のＮＳＡＩＤ作用が存在するため、有効なＮＳＡＩＤに誘導される生存と相関するｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ発現シグネチャーを作製することが重要である。この発現シグネチャーは、多数の独立した重複し、交絡するＮＳＡＩＤの細胞性作用から抽出することができる。
【実施例】
【００５４】
[0062]  実験法
[0063]  一部のＮＳＡＩＤを用いた処置はＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスの生存日数を増大させた。
【００５５】
[0064]  均等な性別のＭｓｈ２ｆｉｏｘ／ｆｌｏｘＶｐＣ＋／＋マウスのコホートをＡＳＡが含まれるＮＳＡＩＤで処置し、それは粉末飼料と混合されて自由に投与された。腸における継続的なＣｒｅ発現の交絡する可能性のある作用に関して照らし合わせるために、ＶｐＣ＋／＋（Ｍｓｈ２＋／＋）マウスを同様に試験した。それぞれのＮＳＡＩＤ処置に関してカプラン・マイヤー生存分析を生成した（図２）。未処置のＭｓｈ２ｆｉｏｘ／ｆｌｏｘＶｐＣ＋／＋マウスの生存日数の中央値は３３３日であった（赤い正方形；図２）。対照的に、４００ｍｇ／ｋｇ  ＡＳＡを用いた処置はＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスの平均生存日数を３９３日まで増大させ、それは寿命における１８％の増大に相当する（黒点、ｐ＜０．００１；図２Ｂおよび図２Ｃ）。これらの結果は、アスピリンのヘテロ接合性のヒトのＬＳ／ＨＮＰＣＣ保因者への作用のランダム化されたプラセボ対照試験において観察された腫瘍抑制傾向と類似の腫瘍抑制傾向を示している。そのＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスのコホートを７種類の追加のＮＳＡＩＤおよびＮＯ−ＮＳＡＩＤ誘導体で処置し、その多くが他のマウスモデルならびにヒトにおいて報告された化学予防活性を有する。ＮＳＡＩＤ処置はマウスに関する最小耐用量（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｔｅｄ  ｄｏｓｅ）（ＭＴＤ）未満の少なくとも２つの用量を組み込み、ＮＯ−ＡＳＡ、ナプロキセン、ＮＯ−ナプロキセン、スリンダク、ＮＯ−スリンダク、スリンダクスルホン、およびＮＯ−スリンダクスルホンが含まれた。代表的な生存データを、生存に対してほとんどまたは全く作用なし（図２Ａ）、中程度の作用（寿命における２０〜５０％の増大；図２Ｂ）、および著しい作用（寿命における７０％より大きい増大；図２Ｃ）に分ける。７２ｍｇ／ｋｇのＮＯ−ＡＳＡで処置したＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスの平均生存日数は４０３日であり；それはＡＳＡに匹敵する生存日数であるが、１０倍低い用量においてであった。スリンダクおよびＮＯ−スリンダクもＡＳＡと類似して生存日数を増大させた（図２Ｂ）。しかし、これらの化合物は両方とも野生型マウスの生存日数を著しく低減させる（三角形、図２Ｂ）。興味深いことに、その結果は広い範囲のＡＳＡおよびＮＯ−ＡＳＡの用量にわたって生存における約２０％より大きい増大を示していない。対照的に、ナプロキセンで処置されたＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスの平均生存日数は、１６６ｍｇ／ｋｇおよび３３１ｍｇ／ｋｇに関してそれぞれ５４５日および５６９日であった。ナプロキセン処置のその２つの用量の間に実質的な差がないことは、より低い用量でも保護を提供しそうであることを示唆している。
【００５６】
[0065]  ＮＳＡＩＤ処置後の腫瘍病理
[0066]  腫瘍はＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスの腸に（主に十二指腸および空腸において、ならびに稀に回腸において）限られており；それはこれらの組織におけるビリン発現のパターンおよびレベルと一致している（図３Ａ）。注目すべきことに、スリンダク処置は他のマウスモデルに関して報告されているように盲腸がんの数を増大させる。ＡＳＡ、ＮＯ−ＡＳＡおよびナプロキセンで処置されたマウスは未処置のマウスよりも有意に遅く病的腫瘍を示したが、屠殺した際、それらは未処置のマウスと比較して統計的に同等の数の腫瘍を有していた（それぞれ１．６８±０．７２、１．７８±１．２５、および１．５８±０．６７対１．９０±１．０２）。腸の病巣および腫瘍には、ヒトの病理と類似した異常陰窩巣、腺腫および腺癌が含まれていた（図３Ｂ〜３Ｅ）。まとめると、これらの結果は、有効なＮＳＡＩＤは腫瘍発生を遅らせることにより化学予防薬として作用するが、最終的に生じる腫瘍は未処置の対照と類似した全体的病理を示すようであることを示している。
【００５７】
[0067]  組織の検査
[0068]  病理学的分析または形態計測分析を必要とするマウス組織を調製し、分析する。腸の病理に関して、マウスを安楽死させ、腸管を分離する。腸の全長を開き、目に見える病巣に関して調べる。腫瘍の部位、大きさおよび数を記録する。全体の分析には、全ての他の器官の転移または原発巣に関する検査および特性付けが含まれる。次いで器官を１０％中性緩衝ホルマリン中で固定し、アルコール類の勾配を通して脱水し、パラフィン中に包理する。組織は組織学におけるルーチン的な技法またはその適合（ａｄａｐｔａｔｉｏｎｓ）を用いて処理されるであろう。マウスのルーチン的なスクリーニングのため、組織学的分析を全ての主要な器官系に相当する３８の組織切片において実施する。切片を４〜５μで切り、ヘマトキシリンおよびエオジンを用いて染色する。ルーチン的な固定剤により破壊または分解されるタンパク質／酵素の分析のため、凍結切片を調べる。凍結切片をＯＣＴ中に包理し、液体窒素中で急速凍結させる。試料をＪｕｎｇクライオスタット上で薄切りするまで−７０℃で保管する。組織特異的分析が示される場合、その特定の器官からの組織のみを収集および分析する。特に重要なのは腸管の分析である。腸全体を方向性を維持して組み込むために、典型的にはマウスの腸の連続的な長軸方向の切片を調べる。この技法は、４枚のスライドガラス上で組織を過度に切断することなく近位−遠位の方向性を有効に維持する。
【００５８】
[0069]  全ての計画における組織試料の分析に重要なことは、胃腸新生物の正確な同定および特性付けである。標準的な診断基準が、以前に確立されたマウスおよびラットにおける病巣の特徴に基づく前新生物性および新生物性病巣の同定に関して用いられる。マウスの自然発生新生物は系統間で異なるため、これらの研究への対照同腹子の使用が重要である。
【００５９】
[0070]  マウスの全体的検査は多数の器官系において異なる病巣を明らかにし得る。特に興味深いのは、腸間膜（腸間膜リンパ節が含まれる）、肝臓、および肺への転移巣である。あらゆる目に見える病巣を測定し、数え上げる。微視的転移の非存在を確証するために、これらの同じ器官をそのマウスにおいて組織学的に調べる。より一般的でない部位への、例えば心臓、膵臓、脾臓、末梢リンパ節または腎臓への転移の非存在を確証するために、代表的な動物の全身分析を実施することもできる。その全身分析を用いて、これらの独特の動物モデルにおける他の疾患の発現を評価する。
【００６０】
[0071]  形態計測分析
[0072]  形態計測分析を用いて、腫瘍サイズまたは腫瘍頻度における違いを識別することができる。スライドガラスをＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ６０顕微鏡上で１〜１００×ドライのレンズ倍率で調べる。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７２カメラを用いて画像をキャプチャーし、形態計測または立体解析学的（ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｉｃ）技法を用いて領域中の比色定量的変化に関して陽性である個々の細胞または病巣を同定する。完全に自動化された計数技法または“ヒト”が手伝う計数を用いることができる。どちらかの収集技法を用いて、格子選択および計数技法に関する標準的なプロトコルの厳正な固守を用いることにより、その集団の偏りのない標本抽出が得られる。そのパターンは体系的ランダム標本抽出技法として記述される。
【００６１】
[0073]  ここで、以下の議論に関して以下の図を参照する。
【００６２】
[0074]  図５は、ナプロキセン、変異体が影響を及ぼす１１５種類のＳａ  ｍｉＲのマイクロアレイおよびスリンダクスルホン−ＮＯスリンダクスルホンに対する差異を示すヒートマップを示す。
【００６３】
[0075]  図６は、ナプロキセン、変異体が影響を及ぼす１１５種類のＳａ  ｍｉＲのマイクロアレイおよびスリンダクスルホン−ＮＯスリンダクスルホンに対する差異を示すヒートマップ（大）を示す。
【００６４】
[0076]  図７は、６１  ｍｉＲ  Ａｆｆｙシグネチャーナプロキセンｖｅｓスルホンａｖｅヒートマップを示すヒートマップ（ｓｅａｔ  ｍａｐ）を示す。
【００６５】
[0077]  図８は、２９  ｍｉＲＧＥ  ８４  ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ調査ＭＳＨ変異体療法薬作用を示すヒートマップを示す。
【００６６】
[0078]  図９は、１５  ｍｉＲ  ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ２４大ライブラリー調査研究ナプロキセンＯｎ１Ｖ３を示すヒートマップを示す。
【００６７】
[0079]  ＮＳＡＩＤのＬＳ／ＨＮＰＣＣ腫瘍の抑制の機序の決定。
【００６８】
[0080]  動物の大きなコホートにわたる腫瘍発達のプロファイルされた差次的比率を分析して寿命を増大させるＮＳＡＩＤおよび寿命を増大させないＮＳＡＩＤと関係するｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ発現変化を定める。ＮＳＡＩＤ腫瘍抑制と関係する経路バイオマーカーをリアルタイムＰＣＲおよびｎＣｏｕｎｔｅｒデジタル分析により検証する。免疫組織化学的プローブを用いた検証を受け入れられる選択された経路バイオマーカーは、さらに病理分析において有用である。相対的作用を引き留めること（Ｄｅｔａｉｎｉｎｇ）は、アスピリン、ナプロキセン、および他のＮＳＡＩＤを用いた処置後に腸のｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡにおける用量および時間依存性の変化を調べて相対的作用を詳細に説明し、また、ＮＳＡＩＤバイオマーカーのパネル（ｐａｎｅｌ）を洗練および拡張することにより成し遂げられる。これらの研究は、経路バイオマーカーのパネルをさらに洗練するために生存と関連付けられる。さらにこの分析に加えて、選択された経路バイオマーカーに関してｔｅｔｏｎ−ｔｅｔｏｆｆ発現系を構築してそれらのＭＭＲ欠陥細胞におけるＭＳＩへの作用を決定する。これらの研究は、ＮＳＡＩＤ腫瘍抑制に寄与する分子経路、それらの相互作用、および機序を同定する。
【００６９】
[0081]  ＮＳＡＩＤ処置は腫瘍組織においてマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）を低減する。
【００７０】
[0082]  小プールＰＣＲ（１〜１０ゲノム相当）によるＡＳＡおよびＮＯ−ＡＳＡ処置からの組織におけるＭＳＩ分析を実施して構成ＤＮＡ(耳、Ｅ）ならびに正常（Ｎ）および腫瘍（Ｔ）腸組織間の新規アレルの分布を決定した。それぞれの組織の多数の試料を分析した際、結果として得られたプロファイルは内因性のアレル多様性の代表的な分布を含んでいた。これらのマウスからの耳の組織は一貫してＭＳＳであり、主なアレルは常にＰＣＲ増幅アーティファクトに起因する比較的変動しないアレルのパターンにより隣接されていた。ＡＳＡおよびＮＯ−ＡＳＡ処置されたマウスからの正常および腸組織は、主要なアレルの大きさおよび分布において変動を示す。しかし、ＡＳＡおよびＮＯ−ＡＳＡによる処置は腸区画において少なくとも部分的にＭＳＩをＭＳＳに変化させた（図４Ａを図４Ｂと比較）。
【００７１】
[0083]  ＭＳＩ状態の比較評価を、腸腫瘍およびそれらと合わせた隣接する正常な組織の間で、それらの間のマイクロサテライト変化における絶対変化を決定することにより行った。比較ＭＳＩは、隣接する発生的に関連する正常および腫瘍組織の間の不安定性における相対的な違いの定量的尺度を提供する。診断上のマイクロサテライト不安定性に関するベセスダ基準を用いた：ＭＳＳ、マイクロサテライトマーカーの状態において変化なし；高マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ−Ｈ；５個のマーカーの２個以上が異なる）。未処置の動物は３３％の比較によるＭＳＩ−Ｈの割合を有し、一方でＡＳＡで処置されたＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスは２２％のＭＳＩ−Ｈを示し、ＮＯ−ＡＳＡで処置されたマウスは２０％のＭＳＩ−Ｈを示した。この分析は、ＡＳＡおよびＮＯ−ＡＳＡによる処置は細胞研究と類似して腸上皮においてＭＳＩを部分的に安定化することを示唆した。
【００７２】
[0084]  ＮＳＡＩＤ処置後のｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの分析。
【００７３】
[0085]  １２匹のマウスの群（６匹のＶｐＣ＋／＋野生型および６匹のＭｓｈ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＶｐＣ＋／＋ＬＳ／ＨＮＰＣＣマウス）を８種類のＮＳＡＩＤのそれぞれで連続的に処置し、２ヶ月間の曝露後に腸を採取した。それぞれの個々に処置されたマウスから腸の０．５ｃｍの切片（盲腸の２．５ｃｍ近位）を採取した。高品質のｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを発現アレイ分析のために調製した。日ごとの変動の可能性を低減するため、全ての試料のハイブリダイゼーションならびに順次の発現分析を同時に実施した。ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡチップ両方からのトランスクリプトーム発現データを分析した。そのデータの分析は、複製試料間の優れた一貫性を示唆している。これらの観察は、そのｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ調製法ならびにチップ分析の高い品質を強調している。
【００７４】
[0086]  ソフトウェア開発はデータ分析に寄与する。ほとんどのプログラミングはＥｃｌｉｐｓｅを用いるＪａｖａ（登録商標）を用いて、そして統計および数学的機能を有するＳｔｒｕｔｓフレームワークを用いて行われ、それはＲ−サーバーアプリケーションプログラミングインターフェイスを用いて実施される。ジャカルタプロジェクトのストラッツフレームワークは、ウェブアプリケーションの迅速な設計および展開を助ける統合されたフレームワークを用いてＳｅｒｖｌｅｔｓ、ＪＳＰ、カスタムＳｔｒｕｔｓタグライブラリーおよび他の構成要素の使用を可能にする。フレームワークの価値は、維持、アップデート、および再利用ならびにＴｏｍｃａｔ展開を促進する規則正しくかつコンポーネント化されたコードの性質において実感される。先進的プログラミング開発者ツール（Ｅｃｌｉｐｓｅ、ＩＤＥ、ＣＶＳ、Ａｎｔ、コンパイラー、デバッガー、グラフィカル開発環境）および並列計算ソフトウェア（ＭＰＩ、ＰＶＭ）も広範囲にわたって用いることができる。
【００７５】
[0087]  興味深いことに、Ｍｓｈ２の状態およびＮＳＡＩＤによる処置の両方がｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ発現プロファイルへの強い影響を有する。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ偽発見（ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で補正されたｐ値を混合効果ＡＮＯＶＡモデルにおいて用いて、２９７のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＭＯＥ４３０に加えて１９７個の独立遺伝子に対応する２つのプローブセットおよびオハイオ州ｍｉＲＮＡオリゴプラットフォーム上の２８種類のｍｉＲＮＡプローブは、ＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスの腸組織における発現変化を示した。次いで、有効なＮＳＡＩＤ処置の結果として統計的に有意な作用を示した差次的に制御されたｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡに対してクラスター分析を行った。
【００７６】
[0088]  ２つの主なパターンが現れた。第１に、腫瘍化学予防に有効であるＮＳＡＩＤにより誘導されたｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの発現変化の大部分は、腫瘍発生の低減において無効であるＮＳＡＩＤへの応答においてほとんどまたは全く変化を示さなかった。この観察結果は、臨床的有用性を有する候補化学予防バイオマーカーの同定における重要な段階である。第２に、これらのｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの多くはＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスの腸組織（Ｍｓｈ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＶｐＣ＋／＋）において野生型の腸組織（ＶｐＣ＋／＋）と比較して差次的に発現していた。これらの結果は、Ｍｓｈ２アレルの欠失と関係するいくつかの適応性発現変化を示している。そのような発現変化は、ＭＳＨ２タンパク質はＭＭＲおよびＤＮＡ損傷の感知において機能することしか知られていないため、意外であった。Ｍｓｈ２の欠失により誘導されたｍＲＮＡのいくつかは、ＡＴＭが含まれるいくつかの損傷応答遺伝子が含まれる潜在的代償性（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ）ＤＮＡ修復経路のメンバーであり、高められているようである。
【００７７】
[0089]  ＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスにおけるＮＳＡＩＤ化学予防に関するシグネチャーを提供するｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡのパネルを同定した。注目すべきことに、その化学予防性ＮＳＡＩＤに誘導されたこのパネルのｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの発現変化の多くは、野生型細胞において見られる発現パターンに戻っている（ＷＴおよびＭＵＴの発現パターンを“有効な”ＮＳＡＩＤの発現パターンと比較）。そのｍｉＲＮＡ発現シグネチャーは、ＮＳＡＩＤに誘導される発現の復帰を非常によく示しているように見える。理論により束縛されることを望むわけではないが、これらの結果は、有効なＮＳＡＩＤ化学予防は細胞の発現の正常なパターンへの再適合を誘発するという仮説と一致する。逆に、Ｍｓｈ２が含まれる腫瘍抑制因子の変異は、広範囲にわたる、おそらく代償性の細胞発現変化を刺激し、それはそれらの特異的な細胞機能の一部であるとは考えられないであろう。さらに、これらの代償性発現変化の一部は腫瘍発生の駆動を助ける可能性があり、有効なＮＳＡＩＤにより逆戻りする可能性がある。この理論から推定すると、がん化学予防におけるＮＳＡＩＤの役割に関するいくつかの重要な予測を行うことができる。第１に、そして最も重要であるのは、これらの可逆性の発現変化はＮＳＡＩＤの容量に依存しており、その用量依存性は化学予防作用と相関していることである。第２に、これらの発現変化のいくつかは、がん発生の間に生じ得る腫瘍経路およびおそらくその発生している腫瘍の分子病理を変化させる。
【００７８】
[0090]  ｍＲＮＡ発現変化の多くはＬＳ／ＨＮＰＣＣ（ＭＵＴ）パターンから野生型（ＷＴ）マウス組織により示されるパターンへと戻る復帰を示しているため、焦点は最大発現変化を有する候補に対してであった。これらは有効なＮＳＡＩＤ曝露により上昇または減少しているｍＲＮＡに相当する。Ｂｍｐｒ１ａ（骨形成タンパク質Ｉ型受容体）はＴＧＦβスーパーファミリーのリガンドのメンバーに結合する受容体セリン／スレオニンキナーゼのクラスに属し、それは細胞増殖を制御する。そのＴＧＦβＲＩＩ受容体はＬＳ／ＨＮＰＣＣ腫瘍の８０％より大きい割合において変異している。ＫｉｔＬ（ＫＩＴリガンド）は、ｃ−Ｋｉｔ受容体に結合するサイトカインである。それは血球新生、精子発生、およびメラニン形成において重要な役割を果たしている。ｃ−Ｋｉｔの活性化変異は胃腸間質性腫瘍と関係している。
【００７９】
[0091]  ＮＳＡＩＤに媒介される腫瘍化学予防の原因である生物学的経路およびネットワークの決定を開始するために、その差次的に制御されているｍｉＲおよびｍＲＮＡの間の機能的および制御的接続性の同定を分析した。ネットワークの相互作用をデコンボリューションするため、ＴｏｐｐＧｅｎｅ、ＴｏｐｐＣｌｕｓｔｅｒ、およびＴｏｐｐＭｉｒツールが含まれるツールの組み合わせを用いた。これらの分析の結果は、差次的に制御されているｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの間の莫大な程度の接続性を示している。さらに、結腸直腸がんの危険性と関係する遺伝子の制御不全のｍＲＮＡとそれらの差次的に制御されるｍＲＮＡを標的とする差次的に制御されるｍｉＲＮＡの間に強い関連性が存在する（ネットワークの線図の上部のライトボックス（ｌｉｇｈｔ  ｂｏｘｅｓ）を参照）。例えば、ｍｉＲ−９およびｍｉＲ−１３５ａはＳＭＣ１ａを標的とする。これらのｍｉＲＮＡの両方がナプロキセンにより下方制御され、一方でＳＭＣ１ａのｍＲＮＡ発現はナプロキセンにより高められる。結腸直腸腫瘍発生の間に一般的に変化しているｃＭｙｃおよびＭＹＣ／ＭＡＸ発現経路との接続性の多数の点も特筆する（ネットワークの線図の下部のライトボックスを参照）。これらの観察は、いくつかの遺伝子の発現を制御するための重複するネットワーク機序を示唆している。
【００８０】
[0092]  一般的方法
[0093]  マイクロアレイは、１回の実験において並行して処理される数十の試料にわたって数千のｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの発現を一度に監視することができる強力な高スループット手段である。利用される情報源には、処置された、および未処置の試料のｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ発現のゲノム全体にわたる分析を実施するためのオハイオ州立大学（ＯＳＵ）総合がんセンター（ＣＣＣ）の一部である核酸共有情報源（ＮＡＳＲ）およびマイクロアレイ共有情報源（ＭＡＳＲ）が含まれる。ＮＡＳＲおよびＭＡＳＲは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ上でのゲノム全体にわたるｍＲＮＡ発現分析ならびにカスタムアレイならびにＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓマイクロ流体カード上でのゲノム全体にわたる／標的化されたｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ発現分析が含まれる、がん研究のための様々なマイクロアレイ適用において有用である。
【００８１】
[0094]  ＯＳＵにおいて開発されたｍｉＲＮＡマイクロアレイプラットフォームは、ＭＡＳＲが１５０００より多くのがん試料をプロファイルすることを可能にしてきた。ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ発現パターンの検証は、リアルタイムＰＣＲおよび最終的にはｎＣｏｕｎｔｅｒデジタル分析システム（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて実施される。そのｎＣｏｕｎｔｅｒ分析システムは、遺伝子発現の直接多重測定に基づく新規のデジタル技術を利用し、高レベルの正確さおよび感度を与える（細胞あたり１コピー未満）。その技術は分子“バーコード”および１分子イメージングを用いて単一の反応で数百種類の独特の転写産物を検出および計数する。
【００８２】
[0095]  ｍＲＮＡ発現プロファイリング−総ＲＮＡの単離はＴＲＩｚｏｌ法（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って用いる。４５，０００個より多い特性付けられた遺伝子および発現配列タグに関するプローブセットを含有するＧｅｎｅＣｈｉｐマウスゲノム４３０  ２．０アレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）は有用である。試料の標識および処理、ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーション、および走査はＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのプロトコルに従って実施されてきた。実施すべき組織からのｍＲＮＡの単離を低減するため、そして検出力に必要とされる試料の最小数を決定するための研究を完了した。簡潔には、二本鎖ｃＤＮＡを総ＲＮＡからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて合成し、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター部位をその３’末端に付加した（Ｇｅｎｓｅｔ，カリフォルニア州ラホヤ）。ＢｉｏＡｒｒａｙ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ標識キット（Ｅｎｚｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いることにより、ビオチン化されたｃＲＮＡをｃＤＮＡからインビトロで生成し、増幅した。ｃＲＮＡのＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ，ドイツ、ヒルデン）による精製後、２０μｇのｃＲＮＡを９４℃で３５分間断片化した。おおよそ１２．５μｇの断片化されたｃＲＮＡを、ニシン精子ＤＮＡ（０．１ｍｇ／ｍｌ；Ｐｒｏｍｅｇａ）＋ハイブリダイゼーション効率に関する内部対照の役目を果たす細菌およびファージｃＲＮＡ対照（１．５ｐＭ  ＢｉｏＢ、５ｐＭ  ＢｉｏＣ、２５ｐＭ  ＢｉｏＤ、および１００ｐＭ  Ｃｒｅ）を含有する２５０μｌのハイブリダイゼーション混合物中で用いた。その混合物の一定分量（２００μｌ）を、ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーションオーブン６４０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）中で４５℃において１８時間アレイにハイブリダイズさせた。それぞれのアレイを、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ  ４５０（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）上で洗浄し、ストレプトアビジン−フィコエリスリン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて染色し、ビオチン化抗ストレプトアビジン抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて増幅した。アレイをＧｅｎｅＡｒｒａｙ  Ｇ７スキャナー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で走査して画像およびシグナル強度を得た。その結果は、６個の独立した試料は検出力を提供するために十分であることを示唆している。
【００８３】
[0096]  ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング−ＲＮＡの標識およびマイクロアレイチップ上でのハイブリダイゼーションを、野生型およびＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスから単離したｍｉＲＮＡを用いて実施した。これらの研究は、実施すべき組織からのｍｉＲＮＡアレイ分析を低減するために、そして発現変化ならびに試料の検出力（ｓａｍｐｌｅ  ｐｏｗｅｒ）に関する統計的ベースラインを提供するために実施された。簡潔には、それぞれの試料からの５μｇの総ＲＮＡを５’ビオチン末端標識ランダムオクタマー（ｏｃｔｏｍｅｒ）オリゴプライマーを用いた逆転写によりビオチン標識した。ビオチン標識されたｃＤＮＡのハイブリダイゼーションを、２４５個のヒトｍｉＲＮＡ遺伝子および２００個のマウスｍｉＲＮＡ遺伝子が含まれる８００種類のｍｉＲＮＡプローブを４通り（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）で含有するｍｉＲＮＡマイクロアレイチップ（オハイオ州立大学、Ｖｅｒ．２．０）上で実施した。ハイブリダイゼーションシグナルをストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートβによりＡｘｏｎスキャナー４０００Ｂを用いて検出し、ＧＥＮＥＰＩＸ  ６．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により定量化した。その結果は、６個体の独立した年齢を合わせたマウスの組織試料は検出力に関して十分であることを示している。
【００８４】
[0097]  マイクロアレイの結果の検証−実験測定の間のマイクロアレイ分析の結果は代わりの方法によることもできる。最も頻繁に用いられる方法は、リアルタイムＰＣＲである。マイクロアレイの結果の検証は、２つの理由のために行われてよい：第１に、観察された変化を検証するためおよびそれらが多数の試料において再現性があることを保証するため；そして第２に、そのアレイの結果がアレイの技術または方法における固有の問題に起因するものではなかったことを保証するため。加えて、特定の態様において、マイクロアレイにおける蛍光検出の相対的に限定された動作範囲は感度および特異性の両方に限界を置く。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７９００ＨＴ配列検出システムまたはｎＣｏｕｎｔｅｒデジタル分析システム（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のどちらかを用いて、予め設計されたプライマーおよび試薬を用いて、発現プロファイリングデータの検証を実施する。定量的なコンピューターを使った分析を実施する。
【００８５】
[0098]  抗体試薬はそのバイオマーカーのｍＲＮＡのタンパク質生成物の全てに対して存在する。さらに、これらの抗体試薬の１２種類がＩＨＣ分析に関して検証されている。ウェスタンまたはＩＨＣにおける使用に関して抗体試薬を検証するための代わりの方法は、タンパク質バイオマーカーに対するペプチド由来のポリクローナル抗体を構築することである。これは、オハイオ州立大学総合がんセンターコアシステムを用いて成し遂げることができる。これらの抗体試薬は、その発現パターンが有効なＮＳＡＩＤに反応して変化するｍＲＮＡのタンパク質生成物を調べるためのものである。野生型およびＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスに関する腸組織を比較のために調べる。ｍＲＮＡ／タンパク質バイオマーカーに関連する同定された追加の経路の構成要素を、それらの発現および翻訳後修飾に関して、適切な抗血清を用いて、ウェスタンおよびＩＨＣ分析により調べる。ｍＲＮＡの発現の変化およびそれらのｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の発現の間の関係を評価する。
【００８６】
[0099]  ＬＳＩＨＮＰＣＣマウスモデルの開発。
【００８７】
[00100]  Ｍｓｈ２のエキソン１２がＬｏｘＰ組換え部位により隣接されているマウスモデル（Ｍｓｈ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）を作製した。Ｍｓｈ２の欠失を、ビリンプロモーターの制御下のＣｒｅリコンビナーゼ（ＶｐＣ＋／＋）の組織特異的発現により腸上皮に標的化し、それは結果として影響を受ける組織におけるＭｓｈ２タンパク質の非存在をもたらす。腫瘍発生は腸に限られ、ＭＳＩが含まれるＨＮＰＣＣ様腫瘍の病理学的特徴の全てを有する。このマウスモデルの有用性を考える際、現在のＬＳ／ＨＮＰＣＣは大部分が結腸において生じるが、それは元々胃がんとして記述されたことを特筆することは重要である。さらに、それらのヒトの対応物と同様に、ＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスは急速に進行するようである１〜２個の腫瘍を発現する（そして最終的にはそのために死ぬ）。この後者の表現型は、ＮＳＡＩＤの腫瘍の多数性への作用が事実上決定不可能であるため、このＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスモデルの欠点の１つである。しかし、腫瘍の数が小さいため、腫瘍の開始および／または進行へのあまり大きくない作用でさえもこれらのＬＳ／ＨＮＰＣＣマウスの生存に対して実証された作用を有し得る。
【００８８】
[00101]  代わりのマウスモデルには、アゾキシメタンに誘導されるＬＳ／ＨＮＰＣＣ結腸がんモデルが含まれる。このモデルは、表現型がヒトの保因者に類似しているヘテロ接合性のＭｓｈ２ｌｏｘ／＋ＶｐＣ＋／＋マウスを用いた。
【００８９】
[00102]  マウス腫瘍発生に対するＮＳＡＩＤの化学予防分析に関する評価項目は生存である。腫瘍の動態、処置計画および腫瘍発達の間の病理学的変化の評価は、相関的定量的データベースを構築する。
【００９０】
[00103]  統計分析
[00104]  生物情報学的分析および統計分析はオハイオ州立大学の生物情報学センター（ＣＢＯＳＵ）と共同で実施される。生存率を各用量の化学予防薬および未処置の対照群の間で比較する。各薬物に関して用量ごとの群あたりｎ＝２０匹のマウスが用いられ、処置の開始後１年の時点で３０％の生存の差を検出するための８０％の検出力があると計算される。これらの計算は、その薬物群のそれぞれに関するおおよその生存率は５０％であるが対照群に関するおおよその生存率は２０％であると仮定している。生存分析に関して対数順位検定が用いられ、その結果を示すためにカプラン・マイヤー曲線が用いられる。有意に増大した生存が特定の薬物処置に関して観察される場合、それらの群の生存を二次（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）として比較する。他の測定、例えば腫瘍の数、腫瘍の部位、および腫瘍の病理を二次評価項目と考える。腫瘍の数を二標本ｔ検定を用いて比較し、他の２つの測定に関して記述統計を提供する。
【００９１】
[00105]  マイクロアレイを用いて、同じ薬物処置により有効な化学予防を示す組織および屈折性（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅ）化学予防を示す組織の間の一般的なｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの発現の違いを調べる。ＯＳＵがカスタマイズしたｍｉＲＮＡマイクロアレイチップをｍｉＲＮＡ発現研究のために用いる。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐを遺伝子発現研究のために用いる。ノイズカットオフより上のアレイの高い割合の必要性に基づくフィルタリング法を適用して、低発現ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡをフィルタリングして除く。変位値正規化（ｑｕａｎｔｉｌｅ  ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏ）法をアレイにわたる正規化のために用いる。線形モデルを実施して差次的に発現した遺伝子を検出する。遺伝子発現レベルを、ｍＲＮＡ発現に関するＲＭＡ法を用いてプローブセットにわたってまとめることができる。差次的発現に関する変動性の概算および統計的検定を向上させるため、分散収縮法（Ｖａｒｉａｎｃｅ  ｓｈｒｉｎｋａｇｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ）を用いることができる。有意性レベルを偽陽性の平均数を制御することにより調節する。遺伝子のクラスまたは経路を同定するため、ＥＡＳＥ（国立アレルギー・感染症研究所、メリーランド州ベセスダ）、ＢＲＢアレイツール、およびＩｎｇｅｎｕｉｔｙソフトウェア（Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，カリフォルニア州レッドウッドシティ）を用いた。フィルタリング後、おおよそ１０，０００種類のｍＲＮＡまたは７００種類のｍｉＲＮＡをそのチップ上で試験することができる。この方法論において、全ての試験可能なｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡに関して１０または５個の偽陽性が許容される。各薬物の用量ごとの群あたりｎ＝６匹のマウスが用いられ、ａ＝０．００１において、ＣＶ＝２０％と仮定して、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ発現における２倍の差を検出するための８０％より大きい検出力がある。一度未処置と比較した遺伝子発現変化のリストが各薬物に関して各用量において同定されたら、共通の遺伝子を同定する。興味深い同定されたｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡの発現ならびにそれらの遺伝子の発現への用量の作用の間の相関を、線形混合モデルを探索（ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ）として用いて調べる。
【００９２】
[00106]  さらなる方法および定義
[00107]  前記の一般的な記述および以下の詳細な記述は両方とも典型的かつ説明的なものでしかなく、本教示の範囲を限定することは意図していないことは理解されるべきである。この出願において、別途明確に記載しない限り、単数形の使用には複数形が含まれる。
【００９３】
[00108]  単語“ａ”または“ａｎ”の使用は、特許請求の範囲および／または明細書中で用語“含む”と合わせて用いられる場合、“１”を意味してよいが、それは“１以上”、“少なくとも１”、および“１または１より多く”の意味とも矛盾しない。
【００９４】
[00109]  また、“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）”、“含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）”、および“含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅ）”、またはそれらの基語の修飾、例えば“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）”、“含有した（ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）”、および“含まれること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”（それらに限定されない）の使用は、限定であることを意図していない。用語“および／または”は、前後の用語を一緒に、または別々に選ぶ（ｔａｋｅｎ）ことができることを意味する。説明目的のため、しかし限定としてではなく、“Ｘおよび／またはＹ”は“Ｘ”もしくは“Ｙ”または“ＸおよびＹ”を意味することができる。
【００９５】
[00110]  ｍｉＲＮＡはゲノム配列または遺伝子に由来することが理解されている。この点において、用語“遺伝子”は簡単化のために所与のｍｉＲＮＡに関する前駆体ｍｉＲＮＡをコードするゲノム配列を指して用いられている。しかし、本発明の態様は、その発現に関わるｍｉＲＮＡのゲノム配列、例えばプロモーターまたは他の制御配列を含んでよい。
【００９６】
[00111]  用語“ｍｉＲ”、“ｍｉｒ”および“ｍｉＲＮＡ”は一般に、ＲＮＡの翻訳を調節することができる小さいＲＮＡ分子のクラスであるマイクロＲＮＡを指す（Zeng and Cullen, RNA, 9(1):112-123, 2003; Kidner and Martienssen Trends Genet, 19(1):13-6, 2003; Dennis C, Nature, 420(6917):732, 2002; Couzin J, Science 298(5602):2296-7, 2002を参照、そのそれぞれを参照により本明細書に援用する）。
【００９７】
[00112]  ｍｉＲＮＡはゲノム配列または遺伝子に由来することが理解されている。この点において、用語“遺伝子”は簡単化のために所与のｍｉＲＮＡに関する前駆体ｍｉＲＮＡをコードするゲノム配列を指して用いられている。しかし、本発明の態様は、その発現に関わるｍｉＲＮＡのゲノム配列、例えばプロモーターまたは他の制御配列を含んでよい。
【００９８】
[00113]  用語“ｍｉＲＮＡ”は一般に一本鎖分子を指すが、特定の態様において、本発明において実現される分子は、同じ一本鎖分子の別の領域に、または別の核酸に部分的に（鎖の長さにわたる相補性が１０〜５０％）、実質的に（鎖の長さにわたる相補性が５０％より大きいが１００％未満）、または完全に相補的である領域または追加の鎖も含むであろう。従って、核酸は、分子を含む特定の配列の１個またはこれ以上の相補または自己相補鎖（単数または複数）または“相補物（単数または複数）”を含む分子を含んでよい。例えば、前駆体ｍｉＲＮＡは１００％まで相補的である自己相補的な領域を有していてよく、本発明のｍｉＲＮＡプローブはそれらの標的に少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％相補的であることができ、または相補的である。
【００９９】
[00114]  用語“それらの組み合わせ”は、本明細書で用いられる際、その用語に先行する列挙された項目の全ての並べ替えおよび組み合わせを指す。例えば、“Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組み合わせ”は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣの少なくとも１つを含み、特定の文脈において順序が重要である場合、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣ、またはＣＡＢも含むことを意図している。
【０１００】
[00115]  別途言及しない限り、技術用語は慣習的な用法に従って用いられる。分子生物学における一般的な用語の定義は、Benjamin Lewin, Genes V, Oxford University Press出版、1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Kendrew et al. (編者), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd.出版、1994 (ISBN 0-632-02182-9)；およびRobert A. Meyers (編者), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc.出版、1995 (ISBN 1-56081-569-8)において見つけることができる。
【０１０１】
[00116]  本開示の様々な態様の再考を容易にするため、以下の特定の用語の説明を提供する：
[00117]  補助的療法：一次処置の効果を向上させるために一次処置との組み合わせで用いられる処置。
【０１０２】
[00118]  臨床転帰：疾患もしくは障害に関する処置後の、または処置なしでの患者の健康状態を指す。臨床転帰には、死亡までの時間の長さにおける増大、死亡までの時間の長さにおける減少、生存の機会における増大、死亡の危険性における増大、生存、疾患なしでの生存、慢性疾患、転移、進行した、または侵攻性の疾患、疾患の再発、死亡、および療法に対する望ましい、または乏しい応答が含まれるが、それらに限定されない。
【０１０３】
[00119]  対照：“対照”は、実験試料、例えば患者から得られた腫瘍試料との比較のために用いられる試料または標準を指す。
【０１０４】
[00120]  生存における減少：本明細書で用いられる際、“生存における減少”は、患者の死亡前の時間の長さの減少、またはその患者の死亡の危険性の増大を指す。
【０１０５】
[00121]  発現のレベルを検出すること：例えば、“ｍｉＲまたはｍｉＲＮＡ発現のレベルを検出すること”は、試料中に存在するｍｉＲまたはｍｉＲＮＡの量を定量化することを指す。特定のｍｉＲ、またはあらゆるマイクロＲＮＡの発現を検出することは、当技術で既知の、または本明細書で記述されるあらゆる方法を用いて、例えばｑＲＴ−ＰＣＲにより達成することができる。ｍｉＲの発現を検出することには、ｍｉＲＮＡの成熟形態またはｍｉＲＮＡの発現と相関している前駆体形態のどちらかの発現を検出することが含まれる。典型的には、ｍｉＲＮＡ検出法は、例えばＲＴ−ＰＣＲによる配列特異的検出を含む。ｍｉＲ特異的プライマーおよびプローブは、その前駆体および成熟したｍｉＲ核酸の配列を用いて設計することができ、それは当技術で既知である。
【０１０６】
[00122]  マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）：遺伝子発現を制御する一本鎖ＲＮＡ分子。マイクロＲＮＡは一般に２１〜２３ヌクレオチドの長さである。マイクロＲＮＡは、一次ｍｉＲＮＡとして知られる一次転写産物からプロセシングされて前駆体（前）ｍｉＲＮＡと呼ばれる短いステムループ構造になり、最終的に機能する成熟したマイクロＲＮＡになる。成熟したマイクロＲＮＡ分子は１種類又はこれ以上のメッセンジャーＲＮＡ分子に部分的に相補的であり、それらの主な機能は遺伝子発現を下方制御することである。マイクロＲＮＡは遺伝子発現をＲＮＡｉ経路を通して制御する。
【０１０７】
[00123]  ｍｉＲ発現：本明細書で用いられる際、“低ｍｉＲ発現”および“高ｍｉＲ発現”は、試料中にあるｍｉＲＮＡのレベルを指す相対的な用語である。一部の態様において、低および高ｍｉＲ発現は、対照試料および試験試料の群中のｍｉＲＮＡレベルの比較により決定される。次いで低および高発現を、試料中のｍｉの発現が平均ｍｉＲ発現レベルまたはｍｉＲ発現レベルの中央値よりも上である（高い）か、または下である（低い）かに基づいて、それぞれの試料に割り当てることができる。個々の試料に関して、高または低ｍｉＲ発現は、その試料の高もしくは低発現を有することが既知である対照もしくは基準試料に対する比較により、または標準値に対する比較により決定することができる。低および高ｍｉＲ発現には、ｍｉＲＮＡの前駆体もしくは成熟形態のどちらか、または両方の発現が含まれ得る。
【０１０８】
[00124]  対象：本明細書で用いられる際、用語“対象”にはヒトおよび非ヒト動物が含まれる。処置に関する好ましい対象はヒトである。“患者”および“対象”は、本明細書において互換的に用いられている。
【０１０９】
[00125]  医薬的に許容できるビヒクル：この開示において有用な医薬的に許容できるキャリヤー（ビヒクル）は従来のものである。E. W. Martin, Mack Publishing Co.（ペンシルベニア州イーストン）によるRemington’s Pharmaceutical Sciences、第１５版(1975)は、１種類以上の療法化合物、分子または薬剤の医薬的送達に適した組成物および配合物を記載している。
【０１１０】
[00126]  疾患を予防、処置または改善すること：疾患を“予防すること”は、疾患の完全な発現を抑制することを指す。“処置すること”は、疾患の徴候もしくは症状または病的状態をそれが発現し始めた後に改善する療法的介入を指す。“改善すること”は、疾患の徴候または症状の数または重症度における低減を指す。
【０１１１】
[00127]  スクリーニング：本明細書で用いられる際、“スクリーニング”は、そのような疾患に影響を及ぼす候補薬剤を評価および同定するために用いられるプロセスを指す。マイクロＲＮＡの発現は、当技術で既知の、および本明細書で記述されるいくつかの技法のいずれか１つを用いて、例えばマイクロアレイ分析により、またはｑＲＴ−ＰＣＲにより定量化することができる。
【０１１２】
[00128]  小分子：典型的には約１０００ダルトン未満、または一部の態様において約５００ダルトン未満の分子量を有する分子、ここでその分子はある測定可能な程度まで標的分子の活性を調節することができる。
【０１１３】
[00129]  療法的：診断および処置の両方が含まれる総称。
【０１１４】
[00130]  療法剤：対象に適切に投与された際に所望の療法的または予防的作用を誘導することができる化学化合物、小分子、または他の組成物、例えばアンチセンス化合物、抗体、プロテアーゼ阻害剤、ホルモン、ケモカインまたはサイトカイン。
【０１１５】
[00131]  本明細書で用いられる際、“候補薬剤”は、それが療法剤として機能することができるかどうかを決定するためのスクリーニングのために選択された化合物である。“保温すること”には、薬剤に関する細胞または組織と相互作用するための十分な長さの時間が含まれる。“接触させること”には、固体または液体形態の薬剤を細胞または組織と共に保温することが含まれる。細胞または組織を薬剤で“処置すること”には、その薬剤をその細胞もしくは組織と接触させること、またはその薬剤をその細胞もしくは組織と共に保温することが含まれる。
【０１１６】
[00132]  療法上有効量：その薬剤で処置されている対象において、または細胞において所望の作用を達成するために十分な明記された医薬または療法剤の量。薬剤の有効量は、処置されている対象または細胞、およびその療法組成物の投与の方法が含まれるがそれらに限定されないいくつかの要因に依存するであろう。
【０１１７】
[00133]  本方法の一部の態様において、対照の使用が望ましい。その点において、その対照は同じ患者から得られた非がん性細胞／組織試料、または健康な対象、例えば健康な組織提供者から得られた細胞／組織試料であってよい。別の例において、その対照は既存の（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ）値から計算された標準である。腫瘍試料および非がん性細胞／組織試料は、当技術で既知のあらゆる方法に従って得ることができる。例えば、腫瘍および非がん性試料は、切除を受けたがん患者から得ることができ、またはそれらは皮下針を用いた抜き取りにより、顕微手術により、もしくはレーザー捕獲により得ることができる。対照（非がん性）試料は、例えば死体提供者から、または健康な提供者から得ることができる。
【０１１８】
[00134]  その活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子は、ｍｉＲ前駆体から、天然のプロセシング経路を通して（例えば完全な細胞または細胞溶解物を用いて）、または合成的プロセシング経路により（例えば単離されたプロセシング酵素、例えば単離されたＤｉｃｅｒ、Ａｒｇｏｎａｕｔ、またはＲＮＡ分解酵素ＩＩＩを用いて）得ることができる。その活性な１９〜２５ヌクレオチドのＲＮＡ分子はｍｉＲ前駆体からプロセシングされなければならないわけではなく、生物学的合成または化学合成により直接生成することもできることは理解されている。マイクロＲＮＡが本明細書において名前により言及される場合、別途示さない限り、その名前はその前駆体および成熟形態両方に対応する。
【０１１９】
[00135]  少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルをその対象から得た生物学的試料の細胞において測定することができる。例えば、組織試料を卵巣がんを有することが疑われる対象から従来の生検技法により採取することができる。別の態様において、血液試料を対象から採取することができ、標準的な技法によるＤＮＡ抽出物のために白血球を分離することができる。その血液または組織試料は、好ましくは放射線療法、化学療法、または他の療法処置の開始前に対象から得られる。対応する対照組織もしくは血液試料、または対照参照試料は、その対象の冒されていない組織から、正常なヒトの個体もしくは正常な個体の集団から、またはその対象の試料中の細胞の大部分に対応する培養細胞から得ることができる。次いでその対照の組織または血液試料を、その対象の試料からの細胞中の所与のｍｉＲ遺伝子から生成されたｍｉＲ遺伝子産物のレベルをその対照試料の細胞からの対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することができるように、その対象からの試料と一緒に処理する。あるいは、参照試料をその試験試料とは別に（例えば異なる時点において）得て処理することができ、その試験試料からの細胞中の所与のｍｉＲ遺伝子から生成されたｍｉＲ遺伝子産物のレベルをその参照試料からの対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較することができる。
【０１２０】
[00136]  １態様において、その試験試料中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも大きい（すなわち、そのｍｉＲ遺伝子産物の発現は“上方制御されている”、または“増大している”）。本明細書で用いられる際、ｍｉＲ遺伝子産物の発現は、対象からの細胞または組織試料中のｍｉＲ遺伝子産物の量が対照の細胞または組織試料中の同じ遺伝子産物の量よりも大きい場合に増大している。別の態様において、その少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも小さい（すなわち、そのｍｉＲ遺伝子産物の発現は“下方制御されている”、または“減少している”）。本明細書で用いられる際、ｍｉＲ遺伝子の発現は、対象からの細胞または組織試料中のその遺伝子から産生されたｍｉＲ遺伝子産物の量が対照の細胞または組織試料中の同じ遺伝子から産生された量よりも少ない場合に減少している。対照および正常な試料中の相対的なｍｉＲ遺伝子発現は、１種類以上のＲＮＡ発現標準に関して決定することができる。その標準は、例えばゼロｍｉＲ遺伝子発現レベル、標準的な細胞株におけるそのｍｉＲ遺伝子の発現レベル、その対象の冒されていない組織におけるそのｍｉＲ遺伝子の発現レベル、または以前に正常なヒトの対照の集団に関して得られたｍｉＲ遺伝子発現の平均レベルを含み得る。
【０１２１】
[00137]  その対象から得られた試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルにおける、対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルと比較した変化（すなわち増大または減少）は、その対象における卵巣がんの存在を示している。１態様において、その試験試料中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、その対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも大きい。別の態様において、その試験試料中の少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、その対照試料中の対応するｍｉＲ遺伝子産物のレベルよりも小さい。
【０１２２】
[00138]  特定の態様において、その少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は本明細書における表および図において示されているような群から選択される。
【０１２３】
[00139]  試料中のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、生物学的試料中のＲＮＡ発現レベルを検出するのに適したあらゆる技法を用いて測定することができる。生物学的試料（例えば細胞、組織）中のＲＮＡ発現レベルを決定するための適切な技法（例えばノーザンブロット分析、ＲＴ−ＰＣＲ、インサイチュハイブリダイゼーション）は、当業者には周知である。特定の態様において、少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルはノーザンブロット分析を用いて検出される。例えば、細胞の総ＲＮＡを細胞から核酸抽出緩衝液の存在下でのホモジナイゼーション、続いて遠心分離により精製することができる。核酸が沈殿し、ＤＮＡをＤＮアーゼによる処理および沈殿により除去する。次いでそのＲＮＡ分子を標準的な技法に従うアガロースゲル上でのゲル電気泳動により分離し、ニトロセルロースフィルターに転写する。次いでそのＲＮＡを加熱によりそのフィルター上に固定する。特定のＲＮＡの検出および定量化は、問題のＲＮＡに相補的な適切に標識されたＤＮＡまたはＲＮＡプローブを用いて成し遂げられる。例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al.（編者）, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 第７章を参照、その全開示を参照により援用する。
【０１２４】
[00140]  所与のｍｉＲ遺伝子産物のノーザンブロットハイブリダイゼーションのための適切なプローブ（例えばＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ）は本明細書中の表において提供される核酸配列から生成することができ、それには対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の相補性を有するプローブ、ならびに対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する完全な相補性を有するプローブが含まれるが、それらに限定されない。標識されたＤＮＡおよびＲＮＡプローブの調製のための方法ならびにその標的ヌクレオチド配列へのハイブリダイゼーションに関する条件は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook et al.（編者）, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 第１０章および第１１章において記述されており、その開示を参照により本明細書に援用する。
【０１２５】
[00141]  例えば、その核酸プローブは、例えば放射性核種、例えば３Ｈ、３２Ｐ、３３Ｐ、１４Ｃ、または３５Ｓ；重金属；標識された結合基（ｌｉｇａｎｄ）に関する特異的な結合対のメンバーとして機能することができる結合基（例えばビオチン、アビジン、または抗体）；蛍光分子；化学発光分子；酵素等を用いて標識することができる。
【０１２６】
[00142]  プローブは、Rigby et al. (1977), J. Mol. Biol. 113:237-251のニックトランスレーション法またはFienberg et al. (1983), Anal. Biochem. 132:6-13のランダムプライミング法のどちらかにより高い特異的活性まで標識することができ、その全開示を参照により本明細書に援用する。後者は一本鎖ＤＮＡから、またはＲＮＡ鋳型から高い特異的活性の３２Ｐ標識されたプローブを合成するための一般的に好まれる方法である。例えば、ニックトランスレーション法に従って既存のヌクレオチドを高度に放射性のヌクレオチドを用いて置き換えることにより、１０８ｃｐｍ／マイクログラムを十分に超える特異的活性を有する３２Ｐ標識された核酸プローブを調製することが可能である。次いでハイブリダイズさせたフィルターを写真フィルムに曝露することにより、ハイブリダイゼーションのオートラジオグラフィーによる検出を実施することができる。ハイブリダイズさせたフィルターに曝露した写真フィルムのデンシトメトリーによる走査は、ｍｉＲ遺伝子転写産物のレベルの正確な測定を提供する。別のアプローチを用いて、ｍｉＲ遺伝子転写産物のレベルをコンピューター化された画像化システム、例えばＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）から入手可能なＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ４００−Ｂ  ２Ｄ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒにより定量化することができる。
【０１２７】
[00143]  ＤＮＡまたはＲＮＡプローブの放射性核種標識が現実的でない場合、ランダムプライマー法を用いて類似体、例えばｄＴＴＰ類似体５−（Ｎ−（Ｎ−ビオチニル−イプシロン−アミノカプロイル）−３−アミノアリル）デオキシウリジン三リン酸をプローブ分子中に組み込むことができる。そのビオチン化されたプローブオリゴヌクレオチドは、蛍光色素または呈色反応を生成する酵素に連結したビオチン結合タンパク質、例えばアビジン、ストレプトアビジンおよび抗体（例えば抗ビオチン抗体）との反応により検出することができる。
【０１２８】
[00144]  ノーザンおよび他のＲＮＡハイブリダイゼーション技法に加えて、ＲＮＡ転写産物のレベルを決定することはインサイチュハイブリダイゼーションの技法を用いて成し遂げることができる。この技法はノーザンブロッティング技法よりも少ない細胞しか必要とせず、細胞全体を顕微鏡カバーガラス上に置き、その細胞の核酸内容物を放射性または他の方法で標識された核酸（例えばｃＤＮＡまたはＲＮＡ）プローブを含有する溶液で調べることを含む。この技法は、対象からの組織生検試料を分析するのに特によく適している。インサイチュハイブリダイゼーション技法の実施は米国特許第５，４２７，９１６号においてより詳細に記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。所与のｍｉＲ遺伝子産物のインサイチュハイブリダイゼーションのための適切なプローブは、本明細書中の表において提供されている核酸配列から生成することができ、それには、上記で記述されたような対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の相補性を有するプローブ、ならびに対象のｍｉＲ遺伝子産物に対する完全な相補性を有するプローブが含まれるが、それらに限定されない。
【０１２９】
[00145]  細胞中のｍｉＲ遺伝子転写産物の相対的な数は、ｍｉＲ遺伝子転写産物の逆転写、続いてポリメラーゼ連鎖反応による逆転写された転写産物の増幅（ＲＴ−ＰＣＲ）により決定することもできる。ｍｉＲ遺伝子転写産物のレベルは、内部標準、例えば同じ試料中に存在する“ハウスキーピング”遺伝子からのｍＲＮＡのレベルと比較して定量化することができる。内部標準としての使用のための適切な“ハウスキーピング”遺伝子には、例えばミオシンまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇ３ＰＤＨ）が含まれる。定量的および半定量的ＲＴ−ＰＣＲならびにその変形を実施するための方法は、当業者には周知である。
【０１３０】
[00146]  一部の場合において、試料中の複数の異なるｍｉＲ遺伝子産物の発現レベルを同時に決定することが望ましい可能性がある。他の場合では、がんと相関している全ての既知のｍｉＲ遺伝子の転写産物の発現レベルを決定することが望ましい可能性がある。数百のｍｉＲ遺伝子または遺伝子産物のがん特異的発現レベルを評価することは時間がかかり、大量の総ＲＮＡ（例えばそれぞれのノーザンブロットに関して少なくとも２０μｇ）および放射性同位体を必要とするオートラジオグラフィーの技法を必要とする。
【０１３１】
[00147]  これらの限界を克服するため、ｍｉＲ遺伝子のセットに特異的であるオリゴヌクレオチド（例えばオリゴデオキシヌクレオチド）プローブのセットを含有するマイクロチップ形式（すなわちマイクロアレイ）のオリゴライブラリーを構築することができる。そのようなマイクロアレイを用いることで、生物学的試料中の多数のマイクロＲＮＡの発現レベルを、ＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを生成し、それらをそのマイクロアレイ上のオリゴヌクレオチドを調べるためにハイブリダイズさせてハイブリダイゼーションプロファイルまたは発現プロファイルを生成することにより決定することができる。次いでその試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料のハイブリダイゼーションプロファイルと比較して、どのマイクロＲＮＡが卵巣がん細胞において変化した発現レベルを有するかを決定することができる。本明細書で用いられる際、“プローブオリゴヌクレオチド”または“プローブデオキシオリゴヌクレオチド”は、標的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを指す。“標的オリゴヌクレオチド”または“標的デオキシオリゴヌクレオチド”は、（例えばハイブリダイゼーションにより）検出されるべき分子を指す。“ｍｉＲ特異的プローブオリゴヌクレオチド”または“ｍｉＲに特異的なプローブオリゴヌクレオチド”は、特異的なｍｉＲ遺伝子産物に、または特異的なｍｉＲ遺伝子産物の逆転写産物にハイブリダイズするように選択された配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを意味する。
【０１３２】
[00148]  特定の試料の“発現プロファイル”または“ハイブリダイゼーションプロファイル”は、本質的にその試料の状態のフィンガープリントであり；２つの状態が類似して発現したあらゆる特定の遺伝子を有し得るが、いくつかの遺伝子の評価はその細胞の状態に特有である遺伝子発現プロファイルの生成を同時に可能にする。すなわち、正常な組織をがん細胞から識別することができ、がん細胞の複数のタイプ内で異なる予後の状態（例えば良好な、または悪い長期生存の見込み）を決定することができる。異なる状態にある卵巣細胞の発現プロファイルを比較することにより、これらの状態のそれぞれにおいてどの遺伝子が重要であるかに関する情報（遺伝子の上方および下方制御両方が含まれる）が得られる。がん細胞または正常細胞において差次的に発現している配列、ならびに結果として異なる予後転帰をもたらす差次的発現の同定は、いくつかの方法でのこの情報の使用を可能にする。例えば、特定の処置計画を（例えば化学療法薬が特定の患者において長期予後を向上させるように作用するかどうかを決定するために）評価することができる。同様に、患者の試料を既知の発現プロファイルと比較することにより、診断を行う、または確証することができる。さらに、これらの遺伝子発現プロファイル（または個々の遺伝子）は、ｍｉＲもしくは疾患発現プロファイルを抑制する、または悪い予後のプロファイルをよりよい予後のプロファイルに変換する薬物候補のスクリーニングを可能にする。
【０１３３】
[00149]  そのマイクロアレイは、既知のｍｉＲＮＡ配列から生成された遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから調製することができる。そのアレイは、それぞれのｍｉＲＮＡに関する２種類の異なるオリゴヌクレオチドプローブ（一方は活性な成熟した配列を含有し、他方はそのｍｉＲＮＡの前駆体に特異的である）を含有することができる。そのアレイは、対照、例えばヒトのオルソログと数塩基のみ異なる１種類以上のマウスの配列も含有していてよく、それはハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの条件に関する対照の役目を果たすことができる。両方の種からのｔＲＮＡおよび他のＲＮＡ（例えばｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）をマイクロチップ上にプリントし、特定のハイブリダイゼーションに関する内部の、比較的安定な陽性対照を提供することもできる。非特異的ハイブリダイゼーションに関する１種類又はこれ以上の適切な対照がそのマイクロチップ上に含まれていてもよい。この目的に関して、配列はあらゆる既知のｍｉＲＮＡと一切相同性がないことに基づいて選択される。
【０１３４】
[00150]  そのマイクロアレイは当技術で既知の技法を用いて製作することができる。例えば、適切な長さ、例えば４０ヌクレオチドのプローブオリゴヌクレオチドをＣ６位において５’−アミン修飾し、商業的に入手可能なマイクロアレイシステム、例えばＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅ  ＯｍｎｉＧｒｉｄ（商標）１００マイクロアレイヤーおよびＡｍｅｒｓｈａｍ  ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）活性化スライドを用いてプリントする。その標的ＲＮＡに対応する標識されたｃＤＮＡオリゴマーを、その標的ＲＮＡを標識されたプライマーを用いて逆転写することにより調製する。最初の鎖の合成の後、そのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドを変性させてＲＮＡ鋳型を分解する。こうして調製された標識された標的ｃＤＮＡを、次いでそのマイクロアレイチップにハイブリダイズする条件（例えば２５℃において６×ＳＳＰＥ／３０％ホルムアミド中で１８時間）下でハイブリダイズさせ、続いて０．７５×ＴＮＴで３７℃において４０分間洗浄する。その固定されたプローブＤＮＡが試料中の相補的な標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置において、ハイブリダイゼーションが起こる。その標識された標的ｃＤＮＡは結合が起こるアレイ上の正確な位置を示し、自動的な検出および定量化を可能にする。その出力は、患者試料中の特異的なｃＤＮＡ配列の相対的存在量、従って対応する相補的ｍｉＲの相対的存在量を示すハイブリダイゼーション事象のリストからなる。１態様によれば、その標識されたｃＤＮＡオリゴマーはビオチン標識されたプライマーから調製されたビオチン標識されたｃＤＮＡである。次いでそのマイクロアレイを、例えばストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートを用いるビオチン含有転写産物の直接検出により処理し、一般に用いられる走査法を利用して走査する。そのアレイ上のそれぞれのスポットの画像強度は、その患者試料中の対応するｍｉＲの存在量に比例している。
【０１３５】
[00151]  そのアレイの使用は、ｍｉＲＮＡ発現の検出に関するいくつかの利点を有する。第１に、数百種類の遺伝子の全体的な発現を同じ試料中で１つの時点において同定することができる。第２に、オリゴヌクレオチドプローブの注意深い設計により、成熟した分子および前駆体分子の両方の発現を同定することができる。第３に、ノーザンブロット分析と比較して、そのチップは少量のＲＮＡしか必要とせず、２．５μｇの総ＲＮＡを用いて再現性のある結果を提供する。その比較的限られた数のｍｉＲＮＡ（種あたり数百）は、それぞれに関して異なるオリゴヌクレオチドプローブを有する、いくつかの種に関する共通のマイクロアレイの構築を可能にする。そのような道具は、様々な条件下でのそれぞれの既知のｍｉＲに関する種を越えた発現の分析を可能にするであろう。
【０１３６】
[00152]  特異的なｍｉＲの定量的発現レベルアッセイのための使用に加えて、ｍｉＲＮｏｍｅの実質的な部分、好ましくはｍｉＲＮｏｍｅ全体に対応するｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含有するマイクロチップを用いて、ｍｉＲ発現パターンの分析のためにｍｉＲ遺伝子発現プロファイリングを実施することができる。異なるｍｉＲシグネチャーを、確立された疾患マーカーと、または直接疾患状態と関連付けることができる。
【０１３７】
[00153]  本明細書に記述される発現プロファイリング法に従って、がんを有することが疑われる対象からの試料からの総ＲＮＡを定量的に逆転写して、その試料中のＲＮＡに相補的な標識された標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供する。次いでその標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせてその試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供する。その結果は、その試料中のｍｉＲＮＡの発現パターンを表すその試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルである。そのハイブリダイゼーションプロファイルは、その試料からの標的オリゴデオキシヌクレオチドのそのマイクロアレイ中のｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドへの結合からのシグナルを含む。そのプロファイルは、結合の存在または非存在（シグナル対ゼロシグナル）として記録することができる。より好ましくは、その記録されたプロファイルには、それぞれのハイブリダイゼーションからのシグナルの強度が含まれる。そのプロファイルを正常な、例えば非がん性の対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較する。そのシグナルにおける変化は、その対象におけるがんの存在またはがんを発現する傾向を示している。あるいは、その試料プロファイルを既知のタイプまたは病因のがんから生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することができる。
【０１３８】
[00154]  特定の態様において、その少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物のレベルは、その対象から得られた試験試料からのＲＮＡを逆転写して標的オリゴデオキシヌクレオチドのセットを提供し、その標的オリゴデオキシヌクレオチドをｍｉＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイにハイブリダイズさせてその試験試料に関するハイブリダイゼーションプロファイルを提供し、そしてその試験試料のハイブリダイゼーションプロファイルを対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することにより測定される。
【０１３９】
[00155]  ｍｉＲ遺伝子発現を測定するための他の技法も当技術分野における技術の範囲内であり、それにはＲＮＡの転写および分解の速度を測定するための様々な技法が含まれる。
【０１４０】
[00156]  本明細書で定義される際、ｍｉＲ遺伝子産物の“変異体”は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物に対して１００％未満の同一性を有し、その対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の１種類以上の生物学的活性を有するｍｉＲＮＡを指す。そのような生物学的活性の例には、標的ＲＮＡ分子の発現の阻害（例えば、標的ＲＮＡ分子の翻訳を阻害する、標的ＲＮＡ分子の安定性を調節する、標的ＲＮＡ分子のプロセシングを阻害する）および卵巣と関係する細胞プロセス（例えば細胞分化、細胞増殖、細胞死）の阻害が含まれるが、それらに限定されない。これらの変異体には、種変異体（ｓｐｅｃｉｅｓ  ｖａｒｉａｎｔｓ）およびｍｉＲ遺伝子中の１個以上の変異（例えば置換、欠失、挿入）の結果である変異体が含まれる。特定の態様において、その変異体は対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物に対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である。
【０１４１】
[00157]  本明細書で定義される際、ｍｉＲ遺伝子産物の“生物学的に活性な断片”は、対応する野生型ｍｉＲ遺伝子産物の１種類またはこれ以上の生物学的活性を有するｍｉＲ遺伝子産物のＲＮＡ断片を指す。上記で記述したように、そのような生物学的活性の例には、標的ＲＮＡ分子の発現の阻害およびがんと関係する細胞プロセスの阻害が含まれるが、それらに限定されない。特定の態様において、その生物学的に活性な断片は少なくとも約５、７、１０、１２、１５、または１７ヌクレオチド長である。特定の態様において、単離されたｍｉＲ遺伝子産物は１種類以上の追加の抗がん処置との組み合わせで対象に投与することができる。適切な抗がん処置には、化学療法、ホルモン療法、放射線療法および組み合わせ（例えば化学放射線療法）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１４２】
[00158]  本発明の態様を用いて、適切な薬物を選択し、その腫瘍または細胞環境の選択された処置への応答性の予測および指標に基づいて患者の処置を適合させることができる。
【０１４３】
[00159]  用語“処置する”、“処置すること”および“処置”は、本明細書で用いられる際、疾患または病気、例えば卵巣がんと関係する症状を改善することを指し、それにはその疾患症状の開始を予防する、もしくは遅らせる、および／またはその疾患もしくは病気の症状の重症度もしくは頻度を減らすことが含まれる。用語“対象”および“個体”は、本明細書において、動物、例えば、霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラット、マウスまたは他のウシの、ヒツジの、ウマの、イヌの、ネコの、齧歯類の、もしくはマウスの種が含まれるがそれらに限定されない哺乳類を含むように定義されている。好ましい態様において、その動物はヒトである。
【０１４４】
[00160]  本明細書で用いられる際、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の“有効量”は、卵巣がんを患う対象中のがん細胞の増殖を阻害するために十分な量である。当業者は、所与の対象に投与するべきｍｉＲ遺伝子産物の有効量を、その対象の大きさおよび体重；疾患浸透（ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）の程度；その対象の年齢、健康状態および性別；投与の経路；ならびにその投与が局所性か全身性かのような要因を考慮することにより容易に決定することができる。
【０１４５】
[00161]  例えば、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、処置されるべき腫瘍塊のおおよその重量に基づくことができる。その腫瘍塊のおおよその重量は、その塊のおおよその体積を計算することにより決定することができ、ここで１立方センチメートルの体積はおおよそ１グラムに相当する。腫瘍塊の重量に基づく単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、約１０〜５００マイクログラム／腫瘍塊１グラムの範囲であることができる。特定の態様において、その腫瘍塊は、少なくとも約１０マイクログラム／腫瘍塊１グラム、少なくとも約６０マイクログラム／腫瘍塊１グラム、または少なくとも約１００マイクログラム／腫瘍塊１グラムであることができる。
【０１４６】
[00162]  単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、処置されるべき対象のおおよその、または推定される体重に基づくこともできる。好ましくは、そのような有効量は、本明細書で記述されるように、非経口で、または経腸的に投与される。例えば、対象に投与される単離されたｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、約５から３０００マイクログラム／ｋｇ体重まで、約７００から１０００マイクログラム／ｋｇ体重までの範囲、または約１０００マイクログラム／ｋｇ体重より多い量であることができる。
【０１４７】
[00163]  当業者は、単離されたｍｉＲ遺伝子産物の所与の対象への投与のための適切な投与計画も容易に決定することができる。例えば、ｍｉＲ遺伝子産物は対象に一度に（例えば単回注射または蓄積として）投与することができる。あるいは、ｍｉＲ遺伝子産物は対象に約３日間から約２８日間まで、より詳細には約７日間から約１０日間までの期間の間、１日１回または２回投与することができる。特定の投与計画において、ｍｉＲ遺伝子産物は１日１回７日間投与される。投与計画が多数回投与を含む場合、その対象に投与されるｍｉＲ遺伝子産物の有効量は、その投与計画全体にわたって投与される遺伝子産物の総量を含むことができる。
【０１４８】
[00164]  本明細書で用いられる際、“単離された”ｍｉＲ遺伝子産物は、合成された、またはヒトの介入により天然の状態から変化した、もしくは取り出されたｍｉＲ遺伝子産物である。例えば、合成ｍｉＲ遺伝子産物、またはその天然の状態の一緒に存在する物質から部分的に、もしくは完全に分離されたｍｉＲ遺伝子産物は、“単離されている”と考えられる。単離されたｍｉＲ遺伝子産物は実質的に精製された形態で存在することができ、またはその中にそのｍｉＲ遺伝子産物が送達された細胞中に存在することができる。従って、細胞に意図的に送達された、またはその中で発現されたｍｉＲ遺伝子産物は、“単離された”ｍｉＲ遺伝子産物と考えられる。細胞内部でｍｉＲ前駆体分子から生成されたｍｉＲ遺伝子産物も、“単離された”分子であると考えられる。本発明によれば、本明細書で記述される単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、対象（例えばヒト）中のがんを処置するための医薬品の製造のために用いることができる。
【０１４９】
[00165]  単離されたｍｉＲ遺伝子産物は、いくつかの標準的な技法を用いて得ることができる。例えば、そのｍｉＲ遺伝子産物は当技術で既知の方法を用いて化学合成することができ、または組換えで生成することができる。１態様において、ｍｉＲ遺伝子産物は適切に保護されたリボヌクレオシドホスホラミダイトおよび一般に用いられるＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置を用いて化学合成される。合成ＲＮＡ分子または合成試薬の商業的な供給業者には、例えばＰｒｏｌｉｇｏ（ドイツ、ハンブルク）、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国コロラド州ラファイエット）、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅの一部、米国イリノイ州ロックフォード）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（米国バージニア州スターリング）、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（米国マサチューセッツ州アッシュランド）およびＣｒｕａｃｈｅｍ（英国グラスゴー）が含まれる。
【０１５０】
[00166]  あるいは、そのｍｉＲ遺伝子産物はあらゆる適切なプロモーターを用いて組換え環状または線状ＤＮＡプラスミドから発現させることができる。ＲＮＡをプラスミドから発現させるための適切なプロモーターには、例えばＵ６もしくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターが含まれる。他の適切なプロモーターの選択は、当技術の範囲内である。本発明の組換えプラスミドは、がん細胞におけるそのｍｉＲ遺伝子産物の発現のための誘導可能または制御可能なプロモーターを含むこともできる。
【０１５１】
[00167]  組換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物を、標準的な技法により培養細胞発現系から単離することができる。組換えプラスミドから発現されたｍｉＲ遺伝子産物をがん細胞に送達することもでき、がん細胞中で直接発現させることもできる。ｍｉＲ遺伝子産物をがん細胞に送達するための組換えプラスミドの使用は、下記でより詳細に論じられる。
【０１５２】
[00168]  そのｍｉＲ遺伝子産物は別の組換えプラスミドから発現させることができ、またはそれらは同じ組換えプラスミドから発現させることができる。１態様において、そのｍｉＲ遺伝子産物は単一のプラスミドからＲＮＡ前駆体分子として発現され、その前駆体分子ががん細胞内に現存するプロセシング系が含まれるがそれらに限定されない適切なプロセシング系によりプロセシングされて機能するｍｉＲ遺伝子産物になる。他の適切なプロセシング系には、例えばインビトロドロソフィラ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞溶解物系（例えばＴｕｓｃｈｌらへの米国公開特許出願第２００２／００８６３５６号において記述されているような系、その全開示を参照により本明細書に援用する）および大腸菌ＲＮＡ分解酵素ＩＩＩ系（例えばＹａｎｇらへの米国公開特許出願第２００４／００１４１１３号において記述されているような系、その全開示を参照により本明細書に援用する）が含まれる。
【０１５３】
[00169]  ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるのに適したプラスミドの選択、核酸配列をそのプラスミド中に挿入してその遺伝子産物を発現させるための方法、およびその組換えプラスミドを対象の細胞に送達する方法は、当技術分野における技術の範囲内である。例えば、Zeng et al. (2002), Molecular Cell 9:1327-1333; Tuschl (2002), Nat. Biotechnol, 20:446-448; Brummelkamp et al. (2002), Science 296:550-553; Miyagishi et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:497-500; Paddison et al. (2002), Genes Dev. 16:948-958; Lee et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:500-505;およびPaul et al. (2002), Nat. Biotechnol. 20:505-508を参照、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１５４】
[00170]  １態様において、ｍｉＲ遺伝子産物を発現するプラスミドは、ＣＭＶ中初期（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ）プロモーターの制御下のｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする配列を含む。本明細書で用いられる際、プロモーターの“制御下”は、ｍｉＲ遺伝子産物をコードする核酸配列がそのプロモーターの３’に、そのプロモーターがそのｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列の転写を開始することができるように位置していることを意味する。
【０１５５】
[00171]  そのｍｉＲ遺伝子産物は、組換えウイルスベクターから発現させることもできる。そのｍｉＲ遺伝子産物は、２個の別個の組換えウイルスベクターから、または同じウイルスベクターから発現させることができることが意図されている。その組換えウイルスベクターから発現されたＲＮＡは、標準的な技法により培養細胞発現系から単離することもでき、またはがん細胞中で直接発現させることもできる。ｍｉＲ遺伝子産物をがん細胞に送達するための組換えウイルスベクターの使用は、下記でより詳細に論じられる。
【０１５６】
[00172]  本発明の組換えウイルスベクターは、そのｍｉＲ遺伝子産物をコードする配列およびそのＲＮＡ配列を発現するためのあらゆる適切なプロモーターを含む。適切なプロモーターには、Ｕ６もしくはＨ１  ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモーター配列、またはサイトメガロウイルスプロモーターが含まれるが、それらに限定されない。他の適切なプロモーターの選択は、当技術分野における技術の範囲内である。本発明の組換えウイルスベクターは、そのｍｉＲ遺伝子産物のがん細胞中での発現のための誘導可能または制御可能なプロモーターを含むこともできる。
【０１５７】
[00173]  ｍｉＲ遺伝子産物に関するコード配列を受け入れることができるあらゆるウイルスベクターを用いることができる；例えば、アデノウイルス（ＡＶ）；アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）；レトロウイルス（例えば、レンチウイルス類（ＬＶ）、ラブドウイルス類、マウス白血病ウイルス）；ヘルペスウイルス等に由来するベクター。そのウイルスベクターの指向性を、他のウイルスからのエンベロープタンパク質もしくは他の表面抗原を用いてそのベクターを偽型化することにより、または異なるウイルスカプシドタンパク質を代わりに用いることにより、適宜改変することができる。
【０１５８】
[00174]  例えば、本発明のレンチウイルスベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病ウイルス、エボラウイルス、モコラウイルス等からの表面タンパク質を用いて偽型化することができる。本発明のＡＡＶベクターは、異なるカプシドタンパク質血清型を発現するようにそのベクターを操作することにより、異なる細胞を標的とするようにすることができる。例えば、血清型２ゲノム上の血清型２カプシドを発現するＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２／２と呼ばれる。ＡＡＶ２／２ベクター中のこの血清型２カプシド遺伝子を血清型５カプシド遺伝子により置き換えてＡＡＶ２／５ベクターを生成することができる。異なるカプシドタンパク質血清型を発現するＡＡＶベクターを構築するための技法は、当技術分野における技術の範囲内であり；例えばRabinowitz, J.E., et al. (2002), J. Virol. 76:791-801を参照、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１５９】
[00175]  本発明における使用に適した組換えウイルスベクターの選択、ＲＮＡを発現するための核酸配列をそのベクター中に挿入するための方法、そのウイルスベクターを対象の細胞に送達する方法、および発現したＲＮＡ産物の回収は、当技術分野における技術の範囲内である。例えばDornburg (1995), Gene Therap. 2:301-310; Eglitis (1988), Biotechniques 6:608-614; Miller (1990), Hum. Gene Therap. 1:5-14;およびAnderson (1998), Nature 392:25-30を参照、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１６０】
[00176]  特に適切なウイルスベクターは、ＡＶおよびＡＡＶ由来のウイルスベクターである。ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるための適切なＡＶベクター、その組換えＡＶベクターを構築するための方法、およびそのベクターを標的細胞中に送達するための方法はXia et al. (2002), Nat. Biotech. 20:1006-1010において記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。ｍｉＲ遺伝子産物を発現させるための適切なＡＡＶベクター、その組換えＡＡＶベクターを構築するための方法、およびそのベクターを標的細胞中に送達するための方法はSamulski et al. (1987), J. Virol. 61:3096-3101; Fisher et al. (1996), J. Virol., 70:520-532; Samulski et al. (1989), J. Virol. 63:3822-3826；米国特許第５，２５２，４７９号；米国特許第５，１３９，９４１号；国際特許出願第ＷＯ９４／１３７８８号；および国際特許出願第ＷＯ９３／２４６４１号において記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。１態様において、そのｍｉＲ遺伝子産物はＣＭＶ中初期プロモーターを含む単一の組換えＡＡＶベクターから発現される。
【０１６１】
[00177]  特定の態様において、本発明の組換えＡＡＶウイルスベクターは、ヒトＵ６  ＲＮＡプロモーターの制御下でポリＴ終結配列と作動可能に連結されたｍｉＲ前駆体ＲＮＡをコードする核酸配列を含む。本明細書で用いられる際、“ポリＴ終結配列と作動可能に連結された”は、そのセンスまたはアンチセンス鎖をコードする核酸配列がポリＴ終結シグナルに５’方向において直接隣接していることを意味する。そのｍｉＲ配列のそのベクターからの転写の間、そのポリＴ終結シグナルは転写を終結するように作用する。
【０１６２】
[00178]  本発明の処置法の他の態様において、有効量のｍｉＲ発現を阻害する少なくとも１種類の化合物をその対象に投与することができる。本明細書で用いられる際、“ｍｉＲ発現を阻害する”は、処置後のｍｉＲ遺伝子産物の前駆体および／または活性な、成熟した形態の産生が処置前に産生されていた量よりも少ないことを意味する。当業者は、ｍｉＲ発現ががん細胞中で阻害されているかどうかを、例えば本明細書で論じられるｍｉＲ転写産物レベルを決定するための技法を用いて容易に決定することができる。阻害は遺伝子発現のレベルで（すなわち、そのｍｉＲ遺伝子産物をコードするｍｉＲ遺伝子の転写を阻害することにより）、またはプロセシングのレベルで（例えば、ｍｉＲ前駆体の成熟した、活性なｍｉＲへのプロセシングを阻害することにより）起こり得る。
【０１６３】
[00179]  本明細書で用いられる際、ｍｉＲ発現を阻害する化合物の“有効量”は、がん（例えば卵巣がん）を患っている対象中のがん細胞の増殖を阻害するために十分な量である。当業者は、所与の対象に投与するべきｍｉＲ発現阻害化合物の有効量を、その対象の大きさおよび体重；疾患浸透の程度；その対象の年齢、健康状態および性別；投与の経路；ならびにその投与が局所性か全身性かのような要因を考慮することによりすぐに決定することができる。
【０１６４】
[00180]  例えば、発現阻害化合物の有効量は、本明細書で記述されたように、処置されるべき腫瘍塊のおおよその重量に基づくことができる。ｍｉＲ発現を阻害する化合物の有効量は、本明細書で記述されたように、処置されるべき対象のおおよその、または推定される体重に基づくこともできる。
【０１６５】
[00181]  当業者はまた、本明細書で記述されたように、ｍｉＲ発現を阻害する化合物を所与の対象に投与するための適切な投与計画をすぐに決定することができる。
【０１６６】
[00182]  ｍｉＲ遺伝子発現を阻害するための適切な化合物には、二本鎖ＲＮＡ（例えば短い、もしくは小さい干渉性ＲＮＡまたは“ｓｉＲＮＡ”）、アンチセンス核酸、および酵素的ＲＮＡ分子、例えばリボザイムが含まれる。これらの化合物のそれぞれが所与のｍｉＲ遺伝子産物を標的としてその標的ｍｉＲ遺伝子産物の発現を（例えば翻訳を阻害することにより、切断および／または分解を誘導することにより）妨げることができる。
【０１６７】
[00183]  例えば、所与のｍｉＲ遺伝子の発現を、そのｍｉＲ遺伝子産物の少なくとも一部と少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列の相同性を有する単離された二本鎖ＲＮＡ（“ｄｓＲＮＡ”）分子を用いてそのｍｉＲ遺伝子のＲＮＡ干渉を誘導することにより妨げることができる。特定の態様において、そのｄｓＲＮＡ分子は“短い、または小さい干渉性ＲＮＡ”または“ｓｉＲＮＡ”である。
【０１６８】
[00184]  本方法において有用なｓｉＲＮＡは、約１７ヌクレオチドから約２９ヌクレオチドまでの長さの、好ましくは約１９ヌクレオチドから約２５ヌクレオチドまでの長さの短い二本鎖ＲＮＡを含む。そのｓｉＲＮＡは、標準的なワトソン−クリック塩基対合相互作用により一緒にアニーリングした（以下“塩基対合した”）センスＲＮＡ鎖および相補的なアンチセンスＲＮＡ鎖を含む。そのセンス鎖は、標的ｍｉＲ遺伝子産物内に含有される核酸配列と実質的に同一である核酸配列を含む。
【０１６９】
[00185]  本明細書で用いられる際、その標的ｍＲＮＡ内に含有される標的配列と“実質的に同一”であるｓｉＲＮＡ中の核酸配列は、その標的配列と同一である、またはその標的配列と１もしくは２ヌクレオチド異なる核酸配列である。そのｓｉＲＮＡのセンスおよびアンチセンス鎖は、２つの相補的な一本鎖ＲＮＡ分子を含むことができ、または２つの相補的な部分が塩基対合し、一本鎖の“ヘアピン”領域により共有結合的に連結されている単一の分子を含むことができる。
【０１７０】
[00186]  そのｓｉＲＮＡは、１個以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または変更により天然存在ＲＮＡと異なる変化したＲＮＡであることもできる。そのような変更には、非ヌクレオチド物質の、例えばそのｓｉＲＮＡの末端（単数または複数）への、もしくはそのｓｉＲＮＡの１個以上の内部のヌクレオチドへの付加、またはそのｓｉＲＮＡをヌクレアーゼ消化に対して耐性にする修飾、またはそのｓｉＲＮＡ中の１個以上のヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドによる置換が含まれ得る。
【０１７１】
[00187]  そのｓｉＲＮＡの一方または両方の鎖は３’突出を含むこともできる。本明細書で用いられる際、“３’突出”は二本鎖のＲＮＡ鎖の３’末端から伸びた少なくとも１個の対合していないヌクレオチドを指す。従って、特定の態様において、そのｓｉＲＮＡは、１から約６ヌクレオチドまで（リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドが含まれる）の長さ、１から約５ヌクレオチドまでの長さ、１から約４ヌクレオチドまでの長さ、または約２から約４ヌクレオチドまでの長さの少なくとも１個の３’突出を含む。特定の態様において、その３’突出はｓｉＲＮＡの両方の鎖に存在し、２ヌクレオチドの長さである。例えば、そのｓｉＲＮＡのそれぞれの鎖はジチミジル酸（“ＴＴ”）またはジウリジル酸（“ｕｕ”）の３’突出を含むことができる。
【０１７２】
[00188]  そのｓｉＲＮＡは、上記で単離されたｍｉＲ遺伝子産物に関して記述したように、化学的もしくは生物学的に生成することができ、または組換えプラスミドもしくはウイルスベクターから発現させることができる。ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を生成および試験するための典型的な方法が、Ｇｅｗｉｒｔｚへの米国公開特許出願第２００２／０１７３４７８号において、およびＲｅｉｃｈらへの米国公開特許出願第２００４／００１８１７６号において記述されており、その両方の全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１７３】
[00189]  所与のｍｉＲ遺伝子の発現をアンチセンス核酸により阻害することもできる。本明細書で用いられる際、“アンチセンス核酸”はＲＮＡ−ＲＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ペプチド核酸相互作用により標的ＲＮＡに結合する核酸分子を指し、それはその標的ＲＮＡの活性を変化させる。本方法における使用に適したアンチセンス核酸は、一般にｍｉＲ遺伝子産物中の連続した核酸配列に相補的な核酸配列を含む一本鎖核酸（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡ−ＤＮＡキメラ、ペプチド核酸（ＰＮＡ））である。そのアンチセンス核酸は、ｍｉＲ遺伝子産物中の連続した核酸配列に対して５０〜１００％相補的、７５〜１００％相補的、または９５〜１００％相補的である核酸配列を含むことができる。特定のヒトｍｉＲ遺伝子産物の核酸配列が本明細書中の表において提供されている。いずれかの理論により束縛されることを望むわけではないが、そのアンチセンス核酸はｍｉＲ遺伝子産物／アンチセンス核酸の二本鎖を消化するＲＮＡ分解酵素Ｈまたは別の細胞性ヌクレアーゼを活性化すると信じられている。
【０１７４】
[00190]  アンチセンス核酸は、標的特異性、ヌクレアーゼ耐性、送達またはその分子の有効性に関連する他の特性を高めるために、核酸主鎖への、またはその糖および塩基部分（またはそれらの均等物）への修飾を含有することもできる。そのような修飾には、コレステロール部分、二本鎖インターカレーター、例えばアクリジン、または１種類又はこれ以上のヌクレアーゼ耐性基が含まれる。
【０１７５】
[00191]  アンチセンス核酸は、上記で単離されたｍｉＲ遺伝子産物に関して記述したように、化学的もしくは生物学的に生成することができ、または組換えプラスミドもしくはウイルスベクターから発現させることができる。生成および試験するための典型的な方法は当技術分野における技術の範囲内であり；例えば、Stein and Cheng (1993), Science 261:1004およびＷｏｏｌｆらへの米国特許第５，８４９，９０２号を参照、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１７６】
[00192]  所与のｍｉＲ遺伝子の発現を酵素的核酸により阻害することもできる。本明細書で用いられる際、“酵素的核酸”は、ｍｉＲ遺伝子産物の連続した核酸配列に対する相補性を有する基質結合領域を含み、ｍｉＲ遺伝子産物を特異的に切断することができる核酸を指す。酵素的核酸の基質結合領域は、例えばｍｉＲ遺伝子産物中の連続した核酸配列に対して５０〜１００％相補的、７５〜１００％相補的、または９５〜１００％相補的であることができる。酵素的核酸は、塩基、糖、および／またはホスフェート基における修飾を含むこともできる。本方法における使用のための典型的な酵素的核酸はリボザイムである。
【０１７７】
[00193]  酵素的核酸は、上記で単離されたｍｉＲ遺伝子産物に関して記述したように、化学的もしくは生物学的に生成することができ、または組換えプラスミドもしくはウイルスベクターから発現させることができる。ｄｓＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ分子を生成および試験するための典型的な方法が、Werner and Uhlenbeck (1995), Nucl. Acids Res. 23:2092-96; Hammann et al. (1999), Antisense and Nucleic Acid Drug Dev. 9:25-31;およびＣｅｃｈらへの米国特許第４，９８７，０７１号において記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１７８】
[00194]  少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物、またはｍｉＲ発現を阻害するための少なくとも１種類の化合物の投与は、がんを有する対象においてがん細胞の増殖を阻害するであろう。本明細書で用いられる際、“がん細胞の増殖を阻害する”は、その細胞を殺す、またはその細胞の増殖もしくは複製（ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）を永久にもしくは一時的に停止させる、もしくは遅くさせることを意味する。がん細胞増殖の阻害は、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ発現阻害化合物の投与後に対象中のそのような細胞の数が一定のままである、または減少する場合に推測され得る。がん細胞増殖の阻害は、そのような細胞の絶対数が増大するが腫瘍成長の速度が低下する場合にも推測され得る。
【０１７９】
[00195]  対象の体の中のがん細胞の数は、直接測定により、または原発性もしくは転移性腫瘍塊の大きさからの推定により決定することができる。例えば、対象中のがん細胞の数は、免疫組織化学的方法、フローサイトメトリー、またはがん細胞の特徴的な表面マーカーを検出するように設計された他の技法により測定することができる。
【０１８０】
[00196]  そのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、これらの化合物を対象のがん細胞に送達するのに適したあらゆる手段により対象に投与することができる。例えば、そのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ発現阻害化合物は、その対象の細胞にこれらの化合物を、またはこれらの化合物をコードする配列を含む核酸を形質移入するのに適した方法により投与することができる。１態様において、その細胞に少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物をコードする配列を含むプラスミドまたはウイルスベクターを形質移入する。
【０１８１】
[00197]  真核細胞に関するトランスフェクション法は当技術において周知であり、それには例えば、核酸の細胞の核または前核中への直接注入；電気穿孔法；リポソームによる輸送または親油性物質に媒介される移送；受容体に媒介される核酸送達、バイオバリスティック（ｂｉｏｂａｌｌｉｓｔｉｃ）または粒子加速；リン酸カルシウム沈殿、およびウイルスベクターに媒介されるトランスフェクションが含まれる。
【０１８２】
[00198]  例えば、細胞にリポソーム性移送化合物、例えばＤＯＴＡＰ（Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウム  メチルサルフェート、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）または均等物、例えばＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮを用いてトランスフェクトすることができる。用いられる核酸の量は本発明の実施にとって重要ではなく；許容可能な結果は０．１〜１００マイクログラムの核酸／１０５個の細胞で達成され得る。例えば、細胞１０５個あたり３マイクログラムのＤＯＴＡＰ中の約０．５マイクログラムのプラスミドベクターの比率を用いることができる。
【０１８３】
[00199]  ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、あらゆる適切な経腸または非経口投与経路により対象に投与することもできる。本方法に関する適切な経腸投与経路には、例えば経口、直腸、または鼻内送達が含まれる。適切な非経口投与経路には、例えば血管内投与（例えば静脈内ボーラス注射、静脈内注入、動脈内ボーラス注射、動脈内注入および血管系中へのカテーテル点滴注入）；組織周囲および組織内への注射（例えば腫瘍周囲および腫瘍内への注射、網膜内注射、または網膜下注射）；皮下注射または皮下注入が含まれる蓄積（例えば浸透圧ポンプによる）；例えばカテーテルまたは他の留置装置（例えば、網膜ペレットまたは坐薬または多孔性、非多孔性、もしくはゲル状材料を含むインプラント）による、対象組織への直接適用；ならびに吸入が含まれる。特に適切な投与経路は、注射、注入および腫瘍中への直接注射である。
【０１８４】
[00200]  本方法において、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物発現阻害化合物を、ｎａｋｅｄ  ＲＮＡとして、送達試薬との組み合わせで、またはそのｍｉＲ遺伝子産物もしくはｍｉＲ遺伝子産物発現阻害化合物を発現する配列を含む核酸（例えば組換えプラスミドまたはウイルスベクター）としてのいずれかで対象に投与することができる。適切な送達試薬には、例えばＭｉｒｕｓ  Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ親油性試薬；ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ；ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ；ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ；ポリカチオン類（例えばポリリジン）およびリポソームが含まれる。
【０１８５】
[00201]  ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子産物発現阻害化合物を発現する配列を含む組換えプラスミドおよびウイルスベクター、ならびにそのようなプラスミドおよびベクターをがん細胞に送達するための技法は本明細書において論じられており、および／または当技術で周知である。
【０１８６】
[00202]  特定の態様において、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（またはそれらをコードする配列を含む核酸）を対象に送達するためにリポソームが用いられる。リポソームはその遺伝子産物または核酸の血中半減期を増大させることもできる。本発明における使用に関する適切なリポソームは標準的なベシクル形成性脂質から形成させることができ、それには一般に中性または負に荷電したリン脂質およびコレステロールのようなステロールが含まれる。脂質の選択は一般に、所望のリポソームの大きさおよび血流中でのリポソームの半減期のような要因の考慮により導かれる。リポソームを調製するための様々な方法、例えばSzoka et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467；ならびに米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号、第４，８３７，０２８号、および第５，０１９，３６９号において記述されているような方法が既知であり、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１８７】
[00203]  本方法における使用のためのリポソームは、そのリポソームをがん細胞に標的化するリガンド分子を含むことができる。がん細胞に広く存在する受容体に結合するリガンド、例えば腫瘍細胞抗原に結合するモノクローナル抗体が好ましい。
【０１８８】
[00204]  本方法における使用のためのリポソームを、単核性マクロファージ系（“ＭＭＳ”）および網内系（“ＲＥＳ”）による排除を回避するように修飾することもできる。そのような修飾されたリポソームは、表面上に、またはそのリポソーム構造中に組み込まれたオプソニン作用阻害部分を有する。特に好ましい態様において、本発明のリポソームはオプソニン作用阻害部分およびリガンドの両方を含み得る。
【０１８９】
[00205]  本発明のリポソームの調製における使用のためのオプソニン作用阻害部分は、典型的にはリポソーム膜に結合した大型の親水性ポリマーである。本明細書で用いられる際、オプソニン作用阻害部分は、それが例えば脂溶性アンカーの膜自体中へのインターカレーションにより、または膜脂質の活性基に直接結合することによりその膜に化学的または物理的に付着している場合、リポソーム膜に“結合している”。これらのオプソニン作用阻害性の親水性ポリマーは、ＭＭＳおよびＲＥＳによるリポソームの取込みを著しく減少させる防御表面層を形成し；これは例えば米国特許第４，９２０，０１６号において記述されており、その全開示を参照により本明細書に援用する。
【０１９０】
[00206]  リポソームを修飾するのに適したオプソニン作用阻害部分は、好ましくは約５００から約４０，０００ダルトンまで、より好ましくは約２，０００から約２０，０００ダルトンまでの数平均分子量を有する水溶性ポリマーである。そのようなポリマーには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）もしくはポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）またはそれらの誘導体；例えばメトキシＰＥＧまたはメトキシＰＰＧ、およびＰＥＧステアレートまたはＰＰＧステアレート；合成ポリマー、例えばポリアクリルアミドまたはポリＮ−ビニルピロリドン；線状、分枝状またはデンドリマー状のポリアミドアミン類；ポリアクリル酸類；カルボキシル基またはアミノ基が化学的に連結されたポリアルコール類、例えばポリビニルアルコールおよびポリキシリトール、ならびにガングリオシド類、例えばガングリオシドＧＭ１が含まれる。ＰＥＧ、メトキシＰＥＧ、もしくはメトキシＰＰＧ、またはそれらの誘導体のコポリマーも適切である。加えて、そのオプソニン作用阻害性ポリマーは、ＰＥＧおよびポリアミノ酸、多糖類、ポリアミドアミン、ポリエチレンアミン、またはポリヌクレオチドのいずれかのブロックコポリマーであることができる。そのオプソニン作用阻害性ポリマーは、アミノ酸またはカルボン酸を含有する天然多糖類であることもでき、それは例えばガラクツロン酸、グルクロン酸、マンヌロン酸、ヒアルロン酸、ペクチン酸、ノイラミン酸、アルギン酸、カラゲナン；アミノ化された多糖類もしくはオリゴ糖（線状または分枝状）；またはカルボキシル化された多糖類もしくはオリゴ糖類、例えばカルボン酸の誘導体と反応して結果としてもたらされたカルボキシル基の連結を有する多糖類もしくはオリゴ糖類である。好ましくは、そのオプソニン作用阻害部分はＰＥＧ、ＰＰＧ、またはそれらの誘導体である。ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体により修飾されたリポソームは時々“ＰＥＧ化リポソーム”と呼ばれる。
【０１９１】
[00207]  そのオプソニン作用阻害部分は、数多くの周知の技法のいずれか１つによりリポソーム膜に結合させることができる。例えば、ＰＥＧのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルをホスファチジル−エタノールアミン脂溶性アンカーと結合させ、次いで膜に結合させることができる。同様に、デキストランポリマーを、Ｎａ（ＣＮ）ＢＨ３および溶媒混合物、例えば３０：１２の比率でのテトラヒドロフランおよび水を６０℃で用いる還元的アミノ化により、ステアリルアミン脂溶性アンカーを用いて誘導体化することができる。
【０１９２】
[00208]  オプソニン作用阻害部分により修飾されたリポソームは未修飾のリポソームよりもはるかに長く循環中に留まる。この理由のため、そのようなリポソームは時々“ステルス（ｓｔｅａｌｔｈ）”リポソームと呼ばれる。ステルスリポソームは多孔性または“漏出性”微小血管系により養われる（ｆｅｄ）組織中に蓄積することが知られている。従って、そのような微小血管系の障害を特徴とする組織、例えば固形腫瘍（例えば卵巣がん）は、これらのリポソームを効率的に蓄積するであろう；Gabizon, et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 18:6949-53を参照。加えて、ＲＥＳによる取込みの低減は、リポソームの肝臓および脾臓における著しい蓄積を予防することにより、ステルスリポソームの毒性を低下させる。従って、オプソニン作用阻害部分により修飾されたリポソームは、ｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物（またはそれらをコードする配列を含む核酸）を腫瘍細胞に送達するのに特に適している。
【０１９３】
[00209]  そのｍｉＲ遺伝子産物またはｍｉＲ遺伝子発現阻害化合物は、それらを対象に投与する前に、当技術で既知の技法に従って医薬組成物（時々“医薬品”と呼ばれる）として配合することができる。従って、本発明はがんを処置するための医薬組成物を含む。１態様において、その医薬組成物は、少なくとも１種類の単離されたｍｉＲ遺伝子産物、または単離されたその変異体もしくは生物学的に活性な断片、および薬学的に許容可能なキャリヤーを含む。特定の態様において、その少なくとも１種類のｍｉＲ遺伝子産物は、がん細胞において適切な対照細胞と比較して低下した発現のレベルを有するｍｉＲ遺伝子産物に対応する。
【０１９４】
[00210]  キット
[00211]  本明細書で記述された組成物のいずれもキット中に含まれてよい。限定的でない例において、ｍｉＲＮＡを単離する、ｍｉＲＮＡを標識する、および／またはｍｉＲＮＡ集団をアレイを用いて評価するための試薬がキット中に含まれる。そのキットにはさらに、ｍｉＲＮＡプローブを作製または合成するための試薬が含まれていてよい。従って、そのキットは、適切な容器手段（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ  ｍｅａｎｓ）中に、標識されたヌクレオチドまたは後で標識される未標識のヌクレオチドを組み込むことによりｍｉＲＮＡを標識するための酵素を含むであろう。それには１種類以上の緩衝液、例えば反応緩衝液、標識緩衝液、洗浄緩衝液、またはハイブリダイゼーション緩衝液、ｍｉＲＮＡプローブを調製するための化合物、およびｍｉＲＮＡを単離するための構成要素も含まれてよい。他のキットには、ｍｉＲＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドを含む核酸アレイを作製するための構成要素も含まれてよく、従って例えば固体支持体が含まれてよい。
【０１９５】
[00212]  アレイが含まれるあらゆるキットの態様に関して、本明細書で記述されたｍｉＲのいずれかの全部または一部と同一または相補的である配列を含有する核酸分子が存在することができる。
【０１９６】
[00213]  そのキットの構成要素は、水性媒体中または凍結乾燥された形態のどちらかで包装されてよい。そのキットの容器手段には一般に、その中に構成要素を入れる、そして好ましくは適切に分取する（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）ことができる少なくとも１個のバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、注射器または他の容器手段が含まれるであろう。そのキット中に１種類より多くの構成要素が存在する場合（標識試薬および標識は一緒に包装されてよい）、そのキットは一般に、その中に追加の構成要素を別々に入れることができる第２、第３または他の追加の容器も含有するであろう。しかし、構成要素の様々な組み合わせが１個のバイアル中に含まれてよい。本発明のキットには典型的には、核酸を含有するための手段、および商業販売のために厳重に密閉されたあらゆる他の試薬容器も含まれるであろう。そのような容器には、その中に所望のバイアルが保持される射出成形または吹込成形されたプラスチック容器が含まれてよい。
【０１９７】
[00214]  そのキットの構成要素が１種類以上の液体溶液中で提供される場合、その液体溶液は水溶液であり、無菌水溶液が１つの好ましい溶液である。キット中に含まれてよい他の溶液は、ｍｉＲＮＡの混合された試料からの単離および／または濃縮（ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ）に関わる溶液である。
【０１９８】
[00215]  しかし、そのキットの構成要素は乾燥粉末（単数または複数）として提供されてよい。試薬および／または構成要素が乾燥粉末として提供される場合、その粉末は適切な溶媒の添加により再構成され得る。その溶媒は別の容器手段中で提供されてもよいと予想される。そのキットには標識されたｍｉＲＮＡの単離を容易にする構成要素も含まれてよい。そのキットにはそのｍｉＲＮＡを保存もしくは維持する、またはその分解に対して保護する構成要素も含まれてよい。その構成要素はＲＮＡ分解酵素無含有であることができ、またはＲＮＡ分解酵素に対して保護することができる。
【０１９９】
[00216]  また、そのキットは一般に、適切な手段中で、それぞれの個々の試薬または溶液のための別個の容器を含むことができる。そのキットには、そのキットの構成要素の使用ならびにそのキット中に含まれていないあらゆる他の試薬の使用のための説明書も含まれ得る。説明書には実施することができる変更が含まれていてよい。そのような試薬は本発明のキットの態様であることが意図されている。また、そのキットは上記で確認された特定の品目に限定されず、ｍｉＲＮＡの操作または特性付けのために用いられるあらゆる試薬が含まれてよい。
【０２００】
[00217]  ｍｉＲＮＡアレイの文脈で論じられたあらゆる態様は、本発明のスクリーニングまたはプロファイリングの方法またはキットにおいてより一般的に用いられてよいことも意図されている。言い換えれば、特定のアレイ中に何が含まれていてよいかを記述しているあらゆる態様は、ｍｉＲＮＡプロファイリングの状況においてより一般的に実施することができ、アレイ自体を含む必要はない。
【０２０１】
[00218]  あらゆるキット、アレイまたは他の検出技法もしくは道具、またはあらゆる方法は、これらのｍｉＲＮＡのいずれかに関するプロファイリングを含み得ることも意図されている。また、ｍｉＲＮＡアレイの文脈で論じられたあらゆる態様は本発明の方法におけるアレイ形式を用いて、または用いずに実施することができ；言い換えれば、ｍｉＲＮＡアレイ中のあらゆるｍｉＲＮＡは本発明のあらゆる方法において当業者に既知のあらゆる技法に従ってスクリーニングまたは評価することができることが意図されている。そのアレイ形式は、実施されるスクリーニングおよび診断法に必要ではない。
【０２０２】
[00219]  療法的、予後的、または診断的適用のためにｍｉＲＮＡアレイを用いるためのキットおよびそのような使用が意図されている。そのキットには、ｍｉＲＮＡアレイ、ならびにそのアレイ上のｍｉＲＮＡに関する標準的な、または規準化されたｍｉＲＮＡプロファイルに関する情報が含まれ得る。また、特定の態様において、対照ＲＮＡまたはＤＮＡがそのキット中に含まれ得る。その対照ＲＮＡは、標識および／またはアレイ分析に関する陽性対照として用いることができるｍｉＲＮＡであることができる。また、その試料は血液または組織であることができる。
【０２０３】
[00220]  １態様において、がんの特性付けのためのキットには、図７において列挙されるｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡに関する少なくとも１種類の検出プローブが含まれる。特定の態様において、そのキットはオリゴヌクレオチドアレイの形態であり、またはオリゴヌクレオチドアレイを含む。
【０２０４】
[00221]  本教示の方法およびキットは、本明細書において広く、かつ一般的に記述されてきた。その一般的な開示の範囲内に入るより狭い種および一般性の低い（ｓｕｂ−ｇｅｎｅｒｉｃ）グループ分けのそれぞれも、本教示の一部を形成している。これには、削除される物質が本明細書において具体的に列挙されたか否かに関わらず、その属（ｇｅｎｕｓ）からあらゆる主題を除去する条件または消極的限定を有する本教示の一般的記述が含まれる。
【０２０５】
[00222]  アレイの調製およびスクリーニング
[00223]  本明細書において、ｍｉＲＮＡアレイの調製および使用も提供され、それは複数のｍｉＲＮＡ分子または前駆体ｍｉＲＮＡ分子に完全に相補的もしくはほぼ相補的または同一であり支持体物質上に空間的に分離された構成で配置された核酸分子（プローブ）の整然とした（ｏｒｄｅｒｅｄ）マクロアレイまたはマイクロアレイである。マクロアレイは典型的にはその上にプローブがスポットされたニトロセルロースまたはナイロンのシートである。マイクロアレイは核酸プローブをより高密度に、１０，０００種類に至るまでの核酸分子を典型的には１〜４平方センチメートルの領域中に収めることができるように配置する。マイクロアレイは、核酸分子、例えば遺伝子、オリゴヌクレオチド等を支持体上にスポットする、またはオリゴヌクレオチド配列を支持体上でその場で製作することにより製作することができる。スポットまたは製作される核酸分子は、平方センチメートルあたり約３０種類に至るまで、またはより多く、例えば平方センチメートルあたり約１００種類、もしくはさらには１０００種類に至るまでの同一でない核酸分子の高密度マトリックスパターンで適用することができる。マイクロアレイは典型的には、フィルターアレイのニトロセルロースに基づく材料とは対照的に、コートされたガラスを固体支持体として用いる。ｍｉＲＮＡに相補的な核酸試料の整然としたアレイを有することにより、それぞれの試料の位置を追跡し、元の試料に結びつけることができる。複数の別個の核酸プローブが固体支持体の表面と安定して結合している様々な異なるアレイ装置が当業者に既知である。アレイのための有用な支持体には、ナイロン、ガラスおよびシリコンが含まれる。そのアレイはいくつかの異なる方法で異なっていてよく、それには平均プローブ長、プローブの配列またはタイプ、プローブおよびアレイ表面の間の結合の性質、例えば共有結合性または非共有結合性等が含まれる。本明細書で記述された標識およびスクリーニング法ならびにアレイは、そのプローブがｍｉＲＮＡを検出することを除いて、その有用性においてあらゆるパラメーターに関して限定されておらず；結果的に、方法および組成物は様々な異なるタイプのｍｉＲＮＡアレイと共に用いられてよい。特定の態様において、そのｍｉＲ遺伝子産物は本明細書で記述されるｍｉＲの１種類又はこれ以上を含む。
【０２０６】
[00224]  マイクロアレイ
[00225]  そのマイクロアレイは、既知の、または予測されるｍｉＲＮＡ配列から得られたオリゴヌクレオチドプローブを含むことができる。そのアレイは、それぞれのｍｉＲＮＡに関する異なるオリゴヌクレオチドプローブ、例えば活性な成熟配列を含有するオリゴヌクレオチドプローブおよびそのｍｉＲＮＡの前駆体に特異的である別のオリゴヌクレオチドプローブを含有することができる。そのアレイは、対照、例えばヒトのオルソログと数塩基のみ異なる１種類以上の配列も含有していてよく、それはハイブリダイゼーションのストリンジェンシー条件に関する対照の役目を果たすことができる。ウイルスのｍｉＲＮＡまたは生物情報学のツールから予測されるような推定上のｍｉＲＮＡが含まれることも可能である。さらに、マイクロアレイ上の非特異的ハイブリダイゼーションに関する適切な対照が含まれることも可能である。
【０２０７】
[00226]  特定の態様において、がん化学予防療法応答または進行の予後のインビトロ診断のための方法において、卵巣がんバイオマーカーとしての１種類以上のｍｉＲＮＡは、以下の工程を含む、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡを疾患診断バイオマーカーとしての使用のために選択するための方法から得られる：ａ）対象から試料を得て、ここでその対象はその疾患を患っている人々およびその疾患を患っていない人々からなり；ｂ）その試料中の候補バイオマーカーｍｉＲＮＡおよび／またはｍＲＮＡならびに内部対照ＲＮＡの発現レベルを決定し；ｃ）そのバイオマーカー（単数または複数）の相対発現レベルを計算し；ｄ）１個以上の変数を用いて予測モデルを計算し、ここでその変数には１種類以上のバイオマーカーの相対発現レベルおよび場合により遺伝因子が含まれる１種類以上のその疾患のリスク因子が含まれ；そしてｅ）その予測モデルにより疾患リスク発生確率、感受性および特異性を計算し、ここで最高の感受性および最高の特異性を有する１種類以上のバイオマーカーを選択して疾患診断バイオマーカーにする。
【０２０８】
[00227]  本明細書で列挙されたあらゆる文書の引用は、前記のいずれかが関連する先行技術であるという自認として意図されているわけではない。その日付に関する全ての記載またはこれらの文書の内容に関する表現は出願者に入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関する自認を構成することは一切ない。
【０２０９】
[00228]  本発明は様々な好ましい態様に関連して記述されてきたが、当業者は、本発明の本質的な範囲から逸脱することなく様々な変更を行ってよく、その要素の代わりに均等物を用いてよいことを理解するべきである。加えて、特定の状況または材料を本発明の教示に適合させるために、その本質的な範囲から逸脱することなく多くの修正を行うことができる。従って、本発明は本明細書で開示されたこの発明を実施するために熟慮された特定の態様に限定されるのではなく、本発明には特許請求の範囲内に入る全ての態様が含まれるであろうことが意図されている。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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