(57)【要約】本発明は、細胞透過性ペプチドならびに疎水性および極性に基づいて細胞透過性ペプチドを同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドのPP1が[(該ペプチドのPP2×X1)+X]より小さく、式中、X1は1.7〜2.3でありかつXは-0.6〜-0.85である、前記ペプチド。
【請求項２】
SEQ ID NO: 1〜455からなる群より選択される、請求項1に記載のペプチド。
【請求項３】
SEQ ID NO: 1〜9からなる群より選択される、請求項2に記載のペプチド。
【請求項４】
SEQ ID NO: 10、11、15、16、17、および18からなる群より選択される、請求項2に記載のペプチド。
【請求項５】
小分子、核酸、ペプチド、またはタンパク質に結合されている、請求項1〜4のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
以下の段階によって、ペプチド群の中から細胞透過性ペプチドを同定する方法：(1)該ペプチドのPP1を決定する段階;(2)該ペプチドのPP2を決定する段階;(3)PP1<[(PP2×X1)+X]であり、式中、X1は1.5〜10でありかつXは0.3〜-1.5であるペプチドを該群内で同定する段階;(4)段階3で同定されたペプチドを、該ペプチドが細胞透過性であることを確認するために、インビトロまたはインビボのアッセイ法で試験する段階。
【請求項７】
癌またはウイルス学的な、中枢神経系の、炎症性の、免疫の、もしくは代謝性の疾患もしくは病態を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、請求項1〜5のいずれか一項に記載のペプチドの治療的有効量を投与する段階を含む、前記方法。
【請求項８】
請求項1〜5のいずれか一項に記載のペプチドをコードする、単離されたヌクレオチド。
【請求項９】
請求項8に記載の単離されたヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１０】
癌またはウイルス学的な、中枢神経系の、炎症性の、免疫の、もしくは代謝性の疾患もしくは病態を治療または予防するための、請求項1〜5のいずれか一項に記載のペプチドの使用。
【請求項１１】
本明細書において前述した本発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、細胞透過性ペプチドならびに疎水性および極性に基づいて細胞透過性ペプチドを同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
アンテナペディアに由来するペネトラチン(Derossi et al., Biol. Chem., 269, 10444-10450, 1994（非特許文献1）)およびTatペプチド(Vives et al., J. Biol. Chem., 272, 16010-16017, 1997（非特許文献2）)などの細胞透過性ペプチド(CPP)は、ペプチド、タンパク質、およびオリゴヌクレオチドなどのカーゴ分子を細胞中へ送達するために広く使用されている手段である(Fischer et al., Bioconjug. Chem., 12, 825-841, 2001（非特許文献3）)。応用範囲は、純然たる細胞生物学的研究から生物医学的研究まで及ぶ(Dietz and Bahr, Mol. Cell., Neurosci, 27, 85-131, 2004（非特許文献4）)。当初は、細胞取込みは、原形質膜を直接透過することによって起こると考えられていた(Prochiantz, Curr. Opin. Cell Biol., 12, 400-406, 2000（非特許文献5）)。過去数年間で、いくつかのCPPに関して、エンドサイトーシスが少なくとも有意に細胞取込みに寄与しているという証拠が積み重ねられている(概要については、Fotin-Mleczek et al., Curr. Pharm. Design, 11, 3613-3628, 2005（非特許文献6）を参照されたい)。したがって、これらの最近の結果を前提とすると、CPPとしてのペプチドの明確な説明(specification)は、特定の細胞移入メカニズムを暗に示すのではなく、むしろ、共有結合的または非共有結合的にカーゴと結合した場合にカーゴ分子の細胞取込みを増大させるペプチドとしての機能を意味する。
【０００３】
大半の細胞透過性ペプチドは、多くの疎水性残基および/または正荷電残基を有しているが、配列の多様性が非常に大きいため、任意の所与のペプチドが細胞透過性であるかを予測することは困難である。Cruciani et al., J. Chemometrics, 2004; 18: 146-155（非特許文献7）では、20種のアミノ酸のそれぞれについて1組の記述子(PP1[極性]およびPP2[疎水性])が提唱された。しかし、これらの記述子はあるものの、あるペプチドの細胞透過性特性をPP1およびPP2に基づいて合理的に予測できる方法は、提唱されてもおらず、存在もしていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Derossi et al., Biol. Chem., 269, 10444-10450, 1994
【非特許文献２】Vives et al., J. Biol. Chem., 272, 16010-16017, 1997
【非特許文献３】Fischer et al., Bioconjug. Chem., 12, 825-841, 2001
【非特許文献４】Dietz and Bahr, Mol. Cell., Neurosci, 27, 85-131, 2004
【非特許文献５】Prochiantz, Curr. Opin. Cell Biol., 12, 400-406, 2000
【非特許文献６】Fotin-Mleczek et al., Curr. Pharm. Design, 11, 3613-3628, 2005
【非特許文献７】Cruciani et al., J. Chemometrics, 2004; 18: 146-155
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、細胞透過性ペプチドならびに疎水性および極性に基づいて細胞透過性ペプチドを同定する方法に関する。
【０００６】
1つの態様において、本発明は、以下の段階によってペプチド群の中から細胞透過性ペプチドを同定する方法に関する：(1)ペプチドの極性(「PP1」と呼ばれる)を決定する段階;(2)ペプチドの疎水性(「PP2」と呼ばれる)を決定する段階;(3)PP1<[(PP2×X1)+X]であり、式中、X1は1.5〜10でありかつXは0.3〜-1.5である、ペプチドを群内で同定する段階;(4)段階3で同定されたペプチドを、該ペプチドが細胞透過性であることを確認するために、インビトロまたはインビボのアッセイ法で試験する段階。
【０００７】
別の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1〜455からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。特に、本発明は、様々な治療的応用および他の応用のために細胞の内部(細胞質または核など)に送達するための小分子、核酸、蛍光性部分、タンパク質、ペプチド、または他のカーゴに結合されている、本発明の細胞透過性ペプチドに関する。
【０００８】
他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1〜455からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする、単離されたヌクレオチドに関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1〜455からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含む、ベクターに関する。本発明はまた、このようなペプチド、ヌクレオチド、およびベクターを製造および使用する方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】天然の配列から選び出した(extracted)ペプチドのランダムなセットの極性(PP1)および疎水性(PP2)をプロットしたグラフである。小さい点はランダムなペプチドを示し、大きい方の点は、ペプチドのランダムなセットの中の細胞透過性ペプチド(文献に基づく)を示し、三角は、ペプチドのランダムなセットの中のSEQ ID NO: 1〜9の細胞透過性ペプチド(本発明者らによって細胞透過性であることが発見された)を示し、星は、ペプチドのランダムなセットの中のSEQ ID NO: 10〜19の細胞透過性ペプチド(本発明者らによって細胞透過性であることが発見された)を示す。(AおよびBと表示した)斜めの線は、各線の右側の範囲を定め、(本発明によると)その範囲内のペプチドは、細胞透過性である確率が高い。線Aの右側の範囲は、X1が1.7でありXが0.3である場合に定められる範囲である。線Bの右側の範囲は、X1が1.7でありXが-0.2である場合に定められる範囲である。
【図２】図2A〜2Bは、実施例1〜9のペプチド(フルオレセインイソチオシアナート(FITC)に共有結合された本発明によって同定されたSEQ ID NO. 1〜9)を濃度30μmで2時間、H460細胞において細胞透過させた結果を示す。
【図３】図3A〜3Bは、実施例10〜19のペプチド(フルオレセインイソチオシアナート(FITC)に共有結合された本発明によって同定されたSEQ ID NO. 10〜19)を濃度3μmで2時間、H460細胞において細胞透過させた結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞透過性ペプチドならびに疎水性および極性に基づいて細胞透過性ペプチドを同定する方法に関する。
【００１１】
あるペプチドの極性すなわちPP1とは、そのペプチド中の全アミノ酸の平均極性であり、個々のアミノ酸の極性は表1において説明している。あるペプチドの疎水性すなわちPP2とは、そのペプチド中の全アミノ酸の平均疎水性であり、個々のアミノ酸の疎水性は表1において説明している。
【００１２】
（表１）
2015522264.tif 000002
【００１３】
大半の細胞透過性ペプチドは、多くの疎水性残基および/または正荷電残基を有しているが、配列の多様性が非常に大きいため、任意の所与のペプチドが細胞透過性であるかを予測することは困難である。Cruciani et al., J. Chemometrics, 2004; 18: 146-155では、20種のアミノ酸のそれぞれについて1組の記述子(PP1[極性]およびPP2[疎水性])が提唱された。しかし、これらの記述子はあるものの、あるペプチドの細胞透過性特性をPP1およびPP2に基づいて合理的に予測できる方法は、提唱されてもおらず、存在もしていない。
【００１４】
したがって、1つの態様において、本発明は、以下の段階によってペプチド群の中から細胞透過性ペプチドを同定する方法に関する：(1)ペプチドの極性(または「PP1」)を決定する段階;(2)ペプチドの疎水性(または「PP2」)を決定段階;(3)PP1<[(PP2×X1)+X]であり、式中、X1は1.5〜10でありかつXは0.3〜-1.5である、ペプチドを群内で同定する段階;(4)段階3で同定されたペプチドを、該ペプチドが細胞透過性であることを確認することによるために、インビトロまたはインビボのアッセイ法で試験する段階。
【００１５】
特定の態様において、X1は1.7でありXは0.3である(図1の線Aの右側の範囲に示される)。他の特定の態様において、X1は1.7でありXは-0.2である(図1の線Bの右側の範囲に示される)。
【００１６】
他の特定の態様において、X1は8でありXは-0.4〜0.1である。他の特定の態様において、X1は6でありXは-0.4〜0.1である。他の特定の態様において、X1は4でありXは-0.4〜0.1である。他の特定の態様において、X1は2でありXは-0.4〜0.1である。他の特定の態様において、X1は1.7でありXは-0.4〜0.1である。他の特定の態様において、X1は1.7でありXは0.1である。他の特定の態様において、X1は1.7でありXは0である。他の特定の態様において、X1は1.7でありXは-0.1である。他の特定の態様において、X1は1.7でありXは-0.2である。他の特定の態様において、X1は1.7でありXは-0.3である。他の特定の態様において、X1は1.7でありXは-0.4である。
【００１７】
別の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1〜455からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。特に、本発明は、様々な治療的応用および他の応用のために細胞の内部(細胞質または核など)に送達するための小分子、核酸、蛍光性部分、タンパク質、ペプチド、または他のカーゴに結合されている、本発明の細胞透過性ペプチドに関する。
【００１８】
他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1〜455からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする、単離されたヌクレオチドに関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1〜455からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。本発明はまた、このようなペプチド、ヌクレオチド、およびベクターを製造および使用する方法にも関する。
【００１９】
1つの好ましい態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1〜9からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。別の好ましい態様において、本発明は、SEQ ID NO: 10、11、15、16、17、および18からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。
【００２０】
1つの特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1〜19からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。
【００２１】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1〜19からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする、単離されたヌクレオチドに関する。
【００２２】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 1〜19からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。
【００２３】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 20〜30からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 20〜30からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 20〜30からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００２４】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 31〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 31〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 31〜40からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００２５】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 41〜50からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 41〜50からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 41〜50からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００２６】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 51〜60からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 51〜60からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 51〜60からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００２７】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 61〜70からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 61〜70からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 61〜70からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００２８】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 71〜80からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 71〜80からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 71〜80からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００２９】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 81〜90からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 81〜90からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 81〜90からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３０】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 91〜100からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 91〜100からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 91〜100からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３１】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 101〜110からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 101〜110からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 101〜110からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３２】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 111〜120からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 111〜120からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 111〜120からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３３】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 121〜130からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 121〜130からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 121〜130からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３４】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 131〜140からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 131〜140からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 131〜140からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３５】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 141〜150からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 141〜150からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 141〜150からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３６】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 151〜160からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 151〜160からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 151〜160からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３７】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 161〜170からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 161〜170からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 161〜170からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３８】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 171〜180からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 171〜180からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 171〜180からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００３９】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 181〜190からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 181〜190からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 181〜190からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００４０】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 191〜200からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 191〜200からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 191〜200からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００４１】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 201〜210からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 201〜210からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 201〜210からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００４２】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 211〜220からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 211〜220からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 211〜220からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００４３】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 221〜230からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 221〜230からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 221〜230からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００４４】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 231〜240からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 231〜240からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 231〜240からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００４５】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 241〜250からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 241〜250からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 241〜250からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００４６】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 251〜260からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 251〜260からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 251〜260からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００４７】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 261〜270からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 261〜270からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 261〜270からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００４８】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 271〜280からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 271〜280からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 271〜280からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００４９】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 281〜290からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 281〜290からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 281〜290からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００５０】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 291〜300からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 291〜300からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 291〜300からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００５１】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 301〜310からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 301〜310からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 301〜310からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００５２】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 311〜320からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 311〜320からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 311〜320からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００５３】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 321〜330からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 321〜330からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 321〜330からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００５４】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 331〜340からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 331〜340からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 331〜340からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００５５】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 341〜350からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 341〜350からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 341〜350からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００５６】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 351〜360からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 351〜360からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 351〜360からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００５７】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 361〜370からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 361〜370からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 361〜370からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００５８】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 371〜380からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 371〜380からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 371〜380からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００５９】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 381〜390からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 381〜390からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 381〜390からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００６０】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 391〜400からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 391〜400からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 391〜400からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００６１】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 401〜410からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 401〜410からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 401〜410からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００６２】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 411〜420からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 411〜420からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 411〜420からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００６３】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 421〜430からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 421〜430からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 421〜430からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００６４】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 431〜440からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 431〜440からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 431〜440からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００６５】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 441〜450からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 441〜450からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 441〜450からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００６６】
他の特定の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 451〜455からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する細胞透過性ペプチドならびにそれを含む組成物および結合体に関する。他の態様において、本発明は、SEQ ID NO: 451〜455からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離された核酸、またはSEQ ID NO: 451〜455からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００６７】
他の特定の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.6〜-0.85である)より小さい、細胞透過性ペプチドに関する。他の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.6〜-0.85である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチド、またはペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.6〜-0.85である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００６８】
他の特定の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.6である)より小さい、細胞透過性ペプチドに関する。他の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.6である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチド、またはペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.6である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００６９】
他の特定の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.65である)より小さい、細胞透過性ペプチドに関する。他の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.65である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチド、またはペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.65である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００７０】
他の特定の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.7である)より小さい、細胞透過性ペプチドに関する。他の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.7である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチド、またはペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.7である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００７１】
他の特定の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.75である)より小さい、細胞透過性ペプチドに関する。他の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.75である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチド、またはペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.75である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００７２】
他の特定の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.8である)より小さい、細胞透過性ペプチドに関する。他の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.8である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチド、またはペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.8である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００７３】
他の特定の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.85である)より小さい、細胞透過性ペプチドに関する。他の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.85である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチド、またはペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は1.7〜2.3であり、Xは-0.85である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００７４】
他の特定の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.60である)より小さい、細胞透過性ペプチドに関する。他の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.60である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチド、またはペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.60である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００７５】
他の特定の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.65である)より小さい、細胞透過性ペプチドに関する。他の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.65である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチド、またはペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.65である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００７６】
他の特定の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.7である)より小さい、細胞透過性ペプチドに関する。他の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.7である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチド、またはペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.7である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００７７】
他の特定の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.75である)より小さい、細胞透過性ペプチドに関する。他の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.75である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチド、またはペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.75である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００７８】
他の特定の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.8である)より小さい、細胞透過性ペプチドに関する。他の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.8である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチド、またはペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.8である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００７９】
他の特定の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.85である)より小さい、細胞透過性ペプチドに関する。他の態様において、本発明は、ペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.85である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチド、またはペプチドのPP1が[(ペプチドのPP2×X1)+X](式中、X1は2.0であり、Xは-0.85である)より小さい細胞透過性ペプチドをコードする単離されたヌクレオチドを含むベクターに関する。
【００８０】
本発明によるCPPの一般的合成
本明細書において言及されるペプチド配列はすべて、通常の慣習に従って記述され、別段の注記の無い限り、N末端アミノ酸が左側にあり、C末端アミノ酸が右側にある。2つのアミノ酸残基の間の短い線は、ペプチド結合を表す。アミノ酸に異性体の形態がある場合、特に別段の指示がない限り、表されるのはアミノ酸のL型である。
【００８１】
本発明を説明するにあたっての便宜上、様々なアミノ酸残基の従来の略語および非従来的な略語が使用される。これらの略語は当業者にはよく知られているが、明確にするために、下記に列挙する:
Asp=D=アスパラギン酸;Ala=A=アラニン;Arg=R=アルギニン;Asn=N=アスパラギン;Gly=G=グリシン;Glu=E=グルタミン酸;Gln=Q=グルタミン;His=H=ヒスチジン;Ile=I=イソロイシン;Leu=L=ロイシン;Lys=K=リジン;Met=M=メチオニン;Phe=F=フェニルアラニン;Pro=P=プロリン;Ser=S=セリン;Thr=T=トレオニン;Trp=W=トリプトファン;Tyr=Y=チロシン;およびVal=V=バリン。
【００８２】
また、便宜上、かつ当業者には容易に分かるように、以下の略語または記号が、本明細書において使用される部分および試薬などを表すのに使用される。
Et2O  ジエチルエーテル
hr    時間
TIS  トリイソプロピルシラン
Fmoc  9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
DMF  ジメチルホルムアミド
DIPEA  N,N-ジイソプロピルエチルアミン
TFA  トリフルオロ酢酸
HOBT  N-ヒドロキシベンゾトリアゾール
BOP  ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ-トリス-(ジメチルアミノ)ホスホニウム-ヘキサフルオロホスファート
HBTU  2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウム-ヘキサフルオロホスファート
(ES)+-LCMS  エレクトロスプレー液体クロマトグラフィー-質量分析法
【００８３】
通常、本発明のペプチドは、アミノ酸間のペプチド結合を形成させるための任意の公知の従来手順によって容易に合成され得る。このような従来手順には、例えば、カルボキシル基および他の反応性基が保護されたあるアミノ酸またはその断片の遊離のαアミノ基と、アミノ基または他の反応性基が保護された別のアミノ酸またはその断片の遊離の一級カルボキシル基との縮合を可能にする任意の液相手順が含まれる。
【００８４】
本発明のペプチドを合成するためのこのような従来手順には、例えば、任意の固相ペプチド合成法が含まれる。このような方法において、ペプチドの合成は、固相法の一般原則に従い、伸長するペプチド鎖に所望のアミノ酸残基を1つずつ順次組み入れることによって、実施され得る。このような方法は、例えば、参照により本明細書に組み入れられるMerrifield, R. B., J. Amer. Chem. Soc. 85, 2149-2154 (1963); Barany et al., The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Vol. 2, Gross, E. and Meienhofer, J., Eds. Academic Press 1-284 (1980)において開示されている。
【００８５】
ペプチド合成の間、アミノ酸の特定の反応性基、例えば、α-アミノ基、ヒドロキシル基、および/または反応性の側鎖基が、それらとの化学反応を防ぐために保護されることが望ましい場合がある。これは、例えば、反応性基を、後で除去できる保護基と反応させることによって達成され得る。例えば、アミノ酸またはその断片のαアミノ基は、それらとの化学反応を防ぐために保護され得、その一方で、そのアミノ酸またはその断片のカルボキシル基は、別のアミノ酸またはその断片と反応して、ペプチド結合を形成する。これに続いてαアミノ保護基を選択的に除去して、後続の反応、例えば別のアミノ酸またはその断片のカルボキシル基との反応をその部位で起こさせてよい。
【００８６】
αアミノ基は、例えば、芳香族ウレタン型保護基(例えば、アリルオキシカルボニ(allyloxycarbony)、ベンジルオキシカルボニル(Z)、および置換されたベンジルオキシカルボニル(例えば、p-クロロベンジルオキシカルボニル、p-ニトロベンジルオキシカルボニル、p-ブロモベンジルオキシカルボニル、p-ビフェニル-イソプロピルオキシカルボニル、9-フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、およびp-メトキシベンジルオキシカルボニル(Moz)));ならびに脂肪族ウレタン型保護基(例えば、t-ブチルオキシカルボニル(Boc)、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、およびアリルオキシカルボニル)より選択される適切な保護基によって保護されてよい。1つの態様において、Fmocが、αアミノ保護のために使用される。
【００８７】
例えば、アミノ酸のヒドロキシル基(OH)は、ベンジル(Bzl)、2,6-ジクロロベンジル(2,6ジCl-Bzl)、およびtert-ブチル(t-Bu)より選択される適切な保護基によって保護され得る。チロシン、セリン、またはトレオニンのヒドロキシル基が保護されることが意図される1つの態様において、例えば、t-Buが使用され得る。
【００８８】
例えば、ε-アミノ酸基は、2-クロロ-ベンジルオキシカルボニル(2-Cl-Z)、2-ブロモ-ベンジルオキシカルボニル(2-Br-Z)、アリルカルボニル、およびt-ブチルオキシカルボニル(Boc)より選択される適切な保護基によって保護され得る。リジンのε-アミノ基が保護されることが意図される1つの態様において、例えば、Bocが使用され得る。
【００８９】
例えば、β-アミド基およびγ-アミド基は、4-メチルトリチル(Mtt)、2,4,6-トリメトキシベンジル(Tmob)、4,4'-ジメトキシジチル(Dod)、ビス-(4-メトキシフェニル)-メチル、およびトリチル(Trt)より選択される適切な保護基によって保護され得る。アスパラギンまたはグルタミンのアミド基が保護されることが意図される1つの態様において、例えば、Trtが使用され得る。
【００９０】
例えば、インドール基は、ホルミル(For)、メシチル-2-スルホニル(Mts)、およびt-ブチルオキシカルボニル(Boc)より選択される適切な保護基によって保護され得る。トリプトファンのインドール基が保護されることが意図される1つの態様において、例えば、Bocが使用され得る。
【００９１】
例えば、イミダゾール基は、ベンジル(Bzl)、t-ブチルオキシカルボニル(Boc)、およびトリチル(Trt)より選択される適切な保護基によって保護され得る。ヒスチジンのイミダゾール基が保護されることが意図される1つの態様において、例えば、Trtが使用され得る。
【００９２】
固相合成は、保護されたα-アミノ酸を適切な樹脂に結合させることにより、ペプチドのC末端から開始することができる。このような出発原料は、p-ベンジルオキシベンジルアルコール(Wang)樹脂へのエステル結合により、またはFmoc-リンカー(例えば、p-((R,S)-?-(1-(9H-フルオレン-9-イル)-メトキシホルムアミド)-2,4-ジメチルオキシベンジル)-フェノキシ酢酸(Rinkリンカー))とベンズヒドリルアミン(BHA)樹脂とのアミド結合により、α-アミノ酸が保護されたアミノ酸を結合させることによって調製することができる。ヒドロキシメチル樹脂の調製は、当技術分野において周知である。Fmoc-リンカー-BHA樹脂支持体は市販されており、合成される所望のペプチドのC末端に置換されていないアミドがある場合、通常、使用される。
【００９３】
1つの態様において、ペプチド合成は、マイクロ波によって補助される。マイクロ波によって補助されるペプチド合成は、固相ペプチド合成を加速させるための魅力的な方法である。これは、マイクロ波ペプチド合成機(Microwave Peptide Synthesizer)、例えば、Libertyペプチド合成機(CEM Corporation, Matthews, NC)を用いて実施され得る。マイクロ波によって補助されるペプチド合成により、所定の温度で所定の長さの時間、反応を制御する方法を作り出すことが可能になる。合成機は、反応に送達されるエネルギー(power)の量を自動的に調節して、温度を設定値で維持する。
【００９４】
典型的には、アミノ酸または模倣体は、Fmocで保護された形態のアミノ酸または模倣体を使用して、2〜5当量のアミノ酸および適切な結合試薬を用いてFmoc-Linker-BHA樹脂に結合される。結合後、樹脂は、洗浄され真空下で乾燥されてよい。樹脂へのアミノ酸の添加(loading)は、Fmoc-アミノ酸樹脂の分取物のアミノ酸解析によって、またはUV解析によるFmoc基の測定によって、測定され得る。任意の未反応アミノ基は、樹脂を塩化メチレンに溶かした無水酢酸およびジイソプロピルエチルアミンと反応させることによってキャッピングされてよい。
【００９５】
樹脂は、アミノ酸を順次添加するために数回の反復サイクルに供される(carried through)。αアミノFmoc保護基は、塩基性条件下で除去される。DMFに溶かしたピペリジン、ピペラジン、またはモルホリン(20〜40％v/v)が、この目的のために使用され得る。1つの態様において、DMFに溶かした20％ピペリジンが使用される。
【００９６】
αアミノ保護基が除去された後、保護された次のアミノ酸が段階的に所望の順序で結合されて、中間体である保護されたペプチド-樹脂が得られる。ペプチドの固相合成においてアミノ酸の結合に使用される活性化試薬は、当技術分野において周知である。例えば、このような合成のために適切な試薬は、ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ-トリ-(ジメチルアミノ)ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(BOP)、ブロモ-トリス-ピロリジノ-ホスホニウムヘキサフルオロホスファート(PyBroP)、2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート(HBTU)、およびジイソプロピルカルボジイミド(DIC)である。1つの態様において、試薬はHBTUまたはDICである。他の活性化剤は、BaranyおよびMerrifield (The Peptides, Vol. 2, J. Meienhofer, ed., Academic Press, 1979, pp 1-284)によって説明されている。1ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBT)、N-ヒドロキシスクシンイミド(HOSu)、および3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジン(HOOBT)などの様々な試薬が、合成サイクルを最適化するために結合混合物に添加されてよい。1つの態様において、HOBTが添加される。
【００９７】
ペプチド合成後、ブロック基は除去されてよく、ペプチドは樹脂から切断されてよい。例えば、ペプチド-樹脂は、室温で180分間、樹脂1グラム当たり100Lのエタンジチオール、100lのジメチルスルフィド、300Lのアニソール、および9.5mLのトリフルオロ酢酸で処理されてよい。あるいは、ペプチド-樹脂は、室温で90分間、樹脂1グラム当たり1.0mLのトリイソプロピルシランおよび9.5mLのトリフルオロ酢酸で処理されてよい。次いで、樹脂はろ過によって除かれ、ペプチドは、冷やしたエチルエーテルの添加によって沈殿させられてよい。次いで、沈殿物は遠心分離され、エーテル層はデカントされてよい。
【００９８】
粗製ペプチドの精製は、例えば、Shimadzu LC-8Aシステムにおいて、逆相C18カラム(50×250mm、300Å、10m)を用いた高速液体クロマトグラフィー(HPLC)によって実施されてよい。ペプチドは、最小限の量の水およびアセトニトリルに溶解され、カラム上に注入されてよい。通常、勾配溶離は、流速60ml/分、70分間に渡る2％〜70％のBで開始されてよい(バッファーA:0.1％TFA/H2O、バッファーB:0.1％ TFA/CH3CN)。UV検出は、220/280nmに設定される。産生物を含有する画分が分離されてよく、それらの純度は、流速2.5ml/分、10分間に渡る勾配(2〜70％)で逆相Pursuit C18カラム(4.6×50mm)を用いるShimadzu LC-10AT解析システムにおいて判断されてよい。(バッファーA:0.1％TFA/H2O、バッファーB:0.1％TFA/CH3CN)。次いで、純度が高いと判断された画分が集められ、凍結乾燥されてよい。
【００９９】
本発明のペプチドの有用性および結合
特定の態様において、本発明の細胞透過性ペプチド(SEQ ID NO. 1〜455を含む)は、様々な治療的応用および他の応用のために細胞の内部(細胞質または核など)に送達するための小分子、核酸、蛍光性部分、タンパク質、ペプチド、または他のカーゴに結合されている。このようなカーゴの例には、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2008/0234183号において開示されているカーゴが含まれるが、それに限定されるわけではない。結合されたカーゴを細胞の内部に送達するためにCPPを使用することならびに小分子、核酸、蛍光性部分、タンパク質、ペプチド、および/または他のカーゴなどのカーゴを結合する方法は、当技術分野において周知である。例えば、前掲書(米国特許出願公開第2008/0234183号); Rhee et al., 201. C105Y, a Novel Cell Penetrating Peptide Enhances Gene Transfer of Sec-R Targeted Molecular Conjugates, Molecular Therapy (2005) 11, S79-S79; Johnson et al., Cell-penetrating Peptide for Enhanced Delivery of Nucleic Acids and Drugs to Ocular Tissues Including Retina and Cornea, Molecular Therapy (2007) 16 (1), 107-114; El-Andaloussi et al., A Novel Cell-penetrating Peptide, M918, for Efficient Delivery of Proteins and Peptide Nucleic Acids, Molecular Therapy (2007) 15 (10), 1820-1826;およびCrombez et al., A New Potent Secondary Amphipathic Cell-Penetrating Peptide for siRNA Delivery Into Mammalian Cells, Molecular Therapy (2008) 17 (1), 95-103; Sasaki, Y. et al., Cell-penetrating peptide-conjugated XIAP-inhibitory cyclic hexapeptides enter into Jurkat cells and inhibit cell proliferation FEBS Journal (2008) 275 (23), 6011-6021; Kolluri, S.K. et al., A Short Nur77-Derived Peptide Converts Bcl-2 from a Protector to a Killer, Cancer Cell (2008) 14 (4), 285-298; Avbelj, M., The Role of Intermediary Domain of MyD88 in Cell Activation and Therapeutic Inhibition of TLRs J. Immunology (2011), 1;187(5):2394-404を参照されたい。
【０１００】
さらに、前述の例は、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)へのSEQ ID NO. 1〜19の結合および細胞アッセイの項(同様に、後述)に要約するその後の細胞透過も実証する。
【実施例】
【０１０１】
下記の個々の実施例のペプチドは、固相合成法によって調製した。Steward and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freemantle, San Francisco, Calif. (1968)を参照されたい。好ましい方法は、メリフィールド法である。Merrifield, Recent Progress in Hormone Res., 23:451 (1967)。さらに、下記の個々の実施例のペプチドは、ペプチドのN末端を緑色蛍光色素としてのFITCで標識することによって合成した。実施例1〜9は、C S Bio Company, Inc.によって調製され、実施例10〜19は、HYBIO Pharmaceutical Co., Ltd.によって調製された。
【０１０２】
実施例1: FITC-6Ahx-MWQPRRPWPRVPWRW-NH2の合成
材料:DMF(Dimethylformamide)、DCM(Methylene Chloride)、DIEA(Diisopropylethylamine)、およびピペリジンなどの化学物質および溶媒はすべて、VWRおよびAldrichから購入し、購入したままでそれ以上精製せずに使用した。エレクトロスプレーイオン化モードを用いて質量スペクトルを記録した。ポリマー担体としてRink Amide MBHA樹脂を用いて、CS 336Xシリーズペプチド合成機(C S Bio Company, Menlo Park, California, USA)において、保護されたアミノ酸の自動化された段階的組立物を構築した。N-(9-フルオレニル)メトキシカルボニル(Fmoc)反応を合成のために利用した。Fmocアミノ酸(AA)のための保護基は次のとおりであった:Arg:(Pbf)、Asn/Gln/Cys/His:(Trt)、Asp/Glu:(OtBu)、Lys/Trp:(Boc)、Ser/Thr/Tyr:(tBu)。
【０１０３】
合成:Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 1)を合成した。合成経路は、あらかじめ添加されたRink Amide樹脂のFmocを除くことから始まり、すべての指示について所与の配列に従って所望のAAを結合/脱保護した。カップリング試薬はDIC/HOBtであり、反応溶媒はDMFおよびDCMであった。ペプチジル樹脂/AA/DIC/HOBTの比率は、1/4/4/4(mol/mol)であった。結合プログラムの後、DMF中20％ピペリジンを用いて、脱Fmocを実行した。例えば、最後のAAが結合されるまで、0.4mmol合成を実施した。脱Fmoc後、樹脂をFmoc-Ahx-OHと結合させ、続いて、脱FmocおよびFITC結合を行った。
【０１０４】
Fmoc-Rink Amide樹脂(0.85g、0.4mmol、置換(sub):0.47mm/g、ロット番号110810、C S Bio)を25mL容反応管(RV)中でDMF(10mL)と混合し、10〜30分間、膨張させた。RVをCS336ペプチド自動合成機に取り付け、所与のペプチド配列に基づいて、アミノ酸をアミノ酸(AA)回転台(wheel)に載せた。HOBt(DMF中0.5M)およびDIC(DMF中0.5M)はすべて、N2下で移動可能な瓶中に別々にあらかじめ溶解しておいた。Fmoc-アミノ酸(AA、4当量)を計量し、AA回転台上に粉末としてあらかじめ置いておいた。例えば、0.4mmolの合成には、1.6mmolのAAが必要であった。あらかじめ設定されたプログラムは、AAチューブにAAを溶解することから始まり、溶液は、M-VAを通ってT-VAへとポンプで押し出された。その後、HOBt溶液をAAと混合した。窒素(N2)通気を用いて、混合を補助した。DIC溶液をAA/HOBt溶液と合一するのと同時に、水気を切った樹脂を含むRV中に混合物全体を5分間で移し、結合を同時に開始させた。
【０１０５】
3〜6時間振盪した後、反応混合物をろ別し、DMFで樹脂を3回洗浄し、続いて、あらかじめ設定されたプログラムに従ってDMF中20％ Pipを用いて脱Fmocを行った。同じ経路に従って、次のAAを結合させた。脱Fmoc後、DMF/DCMを二者択一的に用いて、7回の洗浄工程を行った。所与の配列に基づいて個々の構成単位(building blocks)を用いて、最後のAAが結合されるまで結合プロセスを繰り返した。結合時間:各AA結合について3〜6時間。最後のAAの脱Fmoc後、DIC/HOBtを用いて樹脂をFmoc-Ahx-OH(3当量)と結合させた。脱Fmoc後、DMF中でFITC(3当量)を1〜2当量のDIEAと結合させた。
【０１０６】
切断:最終的なペプチジル樹脂(1〜1.5g)をTFA反応混液(TFA/EDT/TIS/H2O)と混合し、混合物を室温で4時間振盪した。切断されたペプチドをろ過し、TFAで樹脂を洗浄した。エーテル沈殿および洗浄の後、50〜90％の収率で粗製ペプチドを得た。粗製ペプチドを凍結乾燥せずに直接精製した。
【０１０７】
精製:FITCペプチド100mgをバッファーA（0.1％TFA水溶液）およびACNに溶解し、分取HPLC精製システムを伴うC18カラム(2インチ)上にペプチド溶液を載せた。流速25〜40mL/分、60分の勾配を用いてTFA(0.1％)バッファー系において精製を終えた。予想されるMWを含む画分(ペプチド純度>95％)を採取した。次いで、分取HPLCカラムを、80％バッファーBを少なくとも3カラム容量分排出して(void)洗浄し、次の添加前に5％バッファーBと平衡にした。
【０１０８】
凍結乾燥:画分(純度>90％)を合一し、液体窒素によってしっかりと凍らせた1L容凍結乾燥瓶に移した。凍結後、瓶をLyophilizer(Virtis Freezemobile 35EL)に置き、一晩乾燥させた。減圧は500mTより低く、チャンバー温度は-60℃より低かった。凍結乾燥は、室温(周囲温度)において12〜18時間で完了させた。
【０１０９】
結果:0.2mm合成から開始して、TFA系で精製を行い、最終収量は生成物15mg(2.8％)であった。C130H167N35O22S2の算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、2636.1であった。
【０１１０】
実施例2:FITC-6Ahx-LRLLHRRQKRIIGGK-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 2)を合成した。実施例1の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.2mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド19mg(4.0％)を得た。C108H173N35O22Sの算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、2345.84であった。
【０１１１】
実施例3:FITC-6Ahx-RQHGLRHFYNRRRRS-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 3)を合成した。実施例1の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.2mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド17mg(3.3％)を得た。C113H162N42O25Sの算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、2540.86であった。
【０１１２】
実施例4:FITC-6Ahx-KLWKKKELLQRAEKKKKIKK-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 4)を合成した。実施例1の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.2mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド52mg(8.5％)を得た。C146H238N38O31Sの算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、3053.79であった。
【０１１３】
実施例5:FITC-6Ahx-MPKFKQRRRKLKAKAERLFK-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 5)を合成した。実施例1の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.2mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド75mg(12.2％)を得た。C143H226N42O29S2の算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、3061.76であった。
【０１１４】
実施例6:FITC-6Ahx-FVFPRLRDFTLAMAARKASR-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 6)を合成した。実施例1の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.2mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド12mg(2.1％)を得た。C134H196N36O30S2の算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、2855.38であった。
【０１１５】
実施例7:FITC-6Ahx-YLKFIPLKRAIWLIK-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 7)を合成した。実施例1の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.2mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド15mg(3.1％)を得た。C124H179N25O22Sの算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、2404であった。
【０１１６】
実施例8:FITC-6Ahx-IKRKRPFVLKKKRGRKRRRI-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 8)を合成した。実施例1の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.2mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド78mg(12.5％)を得た。C144H242N50O26Sの算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、3121.89であった。
【０１１７】
実施例9:FITC-6Ahx-RTTRRWKRWFKFRKRKGEKR-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 9)を合成した。実施例1の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.2mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド17mg(2.6％)を得た。C154H231N51O30Sの算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、3308.91であった。
【０１１８】
実施例10:FITC-6Ahx-MVLKFFRWLFRLLFR-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 10)を合成した。合成は、Fmoc- Linker-Rinkアミド樹脂(0.5g、置換(Sub)=0.3mmol/g)を用いて0.15ミリモルスケールで実施した。乾燥樹脂0.5gをペプチド合成反応器カラム(20×150mm)に入れ、DMFで膨張させ洗浄した。次いで、20％ピペリジンを添加し、5分間撹拌し、水気を切り、次いで、20％ピペリジンを再び添加し、7分間撹拌し、次いで、樹脂をDMFで洗浄した。Fmoc-Arg(Pbf)-OH  0.75mmol(5当量)、HOBt  0.75mmol、HBTU  0.75mmol、およびDIPEA  0.75mmolを反応カラムに加え、窒素と共に穏やかに2時間撹拌した。いくらかの樹脂試料を比色試験に供し、次いで、Fmoc基を脱保護した。すべてのアミノ酸が結合されるまで、上記の段階を繰り返した。合成の最後に、樹脂を切断するために振盪機上の反応管に移した。光を避けて室温で120分間、切断反応混液(TFA:TIS:H2O:EDT=91:3:3:3(v/v))20.0mLを用いて、ペプチドを樹脂から切断した。脱保護溶液を冷Et2O 1000mLに添加して、ペプチドを沈殿させた。250mL容ポリプロピレンチューブ中でペプチドを遠心分離した。個々のチューブから得られた沈殿物を1つのチューブに集め、冷Et2Oで3回洗浄し、ハウスバキューム(house vacuum)下、デシケーター中で乾燥させた。
【０１１９】
粗製の材料を、C18カラム(250×46mm、粒径10?m)を用いて分取HPLCによって精製し、30分で5〜95％のB(バッファーA:0.1％TFA/H2O;バッファーB:ACN)の直線勾配を用い、流速19mL/分で溶出させ、220nmで検出した。画分を採取し、分析的HPLCによって検査した。純粋な生成物を含む画分を合一し、凍結乾燥して白い非晶質粉末にした。
【０１２０】
FITC結合:ペプチジル樹脂0.15mmolを反応管に入れ、続いて、ピリジン:DMF:DCM=12:7:5(V/V)の試薬混合物と共にFITC 0.165mmolを添加した。N2中で2時間、混合物を反応させた。その後、ペプチドを樹脂から切断した。
【０１２１】
収量は、上記ペプチド80mg(18％)であった。C132H181N29O21S2の算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、2574.78であった。
【０１２２】
実施例11:FITC-6Ahx-RLWEFYKLYKRRHRV-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 11)を合成した。実施例10の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.15mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド90mg(18％)を得た。C129H179N35O25Sの算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、2652.12であった。
【０１２３】
実施例12:FITC-6Ahx-KVFSPKKKMEFFLLF-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 12)を合成した。実施例10の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.15mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド50mg(12％)を得た。C122H168N22O24S2の算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、2389.5であった。
【０１２４】
実施例13:FITC-6Ahx-VKIWFQNRRVRWRKR-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 13)を合成した。実施例10の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.15mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド60mg(12％)を得た。C125H181N39O23Sの算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、2630.12であった。
【０１２５】
実施例14:FITC-6Ahx-MRMIRFRKKIPYLRY-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 14)を合成した。実施例10の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.15mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド55mg(11％)を得た。C123H182N32O23S3の算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、2573.6であった。
【０１２６】
実施例15:FITC-6Ahx-PKWTRPLLPFWKRYL-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 15)を合成した。実施例10の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.15mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド50mg(11％)を得た。C128H172N28O23Sの算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、2501.7であった。
【０１２７】
実施例16:FITC-6Ahx-RWFAFKMMMAKKWAK-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 16)を合成した。実施例10の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.15mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド20mg(4％)を得た。C121H165N27O21Sの算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、2461.6であった。
【０１２８】
実施例17:FITC-6Ahx-SKIVRVIFRYAKWLF-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 17)を合成した。実施例10の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.15mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド25mg(6％)を得た。C123H171N27O23Sの算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、2427.8であった。
【０１２９】
実施例18:FITC-6Ahx-KFFKLKHFILNILKQ-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 18)を合成した。実施例10の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.15mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド80mg(19％)を得た。C123H176N26O23Sの算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、2417.8であった。
【０１３０】
実施例19:FITC-6Ahx-LLPQWPRIRHIKLLR-NH2の合成
Fmoc化学反応を利用して、FITCに結合された上記のペプチド(SEQ ID NO. 19)を合成した。実施例10の手順に従って、Fmoc Rink Amide MBHA樹脂(0.15mmol)を固相合成および精製に供して、上記のペプチド90mg(21％)を得た。C119H178N32O22Sの算出された(「calcd」)(ES)+-LCMS m/eは、2439.8であった。
【０１３１】
実施例20:細胞アッセイ法
以下のように、H460細胞株およびHeLa細胞株における細胞透過に関して実施例1〜19のペプチドを試験した。
【０１３２】
材料:H460細胞株およびHeLa(ATCC)を増殖培地中で維持し、次いで、2〜3日毎に継代した。H460のための増殖培地は、RPMI 1640、10％ウシ胎児血清、ピルビン酸ナトリウム、抗生物質、およびグルタミン(GIBCO)であった。HeLa細胞のための増殖培地は、10％の熱失活させたウシ胎児血清、抗生物質、およびグルタミン(GIBCO)を添加したDMEMであった。
【０１３３】
方法および手順:Whatman製ガラス底96ウェルプレートまたはPerkin Elmer製ガラス底96ウェルプレートに細胞を播種し、一晩培養した。DMSO中でペプチドストック溶液(stocks)を調製し、細胞取込み研究のために細胞増殖培地で希釈した。様々な濃度における2時間および24時間のペプチドインキュベーションの後、培地を除去し、続いて、酸性の生理食塩水で3回洗浄した。(核を染色するための)Hoechst 33342染色溶液を併用または併用しないでホルムアルデヒド固定を行った後、PBSで洗浄した。Operetta High Content Imagingシステムにおいて、共焦点蛍光モードで40倍の水浸型高NA対物レンズを用いて、プレートを画像化した。
【０１３４】
H460細胞における実施例1〜9のペプチドの結果は、図2Aおよび2Bに示している。図に示したように、実施例1〜9のペプチド(SEQ ID NO. 1〜9)について蛍光に基づいて測定した細胞透過は、多かった。H460細胞における実施例10〜19のペプチドの結果は図3Aおよび3Bに示しており、結果は様々であったが、いずれもいくらかの細胞透過を示した。例えば、実施例10〜11および15〜18のペプチド(それぞれSEQ ID NO: 10〜11およびSEQ ID NO: 15〜18)の細胞透過は、多かった。実施例13のペプチド(SEQ ID NO. 13)の細胞透過は中程度であり、実施例12、14、および19(SEQ ID NO: 12、14、および19)のペプチドの細胞透過は少なかったが、それでもなお細胞透過性であった。HeLA細胞における結果は同様であった。
【０１３５】
実施例21  細胞透過性であると予測されるその他のペプチドの同定
本発明の方法を用いて、細胞透過性であると予測されるその他のペプチドを同定した。例えば、SEQ ID NO: 20〜455のペプチドは、PP1<[(PP2×X1)+X](式中、X1は1.5〜10であり、Xは0.3〜-1.5である)ペプチドであり、したがって、細胞透過性であると予測される。表2を参照されたい。
【０１３６】
表2は、細胞透過性ペプチドを同定する本発明の方法に基づいて細胞透過性であると予測される、より長い配列またはタンパク質の範囲内で同定されたSEQ ID NO. 20〜455のペプチドを示す。
【０１３７】
（表２）本発明のその他の細胞透過性ペプチド
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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