(57)【要約】  インスリン誘導体を含有する安定した医薬製剤は、グリセロール、フェノール、m-クレゾールおよび亜鉛イオンをそれに加えることによって、都合よく調製することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式I:Acy-X-Yn-Ins[式中、「Ins」は、インスリン類似体のB29リシンアミノ酸に存在するεアミノ基に側鎖(Acy-X-Yn-と呼ぶ)が結合しているインスリン類似体を表し、前記インスリン類似体は、A14位にグルタミン酸、B25位にヒスチジン、任意選択でB16位にヒスチジンを含有するヒトインスリンであり、任意選択で、B27および/またはB30アミノ酸が除去されており、Acyは、ヒドロキシル基が除去された炭素原子数8〜24の脂肪二酸であり、Xは、アミノ残基が「Acy」に連結されているγGluであり、nがゼロでない場合は、γGluのカルボニル基はYに連結されているか、またはnがゼロである場合は、γGluのカルボニル基は、前記インスリン類似体のB29位のリシンのεアミノ基に連結されており、Yは-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-であり、式中、アミノ基はXに連結され、カルボニル基は前記インスリン類似体のB29位のリシンのεアミノ基に連結され、nは、0(ゼロ)、1、2または3である]を有するインスリン誘導体、約2%(重量/重量)以下のグリセロール、約16〜約35mMのフェノール、約16〜約35mMのm-クレゾール、6モルの前記インスリン誘導体につき約3.5〜約8モルの亜鉛イオンを含有し、約0〜約150の範囲内のイオン強度を有する医薬製剤。
【請求項２】
上の条項で指摘した好ましい特徴を有する、請求項1に記載の医薬製剤。
【請求項３】
一般式I:Acy-X-Yn-Ins[式中、「Ins」は、インスリン類似体のB29リシンアミノ酸に存在するεアミノ基に側鎖(Acy-X-Yn-と呼ぶ)が結合しているインスリン類似体を表し、前記インスリン類似体は、A14位にグルタミン酸、B25位にヒスチジン、任意選択でB16位にヒスチジンを含有するヒトインスリンであり、任意選択で、B27および/またはB30アミノ酸が除去されており、Acyは、ヒドロキシル基が除去された炭素原子数8〜24の脂肪二酸であり、Xは、アミノ残基が「Acy」に連結されているγGluであり、nがゼロでない場合は、γGluのカルボニル基はYに連結されているか、またはnがゼロである場合は、γGluのカルボニル基は、前記インスリン類似体のB29位のリシンのεアミノ基に連結されており、Yは-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-であり、式中、アミノ基はXに連結され、カルボニル基は前記インスリン類似体のB29位のリシンのεアミノ基に連結され、nは、0(ゼロ)、1、2または3である]を有するインスリン誘導体、約1〜約2%(重量/重量)のグリセロール、約16〜約35mMのフェノール、約16〜約35mMのm-クレゾール、6モルの前記インスリン誘導体につき約3.5〜約5.5モルの亜鉛イオン、および約75mM以下の塩化ナトリウムを含有する医薬製剤。
【請求項４】
上の条項で述べた好ましい特徴を有する、請求項3に記載の医薬製剤。
【請求項５】
インスリン誘導体が、A14E、B16H、B25H、B29K((Nεエイコサンジオイル-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル))、desB30ヒトインスリン、A14E、B16H、B25H、B29K(Nεヘキサデカンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリン;A14E、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリン;およびA14E、B25H、desB27、B29K(Nε-(オクタデカンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、請求項4に記載の製剤。
【請求項６】
可能な限り、約1.2mMを超える、好ましくは約2.1mMを超える量の、一般式Iのインスリン誘導体を含有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項７】
可能な限り、約9mM未満、好ましくは約7.1mM未満、より好ましくは約6mM未満の量の、一般式Iのインスリン誘導体を含有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項８】
明細書、特に上の条項に規定する通りである製剤。
【請求項９】
可能な限り、約2.1〜5.2mMのインスリン誘導体、約0.5〜1.8%(重量/重量)のグリセロール、約22〜28mMのフェノール、約22〜28mMのm-クレゾール、6モルのインスリン誘導体につき約3.8〜5の亜鉛イオン、約10〜90mMの塩化ナトリウムを含有し、約7.2〜8.2のpH値を有する、請求項1から8のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１０】
約4.2mMのインスリン誘導体、約1.6%(重量/重量)のグリセロール、約25mMのフェノール、約25mMのm-クレゾール、6モルのインスリン誘導体につき約4.5のZnイオン、約20mMの塩化ナトリウムを含有し、約7.4のpH値を有する、請求項1から9のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１１】
可能な限り、約4.2mMのインスリン誘導体、約0.7%(重量/重量)のグリセロール、約25mMのフェノール、約25mMのm-クレゾール、6モルのインスリン誘導体につき約4.5の亜鉛イオン、約75mMの塩化ナトリウムを含有し、約7.4のpH値を有する、請求項1から10のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項１２】
本明細書に記載される特徴、条項または請求項ならびに/または特徴、条項および/もしくは請求項の組合せによって規定される任意の新規生成物、機器、方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病および本来それに関連する態様を予防、処置および治療するために用いることができる、医薬用インスリン製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
インスリンは、すい臓のβ細胞によって分泌されるポリペプチドホルモンである。
【０００３】
インスリンは、糖尿病およびそれと関連するかそれからもたらされる疾患の処置のために用いられる。インスリンは、正常な代謝調節の維持に必須である。90年前のインスリン療法の導入以来、何百万人の糖尿病患者の生命が救われ、延命され、向上した。最後の数十年には、糖尿病患者が血糖レベルの精密制御を維持することが極めて重要であることがわかった。
【０００４】
Prog. Biophys. Mole. Biol. 91 (2006)、199頁以下には、インスリンの異なる形の概要がある。
【０００５】
通常、インスリンは注射(皮下)によって投与される。Nat. Reviews Drug Disc. 1 (2002)、529頁以下には、インスリン投与のための代替経路の概要がある。
【０００６】
WO 2009/115469では、1つの疎水性アミノ酸が親水性アミノ酸で置換されているアシル化インスリン類似体が指摘されている。WO 2009/115469では、具体的な注射可能な医薬用インスリン製剤の指摘はない。
【０００７】
WO 2008/015099では、ペグ化された長期インスリンが指摘されている。WO 2008/015099では、具体的な医薬用インスリン製剤の指摘はない。
【０００８】
簡潔には、WO 02/067969は、2つの異なるインスリン種を含有するので安定しているインスリン製剤に関し、見かけ上、記載は、インスリンリスプロが2つのインスリン種の1つであることに重点を置いている。
【０００９】
数十年の間、異なる特性を有するインスリン製剤が開発され、市販されており、それらの製剤は多種多様な添加剤を用いて調製された。市販されている中性インスリン製剤では、その全てが単量体の形であるインスリンをいずれも含有しないと推定される。
【００１０】
多くの患者は、例えば、基礎処置および食事処置のために、1日に2〜4回のインスリン注射を受ける。
【００１１】
2007年に、世界で246,000,000人の糖尿病患者がいた。2025年に、その数は約380,000,000になると予想されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO 2009/115469
【特許文献２】WO 2008/015099
【特許文献３】WO 02/067969
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Prog. Biophys. Mole. Biol. 91 (2006)、199頁以下
【非特許文献２】Nat. Reviews Drug Disc. 1 (2002)、529頁以下
【非特許文献３】Naikiら、Anal. Biochem. 177 (1989)、244〜249頁
【非特許文献４】LeVine、Methods. Enzymol. 309 (1999)、274〜284頁
【非特許文献５】Nielsenら、Biochemistry 40 (2001)、6036〜6046頁
【非特許文献６】Guidelines for Examination in the Europe Patent Office、part C、chapter III、4.21、2007年12月
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、先行技術の欠点の少なくとも1つを克服もしくは改善すること、または有益な代替手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明の別の態様は、比較的高いインスリン含有量、例えば、約1.5mMを超えるインスリン、好ましくは約3mMを超えるインスリン、より好ましくは約4mMを超えるインスリン濃度、および約9mMを下回るインスリン濃度を有するインスリン製剤の提供に関する。
【００１６】
本発明の別の態様は、十分な化学的安定性を有するインスリン製剤の提供に関する。
【００１７】
本発明の別の態様は、十分な物理的安定性を有するインスリン製剤の提供に関する。
【００１８】
本発明の別の態様は、十分に低い粘度を有するインスリン製剤の提供に関する。
【００１９】
本発明の別の態様は、十分な溶解性を有するインスリン製剤の提供に関する。
【００２０】
本発明の別の態様は、十分な安定したオリゴマー化パターンを有するインスリン製剤の提供に関する。
【００２１】
本発明の別の態様は、比較的高い濃度で存在するインスリンが、約6以上のpH値、好ましくは約6.5以上のpH値、より好ましくは約7以上のpH値、さらにより好ましくは約7.4以上のpH値で、および約8.2のpH値より下で溶解形である、インスリン製剤の提供に関する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
用語「糖尿病」または「真性糖尿病」には、高血糖を引き起こす1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠性糖尿病(妊娠中)および他の状態が含まれる。この用語は、すい臓が不十分な量のインスリンを生産するか、体細胞がインスリンに適切に応答することができず、したがって細胞がグルコースを吸収することを阻止する代謝異常のために用いられる。その結果、血液中にグルコースが蓄積する。
【００２３】
インスリン依存性真性糖尿病(IDDM)および若年発症糖尿病とも呼ばれる1型糖尿病は、β細胞の破壊によって引き起こされ、通常、インスリンの絶対的欠乏につながる。インスリン非依存性真性糖尿病(NIDDM)および成人発症糖尿病としても知られる2型糖尿病は、支配的なインスリン抵抗性、したがってインスリンの相対的欠乏および/またはインスリン抵抗性を伴う主にインスリン分泌の欠陥と関連する。
【００２４】
本明細書で、用語「製剤」は、用語「組成物」と同義的に用いられる。
【００２５】
溶液のイオン強度は、その溶液中のイオン濃度の測度である。イオン化合物は、水に溶解したときにイオンに解離する。溶液中の総電解質濃度は、異なる塩の解離または溶解性などの重要な特性に影響を及ぼす。溶解したイオンを有する溶液の主要な特性の1つは、イオン強度である。溶液のイオン強度(本明細書で「I」と呼ぶ)は、その溶液に存在する全イオンの濃度の関数である:
【００２６】
【数１】
2015514120.tif 000002
【００２７】
式中、ciはイオンiのモル濃度(mol・dm-3)であり、ziはそのイオンの電荷数であり、合計は溶液中の全イオンでとられる。塩化ナトリウムなどの1:1の電解質については、イオン強度は濃度に等しいが、MgSO4については、イオン強度は4倍高い。一般に多価イオンは、イオン強度に強く寄与する。
【００２８】
本明細書で、以下の略記号が用いられる:「Ac」は酢酸、「γGlu」または「gGlu」は式-CO-CH2CH2-CH(COOH)-NH-を有するガンマL-グルタミルのために;「HMWP」は高分子量ペプチドのために;「OEG」は、[2-(2-アミノエトキシ)-エトキシ]メチルカルボニルとも呼ばれる-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-基に対応する式NH2-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-COOHを有するアミノ酸のために;「ThT」はチオフラビンTのために用いられる。
【００２９】
驚くべきことに、本明細書、例えば本明細書の条項および請求項で指摘される添加剤を、本明細書、例えば本明細書の条項および請求項で指摘される濃度で含有する、本明細書、例えば本明細書の条項および請求項で指摘されるインスリン誘導体の製剤が、上記の目的の多くを果たすことが見出された。例えば、そのような製剤は可溶性であり、所望の薬物動態プロファイルを有する。
【００３０】
本発明によって安定化されるインスリン誘導体は、一般式I:Acy-X-Yn-Insを有する。この式では、「Ins」は、インスリン類似体のB29リシンアミノ酸に存在するεアミノ基に側鎖(Acy-X-Yn-と呼ぶ)が結合しているインスリン類似体を表す。言い換えると、「Ins」は、インスリン類似体を表し;式Iにより、側鎖(Acy-X-Yn-と呼ぶ)は、前記インスリン類似体に結合しており、すなわち、前記インスリン類似体のB29リシンアミノ酸に存在するεアミノ基に結合している。前記インスリン類似体は、A14位にグルタミン酸、B25位にヒスチジン、任意選択でB16位にヒスチジンを含有するヒトインスリンであり、任意選択で、B27および/またはB30アミノ酸が除去されている。一般式II(Acy-X-Yn-と呼ばれる)を有する前記側鎖において、Acyは、ヒドロキシル基が除去された炭素原子数8〜24の脂肪二酸であり、Xは、アミノ残基が「Acy」に連結されたγGluであり、nがゼロでない場合は、γGluのカルボニル基はYに連結されているか、またはnがゼロである場合は、γGluのカルボニル基は、インスリン類似体のB29位のリシンのεアミノ基に連結されており、Yは-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-であり、アミノ残基はXに連結され、カルボニル基はインスリン類似体のB29位のリシンのεアミノ基に連結され、nは、0(ゼロ)、1、2または3である。
【００３１】
式Iのそのようなインスリン誘導体の具体例は、A14E、B16H、B25H、B29K((Nε-エイコサンジオイル-γGlu[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル))、desB30ヒトインスリンである。この化合物は、A14E、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-γGlu-OEG-OEG)、desB30ヒトインスリンと呼ぶこともでき、以下の式を有する:
【００３２】
【化１】
2015514120.tif 000003
【００３３】
親インスリン類似体のAおよびB鎖の配列リストは、配列番号1および2にそれぞれ示す。式Iの他の具体的インスリン誘導体の例は、A14E、B16H、B25H、B29K(Nεヘキサデカンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリン;A14E、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリン;およびA14E、B25H、desB27、B29K(Nε-(オクタデカンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリンである。3つの最後に指摘した化合物の式は、WO 2009/115469の例27、60および151にそれぞれ明記されている。
【００３４】
驚くべきことに、本発明の最も広い態様では、上記の必要条件を満たす医薬製剤は、上記の式Iのインスリン誘導体を、フェノール、m-クレゾール、亜鉛イオン、任意選択で所望のイオン強度を与える1つまたは複数の化合物、および任意選択でグリセロールと、全てこの明細書に記載の量で混合することによって調製することができる。
【００３５】
所望のイオン強度は、適切な量の塩化ナトリウムおよび/または酢酸ナトリウム、および/またはTRIS(2-アミノ-2-ヒドロキシメチル-1,3-プロパンジオール)および/またはアルギニンを、この明細書で指摘した量で加えることによって得ることができる。
【００３６】
驚くべきことに、本発明の一態様では、上記の必要条件を満たす医薬製剤は、上記の式Iのインスリン誘導体を、グリセロール、フェノール、m-クレゾール、亜鉛イオン、および任意選択で塩化ナトリウムと適切な量で混合することによって調製することができ、これらの成分は、下の請求項1に明記される量、好ましくは4.2mMのインスリン誘導体、約1.6%(重量/重量)のグリセロール、約25mMのフェノール、約25mMのm-クレゾール、約4.5Zn/6モルインスリン誘導体、約20mMの塩化ナトリウムで存在することができ、約7.4のpH値を有する。
【００３７】
医薬製剤は、塩化ナトリウムおよびグリセロールの添加によって等張性にされる。
【００３８】
インスリン分野では、調製物中に存在する6モルのインスリンまたはインスリン誘導体あたりに存在する亜鉛イオンの量として存在する亜鉛の量の数量を与えることが一般的である。時には、全てのインスリン分子が六量体立体構造の形成に参加するとは限らないにもかかわらず、前記6モルのインスリンまたはインスリン誘導体は、誤って六量体と呼ばれ、そのような場合、実際には、存在する亜鉛の量は、前記インスリンまたはインスリン誘導体が六量体立体構造の形成に参加するかどうかに関係なく、6モルのインスリンまたはインスリン誘導体あたりに存在する亜鉛イオンの量である。この計算のために、前記亜鉛イオンがどの形で存在するかについて考慮する必要はない。
【００３９】
インスリン製剤の注射の後、インスリン誘導体は自己会合して、特に、二量体、六量体、ジ六量体(十二量体)および多六量体を形成することが望ましい。本明細書において、用語多六量体は、12個を超える分子のインスリン誘導体を含有するインスリンアセンブリーを包含する。本発明の製剤のヒトへの注射の後、製剤中の添加剤の拡散のために多六量体は解離し、遊離の二量体は単量体に速やかに解離すると考えられている。
【００４０】
製剤の十分なオリゴマー化パターンとは、製剤の有効期間を通して、パターンが実質的に不変であることを意味する。さらに、前記製剤は、いくつかの構成成分、すなわち、十二量体プラス単量体または六量体プラス十二量体、六量体、二量体ではなく単量体プラス十二量体から単量体までの不特定の異なるオリゴマーでない単量体からなることができる。
【００４１】
インスリン製剤は、それ自体公知である様式で、例えば、医師の一般知識と合わせた患者の一般知識に従って患者に投与される。本発明は、患者の都合に合わせて最も良好に用いられる。したがって、使用の最終モードは、製品の能力と患者の素質および好みの両方に依存する。これは、任意のインスリン製品の効果が、個々の患者のインスリン必要性および前記インスリンの薬力学作用への感受性、および最後に所与の状況での患者の好みにも依存するという事実による。これらの条件は、より長い期間(年)の間に、および日ごとに、やがて変化することがある。任意の患者のための最適用量レベルは、患者の年齢、体重、身体活動および食事、他の薬物との可能な組合せ、ならびに処置される状態の重症度を含む、様々な因子に依存する。投薬レジメンは、既知のインスリン製剤のために現在行われているのと類似した方法で、熟練者によって個々の患者ごとについて決定されるよう推奨する。
【００４２】
本発明の主要な標的である疾患および状態は、高血糖を特徴とする真性糖尿病(1型または2型)または他の状態であるが、インスリンの代謝作用が臨床上の関連性を有するか関心がある代謝性の疾患および状態一般、例えば糖尿病前期、耐糖能異常、メタボリックシンドローム、肥満、悪液質、生体内でのベータ細胞の減少/死、過剰な食欲および炎症もそうである。全てのこの種の状態は、その疾患または状態を有する対象での安定した代謝状態が有益であることが公知であるか、そうであると考えられている。
【００４３】
本発明を行使するために、そのような処置を必要とする患者にインスリン調製物を非経口的に投与することができる。非経口投与は、シリンジ、任意選択でペン様シリンジによる皮下、筋肉内または静脈内注射によって実施することができる。あるいは、非経口投与は、注入ポンプによって実施することができる。さらなる選択肢は、インスリン組成物を経鼻的または肺に、好ましくはその目的のために特別に設計された組成物、粉末または液体で投与することである。
【００４４】
本発明の好ましい特徴
上の明細書を要約し、補足すると、本発明の特徴および条項は以下の通りである:
【００４５】
1.一般式Iのインスリン誘導体、グリセロール、フェノール、m-クレゾールおよび亜鉛イオンを含有する医薬製剤。
【００４６】
2.一般式I:Acy-X-Yn-Ins[式中、「Ins」はインスリン類似体を表し、前記インスリン類似体のB29リシンアミノ酸に存在するεアミノ基に側鎖(Acy-X-Yn-と呼ぶ)が結合しており、前記インスリン類似体は、A14位にグルタミン酸、B25位にヒスチジン、任意選択でB16位にヒスチジンを含有するヒトインスリンであり、任意選択で、B27および/またはB30アミノ酸が除去されており、Acyは、ヒドロキシル基が除去された炭素原子数8〜24の脂肪二酸であり、Xは、アミノ残基が「Acy」に連結されているγGluであり、nがゼロでない場合は、γGluのカルボニル基はYに連結されているか、またはnがゼロである場合は、γGluのカルボニル基は、前記インスリン類似体のB29位のリシンのεアミノ基に連結されており、Yは-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-であり、式中、アミノ基はXに連結され、カルボニル基は前記インスリン類似体のB29位のリシンのεアミノ基に連結され、nは、0(ゼロ)、1、2または3である]を有するインスリン誘導体、約2%(重量/重量)以下のグリセロール、約16〜約35mMのフェノール、約16〜約35mMのm-クレゾール、6モルの前記インスリン誘導体につき約3.5〜約8モルの亜鉛イオンを含有し、約0〜約150の範囲内のイオン強度を有する医薬製剤。
【００４７】
3.可能な限り、約0.3%(重量/重量)からの範囲内の量のグリセロールを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００４８】
4.可能な限り、約0.7%(重量/重量)からの範囲内の量のグリセロールを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００４９】
5.可能な限り、6モルのインスリン誘導体につき7.1未満である量の亜鉛イオンを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００５０】
6.一般式I:Acy-X-Yn-Ins[式中、「Ins」は、インスリン類似体のB29リシンアミノ酸に存在するεアミノ基に側鎖(Acy-X-Yn-と呼ぶ)が結合しているインスリン類似体を表し、前記インスリン類似体は、A14位にグルタミン酸、B25位にヒスチジン、任意選択でB16位にヒスチジンを含有するヒトインスリンであり、任意選択で、B27および/またはB30アミノ酸が除去されており、Acyは、ヒドロキシル基が除去された炭素原子数8〜24の脂肪二酸であり、Xは、アミノ残基が「Acy」に連結されているγGluであり、nがゼロでない場合は、γGluのカルボニル基はYに連結されており、またはnがゼロである場合は、γGluのカルボニル基は、前記インスリン類似体のB29位のリシンのεアミノ基に連結されており、Yは-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-であり、式中、アミノ基はXに連結され、カルボニル基は前記インスリン類似体のB29位のリシンのεアミノ基に連結され、nは、0(ゼロ)、1、2または3である]を有するインスリン誘導体、約1〜約2%(重量/重量)のグリセロール、約16〜約35mMのフェノール、約16〜約35mMのm-クレゾール、6モルの前記インスリン誘導体につき約3.5〜約5.5モルの亜鉛イオン、および約75mM以下の塩化ナトリウムを含有する、前の請求項に記載の医薬製剤。
【００５１】
7.可能な限り、約1.2mMを超える、好ましくは約2.1mMを超える、より好ましくは3.8mMを超える量の、一般式Iのインスリン誘導体を含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００５２】
8.可能な限り、約9mM未満、好ましくは約7.1mM未満、より好ましくは約6mM未満の量の、一般式Iのインスリン誘導体を含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００５３】
9.可能な限り、約2.1mMの、一般式Iのインスリン誘導体を含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００５４】
10.可能な限り、約4.2mMの、一般式Iのインスリン誘導体を含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００５５】
11.可能な限り、約1〜約2%(重量/重量)の範囲内の量のグリセロールを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００５６】
12.可能な限り、約1.6%(重量/重量)のグリセロールを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００５７】
13.可能な限り、約16を超える、好ましくは約20mMを超える量のフェノールを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００５８】
14.可能な限り、約35mM未満、好ましくは約30mM未満の量のフェノールを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００５９】
15.可能な限り、約25mMのフェノールを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００６０】
16.可能な限り、約16mMを超える、好ましくは約20mMを超える量のm-クレゾールを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００６１】
17.可能な限り、約35mM未満、好ましくは約30mM未満の量のm-クレゾールを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００６２】
18.可能な限り、約25mMのm-クレゾールを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００６３】
19.可能な限り、6モルのインスリン誘導体につき、約3.5を超える、好ましくは約4を超える、より好ましくは約4.2を超える量の亜鉛イオンを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００６４】
20.可能な限り、6モルのインスリン誘導体につき約7.8未満である量の亜鉛イオンを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００６５】
21.可能な限り、6モルのインスリン誘導体につき約6.8未満である量の亜鉛イオンを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００６６】
22.可能な限り、6モルのインスリン誘導体につき、約5.5未満である、好ましくは約5.1未満である、より好ましくは約5未満である、さらにより好ましくは約4.8未満である量の亜鉛イオンを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００６７】
23.可能な限り、6モルのインスリン誘導体につき約4.5の亜鉛イオンを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００６８】
24.可能な限り、約1を超える、好ましくは約10を超えるイオン強度を有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００６９】
25.可能な限り、約150mM未満、好ましくは約120未満、より好ましくは約100未満のイオン強度を有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００７０】
26.可能な限り、約1mMを超える、好ましくは約10mMを超える量の塩化ナトリウムを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００７１】
27.可能な限り、約150mM未満、好ましくは約120mM未満、より好ましくは約100mM未満の量の塩化ナトリウムを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００７２】
28.可能な限り、約75mM未満、好ましくは約50mM未満、より好ましくは約30mM未満の量の塩化ナトリウムを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００７３】
29.可能な限り、約20mMの塩化ナトリウムを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００７４】
30.可能な限り、約1mMを超える、好ましくは約10mMを超える量の酢酸ナトリウムを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００７５】
31.可能な限り、約150mM未満、好ましくは約120mM未満、より好ましくは約100mM未満の量の酢酸ナトリウムを含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００７６】
32.可能な限り、約6.5を超える、好ましくは約6.8を超える、より好ましくは約7を超える、さらにより好ましくは約7.2を超えるpH値を有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００７７】
33.可能な限り、約8未満、好ましくは約7.8未満、より好ましくは約7.6未満のpH値を有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００７８】
34.可能な限り、約7.4のpH値を有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００７９】
35.可能な限り、6モルのインスリン誘導体につき約4〜約5.1の範囲内の量のZnを含有し、約7〜約8.2の範囲内のpH値を有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００８０】
36.可能な限り、6モルのインスリン誘導体につき約4〜約5.1の範囲内の量のZnを含有し、約7〜約7.8の範囲内のpH値を有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００８１】
37.可能な限り、約2.1〜約8.4mMのインスリン誘導体、6モルのインスリン誘導体につき約2〜約6の亜鉛イオンを含有し、約0〜約150のイオン強度を有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００８２】
38.可能な限り、約2.1〜約6mMのインスリン誘導体、6モルのインスリン誘導体につき約3〜約5の亜鉛イオンを含有し、約10〜約100のイオン強度を有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００８３】
39.可能な限り、約2.1〜約6mMのインスリン誘導体、6モルのインスリン誘導体につき約3〜約5の亜鉛イオンを含有し、約20〜約80のイオン強度を有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００８４】
40.可能な限り、約2.1〜5.2mMのインスリン誘導体、約0.5〜1.8%(重量/重量)のグリセロール、約22〜28mMのフェノール、約22〜28mMのm-クレゾール、6モルのインスリン誘導体につき約3.8〜5の亜鉛イオン、約10〜90mMの塩化ナトリウムを含有し、約7.2〜8.2のpH値を有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００８５】
41.可能な限り、約4.2mMのインスリン誘導体、約1.6%(重量/重量)のグリセロール、約25mMのフェノール、約25mMのm-クレゾール、6モルのインスリン誘導体につき約4.5の亜鉛イオン、約20mMの塩化ナトリウムを含有し、約7.4のpH値を有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００８６】
42.可能な限り、約3.8〜5.2mMのインスリン誘導体、約1.3〜1.8%(重量/重量)のグリセロール、約22〜28mMのフェノール、約22〜28mMのm-クレゾール、6モルのインスリン誘導体につき約3.8〜5の亜鉛イオン、約10〜30mMの塩化ナトリウムを含有し、約7.2〜8.2のpH値を有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００８７】
43.インスリン誘導体が、A14E、B16H、B25H、B29K((Nεエイコサンジオイル-γGlu[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル))、desB30ヒトインスリン、A14E、B16H、B25H、B29K(Nεヘキサデカンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリン;A14E、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリン;およびA14E、B25H、desB27、B29K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリンからなる群から選択され、好ましくはA14E、B16H、B25H、B29K((Nεエイコサンジオイル-γGlu[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル))、desB30ヒトインスリンである、前の条項に記載の製剤。
【００８８】
44.可能な限り、約4.2mMのインスリン誘導体、約0.7%(重量/重量)のグリセロール、約25mMのフェノール、約25mMのm-クレゾール、6モルのインスリン誘導体につき約4.5の亜鉛イオン、約75mMの塩化ナトリウムを含有し、約7.4のpH値を有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００８９】
45.可能な限り、約3.8〜5.2mMのインスリン誘導体、約0.5〜1%(重量/重量)のグリセロール、約22〜28mMのフェノール、約22〜28mMのm-クレゾール、6モルのインスリン誘導体につき約3.8〜5の亜鉛イオン、約60〜90mMの塩化ナトリウムを含有し、約7.2〜8.2のpH値を有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００９０】
46.インスリン誘導体が、A14E、B16H、B25H、B29K((Nεエイコサンジオイル-γGlu[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル))、desB30ヒトインスリン、A14E、B16H、B25H、B29K(Nεヘキサデカンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリン;A14E、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリン;およびA14E、B25H、desB27、B29K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリンからなる群から選択され、好ましくはA14E、B16H、B25H、B29K((Nεエイコサンジオイル-γGlu[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル))、desB30ヒトインスリンである、前の条項に記載の製剤。
【００９１】
47.インスリン誘導体の主要部分、例えばその50%(重量/重量)が単量体の形である、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００９２】
48.可能な限り、一般式のインスリン誘導体に存在するインスリン類似体のアミノ酸配列が、5つを超える位置でヒトインスリンから逸脱しない、好ましくは4つを超える位置でヒトインスリンから逸脱しない、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００９３】
49.可能な限り、インスリン誘導体が、A14E、B16H、B25H、B29K-((Nεエイコサンジオイル-γGlu[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル))、desB30ヒトインスリン、A14E、B16H、B25H、B29K(Nεヘキサデカンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリン;A14E、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリン;およびA14E、B25H、desB27、B29K(Nε-オクタデカンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリンからなる群から選択される、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００９４】
50.可能な限り、一般式のインスリン類似体が、A14E、B16H、B25H、B29K(Nεヘキサデカンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリンである、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００９５】
51.可能な限り、一般式のインスリン類似体が、A14E、B16H、B25H、B29K(Nεエイコサンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリンである、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００９６】
52.可能な限り、一般式のインスリン類似体が、A14E、B25H、desB27、B29K(Nεオクタデカンジオイル-γGlu)、desB30ヒトインスリンである、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００９７】
53.可能な限り、一般式のインスリン類似体が、A14E、B16H、B25H、B29K((Nε-エイコサンジオイル-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル))、desB30ヒトインスリンである、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００９８】
54.可能な限り、注射後に、インスリン誘導体が多六量体の形であるか、またはその主要部分、好ましくはその50%を超え、さらにより好ましくはその75%(重量/重量)を超える部分が多六量体の形である、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【００９９】
55.可能な限り、5%未満、好ましくは1%未満、さらにより好ましくは0.1%(重量/重量)未満の固体物質を含有する、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【０１００】
56.可能な限り、明細書に規定する通りであり、特に上の条項に規定する通りである、前の製剤条項のいずれか一項に記載の製剤。
【０１０１】
57.本明細書に記載される特徴およびまたは請求項、ならびに/または特徴および/もしくは請求項の組合せによって規定される任意の新規生成物、機器、方法または使用。
【０１０２】
本明細書に記載される条項および実施形態の1つまたは複数を組み合わせること、任意選択でさらに下記の請求項の1つまたは複数と組み合わせることは、さらなる実施形態をもたらし、本発明は、前記条項、実施形態および請求項の全ての可能な組合せに関する。
【０１０３】
以下の例は、限定ではなく例示として提供される。
【実施例１】
【０１０４】
目的
この実験の目的は、A14E、B16H、B25H、B29K((Nεエイコサンジオイル-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル))、desB30ヒトインスリンによる製剤中の亜鉛濃度の関数としての化学的および物理的安定性を測定することであった。
【０１０５】
製剤
A14E、B16H、B25H、B29K((Nεエイコサンジオイル-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル))、desB30ヒトインスリンを、約8のpH値において26.2mMの最終濃度までmilliq水に溶解した。フェノール、クレゾール、塩化亜鉛(Zn)およびグリセロールを、下の表のZn/6インスリン(本明細書では「ins」と略す)の濃度により、指摘された順序で加え、7.1mMの最終インスリン濃度にした。
【０１０６】
中性pHでSECによって観察される種分布は、方法1を用いて測定した。
【０１０７】
製剤の物理的安定性は、チオフラビンTアッセイで遅延時間として測定した。
【０１０８】
製剤の化学的安定性は、37℃で2週間の保存の後の高分子量タンパク質(HMWP)および脱アミドの、4℃で2週間の保存の後に測定されたHMWPおよび脱アミドの量と比較した増加として測定された。4℃で2週間の保存の後のHMWP含有量は、0.6%である。4℃で2週間の保存の後の脱アミド含有量は、5.4%である。
【０１０９】
HMWPは、HMWP方法1を用いて測定した。
【０１１０】
脱アミドのようなインスリン関連の不純物の形成は、逆相クロマトグラフィー(UPLC)を用いて測定した。
【０１１１】
脱アミドA21およびB3の量は、保存料の溶出後に判定された総吸光度面積の百分率で測定された吸光度面積として判定された。
【０１１２】
【表１】
2015514120.tif 000004
【０１１３】
以下を結論づけることができる
上の表に基づき、亜鉛濃度の関数としてオリゴマー化が増加および減少すると結論づけることができる。六量体の最大量は、2.3Zn/6インスリンを含有する製剤にある。ジ六量体の最大量は、3.5Zn/6insから5.9Zn/6の間を含有する製剤にある。5.9Zn/6インスリンから7.1Zn/6インスリンへのZn濃度の増加は、ジ六量体の量を減少させる。
【０１１４】
ThTアッセイでの遅延時間が亜鉛濃度の関数として増加し、2.3Zn/6insより上で最適であるので、2.3Zn/6insを超える製剤で物理的安定性は最適であり、製剤が2.3Zn/6ins以上を含有するとき、ThT試験後の回収は100%に増加する。
【０１１５】
HMWP形成が2.3Zn/6インスリンから5.9Zn/6insまでを含有する製剤で最適であるので、化学的安定性は亜鉛濃度の関数として増加する。脱アミド形成は、2.3Zn/6インスリンから5.9Zn/6insまでを含有する製剤で同様に最適である。
【０１１６】
インスリンのオリゴマー化は、試料の物理的および化学的安定性に関連づけられる。インスリン単量体(0および1.2Zn/6ins)を主に含有する製剤は、低い物理的および化学的安定性を有する。ジ六量体種を含有する製剤は、化学的に最も安定した立体構造のようである。
【実施例２】
【０１１７】
目的
この実験の目的は、固定化製剤中のA14E、B16H、B25H、B29K((Nεエイコサンジオイル-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル))、desB30ヒトインスリン濃度の関数としての化学的および物理的安定性を測定することであった。インスリンの安定性は、オリゴマー化の程度に依存することが示されている;亜鉛による六量体インスリンは、亜鉛のないインスリンよりも安定している(BrangeおよびLangkjaer 1992)。オリゴマー化は希釈によっても作動されるので、試料中のインスリン濃度は安定性に影響を及ぼすことができる。
【０１１８】
製剤
A14E、B16H、B25H、B29K((Nεエイコサンジオイル-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル))、desB30ヒトインスリンを、約8のpH値のmilliq水に溶解した。フェノール、クレゾール、塩化亜鉛(Zn)およびグリセロールを指摘した順序で加え、4.7Zn/6インスリン、1.6%グリセロール、16mMフェノール、20mMクレゾール、20mM NaCl、pH7.4、を含有する最終製剤にし、インスリン濃度は下の表に明記する。
【０１１９】
製剤の物理的安定性は、チオフラビンT(ThT)アッセイでの時間で表す遅延時間として測定し、インスリンの回収は、新たに調製された試料のThTアッセイの後にHPLCで測定した。
【０１２０】
製剤の化学的安定性は、37℃で2週間の保存の後のHMWPおよび脱アミドの、4℃で2週間の保存の後に測定されたHMWPおよび脱アミドの量と比較した増加として測定した。HWMPは、HMWP方法1を用いて測定した。脱アミド形成は、逆相クロマトグラフィーを用いて測定した。4℃で2週間および5週間の保存の後のHMWP含有量は、0.4〜0.5%である。4℃で2週間の保存の後の脱アミド含有量は、5.4%である。
【０１２１】
【表２】
2015514120.tif 000005
【０１２２】
上の表に基づき、製剤の物理的安定性はインスリン濃度範囲0.51〜7.1mMで類似していたと結論づけることができる。
【０１２３】
37℃で2週間の後に分析されたインスリン濃度範囲0.51〜7.1mMで、A14E、B16H、B25H、B29K((Nεエイコサンジオイル-gGlu-[2-(2-{2-[2-(2-アミノエトキシ)エトキシ]アセチルアミノ}エトキシ)エトキシ]アセチル))、desB30ヒトインスリンのHMWP形成は類似している。アミド分解およびHMWPの発達は、インスリン濃度範囲3.5mM〜7.1mMならびに時間範囲30℃で5週間および37℃で45日間でも類似している。さらに、45日間でHMWPの1%だけが形成されるのでHMWPの発達は低く、HMWPの1〜1.5%だけが形成されるので脱アミドは同様に低い。
【実施例３】
【０１２４】
この研究の目的は、下の結果の表に指定する、pH、NaClおよびZnを変化させる製剤条件での安定性を調査することであった。Table 3(表3)の1〜12の数字を有する製剤は、4.2mMインスリン7、25mMフェノール、20mM m-クレゾール、ならびに下のTable 3(表3)に指摘する成分を含有した。NovoRapid(登録商標)賦形剤対照(Table 3(表3)の製剤番号13)は、600μMのインスリンアスパルト、0.3mMの酢酸亜鉛、20mMのNaCl、16mMのフェノール、16mMのクレゾール、1.6%のグリセロールおよび7mMのリン酸塩(pH7.4)からなった。
【０１２５】
【表３】
2015514120.tif 000006
【０１２６】
上の表からの結論は、製剤のTHT遅延時間が亜鉛含有量の関数として増加し、製剤が6インスリン分子につき4つを超えるZn原子を含有するときに最適であるということである。さらなる結論は、インスリン7のHMWP形成が、試験した製剤のNovoRapidの範囲内にあるということである
【実施例４】
【０１２７】
目的
この実験の目的は、4.2mMのインスリン濃度の、インスリン7、インスリン3、インスリン6、インスリン2およびインスリン8による製剤中の亜鉛濃度の関数として、化学的および物理的安定性を測定することであった。
【０１２８】
製剤
インスリン7、インスリン3、インスリン6、インスリン2およびインスリン8を、約8のpH値で、約9mMの最終濃度にmilliq水で溶解した。フェノール、クレゾール、酢酸亜鉛(Zn)、塩化ナトリウムおよびグリセロールを、下の表のZn/6インスリン(本明細書では「ins」と略す)の濃度により、指摘された順序で加え、4.2mMインスリン、20mM塩化ナトリウム、25mMフェノール、25mMクレゾールpH7.4、の最終インスリン濃度にした。
【０１２９】
「方法セクション」で指定した時間で表すTHT遅延時間で測定したフィブリル化傾向。
製剤の化学的安定性は、4℃での保存後のHMWPの量と比較した、37℃で8週間(w)の保存の後の高分子量タンパク質(HMWP)の増加、インスリン関連の不純物の増加として測定した。
HMWPは、方法1を用いて測定した。本明細書で、文字「w」は、週数の略記号として用いられる。
【０１３０】
単量体の量は、固有ゲル濾過、方法2を用いて測定した。
【０１３１】
【表４】
2015514120.tif 000007
【０１３２】
結論。
インスリン7、インスリン3、インスリン6、インスリン2およびインスリン8が3亜鉛/6ins〜6亜鉛/6insの範囲内の亜鉛を有する4.2mMインスリンで製剤化される場合は、それらはNovoRapidよりもTHT遅延時間が長く、HMWP形成が少なく、および不純物形成が少ない。
【実施例５】
【０１３３】
目的
この実験の目的は、インスリン7、インスリン3、インスリン6、インスリン2およびインスリン8を含有する製剤中の固定亜鉛濃度を有するインスリン濃度の関数として、化学的および物理的安定性を測定することであった。インスリンの安定性は、オリゴマー化の程度に依存することが示されている;亜鉛による六量体インスリンは、亜鉛のないインスリンよりも安定している(BrangeおよびLangkjaer 1992)。オリゴマー化は希釈によっても作動されるので、試料中のインスリン濃度は安定性に影響を及ぼすことができる。
【０１３４】
製剤
インスリン7、インスリン3、インスリン6、インスリン2およびインスリン8を、約8のpH値でmilliq水で溶解した。
フェノール、クレゾール、酢酸亜鉛(Zn)、塩化ナトリウムおよびグリセロールを指摘した順序で加え、4.5Zn/6インスリン、1.6%グリセロール、25mMフェノール、25mMクレゾール、20mM NaCl、pH7.4、を含有する最終製剤にし、インスリン濃度は下の表に明記する。
【０１３５】
製剤の化学的安定性は、4℃での保存後のHMWPの量と比較した、37℃で8週間の保存の後の高分子量タンパク質(HMWP)の増加、インスリン関連の不純物の増加として測定した。
HMWPは、方法1を用いて測定した。
【０１３６】
不純物のような脱アミドの量は、4℃で8週間の保存の後に測定された不純物の量と比較した、37℃で8週後に逆相クロマトグラフィーで測定された不純物の増加として測定された。
【０１３７】
「方法セクション」で指定した時間で表すTHT遅延時間で測定したフィブリル化傾向。
【０１３８】
単量体の量は、フェノールによる溶出剤で固有ゲル濾過法2により測定した。
【０１３９】
【表５】
2015514120.tif 000008
【０１４０】
結論
亜鉛比が4.5Zn/6insに固定される場合は、インスリン7、インスリン3、インスリン6、インスリン2およびインスリン8は、より高いインスリン濃度より低い濃度でより多くの量の単量体を有する。これは、より高いインスリン濃度での一般により高いTHT遅延時間、およびより高いインスリン濃度でのより高い化学的安定性に対応する。
【０１４１】
さらに、固有ゲル濾過で分析したとき、最高80%の単量体含有量にもかかわらず、インスリン7、インスリン3、インスリン6、インスリン2およびインスリン8は、NovoRapidより長いTHTアッセイでの遅延時間、より少ないHMWP形成および不純物形成を有する。
【実施例６】
【０１４２】
目的
この実験の目的は、4.2mMインスリンのインスリン7および固定亜鉛/6インスリンを含有する製剤中のNaCl含有量の関数として、オリゴマー化をサイズ排除クロマトグラフィーによって調査することであった。さらに、目的は物理的および化学的安定性を測定することであった。
【０１４３】
製剤
インスリン7を、約8のpH値のmilliq水に溶解した。フェノール、クレゾール、酢酸亜鉛(Zn)およびグリセロールを指摘した順序で加え、4.5Zn/6インスリン、25mMフェノール、25mMクレゾール、pH7.4、を含有する最終製剤にし、4.2mMのインスリン濃度および塩化ナトリウム(NaCl)、酢酸亜鉛およびグリセロールは下の表に明記する通りである。
【０１４４】
物理的安定性は、以下の測定によって評価した
1.フィブリル化傾向。チオフラビンTアッセイで測定する。フィブリル化傾向は、フィブリル化までの遅延時間として、チオフラビンT(THT)アッセイで測定した。THTアッセイは、新たに調製した試料に関して記載する通りに測定した。
2.動的光散乱によるnmでのオリゴマー半径および4μm未満の凝集体形成。
【０１４５】
製剤の化学的安定性は、4℃での保存後のHMWPの量と比較した、37℃で4週間(4w)の保存の後の高分子量タンパク質(HMWP)の増加、インスリン関連の不純物の増加として測定した。
HMWPは、HMWP方法2を用いて測定した。
脱アミドのようなインスリン関連の不純物の形成は、逆相クロマトグラフィー(UPLC)を用いて測定した。
【０１４６】
単量体の量は、フェノールなしの溶出剤での固有ゲル濾過法2で測定した。
【０１４７】
インスリン7のTHTアッセイでのHMWP形成およびフィブリル化までの遅延時間
【０１４８】
【表６】
2015514120.tif 000009
【０１４９】
結論
インスリン7単量体の量は、わずか最高50mMのNaClの添加の大きな影響を有する塩化ナトリウム濃度の関数として減少する。
HMWP形成および不純物形成として測定される化学的分解は、単量体の含有量にもかかわらず全ての製剤で低い。
THT遅延時間は、亜鉛含有量および塩化ナトリウム含有量とともに増加する。
【０１５０】
nmでの平均水力学的半径Rh avg.およびカウント数106/秒での標準化された強度Inorm avg.(4℃)。注:試料は、t=0で測定されなかった。
【０１５１】
【表７Ａ】
2015514120.tif 000010
【０１５２】
【表７Ｂ】
2015514120.tif 000011
【０１５３】
結論
・流体力学半径は、塩濃度の増加とともに増加する。
・6Insにつき7Zn以外では、Zn濃度はサイズに軽微な影響を及ぼす。
インキュベーション温度からは、オリゴマーサイズおよび物理的安定性に有意な影響はない。
【実施例７】
【０１５４】
目的
この実験の目的は、4.2mMのインスリン7による製剤中の塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウムの濃度の関数として、化学的および物理的安定性を測定することであった。
【０１５５】
製剤
インスリン7を、約8のpH値で、約9mMの最終濃度にmilliq水で溶解した。フェノール、クレゾール、酢酸亜鉛(Zn)、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウムおよびグリセロールを指摘した順序で加え、4.5Zn/6インスリン、25mMフェノール、25mMクレゾール、pH7.4、を含有する最終製剤にし、4.2mMのインスリン濃度および塩化ナトリウム(NaCl)、酢酸ナトリウム(NaAc)およびグリセロールは下の表に明記する通りである。
【０１５６】
物理的安定性は、以下の測定によって評価した。
3.フィブリル化傾向。チオフラビンTアッセイで測定した。フィブリル化傾向は、フィブリル化までの遅延時間として、チオフラビンT(THT)アッセイで測定した。THTアッセイは、新たに調製した試料について記載する通りに測定した。
4.動的光散乱によるnmでのオリゴマー半径および4μm未満の凝集体形成。
【０１５７】
製剤の化学的安定性は、4℃での保存後のHMWPの量と比較した、37℃で4週間(4w)の保存の後の高分子量タンパク質(HMWP)の増加、インスリン関連の不純物の増加として測定した。
HMWPは、HMWP方法2を用いて測定した。
脱アミドのようなインスリン関連の不純物の形成は、逆相クロマトグラフィー(UPLC)を用いて測定した。
【０１５８】
単量体の量は、フェノールを有する溶出剤での固有ゲル濾過法2で測定した。
【０１５９】
THTアッセイでのHMWP形成、不純物形成およびフィブリル化までの遅延時間
【０１６０】
【表８】
2015514120.tif 000012
【０１６１】
nmでの平均水力学的半径Rh avg.およびカウント数106/秒での標準化された強度Inorm avg.(4℃)。
【０１６２】
【表９】
2015514120.tif 000013
【０１６３】
nmでの平均水力学的半径Rh avg.およびカウント数106/秒での標準化された強度Inorm avg.(37℃)。
【０１６４】
【表１０】
2015514120.tif 000014
【０１６５】
結論:
・流体力学半径は、イオン強度の増加とともに増加する。
・サイズおよび散乱強度の非常に小さな経時的変化(NovoRapidに類似するかより優れる。)
インキュベーション温度からは、オリゴマーサイズおよび物理的安定性に有意な影響はない。
【０１６６】
結論
4.2mMインスリンのインスリン7および4.5亜鉛/6モルインスリンが、増加する塩化ナトリウム濃度または酢酸塩と組み合わせた塩化ナトリウムで製剤化される場合は、固有ゲル濾過で分析するとき、単量体含有量は減少する。
塩化ナトリウムおよび酢酸ナトリウムの影響は類似し、総イオン強度は単量体の量を減少させる。
【実施例８】
【０１６７】
目的
この実験の目的は、塩化ナトリウムの濃度の関数として、インスリン7の化学的および物理的安定性を測定することであった。
【０１６８】
製剤
インスリン7を、約8のpH値のmilliq水に溶解した。フェノール、クレゾール、酢酸亜鉛(Zn)およびグリセロールを指摘した順序で加え、4.5Zn/6インスリン、25mMフェノール、25mMクレゾール、pH7.4、を含有する最終製剤にし、塩化ナトリウムおよび塩化ナトリウムは下の表に明記する通りである。
【０１６９】
製剤の物理的安定性は、物理的安定性の異なる態様に対処する3つの異なるアッセイを用いて測定した。
1.フィブリル化までの遅延時間は、チオフラビンT(ThT)アッセイでの時間で表した遅延時間として測定し、インスリンの回収は、THTアッセイの後にHPLCで測定した。
2.4μm未満のサイズ範囲での凝集および粒子形成は、動的光散乱(DLS)で測定した。
3.4μmを超えるサイズ範囲での凝集および粒子形成は、インキュベーションの時間および温度の関数としてのMFI粒子によるタンパク質粒子の濃度を推定することによって、製剤の微流画像化(MFI)で測定した。
【０１７０】
製剤の化学的安定性は、4℃での保存後のHMWPの量と比較した、37℃で4週間(4w)の保存の後の高分子量タンパク質(HMWP)の増加、インスリン関連の不純物の増加として測定した。
HMWPは、HMWP方法2を用いて測定した。
脱アミドのようなインスリン関連の不純物の形成は、逆相クロマトグラフィー(UPLC)を用いて測定した。
【０１７１】
粒子形成の微流画像化測定。
【０１７２】
【表１１】
2015514120.tif 000015
【０１７３】
nmでの平均水力学的半径Rh avg.およびカウント数106/秒での標準化された強度Inorm avg.(4℃)。
【０１７４】
【表１２】
2015514120.tif 000016
【０１７５】
nmでの平均水力学的半径Rh avg.およびカウント数106/秒での標準化された強度Inorm avg.(30℃)。
【０１７６】
【表１３】
2015514120.tif 000017
【０１７７】
nmでの平均水力学的半径Rh avg.およびカウント数106/秒での標準化された強度Inorm avg.(37℃)。
【０１７８】
【表１４】
2015514120.tif 000018
【０１７９】
ここでは、文字「d」は日数の略記号である。
【０１８０】
nmでの平均水力学的半径Rh avg.およびカウント数106/秒での標準化された強度Inorm avg.(45℃)。
【０１８１】
【表１５】
2015514120.tif 000019
【０１８２】
結論
・試料は、そのサイズが塩濃度に依存するオリゴマーを形成する。
・オリゴマーは、実験全体を通じて安定なままである。
・指定条件下で、温度はオリゴマーのサイズおよび安定性に影響を及ぼさない。
【０１８３】
方法
化学的安定性
製剤の化学的安定性は、4℃での保存後のHMWPの量と比較した、37℃で8週間(w)の保存の後の高分子量タンパク質(HMWP)の増加、インスリン関連の不純物の増加として測定した。
【０１８４】
HMWP測定のための方法1。
HMWPは、以下の通りに測定した。ペプチド(単量体)ならびにHMWP含有量の定量は、4mMのL-アルギニンHCl、496mM NaCl、10mM NaH2PO4、5mM H3PO4、50%(容量/容量)2-プロパノールを含有する溶出剤により、0.5ml/分の流量および50℃においてWaters(300×7.8mm、品番wat201549)で実施した。検出は、調整可能な吸光度検出器(Waters486)により276nmで実施した。注入容量は2μlであり、600μMヒトインスリン標準が含まれた。HWMPの量は、クロマトグラムでのインスリンの総面積に対する面積百分率で判定した。
【０１８５】
HMWP測定のための方法2。
HMWPは、以下の通りに測定した。ペプチド単量体の含有量と比較したHMWP含有量の定量は、4mMのL-アルギニン、496mM NaCl、10mM NaH2PO4、5mM H3PO4、50%(容量/容量)2-プロパノールを含有する溶出剤により、0.5ml/分の流量および50℃においてWaters(150×4.5mm、品番wat)で実施した。検出は、調整可能な吸光度検出器(Waters486)により276nmで実施した。600μMヒトインスリン標準が含まれた。HWMPの量は、クロマトグラムでのインスリンの総面積に対する面積百分率で判定した。
【０１８６】
脱アミドのようなインスリン関連の不純物の形成は、以下の通りに測定した。
逆相クロマトグラフィー(UPLC)
インスリン関連の不純物の定量は、Phenomenex Kinetix RP C18 2.1×150mmカラム、1.7μmの粒径を用いるUPLCシステムで、0.3ml/分の流量、50℃、220nmでの検出により実施した。溶出は、以下からなる移動相で実施した:
A. 10%(v/v)アセトニトリル、0.09Mリン酸水素二アンモニウムpH3.6 B. 80%(容量/容量)アセトニトリル。勾配:85%/15%のA/Bから74%/26%のA/Bへ0〜7分の線形変化、60%/40%のA/Bへ7〜34分の線形変化、20%/80%のA/Bへ34〜36分の線形変化、20%/80%のA/Bで36〜38分のアイソクラチック勾配、85%/15%のA/Bへ38〜39分の線形変化、85%/15%のA/Bで39〜42分のアイソクラチック勾配。
【０１８７】
タンパク質製剤の物理的安定性の評価のためのThTフィブリル化アッセイの総論
ペプチドの低い物理的安定性はアミロイド繊維形成につながることがあり、それは、最終的にゲル形成を起こす試料で、秩序立った糸のような巨大分子構造として観察される。これは、伝統的に試料の目視検査で測定されている。しかし、その種の測定は非常に主観的であり、観察者に依存する。したがって、小分子指標プローブの応用がずっと有利である。チオフラビンT(ThT)はそのようなプローブであり、フィブリルに結合するとき、互いに異なる蛍光サインを有する(Naikiら、Anal. Biochem. 177 (1989)、244〜249頁;およびLeVine、Methods. Enzymol. 309 (1999)、274〜284頁)。
【０１８８】
フィブリル形成の時間経過は、以下の式によるS字曲線で記載することができる(Nielsenら、Biochemistry 40 (2001)、6036〜6046頁):
【０１８９】
【数２】
2015514120.tif 000020
【０１９０】
ここでは、Fは、t時間時のThT蛍光である。定数t0は、最大蛍光の50%に到達するのに必要な時間である。フィブリル形成を記載する2つの重要なパラメータは、t0-2τによって計算される遅延時間、および見かけの速度定数kapp=1/τである。
【０１９１】
フィブリル化のための一般的な開始機構として、ペプチドの部分的に折り畳まれた中間体の形成が示唆される。核になって鋳型を形成し、その上でさらなる中間体が集合し、フィブリル化が進行することができるのは、それらの中間体の少数しかない。遅延時間は、核の臨界質量が構築される間隔に対応し、見かけの速度定数は、フィブリル自体が形成される速度である。
【０１９２】
試料調製
試料は、各アッセイの前に新たに調製した。各試料組成は、実施例に記載される。試料のpHは、適当な量の濃縮NaOHおよびHClを用いて所望の値に調整した。1μMの最終濃度まで、H2Oでの保存溶液からチオフラビンTを試料に加えた。
【０１９３】
試料の200μlの一定分量を96穴マイクロタイタープレート(Packard OptiPlate(商標)-96、白いポリスチレン)に入れた。一般的に、各試料の4つ(または、8つ)の複製(1つの試験条件に対応する)を、1列のウェルに入れた。プレートは、Scotch Pad(Qiagen)で密封した。
【０１９４】
インキュベーションおよび蛍光測定
所与の温度でのインキュベーション、振盪およびThT蛍光発光の測定は、Fluoroskan Ascent FL蛍光プレートリーダー(Thermo Labsystems)で行った。温度は、37℃に調整した。プレートは、振盪なし(外部の物理的ストレスなし)で、または1mmの振幅で960rpmに調整したオービタル振盪でインキュベートした。蛍光測定は、444nmフィルター通した励起を用いて行い、発光の測定は485nmフィルターを通して行った。各実行は、アッセイ温度で10分間、プレートをインキュベートすることによって開始した。プレートは、20分おきに所望の時間測定した。各測定の間に、記載の通りにプレートを振盪し、加熱した。アッセイは、最高45時間実行した。
【０１９５】
HPLC濃度測定:回収
ThTアッセイの完了後、各試料の4つまたは8つの複製をプールし、18℃で30分の間20,000rpmで遠心分離した。上清を0.22μmフィルターを通して濾過し、一定分量をHPLCバイアルに移した。
【０１９６】
初期試料および濾過した上清でのペプチドの濃度は、参照として適当な標準を用いた逆相HPLCによって測定した。初期試料濃度に対して構成される濾過した試料の濃度の百分率は、回収として報告した。
【０１９７】
データ処理
さらなる処理および曲線描画のために測定点をMicrosoft Excelフォーマットで保存し、GraphPad Prismを用いてフィッティングを実施した。フィブリル不在下でのThTからのバックグラウンド発光は、無視できた。データポイントは一般的に4つまたは8つの試料の平均であり、標準偏差エラーバーと一緒に示す。同じ実験(すなわち、同じプレート上の試料)で得られたデータだけを同じグラフに示し、実験間でのフィブリル化の相対的測定を確保する。
【０１９８】
データセットは、式(1)に適合させることができる。しかし、フィブリル化前の遅延時間は、ThT蛍光がバックグラウンドレベルより有意に増加する時点を特定する曲線の目視検査によって評価することができる。ThT蛍光の増加が45時間のアッセイ時間内に1つの試料のいかなる複製についても観察されない場合は、45時間の遅延時間を割り当てた。
【０１９９】
動的光散乱(DLS)で測定された物理的安定性
動的光散乱
動的光散乱では、水性試料の上での散乱レーザ光線入射のマイクロ秒変動を検出し、いわゆる自己相関関数を通して個々の種の拡散係数(Df)に転換される。便宜上、拡散係数は一般的に、試料が球状種からなると仮定して、水力学的半径(Rh)で報告される。さらに、半径から、分子量の実験的推定値が得られる。動的光散乱は非常に高感度の方法であり、それはサイズの小さい変化、ならびに医薬製剤で望ましくない微量の凝集種を分析することができる。
【０２００】
より大きな種の発達が散乱強度を大幅に増加させるので、検出器によって記録される平均の静的強度も、試料の物理的安定性の全体的な測定の役割をする。
【０２０１】
方法:動的光散乱
試料は20mMリン酸pH7.5緩衝液で調製し、0.9mg/mLまたは45.5mg/mL(それぞれ、11.5および0.23mM)の濃度を有した。測定は、25℃でWyatt(Santa Barbara、CA)DynaPro DLSプレートリーダーで実施し、試料は測定から測定の間37℃に保った。試料は、Table 1(表1)に示す時点で、最高2週間測定した。測定は、透明プラスチックホイル(Thermo Fischer Scientific、Waltham、MA)で密封したCorning 3540 384穴マイクロタイタープレート(Corning、NY)で、1測定につき20個の10秒取得により、25μLの3反復または5反復で実施した。自己相関曲線は、Dynamics 7.1.7.16で正規化フィットをあてはめ、生じた拡散係数は、球形およびサイズと質量の間の実験的関係を仮定して、水力学的半径および分子質量に転換した。散乱強度は、レーザ強度および検出器感度に関して標準化した。
【０２０２】
微流画像化(MFI)によって測定した4μmを超える粒子形成。
溶液は、表に明記される温度で、Penfill(登録商標)カートリッジでインキュベートした。所与のインキュベーション期間の後、Penfill(登録商標)カートリッジを14mLファルコン管にあけた。試料の2x1mLを、MFI5200+Bot1システムで分析した。シリコーン油様の液滴の濃度のPenfil(登録商標)からPenfill(登録商標)の変動性を濾去するために、タンパク質様粒子(ECD>4μmおよびCircularity*AspectRatio*IntensitySTD<70)の濃度を測定した。
【０２０３】
中性pHでSECによって観察される種分布。
方法1。
掛け流し緩衝液は、150mM NaCl、2mMフェノールおよび10mMトリスpH7.6であった。MW標準は、単量体インスリン(X2)(19.0分)、非解離六量体インスリン(Co(III)HI(「HI」はヒトインスリンである)(16.0分)、HSA(14.0分)を含み、HSA二量体(12.5分)は種の帰属のために用いた。カラム排除限界は、2x106Daであった。クロマトグラフィーエンベロープを統合し、ジ六量体はAUC 12.5分〜14.3分、六量体は14.3分〜16.0分、および六量体より小さなオリゴマーは16.0分〜21.0分と規定した。
【０２０４】
方法2
カラム、BEH200、1.7μm、フェノールによる方法では8mMフェノールの、またはフェノールなしの方法では0mMフェノールの22℃で0.3ml/分の流量によるWatersからの4.6x150mmカラム、140mM NaCl、10mMトリス/HCl pH7.4。種分布は、UVVisによって検出し、適当なMWタンパク質標準に対して評価する。
【０２０５】
本明細書に引用する刊行物、特許出願および特許を含む全ての参考文献は、完全に、および各参考文献が、参照により組み込まれることが個々に、および具体的に示され、かつ本明細書で完全に示されるのと同程度に参照によりここに組み込まれる(法律に違反しない範囲で)。
【０２０６】
本明細書での特許文書の引用および組込みは、便宜上だけのためであり、そのような特許文書の妥当性、特許資格および/または法的拘束力に関するいかなる見解も反映しない。本明細書での参考文献の指摘は、それらが先行技術を構成することの承認ではない。
【０２０７】
全ての見出しおよび小見出しは、本明細書で便宜上だけのために用いられ、本発明を限定するものと決して解釈されるべきでない。
【０２０８】
特に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての技術用語および科学用語は、この発明が属する分野の当業技術者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本開示と、公布特許、出願および本明細書か他の場所で引用される参考文献の間の不一致の場合は、本開示が優先する。
【０２０９】
本明細書で提供される任意および全ての例、または例示を示す言語(例えば、「など」)の使用は、特に主張されない限り、本発明を単により良好に示すことが目的であり、本発明の範囲を限定するものではない。明細書中のいかなる言語も、請求されないいかなる要素も本発明の実施に必須であることを示すと解釈されるべきでない。
【０２１０】
本明細書で、単語「含む(comprise)」は、「含む(include)」、「含有する」または「包含する」を意味すると広義に解釈するべきである(Guidelines for Examination in the Europe Patent Office、part C、chapter III、4.21、2007年12月を参照)。
【０２１１】
本発明は、適用法によって許可される、それに添付される請求項および条項で列挙される発明主題の全ての改変形態および均等物を含む。
【配列表】
2015514120000001.app
【国際調査報告】
2015514120.tif 000021
2015514120.tif 000022
2015514120.tif 000023
2015514120.tif 000024