(57)【要約】本発明は、RANKL-RANKシグナル伝達経路が関与する疾患、特に骨吸収疾患の治療および／または予防における医薬としての使用のためのポリペプチドに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨吸収疾患の治療および／または予防における医薬としての使用のための、最大20アミノ酸の配列からなる単離されたポリペプチドであって、該配列が、
- SEQ ID NO:32；および
- SEQ ID NO:32の全長にわたりSEQ ID NO:32と少なくとも80％の同一性を有する配列
からなる群より選択される配列を含むまたはそれからなる、
単離されたポリペプチド。
【請求項２】
- SEQ ID NO:33；および
- SEQ ID NO:33の全長にわたりSEQ ID NO:33と少なくとも80％の同一性を有する配列
からなる群より選択される配列を含むまたはそれからなる配列からなる、請求項1に記載の使用のための請求項1に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
- SEQ ID NO:1；および
- SEQ ID NO:1の全長にわたりSEQ ID NO:1と少なくとも80％の同一性を有する配列
からなる群より選択される配列を含むまたはそれからなる配列からなる、請求項2に記載の使用のための請求項2に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４】
骨吸収疾患が、
- 骨粗鬆症、溶骨性骨疾患、原発性骨癌、続発性骨癌、歯周病および関節リウマチ
からなる群より選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の使用のための請求項1〜3のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
- SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33
からなる群より選択される配列を含むまたはそれからなる配列からなる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の使用のための請求項1〜4のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
- SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:23
からなる群より選択される配列を含むまたはそれからなる配列からなる、請求項5に記載の使用のための請求項5に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
- SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33
からなる群より選択される配列からなる、請求項5に記載の使用のための請求項5に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
- SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22およびSEQ ID NO:23
からなる群より選択される配列からなる、請求項7に記載の使用のための請求項7に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
PEG化、アセチル化、ホルミル化、ミリスチン酸付加、パルミトイル化、ベンジルオキシカルボニル化、アミド化、スクシニル化、グリコシル化からなる群、特にPEG化からなる群より選択される少なくとも1つの生化学的修飾を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の使用のための請求項1〜8のいずれか一項に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
請求項5〜9のいずれか一項に定義された、単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
SEQ ID NO:2で示されるアミノ酸配列からなる、請求項10に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
請求項10または11に定義された単離されたポリペプチドをコードする、単離された核酸分子。
【請求項１３】
請求項12に定義された核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１４】
請求項12に定義された核酸分子または請求項13に定義されたベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１５】
請求項10または11に定義された単離されたポリペプチドと、請求項12に定義された単離された核酸分子と、請求項13に定義されたベクターとからなる群より選択される少なくとも1種の化合物を含む、薬学的組成物。
【請求項１６】
医薬としての使用のための、請求項10もしくは11に定義された単離されたポリペプチド、または請求項12に定義された単離された核酸分子、または請求項13に定義されたベクター。
【請求項１７】
- 請求項1〜9のいずれか一項に定義された単離されたポリペプチドと、該ポリペプチドをコードする単離された核酸分子と、該核酸分子を含むベクターとからなる群より選択される少なくとも1種の化合物；および
- 別の骨吸収抑制剤
を含む、医薬としての同時の、別々の、または連続した使用のための組み合わせ製品。
【請求項１８】
別の骨吸収抑制剤が、
-副甲状腺ホルモン、BMP2、ビタミンD、抗炎症剤からなる群より特に選択される、同化作用促進剤（anabolism enhancer）；および
-ビスホスホネート、カテプシンK阻害剤、p38阻害剤、JNK阻害剤、IKK阻害剤、NF-κB阻害剤、カルシニューリン阻害剤、NFAT阻害剤、PI3K阻害剤からなる群より特に選択される、異化作用阻害剤（catabolism inhibitor）
からなる群より選択される、請求項17に記載の使用のための組み合わせ製品。
【請求項１９】
骨吸収疾患の治療および／または予防における使用のための、請求項17または18に記載の組み合わせ製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、RANKL-RANKシグナル伝達経路の活性化に関係する疾患の予防および治療の分野に関する。
【０００２】
特に本発明は、骨吸収疾患の予防および治療に有用な、単離されたポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
骨組織は、力学的支持およびカルシウム恒常性の維持というならびに幹細胞供給元としてのその主機能を果たすために、絶え間ないリモデリングを受ける。この過程は、造血性の骨吸収性破骨細胞ならびに骨形成性間葉系骨芽細胞および骨細胞という2つの細胞系列によって仲介される。生理学的条件下で骨形成と骨吸収の間の均衡は緊密に調節されており、これが骨密度を決定する。この均衡は、RANK/RANKL/OPG経路に基づく。
【０００４】
核内因子κB活性化受容体（RANK）は、破骨細胞およびそれらの前駆体によって発現される、腫瘍壊死因子ファミリーの一メンバーである。RANKとRANKL（そのリガンド）との相互作用は、骨吸収が調節される最後の共通経路として同定されている。破骨細胞前駆体上のその受容体RANKに結合することによって、RANKLは、破骨細胞の分化、増殖、および生存を制御する。オステオプロテゲリン（OPG）は、RANKLの天然阻害因子である。RANKおよびRANKLは、多数の通常の細胞型に発現される（Theoleyre et al. 2004）が、それらの活性は、骨組織、皮膚（Duheron et al. 2011）および乳腺（Gonzalez-Suarez et al 2010; Schramek et al 2010）において最も顕著である。RANK-RANKLの発現は、乳癌または黒色腫癌のような非骨癌細胞、それらに関連する転移（Jones et al. 2006）、および骨肉腫のような原発性骨癌（Mori et al. 2007）において極めて増加している。
【０００５】
恒常性均衡の破壊は、加齢性骨粗鬆症、歯周病もしくは炎症性関節リウマチにおけるような病的骨量減少に、または遺伝子突然変異および／もしくは多型に関連するもしくは関連しない骨格奇形（Whyte et al. 2009）におけるような過剰骨形成に、または骨リモデリングの変化に繋がるおそれがある。RANKLに対するOPGの比率の乱れは、エストロゲン欠乏、副甲状腺機能亢進症、および骨吸収を刺激する他の障害と共に起こることが実証されている。RANKLは、また、リンパ球および滑膜線維芽細胞によって発現され、かつ炎症状態に関連する骨量減少を仲介し得る。
【０００６】
RANK/RANKL/OPG経路および骨疾患の病因におけるその意味の発見により、骨の健康を改善する療法のための分子ターゲットが提供された。
【０００７】
RANKLをターゲティングする小分子であるOPG模倣体の開発が、骨疾患、特に骨吸収疾患を処置するための治療剤の開発に関して示唆されている。Chengおよびその共同研究者ら（Cheng et al. 2004）は、RANKLを遮断するためにそのようなOPG由来ペプチドを設計した。それらの最も有望なペプチドOP3-4はRANKLと直接結合することができ、その相互作用は、表面プラズモン共鳴によって測定可能であった。この相互作用は、インビトロで破骨細胞形成を減少させるのに十分であり、かつインビボでマウスを骨量減少から保護するのに十分であった。
【０００８】
Takasakiによって1997年に開始された別のアプローチ（Takasaki et al. 1997）は、RANK配列由来のペプチドに基づき、RANKLをターゲティングすることができる生体適合性分子を設計することであった。最初はTNF-α/TNFR相互作用をターゲティングしていた彼らの調査が、RANKL/RANK相互作用をTNF非依存的に遮断するために有用であると分かった（Aoki et al. 2006）。WP9QYと名付けられたそれらのうち最も有効なペプチドは、インビトロで用量依存的に破骨細胞形成を阻害することができ、かつインビボでマウス骨粗鬆症誘導モデルにおける骨量減少を予防することができた。
【０００９】
これらのペプチドは、TNF/TNF-Rファミリーの他のメンバーに基づくモデルに対する仮定に基づいて、それらがターゲティングするパートナーの天然配列から得られたものであり、すなわち、OP3-4は、推定上のOPG-RANKL界面（OPGに関するモデルはTNFR、FasおよびTRAILの結晶学的構造を使用した）より選択され、WP9QYは、推定上のRANKL-RANK界面（モデルはTNF-R/TNF-βの結晶構造に基づいた）より選択された。それらの生物学的活性は、インビトロおよびインビボモデルで有望な結果を示したものの、RANKLに対するそれらの結合親和性がRANKに対するRANKLの結合に比べて相対的に低いことにより、それらの治療上の利益は潜在的に限定された。
【００１０】
過去10年間にわたり、新規骨キレート剤（ゾレドロネートが現在のところ最も卓越した治療薬である）の導入およびRANKLに対するモノクローナル抗体（デノスマブ）の開発により、代謝性骨障害の管理には多大な進歩があった（Baron et al. 2011）。これらの療法が、骨疾患、特に骨吸収疾患の処置に有望な改善を示しているものの、それらの適用は、抗体もしくはキメラのような大型高分子のバイオアベイラビリティーおよび／もしくは安定性の低さ、投与様式、高いコストならびに、軽度から重度の、時に生命に危険さえある副作用、例えば皮膚発疹、免疫原性、顎骨壊死、海綿骨塩密度増加から成長遅滞に至るまでのリスクによって限定されている。
【００１１】
したがって、骨疾患、特に骨吸収疾患の予防および／または治療のための新規な化合物および改良された化合物であって、破骨細胞形成の阻害に有効であり、製造が安価であり、高いバイオアベイラビリティーを有し、患者に容易に投与できる一方で、重度の副作用を有さない化合物が、依然として必要である。本発明者らは、本明細書に開示された発明で著しい前進を果たした。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の目的は、上述の問題の全体または一部を解決することを可能にする新しいポリペプチドを提供することによって、この必要を満たすことである。
【００１３】
本発明者らは、受容体RANKと特異的に結合することができ、かつ破骨細胞形成に対して強い阻害作用を有する革新的ペプチドを設計した。これまでに開発されたペプチドとは逆に、本発明のペプチド配列は、既存のRANK、RANKLまたはOPGアミノ酸配列由来ではなく、かつ文献において公知のいかなる天然タンパク質中にも天然ペプチド中にも存在しない。
【００１４】
一局面では、本発明は、骨疾患、特に骨吸収疾患の治療および／または予防における医薬としての使用のための、最大20アミノ酸の配列からなる単離されたポリペプチドであって、該配列が、
- SEQ ID NO:32；および
- SEQ ID NO:32の全長にわたりSEQ ID NO:32と少なくとも80％の同一性を有する配列
からなる群より選択される配列を含むまたはそれからなる、
特に、
- SEQ ID NO:33；および
- SEQ ID NO:33の全長にわたりSEQ ID NO:33と少なくとも80％の同一性を有する配列
からなる群より選択される配列を含むまたはそれからなる、
より詳細には、
- SEQ ID NO:1（LKLCS）；および
- SEQ ID NO:1の全長にわたりSEQ ID NO:1と少なくとも80％の同一性を有する配列
からなる群より選択される配列を含むまたはそれからなる、
単離されたポリペプチドに関する。
【００１５】
本発明によるポリペプチドは、特に以下の利点を有する:
-破骨細胞形成に対して強い阻害作用を有する；
-重度の副作用を有さない。特に、明らかな細胞毒性もアポトーシス促進活性も有さない；
-製造が安価である；
-高いバイオアベイラビリティーを有する；
-腫瘍に浸透する能力が高い。Lienら（2003）の論文に例証されているように、癌の処置における全長抗体のような大型タンパク質に対するペプチドのさらなる利点とは腫瘍に浸透できるそれらの優れた能力であることが周知である；
-長期間にわたり非常に安定であることが証明され、このことは、任意の既存の送達技法による患者へのポリペプチドの投与を導く可能性がある。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
特に定義しない限り、本明細書に使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。
【００１７】
便宜上、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲に採用された特定の用語および語句の意味を提供する。
【００１８】
本明細書に使用される用語「骨吸収疾患」は、骨恒常性がRANKL-RANKシグナル伝達経路により変化している任意の疾患を表す。恒常性不均衡は、Theoleyreら（2004）の論文に記載されたような非炎症性または炎症性の骨吸収疾患において、腫瘍性または非腫瘍性の骨吸収疾患において現れる場合がある。
【００１９】
非炎症性の文脈において、骨吸収疾患には、骨粗鬆症（I型（閉経後）およびII型（老人性）骨粗鬆症を含む）のような代謝性骨疾患、遺伝子突然変異および／もしくは多型に関連するもしくは関連しない骨格奇形（Whyte et al. 2009）、くる病素因に認められるようなビタミンD欠乏症、副作用として骨リモデリング変化を有する任意の処置によって引き起こされる任意の疾患（タモキシフェンまたはアロマターゼ阻害剤のような内分泌療法（Lee et al. 2011）、糖質コルチコイド誘導骨粗鬆症（Hansen et al. 2011）、悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症を含む）、溶骨性骨疾患（多発性骨髄腫もしくは骨巨細胞腫のような良性腫瘍（Croucher et al. 2001）または骨肉腫（Dai et al. 2011））が含まれる。
【００２０】
閉経後骨粗鬆症（PMOまたはI型骨粗鬆症とも呼ばれる）は、主としてエストロゲン欠乏症に起因する。
【００２１】
老人性骨粗鬆症（II型骨粗鬆症とも呼ばれる）は、主として加齢した骨格およびカルシウム欠乏症に起因する。
【００２２】
糖質コルチコイド誘導骨粗鬆症は、プレドニゾン（Deltasone、Orasoneなど）、プレドニゾロン（Prelone）、デキサメタゾン（Decadron、Hexadrol）、およびコルチゾン（Cortone Acetate）のような糖質コルチコイド投薬を受けることによって引き起こされる骨粗鬆症の一形態である。
【００２３】
炎症の文脈において、骨吸収疾患には、関節リウマチのような全ての関節炎の病態、溶骨性骨疾患、歯周病およびRANKL-RANK経路が関与するアテローム性動脈硬化症のような任意の心血管疾患および骨折が含まれる。
【００２４】
腫瘍の文脈において、骨吸収疾患には、
- 骨肉腫、ユーイング肉腫、軟骨肉腫のような原発性骨癌、および多発性骨髄腫または骨巨細胞腫のような良性骨癌（Dai et al. 2011; Croucher et al. 2001）；
- RANKL-RANKシグナル伝達経路が腫瘍増殖の直接増強因子である、乳癌（Jones et al. 2006; Schramek et al. 2010; Gonzalez-Suarez 2010）、多発性骨髄腫（Demchenko and Kuehl 2010）、癌腫、神経芽腫、軟骨芽細胞腫、結腸直腸癌、腎臓癌、食道癌、肝臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌（Theoleyre et al. 2004; Santini et al. 2011）のような原発性癌；
- 前立腺癌、乳癌（Schramek et al. 2010; Gonzalez-Suarez 2010）、肺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、食道癌、膀胱癌、肝臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、扁平上皮癌、悪性黒色腫（Smith 2011; Santini et al. 2011）を含む原発性癌の後の、骨格転移としても記載される続発性骨癌
が含まれる。
【００２５】
本明細書に使用される用語「原発性骨癌」は、骨に生じる任意の癌を表す。原発性骨癌には、骨肉腫（骨原性肉腫とも呼ばれる）、ユーイング肉腫、軟骨肉腫が非限定的に含まれる。
【００２６】
本明細書に使用される用語「続発性骨癌」は、前立腺癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、腎臓癌、食道癌、膀胱癌、肝臓癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、扁平上皮癌、悪性黒色腫を含む原発性癌の後の、任意の骨格転移を表す。続発性骨癌は、癌細胞が原発性腫瘍から骨へと広がった結果である。
【００２７】
特に、骨吸収疾患は、骨粗鬆症、溶骨性骨疾患、原発性骨癌、続発性骨癌、歯周病、および関節リウマチからなる群より選択される。
【００２８】
より詳細には、骨疾患は、骨粗鬆症、原発性骨癌、続発性骨癌、および関節リウマチからなる群より選択される。
【００２９】
特に、最大19アミノ酸の、より詳細には最大18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5アミノ酸の、さらにより詳細には最大9、8、7、6、5アミノ酸の配列からなる、本発明による単離されたポリペプチド。
【００３０】
特に、最大20アミノ酸かつ少なくとも5アミノ酸の、より詳細には少なくとも6アミノ酸の、さらにより詳細には少なくとも7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19アミノ酸の配列からなる、本発明による単離されたポリペプチド。
【００３１】
特に、5〜20アミノ酸の、より詳細には5〜19アミノ酸の、さらにより詳細には6〜18、7〜17、8〜16、9〜15、10〜14、11〜13アミノ酸の配列からなる、本発明による単離されたポリペプチド。
【００３２】
特に、本発明による単離されたポリペプチド、より詳細にはSEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33またはSEQ ID NO:1の全長にわたりそれぞれSEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の同一性を有する配列を含むまたはそれからなる配列からなる単離されたポリペプチドが、RANKL誘導型破骨細胞形成を阻害する能力を有する。
【００３３】
ポリペプチドがRANKL誘導型破骨細胞形成を阻害する能力は、Baud'Huinら、2009およびDuplombら、2008の論文に記載されたような破骨細胞分化に及ぼすポリペプチドの作用の評価を含む試験によって当業者が決定することができる。
【００３４】
特に、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33またはSEQ ID NO:1の全長にわたりそれぞれSEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％、より詳細には少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、さらにより詳細には少なくとも99％の同一性を有する配列を含むまたはそれからなる配列からなる、本発明による単離されたポリペプチド。
【００３５】
特に、SEQ ID NO:1の全長にわたりSEQ ID NO:1と少なくとも80％、より詳細には少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、さらにより詳細には少なくとも99％の同一性を有する配列を含むまたはそれからなる配列からなる、本発明による単離されたポリペプチド。
【００３６】
本発明の説明において言及された同一性のパーセンテージは、比較されるべき配列の包括的なアライメントに基づき、すなわち、それらの全長にわたる配列のアライメントに関して、例えばNeedlemanおよびWunsch、1970のアルゴリズムを使用して決定されるものである。この配列比較は、例えばneedleソフトウェアを使用して、パラメーター「ギャップオープン」＝10.0、パラメーター「ギャップ延長」＝0.5およびマトリックス「BLOSUM 62」を使用することによって行うことができる。needleのようなソフトウェアは、世界的に「needle」の名前でウェブサイトebi.ac.ukから入手可能である。
【００３７】
特に、
- SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、より詳細には、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、およびSEQ ID NO:23、さらにより詳細にはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21およびSEQ ID NO:23、さらにより詳細にはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:20、さらにより詳細にはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:20、さらにより詳細にはSEQ ID NO:2
からなる群より選択される配列を含むまたはそれからなる配列からなる、本発明による単離されたポリペプチド。
【００３８】
特に、
- SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:33、より詳細にはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、およびSEQ ID NO:23、さらにより詳細にはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20 SEQ ID NO:21およびSEQ ID NO:23 さらにより詳細にはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12およびSEQ ID NO:20、さらにより詳細にはSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:9およびSEQ ID NO:20、さらにより詳細にはSEQ ID NO:2
からなる群より選択される配列からなる、本発明による単離されたポリペプチド。
【００３９】
特に、本発明による単離されたポリペプチドは、PEG化、アセチル化、ホルミル化、ミリスチン酸付加、パルミトイル化、ベンジルオキシカルボニル化、アミド化、スクシニル化、グリコシル化からなる群、特にPEG化からなる群より選択される少なくとも1つの生化学修飾を含む。
【００４０】
特に、本発明による単離されたポリペプチドは、少なくとも1個のポリエチレングリコール基、より詳細には少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個のポリエチレングリコール基を直鎖状、分岐状またはより複雑な構成で含む。
【００４１】
本発明のポリペプチドのPEG化は、ポリペプチドの溶解性、バイオアベイラビリティー、および安定性が最適化されかつ免疫原性が減少されるという利点を有する。
【００４２】
特に、本発明による単離されたポリペプチドは、20個未満のポリエチレングリコール基、より詳細には19個未満、18個未満、17個未満、16個未満、15個未満、14個未満、13個未満、12個未満、さらにより詳細には11個未満のポリエチレングリコール基を含む。
【００４３】
特に、本発明による単離されたポリペプチドは、1アミノ酸あたり1個のポリエチレングリコール基を含む。
【００４４】
該ポリエチレン基は、本発明のポリペプチドの修飾に適した任意の適切なアミノ酸に結合させることができる。特に、少なくとも1個のポリエチレングリコール基が、該ポリペプチドのN末端アミノ酸またはC末端に結合される。より詳細には、少なくとも1個のポリエチレングリコール基が、該ポリペプチドのN末端アミノ酸に結合される。
【００４５】
特に、本発明による単離されたポリペプチドは、該ポリペプチドのN末端アミノ酸に結合した、5または8個のポリエチレングリコール基を特に直鎖状の構成で含む。
【００４６】
本発明はまた、上記のような本発明による単離されたポリペプチドに関する。有利な態様は、上記に定義されたとおりである。
【００４７】
特に、SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列からなる、本発明による単離されたポリペプチド。
【００４８】
本発明は、修飾されたアミノ酸配列を有する上記ポリペプチドを包含する。修飾には、ポリペプチドがRANKL誘導型破骨細胞形成を阻害できる能力を保持するという条件で、アミノ酸の挿入、欠失、置換、短縮化、融合、環化、ジスルフィド架橋、L-アミノ酸またはβペプチドによるD-アミノ酸の置換、細胞膜透過性を向上させるための修飾（例えば、シグナルペプチドまたはアンテナペディアホメオドメインのフラグメントを用いる、Derossi et al. 1994; May et al. 2000）が非限定的に含まれる。そのような修飾は、ポリペプチドの半減期または生物学的活性を改善するために行うことができる。
【００４９】
本発明によるポリペプチドは、化学合成および該ポリペプチドをコードする核酸分子を使用する合成を含む従来法を使用して、合成することができる。
【００５０】
本発明はまた、本発明による単離されたポリペプチドをコードする単離された核酸分子にも関する。
【００５１】
特に、本発明による核酸分子を、真核生物DNA依存的RNAポリメラーゼのプロモーター、好ましくはRNAポリメラーゼIIのプロモーターに、機能的に連結することができる。組織特異的RNAポリメラーゼIIプロモーターを使用する場合、本発明のポリペプチドを、ターゲティングされた組織／細胞中で選択的に発現させることができる。
【００５２】
該プロモーターは、当業者に周知の構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであることができる。プロモーターは、発達的に調節されてもよく、誘導性でもよく、または組織特異的でもよい。
【００５３】
特に、本発明による核酸分子は、細胞外シグナル配列に機能的に連結されることができる。該細胞外シグナル配列は、細胞外媒質中に本発明のポリペプチドを分泌させるシグナルペプチドをコードすることができる。細胞外シグナル配列は、当業者に周知であって、一例として、次の配列
2015508392.tif 000002
を有するシグナルペプチド（hRANKシグナルペプチド）をコードすることができる（Petersen et al. 2011）。
【００５４】
本発明はまた、本発明による核酸分子を含むベクターに関する。該ベクターを、やや安定なまたは安定な発現に割り当てることができる。
【００５５】
特に、本発明によるベクターは、クローニングまたは発現ベクターである。
【００５６】
ベクターは、バクテリオファージのようなウイルス性ベクターまたはプラスミドのような非ウイルス性であることができる。
【００５７】
本発明はまた、本発明による核酸分子または本発明によるベクターを含む宿主細胞に関する。
【００５８】
本発明による宿主細胞は、本発明によるポリペプチドの製造に有用であり得る。
【００５９】
本発明はまた、本発明による単離されたポリペプチドと、本発明による単離された核酸分子と、本発明によるベクターとからなる群より選択される少なくとも1種の化合物を含む薬学的組成物に関する。有利な態様は、上記に定義されたとおりである。
【００６０】
用語「医薬」および「薬学的組成物」は、本明細書において互換的に、それらの最も広い意味で使用される。
【００６１】
そのような化合物（特に本発明による単離されたポリペプチドと、本発明による単離された核酸分子と、本発明によるベクターとからなる群より選択される）は、本発明による薬学的組成物中に治療的有効量（活性かつ非毒性の量）で存在することができる。治療的有効量とは、症状または状態を改善する化合物の量を表す。治療的有効性および毒性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手法、例えばED50（集団の50％において治療的に有効な量）およびLD50（集団の50％に対して致死的な用量）によって、決定することができる。治療効果に対する毒性効果の量比が治療指数であって、これは、比LD50/ED50として表現することができる。大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。
【００６２】
例えば、本発明によるポリペプチド、特にSEQ ID NO:2に示される配列からなるポリペプチドは、特に注射によって、患者の体重1kgあたり0.1〜100mg/日の範囲、特に患者の体重1kgあたり0.5〜50mg/日の範囲、さらにより詳細には患者の体重1kgあたり0.5〜10mg/日の範囲の量で患者に投与することができる。該用量は、ペプチドの潜在的免疫原性から保護可能でありつつ、治療応答を誘発するように調整される（Toes et al. 1998）。
【００６３】
本発明による薬学的組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄腔内、脳室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、または直腸手段を非限定的に含む、任意の数の経路によって投与し得る。
【００６４】
活性成分に加えて、本発明の薬学的組成物は、薬学的に使用できる製剤へと活性化合物を加工するのを容易にする、賦形剤および佐剤を含む薬学的に許容される適切な担体を含有し得る。特に、本発明による薬学的組成物は、薬学的に許容される担体中で製剤化される。薬学的に許容される担体は、当業者に周知である。製剤化および投与のための技法に関するさらなる詳細は、Remington's Pharmaceutical Sciences（Maack Publishing Co., Easton, Pa.）の最新版に見出し得る。
【００６５】
特に、薬学的に許容される担体はバイオマテリアルである。
【００６６】
本明細書において使用される用語「バイオマテリアル」は、生体適合性であり、特に生物システムと相互作用するように設計された、任意の材料を表す。
【００６７】
バイオマテリアルは、本発明のポリペプチド、特にSEQ ID NO:2に示される配列からなるポリペプチドの局所的効果およびバイオアベイラビリティーを時間および／または用量制御方式で高めるために、その初期送達域を正確に決定し得るという利点を有する。
【００６８】
バイオマテリアルは、リン酸カルシウム（phosphocalcic）セラミクス（例えばヒドロキシアパタイト（HAP）およびβ-リン酸三カルシウム）、ポリマー（例えば乳酸-グリコール酸共重合体、ヒドロゲル）、天然起源の材料（例えばセルロース、コラーゲン）、特にリン酸カルシウムセラミクス、さらにより詳細にはβ-リン酸三カルシウム40％およびヒドロキシアパタイト60％からなるリン酸カルシウムセラミクスからなる群より選択することができる。
【００６９】
ヒドロキシアパタイト（HAP）およびリン酸三カルシウム（特にβ-リン酸三カルシウム）セラミクスは、生体吸収性（bioresorbable）および骨伝導性（osteoconductive）であるという利点を有する。
【００７０】
非経口投与に適した薬学的組成物は、水溶液中で、好ましくはハンクス液、リンゲル液、または生理緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液中で製剤化してもよい。注射用水性懸濁液は、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランのような、懸濁液の粘度を増加させる物質を含有し得る。また、活性化合物の懸濁液を、適切な注射用油性懸濁液として調製してもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルには、ゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームが含まれる。非脂質ポリカチオン性アミノポリマーも送達のために使用され得る。懸濁液はまた任意で、適切な安定化剤または、化合物の溶解性を増加させて高濃度溶液の調製を可能にする剤を含有してもよい。
【００７１】
本発明はまた、骨吸収疾患の治療および／または予防のための方法であって、それを必要とする患者に、本発明による単離されたポリペプチドと、本発明による単離された核酸分子と、本発明によるベクターとからなる群より選択される少なくとも1種の化合物の治療的有効量を投与する段階を含む方法に関する。有利な態様は、上記に定義されたとおりである。
【００７２】
本発明はまた、破骨細胞形成を阻害する方法であって、それを必要とする患者に、特に骨疾患を有する患者に、より詳細には骨吸収疾患を有する患者に、本発明による単離されたポリペプチドと、本発明による単離された核酸分子と、本発明によるベクターとからなる群より選択される少なくとも1種の化合物の治療的有効量を投与する段階を含む方法に関する。有利な態様は、上記に定義されたとおりである。
【００７３】
本発明はまた、医薬としての使用のための、本発明による単離されたポリペプチドに関する。有利な態様は、上記に定義されたとおりである。
【００７４】
本発明はまた、医薬としての使用のための、本発明による単離された核酸分子に関する。有利な態様は、上記に定義されたとおりである。
【００７５】
本発明はまた、医薬としての使用のための、本発明によるベクターに関する。有利な態様は、上記に定義されたとおりである.
【００７６】
本発明はまた、骨疾患、特に骨吸収疾患の治療および／または予防のための医薬の調製のための、本発明による単離されたポリペプチドの使用に関する。有利な態様は、上記に定義されたとおりである。
【００７７】
本発明はまた、骨疾患、特に骨吸収疾患の治療および／または予防のための医薬の調製のための、本発明による単離された核酸分子の使用に関する。有利な態様は、上記に定義されたとおりである。
【００７８】
本発明はまた、骨疾患、特に骨吸収疾患の治療および／または予防のための医薬の調製のための、本発明によるベクターの使用に関する。有利な態様は、上記に定義されたとおりである。
【００７９】
本発明はまた、医薬としての同時の、別々の、または連続した使用のための、
- 本発明による単離されたポリペプチドと、本発明による単離された核酸分子と、本発明によるベクターとからなる群より選択される少なくとも1種の化合物；および
- 別の骨吸収抑制剤
を含む、組み合わせ製品に関する。
【００８０】
有利な態様は、上記に定義されたとおりである。
【００８１】
本明細書において使用する用語「骨吸収抑制剤」は、骨吸収を阻害することができる任意の剤を表す。
【００８２】
特に、前記の別の骨吸収抑制剤は、
-副甲状腺ホルモン、BMP2、ビタミンD、プロスタグランジンE2、抗炎症剤からなる群より特に選択される、同化作用促進剤（anabolism enhancer）；および
-ビスホスホネート、カテプシンK阻害剤、p38阻害剤、JNK阻害剤、IKK阻害剤、NF-κB阻害剤、カルシニューリン阻害剤、NFAT阻害剤、PI3K阻害剤からなる群より特に選択される、異化作用阻害剤（catabolism inhibitor）
からなる群より選択される（Tanaka et al. 2005）。
【００８３】
本明細書において使用する用語「異化作用阻害剤」は、骨破壊から保護することができる任意の剤を表す（Xu et al. 2010）。
【００８４】
本明細書において使用する用語「同化作用促進剤」は、正常な骨塩密度を回復することができる任意の剤を表す（Boyce et al. 2006）。
【００８５】
本発明はまた、医薬としての同時の、別々の、または連続した使用のための、
- 本発明による単離されたポリペプチドと、本発明による単離された核酸分子と、本発明によるベクターとからなる群より選択される少なくとも1種の化合物；および
- 抗癌剤
を含む、組み合わせ製品に関する。
【００８６】
本明細書において使用する用語≪抗癌剤≫は、単独でまたは別の剤と組み合わせて癌を予防および／または治療することができる任意の剤を表す。
【００８７】
特に、前記の抗癌剤は、原発性骨癌および／または続発性骨癌を予防および／または治療することができる。
【００８８】
特に、抗癌剤は、
- アクチノマイシン-D、ブレオマイシン、シスプラチン、シクロホスファミド、ダクチノマイシン、ドキソルビシン、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、メトトレキサート（およびロイコボリンカルシウムで解毒する高用量メトトレキサート）、パクリタキセル、およびビンクリスチン
からなる群より選択することができる（Dai et al. 2011; Wittig et al. 2002）。
【００８９】
本発明はまた、骨吸収疾患、特に、
- 骨粗鬆症、溶骨性骨疾患、原発性骨癌、続発性骨癌、歯周病、および関節リウマチ
からなる群より選択される骨吸収疾患の治療および／または予防における使用のための、本発明による組み合わせ製品に関する。
【００９０】
有利な態様は、上記に定義されたとおりである。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】図1（A〜C）は、RANK/RANKL活性を阻害している小型ポリペプチドの開発を表す。（A）RANK-RANKL二量体の三次元構造および分子モデリングからのポリペプチド相互作用の主要領域。（B）破骨細胞の分化に及ぼす、RANKをターゲティングする阻害剤ポリペプチドの作用。各ポリペプチド（50μM）の存在下または非存在下でCD14+単球をM-SCF（25ng/ml）およびヒトRANKL（100ng/ml）で処理した。破骨細胞が形成した場合、細胞を固定し、TRAPについて染色し、TRAP+多核細胞（MNC）を計数した。結果は、対応するポリペプチドを有さない培養物中のTRAP+細胞に対するパーセンテージとして表現する。RANKLをターゲティングするポリペプチドWP9QYおよびOP3-4、ならびにRANKLデコイ受容体OPG（50ng/ml）を陽性対照として使用した。結果は、3つ組で実施した3回の実験の平均±SDとして表現する。*：P＜0.005、#：P＜0.05。（C）RANKに結合するポリペプチド（ここではPep1（SEQ ID NO:31））の親和性を表面プラズモン共鳴（Biacore）分析によって測定した。センサーグラムは、バックグラウンドを差し引いた後の時間（秒）あたりの共鳴ユニットで相対応答を示すものである。グラフ中に表示した濃度でhRANKに対するPep1の結合を示す。Pep1は、20.6μMのKd（kon＝1.35×101M-1s-1、koff＝2.78×10-4s-1）でRANKと結合する。
【図２】図2（A〜C）は、Pep8（SEQ ID NO:2）によるインビトロでのRANKL誘導型破骨細胞形成の阻害を示す。（A）表示のように漸増する濃度のPep8の存在下または非存在下でヒト単球をM-CSFおよびヒトRANKLと共に培養した。OPG（50ng/ml）を参照阻害剤として使用した。Pep8は、CD14+細胞およびCD11b+細胞での破骨細胞の形成を用量依存的に阻害した。結果は、Pep8（RANKL）の非存在下でRANKLおよびM-SCFで処理された細胞に対して3つ組で実施した少なくとも2回の独立した実験の平均±SDとして表現する。*：P＜0.05。（B）異なる濃度のPep8でのTRAP+細胞の代表的な顕微鏡像。（C）破骨細胞特異的遺伝子であるカテプシンK、TRAPおよび活性化T細胞核内因子c1（NFATc1）の相対発現についてのリアルタイム定量RT-PCR分析から、Pep8がカテプシンK、TRAPおよびNFATc1のmRNA発現を阻害したことが示された。CD14+細胞をPep8（50μM）の存在下または非存在下でM-SCFおよびsRANKLで24時間処理した。マーカーのレベルをβ-2-ミクログロブリン（B2M）に対して基準化した。未分化細胞（対照）の発現レベルを1に設定した。マーカー毎に少なくとも3回の独立した実験を実施した。表に代表的な実験の結果を示す。
【図３】図3（A〜C）は、Pep8によるRANKL誘導型シグナル伝達の阻害を示す。（A） Pep8（50μM）によるAkt、p38およびERK活性化の阻害を、RAW264.7細胞におけるリン酸化（p）の阻害として、ホスホAkt、ホスホp38およびホスホERKに対する抗体を用いたウエスタンブロット分析を使用して評価した。免疫ブロットを剥がし、次にAkt、p38およびERKに対する抗体で再プロービングした。β-アクチンをローディング対照とした。（B）50μM Pep8の存在下または非存在下でのNF-κBの分布のウエスタンブロット分析。ポリペプチドで処理した後に、RAW264.7細胞を核部分および細胞質部分に分画した。核タンパク質（45μg）を抗NF-κB p105抗体、抗NF-κB p50抗体および抗NF-κB p65抗体で分析し、一方、細胞質タンパク質（30μg）を抗IκBαで分析した。非古典的NF-κB経路について、両画分中のRelBの発現を分析した。β-アクチン、HDAC1およびヒストンH3を、それぞれ細胞質画分および核画分についてのローディング対照とした。代表的な実験を示し、RANKL刺激後の時間をカッコ内に表示する。（C）受容体半減期の調査。HEK-RANK細胞を4μg/mLシクロヘキシミド（CHX）と共に2時間予備インキュベーションし、その後、RANKL（100ng/mL）またはPep8（200μM）で表示時間にわたり処理した。RANKの発現を抗RANK/TNFRSF11Aで決定した。
【図４】図4（A〜B）は、Pep8による卵巣摘出誘導型骨量減少の阻害を示す。インビボで卵巣摘出マウスにおける骨密度に及ぼすPep8の作用を決定した。8週齢C57BL/6マウスから卵巣を摘出し、そのマウスを10mg/kg/日のPep8またはビヒクルで35日間処置した。ビヒクルで処置された非卵巣摘出マウスを健常対照として含めた。方法に記載するように、脛骨中の海綿骨の三次元構造（A）および第4腰椎（B）をマイクロコンピュータ断層撮影（μCT）によって検査した。OVXマウスにおける海綿骨の量は健常対照（NOV）における海綿骨の量よりも著しく低下していた。Pep8（10mg/kg）処置は海綿骨の骨量減少を防止した。組織形態計測分析は、Pep8で処置されたマウスにおいて骨体積（BV）/組織体積（TV） の比率、骨梁幅（TbTh）、および骨梁数（TbN）の有意な増加、ならびに骨梁間隙（TbS）の減少を示している。値は、平均±SEMである。OVXに対して、a：P＜0.005、b：P＜0.05；NOVに対して、c：P＜0.005、d：P＜0.05。
【図５】図5（A〜C）は、主要な結合残基の特徴決定および破骨細胞形成に及ぼす本発明の一連のポリペプチドの阻害活性を例証する。（A）RANKに結合するPep8の飽和移動差（STD）。中央モチーフLeu-Lys-Leu-Cys-Ser（L3K4L5C6S7）は、移動の最も重要な部分を受け入れる。これは、分子モデリングにより画定される予測結合域と一致する。実験の限界のせいで、アミノ酸N1 （Asp）およびV2 （Val）はこの実験では調べられない。アミノ酸N1由来の両方のNH基が検出されるが、これらの基は、G8（Gly）およびE9（Glu）由来のNHよりも低い飽和移動を示す。（B）分子モデリングからのRANK結合型Pep8の三次元コンフォメーション。（C）破骨細胞形成に及ぼす本発明の一連のポリペプチド（シリーズ800）の阻害活性。これらのポリペプチドは、RANKに対する主要アミノ酸の特異的結合親和性の分子モデリングからの結果に基づいて産生されたPep8誘導体である。
【図６】Pep8で5週間処置した後の器官毒性の組織形態学的評価を表す。対照群に比べた組織形態学的差異は観察されなかった。
【図７】図7（A〜B）は、非PEG化ペプチドに比べたPEG化Pep8（Pep8-NPEG5、NPEG5）による卵巣摘出誘導型骨量減少の阻害を示す。卵巣摘出C57BL/6マウスを1日用量10mg/kgもしくは2.5mg/kgのPep8-NPEG5で、または10mg/kgの非PEG化Pep8で35日間処置し、上記のように骨密度を評価した。（A）Pep8-NPEG5（10mg/kg/日、n=8もしくは2.5mg/kg/日、n=8）、Pep8（10mg/kg/日、n=7）、またはビヒクル（OVX、n=8）で処置されたマウスからの脛骨近位部の代表的な三次元μCT横断像。偽手術されたマウス（n=5）を健常対照とした。（B）脛骨の組織形態学的分析は、ビヒクル処置マウスと比較した、用量10mg/kgのPep8-NPEG5または非PEG化Pep8で処置されたマウスでの骨体積/組織体積（BV/TV）率、骨梁幅（TbTh）および骨梁数（TbN）の有意な増加、ならびに骨梁間隙（TbS）の減少を示している。低い方の用量（2.5mg/kg）のPep8-NPEG5を用いたマウスの処置は、ほぼ同様に有効であり、脛骨におけるBV/TVおよびTbNを有意に増加させ、TbSを減少させた。値は平均±SEMである。**：P＜ 0.01、*：P＜0.05。
【図８】図8（A〜B）は、非PEG化ペプチドと比べたPEG化Pep8（Pep8-NPEG8、NPEG8）による卵巣摘出誘導型骨量減少の阻害を示す。卵巣摘出されたC57BL/6マウスを1日用量10mg/kgもしくは2.5mg/kgのPep8-NPEG8で、または低い方の用量の2.5mg/kgの非PEG化Pep8で35日間処置し、上記のように骨密度を評価した。（A）Pep8-NPEG8（10mg/kg/日、n=8もしくは2.5mg/kg/日、n=8）、Pep8（2.5mg/kg/日、n=8）、またはビヒクル（OVX、n=8）で処置されたマウスからの脛骨近位部の代表的な三次元μCT横断像。偽手術されたマウス（n=8）を健常対照とした。（B）脛骨の組織形態学的分析は、ビヒクル処置マウスに比べて両方の用量のPep8-NPEG8処置群について骨体積/組織体積（BV/TV）率および骨梁幅（TbTh）の有意な増加を示しているが、低い方の用量2.5mg/kgのPep8は効果が低下していた。値は平均±SEMである。**：P＜0.01。
【図９】RANKに結合したPep8誘導体の代表的なドッキング結果を示す。RANKは、挿入されたアミノ酸電荷にしたがって着色した滑らかな塊（soft volume）として表示する（原図では、赤:陰性、青:陽性、白:中性）。原図ではアミノ酸置換は黄色であり、CPK表現を使用してレンダリングされている。原図では、E126は赤色、R129およびK97は青色、V2およびN9は橙色、L3は淡緑色、K4は緑色、L5は淡青色、E1は桃色、S7は淡紫色、およびC6は紫色である。最上段：Pep8の配向および配列を参照のために表示し、原図でのアミノ酸にしたがって塊を着色した；結合間隙を画定するRANKの主要アミノ酸を矢印で表示する。大きな矢印はRANK上のペプチドの配向を表す。コアモチーフL3-K4-L5-C6-S7だけが存在するとき（Pep822）、アミノ酸K4は、RANK-K97と共に頭→尾配向を採る代わりに、RANK-E126に向かって位置する。位置1および9のアミノ酸を交換すると（Pep813）、ペプチドの配向は逆転する。2段目：N末端（Pep811）位またはC末端（Pep814、Pep805）位でペプチドの長さを増加させると、生じたペプチドは、K4をその最適な位置から移動させてより伸長したコンフォメーションを採る。3段目：L3（Pep809）のコンフォメーション状態を改変すること、またはC7もしくはL5（Pep810および808）の位置的ロックを増加させる結果、ペプチドのN末端の移動が生じる。これらの変化によって誘導されるC末端ペプチドのエントロピーの追加的な減少は、N末端での結合喪失によって相殺されるが、K4の配向は保たれる。最下段:K4の置換は、アミノ酸位置がシフトする代替結合パターンによって（Pep817）、N1によりR129/R130の結合を破壊することによって（Pep818）、またはPep822で認められたコンフォメーションに類似する代替結合コンフォメーション（Pep820）によって、代償することができる。
【図１０】様々なTNF-Rメンバーに対するPep8のドッキング結果を示す。Seaview（Galtier et al. 1996）を用いて生成した系統樹は、RANKがTNF-Rファミリーの他のメンバーと比較的近縁であることを示している（左上）。実験的構造からのTNF-Rメンバーの画像（Liu et al. 2010; Banner et al. 1993; Mukai et al. 2010; Compaan et al. 2005; Zhan et al. 2011; Cha et al. 2000; Kuester et al. 2011; An et al. 2011; Compaan et al. 2006））およびPep8と複合体を形成したDR5の結晶構造（Picarda et al. 2012）から得られたDR4のモデル構造（名前を灰色で表示）（Picarda et al. 2012）を示す。原図では:E9、G8およびS7は淡紫色、C6は紫色、L5は淡青色、L3は淡緑色、V2は橙色であり、RANKのE126、TNFR1のE109、TNFR2のQ109、OX40のD117、DR4のE83、DR5のE98、DR6のN141、CD40のE117、DcR3のE97およびHVEMのD95は赤色である。RANKとは異なり、他のTNF-Rメンバーに関して伸長した結合溝を明確化することはできなかった。RANK-E126と等価のアミノ酸（原図ではCPKを赤色で表示:TNFR1のE109、TNFR2のQ109、OX40のD117、DR4のE83、DR5のE98、DR6のN141、CD40のE117、DcR3のE97およびHVEMのD95）は、対応するTNF受容体／リガンド複合体の結晶構造から手作業で同定した。DR6は結合しているリガンドがなく、開放型コンフォメーションを示し、ペプチドに対する潜在的結合溝をもたない。ドッキング実験から、ターゲティングされたアミノ酸周囲を適切に包み込んでリガンドの結合を遮断することができるPep8のコンフォメーションは無いことが示唆された。いくつかのPep8残基だけが非特異的に受容体と結合することができる。RANK特異性を担うコアモチーフL3-K4-L5-C6-S7は、多くの場合、溶媒に曝露されるか、またはタンパク質との相互作用よりも内部ペプチド相互作用に関与する。
【００９２】
実施例を用いて本発明を下記の文中に詳細に説明するが、本発明の技術的範囲がこれらの実施例によって限定されることはない。
【実施例】
【００９３】
I.  材料および方法
I.1  ポリペプチドの大規模コレクションの産生
インハウスのバイオインフォマティクスツールを使用して、水溶性についてフィルタリングされたポリペプチドの広域データベースを産生させた。簡潔には、所望の長さ（7〜13アミノ酸）のランダムなアミノ酸配列をインシリコで産生させ、生じたポリペプチド配列を生化学フィルターと配列関連フィルターとの組み合わせによりフィルタリングして、生じたポリペプチドの大部分が最も一般的な溶媒（H2O、PBS、DMSO/H2O）にインビトロおよびインビボで可溶性であることを確実にした。生じたコレクションを処理してポリペプチドの三次元座標を提供した。さらに、Discovery Studio 2.5.5（Accelrys Software Inc, San Diego, CA, USA）内でのさらなる解析に適するように各ポリペプチドを、CHARMm力場（Brooks et al. 1983）を用いて分類した。
【００９４】
I.2  ドッキング実験およびドッキングポーズの精密化
ヒトRANK-RANKLの結晶構造（PDB id: 3ME2, Liu et al. 2010）を参照として使用してRANK-RANKL相互作用部位での推定上の結合部位を画定した。RANKLの結合は、RANKのN末端で2個のシステインリッチドメイン（CRD）の36°のスイッチを誘導する（Liu et al. 2010）。本発明者らは、RANKの最初の2個と最後の2個のCRDの間のヒンジ領域がRANKLの結合に重要な接触部を含むことから、その領域をドッキング調査に最も都合のよい結合ポケットとして定義した（Ta et al. 2010）。Discovery Studio 2.5.5のCDOCKERモジュールを使用してドッキング実験を行った（Wu et al. 2003）。主要ポーズを目視検査し、最も有望なポーズを精密化して最も好都合なRANK-ポリペプチド相互作用のよりよい特徴決定に供した。
【００９５】
I.3  表面プラズモン共鳴結合アッセイ
以前に公表されたように（Baud'Huin et al. 2009）、BIAcore 3000装置（BIAcore）でバイオセンサー実験を実施した。組換え精製RANKL（5mMマレイン酸塩中に2μg/mL、pH5.75）またはRANK-Fc（担体なし）（酢酸ナトリウム緩衝液中に5μg/mL、pH5.0）をCM5センサーチップ（BIAcore）のデキストランマトリックスに流速5μL/minで共有結合的に固定化した。RANKLについて400〜3000共鳴ユニット（RU）またはRANKについて5000RUの範囲の固定化レベルが得られた。結合アッセイは、10mMヘペス緩衝液（pH7.4）中において25℃で行った。結合期は180秒であり、それに同緩衝液中での解離期が続いた。シングルサイクルカイネティクスを使用して、関心対象の100μMポリペプチドから開始し、続いて2倍系列希釈（100〜0.78μMの範囲）を行ってRANKまたはRANKLへのポリペプチド結合調査を確認した。センサーグラムをフィッティングさせて、BiaEval 4.1ソフトウェア（BIAcore）でラングミュア1:1モデルを使用して平衡解離定数を計算した。RANK-Fc CF、RANKLおよびOPG（担体なし）はR&D Systems（Minneapolis, MN, USA）から入手した。
【００９６】
I.4  NMR分光法
NMR実験は、溶媒2H2O/水の試料チューブと磁化率が一致した標準5mmチューブまたはShigemi製3mmチューブを使用して、Linux PCワークステーションを備えるBruker AVANCE 500分光計で1Hについて500.13MHzで運転した。試料濃度0.1、0.2、0.4または1mMでのポリペプチドPep8のスペクトルは、95％H2Oおよび5％2H2O中で調製した50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.4）に溶かして記録した。二次元NMRスペクトルは、States-TPPI法（States et al. 1982）を使用して位相敏感モードで記録した。ウォーターサプレッションのためにWATERGATEパルス配列を使用して（Piotto et al. 1992）または励起スカルプティング（excitation sculpting）ウォーターサプレッションを使用して（Hwang et al. 1995）全ての実験を実施して、H2O/2H2O（95:5）溶液での溶媒シグナルを除去した。二次元COSY、TOCSYおよびNOESYスペクトルは、280Kで記録した。TOCSYスペクトルは、それぞれ混合時間（τm）35および70msでMLEV-17スピンロックシーケンスを使用して記録した（Bax et al. 1985）。2D NOESY実験は、混合時間（τm）100、200または500msで記録した。異種核スペクトル1H-13C HSQCは、同条件で280Kにおいて記録した。可溶性RANK受容体-Fc（R&D Systems）を用いたNMR実験について、リガンド対タンパク質の比は100:1〜1000:1（0.1〜1mM Pep8、1μM RANK受容体-Fcタンパク質）の範囲であった。化学シフトの帰属は、内部3-(トリメチルシリル)プロピオン酸ナトリウム塩-2,2,3,3-d4（TSP-d4）を参照する。RANK受容体-Fcタンパク質とのPep8の転移核オーバーハウザー効果（TRNOESY）スペクトルは、混合時間（τm）100、200または500msを使用して記録した。
【００９７】
ポリペプチド-タンパク質混合物の1D1H STD NMRスペクトルは、以前に記載されたように4Kスキャンおよびタンパク質共鳴の選択的な飽和を行って500MHzで記録した（Pons et al. 2011）。飽和移動は、低分子量タンパク質（48kDa）でのスピン拡散効果の低効率のせいで減少しやすい。より良好な飽和移動効率を達成するために、RF照射周波数値-0.4/10.1/60ppm（fon1/fon2/foff）でクリーンSTD-NMR実験も行った（Xia et al. 2010）。ガウス形状パルスの高さを200Hzに設定し、リガンド近傍の共鳴は＞500Hzであった。STD実験における感度増強は、最適化励起90°E-Burp-1選択パルスまたは90°E-Burp-1コサイン改変選択パルスにより達成することができた（Cutting et al. 2007）。興味深いことに、クリーンSTD-NMRと90°E-Burp-1余弦変調選択パルスとの組み合わせは、より良好な信号雑音比を与える。認められた相対STD値は、古典的STD-NMR実験に類似していた。
【００９８】
オン共鳴およびオフ共鳴タンパク質飽和を用いたFID値のサブトラクションは、位相サイクリングによって達成した。STDシグナル強度を、類似のパラメーター条件で記録された同試料の一次元1H NMR参照スペクトルでの対応するシグナル強度で除算することによって相対STD値を計算した。
【００９９】
I.5  ポリペプチドおよび試薬
純度＞95％（HPLC）で届いた全てのポリペプチドおよびPEG化ポリペプチド（PEG化は2つの異なる直鎖長（PEG） 5および（PEG） 8で実施した）は、GeneCust EUROPE（Dudelange, Luxembourg）から購入した。ポリペプチドは使用まで-20℃で保存した。インビトロ実験について、リン酸化緩衝食塩水（PBS）または細胞培養培地中で1mM原液を調製し、その原液を-20℃で最大2週間保存した。疎水性ポリペプチドについて、1〜5％DMSO（v/v）を含有する原液を調製した。ポリペプチドPep8（Pep8）を用いたインビボ実験について、PBS中の2.5mg/mL溶液を新鮮調製し、使用前に無菌濾過した。
【０１００】
I.6  破骨細胞分化アッセイ
ヒト末梢血単核細胞（PBMC）は、Ficoll勾配（Sigma, Saint Quentin Fallavier, France）をかけた遠心分離によって単離した。CD14+細胞をCD14マイクロビーズで磁気ラベルし、以前に記載されたように（Duplomb et al. 2008）MACS技法（Miltenyi Biotec, Paris, France）によってポジティブ選択した。CD11b+単球は、4週齢C57BL6雄性マウスの大腿骨および脛骨から骨髄を洗い出すことによって得られたマウス骨髄細胞からMACSマイクロビーズを使用して精製した（Baud'huin et al. 2010）。細胞調製物の純度は、フローサイトメトリーにより管理したとき約96％であった。ヒトCD14+単球およびマウスCD11b+単球からの破骨細胞の産生は、以前に記載されたように行った（Duplomb et al. 2008, Baud'huin et al. 2010）。簡潔には、精製された細胞を、10％ウシ胎仔血清および25ng/mLヒト／マウスマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF, R&D Systems, Abindgton, UK）を有するα-最小必須培地（α-MEM, Gibco/Invitrogen, USA）中で培養した。培養3日後に、細胞培地を、関心対象のポリペプチド（0.5〜100μM）または参照阻害剤として使用した50ng/mLヒトOPG（R&D Systems）を補充した、または補充していない、M-CSFおよび組換えヒトRANKL（100ng/mL, R&D system）を含有する新鮮培地に交換した。多核破骨細胞が形成するまで、可溶性サイトカイン、受容体およびポリペプチドを3日毎に更新した。CD14+細胞について12日、CD11b+細胞について15日培養後、TRAP染色（Sigma, France）によって破骨細胞を視覚化し、形成した核が3個以上の細胞を手作業で計数し、統計解析した。
【０１０１】
I.7  RNAの単離およびリアルタイムPCR
RANKL（100ng/mL）の存在下または非存在下でPep8（25または50μM）で処理されたCD14+細胞から、Nucleospin RNA IIキット（Macherey-Nagel, Duren, Germany）を製造業者の説明書にしたがって使用して、総RNAを抽出した。RANKL有りまたはなしで培養した未処理細胞を対照とした。CD14+の総RNA5μgからThermoScript（商標）RT（Invitrogen, Saint Aubin, France）およびオリゴ（dT）プライマーを用いて製造業者の推奨にしたがって第一鎖cDNAを合成した。定量リアルタイムPCR（qPCR）は、逆転写された総RNA 15〜40ng、300nMプライマーおよび2×SYBRグリーン緩衝液（Biorad）を含有する反応混合物を用いてChromo4（商標）システム（Biorad, Marnes-la-Coquette, France）で実施した。インバリアント対照としてGAPDH、B2Mおよびβ-アクチン（ACTB）を使用して、Vandesompeleら（Vandesompele et al. 2002）によって記載された方法にしたがって分析を行った。Primer 0.5ソフトウェア（Whitehead Institute for Biomedical Research）で設計された、以下の遺伝子特異的プライマーを使用した:
2015508392.tif 000003
。PCR条件は以下のとおりであった:98℃で30秒予備インキュベーション、続いて95℃で15秒および60℃で30秒を40サイクル（CathK、NFATc1、GAPDH、B2M、ACTB）または60℃で30秒に続いて79℃で30秒（TRAP）。反応産物は、融解温度の測定によって特徴決定した（55〜95℃、0.5℃/秒）。
【０１０２】
I.8  ウエスタンブロット分析
RAW264.7細胞を完全培地中で培養し、2時間欠乏させてから、RANKL（100ng/mL）の存在下または非存在下にてPep8（50μM）で処理した。37℃で5、10、15、30または60分間処理した後に総細胞溶解物を得、以前に記載されたようにタンパク質濃度を決定した（Duplomb et al. 2008）。NF-κB経路分析について、NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Kit（Thermo Scientific, UK）を使用して別個の細胞質タンパク質画分および核タンパク質画分を得た。タンパク質（40μg）を10％SDS-PAGEで泳動させ、Immobilon-Pメンブラン（Millipore, Billerica, MA, USA）に移行させ、次にそれをAkt、ホスホ-Akt、ERK 1/2、ホスホ-ERK 1/2、p38、ホスホ-p38、IκBα、p105、p65、p50およびRelBに対する抗体（Cell Signalling, Danvers, MA, USA）と共にインキュベーションした。ECL試薬（Pierce, Rockford, IL, USA）を使用して標識タンパク質を検出した。βアクチン（総細胞抽出物または細胞質画分）、ヒストンH3、およびHDAC（核画分）をハウスキーピングタンパク質として使用した（Cell Signalling）。
【０１０３】
I.9  細胞系および構築物
マウスRAW264.7細胞（ATCC）は、10％FBS（Hyclone）を補充したαMEM（Invitrogen）中で培養した。ヒト胎児由来腎臓293細胞（ATCC）に、RANK/TNFRSF11AのORF cDNAを含む発現準備済クローン（Ex-O0007-Lv105、OmicsLink（商標）Expression Clone、GeneCopoeia（商標））を安定トランスダクションした。HEK-RANK細胞は、DMEM（Lonza）、10％FBSおよび1μg/mLピューロマイシン中で維持した。
【０１０４】
I.10  マウス骨粗鬆症モデル
8週齢卵巣摘出（OVX）雌性C57BL6マウスおよび非卵巣摘出対照マウスをJanvier（Le Genest Saint Ilsle, France）から購入した。マウスを、Experimental Therapy Unit（Faculty of Medicine, University of Nantes, France）に無病原菌状態で収容し、動物飼育プロトコールおよび実験プロトコールは、フランス研究省（French Ministry of Research）によって承認されており、フランス倫理委員会（French Ethical Committee）の施設ガイドラインにしたがって、権限のある研究者の監督の下に行った。OVX手術から7日間回復および順応させた後に、ペプチドの皮下注射を毎日受ける処置群とビヒクル（PBS）のみの注射を毎日受ける対照群とにマウスをランダムに分けた。非卵巣摘出マウスまたは偽手術マウスを健常対照として調査に含めた。3つの実験プロトコールを定めた。プロトコール1：卵巣摘出マウスに、10mg/kg体重のPep8（Pep8、n=8）またはビヒクルのみ（OVX、n=8）のs.c.注射を毎日行った。非卵巣摘出（NOV、n=8）マウスを正常対照とした。プロトコール2：卵巣摘出マウスを、10mg/kgもしくは2.5mg/kgのPEG化Pep8（Pep8-NPEG5）、または用量10mg/kg/日の非PEG化Pep8、またはビヒクルのみの処置を毎日受ける4群（n=8）にランダムに分けた。偽手術マウス（n=5）を健常対照とした。プロトコール3：卵巣摘出マウスに、上記のように10mg/kgもしくは2.5mg/kgのPEG化Pep8（Pep8-NPEG8）または低い方の用量2.5mg/kg/日の非PEG化Pep8またはビヒクルのみの処置を毎日行った。偽手術マウス（n=8）を健常対照とした。
【０１０５】
実験の期間中、マウスの体重をモニタリングした。試験期間中に卵巣摘出マウスにおける体重の変化に有意差は見られなかった。5週間処置した後に、マウスをイソフルラン（2％、1L/min）で麻酔し、頸椎脱臼により屠殺した。マイクロCT分析のために腰椎および脛骨を収集し、さらに分析するまで4℃で4％パラホルムアルデヒド中に保存した。追加的に、一部のマウス（各群n=3）の内臓（心臓、肝臓、肺、腎臓、脾臓、腸および胸腺）を回収し、毒性スクリーニングのために保存した。
【０１０６】
I.11  骨試料のマイクロCT分析
小動物イメージング用高分解能X線マイクロCTシステムSkyScan-1072（SkyScan, Belgium）を使用して、マウスの脛骨および椎骨の構築変数（architectural variable）の解析を行った。走査後に、画像データをワークステーションに転送し、SkyScan解析システム（CT-analyser, CT-volume, SkyScan）を使用して、近位脛骨および第4腰椎（L4）を3Dディスプレイおよび構造指数の計算のためにレンダリングした（Parfitt et al. 1987）。脛骨での海綿骨パラメーターについて、関心対象の領域において、成長板の約0.1mm下の海綿骨から大腿骨中央部まで軸方向に横断CTスライスを得た。輪郭を明確化し、皮質骨近くに描いた。次に、海綿骨を除去し、別々に解析した。脛骨近位端の成長板から約0.4μm遠位のスライス50枚（1mm）を解析のために使用した。L4椎骨の解析のために、スライス120枚（2.4mm）が椎体内側になるように手作業で輪郭を描き、終板上部および下部が含まれることを回避した。分析のために、測定用のしきいレベルを55に設定した。検体の分析は以下の骨測定を含んでいた:骨体積フラクション（BV/TV、％）、骨梁数（TbN）、骨梁幅（TbTh）および骨梁間隙（TbSp）。
【０１０７】
I.12  器官毒性の組織学的評価
屠殺後に、器官を保存し、4％PFA中で4℃で固定し、パラフィン内に包埋した。切片（4μm）を切り出し、ヘマトキシリン-エオシンで染色した（Lamoureux et al. 2009、Baud'Huin et al. 2010）。DMRXA顕微鏡（Leica, Nussloch, Germany）を使用して各切片に関して器官の全般的形態を評価した。
【０１０８】
I.13  統計解析
インビボデータを動物8匹の平均±SEMとして提示した。ポリペプチドで処置された卵巣摘出マウスとビヒクル処置された動物または健常対照との間の有意差は、ANOVAおよびダネット（Dunnett）多重検定を使用して決定した。インビトロデータについて、スチューデントの両側t検定の使用によって統計解析を行った。すなわち、群間の比較は、t検定（両側）により、または部分集団が2つよりも多い実験についてはANOVAにより解析した。P＜0.05の確率値を統計的に有意と見なした。
【０１０９】
II.  結果
II.1  RANKへのRANKLの結合は、推定上の阻害領域の画定を可能にする
Liuら（2010）の調査によってRANK-RANKLの構造から明らかにされた顕著な一特徴は、RANKLが結合したときにRANKによって達成される大きなコンフォメーションスイッチである。RANKの細胞外領域の基部の大部分は不変のままであり、CRD1ユニットおよびCRD2ユニットは36°スイッチングしてRANKLと密接に接触するようになる（Liu et al. 2010）。結合ポケットを画定するための厳密な空洞はないが、CRD2ドメインにおけるスイッチに起因する割れ目（split）を利用して、2つのコンフォメーション間のヒンジ領域を画定することができる。本発明者らは、この間隙を利用してその主要な結合ポケットを画定し、そのポリペプチド候補のドッキング解析に供した（図1A）。
【０１１０】
II.2  RANKをターゲティングする本発明のポリペプチドはRANKL誘導型破骨細胞形成を阻害する
本発明者らは、受容体RANKからいくつかのポリペプチド阻害剤を設計し（表1）、次にそれらを生物学的活性についてスクリーニングした。精製ポリペプチド（GeneCust）をリン酸緩衝食塩水（PBS、pH7.4）または細胞培地への1mM原液として調製した。いくつかのポリペプチドの疎水性のせいで、溶媒に1％DMSOを補充して所望の濃度を達成することが必要であった。本発明者らは、25mg/mL M-CSFおよび100ng/mL RANKLと共に培養されたPBMCから単離されたヒトCD14+単球での破骨細胞形成に対する50μM濃度のこれらの阻害性ポリペプチドを評価した（図1B）。阻害活性既知のOPG（OP3-4）およびTNF受容体（WP9QY）に由来するポリペプチド模倣体（Takasaki et al. 1997、Cheng et al. 2004）、ならびに濃度50ng/mLのデコイ受容体OPGを陽性対照として使用した。濃度50μMの設計されたポリペプチドのいくつかは、インビトロで破骨細胞形成に中度の効果を示し（Pep501（SEQ ID NO:24）；PepA19（SEQ ID NO:29）；PepA20（SEQ ID NO:30））、TRAP陽性多核細胞の形成を、可溶性RANKL単独で処理された細胞に比べて約25〜35％減少させた。
【０１１１】
このアッセイでスクリーニングされた8種の新規ポリペプチドのうち、Pep8（SEQ ID NO:2）は、RANKLターゲティング模倣体OP3-4およびWP9QYに類似の阻害活性を示し、それ故に、ポリペプチドのパネルの中で最も有望なRANKのポリペプチド性阻害剤と判断された。
【０１１２】
本発明者らは、修飾のための支援として分子モデリングを使用して、Pep8配列から新規ポリペプチドを得た。得られたこれらの全てのポリペプチドは、インビトロで破骨細胞形成を阻害することができ、それらの一部はPep8よりも強い阻害活性を有した（図5C）。得られたこれらの全てのポリペプチドは、SEQ ID NO:32およびSEQ ID NO:32の全長にわたりSEQ ID NO:32と少なくとも80％の同一性を有する配列、SEQ ID NO:33およびSEQ ID NO:33の全長にわたりSEQ ID NO:33と少なくとも80％の同一性を有する配列、SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:1の全長にわたりSEQ ID NO:1と少なくとも80％の同一性を有する配列、特にSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:1の全長にわたりSEQ ID NO:1と少なくとも80％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含むまたはそれからなる配列を有した。
【０１１３】
これらの結果は、本発明によるポリペプチドがインビトロでRANKL誘導型破骨細胞形成を阻害する能力を実証している。
【０１１４】
（表１）RANKの間隙への結合のために設計されたポリペプチド。P8シリーズ（Pep8〜Pep824）は、最大20アミノ酸の配列からなり、ここで、該配列は、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:1、およびSEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33またはSEQ ID NO:1の全長にわたりそれぞれSEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33またはSEQ ID NO:1と少なくとも80％の同一性を有する配列からなる群より選択される配列を含むまたはそれからなる。
2015508392.tif 000004
2015508392.tif 000005
*ペプチドの安定性およびバイオアベイラビリティーを改善すると評価された修飾
**データは計算せず
【０１１５】
II.3  阻害ポリペプチドの動態学的結合能
RANKへのポリペプチドの結合は、表面プラズモン共鳴を使用して調査した（図1C）。いくつかのポリペプチドが固定化RANKと用量依存的に結合したが、本明細書ではPep1（SEQ ID NO:33）を提示する。単純な2分子相互作用についての1:1ラングミュアモデルを使用して得られた結合および解離動態に基づくと、hRANKに対するPep1の測定結合親和性（Kd）（図1C）は20.6μMであった（kon=1.35×101M-1s-1、koff=2.78×10-4s-1）。本発明のポリペプチドPep8は、RANKと10.5μMのKdで結合し、見かけの結合定数（kon）および解離定数（koff）である速度定数は、それぞれ4.95×102M-1s-1および5.20×10-3 s-1と推定された。
【０１１６】
これらの結果は、hRANKへの本発明のポリペプチドPep8の結合親和性（Kd）が、Pep1のような他の被験ポリペプチドよりも大きいことを実証している。
【０１１７】
II.4  Pep8はRANKL誘導型破骨細胞形成を阻害する
次に、本発明のポリペプチドPep8の阻害活性を、ヒトCD14+細胞およびC57/bl6マウス由来マウスCD11b+細胞におけるRANKL誘導型破骨細胞形成でより詳細に検討した。マウスとヒトRANKは、77％のアミノ酸配列同一性を示す。したがって本発明者らは、ヒトRANKに基づき産生されたポリペプチドがマウス受容体ホモログも阻害するであろう結果として、それらのポリペプチドをマウス骨量減少モデルで試験できるであろうと予測した。
【０１１８】
Pep8は、ヒトCD14+細胞（図2AおよびB）、ならびにマウス細胞培養物（データは示さず）中に形成したTRAP陽性多核細胞の数の用量依存的減少を引き起こした。100μM Pep8の存在下で、TRAP陽性多核細胞数は、ポリペプチドなしで行われたヒトまたはマウス共培養で形成した数のそれぞれ39％および28％であった。Pep8のIC50は、ヒトCD14+について40μM、マウスCD11b+細胞について30μMであった。RANKL非存在下のPep8単独は破骨細胞の発達を調節しなかった（データは示さず）。
【０１１９】
単球またはマウスマクロファージ様RAW264.7細胞に対して100μM Pep8に細胞毒性作用がなく（データは示さず）、アリザリンレッド染色によって実証されるようにそのポリペプチドが100μMで間葉系幹細胞（MSC）の石灰化にいかなる作用も有さなかったので（データは示さず）、Pep8は固有毒性を有さなかった。
【０１２０】
したがって、これらのデータは、Pep8が細胞毒性なしにRANKL誘導型破骨細胞形成を打ち消すことを示唆している。
【０１２１】
破骨細胞分化に及ぼすPep8の役割をさらに解明するために、本発明者らは、全て破骨細胞マーカーであるカテプシンK、TRAP、および活性化T細胞核内因子c1（NFATc1）の遺伝子発現に及ぼすその効果を検討した。CD14+単球を、Pep8の非存在下または存在下でM-CSF（25ng/mL）およびhRANKL（100ng/mL）で処理し、続いて総RNAを単離した。
【０１２２】
RT-PCRから、骨形成マーカーであるカテプシンK、TRAPおよびNFATc1のmRNA発現がRANKL刺激の3日後にPep8存在下で顕著に減少し、このマーカー発現減少が11日目まで維持されたことが示され（図2C）、このことは、破骨細胞形成に及ぼすPep8の阻害効果と一致している。
【０１２３】
これらの結果は、本発明のポリペプチドPep8が破骨細胞のマーカー遺伝子の発現を阻害する能力を実証している。PEG化Pep8（Pep8-N（PEG） 5およびPep8-N（PEG） 8）で類似の結果が得られた。
【０１２４】
II.5  Pep8はRANKL誘導型シグナル伝達を阻害する
Pep8が破骨細胞の分化および機能を調節する経路をさらに調査するために、Akt、p38およびERKのRANKL誘導型リン酸化に対するポリペプチドの作用を、50μM Pep8に曝露されたRAW264.7で検討した。ウエスタンブロット分析から、5分間のRANKL処理後にAktリン酸化が実証され、Pep8はRANKL誘導型Aktリン酸化に対して阻害作用を示した（図3A）。同様に、Pep8は15分間のRANKL処理後のp38およびERKのリン酸化を阻害した。pAktおよびpERKの基礎レベルはPep8の存在下で変化しなかったが、Pep8はRANKL刺激の非存在下であってもp38のリン酸化を減少させた（データは示さず）。
【０１２５】
本発明者らは、RAW264.7細胞においてPep8にNF-κBのRANKL誘導型迅速活性化を阻害する能力があるかどうかについても検討した。本発明者らは、50μMのPep8の存在がIκBαのRANKL誘導型分解ならびにその後のp50およびp65の核移行を遮断したことを見出した（図3B）。これらの結果は、Pep8が古典的NF-κB経路のRANKL誘導型活性化を阻害することを示している。対照的に、50μM Pep8を用いた処置は、細胞質画分および核画分中のRelBの発現レベルに作用しなかった（図3B）。
【０１２６】
本発明者らは、RANKを過剰発現しているヒト胎児由来腎臓細胞におけるRANKシグナル伝達に対するPep8の特異性を確認した。Pep8は、RANKLで刺激した後のp38活性化を強く阻害した（図3C）。加えて、RANKL処理は、タンパク質合成阻害剤シクロヘキシミド（CHX）の存在下で経時的にRANKの分解を促進したが、CHX単独は促進しなかった。同様に、CHXおよびPep8を用いた処理はRANKの分解に繋がるものの、その程度は幾分小さい（図3C）。
【０１２７】
結論として、本発明のポリペプチドPep8は、RANKシグナル伝達経路のRANKL誘導型活性化を阻害するように見える。
【０１２８】
II.6  ポリペプチドPep8はマウスを卵巣摘出関連骨量減少から保護する
Pep8がインビトロでRANKL誘導型破骨細胞分化およびシグナル伝達を阻害できることを考慮して、本発明者らは、Pep8がインビボで骨量減少を防止できるかどうかを問うた。卵巣摘出マウスでのエストロゲン欠乏は、骨吸収促進および骨塩密度減少に繋がる（Sato et al. 1997）。したがって本発明者らは、Pep8が、RANKLシグナル伝達を必要とするOVX誘導型骨量減少に対してインビボで保護することができるかどうかを検討した（Cenci et al. 2000, Roggia et al. 2001）。
【０１２９】
雌性C57BL/6マウスに8週齢で卵巣摘出術を行い、手術から1週間回復させた後、処置を開始した。マウスにPep8の皮下注射を10mg/kg体重/日の用量で35日間毎日行った。インビトロでは、Pep8は、30μM（0.029mg/mL）のIC50でCD11b+破骨細胞の形成を活発に阻害した。OVX対照マウスおよび年齢が一致する健常マウス（NOV）をビヒクル（PBS）のみで処置した。組織形態計測およびμCT分析から、生物学的活性用量10mg/kg/日のPep8を用いた処置が、ビヒクルで処置されたOVX対照群に比べて卵巣摘出マウスにおいて海綿骨密度の全体的な増加を誘導したことが実証された（図4）。OVX手法の効果は、健常NOVマウスに比べたビヒクル処置OVXマウスにおける骨体積フラクション（BV/TV）、骨梁幅（TbTh）および骨梁数（TbN）のような骨パラメーターの減少、ならびに骨梁間隙（TbS）の増加によって確認された（図4）。
【０１３０】
近位脛骨では、Pep8を用いた処置は、卵巣摘出マウスにおける骨梁BV/TVを93％有意に増加させた（P＜0.01）。TbThは14％（P＜0.01）、TbNは71％（P＜0.01）増加した。Pep8処置マウスは、ビヒクル処置マウスに比べてTbSの減少も示した（P＜0.01）（図4A）。
【０１３１】
腰椎では、類似の結果が得られた（図4B）。椎骨骨梁BV/TVはPep8処置マウスよりもOVXマウスの方が低下していた（P＜0.05）。同様に、Pep8を用いた処置はTbNを増加させ（P＜0.05）、TbSを減少させた（P＜0.05）。TbThも、OVX対照マウスに比べてPep8処置マウスでわずかに増加したが、その増加は統計的に有意ではなかった。
【０１３２】
Pep8はOVXマウスにおいて体重に作用しなかったが、これはこの用量での処置が動物に毒性を有さなかったことを示しており、このことは、主要器官（心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、皮膚）の組織病理学的評価によって確認された（図6）。
【０１３３】
まとめると、これらの結果は、本発明のポリペプチドPep8がインビボ動物モデルにおいて（RANKをターゲティングすることによって）、毒性なしに閉経後骨量減少を少なくとも部分的に防止することができるという事実を提供している。
【０１３４】
迅速な腎クリアランスによる不十分なバイオアベイラビリティーという、治療用ペプチドの使用に関する大きな懸念が残っている（McGregor 2008）。インビボ調査で使用されたペプチド（Pep8）が被験濃度（10mg/kg/日）で活性であると証明されたものの、本発明者らは、ペプチドのN末端PEG化によってペプチドの半減期をさらに増加できるかどうかを問うた。ペプチドのPEG化は、ペプチドの溶解性、バイオアベイラビリティーおよび安定性を最適化することが周知であり、かつ免疫原性を減少させる。したがって、N末端アミノ酸に2つの異なる鎖長のポリエチレングリコール基を有するPep8（Pep8-N（PEG）5およびPep8-N（PEG）8）を上記の卵巣摘出マウスモデルで試験した。
【０１３５】
マウスに異なる2用量、10mg/kg体重および2.5mg/kg体重でPep8-NPEG5の皮下注射を毎日行った。10mg/kgの非PEG化Pep8を陽性対照とした。OVX対照マウスおよび偽手術マウス（Sham）をビヒクル（PBS）のみで処置した。脛骨のμCT分析から、骨梁BV/TV、TbTh、およびTbNを含む構造パラメーターの有意な増加ならびにTbSの減少によって実証されるように、OVXマウスにおいて用量10mg/kg/日のPep8-NPEG5を用いた処置が、非PEG化ペプチドを用いた処置と同程度に骨量減少を軽減したことが示された（図7）。しかし、2.5mg/kg/日という4分の1用量のPep8-NPEG5は、10mg/kg/日のPEG化Pep8および非PEG化Pep8の両方とほぼ同じ効果で近位脛骨におけるBV/TVおよびTbNを有意に増加させ、TbSを減少させた（図7）。
【０１３６】
2番目の実験で、卵巣摘出マウスを、2.5もしくは10mg/kg体重のPep8-NPEG8で、または低い方の用量2.5mg/kg体重の非PEG化Pep8で毎日処置を受ける異なる処置群に、無作為化に分けた。予想どおり、Pep8-NPEG8は両方の被験用量で同様の活性を示し、ビヒクル処置動物に比べて骨梁BV/TVおよびTbNを有意に増加させた（図8）。対照的に、低い方の用量2.5mg/kgのPep8は、ごくわずかに効果が低かったが、BV/TVおよびTbNを有意に増加させず、ペプチドの用量依存性作用を示していた。
【０１３７】
まとめると、これらの結果は、PEG化がペプチドのバイオアベイラビリティーを増加させ、それによって用量を有意に減少させる一方で、骨量減少に対しては同じ保護作用を達成していることを示している。
【０１３８】
II.7  Pep8とRANKとの間の相互作用のSTD NMR調査
リン酸緩衝液中でhRANKおよびPep8を用いて飽和移動差（STD-NMR）実験を行った（図5A）。Pep8スペクトルを最初にタンパク質なしで測定したところ、ポリペプチドは実験期間（2週間）にわたり実験的NMR条件下で安定なままであった。同じリン酸緩衝液中でhRANKも調査し、NMRチューブに漸増濃度のPep8（100:1〜1000:1の濃度比）を加えてPep8-hRANK相互作用を分析した。RANKに結合しているPep8のスペクトルは、可溶性の未結合Pep8のスペクトルと用量依存的に有意に異なり、NMRチューブへのPep8の添加に比例した。ミックスにポリペプチドを添加してから2週間よりも長くPep8/hRANK相互作用を分析したが、Pep8からそのターゲットRANKへの結合によって誘導されるシフトを除いては、結合スペクトルに目に見える追加的なシフトは観察されなかった。STD実験から、Pep8の中央の5アミノ酸がhRANK（L3K4L5C6S7）と直接相互作用し、3アミノ酸（L3K4L5）が100％の飽和を受けていることが明らかとなった。C6S7は相対移動比60％を有し、G8E9はより低い移動を受けた。N1V2はスペクトルから見て取ることができなかった。これは、この種の実験で典型的なことであるが、N1の末端のNHの両方はG8E9シグナルに近いシグナルで検出可能であった。これらの結果は、Pep8がhRANKと緊密な相互作用を形成すること、およびこれらの相互作用の大部分が中央の5アミノ酸（L3K4L5C6S7、少なくとも主鎖NHについて）に集中していることを示している。これらの相互作用により、hRANKの全体にわたる連続的な相互作用パッチが画定され、そのパッチは、分子モデリング分析から推測された位置と完全に一致している（図1Aおよび5B）。
【０１３９】
これらの結果は、本発明のポリペプチドPep8とhRANKとが、モデル化された相互作用に一致するコンフォメーションで直接相互作用するという明白な証拠を提供している。
【０１４０】
参考文献
2015508392.tif 000006
2015508392.tif 000007
2015508392.tif 000008
2015508392.tif 000009
2015508392.tif 000010
2015508392.tif 000011
【図１】
2015508392.tif 000012
【図２】
2015508392.tif 000013
【図３】
2015508392.tif 000014
【図４】
2015508392.tif 000015
【図５】
2015508392.tif 000016
【図６】
2015508392.tif 000017
【図７】
2015508392.tif 000018
【図８】
2015508392.tif 000019
【図９】
2015508392.tif 000020
【図１０】
2015508392.tif 000021
【配列表】
2015508392000001.app
【国際調査報告】
2015508392.tif 000022
2015508392.tif 000023
2015508392.tif 000024