(57)【要約】  本発明は、脱毛症を治療するための、概して過度の脱毛に対抗するための、化粧品又は医薬組成物であって、活性成分として、Ｒ−Ｎ１−スペルミジン、又は１，４−ブタンジアミン，Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−Ｒである式（Ｉ）の化合物を含む、化粧品又は医薬組成物に関する。一般式（Ｉ）の化合物は、本発明の目的に従って活性があり、また、十分に安定であり、頭皮への局所用途に効果的な適用を可能にするものであり、酸化の結果としてもはや活性がなくなる、異なる物質に変換される可能性がない。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｒ−Ｎ１−スペルミジン、又は１，４−ブタンジアミン，Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−Ｒである式（Ｉ）：
（Ｉ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｒ)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
［式中、Ｒは、スペルミジンの第２級アミン官能基に結合した置換基であり、
・  １〜６個の炭素原子からなる、飽和又は不飽和で、線状又は枝分かれのアルキル基（ここで、任意には１つ以上の炭素原子がフッ素で置換されている）であって、メチル、エチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、エチレン、ビニル、プロピレン、ブチレン等のアルキル基；
・  フェニル、ナフチル、ベンジル、トリル等のアリール又はアリールアルキル基（ここで、任意には１つ以上の炭素原子がフッ素で置換されている）であって、前記アリールアルキル基が、１〜６個の炭素原子からなる、飽和又は不飽和で、線状又は枝分かれのアルキル基（ここで、任意には１つ以上の炭素原子がフッ素で置換されている）であって、メチル、エチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、エチレン、ビニル、プロピレン、ブチレン等のアルキル基を含む、アリール又はアリールアルキル基；
・  ３〜８個の炭素原子からなる飽和又は不飽和のシクロアルキル基であって、任意には、１〜６個の炭素原子からなる、飽和又は不飽和で、線状又は枝分かれのアルキル基（ここで、任意には１つ以上の炭素原子がフッ素で置換されている）であって、メチル、エチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、エチレン、ビニル、プロピレン、ブチレン等のアルキル基で置換されている、シクロアルキル基；
から選択される］の化合物、又はその薬剤的に容認できる塩の、脱毛に対抗するための使用。
【請求項２】
前記式（Ｉ）の化合物が、頭皮に局所的に適用される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記式（Ｉ）の化合物が、式：
（ＩＩ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(ＣＨ３)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、Ｎ１−メチルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−メチル−１，４−ブタンジアミンである、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記式（Ｉ）の化合物が、式：
（ＩＩＩ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｃ６Ｈ１１)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、Ｎ１−シクロヘキシルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−シクロヘキシル−１，４−ブタンジアミンである、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記式（Ｉ）の化合物が、式：
（ＩＶ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｃ２Ｈ５)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、Ｎ１−エチルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−エチル−１，４−ブタンジアミンである、請求項１に記載の使用。
【請求項６】
前記式（Ｉ）の化合物が、式：
（Ｖ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｃ３Ｈ７)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、Ｎ１−プロピルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−プロピル−１，４−ブタンジアミンである、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記式（Ｉ）の化合物が、式：
（ＶＩ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｃ４Ｈ９)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、Ｎ１−イソブチルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−イソブチル−１，４−ブタンジアミンである、請求項１に記載の使用。
【請求項８】
前記式（Ｉ）の化合物が、三塩酸塩の形態である、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記式（Ｉ）の化合物が、マレイン酸との塩の形態である、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
毛幹の伸びを刺激し且つ成長期を延ばす効果によって同時に毛髪の生理的成長を促進させるための、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
脱毛に対抗するための医薬又は化粧品組成物であって、Ｒ−Ｎ１−スペルミジン、又は１，４−ブタンジアミン，Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−Ｒである式（Ｉ）：
（Ｉ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｒ)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
［式中、Ｒは、スペルミジンの第２級アミン官能基に結合した置換基であり、
・  １〜６個の炭素原子からなる、飽和又は不飽和で、線状又は枝分かれのアルキル基（ここで、任意には１つ以上の炭素原子がフッ素で置換されている）であって、メチル、エチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、エチレン、ビニル、プロピレン、ブチレン等のアルキル基；
・  フェニル、ナフチル、ベンジル、トリル等のアリール又はアリールアルキル基（ここで、任意には１つ以上の炭素原子がフッ素で置換されている）であって、前記アリールアルキル基が、１〜６個の炭素原子からなる、飽和又は不飽和で、線状又は枝分かれのアルキル基（ここで、任意には１つ以上の炭素原子がフッ素で置換されている）であって、メチル、エチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、エチレン、ビニル、プロピレン、ブチレン等のアルキル基を含む、アリール又はアリールアルキル基；
・  ３〜８個の炭素原子からなる飽和又は不飽和のシクロアルキル基であって、任意には、１〜６個の炭素原子からなる、飽和又は不飽和で、線状又は枝分かれのアルキル基（ここで、任意には１つ以上の炭素原子がフッ素で置換されている）であって、メチル、エチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、エチレン、ビニル、プロピレン、ブチレン等のアルキル基で置換されている、シクロアルキル基；
から選択される］の化合物、又はその薬剤的に容認できる塩が、頭皮への局所投与に適した賦形剤と共に配合される、医薬又は化粧品組成物。
【請求項１２】
前記式（Ｉ）の化合物が、式：
（ＩＩ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(ＣＨ３)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、Ｎ１−メチルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−メチル−１，４−ブタンジアミンである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記式（Ｉ）の化合物が、式：
（ＩＩＩ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｃ６Ｈ１１)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、Ｎ１−シクロヘキシルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−シクロヘキシル−１，４−ブタンジアミンである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記式（Ｉ）の化合物が、式：
（ＩＶ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｃ２Ｈ５)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、エチルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−エチル−１，４−ブタンジアミンである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記式（Ｉ）の化合物が、式：
（Ｖ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｃ３Ｈ７)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、Ｎ１−プロピルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−プロピル−１，４−ブタンジアミンである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記式（Ｉ）の化合物が、式：
（ＶＩ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｃ４Ｈ９)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、Ｎ１−イソブチルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−イソブチル−１，４−ブタンジアミンである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記式（Ｉ）の化合物が、０．００１〜０．３０重量％の量で存在する、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１８】
式：
（ＶＩ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｃ４Ｈ９)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、Ｎ１−イソブチルスペルミジン化合物、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−イソブチル−１，４−ブタンジアミン化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脱毛症を治療するための、概して過度の脱毛に対抗するための、医薬又は化粧品組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
毛包（ＨＦ）は、再生能力を持つ人体の最も複雑な小型器官の一つである。出生後の生涯における毛の成長サイクルは、経時的な毛幹及び毛包への組織形態学的変化を描く。周期的活動が、毛の生成から始まり、毛幹の急成長及び伸びが続く（成長期ａｎａｇｅｎ  ｐｈａｓｅ）。その後、毛包及び毛は、アポトーシスにより動かされる退行を受け（退行期ｃａｔａｇｅｎ  ｐｈａｓｅ）、休止期（ｔｅｌｏｅｎ）が続き、最後に脱毛期（ｅｘｏｇｅｎ）と続く。
【０００３】
これらの形質転換は、サイトカイン、ホルモン、酵素、神経伝達物質及びその同族受容体、及び毛髪サイクルの重要な媒介物として認識されている転写因子の発現及び／又は活性の変化に基づく上皮及び真皮成分の急速な再構築にかかわる。
【０００４】
伸長、段階の持続期間及び毛幹の長さは、異なる人体領域の間や、遺伝的プログラム、年齢及び健康状態に応じた個人の間で異なるが、人体の毛のすべては、同様なライフサイクルに従っている。更に、多くの制御因子は、毛のバイオロジーに関与しており、形態形成に影響を及ぼし、成長期の開始及び持続期間を制御する。
【０００５】
毛の成長サイクルの制御に関与する様々なホルモンがあり、メラトニン、プロラクチン、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）、甲状腺ホルモン及びエストロゲンが挙げられる。例えば、プロラクチンは、マウス及びヒトの両方における毛の成長の制御に関与することが見出された。
【０００６】
これら制御因子の多くは、臨床治療の標的になる可能性がある。例えば、恥骨及び腋窩の毛包を除き、アンドロゲンは、酵素５α−レダクターゼを必要とし、それは、テストステロンを、より強力な代謝産物である、５α−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）へと代謝することが可能である。実際、これは、アンドロゲン性脱毛症の場合に脱毛に対抗するため、臨床及び化粧品分野の両方において使用される機構である。
【０００７】
脱毛とは対照的に、毛の過度の成長は、特に女性にとって問題となり得る。アンドロゲン性脱毛症との対比によって、多毛症（ｈｉｒｓｕｔｉｓｍ及びｈｙｐｅｒｔｒｉｃｈｏｓｉｓ）は、毛包の異常な拡大を伴う拡張した成長期に起因する。
【０００８】
この状態に対抗する通常の治療は、脱毛剤クリーム及びワックスの使用であり、その刺激及びむしり取りは毛包の成長期及び再成長を急激に誘発するため、一時的であるがその問題を軽減する。使用される他のシステムは、電気分解及び選択的光熱分解であり、毛幹及び毛包の皮膚乳頭を破壊するためにレーザーを使用する。利用できる最新の治療は非常に攻撃的である。
【０００９】
これらの問題を解決するため、より効果的な新しい方法が必要とされる。ここ数十年では、毛のサイクルにおけるオルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）及びポリアミンの役割において特に科学的興味がある。この興味は、主に、毛包が増殖性の最も高い器官の一つであるという事実に起因している。ＯＤＣは、ポリアミン生合成における律速酵素であり、阻害剤（エフロルニチン等）の標的であり、顔の毛の成長速度のインビボでの減少及び器官培養でのヒトの毛の成長の阻害をもたらす。
【００１０】
臨床目的で、生成された毛の量を制御するため、一つの戦略に、多毛症の場合には成長期を短くし又は脱毛症に対抗するためには成長期を増加させて成長期の持続期間を変更するものがある。一般に、多毛症、白髪及び脱毛症等の人の毛包の障害は、発症した人の精神及び自尊心に対してかなり負の効果がある。
【００１１】
同一出願人による特許ＥＰ１４６９８４３は、脱毛に対抗する医薬、化粧品又は栄養目的の組成物を開示しており、ここで、活性成分は、スペルミジン又はＮ’−(３−アミノプロピル)−１，４−ジアミノブタンとして知られるポリアミンであり、経口用途と頭皮への局所的用途の両方がある。スペルミジンの式は、Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−ＮＨ−(ＣＨ２)４−ＮＨ２である。
【００１２】
この特許は、スペルミジンそのもの及び他の微量栄養素添加物と組み合わせて含む組成物が脱毛を遅くして過度の脱毛を阻止することができ、同時にその抵抗及び一般的な毛の健康状態を改善できる実験的証拠を報告する。その引っ張りテストは、スペルミジンが毛の引張強度を増加させることを示し、一方、トリコグラム（ｔｒｉｃｈｏｇｒａｍ）及び洗浄テストは、毛球においてその改善が起こることを示した。洗浄後に失った毛の数の実質的な減少に加えて、休止期で失った毛の数（病理学的な損失）も脱毛期で失った毛の数（自然な交換のための損失）に対して減少している。それ故に、スペルミジンによる治療は、休止期での脱毛の低下によって変化する毛のサイクルを実質的に改善し、それを正常な生理的レベルにまで戻す。従って、スペルミジンは、脱毛症に対抗するために効果的な活性成分である。
【００１３】
しかしながら、スペルミジンは、他のポリアミンのように、特に頭皮への局所適用の場合（ここで、その化合物は、皮膚に吸収されその作用を行う前にしばらくの間空気と広域に接触し続けている）に、酸化を受ける。吸収前のこの期間でのスペルミジンのどんな酸化も、潜在的に有害でなくても、もはや活性のない、酸化生成物に導くであろう。
【００１４】
本発明は、第一に、この問題への解決策を見つけることを目的とする。理論的な解決策のうち、酸化を受けるアミン官能基の潜在的な化学的保護は、特に以下の特許に要約される先行技術を考慮すると、一般には、実施に適していないようである。
【００１５】
ＷＯ９９３７２７７は、哺乳動物の毛の成長を低下させるための置換ポリアミンを記載しており、それは、この効果が作られる皮膚領域を選択し、この皮膚領域に、ハイプシン生合成経路の阻害剤として置換ポリアミンを、毛の成長を効果的に低下させる量で、含む皮膚科学的に容認できる組成物を塗布することによるものである。ヒトを含む哺乳動物において望ましくない毛の成長、特にアンドロゲンによって刺激される毛の成長は、それ故に、正常の成長の場合、又は同様に異常又は障害（例えば多毛症）に由来する増加の場合において、低下することができる。
【００１６】
ＷＯ０２０６２３４１は、ヒト又は非ヒト哺乳動物への局所適用に適した医薬組成物に関し、それが塗布される領域において毛の成長を制御するためのものであり、置換ポリアミン又はその塩を有効量で含むものである。このケースにおいて説明されるポリアミンからのＯＤＣ（オルニチン脱炭酸酵素）阻害機構は、ポリアミンが、ＯＤＣがプトレシンへのオルニチンの脱炭酸を触媒するのを防ぐために細胞内に存在するＯＤＣと不可逆的に結合するものである。この特許によれば、毛の成長は、主としてそれらが吸収される細胞においてＯＤＣの形成を防ぐ特定の置換ポリアミンをヒト及び非ヒト哺乳動物に適用することで制御できる。このように、問題の置換ポリアミンは、真のＯＤＣ阻害剤として作用するというよりもむしろ、ＯＤＣの合成を防ぐことによって効くものであると思われる。この文献の実験例は、投与されたポリアミン、このケースではジエチル−ホモスペルミジンがマウスの剃った毛の再成長を停止することを示す。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】ＥＰ１４６９８４３
【特許文献２】ＷＯ９９３７２７７
【特許文献３】ＷＯ０２０６２３４１
【発明の概要】
【００１８】
とにかく、毛の成長を防ぐことを最終的に達成した効果の裏にある生物学的機構に関係なく、この既知の先行技術は、仮定的な実用的解決策として、本発明の目的である、頭皮の皮膚への適用領域において成長を刺激するという反対の効果を得るために、スペルミジンを官能基で置換する解決策を明らかに助長していない。
【００１９】
同時に、本発明の更なる目的は、脱毛に対抗する上でスペルミジンよりも、少なくとも一部の特性について、一層活性のある可能性がある化合物を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＭＴＴアッセイテストの結果のグラフである。
【図２】ＭＴＴアッセイテストの結果のグラフである。
【図３】抗酸化テストの結果のグラフである。
【図４】毛の伸長テストの結果のグラフである。
【図５】図４のテストにおける成長期及び退行期の結果のグラフである。
【図６】図４のテストにおける成長期及び退行期の結果のグラフである。
【図７】化合物４の１Ｈ−ＮＭＲを示す。
【図８】化合物４の１３Ｃ−ＮＭＲを示す。
【図９】化合物４の質量スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
先に要約された先行技術から想定されるかもしれないことに反して、本発明によれば、驚いたことに、以下に示すＲ−Ｎ１−スペルミジン、又は１，４−ブタンジアミン，Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−Ｒである式（Ｉ）
（Ｉ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｒ)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
［式中、Ｒは、スペルミジンの第２級アミン官能基に結合した置換基であり、
・  １〜６個の炭素原子からなる、飽和又は不飽和で、線状又は枝分かれのアルキル基（ここで、任意には１つ以上の炭素原子がフッ素で置換されている）であって、メチル、エチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、エチレン、ビニル、プロピレン、ブチレン等のアルキル基；
・  フェニル、ナフチル、ベンジル、トリル等のアリール又はアリールアルキル基（ここで、任意には１つ以上の炭素原子がフッ素で置換されている）であって、前記アリールアルキル基が、１〜６個の炭素原子からなる、飽和又は不飽和で、線状又は枝分かれのアルキル基（ここで、任意には１つ以上の炭素原子がフッ素で置換されている）であって、メチル、エチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、エチレン、ビニル、プロピレン、ブチレン等のアルキル基を含む、アリール又はアリールアルキル基；
・  ３〜８個の炭素原子からなる飽和又は不飽和のシクロアルキル基であって、任意には、１〜６個の炭素原子からなる、飽和又は不飽和で、線状又は枝分かれのアルキル基（ここで、任意には１つ以上の炭素原子がフッ素で置換されている）であって、メチル、エチル、トリフルオロメチル、トリフルオロエチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ペンチル、ヘキシル、エチレン、ビニル、プロピレン、ブチレン等のアルキル基で置換されている、シクロアルキル基；
から選択される］の化合物、又はその薬剤的に容認できる塩が、スペルミジンと実質的に比較できる抗脱毛活性を有しているが、頭皮への局所的適用の間、周囲空気の存在における酸化の問題に左右されないことを見出した。実際、それらは、空気に対して非常に安定であるため、本発明の目的に従って不活性である又は活性がない、酸化した副生成物に変換されることなく、頭皮への局所的用途に対して効果的な適用を可能にする。
【００２２】
また、特に驚いたことに、本発明に従うこれら化合物は、少なくとも上述したような特定の性質に対して、脱毛症に対抗する上でスペルミジンよりも活性があることが判明する。
【００２３】
従って、本発明は、脱毛に対抗するためのこれらＲ−Ｎ１−スペルミジン化合物（Ｉ）の使用と、それらを活性成分として含む医薬又は化粧品用途の組成物とに関するものである。
【００２４】
本発明に従う式（Ｉ）の好適な化合物は、式：
（ＩＩ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(ＣＨ３)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、Ｎ１−メチルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−メチル−１，４−ブタンジアミン（ＣＡＳ登録番号５１４６０−２３−２）であり、そのものとして又は薬剤的に容認できる塩、例えば三塩酸塩（３ＨＣｌ）若しくはトリマレエートとして本発明に従う組成物に使用される。本発明に従う式（Ｉ）の更なる好適な化合物は、式：
（ＩＩＩ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｃ６Ｈ１１)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、Ｎ１−シクロヘキシルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−シクロヘキシル−１，４−ブタンジアミン（ＣＡＳ登録番号１８３０７０−２８−２）であり、そのものとして又は薬剤的に容認できる塩、例えば三塩酸塩（３ＨＣｌ）若しくはトリマレエートとして本発明に従う組成物に使用される。本発明に従う式（Ｉ）の更なる好適な化合物は、式：
（ＩＶ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｃ２Ｈ５)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、Ｎ１−エチルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−エチル−１，４−ブタンジアミン（ＣＡＳ登録番号９７１４１−３６−１）であり、そのものとして又は薬剤的に容認できる塩、例えば三塩酸塩（３ＨＣｌ）若しくはトリマレエートとして本発明に従う組成物に使用される。本発明に従う式（Ｉ）の更なる好適な化合物は、式：
（Ｖ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｃ３Ｈ７)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、Ｎ１−プロピルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−プロピル−１，４−ブタンジアミン（ＣＡＳ登録番号６２６５９−１４−７）であり、そのものとして又は薬剤的に容認できる塩、例えば三塩酸塩（３ＨＣｌ）若しくはトリマレエートとして本発明に従う組成物に使用される。本発明に従う式（Ｉ）の更なる好適な化合物は、式：
（ＶＩ）      Ｈ２Ｎ−(ＣＨ２)３−Ｎ１(Ｃ４Ｈ９)−(ＣＨ２)４−ＮＨ２
の、Ｎ１−イソブチルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−イソブチル−１，４−ブタンジアミンであり、そのものとして又は薬剤的に容認できる塩、例えば三塩酸塩（３ＨＣｌ）若しくはトリマレエートとして本発明に従う組成物に使用される。この化合物（ＶＩ）は、文献において知られていない。それ故、以下に、その合成方法を、以下に示す反応スキーム（ここで、化合物（ＶＩ）は化合物４として分離される）を参照しながら、説明する。
【００２５】
【化１】
2015522647.tif 000003
【００２６】
化合物１９の合成：ブタンジアミン（１ｇ、０．０１１３ｍｏｌ、５ｅｑ）をＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍｌ）に可溶化させた。その溶液に、Ｂｏｃ２Ｏ（０．６１９ｇ、０．００２８３ｍｏｌ、１ｅｑ）をＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍｌ）に可溶化したものを加えた。その反応混合物をＲＴにて１６時間撹拌して置いた。その生成物の構造をＴＬＣ  ＣＨ２Ｃｌ２  ８／ＭｅＯＨ  ２／ＮＨ４Ｏａｑ３３％  ０．２によって評価した。形成した懸濁液をろ過し、そのろ液を回転蒸発器によって乾燥させた。油状残留物をＥｔＯＡｃ（１５ｍｌ）で溶出し、過剰の未反応ジアミンを除去するために飽和ＮａＣｌ溶液（３×１０ｍｌ）で洗浄した。その有機抽出物を硫酸ナトリウムで脱水し、蒸発させた。黄色オイル０．５２０ｇを得た。収率９７．６５％。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.38 (s, 9H), 1.52-1.59 (m, 4H), 2.34 (brs, 2H, D2O exch.), 2.72-2.79 (m, 2H), 3.19-3.24 (m, 2H), 5.95 (brs, 1H, D2O exch.).
【００２７】
化合物２０の合成：上述の化合物１９（０．３５８ｇ、０．００１９０ｍｏｌ、１ｅｑ）をＥｔＯＨ（５ｍｌ）に可溶化させた。その溶液に、３Ａ分子篩とイソブチルアルデヒド（０．１３７ｇ、０．００１９０ｍｏｌ、０．１７ｍｌ、１ｅｑ）を加えた。その反応混合物をＲＴにて１８時間撹拌した。ＮａＢＨ４（０．１４４ｇ、０．００３８ｍｏｌ、２ｅｑ）を加え、その混合物をＲＴにて１６時間撹拌した。その生成物の構造をＴＬＣ  ＣＨ２Ｃｌ２  ９／ＭｅＯＨ  １／ＮＨ４ＯＨａｑ３３％  ０．１によって評価した。その溶媒を蒸発させ、油状残留物をＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍｌ）で溶出し、飽和ＮａＣｌ溶液（５ｍｌ）で洗浄した。その有機抽出物を硫酸ナトリウムで脱水し、蒸発させ、得られた残留物を、溶離相としてＣＨ２Ｃｌ２  ９／ＭｅＯＨ  １／ＮＨ４ＯＨａｑ３３％  ０．１の混合物を用いたフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。無色オイル０．２１５ｍｇを得た。収率４６．３３％。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.88 (d, 6H, J= 6.8 Hz), 1.41 (s, 9H), 1.49- 1.52 (m, 4H), 1.72- 1.75 (m, 1H), 2.38 (d, 2H, J= 7.2 Hz), 2.59 (t, 2H, J= 6.6 Hz), 3.07- 3.09 (m, 2H), 4.95 (brs, 1H, D2O exch.).
【００２８】
化合物２１の合成：アミノプロパノール（０．４９ｇ、０．５１ｍｌ、０．００６５２ｍｏｌ、１ｅｑ）をトルエン（５ｍｌ）に可溶化させた。その溶液に、氷浴中で、ＳＯＣｌ２（３．１０ｇ、１．９０ｍｌ、０．００２６１ｍｏｌ、４ｅｑ）を加えた。その反応混合物を還流下で２時間撹拌した。その生成物の構造をＴＬＣ  ＣＨ２Ｃｌ２  ９／ＭｅＯＨ  １／ＮＨ４ＯＨａｑ３３％  ０．１によって評価した。その溶媒を蒸発させ、油状残留物をＨ２Ｏ（１０ｍｌ）で溶出し、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍｌ）で洗浄した。更なる精製を行わずにその水相を次の工程に用い、Ｎｅｔ３（０．６５９ｍｇ、０．９ｍｌ、０．００６５２ｍｏｌ、１ｅｑ）をその溶液に加え、その混合物をＲＴにて３０分間撹拌した。ＴＨＦ（１０ｍｌ）中におけるＢｏｃ２Ｏ（１．４２ｇ、０．００６５２ｍｏｌ、１ｅｑ）の溶液を加えた。その反応混合物をＲＴにて１８時間撹拌した。開始生成物の消失をＴＬＣ  石油エーテル  ８／ＥｔＯＡｃ  ２によって評価した。その溶媒を蒸発させ、残留物をＥｔＯＡｃで溶出し、Ｈ２Ｏで洗浄した。その有機抽出物を硫酸ナトリウムで脱水して、蒸発させた。茶色オイル１．２３ｇを得た。収率９７．７０％。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.43 (s, 9H), 1.94- 1.97 (m, 2H), 3.26 (t, 2H, J= 6.4 Hz), 3.58 (t, 2H, J= 6.4), 4.75 (brs, 1H, D2O exch.).
【００２９】
化合物２２の合成：上述の化合物２０（０．１２０ｇ、０．０００４９ｍｏｌ、１ｅｑ）をＤＭＦ（３ｍｌ）に可溶化させた。その溶液に、上述の化合物２１（０．１０４ｇ、０．０００５４ｍｏｌ、１．１ｅｑ）をＤＭＦ（２ｍｌ）に可溶化させたものを加えた。その反応混合物を還流下で６時間撹拌した。その生成物の構造をＴＬＣ  ＣＨ２Ｃｌ２  ９／ＭｅＯＨ  １／ＮＨ４ＯＨａｑ３３％  ０．０３によって評価した。その溶媒を蒸発させ、油状残留物を、溶離相としてＣＨ２Ｃｌ２  ９／ＭｅＯＨ  １／ＮＨ４ＯＨａｑ３３％  ０．０３の混合物を用いたフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。黄色オイル０．０８４ｍｇを得た。収率４２．７１％。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 0.87 (d, 6H, J= 6.8 Hz), 1.43 (s, 18H), 1.57- 1.61 (m, 7H), 1.98- 2.01 (m, 2H), 2.31- 2.35 (m, 2H), 2.38- 2.42 (m, 2H), 3.10- 3.12 (m, 2H), 3.16- 3.18 (m, 2H), 4.72 (brs, 1H, exch D2O), 5.69 (brs, 1H, D2O exch.).
【００３０】
化合物４の合成：ＭｅＯＨ（２ｍｌ）で可溶化され、氷浴中で保たれた、前述の化合物２２（０．０８４ｇ、０．０００２１ｍｏｌ、１ｅｑ）にＨＣｌ  ３Ｎ（１０ｍｌ）を滴下した。その反応混合物を室温にて１８時間撹拌した。開始生成物の消失をＴＬＣ（ＣＨ２Ｃｌ２  ９／ＭｅＯＨ  １／ＮＨ４ＯＨａｑ  ０．０３）によって評価した。そのＭｅＯＨを蒸発させ、水性残留物をエチルエーテル（２×８ｍｌ）で洗浄し、乾燥させた。０．０６５ｇの化合物４を三塩酸塩として得た。収率１００％。1H NMR (400 MHz, D2O) δ 1.02 (d, 6H, J= 6.8 Hz), 1.76- 1.78 (m, 2H), 1.79- 1.84 (m, 2H), 2.14- 2.17 (m, 3H), 3.06- 3.25 (m, 6H), 3.26- 3.33 (m, 4H); 13C NMR (100 MHz, D2O) δ 19.27, 20.15, 21.26, 23.83, 28.92, 36.52, 38.77, 50.18, 52.66, 58.88, 60.59. MS (ESI+) m/z = 202 (M +H)+
【００３１】
添付図面のうち図７、８及び９は、それぞれ、化合物４、即ち先に定義された式（ＶＩ）の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び質量スペクトルを示す。
【実施例】
【００３２】
組成物の例
以下において、頭皮への局所的用途のための本発明に従う組成物の一部の例を、限定されない例によって記載する。以下に示す例において、Ｎ１−メチルスペルミジンは、化粧品での使用に必要される対応ＩＮＣＩ名、即ちＮ−メチルスペルミジンで言及される。これは、例として与えられる他の発明化合物にも適用する。
【００３３】
例１
脱毛を低下させるためのシャンプートリートメント
成分（ＩＮＣＩ名）・・・量  ％ｐ／ｐ
スルホコハク酸ラウレス二ナトリウム・・・１．００〜５．００
ラウレス硫酸マグネシウム・・・５．００〜９．００
ＰＥＧ−７グリセリルココエート・・・０．５０〜１．００
コカミドＭＩＰＡ・・・０．５０〜２．００
水添パーム油脂肪酸Ｐｅｇ−２００グリセリル・・・０．５０〜２．００
ポリクオタニウム−１０・・・０．１０〜０．５０
ラウロイルサルコシンナトリウム・・・１．００〜４．００
ＥＤＴＡ四ナトリウム・・・０．０５〜０．２０
Ｎ−メチルスペルミジン・・・０．００１〜０．３０
ビオチン・・・０．０１〜０．１０
パントテン酸カルシウム・・・０．０１〜３．０
ウンデシレノイルコムギタンパクカリウム・・・０．５０〜１．００
ラウレス−４・・・０．０１〜０．８０
パルファム・・・０．１０〜０．８０
ジステアリン酸グリコール・・・０．５０〜１．００
ラウレス−７・・・０．５０〜０．８０
ココアンホ酢酸ナトリウム・・・０．０５〜３．００
コカミドプロピルベタイン・・・０．０１〜２．００
ラウレス硫酸ナトリウム・・・０．０１〜３．００
ヒドロキシメチルグリシンナトリウム・・・０．２０〜０．４５
水酸化ナトリウム・・・ｑ．ｓ．
クエン酸・・・ｑ．ｓ．
水・・・ｑ．ｓ．１００．００
【００３４】
例２
脱毛を低下させるためのローショントリートメント
成分（ＩＮＣＩ名）・・・量  ％ｐ／ｖ
水・・・ｑ．ｓ．１００ｍｌ
ヒアルロン酸ヒドロキシプロピルトリモニウム・・・０．００５〜０．５０
ポリウレタン−２６・・・０．００４〜４．０
レシチン（グリシン・マックス・Ｌ．）・・・０．００５〜５．０
変性アルコール・・・１５．０〜２０．０
Ｎ−メチルスペルミジン・・・０．００５〜０．３０
ビオチン・・・０．０１〜０．１０
パントテン酸カルシウム・・・０．１〜３．０
ルチン・・・０．００１〜０．０５
ＰＥＧ−４０水添ヒマシ油・・・０．５〜２．０
ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシヒドロケイヒ酸オクタデシル・・・０．０５
パルファム・・・０．２０
ゼアキサンチン・・・０．００２〜０．０１
ヒマワリ種油・・・０．００１〜０．０１
乳酸・・・ｐＨ５．０のためにｑ．ｓ．
【００３５】
例３
脱毛の低下を助けるバルサムコンディショナー
成分（ＩＮＣＩ名）・・・量  ％ｐ／ｖ
水・・・ｑ．ｓ．１００ｍｌ
セテアリルアルコール・・・０．５０〜７．００
ＰＥＧ−４０水添ヒマシ油・・・０．５０〜２．００
ステアラルコニウムクロリド・・・０．１０〜２．００
Ｎ−メチルスペルミジン・・・０．０１０〜０．３０
ＥＤＴＡ二ナトリウム・・・０．０２５〜０．０５
パルファム・・・０．２０
ヒドロキシメチルグリシンナトリウム・・・０．２０〜０．４５
乳酸・・・ｐＨ５．０のためにｑ．ｓ．
【００３６】
例４
脱毛を低下させるためのバルサムトリートメント
成分（ＩＮＣＩ名）・・・量  ｐ／ｖ（％）
水・・・ｑ．ｓ．１００ｍｌ
ＥＤＴＡ二ナトリウム・・・０．０２５〜０．０５
キシリトール・・・０．５０〜１．５０
パンテノール・・・０．５０〜１．５０
ヒドロキシエチルセルロース・・・０．１０〜０．９０
セトリモニウムクロリド・・・０．５０〜５．００
（ビスイソブチルＰＥＧ／ＰＰＧ−２０／３５／アモジメチコーン）コポリマー・・・０．０５〜０．７５
エチルヘキサン酸セチル・・・０．０５〜１．００
ポリソルベート８０・・・０．０５〜４．００
ブチレングリコール・・・０．０５〜３．００
シクロペンタシロキサン・・・０．１０〜３．００
乳酸Ｃ１２〜１３アルキル・・・０．５０〜５．００
ステアリン酸グリセリル・・・１．００〜５．００
ステアリン酸ＰＥＧ−１００・・・０．５０〜４．００
ジメチコーン・・・１．００〜４．００
ジメチコノール・・・０．１０〜０．８０
セテアリルアルコール・・・１．００〜５．００
フェノキシエタノール・・・０．３０〜０．９０
カプリリルグリコール・・・０．３０〜０．９０
ゼアキサンチン・・・０．００００５〜０．０００３０
ルチン・・・０．０００５〜０．００３
Ｎ−メチルスペルミジン・・・０．０００１０〜０．１５
パルファム・・・０．１０〜０．３０
【００３７】
例５
インテンシブセラムヘアトリートメント
成分（ＩＮＣＩ名）・・・量  ％ｐ／ｖ
水・・・ｑ．ｓ．１００ｍｌ
変性アルコールＣタイプ・・・１０．００〜２０．００
パントテン酸カルシウム・・・０．５０〜２．００
Ｎ−メチルスペルミジン・・・０．０５〜０．２１０
オクタトリエン酸カリウム・・・０．００１〜０．１８
ビオチン・・・０．００５〜０．０２０
アジュガ・レプタンス葉抽出物・・・０．００１〜０．１０
ラクトバシラス大豆発酵物・・・０．０１〜０．１５
パンテノール・・・０．１０〜１．００
ヒアルロン酸ヒドロキシプロピルトリモニウム・・・０．００２〜０．５０
ポリウレタン−２６・・・０．００４〜４．０
レシチン（グリシン・マックス・Ｌ．）・・・０．００５〜５．０
ＰＥＧ−４０水添ヒマシ油・・・０．５０〜２．００
パルファム・・・０．１０〜０．３０
ヒドロキシプロピルグアー・・・０．１０〜０．４０
エトキシジグリコール・・・０．１０〜０．７０
乳酸・・・０．０５〜０．５０
【００３８】
例６
インテンシブセラムアンチロストリートメント
成分（ＩＮＣＩ名）・・・量  ％ｐ／ｖ
水・・・ｑ．ｓ．１００ｍｌ
グリセリン・・・ｄｉ１．００〜８．００
（アクリロイルジメチルタウリンアンモニウム／ｖｐ）コポリマー・・・０．５０〜５．００
シクロペンタシロキサン・・・１．００〜８．００
フェノキシエタノール・・・０．３０〜０．９０
パルファム・・・０．１０〜０．７０
シリコーンクオタニウム−１５・・・０．２０〜１．９０
ジメチコーン・・・０．１０〜６．００
グリチルリチン酸アンモニウム・・・０．０５〜０．７５
Ｃ１１〜１５パレス−５・・・０．０５〜１．００
Ｃ１１〜１５パレス−９・・・０．０５〜１．００
ＥＤＴＡ二ナトリウム・・・０．０２５〜０．０５
Ｎ−メチルスペルミジン・・・０．０２５〜０．２１０
パントテン酸カルシウム・・・０．０１０〜０．５０
エチルパラベン・・・０．０１０〜０．０３０
メチルパラベン・・・０．０５〜０．１２０
トリデセス−５・・・０．０１０〜０．４０
トリデセス−１０・・・０．０１０〜０．４０
乳酸・・・ｐＨ４．５のためのｑ．ｓ．
【００３９】
例７
脱毛を低下させるためのシャンプートリートメント
成分（ＩＮＣＩ名）・・・量  ％ｐ／ｐ
スルホコハク酸ラウレス二ナトリウム・・・１．００〜５．００
ラウレス硫酸マグネシウム・・・５．００〜９．００
ＰＥＧ−７グリセリルココエート・・・０．５０〜１．００
コカミドＭＩＰＡ・・・０．５０〜２．００
水添パーム油脂肪酸Ｐｅｇ−２００グリセリル・・・０．５０〜２．００
ポリクオタニウム−１０・・・０．１０〜０．５０
ラウロイルサルコシンナトリウム・・・１．００〜４．００
ＥＤＴＡ四ナトリウム・・・０．０５〜０．２０
Ｎ−メチルスペルミジントリマレエート・・・０．００２〜０．６０
ビオチン・・・０．０１〜０．１０
パントテン酸カルシウム・・・０．０１〜３．０
ウンデシレノイルコムギタンパクカリウム・・・０．５０〜１．００
ラウレス−４・・・０．０１〜０．８０
ジステアリン酸グリコール・・・０．５０〜１．００
ヒドロキシメチルグリシンナトリウム・・・０．２０〜０．４５
水・・・ｑ．ｓ．１００．００
【００４０】
例８
脱毛を低下させるためのローショントリートメント
成分（ＩＮＣＩ名）・・・量  ％ｐ／ｖ
水・・・７０〜９０
エチルアルコール・・・１０〜２０
ポリオキシエチレン化水添ヒマシ油・・・０．５〜２．５
乳酸溶液８０％・・・０．２〜０．４
Ｎ−メチルスペルミジントリマレエート・・・０．０５〜０．３
パルファムアグリューム２８０７／０３・・・０．０５〜０．３
ヒアルロン酸ヒドロキシプロピルトリモニウム・・・０．０１〜０．１
レシチンＮＡＴ８５３９・・・０．０１〜０．１
ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシヒドロケイヒ酸オクタデシル・・・０．０１〜０．１
フルオロリンク５０３２・・・０．０１〜０．１
【００４１】
例９
強化スタイリングジェル
成分（ＩＮＣＩ名）・・・量  ％ｐ／ｖ
水・・・８５〜９５
Ｆｉｘａｔｅ  ＰＬＵＳ  ポリマー・・・１．５〜３．５
ＰＥＧ−４０水添ヒマシ油・・・１〜３
パルファム・・・０．５〜２
ソルビトール・・・０．５〜２
ヒドロキシメチルグリシンナトリウム・・・０．５〜２
ヒドロキシプロピルグアー・・・０．２〜１．２
ベンゾフェノン−４・・・０．０５〜１
Ｇａｆｑｕａｔ  ７５５Ｎ・・・０．０５〜１
ＥＤＴＡ二ナトリウム二水和物・・・０．０５〜１
タウリン・・・０．０２５〜０．１
Ｄ−パントテン酸カルシウム・・・０．０１〜０．０５
ルチン・・・０．００５〜０．０２
ゼアキサンチン・・・０．００５〜０．０２
アジュガ・レプタンス乾燥抽出物・・・０．００５〜０．０２
Ｎ−メチルスペルミジントリマレエート・・・０．００１５〜０．００６
ビオチン・・・０．０００１〜０．０００４
【００４２】
例１０
脱毛を低下させるためのローショントリートメント
成分（ＩＮＣＩ名）・・・量  ％ｐ／ｖ
変性アルコール・・・１５．０〜２０．０
Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−イソブチル−１，４−ブタンジアミン・・・０．００５〜０．３０
ビオチン・・・０．０１〜０．１０
パントテン酸カルシウム・・・０．１〜３．０
ルチン・・・０．００１〜０．０５
ＰＥＧ−４０水添ヒマシ油・・・０．５〜２．０
ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシヒドロケイヒ酸オクタデシル・・・０．０５
ゼアキサンチン・・・０．００２〜０．０１
乳酸・・・ｐＨ５．０のためのｑ．ｓ．
水・・・ｑ．ｓ．１００ｍｌ
【００４３】
例１１
インテンシブセラムヘアトリートメント
成分（ＩＮＣＩ名）・・・量  ％ｐ／ｖ
変性アルコールＣタイプ・・・１０〜２０
Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−エチル−１，４−ブタンジアミン・・・０．０５〜０．２．０
ヒアルロン酸ヒドロキシプロピルトリモニウム・・・０．００２〜０．５
ポリウレタン−２６・・・０．００４〜４．０
レシチン（グリシン・マックス・Ｌ．）・・・０．００５〜５．０
ＰＥＧ−４０水添ヒマシ油・・・０．５０〜２．０
ヒドロキシプロピルグアー・・・０．１０〜０．４
エトキシジグリコール・・・０．１０〜０．７
乳酸・・・０．０５〜０．５
水・・・ｑ．ｓ．１００ｍｌ
【００４４】
実験セクション及び添付のグラフ
本発明に従う式（ＩＩ）の化合物であるＮ１−メチルスペルミジン、又はＮ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−メチル−１，４−ブタンジアミンの、遊離塩基又は三塩酸塩（３ＨＣｌ）若しくはトリマレエートである塩としての、活性に関して、以下に示すテストを、コントロールとしてのスペルミジン（３ＨＣｌ）との比較によって、行った。
【００４５】
図１及び２には、三塩酸塩（３ＨＣｌ）の形態での、Ｎ１−シクロヘキシルスペルミジン、Ｎ１−エチルスペルミジン、Ｎ１−プロピルスペルミジン及びＮ１−イソブチルスペルミジン、つまり本発明に従う式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖ）、（ＶＩ）の化合物に対しても関連テストを拡大した。
【００４６】
これに関して、以下に示す図面に従う図面を本明細書に添付する。
図１及び２は、ＭＴＴアッセイテストの結果のグラフである。
図３は、抗酸化テストの結果のグラフである。
図４は、毛の伸長テストの結果のグラフである。
図５及び６は、図４のテストにおける成長期及び退行期の結果のグラフである。
最後に、上述したように、図７、８及び９は、それぞれ、化合物４、即ち先に定義された式（ＶＩ）の１Ｈ−ＮＭＲ、１３Ｃ−ＮＭＲ及び質量スペクトルを示す。
【００４７】
式（Ｉ）の化合物の溶液を周囲空気にさらした後の式（Ｉ）の化合物の安定性及び反応性についても研究した。
【００４８】
１．ＭＴＴアッセイ
導入部
ＭＴＴアッセイは、細胞バイアビリティーを分析するのに使用されるテストである（Ｍｏｓｍａｎｎ、１９８３）。それは、テトラゾリウム塩ＭＴＴの使用に基づいた比色テストであり、細胞バイアビリティーを測定し、次いでマイクロプレート分光光度リーダーによって数量化できる。ＭＴＴ（３−(４，５−ジメチルチアゾール−２−イル)−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド、テトラゾール）は、黄色化合物であり、細胞ミトコンドリア内で紫色の物質であるホルマザンに還元される。この着色溶液の吸光度は、分光光度計を用いて所定の波長（５７０ｎｍ）でそれを測定することによって数量化できる。最大吸光度は、使用される溶媒によって決まる。この還元は、ミトコンドリアのレダクターゼ酵素が活性である場合のみにおいて起こり、それ故に、ホルマザンへの転化は、生存細胞の数に直接関係のある可能性がある。ある物質で処理された細胞によって生成されるホルマザンの量を未処理コントロール細胞によって生成される量と比較すると、用量反応曲線の作成によって細胞死を引き起こす上でのテスト物質の有効性を推定することが可能である。ＰＢＳ又は細胞培養液に可溶化したＭＴＴの溶液は、フェノールレッドがない場合、黄色っぽい色である。生存細胞では、ミトコンドリアの脱水素酵素がテトラゾリウム環を切断し、水溶液に溶けない紫色のホルマザンの結晶を生成する。その結晶は、酸性化イソプロパノール又はＤＭＳＯに溶解できる。結果として生じる紫色の溶液を分光光度法によって分析する。細胞の数の増加は、得られるホルマザンの増加と、吸光度の増加をもたらす。ＭＴＴテストの使用には制限があり、１）細胞の生理学的状態及び２）異なる細胞種におけるミトコンドリア脱水素酵素の活性の変化によって影響を受ける。これにもかかわらず、細胞決定のためのＭＴＴアッセイは、マイトジェン、抗原性刺激、成長因子及び細胞成長を促進する他の試薬、細胞毒性の研究に応じて細胞の成長を測定する上で、また、細胞成長曲線を作成する上で、有効である。
【００４９】
細胞決定のためのＭＴＴアッセイは、培養物がマルチウェルプレートで用意される場合に特に有効である。より良い結果のため、指数増殖期の間に細胞の数を決定すべきである。
【００５０】
材料
生物学的モデル
ＮＣＴＣ２５４４ヒトケラチノサイト細胞株（Ｐｅｒｒｙ  Ｖ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，１９５７）を、イタリアジェノアの国立がん研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から得た。
【００５１】
【表１】
2015522647.tif 000004
【００５２】
培養パラメータ
１０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％ＮＥＡＡ  １Ｘ溶液及び１％ペニシリン（１０，０００Ｕ／ｍｌ）／ストレプトマイシン（１０，０００μｇ／ｍｌ）混合物を加えたＥＭＥＭ培地（ＥＢＳＳ）中で、上記細胞株を成長させ、２５ｃｍ２培養フラスコ中で３７℃、５％ＣＯ２にて保った。２日毎に、コンフルエント培養物を１：３〜１：６に分け、ＰＢＳ  １Ｘ（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋なし）で洗浄後、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて、２〜５＊１０４細胞／ｃｍ２、３７℃、５％ＣＯ２にて播種した。
凍結用培地：２０％ＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン混合物及び１０％ＤＭＳＯを加えた培養液。
細胞数量化：トリパンブルーアッセイ
【００５３】
試薬及び機器
【表２】
2015522647.tif 000005
【表３】
2015522647.tif 000006
【００５４】
方法
１日目：細胞の播種
ＮＣＴＣ２５４４ヒトケラチノサイト細胞が約８０％のコンフルエンスに達したとき、それらを引き離し、トリプシン／ＥＤＴＡで集め、９６ウェルプレートに５×１０４細胞／ｍｌの密度で播種し、次いで３７℃、５％ＣＯ２にてインキュベートした（２４ｈ）。
【００５５】
２〜３日目：試薬の曝露  ２４〜４８ｈ
上記細胞が約８０％のコンフルエンスに達したとき、それらを、本発明に従う上述した活性化合物（遊離塩基並びに三塩酸塩（３ＨＣｌ）及びトリマレエート塩としてＮ１−メチルスペルミジン；三塩酸塩（３ＨＣｌ）としてＮ１−シクロヘキシルスペルミジン、Ｎ１−エチルスペルミジン、Ｎ１−プロピルスペルミジン、Ｎ１−イソブチルスペルミジン）と比較対照としてスペルミジン三塩酸塩の増大濃度にさらした。各化合物を２回テストした。化合物のすべては以下に示す濃度でテストした：１ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、５００μＭ（培養液中での最終濃度）。ＳＤＳを内部標準として用いた。
各化合物の所望の希釈物を調製した後、培養液をプレートから取り除き、そのウェルに各濃度の１００μｌが播かれた。培養液のみを含有するコントロールを各プレートに含めた。
３７℃、５％ＣＯ２にて異なる処理時間（２４〜４８ｈ）で細胞をインキュベートした。
【００５６】
４日目：ＭＴＴアッセイ
９６ウェルプレートにおいて興味のある化合物による処理が終わって（２４〜４８ｈ）、その培地を取り除き、１００μｌ／ウェルのＭＴＴ溶液で置換し、そのプレートを３７℃、５％ＣＯ２にて３ｈインキュベートした。ＭＴＴ塩をＰＢＳ（５ｍｇ／ｍｌ）に溶解し、フェノールレッドがなく、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１％ＮＥＡＡ  １００Ｘ溶液（液体）及び１％抗菌性混合物が補充されたＥＭＥＭ培地において、１：１０の希釈液で細胞に加えた。
そのプレートをアルミホイルで覆った。その後、その培地を慎重に取り除いた。紫色のホルマザン生成物を溶解するため、各ウェルに１００μｌのＤＭＳＯを加えた。そのプレートをアルミホイルで覆い、室温にて１５ｍｉｎ撹拌した。
所定の手順により、プレートの配置を正しく規定した後、Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬＸ８０８マイクロプレートリーダーの６３０ｎｍ参照フィルターを用いて、その溶液の吸光度を５７０ｎｍにて読んだ。
【００５７】
データ収集及び統計分析
Ｂｉｏｔｅｋ  ＥＬＸ８０８マイクロプレートリーダーのソフトウェアから光学濃度データを直接記録した。そのソフトウェアは、どんな変換も自動で行う。
・変換１：Ｄｅｌｔａ  ＯＤ  ５７０〜６３０ｎｍの計算（自動ホワイトサブトラクション後に行う）
・変換２：％活力の計算（コントロールに対して）
その後、得られたデータをエクセルにエクスポートし、統計的にグラフを使って分析し、化合物がテストできた非細胞毒性濃度を決定した。
【００５８】
使用した試薬及び機器
【表４】
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【表５】
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【００５９】
結果
図１及び２は、それぞれ２４時間（図１）及び４８時間（図２）でのグラフに得られた結果を要約する。濃度が等しい各グループについてここに与えられる８本の柱は、ここに特定されるように、それぞれ、左から右に、スペルミジン、Ｎ１−メチルスペルミジン、Ｎ１−シクロヘキシルスペルミジン、Ｎ１−エチルスペルミジン、Ｎ１−プロピルスペルミジン、Ｎ１−イソブチルスペルミジン（全てが三塩酸塩（３ＨＣｌ）の形態である）；Ｎ１−メチルスペルミジントリマレエート塩；Ｎ１−メチルスペルミジン遊離塩基に帰するものである。
【００６０】
細胞バイアビリティーは、コントロール（即ち、スペルミジン又は本発明に従う化合物を加えない標準条件下で細胞集団を成長させる）に対するパーセントで表される。テストされた濃度で（１ｎＭ、５００ｎＭ、１ｍＭ、５００ｍＭ）、スペルミジンは、ヒトケラチノサイト（ＮＣＴＣ２５４４）細胞株の曝露の２４又は４８時間後に細胞毒性の効果がない。同様に、本発明に従う化合物（スペルミジンと同一濃度）による２４又は４８時間の処理後の細胞バイアビリティーも実質的に低下し、一部のケースでは向上さえも起き、その化合物に細胞毒性がないことが実証される。本発明に従う化合物について得られた結果は、スペルミジンについて得られた結果と統計的に異なるものではない。
【００６１】
概して、ＭＴＴアッセイは本発明に従う化合物についての細胞毒性を示さないという結論を出すことができる。
【００６２】
２．抗酸化テスト−反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成
Ｔｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ．（Tobi SE, Paul N, T McMillan J. J Photochem. Photobiol, B 2000: 57: 102-112）によって記載されるように、２’，７’−ジクロロフルオロセインジアセタート（ＤＣＦＨ−ＤＡ）を用いた蛍光分光分析によって、反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成を監視した。
【００６３】
上述のＮＣＴＣ２５４４細胞（約８０％コンフルエンス）をトリプシン／ＥＤＴＡで引き離し、９６ウェルプレートにウェル当たり５×１０４細胞の密度で播種した。その後、細胞を本発明に従うＮ−メチルスペルミジンとスペルミジンとで処理した。以下に示す濃度のＮ−メチルスペルミジンとスペルミジンをテストした：１ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、５００μＭ、１ｍＭ（培養液中での最終濃度）。
【００６４】
α−トコフェロール（２５０μｇ／ｍｌ）を比較として用いた。そのプレートを３７℃にて５％ＣＯ２中で１．５ｈインキュベートした。１０％ＦＢＳを含む基礎培地上で成長した細胞をコントロールとして用いた。
【００６５】
図３のグラフは、得られた結果を要約する。反応性酸素種（ＲＯＳ）の細胞内濃度の決定から得られた結果は、上記文献に報告されるようにスペルミジンの抗酸化活性を確認した。Ｈ２Ｏ２で処理したコントロール細胞と比べて、２５０μｇ／ｍｌのα−トコフェロール、スペルミジン及びＮ−メチルスペルミジンで処理した細胞は、ＲＯＳ生成物の濃度の低下を示す。スペルミジンの抗酸化活性をＮ−メチルスペルミジンと比べると、有意差は示されなかった。
【００６６】
３．毛幹伸長テスト
毛幹の伸びに対する効果を測定することが可能である生体外モデルでＮ−メチルスペルミジンの活性をテストした。
【００６７】
材料及び方法
成長ＶＩ期の毛包（ＨＦ）の器官培養は、リューベック大学の倫理委員会の承認を得て、ヘルシンキ宣言に従い、外科処置（顔のしわ取り）を受けていた対象から同意を得た後にヒトの頭皮の皮膚（側頭・前頭部）からのＨＦの顕微解剖を含んだ。このモデルにおいて、ＨＦの成長期（ａｎａｇｅｎ）は、数日継続して、インビボでの成長期と類似の速度で着色した幹を生成し、加えて、循環的成長活性をインビトロで示し、自然発生的にそのサイクル毛の退行期（ｃａｔａｇｅｎ）に入った。
免疫組織化学的研究では、単離した毛包を連続して６日間培養した。
培養液の変更毎に（４８時間毎に）スペルミジン、Ｎ−メチルスペルミジン及びビヒクル（蒸留水）を０．５μＭの濃度で一度投与した。
凍結した切片を使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【００６８】
毛の成長測定
一方の接眼レンズにはレチクルが含まれるＺｅｉｓｓ倒立両眼顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ、オーバーコッヘン、ドイツ）を用いて、ビヒクル、スペルミジン及びＮ−メチルスペルミジンによる処理後の毛幹伸びの測定を０、１、４及び６日目に行った。
【００６９】
結果
毛幹伸びの結果が図４のグラフに示されており、ここには６日目の結果を示す。スペルミジンと本発明に従うＮ−メチルスペルミジンの両方が、ビヒクルに対して、毛幹の伸びを顕著に向上させる。スペルミジンとＮ−メチルスペルミジンの間に観察された違いは統計的には有意なものではなく、それ故に、この２つのケースにおいては比較下で伸びの効果が同程度であると見なしてもよい。
【００７０】
４．成長期及び退行期の結果
図５及び６のグラフに要約された、以下に示す成長期及び退行期の結果についても、先の毛幹伸長テストについて説明されたものと同一の毛包（ＨＦ）細胞外モデルから得た。
【００７１】
図５のグラフは、成長サイクルの異なる段階においてＮ−メチルスペルミジンで処理された毛包のパーセンテージを示す。
【００７２】
これから、処理の６日後に、Ｎ−メチルスペルミジンが、成長期における毛包パーセンテージの著しい増加と退行期における減少をもたらすことが分かる。Ｎ−メチルスペルミジンの存在においては、毛包の３０％（およそ）だけが自然発生的に退行期に入り、一方、ビヒクルの存在においては、６０％を超える毛包が退行期に入る。
【００７３】
図６のグラフは、スペルミジン（０．５μＭ）及びＮ−メチルスペルミジン（０．５μＭ）について得られた毛包の段階の制御についての対応するパーセンテージ値を示す。
【００７４】
２つの化合物間での比較は、驚いたことに、Ｎ−メチルスペルミジンの場合における成長期の延長効果がスペルミジンの場合よりも大きいことを示す。それ故に、退行期（初期、中期、終期の段階に分けた）に入る毛の数は、Ｎ−メチルスペルミジンによる処理後の方がスペルミジンの場合よりもかなり小さかった。
【００７５】
５．反応性の結果
空気にさらした後の１，４−ブタンジアミン，Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−メチル（ＩＩ）及び１，４−ブタンジアミン，Ｎ−(３−アミノプロピル)−Ｎ１−シクロヘキシル（ＩＩＩ）の特性を、対応する非置換誘導体（ここで、Ｒ置換基のないＮ１アミノ基は第二級アミン基になっており、即ち１，４−ブタンジアミン，Ｎ−(３−アミノプロピル)である）との比較により、研究した。第二級アミノ基の酸化の共通生成物の一つが、空気中に存在する酸化窒素との反応により形成されるＮ−ニトロソ誘導体の形態を取るため、テスト化合物の溶液を周囲空気と接触させたままにして形成されたニトロソ化誘導体を反応性パラメータとして決定した。
【００７６】
材料及び方法
使用した測定手段は、亜硝酸イオンの分析とＮ−ニトロソアミンの分析の両方を行う台からなり、後者は強い脱ニトロソ化条件化で行われた。亜硝酸イオンの量に従って発現する酸化窒素とニトロソ基の量に従って発現するものとを化学発光検出器によって評価した。
酢酸／ヨウ化カリウムの還元性混合物（５ｍｌ／１ｍｌの５％Ｈ２Ｏ２溶液）を用いて、ＮＯ２−イオンの含有量を温度０〜４℃にて分析した。酢酸／臭化水素酸の脱ニトロソ化混合物（５ｍｌ／１ｍｌ）を用いて、ニトロソ基を温度７０℃にて分析した。
上記試薬は、例えばシグマ・アルドリッチから一般に入手できる。高純度ガス（Ｈｅ２及びＮＯ）を用いた。
化合物の空気酸化の決定方法は以下の通りであった。
ａ）不活性プラスチック材料（ポリスチレン）の６ウェルプレートの適当なウェルに、精製水中におけるテスト物質の２ｍＭ溶液を５００μｌに等しい量で二重に播種した；
ｂ）汚染物質が存在しない精製水とエタノールの混合物（８５／１５）５００μｌで各ウェルの溶液を希釈した。これは、ウェル表面での液体フィルムの分散を促進させる；
ｃ）この方法で調製されたプレートを周囲空気に７２ｈさらす；
ｄ）曝露時間が終わって、ウェル中の残留物を精製水１ｍｌで溶出し、次いで化学蛍光分析に用いた。
【００７７】
結果
【表６】
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【００７８】
６．結論
細胞毒性の欠如、ＲＯＳに対する抗酸化活性及び毛幹の伸びの観点から、上述の実験は、本発明に従う化合物が、スペルミジンから得られるものと実質的に違いのない結果を提供することを実証する。
【００７９】
また、驚いたことに、Ｎ−メチルスペルミジンは、毛の成長期を延長する上で、スペルミジンよりも高い活性があるように見える。
【００８０】
毛幹の伸びを刺激することと成長期を延長することは両方とも毛の生理的成長に寄与するが、臨床的な観点から見て、成長期の延長の結果は、毛幹を伸ばす作用に関してより重要で且つ関連があると考えられる可能性がある。なぜなら、長期化した成長期は、本発明の主要な目的である、脱毛の低下に関して直接的なプラスの影響を与えるからである。
【００８１】
成長期を延長する活性と退行期の相対的な阻害は、Ｎ−メチルスペルミジンについて先に示されたように、例えばアンドロゲン、毛包周囲炎症、鉄分不足及びエストロゲンに由来する成長期の非生理的な低下又は副作用として非生理的な剥離を引き起こす薬の投与による過度の剥離を特徴とした、脱毛、即ち脱毛症の多くの異なる形態に対抗する上で有効である。
【００８２】
従って、上述の記載から、総じて、一般式（Ｉ）の化合物は本発明の目的に従って活性があり、また、十分に安定であり、酸化の結果としてもはや活性のない異なる物質に変換される可能性がなく、頭皮への局所用途のための効果的な適用を可能にすることが分かる。
【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１】
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【図２】
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【図５】
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【国際調査報告】
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