(57)【要約】デフィブロチドの生物学的活性を決定する為の方法が開示され、該方法は、a)  デフィブロチド、哺乳類のユーグロブリン及び、プラスミンに特異的な基質を接触させる工程、ここで該基質は、プラスミンとの反応により測定可能な産物を与えるものである、；及びb)  形成された産物の量を逐次の時点で測定し、それにより該デフィブロチドの生物学的活性を決定する工程を含む。また、液状デフィブロチド組成物、好ましくは水溶液、も開示され、該組成物は、規定された生物学的活性を有し、特には25〜35IU/mg、好ましくは27.5〜32.5IU/mg、より好ましくは28〜32IU/mgのデフィブロチドの活性を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
デフィブロチドの生物学的活性の決定方法であって、
a)  デフィブロチド、哺乳類のユーグロブリン及び、プラスミンに特異的な基質を接触させる工程、ここで該基質は、プラスミンとの反応により測定可能な産物を与えるものである、；及び
b)  形成された産物の量を逐次の時点で測定し、それにより該デフィブロチドの生物学的活性を決定する工程
を含む前記方法。
【請求項２】
該ユーグロブリンが、哺乳類のユーグロブリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ユーグロブリンが、ヒト、ウサギ、又はウシのユーグロブリンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該プラスミンに特異的な該基質と反応する該プラスミンが、ユーグロブリン中に含まれるプラスミノーゲンによって放出されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該プラスミンに特異的な該基質が、発色性基質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該プラスミンに特異的な該基質が、式A1-A2-A3-Xの化合物であり、ここでA1及びA2が非極性アミノ酸であり、A3がリジン又はアルギニンであり、且つ、Xが該測定可能な産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該測定可能な産物Xが、パラ−ニトロアニリン及び２−ナフチルアミンからなる群から選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該プラスミンに特異的な該基質が、H-D-バリル-L-ロイシル-L-リジン-p-ニトロアニリンである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
該測定可能な産物Xが、スペクトロフォトメトリー又はスペクトロフルオリメトリーにより測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
該哺乳類のユーグロブリンが、由来する血漿と同じ体積に再構成され又は適切なバッファーにより最大で１：１０で希釈され、且つ、発色性／発蛍光性基質が、2.5〜3.5mM、好ましくは3mMの濃度を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
該方法が、7〜8のpH、好ましくは7.4のpHに緩衝された水性溶液である反応媒体中で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
温度が、35〜39℃、好ましくは37℃で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該プラスミンに特異的な該基質の濃度が、0.3〜4mM、好ましくは2.5〜3.5mM、より好ましくは3mMである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
c) 基準試料及び試験試料の両方の酵素反応の経過の間の該測定可能な産物の放出速度を決定する工程； d) 該放出速度を、対応するデフィブロチド濃度と数学的に及び／又はグラフ的に関係付けて、デフィブロチドの該試験試料の生物学的活性を得る工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
デフィブロチドの25〜35IU/mg、好ましくは27.5〜32.5IU/mg、より好ましくは28〜32IU/mgの生物学的活性を有する、デフィブロチド液状組成物。.
【請求項１６】
水溶液であることにより特徴付けられる、請求項１５に記載のデフィブロチド液状組成物。
【請求項１７】
緩衝されている、好ましくは6.5〜8.5、好ましくは7〜8のpHで緩衝されていることにより特徴付けられる、請求項１６に記載のデフィブロチド液状組成物。
【請求項１８】
VODの処置及び予防における使用の為の、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のデフィブロチド液状組成物。
【請求項１９】
デフィブロチド液状組成物を含み且つ5000〜7000IU、好ましくは5500〜6500IU、より好ましくは5600〜6400IUの生物学的活性を有する容器。
【請求項２０】
該デフィブロチド液状組成物が水溶液である、請求項１９に記載の容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、デフィブロチドの生物学的活性を決定する為の方法、より特にはデフィブロチドの生物学的活性を決定するための間接的な酵素的方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
デフィブロチド(Merck  Index,  1996,  no.  2915)は、動物の器官からの抽出により得られ且つ低分子量を有するポリデオキシリボヌクレオチドのナトリウム塩により構成される天然由来物質である。デフィブロチドは、多数の薬理学的調査の対象となっており、当該調査は、それが治療において抗血栓剤として適用されることを提案している(米国特許第3,829,567号明細書)。
【０００３】
加えて、デフィブロチドはまた、末梢動脈症の処置において、急性腎不全の処置において（米国特許第4,694,134号明細書）、又は急性心筋虚血の処置において(米国特許第4,693,995号明細書)において成功裏に用いられている。
【０００４】
デフィブロチドは、静脈閉塞疾患（VOD）の処置及び予防の為に用いられる為の臨床試験を現在受けている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
抽出により得られる他の生物学的物質のように、デフィブロチドもまた、天然バイオポリマーに典型的な、組成物の限定された変動を受ける。この状況の典型的な例が、ヘパリンにより提供され、鎖長、分子量、組成、サルフェート化の程度の点でのバッチ毎のヘパリンの変動がよく知られている。この結果は、デフィブロチドの同じ重量が、特定の生物学的活性の観点から、実際には非等価でありうることである。
【０００６】
抽出、分離、及び精製のプロセスそれ自体は、正確にはその固有のバイオポリマー的性質の故に、産物の完全な再現性を確保し得ない。
【０００７】
しかしながら、もしよく制御されるならば、この変動を減少することが可能である：その為に、器官からの抽出によるデフィブロチドの分離の為の標準化された産業的方法の研究、例えば米国特許第4,985,552号明細書に記載されたもの、がなされてきた。
【０００８】
上記言及された方法に従い得られた産物は、いくつかの特定の物理化学的パラメーター、例えば電気泳動移動性、消失係数、旋光性、及び質量平均相対分子質量など、の決定により特徴付けられる。しかしながら、それらのパラメーターは基本的には、デフィブロチドの構造に依存し、及び、その生物学的活性についての情報を提供することはできない。
【０００９】
我々が知る限り、デフィブロチドの生物学的活性を評価する為にこれまで用いられることが報告されている方法は、フィブリンプレート試験及びユーグロブリン溶解時間のトロンボエラストグラフィー的記録[Prino  G.,  Mantovani  M.,  Niada  R.,  Coccheri  S.,  Butti  A.,  Indagini  preliminary  sull'attivita  fibrinolitica,  nell'animale  e  nell'uomo,  di  una  nuova  sostanza  presente  in  diversi  organi  animali,  Simposio  Internazionale:  La  ricerca  scientifica  nell'industria  farmaceutica  in  Italia,  Rome,  2-4  Oct.  1975-Il  Farmaco,  Ed.  Prat.)  (1969),  24,552-561]及び米国特許第7,338,777号明細書に開示されたプラスミンに基づく方法のみである（これらは、引用することにより本明細書内に組み込まれる）。しかしながら、ユーグロブリン溶解時間のトロンボエラストグラフィー的記録の上記言及された方法は、かなりの実験複雑性により、不満足な再現性及び正確性により、及び、特定のトロンボエラストグラフィー的記録の場合において、非常に制限された濃度範囲に限定された応答線形性により特徴付けられる。
【００１０】
プラスミンに基づく方法に関して、プラスミンの酵素活性は、種々の標準的インビトロ試験により通常は決定される。最も一般に用いられる方法の一つが、適切な基質に対するプラスミンの作用により遊離された発色性又は発蛍光性化合物のスペクトロフォトメトリー又はフルオリメトリーによる決定である[Haemostasis,  (1978),  7,  138-145]。式A1-A2-A3-Xを有するペプチド基質が一般に用いられ、これにおいてA1及びA2は主に非極性であるアミノ酸であり、A3はリジン又はアルギニンであり、且つXは測定可能な遊離される化合物、例えばパラ-ニトロアニリン(pNa)又は2-ナフチルアミン(NA)を表す[Haemostasis,  (1978),  7,  146-149]。上記言及されたペプチド基質に加えて、他のより簡単な化合物、例えばp-ニトロベンジル-p-トルエンスルホニル-L-アルギニンを用いて成功が達成されている[Haemostasis,  (1978),  7,  105-108]。
【００１１】
該化合物Xがインキュベーション媒体中に放出される速度は、試料中に存在するプラスミンの活性(Units/mg)に比例的である。米国特許第7,338,777号明細書に開示された方法はすなわち、上記されたプラスミン評価試験において、デフィブロチドが、化合物Xの放出速度をその濃度に比例的に増加するという発見に基づく。
【００１２】
しかしながら、そのような方法は、その他の血漿／血清アクチベーター／インヒビターを有さないTRISにおいて行なわれる。それ故に、該方法は、生理学的な条件を反映せず、インビボでのデフィブロチドの作用のメカニズムも正確に模倣しない。
【００１３】
それ故に、これまで、（インビボでの）複雑な生物学的システムにおける産物の作用メカニズムを正確な様式で反映する、デフィブロチロの生物学的活性を決定する為の真に有効であり、正確であり、且つ再現性ある方法は記載も確認もされていない。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
我々は、デフィブロチドの生物学的活性を決定する為の簡単且つ信頼性ある方法を開発した。該方法は、抽出により得られた試料が制御されることを可能にし、及び、それ故に、デフィブロチドに基づく医薬的調製物が標準化されることを可能にする。
【発明の効果】
【００１５】
本発明が関する方法は、デフィブロチドの特定の生物学的活性が、参照基準との比較において、高度の精度及び正確さで決定されることを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】デフィブロチド(濃度0〜50 μg/ml、0〜100分)により活性化された及び活性化されていない哺乳類ユーグロブリン画分による、基質S-2251からのpNAの放出の速度論を示す図である。
【図２】デフィブロチドの基準及び試験試料に関して表れるシグモイドを示す図である。
【図３】基準調製物の「吸収対時間」（例：S1_Ca, S1_Cb, S1_Cc）が、適切な線形範囲（例：30〜35分）を同定することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
それ故に、本発明は、デフィブロチドの試料の特定の生物学的活性を決定する為の方法に関し、該方法は、
a) デフィブロチド、ユーグロブリン及び、プラスミンに特異的な基質を接触させる工程、ここで該基質は、プラスミンとの反応により測定可能産物を与えるものである、及び、
b) 形成された該産物の量を逐次の時点で測定する工程、
を含む。
【００１８】
本発明の方法は、デフィブロチドの活性を決定する為の間接的なインビトロ方法に向けられており、これは、デフィブロチドとユーグロブリンとの間の機能的相互作用に基づく。
【００１９】
ユーグロブリンは、蒸留水中で不溶性であるが食塩水溶液中で可溶性である血清グロブリンの画分である。
【００２０】
ユーグロブリンは、フィブリノーゲン、ＰＡＩ−１、組織プラスミノーゲンアクチベーター(tPA)、プラスミノーゲン、及び、より少ない程度でα2-アンチプラスミン及び第VIII因子も含む。
【００２１】
本発明者らは、驚くべきことに、デフィブロチドが、プラスミノーゲンのプラスミンへの加水分解を触媒することを発見した。その結果、デフィブロチドがユーグロブリン及びプラスミン特異的基質、例えばHaemostasis,(1978),7,138-149（引用することにより本明細書内に組み込まれる）により開示されたとおりの式A1-A2-A3-Xのペプチドなど、と一緒にインキュベートされる場合、該化合物Xがインキュベーション媒体中に放出される速度が、デフィブロチド自身の濃度に比例的に増加する。
【００２２】
言い換えると、デフィブロチドは、ユーグロブリンに含まれるプラスミノーゲンのプラスミンへの加水分解を触媒し、該プラスミンが、プラスミンに特異的な基質、好ましくは発色性基質、と酵素的に反応して、測定可能な産物を与える。
【００２３】
本発明の方法はすなわち、c)  デフィブロチドの基準試料及び試験試料の両方の酵素的反応の経過の間の、該測定可能な産物の放出速度を決定する工程；  d)  該放出速度を、対応するデフィブロチド濃度と数学的に及び／又はグラフ的に関連付けて、デフィブロチドの試験試料の生物学的活性を得る工程をさらに含む。
【００２４】
本発明に従う決定の為の用いられるデフィブロチド試料は、例えば米国特許第4,985,552号明細書（これは上記で既に言及されており、及び、引用によって本明細書内に組み込まれる）に記載された、既知の手順に従い器官からの抽出により一般に調製される。
【００２５】
工業的に製造された標準的デフィブロチドのバッチが、参照試料（基準）として選択され、及び、本発明の方法に従い検量線を作る為に用いられた。
【００２６】
一般に、本方法は、汚染物質、例えばＲＮＡ、ヘパリン、減成したデフィブロチド（プリン又はピリミジンが除去されたデフィブロチド）又はエタノールなど、の存在下においてさえ、デフィブロチドの精密且つ正確な測定を提供し、ただし、それらが、該系を害さないように、概して10重量%未満の濃度にあるものとする。
【００２７】
デフィブロチドの該決定を許すことに加えて、該方法はまた、デフィブロチドに由来する他の生物学的に等価な物質、例えば脱アミノ化デフィブロチド又は、より簡単には、物理化学的条件との組み合わせにより変性した／減成したデフィブロチドなど、の決定も許す。
【００２８】
本方法は、2.5 μg/mlに等しい又はそれより低いデフィブロチド濃度（決定系中の最終濃度）を検出するのに十分に感度がよく、及び、一般に、1000μg/mlに等しい又はそれより高い最大濃度値までよい相関を表す。
【００２９】
用いられるユーグロブリンは、一般に、任意の哺乳類のユーグロブリン画分であってよく、例えばウシ、ブタ、ウサギ、又はヒトのユーグロブリンであってよく、ヒト及びウシのユーグロブリンが好ましい。
【００３０】
しかしながら、ユーグロブリン画分が好ましい酵素的系であるけれども、他の等価な酵素的系、例えば希釈された血漿及び血清（バッファーによる最大で1:10）、人工的に作られた又は分離された、プラスミノーゲン、tPA、uPA、PAI-1&2 α2、アンチプラスミン、及び同様物の組合せ、化学的に及び生物学的に関連し且つ同様の機能を有する酵素的系が、本発明の範囲内である。
【００３１】
本発明の方法において、プラスミンにとっての基質は、該方法の条件下で、検出可能な加水分解産物Xを遊離する、プラスミンに特異的な任意の基質であると理解されうる。
【００３２】
該検出可能な基Xの性質によって、当技術分野の当業者に一般的に知られている代替的検出系が、等しくよく採用されうる。スペクトロフォトメトリー検出系又はフルオリメトリー検出系が特に有利であり、特にはスペクトロフォトメトリー系が有利である。
【００３３】
一般的に用いられる基質は、プラスミノーゲン−プラスミンアッセイに特異的なものである。式A1-A2-A3-Xのペプチドを使用することが好ましく、ここでA1及びA2は主に非極性であるアミノ酸であり、A3はリジン又はアルギニンであり、且つ、Xは該検出可能基である。それらの基の例は、Val-Leu-Lys-pNa, Val-Phe-Lys-pNa又はpyroGlu-Phe-Lys-pNaであり、これらにおいて、スペクトロフォトメトリーにより検出可能な基Xは、パラ-ニトロアニリン(pNA)である。他の適切な基、例えばVal-Gly-Arg-2NAは、2-ナフチルアミンを含み、これは、フルオリメトリーにより測定可能である。特に好ましい基質は、化合物H-D-バリル-L-ロイシル-L-リジン-p-ニトロアニリン(H-D-Val-Leu-Lys-pNA)である。
【００３４】
ユーグロブリン画分においてデフィブロチド活性を決定する為に用いられる具体的な基質は一般に市販入手可能である。
【００３５】
本発明の決定方法は、デフィブロチド試料を、ユーグロブリン溶液中に特定のｐＨ及びモル濃度で置くことにより行なわれる。
【００３６】
特に、哺乳類血漿から得られるユーグロブリン画分が、該ユーグロブリンを、生成する血漿の元の体積へと、生理食塩水バッファーにより溶解し及び希釈して、再構成される（例：10 mL血漿から得られたユーグロブリン画分の量が、7〜8のpHでの生理食塩水バッファーにより10 mLへと溶解され及び再構成される）。
【００３７】
しかしながら、該基質に関して、0.3〜4mM、好ましくは2.5〜3.5mM、有利には3mMの濃度が、発色性基質の場合に一般に用いられる一方で、0.05〜0.15mMの濃度が、発蛍光性基質の場合に用いられる。
【００３８】
本発明の決定方法は、他の酵素的方法のように、媒体のｐＨに感受性である。
【００３９】
実際に、それは、該酵素系が不活性化されるだろう極端なｐＨ値で、一般に適用されえない。
【００４０】
また、媒体のｐＨが、測定が行なわれている期間の間のいずれの時点でも変化を受けないことが好ましく、そしてそれ故に、ユーグロブリン画分は、生物学的試験の為に通常用いられるものから選ばれるバッファー系により再構成される。適切なバッファー系は、例えば、ホスフェートバッファー、シトレートバッファー、又はトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンハイドロクロリド及び塩化ナトリウム(TRIS-NaCl)バッファーでありうる。該ユーグロブリン画分の再構成は、好ましくはTRIS-NaClにより行なわれる。
【００４１】
本方法において、該媒体のｐＨを、約7〜8、より好ましくは約7.4〜7.6に維持することが通常好ましい。
【００４２】
加えて、該バッファー系の濃度を、10〜200mM、好ましくは約50mMに維持することが好ましい。TRIS-NaClについてより特には、濃度は、TRIS について50mM及び塩化ナトリウムについて150mMであるべきである。
【００４３】
デフィブロチド生物学的活性を決定する為の本発明の方法において、デフィブロチド試料溶液が、ユーグロブリン画分中に直接に希釈され、次に、発色性又は発蛍光性基質が添加される。特には、該測定を可能にするために、試料及び基準の両方のストック母溶液を得る為に、デフィブロチドをTRIS-NaClバッファー中に予備的に希釈し／溶解することが好ましい。該ストック母溶液から、系列希釈により、該試料及び該基準が、規定のユーグロブリン体積へと、約1〜1000μg/mLのデフィブロチドである分析濃度範囲まで、希釈される。
【００４４】
本決定方法における重要なパラメーターは温度である。同じ温度が、参照曲線の構築に関して及び測定段階の間の両方について、測定の全期間を通じて及び決定される試料の全てについて、維持されることが好ましい。その為に、温度制御された装置を用いることが好ましく、また、必要な場合には、該系が最大の熱均一性を有することを確保する為に、試料の位置を適切に変更し、いくつかのセットの測定を行なうことも可能である。
【００４５】
一般に、この決定方法は、例えば25〜40℃、好ましくは35〜39℃の温度範囲において、さらにより好ましくは37℃の温度で適用される。
【００４６】
本発明に従い、デフィブロチドの作用により媒体中に放出された化合物Xの濃度の測定は、試薬の全てが添加されたときに始まり、そして、Xの化学的性質及び検出系によるものとしての予め決められた期間の間及び予め決められた頻度で継続する。
【００４７】
他の生物学的決定方法と同様に、本発明の方法はまた、実験変動の発生をできる限り減少する為に、同じマイクロプレートにおいて好ましくは行なわれる校正段階及び測定段階を提供する。
【００４８】
該校正段階は、既知の増加するデフィブロチド濃度（基準）での、試料に関する吸収データの取得、それらデータの統計的再処理、及び検量線（これが、本発明の酵素反応の速度の増加とユーグロブリン画分中に存在するデフィブロチドの濃度との間の相関を表す）の外挿を含む。該測定段階において、該校正段階において得られた相関のおかげで、同じ条件下で測定され及び処理された吸収値に基づき、デフィブロチドの試料の未知の生物学的活性を決定することが可能である。
【００４９】
より詳細には、実験的プロトコルは一般に、デフィブロチドの種々の既知の濃度での、基準及び未知の両方の、いくつかの試料の調製を提供する。該デフィブロチド試料は、予め決められた希釈倍率に従う該母溶液の段階的な希釈により調製される。
【００５０】
本方法において、一般的には母溶液の逐次の１：２希釈について、少なくとも該基準の５つの濃度及び試験されるべき試料の５つの濃度を調製し、該基準の各濃度について及び同様に該試験試料の各濃度について少なくとも４つの反復を調製することが好ましい。
【００５１】
デフィブロチドの基準の濃度及び試験試料の濃度の両方が一般には0.1〜1000μg/mlである。
【００５２】
試験試料の濃度は、好ましくは、基準の濃度と同じ大きさ順のものである。
【００５３】
上記説明に従い、各濃度についての測定が、好ましくは、一つのマイクロプレート上で行なわれ、該マイクロプレートにおいて、対応する濃度での基準及び試験試料それぞれの各試料の位置が、好ましくは変えられる。基準デフィブロチド及び試験試料デフィブロチドの両方の各濃度についての試料の配置についてのこのスキーム（これは実験の部においてより詳細に説明される）に従い、少なくとも４つの吸収値が、各時間で測定される。
【００５４】
上記で記載された測定のセットが、予め決められた時点（すなわち、最初に本発明の酵素反応が始まる前のt0時（すなわち、全ての成分が添加されたとき）で行なわれ、そして次に、正確な間隔で且つ必要なデータを獲得するのに十分な期間）で行なわれる。
【００５５】
好ましくは、吸収測定は、最大で９０分まで継続され、読み取りは、１〜１０分毎に行なわれる。より有利には、該読み取りは、１分毎に行なわれる。フォトメトリック吸収読み取りは、酵素的加水分解反応の経過の間に放出される検出可能産物Ｘの性質に依存する波長で行なわれる。Xがp-NAである特定の場合において、吸収は405 nmで測定される。
【００５６】
基準の及び未知のデフィブロチド試料の吸収読み取り値（生データとして知られる）は、読み取り操作を提供する同じ装置から直接に得られる；それらは、吸収値が各時点及びウェルについて表されるように表にされる。
【００５７】
次に、該生データが、例えばSpread  Sheet（Microsoft  Excel（商標））を用いて処理される。この最初の処理操作は、各時点での及び各読み取りセットについての、平均吸収及び付随する標準偏差の計算をもたらし、各セットは、基準及び試験試料のデフィブロチドの両方の各濃度について少なくとも４つの反復を含む。
【００５８】
該データのさらなる統計的処理が、Finney  D  J,  Statistical  Method  in  Biological  Assay,  2nd  ed.  Ch.  Griffin,  Londonand  relevant  Pharmacopoeias、により記載されたとおりの生物学的アッセイ決定の為の市販入手可能ソフトウェアを用いて行なわれる。
【００５９】
より明確には、本発明に従い、デフィブロチド生物学的アッセイ決定は、例えば、関連するEuropean  Pharmacopoeia  General  text  5.3,  Statistical  Analysisにより定義されたとおりの平行ラインモデル（parallel  line  model）、傾き−比モデル（slope  ration  model）、及び４パラメータロジスティック曲線モデル（four-parameter  logistic  curve  models）を用いて行なわれうる。
【００６０】
図１に示されるとおり、横座標上に時間及び縦座標上に吸収を配置することにより、傾き「ｂ」が酵素反応の速度に比例する直線が得られる：デフィブロチドの濃度を増加させることにより、加水分解の速度及び、比例的に、「ｂ」の値が増加する。最後に、傾きの値が、基準デフィブロチド及び試験試料デフィブロチドの反復の各セットについて上記で記載されたとおりに計算され、それらが関係するデフィブロチド濃度に関連させられる。横座標の適切な数学的変換（すなわちデフィブロチド濃度のlog）が、実際の値の代わりに用いられうる。
【００６１】
グラフ的には、その相関が、基準についてのシグモイド及び試験試料についてのシグモイドをもたらす（図２）；該シグモイドの中央部分は、一般的には平行である２つの直線を有し、及び、試験試料と基準との間の生物学的活性の差に関する距離を有する。この間隔が、Finney  D  J,  Statistical  Method  in  Biological  Assay,  2nd  ed.  Ch.  Griffin,  London.により記載されたとおりの平行ラインモデルを用いた有効性決定の為に用いられる。
【００６２】
より特定の決定について、４パラメータロジスティック曲線モデルが用いられ、及び、この場合には、試験試料及び基準の両方の全体シグモイド曲線が、試料の相対的生物学的有効性の計算の為に用いられる。
【００６３】
本発明の好ましい実施態様において、基準溶液及び決定されるべきデフィブロチドの試料の溶液が、マイクロプレートの各ウェル中に導入される。ユーグロブリン画分が、使用のときに調製され、そして、それが、デフィブロチドストック溶液の希釈媒体である。最後に、発色性基質を含む溶液が添加される。次に、該マイクロプレートが、サーモスタットリーダー中に置かれ、そして、迅速な攪拌後、系の吸収の読み取りが、所定の間隔で及び所定の時間行なわれる。得られた生データが次に処理され、すなわち、デフィブロチド試料の未知活性を決定する。
【００６４】
以下の実施例から分かるとおり、本発明の方法は、明確な生物学的活性を有する、特には25〜35 IU/mg、好ましくは27.5〜32.5IU/mg、より好ましくは28〜32 IU/mg、のデフィブロチドの活性を有する、液状デフィブロチド組成物、好ましくは水溶液を得ることを許す。
【００６５】
液状デフィブロチド組成物は、好ましくは容器の形で、より好ましくはバイアルの形で、市販され、2.5mlの緩衝水溶液（好ましくは6.5〜8.5のpH、より好ましくは7〜8のpH）中に200mgのデフィブロチドを含み、使用前に希釈される；その結果、生物学的活性が本発明の方法により評価される場合、各容器は、5000〜7000IU、好ましくは5500〜6500IU、より好ましくは5600〜6400IUのデフィブロチド活性を表す。
【００６６】
本発明のそれら局面及び他の局面が、以下の実施例においてよりよく説明されるが、これらは本発明を限定するものと考えられない。
【００６７】
実施例
【００６８】
以下の材料が、ここに与えられる実施例において用いられた。
【００６９】
2015521477.tif 000003
【００７０】
プログラム及びソフトウェア
Microsoft Excel（商標）  (Microsoft  Corporation、レドモンド、ワシントン、米国)
【００７１】
物質
デフィブロチド(ゲンチウム)
発色性基質S-2251(Chromogenix  Instrumentation  Laboratory  S.p.A.、ミラノ、イタリア)
トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS)-NaCl(Sigma-Aldrich、ミラノ、イタリア) 
1N  HCl(Carlo  Erba  reagenti、ミラノ、イタリア)
1N  NaOH  (Carlo  Erba  reagenti、ミラノ、イタリア)
ウシ血漿(Tebu  Bio  Italia、マジェンタ(MI)、イタリア)
氷酢酸(Carlo  Erba  reagenti、ミラノ、イタリア)
【００７２】
溶液
TRIS-NaCl (1L調製): 1Lビーカーへ、定量的に、6.06gのTRIS-HCl及び2.2gのNaClを移す。500mLの精製水中に溶解し、そして、pHを7.4へと、約40mLのHCl  1Nにより調整する。定量的に、該溶液を1Lメスフラスコへ移し、そして、該溶液を精製水により体積へと希釈する。該溶液を冷蔵庫内(2〜8℃)で保存する。
発色性基質S2251(CAS  63589-93-5)  3mM  (15.2mL調製):約25mgの発色性基質を15.2mLの精製水により溶解する。その溶液を冷蔵庫内(2〜8℃)で保存する。
ウシユーグロブリン(10mL調製)。300mLの最小容量を有する容器中に、240mLの氷冷精製水を導入し、そして、攪拌下で、10mLウシ血漿を添加する。pHを5.3± 0.1へと酢酸1%により調整する。2〜8℃で1〜16時間沈殿させる。透明な上清溶液をサイホン吸引により除去し、そして、沈殿物を2800rpmでの5分間4℃での遠心により集める。該沈殿物を懸濁し、 (例えば実験室ガラス棒により)5mLの氷冷精製水により機械的に分散させ、約5分間振とうし、そして、沈殿物を2800rpmで5分間4℃での遠心により集める。その沈殿物を、機械的に約10mLのTRIS-NaCl中に分散させる; その沈殿物の溶解を容易にするために、該沈殿物の粒子を適切な装置(例えば実験室ガラス棒)により砕く。得られた懸濁物を2〜8℃で、その使用前に1時間以上且つ6時間以下保存する。
【００７３】
基準デフィブロチド溶液及び試料デフィブロチド溶液
【００７４】
参照ストック溶液
20mLのメスフラスコ中に、定量的に、正確に秤量された約100mgのデフィブロチド参照基準を移す。その粉末を、約10mLのTRIS-NaClで溶解し、そして、同溶媒によりその体積にする。得られた溶液を、約1.25mg/mLのデフィブロチドRS溶液を得る為に、TRIS-NaCl により1:4希釈する。
【００７５】
試料ストック溶液
20mLのメスフラスコ中に、定量的に、正確に秤量された約100mgのデフィブロチド試料を移す。その粉末を、約10mLのTRIS-NaClで溶解し、そして、同溶媒によりその体積にする。得られた溶液を、約1.25mg/mLのデフィブロチド試料溶液を得る為に、TRIS-NaClにより1:4希釈する。
【００７６】
参照溶液及び試料溶液の調製
a)        デフィブロチド  125ug/mL: デフィブロチドストック溶液（参照及び試料）をTRIS  NaClにより1:１０希釈する(プレートウェル中への50ug/mLに相当する)。エッペンドルフ中に、定量的に、500uLのその調製された溶液を移し、そして、500uLのユーグロブリンと混合する。該チューブを閉じ、そして、氷冷水中で保存する。
b)        デフィブロチド  62.5ug/mL:溶液(a)をTRIS  NaClにより1:2希釈する(プレートウェル中への25ug/mLに相当する)。エッペンドルフチューブ中に、定量的に500uLのその調製された溶液を移し、そして、500uLのユーグロブリンと混合する。該チューブを閉じ、そして、氷冷水中で保存する。
c)        デフィブロチド  31.25ug/mL:溶液(b)をTRIS  NaClにより1:2 希釈する(プレートウェル中への12.5ug/mLに相当する)。エッペンドルフチューブ中に、定量的に、500uLの該調製された溶液を移し、そして、500uLのユーグロブリンと混合する。該チューブを閉じ、そして、氷冷水中で保存する。
d)        デフィブロチド  12.5ug/mL:溶液(d)をTRIS  NaClにより1:2.5希釈する(プレートウェル中への5ug/mLに相当する)。エッペンドルフチューブ中に、定量的に、500uLの該調製された溶液を移し、そして、500uLのユーグロブリンと混合する。該チューブを閉じ、そして、氷冷水中で保存する。
【００７７】
ブランク溶液
1体積のユーグロブリンを1体積のTRIS  NaCl溶液と混合する(例: 500 uL + 500 uL)。
【００７８】
プレート配置
提案された配置スキーム（以下表１参照）に従い、プレートの各ウェル中に、200uLの基準又は試料又はブランク溶液を添加する。種々の配置スキームが、自動ピペットの利用可能性及び構成に従い用いられうる。しかしながら、参照及び試料溶液のそれぞれについて４以上の配置が、アッセイの為に用いられなければならない。
マイクロプレートリーダー中でのプレートのインキュベーションの直前に、各ウェルに50uLの発色性基質を添加する。
【００７９】
【表１】
2015521477.tif 000004
【００８０】
S1、S2、S3、S4: 参照溶液配置1、配置2、配置3、配置4、
U1、U2、U2、U5: 試料溶液配置1、配置2、配置3、配置4、
Ca、Cb、Cc等: デフィブロチド参照及び試料の濃度a、b、c等
BLK ブランク溶液
【００８１】
計算及び結果
基準調製物(例.: S1_Ca、S1_Cb、S1_Cc)の動的プロット“吸収対時間”から、適切な線形範囲を同定する(例：30〜35分、図3参照)。
線形動的範囲の同定(A@405 nm対時間)。
基準及び試料の調製物夫々について、予め決められた時間範囲におけるアッセイの応答を、以下のとおりに計算する。 
2015521477.tif 000005
ここで:
Aaは、時間Taでの吸収値(上記プロットから30分)
Ab は、時間Tbでの吸収値(上記プロットから35分)
【００８２】
表２において報告されるとおりの表フォーマットにおいて得られた値を報告する。
【００８３】
【表２】
2015521477.tif 000006
【００８４】
調査されるべき物質についての応答及び基準についての応答を、濃度の対数に対してプロットし、そして、調査されるべき物質の活性を、Ph.  Eur  Current  editionの関連する5.3.2章により定義されたとおりの平行ラインモデルを用いて計算する。
参照及び試料の３以上の逐次の系列希釈物が用いられなければならない（例えば、デフィブロチド濃度5μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、又は5μg/mL、12.5μg/mL、25μg/mL、又は12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL）。
【００８５】
分散分析
分散分析が、Ph  Eur.  Current  edition  and  Finney  DJ  (1964)  Statistical  Method  in  Biological  Assay  2nd  edの5.3.2.3節に従い行なわれる。
【００８６】
有効性についての試験
1)        線形回帰関係は有意であり、すなわち計算された確率は0.05未満である。この基準が満たされないならば、95%信頼区間を計算することはできない。
2)        非平行の関係は有意でない。すなわち、計算された確率は0.05未満である。
3)        非線形の関係は有意でない。すなわち、計算された確率は0.05未満である。
【００８７】
許容基準
4)        推定有効性（estimated  potency）が、規定有効性（stated  potency）の90%以上であり且つの111%以下である。
5)        推定有効性の信頼限界(P=0.95)が、規定有効性の80%以上であり且つ125%以下である。
【００８８】
計算
2015521477.tif 000007
ここで、
-          R:平行ラインモデル分析により得られた試料の結果
-          規定有効性: 基準の規定有効性(乾燥物質についてのUI/mg)
-          規定濃度: 基準の濃度(乾燥物質についてのmg/mL)
-          試料濃度: 試料の濃度(乾燥物質についてのmg/mL)
【００８９】
デフィブロチド配合物へ適用されたアッセイ
上記開示されたアッセイが、2.5ml中に200mgのデフィブロチドを有し(１ml 当り80mg)且つ表３に報告されるとおりのいずれかの定量的組成を有する液状配合物の生物学的活性を決定する為に用いられた。
【００９０】
【表３】
2015521477.tif 000008
【００９１】
結果が表４に報告される。
【００９２】
【表４】
2015521477.tif 000009
【図１】
2015521477.tif 000010
【図２】
2015521477.tif 000011
【図３】
2015521477.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成27年5月22日(2015.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デフィブロチドの生物学的活性の決定方法であって、
a)  デフィブロチド、ユーグロブリン及び、プラスミンに特異的な基質を接触させる工程、ここで該基質は、プラスミンとの反応により測定可能な産物を与えるものである、；及び
b)  形成された産物の量を逐次の時点で測定し、それにより該デフィブロチドの生物学的活性を決定する工程
を含む前記方法。
【請求項２】
該ユーグロブリンが、哺乳類のユーグロブリンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該ユーグロブリンが、ヒト、ウサギ、又はウシのユーグロブリンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
該プラスミンに特異的な該基質と反応する該プラスミンが、ユーグロブリン中に含まれるプラスミノーゲンによって放出されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
該プラスミンに特異的な該基質が、発色性基質である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
該プラスミンに特異的な該基質が、式A1-A2-A3-Xの化合物であり、ここでA1及びA2が非極性アミノ酸であり、A3がリジン又はアルギニンであり、且つ、Xが該測定可能な産物である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
該測定可能な産物Xが、パラ−ニトロアニリン及び２−ナフチルアミンからなる群から選ばれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該プラスミンに特異的な該基質が、H-D-バリル-L-ロイシル-L-リジン-p-ニトロアニリンである、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
該測定可能な産物Xが、スペクトロフォトメトリー又はスペクトロフルオリメトリーにより測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
該哺乳類のユーグロブリンが、由来する血漿と同じ体積に再構成され又は適切なバッファーにより最大で１：１０で希釈され、且つ、発色性／発蛍光性基質が、2.5〜3.5mMの濃度を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
発色性／発蛍光性基質が3mMの濃度を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
該方法が、7〜8のpHに緩衝された水性溶液である反応媒体中で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
該方法が、7.4のpHに緩衝された水性溶液である反応媒体中で行なわれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
温度が、35〜39℃で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
温度が37℃で維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
該プラスミンに特異的な該基質の濃度が0.3〜4mMである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
該プラスミンに特異的な該基質の濃度が2.5〜3.5mMである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
該プラスミンに特異的な該基質の濃度が3mMである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
c) 基準試料及び試験試料の両方の酵素反応の経過の間の該測定可能な産物の放出速度を決定する工程； 及びd) 該放出速度を、対応するデフィブロチド濃度と数学的に及び／又はグラフ的に関係付けて、デフィブロチドの該試験試料の生物学的活性を得る工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
デフィブロチドの25〜35IU/mgの生物学的活性を有する、デフィブロチド液状組成物。
【請求項２１】
デフィブロチドの27.5〜32.5IU/mgの生物学的活性を有する、請求項２０に記載のデフィブロチド液状組成物。
【請求項２２】
デフィブロチドの28〜32IU/mgの生物学的活性を有する、請求項２０に記載のデフィブロチド液状組成物。
【請求項２３】
水溶液であることにより特徴付けられる、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載のデフィブロチド液状組成物。
【請求項２４】
緩衝されていることにより特徴付けられる、請求項２３に記載のデフィブロチド液状組成物。
【請求項２５】
6.5〜8.5のpHで緩衝されていることにより特徴付けられる、請求項２３に記載のデフィブロチド液状組成物。
【請求項２６】
7〜8のpHで緩衝されていることにより特徴付けられる、請求項２３に記載のデフィブロチド液状組成物。
【請求項２７】
VODの処置及び予防における使用の為の、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載のデフィブロチド液状組成物。
【請求項２８】
デフィブロチド液状組成物を含む容器であって、該容器が5000〜7000IUのデフィブロチド活性を表す、前記容器。
【請求項２９】
該容器が5500〜6500IUのデフィブロチド活性を表す、請求項２８に記載の容器。
【請求項３０】
該容器が5600〜6400IUのデフィブロチド活性を表す、請求項２８に記載の容器。
【請求項３１】
該デフィブロチド液状組成物が水溶液である、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の容器。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２３】
本発明の方法はすなわち、c)  デフィブロチドの基準試料及び試験試料の両方の酵素的反応の経過の間の、該測定可能な産物の放出速度を決定する工程；及び、d)  該放出速度を、対応するデフィブロチド濃度と数学的に及び／又はグラフ的に関連付けて、デフィブロチドの試験試料の生物学的活性を得る工程をさらに含む。
【国際調査報告】
2015521477.tif 000013
2015521477.tif 000014
2015521477.tif 000015
2015521477.tif 000016