(57)【要約】  本発明は、有効成分として治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物および所望により薬学的に許容可能な担体を含む、薬草組成物に関する。本発明は、さらに前記抽出物の調製方法にも関する。本発明は、前記組成物を用いる代謝障害の治療方法にも関する。本発明は、代謝障害の処置のために、１以上のさらなる治療上有効な薬剤と組み合わせて使用するための、治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物を含む組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体と共に含む、組成物。
【請求項２】
５〜１００％のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
抽出物がテルミナリア・エリプティカ植物の樹皮から得られる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
テルミナリア・エリプティカの抽出物が、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体と共に、生理活性マーカーを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
生理活性マーカーが、エラグ酸、４−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシド（化合物１）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
テルミナリア・エリプティカ植物の抽出物が、生理活性マーカーとして０.０１〜１０.０％の化合物１を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
代謝障害のための処置が必要な対象に経口投与される、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
経口投与のため錠剤、カプセル剤または顆粒剤の形態に製剤化される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
代謝障害の処置のための、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
代謝障害が、インシュリン耐性、高血糖症、糖尿病、肥満、耐糖能低下、高コレステロール血症、脂質異常症、高インスリン血症、アテローム性動脈硬化、多嚢胞性卵巣症候群、冠動脈疾患、メタボリック症候群、高血圧、または異常な血漿リポタンパク質、トリグリセリド類との関連障害もしくは膵臓β細胞再生との関連障害から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
代謝障害が、インシュリン耐性、糖尿病、高血糖症、メタボリック症候群、耐糖能低下、肥満、脂質異常症、または異常な血漿リポタンパク質、トリグリセリド類との関連障害もしくは膵臓β細胞再生との関連障害から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
代謝障害を処置するために、少なくとも一つのさらなる治療上有効な薬剤と組み合わせて使用するために提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
代謝障害の処置のための医薬の製造のための、治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物を含む組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、有効成分として、植物、即ちテルミナリア・エリプティカ(Terminalia elliptica)の抽出物を、単独で、または薬学的に許容可能な担体と共に含む薬草組成物に関する。本発明の組成物は、代謝障害の処置に有用である。本発明は、前記薬草組成物の製造方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
代謝障害とは、身体が炭水化物、脂質、タンパク質または核酸を適切に代謝することができない場合におこる障害または異常である。殆どの代謝障害は、細胞が代謝過程を行なうに必要な酵素を欠失または機能不全へと至らしめる、遺伝子の突然変異によって引き起こされる。代謝障害の例には、肥満、過度の体脂肪、高脂血症、高リポタンパク質血症、高血糖症、高コレステロール血症、高インスリン血症、インシュリン耐性、耐糖能低下および糖尿病（特に、ＩＩ型糖尿病）が含まれる。既存薬に関連する欠点を考えると、代謝性疾患の治療のための新規薬を提供/開発する必要がある。
【０００３】
代謝障害を処置するための新しい医薬候補物質を選抜および開発するために、２つの新しい酵素標的、即ちジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１（ＤＧＡＴ−１）およびステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ−１）を利用することができる。これらの酵素は、トリグリセリド（エネルギーが体内で貯蔵される主な形態）の合成に重要な役割を果たす。
【０００４】
ＤＧＡＴ−１は、トリグリセリドの生合成を触媒する小胞体の膜結合酵素であって、この生合成過程の最終段階でジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および脂肪酸アシル-コエンザイムＡ（ＣｏＡ）をトリグリセリドに変換する酵素である。この酵素活性は、細胞が必要とするトリグリセリドを産生する必要があるために、全てのタイプの細胞に存在している。ＤＧＡＴ−１は、腸および脂肪組織において高度に発現しており、肝臓および筋肉ではより低いレベルで発現する。これらの各組織（腸、脂肪組織、肝臓および筋肉）においてＤＧＡＴ−１を阻害することにより、トリアシルグリセロール合成を阻害して、ヒトの代謝障害における過度な脂質蓄積の病態生理を阻止することができる［Expert. Opin. Ther. Patents 17(11), 1331-1339(2007)]。
【０００５】
ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ−１）は、脂質代謝の制御における主要酵素のうちの１つとして報告されており、有力な新規治療標的となり得る。ＳＣＤ−１は、飽和脂肪酸から一価不飽和脂肪酸の生合成を触媒する律速酵素である。ＳＣＤ−１の好ましい基質であるステアリン酸（Ｃ１８：０）およびパルミチン酸（Ｃ１６：０）は、オレイン酸（Ｃ１８：１）およびパルミトイル酸（Ｃ１６：１）に各々変換される。これらの一価不飽和脂肪酸は、トリグリセリド、コレステロールエステル、リン脂質およびワックスエステルを含めた様々な脂質の主要成分と考えられる。実験動物における試験から、これらの酵素の活性を阻害または低下することにより、肥満、糖尿病および関連合併症の発症に対して抵抗性となることが示唆された[European Journal of Pharmacology, 618, 28-36, (2009); European Journal of Pharmacology, 650, 663-672(2011)]。
【０００６】
現代の医薬分野において、薬草材料および植物は、創薬および医薬品開発において重要な役割を担い続けている。植物から得た粗生成物または加工生成物は、合成低分子である薬剤と比較して副作用が少ないか、または副作用がないと考えられるため、植物を基にした医薬に対する需要は増大し続けている。
【０００７】
「テルミナリア（Terminalia）」とは、大木の顕花植物のシクンシ科（Combretaceae）の属であって、世界の熱帯地域に分布する約１００種を含む。最も良く知られているテルミナリア属の植物は、テルミナリア・ベリリカ(Terminalia bellirica)、テルミナリア・カタッパ(Terminalia catappa)、テルミナリア・パニキュラタ(Terminalia paniculata)、テルミナリア・シトリナ(Terminalia citrina)、テルミナリア・フェロカルパ(Terminalia phellocarpa)、テルミナリア・コペランディ（Terminalia copelandii）、テルミナリア・ブラッシ(Terminalia brassi）、テルミナリア・イヴォレンシス（Terminalia ivorensis）、テルミナリア・スペルバ（Terminalia superba）、テルミナリア・アルジュナ(Terminalia arjuna)、テルミナリア・エリプティカおよびテルミナリア・ケブラ(Terminalia chebula)である。この属の樹は、二次代謝物、例えば、環状トリテルペン類およびその誘導体類、フラボノイド類、タンニン類、および他の芳香物質の起源物として特に知られている。テルミナリア・ベリリカ植物から得られた抽出物、特に種を除いた果実から得られた抽出物は、α-グルコシダーゼ阻害効果を有することが知られている（特開２００６−１８８４８６号公報）。また、植物、テルミナリア・チェブラの果実が、弱いα-グリコシダーゼ阻害効果を示したことも特開２００６−１８８４８６号公報に報告されている。
【０００８】
テルミナリア・エリプティカは、テルミナリア種であって、南アジアや南東アジアのインド、ネパール、バングラデェシュ、ミャンマー、タイ、ラオス、カンボジアおよびベトナムに自生している。テルミナリア・エリプティカの近縁類には、テルミナリア・トメントサ(Terminalia tomentosa)、テルミナリア・クレヌレート(Terminalia crenulata)、テルミナリア・アラタ(Terminalia alata)、テルミナリア・コリアセアナ(Terminalia coriaceana)およびペンタプテラ・クレヌレート(Pentaptera crenulata)が挙げられる。
【０００９】
テルミナリア・エリプティカは、直径１メートルの幹を持ち、３０ｍの高さまで生長する大きな落葉樹である。テルミナリア・エリプティカの樹皮は、ザラついており、深い亀裂が入っている。外部表面は、淡褐色から濃褐色の色調であり、内部表面は、濃褐色から黒色の色調であり、滑らかな縦方向の筋がある。この樹皮は苦く収斂性であり、潰瘍、骨折、出血および気管支炎の治療に有用である。この樹皮は、利尿作用および強心特性がある。樹皮の煎出物は、無緊張症下痢において内服され、弱い無痛潰瘍下痢のための適用として局所的に投与される(Glossary of Indian Medicinal Plants. CSIR, NewDehli, ISBN:8172361262, 1956)。Sushrutaらは、蛇毒の治療においてこの植物の灰を推奨している。
【００１０】
テルミナリア・エリプティカの葉は、タッサーシルクを産生するAntheraea paphia（蚕）の餌として用いられる。テルミナリア・エリプティカの花は、淡黄色の雌雄同体であり、先が尖っているか、または末端が円錐花序にて存在する。開花時期は３月から６月である。
【００１１】
ＩＩ型糖尿病および肥満のような代謝障害が一般化する時流を考えれば、代謝障害の有効な処置のための新規組成物および方法を求める要求が引き続き存在する。実際に、これらの問題の解決策を見出だす事を目的とした本発明の発明者らの努力により、ＤＧＡＴ−１およびＳＣＤ−１への二重の阻害活性を持ち、代謝性疾患の処置のために有用な組成物、即ちテルミナリア・エリプティカの抽出物を含む薬草組成物が得られた。
【００１２】
（発明の要旨）
本発明の一態様に従い、代謝障害の処置において使用するための、有効成分として治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物、および所望により少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物が提供される。
【００１３】
本発明の一態様に従い、代謝障害を処置するための、さらなる治療上有効な薬剤と組み合わせて使用される、治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物を含む組成物が提供される。
【００１４】
本発明の別の態様に従い、本発明は、有効成分として治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物、および所望により少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物を対象に投与することを含む、対象における代謝障害を処置するための方法に関する。
【００１５】
別のさらなる態様において、本発明は、有効成分として治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物、および所望により少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物を対象に投与することを含む、対象における代謝性疾患の治療方法であって、前記組成物をさらなる治療上有効な薬剤と組み合わせて投与することを含む治療方法に関する。
【００１６】
本発明の別の態様に従って、治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物および少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物の製造方法が提供される。
【発明の詳細な説明】
【００１７】
（発明の詳細な記載）
発明の範囲内での様々な変更および修飾は当業者には明白であるため、詳細な説明および具体的実施例は、発明の実施態様を示す一方で、単に説明の目的でのみ提供されることを理解されたい。本明細書の記載に基づいて、当業者は、本発明をその全ての範囲にまで利用しうる。以下の特定の実施態様は、本開示内容の単なる説明として理解されるものであり、いかなることがあっても本開示の他の部分を限定するものではない。
【００１８】
別途定義されなければ、本明細書において使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００１９】
用語「代謝障害」とは、身体が炭水化物、脂質、タンパク質または核酸を適切に代謝することができない場合におこる障害あるいは異常をいう。従って、本発明の内容において、代謝の異常状態に関連するあらゆる疾患が、用語「代謝障害」に包含される。代謝障害なる用語には、インシュリン耐性、高血糖症、糖尿病、肥満、耐糖能低下、高コレステロール血症、脂質異常症、高インスリン血症、アテローム性動脈硬化、多嚢胞性卵巣症候群、冠動脈疾患、メタボリック症候群、高血圧、または異常な血漿リポタンパク質、トリグリセリドとの関連疾患もしくはグルコースレベルとの関連疾患、例えば膵臓のβ細胞再生が挙げられるが、これらに限定するものではない。
【００２０】
本明細書に使用される用語「処置すること」、「処置する」または「処置」は、予防的および緩和的処置を含む。
【００２１】
本明細書に使用される用語「薬学的に許容可能な」は、組成物中に使用される担体、希釈剤、賦形剤および/または塩が、その製剤の他の成分と適合性であるべきであり、その受容者に有害ではないことを意味する。
【００２２】
用語「薬草組成物」または「組成物」は、互換的に使用され、治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物を、単独で、あるいは少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体または賦形剤と共に含む組成物を示すことができる。用語「単独で」とは、組成物が、テルミナリア・エリプティカ植物の抽出物のみを含み、いかなる薬学的に許容可能な担体も添加されていないことをさらに意味しうる。用語「組成物」とは、広義に解釈されるべきであって、例えば、目的とする適応症に関する表示を伴う医薬品として販売されていてもいなくも、店舗販売されていてもいなくても、植物性医薬(phytopharmaceutical)として販売されていてもいなくても、治療効果を達成するという目的を意図するあらゆる組成物を包含することに留意されたい。
【００２３】
本明細書に使用される用語「テルミナリア・エリプティカ」は、テルミナリア・トメントサ、テルミナリア・クレヌレート、テルミナリア・アラタ、テルミナリア・コリアセアナおよびペンタプテラ・クレヌレートのようなその全ての異名を含む。
【００２４】
本明細書に使用される用語「薬学的に許容可能な担体」とは、無毒かつ不活性な固体、半固形、希釈剤、封入材またはあらゆるタイプの製剤用助剤を意味する。薬学的に許容可能な担体としての役割を果たす材料の幾つかの例には、例えば以下のものが挙げられる：ラクトース、グルコースおよびスクロースのような糖類；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンのようなデンプン類；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；麦芽；ゼラチン；他の無毒な適合性の、滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）ならびに着色料、解離剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤および芳香剤；保存剤および酸化防止剤も、製剤者の判断によって組成物中に使用できる。
【００２５】
本明細書に使用される用語「治療上有効量」とは、抽出物（テルミナリア・エリプティカ抽出物）または前記抽出物を含有する組成物の量を意味し、これは妥当な医学的判断の範囲内において、制御または処置されるべき症状に有意な正の変化を誘導するのに十分であるが、副作用があったとしても、その副作用を回避するのに十分低い（合理的な利益/リスク比の）量である。抽出物または組成物の治療上有効量は、処置される特定の症状、例えば糖尿病または肥満、エンドユーザの年齢および身体状態、処置/予防される症状の重篤度、治療期間、併用療法の性質、利用される特定の薬学的に許容可能な担体ならびに因子類に拠って変化する。本明細書に使用される全ての％は、特段の記載がなければ重量％である。
【００２６】
明細書および添付の特許請求の範囲に使用されるように、単数形は、明示的に反する記載がない限り、複数形を包含する。
【００２７】
本明細書に使用される用語「テルミナリア・エリプティカ抽出物」または「テルミナリア・エリプティカの抽出物」は、テルミナリア・エリプティカ植物の任意の部分に存在する化合物類の混合物を意味する。かかる化合物は、植物のあらゆる部分（例えば、植物の樹皮、小枝、茎、木質部、葉、および果実など）から、当分野では十分知られた抽出方法、例えば、低級アルコール(例えば、メタノールまたはエタノール）、アルキルエステル（例えば、酢酸エチル）、アルキルエーテル（例えば、ジエチルエーテル）、アルキルケトン（例えば、アセトン、クロロホルム、石油エーテル、ヘキサン）のような有機溶媒を使用する抽出方法および／または水のような水性溶媒を使用する抽出方法を実施して抽出することができる。植物材はまた、好適な比率の溶媒混合物、例えばヘキサン−酢酸エチル（１：１）、クロロホルム−メタノール（１：１）またはメタノール−水（３：１）を用いて抽出することができる。
【００２８】
本明細書に使用される用語「対象」とは、動物、特に哺乳動物、より具体的にはヒトをいう。本明細書に使用される用語「哺乳動物」とは、皮膚が毛に覆われており、幼児を育てるために母乳を出す雌の乳腺を特徴とする、ヒトを含めた哺乳類の温血脊椎動物をいう。用語「哺乳動物」とは、ネコ、イヌ、ウサギ、クマ、キツネ、オオカミ、サル、シカ、マウス、ブタおよびヒトのような動物を含む。
【００２９】
ある実施態様において、「テルミナリア・エリプティカ抽出物」の調製方法は、溶媒としてアルコール、例えばメタノールの使用を含む。
【００３０】
例えば、抽出物は、テルミナリア・エリプティカ植物の任意の部分、例えば樹皮の抽出により得ることができる。
【００３１】
ある実施態様において、抽出物は、溶媒としてメタノールを用いて、テルミナリア・エリプティカ植物の粉砕樹皮から得られる。
【００３２】
ある実施態様において、抽出物は、好適な比率の溶媒混合物を用いて、テルミナリア・エリプティカ植物の粉砕樹皮から得られる。
【００３３】
ある実施態様において、テルミナリア・エリプティカ植物の粉砕樹皮を、様々な比率のメタノール−水の混合液、例えばメタノール−水（９：１）混合液、メタノール−水（３：１）混合液またはメタノール−水（１：１）混合液を使用して抽出できる。
【００３４】
テルミナリア・エリプティカ植物の抽出物の調製方法は、従来的手法に従って大規模な製造のために容易に拡大できる。
【００３５】
テルミナリア・エリプティカ抽出物は、高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)または高性能薄層クロマトグラフィー(ＨＰＴＬＣ)のような従来技術を使用して標準化することができる。用語「標準抽出物」とは、抽出物中に存在する特有の生理活性成分または生理活性マーカー類を同定することにより標準化された抽出物をいう。
【００３６】
本明細書で使用される用語「有効成分」は、化合物の混合物を含むテルミナリア・エリプティカ抽出物、すなわち１つ以上の生理活性化合物(生理活性マーカー)を含むテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物をいう。
【００３７】
生理活性マーカーまたは生理活性成分は、高性能薄層クロマトグラフィー(ＨＰＴＬＣ)または高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)のような様々な技術を使用して同定することができる。生理活性マーカーは、生理活性に従うカラムクロマトグラフィー精製および分取高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)により、テルミナリア・エリプティカ植物の抽出物から単離することができる。生理活性マーカーは、スペクトルのデータの分析により特徴付けることができる。
【００３８】
用語「生理活性マーカー」とは、許容可能な程度の医薬活性と相互に関連する活性化合物の特徴(あるいは、植物化学プロファイル)を規定するために、本明細書において使用される。活性化合物である「生理活性マーカー」は、生理活性に基づきテルミナリア・エリプティカ植物から得た抽出物から単離できる。
【００３９】
単離された化合物（生物活性マーカー）は、質量スペクトル（ＭＳ）、赤外線（ＩＲ）および核磁気共鳴（ＮＭＲ）分析データのようなスペクトルデータの分析により特徴付けることができる。
【００４０】
ある実施態様において、テルミナリア・エリプティカ植物から単離された生物活性マーカーは、エラグ酸、４−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシド（以下、「化合物１」と称する）として同定された。
【００４１】
抽出物の生理活性の測定は、周知の種々の生物学的な生体外および生体内アッセイを用いて実施することができる。例えば、予備的な抽出物の生体外の活性測定は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１（ＤＧＡＴ−１）アッセイ、ステアロイル-ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ−１）アッセイまたはトリグリセリド合成アッセイを使用して実施することができる。生体内活性は、高脂肪食（ＨＦＤ）誘導性肥満モデルのようなアッセイを用いて測定することができる。
【００４２】
ある実施態様において、本発明は、治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物および所望により少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む薬草組成物を提供する。
【００４３】
別の実施態様において、本発明は、テルミナリア・エリプティカ植物の標準抽出物および所望により少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を含む薬草組成物に関する。
【００４４】
本明細書において使用される用語「標準抽出物」とは、生理活性マーカーとしてある化合物を特定量含有するように処理された、植物（例えばテルミナリア・エリプティカ植物）の抽出物をいう。本発明に関して、標準抽出物なる用語は、生理活性マーカーとして特定量の化合物１を含有するテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物をいう。標準抽出物中に存在する化合物１の特定量は、０.０１％〜１０％、０.０５％〜５％、または０.１５〜２％と変化し得る。
【００４５】
別の実施態様において、テルミナリア・エリプティカ植物の標準抽出物は、生理活性マーカーとして、０.０１〜１０.０％の化合物１を含有する。
【００４６】
別の実施態様において、テルミナリア・エリプティカ植物の標準抽出物は、生理活性マーカーとして、０.０５〜５.０％の化合物１を含有する。
【００４７】
別の実施態様において、テルミナリア・エリプティカ植物の標準抽出物は、生理活性マーカーとして、０.１５〜２.０％の化合物１を含有する。
【００４８】
別の実施態様において、本発明は、生理活性マーカーとして０.０１〜１０.０％の化合物１（エラグ酸、４-Ｏ-α-Ｌ-ラムノピラノシド）を含有するテルミナリア・エリプティカ植物の標準抽出物、および所望により少なくとも薬学的に許容可能な担体を含む薬草組成物に関する。
【００４９】
別の実施態様において、治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の樹皮の抽出物、および所望により少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を含む薬草組成物を提供する。
【００５０】
ある実施態様において、治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の茎の抽出物、および所望により少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を含む薬草組成物を提供する。
【００５１】
本発明の薬草組成物は、５〜１００％のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物を含む。
【００５２】
ある実施態様において、本発明は、４５〜７５％のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物を含む薬草組成物を提供する。
【００５３】
本発明の薬草組成物は、少なくとも０.０１〜１０.０％の化合物１を生理活性マーカーとして含有するテルミナリア・エリプティカ植物から得た抽出物を５〜１００％含む。
【００５４】
ある実施態様において、本発明は、少なくとも０.０５〜５.０％の化合物１を生理活性マーカーとして含有するテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物を４５〜７５％含む薬草組成物を提供する。
【００５５】
ある実施態様において、本発明は、少なくとも０.１５〜２.０％の化合物１を生理活性マーカーとして含有するテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物を４５〜７５％含む薬草組成物を提供する。
【００５６】
ある実施態様において、本発明は、代謝障害を処置するための医薬製造における、治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物を含む組成物の使用を提供する。
【００５７】
ある実施態様において、組成物中に含有されるテルミナリア・エリプティカ抽出物は、標準抽出物である。
【００５８】
テルミナリア・エリプティカ抽出物は、薬学的に許容可能な担体と混合して、治療用投薬形態へと製剤される。
【００５９】
治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物を含む組成物は、例えば、丸剤、錠剤、糖衣錠、カプセル剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤あるいはシロップの形態で経口投与することができる。
【００６０】
テルミナリア・エリプティカ抽出物を５〜１００重量％含有する経口組成物は、前記抽出物を常法により薬学的に許容可能な担体と完全に混合することにより製造することができる。
【００６１】
本発明の組成物は、経皮投与のために使用することができる。
【００６２】
ある実施態様において、組成物は、代謝障害の処置のために提供される。
【００６３】
ある実施態様において、代謝障害は、インシュリン耐性、高血糖症、糖尿病、肥満、耐糖能低下、高コレステロール血症、脂質異常症、高インスリン血症、アテローム性動脈硬化の疾病、多嚢胞性卵巣症候群、冠動脈疾患、メタボリック症候群、高血圧、異常な血漿リポ蛋白や、トリグリセリドとの関連障害、または膵臓のβ細胞再生との関連障害から選択される。
【００６４】
別の実施態様において、代謝障害は下記のものから選択される：インシュリン耐性、糖尿病、高血糖症、メタボリック症候群、耐糖能低下、肥満、脂質異常症、異常な血漿リポ蛋白、トリグリセリドとの関連障害、または膵臓のβ細胞再生との関連障害。
【００６５】
ある実施態様において、前記組成物は、糖尿病の処置のために提供される。
【００６６】
用語「糖尿病」とは、膵臓が十分にインシュリンを産生しない場合におこるか、または身体が産生するインスリンを有効に利用できない場合に生じる慢性疾患または症状をいう。これにより、血中グルコース濃度の増加（高血糖症）がもたらされる。糖尿病の２つの主要形態は、Ｉ型糖尿病（インスリン依存性糖尿病）およびＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病）（ＮＩＤＤＭ）である。Ｉ型糖尿病とは、膵臓のインスリン産生β-細胞が破壊される自己免疫性疾患であり、これは一般的にグルコース利用を調節するホルモンであるインスリンの完全な欠乏へと至る。ＩＩ型糖尿病は、インスリンが正常レベルであるか、またはより高いレベルであっても起こり、組織がインスリンに対して適切に応答できないことに起因しうる。糖尿病の他のカテゴリーは、妊娠性糖尿病（妊娠中に発症する高血糖症状態）および「その他」の稀な原因（遺伝的症候群、膵炎のような獲得プロセス、嚢胞性繊維症のような疾患、特定の薬剤、ウイルスおよび未知の原因に対する暴露)を包含する。
【００６７】
本発明のある実施態様において、用語「糖尿病」は、ＩＩ型糖尿病（インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ））をいう。
【００６８】
ある実施態様において、前記組成物は、肥満の処置のために提供される。
【００６９】
ある実施態様において、前記組成物は、脂質異常症の処置のために提供される。 
【００７０】
ある実施態様において、前記組成物は、異常な血漿リポタンパク質、トリグリセリドとの関連疾患に関係する代謝障害の処置のために提供される。
【００７１】
実施態様において、前記組成物は、グルコースレベルに関係する代謝障害、例えば膵臓のβ細胞再生の処置のために提供される。
【００７２】
また別の実施態様において、本発明は、代謝障害の処置のため、少なくとも一つの治療上有効な薬剤と組み合わせて使用するための、治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物を含む組成物に関する。
【００７３】
また別の実施態様において、本発明は、代謝障害の処置のため、少なくとも一つのさらなる治療上有効な薬剤と組み合わせて使用するための、治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物および所望により少なくとも薬学的に許容可能な担体を含む組成物に関する。
【００７４】
本発明の組成物と組み合わせうる治療上有効な薬剤は、カロフィラム・イノフィラム（Calophyllum inophyllum）、プテロスペルマム・アセリフォリウム（Pterospermum acerifolium）、ティノスポラ・カルジフォリア（Tinospora cardifolia）、カプシクム・アニューム（Capsicum annum）、ガレガ・オフィシナリス（Galega officinalis）またはアリウム・サティヴム（Allium sativum）から選択される植物の抽出物から選択することができる。
【００７５】
本発明の組成物と組み合わせうる治療上有効な薬剤は、オルリスタット、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、グリベンクラミド、グリピジド、グリメピリド、レパグリニド、ナテグリニドまたはメトホルミンのような既知の治療剤から選択することができる。
【００７６】
さらに、本発明の組成物は、カロフィラム・イノフィラム（Calophyllum inophyllum）、プテロスペルマム・アセリフォリウム（Pterospermum acerifolium）、ティノスポラ・カルジフォリア（Tinospora cardifolia）、カプシクム・アニューム（Capsicum annum）、ガレガ・オフィシナリス（Galega officinalis）またはアリウム・サティヴム（Allium sativum）から選択される植物の抽出物から選択され得る１以上のさらなる治療剤、ならびにオルリスタット、ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、グリベンクラミド、グリピジド、グリメピリド、リパグリニド、ナテグリニドまたはメトホルミンから選択される既知の薬剤と組み合わせてもよい。
【００７７】
本発明はまた、治療上有効量のテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物、および所望により少なくとも一つの薬学的に許容可能な担体を含む組成物を、経口経路によって選択的に投与することを含む代謝障害を処置する方法に関する。
【００７８】
本発明の薬草組成物は、有効成分（即ち、標準抽出物であってもよいテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物）を、通常の無毒な薬学的に許容可能な担体と共に、粉末剤、錠剤、丸剤、糖衣錠、丸薬、顆粒剤、カプセル剤、溶液、乳剤、懸濁、エリキシル剤、シロップおよび使用に好適な他の形態として、経口投与のために製剤することができる。本発明の製剤は、タルク、水、グルコース、ラクトース、スクロース、アカシアガム、ゼラチン、マンニトール、スターチ、三ケイ酸マグネシウム、トウモロコシデンプン、ケラチン、コロイド様シリカ、ジャガイモデンプン、尿素、ならびにセルロースおよびそれらの誘導体（例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース）；麦芽；ゼラチン；ならびにその他の無毒な適合性の滑沢剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）、放出剤、コーティング剤、および固体、半固体または液体の形態の製剤の製造に好適なその他の賦形剤を含むものを包含し、さらには助剤、安定化剤、増粘剤および着色料を使用してもよい。錠剤またはカプセル剤のような固体組成物を製造するため、抽出物を、薬学的担体(例えば、トウモロコシデンプン、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウムあるいはガムのような従来の錠剤化成分)および他の薬学的希釈剤(例えば、水)と混合して、固体組成物を形成する。その後、この固体組成物は、有効量の本発明の組成物を含有する単位投薬形態へと分割される。抽出物を含有する錠剤または丸剤は、持続作用の利点を提供する投薬形態を提供するように被覆または調合することができる。
【００７９】
標準抽出物であってもよいテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物が経口投与または非経口投与のために導入され得る液体形態には、水溶液、好適に風味付けされたシロップ剤、水性懸濁液または油性懸濁液、食用油で風味付けされたエマルジョン、エリキシル剤や類似の薬学用媒体が挙げられる。水性懸濁液に好適な分散剤または懸濁化剤は、合成の天然ガム、例えばトラガカント、アカシアガム、アルギン酸塩、デキストラン、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリビニルピロリドンまたはゼラチンを含む。経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップ剤または懸濁液の形態をとることができ、あるいは、それらは、使用前に水または他の適切な媒体を用いて再構成するための乾燥製品として存在してもよい。かかる液体製剤は、常法により、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、メチルセルロースまたは水素化食用脂)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシアガム)；非水性媒体(例えば、アーモンド油、油性エステルまたはエチルアルコール)；保存剤(例えば、メチルまたはｐ-オキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸)；ならびに人工または天然色素および/または甘味料などの薬学的に許容可能な添加剤と共に製造できる。
【００８０】
選択された投薬レベルは、用いた本発明の特定の抽出物の活性、投与経路、投与時間、用いた特定の組成物の排出速度、処置の期間、その他の抽出物との併用、処置される患者の年齢、性別、重量、条件、一般的な健康状態および既往歴、医薬分野で周知の同様の因子に依存するであろう。しかし、一般的には、ヒトの治療に用いられる投薬量は、１日あたり１〜５０００ｍｇの範囲内である。いずれの場合においても、必要な投薬量は、医師により疾患の重症度および他のパラメーターによって増加または低下されてもよい。例えば、使用できる組成物中の投薬量は、１〜１５００ｍｇ／日、または５〜１０００ｍｇ／日、または１０〜１０００ｍｇ／日、または５〜５００ｍｇ／日、またはその他の好適な投薬量であってもよい。所望の投薬量は、単回用量にて、または好適な間隔で投与される分割用量として、例えば１日あたり２、３あるいは４つ以上の分割用量にて適宜提供される。
【００８１】
本発明は、以下の実施例を参照してより容易に理解されるであろうが、これら実施例は発明を説明するために提供され、発明の範囲を制限するものではない。
【００８２】
実施例
以下の用語/略語を実施例において用いる：
2015514797.tif 000002
【００８３】
植物の抽出物
テルミナリア・エリプティカ植物の樹皮を、ＩＶＹＳＡgro（Pune，India）から購入した。証明のための顕微鏡試験および肉眼試験を、テルミナリア・エリプティカ植物の樹皮について行い、試料片は、Piramal Healthcare Limited（Goregaon, Mumbai, Maharashtra, Indi)の植物部門で保持されている。
【００８４】
植物樹皮を、小片に切断して、除湿機により乾燥させた。完全に乾燥した試料を、その後粉砕機を使用して粗く挽いた。
【００８５】
実施例１
乾燥したテルミナリア・エリプティカの粉砕樹皮（２００ｇ）を、メタノール（２Ｌ）を使用して４５℃で３時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール（１.６Ｌ）を用いて２回繰り返した。抽出物を合わせて、乾燥状態まで濃縮した。収量：４１.１８ｇ（２０.５９％）。
実施例１において得られた抽出物を、「実施例１の抽出物」として示す。
実施例１の抽出物は、０.７１％の生物活性マーカー（化合物１：実施例５に記載したＨＰＬＣ分析方法による評価）を含有していることが判った。
実施例１の抽出物を、ポリプロピレンバイアル中で４℃〜８℃の涼しい場所にて保存した。
【００８６】
実施例２
乾燥したテルミナリア・エリプティカの粉砕樹皮（１００ｇ）を、メタノール：水（９：１）（１Ｌ）を使用して、４５℃で３時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール：水（９：１）（７００ｍＬ）を用いて２回繰り返した。抽出物を、合わせて濃縮した。濃縮した抽出物を、凍結乾燥器（Edwards）を使用して凍結乾燥した。収量：５.２ｇ（５.２％）。
実施例２において得られた抽出物は、本明細書において「実施例２の抽出物」として示す。
実施例２の抽出物は、０.８９％の生物活性マーカー（化合物１：実施例５に記載したＨＰＬＣ分析方法による評価）を含有していることが判った。
実施例２の抽出物を、ポリプロピレンバイアル中で４℃〜８℃の涼しい場所にて保存した。
【００８７】
実施例３
乾燥したテルミナリア・エリプティカの粉砕樹皮（５０ｇ）を、メタノール：水（３：１）（５００ｍＬ）を使用して、４０℃±５℃で３時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、メタノール：水（３：１）（４００ｍＬ）を用いて２回繰り返した。この抽出物を、合わせて濃縮した。濃縮した抽出物を、凍結乾燥器（Edwards）を使用して凍結乾燥した。収量：７.６ｇ（１５.１２％）。この抽出物を、ポリプロピレンバイアル中で４℃〜８℃の涼しい場所にて保存した。
実施例３の抽出物は、０.４９％の生物活性マーカー（化合物１：実施例５に記載したＨＰＬＣ分析方法による評価）を含有していることが判った。
【００８８】
実施例４
乾燥したテルミナリア・エリプティカの粉砕樹皮（５０ｇ）を、蒸留水（５００ｍＬ）を使用して、４０℃±５℃で３時間攪拌することにより抽出した。この抽出過程を、蒸留水（４００ｍＬ）を用いて繰り返した。この抽出物を、合わせて濃縮した。濃縮した抽出物を、凍結乾燥器（Edwards）を使用して凍結乾燥した。収量：６.３ｇ（１２.６％）。この抽出物を、ポリプロピレンバイアル中で４℃〜８℃の涼しい場所にて保存した。
実施例４の抽出物は、０.６１％の生物活性マーカー（化合物１：実施例５に記載したＨＰＬＣ分析方法による評価）を含有していることが判った。
【００８９】
実施例５
生物活性マーカーの単離（化合物１）
実施例１の抽出物を、ＨＰＬＣ分析により分析した（条件は以下に示す）：
カラム：Unispere aqua C18, 150mm×4.6mm, ３μ
グラジエント：
【表１】
2015514797.tif 000003
【００９０】
実施時間：３０分間；  濃度：１０ｍｇ/ｍＬ、メタノール中
注入量：１０μＬ；流速：１ｍＬ/分；検出：ＵＶ２５４ｎｍ
保持時間９.５分のピークは、主要ピークであって、生物活性マーカー（化合物１）として同定された。この成分を単離して、下記のとおりに精製した。
【００９１】
実施例１の抽出物（１００ｇ）に、水（８Ｌ）およびポリアミド（３００ｇ）を添加した。この混合物を、６０℃で３時間攪拌して、濾過し、水（２Ｌ）により洗浄した。得られた残渣に、メタノール（８Ｌ）を添加して、１６時間ＲＴで攪拌して、濾過した。得られた残渣に、メタノール（８Ｌ）を添加して、８時間ＲＴで攪拌して、濾過した。メタノール抽出物の濾液を集めて、濃縮し、濃縮抽出物を得た（１０ｇ）。
【００９２】
生物活性マーカーを多く含む上記抽出物（化合物１；５ｇ）を、Ｃ１８フラッシュクロマトグラフィー（下記に示したとおりの条件）を用いて、各ロット（１.２５ｇ）にて精製した。
カラム：Ｒｅｄｉｓｅｐ Ｃ１８, ４３ｇ, １４ｃｍ×２ｃｍ
グラジエント：
【００９３】
【表２】
2015514797.tif 000004
サンプル充填剤：４ｇＣ１８材を用いて充填された１.２５ｇ乾燥物
流速：２５ｍＬ/分；検出：ＵＶ２５４ｎｍ
【００９４】
フラクションをＨＰＬＣ分析によりモニターした。フラクションが有意な量の生物活性マーカー（化合物１）を含有しており、一晩（〜１６時間）置くと結晶性固体が生じた。結晶を含むフラクションを集めて、濾過し、乾燥させて、生物活性マーカー（化合物１：１１３ｍｇ）を得た。
【００９５】
生物活性マーカーの分光分析データ：IR(KBr):3379, 1728, 1621, 1501, 1441, 1339, 1188, 1130, 1048, 974, 918, 753cm-1；1HNMR(500MHzおよびDMSO-d6):δ11.05(s, 1H), 10.88(br s, 1H), 10.72(br s, 1H), 7.75(s, 1H), 7.49(s, 1H), 5.47(s, 1H), 5.11(br s, 1H), 4.94(br s, 1H), 4.72(br s, 1H), 4.00(br s, 1H)および3.86(br d)1H, J=8.65, 3.55(m, 1H), 3.31(br s, 1H)および1.15(d, 3H J=6.2)；13CNMR(75MHzおよびDMSO-d6):δ159.56, 159.41, 149.14, 146.82, 141.57, 140.04, 137.19, 136.85, 114.96, 112.25, 112.01, 110.85, 108.68, 108.02, 100.65, 72.23, 70.53, 70.42, 70.34 and 18.35;MS:m/z(ESI)446.7(M-)．
【００９６】
ＭＳ、ＩＲおよびＮＭＲの分光分析データに基づいて、生物活性マーカーをエラグ酸、即ち４−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシド（化合物１）と同定した。さらに、その構造を、得られた分光分析データと、報告された文献のデータ（J.Nat. Products, 61, 901-906, 1998）と比較することにより確認した。
【化１】
2015514797.tif 000005
生物活性マーカー（化合物１またはエラグ酸、４−Ｏ−α−Ｌ−ラムノピラノシド）を、生体外での生物活性について試験し、この試験および結果を実施例６および実施例７に示した。
【００９７】
薬理学的アッセイ
ＤＧＡＴ-１およびＳＣＤ−１酵素の活性の阻害におけるテルミナリア・エリプティカ植物の抽出物の効力を、当業界で周知の下記の様々な薬理学的アッセイにより決定した。
【００９８】
生体外アッセイ
実施例６
ｈＤＧＡＴ−１アッセイ
ＤＧＡＴ−１アッセイを、文献（Eueopean Journal of Pharmacology., 650, 663-672(2011)）に記載されるように、Ｓｆ９細胞株において過剰発現させたヒトＤＧＡＴ−１酵素を用いて設計した。文献の開示内容を、アッセイ技術の教示のために参照により本明細書に組み込む。
【００９９】
ヒトＤＧＡＴ−１（ｈＤＧＡＴ−１）クローンのクローニングおよび発現
ｈＤＧＡＴ−１ＯＲＦ発現クローン（ｐＤＥＳＴベクター中ＲＺＰＤ０８３９Ｃ０９１４６）を、ＲＺＰＤ(Germany)から得た。ｈＤＧＡＴ−１遺伝子（ＮＭ＿０１２０７９）を、アンピシリン耐性マーカーと共にキンウワバ科（Autographa californica）の核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）の強力なポリヘドリンプロモーターのもとでｐＤＥＳＴ８ベクターにクローニングした。この組み換えプラスミドを、トランスフェクションによりバキュロウイルス・シャトルベクター（バクミド：bacmid）を含有するＤＨ１０ＢＡＣコンピテントセルに移入して、得られる細胞を、Bac-to-Bac baculovirus Expression System (Invitrogen, USA)に従い、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびゲンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）を含むルリアブロス（ＬＢ）寒天プレート上へ筋状に塗布した。白色コロニーを摘み取り、上記抗生物質を含むＬＢ寒天培地上に再度塗布して、３７℃で一晩インキュベートした。翌日に、ｈＤＧＡＴ−１遺伝子を含有する組み換えバクミドを有する単離白色コロニーを、抗生物質（アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）およびゲンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ））を含むルリア培地（１０ｍＬ）中に植菌して、オービタルシェーカー（New Brunswick）上で、３７℃、２００ｒｐｍにて終夜インキュベートした。ルリア培地（10ｍＬ）を取り出し、組み換えバクミドＤＮＡ（ｈＤＧＡＴ−１遺伝子を有する）を、Qiagen Mini prep kitを用いて調製して、ナノドロップ(Nanodrop)を用いて定量した。ｈＤＧＡＴ−１遺伝子を含むバクミドＤＮＡの濃度は、およそ９７ｎｇ／μＬであった。
【０１００】
Ｓｆ９細胞を使用するトランスフェクションおよびウイルス増幅
１〜３μｇのｈＤＧＡＴ−１バクミドＤＮＡを、６ウェル組織培養プレート中で仕様説明書に従って、Cellfectin(Invitrogen, USA)を使用して、Ｓｆ９細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされたＳｆ９細胞を、子ウシ血清不含の不完全グレース昆虫培地(Gibco R)ならびにAntibiotic-Antimycotic(100ユニット/mL)、ペニシリン(100μg/mL)、ストレプトマイシン硫酸塩(0.25μg/mL)およびアンホテリシンＢにおいて２７℃で５時間培養した。インキュベーション完了後に、培地を増殖培地[グレース昆虫培地；(Gibco(登録商標)）子ウシ血清およびAntibiotic-Antimycotic(100ユニット/mL)、ペニシリン(100μg/mL)、ストレプトマイシン硫酸塩(0.25μg/mL)およびアンホテリシンＢを含有する]に置換して、細胞を、２７℃で１２０時間インキュベーター内でさらに培養した。
【０１０１】
この培養中に、ウイルス粒子が昆虫内で形成され、分泌された。このウイルス含有上清を、１２０時間終了時に収集して、Biofuge statos遠心分離機(Heraeus 400)を使用して、５分間、１５００Ｘｇで遠心分離を行い、０.２２μｍフィルター(Millipore)を通して濾過した。それをＰ１の組み換えバキュロウイルスとして４℃で保存した。含有量＞１０５ｐｆｕ（プラーク形成単位）／ｍＬを、製造社指示書(Invitrogen Kit)に従い行なったプラークアッセイにより決定した。
【０１０２】
Ｐ１組み換えバキュロウイルスを、０.０５〜０.１のＭＯＩ（感染多重度）にてさらに増幅させて、１２０時間、グレース昆虫完全培地（５ｍＬ）中に５ｘ１０６Ｓｆ９細胞を含むＴ−２５フラスコ(Nunc)内で、Ｐ２組み換えバキュロウィルスを生成させて、その後５分間、１５００Ｘｇの遠心分離に供し、０.２２μｍのフィルター(Millipore)による濾過を行い、Ｐ２／（＞１０６ｐｆｕ／ｍＬ）組換えバキュロウイルスとして４℃で保存した。同様に、Ｐ３およびＰ４組換えバキュロウイルスを、０.０５〜０.１のＭＯＩの再感染によりさらに増幅させて、各々Ｐ３とＰ４の組換えバキュロウイルスを生成させて、次回使用時まで４℃で保存した。Ｐ４の組換えバキュロウイルスについてのウイルス価を決定して、これが１ｘ１０８ｐｆｕ／ｍＬであることが判った。Ｐ４（＞１０８ｐｆｕ／ｍＬ）組み換えバキュロウイルスを、最終的に用いて、５〜１０のＭＯＩにてｓｆ９細胞を感染させた。
【０１０３】
ミクロソーム調製
Ｓｆ９細胞（２ｘ１０６細胞／ｍＬ）を、５００ｍＬのスピナーフラスコ内のAntibiotic-Antimycotic(Gibco登録商標)を含むグレース昆虫細胞培地(Gibco)（２５０ｍＬ）中で増殖させて、５のＭＯＩにて、ｈＤＧＡＴ−１の組換えバキュロウイルス（２５ｍＬ）に感染させた。感染細胞を、２８℃で４８時間維持し、培地を室温で１０００Ｘｇにて遠心分離機に供し、細胞残渣を回収した。この残渣を、ＰＢＳ（ｐＨ７.４）により洗浄して、残留培地を除去した。
【０１０４】
次いで、この残渣をプロテアーゼカクテル錠(Roche)の１Ｘ量および社内調製したプロテアーゼ阻害混合物を含むミクロソーム調製緩衝液（１５ｍＬ）に懸濁させて、溶解物を２７Ｇのニードルに通して、その後４℃で超音波処理を穏やかに行うことにより、細胞を破砕した。細胞破片を分離して、核除去後上清（post nuclear supernatant、ＰＮＳ）である溶解物を、Biofuge statos遠心分離機(Heraeus 400)を用いて、４℃で１０分間１０００Ｘｇにて遠心分離を行なった。その後に、得られたＰＮＳを、Biofuge statos 遠心分離機(Heraeus)を用いて、４℃で３０分間１５０００Ｘｇにて遠心分離を行ない、ミトコンドリア除去後上清（post mitochondrial supernatant、ＰＭＳ）を分離した。最終的に、超遠心分離を、BeckmaTi-rotorを用いて４℃で１時間１００,０００Ｘｇにて行い、ミクロソーム沈殿物を得た。純度を高めるために、この沈殿物を、プロテアーゼ阻害剤混合物[アプロチニン（０.８μＭ）、ペプスタチンＡ（１０μＭ）およびロイペプチン（２０μＭ）-Sigma]の社内調製物を含有するミクロソーム調製緩衝液で２回洗浄した。
最後に、ミクロソーム残渣を、ミクロソーム調製緩衝液（１.５ｍＬ）に懸濁して、タンパク濃度をブラッドフォード法によって決定した。
ミクロソームを、生体外アッセイのために−７０℃で各々１００μＬのアリコートとして保存した。
【０１０５】
緩衝液および試薬調製
ストック溶液
ｈＤＧＡＴ−１アッセイ緩衝液ストック：アッセイ緩衝液（ｐＨ７.４）を、０.２５Ｍのスクロース(Sigma)および１ｍＭ ＥＤＴＡ(Sigma)を１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ(Sigma)に溶解することにより調製した。
停止液：１０ｍＬの停止液を作成するために、イソプロパノール（Qualigens）（７.８４ｍＬ）およびｎ−ヘプタン（Qualigens）（１.９６ｍＬ）を、脱イオン水（０.２ｍＬ）に添加した。
Ａ.Ｅ.Ｓ.Ｓ.Ｍ（アルカリ性エタノール停止混合液）：Ａ.Ｅ.Ｓ.Ｓ.Ｍ溶液（１０ｍＬ）を作るために、変性エタノール（１.２５ｍＬ）、脱イオン水（１.０ｍＬ）および１Ｎ ＮａＯＨ（Qualigens）（０.２５ｍＬ）を、停止液（７.５ｍＬ）に添加した。
シンチレーション溶液：２.５Ｌのシンチレーション溶液を作るために、トルエン（Merck）（１６６７ｍＬ）、トライトンＸ−１００(Sigma)（８３３ｍＬ）、２,５−ジフェニルオキサゾール（ＰＰＯ；Sigma）（１２.５ｇ）および（１,４−ビス（５−フェニル−２−オキサゾリル）ベンゼン（ＰＯＰＯＰ；Sigma）（５００ｍｇ）を混合した。
【０１０６】
処理用ストック(Working stock)
ｈＤＧＡＴ−１アッセイ緩衝液：０.１２５％ＢＳＡ（遊離脂肪酸, Sigma)を含む新たなｈＤＧＡＴ−１アッセイ緩衝液を使用前に調製した。
基質混合物の調製：２０４７.５μＭの１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロール（１９.５ｍＭ；Sigma）および２８０ ｎＣｉ／ｍＬの［１４Ｃ］オレオイル基−ＣｏＡ（０.１ｍＣｉ／ｍＬ America Radiolabelled Chemicals)を添加することにより、基質混合物を新たに調製し、ｈＤＧＡＴ−１アッセイ緩衝液を使用して最終容量を１０００μＬとした。
ｈＤＧＡＴ−１酵素調製物：酵素をｈＤＧＡＴ−１アッセイ緩衝液中で１ｍｇ／ｍＬの処理濃度に希釈し、この処理用酵素ストックの２.５μＬを、ｈＤＧＡＴ−１アッセイ（終濃度２５μｇ／ｍＬ）に使用した。
【０１０７】
試験サンプルの調製
試験サンプルを、以下のように調製した。各抽出物（実施例１の抽出物〜実施例７の抽出物）について、２０ｍｇ／ｍＬのストック溶液（１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中）を調製した。処理用ストックを、ｈＤＧＡＴ−１アッセイ緩衝液中で調製した。処理用ストック（１０μL）をアッセイ混合物（１００μＬ）に添加し、抽出物の最終濃度を５０μｇ／ｍＬにて得た。
実施例１の抽出物および実施例２の抽出物について、用量応答のための３つの異なる濃度（すなわち、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬ）を、ストック溶液の連続希釈により準備した。
生理活性マーカー（化合物１）は５０μｇ/ｍＬ濃度で試験した。
【０１０８】
アッセイ
基質混合液（６０μＬ）（上記のとおり）を、１００μＬのアッセイ全量に添加した。反応を、ｈＤＧＡＴ−１含有ミクロソームタンパク質(２.５μｇ)を添加することにより開始して、１０分間３７℃で培養した。この反応を、アルカリ性エタノール停止混合液（ＡＥＳＳＭ）（３００μＬ）を添加して停止させた。この反応は、放射活性を有する［１４Ｃ］オレオイル基−ＣｏＡを１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロールの３位の水酸基（ＯＨ）へ導入して、後に上部のヘプタン相中に抽出される放射活性を有するトリグリセリド（［１４Ｃ］トリグリセリド）を形成させることを含む。このように形成した放射活性トリグリセリド生成物を、ｎ−ヘプタン（６００μＬ）を添加して、有機相へ移行させる。この上部のヘプタン（２５０μＬ）を、シンチレーション溶液（４ｍＬ）に加えて、液体シンチレーション計測器(Packard;1600CA)を用いて、１分当たりの壊変数（ｄｐｍ）計測値として測定した。％阻害を、媒体に関して算出した。結果を表１に示す。
【０１０９】
実施例１の抽出物および実施例２の抽出物のストック溶液をｈＤＧＡＴ−１アッセイ緩衝液にて連続希釈して、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの濃度で用量応答を決定した。結果を表２に示す。
【０１１０】
表１：ｈＤＧＡＴ−１阻害アッセイ
【表３】
2015514797.tif 000006
＊ＩＮ５５３０：国際公開第２００４／０４７７５５号パンフレットに記載のように社内で調製された、標準化合物として使用される（２−（（１ｓ,４ｓ）−４−（４−（４−アミノ−７,７−ジメチル−７Ｈ−ピリミド［４,５−ｂ］［１,４］オキサジン−６−イル）フェニル）シクロヘキシル）酢酸
結論：テルミナリア・エリプティカ植物の抽出物（実施例１の抽出物および実施例２の抽出）および生理活性マーカー(化合物１)は、ｈＤＧＴＡ−１阻害アッセイにおいて活性であることが判った。
【０１１１】
表２：ｈＤＧＡＴ−１阻害アッセイにおける用量応答
【表４】
2015514797.tif 000007
＊ＩＮ５５３０：標準化合物、２−（（１ｓ,４ｓ）−４−（４−(４−アミノ−７,７−ジメチル−７Ｈ−ピリミド［４,５−ｂ］［１,４］オキサジン−６−イル）フェニル）シクロヘキシル）酢酸
結論：実施例１の抽出物および実施例２の抽出物は、用量依存性の生体外ＤＧＡＴ−１阻害を示さない。
【０１１２】
実施例７
ＳＣＤ−１アッセイ
文献[European Journal of Pharmacology., 618, 28-36(2009)]に記載された方法に従って、アッセイを実施した。この開示内容をアッセイの教示として参照により本明細書に組み込む。
【０１１３】
ＳＣＤ−１酵素の調製
ＳＣＤ−１酵素を、国際公開第２００８／０７４８３５号パンプレットに記載のとおり、ラット肝臓ミクロソームから調製した。この開示内容をアッセイの教示として参照により本明細書に組み込む。
雄のスプラーグドーリーラット（１５０〜１７５ｇ）を、２日間絶食させて、次いで３日間低脂肪食餌を与え、ＳＣＤ−１活性を誘導した。次いで、ラットを屠殺し、ラットの肝臓を摘出して、氷上に置いた。肝臓を、最終的に鋏で細かく切断して、ポリトロンホモジナイザーを使用して、４℃で均質化緩衝液（１５０ｍＭ ＫＣｌ,２５０ｍＭ スクロース、５０ｍＭ トリスＨＣｌ（ｐＨ７.５）、５ｍＭ ＥＤＴＡおよび１.５ｍＭ 還元グルタチオン）中で均質化した。均質化物を、４℃、２０分間、１５００Ｘｇにて遠心分離した。上清を、収集して、各々４℃、２０分間、１０,０００Ｘｇにて遠心分離を２回行った。得られた上清を集めて、４℃、６０分間、１００,０００Ｘｇにて遠心分離を行なった。この上清を廃棄し、ミクロソーム沈殿物を均質化緩衝液に再懸濁して、等分割して−８０℃で保存した。再懸濁した沈殿物のタンパク質含有量を、ブラッドフォード分析によって同定した。
【０１１４】
緩衝液および試薬の調製
ＳＣＤ−１分析緩衝液の調製：緩衝液は、１００ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４（Qualigens）および１００ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（Qualigens）（ｐＨ７.４）から構成される。
リン酸カリウム緩衝液の調製：緩衝液は、２００ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４（Qualigens）および２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４（Qualigens）（ｐＨ７.０）から構成される。
【０１１５】
ＳＣＤ−１抽出緩衝液の調製：緩衝液は、２５０ｍＭ スクロース(Sigma)、１５ｍＭＮ−アセチルシステイン(Sigma)、５ｍＭ ＭｇＣｌ２(Sigma)、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ(Sigma)、０.１５Ｍ ＫＣｌ(Sigma)および６２ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７.０）から構成される。
β−ＮＡＤＨの調製：β−ＮＡＤＨ(Sigma)の２０ｍＭ ストック溶液を、ＳＣＤ−１アッセイ緩衝液中で調製して、−７０℃で保存した。β−ＮＡＤＨの処理用ストックを、使用直前にアッセイ緩衝液を用いて、このストックを８ｍＭに希釈して調製した。
ステアロイルｃｏ−Ａの調製：ステアロイルｃｏ−Ａ(Sigma)の１.６５ｍＭストック溶液を、ＳＣＤ−１アッセイ緩衝液中で調製して、−７０℃で保存した。
放射性カクテルの調製：１μＣｉ／ｍＬ ステアロイル（９,１０３Ｈ）ＣｏＡ(American Radiolabeled Chemicals)（１００μＬ）および１.６５ｍＭ ステアロイルｃｏ−Ａ（１４４μＬ）を、ＳＣＤ−１アッセイ緩衝液（５５１６μＬ）に添加した。
【０１１６】
マルチスクリーンプレート内の活性炭ベッドの調製
３３％の活性炭(Sigma)溶液を、アッセイ緩衝液中で作成した。この溶液（２５０μＬ）を、マルチスクリーンプレートの各ウェルに添加した。真空マニホールドにより該プレートを真空に供して、炭ベッドを形成した。プレートを使用時まで保存した。
【０１１７】
試験サンプルの調製
試験サンプルを、以下のように調製した。各抽出物（実施例１の抽出物および実施例２の抽出物）について、２０ｍｇ／ｍＬのストック溶液（１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中）を調製した。処理用ストックを、ＳＣＤ−１アッセイ緩衝液中で調製した。処理用ストック（１０μＬ）をアッセイ混合物（１００μＬ）に添加し、抽出物の最終濃度を５０μｇ／ｍＬにて得た。
実施例２の抽出物について、用量応答のための３つの異なる濃度（即ち、２５μｇ/ｍＬ、５０μｇ/ｍＬおよび１００μｇ/ｍＬ）を、ストック溶液の連続希釈により準備した。
生理活性マーカー（化合物１）を、５０μｇ/ｍＬ濃度で試験した。
【０１１８】
アッセイ
ミクロソーム（６２.５μｇ）を、試験サンプルにより１５分間処理した。その後、β−ＮＡＤＨ処理用ストック（２５μＬ）および９,１０−３ＨステアロイルＣｏＡを含有する放射性カクテル（２０μＬ）を添加し、この混合物を、２５℃で３０分間インキュベートした。この反応を、過塩素酸の添加により停止させた。次いで、このプレートを遠心分離に供して、各ウェルからの上清を、真空マニホールドを用いて、炭ベッドから保存プレートへと通過させた。３Ｈ２Ｏを含有する濾液を、シンチレーション液（４ｍＬ）を入れたシンチレーションバイアルに移して、ｃｐｍ計測値を、液体シンチレーション計数器を使用して測定した。％阻害を、媒体コントロールを対照として算出した。
用量応答を、実施例２の抽出物のストック溶液を連続希釈することにより、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの濃度で決定した。
陽性コントロールを、各試験にてアッセイした。結果を、表３および４に示す。
【０１１９】
表３：ＳＣＤ−１阻害アッセイ
【表５】
2015514797.tif 000008
＊ＭＦ１５２：標準化合物［Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 19, 5214-5217(2009)]。
結論：テルミナリア・エリプティカ植物の抽出物（実施例１の抽出物および実施例２の抽出物）および生物活性マーカー（化合物１）は、ＳＣＤ−１阻害アッセイにおいて活性であることが判った。
【０１２０】
表４：用量応答ＳＣＤ−１阻害アッセイ
【表６】
2015514797.tif 000009
＊ＭＦ１５２：標準化合物［Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 19, 5214-5217(2009)]。
結論：実施例２の抽出物は、生体外ＳＣＤ−１阻害アッセイにおいて用量依存的阻害を示した。
【０１２１】
実施例８
細胞を基にしたトリグリセリド（ＴＧ）合成アッセイ
実施例１の抽出物および実施例２の抽出物を、文献[Pharmacol. Res., 618, 28-36((2009)]に報告された方法により、ＨｅｐＧ２細胞中のトリグリセリド合成を阻害するその能力について評価した。この開示内容を、アッセイの教示として参照により本明細書に組み込む。
【０１２２】
緩衝液、試薬および培地の調製
イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）：粉末ＥＭＥＭ(Sigma)の１つの小袋を、１Ｌの三角フラスコに添加した。空の小袋を、蒸留水（１０ｍＬ）で濯いだ。粉末を、マグネチックスターラーを使用して、蒸留水（９００のｍＬ）に溶解した。炭酸水素ナトリウム(Sigma)（１.５ｇ）、ピルビン酸ナトリウム(Sigma)（１０ｍＬ）およびペニシリンストレプトマイシン(Gibco)（１ｍＬ）も加えた。適切に混合した後に、ｐＨを７.２に調整して、容量を１Ｌとした。該培地をフィルター滅菌して４℃で保存した。
【０１２３】
不活性化ウシ胎児血清(ＦＢＳ)：ウシ胎児血清(Hyclone)を、３０分間５６℃に設定した温浴中に置いた。次いで、ＦＢＳを、５０ｍＬのポリプロピレンチューブに等分（４５ｍＬ）して、−８０℃で保存した。
【０１２４】
リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）：ＰＢＳ(Sigma)の１つ小袋の内容物を、蒸留水（９００ｍＬ）に溶解した。ｐＨを、７.２に調整して、容量を１Ｌとした。次いで、フィルター殺菌して、−２０℃で保存した。
【０１２５】
トリプシン−ＥＤＴＡ溶液：トリプシン−ＥＤＴＡ溶液(Sigma)を解凍して、ポリプロピレンチューブ（５０ｍＬ）に無菌的に等分割して（４５ｍＬ）、−２０℃で保存した。
【０１２６】
試験サンプルの準備
試験サンプルを、以下のように調製した。実施例１の抽出物および実施例２の抽出物について、２０ｍｇ／ｍＬのストック溶液（１００％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中）を準備した。処理用ストック（１０μＬ）をアッセイ混合物（１００μＬ）に添加し、抽出物の最終濃度を５０μｇ／ｍＬにて得た。
実施例１の抽出物および実施例２の抽出物について、用量応答のための３つの異なる濃度（即ち、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬ）を、ストック溶液の連続希釈により準備した。
【０１２７】
ＨｅｐＧ２細胞の培養
凍結したＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ番号ＨＢ−８０６５）のバイアルを、３７℃の水中で解凍した。バイアルの全内容物を、ＥＭＥＭ（９ｍＬ）および不活性化ウシ胎児血清（１ｍＬ）を入れたＴ−７５組織培養フラスコへ移した。フラスコを、３７℃で５％ＣＯ２にて湿度制御されたインキュベータ内でインキュベートした。このフラスコを、細胞増殖について観察した。細胞が〜７０％コンフルエントとなった場合に、使用した培地を廃棄して、細胞単層を、ＰＢＳ（５ｍＬ）で洗浄した。全細胞層が覆われるように、トリプシンＥＤＴＡ溶液（１.５〜２ｍＬ）をフラスコに添加した。フラスコから全ての細胞が剥離した時に、１０％のウシ胎児血清を加えたＥＭＥＭ（６ｍＬ）を添加して、混合し、均一な細胞懸濁液を得た。細胞懸濁液を、５分間、１０００ｒｐｍで遠心分離し、細胞沈殿物を得た。細胞沈殿物を、１０％のウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ（６ｍＬ）中で穏やかに分散させた。６つのＴ−７５フラスコを上記のとおりに調製して、細胞懸濁液（１ｍＬ）を、各フラスコに添加した。フラスコを、湿度制御されたインキュベータ内で、５％ＣＯ２、３７℃で２４時間インキュベートした。培地を、４８時間後毎に換えた。７２時間までに、フラスコは〜７０％のコンフルエントとなり、播種する準備が整った。
【０１２８】
アッセイ
ＨｅｐＧ２細胞の懸濁液を、１０％のウシ胎児血清を含有するＥＭＥＭ培地中で調製した。細胞数を、血球計を用いて測定して、２４ウェルプレート用に細胞数を４ｘ１０５／ｍＬ／ウェルに調整した。実験終了時に生存試験を実施するため、同様のプレートをさらに作成した。プレートを、湿度制御されたインキュベータ内で５％ＣＯ２にて３７℃で、細胞がコンフルエントとなるまでインキュベートした。細胞が７０〜８０％コンフルエントとなった時点で、培地を廃棄して、１０μＭの標準化合物（ＭＦ−１５２）または５０μｇ／ｍＬの実施例１の抽出物または実施例２の抽出物を含有する新鮮培地に置きかえた。ＤＭＳＯを０.１％の最終濃度にて媒体ウェルに添加した。プレートを、１８時間まで、終夜インキュベートした。翌日、培地を廃棄して、０.１％のＢＳＡ（脂肪酸不含）を加えた標準化合物／抽出物／ＤＭＳＯを含有するものと置換した。
【０１２９】
１ウェルあたり２μＣｉの１４Ｃ標識された酢酸を添加して、プレートを、３７℃で６時間インキュベートして、その後に培地を廃棄して、脂質を抽出した。
【０１３０】
植物抽出物の細胞毒性効果を評価するため、同様のプレート上で、ＭＴＳ（３−（４,５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホニル）−２Ｈ−テトラゾリウム試薬を使用して２時間のインキュベーション後に細胞生存試験を実施した。
【０１３１】
脂質抽出
抽出を以下のプロトコルのとおりに実行した：
実験終了時に、細胞を、氷冷ＰＢＳにより２回洗浄した。細胞を、１ｍＬの冷ＰＢＳ中にこそぎ落とし、４ｍＬのメタノール：クロロホルム（２：１）を入れた１５ｍＬガラス管へピペットで移して、ボルテックス・ミキサーを用いて攪拌した。この管を４０００ｒｐｍで５分間回して、上清を新しい管に移した。大部分のタンパク質を含有する沈殿物を廃棄した。５０ｍＭ クエン酸（１ｍＬ）、水（２ｍＬ）およびクロロホルム（１ｍＬ）を、上記上清に添加して、ボルテックス・ミキサーを使用して撹拌した。混濁した２相の混合物を得た。この管を、冷却していない遠心分離器において、１５分間、３５００ｒｐｍで回転させた。低部にクロロホルム相および上部に水／メタノール相を得た。２相間には主に沈殿タンパク質から成る境界も存在する。上部の水／メタノール相を、相境界には触れずに廃棄した。脂質を含有する下部クロロホルム相を、新しい管に移して、加熱ブロック上で蒸発させた。脂質を、クロロホルム：メタノール（２：１）（２００μＬ）に再溶解させた。トリグリセリドを、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸（８５：１５：０.５）の溶媒系を使用して、ＴＬＣシリカプレート上で単離した。放射性同位体で標識されていないトリグリセリド標準物も同時に行い、さらに全てのスポットをトリグリセリド標準物と共に同時にスポットした。ＴＬＣプレートを、ヨード蒸気に暴露して、トリグリセリドスポットを掻き取って、シンチレーション液（４ｍｌ）を含むシンチレーションバイアルに移した。放射活性を、ｃｐｍにて液体シンチレーション計数器で計測し、阻害を、ビヒクルを基準として計算した。結果を表５に示す。
【０１３２】
実施例１の抽出物および実施例２の抽出物のストック溶液を連続希釈することにより、用量応答を、２５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの濃度で決定した。結果を表６に示す。
【０１３３】
表５：トリグリセリド合成の阻害
【表７】
2015514797.tif 000010
＊ＭＦ１５２：標準化合物
[Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 19, 5214-5217(2009)]。
結論：テルミナリア・エリプティカ植物の抽出物（実施例１の抽出物および実施例２の抽出物）は、細胞を基にしたトリグリセリド合成アッセイにおいて活性であることが判った。
【０１３４】
表６：トリグリセリド合成阻害の用量応答
【表８】
2015514797.tif 000011
*ＭＦ１５２：標準化合物[Bioorganic & Medical Chemistry Letters, 19, 5214-5217(2009)]
結論：実施例１の抽出物および実施例２の抽出物が、トリグリセリド合成の用量依存的阻害を示した。
【０１３５】
生体内試験
生体内試験を、動物実験統制管理委員会（ＣＰＣＳＥＡ）および動物倫理委員会（ＩＡＥＣ）承認のガイドラインに従って行なった。
【０１３６】
実施例９
高脂肪食（ＨＦＤ）誘導性の体重増加に対する実施例１の抽出物の効果
げっ歯類動物の高脂肪食（ＨＦＤ）誘導性肥満モデルは、抗肥満剤の効果を評価するために有用なモデルであることが報告されている[Obesity, 17(12), 2127-2133(2009)]。５８％ｋｃａｌの脂肪を含有する高脂肪食を給餌することはマウスの肥満の原因となることが報告されている(Metabolism, 47 , 1354-1359(1998))。さらに、高脂肪食で飼育されたマウスは、普通食で飼育されたマウスよりも、有意に高い体重および有意に重い内臓脂肪組織（例えば、精巣上体の脂肪組織、腹膜後方の脂肪組織および腸間膜の脂肪組織）を示した[Life Sciences, 77, 194-204(2005)]。
【０１３７】
ＨＦＤ誘導性体重増加モデルは、様々な天然生成物に関する抗肥満効果の評価について報告される(BMC Complementary and Alternative Medicine, 5:9, 1-10, (2005);BMC Complementary and Alternative Medicine, 6:9, 1-9(2006))。
【０１３８】
マウスにおけるＨＦＤ誘導性体重増加試験を行い、実施例１の抽出物の効果を評価した。
【０１３９】
雄のＣ５７ＢＬ／６ｊマウス（社内；Central Animal Facility, Piramal Healthcare Limited, Goregaon, Mumbai, Maharashtra, India)を、ＨＦＤ(60% kcal，D12492，Research Diets, USA)にて２週間馴化させた。体重増加を示すマウスを、試験のために選抜して、各々１０匹のマウスから構成する処置群へ無作為に分けた。
【０１４０】
試験サンプルの調製
実施例１の抽出物の懸濁液を、ポリエチレングリコール４００（３０％）(PEG 400, Fisher Scientific, India)および０.５％カルボキシメチルセルロース（７０％）(CMC, Sigma, America)中で調製した。
【０１４１】
アッセイ
実施例１の抽出物を、５００ｍｇ／ｋｇ体重の投薬量で、１日１回経口投与した。オルリスタット(Biocon, India)を、標準薬として使用して、１５ｍｇ／ｋｇ体重の投与量で、１日に２回経口投与した。別の群の１０匹のマウスに、正常なコントロールとして低脂肪食(LFD, 10% kcal, D12450B, Research Diet, USA)を与えた。媒体を、１０ｍＬ／ｋｇ体重の投与量で、ＨＦＤおよびＬＦＤ対照群に投与した。
【０１４２】
この処置を６０日間継続した。体重および食餌摂取を、毎日モニターした。体重の％変化（１日目からの体重の％増加）および累積的な食餌摂取データを計算した。６１日目に、血液サンプル（〜２００μＬ／マウス）を、イソフルラン麻酔下にて、ヘパリン処理済（５０ＩＵ／ｍＬ）の微小遠心管に収集した。種々の血漿生化学パラメーターを評価するために、血漿を、４℃で１００００ｒｐｍの遠心分離により分離した。生化学分析を、ＢＳ−４００自動分析装置(Mindray, China)で行った。その後、マウスを屠殺して、器官/組織を解剖して、肝臓、心臓、腎臓、精巣上体の脂肪および腹膜後方の脂肪を秤量した。全てのデータを、一元配置分散分析、その後ダンネットのポストホックテストにより統計学的有意差を分析し、Ｐ＜０.０５値を有意差とみなした。全ての分析を、Windows(GraphPad Software, San Diego(CA), USA)用のGraphPad Prism version 4.00を用いて行なった。結果を、表７、表８および表９に示す。
【０１４３】
表７：マウスにおけるＨＦＤ誘導性の体重増加に対する効果
【表９】
2015514797.tif 000012
* p<0.05、** p<0.01、HFD+賦形剤に対して；平均±S.E.M.
ＨＦＤ＋媒体群と比較して、実施例１の抽出物は、体重増加量の有意な阻害を示した。
【０１４４】
表８：累積的食餌摂取に対する効果
【表１０】
2015514797.tif 000013
平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.
ＨＦＤ＋媒体群と比較した場合に、実施例１の抽出物においては累積的食餌摂取における有意な低下を観察しなかった。
【０１４５】
表９：脂肪組織重量に対する効果
【表１１】
2015514797.tif 000014
＃全脂肪＝精巣上体の脂肪＋腹膜後方の脂肪
＊ｐ＜０.０５、＊＊ｐ＜０.０１、ＨＦＤ＋媒体に対して；平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ.
実施例１の抽出物は、ＨＦＤ＋媒体群と比較して、脂肪組織重量の良好な低下を示した。
【０１４６】
グルコース、トリグリセリド、コレステロール、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アルブミン、クレアチニンおよび尿素のようなパラメーターに対する血漿生化学分析は、実施例１の抽出物および媒体の群間の有意差を示さなかった。臓器重量（心臓、肝臓および腎臓）は、何ら有意差を示さなかった。
【０１４７】
結論：ＨＦＤのマウスに対する実施例１の抽出物を用いた処置により、体重増加における有意な低下が生じた。体重増加におけるこの低下は、食餌摂取量における有意な低下なしに達成され、さらに歴然とした脂肪組織重量（脂肪量）の低下があった。実施例１の抽出物は、高脂肪食（ＨＦＤ）誘導性肥満モデルにおいて抗肥満活性を示した。
【０１４８】
実施例１０
テルミナリア・エリプティカの抽出物を含有する錠剤の製造
【表１２】
2015514797.tif 000015
【０１４９】
方法
工程１：実施例１の抽出物の５００ｍｇを秤量して、＃４０メッシュによってそれを篩過する。
工程２：２１２ｍｇの微晶質セルロース、４０ｍｇのクロスカルメロースナトリウム、８ｍｇのヒドロキシプロピルセルロースを秤量して、＃４０メッシュによって篩過する。
工程３：工程１の成分を、非せん断性ブレンダー中で工程２の成分と共に１０分間混合する。
工程４：好適な圧縮機を使用して、この混合物を圧縮する。
工程５：好適なサイズスクリーンを用いて得られた薄片を粉砕して、所望の粒子サイズを得る。所望の顆粒量が得られるまで、この工程を繰り返す。
工程６：追加の顆粒化賦形剤(extragranular excipients)、即ち前ゼラチン化デンプン、コロイド状二酸化ケイ素、タルクを秤量して、＃４０メッシュによって成分を篩過する。
工程７：非せん断性ブレンダー中で工程６の成分を工程５の造粒物と共に１５分間混合する。
工程８：８ｍｇのステアリン酸マグネシウムを秤量して、＃６０メッシュによってそれを篩過する。
工程９：篩過されたステアリン酸マグネシウムを、工程７の混合物と２分間混合する。
工程１０：この混合物を所望の機器を用いて圧縮する。
【０１５０】
コーティング溶液の調製
工程１：必要な水の量に、コーティング剤を分散させる。
工程２：３０分間の均質化する。
工程３：ナイロン布によって溶液を濾過する。
工程４：錠剤をコーティングして、所望の重量を得る。
工程５：該錠剤を、約２０〜３０分間コーティングパンにて乾燥させる。
【国際調査報告】
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