(57)【要約】  誘導多能性幹細胞を産生するための改善された細胞リプログラミングのための方法及び組成物。
2015534830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸及び／又はアンチ−ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸を分化細胞中に導入する工程、及び該分化細胞をｉＰＳＣの発生に適した条件下で処理する工程を含む、誘導された多能性幹細胞を産生する方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＯＴ１Ｌ、ＳＵＶ３９Ｈ１からなる群から選択されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３０２（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）、ｍｉＲ−３６７（３ｐ及び５ｐ）、ｍｉＲ３７２からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡは、Ｌｅｔ７、ｍｉＲ−２９からなる群から選択されるｍｉＲＮＡにハイブリダイズすることができる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記アンチ−ｍｉＲＮＡは、ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＢＣＬ２、ＤＮＭ３Ｂ、ＤＮＭ３Ａ、ＢＣＬ２、及びＣＤＫ６からなる群から選択されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるｍｉＲＮＡを標的とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡは、アンチ−Ｌｅｔ７ａ及びアンチ−ｍｉＲ２９ａからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つの追加の再プログラミング因子を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記追加の再プログラミング因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、及びＳＶ４０ラージＴ抗原、及び／又はこれらをコードする核酸からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記培地は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ｍｉＲ−３０２（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）、ｍｉＲ−３６７（３ｐ及び５ｐ）、ｍｉＲ３７２、アンチ−Ｌｅｔ７ａ、アンチ−ｍｉＲ２９ａ、及び任意でＳＶ４０ラージＴ抗原、又はこれらをコードする核酸を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１から７に記載のいずれかの方法によって得られたｉＰＳＣ培養物。
【請求項１１】
分化細胞中に導入する、ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸及び／又はアンチ−ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸、及び任意でｉＰＳＣの発生及び成長に適した他の因子を含む、誘導された多能性幹細胞を産生するための培地。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＯＴ１Ｌ、ＳＵＶ３９Ｈ１からなる群から選択されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる、請求項９に記載の培地。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−３０２（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）、ｍｉＲ−３６７（３ｐ及び５ｐ）、ｍｉＲ３７２からなる群から選択される、請求項９に記載の培地。
【請求項１４】
前記少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡは、Ｌｅｔ７、ｍｉＲ−２９からなる群から選択されるｍｉＲＮＡにハイブリダイズすることができる、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記アンチ−ｍｉＲＮＡは、ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＢＣＬ２、ＤＮＭ３Ｂ、ＤＮＭ３Ａ、ＢＣＬ２、及びＣＤＫ６からなる群から選択されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるｍｉＲＮＡを標的とする、請求項９に記載の培地。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡは、アンチ−Ｌｅｔ７ａ及びアンチ−ｍｉＲ２９ａからなる群から選択される、請求項９に記載の培地。
【請求項１７】
少なくとも１つの追加の再プログラミング因子を更に含む、請求項９に記載の培地。
【請求項１８】
前記追加の再プログラミング因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、及びＳＶ４０ラージＴ抗原、及び／又はこれらをコードする核酸からなる群から選択される、請求項１７に記載の培地。
【請求項１９】
Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ｍｉＲ−３０２（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）、ｍｉＲ−３６７（３ｐ及び５ｐ）、ｍｉＲ３７２、アンチ−Ｌｅｔ７ａ及びアンチ−ｍｉＲ２９ａ、及び任意でＳＶ４０ラージＴ抗原、又はこれらをコードする核酸を含む、請求項１８に記載の培地。
【請求項２０】
ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸及び／又はアンチ−ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸、及び適当な送達系を含む、ｉＰＳＣの産生のために細胞を再プログラミングするためのキット。
【請求項２１】
また提供されるのは、多能性表現型の発生を誘発することに関与する因子の発現を誘発することができるｍｉＲＮＡを同定する方法であって、
ヒト胚幹細胞（「ｈＥＳＣ」）中のｍｉＲＮＡの発現をモニターする工程と、分化細胞と比較して該ｈＥＳＣ中で過剰発現されているｍｉＲＮＡを単離する工程を含む、方法。
【請求項２２】
多能性表現型の発生を誘発することに関与する因子の発現を阻害することができるｍｉＲＮＡを同定する方法であって、
分化細胞中のｍｉＲＮＡの発現をモニターする工程と、ｈＥＳＣと比較して該分化細胞中で過剰発現されているｍｉＲＮＡを単離する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は２０１２年１１月２日に出願された米国仮出願Ｎｏ．６１／７２１，９９０の優先権を主張し、その全体を参照することによって本出願にその内容を組み込む。
マイクロＲＮＡを用いる細胞リプログラミングを改善する方法、組成物、及びキットを記載する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞は、疾病を理解し、新たな治療法を開発するための理想的な手段である。しかしながら、必要な量の幹細胞を得ることは難しい。
【０００３】
分化細胞の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）への形質転換は、再生医療のための多能性細胞のより扱いやすい供給源を提供して、幹細胞生物学に大革命を起こした。多数の正常及び異常細胞供給源からのｉＰＳＣの誘導は、細胞療法及び再生医療における終局的用途のための患者特異的幹細胞の産生を可能にした。
【０００４】
２００６年に、高橋及び山中（Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors, Cell. 2006;126:663-676）は、山中因子又はＯＫＳＭ因子と名付けられた−Ｏｃｔ４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２及びｃ−Ｍｙｃの４つの転写因子の発現によって、分化細胞が誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣｓ）に転換されることを実証した。オリジナルの４因子リプログラミング方法に対するいくつもの代替手段及び改良が長年にわたって考案されてきた。これらには、Ｎａｎｏｇ及びＬｉｎ２８などの代替的リプログラミング因子の異所性発現（ectopic expression）、ｐ５３及びｐ２１などのリプログラミングに対する障壁として作用する経路の操作、安定的な遺伝的修飾を回避するためのリプログラミングタンパク質の一過性発現、及びリプログラミングプロセスの効率を増加させる化学的阻害剤の含有を含む（Plath K, Lowry WE.. Nat Rev Genet. 12:253-265.2011）。他の転写因子、シグナル伝達因子、及び薬理学的分子の使用を含む、いくつかのＯＫＳＭ因子に対する数個の代替手段が存在する。しかしながら、少なくとも１つの多能性幹細胞転写因子、通常−Ｏｃｔ４が、効率的なｉＰＳＣリプログラミングに必要とされる（Huangfu, et al. Nat. Biotechnol.26, 795-797. 2008;Huangfu, D. et al Nat. Biotechnol. 26, 1269-1275.2008;Judson et al., Nat. Biotechnol. 27, 459-461.2009;Melton et al., Nature 463, 621-626.2010; Yoshida et al., Cell Stem Cell 5, 237-241. 2009）。したがって、リプログラミングは、依然として１つ以上のオリジナル山中因子の送達及び外因性発現に大いに依存している。最新のｉＰＳＣ産生のための標準戦略は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃ（ＯＳＫＭ）の異所性発現(ectopic expression)に依存している。当該戦略の第一世代は、転写因子をコードするＤＮＡを宿主細胞に遺伝子導入するために、レトロウイルス及び／又はレンチウイルス送達系を用いていた。しかしながら、当該方法では、非常に好ましくない、ウイルスベクターの宿主ゲノムへの組み込みという結果を生じる。第二世代戦略はしたがって、アデノウイルス、プラスミドＤＮＡ、エピソームＤＮＡ、又は小環状ＤＮＡを用いた宿主細胞の一過性遺伝子導入を試みた。しかしながら、当該戦略でも、宿主ゲノムに外来核酸が組み込まれる可能性がある。当該方法はまた、ゲノムへのエピソームベクターの組み込みについて細胞をスクリーニングすることが必要になる。ゲノムＤＮＡを収集し、ＰＣＲがエピソームベクター上の領域に特異的なプライマーで実施される。陰性とされる細胞が、続けるのに適する細胞である。
【０００５】
有力であるものの、従来のｉＰＳＣ産生には、多数の工程及びプロセスのかなり低い効率性（０．２％〜１．０％）並びにＯｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、及び／又はＭｙｃを含む少なくとも１つの多能性幹細胞転写因子の強制的発現の必要性を含む、いくつかの制限がある。これらの制限は、大きな患者群からのヒトｉＰＳＣクローンの産生などのハイスループット方式でのｉＰＳＣ技術の使用を妨げる。
【０００６】
第三世代戦略は、非ＤＮＡによる技術を用い、必要な転写因子を送達するために、組換えタンパク質、ｍＲＮＡ、及び／又は小分子の使用を含む。１つの可能性のある非ＤＮＡによる技術は、転写因子の発現に影響を及ぼすマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の操作を含む。ｍｉＲＮＡは小さな非コードＲＮＡであり、メッセンジャーＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）への配列特異的ハイブリダイゼーションを通じて遺伝子発現を制御し、これにより標的メッセンジャーＲＮＡの翻訳を阻害するか当該ＲＮＡの分解を指示して、遺伝子をサイレンシングする。ｍｉＲＮＡは、細胞増殖、分化、アポトーシス、形態形成、腫瘍形成、及び代謝を含む、多くの重要な生物学的工程に関与する。ヒト胚幹細胞（「ｈＥＳＣ」）は、ｍｉＲＮＡの特有なセットを発現することが知られており、分化細胞と比較して腫瘍形成性ｍｉＲＮＡを過剰発現し、腫瘍抑制性ｍｉＲＮＡを低発現している。
【０００７】
ｍｉＲＮＡは、当該ｍｉＲＮＡにより標的とされた遺伝子の発現を増加又は減少させるように操作することができる。標的遺伝子の発現は、細胞におけるｍｉＲＮＡの異所的発現により減少させることができる。異所的に発現したｍｉＲＮＡは次にその標的ｍＲＮＡにハイブリダイズすることにより翻訳を下方制御する。または、アンチ−ｍｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを、細胞において異所的に発現させることができる。アンチ−マイクロＲＮＡは、論理的にｍｉＲＮＡにハイブリダイズするように設計された短いオリゴヌクレオチドで、これにより、ｍｉＲＮＡのその標的へのハイブリダイゼーションを阻害する。
【０００８】
近年、これらのｈＥＳＣ  ｍｉＲＮＡのいくつかのｍｉＲＮＡは、ＯＳＫＭ因子の組み合わせとともに発現させた場合、ｉＰＳＣリプログラミングを促進することが示された(Judson et al., Nat. Biotechnol. 27, 459-461, 2009)。これらのｍｉＲＮＡは、胚幹細胞において選択的に発現され、ＥＳＣ表現型の維持を補助すると考えられているｍｉＲＮＡのファミリーに属している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ｉＰＳＣを産生するためのプロトコールにｍｉＲＮＡ操作を統合するための戦略を開発することは有益である。
【００１０】
ｉＰＳＣ産生において使用する新規のｍｉＲＮＡを同定するためのシステムを有することは有益である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本開示は、誘導多能性幹細胞を産生するための細胞リプログラミングに有益な方法、組成物、及びキットを提供する。
【００１２】
ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸及び／又はアンチ−ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸を分化細胞に導入する工程、及びｉＰＳＣの発生に適した条件下で該分化細胞を処理する工程を含む誘導多能性幹細胞を産生する方法が提供される。当該ｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ３０２ａ、ｍｉＲ３０２ｂ、ｍｉＲ３０２ｃ、ｍｉＲ３０２ｄ、ｍｉＲ３７２、ｍｉＲ３６７（３ｐ）、ｍｉＲ３６７（５ｐ）が含まれうるが、これらに制限されない。当該アンチ−ｍｉＲＮＡには、Ｌｅｔ７ｃに対する阻害剤、ｍｉＲ２９ａに対する阻害剤が含まれうるが、これらに制限されない。
【００１３】
ｉＰＳＣ培養物も提供される。当該ｉＰＳＣ培養物は、ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸及び／又はアンチ−ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸を分化細胞に導入する工程、及びｉＰＳＣの発生に適した条件下で当該分化細胞を処理する工程を含む方法によって得られる。
【００１４】
ｉＰＳＣ産生用のリプログラミング細胞のためのキットも提供される。当該キットは、ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸及び／又はアンチ−ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸、及び適当な送達系を含む。当該送達系は、形質転換及び遺伝子導入であってよいが、これらに制限されない。
【００１５】
多能性表現型の発生を誘導することに関与する因子の発現を誘導することができるｍｉＲＮＡを同定する方法も提供される。この方法は、ヒト胚幹細胞（「ｈＥＳＣ」）中のｍｉＲＮＡの発現をモニターする工程、及び分化細胞と比較して該ｈＥＳＣ細胞で過剰発現されたｍｉＲＮＡを単離する工程を含む。
【００１６】
多能性表現型の発生を誘導することに関与する因子の発現を阻害することができるｍｉＲＮＡを同定する方法であり、この方法は、分化細胞中のｍｉＲＮＡの発現をモニターする工程、及びｈＥＳＣと比較して該分化細胞で過剰発現されたｍｉＲＮＡを単離する工程を含む。
【００１７】
他の側面及び態様は、以下の記載、例及び図より明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、多能性及び分化におけるマイクロＲＮＡの理論的役割に関する模式図を示す。
【００１９】
【図２】図２は、細胞リプログラミングにおけるマイクロＲＮＡの提案された作用機序に関する模式図を示す。
【００２０】
【図３】図３はフィーダーなし条件下（ｆｅｅｄｅｒ−ｆｒｅｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）におけるＣ５及びＴｇのリプログラミング効率に関するｍｉＲＮＡ／アンチ−ｍｉＲＮＡの効果を試験した実験結果を示す。
【００２１】
【図４】図４はｍｉＲＮＡを用いたリプログラミング効率がフィーダー条件下（Ｆｅｅｄｅｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）で顕著に促進されたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本開示は、ＤＮＡエレメントを用いることなく細胞をリプログラミングして誘導多能性幹細胞を産生するのに有用な組成物、方法及びキットを提供する。
【００２３】
誘導多能性幹細胞を産生する方法であって、該方法は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／又は少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡ及び／又はアンチ−ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸を含むリプログラミング因子のセットを、該少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／又は該少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡ及び／又は該ｍｉＲＮＡ及び／又はアンチ−ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸が該細胞に入り込むことができる充分な条件下において、分化細胞と接触させる工程、及びｉＰＳＣの発生に適した条件下で該分化細胞を処理する工程を含む。
【００２４】
一実施態様では、当該分化細胞は、臍帯血ＣＤ３４＋細胞である。
【００２５】
一実施態様では、当該ｍｉＲＮＡは、ヒト胚幹細胞において過剰発現されているｍｉＲＮＡである。
【００２６】
一実施態様では、当該少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＯＴ１Ｌ、及びＳＵＶ３９Ｈからなる群から選択されるｍＲＮＡにハイブリダイズするか、ハイブリダイズすると予測されるｍｉＲＮＡである。
【００２７】
一実施態様では、当該少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ヒト胚幹細胞において高く発現されているｍｉＲＮＡからなる群から選択される。例として、当該ｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−３０２（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）、ｍｉＲ−３６７（３ｐ及び５ｐ）、及びｍｉＲ３７２が含まれうるが、これらに制限されない。
【００２８】
一実施態様では、当該少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡは、Ｌｅｔ７及びｍｉＲ−２９からなる群から選択されるｍｉＲＮＡに、ハイブリダイズするか、ハイブリダイズすると予測される。また別の実施態様では、当該アンチ−ｍｉＲＮＡは、ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＢＣＬ２、ＤＮＭ３Ｂ、ＤＮＭ３Ａ、ＢＣＬ２、及びＣＤＫ６からなる群から選択されるｍＲＮＡにハイブリダイズするか、ハイブリダイズすると予測されるｍｉＲＮＡにハイブリダイズする。
【００２９】
一実施態様では、当該少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡは、体細胞において高く発現されているｍｉＲＮＡに、ハイブリダイズするか、ハイブリダイズすると予測される。例として、当該アンチ−ｍｉＲＮＡには、アンチ−Ｌｅｔ７ａ及びアンチ−ｍｉＲ２９ａが含まれうるが、これらに制限されない。
【００３０】
一実施態様では、当該分化細胞は、少なくとも１つの追加のリプログラミング因子に更に接触させる。本出願において使用されるように、用語「リプログラミング因子」とは、誘導多能性幹細胞への分化細胞の形質転換に関与しうる、いかなる実体を含む。リプログラミング因子は、マイクロＲＮＡ、アンチ−マイクロＲＮＡ、並びにＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、及びＳＶ４０ラージＴ抗原などの他の因子、及び／又はこれらをコードする核酸を含むが、これらに制限されない。
【００３１】
一実施態様では、ｍｉＲＮＡ及び／又はアンチ−ｍｉＲＮＡの組み合わせは、少なくとも１つのリプログラミング因子の代わりとして選択される。一実施態様では、ｍｉＲＮＡ及びアンチ−ｍｉＲＮＡの群は、リプログラミングプロトコールのＳＶ４０ラージＴ抗原の代わりとして選択される。一実施態様では、ｍｉＲ−３０２（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）、ｍｉＲ−３６７（３ｐ及び５ｐ）、ｍｉＲ３７２、アンチ−Ｌｅｔ７ａ及びアンチ−ｍｉＲ２９ａの群は、ＳＶ４０ラージＴ抗原と置き換わる。
【００３２】
一実施態様では、当該リプログラミング因子は、エピソームベクター、核酸、又はタンパク質の形態でもよい。
【００３３】
一実施態様では、当該方法は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ｍｉＲ−３０２（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）、ｍｉＲ−３６７（３ｐ及び５ｐ）、ｍｉＲ３７２、アンチ−Ｌｅｔ７ａ及びアンチ−ｍｉＲ２９ａ、及び場合によってＳＶ４０ラージＴ抗原、又はこれらをコードする核酸を分化細胞と接触させる工程を含む。
【００３４】
別の実施態様では、分化細胞は、これらに制限されないが、形質転換、遺伝子導入によるなどの、リプログラミング因子の取り込みを助けるような実体と更に接触させるか、又はエレクトロポレーションによるなどの、リプログラミング因子の取り込みを助けるような方法で操作される。当業者は、使用される細胞のタイプ及び送達されるリプログラミング因子のタイプによって適当な実体又は操作を選択することができるであろう。一実施態様では、このような実体又は操作は、臍帯血ＣＤ３４＋細胞にエピソームベクターを送達するのに適当である。例として、エピソームベクターは、Ｐ３  ４Ｄ−ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭ  Ｘ  溶液（Ｌｏｎｚａ，  Ｂａｓｅｌ，  ＣＨ）及び４Ｄ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭシステム（Ｌｏｎｚａ，  Ｂａｓｅｌ，  ＣＨ）を用いて臍帯血ＣＤ３４＋細胞に送達される。ＬＯＮＺＡ  ４Ｄ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭシステムは、電流を適用することにより細胞膜に小さな穴を瞬間的に作成することに基づく技術を利用している。ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭプログラム及び細胞特異的解決法を発展させる総合的方法は、細胞質へだけでなく核膜を通過して核へ核酸基質(nucleic acid substrates)を送達することをも可能にした。これは最大９９％もの高い遺伝子導入効率を可能にし、いかなる細胞増殖からも独立して遺伝子導入を成功させる。
【００３５】
更なる実施態様では、当該方法は、フィーダー細胞なしで、動物由来成分を使わない、ｃＧＭＰ適合培地を用いて実施される。
【００３６】
誘導多能性幹細胞を産生するための培地も提供され、当該培地は、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／又は少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡ及び／又はｍｉＲＮＡ及び／又はアンチ−ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸が細胞に入り込むことができる充分な条件下で、該少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／又は該少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡ及び／又は該ｍｉＲＮＡ及び／又は該アンチ−ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸、並びに任意でｉＰＳＣの発生及び成長に適した他の因子を含む、リプログラミング因子のセットを含む。
【００３７】
一実施態様では、当該ｍｉＲＮＡは、ヒト胚幹細胞において過剰発現されている。
【００３８】
一実施態様では、当該少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＯＴ１Ｌ、及びＳＵＶ３９Ｈ１からなる群から選択されるｍＲＮＡにハイブリダイズするか、ハイブリダイズすると予測されるｍｉＲＮＡである。
【００３９】
一実施態様では、当該少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ヒト胚幹細胞において高く発現されているｍｉＲＮＡからなる群から選択される。例として、当該ｍｉＲＮＡには、ｍｉＲ−３０２（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）、ｍｉＲ−３６７（３ｐ及び５ｐ）、ｍｉＲ３７２が含まれうるが、これらに制限されない。
【００４０】
一実施態様では、当該少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡは、Ｌｅｔ７及びｍｉＲ−２９からなる群から選択されるｍｉＲＮＡにハイブリダイズするか、ハイブリダイズすると予測される。また別の態様では、当該アンチ−ｍｉＲＮＡは、ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＢＣＬ２、ＤＮＭ３Ｂ、ＤＮＭ３Ａ、ＢＣＬ２、及びＣＤＫ６からなる群から選択されるｍＲＮＡにハイブリダイズするか、ハイブリダイズすると予測されるｍｉＲＮＡにハイブリダイズする。
【００４１】
一実施態様では、当該少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡは、体細胞において高く発現されているｍｉＲＮＡにハイブリダイズするか、ハイブリダイズすると予測される。例として、当該アンチ−ｍｉＲＮＡには、アンチ−Ｌｅｔ７ａ及びアンチ−ｍｉＲ２９ａが含まれうるが、これらに制限されない。
【００４２】
一実施態様では、当該培地は、少なくとも１つの追加のリプログラミング因子を更に含む。リプログラミング因子は、マイクロＲＮＡ、アンチ−マイクロＲＮＡ、及びＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、及びＳＶ４０ラージＴ抗原などの他の因子、及び／又はこれらをコードする核酸を含むが、これらに制限されない。
【００４３】
一実施態様では、当該リプログラミング因子は、エピソームベクター、核酸、又はタンパク質の形態である。
【００４４】
一実施態様では、当該培地は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ｍｉＲ−３０２（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）、ｍｉＲ−３６７（３ｐ及び５ｐ）、ｍｉＲ３７２、アンチ−Ｌｅｔ７ａ及びアンチ−ｍｉＲ２９ａ、並びに任意でＳＶ４０ラージＴ抗原、又はこれらをコードする核酸を含む。
【００４５】
一実施態様では、ｍｉＲＮＡ及び／又はアンチ−ｍｉＲＮＡの組合せは、少なくとも１つのリプログラミング因子の代わりとして選択される。一実施態様では、ｍｉＲＮＡ及びアンチ−ｍｉＲＮＡの群は、リプログラミングプロトコールのＳＶ４０ラージＴ抗原の代わりとして選択される。一実施態様では、ｍｉＲ−３０２（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）、ｍｉＲ−３６７（３ｐ及び５ｐ）、ｍｉＲ３７２、アンチ−Ｌｅｔ７ａ及びアンチ−ｍｉＲ２９ａの群は、ＳＶ４０ラージＴ抗原と置き換わる。
【００４６】
また別の実施態様では、当該培地は、遺伝子導入などの、リプログラミング因子の取り込みを助けるような実体を更に含む。当業者は、使用される細胞のタイプ及び送達されるリプログラミング因子のタイプによって適当な実体を選択することができるであろう。一実施態様では、該実体は、Ｐ３  ４Ｄ−ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭ  Ｘ  溶液（Ｌｏｎｚａ，  Ｂａｓｅｌ，  ＣＨ）などの、臍帯血ＣＤ３４＋細胞にエピソームベクターを送達するのに適している。
【００４７】
更なる実施態様では、当該培地は、フィーダー細胞なしで、例えば、動物由来成分を使わない、ｃＧＭＰ適合培地を用いるｉＰＳＣを産生するのに適当なものである。
【００４８】
リプログラミング細胞のためのキットもまた提供され、当該キットは、リプログラミング因子、及び、任意で形質転換培地を含む。当該因子及び培地栄養補助剤は、個別の成分として、キットの一以上の他の成分とあらかじめ混合されたものとして、又はあらかじめ混合された細胞培地として提供されうる。キットのこれらの成分は、濃縮された成分ストックとして、又はあらかじめ混合された成分ストックとして、濃縮された細胞培地として、又は使用濃度の細胞培地として提供されうる。
【００４９】
一実施態様では、当該キットは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／又は少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡ、及び／又はｍｉＲＮＡ及び／又はアンチ−ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸が細胞に入り込むことができる充分な条件下で、当該少なくとも１つのｍｉＲＮＡ及び／又は当該少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡ、及び／又は当該ｍｉＲＮＡ及び／又はアンチ−ｍｉＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸を含む、リプログラミング因子のセットを含んでもよい。
【００５０】
一実施態様では、当該少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ＣＤＫＮ１Ａ、ＤＯＴ1Ｌ、ＳＵＶ３９Ｈ１からなる群から選択されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる。
【００５１】
一実施態様では、当該少なくとも１つのｍｉＲＮＡは、ヒト胚幹細胞において高く発現されている群から選択される。例として、これらには、ｍｉＲ−３０２（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）、ｍｉＲ−３６７（３ｐ及び５ｐ）、ｍｉＲ３７２が含まれうるが、これらに制限されない。
【００５２】
一実施態様では、当該少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡは、Ｌｅｔ７及びｍｉＲ−２９からなる群から選択されるｍｉＲＮＡとハイブリダイズすることができる。別の実施態様では、当該アンチ−ｍｉＲＮＡは、ＭＹＣ、ＬＩＮ２８、ＢＣＬ２、ＤＮＭ３Ｂ、ＤＮＭ３Ａ、ＢＣＬ２、及びＣＤＫ６からなる群から選択されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができるｍｉＲＮＡを標的にする。
【００５３】
一実施態様では、当該少なくとも１つのアンチ−ｍｉＲＮＡは、体細胞において高く発現されている群から選択される。例として、これらには、アンチ−Ｌｅｔ７ａ及びアンチ−ｍｉＲ２９ａが含まれうるが、これらに制限されない。
【００５４】
一実施態様では、当該キットは、少なくとも１つの追加のリプログラミング因子を更に含む。更なる実施態様では、当該追加のリプログラミング因子は、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、及びＳＶ４０ラージ抗原、及び／又はこれらをコードする核酸からなる群から選択される。
【００５５】
一実施態様では、当該培地は、更に少なくとも１つの追加のリプログラミング因子を、エピソームベクター、核酸、又はタンパク質の形態で含む。
【００５６】
一実施態様では、当該キットは、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ｍｉＲ−３０２（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）、ｍｉＲ−３６７（３ｐ及び５ｐ）、ｍｉＲ３７２、アンチ−Ｌｅｔ７ａ及びアンチ−ｍｉＲ２９ａ、及び任意でＳＶ４０ラージＴ抗原、又はこれらをコードする核酸を含む。
【００５７】
他の実施態様では、当該キットは、形質転換又は遺伝子導入を助ける実体などの、リプログラミング因子の細胞による取り込みを助ける少なくとも１つの実体を更に含む。
【００５８】
更なる実施態様では、当該キットは、培地又は培地を作成するのに役に立つストックを含む。更なる実施態様では、当該培地は、フィーダー細胞なしで、例えば動物由来成分を使わない、ｃＧＭＰ適合培地を用いたｉＰＳＣを産生するのに適当なものである。
【００５９】
下記の例は例証としてのみ用いられる。他の側面や態様は、本願の記載、例及び図から容易に明らかとなるであろう。
【実施例】
【００６０】
例１：更なるリプログラミング因子の存在下又は不存在下におけるアンチ−ｍｉＲＮＡとの組合せでのｍｉＲＮＡの使用
図１に図示されているように、天然のｍｉＲＮＡ発現は所与の細胞の分化状態に影響すると考えられている。ｈＥＳＣは、分化細胞とは異なるｍｉＲＮＡのセットを発現することが示されてきた。従って、ｈＥＳＣと関連するｍｉＲＮＡと体細胞と関連するｍｉＲＮＡに特異的なアンチ−ｍｉＲＮＡとの組合せは、ｉＰＳＣが産生されうる効率を増加させ得ると仮定された。図１参照。
例２：フィーダーにおけるエピソームベクターによるヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のリプログラミング
【００６１】
下記の実験手順が利用された：
【００６２】
材料
無血清培地（ＳＦＭ）［５０％  ＩＭＤＭ、５０％  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、１：１００  既知組成合成脂質、１×ＩＴＳ−Ｘ  栄養補助剤（インスリン−トランスフェリン−セレニウム）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２ｍＭ  グルタミン］；
サイトカイン：１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＬ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、  １０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３
ＭＥＦ培地：［ＤＭＥＭ，１０％  ＦＢＳ］
ｈＥＳＣ培地［ノックアウトＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、２０％  ノックアウト血清代替物、１×ＮＥＡＡ、５５ｎＭ  β−メルカプトエタノール、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ
ＭＥＦ−条件培地
１．  Ｔ７５フラスコを細胞播種の少なくとも１日前にゼラチンで被膜する。
２．  ２０ｍｌＭＥＦ培地のＴ７５フラスコ中に５×１０６ＭＥＦ細胞を播種し、一晩付着させる。
３．  培地を除去し、１×ＰＢＳで１回洗浄し、２０ｍｌｈＥＳＣ培地を加えて一晩インキュベーションする。
４．  次の日条件培地を回収し、４℃で保存する。
５．  ＭＥＦを廃棄するまで毎日７日間にわたり条件培地を回収する。
６．  回収培地を混合し、フィルター滅菌して−２０℃で保存する。使用前に新鮮なｂＦＧＦ（ｆ．ｃ．１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。
他の試薬
ゼラチン
【００６３】
方法
【００６４】
工程１：４〜５日でのヒトＣＤ３４＋細胞の再生及び拡張
０日目
ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞（１，０００，０００細胞以下）１バイアルを１２ウェルプレートの１ウェルに解凍して入れ、細胞を初期刺激するために４〜５日間、サイトカイン（１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＬ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３）を補充した無血清培地（ＳＦＭ）１ｍｌにて培養する。
２日目
細胞を回収し、１２ウェルプレートの２ウェルに再度播く。新鮮な０．５ｍｌＳＦＭを各ウェルに添加する。
【００６５】
工程２：ヒトＣＤ３４＋細胞のリプログラミング
０日目
１．１５ｍｌコニカルチューブに細胞を回収する。細胞を数える。１０６細胞を新しいチューブに移し、細胞をペレット化する（９０×ｇ、５秒間）。培地を取り除き、あらかじめ混合したＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭ溶液：１０μｇエピソームベクター（８μｇ  ｐＥＢ−Ｃ５＋２μｇ  ｐＥＢ−Ｔｇ又は８μｇ  ｐＥＢ−Ｃ５のみ）を含む１００μｌ初期細胞ｐ３に細胞を再懸濁する。混合し、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭキュベットに移す。
２．細胞を４Ｄ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭにかける。
３．４Ｄ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭでの処理後、ホールピペットを用いて５００μｌのあらかじめ温めてあったＳＦＭを添加し、１．５ｍｌのあらかじめ温めてあったＳＦＭを含有する１２ウェルプレートの１ウェルに細胞を移す。低酸素状態（３％  Ｏ２インキュベーター）に細胞を置く。
１日目
０．１％ゼラチンで６ウェルプレートを被膜し、製造者の提案するプロトコールにしたがってＭＥＦフィーダー（ミリポア、カタログ番号ＰＭＥＦ−ＣＦ）を播種する。
２日目
ヌクレオフェクトした（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｅｄ）ＣＤ３４＋細胞を回収し、遠心沈殿する。６ｍｌＭＥＦ培地に細胞を再懸濁し、６ウェルプレートの１ウェルのＭＥＦフィーダー中に播種する。低酸素状態（３％  Ｏ２インキュベーター）に細胞を置く。
３日目
ｈＥＳＣ培地に換える。１日おきに新鮮なｈＥＳＣ培地に換える。
１０日目
１０日目からコロニーが拾い上げるのに充分大きくなるまでＭＥＦ−条件培地（ＭＥＦ−ＣＭ）において細胞を培養する。
ｉＰＳＣコロニーは１４日目から１６日目に可視化されるべきである。
例３：ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のエピソームベクターによる動物由来成分を含まないｃＧＭＰ適合培地におけるリプログラミング
【００６６】
下記の実験手順が利用された。
【００６７】
材料
無血清培地  （ＳＦＭ）：［５０％  ＩＭＤＭ、５０％  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、１：１００  既知組成合成脂質、１×ＩＴＳ−Ｘ  栄養補助剤（インスリン−トランスフェリン−セレニウム）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２ｍＭ  グルタミン
サイトカイン：１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＬ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３
ＭＥＦ培地  ［ＤＭＥＭ、  １０％  ＦＢＳ］
動物由来成分を含まない、ｃＧＭＰ適合、培地
ビトロネクチン
【００６８】
方法
【００６９】
工程１：４〜５日でのヒトＣＤ３４＋細胞の再生及び拡張
０日目
ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞（１，０００，０００細胞以下）１バイアルを１２ウェルプレートの１ウェルに解凍して入れ、細胞を初期刺激するために４〜５日間、サイトカイン（１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＬ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３）を補充した無血清培地（ＳＦＭ）１ｍｌにて培養する。
２日目
細胞を回収し、１２ウェルプレートの２ウェルに再度播く。新鮮な０．５ｍｌＳＦＭを各ウェルに添加する。
【００７０】
工程２：ヒトＣＤ３４＋細胞のリプログラミング
０日目
１．１５ｍｌコニカルチューブに細胞を回収する。細胞を数える。１０６細胞を新しいチューブに移し、細胞をペレット化する（９０×ｇ、５秒間）。培地を取り除き、あらかじめ混合したＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭ溶液：１０μｇエピソームベクター（８μｇｐＥＢ−Ｃ５＋２μｇｐＥＢ−Ｔｇ又は８μｇｐＥＢ−Ｃ５のみ）を含む１００μｌ初期細胞ｐ３に細胞を再懸濁する。混合し、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭキュベットの１０ウェルに移す。
２．細胞を４Ｄ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭにかける。
３．４Ｄ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭでの処理後、ホールピペットを用いて５００μｌのあらかじめ温めてあったＳＦＭを移し、１．５ｍｌのあらかじめ温めてあったＳＦＭを含有する１２ウェルプレートの１ウェルに該細胞を移す。低酸素状態（３％  Ｏ２インキュベーター）に細胞を置く。
１日目
ビトロネクチンで６ウェルプレートを被膜する。
２日目
ヌクレオフェクトしたＣＤ３４＋細胞を回収し、遠心沈殿する。動物由来成分を含まない、ｃＧＭＰ、適合培地に細胞を再懸濁する。ビトロネクチンで被膜した６ウェルプレートの１ウェルに細胞を播種する。低酸素状態（３％  Ｏ２インキュベーター）に細胞を置く。１日おきに培地を換える。
ｉＰＳＣコロニーは８日目から１０日目に可視化されるはずである。
【００７１】
例４：ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞の動物由来成分を含まないｃＧＭＰ適合培地におけるエピソームベクター及びｍｉＲＮＡによるリプログラミング
【００７２】
下記の実験手順が利用された。
【表１】
2015534830.tif 000003
【００７３】
材料：
無血清培地（ＳＦＭ）：５０％  ＩＭＤＭ、５０％  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、１：１００  既知組成合成脂質、１×ＩＴＳ−Ｘ  栄養補助剤（インスリン−トランスフェリン−セレニウム）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２ｍＭ  グルタミン。
サイトカイン：１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＬ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３。
ＭＥＦ培地：ＤＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ。
Ｌｏｎｚａ  動物由来成分を含まない  ｃＧＭＰ適合、培地
ビトロネクチン
【００７４】
工程１：４〜５日でのヒトＣＤ３４＋細胞の再生及び拡張
０日目
ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞（１，０００，０００細胞以下）１バイアルを１２ウェルプレートの１ウェルに解凍して入れ、細胞を初期刺激するために４〜５日間サイトカイン（１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＬ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３）を補充した無血清培地（ＳＦＭ）１ｍｌにて培養する。
２日目
細胞を回収し、１２ウェルプレートの２ウェルに再度播く。新鮮な０．５ｍｌＳＦＭを各ウェルに添加する。
【００７５】
工程２：ヒトＣＤ３４＋細胞のリプログラミング
０日目
１．１５ｍｌコニカルチューブに細胞を回収する。細胞を数える。１０６細胞を新しいチューブに移し、細胞をペレット化する（９０×ｇ、５秒間）。培地を取り除き、あらかじめ混合したＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭ溶液：５０ｎｍｏｌの各マイクロＲＮＡを含む２００μｌ初期細胞ｐ３に細胞を再懸濁する。混合し、１０ウェルのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭストリップ（２０μｌ／ウェル、１０５細胞／ウェル）に移す。
２．細胞をプログラムＥＯ−１１７で４Ｄ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭにかける。
３．４Ｄ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭでの処理後、各ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭウェルに８０μｌのあらかじめ温めてあったＳＦＭを添加し、１０ウェルから、１．５ｍｌのあらかじめ温めてあったＳＦＭを含有する１２ウェルプレートの１ウェルに該細胞を移す。低酸素状態（３％  Ｏ２）インキュベーターに細胞を置く。
１日目
ビトロネクチンで６ウェルプレートを被膜する。
２日目
１．１５ｍｌコニカルチューブに細胞を回収する。細胞を数える。１０６細胞を新しいチューブに移し、細胞をペレット化する（９０×ｇ、５秒間）。培地を取り除き、あらかじめ混合したＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭ溶液：１０μｇエピソームベクター（８μｇ  ｐＥＢ−Ｃ５＋２μｇ  ｐＥＢ−Ｔｇ又は８μｇ  ｐＥＢ−Ｃ５のみ）及び５０ｎｍｏｌの各マイクロＲＮＡを含む２００μｌ初期細胞ｐ３に細胞を再懸濁する。混合し、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭストリップ（２０μｌ／ウェル）に移す。
２．細胞数を１０５細胞／ウェルとなるように調整する。ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭ溶液、エピソームベクター、及びｍｉＲを細胞数に合わせるよう調整する。
３．細胞を４Ｄ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭにかける。
４．４Ｄ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭでの処理後、各ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭウェルに８０μｌのあらかじめ温めてあったＳＦＭを添加し、１０ウェルから、１．５ｍｌのあらかじめ温めてあったＳＦＭを含有する１２ウェルプレートの１ウェルに該細胞を移す。低酸素状態（３％  Ｏ２）インキュベーターに細胞を置く。
４日目
ヌクレオフェクトしたＣＤ３４＋細胞を回収し、遠心沈殿する。動物由来成分を含まない、ｃＧＭＰ適合、培地に細胞を再懸濁する。ビトロネクチンで被膜した６ウェルプレートの１ウェルに細胞を播種する。低酸素状態（３％  Ｏ２）インキュベーターに細胞を置く。１日おきに培地を換える。
ｉＰＳＣコロニーは１０日目から１４日目に可視化されるべきである。
例５：フィーダーにおけるエピソームベクター及びマイクロＲＮＡによるヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞のリプログラミング
【表２】
2015534830.tif 000004
【００７６】
下記の実験手順が利用された。
材料
無血清培地（ＳＦＭ）［５０％  ＩＭＤＭ、５０％  Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１２、１：１００  既知組成合成脂質、１×ＩＴＳ−Ｘ  栄養補助剤（インスリン−トランスフェリン−セレニウム）、５０μｇ／ｍｌ  アスコルビン酸、５ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、２ｍＭ  グルタミン］
サイトカイン  ［１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＬ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３］
ＭＥＦ培地［ＤＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ］
ｈＥＳＣ培地［ノックアウトＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、２０％  ノックアウト血清代替物、１×ＮＥＡＡ、５５ｎＭ  β−メルカプトエタノール、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ］
ＭＥＦ−条件培地
１．  Ｔ７５フラスコを細胞播種の少なくとも１日前にゼラチンで被膜する。
２．  ２０ｍｌＭＥＦ培地のＴ７５フラスコ中に５×１０６ＭＥＦ細胞を播種し、一晩付着させる。
３．  培地を除去し、１×ＰＢＳで１回洗浄し、２０ｍｌｈＥＳＣ培地を加えて一晩インキュベーションする。
４．  次の日条件培地を回収し、４℃で保存する。
５．  ＭＥＦを廃棄するまで毎日７日間にわたり条件培地を回収する。
６．  回収培地を混合し、フィルター滅菌して−２０℃で保存する。使用前に新鮮なｂＦＧＦ（ｆ．ｃ．１０ｎｇ／ｍｌ）を添加する。
工程１：４〜５日でのヒトＣＤ３４＋細胞の再生及び拡張
０日目
ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞（１，０００，０００細胞以下）１バイアルを１２ウェルプレートの１ウェルに解凍して入れ、該細胞を初期刺激するために４〜５日間、サイトカイン（１００ｎｇ／ｍｌ  ＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＬ、２０ｎｇ／ｍｌ  ＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３）を補充した無血清培地（ＳＦＭ）１ｍｌにて培養する。
２日目
該細胞を回収し、１２ウェルプレートの２ウェルに再度播く。新鮮な０．５ｍｌＳＦＭを各ウェルに添加する。
工程２：ヒトＣＤ３４＋細胞のリプログラミング
０日目
１．１５ｍｌコニカルチューブに細胞を回収する。細胞を数える。１０６細胞を新しいチューブに移し、細胞をペレット化する（９０×ｇ、５秒間）。培地を取り除き、あらかじめ混合したＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭ溶液：５０ｎｍｏｌ各マイクロＲＮＡを含む２００μｌ初期細胞ｐ３に細胞を再懸濁する。混合し、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭストリップ（２０μｌ／ウェル、１０５細胞／ウェル）の１０ウェルに移す。
２．細胞をプログラムＥＯ−１１７で４Ｄ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭにかける。
３．４Ｄ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭでの処理後、各ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭウェルに８０μｌのあらかじめ温めてあったＳＦＭを添加し、１０ウェルから、１．５ｍｌのあらかじめ温めてあったＳＦＭを含有する１２ウェルプレートの１ウェルに該細胞を移す。低酸素状態（３％  Ｏ２インキュベーター）に細胞を置く。
１日目
０．１％ゼラチンで６ウェルプレートを被膜し、製造者の提案するプロトコールに従ってＭＥＦフィーダー（ミリポア、カタログ番号ＰＭＥＦ−ＣＦ）を播種する。
２日目
１．１５ｍｌコニカルチューブに細胞を回収する。細胞を数える。１０６細胞を新しいチューブに移し、細胞をペレット化する（９０×ｇ、５秒間）。培地を取り除き、あらかじめ混合したＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭ溶液：１０μｇエピソームベクター（８μｇ  ｐＥＢ−Ｃ５＋２μｇ  ｐＥＢ−Ｔｇ又は８μｇ  ｐＥＢ−Ｃ５のみ）及び５０ｎｍｏｌの各マイクロＲＮＡを含む２００μｌ初期細胞ｐ３に細胞を再懸濁する。混合し、ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭストリップ（２０μｌ／ウェル）に移す。
２．細胞数を１０５細胞／ウェルとなるように調整する。ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭ溶液、エピソームベクター、及びｍｉＲを細胞数に合わせるよう調整する。
３．細胞をプログラムＥＯ−１１７で４Ｄ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭにかける。
４．４Ｄ  ＮＵＣＬＥＯＦＥＣＴＯＲＴＭでの処理後、各ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎＴＭウェルに８０μｌのあらかじめ温めてあったＳＦＭを添加し、１０ウェルから、１．５ｍｌのあらかじめ温めてあったＳＦＭを含有する１２ウェルプレートの１ウェルに該細胞を移す。低酸素状態（３％  Ｏ２インキュベーター）に細胞を置く。
４日目
ヌクレオフェクトしたＣＤ３４＋細胞を回収し、遠心沈殿する。２ｍｌＭＥＦ培地に細胞を再懸濁し、６ウェルプレートの１ウェルのＭＥＦフィーダー中に播種する。低酸素状態（３％  Ｏ２インキュベーター）に細胞を置く。
５日目
ｈＥＳＣ培地に換える。１日おきに新鮮なｈＥＳＣ培地に換える。
１５日目
１５日目からコロニーが拾い上げるのに充分大きくなるまでＭＥＦ−条件培地（ＭＥＦ−ＣＭ）において細胞を培養する。
ｉＰＳＣコロニーは１１日目から１４日目に可視化されるべきである。
例６：他のリプログラミング因子との様々な組合せでのｍｉＲＮＡ／アンチ−ｍｉＲＮＡ組合せの使用
【００７７】
下記のｍｉＲＮＡ又はこれらを標的とするアンチ−ｍｉＲＮＡの組合せの効果：
【表３】
2015534830.tif 000005
【００７８】
ｉＰＳＣは、下記のリプログラミング因子をコードするエピソームベクタ−によってＣＤ３４＋細胞から産生された：
【表４】
2015534830.tif 000006
例４
【００７９】
実験は、フィーダー細胞及び動物由来成分を含まないｃＧＭＰ適合培地中でｍｉＲＮＡを用いるリプログラミングの効率を試験するために実施された。図３及び４を参照されたい。フィーダー細胞条件下においては、ｉＰＳＣコロニーの数は、ｍｉＲＮＡなしの場合の４５と比較して、ｍｉＲＮＡが添加された場合には２７０であった。動物由来成分を含まないｃＧＭＰ適合培地では、ｉＰＳＣコロニーの数は、ｍｉＲＮＡなしの場合の４と比較して、ｍｉＲＮＡが添加された場合には２０であった。両者の場合で、リプログラミング効率は顕著に促進されている。更に、図に示される通り、ｍｉＲ−３０２（ａ、ｂ、ｃ及びｄ）、ｍｉＲ−３６７（３ｐ及び５ｐ）、ｍｉＲ３７２、アンチ−Ｌｅｔ７ａ及びアンチ−ｍｉＲ２９ａの群は、プロトコール中のＳＶ４０ラージＴ抗原と置き換わるのに充分である。
【図１】
2015534830.tif 000007
【図２】
2015534830.tif 000008
【図３】
2015534830.tif 000009
【図４】
2015534830.tif 000010
【国際調査報告】
2015534830.tif 000011