(57)【要約】電子ビーム信号に露出される試料のイメージングの方法は、試料の一連のイメージからなるイメージシーケンスを取得する工程を備える。イメージシーケンスにおける各後続のイメージは、試料に対する累積的な電子ビーム信号の露出の増大を示している。その方法は、イメージシーケンスの各イメージに関する累積的な露出のデータを収集する工程を備える。その方法は、フィルタが適用される各イメージに対応する累積的な露出のデータを使用してイメージシーケンスのイメージにローパスイメージ処理フィルタを適用し、処理されたイメージを生成する工程を備える。その方法は、最終的なイメージを生成するように、処理されたイメージを組み合わせる工程を備える。イメージシーケンスのイメージを選択的に破棄する工程を備えるイメージングの方法も提供される。
2015532512.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子ビーム信号に露出される試料のイメージングの方法において、
前記試料の一連のイメージからなるイメージシーケンスを取得する工程であって、前記イメージシーケンスにおける各後続のイメージは、前記試料に対する累積的な電子ビーム信号の露出の増大を示している、前記取得する工程と、
前記イメージシーケンスの各イメージに関する累積的な露出のデータを収集する工程と、
フィルタが適用される各イメージに対応する前記累積的な露出のデータを使用して前記イメージシーケンスのイメージにローパスイメージ処理フィルタを適用し、処理されたイメージを生成する工程と、
最終的なイメージを生成するように、前記処理されたイメージを組み合わせる工程と、を備える方法。
【請求項２】
前記試料を前記電子ビーム信号に露出する工程をさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シーケンスの取得は、電子検出器を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記電子検出器は、直接衝撃検出器である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記取得する工程は、連続的なイメージストリームを収集するように電子検出器を使用することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記イメージの連続的なストリームは、５フレーム毎秒（ｆｐｓ）以上で取得される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記イメージシーケンスの全体を通じた前記試料に対する前記累積的な露出は、１０〜１００電子／平方オングストローム（ｅ−／Å２）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ローパスイメージ処理フィルタは、フィルタの強度によって特徴付けられ、該フィルタの強度は、前記イメージシーケンスにおける各後続のイメージについて増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ローパスイメージ処理フィルタは、前記イメージシーケンスのイメージに対し選択的に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ローパスイメージ処理フィルタは、前記イメージシーケンスの前記イメージのうちの最初の複数のイメージに適用されない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
電子ビーム信号に露出される試料のイメージングの方法において、
前記試料の一連のイメージからなるイメージシーケンスを取得する工程であって、前記イメージシーケンスにおける各後続のイメージは、前記試料に対する累積的な電子ビーム信号の露出の増大を示している、前記取得する工程と、
前記イメージシーケンスにおいて前記イメージシーケンスにおける他のイメージと十分な対応を有しないイメージを選択的に破棄する工程と、
最終的なイメージを生成するように、残りの前記イメージを組み合わせる工程と、を備える方法。
【請求項１２】
前記イメージシーケンスにおけるイメージ間の対応は、破棄される前記イメージの２次
元フーリエ変換と、前記イメージの残りのうちの選択されるイメージの２次元フーリエ変換との比較によって決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記破棄する工程は、破棄される前記イメージの２次元フーリエ変換と、前記イメージの残りのうちの選択されるイメージの２次元フーリエ変換とを比較することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
破棄される前記イメージは、前記イメージシーケンスの開始からの複数のイメージを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料を前記電子ビーム信号に露出する工程をさらに備える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記シーケンスの取得は、電子検出器を用いて行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記電子検出器は、直接衝撃検出器である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記取得する工程は、連続的なイメージストリームを収集するように電子検出器を使用することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記イメージの連続的なストリームは、５フレーム毎秒（ｆｐｓ）以上で取得される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記イメージシーケンスの全体を通じた前記試料に対する前記累積的な露出は、１０〜１００電子／平方オングストローム（ｅ−／Å２）である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、電子ビーム粒子イメージングに関し、より詳細には、イメージシーケンスのイメージ同士を組み合わせることによる試料の電子ビームイメージングの方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＥＭ（透過型電子顕微鏡）の性能は、電子の物質との相互作用の物理に基づく理論限界と比べて相当に遅れており、特に、試料が電子ビームによる損傷に敏感であることにより低線量のイメージングが必要な場合において相当に遅れている。複数の要因が、ＴＥＭイメージの解像度及び信号対ノイズ比（ＳＮＲ）を低下させることがあり、これには、電子顕微鏡装置と非理想的な電子検出器の使用とに関する複数の要因が含まれる。しかしながら、全体として考えると、装置の要因により説明されるのは、理論上達成可能な性能と実際の性能との間の隔たりのうちの僅かな一部に過ぎない。ドリフト、ビームにより誘起される動き、帯電、照射の損傷等、試料の動的な過程は、一般に、全体的なシステムの性能を低下させる非理想的な性質のうちの大きな部分の原因となっている。さらに、非理想的な電子検出器は、ＴＥＭの実際の性能と理論上の性能との間の隔たりを説明する大きな最後の要因である。
【０００３】
試料に対する照射の損傷とは、電子ビームとの相互作用の結果、観察下の試料の化学的構造が破壊されることである。試料に対する電子の非弾性散乱によって試料の価電子が励起され、これにより照射の損傷が生じ、その損傷には、結合切断、フリーラジカルの形成、水素原子の遊離、試料の物理的性質（例えば、密度）における変化、構造転位が含まれる。一般に、損傷は累積的であり、このことは、試料に対する全露光が積み重なるので、損傷が増大し続けることを意味する。そして、損傷は、初めに高解像度の構造（ｆｅａｔｕｒｅ）に影響を与え、露光が積み重なり続けるに連れて、次いで比較的低い解像度の構造に影響を与える。累積的な損傷は、線量率にも依存する場合があり、これは、２０個の電子が平方オングストローム毎に短い時間（例えば、１秒）にわたって送達されることによって、同じ数の電子がより長い時間（例えば、５秒）にわたって送達されるよりも大きな損傷が生じる場合があることを意味する。
【０００４】
水和の自然状態に保持されている（非晶質氷に凍結されている）生物学的に重要な試料等の敏感な試料は、少ない全電子露出（イメージを形成するために使用される電子の総数であり、例えば、試料に対する平方オングストローム毎に２０個の電子である）と低い電子露出率（イメージの取得のために試料に照射するために使用される、単位時間毎、単位面積毎の電子数であり、例えば、試料に対する平方オングストローム毎、秒毎に１０個の電子である）との両方を用いて電子顕微鏡においてイメージングされる。しかしながら、生物試料についてのそのようなクライオ電子顕微鏡では、試料の動的な過程は、特に有害であり、これによって、非等方性の解像度の損失（すなわち、試料ドリフト）や、各像のＳＮＲの全体的な低下（例えば、ビームにより誘起される動き、帯電、照射の損傷等）が生じる。さらに、そのような試料の動的な過程は、長期の電子ビーム露出を伴う“動画”モードにおける一連のイメージングの文脈において悪化させられる。
【０００５】
ＴＥＭイメージを記録するために使用される写真フィルム又はＣＣＤ方式の電子カメラは、試料の全電子露出を示す１つのイメージを収集する。試料の複数のイメージからなるシーケンスは、試料の複数のイメージを次々に手動又は自動により収集することによって取得される場合があり、各イメージの取得の間には幾分かの不感時間が伴われる。これに
代えて、ＣＭＯＳ方式の電子カメラが、試料のイメージからなるシーケンスを収集してもよく、伴われる各イメージの間の不感時間はごく僅かであるので、１つの電子露出が、複数のイメージに区分けされることになる。いずれの場合においても、試料の複数のイメージからなるシーケンスは、１つの静的な試料イメージを形成するために組み合わせられる（例えば、加算による）。
【０００６】
最近、とりわけ本発明者らは、直接検出装置（ＤＤＤ）と呼ばれる、センサに対する直接衝撃による電子の検出用に特別に開発されたアクティブ・ピクセル・センサ（ＡＰＳ）に基づいて、ＴＥＭカメラシステムを開発した。ＤＤＤは、他の電子カメラよりも非常に高い感度及び解像度を有し、写真フィルムと同様の広い視野を提供する。さらに、このＤＤＤカメラのアーキテクチャによって、連続したフレーム同士の間に不感時間がほとんど又は全くなく、４０フレーム毎秒までフル解像度でフルフレームのイメージの連続的なストリーミングが可能になる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、当該技術分野において、先行技術と比較して改良されたイメージング技術の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様によると、電子ビーム信号に露出される試料のイメージングの方法が提供される。その方法は、試料の一連のイメージからなるイメージシーケンスを取得する工程を備える。イメージシーケンスにおける各後続のイメージは、試料に対する累積的な電子ビーム信号の露出の増大を示している。その方法は、イメージシーケンスの各イメージに関する累積的な露出のデータを収集する工程をさらに備える。その方法は、フィルタが適用される各イメージに対応する累積的な露出のデータを使用してイメージシーケンスのイメージにローパスイメージ処理フィルタを適用し、処理されたイメージを生成する工程をさらに備える。その方法は、最終的なイメージを生成するように、処理されたイメージを組み合わせる工程をさらに備える。
【０００９】
様々な実施形態によると、方法は、試料を電子ビーム信号に露出する工程を備える場合がある。シーケンスの取得は、電子検出器を用いて行われる場合がある。電子検出器は、直接衝撃検出器である場合がある。取得する工程は、イメージの連続的なストリームを収集するように電子検出器を使用することによって行われる場合がある。イメージの連続的なストリームは、５フレーム毎秒（ｆｐｓ）以上で取得される場合がある。イメージシーケンスの全体を通じた試料に対する累積的な露出は、１０〜１００電子／平方オングストローム（ｅ−／Å２）である場合がある。ローパスイメージ処理フィルタは、フィルタの強度によって特徴付けられる場合があり、そのフィルタの強度は、イメージシーケンスにおける各後続のイメージついて増大する場合がある。ローパスイメージ処理フィルタは、イメージシーケンスのイメージに対し選択的に適用される場合がある。ローパスイメージ処理フィルタは、イメージシーケンスのイメージのうちの最初の複数のイメージに適用されない場合がある。
【００１０】
別態様によると、電子ビーム信号に露出される試料のイメージングの方法が提供される。その方法は、試料の一連のイメージからなるイメージシーケンスを取得する工程を備える。イメージシーケンスの各後続のイメージは、試料に対する累積的な電子ビーム信号の露出の増大を示している。その方法は、イメージシーケンスにおいてイメージシーケンスにおける他のイメージと十分な対応を有しないイメージを選択的に破棄する工程をさらに備える。その方法は、最終的なイメージを生成するように、残りのイメージを組み合わせる工程をさらに備える。
【００１１】
様々な実施形態によると、イメージシーケンスにおけるイメージ間の対応は、破棄されるイメージの２次元フーリエ変換と、イメージの残りのうちの選択されるイメージの２次元フーリエ変換との比較によって決定される場合がある。この点について、方法は、破棄されるイメージの２次元フーリエ変換と、イメージの残りのうちの選択されるイメージの２次元フーリエ変換とを比較することを含む場合がある。破棄されるイメージは、イメージシーケンスの開始からの複数のイメージを含む場合がある。その方法は、試料を電子ビーム信号に露出する工程をさらに備える場合がある。シーケンスの取得は、電子検出器を用いて行われる場合がある。電子検出器は、直接衝撃検出器である場合がある。取得する工程は、イメージの連続的なストリームを収集するように電子検出器を使用することによって行われる場合がある。イメージの連続的なストリームは、５フレーム毎秒（ｆｐｓ）以上で取得される場合がある。イメージシーケンスの全体を通じた試料に対する累積的な露出は、１０〜１００電子／平方オングストローム（ｅ−／Å２）である場合がある。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】入射電子ビームとともに、アクティブ・ピクセル・アレイを有する直接衝撃検出器を概略的に示す図。
【図２】本発明の一態様によるイメージングの方法のフロー図。
【図３】図２のフロー図の方法とともに使用される場合のある、イメージフレームに対しプロットされているローパスフィルタの強度の例示的なグラフを示す図。
【図４】本発明の別態様によるイメージングの方法のフロー図。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において開示される様々な実施形態のこれらの及び他の特徴及び利点は、下記の説明及び図面に関してより良く理解され、その説明及び図面において類似の番号は全体を通じて類似の部分を参照する。
【００１４】
添付の図面とともに以下に述べられている詳細な説明は、本発明の現在好適な実施形態の説明として意図されており、本発明が構成又は利用される唯一の形態を表すように意図されていない。詳細な説明を通じて行われる“一実施形態”（“ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ”）又は“実施形態”（“ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ”）に対する参照は、実施形態とともに説明される特定の特徴、構造、又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、この詳細な説明を通じて様々なところにおける“一実施形態では”（“ｉｎ  ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ”）又は“実施形態では”（“ｉｎ  ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ”）の句の出現は、必ずしも全て同じ実施形態を参照していない。下記の説明は、限定としてではなく例示として与えられている。上記の開示を考慮して、当業者は、本明細書において開示されている本発明の範囲及び趣旨内の変形を考案し得る。さらに、本明細書において開示されている実施形態の様々な特徴は、単独で利用される場合もあれば、互いに様々な組み合わせにおいて利用される場合もあり、本明細書において説明される特定の組み合わせに限定するように意図されていない。したがって、特許請求の範囲は、示されている実施形態によって限定されない。下記の説明では、本発明の実施形態の完全な理解を提供するために多くの特定の詳細が示されている。しかしながら、関連技術分野の当業者は、本発明が１つ以上の特定の詳細を用いずに実施される場合があることや、他の方法、構成要素、材料等を用いて実施される場合があることを認識する。他の例では、周知の構造、材料、又は動作は、本発明の態様を曖昧にすることを避けるために示されていないか又は説明されていない。第１及び第２等の関係についての語の使用は、あるエンティティを別のエンティティから区別するためにのみ使用され、そのようなエンティティ同士の間における実際のそのような関係又は順序を必ずしも必要としたり含意したりしないとさらに理解される。
【００１５】
本発明は、電子ビーム検出装置等の高エネルギ粒子イメージング検出装置を意図しており、その電子ビーム検出装置は、イメージ同士の間に不感時間がほとんど又は全くなく、露出中に複数の高品質のイメージを収集することを可能にするように、妥当な感度及びフレームレートを提供する。本発明の一態様には、カメラからの“動画”（データ取得中、連続的にストリーミングされる未処理のフレーム）を処理し試料の動的な過程を“補正する”ことを伴う方法が含まれる。
【００１６】
ここで、図１を参照すると、高エネルギ粒子イメージングカメラ１０が概略的に示されている。実施形態では、カメラ１０は、電子ビーム源１２から放出される電子ビーム１４等、入射する照射線を利用するように構成されている場合がある。カメラ１０は、試料支持部１８によって支持されている試料１６のイメージを取り込むように使用される。試料１６は、電子ビーム１４の入射電子ビーム信号を受ける。検出器２０は、高エネルギ粒子を感知するように使用される。例えば、検出器２０は、電子検出器であってよい。当業者に周知の検出器に従って、他の検出器が、陽子、中性子、及び他の原子より小さい粒子、並びにＸ線及び他の電離放射線を感知するように構成されてもよい。
【００１７】
検出器２０は、アクティブ・ピクセルの直接衝撃検出器として概略的に示されている。検出器２０は、ピクセルのアレイ２２を有する（個々のピクセルは、ピクセル２４として示されている）。検出器２０は、当業者に周知の任意の装置の形態を取ってよい。検出器２０は、“直接収集透過型電子顕微鏡”（“Ｄｉｒｅｃｔ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ”）という題号の米国特許第７，２６２，４１１号の教示に基づく設計を有していてもよく、その全部の内容は、本明細書に参照として援用される。したがって、検出器２０は、シンチレータスクリーンを使用せずに１次電子の直接検出を達成するように、直接衝撃モードにおいて使用されるアクティブ・ピクセル・センサに基づくことが可能である。ピクセルのアレイ２２は、各ダイオードのｐ−ｎ接合が形成されている薄いエピタキシャルシリコン層を１次電子が通過するときに発生させられる２次電子を収集する電荷収集ダイオードを含むアクティブ・ピクセル・アレイの場合がある。しかしながら、本発明は、シンチレータスクリーンを含む検出器等の非直接型の検出器を使用して生成されるイメージを利用する場合があると意図されている。さらに、ピクセルのアレイ２２は、２次元アレイとして示されているが、１列型の構成、３次元の構成、又は他の次元の構成であってもよいと意図されている。
【００１８】
検出器２０は、制御装置２６とサンプリング装置２８とをさらに備えることができる。制御装置２６とサンプリング装置２８とは、１つのまとまった電気構成要素に一体化されていてもよい。制御装置２６は、電子ビーム源１２と、ピクセルのアレイ２２と、カメラ１０の全体的な機能とを制御するように構成されている。サンプリング装置２８は、ピクセルのアレイ２２からの出力と、制御装置２６から受信される電子ビーム源１２の動作に関する情報とに基づいて、イメージを取り込み、処理するように構成されている。制御装置２６とサンプリング装置２８とは、本明細書に含まれる教示とともに当業者に周知の方法に従って、ハードウェア、回路、及びソフトウェアを含むように構成される。
【００１９】
本発明の一態様によると、電子ビーム信号に露出される試料１６のイメージングの方法が提供される。ここで、図２のフロー図を参照すると、方法は、最初に、試料１６を電子ビーム信号に露出する工程１００を備える場合がある。その方法は、試料１６の一連のイメージからなるイメージシーケンスを取得する工程１１０をさらに備える。イメージシーケンスにおける各後続のイメージは、試料１６に対する累積的な電子ビーム信号の露出の増大を示している。その方法は、イメージシーケンスの各イメージに関する累積的な露出のデータを収集する工程１２０をさらに備える。その方法は、フィルタが適用される各イメージに対応する累積的な露出のデータを使用してイメージシーケンスのイメージにローパスイメージ処理フィルタを適用し、処理されたイメージを生成する工程をさらに備える
。その方法は、最終的なイメージを生成するように、処理されたイメージを組み合わせる工程１３０をさらに備える。下記のように、ローパスイメージ処理フィルタを利用する上記の方法は、イメージングされる試料１６に対する照射の損傷を補償又は補正するために特に適している。
【００２０】
試料１６は、イメージング中に電子ビームに露出されるに連れて、電子ビーム１４からの高エネルギ電子との相互作用により変化する。試料１６に対する露出が積み重なり続けるに連れて、試料１６の構造が変化し得る（“照射の損傷”としてよく知られている）。その変化は、最初に試料１６の微小な細部（高解像度の情報）に影響を与え得る。しかしながら、比較的低い解像度の細部も、試料１６に対する累積的な露出が増大するに連れて、次第に影響される。損傷は、典型的には、試料１６の比較的低い解像度の構造に影響を与えるよりも前に高解像度の構造に影響を与えるので、情報量は各イメージングの時点において空間周波数により異なることが、本発明では認識されている。本発明では、各個々のフレーム又は数フレームの総和に対し、対応する時点における予想される照射の損傷に基づいてカットオン周波数を設定したローパスイメージ処理フィルタを適用することによって、イメージコントラストと、その各空間周波数におけるＳＮＲとが最適化される（又は少なくとも照射の損傷の影響の増大が軽減される）。したがって、後に取得されるフレームは、より多くの累積的な露出を示しており、よって、より大きな照射の損傷を示しているので、よりフィルタリングが強い。したがって、取り込まれるイメージのシーケンスに対して次第にフィルタ強度を次第に増大させることが望ましい。本明細書において使用されるように、フレームの語は、取り込まれたイメージからなるシーケンスにおける取り込まれたイメージを参照する。
【００２１】
ここで図３を参照すると、図２のフロー図の方法とともに使用される、イメージフレームに対しプロットされているローパスフィルタの強度の例示的なグラフが示されている。ローパスフィルタの強度は、オングストロームによる解像度に関して測定される。ローパスイメージ処理フィルタは、フィルタの強度によって特徴付けられる。フィルタの強度は、フレーム又はイメージの番号の増大とともにカーブに沿って増大すると観察される。この点について、フィルタの強度は、イメージシーケンスにおける各後続のイメージについて増大する。ローパスフィルタの調節可能な性質には、形状（又は種類）と強度（又はカットオフ周波数）とが含まれる。ローパスフィルタの形状は、使用される特定の数学関数によって定義される。ローパスイメージ処理フィルタは、当業者に周知のアルゴリズムや技術に従って適用されてよい。ローパスイメージ処理フィルタがイメージシーケンスのイメージに対し選択的に適用され得ることが想定されている。この点について、ローパスイメージ処理フィルタは、イメージシーケンスのイメージのうちの最初の複数のイメージに適用されない場合がある。
【００２２】
イメージシーケンスの各イメージに適用されるローパスフィルタの強度は、試料１６に対する対応する累積的な露出に基づいて決定される。一般に、試料の損傷率は、関心となる同じ試料の照射の損傷の研究に基づいて、又は類似の試料の損傷率についてのより一般的な研究に基づいて推測される。例えば、凍結水和生物試料の場合、損傷率は、一般に、凍結水和カタラーゼ結晶についての公開されている損傷率に基づいて推測されてもよい。試料１６に対する様々な累積的な露出の後に予測される、予測される解像度が、損傷率によってわかる。したがって、イメージシーケンスの各イメージに適用されるローパスフィルタの強度は、累積的な試料の露出に基づいて調節されることが可能であり、これによって、試料１６における損傷していない空間周波数のみが確保される。累積的な試料の露出は、典型的には、試料１６に対する露出率と、イメージシーケンスの各イメージについての露出時間とを乗算することによって計算される。試料１６に対する露出率は、電子ビームの輝度に対応し、顕微鏡のスクリーン電流を利用して測定されたり、電子ビーム１４が検出器２０によって検出されるよりも前に、ファラデープレートを使用して電子ビーム１
４の電子束を測定することによって測定されたりすることがある。露出時間は、露出の開始とイメージシーケンスのイメージの取得との間に経過した時間である。イメージシーケンスが、イメージ同士の間に不感時間がなく、あるフレームレートにおいて取り込まれることを可能にする直接検出カメラについて、露出時間は、各イメージについての時間（フレームレートの数学的な逆数）と、イメージシーケンスのイメージのインデックス（一連の番号）とを乗算することによって単純に計算される。
【００２３】
様々な実施形態によると、イメージシーケンスを取得する工程１１０は、検出器２０等の電子検出器を用いて行われる場合がある。さらに、電子検出器は、直接衝撃検出器である。イメージシーケンスの取得１１０は、イメージの連続的なストリームを収集するように電子検出器を使用することによって行われる。イメージの連続的なストリームは、５フレーム毎秒（ｆｐｓ）以上で取得され得る。イメージシーケンスの全体を通じた試料１６に対する累積的な露出は、１０〜１００電子／平方オングストローム（ｅ−／Å２）の場合がある。
【００２４】
上述したように、方法は、試料１６の一連のイメージからなるイメージシーケンスを取得する工程１１０を備える。カメラ１０の文脈では、この取得する工程１１０は、ピクセルのアレイ２２によって読出電圧が出力され、検出器２０によってイメージが取り込まれ、“リアルタイム”で達成される。次いで、サンプリング装置２８は、イメージシーケンスを処理するために使用されることが可能であり、カメラの使用者は、最初の“未処理の”イメージ同士の任意の組み合わせの出力、処理されたイメージ、及び／又は最終的なイメージを得る。しかしながら、取得する工程１１０は、未処理のイメージが取り込まれ、後に提供され、その結果取得されるデータ処理機能として行われてもよいと意図されている。この点について、イメージシーケンスを生成するように、あるエンティティが、最初に、カメラ１０を動作させてもよい。その後、本発明の一態様は、イメージシーケンスを取得する工程１１０から開始する方法によって達成されることが可能である（リアルタイムでないとしても）。
【００２５】
上述したように、方法は、イメージシーケンスの各イメージについての累積的な露出のデータを収集する工程１２０を備える。この点について、サンプリング装置２８は、累積的な露出のデータを収集するように構成されている。
【００２６】
本発明の一態様によると、電子ビーム信号に露出される試料１６のイメージングの方法が提供される。ここで、図４のフロー図を参照すると、方法は、最初に、試料１６を電子ビーム信号に露出する工程２００を備える場合がある。その方法は、試料１６の一連のイメージからなるイメージシーケンスを取得する工程２１０をさらに備える。イメージシーケンスの各後続のイメージは、試料１６に対する増大した累積的な電子ビーム信号の露出を示している。その方法は、イメージシーケンスにおいてイメージシーケンスにおける他のイメージと十分な対応を有しないイメージを選択的に破棄する工程２２０をさらに備える。その方法は、最終的なイメージを生成するように、残りのイメージを組み合わせる工程２３０をさらに備える。下記のように、最初の複数のイメージを破棄する上記のイメージング方法は、試料１６が最初に電子ビーム１４に露出されるときに生じる試料１６に対する“帯電”型の照射の損傷を補償又は補正するために特に適している。
【００２７】
試料は、イメージング中に電子ビームに露出されるに連れて、顕微鏡又はカメラからの高エネルギ電子との相互作用によって変化する。本発明では、各露出の開始時に、試料１６の電子的性質が変化する（“帯電”としてよく知られている）場合があると認識されている。その変化は、トーンリング（Ｔｈｏｎ  ｒｉｎｇ）の直径、形状、又は振幅の一様性（等方性）に影響を与えることがある。２次元フーリエ変換は、空間領域（各ピクセル２４は、特定の場所における情報を表す）と周波数領域（各ピクセル２４は、特定の周波
数における、イメージ全体にわたる全情報を表す）との間においてイメージを変換する数学的技術である。ＴＥＭイメージの２次元フーリエ変換は、顕微鏡のコントラスト伝達関数（ＣＴＦ）により示される特定の特性を有する。例えば、焦点が外れて収集されたＴＥＭイメージの２次元フーリエ変換は、同心のリング（トーンリングと呼ばれる）のパターンを示す。そのリングの直径は、イメージの焦点が外れている程度に依存する。１つのイメージに対応するトーンリングの直径は、イメージシーケンスの別のイメージのトーンリングの直径と比較され得る。そのリングの振幅（又は輝度）は、対応する空間周波数（解像度）における情報の程度（信号対ノイズ比）に依存する。トーンリングの輝度の一様性（トーンリングについて、角度位置に関し）は、比較のために使用されてよい。さらに、トーンリングの全体的な形状（円形か楕円形か）は、照射の損傷の変化する度合いを示している。さらに、トーンリングの中央の明るい中心は、対応するイメージ同士の間における異なる形状及び輝度を示している場合がある。これらのパラメータ及び／又は組み合わせや相対的な重み付けの全ては、イメージ同士の間の対応の決定に利用されてよい。
【００２８】
上記のように、方法は、イメージシーケンスにおいてイメージシーケンスにおける他のイメージと十分な対応を有しないイメージを選択的に破棄する工程２２０を備える。この点について、対応するトーンリングの様々なパラメータを考慮する場合における当業者に周知の任意の技術を利用してフィルタが適用され、イメージを破棄するか否かが決定されてもよい。様々な実施形態によると、イメージシーケンスのイメージ同士の対応は、破棄されるイメージの２次元フーリエ変換と、イメージの残りのうちの選択されるイメージの２次元フーリエ変換との比較によって決定される。イメージを選択的に破棄することは、破棄されるイメージの２次元フーリエ変換と、イメージの残りのうちの選択されるイメージの２次元フーリエ変換とを比較することを含む。破棄されるイメージは、イメージシーケンスの開始からの複数のイメージを含む場合がある。
【００２９】
様々な実施形態によると、イメージシーケンスを取得する工程１１０は、検出器２０等の電子検出器を用いて行われる場合がある。さらに、電子検出器は、直接衝撃検出器である。イメージシーケンスの取得１１０は、イメージの連続的なストリームを収集するように電子検出器を使用することによって行われる。イメージの連続的なストリームは、５フレーム毎秒（ｆｐｓ）以上で取得され得る。イメージシーケンスの全体を通じた試料１６に対する累積的な露出は、１０〜１００電子／平方オングストローム（ｅ−／Å２）の場合がある。
【００３０】
カメラ１０等のカメラからのイメージシーケンスの取得は、電子露出中の試料の物理的な動きを補正するために利用される場合がある。電子イメージの取得中の試料の動きは、イメージのぼやけを生じ、イメージの質を非常に低下させる。試料の動きは、方向及び大きさについてイメージ全体にわたって一様な場合もあれば、様々な試料の粒子又はイメージ内の関心領域に関し異なる場合もある。カメラ１０等の直接検出カメラを用いて取得される複数のイメージからなるシーケンスを利用して、イメージの全範囲や、各イメージの比較的小さな関心領域を使用し、各イメージにおける試料の位置を追跡することによって、試料の動きは補正され得る。電子検出器からの固定パターンノイズの影響は、固定パターンノイズによって最も影響されているイメージの成分の重み付けを小さくするようにイメージシーケンスの各イメージをフィルタリングすることによって弱められ得る。試料の位置を追跡することは、試料１６のコントラストを向上するように、イメージシーケンスの複数のイメージを組み合わせること（ピクセル値の加算又は平均によって）によって容易にされ得る。イメージの得られる組み合わせにおける試料の位置は、組み合わせに使用されたイメージの全て、及び組み合わせの中間のイメージのみのいずれかに割り当てられ得る。前者の場合、イメージシーケンス全体が、試料の整合の目的のために個々のイメージからなる集合へとグループ化され、後者の場合、イメージシーケンス全体が、そのイメージシーケンスのローリング平均を示すイメージの集合を生成するように使用される。ど
の場合においても、整合される最終的なイメージは、試料１６のコントラストを強調するように、ローパス又はバンドパスのフィルタリングがされ得る。互いにシーケンスのイメージ同士を比較したり、参照イメージに対しシーケンスのイメージを比較したりすることは、イメージシーケンスを通じた相対的な試料の動きを明らかにする。したがって、シーケンスの各イメージは、イメージからなるシーケンスを１つの最終的なイメージへと組み合わせる前に、試料の位置がシーケンスの全てのイメージにわたって一致するように変えられ得る。そのような手順に従うことによって、試料の動きによるぼやけが低減されるが、照射の損傷等の他の試料の動的な過程は考慮されない。
【００３１】
本発明の別態様によると、本明細書において説明した任意の実施形態により説明されるカメラ１０が提供される。本発明のさらに別の態様によると、本明細書において説明した任意の実施形態により説明される検出器２０が提供される。
【００３２】
本明細書において示した詳細は、例示であり、本開示の実施形態を示す説明の目的のために過ぎず、本開示の原理及び概念的な態様の最も有用で容易に理解される説明と考えられるものを提供するために提示されている。この点について、本開示の根本的な理解のために必要な詳細よりも多くの詳細を示そうとはされておらず、図面とともに説明は、どのように本開示の方法のうちのいくつかの形態が実施において具現化され得るか当業者に対して明らかにしている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年3月31日(2015.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
電子ビーム信号に露出される試料のイメージングの方法において、
前記試料の一連のイメージからなるイメージシーケンスを取得する工程であって、前記イメージシーケンスにおける各後続のイメージは、前記試料に対する累積的な電子ビーム信号の露出の増大を示している、前記取得する工程と、
前記イメージシーケンスの各イメージに関する累積的な露出のデータを収集する工程と、
フィルタが適用される各イメージに対応する前記累積的な露出のデータを使用して前記イメージシーケンスのイメージにローパスイメージ処理フィルタを適用し、処理されたイメージを生成する工程と、
最終的なイメージを生成するように、前記処理されたイメージを組み合わせる工程と、を備える方法。
【請求項２】
前記試料を前記電子ビーム信号に露出する工程をさらに備える、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記イメージシーケンスの取得は、電子検出器を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記電子検出器は、直接衝撃検出器である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記取得する工程は、連続的なイメージストリームを収集するように電子検出器を使用することによって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記イメージの連続的なストリームは、５フレーム毎秒（ｆｐｓ）以上で取得される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記イメージシーケンスの全体を通じた前記試料に対する前記累積的な露出は、１０〜１００電子／平方オングストローム（ｅ−／Å２）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ローパスイメージ処理フィルタは、フィルタの強度によって特徴付けられ、該フィルタの強度は、前記イメージシーケンスにおける各後続のイメージについて増大する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ローパスイメージ処理フィルタは、前記イメージシーケンスのイメージに対し選択的に適用される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ローパスイメージ処理フィルタは、前記イメージシーケンスの前記イメージのうちの最初の複数のイメージに適用されない、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
電子ビーム信号に露出される試料のイメージングの方法において、
連続的なイメージストリームを収集するように電子検出器を使用することによって、前記試料の一連のイメージからなるイメージシーケンスを取得する工程であって、前記イメージシーケンスにおける各後続のイメージは、前記試料に対する累積的な電子ビーム信号の露出の増大を示している、前記取得する工程と、
前記イメージシーケンスにおいて前記イメージシーケンスにおける他のイメージと十分な対応を有しないイメージを選択的に破棄する工程と、
最終的なイメージを生成するように、残りの前記イメージを組み合わせる工程と、を備える方法。
【請求項１２】
前記イメージシーケンスにおけるイメージ間の対応は、破棄される前記イメージの２次元フーリエ変換と、前記イメージの残りのうちの選択されるイメージの２次元フーリエ変換との比較によって決定される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記破棄する工程は、破棄される前記イメージの２次元フーリエ変換と、前記イメージの残りのうちの選択されるイメージの２次元フーリエ変換とを比較することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
破棄される前記イメージは、前記イメージシーケンスの開始からの複数のイメージを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料を前記電子ビーム信号に露出する工程をさらに備える、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記イメージシーケンスの取得は、電子検出器を用いて行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記電子検出器は、直接衝撃検出器である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記イメージの連続的なストリームは、５フレーム毎秒（ｆｐｓ）以上で取得される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記イメージシーケンスの全体を通じた前記試料に対する前記累積的な露出は、１０〜１００電子／平方オングストローム（ｅ−／Å２）である、請求項１１に記載の方法。
【国際調査報告】
2015532512.tif 000007