(57)【要約】【課題】糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および他の循環器病のための診断法および治療法に関する。【解決手段】必要があるかまたはリスクがある被験体において、ＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１の発現レベルまたは活性、およびその下流のシグナル伝達経路を調節することによって、インスリン分泌ならびにβ細胞の数および機能を増強するため、ならびに糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、心筋梗塞、および他の循環器病と関連付けられる糖血症を制御するための、診断、予後診断、および治療の方法、組成物、およびキット。【選択図】図１３
2015514685.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１または下流のシグナル伝達経路を活性化する因子を備える有効量の組成物を投与の必要がある被験体に投与することを備える、インスリン分泌を増加させるため、および糖血症を制御するための医薬の製造のための方法。
【請求項２】
前記因子が可溶性ＦＫＮまたはそのアナログである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記因子がＣＸ３ＣＲ１アゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記因子が前記被験体におけるＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮの発現または活性を増強する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記因子がＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１下流のシグナル伝達経路を増強する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記因子が、前記被験体において、β細胞数を増加させ、膵島機能を改善し、または血中グルコースレベルを低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記因子が、アテローム性動脈硬化病変へのマクロファージのプラーク形成能を減少させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、心筋梗塞、および循環器病からなる群より選択される障害を予防または治療するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
薬学的に許容可能な賦形剤、およびＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１または下流のシグナル伝達経路を活性化する有効量の因子を備える、インスリン分泌を増加させるため、および糖血症を制御するための薬学的組成物。
【請求項１０】
前記因子が可溶性ＦＫＮまたはそのアナログである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記因子がＣＸ３ＣＲ１アゴニストである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記因子が前記被験体におけるＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮの発現または活性を増強する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記因子がＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１下流のシグナル伝達経路を増強する、請求項９に記載の組成物。
【請求項１４】
前記因子が、前記被験体において、β細胞数を増加させ、膵島機能を改善し、または血中グルコースレベルを低下させる、請求項９に記載の組成物。
【請求項１５】
前記因子が、アテローム性動脈硬化病変へのマクロファージのプラーク形成能を減少させる、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記因子が、糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、心筋梗塞、および循環器病からなる群より選択される障害を予防または治療するために使用される、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
インスリン分泌欠損、β細胞機能不全、または糖血症のための診断方法であって：
（ａ）リスクがある被験体から生物学的サンプルを入手すること；
（ｂ）前記サンプル中のＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮの発現レベルまたは活性を決定すること、および
（ｃ）前記被験体におけるＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮの発現レベルまたは活性が、正常被験体におけるＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮの発現レベルまたは活性と比較した場合に、有意に低下または減少しているとき、前記被験体をインスリン分泌欠損またはβ細胞機能不全のリスクがあると診断すること
を備える、方法。
【請求項１８】
インスリン分泌欠損、β細胞機能不全、または糖血症である被験体の予後を決定するための方法であって：
（ａ）前記被験体の生物学的サンプルを入手すること；
（ｂ）治療前および治療後の前記被験体からのサンプル中のＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮの発現レベルまたは活性を決定すること、ならびに
（ｃ）より低い相対的なＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮの発現レベルまたは活性を、インスリン分泌欠損、β細胞機能不全、または糖血症のより高いリスク経過と関連付けて、それによって、前記被験体の予後を決定すること
を備える、方法。
【請求項１９】
インスリン分泌欠損、β細胞機能不全、または糖血症の診断のためのキットであって、ＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮの発現レベルまたは活性を決定するためのバイオマーカー検出試薬、およびこれらの障害を診断する際のそれらの使用のための説明書を備える、キット。
【請求項２０】
ＦＫＮのＣＸ３ＣＲ１との相互作用およびその下流のシグナル伝達経路の直接的または間接的な調節因子としての候補分子を同定することを備える、インスリン分泌を増強するかまたは糖血症を制御するための因子としての候補分子を評価するための研究ツール、システム、および方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、全体が参照により組み込まれる、２０１２年３月１日に出願された米国仮出願シリアル番号６１／６０５，４４４からの優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府によって資金援助された研究に関する言及
本発明は、米国国立衛生研究所によって支給された補助金番号ＤＫ０３３６５１、ＤＫ０６３４９１、およびＤＫ０７４８６８の下で政府の援助を伴って行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および他の循環器病のための診断法および治療法に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
２型糖尿病の有病率は米国においておよび全世界的に劇的に上昇しており、現在では流行性の割合にまで達している（Ｏｌｅｆｓｋｙ  ａｎｄ  Ｇｌａｓｓ，２０１０）。この疾患の病因は、インスリン抵抗性とβ細胞インスリン分泌の減少の両方を伴い、典型的には、高血糖糖尿病状態を発症するためには、両方の欠陥が必要である（ツーヒット仮説）（Ｄｅｆｒｏｎｚｏ，２００９；Ｏｌｅｆｓｋｙ  ａｎｄ  Ｇｌａｓｓ，２０１０；Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ，２００４）。２型糖尿病におけるβ細胞の不具合は、少なくとも２つの主要な機序と関連している：全体的なβ細胞の量の減少およびβ細胞あたりのインスリン分泌機能の減少である（Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ，２００４）。前糖尿病のインスリン抵抗性状態において、膵島は、インスリン要求の増加に対してインスリン分泌の増強およびβ細胞の量の増加を伴って応答し、代償性高インスリン血症を生成しかつ相対的な正常血糖値を維持する。しかし、２型糖尿病が現れたときには、β細胞の機能および量は有意に低下され、インスリン抵抗性を相殺するためには不十分なインスリン分泌となり、慢性的な高血糖糖尿病状態を生じる。このβ細胞の機能不全は、概して、機能が損なわれたグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）として現れ、２型糖尿病の最初期段階において検出でき、第１段階ＧＳＩＳの完全な喪失を伴う（Ｄｅｆｒｏｎｚｏ，２００９；Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ，２００４）。一方、β細胞の量の減少は２型糖尿病の診断の時点では通常は存在せず（Ｒａｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、β細胞の量の喪失は２型糖尿病の発症の原因ではないが、むしろ糖尿病の結果であることを示唆する。
【０００５】
最近、糖尿病におけるβ細胞機能不全がβ細胞の進行性脱分化と関連することが提案されている（Ｊｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ，２００４）。これには、ＰＤＸ−１、Ｇｌｕｔ２、およびインスリンを含む、成熟β細胞表現型を維持するために必要な遺伝子の発現の減少が付随し、ｃ−ｍｙｃなどの増殖性遺伝子の発現の増加を伴う（Ｊｏｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｒａｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。これは、β細胞機能の減少という出費に際して、β細胞の量を増加させるための機序を提供するかもしれない。
【０００６】
フラクタルキン（ＣＸ３ＣＬ１またはニューロタクチンとしてもまた知られる；ＦＫＮ）は、ＣＸ３Ｃケモカインファミリーの唯一のメンバーであり、神経細胞、内皮細胞、肝細胞、および血管平滑筋細胞において発現される（Ａｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｃａｒｄｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｈａｓｋｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｌｕｃａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｚｅｒｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＦＫＮは膜結合タンパク質として産生され、そのコグネイト受容体ＣＸ３ＣＲ１（ＧＰＲ１３としてもまた知られる）への結合によって、細胞間の接着およびコミュニケーションを媒介する（Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｌｅｓｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｔａｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｔｅｕｐｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｚｅｒｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。肝臓においては、肝細胞および星状細胞中で発現されるＦＫＮは、抗線維性であり、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞の炎症性活性化を抑制できる（Ａｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。脳においては、ＦＫＮは、神経細胞とグリア細胞の間の相互作用を媒介する（Ｃａｒｄｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。可溶型のＦＫＮは、ＡＤＡＭ  １０およびＡＤＡＭ  １７によって媒介される、ムチン様ストークの基部でタンパク質分解的切断を通して生成され（Ｇａｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｈｕｎｄｈａｕｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、パラクリン機序によって標的細胞を調整できる細胞外型のＦＫＮを産生する。さらに、可溶型ＦＫＮは、細胞外間隙においてパラクリン効果を発揮でき、循環に入って、離れた組織に対してエンドクリン効果を潜在的に引き起こすこともできる（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０００７】
ＣＸ３ＣＲ１は、ＦＫＮについての独特な受容体であり、このＧタンパク質共役受容体にとって、ＦＫＮは唯一の知られているリガンドである（Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｚｅｒｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。ＦＫＮは膜結合タンパク質として発現され、これは、隣接する細胞上のＣＸ３ＣＲ１と相互作用して細胞間接着およびコミュニケーションを容易にでき、そしてＣＸ３ＣＲ１発現細胞型への単球／マクロファージの接着において役割を果たす（Ｈａｓｋｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｚｅｒｎｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【０００８】
ヒトＣＸ３ＣＲ１のコード配列に位置する２つの一塩基変異多型（Ｔ２８０ＭおよびＶ２４９Ｉ）が２型糖尿病および代謝症候群の発生の増加と関連があることが最近報告されている（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｓｉｒｏｉｓ−Ｇａｇｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。これらのＣＸ３ＣＲ１遺伝子変異体は、より低いＦＫＮ結合親和性を生じ、このことは、ＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１系が適切なインスリン分泌および糖血症コントロールの維持において有益な役割を果たしているという観点と一致している。一方、可溶性ＦＫＮの循環レベルは２型糖尿病患者において減少しておらず、実際は、対照よりわずかに高い（Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、糖尿病と関連するインスリン分泌欠損および／またはβ細胞機能不全を診断および予後診断する新たな標的および組成物および方法を提供する。より具体的には、本発明は、可溶性ＦＫＮタンパク質またはアナログまたはＣＸ３ＣＲ１に結合する低分子などのＣＸ３ＣＲ１発現および活性を調節する因子を提供し、これは、インスリン分泌を刺激すること、および膵島機能を改善することによって、糖尿病を改善するために有益さを提供する。本発明はさらに、血中グルコースレベルを減少させること、またはアテローム性動脈硬化病変へのマクロファージのプラーク形成能を減少させること、および／または進行したアテローム性動脈硬化病変の壊死性コアにおける血管平滑筋細胞のアポトーシスを阻害することによって、糖血症、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、および心筋梗塞を診断、予後診断、および予防する新たな標的および組成物および方法を提供する。
【００１０】
特定の実施形態において、本発明は、ＦＫＮまたはそのアナログまたは低分子ＣＸ３ＣＲ１アゴニストの投与が、インスリン分泌を増強すること、および／または膵島機能を改善することによって糖尿病を改善することを提供する。さらに、本発明は、細胞内カルシウムイオンレベルの増加、ならびに膵臓におけるマクロファージトラフィックおよび炎症の調整を含む、ＣＸ３ＣＲ１下流シグナル伝達経路を増強することによって、ＣＸ３ＣＲ１活性化因子が膵臓β細胞におけるインスリンの発現および分泌を増加させることを提供する。
【００１１】
他の実施形態において、本発明は、活性化内皮細胞上で発現された内因性膜結合型ＦＫＮと競合すること、ならびに単球／マクロファージの補充および接着を阻害することによって、可溶型のＦＫＮ、またはアナログの注入がプラーク形成を鈍らせるために有益であることを提供する。
【００１２】
従って、本発明はまた、糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化症、および循環器病の患者においてインスリン分泌を増強するため、および糖血症を制御するための創薬のため、ならびに、糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化症、および他の循環器病を治療するためのＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１を標的とする内因性もしくは低分子リガンドまたは治療剤の開発のための新たな研究ツールを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスは、正常な体重、食物摂取、脂肪および肝臓重量、ならびに脂肪組織における炎症性および代謝性遺伝子発現を呈する。（Ａ）ＨＦＤでの体重変化。平均＋／−ＳＥＭ、ＷＴおよびＫＯの両方についてｎ＝２０。（Ｂ）ＨＦＤの累積食物摂取。食物摂取は群あたり５つの異なるケージから測定され、４匹のマウスが各ケージに収容された。平均＋／−ＳＥＭ。（Ｃ）肝臓重量。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝８。Ｎ．Ｓ．、有意でない。ＮＣＤ、通常の固形飼料による食餌。（Ｄ）精巣上体脂肪重量。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝８。＊、Ｐ＜０．０５。（Ｅ）抗Ｆ４／８０抗体を使用する精巣上体脂肪組織の免疫組織化学分析。代表的な図面は群あたり５匹の異なるマウスの分析から提示された。（Ｆ）ＮＣＤおよびＨＦＤでの精巣上体脂肪組織における炎症性遺伝子および代謝性遺伝子のｍＲＮＡ発現。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝５。Ｎ、通常の固形飼料による食餌；Ｈ、高脂肪食。ＡＵ、任意単位。
【図２】ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスは、インスリン分泌の減少に起因する損なわれた耐糖能を呈する。（Ａ−Ｄ）ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスは、ＮＣＤ（ｎ＝１１）またはＨＦＤ（ｎ＝１２）のいずれかの正常インスリン感受性を伴う損なわれた耐糖能を表す。平均＋／−ＳＥＭ。（Ａ）経口耐糖能試験。＃＃、Ｐ＜０．０１  ＷＴ−ＮＣＤ対ＫＯ−ＮＣＤ；＃＃＃、Ｐ＜０．００１  ＷＴ−ＮＣＤ対ＫＯ−ＮＣＤ；＊＊＊、Ｐ＜０．００１  ＷＴ−ＨＦＤ対ＫＯ−ＨＦＤ。ＡＵＣ、曲線下面積。（Ｂ）インスリン耐性試験。＊、Ｐ＜０．０５  ＷＴ−ＨＦＤ対ＫＯ−ＨＦＤ；＊＊、Ｐ＜０．０１  ＷＴ−ＨＦＤ対ＫＯ−ＨＦＤ；Ｎ．Ｓ．、有意でない。（Ｃ）パネルＡにおけるＯＧＴＴの間のＮＣＤマウスの血漿インスリン（左）、Ｃ−ペプチド（中央）、およびＧＬＰｌ（右）のレベル。＃、Ｐ＜０．０５；＃＃、Ｐ＜０．０１。（Ｄ）パネルＡにおけるＯＧＴＴの間のＨＦＤマウスの血漿インスリン、Ｃ−ペプチド、およびＧＬＰｌのレベル。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。（Ｅ）静脈内耐糖能試験（左）およびＩＶＧＴＴの間の血漿インスリンレベル（右）。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝４。（Ｆ−Ｇ）アルギニン耐性試験の間のＮＣＤ（Ｆ）またはＨＦＤ（Ｇ）マウスの血漿インスリンおよびＣ−ペプチドのレベル。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝８。＃、Ｐ＜０．０５；＃＃、Ｐ＜０．０１；＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、０．０１。（Ｈ）ＷＴマウスにおいて、フラクタルキン中和はインスリン分泌を減少させ、グルコース不耐容を引き起こす。ＦＫＮ中和抗体は、ＷＴマウスにＩＰ注射され、３０分後、マウスは、ＧＴＴのためのグルコース（２ｇ／ｋｇ）の経口胃管栄養を与えられた。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝１０。左、ＧＴＴの間の血漿インスリンレベル；右、ＧＴＴ。図８もまた参照のこと。
【図３】ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島は、β細胞の機能および伝達に関与する遺伝子のより低い発現に伴うインスリン分泌の減少を示す。（Ａ）ＮＣＤを与えたＷＴマウスおよびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスからの一次マウス膵島を使用する静的ＧＳＩＳ試験。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝６。＊、Ｐ＜０．０５。（Ｂ）ＨＦＤを１０週間与えたＷＴマウスおよびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスからの一次マウス膵島を使用する静的ＧＳＩＳ試験。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝６。（Ｃ）一次マウス膵島を使用するアルギニン（Ａｒｇ；１０ｍＭ）の存在下または非存在下での静的ＧＳＩＳ。（Ｄ）ＣＸ３ＣＲ１のノックダウンはＭｉｎ６細胞においてＧＳＩＳを減少する。Ｍｉｎ６細胞は、スクランブルｓｉＲＮＡ（Ｓｃｒｂ）または２つの異なるＣＸ３ＣＲ１  ｓｉＲＮＡ（ＣＸ−１およびＣＸ−２）をトランスフェクトされた。トランスフェクションの４８時間後、ＧＳＩＳは、１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＫＮの存在下もしくは非存在下で測定され（左のパネル）、または定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲがＣＸ３ＣＲ１発現について実施された（右のパネル）。＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１。（Ｅ）ＮＣＤでのＷＴマウスおよびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスからの膵島を使用する洗い流し実験。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝５。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。（Ｆ−Ｇ）ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島を移植したＳＴＺ処理マウスは、ＷＴ膵島を移植されたマウスよりもよりグルコース非耐容性であった。ＧＴＴの間の血漿グルコース（Ｆ）およびインスリン（Ｇ）レベル。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝６。群あたりｎ＝５。（Ｈ）固形飼料およびＨＦＤのいずれかでのＷＴマウスまたはＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスからの膵島におけるβ細胞機能および伝達に関与する遺伝子のｍＲＮＡレベル。各遺伝子のｍＲＮＡレベルは、同じサンプル中での１８Ｓ  ｒＲＮＡレベルに標準化された。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝６。＊、Ｐ＜０．０５  ＷＴ−ＮＣＤ対ＫＯ−ＮＣＤまたはＷＴ−ＮＣＴ対ＷＴ−ＨＦＤ；＊＊、Ｐ＜０．０１  ＷＴ−ＮＣＤ対ＫＯ−ＮＣＤまたはＷＴ−ＮＣＴ対ＷＴ−ＨＦＤ；＃、Ｐ＜０．０５  ＷＴ−ＨＦＤ対ＫＯ−ＨＦＤ。図９および１０もまた参照のこと。
【図４】ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスは、β細胞量およびインスリン含量の増加を呈する。（Ａ）抗インスリン抗体（緑グレースケール）および抗グルカゴン抗体（赤グレースケール）を使用するＷＴ膵島およびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島の免疫組織化学分析。（Ｂ）ＮＣＤでのＷＴマウスおよびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスのβ細胞量。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝８。＊、Ｐ＜０．０５。（Ｃ）膵臓インスリン含量。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝１０。（Ｄ）ＷＴマウスおよびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスの相対膵島細胞サイズ。相対膵島細胞サイズは、β細胞面積を核の数によって除算することによって計算された。ＡＵ、任意単位。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝８。（Ｅ−Ｆ）ＷＴβ細胞およびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ  β細胞の限外顕微鏡分析。（Ｅ）ＮＣＤでのＷＴマウス膵島およびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウス膵島の限外顕微鏡写真。（Ｆ）ミトコンドリアの長さ（上左）および幅（上右）、所定の面積あたりのミトコンドリア数（下左）、ならびにクリステの存在量（下右）がＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して計算された。平均＋／−ＳＥＭ。ＷＴ膵島およびＫＯ膵島の１０枚の異なるＥＭ写真、および各ＥＭ写真の中心に対して最も近くに位置する少なくとも２つのミトコンドリアが、形態計測のために分析された。ＡＵ、任意単位；Ｎ．Ｓ．、有意でない。（Ｇ）ＮＣＤでのＷＴマウスおよびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスの膵島における血管密度は免疫組織化学によって分析された。膵臓切片は、抗ＣＤ３４抗体（内皮細胞；緑グレースケール）および抗インスリン抗体（β細胞；赤グレースケール）で同時染色され、インスリン陽性領域におけるＣＤ３４陽性シグナルの強度が測定され、右パネルにおいてグラフ化された。平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝６（ＷＴ）および８（ＫＯ）。（Ｈ）抗ＣＸ３ＣＲ１抗体（赤グレースケール、左）、抗ＦＫＮ抗体（赤グレースケール、右）、または抗インスリン抗体（緑グレースケール）を使用するマウス膵島の免疫組織化学分析。（Ｉ）抗ＣＸ３ＣＲ１抗体（緑グレースケール）および抗インスリン抗体（赤グレースケール）、または抗グルカゴン（赤グレースケール）抗体を使用するヒト膵島の免疫組織化学。図１１および１２も参照のこと。
【図５】ＦＫＮは、マウスにおいて、ＣＸ３ＣＲ１依存性様式で、インスリン分泌を増強し、耐糖能を改善する。（Ａ−Ｃ）ＷＴマウスおよびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウス（ＮＣＤ）に、グルコース（２ｇ／ｋｇ）＋ＦＫＮ（４０μｇ／ｋｇ）またはグルコース＋ビヒクル溶液が腹腔内注射され、そして血液グルコースおよびインスリンのレベルが、示された時点で測定された。平均＋／−ＳＥＭ、ｎ＝６（ビヒクル）または７（ＦＫＮ）。（Ａ）ＷＴマウスにおける耐糖能試験。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１。（Ｂ）ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスにおける耐糖能試験。（Ｃ）ＧＴＴの間の血漿インスリンレベル。（Ｄ）マウスＦＫＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下でのＷＴ膵島およびＫＯ膵島を使用するインビトロ静的ＧＳＩＳ研究。群あたりｎ＝６。（Ｅ）示されたレベルのグルコースに応答した一次マウス膵島を使用する洗い流し実験、ＧＬＰ１（１００ｎＭ）およびＦＫＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）。＊＊＊、Ｐ＜０．００１。（Ｆ）パネルＥにおける洗い流し実験の間の膵島での酸素消費率。（Ｇ）ヒトＦＫＮ（１００または４００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下でのヒト膵島を使用するインビトロ静的ＧＳＩＳ研究。ｎ＝４。＃、Ｐ＝０．０７６；＊、レーン２と比較してＰ＜０．０５。図１３も参照のこと。
【図６】ＦＫＮは、ＣＸ３ＣＲ１−およびＭＥＫ−依存性様式で、細胞内カルシウムレベルを増加させることによって、インスリン分泌を刺激する。（Ａ）ＦＫＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下での百日咳毒素（ＰＴＸ；２５０ｎｇ／ｍｌ）、ワートマニン（Ｗｏｒｔ；１０μΜ）、またはＰＤ９８０５９（５０μＭ）を伴うか伴わずに、一次マウス膵島を使用するＧＳＩＳ試験。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝６。（Ｂ）ＦＫＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＵ０１２６（１０μΜ）を伴うかまたは伴わずにＭｉｎ６細胞を使用するＧＳＩＳ試験。平均＋／−ＳＥＭ。（Ｃ−Ｉ）グルコース（Ｃ、グルコースあり；Ｄ、グルコースなし）、ニモジピン（１０μΜ）（Ｅ）、対照抗体（Ｆ）、抗ＣＸ３ＣＲ１中和抗体（Ｇ）、ＰＴＸ（２５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｈ）、またはＵ０１２６（１０μΜ）（Ｉ）の存在下または非存在下でのＭｉｎ６マウスβ細胞中の細胞内カルシウムレベル。平均＋／−ＳＥＭ。（Ｊ）細胞内ｃＡＭＰレベル。Ｍｉｎ６細胞は、イソブチルメチルキサンチンと３０分間プレインキュベートされ、次いで、低グルコース条件（２．８ｍＭ）または高グルコース条件（１６．７ｍＭ）で、ＧＬＰ１（１００ｎＭ）、フォルスコリン（１００μΜ）、またはＦＫＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）で３０分間処理された。平均＋／−ＳＥＭ。（Ｋ）ＰＫＡ酵素活性は、ＧＬＰ１（１００ｎＭ）またはＦＫＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、低グルコース条件（２．８ｍＭ）または高グルコース条件（１６．７ｍＭ）において、１５分間インキュベートされたＭｉｎ６細胞において測定された。平均＋／−ＳＥＭ。（Ｌ）ＦＫＮは、β細胞機能に関与する遺伝子の発現を刺激する。一次マウス膵島は、ＦＫＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）を伴うかまたは伴わずに７日間インキュベートされ、ＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｇｌｕｔ２、およびＨＩＦ−１αのｍＲＮＡ発現が、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定された。平均＋／−ＳＥＭ。＊、Ｐ＜０．０５。（Ｍ）ＷＴ膵島およびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島におけるＩＣＥＲ−１  ｍＲＮＡ発現。平均＋／−ＳＥＭ。（Ｎ）パルミチン酸誘導性ＩＣＥＲ−１発現はＭｉｎ６細胞においてＦＫＮによって抑制される。平均＋／−ＳＥＭ。（Ｏ）ＦＫＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下でパルミチン酸（Ｐａｌ；０．４ｍＭ）で４８時間処理されたＭｉｎ６細胞によるＧＳＩＳ。（Ｐ）ＦＫＮは、ＩＣＥＲ−１のＮｅｕｒｏＤプロモーターへの結合を抑圧する。Ｍｉｎ６細胞は、無血清培地中でパルミチン酸（１００μΜ）および／またはＦＫＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下でインキュベートされた。４８時間後、細胞は固定され、抗ＩＣＥＲ−１抗体を用いるクロマチン免疫沈殿に供せられた。（Ｑ）ＩＣＥＲ−１発現に対するＦＫＮの抑制効果はＭＥＫ阻害剤（Ｕ０１２６）によって無効にされる。Ｍｉｎ６細胞は、ＦＫＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＵ０１２６（１０μΜ）の存在下または非存在下で、パルミチン酸（Ｐａｌ；０．４ｍＭ）とともにインキュベートされた。４８時間後、細胞は収集され、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに供せられた。図１４、１５、および１６もまた参照のこと。
【図７】ＦＫＮ発現は、膵島において、加齢およびＨＦＤによって低下される。（Ａ）７週齢（７ｗ）−ＮＣＤ（Ｎ）、２４週齢（２４ｗ）−ＮＣＤ、または２４週齢−ＨＦＤマウスにおけるＦＫＮ  ｍＲＮＡ発現。＊、Ｐ＜０．０５  ２４ｗ−ＮＣＤ対２４ｗ−ＨＦＤ。ＦＫＮ  ｍＲＮＡレベルは、各サンプルにおける１８Ｓ  ｒＲＮＡレベルに対して標準化された。平均＋／−ＳＥＭ、群あたりｎ＝６。（Ｂ）７週齢（７ｗ）−ＮＣＤ（Ｎ；ｎ＝５）、１年齢（１ｙ）−ＮＣＤ（ｎ＝８）、または１年齢−ＨＦＤ（Ｈ；ｎ＝６）マウスにおけるＦＫＮ  ｍＲＮＡ発現。平均＋／−ＳＥＭ。＊、Ｐ＜０．０５  ７ｗ−ＮＣＤ対１ｙ−ＮＣＤまたは７ｗ−ＮＣＤ対１ｙ−ＨＦＤ。（Ｃ）ＦＫＮタンパク質発現レベルは、パネルＢにおいて使用されたサンプルのアリコート中で測定された。ＦＫＮタンパク質レベルは、全体のタンパク質濃度によって標準化された。平均＋／−ＳＥＭ。＊、Ｐ＜０．０５  ７ｗ−ＮＣＤ対ｌｙ−ＮＣＤ；＊＊、Ｐ＜０．０１  ７ｗ−ＮＣＤ対１ｙ−ＨＦＤ；＃、Ｐ＜０．０５  １ｙ−ＮＣＤ対１ｙ−ＨＦＤ。（Ｄ）ＦＫＮ  ｍＲＮＡ発現は、インビトロ拡大されたヒトβ細胞において低下される。ＦＫＮおよびＣＸ３ＣＲ１のｍＲＮＡレベルは新鮮に単離されたヒト膵島（Ｉｓｌｅｔ）において、またはインビトロ拡大された膵島（Ｅｘｐ）において、実験手順に示されたように分析された。平均＋／−ＳＥＭ。
【図８】図２ＡにおけるＯＧＴＴの間のインスリン対グルコース比率。平均＋／−ＳＥＭ。
【図９】洗い流し（図３と関連）の間のＦＫＮによる膵島における酸素消費。（Ａ）ミトコンドリア燃料ＫＩＣ（１０ｍＭ）、高グルコース（２０ｍＭ）、または高グルコース（２０ｍＭ）＋ニモジピン（５μΜ）に応答した洗い流しＷＴ膵島の酸素消費速度の変化（ΔＯＣＲ）。平均＋／−ＳＥＭ。（Ｂ）ミトコンドリア燃料ＫＩＣ（１０ｍＭ）、高グルコース（２０ｍＭ）、または高グルコース（２０ｍＭ）＋ニモジピン（５μΜ）に応答した洗い流しＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島の酸素消費速度。平均＋／−ＳＥＭ。（Ｃ）パネルＡおよびＢにおける曲線下面積、および統計学的分析。
【図１０】ＷＴ膵島またはＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島におけるＡＴＰ依存性カリウムチャネルおよび電位開口型カルシウムチャネルの成分のｍＲＮＡ発現（図３に関連）。
【図１１】ＷＴ膵島またはＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島のインスリン含量および全体の膵臓重量（図４に関連）。（Ａ−Ｂ）ＮＣＤ（Ａ）またはＨＦＤ（Ｂ）のいずれかでのＷＴマウスおよびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスの膵臓重量。平均＋／−ＳＥＭ。（Ｃ）ＷＴマウスまたはＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスからの膵島あたりのインスリン含量。比較のために、２０個の同様のサイズの膵島がＷＴ膵島またはＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島から手で取り上げられ、酸性エタノール中で溶解され、そしてインスリン測定に供せられた。膵島あたりのインスリン含量は、管あたりの全体のインスリン含量を２０で除算することによって計算された。ｎ＝６。平均＋／−ＳＥＭ。＊、Ｐ＜０．０５。
【図１２】ＣＸ３ＣＲ１およびＦＫＮは、ヒトおよびマウスの膵島、ならびにＭｉｎ６およびＩＮＳ−１マウス、およびラットのβ細胞系統において発現された（図４と関連）。ヒト膵島およびマウス膵島、ならびにＭｉｎ６細胞およびＩＮＳ−１細胞におけるＣＸ３ＣＲ１およびＦＫＮ発現の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析。
【図１３】ＦＫＮは用量依存的な様式でＧＳＩＳを刺激する。一次マウス膵島は、様々なＦＫＮの濃度（１０−１０００ｎｇ／ｍｌ）において、中間体（１１ｍＭ）または高グルコース（１６．７ｍＭ）濃度で刺激された（図５と関連）。
【図１４】ＦＫＮはＰＴＸ感受性様式でＥＲＫリン酸化を刺激する（図６と関連）。Ｍｉｎ６細胞は、ＤＭＳＯ（対照）、Ｕ０１２６（１０μΜ）、またはＰＴＸ（２５０ｎｇ／ｍｌ）で１５分間前処理され、次いで、ＦＫＮ（１００ｎｇ）を伴うかまたは伴わずに、１５分間インキュベートされた。細胞は収集され、ウェスタンブロットに供せられた。
【図１５】Ｕ０１２６によるＥｒｋ活性化の阻害は、Ｍｉｎ６マウスβ細胞において、アルギニン＋グルコースで刺激された細胞内カルシウムの増加およびインスリン分泌活性を減少させた（図６と関連）。（Ａ−Ｂ）Ｍｉｎ６細胞における細胞内カルシウムレベル。Ｍｉｎ６細胞は、Ｕ０１２６あり（中央）またはなし（１０μΜ；左）で、３０分間、２．８ｍＭ  グルコース培地中でインキュベートされ、次いで、アルギニン（１０ｍＭ）および／または高グルコース（１６．７ｍＭ）チャレンジの存在下または非存在下で細胞内カルシウム測定に供せられた。（Ａ）アルギニン処理を伴う細胞内カルシウムレベル。（Ｂ）アルギニン＋高グルコース（１６．７ｍＭ）処理に伴う細胞内カルシウムレベル。最初の９０秒間（パネルＡ）および６０秒間（パネルＢ）についての曲線下面積は右側にグラフ化された。（Ｃ）Ｕ０１２６によるＥｒｋ活性化の阻害は、Ｍｉｎ６細胞において、グルコース刺激されたインスリン分泌およびアルギニン＋グルコース刺激されたインスリン分泌を減少させる。
【図１６】ＦＫＮは、ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ−依存的経路におけるパルミチン酸誘導性β細胞アポトーシスを妨害する（図６に関連）。（Ａ−Ｃ）Ｍｉｎ６細胞は、４８時間の間、ＦＫＮ（１００ｎｇ／ｍｌ＝１０．５ｎＭ）またはＧＬＰ１（１００ｎＭ）の存在下または非存在下で、パルミチン酸（Ｐａｌ；０．４ｍＭ）で処理され、次いで、カスパーゼ−３／７活性測定（Ａ）、細胞生存度アッセイ（ＭＴＴアッセイ）（Ｂ）、または細胞数計数（Ｃ）が行われた。処理による細胞数の倍数変化は、インキュベーションの４８時間後の全細胞数を、各ウェル上に最初にプレートされた細胞の数（１×１０４細胞／ウェル）によって除算することによって測定された。（Ｄ）ＷＴおよびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯの膵臓切片のＫｉ６７染色。７週齢において、マウスは、１０週間の間、固形飼料または６０％  ＨＦＤに供せられた。マウスから収集された全膵臓は４％  パラホルムアルデヒドで固定され、ＩＨＣに供せられた。（Ｅ）Ｍｉｎ６細胞は、１５分間の間、ＦＫＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＧＬＰ１（１００ｎＭ）、またはワートマニン（Ｗｏｒｔ；１０μΜ）で処理され、次いで、ウェスタンブロット分析に供せられた。（Ｆ）ＦＫＮは、ＰＩ３Ｋ依存性経路を通して、パルミチン酸誘導性β細胞アポトーシスを抑制する。Ｍｉｎ６細胞は、ＦＫＮ（１００ｎｇ／ｍｌ）またはワートマニン（Ｗｏｒｔ；１０μΜ）の存在下または非存在下で、４８時間の間、パルミチン酸（Ｐａｌ；０．４ｍＭ）とともにインキュベートされ、そしてカスパーゼ−３／７活性測定に供せられた。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明および本明細書に含まれる実施例を参照することにより、より容易に理解されるかもしれない。しかし、本発明の核酸、ペプチド、化合物、組成物、および方法が開示および記載される前に、本発明は、特定の核酸、ペプチドもしくはタンパク質、化合物、組成物、細胞型、宿主細胞、条件、または方法などに限定されず、このようなものとして、当然、変動してもよく、そしてその中での多数の改変およびバリエーションが当業者に明白であることが理解される。本明細書で使用される命名法は特定の実施形態を説明する目的のみのためであり、限定が意図されないこともまた理解される。明細書および特許請求の範囲の中で使用される場合、単数形（「ａ」または「ａｎ」）は、それが使用される文脈に依存して、１つ以上を意味することができることもまた理解される。従って、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」の言及は少なくとも１つの細胞が利用できることを意味することができる。
【００１５】
本発明は、ＣＸ３ＣＲ１（ニューロアクチンまたはフラクタルキン受容体としてもまた知られる、ＣＸ３Ｃケモカイン受容体）のインスリン分泌促進作用を標的とし、および調節することによって、糖尿病、肥満、ならびにアテローム性動脈硬化症、脳卒中、および心筋梗塞が含まれるがこれらに限定されない循環器病のための新たな診断、予後診断、治療および研究ツール、方法、ならびに組成物を提供する。特定の実施形態において、この治療方法は、ＣＸ３ＣＲ１発現および／または活性を活性化する、可溶性内因性ＦＫＮ（ＣＸＣＲＬ１またはフラクタルキンとしてもまた知られる）リガンド、またはそのアナログ、またはＣＸ３ＣＲ１アゴニスト、活性化因子、または抗体などの薬剤の治療有効量を含む組成物を、必要がある被験体に投与すること、従って、細胞内カルシウムイオンレベルの増加などのＣＸ３ＣＲ１下流シグナル伝達経路を増強すること、ならびに被験体の膵臓におけるマクロファージの輸送および炎症を調整することを備える。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「発現レベル」という用語は、細胞内で発現される、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質がコードされた治療の量をいう。本明細書で使用される場合、「遺伝子」は、転写および翻訳された後で、特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることが可能である少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するＤＮＡポリヌクレオチドを含む。本明細書に記載されているポリヌクレオチド配列のいずれかはまた、それらが関連する遺伝子のより大きなフラグメントまたは全長コード配列を同定するために使用されてもよい。より大きなフラグメント配列を単離する方法は当業者には公知である。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸／ヌクレオチド」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は交換可能に使用され、任意の長さの、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそのアナログのいずれかのヌクレオチドのポリマー型を含む。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有してもよく、知られているかまたは知られていない、任意の機能を発揮してもよい。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、天然に存在、合成、組換え、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「天然に存在する」ポリヌクレオチド分子には、例えば、天然に存在する（例えば、天然のタンパク質をコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡ（ｍＲＮＡ）またはＤＮＡ分子が挙げられる。本明細書で使用される場合、「組換え」とは、合成されるかもしくは他の方法でインビトロ操作されたポリヌクレオチド（例えば、「組換えポリヌクレオチド」）、細胞もしくは他の生物学的系の中で遺伝子産物を産生するために組換えポリヌクレオチドを使用する方法、または組換えポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド（組換えタンパク質）をいう。「組換え」はまた、本発明の移行ドメインおよび本発明のプライマーを使用して増幅された核酸配列を備える融合タンパク質の発現、例えば、誘導性または構成的発現のための発現カセットまたはベクターへの、異なる供給源からの様々なコード領域またはドメインまたはプロモーター配列を有する核酸のライゲーションも包含する。
【００１９】
ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーのアセンブリーの前後で付与されてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分との結合体化によって、ポリマー化後にさらに修飾されてもよい。この用語はまた、二本鎖の分子と一本鎖の分子の両方を含む。他に特定されないかまたは必要とされない場合、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、二本鎖型と、二本鎖型を作り上げることが知られているかまたは予測される、２つの相補的な一本鎖型の各々の両方を包含する。「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。ポリヌクレオチドは、４つのヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡのときのグアニンの代わりのウラシル（Ｕ）の特定の配列から構成される。このアルファベット表記は、コンピューターの中のデータベースに入力でき、例えば、機能的ゲノミクスおよびホモロジー検索などのバイオインフォマティクス適用のために使用できる。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」という用語は交換可能であり、２つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログ、またはペプチド模倣物の化合物を含む。これらのサブユニットはペプチド結合によって連結されてもよい。別の実施形態において、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結されてもよい。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸および／または天然でないかもしくは合成のアミノ酸のいずれかを含み、これには、Ｄ型またはＬ型の光学異性体と、アミノ酸アナログおよびペプチド模倣物の両方が含まれる。３つ以上のアミノ酸のペプチドは、一般的には、オリゴペプチドと呼ばれる。３つ以上のアミノ酸よりも大きなペプチド鎖は、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【００２１】
本明細書で使用される場合、治療剤の「治療有効量」という用語は、非毒性であるが、少なくともある程度のレベルの所望の治療効果を提供するためのそのような治療剤の十分な量を意味することが意図される。有効である量は、個体の年齢および一般的状態、特定の活性な因子などに依存して、被験体から被験体で変動する。従って、正確な有効量を特定することが常に可能であるわけではない。しかし、任意の個体の場合における適切な有効量は、日常的な実験を使用して当業者によって決定されてもよい。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「調節する」という用語は、活性化すること、刺激すること、および／またはアップレギュレーションをいう。活性化因子またはアゴニストは、例えば、ＣＸ３ＣＲ１または下流のシグナル伝達経路における他の分子の遺伝子またはタンパク質に結合し、これを部分的または全体的に刺激し、増強し、増加し、活性化し、感作し、またはアップレギュレートする化合物である。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「治療剤」という用語は、任意のオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド剤）、ポリヌクレオチド（例えば、治療用ＤＮＡ）、リボザイム、ｄｓＲＮＡｓ、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、および／または遺伝子治療ベクターをいってもよい。「アンチセンスオリゴヌクレオチド剤」という用語は、ｍＲＮＡ上の独特な配列セグメントに結合することによって、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害するための特異的ｍＲＮＡの配列に相補的であるよう設計されている、通常はオリゴヌクレオチドといわれるＤＮＡまたはＲＮＡの短い合成セグメントをいう。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば、アンチセンス技術の中で開発され、使用されている。「アンチセンス技術」という用語は、特異的疾患原因タンパク質の産生を阻害するために標的ｍＲＮＡに相補的な合成オリゴヌクレオチドの設計および使用に関わる、創薬および開発技術をいう。アンチセンス技術は、遺伝子レベルで疾患関連タンパク質の産生に介入し、これを阻害する、アンチセンスオリゴヌクレオチドと呼ばれる薬物の設計を可能にする。アンチセンスオリゴヌクレオチド剤は、遺伝情報に基づいて開発される。
【００２４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドに対する代替として、リボザイムまたは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、および／または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、細胞中の遺伝子発現の調整のための治療剤として使用できる。本明細書で使用される場合、「リボザイム」という用語は、リボザイムが相補領域を有するｍＲＮＡなどの一本鎖核酸を切断することが可能である、リボヌクレアーゼ活性を有する、触媒ＲＮＡに基づく酵素をいう。リボザイムは、標的ｍＲＮＡ転写を触媒的に切断するために使用でき、それによって、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。「ｄｓＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、２本鎖のＲＮＡを備えるＲＮＡハイブリッドをいう。ｄｓＲＮＡは、構造が線状または環状であり得る。ｄｓＲＮＡは、リボヌクレオチド、２’−Ｏ−メチルリボシル残基などのリボヌクレオチドアナログ、またはこれらの組み合わせを備えてもよい。「ＲＮＡｉ」という用語は、ＲＮＡ干渉または転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）をいう。「ｓｉＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡｉ効果の媒介因子である低分子ｄｓＲＮＡ分子（例えば、２１〜２３ヌクレオチド）をいう。ＲＮＡｉは、インビトロ転写によって産生される長いｄｓＲＮＡ（１〜２ｋｂまで）の導入によって誘導され、様々な生物において遺伝子発現を減少するために首尾よく使用されてきた。哺乳動物細胞において、ＲＮＡｉはｓｉＲＮＡ（例えば、２２ヌクレオチド長）を使用して、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合し、次いでこれは、いかなる一致するｍＲＮＡにも結合して標的ｍＲＮＡを分解し、従って、遺伝子をサイレンシングする。
【００２５】
本明細書で使用される場合、治療剤はまた、遺伝子治療のために使用される任意のベクター／ウイルスを含んでもよい。「遺伝子治療」という用語は、欠損遺伝子を修正し、または疾患の発生の原因である遺伝子を阻害もしくは増強するための技術をいう。このような技術は、機能的でない遺伝子を置き換えるために、ゲノム中の特異的でない位置に正常遺伝子を挿入すること；相同組み換えを通して、異常遺伝子を正常遺伝子と交換すること、選択的復帰突然変異を通して、異常遺伝子を修復してその正常機能を再開すること；ならびに、特定の遺伝子の遺伝子発現および／または機能を変化させ、または調整することを含んでもよい。本明細書で使用される場合、「ベクター／ウイルス」という用語は、患者の標的細胞に「正常な」治療遺伝子を運び、および送達するキャリア分子をいう。ウイルスは、病原性の様式で、ヒト細胞にウイルスの遺伝子を封入および送達する方法を進化させてきたので、遺伝子治療のための大部分の一般的なベクターは、正常ヒトＤＮＡを運ぶように遺伝的に変化されたウイルスである。本明細書で使用される場合、遺伝子治療のためのウイルス／ベクターには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルスが挙げられる。「レトロウイルス」という用語は、宿主細胞の染色体にさらに組み込むことができる、それらのＲＮＡゲノムの二本鎖ＤＮＡコピーを作製することができるウイルスのクラスをいい、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）はレトロウイルスである。「アデノウイルス」という用語は、ヒトにおける呼吸器、腸、および眼の感染を引き起こす二本鎖ＤＮＡゲノムを有するウイルスのクラスをいい、例えば、一般的な風邪を引き起こすウイルスはアデノウイルスである。「アデノ随伴ウイルス」という用語は、第１９染色体上の特定の部位にそれらの遺伝物質を挿入できる小さな一本鎖ＤＮＡウイルスのクラスをいう。「単純ヘルペスウイルス」という用語は、特定の細胞型、神経細胞に感染する二本鎖ＤＮＡウイルスのクラスをいう。１型単純ヘルペスウイルスは、口唇ヘルペスを引き起こす一般的なヒト病原体である。
【００２６】
特定の実施形態において、本発明は、細胞中でＣＸ３ＣＲ１の発現または活性を直接的または間接的に活性化する、タンパク質活性化因子、リガンド、および／またはアゴニスト、ならびにそれらの医薬組成物を使用して、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、および他の循環器病を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、このようなＣＸ３ＣＲ１選択的活性化因子、リガンド、アゴニストは、直接的または間接的に、ＣＸ３ＣＲ１に結合し、またはこれらと相互作用することが可能であり、従って、膵臓において、細胞内カルシウムイオンレベルの増加、ならびに、マクロファージ輸送および炎症を調整することを含む、ＣＸ３ＣＲ１下流シグナル伝達経路を増強することによって、膵臓β細胞におけるインスリンの発現および分泌を増加する、任意のポリペプチド、タンパク質、合成の、非毒性の、生物活性分子、および／または免疫学的に活性な分子を備える。他の実施形態において、このようなＣＸ３ＣＲ１選択的活性化因子、リガンド、アゴニストは、直接的または間接的にＣＸ３ＣＲ１に結合し、またはこれらと相互作用することが可能であり、従って、血中グルコースレベルを低下させ、もしくはアテローム性動脈硬化病変へのマクロファージのプラーク形成能を減少させ、ならびに進行したアテローム性動脈硬化病変の壊死性コアにおける血管平滑筋細胞のアポトーシスを阻害する、任意のポリペプチド、タンパク質、合成、非毒性、生物活性分子、および／または免疫学的に活性な分子を備える。
【００２７】
他の実施形態において、本発明は、ＣＸ３ＣＲ１および／またはＦＫＮの発現レベルおよび／または活性を活性化することが可能である、任意の薬物、化合物、小分子、タンパク質、抗体、ヌクレオチド、およびこれらの薬学的組成物を使用する、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、脳卒中、および他の循環器病を治療する方法を提供する。本発明は、ＣＸ３ＣＲ１もしくはＦＫＮ、またはそれらの下流のシグナル伝達経路を直接的または間接的に調節する、公知であるかまたは後で開発される任意の分子を意図する。本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、上記のような１種以上の治療剤、および１種以上の薬学的に許容可能な担体またはビヒクルを備える組成物を意図する。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体またはビヒクル」という用語は、当該分野において公知である任意の許容可能な材料、および／または任意の１種以上の添加物を備える。本明細書で使用される場合、「担体」または「ビヒクル」という用語は、当該分野において公知である様々な従来的な投与経路を通して薬物投与のために適切である担体材料をいう。本発明において有用である担体およびビヒクルには、非毒性でありかつ有害な様式で組成物の他の成分と相互作用しない、当該分野において公知である任意のこのような材料が挙げられる。
【００２８】
本発明はまた、上記のような薬学的組成物の製剤のための任意の従来的な方法も意図する。当業者に公知である様々な添加物が、製剤中に含まれてもよい。例えば、比較的少量のアルコールを含む溶媒は、特定の薬剤物質を可溶化するために使用されてもよい。他の任意の添加剤には、乳白剤、抗酸化剤、香料、着色剤、ゲル化剤、濃厚剤、安定剤、界面活性剤などが挙げられる。保存に際して腐敗を妨害するために、すなわち、酵母およびカビなどの微生物の増殖を阻害するために、抗菌剤などの他の剤もまた、加えられてもよい。適切な抗菌剤は、典型的には、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のメチルおよびプロピルエステル（すなわち、メチルおよびプロピルパラベン）、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、イミドウレア、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２９】
本発明はまた、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、または他の循環器病のような障害のリスクがある被験体におけるＣＸ３ＣＲ１および／またはＦＫＮの発現および／または活性のレベルを、正常被験体におけるそれと比較することによる、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、または他の循環器病のための診断方法を提供する。本発明の特定の実施形態において、これらの障害のリスクがある被験体からの細胞における、ＣＸ３ＣＲ１および／またはＦＫＮのｍＲＮＡとタンパク質の両方の発現レベルが、正常細胞におけるベースラインレベルのＣＸ３ＣＲ１および／またはＦＫＮ  ｍＲＮＡならびにタンパク質の発現レベルと比較され、ここで、ＣＸ３ＣＲ１および／もしくはＦＫＮのｍＲＮＡおよび／もしくはタンパク質の発現もしくは活性のレベルのベースラインレベルに関して、ＣＸ３ＣＲ１および／もしくはＦＫＮのｍＲＮＡのレベルおよび／もしくはタンパク質の発現レベルの低下、またはＣＸ３ＣＲ１および／もしくはＦＫＮｌ活性の減少は、被験体における糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化症、および／または他の循環器病との関連性を示す。本発明の診断方法は、膵臓細胞および／または膵島を含有する任意の生物学的液体および／または組織を使用して実施される。
【００３０】
本発明はさらに、糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化症、および他の循環器病の診断のためのキットを提供し、このキットは、ＣＸ３ＣＲ１および／またはＦＫＮの発現または活性のレベルを決定するためのバイオマーカー検出試薬、ならびにこれらの障害を診断する際のこれらの使用のための説明書を備える。本明細書で使用される場合、「バイオマーカー」という用語は、生物学的プロセスもしくは病理学的プロセス、または治療的介入に対する薬理学的応答の指標および／または予後診断因子をいう。本明細書で使用される場合、「予後診断因子」という用語は、疾患の様々な発症、変化、および結果を含む、糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化症、および他の循環器病の予想、および／または予測される経過に寄与する任意の分子および／または物質をいう。本明細書で使用される場合、「検出試薬」という用語は、ＣＸ３ＣＲ１および／またはＦＫＮを検出、測定、および調べることが可能である化学反応およびプロセスにおいて使用される任意の物質、化学物質、溶液をいう。特定の実施形態において、本発明において使用されるバイオマーカー検出試薬は、ＣＸ３ＣＲ１および／またはＦＫＮのｍＲＮＡもしくはタンパク質のいずれか、または両方の発現および／または活性のレベルを決定するために適切である化学物質、物質、および溶液を備える。
【００３１】
１つの検出試薬は、ＣＸ３ＣＲ１もしくはＦＫＮに特異的に結合する抗体分子もしくはそのフラグメント、またはＣＸ３ＣＲ１もしくはＦＫＮについての抗原を備える、免疫学的に活性な分子を含んでもよい。「抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、二重特異的抗体）、および、ＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮに結合する所望の生物学的活性を呈する限りは、抗体のフラグメントを包含する。「抗体フラグメント」という用語は、全長抗体の一部、一般的には、その抗原結合領域または可変領域を備える。抗体フラグメントの例には、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびＦｖフラグメントが挙げられる。
【００３２】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわち、この集団を備える個々の抗体は、わずかな量で存在してもよいあり得る天然に存在する変異を除けば同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向されている。さらに、典型的には、様々な決定基（エピトープ）に対して指向される様々な抗体を含む、従来的な（ポリクローナル）抗体調整物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向されている。「モノクローナル抗体」はまた、当該分野において公知である技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００３３】
本発明におけるモノクローナル抗体は、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含み、そこでは、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種から誘導された抗体、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に対して同一または相同であるのに対して、残りの鎖は、別の種から誘導された抗体、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列、ならびに、所望の生物学的活性を呈する限り、このような抗体のフラグメントに対して、同一または相同である。
【００３４】
「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントという用語は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを備え、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。一般的には、Ｆｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の結合を形成することを可能にする、ＶＨドメインとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーをさらに備える。
【００３５】
「単離された」抗体は、その天然の環境の成分から同定および分離され、ならびに／または回収されたものである。その天然の環境の夾雑成分は、抗体にとっての診断用途または治療用途と干渉する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含んでもよい。好ましい実施形態において、抗体は、（１）Ｌｏｗｒｙ法によって決定されるように、抗体の９５重量％より高く、および最も好ましくは９９重量％より高く、（２）スピニングカップシークエネーターの使用により少なくともＮ末端もしくは内部の１５個の残基のアミノ酸を得るために十分な程度まで、または（３）還元条件下もしくは非還元条件下で、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ染色または好ましくは銀染色を使用する、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による均一まで、精製される。単離された抗体は、組換え細胞中にその抗体をインサイチュで含む。なぜなら、抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分が存在しないからである。しかし、通常は、単離された抗体は、少なくとも１回の精製工程によって調製される。
【００３６】
ヒトにおけるモノクローナル抗体の潜在的な免疫原性を回避するために、所望の機能を有するモノクローナル抗体は、好ましくは、ヒト化される。非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有するキメラ抗体である。大半の部分については、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、そこでは、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、または非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）からの超可変領域残基によって置き換えられている。ある例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体には見出されない残基を備えてもよい。これらの修飾は、抗体の性能をさらに洗練するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを備え、そこでは、すべてまたは実質的にすべての超可変ループが非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、そしてすべてまたは実質的にすべてのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン配列のそれである。ヒト化抗体はまた、任意に、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部を備える。特定のＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮと免疫反応することが可能である抗体は、当該分野において公知である従来的な方法を使用して作製される。
【００３７】
当業者に知られているか、または将来発見される、ＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮ遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）に選択的に結合する他の分子は、本発明の範囲内にあることが意図される。このような分子には、所望のＤＮＡ、ＲＮＡ、および／またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの配列を備える、プライマーおよび／またはプローブが挙げられる。本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語は、所定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列（例えば、特定のＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮの配列）に相補的であり、そしてＤＮＡポリメラーゼによる複製を開始するために必要とされる、ＤＮＡまたはＲＮＡのセグメントをいい、「プローブ」という用語は、放射性標識され、または他の方法でマークされ、サンプル中の別の物質を検出または同定するために使用される、ＤＮＡなどの物質をいう。本明細書で使用される場合、「プライマー」および「プローブ」という用語は交換可能に使用され、典型的には、実質的に単離されたオリゴヌクレオチドを備え、このオリゴヌクレオチドは、ＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮのヌクレオチド配列、またはその天然に存在する変異体のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖の少なくとも約１２、好ましくは約２５、より好ましくは、約４０、５０、または７５の連続するヌクレオチドに、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を備える。
【００３８】
本明細書で使用される場合、ＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮのヌクレオチド配列に基づくプライマーは、ＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮのホモログをクローニングするためにＰＣＲ反応において使用できる。ＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮのヌクレオチド配列に基づくプローブは、同じかまたは実質的に同一であるポリペプチドまたはタンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出するために使用できる。好ましい実施形態において、このプローブは、そこに結合した標識基をさらに備え、例えば、この標識基は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素コファクターであり得る。このようなプローブは、細胞のサンプル中のコード核酸のレベルを測定することなどにより、例えば、ｍＲＮＡレベルを検出すること、またはゲノム遺伝子が変異されたかもしくは欠失されたかを決定することにより、ＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮを発現するかまたは過剰発現する細胞を同定するためのゲノムマーカーテストキットの一部として使用できる。
【００３９】
特定の実施形態において、糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化症、または他の循環器病を診断およびモニタリングするためのバイオマーカーおよび／または予後診断因子は、ＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮを備える。なお特定の実施形態において、本発明のキットは、ＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮのｍＲＮＡ、タンパク質、または両方の発現または活性のレベルを検出することが可能である任意の検出試薬を備える。なお他の実施形態において、本発明のキットは、ＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮの発現または活性のレベルを計算するための手段を備える。本発明のキットは、糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化症、または他の循環器病を診断およびモニターする際の使用のための説明書をさらに備える。１つの好ましい実施形態において、キットにおける説明書は、ＣＸ３ＣＲ１またはＦＫＮおよび／またはタンパク質発現または活性のレベルの低下または減少が、糖尿病、肥満、アテローム性動脈硬化症、または他の循環器病との関連を示すことを提供する。
【００４０】
本願の全体を通して、様々な刊行物が引用されている。これらの刊行物およびこれらの刊行物の中で引用されている参考文献のすべての開示は、本発明が属する分野の状態をより完全に説明するために、それらの全体が参照により本願に組み込まれる。
【００４１】
いくつかの実施例が以下に提示される。前述は本発明の好ましい実施形態に関すること、および、多くの変化が本発明の範囲から逸脱することなくそこで行われてもよいことが理解されるべきである。本発明は、以下の実施例によってさらに例証され、これは、いかなる場合においても、本発明の範囲に対して限定を課するものとして解釈されることはない。反対に、この手段は、様々な他のその実施形態、修飾、および等価物に与えられてもよく、本明細書の説明を読んだ後で、これは、本発明の技術思想および／または添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、当業者に、これら自体を示唆してもよいことが明確に理解される。
【実施例】
【００４２】
実施例
以下の実施例は、β細胞インスリン分泌機能の調節におけるＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１系のための新たな制御経路を提供する。ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスが栄養によって刺激されるインスリン分泌の減少を伴う高血糖症を発症すること、およびＫＯマウスから単離された膵島は、ＷＴ膵島と比較して、様々な刺激に応答してインスリンを産生することが少ないことが見出された。さらに、インビボＦＫＮ投与は、耐糖能の改善を伴って血漿インスリンレベルの増加に導くのに対して、単離された膵島のインビトロＦＫＮ処理は、β細胞インスリン分泌を直接的に増強する。
【００４３】
ここで、ＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１系を通してβ細胞機能を調整するための新たな機序が説明される。ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスは、固形飼料とＨＦＤの両方で、インスリン分泌の減少に起因して、グルコース不耐容性を発症する。抗ＦＫＮ抗体のインビボ投与による循環ＦＫＮの中和は、この効果を反復し、インスリン分泌を減じることを伴ってグルコース不耐容性を引き起こし、ＦＫＮが循環インスリンレベルの進行中の維持のために必要であることを実証した。損なわれたインスリン分泌は、一次β細胞欠損を表す。なぜなら、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスからの単離された膵島は、ＷＴ膵島と比較して損なわれたＧＳＩＳを呈し、ＳＴＺ誘導性糖尿病マウスに移植されたＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島は、ＷＴ膵島の移植と比較して、糖尿病状態を修正する能力が軽減されたからである。最後に、ＦＫＮ処理のインビボ投与は、インスリン分泌の増加を伴って、耐糖能の改善をもたらした。直接的に引き起こされたインビボ処理は、単離されたマウス膵島およびヒト膵島においてＧＳＩＳの増加を引き起こした。対照的に、ＦＫＮは、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスまたはＫＯ動物からの膵島において、インスリン分泌に対して効果を伴わなかった。まとめると、これらの研究は、β細胞インスリン分泌のための新たな制御系を明らかにし、ＦＫＮに基づく生物製剤または低分子ＣＸ３ＣＲ１アゴニストが、２型糖尿病の治療における有用な治療ツールであり得ることを示唆する。
【００４４】
このインビトロ研究は、ＦＫＮが直接的インスリン分泌促進物質ではないことを実証する。なぜなら、これは、グルコースの非存在下または低グルコース濃度で、インスリン分泌を増強しないからである。その代わりに、ＦＫＮは、ＧＳＩＳ、アルギニン−、またはＧＬＰ１−媒介インスリン分泌を強化することによって、その効果を発揮するのみである。インビトロ研究は、インスリン分泌に対するＦＫＮの急性効果が、ミトコンドリア機能の変化、環状ＡＭＰレベルの変化、またはＰＫＡ活性の増加に起因するものではないことを示す。グルコースの存在下では、ＦＫＮは、ＭＥＫ−依存性機序を通して、細胞内カルシウムレベルの増加を引き起こす。ＣＸ３ＣＲ１欠失がアルギニンに対するインスリン分泌応答を損なうという事実と合わせると、このことは、インスリン分泌に対するＦＫＮの効果が、いくつかの刺激入力に共通な下流工程において発揮され、ＭＥＫ−依存性カルシウム動員事象と関わる可能性が最も高いことを示唆する。
【００４５】
これらのデータは、ＦＫＮが、ＧＳＩＳおよびＧＬＰ１で刺激されたインスリン分泌を強化するための急性効果を有するが、しかし、ＦＫＮはβ細胞機能に対して長期的効果も同様に有することもまた可能であることを実証する。従って、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島は、ＰＤＸ１、ＮｅｕｒｏＤ、ＧＬＵＴ２、ウロコルチン３、およびＣＸ３６を含む、正常で、完全に機能するβ細胞に特徴的な一連の遺伝子の発現の減少を表示する。さらに、ＷＴ膵島の長期的ＦＫＮ処理は、これらの遺伝子の発現の増加をもたらす。これらの観察は、ＦＫＮシグナル伝達の除去を伴うＣＸ３ＣＲ１欠失が、部分的に脱分化されているβ細胞を生じることを示唆する。確かに、ＫＯ膵島は、より小さなβ細胞の数の増加に起因して、全体の細胞重量の増加によって特徴付けられ、β細胞サイズの減少はインスリン分泌機能を損なうことと関連することが報告されている（Ｇｉｏｒｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｐｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。さらに、ＩＣＥＲ−１はＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島において誘導されるのに対し、Ｍｉｎ６細胞のＦＫＮ処理は、パルミチン酸誘導性ＩＣＥＲ−１発現を抑制することが見出された。ＩＣＥＲ−１は、正常な分化したβ細胞機能状態と関連する遺伝子を阻害できる転写リプレッサーである。ＩＣＥＲ−１は、飽和脂肪酸、酸化ＬＤＬ、高血糖症、および高脂肪食によって誘導され、そしてＩＣＥＲ−１誘導は、ＣＸ３６、ならびに、図３に例示されるようなインスリン分泌機構の成分の発現を阻害することによって、β細胞機能不全を引き起こすことができることが示されてきた（Ｆａｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。このことは、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ  β細胞におけるＩＣＥＲ−１発現の増加が、より長期的な状態のβ細胞機能不全に機構的に連関されることを示唆する。この状況において、Ｍｉｎ６細胞におけるＣＸ３ＣＲ１のインビトロｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンがＧＳＩＳの低下を引き起こし、このことは、ＫＯマウスにおけるインスリン分泌のインビボ低下が、インビボでのβ細胞の発生の欠損に起因するものではなかったことに注目することは重要である。
【００４６】
まとめると、これらの研究は、β細胞分泌機能を調整する新たな経路を説明し、ここで、ＦＫＮが、インスリン分泌応答の増加を促進するために、ＣＸ３ＣＲ１を刺激する。ＣＸ３ＣＲ１欠損は、糖尿病の膵島において観察されたβ細胞の異常のいくつかを模倣し、そしてＦＫＮ処理はこれらの欠損を正常に向けて回復する。マウスにおいて、加齢およびＨＦＤ／肥満高血糖状態は、膵島ＦＫＮ発現の減少と関連がある。従って、この新たに確認されたＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１系の軽減は、糖尿病の膵島における欠損のいくつかの根底にあり得る。さらに、ＦＫＮに基づく生物学的治療剤または低分子ＣＸ３ＣＲ１アゴニストは、２型糖尿病の治療において有用性を有することができる。
【００４７】
実施例１
実験手順
動物および処理
７週齢雄性Ｃ５７ＢＬ／６ＮおよびＣＸ３ＣＲ１  ノックアウトマウスはＴａｃｏｎｉｃ（ＵＳＡ）から購入された。ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスからのＧＴＴおよびＩＴＴの結果は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＵＳＡ）から得られたＣＸ３ＣＲ１ｇｆｐ／ｇｆｐノックインマウスにおいて確認された。すべてのマウスは１２時間光／１２時間暗周期のコロニーケージに収容された。ＨＦＤ研究のために、８週齢マウスはＮＣＤまたは６０％  ＨＦＤ（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、Ｉｎｃ；ＵＳＡ）に供せられた。経口耐糖能試験のために、マウスは６時間絶食させられ、基礎血液サンプルが取られ、続いて２ｇ／ｋｇボーラスグルコースの経口胃管栄養が行われた。血液サンプルは、経口胃管栄養の１０分後、２０分後、３０分後、４５分後、６０分後、９０分後、および１２０分後に取り出された。静脈内（ｉｎｔｒａｖｅｎｉａｌ）耐糖能試験のために、マウスは、以前に記載されたように（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、頸静脈へのカテーテル移植のために手術された。３日間の回復後、マウスは５時間絶食させられ、次いで、レストレイナーに移された。１．５時間の安定化後、血液サンプルが基礎グルコースおよびインスリン測定のために尾から取り出され、続いて、頸動脈カテーテルを通して１ｇ／ｋｇボーラスグルコース注射が行われた。血液サンプルは、グルコース注射の１分後、５分後、１０分後、３０分後、および６０分後に、グルコースおよび／またはインスリン測定のために取り出された。インスリン耐性試験のために、マウスは６時間絶食させられ、基礎血液サンプルが取り出され、続いて、インスリンの腹腔内注射が行われた（ＮＣＤマウスについて０．４Ｕ／ｋｇ、ＨＦＤマウスについて０．６Ｕ／ｋｇ）。ＦＫＮ中和実験のために、マウスは、抗ＦＫＮ中和抗体を腹腔内注射された（２μｇ／マウス；Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）。アルギニン耐性試験のために、マウスは６時間絶食させられ、基礎血液サンプルが取り出され、続いて、１ｇ／ｋｇアルギニンのＩＰ注射が行われた。すべての動物手順は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏの実験用動物の使用のための研究ガイドラインに準拠して行われた。
【００４８】
血漿タンパク質測定
血漿インスリン（ＡＬＰＣＯ，ＵＳＡ）、Ｃ−ペプチド（ＡＬＰＣＯ，ＵＳＡ）、ＧＬＰ１（活性７−３６  ＧＬＰ１；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）、およびフラクタルキン（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）のレベルは、ＥＬＩＳＡによって測定された。
【００４９】
膵島の単離および移植
一次マウス膵島単離のために、ファーテル膨大部の近傍の胆管が結紮され、通常の胆管がカニューレ挿入され、そしてコラゲナーゼＸＩ（８００Ｕ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ，ＵＳＡ）を含有する３ｍｌのＫＲＢ緩衝液が注射された。膵臓は、周辺の組織から切開され、取り出され、そして備え付けバスの中で、３７℃にて１３分間、インキュベートされた。消化された組織は、コラゲナーゼを含まないＫＲＢで洗浄され、次いで、膵島は、３，０００ｇ、２５分間の密度勾配（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７および１１１９；Ｓｉｇｍａ）遠心分離によって精製された。２００の新鮮に単離された膵島等価物の単一のアリコートが、２００μｌピペットチップに吸引され、次いで、このピペットチップは、シリコンチューブ（Ｉ．Ｄ．×Ｏ．Ｄ．＝０．７６ｍＭ×１．６７ｍＭ；Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）に接続された。麻酔下で、レシピエントマウスの左腎臓が、腰部切開を通して露出された。嚢切開が腎臓の尾側外面で実施され、チュービングの先端が嚢の下で前進され、続いて、２００μｌピペットチップに装着した２０μｌピペットを使用して膵島のゆっくりとした注射が行われた。次いで、チューブは取り外され、嚢切開は使い捨て焼灼ペン（Ａａｒｏｎ  ｍｅｄｉｃａｌ，ＵＳＡ）を用いて焼灼された。
【００５０】
組織学分析
膵臓組織におけるＦＫＮおよびＣＸ３ＣＲ１の発現を同定するために、脱パラフィン化された組織切片は、内因性ペルオキシダーゼおよび内因性ビオチンについてブロックされ、リン酸緩衝化生理食塩水Ｔｗｅｅｎ２０中の０．５％  魚ゼラチンが重層された。次いで、切片は対照ＩｇＧとともにインキュベートされ、抗インスリン抗体（Ｎ１５４２；Ｄａｋｏ，ＵＳＡ）、抗グルカゴン抗体（ＰＡ１−８５４６５；Ｐｉｅｒｃｅ，ＵＳＡ）、抗ＣＤ３４抗体（ＭＥＣ１７．４；Ｎｏｖｕｓ，ＵＳＡ）、抗ＦＫＮ抗体（ＴＰ−２３３；Ｔｏｒｒｅｙ  ｐｉｎｅｓ  ｂｉｏｌａｂｓ，ＵＳＡ）、または抗ＣＸ３ＣＲ１抗体（ａｂ８０２１；Ａｂｃａｍ，ＵＳＡ）とともにインキュベートされ、続いて、Ａｌｅｘａ４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＵＳＡ）またはＣｙ３（Ｊａｃｋｓｏｎ）と結合体化された二次抗体とのインキュベーションが行われた。膵島の形態計測研究のために、試料は、Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＯｂｓｅｒｖｅｒ  Ｚ１顕微鏡上で観察され、２４ビットＴＩＦＦ画像が、Ｚｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ  ３．１ソフトウェア（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって駆動されたＺｅｉｓｓ  ＡｘｉｏＣａｍデジタルカメラを用いて獲得された。画像は、Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ４（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を用いて処理された。β細胞の相対膵臓面積は、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（Ｕ．Ｓ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ＵＳＡ）を使用して、インスリン陽性面積を測定された全体の膵臓面積によって除算することによって計算された。
【００５１】
単離された膵島からのインスリン分泌性応答の測定
単離されたマウス膵島は、マウス膵島培地（１ｇ／Ｌ  グルコース、１０％  ｖ／ｖ  ＦＢＳ、０．１％  ｖ／ｖ  ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ）中で一晩培養された。類似のサイズの膵島が、顕微鏡下で、手動で拾い上げることによって収集された。インスリン分泌性応答の動的解明のために、膵島は、３７℃、５％  ＣＯ２にて、ポンプ、ガス平衡システム、および膵島チャンバーから構成されるシステムで洗い流しが行われた。このチャンバーは、以前に記載されたように（Ｓｗｅｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、インスリンフラクションコレクターの次のアッセイのための流出画分を収集しながら、酸素消費速度を同時測定した。洗い流し液である、クレブスリンガー炭酸水素塩緩衝液（２０ｍｍｏｌ／ｌ  ＨＥＰＥＳ／Ｎａ−ＨＥＰＥＳ（Ｒｏｃｈｅ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）および０．１％  ＢＳＡ（Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）が補充された２．６ｍｍｏｌ／ｌ  ＣａＣｌ２／２Ｈ２Ｏ、１．２ｍｍｏｌ／ｌ  ＭｇＳＯ４／７Ｈ２Ｏ、１．２ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．９ｍｍｏｌ／ｌ  ＫＣ１、９８．５ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＣｌ、および２５．９ｍｍｏｌ／ｌ  ＮａＨＣＯ３（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯより））がポンプで１００マイクロＬ／分で送液され、このとき、酸素消費は２５０マイクロＬ／分で測定され、このとき、インスリン分泌のみが測定された（グルコースに対する第１相インスリン分泌性応答を解明するため）。グルコースおよびＧＬＰ１は、図面に示されるような緩衝液に加えられた。画分が収集され、インスリンの分析まで、−８０℃で維持された。マウス膵島を用いる静的ＧＳＩＳアッセイのために、およそ２０の膵島が手で拾い上げられ、ＫＲＢ緩衝液中で、３７℃、５％ＣＯ２にて２時間インキュベートされ、次いで、同じ条件で、２．８ｍＭまたは１６．７ｍＭ  グルコースを用いて、７５分間、インキュベートされた。ヒト膵島を用いる静的ＧＳＩＳアッセイのために、一晩輸送された死体のヒト膵島（Ｐｒｏｄｏ  Ｌａｂｓ，ＵＳＡ）が、回収培地（Ｐｒｏｄｏ  Ｌａｂｓ，ＵＳＡ）で２回洗浄され、そして３７℃、５％ＣＯ２にて回収培地中で一晩インキュベートされた。翌日、膵島は、２．８ｍＭ  グルコースＤＭＥＭで２回洗浄され、１％の遊離脂肪酸を含まないＢＳＡによって補充された２．８ｍＭ  グルコースＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２にて一晩インキュベートされた。３日目に、膵島は新鮮な２．８ｍＭ  グルコース培地で洗浄され、次いで、ＦＫＮを伴うかまたは伴わない、２．８ｍＭまたは１６．７ｍＭ  グルコース培地中で、６０分間インキュベートされた。上清中のインスリン濃度は、超高感度マウスまたはヒトインスリンＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｃｏ）を使用して決定された。
【００５２】
細胞内カルシウムレベル測定
Ｍｉｎ６細胞における細胞質遊離カルシウムイオン濃度は、ｆｕｒａ−２蛍光比率デジタルイメージングによって測定された。手短に述べると、カバーガラス上で増殖されたＭｉｎ６細胞は、室温で６０分間、５μΜ  ｆｕｒａ−２  ＡＭ［ＫＲＢ中０．０１％  Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７＋０．１％  ＤＭＳＯに溶解］を負荷され、次いで、新鮮なＫＲＢ中で３０分間洗浄された。Ｍｉｎ６細胞を有するカバーガラスは、灌流チャンバー内で、Ｎｉｋｏｎ顕微鏡ステージにマウントされた。３４０または３８０ｎＭの励起（Ｆ３４０／３８０）を有するｆｕｒａ−２蛍光の比率は、単一セル中で経時的に追跡され、増感ＣＣＤカメラ（ＩＣＣＤ２００）およびＭｅｔａＦｌｕｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｄｏｗｎｉｎｇｔｏｗｎ，ＰＡ）を用いてキャプチャーされた。各カバーガラス上の５０細胞より多くからのデータは統計学について分析され、データは少なくとも３つの独立した実験によって確認された。
【００５３】
ｃＡＭＰレベル測定
Ｍｉｎ６細胞の細胞内ｃＡＭＰレベルは、Ｂｒｉｄｇｅ−ｉｔ  ｃＡＭＰアッセイキット（Ｍｅｄｉｏｍｉｃｓ，ＬＬＣ，ＵＳＡ）を使用して測定された。
【００５４】
電子顕微鏡
走査型電子顕微鏡写真は、Ｃａｌｉｔ２−Ｎａｎｏ３施設において、環境モードで、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  １２  ＸＬ３０  ＥＳＥＭを使用して撮影された。各々が７個の個眼を有する単一ＳＥＭ画像の中心領域における非重複範囲が５つ選択され、個眼サイズ測定のために使用された。透過型電子顕微鏡写真のために、一次マウス膵島は、氷上で１時間、０．１Ｍ  カコジル酸ナトリウム（ｐＨ  ７．４）中の２％パラホルムアルデヒド＋２．５％グルタルアルデヒド（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）中に固定された。サンプルは、氷上で、０．１Ｍ  カコジル酸ナトリウム＋３ｍＭ  塩化カルシウム（ｐＨ  ７．４）からなる緩衝液で３回洗浄され、次いで、０．１Ｍ  カコジル酸ナトリウム（ｐＨ  ７．４）中の１％  四酸化オスミウム、０．８％  フェロシアン化カリウム、３ｍＭ  塩化カルシウムで１時間、ポスト固定され、氷冷蒸留水で３回洗浄され、４℃で１時間、２％  酢酸ウラニルでひとまとめにして染色され、段階的なエタノール溶液を通して脱水され、そしてＤｕｒｃｕｐａｎ  ＡＣＭ樹脂（Ｆｌｕｋａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に包埋された。超薄（８０ｎｍ）切片が酢酸ウラニルおよび鉛塩でポスト染色され、その後、８０ｋＶで操作されるＪＥＯＬ  １２００ＦＸ透過型ＥＭを使用してイメージングが行われた。ネガティブがＮｉｋｏｎ  ＣｏｏｌＳｃａｎシステムを使用して１８００ｄｐｉでデジタル化され、４０３３×６０１０ピクセルの画像サイズおよび１．７７ｎｍのピクセル解像度を与えた。
【００５５】
ヒト膵島およびインビトロβ細胞拡大
ヒト膵島およびβ細胞サンプルは、以前に記載されたように調製および分析された（Ｋａｙａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。ヒト成人膵島はｔｈｅ  Ｉｓｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｉｓｌｅｔ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ、およびｔｈｅ  Ｉｓｌｅｔ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ａｔ  Ｃｈｉｃａｇｏによって提供された。膵島は、２５〜５５歳の６例の死体ドナーからであり、成熟膵島が６０〜９０％純度であった（８０〜９０％の生存度）。膵島は、以前に記載されたように、ＷｈｉｔｔｉｅｒまたはＮＩＨプロトコールによって拡大された（Ｋａｙａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）。手短に述べると、Ｗｈｉｔｔｉｅｒプロトコールにおいて、単離された膵島は、ジチゾン染色後、手で拾い上げられ、部分的に切開され、そして２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０％  ウシ胎仔血清および２５ｎｇ／ｍｌ  肝細胞増殖因子を補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ，Ｈｅｒｎｄｏｎ．ＶＡ）を使用してＨＴＢ−９コートされたディッシュ上にプレートされた。細胞は、コンフルエンスに際して１：２継代された。ＮＩＨプロトコールにおいて、４０μｍフィルター上の保持によって富化された２，０００の膵島等価物は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミンおよび１０％  ウシ胎仔血清を含有するＣＭＲＬ−１０６６培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）中で、組織培養処理したディッシュに播種された。細胞は２週間培養され（継代０）、その後、細胞は、トリプシンを用いて４〜７日間ごとに収集され、そして２ヶ月までサブクローニング（１：２）された。ＲＮＡは、新鮮なヒト成人膵島から単離され、または膵島は３代または４代の継代の間、単層で培養された。マイクロアレイ分析は、以前に記載されたようにＲＮＡサンプルに対して実施された（Ｋａｙａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｋｕｔｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。
【００５６】
統計学
結果は平均±ＳＥＭとして示される。すべての統計学的分析は、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）においてスチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡによって実施された；Ｐ＜０．０５は有意であると見なされた。
【００５７】
実施例２
ＣＸ３ＣＲ１欠損マウスはインスリン分泌の減少を伴う耐糖能障害を呈する
肥満は炎症およびインスリン抵抗性を引き起こし、ＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１系は、単球接着および免疫細胞移動において役割を果たす（Ｃｏｍｂａｄｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｌｅｓｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｏｌｅｆｓｋｙ  ａｎｄ  Ｇｌａｓｓ、２０１０；Ｔａｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｔｅｕｐｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。肥満によって誘導される炎症に対するこの受容体の潜在的な効果に取り組むために、細身のおよび肥満のＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスが研究された。ＫＯマウスは、固形飼料または高脂肪食（ＨＦＤ）のいずれかで、通常の食餌摂取、体重増加、および肝臓重量を呈した（図１Ａ−１Ｃ）。脂肪組織重量は、キャベツ食餌でＫＯマウスとＷＴマウスの間で同じであったが、ＨＦＤではＫＯマウスにおいてわずかに低かった（図１Ｄ）。
【００５８】
興味深いことに、ＦＫＮまたはＣＸ３ＣＲ１が、脂肪組織もしくは肝臓中のマクロファージ蓄積において、または炎症誘導性インスリン抵抗性において役割を果たすことは証拠が見い出されなかった。例えば、マクロファージ浸潤（図１Ｅ）およびＦ４／８０およびＣＤ１１ｃなどのマクロファージマーカー遺伝子の発現（図１Ｆ）は、ＫＯマウスの脂肪組織において変化しなかった。さらに、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯは、脂肪組織において、炎症に関与する遺伝子（ｉＮＯＳ、ＭＣＰ−１、およびＴＮＦ−α）または線維症に関与する遺伝子（リジルオキシダーゼおよびコラーゲン１ａ）のＨＦＤ−誘導に影響を与えなかった（図１Ｆ）。このことと一致して、最近、Ｌｕｍｅｎｇもまた、ＣＸ３ＣＲ１欠損はＨＦＤマウスにおいて脂肪組織マクロファージ含量に対する効果を伴わないことを報告した（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。さらに、典型的にはＨＦＤに対して起こるＧＬＵＴ４発現の低下は、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯによって軽減されず（図１Ｆ）、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯがインスリン抵抗性に影響を与えないことを示唆する。
【００５９】
予想外に、細身／固形飼料食と肥満／ＨＦＤの両方のＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスが、経口グルコース投与に際して、野生型（ＷＴ）マウスと比較して、グルコース非耐容性を発症し、そしてこの効果は、肥満状態において悪化された（図２Ａ）。グルコース非耐容性にも関わらず、これらのマウスは、インスリン耐性試験によって示されるように、正常のインスリン感受性を呈し（図２Ｂ）、インスリン分泌における欠陥が高血糖の原因であったことを示唆した。このことを評価するために、循環インスリンおよびＣ−ペプチドレベルが、経口耐糖能試験（ＯＧＴＴ）の間に測定された。固形飼料を与えた細身のＫＯマウスおよび肥満ＨＦＤ  ＫＯマウスは、それらのＷＴ対応物と比較して、正常ＧＬＰ１レベルを伴って、インスリンおよびＣ−ペプチド分泌の低下を表示し（図２Ｃ、２Ｄ、および図８）、ＣＸ３ＣＲ１欠乏がβ細胞分泌欠損を引き起こすことを示す。興味深いことに、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスにおけるグルコース非耐容性およびインスリン分泌の欠損は、静脈内（ＩＶ）グルコースチャレンジ後により顕著であり、ＷＴマウスとＫＯマウスの間の違いは、経口グルコース後よりも定量的に大きかった（図２Ｅ）。さらに、腹腔内（ＩＰ）アルギニン投与によって誘発されたインスリン分泌は、細身／固形飼料食と肥満／ＨＦＤの両方のＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスにおいて減少され（図２Ｆおよび２Ｇ）、ＣＸ３ＣＲ１欠乏がβ細胞分泌欠損を引き起こすことをさらに示した。
【００６０】
相補実験において、抗ＦＫＮ抗体がマウスに注射され、循環ＦＫＮを中和した。このことは、Ｃ−ペプチドレベルの減少およびグルコース非耐容性に導き（図２Ｈ）、ＫＯマウスにおける結果と完全に一致し、ＣＸ３ＣＲ１の進行する刺激は、正常なインスリン分泌および血糖コントロールのために必要とされることを示す。
【００６１】
実施例３
ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島は、β細胞機能と関連する遺伝子の発現の低下を伴ってインスリン分泌の減少を表す
β細胞機能を直接的に試験するために、およびインビボインスリン分泌欠損が一次的かまたは二次的かを決定するために、単離された膵島およびＭｉｎ６細胞に対するインビトロ系が実行された。最初に、β細胞におけるＣＸ３ＣＲ１の機能を直接的に試験するために、固形飼料およびＨＦＤでのＷＴおよびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスから得られた単離された膵島による静的インキュベーション条件下で、インスリン分泌が実行された。図３Ａにおいて見られるように、ＫＯ膵島は、ＧＳＩＳの顕著な減少を呈し、これは、ＨＦＤ  ＫＯマウスから得られた膵島においてより激しかった（図３Ｂ）。さらに、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島は、アルギニンに応答してインスリン分泌の減少を呈し（図３Ｃ）、図２Ｆにおいて見られたインビボの結果と一致した。ＧＳＩＳに対するＣＸ３ＣＲ１の細胞自律性効果を別のやり方で実証するために、およびこれらがインビボ発生組織とは独立していることを示すために、ＲＮＡｉ干渉が使用されて、インビトロでＭｉｎ６細胞におけるＣＸ３ＣＲ１を枯渇させた（図３Ｄ）。２つの異なる抗ＣＸ３ＣＲ１  ｓｉＲＮＡはＣＸ３ＣＲ１ノックダウンをもたらし、両方が、ＧＳＩＳ効果を軽減し、インスリン分泌に対するＦＫＮ効果を無効にした。時間依存性インスリン分泌は、引き続いて、洗い流し分析を使用して、ＷＴおよびＫＯ膵島において測定された。ＫＯ膵島は、高グルコースとＧＬＰ１刺激の両方に応答して、ＷＴと比較して有意により低いインスリン分泌を実証した（図３Ｅ）。興味深いことに、ＷＴ膵島およびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島による酸素消費速度は比較可能であり（図９）、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯが代謝経路またはミトコンドリア呼吸に影響を与えないことを暗示する。これらのインビトロ実験は、ＣＸ３ＣＲ１欠失の効果が細胞自律性であり、他のインビボ事象に対して二次的なものではないことを実証する。
【００６２】
ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯの影響はインビボで膵島に固有であることを試験するために、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯおよびＷＴの膵島が、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）誘導された糖尿病マウスの腎臓被膜に移植された。図３Ｆにおいて見られるように、ＷＴ膵島の移植は、ＫＯ膵島の移植と比較して、より低いグルコースレベルに対してより大きな効果を有した。このことは、インスリン分泌の測定によってさらに確認され、これは、ＫＯ膵島を受容したＳＴＺマウスと比較して、ＷＴ膵島を移植したＳＴＺマウスにおいて、より大きな基礎インスリンレベルおよびインスリン刺激されたインスリンレベルを示した（図３Ｇ）。従って、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島におけるインスリン分泌欠損は、膵島外機序とは独立した膵島機能の変化によって媒介される。まとめると、これらのデータは、β細胞ＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１系が、インビトロとインビボの両方で、グルコース、アルギニン、およびＧＬＰ１に応答した正常なインスリン分泌機能のために必要であることを示す。
【００６３】
ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島のインスリン分泌欠損が遺伝子発現の変化と関連するか否かを試験するために、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析が実施された。図３Ｈに示されるように、ＫＯ膵島は、ＰＤＸ−１、ＮｅｕｒｏＤ、インスリン、Ｇｌｕｔ２、およびウロコルチン３などの正常β細胞分泌機能に関与する遺伝子のより低いレベルを発現する。さらに、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島は、代謝シグナルに応答して膵島の同期化を可能にする、β細胞コミュニケーションに関与するギャップジャンクション成分であるコネキシン３６（Ｃａｌａｂｒｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｃａｒｖａｌｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｓｐｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）の発現の減少を呈した（図３Ｈ）。さらに、ＡＴＰ依存性カリウムチャネル（Ｋｉｒ６．２）またはＬ型電位依存性カルシウムチャネル（Ｃａｖｌ．２およびＣａｖｌ．３）のいくつかの成分の発現がＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島において減少されたが、これは、統計学的な有意さには到達しなかった（図１０）。従って、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島におけるインスリン分泌欠損は、β細胞の機能およびコミュニケーションに関与する遺伝子の発現の減少と関連する。
【００６４】
実施例４
ＷＴ膵島およびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島の組織学的研究
ＣＸ３ＣＲ１欠失が膵島発生に影響を与えるか否かを決定するために、免疫組織学的（ＩＨＣ）研究が行われ、膵島サイズを増加するＨＦＤの予測された効果（Ｍａｃｌｅａｎ  ａｎｄ  Ｏｇｉｌｖｉｅ、１９５５；Ｐｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）が見い出された。しかし、固形飼料とＨＦＤの両方の条件下で、膵島はＫＯマウスよりも大きかった（図４Ａ）。これには、インスリン陽性膵島細胞の形態計測分析によって測定されるような、β細胞重量の有意な（Ｐ＜０．０５）増加（図４Ｂ）、および全体の膵臓インスリン含量の対応する増加が付随した（図４Ｃ、図１１Ａおよび１１Ｂ）。これらの結果は、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスが十分なβ細胞およびインスリンを有することを示し、このことは、インビボ表現型がインスリン分泌機構に細胞外シグナルを共役させる際の欠陥に起因することを示す。興味深いことに、平均β細胞サイズはＫＯ膵島において低下され（図４Ｄ）、このことは、膵島重量の増強がより小さなβ細胞の数の増加に起因することを示す。より小さなβ細胞は、ＧＳＩＳ活性の低下を表示することが報告されてきた（Ｇｉｏｒｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；Ｐｅｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。このことと一致して、類似のサイズのＷＴ膵島およびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島が比較のために選択されたとき、膵島あたりのインスリン含量の小さいがしかし有意な低下が、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ群において見られた（図１１Ｃ）。
【００６５】
組織学的分析もまた、グルカゴン陽性α細胞によって覆われたコアにおけるインスリン陽性β細胞の優位さなどの、ＷＴ膵島およびＫＯ膵島の形態学的特徴が、ＫＯによって影響されないことを示した（図４Ａ）。ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島中のミトコンドリアを評価するために、超顕微鏡分析が電子顕微鏡を使用して実施された。図４Ｅおよび４Ｆにおいて見られるように、ミトコンドリアの形態学、サイズ、数、およびクリステの存在量は、ＷＴおよびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯのβ細胞において比較可能であり、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島における正常酸素消費速度と一致していた（図９）。膵島内での適切な微小血管ネットワークの形成は、十分なインスリン分泌のために必須であり（Ｅｂｅｒｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０；Ｌａｍｍｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１は血管形成経路を調節できるので、膵島内の血管密度は、内皮マーカーＣＤ３４についての染色によって評価された。図４Ｇにおいて見られるように、ＣＤ３４染色は、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島とＷＴ膵島とで同じであった。最後に、固形飼料摂取マウスまたはＨＦＤ  ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスにおける全膵臓重量は、ＷＴに匹敵した（図１１）。まとめると、これらの結果は、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスにおける欠損性インスリン分泌は、全体的な発生の欠損、ミトコンドリアの機能不全、または欠損性膵島内血管新生に起因するものではなかったことを示唆する。
【００６６】
図４Ｈに示されるように、ＩＨＣは、ＦＫＮおよびＣＸ３ＣＲ１が、マウス膵島のインスリン陽性β細胞において高度に発現されていることを明らかにした。同様に、ヒト膵島において、ＣＸ３ＣＲ１はβ細胞において発現されたが、グルカゴン陽性α細胞においては発現されなかった（図４Ｉ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＦＫＮが、単離されたヒト膵島およびマウス膵島において、ならびにＭｉｎ６（マウス）およびＩＮＳ−１（ラット）β細胞系統において発現されることを明らかにした（図１２）。
【００６７】
実施例５
インビトロおよびインビボＦＫＮ処理
全体的なコンセプトのさらなる試験を提供するために、ＷＴマウスおよびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯマウスが、循環マウスＦＫＮの８４アミノ酸可溶性ケモカイン部分の急性投与で処理された。これは、ＷＴマウスにおいて耐糖能の改善をもたらしたが（図５Ａ）、しかし、ＫＯ動物においてはグルコースレベルに効果がなかった（図５Ｂ）。重要なことに、インビボＦＫＮ投与は、ＷＴマウスにおいてインスリン分泌の増加を引き起こしたが、しかしＫＯにおいては引き起こさなかった（図５Ｃ、図１３）。単離されたＷＴ膵島およびＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島もまた、可溶性ＦＫＮで処理され、ＷＴ膵島においてＧＳＩＳの顕著な５８％増加が見い出されたが、ＫＯ膵島においては効果がなかった（図５Ｄ）。ＦＫＮはまた、洗い流し一次マウス膵島において、グルコース＋ＧＬＰ１誘導性インスリン分泌を有意に強化したが（図５Ｅ）、しかし、酸素消費には効果がなかった（図５Ｆ）。これらのインビボおよびインビトロの結果は、ＦＫＮ効果は直接的であり、ＣＸ３ＣＲ１依存性であることを実証する。これらの知見のヒトβ細胞への翻訳可能性を実証するために、単離されたヒト膵島の研究が実施された。図５Ｇにおいて見られるように、ヒトＦＫＮを用いるヒト膵島の処理は、ＧＳＩＳの用量応答性増加をもたらし、最大濃度において６５％増加であった。従って、ＦＫＮの強化効果は、マウスおよびヒトの膵島において定量的に同様である。
【００６８】
実施例６
β細胞シグナル伝達に対するＦＫＮ処理の効果
ＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１がインスリン分泌を制御する経路を決定するために、ＧＳＩＳは、低グルコースレベルおよび高グルコースレベルで、Ｇαｉ（百日咳毒素）、ＰＩ３Ｋ（ワートマニン）、およびＭＥＫ（ＰＤ９８０５９）の阻害剤で処理された単離された膵島において測定された。ＦＫＮ刺激インスリン分泌は、百日咳毒素およびＭＥＫ阻害剤によって阻害されたが、しかし、ワートマニンによっては阻害されなかった（図６Ａ）。これらの結果と一致して、ＦＫＮは、ＧαｉおよびＭＥＫ依存性様式でＥＲＫリン酸化を刺激し（図１４）、そしてＭＥＫの阻害は、Ｍｉｎ６細胞においてグルコースおよびＧＬＰ１誘導性インスリン分泌のＦＫＮ強化を抑制した（図６Ｂ）。図６Ａおよび６Ｂにおいて見られるように、ＦＫＮ刺激インスリン分泌は、２．８ｍＭ  グルコースにおいて明白ではなく、十分なグルコースが提供されたとき（１６．７ｍＭ）のみに起き、図５と一致して、これは、ＦＫＮが直接的インスリン分泌促進物質ではなく、むしろ、グルコースおよびＧＬＰ１などの他のインスリン分泌シグナルの効果を強化する。
【００６９】
β細胞において、カルシウムシグナル伝達は、インスリン分泌プロセスの決定的な成分である（Ｓｅｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＦＫＮはマクロファージおよび線維芽細胞における細胞質カルシウムレベルを増加することが知られていたので（Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｉｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）、低グルコース条件または高グルコース条件における細胞内カルシウムに対するＦＫＮ効果は、Ｍｉｎ６細胞において測定された。図６Ｃおよび６Ｄにおいて示されるように、ＦＫＮは、高グルコースに伴って細胞内カルシウムレベルを増加させたが（６Ｃ）、グルコースの非存在下では効果がなかった（６Ｄ）。興味深いことに、Ｌ型カルシウムチャネル阻害剤であるニモジピンによるカルシウム流入の阻害は、グルコースによって誘導される細胞内カルシウムの増加と、ＦＫＮによって誘導される細胞内カルシウムの増加の両方をブロックし、このことは、カルシウム流入がＦＫＮ効果のために必要であることを暗示した（図６Ｅ）。特異的抗体を用いるＣＸ３ＣＲ１中和は、ＦＫＮによって誘導される細胞内カルシウムの増加をブロックし、このことは、ＦＫＮのこの効果が、ＣＸ３ＣＲ１活性化によって媒介されることを示す（図６Ｆおよび６Ｇ）。さらに、細胞内カルシウムに対するＦＫＮの効果は、百日咳毒素またはＭＥＫ阻害剤を用いる処理によってブロックされ（図６Ｈおよび６Ｉ）、このことは、ＧαｉおよびＭＥＫ−媒介性効果が、ＦＫＮ刺激インスリン分泌において機構的な役割を果たすことを示唆した。興味深いことに、ＭＥＫ阻害剤は、Ｍｉｎ６細胞において、アルギニン誘導性細胞内Ｃａ２＋増加およびインスリン分泌を軽減したが、グルコースの存在下においてのみであった（図１５）。
【００７０】
インスリン分泌を増大するためのグルコースおよびＧＬＰ１の効果の一部は、環状ＡＭＰレベルの増加を伴う。結果的に、ＦＫＮのあるなしでのグルコース、ＧＬＰ１、およびフォルスコリン刺激された環状ＡＭＰレベルがＭｉｎ６細胞中で測定された（図６Ｊ）。興味深いことに、ＦＫＮは環状ＡＭＰ濃度に効果がなく、これと一致して、ＰＫＡ活性もまた、ＦＫＮ処理によって影響を受けなかった（図６Ｋ）。
【００７１】
膵島遺伝子発現に対するＦＫＮのより長期的な効果もまた評価された。ＦＫＮを用いる膵島の７日間（７）の長期インビトロ処理は、ＰＤＸ１、ＮｅｕｒｏＤ、ＨＩＦ−１α、およびインスリンの発現の増加をもたらし（図６Ｌ）、そしてこれらの遺伝子のすべてが、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島においてダウンレギュレートされた（図３Ｈ）。最近、ＨＦＤまたは遊離脂肪酸処理によって誘導されるβ細胞機能不全が、少なくとも部分的に、誘導性環状ＡＭＰ初期リプレッサー（ＩＣＥＲ−１）の誘導によって媒介されることが示された（Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｆａｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１；Ｈｕｓｓａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。興味深いことに、ＩＣＥＲ−１発現は、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯ膵島において高度に誘導され（図６Ｍ）、そしてＦＫＮ処理は、Ｍｉｎ６細胞におけるＩＣＥＲ−１  ｍＲＮＡのパルミチン酸誘導性の誘導を無効にした（図６Ｎ）。同時に、ＦＫＮ処理は、ＧＳＩＳの長期的パルミチン酸媒介性阻害を妨害した（図６Ｏ）。さらに、クロマチン免疫沈殿実験を使用して、ＦＫＮ処理は、Ｍｉｎ６細胞において、パルミチン酸の効果をブロックして、ＩＣＥＲ−１のＮｅｕｒｏＤプロモーターへの結合を誘導することが見い出された（図６Ｐ）。これらの結果は、β細胞に対するＦＫＮ効果の１つの態様が、インスリン分泌機構のために必要な遺伝子の制御を伴うかもしれず、これは、ＩＣＥＲ−１抑制によって部分的に媒介できることを示唆する。ＩＣＥＲ−１のＦＫＮ制御がＭＥＫシグナル伝達経路と関連するか否かを試験するために、Ｍｉｎ６細胞は、ＦＫＮおよびＭＥＫ阻害剤の存在下または非存在下で、パルミチン酸とともにインキュベートされた。図６Ｑに示されるように、ＦＫＮ処理は、パルミチン酸誘導性ＩＣＥＲ−１発現を抑制したのに対して、これは、ＮｅｕｒｏＤ、ＰＤＸ−１、およびＧｌｕｔ２の発現を増加した；すべてのＦＫＮ効果は、ＭＥＫ阻害剤によって無効にされた。これらの結果は、ＦＫＮが、ＭＥＫ依存性経路を通して、ＩＣＥＲ−１発現を抑制することを示唆する。
【００７２】
２型糖尿病におけるβ細胞の不具合は、β細胞の体積の喪失ならびにＧＳＩＳの喪失と関連する（Ｐｒｅｎｔｋｉ  ａｎｄ  Ｎｏｌａｎ、２００６）。ＦＫＮは、ＣＸ３ＣＲ１−ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ依存性経路を通して、ミクログリア細胞および血管平滑筋細胞の生存を増加させることが示されてきた（Ｂｏｅｈｍｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。従って、ＦＫＮがβ細胞増殖および生存に対するインビトロ効果を有するか否かが評価された。図１６Ａに示されるように、ＦＫＮは、長期的パルミチン酸処理によって誘導されるβ細胞アポトーシスを妨害し、そしてこの効果は、ＧＬＰ１処理に伴って観察されたものに匹敵した。さらに、ＦＫＮは、生存細胞の数を増加させ、これは、長期的なパルミチン酸処理によって減少された（図１６Ｂおよび１６Ｃ）。興味深いことに、ＦＫＮによる生存細胞数の増加は、β細胞アポトーシスの阻害の程度に匹敵し、このことは、β細胞の数の増加は、増殖の増加ではなく、アポトーシスの減少に起因したことを示唆する。このことと一致して、ＣＸ３ＣＲ１  ＫＯは、固形飼料とＨＦＤの両方で、Ｋｉ６７陽性増殖細胞の数を変化させなかった（図１６Ｄ）。ＦＫＮはＡｋｔリン酸化を刺激し、これはワートマニンによって阻害された（図１６Ｅ）。さらに、パルミチン酸誘導性アポトーシスに対するＦＫＮの妨害効果は、ワートマニンによって阻害され（図１６Ｆ）、このことは、ＦＫＮの抗アポトーシス効果はＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ依存性機序を通して作動することを示唆する。
【００７３】
実施例７
膵島ＦＫＮ発現は加齢およびＨＦＤによって低下される
加齢および肥満は、β細胞機能不全の主要なリスク因子である。ＦＫＮのｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルは、高齢またはＨＦＤ／肥満／糖尿病マウスからの膵島において低下した（図７Ａ〜７Ｃ）ことが見い出された。一方、ＣＸ３ＣＲ１発現は、加齢またはＨＦＤによって影響を受けなかった（データ示さず）。興味深いことに、ＦＫＮ発現は、正常固形飼料で２４週齢後に低下しなかったが、ＨＦＤの１６週間までに同じ週齢のマウスにおいて有意に低下し、ＨＦＤが加齢におけるＦＫＮ発現の低下を加速することを示唆した。β細胞のエキソビボ拡大は、脱分化およびβ細胞機能の喪失を引き起こす。ＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１シグナル伝達の減少がβ細胞分化状態と相関するか否かを評価するために、ＦＫＮおよびＣＸ３ＣＲ１のｍＲＮＡレベルが、ヒト膵島およびエキソビボ拡大されたヒトβ細胞の中で比較された。図７Ｄに見られるように、ＦＫＮ発現は、拡大されたヒト膵島由来細胞中で有意に低下したが、ＣＸ３ＣＲ１発現は低下しなかった。拡大されたヒト膵島細胞が脱分化し、インビトロで上皮性から間葉性に移行することが以前に実証されており（Ｋａｙａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｋｕｔｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、その結果、得られる拡大細胞は、もともとの内分泌細胞よりも、間葉系幹細胞に表現型が近い。
【００７４】
確かに、糖尿病におけるβ細胞の機能不全は、ＦＫＮ／ＣＸ３ＣＲ１に加えて因子を伴う、複雑な多因子プロセスである。いくつかの他の可能性もまた思い浮かぶ。第１に、可溶性ＦＫＮの局所的発現は循環レベルを超えて優位であること、および膵島内ＦＫＮレベルは２型糖尿病において低く、これは、マウスにおいて加齢およびＨＦＤ／肥満膵島において観察されたものと類似していることが可能性としてある。第２に、ＣＸ３ＣＲ１シグナル伝達は、ＦＫＮ抵抗性に導く糖尿病性β細胞において損なわれている可能性がある。最後に、ＦＫＮレベルは低下していないが、ＣＸ３ＣＲ１発現が２型糖尿病患者からのβ細胞において低下している可能性があるものの、本発明者らは加齢またはＨＦＤ／肥満マウスからの膵島においてこのことを観察しなかった。
【００７５】
参考文献
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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