(57)【要約】  装置であって、バンドル化されたマイクロキャピラリーウェルのキャピラリーアレイと、最密充填配置された前記バンドルと、試料受け表面を形成する前記アレイの第１端とを備え、前記装置は、毛細管作用を介して前記キャピラリーアレイに前記試料を吸引し、前記試料を、前記ウェルにおける複数のサブ反応に分離するように配置される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
装置であって、
バンドル化されたマイクロキャピラリーウェルのキャピラリーアレイと、
最密充填配置された前記バンドルと、
試料受け表面を形成する前記アレイの第１端と、
を備え、
前記装置は、毛細管作用を介して前記キャピラリーアレイに前記試料を吸引して、前記試料を、前記ウェルにおける複数のサブ反応に分離するように配置される、装置。
【請求項２】
請求項１に記載の装置であって、
ウェルの大部分を満たすように、前記表面にわたって摺動して、前記表面にわたって前記試料を分配するように配置される分配用具をさらに含む、装置。
【請求項３】
請求項２に記載の装置であって、
前記分配用具は、表面張力を介して前記試料を係合するように配置され、前記表面にわたって前記用具を摺動させることで、前記試料が前記表面にわたって引っ張られる、装置。
【請求項４】
請求項２に記載の装置であって、
前記分配用具は、前記表面にわたって前記試料を押し出すように配置される、装置。
【請求項５】
請求項２または請求項３に記載の装置であって、
前記分配用具は、前記表面と摺接する、装置。
【請求項６】
請求項２または請求項３に記載の装置であって、
前記分配用具は、予め定義された間隙を空けながら前記表面にわたって摺動するように配置される、装置。
【請求項７】
請求項３に記載の装置であって、
前記分配用具は、表面張力を介して前記試料を係合するように配置される試料係合縁部を含む、装置。
【請求項８】
請求項７に記載の装置であって、
前記縁部は、曲がった形である、装置。
【請求項９】
請求項７に記載の装置であって、
前記縁部は、真っ直ぐである、装置。
【請求項１０】
請求項１〜請求項９のいずれか一項に記載の装置であって、
前記装置は、複数の前記キャピラリーアレイを備える基板を含む、装置。
【請求項１１】
請求項１〜請求項１０のいずれか一項に記載の装置であって、
前記キャピラリーアレイが配置されるチューブをさらに含み、前記チューブは、キャップを用いて選択的に密封可能である、装置。
【請求項１２】
請求項１〜請求項１１のいずれか一項に記載の装置であって、前記ガラスキャピラリーアレイは、チップ内に組み込まれ、前記チップは、前記キャピラリーアレイの対向端に接近した層で密封される、装置。
【請求項１３】
請求項１２に記載の装置であって、
前記層は、前記対向端に空気ブランケットを形成するように前記キャピラリーアレイから離間される、装置。
【請求項１４】
請求項１２に記載の装置であって、
前記層は、前記対向端と接触している、装置。
【請求項１５】
請求項１２に記載の装置であって、
少なくとも一つの前記層は、鉱油層を含む、装置。
【請求項１６】
前記請求項のいずれか一項に記載の装置であって、
前記キャピラリーアレイは、少なくとも２００ウェル含む、装置。
【請求項１７】
前記請求項のいずれか一項に記載の装置であって、
前記キャピラリーアレイ内の各ウェルの容量は、５０ｎｌ以下である、装置。
【請求項１８】
キャピラリーアレイ内に試料を配置する方法であって、
前記方法は、
前記キャピラリーアレイの試料受け表面上に前記試料を配置する工程と；
前記試料受け表面にわたって分配用具を摺動させる工程と、
前記表面にわたって前記試料を分配する工程と、および結果として、
毛細管作用を介して前記マイクロキャピラリーアレイのウェルに前記試料を吸引させる工程と、
を備える、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、
前記吸引させる工程は、前記試料を、各ウェルにおける複数のサブ反応に分離することを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１８または請求項１９に記載の方法であって、
前記吸引させる工程の後、前記キャピラリーアレイをチップに配置する工程をさらに含む、方法。
【請求項２１】
請求項１８〜請求項２０のいずれか一項に記載の方法であって、
前記吸引させる工程の後、前記ウェルを密封するように前記キャピラリーアレイの各端を覆う層を配置する工程をさらに含む、方法。
【請求項２２】
請求項１８〜請求項２１のいずれか一項に記載の方法であって、
さらに、
チューブに前記キャピラリーアレイを配置する工程と、
前記チューブを密封する工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、試料を複数のサブ試料に分離するための方法および装置に関する。具体的には、本発明は、前記試料を、例えばＰＣＲ法の実行の目的のためなどのサブ反応に分離するように設定される方法に関する。
［背景］
デジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）は、極めて利益の多いＰＣＲ市場において、強力な新たな技術である。ＰＣＲ、具体的には、リアルタイムＰＣＲは、生物医学研究および診断の多くの分野で不可欠な過程であり、ＲＮＡおよびＤＮＡなどのような核酸標的を検出するために最も高感度な方法である。リアルタイムＰＣＲの需要は、検出されるＤＮＡ量を定量する能力にあり、当該能力は、癌診断などのような分野において重要である。デジタルＰＣＲは、リアルタイムＰＣＲの定量能力とエンドポイントＰＣＲの単純さとを組み合わせたものである。デジタルＰＣＲは、一本鎖ＤＮＡ分子に至るまでも検出する能力があるため、極めて高感度でもあり、例えば、ダウン症の非侵襲的な出生前診断につながり得る母体血漿における胎児ＤＮＡの遺伝的異常を検出するなどの特定の用途に特に有用である。
【０００２】
ｄＰＣＲを行うために、典型的なＰＣＲ溶液は、多くの非常に小さいサブ反応に分離され、各サブ反応は、多くても単一のＤＮＡコピーを有する。ＰＣＲ実行後、いくつかのゾーンは、ＰＣＲ産物が陽性になるであろう。一方、その他は、陽性ではなく、１または０の結果を与えことになるだろう。従って、「デジタル」と呼ばれている。次いで、ポアソン分布を用いて、初期ＤＮＡ量を定量化することができる。較正用のコントロールと共に時間的にＰＣＲを監視することによってＤＮＡを定量化する（従って、「リアルタイム」と呼ばれている）リアルタイムＰＣＲと比較して、ｄＰＣＲは、反応をほんのわずかな量に分離し、較正用コントロールを必要とせずに、それらを空間的に監視することによって定量化を行う。
【０００３】
ｄＰＣＲの感度および正確さは、ＰＣＲ試料を、数千のより小さな反応に分離する能力に依存する。より多くのサブ反応が、そしてサブ反応に対してより小量なことが、感度および正確さを高めるであろう。
［発明の概要］
第１の側面において、本発明が提供するのは、装置であって、バンドル化されたマイクロキャピラリーウェルのキャピラリーアレイと、最密充填配置された前記バンドルと、試料受け表面を形成する前記アレイの第１端とを備え、前記装置は、毛細管作用を介して前記キャピラリーアレイに前記試料を吸引し、前記試料を前記ウェルにおける複数のサブ反応に分離するように配置される装置である。
【０００４】
第２の側面において、本発明が提供するのは、キャピラリーアレイ内に試料を配置する方法であって、前記方法は、前記キャピラリーアレイの試料受け表面に試料を配置する工程と、前記試料受け表面にわたって分配用具を摺動させる工程と、前記表面にわたって前記試料を分配する工程と、その結果、毛細管作用を介して前記マイクロキャピラリーアレイのウェルに前記試料を吸引させる工程と、を備える方法である。
【０００５】
例えば、ガラスマイクロキャピラリーアレイを説明する。本発明の目的のために、例えばポリカーボネートなどのようなポリマーを含む他の物質が等しく適用可能であるということが分かるであろう。
【０００６】
溶液試料をマイクロキャピラリーアレイの表面上に加える場合、溶液試料は、その下のマイクロキャピラリーウェルと接触することになる。すぐに、これらのウェルは、毛細管作用の結果として溶液を吸引する。毛細管作用とは、付着張力および表面張力の結果として狭いチューブに液体が吸引される性質である。マイクロキャピラリーウェルは、流路幅が非常に狭いので、毛細管作用は、全ウェルを満たすように溶液を吸引するのに十分な強さである。多数のこれらのウェルは、毛細管作用によって同時に満たされる。最終的に、溶液をより小さなサブ反応のアレイに分離する結果になる。例えば選択的に密封可能なキャップを有するチューブなどのようなケーシングにウェルが集められる場合、本発明の装置を形成することになる。
【０００７】
装置は、前記表面上に前記試料の薄い膜を形成するために、前記表面にわたって摺動するように配置される、分配用具、または単に摺動体を含んでもよい。分配用具は、表面張力を介して試料を係合してもよく、分配用具に結合する表面張力引力を用いて分配用具と試料とを接触させている。その後、表面にわたって、分配用具を摺動させることで、表面にわたって試料は「引っ張られ」、試料を大部分のウェルと接触させ、利用できるサブ反応の数を増加させる。代替的には、分配用具は、表面にわたって試料を押し出し、大部分のウェルを係合するために表面にわたって試料を分配してもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本発明の可能な配置を説明する添付の図面に関して、本発明をさらに説明することが都合がよいであろう。本発明において他の配置が可能であり、結果として、添付の図面の詳細は、本発明の前述の説明の一般性に優先すると理解されることはない。
【図１Ａ−１Ｂ】本発明の一実施形態に係る装置のためのマイクロキャピラリーアレイの概略図である。
【図１Ｃ】本発明の更なる実施形態に係る装置のためのマイクロキャピラリーアレイの等角図である。
【図２Ａ】本発明の一実施形態に係る分配装置のシーケンシャル図である。
【図２Ｂ】図２Ａにおける分配用具の平面図である。
【図３Ａ】本発明の更なる実施形態に係る分配用具のシーケンシャル立面図である。
【図３Ｂ】図３Ａにおける分配用具の平面図である。
【図４Ａ−４Ｂ】本発明の更なる実施形態に係る装置の様々な図である。
【図５Ａ−５Ｃ】本発明の更なる実施形態に係る装置の様々な図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
［詳細な説明］
図１Ａおよび図１Ｂは、本発明の一般原理を示す。ここで、例えばガラスキャピラリーアレイ（ＧＣＡ）５などのようなマイクロキャピラリーアレイは、マイクロキャピラリーウェル７のバンドルを含み、マイクロキャピラリーウェル７が配置されると試料２０を置くことができる表面８を提供する。マイクロキャピラリーウェル７は、ウェル７におけるウェル１０に試料２０を下方向１５に引き下げるサイズである。結果、図１Ｂに示されるように、続く過程のためにＧＣＡ５内のサブ反応２５に試料を混入することになる。実際の実施形態を図１Ｃに見ることができ、装置３５は、ケース４０内に収納されたＧＣＡ３０を含む。一例として、各ウェルは、直径１００ミクロンであってもよく、さらに１０ミクロンまで下げてもよい。ガラスを使用する目的は、各ウェル内の必要な容量に達するサイズにウェルのサイズを引き下げる能力であり、ガラスが最も簡単に行われる。
【００１０】
バンドルは、例えば最密充填ヘキサゴナール配置などのように高密度に配置される。ＧＣＡ配置への各ウェルのバンドル化は、全面積に対するウェルの内径の比率が８０％である開口比を提供してもよい。装置内のＧＣＡは、３０％に至るまでの開口比内であるとさらに効果的であり得る。ＧＣＡは、各ウェルの必要な容量に依存して１ｍｍ以上の深さを有してもよい。したがって、１ｍｍの深さでは、各１０ミクロンのウェルが０．１ナノリットルの用量を有することになる。
【００１１】
例えば、キャピラリーアレイは、少なくとも２００ウェル、したがって最大２００のサブ反応を含んでもよい。しかしながら、本発明のより有用な実施形態は、５０００程度のウェルを含んでもよく、結果として最大５０００のサブ反応を目的としてもよい。例えば１０，０００ウェルまたはさらに１００，０００ウェルなどを含むような、さらに大きなキャピラリーアレイを作り出すことも可能であり得る。
【００１２】
各ウェルは、最大５０ｎｌの容量を有してもよい。上記で計算されたように、有用な容量は、０．１ｎｌほど小さくてもよく、本発明では０．０１ｎｌほど低いウェル容量を含む。
【００１３】
マイクロキャピラリーウェルにおける毛細管作用の使用は、ウェルに溶液を吸引し、満たすために両端が開口しており、溶液がより小さなサブ反応に分離することを可能にする。さらに、ＧＣＡがガラス基板からなるように、各マイクロキャピラリーウェルは、非常に小幅なものにされてもよい。ガラス基板は、マイクロキャピラリーウェルを非常に密接して充填させ、１平方ｃｍ当たり数千のウェルになる高密度アレイを形成することもでき得る。このことは、ウェル間の壁が非常に薄いことに起因する。
【００１４】
各マイクロキャピラリーウェルは、高い縦横比を有してもよく、１００μｍ以下の直径と、１ｍｍ以上の深さとを有するキャピラリーを用いてもよい。深さは１ｍｍ未満であってもよいことが分かるであろう。このことが、非常に強い毛細管作用を作り出す。
【００１５】
さらに、ガラス基板は親水性であり、毛細管作用を介して溶液を各マイクロキャピラリーウェルに容易に吸引し、各マイクロキャピラリーウェル内に保持することができる。
密に充填されたマイクロキャピラリーによって、ウェル間において多数のサブ反応を最小の試料損失で作ることができる。これにより、全ての溶液を分離することができるようになり得り、１００％の試料をｄＰＣＲで分析できるようになり得る。
【００１６】
ウェルは、高い縦横比を有することができるので、強い毛細管作用をもたらし、ｄＰＣＲ後に検出できるシグナル量も増加させる（このことは、センサーが、各ウェルの深さに従ってシグナルを検出することに起因する）。
【００１７】
図２および図３は、ウェルにおける「引き下げ」作用の促進に関する代替的な実施形態を示す。
通常、試料６０、１００がＧＣＡ５０、９０の表面に添加される場合、ウェルが下方に向かって満たされた後、過剰の試料は未だ存在することになるであろう。そのことを解決するために、一つの方法は、ウェルの深さを増加させることによってウェルの容量を増加させることである。しかしながら、各サブ反応の容量を増加させることは、ｄＰＣＲでは望ましくない。したがって、試料は、全ての試料が任意の過剰量を出すことなく、サブ反応に分離されるようにＧＣＡにわたって広がらなければならない。これにより、添加されることになる試料の容量を増加させることもできるので、サブ反応の数を増加させ、ｄＰＣＲの感度および正確さを高めることにもなる。我々の発明の他の重要な側面は、ＧＣＡの表面にわたって試料を広げる方法に関連する。ここで、我々は「スライダーアプローチ（ｓｌｉｄｅｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ」を説明する。
【００１８】
スライダーアプローチにおいて、スライダーはＧＣＡの上に置かれる。スライダー５７、８５を、ＧＣＡ５０、９０に乗せるように、またはスライダーとＧＣＡとの間に間隙ができるように置くことができ、試料はＧＣＡの指定された領域に添加される。図２Ａおよび図２Ｂで示される実施形態において、試料を添加する場合、試料はスライダー５７の一端と接触する。スライダー５７は、ＧＣＡ５０に沿って６５の方向に動くので、スライダーと試料との間の表面張力７５によって試料を「引っ張る」。目的は、マイクロキャピラリーウェルが毛細管作用によって満たされるように、ＧＣＡの表面に沿って試料を７０のように広げることである。この方法は、任意の死容量を作り出すことのない、ＧＣＡを満たす迅速で簡単な方法である。さらに、ＧＣＡウェルは急速に満たされるので、試料をかなり迅速に引っ張ることができる。
【００１９】
試料と接触するスライダーの縁部は、真っ直ぐであっても、もしくは５５のように曲がっていても、または任意の他の形を有してもよい。一つの好ましい実施形態において、スライダーと試料との間の接触面を増加させ、表面張力を増加させることになるように、縁部は、５５のように凹んでいる。凹んでいる縁部は、結果的に真っ直ぐな縁部と比較してより良い「引っ張り」力をもたらす。
【００２０】
代替的な実施形態を図３Ａおよび図３Ｂに示す。それによると、試料を「引っ張る」代わりに、スライダー８５は、ＧＣＡ９０にわたって試料１００を１０５のように広げるために試料を９５のように「押す」こともできる。図２Ａおよび図２Ｂにおいては、スライダー５７は、空のウェル上まで移動する一方、図３Ａおよび図３Ｂにおいては、スライダー８５は、満たされたウェル上まで移動する。
【００２１】
ＧＣＡの一表面まで試料を移動するための物理的装置（すなわち、スライダー）の使用は、マイクロキャピラリーウェルの一開口端と接触するので、マイクロキャピラリーウェルを試料でより効率的に満たすことを促進する。
【００２２】
スライダーは、当該方法の効率性を増加させるために疎水性物質（例えば、ＰＭＭＡ、ポリカーボネート、またはポリプロピレン）から作られてもよい。
一実施形態において、スライダーは、スライダーとＧＣＡとの間に任意の間隙がなく、ＧＣＡに直接置かれてもよい。しかしながら、スライダーとＧＣＡとの間に間隙があってもよい。
【００２３】
試料と接触するスライダーの縁部は、引っ張り力を増加させるために曲がっていてもよい。表面積の増加によって、結果として、表面張力による引力を増加させる。しかしながら、縁部は、製造の容易さのために真っ直ぐであってもよく、または複数の試料、潜在的な混合試料、もしくは他の当該側面と相互作用する他の形であってもよい。
【００２４】
スライダーは、試料の容量に依存して十分な厚さおよび幅があるべきである。さらに、スライダーは、押すこと、引っ張ることのために特別に設計されてもよく、または技術者の好みに依存して、押すこと、引っ張ることのために最適化されてもよい。
【００２５】
図４Ａに示されるように、ＧＣＡアプローチは、フラットチップフォーマット１１０として構成されてもよい。ここで、複数のＧＣＡ１１５はチップに組み入れてもよい。各ＧＣＡは、各ＧＣＡ上に配置される（図示しない）スライダーを有するであろう。このことにより、試料を各ＧＣＡに広げることができる。スライダーを一緒に、または個々に移動することができる。
【００２６】
図４Ｂに示されるように、ＧＣＡアプローチは、チューブフォーマット１２５として構成されてもよい。ここで、ＧＣＡ１２０はチューブ１３０の内部に適合する。チューブの外部は、典型的なＰＣＲチューブと同じ寸法を有することにより、通常のサーマルサイクラーのヒートブロックに適合することができる。ＧＣＡ１２０は、ＧＣＡ１２０上に配置される（図示しない）スライダーも有する。試料を添加後、スライダーは、ＧＣＡを満たすために試料を広げるように移動することができ、固定した状態でとどまる。チューブはキャップ１３５によって閉じることができる。重要なことは、キャップを閉める作用が、スライダーに試料を広げさせるのと同じ作用をもたらすことができるということである。代替的に、スライダーは、例えば移動を開始するためにスライダーに外力を適用することなどのような他の作用によって移動されてもよい。好ましくは、ＧＣＡはチューブの底に、またはチューブの底の近くに配置される。これは、ほとんどのサーマルサイクラーが、ＰＣＲチューブの底部分のみを加熱するからである。
【００２７】
ＧＣＡ上に試料を広げるスライダーアプローチに代わるものは、遠心分離を行うことである。試料をＧＣＡの上部に添加しなければならない。遠心分離によって、試料をＧＣＡに沿って押し下げ、その過程においてＧＣＡを満たす。この方法は、例えばスライダーなどのような物理的装置を使用することなく、ＧＣＡ上に試料を移動する方法を提供する。
【００２８】
図５Ａ〜図５Ｃを参照する。溶液をＧＣＡに分離した後、次にＰＣＲを実行する。ＰＣＲ中、加熱はＧＣＡ内の圧力の増加を引き起こす。各マイクロキャピラリーウェルは、流路幅が非常に狭く、各マイクロキャピラリーウェル内の容量が非常に小さいので、溶液がウェルから押し出される強い傾向がある。この傾向は望ましくない。溶液は、ＧＣＡ内に含まれていなければならない。これを達成する一つの方法は、鉱油層を用いて満たされたＧＣＡを覆うことである。
【００２９】
図５Ａ〜図５Ｃは、ＧＣＡ内に試料を保持する（または溶液を密封する）２つの代替的な方法を示す。これらは本発明の重要な側面を形成する。
第１のアプローチにおいて、図５Ａに示されるように、試料の密封１５５は、ＧＣＡ１６０をシリコーン１６５の２つの薄い層の間に挟むことによって達成される。２つのシリコーン層１６５は、試料がウェルから出ることを防ぐためにＧＣＡ１６０に対して物理的に圧力をかけている。層は、外力によってＧＣＡ１６０に対して機械的に圧力をかけることができ、または、層自身の接着力に起因してＧＣＡ１６０に対して圧力をかけることができる。この実施形態において、層は、シリコーンから作られており、一方または両方の層は光学的に透明である。一つの実施例は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）であり、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）は、例えばシルガード（Ｓｙｌｇａｒｄ）１８４などのような２部（ｔｗｏ−ｐａｒｔ）エラストマーキットから調製することができる。
【００３０】
しかしながら、層は、他の物質から作られてもよく、他の物質としては、ガラスウエハー、ポリカーボネート、アクリル、または少なくとも一つの上記層のための鉱油を含み、目的に適切な他の物質が含まれることが分かるであろう。
【００３１】
第２のアプローチにおいて、図５Ｂに示されるように、ＧＣＡ１６０において試料を密封するための「空気ブランケット１７５」の使用を説明する。ＧＣＡの上部表面および底部表面は、空気ブランケット１７５によって密封され、空気ブランケット１７５は、実質的には、わずかに加圧することになる空気間隙である。加圧は、密封チャンバー１７０内に空気を保つことによって形成される。
【００３２】
チューブ型１８０において、図５Ｃに示されるように、ＧＣＡ１９５において溶液を密封することは、キャップ１９０を用いてチューブを閉じ、チューブ内にわずかな空気の加圧２００を引き起こす作用によって達成され、空気の圧力２００は、ＧＣＡ１９５における溶液を密封するのに役立ち、加熱時に溶液が漏れることを防ぐ。重要なことは、チューブが加熱される場合、密封チャンバー１８５内の空気も加熱され、圧力２００を増加させる。このことは、ＧＣＡ１９５に試料を維持するのにさらに役立つ。この方法の利点は、試料が空気以外のいかなる他の物質とも接触しないということである。
【図１Ａ】
2015532109.tif 000003
【図１Ｂ】
2015532109.tif 000004
【図１Ｃ】
2015532109.tif 000005
【図２Ａ】
2015532109.tif 000006
【図２Ｂ】
2015532109.tif 000007
【図３Ａ】
2015532109.tif 000008
【図３Ｂ】
2015532109.tif 000009
【図４Ａ】
2015532109.tif 000010
【図４Ｂ】
2015532109.tif 000011
【図５Ａ】
2015532109.tif 000012
【図５Ｂ】
2015532109.tif 000013
【図５Ｃ】
2015532109.tif 000014
【国際調査報告】
2015532109.tif 000015
2015532109.tif 000016
2015532109.tif 000017
2015532109.tif 000018
2015532109.tif 000019
2015532109.tif 000020