(57)【要約】  本発明は迅速なサンプル前処理方法を目的とし、前記方法は、粗雑な未精製の生物学的サンプル溶解物（例えばヒトの尿、唾液、血液、尿道及び子宮頸管スワブ、並びに生物学的材料を含む他のサンプル）から直接増幅させることにより、高度に鋭敏で特異的な標的核酸（例えばヒトゲノムDNA、ヒト病原体のゲノムDNA、ヒト非病源体のゲノムDNA）の検出を可能にする。本発明の主眼は、ヒト及び病源体の細胞からゲノム物質を迅速に放出させることができる生物学的サンプルの前処理方法、後続する核酸増幅方法に適合し得るものの成分を記載することにある。適用の例として、本発明はまた、イソサーマル核酸増幅（リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）、ループ媒介イソサーマル増幅（LAMP））のためのプロトコル及びプライマー配列を開示する。前記は、粗雑な生物学的サンプル溶解物及び／又は精製された全DNAに由来するホモ・サピエンス、クラミジア・トラコマチス及びマイコプラズマ・ジェニタリウムのゲノム物質の高度に特異的で鋭敏な診断を可能にする。本事例増幅はラテラルフローストリップを用いる免疫クロマトグラフィー生成物検出と併用することができ、ヒト尿サンプルの迅速な（20分未満）イソサーマル核酸増幅によるC.トラコマチス及びM.ジェニタリウム診断を可能にする。前記は、特別な検査室装置も有資格者も必要とせず、したがってポイント・オブ・ケア環境での適用に良好に適合する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプル及び体液に由来する核酸標的の検出方法であって、前記方法が、a）細胞溶解並びに生物学的サンプル及び体液中の核酸標的の放出を含むサンプル前処理工程、b）核酸増幅工程、c）増幅生成物検出工程を含み、溶解ペプチドを用いて生物学的サンプル又は体液中の核酸標的を放出する、前記検出方法。
【請求項２】
界面活性剤を用いて生物学的サンプル又は体液中の核酸標的を放出する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
溶解ペプチドと界面活性剤との組み合わせを用いて生物学的サンプル又は体液中の核酸標的を放出する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
1つ以上の特異的標的をベースとする配列が増幅される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
工程（1）の間に得られるサンプル溶液が更なる増幅手順に直接付される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
定性的及び定量的検出が粗サンプル溶液で実施される、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）核酸標的が、表1に提供される特異的標的領域の使用により検出される、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
マイコプラズマ・ジェニタリウム（Mycoplasma genitalium）核酸標的が、表1に提供される特異的標的領域の使用により検出される、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
クラミジア・トラコマチス核酸標的が、表2及び3に提供される特異的プライマー及び／又はその標識誘導体配列の使用により検出される、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
マイコプラズマ・ジェニタリウム核酸標的が、表2及び3に提供される特異的プライマー及び／又はその標識誘導体配列の使用により検出される、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
ヒトゲノムGAPDH標的が、内部検証及びプラットフォーム評価技術として検出に用いられる、請求項1に記載の方法。
【請求項１２】
ヒトゲノムGAPDH標的が、表2、3に提供される特異的プライマー及び／又はその標識誘導体配列により、内部検証及びプラットフォーム評価技術として検出に用いられる、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
クラミジア・トラコマチスの分子診断方法であって、TRPB遺伝子が分子診断標的として用いられる、前記診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学的サンプルの迅速な前処理のための組成物及び方法を目的とし、前記前処理は、後続する生物学的サンプル及び体液由来標的核酸の核酸増幅による検出を可能にする。
【背景技術】
【０００２】
従来の診断は主として核酸増幅技術（NAAT）に依存する。特定DNAの増幅のためのもっとも一般的に知られた方法はPCRであり、前記は相応な実験室レベルの感度を提供する。最近出現した新規な技術はイソサーマル増幅（例えばリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）、ループ媒介イソサーマル増幅（LAMP）、ヘリカーゼ依存増幅）から発達してきた。これらのイソサーマルNAATは当該反応のサーモサイクリングを必要とせず、さらに極めて高レベルの感度を示し、わずか1−2個の鋳型コピーから検出可能な増幅生成物を生じる。イソサーマル反応は、当該技術をポイント・オブ・ケア（POC）環境（例えば一般開業医院、自宅）に良好に適合せしめ、該当患者に簡便かつ迅速に診断検査をもたらし、さらに結果までの時間を短縮する。性行為感染症の分野で、POC診断はまた、該当病原体（特に無症候型に存在するもの、例えばC.トラコマチス（C. trachomatis）及びM.ジェニタリウム（M. genitalium））の拡散を顕著に低下させる潜在能力を有する、私的で非侵襲的検査を可能にする。
【０００３】
M.ジェニタリウム及びC.トラコマチス感染症はともにしばしば無症候性を維持するので“サイレント”疾患として知られている。したがって、これらの性行為感染病源体の定期的な診断スクリーニングは非常に重要である。旧来、C.トラコマチス感染は、尿道又は子宮頸管スワブから組織培養方法によって診断されてきた。培養は生命力を有するC.トラコマチス細胞のみを同定するので、当該診断の感度は収集から検査室での処理までの時間に左右される標本の鮮度の影響を受ける。したがって1980年代には、抗原及び核酸検出技術は、コスト、時間、経験、輸送時の感染性の保全の要求がより少ないC.トラコマチス診断を目指して開発されてきた。さらにまた、核酸検出技術は生命力のない細胞又は細胞残屑に由来する病源体DNAを検出できるので、はるかに高い感度レベルを有することを立証した。M.ジェニタリウムの生物学的検出もまたもっぱらPCRによる病源体DNAの特異的増幅によって実施される。M.ジェニタリウム培養は極めて困難であり、日常的には実施されない。M.ジェニタリウムの血清学的な検出方法は感度及び特異性が低い。
【０００４】
NAATは高度に有効な診断の重大な契機を提供したが、前記は今日まで検査室レベルでのみ日常的に用いられているだけである。NAATは実施が複雑であり、熟練者及び高価な機械類を必要とする。したがって、NAATによる診断は大きな病院及び診断センターに集中する。NAAT技術の主要な限界の1つは純粋なDNAサンプルが要求されることである。サンプルの純度は、NAAT（特にPCR）の性能に顕著に影響し得る。新規なイソサーマルNAAT、例えばRPA、LAMP、HDAなどは核酸サンプル純度に対してより鈍感なようであり、例えばヒトの尿サンプルに存在するDNAを効率的に増幅させることができる。
本発明は、生物学的サンプルの前処理のための方法及びその化合物を開示し、前記前処理は細胞性材料からゲノムDNAの効率的な放出を可能にする。記載するサンプル前処理方法は、粗雑なサンプル溶解物に由来する標的DNAの検出を可能にする後続の核酸増幅手順に適合する。本発明は、NAAT分析の前のDNA精製工程の省略を可能にし、したがって当該診断技術の複雑さ及び速さに重大な影響を与える。本発明は、POC環境で高度に鋭敏かつ特異的なNAAT診断の実施を顕著に促進する。
【０００５】
本発明の実施例はもっぱらヒトの性行為感染病源体診断を対象とするので、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）及びマイコプラズマ・ジェニタリウム（Mycoplasma genitalium）の概要が以下で提供されるであろう。
C.トラコマチス及びM.ジェニタリウムはヒトの性行為感染病原体である。それらはともに、男性の非淋菌性（非特異性）尿道炎及び女性のいくつかの炎症性生殖管症候群（例えば子宮頸管炎及び骨盤炎症疾患）に付随する。C.トラコマチス及びM.ジェニタリウムの急性未処置感染によって引き起こされる炎症性疾患は、世界的に女性の不妊の主要原因の1つである。
M.ジェニタリウムの流行は男性で1−4％、女性で1−6％の範囲にある。報告されている高リスク集団内（例えば性行為感染症（STD）検査センター内）の流行データは38％に達する。性行為が活発な若者のC.トラコマチス流行率は、年齢、人種などに左右され5−10％である。C.トラコマチス感染はほぼ常態的に女性で流行がより高く、世界的に過去数十年間増加傾向を示している。
【０００６】
M.ジェニタリウムは小さな（0.2−0.3μm）多形性細菌であり、細胞壁を欠き、そのことは細胞壁を標的とする一般的抗生物質（例えばペニシリン）に対して当該細菌を耐性にする。M.ジェニタリウムはビン状形で特有の接着性細胞器官を有する。前記細胞器官は、細菌が多様な物質及び細胞（ヒト上皮細胞を含む）に接着することを可能にする。接着はM.ジェニタリウムの病理発生の主要な機構であり、前記機構は主要アドヘシンMgPa（MgPB遺伝子によってコードされる）を含む少なくとも7つのアドヘシンを必要とする。
C.トラコマチスはグラム陰性の偏性細胞内病源体であり、その間2つの発育型（EB（又は基本小体）及びRB（又は網様構造体））として存在する固有の二相性発育周期を有する。EBは、当該生物のより小さく（0.2μm）代謝的に不活性な感染性細胞外型であり、RBは、より大きく（0.8μm）代謝的に活性な細胞内型である。クラミジア感染は、EBの宿主細胞への付着及びその後の膜結合小胞への内在化を必要とする。封入物はRBに分化し、RBは宿主細胞のATP及び代謝産物を利用して、8−12回の細胞分割を経る。RBは分化し感染性EBに成熟し、宿主細胞溶解によって放出される。C.トラコマチス株は、主要な外膜タンパク質の抗原変化に基づいて血清学的に15の血清型に分類される。A−C血清型は、眼のトラコーマを引き起こす眼の病原体である。血清型D−K及びL1−L2は性行為感染病源体であり、生殖管の円柱上皮細胞に感染する。
【０００７】
C.トラコマチスに対する適応免疫はINF-γ媒介宿主細胞応答を巻き込み、前記応答はクラミジアのRBからトリプトファンを奪い、最終的にトラコマチスの成長及び複製能力を妨害する。C.トラコマチス性器血清型は、真正細菌のトリプトファン生合成遺伝子のいくつか（インドールのトリプトファンへの変換を触媒するトリプトファンシンターゼのα及びβサブユニットをコードするTRPA及びTRPB）を保有している。したがって、C.トラコマチス性器血清型は、生殖管の正常な細菌叢によって分泌される外因性インドールを利用する能力を保有し、前記能力は該トラコマチスにIFN-γ媒介増殖制限を克服させ、長期の感染樹立を支援する。
M.ジェニタリウムは小さなATに富む（68％）0.58Mbのゲノム（485の遺伝子をコードする）を有する。その小さなサイズにもかかわらず、当該ゲノムの4％は、MGPB遺伝子と相同性を示す反復エレメント（MgPaリピート）から成る。C.トラコマチスもまた約1Mbの染色体の小さなゲノム及び7.5kbの潜在プラスミドを保持する。ほぼ全てのC.トラコマチス株が染色体当たり4から10のプラスミドコピーを保有する。プラスミドを含まないいくつかのC.トラコマチス単離株も報告されているが、それらのビルレンスはプラスミド保持株と比較して顕著に低下する。クラミジアプラスミド配列は高度に保存され（1％未満の変異）、4つの22bpタンデムリピートによって形成される複製起点とともに8つの主要なコード配列（CDS）を含む。コンピュータ分析によって、プラスミドコードタンパク質は複製で機能を有することが認定された。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明は、細胞性材料からゲノムDNAの効率的な放出を可能にする、生物学的サンプルの前処理のための方法及び化合物を開示する。開示するサンプル前処理方法の主要な利点は、粗サンプル溶解物に由来する標的DNAの検出を可能にする後続の核酸増幅手順に対するその適合性である。したがって、本発明はNAAT分析の前のDNA精製工程の省略を可能にし、したがって当該診断技術の複雑さ及び速さに重大な影響を与える。
本発明は細胞溶解化合物を開示し、前記化合物は、哺乳動物細胞、それらの病源体及び共生微生物、細菌及び菌類培養などからゲノム物質を迅速（RT℃で5分以内）かつ効率的に放出させる。サンプル前処理緩衝剤は、膜活性（細胞貫通）ペプチド、温和な界面活性剤、又は上記2つの組み合わせから成る。
膜活性ペプチドは、細菌膜で破壊的に作用する抗菌性及び抗微生物性作用を有する。前記はまた、種々のカーゴ分子を哺乳動物細胞に送り届けることができる細胞膜貫通薬剤としても知られている（例えばオリゴヌクレオチド、siRNA、プラスミド、ペプチド）。本発明は、診断目的のための細胞貫通ペプチドの新規な使用を目的とする。より高い（μM−mM）濃度では、細胞貫通ペプチドは細胞膜を破壊し、後続の核酸増幅反応で標的として用いることができるゲノムDNAの放出を可能にする。細胞膜破壊ペプチドは、たとえ高濃度であっても核酸増幅に対して全く又は極めてわずかな阻害作用しか示さず、したがってゲノム物質放出促進剤として効率的に用いることができる。
【０００９】
界面活性剤は非常に良好な可溶化剤であるが、それらは本来の三次元構造を破壊することによりタンパク質を変性させる傾向がある。低濃度（例えば0.1−1％）の温和なイオン性又は非イオン性界面活性剤（例えばトリトンX-100、トリトンX-114、NP-40、CHAPS、オクチル-β-グルコシド、オクチル-β-チオグルコピラノシド）のある種の組み合わせは効率的に細胞壁を破壊し、細胞内に封入されているゲノム物質を放出させる。これらの温和な界面活性剤は核酸増幅手順を顕著には損なわず、十分な量の標的核酸の放出を誘発又は促進することができる。RT℃での5分以内のインキュベーションで効率的に細胞を溶解するために、該界面活性剤の組成及び濃度が設定される。
生物学的サンプルを核酸増幅に良好に用いることができる材料に変換する、膜活性ペプチド及び／又は界面活性剤媒介サンプル前処理の能力は本発明の主要な狙いであり、前記能力は、粗雑なヒト尿溶解物によるクラミジア・トラコマチス、マイコプラズマ・ジェニタリウム及びヒト（Homo sapiens）のゲノムDNAの検出を確立することによって確認された。
【００１０】
そのために、ヒトサンプルの高度に特異的で鋭敏なC.トラコマチス及びM.ジェニタリウム検出のための診断方法が、イソサーマル核酸増幅（RPA、LAMP）を土台にし、ラテラルフローストリップを用いる免疫クロマトグラフィー生成物検出を併用しつつ開発された。両病源体のために、我々は、2つの異なるゲノム標的の同時検出が実施される二重標的系を用いた。前記は、増幅標的として用いられる病源体のゲノムDNA領域に欠失又は変異が導入されている場合に、偽の陰性診断結果の確率を減少させる。全ての標的領域は、種々の病源体株間におけるそれらの高い相同性及び類似種との同一性の欠如を基準にして選択された。
C.トラコマチスの検出のために、我々はしっかりと確立されている診断標的に由来するゲノム配列、マルチコピー潜在プラスミドのコード配列2（CDS2）を用いた。第二の標的のために、我々は、トリプトファンシンターゼ遺伝子TRPBのβサブユニットを選択した。M.ジェニタリウム検出のために、我々は、そのゲノムを通してマルチリピートの主要成分であるMgPaドミナントアドヘシンをコードする遺伝子（MGPB）のゲノム配列を用いた。第二の標的のために、我々は16S rRNA遺伝子を用いた（前記もまたM.ジェニタリウムゲノム内のマルチコピーに存在する）。しかしながら、M.ジェニタリウム16S rRNA遺伝子は種々のマイコプラズマ種の間で高度に保存されている（例えばM.プニューモニアエ（M. pneumonia）とは98％同一性、M.ガリセプチクム（M. gallisepticum）とは91％同一性）。したがって多重変異を含む領域をイソサーマル増幅のために選択し、さらにこの特定の標的のために付加的な特異性検査を実施した。
【００１１】
各標的のために、当該アッセイで最高の感度レベルを可能にする最適プライマー対の組み合わせを確立した。最適化RPA反応は、最低限20−50の標的配列コピーを生じる、良好に検出できる安定な生成物の増幅を可能にした。ループプライマーによる最適化LAMP反応は、最低限5−10の標的配列コピーを生じる生成物増幅を可能にした。各診断標的は、H.サピエンスゲノムDNAの50,000コピー（0.16ng）を用い、さらにM.ジェニタリウム16S rRNA標的の場合にはまたM.プニューモニアゲノムDNAの100,000コピーを用いて反応の特異性について試験した。イソサーマル増幅の感度及び特異性は、ヒトの尿サンプルから抽出した全DNAにより立証した。
本発明の主要な目的は、ポイント・オブ・ケア条件下で適用できる診断アッセイを開発することであった。したがって、我々は、本診断アッセイに免疫クロマトグラフィー増幅生成物検出を組み入れた。当該目的のために、フォワードプライマー配列をビオチンにより5'標識し、リバースプライマーをフルオレセインアミダイト（FAM）により標識した。増幅反応中に二重標識生成物が生成され、前記はラテラルフローストリップを用いて数分以内に検出された。免疫クロマトグラフィー生成物検出の組み込みは追加のプライマー最適化を必要とした。鋳型非依存ラテラルフローストリップが検出し得るシグナルを取得するプライマーは当該選別から排除された。
RPA及びLAMPイソサーマル増幅による診断方法はまた多数の標的の同時検出に適切であることが示された。両アッセイとも、ヒトサンプルの診断検査の陽性コントロールとして用いられるH.サピエンスGAPDH遺伝子標的について最適化された。PCR及びイソサーマル増幅（RPA/LAMP/HDA）プロトコルは当該診断検査の最適な感度及び高い特異性のために調整された。
【００１２】
生物学的な粗サンプル及び体液から核酸標的を検出する本方法は以下の工程を含む：
a）細胞の溶解、並びに生物学的サンプル及び体液（例えば組織、尿、唾液、血液、大便、毛髪など及びそれらの派生物（ただしこれら例示一覧に限定されない））中の核酸標的の放出を含むサンプルの前処理、ここで生物学的サンプル中の核酸標的を放出させるために溶解ペプチド（lytic peptide）が用いられる；
b）核酸、例えばDNA、RNA及びそれらの誘導体（ただし前記一覧に限定されない）を含む核酸の増幅、増幅は標的の存在によって開始され、例えばPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、HCR（ハイブリダイゼーション連鎖反応）、RCA（ローリングサークル増幅）、RPA（リコンビナーゼポリメラーゼ増幅）、LAMP（ループ媒介イソサーマル増幅）、HDA（ヘリカーゼ依存増幅）など及びそれらの派生方法（ただし前記例示一覧に限定されない）のような増幅方法を含み、ここで1つ以上の特異的標的をベースにする配列が増幅されるか、又は工程（1）の間に得られるサンプル溶液が直接更なる増幅手順に付される；
c）定性的又は定量的検出方法の使用を含む増幅生成物の検出、前記方法は、例えばサンドイッチアッセイ、ELISA（酵素結合免疫吸着アッセイ）、LF（ラテラルフロー）免疫クロマトグラフィーアッセイ、波長が変化する（可視スペクトル、化学発光、蛍光、燐光）染料、デンリメア（denrimere）など又は該当する部分を結合させた検出分子及びリガンドであり、光学装置、適切な波長の発射装置若しくは読み取り装置又はそれらの組み合わせを用いる場合も用いない場合もあり、本工程で定性的及び定量的検出は粗雑なサンプル溶液で実施される。
【００１３】
前処理方法は具体的には以下の核酸標的を検出するために設計される：
−クラミジア・トラコマチス（表1に提供される特異的標的領域を使用するか、又は表2、3に提供される特異的プライマー及び／又は標識したその誘導配列を使用する）；及び
−マイコプラズマ・ジェニタリウム（表1に提供される特異的標的領域を使用するか、又は表2、3に提供される特異的プライマー及び／又は標識したその誘導配列を使用する）。
ヒトゲノムGAPDH標的を用いる本発明は、
−内部検証及びプラットフォーム評価技術として、
−表2、3に提供される特異的プライマー及び／又は標識したその誘導配列により内部検証及びプラットフォーム評価技術として検出に用いられる。
本前処理方法は、クラミジア・トラコマチスの分子診断に関し、ここでTRPB遺伝子が分子診断標的として用いられる。
実施例
【実施例１】
【００１４】
尿サンプルにおけるクラミジア・トラコマチスの存在の迅速診断
本プロトコルは、ヒト尿サンプルの高度に鋭敏なクラミジア・トラコマチス診断のための方法及びその成分を記載する。サンプルの前処理、標的のイソサーマル増幅及び生成物の検出を含む全手順は20分未満を要し、37℃で10分間のインキュベーションを必要とする。記載の方法は、2つのC.トラコマチス標的、ゲノム領域中のTRPB配列及び潜在プラスミド領域中のCDS2配列を検出する（表1）。
【００１５】
表1：イソサーマル増幅による検出に用いられるクラミジア・トラコマチス、マイコプラズマ・ジェニタリウム及びホモ・サピエンスのゲノム領域
2015532114.tif 000002
両C.トラコマチス標的は、同じ標識を有する高度に特異的で鋭敏なプライマーを用いて増幅される（フォワードプライマーはビオチンで標識され、リバースプライマーはFAMで標識される）。したがって、C.トラコマチスに特異的な生成物は、ラテラルフローストリップ上での免疫クロマトグラフィー検出時に区別されない。2つのC.トラコマチス領域の検出は、該標的領域の一方が変異又は欠失する場合に陽性検査結果を担保するために用いられる。該反応はまたH.サピエンスGAPDH遺伝子を標的とするプライマーを含み、前記プライマーはDIG及びFAM標識生成物を生じる。この生成物は、ラテラルフローストリップ上で分離したレーンとして認識され、全手順（細胞のゲノム物質の放出、増幅及び検出）のための陽性コントロールとして供される。記載の方法の分析感度は、一検査につき50個のC.トラコマチス細胞及び50個のH.サピエンス細胞である。これは、起床時尿（first void urine）の尿1mL当たり10,000細胞以上の病源体濃度のC.トラコマチスの検出を可能にする。
患者の尿サンプルを等体積のサンプル前処理緩衝液（0.2％トリトンX-114、150mM NaCl、50mMトリス（pH 7.0）を含む）と混合し、RT℃で5分インキュベートする。10μLの前記処理サンプルをRPA反応に用いる。前記RPA反応は以下の成分を含む：C.トラコマチスPL-CDS2 の5'ビオチン標識FW3プライマー（最終濃度0.4μM）、C.トラコマチスPL-CDS2 の5' FAM標識RV1プライマー（最終濃度0.4μM）、C.トラコマチスTRPBの 5'ビオチン標識FW2プライマー（最終濃度0.4μM）、C.トラコマチスTRPBの5'FAM標識RV3プライマー（最終濃度0.4μM）、H.サピエンスGAPDHの5'DIG標識FW3プライマー（最終濃度0.4μM）、H.サピエンスGAPDHの5'FAM標識RV2プライマー（最終濃度0.4μM）（プライマー配列については表2を参照されたい）、14mM酢酸マグネシウム、TwistDX RPA酵素ペレット及び 29.5μLの再水和緩衝液。反応物を37℃で10分間インキュベートする。稀釈緩衝液を用い生成物を1：10比に稀釈し、ビオチン-FAM及びDIG-FAM標識分子を検出するラテラルフローストリップで分析する。
【００１６】
表2：リコンビナーゼポリメラーゼ増幅のための表1に提供する標的に対する特異的プライマー配列
2015532114.tif 000003
2015532114.tif 000004
検査が2本線（ビオチン-FAM及びDIG-FAM）を示す場合クラミジア検査は陽性であり、検査が1本線（DIG-FAM）を示す場合陰性である。いずれの線も存在しないか又はビオチン-FAM線のみが存在する場合、検査の結果は無効である。
【実施例２】
【００１７】
尿サンプルにおけるマイコプラズマ・ジェニタリウムの存在の迅速診断
本プロトコルは、ヒト尿サンプルの高度に鋭敏なマイコプラズマ・ジェニタリウム診断のための方法及びその成分を記載する。サンプルの前処理、標的のイソサーマル増幅及び生成物の検出を含む全手順は20分未満を要し、37℃で10分間のインキュベーションを必要とする。記載の方法は、2つのM.ジェニタリウム標的、病源体ゲノム中のMGPA及び16S rRNA配列を検出する（表1）。両M.ジェニタリウム標的は、同じ標識を有する高度に特異的で鋭敏なプライマーを用いて増幅される（フォワードプライマーはビオチンで標識され、リバースプライマーはFAMで標識される）。したがって、M.ジェニタリウムに特異的な生成物は、ラテラルフローストリップ上での免疫クロマトグラフィー検出時に区別されない。
【００１８】
2つのM.ジェニタリウム領域の検出は、該標的領域の一方が変異又は欠失する場合に陽性検査結果を担保するために用いられる。該反応はまたH.サピエンスGAPDH遺伝子を標的とするプライマーを含み、前記プライマーはDIG及びFAM標識生成物を生じる。この生成物は、ラテラルフローストリップ上の分離したレーンとして認識され、全手順（細胞のゲノム物質の放出、増幅及び検出）のための陽性コントロールとして供される。記載の方法の分析感度は、一検査につき少なくとも50個のM.ジェニタリウム細胞及び50個のH.サピエンス細胞である。これは、起床時尿の尿1mL当たり10,000細胞以上の病源体濃度のM.ジェニタリウムの検出を可能にする。
患者の尿サンプルを等体積のサンプル前処理緩衝液（0.2％NP-40、150mM NaCl、50mMトリス（pH 7.0）を含む）と混合し、RT℃で5分インキュベートする。10μLの前記処理サンプルをRPA反応に用いる。前記RPA反応は以下の成分を含む：M.ジェニタリウムMGPAの5'ビオチン標識FW4プライマー（最終濃度0.4μM）、M.ジェニタリウムMGPAの5' FAM標識RV4プライマー（最終濃度0.4μM）、M.ジェニタリウム16S rRNAの 5'ビオチン標識FW1プライマー（最終濃度0.4μM）、M.ジェニタリウム16S rRNAの5'FAM標識RV1プライマー（最終濃度0.4μM）、H.サピエンスGAPDHの5'DIG標識FW3プライマー（最終濃度0.4μM）、H.サピエンスGAPDHの5'FAM標識RV2プライマー（最終濃度0.4μM）（プライマー配列については表2を参照されたい）、14mM酢酸マグネシウム、TwistDX RPA酵素ペレット及び 29.5Lの再水和緩衝液。反応物を37℃で10分間インキュベートする。稀釈緩衝液を用い生成物を1：10比に稀釈し、ビオチン-FAM及びDIG-FAM標識分子を検出するラテラルフローストリップで分析する。
検査が2本線（ビオチン-FAM及びDIG-FAM）を示す場合M.ジェニタリウム検査は陽性であり、検査が1本線（DIG-FAM）を示す場合陰性である。いずれの線も存在しないか又はビオチン-FAM線のみが存在する場合、検査の結果は無効である。
【実施例３】
【００１９】
本方法は、C.トラコマチスDNAの特異的検出のために高度に鋭敏なループ媒介イソサーマル増幅（LAMP）を用いる。当該記載方法の分析感度は、検査当たり少なくとも5 C.トラコマチス細胞である。LAMP反応は以下のように調製される：25μLの反応物当たり、C.トラコマチスPL-CDS2のセット4のプライマーF3及びB3（それぞれ濃度0.2μM）、C.トラコマチスPL-CDS2のセット4の5'ビオチン標識FIP及び5' FAM標識BIPプライマー（各々1.6μM）、C.トラコマチスPL-CDS2のセット4の5'ビオチン標識LF及び5'FAM標識LBループプライマー（各々0.8μM）（プライマー配列のための表3を参照されたい）、5.6μM dNTP、6 mM MgSO4、0.8 Mベタイン、8単位のBstポリメラーゼ、10x Bstポリメラーゼ緩衝液2.5μL及び患者サンプルから抽出した全DNAの5μL。反応物を63℃で1時間インキュベートし、稀釈緩衝液を用い1：10比に稀釈し、ビオチン-FAM標識分子を検出するラテラルフローストリップで分析する。
同様な反応で、追加の陽性コントロールのためのセット1プライマー（表3）を用いC.トラコマチスTRPB標的LAMPを実施できる（分析感度は検査当たり少なくとも5 C.トラコマチス細胞である）。さらにまた、セット1プライマー（表3）を用い、H.サピエンスGAPDH標的LAMPを反応の陽性コントロールとして用いることができた。
【００２０】
表3：ループ媒介イソサーマル増幅（LAMP）のための表1に提供する標的に対する特異的プライマー配列
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【配列表】
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【国際調査報告】
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