(57)【要約】比表面積および空隙率が増大された凍結乾燥肺サーファクタントを記載する。該凍結乾燥肺サーファクタントの製造方法もまた記載する。
2015514714.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロセスの間のケーキ浮上が減少したかまたはなくなった凍結乾燥合成肺サーファクタントの製造プロセスであって:
凍結乾燥前の混合液の総量の3%(v/v)〜20%(v/v)の有機溶媒を有していて残りは水および/または緩衝剤である溶媒中に分散させた、少なくとも1つのリン脂質および合成ペプチドを含む凍結乾燥前の混合液を、凍結乾燥チャンバーに入れること[ここで、該凍結乾燥前の混合液は容器に充填されており、そして、該合成ペプチドは、少なくとも10個のアミノ酸残基を有していて、式:
(ZaUb)cZd
（式中、Zは親水性アミノ酸残基を示していて、Uは疎水性アミノ酸残基を示し;各Zは、独立して、R、D、EまたはKであって;各Uは、独立して、V、I、L、C、Y、またはFであり;aは平均値が約1〜約5の整数であり;bは平均値が約3〜約20の整数であり;cは約1〜約10の整数であり;そして、dは約1〜約3の整数である）で示される];
凍結段階において、凍結乾燥チャンバーの内部の温度を低下させて凍結乾燥前の混合液を冷却および固化させ始めること;ならびに、
一次乾燥段階の前にアニーリング段階を実施することによって、凍結乾燥合成肺サーファクタントにおけるケーキ浮上を減らすかまたはなくすこと、
を含む、該プロセス。
【請求項２】
凍結乾燥チャンバーの内部の温度を低下させるプロセスにおける凍結段階を実施すること［ここで、該凍結乾燥前の混合液を0.1〜1.0℃/分の速度で第一の温度である-45℃まで冷却し、そして、溶媒の少なくとも76%を固化させるのに十分な第一の期間、該第一の温度で凍結乾燥前の混合液を保持して第一の固化混合物を得る］;
アニーリング段階を実施することによって第一の固化混合物のケーキ浮上を減らすかまたはなくすこと［ここで、該第一の固化混合物を、(i)第一の固化混合物の浮上を減らすかまたはなくすために選択される第二の温度まで加熱し、(ii)第一の固化混合物の浮上を減らすかまたはなくすのに十分な第二の期間、該第二の温度で保持し、そして、(iii)0.1〜1.0℃/分の速度で第三の温度である-45℃以下まで冷却して第二の固化混合物を得る（ここで、該第二の固化混合物を、第二の固化混合物からの未凍結の有機溶媒の分離を促進するのに十分な第三の期間、該第三の温度で保持し、それにより未凍結の有機溶媒を容器と該第二の固化混合物の間の界面に移動させる）］;
30 mT以上の減圧下で一次乾燥段階を実施すること［ここで、該第二の固化混合物を、有機溶媒の少なくとも5%を除去するのに十分な第四の期間、第四の温度で保持した後、容器の中で該第二の固化混合物が浮上するのを避けてアニーリング段階の間に得られた構造を維持するのに十分な該第四の温度まで加熱し、さらに、溶媒の少なくとも70%を除去するのに十分な第五の期間、該第四の温度で保持することによって第三の固化混合物を得る］;および、
最大で2%の残留溶媒含量を有する凍結乾燥合成肺サーファクタントを得るのに十分な第六の期間、減圧にて二次乾燥段階を実施すること、
を含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
容器の容積に対する該容器中の凍結乾燥前の混合液の体積の割合が約28%〜約68%である、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
容器の径に対する該容器中の凍結乾燥前の混合液の高さの比が約0.3〜約0.8である、請求項２に記載のプロセス。
【請求項５】
有機溶媒が約3%〜約15%である凍結乾燥前の混合液を提供することを含む、請求項２に記載のプロセス。
【請求項６】
有機溶媒が約5%〜約10%である凍結乾燥前の混合液を提供することを含む、請求項２に記載のプロセス。
【請求項７】
有機溶媒が約7%〜約10%である凍結乾燥前の混合液を提供することを含む、請求項２に記載のプロセス。
【請求項８】
凍結乾燥前の混合液を0.1〜1.0℃/分の速度で第一の温度である-50℃±5℃まで冷却する凍結段階を実施すること;
該第一の固化混合物を(i)0.1〜1.0℃/分の速度で第二の温度である-22℃±5℃まで加熱し、(ii)4〜8時間の第二の期間、該第二の温度で保持し、(iii)0.1〜1.0℃/分の速度で第三の温度である-50℃±5℃まで冷却し;そして、(iv)約3〜8時間の第三の期間、該第三の温度で加熱する、アニーリング段階を実施すること;ならびに、
約30mT〜約200mTの範囲から選択される圧力および約-25℃〜0℃の範囲から選択される一次乾燥温度（-50℃±5℃から一定の比率で上昇させた）での一次乾燥段階であって、さらに、該一次乾燥は少なくとも10時間保持される、該一次乾燥段階を実施すること、
を含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
約30mT〜約200mTの範囲から選択される圧力および最大で46℃±5℃の温度で二次乾燥段階を実施することを含む、請求項２〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
該凍結乾燥前の混合液が、配列番号1(KL4 ポリペプチド)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)およびパルミチン酸を含み、該凍結乾燥合成肺サーファクタントが少なくとも2.2 m2/gの比表面積を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１１】
該比表面積が約3.7 m2/g〜約2.2 m2/gの範囲である、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１２】
該凍結乾燥合成肺サーファクタントが、凍結乾燥合成肺サーファクタントの総領域の40体積%以上の空隙率を有する、請求項１０に記載のプロセス。
【請求項１３】
少なくとも1つのリン脂質、ならびに少なくとも10アミノ酸残基を有していて、式:
(ZaUb)cZd
（式中、Zは親水性アミノ酸残基を示していて、Uは疎水性アミノ酸残基を示し;各Zは、独立して、R、D、EまたはKであり;各Uは、独立して、V、I、L、C、Y、またはFであり;aは平均値が約1〜約5の整数であり;bは平均値が約3〜約20の整数であり;cは約1〜約10の整数であり;そして、dは約1〜約3の整数である）で示される合成ポリペプチドを含む凍結乾燥合成肺サーファクタント組成物であって、少なくとも2.2 m2/gの比表面積を有する、該凍結乾燥合成肺サーファクタント組成物。
【請求項１４】
該比表面積が約3.7 m2/g〜約2.2 m2/gの範囲である、請求項１３に記載の凍結乾燥合成肺サーファクタント。
【請求項１５】
該凍結乾燥合成肺サーファクタントが該凍結乾燥合成肺サーファクタントの総領域の40体積%以上の空隙率を有する、請求項１３に記載の凍結乾燥合成肺サーファクタント。
【請求項１６】
該凍結乾燥合成肺サーファクタントが、配列番号1(KL4 ポリペプチド)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)およびパルミチン酸を含む、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の凍結乾燥合成肺サーファクタント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体の合成肺サーファクタントおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肺（pulmonary）サーファクタント(「肺（lung）サーファクタント」とも称される)は、脂質およびタンパク質の複合混合物であり、肺胞の気液界面での単分子膜の形成を促進し、表面張力を低下させることにより、呼気中の肺胞の崩壊を防ぐ。肺サーファクタントは成熟した哺乳動物の肺の肺胞上皮を覆っている。天然の肺サーファクタントは、肺の気液界面における表面張力を低下させるように相互作用するリン脂質とアポタンパク質の両方を含むので、「リポタンパク質複合体」といわれている。4つのタンパク質が肺サーファクタントに関連することが分かっている（すなわち、SP-A、SP-B、SP-C、およびSP-D）。特に、SP-Bは肺サーファクタントの生物物理学的作用に不可欠であると思われる。肺サーファクタントを患者の肺に投与することは、様々な呼吸障害の処置のための一般に認知されている療法である。
【０００３】
薬理学的観点から、処置で用いるための最適な外因性肺サーファクタントは研究所で完全に合成されうる。これに関して、有用であると分かったSP-Bの1つの模倣物はKL4であり、それは21個のアミノ酸のカチオン性ポリペプチドである。
【０００４】
医学的用途のために商業スケールで肺サーファクタントを製造する1つの方法は、薄膜式エバポレーター(TFE)ユニットオペレーションを用いる方法によるものである。KL4肺サーファクタントの製造に適合する方法は、以下のプロセスから成る:1)4つの一次製剤成分、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)、パルミチン酸(PA)およびKL4をエタノール中に可溶化すること;2)TFEを用いてエタノールを除去すること;そして、3)最終分散物をバイアルに分注すること。該TFEユニットオペレーション自体は複雑であって、スケーリング限界を有する。具体的には、1 ft2のTFEは40リットルのバッチを製造し、利用可能な最大ユニットは10 ft2のTFEである。これによりバッチサイズが制限されることは、さらなる適応症がKL4サーファクタントに対して認められつつあり、必要とされるサーファクタントの量は増える一方である状況において、望ましくない。さらに、該方法は、コスト、柔軟なスケジューリング、および生産品の複雑性に大きく影響する無菌条件下において実施される。
【０００５】
TFEを用いることのコストと複雑性に加えて、組成物を液体状態で保存することに起因するさらに複雑な事態が存在する。該組成物のポリペプチドおよび液体成分は分解されやすいので、該溶液を冷蔵で保存して、いかなる分解をも遅延させて、長期安定性を達成しなくはならない。
【０００６】
凍結乾燥またはフリーズドライは固体の医薬製剤の製造において重要なプロセスである。固体製剤は、液体製剤よりも長い安定性を有しており、より容易に輸送および保存ができる。凍結乾燥プロセスの間、医薬製剤は、温度を30℃以上に上げることなく、2%以下の残留水分含量まで乾燥され得る。従って、このプロセスは高温プロセス（例えば、噴霧乾燥など）よりも、製剤の熱分解を引き起こす可能性が少ない。
【０００７】
該凍結乾燥プロセスには、液体製剤を凍結させること、ならびに、それに関連する溶媒を、中間の液相を経ることなく固相から気相への直接昇華によって除去することが含まれる。通常、該凍結乾燥プロセスは3つの段階、凍結段階、一次乾燥、および二次乾燥から成る。
【０００８】
凍結は、0℃以下の所定の温度以下で物質を冷却することによって、出発液状物を固化させるプロセスである。一次乾燥は凍結乾燥サイクルであり、そこで、凍結の間に得られた構造を維持するために物質を閾値温度以下で維持しながら、凍結した溶媒の大部分を昇華により除去する。二次乾燥は残留水分の一部を脱離させるプロセスであって、通常は25℃以上の温度で行われる。これら3つの工程の各々に関連する重要なプロセスのパラメーターは、棚温度、チャンバー圧および時間である。
【０００９】
凍結乾燥プロセスは何十年もの間進化し続けている。この分野で培われた豊富な知識にもかかわらず、依然として、合理的なコストおよび時間での商業スケールで、力学的に安定な構造を有する均一に分布したケーキを製造することを試みている。
【００１０】
Bornsteinの特許文献１は、リン脂質、パルミチン酸およびペプチドの組み合わせの水溶性懸濁液を凍結乾燥させることによって得られた凍結乾燥合成肺サーファクタントについて記載している。
Johnsonの特許文献２は、20%以上の有機溶媒を含む溶媒系中のリン脂質、パルミチン酸およびペプチドの液体製剤を凍結乾燥させることによる、凍結乾燥合成肺サーファクタントの製造方法について記載している。
【００１１】
5%以上20%未満で有機溶媒を有する液体の合成肺サーファクタントの凍結乾燥について上記特許に記載の凍結乾燥プロセスを用いることによって、商業的流通に許容されない脆弱で崩壊性の物質が得られた。前述の凍結乾燥サイクルを用いて合成肺サーファクタントを製造した結果、バイアルの底から物質が持ち上げられ(「浮上」)、それにより熱伝達が減少し、不均一な熱分配がもたらされ、そして、様々な品質特性（例えば、物理的形態および残留水分）の生成物が得られた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第5,952,303号
【特許文献２】米国特許第7,582,312号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
従って、肺サーファクタント組成物および改良肺サーファクタント組成物を製造するための改良法が必要とされている。本発明は、乾燥合成肺サーファクタントの製造の問題点について、化学的および力学的に安定であって、凍結乾燥プロセスにおいてその生物学的活性が損なわれない解決策を示す。
【００１４】
本明細書に引用された全ての文献は、参照によりその全般が本明細書に援用される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
（本発明の概要）
本発明の一態様は、プロセスの間のケーキ浮上が減少したかまたはなくなった凍結乾燥合成肺サーファクタントの製造プロセスを特徴とする。該プロセスには、凍結乾燥前の混合液の総量の3%(v/v)〜20%(v/v)の有機溶媒を有していて残りは水および/または緩衝剤である溶媒中に分散させた、少なくとも1つのリン脂質および合成ペプチドを含む凍結乾燥前の混合液を、凍結乾燥チャンバーに入れること［ここで、該凍結乾燥前の混合液は容器に充填されており、そして、該合成ペプチドは、少なくとも10個のアミノ酸残基を有していて、式:
(ZaUb)cZd
（式中、Zは親水性アミノ酸残基を示していて、Uは疎水性アミノ酸残基を示し;ここで、各Zは、独立して、R、D、EまたはKであって;各Uは、独立して、V、I、L、C、Y、またはFであり;aは平均値が約1〜約5の整数であり;bは平均値が約3〜約20の整数であり;cは約1〜約10の整数であり;そして、dは約1〜約3の整数である）で示される］;凍結段階において、凍結乾燥チャンバーの内部の温度を低下させて凍結乾燥前の混合液を冷却および固化させ始めること;ならびに、一次乾燥段階の前にアニーリング段階を実施することによって、凍結乾燥合成肺サーファクタントにおけるケーキ浮上を減らすかまたはなくすこと、が含まれる。
【００１６】
一実施態様において、該プロセスには、さらに、凍結乾燥チャンバーの内部の温度を低下させるプロセスにおける凍結段階を実施すること［ここで、該凍結乾燥前の混合液を0.1〜1.0℃/分の速度で第一の温度である-45℃まで冷却し、そして、溶媒の少なくとも76%を固化させるのに十分な第一の期間、該第一の温度で凍結乾燥前の混合液を保持して第一の固化混合物を得る］; アニーリング段階を実施することによって該第一の固化混合物のケーキ浮上を減らすかまたはなくすこと［ここで、該第一の固化混合物を、(i)第一の固化混合物の浮上を減らすかまたはなくすために選択される第二の温度まで加熱し、(ii)第一の固化混合物の浮上を減らすかまたはなくすのに十分な第二の期間、該第二の温度で保持し、そして、(iii)0.1〜1.0℃/分の速度で第三の温度である-45℃以下まで冷却して第二の固化混合物を得る（ここで、該第二の固化混合物を、第二の固化混合物からの未凍結の有機溶媒の分離を促進するのに十分な第三の期間、該第三の温度で保持し、それにより未凍結の有機溶媒を容器と該第二の固化混合物の間の界面に移動させる）］; 30 mT以上の減圧下で一次乾燥段階を実施すること［ここで、該第二の固化混合物を、有機溶媒の少なくとも5%を除去するのに十分な第四の期間、第四の温度で保持した後、容器の中で該第二の固化混合物が浮上するのを避けてアニーリング段階の間に得られた構造を維持するのに十分な該第四の温度まで加熱し、さらに、溶媒の少なくとも70%を除去するのに十分な第五の期間、該第四の温度で保持することによって第三の固化混合物を得る］;および、最大で2%の残留溶媒含量を有する凍結乾燥合成肺サーファクタントを得るのに十分な第六の期間、減圧にて二次乾燥段階を実施すること、が含まれる。
【００１７】
該プロセスのある特定の実施態様において、容器の容積に対する該容器中の凍結乾燥前の混合液の体積の割合は、約28%〜約68%である。
【００１８】
該プロセスのある特定の実施態様において、容器の径（diameter）に対する該容器中の凍結乾燥前の混合液の高さの比は、約0.3〜約0.8である。
【００１９】
ある特定の実施態様において、該プロセスは、有機溶媒が約3%〜約15%である凍結乾燥前の混合液を提供することを含む。より具体的には、該有機溶媒は約5%〜約10%である。さらに具体的には、該有機溶媒は約7%〜約10%である。
【００２０】
該プロセスの上記バリエーションのいずれかは、(1)凍結乾燥前の混合液を0.1〜1.0℃/分の速度で第一の温度である-50℃±5℃まで冷却する凍結段階を実施すること;(2)第一の固化混合物を(i)0.1〜1.0℃/分の速度で第二の温度である-22℃±5℃まで加熱し、(ii)4〜8時間の第二の期間、該第二の温度で保持し、(iii)0.1〜1.0℃/分の速度で第三の温度である-50℃±5℃まで冷却し;そして、(iv)約3〜8時間の第三の期間、該第三の温度で加熱する、アニーリング段階を実施すること;ならびに、(3)約30mT〜約200mTの範囲から選択される圧力および約-25℃〜0℃の範囲から選択される一次乾燥温度（-50℃±5℃から一定の比率で上昇させた）での一次乾燥段階であって、さらに、該一次乾燥は少なくとも10時間保持される、該一次乾燥段階を実施すること、により行われ得る。
【００２１】
上記で要約したプロセスのある特定の実施態様において、該二次乾燥段階は、約30mT〜約200mTの範囲から選択される圧力、および最大で46℃±5℃の温度で、実施される。
【００２２】
上記プロセスの様々な実施態様において、該凍結乾燥前の混合液は配列番号1(KL4ポリペプチド)を有するペプチド、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)およびパルミチン酸を含み、該プロセスは少なくとも2.2 m2/gの比表面積を有する凍結乾燥合成肺サーファクタントを提供する。特定の実施態様において、比表面積は約3.7 m2/g〜約2.2 m2/gである。ある特定の実施態様において、該凍結乾燥合成肺サーファクタントは、凍結乾燥合成肺サーファクタントの総領域（area）の40体積%以上の空隙率を有する。
【００２３】
本発明の別の態様は、1つ以上のリン脂質、ならびに少なくとも10アミノ酸残基を有していて式:
(ZaUb)cZd
（式中、Zは親水性アミノ酸残基を示していて、Uは疎水性アミノ酸残基を示し;各Zは、独立して、R、D、EまたはKであり;各Uは、独立して、V、I、L、C、Y、またはFであり;aは平均値が約1〜約5の整数であり;bは平均値が約3〜約20の整数であり;cは約1〜約10の整数であり;そして、dは約1〜約3の整数である）で示される合成ポリペプチドを含む、凍結乾燥合成肺サーファクタント組成物を特徴とし、ここで、該凍結乾燥合成肺サーファクタント組成物は少なくとも2.7 m2/gの比表面積を有する。
【００２４】
ある特定の実施態様において、凍結乾燥合成肺サーファクタントは、約3.7 m2/g〜約2.7 m2/gである比表面積を有する。
【００２５】
ある特定の実施態様において、凍結乾燥合成肺サーファクタントは、凍結乾燥合成肺サーファクタントの総領域の40体積%以上の空隙率を有する。
【００２６】
ある特定の実施態様において、該凍結乾燥合成肺サーファクタントは、配列番号1(KL4 ポリペプチド)を有するペプチド、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)およびパルミチン酸を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図1は、反転によるバイアル内での凍結乾燥物質の移動の有無を示す棒グラフであり、反転により移動した凍結乾燥物質を含むバイアルの数(黒色の棒で示す)および反転により移動しなかった凍結乾燥物質を含むバイアルの数(網掛けの棒で示す)を示す(実施例5参照)。
【００２８】
【図２】図2は、凍結乾燥プロセスの間の物質の浮上を示すグラフである(実施例5参照)。
【００２９】
【図３】図3Aおよび3Bは、30 mlバイアル中で製造された本発明の凍結乾燥肺サーファクタントの20倍での走査型電子顕微鏡(SEM)画像である（各々、表面Aおよび表面B）。
【００３０】
【図４】図4Aおよび4Bは、実施例3に記載の通り30 mlバイアル中でBornstein Lyo Cycleにより製造された凍結乾燥肺サーファクタント製剤IIの20倍でのSEM画像である（各々、表面Aおよび表面B）。
【００３１】
【図５】図5Aおよび5Bは、30 mlバイアル中で製造された本発明の凍結乾燥肺サーファクタントの100倍でのSEM画像である（各々、表面Aおよび表面B）。
【００３２】
【図６】図6Aおよび6Bは、実施例3に記載の通り30 mlバイアル中でBornstein Lyo Cycleにより製造された凍結乾燥肺サーファクタント製剤IIの100倍でのSEM画像である（各々、表面Aおよび表面B）。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
（本発明の好ましい実施態様の詳細な説明）
改善された凍結乾燥サイクルによって、空輸および取り扱いに耐え得る力学的に安定で強固な構造に配置された均一に分布した固形物を有する乾燥合成肺サーファクタントを製造することができることを見いだした。
【００３４】
凍結乾燥医薬製剤は、構造および質感における均一な外観ならびに良好な物理的強度(例えば、輸送および取り扱いに耐え得る)を有していて、商業的流通に適していると予想される。均一な外観は、薬物活性における安定性の向上および変動性の低下、外観の医薬的上質性（pharmaceutical elegance）、残留水分、ならびに再構成時間に関連している。
【００３５】
リポソーム組成物および有機溶媒の懸濁液を含む医薬製剤を凍結乾燥させることは、有機溶媒が非凍結液体として含まれていて他の凍結液体（例えば、氷）と異なる速度で気化すること、およびそれにより溶媒組成に変動が生じてプロセスの制御不能が引き起こされること、チャンバー圧の重要なプロセスパラメーターの維持の難しさ、ならびに乾燥生成物中における残留溶媒の存在の制御の難しさに起因して、複雑な課題である。
【００３６】
米国特許第5,952,303号および第7,582,312号に記載された凍結乾燥サイクルを用いて、3%〜20%の範囲内の有機溶媒を含む凍結乾燥前の混合液から乾燥合成肺サーファクタントを合成する試みは、商業的に許容される生成物を提供することができなかった。得られた生成物は、凍結乾燥バイアルの表面に沿って不均一に分布した固形物を有していた;該固形物は、該プロセスの間にバイアル中で浮上したと思われ、崩壊した粉状の表面を有していた。
【００３７】
棚温度、圧力および時間のルーチン的な変更によっては、構造および質感において均一な外観および良好な物理的強度を有する目的の生成物(例えば、凍結乾燥されたバイアルの反転後もその形状を保持し、その位置のままであることができる凍結乾燥生成物)は得られなかった。本発明の凍結乾燥プロセスの開発における最初のステップは、特定の成分に特有の物質に関する熱分析データ、ならびに該製剤に含まれるそれら成分の比率を確認することであった(大部分は緩衝剤中の非晶質な賦形剤（塩も含む)および有機溶媒)。この熱分析は、フリーズドライ顕微鏡(FDM)、電気抵抗(ER)および低温示差走査熱量(LT-DSC)測定を実施することにより行われた。熱分析によって、凍結工程の間に得られた構造を確実に保持するための、重要な情報（例えば、一次乾燥の間に氷の存在下のまま物質を安全に乾燥させるための適切な固化温度および閾値温度データ）を得た。有機成分の特徴およびプロセス中の挙動についての知識に基づいて、通常の凍結乾燥プロセスに用いられる条件では完全な固化を達成することができないと予想された。バルク溶液(すなわち、凍結乾燥前の混合液)は、揮発性成分（例えば、有機溶媒）を凍結乾燥前の混合液の総量の3%〜20%、好ましくは3%〜15%、より好ましくは5%〜10%、そしてさらに好ましくは7%〜10%(v/v)の範囲で有していて残りはおよび/または緩衝剤である溶媒系を含むので、この事実によってさらなる重大なプロセス課題が提起された。揮発性成分は、冷却器（condenser）が到達できる温度より低い融点を有する。その結果、冷却器では有機溶媒を固化させることができず、従来の方法と同様に、乾燥プロセスの間中ずっと冷却器によってしばしば非効率的に集められる。このプロセスにおいて、凍結乾燥の乾燥段階の間中ずっと、チャンバー圧を低下させることによって物質から除去された有機蒸気は、生成物中の溶媒と冷却器の間の温度差によって冷却器の表面で直ちに集められる。これらの蒸気は、冷却器の表面上にある間は液体状態である。冷却器の温度まで低下させて液体として集められた各有機溶媒に関連する蒸気圧はチャンバー圧よりも著しく高いため、続いて、有機液体が蒸気状態に戻る変換が引き起こされる。この一連の事象は、還流(蒸気＞液体＞蒸気)と呼ばれ、徐々に有機蒸気が冷却器の排出口（draw）から漏出して真空ポンプによりチャンバーから除去されるまで、該プロセスの間ずっと連続的に繰り返される。その一方で還流状態の物質は、ある相から他の相に変化するために絶えず、熱エネルギーを放出したり(蒸気から液体)、熱エネルギーを消費したり(液体から蒸気)している。その結果として冷却器上に集められた物質は、還流に関連する熱の取り込みと放出を経て、これ以上、定常状態を維持できなくなる。有機溶媒の還流中に氷の昇華が高レベルで生じた場合、冷却器の一定の温度変動および空き表面積（還流中の有機溶媒がない）の大きさの両者は、水蒸気から氷への凝縮、チャンバー圧の制御、そして最終的には生成物からの氷の昇華に影響を及ぼす。当該凍結乾燥の従来の方法は、氷の昇華による水蒸気の形成ならびに冷却器上で集めた該水蒸気を氷へ戻す変換であり、最先端とされる。プロセス中にケーキ浮上が観察されることと共に、有機溶媒が存在することによってもたらされる課題に基づいて、特定の2段階の一次乾燥法を行うことでこれらの影響を克服することに成功した。該2段階の一次乾燥段階（segment）の意図は、マトリックス/バイアル界面からのいずれの周辺の有機溶媒の蒸発を、凍結水の昇華から分離することである。質量分析計を用いて凍結乾燥チャンバー内の残留気体濃度を測定した。これらのデータによって、一次乾燥のこの最初の段階の間に有機溶媒が除去され、この特定の段階に対する標的サイクルパラメーターによって有機溶媒の濃度の低下がもたらされた（プロセスを一次乾燥の第二部に進めることができることを示唆している）ことが示された。この技法の使用は、蒸発を介して遊離（free）溶媒を除去するための段階を実施することによって、初めて目標の体裁においてケーキを浮上させなかった。その結果、関連する段階パラメーター（例えば凍結、アニーリング、および一次乾燥への昇温速度）がバイアル内での浮上に関連する生成物の可動性を回避するためにさらに制御されうる場合、この最初の段階における未凍結の有機溶媒の除去によってケーキ浮上現象を減らすことができると推論された。
【００３８】
本発明者らは、浮上の原因の1つは、以前用いた凍結温度である-30℃および-40℃で得られる固化が不十分であったことだと判断した。棚温度を-45℃まで低下させること、ならびに一次乾燥段階の間にチャンバー圧を上昇させることによる、浮上を減少させるための様々な試みは、顕著な改善をもたらさなかった。凍結乾燥混合物中にアルコールが存在することによって「潤滑」効果が生み出され;ケーキを昇温させると、バイアル側面に沿ってアルコールが存在することによりケーキが浮上され得た。凍結段階で最終凍結温度の-45℃以下まで低下させること（一次乾燥段階の前に、アニーリングの熱処理によってより多くの有機溶媒を混合物から分離させることを含む）により、浮上をなくした。該凍結段階に対する好ましいパラメーターは以下の通りであった:棚温度を-45℃以下、好ましくは-50℃〜-40℃まで(「最終凍結温度」)まで漸次冷却、その後1-10時間、好ましくは2-8時間、より好ましくは3-5時間、該棚温度で保持、全て大気圧で実施。該漸次冷却は凍結乾燥前の混合液を棚で2-8℃にて数時間平衡化した後で開始し、その後、約0.1〜1℃/分の速度で温度を低下させ始めた。
【００３９】
さらに、プロセス時間を改善し、必要とされる均一性と外観を維持したままにすることを試みて、本発明者らはサンプルの体積とバイアルのサイズの比を分析した。ケーキ浮上は稀な現象であるので、最小化された充填量の高さとバイアルの比を得ることに基づいて様々なバイアルサイズを評価する従来の方法ではなく、凍結ケーキが付着する表面領域をより多く得ることに基づいて様々なバイアルサイズにおけるプロセス挙動を評価することは、初めてのことである。驚くべきことに、同じ初期充填量(13.7 ml)のまま、バイアルサイズを20 ml容量〜50 ml容量で変化させたところ、少量サイズのバイアルから最大サイズのバイアルにおける凍結乾燥ケーキの外観に相関的改善をもたらさないことが見いだされた。30 mlバイアルのサンプルは20 mlバイアルのサンプルよりも均一に分散したケーキであったが、50 mlバイアルのサンプルは20 mlバイアルのサンプルよりも均一でなかった。50 ml容量のバイアル中で処理された物質に改善がなかったことは、この容器で観察されたケーキ浮上レベルが20ccおよび30ccバイアルのケーキの高さと比較して増大していたことと関連しているようであった（得られたケーキの高さに関連する）。充填量のスケールアップにおいて、充填量(凍結乾燥前の混合液の体積)とバイアル(または充填物を保持するために用いる他の種類の容器)体積との間の比および/またはバイアルの径に対するバイアル中の凍結乾燥前の混合液の凍結乾燥前の混合液の充填量高さの比を観察すべきである。バイアルの径に対するバイアル中の充填量の高さの比は、約0.3〜約0.8、好ましくは約0.4〜約0.7、およびより好ましくは約0.5〜約0.6の範囲であるべきである。バイアル容積に対する充填体積の比は、約28%〜約68%であるべきであり、約35%〜約55%での範囲が好ましい。これらの算出に用いたバイアルの容積は、「記載の」容積(すなわち、カタログおよび商品パンフレットに記載の容積)であって、実際の内部容積でない（ここで、記載の容積は実際の容積と約10%の差で異なり得る）ことが理解されるべきである。
【００４０】
本発明者らは、凍結段階の後または最終凍結温度の前の中間段階としてアニーリング段階を加えることは拡大した足場を有するより強固なケーキを作り出すことの助けとなり、該足場によってバイアルの側面および底により密接に付着されることで、固形物の浮上をなくしうることを見いだした。アニーリング段階を加えることによって達成される別の目的は、ケーキ外観を損なうことなく、昇華速度の上昇ならびにそれによる総プロセス時間の減少をもたらすことであった。
【００４１】
アニーリング段階を詳細に説明する。用語「アニーリング段階」は、成分の分離および/または混合物の成分の結晶化を促進する熱処理の条件を意味する。この熱処理は、(A)中間温度まで冷却した後、最終的な低温(「最終凍結温度」)までさらに冷却するか、(B)低温まで冷却した後で中間温度まで昇温させ、さらにその後、最終的な低温まで冷却するか、あるいは(C)低温まで冷却した後で中間温度まで昇温させること、を含みうる。該「アニーリング段階」は、凍結乾燥プロセスの凍結段階の間に存在するように意図されている。アニーリングを実施することで、より強固な凍結マトリックスを作り出すことにより、プロセスの間にバイアルの底からケーキが浮上するのを防ぐ可能性が高められた。加えて、該アニーリングは、未凍結の溶媒がバイアル/マトリックス界面へ移動するのを促進し、さらに、それに続いて一次乾燥に用いる初期条件の間に生成物から溶媒が分離されるのを促進し、溶媒の量を効率的に減少させて溶質（すなわち、APIおよび緩衝塩）をより強固にすることを促進し、一方でいずれの未凍結の水をも氷に変換した。該中間温度は、物質の低温熱分析および視覚キャラクタリゼーションに基づいて選択される（ここでは、ガラス転移温度(Tg')または観察された物理的変化に対応する温度のいずれかが決定される）。該低温は、物質の熱分析および視覚によるキャラクタリゼーションに基づいて決定される（ここでは完全固化温度が測定される）。Tg'または他の観察された物理的変化（例えば、不透明性または液体様移動における変化）によって、生成物をアニールすべき中間温度が決定され、そして、完全固化温度によって、一次乾燥に進めるための理想的な凍結物質の性状を促進するために用いるべき低温設定ポイントが決定される。特に、該物質はTg'または物理的変化が観察されるより数度高い温度でアニールされるべきであり、最低でも、該物質は完全固化温度かまたはそれ以下の温度まで冷却されるべきである。この明細書において製剤Iとして記載される物質について、熱分析の間に、観察された物理的変化である液体様移動が-28℃の温度(液体様移動が凍結乾燥顕微鏡下において観察された温度)にて観察された。ある特定の実施態様において、該完全固化温度は-45℃にて観察された。中間温度または低温保持のいずれかを行う前に、核形成を確認しなければならない。該温度はA、BおよびCの変形の各々について同一または類似でありうるが、それらが実行される順序は変化しうる。該温度の選択は製剤の成分または閾値温度に基づくものであり得る。該閾値温度は、氷が存在する中で、崩壊、融解または場合によってケーキ浮上を回避するように、生成物温度が一次乾燥の間中それ以下に維持される必要がある温度として定義される。
【００４２】
ある特定の実施態様において、該アニーリング段階は上記変形(B)に記載の通り実施される。これらの実施態様において、該アニーリング段階には、凍結ケーキを、約0.1℃/分〜約1℃/分の範囲の速度から選択される速度にて、-45℃ +/- 5℃(最終凍結温度)から-22℃ +/- 5℃(中間温度)に昇温させること(昇温段階)、ならびに溶質混合物からの有機溶媒の分離を促進させてより強固な固形物をもたらして浮上を減少させるのに十分な時間、好ましくは-22℃ +/- 5℃で3-8時間保持すること(保持段階)、その後、約0.1℃/分〜約1℃/分の速度で-45℃ +/- 5℃まで再び冷却すること(冷却段階)および十分な固化を確保するのに十分な時間、例えば、-45℃ +/- 5℃にて、3-8時間、好ましくは4時間保持すること（ここで、全4段階は大気圧で実施された）が含まれた。ある特定の実施態様において、該アニーリング段階は、実施例2、および9-13に記載の通り実施される。
【００４３】
別法として、十分な固化は、目的の温度に達するまで約0.1℃/分〜約1℃/分の速度から選択される一定の速度でバイアルを最終的な低温まで冷却することによる最終保持段階を行うことなく、最終的な低温まで直接冷却することで達成され得る。別の実施態様において(上記変形(A))、アニーリング段階は凍結段階において最終的な低温に達する前の中間段階として実施される。この実施態様において、該アニーリング段階は、棚の温度が液体生成物の核形成の温度(約-15℃ +/- 5℃)(「核形成温度」)に達した後で開始され、水から氷への変換および混合物の溶質の分離に十分な時間、45分〜4時間、核形成温度で保持すること(中間保持段階)、その後、目的の最終凍結温度に到達する(-50℃ +/- 5℃)まで該混合物を0.1℃/分〜1.0℃/分の速度で冷却し続けることを含み、該凍結段階が完了するまでその温度で保持する段階を実施した。
【００４４】
一実施態様において、該アニーリング段階には、凍結ケーキを0.1〜1℃/分の速度で-50℃ +/- 5℃から-22℃ +/- 5℃に昇温させること、ならびに-22℃ +/- 5℃で3-8時間保持した後、0.1〜1℃/分の速度で-50℃ +/- 5℃まで再び冷却し、-50℃ +/- 5℃で、3-8時間、好ましくは4時間保持することが含まれ、ここで、全4段階は大気圧で実施された。
【００４５】
ある特定の実施態様において、該アニーリング段階は上記変形(A)に記載される通り実施される。該中間温度は-10℃〜-35℃の間で選択され得る。中間温度での保持は、水から氷への変換および混合物の溶質の分離に十分な時間、45分〜4時間である。最終凍結温度へは約0.1〜1℃/分の速度で傾きがつけられ、その後、凍結段階が完了するまで、約0.5〜5時間、該温度で保持する。その後、該一次乾燥段階を記載の通り実施する。該プロセスの1つの実施例を実施例14に記載する（表16参照）。
【００４６】
該一次乾燥段階は減圧(吸引)にて実施され、それには適宜、少なくとも5%、好ましくは5〜10%の有機溶媒を蒸発させるのに十分な時間、前段階の温度で保持すること、前段階の温度-50℃ +/- 5℃から約-25℃〜約0℃以内の温度(一次乾燥温度)まで、0.1℃/分〜2℃/分の速度および30 mT〜200mT、好ましくは40 mT +/- 10mTの圧力にて、徐々に上昇させること(加熱段階)、次いで保持段階を、一次乾燥温度にて少なくとも70%の溶媒、好ましくは少なくとも80%、好ましくは5〜10%の有機溶媒を昇華させるのに十分な時間実施するか、あるいは該保持段階が適宜実施される場合は、少なくとも80%の溶媒を昇華させるのに十分な時間実施すること、が含まれる。該保持段階は10時間以上続けられ得る。ある特定の実施態様において、該保持段階は18〜140時間、好ましくは18-100時間である。0℃〜-25℃での一次乾燥のための温度の選択は、バイアル中のサンプルを浮上しないようにするため、および凍結の間に得られた構造を保持したまま乾燥させるために要求される温度に基づいた。一次乾燥段階の継続時間を最適にする能力はアニーリング段階の設計により高められた。
【００４７】
次に、二次乾燥段階について説明する。該二次乾燥段階の目的は、一次乾燥段階で得られた生成物中の残留含水量を、その温度を上昇させて（典型的には周囲温度以上まで）いずれの残留水をも除去すること、ならびに選択した温度にて最大でも2%の残留溶媒含量である凍結乾燥合成肺サーファクタントを得るのに十分な時間保持することにより、低下させることである。二次乾燥温度の典型的な範囲は20℃〜30℃である。しかしながら、該二次乾燥温度の範囲は-7℃という低温から最大で+60℃という高温であり得る。該二次乾燥温度設定ポイントは、1)該二次乾燥段階の間、実測Tg以下（少なくとも5℃まで）で生成物の温度を維持するように棚温度で実行することにより、生成物を安定に保つこと、ならびに、2)商業的に適切な速度で残留水分を規格内まで効率的に減少させるのに十分な温度で実行することによって脱離を促進させること、に基づいて選択されるべきである。製剤Iの実測Tgは、45℃〜51℃であったので、二次乾燥の間の温度は46℃の高さであり得る。該残留水分成績によって、25℃という二次乾燥温度の設定ポイントが残留水分成績を達成することに効果的であることが示された。次に、該生成物を、選択した二次乾燥温度にて、残留溶媒含量が最大2%である最終生成物を得るのに十分な時間、保持した。乾燥が十分であるかどうか判断するための方法の1つは、プライズテスト(prize test)を実施することであり、ここで、10ミクロンの圧力は残留水分が規格内であることを示す。ある特定の実施態様において、該二次乾燥段階は、前述の段階の棚温度を、0.1〜1℃/分の速度、好ましくは0.2〜0.5℃/分の速度で、25℃ +/- 3℃まで加熱することにより実施された。この段階はまた、前述の段階の通り減圧で実施された。好ましい圧力範囲は、30mT〜500mT、より好ましくは40mT〜150mTであった。生成物が選択された棚温度に達した後、25℃ +/- 3℃の保持段階を4〜10時間、好ましくは6時間、実施した。
【００４８】
その後、凍結乾燥物質を、不活性ガス（例えば窒素）で0.5 barにてフラッシュした後、最終的には完全に、保存のためにストッパーを挿入して密閉した。
【００４９】
標的サイクルパラメーターの再現性を決定するために、主要な生成物の性状、例えば、温度プロファイル、昇華停止（break）温度および最終生成物の特徴を、同じ凍結乾燥サイクルで処理した後で比較した。該昇華「停止」温度は、一次乾燥の間に生成物の温度が棚温度に急速に近づくポイントの直前の温度である。生成物温度「停止」は、氷が存在し続けそうな適当な位置(底の中心)に計測用熱電対が配置されていることを踏まえた、所定の容器における昇華の完了を示す。該プロセスにおける各重要な段階(例えば、アニーリング、凍結、一次乾燥、昇華停止および二次乾燥)において、両研究からの生成物の温度変動範囲は、アニーリングおよび凍結については0.5℃以内、一次乾燥および昇華停止については1℃以内、そして二次乾燥については1.5℃以内であった。この名目上の変動に基づくと、プロセス中の熱挙動は再現性があると考えられた。昇華終了時間の変動範囲の評価によって、昇華が研究ごとに6時間の範囲内で完了されたことが示され、このことはまた、十分な再現性も示唆している。最終的に、最終生成物の評価、例えば、物理的外観、残留水分、再構成時間、溶液の澄明性、再構成pH、熱重量による質量損失測定（thermogravimetric mass loss）(TGA)および高温示差走査熱量測定(HT-DSC)は全て、同様の結果が得られ、このことはさらに、大規模での研究ごとに一貫した生成物品質を再現することができる可能性を示唆している。これらの研究の評価から、凍結乾燥前の混合液の総量の3〜20%、好ましくは3%〜15%、より好ましくは5%〜10%、さらに好ましくは7%〜10%(v/v)の有機溶媒を含む合成肺サーファクタントを凍結乾燥させるために実行された凍結乾燥サイクルパラメーターは、ケーキ浮上現象を起こすことなく、許容される生成物品質特性を有する一貫した物質を得るために、着実で適切であるという結論が得られた。
【００５０】
凍結乾燥は、8平方フィートの棚スペースを提供し、15キログラムの内部アイスコンデンサ収容能力を有する、4つの棚式凍結乾燥ユニットにおいて実施された。該ユニットは、蒸気滅菌を目的として最大20 psigまで作動する圧力容器として認定されている、タイプ304Lのステンレススチール製のものであった。典型的な凍結乾燥装置は、定格圧力（pressure rated）チャンバー、冷却器、圧力制御機能を有する減圧システム、および約-55℃〜50℃の温度範囲に対応可能な循環型熱伝導流体ループから成る。
【００５１】
凍結乾燥物質は、白色で、バイアル内に均一に分散され、円柱状(すなわち、バイアルの形状を呈する)で、高密度な外観であり、最初の充填物に対する縮小度が最小化されており、バイアルの反転で動かないような強固な構造を有し、該物質の上面上に縁取りもしくは物質の痕跡を有しないように見えた。該物質は、ケーキの上部、側面および底に沿う光沢のない表面を有していた。該凍結乾燥物質は、残留水分、DSC、再構成、pH、および粘稠性についての規格を満たしていた。
【００５２】
凍結乾燥前の混合液およびその製造を詳細に説明する。主要成分-医薬品有効成分(APIs)は、リン脂質(例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)およびパルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG))、パルミチン酸(PA)、および合成肺ペプチド（synthetic pulmonary peptide）(好ましくは、KL4)であった。
【００５３】
ある特定の実施態様において、肺サーファクタントポリペプチド模倣物とは、0未満、好ましくは-1以下、より好ましくは-2以下の複合性の疎水性を持つアミノ酸残基配列を有するポリペプチドのことを言う。ペプチドの複合性の疎水性値は、ペプチド中の各アミノ酸残基にHopp et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 3824-3829, 1981（その開示は参照により援用される）に記載されるその対応する親水性値を割り当てることにより決定される。指定のペプチドについて、該疎水性値を合計し、その合計が複合性の疎水性値を表す。
【００５４】
ある特定の実施態様において、米国特許第3,789,381号（その全般が引用により本明細書に援用される）に記載される通り、肺サーファクタントポリペプチド模倣物のアミノ酸配列はSP18の疎水性残基および親水性残基のパターンを模倣し、SP18の疎水性領域の機能を果たす。ある特定の実施態様において、本明細書で用いるためのSP-B模倣物は、疎水性と親水性のアミノ酸残基領域を交互に有するポリペプチドを含み、そして、式:
(ZaUb)cZd
［式中、ZおよびUは、ZおよびUが各々独立して選択されるようなアミノ酸残基である。Zは親水性アミノ酸残基であり、好ましくはR、D、EおよびKからなる群から選択される。Uは疎水性アミノ酸残基であり、好ましくはV、I、L、C、Y、およびFからなる群から選択される。該文字「a」、「b」、「c」および「d」は、親水性または疎水性残基の数を示す番号である。該文字「a」は、約1〜約5、好ましくは約1〜約3の平均値を有する。該文字「b」は、約3〜約20、好ましくは約3〜約12、最も好ましくは約3〜約10の平均値を有する。該文字「c」は、1〜10、好ましくは2〜10、最も好ましくは3〜6である。該文字「d」は1〜3、好ましくは1〜2である。］
により示される少なくとも10のアミノ酸残基を有することを特徴とする。
【００５５】
ZおよびUで示されるアミノ酸残基が独立して選択されると記載することは、各々、特定の群からの残基が選択されることを意味する。すなわち、「a」が2である場合、例えば、Zで示される親水性残基の各々は独立して選択されるため、RR、RD、RE、RK、DR、DD、DE、DKなどが含まれ得る。「a」および「b」が平均値を有すると記載することは、繰り返し配列(ZaUb)中の残基の数はペプチド配列内で多少変動できるけれども、「a」および「b」の平均値は、各々、約1〜約5および約3〜約20であろうことを意味する。
【００５６】
ある特定の実施態様において、本発明で用いることのできる例示的なSP-Bポリペプチド模倣物としては、限定はされないが、肺サーファクタント模倣ペプチドの表に示されるものが挙げられる。
肺サーファクタント模倣ペプチドの表
【表１】
2015514714.tif 000003
【００５７】
本発明により提供される組成物に有用なリン脂質の例としては、天然および/または合成リン脂質が挙げられる。用いることができるリン脂質としては、限定はされないが、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴ脂質、ジアシルグリセリド、カルジオリピン、セラミド、セレブロシドなどが挙げられる。例示的なリン脂質としては、限定はされないが、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジラウリルホスファチジルコリン(DLPC)(C12:0)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)(C14:0)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジフタロイル（diphytanoyl）ホスファチジルコリン、ノナデカノイルホスファチジルコリン、アラキドイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)(C18:1)、ジパルミトレオイルホスファチジルコリン(C16:1)、リノレオイルホスファチジルコリン(C18:2)、ミリストイルパルミトイルホスファチジルコリン(MPPC)、ステアロイル（steroyl）ミリストイルホスファチジルコリン(SMPC)、ステアロイルパルミトイルホスファチジルコリン(SPPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルパルミトオレオイルホスファチジルコリン(PPoPC)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジミリストイルホスファチジルグリセロール(DMPG)、ジステアロイルホスファチジルグリセロール(DSPG)、ジミリストイルホスファチジルセリン(DMPS)、ジステアロイルホスファチジルセリン(DSPS)、パルミトイルオレオイルホスファチジルセリン(POPS)、大豆レシチン、卵黄レシチン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジン酸、および卵ホスファチジルコリン(EPC)が挙げられる。
【００５８】
これらの混合物において有用な脂肪酸および脂肪アルコールの例としては、限定はされないが、ステロール、パルミチン酸、セチルアルコール、ラウリン酸、ミスチリン酸、ステアリン酸、フィタン酸、ジパルミチン酸などが挙げられる。好ましくは、該脂肪酸はパルミチン酸であり、好ましくは、該脂肪アルコールはセチルアルコールである。
【００５９】
これらの混合物において有用な脂肪酸エステルの例としては、限定はされないが、パルミチン酸メチル、パルミチン酸エチル、パルミチン酸イソプロピル、パルミチン酸コレステリル、パルミチン酸パルミチル、パルミチン酸ナトリウム、パルミチン酸カリウム、トリパルミチンなどが挙げられる。
【００６０】
半合成または改変天然脂質の例は、化学的に修飾された上記の脂質のうちのいずれか一つである。該化学的修飾には多くの修飾が含まれ得る;しかしながら、好ましい修飾は、脂質の目的とする部位への1つ以上のポリエチレングリコール(PEG)基の結合である。ポリエチレングリコール(PEG)は生体適合性があり、無毒で、非免疫原性および水溶性のポリマーであることを主な理由として、PEGは、バイオマテリアル、バイオテクノロジーおよび医薬で広く用いられている。ドラッグデリバリーの分野では、PEG誘導体をタンパク質への共有結合(すなわち、「PEG化」)に広く用いて、免疫原性、タンパク質分解および腎クリアランスを低下させ、溶解性を高めている。
【００６１】
PEGと結合した脂質は、本明細書中で「PEG-脂質」と呼ばれる。好ましくは、本発明の方法および組成物においてPEG-脂質が用いられる場合、それらはアルコールおよび/またはアルデヒド中に存在する。
【００６２】
他の賦形剤を、凍結乾燥の前に、肺サーファクタントポリペプチド、1つ以上の脂質、および有機溶媒系と合わせることができ、該他の賦形剤には、限定はされないが、様々な糖（例えば、ブドウ糖、フルクトース、ラクトース、マルトース、マンニトール、スクロース、ソルビトール、トレハロースなど）、界面活性物質（例えば、ポリソルベート-80、ポリソルベート-20、ソルビタントリオレエート、チロキサポールなど）、ポリマー（例えば、PEG、デキストランなど）、塩（例えば、NaCl、CaCl2など）、アルコール（例えば、セチルアルコール）および緩衝剤が含まれる。
【００６３】
好ましくは、該肺サーファクタントペプチドは、リン脂質および遊離脂肪酸もしくは脂肪アルコール、例えば、DPPC(ジパルミトイルホスファチジルコリン)、POPG(パルミトイル-オレイルホスファチジルグリセロール)およびパルミチン酸(PA)と合わせられる。例えば、米国特許第5,789,381号参照（その開示は引用によりその全般があらゆる目的で本明細書に援用される）。
【００６４】
凍結乾燥前の混合液の製造における第一段階は、93-100%の有機溶媒、好ましくは95%のエタノールを含む有機溶媒系中の肺サーファクタントペプチドおよび1つ以上の脂質の、実質的に均一な液体混合物を得ることである。用語「実質的に均一な」は、成分が互いに均一に、例えば、溶液中のように、分散されていることを意味する。該APIを、45℃ ± 5℃まで加熱された有機溶媒系において、溶液が得られるまで混合する。次いで、得られた溶液を、無菌フィルター(0.22 ミクロン)により、緩衝剤、好ましくは、45℃ ± 5℃に加熱されたトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS)緩衝液中に濾過し、撹拌して、リポソーム懸濁液の形態の凍結乾燥前の混合液を得る（有機溶媒の濃度は凍結乾燥前の混合液の総量の3%〜20%(v/v)、好ましくは3%〜15%、より好ましくは5%〜10%、さらに好ましくは7%〜10%で、残りは水および/または緩衝剤である）。
【００６５】
ある特定の好ましい実施態様において、肺サーファクタントペプチド、リン脂質および遊離脂肪酸もしくは脂肪アルコール、例えば、DPPC(ジパルミトイルホスファチジルコリン)およびPOPG(パルミトイル-オレイルホスファチジルグリセロール)およびパルミチン酸(PA)の混合物を有機溶媒系と合わせて、実質的に均一な液体混合物を得る。該個々の成分はいずれの濃度で該混合物中に存在し得る。該分散液におけるリン脂質の総濃度は、例えば、約1〜約80 mg以上-総リン脂質含量/mlの範囲であり得る。適切な緩衝剤としては、限定はされないが、トリス酢酸塩、トリス塩酸塩、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、などが挙げられる。該緩衝剤は、典型的には、商業的に入手可能である。
【００６６】
好ましい実施態様において、本発明の方法において用いるためのリポソーム懸濁液は、凍結乾燥前の混合液の総量の3%〜20%(v/v)、好ましくは3%〜15%、より好ましくは5%〜10%、さらに好ましくは7%〜10%の範囲の濃度で有機溶媒を含んでいて残りは水および/または緩衝剤である生理学的に許容される溶媒中に、DPPC、POPG、PAおよびKL4(約7.5:2.5:1.35:0.267の重量比)を含む。
【００６７】
ある特定の実施態様において、該有機溶媒系はさらに、さらなる賦形剤（限定はされないが、様々な糖（例えば、ブドウ糖、フルクトース、ラクトース、マルトース、マンニトール、スクロース、ソルビトール、トレハロースなど）、サーファクタント（例えば、ポリソルベート-80、ポリソルベート-20、ソルビタントリオレエート、チロキサポールなど）、ポリマー（例えば、PEG、デキストランなど）、塩（例えば、NaCl、CaCl2）、および緩衝剤を含む）を含む。ある特定の好ましい実施態様において、該有機溶媒系は実質的に塩フリーである。ある特定の好ましい実施態様において、該有機溶媒系は実質的にNaClフリーである。
【００６８】
ある特定の実施態様において、該有機溶媒系は、該系の成分の全てを合わせることによって製造され得る。例えば、ある特定の実施態様において、該有機溶媒は室温の有機溶媒および水性媒体から成り、該水性媒体および有機溶媒を合わせて、有機溶媒系を得ることができる。好ましくは、該有機溶媒系はエマルションまたは混和溶液である。
【００６９】
選択された有機溶媒は、好ましくは、無菌濾過および凍結乾燥と適合性を有する。好ましくは、本発明の有機溶媒は、低級オキシ炭化水素、低級ハロ炭化水素、低級ハロオキシ炭化水素（haloxyhydrocarbon）、低級スルホキシ炭化水素、低級シクロ炭化水素およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００７０】
本発明で用いるのに適した有機溶媒としては、限定はされないが、イソプロピルアルコール、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、シクロヘキサン、クロロブタノール、ジメチルスルホキシド、t-ブタノール、ヘキサノール、ベンジルアルコール、酢酸、ペンタノール (1-ペンタノール)、n-ブタノール、n-プロパノール、酢酸メチル、炭酸ジメチル、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、四塩化炭素、ヘキサフルオロアセトン、クロロブタノール、ジメチルスルホン、シクロヘキサン、およびそれらの組み合わせが挙げられる。好ましい溶媒としては、低級アルカノール、例えば、t-ブタノール、エタノール、イソプロピルアルコールなどが挙げられる。本発明の特に好ましい溶媒はエタノールである。
【００７１】
ある特定の好ましい実施態様において、該肺サーファクタント組成物は、ルシナクタントか、または合成サーファクタントペプチド KLLLLKLLLLKLLLLKLLLLK (KL4; 配列番号1)を含む別の肺サーファクタント製剤である。ある特定の好ましい実施態様において、本発明の凍結乾燥肺サーファクタントは、再構成された場合、約7.5:2.5:1.35:0.267の重量比か、またはサーファクシン（登録商標）(ルシナクタント)（Discovery Laboratories, Inc(Warrington, PA, USA)製の液体の合成肺サーファクタント）中と同じ重量比の、API:DPPC、POPG、PAおよびKL4ペプチドの組み合わせをもたらす。ある特定の実施態様において、該肺サーファクタント組成物は、以下の濃度、例えば、10、20、および30 mg/mlのリン脂質含量で製剤化される。ある特定の他の実施態様において、該肺サーファクタント組成物は、KL4濃度の増加に伴ってより多い濃度、例えば、60、90、120mg/ml以上のリン脂質含量で製剤化される。
【００７２】
本発明のある特定の例示的実施態様において、肺サーファクタントペプチド、リン脂質および遊離脂肪酸もしくは脂肪アルコールの相対量は、約1重量部の合成サーファクタントペプチド;1重量部の合成サーファクタントペプチドあたり約20〜約150重量部のリン脂質;1重量部の合成サーファクタントペプチドあたり約0〜約25重量部の遊離脂肪酸もしくは脂肪アルコールである。ある特定の実施態様において、有機溶媒系の相対量は、1重量部の肺サーファクタントペプチドあたり62.5〜250重量部の範囲である。ある特定の実施態様において、該有機溶媒系は、1重量部の肺サーファクタントペプチドあたり80〜125重量部で存在する。ある特定の例示的実施態様において、肺サーファクタントペプチド、リン脂質および遊離脂肪酸もしくは脂肪アルコールの相対量は、約1重量部の肺サーファクタントペプチド（例えば、KL4など）;約20〜約100重量部のDPPC;0〜約50重量部のPOPG;おようび約0〜約25重量部のパルミチン酸である。
【００７３】
本発明の凍結乾燥物質は、白色で、バイアル内に均一に分散され、円柱状(すなわち、バイアルの形状を呈する)で、高密度で、最初の充填物に対する縮小度が最小化されており、バイアルの反転で動かないような強固な構造を有し、該物質の上面上に縁取りもしくは物質の痕跡を有しないように見えた。上記の方法により得られた本発明の凍結乾燥合成肺サーファクタントは、他の凍結乾燥法により得られる肺サーファクタントよりも大きな比表面積(少なくとも2.2 m2/g)および大きな総細孔面積(少なくとも40%)を有する。好ましくは、本発明の凍結乾燥合成肺サーファクタントの比表面積は約3.7 m2/g〜約2.2 m2/gの範囲である。また、より強固なケーキ構造を得るためのアニーリングに加えて、一次乾燥の間の減圧の変動も比表面積に影響を与えることが見いだされた。実施例15で示されるBETデータは、40ミクロンにて比表面積が最大であったことを示す（150ミクロンで得られるサンプルの比表面積と比べて）。この発見は、凍結乾燥合成肺サーファクタントケーキ構造の設計を改良するのにさらに役立つであろう。
【００７４】
凍結乾燥物質は、残留水分、再構成時間、pH、粘稠性、およびその生物学的活性の検査に通過した。該凍結乾燥物質を10 mlの滅菌注射用水(WFI)で再構成し、該固形物を20〜30秒間以内で分散させた。pHは7.6 - 7.9の範囲であった。37℃にてブルックフィールド粘度計, Model LVDV-II(Brookfield Engineering Laboratories, Inc., Middleboro, MA)を用いて測定された粘稠性は、77-105 cP(0.077-0.105 Pa s)の範囲であった。サンプルを、表面張力を低下させる能力(例えば、生物学的活性)について、37℃にて、Pulsating Bubble Surfactormeter (PBS) Model EC-PBS-B (Electronetics Corporation, USA, now General Transco Inc., Largo, FL)によって分析した; 平均の表面張力測定値は2〜7ダイン/cm(2x10-3 〜 7x10-3 N/m)であった。有効な肺サーファクタントについて許容される値は、10ダイン/cm(0.01N/m)以下である。
【００７５】
凍結乾燥物質をキャラクタライズする1つの方法は、その比表面積を測定することである。比表面積は、分子レベルでの固体サンプルの露出面の尺度である。BET(Brunauer EmmetおよびTeller)表面積分析法は、気体分子の物理吸着により固形物の比表面積を決定するために用いられる確立された方法である(米国薬局方 表題: ＜846＞ 比表面積(http://www.pharmacopeia.cn/v29240/usp29nf24s0_c846.html)参照)。サンプルは、通常、加熱するとともに、同時に、気体を抜くかサンプル上に気体を流すかして遊離した不純物を除去することにより、得られる。その後、得られたサンプルを液体窒素またはクリプトンで冷却し、特定の圧力にて吸着した気体の体積を測定することにより、分析した。BETの11点での試験は、選択したサンプルにおいて、Micromeritics Pharmaceutical Services (Norcross, GA)により、ASAP（登録商標）2420 高効率比表面積および細孔分布測定装置(Micromeritics Instruments Co., Norcross, GA)を用いて、行われた。サンプルを、減圧下において25℃で16時間、脱気した。100%クリプトンを吸着質として用いた。分析用浴温度は約77Kであった。以下のパラメーターを測定した:サンプル質量(g)、冷フリースペース（Cold Free Space）(cm3)、温フリースペース（Warm Free Space）(cm3)、飽和圧(Po)(mm Hg)、絶対圧(P)(mm Hg)、および経過時間。等温線リニアプロットを各サンプルについて計算した（ここで、Y軸は吸着量(cm3/g STP)であって、X軸は相対圧(P/Po)であった）。STPは、標準温度および標準圧力、すなわち、273.15 Kの温度および大気圧(1.013 x 105 Pa)）として知られている。データを以下の実施例に示す。
【００７６】
凍結乾燥物質の形態のキャラクタライズに有用な別のパラメーターはその空隙率であり、該空隙率は全体の体積に対する物質中の細孔の体積の比率として定義される。凍結乾燥物質の空隙率は、走査型電子顕微鏡(SEM) JEOL 6480 Scanning Electron Microscope (JEOL, Japan)を用いて決定された。ダイヤモンド・ソーを用いてバイアルの上部を切断することによりバイアルからサンプルを取り出し、その幅方向に半分に切断した。切断サンプルの横断面をSEM装置に設置し、20および100の倍率(X)で可視化した。分析は、室温で減圧下において行われた。20倍での表面積は約6.4mm x 5.1 mmであった。100倍での表面積は約1,200ミクロン x 965ミクロンであった。
【００７７】
クロス切断した足場のSEM顕微鏡画像により、各サンプルの横断面全体にわたって、マイクロチャネルまたは多孔質構造が示される。イメージングのために2つの有利なポイントを選択した:「表面A」としてケーキの上部(未切断部分)および「表面B」としてケーキの内部。図3Aおよび3Bは、30 mlバイアルにおいて製造された本発明の凍結乾燥肺サーファクタントの20倍での拡大像を示す（各々、表面Aおよび表面B）。図4Aおよび4Bは、実施例3に記載の通りに30 mlバイアルにおいてBornstein Lyo Cycleにより製造された凍結乾燥肺サーファクタント製剤IIの20倍での拡大像を示す（各々、表面Aおよび表面B）。図5Aおよび5Bは、30 mlバイアルにおいて製造された本発明の凍結乾燥肺サーファクタントの100倍での拡大像を示す（各々、表面Aおよび表面B）。図6Aおよび6Bは、実施例3に記載の通りに30 mlバイアルにおいてBornstein Lyo Cycleにより製造された凍結乾燥肺サーファクタント製剤IIの100倍での拡大像を示す（各々、表面Aおよび表面B）。
【００７８】
とりわけ、“Johnson Lyo Cycle”を用いて実施例4に記載の通りに製造した製剤III(A0490-62)は、その脆弱性のためSEMで解析することができなかった。該ケーキは、該ソーのわずかな圧力にさえも耐えられず、崩壊した。新規のLyo Cycleを用いて実施例2に記載の通りに製造した製剤I(A0490-55)の総細孔面積と、“Bornstein Lyo Cycle”を用いて実施例3に記載の通りに製造した製剤II(A0490-58)の総細孔面積を比較すると、製剤Iは少なくとも11%の絶対値差分でより多孔質であることが観察された。
【００７９】
顕微鏡用のMOTIC（登録商標） Images Plus 2.0 software (Motic Group Co., Ltd, Xiamen, China)を用いて、選択した画像の空き面積（open area）を計算した。浮彫りフィルタを適用して空き面積を強調した後、自動分割および自動計算機能を用いて空き表面積を計算した。この方法によって手作業によるデータ操作が最小化され、画像比較における偏りが取り除かれた。製剤Iについて、該細孔面積はサンプルの上部(表面A)の測定面積の49.1%およびケーキの内部(表面B)の測定面積の50.5%を占めた。製剤IIについて、該細孔面積はサンプルの上部(表面A)の測定面積の37.3%およびケーキの内部(表面B)の測定面積の36.7%を占めた。それぞれの差は11.8%および13.8%であった。
【００８０】
手作業での細孔計算を行って、図5A(製剤I, 表面A, X100)および図6A(製剤II, 表面A, X100)に示されるサンプルについて、上記方法の正確性を試験した。各顕微鏡画像を6.4 mm(幅)および3.9 mm(高さ)のサイズに整え、各画像において20個の「細孔」を高さと幅について測定し、比較した。
【００８１】
本発明の凍結乾燥合成肺サーファクタント組成物は、より大きな表面積(少なくとも2.7 m2/g)、より大きな空隙率(40体積%以上)、および実証された強剛性（例えば、反転した場合の移動に対して観察された耐性、およびまた、物質を含むバイアルを軽くたたいた場合の移動に対して観察された耐性）の特有の組み合わせを有する。より強固な塊は、分子運動性の減少、化学反応の前駆体の減少、ひいてはより安定な生成物に相関する。
【００８２】
4つのAPIのうち、シナプルチドまたはKL4ペプチドは、凍結乾燥物質として固体状態にあるよりも液体環境にある方がより早く分解することが、以前に観察された(Bornsteinの米国特許第5,952,303号参照)。凍結乾燥製剤が均一な外観であることはより安定な生成物であることの現れでもあるという考えに基づいて、本発明者らは、本明細書に記載の本発明の方法により得られた凍結乾燥製剤によって、少なくとも25℃の3か月保存において、少なくともKL4ペプチドの安定性が向上されることが実証されるだろうと予期する。より長期（例えば、25℃で6か月および9か月）およびより高温（例えば、30℃および40℃）で保存された場合でも、KL4および他のAPIの安定性は、他の凍結乾燥プロセスで製造された凍結乾燥製剤と比べて本発明の方法により得られた凍結乾燥製剤の方が、統計的により良好であるだろうと予期される。安定性の向上は、少なくとも2%以上、少なくとも5%以上、または少なくとも10%以上であると予期される。
【００８３】
本発明の凍結乾燥肺サーファクタントは、水または他の医薬的に許容される希釈剤を用いて再構成され得る。肺サーファクタント（液体かまたは凍結乾燥）の使用は先述されている。該新規凍結乾燥肺サーファクタントは優れたケーキ移動および輸送に耐える能力を示し、それは医薬品の必須性状である。
【００８４】
本発明は以下の実施例を参照してより詳細に説明されるが、本発明はそれらに限定されないことが理解されるべきである。
【実施例】
【００８５】
実施例1
凍結乾燥を、新規プロセスならびに米国特許第5,952,303号および第7,582,312号に記載の以前に公開された方法を用いて実施し、凍結乾燥生成物を得ることにおいて各プロセスによりもたらされる差違を示した。
材料:該3つのプロセスの各々により凍結乾燥された製剤中の成分を下記表1に要約する。実際の量は原料の純度で調整される。
表1. 製剤I、II、およびIII(3000 g バッチサイズ)用の原料
【表２】
2015514714.tif 000004
方法: 3つのプロセスの各々について3000 gのバッチを2つずつ調製した。シリンジを用いて、標準充填重量である13.7 gをバイアル毎に充填した。凍結乾燥前の混合液の調製:APIを46℃ ± 1℃にて95%エタノールに溶解させて溶液を得た。得られた溶液を撹拌中のトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(TRIS)緩衝液中に、45℃ ± 2℃にて、0.22ミクロン 33mm フィルターを用いて加圧無菌濾過して、リポソーム製剤（最終エタノール濃度 10%(w/w)）を製造した。30℃以下の温度まで冷却した後、得られたリポソーム製剤、すなわち、凍結乾燥前の混合液を、20、30および50 mLのホウケイ酸ガラスの凍結乾燥バイアル中に、13.7 g/バイアルの充填量で移した。得られた凍結乾燥物質を5℃で保存した。
【００８６】
実施例2
製剤I. 表1からの凍結乾燥前の混合液を20、30および50 mLのガラスバイアル中に充填し、上記の新規凍結乾燥方法を用いて凍結乾燥させた。表2に凍結乾燥プロセスのパラメーターを要約する。
表2. 新規凍結乾燥プロセスのパラメーター
【表３】
2015514714.tif 000005
【００８７】
実施例3
製剤II. 表1からの凍結乾燥前の混合液を20、30および50 mLのガラスバイアル中に充填し、Bornsteinの米国特許第5,952,303号に記載のプロセス(“Bornstein Lyo Cycle”)を用いて凍結乾燥させた。表3に該プロセスのパラメーターを要約する。
表3. Bornstein Lyo Cycleの凍結乾燥プロセスのパラメーター
【表４】
2015514714.tif 000006
【００８８】
実施例4
製剤III. 表1からの凍結乾燥前の混合液を20、30および50 mLのガラスバイアルに充填し、Johnsonの米国特許第7,582,312号に記載のプロセス(“Johnson Lyo Cycle”)を用いて凍結乾燥させた。表4に該プロセスのパラメーターを要約する。
表4. Johnson Lyo Cycleの凍結乾燥プロセスのパラメーター
【表５】
2015514714.tif 000007
【００８９】
実施例5
凍結乾燥物質の物理的外観の評価.  20個のバイアルを無作為に選択した。ロット55-20、55-30および55-50は、各々、20、30および50 mlバイアル中の製剤Iに相当する。ロット58-20、58-30および58-50は、各々、20、30および50 mlバイアル中の製剤IIに相当する。ロット62-20、62-30および62-50は、各々、20、30および50 mlバイアル中の製剤IIIに相当する。全てのカテゴリー変数を、頻度と、必要に応じて、パーセントを用いて要約した。全ての連続変数を、選択した評価に用いられる、平均および標準偏差(SD)ならびに中央値およびレンジ(最小、最大)を用いて要約した。20、30および50 mlバイアル中で凍結乾燥させた製剤I、IIおよびIIIを、浮上のサイン（初期充填の高さの上の白色の輪）について視覚的に検査した。20 mlバイアルにおいて液体の充填の高さは25mmであって、30 mlバイアルにおいて液体の充填の高さは20 mmであって、そして、50 mlバイアルにおいて、液体の充填の高さは15 mmであった。
【００９０】
実際の浮上距離の測定値と、バイアルの底から初期充填の高さの上の白色の輪までの測定値から初期充填の高さを減じたものを得て、表5および図2に示した。
表5
【表６】
2015514714.tif 000008
【００９１】
30および50 mlバイアル中の製剤I(ロット55-30および55-50)(本発明の凍結乾燥肺サーファクタント)のサンプルは浮上のいかなるサインも有しなかったが、一方、20 mlバイアル中のサンプル(ロット55-20)は20サンプルのうち7サンプルで最大2 mmのいくらかのわずかな浮上を有した。全3サイズの製剤IIのサンプル(58-20、58-30および58-50)ならびに同じく製剤IIIサンプル(62-20、62-30および62-50)（20 mlバイアル中の製剤IIIのサンプルが最も悪い）は、全て凍結乾燥プロセスの間に浮上のサインを示す。新規の凍結乾燥プロセスを用いると、明らかに、浮上の問題が顕著に減るかまたは除かれる。
【００９２】
20、30および50 mlのバイアル中で凍結乾燥された製剤I、IIおよびIIIのうちの20個の無作為に選択されたバイアルを、反転での移動のサインについて、バイアルを一度反転させることにより調べた。図1は、反転で移動した凍結乾燥物質を含むバイアルの数(黒色の棒で示す)および反転で移動しなかった凍結乾燥物質を含むバイアルの数(網掛けの棒で示す)を示す棒グラフである。製剤Iのサンプル(本発明の凍結乾燥肺サーファクタント)はいずれも反転により移動しなかったが、製剤IIIサンプルの全ておよび製剤IIサンプルのほとんどが移動した。この試験によって、本発明の凍結乾燥肺サーファクタントは他のサンプルと比較してバイアル中において優れた配置であることが実証された。
【００９３】
実施例6
APIの安定性および効力についての提案研究
4つのAPI、KL4(シナプルチド)、DPPC、POPGおよびパルミチン酸(PA)を、選択された期間（25℃、30℃または40℃で3〜12か月保存）における完全性について、HLPCを用いて試験しうる。HPLCパラメーターを表6に示す。
表6 クロマトグラフィー条件
【表７】
2015514714.tif 000009
該4個のAPIの各々を含む標準をランして溶出パターンを確定する。サンプルをカラムにロードし、APIの量を算出する。
【００９４】
実施例7
20、30および50 mlバイアル中の製剤I、IIおよびIIIを、同時にBET試験で処理した。とりわけ、製剤I、IIおよびIIIを、BET試験のために、終夜、FEDEXを介してMicromeriticsに輸送したところ、製剤IIIは無傷では到着せず、目に見えて崩壊していたために試験に使用できなかった。該物質を、より安全な梱包を用いて再び輸送したところ、50 mlバイアル中のサンプル(62-50)は依然として崩壊したように見えた。サンプル62-50についての試験結果は真値で表されなかった。
BET試験は以下の通り実施された: 分析用吸着質: Kr; 温度補正: Yes; 平衡化間隔: 10 s; 周囲温度: 22.00℃; 自動脱気: Yes。20ml、30mlおよび50 mlバイアル中の本発明の凍結乾燥物質(製剤I)についての結果を、表7に示す。製剤IIおよびIIIの結果を表8に示す。
表7
【表８】
2015514714.tif 000010
表8
【表９】
2015514714.tif 000011
製剤Iのサンプルの比表面積は約3.7 m2/g〜約2.7 m2/gの範囲であった。製剤IIのサンプルの比表面積は約1.7 m2/gであった。製剤IIIのサンプルの比表面積は約0.6 m2/g〜約0.9 m2/gの範囲であった。明らかに、製剤Iのサンプルの比表面積は他のサンプルのものよりも著しく大きかった。
【００９５】
実施例8
製剤IV.
10 mlの注射用滅菌水で再構成させた場合、該凍結乾燥製剤IVは、表9に示す通り、以下の濃度のAPIを提供しうる:
表9
【表１０】
2015514714.tif 000012
表10. 製剤IVの原料(8000 g バッチサイズ)
【表１１】
2015514714.tif 000013
表10に従って、いくつかのバッチを製造した。凍結乾燥前の混合液の製造:APIを95%エタノールに46℃±1℃にて溶解させて溶液を得た。得られた溶液を、0.22ミクロン 33mm (PVDF) Millipore Millex GV（カタログ番号SLGV033NS filter）によって、撹拌中のTRISバッファー溶液に45℃±2℃中にて加圧濾過して、最終エタノール濃度7%(w/w)であるリポソーム製剤を得た。30℃以下の温度まで冷却した後、得られたリポソーム製剤、すなわち、凍結乾燥前の混合液を、13.7 g/バイアルの充填量にて、蠕動ポンプを用いて30 mLのホウケイ酸ガラス凍結乾燥バイアル中に移し、実施例9-14、ラン1-6に記載の通りに凍結乾燥させた。
【００９６】
実施例9
ラン2
表11
【表１２】
2015514714.tif 000014
【００９７】
実施例10
ラン3
表12
【表１３】
2015514714.tif 000015
【００９８】
実施例11
ラン4
表13
【表１４】
2015514714.tif 000016
【００９９】
実施例12
ラン5
表14
【表１５】
2015514714.tif 000017
【０１００】
実施例13
ラン6
表15
【表１６】
2015514714.tif 000018
【０１０１】
実施例14
ラン1
表16
【表１７】
2015514714.tif 000019
【０１０２】
実施例15
ラン1-6から得た凍結乾燥生成物を、BET試験で同時に処理した。
BET試験は、上記実施例7に記載されたものと同じパラメーターで実施された。各ランから3つのバイアルを試験した。結果を表17に示す。
表17
【表１８】
2015514714.tif 000020
【０１０３】
方法:再構成
再構成された溶液は、目に見える不溶性物質が存在しないこと、ならびに該溶液は所定時間後に希釈剤と同程度に澄明であることが要求される。再構成の体積は、バルク溶液を満たすための出発生成物と同じ体積および濃度に該生成物を戻すものであってもよく、また、臨床の場における患者への投与を目的とした体積と同じであってもよい。10mlの体積の希釈剤としての精製水（USP）を、シリンジに吸い上げた。次いで、該希釈剤を該乾燥ケーキの中心に押し出し、タイマーをスタートさせた。その後、該生成物をライトボックスにおいて約5秒間隔で点検して、いずれの不溶性物質も存在しないこと、および溶液の澄明性を確認した。ひとたび完全に再構成された溶液は、澄明、無色、不澄明（hazy）、不透明および/または濁っていることを特徴とした。粒子は、存在する場合、微細な不溶性物質から粗い繊維に分類された。溶解されていない賦形剤またはAPIがそのままで認められる。
【０１０４】
pH測定 - 再構成された溶液(上記参照)を、“USP<791>, pH”に従って、pHについて測定した。使用前に、2または3つのpH緩衝剤（予期されるサンプルの範囲を含む）での標準化を行った。選択されたpH緩衝剤は、別々の2つのpH単位以上かつ3つのpH単位以下であった(例えば、4.01, 7.00, および10.01)。自動温度補正のためにATCプローブを用いた。pHプローブセンサーおよびプローブの側面にあるいずれの基準接点を覆うのに十分なサンプル溶液の量を適切な容器に分注した。該溶液を穏やかに撹拌した後、静止させ、少なくとも15秒間にわたって一定の値に安定化させ、その時点で表示されたpH値を記録した。
【０１０５】
電量的Karl Fischer滴定 - 含水量試験は、広く受け入れられている“USP<921>, 水分測定”に概説される従来の方法に従った。最初の乾燥サンプルおよび容器を秤量した。溶媒抽出法として、無水メタノール（特級試薬, A.C.S）を、乾燥物質を懸濁および溶解させるために用いる容器に注入した。該乾燥物質を覆うために用いたメタノールの抽出量は、各研究について13.0ml〜13.7mlであった。その後、該サンプルを、生成物中の水分を抽出するために所定の時間浸漬させた。次いで、アリコートを取り出し、量を測定した後、KF装置の反応容器に注入した。滴定のエンドポイントに到達したらすぐに、結果を記録した。KF装置によって含水量がマイクログラムまで決定された。その後、空の容器を秤量して、最初の容器内容物についての水分率を計算した。
【０１０６】
高温示差走査熱量測定(HT DSC)−固体物質のガラス転移を測定する手段として用いられ、製剤の評価および乾燥状態での挙動の評価のための有用な情報を提供する。HT DSCは、現在の“USP<891>, 熱分析”に従い、TAC 7/7 Instrument Controllerに連結されたPerkin Elmer DSC 7を用いて実施された。試験パラメーターおよびデータ解析はPCインターフェースにてPYRISソフトウェア バージョン4.0を用いて実施された。約10-15mgの固体物質を、圧着式の通気口付きの蓋とともにアルミニウムのサンプルパンの中に設置した。窒素, NFを用いて流速20 ml/分で持続的にサンプルにパージした。凍結乾燥物質を加温して、高温での熱挙動を評価した。加温の間、サンプルが熱イベントを経るにつれて、サンプルからの熱の放出または取り込みはエネルギーの差を反映した。走査データを記録し、同時に、Pyris（登録商標） 4.0ソフトウェアを用いてグラフに描いた。走査が完了するとすぐに計算して、熱イベントの開始およびピークの温度を確認した。走査の結果に基づいて、乾燥最終生成物のガラス転移(Tg)、結晶化、融点(Tm)、ならびに関連する融解熱、および/または比熱としての熱イベントについての温度を、この方法を用いて決定した。
【０１０７】
結果
製剤Iの凍結乾燥サンプルの平均残留水分値は、ほぼ0%であった。平均再構成時間は8〜10秒であった。該物質で2℃／分にて実施された高温DSC走査によって、一貫した大きな吸熱ピークが49.0℃〜51.0℃の温度にて観察されたことが示された。
【０１０８】
本発明は、詳細にかつその特定の実施例を参照して記載されているが、その精神および範囲から逸脱することなく様々な変更および改変を行うことができることが当業者には明らかであろう。
【図１】
2015514714.tif 000021
【図２】
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【図３Ａ】
2015514714.tif 000023
【図３Ｂ】
2015514714.tif 000024
【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
2015514714.tif 000027
【図５Ｂ】
2015514714.tif 000028
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年11月21日(2014.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2015514714000001.app
【国際調査報告】
2015514714.tif 000031
2015514714.tif 000032