(57)【要約】本発明は、薬理学的活性を有する１−［１−（ベンゾイル）−ピロリジン−２−カルボニル］−ピロリジン−２−カルボニトリル誘導体、このような化合物の調製方法、それらを含んでなる医薬組成物、ならびに認知障害の治療および／または予防におけるそれらの使用に関する。【化１】2015536965.tif 000076
2015536965.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2015536965.tif 000069
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立に、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルカルボニルオキシ、ベンジルオキシ、フェニルカルボニルオキシ、ナフチルカルボニルオキシ、キノリニルカルボニルオキシ、イソキノリニルカルボニルオキシ、トリフルオロメチル、ハロゲンおよび水素からなる群から選択されるものであり；
Ｒ５は、ハロゲン、ニトリル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルチオ、Ｃ１−４アルキル、フェニル、フェノキシ、フェニルチオおよびトリフルオロメチルからなる群から選択されるものであり；
Ｒ６は、水素、フルオロおよびメチルからなる群から選択されるものである）、
またはその医薬的に許容される塩、異性体、プロドラッグ若しくは溶媒和物。
【請求項２】
Ｒ２およびＲ４は各々独立に、水素、ハロゲン、トリフルオロメチルおよびＣ１−４アルコキシからなる群から選択されるものである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２は水素およびメトキシからなる群から選択されるものであり、Ｒ４はフルオロ、トリフルオロメチルおよびメトキシからなる群から選択されるものである、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ３はベンジルオキシである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ５はフルオロである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ６は水素またはフルオロである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記化合物は下記群：
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−メトキシピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−フルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−フェニルピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−（メチルチオ）ピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−メチルピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−シアノピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−（トリフルオロメチル）−ピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−（ｔ−ブトキシ）ピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−アセトキシピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（４−アセトキシ−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（４−ベンゾイルオキシ−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（３，４−ジベンジルオキシ−５−メトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（３，４−ジベンゾイルオキシ−５−メトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（３−アセトキシ−４，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（３−ピバロイルオキシ−４，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）ベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（３−（ベンジルオキシ）ベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（２−（ベンジルオキシ）ベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３−（トリフルオロメチル）ベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３−フルオロベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
から選択されるものであるか、またはその医薬的に許容される塩、異性体、プロドラッグ若しくは溶媒和物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項で定義される式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、異性体、プロドラッグ若しくは溶媒和物の調製方法であって、
ａ）式（ＩＸ）の化合物：
【化２】
2015536965.tif 000070
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は式（Ｉ）で定義される通りのものである）
を、式（ＸＩ）の化合物：
【化３】
2015536965.tif 000071
と反応させて、式（ＸＩＩ）の化合物： 
【化４】
2015536965.tif 000072
を生成する工程と；
ｂ）前記式（ＸＩＩ）の化合物を加水分解して式（ＸＩＶ）の化合物：
【化５】
2015536965.tif 000073
を生成する工程と；
ｃ）前記式（ＸＩＶ）の化合物を、カルボキサミド基をニトリル基に変換可能な条件に付して、前記式（Ｉ）の化合物を生成する工程と；
を少なくとも含んでなり、
工程ｂ）および工程ｃ）は別々に実施してもよいし、ワンポット反応で実施してもよいことを特徴とする、
調製方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一項で定義した式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、異性体、プロドラッグ若しくは溶媒和物の調製方法であって、
前記式（ＩＸ）の化合物：
【化６】
2015536965.tif 000074
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は式（Ｉ）で定義した通りのものである）
を、式（ＩＶ）の化合物：
【化７】
2015536965.tif 000075
と反応させる工程
を少なくとも含んでなることを特徴とする、調製方法。
【請求項１０】
少なくとも１種の請求項１〜７のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物、またはその医薬的に許容される塩、異性体、プロドラッグもしくは溶媒和物と、医薬的に許容されるキャリア、アジュバントまたはビヒクルとを含んでなる医薬組成物。
【請求項１１】
薬剤として用いられる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１２】
認知障害の治療および／または予防に用いられる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物。
【請求項１３】
前記認知障害が、統合失調症、双極性気分障害、アルツハイマー病およびパーキンソン病からなる群から選択される疾病と関連する認知障害である、請求項１２に記載の用途のための化合物。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか一項で定義した化合物の治療量を、前記治療を必要としている患者に投与することを特徴とする、哺乳動物の認知障害の治療または予防方法。
【請求項１５】
前記認知障害が、統合失調症、双極性気分障害、アルツハイマー病およびパーキンソン病からなる群から選択される疾病と関連する認知障害である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
薬剤を製造するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１７】
認知障害の治療および／または予防用の薬剤を製造するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項１８】
前記認知障害が、統合失調症、双極性気分障害、アルツハイマー病およびパーキンソン病からなる群から選択される疾病と関連する認知障害である、請求項１７に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬理学的活性を有する化合物、より詳細には、ある種の１−［１−（ベンゾイル）−ピロリジン−２−カルボニル］−ピロリジン−２−カルボニトリル誘導体、このような化合物の調製方法、それらを含んでなる医薬組成物、および認知障害の治療および／または予防におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＲＥＰ）としても知られているプロリルオリゴペプチダーゼ（ＥＣ  ３．４．２１．２６）（ＰＯＰ）は、Ｌ−プロリン残基のＣ末端側でペプチドの加水分解を触媒するセリンプロテアーゼである。これは、哺乳動物において広く分布しており、脳を含む種々の器官から精製できる。
【０００３】
この酵素は、学習機能および記憶機能に関連するプロリン含有神経ペプチドの分解において重要な役割を果たしている（Ｗｉｌｋ  Ｓ等、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．１９８３；３３：２１４９−５７；Ｏ’Ｌｅａｒｙ  ＲＭ、Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  Ｂ、Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９５；６５：９５３−６３）。
【０００４】
プロリルオリゴペプチダーゼ阻害の効果が、神経変性プロセスに関連した認知障害の治療において試験されている。パーキンソン病を、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）（Ｐ物質の枯渇を引き起こす神経毒）を用いた治療によりサルにおいて発生させた。続いて、強力なＰＯＰ阻害剤であるＳ−１７０９２を用いて治療すると、認知課題のパフォーマンスが改善した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＪＳ等、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００２；２６（２）：１７６−８２）。また、ＰＯＰ阻害により、エクスビボにおいてα−シヌクレインのオリゴマー形成が抑制されることが明らかにされた［Ｍｙｏｈａｎｅｎ  ＴＴ等、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１２；１６６（３）：１０９７−１１３］。アルツハイマー病（ＡＤ）の場合、動物モデルにおけるいくつかのインビボ実験により、ＰＯＰ阻害が神経保護および認知亢進効果をもたらすことが見出されている（Ｋａｔｏ  Ａ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９９７；２８３（１）：３２８−３５およびＴｏｉｄｅ  Ｋ等、Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９８；９（１）：１７−２９）。皮質細胞および小脳顆粒細胞がＰＯＰ阻害剤ＯＮＯ−１６０３を用いた治療により加齢誘発アポトーシスから防止され、神経保護効果が、Ｋａｔｓｕｂｅのグループにより最初に観察された（Ｋａｔｓｕｂｅ  Ｎ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．１９９９；２８８（１）：６−１３）。
【０００５】
認知障害の治療において、ＰＯＰ阻害剤を用いた臨床試験が、わずかな数実施されている。フェーズＩ臨床研究において、Ｍｏｒａｉｎのグループ（Ｍｏｒａｉｎ  Ｐ等、Ｂｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０００；５０（４）：３５０−９）は、新規な経口活性を有するプロリルエンドペプチダーゼ阻害剤であるＳ１７０９２が、健康で高齢の被験体において認知亢進性を示すとともに、明確な用量依存性を示し、さらに悪影響は検出されないことを見出した。その後の研究から、この化合物について、さらなるわずかな気分安定性が示唆された（Ｍｏｒａｉｎ  Ｐ等、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００７；５５（３−４）：１７６−８３）。
【０００６】
プロリルオリゴペプチダーゼ活性は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病は、ハンチントン病および多発性硬化症（ＭＳ）を含むいくつかの神経変性病において変化する（死後）ことが報告されている（Ｍａｎｔｌｅ  Ｄ  等、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ１９９６；２４９（１−２）：１２９−３９）。
【０００７】
ＡＤ、ＭＳおよびパーキンソン病などの神経変性疾患の発症における神経炎症の役割を示す多数の証拠もある（Ｈｉｒｓｃｈ  ＥＣ  等、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００９；８（４）：３８２−９７、Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ｔ等、Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌ．２０１１；１０（３）：２５３−６３）。ＰＯＰは、脳においてＴβ４による抗炎症性テトラペプチドＡｃ−ＳＤＫＰの放出に関与する主要酵素であると考えられてきた（Ｙａｎｇ  Ｆ等、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２００４；４３（２）：２２９−３６、Ｎｏｌｔｅ  ＷＭ  等、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００９；４８（５０）：１１９７１−８１）。このことは、ＰＯＰの阻害が神経炎症を低減させるのに役立つことがあり、その結果、ＰＯＰ阻害剤がアルツハイマー病およびパーキンソン病などの炎症要因による神経変性疾患の治療に有用なことがあり、特にこれらの疾患と関連する認知障害の改善に役立つことがあることを示唆している。
【０００８】
大脳皮質領域に広がる老人斑は、ＡＤの典型的な神経病理学的特徴である。これらの斑の主要タンパク質成分はアミロイドβ−ペプチド（Ａβ）である。Ａβの沈着は神経機能障害と脳死を引き起こす。このペプチドは、β−アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）由来のものである。通常の条件下で、ＡＰＰはα−セクレターゼにより切断されて、Ａβ生成を防止する可溶性ＡＰＰαを生成する。
【０００９】
興味深いことに、ＰＯＰ阻害は、細胞内ＩＰ３レベルを増加させ、ＡＰＰα産生の刺激に寄与し、ひいてはＡβ生成を減少させる。
【００１０】
さらに、Ｒｏｓｓｎｅｒ（Ｒｏｓｓｎｅｒ  Ｓ等、Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．２００５；３０（６−７）：６９５−７０２）は、Ａβプラークにより影響されるＡＤ患者の脳構造におけるＰＯＰ免疫反応ニューロンが少ないことを見出した。
【００１１】
さらに、Ｐ物質はβ−アミロイドタンパク質の神経毒性作用を抑制することができると考えられる（Ｋｏｗａｌｌ  ＮＷ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９１；８８（１６）：７２４７−５１）。プロリルオリゴペプチダーゼ阻害剤は、Ｐ物質の代謝を阻害してβ−アミロイドタンパク質の神経毒性作用を抑制可能なＰ物質のレベルを維持するのに役立つ。
【００１２】
上記した効果から、プロリルオリゴペプチダーゼ阻害剤は、アルツハイマー病の治療に有用な薬剤であり、この疾患と関連する認知障害を改善するのに役立つと考えられる。
【００１３】
また、プロリルオリゴペプチダーゼは、多発性硬化症（ＭＳ）に関係する可能性があるいくつかの要因と関連するものであった。例えば、ＰＯＰはミクログリア毒性の調節に関与している（Ｋｌｅｇｅｒｉｓ  Ａ等、Ｇｌｉａ２００８；５６（６）：６７５−８５）。実際に、ＰＯＰとＭＳとの間に直接の関係があることが最近の報告により明らかとなっている；ＲＲ−ＭＳを患っている患者の血漿ＰＯＰ活性が有意に減少した（Ｔｅｎｏｒｉｏ−Ｌａｒａｎｇａ  Ｊ等、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ２０１０；７：２３）。興味深いことに、この減少は、疾患症状の重度と相関があったが、患者の年齢とは相関がなかった。むしろ、ＰＯＰ活性と年齢との間には健康な対照において逆相関があり、高齢対照では、レベルがＭＳ患者にみられるレベルと同程度であった。
【００１４】
パーキンソン病の神経病理学的特徴は、レビー小体として知られている細胞内封入体、および黒質緻密部におけるメラニン化ドーパミン作動性ニューロンの進行性変性である。レビー小体の主要成分は、１４０アミノ酸タンパク質、α−シヌクレインである。一定の条件下で、α−シヌクレインモノマーは相互作用して、細胞毒性不溶性線維を生成することができるプレフィブリル凝集体またはプロトフィブリルを形成する。これらの線維はプロテアソームによって分解され得ず、細胞内タンパク質分解系の機能を阻害する。これにより、サイトゾルにおけるα−シヌクレインプロトフィブリル（およびプロテアソームにより分解される他のタンパク質）の蓄積が生じ（Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＭＣ、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００５；１０５（３）：３１１−３１）、その結果、α−シヌクレインプロトフィブリルがパーキンソン病患者の脳において増加する。これらの線維は、α−シヌクレイン過剰発現細胞およびマウスモデルにおける神経毒性と関連するものであった（Ｍａｓｌｉａｈ  Ｅ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２０００；２８７（５４５６）：１２６５−９；Ｇｏｓａｖｉ  Ｎ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２；２７７（５０）：４８９８４−９２）。ミスフォールドしたα−シヌクレインの異常蓄積により、酸化ストレスを促進し、細胞死を引き起こすことができるミトコンドリア変化を引き起こす可能性がある（Ｈｓｕ  ＬＪ等、Ａｍ．Ｊ．  Ｐａｔｈｏｌ．２０００；１５７（２）：４０１−１０）。さらに、α−シヌクレイン遺伝子における３点突然変異（Ａ５３Ｔ、Ａ３０ＰまたはＥ４６Ｋ）は、家族性パーキンソン病の発症に関与していることが知られている（Ｐｏｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ  ＭＨ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９７；２７６（５３２１）：２０４５−７；Ｚａｒｒａｎｚ  ＪＪ等、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２００４；５５（２）：１６４−７３）。
【００１５】
α−シヌクレインを野生型ブタＰＯＰのクローンと一緒にインキュベートすると、α−シヌクレインの凝集速度が速まり、この速まりはＰＯＰ濃度に依存するものであることがインビトロにおいて示された（Ｂｒａｎｄｔ  Ｉ等、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２００８；２９（９）：１４７２−８）。さらに、ＰＯＰ活性がない突然変異変異体（Ｓ５４４Ａ）は、凝集速度を促進しなかった。
【００１６】
凝集の増大は、ＰＯＰ阻害剤の添加によっても防止することができ、このことはその効果がＰＯＰ酵素活性に依存することを示唆していた。最近の証拠によれば、ＰＯＰ阻害剤が、ヒトα−シヌクレイン過剰発現神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞において酸化ストレスにより誘発されるα−シヌクレイン凝集の増大をブロックすることができることが示唆されている（Ｍｙｏｈａｎｅｎ  ＴＴ等、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１２；１６６（３）：１０９７−１１３）。ＰＯＰは、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞においてα−シヌクレインと共局在化し、この共局在化はＰＯＰ阻害剤を用いてインキュベーションした後に消失し、このことはＰＯＰとα−シヌクレインとの間の相互作用を示している。ＰＯＰ阻害剤による５日間の治療により、Ａ３０Ｐ  α−シヌクレイントランスジェニックマウスの脳における可溶性α−シヌクレインの量が減少した。
【００１７】
このように、脳ＰＯＰ活性の阻害により、α−シヌクレイン凝集を防止することができ、したがって、レビー小体に存在する細胞毒性プロトフィブリルの形成を防止することができる。したがって、ＰＯＰ阻害剤は、α−シヌクレイン凝集の促進が特徴であるような場合に、神経変性疾患の治療における治療価値を有する可能性がある。
【００１８】
ＰＯＰを阻害することができる化合物は、ラットにおいてスコポラミンにより誘発される実験的記憶喪失を防止するのに有効であり、このことから、ＰＯＰ阻害剤が記憶機能障害を軽減する機能を有することが推測される（Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ  Ｔ等、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ．１９８７；１０：７３０−５）。
【００１９】
非競合的ＰＯＰ阻害剤であるロスマリン酸（６３．７μＭの比較的高いＩＣ５０値を有する）の亜慢性投与の効果をラットにおけるＭｏｒｒｉｓ水迷路において試験し、空間記憶の増大が報告された（Ｐａｒｋ  ＤＨ等、Ｆｉｔｏｔｅｒａｐｉａ２０１０；８１（６）：６４４−８）。
【００２０】
双極性障害を患う患者は血清におけるＰＯＰの高レベルの活性を有することが見出されている。近年、ＰＯＰは、とりわけイノシトール−１，４，５−Ｐ３（ＩＰ３）の代謝に関与していることから、この疾患の治療用の標的としての重要性を増してきている。ＩＰ３は、神経ペプチドのシグナル伝達カスケードにおける主要な分子である。特定の受容体への結合を介して、神経ペプチドはＩＰ３の増加を誘発し、これが小胞体の膜上でその受容体に結合し、Ｃａ２＋の放出を誘発し、これが学習および記憶において重要な役割を果たすと考えられている。最近の知見によれば、ＰＯＰはＩＰ３の濃度を調節するとある（Ｋｏｍａｔｓｕ  Ｙ  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９６；１６：６３４２−５２）。したがって、真核性のキイロタマホコリカビにおけるＰＯＰ遺伝子の破壊は、ＩＰ３の上昇によるリチウムに対する耐性を誘発し（Ｓｃｈｕｌｚ  Ｉ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ２００２；２６９：５８１３−２０）、またＰＯＰについてアンチセンスのヒトグリオーマ細胞における高濃度ＩＰ３の原因であるＰＯＰのタンパク質分解活性を減少させた。また、この効果は、これらの細胞が特定のＰＯＰ阻害剤で処置されるときに観察される（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＲＳ等、ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９９；１８：２７３４−４５）。
【００２１】
ＩＰ３シグナル経路は、いくつかの薬剤治療的気分安定剤（リチウム、カルバマゼピンおよびバルプロ酸）の作用に関与しており、ＩＰ３シグナル伝達の調節機序の欠陥は双極性障害を引き起こすことがある。さらに、双極性障害を治療するのに一般的に使用されている気分安定剤であるバルプロ酸は、組換えＰＯＰの活性を直接に阻害する（Ｃｈｅｎｇ  Ｌ等、Ｍｏｌ．  ＣｅＩＩ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２００５；２９：１５５−６１）。要するに、ＰＯＰ阻害剤が哺乳動物における双極性気分障害の予防および／または治療に有用であるとの有力な証拠がある。したがって、ＰＯＰの新規阻害剤を提供することは、この障害または疾患の治療において価値がある。
【００２２】
要するに、種々の認知課題におけるいくつかのＰＯＰ阻害剤の効果は特徴付けられてきており、ＰＯＰ阻害剤が学習および記憶に対してよい影響を及ぼすとのある種の共通した意見がある（Ｍｏｒａｉｎ  Ｐ等、ＣＮＳ  Ｄｒｕｇ．  Ｒｅｖ．２００２；８（１）：３１−５２；Ｓｈｉｎｏｄａ  Ｍ等、Ｅｕｒ．  Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９６；３０５（１−３）：３１−８；Ｍａｒｉｇｈｅｔｔｏ  Ａ等、Ｌｅａｒｎ．  Ｍｅｍ．２０００；７（３）：１５９−６９；  Ｔｏｉｄｅ  Ｋ等、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｈａｖ．  １９９７；５６（３）：４２７−３４；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＪＳ等、Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ２００２；２６（２）：１７６−８２）。
【００２３】
いくつかの特許と特許出願は、ＰＯＰ阻害剤を開示している：ＷＯ２００８／０７７９７８Ａ１、ＷＯ２００５／０２７９３４Ａ１、ＪＰ２０１１−０３７８７４Ａ２、ＷＯ２００５／００２６２４Ａ１、ＷＯ２００４／０６０８６２Ａ２、ＷＯ０３／０４４６８Ａ１；ＤＥ１９６０３５１０Ａ１、ＵＳ２００６／０１００２５３Ａ１およびＵＳ６，１５９，９３８Ａ。しかしながら、インビボで研究がなされた化合物は数種しかなく（ＪＴＰ−４８１９、Ｓ１７０９２、Ｚ−３２１、ＯＮＯ−１６０３、Ｙ−２９７９４、ＺＴＴＡ、Ｚ−Ｐｒｏ−ＰｒｏｌｉｎａｌおよびＫＹＰ−２０４７）、このリストにおける最初の３種だけが臨床試験が開始されているが、それらのどれも市場には出てきていない。
【００２４】
ＰＯＰ阻害剤が存在するにもかかわらず、当該技術分野において、ＰＯＰに対して高い親和性を有し、認知障害の治療に使用されるときに阻害剤の作用が生じる、血液−脳バリアを横断して脳に到達するための良好な能力を有する代替化合物を提供する必要性がまだある。これは、当該化合物が認知障害の治療に使用される良好な候補であるための重要な特徴である。
【発明の概要】
【００２５】
本発明者等は、今般、一連の１−［１−（ベンゾイル）−ピロリジン−２−カルボニル］−ピロリジン−２−カルボニトリル誘導体が高い効力でＰＯＰを阻害するだけではなく、血液−脳バリアを横断する能力を有するであろうと広く受けいれられている、平行人工膜を横断できる能力を有するとの知見を成功裏に見出した。これらの２つの性質を有することにより、本発明の化合物は認知障害の治療に用いられる理想的な候補となる。
【００２６】
したがって、本発明の一態様は、式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2015536965.tif 000003
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立にＣ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルカルボニルオキシ、ベンジルオキシ、フェニルカルボニルオキシ、ナフチルカルボニルオキシ、キノリニルカルボニルオキシ、イソキノリニルカルボニルオキシ、トリフルオロメチル、ハロゲンおよび水素からなる群から選択されるものであり；
Ｒ５はハロゲン、ニトリル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルチオ、Ｃ１−４アルキル、Ｃ１−４アルキルカルボニルオキシ、フェニル、フェノキシ、フェニルチオおよびトリフルオロメチルからなる群から選択されるものであり；
Ｒ６は水素、フルオロおよびメチルからなる群から選択されるものである）、
またはその医薬的に許容される塩、異性体、プロドラッグ若しくは溶媒和物に関する。
【００２７】
本発明の別の態様は、上記で定義した式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩、異性体、プロドラッグもしくは溶媒和物の調製方法に関する。
【００２８】
本発明の別の態様は、少なくとも1種の上記で定義した式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩、異性体、プロドラッグもしくは溶媒和物と、医薬的に許容されるキャリア、アジュバントまたはビヒクルとを含んでなる薬剤または医薬組成物に関する。
【００２９】
本発明の別の態様は、薬剤として用いられる、特に認知障害の予防および／または治療のための薬剤として使用される、上記で定義した式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩、異性体、プロドラッグもしくは溶媒和物に関する。
【００３０】
本発明の別の態様は、哺乳動物における認知障害の治療または予防方法であって、治療量の上記で定義した式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩、異性体、プロドラッグもしくは溶媒和物を、前記治療を必要としている患者に投与することを特徴とする方法に関する。特定の実施態様によれば、前記障害は、統合失調症、双極性気分障害、アルツハイマー病およびパーキンソン病からなる群から選択される疾患と関連する認知障害である。
【００３１】
本発明の別の実施態様は、薬剤、特に認知障害、より具体的には統合失調症、双極性気分障害、アルツハイマー病およびパーキンソン病からなる群から選択される疾患と関連する認知障害の予防および／または治療用薬剤を調製するための、上記で定義した式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩、異性体、プロドラッグもしくは溶媒和物の使用に関する。これらの態様およびそれらの好ましい実施態様は、さらに特許請求の範囲にも記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】ＰＢＳ＋ビヒクル、ＭＫ−８０１＋ビヒクル、およびＭＫ−８０１＋実施例４の化合物について、新規な物体認識（ＮＯＲ）試験において得られる結果を比較したグラフである。
【図２】ＰＢＳ＋ビヒクル、ＭＫ−８０１＋ビヒクル、およびＭＫ−８０１＋実施例４の化合物について、受動的回避課題試験において得られた結果を比較したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明に関し、以下の用語は以下に詳細に説明する意味を有する。
【００３４】
本明細書において使用される基または基の一部としてのＣ１−４アルキルとは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチルおよびｔ−ブチルなどの炭素数１〜４の直鎖状または分岐鎖状の飽和炭化水素基を表す。アルキル基は、アリール、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、カルボキシ、シアノ、カルボニル、アシル、アルコキシカルボニル、アミノ、ニトロ、メルカプト、アルキルチオなどの１つまたはそれ以上の置換基により場合により置換されていてもよい。アリールにより置換される場合、ベンジルおよびフェネチルなどの「アラルキル」基となる。
【００３５】
用語Ｃ１−４アルコキシは、Ｃ１−４アルキルオキシ基またはＣ１−４アルキルエーテル基（但し、Ｃ１−４アルキルは上記において定義した通りである）を意味する。好適なアルキルエーテル基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｉ−ブトキシ、ｓ−ブトキシおよびｔ−ブトキシなどがある。
【００３６】
用語Ｃ１−４アルキルカルボニルオキシは、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｏ−基に結合したＣ１−４アルキル（但し、Ｃ１−４アルキルは、上記にて定義した通りである）を意味する。
【００３７】
「ハロゲン（Ｈａｌｏｇｅｎ）」、「ハロ（Ｈａｌｏ）」または「ハル（Ｈａｌ）」は、ブロモ、クロロ、ヨードまたはフルオロを指す。
【００３８】
「ニトリル」、「シアノ」または「カルボニトリル」は、−Ｃ≡Ｎ基を指す。
【００３９】
用語Ｃ１−４アルキルカルボニルは、カルボニル−Ｃ（＝Ｏ）−基に連結したＣ１−４アルキルを指す。
【００４０】
用語フェノキシは、フェニルオキシ基またはフェニルエーテル基を意味する。
【００４１】
用語フェニルチオは、チオエーテル基−Ｓ−に連結したフェニルを意味する。
【００４２】
上記の定義で使用される任意の分子部分にある基の位置は、化学的に安定である限り、このような部分のどの位置でもよい。
【００４３】
本明細書において、任意の変わり得るものの定義に使用される基には、特記のない限り全ての可能な異性体が含まれる。
【００４４】
用語「塩」は、本発明において使用されるいずれかの形態の活性化合物であり、前記化合物はイオンの形態であるか、または帯電しており且つ対イオン（カチオンまたはアニオン）に結合しているか、または溶液の形態である。また、この定義には、第４級アンモニウム塩ならびに活性分子と他の分子およびイオンとの複合体、特にイオン相互作用により形成された複合体が含まれる。この定義には、特に生理学的に許容される塩が含まれ、この用語は、「薬理学的に許容される塩」または「医薬的に許容される塩」と同等である。
【００４５】
本発明に関し、用語「医薬的に許容される塩」は、特にヒトおよび／または哺乳動物において適用または使用される治療のために適切な方法で使用されるときに、生理学的に許容される任意の塩を意味する（通常、特に対イオンの結果として有毒ではないことを意味する）。これらの生理学的に許容される塩は、カチオンまたは塩基で形成され、本発明に関しては、特にヒトおよび／または哺乳動物に使用されるときに、アニオンなどの本発明において使用される少なくとも１種の化合物（通常は酸（脱プロトン化したもの））により形成される塩であると理解される。また、これらの生理学的に許容される塩は、アニオンまた酸で形成されるものであり、本発明に関しては、特にヒトおよび／または哺乳動物に使用されるとき、カチオンなどの、例えば、窒素において通常プロトン化された本発明において使用される少なくとも１種の化合物と、少なくとも１種の生理学的に許容されるアニオンにより形成される塩であると理解される。この定義には、具体的に、本発明に関しては、生理学的に許容される酸により形成される塩、すなわち、特にヒトおよび／または哺乳動物に使用されるとき、特定の活性化合物と生理学的に許容される有機酸または無機酸との塩が含まれる。この種の塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、メタンスルホン酸、ギ酸、酢酸、しゅう酸、コハク酸、リンゴ酸、酒石酸、マンデル酸、フマル酸、乳酸またはクエン酸で形成されるものがある。
【００４６】
本発明による用語「溶媒和物」は、任意の形態の本発明による活性化合物であり、当該活性化合物が別の分子（通常極性溶媒）に非共有結合により結合しているもの、例えば、とりわけ水和物およびアルコール和物、例えば、メタノール和物を意味するものと理解される。好ましい溶媒和物は、水和物である。
【００４７】
また、式（Ｉ）の化合物のプロドラッグである任意の化合物も、本発明の範囲に属するものである。用語「プロドラッグ」は、広義で使用され、インビボで本発明の化合物に転化する誘導体を含む。プロドラッグとしては、例えば、式Ｉの化合物の誘導体および代謝産物、例えば、生物加水分解性アミド、生物加水分解性エステル、生物加水分解性カルバメート、生物加水分解性カーボネート、生物加水分解性ウレイドおよび生物加水分解性ホスフェート類似体などの生物加水分解性成分などが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、カルボキシル官能基を有する化合物のプロドラッグは、カルボン酸の低級アルキルエステルである。カルボン酸エステルは、その分子に存在する任意のカルボン酸部分をエステル化することにより形成されるのが都合がよい。プロドラッグは、典型的にはＢｕｒｇｅｒ「Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ６ｔｈ  ｅｄ．（Ｄｏｎａｌｄ  Ｊ．Ａｂｒａｈａｍ  ｅｄ．、２００１、Ｗｉｌｅｙ）、「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」（Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ  ｅｄ．、１９８５、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）およびＫｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ等「Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ」  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ（Ａｐｒｉｌ  ２００２）に記載されている方法などの周知の方法を用いて調製することができる。
【００４８】
上記式（Ｉ）により表される本発明の化合物には、キラル中心の存在に応じてエナンチオマー、または多重結合の存在に応じて異性体（例えば、Ｚ、Ｅ）が含まれる。単一異性体、エナンチオマーまたはジアステレオマーおよびそれらの混合物は、本発明の範囲内である。
【００４９】
さらに、本発明において言及される任意の化合物は、互変異性体として存在してもよい。具体的には、用語互変異性体は、平衡状態で存在する化合物の２つまたはそれ以上の構造異性体のうちの１つを指し、一つの異性体から別の異性体へ容易に転化されるものを指す。一般の互変異性対は、アミン−イミン、アミド−イミド酸、ケト−エノール、ラクタム−ラクティムなどである。
【００５０】
特記のない限り、本発明の化合物には、同位体標識形態、すなわち、１つまたはそれ以上の同位体濃縮原子の存在のみが異なる化合物が含まれることを意味する。例えば、デューテリウムまたはトリチウムによる少なくとも１つの水素原子の置換、１３Ｃ−または１４Ｃ−濃縮炭素による少なくとも１つの炭素の置換、または１５Ｎ−濃縮窒素による少なくとも１つの窒素の置換以外は本構造を有する化合物は本発明の範囲内である。
【００５１】
式（Ｉ）の化合物またはそれらの塩もしくは溶媒和物は、好ましくは医薬的に許容される形態または実質的に純粋な形態である。医薬的に許容される形態とは、とりわけ希釈剤やキャリアなどの通常の医薬添加物を除いて医薬的に許容されるレベルの純度を有し、且つ通常の投与量レベルで毒性があると考えられる物質を含まないことを意味する。薬剤物質の純度レベルは、好ましくは５０％超、より好ましくは７０％超、最も好ましくは９０％超である。好ましい態様によれば、式（Ｉ）の化合物またはその塩、溶媒和物もしくはプロドラッグの９５％超である。
【００５２】
上記したように、用語「医薬的に許容される塩、溶媒和物、プロドラッグ」は、レシピエントに投与すると、本明細書に記載の化合物を提供（直接的または間接的に）することができる任意の塩、溶媒和物または任意の他の化合物を指す。しかしながら、非医薬的に許容される塩、溶媒和物およびプロドラッグも、医薬的に許容される塩、溶媒和物およびプロドラッグの調製に有用である可能性があるため、本発明の範囲内である。塩、溶媒和物およびプロドラッグは、当該技術分野において知られている方法により調製することができる。
【００５３】
本明細書で使用される用語「治療する」、「治療すること」および「治療」は、認知障害などの疾患または状態の根絶、除去、回復、軽減、改良または管理を含む。
【００５４】
本明細書で使用される用語「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ」、「予防すること」、「予防的」、「予防する」および「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」は、式（Ｉ）の化合物が発症前に認知障害などの疾患または状態の発症または進行を回避、最小化または困難にする能力を指す。
【００５５】
したがって、「治療すること」または「治療」および／または「予防すること」または「予防」は、全体として、被験体を悩ます状態に関連した症状、の少なくとも抑制または改善を意味する。ここで、抑制および改善は、広義に用いられ、パラメーター、例えば認知障害などの治療されるべき状態に関連した症状の大きさの少なくとも減少を指す。また、本発明の方法は、それ自体、状態を完全に阻害する状況、例えば、起きることを予防する状況、または停止する状況、例えば、被験体がもはやその状態にならないように終了させる状況も含む。本発明の方法は、それ自体、認知障害を予防および管理することの両方を含む。
【００５６】
本明細書で使用される用語「認知障害」は、思考、学習または記憶と関連した精神活動における障害により特徴付けられる任意の状態をも意味する。このような疾患としては、失認、記憶喪失、失語症、失行症、せん妄、認知症および学習障害などが挙げられる。
【００５７】
認知障害は、ニューロン間のシグナルの伝達に関与するニューロンまたは他の構造の損傷または損失により特徴付けられる他の状態と関連し（すなわち、他の状態により生じ、または他の状態の存在下において生じ）ている可能性がある（そしてしばしば関連している）。したがって、認知障害は、アルツハイマー病、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト−ヤコブ病、前頭側頭肺葉変性、ハンチントン病、多発性硬化症、正常圧水頭症、有機慢性脳症候群、パーキンソン病、ピック病、進行性核上まひ、または老年性認知症（アルツハイマー型）などの神経変性疾患と関連するものであってもよい。
【００５８】
また、認知障害は、中枢神経系の通常機能を損なう他の状態、例えば、精神障害、例えば、不安障害、解離性障害、気分障害、例えば、双極性気分障害、統合失調症、身体表現性障害および虚偽性精神障害と関連していてもよい。
【００５９】
本明細書に記載されている化合物は、失認症、記憶喪失、失語症、失行症、せん妄、認知症、学習障害および他の認知障害を治療するのに使用してもよい。
【００６０】
本発明の方法で治療できる認知症としては、例えば、エイズによる認知症、ビンスワンガー病、レビー小体を伴う認知症、前頭側頭認知症、多発脳梗塞性認知症、ピック病、意味認知症、老年性認知症、および血管性認知症などがある。
【００６１】
本発明の方法で治療してもよい学習障害としては、例えば、アスペルガー症候群、注意力欠如障害、注意欠陥過活動性障害、自閉症、小児期崩壊性障害、およびレット症候群などがある。
【００６２】
本発明の方法で治療してよい失語症としては、例えば、進行性非能弁的失語症などがある。
【００６３】
本明細書に記載の化合物は、軽度であるか、あるいは日常生活を大きく妨げない程度の精神活動の欠陥を有する患者を治療するのに使用してもよい。軽度認知障害は、このような状態の一例である：軽度認知障害を患う患者は、認知症（例えば、言語または記憶に関する困難）の症状を示すが、これらの症状の重度については、認知症の診断が適切でない場合もある。本明細書に記載の化合物は、軽度認知障害の治療、および同様に他の重症度の低い認知障害を治療するのに使用できる。
【００６４】
従って、本発明の別の態様は、哺乳動物における認知障害の治療または予防方法であって、治療量の本発明の化合物をこの治療を必要としている患者に投与する方法である。
【００６５】
本発明の特定の実施態様によれば、本明細書に記載の化合物は、統合失調症、双極性気分障害、アルツハイマー病またはパーキンソン病に関連する認知障害を患っている患者を治療するのに使用してもよい。
【００６６】
本発明の特定の実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩、異性体、プロドラッグもしくは溶媒和物において、Ｒ１は水素であり；Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は各々独立にＣ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルカルボニルオキシ、ベンジルオキシ、フェニルカルボニルオキシ、ナフチル−カルボニルオキシ、キノリニルカルボニルオキシおよびイソキノリニルカルボニルオキシからなる群から選択されるものであり；Ｒ５はハロゲン、ニトリル、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルチオ、Ｃ１−４アルキル、フェニル、フェノキシ、フェニルチオおよびトリフルオロメチルからなる群から選択されるものであり；Ｒ６は水素、フルオロおよびメチルからなる群から選択されるものである。
【００６７】
特定の実施態様によれば、Ｒ２およびＲ４は各々独立に、水素、ハロゲン、トリフルオロメチルおよびＣ１−４アルコキシからなる群から選択されるものである。
【００６８】
別の特定の実施態様によれば、Ｒ２は水素およびメトキシからなる群から選択されるものであり、Ｒ４はフルオロ、トリフルオロメチルおよびメトキシからなる群から選択されるものである。
【００６９】
別の特定の実施態様によれば、Ｒ５はフルオロである。
【００７０】
特定の実施態様によれば、Ｒ２およびＲ４は各々独立に、Ｃ１−４アルコキシ、Ｃ１−４アルキルカルボニルオキシおよびベンジルオキシからなる群から選択されるものである。
【００７１】
特定の実施態様によれば、Ｒ２およびＲ４はメトキシである。
【００７２】
別の実施態様によれば、Ｒ３はベンジルオキシである。
【００７３】
別の実施態様によれば、Ｒ１は水素である。
【００７４】
別の実施態様によれば、Ｒ５はフルオロ、メトキシ、メチルチオおよびフェニルから選択されるものであり、好ましくはフルオロである。
【００７５】
別の実施態様によれば、Ｒ６は水素またはフルオロである。
【００７６】
さらなる好ましい実施態様によれば、異なる置換基として、上記した選好を組み合わせる。また本発明は、上記式における好ましい置換の組み合わせに関する。
【００７７】
式（Ｉ）の範囲内にある本発明の特定の個々の化合物には、以下に挙げるものが含まれる：
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−メトキシピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−フルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−フェニルピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−（メチルチオ）ピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−メチルピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−シアノピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−（トリフルオロメチル）−ピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−（ｔ−ブトキシ）ピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−アセトキシピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（４−アセトキシ−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（４−ベンゾイルオキシ−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（３，４−ジベンジルオキシ−５−メトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（３，４−ジベンゾイルオキシ−５−メトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（３−アセトキシ−４，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（３−ピバロイルオキシ−４，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）ベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（３−（ベンジルオキシ）ベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（２−（ベンジルオキシ）ベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３−（トリフルオロメチル）ベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
・  （Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３−フルオロベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
またはその医薬的に許容される塩、異性体、プロドラッグ若しくは溶媒和物。
【００７８】
上記で定義した式（Ｉ）の化合物は、以下の一般スキームにより説明される利用可能な合成手順により得ることができる：
【化２】
2015536965.tif 000004
【００７９】
手順Ｅについての詳細スキーム
【化３】
2015536965.tif 000005
【００８０】
第１工程において、式（ＩＩ）のエステルを、エタノール（ＥｔＯＨ）もしくはメタノールなどの極性有機溶媒（好ましくは、プロトン性極性有機溶媒）または極性有機溶媒の混合物に溶解または懸濁する。塩基水溶液を添加し、典型的には還流下で、室温と、溶媒混合物の還流温度との間の温度で、加水分解の完了まで、典型的には０．５〜４時間、好ましくは１〜２時間、混合物を維持することにより加水分解反応を実施する。塩基溶液は、好ましくは希アルカリ、例えば、ＮａＯＨなどの無機性である。次に、反応混合物を放置して室温とし、好ましくは反応容積のおおよそ五分の一まで濃縮する。次に、反応混合物を、１ＭＨＣｌ溶液などの酸溶液にゆっくりと添加し、氷浴中で冷却しながら中和する。酸性化により沈殿を生じる場合、固体を濾過し、水洗し、式（ＶＩＩ）の生成物を得る。沈殿が得られない場合には、得られた溶液を酢酸エチルなどの適切な有機溶媒で数回抽出し、有機相を乾燥させ、蒸発させる。式（ＶＩＩ）の粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。
【００８１】
式（ＩＩＩ）のアミンの脱保護を、ジオキサンなどの有機溶媒中またはＴＦＡ／ＤＣＭ混合物を用いて、０℃〜室温の範囲の低温で、塩化水素溶液への添加などの弱酸性条件下で達成させる。反応液を、室温で１〜３時間攪拌する。次に、溶媒を蒸発乾固させて、使用する酸に応じて、式（ＶＩ）のアミンの塩酸塩またはトリフルオロ酢酸塩を得る。
【００８２】
式（ＩＸ）の化合物を、式（ＶＩＩ）のカルボン酸と式（ＶＩ）のアミンからショッテン−バウマン条件下で調製する。したがって、塩化オキサリルなどの塩素化剤を、トルエンなどの有機溶媒中、式（ＶＩＩ）のカルボン酸の溶液に添加する。反応液を、５０℃〜８０℃の温度で１〜２時間攪拌して、式（ＶＩＩＩ）のカルボン酸塩化物を形成させる。溶媒を蒸発させた後、得られた粗生成物を、ＴＨＦなどの有機溶媒に可溶化し、０℃などの低温で、式（ＶＩ）のアミンの塩基水溶液、典型的には式（ＶＩ）のアミンのＮａＯＨ水溶液に添加する。反応混合物を、低温で１〜２時間、そして室温で２〜４時間攪拌する。次に、溶媒を蒸発させて、残りの水性フラクションを、ＨＣｌ溶液を添加して酸性ｐＨ（３〜４）に調整し、酢酸エチルで抽出する。有機相を食塩水で洗浄し、乾燥させ、濾過し、蒸発させる。粗生成物を、必要に応じてフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。
【００８３】
次に、式（ＩＸ）の生成物を、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）などの塩基の存在下で、式（ＩＶ）の（Ｓ）−ピロリジン−２−カルボニトリルに結合させ、カルボジイミドなどのカップリング試薬により促進させる。特に、式（ＩＸ）の化合物を、ジクロロメタンなどの非プロトン性有機溶媒に溶解し、そしてカルボジイミド、例えば、Ｎ−シクロヘキシルカルボジイミドなどの固体担持カルボジイミドに、Ｎ’−メチルポリスチレン、およびＤＩＥＡと一緒に添加する。５分後、式（ＩＶ）の（Ｓ）−ピロリジン−２−カルボニトリルおよび追加のＤＩＥＡを添加する。反応液を室温で８〜１６時間攪拌する。次に、反応混合物を濾過し、残りの固体を非プロトン性有機溶媒で洗浄する。濾液を蒸発乾固する。次に、粗生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。
【００８４】
別法として、式（Ｉ）の化合物を、スキームＥおよび以下で説明するようにして調整してもよい。
【００８５】
式（Ｘ）のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂などのアミン官能化樹脂を、ポリエチレン多孔性ディスクを装着したシリンジに入れる。樹脂を、ジクロロメタン（ＤＣＭ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）などの適切な有機溶媒で洗浄することにより膨潤させる。樹脂のアミン基を保護するとき（すなわち、Ｓｉｅｂｅｒアミド樹脂の場合において）、保護基（フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基など）をＤＭＦ中ピペリジン溶液などのアミン塩基溶液で処理することにより除去する。
【化４】
2015536965.tif 000006
【００８６】
樹脂から保護基を除去した後、式（Ｖ）のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリンを、ＤＭＦなどの適切な有機溶媒中、トリアゾール（すなわち、ＴＢＴＵ）などの活性化剤およびＤＩＥＡなどのアミン塩基を用いて樹脂に結合させる。混合物を１〜２時間攪拌する。濾過および洗浄の後、カップリングの程度をＫａｉｓｅｒ試験を用いてモニターし、必要な場合は再カップリングを実施する。ＤＭＦ中ピペリジン溶液などのアミン塩基溶液および／またはピペリジン／ＤＢＵ／トルエン／ＤＭＦの混合物を用いた処理により、Ｆｍｏｃを除去して式（ＸＩ）の生成物を得る。Ｆｍｏｃの除去は、ｐ−ニトロフェニルエステルＮＦ３１試験を用いて評価してもよい。
【化５】
2015536965.tif 000007
【００８７】
式（ＸＩ）の生成物を、ＤＭＦなどの適切な有機溶媒中、ＨＯＡｔなどの添加剤およびＤＩＥＡなどのアミン塩基の存在下または不存在下でＰｙＢＯＰなどの活性剤を用いて、式（ＩＸ）の生成物に結合させて式（ＸＩＩ）の生成物を得る。混合物を１〜２時間の総反応時間中手動で攪拌する。系統的再カップリングを同量および同時間で実施する。カップリングの程度をｐ−ニトロフェニルエステルＮＦ３１試験を用いてモニターしてもよい。
【化６】
2015536965.tif 000008
【００８８】
別法として、式（ＸＩＩ）の生成物を、まず生成物（ＸＩ）を式（ＸＩＩＩ）の化合物に段階的にカップリングした後、Ｆｍｏｃ保護基を除去し、次に式（ＶＩＩ）の化合物でカップリングすることにより得てもよい。
【００８９】
ＤＣＭなどの適切な有機溶媒で完全に洗浄し、乾燥させた式（ＸＩＩ）の生成物をフラスコに移し、それに無水トリフルオロ酢酸およびピリジンを少量の有機溶媒に添加する。混合物を２０〜４０℃の温度で８〜１６時間保つ。次に、反応混合物を濾過し、樹脂を同じ有機溶媒で洗浄する。濾液を集め、溶媒を蒸発させて乾固する。得られた粗生成物を酢酸エチルなどの適切な溶媒に溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液および５％ＫＨＳＯ４水溶液で洗浄する。有機相を乾燥させ、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＨ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮに入れ、凍結乾燥させて式（Ｉ）のペプチドニトリルを得る。
【００９０】
別法として、式（ＸＩＩ）のペプチジル樹脂を、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳの混合物で１〜２時間処理してもよい。次に、樹脂を濾過し、ＴＦＡで洗浄し、濾液を集め、溶媒を蒸発させて乾固する。粗生成物をＨ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮの混合物に再懸濁し、凍結乾燥させる。得られた粗ペプチドアミドをＤＣＭなどの適切な有機溶媒に入れ、例えば、五酸化リン、四塩化チタン、塩化チオニル、無水トリフルオロ酢酸／ピリジンまたはトリフェニルホスフィン／四塩化炭素の存在下でニトリルに転化する。混合物を室温で８〜１６時間保ち、溶媒を蒸発させ、残留物を酢酸エチルに入れる。続いて、有機溶液をＫＨＳＯ４水溶液およびＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄する。有機相を乾燥し、蒸発させることにより式（Ｉ）のペプチドニトリルを得る。
【００９１】
粗生成物をＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。
【００９２】
上記した本発明の化合物の調製方法により立体異性体の混合物を生じる場合、これらの異性体を分取クロマトグラフィーなどの従来法により分離してもよい。キラル中心がある場合、化合物をラセミ体で調製してもよいし、または個々の鏡像異性体をエナンチオ選択的合成または分解により調製してもよい。
【００９３】
出発物質として使用される式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）および（Ｖ）の化合物ならびに式（ＶＩＩ）の化合物の一部は、市販のものでもよいし、当業者に周知の方法を用いて調製してもよい。
【００９４】
したがって、本発明の一つの態様によれば、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩、異性体、プロドラッグもしくは溶媒和物の調製方法が提供される。
【００９５】
一つの実施態様によれば、本発明の方法は、
ａ）式（ＩＸ）の化合物：
【化７】
2015536965.tif 000009
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は式（Ｉ）で定義される通りのものである）
を、式（ＸＩ）の化合物：
【化８】
2015536965.tif 000010
（式中、ポリマーは本明細書に記載の合成方法の反応条件下で不活性であり、および本明細書で用いられる溶媒に不溶であるが膨潤性である、低架橋ポリスチレンおよびボリエチレングリコールグラフトポリスチレンポリマーなどのポリマーを表す）
と反応させて、式（ＸＩＩ）の化合物： 
【化９】
2015536965.tif 000011
を生成する工程と；
ｂ）前記式（ＸＩＩ）の化合物を加水分解して式（ＸＩＶ）の化合物：
【化１０】
2015536965.tif 000012
を生成する工程と；
ｃ）前記式（ＸＩＶ）の化合物を、カルボキサミド基をニトリル基に変換可能な条件に付して、前記式（Ｉ）の化合物を生成する工程と；
を少なくとも含んでなり、
工程ｂ）および工程ｃ）は別々に実施してもよいし、ワンポット反応で実施してもよいことを特徴とする。
【００９６】
本発明の別の実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物またはその医薬的に許容される塩、異性体、プロドラッグもしくは溶媒和物の調製方法は、
ａ）式（ＩＸ）の化合物：
【化１１】
2015536965.tif 000013
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は式（Ｉ）において上記で定義した通りのものである）
を、式（ＩＶ）の化合物：
【化１２】
2015536965.tif 000014
と反応させる工程を少なくとも含んでなる。
【００９７】
さらに別の実施態様によれば、本発明の方法は、
ａ）式（ＸＩ）の化合物：
【化１３】
2015536965.tif 000015
（式中、ポリマーは本明細書に記載の合成方法の反応条件下で不活性であり、および本明細書で用いられる溶媒に不溶であるが膨潤性である、低架橋ポリスチレンおよびボリエチレングリコールグラフトポリスチレンポリマーなどのポリマーを表す）
を、式（ＸＩＩＩ）の化合物：
【化１４】
2015536965.tif 000016
（式中、Ｒ５およびＲ６は式（Ｉ）において上記で定義した通りのものである）
と反応させる工程と、
ｂ）Ｆｍｏｃ保護基を除去する工程と、
ｃ）式（ＶＩＩ）の化合物：
【化１５】
2015536965.tif 000017
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は式（Ｉ）において上記で定義した通りのものである）
と反応させる工程と、
ｄ）担持ポリマーから得られた生成物を加水分解して式（Ｉ）の化合物：
【化１６】
2015536965.tif 000018
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５およびＲ６は上記で定義した通りのものである）
を得る工程と
を少なくとも含んでなる。
【００９８】
一般式（Ｉ）の化合物は、認知障害、特に中枢神経系の他の疾患または状態と関連した認知障害の治療に有用であることが判明している。
【００９９】
本発明の特定の実施態様によれば、認知障害は、統合失調症、双極性気分障害、アルツハイマー病およびパーキンソン病からなる群から選択される疾患に関連する認知障害である。
【０１００】
さらに、本発明によれば、本発明の化合物またはその医薬的な塩、誘導体、プロドラッグもしくは立体異性体と、医薬的に許容される担体、アジュバントまたはビヒクルとを含んでなる、患者へ投与するための薬剤または医薬組成物が提供される。
【０１０１】
本発明による医薬組成物の補助物質または添加剤は、担体、賦形剤、担持物質、滑剤、充填剤、溶媒、希釈剤、着色剤、糖類などの香味調整剤、酸化防止剤、バインダー、接着剤、崩壊剤、付着防止剤、流動促進剤および／または凝着剤から選択することができる。坐剤の場合、これは、ワックス、脂肪酸エステル、防腐剤、乳化剤および／または非経口用途の担体でよい。これらの補助物質および／または添加剤ならびに使用量は、医薬組成物の用途形態に応じて異なる。
【０１０２】
本発明による薬剤または医薬組成物は、ヒトおよび／または動物、好ましくは乳幼児、子供および成人を含むヒトへの適用に好適ないずれの形態でもよく、当業者に知られている標準的な手順により製造できる。したがって、本発明による製剤は、局所適用または全身適用、特に、経皮、トランス経皮、皮下、筋肉内、関節内、腹腔内、静脈内、動脈内、膀胱内、骨内、陰茎海綿体内、鼻腔内、肺性、口腔、舌下、眼、硝子体内、経皮、直腸、膣、経口、硬膜外、鞘内、心室内、脳内、脳室内、嚢内、髄腔内、骨髄周囲、頭蓋内に対する適用、ポンプ装置の有無にかかわらず注射針またはカテーテルによる、または他の適用経路を経由する送達に適応するようにしてもよい。
【０１０３】
一つの実施態様によれば、医薬組成物は、固形または液状の経口剤型である。経口投与に好適な剤型は、錠剤、丸剤、カプレット、ジェルキャップ、チューインガム、カプセル、顆粒、点滴剤、シロップ剤または液剤であり、当該技術分野において知られている通常の賦形剤、例えば、結合剤、例えば、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガントまたはポリビニルピロリドン；充填剤、例えば、乳糖、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトールまたはグリシン；錠剤化滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム；崩壊剤、例えば、デンプン、ポリビニルピロリドン、グリコール酸デンプンナトリウムまたは微結晶性セルロース；または医薬的に許容される湿潤剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウムを含有することができる。
【０１０４】
別の実施態様によれば、医薬組成物は、非−非経口（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）鼻腔内投与用生成物の形態、好ましくは鼻腔内投与用生成物の形態である。典型的には、鼻腔内投与は、送達装置として鼻腔用スプレー、スクイーズボトル、および液体ドロッパーを使用することにより実施される。これらの装置を使用するためには、医薬組成物は、本発明の化合物の溶液または懸濁液であることが有利である。
【０１０５】
組成物は、従来の配合法、充填法または錠剤化法により調製してもよい。配合を反復して、大量の充填剤を用いて組成物全体にわたって活性剤を分布させてもよい。このような操作は、当該技術分野において通常のことである。錠剤は、例えば、湿式造粒または乾式造粒により調製し、必要に応じて通常の薬務において周知の方法に準じて塗布、特に腸溶コーティングを施してもよい。
【０１０６】
また、医薬組成物は、適切な単位剤型において、非経口投与製剤、例えば、滅菌溶液、懸濁液または再構成可能乾燥調製物、アエロゾルまたはスプレーに適応するようにしてもよい。増量剤、緩衝剤または界面活性剤などの適切な賦形剤を使用することができる。
【０１０７】
本発明の組成物は、経皮適用のための溶解形態またはパッチにおける付着物として製剤化してもよい。
【０１０８】
皮膚への適用には、軟膏剤、ゲル、クリーム、ローション、懸濁剤または乳剤などがある。
【０１０９】
直腸への適用の好適な形態は、坐剤である。
【０１１０】
上記した製剤は、スペインおよび米国薬局方ならびに同様な参考書において記載または言及されているような標準的な方法を用いて調製される。
【０１１１】
本発明の一つの実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、治療的に有効な量で使用されることが好ましい。医師は、最も適切な本発明の治療薬の投与量を定めるが、これは、投与剤型および選択される具体的化合物により異なり、さらに、治療中の患者、患者の年齢、疾患の種類、または治療されている状態により異なる。組成物を経口投与するとき、より少量を非経口投与したのと同じ効果を生じるのにはより多量の活性剤が必要である。化合物は、同等の治療薬と同様に有効であり、投与量レベルは、これらの他の治療薬について一般的に用いられるのと同じレベルである。活性化合物は、典型的には１日１回またはそれ以上、例えば、毎日１回、２回、３回または４回（１日の典型的な総投与量は０．１〜１０００ｍｇ／ｋｇ／日）投与する。
【０１１２】
本発明の化合物および組成物は、他の薬剤とともに使用して併用療法を提供することもできる。他の薬剤は同じ組成物の一部分を形成してもいいし、あるいは同時または異なる時に投与する別個の組成物として提供してもよい。
【０１１３】
特に、少なくとも１種の式（Ｉ）の化合物と少なくとも１種の別の薬剤との組み合わせを、同時、別個または順次投与用として、少なくとも医薬的に許容される担体、添加剤、アジュバントまたはビヒクルとともに製剤化してもよい。式（Ｉ）の化合物と他の薬剤との組み合わせは以下のようにして投与してもよい：
ａ）両方が常に同時に投与される同じ薬剤製剤の一部分である組み合わせとして。
ｂ）２つの単位の組み合わせで、それらのうちの１つが同時、順次または別個投与されることがある組み合わせ。特定の実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物は、他の薬剤とは独立的（すなわち、２つの単位で）ではあるが同時に投与される。別の特定の実施態様によれば、式（Ｉ）の化合物が最初に投与され、次に他の薬剤が別個または順次に投与される。さらに別の特定の実施態様によれば、他の薬剤が最初に投与され、次に式（Ｉ）の化合物が定義されているようにして別個または順次投与される。
【０１１４】
本発明に関し、以下のアクロニムおよび略字を使用した。意味を以下に述べる：
ＡｃＯＥｔ：酢酸エチル
ＡｃＳＤＫＰ：Ｎ−アセチル−セリル−アスパルチル−リシル−プロリン
ＡＤ：アルツハイマー病
ＢＢＢ：血液脳関門
Ｂｏｃ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＢＳＡ：牛血清アルブミン
ＤＢＵ：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＤＰＰＩＶ：ジペプチジルペプチダーゼＩＶ
ＥｔＯＨ：エタノール
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＦＰＬＣ：高速タンパク質液体クロマトグラフィー
ＨＯＡｔ：１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
ＩＰ３：イノシトールトリホスフェート
ＩＰＴＧ：イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド
ＬＢ：溶原性ブロス
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ：マトリクス支援レーザー脱離イオン化飛行時間
ＭＫ−８０１：ジゾシルピン（ＩＮＮ）
ＭＳ：多発性硬化症
ＯＤ：光学濃度
ＰＡＭＰＡ：並列人工膜透過性アッセイ
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＣ：ホスファチジルコリン
ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン
ｐＥＴＭ１０：プラスミドｐＥＴＭ１０  
ＰＩ：ホスファチジルイノシトール
ＰＯＰ：プロリルオリゴペプチダーゼ
ｈＰＯＰ：ヒトプロリルオリゴペプチダーゼ
ＰＲＥＰ：プロリルエンドペプチダーゼ（ＰＯＰとＰＲＥＰは同義語である）
ＰＳ：ホスファチジルセリン
ＰｙＢＯＰ：（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆相高速液体クロマトグラフィー
ＳＤ：標準偏差
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動
ＴＢＴＵ：Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＩＳ：トリイソプロピルシラン
Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
Ｔβ４：サイモシンベータ−４タンパク質
Ｚ−Ｇ−Ｐ−ＡＭＣ：（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−メチルクマリニル−７−アミド）
【０１１５】
以下の実施例は、本発明のある実施態様を単に示しただけであり、いかなる場合であっても本発明を限定的に考慮するものではない。
【実施例】
【０１１６】
実施例で説明されている調製に使用された具体的合成条件
手順Ａ：式（ＩＩ）のエステルの式（ＶＩＩ）のカルボン酸への加水分解
式（ＩＩ）のエステル（１ｍｍｏｌ）を９５％ＥｔＯＨに可溶化する。ＮａＯＨ（３．７ｍｍｏｌ）を添加し、反応を約２時間還流状態で維持する。次に、室温になるまで放置する。反応混合物を濃縮して約１５〜２０ｍＬとした後、この溶液を、氷浴冷却しながら１ＭＨＣｌ溶液にゆっくり添加する。白色固体沈殿を濾取し、水洗し、十分に乾燥させてから次の合成工程で使用する。沈殿が生成しない場合、得られた溶液をＡｃＯＥｔで抽出（３ｘ）し、有機相を乾燥させ、蒸発させる。粗生成物を必要に応じてフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。
【０１１７】
手順Ｂ：式（ＩＩＩ）のＢｏｃ保護アミンの脱保護による式（ＶＩ）のアミンの生成
式（ＩＩＩ）のＢｏｃ保護アミン（１ｍｍｏｌ）を、０℃で、ジオキサン（２０ｍｌ）中４Ｍ  ＨＣｌにゆっくり添加する。反応液を室温で２時間攪拌する。次に、溶媒を蒸発乾固して、式（ＶＩ）のアミンの塩酸塩を得る。
【０１１８】
手順Ｃ：式（ＶＩＩＩ）のカルボン酸塩化物の形成による、式（ＶＩ）のアミンの式（ＶＩＩ）のカルボン酸への結合
塩化オキサリル（１．５ｍｍｏｌ）を、トルエン（５ｍｌ）に式（ＶＩＩ）のカルボン酸（１ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に添加する。反応液を５０℃で１．５時間攪拌して、式（ＶＩＩＩ）のカルボン酸塩化物を形成させる。溶媒を蒸発させた後、得られた粗生成物をＴＨＦに可溶化し、式（ＶＩ）のアミン（１．１ｍｍｏｌ）のＮａＯＨ水溶液に０℃で添加する。反応混合物を０℃で１．５時間、そして室温で３時間攪拌する。次に、ＴＨＦを蒸発させ、１Ｍ  ＨＣｌ溶液を添加することにより残りの水性フラクションを酸性ｐＨ（３〜４）に調整し、ＡｃＯＥｔで抽出する。有機相を食塩水で洗浄し、乾燥させ、濾過し、蒸発させる。式（ＩＸ）の粗生成物を必要に応じてフラッシュクロマトグラフィーにより精製する。
【０１１９】
手順Ｄ：溶液中での式（ＩＸ）の生成物の式（ＩＶ）の（Ｓ）−ピロリジン−２−カルボニトリルへの結合
式（ＩＸ）の生成物（１．２ｍｍｏｌ）をＤＣＭに溶解し、ＤＩＥＡ（１ｍｍｏｌ）とともに、Ｎ−シクロヘキシルカルボジイミド，Ｎ’−メチルポリスチレン（３ｍｍｏｌ）に添加する。５分後、式（ＩＶ）の（Ｓ）−ピロリジン−２−カルボニトリル（１ｍｍｏｌ）とＤＩＥＡ（１ｍｍｏｌ）とを添加する。反応液を室温で一晩攪拌する。次に、反応混合物を濾過し、残留固体をＤＣＭで洗浄する。濾液を蒸発乾固させる。次に、粗生成物を分取ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。
【０１２０】
手順Ｅ：固相での合成のための一般的な手順
樹脂の膨潤／条件付け：式（Ｘ）のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（１当量）を、ポリエチレン多孔性ディスクを装着したシリンジに入れる。樹脂を、ＤＣＭおよびＤＭＦで洗浄することにより膨潤させる。フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護基は、ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液で処理することにより除去することができる。
【化１７】
2015536965.tif 000019
【０１２１】
次に、式（Ｖ）のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（４当量）を、ＤＭＦ中ＴＢＴＵ（４当量）およびＤＩＥＡ（８当量）を用いて樹脂に結合させる。混合物を断続的に手動で９０分間攪拌する。濾過および洗浄の後、カップリングの程度をＫａｉｓｅｒ試験を用いてモニターし、必要な場合は再カップリングを実施する。ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液、続いてピペリジン／ＤＢＵ／トルエン／ＤＭＦ（２０：５：５：７０）溶液で処理することにより、Ｆｍｏｃを除去して式（ＸＩ）の生成物を得る。Ｆｍｏｃの除去は、ｐ−ニトロフェニルエステルＮＦ３１試験を用いて評価する（Ｍａｄｄｅｒ、Ａ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９９；（１１）：２７８７−９１に記載されている）。
【化１８】
2015536965.tif 000020
【０１２２】
式（ＩＸ）の生成物（２当量）を、ＤＭＦ中ＰｙＢＯＰ（２当量）、ＨＯＡｔ（６当量）およびＤＩＥＡ（６当量）を用いて、式（ＸＩ）の生成物に結合させて式（ＸＩＩ）の生成物を得る。混合物を総反応時間である９０分間断続的に手動で攪拌する。系統的再カップリングを同量および同時間でおこなう。カップリングの程度をｐ−ニトロフェニルエステルＮＦ３１試験を用いてモニターする。
【０１２３】
別法として、式（ＸＩＩＩ）の生成物（４当量）を、ＤＭＦ中ＰｙＢＯＰ（４当量）、ＨＯＡｔ（１２当量）およびＤＩＥＡ（１２当量）を用いて、式（ＸＩ）の生成物に結合させる。混合物を総反応時間である９０分間断続的に手動で攪拌する。カップリングの程度をｐ−ニトロフェニルエステルＮＦ３１試験を用いてモニターし、必要な場合は再カップリングをおこなう。ＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液での処理、そしてピペリジン／ＤＢＵ／トルエン／ＤＭＦ（２０：５：５：７０）溶液での処理により、Ｆｍｏｃ基を除去する。続いて、式（ＶＩＩ）の生成物（４当量）を、ＤＭＦ中ＰｙＢＯＰ（４当量）、ＨＯＡｔ（１２当量）およびＤＩＥＡ（１２当量）を用いて組み込み、式（ＸＩＩ）の生成物を得る。混合物を総反応時間である９０分間断続的に手動で攪拌する。カップリングの程度をｐ−ニトロフェニルエステルＮＦ３１試験を用いてモニターし、必要な場合は再カップリングをおこなう。
【化１９】
2015536965.tif 000021
【０１２４】
ＤＣＭで完全に洗浄し乾燥させた式（ＸＩＩ）の生成物を丸底フラスコに移し、ＤＣＭ中無水トリフルオロ酢酸（５当量）とピリジン（１０当量）（約２ｍＬ／１００ｍｇ）を添加する。混合物を室温で一晩中保つ。次に、反応混合物を濾過し、樹脂をＤＣＭで洗浄する。濾液を集め、溶媒を蒸発させて乾固する。得られた粗生成物をＡｃＯＥｔに溶解し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液および５％ＫＨＳＯ４水溶液で洗浄する。有機相を乾燥させ、濾過し、蒸発させる。粗生成物をＨ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ（１：１）に入れ、凍結乾燥させて式（Ｉ）のペプチドニトリルを生成する。
【０１２５】
別法として、式（ＸＩＩ）のペプチジル樹脂を、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５、約２〜５ｍＬ／１００ｍｇ）混合物で、１〜２時間処理してもよい。次に、樹脂を濾過し、ＴＦＡで洗浄し、濾液を集め、溶媒を蒸発させて乾固する。粗生成物をＨ２Ｏ：ＣＨ３ＣＮ（１：１）の混合物に再懸濁し、凍結乾燥させる。得られた粗ペプチドアミドをＤＣＭに入れ、無水トリフルオロ酢酸（５当量）およびピリジン（１０当量）を添加する。混合物を室温で一晩保ち、溶媒を蒸発させ、残留物をＡｃＯＥｔに入れる。続いて、有機溶液を５％ＫＨＳＯ４水溶液および１０％ＮａＨＣＯ３水溶液で洗浄する。有機相を乾燥および蒸発させることにより、式（Ｉ）のペプチドニトリルを得る。
【０１２６】
粗生成物を、ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製する。
【０１２７】
中間体化合物の合成：
中間体１：４−ベンジルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸
【化２０】
2015536965.tif 000022
３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシ安息香酸メチル（２．０ｇ、９．４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（３．２ｇ、２２．６ｍｍｏｌ）およびヨウ化カリウム（５００ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに入れる。アセトン（２００ｍＬ）を添加する。反応液を室温で３０分間攪拌する。次に、塩化ベンジル（４．３ｍＬ、３７．７ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、還流しながら８時間攪拌を続ける。その後、反応液を室温まで放冷する。水を添加し、ジエチルエーテルで３回抽出し、有機抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥させ、蒸発させる。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、生成物１．７ｇ（５．７ｍｍｏｌ）を得る。続いて、上記した手順Ａに準じてメチルエステルの加水分解を実施して、４−ベンジルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸（２．４ｇ、７．９ｍｍｏｌ）を得る。
【０１２８】
中間体２：（２Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシピロリジン−２−カルボン酸
【化２１】
2015536965.tif 000023
市販の（２Ｓ，４Ｒ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−メトキシピロリジン−２−カルボン酸（２２１ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を原料として、上記した手順Ｂに準じて塩酸塩として定量的収率で生成物を得て、さらに精製することなく使用する。
【０１２９】
中間体３：（Ｓ）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボン酸
【化２２】
2015536965.tif 000024
市販の（Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボン酸（１５０ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を原料として、上記した手順Ｂに準じて塩酸塩として定量的収率で生成物を得て、さらに精製することなく使用する。
【０１３０】
中間体４：（２Ｓ，４Ｓ）−４−（メチルチオ）ピロリジン−２−カルボン酸
【化２３】
2015536965.tif 000025
市販の（２Ｓ，４Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−メチルチオ−ピロリジン−２−カルボン酸（３１０ｍｇ、１．９３ｍｍｏｌ）を原料として、上記した手順Ｂに準じて塩酸塩として定量的収率で生成物を得て、さらに精製することなく使用する。
【０１３１】
中間体５：（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルピロリジン−２−カルボン酸
【化２４】
2015536965.tif 000026
市販の（２Ｓ，４Ｓ）−１−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）−４−メチルピロリジン−２−カルボン酸（５００ｍｇ、２．１８ｍｍｏｌ）を原料として、上記した手順Ｂに準じて塩酸塩として定量的収率で生成物を得て、さらに精製することなく使用する。
【０１３２】
中間体６：（２Ｓ，４Ｒ）−４−アセトキシピロリジン−２−カルボン酸
【化２５】
2015536965.tif 000027
市販のトランス−Ｌ−ヒドロキシプロリン（５００ｍｇ、３．８１ｍｍｏｌ）を６Ｎ塩酸（１ｍＬ）に溶解する。氷酢酸（１ｍＬ）を添加し、溶液を氷浴で０℃に冷却する。次に、塩化アセチル（１０ｍｌ）をゆっくりと添加する。数分後、生成物を沈殿により得る。この際、エーテルを添加して沈殿しやすくする。塩酸塩の形態の化合物（６２６ｍｇ、２．９８ｍｍｏｌ）を濾過して単離し、エーテルで洗浄し、乾燥させて、次の工程で直接使用する。
【０１３３】
中間体７：（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−メトキシ−ピロリジン−２−カルボン酸
【化２６】
2015536965.tif 000028
中間体１（４−ベンジルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）（４２５ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）および中間体２（（２Ｓ，４Ｒ）−４−メトキシピロリジン−２−カルボン酸）（１．５ｍｍｏｌ）から上記した手順Ｃに準じて調製する。フラッシュクロマトグラフィーによる精製により、所望の生成物（４２８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）が得られる。
【０１３４】
中間体８：（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−フルオロピロリジン−２−カルボン酸
【化２７】
2015536965.tif 000029
中間体１（４−ベンジルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）（７１４ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）および市販の（２Ｓ，４Ｒ）−４−フルオロピロリジン−２−カルボン酸（３６３ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）から、上記した手順Ｃに準じて調製する。フラッシュクロマトグラフィーによる精製により、所望の生成物（６７０ｍｇ、１．７ｍｍｏｌ）が得られる。
【０１３５】
中間体９：（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−フェニルピロリジン−２−カルボン酸
【化２８】
2015536965.tif 000030
中間体１（４−ベンジルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）（７００ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）および市販の（２Ｓ，４Ｓ）−４−フェニルピロリジン−２−カルボン酸（６０８ｍｇ、２．７ｍｍｏｌ）から上記した手順Ｃに準じて調製する。フラッシュクロマトグラフィーによる精製により、所望の生成物（７００ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）が得られる。
【０１３６】
中間体１０：（Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボン酸
【化２９】
2015536965.tif 000031
中間体１（４−ベンジルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）（２６０ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）および中間体３（（Ｓ）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボン酸）（１．０ｍｍｏｌ）から上記した手順Ｃに準じて調製する。フラッシュクロマトグラフィーによる精製により、所望の生成物（３６６ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）が得られる。
【０１３７】
中間体１１：（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−（メチルチオ）−ピロリジン−２−カルボン酸
【化３０】
2015536965.tif 000032
中間体１（４−ベンジルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）（５０５ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）および中間体４（（２Ｓ，４Ｓ）−４−（メチルチオ）ピロリジン−２−カルボン酸）（１．９３ｍｍｏｌ）から上記した手順Ｃに準じて調製する。フラッシュクロマトグラフィーによる精製により、所望の生成物（５３７ｍｇ、１．２４ｍｍｏｌ）が得られる。
【０１３８】
中間体１２：（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−メチルピロリジン−２−カルボン酸
【化３１】
2015536965.tif 000033
中間体１（４−ベンジルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）（３８４ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）および中間体５（（２Ｓ，４Ｓ）−４−メチルピロリジン−２−カルボン酸）（１．４７ｍｍｏｌ）から上記した手順Ｃに準じて調製する。フラッシュクロマトグラフィーによる精製により、所望の生成物（３４２ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）が得られる。
【０１３９】
中間体１３：（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−アセトキシピロリジン−２−カルボン酸
【化３２】
2015536965.tif 000034
中間体１（４−ベンジルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）（４００ｍｇ、１．３９ｍｍｏｌ）および中間体６（（２Ｓ，４Ｒ）−４−アセトキシピロリジン−２−カルボン酸）（１．５３ｍｍｏｌ）から上記した手順Ｃに準じて調製する。フラッシュクロマトグラフィーによる精製により、所望の生成物（３４２ｍｇ、０．８５ｍｍｏｌ）が得られる。
【０１４０】
中間体１４：４−アセトキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸
【化３３】
2015536965.tif 000035
４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸（３００ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）を０℃でピリジン（７３２μＬ、９．０８ｍｍｏｌ）に溶解する。混合物を攪拌しながら、無水酢酸（２１４μＬ、２．２７ｍｍｏｌ）を滴下する。氷浴を２時間保った後、混合物を氷水に注ぐ。混合物をＤＣＭで抽出（３ｘ）し、有機相を１Ｎ  ＨＣｌ溶液で洗浄（３ｘ）し、水で洗浄し、食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、４−アセトキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸（２６６ｍｇ、１．１０ｍｍｏｌ）を得る。
【０１４１】
中間体１５：４−ベンゾイルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸
【化３４】
2015536965.tif 000036
４−ヒドロキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸（３００ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）を水（６ｍＬ）に溶解後、イソプロパノール（２．５ｍＬ）を添加してから、炭酸カリウム（５２３ｍｇ、３．７８ｍｍｏｌ）を添加する。混合物をアルゴン下で保ち、０℃まで冷却する。次に、塩化ベンゾイル（１８５μＬ、１．５９ｍｍｏｌ）を激しく攪拌した反応混合物に滴下する。添加中に濃厚白色沈殿が形成される。混合物をさらに２０分間攪拌してから、反応混合液を冷状態に保ちながら６Ｍ  ＨＣｌで急冷する。固体を濾取し、冷水で洗浄し、乾燥させて白色固体として４−ベンゾイルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸を得る（４０１ｍｇ、１．３３ｍｍｏｌ）。
【０１４２】
中間体１６：３，４−ジベンジルオキシ−５−メトキシ安息香酸
【化３５】
2015536965.tif 000037
３，４−ジヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸メチル（３００ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（１．０ｇ、７．３ｍｍｏｌ）およびヨウ化カリウム（１６１ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに入れる。アセトン（６０ｍＬ）を添加する。反応液を室温で３０分間攪拌する。次に、塩化ベンジル（１．３９ｍＬ、１２．１ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、還流しながら８時間攪拌を続ける。その後、反応液を室温まで放冷する。水を添加し、ジエチルエーテルで３回抽出し、有機抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥させ、蒸発させる。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、３７７ｍｇ（１．０ｍｍｏｌ）の生成物を生成する。続いて、上記した手順Ａに準じてメチルエステルの加水分解を実施して、３，４−ジベンジルオキシ−５−メトキシ安息香酸（１４４ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を得る。
【０１４３】
中間体１７：３，４−ジベンゾイルオキシ−５−メトキシ安息香酸
【化３６】
2015536965.tif 000038
３，４−ジヒドロキシ−５−メトキシ安息香酸（３００ｍｇ、１．６３ｍｍｏｌ）を水（６ｍＬ）に溶解後、イソプロパノール（２．５ｍＬ）を添加してから、炭酸カリウム（１．１３ｇ、８．１５ｍｍｏｌ）を添加する。混合物をアルゴン下で保持し、０℃まで冷却する。次に、塩化ベンゾイル（３８８μＬ、３．３４ｍｍｏｌ）を激しく攪拌した反応混合物に滴下する。混合物をさらに２０分間攪拌してから、反応混合物を冷状態に保ちながら６Ｍ  ＨＣｌで急冷する。次に、ＡｃＯＥｔで希釈し、相分離する。有機相を１Ｍ  ＨＣｌ溶液および食塩水で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させる。フラッシュクロマトグラフィーにより粗生成物を精製することにより、白色固体として３，４−ジベンゾイルオキシ−５−メトキシ安息香酸（５４８ｍｇ、１．４０ｍｍｏｌ）を得る。
【０１４４】
中間体１８：３−アセトキシ−４，５−ジメトキシ安息香酸
【化３７】
2015536965.tif 000039
３−ヒドロキシ−４，５−ジメトキシ安息香酸（３００ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）を０℃でピリジン（７３２μＬ、９．０８ｍｍｏｌ）に溶解する。混合物を攪拌しながら、無水酢酸（２１４μＬ、２．２７ｍｍｏｌ）を滴下する。氷浴を２時間保った後、混合物を氷水に注ぐ。混合物をＤＣＭで抽出（３ｘ）し、有機相を１Ｎ  ＨＣｌ溶液で洗浄（３ｘ）し、水で洗浄（２ｘ）し、食塩水で洗浄（２ｘ）し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させて、３−アセトキシ−４，５−ジメトキシ安息香酸（２７７ｍｇ、１．１５ｍｍｏｌ）を得る。
【０１４５】
中間体１９：３−ピバロイルオキシ−４，５−ジメトキシ安息香酸
【化３８】
2015536965.tif 000040
３−ヒドロキシ−４，５−ジメトキシ安息香酸（３００ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ）およびピリジン（２４４μＬ、３．０２ｍｍｏｌ）のクロロホルム（２ｍＬ）溶液を３０分間攪拌する。この反応混合物に、室温で塩化ピバロイル（１９６μＬ、１．５９ｍｍｏｌ）のクロロホルム（２ｍＬ）溶液を滴下し、反応液をＴＬＣが完了するまで（約３時間）攪拌する。その後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ溶液を添加し、相分離する。有機相を１Ｍ  ＨＣｌ溶液（２ｘ）、水および食塩水で順次洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、蒸発させる。フラッシュクロマトグラフィーによる精製により、４−ピバロイルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸（３２１ｍｇ、１．１４ｍｍｏｌ）を得る。
【０１４６】
中間体２０：４−ベンジルオキシ−３−トリフルオロメチル安息香酸
【化３９】
2015536965.tif 000041
４−ヒドロキシ−３−トリフルオロメチル安息香酸（１．０ｇ、４．９ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（１．６ｇ、１１．６ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに入れる。ＤＭＦ（１０ｍＬ）を添加し、反応液を室温で５分間攪拌する。次に、塩化ベンジル（２．２ｍＬ、１９．４ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、還流しながら４時間維持する。その後、反応液を室温まで放冷する。水を添加し、酢酸エチルで３回抽出（３×５０ｍＬ）し、有機抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥させ、蒸発させる。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、生成物１．３ｇ（３．４ｍｍｏｌ）を得る。続いて、上記した手順Ａに準じてベンジルエステルの加水分解を実施して、４−ベンジルオキシ−３−トリフルオロメチル安息香酸（３２０ｍｇ、１．１ｍｍｏｌ）を得る。
【０１４７】
中間体２１：４−ベンジルオキシ−３−フルオロ安息香酸
【化４０】
2015536965.tif 000042
４−ヒドロキシ−３−フルオロ安息香酸（１．０ｇ、６．４ｍｍｏｌ）、炭酸カリウム（２．７ｇ、１９．２ｍｍｏｌ）およびヨウ化カリウム（５３２ｍｇ、３．２ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに入れる。アセトン（１４０ｍＬ）を添加し、反応液を室温で３０分間攪拌する。次に、臭化ベンジル（３．８ｍＬ、３２．０ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、還流しながら１２時間維持する。その後、反応液を室温まで放冷する。水を添加し、酢酸エチルで３回抽出（３×５０ｍＬ）し、有機抽出物を食塩水で洗浄し、乾燥させ、蒸発させる。粗生成物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製して、生成物１．２ｇ（３．５ｍｍｏｌ）を得る。続いて、上記した手順Ａに準じてベンジルエステルの加水分解を実施して、４−ベンジルオキシ−３−フルオロメチル安息香酸（６１２ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を得る。
【０１４８】
実施例１：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−メトキシピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化４１】
2015536965.tif 000043
市販の（Ｓ）−ピロリジン−２−カルボニトリル（５８ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）および中間体７（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−メトキシピロリジン−２−カルボン酸）（２２０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を、上記した手順Ｄに準じて結合させる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物１０ｍｇ（０．０２ｍｍｏｌ）を得る。
【０１４９】
実施例２：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−フルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化４２】
2015536965.tif 000044
市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（５００ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ、１当量）、市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（４００ｍｇ、１．２ｍｍｏｌ）および中間体８（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−フルオロピロリジン−２−カルボン酸）（２３９ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）を原料として、上記した手順Ｅに準じて生成物を調製する。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物８０ｍｇ（０．１７ｍｍｏｌ）を得る。
【０１５０】
実施例３：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−フェニルピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化４３】
2015536965.tif 000045
市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（５００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、１当量）、市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（５１６ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）および中間体９（（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−フェニルピロリジン−２−カルボン酸）（３５１ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を原料として、上記した手順Ｅに準じて生成物を調製する。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物１６ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を得る。
【０１５１】
実施例４：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化４４】
2015536965.tif 000046
市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（２５０ｍｇ、０．１９ｍｍｏｌ、１当量）、市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（２５８ｍｇ、０．７７ｍｍｏｌ）および中間体１０（（Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボン酸）（１６１ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ）を原料として、上記した手順Ｅに準じて調製する。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物１８ｍｇ（０．０３６ｍｍｏｌ）を得る。
【０１５２】
実施例５：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−（メチルチオ）ピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化４５】
2015536965.tif 000047
市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（５００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、１当量）、市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（５１６ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）および中間体１１（（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−（メチルチオ）ピロリジン−２−カルボン酸）（３３０ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）を原料として、上記した手順Ｅに準じて生成物を調製する。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物２２ｍｇ（０．０４３ｍｍｏｌ）を得る。
【０１５３】
実施例６：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−メチルピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化４６】
2015536965.tif 000048
市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（３００ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ、１当量）、市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（２４７ｍｇ、０．７３ｍｍｏｌ）および中間体１２（（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）８−４−メチルピロリジン−２−カルボン酸）（１４６ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）を原料として、上記した手順Ｅに準じて生成物を調製する。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物１０ｍｇ（０．０２ｍｍｏｌ）を得る。
【０１５４】
実施例７：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−シアノピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化４７】
2015536965.tif 000049
市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（５１６ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）およびＢｏｃ−トランス−４−シアノ−Ｌ−プロリン（３６８ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）を、上記した手順Ｅに記載した段階的結合により市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（５００ｍｇ、０．３８ｍｍｏｌ、１当量）に順次結合する。上記樹脂からジペプチドを切断した後、中間体１（４−ベンジルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）（１４５ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）を、手順Ｃに準じて、すなわちカルボン酸塩化物の形成を介して、得られたニトリルジペプチドに結合させる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる粗生成物の精製により、最終生成物１１ｍｇ（０．０３ｍｍｏｌ）を得る。
【０１５５】
実施例８：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−（トリフルオロメチル）−ピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化４８】
2015536965.tif 000050
市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（１３５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、（２Ｓ，４Ｓ）−Ｆｍｏｃ−４−トリフルオロメチル−ピロリジン−２−カルボン酸（１６２ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）および中間体１（４−ベンジルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）（１１５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を、上記した手順Ｅに記載した段階的結合により市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（１６５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１当量）に順次結合させる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物１３ｍｇ（０．０４５ｍｍｏｌ）を得る。
【０１５６】
実施例９：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−（ｔｅｒｔ−ブトキシ）ピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化４９】
2015536965.tif 000051
市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（１３５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−４−ｔｅｒｔ−ブトキシ−Ｌ−プロリン（１６４ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）および中間体１（４−ベンジルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）（１１５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を、上記した手順Ｅに記載した段階的結合により市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（１６５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１当量）に順次結合させる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物２２ｍｇ（０．０７６ｍｏｌ）を得る。
【０１５７】
実施例１０：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−アセトキシピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化５０】
2015536965.tif 000052
市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（１６５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１当量）、市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（１３５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）および中間体１３（（２Ｓ，４Ｒ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４−アセトキシピロリジン−２−カルボン酸）（９０ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ）を原料として、上記した手順Ｅに準じて生成物を調製する。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物６．２ｍｇ（０．０１２ｍｍｏｌ）を得る。
【０１５８】
実施例１１：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（４−アセトキシ−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化５１】
2015536965.tif 000053
市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（１３５ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−４，４−ジフルオロ−Ｌ−プロリン（１４９ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）および中間体１４（４−アセトキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）（９６ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ）を、上記した手順Ｅに記載した段階的結合により市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（１６５ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ、１当量）に順次結合させる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物２５ｍｇ（０．０５４ｍｍｏｌ）を得る。
【０１５９】
実施例１２：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（４−ベンゾイルオキシ−３，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化５２】
2015536965.tif 000054
市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（１３５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−４，４−ジフルオロ−Ｌ−プロリン（１４９ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）および中間体１５（４−ベンゾイルオキシ−３，５−ジメトキシ安息香酸）（１２１ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を、上記した手順Ｅに記載した段階的結合により市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（１６５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１当量）に順次結合させる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物２６ｍｇ（０．０５１ｍｍｏｌ）を得る。
【０１６０】
実施例１３：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（３，４−ジベンジルオキシ−５−メトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化５３】
2015536965.tif 000055
市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（１３５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−４，４−ジフルオロ−Ｌ−プロリン（１４９ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）および中間体１６（３，４−ジベンジルオキシ−５−メトキシ安息香酸）（１４６ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を、上記した手順Ｅに記載した段階的結合により市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（１６５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１当量）に順次結合させる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物２４ｍｇ（０．０４１ｍｍｏｌ）を得る。
【０１６１】
実施例１４：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（３，４−ジベンゾイルオキシ−５−メトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化５４】
2015536965.tif 000056
市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（１３５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−４，４−ジフルオロ−Ｌ−プロリン（１４９ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）および中間体１７（３，４−ジベンゾイルオキシ−５−メトキシ安息香酸）（１５７ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を、上記した手順Ｅに記載した段階的結合により市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（１６５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１当量）に順次結合させる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物３１ｍｇ（０．０５２ｍｍｏｌ）を得る。
【０１６２】
実施例１５：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（３−アセトキシ−４，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化５５】
2015536965.tif 000057
市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（１３５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−４，４−ジフルオロ−Ｌ−プロリン（１４９ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）および中間体１８（３−アセトキシ−４，５−ジメトキシ安息香酸）（９６ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を、上記した手順Ｅに記載した段階的結合により市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（１６５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１当量）に順次結合させる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物２２ｍｇ（０．０４８ｍｍｏｌ）を得る。
【０１６３】
実施例１６：
（Ｓ）−１−（（２Ｓ）−１−（３−ピバロイルオキシ−４，５−ジメトキシベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化５６】
2015536965.tif 000058
市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（１３５ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−４，４−ジフルオロ−Ｌ−プロリン（１４９ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）および中間体１９（３−ピバロイルオキシ−４，５−ジメトキシ安息香酸）（１１３ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を、上記した手順Ｅに記載した段階的結合により市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（１６５ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ、１当量）に順次結合させる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物１９ｍｇ（０．０４０ｍｍｏｌ）を得る。
【０１６４】
実施例１７：
（Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）ベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化５７】
2015536965.tif 000059
市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（１５０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−４，４−ジフルオロ−Ｌ−プロリン（１６６ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）および４−ベンジルオキシ安息香酸（１０１ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を、上記した手順Ｅに記載した段階的結合により市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（２００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１当量）に順次結合させる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物１７ｍｇ（０．０３８ｍｍｏｌ）を得る。
【０１６５】
実施例１８：
（Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（３−（ベンジルオキシ）ベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化５８】
2015536965.tif 000060
市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（１５０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−４，４−ジフルオロ−Ｌ−プロリン（１６６ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）および３−ベンジルオキシ安息香酸（１０１ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を、上記した手順Ｅに記載した段階的結合により順次結合させる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物８ｍｇ（０．０１８ｍｍｏｌ）を得る。
【０１６６】
実施例１９：
（Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（２−（ベンジルオキシ）ベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化５９】
2015536965.tif 000061
市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（１５０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−４，４−ジフルオロ−Ｌ−プロリン（１６６ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）および２−ベンジルオキシ安息香酸（１０１ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を、上記した手順Ｅに記載した段階的結合により市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（２００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１当量）に順次結合させる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物５ｍｇ（０．０１１ｍｍｏｌ）を得る。
【０１６７】
実施例２０：
（Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３−（トリフルオロメチル）ベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化６０】
2015536965.tif 000062
市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（１５０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−４，４−ジフルオロ−Ｌ−プロリン（１６６ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）および中間体２０（４−ベンジルオキシ−３−トリフルオロメチル安息香酸）（１３２ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を、上記手順Ｅに記載した段階的結合により市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（２００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１当量）に順次結合させる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物３２ｍｇ（０．０６１ｍｍｏｌ）を得る。
【０１６８】
実施例２１：
（Ｓ）−１−（（Ｓ）−１−（４−（ベンジルオキシ）−３−フルオロベンゾイル）−４，４−ジフルオロピロリジン−２−カルボニル）ピロリジン−２−カルボニトリル
【化６１】
2015536965.tif 000063
市販のＦｍｏｃ保護Ｌ−プロリン（Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ）（１５０ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ−４，４−ジフルオロ−Ｌ−プロリン（１６６ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）および中間体２１（４−ベンジルオキシ−３−フルオロ安息香酸）（１０９ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ）を、上記した手順Ｅに記載した段階的結合により市販のＳｉｅｂｅｒアミド樹脂（２００ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ、１当量）に順次結合させる。ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製により、最終生成物１４ｍｇ（０．０３０ｍｍｏｌ）を得る。
【０１６９】
薬理学的データ
新規化合物の（ヒト）プロリルオリゴペプチダーゼ活性に対する阻害効果の測定
プロリルオリゴペプチダーゼ（ＰＯＰ）の発現および精製
以下で簡潔に述べる文献（Ｔａｒｒａｇｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００６；７：８２７−３３）に記載の手順に従ってＥ．ｃｏｌｉにおける発現およびＨｉｓテール融合を用いたアフィニティー精製によりＰＯＰを得た。
【０１７０】
ｈＰＯＰの発現：Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１コンピテント細胞を、ｐＥＴＭ１０  ｈＰＯＰで形質転換した。発現を誘発するために、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢ培地（５０ｍＬ）の前培養液に、一つのコロニーを接種し、３７℃で一晩成長させた。翌日、ＬＢ培地（５００ｍＬ）の２つの培養液に、上記の一晩培養液（１０ｍＬ）を接種した。接種培養液を、ＯＤ５９５が１．２（２．５〜３時間）になるまで３７℃、２２０ｒｐｍで成長させた。次に、ＩＰＴＧを添加（最終濃度１ｍＭ）し、２５℃で一晩誘発した。細胞を回収（３５００ｇ、１５分間、４℃）し、ペレットを懸濁緩衝液（５０ｍＬ）［Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８（５０ｍＭ）、ＮａＣｌ（３００ｍＭ）、イミダゾール（１ｍＭ）］に懸濁し、試料を氷で冷却しながら、５０％、０．５パルスの強度で、４サイクル（各サイクルは超音波処理１５秒と静止１５秒とからなる）の超音波処理をおこなった。超音波処理後、試料を遠心分離（４００００ｇ、３０分間、４℃）して、上清を直ちにＰＯＰを精製するのに使用した。ＡＫＴＡエクスプローラーＦＰＬＣシステムを精製に使用した。上清を、５カラム容の懸濁バッファーで予め平衡化したＨｉＴｒａｐＱｕｅｌａｔｉｎｇカラム（５ｍＬ）に１ｍＬ／分の流量で適用した。カラムを２８０ｎｍでの吸光度が基礎レベルに戻るまで懸濁バッファーで洗浄した。次に、カラムを５容の洗浄バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭイミダゾール）ですすいだ。溶離を、４容の溶離バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール）で実施した。フラクション（４ｍＬ）は全溶離工程の間で集めた。ＰＯＰ活性を全てのフラクションにおいて確認し、陽性のものは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析し、Ｂｉｏｓａｆｅ  Ｃｏｍａｓｓｉｅ  Ｓｔａｉｎ  Ｇ−２５０で染色した。陽性フラクションを集め、バッファーとしてＴｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ８）を用いてＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラムにより脱塩した。組換えｈＰＯＰを、標準としてＢＳＡを用いてＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイで定量した。組換え酵素のアリコットを調製し、液体窒素で直ちに凍結し、−８０℃で保存した。
【０１７１】
ＰＯＰ阻害アッセイ
ＰＯＰ活性を、ＰＯＰ基質としてＺ−Ｇ−Ｐ−ＡＭＣ（Ｎ−ベンジルオキシカルボニル−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−メチルクマリニル−７−アミド）を用い、Ｔｏｉｄｅ等（Ｔｏｉｄｅ  Ｋ等、Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  １９９５；２７４：１３７０−８）に記載されている方法に準じて測定した。反応は、多重反応を同時にモニタリング可能な９６ウエルマイクロタイタープレートで実施した。各反応について、活性バッファー（１３４μｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム／カリウムバッファー、ｐＨ８．０）を、ｈＰＯＰ（ｈＰＯＰバッチの活性に応じて２０〜６０ｎＭの範囲）およびこれに対応する新規化合物溶液（３μｌ）と一緒に３７℃で１５分間プレインキュベートした。新規化合物の原液は、ＤＭＳＯ（１００ｍＭ）で調製し、この原液からＤＭＳＯを用いて希釈液を調製した。別法として、別の活性バッファー（１４１μＬ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓアセテート、１０ｍＭ  ＢＳＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ７．３）を用いて反応を実施し、ｈＰＯＰ（１０ｎＭ）およびこれに対応する新規化合物溶液（３μｌ）と一緒にプレインキュベートした（条件Ｂ）。
【０１７２】
プレインキュベーション後、Ｚ−Ｇ−Ｐ−ＡＭＣ（１０μｌ、４０％１，４−ジオキサン中３ｍＭ）を添加（３μｌ、４０％の１，４−ジオキサン中１．５ｍＭ（条件Ｂ））し、反応液を３７℃で１時間インキュベートした。酢酸ナトリウム（１５０μｌ、１Ｍ、ｐＨ４）を添加することにより反応を停止し、ＡＭＣの形成を蛍光的に測定した。励起波長と放出波長は、それぞれ３６０／４０ｎｍおよび４８５／２０ｎｍであった。
【０１７３】
各化合物について、幾つかの濃度点（２５ｐＭ〜４００μＭの範囲）を測定した。プロリルオリゴペプチダーゼについての阻害活性を式１に従って算出した。各新規化合物について、ｈＰＯＰの存在下（ａ）および不存在下（ｂ）における蛍光を測定した。最大蛍光（阻害活性０％）は、阻害化合物の不存在下におけるｈＰＯＰの試料から得た。新規化合物の阻害能力を推定するために、活性を化合物の対数濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを用いてＳ字形曲線に調整し、ＰＯＰ活性の５０％を阻害するのに必要とされる化合物の濃度として定義されるＩＣ５０値を得られた曲線から求めた。
【数１】
2015536965.tif 000064
（式中、
ａは、基質＋試験化合物＋ｈＰＯＰの存在下における蛍光強度であり；
ｂは、基質＋試験化合物の存在下における蛍光強度であり；
ｃは、基質＋ｈＰＯＰの存在下における蛍光強度であり；
ｄは、基質の存在下における蛍光強度である）。
【０１７４】
新規化合物は、ヒトプロリルオリゴペプチダーゼに対して高い阻害能力を示す。結果を表１にまとめて示す。
【表１】
2015536965.tif 000065
【０１７５】
関連プロリン特異的プロテアーゼに対する阻害活性
ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）の活性に対する新規化合物の阻害効果を試験した。基質としてＧ−Ｐ−ＡＭＣ（Ｈ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−メチルクマリニル−７−アミド）を用い、プロリルオリゴペプチダーゼに対する阻害活性を測定するための上記の手順に準じた。活性バッファーおよび対応化合物溶液と一緒にＤＰＰＩＶをプレインキュベートした後、Ｇ−Ｐ−ＡＭＣ（１０μｌ、４０％１，４−ジオキサン中７５０μＭ）を添加し、反応液を３７℃で２０分間インキュベートした。酢酸ナトリウム（１５０μｌ、１Ｍ、ｐＨ４）を添加することにより、反応を停止し、ＡＭＣの形成を蛍光的に測定した。各化合物について、幾つかの濃度点（１００μＭ〜４００μＭの範囲）を測定した。ＤＰＰＩＶに対する阻害活性を式１により算出した。新規化合物のいずれも、ジペプチジルペプチダーゼＩＶに対する阻害活性を示さず（ＩＣ５０値：４００μＭ超）、したがって、特異的ＰＯＰ阻害剤である。
【０１７６】
さらに、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）に対する新規化合物の阻害活性を試験した。ＰＯＰに対する阻害活性の測定についての上記手順と同様の手順に準じた。Ｚ−Ｇ−Ｐ−ＡＭＣを基質として最終濃度１００μＭで使用した。アッセイで使用したバッファーは、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、ｐＨ：７．５であった。組換えヒトＦＡＰを、活性バッファー中２μｇ／ｍＬの原液濃度（アッセイにおける最終濃度０．１μｇ／ｍＬ）で使用した。各新規化合物の原液は、ＤＭＳＯ中２０ｍＭで調製し、適宜希釈した。活性バッファーおよび対応新規化合物溶液と一緒にＦＡＰを３７℃で１５分間プレインキュベートした後、基質を添加（５０μｌ、活性バッファー中１００μＭ）し、反応液を３７℃で１時間インキュベートした。酢酸ナトリウム（１５０μｌ、１Ｍ、ｐＨ４）を添加することにより反応を停止し、ＡＭＣの形成を蛍光的に測定した。各化合物について、幾つかの濃度点（１００μＭ〜４００μＭの範囲）を測定した。ＦＡＰに対する阻害活性を式１により算出した。新規化合物のいずれもＦＡＰに対する阻害活性を示さず（ＩＣ５０値：４００μＭ超）、したがって、特異的ＰＯＰ阻害剤である。
【０１７７】
化合物の透過性の測定
並列人工膜透過性アッセイ（ＰＡＭＰＡ）
Ｋａｎｓｙ  Ｍ等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９８；４１（７）：１００７−１０に記載の並列人工膜透過性アッセイ（ＰＡＭＰＡ）を使用して、化合物が受動拡散（Ｄｉ  Ｌ等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００３；３８（３）：２２３−３２）により血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する能力を測定した。化合物の有効透過度（Ｐｅ）を初期濃度２００μＭで測定した。バッファー溶液を、製造業者の説明書に準じて市販の濃縮液から調製した。０．５Ｍ  ＮａＯＨ溶液を用いて、ｐＨを７．４に調整した。新規化合物の原液は、ＤＭＳＯで調製し、バッファー溶液で最終濃度２００μＭ（ＤＭＳＯ含量０．５％）に希釈した。ＰＡＭＰＡサンドイッチを分離し、各ドナーウエルに化合物溶液２００μＬを満たした。アクセプタープレートを、膜の下側がバッファーと確実に接触するように、ドナープレートに入れた。ドデカン中リン脂質（２０ｍｇ／ｍＬ）混合物４μＬを各ウエルのフィルターに添加し、バッファー溶液２００μＬを各アクセプターウエルに添加した。プレートをカバーし、１００ｒｐｍで軌道攪拌しながら、飽和湿度雰囲気中室温で４時間インキュベートした。４時間後、アクセプターコンパートメントおよびドナーコンパートメントの量をＨＰＬＣにより解析した：ドナープレートからの各ウエル１５０μＬとアクセプタープレートからの各ウエル１５０μＬをＨＰＬＣバイアルに移し、各試料を逆相Ｃ１８カラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ×５μｍ、１００オングストローム）に注入した（アクセプターウエルからの注入１回当たり１００μＬ、ドナーウエルからの注入１回当たり１０μＬ、ｔ０：標準）。また、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分光分析により輸送を確認した。
【０１７８】
使用したリン脂質混合物はアバンティ極性脂質により提供されたブタ極性脳脂質抽出物であり、以下の組成を有するものであった：ホスファチジルコリン（ＰＣ）１２．６％、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）３３．１％、ホスファチジルセリン（ＰＳ）１８．５％、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）４．１％、ホスファチジン酸０．８％および他の化合物３０．９％。
【０１７９】
４時間後、有効透過度（Ｐｅ）を式２を用いて算出し、輸送率（％）を式３を用いて算出した：
【数２】
2015536965.tif 000066
（式中、
ｔは時間（ｈ）であり；
ＣＡ（ｔ）は時間ｔでのアクセプターウエルにおける化合物濃度であり；
ＣＤ（ｔ０）はｔ０でのドナーウエルにおける化合物濃度である）。
【０１８０】
表２に示す標示Ｐｅ値に基づき、新規化合物はＢＢＢに対して良好な透過性を示す（表３）。
【表２】
2015536965.tif 000067
【表３】
2015536965.tif 000068
【０１８１】
認知障害動物モデルにおける学習および記憶に対する新規化合物の影響
新規化合物を、認知障害の薬理学的モデルにおける認知増強剤としての有効性について評価した。新規化合物の効果を、未治療およびＭＫ−８０１治療齧歯動物（マウスまたはラット）において評価した。ＭＫ−８０１は、種々の学習および記憶パラダイムにおいて動物の能力を害するＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ）受容体の非競合的アンタゴニストである（Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ  Ｃ等、Ｃｕｒｒ．  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２００１；２：２７３−８３；Ｒｉｅｄｅｌ  Ｇ等、Ｂｅｈａｖ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ２００３；１４０：１−４７）。また、ＭＫ−８０１は、齧歯動物の挙動に対して、感覚処理、過剰運動性、常同症、運動失調における欠陥を含む種々の影響を及ぼす。ＭＫ−８０１治療により誘発される行動的表現型は、認知障害の動物モデルとして広く使用されてきた（Ｂａｒｄｇｅｔｔ  ＭＥ等、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  Ｂｕｌｌ．２００３；６０：１３１−４２；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｔａａｙ  ＦＪ等、Ｂｅｈａｖ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  ２０１１；２２０：２１５−２９；Ｍｕｔｌｕ  Ｏ等、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｅｈａｖ．２０１１；９９：５５７−６５）。
【０１８２】
試験化合物が認知増強剤として作用するか否かを判定するために、正常な認知行動を回復する能力を、新規な物体認識試験など広く使用されている試験により試験した（Ｄｅｒｅ  Ｅ等、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  Ｂｉｏｂｅｈａｖ．  Ｒｅｖ．２００７；３１：６７３−７０４；Ｂｏｅｓｓ  ＦＧ等、Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．２００７；３２１：７１６−２５）；ｔｈｅ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ａｖｏｉｄａｎｃｅ  ｔａｓｋ（受動的回避課題または抑制性回避課題）（Ｓａｒｔｅｒ  Ｍ等、Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｂｅｒｌ）１９９２；１０７：１４４−５９）；ｔｈｅ  Ｍｏｒｒｉｓ  ｗａｔｅｒ  ｍａｚｅ（モリス水迷路）（Ｄ’Ｈｏｏｇｅ  Ｒ  等．、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．  Ｒｅｖ．２００１；３６：６０−９０）；およびｔｈｅ  Ｔ−ｍａｚｅ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｏｎ  ｔａｓｋ（Ｔ迷路転換課題）（Ｂｏｅｓｓ  ＦＧ等、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００４；４７：１０８１−９２；Ｓｐｏｗａｒｔ−Ｍａｎｎｉｎｇ  Ｌ等、Ｂｅｈａｖ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．２００４；１５１：３７−４６）。
【０１８３】
新規ＰＯＰ阻害剤の評価のための代表例として、各行動試験に準じたプロトコルおよび物体認識試験および受動的回避試験において得られた結果を説明する。
【０１８４】
新規物体認識課題
新規物体認識（ＮＯＲ）課題は、齧歯動物が新規物体を探索するための自然の選好に基づいている（Ｅｎｎａｃｅｕｒ  Ａ等、Ｂｅｈａｖ．  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１９８８；３１：４７−５９）。これは、視覚学習障害および記憶障害を研究するための関連非報酬試験である。簡潔に述べれば、ＮＯＲ課題手順は３つの実験：馴化、訓練および保持から構成されるものであった。各動物を物体の不存在下で１０分間、直径４０ｃｍの円形アリーナに慣れさせる（馴化セッション）。翌日、動物を訓練実験のために１０分間円形アリーナに入れておき、２つの同一の物体を対称な位置に配置した。この工程は連続した２日間でおこなった。３日目に、物体のうちの一つを異なる物体に置き換えた。訓練実験において使用しなかった物体を保持実験において新規物体として使用した。次に、動物を１０分間自由に探索させ、各物体を探索するのに費やした時間を記録した。動物は、インタクトな認識記憶のサインである、新規物体を探索するのにより多くの時間を費やすと考えられる。識別指数は以下のように算出した：［（新しい物体を探索するのに費やした時間−古い物質を探索するのに費やした時間）／両方の物体を探索するのに費やした総時間］×１００。識別指数が大きいほど、記憶保持が大きいと考えた。
【０１８５】
ＰＢＳにＴｗｅｅｎ８０を５％溶解した新たな対応する試験ＰＯＰ阻害剤を、動物体重１０ｇ当たり容積０．１ｍＬにおいて、投与量５ｍｇ／Ｋｇで皮下投与（皮下注射ｓ．ｃ．）した。１５分後、ＰＢＳバッファーに溶解したＭＫ−８０１を、動物体重１０ｇ当たり容積０．１ｍＬにおいて、投与量０．２ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射（ｉ．ｐ．）した。対照群では、ＭＫ−８０１を腹腔内注射し、同容量のビヒクル（５％Ｔｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳ）を皮下注射で投与した。別の対照群では、ＰＢＳを腹腔内注射し、同容量のビヒクルを皮下注射した。薬剤投与量を行動研究と神経化学的研究に従って選択した結果、薬剤が意図した効果を有することが判明した。
【０１８６】
動物に訓練期間中および試験セッション前に毎日２種の薬剤を注射した。
【０１８７】
本発明の化合物の代表例として実施例４の化合物を投与したときに得られた結果を図１に示す。
【０１８８】
実施例４の化合物について示したように、本発明の化合物は、ＮＯＲ試験においてＭＫ−８０１誘発記憶障害を回復させることができる。
【０１８９】
受動的回避課題
受動的回避課題の評価について、同じ寸法の明コンパートメントと暗コンパートメントの２つのコンパートメントボックスを使用した。２つのコンパートメントを、持ち上げ可能なギロチンドアにより分離した。使用した装置は、この試験用の標準手順に準じたものであった。１回のショックセッションと評価セッションをその間に２４時間の間隔をあけておこなった。ショックセッションでは、齧歯動物を明コンパートメントに入れた。２０秒の順応期間後、他方のコンパートメントへのギロチンドアを開き、齧歯動物が暗コンパートメントに入ったら再び下げた。次に、短時間で弱いフットショックを与えた。ショックが終了してから６０秒後に齧歯動物を装置からとり出し、ホームケージに戻した。評価セッションにおいて、動物が暗コンパートメントに入る時間（秒単位）を、前のセッション中に暗コンパートメントで受けたショックの記憶保持のサインとして測定した。第２の評価セッションは最初のショックセッションの１週間後に実施した。物体認識試験について説明したのと同じ投与量および容量で、対応する評価化合物を、ショックセッションの３５分前に皮下注射し、１５分間後にＭＫ−８０１を腹腔内注射するか、または対照の場合にはＰＢＳを腹腔内注射した。ＭＫ−８０１単独で治療した動物はショックセッションの記憶をほとんど保持しておらず、一方、ＰＯＰ阻害剤をさらに投与した動物は、暗コンパートメントに入るまでの待ちがより長く、記憶保持が良好であることが示された。
【０１９０】
本発明の化合物の代表例として実施例４の化合物を投与したときに得られた結果を図２に示す。
【０１９１】
実施例４の化合物について示したように、本発明の化合物は、受動的回避試験においてＭＫ−８０１誘発記憶障害を回復させることができる。
【０１９２】
水迷路（Ｍｏｒｒｉｓ逃避試験）
Ｍｏｒｒｉｓ水逃避能力を、この試験についての標準手順および寸法に準じ、約２２℃の温度でラテックスで染色した水道水で満たした水槽において評価した。逃避プラットフォームは、水面下１．５ｃｍに沈めた灰色のポリエチレン円筒から構成されたものであった。物体認識試験について説明したのと同じ投与量および容量で、対応する評価ＰＯＰ阻害剤を、訓練セッションおよび試験セッションの３５分前に皮下注射し、１５分後にＭＫ−８０１を腹腔内注射するか、または対照の場合にはＰＢＳを腹腔内注射した。動物には、訓練セッション中だけでなく、評価セッション中でも、毎日２種の化合物を注射した。
【０１９３】
齧歯動物は、連続した３日間に２セットの訓練セッションを、当該２セットの間に２日間の間隔をあけて受けた。各訓練セッションは、３回の実験（間隔を短く連続して）を２セットおこなうことから構成されていた。実験は、齧歯動物を槽の壁に対向させるようにプールに入れて開始した。４つの開始位置（北、東、南および西）をランダムな順序で使用した。逃避プラットフォームはいつも同じ象限にあるようにした。動物が逃避プラットフォームに登ってすぐか、あるいは６０秒が経過したときのいずれかが先に起こったときに実験を終了した。齧歯動物がプラットフォームに到達したら、３０秒間とどまらせて、逃避プラットフォームを槽の特定位置と関連づけられるようにした。次に、プラットフォームからとり出し、次の実験を開始した。動物が６０秒以内にプラットフォームを見つけなかった場合、実験者により動物はプラットフォーム上に置かれ、そこに３０秒間とどまらせた。第１の訓練セッション中に、視覚的な手がかりを配置してプラットフォームの印とした。この手がかりを取り除いてから次のセッションをおこなった。訓練セッション中、プラットフォームに到達するための待ち時間を記録した。
【０１９４】
第二セットの訓練セッション終了の翌日、評価を実施した：プラットフォームを取り除き、齧歯動物が訓練セッション中にプラットフォームが置かれていたプールの象限（標的象限）で過ごした時間を６０秒間測定した。プローブ実験において、全ての動物を標的象限とは反対の同じ開始位置から開放した。ＭＫ−８０１で治療した動物は、効果的に学習することができず、より長い遊泳距離と逃避待ち時間、およびこれらの動物が標的象限で費やした時間（他の象限と比較してほぼ平均）により示されるように、どこにプラットフォームがあったのかを憶えることができなかった。ＭＫ−８０１および対応するＰＯＰ阻害剤で治療した動物は試験でより良好な結果を示し、プラットフォームの位置を学習し（標的象限で費やした時間のより高い百分率に反映されている）、ＭＫ−８０１の影響は効果的に回復されたことが示された。動物を１週間休ませ、その後、さらに４日間訓練した。５日目に、プラットフォームを取り除き、第二評価を実施した。
【０１９５】
Ｔ迷路交替課題
ワーキングメモリをＴ迷路交替課題を用いて試験した。実験は一般的な寸法と手順に準じて、木で構成され黒く塗装されたＴ迷路で実施した。側小路を可動ドアにより主小路から隔絶した。馴化の１週間前に、全ての動物は一部食事制限をし、実験の残りの部分を通してそれを維持して、動物を自由に餌を摂取可能な場合の体重の８５％を維持するようにした。ビデオカメラをＴ迷路の上ほぼ１ｍに位置させて、試験セッションをビデオで撮影した。Ｔ迷路は、異なる実験の間ではなく、異なる動物の間にきれいにした。全実験は３つの部分：馴化、訓練および試験から構成されていた。馴化中、全ての動物を、これらの動物が２片の食物を食べるか、あるいは９０秒間が経過するまでＴ迷路上に配置した。これを１日３回５日間繰り返した。訓練中、全ての動物に対して１日当たり１日６回の実験をおこなった。各実験は強制試験と自由試験の２つの試験から構成されていた。強制試験では、齧歯動物をＴ迷路の一方の目標アームから１片の食物を強制的に得るようにし、他方の目標アームをドアでブロックしておいた。次に、動物を開始アームに戻し、１０秒の遅延期間を設けた。自由試験のはじめに、動物がどちらかの目標アームを選べるようにした。動物が強制試験中に強制的に入れられたアームと反対のアームを選んだ場合には、食物の褒美を与えた。動物が強制的に入れられたアームと同じアームを選んだ場合には、食物の褒美は与えなかった。試験間の間隔は５分であった。訓練期間は、対照動物が２日間連続で７０％以上の正しい選択をした後に終了した。動物が基準に到達するのに７〜１２日間かかった。１４日間で基準に到達しなかった動物は、研究から除去した。次に、齧歯動物を１０または４０秒の遅延期間で能力について試験した。動物に対して、試験日の間、３回の１０秒間の遅延と３回の４０秒間の遅延試験を実施した。薬剤試験のために、齧歯動物を薬剤に暴露してから１５分後に６回の１０秒遅延試験をおこなった。遅延の順序および強制試験食物位置（左または右）は、同じ遅延または同じ強制アーム位置を連続して３回の試験に使用しない限り、毎日ランダムとした。ゴールエントリーは、アームに４本の足が置かれたときとして定義した。
【０１９６】
物体認識試験について説明したのと同じ投与量および容量で、対応する評価ＰＯＰ阻害剤を試験セッションの３５分前に皮下注射し、１５分後にＭＫ−８０１を、または対照の場合にはＰＢＳを腹腔内注射した。
【０１９７】
対照動物は、訓練の１日目〜４日目の間でほぼ偶然レベルの結果（正しいアームエントリーのほぼ５０％）の学習曲線を示し、７０％の正しいアームエントリーのプラトーに到達するまで訓練の１１日目〜１４日目の間で徐々に改善を示した。１０秒遅延試験および４０秒遅延試験の結果も安定を維持した。ＭＫ−８０１で治療した動物は、交替課題を効果的に学習できず、遅延試験において偶然レベル未満の結果であった。ＭＫ−８０１および対応するＰＯＰ阻害剤で治療処置した動物は、試験結果がより良好で、遅延実験において対照動物と同様な学習曲線および保持メモリーを有し、したがって、ＭＫ−８０１の影響は効果的に回復された。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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