(57)【要約】本発明は、臨床的疾患の過程の早期に、または脳損傷および臨床症状の発生前に、Ａβアミロイドーシスを診断し、モニタリングし、処置効果を評価する方法に関する。対象のＣＮＳ中で生産される生体分子のインビボ代謝を測定する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるＡβアミロイドーシスを診断し、またはその進行もしくは処置をモニタリングする方法であって、対象からの生物学的試料中の、Ａβ３８、Ａβ４０またはＡβ４２を含むＡβ変異体のインビボ相対ラベリングを測定することと、Ａβ４２タンパク質変異体の相対ラベリングの、もう一つのＡβタンパク質変異体の相対ラベリングに対する比を算出することとを含み、１以外の比がＡβアミロイドーシスの存在を示す方法。
【請求項２】
Ａβ、Ａβ３８、Ａβ４０またはＡβ４２のインビボ相対ラベリングが、
ａ．Ａβが対象において合成される時にＡβに組み込まれうる標識成分を、対象に投与すること、
ｂ．該成分で標識されたＡβ変異体画分と該成分で標識されていないＡβ変異体画分とを含む生物学的試料を、対象から得ること、および
ｃ．標識Ａβ変異体の量および非標識Ａβ変異体の量を検出すること
によって測定され、標識Ａβ変異体の非標識Ａβ変異体に対する比が、対象における該Ａβ変異体の相対ラベリングを表す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生物学的試料が、脳脊髄液、血液、尿、唾液、および涙からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ａβ変異体の相対ラベリングがＣＳＦ生物学的試料において測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
Ａβ変異体の相対ラベリングが、対象に標識成分を投与した１０時間後に測定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
１０時間の時点で測定されたＡβ４２の、あるＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が、１より大きいことが、Ａβアミロイドーシスの存在を示す、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ａβ変異体の相対ラベリングが、対象に標識成分を投与した２７時間後に測定される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
２７時間の時点で測定されたＡβ４２の、あるＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が、１より小さいことが、Ａβアミロイドーシスの存在を示す、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ａβ４２の、あるＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が、血液生物学的試料において測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
標識成分が原子、または標識原子を持つ分子である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
原子が放射性同位体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
原子が非放射性同位体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
非放射性同位体が、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３３Ｓ、３４Ｓ、および３６Ｓからなる群より選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１４】
非放射性同位体が、アミノ酸の構成要素であるか、アミノ酸に結合される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
アミノ酸がロイシンであり、非放射性同位体が１３Ｃであり、タンパク質がＡβ変異体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
標識成分が対象に静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、または経口投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項１７】
標識タンパク質画分および非標識タンパク質画分を生物学的試料から精製することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
タンパク質が免疫沈降によって分離される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
標識Ａβ変異体の量および非標識Ａβ変異体の量が質量分析によって検出される、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
対象がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
対象におけるＡβアミロイドーシスを診断し、またはその進行もしくは処置をモニタリングする方法であって、対象からの生物学的試料中の、Ａβ３８、Ａβ４０またはＡβ４２を含むＡβ変異体のインビボ相対ラベリングを測定することと、該ラベリングを対照試料と比較することとを含み、ラベルの量の相違がＡβアミロイドーシスの存在を示す方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所によって付与されたＲ−０１−ＮＳ０６５６６７の下に、政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明はＡβアミロイドーシスの診断方法および処置方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は認知症の最も一般的な原因であり、公衆衛生上も問題が大きくなりつつある。この疾患は、現在、米国では５００万人を苦しめていると推定され、２０５０年には１３００万人まで増加すると予測されている（Ｈｅｒｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｄｉｓ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｄｉｓｏｒｄ．  １５（４）：  １６９−１７３）。ＡＤは、他の中枢神経系（ＣＮＳ）変性疾患と同様、タンパク質の生産、蓄積およびクリアランスの障害を特徴とする。ＡＤでは、タンパク質・アミロイド−β（Ａβ）の代謝調節不全が、疾患を持つ患者の脳にこのタンパク質が大量に集積すること、すなわちＡβアミロイドーシスによって示される。ＡＤは、記憶、認知機能、そして最終的には自立性の喪失につながる。この疾患は、患者とその家族に、重い個人的および経済的負担を強いる。この疾患は重症であり、人口に占める有病率が増加しつつあることから、より良い処置を開発することは、喫緊の課題である。
【０００４】
現在、症状を修飾する薬物治療がいくつか存在するが、疾患修飾的処置は存在しない。疾患修飾的処置は、おそらく、永久的な脳損傷が発生する前に施行されると、最も有効であるだろう。しかし、ＡＤの臨床診断がなされる時点までに、既に広範なニューロン喪失が起こっている（Ｐｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００１，  Ａｒｃｈ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ５８（９）：  １３９５−１４０２）。ＡＤを発症するリスクのある個体を臨床症状が発生する前に診断する手段や、疾患の発生を防止しまたはその進行を遅らせうる処置の効果を効果的に測定する手段は、現在のところ存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
それゆえに、ＡＤを発症するリスクのある人々を同定する方法が必要とされている。早期の同定と、Ａβ生成を標的とする薬物の効果を測定する能力とは、ＡＤの発生を防止しまたは遅延させ、薬物開発の努力を強化するのに、最も役立つであろう。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】６人の参加者に関して４８時間にわたる血中の標識Ａβ（ｌａｂｅｌｅｄ  Ａβ）パーセントを示すグラフである。９時間までにプラトーへの迅速な上昇が起こり、迅速なクリアランス速度を伴うことに注目されたい。
【０００７】
【図２】６人の参加者に関して３６時間にわたる血中の標識Ａβパーセント（青い丸）および１２人の参加者におけるＣＳＦ中の標識Ａβパーセント（赤い四角）を示すグラフである。
【０００８】
【図３】血液Ａβ動態がＣＮＳ  Ａβ標識動態よりも速いことを示すグラフである。９時間にわたる静脈内ラベリング（ｌａｂｅｌｉｎｇ）の間およびその後に、ＡＤ参加者から血液試料およびＣＳＦ試料を収集した。血漿Ａβラベリングは１時間以内に増加し、一方、ＣＳＦ  Ａβラベリングは５時間まで増加しなかった。高齢の参加者では、血液Ａβの半減期が２．１時間であり、ＣＮＳ  Ａβの半減期は１１．６時間である。
【０００９】
【図４】静脈内ラベリングの間およびその後の血液Ａβ動態を示す図である。Ａ．９時間の静脈内ラベリングの間およびその後の、ＡＤ参加者および対照からの血液試料。ラベリング相の間およびその後に、ＡＤ群は最初の１５時間にわたって標識Ａβを増加させた。ＢおよびＣ．標準化標識血漿Ａβ。標識血漿Ａβを各時間ごとに標識血漿ロイシンで標準化した（４Ｂには０〜９時間を図示し、４Ｃには１０〜１５時間を図示している）。ＡＤでは対照と比較して、標準化標識Ａβの増加が、５時間から１５時間まで認められる。
【００１０】
【図５】経口ラベリング後の血中のＡβ動態を示す図である。時刻ゼロに、単回経口量の標識ロイシンを、参加者に与えた。血液試料を４８時間にわたって１時間毎に収集した。血漿標識Ａβを測定した。動態曲線を示す。その後の用量漸増経口ラベリング試験により、血漿Ａβは低用量の経口標識ロイシンで十分に標識できることが明らかになった。比較のために標識ＣＳＦ  Ａβ曲線を示す。著しく速い血液Ａβの半減期と、その後の二次的なクリアランス効果を測定するために取得された長時間にわたる時間経過とに注目されたい。
【００１１】
【図６】Ａβトータル（Ａβ  ｔｏｔａｌ）、Ａβ４２、Ａβ４０、およびＡβ３８変異体の経時的定量を示すグラフである。ＡＤでは、特定Ａβ変異体の動態（例えばＡβ４２）が改変されうるので、標識Ａβ変異体の高感度かつ特異的な測定が可能になるように、新規な方法を開発した。パルス経口標識血漿試料からＡβ変異体を免疫沈降させ、動態解析のために定量した（Ａ）。標識Ａβ４２が（認知機能が正常なこの参加者では）他のＡβ変異体と比較して増大したピークと、より速いクリアランス（半減期約１時間）とを持っていたことに注目されたい。Ａβ変異体を定常状態ＩＶ標識ＣＳＦ試料から同様に加工し、動態解析のために定量した（Ｂ）。認知機能が正常なこのＰＥＴ  ＰｉＢ陰性参加者のＣＳＦにおける、類似する代謝作用に注目されたい。
【００１２】
【図７】１２人のＡＤ参加者（赤い三角）および１２人の対照（青い丸）のＣＮＳにおけるＡβ動態を示す図である。標識Ａβ４２および標識Ａβ４０の量を測定し、群間で比較することで、両Ａβ種の生産速度およびクリアランス速度を測定した。エラーバーはＳＥＭを示す。（Ａ）標準化標識Ａβ４２生産相。（Ｂ）Ａβ４２クリアランス相。（Ｃ）標準化標識Ａβ４０生産相。（Ｄ）Ａβ４０クリアランス相。（Ｅ）Ａβ４２およびＡβ４０の分率合成速度（ｆｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｒａｔｅ）。（Ｆ）Ａβ４２およびＡβ４０の分率クリアランス速度。
【００１３】
【図８】ＡＤおよび対照におけるＡβ生産のクリアランスに対する比をグラフで表した図である。Ａβ４２生産速度のクリアランス速度に対する比は対照ではバランスがとれているが（０．９５）、ＡＤの人々では高い（１．３５）。同様に、Ａβ４０の生産対クリアランス比も、対照（０．９９）と比較して、ＡＤでは増加している（１．３７）。平均±標準偏差がプロットされている（ｐ＜０．０５  ＡＮＯＶＡ）。
【００１４】
【図９】平均ＣＳＦ（Ａ）およびＡβ４０（Ｂ）濃度をグラフで表した図である。予想どおり、ＣＳＦ  Ａβ４２濃度はＡＤ群では対照群より低かった（ｐ＜０．０５）。平均±標準偏差がプロットされている。
【００１５】
【図１０】１２人のＡＤ参加者（赤い三角）および１２人の対照（青い丸）のＣＮＳにおける平均Ａβ動態の全時間経過をグラフで表した図である。平均ロイシン標準化標識Ａβ４２（Ａ）および平均ロイシン標準化標識Ａβ４０（Ｂ）の時間経過を１〜１８時間について示す。Ａβ４２（Ｃ）およびＡβ４０（Ｄ）の標識対非標識比の自然対数（ｌｎ）プロットを１８〜３６時間について示す。
【００１６】
【図１１】１３Ｃ６−Ｌｅｕ／１２Ｃ６−ＬｅｕのＨ：Ｌ比を経時的にプロットした２つのグラフである。（Ａ）ＰＩＢでアミロイド沈着を持たない正常な人からの試料、および（Ｂ）アミロイド沈着陽性であるＡＤ個体からの試料。
【００１７】
【図１２】５０人のＡＤ患者における１３Ｃ６−Ｌｅｕ／１２Ｃ６−ＬｅｕのＡβ４２：Ａβ４０  Ｈ：Ｌ比を、経時的にプロットしたグラフである。
【００１８】
【図１３】１０時間における１３Ｃ６−Ｌｅｕ／１２Ｃ６−ＬｅｕのＡβ４２：Ａβ４０  Ｈ：Ｌ比の相対ラベリングを示すプロットである。
【００１９】
【図１４】さまざまなＡβアイソフォームの相対ラベリング、１３Ｃ６−Ｌｅｕ／１２Ｃ６−ＬｅｕのＨ：Ｌ比を経時的に示すプロットである。
【００２０】
【図１５】動態トレーサー曲線の後端の中央部付近における同位体濃縮の比較によって、ＰＩＢ群を著しく有意に識別できることを示す３つのグラフである。図１５Ａは、ｙ軸上にグラフ化した２３時間におけるＡβ４２標識パーセント／Ａβ４０標識パーセントの比と、ｘ軸上にグラフ化したＰＩＢ染色とを示す。０．９の閾比を破線で示す。図１５Ｂは、ｙ軸上にグラフ化した２３時間および２４時間におけるＡβ４２標識パーセント／Ａβ４０標識パーセントの比の平均と、ｘ軸上にグラフ化したＰＩＢ染色とを示す。０．９の閾比を破線で示す。図１５Ｃは、ｋｅｘ４２の１０倍をＡβ４２とＡβ４０との不可逆的喪失に関する速度定数の比に加えた算出値（１０×ｋｅｘ４２＋ＦＴＲ比）を、ＰＩＢ染色の関数としてプロットしたものを示す。１．７５の閾比を破線で示す。ＭＣ＋＝ＰＥＴでＰＩＢ陽性であったＰＳＥＮ１またはＰＳＥＮ２変異を持つ患者；ＭＣ−＝ＰＥＴでＰＩＢ陰性であったＰＳＥＮ１またはＰＳＥＮ２変異を持つ患者；ＮＣ＝ノンキャリア変異キャリア同胞対照。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
好ましい実施形態の詳細な説明
対象におけるＡβアミロイドーシスを診断し、またはその進行もしくは処置をモニタリングする方法を開発した。本発明は、臨床的疾患の過程において早期になされる、またはＡＤを発症するリスクのある患者で脳損傷および臨床症状が発生する前になされる、Ａβアミロイドーシスの検出の正確度、および疾患進行のモニタリングの正確度を、著しく向上させる。実施例で例証するように、本方法は、好都合なことに、侵襲的な脊髄カテーテルを使用せずに、血中のＡβダイナミクスを測定することを可能にする。加えて、本方法は、Ａβを標的とする疾患修飾性治療薬候補の特異的試験を可能にする。
【００２２】
Ｉ．神経由来生体分子のインビボ代謝をモニタリングするための方法
本発明は、対象におけるアミロイド−β（Ａβ）タンパク質およびＡβタンパク質変異体の弁別的動態に起因するＡβアミロイドーシスを診断し、またはその進行もしくは処置をモニタリングするための方法を提供する。アルツハイマー病（ＡＤ）は、アミロイド−β（Ａβ）タンパク質およびＡβタンパク質変異体の生産の増加、クリアランスの減少、またはその両方に起因する、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるアミロイド斑の蓄積（Ａβアミロイドーシス）を特徴とする消耗性疾患である。Ａβアミロイドーシスに関連する非限定的な例として、認知機能障害、行動変容、異常言語機能、情動調節不全、発作、神経系の構造または機能の障害、およびアルツハイマー病または脳アミロイド血管症の発症のリスクの増加を挙げることができる
【００２３】
いくつかの実施形態では、対象におけるＡβ変異体のレベルを、アミロイドーシスを持たない個体におけるそのＡβ変異体のレベルと比較することにより、当業者は、Ａβアミロイドーシスに関連する症状が発症する前に、対象におけるＡβアミロイドーシスを診断することができるであろう。別の実施形態では、対象におけるＡβ変異体のレベルを、その対象におけるもう一つのＡβ変異体のレベルと比較することにより、当業者は、Ａβアミロイドーシスに関連する症状が発症する前に、その対象におけるＡβアミロイドーシスを診断することができるであろう。加えて、本発明は、対象における疾患修飾性治療薬の薬力学的効果の測定も可能にする。
【００２４】
（ａ）Ａβ変異体
本発明の方法は、１つまたは複数のＡβ変異体のインビボレベルを測定することを含む。本明細書において使用する用語「Ａβ変異体」は、全Ａβタンパク質、Ａβ４０、Ａβ４２、Ａβ３８、または他のＡβアイソフォームを指す。いくつかの実施形態では、標識Ａβ変異体のインビボレベルを測定することによって、Ａβ変異体のインビボレベルを測定することができる。インビボレベルの測定対象となりうるＡβ変異体の非限定的な例として、全Ａβタンパク質、Ａβ４０、Ａβ４２、またはＡβ３８を挙げることができる。ある実施形態では、標識Ａβタンパク質のインビボレベルを測定することができる。もう一つの実施形態では、標識Ａβ４０のインビボレベルを測定することができる。さらにもう一つの実施形態では、標識Ａβ４２のインビボレベルを測定することができる。もう一つの実施形態では、標識Ａβ３８のインビボレベルを測定することができる
【００２５】
別の実施形態では、Ａβ変異体のインビボ相対ラベリングを測定することによって、Ａβ変異体のインビボレベルを測定することができる。本明細書にいう「インビボ相対ラベリング（ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ）」とは、インビボで、標識された変異体のパーセントを指す。インビボ相対ラベリングの測定対象となりうるＡβ変異体の非限定的な例としては、Ａβタンパク質、Ａβ４０、Ａβ４２、またはＡβ３８を挙げることができる。ある実施形態では、Ａβタンパク質のインビボ相対ラベリングを測定することができる。もう一つの実施形態では、Ａβ４０のインビボ相対ラベリングを測定することができる。さらにもう一つの実施形態では、Ａβ４２のインビボ相対ラベリングを測定することができる。もう一つの実施形態では、Ａβ３８のインビボ相対ラベリングを測定することができる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、対象において、２つ以上のＡβタンパク質またはＡβタンパク質変異体のインビボ相対ラベリングを、インビボで測定することができる。いくつかの実施形態では、Ａβタンパク質とＡβ４２のインビボ相対ラベリングを測定することができる。別の実施形態では、Ａβタンパク質とＡβ４０のインビボ相対ラベリングを測定することができる。さらに別の実施形態では、Ａβタンパク質とＡβ３８のインビボ相対ラベリングを測定することができる。さらなる実施形態では、Ａβ４０タンパク質とＡβ３８のインビボ相対ラベリングを測定することができる。さらに別の実施形態では、Ａβタンパク質とＡβ３８のインビボ相対ラベリングを測定することができる。別の実施形態では、Ａβタンパク質、Ａβ４２およびＡβ４０のインビボ相対ラベリングを測定することができる。さらに別の実施形態では、Ａβタンパク質、Ａβ４０およびＡβ３８のインビボ相対ラベリングを測定することができる。さらに別の実施形態では、Ａβタンパク質、Ａβ４２およびＡβ３８のインビボ相対ラベリングを測定することができる。さらなる実施形態では、Ａβ４２、Ａβ４０およびＡβ３８のインビボ相対ラベリングを測定することができる。好ましい実施形態では、Ａβ４２タンパク質とＡβ４０のインビボ相対ラベリングを測定することができる。
【００２７】
Ａβのインビトロ消化産物（例えばＡβ６−１６、Ａβ１７−２８）の測定を使って、Ａβインビトロ消化産物を含むＡβタンパク質およびＡβ変異体のインビボ代謝を決定しうることは、当業者にはわかるであろう。いくつかの実施形態では、Ａβのインビトロ消化産物（例えばＡβ６−１６、Ａβ１７−２８）を測定することによって、１つまたは複数のＡβ変異体のインビボ相対ラベリングを測定することができる。
【００２８】
（ｂ）インビボ相対ラベリングの測定
Ａβ変異体を、それが中枢神経系において合成される時にインビボで標識し、そのＡβ変異体のラベリングを経時的に測定することによって、Ａβ変異体のインビボ相対ラベリングを測定することができる。これらの測定を使って、標識Ａβ変異体比またはパーセントを算出することができる
【００２９】
ｉ．ラベリング成分（ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）
Ａβ変異体は、それが中枢神経系において合成される時に、標識成分（ｌａｂｅｌｅｄ  ｍｏｉｅｔｙ）を使って標識することができる。Ａβ変異体の標識には数個の異なる成分を使用することができる。一般論として、本発明の方法において典型的に利用される２タイプのラベリング成分は、放射性同位体および非放射性（安定）同位体である。好ましい一実施形態では、非放射性同位体を使用し、質量分析によって測定することができる。好ましい安定同位体には、重水素２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１７または１８Ｏ、３３、３４、または３６Ｓなどがあるが、主要天然型として見出されるものよりも中性子が多いかまたは少ないかによって原子の質量を異なっている他のいくつかの安定同位体も有効であるだろうと考えられる。適切なラベル（ｌａｂｅｌ）は、一般に、検討中の生体分子の質量を、質量分析計でそれを検出することができるような形で、変化させるであろう。ある実施形態では、標識成分が非放射性同位体（例えば１３Ｃ）を含むアミノ酸である。あるいは、放射性同位体を使用して、標識生体分子を、質量分析計ではなく、シンチレーション計数器で測定することもできる。１つまたは複数の標識成分を同時に、または逐次的に使用することができる。
【００３０】
Ａβ変異体のラベルを提供するために数個のアミノ酸を使用しうることも、当業者には理解されるであろう。一般に、アミノ酸の選択は、次に挙げるようなさまざまな因子に基づく。（１）そのアミノ酸が一般にＡβ変異体の少なくとも１つの残基中に存在する。（２）そのアミノ酸は一般に、タンパク質合成の部位に迅速に到達することができ、血液脳関門の前後で迅速に平衡に達する。ロイシンは、ＣＮＳにおいて合成されるＡβ変異体などのタンパク質を標識するのに好ましいアミノ酸である。（３）そのアミノ酸は、理想的には、達成されるラベリングのパーセントがより高くなるように、必須アミノ酸（身体によって生産されないもの）であることができる。非必須アミノ酸も使用することはできるが、測定の正確度はおそらく低下するであろう。（４）そのアミノ酸ラベルは一般に、関心タンパク質の代謝に影響を及ぼさない（例えば極めて高用量のロイシンは筋代謝に影響を及ぼしうる）。そして、（５）所望のアミノ酸の入手可能性（すなわち、一部のアミノ酸は、他のアミノ酸よりはるかに高価であるか製造が難しい）。ある実施形態では、６つの１３Ｃ原子を含有する１３Ｃ６−フェニルアラニンを使って、Ａβ変異体を標識する。好ましい一実施形態では、１３Ｃ６−ロイシンを使って、Ａβ変異体を標識する。
【００３１】
標識アミノ酸の商業的供給源は、非放射性同位体も放射性同位体も、数多くある。一般に、標識アミノ酸は、生物学的に生産するか、合成的に生産することができる。生物学的に生産されるアミノ酸は、１３Ｃ、１５Ｎ、または当該生物がタンパク質を生産するときにアミノ酸に組み込まれる他の同位体の濃縮混合物中で成長させた生物（例えばケルプ／海藻）から得ることができる。次に、アミノ酸を分離し、精製する。あるいは、アミノ酸を既知の合成化学プロセスで作製することもできる。
【００３２】
ｉｉ．標識成分の投与
本発明の方法では、標識成分を対象に投与することができる。標識成分は、いくつかの方法で対象に投与することができる。好適な投与方法には、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、または経口などがある。好ましい一実施形態では、標識成分が静脈内注入によって投与される。もう一つの好ましい実施形態では、標識成分を経口摂取することができる。
【００３３】
標識成分は、選択した分析のタイプ（例えば定常状態またはボーラス／チェイス）に応じて、ある期間にわたってゆっくり投与するか、高用量単回投与として投与することができる。標識Ａβ変異体の定常状態レベルを達成するには、標識Ａβ変異体が高い信頼性で定量されうるように、一般にラベリング時間は十分な継続時間にすべきである。ある実施形態では、標識成分が標識ロイシンであり、標識ロイシンは９時間にわたって静脈内に投与される。もう一つの実施形態では、標識ロイシンが１２時間にわたって静脈内に投与される。さらにもう一つの実施形態では、標識ロイシンが経口投与される。もう一つの実施形態では、標識ロイシンが、パルスラベリング用の単回ボーラスとして、経口投与される。
【００３４】
標識成分の量（または用量）はさまざまであることができ、また実際にさまざまであろうことは、当業者には理解されるであろう。一般に、量は、次に挙げる因子に依存する（また次に挙げる因子によって見積もられる）。（１）所望する分析のタイプ。例えば、血漿中に約１５％標識ロイシンの定常状態を達成するには、１０分間で２ｍｇ／ｋｇのプライムドボーラス（ｐｒｉｍｅｄ  ｂｏｌｕｓ）の後に、９時間にわたる約２ｍｇ／ｋｇ／時が必要である。これに対し、定常状態が必要でないなら、標識ロイシンの高用量ボーラス（例えば１グラムまたは５グラムの標識ロイシン）を与えることができる。（２）分析されるＡβ変異体。例えば、Ａβ変異体が迅速に生産されている場合、必要なラベリング時間は短くなり、必要なラベルも−おそらく１時間で０．５ｍｇ／ｋｇ程度に−少なくなりうる。しかし大半のＡβ変異体は数時間〜数日の半減期を有するので、０．５ｍｇ／ｋｇ〜４ｍｇ／ｋｇで、４、９または１２時間の持続注入が使用される可能性が高いであろう。そして（３）ラベルの検出感度。例えば、ラベル検出の感度が増加するにつれて、必要なラベルの量は減少しうる。
【００３５】
２つ以上のラベルを一人の対象で使用しうることは、当業者には理解されるであろう。これにより、同じＡβ変異体の多重ラベリングが可能になり、異なる時点におけるそのＡβ変異体の生産またはクリアランスに関する情報が得られるであろう。例えば、第１ラベルを初回期間にわたって対象に与えた後、薬理作用物質（薬物）を与え、次に第２ラベルを投与することができる。一般に、この対象から得られる試料の分析は、同じ対象における薬物の薬力学的効果を直接測定する、薬物投与前と薬物投与後の代謝の測定値を与えるであろう。
【００３６】
あるいは、Ａβ変異体のラベリングを増加させるため、ならびにより広範なＡβ変異体のラベリングを得るために、多重ラベルを同時に使用することもできる。
【００３７】
ｉｉｉ．生物学的試料
本発明の方法では、標識Ａβ変異体のインビボ代謝を決定することができるように、対象から生物学的試料が得られる。好適な生物学的試料には、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血漿、血清、尿、唾液、汗、および涙などがあるが、これらに限定されるわけではない。本発明の一実施形態では、生物学的試料がＣＳＦから採取される。代替的一実施形態では、生物学的試料が尿から収集される。好ましい実施形態では、生物学的試料が血液から収集される。本明細書にいう「血液」は、血漿または血清のどちらかを指す。
【００３８】
脳脊髄液は、留置ＣＳＦカテーテルを使って、または留置ＣＳＦカテーテルを使わずに、腰椎穿刺によって得ることができる（経時的に複数回の収集を行うのであればカテーテルが好ましい）。血液は、静脈内カテーテルを使って、または静脈内カテーテルを使わずに、静脈穿刺によって収集し、当技術分野で知られている方法で加工することができる。尿は、簡単な採尿によって、またはより正確にはカテーテルを使って、収集することができる。唾液と涙は、標準的な医薬品適正製造基準（ＧＭＰ）法を使った直接収集によって収集することができる。
【００３９】
標識アミノ酸の投与後に１つまたは複数の試料を対象から収集することになる。当業者には理解されるであろうとおり、試料の数およびそれらをいつ採取するかは、一般に、次に挙げるようないくつかの因子に依存するであろう：分析のタイプ、投与のタイプ、関心対象のＡβ変異体、代謝の速度、検出のタイプなど。いくつかの実施形態において、本発明の方法では、当該対象に関するベースラインを得るために、第１生物学的試料が、ラベルの投与前に対象から採取される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、血液またはＣＳＦの試料が、３６時間にわたって１時間毎に採取される。あるいは、試料を２時間毎に、またはそれより低い頻度で、採取してもよい。ある実施形態では、標識成分の投与の約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５時間後に、ＣＳＦの試料が採取される。もう一つの実施形態では、標識成分の投与の約９、１０、または１１時間後にＣＳＦの試料が採取される。さらにもう一つの実施形態では、標識成分の投与の約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６時間後にＣＳＦの試料が採取される。さらにもう一つの実施形態では、標識成分の投与の約２６、２７または２８時間後にＣＳＦの試料が採取される。好ましい一実施形態では、標識成分の投与の約１０時間後にＣＳＦの試料が採取される。もう一つの好ましい実施形態では、標識成分の投与の約２７時間後にＣＳＦの試料が採取される。
【００４１】
ある実施形態では、標識成分の投与の約１、２、３、４、５、６、７、８、または９時間後に血液試料が採取される。もう一つの実施形態では、標識成分の投与の約５、６、７、８、９、１０、１１、または１２時間後に血液試料が採取される。さらにもう一つの実施形態では、標識成分の投与の約１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６時間後に血液試料が採取される。
【００４２】
一般に、生産相中に得られた生物学的試料は、Ａβ変異体の合成の速度を決定するために使用することができ、クリアランス相中に採取された生物学的試料は、Ａβ変異体のクリアランス速度を決定するために使用することができる。ＣＳＦの場合、生産相は典型的にはラベリング後、最初の１２時間にあり、一方、クリアランス相は、典型的には、ラベリングの２４〜３６時間後である。血液の場合、生産相は典型的にはラベリング後、最初の３時間であり、一方、クリアランス相は、典型的には、ラベリング後、約４〜約１０時間である。代替的一実施形態では、タンパク質合成速度およびクリアランス速度に応じて、１時間から数日または数週間の間隔を空けて、試料を採取することができる。
【００４３】
ｉｖ．検出
本発明では、生物学的試料中の標識Ａβの量および非標識Ａβの量を検出することができる。標識および非標識Ａβを検出するための好適な方法は、それを標識するために使用する標識成分のタイプに応じて異なることができ、また実際に異なるであろう。標識成分が非放射標識アミノ酸である場合、検出方法は、典型的には、非標識タンパク質に対する標識タンパク質の質量の変化を検出するのに足りる感度を持たなければならない。好ましい一実施形態では、標識Ａβと非標識Ａβの間の質量の相違を検出するために、質量分析が使用される。ある実施形態では、ガスクロマトグラフィー質量分析が使用される。代替的一実施形態では、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析が使用される。好ましい一実施形態では、高分解能タンデム質量分析が使用される。
【００４４】
Ａβを生物学的試料中の他のタンパク質および生体分子から分離するために、追加の技法を利用してもよい。一例として、Ａβを質量分析法で分析する前に、Ａβを単離、精製するために、免疫沈降を使用することができる。あるいは、クロマトグラフィー機構を持つ質量分析計を使って、免疫沈降なしでタンパク質を単離した後、Ａβをそのまま測定してもよい。例示的一実施形態では、Ａβを免疫沈降させてから、エレクトロスプレーイオン化源を装備したタンデムＭＳと接続された液体クロマトグラフィーシステム（ＬＣ−ＥＳＩ−タンデムＭＳ）によって分析する。
【００４５】
本発明では、同じ生物学的試料中の複数のＡβ変異体を同時に測定することもできる。すなわち、非標識Ａβの量と標識Ａβの量の両方を、複数のＡβ変異体について、個別にまたは同時に検出し、測定することができる。したがって本発明は、Ａβ変異体の合成およびクリアランスの変化を大規模にスクリーニングするため（すなわちプロテオミクス／メタボロミクス）の有用な方法を提供し、ＡＤの基礎にある病態生理に関与するＡβ変異体を検出し、測定するための高感度な手段を提供する。
【００４６】
ｖ．Ａβ変異体の相対ラベリングの比
生物学的試料中の標識および非標識Ａβ変異体の量を使って、試料中のＡβ変異体の相対ラベリングを決定することができる。本発明によれば、試料中のＡβ変異体の相対ラベリングとは、試料中の標識Ａβ変異体の非標識Ａβ変異体に対する比である。生物学的試料中のＡβ変異体の相対ラベリングが、対象における該Ａβ変異体の代謝に正比例することは、当業者にはわかるであろう。
【００４７】
（ｃ）相対ラベリングの比および診断
本発明の方法は、あるＡβ変異体の相対ラベリングの、もう一つのＡβ変異体の相対ラベリングに対する比を算出することを含みうる。任意の２つのＡβ変異体の相対ラベリングが、所与の試料において類似している場合、前記２つのＡβ変異体の相対ラベリングの比が約１になりうることは、当業者にはわかるであろう。逆に、所与の試料において、いずれか１つのＡβ変異体の相対ラベリングが、他のＡβ変異体の相対ラベリングとは異なる場合、その生物学的試料における前記Ａβ変異体のもう一つのＡβ変異体に対する相対ラベリングの比は、１ではない数字（すなわち１より大きい数字または１より小さい数字）になりうる。
【００４８】
実施例において例証するように、本発明者らは、健常対象におけるＡβ変異体の相対ラベリングは、所与の時点において採取された所与の試料において類似していることを発見した。それゆえに、健常対象における任意のＡβ変異体の他の任意のＡβ変異体に対する相対ラベリングの比は、約１であろう。驚いたことに、本発明者らは、所与の時間に採取された所与の試料において、Ａβアミロイドーシスを持つ対象におけるＡβ４２の相対ラベリングが、他のＡβ変異体の相対ラベリングとは異なることも発見した。それゆえに、Ａβアミロイドーシスを持つ対象では、Ａβ４２の他の任意のＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が、１ではない数字になるであろう。言い換えると、ある対象において、Ａβ４２の他の任意のＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が約１であることは、Ａβアミロイドーシスが存在しないことを示す。逆に、ある対象において、Ａβ４２の他の任意のＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が１以外であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。
【００４９】
いくつかの実施形態では、Ａβタンパク質のＡβ４２に対する相対ラベリングの比を測定することができる。別の実施形態では、Ａβ４２のＡβタンパク質に対する相対ラベリングの比を測定することができる。さらに別の実施形態では、Ａβタンパク質のＡβ４０に対する相対ラベリングの比を測定することができる。さらなる実施形態では、Ａβ４０のＡβタンパク質変異体に対する相対ラベリングの比を測定することができる。さらに別の実施形態では、Ａβタンパク質のＡβ３８に対する相対ラベリングの比を測定することができる。別の実施形態では、Ａβ３８のＡβタンパク質変異体に対する相対ラベリングの比を測定することができる。さらなる実施形態では、Ａβ４０のＡβ３８に対する相対ラベリングの比を測定することができる。さらなる実施形態では、Ａβ３８のＡβ４０に対する相対ラベリングの比を測定することができる。さらなる実施形態では、Ａβ４２のＡβ３８に対する相対ラベリングの比を測定することができる。別の実施形態では、Ａβ３８のＡβ４２に対する相対ラベリングの比を測定することができる。いくつかの実施形態では、Ａβ４０のＡβ４２に対する相対ラベリングの比を測定することができる。好ましい実施形態では、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比を測定することができる。
【００５０】
実施例において説明するように、約４時間〜約２２時間の時点で採取したＣＳＦ試料では、Ａβアミロイドーシスを持つ対象におけるＡβ４２の相対ラベリングが、他のＡβ変異体の相対ラベリングより高いであろう。それゆえに、約４時間〜約１７時間の時点で採取したＣＳＦ試料では、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約１より大きいであろう。いくつかの実施形態では、約４時間〜約２２時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１より大きいことが、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。別の実施形態では、約４時間〜約１７時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１より大きいことが、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。ある実施形態では、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７時間またはそれ以上の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１より大きいことが、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。もう一つの実施形態では、約８、９、１０、１１、１２時間またはそれ以上の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１より大きいことが、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。好ましい一実施形態では、約１０時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１より大きいことが、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。
【００５１】
いくつかの実施形態では、約４時間〜約２２時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４またはそれ以上であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。別の実施形態では、約４時間〜約１７時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約１．０１、１．０２、１．０３、１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９、１．１、１．２、１．３、１．４、または１．５であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。さらに別の実施形態では、約４時間〜約２２時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約１．０９、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。さらなる実施形態では、約４時間〜約２２時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。別の実施形態では、約４時間〜約２２時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４またはそれ以上であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、約６時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０またはそれ以上であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。別の実施形態では、約６時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５またはそれ以上であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。さらに別の実施形態では、約６時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１．４、１．４１、１．４２、１．４３、１．４４、１．４５、１．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５，、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７、１、１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、１．９、１．９１、１．９２、１．９３、１．９４、１．９５、１．９６、１．９７、１．９８、１．９９、２、２．１、２．１、２．３、２．４、２．５またはそれ以上であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。
【００５３】
いくつかの実施形態では、約７時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０またはそれ以上であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。別の実施形態では、約７時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５またはそれ以上であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。さらに別の実施形態では、約７時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１．４、１．４１、１．４２、１．４３、１．４４、１．４５、１．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７、１、１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、１．９、１．９１、１．９２、１．９３、１．９４、１．９５、１．９６、１．９７、１．９８、１．９９、２、２．１、２．１、２．３、２．４、２．５またはそれ以上であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。
【００５４】
いくつかの実施形態では、約８時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２，１、２．２、２．３、２．４、２．５またはそれ以上であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。別の実施形態では、約８時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１．２、１．２１、１．２２、１．２３、１．２４、１．２５、１．２６、１．２７、１．２８、１．２９、１．３、１．３１、１．３２、１．３３、１．３４、１．３５、１．３６、１．３７、１．３８、１．３９、１．４、１．４１、１．４２、１．４３、１．４４、１．４５、１．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７、１、１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、１．９、１．９１、１．９２、１．９３、１．９４、１．９５、１．９６、１．９７、１．９８、１．９９、２、２．１、２．１、２．３、２．４、２．５またはそれ以上であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。
【００５５】
いくつかの実施形態では、約９時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２，１、２．２、２．３、２．４、２．５またはそれ以上であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。別の実施形態では、約９時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１．２、１．２１、１．２２、１．２３、１．２４、１．２５、１．２６、１．２７、１．２８、１．２９、１．３、１．３１、１．３２、１．３３、１．３４、１．３５、１．３６、１．３７、１．３８、１．３９、１．４、１．４１、１．４２、１．４３、１．４４、１．４５、１．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７、１、１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、１．９、１．９１、１．９２、１．９３、１．９４、１．９５、１．９６、１．９７、１．９８、１．９９、２、２．１、２．１、２．３、２．４、２．５またはそれ以上であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す
【００５６】
いくつかの好ましい実施形態では、約１０時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２またはそれ以上であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。別の好ましい実施形態では、約１０時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１．２、１．２１、１．２２、１．２３、１．２４、１．２５、１．２６、１．２７、１．２８、１．２９、１．３、１．３１、１．３２、１．３３、１．３４、１．３５、１．３６、１．３７、１．３８、１．３９、１．４、１．４１、１．４２、１．４３、１．４４、１．４５、１．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、１．７、１、１、１．７２、１．７３、１．７４、１．７５、１．７６、１．７７、１．７８、１．７９、１．８、１．８１、１．８２、１．８３、１．８４、１．８５、１．８６、１．８７、１．８８、１．８９、１．９、１．９１、１．９２、１．９３、１．９４、１．９５、１．９６、１．９７、１．９８、１．９９、２またはそれ以上であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。さらに別の好ましい実施形態では、約１０時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１．２５、１．２６、１．２７、１．２８、１．２９、１．３、１．３１、１．３２、１．３３、１．３４、１．３５、１．３６、１．３７、１．３８、１．３９、１．４、１．４１、１．４２、１．４３、１．４４、１．４５、１．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５、１．６６、１．６７、１．６８、１．６９、または１．７であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。さらに別の好ましい実施形態では、約１０時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１．３、１．３１、１．３２、１．３３、１．３４、１．３５、１．３６、１．３７、１．３８、１．３９、１．４、１．４１、１．４２、１．４３、１．４４、１．４５、１．４６、１．４７、１．４８、１．４９、１．５、１．５１、１．５２、１．５３、１．５４、１．５５、１．５６、１．５７、１．５８、１．５９、１．６、１．６１、１．６２、１．６３、１．６４、１．６５であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。
【００５７】
実施例において説明するように、約２２時間〜約３２時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβアミロイドーシスを持つ対象におけるＡβ４２変異体の相対ラベリングは、他のＡβ変異体の相対ラベリングよりも低いであろう。それゆえに、約２２時間〜約３２時間の時点で採取したＣＳＦ試料におけるＡβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比は、約１未満であろう。
【００５８】
いくつかの実施形態では、約２２時間〜約３２時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約１未満であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。ある実施形態では、約２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、もしくは３２時間またはそれ以上の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１未満であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。もう一つの実施形態では、約２５、２６、２７、２８、２９時間またはそれ以上の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１未満であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。さらにもう一つの実施形態では、約２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１時間またはそれ以上の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１未満であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。
【００５９】
いくつかの実施形態では、約２３時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１未満であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。ある実施形態では、約２３時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５、０．４９、０．４８、０．４７、０．４６、０．４５、０．４４、０．４３、０．４２、０．４１、０．４、０．３９、０．３８、０．３７、０．３６、０．３５、０．３４、０．３３、０．３２、０．３１、０．３、０．２９、０．２８、０．２７、０．２６、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２、０．１、またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。もう一つの実施形態では、約２３時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、約２４時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１未満であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。ある実施形態では、約２４時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５、０．４９、０．４８、０．４７、０．４６、０．４５、０．４４、０．４３、０．４２、０．４１、０．４、０．３９、０．３８、０．３７、０．３６、０．３５、０．３４、０．３３、０．３２、０．３１、０．３、０．２９、０．２８、０．２７、０．２６、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２、０．１、またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。もう一つの実施形態では、約２４時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、約２５時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１未満であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。ある実施形態では、約２５時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５、０．４９、０．４８、０．４７、０．４６、０．４５、０．４４、０．４３、０．４２、０．４１、０．４、０．３９、０．３８、０．３７、０．３６、０．３５、０．３４、０．３３、０．３２、０．３１、０．３、０．２９、０．２８、０．２７、０．２６、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２、０．１、またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。もう一つの実施形態では、約２５時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、約２６時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１未満であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。ある実施形態では、約２６時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５、０．４９、０．４８、０．４７、０．４６、０．４５、０．４４、０．４３、０．４２、０．４１、０．４、０．３９、０．３８、０．３７、０．３６、０．３５、０．３４、０．３３、０．３２、０．３１、０．３、０．２９、０．２８、０．２７、０．２６、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２、０．１、またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。もう一つの実施形態では、約２６時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、約２８時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１未満であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。ある実施形態では、約２８時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５、０．４９、０．４８、０．４７、０．４６、０．４５、０．４４、０．４３、０．４２、０．４１、０．４、０．３９、０．３８、０．３７、０．３６、０．３５、０．３４、０．３３、０．３２、０．３１、０．３、０．２９、０．２８、０．２７、０．２６、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２、０．１、またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。もう一つの実施形態では、約２８時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、約２９時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１未満であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。ある実施形態では、約２９時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５、０．４９、０．４８、０．４７、０．４６、０．４５、０．４４、０．４３、０．４２、０．４１、０．４、０．３９、０．３８、０．３７、０．３６、０．３５、０．３４、０．３３、０．３２、０．３１、０．３、０．２９、０．２８、０．２７、０．２６、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２、０．１、またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。もう一つの実施形態では、約２９時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、約３０時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１未満であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。ある実施形態では、約３０時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５、０．４９、０．４８、０．４７、０．４６、０．４５、０．４４、０．４３、０．４２、０．４１、０．４、０．３９、０．３８、０．３７、０．３６、０．３５、０．３４、０．３３、０．３２、０．３１、０．３、０．２９、０．２８、０．２７、０．２６、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２、０．１、またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。もう一つの実施形態では、約３０時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、約３１時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１未満であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。ある実施形態では、約３１時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５、０．４９、０．４８、０．４７、０．４６、０．４５、０．４４、０．４３、０．４２、０．４１、０．４、０．３９、０．３８、０．３７、０．３６、０．３５、０．３４、０．３３、０．３２、０．３１、０．３、０．２９、０．２８、０．２７、０．２６、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２、０．１、またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。もう一つの実施形態では、約３１時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。
【００６７】
好ましい実施形態では、約２７時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１未満であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。好ましい一実施形態では、約２７時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５、０．４９、０．４８、０．４７、０．４６、０．４５、０．４４、０．４３、０．４２、０．４１、０．４、０．３９、０．３８、０．３７、０．３６、０．３５、０．３４、０．３３、０．３２、０．３１、０．３、０．２９、０．２８、０．２７、０．２６、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２、０．１、またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。もう一つの好ましい実施形態では、約２７時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。
【００６８】
好ましい一実施形態では、約２７時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が約１未満であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。さらにもう一つの好ましい実施形態では、約２７時間の時点で採取したＣＳＦ試料において、Ａβ４２のＡβ４０に対する相対ラベリングの比が、約０．７、０．６、０．５、０．４、または約０．３であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。
【００６９】
約１時間〜約３２時間の時点で採取した血液試料において、Ａβアミロイドーシスを持つ対象におけるＡβ４２変異体の相対ラベリングは、他のＡβ変異体の相対ラベリングより高いであろう。それゆえに、約１時間〜約３２時間の時点で採取した血液試料において、Ａβ４２の、もう一つのＡβ変異体に対する相対ラベリングの比は、約１より大きいであろう。いくつかの実施形態では、約１時間〜約３２時間の時点で採取した血液試料において、Ａβ４２の、もう一つのＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が、約１より大きく、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。ある実施形態では、約１時間〜約４時間、例えば約１、２、３、または４時間またはそれ以上の時点で採取した血液試料において、Ａβ４２の、もう一つのＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が約１より大きく、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。もう一つの実施形態では、約１０分、１５分、３０分、１時間、９０分、２時間、２．５時間、３時間、または３．５時間の時点で採取した血液試料において、Ａβ４２の、もう一つのＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が約１より大きく、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。さらにもう一つの実施形態では、約１０分〜６０分、３０分〜９０分、６０分〜２時間、９０分〜２．５時間、または２時間〜３時間の間に採取した血液試料において、Ａβ４２の、もう一つのＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が約１より大きく、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ラベリング後、約０〜約３時間の間に採取した血液試料において、Ａβ４２の、あるＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が、約１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４またはそれ以上であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。別の実施形態では、約０〜約３時間の間に採取した血液試料において、Ａβ４２の、あるＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が、約１．０１、１．０２、１．０３、１．０４、１．０５、１．０６、１．０７、１．０８、１．０９、１．１、１．２、１．３、１．４、または１．５であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。さらに別の実施形態では、約０〜約４時間の間に採取した血液試料において、Ａβ４２の、あるＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が、約１．０９、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。さらなる実施形態では、約０〜約３時間の間に採取した血液試料において、Ａβ４２の、あるＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が、約１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。別の実施形態では、約０〜約３時間の間に採取した血液試料において、Ａβ４２の、あるＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が、約２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４またはそれ以上であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、約４．５時間〜約１０時間の間に採取した血液試料において、Ａβ４２の、もう一つのＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が約１未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。ある実施形態では、ラベリング後、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、もしくは３２時間またはそれ以上の時点で採取した血液試料において、Ａβ４２の、もう一つのＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が、約１未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。もう一つの実施形態では、約４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、もしくは９．５時間またはそれ以上の時点で採取した血液試料において、Ａβ４２の、もう一つのＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が、約１未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ラベリング後、約５〜約９時間の間に採取した血液試料において、Ａβ４２の、あるＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が、約１未満であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。ある実施形態では、約５〜約９時間の時点で採取した血液試料において、Ａβ４２の、あるＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５、０．４９、０．４８、０．４７、０．４６、０．４５、０．４４、０．４３、０．４２、０．４１、０．４、０．３９、０．３８、０．３７、０．３６、０．３５、０．３４、０．３３、０．３２、０．３１、０．３、０．２９、０．２８、０．２７、０．２６、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２、０．１、またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。もう一つの実施形態では、約５〜約９時間の時点で採取した血液試料において、Ａβ４２の、あるＡβ変異体に対する相対ラベリングの比が、約０．９、０．８９、０．８８、０．８７、０．８６、０．８５、０．８４、０．８３、０．８２、０．８１、０．８、０．７９、０．７８、０．７７、０．７６、０．７５、０．７４、０．７３、０．７２、０．７１、０．７、０．６９、０．６８、０．６７、０．６６、０．６５、０．６４、０．６３、０．６２、０．６１、０．６、０．５９、０．５８、０．５７、０．５６、０．５５、０．５４、０．５３、０．５２、０．５１、０．５またはそれ未満であって、Ａβアミロイドーシスの存在を示しうる。
【００７３】
例示的一実施形態では、対象に標識ロイシンを投与し、３６時間にわたって定期的に１つまたは複数の生物学的試料を収集することによって、Ａβ４２およびＡβ４０のインビボ相対ラベリングが測定される。生物学的試料は血漿またはＣＳＦから収集することができる。生物学的試料中の標識および非標識Ａβの量は、典型的には、免疫沈降と、それに続くＬＣ−ＥＳＩ−タンデムＭＳとによって決定される。Ａβ４２およびＡβ４０の相対ラベリングを決定するために、これらの測定から、標識Ａβの、非標識Ａβに対する比を算出することができる。次に、所与の生物学的試料において、Ａβ４２の相対ラベリングの、Ａβ４０の相対ラベリングに対する比を算出することができる。所与の試料におけるＡβ４２の相対ラベリングの、Ａβ４０の相対ラベリングに対する比が、１以外であることは、Ａβアミロイドーシスの存在を示す。
【００７４】
ＩＩ．神経学的疾患および神経変性疾患を診断しまたはその進行もしくは処置をモニタリングするためのキット
本発明は、対象における２つのＡβ変異体の相対ラベリングの比を測定することによってＡβアミロイドーシスを診断しまたはその進行もしくは処置をモニタリングするためのキットを提供する。一般にキットは、標識アミノ酸、標識アミノ酸を投与するための手段、生物学的試料を経時的に収集するための手段、および２つのＡβ変異体の相対ラベリングの比を算出することができるように、標識タンパク質の非標識タンパク質に対する比を検出し、決定するための説明書を含む。２つのＡβ変異体の相対ラベリングの比が約１であることは、Ａβアミロイドーシスが存在しないことを示し、一方、２つのＡβ変異体の相対ラベリングの比が１以外であることは、Ａβアミロイドーシスが存在しないことをしめす。これらの比較は、医師が、ＡＤの出現を予測し、ＡＤの発生を診断し、Ａβアミロイドーシスの進行をモニタリングし、またはＡβアミロイドーシスの処置の有効性を検証することを可能にしうる。好ましい一実施形態では、キットが、１３Ｃ６−ロイシンまたは１３Ｃ６−フェニルアラニンを含み、測定されるＡβ変異体がＡβ４２およびＡβ４０であり、評価される疾患がＡＤである。
【００７５】
定義
別段の定義がある場合を除き、本明細書において使用される技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されている意味を有する。当業者は、本発明において使用される用語の多くについて、その一般的定義を、次に挙げる参考文献に見ることができる：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎら「Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（第２版、１９９４）；  「Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」（Ｗａｌｋｅｒ編、１９８８）；「Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」第５版、Ｒ．  Ｒｉｅｇｅｒら（編）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ  （１９９１）；およびＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ「Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（１９９１）。本明細書において使用する以下の用語は、別段の明記がある場合を除き、それらに割り当てられた意味を有する
【００７６】
「同位体」とは、核の原子番号は同じであるが、含有する中性子の数が異なるために質量数が異なっている、所与の元素の全ての形態を指す。非限定的な一例として、１２Ｃと１３Ｃはどちらも炭素の安定同位体である。
【００７７】
「遅延時間」は、一般に、生体分子が最初に標識された時点から標識生体分子が検出されるまでの時間の遅延を指す。
【００７８】
「代謝」は、生体分子の合成、輸送、分解、修飾、またはクリアランス速度の任意の組み合わせを指す。
【００７９】
「代謝指数」は、関心生体分子の分率合成速度（ＦＳＲ）および分率クリアランス速度（ＦＣＲ）を含む測定値を指す。正常個体と罹患個体からの代謝指数の比較は、神経学的疾患または神経変性疾患の診断またはモニタリングに役立ちうる。
【００８０】
「神経由来細胞」には、例えばニューロン、アストロサイト、ミクログリア、脈絡叢細胞、上衣細胞、他のグリア細胞など、血液脳関門内の全ての細胞が包含される。
【００８１】
「定常状態」は、指定の期間において測定されるパラメータの変化が有意でない状態を指す。
【００８２】
「合成速度」は、関心生体分子が合成される速度を指す。
【００８３】
代謝トレーサー研究において、「安定同位体」とは、最も存在量が多い天然同位体より存在量が少ない非放射性同位体である。
【００８４】
本明細書にいう「対象」は、中枢神経系を有する生きた生物を意味する。特に対象は哺乳動物である。好適な対象には、研究動物、伴侶動物、農用動物、および動物園動物などが含まれる。好ましい対象はヒトである。
【実施例】
【００８５】
本発明の好ましい実施形態を実証するために、以下に実施例を挙げる。
【００８６】
実施例１．血液におけるＡβの代謝回転
アミロイド−β（Ａβ）がＡＤにおいて中心的役割を果たすこと、より具体的には、毒性型のＡβの蓄積とコンフォメーション変化がＡＤ病理発生の主要な一因であることは、遺伝学的研究、生化学的研究、および動物モデル研究によって、強く裏付けられている。
【００８７】
生きているヒトの中枢神経系におけるＡβ代謝を直接測定するための先駆的アプローチが最近開発された。この方法では、参加者を研究病院の病室に入院させ、１時間毎に血液試料と脳脊髄液とを得ることができるように、２本のＩＶカテーテルと１本の腰椎脊髄カテーテルとを設置する必要がある。この方法を使って、ヒト脳および脳脊髄液（ＣＳＦ）ではＡβが迅速な代謝（８〜１０時間の半減期）を有することが、最近の研究によって実証されている。本発明者らは、最近、ＡＤの疾患修飾的処置候補であるγ−セクレターゼ阻害剤の用量関連効果を測定し、ヒト中枢神経系におけるＡβの生産の直接阻害を実証した。加えて、極めて軽度のＡＤを持つ患者でさえ、同齢対照群と比較して、中枢神経系にＡβ代謝障害を持つことが、予備データによって示唆されている。
【００８８】
これらの知見はＡＤの原因の理解および処置の開発にとって重要であるが、血液内の標識Ａβを測定するための方法が今まではなかったので、血液Ａβダイナミクスはよくわかっていない。そのような方法が利用可能になれば、Ａβの生理（および病態生理）が、脳におけるＡβ生産、血液および脳脊髄液への輸送、ならびに血液からのクリアランスの定量的尺度として、より良く理解されるであろう。血液標識Ａβアッセイにより、侵襲的な脊髄カテーテルを使わずに、Ａβの生理および病態生理を測定することが可能になると共に、ＡＤに関する診断検査の大規模調査およびＡβを標的とする疾患修飾性治療薬候補の特異的試験が可能になるだろう。
【００８９】
標識血液Ａβを測定するために安定同位体ラベリング動態免疫沈降−質量分析アプローチを開発した。これにより、ヒトにおける血液Ａβの生産、コンパートメント間の輸送、およびクリアランス速度を測定することが可能になる。
【００９０】
血液／血漿Ａβの半減期は、ＣＮＳ／ＣＳＦにおける半減期とは明確に異なり、生産において（ｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）２〜３時間のｔ１／２である（図１）。これはＣＳＦで測定される９〜１０時間の半減期とは対照的である（Ｂａｔｅｍａｎ  ｅｔ．  ａｌ  ２００６）。図１のために、対象に標識アミノ酸（１３Ｃ６ロイシン；２ｍｇ／ｋｇで１０分間のプライムド注入（ｐｒｉｍｅｄ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ）後に、２ｍｇ／ｋｇ／時間で８時間５０分にわたる、９時間の注入）を投与し、次に０〜１５時間は１時間毎に、３５時間までは奇数時間毎に、そして３６時間および４８時間の時点で、血液試料を採取した。合計２８個の試料を採取した。試料は凍結保存した。次に、試料を融解し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを加えた。試料を遠心分離し、次に、各時点において、２つの血漿試料からプールした（合計２ｍｌ）。次に、後述のように、Ａβを試料から免疫沈降した。
１日目：
１．試料を氷上でゆっくり融解する（約１時間）。
２．融解したら、２０μｌのコンプリート・プロテアーゼ・インヒビター（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）を加える。
３．粒状物を除去するために、Ａｌｌｅｇｒａ遠心機中、４℃で、１５分間、１４，０００ＲＰＭで遠心分離する。
４．２つの試料からの上清をプールする（１５ｍｌチューブに２ｍｌ）。
５．培地標準（ｍｅｄｉａ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を希釈する−５０μｌを２ｍｌ  ＰＢＳに。
６．０．０２％アジドを含む１×ＰＢＳでＨＪ５．１（Ａβ特異的抗体）ビーズを２回洗浄する。最後に５０％ビーズスラリーにする。
７．２２０μｌの５Ｍ塩酸グアニジン溶液を加える。
８．２０μｌのＴｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ中５％、最終０．０５％用）を加える。
９．５μｌのＩＳＴＤ（Ｎ１５−Ａβ４０／４２）を加える。
１０．３０μｌの抗体ビーズ（約２０ｎｇのＡβに十分な５０％スラリー）を加える。
１１．４℃で終夜インキュベートする。
２日目：
１２．ビーズを４５００ＲＰＭで５分間遠心分離する。
１３．上清を新しいチューブに取り出し、保存する（血漿のみ）。
１４．１ｍｌの０．５Ｍ塩酸グアニジン溶液を加える。
１５．１０μｌの５％（最終０．０５％用）Ｔｗｅｅｎ−２０を加える。
１６．再懸濁したら、ビーズを１．５ｍｌ  Ａｘｙｇｅｎチューブに移す。
１７．ビーズを４５００ＲＰＭで５分間遠心分離する。
１８．クリンプピペットチップ（ｃｒｉｍｐｅｄ  ｐｉｐｅｔｔｅ  ｔｉｐ）を使用し、アスピレーター減圧システムを使って、上清を捨てる。
１９．ビーズを次のとおり２回洗浄する：
ａ．１ｍｌの１×ＡｍＢｉＣですすぐ
ｂ．４５００ＲＰＭで５分間
ｃ．上清を捨てる
ｄ．１ｍｌの１×ＡｍＢｉＣですすぐ
ｅ．４５００ＲＰＭで５分間
ｆ．上清を捨て、ビーズを乾燥する。
２０．５０μｌ（ビーズ体積）の９８％ギ酸（溶離溶液）を加え、ビーズを４５００ＲＰＭで２分間遠心分離し、上清をクリンプフィルターゲルローディングチップ（ｃｒｉｍｐｅｄ  ｆｉｌｔｅｒ  ｇｅｌ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｔｉｐ）で取り出し、１．５ｍｌ  Ａｘｙｇｅｎチューブに入れる。
２１．ギ酸を除去するために溶離溶液をスピードバックで１時間乾燥した（３７℃、６０分、６０分）。
２２．ＨＰＬＣ用水で、２５ｍＭ  ＡｍＢｉＣ溶液を調製する。
２３．１ｍｌの２５ｍＭ  ＡｍＢｉＣ溶液をトリプシンに加えて、最終濃度を２０ｎｇ／μｌにする。
２４．１０μｌの２５ｍＭ  ＡｍＢｉＣ溶液にタンパク質を再懸濁する。
２５．消化のためにビーズに１０μｌの２０ｎｇ／μｌトリプシン溶液を加える。
２６．インキュベーター中、３７℃で終夜（１６時間）消化する。
３日目：
２７．試料の短い遠心分離を行って、凝縮物をチューブの底に沈降させる。
２８．消化産物に２μｌのギ酸を加える（タンパク質を沈殿させるため）。
２９．試料のラックをボルテックスに載せ、３０秒間混合する。
３０．トリプシン消化物をＡｌｌｅｇｒａ遠心機中、４℃で１５分間、１４，０００ＲＰＭで遠心分離する。
３１．オートサンプラーバイアルに移し、次に、スピードバックを使って試料を遠沈し、冷蔵庫内で４℃に保つ。
【００９１】
次に試料を、以下に述べるように質量分析によって分析した。
【００９２】
Ａβ１−４２のアミノ酸配列はＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号１）、Ａβ１−４０はＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号２）、およびＡβ１−３８はＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧ（配列番号３）である。トリプシンのようなプロテアーゼで消化すると、さらに小さな４つのペプチドが、Ａβ１−５ＤＡＥＦＲ（配列番号４）、Ａβ６−１６ＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫ（配列番号５）、Ａβ１７−２８ＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ（配列番号６）、およびＡβ２９−４２ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号７）として生成する。これらのペプチドのうち、ロイシンラベリングによるＳＩＬＫ技術（Ｓｔａｂｌｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ−Ｂａｔｅｍａｎ  ｅｔ．  ａｌ  ２００９）を使った定量に関連するのは、２つだけである。なぜなら、それらの配列はインビボで標識されうるロイシン残基を含むからである。これらのペプチドはＡβ１７−２８ＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ（配列番号６）とＡβ２９−４２ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号７）であるが、本発明者らはＡβ１７−２８ＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ（配列番号６）ペプチドだけを使用する。なぜなら、これは血中のＡβの総量を表し、より高いシグナルを生じるからである。もちろん、血中のｃ末端フラグメント（Ａβ２９−４２ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号７）またはＡβ２９−４０ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号８））またはｎ末端フラグメントを定量することも、同様に有用でありうる。一般に、血液においてＡβを標識し、そのラベルを定量するには、任意のアミノ酸ラベルを使用することができ、任意のエンドプロテアーゼを使用することができる（または全く使用しなくてもよい）。血液Ａβ代謝は、アルツハイマー病またはアルツハイマー病への素因を示すＡβ代謝の不均衡を直接反映しうる。
【００９３】
実験は、ナノフローＥＳＩ源およびナノ−２Ｄ液体クロマトグラフィー（ＮａｎｏＬＣ−２Ｄ）と連結したＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ質量分析計で行った。試料をオートサンプラートレイ中、４℃の温度に維持した。延伸チップ（ｐｕｌｌｅｄ  ｔｉｐ）にＡｃｅ  ５  Ｃ１８  ＡＲカラム充填材（ＭＡＣ−ＭＯＤ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、ペンシルバニア州チャッズフォード）を１５ｃｍ充填した手製のナノカラム（１５０ｍｍ直径）に試料を注入した。ペプチドをＮａｎｏ２Ｄ−ＬＣ（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ，  Ｉｎｃ．  Ｕｌｔｒａ  ＮａｎｏＬＣ−２Ｄ）により、１ｍＬ／分の流速で分離した。溶媒Ａは０．１％ギ酸／水、溶媒Ｂは０．１％ギ酸／アセトニトリルとした。勾配は、１０分間で１５％Ｂから２５％Ｂの後、５分間で２５％Ｂから９５％Ｂとし、次に、２分間で１５％Ｂまで漸減し、カラムを３分間再平衡化している間に、オートサンプラーに次の注入用試料を採取させた。
【００９４】
ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅ質量分析計（ＭＳ）は、ペプチドによる調整で最適化されたパラメータで、１．２ｋＶのスプレー電圧を使って、正イオンモードで操作した。データはマルチプルリアクションモニタリング（ＭＲＭ）モードで取得した。このＭＲＭ実験では、ペプチドの質量をまず、１次元目で、すなわちＭＳ１として検出した。定量はＭＳ１を使って行われるが、この技法には、多くのペプチドが同じインタクト質量（ｉｎｔａｃｔ  ｍａｓｓ）を持つ血液などの極めて複雑なマトリックスではとりわけ、特異性の欠如という問題がある。ペプチドイオンをフラグメント化し、質量分析計で検出した。この２次元目のＭＳフラグメント化（ＭＳ２）により、ユニークなフラグメントが得られた。特定プリカーサー質量とユニークフラグメントイオンとの組み合わせを使って、定量すべきペプチドを選択的にモニタリングした。この場合は、Ａβ１７−２８を定量するために複数のフラグメントイオン（リアクションとも呼ばれる）を選択的にモニタリングして、ユニークなＭＲＭ実験とした。Ａβ１７−２８は、電荷質量比（ｃｈａｒｇｅ  ｔｏ  ｍａｓｓ  ｒａｔｉｏ）が内在性ペプチドに関して６６３．３４０およびラベル組込みペプチドに関して６６６．３４０であるプリカーサー質量（ＭＳ１）を持つ。ＭＳ２フラグメント化後に、それらのフラグメントイオンを３つずつモニタリングした。モニタリングしたフラグメントイオン（トランジションイオンともいう）は、８１９．３８、９６６．４５および１１１３．５２の質量電荷比を有する。ＭＲＭ実験で検出を行い、測定器制御ソフトウェアであるＸｃａｌｉｂｕｒによって処理された単一クロマトグラフィーピークとしてプロットした。
【００９５】
結果を図２に記載する。血液では、９時間までにプラトーへの迅速な上昇が起こり、迅速なクリアランス速度を伴うが、ＣＳＦでは１８時間またはそれ以上までプラトーに達しないことに注目されたい。また、ＣＳＦ  Ａβと比較してはるかに迅速な血液Ａβのクリアランスにも注目されたい。血液では、２０時間から３０時間（ピーク約２６時間）に、標識Ａβの２つ目のピークも存在しうる。
【００９６】
実施例２．Ａβ血中動態
血液Ａβ動態を決定するために、血漿中の１３Ｃ６−ロイシン標識Ａβを測定するための方法を開発した。動物モデルにおける先行研究では、ＣＮＳと比較して末梢ではＡβの代謝回転が速いことが実証されている。新しい方法には、低アトモル（１０−１８）域の定量レベルを持つ最新の質量分析計が必要であった。血液Ａβ動態の最初の測定をＣＳＦ  Ａβ動態と比較して図３に示す。
【００９７】
これらの結果は、血液Ａβ動態がＣＮＳ  Ａβ動態とは異なることを実証しており、ＣＮＳと身体の両方におけるＡβの形成、輸送、および分解の速度を算出するために、マルチコンパートメントモデルで利用することができる。
【００９８】
血液Ａβの動態をＡＤと対照とで比較するために、本発明者らは、１２人のＡＤ参加者および８人の対照参加者からの血液試料で標識血漿Ａβを測定し、図４に示すように比較した。
【００９９】
はるかに速い代謝回転率を有する血液Ａβ動態に関して重要な追加動態情報を得るために、そしてまた、可能性としてＡＤと対照とをより良く区別するために、代替的な経口パルスラベリングプロトコールを開発した（図５）。パルスラベリングではＡβの輸送およびクリアランスに関する追加情報が得られ、Ａβ輸送のモデルを区別することができる二次的な遅いクリアランス速度の評価が可能になる。さらに、パルス経口ラベリング法は単回経口飲料として簡易化されているので、血液Ａβ動態検査を処置治験のための臨床検査として、または診断検査として、簡単に実施することが可能になる。
【０１００】
ＡＤにおいてユニークに変化しうる具体的Ａβ変異体（例えばＡβ４２）の理解を深めるために、本発明者らは、同じ試料中のＡβ  ｃ末端変異体を測定するための方法を開発した（図６）。この新規な定量的アプローチにより、同じ試料中の主要Ａβ変異体を評価することできる。
【０１０１】
実施例３．アルツハイマー病におけるＣＮＳ  β−アミロイドのクリアランスの減少
アルツハイマー病（ＡＤ）は、可溶性および不溶性β−アミロイド（Ａβ）の量が、アミロイド斑では主にＡβ４２の形態で、またアミロイド血管症では主にＡβ４０の形態で、増加することを特徴とする。アミロイド仮説は、モノマー、オリゴマー、不溶性フィブリル、中枢神経系（ＣＮＳ）中のプラークなど、さまざまな形態でＡβの量の増加をもたらすＡβの生産とクリアランスとの不均衡が、ＡＤを引き起こすとしている（１）。次に、高レベルなＡβは、最終的にはアルツハイマー型の進行性臨床認知症として発現するニューロン損傷およびニューロン死につながる事象のカスケードを開始する（２）。
【０１０２】
ＡＤのまれな症例では、遺伝子変異がＡβの生産を増加させる（３）。しかし、それよりはるかに一般的な遅発型「散発性」ＡＤにおけるＡβ調節不全はあまりよくわかっていない。遅発型ＡＤの場合、考えうるＡβ生産量増加の機序には、γまたはβ−セクレターゼ活性の変化が含まれる。あるいは、Ａβのクリアランス障害も、ＡｐｏＥ４との相互作用、、タンパク質分解の低減によるＡβの異化の減少、血液脳関門を横切る輸送の障害、または脳脊髄液（ＣＳＦ）輸送の障害によって、遅発型ＡＤを引き起こしうる。
【０１０３】
ＡＤにおけるＡβの生産およびクリアランスを測定するために、本発明者らは、ヒトＣＮＳ  Ａβの生産とクリアランスを測定するための方法を開発し（４）、症候性ＡＤを持つ個体および認知機能が正常な人におけるＡβ４２とＡβ４０の生産速度およびクリアランス速度を比較することで、どちらか一方または両方がＡＤにおいて変化しているかどうかを決定した。
【０１０４】
本発明者らは、生産相（５時間〜１４時間）およびクリアランス相（２４時間〜３６時間）について、標識Ａβ４２およびＡβ４０の平均時間経過結果をプロットした（図７）。生産速度およびクリアランス速度を各参加者について算出し、群ステータス（ｇｒｏｕｐ  ｓｔａｔｕｓ）によって比較した（ＡＤ対対照）。平均Ａβ４２生産速度は、対照群（６．７％／時間）とＡＤ群（６．６％／時間）との間で異ならず（Ｐ＝０．９６）、Ａβ４０生産速度も群間で異ならなかった（対照群では６．８％／時間およびＡＤ群では６．８％／時間；Ｐ＝０．９８）。Ａβ４２の平均クリアランス速度は、認知機能が正常な対照と比較して、ＡＤ個体のほうが遅く（５．３％／時間対７．６％／時間、Ｐ＝０．０３）、Ａβ４０の平均クリアランス速度も同様だった（ＡＤ個体の５．２％／時間に対して対照群の７．０％／時間；Ｐ＝０．０１）。
【０１０５】
Ａβの生産速度とクリアランス速度とのバランスを、ＡＤと対照とで決定するために、本発明者らは生産のクリアランスに対する比を測定した（図８）。Ａβ４２の生産速度のクリアランス速度に対する比は、認知機能が正常な参加者では釣り合っていたが（０．９５）、ＡＤ参加者ではクリアランスが減少しているので、Ａβ４２生産対クリアランス比には不均衡が存在した（１．３５）。同様に、本発明者らは、Ａβ４０生産対クリアランス比にも、認知機能が正常な参加者における比（０．９９）と比較して、ＡＤでは不均衡を観察した（１．３７）。
【０１０６】
Ａβの生産とクリアランスを測定する技法は、Ａβ生成を標的とする薬物の効果を測るために使用されて、生産の減少を実証している（５）。本発明者らは、遅発型ＡＤが、Ａβ４２とＡβ４０の両方のクリアランスの３０％の悪化と関連していることを見出した。これは、ＡＤの発症においては、Ａβクリアランスの機序が決定的に重要であることを示している（６）。Ａβクリアランス速度の３０％の減少に基づいて見積もると、ＡＤでは脳Ａβが約１０年以上蓄積することが示唆される。Ａβ４０とＡβ４２のクリアランス障害は、柔組織アミロイド斑におけるＡβ４０およびＡβ４２の沈着、ならびにＡＤ症例の約８０％での脳アミロイド血管症におけるＡβ４０の著しい沈着という先の知見と合致している（７）。
【０１０７】
この研究の限界として、参加者の数が比較的少ないこと（各群１２人）と、Ａβクリアランス障害のＡＤとの因果関係を証明できないことが挙げられる。ＣＮＳ  Ａβクリアランスの減少に加えて、ＣＳＦ  Ａβ４２濃度も、ＡＤでは、対照と比べて減少している（図９）。総合すると、これらは、脳からＣＳＦへのＡβ４２クリアランス（流出）の減少と合致しうる。しかし、ＣＳＦ  Ａβ４２の濃度減少と、標識ＡβのＣＮＳクリアランスの減少との間の関係は（図１０）、完全にはわかっていない。さらなる可能性として、ＣＳＦにおける２つ以上のＡβプール、酵素結合免疫吸着アッセイでは検出されないＣＳＦ中のＡβのプール（例えばオリゴマー）、またはＡβ生産の増加と柔組織からＣＳＦへの流出障害との複合が挙げられる。全体として、これらの結果は、対照における代謝と比較してＡＤにおけるＡβの代謝の障害を示唆している。
【０１０８】
実施例３に関する材料と方法
研究参加者はワシントン大学アルツハイマー病研究センター（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）から登録された。組み入れ基準は年齢＞６０歳、認知機能が正常（臨床認知症評価またはＣＤＲ０）、最軽度ＡＤ（ＣＤＲ０．５）または軽度ＡＤ（ＣＤＲ１）とした。除外基準は、他の認知症の一次診断、または脳卒中、出血性素因、抗凝固、および活動性感染過程を含む重大な医学的併存症とした。口頭と書面による十分なインフォームドコンセントを全ての参加者から得た。２４人の参加者を臨床評価し、最軽度〜軽度のアルツハイマー型認知症（ｎ＝１２、平均年齢７７±７．３歳、範囲６１〜８５；  アポリポプロテインＥ（ＡｐｏＥ）遺伝子型４／４  ｎ＝２、３／４  ｎ＝４、３／３  ｎ＝５、２／３  ｎ＝１；性別、男性９人、女性３人）、または認知機能正常（ｎ＝１２、平均年齢７０．６歳±６．２、範囲６５〜８４；ＡｐｏＥ遺伝子型  ３／４  ｎ＝６、３／３  ｎ＝５、２／３  ｎ＝１；性別、男性４人、女性８人）と評価した。ＣＳＦ試料採取後に３人の被験者に頭痛があり、１人はブラッドパッチを必要とした。１人の参加者は、夜間に既存の錯乱を起こしたので、試験を中断した。
【０１０９】
参加者は午前７時にワシントン大学臨床研究部門（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｕｎｉｔ）に入院した。２本の静脈内カテーテルと１本の腰椎髄腔内カテーテルとを、既述のように設置した（Ｂａｔｅｍａｎ  ｅｔ．  ａｌ  ２００６）。ベースライン血液試料およびＣＳＦ試料を収集した後、１３Ｃ６−ロイシンのプライムドボーラスを２ｍｇ／ｋｇで１０分間かけて注入した後、残りの８時間５０分は２ｍｇ／ｋｇ／時間で注入した。注入中と注入後に、ＣＳＦ試料と血液試料とを合計３６時間にわたって収集し、−７０℃で保存した。１２時間後に、腰椎カテーテルを除去し、参加者を研究部門から退院させた。
【０１１０】
全ての試料を盲検的に加工、測定し、データ結果と個々の分析は、参加者の疾患状態を明らかにする前に完了した。ｃ末端特異的抗体２１ｆ１２および２ｇ３を使って、まずＡβ４２を、次にＡβ４０を、ＣＳＦ試料から逐次的に免疫沈降させた。次に精製Ａβをトリプシンで消化し、これらのトリプシンフラグメントにおける１３Ｃ６−ロイシンの存在量を、既述のように、タンデム質量分析を使って定量した（８、９）。
【０１１１】
１３Ｃ６−ロイシン標識培地濃縮標準およびＣＳＦ試料を、安定同位体ラベリングタンデム質量分析（ＳＩＬＴ  ＭＳ）法（１０）により、ＳＩＬＴｍａｓｓ（１１）を使って分析した。各タンデム質量分析スキャンをＡβ  ＦＡＳＴＡ配列データベースで検索してペプチドを同定し、スコアを割り当てた。ＳＩＬＴｍａｓｓは、Ａβトリプシンフラグメントの理論的ｂイオンおよびｙイオンと合致するタンデム質量分析イオンのシグナル強度を合計し、結果をｐｅｐＸＭＬファイルの一部として保存した。次に、各被験者について一組のｐｅｐＸＭＬファイルを分析して、総標識シグナル強度および非標識シグナル強度を分割することによって、標識Ａβの非標識Ａβに対する比を算出した。１３Ｃ６−ロイシン標識Ａβパーセントは、天然同位体存在量Ａβ１７-２８で割った１３Ｃ６−ロイシン−Ａβ１７−２８の比として算出した。結果を、マイクロソフト・エクセルにエクスポートし、標準曲線の傾きおよびロイシンラベリング比（１３Ｃ６−Ｌｅｕ／１２Ｃ６−Ｌｅｕ）によって標準化した（１２）。
【０１１２】
分率合成速度（ＦＳＲ）および分率クリアランス速度（ＦＣＲ）の算出は、認知症ステータスに関して盲検的に、既述のように行った（９）。算出と測定を行った後、各参加者の認知症ステータスを統計比較に使用した。認知機能が正常な群とＡＤ群との間のＦＳＲとＦＣＲの比較は両側ｔ検定で行い、有意水準をｐ＜０．０５に設定した（Ｇｒａｐｈｐａｄ  ５．０３）。
実施例３の参考文献
１．  Ｊ．  Ｈａｒｄｙ，  Ｄ．  Ｊ．  Ｓｅｌｋｏｅ，  Ｔｈｅ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｂｌｅｍｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｏａｄ  ｔｏ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７，  ３５３  （２００２）．
２．  Ｊ．  Ｌ．  Ｃｕｍｍｉｎｇｓ，  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５１，  ５６  （２００４）．
３．  Ｄ．  Ｓｃｈｅｕｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｂｅｔａ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｔｈａｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｎｉｌｅ  ｐｌａｑｕｅｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ  １  ａｎｄ  ２  ａｎｄ  ＡＰＰ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｆａｍｉｌｉａｌ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ２，  ８６４  （１９９６）．
４．  Ｒ．  Ｊ．  Ｂａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｈｕｍａｎ  ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｒａｔｅｓ  ａｓ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｉｎ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １２，  ８５６  （２００６）．
５．  Ｒ．  Ｊ．  Ｂａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａ  ｇａｍｍａ−ｓｅｃｒｅｔａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ａｎｎ．  Ｎｅｕｒｏｌ．  ６６，  ４８  （２００９）．
６  Ｒ．  Ｂ．  ＤｅＭａｔｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＡｐｏＥ  ａｎｄ  ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ａｂｅｔａ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ：  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ＡｐｏＥ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ａｂｅｔａ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｎｅｕｒｏｎ  ４１，  １９３  （２００４）．
７．  Ｒ．  Ｊ．  Ｅｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｒａｉｎｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：  ｔｈｅ  ＣＥＲＡＤ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ，  Ｐａｒｔ  ＸＶ．  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４６，  １５９２  （１９９６）．
８．  Ｒ．  Ｊ．  Ｂａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ，  （Ｍａｒ  １８，  ２００９）．
９．  Ｒ．  Ｊ．  Ｂａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １２，  ８５６  （Ｊｕｌ，  ２００６）．
１０．  Ｒ．  Ｊ．  Ｂａｔｅｍａｎ，  Ｌ．  Ｙ．  Ｍｕｎｓｅｌｌ，  Ｘ．  Ｃｈｅｎ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，  Ｋ．  Ｅ．  Ｙａｒａｓｈｅｓｋｉ，  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  １８，  ９９７  （Ｊｕｎ，  ２００７）．
１１．  Ｄ．  Ｌ．  Ｅｌｂｅｒｔ，  Ｋ．  Ｇ．  Ｍａｗｕｅｎｙｅｇａ，  Ｅ．  Ａ．  Ｓｃｏｔｔ，  Ｋ．  Ｒ．  Ｗｉｌｄｓｍｉｔｈ，  Ｒ．  Ｊ．  Ｂａｔｅｍａｎ，  Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ  ７，  ４５４６  （Ｏｃｔ  ３，  ２００８）．
１２．  Ｋ．  Ｅ．  Ｙａｒａｓｈｅｓｋｉ，  Ｋ．  Ｓｍｉｔｈ，  Ｍ．  Ｊ．  Ｒｅｎｎｉｅ，  Ｄ．  Ｍ．  Ｂｉｅｒ，  Ｂｉｏｌ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ  ２１，  ４８６  （Ｏｃｔ，  １９９２）．
【０１１３】
実施例４．ＣＮＳ試料ではＡβ４２代謝が変化している
本発明者らによる遅発型アルツハイマー病Ａβ代謝の最新のデータ分析において、本発明者らは、Ａβ４２代謝のパターンが、他の変異体と比較して異なることを見出している。ＰＩＢでアミロイド沈着を持たない正常な個体（図１１Ａ）およびアミロイド沈着を持つことがＰＩＢで示されたＡＤ患者（図１１Ｂ）から採取したＣＳＦ試料中のさまざまなＡβ変異体について、相対ラベリング（１３Ｃ６−Ｌｅｕ／１２Ｃ６−ＬｅｕのＨ：Ｌ比）を算出した。これらの結果は、Ａβ４２代謝がＡＤ個体では変化していることを示している。Ａβ４２曲線のクリアランス部分は、一貫して変化しているように見える。
【０１１４】
同じ分析を拡大して５０人のＡＤ患者からのデータを含むようにした。相対ラベリング（１３Ｃ６−Ｌｅｕ／１２Ｃ６−ＬｅｕのＨ：Ｌ比）をさまざまなＡβ４２およびＡβ４０変異体について算出し、ＣＳＦ中での各時点について、ＣＳＦにおけるＡβ４２：Ａβ４０相対ラベリングの比を、アミロイドステータス（ＰＥＴ  ＰＩＢスキャン）によって群化した９５％信頼区間帯と共に算出した（図１２）。大半の時間で、群による著しく有意な差がある（６〜１５時間では高く、２４〜３０時間では低い）ことに注目されたい。図１２では、また個別にプロットした場合（図１３）には、１０時間および２７時間が有意だった。
【０１１５】
実施例５．血液試料ではＡβ４２代謝が変化している
５０人のＡＤ患者からの血液試料を使って実施例５の場合と同じ分析を行った。相対ラベリング（１３Ｃ６−Ｌｅｕ／１２Ｃ６−Ｌｅｕ  のＨ：Ｌ比）をさまざまなＡβ４２およびＡβ４０変異体について算出し、血液中での各時点について、血液におけるＡβ４２：Ａβ４０相対ラベリングの比を、アミロイドステータス（ＰＥＴ  ＰＩＢスキャン）によって群化した９５％信頼区間帯と共に算出することができる。例えば図１４参照。
【０１１６】
実施例６．ＳＩＬＫ法を使ったさらなるインビボデータ
アミロイドβ（Ａβ）のＳＩＬＫトレーサー曲線のいくつかの側面を要約する簡単な測定値が、ＡＤを持つ患者、ＡＤのリスクがある患者、またはＡＤを持つと疑われる患者についての診断情報または予後情報を与えうるという仮説を立てた。上記の仮説を検証するために、Ａβ  ＳＩＬＫトレーサー曲線の下降中に算出されたＡβ４２ラベリングのパーセントの、Ａβ４０のパーセントに対する比に基づいて、３つの患者群間の識別を試みた。インビボＳＩＬＫ研究は、別段の注記がある場合を除き、別記のとおり（Ｂａｔｅｍａｎ  ＲＪ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １２（７）：８５６およびＵＳ７８９２８４５）、ＰＥＴでＰＩＢ陽性であるＰＳＥＮ１またはＰＳＥＮ２変異を持つ患者（ＭＣ＋）、ＰＥＴでＰＩＢ陰性であるＰＳＥＮ１またはＰＳＥＮ２変異を持つ患者（ＭＣ−）、ノンキャリア変異キャリア同胞対照（ＮＣ）で行った。簡単に述べると、被験者に同位体標識ロイシン（１３Ｃ６−ロイシン）を静脈内注入により９時間にわたって投与した。ＣＳＦ試料（６ｍＬ／試料）を、標識アミノ酸の注入開始の２３時間後および２４時間後に収集した。標識および非標識Ａβ４２およびＡβ４０の定量的測定値をタンデム質量分析によって得て、標識：非標識Ａβ４２および標識：非標識Ａβ４０の比を各時間について算出した。これらの比は、注入後２３時間および２４時間における各Ａβアイソフォームの標識パーセントを表す。
【０１１７】
これらの実験では、０．９未満のＡβ４２標識パーセント／Ａβ４０標識パーセントの比は被験者をＡＤ陽性と分類し、０．９を上回るＡβ４２標識パーセント／Ａβ４０標識パーセントの比は被験者をＡＤ陰性と分類するように、０．９の診断閾が設定された。注入の２３時間後におけるＡβ４２標識パーセント／Ａβ４０標識パーセントの比が、３つの患者群の間で弁別されるかどうかを決定するために、各患者について得られた比をＰＩＢ染色に対してグラフ化した。図１５Ａでわかるように、この比に関する０．９という閾は、ＭＣ＋被験者の大半をＮＣ被験者から明確に弁別する（６／７のＭＣ＋被験者がこの閾より下にあり、一方、１１／１２のＮＣ被験者がこの閾より上にあった）。ＭＣ−群内では、被験者の３／４がこの閾の下にあった。しかし、ＭＣ−群内の被験者がＡＤの初期段階にあった可能性はある。同様に、２３時間および２４時間ラベリングパーセンテージの平均を、Ａβ４２とＡβ４０との間の比として比較することもできる。注入の２３時間および２４時間後のＡβ４２標識パーセント／Ａβ４０標識パーセントは３つの患者群の間で弁別された。各患者について得られた比をＰＩＢ染色に対してグラフ化した。図１５Ｂでわかるように、この尺度を使うと、７／７のＭＣ＋被験者が閾の下にあり、一方、１１／１２のＮＣが閾の上にある。ＭＣ−群については、２／４の被験者が閾の下にある。
【０１１８】
これらのデータは、完全な動態モデルからの結果を使用する簡単な尺度に匹敵しうる。この例では、交換コンパートメント（ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ）へのＡβ４２の進入速度を表すパラメータｋｅｘ４２を１０倍してから、Ａβ４２とＡβ４０との不可逆的喪失に関する速度定数の比に加える。図１５Ｃに示すように、１．７５の閾は、６／７のＭＣ＋被験者が閾の上にあり、１２／１２のＮＣ被験者が閾の下にあることを示す。ＭＣ−群については、２／４の被験者が閾の下である。
【０１１９】
これらの実施例は、ＳＩＬＫトレーサー曲線のいくつかの側面を要約する簡単な尺度が、ＡＤの診断に役立ちうることを示している。これは、Ａβ４２動態の変化を診断するには、短期間のＣＳＦ収集で十分でありうることも示している。
【０１２０】
本発明を詳細に説明し終えたので、本願の特許請求の範囲に定義される本発明の範囲から逸脱することなく、変更および変形が可能であることは、明白であるだろう。ただし、本開示に照らして、開示されている具体的実施形態には多くの改変を加えることができ、それでもなお、本発明の要旨および範囲から逸脱することなく、匹敵するまたは類似する結果を得ることができ、それゆえに本明細書に記載する全ての事項は、例示であって限定ではないと解釈されるべきであることを、当業者は理解すべきである。
【図１】
2015505365.tif 000002
【図２】
2015505365.tif 000003
【図３】
2015505365.tif 000004
【図４】
2015505365.tif 000005
【図５】
2015505365.tif 000006
【図６】
2015505365.tif 000007
【図７】
2015505365.tif 000008
【図８】
2015505365.tif 000009
【図９】
2015505365.tif 000010
【図１０】
2015505365.tif 000011
【図１１】
2015505365.tif 000012
【図１２】
2015505365.tif 000013
【図１３】
2015505365.tif 000014
【図１４】
2015505365.tif 000015
【図１５】
2015505365.tif 000016
【配列表】
2015505365000001.app
【国際調査報告】
2015505365.tif 000017