(57)【要約】  ＣＤ４３の特異的領域に結合する抗体を含むか又は利用する癌の分類のための試薬、方法及びキット。１つの方法は、組織を、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体に接触させるステップ、前記組織を、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体に接触させるステップ、並びに、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体を用いた組織へのいかなる結合の細胞局在も解明するステップを含む。抗体の結合パターンを使用し、癌を、より高悪性度の癌又は悪性度の低い癌として特徴づけることができ、さらに、非小細胞肺癌から小細胞肺癌を区別することができる。従って、その特徴づけに従い癌を処置してもよい。
2015514985.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌性組織を特徴づける、又は、癌性組織を特徴づける及び処置する方法であって、
癌性ではないかと疑われる組織を、核結合及び細胞質結合を解明する能力を持つ型式で第１の抗体に接触させるステップであり、前記第１の抗体が、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体である、ステップ、
前記組織を、核結合及び細胞質結合を解明する能力を持つ型式で第２の抗体に接触させるステップであり、前記第２の抗体が、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体である、ステップ、並びに、
前記第１の抗体及び前記第２の抗体を用いた前記組織へのいかなる結合の細胞局在も解明するステップであり、前記第１の抗体との核結合、前記第１の抗体との細胞質結合の欠如、前記第２の抗体との核結合の欠如、及び、前記第２の抗体との細胞質結合の欠如が、前記組織を、前記第１の抗体との核結合、前記第１の抗体との細胞質結合の欠如、前記第２の抗体との核結合の欠如、及び、前記第２の抗体との細胞質結合の欠如を示さない組織よりも攻撃的に癌性であるとして特徴づける、ステップ、
を含む方法。
【請求項２】
前記第１の抗体が、配列ＷＲＲＲＱＫＲＲＴＧＡＬＶＬＳＲＧＧＫＲＮＧＶＶＤＡＷＡＧＰＡＱＶＰＥＥＧＡＶＴＶＴＶＧＧＳＧＧＤＫＧＳＧＦＰＤＧＥＧＳＳＲＲＰＴＬＴＴＦＦＧＲＲＫＳＲＱＧＳＬＡＭＥＥＬＫＳＧＳＧＰＳＬＫＧＥＥＥＰＬＶＡＳＥＤＧＡＶＤＡＰＡＰＤＥＰＥＧＧＤＧＡＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基２７７〜４００）を含むポリペプチドの少なくとも一部に特異的に結合する能力を持つ、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の抗体が、配列ＰＬＶＡＳＥＤＧＡＶＤＡＰＡＰＤＥＰＥＧＧＤＧＡＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基３７５〜４００）を含むポリペプチドの少なくとも一部に特異的に結合する能力を持つ、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第２の抗体が、配列ＳＴＴＡＶＱＴＰＴＳＧＥＰＬＶＳＴＳＥＰＬＳＳＫＭＹＴＴＳＩＴＳＤＰＫＡＤＳＴＧＤＱＴＳＡＬＰＰＳＴＳＩＮＥＧＳＰＬＷＴＳＩＧＡＳＴＧＳＰＬＰＥＰＴＴＹＱＥＶＳＩＫＭＳＳＶＰＱＥＴＰＨＡＴＳＨＰＡＶＰＩＴＡＮＳＬＧＳＨＴＶＴＧＧＴＩＴＴＮＳＰＥＴＳＳＲＴＳＧＡＰＶＴＴＡＡＳＳＬＥＴＳＲＧＴＳＧＰＰＬＴＭＡＴＶＳＬＥＴＳＫＧＴＳＧＰＰＶＴＭＡＴＤＳＬＥＴＳＴＧＴＴＧＰＰＶＴＭＴＴＧＳＬＥＰＳＳＧＡＳＧＰＱＶＳＳＶＫＬＳＴＭＭＳＰＴＴＳＴＮＡＳＴＶＰＦＲＮＰＤＥＮＳＲ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基２０〜２５３）を含むポリペプチドの少なくとも一部に特異的に結合する能力を持つ、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の抗体との核結合、前記第１の抗体との細胞質結合の欠如、前記第２の抗体との核結合の欠如、及び、前記第２の抗体との細胞質結合の欠如が、前記組織を提供する患者の減少した生存率を、前記第１の抗体との核結合、前記第１の抗体との細胞質結合の欠如、前記第２の抗体との核結合の欠如、及び、前記第２の抗体との細胞質結合の欠如によって特徴づけられない組織を提供する患者の生存率と比較して示す、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の抗体との核結合、前記第１の抗体との細胞質結合の欠如、前記第２の抗体との核結合の欠如、及び、前記第２の抗体との細胞質結合の欠如が、前記組織を提供する患者の減少した生存率を、前記第１の抗体との核結合、及び、少なくとも、前記第２の抗体との細胞質結合によって特徴づけられる組織を提供する患者の生存率と比較して示す、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の抗体との核結合、前記第１の抗体との細胞質結合の欠如、前記第２の抗体との核結合の欠如、及び、前記第２の抗体との細胞質結合の欠如が、前記組織を提供する患者の減少した生存率を、前記第１の抗体との核結合、前記第２の抗体との細胞質結合、及び、前記第２の抗体との核結合によって特徴づけられる組織を提供する患者の生存率と比較して示す、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の抗体との核結合、前記第１の抗体との細胞質結合の欠如、前記第２の抗体との細胞質結合、及び、前記第２の抗体との核結合の欠如が、前記組織を提供する患者の減少した生存率を、前記第１の抗体との核結合、前記第２の抗体との細胞質結合、及び、前記第２の抗体との核結合によって特徴づけられる組織を提供する患者の生存率と比較して示す、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記組織が、肺組織及び乳房組織を含む群から選択される、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組織が肺組織であり、さらに、前記第１の抗体との核結合、前記第１の抗体との細胞質結合の欠如、前記第２の抗体との核結合の欠如、及び、前記第２の抗体との細胞質結合の欠如が、前記組織を、ほぼ確実な小細胞肺癌組織として特徴づける、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記組織が肺組織であり、さらに、前記第２の抗体との細胞質結合が、前記組織を、ほぼ確実な非小細胞肺癌組織として特徴づける、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組織が肺組織であり、さらに、前記第１の抗体との核結合、及び、前記第２の抗体との細胞質結合が、前記組織を、ほぼ確実な非小細胞肺癌組織として特徴づける、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記組織が肺組織であり、さらに、前記第１の抗体との核結合、前記第２の抗体との細胞質結合、及び、前記第２の抗体との核結合が、前記組織を、ほぼ確実な非小細胞肺癌組織として特徴づける、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記解明された前記第１の抗体及び前記第２の抗体を用いた前記組織へのいかなる結合の細胞局在にも基づき、前記組織を提供する患者を治療するステップをさらに含む、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記組織を、ほぼ確実な小細胞肺癌組織として特徴づけるステップ、及び、小細胞肺癌の細胞特異的処置で、前記組織を提供する患者を治療するステップをさらに含む、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記組織を、ほぼ確実な非小細胞肺癌組織として特徴づけるステップ、及び、非小細胞肺癌の細胞特異的処置で、前記組織を提供する患者を治療するステップをさらに含む、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ第１の抗体、
ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ第２の抗体、
前記ＣＤ４３の細胞質側末端に対する前記第１の抗体の結合、又は、前記ＣＤ４３の細胞外ドメインに対する前記第２の抗体の結合に実質的に干渉することなく、前記第１の抗体、前記第２の抗体、又は、前記第１の抗体及び前記第２の抗体に結合するシグナル生成試薬、
を含むキット。
【請求項１８】
前記第１の抗体が、配列ＷＲＲＲＱＫＲＲＴＧＡＬＶＬＳＲＧＧＫＲＮＧＶＶＤＡＷＡＧＰＡＱＶＰＥＥＧＡＶＴＶＴＶＧＧＳＧＧＤＫＧＳＧＦＰＤＧＥＧＳＳＲＲＰＴＬＴＴＦＦＧＲＲＫＳＲＱＧＳＬＡＭＥＥＬＫＳＧＳＧＰＳＬＫＧＥＥＥＰＬＶＡＳＥＤＧＡＶＤＡＰＡＰＤＥＰＥＧＧＤＧＡＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基２７７〜４００）を含むポリペプチドの少なくとも一部に特異的に結合する能力を持つ、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記第１の抗体が、配列ＰＬＶＡＳＥＤＧＡＶＤＡＰＡＰＤＥＰＥＧＧＤＧＡＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基３７５〜４００）を含むポリペプチドの少なくとも一部に特異的に結合する能力を持つ、請求項１７又は１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記第２の抗体が、配列ＳＴＴＡＶＱＴＰＴＳＧＥＰＬＶＳＴＳＥＰＬＳＳＫＭＹＴＴＳＩＴＳＤＰＫＡＤＳＴＧＤＱＴＳＡＬＰＰＳＴＳＩＮＥＧＳＰＬＷＴＳＩＧＡＳＴＧＳＰＬＰＥＰＴＴＹＱＥＶＳＩＫＭＳＳＶＰＱＥＴＰＨＡＴＳＨＰＡＶＰＩＴＡＮＳＬＧＳＨＴＶＴＧＧＴＩＴＴＮＳＰＥＴＳＳＲＴＳＧＡＰＶＴＴＡＡＳＳＬＥＴＳＲＧＴＳＧＰＰＬＴＭＡＴＶＳＬＥＴＳＫＧＴＳＧＰＰＶＴＭＡＴＤＳＬＥＴＳＴＧＴＴＧＰＰＶＴＭＴＴＧＳＬＥＰＳＳＧＡＳＧＰＱＶＳＳＶＫＬＳＴＭＭＳＰＴＴＳＴＮＡＳＴＶＰＦＲＮＰＤＥＮＳＲ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基２０〜２５３）を含むポリペプチドの少なくとも一部に特異的に結合する能力を持つ、請求項１７乃至１９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトにおける癌の分類のための試薬、方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍悪性度は、顕微鏡下で癌細胞がどのくらい異常に見えるか、及び、どのくらい急速に腫瘍が増殖及び転移しそうかという点から癌細胞を分類するために使用されるシステムである。腫瘍悪性度を決定する場合に、細胞の構造及び増殖パターンを含む多くの要因が考慮される。腫瘍悪性度を決定するために使用される特定の要因は、癌の各タイプによって異なる。
【０００３】
腫瘍が悪性であると疑われる場合、医師は、生検と呼ばれる手順で組織の試料又は腫瘍全体を取り除く。病理医がその組織を検査して、その腫瘍が良性か又は悪性かどうかを決定する。病理医は、腫瘍悪性度を決定すること、及び、その腫瘍細胞の他の特徴を同定することもできる。
【０００４】
癌細胞の顕微鏡下での様子に基づき、病理医は、一般的に、４つの重症度：グレード１、２、３及び４によって腫瘍悪性度を説明する。グレード１の腫瘍の細胞は、正常な細胞に似ており、ゆっくりと成長及び増殖する傾向がある。グレード１の腫瘍は、一般的に、その挙動において最も攻撃的でないと考慮される。その対極にあるグレード３又はグレード４の腫瘍の細胞は、同じタイプの正常な細胞のようには見えない。グレード３及び４の腫瘍は、急速に増殖し、さらに、低いグレードの腫瘍よりも速く転移する傾向がある。
【０００５】
医師は、いろいろある中でも腫瘍悪性度を使用して、患者に対する個々の治療プランを展開し、さらに、患者の予後を予測する。一般に、グレードが低いほど、回復又は回帰のチャンス等、より優れた予後を示す。
【０００６】
しかし、腫瘍類別システムは、常にまぎれもないというわけではない。第一に、類別システムは、細胞の形態等の質的パラメータに大いに基づく。第二に、類別システムは、癌のタイプよって異なることが多くある。例えば、病理医は、前立腺癌細胞の分化の程度を説明するためにＧｌｅａｓｏｎシステムを使用する。Ｇｌｅａｓｏｎシステムは、グレード２からグレード１０に及ぶスコアを使用する。他の類別システムは、乳癌に対するＢｌｏｏｍ−Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎシステム、及び、腎癌に対するＦｕｈｒｍａｎシステムを含む。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
１つのより他覚的な分類システムが、異なるタイプの癌に対する予後及び治療プランを決定するために必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、癌の分類のための試薬、方法及びキットを対象としており、当該試薬、方法及びキットは、ＣＤ４３の特異的領域に結合する抗体を含む。その抗体は、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体を含む。ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ例証的な抗体は、ヒトＣＤ４３のＣ末端ドメインの末端部分を表す２６アミノ酸ペプチド内のエピトープに特異的に結合するウサギポリクローナル抗体（ＳＳＧＺ）である。ＳＳＧＺ抗体は、単独で又は他の抗体と組み合わせて、ヒトの癌を分類すること、さらに、いろいろある中でも肺及び乳房組織における癌組織を同定する及び特徴づけることができる。従って、癌はこの特徴づけに従い処置されてもよい。
【０００９】
本発明の１つの方法は、癌性組織を特徴づける方法である。当該方法は、癌性ではないかと疑われる組織を、核結合及び細胞質結合を解明する能力を持つ型式で第１の抗体に接触させるステップであって、前記第１の抗体が、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体である、ステップ、前記組織を、核結合及び細胞質結合を解明する能力を持つ型式で第２の抗体に接触させるステップであって、前記第２の抗体が、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体である、ステップ、並びに、第１の抗体及び第２の抗体を用いた組織へのいかなる結合の細胞局在も解明するステップを含む。前記解明するステップにおける第１の抗体及び第２の抗体とのいかなる結合の局在に応じても、前記解明するステップは、非癌性組織から癌性組織を区別する、悪性度の少ない癌からより悪性の癌を区別する、及び、肺癌の場合には、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）から小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）を区別することができる。そのような癌組織の特徴づけを可能にする第１及び第２の抗体の特定の結合パターンが、以下において詳細に記載される。一部のバージョンにおいて、当該特徴づけ方法はｅｘ  ｖｉｖｏで組織に対して行われる。一部のバージョンにおいて、当該特徴づけ方法はｉｎ  ｖｉｖｏで組織に対して行われる。
【００１０】
一部のバージョンにおいて、当該方法は、解明された第１の抗体及び第２の抗体を用いた組織へのいかなる結合の細胞局在にも基づき、組織を提供する患者を治療するステップをさらに含む。例えば、組織が、悪性度の低い又は高悪性ではない癌とは反対に高悪性度の癌として特徴づけられる場合、患者は、高悪性度の癌のための治療をされる。組織が、高悪性度の癌とは反対に悪性度の低い又は高悪性ではない癌として特徴づけられる場合、患者は、悪性度の低い又は高悪性ではない癌のための治療をされる。組織が、ほぼ確実な小細胞肺癌組織として特徴づけられる場合、患者は、小細胞肺癌の細胞特異的処置で治療される。組織が、ほぼ確実な非小細胞肺癌組織として特徴づけられる場合、患者は、非小細胞肺癌の細胞特異的処置で治療される。
【００１１】
本発明によって提供されるキットの例は、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ第１の抗体、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ第２の抗体、並びに、ＣＤ４３の細胞質側末端に対する第１の抗体の結合、又は、ＣＤ４３の細胞外ドメインに対する第２の抗体の結合に実質的に干渉することなく、第１の抗体、第２の抗体、又は、第１の抗体及び第２の抗体に結合するシグナル生成試薬を含む。
【００１２】
上記の方法及びキットの一部のバージョンにおいて、第１の抗体は、配列ＷＲＲＲＱＫＲＲＴＧＡＬＶＬＳＲＧＧＫＲＮＧＶＶＤＡＷＡＧＰＡＱＶＰＥＥＧＡＶＴＶＴＶＧＧＳＧＧＤＫＧＳＧＦＰＤＧＥＧＳＳＲＲＰＴＬＴＴＦＦＧＲＲＫＳＲＱＧＳＬＡＭＥＥＬＫＳＧＳＧＰＳＬＫＧＥＥＥＰＬＶＡＳＥＤＧＡＶＤＡＰＡＰＤＥＰＥＧＧＤＧＡＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基２７７〜４００）を含むポリペプチドの少なくとも一部に特異的に結合する能力を持つ。
【００１３】
上記の方法及びキットの一部のバージョンにおいて、第１の抗体は、配列ＰＬＶＡＳＥＤＧＡＶＤＡＰＡＰＤＥＰＥＧＧＤＧＡＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基３７５〜４００）を含むポリペプチドの少なくとも一部に特異的に結合する能力を持つ。
【００１４】
上記の方法及びキットの一部のバージョンにおいて、第２の抗体は、配列ＳＴＴＡＶＱＴＰＴＳＧＥＰＬＶＳＴＳＥＰＬＳＳＫＭＹＴＴＳＩＴＳＤＰＫＡＤＳＴＧＤＱＴＳＡＬＰＰＳＴＳＩＮＥＧＳＰＬＷＴＳＩＧＡＳＴＧＳＰＬＰＥＰＴＴＹＱＥＶＳＩＫＭＳＳＶＰＱＥＴＰＨＡＴＳＨＰＡＶＰＩＴＡＮＳＬＧＳＨＴＶＴＧＧＴＩＴＴＮＳＰＥＴＳＳＲＴＳＧＡＰＶＴＴＡＡＳＳＬＥＴＳＲＧＴＳＧＰＰＬＴＭＡＴＶＳＬＥＴＳＫＧＴＳＧＰＰＶＴＭＡＴＤＳＬＥＴＳＴＧＴＴＧＰＰＶＴＭＴＴＧＳＬＥＰＳＳＧＡＳＧＰＱＶＳＳＶＫＬＳＴＭＭＳＰＴＴＳＴＮＡＳＴＶＰＦＲＮＰＤＥＮＳＲ（ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基２０〜２５３）を含むポリペプチドの少なくとも一部に特異的に結合する能力を持つ。
【００１５】
本発明の目的及び利点は、付随の図面と組み合わせて行われる以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明からより完全に明らかになる。
【００１６】
本願は、２０１３年３月１５日に出願した米国仮特許出願第６１／７９０，８９８号、及び、２０１２年４月２日に出願した米国仮特許出願第６１／６１９，００２号に基づく優先権を主張するものであり、全内容を本願において援用する。
【００１７】
政府基金に関する記述
本発明は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｆｅｎｓｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｇｒｅｓｓｉｏｎａｌｌｙ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｇｒａｍｓ（Ｃｏｎｃｅｐｔ  Ａｗａｒｄ  Ｗ８１ＸＷＨ−０９−１−０６２９）により与えられた米国政府の支援のもとに行われた。米国政府は本発明についてある種の権利を有している。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】注釈付きの例証的なＣＤ４３タンパク質の配列を描写した図である。このタンパク質から、本発明の抗体を生成するためのペプチドを得ることができる。
【図２】１００ｎｇ／ｍｌのホルボールミリステートアセテートで処理された（＋）か又は未処理（−）のジャーカットＴリンパ球細胞の全タンパク質ライセートのウエスタンブロットを描写した図である。タンパク質は、マウスモノクローナル抗体Ｌ１０及びウサギポリクローナル抗体ＳＳＧＺで可視化されている。Ｌ１０抗体は、ＣＤ４３の細胞外ドメインを認識し、さらに、１０２ｋＤａを超えるインタクトな分子を検出する。ＳＳＧＺ抗体は、ＣＤ４３の細胞内ドメインを認識し、さらに、インタクトな分子も、白血球活性化の間に産生された７６ｋＤａを下回るタンパク質分解断片も検出する（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｍａｍｂｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｅｏ  ａｎｄ  Ｚｉｌｔｅｎｅｒ，２００９）。
【図３】ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＣ及び対照の肺組織切片の免疫組織化学染色を描写した図である。図３Ａ乃至３Ｃは、扁平上皮ＮＳＣＬＣから得られた、ホルマリン固定されたパラフィン包埋組織由来の５μｍカットの三つ組の切片を描写している。図３Ｄ乃至３Ｆは、腺癌ＮＳＣＬＣの三つ組の切片を描写している。図３Ｇ乃至３Ｉは、カルチノイドＮＳＣＬＣの三つ組の切片を描写している。図３Ｊ乃至３Ｏは、ＳＣＬＣの２つのケースの三つ組の切片を描写している。図３Ｐ乃至３Ｒは、軽度の珪肺症を有する患者から得られた非悪性の肺組織の三つ組の切片を描写している。図３Ａ、３Ｄ、３Ｇ、３Ｊ、３Ｍ及び３Ｐは、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した切片（Ｈ＆Ｅ）を示している。図３Ｂ、３Ｅ、３Ｈ、３Ｋ、３Ｎ及び３Ｑは、非免疫のウサギＩｇＧ抗体（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）でインキュベートした切片（非免疫）を示している。図３Ｃ、３Ｆ、３Ｉ、３Ｌ、３Ｏ及び３Ｒは、ＣＤ４３に特異的に結合するウサギポリクローナル抗体ＳＳＧＺでインキュベートした切片（ＣＤ４３−ＳＳＧＺ）を示している。ＣＤ４３に対するＳＳＧＺ結合及びバックグラウンドの非免疫ＩｇＧ結合を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用して可視化した。ヘマトキシリンを用いた対比染色は、核を可視化した。灰色の沈殿物は、ＣＤ４３に対するＳＳＧＺ結合を示している。腺癌、カルチノイド癌腫、及び、扁平上皮細胞癌腫の全てのケースが、主なＳＳＧＺ染色の核局在を示した。ＳＣＬＣのケースは、主に、核（Ｎ）又は細胞質（Ｃ）において染色を示した。矢印は、膜染色を示す非悪性組織において存在する白血球である。バーは、１００μｍの長さを意味している。図３におけるデータは、非悪性の肺組織によってではなく、ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣの原発腫瘍によってＣＤ４３が発現されるということを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の一態様は、種々のＣＤ４３の特定部分に結合する能力を持つ抗体を含む。これらの抗体は、癌細胞を診断すること、及び、癌患者の治療を指示するために癌細胞を特徴づけることにおいて有用である。
【００２０】
「抗体」という用語は、本明細書において使用される場合、その抗体に特異的に結合する抗原への曝露に応答して、Ｂリンパ球細胞によって産生される糖タンパク質を一般的に意味する。場合によっては、ＣＨＯ細胞又は他の細胞等、非Ｂリンパ球細胞を操作して、抗体を産生させることができる。そのような細胞の例として、Ｃａｔａｌｅｎｔ  Ｐｈａｒｍａ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｓｏｍｅｒｓｅｔ、ＮＪ）によって作製される“ＧＰＥＸ”ブランドの細胞が挙げられる。「抗体」という用語は、その最も広い意味で使用され、特に、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多選択性の抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び、所望の生物学的活性を示す限り抗体断片をカバーする。
【００２１】
本明細書において使用される場合、「抗体」という用語は、いかなるタンパク質又はペプチド含有分子も含み、該分子は、重鎖又は軽鎖一定領域、フレームワーク領域、又は、いかなるその一部の１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）等、免疫グロブリン分子の少なくとも一部を含むが、それに限定されない。
【００２２】
「抗体断片」という用語は、本明細書において使用される場合、全長抗体の一部を意味し、一般的には、その抗原結合又は可変ドメインを意味する。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２及びＦｖの断片、二特異性抗体、直線抗体、単鎖抗体分子、及び、抗体断片由来の多選択性の抗体を含んでもよい。
【００２３】
本発明の抗体は、本発明の単離された組換え若しくは改変された抗原、又は、そのような抗原の混合物又は抗原断片を利用する従来の手段によって生成される。例えば、ポリクローナル抗体は、本明細書において記載される単離された抗原又は抗原タンパク質若しくはペプチドの混合物で、選択された動物の免疫系を従来法で刺激し、それに対して自然の抗体を免疫系が産生するのを可能にし、さらに、動物の血液又は他の生物学的流体からこれらの抗体を回収することによって生成される。動物から回収された抗体は、ポリクローナル抗体である。そのような様式で抗体を産生させる例証的な方法に対する実施例を参照されたい。
【００２４】
本明細書において記載される種々のペプチドに対して作られるモノクローナル抗体（ＭＡｂｓ）も生成することができる。所望のＭＡｂｓを発現する融合細胞株が、よく知られた従来技術によって生成される。同様に、所望の高力価の抗体が、これらの抗原に対して開発されるモノクローナル又はポリクローナル抗体に対して既知の組換え技術を適用することによって生成される。例えば、ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＧＢ８５／００３９２、英国特許公開出願ＧＢ２１８８６３８Ａ、Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７−７５３（１９８６）；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ´ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６：１００２９−１００３３（１９８９）；ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＷＯ９００７８６１；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；及び、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４６：１２７５−１２８１（１９８８ａ）を参照されたい。
【００２５】
本発明の抗体を生成するために使用される抗原は、マルチ抗原性複合体として（例えば、１９８９年１１月２日に公開された欧州特許出願０３３９６９５を参照されたい）、又は、抗原性タンパク質／ペプチドの単なる混合物として構築されてもよく、さらに、１つ又は複数の選択された抗原に結合する能力を持つ高力価の抗体を誘発するために利用されてもよい。
【００２６】
本発明によってさらに熟考されるのは、抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）及び抗抗イディオタイプ抗体（Ａｂ３）である。Ａｂ２は、本発明の抗原に結合する抗体（Ａｂ１）の結合ドメインに特異的であり、さらに、Ａｂ３は、その結合特異性及び生物学的活性においてＡｂ１に類似している（例えば、Ｍ．Ｗｅｔｔｅｎｄｏｒｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｉｎ  Ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ｅｄ．ｂｙ  Ｊ．Ｃｅｒｎｙ  ａｎｄ  Ｊ．Ｈｉｅｒｎａｕｘ  Ｊ，Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．：ｐｐ．２０３−２２９，（１９９０）を参照されたい）。これらの抗イディオタイプ及び抗抗イディオタイプ抗体は、当業者にはよく知られた技術を使用して作製される。そのような抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）は、抗原の内部像を有することができ、従って、本明細書において記載されるペプチドと同じ目的に対して有用である。一般に、選択された抗原（Ａｂ１）に結合するポリクローナル抗血清、モノクローナル抗体及び他の抗体は、ペプチド抗原のエピトープを同定するのに、及び、これらのペプチド及びタンパク質を、組織内（例えば、クロマトグラフコラム内等）の汚染物質から分けるのに、さらに、一般には、上記の他のタイプの抗体の開発に不可欠であるリサーチツールとして及び開始材料として有用である。抗イディオタイプ抗体（Ａｂ２）は、従って、元の抗原の代わりに使用されてもよい。
【００２７】
「特異的に結合する」又は「に特異的な」という用語は、本発明の抗原が、他の非特異的抗原に対するよりも高い親和性で第１の抗原、例えばＣＤ４３細胞質側末端等を認識し且つ結合するということを意味する。非特異的抗原は、第１の抗原と共通のエピトープを共有しない抗原である。例えば、第１の抗原（例えばポリペプチド）に対する抗体であって、非特異的抗原に対するよりも効率的に第１の抗原に結合する抗体は、第１の抗原に特異的に結合するとして記載することができる。特異的結合は、例えば、当技術分野においてよく知られた方法論を使用した酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）又はウエスタンブロットアッセイを使用してテストすることができる。本発明の一部のバージョンにおいて、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体は、ＣＤ４３の細胞外ドメイン及び／又は他の非特異的抗原には実質的に結合しない。本発明の一部のバージョンにおいて、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体は、ＣＤ４３の細胞質側末端及び／又は他の非特異的抗原には実質的に結合しない。
【００２８】
本発明の抗体を生成するために使用される抗原は、種々のＣＤ４３の一部から得ることができる。そのようなペプチドを得ることができる例証的なＣＤ４３タンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃ．Ｎｏ．ＮＰ＿００３１１４（ＳＥＱ  ＩＤ番号１）の配列を有し、その注釈付きのバージョンが、図１において示されている。ＳＥＱ  ＩＤ番号１によって表されている例証的なＣＤ４３タンパク質は、以下のドメイン、
残基１〜４００：前駆体タンパク質、
残基１〜１９：シグナルペプチド、
残基２０〜４００：成熟ペプチド、
残基２０〜２５３：細胞外ドメイン、
残基２５４〜２７６：膜貫通領域、
残基２７７〜４００：細胞質側末端、及び
残基３７５〜４００：ＳＳＧＺ抗体を生成するために使用される例証的なペプチド配列、
を有する。
【００２９】
本発明のいくつかの抗体は、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ。（図１において太字で示されている）ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基２７７〜４００に一致する配列を有するペプチド又はその断片は、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体を生成するために使用することができる。従って、この様式で生成される抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基２７７〜４００から成るポリペプチド等、ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基２７７〜４００に一致する配列を有するポリペプチド又はその断片の少なくとも一部に特異的に結合する能力を持つ。ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基３７５〜４００に一致する配列を有するペプチド又はその断片も、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体を生成するために使用することができる。従って、この様式で生成される抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基３７５〜４００から成るポリペプチド等、（図１において太字の下線で示されている）ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基３７５〜４００に一致する配列を有するポリペプチドの少なくとも一部に特異的に結合する能力を持つ。ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基３７５〜４００に一致する配列を有するポリペプチドの少なくとも一部に特異的に結合する能力を持つ抗体の例証的なバージョンは、ＳＳＧＺ抗体である。ＳＳＧＺ抗体の生成及びその結合特性は、以下においてさらに詳細に記載される。ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ他の抗体は、Ｓｉｋｕｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．１９９９；８２：５２−８によって記載される３Ａ１、１Ｅ１２、１Ｃ５、２Ｃ２、１Ｂ６、６Ｂ１１、１Ｄ１２、４Ｄ２、６Ｂ１２及び３Ｅ１２を含む。
【００３０】
本発明の他の抗体は、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ。（図１において下線で示されている）ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基２０〜２５３に一致する配列を有するペプチド又はその断片は、抗体を生成するために使用することができる。当該ペプチドは、好ましくは、ペプチドをグリコシル化する能力を持つ哺乳類細胞等の細胞内で生成される。ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基２０〜２５３に一致する配列を有するペプチド又はその断片を用いて生成される抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基２０〜２５３から成るポリペプチド等、ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基２０〜２５３に一致する配列を有するポリペプチドの少なくとも一部に特異的に結合する能力を持つ。ＣＤ４３細胞質ドメインに特異的に結合する能力を持つ例証的な抗体は、Ｒｅｍｏｌｄ−Ｏ´Ｄｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９８４；１５９：１７０５−２３によって記載されるＬ１０抗体を含む。
【００３１】
本明細書において記載される抗体は、癌性組織を特徴づける方法において使用することができる。当該抗体を使用して、いかなるタイプの組織におけるいかなるタイプの癌も特徴づけることができる。例証的な癌は、肺癌及び乳癌を含む。他の適用可能な癌は、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、腎癌、甲状腺癌、喉頭癌、胃癌、結腸癌、腺様嚢胞癌、婦人科癌及び脳癌、他の非造血性癌（Ｓａｎｔａｍａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５６，３３２６−３５２９，Ａｕｇ．１，１９９６を参照）並びに他の癌を含む。
【００３２】
癌性組織を特徴づける例証的な方法は、組織を、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体に接触させるステップ、前記組織を、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体に接触させるステップ、並びに、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体のいかなる結合の細胞局在も解明するステップを含む。
【００３３】
組織は、数ある中でも肺、乳房、膀胱、前立腺、精巣、腎臓、甲状腺、喉頭、胃の組織、結腸、脳及び膣の組織を含む、癌性ではないかと疑われる組織から採取される１つ又は複数の細胞若しくは細胞の群を含んでもよい。生検を介して組織を得るためのいかなる方法も受け入れられる。本発明の一部のバージョンにおいて、細胞は得られ、次に、培養液において分散され増殖され、さらに、接触及び解明ステップに供される前に処理されるかもしれない。本発明の他のバージョンにおいて、連結した細胞の群の全体的な断片、すなわち切片等が切除され、さらに、固定されるか、又さもなければ、接触及び解明ステップに供される前に処理される。本明細書において使用される場合、「組織」は、少なくとも、癌性又は癌性かもしれない腫瘍由来の個々のインタクトな細胞、インタクトな個々の細胞の群、インタクトな連結した細胞の群、細胞のライセート、分取された細胞のライセート、単離された細胞タンパク質、及び、他の処理された生物学的物質を意味する。
【００３４】
組織を、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体に接触させるステップ、及び、組織を、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体に接触させるステップは、組織の同じ部分又は組織の異なる部分に対して行われてもよい。例えば、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体に接触させるステップ、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体に接触させるステップは、腫瘍から得られた単一の細胞、細胞の単一の群、又は、細胞由来のライセートの単一の部分に対して行われてもよい。接触させるステップが組織の異なる部分に対して行われる場合、各部分における抗体の結合が他の部分を表している、好ましくは腫瘍全体として表しているように、組織の異なる部分は、同じ腫瘍、好ましくは腫瘍の近位の領域から得られるべきである。
【００３５】
抗体接触ステップは、好ましくは、核結合及び細胞質結合を解明する能力を持つ型式で行われる。核結合及び細胞質結合を解明する能力を持つ型式は、抗体が、細胞質の細胞要素ではなく核の細胞要素に結合するかどうか、核の要素ではなく細胞質の細胞要素に結合するかどうか、又は、核の細胞要素にも細胞質の細胞要素にも結合するかどうか決定することを可能にするものである。「核の要素」は、インタクトな細胞内の核に属する要素を意味する。「細胞質の要素」は、インタクトな細胞内の細胞質に属する、すなわち、核の外側ではあるが細胞膜の内側の要素を意味する。従って、「核結合」及び「細胞質結合」という用語は、核の要素又は細胞質の要素に対する、接触時にそのような要素がそれぞれ核又は細胞質内に現在属していようとなかろうと、抗体の結合を意味する。核結合及び細胞質結合を解明する能力を持ち得る適した型式は、以下においてさらに詳細に考察される特定の上流及び下流手順に応じて、数ある中でも免疫細胞化学、免疫組織化学、免疫ブロット及び酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を含んでもよい。
【００３６】
ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体のいかなる結合の細胞局在も解明するステップは、抗体自体に、又は、抗体に直接若しくは間接的に特異的に結合する別の分子に結合若しくは接合したラベルからの検出可能なシグナルを検出することによって行うことができる。ラベル、又は、ラベルが結合若しくは接合された分子は、本明細書において「シグナル生成試薬」と呼ばれる。シグナル生成試薬は、好ましくは、抗体の結合に実質的に干渉することなく、本発明の抗体に特異的に結合する。シグナル生成試薬の非限定的な例は、本発明の抗体に特異的に結合するラベルされた二次抗体である。
【００３７】
ラベルは、単独で又は他の組成物若しくは化合物と協調して、検出可能なシグナルを提供する能力を持つ。ラベルは、例えば比色測定又は他の既知の方法によって、視覚的に検出可能である。アッセイにおける比色分析シグナルを明らかにするように作動する種々の酵素システムが、当技術分野において記載されている。１つの例として、（基質としてグルコースを使用する）グルコースオキシダーゼは、産物としてペルオキシドを放出する。ペルオキシド、及び、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）等の水素供与体と反応するペルオキシダーゼは、青色のものとして見られる酸化ＴＭＢを産生する。他の例として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）、並びに、ＡＴＰ、グルコース及びＮＡＤ＋と反応して数ある産物の中でも、３４０ｎｍ波長にて増加した光吸収として検出されるＮＡＤＨを生じるグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼと組み合わせてヘキソキナーゼが挙げられる。本発明の方法において利用されてもよい他のラベルシステムは他の手段によって検出可能であり、例えば、色素が包埋されている着色ラテックス微粒子（Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｄ．）を、酵素の代わりに使用して、抗体との接合体を形成し、さらに、適用可能なアッセイにおいて結果として生じる複合体の存在を示す視覚性シグナルを提供してもよい。さらに他のラベルは、蛍光化合物、放射性化合物又は要素を含む。本発明の診断アッセイにおいて有用な、抗体へ付着させるための検出可能なラベルは、診断アッセイの技術分野における熟練者にとって既知であり、容易に入手可能な数多くの組成物の中から容易に選択することができる。本発明の方法及び抗体は、利用される特定の検出可能なラベル又はラベルシステムによって限定されない。
【００３８】
ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体のいかなる結合の細胞局在も解明するステップは、さらに、多くの方法のいずれによっても行うことができる。免疫細胞化学及び免疫組織化学において、細胞局在は、顕微鏡を介して典型的に決定されるように、既知の小器官に結合する抗体又は細胞局在マーカーからのシグナルの共局在によって決定することができる。核、細胞表面及び他の細胞局在のマーカーが、当技術分野においてはよく知られている。例えば、４´，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）は、一般的に使用される核のマーカーであり、さらに、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）は、一般的に使用される細胞表面のマーカーである。細胞局在は、目視検査によって決定することもできる。核結合は、典型的に、細胞の内部における明確な非中空円形の形状で明らかになる。細胞表面結合は、典型的に、細胞の周辺を画定する明確な中空のとぎれのない円形の形状で明らかになる。細胞内又は細胞質結合は、典型的に、細胞の周辺の境界内の拡散染色（ｄｉｆｆｕｓｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）によって明らかにされる。ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を、比較目的のために、組織に対して行って、他の細胞構造体から核を解明することができる。種々のソフトウェアプログラムを使用して、シグナルの細胞局在を検出及び定量化することができる。そのようなプログラムの例は、ＭＥＴＡＭＯＲＰＨ−ｂｒａｎｄ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．，ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）である。免疫細胞化学又は免疫組織化学は、分散した細胞又は組織全体の切片に対して使用することができる。「免疫細胞化学」という用語は、当技術分野においては、分散した細胞を免疫染色することを典型的に意味する。「免疫組織化学」という用語は、当技術分野においては、組織切片を免疫染色することを典型的に意味する。
【００３９】
ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体のいかなる結合の細胞局在も解明するステップは、細胞成分で分画される組織ライセートを用いて、免疫ブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）又は他の方法を介して行うこともできる。核、膜、細胞質成分へのライセートの細胞成分分画を行うための方法は、当技術分野においてよく知られている。加えて、多くのキットが、そのような分画方法を行うために、商業的に入手可能である。そのようなキットの１つの例は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）からのＳｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  Ｋｉｔである。１つ又は複数の細胞成分分画における成分に結合する抗体の検出は、抗体結合の細胞局在を効果的に示す。従って、本発明の一部のバージョンは、核、膜及び細胞質成分へ組織ライセートを細胞成分で分画するステップ、各分画を、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ第１の抗体、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ第２の抗体に接触させるステップ、並びに、どの分画に第１及び第２の抗体が結合しているか又は結合していないかを決定することによって、第１の抗体及び第２の抗体のいかなる結合の細胞局在も解明するステップを含む。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「細胞内」局在又は結合は、細胞の形質膜又は細胞表面に関して内部に発生する局在又は結合を意味し、さらに、細胞質及び／又は核の局在若しくは結合を含んでもよい。「細胞表面」局在又は結合は、細胞膜上等、細胞の周辺上で発生する局在又は結合を意味する。「核」局在又は結合は、細胞の核の上又は細胞の核内で発生する局在又は結合を意味する。「細胞質」局在又は結合は、非核の細胞内局在又は結合を意味する。
【００４１】
上記例において要点が述べられているように、本発明は、特定の抗体の結合の細胞局在を解明することによって、癌組織を同定しさらに特徴づけるための方法を提供する。
【００４２】
一部のバージョンにおいて、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体の細胞内結合は、細胞が癌細胞であるということを示す。一部のバージョンにおいて、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体の核結合は、癌性細胞として細胞を同定する。
【００４３】
一部のバージョンにおいて、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合の欠如、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合の欠如、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合の欠如は、高悪性度の癌であるか又は高悪性度の癌を含むとして、特に、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合の欠如、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合の欠如、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合の欠如を示さない組織よりも悪性度が高い癌性であるとして、組織を特徴づける。
【００４４】
一部のバージョンにおいて、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合の欠如、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合の欠如、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合の欠如は、組織を提供する患者の減少した生存率を、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合、及び、少なくとも、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合によって特徴づけられる組織を提供する患者の生存率と比較して示す。「少なくとも、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合」は、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体が、核結合も示し得るということも意味する。
【００４５】
一部のバージョンにおいて、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合の欠如、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合の欠如、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合の欠如は、組織を提供する患者の減少した生存率を、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合によって特徴づけられる組織を提供する患者の生存率と比較して示す。
【００４６】
一部のバージョンにおいて、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合の欠如、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合の欠如は、組織を提供する患者の減少した生存率を、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合によって特徴づけられる組織を提供する患者の生存率と比較して示す。
【００４７】
一部のバージョンにおいて、組織は肺組織である。ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体を用いた肺組織への核結合、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合の欠如、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合の欠如、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合の欠如は、組織を、ほぼ確実な小細胞肺癌組織として特徴づける。
【００４８】
一部のバージョンにおいて、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体を用いた肺組織への細胞質結合は、組織を、ほぼ確実な非小細胞肺癌組織として特徴づける。これは、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体が、核結合も示そうとなかろうと、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体が核結合を示そうとなかろうと関係ない。
【００４９】
一部のバージョンにおいて、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体を用いた肺組織への核結合、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合は、組織を、ほぼ確実な非小細胞肺癌組織として特徴づける。これは、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体が、核結合も示そうとなかろうと関係ない。
【００５０】
一部のバージョンにおいて、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体を用いた肺組織への核結合、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との細胞質結合、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との核結合は、組織を、ほぼ確実な非小細胞肺癌組織として特徴づける。
【００５１】
単一細胞への結合の評価に関して本明細書において使用される場合、「結合」は、適した正の対照と実質的には同じである、及び／又は、適した負の対照よりも実質的には大きい、局在しているシグナルの存在を意味する。「結合の欠如」は、適した正の対照よりも実質的には少ない、及び／又は、適した負の対照と実質的には同じである、局在しているシグナルを意味する。細胞の集団に対する結合の評価に関して本明細書において使用される場合、「結合」は、１０％以上の細胞において、適した正の対照と実質的には同じである、及び／又は、適した負の対照よりも実質的には大きい、局在しているシグナルの検出を意味する。「結合の欠如」は、１０％未満の細胞において、適した正の対照よりも実質的には少ない、及び／又は、適した負の対照と実質的には同じである、局在しているシグナルの検出を意味する。「ほぼ確実な非小細胞癌組織」及び「ほぼ確実な小細胞癌組織」等を参考にして使用される「ほぼ確実な」は、組織が、特定されたタイプの癌組織でないということよりも、統計学的に、特定されたタイプの癌組織でありそうであるということを意味する。
【００５２】
本発明は、本明細書において記載される抗体を用いたＣＤ４３の特定部分の細胞内局在を検出及び解明することによって癌細胞を同定することに限定されない。本発明は、いかなる方法によるＣＤ４３細胞質側末端を含むペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基２７７〜４００若しくはその他）又はその断片（ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基３７５〜４００若しくはその他）の細胞内局在を検出及び解明することを含む。本発明は、加えて、いかなる方法によるＣＤ４３の細胞外ドメインを含むペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ番号１の残基２０〜２５３）又はその断片の細胞内局在を検出及び解明することを含んでもよい。癌細胞を同定し特徴づける目的でのそのような検出の実際的重要性は、本発明の説明においてどこか他で行われる考察から明らかである。
【００５３】
本発明の一部のバージョンは、癌を有しているのではないかと疑われる患者から組織を得ること、本明細書において記載される方法に従って癌性組織を同定し、患者における癌の存在を確かめること、及び、確かめられた患者における癌を処置することを含む。一般的に癌を処置するために、当技術分野において知られるいかなる既知の癌治療も受け入れられる。例として、外科手術、化学療法及び／又は放射線照射が挙げられる。
【００５４】
本発明の一部のバージョンは、解明された、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体、及び、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体との結合の細胞局在に基づき患者を治療することを含む。例えば、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体が、核結合を示し、且つ、細胞質結合の欠如を示し、さらに、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体が、核結合の欠如及び細胞質結合の欠如を示す場合、組織は、悪性度の低い又は高悪性ではない癌とは反対に高悪性度の癌として特徴づけられる。そのような高悪性度の癌は、好ましくは、腫瘍の外科的除去、化学療法、放射線療法、及び／又は、抗体療法の組み合わせで処置される。一部の好ましい処置は、少なくとも、腫瘍の外科的除去、化学療法及び放射線療法を含む。他の好ましい処置は、放射線療法及び化学療法を含む。他の好ましい処置は、腫瘍の外科的除去及び化学療法を含む。他の好ましい処置は、腫瘍の外科的除去及び放射線療法を含む。他の好ましい処置は、腫瘍の外科的除去、化学療法、放射線療法及び抗体療法を含む。場合によっては、そのような特徴づけられる癌は乳癌である。
【００５５】
ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ抗体が、核結合を示し且つ細胞質結合の欠如を示し、さらに、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ抗体が、核結合及び細胞質結合を示す場合、組織は、高悪性度の癌とは反対に悪性度の低い又は高悪性ではない癌として特徴づけられる。そのような悪性度の低い又は高悪性ではない癌は、好ましくは、腫瘍の外科的除去、化学療法、放射線療法及び抗体療法の全てよりも少ない療法を用いて処置される。例として、腫瘍の外科的除去のみ、化学療法のみ、放射線療法のみ、又は、抗体療法のみが挙げられる。場合によっては、そのような特徴づけられる癌は乳癌である。
【００５６】
本発明の一部のバージョンは、本明細書において記載される方法によって、患者における癌性組織を、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）又は小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）として同定すること、次に、そのような細胞を得た患者を、ＮＳＣＬＣ特異的処置又はＳＣＬＣ特異的処置でそれぞれ治療することを含む。ＳＣＬＣは、その臨床的及び生物学的特徴のため、ＮＳＣＬＣとは異なっていると考慮される。小細胞肺癌は、急速な増殖、遠い部位への早期の転移、及び、高頻度の異なる腫瘍随伴症候群との関連を有する攻撃的行為を示す。ＳＣＬＣに対する治療計画は、ＮＳＣＬＣに対するものとは異なる。ＳＣＬＣは、化学療法及び放射線療法に対して非常に感受性がある。従って、ＳＣＬＣの処置は、化学療法と、通常、白金含有治療計画及び胸部放射線療法との組み合わせを含む。患者が完治を達成する場合、患者には、典型的に、予防的全脳照射が勧められる。外科手術は、ＳＣＬＣの処置において役割を果たすとしても、ほとんどその役割を果たさない。対照的に、外科的切除は、ＮＳＣＬＣを有する全ての患者に対して、依然として頼みの綱の処置である。本明細書において記載されるＳＣＬＣ細胞及びＮＳＣＬＣ細胞を同定する方法は、患者に存在する特定タイプの癌を同定することができ、その結果、上記の適切な治療計画（すなわち、ＮＳＣＬＣ特異的又はＳＣＬＣ特異的治療）を示すことができる。
【００５７】
本発明は、本明細書において記載される方法のいずれも行うためのキットをさらに含む。当該キットは、本明細書において記載される方法のいずれも行うために使用することができる、本明細書において記載されるいかなる試薬、抗体又は要素も含有し得る。１つの例証的なバージョンは、ＣＤ４３の細胞質側末端に特異的に結合する能力を持つ第１の抗体、ＣＤ４３の細胞外ドメインに特異的に結合する能力を持つ第２の抗体、並びに、ＣＤ４３の、それぞれ細胞質側末端又は細胞外ドメインに対する第１又は第２の抗体の結合に実質的に干渉することなく、第１及び／又は第２の抗体に特異的に結合する１つ又は複数のシグナル生成試薬を含むキットである。一部のバージョンにおいて、当該キットは、第２の抗体に実質的に結合しないように第１の抗体に特異的に結合する少なくとも１つのシグナル生成試薬を含有する。一部のバージョンにおいて、当該キットは、第１の抗体に実質的に結合しないように第２の抗体に特異的に結合する少なくとも１つのシグナル生成試薬を含有する。別の又はさらなる要素が、本発明のキットに含ませるために受け入れられる。
【００５８】
本明細書において記載される要素及び方法のステップは、明白に記載されていようがなかろうが、いかなる組み合わせにおいても使用することができる。本明細書において記載される方法のステップの全ての組み合わせを、その組み合わせが参照される状況によってそれとは反対に他に規定されない又は明白に意味しない限り、いかなる順においても行うことができる。
【００５９】
本明細書において使用される場合、単数名詞を言及する際に不定冠詞又は定冠詞が使用されている場合は、何か他に明確に述べられていない限りその名詞の複数形を含む。
【００６０】
数値範囲は、本明細書において使用される場合、明確に開示されていようとなかろうと、その範囲内に含まれる全ての数及び数の部分集合を含むよう意図される。さらに、これらの数値範囲は、その範囲内のいかなる数又は数の部分集合も対象とした請求項に対する支持を提供するとして解釈されるべきである。例えば、１から１０という開示は、２から８、３から７、５から６、１から９、３．６から４．６、３．５から９．９等という範囲を支持するとして解釈されるべきである。
【００６１】
本明細書において引用された全ての特許、特許刊行物及びピア・レビュー刊行物（すなわち、「参考文献」）は、各個々の参考文献が明確且つ個々にその全内容を参照により援用されたかのように、同じ程度まで参照により特別に援用される。本開示と援用された参考文献との間で矛盾が生じる場合、本開示を考慮に入れる。
【００６２】
本発明は、本明細書において例示され記述された部分の特定の構成及び配置に制限されないが、請求項の範囲内でそのような改変された形状を含むということが理解されたい。
【００６３】
実施例
通常、大きなシアロ糖タンパク質、ｇｐＬ１１５、ロイコシアリン及びシアロホリンとも呼ばれてきたＣＤ４３は、白血球及び血小板の表面上でのみ発現する［１、２］。成熟ＣＤ４３分子は、３８１個のアミノ酸で構成され、２３５残基の細胞外領域、２３残基の膜貫通領域、及び、１２３アミノ酸Ｃ末端細胞内領域に分けられる［３、４］。細胞外領域は、ほぼ８４のシアル酸付加のＯ結合型糖単位を含有し、さらに、電子顕微鏡によって、細胞表面から４５ｎｍ延びる棒状の構造であるように見える［５］。
【００６４】
ＣＤ４３は、２つの顔を有するローマの神からヤヌス分子として記載されてきた［１］。この類似性は、ＣＤ４３が完全に反対の機能を行うことができるという発見を反映している。第一に、どのようにして表面細胞にて結合しているかに応じて、ＣＤ４３は、白血球のアポトーシスを誘発するか又はそれから保護することができる［６〜１０］。第二に、白血球活性化の状態に応じて、ＣＤ４３は、抗接着性バリア分子又は接着性（ｐｒｏａｄｈｅｓｉｏｎ）受容体として作用することができる［６、１１〜１８］。
【００６５】
白血球は静止状態であるけれども、ＣＤ４３の長さ、容積、存在量及び強い負電荷が組み合わされて、接着を抑制し、さらに、循環において白血球を維持する［１１〜１４］。白血球活性化の間、ＣＤ４３の表面発現は、コード化する遺伝子の抑圧によっても、その細胞外ドメインのタンパク質切除によっても減らされる［１９〜２５］。加えて、ＣＤ４３は、細胞間接着のフォーカスから排除され、極性化の間に罹患しているウロポッド（ｃｏｎｔｒａｃｔｉｎｇ  ｕｒｏｐｏｄ）にて蓄積する［１３、２６〜２９］。共に、この下方制御及び再分布は、β２インテグリン等の他の白血球分子による影響を受ける細胞内相互作用及び移動を促進する［２６］。その抗接着性機能の軽減に加えて、ＣＤ４３は、活性化された白血球の能力において積極的な役割も果たす。その細胞外ドメインの糖鎖付加パターンにおける変化は、ＣＤ４３が、ガレクチン１、ＩＣＡＭ１、Ｅ−セレクチン、シアロアドヘシン及びＭＨＣクラスＩ分子に対する接着性（ｐｒｏａｄｈｅｓｉｏｎ）対抗受容体として機能することを可能にする［６、１３、１５〜１８、２８、３０、３１］。
【００６６】
ＣＤ４３は、通常、その発現において白血球及び血小板に制限されるけれども、結腸及び唾液腺癌における異常発現が記載されてきた［３２〜３５］。加えて、肺癌、乳癌、膀胱癌、前立腺癌、精巣癌、腎癌、甲状腺癌、喉頭癌及び胃癌も、ＣＤ４３発現によって特徴づけることができるということが限られた分析によって示唆されている［３６、３７］。
【００６７】
癌におけるＣＤ４３発現の以前の研究に関する重大な問題は、白血球によってＣＤ４３が発現されるに従いＣＤ４３の細胞外ドメインを認識するモノクローナル抗体を使用していたということである。ＣＤ４３の細胞外ドメインは、重度且つ不定にグリコシル化される［１］。その結果、白血球ＣＤ４３の細胞外ドメインに対する抗体は、おそらく、癌細胞によって発現されるに従いＣＤ４３の偽陰性の評価を与えやすい。これは、２つのＳＣＬＣケースのみに基づき、ＣＤ４３が、ＳＣＬＣではなくＮＳＣＬＣによって発現されるということを１つの以前のレポートが結論を出した［３６］とすれば、重要な考慮すべきことである。
【００６８】
多数の遺伝子発現特性が、肺癌に対して収集されてきた［３８］。しかし、いずれも、異常に発現されているとしてＣＤ４３を同定していない。これは、肺癌におけるいかなる異常なＣＤ４３発現も、誘発されたｍＲＮＡ安定性及び／又は転写とは反対の、異常な翻訳の誘発及び／又はタンパク質安定性によるものであるように思われるため、ＤＮＡマイクロアレイ技術の固有の制限を強調している。
【００６９】
以下の実施例は、抗体に基づく癌の特徴づけテストの態様を記載しており、このテストによって、適切な癌の処置に対する癌細胞の同定及び特徴づけにおけるＣＤ４３の存在及び局在が検出される。
【実施例１】
【００７０】
ポリクローナル抗体ＳＳＧＺの生成
癌細胞におけるＣＤ４３発現の以前の研究において使用された抗体に関する問題のため、その細胞内ドメインの末端の２６個のアミノ酸に対するウサギポリクローナル抗体を産生させた。この抗体を「ＳＳＧＺ」と名付けた。
【００７１】
Ｃｏｖａｌａｂ  Ｓ．Ａ．Ｓ（Ｖｉｌｌｅｕｒｂａｎｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）によって、配列ＮＨ２−ＰＬＶＡＳＥＤＧＡＶＤＡＰＡＰＤＥＰＥＧＧＤＧＡＡＰ−ＣＯＯＨを有する２６個のアミノ酸のペプチドが合成された。このペプチドは、ＣＤ４３ｍＲＮＡの一次翻訳産物の残基３７５〜４００に相当する［３、４］。これらの残基は、ＣＤ４３の細胞内ドメインの２６末端残基である。同じ会社によって、次に、グルタルアルデヒド架橋結合が使用され、ペプチドのＮ末端をキーホールリンペットヘモシアニンに接合した。次に、１００μｇの複合ペプチドを含有する溶液０．５ｍｌを、０．５ｍｌのフロイント完全アジュバントと混ぜ合わせ、次に、この混合液を、ニュージーランドホワイトウサギの皮内に注入した。２１日後、さらに４２日後にも、フロイント不完全アジュバントではあるが皮内注射を繰り返した。６３日後、さらに９１日後にも、フロイント不完全アジュバントで皮下注射を行った。１１６日後、血清を抜き取り、さらに、ＩｇＧを免疫精製（ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｙ）した。
【実施例２】
【００７２】
ＳＳＧＺによるＣＤ４３結合の検証
ウエスタンブロット分析を使用して、ＣＤ４３結合に対してＳＳＧＺをテストした。ＳＳＧＺによって、モノクローナル抗体Ｌ１０によって検出される主要なタンパク質に相当する電気泳動移動度を有したジャーカットＴリンパ球細胞の抽出物における１つの主要なタンパク質を検出した（図２）。Ｌ１０抗体は、ＣＤ４３のＮ末端に結合する［４０］。
【実施例３】
【００７３】
免疫細胞化学
ヒトの肺又は乳房組織を含有する、ホルマリン固定されたパラフィン包埋ブロックから、４μｍの連続的な切片を作り、さらに、Ｃｏｌｏｒｆｒｏｓｔ（登録商標）プラス顕微鏡スライド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）上で一晩乾燥させた。次に、サンプルスライドを、６０℃での６０分のインキュベーションによって脱パラフィンし、４度のキシレンの取りかえ（４  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ｘｙｌｅｎｅ）、３度の１００％エタノールの取りかえ、２度の９５％エタノールの取りかえ、さらに、水道水における保存を続けた。各ブロックから１つのスライドを、ヘマトキシリン及びエオシンＹで染色した。残りのスライドを、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，ｐＨ９（Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）の存在下で、９０〜１００℃での２０分のインキュベーションに供した。次にそのスライドを、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ（ＤＡＢ）（Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）のペルオキシダーゼブロッキング試薬によって組織を覆いながら、５分間室温にて揺り動かした。次に、ロッキングインキュベーション（ｒｏｃｋｉｎｇ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）を、Ｓｕｒｆａｃｔ−Ａｍｐｓ（登録商標）Ｘ−１００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いて３０分間室温にて行った。各ブロックから１つのスライドを、製造業者（Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）によって推奨されたように希釈したＩｇＧ非免疫ウサギ又はマウス抗体と共に、４５分間室温にて揺り動かした。各ブロックから１つのスライドを、ＣＤ４３のＣ及びＮ末端をそれぞれ特異的に認識する１：２４００希釈のウサギポリクローナル抗体ＳＳＧＺ又は１：１００希釈のマウスモノクローナル抗体Ｌ１０［４０］を用いて同じくインキュベートした。次に、連続のロッキングインキュベーションを、ポリマーＨＲＰ標識抗ウサギ又は抗マウスを用いて３０分間室温にて行い、洗浄バッファーを用いて、２度、５分間行い、さらに、ＤＡＢ＋色素原（Ｄａｋｏ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．）を用いて５分間行った。スライドを、ヘマトキシリンにおいて浸漬し、水道水で洗浄し、１％氷酢酸において浸漬し、水道水において再度洗浄し、次に、１％水酸化アンモニウムにおいて浸漬することによって対比染色を成し遂げた。１００％エタノール、次にキシリンにおいて洗浄することによって、組織を脱水し、その組織を、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）付きカバーガラスによって最終的に保護した。核及び細胞質に特異的なＬ１０及びＳＳＧＺの染色の程度を、０又は１＋としてスコア化した。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏａｒｄ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙによって認定されている病理学者（ＪＪＡ）が、肺癌研究における染色をスコア化した。０のスコアは、１０％未満の悪性物質において染色を観察したということを示した。１＋のスコアは、１０〜７０％＋の腫瘍を染色したということを示した。
【実施例４】
【００７４】
ＳＣＬＣ又はＮＳＣＬＣとしての肺組織における癌の特徴づけ
Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ＢｉｏＢａｎｋ及びＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ａｔ  Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ  Ｌｕｔｈｅｒａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒのファイルの遡及検索によって、１９８４年から１９８６年にさかのぼり２５のＳＣＬＣの症例、１９８４年から２００８年にさかのぼり２８のカルチノイドＮＳＣＬＣの症例、１９８３年から１９８４年にさかのぼり１８の扁平上皮ＮＳＣＬＣの症例、及び、１９８３年から１９８５年の間に腺癌として診断された２０のＮＳＣＬＣの症例を同定した。１９８５年に診断された１つの軽度の珪肺症の症例も同定した。珪肺症対照事例を表すパラフィン包埋のホルマリン固定された組織及び各癌症例の原発腫瘍の切片を作り、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、さらに、組織学的診断を検証した。全てのファイル検索及び後の実験手順は、Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｇｕｎｄｅｒｓｅｎ  Ｃｌｉｎｉｃ，Ｉｎｃ．ｏｆ  Ｌａ  Ｃｒｏｓｓｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎによって認可された。
【００７５】
次に、ＳＳＧＺ及びＬ１０抗体を使用して、ＳＣＬＣを有する２５人の患者、カルチノイドＮＳＣＬＣを有する２８人の患者、扁平上皮ＮＳＣＬＣを有する１８人の患者、及び、腺癌組織学的タイプのＮＳＣＬＣを有する２０人の患者から除去された、ホルマリン固定されたパラフィン包埋原発性肺腫瘍を分析した（図３）。軽度の珪肺症を有する５２歳男性から除去された、ホルマリン固定されたパラフィン包埋肺組織を、非悪性の対照として使用した。
【００７６】
腫瘍を、核及び細胞質におけるそのＬ１０及びＳＳＧＺ染色のパターンによって規定される以下の９つの群、
ＬＣ／ＳＣ：    核における０のＳＳＧＺ染色スコア及び細胞質における１＋のＳＳＧＺ染色スコアと共に、核において０のＬ１０染色スコアを示すが、細胞質において１＋のＬ１０染色スコアを示す腫瘍
ＬＣ／ＳＮ：    核における１＋のＳＳＧＺ染色スコア及び細胞質における０のＳＳＧＺ染色スコアと共に、核において０のＬ１０染色スコアを示すが、細胞質において１＋のＬ１０染色スコアを示す腫瘍
ＬＣＮ／ＳＮ：  核における１＋のＳＳＧＺ染色スコア及び細胞質における０のＳＳＧＺ染色スコアと共に、核においても細胞質においても１＋のＬ１０染色スコアを示す腫瘍
ＬＣ：          核においても細胞質においても０のＳＳＧＺ染色スコアと共に、核において０、及び、細胞質において１＋のＬ１０染色スコアを示す腫瘍
ＬＮ：          核においても細胞質においても０のＳＳＧＺ染色スコアと共に、核において１＋、及び、細胞質において０のＬ１０染色スコアを示す腫瘍
ＬＣＮ：        核においても細胞質においても０のＳＳＧＺ染色スコアと共に、核においても細胞質においても１＋のＬ１０染色スコアを示す腫瘍
ＳＮ：          核においては１＋のＳＳＧＺ染色スコアであるが、細胞質においては０のＳＳＧＺ染色スコアと共に、核においても細胞質においても０のＬ１０染色スコアを示す腫瘍
ＳＣＮ：        核においても細胞質においても１＋のＳＳＧＺ染色スコアと共に、核においても細胞質においても０のＬ１０染色スコアを示す腫瘍
４ＮＧ：        核においても細胞質においても０のＳＳＧＺ染色スコアと共に、核においても細胞質においても０のＬ１０染色スコアを示す腫瘍
に分類した（表１を参照）。
【００７７】
【表１】
2015514985.tif 000003
免疫組織化学的シグナルは、通常発現されるＣＤ４３に対して予想される白血球の細胞膜上以外、非悪性の対照組織において検出しなかった。しかし、ＳＣＬＣ、カルチノイドＮＳＣＬＣ、扁平上皮ＮＳＣＬＣ及び腺癌において、少なくとも１０％の悪性組織が、それぞれ症例の９２％、１００％、８９％及び１００％においてＣＤ４３−陽性であった（表１）。Ｌ１０及びＳＳＧＺ染色の明確なパターンに基づき、肺癌は、表１において示されている９つの分子カテゴリーに分けることができる。さらなる例証的な結果に対して、全内容を本出願において援用するＦｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１３，１３２：１７６１−１７７０も参照されたい。
【００７８】
これらの結果は、ＣＤ４３発現が、ＮＳＣＬＣに対してだけでなくＳＣＬＣに対しても頑強なバイオマーカーであるということを示している。ＳＣＬＣは主にＣＤ４３−陽性であるという本発明者等の発見と、ＣＤ４３−陰性であるというＳＣＬＣの以前のレポート［３６］との間の矛盾は、おそらく、２つの研究において分析された異なる数の症例、及び、異なる抗体の使用から生じている。
【００７９】
ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣ両者におけるＣＤ４３発現の著しい特徴は、白血球に特有である細胞膜局在を有することなく排他的に細胞内であるということである。この結果の意味は、肺癌におけるＣＤ４３輸送が、白血球におけるものとは異なっているということである。肺癌におけるＣＤ４３の発現の別の著しい特徴は、症例の８５％において、ＳＳＧＺによって認識されるＣ末端エピトープが、排他的に核内で発現される一方で、別の抗ＣＤ４３抗体Ｌ１０によって認識されるＮ末端エピトープは、細胞内に排他的に局在しているということである。このＣＤ４３のＣ及びＮ末端の、異なる細胞内コンパートメントへの分離はタンパク質切断事象を意味し、このタンパク質切断事象は、核局在シグナルの分子を含有するＣ末端断片、及び、このシグナルを欠いているＮ末端断片を産生する［３９］。
【００８０】
ＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣは、ＣＤ４３発現の頻度の観点からほぼ等しいけれども、どのようにしてこの発現が示されているかという観点からは全く異なっている。ＮＳＣＬＣにおいて、症例の４８％が、細胞質におけるＮ末端発現と共に、核におけるＣ末端発現を示している。この肺癌の分子カテゴリーを、本発明者等は、細胞質におけるＬ１０発現、及び、核におけるＳＳＧＺ染色を示しているＬＣ／ＳＮと命名した。ＳＣＬＣにおいても、症例の６４％が、核におけるＣ末端発現を示しているが、Ｌ１０によって検出されるＮ末端の発現は存在していない。この分子カテゴリーを、本発明者等はＳＮと命名した。判別の目安になるＮＳＣＬＣ及びＳＣＬＣの攻撃性は、ＣＤ４３によって規定される異なる分子カテゴリーに対するその傾向に関連づけられるということが予想される。
【００８１】
Ｌ１０及びＳＳＧＺ染色に基づき、ＮＳＣＬＣ症例の５２％を、ＬＣ／ＳＮ以外の６つの群に、ＳＣＬＣの３６％を、ＳＮ以外の５つの群に分類することができる。全体で、ＣＤ４３発現の明確なパターンによって規定される９つの分子カテゴリーに、肺癌を分けることができる。この分類は、臨床的に関連性のある予知力を有するということが予想される。
【００８２】
肺癌におけるＣＤ４３のＣ末端ドメインの核局在は、主に細胞質に局在している結腸癌［３３］と対比させられる。これは、肺癌において、ＣＤ４３のＣ末端ドメインは、その二分核定位シグナルに関連付けられるが一方、結腸癌においては関連付けられないということを示している。
【実施例５】
【００８３】
癌の攻撃性の特徴づけ
乳癌を有する８４人の患者から単離されたホルマリン固定されたパラフィン包埋組織を、そのＣＤ４３発現の細胞内パターンに対して分析した。患者は、１９８０年から２００７年の間にＧｕｎｄｅｒｓｅｎ  Ｌｕｔｈｅｒａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｌａ  Ｃｒｏｓｓｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎにて診断された。病期は０からＩＶに及んだ。
【００８４】
個々の腫瘍が細胞質又は核において抗ＣＤ４３抗体Ｌ１０及びＳＳＧＺで染色された程度を、上記のように０又は１＋でスコア化した。腫瘍を、核及び細胞質におけるそのＬ１０及びＳＳＧＺ染色のパターンによって規定される以下の３つの群、
ＬＣＮ／ＳＮ：  核における１＋のＳＳＧＺ染色スコア及び細胞質における０のＳＳＧＺ染色スコアと共に、核においても細胞質においても１＋のＬ１０染色スコアを示す腫瘍
ＬＣ／ＳＮ：    核における１＋のＳＳＧＺ染色スコア及び細胞質における０のＳＳＧＺ染色スコアと共に、核において０のＬ１０染色スコアを示すが、細胞質において１＋のＬ１０染色スコアを示す腫瘍
ＳＮ：          核においては１＋のＳＳＧＺ染色スコアであるが、細胞質においては０のＳＳＧＺ染色スコアと共に、核においても細胞質においても０のＬ１０染色スコアを示す腫瘍
に分類した。
【００８５】
上記の実施例において記載した他のＬ１０及びＳＳＧＺ染色パターン（すなわち、ＬＣ／ＳＣ、ＬＣ、ＬＮ、ＬＣＮ、ＳＣＮ及び４ＮＧ）は、この実施例の乳癌組織において、めったに観察されなかった。
【００８６】
【表２】
2015514985.tif 000004
表２において示されているように、核においてＳＳＧＺによって染色された腫瘍を有する患者は、Ｌ１０の細胞内染色の程度に応じて、減少した全生存期間を有している。従って、ＣＤ４３発現の細胞内パターンは、患者の生存期間を予想し、その結果、処置を決定するためにバイオマーカーとして役立つように思われる。
【実施例６】
【００８７】
考察
上記のデータによって、ＳＳＧＺ抗体を、単独で又は他の抗体若しくは他の分子試薬と組み合わせて使用して規定される、癌の新たな分子カテゴリーが明らかにされる。本発明は、スクリーニング、診断及び／又は予測キットにおける、ＳＳＧＺ、ＳＳＧＺが結合する２６個のアミノ酸のペプチド、及び、このペプチドをコード化するＤＮＡ配列の使用まで拡張する。
【００８８】
参照文献
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【図１】
2015514985.tif 000005
【図２】
2015514985.tif 000006
【図３】
2015514985.tif 000007
【配列表】
2015514985000001.app
【国際調査報告】
2015514985.tif 000008
2015514985.tif 000009
2015514985.tif 000010