(57)【要約】子癇前症／ＨＥＬＬＰ症候群の初期試験を可能にする特異的バイオマーカーを開示し、妊婦の子癇前症を予測する方法を提供する。妊婦から採取した試料を特異的バイオマーカーの濃度について分析する手段を含むキットを開示する。【選択図】図２Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
女性における子癇前症／ＨＥＬＬＰ症候群の有無またはリスクを評価し、治療計画の必要性を判断する方法であって、
前記女性から採取した生体試料中の補体因子Ｂ；ゲルゾリンイソ型Ａ前駆体；ホルネリン、フェチュインＢ；ヘモペキシン前駆体；アポリポタンパク質Ｈ前駆体；ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１；ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ１；レプチン；可溶性ガラクトシド結合性レクチン１４；パッパリシン２または胎盤特異性遺伝子１の１つまたは複数のレベルを測定する手順；
前記測定されたレベルに基づいてデータセットを作成する手順；
前記データセットに基づいて前記女性における子癇前症の有無または発症リスクを評価する手順；
前記子癇前症の有無またはリスクの評価に基づいて治療計画を決定する手順；を有する
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
女性における子癇前症の有無またはリスクを評価し、治療計画の必要性を判断する方法であって、
前記女性から採取した生体試料中の補体因子Ｂ、ホルネリン、ヘモペキシン前駆体、ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ１、可溶性ガラクトシド結合性レクチン１４、またはパッパリシン２の１つまたは複数のレベルを測定する手順；
前記測定されたレベルに基づいてデータセットを作成する手順；
前記データセットに基づいて前記女性における子癇前症の有無または発症リスクを評価する手順；
前記子癇前症の有無またはリスクの評価に基づいて治療計画を決定する手順；を有する
ことを特徴とする方法。
【請求項３】
子癇前症／ＨＥＬＬＰ症候群に密接に関連した妊娠初期の合併症（女性における着床不全、切迫流産、自然流産に限定されない）のリスクを評価し、治療計画の必要性を判断する方法であって、
前記女性から採取した生体試料中の補体因子Ｂ；ゲルゾリンイソ型Ａ前駆体；ホルネリン、フェチュインＢ；ヘモペキシン前駆体；アポリポタンパク質Ｈ前駆体；ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１；ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ１；レプチン；可溶性ガラクトシド結合性レクチン１４；パッパリシン２または胎盤特異性遺伝子１の１つまたは複数のレベルを測定する手順；
前記測定されたレベルに基づいてデータセットを作成する手順；
前記データセットに基づいて前記女性における子癇前症の有無または発症リスクを評価する手順；
前記子癇前症の有無またはリスクの評価に基づいて治療計画を決定する手順；を有する
ことを特徴とする方法。
【請求項４】
前記分析手順が、少なくとも３つのバイオマーカーのレベルについて実施される
請求項１ないし３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記試料が血液試料である
請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記試料がその他の体液、分泌物または排泄物（子宮頸膣液、唾液、尿に限らない）試料である
請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記試料が羊水試料である
請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記試料が侵襲的または非侵襲的に採取した胎児細胞である
請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記試料が胎盤試料である
請求項１ないし４のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記生体試料が、妊娠２０週より前に、妊娠１９週より前に、妊娠１８週より前に、妊娠１７週より前に、妊娠１６週より前に、妊娠１５週より前に、妊娠１４週より前に、妊娠１３週より前に、妊娠１２週より前に、妊娠１１週より前に、妊娠１０週より前に、妊娠９週より前に、妊娠８週より前に、妊娠７週より前に、妊娠６週より前に、または分娩後に採取される
請求項１ないし６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記治療計画が治療介入である
請求項１ないし７のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記治療介入は前記女性及び／または胎児に症状が顕在化する前に、子癇前症の症状を予防または軽減する
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
女性における子癇前症の有無またはリスクを評価し、治療計画の必要性を判断するキットであって、
前記女性から採取した生体試料中の補体因子Ｂ；ゲルゾリンイソ型Ａ前駆体；ホルネリン、フェチュインＢ；ヘモペキシン前駆体；アポリポタンパク質Ｈ前駆体；ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１；ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ１；レプチン；可溶性ガラクトシド結合性レクチン１４；パッパリシン２または胎盤特異性遺伝子１の１つまたは複数のレベルを測定する検出機構；（ｉ）前記測定されたレベルに基づいてデータセットを作成する方法；（ｉｉ）前記データセットに基づいて前記女性における子癇前症の有無または発症リスクを評価する方法；ならびに（ｉｉｉ）前記子癇前症の有無またはリスクの評価に基づいて治療計画を決定する方法の指示を含む
ことを特徴とするキット。
【請求項１４】
女性における子癇前症の有無またはリスクを評価し、治療計画の必要性を判断するキットであって、
前記女性から採取した生体試料中の補体因子Ｂ、ホルネリン、ヘモペキシン前駆体、ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ１、可溶性ガラクトシド結合性レクチン１４、またはパッパリシン２の１つまたは複数のレベルを測定する検出機構；（ｉ）前記測定されたレベルに基づいてデータセットを作成する方法；（ｉｉ）前記データセットに基づいて前記女性における子癇前症の有無または発症リスクを評価する方法；ならびに（ｉｉｉ）前記子癇前症の有無またはリスクの評価に基づいて治療計画を決定する方法の指示を含む
ことを特徴とするキット。
【請求項１５】
前記キットが少なくとも３つのバイオマーカーの検出機構を含む
請求項１３または１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記キットが、請求項１３または１４に記載のすべてのマーカーの検出機構を含む
請求項１３または１４に記載のキット。
【請求項１７】
前記キットが、請求項１３または１４に記載の少なくとも１つのマーカーの検出機構を含む
請求項１３または１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、妊婦の子癇前症ならびに／または溶血、肝酵素の上昇及び血小板減少（ＨＥＬＬＰ）症候群を予測ならびに／または検出するのに使用できる検査を提供する。より具体的には、本開示は、子癇前症及び／またはＨＥＬＬＰ症候群の早期予測及び／または検出に使用でき、かつ、これらに密接に関連した妊娠初期の妊娠合併症（着床不全、切迫流産及び自然流産などを含むがこれらに限定されない）の予測及び検出も可能にするバイオマーカーのパネルを提供する。
【背景技術】
【０００２】
子癇前症は、妊娠誘発性の高血圧とタンパク尿とを特徴とする症候群で、子癇（痙攣）ならびに母体及び／または胎児に他の重篤な合併症をもたらす可能性がある。子癇前症は、着床不全及び／または胎盤発育不全によって妊娠初期に生じ、そのため、妊娠初期の妊娠合併症（着床不全、切迫流産及び自然流産などを含むがこれらに限定されない）に密接に関連している。子癇前症は、妊婦の約５〜７％（全世界で年間約８３７万人の妊婦）が罹患し、母体及び周産期死亡の主な原因となっている。さらに、子癇前症を発症した女性はその後の人生において心血管系死亡のリスクが８倍高く、子癇前症を発症した妊娠で生まれた子孫は、その後の人生において代謝疾患や循環器疾患するリスク及び死亡リスクが高い。
【０００３】
米国のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｈｉｇｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｎ  Ｈｉｇｈ  Ｂｌｏｏｄ  Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｉｎ  Ｐｒｅｇｎａｎｃｙが定める子癇前症の現在の診断基準には、それまで正常血圧であった女性において妊娠２０週以降に発生するタンパク尿を伴う初発高血圧が含まれる。さらにこれらの基準では、子癇前症を、４時間以上かつ１週間以内の２つ以上の異なる時点に測定した収縮期血圧が≧１４０ｍｍＨｇ及び／または拡張期血圧が≧９０ｍｍＨｇであり、さらに、２４時間尿採取で≧３００ｍｇのタンパク質、または４時間以上かつ１週間以内に採取された２つの無作為尿検体に尿試験紙で≧１＋のタンパク質が含まれることと定義している。
【０００４】
臨床症状の時期に基づいて、子癇前症は歴史的に、「満期産」（≧３７週）及び「早産」（＜３７週）、または代替用語として、「遅発型」及び「早発型」子癇前症などの異なる派生型に分類されている。後者の分類の使用は一様ではないが、さまざまな試験で、子癇前症の早発型と遅発型との区別に、２８〜３５週のそれぞれ異なる妊娠期間が採用されている。近年、早発型と遅発型の区切りを妊娠３４週と定義することが提案されている。子癇前症は分娩中または分娩後に発症する場合もあることに注意する必要がある。したがって、子癇前症の症状の観察や評価は、分娩後も続ける必要がある。
【０００５】
子癇前症が溶血、異常肝機能及び血小板減少と関連している可能性があることは、１９５４年に初めて報告された。当初は子癇前症の重症型と解されたこの症状群は、のちに溶血、肝酵素の上昇及び血小板減少（ＨＥＬＬＰ）症候群と呼ばれる個別の臨床単位を構成するよう提案された。ＨＥＬＬＰ症候群は異なる疾患であるという考えの裏付けとして、ＨＥＬＬＰ症候群の患者の２０％までが高血圧症を発症せず、５〜１５％が最小限しか、またはまったくタンパク尿を伴わず、かつ、１５％が高血圧もタンパク尿も発症しない。さらに、ＨＥＬＬＰ症候群の検査所見が高血圧またはタンパク尿の重症度と相関することはめったにない。
【０００６】
母親が患う内科的合併症や子孫へのリスクに加え、子癇前症及びＨＥＬＬＰ症候群には、米国で年間約７０億ドルの医療費が費やされている。そのため、子癇前症／ＨＥＬＬＰ症候群の信頼できる予測検査を提供する多くの試みがなされてきた。以前の試みには、母体血中を循環する生化学マーカーの濃度の測定などがあるが、これまで、こうした手法に関する科学文献は相反しており、結論が出ていない。当技術分野においては、これらの疾患を予測及び診断する改良された新規の方法が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第５，１４３，８５４号
【特許文献２】米国特許第６，０８７，１１２号
【特許文献３】米国特許第５，２１５，８８２号
【特許文献４】米国特許第５，７０７，８０７号
【特許文献５】米国特許第５，８０７，５２２号
【特許文献６】米国特許第５，９５８，３４２号
【特許文献７】米国特許第５，９９４，０７６号
【特許文献８】米国特許第６，００４，７５５号
【特許文献９】米国特許第６，０４８，６９５号
【特許文献１０】米国特許第６，０６０，２４０号
【特許文献１１】米国特許第６，０９０，５５６号
【特許文献１２】米国特許第６，０４０，１３８号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｊａｎｓｓｅｎ，Ｂ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｒｔｉｃｌｅ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｅ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，１０：２２（２０１３）
【非特許文献２】Ｔａｂｉｓｈ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２０１２，７：ｅ３４６７４
【非特許文献３】Ｇｏｄｄｅｒｉｓ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４：２６９−２７７（２０１２）
【非特許文献４】Ｐｒｏｃｔｏｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５２：１２７６−１２８３（２００６）
【非特許文献５】Ｓｈｅｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｌｉｎ．Ｎｕｔｒ．Ｍｅｔａｂ．Ｃａｒｅ．１０：５７６−８１（２００７）
【非特許文献６】Ｇｕ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７：１３３−１３８（２０１０）
【非特許文献７】Ｂｏｃｋ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１１０６−１１１４（２０１０）
【非特許文献８】Ｈａｒｒｉｓ  ＲＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１０９７−１１０５（２０１０）
【非特許文献９】Ｓｉｂａｉ，Ｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅ−ｅｃｌａｍｐｓｉａ．Ｌａｎｃｅｔ  ２００５；３６５：７８５−９９
【非特許文献１０】Ｓｕ，ＡＩ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｇｅｎｅ  ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ．ＰＮＡＳ  ２００４；１０１：６０６２−６７
【非特許文献１１】Ｔａｒｃａ，Ａ．Ｌ．，Ｔｈａｎ，Ｎ．Ｇ．，＆Ｒｏｍｅｒｏ，Ｒ．Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｂｅｓｔ  Ｏｖｅｒａｌｌ  Ｔｅａｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＩＭＰＲＯＶＥＲ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  Ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ提出済（２０１３）
【非特許文献１２】Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９２）２０３（１），１７３−１７９．
【非特許文献１３】Ｈｅｌｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９５）２２４（１），４５１−４５５．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
子癇前症及び／またはＨＥＬＬＰ症候群の予測及び／または早期検出を可能にし、かつ、これらに密接に関連した妊娠初期の妊娠合併症（着床不全、切迫流産及び自然流産などを含むがこれらに限定されない）の予測及び検出も可能にする改良された新規の方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、子癇前症及び／またはＨＥＬＬＰ症候群の予測及び／または早期検出を可能にし、かつ、これらに密接に関連した妊娠初期の妊娠合併症（着床不全、切迫流産及び自然流産などを含むがこれらに限定されない）の予測及び検出も可能にするバイオマーカーの組み合わせを提供する。
【００１１】
１つの実施形態は、女性における子癇前症の有無またはリスクを評価し、治療計画の必要性を判断する方法を含み、これには以下を含む：女性から採取した生体試料中の補体因子Ｂ；ゲルゾリンイソ型Ａ前駆体；ホルネリン、フェチュインＢ；ヘモペキシン前駆体；アポリポタンパク質Ｈ前駆体；ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１；ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ１；レプチン；可溶性ガラクトシド結合性レクチン１４；パッパリシン２または胎盤特異性遺伝子１の１つまたは複数のレベルを測定する手順；測定されたレベルに基づいてデータセットを作成する手順；データセットに基づいて女性における子癇前症の有無または発症リスクを評価する手順；ならびに子癇前症の有無またはリスクの評価に基づいて治療計画を決定する手順。
【００１２】
別の実施形態は、女性における子癇前症の有無またはリスクを評価し、治療計画の必要性を判断する方法を含み、これには以下を含む：女性から採取した生体試料中の補体因子Ｂ、ホルネリン、ヘモペキシン前駆体、ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ１、可溶性ガラクトシド結合性レクチン１４、またはパッパリシン２の１つまたは複数のレベルを測定する手順；測定されたレベルに基づいてデータセットを作成する手順；データセットに基づいて女性における子癇前症の有無または発症リスクを評価する手順；ならびに子癇前症の有無またはリスクの評価に基づいて治療計画を決定する手順。
【００１３】
別の実施形態では、分析手順は少なくとも３つのバイオマーカーのレベルについて実施する。
【００１４】
別の実施形態では、試料は血液試料である。
【００１５】
別の実施形態では、試料はその他の体液、分泌物または排泄物（子宮頸膣液、唾液もしくは尿などを含むがこれらに限らない）試料である。
【００１６】
別の実施形態では、試料は羊水試料である。
【００１７】
別の実施形態では、試料は侵襲的または非侵襲的に採取した胎児細胞である。
【００１８】
別の実施形態では、試料は胎盤試料である。
【００１９】
別の実施形態では、生体試料は妊娠２０週より前に、妊娠１９週より前に、妊娠１８週より前に、妊娠１７週より前に、妊娠１６週より前に、妊娠１５週より前に、妊娠１４週より前に、妊娠１３週より前に、妊娠１２週より前に、妊娠１１週より前に、妊娠１０週より前に、妊娠９週より前に、妊娠８週より前に、妊娠７週より前に、妊娠６週より前に、または分娩後に採取する。
【００２０】
別の実施形態では、治療計画は治療介入である。
【００２１】
別の実施形態では、治療介入は女性及び／または胎児に症状が顕在化する前に、子癇前症の症状を予防または軽減する。
【００２２】
別の実施形態は、女性における子癇前症の有無またはリスクを評価し、治療計画の必要性を判断するキットを含み、これには以下を含む：女性から採取した生体試料中の補体因子Ｂ；ゲルゾリンイソ型Ａ前駆体；ホルネリン、フェチュインＢ；ヘモペキシン前駆体；アポリポタンパク質Ｈ前駆体；ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ１；ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ１；レプチン；可溶性ガラクトシド結合性レクチン１４；パッパリシン２または胎盤特異性遺伝子１の１つまたは複数のレベルを測定する検出機構；（ｉ）測定されたレベルに基づいてデータセットを作成する方法；（ｉｉ）データセットに基づいて女性における子癇前症の有無または発症リスクを評価する方法；ならびに（ｉｉｉ）子癇前症の有無またはリスクの評価に基づいて治療計画を決定する方法の指示。
【００２３】
別の実施形態は、女性における子癇前症の有無またはリスクを評価し、治療計画の必要性を判断するキットを含み、これには以下を含む：女性から採取した生体試料中の補体因子Ｂ、ホルネリン、ヘモペキシン前駆体、ヒドロキシステロイド（１７−β）デヒドロゲナーゼ１、可溶性ガラクトシド結合性レクチン１４、またはパッパリシン２の１つまたは複数のレベルを測定する検出機構；（ｉ）測定されたレベルに基づいてデータセットを作成する方法；（ｉｉ）データセットに基づいて女性における子癇前症の有無または発症リスクを評価する方法；ならびに（ｉｉｉ）子癇前症の有無またはリスクの評価に基づいて治療計画を決定する方法の指示。
【００２４】
別の実施形態では、キットは少なくとも３つのバイオマーカーの検出機構を含む。
【００２５】
別の実施形態では、キットは上述のすべてのマーカーの検出機構を含む。
【００２６】
別の実施形態では、方法とキットは、本明細書に記載する図及び実施例で説明する少なくとも１つのマーカーのレベルを測定する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】子癇前症における発現変動遺伝子のゲノム地図。Ｃｉｒｃｏｓで、内側の円内に実線で染色体を可視化している。曲線は、有意に相関する遺伝子と転写調節遺伝子のゲノム座標を結んでいる。有意性は、遺伝子と転写調節遺伝子対の発現レベル間の線形モデルをすべての試料に当てはめ、ＦＤＲを５％に制御して判断した。曲線は正相関及び逆相関を表す。２つめの円は、優勢胎盤発現（ＰＰＥ）を示す遺伝子のゲノム上の位置を示す（黒色の線：非発現変動；灰色の線：上方または下方制御）。３つめの円及び４つめの円は、それぞれ発現変動転写調節遺伝子の位置と非調節遺伝子の位置を、内向きの棒（下方制御）及び外向きの棒（上方制御）で示す。３つめの円及び４つめの円の棒の長さは、遺伝子発現変化の大きさを示す。
【図２Ａ】子癇前症における２つの遺伝子モジュールが、ＰＰＥ遺伝子で濃縮されており、かつ、平均動脈圧及び出生時体重パーセンタイルと関連していることを示す説明図。マイクロアレイデータのＷＧＣＮＡ解析により同定した遺伝子モジュール。調節不全の胎盤遺伝子発現は、グレーの濃度を変えて印し、子癇前症における１，４０９個の発現変動遺伝子内の５つの遺伝子モジュールによって特徴付けることができた。ｙ軸上に表示した高さは、ＷＧＣＮＡで用いた距離（１−ＴＯＭ）を示す。３８個のＰＰＥ遺伝子（黒色の縦線）のうち、３３個がグレースケールモジュールに属する（明るいグレー；ｎ＝２２、濃いグレー；ｎ＝１１）。これら２つのモジュールも上方制御遺伝子と下方制御遺伝子とで濃縮されており、それぞれ、グレーまたは黒色の線のモジュールの下に印した。
【図２Ｂ】子癇前症における２つの遺伝子モジュールが、ＰＰＥ遺伝子で濃縮されており、かつ、平均動脈圧及び出生時体重パーセンタイルと関連していることを示す説明図。１００個の試料と選択した４７個の遺伝子から得たｑＲＴ−ＰＣＲデータの階層的クラスタリング。明るいグレーと濃いグレーのモジュールの遺伝子が、検証用試料セットにおいて集まっている。重要なことに、子癇前症を有する女性から採取した６０個の試料のうち３４個が密集していた。距離、及び連結の平均についてピアソン相関を用いた。試料（カラムリーフ）は、患者群と発育状態に従って濃淡を付けた。
【図２Ｃ】子癇前症における２つの遺伝子モジュールが、ＰＰＥ遺伝子で濃縮されており、かつ、平均動脈圧及び出生時体重パーセンタイルと関連していることを示すグラフ。遺伝子発現と平均動脈圧及び出生時体重パーセンタイルとの関連性。各遺伝子について、線形モデルを当てはめた（発現〜血圧＋出生時体重パーセンタイル＋性別＋発育状態）。２つの係数（血圧及び出生時体重パーセンタイル）の有意性ｐ値（−ｌｏｇ１０）を４７個の遺伝子すべてについて示した。遺伝子は、モジュールのメンバーシップに従って濃淡を付けた（マイクロアレイ上で非発現変動であった黒色を除く）。色付きの丸はＰＰＥ遺伝子を、破線はｐ＝０．０５での有意性閾値を示す。出生時体重パーセンタイルと関連している９個の遺伝子のうち７個は明るいグレーのモジュールで、血圧と関連している１５個の遺伝子のうち１０個は濃いグレーのモジュールであることに注意されたい。
【図３】（Ａ）濃いグレーのモジュールの遺伝子の発現が、子癇前症のサブグループにおいて同じ方向に変化することを示すグラフ。各棒グラフにおいて、左右のパネルはそれぞれ早産と満期産の試料における有意差（「＊」）を示す。遺伝子発現は、子癇前症のサブグループにおいて同様のパターンを示す。早産試料における子癇前症を伴う変化が、満期産試料における子癇前症を伴う変化と比べて有意差がある場合、「＋」マークでこの相互作用を示す。  （Ｂ）濃いグレーのモジュールの遺伝子の発現が、子癇前症のサブグループにおいて同じ方向に変化することを示すグラフ。各棒グラフにおいて、左右のパネルはそれぞれ早産と満期産の試料における有意差（「＊」）を示す。タンパク質免疫染色は、子癇前症のサブグループにおいて同様のパターンを示す。早産試料における子癇前症を伴う変化が、満期産試料における子癇前症を伴う変化と比べて有意差がある場合、「＋」マークでこの相互作用を示す。４つのタンパク質に対する半定量的免疫スコアリングで、遺伝子発現データを検証した。  （Ｃ）濃いグレーのモジュールの遺伝子の発現が、子癇前症のサブグループにおいて同じ方向に変化することを示す写真。４種類の免疫染色の画像。早産対照（左、２９週）とＳＧＡを有する早産子癇前症を有する患者（右、３１週）とから得た同じ胎盤に４種類の免疫染色を行ったものを示している（倍率４０倍）。
【図４Ａ】ＡＲＮＴ２遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｂ】ＢＣＬ３遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｃ】ＢＣＬ６遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｄ】ＢＴＧ２遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｅ】ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｆ】ＣＧＢ３遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｇ】ＣＬＣ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｈ】ＣＬＤＮ１遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｉ】ＣＲＨ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｊ】ＣＳＨ１遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｋ】ＣＹＰ１９Ａ１遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｌ】ＤＵＳＰ１遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｍ】ＥＮＧ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｎ】ＥＲＶＦＲＤＥ１遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｏ】ＥＲＶＷＥ１遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｐ】ＥＳＲＲＧ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｑ】ＦＢＬＮ１遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｒ】ＦＬＴ１遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｓ】ＧＡＴＡ２遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｔ】ＧＣＭ１遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｕ】ＧＨ２遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｖ】ＨＬＦ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｗ】ＨＳＤ１１Ｂ２遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｘ】ＨＳＤ１７Ｂ１遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｙ】ＩＫＢＫＢ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４Ｚ】ＩＮＳＬ４遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＡＡ】ＪＵＮＢ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＢＢ】ＫＩＴ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＣＣ】ＬＥＰ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＤＤ】ＬＧＡＬＳ１３遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＥＥ】ＬＧＡＬＳ１４遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＦＦ】ＬＧＡＬＳ１６遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＧＧ】ＬＧＡＬＳ１７Ａ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＨＨ】ＭＡＰＫ１３遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＩＩ】ＮＡＮＯＧ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＪＪ】ＰＡＰＰＡ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＫＫ】ＰＡＰＰＡ２遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＬＬ】ＰＧＦ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＭＭ】ＰＬＡＣ１遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＮＮ】ＰＯＵ５Ｆ１遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＯＯ】ＳＩＧＬＥＣ６遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＰＰ】ＴＥＡＤ３遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＱＱ】ＴＦＡＭ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＲＲ】ＴＦＡＰ２Ａ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＳＳ】ＴＰＢＧ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＴＴ】ＶＤＲ遺伝子の比較を示すグラフ。
【図４ＵＵ】ＺＮＦ５５４遺伝子の比較を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
上述のように、子癇前症及び／またはＨＥＬＬＰ症候群の早期予測用バイオマーカーの開発及び検証のために、過去数年かけていくつかの試みが行われてきたが、結果は満足のいくものではなかった。考えられる理由として、分子背景が不均一である症候群の早期診断は、１つや２つのバイオマーカー分子だけを使っても解決できないということがある。
【００２９】
本開示は、妊娠７〜９週で繰り返し検出が可能な、遺伝子、タンパク質及びホルモンのバイオマーカーパネルの同定に至った総合的生物学的手法の使用について説明する。本開示の目的は、以下の複数の高次元技術を統合することによって実現した。１）胎盤の全ゲノムトランスクリプトミクス、２）胎盤のハイスループットｑＲＴ−ＰＣＲ発現プロファイリング、３）胎盤のハイスループット組織マイクロアレイタンパク質発現プロファイリング、４）ニューラルネットワーク解析で、血圧及び出生時体重を予測する候補バイオマーカーの最良の組み合わせを選択、５）線形判別分析モデルで、子癇前症予測の感度及び特異度の指標を確認、６）妊娠初期の母体血清の２Ｄ−ＤＩＧＥプロテオミクス。
【００３０】
１７個の胎盤を用いた全ゲノムトランスクリプトミクス試験で、子癇前症及び／またはＨＥＬＬＰ症候群の胎盤において胎盤特異的遺伝子及び妊娠特異的遺伝子の発現変動を同定した。この遺伝子群の産物は、妊娠中、母体血清中で大量に同定され得ることから、その発現及び分化調節は妊娠特異的である。しかしながら、その変化は、子癇前症だけでなく、他の産科症候群にも特異的である可能性がある。
【００３１】
１００個の胎盤のハイスループットｑＲＴ−ＰＣＲ発現プロファイリングで、選択された推定子癇前症バイオマーカーをＲＮＡレベルで検証した。
【００３２】
１００個の胎盤のハイスループット組織マイクロアレイタンパク質発現プロファイリングで、選択された推定子癇前症バイオマーカーをタンパク質レベルで検証した。
【００３３】
ニューラルネットワーク解析により、その発現が血圧及び出生時体重を予測できる、推定子癇前症バイオマーカー遺伝子の最良の組み合わせの選択を裏付けた。
【００３４】
線形判別分析により、子癇前症の検出用トランスクリプトームバイオマーカーの平均感度と特異度が、それぞれ９１．５％と７５％であったことが示された。
【００３５】
妊娠初期の母体血清の２Ｄ−ＤＩＧＥプロテオミクスから、妊娠第一期の母体血のプロテオームは、早発型または遅発型子癇前症を有する女性と、正常な妊婦とで異なっており、この差異が、特に子癇前症の２つのサブタイプで異なっていることが明らかとなった。これらの炎症及び／または代謝マーカーは妊娠に特有ではないものの、子癇前症の２つのサブタイプ間で区別することができる。これらのトランスクリプトームバイオマーカー候補とプロテオミックバイオマーカー候補とを組み合わせることにより、母体血における子癇前症特異的変化を検出でき、かつ、子癇前症の異なるサブタイプ間で区別も可能な分子のパネルが得られた。発現データを得るための数多くの方法が、本開示の文脈において、発現パターン及び発現プロファイルを確認するために、単独で、または組み合わせて用いることができる。例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡの発現パターンは、ノーザン解析、ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＴａｑＭａｎアッセイを用いた定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析、ＦＲＥＴ検出、１つまたは複数の分子標識のモニタリング、オリゴヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡアレイへのハイブリダイゼーション、ポリヌクレオチドアレイへのハイブリダイゼーション、液体マイクロアレイへのハイブリダイゼーション、微小電気アレイへのハイブリダイゼーション、分子標識、ｃＤＮＡ配列決定、クローンハイブリダイゼーション、ｃＤＮＡ断片フィンガープリント、遺伝子発現の連続解析（ＳＡＧＥ）、減法ハイブリダイゼーション、ディファレンシャルディスプレイ及び／またはディファレンシャルスクリーニングによって評価できる。
【００３６】
遺伝子発現変化は、後成的変動（例えば、ＤＮＡメチル化）に関連している可能性がある。後成的調節機構はＤＮＡ配列の変更に関与していない。代わりに、後成的変動は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びＤＮＡと関連するタンパク質の共有結合修飾を含む。これらは同様に、ＤＮＡの配座及びＤＮＡへの調節因子の到達性に変化をもたらす可能性がある。そのような変化は、遺伝子配列決定によって容易に同定できない。非特許文献１は、非特許文献２及び３により公表されている方法を用いて胎盤組織におけるメチル化を研究した。例えば非特許文献４において、ＭＳ−ＭＬＰＡ（メチル化特異的多重ライゲーション依存性プローブ増幅法）を用いて特異的遺伝子のメチル化状態を調べることができる。公表された試験で用いられているＭＳ−ＭＬＰＡの材料及び方法は、ＭＲＣ−Ｈｏｌｌａｎｄ（オランダ、アムステルダム）から入手可能である。さらなる方法が、非特許文献５〜８で考察、比較されている。
【００３７】
タンパク質発現パターンは、定量的に測定でき、かつ、試料から抽出した複数のマーカーの評価に適した任意の方法を用いて評価できる。こうした方法の例に、ＥＬＩＳＡサンドイッチ分析、質量分析検出、熱量測定分析、タンパク質アレイ（例えば、抗体アレイ）への結合、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などがある。手法では、ＥＬＩＳＡ、抗体アレイまたはＦＡＣＳ選別においてタンパク質産物の１つまたは複数のエピトープを認識する親和性標識試薬（例えば、抗体、小分子など）を使用できる。
【００３８】
通常、ハイスループットという用語は、１日に少なくとも約１００件、または少なくとも約５００件、または少なくとも約１０００件、または少なくとも約５０００件、または少なくとも約１０，０００件、またはそれ以上の分析を実施する方式を表す。分析を計測する際、分析する試料またはタンパク質マーカーの数を考慮できる。一般に、ハイスループット発現解析法には、対象試料かタンパク質マーカー、またはその両方の論理アレイまたは物理アレイが必要である。アレイ形式は、液相アレイと固相アレイのいずれも適している。例えば、核酸のハイブリダイゼーション、抗体またはその他の受容体とリガンドとの結合などに液相アレイを用いる分析は、マルチウェルまたはマイクロタイタープレートで実施できる。９６、３８４または１５３６ウェルのマイクロタイタープレートが広く使用されているが、例えば、３４５６や９６００ウェルなど、さらにウェル数の多いものも使用できる。一般に、マイクロタイタープレートの選択は、試料の調整や分析に用いられる方法や、ロボット処理システムやロボット充填システムなどの装置によって決定される。
【００３９】
別法として、さまざまな固相アレイも、発現パターンの測定に使用できる。例として、薄膜またはフィルターアレイ（例えば、ニトロセルロース、ナイロン）、ピンアレイ、ビーズアレイ（例えば、液体「スラリー」中で）などの形式がある。基本的に、特定の発現解析を実施するのに必要な試薬や条件に耐えられる任意の固相担体を利用することができる。例えば、機能化ガラス、シリコン、二酸化ケイ素、変成シリコン、各種ポリマー、例えば（ポリ）テトラフルオロエチレン、（ポリ）ビニリデンジフルオリド、ポリスチレン、ポリカーボネートまたはそれらの組み合わせはすべて、固相アレイの基質として用いることができる。
【００４０】
１つの実施形態において、アレイは、例えば上述の材料の１つから成る「チップ」を含むことができる。候補ライブラリの個々の成分の発現産物と特異的に相互作用するポリヌクレオチドプローブ、例としてＲＮＡまたはＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ、合成オリゴヌクレオチドなど、または結合タンパク質、例えば抗体もしくは抗原結合性フラグメントもしくはその誘導体などは、論理的に秩序のある方法で、すなわちアレイでチップに付着させる。さらに、（試料の標識化の設計に応じて）マーカーヌクレオチド配列のセンス配列またはアンチセンス配列に対して特異親和性を有する任意の分子を、マーカーに対する特異親和性が消失することなくアレイ表面に固定することができ、かつ、例えば、マーカー、リボザイム、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、または特異親和性を有するその他の化学物質もしくは分子の特定核酸配列を特異的に認識するタンパク質のアレイ作製用に、入手し、産生することができる。
【００４１】
核酸及びタンパク質をチップ基質に結合させる方法についての詳細な考察は、例えば、特許文献１〜１２に見られる。
【００４２】
マイクロアレイ発現は、多様なレーザーまたはＣＣＤベースのスキャナーを用いてマイクロアレイをスキャンし、例えばＩｍａｇｅｎｅ（Ｂｉｏｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、カリフォルニア州ホーソーン）、Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェア（Ａｇｉｌｅｎｔ）、Ｓｃａｎａｌｙｚｅ（Ｅｉｓｅｎ，Ｍ．１９９９．ＳＣＡＮＡＬＹＺＥ  Ｕｓｅｒ  Ｍａｎｕａｌ；Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．，Ｓｔａｎｆｏｒｄ，Ｃａｌｉｆ．Ｖｅｒ  ２．３２．）、またはＧｅｎｅＰｉｘ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）などのソフトウェアを用いて特徴を抽出して検出してよい。
【００４３】
１つの実施形態において、関心のマーカーに関して得られた定量的データ及びその他のデータセット要素は、選択パラメーターを用いて分析処理を行うことができる。分析処理のパラメーターは、本明細書において開示するもの、または本明細書に記載するガイドラインを用いて生成されたものであってよい。結果を出すために用いる分析処理は、試料を分類するのに役立つ結果をもたらすことのできる任意の処理、例えば、取得したデータセットと参照データセットとの比較、線形アルゴリズム、二次アルゴリズム、決定木アルゴリズム、または投票アルゴリズムであってよい。分析処理では、試料が所定の分類に属する確率を決定する閾値を設定してよい。確率は、好ましくは少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％以上である。
【００４４】
以下の実施例で、さらに本発明を説明するが、これらはその範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００４５】
マイクロアレイ試験
本実施例に記載する研究は、ハンガリーのＨｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏａｒｄ及びＷａｙｎｅ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＨｕｍａｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。インフォームドコンセントを得たのち、Ｓｅｍｍｅｌｗｅｉｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙの第一産婦人科でコーカサス人女性から胎盤組織試料を採取した。検体及びデータは匿名で保管した。妊娠期間は、超音波スキャンに基づいて妊娠８〜１２週と定めた。多胎妊娠（双子、三つ子など）患者、及び胎児が先天性異常または染色体異常を有する患者は除外した。女性を以下の同種群に組み入れた：（１）ＨＥＬＬＰ症候群のある／ない早産の重度子癇前症（ｎ＝１２）、（２）早産対照（ｎ＝５）（表１）。子癇前症は、米国産婦人科学会（ＡＣＯＧ）が定める基準に従って定義した（血圧：以前は血圧値が正常であり、妊娠２０週以降に収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇ以上、または拡張期血圧が９０ｍｍＨｇ以上；タンパク尿：２４時間尿採取でタンパク質が０．３ｇ以上（通常、尿試験紙で１＋以上のタンパク質に相当））。重度子癇前症は、Ｓｉｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．に従って定義した［非特許文献９］。早産対照は、内科的合併症、絨毛羊膜炎の臨床徴候または組織学的所見が認められず、満期出産胎児齢相当（ＡＧＡ）児を分娩した。全子癇前症例で症状が重かったため、また、全対照で帝王切開歴または妊娠３７週以前の胎位異常が原因で帝王切開を実施した。
【００４６】
【表１】
2015522258.tif 000003
【００４７】
ＲＮＡ単離及びマイクロアレイ事件
胎盤（ｎ＝１７）は分娩直後に採取した。組織検体は、遺伝子発現の局所差に起因するバイアスの可能性を減らすため、臍帯に近い中央の胎盤葉から切除し、ドライアイス上で絨毛脱落膜から切り分け、−８０℃で保管した。組織は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓａｖａｎｔ  ＦａｓｔＰｒｅｐ  ＦＰ１２０ホモジナイザー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、米国デラウェア州）とＬｙｓｉｎｇ  ＭａｔｒｉｘＤ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、フランス、イルキルシュ）を用いてホモジナイズした。全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ、ドイツ、ヒルデン）を用いて単離し、ＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量化し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ｍａｔｒｉｋｓ  ＡＳ、ノルウェー、オスロ）で評価した。全ＲＮＡ（対照：ｎ＝５、子癇前症：ｎ＝１２）を標識してから、Ｃｙ３−ＲＮＡを分解し、Ｗｈｏｌｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｏｌｉｇｏ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｇ４１１２Ａでハイブリダイゼーションを行い、Ａｇｉｌｅｎｔスキャナー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州サンタクララ）を用いた後、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアｖ９．５を使い、製造者の使用説明書に従って処理した。
【００４８】
データ解析
人口統計データは、ＳＰＳＳバージョン１２．０（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、米国イリノイ州シカゴ）を用いて、フィッシャーの正確確率検定とマンホイットニー検定で比較した。マイクロアレイデータ解析は、統計処理言語・環境Ｒを用いて実施した（ウェブサイト：ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）。マイクロアレイ発現強度は、「ｌｉｍｍａ」パッケージの「ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄＣｏｒｒｅｃｔ」機能で「ｍｉｎｉｍｕｍ」法を用いてバックグラウンド補正を行った。ｌｏｇ２変換した後、データを変位値により正規化した。アレイ上の４１，０９３個のプローブセットのうち９３個は、アレイ定義ファイル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にアノテーションがなかったため、差次的発現解析の前に取り除いた。次いで、発現フィルターを用いて、少なくとも２つの試料においてプローブセットをｌｏｇ２より高い強度に保ち、３０，０２７個のプローブセット（１５，９３９種類の遺伝子）の最終マトリックスを作成した。差次的遺伝子発現は調整ｔ検定を用いて評価した。ｐ値は偽発見率（ＦＤＲ）法を用いて調整した。プローブセットについて対象遺伝子のＥｎｔｒｅｚ  ＩＤを、Ｒパッケージ「ｈｇｕ４１１２ａ．ｄｂ」を用いて確認した。パッケージにアノテーションがないプローブセットについては、アレイ定義ファイル（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からＥｎｔｒｅｚ  ＩＤを取得した。アノテートされていない（Ｅｎｔｒｅｚ  ＩＤ及び／または遺伝子記号がない）プローブセットは、その後の解析から除外した。本実施例では、プローブセットのＦＤＲが≦０．２、かつ倍率変化（ＦＣ）が≧１．５であれば、発現変動と定義した（ｎ＝１４０９）。本明細書で使用する「差次的発現」、「有意な発現変動」及びこれに似た文言は、一般に、統計的検出力分析に基づいて遺伝子の発現に有意差があることを意味し、その結果は９５％信頼区間でｑＰＣＲにより検証できる。
【００４９】
７９個のヒト組織、細胞及び細胞株に関するヒトＵ１３３Ａ／ＧＮＦ１Ｈマイクロアレイデータを、Ｓｙｍａｔｌａｓマイクロアレイデータベース［非特許文献１０］からダウンロードし、優勢胎盤発現を有するヒト遺伝子を検索した。その胎盤発現が、１）蛍光強度≧１，０００である、２）他の７８個の組織及び細胞源における値の７５番目の変位値より６倍高い、３）発現が２番目に高い組織における発現よりも２倍高い場合、プローブセットは優勢胎盤発現を有すると定義した。得られた２１５のプローブセットは１５３種類の遺伝子に相当した。Ｓｙｍａｔｌａｓで用いられたマイクロアレイプラットフォーム（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、米国カリフォルニア州サンタクララ）に存在しないこの他の１１の遺伝子を、その潜在的関連性に応じてこのリストに追加した。１６４個の優勢胎盤発現遺伝子のうち１５７個が、使用したＡｇｉｌｅｎｔアレイに存在した。これらの遺伝子は、フィッシャーの正確確率検定を用いて、アレイ上の全遺伝子（１５，９３９個のうち１，４０９個）と比較して発現変動遺伝子の濃縮を試験した。
【００５０】
Ａｇｉｌｅｎｔアレイで試験した全遺伝子の染色体上の位置を、Ｒパッケージ「ｏｒｇ．Ｈｓ．ｅｇ．ｄｂ」から得た。アレイ上の１５，９３９個の遺伝子及び１，４０９個の発現変動遺伝子のうち、それぞれ１５，９３５個及び１，４０８個を染色体に割り当てることができた。ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトＵ１３３Ａ／ＧＮＦ１Ｈチップ上のマイクロアレイプローブセットのＥｎｔｒｅｚ ＩＤへのマッピングは、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｈｇｕ１３３ａ．ｄｂ及びｈｇｆｏｃｕｓ．ｄｂパッケージを用いて実施した。できあがった遺伝子リストの染色体位置は、パッケージｏｒｇ．Ｈｓ．ｅｇ．ｄｂから、及び追加の１１個の遺伝子についてはＮＣＢＩから得た。ＰＰＥ遺伝子、発現変動遺伝子、及び転写制御因子をコードする発現変動遺伝子における染色体の濃縮解析は、フィッシャーの正確確率検定により試験した。ＰＰＥ遺伝子及び発現変動遺伝子（転写制御因子、非転写制御因子）の染色体位置をＣｉｒｃｏｓで可視化した（図１）。
【００５１】
１７個の試料における１，４０９個の発現変動遺伝子で加重遺伝子共発現ネットワーク解析（ＷＧＣＮＡ）を行い、異なる制御モジュールを同定し、ｑＰＣＲ検証の候補遺伝子について優先順位を決定した。最初に遺伝子のペアワイズ類似度（絶対ピアソン相関）行列を計算し、次いで、１０乗してソフト閾値処理を行い（スケールフリートポロジー基準に基づいて選択）、隣接行列を得た。次いで、トポロジー重複行列（ＴＯＭ）を隣接行列から得た。トポロジー重複でネットワーク内のノードの相互接続性を評価し、加重共発現ネットワークに一般化した。この評価により遺伝子内の相関及び外部での他の遺伝子との相関に基づいて、２つの遺伝子の類似度を定義する。遺伝子の距離行列は、１−ＴＯＭと定義し、階層的クラスタリングの平均連結法に用いた。ハイブリッド動的木切除法を用いてモジュール（木クラスター）を得た。この手法により同定された遺伝子モジュールを、フィッシャーの正確確率検定を用いて、ＰＰＥ遺伝子の濃縮についてさらに試験した。高レベル（平均ｌｏｇ2強度＞９）で発現し、かつ、ＰＰＥ遺伝子間でもっとも数の多い遺伝子と共発現（絶対ピアソン相関＞０．８）した転写調節遺伝子を、モジュールのハブ遺伝子候補として処理した。
【実施例２】
【００５２】
有効性確認試験
試験群、臨床的定義、試料採取
本実施例に記載する研究は、Ｅｕｎｉｃｅ  Ｋｅｎｎｅｄｙ  Ｓｈｒｉｖｅｒ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（ＮＩＣＨＤ）のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（ＤＨＨＳ）及びＷａｙｎｅ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙにより承認された。インフォームドコンセントを得たのち、周産期医学研究部門（ＮＩＣＨＤ、ＮＩＨ、ＤＨＨＳ）の生物試料バンクから胎盤（ｎ＝１００）を取得した。妊娠期間は、超音波スキャンに基づいて妊娠８〜１２週と定めた。多胎妊娠（双子、三つ子など）患者、及び胎児が先天性異常または染色体異常を有する患者は除外した。検体及びデータは匿名で保管した。
【００５３】
ｑＲＴ−ＰＣＲ、組織マイクロアレイ、ｍＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション及びレーザーキャプチャーマイクロダイセクションのために、以下の同種群から成る大規模コホートから選択した女性の胎盤を用いた：（１）早産の重度子癇前症（ＰＥ；≦３６週；ｎ＝２０）、（２）低出生体重（ＳＧＡ）を伴う早産の重度子癇前症（ＰＥ−ＳＧＡ；≦３６週；ｎ＝２０）、（３）早産対照（ＰＴＣ；≦３６週；ｎ＝２０）、（４）満期産の重度子癇前症（ＴＰＥ；≧３７週；ｎ＝１０）、（５）ＳＧＡを伴う満期産の重度子癇前症（ＴＰＥＳＧＡ；≧３７週；ｎ＝１０）、（６）満期産対照（ＴＣ；≧３７週；ｎ＝２０）。これらの群の女性は、主にアフリカ系アメリカ人であった（表２）。陣痛あり（ｎ＝１０）または陣痛なし（ｎ＝１０）の正常妊婦から成る満期産対照、ならびに早期陣痛及び分娩であった早産対照（ｎ＝２０）は、内科的合併症、絨毛羊膜炎の臨床徴候または組織学的所見が認められず、ＡＧＡ児を分娩した。陣痛の定義は、子宮頸部の変化を伴う規則的な子宮収縮が１０分ごとに少なくとも２回生じ、分娩に至ることとした。子癇前症は、米国産婦人科学会（ＡＣＯＧ）が定める基準に従って定義した。重度子癇前症は、Ｓｉｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．（上記参照）に従って定義した。ＳＧＡは、在胎齢に対し新生児の出生時体重が１０パーセンタイル未満と定義した。全子癇前症例で症状が重かったため、また、対照群では帝王切開歴または胎位異常が原因で帝王切開を実施した。
【００５４】
【表２】
2015522258.tif 000004
【００５５】
全ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ作製、定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、急速凍結した胎盤絨毛組織（ｎ＝１００）からＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）とＱｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、米国カリフォルニア州バレンシア）とを用いて、製造者の推奨に従って単離した。２８Ｓ／１８Ｓ比及びＲＮＡ完全数をＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  ２１００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて評価し、ＲＮＡ濃度をＮａｎｏＤｒｏｐ１０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。全ＲＮＡの５００ｎｇを、ランダムヘキサマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔで逆転写した。ＴａｑＭａｎ  Ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、製造者の使用説明書に従って、Ｂｉｏｍａｒｋ（登録商標）ｑＲＴ−ＰＣＲシステム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ、米国カリフォルニア州サンフランシスコ）でのハイスループット遺伝子発現プロファイリングに使用した。
【００５６】
組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）作製、免疫染色、免疫スコアリング
ＦＦＰＥ絨毛組織ブロックからＴＭＡを作製した（ｎ＝１００）。簡潔に説明すると、２０×３５ｍｍのレシピエントブロック３つを、Ｐａｒａｐｌａｓｔ  Ｘ−Ｔｒａ組織包理剤（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ）で作製した。組織ブロックから直径１ｍｍコアを、自動組織アレイヤー（Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、米国メリーランド州シルバースプリング）を用いて、レシピエントパラフィンブロックに３連で移した。ＴＭＡの５μｍ切片を、シラン処理したスライドに載せ、抗体と試薬とを用いて手動で、またはＶｅｎｔａｎａ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ自動染色装置（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、米国アリゾナ州ツーソン）もしくはＬｅｉｃａ  ＢＯＮＤ−ＭＡＸ（登録商標）自動染色装置（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツ、ヴェッツラー）のいずれかで染色した。画像はＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ．、米国ペンシルベニア州センター・バレー）で取り込んだ。免疫染色は、２人の試験者が臨床情報を見ずに修正免疫反応性スコアを用いて半定量的に評価した。免疫染色強度は、以下のように等級分けした：０＝陰性、１＝弱染色、２＝中染色、３＝強染色。３つのコアそれぞれの任意領域の絨毛すべてを２人の試験者が評価し、各コア内のスコアの平均値を求め、当該コアの対象タンパク質を示した。したがって、各胎盤につき、試験した３つのコアに対応する３つのスコアがあり、これらのスコアを用いた群間比較をｑＲＴ−ＰＣＲデータと同じ方法で実施した。
【００５７】
胎盤の病理組織学的評価
胎盤組織試料（ｎ＝１００）を、系統的無作為標本抽出法により採取し、１０％中性緩衝ホルマリンで固定し、パラフィンに埋め込んだ。５μｍ片を絨毛組織ブロックから切除し、ヘマトキシリンとエオシンで染色し、２人の解剖病理学者が臨床情報を見ずに明視野光学顕微鏡を用いて調べた。病理組織学的変化は、公表されている基準に従って定義した。「母体の低灌流」と「胎児の血管内血栓閉塞性疾患」のスコアは、所定の胎盤に存在するこれらの病変の種類と一致するさまざまな病理学的病変の数を合計して算出した。
【００５８】
ｑＲＴ−ＰＣＲデータの統計解析と評価
人口統計データは、ＳＰＳＳバージョン１２．０（ＳＰＳＳ）を用いて、フィッシャーの正確確率検定とマンホイットニー検定で比較した。ｑＰＣＲデータは、統計解析環境ＲでΔΔＣｔ法を用いて解析した（ウェブサイト：ｒ−ｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）。データは最初に参照遺伝子（ＲＰＬＰＯ）に対して正規化し、バッチ効果を標準試料で調整した。各試料について、−ΔＣｔ（遺伝子）＝Ｃｔ（ＲＰＬＰＯ）−Ｃｔ（遺伝子）としてｌｏｇ2ｍＲＮＡ相対濃度を得た。代理遺伝子発現値（−ΔＣｔ遺伝子）を使い、１−ピアソン相関距離と平均連結法とを用いて階層的クラスタリングを実施した。群間比較（群は患者の臨床所見に基づいて事前に定めた）は、共変量として群変数指標を用いると同時に、群変数と胎児の発育状態（満期産と早産）との相互作用を考慮し、線形モデルを−Ｃｔ値に当てはめて実施した。
【００５９】
これらの群間比較に加え、解析を拡張して１００人の患者全員を検証段階に含め、遺伝子発現と血圧ならびに出生時体重との関連性について調べるとともに、妊娠期間について調整した。後の解析における変数はすべて、連続型として処理した。Ｐ値＜０．０５であれば、有意と判断した。
【００６０】
ニューラルネットワークベースの手法を用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲデータに基づいて血圧と出生時体重とを同時に最適に予測する２〜８個の遺伝子の最良の組み合わせを決定した。試料（ｎ＝１００）は、交差検証として、等分に（子癇前症の有無に関して）均衡をとって無作為に１０分割した。各分割で、試料の９０％を使用し、血圧と出生時体重との予測に関して別々に単変量で遺伝子をランク付けしたのち、この２つの結果のそれぞれについて、単純線形モデルを用い、性別と発育（満期産／早産）について調整し、最良の１５個の遺伝子を保持した。これらの遺伝子の組み合わせすべてを、訓練データを用いて血圧と出生時体重の両方を予測するよう訓練されたニューラルネットワークモデルへの入力データとして使用した。試料の残りの１０％は、遺伝子の組み合わせそれぞれについて、ニューラルネットワークの平均絶対相対予測誤差（ＡＡＲＥ）を決定するのに用いた。交差検証手順は１０回くり返した。したがって、データが１０種の１０倍の分割になり、試料が合計で１００の訓練セット及び１００の試験セットとなった。所定の遺伝子の組み合わせが組み合わせの上位５％にあった（最小ＡＡＲＥ）回数を記録し、血圧と出生時体重パーセンタイルとの両方を予測する能力について、その遺伝子の組み合わせをランク付けした。線形判別分析（ＬＤＡ）モデルを使用し、疾患状態（子癇前症と対照）を予測するモデルの感度と特異度の現実的な指標を得た。ＬＤＡは、上位２個の予測因子及び／または胎盤特異性の高い遺伝子としてニューラルネットワーク解析の結果から選択した６個の遺伝子（ＦＬＴ１、ＨＳＤ１７Ｂ１、ＬＥＰ、ＬＧＡＬＳ１４、ＰＡＰＰＡ２、ＰＬＡＣ１）でまず実施し、次いで、４個の遺伝子（ＨＳＤ１７Ｂ１、ＬＧＡＬＳ１４、ＰＬＡＣ１、ＰＡＰＰＡ２）の制限セットでも繰り返した。１００個の試料を繰り返し無作為に以下の２つの部分に分割した：ＬＤＡモデルに当てはめるために使用する訓練部分（試料の８０％）、及び当てはめたモデルの感度と特異度とを計算するために使用する試験部分（試料の２０％）。感度及び特異度の推定は、そのような１００回の試行の平均値を求め、ロバスト推定を得た。各試行では、検討された遺伝子を、ｔ検定を用いてランク付けし、内部の３重交差検証法によるＬＤＡモデルの性能を用いて、ＬＤＡモデルに取り入れる最適な数を決定する。この手法については別途詳細に記載されている（非特許文献１１）。
【００６１】
モデルは２セットのパラメーターを有していた。２つの群の４個の遺伝子の平均発現値（−ΔＣｔ値）は以下の表３のとおりであった（ｍ）。分散共分散行列（Σ）は以下の表４のとおりであった。任意の新しい固体については、発現プロファイルｘが利用できると仮定した。例えばｘは以下の表５のとおりである。
【００６２】
【表３】
2015522258.tif 000005
【００６３】
【表４】
2015522258.tif 000006
【００６４】
【表５】
2015522258.tif 000007
【００６５】
各患者分類（子癇前症と対照）の事後確率を、多変量正規式を用いて、新たなプロファイル値とモデルパラメーターから計算した。
【００６６】
【数１】
2015522258.tif 000008
【００６７】
【数２】
2015522258.tif 000009
【００６８】
ｐ（ｘ｜ＰＥ）＞ｐ（ｘ｜Ｃｔｌ）であれば、試料は子癇前症に分類し、ｐ（ｘ｜Ｃｔｌ）＞ｐ（ｘ｜ＰＥ）であれば、試料は対照に分類した。
【００６９】
統計的Ｒパッケージを使用し、これらのパラメーターを最初にＲに読み込み、かつ、ｍｖｔｎｏｒｍライブラリも読み込むと仮定して、以下の構文を用いてこれらの確率を計算した。
【００７０】
【数３】
2015522258.tif 000010
【実施例３】
【００７１】
母体血清プロテオミクス
試験群、臨床的定義、試料採取
全被験者が、Ｍａｃｃａｂｉ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ（イスラエル）の妊婦地域診療所における、２００２年８月〜２００３年３月の長期前向き多施設試験に組み入れられた。妊娠期間は、最終月経期に基づいて計算し、妊娠第一期の超音波検査で確認した。多胎妊娠（双子、三つ子など）患者、及び胎児が先天性異常または染色体異常を有する患者は除外した。ヒトの臨床試料の採取及び調査についてはＭａｃｃａｂｉ施設内審査委員会により、試験手順及びデータ解析については、ハンガリーのＨｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏａｒｄ及びＷａｙｎｅ  Ｓｔａｔｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＨｕｍａｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。被験者からは試料採取前にインフォームドコンセントを得た。検体及びデータは匿名で保管した。
【００７２】
子癇前症は、国際妊娠高血圧学会に従って、タンパク尿（２４時間尿採取で≧３００ｍｇ、または尿試験紙で≧２＋）を伴う、妊娠２０週以降に発症した高血圧（４時間〜〜１週間の間隔で２つの異なる時点に測定した収縮期血圧≧１４０ｍｍＨｇまたは拡張期血圧≧９０ｍｍＨｇ）と定義した。子癇前症は、１）タンパク尿を伴う重症高血圧（収縮期血圧が≧１６０ｍｍＨｇもしくは拡張期血圧が≧１１０ｍｍＨｇ）、２）重症タンパク尿（≧５ｇ／２４時間、もしくは尿試験紙で≧３）を伴う高血圧、または、３）肺水腫、欠尿、異常肝機能、上腹部痛、右上腹部痛、血小板減少、もしくは発作を含む重度の中枢神経症状など、母体に多臓器障害がある場合には、重度と定義した。低出生体重は、在胎齢に対し新生児の出生時体重が１０パーセンタイル未満と定義した。健常対照群は、内科的または産科的合併症がなく、在胎齢に見合った出生時体重の新生児を分娩した。
【００７３】
妊娠第一期の女性から静脈穿刺により末梢血試料を得た。これらの妊婦は、その後、早産の重度子癇前症（＜３６週；ｎ＝５）または満期産の重度子癇前症（≧３７週；ｎ＝５）を発症したか、または、採血時の妊娠期間に合致した健常対照（≧３７週；ｎ＝１０）となった（表３）。試料は、室温（ＲＴ）で１〜２時間保管し、１０，０００Ｇで１０分間遠心分離機にかけた。血清を採取し、２〜８℃で最大４８時間保管したのちＭａｃｃａｂｉ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに移動させ、そこでアリコートで−２０℃で保管してから、ドライアイス上でハンガリーに送付した。
【００７４】
【表６】
2015522258.tif 000011
【００７５】
Ｉ．発見段階
試料調製、多量の血清タンパク質の免疫除去
血清は、Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．（ハンガリー、デブレツェン）にて、Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ＬＣ  Ｃｏｌｕｍｎ−Ｈｕｍａｎ  １４（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州サンタクララ）を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣシステムで１４の多量の血清タンパク質について製造者の手順書に従って免疫除去した。２Ｄゲルの分解能を改善するために、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｌｔｄ．（ハンガリー、ブダペスト）にて、免疫除去した血清試料を凍結乾燥させたのち、脱脂、脱塩した。簡潔に説明すると、全試料の１容量にメタノール４容量を混合し、十分にボルテックスした。次いで、これらの混合物にクロロホルム１容量を加え、再度ボルテックスしてから、水（ＨＰＬＣグレード）３容量を混合する。遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、５分間、４℃）後、上の層を捨てた。次いで、メタノール３容量を加え、得られた混合物をボルテックスし、再度遠心分離を行った。上清を捨て、沈殿した血漿タンパク質を含むペレットを１０分間風乾した。脱脂及び脱塩した血漿タンパク質試料を溶解緩衝液（７Ｍ尿素；２Ｍチオ尿素；２０ｍＭトリス；５ｍＭ酢酸マグネシウム、４％ＣＨＡＰＳ）に溶解し、ｐＨを８．０に調整した。
【００７６】
蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動（２Ｄ−ＤＩＧＥ）
免疫除去、脱塩、脱脂した血清試料のタンパク質濃度は、ＰｌｕｓＯｎｅ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ）を用いた測定で、２〜４μｇ／μＬであった。試料はタンパク質含有量を均一にし、次いで、各タンパク質試料の５μｇをＣｙＤｙｅ  ＤＩＧＥ  Ｆｌｕｏｒ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｋｉｔ  ｆｏｒ  Ｓｃａｒｃｅ  Ｓａｍｐｌｅｓ（飽和色素）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて４ｎｍｏｌ／５μｇタンパク質の濃度で、製造者の使用説明書に従って標識した。症例（ｎ＝１０）及び対照（ｎ＝１０）の個々の試料をＣｙ５で標識した。内部標準試料は、この試験セットにおけるすべての試料について等量（２．５μｇ）をプールし、Ｃｙ３で標識した。次いで、各Ｃｙ５標識試料５μｇをＣｙ３標識標準試料５μｇと混合し、これら２０の混合物を２×１０ゲルで同時に処理した。簡潔に説明すると、標識タンパク質を、０．５％両性電解質、０．５％ＤＴＴ、８Ｍ尿素、３０％グリセリン、２％ＣＨＡＰＳを含有するＩＥＦ緩衝液に溶解し、２０枚の２４ｃｍ  ＩＰＧストリップ（ｐＨ３〜１０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、少なくとも１４時間、室温で受動的に再水和した。再水和後、ＩＰＧストリップは一次元目ＩＥＦを２４時間行った（合計８０ｋＶｈ）。集まったタンパク質は、１％メルカプトエタノールを含有する緩衝液で２０分間平衡化して還元した。還元後、ＩＰＧストリップを、１０％ポリアクリルアミドゲル（２４×２０ｃｍ）に載せ、二次元目で１０Ｗ／ゲルでＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した。次いで、ゲルをＴｙｐｈｏｏｎ  ＴＲＩＯ＋スキャナー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、適切なレーザーとフィルターを用い、ＰＭＴのバイアスを６００Ｖとしてスキャンした。異なるチャンネルの画像は、選択した色を使ってオーバーレイし、差分をＩｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて可視化した。ＤｅＣｙｄｅｒ  ６．０ソフトウェアパッケージ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｉｎ−ｇｅｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＤＩＡ）とＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｖａｒｉａｎｃｅ（ＢＶＡ）モジュールとを用いて、差分タンパク質解析を実施した。
【００７７】
発現変動タンパク質スポットの同定
全試験で存在したすべてのタンパク質の内部標準試料の代表をすべてのゲルに均等に載せ、個々の試料を正規化するための平均画像を得た。全ゲルにおける内部標準間の蛍光シグナルの相対存在量の測定は、試験変動を排除し、ゲル間変動を低減して、ゲル間で標準化した。標準プロテオミクスプロトコルに従って、差次的発現の閾値を、最小倍率変化１．０５倍に設定した。各タンパク質スポットについて、スチューデントのｔ検定を用いて、ＤｅＣｙｄｅｒソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＢＶＡ モジュールによってｐ値を求めた。ｐ値が＜０．０５であれば、統計的に有意と判断した。
【００７８】
ＩＩ．調製段階
試料調製、蛍光標識、２Ｄ−ＤＩＧＥ
Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅで標識した場合、スポットの濃度は試料中のタンパク質の濃度のみに依存するが、飽和色素で標識した場合、スポットの濃度は標識タンパク質のシステインの数にも依存する。その理由は、飽和色素標識法では各タンパク質で利用可能なシステインすべてが標識されるからである。このため、分析ゲル及び調製ゲルの試料において、異なる密度で同じパターンとなり、同定がより困難となる。この問題を排除し、関心スポットにおけるタンパク質を正確に同定できるようにするため、同じゲルでＣｙＤｙｅ飽和蛍光標識とＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ標識とを用いて調製二次元電気泳動を行った。２つのゲルのそれぞれにつき合計８００μｇのタンパク質を処理した。簡潔に説明すると、「早産」と「満期産」比較で、免疫除去した血清試料１０−１０をともにプールし、脱塩ステップを３回くり返した。プールしたこれら２つの試料のタンパク質５μｇをＣｙ３で標識し、同じ試料の未標識タンパク質８００μｇと混合したのち、ドライストリップに分割した。一次元目の分離後、集まったタンパク質をまず１％メルカプトエタノールを含有する緩衝液で２０分間平衡化して還元し、次いで、２．５％ヨードアセトアミドを含有する緩衝液で２０分間アルキル化した。電気泳動の後、ゲルを上述のようにＴｙｐｈｏｏｎ ＴＲＩＯ＋スキャナーでスキャンし、発現変動スポットを、「マスター」分析ゲル及び蛍光調製ゲル画像間で、ＤｅＣｙｄｅｒ ６．０ソフトウェアパッケージ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）のＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｖａｒｉａｎｃｅ（ＢＶＡ）モジュールを用いてマッチングした。解像したタンパク質スポットを、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ Ｇ−２５０染色プロトコルにより可視化した。発現変動の個々のスポットをゲルから切り出し、画像を比較した。
【００７９】
ＩＩＩ．同定段階
ゲル内消化
切り出したタンパク質スポットは、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｕｎｇａｒｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ハンガリー、セゲド）のＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｇｒｏｕｐで分析した。詳細な手順は「Ｉｎ−Ｇｅｌ Ｄｉｇｅｓｔ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ」という表題でウェブサイト（ｍｓｆａｃｉｌｉｔｙ．ｕｃｓｆ．ｅｄｕ／ｉｎｇｅｌ．ｈｔｍｌ）に掲載されており、以下のように再現した。簡潔に説明すると、塩、ＳＤＳ、クマシーブリリアントブルーを洗い落とし、ジスルフィド架橋をジチオスレイトールで還元し、次いで、遊離スルフヒドリルをヨードアセトアミドでアルキル化した。側鎖保護ブタトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、３７℃で４時間消化し、得られたペプチドを抽出した。
【００８０】
ゲル内消化手順
１．手袋と袖カバーを装着し、メタノールまたは水で濡らした糸くずの出ない布で、使用する全試験管の外側（標示を拭き取らないように気を付ける）、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃと遠心分離機の内側と外側、試験管立て、ボトルなど、フード内の表面すべてをきれいに拭く。メタノールに浸した糸くずの出ない布で、かみそりの刃を拭く。
２．以下の溶液を調製する。
２５ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3（１００ｍｇ／５０ｍＬ）
２５ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3と５０％ＡＣＮとの混合溶液
５０％ＡＣＮ／５％ギ酸（ＴＦＡまたは酢酸で代用してもよい）
１２．５ｎｇ／μＬトリプシンと２５ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3との混合溶液（新たに希釈）
３．各ゲルスライスを小さなさいの目に切り（１ｍｍ2）、０．６５ｍＬシリコン処理試験管（ＰＧＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に入れる。
４．１００μＬの（または十分に浸る）２５ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3／５０％ＡＣＮを加え、１０分間ボルテックスする。
５．ゲルローディングピペットチップを用いて、上清を抽出し、捨てる。
６．手順３及び４を１回または２回くり返す。
７．Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃでゲル片を完全に乾燥させる（約２０分）。
低レベルタンパク質（＜１ｐｍｏｌ）の場合、特に１−Ｄ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した場合は、還元とアルキル化が推奨される。これらの手順は、手順６の後に行う。
ａ．新しい溶液を調製する。
１０ｍＭ ＤＴＴと２５ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3との混合溶液（１．５ｍｇ／ｍＬ）
５５ｍＭヨードアセトアミドと２５ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3との混合溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）
b．２５μＬの（または十分に浸る）１０ｍＭ ＤＴＴ／２５ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3を乾燥したゲルに加える。ボルテックスし、短時間スピンする。５６℃で１時間反応させる。
c．上清を除去し、２５μＬの５５ ｍＭ ヨードアセトアミドをゲル片に加える。ボルテックスし、短時間スピンする。暗所で４５分間、室温で反応させる。 
d．上清を除去する（捨てる）。ゲルを約１００μＬのＮＨ4ＨＣＯ3で洗い、１０分間ボルテックスし、スピンする。
e．上清を除去する（捨てる）。約１００μＬの（または十分に浸る）２５ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3／５０％ＡＣＮでゲルを脱水し、５分間ボルテックスし、スピンする。この手順を１回くり返す。
f．Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃでゲル片を完全に乾燥させる（約２０分）。トリプシン消化を進める。
８．トリプシン溶液を、ゲル片がぎりぎり浸るくらいに加える。ゲルの量を推量し、約３倍量のトリプシン溶液を加える。この容量は試料ごとに異なるが、概して約５〜２５μＬで十分である。
９．ゲル片を氷上または４℃で１０分間再水和したのち、スピンする。必要に応じて２５ｍＭ ＮＨ4ＨＣＯ3を加え、ゲル片を覆う。
１０．短時間スピンし、３７℃で４時間から一晩インキュベートする。
ペプチドの抽出
１．消化液（水抽出）を清潔な０．６５ｍＬシリコン処理試験管に移す。
２．ゲル片に３０μＬの（十分に浸る）５０％ＡＣＮ／５％ギ酸を加え、２０〜３０分間ボルテックスする。スピンし、５分間超音波で分解する。この手順を繰り返す。
３．抽出した消化物をボルテックスし、スピンして、Ｓｐｅｅｄ Ｖａｃで１０μＬに濃縮する。
４．Ｃ１８ ＺｉｐＴｉｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で精製するか、またはＬＣ−ＭＳで分析する。２〜５μＬの５％ギ酸を加える。低レベルのタンパク質を分析するときは、３μＬの溶出液を用いてＺｉｐＴｉｐから溶出してペプチドを濃縮し、清潔な０．６５ｍＬシリコン処理試験管に入れる。
５．分離していない消化物１μＬを用いてＭＡＬＤＩで分析する。
分離していない消化物のマトリクス：
α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸と５０％ＡＣＮ／１％ＴＦＡとの混合溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）。
２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、飽和水溶液。
参考：非特許文献１２、１３
【００８１】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ
試料は、イオントラップタンデム質量分析計（ＬＣＱ Ｆｌｅｅｔ，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にオンライン接続されたＷａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ｎａｎｏＵＰＬＣで、ＩＤＡ（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ）モードで分析した。ＭＳ取得（１秒サーベイスキャン）ののち、コンピューターで選択した多価イオンをＣＩＤ分析（３秒ＭＳ／ＭＳスキャン）した。ＨＰＬＣ条件は、ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ捕集カラム（Ｓｙｍｍｅｔｒｙ、Ｃ１８ ５μｍ、１８０μｍ×２０ｍｍ）（３％溶媒Ｂで１５μＬ／分）でのインライン捕集と、その後の溶媒Ｂの直線勾配（４０分で１０〜５０％、流量：２５０ｎＬ／分；ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ Ｃｏｌｕｍｎ、１．７μｍ、７５μｍ×２００ｍｍ）などであった。溶媒Ａ：０．１％ギ酸水溶液、溶媒Ｂ：０．１％ギ酸アセトニトリル溶液。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を、「トリプルプレイ」モードで４５０〜１６００ｍ／ｚの質量範囲で実施した。
【００８２】
データベース検索とデータ解釈
生データファイルは、Ｍａｓｃｏｔ Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒソフトウェアｖ２．１．１．０．（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ、英国ロンドン）を用いて検索可能なピークリストのＭａｓｃｏｔジェネリックファイル形式（＊．ｍｇｆ）に変換した。得られたピークリストは、社内Ｍａｓｃｏｔサーバーｖ２．２．０４のＭＳ／ＭＳイオン検索モードでＭａｓｃｏｔ Ｄａｅｍｏｎソフトウェアｖ２．２．２（Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ）を用いて、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩｎｒ ２００８．０７．１８．、米国メリーランド州ベセスダ；６，８３３，８２６配列）の非冗長タンパク質データベースのヒトサブデータベースに対して検索した。ペプチド質量誤差が±５０ｐｐｍで、フラグメント質量誤差が±０．１Ｄａのモノアイソトピック質量を示した。Ｃｙｓのカルバミドメチル化を固定修飾として設定し、タンパク質Ｎ末端のアセチル化、メチオニン酸化、及びペプチドＮ末端Ｇｌｎ残基からのピログルタミン酸形成は、可変修飾として認めた。判定基準は、１つのタンパク質に対し少なくとも２つの有意な（ペプチドスコア＞４０、p＜０．０５）個別ペプチドに設定した。
【００８３】
結果
Ｉ．子癇前症における発現変動遺伝子は、主に胎盤発現遺伝子及び３つの染色体で濃縮されている
子癇前症の病因は胎盤に由来するため、主に胎盤で発現する新しいバイオマーカー候補、及び子癇前症の胎盤病因に関与する遺伝子調節ネットワークを、システム生物学的手法を用いて探索した。マイクロアレイデータセットの解析より、早産対照と比べて、早産の子癇前症で１，４０９種類の発現変動遺伝子が明らかとなった。これらの発現変動遺伝子から、１３７個を見つけ、転写調節機能（転写因子、コアクチベーター、またはコリプレッサー）とともにタンパク質をコードした。ＢｉｏＧＰＳマイクロアレイデータの分析と以前の証拠から、１６４種類の遺伝子が主に胎盤で発現することが明らかとなり、そのうち１５７個が我々のマイクロアレイプラットフォームに存在した。
【００８４】
アレイ上の全遺伝子と比較すると、子癇前症における発現変動遺伝子はＰＰＥ遺伝子（１５７個中３８個）において高度に濃縮されていた（ＯＲ＝３．４、ｐ＝６．９×１０-9）。関心遺伝子の染色体位置を調べると、発現変動遺伝子が、６及び７番染色体（それぞれＯＲ＝１．５４、ｐＦＤＲ＝１．６×１０-3、ＯＲ＝１．４２、ｐＦＤＲ＝０．０２）に位置する遺伝子で濃縮されていた。興味深いことに、１９番染色体は、発現変動転写調節遺伝子（ＯＲ＝２．６、ｐＦＤＲ＝０．０２）及び優勢胎盤発現を伴う遺伝子（ＯＲ＝２．５、ｐ＝１×１０-4）において過剰に出現していた。こうした濃縮は、１９番染色体が大型霊長類特異性及び胎盤特異性遺伝子ファミリー（例えば、ＣＧＢ、ＬＧＡＬＳ、ＰＳＧ）とジンクフィンガー転写因子遺伝子ファミリーとを持つという事実と一致している。可視化した遺伝子発現及び共発現データは、霊長類の胎盤遺伝子発現における１９番染色体の調節「ハブ」の潜在的役割及び子癇前症におけるその調節不全を裏付けている。
【００８５】
図１．子癇前症における発現変動遺伝子のゲノム地図。Ｃｉｒｃｏｓで、内側の円内に実線で染色体を可視化している。曲線は、有意に相関する遺伝子と転写調節遺伝子のゲノム座標を結んでいる。有意性は、遺伝子と転写調節遺伝子対の発現レベル間の線形モデルをすべての試料に当てはめ、ＦＤＲを５％に制御して判断した。曲線は正相関及び逆相関を表す。２つめの円は、ＰＰＥ遺伝子のゲノム上の位置を示す（黒色の線：非発現変動；灰色の線：上方または下方制御）。３つめの円及び４つめの円は、それぞれ発現変動転写調節遺伝子の位置と非調節遺伝子の位置を、内向きの棒（下方制御）及び外向きの棒（上方制御）で示す。３つめの円及び４つめの円の棒の長さは、遺伝子発現変化の大きさを示す。
【００８６】
図２．子癇前症における２つの遺伝子モジュールが、ＰＰＥ遺伝子で濃縮されており、かつ、平均動脈圧及び出生時体重パーセンタイルと関連している。２Ａ）マイクロアレイデータのＷＧＣＮＡ解析により同定した遺伝子モジュール。調節不全の胎盤遺伝子発現は、グレーの濃度を変えて印し、子癇前症における１，４０９個の発現変動遺伝子内の５つの遺伝子モジュールによって特徴付けることができた。ｙ軸上に表示した高さは、ＷＧＣＮＡで用いた距離（１−ＴＯＭ）を示す。３８個のＰＰＥ遺伝子（黒色の縦線）のうち、３３個がグレースケールモジュールに属する（明るいグレー；ｎ＝２２、濃いグレー；ｎ＝１１）。これら２つのモジュールも上方制御遺伝子と下方制御遺伝子とで濃縮されており、それぞれ、グレーまたは黒色の線のモジュールの下に印した。２Ｂ）１００個の試料と選択した４７個の遺伝子から得たｑＲＴ−ＰＣＲデータの階層的クラスタリング。明るいグレーと濃いグレーのモジュールの遺伝子が、検証用試料セットにおいて集まっている。重要なことに、子癇前症を有する女性から採取した６０個の試料のうち３４個が密集していた。距離、及び連結の平均についてピアソン相関を用いた。試料（カラムリーフ）は、患者群と発育状態に従って濃淡を付けた。２Ｃ）遺伝子発現と平均動脈圧及び出生時体重パーセンタイルとの関連性。各遺伝子について、線形モデルを当てはめた（発現〜血圧＋出生時体重パーセンタイル＋性別＋発育状態）。２つの係数（血圧及び出生時体重パーセンタイル）の有意性ｐ値（−ｌｏｇ10）を４７個の遺伝子すべてについて示した。遺伝子は、モジュールのメンバーシップに従って濃淡を付けた（マイクロアレイ上で非発現変動であった黒色を除く）。色付きの丸はＰＰＥ遺伝子を、破線はｐ＝０．０５での有意性閾値を示す。出生時体重パーセンタイルと関連している９個の遺伝子のうち７個は明るいグレーのモジュールで、血圧と関連している１５個の遺伝子のうち１０個は濃いグレーのモジュールであることに注意されたい。
【００８７】
ＩＩ．子癇前症における発現変動遺伝子を主な調節モジュールに分ける
調節不全の胎盤遺伝子発現を促進する可能性のある遺伝子及び転写調節遺伝子の調節モジュールを同定するために、マイクロアレイ上の発現変動遺伝子を用いてＷＧＣＮＡ解析を実施した。１，４０９個の遺伝子のうち１，４０３個を、５０６個、４４２個、３８１個及び７４個の遺伝子を含む４つのモジュールに割り当てた。関心のある、優勢胎盤発現を有する３８個の遺伝子のうち３３個が、明るいグレー（ｎ＝２２）及び濃いグレー（ｎ＝１１）のモジュールに属していた。明るいグレーのモジュールが下方制御（ＯＲ＝１．８８、ｐ＝２．５９×１０-8）遺伝子で濃縮されているのに対し、濃いグレーのモジュールは上方制御（ＯＲ＝６．４７、ｐ＜２．２×１０-16）遺伝子で濃縮されており、早産の子癇前症において調節不全の遺伝子ネットワークの存在を示唆している。
【００８８】
上方制御遺伝子のうち、濃いグレーのモジュールにあるのはＦＬＴ１であった。ＦＬＴ１は、可溶性Ｆｌｔ−１の量を増やし、血圧上昇を促進することにより、子癇前症において病因的役割を有する。優勢胎盤発現を有する上方制御遺伝子には、ＣＲＨ、ＬＥＰ、ＰＡＰＰＡ２、ＳＩＧＬＥＣ６及び新規のバイオマーカー候補などがある。下方制御遺伝子のうち、明るいグレーのモジュールにあるＰＰＥ遺伝子は、胎児発育（ＣＳＨ１、ＨＳＤ１１Ｂ２）、代謝（ＥＳＲＲＧ）、エストロゲン合成（ＨＳＤ１７Ｂ１）、ストレスホルモン代謝（ＨＳＤ１１Ｂ２）及び胎盤形成の免疫調節（ＬＧＡＬＳ１４）の調節因子であった。
【００８９】
ＩＩＩ．濃いグレー及び明るいグレーのモジュールにある発現変動遺伝子は、それぞれ血圧及び出生時体重パーセンタイルに関連している
説明した結果を、多様な民族的起源及び子癇前症のさまざまなサブタイプ（早産または満期産、ＳＧＡの有無）を含む大規模患者集団で検証するために、ハイスループット発現プロファイリング用の４７個の遺伝子を選択した。これらの遺伝子は、１）マイクロアレイで発現変動、主に胎盤発現を示し、合胞体栄養膜により特異的で、潜在的に分泌される、２）ＰＰＥ遺伝子と高い共発現を示す転写調節遺伝子であり、かつ、３）栄養膜分化（例えば、ＧＣＭ１）、栄養膜特異的遺伝子発現（例えば、ＴＥＡＤ３）、または子癇前症の病因（例えば、ＥＮＧ、ＬＧＡＬＳ１３）に関連した役割を持つその他の遺伝子であった。
【００９０】
ｑＲＴ−ＰＣＲデーの階層的クラスタリングから、子癇前症を有する妊婦の６０個の胎盤のうち３０個が集まっていることが示された。これは、明るいグレー及び濃いグレーのモジュールに属している遺伝子についても同様であった（図２Ｂ）。異なる病原経路におけるこれらのモジュールの関与の可能性に基づいて、その生物学的関連性を新規の方法で明らかにすることを試みた。「表現型分析」では、出生時体重パーセンタイルに関連する９個の遺伝子のうち７個が明るいグレーのモジュールにあるのに対し、血圧に関連する１５個の遺伝子のうち１０個が濃いグレーのモジュールにあることが示された（図２Ｃ）。
【００９１】
胎盤の病理組織学的データの評価も行った。濃いグレーのモジュールにおける遺伝子の発現が、「胎児の血管内血栓閉塞性疾患」（ＳＩＧＬＥＣ６、ＥＮＧ、ＴＰＢＧ）及び「母体の低灌流」（関連性の高い遺伝子：ＬＥＰ、ＦＬＴ１、ＴＰＢＧ、ＥＮＧ）、胎盤低酸素症及び／または虚血に相当する疾患の有無に関連していることがわかった。明るいグレーのモジュールの大多数（関連性の高い遺伝子：ＣＬＤＮ１、ＨＳＤ１７Ｂ１、ＣＳＨ１、ＰＬＡＣ１、ＬＧＡＬＳ１４）が、「母体の低灌流」に有意に関連していた。
【００９２】
加えて、古典的な手法として、子癇前症の満期産及び早産の２群と対照との群間比較を別々に実施した。ｑＲＴ−ＰＣＲデータによってマイクロアレイの７２％（３４／４７遺伝子）が実証されたことがわかった。選択した４つのタンパク質の組織マイクロアレイ免疫染色により、このモジュールについて、タンパク質レベルでマイクロアレイデータが実証された。
【００９３】
図３．濃いグレーのモジュールの遺伝子の発現が、子癇前症のサブグループにおいて同じ方向に変化する。３Ａ、Ｂ）各棒グラフにおいて、左右のパネルはそれぞれ早産と満期産の試料における有意差（「＊」）を示す。遺伝子発現（３Ａ）及びタンパク質免疫染色（３Ｂ）は、子癇前症のサブグループにおいて同様のパターンを示す。早産試料における子癇前症による変化が、満期産試料における子癇前症による変化と比べて有意差がある場合、「＋」マークでこの相互作用を示す。４つのタンパク質に対する半定量的免疫スコアリングで、遺伝子発現データを検証した。３Ｃ）４種類の免疫染色の画像。早産対照（左、２９週）とＳＧＡを有する早産子癇前症を有する患者（右、３１週）とから得た同じ胎盤に４種類の免疫染色を行ったものを示している（倍率４０倍）。
【００９４】
明るいグレーのモジュールでは、遺伝子発現変化は子癇前症の満期産群より早産群の方が大きかった。有意な調節不全が、満期産と早産の両方で認められた遺伝子もあれば（例えば、ＬＧＡＬＳ１３、ＬＧＡＬＳ１４）、早産でのみ認められた遺伝子もあった（例えば、ＣＳＨ１）。これらのデータは、子癇前症の病因の背後にある胎盤病理が複雑であることや、早産では病理学的により重症となることを反映している。
【００９５】
図４Ａ〜図４ＵＵは、それぞれＡＲＮＴ２；ＢＣＬ３；ＢＣＬ６；ＢＴＧ２；ＣＤＫＮ１Ａ；ＣＧＢ３；ＣＬＣ；ＣＬＤＮ１；ＣＲＨ；ＣＳＨ１；ＣＹＰ１９Ａ１；ＤＵＳＰ１；ＥＮＧ；ＥＲＶＦＲＤＥ１；ＥＲＶＷＥ１；ＥＳＲＲＧ；ＦＢＬＮ１；ＦＬＴ１；ＧＡＴＡ２；ＧＣＭ１；ＧＨ２；ＨＬＦ；ＨＳＤ１１Ｂ２；ＨＳＤ１７Ｂ１；ＩＫＢＫＢ；ＩＮＳＬ４；ＪＵＮＢ；ＫＩＴ；ＬＥＰ；ＬＧＡＬＳ１３；ＬＧＡＬＳ１４；ＬＧＡＬＳ１６；ＬＧＡＬＳ１７Ａ；ＭＡＰＫ１３；ＮＡＮＯＧ；ＰＡＰＰＡ；ＰＡＰＰＡ２；ＰＧＦ；ＰＬＡＣ１；ＰＯＵ５Ｆ１；ＳＩＧＬＥＣ６；ＴＥＡＤ３；ＴＦＡＭ；ＴＦＡＰ２Ａ；ＴＰＢＧ；ＶＤＲ；及びＺＮＦ５５４の比較を示す。
【００９６】
ＩＶ．トランスクリプトームバイオマーカー
ニューラルネットワークに基づいた解析の結果は、訓練試料のさまざまなサブセットを用いたときの血圧及び出生時体重パーセンタイルの最良の予測因子として保持された回数により評価した、２〜８個の遺伝子の組み合わせのセットとなった（表７）。これらの組み合わせのセットから、６個の遺伝子（ＦＬＴ１、ＨＳＤ１７Ｂ１、ＬＥＰ、ＬＧＡＬＳ１４、ＰＡＰＰＡ２、及びＰＬＡＣ１）を、上位２個の予測因子及び／または胎盤特異性の高い遺伝子として選択した。
【００９７】
【表７】
2015522258.tif 000012
【００９８】
【表８】
2015522258.tif 000013
【００９９】
【表９】
2015522258.tif 000014
【０１００】
【表１０】
2015522258.tif 000015
【０１０１】
【表１１】
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【０１０２】
【表１２】
2015522258.tif 000017
【０１０３】
【表１３】
2015522258.tif 000018
【０１０４】
線形判別分析では、子癇前症の検出用トランスクリプトームバイオマーカーの選択されたセットの平均感度が９１．５％、平均特異度が７５％であったことが示された。
【０１０５】
Ｖ．子癇前症の母体血清における発現変動タンパク質
発見段階では、正常な妊娠結果を有する正常な妊婦と、その後に早産の重度子癇前症を発症した妊婦とから採取した試料の比較で、ゲル上で２０８０〜２４６０個のタンパク質スポットを同定した。疾患試料５つのうち少なくとも３つで発現変動を示したタンパク質スポットが３９個あった（下方制御２９個、上方制御１０個）。疾患試料における最大差は、３．１倍の上方制御及び３．１倍の下方制御であった。
【０１０６】
正常な妊娠結果を有する正常な妊婦と、その後に満期産の重度子癇前症を発症した妊婦とから採取した試料の比較で、ゲル上で２１３０〜２３８０個のタンパク質スポットを同定した。疾患試料５つのうち少なくとも３つで発現変動を示したタンパク質スポットが２０個あった（下方制御１１個、上方制御９個）。疾患試料における最大差は、３．９倍の上方制御及び４．５倍の下方制御であった。
【０１０７】
調製段階では、正常な妊娠結果を有する正常な妊婦と、その後に早産の重度子癇前症を発症した妊婦とから採取した試料の比較で、ゲル上で約２３８０個のタンパク質スポットを同定した。早産の子癇前症において先に同定された３９個の発現変動から２９個（下方制御２５個、上方制御４個）を同定し、ゲルから切り出した。
【０１０８】
正常な妊娠結果を有する正常な妊婦と、その後に満期産の重度子癇前症を発症した妊婦とから採取した試料の比較で、ゲル上で約２３５０個のタンパク質スポットを同定した。先に同定された２０個の発現変動から１８個（下方制御１１個、上方制御７個）を同定し、ゲルから切り出した。
【０１０９】
同定段階では、以下の発現変動タンパク質が同定できた。
【０１１０】
【表１４】
2015522258.tif 000019
【０１１１】
【表１５】
2015522258.tif 000020
【０１１２】
それぞれの２つの比較において、これらの候補は、全疾患検体で発現変動を示し、倍率変化が高く、かつ、以下のｐ値が最高であったものから選択した：補体因子Ｂ、ゲルゾリンイソ型Ａ前駆体、ホルネリン、フェチュインＢ、ヘモペキシン前駆体、及びアポリポタンパク質Ｈ前駆体。
【０１１３】
別段の指示がない限り、成分の量、例えば分子量、反応条件などの特性を表す数字、ならびに明細書及び特許請求の範囲で用いられる数字は、すべての場合において、用語「約」で修飾されると理解されるべきである。したがって、それと反対の指示がない限り、明細書及び添付の特許請求の範囲で示される数値パラメーターは、本開示によって得ようとされる所望の特性に応じて変化する可能性のある近似値である。最低限でも、そして特許請求の範囲への均等論の適用を制限する試みとしてではなく、少なくとも各数値パラメーターは、報告された有効数字の数に照らして、かつ、通常の丸め手法を適用することによって解釈されるべきである。発明の広い範囲を記載する数値範囲及びパラメーターは近似値ではあるとはいえ、特定の実施例に示される数値は可能な限り正確に報告されている。しかしながら、いずれの数値も、本質的にそれぞれの試験測定に見られる標準偏差から生じる一定の誤差を含む。
【０１１４】
本発明を説明する文脈で（特に以下の特許請求の範囲の文脈において）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び類似の指示対象は、本明細書において別段の指示がない限り、または明らかに文脈と矛盾しない限り、単数形と複数形の両方を包含する。本明細書における値の範囲の列挙は、その範囲内に入るそれぞれ別個の値を個々に言及する簡便な方法として機能することを意図しているにすぎない。本明細書において別段の指示がない限り、それぞれ別個の値は、それが個々に本明細書に列挙されているものとして明細書に組み込まれる。本明細書において別段の指示がない限り、または明らかに文脈と矛盾しない限り、本明細書に記載のすべての方法は、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で記載されるすべての例示または例示的な文言（例えば、「〜などの」）は、本発明をより明らかにすることを意図しているにすぎず、特に本発明の特許請求の範囲を限定するものではない。明細書中のいかなる文言も、任意の非請求要素が本発明の実施に必要であると示すものではない。
【０１１５】
本明細書に開示される発明の代替的な要素または実施形態のグループ分けは、制限ではない。各グループの構成物は、個別に、または本明細書中にあるグループの他の構成物もしくは他の要素との任意の組み合わせで言及または請求されてよい。予想されるように、グループの１つまたは複数の構成物が、便宜及び／または特許性を理由として、グループに包含、またはグループから削除されてもよい。そのような包含または削除が生じた場合、本明細書は添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマルクーシュグループの記載を満たすように改変されたグループを含むとみなされる。
【０１１６】
本発明の特定の実施形態は、発明を実施するために発明者に既知の最良の態様を含め、本明細書中に記載されている。当然ながら、記載されたこれらの実施形態の変形は、前述の説明を読むことにより当業者に明らかとなる。発明者は、当業者がそのような変形を適宜採用することを予期し、本発明が本明細書に具体的に記載した以外の方法で実施されることを予定している。したがって、本発明は、適用法によって認められているように、本明細書に添付の特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変及び均等物を含む。さらに、本明細書において別段の指示がない限り、または明らかに文脈と矛盾しない限り、すべての可能な変形における前述の要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。
【０１１７】
本明細書に開示された具体的な実施形態は、「〜から成る」または「本質的に〜からなる」という文言を用いて特許請求の範囲に限定することができる。特許請求の範囲で使用する場合、出願であるか補正として追加するかにかかわらず、「〜から成る」という用語は、特許請求の範囲において指定されていない任意の要素、手順または成分を除外する。「本質的に〜から成る」という用語は、特許請求の範囲を、基本的で新規な特性に実質的に影響しない特定の材料または手順などに制限する。そのように請求された発明の実施形態は、本質的にまたは明示的に本明細書に記載及び本明細書で使用可能である。
【０１１８】
さらに、本明細書を通して、特許及び刊行物に対して数多くの参照指示がなされている。上記に引用した参考文献及び刊行物はそれぞれ、参照によりその全体が個々に本明細書に援用される。最後に、本明細書に開示された本発明の実施形態は、本発明の原理を例示するものである。採用される可能性のある他の改変は、本発明の範囲内にある。したがって、一例として、ただしこれに限定されないが、本発明の代替的な構成は、本明細書の教示に従って利用することができる。したがって、本発明は、厳密に図示及び説明されるものに限定されない。
【図１】
2015522258.tif 000021
【図２Ａ】
2015522258.tif 000022
【図２Ｂ】
2015522258.tif 000023
【図２Ｃ】
2015522258.tif 000024
【図３】
2015522258.tif 000025
【図４Ａ】
2015522258.tif 000026
【図４Ｂ】
2015522258.tif 000027
【図４Ｃ】
2015522258.tif 000028
【図４Ｄ】
2015522258.tif 000029
【図４Ｅ】
2015522258.tif 000030
【図４Ｆ】
2015522258.tif 000031
【図４Ｇ】
2015522258.tif 000032
【図４Ｈ】
2015522258.tif 000033
【図４Ｉ】
2015522258.tif 000034
【図４Ｊ】
2015522258.tif 000035
【図４Ｋ】
2015522258.tif 000036
【図４Ｌ】
2015522258.tif 000037
【図４Ｍ】
2015522258.tif 000038
【図４Ｎ】
2015522258.tif 000039
【図４Ｏ】
2015522258.tif 000040
【図４Ｐ】
2015522258.tif 000041
【図４Ｑ】
2015522258.tif 000042
【図４Ｒ】
2015522258.tif 000043
【図４Ｓ】
2015522258.tif 000044
【図４Ｔ】
2015522258.tif 000045
【図４Ｕ】
2015522258.tif 000046
【図４Ｖ】
2015522258.tif 000047
【図４Ｗ】
2015522258.tif 000048
【図４Ｘ】
2015522258.tif 000049
【図４Ｙ】
2015522258.tif 000050
【図４Ｚ】
2015522258.tif 000051
【図４ＡＡ】
2015522258.tif 000052
【図４ＢＢ】
2015522258.tif 000053
【図４ＣＣ】
2015522258.tif 000054
【図４ＤＤ】
2015522258.tif 000055
【図４ＥＥ】
2015522258.tif 000056
【図４ＦＦ】
2015522258.tif 000057
【図４ＧＧ】
2015522258.tif 000058
【図４ＨＨ】
2015522258.tif 000059
【図４ＩＩ】
2015522258.tif 000060
【図４ＪＪ】
2015522258.tif 000061
【図４ＫＫ】
2015522258.tif 000062
【図４ＬＬ】
2015522258.tif 000063
【図４ＭＭ】
2015522258.tif 000064
【図４ＮＮ】
2015522258.tif 000065
【図４ＯＯ】
2015522258.tif 000066
【図４ＰＰ】
2015522258.tif 000067
【図４ＱＱ】
2015522258.tif 000068
【図４ＲＲ】
2015522258.tif 000069
【図４ＳＳ】
2015522258.tif 000070
【図４ＴＴ】
2015522258.tif 000071
【図４ＵＵ】
2015522258.tif 000072
【配列表】
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【国際調査報告】
2015522258.tif 000073
2015522258.tif 000074
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