(57)【要約】治療的投与量の部位１ナトリウムチャネル遮断薬を含有する製剤のための投薬レジメンであって、投薬レジメンは、延長された神経遮断を提供し、神経因性疼痛、例えば、痛覚過敏および／またはアロディニアの発症を、神経遮断が施された部位、好ましくは神経遮断が施された領域（例えば、肢全体）において少なくとも１週間、好ましくは、より長く遅延させる有効量である。部位１ナトリウムチャネル遮断薬は、好ましくは、（好ましくは、コルチコステロイド（好ましくは、デキサメタゾン）と組み合わせた）サキシトキシン（ＳＴＸ）である。好ましい実施形態において、リポソームは、製剤中に制御放出系として含まれ、全身毒性を伴うことなく、延長された遮断持続時間を生じさせる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経因性疼痛の発症を遅延させるための、局所毒性なしで、持続時間において７日間超、８日間超、１０日間超、または概ね１８日間の持続時間の神経遮断を提供する有効量での、制御放出系において必要に応じてグルココルチコイドと組み合わせた部位１ナトリウムチャネル遮断薬を含む組成物の使用。
【請求項２】
前記制御放出系が、リポソーム、ミセル、微粒子およびナノ粒子からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記制御放出系が、リポソームであり、前記部位１ナトリウムチャネル遮断薬が、前記リポソーム中に被包されている、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記部位１ナトリウムチャネル遮断薬が、テトロドトキシン（ＴＴＸ）、サキシトキシン（ＳＴＸ）、デカルバモイルサキシトキシン、ネオサキシトキシン、およびゴニオートキシン類からなる群から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記部位１ナトリウムチャネル遮断薬が、ＳＴＸである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記組成物が、前記ナトリウムチャネル遮断薬単独と比較して、局所毒性の非存在下で神経遮断を増強する有効量のグルココルチコイドを含み、該グルココルチコイドが、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルニソリド、メチルプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アルクロメタゾン、アムシノニド、クロベタゾール、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフロラゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオロメトロン、フルランドレノリド、ハルシノニド、メドリゾン、およびモメタゾン、ならびにこれらの薬学的に許容され得る塩および混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項７】
前記部位１ナトリウムチャネル遮断薬が、ＳＴＸであり、前記グルココルチコイドが、デキサメタゾンである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記リポソームが、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびコレステロールからなる群から選択される１種または複数種の脂質から形成される、請求項３に記載の使用。
【請求項９】
前記リポソームが、３：１：２：０．０００１のモル比でＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：コレステロール：デキサメタゾンを含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記組成物が、１より多くの逐次投与される用量、好ましくは、少なくとも２用量、より好ましくは、少なくとも３用量で投与される、請求項１から９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
制御放出系における、必要に応じてグルココルチコイドと組み合わせた、部位１ナトリウムチャネル遮断薬を含む組成物と、
局所毒性なしで、７日間超、８日間超、１０日間超、または概ね１８日間の持続時間の神経遮断を提供するために、治療有効量の前記組成物を患者に投与するための投薬レジメンのための指示書と
を含む、神経遮断を提供するための、好ましくは、神経因性疼痛の発症を遅延させるためのキット。
【請求項１２】
前記制御放出系が、リポソームであり、前記組成物が、乾燥粉末としてバイアル中で貯蔵されている、または注射用水溶液に懸濁されている、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
局所毒性なしで、７日間超、８日間超、１０日間超、または概ね１８日間の持続時間の神経遮断を提供する有効量で、制御放出系における、必要に応じてグルココルチコイドと組み合わせた、部位１ナトリウムチャネル遮断薬を含む治療有効量の組成物を投与することを含む、神経因性疼痛の発症を遅延させるための方法。
【請求項１４】
前記制御放出系が、リポソーム、ミセル、微粒子およびナノ粒子からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記制御放出系が、リポソームであり、前記部位１ナトリウムチャネル遮断薬が、前記リポソーム中に被包されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記部位１ナトリウムチャネル遮断薬が、テトロドトキシン（ＴＴＸ）、サキシトキシン（ＳＴＸ）、デカルバモイルサキシトキシン、ネオサキシトキシン、およびゴニオートキシン類からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記部位１ナトリウムチャネル遮断薬が、ＳＴＸである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、前記ナトリウムチャネル遮断薬単独と比較して、局所毒性なしで神経遮断を増強する有効量のグルココルチコイドを含み、前記グルココルチコイドが、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルニソリド、メチルプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アルクロメタゾン、アムシノニド、クロベタゾール、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフロラゾン、フルオシノロンアセトニド、フルオロメトロン、フルランドレノリド、ハルシノニド、メドリゾン、およびモメタゾン、ならびにこれらの薬学的に許容され得る塩および混合物からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記部位１ナトリウムチャネル遮断薬が、ＳＴＸであり、前記グルココルチコイドが、デキサメタゾンである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リポソームが、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびコレステロールからなる群から選択される１種または複数種の脂質から形成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記リポソームが、３：１：２：０．０００１のモル比でＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：コレステロール：デキサメタゾンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、１より多くの逐次投与される用量、好ましくは、少なくとも２用量、より好ましくは、少なくとも３用量で投与される、請求項１３から２１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に、慢性神経因性疼痛の発症を遅延させるための方法および組成物に関する。
【０００２】
政府支援
本発明は、米国国立衛生研究所から認定された認可番号Ｒ０１ＧＭ０７３６２６の下で政府支援により行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
神経系における一次損傷または機能障害によって引き起こされる疼痛は、神経因性疼痛と定義され、神経外傷、糖尿病、多発性硬化症、ＨＩＶ感染、および様々な形態の悪性腫瘍が、共通原因のいくつかである。米国のみで、概ね３７５万症例の慢性神経因性疼痛が報告されている。R.N.  Harden、「Chronic  Neuropathic  Pain:  Mechanisms,  Diagnosis,  and  Treatment」、The  Neurologist、１１巻：１１１頁（２００５年）。患者の罹患率に加えて、慢性神経因性疼痛の管理は、保健医療費用に対して相当な負担を及ぼしている。
【０００４】
オピオイド、ＮＳＡＩＤおよび三環式化合物を含めたいくつかの薬物が利用可能であるにも関わらず、かなりの数の患者が満足できるものではない疼痛管理を受けており、望ましくない副作用を経験し得る。神経因性疼痛の顕著な特徴である増大したニューロン活性は、様々な動物の慢性疼痛の神経損傷モデルにおいて一貫して報告されてきた。例えば、Coggeshallら、「A-fiber  sensory  input  induces  neuronal  cell  death  in  the  dorsal  horn  of  the  adult  rat  spinal  cord」、J.  Comp.  Neurol.、４３５巻：２７６〜２８２頁（２００１年）；Govrin-Lippmannら、「Ongoing  activity  in  severed  nerves:  source  and  variation  with  time」、Brain  Res.、１５９巻、４０６〜４１０頁（１９７８年）；Wuら、「Early  onset  of  spontaneous  activity  in  uninjured  C-fiber  nociceptors  after  injury  to  neighboring  nerve  fibers」、Journal  of  Neuroscience、２１巻：ＲＣ１４０（２００１年）を参照されたい。
【０００５】
損傷が誘発する異常なニューロンの活動電位に反応して放出された興奮性神経伝達物質、例えば、グルタメートは、後根神経節（ＤＲＧ）および脊髄のレベルでのカルシウムが媒介する興奮毒性およびそれに続く細胞の損傷をもたらすことが議論されてきた。例えば、D.W.  Choi、「Calcium  and  Excitotoxic  Neuronal  Injury」、Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.、７４７巻：１６２〜１７１頁（２００６年）；Coggeshallら、「A-fiber  sensory  input  induces  neuronal  cell  death  in  the  dorsal  horn  of  the  adult  rat  spinal  cord」、J.  Comp.  Neurol.、４３５巻：２７６〜２８２頁（２００１年）；C.J.  Woolf、「Neuronal  Plasticity:  Increasing  the  Gain  in  Pain」、Science、２８８巻：１７６５〜１７６８頁（２０００年）を参照されたい。
【０００６】
しかし、短期間の神経伝導遮断薬、例えば、リドカインおよびブピバカインのミクロスフィアを使用して、損傷が誘発するニューロンの放電を遮断しようとする試みは、大部分は不成功であった。Wenら、「Nerve  Conduction  Blockade  in  the  Sciatic  Nerve  Prevents  but  Does  Not  Reverse  the  Activation  of  p38  Mitogen-activated  Protein  Kinase  in  Spinal  Microglia  in  the  Rat  Spared  Nerve  Injury  Model」、Anesthesiology、１０７巻：３１２〜３２１頁（２００７年）；Suterら、「Development  of  neuropathic  pain  in  the  rat  spared  nerve  injury  model  is  not  prevented  by  a  peripheral  nerve  block」、Anesthesiology、９９巻（６号）：１４０２〜８頁（２００３年）。実際は、アミノ−アミド局所麻酔剤自体、例えば、ブピバカインおよびリドカインは、神経毒性をもたらすことが公知である。Goldら、「Lidocaine  toxicity  in  primary  afferent  neurons  from  the  rat」、J.  Pharmacol.  Exp.  Ther.、２８５巻（２号）：４１３〜２１頁（１９９８年）；Radwanら、「The  neurotoxicity  of  local  anesthetics  on  growing  neurons:  a  comparative  study  of  lidocaine,  bupivacaine,  mepivacaine,  and  ropivacaine」、Anesth.  Analg.、９４巻：３１９〜２４頁（２００２年）。長期間の神経遮断、ならびに神経因性疼痛の発症および維持に対するその効果は、まだ決定されていない。
【０００７】
単回注射からの延長された無痛を提供する局所麻酔剤の開発は、３つの主要な課題：（１）不適切な作用持続時間；（２）全身毒性；および（３）局所組織有害反応に遭遇してきた。
【０００８】
神経遮断の持続時間を伸ばすために多種多様の制御放出技術が用いられてきたが、大部分のこのような系は、被包されていない薬物と比較して、良くても数倍の持続時間の伸びしかもたらさない。相乗的な薬物の組合せを被包するアプローチは、何日も継続する神経遮断を達成してきた。例えば、ポリマーミクロスフィア中のブピバカインとデキサメタゾンとの共被包は、４日間より長く継続する神経遮断を生じさせた。Dragerら、Anesthesiology、８９巻（４号）：９６９〜９７９頁（１９９８年）。部位１ナトリウムチャネル遮断薬（外表面上の部位１におけるナトリウムチャネルを遮断する）と従来の局所麻酔剤との共被包はまた、坐骨神経遮断を非常に延長した。デキサメタゾンの添加は、ラットにおいて坐骨神経遮断を９日間より長期に延長した（Kohaneら、Pain、１０４巻（１〜２号）：４１５〜４２１頁（２００３年））。
【０００９】
しかし、このような製剤に対する組織反応には問題があった。従来の局所麻酔剤は、固有に筋毒性である（Paderaら、Anesthesiology、１０８巻（５号）：９２１〜９２８頁（２００８年）；Pereら、Reg  Anesth、１８巻（５号）：３０４〜３０７頁（１９９３年））。これらはまた、送達系自体の毒性が最低限であるときでさえ、広範囲の送達系から放出されると筋毒性である（Paderaら、Anesthesiology、１０８巻（５号）：９２１〜９２８頁（２００８年）；Jiaら、Biomaterials、２５巻（１９号）：４７９７〜４８０４頁（２００４年））。ブピバカインの筋毒性は、伸びた曝露持続時間に亘って劇的に増加し（Paderaら、Anesthesiology、１０８巻（５号）：９２１〜９２８頁（２００８年））、筋毒性がこのような化合物の持続放出の回避不能な結果であり得ることを示唆する。
【００１０】
従来の局所麻酔剤は、神経毒性でもある（Zimmerら、Anaesthesist、５６巻（５号）：４４９〜４５３頁（２００７年）；Yamashitaら、Anesth  Analg、９７巻（２号）：５１２〜５１９頁（２００３年））。粒子自体の存在は、局所麻酔剤の筋毒性をインビボで増強し（Paderaら、Anesthesiology、１０８巻（５号）：９２１〜９２８頁（２００８年）、遮断の持続時間よりかなり長く継続し得る、神経における炎症応答をもたらすことがあり得る（Kohaneら、Pain、１０４巻（１〜２号）：４１５〜４２１頁（２００３年）；Paderaら、Anesthesiology、１０８巻（５号）：９２１〜９２８頁（２００８年）；およびKohaneら、J  Biomed  Mater  Res.、５９巻（３号）：４５０〜４５９頁（２００２年））。
【００１１】
Kohaneらへの米国特許第６，３２６，０２０号は、天然に存在する部位１ナトリウムチャネル遮断薬と、神経遮断の延長された持続時間のための他の薬剤、例えば、局所麻酔剤、血管収縮薬、グルココルチコイド（glutocorticoids）、またはアドレナリン作動性薬物との組合せを含有する組成物を開示している。部位１ナトリウムチャネル遮断薬は、筋毒性も神経毒性ももたらさず（Barnetら、Pain、１１０巻（１〜２号）：４３２〜４３８頁（２００４年）；Sakuraら、Anesth  Analg、８１巻（２号）：３３８〜３４６頁（１９９５年））、それによってこれらは伸びた放出製剤のために望ましいものとなっている。米国特許第６，３２６，０２０号は、エピネフリンを含有する担体流体中で（０．１％の理論的ローディング量で）ＴＴＸ単独を含有するポリ（乳酸−グリコール酸）ミクロスフィアを開示しており、これは１時間より長い発症を伴う約６時間継続する神経遮断を生じさせる。エピネフリンを有さないＴＴＸは、坐骨神経遮断を生じさせることが示されてきているが、大部分の有効用量においてかなりの毒性である（Kohaneら、Anesthesiology、８９巻（１号）：１１９〜１３１頁（１９９８年）。ＴＴＸ単独のポリマーミクロスフィアを用いたKohaneら、Pain、１０４巻（１〜２号）：４１５〜４２１頁（２００３年）による研究は、ＴＴＸが（０．１％ｗ／ｗで）致死的、または（０．０５％ｗ／ｗで）神経遮断について効果的でなく、０分という中央値の遮断を生じさせたことを示した。
【００１２】
さらに、これらの極度に強力な局所麻酔剤は、親水性であるため、ポリマー粒子中に効果的に被包することが極度に困難であり、これらの最初の急速な放出による全身毒性は用量を制限してある（Barnetら、Anesth  Analg、１０１巻（６号）：１８３８〜１８４３頁（２００５年）；Kohaneら、Anesthesiology、８９巻（１号）：１１９〜１３１頁（１９９８年））。これによって、このような化合物を全体的にベースとする粒子状系（すなわち、従来の局所麻酔剤の含有を伴わないもの）の開発を非常に困難なものとなっている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】R.N.  Harden、「Chronic  Neuropathic  Pain:  Mechanisms,  Diagnosis,  and  Treatment」、The  Neurologist、１１巻：１１１頁（２００５年）
【非特許文献２】Coggeshallら、「A-fiber  sensory  input  induces  neuronal  cell  death  in  the  dorsal  horn  of  the  adult  rat  spinal  cord」、J.  Comp.  Neurol.、４３５巻：２７６〜２８２頁（２００１年）
【非特許文献３】Govrin-Lippmannら、「Ongoing  activity  in  severed  nerves:  source  and  variation  with  time」、Brain  Res.、１５９巻、４０６〜４１０頁（１９７８年）
【非特許文献４】Wuら、「Early  onset  of  spontaneous  activity  in  uninjured  C-fiber  nociceptors  after  injury  to  neighboring  nerve  fibers」、Journal  of  Neuroscience、２１巻：ＲＣ１４０（２００１年）
【非特許文献５】D.W.  Choi、「Calcium  and  Excitotoxic  Neuronal  Injury」、Ann.  N.Y.  Acad.  Sci.、７４７巻：１６２〜１７１頁（２００６年）
【非特許文献６】C.J.  Woolf、「Neuronal  Plasticity:  Increasing  the  Gain  in  Pain」、Science、２８８巻：１７６５〜１７６８頁（２０００年）
【非特許文献７】Wenら、「Nerve  Conduction  Blockade  in  the  Sciatic  Nerve  Prevents  but  Does  Not  Reverse  the  Activation  of  p38  Mitogen-activated  Protein  Kinase  in  Spinal  Microglia  in  the  Rat  Spared  Nerve  Injury  Model」、Anesthesiology、１０７巻：３１２〜３２１頁（２００７年）
【非特許文献８】Suterら、「Development  of  neuropathic  pain  in  the  rat  spared  nerve  injury  model  is  not  prevented  by  a  peripheral  nerve  block」、Anesthesiology、９９巻（６号）：１４０２〜８頁（２００３年）
【非特許文献９】Goldら、「Lidocaine  toxicity  in  primary  afferent  neurons  from  the  rat」、J.  Pharmacol.  Exp.  Ther.、２８５巻（２号）：４１３〜２１頁（１９９８年）
【非特許文献１０】Radwanら、「The  neurotoxicity  of  local  anesthetics  on  growing  neurons:  a  comparative  study  of  lidocaine,  bupivacaine,  mepivacaine,  and  ropivacaine」、Anesth.  Analg.、９４巻：３１９〜２４頁（２００２年）
【非特許文献１１】Dragerら、Anesthesiology、８９巻（４号）：９６９〜９７９頁（１９９８年）
【非特許文献１２】Kohaneら、Pain、１０４巻（１〜２号）：４１５〜４２１頁（２００３年）
【非特許文献１３】Paderaら、Anesthesiology、１０８巻（５号）：９２１〜９２８頁（２００８年）
【非特許文献１４】Pereら、Reg  Anesth、１８巻（５号）：３０４〜３０７頁（１９９３年）
【非特許文献１５】Jiaら、Biomaterials、２５巻（１９号）：４７９７〜４８０４頁（２００４年）
【非特許文献１６】Zimmerら、Anaesthesist、５６巻（５号）：４４９〜４５３頁（２００７年）
【非特許文献１７】Yamashitaら、Anesth  Analg、９７巻（２号）：５１２〜５１９頁（２００３年）
【非特許文献１８】Kohaneら、J  Biomed  Mater  Res.、５９巻（３号）：４５０〜４５９頁（２００２年）
【非特許文献１９】Barnetら、Pain、１１０巻（１〜２号）：４３２〜４３８頁（２００４年）
【非特許文献２０】Sakuraら、Anesth  Analg、８１巻（２号）：３３８〜３４６頁（１９９５年）
【非特許文献２１】Kohaneら、Anesthesiology、８９巻（１号）：１１９〜１３１頁（１９９８年）
【非特許文献２２】Barnetら、Anesth  Analg、１０１巻（６号）：１８３８〜１８４３頁（２００５年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
神経因性疼痛、例えば、痛覚過敏またはアロディニアの発症を予防または遅延させるための製剤および／または方法が必要とされている。
【００１５】
本発明の目的は、神経因性疼痛、例えば、痛覚過敏またはアロディニアの発症を予防または遅延させるための製剤を提供することにある。
【００１６】
神経因性疼痛、例えば、痛覚過敏またはアロディニアの発症を予防または遅延させる方法を提供することは本発明のまた別の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の概要
治療的投与量の部位１ナトリウムチャネル遮断薬を含有する製剤のための投薬レジメンが本明細書に記載されている。投薬レジメンは、延長された神経遮断を提供し、神経遮断が終了した後、チャネル遮断薬は、神経因性疼痛、例えば、痛覚過敏および／またはアロディニアの発症を、神経遮断が施された部位、および好ましくは神経遮断が施された領域（例えば、肢全体）において、１週間、好ましくは２週間、および好ましくはより長く、遅延させる有効量で存在する。
【００１８】
製剤は、急速な神経遮断、改善された効力および有効性を伴い、かつ局所毒性を伴わない局所麻酔剤として使用するための、部位１ナトリウムチャネル遮断薬、好ましくは、サキシトキシン（ＳＴＸ）を含有する。好ましい実施形態において、リポソームは、全身毒性を伴うことなく延長された遮断持続時間を生じさせる、部位１ナトリウムチャネル遮断薬のローディング量の増加のための製剤中に用いられる。一実施形態において、組成物は、部位１ナトリウムチャネル遮断薬のみを含有する。別の実施形態において、組成物は、コルチコステロイドと組み合わせた部位１ナトリウムチャネル遮断薬を含有する。好ましい実施形態において、部位１ナトリウムチャネル遮断薬は、（好ましくは、コルチコステロイドと組み合わせた）サキシトキシンであり、好ましいコルチコステロイドは、デキサメタゾンである。しかし、リポソーム、例えば、ミセル、ポリマー微粒子、またはポリマーナノ粒子に加えて、代わりの制御放出製剤を使用し得る。
【００１９】
実施例によって実証されるように、（好ましくは、コルチコステロイドもまた含む）リポソーム中にＳＴＸを被包（encapsulate）し、全身毒性を伴うことなく延長された神経遮断を達成する適切な投薬レジメンで投与することは、痛覚過敏の発症を遅延させる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａ、ＢおよびＣは、リポソーム内ＳＴＸ含量（μｇ／ｍｌ）および平均リポソームサイズ（ミクロン）（図１Ａ）、坐骨神経部分損傷（spared  nerve  injury；ＳＮＩ）後に処置を受けなかったラット（白色の丸）と比較した、１．１ｍｇ／ｍｌのＳＴＸを含有する１回の０．３ｍｌ用量のリポソーム（本明細書において、「ＳＴＸ−Ｌ」と称する）を神経遮断注射として投与されたラット（濃色の丸）からの、引っ込め潜時（秒）の関数としての感覚遮断（図１Ｂ）、および姿勢性伸筋突伸反応（extensor  postural  thrust）（ｇ）の関数としての運動遮断（図１Ｃ）の持続時間（日）のグラフである。データは、標準偏差を伴う平均（ｎ＝５）である。
【図２】図２は、処置を受けなかったラット（「処置されていない肢」）と、神経遮断注射として１回の０．３ｍｌ用量のＳＴＸ−Ｌを投与されたラットとについて、Ｍ波とＨ波とを比較したグラフである。Ｍ波およびＨ波の潜時（ｍｓ）ならびにＭ波の振幅（ｍＶ）を提供する。データは、標準偏差を伴う平均（ｎ＝５）である。
【図３】図３ＡおよびＢは、処置されていないラット（ＳＮＩ単独）（濃色の丸）と比較した、ＳＮＩの後に１用量のＳＴＸ−Ｌ（ＳＮＩ＋ＳＴＸリポソーム）を投与されたラット（白色の丸）についての、処置された（同側肢）（図３Ａ）および処置されていない肢（反対側肢）（図３Ｂ）についての、時間（日）に対する引っ込め閾値（ｇ）のグラフである。神経遮断の持続時間は、７．０日間±１．１日間であった。データを、標準偏差を伴う平均（ｎ＝５）として提供する。
【図４】図４Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、処置された（同側肢）（図４Ａ）および処置されていない肢（反対側肢）（図４Ｂ）についての時間（週）に対する引っ込め閾値（ｇ）；処置された（同側）肢についての時間（日）に対する引っ込め潜時（秒）（図４Ｃ）；ならびに処置されていないラット（ＳＮＩ単独）（濃色の丸）と比較した、ＳＮＩ後に３回の０．３ｍｌ用量のＳＴＸ−Ｌ（ＳＮＩ＋ＳＴＸリポソーム）を投与されたラット（白色の丸）についての、時間（週）に対する体重（ｇ）のグラフである。神経遮断の持続時間を、図４Ａにおいて灰色のボックスとして示す（１８．１±３．４日間）。データを、標準偏差を伴う平均（ｎ＝５）として提供する。
【図５】図５ＡおよびＢは、３つの群：ＳＮＩを有さないが、リポソーム単独（ＳＴＸを伴わない）（「ビヒクル」）を投与されたラット（白色の棒）、ＳＮＩを有するが、処置を受けないラット（「ＳＮＩ」）（黒色の棒）、およびＳＮＩを有し、ＳＴＸ−Ｌ（「ＳＮＩ＋ＳＴＸリポソーム」）で処置されたラット（灰色の棒）についての、２つの期間（手術後５日目および手術後６０日目）における、ＳＮＩラットから収集した腰髄中のグリーン（green）線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）陽性面積％（アストロサイト活性化の指標）の棒グラフである。図５Ａは、同側肢についての結果を示し、図５Ｂは、反対側肢についての結果を示す。データを、標準偏差を伴う平均（ｎ＝５）として提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書において使用する場合、部位１ナトリウムチャネル遮断薬は、「部位１」と称される場所においてナトリウムチャネルの外側の開口に結合する分子である。好ましい実施形態において、部位１ナトリウムチャネル遮断薬は、天然に存在する毒素またはその誘導体である。
【００２２】
「その誘導体」という用語は、本明細書において使用する場合、生物学的特性および／または薬理学的特性など、非誘導体化部位１ナトリウムチャネル遮断薬と実質的に同じ機能特性を有する、すなわち、ナトリウムチャネルを効果的に遮断する、部位１ナトリウムチャネル遮断薬の任意の誘導体を包含する。
【００２３】
「痛覚過敏」という用語は、本明細書において使用する場合、疼痛性刺激に対する増大した応答を意味する。
【００２４】
「アロディニア」という用語は、本明細書において使用する場合、通常は非侵害性の刺激に対する疼痛応答を意味する。
【００２５】
ＩＩ．組成物
組成物は、全身毒性を伴うことなく、局所麻酔剤による遮断の持続時間を延長するように設計されている。組成物は、全身毒性を伴うことなく、局所麻酔剤の遮断の持続時間を延長するのに有効な量で、薬学的に許容される担体中で投与される、部位１ナトリウムチャネル遮断薬を単独で、またはコルチコステロイドと組み合わせて、含有する。組成物は、製剤中で、好ましくは懸濁剤として、神経が遮断されるべき部位にて局所投与される。
【００２６】
好ましい実施形態において、担体は、リポソームである。しかし、他の制御放出系、例えば、ミセル、微粒子またはナノ粒子を使用することができる。
【００２７】
Ａ．部位１ナトリウムチャネル遮断薬
部位Ｉナトリウムチャネル遮断薬は、テトロドトキシン（ＴＴＸ）、サキシトキシン（ＳＴＸ）、デカルバモイルサキシトキシン、ネオサキシトキシン、およびゴニオートキシン類（本明細書において、「毒素」と総称される）を包含する。好ましい毒素は、ＳＴＸである。
【００２８】
特定の種の藻類によって天然に生成される神経毒であるサキシトキシンは、ニューロンの電位開口型ナトリウムチャネルの部位１に特異的に結合し、神経伝導の遮断を生じさせることによってニューロン活性を抑制する。サキシトキシンは、アラスカバタークラム（Ｓａｘｉｄｏｍｕｓ  ｇｉｇａｎｔｃｕｓ）から最初に抽出されたが、ここでこれはゴニオラクス（Ｇｏｎｙａｕｌａｘ）属の藻類中に存在する。報告された化学式は、Ｃ１０Ｈ１５Ｎ７Ｏ３・２ＨＣｌである。この毒素は、２つのグアニジニウム部分が組み込まれているペルヒドロプリン核を有すると考えられる。サキシトキシンは、局所麻酔剤として単独で使用するには毒性が強すぎる。
【００２９】
いくつかのポリペプチドが、フィリピン群島において見出されるイモガイ属の魚食性イモガイの麻痺性毒液から単離された。「コノトキシン」と命名され、これらはイオンチャネル機能に影響を与えることが発見されてきた。麻痺性のａ、ｍ、およびｗコノトキシンは、それぞれニコチン性アセチルコリン受容体、ナトリウムチャネル、および電位感受性カルシウムチャネルを遮断する（Oliveraら、Science、２４９巻：２５７〜２６３頁（１９９０年）において概説されている）。ナトリウムチャネルを遮断するものは、テトロドトキシンおよびサキシトキシンと同じ様式で使用することができる。
【００３０】
１．投薬レジメン
好ましくは、適切な投薬レジメンを使用して、延長された神経遮断、すなわち、第１の用量のリポソームの投与後に、７日間超、好ましくは８日間超、好ましくは１０日間超、最も好ましくは約１８日間の延長された持続時間の神経遮断を提供する。好ましくは、投薬レジメンはまた、神経遮断が施されないときと比較して、痛覚過敏の発症における延長された遅延を提供するのに適している。いくつかの実施形態において、投薬レジメンは、神経遮断が施されないときと比較して、アロディニアの発症を遅延させるのに適している。
【００３１】
担体中に被包されたＳＴＸについての投与量範囲は、（好ましくは、０．１〜９０重量％、より好ましくは、５〜７５重量％の担体（好ましくは、リポソーム）中のローディングで）２８マイクログラム〜１．５ｍｇである。
【００３２】
Ｂ．コルチコステロイド
インビボでの神経遮断を延長するのに有用なコルチコステロイドとしては、グルココルチコイド、例えば、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン、および経口的にまたは注射によって慣用的に投与されるその他のものが挙げられる。他のグルココルチコイドとしては、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルニソリド、メチルプレドニゾン、パラメタゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン（triamcinolome）、アルクロメタゾン、アムシノニド、クロベタゾール、フルドロコルチゾン、二酢酸ジフロラゾン（diflurosone  diacetate）、フルオシノロンアセトニド、フルオロメトロン（fluoromethalone）、フルランドレノリド、ハルシノニド、メドリゾン、およびモメタゾン、ならびにこれらの薬学的に許容され得る塩および混合物が挙げられる。異なるコルチコステロイド（corticosteriods）の相対的強度は周知であり、例えば、GoodmanおよびGilman'sにおいて記載されている。
【００３３】
典型的には、これらは、０．０５〜１ｍｇのデキサメタゾン／ｍｇまたはグルココルチコイドの強度に基づく当量で投与される（より弱いとより多く必要とし、より強いとより少なく必要とする）。好ましくは、グルココルチコイドは、１０：０．０００１から１：０．０００１、好ましくは、６：０．０００１の範囲の脂質：グルココルチコイドのモル比で、担体（好ましくはリポソーム）中に組み込まれる。好ましくは、グルココルチコイドは、デキサメタゾンである。
【００３４】
サキシトキシンを含有するリポソームは、局所毒性を伴うことなく、および大部分の製剤において、全身毒性を伴うことなく、延長された神経遮断を生じさせることが示されてきた。これらのリポソームは相乗的な化合物、例えば、ブピバカインおよびデキサメタゾンを必要としなかったが、遮断の持続時間は、それらの使用によって非常に伸びた。米国特許出願公開第２０１２−００３４２０９６号を参照されたい。例えば、デキサメタゾンを配合すると、神経行動学的試験法および臨床検査によって検出可能な全身毒性を何ら伴うことなく７日間より長く継続する遮断を生じさせた（Kohaneら、Pain.、１０４巻（１〜２号）：４１５〜４２１頁（２００３年））。
【００３５】
Ｃ．担体
製剤は、（例えば、７日間より長い、８日間より長い、１０日間より長い、１５日間より長い、または概ね１８日間の持続時間の）延長された神経遮断が提供されるように、部位Ｉナトリウムチャネル遮断薬を制御された様式で送達することができる任意の薬学的に許容され得る担体を含み得る。適切な担体としては、リポソーム、ミセル、微粒子、およびナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。部位Ｉナトリウムチャネル遮断薬は、適切なリガンドを使用して担体に取り付けられ得るかまたは担体中に被包し得る。
【００３６】
好ましい実施形態において、担体は、乾燥粉末としてバイアル中で貯蔵されているかまたは注射用水溶液に懸濁されている、リポソームである。リポソーム（ＬＰ）は、水性コンパートメントによって分離された同心円状のリン脂質二重層から構成される球状の小胞である。ＬＰは、細胞の表面に接着し、細胞の表面上に分子膜を生じさせる特徴を有する。リポソームは、水性の内部を封入する同心円状のリン脂質二重層から構成される脂質小胞である（Gregoriadisら、Int  J  Pharm、３００巻：１２５〜３０頁、２００５年（２００５年）；GregoriadisおよびRyman、Biochem  J、１２４巻：５８頁（１９７１年））。脂質小胞は、１つ（単膜）またはいくつかの（多重膜）リン脂質二重層によって画定される１つまたはいくつかの水性コンパートメントを含む（Sapraら、Curr  Drug  Deliv、２巻：３６９〜８１頁（２００５年））。クリニックにおけるリポソームの成功は、これらの製剤において使用される脂質の無毒性の性質に帰するものとされてきた。リポソームの脂質二重層および水性の内部コアの両方は、処置の目的を果たすことができる。
【００３７】
リポソームは、より低い用量における毒素の有効性を増強するための毒素の担体としてよく研究されてきた（Alamら、Mol  Cell  Biochem、１１２巻、９７〜１０７頁、１９９２年；Chaim-Matyasら、Biotechnol  Appl  Biochem、１７巻（Ｐｔ１）、３１〜６頁、１９９３年；de  PaivaおよびDolly、FEBS  Lett、２７７巻、１７１〜４頁（１９９０年）；FreitasおよびFrezard、Toxicon、３５巻、９１〜１００頁（１９９７年）；MandalおよびLee、Biochim  Biophys  Acta、１５６３巻、７〜１７頁（２００２年））。
【００３８】
リポソームは、種々の化学療法剤のための薬物担体として広範に研究されてきた（概ね２５，０００の科学論文が、この対象について公表されてきた）（Gregoriadis、N  Engl  J  Med、２９５巻、７６５〜７０頁（１９７６年）；Gregoriadisら、Int  J  Pharm、３００巻、１２５〜３０頁（２００５年））。水溶性抗癌性物質、例えば、ドキソルビシンは、リン脂質二重層（複数可）によって画定されたリポソームの水性コンパートメント（複数可）内に保護することができ、一方では、脂溶性物質、例えば、アンホテリシンおよびカプサイシンは、リン脂質二重層中に組み込むことができる（Aboul-Fadl、Curr  Med  Chem、１２巻、２１９３〜２１４頁（２００５年）；Tyagiら、J  Urol、１７１巻、４８３〜９頁（２００４年））。リポソームを使用した化学療法剤の送達は、薬物動態の改善および毒性プロファイルの低減をもたらす（Gregoriadis、Trends  Biotechnol、１３巻、５２７〜３７頁（１９９５年）；GregoriadisおよびAllison、FEBS  Lett、４５巻、７１〜４頁、１９７４年；Sapraら、Curr  Drug  Deliv、２巻、３６９〜８１頁（２００５年））。
【００３９】
１．リン脂質
好ましいリン脂質は、天然に存在するリン脂質、例えば、１，２ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール、ナトリウム塩（ＤＳＰＧ）、および１，２−ジミリストイルｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、ナトリウム塩（ＤＭＰＧ）である。好ましい実施形態において、リポソームは、ＤＭＰＣおよびＤＭＰＧ、またはＤＳＰＣおよびＤＳＰＧ（ＤＭＰＣ＝１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＭＰＧ＝２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール、ＤＳＰＣ＝１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＳＰＧ＝１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール）を用いて生成される。その相転移温度（Ｔｍ）に基づいて、ＤＭＰＣを用いて作製したものは、「流動性」（fluid）リポソームと称され、ＤＳＰＣを用いて作製したものは、「固体」と称される。
【００４０】
２．薬学的に許容され得る担体
組成物は、注射用の任意の薬学的に許容され得る担体、例えば、注射用の水、滅菌水、食塩水、デキストロース溶液、カルボキシメチルセルロース、マンニトール、および緩衝化溶液中で提供することができる。局所的に適用される製剤には、局所的適用のために適切な担体を使用する。
【００４１】
ＩＩＩ．投与の方法
組成物は、当業者に公知の局所麻酔剤を投与するための方法のいずれかによって投与することができる。組成物は、局所的麻酔、浸潤麻酔、周囲浸潤麻酔、神経遮断麻酔、経静脈内局所麻酔、脊髄麻酔、および硬膜外麻酔のために製剤化することができる。
【００４２】
好ましくは、組成物は、神経遮断麻酔のために製剤化される。典型的な製剤は、注射または局所的投与に適している。
【００４３】
ＩＶ．使用
本明細書に記載されている投薬レジメンを使用して、患者における慢性疼痛、例えば、幻肢痛、ニューロパシー、神経因性疼痛および／または反射性交感神経性ジストロフィーの発症を処置する、予防するまたは遅延させることができる。
【００４４】
本発明は、下記の非限定的実施例を参照することによってさらに理解される。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
坐骨神経部分損傷（ＳＮＩ）モデルにおける慢性疼痛の発症に対するＳＴＸ含有リポソームによる損傷を受けた神経におけるニューロン活性の延長された抑制の効果
リポソーム調製物
リポソームを、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３ホスホコリン（ＤＳＰＣ）および１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）およびコレステロールを使用し、脂質薄膜技術を使用して生成した。ＤＳＰＣ：ＤＳＰＧ：コレステロール：デキサメタゾン（３：１：２：０．０００１のモル比）を、温かいクロロホルムおよびメタノールの混合物（９：１ｖ／ｖ）に溶解した。脂質混合物を、ロータリーエバポレーター（ＢＵＣＨＩ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｋ  ＡＧ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で６０℃にて乾燥させ、脂質薄膜層を得た。ロータリーエバポレーター内の減圧を、４８０ｔｏｒｒで２０分間維持し、次いで、３０分間かけて２０ｔｏｒｒに徐々に減少させた。温かいｔ−ブタノールを使用して、脂質膜を再構成し、それに続いて液体窒素中に直ちに浸漬した。次いで、脂質混合物を少なくとも２４時間凍結乾燥し、このように得られた脂質ケークを、０．６ｍＭのサキシトキシン二塩酸塩（Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  Ｈａｌｌ博士、ＦＤＡ、Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｐａｒｋ、ＭＤより）を含有する温かい２５０ｍＭの硫酸アンモニウム緩衝液で水和させた。リポソーム懸濁液を、高剪断実験室用ミキサー（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用して１０，０００ｒｐｍにてホモジナイズし、その後、凍結融解サイクルを繰り返し行った。次いで、リポソームを、０．９％食塩水に対して４℃にて４８〜７４時間、５０ｋＤのカットオフ透析管中で透析し、遊離ＳＴＸを含有しない最終的なリポソーム製剤を生じさせた。
【００４６】
ＳＴＸリポソーム（ＳＴＸ−Ｌ）は、１．１ｍｇのＳＴＸ／ｍｌ製剤を含有しており、０．３ｍｌの用量で投与された。
【００４７】
リポソームの特性
リポソームのサイズを、Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ  ３  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ）を使用して決定した。リポソーム内ＳＴＸ含量を、BlighおよびDryerの方法（E.G.  Bligh、W.J.  Dyer、A  Rapid  Method  Of  Total  Lipid  Extraction  And  Purification、（１９５９年））を使用して脂質画分を分離した後で決定した。ＳＴＸ含量の決定は、Batesら、「A  chemical  assay  for  saxitoxin.  Improvements  and  modifications」、J.  Agric.  Food  Chem.、２６巻：２５２〜２５４頁（１９７８年）による従前に公表されている方法に基づいた。
【００４８】
動物ケア
この研究を、ＩＡＳＰガイドラインに従って、マサチューセッツ工科大学の動物ケア委員会によって承認されたプロトコールを使用して行った（M.  Zimmermann、「Ethical  guidelines  for  investigations  of  experimental  pain  in  conscious  animals」、Pain、１６巻：１０９〜１１０頁（１９８３年）。４００〜４２５グラムの重量の成体雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、対で収容し、標準的なラット食餌および水を自由に摂取させ、７ａ．ｍ．〜７ｐ．ｍ．の明／暗サイクルに維持した。動物を、リポソーム処置および／または神経損傷手術を受ける群にランダムに分割した。偽手術を受けた動物を、対照として使用した。リポソーム処置および／または神経損傷手術後５日目または６０日目に、ラットを二酸化炭素吸入によって安楽死させた。
【００４９】
坐骨神経部分損傷（ＳＮＩ）
２％イソフルランおよび９８％酸素の吸入によって、ラットを麻酔した。
【００５０】
３〜４ｃｍの皮膚切開を、左大転子から膝関節に行った。筋層を分離し、坐骨神経を露出させた。坐骨神経の三分枝を同定し、共通の腓骨および脛骨の枝を露出させ、５−０絹縫合糸で結紮し、一方で、腓腹神経への損傷を回避するように特に注意した。結紮下の概ね２ｍｍの神経セグメントを、両方の枝から切断した。この研究において、５匹のラットを各群（対照群およびＳＴＸ−リポソーム処置群）について試験した。対照群は、皮膚切開および筋層の分離をされたが、神経損傷は受けなかった。リポソーム処置群のラットは、手術の直後に、ＳＮＩ手順と同側の神経遮断注射として０．３ｍｌのＳＴＸ製剤を受けた。リポソームのＳＴＸを受けなかった動物は、他の形態の処置を何ら受けなかった。全ての神経遮断注射を、２３ゲージのニードルを使用して行った。ニードルを、前内側方向に向けて大転子に対して後内側に導入した。骨と接触すると、ニードルを概ね１ｍｍ引き戻し、０．３ｍＬのリポソーム製剤を注射した。
【００５１】
触覚応答性および熱応答性についての行動試験
Ｖｏｎ−Ｆｒｅｙフィラメント（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ、Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ、ＩＬ）への後肢の触覚応答性を、全ての動物について６０日間にわたって１週間に少なくとも２〜３回測定した。Shankarappaら、「Forced-exercise  delays  neuropathic  pain  in  experimental  diabetes:  effects  on  voltage-activated  calcium  channels」、J.  Neurochem.、１１８巻：２２４〜２３６頁（２０１１年）において従前に記載されているように、ワイヤーメッシュの底を有する柵への順化後に、較正されたＳｅｍｍｅｓ  Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎモノフィラメント（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ、Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ  ＩＬ）を、ラットの外側足底面に当てた。フィラメントを、モノフィラメントの僅かな座屈をもたらすのに十分な力で、８秒間の期間にわたって各後肢に個々に当てた。フィラメント選択のパターンは、Ｄｉｘｏｎのアップダウン方法に基づき、試験は２ｇのフィラメントで開始し、それに続いてそれぞれ、プラスまたはマイナスの足の応答によって、より低いまたはより高い重量のフィラメントとなった（Chaplanら、「Quantitative  assessment  of  tactile  allodynia  in  the  rat  paw」、Journal  of  Neuroscience  Methods、５３巻：５５〜６３頁（１９９４年）を参照されたい）。８秒間の刺激持続時間以内の反射的足引っ込めまたは足をなめることは、プラスの応答と考えた。５０％のプラスの応答割合を引き出すのに必要とされるフィラメント質量を、引っ込め閾値と定義し、従前（Chaplan）に記載のように計算した。調査者は、試験の期間の間、群に対して盲検のままであった。
【００５２】
ＳＴＸ−リポソームが誘発する神経遮断の持続時間を決定するために、熱刺激に対する行動応答を、Kohaneら、「A  re-examination  of  tetrodotoxin  for  prolonged  duration  local  anesthesia」、Anesthesiology、８９巻：１１９〜１３１頁（１９９８年）によって従前に報告されているように修正したホットプレートを使用して評価した。手短に言えば、タオルで拘束したラットを、５６℃に事前加熱したホットプレート（ＩＩＴＣ  Ｉｎｃ．、Ｗｏｏｄｌａｎｄ  Ｈｉｌｌｓ、ＣＡ）上に保持し、後足の足底面を熱したプレート上に逐次的に置いた。動物がその足を後退させるのに必要とされる時間を、引っ込め潜時として記録した。１２秒後もそれらの足を引っ込めなかった動物を、実験者がホットプレートからはずし、熱が媒介する損傷を防止した。６秒間よりも長い引っ込め応答（最大引っ込め潜時の５０％）を、神経遮断と考えた。各試験の間に１０秒間の休止を取って測定を３回繰り返した。
【００５３】
どのような処置を特定のラットが受けているかについて実験者は知らされなかった。
【００５４】
熱侵害受容遮断の持続時間を、熱潜時が、より高い値から７秒間の値に戻るまでに必要とされる時間として計算した。７秒間は、成体ラットにおける約２秒間というベースラインの熱潜時と１２秒間という最大潜時との間の中間点である。
【００５５】
ＳＴＸ−リポソーム処置された非ＳＮＩ動物における運動遮断を試験するために、各動物の姿勢性伸筋突伸反応を、デジタル秤量スケール上にそれぞれの後足を逐次的に置き、動物の足首が秤量表面に触れることなく動物が耐えることができる最大量の重量を測定することによって試験した。運動遮断の持続時間を、重量支持が最大の遮断から正常への中間に戻るのに必要とされる時間と定義した（２０ｇ未満の支持される重量）（Kohane、１９９８年を参照されたい）。各ラットについての中間点を、［（いずれかの脚が支持する最も高い重量）−（遮断された脚が支持する最も低い重量）］／２＋（遮断された脚が支持する最も低い重量）と定義した。
【００５６】
神経伝導の測定
神経機能に対するＳＴＸ−リポソームの効果を評価するために、熱足引っ込め試験によって特徴付けられる神経遮断のピーク（ＳＴＸ−リポソーム処置後の４日目）における坐骨神経からの誘発された複合筋活動電位潜時および振幅を測定した（Shankarappa、２０１１年を参照されたい）。手短に言えば、ラットを酸素中の２％イソフルランの吸入によって麻酔し、加温パッドの助けによって体温を維持した。坐骨神経を、超最大方形波（２４．９ｍＡ、０．０５ｍｓ、１Ｈｚ）を使用してピン電極を介して足首または坐骨神経切痕において刺激し、一方、記録用電極を足の足底筋中に置いた。引き起こされた反応を記録した。神経の近位セグメントおよび遠位セグメントにおける伝導を、Ｍ波およびＨ波の潜時を測定することによって評価した。
【００５７】
リアルタイムＰＣＲ
総ＤＲＧ  ＲＮＡ試料に、製造業者の手順に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写を行った。各試料についてのリアルタイムＰＣＲ反応を、Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において、製造業者の指示書によって、１００ｎｇのｃＤＮＡを使用して２連で行った。リアルタイムＰＣＲを、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＳｔｅｐ  Ｏｎｅ装置およびプログラムを使用して行った。特異的に増幅されたｃＤＮＡの相対量を、デルタ−ＣＴ方法を使用して計算した（Vandesompeleら、Genome  biology、３巻（７号）：RESEARCH００３４−１−００３４．１１（２００２年）；Hoebeeckら、Laboratory  investigation；A  Journal  of  Technical  Methods  and  Pathology、８５巻（１号）：２４〜３３頁（２００５年））。使用したＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓプライマーは、下記の通りである：ＧＡＰＤＨ：Ｒｎ９９９９９９１６＿Ｓ１、β−アクチン：Ｒｎ００６６７８６９＿ｍ１；Ｇａｄｄ４５  α：Ｒｎ００５７７０４９＿ｍ１；ＡＴＦ３：Ｒｎ００５６３７８４＿ｍ１；Ｃａｃｎａ２ｄ１：Ｒｎ０１４４２５８０＿ｍ１；Ｓｍａｇｐ：Ｒｎ００７８８１４５＿ｇ１。
【００５８】
統計
データを、平均±標準偏差（ｎ＝５）として提示する。多重比較を考慮に入れるために、全ての統計的比較を、ＩｎＳｔａｔソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を使用してＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ検定によって行った。Ｐ値＜０．０５を、統計的有意性を意味すると考えた。
【００５９】
結果
図１Ａに示すように、平均リポソームサイズを、５．２±１．３ミクロンであると決定し、平均リポソーム内ＳＴＸ含量（μｇ／ｍｌ）を、２７±４（μｇ／ｍｌ）であると決定した。
【００６０】
ラットに単一の０．３ｍｌ用量のサキシトキシンリポソームを投与したとき、リポソームは、局所神経損傷を生じることなく６日間までの運動神経遮断および感覚神経遮断を生じさせた（感覚遮断の持続時間について図１Ｂを、および運動遮断の持続時間について図１Ｃを参照されたい）。
【００６１】
ＳＴＸ−Ｌで処置された肢および処置されていない肢からの坐骨神経の着色した切片は、炎症または損傷の徴候を何ら示さず、一方、透過型電子顕微鏡法画像化によって、ＳＴＸ−Ｌ処置に反応した正常な神経形態が確認された（データは示さず）。
【００６２】
ＳＴＸ−Ｌは、完全な局所化された神経伝導遮断を生じさせた。尻における電気刺激によって、ＳＴＸ−Ｌで処置されたラットにおける神経伝導の記録は、「Ｍ」波および「Ｈ」波の完全な喪失を示し、一方、足首における電気刺激は、「Ｈ」波の非存在下でのみもたらされたが、これは尻の領域における非常に局所化された神経遮断を示唆する。
【００６３】
図２における表は、ＳＴＸ−Ｌによる処置が遮断に対して遠位である神経セグメントにおける機能に影響を与えないことを示す。
【００６４】
図３ＡおよびＢに示すように、単回用量のＳＴＸリポソーム製剤は、ＳＮＩモデルにおいて神経因性疼痛の発症を予防または遅延させるのに効果的でなく、神経遮断は持続時間が概ね７日間であった。単回用量のＳＴＸ−Ｌを投与されたＳＮＩラットは、神経遮断が消滅した直後に同側後肢の感受性を生じさせ、一方、反対側肢は、ＳＴＸ−Ｌによる処置に応答した効果を何ら示さなかった。
【００６５】
図３Ａにおけるデータと対照的に、概ね１８日間の有意により長い神経遮断を生じさせるのに使用される投薬レジメンは、ＳＮＩラットにおける神経因性疼痛の発症を遅延させるのに十分であった。これは、図４Ａにおけるデータによって強調される。概ね１８日間の持続時間の延長された神経遮断は、０．３ｍｌ用量のＳＴＸ−Ｌを３回投与することによって得られた。従前の用量の効果が漸減の徴候を示した後に、各用量を投与した。神経遮断の持続時間を、図４Ｃにおけるデータを使用して計算した。
【００６６】
図４Ａに示すように、ＳＴＸ−Ｌは、同側後肢において触覚過敏性（痛覚過敏）の発症を４週間遅延させる（灰色の棒は、図４Ｃから計算した場合の神経遮断の持続時間を示す）。図４Ｂは、反対側肢において、３回の連続用量のＳＴＸ−Ｌの投与が触覚過敏性の発症を完全に予防したことを示す。
【００６７】
図４Ｄは、ＳＴＸ−Ｌを受けたラットにおける体重増加がＳＴＸ−Ｌによる処置中に中等度の減少を示したが、すぐ後に回復したことを示す。
【００６８】
図５ＡおよびＢにおけるデータは、ＳＴＸ−Ｌによる処置が、腰髄における、神経因性疼痛が関連するアストロサイトの応答を減弱させることを実証する。
【００６９】
ＳＮＩ動物から収集した腰髄は、アストロサイトの活性化の指標であるグリーン線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の表面積の増加を示し、一方、ＳＴＸ−Ｌで処置されたＳＮＩ動物は、手術後５日目および６０日目にて同側肢において減弱した応答を示した。図５ＡおよびＢにおける棒グラフは、画像分析技術から得た定量化した結果を提供する。
【００７０】
リアルタイムＰＣＲ
注射の５日後および最初の注射の２カ月（６０日間）後の神経損傷が存在するかまたはしないかについてさらに評価するために、リアルタイムＰＣＲを使用して、神経遮断を受けた動物（各群においてｎ＝５）の後根神経節からのＲＮＡを使用して、その発現が神経損傷によって変化する下記の遺伝子：Ｇａｄｄ４５ａ（Befortら、Eur  J  Neurosci.、１８巻（４号）：９１１〜９２２頁（２００３年））、ＡＴＦ３（Nakagomiら、J  Neurosci.、２３巻（１２号）：５１８７〜５１９６頁（２００３年）；Songら、Exp  Neurol．、２０９巻（１号）：２６８〜２７８頁（２００８年））、Ｃａｃｎａ２ｄ１（Luoら、J  Pharmacol  Exp  Ther.、３０３巻（３号）：１１９９〜１２０５頁（２００２年）；Newtonら、Brain  Res  Mol  Brain  Res.、９５巻（１〜２号）：１〜８頁（２００１年））の発現を研究した。発現を、内部対照としてのＧＡＰＤＨに対して規準化した。試験したさらなる遺伝子は、Ｐｐｉａ、Ｈｔｒ３ａ、Ｓｃｎ１１ａ、Ｎｐｙ、Ｇａｌ、Ｖｉｐ、Ｃ１ｑｂ、Ｊｕｎ、およびＲＴ１Ｄｂ１であった。
【００７１】
同側肢および反対側肢についての結果を、下記の表１において提供する。
【００７２】
【表１】
2015514805.tif 000002
【００７３】
表１におけるデータによって示されるように、ＳＴＸ−Ｌ処置は、後根神経節ニューロンにおける遺伝子発現のＳＮＩが誘発する変化に影響を与えない。
【００７４】
これらのリポソーム中のＳＴＸの投与が、十分に長い神経遮断を達成する適切な投薬レジメンで投与された場合に、処置された肢における慢性神経因性疼痛の発症をかなり遅延させるのに効果的であったことをこのデータは実証する。対照的に、リポソーム処置を伴わずに、ラットは殆ど１カ月早く疼痛を発生させた。さらに、対照的に、より短い神経遮断が施された場合（すなわち、概ね７〜８日の持続時間）、ラットはまた、神経遮断の終了の数日以内に神経因性疼痛を発生させた。
【図１】
2015514805.tif 000003
【図２】
2015514805.tif 000004
【図３】
2015514805.tif 000005
【図４】
2015514805.tif 000006
【図５】
2015514805.tif 000007
【国際調査報告】
2015514805.tif 000008
2015514805.tif 000009
2015514805.tif 000010