(57)【要約】マウスＲＰ２１５モノクローナル抗体のヒト化形態、およびそれを使用する方法が本明細書中に提供される。これらのヒト化ＲＰ２１５モノクローナル抗体は、それぞれの対応する腫瘍関連抗原であるＣＡ２１５に対する親和性および特異性によって特徴づけられ、そしてマウスＲＰ２１５の親和性および特異性に匹敵することが示された。１つの局面において、本発明は、ＲＰ２１５の特異性および親和性と実質的に等価な特異性および親和性で、ＣＡ２１５に結合するヒト化抗体またはフラグメントに関する。特に、図８に示される可変領域を有する抗体またはフラグメントが、本発明の一部である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＡ２１５と特異的に反応し、かつＲＰ２１５の親和性と実質的に等価な親和性で該ＣＡ２１５に結合する、ヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはそのフラグメント。
【請求項２】
ＫａｂａｔまたはＣｌｏｔｈｉａのいずれかのナンバリングシステムにしたがって、図８に示される重鎖可変領域の１つおよび／または軽鎖可変領域の１つにおける固有のＣＤＲ領域を含む、請求項１に記載のｍＡｂまたはフラグメント。
【請求項３】
ａ）前記重鎖のＣＤＲ１領域がＤＹＷＭＨであり、かつ
ｂ）該重鎖のＣＤＲ２領域がＡＩＤＴＳＤＳＹＴＲＹＡＱＫＦＱＧまたはＧＩＤＴＳＤＳＹＴＲＹＡＱＫＦＱＧであり、かつ
ｃ）該重鎖のＣＤＲ３領域がＳＩＹＤであり、そして／または
ｄ）前記軽鎖のＣＤＲ１領域がＫＳＳＱＳＬＬＮＳＳＮＱＫＳＹＬＡであり、かつ
ｅ）該軽鎖のＣＤＲ２領域がＦＡＳＴＲＥＳであり、かつ
ｆ）該軽鎖のＣＤＲ３領域がＱＧＨＹＳＴＰＳＴである、
請求項１に記載のｍＡｂまたはフラグメント。
【請求項４】
ＶＨ１＋ＶＬ１；ＶＨ１＋ＶＬ２；ＶＨ２＋ＶＬ１；ＶＨ２＋ＶＬ２；ＶＨ３＋ＶＬ１；またはＶＨ３＋ＶＬ２の可変領域を含む、請求項１に記載のｍＡｂまたはフラグメント。
【請求項５】
完全抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｍＡｂ。
【請求項６】
単鎖抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のフラグメント。
【請求項７】
検出可能なマーカーおよび／または治療剤に結合された、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｍＡｂまたはフラグメント。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のｍＡｂまたはフラグメントと、薬学的に受容可能な賦形剤とを含む、薬学的組成物。
【請求項９】
追加の治療剤をさらに含む、請求項８に記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のｍＡｂまたはフラグメントを産生する、組換え宿主細胞または不死化細胞。
【請求項１１】
ＣＡ２１５と特異的に反応するヒト化ｍＡｂまたはフラグメントを産生する方法であって、該方法は、
請求項１０に記載の細胞を培養する工程、および
該ｍＡｂまたはフラグメントを回収する工程
を包含する、方法。
【請求項１２】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のｍＡｂまたはフラグメントの可変領域をコードする、１または複数の核酸分子。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のｍＡｂまたはフラグメントを産生する、トランスジェニック非ヒト動物またはトランスジェニック植物。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のｍＡｂまたはフラグメントを含む、癌を処置するための組成物。
【請求項１５】
前記癌は、乳房、卵巣、子宮内膜、前立腺、頸部、膵臓、結腸、肺、肝臓、または腎臓の癌である、請求項１４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マウス起源であるＲＰ２１５モノクローナル抗体のヒト化の分野に関する。ＲＰ２１５は、ＣＡ２１５として知られる癌細胞発現糖タンパク質の炭水化物関連エピトープを特異的に認識することが公知である。次いで、ＲＰ２１５のヒト化形態の一次構造は、抗体ベースの抗癌薬としてヒトの癌の治療的処置のために利用され得る。
【背景技術】
【０００２】
米国特許第５，６５０，２９１号および国際公開第２００８／１３８，１３９号に記載されたＲＰ２１５モノクローナル抗体は、ＯＣ−３−ＶＧＨ卵巣癌細胞の抽出物に対して免疫化されたマウスにおいて生成された３０００のモノクローナル抗体のうちの１つである。何年もの努力を通じて、ＲＰ２１５が、ＣＡ２１５と命名された、癌細胞に発現される全（ｐａｎ）癌バイオマーカーまたは糖タンパク質と特異的に反応することが立証された。ＲＰ２１５の可変領域のアミノ酸配列は、上記国際公開公報に開示されている。ＣＡ２１５に結合する抗体の用途に関連するこれらの文書の内容は、本明細書中に参考として援用される。
【０００３】
１００を超えるＣＡ２１５由来トリプシンペプチドのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによる包括的分析の後、ＣＡ２１５が、癌細胞によって発現される、各々がＲＰ２１５特異的炭水化物関連エピトープを含む糖タンパク質の混合物であることがさらに立証された。これらの糖タンパク質の間では、免疫グロブリン重鎖、Ｔ細胞レセプターおよび細胞接着分子、ならびにムチンなどを含む免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）タンパク質が主である。
【０００４】
インビトロおよびインビボの両方の生化学および免疫学的アッセイが、ＲＰ２１５がヒトにおけるほぼ全ての癌細胞または癌様組織の表面と反応することを立証するために実施された。免疫化学研究に加えて、アポトーシスと、補体依存性細胞傷害とが、μｇ／ｍｌのオーダーの濃度においてＲＰ２１５の存在下で、癌細胞に対して誘導され得る。モデル系における移植された腫瘍細胞のＲＰ２１５による増殖阻害もまた、ヌードマウス実験において実証された。さらに、ＲＰ２１５に対するラット抗イディオタイプ（Ａｉｄ）モノクローナル抗体が生成された。マウスにおいて、これらのＡｉｄモノクローナル抗体の免疫化の際のＡｂ３応答は、首尾よく誘導された。抗ａｉｄ（Ａｂ３）抗血清は、ＲＰ２１５に対して機能的に等価であることが示された。Ａｉｄモノクローナル抗体は、ヒト用途のための抗癌ワクチンの開発のためにも使用され得る。
ヒト用途のためのＲＰ２１５ベースの抗癌薬を開発するために、オリジナルのマウスＲＰ２１５モノクローナル抗体をヒト化形態に改変することが必須である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，６５０，２９１号明細書
【特許文献２】国際公開第２００８／１３８，１３９号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の開示）
本発明は、ＲＰ２１５モノクローナル抗体のヒト化形態に関する。本発明のＲＰ２１５のヒト化バージョンは、オリジナルのマウスＲＰ２１５のＣＡ２１５に対する親和性および特異性に匹敵するか、または等価な親和性および特異性を有することが示された。したがって、１つの局面において、本発明は、ＲＰ２１５の特異性および親和性と実質的に等価な特異性および親和性で、ＣＡ２１５に結合するヒト化抗体またはフラグメントに関する。特に、図８に示される可変領域を有する抗体またはフラグメントが、本発明の一部である。
【０００７】
本発明の完全抗体については、重鎖の定常領域はＩｇＧであり、軽鎖の定常領域はカッパであることが好ましい。しかしながら、例えばＩｇＭを含む他のＩｇ形態は、その軽鎖にラムダ定常領域を有する実施形態も含まれる。
【０００８】
なお他の局面において、本発明は、ヒト被験体における癌の処置における、本発明の抗体の使用方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＲＰ２１５モノクローナル抗体の種々のヒト化形態およびキメラ形態の抗原結合曲線を示す。
【００１０】
【図２】図２は、種々のヒト化ＲＰ２１５モノクローナル抗体のヒトＩｇＧに対する低い交差反応性を測定するためのＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００１１】
【図３】図３は、ＶＬの配列解析を示す：３つのマウスＲＰ２１５のＣＤＲループが一次アミノ酸配列においてハイライトされ、重要残基（Ｃ−Ｗ−Ｃ−Ｆ）が特定され、遊離ＣｙｓおよびＮ結合グリコシル化部位はない。
【００１２】
【図４】図４は、考えられるヒトフレームワークドナーを示す。
【００１３】
【図５】図５は、マウスＲＰ２１５のテンプレート抗体構造モデルである（左手側にＶＬが、右手側にＶＨが示され、ＣＤＲループはファンデルワールス半径を有する球として示される）。
【００１４】
【図６】図６は、マウスＲＰ２１５のテンプレート抗体構造モデルである。ＣＤＲループに対して近くに隣接する残基は棒で示されている。これらの残基位置は、復帰変異のための候補である。
【００１５】
【図７】図７は、ヒト抗体配列に対して高い相同性を示すヒト化配列を示す。ｈＲＰ２１５＿ＶＨ１は、ＣＤＲ領域の外側の、その最も近いヒトＦＲドナー（生殖系列）に対して約９７％の配列同一性を有し、ｈＲＰ２１５は生殖系列ＦＲ領域に対して約９９％の同一性を有し（ヒト化ＶＨとヒトＶＨフレームワークドナーとのアライメント）、他方でｈＲＰ２１５＿ＶＨ２はＣＤＲの外側のドナーを有する。異なる残基は、ＶＨにおけるループ３を除いて、ほとんどがＣＤＲ内またはＣＤＲに隣接して位置している。
【００１６】
【図８】図８は、ＲＰ２１５のヒト化形態の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列と、マウスＲＰ２１５の重鎖および軽鎖のアミノ酸配列との比較を示す。
【００１７】
【図９−１】図９は、図８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
【図９−２】図９は、図８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明のヒト化抗体は、全抗体、ＣＡ２１５と免疫反応性のフラグメント（Ｆａｂ、  Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む）、ならびに組換え産生された単鎖抗体を含む、種々の形態のものであり得る。以下に記載される得られたヒト化形態は、マウスＲＰ２１５と等価の親和性および特異性のものであり、実質的に類似または同一のＣＤＲ領域を含有する。
【００１９】
重鎖および軽鎖両方の可変領域のＣＤＲ領域は、多数の当該分野で公知の方法によって決定され得る。この方法は、軽鎖においてＣＤＲ１を残基２４〜３４、ＣＤＲ２を残基５０〜５６、ＣＤＲ３を残基８９〜９７と、そして重鎖においてＣＤＲ１を残基３１〜３５、ＣＤＲ２を５０〜６５、ＣＤＲ３を残基９５〜１０２と規定するＫａｂａｔのナンバリングシステム（Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．，およびＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７０）１３２：２１１−２５０）を含む。ＣＤＲはまた、わずかに異なる結果を与えるＣｌｏｔｈｉａのシステム（Ｃｌｏｔｈｉａ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９）３４２：８７７−８８３；Ａｌ−Ｌａｚｉｋｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９７）２７３：９２７−９４８）に従っても決定され得る。種々のその後の著者が、いくつかのわずかな改変を示唆している。ＫａｂａｔシステムおよびＣｌｏｔｈｉａシステムの両方によって割り当てられるＣＤＲが、本発明の範囲内に含まれる。
【００２０】
サンドイッチおよび／または結合免疫アッセイを使用して、ヒト化形態とマウスＲＰ２１５との間の実質的等価性を実証した。同種抗原である癌細胞発現ＣＡ２１５に対するそれぞれの親和性および特異性は、それらの実質的等価性を確立するための２つの重要なパラメーターである。
【００２１】
（ヒト化のための一般的アプローチ）
ＲＰ２１５可変鎖の公開された配列に基づいて、ＣＤＲのうちの５つ（Ｈ３を除く）が、以下に示される標準構造クラスの１つに入ることが決定された。
【表１Ａ】
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【００２２】
ヒトフレームワークドナー選択は、生殖系列のサーチと、その後のＣＤＲを含むかまたは含まないＶＬおよびＶＨ配列を用いたヒトＩｇＧデータベースの再配列とを通じて行われた。ヒトＩｇＧ結果を得るために、通常、本発明者らは各ヒットを検討し、不適切なドナー（例えば、マウス配列またはヒト化配列など）を除外する。ＶＬおよびＶＨ配列については、各グループにおける最良のヒットがアライメントされた。最終的に、１つの生殖系列ＦＲドナーと、１つの再配列された（成熟）ＦＲドナーとが、配列類似性および他の因子に基づいて選択される。これらの因子は、ＣＤＲ長さ（ＣＤＲ−Ｈ３以外）、ＣＤＲ標準構造、重要位置におけるプロリン残基、またはヒト化抗体の適切なフォールディングに影響し得る因子を含んだ。
【００２３】
ＣＤＲを含むかまたは含まないテンプレート抗体ＶＬおよびＶＨ配列について、ＰＤＢデータベースをサーチすることによって、相同性モデリングを使用して、テンプレート抗体構造を得た。以下の条件が、考慮に入れられる：
（１）配列相同性、
（２）ＣＤＲ長さ、
（３）ＣＤＲ標準構造、および
（４）正確なジスルフィド結合を有するモデル。
【００２４】
抗体構造モデルの抗原結合領域は、次いで、ＣＤＲループデータベースおよび標準構造クラス、ならびにテンプレート構造の比較を通じて最適化され得る。
【００２５】
ＣＤＲ配置に影響し得るＣＤＲループの外側の残基を同定するために、構造モデリングが使用された。以下の結合または相互作用因子が考慮に入れられるべきである：ＣＤＲ残基の水素結合、立体障害、ならびに主鎖および側鎖に対する他の相互作用。
【００２６】
ＣＤＲループ構造に顕著に影響すると予測された残基に対して、復帰変異が実施された。（１）適切なＶＬおよびＶＨ相互作用のためのＦＲドナーにおけるヘテロダイマーインターフェース、（２）鎖内ドメインインターフェース、ならびに（３）既知の構造における抗原／エピトープに対する直接的相互作用における残基を含む、他のクリティカルな残基もまた、検証された。
【００２７】
したがって、上記の考慮事項に基づいて、異なる復帰変異の組み合わせが、そのようなプロセスの最小の必要性のバランスを取るために設計された。結果的に、ヒトに対する低い免疫原性を得ることができ、そして抗原結合親和性の最大保存を保存することができる。
【００２８】
以下の実施例は例示のために提示され、本発明を限定するために提示されるものではない。
【実施例】
【００２９】
（実施例１  ヒト化ＲＰ２１５モノクローナル抗体の特徴付け）
００２１−００２３（ＶＨ１−ＶＨ３およびＶＬ１−ＶＬ２）と命名された重鎖および軽鎖を有するヒト化ＲＰ２１５モノクローナル抗体、ならびに親マウス鎖００２４を生成し、発現し、そして親和性精製した。種々の重鎖／軽鎖の組み合わせを使用して、表１に示すように抗体ＦＹ１〜ＦＹ６を構築した。ＣｈＲＰ２１５は、ヒトＩｇＧとのマウスキメラである。
【表１】
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【００３０】
ＣＨＯ細胞由来のＦＹ１〜ＦＹ６の力価および量を、表２に示す。
【表２】
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【００３１】
マイクロウェル上にコーティングされた親和性精製ＣＡ２１５を使用して、結合免疫アッセイを実施し、これらのヒト化ＲＰ２１５のＣＡ２１５に対する結合親和性を決定し、そしてオリジナルのマウスＲＰ２１５のものと比較した。そのような比較結合アッセイの結果を、図１に提示する。示されるように、ＦＹ１〜ＦＹ６の全てが、ＲＰ２１５に匹敵する親和性を有する。
【００３２】
以前に、ＲＰ２１５は正常ヒトＩｇＧに対して交差反応性を有さないことが確立された。それは、ＲＰ２１５特異的炭水化物関連エピトープを含有する癌細胞によって発現されるＣＡ２１５とだけ反応する。したがって、ヒト化ＲＰ２１５モノクローナル抗体もまた、正常ヒトＩｇＧに対して交差反応性を示さないはずである。図２に示すように、ヒト化ＲＰ２１５  ＦＹ１、ＦＹ４およびＦＹ５（マウスキメラに類似）はヒトＩｇＧに対する結合を示さなかったので、この交差反応性欠如の結果が実証された。
【００３３】
図８は、このヒト化抗体の重鎖および軽鎖両方の完全アミノ酸配列を示す。これらの鎖についての完全ヌクレオチド配列は、図９に示される。
【００３４】
参考として、図３〜７はこれらの抗体の種々の追加の構造的特徴を示す。
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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