(57)【要約】本発明は、ヒト眼の網膜下腔中への移植のための生体適合性組成物に関する。組成物は、生分解性ポリエステルフィルム、好ましくはポリカプロラクトン（PCL）フィルム、および、ヒト網膜前駆細胞の層を含む。本発明の組成物は、網膜色素変性症および加齢性黄斑変性症を含む多数の眼疾患の処置のための足場として使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生分解性かつ生体適合性のポリエステル担体フィルム、ならびに
該ポリエステルフィルムの表面の少なくとも一部に付着した、単離されたヒト網膜前駆細胞および／またはその派生物の層
を含む、生体適合性組成物。
【請求項２】
ポリエステルが、ポリ乳酸（PLA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリエステルアミド（PEA）、ポリヒドロキシブチラート（PHB）、ならびにこれらの派生物および混合物からなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
ポリエステルがポリカプロラクトン（PCL）である、請求項1に記載の組成物。
【請求項４】
ヒト前駆細胞の派生物が光受容細胞を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
その派生物が多分化能網膜細胞を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
ポリエステルフィルム表面に適用され、かつ単離された細胞と該ポリエステルフィルム表面との間に位置するコーティング材料をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
コーティングが、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンI、コラーゲンIV、ビトロネクチン、マトリゲル、およびこれらの混合物からなる群より選択される材料である、請求項6に記載の組成物。
【請求項８】
単離された網膜前駆細胞が、出生後の網膜組織から取得される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
単離された網膜前駆細胞が、胎児の神経網膜から取得される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
ポリエステルフィルムが、約1.0μm〜約10μmの範囲の、好ましくは約5μmの厚さを有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
単離された細胞が単層として付着している、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
ポリエステルフィルムの表面がマイクロテクスチャ加工されている（microtextured）、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
テクスチャが、連続した微小溝の形態である、請求項12に記載の組成物。
【請求項１４】
テクスチャが、連続した微小柱（micro-post）の形態である、請求項12に記載の組成物。
【請求項１５】
単離されたヒト網膜前駆細胞および／またはその派生物の層を、生分解性かつ生体適合性のポリエステル担体フィルム上に、該単離された細胞を該担体フィルムに付着させる条件下で堆積させる段階、ならびに
該細胞を培養する段階
を含む、ヒト網膜前駆細胞を培養するための方法。
【請求項１６】
ポリエステルが、ポリ乳酸（PLA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリエステルアミド（PEA）、ポリヒドロキシブチラート（PHB）、ならびにこれらの派生物および混合物からなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
細胞を、光受容細胞を含むように培養する、請求項15または16に記載の方法。
【請求項１８】
細胞を培養して実質的に均一な多分化能網膜細胞の集団にする、請求項15または16に記載の方法。
【請求項１９】
ポリエステルフィルム表面を、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンI、コラーゲンIV、ビトロネクチン、マトリゲル、およびこれらの混合物からなる群より選択される材料でコーティングする段階をさらに含む、請求項15または16に記載の方法。
【請求項２０】
単離された網膜前駆細胞が、出生後の網膜組織から取得される、請求項15または16に記載の方法。
【請求項２１】
単離された網膜前駆細胞が、胎児の神経網膜から取得される、請求項15または16に記載の方法。
【請求項２２】
ポリエステルフィルムが、約1.0μm〜約10μmの範囲の、好ましくは約5μmの厚さを有する、請求項15または16に記載の方法。
【請求項２３】
単離された細胞を単層として堆積させる、請求項15または16に記載の方法。
【請求項２４】
ポリエステルフィルムの表面がマイクロテクスチャ加工されている、請求項15または16に記載の方法。
【請求項２５】
テクスチャが、連続した微小溝の形態である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
テクスチャが、連続した微小柱の形態である、請求項24に記載の方法。
【請求項２７】
細胞をポリエステルフィルムから分離する段階をさらに含む、請求項15または16に記載の方法。
【請求項２８】
請求項15または16に記載の方法により調製された、単離されたヒト網膜前駆細胞および／またはその派生物。
【請求項２９】
請求項27に記載の方法により調製された、単離された複数の単離されたヒト網膜前駆細胞および／またはその派生物。
【請求項３０】
複数の細胞が、実質的に均一または不均一である、請求項28に記載の単離された複数の単離された細胞。
【請求項３１】
候補薬物標的を単離されたヒト網膜前駆細胞と接触させる段階、および該薬物標的と該細胞との相互作用を評価する段階をさらに含む、請求項15に記載の方法。
【請求項３２】
前記相互作用に基づいて、有望な薬物候補を選択する段階をさらに含む、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
候補薬物標的を、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物上で培養されたヒト網膜前駆細胞と接触させる段階、
該薬物標的と該細胞との相互作用を評価する段階、および
該相互作用に基づいて、有望な薬物候補を選択する段階
を含む、薬物の発見のための方法。
【請求項３４】
前記相互作用が、前記網膜前駆細胞の増殖および／または分化の増強を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項３５】
請求項3に記載の組成物をヒト眼の網膜下腔中に移植して、それにより患者における光受容細胞を置換または修復する段階を含む、該患者における罹患または変性したヒト網膜の処置のための方法。
【請求項３６】
罹患状態または変性状態が、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、外傷性視神経症、および網膜剥離からなる群より選択される、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
罹患状態または変性状態が、加齢性黄斑変性症である、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
請求項1〜3のいずれか一項に記載の生分解性かつ生体適合性の足場、および使用説明書を含む、網膜前駆細胞を培養するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
外傷、年齢、または疾患のいずれかの結果としてのヒト網膜の変性は、永久的な視力喪失を結果として生じ得、世界中の何百万人もの人々がこれに冒されている可能性がある。変性状態は、例えば、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、および糖尿病性網膜症を含む。これらの状態は、網膜の、光を感知する光受容細胞の進行性の死を特徴とし、西欧諸国における不治の盲目の主要な原因である。ヒト網膜の内因性再生能力は極度に限定されたものであるため、光受容細胞の喪失を患う人々にとっての唯一の有望な処置選択肢は、細胞の置換である。
【０００２】
光受容細胞を置換するための1つの戦略は、健康なドナー由来の網膜組織を罹患宿主の網膜へ移植することである。そのような戦略の結果は、組織移植片の生着の観点で期待が持てるが、移植片と宿主組織の問題は困難なままである。その結果、実験室での研究は、移植および分化のための多分化能幹細胞（様々に前駆細胞、未熟細胞、先駆細胞、未分化細胞、または増殖細胞とも呼ばれる）に焦点を合わせてきている。
【０００３】
神経網膜由来の真の幹細胞、特にインビトロおよびインビボの両方で機能的な光受容細胞へ分化することができる細胞の単離は、実現できそうにないことが判明している。毛様体辺縁帯色素上皮層に由来する推定上の網膜幹細胞が、米国特許第6,117,675号（特許文献1）に記載されている。これらの細胞は、成長因子の非存在下で増殖することができると言われているが、これらの細胞が宿主の網膜に組み込まれてインビボで機能的な成熟細胞へ分化することができるという証拠は非常に限られている。さらに、これらの細胞は、生存可能な光受容体へ分化することができない。実際に、これらの「幹細胞」の存在は、議論の余地があるままである。
【０００４】
胎児網膜から単離された網膜前駆細胞は、インビトロで拡大することができ、かつ、網膜変性宿主への移植後に、遊走し、組み込まれ、かつ、新たな機能する光受容体を形成することができる。例えば、ヒト網膜を再生することができる神経網膜由来の光受容細胞に向けられた、同一出願人による米国特許第7,514,259号（特許文献2）を参照されたい。これらの細胞は、混入を排除するために毛様体辺縁帯および視神経を除去することによって神経網膜組織から派生するものであり、出生前および出生後の組織から取得することができる。
【０００５】
臨床においてこの技術を実施するための重大な障壁は、ヒト網膜前駆細胞が、細胞移植後のインビトロおよびインビボの両方における分化の間に、多数の光受容体を生成できないことである。動物モデルにおいてインビトロおよびエクスビボで実施された研究によると、移植された細胞のごく一部のみが宿主の網膜中に組み込まれて生存可能であり続ける。残りの細胞は、細胞死を起こすか、未分化のままであるか、または移植部位から遊走するかのいずれかである。哺乳動物光受容体を生成するための高産出量かつ高再現性を有するその他の利用可能な方法は現在存在しないので、これは、臨床における、ならびに薬物スクリーニングおよび試験応用における使用のために意図される光受容体にとっての重大な障壁となる。
【０００６】
ヒト網膜前駆細胞の光受容体への分化を促進するための他のアプローチは、IGF、Dkk-1、およびNogginなどの成長因子、N2およびB27などの培地補給物、血清（胎児ウシ血清）または血清代替物、ならびに未定義の細胞外マトリクス、例えばMatrigel（商標）およびStellgent（商標）を利用する。これらのアプローチは、ヒト網膜前駆細胞から限られた数の光受容体しか生成できず、そのような限られた数は、臨床応用において望ましい結果を達成するには不十分である。
【０００７】
生存可能な網膜幹細胞のヒト網膜中への移植もまた、問題となり得る。網膜前駆細胞の懸濁液を網膜中に直接注射することは、流出および細胞死のために大量の移植細胞の喪失を結果として生じ得る。例えば、いくつかの最近の研究により、ボーラス注射技術により注射した細胞の0.5％未満しか実際に網膜中に遊走できないことが示されている一方、他の研究により、網膜下腔中へ脳由来のニューロンを送達する試みは、注射過程のみの間におよそ90％の細胞死を結果として生じたことが示されている。
【０００８】
細胞移植のための足場の使用を含む網膜組織工学戦略もまた、試みられてきた。これらの足場は、細胞を堆積させるための薄い基質を形成するために、ポリメチルメタクリラート（PMMA）およびポリグリセロールセバカート（PGS）などの生体適合性ポリマーから微細機械加工される。生体適合性ポリマーの利点は、これらが、宿主により吸収され得る一時的な足場を提供して、新規の組織を結果として生じることである。フォトリソグラフィーおよび反応性イオンエッチングの2段階の過程を含む微細機械加工技術により、50μm未満の比較的薄い足場を生成することができる。これらの技術は、ボーラス注射を上回る改善を提示するが、足場材料としてのPGSおよびPMMAの使用が、臨床的受入れのために重要である、移植後の網膜前駆細胞の光受容体への分化の促進に関しては特に成功しているとは証明されていない。例えば、Tao et al., Lab on a Chip, Royal Society of Chemistry, pp 1-10 (2007)（非特許文献1）；およびRedenti et al., Biomaterials, 30. pp 3405-3414 (2009)（非特許文献2）を参照されたく、これらのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００９】
前述の、ならびに臨床的な評価および使用のためのヒト網膜前駆細胞の重要性を考慮して、細胞を網膜下腔中へ送達する能力を改善する必要性、ならびにそのような細胞のインビボでの可塑性を維持しながらインビトロで分化および複製する能力を改善する必要性が存在することが、容易に認識される。本発明のこれらおよび他の目的は、以下の説明から明らかとなる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第6,117,675号
【特許文献２】米国特許第7,514,259号
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Tao et al., Lab on a Chip, Royal Society of Chemistry, pp 1-10 (2007)
【非特許文献２】Redenti et al., Biomaterials, 30. pp 3405-3414 (2009)
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、生分解性で生体適合性のポリエステルフィルム基質を含み、該フィルムの表面上に堆積した網膜前駆細胞を有する組成物に向けられる。細胞は、基質上に堆積し、かつフィルム表面の少なくとも一部に付着して、それにより、増強された細胞分化、および光受容細胞（桿体および錘体の両方）の生成を提供する。前駆細胞は、培養され、かつ網膜特異的光受容体へ分化することができ、これを、ポリエステルフィルムを用いたまたは用いない眼の網膜下腔中への移植によって網膜障害を処置するために使用することができる。前駆細胞とフィルムとの組み合わせを、患者において移植のための組織足場として使用することができる。あるいは、網膜移植における使用のために前駆細胞をより成熟した細胞へあらかじめ分化させる手段として、ポリマー足場を使用することもできる。本発明の組成物および細胞はまた、細胞ベースのアッセイを用いて見込みのある治療標的を同定するために、薬物の発見およびインビトロでの試験応用において使用することもできる。
【００１３】
本発明の実施において使用され得る生分解性かつ生体適合性のポリエステルは、成長および分化のために網膜前駆細胞を支持することができる。好ましくは、生分解性ポリエステルは、ポリ乳酸（PLA）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリエステルアミド（PEA）、ポリヒドロキシブチラート（PHB）、ならびにこれらの派生物および混合物からなる群より選択される。ポリカプロラクトン（PCL）が、特に好ましいポリエステルである。本発明のポリエステルから調製された薄いフィルムは、典型的に、約1ミクロン（μm）〜約50ミクロン、好ましくは約1ミクロン〜約10ミクロン、最も好ましくは約5ミクロンの厚さを有し得る。
【００１４】
本明細書において記載される生分解性かつ生体適合性の足場は、網膜前駆細胞を成長および分化させるためのキット中に組み入れられ得る。キットは、例えば、本明細書において記載される候補薬物作用物質をスクリーニングするために、本明細書において記載される足場、ならびに足場および細胞の使用説明書を含む。
【００１５】
本発明の網膜前駆細胞は、ヒト出生後のヒト成体の網膜組織源から、および胎児網膜から取得することができる。本発明によると、ヒト網膜前駆細胞は、網膜ニューロスフェアなどの生存可能な神経網膜源組織から取得される。これらの網膜前駆細胞は、6つの神経細胞型へ分化する潜在能力を有するが、本発明において望ましい成熟細胞型は光受容細胞である。
【００１６】
網膜前駆細胞は、好ましくは単層の細胞として、ポリマーフィルム上に直接堆積させるか、またはプレーティングすることができる。フィルム表面は、平滑であるか、または細胞の付着の改善を提供するようにテクスチャ加工される（textured）ことができる。テクスチャ加工は、例えば、フィルム製造過程の間のポリマー表面トポグラフィーの一部としての、サブミクロンの溝またはサブミクロンの柱（post）の形成を含み得る。1つの態様において、中間コーティングを、網膜前駆細胞の堆積より前にポリマーフィルム上に提供することができる。そのようなコーティングは、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンI、コラーゲンIV、ビトロネクチン、およびマトリゲルを含み得る。
【００１７】
本発明による組成物は、罹患した眼への移植の際の網膜疾患の処置のために、有用である。従って、本発明は、宿主レシピエント中へのインビボ移植に適した、インビトロにおいて支持基質ポリエステルフィルム上で多分化能網膜前駆細胞の集団を取得する方法を提供する。1つの局面において、多分化能前駆細胞の集団は、実質的に均一であり、例えば、クローン的に拡大される。
【００１８】
方法を行うために、1つまたは複数の単離されたヒト網膜前駆細胞および／またはその派生物を、本明細書において記載される生分解性かつ生体適合性のポリエステル担体フィルム上に、該単離された細胞を該担体フィルムに付着させる条件下で堆積させる。1つの局面において、該1つまたは複数の細胞を、単層として堆積させる。別の局面において、該細胞を、細胞約5,000個／cm2〜細胞約15,000個／cm2の範囲内、好ましくは細胞約10,000個／cm2の密度で堆積させる。
【００１９】
別の局面において、細胞を培養し、基質上に単層として堆積した細胞の集団にする。該細胞を次に、細胞の分化および／またはクローン的拡大に有利な条件下で培養する。好ましくは、該細胞を、生理的条件または低酸素条件、すなわち6％酸素の下で培養する。分化した細胞は、実質的に均一または不均一であり得る。1つの局面において、細胞を、光受容細胞を含むように培養する。別の局面において、単離された細胞を培養し、実質的に均一な多分化能網膜細胞の集団にする。
【００２０】
さらなる局面において、方法は、細胞の堆積より前のポリエステルフィルム表面または表面を、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンI、コラーゲンIV、ビトロネクチン、マトリゲル、およびこれらの混合物からなる群より選択される材料でコーティングする段階を、さらに含む。
【００２１】
方法は、出生後の網膜組織から取得された、単離された網膜前駆細胞を用いて実施することができる。別の局面において、方法は、胎児の神経網膜から取得された網膜前駆細胞を用いて実施することができる。
【００２２】
1つの局面において、方法は、細胞をポリエステルフィルムから分離する段階をさらに含む。本方法により取得された、単離された複数または集団の細胞が、本開示によりさらに提供される。1つの局面において、本明細書中の複数の細胞は、実質的に均一または不均一である。
【００２３】
本明細書において記載される基質および方法は、薬物候補をスクリーニングするために有用である。本局面において、基質上に堆積したかまたは基質から単離された、単離されたヒト網膜前駆細胞と、候補薬物標的を接触させ、次に、該薬物標的と該細胞との相互作用を評価する。またさらなる局面において、方法は、該相互作用に基づいて、有望な薬物候補を選択する段階をさらに含む。
【００２４】
本発明の組成物および細胞は、治療用途を有し、宿主患者またはレシピエントにとって自己由来または同種異系であることができる。本発明の組成物および細胞はまた、薬物の発見および試験のために使用することができる。網膜前駆細胞は光受容細胞へ分化できるので、患者において光受容組織を置換または修復するために、ならびに、例えば、網膜色素変性症、加齢性黄斑変性症、および糖尿病性網膜症などの眼の変性疾患の処置のために、有用である。
【００２５】
本発明の前述の態様および局面は、単なる例証であり、特許請求される本発明の精神および範囲を制限することを意味するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本発明の前述のおよび他の利点および特徴は、添付の図および図面を参照して以下の詳細な説明を読むと、明白になる。
【図１】図1A、図1B、および図1Cはそれぞれ、平滑なフィルム、微小溝の表面を有するフィルム、およびその表面上に微小柱（micro-post）を有するフィルムを示す、本発明のポリエステルフィルムの表面の特徴の表示である。
【図２】図2A、図2B、および図2Cはそれぞれ、平滑フィルム表面、微小溝フィルム表面、および微小柱フィルム表面での、フィルム表面上にプレーティングした網膜前駆細胞を有するPCLフィルムの走査型電子顕微鏡画像である。
【図３】平滑表面、微小溝表面、および微小柱表面を有するフィルム上で成長した細胞について、7日間にわたる網膜前駆細胞の増殖を示すグラフである。
【図４】対照条件下の細胞（P5）について、ならびに平滑表面、微小溝表面、および微小柱表面を有するPCLフィルム上にプレーティングした細胞について、増殖マーカーであるKi67を示す棒グラフである。
【図５】図5A〜図5Dは、対照細胞（P5）、ならびに平滑表面、微小溝表面、および微小柱表面を有するPCLフィルム上にプレーティングした細胞についてそれぞれ、分化細胞マーカーであるCRX、リカバリン、ロドプシン、および青オプシンを示す一連の棒グラフである。
【図６】図6A〜図6Cは、対照細胞（PS）、ならびに平滑表面、微小溝表面、および微小柱表面を有するPCLフィルム上にプレーティングした細胞についてそれぞれ、幹細胞性細胞マーカーであるPAX6、cMyc、およびSOX2を示す一連の棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
態様の詳細な説明
別の方法で定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料が、本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法、装置、および材料が次に記載される。本明細書において引用されるすべての技術刊行物および特許刊行物は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明によるそのような開示に先立つ権利を与えられないことの承認として解釈されるべきではない。
【００２８】
本発明の実施は、別の方法で示されない限り、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組み換えDNAの従来の技術を使用し、それらは当技術分野の技能内である。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition；Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biologyのシリーズ；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)のシリーズ；MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press)；MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach；Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual；Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition；Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis；米国特許第4,683,915号；Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization；Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization；Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation；Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986))；Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning；Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory)；Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells；Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London)；およびHerzenberg et al., eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunologyを参照されたい。
【００２９】
範囲を含む、すべての数字表示、例えば、pH、温度、時間、濃度、および分子量は適切に、1.0または0.1の増分で（＋）または（−）に変動する近似値である。常に明確に述べられるわけではないが、すべての数字表示は、「約」という用語が前に付くように理解されるべきである。常に明確に述べられるわけではないが、本明細書において記載される試薬は単に例示的であること、およびその同等物が当技術分野において公知であることもまた、理解されるべきである。
【００３０】
当業者により理解されるように、任意のおよびすべての目的に関して、特に書面による説明を提供する点において、本明細書で開示されるすべての範囲はまた、任意のおよびすべての可能な部分範囲、ならびにその部分範囲の組み合わせも包含する。任意の列挙された範囲は、同じ範囲が少なくとも等しい半分、三分の一、四分の一、五分の一、十分の一などに分解されることを十分に記載しかつ可能にするように、容易に理解され得る。非限定的な例として、本明細書において議論される各範囲は、下部の三分の一、中央の三分の一、および上部の三分の一などに容易に分解することができる。当業者によりまた理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」などのような言語のすべては、列挙された数を含み、かつ、上記で議論された部分範囲へと次に分解することができる範囲を指す。
【００３１】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される際、単数形である「ある」、「1つの」、および「その」は、文脈が明らかに他の方法で示さない限り、複数の言及を含む。例えば、「薬学的に許容される担体」という用語は、その混合物を含む、複数の薬学的に許容される担体を含む。
【００３２】
本明細書において使用される際、「含む」という用語は、組成物および方法が、列挙された要素を含むが、他のものを排除しないことを意味するように、意図される。組成物および方法を定義するために使用される際の「から本質的になる」とは、意図される用途のための組み合わせにとって本質的に重要である任意の他の要素を排除することを意味するものとする。従って、本明細書において定義される要素から本質的になる組成物は、単離法および精製法由来の極微量の混入物、ならびに、リン酸緩衝食塩水、保存料などのような薬学的に許容される担体を排除しないものとする。「からなる」とは、他の構成成分の極微量より多い要素および本発明の組成物を投与するための実質的な方法段階を排除することを意味するものとする。これらの移行性の用語の各々により定義される態様は、本発明の範囲内である。
【００３３】
本発明の「宿主」または「患者」とは、哺乳動物などの動物、またはヒトである。診断または処置に供される非ヒト動物は処置を必要とするものであり、例えば、サル、ラット、マウスなどのネズミ科の動物、イヌなどのイヌ科の動物、ウサギなどのウサギ科の動物、家畜、スポーツの動物、およびペットなどである。
【００３４】
「単離された」という用語は、天然においてその中に細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片が通常付随している、細胞性のおよび別の構成要素から分離されていることを意味する。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、例えば染色体上で、その自然または天然の環境において通常関連している3'および5'の隣接したヌクレオチドから分離されている。当業者に明白であるように、天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片は、その天然に存在する対応物から識別するための「単離」を必要としない。単離された細胞とは、類似していない表現型または遺伝子型の組織または細胞から分離されている細胞である。
【００３５】
本明細書において使用される際、「幹細胞」とは、培養中に不定期間分裂することができ、かつ分化した細胞を生じることができる、細胞を定義する。現在のところ、幹細胞は便宜上、体性（成体）または胚性に分類される。体性幹細胞とは、分化した組織中に見出される未分化細胞であり、これは、（クローン的に）自分自身を複製することができ、かつ（一定の限界の下で）分化して、その起源である組織の特殊化した細胞型すべてをもたらすことができる。胚性幹細胞は、多種多様の特殊化した細胞型になる潜在能力を有する、胚由来の原始（未分化）細胞である。胚性幹細胞とは、数か月間から数年間、分化せずに増殖することを可能にするインビトロ条件下で培養されている細胞である。多能性胚性幹細胞は、Oct-4、アルカリホスファターゼ、CD30、TDGF-1、GCTM-2、Genesis、生殖細胞核因子、SSEA1、SSEA3、およびSSEA4を含むがこれらに限定されないマーカーの使用により、他の型の細胞から識別することができる。「幹細胞」という用語はまた、「脱分化した」幹細胞を含み、その例は、直接幹細胞に変換された、すなわちリプログラミングされた体性細胞である。クローンとは、起源となる細胞と遺伝学的に同一である細胞の系統であり、この場合は幹細胞である。
【００３６】
「増殖させる」という用語は、細胞の表現型もしくは細胞の集団を成長させることまたは変更することを意味する。「成長させること」または「拡大すること」という用語は、支持培地、栄養素、成長因子、支持細胞、または望ましい数の細胞または細胞型を取得するために必要な任意の化学的もしくは生物学的化合物の存在下での細胞の増殖を指す。1つの態様において、細胞を成長させる段階は、組織の再生を結果として生じる。また別の態様において、組織は心筋細胞から構成される。
【００３７】
「培養すること」という用語は、様々な種類の培地上または培地中での細胞または生物のインビトロ増殖を指す。培養において成長した細胞の子孫は、親細胞と完全に（すなわち、形態学的に、遺伝学的に、または表現型的に）同一でなくてもよいことが理解される。「拡大された」とは、細胞の任意の増殖または分裂を意味する。「クローン的な増殖」とは、単一細胞が2つの同一の娘細胞および／または同一細胞の集団へと連続的に分裂することによる、細胞の集団の成長を指す。
【００３８】
本明細書において使用される際、細胞の「系統」とは、細胞の遺伝、すなわち、その先代および後代を定義する。細胞の系統により、細胞は、代々の発生および分化の体系内に位置づけられる。
【００３９】
「分化」とは、特殊化していない細胞が、それにより心臓、肝臓、または筋肉細胞などの特殊化した細胞の特性を獲得する過程を説明するものである。「定方向分化」とは、分化を特定の細胞型または表現型に誘導するための幹細胞培養条件の操作を指す。「脱分化」とは、細胞の系統内でそれほど専門化していない位置に逆戻りする細胞を定義するものである。本明細書において使用される際、「分化するまたは分化した」という用語は、細胞の系統内でより専門化した（「分化した」）位置を呈する細胞を定義する。
【００４０】
「網膜前駆細胞」、または「神経網膜由来の網膜幹細胞」、または「網膜幹細胞」は、それらの用語が本明細書において使用される際、同義であり、神経網膜組織に由来する単離された生存可能な幹細胞を意味する。これらの細胞の起源が、それらを網膜色素上皮、毛様体、または虹彩の色素含有細胞などの非神経網膜細胞から識別する1つの要素である。本発明の細胞は、成長因子の非存在下で増殖できないことによりさらに識別される。本発明の細胞は、出生前および出生後の供給源のどちらにも由来することができ、かつ多分化能であり、これは、それらが自己複製できかつ光受容体へ網膜特異的に分化できることを意味する。そのような細胞は、米国特許第7,514,259号においてより詳細に記載され、この開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられる。本発明の網膜幹細胞または網膜前駆細胞は：（a）インビトロでの自己複製；（b）ニューロンおよびアストロサイトへ分化すること（しかしオリゴデンドロサイトへは分化しない）；（c）後眼部への移植後に神経網膜中へ組み込まれること；ならびに（d）網膜外植片上へ、またはレシピエントの成熟眼中へ移植された際の、光受容細胞への分化が可能である。重要なことに、（正常の健康な網膜と比較して）罹患した網膜中への移植によって、分化は阻害されるよりむしろ増強されるという証拠が存在する。
【００４１】
本発明の網膜前駆細胞と関連して本明細書において使用される際、「多分化能」という用語は、網膜前駆細胞が増殖でき、かつ成熟網膜細胞型、特に光受容細胞を形成できる能力を意味する。
【００４２】
「実質的に均一」とは、細胞の約50％より多く、または代わりに約60％より多く、または代わりに70％より多く、または代わりに75％より多く、または代わりに80％より多く、または代わりに85％より多く、または代わりに90％より多く、または代わりに95％より多くが、同じかまたは類似した表現型である、細胞の集団を説明するものである。表現型は、あらかじめ選択された細胞表面マーカー、または他のマーカー、例えば、ロドプシン、CRX、リカバリン、および、SOX2、ミオシン、もしくはアクチンの下方制御、または遺伝子もしくはタンパク質の発現により決定することができる。
【００４３】
本明細書において使用される際、「処置すること」、「処置」などの用語は、望ましい薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために、本明細書において使用される。効果は、障害またはその徴候もしくは症候を完全にまたは部分的に防ぐ観点で予防的であることができ、かつ／または、障害および／もしくは障害に起因し得る有害効果についての部分的または完全な治癒の観点で治療的であることができる。「処置」の例は、障害の素因を有し得るがまだそれを有するとは診断されていない対象において障害が起こるのを防ぐこと；障害を阻害すること、すなわちその発症を停止すること；および／または、障害、例えば黄斑変性症の症候を軽減もしくは改善することを含むが、これらに限定されない。当業者により理解されるように、「処置」は、病理と関連する症候の全身の改善、および／または胸痛などの症候の発症の遅延を含むことができる。「処置」の臨床的および前臨床的な証拠は、病理、個体、および処置によって変動すると考えられる。
【００４４】
「生体適合性」という用語は、レシピエントまたは治療の受益者において望ましくない局所または系の効果を誘発しないが、特定の状況において適切な細胞または組織応答を生じ、かつ臨床的に関連した性能または治療を最適化する、医学的治療に関してその望ましい機能を果たす生体材料の能力を意味する。移植された医療装置の「生体適合性」とは、有害な変化を引き起こすことなく組織と調和して体内に存在するための装置の能力である。
【００４５】
「生体適合性足場」とは、細胞においていかなる望ましくない効果も誘発することなく、かつ最終的な宿主においていかなる望ましくない局所的または全身的応答も誘導することなく、分子的または機械的なシグナル伝達系の促進を含む望ましい組織を生成するための適切な細胞活性を支持する基質として機能できる、組織工学目的のための足場またはマトリクスを指す。他の態様において、生体適合性足場は、宿主において望ましくない局所的または全身的効果を誘発することなく、宿主における望ましい取り込みの程度で、その意図される機能を果たすことができる、移植可能な装置の前駆体である。生体適合性足場は、米国特許第6,638,369号に記載されている。
【００４６】
「生分解性ポリマー」とは、分解するまでその機械的完全性を維持することができ、かつ制御された速度の分解をすることができる、非毒性ポリマーである。生分解性ポリマーは、移植基質として使用される際などに生物において免疫応答を誘発しないポリマーであり、生物におけるポリマー分解の生成物は、非毒性である。
【００４７】
「組成物」とは、活性作用物質、細胞または細胞の集団と、不活性の（例えば、検出可能な作用物質もしくは標識）または生体適合性足場などの活性を有する、別の化合物または組成物との組み合わせを意味することが意図される。
【００４８】
「薬学的組成物」とは、活性作用物質と、不活性であるか活性である、例えば生体適合性足場などの、担体との組み合わせを含むことが意図され、該担体は、該組成物をインビトロ、インビボ、またはエクスビボでの診断用途または治療用途に適したようにさせる。
【００４９】
本明細書において使用される際、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝食塩溶液、水、および、乳剤、例えば、油／水型乳剤または水／油型乳剤、ならびに種々のタイプの湿潤剤などの標準的な薬学的担体のいずれかを包含する。組成物はまた、安定剤および保存料も含むことができる。担体、安定剤、およびアジュバントの例については、Martin, Remington's Pharm. Sci., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1975))を参照されたい。
【００５０】
「有効量」とは、有益なまたは望ましい結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、1つまたは複数の投与、適用、または投薬量において投与することができる。
【００５１】
生分解性ポリマーフィルム、網膜前駆細胞、生体適合性足場
本発明は、網膜前駆細胞のための生分解性ポリエステルフィルム支持体を含む、生体適合性組成物に関する。生分解性ポリエステルは、網膜前駆細胞の増殖および分化を支持するための基質または足場としての使用に適した任意の生分解性ポリエステルであることができる。ポリエステルは、薄いフィルム、好ましくはマイクロテクスチャ加工されたフィルムを形成することができ、組織または細胞移植のために使用される場合は生分解性であるべきである。
【００５２】
本発明における使用に適した生分解性ポリエステルは、ポリ乳酸（PLA）、ポリラクチド、ポリヒドロキシアルカノアート、ホモポリマーおよびコポリマーの両方、例えば、ポリヒドロキシブチラート（PHB）、ポリヒドロキシブチラートコヒドロキシバレラート（PHBV）、ポリヒドロキシブチラートコヒドロキシヘキサノート（PHBHx）、ポリヒドロキシブチラートコヒドロキシオクトノアート（PHBO）、およびポリヒドロキシブチラートコヒドロキシオクタデカノアート（PHBOd）、ポリカプロラクトン（PCL）、ポリエステルアミド（PEA）、脂肪族コポリエステル、例えば、ポリブチレンサクシナート（PBS）およびポリブチレンサクシナート／アジパート（PBSA）、芳香族コポリエステルを含む。高分子量および低分子量のポリエステルの両方、置換されているおよび置換されていないポリエステル、ブロック、分岐、またはランダム、ならびにポリエステル混合物およびブレンドを使用することができる。好ましくは、生分解性ポリエステルは、ポリカプロラクトン（PCL）である。
【００５３】
生分解性ポリエステルは、公知の技術を用いて薄いフィルムに形成することができる。フィルムの厚さは、有利には、約1ミクロン（μm）〜約50ミクロン（μm）、好ましくは約5μmの厚さである。フィルムの表面は平滑であってもよく（図1A参照）、または、フィルム表面は部分的にまたは完全にマイクロテクスチャ加工されることができる。適当な表面テクスチャは、例えば、図IBおよびIeに示されるように、微小溝または微小柱を含む。また、平滑フィルム（図1A）およびマイクロテクスチャ加工フィルム（図2Bに示される微小溝および図3Bに示される微小柱）の両方の上にプレーティングした生分解性ポリエステルフィルムを示す、図2A、図2B、および図2Cも参照されたい。マイクロテクスチャは、当技術分野において周知であるポリエステル成形技術およびフィルム形成技術を用いて形成することができる。フィルムを切って、移植に適した形状を形成するための形にすることができる。
【００５４】
フィルムに、網膜前駆細胞を播種するかまたはプレーティングする。網膜前駆細胞の主要な供給源は、1つの局面において、出生前の網膜組織であることができる。単離されたヒト網膜前駆細胞は、宿主組織、例えば、生きている宿主または死体、出生前供給源、胎児組織、または成体組織からのヒト神経網膜の解剖に由来することができ、網膜ニューロスフェアから単離することができる。細胞はまた、例えば、眼領域発生の転写因子であるOtx2、Sox2、Pax6；増殖マーカーであるサイクリンD1、Ki67、hTERT；「幹細胞性」転写因子であるcMyc、Klf4、Oct4；未分化細胞に特徴的な表面抗原であるSSEA4を含むマーカーにより、同定することができる。好ましくは、網膜前駆細胞は、HIPIおよびHIF2の両方を発現する。
【００５５】
解剖中に、高度に粘着力を有する硝子体ゲル成分を管理する必要があり得る。これは、硝子体切除術、眼球反転、機械的摘除、および吸収性創面切除術、ならびに酵素消化を含む様々な技術を単独または組み合わせで用いて、達成することができる。この目的に適した酵素は、ヒアルロニダーゼおよびコラゲナーゼを含むが、これらに限定されない。網膜幹細胞単離のために使用した標本から非神経網膜組織を除去することもまた、有利であり得る。非神経組織は、視神経頭および毛様体扁平部の上皮を含み、これは典型的に末梢の縁（鋸状縁）に沿って付着している。組織は、好ましくは、無菌技術を用いて取り扱う。
【００５６】
単離した神経網膜組織を細胞へと解離させるために、単離した神経網膜組織を機械的に細かくし、約100ミクロンの孔サイズのナイロンメッシュスクリーンを通過させることができる。組織の機械的解離のために滅菌の小孔フィルタースクリーンを使用することにより、成長因子受容体などの細胞表面分子を分解し得る酵素の使用を最小限にすることができる。
【００５７】
解剖した組織由来の細胞のアリコートを、次に、好ましくはタンパク質層でコーティングされた、プラスチック組織培養フラスコなどの培養容器中に配置することができる。有利には、層は、ラミニンまたはフィブロネクチンを重ね合わせたポリオルニチンであってもよい。
【００５８】
細胞のアリコートを、次に、好ましい場合、第1の細胞培養培地中で初期細胞密度を提供するように約24時間、約35℃〜39℃で、低酸素条件（培養培地中で1％〜6％、好ましくは2％〜4％、最も好ましくは3％）でインキュベーションすることができる。第1の細胞培養培地は、約0.5〜3.0 mg／リットル、好ましくは約1 mg／リットルのD-グルコース含量を含有する生理的平衡塩溶液、Nz補給物、ならびに5〜15容量％の神経／網膜用調整培地、および有効量の少なくとも1つの抗生物質、例えばゲンタマイシンを含むことができる。
【００５９】
第1の培養培地中での約24時間のインキュベーション後、その培地を培養容器から除去することができる。第2の培養培地は、約0.5〜3.0 mg／リットル、好ましくは1 mg／リットルのグルコース含量を含有する生理的平衡塩溶液（例えば、Ultraculture培地）、成長因子当たり約30〜50 ng/mlの濃度の少なくとも1つの成長因子、有効量のLグルタミン（約0.5〜3.0 mM、好ましくは約1.0 mM）、有効量の神経前駆細胞用調整培地、ならびに有効量の少なくとも1つの抗生物質、例えばペニシリンおよび／またはストレプトマイシンを、以前に記載したような低酸素濃度で含むことができる。有利には、ペニシリンおよび／またはストレプトマイシンは、以下のように添加してもよい：10,000単位／mlペニシリン、10,000マイクログラム／mlストレプトマイシンを1：50〜150、好ましくは1:100で、培養培地中でそれぞれ100単位／ml、100マイクログラム／mlの最終濃度になるように添加する。本明細書を読む当業者は、培養培地成分の設計および操作条件に対して軽微な改変がなされ得ることを認識するであろう。その完全な開示が参照により本明細書に組み入れられる、2011年6月14日に出願された同時係属中の米国特許出願第13/160,002号もまた参照されたい。
【００６０】
網膜前駆細胞を、生体適合性足場を形成するように生分解性ポリマーフィルム上に直接プレーティングすることができる。あるいは、ポリマーフィルムを、ポリ-D-リジン、ポリ-L-リジン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンI、コラーゲンIV、ビトロネクチン、およびマトリゲルなどの適当なコーティング材料でコーティングすることができる。細胞を任意の望ましい密度にプレーティングすることができるが、細胞の単一の層（単層）が好ましい。細胞を、細胞を採集することができるインビトロ、またはヒト眼の網膜下腔中への移植後のインビボのいずれかで、プレーティング後にさらに増殖させることができる。本発明の網膜前駆細胞は多分化能であり、特殊化した網膜細胞、特に光受容細胞へ分化することができる。
【００６１】
治療用途
本発明はまた、上記の生体適合性足場を、罹患または変性したヒト網膜の網膜下腔に移植する段階を含む、この処置を必要とする患者において光受容細胞を置換または修復するための方法も提供する。1つの局面において、生体適合性足場は、処置を必要とする患者において網膜色素変性症の症候を処置または緩和することができる。別の局面において、生体適合性足場は、この処置を必要とする患者において加齢性黄斑変性症の症候を処置または緩和することができる。これらの処置のすべてについて、網膜前駆細胞は、患者にとって自己由来または同種異系であることができる。さらなる局面において、本発明の細胞および足場は、他の処置との組み合わせで投与することができる。
【００６２】
スクリーニングアッセイ
本発明は、網膜前駆細胞の分化を調節する種々の作用物質をスクリーニングするための方法を提供する。これはまた、ポリマー足場上で成長した網膜前駆細胞から培養中に生成される成熟光受容体を支持および／またはレスキューする治療用作用物質を発見するためにも使用することができる。本発明の目的に関して、「作用物質」とは、生物学的または化学的化合物、例えば、単純もしくは複雑な有機もしくは無機の分子、ペプチド、タンパク質（例えば抗体）、ポリヌクレオチド（例えばアンチセンス）、またはリボザイムを含むが、これらに限定されないことが意図される。数多くのいろいろな化合物、例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどのポリマー、ならびに種々のコア構造に基づく合成有機化合物を合成することができ、これらもまた、「作用物質」という用語に含まれる。加えて、植物または動物の抽出物などのような種々の天然供給源が、スクリーニングのための化合物を提供することができる。常に明確に述べられるわけではないが、作用物質は、単独で、または本発明のスクリーニングにより同定された作用物質と同じかまたは異なる生物学的活性を有する別の作用物質との組み合わせで使用されることが、理解されるべきである。
【００６３】
インビトロでスクリーニング法を実施するために、単離された細胞の集団を、上記のように取得することができる。作用物質が、上記の低分子などの、DNAまたはRNA以外の組成物である場合、作用物質を細胞に直接添加するか、または添加用の培養培地に添加することができる。当業者に明白であるように、経験的に決定することができる「有効」量を添加しなければならない。作用物質がポリヌクレオチドである場合、遺伝子銃またはエレクトロポレーションの使用により直接添加することができる。あるいは、遺伝子送達媒体または上記のような他の方法を用いて細胞に挿入することができる。薬物または他の作用物質の意図される活性を確認するために、陽性および陰性の対照をアッセイすることができる。
【００６４】
本発明は、それにより本発明の範囲を限定するように意図されない以下の実施例において、さらに説明されかつ例証され得る。
【実施例】
【００６５】
材料および方法
網膜形態
本発明の主題である神経網膜の形態は、その完全な開示が参照により本明細書に組み入れられる、2011年6月14日に出願された同一出願人による同時係属中の米国特許出願第13/160,002号においてさらに記載されている。
【００６６】
細胞単離
hRPC（ヒト網膜前駆細胞）を、小さな改変を伴い、以下の参照文献において記載されているように、胎児網膜から単離した：Klassen, H.J. et al., Multipotent Retinal Progenitors Express Developmental Markers, Differentiate into Retinal Neurons, and Preserve Light-Mediated Behavior, Invest. Opthalmol. Vis. Sci., 2004,45(11), 4167-4173ページ；Klassen, H. et al., Isolation of Retinal Progenitor Cells from Post-Mortem Human Tissue and Comparison with Autologous Brain Progenitors, J. Neuroscience Research, 2004, 77(3), 334-343ページ；Klassen, H. et al., Progenitor Cells from the Porcine Neural Retina Express Photoreceptor Markers after Transplantation to the Subretinal Space of Allorecipients; Stem Cells, 2007, 25(5); 1222-1230ページ。簡潔に言うと、ヒト胎児の眼（14〜18週の在胎齢）由来の全神経網膜を解剖し、4サイクル（全体で1.5時間の16発酵）にわたり0.1％コラゲナーゼI（Sigma）で解離させ、改変Ultraculture培地（10 ng/ml rhEGF、20 ng/ml rhbFGF、ペニシリン／ストレプトマイシン、ナイスタチン、およびL-グルタミン）中にプレーティングするかまたは凍結した。単一細胞および凝集塊の量および生存率を、トリパンブルーおよび血球計算板を用いて概算した。
【００６７】
細胞培養
細胞を、細胞およそ10,000個／cm2の密度でプレーティングし、生理的酸素（3％酸素）条件下、37℃、100％湿度、5％CO2で、改変Ultraculture培地（10 ng/ml rhEGF、20 ng/ml rhbFGF、ペニシリン／ストレプトマイシン、ナイスタチン、およびL-グルタミン）中で培養した。細胞を、8ウェルスライド対照上、ならびにポリスチレン（非生分解性）およびポリカプロラクトン（生分解性）の薄いフィルム（およそ5μmの厚さ）上にプレーティングした。スライドおよびポリマーフィルムは、細胞をプレーティングする前にフィブロネクチンでコーティングした。トリプシン-EDTA溶液を用いて、細胞を75％〜85％コンフルエントで（通常2〜5日毎に）継代した。各継代時に、細胞を計数し、上述の密度でプレーティングした。低酸素条件は、6％酸素の限界を超えないように、Thermo 150iインキュベーター中で構築した。
【００６８】
細胞増殖および成長曲線
細胞増殖を、血球計算板を介した細胞計数により日常的な継代中に評価した（各継代／供給源について少なくとも2つのフラスコにおいて）。CyQuant NFアッセイ（Invitrogen）を行って、各継代時の増殖速度を概算し：96ウェルプレート（BD Optilux）のウェル中に細胞1000、2000、4000、および8000個をプレーティングすることにより、較正曲線を作成した。実験ウェル（細胞4000個／ウェル）中の細胞の量を、48および72時間後にCyQuant染色により評価した（較正曲線についてはn＝4および実験ウェルについてはn＝6）。
【００６９】
アポトーシス
TUNELアッセイ（Roche）のために、hRPC（p1〜p9）を、維持条件と同じ方式で、フィブロネクチンでコーティングされた8ウェルスライド中にプレーティングし（各ウェルに4,000の生細胞、補給物を伴うhRPC培地）；プレーティングの48時間後に細胞を固定し、透過処理（0.01％ Triton-X、0.01％クエン酸ナトリウム）し、二重染色DNA切断について染色した。スライドをマウントし、各条件について9つの視野において細胞計数を行った。生存促進性経路タンパク質であるp44/42およびp38についてのウェスタンブロット解析（Cell Signaling）を行った（タンパク質を培養4日目に収集した）。
【００７０】
免疫細胞化学
細胞を、免疫細胞化学解析を介して、以下の幹細胞性および増殖マーカーの発現について評価した：眼領域発生の転写因子であるOtx2、Sox2、Pax6；増殖マーカーであるサイクリンD1、Ki67、hTERT；「幹細胞性」転写因子であるcMyc、Klf4、Oct4；未分化細胞に特徴的な表面抗原であるSSEA4。この目的で、細胞4,000個を、16ウェルのフィブロネクチンでコーティングされたチャンバースライドグラス（Nunc）の各ウェル中にプレーティングした。適切な条件下での24時間のインキュベーション後、細胞をPBS中で洗浄し、固定（冷たい、新しく調製した4％ PFA）し、透過処理（5％ BSA中の0.02％ Triton X-100）し、ブロッキングして、一次抗体で一晩4℃で、および二次抗体（1:50、ヤギCy3結合抗ウサギまたは抗マウス、Jackson Immunoresearch）で1時間室温で、染色した。ウェスタンブロット。4日間上記の条件下で培養したhRPCを、タンパク質解析のために継代1、3、5、7、10、および16で採集し、RIPA緩衝液中で溶解し、ウェスタンブロットによりタンパク質発現について解析した。タンパク質を8％ SDS-PAGEゲル上で分離し、PVDF膜（Bio-Rad）に転写して、それをTBS-T中の5％脱脂乳（Bio-Rad）でブロッキングし、TBS-T中の5％ BSAに希釈した抗体（EGFR、HIF1α、HIF2α、hTERT、ネスチン、Sox2、Oct4、Klf4、cMyc、p44/42、およびp38）で染色した。結果として生じたバンドを、ECL Plus（Perkin Elmer）およびCL-Xposureフィルム（Thermo Sientific）で画像化した。抗bアクチンHRP連結抗体（Abeam）を、ローディング対照として用いた。バンドの四角形を、ImageJを用いて測定した。
【００７１】
テロメラーゼ活性アッセイ
テロメラーゼ活性を、TRAPeze法により製造業者（Millipore）の説明書に従って評価した。簡潔に言うと、細胞を採集し、CHAPS緩衝液中で30分間、氷上で溶解して、テロメアを30分間30℃で増幅した。生成物を、Platinum Taq（Invitrogen）を用いて増幅し、PAGEゲル電気泳動（非還元条件）により分離して、SYBR Gold（1:10000, Invitrogen）で20分間、室温で染色した。
【００７２】
インビトロでの分化能力
インビトロで分化するhRPCの能力を評価するために、3％酸素中で拡大したhRPCを、継代1、5、10、および16から、フィブロネクチンおよびラミニンでコーティングされた16ウェルスライド上にプレーティングした。細胞を、分化培地（DMEM1F12、1×NEAA、Lglu、5％ HI FBS、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびナイスタチン）において3％酸素中で培養した。2、5、および9日目に、細胞を固定して、青オプシン（短波長錐体）、赤／緑オプシン（長波長錐体）、ロドプシン（桿体）、リカバリン（光受容体前駆体）、カルビンジン（水平細胞）、GFAP（ミュラー細胞および神経節細胞）、グルタミン合成酵素（神経節細胞）、MAP2およびサイクリンD3（神経節細胞）、ならびにPKCa（双極細胞）について染色した。同じ染色を、同じ継代であるが維持条件において24時間後のhPRCについて行った。分化する能力を、分化条件対維持条件において成熟網膜マーカーを発現する細胞の数を比較することにより概算した。
【００７３】
結果
生分解性足場を、フィブロネクチンでコーティングされたポリカプロラクトン（PCL）フィルムで構築した。比較および評価のために、フィルムは、平滑から、微小溝および微小柱の形態のマイクロテクスチャまでの、種々の表面トポグラフィーを有した。本明細書において記載されるヒト網膜前駆細胞を、フィルム上にプレーティングした。細胞を、14週〜18週の在胎齢のヒト網膜から単離し、インビトロで低圧酸素（3％）中で拡大した。継代5で、細胞を、対照として8ウェルスライド中に、および記載される3つの異なる表面特徴を有するPCL足場上に播種した。細胞をまた、対照としてポリスチレンフィルム（非生分解性）上にプレーティングして成長させた。
【００７４】
細胞および足場の最初の調製の1週間後に、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および免疫細胞化学（ICC）アッセイを、生分解性ポリマー、ポリスチレンポリマー上で培養した細胞、および対照細胞について行った。網膜前駆細胞の光受容細胞への分化を、評価した。あらかじめ分化した網膜前駆細胞の外植実験および網膜下移植を行って、ロドプシンノックアウトマウスの宿主網膜中への細胞の遊走および組み込みを解析した。
【００７５】
得られた結果を要約すると、ポリカプロラクトンフィルム上で成長した細胞は、対照細胞およびポリスチレンフィルム上で成長した細胞の両方と比較した際に、付着、組織化、および増殖の増強を示した。マイクロテクスチャ加工されたPCLフィルム上で成長した細胞は、平滑なPCLフィルム上で成長した細胞と比較した際に、さらに増強された。PCLフィルムに付着したヒト網膜前駆細胞は、mRNAおよびタンパク質レベルでの変化により証明されるように、成熟光受容体表現型に向かって分化することが観察された。リアルタイム定量PCRおよびICCを用いて、ロドプシン、CRX、およびリカバリンの発現の統計学的に有意な上方制御、ならびにSOX2（未分化前駆細胞のマーカー）およびPAX6の統計学的に有意な下方制御が、また対照細胞およびポリスチレン上で成長した細胞と比較して、観察された。
【００７６】
フローサイトメトリーおよびICCを用いて、光受容体マーカーを発現する細胞の比における有意な増大が、bFGFおよびEGFを補給したUltraculture培地における7日間の培養後に観察された（フィブロネクチンでコーティングされたPCL対対照）。これらのマーカーには、ロドプシン（45％対5％）、赤／緑オプシン（20％対3％）、青オプシン（20％対5％）が含まれた。分化した細胞の比が大きいことの結果として、細胞のより良好な組み込みが、フィルムの厚さとは独立して、異なるマイクロトポグラフィーを有するPCLフィルム上で観察された。移植されたあらかじめ分化したヒト網膜前駆細胞は、宿主網膜の外核層中に遊走して、光受容体成熟マーカーの発現を呈することが観察された。
【００７７】
細胞形態
細胞形態を、フィブロネクチンでコーティングされたポリカプロラクトンフィルム上にプレーティングした細胞について評価した。図2A、図2B、および図2Cに示されるように、形態は、平滑な表面およびマイクロテクスチャ加工された表面によって異なることが観察された。フィルム表面のマイクロトポグラフィーの違いは、網膜前駆細胞の分化を変化させなかった。
【００７８】
細胞増殖および成長曲線
hRPC（ヒト網膜前駆細胞）増殖の速度を、平滑、微小溝、および微小柱の表面トポグラフィーを有するポリカプロラクトン（PCL）フィルムについて測定した。これらの結果を、時間（日数）に対する細胞密度のグラフである図3に示す。最高の細胞密度は、微小溝を有するポリカプロラクトンフィルム上に堆積した細胞について観察された。
【００７９】
増殖マーカー
PCL上にプレーティングした細胞について観察されたhPRC増殖の低下は、マーカーKi67の発現の低下と相関する。対照（P5）および示されるような様々な表面マイクロテクスチャを有するPCLフィルム上にプレーティングした細胞についての、増殖マーカーKi67の棒グラフを示す図4を参照されたい。
【００８０】
分化
hRPC細胞の主な特徴は、機能性、すなわち、特殊化した網膜細胞へ分化する能力である。分化マーカーを、種々のPCL基質上にプレーティングした細胞および対照細胞についてqPCRを用いて解析した。図5A〜図5Dは、種々の分化マーカーについての結果を示す：図5A（CRX）；図5B（リカバリン）；図5C（ロドプシン）；および図5D（青オプシン）。幹細胞性マーカー。以下の幹細胞性マーカーを、種々のPCL基質上にプレーティングした細胞および対照細胞についてqPCRを用いて評価した。図6A〜図6Cは、幹細胞性マーカーについての結果を示す：図6A（Pax6）；図6B（cMyc）；図6C（Sox2）。
【００８１】
網膜前駆細胞のための足場としての他のポリマーの使用は、有効であると証明されていない。そのようなポリマーには、ポリスチレン、ポリメチルメタクリラート（PMMA）、およびポリグリセロールセバカート（PGS）が含まれる。これらのポリマーのいくつかは生分解性であり（PGS）、他のものはトポグラフィー特性を含み得る（PMMA）が、これらのポリマーのいずれも、網膜前駆細胞の生存可能な光受容体への分化のために満足なプラットフォームを提供することができるとは見出されなかった。
【００８２】
本発明のヒト網膜前駆細胞および生分解性足場を、網膜および眼の発生、ならびに（有益か不利益かに関わらず）そのような発生に影響を及ぼす要素を研究するために使用してもよい。これらのhRPCはまた、眼の機能不全を患う網膜中への移植により、臨床試験のために使用することもできる。それらを、ジストロフィのおよび変性した眼の組織、特に機能不全の網膜を再生するためまたはレスキューするために有利に使用してもよい。網膜機能不全は、疾患、機械的もしくは化学的損傷、または、レシピエントの網膜に影響を及ぼす変性過程もしくは病理学的過程によるものであるかに関わらず、正常な網膜機能の任意の欠如または喪失を包含する。hRPCは、当技術分野において公知である技術に従って、網膜部位、網膜下腔、硝子体腔、または視神経に注入してもよく、またはさもなければ配置してもよい。
【００８３】
有利には、本発明のhRPCを、光受容細胞機能の欠如または減少を補償するために使用してもよい。本発明の網膜幹細胞集団および方法により処置することができる網膜機能不全の例は、以下を含むが、これらに限定されない：光受容体の変性（例えば、網膜色素変性症、錐体ジストロフィ、錐体桿体ジストロフィおよび／または桿体錐体ジストロフィ、ならびに黄斑変性症において起こるようなもの）；網膜剥離および網膜外傷；レーザーおよび太陽光により引き起こされる光損傷；黄斑円孔；黄斑浮腫；夜盲および色盲；糖尿病または血管閉塞により引き起こされるような虚血性網膜症；未熟／早産による網膜症；例えば、CMV網膜炎およびトキソプラズマ症などの感染状態；ブドウ膜炎などの炎症状態；網膜芽腫および眼メラノーマなどの腫瘍；ならびに、緑内障、外傷性視神経症、剥離、ならびに、放射線視神経症および網膜症を含む眼の神経症において影響を受けている内部網膜ニューロンの置換のため。
【００８４】
本明細書において記載される処置は、単独型の治療として、または他の治療的処置との組み合わせで使用することができる。そのような処置は、神経網膜由来の幹細胞の光受容細胞または他の網膜細胞型（例えば、双極細胞、神経節細胞、水平細胞、無軸索細胞、ミュラー細胞）への分化を刺激する物質の投与を含むことができる。
【００８５】
前述から、本発明の特定の態様が例証の目的で本明細書において記載されているが、添付の特許請求の範囲において示される本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の改変がなされてもよいことが、認識される。本明細書において参照とされるすべての刊行物、特許、および特許出願は、全体として参照により組み入れられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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