(57)【要約】本発明は、ＨＩＦ−１αのＣ末端トランス活性化ドメインのへリックスαＢを模倣するオリゴオキソピペラジンに関する。開示されるのはまた、これらのオリゴオキソピペラジンを含有する医薬組成物及び（たとえば、遺伝子の転写を減らすために、ＨＩＦ−１αの、ＣＲＥＢ結合タンパク質及び／又はｐ３００との相互作用が媒介する障害を治療するか又は予防するために、組織における血管形成を減らすために、アポトーシスを誘導するために、及び細胞の生存及び／又は増殖を減らすために）これらのオリゴオキソピペラジンを使用する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉのオリゴオキソピペラジン：
2015508779.tif 000011
（式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のそれぞれは独立して、アミノ酸側鎖、Ｈ、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲ、ハロゲン、アルキル、又はアリールであり；その際、各Ｒは独立して、Ｈ、アルキル、又はアリールであり；
各Ｒ６は独立して、Ｈ、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲ、ハロゲン、アルキル、又はアリールであり；その際、各Ｒは独立して、Ｈ、アルキル、又はアリールであり；
ＡはＸ１又はＣであり、その際：
Ｘ１は、Ｈ、ＣＯＲ'、ＣＯ２Ｒ'、ＣＯＮＲ'、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、アミンの保護のための保護基、標的指向部分、又はタグであり；その際、Ｒ'は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；
Ｃは、式
2015508779.tif 000012
の部分であり、式中：
各Ｘ'は独立して、Ｈ、ＣＯＲ'、ＣＯ２Ｒ'、ＣＯＮＲ'、Ｎ（Ｒ''）２、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；その際：
Ｒ'は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；及び
各Ｒ''は独立して、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；
Ｒ０は、アミノ酸側鎖、Ｈ、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲ、ハロゲン、アルキル、又はアリールであり；その際、各Ｒは独立して、Ｈ、アルキル、又はアリールであり；及び
Ｒ６は、Ｈ、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲ、ハロゲン、アルキル、又はアリールであり；その際、各Ｒは独立して、Ｈ、アルキル、又はアリールであり；及び
Ｂは、ＯＲ'、ＣＯＲ'、Ｎ（Ｒ'''）２、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、カルボン酸の保護のための保護基、標的指向部分、又はタグであり；その際：
Ｒ'は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；及び
各Ｒ'''は独立して、Ｈ、ＣＯ２Ｒ'、ＣＯＮＲ'、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；
式中、Ｒ１及びＲ２は疎水性であり、Ｒ４は水素結合受容体又は水素結合供与体であり、又はＡは、式
2015508779.tif 000013
の部分であり、Ｒ０及びＲ３は疎水性であり、Ｒ４は水素結合受容体又は水素結合供与体であり；但し、以下：Ｒ１がロイシン側鎖であり、Ｒ２がロイシン側鎖であり、及びＲ４がグルタミン側鎖である、のうち少なくとも１つが満たされないという条件がある）。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２が疎水性であり、Ｒ４が水素結合受容体又は水素結合供与体である、請求項１に記載のオリゴオキソピペラジン。
【請求項３】
ＢＢ２−１２５又はＢＢ２−１６２である、請求項２に記載のオリゴオキソピペラジン。
【請求項４】
Ａが、式
2015508779.tif 000014
の部分であり、Ｒ０及びＲ３が疎水性であり、Ｒ４が水素結合受容体又は水素結合供与体である、請求項１に記載のオリゴオキソピペラジン。
【請求項５】
ＢＢ２−１６４である、請求項２に記載のオリゴオキソピペラジン。
【請求項６】
請求項１に記載のオリゴオキソピペラジン及び薬学上許容可能な溶媒を含む医薬製剤。
【請求項７】
Ｒ１及びＲ２が疎水性であり、Ｒ４が水素結合受容体又は水素結合供与体である、請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項８】
オリゴオキソピペラジンがＢＢ２−１２５又はＢＢ２−１６２である、請求項７に記載の医薬製剤。
【請求項９】
Ａが、式
2015508779.tif 000015
の部分であり、Ｒ０及びＲ３が疎水性であり、Ｒ４が水素結合受容体又は水素結合供与体である、請求項６に記載の医薬製剤。
【請求項１０】
オリゴオキソピペラジンがＢＢ２−１６４である、請求項９に記載の医薬製剤。
【請求項１１】
細胞における遺伝子の転写を低下させる方法であって、遺伝子の転写が、低酸素誘導因子１αの、ＣＲＥＢ結合タンパク質及び／又はｐ３００との相互作用によって媒介され、前記方法が遺伝子の転写を低下させるのに有効な条件下で請求項１に記載のオリゴオキソピペラジンに細胞を接触させる段階を含む、方法。
【請求項１２】
遺伝子が、α１Ｂ−アドレナリン受容体、アデニル酸キナーゼ３、アドレノモジュリン、アルドラーゼＡ、アルドラーゼＣ、炭酸脱水酵素ＩＸ、セルロプラスミン、ケモカイン受容体４型（ＣＸＣＲ４、フシン（Fusin）、ＣＤ１８４）、ｃ−Ｍｅｔ、エンドセリン−１、エノラーゼ１、エリスロポイエチン、グルコース輸送体１、グルコース輸送体３、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘムオキシゲナーゼ１、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、ＩＧＦ結合タンパク質１、ＩＧＦ結合タンパク質３、インスリン様増殖因子２、乳酸脱水素酵素Ａ、リシルオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼアイソフォームＡ、モノアミンオキシダーゼアイソフォームＢ、一酸化窒素合成酵素２、ｐ２１、ｐ３５ｓｒｇ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ１、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、ピルビン酸キナーゼＭ、間質由来因子１、トランスフェリン受容体、トランスフェリン、形質転換増殖因子β３、トリオースリン酸イソメラーゼ１、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体ＦＬＴ−１、及び血管内皮増殖因子受容体ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１から成る群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
低酸素誘導因子１αの、ＣＲＥＢ結合タンパク質及び／又はｐ３００との相互作用が媒介する障害を対象において治療する又は予防する方法であって、前記方法が障害を治療する又は予防するのに有効な条件下で請求項１に記載のオリゴオキソピペラジンを対象に投与する段階を含む、方法。
【請求項１４】
障害が、異常な臓器発達、異常な鉄の取り込み、異常な鉄の代謝、異常な酸素輸送、異常な血管収縮、異常な血管運動神経性緊張度、好気性解糖、加齢性黄斑変性症、攻撃性、血管形成、癌、鬱病、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、ハシモト脳症、子宮内発育遅延、心筋梗塞、褐色細胞腫、肺高血圧症、網膜虚血、及び喘息の群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組織における血管形成を減らす又は防ぐ方法であって、組織における血管形成を減らす又は防ぐのに有効な条件下で請求項１に記載のオリゴオキソピペラジンに組織を接触させる段階を含む、方法。
【請求項１６】
インビボで実施される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
組織が腫瘍である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、細胞のアポトーシスを誘導するのに有効な条件下で請求項１に記載のオリゴオキソピペラジンに細胞を接触させる段階を含む、方法。
【請求項１９】
細胞の生存及び／又は増殖を減らす方法であって、細胞の生存及び／又は増殖を減らすのに有効な条件下で請求項１に記載のオリゴオキソピペラジンに細胞を接触させる段階を含む、方法。
【請求項２０】
細胞が、癌性であるか又は癌性細胞を含有する組織の内皮血管系に含有される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１２年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６１／５９９，７６３号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、全米科学財団によって授与された助成金番号ＣＨＥ−０８４８４１０のもとでの米国政府の支援によって為された。米国政府は本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、低酸素誘導因子１αのＣ末端トランス活性化ドメインのへリックスαＢを実質的に模倣する配列を含む、オリゴオキソピペラジンに関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
図１で説明されるように、新しい血管の誘導である血管形成は、正常な成長及び種々の疾患の病態形成にも重要である。癌では、血管形成は固形腫瘍の増殖を加速し、新しく形成された血管系を介して転移への道を提供する。それに対して治療上の血管形成は組織虚血の効果を軽減し、臓器不全を妨げるのに重要である。血管形成の過程は多数の分裂促進因子によって厳密に制御されているが、中でも血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）及びその受容体はカギとなる役割を担っている。ＶＥＧＦのレベルは広い範囲の腫瘍にわたって上方調節され、発癌シグナル伝達において因果的役割を担う。細胞及び組織では、ＶＥＧＦ遺伝子の転写は低酸素誘導因子によって調節される。とりわけ、低酸素誘導因子１（「ＨＩＦ−１」）は臓器の大半における酸素依存性転写の主な調節因子であり、低酸素誘導遺伝子の発現上昇の主な原因である。ＨＩＦ−１は酸素感受性のαサブユニットと構成的に発現されたβサブユニットから成る。十分な含酸素条件下では、ＨＩＦ−１αはヒドロキシル化され（Ivan et al., "HIFα Targeted for VHL-mediated Destruction by Proline Hydroxylation: Implications for O2 Sensing," Science 292:464-8 (2001)（非特許文献1））、ユビキチン化され、ユビキチン／プロテアソーム系によって分解される。低酸素状態のもとでは、ＨＩＦ−１αは安定化され、核に移行し、そこで構成的に発現されたその結合相手であるアリール炭化水素受容体核輸送体（「ＡＲＮＴ」）（Wood et al., "The Role of the Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT) in Hypoxic Induction of Gene Expression," J. Biol. Chem. 271:15117-23 (1996)（非特許文献2））とのヘテロ二量体化が、同族の低酸素応答要素（「ＨＲＥ」）との結合を生じる（Forsythe et al., "Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxia-inducible Factor 1," Mol. Cell. Biol. 16:4604-13 (1996)（非特許文献3））。次いでヘテロ二量体は転写活性化補助因子、ｐ３００、ＣＢＰ及びＳＲＣ−１を動員し、低酸素誘導遺伝子の上方調節を生じる。低酸素誘導因子の活性の調節には、３つの重要な工程（ｉ）２つのプロリン残基のヒドロキシル化を阻害してＨＩＦ−１αとユビキチンリガーゼ複合体の一部であるｐＶＨＬとの相互作用を不可能にし、それによってそのプロテアソームの分解を妨げること；（ｉｉ）ＨＩＦ−１αを阻害する因子（「ＦＩＨ」）によってＡｓｎ８０３のヒドロキシル化を阻害して（Lando et al., "FIH-1 Is an Asparaginyl Hydroxylase Enzyme That Regulates the Transcriptional Activity of Hypoxia-inducible Factor," Genes & Develop. 16:1466-71 (2002)（非特許文献4））活性化補助因子の動員を可能にし、それがＶＥＧＦ及びＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）及びＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）のような血管形成ペプチド並びにグルコース輸送体ＧＬＵＴ１及びＧＬＵＴ３及びヘキソキナーゼ１及び２のような代替のエネルギー代謝に関与するタンパク質（Forsythe et al., "Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxia-inducible Factor 1," Mol. Cell. Biol. 16:4604-13 (1996)（非特許文献3）; Okino et al., "Hypoxia-inducible Mammalian Gene Expression Analyzed in Vivo at a TATA-driven Promoter and at an Initiator-driven Promoter," J. Biol. Chem. 273:23837-43 (1998)（非特許文献5））をコードする遺伝子を含む低酸素誘導遺伝子の過剰発現を誘発すること；及び（ｉｉｉ）活性化補助因子タンパク���ｐ３００（又は相同性のＣＲＥＢ結合タンパク質、ＣＢＰ）とプロモータを結合したＨＩＦ−１α／１βが相互作用して転写の上方調節をもたらすこと、が含まれる。
【０００５】
ｐ３００／ＣＢＰのシステイン／ヒスチジンリッチ１ドメイン（「ＣＨ１」）と、ＨＩＦ−１αのＣ末端トランス活性化ドメイン（「Ｃ−ＴＡＤ７８６−８２６」）の相互作用（Freedman et al., "Structural Basis for Recruitment of CBP/p300 by Hypoxia-inducible Factor-1α," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:5367-72 (2002)（非特許文献6）; Dames et al., "Structural Basis for Hif-1α/CBP Recognition in the Cellular Hypoxic Response," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:5271-6 (2002)（非特許文献7））が、低酸素誘導遺伝子のトランス活性化を媒介する（Hirota & Semenza, "Regulation of Angiogenesis by Hypoxia-inducible Factor 1," Crit. Rev. Oncol. Hematol. 59:15-26 (2006)（非特許文献8）; Semenza, "Targeting HIF-1 for Cancer Therapy," Nat. Rev. Cancer 3:721-32 (2003)（非特許文献9））（図２Ａを参照）。図２Ａ〜Ｃで説明するように、構造的な検討はこの転写因子／活性化補助因子の相互作用に関する分子的基礎を提供し、ｐ３００によるその認識についての重要な決定基としてのＨＩＦ−１αに由来する２つの短いα−へリックスドメインを特定する（Freedman et al., "Structural Basis for Recruitment of CBP/p300 by Hypoxia-Inducible Factor-1 α," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:5367-72 (2002)（非特許文献6）; Dames et al., "Structural Basis for Hif-1 α/CBP Recognition in the Cellular Hypoxic Response," Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 99:5271-76 (2002）（非特許文献7）)。これらのドメインの合成模倣体は、ＨＩＦ−１α／ｐ３００又はＨＩＦ−１α／ＣＢＰの複合体形成を阻害し、転写を調節することができた。２つのへリックスのうち1つの結合に寄与する重要な残基（ＰＤＢコード、ＩＬ８Ｃ残基１３９〜１４７）を図２Ｃに示す。
【０００６】
ＨＩＦ−１αＣ-ＴＡＤの、転写活性化補助因子ｐ３００／ＣＢＰとの相互作用は、転写応答における重要な増幅のポイントなので、設計したタンパク質リガンドによるその破壊は、癌における好気性の解糖及び血管形成（すなわち、新しい血管の形成）を抑える有効な手段であり得る（Hirota & Semenza, "Regulation of Angiogenesis by Hypoxia-inducible Factor 1," Crit. Rev. Oncol. Hematol. 59:15-26 (2006)（非特許文献8）; Rarnanathan et al., "Perturbational Profiling of a Cell-line Model of Tumorigenesis by Using Metabolic Measurements," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 102:5992-7 (2005)（非特許文献10）; Underiner et al., "Development of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR) Kinase Inhibitors as Anti-angiogenic Agents in Cancer Therapy," Curr. Med. Chem. 11:731-45 (2004)（非特許文献11））。ＨＩＦ−１αＣ-ＴＡＤとｐ３００／ＣＢＰとの接触面積は広い（３３９３Å２）けれども、このタンパク質／タンパク質相互作用の阻害は直接的な干渉を必要としなくてもよい。代わりに、結合相手（ｐ３００／ＣＢＰ）の1つに対する構造変化の誘導が複合体を破壊するのに十分であり得る（Kung et al., "Small Molecule Blockade of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway," Cancer Cell 6:33-43 (2004)（非特許文献12））。
【０００７】
これまでは小分子による、核のタンパク質／タンパク質の相互作用の阻害は困難であることが判明しているけれども（Arkin & Wells, "Small-molecule Inhibitors of Protein-Protein Interactions: Progressing Towards the Dream," Nat. Rev. Drug Discov. 3:301-17 (2004)（非特許文献13））、高親和性のタンパク質リガンドについてのスクリーニングは幾つかの顕著な達成を生じている（Kung et al., "Small Molecule Blockade of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway," Cancer Cell 6:33-43 (2004)（非特許文献12）; Issaeva et al., "Small Molecule RITA Binds to p53, Blocks p53-HDM-2 Interaction and Activates p53 Function in Tumors," Nat. Med. 10:1321-8 (2004)（非特許文献14）; Lepourcelet et al., "Small-molecule Antagonists of the Oncogenic Tcf/β-Catenin Protein Complex," Cancer Cell 5:91-102 (2004)（非特許文献15）; Vassilev et al., "In Vivo Activation of the p53 Pathway by Small-molecule Antagonists of MDM2," Science 303:844-8 (2004)（非特許文献16）; Grasberger et al., "Discovery and Cocrystal Structure of Benzodiazepinedione HDM2 Antagonists That Activate p53 in Cells," J. Med. Chem. 48:909-12 (2005)（非特許文献17）; Ding et al., "Structure-based Design of Potent Non-peptide MDM2 Inhibitors," J. Am. Chem. Soc. 127:10130-1 (2005)（非特許文献18）; Berg et al., "Small-molecule Antagonists of Myc/Max Dimerization Inhibit Myc-induced Transformation of Chicken Embryo Fibroblasts," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:3830-5 (2002)（非特許文献19）; International Patent Publication No. WO 2006/066775 to De Munari et al. （特許文献1））。２つの小分子、ケトシン１（Hauser et al., "Isolation and Structure Elucidation of Chaetocin," Helv. Chim. Acta 53(5):1061-73 (1970)（非特許文献20））及びケトミン２（Waksman & Bugie, "Chaetomin, a New Antibiotic Substance Produced by Chaetomium Cochliodes I. Formation and Properties," J. Bacteriol. 48:527-30 (1944)（非特許文献21））は、ＨＩＦ−１αＣ-ＴＡＤとｐ３００／ＣＢＰとの間での相互作用を阻害し、低酸素誘導の転写を減衰させることが示されている。当初の有望な報告にもかかわらず、１及び２は双方とも実験動物にて凝固壊死、貧血、及び白血球増加を誘導したので、ＨＩＦ−１経路の阻害のさらなる設計が必要とされる。副作用を欠く又は副作用の少ないＨＩＦ−１経路の他の阻害剤を特定することが望ましい。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】WO 2006/066775
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ivan et al., "HIFα Targeted for VHL-mediated Destruction by Proline Hydroxylation: Implications for O2 Sensing," Science 292:464-8 (2001)
【非特許文献２】Wood et al., "The Role of the Aryl Hydrocarbon Receptor Nuclear Translocator (ARNT) in Hypoxic Induction of Gene Expression," J. Biol. Chem. 271:15117-23 (1996)
【非特許文献３】Forsythe et al., "Activation of Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transcription by Hypoxia-inducible Factor 1," Mol. Cell. Biol. 16:4604-13 (1996)
【非特許文献４】Lando et al., "FIH-1 Is an Asparaginyl Hydroxylase Enzyme That Regulates the Transcriptional Activity of Hypoxia-inducible Factor," Genes & Develop. 16:1466-71 (2002)
【非特許文献５】Okino et al., "Hypoxia-inducible Mammalian Gene Expression Analyzed in Vivo at a TATA-driven Promoter and at an Initiator-driven Promoter," J. Biol. Chem. 273:23837-43 (1998)
【非特許文献６】Freedman et al., "Structural Basis for Recruitment of CBP/p300 by Hypoxia-inducible Factor-1α," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:5367-72 (2002)
【非特許文献７】Dames et al., "Structural Basis for Hif-1α/CBP Recognition in the Cellular Hypoxic Response," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:5271-6 (2002)
【非特許文献８】Hirota & Semenza, "Regulation of Angiogenesis by Hypoxia-inducible Factor 1," Crit. Rev. Oncol. Hematol. 59:15-26 (2006)
【非特許文献９】Semenza, "Targeting HIF-1 for Cancer Therapy," Nat. Rev. Cancer 3:721-32 (2003)
【非特許文献１０】Rarnanathan et al., "Perturbational Profiling of a Cell-line Model of Tumorigenesis by Using Metabolic Measurements," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 102:5992-7 (2005)
【非特許文献１１】Underiner et al., "Development of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR) Kinase Inhibitors as Anti-angiogenic Agents in Cancer Therapy," Curr. Med. Chem. 11:731-45 (2004)
【非特許文献１２】Kung et al., "Small Molecule Blockade of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-inducible Factor Pathway," Cancer Cell 6:33-43 (2004)
【非特許文献１３】Arkin & Wells, "Small-molecule Inhibitors of Protein-Protein Interactions: Progressing Towards the Dream," Nat. Rev. Drug Discov. 3:301-17 (2004)
【非特許文献１４】Issaeva et al., "Small Molecule RITA Binds to p53, Blocks p53-HDM-2 Interaction and Activates p53 Function in Tumors," Nat. Med. 10:1321-8 (2004)
【非特許文献１５】Lepourcelet et al., "Small-molecule Antagonists of the Oncogenic Tcf/β-Catenin Protein Complex," Cancer Cell 5:91-102 (2004)
【非特許文献１６】Vassilev et al., "In Vivo Activation of the p53 Pathway by Small-molecule Antagonists of MDM2," Science 303:844-8 (2004)
【非特許文献１７】Grasberger et al., "Discovery and Cocrystal Structure of Benzodiazepinedione HDM2 Antagonists That Activate p53 in Cells," J. Med. Chem. 48:909-12 (2005)
【非特許文献１８】Ding et al., "Structure-based Design of Potent Non-peptide MDM2 Inhibitors," J. Am. Chem. Soc. 127:10130-1 (2005)
【非特許文献１９】Berg et al., "Small-molecule Antagonists of Myc/Max Dimerization Inhibit Myc-induced Transformation of Chicken Embryo Fibroblasts," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 99:3830-5 (2002)
【非特許文献２０】Hauser et al., "Isolation and Structure Elucidation of Chaetocin," Helv. Chim. Acta 53(5):1061-73 (1970)
【非特許文献２１】Waksman & Bugie, "Chaetomin, a New Antibiotic Substance Produced by Chaetomium Cochliodes I. Formation and Properties," J. Bacteriol. 48:527-30 (1944)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は当該技術のこれら及び他の欠陥を克服することを指向する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の態様の１つは、ＨＩＦ−１αのＣ末端トランス活性化ドメインのへリックスαＢを模倣する式Ｉのオリゴオキソピペラジンに関するものであり；
2015508779.tif 000002
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のそれぞれは独立して、アミノ酸側鎖、Ｈ、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲ、ハロゲン、アルキル、又はアリールであり；その際、各Ｒは独立して、Ｈ、アルキル、又はアリールであり；
各Ｒ６は独立して、Ｈ、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲ、ハロゲン、アルキル、又はアリールであり；その際、各Ｒは独立して、Ｈ、アルキル、又はアリールであり；
ＡはＸ１又はＣであり、その際：
Ｘ１は、Ｈ、ＣＯＲ'、ＣＯ２Ｒ'、ＣＯＮＲ'、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、アミンの保護のための保護基、標的指向部分、又はタグであり；その際、Ｒ'は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；及び
Ｃは、式
2015508779.tif 000003
の部分であり、式中：
各Ｘ'は独立して、Ｈ、ＣＯＲ'、ＣＯ２Ｒ'、ＣＯＮＲ'、Ｎ（Ｒ''）２、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；その際：
Ｒ'は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；及び
各Ｒ''は独立して、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；
Ｒ０は、アミノ酸側鎖、Ｈ、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲ、ハロゲン、アルキル、又はアリールであり；その際、各Ｒは独立して、Ｈ、アルキル、又はアリールであり；及び
Ｒ６は、Ｈ、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲ、ハロゲン、アルキル、又はアリールであり；その際、各Ｒは独立して、Ｈ、アルキル、又はアリールであり；及び
Ｂは、ＯＲ'、ＣＯＲ'、Ｎ（Ｒ'''）２、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、カルボン酸の保護のための保護基、標的指向部分、又はタグであり；その際：
Ｒ'は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；及び
各Ｒ'''は独立して、Ｈ、ＣＯ２Ｒ'、ＣＯＮＲ'、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；
式中、Ｒ１及びＲ２は疎水性であり、Ｒ４は水素結合受容体又は水素結合供与体であり、又はＡは、式
2015508779.tif 000004
の部分であり、Ｒ０及びＲ３は疎水性であり、Ｒ４は水素結合受容体又は水素結合供与体であり；但し、以下：Ｒ１がロイシン側鎖であり、Ｒ２がロイシン側鎖であり、及びＲ４がグルタミン側鎖である、のうち少なくとも１つが満たされないという条件がある。
【００１２】
本発明はさらに式Ｉのオリゴオキソピペラジンを含有する医薬製剤を指向する。
【００１３】
本発明の第２の態様は、細胞における遺伝子の転写を低減する方法に関するものであり、その際、遺伝子の転写は、ＨＩＦ−１αの、ＣＲＥＢ結合タンパク質及び／又はｐ３００との相互作用によって媒介される。この方法には、遺伝子の転写を低減するのに有効な条件下で本発明のオリゴオキソピペラジンに細胞を接触させる段階が含まれる。
【００１４】
本発明の第３の態様は、ＨＩＦ−１αの、ＣＲＥＢ結合タンパク質及び／又はｐ３００との相互作用が媒介する障害を対象において治療する又は予防する方法に関する。この方法には、障害を治療する又は予防するのに有効な条件下で本発明のオリゴオキソピペラジン対象に投与する段階が含まれる。
【００１５】
本発明の第４の態様は、組織における血管形成を低減する又は防ぐ方法に関する。この方法には、組織における血管形成を低減する又は防ぐのに有効な条件下で本発明のオリゴオキソピペラジンに組織を接触させる段階が含まれる。
【００１６】
本発明の第５の態様は、細胞のアポトーシスを誘導する方法に関する。この方法には、細胞のアポトーシスを誘導するのに有効な条件下で本発明のオリゴオキソピペラジンに細胞を接触させる段階が含まれる。
【００１７】
本発明の第６の態様は、細胞の生存及び／又は増殖を減らす方法に関する。この方法には、細胞の生存及び／又は増殖を減らすのに有効な条件下で本発明のオリゴオキソピペラジンに細胞を接触させる段階が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】酸素依存性の転写の、ＨＩＦ−１αが媒介する調節を説明する模式図である（Rankin & Giaccia, Cell Death Different. 15:678 (2008)）。
【図２】ＨＩＦ−１α／ＴＡＺ１の構造（Dames et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. 99:5271 (2002)）に関する図である。図２Ａは、活性化補助因子タンパク質ｐ３００のシステイン／ヒスチジンリッチ１ドメイン（「ＣＨ１」）とのＨＩＦ−１αのＣ末端トランス活性化ドメイン（「Ｃ−ＴＡＤ」）の複合体の構造を説明する模式図である。ヒトＨＩＦ−１αＣ−ＴＡＤ配列（配列番号１）は、αＡへリックス（ＰＤＢ残基１２１〜１２７）及びαＢへリックス（ＰＤＢ残基１３９〜１４７）の位置と共に図２Ｂに示す。図２Ｃは、へリックスαＢの結合に寄与するカギとなる残基を示す表である。
【図３】転写を開始することにおける転写因子、活性化補助因子及びプロモータの間の相互作用を説明する模式図である（Guarracino et al., Biopolymers 95:1 (2011)）。
【図４】ＢＢ２−１２５の分析用ＨＰＬＣのトレース図である。勾配：３０分での５〜９５％のアセトニトリル／水。
【図５】ＢＢ２−１６２の分析用ＨＰＬＣのトレース図である。勾配：３０分での５〜９５％のアセトニトリル／水。
【図６】ＢＢ２−１６４の分析用ＨＰＬＣのトレース図である。勾配：３０分での５〜９５％のアセトニトリル／水。
【図７】アミノ酸に由来するオリゴオキソピペラジン（Tosovska & Arora, Org. Lett. 12:1588 (2010)）の設計を説明する図である。オリゴオキソピペラジンは、描かれたように、ペプチドにおける近くのアミド窒素原子をエチレン結合で連結することによって得られる。
【図８】マイクロ波支援型固相合成を用いたオリゴオキソピペラジンを作製する一般的な合成スキームを示す図である。
【図９】オリゴオキソピペラジン二量体Ａ〜Ｃのモデル及びオリゴオキソピペラジン三量体のモデルの設計及び構造を示す図である。各モデルのオリゴオキソピペラジンの予想される構造とその標的α−へリックスの重なり合いも示す。
【図１０】ＨＩＦ−１αのαＢへリックスを模倣するモデルのオリゴオキソピペラジン二量体Ｂの設計及び構造を示す図である。
【図１１】ＨＩＦ−１αのαＢへリックスを模倣するモデルのオリゴオキソピペラジン二量体Ｃの設計及び構造を示す図である。
【図１２】オリゴオキソピペラジンＢＢ２−１６４、ＢＢ２−１６２、ＢＢ２−１２５及びＢＢ２−２８２を示す図である。
【図１３】オリゴオキソピペラジンＢＢ２−１６２の設計を示す図である。各ホットスポット残基をボックスで囲んで、へリックスαＢの配列（配列番号２）も示す。
【図１４】種々の濃度のオリゴオキソピペラジンＢＢ２−１２５又はＢＢ２−１６２に暴露した際の、細胞生存率のグラフである。
【図１５】ルシフェラーゼリポーターアッセイをどのように用いて標的遺伝子の転写を下方調節する剤の能力を定量するのかを説明する模式図（www.berthold.comから適合させた）である。
【図１６】溶媒対照又は種々の濃度のオリゴオキソピペラジンＢＢ２−１２５、ＢＢ２−１６２、ＢＢ２−１６４に暴露した際の、ＭＤＡ２３１−ＶＥＧＦ−ｌｕｃ細胞におけるＶＥＧＦの転写のレベルに対応する相対的な発光のグラフである。
【図１７】ＨＩＦ−１α／ｐ３００の相互作用の破壊によるＶＥＧＦ産生の低下を示す、ＨＩＦ−１αが媒介する酸素依存性の転写調節を示す模式図である（Rankin & Giaccia, Cell Death Different. 15:678 (2008)）。
【図１８】溶媒対照、ケトミン（「ＣＴＭ」）、ＢＢ２−１２５、ＢＢ２−１６２、又はＢＢ２−１６４で処理した細胞におけるＶＥＧＦのｍＲＮＡの相対的なレベルを示すグラフである。
【図１９】溶媒対照、ケトミン（「ＣＴＭ」）、ＢＢ２−１２５、ＢＢ２−１６２、又はＢＢ２−１６４で処理した細胞におけるＬＯＸのｍＲＮＡの相対的なレベルを示すグラフである。
【図２０】正常酸素状態及び低酸素状態（４２時間）における０．２％ＦＢＳの培地にてＢＢ２−１６２で４８時間処理した後のＡ５４９細胞でのβ−アクチンの相対レベルに対するＨＩＦ−１αの相対レベルの比を示すグラフ（上のパネル）及びウエスタンブロット（下のパネル）である。ＶＮ：正常酸素状態にて溶媒対照で処理した細胞；ＢＢ２−１６２  １μＭ、Ｎ：正常酸素状態にて１μＭのＢＢ２−１６２で処理した細胞；ＢＢ２−１６２  ５μＭ、Ｎ：正常酸素状態にて５μＭのＢＢ２−１６２で処理した細胞；ＶＨＢ：低酸素状態にて溶媒対照で処理した細胞；ＢＢ２−１６２  １μＭ、ＨＢ：低酸素状態にて１μＭのＢＢ２−１６２で処理した細胞；ＢＢ２−１６２  ５μＭ、ＨＢ：低酸素状態にて５μＭのＢＢ２−１６２で処理した細胞。
【図２１】正常酸素状態及び低酸素状態（４２時間）における０．２％ＦＢＳの培地にてＢＢ２−１６２で４８時間処理した後のＡ５４９細胞でのβ−アクチンの相対レベルに対するｃ−Ｍｅｔの相対レベルの比を示すグラフ（上のパネル）及びウエスタンブロット（下のパネル）である。ＶＮ：正常酸素状態にて溶媒対照で処理した細胞；ＢＢ２−１６２  １μＭ、Ｎ：正常酸素状態にて１μＭのＢＢ２−１６２で処理した細胞；ＢＢ２−１６２  ５μＭ、Ｎ：正常酸素状態にて５μＭのＢＢ２−１６２で処理した細胞；ＶＨＢ：低酸素状態にて溶媒対照で処理した細胞；ＢＢ２−１６２  １μＭ、ＨＢ：低酸素状態にて１μＭのＢＢ２−１６２で処理した細胞；ＢＢ２−１６２  ５μＭ、ＨＢ：低酸素状態にて５μＭのＢＢ２−１６２で処理した細胞。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
本明細書で記載されるのは、ＨＩＦ−１α転写因子と活性化補助因子ｐ３００／ＣＢＰの間の相互作用を改変することによって低酸素誘導遺伝子の転写を阻害するオリゴオキソピペラジンへリックス模倣体の設計である。図３で説明するように、転写因子は、相手タンパク質とプロモータＤＮＡによる相互作用の複雑な仕組みに関与し、それは、クロマチンリモデリング酵素の動員及び前開始複合体の集合を生じる（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるMark Ptashne & Alexander Gann, Genes and Signals (2002)）。遺伝子発現が疾患の進行で担う本質的な役割のために、定義されたやり方で転写を調節する合成剤は薬剤の設計にとって魅力的な候補である（それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるArndt, "Small Molecule Modulators of Transcription," Angew Chem. Int'l Ed. Engl. 45:4552-60 (2006); Berg, "Inhibition of Transcription Factors with Small Organic Molecules," Curr. Opin. Chem. Biol. 12:464-71 (2008); Mapp, "Regulating Transcription: A Chemical Perspective," Org. Biomol. Chem. 1:2217-20 (2003)）。
【００２０】
本発明の第１の態様は、ＨＩＦ−１αのＣ末端トランス活性化ドメインのへリックスαＢを模倣する式Ｉのオリゴオキソピペラジンに関するものであり、
2015508779.tif 000005
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、及びＲ４のそれぞれは独立して、アミノ酸側鎖、Ｈ、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲ、ハロゲン、アルキル、又はアリールであり；その際、各Ｒは独立して、Ｈ、アルキル、又はアリールであり；
各Ｒ６は独立して、Ｈ、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲ、ハロゲン、アルキル、又はアリールであり；その際、各Ｒは独立して、Ｈ、アルキル、又はアリールであり；
ＡはＸ１又はＣであり、その際：
Ｘ１は、Ｈ、ＣＯＲ'、ＣＯ２Ｒ'、ＣＯＮＲ'、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、アミンの保護のための保護基、標的指向部分、又はタグであり；その際、Ｒ'は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；
Ｃは、式
2015508779.tif 000006
の部分であり、式中：
各Ｘ'は独立して、Ｈ、ＣＯＲ'、ＣＯ２Ｒ'、ＣＯＮＲ'、Ｎ（Ｒ''）２、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；その際：
Ｒ'は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；及び
各Ｒ''は独立して、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；
Ｒ０は、アミノ酸側鎖、Ｈ、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲ、ハロゲン、アルキル、又はアリールであり；その際、各Ｒは独立して、Ｈ、アルキル、又はアリールであり；
Ｒ６は、Ｈ、Ｎ（Ｒ）２、ＯＲ、ハロゲン、アルキル、又はアリールであり；その際、各Ｒは独立して、Ｈ、アルキル、又はアリールであり；
Ｂは、ＯＲ'、ＣＯＲ'、Ｎ（Ｒ'''）２、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、カルボン酸の保護のための保護基、標的指向部分、又はタグであり；その際：
Ｒ'は、Ｈ、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；
各Ｒ'''は独立して、Ｈ、ＣＯ２Ｒ'、ＣＯＮＲ'、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ヘテロアリール、標的指向部分、又はタグであり；
その際、Ｒ１及びＲ２は疎水性であり、Ｒ４は水素結合受容体又は水素結合供与体であり、又はＡは、式
2015508779.tif 000007
の部分であり、Ｒ０及びＲ３は疎水性であり、Ｒ４は水素結合受容体又は水素結合供与体であり；但し、以下：Ｒ１がロイシン側鎖であり、Ｒ２がロイシン側鎖であり、及びＲ４がグルタミン側鎖である、のうち少なくとも１つが満たされないという条件がある。
【００２１】
本発明のこの態様及びすべての態様に係るアミノ酸側鎖は、αアミノ酸、二置換アミノ酸、βアミノ酸、γアミノ酸、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸等を含む、天然のアミノ酸から非天然のアミノ酸までの任意のアミノ酸側鎖であり得る。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、用語「アルキル」は鎖において約１個〜約６個の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖であってもよい脂肪族炭化水素基を意味する。分枝は、１つ以上の低級アルキル基、たとえば、メチル、エチル又はプロピルが直鎖アルキル鎖に結合することを意味する。例となるアルキル基には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル及び３−ペンチルが挙げられる。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、「シクロアルキル」は、３個〜６個の炭素原子を含有してもよく、少なくとも１つの二重結合を含んでもよい非芳香族の飽和又は不飽和の単環系又は多環系を指す。例となるシクロアルキル基には、限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、アンチ−ビシクロプロパン又はシン−ビシクロプロパンが挙げられる。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、用語「アリール」は、６個〜１９個の炭素原子を含有する芳香族の単環系又は多環系を指し、環系は任意で置換され得る。本発明のアリール基には、フェニル、ナフチル、アズレニル、フェナントレニル、アントラセニル、フルオレニル、ピレニル、トリフェニレニル、クリセニル及びナフタセニルのような基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
用語「アリールアルキル」は式−ＲａＲｂの基を指し、式中、Ｒａは上記で定義されたようなアルキル基であり、Ｒｂは上記で定義されたようなアリール基である。アルキル基及びシクロアルキル基は上記で定義されたように任意で置換され得る。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、「ヘテロアリール」は、炭素原子と、窒素、酸素及びイオウから成る群から選択される１個〜５個のヘテロ原子とから成る芳香族環基を指す。ヘテロアリール基の例には、限定されないが、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、トリアゾリル、フラニル、チオフェニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、トリアジニル、チエノピロリル、フロピロリル、インドリル、アザインドリル、イソインドリル、インドリニル、インドリジニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、イミダゾピリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズオキサゾリル、ベンズオキサジアゾリル、ベンゾチアゾリル、ピラゾロピリジニル、トリアゾロピリジニル、チエノピリジニル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾフリル、ベンゾチオフェニル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリル、テトラヒドロイソキノリル、シンノリニル、キナゾリニル、キノリジリニル、フタラジニル、ベンゾトリアジニル、クロメニル、ナフチリジニル、アクリジニル、フェナンジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、プテリジニル及びプリニルが挙げられる。追加のヘテロアリールは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＣｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ（Ｋａｔｒｉｔｚｋｙら編、１９８４）に記載されている。
【００２７】
式Ｉのオリゴオキソピペラジンは、アミン又はカルボン酸の保護のために好適である保護基を含み得る。そのような保護基は主として官能基の反応性を保護する又は覆い隠すように機能する。アミン基の保護のために好適である保護基は当該技術で周知であり、限定されないが、カルバメート、アミド、Ｎ−アルキル及びＮ-アリールアミン、イミン誘導体、エナミン誘導体、及びその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＴｈｅｏｄｏｒａ、Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰｅｔｅｒ、Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．４９４−６１５（１９９９）によって記載されたようなＮ−ヘテロ原子誘導体が挙げられる。カルボン酸の保護のために好適である保護基も当該技術で周知である。好適なカルボン酸保護基には、限定されないが、エステル（たとえば、置換されたメチルエステル、２−置換のエチルエステル、２,６−ジアルキルフェニルエステル、置換されたベンジルエステル、シリルエステル及びスタンニルエステル）、アミド、及びその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＴｈｅｏｄｏｒａ、Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰｅｔｅｒ、Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．３７２−４５０（１９９９）によって記載されたようなヒドラジドが挙げられる。アミン及びカルボン酸を保護し、脱保護する方法は、選択される保護基によって変化するが、これらの方法は当該技術で周知であり、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＴｈｅｏｄｏｒａ、Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰｅｔｅｒ、Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．３７２−４５０及び４９４-６１５（１９９９）に記載されている。
【００２８】
本発明に係る標的指向部分は、（ｉ）オリゴオキソピペラジンの細胞への取り込みを促進する、（ｉｉ）特定の細胞種又は組織種に対してオリゴオキソピペラジンを標的指向させる（たとえば、シグナル伝達ペプチドの配列）、又は（ｉｉｉ）細胞への取り込みの後、特定の細胞内の局在化に対してオリゴオキソピペラジンを標的指向させる（たとえば、輸送ペプチド配列）ように機能する。
【００２９】
本発明のオリゴオキソピペラジンの細胞への取り込みを促進するために、標的指向部分は細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）であり得る。ＣＰＰは、一見したところエネルギーとは無関係な経路によって真核細胞の原形質膜を横切って移行し、それ自体よりも数倍も大きな分子量を持つ抗体、ペプチド、タンパク質及び核酸を含む高分子の細胞内送達のために上手く使用されている。ポリアルギニン、トランスポータント、プロタミン、マウロカルシン及びＭ９１８を含む幾つかの一般的に使用されるＣＰＰは本発明での使用に好適な標的指向部分であり、当該技術で周知である（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるStewart et al., "Cell-Penetrating Peptides as Delivery Vehicles for Biology and Medicine," Organic Biomolecular Chem. 6:2242-2255 (2008)を参照のこと）。さらに、ＣＰＰを作製する方法は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｈａｌｌｂｒｉｎｋらの米国特許出願公開番号２００８０２３４１８３に記載されている。
【００３０】
オリゴオキソピペラジンの細胞への取り込みを高めるのに有用な別の好適な標的指向部分はその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＬｉｎらの米国特許第６，０４３，３３９号によって開示されたような「移入に適格な」シグナルペプチドである。移入に適格なシグナルペプチドは一般に約１０個〜約５０個のアミノ酸残基の長さで通常疎水性残基であり、細胞膜を介して細胞の外側から細胞の内側へオリゴオキソピペラジンが浸透するのを可能にさせる。例となる移入に適格なシグナルペプチドには、カポジ線維芽細胞増殖因子（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＬｉｎらの米国特許第６，０４３，３３９号を参照）に由来するシグナルペプチドが挙げられる。他の好適なペプチド配列は、ＳＩＧＰＥＰデータベース（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるvon Heijne G., "SIGPEP: A Sequence Database for Secretory Signal Peptides," Protein Seq. Data Anal. 1(1):41-42 (1987)を参照）から選択することができる。
【００３１】
別の好適な標的指向部分は、特定の組織又は細胞種に対してオリゴオキソピペラジンを標的指向させることが可能であるシグナルペプチド配列である。シグナル伝達ペプチドはリガンド結合タンパク質の少なくとも一部を含むことができる。好適なリガンド結合タンパク質には、高親和性抗体断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆａｂ'及びＦ（ａｂ'）２、単鎖Ｆｖ抗体断片）、ナノボディ又はナノボディの断片、フルオロボディ、又はアプタマーが挙げられる。他のリガンド結合タンパク質には、ビオチン結合タンパク質、脂質結合タンパク質、細胞周辺質結合タンパク質、レクチン、血清アルブミン、酵素、リン酸及び硫酸結合タンパク質、イムノフィリン、メタロチオネイン又は種々の他の受容体タンパク質が挙げられる。細胞特異的なターゲティングについては、シグナル伝達ペプチドは好ましくは細胞特異的な膜受容体のリガンド結合ドメインである。従って、修飾されたオリゴオキソピペラジンが静脈内で送達されると、又はさもなければ血液若しくはリンパ液に導入されると、オリゴオキソピペラジンは標的化された細胞に吸着し、標的化された細胞はオリゴオキソピペラジンを内部移行させるであろう。たとえば、標的細胞が癌細胞であれば、オリゴオキソピペラジンは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＴａｙｌｏｒらの米国特許第６，５７２，８５６号によって開示されたような抗Ｃ３Ｂ（Ｉ）抗体に結合され得る。或いは、オリゴオキソピペラジンは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＭｏｒｏへの米国特許第６，５１４，６８５号によって開示されたようなαフェトタンパク質受容体、又はＨｏｓｏｋａｗａへの米国特許第５，８３７，８４５号によって開示されたようなモノクローナルＧＡＨ抗体に結合され得る。心臓細胞に対してオリゴオキソピペラジンを標的指向させることについては、オリゴオキソピペラジンは、エラスチン微細繊維インターフェイサ（ＥＭＩＬＩＮ２）（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるVan Hoof et al., "Identification of Cell Surface for Antibody-Based Selection of Human Embryonic Stem Cell-Derived Cardiomyocytes," J Proteom Res 9:1610-18 (2010)）心臓トロポニンＩ、コネキシン−４３又は当該技術で既知である心臓細胞表面膜受容体を認識する抗体に結合され得る。肝細胞に対してオリゴオキソピペラジンを標的指向させることについては、シグナル伝達ペプチドには肝細胞特異的なアシアロ糖タンパク質受容体に特異的なリガンドドメインが挙げられ得る。そのようなキメラのオリゴオキソピペラジンは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＨｅａｒｔｌｅｉｎらの米国特許第５，８１７，７８９号に記載されたキメラのタンパク質及びペプチドを調製するためのものに類似する方法を用いて調製することができる。
【００３２】
別の好適な標的指向部分は、オリゴオキソピペラジンがいったん標的の細胞又は組織によって内部移行されるとオリゴオキソピペラジンの細胞内区画への移動を指揮する輸送ペプチドである。たとえば、阻害されることが求められるタンパク質の活性又はタンパク質／タンパク質相互作用が小胞体（ＥＲ）で生じるのであれば、オリゴオキソピペラジンをＥＲ輸送ペプチド配列に結合させることができる。シグナルペプチドＭＭＳＦＶＳＬＬＬＶＧＩＬＦＹＡＴＥＡＥＱＬＴＫＣＥＶＦＱ（配列番号３）を含めて多数のそのようなシグナルペプチドが当該技術で知られている。他の好適なＥＲシグナルペプチドには、酵素１７β−ヒドロキシステロイド脱水素酵素１１型のＮ末端小胞体標的配列（その全体が参照によって本明細書に組み入れられるHoriguchi et al., "Identification and Characterization of the ER/Lipid Droplet-Targeting Sequence in 17?-hydroxysteroid Dehydrogenase Type 11," Arch. Biochem. Biophys. 479(2):121-30 (2008)）、又はその全体が参照によって本明細書に組み入れられるＲｅｅｄらの米国特許出願公開第２００８０２５０５１５号にて開示されたＥＲシグナル伝達ペプチド（ＥＲシグナルペプチドをコードする核酸配列を含む）のいずれかが挙げられる。さらに、本発明のオリゴオキソピペラジンは保留シグナルＫＥＤＬ（配列番号４）のようなＥＲ保留シグナルを含有することができる。ＥＲにオリゴマーを局在化させるために輸送ペプチドを組み入れるように本発明のオリゴオキソピペラジンを修飾する方法は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＲｅｅｄらの米国特許出願公開第２００８０２５０５１５号に記載されたように実施することができる。
【００３３】
阻害されることが求められるタンパク質の活性又はタンパク質／タンパク質相互作用が核で生じるのであれば、オリゴオキソピペラジンは核局在化輸送シグナルを含むことができる。好適な核輸送ペプチドは、核輸送ペプチドＰＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５）を含めて当該技術で知られている。他の核局在化輸送シグナルには、たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＬｉｎらの米国特許第６，０４３，３３９号によって開示されたような酸性線維芽細胞増殖因子の核局在配列及び転写因子ＮＦ−κＢｐ５０の核局在配列が挙げられる。当該技術で既知の他の核局在ペプチド配列も本発明のこの態様に従って使用するのに好適である。
【００３４】
ミトコンドリアに対して標的指向させるのに好適な輸送ペプチド配列には、ＭＬＳＬＲＱＳＩＲＦＦＫＰＡＴＲＴＬＣＳＳＲＹＬＬ（配列番号６）が挙げられる。ミトコンドリアに対して本発明のオリゴオキソピペラジンを選択的に標的指向させるのに好適な他の輸送ペプチド配列は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷｉｐｆへの米国公開特許出願番号２００７０１６１５４４にて開示されている。
【００３５】
「タグ」は本明細書で使用されるとき、本発明のオリゴオキソピペラジンの検出、定量、分離、及び／又は精製を円滑にする標識部分を含む。好適なタグには、精製タグ、放射性又は蛍光性の標識及び酵素タグが挙げられる。
【００３６】
たとえば、ポリヒスチジン（Ｈｉｓ６−）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−）又はマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ−）のような精製タグはオリゴマーの精製又は分離を助けることができるが、その後、取り外す、すなわち、回収に続いてオリゴオキソピペラジンから切断することができる。プロテアーゼ特異的な切断部位を使用して精製タグの取り外しを円滑にすることができる。所望のオリゴオキソピペラジン生成物をさらに精製して切断した精製タグを取り除くことができる。
【００３７】
他の好適なタグには、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ又は９９ＴＣのような放射性標識が挙げられる。化合物を放射性標識する方法は当該技術で知られおり、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎらの米国特許第５，８３０，４３１号に記載されている。シンチレーションカウンタ又はオートラジオグラフィを用いて放射活性を検出し、定量する。或いは、オリゴオキソピペラジンを蛍光タグに結合することができる。好適な蛍光タグには、限定されないが、キレート剤（ユーロピウムキレート剤）、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、リサミン、フィコエリスリン及びテキサスレッドが挙げられる。その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ(Coligen et al. eds., 1991）にて開示された技法を用いて蛍光標識をオリゴオキソピペラジンに結合することができる。蛍光光度計を用いて蛍光を検出し、定量することができる。
【００３８】
酵素タグは、種々の技法を用いて測定することができる発色性基質の化学変化を一般に触媒する。たとえば、酵素は基質における色変化を触媒してもよく、それは分光光度計で測定することができる。或いは、酵素は基質の蛍光又は化学発光を変化させ得る。好適な酵素タグの例には、ルシフェラーゼ（たとえば、ホタルのルシフェラーゼ及び細菌のルシフェラーゼ、たとえば、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＷｅｎｇらの米国特許第４，７３７，４５６号を参照のこと）、ルシフェリン、２,３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸脱水素酵素、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ（たとえば、西洋ワサビのペルオキシダーゼ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（たとえば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸脱水素酵素）、複素環オキシダーゼ（たとえば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等が挙げられる。酵素をタンパク質及びペプチドに結合する技法は、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるＯ'Ｓｕｌｌｉｖａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ-Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１４７-６６(Langone et al. eds., 1981）に記載されており、本発明のオリゴオキソピペラジンに酵素を結合するのに使用することができる。そのようなタグは、本発明のオリゴオキソピペラジン用いてタンパク質／タンパク質相互作用の阻害を検出するのに特に有用である。
【００３９】
式Ｉのオリゴオキソピペラジンはまた水素結合供与体又は水素結合受容体も含む。水素結合受容体は孤立電子対を伴った原子を含有して電気陰性原子上でプロトンと相互作用する。好適な例には、限定されないが、カルボニル基及びたとえば、ピリジンやイミダゾールのような芳香族アミンが挙げられる。水素結合供与体は共有する少なくとも１つのプロトンを伴った電気陰性原子を含有する。好適な例には、限定されないが、アミン、アミド、カルボン酸、ヒドロキシル、及びチオールの官能基が挙げられる。
【００４０】
式Ｉの例となるオリゴオキソピペラジン化合物には、限定されないが、ＢＢ２−１２５、ＢＢ２−１６２及びＢＢ２−１６４が挙げられる。
【００４１】
本発明のペプチドは当該技術の方法を用いて作製され得る。好適な方法にはその全体が参照によって本明細書に組み入れられる米国特許出願番号１２／９１７，１７６に記載されたものが挙げられる。
【００４２】
本発明に包含されるのはまた、本発明のオリゴオキソピペラジン及び薬学上許容可能な溶媒を含む医薬製剤である。
【００４３】
好適な医薬製剤は、オリゴオキソピペラジン及び薬学上許容可能な補助剤、キャリア、溶液、懸濁液、エマルジョン、賦形剤、粉末及び／又は安定剤を含み、たとえば、錠剤、カプセル剤、粉剤、溶液、懸濁液又はエマルジョンのような固体又は液体の形態であることができる。組成物は好ましくは、補助剤、キャリア及び／又は賦形剤と共に、約０．０１〜約９９重量％、さらに好ましくは約２〜約６０重量％のオリゴオキソピペラジンを含有する。そのような治療上有用な組成物における活性化合物の量は好適な投与単位が得られるようにする。
【００４４】
加えて、本発明の医薬製剤はさらに、投与の方式及び投与形態の性質に応じて、たとえば、保存剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、抗菌剤、抗真菌剤、潤滑剤、及び分注剤のような１種以上の薬学上許容可能な希釈剤又は溶媒を含み得る。懸濁剤の例には、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール及びソルビタンエステル、微細結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天／寒天及びトラガカント、又はこれらの物質の混合物が挙げられる。微生物の作用の防除は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等によって保証することができる。等張剤、たとえば、糖類、塩化ナトリウム等を含めることが必要とされてもよい。注射用医薬形態の長時間吸収は、吸収を遅らせる剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらすことができる。好適なキャリア、希釈剤、溶剤又は溶媒の例には、水、エタノール、ポリオール、それらの好適な混合物、植物油（たとえば、オリーブ油）、及びオレイン酸エチルのような注射用有機エステルが挙げられる。賦形剤の例にはラクトース、乳糖、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム及びリン酸二カルシウムが挙げられる。崩壊剤の例にはデンプン、アルギン酸、及び特定の錯体ケイ酸塩が挙げられる。潤滑剤の例には、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、同様に高分子量のポリエチレングリコールが挙げられる。
【００４５】
経口の治療用組成物については、本発明のオリゴオキソピペラジンは賦形剤と共に組み入れられてもよく、錠剤、カプセル剤、エリキシル、懸濁液、シロップ等の形態で使用されてもよい。そのような組成物及び製剤は少なくとも０．１％のオリゴオキソピペラジンを含有すべきである。これらの組成物におけるオリゴオキソピペラジンの比率は当然変化してもよく、都合よく単位の重量の約２％〜約６０％の間であり得る。そのような治療上有用な組成物におけるオリゴオキソピペラジンの量は、好適な投与量が得られるようにする。
【００４６】
錠剤、カプセル剤等は、たとえば、トラガカントゴム、アカシアゴム、コーンスターチ又はゼラチンのような結合剤；たとえば、リン酸二カルシウムのような賦形剤；たとえば、コーンスターチ、ジャガイモデンプン又はアルギン酸のような崩壊剤；たとえば、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤；たとえば、スクロース、ラクトース又はサッカリンのような甘味剤も含有し得る。投与単位形態がカプセル剤である場合、それは上記の種類の物質に加えて、脂肪油のような液体キャリアを含有し得る。
【００４７】
種々の他の物質がコーティングとして又は投与単位の物理形態を改変するために存在し得る。たとえば、錠剤はセラック、糖又はその双方によって被覆され得る。シロップ剤は、有効成分に加えて、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルパラベン及びプロピルパラベン、色素、及びサクランボ風味又はオレンジ風味のような風味剤を含有し得る。
【００４８】
オリゴオキソピペラジンの溶液又は懸濁液（たとえば、非経口投与のための）は、たとえば、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と好適に混合された水にて調製することができる。分散液もまた、グリセロール、液状ポリエチレングリコール及び油におけるそれらの混合物にて調製することができる。実例となる油は、石油、動物、植物、又は合成起源のものであり、たとえば、ピーナッツ油、大豆油又は鉱物油である。一般に、水、生理食塩水、水性デキストロース及び関連する糖溶液、及びたとえば、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールのようなグリコールは、特に注射用溶液のために好ましい液体キャリアである。保存及び使用の普通の条件下で、これらの製剤は保存剤を含有して微生物の増殖を妨げる。
【００４９】
注射用の使用に好適な医薬形態には、無菌の水性溶液又は分散液、及び無菌の注射用の溶液又は分散液の即時の調製のための無菌の粉剤が挙げられる。あらゆる場合で、形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、たとえば、細菌及び真菌のような微生物の混入作用に対して保護されなければならない。キャリアは、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコール）、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶剤又は分散媒であることができる。
【００５０】
本発明の第２の態様は、本発明のオリゴオキソピペラジンを用いてＨＩＦ−１αとｐ３００／ＣＢＰの相互作用を阻害することに関する。
【００５１】
本発明のこの態様の一実施形態は、細胞における遺伝子の転写を減らす方法に関するものであり、その際遺伝子の転写は、ＨＩＦ−１αの、ＣＲＥＢ結合タンパク質／ｐ３００との相互作用によって媒介される。この方法には、オリゴオキソピペラジンの核への取り込みを生じるのに有効な条件下で本発明のオリゴオキソピペラジンに細胞を接触させる段階が含まれ、オリゴオキソピペラジンはＨＩＦ−１αとｐ３００／ＣＢＰの相互作用を破壊し、それによって遺伝子の転写を低下させる。
【００５２】
その転写を、ＨＩＦ−１αの、ＣＢＰ及び／又はｐ３００との相互作用が媒介する遺伝子には、α１Ｂ−アドレナリン受容体、アデニル酸キナーゼ３、アドレノモジュリン、アルドラーゼＡ、アルドラーゼＣ、炭酸脱水酵素ＩＸ、セルロプラスミン、ケモカイン受容体４型（ＣＸＣＲ４、フシン（Fusin）、ＣＤ１８４）、ｃ−Ｍｅｔ、エンドセリン−１、エノラーゼ１、エリスロポイエチン、グルコース輸送体１、グルコース輸送体３、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、ヘムオキシゲナーゼ１、ヘキソキナーゼ１、ヘキソキナーゼ２、ＩＧＦ結合タンパク質１、ＩＧＦ結合タンパク質３、インスリン様増殖因子２、乳酸脱水素酵素Ａ、リシルオキシダーゼ、モノアミンオキシダーゼアイソフォームＡ、モノアミンオキシダーゼアイソフォームＢ、一酸化窒素合成酵素２、ｐ２１、ｐ３５ｓｒｇ、ホスホフルクトキナーゼ、ホスホグリセリン酸キナーゼ１、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、ピルビン酸キナーゼＭ、間質由来因子１、トランスフェリン受容体、トランスフェリン、形質転換増殖因子β３、トリオースリン酸イソメラーゼ１、血管内皮増殖因子、血管内皮増殖因子受容体ＦＬＴ−１、及び血管内皮増殖因子受容体ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１が挙げられる。これらの遺伝子の転写を阻害するための一部の用途を表１に示す。
【００５３】
（表１）障害の事例
2015508779.tif 000008
【００５４】
本発明のこの態様の別の実施形態は、ＨＩＦ−１αの、ＣＢＰ及び／又はｐ３００との相互作用が媒介する障害を対象において治療する又は予防する方法に関する。この方法には、障害を治療する又は予防するのに有効な条件下で対象に本発明のオリゴオキソピペラジンを投与する段階が含まれる。
【００５５】
治療する又は予防することができる障害には、たとえば、網膜虚血（それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるZhu et al., "Long-term Tolerance to Retinal Ischemia by Repetitive Hypoxic Preconditioning: Role of HIF-1α and Heme Oxygenase-1," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48:1735-43 (2007); Ding et al., "Retinal Disease in Mice Lacking Hypoxia-inducible Transcription Factor-2α," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 46:1010-6 (2005)）、肺高血圧症（それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるSimon et al., "Hypoxia-induced Signaling in the Cardiovascular System," Annu. Rev. Physiol. 70:51-71 (2008); Eul et al., "Impact of HIF-1α and HIF-2α on Proliferation and Migration of Human Pulmonary Artery Fibroblasts in Hypoxia," FASEB J. 20:163-5 (2006)）、子宮内発育遅延（それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるCaramelo et al., "Respuesta a la Hipoxia. Un Mecanismo Sistemico Basado en el Control de la Expresion Genica [Response to Hypoxia. A Systemic Mechanism Based on the Control of Gene Expression]," Medicina B. Aires 66:155-64 (2006); Tazuke et al., "Hypoxia Stimulates Insulin-like Growth Factor Binding Protein 1 (IGFBP-1) Gene Expression in HepG2 Cells: A Possible Model for IGFBP-1 Expression in Fetal Hypoxia," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:10188-93 (1998)）、糖尿病性網膜症（それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるRitter et al., "Myeloid Progenitors Differentiate into Microglia and Promote Vascular Repair in a Model of Ischemic Retinopathy," J. Clin. Invest. 116:3266-76 (2006); Wilkinson-Berka et al., "The Role of Growth Hormone, Insulin-like Growth Factor and Somatostatin in Diabetic Retinopathy," Curr. Med. Chem. 13:3307-17 (2006); Vinores et al., "Implication of the Hypoxia Response Element of the Vegf Promoter in Mouse Models of Retinal and Choroidal Neovascularization, but Not Retinal Vascular Development," J. Cell. Physiol. 206:749-58 (2006); Caldwell et al., "Vascular Endothelial Growth Factor and Diabetic Retinopathy: Role of Oxidative Stress," Curr. Drug Targets 6:511-24 (2005)）、加齢性黄斑変性症（それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるInoue et al., "Expression of Hypoxia-inducible Factor 1α and 2α in Choroidal Neovascular Membranes Associated with Age-related Macular Degeneration," Br. J. Ophthalmol. 91:1720-1 (2007); Zuluaga et al., "Synergies of VEGF Inhibition and Photodynamic Therapy in the Treatment of Age-related Macular Degeneration," Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 48:1767-72 (2007); Provis, "Development of the Primate Retinal Vasculature," Prog. Retin. Eye Res. 20:799-821 (2001)）、糖尿病性黄斑浮腫（それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるVinores et al., "Implication of the Hypoxia Response Element of the Vegf Promoter in Mouse Models of Retinal and Choroidal Neovascularization, but Not Retinal Vascular Development," J. Cell. Physiol. 206:749-58 (2006); Forooghian & Das, "Anti-angiogenic Effects of Ribonucleic Acid Interference Targeting Vascular Endothelial Growth Factor and Hypoxia-inducible Factor-1α," Am. J. Ophthalmol. 144:761-8 (2007)）、及び癌（それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるMarignol et al., "Hypoxia in Prostate Cancer: A Powerful Shield Against Tumour Destruction?" Cancer Treat. Rev. 34:313-27 (2008); Galanis et al., "Reactive Oxygen Species and HIF-1 Signalling in Cancer," Cancer Lett. 266:12-20 (2008); Ushio-Fukai & Nakamura, "Reactive Oxygen Species and Angiogenesis: NADPH Oxidase as Target for Cancer Therapy," Cancer Lett. 266:37-52 (2008); Adamski et al., "The Cellular Adaptations to Hypoxia as Novel Therapeutic Targets in Childhood Cancer," Cancer Treat. Rev. 34:231-46 (2008); Toffoli & Michiels, "Intermittent Hypoxia Is a Key Regulator of Cancer Cell and Endothelial Cell Interplay in Tumours," FEBS J. 275:2991-3002 (2008); Peehl & Coram, "The Significance of Monoamine Oxidase-A Expression in High Grade Prostate Cancer," J. Urol. 180:2206-11 (2008); Flamand & Zhao, "Targeting Monoamine Oxidase A in Advanced Prostate Cancer," J. Cancer Res. Clin. Oncol. 136:1761-71 (2010)）が挙げられる。
【００５６】
本発明のこの態様のさらに別の実施形態は、組織における血管形成を減らす又は防ぐ方法に関する。この方法には、組織における血管形成を減らす又は防ぐのに有効な条件下で本発明のオリゴオキソピペラジンに組織を接触させる段階が含まれる。
【００５７】
本発明のこの態様の別の実施形態は、細胞にてアポトーシスを誘導する方法に関する。この方法には、細胞にてアポトーシスを誘導するのに有効な条件下で本発明のオリゴオキソピペラジンに細胞を接触させる段階が含まれる。
【００５８】
本発明のこの態様の別の実施形態は、細胞の生存及び／又は増殖を減らす方法に関する。この方法には、細胞の生存及び／又は増殖を減らすのに有効な条件下で本発明のオリゴオキソピペラジンに細胞を接触させる段階が含まれる。
【００５９】
本発明のこの態様に従って接触させる段階（投与する段階を含む）は、当業者に明らかであろう方法を用いて実施することができ、インビトロ又はインビボで行うことができる。
【００６０】
細胞に剤を送達するアプローチの１つにはリポソームの使用が含まれる。基本的に、これには、送達される剤を含むリポソームを提供し、次いで細胞、組織又は臓器に剤を送達するのに有効な条件下で該リポソームに細胞、組織又は臓器を接触させる段階が含まれる。
【００６１】
能動的ターゲティング（たとえば、リポソーム媒体の表面に抗体又はホルモンを組み入れることによって）を介して標的である臓器、組織又は細胞にて蓄積させるために、このリポソーム送達方式を行うこともできる。既知の方法に従ってこれを達成することができる。
【００６２】
タンパク質又はポリペプチドを含有する剤（たとえば、１種以上のタンパク質又はポリペプチドの側鎖を含有する本発明のオリゴオキソピペラジン）を送達する別のアプローチには、結合されたタンパク質又はポリペプチドの酵素的分解を回避するように安定化されるポリマーへの所望の剤の結合が含まれる。この種の結合されたタンパク質又はポリペプチドは、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｅｋｗｕｒｉｂｅへの米国特許第５，６８１，８１１号に記載されている。
【００６３】
剤の送達のさらに別のアプローチには、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Ｈｅａｒｔｌｅｉｎらの米国特許第５，８１７，７８９号に係るキメラ剤の調製が含まれる。キメラ剤は、リガンドドメインと剤（たとえば、本発明のオリゴオキソピペラジン）を含むことができる。リガンドドメインは標的細胞上に位置する受容体に特異的である。従って、キメラ剤が静脈内に送達される、又はさもなければ血中若しくはリンパ液に導入されると、キメラ剤は標的化された細胞に吸着し、標的化された細胞はキメラ剤を内部移行させるであろう。
【００６４】
本発明のオリゴオキソピペラジンは標的化された細胞／組織／臓器に直接送達され得る。
【００６５】
さらに及び／又は代わりに、オリゴオキソピペラジンは、オリゴオキソピペラジンの、標的化された組織、臓器又は細胞への移動（及び／又はそれによる取り込み）を促進する１種以上の剤と共に、非標的化領域に投与され得る。当業者に明らかであるように、オリゴオキソピペラジン自体が、脳血管関門を横切る輸送を含めて、標的である組織、臓器又は細胞への輸送を円滑にするように、及び／又は標的化された細胞による取り込み（たとえば、細胞膜を横切る輸送）を円滑にするように、修飾され得る。好ましい実施形態では、本発明のオリゴオキソピペラジンは適当な媒体によって修飾され及び／又は送達されて標的細胞の核へのその送達を円滑にする（それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるWender et al., "The Design, Synthesis, and Evaluation of Molecules That Enable or Enhance Cellular Uptake: Peptoid Molecular Transporters," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 97:13003-8 (2000); Roberts, "Buyer's Guide to Protein Transduction Reagents," Scientist 18:42-3 (2004); Joliot & Prochiantz, "Transduction Peptides: From Technology to Physiology," Nat. Cell Biol. 6:189-96 (2004)）。上述された実施形態のための標的である細胞、組織及び／又は臓器の一部の例を表２に示す。
【００６６】
（表２）標的である細胞／組織／臓器の事例
2015508779.tif 000009
【００６７】
インビボでの投与は、対象への全身性の投与を介して、又は上述のように冒された組織、臓器及び／又は細胞への標的指向する投与を介して達成することができる。通常、治療剤（すなわち、本発明のオリゴオキソピペラジン）は、治療剤を標的である細胞、組織又は臓器に送達する媒体にて患者に投与されるであろう。通常、治療剤は、上述のもののような医薬製剤として投与されるであろう。
【００６８】
例となる投与経路には、限定されないが、経口、局所、経皮、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、脳室内、及び病変内の投与；気管内接種、吸引、気道注入、エアロゾル化、噴霧化、鼻内点滴、経口又は経鼻胃の注入、腹腔内注射、血管内注射、静脈内注射、動脈内注射（たとえば、肺動脈を介して）、筋肉内注射及び胸膜内注入による投与；粘膜への塗布（たとえば、鼻、喉、気管、性器及び／又は肛門の粘膜）及び徐放性媒体の埋め込みによる投与が挙げられる。
【００６９】
エアロゾルとしての使用については、溶液又は懸濁液における本発明のオリゴオキソピペラジンは、従来の補助剤を伴った好適な高圧ガス、たとえば、プロパン、ブタン又はイソブタンのような炭化水素高圧ガスと一緒に加圧したエアロゾル容器に包装され得る。本発明のオリゴオキソピペラジンは非加圧形態でも投与され得る。
【００７０】
例となる送達器具には、限定されないが、ネブライザー、アトマイザー、リポソーム（能動的及び受動的な薬剤送達法を含む）（それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるWang & Huang, "pH-Sensitive Immunoliposomes Mediate Target-cell-specific Delivery and Controlled Expression of a Foreign Gene in Mouse," Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:7851-5 (1987); Bangham et al., "Diffusion of Univalent Ions Across the Lamellae of Swollen Phospholipids," J. Mol. Biol. 13:238-52 (1965); U.S. Patent No. 5,653,996 to Hsu; U.S. Patent No. 5,643,599 to Lee et al.; U.S. Patent No. 5,885,613 to Holland et al.; U.S. Patent No. 5,631,237 to Dzau & Kaneda; and U.S. Patent No. 5,059,421 to Loughrey et al.; Wolff et al., "The use of monoclonal anti-Thy1 IgG1 for the targeting of liposomes to AKR-A cells in vitro and in vivo," Biochim. Biophys. Acta 802:259-73 (1984)）、経皮貼付剤、インプラント、埋め込み可能な又は注射可能なタンパク質デポー組成物、及び注射器が挙げられる。当業者に既知の他の送達系を採用して所望の臓器、組織又は細胞へのオリゴオキソピペラジンのインビボでの所望の送達を達成して本発明のこの態様を達成することができる。
【００７１】
必要に応じた頻度で、所望の効果を提供するのに好適な期間、接触（インビボの投与を含む）を実施することができる。たとえば、接触は１回又は複数回行うことができ、インビボの投与は単回の徐放性投与製剤で又は複数回（たとえば、毎日）投与で実施することができる。
【００７２】
投与量は当然、特定の条件及び治療計画に応じて変化する。所望の効果を得るのに必要とされる量／用量は、剤、製剤、細胞種、培養条件（生体外の実施形態について）、治療が所望される期間、及びインビボの実施形態について、剤が投与される個体に応じて変化し得る。
【００７３】
有効な量は当業者によって経験的に決定することができる。たとえば、このことには、種々の量の本発明のオリゴオキソピペラジンを培養における細胞に投与し、所望の結果を得るのに有効な濃度を算出するアッセイを含み得る。インビボの投与についての有効量の決定には、種々の用量の剤を培養における細胞に投与し、インビボで必要とされる濃度を算出するために、所望の結果を達成するのに有効な剤の濃度を決定するインビボアッセイも含み得る。有効量はインビボでの動物試験にも基づき得る。
【００７４】
以下の実施例を参照して本発明をさらに説明し得る。
【実施例】
【００７５】
以下の実施例は説明を意図するものであって、添付の特許請求の範囲で述べられるような本発明の範囲を限定するように決して意図するものではない。
【００７６】
実施例１：オリゴオキソピペラジンの合成
以下のスキーム１に示すように、その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Ａｒｏｒａらの米国特許出願番号１２／９１７，１７６に記載されたような固相合成を介してオリゴオキソピペラジンを合成した。
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【００７７】
固相反応容器にてＫｎｏｒｒ樹脂上で標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成によってジペプチド１を合成した。ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％ピペリジンによる処理によってＦｍｏｃ基を取り外し、ＤＭＦ、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、メタノール（ＭｅＯＨ）及びジエチルエーテルで樹脂を順次洗浄し、真空下で乾燥させた。塩化ｏ−ニトロベンゼンスルホニル（Ｎｓ-Ｃｌ、１０当量）とコリジン（１０当量）を無水ＤＣＭに溶解し、反応容器に加えた。混合物を２３℃で２時間振盪して２を得た。次いで２を含有する樹脂を、ＤＭＦ、ＤＣＭ、ＭeＯＨ及びジエチルエーテルで順次洗浄し、真空下で１２時間乾燥させた。
【００７８】
２を含有する樹脂をガラス製のマイクロ波チューブ（ＣＥＭ）に移した。トリフェニルホスフィン（ＰＰｈ３、５当量）を加え、チューブに窒素ガスを３０分間流した。テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（ＤＩＡＤ、１０当量）及び２−ブロモエタノール（１０当量）を加え、反応混合物を１００℃での１０分間のマイクロ波照射（２００ワット、２５０ｐｓｉ）に供した。樹脂をＴＨＦ、ＤＭＦ及びＤＣＭで順次洗浄した。次に、樹脂を固相容器に移し、ＴＨＦ中の１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデック−７−エン（ＤＢＵ）で２時間処理し、次いでＴＨＦ、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びジエチルエーテルで洗浄し、３０分間乾燥させた後、ＤＭＦ中のＤＢＵ及び２−メルカプトエタノールで２時間処理した。今や３を含有する樹脂をＤＭＦ、ＤＣＭ、ＭｅＯＨ及びジエチルエーテルで洗浄し、乾燥させた。
【００７９】
３を含有する樹脂に、所望の事前に活性化したＦｍｏｃアミノ酸（Ｆｍｏｃ−ＡＡ−ＯＨ）を加え、混合物を２３℃で１２時間振盪した。ノシル保護及び環形成の工程を繰り返し、９５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、２．５％の水及び２．５％のトリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）による樹脂からの切断の後、オキソピペラジン二量体ＢＢ２−１２５及びＢＢ２−１６２を得た。ＢＢ２−１６４の形成については、樹脂に結合したオキソピペラジン二量体６をＤＭＦ中の事前に活性化したＦｍｏｃアミノ酸で処理し、その後、樹脂から切断した。ＢＢ２−１２５、ＢＢ２−１６２及びＢＢ２−１６４の分析用ＨＰＬＣのトレース図をそれぞれ図４、図５及び図６に示す。
【００８０】
実施例２：ＭＴＴ細胞生存率
ヒト乳癌（ＭＣＦ７）細胞及びヒト肺癌（Ａ５４９）細胞をウェル当たり２００μＬの新鮮な培地中、５，０００〜１０，０００個の密度で９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播いた；ＭＣＦ７は１０％ＦＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を伴ったＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）にて、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ）は２％ＦＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を伴ったＦ−１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ）にて。次いで、所望の集密度（約７０％）に達するまで（約２４〜７２時間）プレートをインキュベータ（３７℃、５〜１０％のＣＯ２）に入れた。その後、ウェルすべての培地を、適当な培地中のＢＢ２−１２５又はＢＢ２−１６２（４８時間試験では１５０μＬ、７２時間試験では２００μＬ）の溶液で置き換えた。次いでプレートをインキュベータにて３７℃、５〜１０％ＣＯ２で４８又は７２時間維持した。化合物とのインキュベートの４８（又は７２）時間後、ＭＴＴ（ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を各ウェル（１０％ｖ／ｖ）に加え、慎重且つ十分に混合した。３７℃及び５〜１０％ＣＯ２でプレートをさらに３〜４時間インキュベートし、次いで培地を慎重に且つ完全に取り除いた。得られた紫色の沈殿物をＤＭＳＯ（２００μＬ／ウェル）に溶解し、マイクロプレートリーダー（ＳｙｎｅｒｇｙＩＩ，ＢｉｏＴｅｋ社）を用いて各ウェルの吸光度を５６２ｎｍで測定した。
【００８１】
実施例３：ルシフェラーゼ転写アッセイ
作業はすべて無菌の器具と共に生物実験用フードで行った。ＭＤＡ２３１−ＶＥＧＦ（ＨＲＥ）−ｌｕｃ細胞を２４穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ，ウェル当たり１０％ＦＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を伴ったＧ４１８  ＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）２ｍＬに６５，０００個の細胞）に播いた。プレートを２４時間インキュベータに入れた（３７℃及び５〜１０％ＣＯ２）。その後、各ウェルの培地を培地（Ｇ４１８  ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ）中のＢＢ２−１２５、ＢＢ２−１６２、ＢＢ２−１６４又は溶媒対照（１ｍＬ／各ウェル）の１０μＭ又は２０μＭの溶液で置き換えた。プレートを６時間インキュベートし（３７℃及び５〜１０％ＣＯ２）、次いでＤＦＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の水溶液（１９．６ｍｇ／ｍＬ、０．２ミクロンのＴｕｆｆｒｙｎフィルター（ＰＡＬＬ）を通した、ウェル当たり１０μＬ）を適当なウェルに加え、低酸素状態を誘導した。プレートをさらに３時間インキュベートし（３７℃及び５〜１０％ＣＯ２）、次いで湿ったペーパタオルと嫌気性のポーチ（ＢＤ  ＧａｓＰａｋ  ＥＺ  Ｐｏｕｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍ)を含有するプラスチックバッグにプレートを入れて低酸素状態を誘導した。次いでバッグを密封し（ジップロック）、プレートを１５時間、化合物と共に合計２４時間インキュベータ（３７℃及び５〜１０％ＣＯ２）に入れた。細胞に化合物を投与した２４時間後、すべてのウェルから培地を取り除き、細胞をＰＢＳ緩衝液（1回、ウェル当たり１ｍＬ）で洗浄した。Ｐｒｏｍｅｇａ溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイ系Ｅ１５００）を希釈し（１×に）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１００×）と混合し、次いで細胞に加えた（１５０μＬ／ウェル）。２分後、各ウェルの内容物を別々の冷たいエッペンドルフチューブに移し、チューブの残りの移動が完了するまでそれを氷上で保った。チューブを遠心した（２分、１３，０００ｒｐｍ、４℃）。各チューブの上清を３つの新しいチューブに慎重に移した（チューブ当たり５０μＬ）。次いで試料を−７０℃で保存した。各試料のアリコートの１つを冷凍庫から取り出し、融解した。アリコート（２０μＬ）をルシフェラーゼアッセイ試薬（１００μＬ、Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイ系Ｅ１５００）と混合し、ルミノメーターによって直ちに読み取りを行った（Ｔｕｒｎｅｒ  ＴＤ−２０Ｅ）。各アリコートにおけるタンパク質の濃度はプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＩＩ，  ＢｉｏＴｅｋ社）を用いてＢＣＡアッセイ（ＢＣＡアッセイキット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって決定した。試料の総タンパク質濃度によって各ルミノメーターの読み取りを正規化した。
【００８２】
実施例４：ｍＲＮＡ転写アッセイ
ｍＲＮＡ単離実験（Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット）を用いて、オリゴオキソピペラジンの、転写活性を変化させる能力も評価した。ＭＣＦ７細胞及びＡ５４９細胞を６穴プレートに播いた（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ＢｉｏＯｎｅ；ＭＣＦ７は１０％ＦＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を伴ったＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）にて３００，０００個／ウェル、Ａ５４９細胞（ＡＴＣＣ）は２％ＦＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を伴ったＦ−１２Ｋ培地（ＡＴＣＣ）にて２００，０００個／ウェル）。次いでプレートを２４時間インキュベータに入れた（３７℃、５〜１０％ＣＯ２）。
【００８３】
７０〜８０％の集密度（２４〜４８時間後）の時点で、対応する培地（ＭＣＦ７は１０％ＦＢＳを伴ったＲＰＭＩ培地、Ａ５４９細胞は０.２％ＦＢＳを伴ったＦ−１２Ｋ培地）におけるケトミン（約１００ｎＭ）、ＢＢ２−１２５（５又は１０μＭ）、ＢＢ２−１６２（５又は１０μＭ）、ＢＢ２−１６４（２０μＭ）、又は溶媒対照の溶液で培地を置き換えた。プレートを６時間インキュベートし（３７℃及び５〜１０％ＣＯ２）、次いでＤＦＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の水溶液（１９．６ｍｇ／ｍＬ、０．２μｍのＴｕｆｆｒｙｎフィルター（ＰＡＬＬ）を通した、ウェル当たり１０μＬ）を適当なウェルに加え、低酸素状態を誘導した。プレートをさらに３時間インキュベートし（３７℃及び５〜１０％ＣＯ２）、次いで湿ったペーパタオルと嫌気性のポーチ（ＢＤ  ＧａｓＰａｋ  ＥＺ  Ｐｏｕｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍ)を含有するプラスチックバッグにプレートを入れて低酸素状態を誘導した。次いでバッグを密封し（ジップロック）、プレートを１５時間、化合物と共に合計２４時間インキュベータ（３７℃及び５〜１０％ＣＯ２）に入れた。
【００８４】
細胞に化合物を投与した２４時間後、すべてのウェルから培地を取り除き、細胞をＰＢＳ緩衝液（２回、ウェル当たり１ｍＬ）で洗浄した。細胞を溶解するために１％ｖ／ｖのβ-メルカプトエタノールを伴ったＲＬＴ緩衝液（３５０μＬ／ウェル）をウェルに加えた。細胞の残渣を注意深くピペットの先端で取り除き、次いで溶解物を各ウェルから別々の１．５ｍＬの回収チューブ（Ａｍｂｉｏｎ）に移した。ウェルをエタノール溶液（７０％水溶液、４００μＬ／ウェル）で洗浄し、一度に１ウェル洗浄し、次いで洗浄液を各回収チューブに移し、粘度の低い均質な溶液が認められるまで、チューブの内容物をピペットで上下させることによってよく混合した。次いで溶解物を回収チューブからＲＮｅａｓｙスピンカラムに移し、それを２ｍＬの回収チューブに入れた。カラムを遠心し（１５秒、１３０００ｒｐｍ、室温）、通過画分を捨てた。各ＲＮｅａｓｙカラムにＲＷ１緩衝液（７００μＬ）を加え、カラムを遠心し（１５秒、１３０００ｒｐｍ、室温）、通過画分を捨てた。各ＲＮｅａｓｙカラムにＲＰＥ緩衝液（無水エタノール中２０％溶液、５００μＬ）を加え、カラムを遠心し（１５秒、１３０００ｒｐｍ、室温）、通過画分を捨て、ＰＲＥ緩衝液による別の洗浄を行った。ＲＮｅａｓｙカラムを新しい２ｍＬの回収チューブに入れ、遠心した（１分、１３０００ｒｐｍ、室温）。通過画分及び回収チューブを捨てた。ＲＮｅａｓｙカラムを新しい１．５ｍＬの回収チューブに入れ、ＲＮＡ分解酵素を含まない水（５０μＬ／試料）によってｍＲＮＡを溶出し、各カラムの中央に直接加え、その後遠心した（２分、１３０００ｒｐｍ、室温）。ＲＮＡｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、０．５μＬ／試料）によってＲＮＡを安定化した。
【００８５】
残留するゲノムＤＮＡを取り除くために、各試料にＴｕｒｂｏＤＮＡ分解酵素緩衝液（１０×、５μＬ）及びＴｕｒｂｏＤＮＡ分解酵素（１μＬ）を加えた。試料を３７℃で３０分間インキュベートした。ＤＮＡ不活化試薬をボルテックスによって再懸濁し、各試料に加えた（５μＬ）。試料を室温で５分間インキュベートし、次いで遠心した（２分、１３０００ｒｐｍ、室温）。上清（ｍＲＮＡの溶液）を新しい回収チューブ（Ａｍｂｉｏｎ）に移した。ｍＲＮＡ試料を２０又は４０倍（期待される濃度範囲に応じて）に希釈し、ＵＶ分光光度計（２６０ｎｍでの吸収）によってｍＲＮＡの濃度を決定した。
【００８６】
ｃＤＮＡを調製するために（ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ逆転写プロトコール、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｍＲＮＡ（１１μＬ）をオリゴ（ｄＴ）１８（１μＬ）、ランダムプライマー（１μＬ）及びｄＮＴＰミックス（１μＬ）と混合した。混合物を６５℃で５分間加熱し、次いで４℃で少なくとも１分間保持し（Ｐ×Ｅ−０．２熱循環装置）、次いでチューブを１３，０００ｒｐｍで１５秒間遠心した。第１の鎖緩衝液（５×、４μＬ）、ＤＴＴ（０．１Ｍ、１μＬ）及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩＲＴ（１μＬ）を各試料に混合し、次いで試料を２５℃で５分間、次いで５０℃で６０分間インキュベートし、最終的に７０℃で１５分間インキュベートして反応を不活化した。ｃＤＮＡの試料は冷凍庫で−８０℃にて保存した。
【００８７】
実施例５：ウエスタンブロッティング
Ａ５４９細胞を６穴プレートに播いた（２００，０００個／ウェル）。４２〜４４時間後、細胞は約７０〜８０％の集密度に達した。次いでウェルすべての培地を、ＤＭＳＯ（０．１％ｖ／ｖ）及び適当な濃度のオリゴオキソピペラジンを含有する新しい培地で置き換えた。１枚のプレートのあらゆるウェルを同じ方法で処理した。３７℃（５％ＣＯ２）での６時間のインキュベートの後、ＢＤ  ＧａｓＰａｋ嫌気性ＥＺポーチに適当なプレートを入れることによって低酸素状態を誘導した。次いで細胞をさらに１８又は４２時間インキュベータに戻した。
【００８８】
インキュベートが終わった後、プレートすべてを氷上に置いた。次いで細胞を氷冷ＰＢＳ（１ｍＬ／ウェルで２回）で洗浄し、常温にてＰｒｏｍｅｇａルシフェラーゼアッセイ溶解緩衝液（水で１×濃度に希釈し、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤カクテルで補完した）で溶解した：３００μＬの溶解緩衝液を使用して１枚のプレートのウェルすべてからの細胞溶解物を回収し、事前に冷却した１．５ｍＬのＰＰチューブに統合した。溶解物を伴ったチューブを１０分間遠心した。各チューブの上清を慎重に回収し、２本の０．５ｍＬのＰＰチューブに分配し、−８０℃で凍結した。
【００８９】
各試料のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイによって決定し、次いで試料を４×Ｌａｅｍｍｌｉ負荷緩衝液と混合した。ポリアクリルアミドゲル（１２％）を作製し、各試料の３０μｇの総タンパク質をゲルに負荷した。ＳＤＳ-ＰＡＧＥを行った（１２０Ｖで１０分間、次いで１４０Ｖで約１時間）。その後、各ゲルからのタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。湿潤転写は、氷槽にてＴｏｗｂｉｎ緩衝液（１９２ｍＭのグリシン、２５のｍＭトリス、２０％のＭｅＯＨ、ｖ／ｖ）中で１．５〜２時間行い、アセンブリを４℃の冷蔵庫に入れた。
【００９０】
転写の後、膜をＴＢＳＴで１０分間洗浄し、次いでミルク（ＴＢＳＴ緩衝液中５％ｗ／ｖ、振動、常温、１時間）によってブロックした。次いで膜をＴＢＳＴ緩衝液にてすすぎ、次いで直ちに一次抗体（ＴＢＳＴ中１％ミルク、４℃、穏やかに振動、一晩）と共にインキュベートした。翌日、膜をＴＢＳＴ緩衝液で洗浄し（３回、各５分間）、次いで適当な二次抗体（ＴＢＳＴ中１％ミルク、穏やかに振動、常温、１時間）と共にインキュベートし、その後、ＴＢＳＴ緩衝液で再び洗浄した（３回、各１０分間）。膜をＥＣＬ溶液で３分間処理し（Ａｍｂｉｏｎ）、次いでＸ線フィルムを膜に暴露した。結果はＩｍａｇｅＪソフトウエアによって定量した。（一次抗体：抗−ＨＩＦ−１α、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マウス、６１０９５９、ロット＃２３６８１、１：７５０；抗−ｃ−Ｍｅｔ（Ｄ１Ｃ２）ＸＰ、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ウサギ、＃８１９８Ｐ、ロット＃１、１：２０００；抗−β−アクチン、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、ウサギ、４９６７Ｓ、ロット６、１：２０００．二次抗体：ヤギ抗−マウスＨＲＰ−標識、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＩｇＧ−ＨＲＰ、ｓｃ−２００５、ロット＃Ｅ０１１２、１：２０００；ウシ抗−ウサギＨＲＰ−標識、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＩｇＧ−ＨＲＰ、ｓｃ−２３７９、ロット＃Ａ１６１２）。
【００９１】
Ａ５４９細胞を上述のような正常酸素状態及び低酸素状態下にてＢＢ２−１６２で処理し、ＨＩＦ及びｃＭｅｔのレベルについて調べた。図２０〜２１に示すように、予想どおり、ＨＩＦタンパク質のレベルはＢＢ２−１６２によって影響されなかったが、ｃＭｅｔのレベルはＢＢ２−１６２で処理された細胞では低下した。このことは、化合物はＨＩＦが媒介する転写を標的とするが、ＨＩＦ自体のレベルを標的とはしないことを裏付けている。
【００９２】
実施例１〜５の考察
オリゴオキソピペラジンは、キラル骨格を特徴とする非ペプチド性へリックス模倣体である（図７を参照）。これらの化合物は、骨格の迅速な多様化を可能にするα−アミノ酸から容易に合成される。α−アミノ酸から構成されるオキソピペラジンの二量体及び三量体の立体構造解析は、これらの化合物が７〜１０量体のα−へリックスの長さに及ぶことを示唆している。オキソピペラジン骨格の立体構造をさらによく理解するために関連する化合物の結晶構造、量子力学的計算及び分子力学シミュレーションが使用されている。結果は、オリゴオキソピペラジンが安定で、幾何学的に適切なヘリックス模倣体を提供するという仮説を支持している。
【００９３】
図８に示すように、オキソピペラジンオリゴマーの効率的なマイクロ波支援型固相合成が開発されている（その全体が参照によって本明細書に組み入れられる、Ａｒｏｒａらの米国特許出願番号１２／９１７，１７６）。合成におけるカギとなる工程には閉環が含まれ、ノシル保護のアミノ酸残基を伴ったミツノブ条件は最高の収率を提供することが見いだされた。
【００９４】
図９に示すように、２巻きのへリックスの一方の面における官能性を模倣するオリゴオキソピペラジンの設計について、予想される最低のエネルギー配座に基づく４つの考えられる選択肢が熟考された。これらの構造を図９にて「二量体Ａ〜Ｃ」及び「三量体」と名付けた。二量体の構造は、標準のへリックス上のオキソピペラジン残基の重なり合いで互いに異なり；二量体Ｃは余分なＮ末端残基を含有する。二量体Ａ及びＢでは、オキソピペラジンの位置Ｒ１及びＲ２がｉ及びｉ＋４残基に重なるが、二量体Ｃでは、これらの位置に位置Ｒ１及びＲ３が重なる。二量体Ａ及びＢはオキソピペラジン骨格の軸の相対的な位置決めで異なり；その重なり合いはＲ４がｉ＋６又はｉ＋7残基と並び得ることを示唆している。二量体Ｃの設計は異なる配列比較を使用し、Ｎ末端のアミノ酸残基が最初の接触を提供する。
【００９５】
本明細書で記載され、図１０及び図１１で説明するように、二量体Ｂ（図１０）及び二量体Ｃ（図１１）のへリックスの重なり合いについてのＨＩＦ−１α模倣体が設計されている。図１２に示すように、コンピュータ解析に基づいて４つの類似体を設計した。ＢＢ２−１６４オリゴオキソピペラジンは二量体Ｃの設計に基づく。ＢＢ２−１６２は二量体Ｂの設計に基づく。ＢＢ２−１２５はＢＢ２−１６２の陰性対照であり、ここでグルタミン残基がアラニン残基で置き換えられる。ＢＢ２−２８２も陰性対照であり、決定的な残基を提示しない。模倣体を設計することにおいては、図１３で説明するように、へリックスαＢ（ＰＤＢコードＩＬ８Ｃ、残基１３９〜１４７）ＨＩＦ−１αの天然のアミノ酸配列を利用した。図１３は、オリゴオキソピペラジンＢＢ２−１６２とへリックスαＢの重なり合いを示す。
【００９６】
細胞生存率のＭＴＴアッセイを行ってオリゴオキソピペラジンの毒性を評価した。図１４に示すように、オリゴオキソピペラジンは２０μＭの濃度までＨｅＬａ細胞に対する毒性効果を発揮せず、ＧＩ５０値は３０μＭだった。
【００９７】
ＶＥＧＦ遺伝子産物がルシフェラーゼ（ＭＤＡ２３１−ＶＥＧＦ−ｌｕｃ）と融合されるルシフェラーゼリポーターアッセイ用いて、図１５で説明するように、細胞に入り、ＨＩＦ−１αが媒介するＶＥＧＦの転写を下方調節するオリゴオキソピペラジンの能力を定量した。図１６に示すように、ＶＥＧＦ−ルシフェラーゼ産物のレベルにおける濃度依存性の低下が、ＢＢ２−１２５、ＢＢ２−１６２及びＢＢ２−１６４によって認められた。２０μＭの濃度では、ＢＢ２−１２５は大まかに７５％ルシフェラーゼの転写を阻止する。比較すると、ＢＢ２−１６４は８８％転写を阻止し、ＢＢ２−１６２は９５％阻止した。従って、ＢＢ２−１６２及びＢＢ２−１６４はＨＩＦ−１αによる転写の強力な阻害剤である。陰性対照は設計されたように、活性がより少ないが、調べたオリゴオキソピペラジンのそれぞれは少なくとも５０％転写を低下させた。とりわけ、この低下はたった１０又は２０μＭの濃度を用いて達成された。このことは、非毒性レベルで十分な転写の低下を達成するＨＩＦ−１α標的について初めての知見を実証するものである。
【００９８】
定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイを用いて転写因子／活性化補助因子の複合体形成の阻害に応答するＶＥＧＦの細胞レベルに関する、設計された化合物の効果を立証した（図１７を参照）。図１８に示すように、ＢＢ２−１６２は、５μＭ及び１０μＭの濃度でそれぞれ２０％及び４０％ＶＥＧＦレベルを低下させる。ＢＢ２−１６４及びＢＢ２−１２５はＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルにさらに小さな効果を有する。ケトミン（ＣＴＭ）は陽性対照として用いた。ケトミンは、Ｚｎ含有タンパク質（ｐ３００／ＣＢＰを含む）を非特異的に変性させることによってＨＩＦ−１αの転写を阻害することが知られており（それぞれ、その全体が参照によって本明細書に組み入れられるCook et al., "Epidithiodiketopiperazines Block the Interaction Between Hypoxia Inducible Factor-1α (HIF-1α) and p300 by a Zinc Ejection Mechanism," J. Biol. Chem. 284:M109.009498 (2009); Kung et al., "Small Molecule Blockade of Transcriptional Coactivation of the Hypoxia-Inducible Factor Pathway," Cancer Cell 6:33-43 (2004)）、有効な濃度で毒性である。ＨＩＦ−１αの、ｐ３００／ＣＢＰとの相互作用は、幾つかの遺伝子の転写を制御する。たとえば、図１９に示すように、ＬＯＸのレベルは３つの化合物すべてによって下方調節されることも見いだされた。
【００９９】
これらの実験は、ＨＩＦ−１αのへリックスαＢのオリゴオキソピペラジン模倣体は低酸素状態が誘導する遺伝子の転写を効果的に阻害することができ、これらの効果は非毒性濃度で達成することができることを明らかにしている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年10月27日(2014.10.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015508779000001.app
【国際調査報告】
2015508779.tif 000037
2015508779.tif 000038
2015508779.tif 000039