(57)【要約】本発明は、一般に、ＨＩＶ  ＲＮＡ成分とＨＩＶ  ポリペプチド成分とを含む免疫原性組成物に関する。抗原エピトープを２つの異なる形態（ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する第１のエピトープであって、ＲＮＡによりコードされる形態にあるエピトープ；およびＨＩＶに由来する第２のエピトープであって、ポリペプチド形態にあるエピトープ）で送達する免疫原性組成物は、ＨＩＶに対する免疫応答の誘導において有効である。本発明は、ＨＩＶ  ＲＮＡに基づく初回刺激組成物とＨＩＶ  ポリペプチドに基づく追加刺激組成物とを含むキットにも関する。キットは、初回刺激組成物および追加刺激組成物の逐次投与のために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子と；
（ｉｉ）第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原と
を含む、免疫原性組成物であって、
前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来するエピトープである、
免疫原性組成物。
【請求項２】
前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとが同じエピトープである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとが異なるエピトープである、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記第１のポリペプチド抗原と前記第２のポリペプチド抗原とが実質的に同じである、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記第１のポリペプチド抗原が可溶性ポリペプチドまたは膜アンカー型ポリペプチドであり、前記第２のポリペプチド抗原が可溶性ポリペプチドである、請求項１から４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記第１のポリペプチド抗原が、異なる病原体に由来する第３のエピトープをさらに含む融合ポリペプチドである、請求項１から５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記第２のポリペプチド抗原が、異なる病原体に由来する第３のエピトープをさらに含む融合ポリペプチドである、請求項１から６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとが、ＨＩＶの同じ亜種に由来するエピトープである、請求項１から７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記自己複製ＲＮＡが、アルファウイルスに由来するＲＮＡレプリコンである、請求項１から８のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記自己複製ＲＮＡ分子が、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、またはカチオン性ナノエマルジョンをさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記ＲＮＡ分子を、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、ならびにこれらの組合せの中に被包する、これらへと結合させる、またはこれらに吸着させる、請求項１から１１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記ＨＩＶ抗原が、独立に、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０およびｇｐ１２０からなる群から選択される、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記ＨＩＶ抗原が、配列番号＿＿＿＿＿＿から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
アジュバントをさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
前記アジュバントがＭＦ５９である、請求項１５に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物と、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルとを含む医薬組成物。
【請求項１８】
被験体における免疫応答を誘導するための方法であって、それを必要とする被験体に、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物を治療有効量で投与するステップを含む方法。
【請求項１９】
被験体にワクチン接種する方法であって、それを必要とする被験体に、請求項１から１７のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む方法。
【請求項２０】
（ｉ）ＨＩＶに由来する第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む初回刺激組成物と；
（ｉｉ）ＨＩＶに由来する第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む追加刺激組成物と
を含むキットであって、
前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとが同じエピトープである、
キット。
【請求項２１】
前記第１のポリペプチド抗原と前記第２のポリペプチド抗原とが実質的に同じである、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記第１のポリペプチド抗原が可溶性ポリペプチドまたは膜アンカー型ポリペプチドであり、前記第２のポリペプチド抗原が可溶性ポリペプチドである、請求項２０または２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記第１のポリペプチド抗原が、融合ポリペプチドである、請求項２０から２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
前記第２のポリペプチド抗原が、融合ポリペプチドである、請求項２０から２３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２５】
前記自己複製ＲＮＡが、アルファウイルスに由来するＲＮＡレプリコンである、請求項２０から２４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２６】
前記自己複製ＲＮＡ分子が、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項２０から２５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２７】
前記初回刺激組成物が、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、またはカチオン性ナノエマルジョンをさらに含む、請求項２０から２６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２８】
前記ＲＮＡ分子を、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、ならびにこれらの組合せの中に被包する、これらへと結合させる、またはこれらに吸着させる、請求項２０から２７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２９】
前記ＨＩＶ抗原が、独立に、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０およびｇｐ１２０からなる群から選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項３０】
前記ＨＩＶ抗原が、配列番号＿＿＿＿＿＿から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記初回刺激組成物、前記追加刺激組成物、またはこれらの両方が、アジュバントを含む、請求項２０から３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
前記アジュバントがＭＦ５９である、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記初回刺激組成物、前記追加刺激組成物、またはこれらの両方が、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルを含む、請求項２０から３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３４】
被験体における免疫応答を生じさせる方法であって、
（ｉ）それを必要とする被験体に、ＨＩＶに由来する第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと；
（ｉｉ）その後前記被験体に、ＨＩＶに由来する第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと
を含み；前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとが同じエピトープである、
方法。
【請求項３５】
被験体にワクチン接種する方法であって、
（ｉ）それを必要とする被験体に、ＨＩＶに由来する第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと；
（ｉｉ）その後前記被験体に、ＨＩＶに由来する第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと
を含み；前記第１のエピトープと前記第２のエピトープとが同じエピトープである、
方法。
【請求項３６】
前記第１のポリペプチド抗原と前記第２のポリペプチド抗原とが実質的に同じである、請求項３４または請求項３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１のポリペプチド抗原が可溶性ポリペプチドまたは膜アンカー型ポリペプチドであり、前記第２のポリペプチド抗原が可溶性ポリペプチドである、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１のポリペプチド抗原が、融合ポリペプチドである、請求項３４から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２のポリペプチド抗原が、融合ポリペプチドである、請求項３４から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記自己複製ＲＮＡが、アルファウイルスに由来するＲＮＡレプリコンである、請求項３４から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記自己複製ＲＮＡ分子が、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを含む、請求項３４から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記初回刺激組成物が、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、またはカチオン性ナノエマルジョンをさらに含む、請求項３４から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＲＮＡ分子を、カチオン性脂質、リポソーム、コクリエート、ウィロソーム、免疫刺激複合体、微粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、単層小胞、多重膜小胞、水中油エマルジョン、油中水エマルジョン、エマルソーム、およびポリカチオン性ペプチド、カチオン性ナノエマルジョン、ならびにこれらの組合せの中に被包する、これらへと結合させる、またはこれらに吸着させる、請求項３４から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＨＩＶ抗原が、独立に、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０およびｇｐ１２０からなる群から選択される、請求項３４から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＨＩＶ抗原が、配列番号から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記初回刺激組成物、前記追加刺激組成物、またはこれらの両方が、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルを含む、請求項３４から４５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１２年７月６日に出願された米国仮特許出願第６１／６６９，０１０号、２０１２年９月１０日に出願された米国仮特許出願第６１／６９８，９７１号の利益を主張し、この米国仮特許出願の全体の内容は、あらゆる目的のために本明細書中に参考として援用される。
政府による資金提供
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与されたＨＩＶＲＡＤ  Ｇｒａｎｔ  Ｎｏ．５  ＰＯ１ＡＩ０６６２８７；国立衛生研究所により授与されたＨＩＶ  ＤＤＴ  ＡＤＢ  Ｃｏｎｔｒａｃｔ  Ｎｏ．ＮＯ１−ＡＩ−５０００７；および国立衛生研究所により授与されたＨＩＶ  ＤＤＴ  Ｃｏｎｔｒａｃｔ  Ｎｏ．ＨＨＳＮ２６６２００５００００７Ｃの下で政府支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶとも称される）は、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および関連する障害の病原因子である（例えば、Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら（１９８３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０巻：８６８〜８７１頁；Ｇａｌｌｏら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４巻：５００〜５０３頁；Ｌｅｖｙら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５巻：８４０〜８４２頁；Ｓｉｅｇａｌら（１９８１年）Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３０５巻：１４３９〜１４４４頁を参照されたい）。ヨーロッパまたはアメリカにおいて単離された数種類の株に関する集合的な用語であるＨＩＶ−１、および多くの西アフリカ諸国に流行している株であるＨＩＶ−２を含めたＨＩＶの株がいくつか公知である。ＨＩＶ−１は、系統発生解析により、グループＭ（主系統）、グループＯ（アウトライヤー）、および、カメルーンの発生中心地で同定されたグループＮと称されるＨＩＶ−１のバリアント（Ｓｉｍｏｎら（１９９８年）Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ４巻：１０３２〜１０３７頁）の３つのグループに分類される。ＨＩＶ−１の３つのグループの全てによりＡＩＤＳが引き起こされる。
【０００３】
ＡＩＤＳ患者では、通常、長い期間にわたって無症候であり、その後、免疫系および中枢神経系の変性が進行する。組織培養物において、ウイルスの複製は高度に調節され、Ｔ−リンパ球のＣＤ４陽性ヘルパーサブセットの潜伏感染および溶解感染の両方が起こる（Ｚａｇｕｒｙら（１９８６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１巻：８５０〜８５３頁）。ＨＩＶ−１の分子試験により、ＨＩＶ−１が、全てのレトロウイルスに共通の３つの構造遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含めたいくつもの遺伝子をコードすることが示されている（Ｒａｔｎｅｒら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３巻：２７７〜２８４頁；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７巻：４８４〜４９２頁）。他のレトロウイルス、特にＨＩＶ−２およびサル免疫不全ウイルスであるＳＩＶ（以前はＳＴＬＶ−ＩＩＩと称されていた）のウイルスのゲノムに由来するヌクレオチド配列もこれらの構造遺伝子を含有する（Ｇｕｙａｄｅｒら（１９８７年）Ｎａｔｕｒｅ  ３２６巻：６６２〜６６９頁）。
【０００４】
ＨＩＶ−１、ＨＴＶ−２およびＳＩＶのエンベロープタンパク質は、約１６０ｋｄの糖タンパク質（ｇｐ１６０）である。宿主細胞へのウイルス感染の間に、ｇｐ１６０が宿主細胞のプロテアーゼによって切断されてｇｐ１２０および内在性膜タンパク質であるｇｐ４１が形成される。ｇｐ４１部分はビリオンの膜内二重層につなぎ留められ、一方、ｇｐ１２０セグメントは周囲の環境に突出する。ｇｐ１２０およびｇｐ４１はより共有結合的に結びつき、遊離のｇｐ１２０がビリオンおよび感染細胞の表面から放出されうる。さらに、その受容体であるＣＤ４と結合すると、Ｅｎｖポリペプチドは著しい構造の再構成を受ける。このコンフォメーションの変化の後、ＣＣＲ５または他のケモカイン結合性コレセプター結合部位が露出する。このケモカイン受容体結合部位の露出により、今度は、ウイルスの宿主細胞への進入が媒介される。例えば、Ｗｙａｔｔ，  Ｒ．ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３巻：７０５〜７１１頁；Ｋｗｏｎｇ，  Ｐ．ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３巻：６４８〜６５９頁を参照されたい。
ＨＩＶ感染に対して患者を免疫するためのワクチンは２０年にわたって開発されているが、限られた成功しか得られていない。免疫するための多くの手法は、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質に焦点を当てるものであったが、ｔａｔまたはｇａｇなどの他の抗原も対象とされてきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂａｒｒｅ−Ｓｉｎｏｕｓｓｉら（１９８３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２０巻：８６８〜８７１頁
【非特許文献２】Ｇａｌｌｏら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２４巻：５００〜５０３頁
【非特許文献３】Ｌｅｖｙら（１９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５巻：８４０〜８４２頁
【非特許文献４】Ｓｉｅｇａｌら（１９８１年）Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３０５巻：１４３９〜１４４４頁
【非特許文献５】Ｓｉｍｏｎら（１９９８年）Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  ４巻：１０３２〜１０３７頁
【非特許文献６】Ｚａｇｕｒｙら（１９８６年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３１巻：８５０〜８５３頁
【非特許文献７】Ｒａｔｎｅｒら（１９８５年）Ｎａｔｕｒｅ  ３１３巻：２７７〜２８４頁
【非特許文献８】Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄｏｒら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２７巻：４８４〜４９２頁
【非特許文献９】Ｇｕｙａｄｅｒら（１９８７年）Ｎａｔｕｒｅ  ３２６巻：６６２〜６６９頁
【非特許文献１０】Ｗｙａｔｔ，  Ｒ．ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３巻：７０５〜７１１頁
【非特許文献１１】Ｋｗｏｎｇ，  Ｐ．ら（１９９８年）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３巻：６４８〜６５９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
例えばワクチンまたは免疫原性組成物（ｃｏｍｐｏｓｔｉｏｎ）として投与した場合に、被験体において種々のＨＩＶ株および亜型に対する免疫学的応答（例えば、中和抗体および／または防御抗体）を引き出すことができる組成物が依然として必要とされている。ＨＩＶに対する免疫の改善された方法も依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明を記載するために使用される特定の用語は、本明細書のセクション６において定義され、説明されている。
【０００８】
本発明は、一般に、ＨＩＶ  ＲＮＡ成分とＨＩＶ  ポリペプチド成分とを含む免疫原性組成物に関する。抗原エピトープを２つの異なる形態（ＨＩＶに由来する第１のエピトープであって、ＲＮＡによりコードされる形態にあるエピトープ；およびＨＩＶに由来する第２のエピトープであって、ポリペプチド形態にあるエピトープ）で送達する免疫原性組成物は、ＲＮＡを単独で用いた免疫、またはポリペプチドを単独で用いた免疫と比較して、ＨＩＶに対する免疫応答を増強しうる。好ましくは、第１のエピトープと第２のエピトープとは同じエピトープである。
【０００９】
本発明は、逐次投与するための、ＨＩＶ  ＲＮＡに基づく初回刺激組成物とＨＩＶ  ポリペプチドに基づく追加刺激組成物とを含むキットにも関する。キットは、例えば、ＨＩＶに対する免疫応答を発生させるための「ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」の免疫レジメンに適する。
【００１０】
本発明は、ＨＩＶ感染を処置または予防するための方法、免疫応答（例えば、中和抗体応答などの体液性応答および／または細胞性免疫応答）を誘導するための方法、ならびにＨＩＶ  ＲＮＡ分子とＨＩＶ  ポリペプチド分子とを共送達すること（共投与）によって被験体にワクチン接種する方法にも関する。
【００１１】
本発明は、ＨＩＶを処置または予防するための方法、免疫応答を誘導するための方法、または、ＨＩＶ  ＲＮＡ分子とＨＩＶ  ポリペプチド分子とを逐次投与すること（初回刺激−追加刺激）によって被験体にワクチン接種する方法にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、実施例ＶＩのＨＩＶ  ｇｐ１６０／ｇｐ１４０製剤をＢＡＬＢ／ｃマウスに投与するための免疫スケジュールを示す図である。「ＰＲＥ」とは、タンパク質による追加刺激を行う前の時点を指し、「ＰＯＳＴ」とは、タンパク質による追加刺激を行った後の時点を指す。
【００１３】
【図２−１】図２は、実施例ＩのＨＩＶ  ｇｐ１６０／ｇｐ１４０製剤のＢＡＬＢ／ｃマウスに対する有害作用が要約されたグラフである。ＲＮＡレプリコンと、それにコードされるタンパク質抗原とを共送達することによって有害作用は示されなかった。
【図２−２】図２は、実施例ＩのＨＩＶ  ｇｐ１６０／ｇｐ１４０製剤のＢＡＬＢ／ｃマウスに対する有害作用が要約されたグラフである。ＲＮＡレプリコンと、それにコードされるタンパク質抗原とを共送達することによって有害作用は示されなかった。
【図２−３】図２は、実施例ＩのＨＩＶ  ｇｐ１６０／ｇｐ１４０製剤のＢＡＬＢ／ｃマウスに対する有害作用が要約されたグラフである。ＲＮＡレプリコンと、それにコードされるタンパク質抗原とを共送達することによって有害作用は示されなかった。
【００１４】
【図３Ａ】図３Ａは、実施例ＩのＨＩＶ  ｇｐ１６０／ｇｐ１４０製剤を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、さまざまな時点でのＨＩＶ  ｇｐ１４０特異的ＩｇＧ抗体力価を示すグラフである。グラフの一番上の行の数字は、各群の検査された動物の総数のうち、検出可能なＩｇＧ応答を示す動物の数を指す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、同じマウス５匹における追加刺激（１０μｇのタンパク質／ＭＦ５９、表Ｉ−１を参照されたい）を行う前後の抗ｇｐ１４０  ＩｇＧ力価を比較したグラフである。タンパク質による追加刺激を行った後、１μｇのＲＮＡ／リポソームによる初回刺激を受けた群のＩｇＧ力価は、１５μｇのＤＮＡ／リポソームによる初回刺激を受けた群、ＶＲＰ（１ｅ７）による初回刺激を受けた群、またはタンパク質による初回刺激を受けた群のＩｇＧ力価と有意に異ならなかった。
【００１５】
【図４Ａ】図４Ａは、免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスのＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａプロファイルを示すグラフである。ＲＮＡ／リポソーム製剤により、ＶＲＰによるものと類似したバランスのとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ亜型プロファイルが誘導された。実施例ＩのＨＩＶ  ｇｐ１６０／ｇｐ１４０製剤（表Ｉ−１を参照されたい）を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの力価が示されている。
【図４Ｂ】図４Ｂは、免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスのＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａプロファイルを示すグラフである。ＲＮＡ／リポソーム製剤により、ＶＲＰによるものと類似したバランスのとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ亜型プロファイルが誘導された。実施例ＩのＨＩＶ  ｇｐ１６０／ｇｐ１４０製剤（表Ｉ−１を参照されたい）を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比が示されている。
【図４Ｃ】図４Ｃは、免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスのＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａプロファイルを示すグラフである。ＲＮＡ／リポソーム製剤により、ＶＲＰによるものと類似したバランスのとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ亜型プロファイルが誘導された。裸のＲＮＡによる初回刺激を受けた群における、タンパク質／ＭＦ５９による追加刺激後のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの力価ならびにＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比が示されている（ＩｇＧ力価は、タンパク質／ＭＦ５９による追加刺激前には検出不可能であった）。
【００１６】
【図５】図５は、どちらもリポソームとして製剤化されたＲＮＡとして送達した、クレードＣ（ＤＵ４２２．１）ｇｐ１６０抗原とクレードＢ（ＳＦ１６２）ｇｐ１６０抗原の免疫原性を比較したグラフである。追加刺激後のＴｈ１型ＩｇＧ応答およびＴｈ２型ＩｇＧ応答について、クレードＢ抗原とクレードＣ抗原のどちらについてもバランスのとれたプロファイルが示された。
【００１７】
【図６Ａ】図６Ａは、実施例ＩのＨＩＶ  ｇｐ１６０／ｇｐ１４０製剤によって誘導されたＴ細胞応答を示すグラフである。サイトカイン分泌細胞の百分率によって測定されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答が示されている。
【図６Ｂ】図６Ｂは、実施例ＩのＨＩＶ  ｇｐ１６０／ｇｐ１４０製剤によって誘導されたＴ細胞応答を示すグラフである。サイトカイン分泌細胞の百分率によって測定されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答が示されている。
【００１８】
【図７−１】図７は、実施例ＩのＨＩＶ  ｇｐ１６０／ｇｐ１４０製剤を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの膣洗浄物におけるｇｐ１４０特異的ＩｇＡ抗体力価を示すグラフである。
【図７−２】図７は、実施例ＩのＨＩＶ  ｇｐ１６０／ｇｐ１４０製剤を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの膣洗浄物におけるｇｐ１４０特異的ＩｇＡ抗体力価を示すグラフである。
【００１９】
【図８】図８は、実施例ＩＩの種々のＨＩＶ  ｇｐ１４０製剤をＢＡＬＢ／ｃマウスに投与するための免疫スケジュールを示す図である。
【００２０】
【図９−１】図９は、実施例ＩＩのＨＩＶ  ｇｐ１４０製剤のＢＡＬＢ／ｃマウスに対する有害作用が要約されたグラフである。ＲＮＡレプリコンと、それにコードされるタンパク質抗原とを共送達することによって有害作用は示されなかった。
【図９−２】図９は、実施例ＩＩのＨＩＶ  ｇｐ１４０製剤のＢＡＬＢ／ｃマウスに対する有害作用が要約されたグラフである。ＲＮＡレプリコンと、それにコードされるタンパク質抗原とを共送達することによって有害作用は示されなかった。
【図９−３】図９は、実施例ＩＩのＨＩＶ  ｇｐ１４０製剤のＢＡＬＢ／ｃマウスに対する有害作用が要約されたグラフである。ＲＮＡレプリコンと、それにコードされるタンパク質抗原とを共送達することによって有害作用は示されなかった。
【００２１】
【図１０】図１０は、実施例ＩＩのＨＩＶ  ｇｐ１４０製剤を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＩＶ  ｇｐ１４０特異的ＩｇＧ抗体力価（追加刺激前）を示すグラフである。ＲＮＡレプリコンとｇｐ１４０タンパク質とを組み合わせることにより、ＲＮＡレプリコン単独によるものと比較して、より強力な免疫応答が誘導された。
【００２２】
【図１１】図１１は、追加刺激（１０μｇのタンパク質／ＭＦ５９）を行った後の抗ｇｐ１４０  ＩｇＧ力価を示すグラフである。
【００２３】
【図１２Ａ】図１２Ａは、実施例ＩのＨＩＶ  ｇｐ１４０製剤を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスのＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａプロファイルを示すグラフである。ＲＮＡ／リポソーム製剤およびＲＮＡ／リポソーム／タンパク質製剤により、ＶＲＰによるものと類似したバランスのとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ亜型プロファイルが誘導された。実施例ＩＩのＨＩＶ  ｇｐ１４０製剤を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの力価が示されている。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、実施例ＩのＨＩＶ  ｇｐ１４０製剤を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスのＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａプロファイルを示すグラフである。ＲＮＡ／リポソーム製剤およびＲＮＡ／リポソーム／タンパク質製剤により、ＶＲＰによるものと類似したバランスのとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ亜型プロファイルが誘導された。実施例ＩＩのＨＩＶ  ｇｐ１４０製剤を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ比が示されている。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、裸のＲＮＡによる初回刺激を受けた群における、タンパク質／ＭＦ５９による追加刺激後のＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの力価を示すグラフである（ＩｇＧ力価は、タンパク質／ＭＦ５９による追加刺激前には検出不可能であった）。
【００２４】
【図１３−１】図１３は、実施例ＩＩのＨＩＶ  ｇｐ１４０製剤を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの膣洗浄物におけるｇｐ１４０特異的ＩｇＡ抗体力価を示すグラフである。
【図１３−２】図１３は、実施例ＩＩのＨＩＶ  ｇｐ１４０製剤を投与したＢＡＬＢ／ｃマウスの膣洗浄物におけるｇｐ１４０特異的ＩｇＡ抗体力価を示すグラフである。
【００２５】
【図１４】図１４は、ＲＮＡによるワクチン接種後のウサギにおける抗Ｅｎｖ  ＩｇＧ結合抗体力価を示すグラフである。群当たり５羽のウサギを、０週目および４週目にそれぞれのワクチンを用いて筋肉内に免疫し、その後、１２週目および２４週目に、ＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０（ＴＶ１．Ｃ）（Ｅｎｖ／ＭＦ５９）ワクチンを用いて２回追加刺激した。核酸およびＶＲＰワクチンはＴＶ１．Ｃのｏ−ｇｐ１４０タンパク質をコードした。ＴＶ１．Ｃ  ｏ−ｇｐ１４０に対する抗Ｅｎｖ結合抗体力価を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。血清の力価測定を１：４００の希釈度から行った（点線）。ＳＥＭを伴う幾何平均力価が示されている。
【００２６】
【図１５】図１５は、ＲＮＡによるワクチン接種を行うと、ＭＷ９６５  Ｅｎｖシュードウイルス（ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ）を中和する抗体が誘導されることを示すグラフである。２ｗｐ２、２ｗｐ３、および２ｗｐ４の時点の血清を、ＭＷ９６５  Ｅｎｖシュードウイルスを用いたＵ８７  ＣＤ４  ＣＣＲ５中和アッセイを使用して中和についてアッセイした。各符号は、ウサギについて得られた力価であり、横棒は幾何平均力価を示す。グラフの上の数字は５羽のウサギのうちの応答者（血清力価測定を開始した１：１６０以上の力価；点線）の数を示す。ダンの事後検定を用いたクラスカル・ワリス検定を使用して統計解析を行った。
【００２７】
【図１６Ａ】図１６Ａ〜Ｂはウサギの膣洗浄物における総Ｉｇ力価（Ａ）および抗Ｅｎｖ  Ｉｇ力価（Ｂ）を示すグラフである。試料の力価測定を、１：２５（総Ｉｇ；Ａ）またはニート（抗Ｅｎｖ  Ｉｇ；Ｂ）で開始し、ＥＬＩＳＡプレートで抗ウサギＩｇ捕捉抗体（Ａ）またはコーティングされたＥｎｖタンパク質（Ｂ）を使用して行った。Ｅｎｖ特異的Ｉｇのグラフ（Ｂ）の一番下のカットオフ２は任意である。免疫前の洗浄物の９０％超の力価がニートと２の間になり、したがって、これをカットオフ力価として選択した。少数の例では、免疫前の洗浄物（群に応じてウサギ１〜２羽）の非特異的力価が高かった（＞２）。これらが採取されたウサギを全ての時点について分析から除いた。各群の横棒は幾何平均力価を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜Ｂはウサギの膣洗浄物における総Ｉｇ力価（Ａ）および抗Ｅｎｖ  Ｉｇ力価（Ｂ）を示すグラフである。試料の力価測定を、１：２５（総Ｉｇ；Ａ）またはニート（抗Ｅｎｖ  Ｉｇ；Ｂ）で開始し、ＥＬＩＳＡプレートで抗ウサギＩｇ捕捉抗体（Ａ）またはコーティングされたＥｎｖタンパク質（Ｂ）を使用して行った。Ｅｎｖ特異的Ｉｇのグラフ（Ｂ）の一番下のカットオフ２は任意である。免疫前の洗浄物の９０％超の力価がニートと２の間になり、したがって、これをカットオフ力価として選択した。少数の例では、免疫前の洗浄物（群に応じてウサギ１〜２羽）の非特異的力価が高かった（＞２）。これらが採取されたウサギを全ての時点について分析から除いた。各群の横棒は幾何平均力価を示す。
【００２８】
【図１７Ａ】図１７Ａ〜Ｄは、ＲＮＡによるワクチン接種後のアカゲザルにおける抗Ｅｎｖ  ＩｇＧ結合抗体力価を示す図である。群当たり６匹のサルを、０週目、４週目、および１２週目にそれぞれのワクチンを用いて筋肉内に免疫し（ｘ軸上の黒い三角形）、その後、２４週目および３６週目にＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０（ＴＶ１．Ｃ）（Ｅｎｖ／ＭＦ５９）ワクチンを用いて２回追加刺激した（ｘ軸上の白抜きの三角形）。核酸およびＶＲＰワクチンはＴＶ１．Ｃのｏ−ｇｐ１４０タンパク質をコードした。ＴＶ１．Ｃ  ｏ−ｇｐ１４０に対する抗Ｅｎｖ結合抗体力価を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。血清の力価測定を１：２５の希釈度から行った。各符号は、サル１匹からの力価を示し、各グラフの上の数字は６匹のサルのうちの応答者（１：２５を超える力価）の数を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜Ｄは、ＲＮＡによるワクチン接種後のアカゲザルにおける抗Ｅｎｖ  ＩｇＧ結合抗体力価を示す図である。群当たり６匹のサルを、０週目、４週目、および１２週目にそれぞれのワクチンを用いて筋肉内に免疫し（ｘ軸上の黒い三角形）、その後、２４週目および３６週目にＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０（ＴＶ１．Ｃ）（Ｅｎｖ／ＭＦ５９）ワクチンを用いて２回追加刺激した（ｘ軸上の白抜きの三角形）。核酸およびＶＲＰワクチンはＴＶ１．Ｃのｏ−ｇｐ１４０タンパク質をコードした。ＴＶ１．Ｃ  ｏ−ｇｐ１４０に対する抗Ｅｎｖ結合抗体力価を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。血清の力価測定を１：２５の希釈度から行った。各符号は、サル１匹からの力価を示し、各グラフの上の数字は６匹のサルのうちの応答者（１：２５を超える力価）の数を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ａ〜Ｄは、ＲＮＡによるワクチン接種後のアカゲザルにおける抗Ｅｎｖ  ＩｇＧ結合抗体力価を示す図である。群当たり６匹のサルを、０週目、４週目、および１２週目にそれぞれのワクチンを用いて筋肉内に免疫し（ｘ軸上の黒い三角形）、その後、２４週目および３６週目にＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０（ＴＶ１．Ｃ）（Ｅｎｖ／ＭＦ５９）ワクチンを用いて２回追加刺激した（ｘ軸上の白抜きの三角形）。核酸およびＶＲＰワクチンはＴＶ１．Ｃのｏ−ｇｐ１４０タンパク質をコードした。ＴＶ１．Ｃ  ｏ−ｇｐ１４０に対する抗Ｅｎｖ結合抗体力価を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。血清の力価測定を１：２５の希釈度から行った。各符号は、サル１匹からの力価を示し、各グラフの上の数字は６匹のサルのうちの応答者（１：２５を超える力価）の数を示す。
【図１７Ｄ】図１７Ａ〜Ｄは、ＲＮＡによるワクチン接種後のアカゲザルにおける抗Ｅｎｖ  ＩｇＧ結合抗体力価を示す図である。群当たり６匹のサルを、０週目、４週目、および１２週目にそれぞれのワクチンを用いて筋肉内に免疫し（ｘ軸上の黒い三角形）、その後、２４週目および３６週目にＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０（ＴＶ１．Ｃ）（Ｅｎｖ／ＭＦ５９）ワクチンを用いて２回追加刺激した（ｘ軸上の白抜きの三角形）。核酸およびＶＲＰワクチンはＴＶ１．Ｃのｏ−ｇｐ１４０タンパク質をコードした。ＴＶ１．Ｃ  ｏ−ｇｐ１４０に対する抗Ｅｎｖ結合抗体力価を、ＥＬＩＳＡを使用して決定した。血清の力価測定を１：２５の希釈度から行った。各符号は、サル１匹からの力価を示し、各グラフの上の数字は６匹のサルのうちの応答者（１：２５を超える力価）の数を示す。
【００２９】
【図１８−１】図１８は、ＲＮＡによるワクチン接種後のアカゲザルにおける抗ＥｎｖＴ細胞応答を示すグラフである。それぞれの群からの免疫されたサルのそれぞれに由来するＰＢＭＣを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、コンセンサスクレードＣ  ｇｐ１２０ペプチドライブラリーのプール（最初の列）またはコンセンサスクレードＣ  ｇｐ４１ペプチドライブラリーのプール（中央の列）またはＴＶ１．Ｃタンパク質のいずれかを用いて再刺激した。グラフは、群当たりの個々のサル（ｍａｃｑｕｅ）についてのＰＢＭＣ１０６個当たりのＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数として表された経時的なＴ細胞応答を示す。グラフの下の矢印は免疫を示す。
【図１８−２】図１８は、ＲＮＡによるワクチン接種後のアカゲザルにおける抗ＥｎｖＴ細胞応答を示すグラフである。それぞれの群からの免疫されたサルのそれぞれに由来するＰＢＭＣを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、コンセンサスクレードＣ  ｇｐ１２０ペプチドライブラリーのプール（最初の列）またはコンセンサスクレードＣ  ｇｐ４１ペプチドライブラリーのプール（中央の列）またはＴＶ１．Ｃタンパク質のいずれかを用いて再刺激した。グラフは、群当たりの個々のサル（ｍａｃｑｕｅ）についてのＰＢＭＣ１０６個当たりのＩＦＮγスポット形成細胞（ＳＦＣ）の数として表された経時的なＴ細胞応答を示す。グラフの下の矢印は免疫を示す。
【００３０】
【図１９Ａ−１】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図１９Ａ−２】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図１９Ｂ−１】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図１９Ｂ−２】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図１９Ｂ−３】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図１９Ｃ−１】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図１９Ｃ−２】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図１９Ｃ−３】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図１９Ｄ−１】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図１９Ｄ−２】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図１９Ｄ−３】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図１９Ｅ−１】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図１９Ｅ−２】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図１９Ｅ−３】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図１９Ｆ−１】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図１９Ｆ−２】図１９は、Ｈ３５１［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【００３１】
【図２０Ａ−１】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２０Ａ−２】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２０Ｂ−１】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２０Ｂ−２】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２０Ｂ−３】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２０Ｃ−１】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２０Ｃ−２】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２０Ｃ−３】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２０Ｄ−１】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２０Ｄ−２】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２０Ｄ−３】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２０Ｅ−１】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２０Ｅ−２】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２０Ｅ−３】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２０Ｆ−１】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２０Ｆ−２】図２０は、Ｈ３５０［Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−Ｄｕ４２２．１  ｇｐ１６０ｍｏｄ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【００３２】
【図２１Ａ−１】図２１は、Ｈ３５４［Ｔ７（−Ｇ）−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２１Ａ−２】図２１は、Ｈ３５４［Ｔ７（−Ｇ）−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２１Ｂ−１】図２１は、Ｈ３５４［Ｔ７（−Ｇ）−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２１Ｂ−２】図２１は、Ｈ３５４［Ｔ７（−Ｇ）−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２１Ｂ−３】図２１は、Ｈ３５４［Ｔ７（−Ｇ）−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２１Ｃ−１】図２１は、Ｈ３５４［Ｔ７（−Ｇ）−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２１Ｃ−２】図２１は、Ｈ３５４［Ｔ７（−Ｇ）−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２１Ｃ−３】図２１は、Ｈ３５４［Ｔ７（−Ｇ）−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２１Ｄ−１】図２１は、Ｈ３５４［Ｔ７（−Ｇ）−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２１Ｄ−２】図２１は、Ｈ３５４［Ｔ７（−Ｇ）−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２１Ｄ−３】図２１は、Ｈ３５４［Ｔ７（−Ｇ）−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２１Ｅ−１】図２１は、Ｈ３５４［Ｔ７（−Ｇ）−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２１Ｅ−２】図２１は、Ｈ３５４［Ｔ７（−Ｇ）−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２１Ｆ−１】図２１は、Ｈ３５４［Ｔ７（−Ｇ）−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２１Ｆ−２】図２１は、Ｈ３５４［Ｔ７（−Ｇ）−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【００３３】
【図２２Ａ】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｂ−１】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｂ−２】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｂ−３】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｃ−１】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｃ−２】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｃ−３】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｃ−４】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｃ−５】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｄ−１】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｄ−２】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｄ−３】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｅ−１】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｅ−２】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｅ−３】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｆ−１】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｆ−２】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｇ−１】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【図２２Ｇ−２】図２２は、Ｈ４１２［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＳＦ１６２  ＴＰＡ−ｇｐ１６０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物；ならびにＨ４２５［ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ＴＶ１ｃ８．２  ＴＰＡ  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ＵＮＣ］ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物を示す図である。
【００３４】
【図２３】図２３は、ＲＮＡによるワクチン接種後、ＲＮＡおよびタンパク質によるワクチン接種後、またはタンパク質のみによるワクチン接種後のウサギのＥｎｖ特異的結合ＩｇＧ力価を示すグラフである。ウサギ（ｎ＝６）を、０週目および４週目にＨＩＶ−ＳＡＭ／ＣＭＦ３４ワクチン２５μｇおよび／またはＭＦ５９でアジュバント処理したＥｎｖワクチンもしくはミョウバンでアジュバント処理したＥｎｖワクチン２５μｇを用いて免疫した。ＨＩＶ−ＳＡＭ／ＣＭＦ３４と、ＭＦ５９でアジュバント処理したＥｎｖワクチンまたはミョウバンでアジュバント処理したＥｎｖワクチンとを同時にワクチン接種するために、動物に、ワクチンを同じ四頭筋におよそ３ｃｍ離して（同じ側、２カ所）接種するか、または各ワクチンを１本の脚の四頭筋に免疫した（ｏｐｐ．Ｓｉｄｅ−反対側）。２回目の免疫の２週間後（２ｗｐ２）または８週間後（８ｗｐ２）の血清をＥＬＩＳＡによってアッセイして、ＴＶ１、ｇｐ１４０  Ｅｎｖ特異的結合ＩｇＧ力価を推定した。グラフ中の各符号はウサギについての力価を示し、群ごとの横線は幾何平均力価を示す。
【００３５】
【図２４Ａ−１】図２４Ａは、時間内にワクチンにより誘導された抗原特異的なＴ細胞応答を示すグラフである。群ごとの個々の動物全てのＰＢＭＣによるｇｐ１２０コンセンサス（Ｃｏｎｓ）Ｃペプチドプール（ｐｐ）、ｇｐ４１  Ｃｏｎｓ  Ｃ  ｐｐ、または組換えＴＶ１  ｇｐ１４０に対するＩＦＮγの分泌をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。
【図２４Ａ−２】図２４Ａは、時間内にワクチンにより誘導された抗原特異的なＴ細胞応答を示すグラフである。群ごとの個々の動物全てのＰＢＭＣによるｇｐ１２０コンセンサス（Ｃｏｎｓ）Ｃペプチドプール（ｐｐ）、ｇｐ４１  Ｃｏｎｓ  Ｃ  ｐｐ、または組換えＴＶ１  ｇｐ１４０に対するＩＦＮγの分泌をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。
【図２４Ａ−３】図２４Ａは、時間内にワクチンにより誘導された抗原特異的なＴ細胞応答を示すグラフである。群ごとの個々の動物全てのＰＢＭＣによるｇｐ１２０コンセンサス（Ｃｏｎｓ）Ｃペプチドプール（ｐｐ）、ｇｐ４１  Ｃｏｎｓ  Ｃ  ｐｐ、または組換えＴＶ１  ｇｐ１４０に対するＩＦＮγの分泌をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。
【図２４Ａ−４】図２４Ａは、時間内にワクチンにより誘導された抗原特異的なＴ細胞応答を示すグラフである。群ごとの個々の動物全てのＰＢＭＣによるｇｐ１２０コンセンサス（Ｃｏｎｓ）Ｃペプチドプール（ｐｐ）、ｇｐ４１  Ｃｏｎｓ  Ｃ  ｐｐ、または組換えＴＶ１  ｇｐ１４０に対するＩＦＮγの分泌をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。
【図２４Ｂ−１】図２４Ｂは、時間内にワクチンにより誘導された抗原特異的なＴ細胞応答を示すグラフである。群ごとの個々の動物全てのＰＢＭＣによるｇｐ１２０コンセンサス（Ｃｏｎｓ）Ｃペプチドプール（ｐｐ）、ｇｐ４１  Ｃｏｎｓ  Ｃ  ｐｐ、または組換えＴＶ１  ｇｐ１４０に対するＩＬ２の分泌をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。
【図２４Ｂ−２】図２４Ｂは、時間内にワクチンにより誘導された抗原特異的なＴ細胞応答を示すグラフである。群ごとの個々の動物全てのＰＢＭＣによるｇｐ１２０コンセンサス（Ｃｏｎｓ）Ｃペプチドプール（ｐｐ）、ｇｐ４１  Ｃｏｎｓ  Ｃ  ｐｐ、または組換えＴＶ１  ｇｐ１４０に対するＩＬ２の分泌をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。
【図２４Ｂ−３】図２４Ｂは、時間内にワクチンにより誘導された抗原特異的なＴ細胞応答を示すグラフである。群ごとの個々の動物全てのＰＢＭＣによるｇｐ１２０コンセンサス（Ｃｏｎｓ）Ｃペプチドプール（ｐｐ）、ｇｐ４１  Ｃｏｎｓ  Ｃ  ｐｐ、または組換えＴＶ１  ｇｐ１４０に対するＩＬ２の分泌をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。
【図２４Ｂ−４】図２４Ｂは、時間内にワクチンにより誘導された抗原特異的なＴ細胞応答を示すグラフである。群ごとの個々の動物全てのＰＢＭＣによるｇｐ１２０コンセンサス（Ｃｏｎｓ）Ｃペプチドプール（ｐｐ）、ｇｐ４１  Ｃｏｎｓ  Ｃ  ｐｐ、または組換えＴＶ１  ｇｐ１４０に対するＩＬ２の分泌をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。
【図２４Ｃ−１】図２４Ｃは、時間内にワクチンにより誘導された抗原特異的なＴ細胞応答を示すグラフである。群ごとの個々の動物全てのＰＢＭＣによるｇｐ１２０コンセンサス（Ｃｏｎｓ）Ｃペプチドプール（ｐｐ）、ｇｐ４１  Ｃｏｎｓ  Ｃ  ｐｐ、または組換えＴＶ１  ｇｐ１４０に対するＩＬ４の分泌をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。
【図２４Ｃ−２】図２４Ｃは、時間内にワクチンにより誘導された抗原特異的なＴ細胞応答を示すグラフである。群ごとの個々の動物全てのＰＢＭＣによるｇｐ１２０コンセンサス（Ｃｏｎｓ）Ｃペプチドプール（ｐｐ）、ｇｐ４１  Ｃｏｎｓ  Ｃ  ｐｐ、または組換えＴＶ１  ｇｐ１４０に対するＩＬ４の分泌をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。
【図２４Ｃ−３】図２４Ｃは、時間内にワクチンにより誘導された抗原特異的なＴ細胞応答を示すグラフである。群ごとの個々の動物全てのＰＢＭＣによるｇｐ１２０コンセンサス（Ｃｏｎｓ）Ｃペプチドプール（ｐｐ）、ｇｐ４１  Ｃｏｎｓ  Ｃ  ｐｐ、または組換えＴＶ１  ｇｐ１４０に対するＩＬ４の分泌をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。
【図２４Ｃ−４】図２４Ｃは、時間内にワクチンにより誘導された抗原特異的なＴ細胞応答を示すグラフである。群ごとの個々の動物全てのＰＢＭＣによるｇｐ１２０コンセンサス（Ｃｏｎｓ）Ｃペプチドプール（ｐｐ）、ｇｐ４１  Ｃｏｎｓ  Ｃ  ｐｐ、または組換えＴＶ１  ｇｐ１４０に対するＩＬ４の分泌をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した。
【００３６】
【図２５−１】図２５は、４回目の免疫の２週間後（２６週目）および５回目の免疫の２週間後（３８週目）に採取した血清の中和（ＩＣ５０）を示す図である。血清を、クレードＣ  Ｔｉｅｒ２（ＳＨＩＶ１１５７ｉｐｄ３Ｎ４）シュードウイルス、Ｔｉｅｒ１（ＳＨＩＶ１１５７ｉｐＥＬ−ｐ）ＰＶ、Ｔｉｅｒ１  ＨＩＶ−１／ＴＶ１  ＰＶに対して、およびＴｉｅｒ１  クレードＢ  ＰＶ（ＳＨＩＶ  ＳＦ１６２Ｐ４）に対して評価した。
【図２５−２】図２５は、４回目の免疫の２週間後（２６週目）および５回目の免疫の２週間後（３８週目）に採取した血清の中和（ＩＣ５０）を示す図である。血清を、クレードＣ  Ｔｉｅｒ２（ＳＨＩＶ１１５７ｉｐｄ３Ｎ４）シュードウイルス、Ｔｉｅｒ１（ＳＨＩＶ１１５７ｉｐＥＬ−ｐ）ＰＶ、Ｔｉｅｒ１  ＨＩＶ−１／ＴＶ１  ＰＶに対して、およびＴｉｅｒ１  クレードＢ  ＰＶ（ＳＨＩＶ  ＳＦ１６２Ｐ４）に対して評価した。
【００３７】
【図２６−１】図２６は、５回目の免疫の２週間後（３８週目）に採取した血清の中和（ＩＣ５０）を示す図である。血清を、ＴＺＭ−ｂｌ細胞においてクレードＣ  Ｔｉｅｒ１（ＭＷ９６５．２６）に対して評価し、Ａ３Ｒ５．７細胞においてＴｉｅｒ２ウイルス（ＴＶ１．２１．ＬｕｃＲ．Ｔ２Ａ．ｅｃｔｏおよびＣｅ１１７６＿Ａ３．ＬｕｃＲ．Ｔ２Ａ．ｅｃｔｏ）に対して評価した。
【図２６−２】図２６は、５回目の免疫の２週間後（３８週目）に採取した血清の中和（ＩＣ５０）を示す図である。血清を、ＴＺＭ−ｂｌ細胞においてクレードＣ  Ｔｉｅｒ１（ＭＷ９６５．２６）に対して評価し、Ａ３Ｒ５．７細胞においてＴｉｅｒ２ウイルス（ＴＶ１．２１．ＬｕｃＲ．Ｔ２Ａ．ｅｃｔｏおよびＣｅ１１７６＿Ａ３．ＬｕｃＲ．Ｔ２Ａ．ｅｃｔｏ）に対して評価した。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
１．概観
ＨＩＶ  ＲＮＡワクチンに特有の１つの利点は、ＲＮＡ分子が自己アジュバント作用性であることである。たとえば本発明者らは、ＲＮＡ分子（リポソーム中で製剤化された）が、マウスモデルへの筋内注射後２４時間以内に、ＩＦＮ−α、ＩＰ−１０（ＣＸＣＬ−１０）、ＩＬ−６、ＫＣ（ＣＸＣＬ１）、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＭＣＰ−１、およびＭＩＰ−αを含めた複数の血清サイトカインを誘導することを観察した。これらのサイトカインは、ＲＮＡ分子によりコードされたタンパク質抗原に対する、宿主による免疫応答を増強しうる。
【００３９】
ＨＩＶ  ＲＮＡ分子とＨＩＶ  ポリペプチド分子とを組み合わせるワクチン接種戦略（たとえばＲＮＡ成分とタンパク質成分とを有する免疫原性組成物の投与；または「ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」などの逐次投与レジメン）は、複数の利益をもたらす。たとえばポリペプチド分子が宿主における全抗体力価を増強しうるのに対し、ＲＮＡ分子は、その天然構造における抗原を認識する抗体の産生を増強しうる。したがって、これらの組合せは、全抗体に対する機能的抗体（たとえば中和抗体）の比を増強した抗体応答を誘導しうる。さらに、ＲＮＡ分子が、１型ヘルパーＴ細胞応答（Ｔｈ１、ＩＦＮ−γｈｉ、ＩＬ−４ｌｏ）を促進するのに対し、タンパク質分子は、２型ヘルパーＴ細胞応答を促進する。したがって、ＲＮＡ分子とポリペプチド分子とを組み合わせることにより、Ｔ細胞介在性免疫ならびに体液性免疫の両方を促進することができる。加えて、ＲＮＡ分子は、リポソームまたは水中油エマルジョンなどの送達系を使用して細胞へと送達することができる。リポソームおよび水中油エマルジョンはまた、アジュバント活性を有することも公知である。したがって、送達系のアジュバント活性と併せたＲＮＡのアジュバント活性が相乗作用的に作用して、抗原に対する免疫応答を増強しうる。最後に、ポリペプチド抗原を、同じ病原体に由来する異なる抗原をコードするＲＮＡと組み合わせることにより、多価性も達成することができる。
【００４０】
（Ａ）ＲＮＡ分子とポリペプチド分子との共投与
一態様では、本発明は、ＨＩＶ  ＲＮＡ成分とＨＩＶ  ポリペプチド成分とを含む免疫原性組成物に関する。抗原エピトープを２つの異なる形態（ＨＩＶに由来する第１のエピトープであって、ＲＮＡによりコードされる形態にあるエピトープ；およびＨＩＶに由来する第２のエピトープであって、ポリペプチド形態にあるエピトープ）で送達する免疫原性組成物は、ＨＩＶに対する免疫応答を増強しうる。
【００４１】
好ましくは、第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである（すなわちＲＮＡによりコードされる形態にある第１の抗原と、ポリペプチド形態にある第２の抗原とが、少なくとも１つの共通のエピトープを共有する）。たとえば免疫原性組成物のＲＮＡ成分は、免疫原性組成物のポリペプチド成分と実質的に同じタンパク質をコードしうる（たとえばＲＮＡ分子によりコードされるアミノ酸配列と免疫原性組成物のポリペプチド成分とは、短い方の抗原の長さにわたり少なくとも約９０％の配列同一性を共有する）。代替的に２つの抗原は、（１つまたは複数の）同じ免疫優性エピトープなど、同じエピトープを有する。
【００４２】
本明細書に記載の通り、本発明者らは、（ｉ）ＨＩＶ抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子と、（ｉｉ）ポリペプチド形態にあるＨＩＶ抗原とを含む免疫原性組成物の有効性を評価した。結果により、ＨＩＶ抗原をコードするＲＮＡ分子と、ポリペプチド形態にあるＨＩＶ抗原とを一緒に共投与することにより、抗原に対する免疫応答が増し、ＲＮＡ分子を単独で投与することと比較して、より高い抗体力価がもたらされることが実証された。さらに、ＲＮＡによりコードされる形態にあるＨＩＶ抗原と、ポリペプチド形態にあるＨＩＶ抗原とを共投与することにより、ＩｇＧ１からＩｇＧ２ａへのアイソタイプスイッチが増強し、これにより、ポリペプチド抗原を単独で投与することと比較してよりバランスのとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ亜型プロファイルが生じた。最後に、本明細書に開示されている試験により、ＲＮＡによりコードされる形態にある抗原とポリペプチド形態にある抗原とを投与することにより、ＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性免疫およびＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫が増強されうることも示される。
【００４３】
本明細書で記載される免疫原性組成物は、宿主によるＨＩＶ感染に対する免疫応答を誘導または増強するためのワクチンとして処方することができる。本明細書ではまた、本発明の免疫原性組成物を使用して、それを必要とする被験体における免疫応答を誘導または増強する方法も提供される。
（Ｂ）初回刺激−追加刺激
【００４４】
別の態様では、本発明は、（ｉ）第１のエピトープを含むＨＩＶポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む初回刺激組成物と、（ｉｉ）第２のエピトープを含むＨＩＶポリペプチド抗原を含む追加刺激組成物とを含み；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである（すなわちＲＮＡによりコードされる形態にある第１の抗原と、ポリペプチド形態にある第２の抗原とが、少なくとも１つの共通のエピトープを共有する）キットに関する。キットは、初回刺激組成物および追加刺激組成物の逐次投与のために使用することができる。
【００４５】
別の態様では、本発明は、感染性疾患を処置もしくは予防するための方法、被験体において免疫応答を誘導するための方法、または被験体にワクチン接種する方法であって、（ｉ）それを必要とする被験体に、第１のエピトープを含むＨＩＶポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと、（ｉｉ）その後被験体に、第２のエピトープを含むポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップとを含み；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである（すなわちＲＮＡによりコードされる形態にある第１の抗原と、ポリペプチド形態にある第２の抗原とが、少なくとも１つの共通のエピトープを共有する）方法に関する。
【００４６】
本明細書で記載される通り、本発明者らは、「ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」のワクチン接種戦略を評価した。これらの研究は、「タンパク質による初回刺激、タンパク質による追加刺激」の戦略と比較して、たとえば抗体力価の増大、よりバランスのとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ亜型プロファイル、ウイルス粒子による免疫応答の誘導と類似したＴＨ１型のＣＤ４＋  Ｔ細胞介在性免疫応答の誘導、および非中和抗体の産生の低減を含め、「ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」の戦略の複数の利益を裏付けている。
【００４７】
好ましくは、初回刺激組成物中のＲＮＡ分子が、追加刺激組成物中のポリペプチド分子と実質的に同じＨＩＶタンパク質をコードする（たとえば初回刺激組成物中のＲＮＡ分子によりコードされるアミノ酸配列と、追加刺激組成物中のポリペプチドとは、短い方の抗原の長さにわたり少なくとも約９０％の配列同一性を共有する）。代替的に２つの抗原は、（１つまたは複数の）同じ免疫優性エピトープなど、同じエピトープを有する。
【００４８】
本明細書で記載される初回刺激組成物と追加刺激組成物とは、病原体に対する免疫応答を誘導または増強するためのワクチンとして処方することができる。本明細書ではまた、本発明の初回刺激組成物および追加刺激組成物を使用して、それを必要とする被験体における免疫応答を誘導または増強する方法も提供される。
【００４９】
本発明はまた、治療における使用のための、本明細書で記載される免疫原性組成物、医薬組成物、またはキット、および免疫応答を誘導するか増強するかまたは生成させるための医薬の製造のための、本明細書で記載される免疫原性組成物、医薬組成物、またはキットの使用にも関する。
２．免疫原性組成物
【００５０】
一態様では、本発明は、ＨＩＶ  ＲＮＡ成分とＨＩＶ  ポリペプチド成分とを含む免疫原性組成物を提供する。免疫原性組成物は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子（ＲＮＡ成分）と；（ｉｉ）第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原（ポリペプチド成分）とを含み；ここで、前記第１のエピトープと第２のエピトープとは、ＨＩＶに由来するエピトープである。
【００５１】
第１のエピトープと第２のエピトープとは同じエピトープであってもよく、所望であれば異なるエピトープであってもよい。第１のエピトープと第２のエピトープとは、ＨＩＶの同じポリペプチドに由来してもよく、ＨＩＶの異なるポリペプチドに由来してもよい。また、第１のエピトープと第２のエピトープとは、病原体の異なる株または亜種の間で高度に保存されているエピトープ、例えば、変異による変動が限られている、またはそれがないエピトープなどであってもよい。
【００５２】
ある特定の実施形態では、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とは、ＨＩＶに由来する同じタンパク質に由来する。例えば、ＲＮＡ分子は、ＨＩＶに由来する全長のタンパク質、または必要に応じてＲＮＡによりコードされるウイルスタンパク質の発現、産生、精製もしくは検出を容易にしうる異種配列と融合したその抗原性部分を含む第１のポリペプチド抗原をコードしうる。第２のポリペプチド抗原は、全長のタンパク質、または必要に応じて第２のポリペプチド抗原の発現、産生、精製もしくは検出を容易にしうる異種配列（例えば、Ｈｉｓタグ）と融合したその抗原性部分、またはトランケート型形態（例えば、ｇｐ１４０はｇｐ１６０のトランケート型形態である）を含む組換えタンパク質でありうる。あるいは、第１のポリペプチド抗原、第２のポリペプチド抗原、またはこれらの両方は、ＨＩＶに由来するタンパク質の変異バリアント（例えば、アミノ酸の（１つまたは複数の）置換、（１つまたは複数の）付加、または（１つまたは複数の）欠失を有するウイルスタンパク質）を含みうる。
【００５３】
好ましくは、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原との間のアミノ酸配列の同一性は、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％である。ある実施形態では、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とが同じ抗原である。
【００５４】
ある実施形態では、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とが、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つの共通のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを共有する。ある実施形態では、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とが、少なくとも１つの共通の免疫優性エピトープを有する。ある実施形態では、第１のポリペプチド抗原と第２のポリペプチド抗原とが、（１つまたは複数の）同じ免疫優性エピトープ、または同じ主要免疫優性エピトープを有する。
【００５５】
ある実施形態では、第１のポリペプチド抗原が、可溶性ポリペプチドまたは膜アンカー型ポリペプチドであり、第２のポリペプチド抗原が、可溶性ポリペプチドである。たとえば野生型ウイルスタンパク質が膜貫通型表面タンパク質である場合、ＲＮＡ分子が、第１の（膜アンカー型）抗原を産生する全長コード配列を含みうるのに対し、ウイルスタンパク質の膜貫通領域を欠失させて、第２のポリペプチド抗原（これは可溶性である）を産生させることができる。
【００５６】
ある特定の実施形態では、第１の抗原または第２の抗原は、第３のエピトープをさらに含む融合ポリペプチドである。第３のエピトープはＨＩＶ以外の病原体に由来してもよく、異なるＨＩＶ抗原に由来してもよい。
Ａ．抗原
【００５７】
本明細書で記載される免疫原性組成物中に包含させるのに適した抗原（ＲＮＡによりコードされる形態にあるまたはポリペプチド形態にある）は、あらゆる病原体（たとえば細菌性病原体、ウイルス性病原体、真菌性病原体、原虫病原体、または多細胞寄生虫性病原体）、アレルゲン、または腫瘍に由来しうる。
ＨＩＶ
【００５８】
ある特定の実施形態では、第１の抗原と第２の抗原とは、ＨＩＶ−１ＣＭ２３５、ＨＩＶ−１ＵＳ４、ＨＩＶ−１ＳＦ１６２、ＨＩＶ−１ＴＶ１、ＨＩＶ−１ＭＪ４などのあらゆるＨＩＶ−１株、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｊ、Ｋ、およびＯなどのＨＩＶ−１亜型（またはクレード）、ならびにＡ／Ｂ、Ａ／Ｅ、Ａ／Ｇ、Ａ／Ｇ／Ｉなどを含めたＨＩＶ−１循環組換え型（ＣＲＦ）を含めたＨＩＶ−１に由来する。
【００５９】
ある特定の実施形態では、第１の抗原と第２の抗原とは、独立に、以下の１つまたは複数のタンパク質に由来する：ｇａｇ（ｐ２４ｇａｇ、ｐ５５ｇａｇ）、ｐｏｌ、ｅｎｖ（ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１）、ｔａｘ、ｔａｔ、ｒｅｘ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｕ、またはｖｐｒ。ある特定の実施形態では、第１の抗原と第２の抗原とは、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０またはｇｐ１２０などのＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチドである。Ｅｎｖポリペプチドは、モノマーまたはオリゴマー、例えば、ｇｐ１２０モノマー、またはｇｐ１４０およびｇｐ１６０のホモオリゴマーもしくはヘテロ−オリゴマーでありうる。
【００６０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の免疫原性組成物に含めるために適したＨＩＶ抗原は、ＨＩＶ（例えば、ＨＩＶ−１）Ｅｎｖタンパク質（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ１４０、およびｇｐ１６０を含む）に由来する。
【００６１】
多くのＨＩＶ分離株に由来するＥｎｖタンパク質をコードする核酸配列、および該Ｅｎｖタンパク質のアミノ酸配列が当技術分野で周知である。例えば、ＨＩＶ−１  Ｂｒｕ、ＨＩＶ−１  ＭＮ、ＨＩＶ−１  ＥＬＩ、ＨＩＶ−１  ＲＦ、ＨＩＶ−１  ＳＦ２ＣおよびＨＩＶ−１  ＳＣに由来するＥｎｖタンパク質（ｇｐ１６０前駆体）のアミノ酸配列が米国特許第６，２８４，２４８号において配列番号１〜６として開示されている。
【００６２】
Ｅｎｖがまず小胞体においてｇｐ１６０ポリタンパク質前駆体として合成され、それが切断されてｇｐ１２０およびｇｐ４１が形成される、または短縮されてｇｐ１４０が形成されることが周知である。ｇｐ１２０は、オリゴマー形成ドメインまたは膜貫通ドメインを伴わないｇｐ１６０のＮ末端に対応し、ｇｐ１４０は、膜貫通ドメインは伴わないがオリゴマー形成ドメインは保持するｇｐ１６０のＮ末端に対応する。Ｍｏｒｉｋａｗａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ、６７巻：３６０１〜３６０４頁（１９９３年）；Ｒｉｃｈｍｏｎｄら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：９０９２〜９１００頁（１９９８年）；Ｅａｒｌら  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７５巻：６４５〜６５３頁（２００１年）を参照されたい。
【００６３】
ｇｐ１６０ポリタンパク質前駆体は、主要な切断部位および／または副次的な切断部位において切断されて、ｇｐ１２０が形成される。所望であれば、一方または両方の切断部位を変異させて、ｇｐ１６０のｇｐ１２０へのプロセシングを防止することができる。いくつもの適切な変異が当技術分野で周知であり、例えば、米国特許第６，２８４，２４８号、および米国特許出願公開第２０１０／０３１６６９８号に記載されている。
【００６４】
例示的なｇｐ１４０配列が配列番号［＿］に記載されている。例示的なｇｐ１２０配列が配列番号［＿］に記載されている。例示的なｇｐ１６０配列が配列番号［＿］に記載されている。本発明では、配列番号＿＿、＿＿、もしくは＿＿を含む、または配列番号＿＿、＿＿、もしくは＿＿と少なくとも７５％同一である（例えば、配列番号＿＿、＿＿、もしくは＿＿と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である）アミノ酸配列を含むＨＩＶ  Ｅｎｖ抗原を使用することができる。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【００６５】
Ｅｎｖ抗原は、例えば、ｇｐ１６０の膜貫通領域の欠失により形成される可溶性タンパク質でありうる。この膜貫通領域は、およそ６５９位にあるアミノ酸残基からおよそ６８０位にあるアミノ酸残基までのｇｐ４１に対応する帯域に位置する。必要に応じて、およそ４８７位にあるアミノ酸残基からおよそ５１４位にあるアミノ酸残基までの別の疎水性領域を欠失させることもできる。
【００６６】
ｇｐ１６０の少なくとも３つのドメインが、ｇｐ１６０ごとに超可変である配列を含有する。これらの３つのドメインは、共通してＶ１、Ｖ２およびＶ３ドメイン（またはループ）と称される。最初の２つのドメイン、Ｖ１およびＶ２は、およそ９６位にあるシステイン残基とおよそ１７１位にあるシステイン残基との間に位置するが、第３のドメイン、Ｖ３は、およそ２７１位にあるシステイン残基からおよそ３０６位にあるシステイン残基までに位置する。これらより小さいとしてもある程度の変動性を示す最後のドメインも存在する。これは、Ｔ−ヘルパーリンパ球のＣＤ４受容体と結合する部位であり、およそ３４０位にあるアミノ酸残基からおよそ４４０位にあるアミノ酸残基までに位置する。第１の超可変ドメインおよび第２の超可変ドメイン、ならびにＣＤ４受容体結合部位は、得られうる免疫の程度に影響を及ぼすと考えられている。
【００６７】
ある特定の実施形態では、Ｅｎｖ抗原は、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、またはｇｐ１２０の可変領域Ｖ１および／またはＶ２の欠失などの修飾を含有しうる。
【００６８】
ＨＩＶ抗原は融合ポリペプチドでもありうる。例えば、抗原は、第１のドメインと第２のドメインとを含み得、（ｉ）第１のドメインが、ＨＩＶ  Ｅｎｖポリペプチド（例えば、ｇｐ１６０、ｇｐ１４０、ｇｐ１２０、またはその抗原断片）を含み、（ｉｉ）第２のドメインが、別のウイルスタンパク質（例えば、ｇａｇ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｎｅｆ、またはその抗原断片などの別のＨＩＶ抗原）を含む。
【００６９】
Ｂ．ＲＮＡ分子
本明細書で記載される免疫原性組成物は、ＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを含む。ＲＮＡは、自己複製ＲＮＡであることが好ましい。
【００７０】
組成物は、抗原をコードする１つより多いＲＮＡ分子、たとえば２つ、３つ、５つ、１０以上のＲＮＡ分子を含有しうる。代替的にまたは加えて、１つのＲＮＡ分子はまた、１つより多い抗原もコードすることが可能であり、たとえば異なる抗原または同一な抗原をコードするバイシストロニックＲＮＡ分子またはトリシストロニックＲＮＡ分子でもありうる。
【００７１】
ＲＮＡ分子の配列は、ヒト細胞など所望の宿主における発現についてコドン最適化されていてもよく、または脱最適化されていてもよい。
【００７２】
ＲＮＡ分子の配列は、所望の場合、たとえばＲＮＡの発現または複製の有効性を増大させるように修飾してもよく、またはさらなる安定性または分解に対する耐性をもたらすように修飾してもよい。たとえばＲＮＡ配列は、そのコドン使用に関して修飾して、たとえばＲＮＡの翻訳有効性を増大させ、半減期を延長することができる。ポリＡテール（たとえば約３０以上のアデノシン残基の）を、ＲＮＡの３’末端へと付着させて、その半減期を延長することができる。ＲＮＡの５’末端は、構造ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｎ（キャップ０構造）またはその誘導体であって、ＲＮＡ合成の間に組み込むこともでき、ＲＮＡの転写後において酵素的に操作することもできる（たとえばｍＲＮＡトリホスファターゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、およびグアニン−７−メチルトランスフェラーゼからなるワクシニアウイルスキャッピング酵素（ＶＣＥ）であって、Ｎ７−モノメチル化されたキャップ０構造の構築を触媒するＶＣＥを使用することにより）、キャップ０構造またはその誘導体を有する修飾リボヌクレオチドでキャップすることができる。キャップ０構造は、ＲＮＡ分子の安定性および翻訳有効性の維持において重要な役割を果たす。ＲＮＡ分子の５’側キャップは、キャップ１構造（ｍ７Ｇｐｐｐ［ｍ２’−Ｏ］Ｎ）の生成を結果としてもたらす２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼによりさらに修飾することができ、これにより、翻訳有効性をさらに増大させることができる。
【００７３】
所望の場合、ＲＮＡ分子は、あらゆる５’側キャップ構造に加えて、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドも含みうる。哺乳動物のＲＮＡでは、９６を超える天然に存在するヌクレオシド修飾が見出されている。たとえばＬｉｍｂａｃｈら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２２巻（１２号）：２１８３〜２１９６頁（１９９４年）を参照されたい。当技術分野では、ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチドならびに修飾ヌクレオシドの調製が、たとえばそれらのすべてが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第４３７３０７１号、同第４４５８０６６号、同第４５００７０７号、同第４６６８７７７号、同第４９７３６７９号、同第５０４７５２４号、同第５１３２４１８号、同第５１５３３１９号、同第５２６２５３０号、同第５７００６４２号から周知であり、多くの修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドが市販されている。
【００７４】
修飾ヌクレオシドおよび修飾ヌクレオチドへと組み込むことが可能であり、ＲＮＡ分子内に存在させうる修飾核酸塩基には、ｍ５Ｃ（５−メチルシチジン）、ｍ５Ｕ（５−メチルウリジン）、ｍ６Ａ（Ｎ６−メチルアデノシン）、ｓ２Ｕ（２−チオウリジン）、Ｕｍ（２’−Ｏ−メチルウリジン）、ｍ１Ａ（１−メチルアデノシン）；ｍ２Ａ（２−メチルアデノシン）；Ａｍ（２−１−Ｏ−メチルアデノシン）；ｍｓ２ｍ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−メチルアデノシン）；ｉ６Ａ（Ｎ６−イソペンテニルアデノシン）；ｍｓ２ｉ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６イソペンテニルアデノシン）；ｉｏ６Ａ（Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｍｓ２ｉｏ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−（ｃｉｓ−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン）；ｇ６Ａ（Ｎ６−グリシニルカルバモイルアデノシン）；ｔ６Ａ（Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｔ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｍ６ｔ６Ａ（Ｎ６−メチル−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン）；ｈｎ６Ａ（Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；ｍｓ２ｈｎ６Ａ（２−メチルチオ−Ｎ６−ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン）；Ａｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルアデノシン（ホスフェート））；Ｉ（イノシン）；ｍ１Ｉ（１−メチルイノシン）；ｍ’Ｉｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルイノシン）；ｍ３Ｃ（３−メチルシチジン）；Ｃｍ（２Ｔ−Ｏ−メチルシチジン）；ｓ２Ｃ（２−チオシチジン）；ａｃ４Ｃ（Ｎ４−アセチルシチジン）；ｆ５Ｃ（５−ホンニルシチジン）；ｍ５Ｃｍ（５，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ａｃ４Ｃｍ（Ｎ４アセチル２ＴＯメチルシチジン）；ｋ２Ｃ（リシジン）；ｍ１Ｇ（１−メチルグアノシン）；ｍ２Ｇ（Ｎ２−メチルグアノシン）；ｍ７Ｇ（７−メチルグアノシン）；Ｇｍ（２’−Ｏ−メチルグアノシン）；ｍ２２Ｇ（Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン）；ｍ２Ｇｍ（Ｎ２，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ２２Ｇｍ（Ｎ２，Ｎ２，２’−Ｏ−トリメチルグアノシン）；Ｇｒ（ｐ）（２’−Ｏ−リボシルグアノシン（ホスフェート））；ｙＷ（ウィブトシン）；ｏ２ｙＷ（ペルオキシウィブトシン）；ＯＨｙＷ（ヒドロキシウィブトシン）；ＯＨｙＷ＊（修飾不十分なヒドロキシウィブトシン）；ｉｍＧ（ウィオシン）；ｍｉｍＧ（メチルグアノシン）；Ｑ（クォイオシン）；ｏＱ（エポキシクォイオシン）；ｇａｌＱ（ガルタクトシル−クォイオシン）；ｍａｎＱ（マンノシル−クォイオシン）；ｐｒｅＱｏ（７−シアノ−７−デアザグアノシン）；ｐｒｅＱｉ（７−アミノメチル−７−デアザグアノシン）；Ｇ＊（アルカエオシン）；Ｄ（ジヒドロウリジン）；ｍ５Ｕｍ（５，２’−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｓ４Ｕ（４−チオウリジン）；ｍ５ｓ２Ｕ（５−メチル−２−チオウリジン）；ｓ２Ｕｍ（２−チオ−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ａｃｐ３Ｕ（３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウリジン）；ｈｏ５Ｕ（５−ヒドロキシウリジン）；ｍｏ５Ｕ（５−メトキシウリジン）；ｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸）；ｍｃｍｏ５Ｕ（ウリジン５−オキシ酢酸メチルエステル）；ｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン））；ｍｃｈｍ５Ｕ（５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジンメチルエステル）；ｍｃｍ５Ｕ（５−メトキシカルボニルメチルウリジン）；ｍｃｍ５Ｕｍ（Ｓ−メトキシカルボニルメチル−２−Ｏ−メチルウリジン）；ｍｃｍ５ｓ２Ｕ（５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン）；ｎｍ５ｓ２Ｕ（５−アミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５Ｕ（５−メチルアミノメチルウリジン）；ｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍｎｍ５ｓｅ２Ｕ（５−メチルアミノメチル−２−セレノウリジン）；ｎｃｍ５Ｕ（５−カルバモイルメチルウリジン）；ｎｃｍ５Ｕｍ（５−カルバモイルメチル−２’−Ｏ−メチルウリジン）；ｃｍｎｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン）；ｃｎｍｍ５Ｕｍ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−Ｌ−オメチルウリジン）；ｃｍｎｍ５ｓ２Ｕ（５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン）；ｍ６２Ａ（Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン）；Ｔｍ（２’−Ｏ−メチルイノシン）；ｍ４Ｃ（Ｎ４−メチルシチジン）；ｍ４Ｃｍ（Ｎ４，２−Ｏ−ジメチルシチジン）；ｈｍ５Ｃ（５−ヒドロキシメチルシチジン）；ｍ３Ｕ（３−メチルウリジン）；ｃｍ５Ｕ（５−カルボキシメチルウリジン）；ｍ６Ａｍ（Ｎ６，Ｔ−Ｏ−ジメチルアデノシン）；ｒｎ６２Ａｍ（Ｎ６，Ｎ６，Ｏ−２−トリメチルアデノシン）；ｍ２’７Ｇ（Ｎ２，７−ジメチルグアノシン）；ｍ２’２’７Ｇ（Ｎ２，Ｎ２，７−トリメチルグアノシン）；ｍ３Ｕｍ（３，２Ｔ−Ｏ−ジメチルウリジン）；ｍ５Ｄ（５−メチルジヒドロウリジン）；ｆ５Ｃｍ（５−ホルミル−２’−Ｏ−メチルシチジン）；ｍ１Ｇｍ（１，２’−Ｏ−ジメチルグアノシン）；ｍ’Ａｍ（１，２−Ｏ−ジメチルアデノシン）イリノメチルウリジン）；ｔｍ５ｓ２Ｕ（Ｓ−タウリノメチル−２−チオウリジン））；ｉｍＧ−１４（４−デメチルグアノシン）；ｉｍＧ２（イソグアノシン）；ａｃ６Ａ（Ｎ６−アセチルアデノシン）、ヒポキサンチン、イノシン、８−オキソ−アデニン、その７置換誘導体、ジヒドロウラシル、プソイドウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−アミノウラシル、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルウラシル、５−メチルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルウラシル、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシシトシン、５−（Ｃ１〜Ｃ６）−アルキルシトシン、５−メチルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルケニルシトシン、５−（Ｃ２〜Ｃ６）−アルキニルシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ブロモシトシン、Ｎ２−ジメチルグアニン、７−デアザグアニン、８−アザグアニン、７−デアザ−７−置換グアニン、７−デアザ−７−（Ｃ２〜Ｃ６）アルキニルグアニン、７−デアザ−８−置換グアニン、８−ヒドロキシグアニン、６−チオグアニン、８−オキソグアニン、２−アミノプリン、２−アミノ−６−クロロプリン、２，４−ジアミノプリン、２，６−ジアミノプリン、８−アザプリン、置換７−デアザプリン、７−デアザ−７−置換プリン、７−デアザ−８−置換プリン、水素（非塩基性残渣）、ｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、Ｗ、または２’−Ｏ−メチル−Ｕが含まれる。これらの修飾核酸塩基およびそれらの対応するリボヌクレオシドの多くは、商業的販売元から入手可能である。たとえば参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１１／００５７９９を参照されたい。
【００７５】
所望の場合、ＲＮＡ分子は、ホスホルアミデート連結、ホスホロチオエート連結、および／またはメチルホスホネート連結を含有しうる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子が、修飾ヌクレオチドを包含しない、たとえば修飾核酸塩基を包含せず、ＲＮＡ分子内のすべてのヌクレオチドが、たとえば７−メチルグアノシンが含まれうる任意選択の５’側キャップを除き、通常の標準的なリボヌクレオチドＡ、Ｕ、Ｇ、およびＣである。他の実施形態では、ＲＮＡが、７’−メチルグアノシンを含む５’側キャップを包含することが可能であり、最初の１つ、２つ、または３つの５’側リボヌクレオチドを、リボースの２’位でメチル化することができる。
自己複製ＲＮＡ
【００７７】
いくつかの態様では、免疫原性組成物は、自己複製ＲＮＡ分子を含有する。ある特定の実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルスに由来するまたはそれに基づく。
【００７８】
当技術分野では、自己複製ＲＮＡ分子が周知であり、たとえばアルファウイルスに由来する複製エレメントを使用し、ウイルス構造タンパク質を、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列で置換することにより作製することができる。自己複製ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、アポトーシスによる死滅を経る前の短時間にわたり、抗原を産生する。この死滅は、樹状細胞を超活性化することもまた示されている、必須の二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ中間体の結果である可能性が高い。したがって、自己複製ＲＮＡの免疫原性の増強は、宿主細胞のＲＮＡウイルス感染を模倣する炎症促進性ｄｓＲＮＡの産生の結果でありうる。
【００７９】
自己複製ＲＮＡ分子により、細胞機構が、細胞内に蓄積されうるまたは細胞から分泌されうるタンパク質または抗原など、コードされる遺伝子産物の指数関数的増大を発生させるように使用されると有利である。自己複製ＲＮＡ分子によるタンパク質または抗原の過剰発現は、トランスフェクトされた細胞のアポトーシスを誘導する、ＲＮＡの複製産物および増幅産物ならびに翻訳産物による、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）３経路、ＴＬＲ７経路、およびＴＬＲ８経路、ならびに非ＴＬＲ（たとえば、ＲＩＧ−１、ＭＤ−５）経路の刺激を含めた免疫刺激性アジュバント効果を利用する。
【００８０】
自己複製ＲＮＡは、一般的に、ウイルスレプリカーゼ、ウイルスプロテアーゼ、ウイルスヘリカーゼ、および他の非構造ウイルスタンパク質からなる群より選択される少なくとも１つまたは複数の遺伝子を含有し、また、５’末端および３’末端のシス活性複製配列ならびに所望の場合、所望のアミノ酸配列（たとえば目的の抗原）をコードする異種配列を含む。異種配列の発現を誘導するサブゲノムプロモーターは、自己複製ＲＮＡ中に包含することができる。所望の場合、異種配列（たとえば目的の抗原）は、自己複製ＲＮＡにおける他のコード領域に対してインフレームで融合させてもよく、かつ／または内部リボソーム導入部位（ＩＲＥＳ）の制御下に置いてもよい。
【００８１】
ある実施形態では、自己複製ＲＮＡ分子をウイルス様粒子内に被包しない。本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、自己複製ＲＮＡ分子が感染性ウイルス粒子の産生を誘導することができないように、設計することができる。これは、たとえば、自己複製ＲＮＡにおけるウイルス粒子の産生に必要な構造タンパク質をコードする１つまたは複数のウイルス遺伝子を取り除くことによって達成することができる。たとえば、自己複製ＲＮＡ分子が、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｅｂｉｓウイルス）（ＳＩＮ）、セムリキ森林ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）などのアルファウイルスに基づくものである場合は、カプシドおよび／またはエンベロープ糖タンパク質などのウイルス構造タンパク質をコードする１つまたは複数の遺伝子を取り除くことができる。
【００８２】
所望の場合、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、弱毒化されたもしくは毒性のある感染性ウイルス粒子の産生を誘導するようにまたは１回の続く感染が可能なウイルス粒子を産生するように設計することができる。
【００８３】
自己複製ＲＮＡ分子は、脊椎動物細胞に送達された場合、それ自体からの（またはそれ自体のアンチセンスコピーからの）転写によって複数の娘ＲＮＡの産生を導くことができる。自己複製ＲＮＡは、細胞に送達した後に、直接翻訳することができ、この翻訳は、送達されたＲＮＡから転写物をその後産生するＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを提供する。したがって、送達されたＲＮＡは、複数の娘ＲＮＡの産生を導く。これらの転写物は、送達されたＲＮＡに関してアンチセンスであり、遺伝子産物のｉｎ  ｓｉｔｕ発現をもたらすためにそれら自体翻訳されてもよい、または遺伝子産物のｉｎ  ｓｉｔｕ発現を提供するために翻訳される、送達されたＲＮＡと同じセンスを有するさらなる転写物を提供するために転写されてもよい。
【００８４】
自己複製を達成するのに適した１つの系は、アルファウイルスベースのＲＮＡレプリコンを使用することである。アルファウイルスは、遺伝子的、構造的、および血清学的に類縁の、一連のＴｏｇａｖｉｒｉｄａｅ科の節足動物媒介性ウイルスを含む。２６の公知のウイルスおよびウイルス亜型が、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスを含めた、アルファウイルス属内に分類されている。本発明の自己複製ＲＮＡはそれ自体、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、またはアルファウイルス科に属する他のウイルスに由来するＲＮＡレプリカーゼを組み込みうる。
【００８５】
本発明では、アルファウイルスベースの「レプリコン」による発現ベクターを使用することができる。レプリコンベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、および組換えレプリコン粒子を含めた複数のフォーマットで用いることができる。このようなレプリコンベクターは、たとえばシンドビスウイルス（Ｘｉｏｎｇら（１９８９年）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４３巻：１１８８〜１１９１頁；Ｄｕｂｅｎｓｋｙら（１９９６年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７０巻：５０８〜５１９頁；Ｈａｒｉｈａｒａｎら（１９９８年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．、７２巻：９５０〜９５８頁；Ｐｏｌｏら（１９９９年）、ＰＮＡＳ、９６巻：４５９８〜４６０３頁）、セムリキ森林ウイルス（Ｌｉｌｊｅｓｔｒｏｍ（１９９１年）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９巻：１３５６〜１３６１頁；Ｂｅｒｇｌｕｎｄら（１９９８年）、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６巻：５６２〜５６５頁）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｐｕｓｈｋｏら（１９９７年）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２３９巻：３８９〜４０１頁）が含まれるアルファウイルスに由来している。アルファウイルスに由来するレプリコンは、全体的な特徴（たとえば構造、複製）において一般的にきわめて類似しているが、個別のアルファウイルスは、固有ないくつかの特定の特性（たとえば受容体結合、インターフェロン感受性、および疾患プロファイル）を呈示しうる。したがって、様々なウイルス科から作製されるキメラアルファウイルスレプリコンもまた有用でありうる。
【００８６】
アルファウイルスに基づくレプリコンは、レプリカーゼ（またはレプリカーゼ−トランスクリプターゼ）を産生するために細胞に送達した後に翻訳され得る（＋）鎖レプリコンである。レプリカーゼは、＋鎖送達ＲＮＡのゲノム（−）鎖コピーを生成する複製複合体を提供するために自己切断するポリプロテインとして翻訳される。これらの（−）鎖転写物は、（＋）鎖の親ＲＮＡのさらなるコピーを提供するために、また、所望の遺伝子産物をコードするサブゲノム転写物をも提供するために、それら自体を転写することができる。サブゲノム転写物の翻訳は、したがって、感染細胞による所望の遺伝子産物のｉｎ  ｓｉｔｕ発現を導く。適したアルファウイルスレプリコンは、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスなどに由来するレプリカーゼを使用することができる。
【００８７】
好ましい自己複製ＲＮＡ分子は、したがって、（ｉ）自己複製ＲＮＡ分子からＲＮＡを転写することができるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよび（ｉｉ）ポリペプチド抗原をコードする。ポリメラーゼは、たとえばアルファウイルスタンパク質ｎｓＰ４を含むアルファウイルスレプリカーゼでありうる。
【００８８】
天然アルファウイルスゲノムは、非構造レプリカーゼに加えて構造ビリオンタンパク質をコードするのに対して、本発明のアルファウイルスベースの自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス構造タンパク質をコードしないことが好ましい。したがって、自己複製ＲＮＡは、ＲＮＡ含有アルファウイルスビリオンの産生ではなく、細胞におけるそれ自体のゲノムＲＮＡコピーの産生を導くことができる。これらのビリオンを産生することができないということは、野生型アルファウイルスと異なり、自己複製ＲＮＡ分子が感染性形態でそれ自体を永続させることができないことを意味する。野生型ウイルスにおいて永続化に必要なアルファウイルス構造タンパク質は、本発明の自己複製ＲＮＡに存在せず、それらの場所は、所望の遺伝子産物をコードする遺伝子（複数可）によって使用され、サブゲノム転写物は、構造アルファウイルスビリオンタンパク質ではなく所望の遺伝子産物をコードする。
【００８９】
したがって、本発明による有用な自己複製ＲＮＡ分子は、２つのオープンリーディングフレームを有しうる。第１の（５’）オープンリーディングフレームは、レプリカーゼをコードし、第２の（３’）オープンリーディングフレームは、ポリペプチド抗原をコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、たとえば別の所望の遺伝子産物をコードする、追加の（下流）オープンリーディングフレームを有していてもよい。自己複製ＲＮＡ分子は、コードされるレプリカーゼと適合性の５’配列を有することができる。
【００９０】
他の態様では、自己複製ＲＮＡ分子は、アルファウイルス以外のウイルス、好ましくはプラス鎖ＲＮＡウイルスおよびより好ましくはピコルナウイルス、フラビウイルス、ルビウイルス、ペスチウイルス、ヘパシウイルス、カリシウイルス、またはコロナウイルスに由来するまたはそれに基づく。適した野生型アルファウイルス配列は、周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄ．などの配列保管機関から入手可能である。適したアルファウイルスの代表的な例は、アウラ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）、ベバルウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）、カバス（Ｃａｂａｓｓｏｕ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）、チクングニヤウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）、東部ウマ脳脊髄炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）、フォートモーガン（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）、ゲタウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）、キジラガチ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）、マヤロ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６）、マヤロウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２７７）、ミッデルブルグ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ムカンボウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）、ヌドゥム（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）、ピクスナウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、セムリキ森林（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、シンドビスウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６８、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４８）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）、トリニティ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）、ユナ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４）、ベネズエラウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２）、西部ウマ脳脊髄炎（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１、ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２）、ワタロア（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）、およびＹ−６２−３３（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）を含む。
【００９１】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、他の種類のＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）より大型である。典型的に、本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、少なくとも約４ｋｂを含有する。たとえば自己複製ＲＮＡは、少なくとも約５ｋｂ、少なくとも約６ｋｂ、少なくとも約７ｋｂ、少なくとも約８ｋｂ、少なくとも約９ｋｂ、少なくとも約１０ｋｂ、少なくとも約１１ｋｂ、少なくとも約１２ｋｂ、または１２ｋｂ超を含有しうる。ある例では、自己複製ＲＮＡが、約４ｋｂ〜約１２ｋｂ、約５ｋｂ〜約１２ｋｂ、約６ｋｂ〜約１２ｋｂ、約７ｋｂ〜約１２ｋｂ、約８ｋｂ〜約１２ｋｂ、約９ｋｂ〜約１２ｋｂ、約１０ｋｂ〜約１２ｋｂ、約１１ｋｂ〜約１２ｋｂ、約５ｋｂ〜約１１ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約５ｋｂ〜約９ｋｂ、約５ｋｂ〜約８ｋｂ、約５ｋｂ〜約７ｋｂ、約５ｋｂ〜約６ｋｂ、約６ｋｂ〜約１２ｋｂ、約６ｋｂ〜約１１ｋｂ、約６ｋｂ〜約１０ｋｂ、約６ｋｂ〜約９ｋｂ、約６ｋｂ〜約８ｋｂ、約６ｋｂ〜約７ｋｂ、約７ｋｂ〜約１１ｋｂ、約７ｋｂ〜約１０ｋｂ、約７ｋｂ〜約９ｋｂ、約７ｋｂ〜約８ｋｂ、約８ｋｂ〜約１１ｋｂ、約８ｋｂ〜約１０ｋｂ、約８ｋｂ〜約９ｋｂ、約９ｋｂ〜約１１ｋｂ、約９ｋｂ〜約１０ｋｂ、または約１０ｋｂ〜約１１ｋｂである。
【００９２】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、１つまたは複数の修飾ヌクレオチド（たとえばプソイドウリジン、Ｎ６−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン）を含みうる。
【００９３】
自己複製ＲＮＡ分子は、単一のポリペプチド抗原をコードすることもでき、必要に応じて、配列の各々がアミノ酸配列として発現したときにその同一性を保持する方式で併せて連結された（たとえば直列で連結された）ポリペプチド抗原の２つ以上をコードすることもできる。したがって、自己複製ＲＮＡから生成したポリペプチドは、融合ポリペプチドとして作製することもでき、別個のポリペプチドまたはペプチド配列を結果としてもたらすような様式で操作することもできる。
【００９４】
本発明の自己複製ＲＮＡは、ある範囲のエピトープを含有する１つまたは複数のポリペプチド抗原をコードしうる。エピトープは、ヘルパーＴ細胞応答もしくは細胞傷害性Ｔ細胞応答またはこれらの両方を誘導することが好ましくは可能である。
【００９５】
本明細書で記載される自己複製ＲＮＡ分子を操作して、複数のヌクレオチド配列を、２つ以上のオープンリーディングフレームから発現させ、これにより、２つ以上の抗原など、タンパク質の、免疫応答の発生を増強しうるサイトカインまたは他の免疫調節物質との共発現を可能とすることができる。このような自己複製ＲＮＡ分子であれば、たとえば多様な遺伝子産物（たとえばタンパク質）を、たとえば二価ワクチンまたは多価ワクチンと同時に産生させるのに特に有用であろう。
【００９６】
本発明の自己複製ＲＮＡ分子は、あらゆる適した方法を使用して調製することができる。当技術分野では、修飾ヌクレオチドを含有するＲＮＡ分子を作製するための複数の適した方法が公知である。たとえば修飾ヌクレオチドを含有する自己複製ＲＮＡ分子は、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ファージＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ファージＲＮＡポリメラーゼなど、または修飾ヌクレオチドのＲＮＡ分子への効率的な組込みを可能とするこれらのポリメラーゼの変異体など、適したＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、自己複製ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡを転写させること（たとえばｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写）により調製することができる。転写反応物は、ヌクレオチドおよび修飾ヌクレオチド、ならびに適した緩衝液および適した塩など、選択されるポリメラーゼの活性を支援する他の成分を含有するであろう。ヌクレオチドアナログの自己複製ＲＮＡへの組込みは、たとえばこのようなＲＮＡ分子の安定性を改変する、ＲＮアーゼに対する耐性を増大させる、適切な宿主細胞への導入後における複製を確立する（ＲＮＡの「感染性」）、および／または生得免疫応答および獲得免疫応答を誘導もしくは低減するように操作することができる。
【００９７】
適した合成の方法を、単独でまたは１つもしくは複数の他の方法（たとえば組換えＤＮＡ法または組換えＲＮＡ法）と組み合わせて使用して、本発明の自己複製ＲＮＡ分子を産生することができる。当技術分野では、新規の合成に適した方法が周知であり、特定の適用に適応させることができる。例示的な方法には、たとえばＣＥＭ（Ｍａｓｕｄａら（２００７年）、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ、５１巻：３〜４頁）などの適した保護基を使用する化学合成；β−シアノエチルホスホルアミダイト法（Ｂｅａｕｃａｇｅ  Ｓ  Ｌら（１９８１年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、２２巻：１８５９頁）；ヌクレオシドＨ−ホスホネート法（Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、２７巻：４０５１〜４頁；Ｆｒｏｅｈｌｅｒ  Ｂ  Ｃら（１９８６年）、Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ、１４巻：５３９９〜４０７頁；Ｇａｒｅｇｇ  Ｐら（１９８６年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、２７巻：４０５５〜８頁；Ｇａｆｆｎｅｙ  Ｂ  Ｌら（１９８８年）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ、２９巻：２６１９〜２２頁）が含まれる。市販されている自動式核酸合成器と使用するために、これらの化学反応を実行するまたは適応させることができる。さらなる適した合成法は、Ｕｈｌｍａｎｎら（１９９０年）、Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ、９０巻：５４４〜８４頁；およびＧｏｏｄｃｈｉｌｄ  Ｊ（１９９０年）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ、１巻：１６５頁において開示されている。核酸合成はまた、ポリヌクレオチドおよびこのようなポリヌクレオチドによりコードされる遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を含め、当技術分野において周知であり通常である、適した組換え法を使用しても実行することができる。遺伝子断片および合成ポリヌクレオチドのランダムな断片化およびＰＣＲによる再構成を介するＤＮＡシャフリングは、ポリヌクレオチド配列を設計および操作するのに使用しうる公知の技法の例である。部位指向変異誘発を使用して、たとえば新たな制限部位を挿入する、グリコシル化パターンを改変する、コドンの優先性を変化させる、スプライス改変体を作製する、変異を導入するなどのように、核酸およびコードされるタンパク質を改変することができる。当技術分野では、核酸配列の転写、翻訳、および発現に適した方法が公知であり、通常である（一般的に、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、２巻、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈ．  Ａｓｓｏｃ．  ＆  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１３章、１９８８年；Ｇｌｏｖｅｒ、「ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、ＩＩ巻、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈ．，  Ｄ．Ｃ．、３章、１９８６年；Ｂｉｔｔｅｒら、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１５３巻：５１６〜５４４頁（１９８７年）；「Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｙｅａｓｔ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ」、Ｓｔｒａｔｈｅｒｎら編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＩおよびＩＩ巻、１９８２年；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃ��ｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９年を参照されたい）。
【００９８】
自己複製ＲＮＡ分子における１つまたは複数の修飾ヌクレオチドの存在および／または量は、任意の適した方法を使用して決定することができる。たとえば自己複製ＲＮＡを、モノホスフェートへと消化し（たとえばヌクレアーゼＰ１を使用して）、脱リン酸化し（たとえばＣＩＡＰなどの適したホスファターゼを使用して）、結果として生じるヌクレオシドを、逆相ＨＰＬＣ（たとえばＹＭＣ  Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−ＡＱカラム（５ミクロン、４．６×２５０ｍｍ）を使用し、３０％Ｂ（０〜５分）〜１００％Ｂ（５〜１３分）、１００％Ｂ（１３〜４０分）の勾配、流量（０．７ｍｌ／分）、ＵＶ検出（波長：２６０ｎｍ）、カラム温度（３０℃）を使用して溶離した。緩衝液Ａ（ｐＨ３．５の２０ｍＭ酢酸−酢酸アンモニウム）、緩衝液Ｂ（ｐＨ３．５の２０ｍＭ酢酸−酢酸アンモニウム／メタノール［９０／１０］））により分析することができる。
【００９９】
必要に応じて、本発明の自己複製ＲＮＡ分子に、１つまたは複数の修飾ヌクレオチドを包含させ、宿主細胞（たとえばヒト細胞）への導入または移入時における自己複製ＲＮＡ分子の免疫調節活性を、修飾ヌクレオチドを含有しない、対応する自己複製ＲＮＡ分子と比較して低下させてもよい。
【０１００】
所望の場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏにおける当業者に公知の多様な試験法を使用して、自己複製ＲＮＡ分子をスクリーニングまたは分析し、それらの治療的特性および予防的特性を確認することができる。たとえば自己複製ＲＮＡ分子を含むワクチンを、目的の特定のリンパ球型、たとえばＢ細胞、Ｔ細胞、Ｔ細胞株、およびＴ細胞クローンの増殖またはエフェクター機能の誘導に対するそれらの効果について調べることができる。たとえば免疫されたマウスに由来する脾臓細胞を単離し、細胞傷害性Ｔリンパ球が、ポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含有する自己標的細胞を溶解させる潜在能力について調べることができる。加えて、ＥＬＩＳＡを介して、ＴＨ１（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）サイトカインおよび／もしくはＴＨ２（ＩＬ−４およびＩＬ−５）サイトカインの増殖または産生を測定することにより、ヘルパーＴ細胞の分化を分析することもでき、または細胞質サイトカインの染色およびフローサイトメトリーを介して、ＣＤ４＋  Ｔ細胞内で直接的にヘルパーＴ細胞の分化を分析することもできる。
【０１０１】
ポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子はまた、たとえばＢ細胞による目的の抗原に特異的な抗体の産生の誘導により証拠立てられる、体液性免疫応答を誘導する能力についても調べることができる。これらのアッセイは、たとえば免疫された個体に由来する末梢Ｂリンパ球を使用して行うことができる。このようなアッセイ法は、当業者に公知である。本発明の自己複製ＲＮＡ分子を特徴付けるのに使用しうる他のアッセイは、標的細胞によりコードされる抗原の発現を検出することを伴いうる。たとえばＦＡＣＳを使用して、細胞表面においてまたは細胞内で抗原の発現を検出することができる。ＦＡＣＳによる選択の別の利点は、異なるレベルの発現について分取しうる（場合によって低度の発現が所望でありうる）ことである。特定の抗原を発現させる細胞を同定するために適する他の方法は、プレート上でモノクローナル抗体を使用するパニングまたはモノクローナル抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用する捕捉を伴う。
【０１０２】
本発明の自己複製ＲＮＡは、裸のＲＮＡ送達または細胞への移入を容易とする脂質、ポリマー、もしくは他の化合物と組み合わせた送達など、多様な方法で送達することができる。本発明のＲＮＡ分子は、たとえば直接的な注射、マイクロインジェクション、電気穿孔、リポフェクション、微粒子銃（ｂｉｏｌｙｓｔｉｃｓ）などによるあらゆる適した技法を使用して標的細胞または被験体へと導入することができる。
Ｃ．ポリペプチド分子
【０１０３】
本明細書で記載される免疫原性組成物は、ポリペプチド成分とＲＮＡ成分とを含む。ポリペプチド成分は、ポリペプチド複合体（たとえば２つ以上のタンパク質により形成される複合体）、またはＶＬＰなどの大型のポリペプチド構造など、多重鎖ポリペプチド構造を包含する。
【０１０４】
免疫原性組成物のポリペプチド成分（「第２のポリペプチド抗原」）として使用することができる適切な抗原は、ＨＩＶに由来するタンパク質およびペプチドを包含する。組成物は、２つ以上のポリペプチド抗原を含有しうる。その代わりに、またはそれに加えて、ポリペプチドは、ＨＩＶの２つの異なるタンパク質に由来する２つ以上のエピトープを含む融合ポリペプチドでもありうる。
【０１０５】
ポリペプチド抗原は、発現、産生、精製、または検出を容易とする配列（たとえばポリＨｉｓ配列）など、付加的な配列を包含しうる。
【０１０６】
ポリペプチド抗原は通例、単離または精製されるであろう。したがって、ポリペプチド抗原は、妥当な場合にそれらが通常天然で共に見出される分子と会合していないであろう。
【０１０７】
ポリペプチドは通例、組換え宿主系における発現により調製されるであろう。一般的に、ポリペプチドは、適した組換え宿主細胞において細胞外ドメインをコードする組換え構築物の発現により作製されるが、あらゆる適した方法を使用することができる。適した組換え宿主細胞には、たとえば昆虫細胞（たとえばＡｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、およびＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、哺乳動物細胞（たとえばヒト、非ヒト霊長動物、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、およびげっ歯動物（たとえばハムスター）、鳥類細胞（たとえばニワトリ、アヒル、およびガチョウ）、細菌（たとえばＥ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種）、酵母細胞（たとえばＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｌｔｏｓａ、Ｈａｎｓｅｎｕａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｇｕｉｌｌｅｒｉｍｏｎｄｉｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、およびＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、テトラヒメナの細胞（たとえばＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、またはこれらの組合せが含まれる。当技術分野では、多くの適した昆虫細胞および哺乳動物細胞が周知である。適した昆虫細胞には、たとえばＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞、Ｔｎ５細胞、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ２細胞、および高度な５細胞（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉのＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４親細胞株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に由来するクローン分離株）が含まれる。適した哺乳動物細胞には、たとえばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓細胞（剪断されたアデノウイルス５型ＤＮＡによって典型的に形質転換されたＨＥＫ２９３細胞）、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞、２９３−Ｔ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＰＥＲＣ．６細胞（ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０）、Ｈｅｐ  Ｇ２細胞、ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１７１）、ＷＩ−３８（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−７５）、胎児アカゲザル肺細胞（ＡＴＣＣ  ＣＬ−１６０）、メイディン−ダービーウシ腎臓（「ＭＤＢＫ」）細胞、メイディン−ダービーイヌ腎臓（「ＭＤＣＫ」）細胞（たとえばＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４；またはＭＤＣＫ  ３３０１６、ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）、ＢＨＫ２１−Ｆなどのベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＨＫＣＣ細胞などが含まれる。適した鳥類細胞には、たとえばニワトリ胚性幹細胞（たとえばＥＢｘ（登録商標）細胞）、ニワトリ胚性線維芽細胞、ニワトリ胚性生殖細胞、アヒル細胞（たとえばＶａｃｃｉｎｅ、２７巻：４９７５〜４９８２頁（２００９年）およびＷＯ２００５／０４２７２８において記載されている、たとえばＡＧＥ１．ＣＲおよびＡＧＥ１．ＣＲ．ｐＩＸ細胞株（ＰｒｏＢｉｏＧｅｎ））、ＥＢ６６細胞などが含まれ���。
【０１０８】
当業者には、バキュロウイルス系などの適した昆虫細胞発現系が公知であり、たとえばＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍｉｔｈ、Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、１５５５号（１９８７年）において記載されている。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、キット形態で、とりわけＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡから市販されている。当業者にはまた、鳥類細胞発現系も公知であり、たとえば米国特許第５，３４０，７４０号；同第５，６５６，４７９号；同第５，８３０，５１０号；同第６，１１４，１６８号；および同第６，５００，６６８号；欧州特許第ＥＰ０７８７１８０Ｂ号；欧州特許出願第ＥＰ０３２９１８１３．８号；ＷＯ０３／０４３４１５；ならびにＷＯ０３／０７６６０１において記載されている。同様に当技術分野ではまた、細菌発現系および哺乳動物細胞発現系も公知であり、たとえば「Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」（Ｂａｒｒら編、１９８９年）Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｌｏｎｄｏｎにおいて記載されている。
【０１０９】
ポリペプチドをコードする組換え構築物は、通常の方法を使用して適したベクター内で調製することができる。当技術分野では、昆虫細胞または哺乳動物細胞における組換えタンパク質の発現に適した多数のベクターが周知であり通常のものである。適したベクターは、以下：複製起点；選択マーカー遺伝子；転写制御エレメント（たとえばプロモーター、エンハンサー、ターミネーター）、および／または１もしくは複数の翻訳シグナルなど、１もしくは複数の発現制御エレメント；ならびに選択された宿主細胞内の分泌経路を標的とするためのシグナル配列もしくはリーダー配列（たとえば哺乳動物を起源とする、または異種哺乳動物もしくは哺乳動物以外の種に由来する）のうちの１または複数が含まれるがこれらに限定されない多数の成分を含有しうる。たとえば昆虫細胞における発現のためには、ｐＦａｓｔＢａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの適したバキュロウイルス発現ベクターを、組換えバキュロウイルス粒子を作製するために使用する。バキュロウイルス粒子を増幅し、昆虫細胞に感染させて、組換えタンパク質を発現させるために使用する。哺乳動物細胞における発現のためには、所望の哺乳動物の宿主細胞（たとえばチャイニーズハムスター卵巣細胞）における構築物の発現を駆動するベクターを使用する。
【０１１０】
ポリペプチドは、あらゆる適した方法を使用して精製することができる。当技術分野では、たとえばイムノアフィニティークロマトグラフィーによりポリペプチドを精製するための方法が公知である（Ｒｕｉｚ−Ａｒｇｕｅｌｌｏら、Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．、８５巻：３６７７〜３６８７頁（２００４年））。当技術分野では、沈殿ならびに疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、キレート化クロマトグラフィー、およびサイズ除外クロマトグラフィーなどの多様な種類のクロマトグラフィーを含め、所望のタンパク質を精製するのに適した方法が周知である。これらの適した方法または他の適した方法のうちの２つ以上を使用して適した精製スキームを創出することができる。所望の場合、ポリペプチドは、エピトープタグまたはＨＩＳタグなど、精製を容易にする「タグ」を包含しうる。このようなタグ付けされたポリペプチドは、たとえば馴化培地から、キレート化クロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーにより簡便に精製することができる。
Ｄ．任意選択のＲＮＡ送達系
【０１１１】
タンパク質成分およびＲＮＡ成分に加えて、脂質、ポリマー、または他の化合物などの付加的成分を、本明細書で記載される免疫原性組成物中に、必要に応じて包含させて、ＲＮＡの標的細胞への移入を容易とすることができる。
【０１１２】
ＲＮＡは、裸のＲＮＡとして（たとえばただＲＮＡの水溶液として）送達して、細胞への移入を増強し、また後の細胞内効果も増強しうるが、ＲＮＡ分子は、粒子状送達系またはエマルジョン送達系などの送達系と組み合わせて投与することが好ましい。大多数の送達系は、当業者に周知である。
【０１１３】
例えば、ＲＮＡ分子は、受容体媒介性エンドサイトーシスによって細胞の中に導入されてもよい。たとえば米国特許第６，０９０，６１９号；ＷｕおよびＷｕ、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．、２６３巻：１４６２１頁（１９８８年）；およびＣｕｒｉｅｌら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８巻：８８５０頁（１９９１年）を参照されたい。たとえば、米国特許第６，０８３，７４１号は、それ自体インテグリン受容体結合部分（たとえば配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを有する環状ペプチド）にカップリングされているポリカチオン部分（たとえば３〜１００リシン残基を有するポリＬ−リシン）に核酸を結合することによって、哺乳動物細胞の中に外因性の核酸を導入することを開示する。
【０１１４】
本発明のＲＮＡ分子は、両親媒性物質によって細胞の中に送達することができる。たとえば米国特許第６，０７１，８９０号を参照されたい。典型的に、核酸分子は、カチオン性両親媒性物質と共に複合体を形成してもよい。複合体と接触させた哺乳動物細胞は、容易にそれを取り込むことができる。
【０１１５】
３つの特に有用な送達系は、（ｉ）リポソーム、（ｉｉ）無毒性で生分解性のポリマー微粒子、および（ｉｉｉ）カチオン性サブミクロン水中油型エマルジョンである。
１．リポソーム
【０１１６】
様々な両親媒性脂質は、リポソームとしてＲＮＡ含有水性コアを被包するために、水性環境において二重層を形成することができる。これらの脂質は、アニオン性、カチオン性、または両性イオン性の親水性頭部基（ｈｅａｄ  ｇｒｏｕｐ）を有することができる。アニオン性リン脂質からのリポソームの形成は、１９６０年代にさかのぼり、カチオン性リポソーム形成脂質は、１９９０年代から研究されてきた。いくつかのリン脂質は、アニオン性であるのに対して、他のものは、両性イオン性である。適したクラスのリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロールを含むが、これらに限定されず、いくつかの有用なリン脂質は、表２に列挙される。有用なカチオン性脂質は、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジステアリルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＳＤＭＡ）、１，２−ジオレイルオキシ−Ｎ，Ｎ  ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）を含むが、これらに限定されない。両性イオン性脂質は、アシル両性イオン性脂質およびエーテル両性イオン性脂質を含むが、これらに限定されない。有用な両性イオン性脂質の例は、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＣ、およびドデシルホスホコリンである。脂質は、飽和または不飽和であってもよい。
【表２−１】
2015522580.tif 000007
【表２−２】
2015522580.tif 000008
【０１１７】
リポソームは、単一の脂質または脂質の混合物から形成することができる。混合物は、（ｉ）アニオン性脂質の混合物（ｉｉ）カチオン性脂質の混合物（ｉｉｉ）両性イオン性脂質の混合物（ｉｖ）アニオン性脂質およびカチオン性脂質の混合物（ｖ）アニオン性脂質および両性イオン性脂質の混合物（ｖｉ）両性イオン性脂質およびカチオン性脂質の混合物、または（ｖｉｉ）アニオン性脂質、カチオン性脂質、および両性イオン性脂質の混合物を含んでいてもよい。同様に、混合物は、飽和および不飽和脂質の両方を含んでいてもよい。たとえば、混合物は、ＤＳＰＣ（両性イオン性、飽和）、ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性、不飽和）、および／またはＤＭＰＧ（アニオン性、飽和）を含んでいてもよい。脂質の混合物が使用される場合、混合物における成分脂質のすべてが、両親媒性である必要があるとは限らない、たとえば、１つまたは複数の両親媒性脂質は、コレステロールと混合することができる。
【０１１８】
脂質の親水性部分は、ペグ化することができる（すなわち、ポリエチレングリコールの共有結合によって修飾することができる）。この修飾は、リポソームの安定性を増大させ、非特異的吸着を予防することができる。たとえば、脂質は、Ｈｅｙｅｓら（２００５年）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７巻：２７６〜８７頁において開示されるものなどの技術を使用してＰＥＧにコンジュゲートすることができる。
【０１１９】
ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＰＧ、およびコレステロールの混合物は、本実施例で使用される。本発明の別の態様は、ＤＳＰＣ、ＤｌｉｎＤＭＡ、ＰＥＧ−ＤＭＧ、およびコレステロールを含むリポソームである。このリポソームは、好ましくは、たとえば免疫原をコードする自己複製ＲＮＡなどのＲＮＡを被包する。
【０１２０】
リポソームは、３つの群に通常分けられる：多重膜小胞（ＭＬＶ）；小型単層小胞（ＳＵＶ）；また大型単層小胞（ＬＵＶ）。ＭＬＶは、いくつかの別々の水性コンパートメントを形成する、それぞれの小胞において複数の二重層を有する。ＳＵＶおよびＬＵＶは、水性コアを被包する単一の二重層を有する；ＳＵＶは、典型的に、直径≦５０ｎｍを有し、ＬＵＶは、直径＞５０ｎｍを有する。本発明で有用なリポソームは、理想的には、５０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するＬＵＶである。異なる直径を有するＬＵＶの集団を含む組成物については：（ｉ）数の上で少なくとも８０％が、２０〜２２０ｎｍの範囲の直径を有するべきであり、（ｉｉ）集団の平均直径（Ｚａｖ、強度による）は、理想的には、４０〜２００ｎｍの範囲にあり、および／または（ｉｉｉ）直径は、多分散指数（ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）＜０．２を有するべきである。
【０１２１】
適したリポソームを調製するための技術は、当技術分野において周知であり、たとえばＬｉｐｏｓｏｍｅｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、第１巻：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．（Ｗｅｉｓｓｉｇ編）．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、２００９年．ＩＳＢＮ  １６０３２７３５９Ｘ；Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第Ｉ巻、ＩＩ巻、およびＩＩＩ巻．（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ編）．Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２００６年；ならびにＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ＆  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）．（Ａｒｓｈａｄｙ  ＆  Ｇｕｙｏｔ編）．Ｃｉｔｕｓ  Ｂｏｏｋｓ、２００２年を参照されたい。１つの有用な方法は、（ｉ）脂質のエタノール性の溶液、（ｉｉ）核酸の水溶液、および（ｉｉｉ）緩衝剤を混合し、その後に、混合、平衡化、希釈、および精製を続けることを含む（Ｈｅｙｅｓら（２００５年）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １０７巻：２７６〜８７頁）。
【０１２２】
ＲＮＡは、好ましくは、リポソーム内に被包され、したがって、リポソームは、水性ＲＮＡ含有コアのまわりに外層を形成する。この被包は、ＲＮアーゼ消化からＲＮＡを保護することが分かっている。リポソームは、いくつかの外部ＲＮＡを含むことができる（たとえばリポソームの表面上に）が、少なくともＲＮＡの半分（理想的には、そのすべて）は、被包される。
２．ポリマー微粒子
【０１２３】
様々なポリマーは、ＲＮＡを被包するまたは吸着するために微粒子を形成することができる。実質的に無毒性のポリマーの使用は、レシピエントが安全に粒子を受けることができることを意味し、生分解性ポリマーの使用は、粒子が、長期的な存続を回避するように送達後に代謝され得ることを意味する。有用なポリマーはまた、医薬グレードの製剤を調製するのを支援するために滅菌することもできる。
【０１２４】
適した無毒性で生分解性のポリマーは、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリラクトン（ポリカプロラクトンを含む）、ポリジオキサノン、ポリバレロラクトン、ポリオルトエステル、ポリ酸無水物、ポリシアノアクリレート、チロシン由来ポリカーボネート、ポリビニルピロリジノン、またはポリエステルアミドおよびその組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、微粒子は、ポリ（ラクチド）（「ＰＬＡ」）などのポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（「ＰＬＧ」）などのラクチドおよびグリコリドのコポリマー、ならびにＤ，Ｌ−ラクチドおよびカプロラクトンのコポリマーから形成される。有用なＰＬＧポリマーは、たとえば２０：８０〜８０：２０、たとえば２５：７５、４０：６０、４５：５５、５５：４５、６０：４０、７５：２５の範囲のラクチド／グリコリドモル比を有するものを含む。有用なＰＬＧポリマーは、たとえば５，０００〜２００，０００Ｄａ、たとえば１０，０００〜１００，０００、２０，０００〜７０，０００、４０，０００〜５０，０００Ｄａの分子量を有するものを含む。
【０１２６】
微粒子は、理想的には、０．０２μｍ〜８μｍの範囲の直径を有する。異なる直径を有する微粒子の集団を含む組成物については、数の上で少なくとも８０％が、０．０３〜７μｍの範囲の直径を有するべきである。
【０１２７】
適した微粒子を調製するための技術は、当技術分野において周知であり、たとえばＦｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  第４巻（Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，  ｍｉｃｒｏｃａｐｓｕｌｅｓ  ＆  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）．（Ａｒｓｈａｄｙ  ＆  Ｇｕｙｏｔ編）．Ｃｉｔｕｓ  Ｂｏｏｋｓ、２００２年；Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．（Ｕｃｈｅｇｂｕ  ＆  Ｓｃｈａｔｚｌｅｉｎ編）．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２００６年．（特に第７章）、およびＭｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．（Ｃｏｈｅｎ  ＆  Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ編）．ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年を参照されたい。ＲＮＡの吸着を容易にするために、微粒子は、たとえばＯ’Ｈａｇａｎら（２００１年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７５巻：９０３７〜９０４３頁；およびＳｉｎｇｈら（２００３年）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０巻：２４７〜２５１頁において開示されるように、カチオン性界面活性剤および／または脂質を含んでいてもよい。ポリマー微粒子を作製するための代替方法は、たとえば国際公開第２００９／１３２２０６号において開示されるように成形し、硬化することによるものである。
【０１２８】
本発明の微粒子は、４０〜１００ｍＶのゼータ電位を有することができる。
【０１２９】
ＲＮＡは、微粒子に吸着することができ、吸着作用は、微粒子中にカチオン性材料（たとえばカチオン性脂質）を含めることによって容易になる。
３．水中油型カチオン性エマルジョン
【０１３０】
水中油型エマルジョンは、インフルエンザワクチンのアジュバント処理（ａｄｊｕｖａｎｔｉｎｇ）、たとえばＦＬＵＡＤ（商標）製品におけるＭＦ５９（商標）アジュバント、およびＰＲＥＰＡＮＤＲＩＸ（商標）製品におけるＡＳ０３アジュバントについて公知である。エマルジョンが１つまたは複数のカチオン性分子を含むという条件で、本発明にしたがうＲＮＡ送達は、水中油型エマルジョンを利用し得る。たとえば、カチオン性脂質は、負に荷電したＲＮＡが付着することができる正に荷電した液滴表面を提供するためにエマルジョン中に含むことができる。
【０１３１】
エマルジョンは、１つまたは複数の油を含む。適した油（複数可）は、たとえば、動物（魚類など）供給源または植物供給源に由来するものを含む。油は、理想的には、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。植物油についての供給源は、堅果、種子、および穀類を含む。最も一般的に入手可能なラッカセイ油、ダイズ油、ヤシ油およびオリーブ油は、堅果油を例示する。たとえばホホバ豆から得られるホホバ油を使用することができる。種子油は、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ油、およびその他同種のものを含む。穀類の群において、コーン油は、最も容易に入手可能であるが、コムギ、カラスムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギ、およびその他同種のものなどの他の穀物粒（ｃｅｒｅａｌ  ｇｒａｉｎ）の油もまた、使用されてもよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然に存在しないが、堅果および種子油から出発して、適切な材料の加水分解、分離、およびエステル化によって調製されてもよい。哺乳動物の乳由来の脂肪および油は、代謝可能であり、したがって、使用されてもよい。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化、および他の手段についての手順は、当技術分野において周知である。
【０１３２】
ほとんどの魚は、容易に回収され得る代謝可能な油を含有する。たとえば、タラ肝油、サメ肝油、および鯨ろうなどの鯨油は、本明細書において使用されてもよいいくつかの魚油を例示する。多くの分枝鎖油は、５−炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般的にテルペノイドと呼ばれる。スクアレンは、酵母または他の適切な微生物からも取得することができる。一部の実施形態において、スクアレンは、好ましくは非動物供給源、例えば、オリーブ、オリーブ油または酵母から取得される。スクアラン（スクアレンに対する飽和アナログ）もまた、使用することができる。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、市販の供給源から容易に入手可能であるまたは当技術分野において公知の方法によって得られてもよい。
【０１３３】
他の有用な油は、特にスクアレンと組み合わせたトコフェロールである。エマルジョンの油相がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、ε、またはζトコフェロールのいずれかを使用することができるが、α−トコフェロールが好ましい。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールは両方とも使用することができる。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールである。スクアレンおよびトコフェロール（たとえばＤＬ−α−トコフェロール）を含む油の組み合わせを使用することができる。
【０１３４】
好ましいエマルジョンは、スクアレン、分岐不飽和テルペノイドであるサメ肝油を含む（Ｃ３０Ｈ５０；［（ＣＨ３）２Ｃ［＝ＣＨＣＨ２ＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）］２＝ＣＨＣＨ２−］２；２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエン；ＣＡＳ  ＲＮ  ７６８３−６４−９）。
【０１３５】
エマルジョン中の油は、油、たとえばスクアレンおよび少なくとも１つのさらなる油の組み合わせを含んでいてもよい。
【０１３６】
エマルジョンの水性成分は、淡水（ｐｌａｉｎ  ｗａｔｅｒ）（たとえばｗ．ｆ．ｉ．）であり得るか、または成分、たとえば溶質をさらに含むことができる。たとえば、それは、緩衝液を形成するための塩（たとえば、ナトリウム塩などのクエン酸塩またはリン酸塩）を含んでいてもよい。典型的な緩衝剤は、リン酸緩衝剤；Ｔｒｉｓ緩衝剤；ホウ酸緩衝剤；コハク酸緩衝剤；ヒスチジン緩衝剤；またはクエン酸緩衝剤を含む。緩衝化された水相が好ましく、緩衝剤は、典型的に、５〜２０ｍＭの範囲で含まれるであろう。
【０１３７】
エマルジョンはまた、カチオン性脂質をも含む。好ましくは、この脂質は、それがエマルジョンの形成および安定化を容易にすることができるように、界面活性剤である。有用なカチオン性脂質は、一般的に、たとえば第三級または第四級アミンとして生理学的条件下で正に荷電した窒素原子を含有する。この窒素は、両親媒性界面活性剤の親水性頭部基中にあり得る。有用なカチオン性脂質は、１，２−ジオレオイルオキシ−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、３’−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロール（ＤＣコレステロール）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ、たとえばブロミド）、１，２−ジミリストイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＭＴＡＰ）、ジパルミトイル（Ｃ１６：０）トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＰＴＡＰ）、ジステアロイルトリメチルアンモニウムプロパン（ＤＳＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジオレオイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン（ＤＯＥＰＣ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含むが、これらに限定されない。他の有用なカチオン性脂質は、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＫ）、塩化ベンゼトニウム、セトラミド（ｃｅｔｒａｍｉｄｅ）（テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミドならびにおそらく少量のドデシルトリメチルアンモニウム（ｄｅｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ブロミドおよびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドを含有する）、セチルピリジニウムクロリド（ＣＰＣ）、セチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）、一級アミン、二級アミン、三級アミン（Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ポリオキシエチレン（１０）−Ｎ−獣脂（ｔａｌｌｏｗ）−１，３−ジアミノプロパンを含むが、これに限定されない）、以下を含むがこれらに限定されない四級アミン塩：ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、混合アルキルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンジルジメチルドデシルアンモニウムクロリド、ベンジルジメチルヘキサデシルアンモニウムクロリド、ベンジルトリメチルアンモニウムメトキシド、セチルジメチルエチルアンモニウムブロミド、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、メチルベンゼトニウムクロリド、デカメトニウムクロリド、メチル混合トリアルキルアンモニウムクロリド、メチルトリオクチルアンモニウムクロリド、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−［２（２−メチル−４−（１，１，３，３テトラメチルブチル）−フェノキシ］−エトキシ）エチル］−ベンゼンメタンアミニウムクロリド（ＤＥＢＤＡ）、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、［１−（２，３−ジオレイルオキシ）−プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ，トリメチルアンモニウムクロリド、１，２−ジアシル−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジアシル−３（ジメチルアンモニオ）プロパン（アシル基＝ジミリストイル、ジパルミトイル、ジステアロイル、ジオレオイル）、１，２−ジオレオイル−３−（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノイル−ｓｎ−グリセロール、１，２−ジオレオイル３−スクシニル−ｓｎ−グリセロールコリンエステル、コレステリル（４’−トリメチルアンモニオ）ブタノエート、Ｎ−アルキルピリジニウム塩（たとえばセチルピリジニウムブロミドおよびセチルピリジニウムクロリド）、Ｎ−アルキルピペリジニウム塩、ジカチオン性ボラホルム（ｂｏｌａｆｏｒｍ）電解質（Ｃ１２Ｍｅ６；Ｃ１２Ｂｕ６）、ジアルキルグリセチルホスホリルコリン、リソレシチン、Ｌ−αジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロールヘミスクシネートコリンエステル、リポポリアミン（ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミドスペルミン（ＤＰＰＥＳ）、リポポリＬ（またはＤ）−リシン（ＬＰＬＬ、ＬＰＤＬ）、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミンにコンジュゲートされたポリＬ（またはＤ）−リシン、ペンダントアミノ基を有するジドデシルグルタミン酸エステル（Ｃ１２ＧｌｕＰｈＣｎＮ＋）、ペンダントアミノ基を有するジテトラデシルグルタミン酸エステル（Ｃ１４ＧｌｕＣｎＮ＋）を含むが、これらに限定されない）、コレステロールのカチオン性誘導体（コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−オキシスクシンアミドエチレンジメチルアミン、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレントリメチルアンモニウム塩、コレステリル−３β−カルボキシアミドエチレンジメチルアミンを含むが、これらに限定されない）である。他の有用なカチオン性脂質は、参照によって本明細書において組み込まれるＵＳ  ２００８／００８５８７０およびＵＳ  ２００８／００５７０８０において記載される。
【０１３８】
カチオン性脂質は、好ましくは、生分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。
【０１３９】
油およびカチオン性脂質に加えて、エマルジョンは、非イオン性界面活性剤および／または両性イオン性界面活性剤を含むことができる。そのような界面活性剤は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、とりわけポリソルベート２０およびポリソルベート８０；線状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーなどの、ＤＯＷＦＡＸ（商標）商標下で販売されている、エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；繰り返しのエトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得るオクトキシノール、オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が特に興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）などのリン脂質；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）などの、ラウリル、セチル、ステアリル、およびオレイルアルコールから誘導されるポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知）；ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル；ならびにソルビタントリオレエート（Ｓｐａｎ  ８５）およびソルビタンモノラウレートなどのソルビタンエステル（Ｓｐａｎとして一般的に公知）を含むが、これらに限定されない。エマルジョン中に含むための好ましい界面活性剤は、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ８０；ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、Ｓｐａｎ  ８５（ソルビタントリオレエート）、レシチン、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【０１４０】
これらの界面活性剤の混合物、たとえばＴｗｅｅｎ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物またはＴｗｅｅｎ８０／Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００混合物は、エマルジョン中に含むことができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０）などのポリオキシエチレンソルビタンエステルおよびｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）などのオクトキシノールの組み合わせもまた、適している。他の有用な組み合わせは、ラウレス９ならびにポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールを含む。有用な混合物は、１０〜２０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（たとえば、１５．０のＨＬＢを有するポリソルベート８０）および１〜１０の範囲のＨＬＢ値を有する界面活性剤（たとえば、１．８のＨＬＢを有するソルビタントリオレエート）を含むことができる。
【０１４１】
最終エマルジョン中の油の好ましい量（容積による％）は、２〜２０％、たとえば５〜１５％、６〜１４％、７〜１３％、８〜１２％である。約４〜６％または約９〜１１％のスクアレン含有量は、特に有用である。
【０１４２】
最終エマルジョン中の界面活性剤の好ましい量（重量による％）は、０．００１％〜８％である。たとえば、０．２〜４％、特に０．４〜０．６％、０．４５〜０．５５％、約０．５％、または１．５〜２％、１．８〜２．２％、１．９〜２．１％、約２％、または０．８５〜０．９５％、または約１％のポリオキシエチレンソルビタンエステル（ポリソルベート８０など）；０．０２〜２％、特に約０．５％または約１％のソルビタンエステル（ソルビタントリオレエートなど）；０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％のオクチルまたはノニルフェノキシポリオキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００など）；０．１〜８％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％、または約０．５％のポリオキシエチレンエーテル（ラウレス９など）。
【０１４３】
油および界面活性剤の絶対量ならびにそれらの比は、なおエマルジョンを形成しながらも、広い範囲内で変動され得る。当業者は、所望のエマルジョンを得るために成分の相対的な割合を容易に変動し得るが、油および界面活性剤についての４：１〜５：１の重量比は、典型的である（過剰な油）。
【０１４４】
エマルジョンの免疫賦活性活性を確実にするための重要なパラメーターは、特に大型の動物において、油滴サイズ（直径）である。最も有効なエマルジョンは、サブミクロン（ｓｕｂｍｉｃｒｏｎ）範囲の液滴サイズを有する。適切には、液滴サイズは、範囲５０〜７５０ｎｍにあるであろう。最も有用には、平均液滴サイズは、２５０ｎｍ未満、たとえば２００ｎｍ未満、１５０ｎｍ未満である。平均液滴サイズは、有用には、８０〜１８０ｎｍの範囲にある。理想的には、エマルジョンの油滴の少なくとも８０％（数で）は、直径２５０ｎｍ未満であり、好ましくは少なくとも９０％がそうである。エマルジョン中の平均液滴サイズおよびサイズ分布を決定するための装置は、市販で入手可能である。これらは、典型的に、動的光散乱および／または単一粒子光学検知法（ｓｉｎｇｌｅ−ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｓｅｎｓｉｎｇ）の技術、たとえば、Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＵＳＡ）から入手可能な機器のＡｃｃｕｓｉｚｅｒ（商標）およびＮｉｃｏｍｐ（商標）シリーズ、またはＭａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（ＵＫ）からのＺｅｔａｓｉｚｅｒ（商標）機器、またはＨｏｒｉｂａ（Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）からのＰａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｚｅｒ機器を使用する。
【０１４５】
理想的には、液滴サイズの分布（数による）は、１つの最大値だけを有する、すなわち、２つの最大値を有するのではなく、平均値（モード）のあたりで分布する液滴の単一の集団がある。好ましいエマルジョンは、＜０．４、たとえば０．３、０．２、またはそれ以下の多分散性を有する。
【０１４６】
サブミクロン液滴および狭いサイズ分布を有する適したエマルジョンは、微少流動化（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の使用によって得ることができる。この技術は、高圧および高速度で、幾何学的に固定されたチャネルを通して入力成分のストリームを推進させることによって、平均油滴サイズを低下させる。これらのストリームは、チャネル壁、チャンバー壁、および互いに接触する。その結果としての剪断力、衝撃力、およびキャビテーション力は、液滴サイズの低下を引き起こす。微少流動化の繰り返しのステップは、所望の液滴サイズ平均値および分布を有するエマルジョンが達成されるまで、実行することができる。
【０１４７】
微少流動化の代替物として、熱的方法は、転相を引き起こすために使用することができる。これらの方法もまた、厳密な粒度分布を有するサブミクロンエマルジョンを提供することができる。
【０１４８】
好ましいエマルジョンは、濾過滅菌することができる、すなわち、それらの液滴は、２２０ｎｍのフィルターを通過することができる。滅菌の提供と同様に、この手順はまた、エマルジョン中のあらゆる大きな液滴をも除去する。
【０１４９】
ある実施形態では、エマルジョン中のカチオン性脂質は、ＤＯＴＡＰである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ〜約２５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２４ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．９ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．８ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．７ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．７ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１．８ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌなどのＤＯＴＡＰを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約１．６ｍｇ／ｍｌ、たとえば０．８ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、または１．６ｍｇ／ｍｌのＤＯＴＡＰを含む。
【０１５０】
ある実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＣコレステロールである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ  ＤＣコレステロールのＤＣコレステロールを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ、約０．６２ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約２．４６ｍｇ／ｍｌ、約４．９２ｍｇ／ｍｌなどのＤＣコレステロールを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．６２ｍｇ／ｍｌ〜約４．９２ｍｇ／ｍｌ、たとえば２．４６ｍｇ／ｍｌのＤＣコレステロールを含む。
【０１５１】
ある実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＤＡである。カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含んでいてもよい。たとえば、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約４ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約３ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．６ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約４．５ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．４５ｍｇ／ｍｌなどのＤＤＡを含んでいてもよい。その代わりに、カチオン性水中油型エマルジョンは、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２１ｍｇ／ｍｌ、約２１．５ｍｇ／ｍｌ、約２１．６ｍｇ／ｍｌ、約２５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含んでいてもよい。例示的な実施形態では、カチオン性水中油型エマルジョンは、約０．７３ｍｇ／ｍｌ〜約１．４５ｍｇ／ｍｌ、たとえば１．４５ｍｇ／ｍｌのＤＤＡを含む。
【０１５２】
また、本発明のＲＮＡ分子を、個別の患者から外植される細胞（たとえばリンパ球、骨髄吸引物、組織生検材料）またはユニバーサルドナーの造血幹細胞など、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける細胞へと送達した後、これらの細胞を、通例ＲＮＡ分子でトランスフェクトされた細胞についての選択の後で、患者へと再移植することもできる。患者に送達するのに適切な細胞の量は、当業者により決定されうる患者の状態および所望の効果と共に変化するであろう。たとえば米国特許第６，０５４，２８８号；同第６，０４８，５２４号；および同第６，０４８，７２９号を参照されたい。好ましくは、使用される細胞は自己由来、すなわち処置される患者から得られる細胞である。
【０１５３】
Ｅ．アジュバント
ある実施形態では、本明細書で提示される免疫原性組成物が、アジュバントなど、１つもしくは複数の免疫調節剤を包含する、または必要に応じて包含する。例示的なアジュバントには、以下でさらに論じられるＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントが含まれるがこれらに限定されない。ある実施形態では、本明細書で提示される免疫原性組成物中で使用されるアジュバントに、
１．ミネラル含有組成物；
２．油エマルジョン；
３．サポニン製剤；
４．ウィロソームおよびウイルス様粒子；
５．細菌性誘導体または微生物性誘導体；
６．生体付着物質および粘膜付着物質；
７．リポソーム；
８．ポリオキシエチレンエーテル製剤およびポリオキシエチレンエステル製剤；
９．ポリホスファゼン（ＰＣＰＰ）；
１０．ムラミルペプチド；
１１．イミダゾキノロン化合物；
１２．チオセミカルバゾン化合物；
１３．トリプタントリン化合物；
１４．ヒト免疫調節物質；
１５．リポペプチド；
１６．ベンゾナフチリジン；
１７．微粒子
１８．免疫刺激性ポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ；たとえばＣｐＧを含有するオリゴヌクレオチドなど）
が含まれるがこれらに限定されない。
【０１５４】
１．ミネラル含有組成物
アジュバントとしての使用に適したミネラル含有組成物には、アルミニウム塩およびカルシウム塩などのミネラル塩が含まれる。免疫原性組成物には、水酸化物（たとえばオキシ水酸化物）、リン酸塩（たとえばヒドロキシリン酸塩、オルトリン酸塩）、硫酸塩などのミネラル塩（たとえば「ＶＡＣＣＩＮＥ  ＤＥＳＩＧＮ：  ＴＨＥ  ＳＵＢＵＮＩＴ  ＡＮＤ  ＡＤＪＵＶＡＮＴ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ」（Ｐｏｗｅｌｌ，  Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，  ＭＪ．編）（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９５年、８および９章を参照されたい）、または異なるミネラル化合物（たとえば必要に応じて過剰なリン酸塩を含む、リン酸アジュバントと水酸化物アジュバントとの混合物）の混合物が含まれ得、これらの化合物は任意の適した形態（たとえばゲル、結晶質、アモルファスなど）をとり、（１つまたは複数の）塩への吸着が好ましい。ミネラル含有組成物はまた、金属塩の粒子としても処方することができる（ＷＯ００／２３１０５）。
【０１５５】
アルミニウム塩は、Ａｌ３＋の用量が１用量当たり０．２〜１．０ｍｇの間であるように、本発明のワクチン中に包含させることができる。
【０１５６】
ある実施形態では、アルミニウムベースのアジュバントが、ミョウバン（硫酸アルミニウムカリウム（ＡｌＫ（ＳＯ４）２）またはミョウバン誘導体であって、リン酸緩衝液中の抗原をミョウバンと混合するのに続き、水酸化アンモニウムまたは水酸化ナトリウムなどの塩基で滴定および沈殿を行うことにより、ｉｎ  ｓｉｔｕで形成されるミョウバン誘導体などのミョウバン誘導体である。
【０１５７】
ワクチン製剤における使用に適した別のアルミニウムベースのアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバント（Ａｌ（ＯＨ）３）、または約５００ｍ２／ｇの表面積を有する優れた吸着剤である結晶質アルミニウムオキシ水酸化物（ＡｌＯＯＨ）である。代替的にアルミニウムベースのアジュバントは、水酸化アルミニウムアジュバントのヒドロキシル基の一部または全部の代わりにリン酸基を含有する、リン酸アルミニウムアジュバント（ＡｌＰＯ４）またはヒドロキシリン酸アルミニウムでもありうる。本明細書で提示される好ましいリン酸アルミニウムアジュバントは、酸性、塩基性、および中性の媒体中でアモルファスおよび可溶性である。
【０１５８】
ある実施形態では、アジュバントが、リン酸アルミニウムと水酸化アルミニウムとの両方を含む。より具体的な実施形態では、アジュバントのリン酸アルミニウムの量が、リン酸アルミニウム対水酸化アルミニウムの重量で２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、または９：１を超える比など、水酸化アルミニウムの量より多い。別の実施形態では、ワクチン中のアルミニウム塩を、ワクチン１用量当たり０．４〜１．０ｍｇ、またはワクチン１用量当たり０．４〜０．８ｍｇ、またはワクチン１用量当たり０．５〜０．７ｍｇ、またはワクチン１用量当たり約０．６ｍｇで存在させる。
【０１５９】
一般的に、（１つまたは複数の）好ましいアルミニウムベースのアジュバント、またはリン酸アルミニウム対水酸化アルミニウムの比など、複数のアルミニウムベースのアジュバントの比は、抗原が、所望のｐＨでアジュバントと反対の電荷を帯びるように、分子間の静電引力を最適化することにより選択する。たとえばリン酸アルミニウムアジュバント（ｉｅｐ＝４）は、ｐＨ７．４でリゾチームには吸着するが、アルブミンには吸着しない。アルブミンを標的とするならば、水酸化アルミニウムアジュバントが選択されるであろう（ｉｅｐ＝４）。代替的に水酸化アルミニウムのリン酸塩による前処理は、その等電点を低下させ、それをより塩基性の抗原に好ましいアジュバントとする。
【０１６０】
２．油エマルジョン
アジュバントとしての使用に適した油エマルジョン組成物および油エマルジョン製剤（ムラミルペプチドまたは細菌性細胞壁成分など、他の特異的免疫刺激剤を有するまたは有さない）には、ＭＦ５９（マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロンの粒子へと製剤化される５％のスクアレン、０．５％のＴｗｅｅｎ  ８０、および０．５％のＳｐａｎ  ８５）などのスクアレン−水エマルジョンが含まれる。ＷＯ９０／１４８３７を参照されたい。また、Ｐｏｄｄａ（２００１年）、ＶＡＣＣＩＮＥ、１９巻：２６７３〜２６８０頁；Ｆｒｅｙら（２００３年）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２１巻：４２３４〜４２３７頁も参照されたい。ＭＦ５９は、ＦＬＵＡＤ（商標）インフルエンザウイルス三価サブユニットワクチン中でアジュバントとして使用されている。
【０１６１】
本組成物における使用に特に好ましい油エマルジョンアジュバントは、サブミクロンの水中油エマルジョンである。本発明における使用に好ましいサブミクロンの水中油エマルジョンは、４〜５％  ｗ／ｖのスクアレン、０．２５〜１．０％  ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ  ８０（商標）（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、および／または０．２５〜１．０％のＳｐａｎ  ８５（商標）（ソルビタントリオレエート）、ならびに、必要に応じて、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ＳＭ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（Ｎ−ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｙｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕａｔｍｉｎｙｌ−Ｌ−ａｌａｎｉｎｅ−２−（ｌ’−２’−  ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ＳＭ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３  −ｈｕｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌｏｘｙ）−ｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（ＭＴＰ−ＰＥ）を含有するサブミクロンの水中油エマルジョンなど、必要に応じて量を変化させるＭＴＰ−ＰＥを含有するスクアレン／水エマルジョン、たとえば「ＭＦ５９」として公知のサブミクロンの水中油エマルジョン（ＷＯ９０／１４８３７；米国特許第６，２９９，８８４号；米国特許第６，４５１，３２５号；およびＯｔｔら、「ＭＦ５９  −  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｓａｆｅ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐｏｗｅｌｌ，  Ｍ．Ｆ．およびＮｅｗｍａｎ，  ＭＪ．編）（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）１９９５年、２７７〜２９６頁）である。ＭＦ５９は、４〜５％  ｗ／ｖのスクアレン（たとえば４．３％）、０．２５〜０．５％  ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ  ８０（商標）、および０．５％  ｗ／ｖのＳｐａｎ  ８５（商標）を含有し、必要に応じて、Ｍｏｄｅｌ  １１ＯＹマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｎｅｗｔｏｎ、ＭＡ）などのマイクロフルイダイザーを使用してサブミクロンの粒子へと製剤化された多様な量のＭＴＰ−ＰＥを含有する。たとえばＭＴＰ−ＰＥは、１用量当たり約０〜５００μｇ、より好ましくは１用量当たり０〜２５０μｇ、および最も好ましくは、１用量当たり０〜１００μｇの量で存在させることができる。本明細書で使用される用語「ＭＦ５９−０」が、ＭＴＰ−ＰＥを欠く上記のサブミクロンの水中油エマルジョンを指すのに対し、用語ＭＦ５９−ＭＴＰは、ＭＴＰ−ＰＥを含有する製剤を指し示す。たとえば「ＭＦ５９−１００」は、１用量当たり１００μｇのＭＴＰ−ＰＥを含有するなどである。本発明における使用のための別のサブミクロンの水中油エマルジョンであるＭＦ６９は、４．３％  ｗ／ｖのスクアレン、０．２５％  ｗ／ｖのＴｗｅｅｎ  ８０（商標）、および０．７５％  ｗ／ｖのＳｐａｎ  ８５（商標）を含有し、必要に応じてＭＴＰ−ＰＥを含有する。さらに別のサブミクロンの水中油エマルジョンは、ＳＡＦとしてもまた公知であり、１０％のスクアレン、０．４％のＴｗｅｅｎ  ８０（商標）、５％のプルロニッ���ブロックポリマーＬ１２１、およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有し、これもまたサブミクロンのエマルジョンへと微少流動化されるＭＦ７５である。ＭＦ７５−ＭＴＰとは、１用量当たり１００〜４００μｇのＭＴＰ−ＰＥなど、ＭＴＰを包含するＭＦ７５製剤を指し示す。
【０１６２】
本組成物における使用のためのサブミクロンの水中油エマルジョン、これを作製する方法、およびムラミルペプチドなどの免疫刺激剤については、ＷＯ９０／１４８３７；米国特許第６，２９９，８８４号；および米国特許第６，４５１，３２５号において詳細に記載されている。
【０１６３】
本発明ではまた、フロイントの完全アジュバント（ＣＦＡ）およびフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）もアジュバントとして使用することができる。
【０１６４】
３．他の免疫アジュバント
サポニンとは、広範囲にわたる植物種の樹皮、葉、茎、根、およびまた花において見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの異種群である。Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ（Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ）の木の樹皮から単離されたサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンはまた、Ｓｍｉｌａｘ  ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ  ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライダルベール（ｂｒｉｄｅｓ  ｖｅｉｌ））、およびＳａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（Ｓａｐｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ）（カスミソウ（ｓｏａｐ  ｒｏｏｔ））から商業的に得ることもできる。サポニンアジュバント製剤には、ＱＳ２１などの精製製剤の他、ＩＳＣＯＭなどの脂質製剤も含まれる。サポニンアジュバント製剤には、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（登録商標）アジュバント（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）が含まれる。
【０１６５】
サポニン組成物は、高速薄層クロマトグラフィー（ＨＰ−ＴＬＣ）および逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を使用して精製されている。これらの技法を使用して、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−Ｂ、およびＱＨ−Ｃを含めた特定の精製画分が同定されている。サポニンはＱＳ２１であることが好ましい。米国特許第５，０５７，５４０号では、ＱＳ２１を作製する方法が開示されている。サポニン製剤はまた、コレステロールなどのステロールも含みうる（ＷＯ９６／３３７３９を参照されたい）。
【０１６６】
サポニン製剤は、ステロール、コレステロール、および脂質製剤を包含しうる。サポニンとコレステロールとの組合せを使用して、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる固有の粒子を形成することができる。ＩＳＣＯＭはまた典型的に、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンなどのリン脂質も包含する。あらゆる公知のサポニンは、ＩＳＣＯＭ中で使用することができる。ＩＳＣＯＭは、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＨＡ、およびＱＨＣのうちの１または複数を包含することが好ましい。ＥＰ０１０９９４２、ＷＯ９６／１１７１１、およびＷＯ９６／３３７３９では、ＩＳＣＯＭがさらに記載されている。必要に応じて、ＩＳＣＯＭは、追加の（１つまたは複数の）洗浄剤を欠くこともできる。ＷＯ００／０７６２１を参照されたい。
【０１６７】
Ｂａｒｒら（１９９８年）、ＡＤＶ．  ＤＲＵＧ  ＤＥＬ．  ＲＥＶ．、３２巻：２４７〜２７１頁では、サポニンに基づくアジュバントの開発についての総説を見出すことができる。また、Ｓｊｏｌａｎｄｅｒら（１９９８年）、ＡＤＶ．  ＤＲＵＧ  ＤＥＬ．  ＲＥＶ．、３２巻：３２１〜３３８頁も参照されたい。
【０１６８】
ウィロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）は一般的に、ウイルスに由来する１または複数のタンパク質であって、必要に応じて、リン脂質と組み合わせたまたは製剤化されたタンパク質を含有する。それらは一般的に、非病原性、非複製性であり、一般的に天然のウイルスゲノムのうちのいずれも含有しない。ウイルスタンパク質は、組換えにより作製されうるまたは全ウイルスから単離されうる。ウィロソームまたはＶＬＰにおいて使用するのに適したこれらのウイルスタンパク質には、インフルエンザウイルス（ＨＡまたはＮＡなど）、Ｂ型肝炎ウイルス（コアタンパク質またはカプシドタンパク質など）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（コートタンパク質など）、ＧＡファージ、ｆｒファージ、ＡＰ２０５ファージ、およびＴｙ（レトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１など）に由来するタンパク質が含まれる。ＶＬＰは、ＷＯ０３／０２４４８０；ＷＯ０３／０２４４８１；Ｎｉｉｋｕｒａら（２００２年）、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、２９３巻：２７３〜２８０頁；Ｌｅｎｚら（２００１年）、Ｊ．  ＩＭＭＵＮＯＬ．、１６６巻（９号）：５３４６〜５３５５頁；Ｐｉｎｔｏら（２００３年）、Ｊ．  ＩＮＦＥＣＴ．  Ｄｉｓ．、１８８巻：３２７〜３３８頁；およびＧｅｒｂｅｒら（２００Ｉ）Ｊ．  ＶＩＲＯＬ．、７５巻（１０号）：４７５２〜４７６０頁においてさらに論じられている。ウィロソームは、たとえばＧｌｕｃｋら（２００２年）、ＶＡＣＣＩＮＥ、２０巻：Ｂ１０〜Ｂ１６頁においてさらに論じられている。鼻腔内用の三価ＩＮＦＬＥＸＡＬ（商標）製品（ＭｉｓｃｈｌｅｒおよびＭｅｔｃａｌｆｅ（２００２年）、ＶＡＣＣＩＮＥ、２０巻、増刊５号：Ｂ１７〜Ｂ２３頁）およびＩＮＦＬＵＶＡＣ  ＰＬＵＳ（商標）製品では、免疫増強再構成型インフルエンザウィロソーム（ＩＲＩＶ）がサブユニット抗原送達系として使用されている。
【０１６９】
アジュバントとしての使用に適した細菌性誘導体または微生物性誘導体には、以下が含まれるがこれらに限定されない。
【０１７０】
（１）腸内細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体：このような誘導体は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）を包含する。３ｄＭＰＬとは、４つ、５つ、または６つのアシル化鎖を有する３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。ＥＰ０６８９４５４では、３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小粒子」形態が開示されている。３ｄＭＰＬのこのような「小粒子」は、０．２２ミクロンの膜を介して滅菌濾過するのに十分な程度に小型である（ＥＰ０６８９４５４を参照されたい）。他の非毒性ＬＰＳ誘導体には、アミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体、たとえばＲＣ−５２９など、モノホスホリルリピドＡ模倣体が含まれる。Ｊｏｈｎｓｏｎら（１９９９年）、Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．、９巻：２２７３〜２２７８頁を参照されたい。
【０１７１】
（２）リピドＡ誘導体：リピドＡ誘導体には、ＯＭ−１７４など、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来するリピドＡの誘導体が含まれる。ＯＭ−１７４については、たとえばＭｅｒａｌｄｉら（２００３年）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２１巻：２４８５〜２４９１頁；およびＰａｊａｋら（２００３年）、Ｖａｃｃｉｎｅ、２１巻：８３６〜８４２頁において記載されている。別の例示的なアジュバントは、合成のリン脂質二量体のＥ６０２０（日本、東京、エーザイ株式会社）であり、これは、グラム陰性菌に由来する天然のリピドＡのうちの多くの物理化学的特性および生物学的特性を模倣する。
【０１７２】
（３）免疫刺激性オリゴヌクレオチド：本発明におけるアジュバントとしての使用に適した免疫刺激性オリゴヌクレオチドまたはポリマー分子は、ＣｐＧモチーフ（非メチル化シトシンに続きグアノシンを含有し、ホスフェート結合により連結された配列）を含有するヌクレオチド配列を包含する。また、細菌性二本鎖ＲＮＡまたは回文配列もしくはポリ（ｄＧ）配列を含有する細菌性オリゴヌクレオチドも、免疫刺激性であることが示されている。ＣｐＧは、ホスホロチオエート修飾などのヌクレオチド修飾／アナログを包含することができ、二本鎖であってもよく、または一本鎖であってもよい。必要に応じて、グアノシンを、２’−デオキシ−７−デアザグアノシンなどのアナログと交換することもできる。可能なアナログ置換の例については、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３１巻（９号）：２３９３〜２４００頁；ＷＯ０２／２６７５７；およびＷＯ９９／６２９２３を参照されたい。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、Ｋｒｉｅｇ（２００３年）、Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．、９巻（７号）：８３１〜８３５頁；ＭｃＣｌｕｓｋｉｅら（２００２年）、ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３２巻：１７９〜１８５頁；ＷＯ９８／４０１００；米国特許第６，２０７，６４６号；米国特許第６，２３９，１１６号；および米国特許第６，４２９，１９９号においてさらに論じられている。
【０１７３】
ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴなど、ＴＬＲ９へと方向付けられうる。Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．、３１巻（３号）：６５４〜６５８頁を参照されたい。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮなど、ＴｈＩ免疫応答を誘導するのに特異的であってもよく、またはＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮなど、Ｂ細胞応答を誘導するのにより特異的であってもよい。ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮおよびＣｐＧ−Ｂ  ＯＤＮは、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌら（２００３年）、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７０巻（８号）：４０６１〜４０６８頁；Ｋｒｉｅｇ（２００２年）、ＴＲＥＮＤＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２３巻（２号）：６４〜６５頁；およびＷＯ０１／９５９３５において論じられている。ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ  ＯＤＮであることが好ましい。
【０１７４】
ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のために接近可能であるように構築することが好ましい。必要に応じて、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をそれらの３’末端において接合して「イムノマー」を形成してもよい。たとえばＫａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）、ＢＢＲＣ、３０６巻：９４８〜９５３頁；Ｋａｎｄｉｍａｌｌａら（２００３年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．、３１巻（３号）：６５４〜６５８頁；Ｂｈａｇａｔら（２００３年）、ＢＢＲＣ、３００巻：８５３〜８６１頁；およびＷＯ０３／０３５８３６を参照されたい。
【０１７５】
また、免疫刺激性オリゴヌクレオチドおよびポリマー分子には、ポリビニル骨格（Ｐｉｔｈａら（１９７０年）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ、２０４巻（１号）：３９〜４８頁；Ｐｉｔｈａら（１９７０年）、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、９巻（８号）：９６５〜９７７頁）、およびモルホリノ骨格（米国特許第５，１４２，０４７号；米国特許第５，１８５，４４４号）などであるがこれらに限定されない、代替的なポリマー骨格構造も含まれる。当技術分野では、多様な他の荷電ポリヌクレオチドアナログおよび非荷電ポリヌクレオチドアナログが公知である。当技術分野では、非荷電連結（たとえばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、およびカルバメート）および荷電連結（たとえばホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート）が含まれるがこれらに限定されない、多数の骨格修飾が公知である。
【０１７６】
アジュバントのＩＣ３１（Ｉｎｔｅｒｃｅｌｌ  ＡＧ、Ｖｉｅｎｎａ、Ａｕｓｔｒｉａ）は、抗菌ペプチドであるＫＬＫおよび免疫刺激性オリゴヌクレオチドであるＯＤＮＩａを含有する合成の製剤である。２つの成分溶液は、抗原（たとえば抗原と会合した、本発明に従う粒子）と簡単に混合することができ、コンジュゲーションは必要とされない。
【０１７７】
ＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの解毒誘導体：細菌性ＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの解毒誘導体は、本発明におけるアジュバントとして使用することができる。好ましくは、タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（すなわちＥ．ｃｏｌｉの易熱性腸内毒素「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）、または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。解毒ＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は、ＷＯ９５／１７２１１において記載されており、非経口アジュバントとしての使用は、ＷＯ９８／４２３７５において記載されている。好ましくは、アジュバントが、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、およびＬＴＲ１９２Ｇなどの解毒ＬＴ変異体である。ＡＤＰリボシル化毒素およびそれらの解毒誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２のアジュバントとしての使用は、以下の参考文献：Ｂｅｉｇｎｏｎら（２００２年）、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．、７０巻（６号）：３０１２〜３０１９頁；Ｐｉｚｚａら（２００１年）、Ｖａｃｃｉｎｅ、１９巻：２５３４〜２５４１頁；Ｐｉｚｚａら（２０００年）、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２９０巻（４〜５号）：４５５〜４６１頁；Ｓｃｈａｒｔｏｎ−Ｋｅｒｓｔｅｎら（２０００年）、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．、６８巻（９号）：５３０６〜５３１３頁；Ｒｙａｎら（１９９９年）、Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．、６７巻（１２号）：６２７０〜６２８０頁；Ｐａｒｔｉｄｏｓら（１９９９年）、Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｌｅｔｔ．、６７巻（３号）：２０９〜２１６頁；Ｐｅｐｐｏｌｏｎｉら（２００３年）、Ｖａｃｃｉｎｅｓ、２巻（２号）：２８５〜２９３頁；およびＰｉｎｅら（２００２年）、Ｊ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ、８５巻（１〜３号）：２６３〜２７０頁において見出すことができる。アミノ酸置換の番号について言及は、Ｄｏｍｅｎｉｇｈｉｎｉら（１９９５年）、Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１５巻（６号）：１１６５〜１１６７頁において示されている、ＡＤＰリボシル化毒素のＡサブユニットおよびＢサブユニットのアラインメントに基づくことが好ましい。
【０１７８】
また、生体付着物質および粘膜付着物質もアジュバントとして使用することができる。適した生体付着物質には、エステル化されたヒアルロン酸マイクロスフェア（Ｓｉｎｇｈら（２００１年）、Ｊ．  Ｃｏｎｔ．  Ｒｅｌｅａｓｅ、７０巻：２６７〜２７６頁）またはポリアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖、およびカルボキシメチルセルロースの架橋された誘導体などの粘膜付着物質が含まれる。また、キトサンおよびその誘導体も、本発明におけるアジュバントとして使用することができる（ＷＯ９９／２７９６０を参照されたい）。
【０１７９】
アジュバントとしての使用に適したリポソーム製剤の例は、米国特許第６，０９０，４０６号；米国特許第５，９１６，５８８号；およびＥＰ特許公開第ＥＰ０６２６１６９号において記載されている。
【０１８０】
本発明における使用に適したアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルを包含する（たとえばＷＯ９９／５２５４９を参照されたい）。このような製剤には、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１２０７）の他、オクトキシノールなど、少なくとも１つの追加の非イオン性界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテル界面活性剤またはポリオキシエチレンアルキルエステル界面活性剤（ＷＯ０１／２１１５２）がさらに含まれる。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン−８−ステオリルエーテル（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ−８−ｓｔｅｏｒｙｌ  ｅｔｈｅｒ）、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。
【０１８１】
アジュバントとしての使用に適したＰＣＰＰ製剤については、たとえばＡｎｄｒｉａｎｏｖら（１９９８年）、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、１９巻（１〜３号）：１０９〜１１５頁；およびＰａｙｎｅら（１９９８年）、Ａｄｖ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．  Ｒｅｖ．、３１巻（３号）：１８５〜１９６頁において記載されている。
【０１８２】
アジュバントとしての使用に適したムラミルペプチドの例には、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−トレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−ｌ−アラニル−ｄ−イソグルタミニル−ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）が含まれる。
【０１８３】
アジュバントとしての使用に適したイミダゾキノリン化合物の例には、Ｓｔａｎｌｅｙ（２００２年）、Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、２７巻（７号）：５７１〜５７７頁；Ｊｏｎｅｓ（２００３年）、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．  Ｄｒｕｇｓ、４巻（２号）：２１４〜２１８頁；ならびに米国特許第４，６８９，３３８号；同第５，３８９，６４０号；同第５，２６８，３７６号；同第４，９２９，６２４号；同第５，２６６，５７５号；同第５，３５２，７８４号；同第５，４９４，９１６号；同第５，４８２，９３６号；同第５，３４６，９０５号；同第５，３９５，９３７号；同第５，２３８，９４４号；および同第５，５２５，６１２号においてさらに記載されている、イミキモドおよびそのアナログが含まれる。
【０１８４】
アジュバントとしての使用に適したチオセミカルバゾン化合物、ならびにこのような化合物を処方する方法、製造する方法、およびこれらについてスクリーニングする方法の例には、ＷＯ０４／６０３０８において記載される例が含まれる。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αなどのサイトカインを産生するためにヒト末梢血単核細胞を刺激するのに特に有効である。
【０１８５】
アジュバントとしての使用に適したトリプタントリン化合物、ならびにこのような化合物を処方する方法、製造する方法、およびこれらについてスクリーニングする方法の例には、ＷＯ０４／６４７５９において記載される例が含まれる。トリプタントリン化合物は、ＴＮＦ−αなどのサイトカインを産生するためにヒト末梢血単核細胞を刺激するのに特に有効である。
【０１８６】
アジュバントとしての使用に適したベンゾナフチリジン化合物、ならびに処方する方法および製造する方法の例には、ＷＯ２００９／１１１３３７において記載される例が含まれる。
【０１８７】
アジュバントとしての使用に適したリポペプチドについては、上記に記載されている。他の例示的なリポペプチドには、たとえばＴＬＲ２のアゴニストであるＬＰ４０が含まれる。たとえばＡｋｄｉｓら、ＥＵＲ．  Ｊ．  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、３３巻：２７１７〜２６頁（２００３年）を参照されたい。ムレインリポペプチドとは、Ｅ．ｃｏｌｉに由来するリポペプチドである。Ｈａｎｔｋｅら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、３４巻：２８４〜２９６頁（１９７３年）を参照されたい。ムレインリポペプチドは、Ｎ−アセチルムラミン酸へと連結されたペプチドを含み、したがって、Ｂａｓｃｈａｎｇら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４５巻（２０号）：６３３１〜６３６０頁（１９８９年）において記載されているムラミルペプチドと類縁である。
【０１８８】
アジュバントとしての使用に適したヒト免疫調節物質には、例だけを目的として述べると、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２）、インターフェロン（例だけを目的として述べると、インターフェロンγなど）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子などのサイトカインが含まれるがこれらに限定されない。
【０１８９】
アジュバントとしての使用に適した微粒子には、生分解性および非毒性の物質（たとえばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成される微粒子が含まれるがこれらに限定されない。ある実施形態では、このような微粒子を、負に荷電した表面を有するように（たとえばＳＤＳにより）処理する、または正に荷電した表面を有するように（たとえばＣＴＡＢなどのカチオン性洗浄剤により）処理する。アジュバントとしての使用に適した微粒子の粒子直径は、約１００ｎｍ〜約１５０μｍである。ある実施形態では、粒子直径が、約２００ｎｍ〜約３０μｍであり、他の実施形態では、粒子直径が、約５００ｎｍ〜１０μｍである。
【０１９０】
３．キット
（Ａ）ＲＮＡ分子とポリペプチド分子とを共投与するためのキット
本発明はまた、第１のポリペプチド抗原をコードするＲＮＡ分子（ＲＮＡ成分）と、第２のポリペプチド抗原（ポリペプチド成分）とが別個の容器に入ったキットも提供する。たとえばキットは、第１のポリペプチド抗原をコードするＲＮＡ分子を含む組成物を含む第１の容器と、第２のポリペプチド抗原を含む組成物を含む第２の容器とを含有しうる。ポリペプチドまたはＲＮＡ分子は、液体形態であってもよく、または固体形態（たとえば凍結乾燥させた）であってもよい。
【０１９１】
記載されるキットは、本明細書で記載される免疫原性組成物のＲＮＡ成分とポリペプチド成分との共送達のために使用することができる（たとえばＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを、同時的送達のために、投与前に混合する、たとえば投与前約７２時間、約４８時間、約２４時間、約１２時間、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、約４５分間、約３０分間、約１５分間、約１０分間、または約５分間以内に混合する）。
【０１９２】
（Ｂ）初回刺激−追加刺激のためのキット
別の態様では、本発明は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む初回刺激組成物と；（ｉｉ）第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む追加刺激組成物とを含み；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープであるキットを提供する。キットは、病原体に対する免疫応答を発生させるための「ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」の免疫レジメンなど、ＲＮＡおよびポリペプチドの逐次投与に適する。
【０１９３】
ＲＮＡによりコードされる抗原（第１のポリペプチド抗原）として使用しうる抗原であって、初回刺激組成物に適した抗原、または追加刺激組成物のためのポリペプチド抗原（第２のポリペプチド抗原）には、ＨＩＶに由来するタンパク質およびペプチドが含まれる。
【０１９４】
初回刺激組成物のＲＮＡ分子は、裸のＲＮＡとして（たとえば、単にＲＮＡの水溶液として）送達しうる。代替的に、細胞への移入を増強するために、かつまた後の細胞内効果も増強するために、ＲＮＡ分子が送達系と組み合わせて投与されるように、初回刺激組成物は、送達系（粒子状送達系またはエマルジョン送達系など）を必要に応じて含みうる。例示的な送達系は上記に記載されている。送達系は、ＲＮＡ分子（たとえばあらかじめ製剤化された）と同じ容器内に入れてもよく、またはＲＮＡと異なる容器内に入れてもよい（たとえばＲＮＡと送達系とを別個にパッケージングし、たとえば投与前約７２時間、約４８時間、約２４時間、約１２時間、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、約４５分間、約３０分間、約１５分間、約１０分間、または約５分間以内に混合することができる）。
【０１９５】
初回刺激組成物、追加刺激組成物、またはこれらの両方は、本明細書で記載されるアジュバントなど、１つまたは複数の免疫調節剤を必要に応じて包含しうる。免疫調節剤は、初回刺激組成物もしくは追加刺激組成物と同じ容器内に入れてもよく、または投与前に初回刺激組成物もしくは追加刺激組成物と混合しうる別個の容器内に入れてもよい。
【０１９６】
ＲＮＡ分子を含む初回刺激組成物またはポリペプチドを含む追加刺激組成物は、液体形態であってもよく、または固体形態（たとえば凍結乾燥させた）であってもよい。
【０１９７】
（Ｃ）キットの他の成分
適した容器には、たとえばボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックを含めた多様な材料から形成されうる。容器は、滅菌のアクセスポートを有しうる（たとえば容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針により穿刺可能なストッパーを有するバイアルでありうる）。
【０１９８】
キットは、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液など、薬学的に許容される緩衝液を含む第３の容器をさらに含みうる。キットはまた、緩衝剤、希釈剤など、薬学的に許容される他の処方溶液、フィルター、注射針、およびシリンジ、または他の送達デバイスを含め、エンドユーザーに有用な他の材料も含有しうる。キットは、アジュバント（アルミニウム含有アジュバントまたはＭＦ５９など）を含む第４の容器もさらに包含しうる。
【０１９９】
キットはまた、免疫を誘導する方法または感染を処置する方法についての書面による指示を含有するパッケージの添付文書も含みうる。パッケージの添付文書は、未承認のパッケージの添付文書の草稿であってもよく、または米国食品医薬品局（ＦＤＡ）または他の規制機関により承認されたパッケージの添付文書であってもよい。
【０２００】
本発明はまた、上記の免疫原性組成物、初回刺激組成物、または追加刺激組成物であらかじめ充填された送達デバイスも提供する。
【０２０１】
４．医薬組成物
一態様では、本発明は、ＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子（ＲＮＡ成分）と；（ｉｉ）第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原（ポリペプチド成分）（前記第１のエピトープと第２のエピトープとはＨＩＶに由来するエピトープである）と；（ｉｉｉ）薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルとを含む。
【０２０２】
別の態様では、本発明は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む初回刺激組成物と；（ｉｉ）第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む追加刺激組成物とを含み；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープであり；初回刺激組成物、追加刺激組成物、またはこれらの両方が、薬学的に許容される担体および／または薬学的に許容されるビヒクルを含むキットに関する。
【０２０３】
医薬組成物は典型的に、本明細書で記載される、薬学的に許容される担体および／または適した送達系（リポソーム、ナノエマルジョン、ＰＬＧによる微粒子およびナノ粒子、リポプレックス、キトサンによる微粒子およびナノ粒子、ならびにＲＮＡ送達のための他のポリプレックスなど）を包含する。所望の場合、他の薬学的に許容される成分は、賦形剤およびアジュバントなどを包含しうる。これらの医薬組成物は、ワクチンとして使用することができる。
【０２０４】
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物により部分的に決定される他、組成物を投与するのに使用される特定の方法によっても決定される。したがって、本発明の医薬組成物に適した多種多様な製剤が存在する。多様な水性担体を使用することができる。医薬組成物において使用するのに適した、薬学的に許容される担体には、真水（たとえばｗ．ｆ．ｉ）または緩衝液、たとえばリン酸緩衝液、トリス緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、またはクエン酸緩衝液が含まれる。緩衝液の塩は典型的に、５〜２０ｍＭの範囲で包含することができる。
【０２０５】
医薬組成物は滅菌であることが好ましく、通常の滅菌技法で滅菌することができる。
【０２０６】
組成物は、ｐＨ調整剤およびｐＨ緩衝剤、ならびに張度調整剤など、たとえば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど、生理学的状態を近似するのに必要とされる、薬学的に許容される補助物質を含有しうる。
【０２０７】
本発明の医薬組成物のｐＨは、５．０〜９．５の間、たとえば６．０〜８．０の間であることが好ましい。
【０２０８】
本発明の医薬組成物は、張度をもたらすためのナトリウム塩（たとえば塩化ナトリウム）を包含しうる。１０±２ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ濃度が典型的である（たとえば約９ｍｇ／ｍｌ）。
【０２０９】
本発明の医薬組成物の浸透圧モル濃度は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、たとえば２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、または２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの間でありうる。
【０２１０】
本発明の医薬組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールなど、１つまたは複数の防腐剤を包含しうる。水銀非含有組成物が好ましく、防腐剤非含有ワクチンも調製することができる。
【０２１１】
本発明の医薬組成物は、非発熱性であることが好ましく、たとえば１用量当たり＜１ＥＵ（標準的な尺度である内毒素単位）を含有し、１用量当たり＜０．１ＥＵを含有することが好ましい。本発明の医薬組成物は、グルテン非含有であることが好ましい。
【０２１２】
医薬組成物中のポリペプチド分子および／またはＲＮＡ分子の濃度は、変化する可能性があり、選択される特定の投与方式および意図されるレシピエントの必要に従い、流体の容量、粘性、体重、および他の検討事項に基づき選択されるであろう。しかし、医薬組成物は、処置または防止に有効な量（単回用量において、またはシリーズの一部として）など、有効量のＲＮＡ＋ポリペプチド（ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激など、同時投与または逐次投与される）を提供するように製剤化される。この量は、処置される個体の健康および体調、年齢、処置される個体の分類群（たとえば非ヒト霊長動物、霊長動物など）、抗原によりコードされるタンパク質またはペプチドに対して個体の免疫系が反応する能力、処置される状態、および他の関与性の因子に応じて変化する。量は、日常的な試験を介して決定されうる比較的広い範囲内に収まることが予測される。組成物のＲＮＡ含量は一般的に、１用量当たりのＲＮＡの量で表現される。好ましい用量は、≦２００μｇ、≦１００μｇ、≦５０μｇ、または≦１０μｇのＲＮＡであり、発現は、たとえば１用量当たり≦１μｇ、１用量当たり≦１００ｎｇ、１用量当たり≦１０ｎｇ、１用量当たり≦１ｎｇなどはるかに低レベルで見られうる。各用量におけるポリペプチドの量は一般的に、約０．１〜約１００μｇのポリペプチドを含み、約５〜約５０μｇが好ましく、１用量当たり約５〜約２５μｇが代替的に好ましい。
【０２１３】
存在する場合のアジュバントの量は、著明な有害な副作用を有さない免疫調節性応答を誘導する量であろう。特定のワクチンのための任意選択の量は、ワクチンの抗体力価およびそれらのウイルスの中和能についての観察を伴う標準的な研究により確認することができる。アジュバントの量は、１用量当たり約１〜約１００μｇであり、１用量当たり約５〜約５０μｇが好ましく、１用量当たり約２０〜約５０μｇが代替的に好ましい。
【０２１４】
たとえば関節内（ｉｎｔｒａａｒｔｉｃｕｌａｒ）（関節内（ｉｎ  ｔｈｅ  ｊｏｉｎｔｓ））注射、静脈内注射、または腹腔内注射により、好ましくは筋内注射、皮内注射、または皮下注射によるなど、非経口投与に適する製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性とする溶質を含有しうる水性および非水性で等張性の滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を包含しうる水性および非水性の滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、アンプルおよびバイアルなど、単位用量または複数用量の密封容器内に存在させることができる。注射溶液および懸濁液は、滅菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。また、ＲＮＡ分子により形質導入される細胞も、静脈内投与または非経口投与することができる。
【０２１５】
経口投与に適する製剤は、（ａ）水、食塩水、またはＰＥＧ  ４００などの希釈剤中に懸濁させた、有効量のパッケージングされた核酸などの液体溶液；（ｂ）各々が液体、固体、顆粒、またはゼラチンとしての所定量の有効成分を含有する、カプセル、小袋（ｓａｃｈｅｔ）、または錠剤；（ｃ）適切な液体中の懸濁液；および（ｄ）適したエマルジョンからなりうる。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、トラガント、微晶質セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状の二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、防腐剤、芳香剤、色素、崩壊剤、および医薬として適合性の担体のうちの１または複数を包含しうる。ロゼンジ形態が、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガントである矯味矯臭剤中に有効成分を含みうる他、香錠は、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースなど、不活性の基剤中に有効成分を含み、アカシアエマルジョン、アカシアゲルなどは、有効成分に加えて、当技術分野で公知の担体を含有する。
【０２１６】
ポリペプチドおよびＲＮＡ分子は、経口投与される場合、消化から保護されなければならないことが認識される。ポリペプチドおよびＲＮＡ分子の保護は、典型的にＲＮＡ分子またはポリペプチド分子を組成物と複合体化させて、ＲＮＡ／ポリペプチドを酸および酵素による加水分解に対して耐性とすることにより、またはＲＮＡ分子またはポリペプチド分子を、リポソームなど、適切に耐性である担体中にパッケージングすることにより達成することができる。当技術分野では、核酸（ＲＮＡ分子など）およびポリペプチドを消化から保護する手段が周知である。
【０２１７】
医薬組成物は、たとえばリポソーム中または有効成分の徐放をもたらす製剤中に被包することができる。たとえばＲＮＡ分子は、リポソームとして処方し、次いで、初回刺激組成物として投与することができる。代替的にリポソームと製剤化されたＲＮＡは、本発明のＲＮＡ＋ポリペプチド免疫原性組成物を産生するためのポリペプチド分子と混合することができる。代替的にＲＮＡ分子とポリペプチド分子とは、リポソーム内に共被包することができる。
【０２１８】
本明細書で記載される組成物（初回刺激組成物、追加刺激組成物、またはＲＮＡおよびポリペプチドを含む免疫原性組成物）は、単独でまたは他の適した成分と組み合わせて、吸入を介して投与するためのエアゾール製剤へと作製することができる（たとえば「噴霧化」させることができる）。エアゾール製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容可能な噴霧体中に入れることができる。
【０２１９】
適した坐剤製剤は、ＲＮＡ、ポリペプチド、または本明細書で記載されるポリペプチドとＲＮＡとの組合せ、および坐剤基剤を含有しうる。適した坐剤基剤には、天然または合成のトリグリセリドまたはパラフィン炭化水素が含まれる。また、本明細書で記載されるポリペプチドおよびＲＮＡ分子ならびに適した基剤、たとえば液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、およびパラフィン炭化水素で充填したゼラチンによる直腸用カプセルを使用することも可能である。
【０２２０】
５．免疫応答を生成させる方法またはこれを増強する方法
（Ａ）ＲＮＡ分子とポリペプチド分子との共投与
別の態様では、本発明は、免疫応答を、それを必要とするヒトなどの被験体において誘導する、生成させる、または増強するための方法であって、有効量のＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを含む免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を提供する。組成物は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子（ＲＮＡ成分）と；（ｉｉ）第２のエピトープを含むポリペプチド抗原（ポリペプチド成分）とを含み；ここで、前記第１のエピトープと第２のエピトープとはＨＩＶに由来するエピトープである。免疫応答は防御性であることが好ましく、抗体および／または細胞介在性免疫を伴うことが好ましい。方法を使用して、一次免疫応答を誘導することもでき、かつ／または免疫応答を追加刺激することもできる。
【０２２１】
別の態様では、本明細書で開示される免疫原性組成物を、それを必要とするヒトなどの被験体において免疫応答を誘導する、生成させる、または増強するための医薬の製造において使用することができる。
【０２２２】
別の態様では、本発明は、それを必要とする被験体（例えば、ヒト）において感染性疾患を処置または予防するための方法であって、有効量のＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを含む免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を提供する。組成物は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子（ＲＮＡ成分）と；（ｉｉ）第２のエピトープを含むポリペプチド抗原（ポリペプチド成分）とを含み；ここで、前記第１のエピトープと第２のエピトープとはＨＩＶに由来するエピトープである。
【０２２３】
別の態様では、本明細書に開示されている組成物は、それを必要とするヒトなどの被験体においてＨＩＶを処置または予防するための医薬の製造において使用することができる。
【０２２４】
別の態様では、本発明は、ヒトなどの被験体にワクチン接種する、または被験体をＨＩＶに対して免疫するための方法であって、それを必要とする被験体に、有効量のＲＮＡ成分とポリペプチド成分とを含む免疫原性組成物を投与するステップを含む方法を提供する。組成物は、（ｉ）第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子（ＲＮＡ成分）と；（ｉｉ）第２のエピトープを含むポリペプチド抗原（ポリペプチド成分）とを含み；ここで、上記第１のエピトープと前記第２のエピトープとはＨＩＶに由来するエピトープである。
【０２２５】
別の態様では、本明細書に開示されている組成物は、それを必要とするヒトなどの被験体にワクチン接種するための医薬の製造において使用することができる。
【０２２６】
ＲＮＡ分子とポリペプチド分子とを共投与する場合も、ポリペプチド分子とＲＮＡ分子とを別個にパッケージングすることが依然として望ましくあり得る。２つの成分は、たとえば投与前約７２時間、約４８時間、約２４時間、約１２時間、約１０時間、約９時間、約８時間、約７時間、約６時間、約５時間、約４時間、約３時間、約２時間、約１時間、約４５分間、約３０分間、約１５分間、約１０分間、または約５分間以内に混合することができる。たとえばポリペプチド分子とＲＮＡ分子とは、患者のベッドサイドで混合することができる。
【０２２７】
（Ｂ）初回刺激−追加刺激
本発明の一態様は、「初回刺激および追加刺激」による免疫レジームであって、初回刺激組成物により誘導された免疫応答を、追加刺激組成物により追加刺激する免疫レジームに関する。たとえば抗原（たとえばポリペプチド抗原、ＲＮＡによりコードされる抗原、弱毒化された病原体、またはこれらの組合せ）による初回刺激（少なくとも１回）の後に、実質的に同じ抗原を同じ形態で含む追加刺激組成物（たとえばタンパク質による初回刺激、タンパク質による追加刺激；ＲＮＡによる初回刺激、ＲＮＡによる追加刺激など）、実質的に同じ抗原を異なる形態で含む追加刺激組成物（たとえばＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激；この場合、ＲＮＡとタンパク質とが同じ標的抗原を指向する）、または異なる抗原を同じもしくは異なる形態で含む追加刺激組成物（たとえば抗原１を標的とするＲＮＡによる初回刺激、抗原２を標的とするタンパク質による追加刺激、ここで、抗原１と抗原２とは異なるが、共通のエピトープを共有する）を投与して、初回刺激された宿主における免疫応答を追加刺激することができる。
【０２２８】
別の態様では、本発明は、免疫応答を、それを必要とする、ヒトなどの被験体において誘導する、生成させる、または増強するための方法であって、（ｉ）それを必要とする被験体に、第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと；（ｉｉ）その後この被験体に、第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップとを含み；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである方法を提供する。免疫応答は防御性であることが好ましく、抗体および／または細胞介在性免疫を伴うことが好ましい。
【０２２９】
別の態様では、本明細書で開示される初回刺激組成物および追加刺激組成物を、それを必要とするヒトなどの被験体において免疫応答を誘導する、生成させる、または増強するための医薬の製造において使用することができる。
【０２３０】
別の態様では、本発明は、それを必要とする被験体（例えば、ヒト）においてＨＩＶを処置または予防するための方法であって、（ｉ）それを必要とする被験体に、第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと；（ｉｉ）その後この被験体に、第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップとを含み；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである方法を提供する。
【０２３１】
別の態様では、本明細書で開示される初回刺激組成物および追加刺激組成物を、それを必要とするヒトなどの被験体においてＨＩＶを処置または予防するための医薬の製造において使用することができる。
【０２３２】
別の態様では、本発明は、ヒトなどの被験体にワクチン接種するか、またはヒトなどの被験体をＨＩＶに対して免疫するための方法であって、（ｉ）それを必要とする被験体に、第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードする自己複製ＲＮＡ分子を含む治療有効量の初回刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップと；（ｉｉ）その後この被験体に、第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む治療有効量の追加刺激組成物を、少なくとも１回投与するステップとを含み；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである方法を提供する。
【０２３３】
別の態様では、本明細書で開示される初回刺激組成物および追加刺激組成物を、それを必要とする、ヒトなどの被験体にワクチン接種するための医薬の製造において使用することができる。
【０２３４】
初回刺激組成物と追加刺激組成物とは、実質的に同じ（たとえばＲＮＡ＋タンパク質の初回刺激、ＲＮＡ＋タンパク質の追加刺激）であってもよく、または異なって（たとえばＲＮＡ＋タンパク質の初回刺激、タンパク質の追加刺激）いてもよい。
【０２３５】
初回刺激組成物中に包含される抗原と追加刺激組成物中に包含される抗原（ポリペプチド形態にある、またはＲＮＡによりコードされる形態にある）とは、同一である必要はないが、少なくとも１つの共通のエピトープ（たとえば第１のエピトープを含む第１のポリペプチド抗原をコードするＲＮＡ分子を含む初回刺激組成物；第２のエピトープを含む第２のポリペプチド抗原を含む追加刺激組成物であって；前記第１のエピトープと第２のエピトープとが同じエピトープである）を共有するものとする。
【０２３６】
本発明の一実施形態では、「ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」の免疫戦略を使用する。ＲＮＡ分子による初回刺激（少なくとも１回）に続き、その後ポリペプチド分子を投与して、初回刺激された宿主における免疫応答を追加刺激する。
【０２３７】
本発明の別の実施形態では、「ＲＮＡ＋タンパク質による初回刺激、タンパク質による追加刺激」の戦略を使用する。ＲＮＡ分子とポリペプチド分子とを含む免疫原性組成物による初回刺激（少なくとも１回）に続き、その後ポリペプチド分子を投与して、初回刺激された宿主における免疫応答を追加刺激する。
【０２３８】
被験体を、１回より多く初回刺激および／または追加刺激することができる。たとえば免疫戦略は、初回刺激、初回刺激、追加刺激であってもよく；初回刺激、追加刺激、追加刺激であってもよい。ある実施形態では、初回刺激組成物を少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、または少なくとも５回にわたり投与する。ある実施形態では、追加刺激組成物を少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、または少なくとも５回にわたり投与する。
【０２３９】
追加刺激組成物の投与は、初回刺激組成物を投与した約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約８週間、約１２週間、約１６週間、約２０週間、約２４週間、約２８週間、約３２週間、約３６週間、約４０週間、約４４週間、約４８週間、約５２週間、約１カ月間、約２カ月間、約３カ月間、約４カ月間、約５カ月間、約６カ月間、約７カ月間、約８カ月間、約９カ月間、約１０カ月間、約１１カ月間、約１２カ月間、約１８カ月間、約２年間、約３年間、約４年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、または約１０年間の後など、一般的に初回刺激組成物を投与した数週間後または数カ月後である。
【０２４０】
（Ｃ）投与のための付加的な検討事項
治療的処置の有効性を点検する１つの方法は、本明細書で開示される組成物またはワクチンを投与した後における病原体感染のモニタリングを伴う。予防的処置の有効性を点検する１つの方法は、抗原に対する全身における免疫応答のモニタリング（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａの産生レベルのモニタリングなど）および／または粘膜における免疫応答のモニタリング（ＩｇＡの産生レベルのモニタリングなど）を伴う。典型的に、抗原特異的血清抗体応答が、免疫後であるが攻撃前に決定されるのに対し、抗原特異的粘膜性抗体応答は、免疫後であり攻撃後に決定される。
【０２４１】
核酸分子（たとえばＲＮＡ）がタンパク質抗原をコードする場合に本明細書で開示される組成物またはワクチンの免疫原性を評価する別の方法は、タンパク質抗原を組換えにより発現させて、患者の血清または粘膜性分泌物を免疫ブロットおよび／またはマイクロアレイによりスクリーニングすることである。タンパク質と患者試料との陽性反応は、患者が問題のタンパク質に対する免疫応答を惹起したことを示す。この方法はまた、タンパク質抗原内の免疫優性抗原および／または免疫優性エピトープを同定するのにも使用することができる。
【０２４２】
組成物の有効性はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて目的の感染病原体の適切な動物モデルを攻撃することによっても決定することができる。
【０２４３】
投与は、単回用量スケジュールによってもよく、または複数回用量スケジュールによってもよい。複数回投与は、一次免疫スケジュールおよび／または追加投与免疫スケジュールにおいて使用することができる。複数回用量スケジュールでは、多様な用量を、たとえば非経口の初回刺激および粘膜の追加刺激、粘膜の初回刺激および非経口の追加刺激など、同じ経路により施してもよく、または異なる経路により施してもよい。複数回用量は典型的に、少なくとも１週間（たとえば約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）隔てて投与される。
【０２４４】
本明細書で開示される組成物を使用して、小児および成人の両方を処置することができる。したがって、ヒト被験体は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳、または少なくとも５５歳でありうる。
【０２４５】
好ましい投与経路は、筋内注射、腹腔内注射、皮内注射、皮下注射、静脈内注射、動脈内注射、および眼内注射が含まれるがこれらに限定されない。経口投与および経皮投与の他また、吸入または坐剤による投与も想定される。特に好ましい投与経路には、筋内注射、皮内注射、および皮下注射が含まれる。本発明のいくつかの実施形態に従い、組成物は、周知であり広く利用可能な注射針のない注射デバイスを使用して宿主動物へと投与される。
【０２４６】
場合によって、特定の標的細胞型（たとえば抗原提示細胞または抗原プロセシング細胞）を標的とするワクチンを用いることも有利である。
【０２４７】
カテーテルまたは同様のデバイスを使用して、本発明の組成物を、ポリペプチド＋裸のＲＮＡ、送達系と製剤化されたポリペプチド＋ＲＮＡ（たとえばリポソーム内に被包されるＲＮＡ）、ＲＮＡだけ、またはポリペプチドだけとして、標的器官または組織の中に送達してもよい。適したカテーテルは、たとえば、すべてが参照によって本明細書において組み込まれる米国特許第４，１８６，７４５号；同第５，３９７，３０７号；同第５，５４７，４７２号；同第５，６７４，１９２号；および同第６，１２９，７０５号において開示されている。本発明のＲＮＡ分子はまた、筋肉などの組織へと直接的に導入することもできる。たとえば米国特許第５，５８０，８５９号を参照されたい。「微粒子銃」または粒子介在性形質転換（たとえばＳａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，０５０号；米国特許第５，０３６，００６号を参照されたい）など、他の方法もまた、ＲＮＡを哺乳動物の細胞へと導入するのに適する。これらの方法は、ＲＮＡの哺乳動物へのｉｎ  ｖｉｖｏにおける導入に有用であるだけでなく、また、哺乳動物へと再導入される細胞のｅｘ  ｖｉｖｏにおける修飾にも有用である。
【０２４８】
本発明は、ＲＮＡ、またはＲＮＡ＋ポリペプチドを送達して、免疫応答を誘導するための、ＲＮＡまたはＲＮＡ＋ポリペプチドを被包したまたは吸着させたリポソーム、ポリマー微粒子、またはサブミクロンのエマルジョン微粒子など、適した送達系の使用を包含する。本発明は、ＲＮＡまたはＲＮＡ＋ポリペプチドを吸着させたかつ／または被包した、リポソーム、微粒子、サブミクロンのエマルジョン、またはこれらの組合せを包含する。
【０２４９】
本明細書で開示される組成物であって、１つもしくは複数の抗原を包含するまたは１つもしくは複数の抗原と共に使用される組成物は、他のワクチン、たとえば麻疹ワクチン、ムンプスワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、ｂ型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅコンジュゲートワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌性コンジュゲートワクチン（四価のＡ  Ｃ  Ｗ１３５  Ｙワクチンなど）、ＲＳウイルスワクチンなどと実質的に同時に（たとえば医療ケア従事者またはワクチン接種施設への同じ医療診察または医療来院の間に）患者へと投与することができる。
【０２５０】
６．定義  本明細書で使用される用語「約」とは、値の±１０％を意味する。
【０２５１】
「抗原」とは、免疫学的な応答を誘導する１つまたは複数のエピトープ（直鎖状エピトープ、コンフォメーショナルエピトープ、またはこれらの両方）を含有する分子を指す。
【０２５２】
「エピトープ」とは、免疫系により（たとえば抗体、免疫グロブリン受容体、Ｂ細胞受容体、またはＴ細胞受容体により）認識される抗原の部分である。エピトープは、直鎖状エピトープであってもよく、またはコンフォメーショナルエピトープであってもよい。一般的に、エピトープとは、天然に存在する抗原内のポリペプチドまたは多糖である。人工抗原では、エピトープが、アルサニル酸誘導体などの低分子量物質でありうる。
【０２５３】
Ｔ細胞とＢ細胞とは、抗原を異なる方式で認識する。Ｔ細胞が、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子またはクラスＩ  ＭＨＣ分子に埋め込まれたタンパク質のペプチド断片を細胞の表面において認識するのに対し、Ｂ細胞は、免疫グロブリン様細胞表面受容体を介してプロセシングされていない抗原の表面特徴を認識する。Ｔ細胞の抗原認識機構とＢ細胞の抗原認識機構との差違は、それらのエピトープの異なる性格に反映されている。したがって、Ｂ細胞が、抗原または病原体の表面特徴を認識するのに対し、Ｔ細胞エピトープ（約８〜１２アミノ酸の長さのペプチドを含む）は、抗原の三次元構造の文脈で見ると、「内部」エピトープの他、「表面」エピトープでもありうる。したがって、Ｂ細胞エピトープが、抗原または病原体の表面において露出されることが好ましく、直鎖状エピトープであってもよく、またはコンフォメーショナルエピトープであってもよいのに対し、Ｔ細胞エピトープは典型的に、直鎖状エピトープであるが、利用可能であるまたは抗原の表面にあることが必要とされない。通常、Ｂ細胞エピトープは、少なくとも約５アミノ酸を包含するが、３〜４アミノ酸ほどの小型であってもよい。ＣＴＬエピトープなどのＴ細胞エピトープは典型的に、少なくとも約７〜９アミノ酸を包含し、ヘルパーＴ細胞エピトープは典型的に、少なくとも約１２〜２０アミノ酸を包含する。
【０２５４】
個体を、複数のエピトープを有するポリペプチド抗原で免疫する多くの場合、応答するＴリンパ球の大部分は、その抗原に由来する１つまたは少数の直鎖状エピトープに特異的であり、かつ／または応答するＢリンパ球の大部分は、その抗原に由来する１つまたは少数の直鎖状エピトープまたはコンフォメーショナルエピトープに特異的であろう。このようなエピトープを典型的に「免疫優性エピトープ」と称する。複数の免疫優性エピトープを有する抗原では、単一のエピトープが、最も優性となる可能性があり、典型的に「主要」免疫優性エピトープと称する。残りの免疫優性エピトープを、典型的に（１つまたは複数の）「二次的」免疫優性エピトープと称する。
【０２５５】
用語「融合ポリペプチド」とは、アミノ酸配列が、少なくとも２つの異なる天然に存在するタンパク質またはポリペプチド鎖に由来する単一のポリペプチドを指す。
【０２５６】
本明細書で使用される用語「裸の」とは、脂質、ポリマー、およびタンパク質など、他の高分子を実質的に含まない核酸を指す。自己複製ＲＮＡなど、「裸の」核酸は、細胞への取込みを改善するために他の高分子と一緒に処方しない。したがって、裸の核酸は、リポソーム、微粒子またはナノ粒子、カチオン性エマルジョンなどの中に被包しない、これらに吸着させない、またはこれらへと結合させない。
【０２５７】
本明細書で使用される「ヌクレオチドアナログ」または「修飾ヌクレオチド」とは、１つまたは複数の化学修飾（たとえば置換）を、ヌクレオシド（たとえばシトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）（またはウラシル（Ｕ））、アデニン（Ａ）、またはグアニン（Ｇ））の窒素性塩基の内部または表面上において含有するヌクレオチドを指す。ヌクレオチドアナログは、ヌクレオシドの糖部分（たとえばリボース、デオキシリボース、修飾リボース、修飾デオキシリボース、六員環糖アナログ、または非環式糖アナログ）またはホスフェートの内部または表面上においてさらなる化学修飾を含有しうる。
【０２５８】
本明細書で使用される２つのエピトープは、２つのエピトープが同じ病原体の種に由来するが、必ずしも同じ株、血清型、クレードなどに由来しない場合も、同じ病原体に由来する。したがって、２つのエピトープは、同じ病原体の２つの異なる亜種、株、または血清型に由来しうる（たとえば１つのエピトープがＨＩＶ−１のクレードＢに由来し、他のエピトープがＨＩＶ−１のクレードＣに由来するなど）。
【０２５９】
本明細書で使用される「ポリペプチド抗原」とは、免疫学的な応答を誘導する１つまたは複数のエピトープ（直鎖状エピトープ、コンフォメーショナルエピトープ、またはこれらの両方）を含むポリペプチドを指す。ポリペプチド抗原には、たとえば天然に存在するタンパク質、天然に存在するタンパク質の変異改変体（たとえば（１つまたは複数の）アミノ酸置換、（１つまたは複数の）アミノ酸付加、または（１つまたは複数の）アミノ酸欠失を有するタンパク質）、天然に存在するタンパク質のトランケート型形態（たとえば膜アンカー型タンパク質の細胞内ドメインまたは細胞外ドメイン）の他、融合タンパク質（少なくとも２つの異なる天然に存在するタンパク質またはポリペプチド鎖に由来するタンパク質）が含まれる。加えて、ポリペプチド抗原はまた、１つまたは複数のアミノ酸の立体異性体、誘導体、またはアナログを含むポリペプチドも包含する。たとえばアミノ酸誘導体は、たとえばアルキル化、アシル化、カルバミル化、ヨード化など、アミノ酸の化学修飾を包含する。アミノ酸アナログには、たとえばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなど、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する化合物が含まれる。ポリペプチド抗原はまた、翻訳後修飾されたポリペプチド（アセチル化、リン酸化、またはグリコシル化されたポリペプチドなど）も包含する。したがって、ポリペプチド抗原のエピトープは、ペプチドに限定されない。たとえばグリコシル化されたポリペプチドのエピトープは、ポリペプチド鎖へと接合された糖基でありうる。
【０２６０】
２つのタンパク質抗原は、２つの抗原の間のアミノ酸配列の同一性が、短い方の抗原の長さにわたり少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％であれば、「実質的に同じ」である。
【０２６１】
本明細書で使用される用語「〜を処置する」、「〜を処置すること」、または「処置」は、疾患もしくは状態の症状の緩和、軽減、もしくは改善、さらなる症状の防止、症状の根底にある代謝性原因の改善もしくは防止、疾患もしくは状態の阻害、たとえば疾患もしくは状態の発症の抑止、疾患もしくは状態の除去、疾患もしくは状態の退縮の惹起、疾患もしくは状態により引き起こされる状態の除去、または疾患もしくは状態の症状の停止を包含する。用語「〜を処置する」、「〜を処置すること」、または「処置」には、予防的処置および／または治療的処置が含まれるがこれらに限定されない。
【０２６２】
用語「ウイルス性レプリコン粒子」または「ＶＲＰ」とは、（１つまたは複数の）構造遺伝子が欠失するために、感染性後代を発生させることが不可能な組換え感染性ビリオンを指す。
【０２６３】
用語「ウイルス様粒子」または「ＶＬＰ」とは、ウイルス性コートタンパク質（たとえばカプシド）により形成され、必要に応じてエンベロープにより形成されるが、遺伝物質を有さない構造を指す。ＶＬＰは、ウイルス粒子に類似する。
【実施例】
【０２６４】
ここまで一般的に記載されつつある本発明は、本発明のある態様および実施形態の例示だけを目的として包含されるものであり、本発明を限定することを意図するものではない、以下の例を参照することによりより容易に理解されるであろう。
【０２６５】
方法：
ＲＮＡの合成
アルファウイルスレプリコン（ｖＡ３１７、ｖＡ１７、ｖＡ３３６、ｖＡ１６０、ｖＡ３２２、ｖＡ３１１、ｖＡ３０６、ｖＡ１４２、ｖＡ５２６、ｖＡ５２７、ｖＡ３１８、ｖＡ１４０、ｖＡ３１８、ｖＡ３７２、ｖＡ３６８、ｖＡ３６９の配列を参照されたい）をコードするプラスミドＤＮＡを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＲＮＡを合成するための鋳型として用いた。レプリコンは、ＲＮＡを複製するために必要とされる遺伝子エレメントを含有するが、粒子のアセンブリーに必要な遺伝子産物をコードする遺伝子エレメントは欠き、アルファウイルスゲノムの構造遺伝子が、異種タンパク質をコードする配列で交換される。レプリコンが真核細胞へと送達されると、プラス鎖ＲＮＡが翻訳されて、ゲノムＲＮＡを複製するのと併せて、異種遺伝子産物をコードする豊富なサブゲノムｍＲＮＡも転写する、４つの非構造タンパク質が産生される。アルファウイルス構造タンパク質の発現の欠如に起因して、レプリコンは、感染性粒子の生成を誘導することが不可能である。アルファウイルスｃＤＮＡの上流のバクテリオファージ（Ｔ７またはＳＰ６）プロモーターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるレプリコンＲＮＡの合成を容易とし、ポリ（Ａ）テールのすぐ下流の肝炎デルタウイルス（ＨＤＶ）のリボザイムは、その自己切断活性を介して適正な３’末端を生成させる。
【０２６６】
適した制限エンドヌクレアーゼによりＨＤＶリボザイムの下流のプラスミドＤＮＡを直鎖化するのに続き、Ｔ７バクテリオファージまたはＳＰ６バクテリオファージに由来するＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてランオフ転写物を合成した。転写は、製造元（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）により提供されている指示書に従い、ヌクレオシド三リン酸（ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ）の各々７．５ｍＭ（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ）または５ｍＭ（ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ）の存在下、３７℃で２時間にわたり実行した。転写の後、鋳型ＤＮＡを、ＴＵＲＢＯ  ＤＮアーゼ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）で消化させた。レプリコンＲＮＡをＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。キャップされていないＲＮＡは、使用者用マニュアルにおいて概括されている通りにＳｃｒｉｐｔＣａｐ  ｍ７Ｇ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、ワクシニアキャッピング酵素（ＶＣＥ）で転写後キャップを施した。転写後キャップを施されたＲＮＡは、ＬｉＣｌで沈殿させ、ヌクレアーゼ非含有水中で再構成した。ＲＮＡ試料の濃度は、２６０ｎｍにおける光学密度を測定することにより決定した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける転写物の完全性は、変性アガロースゲル電気泳動により確認した。
【０２６７】
ＬＮＰ製剤
１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤｌｉｎＤＭＡ）は、既に公表された手順［Ｈｅｙｅｓ，  Ｊ．、Ｐａｌｍｅｒ，  Ｌ．、Ｂｒｅｍｎｅｒ，  Ｋ．、ＭａｃＬａｃｈｌａｎ，  Ｉ．、「Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、１０７巻：２７６〜２８７頁（２００５年）］を使用して合成した。１，２−ジステアロイル（Ｄｉａｓｔｅａｒｏｙｌ）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）は、Ｇｅｎｚｙｍｅから購入した。コレステロールは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｉｓ、ＭＯ）から得た。１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＰＥＧ  ＤＭＧ  １０００）、および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（アンモニウム塩）（ＰＥＧ  ＤＭＧ  ３０００）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から得た。１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（塩化物塩）（ＤＯＴＡＰ）および３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル］コレステロールヒドロクロリド（ＤＣ−ｃｈｏｌ）は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓから得た。
【０２６８】
ＬＮＰは、以下の３つの方法を使用して処方した：
方法Ａ（４０μｇのバッチ、Ｍｕｓｔａｎｇなし、２回目の混合なし、ＴＦＦなし、透析あり）
エタノール中で新鮮な脂質原液を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロール、および８．０７ｍｇのＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００を秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中で溶解させた。調製したばかりの脂質原液を、３７℃で約１５分間にわたり静かに振盪して、均一な混合物を形成した。次いで、１２０．９μＬの原液を、１．８７９ｍＬのエタノールへと添加して、２ｍＬの作業用脂質原液を作製した。この量の脂質を使用して、４０μｇのＲＮＡを８：１のＮ：Ｐ（窒素対ホスフェート）比で有するＬＮＰを形成した。ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性脂質）におけるプロトン化可能な窒素とＲＮＡ上のホスフェートとを、この計算に使用する。１μｇの自己複製ＲＮＡ分子は、３ナノモルずつのアニオン性ホスフェートを含有すると仮定し、１μｇのＤｌｉｎＤＭＡは、１．６ナノモルずつのカチオン性窒素を含有すると仮定した。また、２ｍＬのＲＮＡ作業用溶液も、１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）（Ｔｅｋｎｏｖａ）中に約１μｇ／μＬの原液から調製した。３つの２０ｍＬガラスバイアル（攪拌バーを有する）を、使用前にＲＮａｓｅ  Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ですすぎ、潤沢なＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、バイアル内のＲＮアーゼを除染した。バイアルのうちの１つをＲＮＡ作業用溶液に使用し、他のバイアルを、脂質およびＲＮＡミックスを回収するのに使用した（後出で記載される通り）。作業用脂質およびＲＮＡ溶液を３７℃で１０分間にわたり加熱してから、３ｃｃのルアロックシリンジ（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ）へと投入した。２ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃシリンジに投入した。ＲＮＡおよび脂質を含有するシリンジは、２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤのＦＥＰ管（［フッ化エチレン−プロピレン］、Ｉｄｅｘ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｏａｋ  Ｈａｒｂｏｒ、ＷＡ）を使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫ（商標）  ５００μｍ  ＩＤ接合部）へと接続した。Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰ管（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍ）とした。クエン酸緩衝液を含有する第３のシリンジは、別個の管部分（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤ）へと接続した。次いで、すべてのシリンジを、シリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製；モデル番号：ＫＤＳ−２２０）を使用して、７ｍＬ／分の流量で駆動した。管の出口は、混合物を２０ｍＬガラスバイアル内に回収する（攪拌しながら）ように配置した。次に、ＬＮＰを、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、特別な強度、０．５〜３ｍＬの容量）へと投入し、オートクレーブ処理されたプラスチック容器内の４００〜５００ｍＬの１倍濃度ＰＢＳ（Ｌｏｎｚａ製の１０倍濃度のＡｃｃｕＧＥＮＥ  ＰＢＳから希釈した）に対して４℃で一晩にわたり透析してから、最終生成物を回収した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験のために、製剤を、必要とされるＲＮＡ濃度まで、１倍濃度ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）で希釈した。
【０２６９】
ｐＫａ
別段であることが明示的に示されない限り、本明細書で言及されるすべてのｐＫａは、標準的な温度および圧力の水中で測定される。また、別段に示されない限り、ｐＫａに対するすべての言及は、以下の技法を使用して測定したｐＫａに対する言及である。エタノール中に２ｍＭの脂質溶液は、脂質を秤量し、次いで、エタノール中で溶解させることにより調製する。９：１のエタノール：メタノール中に０．３ｍＭの蛍光プローブＴＮＳ溶液は、まず、メタノール中に３ｍＭのＴＮＳ溶液を作製し、次いで、エタノールで０．３ｍＭまで希釈することにより調製する。
【０２７０】
リン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、および塩化ナトリウムを、それぞれ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、および１５０ｍＭの濃度で含有する水性緩衝液を調製する。緩衝液を８部に分け、１２ＮのＨＣｌまたは６ＮのＮａＯＨにより、ｐＨを、４．４４〜４．５２、５．２７、６．１５〜６．２１、６．５７、７．１０〜７．２０、７．７２〜７．８０、８．２７〜８．３３、および１０．４７〜１１．１２へと調整した。２ｍＭの脂質溶液４００ｕＬと、０．３ｍＭのＴＮＳ溶液８００ｕＬとを混合する。
【０２７１】
Ｔｅｃａｎ  Ｇｅｎｅｓｉｓ  ＲＳＰ  １５０ハイスループット液体処理機およびＧｅｍｉｎｉ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して、７．５ｕＬのプローブ／脂質ミックスを、１ｍＬの９６ウェルプレート（ＮＵＮＣ  ２６０２５２モデル；Ｎａｌｇａｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）内の２４２．５ｕＬの緩衝液へと添加した。これは、８つの緩衝液すべてについて行う。
【０２７２】
１ｍＬの９６ウェルプレート内で混合した後、１００ｕＬの各プローブ／脂質／緩衝液混合物を、２５０ｕＬの黒色で底部が透明な９６ウェルプレート（ＣＯＳＴＡＲ  ３９０４モデル；Ｃｏｒｎｉｎｇ）へと移す。蛍光の測定は、ＳｏｆｔＭａｘ  ｐｒｏ  ５．２ソフトウェアおよび以下のパラメータを使用するＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５分光光度計上で実行する：
読取りモード：蛍光、トップリード
波長：励起波長：３２２ｎｍ、発光波長：４３１ｎｍ、自動カットオフ波長：４２０ｎｍ
感度：読取り：６、ＰＭＴ：自動
自動ミックス：前：オフ
自動較正：オン
アッセイプレート型：９６ウェル標準透明底部
読み取るウェル：プレートの全体を読み取る
修正時間：オフ
カラム波長の優先：カラム優先
キャリッジ速度：通常
自動読取り：オフ
【０２７３】
測定後、９６ウェルプレート上の空のウェルのバックグラウンドの蛍光値を、各プローブ／脂質／緩衝液混合物の蛍光値から減じる。次いで、蛍光強度値を、ｐＨが最低のときの値に対して正規化する。次いで、正規化された蛍光強度対ｐＨチャートをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌソフトウェアによりプロットする。８つの点を滑らかな直線でつなぐ。
【０２７４】
正規化された蛍光強度が０．５と等しくなる直線上の点が見出される。０．５と等しい正規化された蛍光強度に対応するｐＨが見出され、これが脂質のｐＫａであると考えられる。
【０２７５】
方法Ｂ（７５μｇのバッチ、ＰＥＳ中空糸、Ｍｕｓｔａｎｇなし）：
エタノール中で新鮮な脂質原液を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロール、および８．０７ｍｇのＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００を秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中で溶解させた。調製したばかりの脂質原液を３７℃で約１５分間にわたり静かに振盪し、均一な混合物を形成した。次いで、２２６．７μＬの原液を、１．７７３ｍＬのエタノールへと添加して、２ｍＬの作業用脂質原液を作製した。この量の脂質を使用して、７５μｇのＲＮＡを８：１のＮ：Ｐ（窒素対ホスフェート）比で有するＬＮＰを形成した。ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性脂質）におけるプロトン化可能な窒素とＲＮＡ上のホスフェートとを、この計算に使用する。１μｇの自己複製ＲＮＡ分子は、３ナノモルずつのアニオン性ホスフェートを含有すると仮定し、１μｇのＤｌｉｎＤＭＡは、１．６ナノモルずつのカチオン性窒素を含有すると仮定した。また、２ｍＬのＲＮＡ作業用溶液も、１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）（Ｔｅｋｎｏｖａ）中に約１μｇ／μＬの原液から調製した。３つの２０ｍＬガラスバイアル（攪拌バーを有する）を、使用前にＲＮａｓｅ  Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ですすぎ、潤沢なＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、バイアル内のＲＮアーゼを除染した。バイアルのうちの１つをＲＮＡ作業用溶液に使用し、他のバイアルを、脂質およびＲＮＡミックスを回収するのに使用した（後出で記載される通り）。作業用脂質およびＲＮＡ溶液を３７℃で１０分間にわたり加熱してから、３ｃｃのルアロックシリンジ（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ）へと投入した。２ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃシリンジに投入した。ＲＮＡおよび脂質を含有するシリンジは、２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤのＦＥＰ管（［フッ化エチレン−プロピレン］、Ｉｄｅｘ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｏａｋ  Ｈａｒｂｏｒ、ＷＡ）を使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫ（商標）  ５００μｍ  ＩＤ接合部）へと接続した。Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰ管（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍ）とした。クエン酸緩衝液を含有する第３のシリンジは、別個の管部分（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤ）へと接続した。次いで、すべてのシリンジを、シリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製；モデル番号：ＫＤＳ−２２０）を使用して、７ｍＬ／分の流量で駆動した。管の出口は、混合物を２０ｍＬガラスバイアル内に回収する（攪拌しながら）ように配置した。攪拌バーを取り出し、エタノール／水溶液を、１時間にわたり室温へと平衡化させた。次いで、混合物を５ｃｃのシリンジに投入し（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、これをＦＥＰ管（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤ）の部分へと適合させ、等しい長さのＦＥＰ管を有する別の５ｃｃシリンジには、等容量の１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を投入した。２つのシリンジを、シリンジポンプを使用して、７ｍＬ／分の流量で駆動し、最終混合物を２０ｍＬのガラスバイアル内に回収した（攪拌しながら）。次に、ＬＮＰを２ｍＬまで濃縮し、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション（ＴＦＦ）系を使用して、１０〜１５容量の１倍濃度ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）に対して透析してから、最終生成物を回���した。ＴＦＦ系および中空糸濾過膜は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓから購入し、製造元のガイドラインに従い使用した。１００ｋＤの孔径カットオフおよび２０ｃｍ２の表面積を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空糸濾過膜（部品番号：Ｐ−Ｃ１−１００Ｅ−１００−０１Ｎ）を使用した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験のために、製剤を、必要とされるＲＮＡ濃度まで、１倍濃度ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）で希釈した。
【０２７６】
方法Ｃ（７５μｇのバッチ、ＭｕｓｔａｎｇおよびＰＥＳ中空糸あり）：
エタノール中で新鮮な脂質原液を調製した。３７ｍｇのＤｌｉｎＤＭＡ、１１．８ｍｇのＤＳＰＣ、２７．８ｍｇのコレステロール、および８．０７ｍｇのＰＥＧ  ＤＭＧ  ２０００を秤量し、７．５５ｍＬのエタノール中で溶解させた。調製したばかりの脂質原液を３７℃で約１５分間にわたり静かに振盪し、均一な混合物を形成した。次いで、２２６．７μＬの原液を、１．７７３ｍＬのエタノールへと添加して、２ｍＬの作業用脂質原液を作製した。この量の脂質を使用して、７５μｇのＲＮＡを８：１のＮ：Ｐ（窒素対ホスフェート）比で有するＬＮＰを形成した。ＤｌｉｎＤＭＡ（カチオン性脂質）におけるプロトン化可能な窒素とＲＮＡ上のホスフェートとを、この計算に使用する。１μｇの自己複製ＲＮＡ分子は、３ナノモルずつのアニオン性ホスフェートを含有すると仮定し、１μｇのＤｌｉｎＤＭＡは、１．６ナノモルずつのカチオン性窒素を含有すると仮定した。また、２ｍＬのＲＮＡ作業用溶液も、１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）（Ｔｅｋｎｏｖａ）中に約１μｇ／μＬの原液から調製した。３つの２０ｍＬガラスバイアル（攪拌バーを有する）を、使用前にＲＮａｓｅ  Ａｗａｙ溶液（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ）ですすぎ、潤沢なＭｉｌｌｉＱ水で洗浄して、バイアル内のＲＮアーゼを除染した。バイアルのうちの１つをＲＮＡ作業用溶液に使用し、他のバイアルを、脂質およびＲＮＡミックスを回収するのに使用した（後出で記載される通り）。作業用脂質およびＲＮＡ溶液を３７℃で１０分間にわたり加熱してから、３ｃｃのルアロックシリンジ（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ）へと投入した。２ｍＬのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を、別の３ｃｃシリンジに投入した。ＲＮＡおよび脂質を含有するシリンジは、２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤのＦＥＰ管（［フッ化エチレン−プロピレン］、Ｉｄｅｘ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｏａｋ  Ｈａｒｂｏｒ、ＷＡ）を使用して、Ｔミキサー（ＰＥＥＫ（商標）  ５００μｍ  ＩＤ接合部）へと接続した。Ｔミキサーからの出口もまた、ＦＥＰ管（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍ）とした。クエン酸緩衝液を含有する第３のシリンジは、別個の管部分（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤ）へと接続した。次いで、すべてのシリンジを、シリンジポンプ（ｋｄＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製；モデル番号：ＫＤＳ−２２０）を使用して、７ｍＬ／分の流量で駆動した。管の出口は、混合物を２０ｍＬガラスバイアル内に回収する（攪拌しながら）ように配置した。攪拌バーを取り出し、エタノール／水溶液を、１時間にわたり室温へと平衡化させた。次いで、混合物を５ｃｃのシリンジに投入し（ＢＤ  Ｍｅｄｉｃａｌ）、これをＦＥＰ管（２ｍｍのＩＤ×３ｍｍのＯＤ）の部分へと適合させ、等しい長さのＦＥＰ管を有する別の５ｃｃシリンジには、等容量の１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）を投入した。２つのシリンジを、シリンジポンプを使用して、７ｍＬ／分の流量で駆動し、最終混合物を２０ｍＬのガラスバイアル内に回収した（攪拌しながら）。次に、２回目の混合ステップから回収された混合物（ＬＮＰ）に、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑ膜（アニオン性分子に結合し、これらを除去するアニオン交換支持体であって、Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＡｎｎＡｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡから得たアニオン交換支持体）中を通過させた。ＬＮＰを通過させる前に、４ｍＬの１Ｍ  ＮａＯＨ、４ｍＬの１Ｍ  ＮａＣｌ、および１０ｍＬの１００ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）をＭｕｓｔａｎｇ膜に順次通過させた。ＬＮＰを３７℃で１０分間にわたり温めてから、Ｍｕｓｔａｎｇフィルター中を通過させた。次に、ＬＮＰを２ｍＬまで濃縮し、タンジェンシャルフロー・フィルトレーション（ＴＦＦ）系を使用して、１０〜１５容量の１倍濃度ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）に対して透析してから、最終生成物を回収した。ＴＦＦ系および中空糸濾過膜は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓから購入し、製造元のガイドラインに従い使用した。１００ｋＤの孔径カットオフおよび２０ｃｍ２の表面積を有するポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）中空糸濾過膜（部品番号：Ｐ−Ｃ１−１００Ｅ−１００−０１Ｎ）を使用した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおける実験のために、製剤を、必要とされるＲＮＡ濃度まで、１倍濃度ＰＢＳ（Ｔｅｋｎｏｖａ製）で希釈した。
【０２７７】
ＣＮＥ製剤
既に記載されている通り（Ｏｔｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ、７９巻、１〜５頁、２００２年）、ＣＭＦ３４に対する１つの大きな修飾を有して、荷電ＭＦ５９と同様に調製した。ＤＯＴＡＰをスクアレン中で直接溶解させ、有機溶媒は使用しなかった。溶媒を、１．６ｍｇ／ｍｌを超えるＤＯＴＡＰを含有するエマルジョン中に包含させると、エマルジョンを作製するのに微少流動化することが不可能な泡沫状の原料が作製されることが発見された。スクアレンを３７℃まで加熱したところ、ＤＯＴＡＰを直接的にスクアレン中で溶解させることが可能となり、次いで、油性相を水性相中にうまく分散させ（たとえばホモジナイゼーションにより）、エマルジョンを作製することができた。
【表３】
2015522580.tif 000009
【０２７８】
ＲＮＡの複合体化
溶液中の窒素の数は、カチオン性脂質濃度から計算したが、たとえばＤＯＴＡＰは、分子１個当たりでプロトン化されうる窒素が１個である。ＲＮＡ濃度を、ＲＮＡ１マイクログラム当たり３ナノモルのホスフェートの推定量を使用して溶液中のホスフェートの量を計算するのに使用した。ＲＮＡ：脂質の量を変化させることにより、Ｎ／Ｐ比を改変することができる。ＲＮＡを、ある窒素／ホスフェート比（Ｎ／Ｐ）の範囲内でＣＮＥへと複合体化させた。Ｎ／Ｐ比の計算は、エマルジョン中で１ミリリットル当たりのプロトン化可能な窒素のモル数を計算することにより行った。ホスフェートの数を計算するために、ＲＮＡ１マイクログラム当たり３ナノモルのホスフェートの定数を使用した。Ｎ／Ｐ比を、以下の式を用いて算出した。
【数１】
2015522580.tif 000010
【０２７９】
Ａはカチオン性脂質の濃度（ｍｇ／ｍｌ）であり、ＢはＲＮＡの量（μｇ）であり、Ｃはカチオン性脂質の分子量であり、Ｄは複合体形成するエマルジョンの体積（ｍｌ）であり、Ｅはカチオン性脂質内のプロトン化可能な窒素原子の数である。定数３は１μｇのＲＮＡ当たりのリン酸のナノモル数である。
【０２８０】
値を決定した後、適切な比のエマルジョンをＲＮＡへと添加した。これらの値を使用して、ＲＮＡを適切な濃度へと希釈し、等容量のエマルジョンへと直接的に添加する一方で、軽くボルテックスした。溶液を室温で約２時間にわたり静置した。複合体化させたら、結果として得られる溶液を適切な濃度まで希釈し、１時間以内に使用した。
【０２８１】
粒径
製造元の指示書に従いＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用して、粒径を測定した。粒径は、多分散指数（ｐｄｉ）によるＺ平均として報告される。リポソームを１倍濃度ＰＢＳ中で希釈してから測定した。
【０２８２】
被包効率およびＲＮＡ濃度
ＲＮＡの被包百分率およびＲＮＡ濃度は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ  ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ  ＲＮＡ試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により決定した。アッセイでは、製造元の指示書に従った。キットにより提供されるリボソームＲＮＡの標準を使用して、検量線を作成した。ＬＮＰを１倍濃度のＴＥ緩衝液（キットによる）中で１０倍または１００倍に希釈してから、色素を添加した。別個に、ＬＮＰを、０．５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１倍濃度のＴＥ緩衝液中で１０または１００倍に希釈してから、色素を添加した。その後、等量の色素を、各溶液へと添加し、次いで、色素添加後における約１８０μＬの各溶液を２連で９６ウェル組織培養プレート（ＶＷＲから得た；型番：３５３０７２）へと投入した。蛍光（励起波長：４８５ｎｍ、発光波長：５２８ｎｍ）は、マイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ製）上で読み取った。
【０２８３】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘを使用してＬＮＰを破裂させて、全ＲＮＡ量に対応する蛍光の読取りをもたらし、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘを有さない試料により、被包されていないＲＮＡに対応する蛍光をもたらした。ＲＮＡの被包％は、以下の通りに決定した：ＬＮＰ  ＲＮＡの被包（％）＝［（Ｆｔ−Ｆｉ）／Ｆｔ］×１００［式中、Ｆｔは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘを添加したＬＮＰの蛍光強度であり、Ｆｉは、洗浄剤を添加されていないＬＮＰ溶液の蛍光強度である］。これらの値（ＦｔおよびＦｉ）は、ブランク（１倍濃度のＴＥ緩衝液）の蛍光強度を減じた後で得た。被包されたＲＮＡの濃度は、Ｆｔ−Ｆｉを、作成された検量線と比較することにより得た。すべてのＬＮＰ製剤は、被包された用量に基づき、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて投与した。
【０２８４】
ゲル電気泳動
変性ゲル電気泳動を実行して、処方工程後におけるＲＮＡの完全性について評価し、被包されたＲＮＡのＲＮアーゼからの保護についても評価した。ゲルは、以下の通りに注型した：０．４ｇのアガロース（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を、３６ｍｌのＤＥＰＣ処理水へと添加し、溶解するまで電子レンジで加熱し、次いで、温熱状態まで冷却した。次いで、４ｍｌの１０倍濃度の変性ゲル緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を、アガロース溶液へと添加した。ゲルを注ぎ込み、室温で少なくとも３０分間にわたり硬化させた。次いで、ゲルを、ゲルタンク内に入れ、１倍濃度のＮｏｒｔｈｅｒｎｍａｘ泳動バッファー（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を添加して、ゲルを数ミリメートル被覆した。
【０２８５】
ＲＮアーゼ保護アッセイ
ＲＮアーゼによる消化は、ＲＮＡ１マイクログラム当たり３．８ｍＡＵのＲＮアーゼＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）との室温で３０分間にわたるインキュベーションにより達成した。ＲＮアーゼは、試料を、Ｐｒｏｔｅｎａｓｅ  Ｋ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）と共に、５５℃で１０分間にわたりインキュベートすることにより不活化した。ＲＮアーゼを不活化させた後、試料  対  ２５：２４：１  ｖ／ｖ／ｖのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコールの１：１  ｖ／ｖの混合物を添加して、ＲＮＡを脂質から抽出し水性相にいれた。数秒間にわたりボルテックスすることにより試料を混合し、次いで、１２ｋ  ＲＰＭで１５分間にわたる遠心分離にかけた。水性相（ＲＮＡを含有する）を取り出し、ＲＮＡを分析するのに使用した。投入する（ウェル１つ当たり４００ｎｇのＲＮＡ）前に、すべての試料を、ホルムアルデヒドローディングダイと共にインキュベートし、６５℃で１０分間にわたり変性させ、室温まで冷却した。Ａｍｂｉｏｎ  Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍマーカーを使用して、ＲＮＡ構築物の分子量を近似した。ゲルは、９０Ｖで泳動させた。ゲルは、製造元（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のガイドラインに従い、０．１％のＳＹＢＲ  ｇｏｌｄを使用して、水中、室温で１時間にわたり振盪することにより染色した。ゲル画像は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳ画像化システム（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）により撮影した。
【０２８６】
分泌性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）アッセイ
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗原産生の動態および量を評価するために、ＳＥＡＰをコードするＲＮＡレプリコンＳＥＡＰをコードするＲＮＡレプリコンを、筋内注射を介してマウスへ、製剤と一緒にまたは製剤を含めずに投与した。８〜１０週齢で体重約２０ｇの雌ＢＡＬＢ／ｃマウス５匹ずつの群を、ＳＥＡＰをコードするＲＮＡを被包するリポソームで免疫した。裸のＲＮＡは、ＲＮアーゼ非含有１倍濃度ＰＢＳにより投与した。場合によってまた、陽性対照として、５×１０５感染単位（ＩＵ）の用量のウイルス性レプリコン粒子（ＶＲＰ）も投与する。１００μｌの用量を各マウスの四頭筋へと投与した（部位１カ所当たり５０μｌずつ）。血液試料は、注射の１、３、および６日後に採取した。血清は、回収直後の血液から分離し、使用まで−３０℃で保存した。
【０２８７】
化学発光ＳＥＡＰアッセイ用のＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ
Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、ＭＡ）を使用して、血清を分析した。マウス血清を、１倍濃度のＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔ希釈緩衝液中１：４に希釈した。試料を、アルミニウム製の密封用フォイルで密封した水浴中に入れ、６５℃で３０分間にわたり熱不活化した。氷上で３分間にわたり冷却し、室温へと平衡化した後、５０μＬのＰｈｏｓｐｈａ−Ｌｉｇｈｔアッセイ緩衝液を、ウェルへと添加して、試料を室温で５分間にわたり放置した。次いで、ＣＳＰＤ（登録商標）基質（化学発光性のアルカリ性ホスフェート基質）を１：２０で含有する５０μＬの反応緩衝液を添加し、室温で２０分間のインキュベーション後に発光を測定した。発光は、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｃｅｎｔｒｏ  ＬＢ  ９６０ルミノメーター（Ｏａｋ  Ｒｉｄｇｅ、ＴＮ）により、ウェル１つ当たり１秒間の積算（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）で測定した。各試料中のＳＥＡＰの活性は、２連で測定し、これらの２回の測定値の平均を取った。
【０２８８】
ウイルス性レプリコン粒子（ＶＲＰ）
ＲＮＡワクチンを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるレポーター遺伝子または抗原の発現を達成するための従来のＲＮＡベクター法と比較するために、本発明者らは、Ｐｅｒｒｉら（２００３年）、「Ａｎ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｇｅｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ」、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、７７巻：１０３９４〜１０４０３頁により記載されている方法によりＢＨＫ細胞内で産生されるウイルス性レプリコン粒子（ＶＲＰ）を利用した。この系では、抗原（またはレポーター遺伝子）のレプリコンが、アルファウイルスキメラレプリコン（ＶＣＲ）であって、シンドビスウイルスの３’末端配列（３’ＵＴＲ）およびシンドビスウイルスパッケージングシグナル（ＰＳ）を含有するように操作されたベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）のゲノムに由来するＶＣＲからなった（Ｐｅｒｒｉらの図２を参照されたい）。これらのレプリコンを、それらをベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞へと共電気穿孔することにより、シンドビスウイルスのカプシド遺伝子および糖タンパク質遺伝子をコードする欠損性ヘルパーＲＮＡと共にＶＲＰへとパッケージングした（Ｐｅｒｒｉらの図２を参照されたい）。次いで、ＶＲＰを採取し、標準的な方法により力価測定（ｔｉｔｒａｔｅ）し、培養物流体または他の等張性緩衝液中で動物へと接種した。
【０２８９】
Ｐｅｒｒｉ  Ｓ、Ｇｒｅｅｒ  ＣＥ、Ｔｈｕｄｉｕｍ  Ｋ、Ｄｏｅ  Ｂ、Ｌｅｇｇ  Ｈ、Ｌｉｕ  Ｈ、Ｒｏｍｅｒｏ  ＲＥ、Ｔａｎｇ  Ｚ、Ｂｉｎ  Ｑ、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ  ＴＷ，  Ｊｒ．ら（２００３年）Ａｎ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｈｉｍｅｒａ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｇｅｎｅ−ｂａｓｅｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７巻：１０３９４〜１０４０３頁
（実施例Ｉ）
ＨＩＶエンベロープタンパク質試験１−ＧＰ１６０／ＧＰ１４０（ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激）
【０２９０】
本実施例では、ＨＩＶ−１クレードＢ（ＳＦ１６２）に由来する、およびクレードＣ（ＤＵ４２２．１）に由来するＨＩＶエンベロープタンパク質ｇｐ１６０およびｇｐ１４０を抗原として使用した。「ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」のレジメンを使用して、（ｉ）ＨＩＶ  ｇｐ１６０をコードするＲＮＡ分子と、（ｉｉ）「同族の（ｃｏｇｎａｔｅ）」ポリペプチド分子、ｇｐ１４０とを逐次投与することの効果を評価した。ｇｐ１４０ポリペプチドは、ｇｐ１６０の膜貫通ドメインが欠失した、ｇｐ１６０のトランケート型形態に対応する。したがって、ポリペプチド抗原は、ＲＮＡ分子によりコードされるポリペプチドのトランケート型形態であり、それと実質的に同じであるので、「同族の」抗原である。
１．試験デザイン
【０２９１】
以下のＲＮＡレプリコンを使用してマウスを初回刺激した
・Ｈ３５１  Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＳＦ１６２ｇｐ１６０ｍｏｄ−このＲＮＡレプリコンは、クレードＢ  ＳＦ１６２株に由来するｇｐ１６０エンベロープタンパク質を発現する。ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物が図１９に示されている。
・Ｈ３５０  Ｔ７Ｇ−ＶＣＲ−ＣＨＩＭ２．１２−ＤＵ４２２．１ｇｐ１６０ｍｏｄ−このＲＮＡレプリコンは、クレードＣ  ＤＵ４２２．１株に由来するｇｐ１６０エンベロープタンパク質を発現する。ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物が図２０に示されている。
ＲＮＡの作製および精製−ＤＮＡを、まず、ＰｍｅＩを使用して線状化し、フェノール：クロロホルム抽出によって精製した。ＡｍｂｉｏｎのＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ  Ｔ７キットを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＲＮＡに転写し、ＬｉＣｌ沈殿によって精製した。次いで、キャップされていないＲＮＡに、ＣｅｌｌｓｃｒｉｐｔのＳｃｒｉｐｔｃａｐ  ｍ７Ｇ  Ｃａｐｐｉｎｇ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して５’キャップを施し、ＬｉＣｌ沈殿によって精製した。次いで、ＲＮＡ産物を、ＲＮＡを変性させ、アガロースゲルで泳動することによって視覚的に確認した。
【０２９２】
以下のＤＮＡベクターを使用してマウスを初回刺激した
・ｐＣＭＶ−ＫＭ２  ｇｐ１６０．ＳＦ１６２  ｍｏｄ−このＤＮＡベクターは、クレードＢ  ＳＦ１６２株に由来するｇｐ１６０エンベロープタンパク質を発現する。ＧａｇおよびＥｎｖを、以下の真核発現ベクター：一過性発現アッセイおよびＤＮＡ免疫試験のためのｐＣＭＶＫｍ２であって、ｐＣＭＶ６ａに由来し（Ｃｈａｐｍａｎら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９９１年）１９巻：３９７９〜３９８６頁）、カナマイシン選択マーカー、ＣｏｌＥ１複製起点、ＣＭＶプロモーターエンハンサーおよびイントロンＡ、その後に下記の合成配列の挿入部位、その後にウシ成長ホルモンに由来するポリアデニル化シグナルを含み、また、ｐＣＭＶ連結を生じさせるためにポリリンカー部位がｐＣＭＶＫｍ２に挿入されている点のみでｐＣＭＶ連結ベクターと異なるｐＣＭＶＫｍ２ベクター；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において発現させるためのｐＥＳＮ２ｄｈｆｒおよびｐＣＭＶＰＬＥｄｈｆｒ（米国特許第７，９４３，３７５号を参照されたい）にクローニングする。
ＤＮＡの作製−プラスミドＤＮＡを使用して、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｏｐｔｅｎ細胞をプロトコールの通り形質転換した。１６〜１８時間後、単一のコロニーを選び取り、２５０ｍｌのＬＢを３７℃、２２５ｒｐｍで振とうしながら１６〜１８時間にわたって接種するために使用した。次いで、ＱＩＡＧＥＮのＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔを使用して培養物からプラスミドＤＮＡを精製した。
【０２９３】
以下のウイルス性レプリコン粒子（ＶＲＰ）を使用してマウスを初回刺激した
ＶＲＰ  ｇｐ１４０．ｄＶ２．ＳＦ１６２−このＶＲＰは、クレードＢ  ＳＦ１６２株に由来するｇｐ１４０エンベロープタンパク質（可変ループ２が欠失した）を発現する。ＶＲＰの作製および特徴付けに関しては、例えば、Ｐｅｒｒｉら（２００３年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７巻（１９号）：１０３９４〜１０４０３頁を参照されたい。
【０２９４】
クレードＢ  ＳＦ１６２株に由来するｇｐ１４０タンパク質−ｇｐ１２０  Ｅｎｖタンパク質を、ＣＨＯ安定細胞株またはＨＥＫ２９３Ｔ一過性トランスフェクションのいずれかから発現させた。いずれの場合も、分泌される可溶性タンパク質としてｇｐ１２０を発現させた。馴化培地を１０×に濃縮し、Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  Ｎｉｖａｌｉｓレクチンアガロース捕捉ステップ、その後のＤＥＡＥカラムを使用した浄化を含む２−ステッププロトコールに従って精製した：
１．  Ｇａｌａｎｔｈｕｓ  Ｎｉｖａｌｉｓレクチンアガロース（ＧＮＡ）カラムを、２０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液（カラム緩衝液）を用いて平衡化した。
２．Ｇｐ１２０をＧＮＡカラムで捕捉した。Ａ２８０の読取りがベースラインに戻るまでカラムを洗浄した後、ＧＮＡカラムを、カラム緩衝液を用いて平衡化したＤＥＡＥカラムおよびポリミキシンカラム（内毒素を除去するため）とインラインで接続した。Ｇｐ１２０を、５００ｍＭのＭＭＰを添加したカラム緩衝液を用いて溶離した。ＤＥＡＥには混入タンパク質のみが結合し、ｇｐ１２０は結合しない。溶離を約７カラム体積にわたって、またはＡ２８０がベースラインに戻るまで続ける。
３．撹拌した細胞を使用して、精製されたｇｐ１２０の緩衝液をＰＢＳと交換し、約１ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
４．濃度を、Ａ２８０によって、および適切なモル吸光係数を使用して決定する。ＢＣＡアッセイもタンパク質の濃度を確認するために使用した。
５．タンパク質の完全性を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによって評価した。
６．内毒素含量を、Ｅｎｄｏｓａｆｅシステムを使用して測定した
７．最終的なタンパク質溶液を−８０℃で凍結させた
【０２９５】
核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を、エタノール中の脂質と滅菌クエン酸緩衝液中の核酸を組み合わせることによってリポソーム中に被包した。接線流濾過（ＴＦＦ）を使用してリポソームを濃縮し、最終的な緩衝液をＰＢＳに交換した。動的光散乱（ＤＬＳ）によりサイズ分布を決定した。核酸の被包を決定するために、トリトン−Ｘ処理した後、ＲｉｂｏｇｒｅｅｎアッセイおよびＰｉｃｏｇｒｅｅｎアッセイを使用して、それぞれ全ＲＮＡ含量および全ＤＮＡ含量を測定した。核酸の被包（μｇ／ｍｌ単位）は、破壊されていないリポソームから測定されたＲＮＡの量を引いた、トリトン−Ｘ処理した後の核酸の総量（破壊されたリポソーム）であった。
【０２９６】
種々のＨＩＶ  ｇｐ１６０／ｇｐ１４０製剤を、図１に示されているスケジュールに従ってマウスに投与した。ｇｐ１６０／ｇｐ１４０製剤を受けた６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの群が以下の表Ｉ−１に要約されている。
【表１−１】
2015522580.tif 000011
２「ＲＮＡによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」のレジメンにより、ロバストかつバランスのとれた免疫応答が誘導された。
【０２９７】
第１に、表Ｉ−１に記載のＨＩＶ  ｇｐ１６０／ｇｐ１４０構成物（ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を、潜在的な有害作用について評価した。図２は、リポソームに被包されたＲＮＡレプリコンを投与することによって有害作用は示されなかったことを示す。リポソームに被包されたＤＮＡ製剤（１５μｇの用量で）を投与した後に体重の一過性の減少および他の苦痛の視覚的徴候が観察されたが、０．１μｇのＲＮＡ／リポソーム、または１μｇのＲＮＡ／リポソームに伴う有害作用の証拠はなかった。
【０２９８】
第２に、抗ｇｐ１４０  ＩｇＧ抗体力価を測定して、表Ｉ−１に記載のＨＩＶ  ｇｐ１６０／ｇｐ１４０構成物によって誘導される免疫応答を評価した。図３Ａおよび図３Ｂに示されているように、タンパク質による追加刺激を行う前には、裸のＲＮＡによって検出可能なＩｇＧ応答は誘導されなかった。ＲＮＡ／リポソーム製剤により、動物の８０〜９０％において検出可能なＩｇＧ応答が誘導され、用量反応性作用が観察された（図３ＡのＲＮＡ／リポソームの１μｇの用量対０．１μｇの用量を比較されたい）。しかし、異なる動物におけるＩｇＧ力価は有意な変動を示した。１μｇのＲＮＡ／リポソーム製剤によって誘導されるＩｇＧ力価の中央値は、１５μｇのＤＮＡ／リポソーム製剤によるものと同程度であり、電気穿孔によって送達された１５μｇのＤＮＡによるものよりはるかに高かった。
【０２９９】
タンパク質による追加刺激（１０μｇのタンパク質／ＭＦ５９、表Ｉ−１を参照されたい）により、１μｇのＲＮＡ／リポソームによる初回刺激を受けたマウスにおいてＩｇＧ力価が２０倍に増大した（図３Ｂ）。タンパク質による追加刺激を行った後、「１μｇのＲＮＡ／リポソームによる初回刺激、タンパク質による追加刺激」のレジメンにより、ＨＩＶ−１  Ｅｎｖ（ＳＦ１６２）特異的なＩｇＧ力価が誘導され、これは、「ＤＮＡ／リポソームによる初回刺激（１５μｇ）、タンパク質による追加刺激」のレジメンによるものと同程度であり、また、「ＶＲＰ（１ｅ７）による初回刺激、タンパク質による追加刺激」のレジメンまたは「タンパク質による初回刺激、タンパク質による追加刺激」のレジメンによるのものとも同程度であった（１ログ未満低い（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ａ  ｌｏｇ  ｌｏｗｅｒ））（図３Ａおよび図３Ｂ）。１μｇのＲＮＡ／リポソームによる初回刺激、タンパク質による追加刺激のレジメンによっても、１０μｇのＤＮＡ／リポソームによる初回刺激、タンパク質による追加刺激のレジメン（データは示していない）と比較して優れた結果が実現された。「裸のＲＮＡによる初回刺激」を受けた群でもＩｇＧ力価が追加刺激され、これはタンパク質／ＭＦ５９による初回刺激を受けた群の２ｗｐ１におけるものと同様であった（図３Ａを参照されたい）。
【０３００】
図４Ａは、ＲＮＡ／リポソーム製剤により、ＶＲＰによるものと類似したバランスのとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ亜型プロファイルが誘導されたことを示す。対照的に、タンパク質／ＭＦ５９による初回刺激を受けた群では、ＩｇＧ１力価がＩｇＧ２ａ力価よりも有意に高かった。ＩｇＧ２ａはＴｈ１応答の代用物と考えられ、ＩｇＧ１はＴｈ２応答の代用物と考えられる。バランスのとれたＴｈ１：Ｔｈ２応答が望ましい。追加刺激前と追加刺激後のどちらの時点においても、ＲＮＡ／リポソームによる初回刺激を受けた群、ＤＮＡ／リポソームによる初回刺激を受けた群、およびＶＲＰによる初回刺激を受けた群におけるＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比の中央値は、ＤＮＡ／電気穿孔による初回刺激を受けた群、またはタンパク質／ＭＦ５９による初回刺激を受けた群のものよりも高かった（図４Ｂ）。ＩｇＧ力価がタンパク質／ＭＦ５９による追加刺激前には検出不可能であった「裸のＲＮＡ」による初回刺激を受けた群でも、追加刺激後にバランスのとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａプロファイルが示された（図４Ｃ）。
【０３０１】
図５では、どちらもリポソームとして製剤化されたＲＮＡとして送達した、クレードＣ（ＤＵ４２２．１）ｇｐ１６０抗原とクレードＢ（ＳＦ１６２）ｇｐ１６０抗原の免疫原性が比較されている。クレードＣ（ＤＵ４２２．１）ｇｐ１６０抗原により、タンパク質による追加刺激前にはクレードＢ（ＳＦ１６２）ｇｐ１６０抗原と比較して弱いＩｇＧ応答が引き出された。しかし、タンパク質による追加刺激を行った後には、２つの抗原についての総ＩｇＧ力価は同程度であった。ＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａプロファイルは、クレードＢ  ｇｐ１６０抗原とクレードＣ  ｇｐ１６０抗原のどちらについても同様にバランスのとれたものであった。
【０３０２】
図６Ａは、ＲＮＡ／リポソームによる初回刺激により、機能的なＣＤ４＋Ｔ細胞媒介性免疫応答が誘導され、これがタンパク質による追加刺激によって有効に追加刺激されたことを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、サイトカイン分泌細胞のレベルの上昇によって特徴付けた。図６Ａに示されている通り、タンパク質による追加刺激を行う前に、ＲＮＡ／リポソーム製剤（表Ｉ−１を参照されたい）により、検出可能なＳＦ１６２特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答が誘導された。ＲＮＡ／リポソームによる初回刺激を受けた群におけるサイトカイン分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルは、ＤＮＡ／リポソームまたはＶＲＰによる初回刺激を受けた群のものよりも低かったが、タンパク質／ＭＦ５９による初回刺激を受けた群のものと同程度であった。
【０３０３】
タンパク質による追加刺激を行った後、ＲＮＡ／リポソームによる初回刺激を受けた群（０．１μｇまたは１μｇのいずれかの初回刺激用量において、どちらも同等に追加刺激された）ではサイトカイン分泌ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルが有意に上昇した。ＣＤ４＋Ｔ細胞応答のタンパク質による追加刺激は、ＲＮＡ／リポソームによる初回刺激を用いた場合に、１５μｇのＤＮＡ／電気穿孔による初回刺激を用いた場合に認められたものよりも有効であり；最高用量のＶＲＰによる初回刺激を用いた場合に認められたものと同等またはそれよりも有効であり；１５μｇのＤＮＡ／リポソームによる初回刺激を用いた場合に認められたものと同様またはそれよりもわずかに低かった。裸のＲＮＡによる初回刺激を受けた群におけるＣＤ４＋Ｔ細胞応答も追加刺激された。
【０３０４】
ＲＮＡ／リポソームによる初回刺激、タンパク質による追加刺激を受けた群におけるＩＬ−２分泌細胞、ＩＦＮγ分泌細胞、およびＴＮＦα分泌細胞は、タンパク質／ＭＦ５９の３回用量を受けた群のものよりも高かった。ＲＮＡ／リポソームによる初回刺激、タンパク質による追加刺激を受けた群におけるＣＤ４＋Ｔ細胞からのＩＬ−５分泌は、タンパク質／ＭＦ５９の３回用量を受けた群のものよりも低かった。結果により、ＲＮＡによる初回刺激により、ＴＨ１応答が開始され（ＩＬ−２ｈｉｇｈ、ＩＦＮγｈｉｇｈ、ＴＮＦαｈｉｇｈ、ＩＬ−５−）、それがタンパク質による追加刺激後に持続または上昇したことが示されている。ＤＮＡ／リポソームまたはＶＲＰによる初回刺激を受けた群において同様のサイトカインプロファイルが認められた。サイトカインプロファイルは、タンパク質による初回刺激、タンパク質による追加刺激を受けた群において認められたＴＨ２型（ＩＬ−２ｌｏｗ、ＩＦＮγｌｏｗ、ＴＮＦαｌｏｗ、ＩＬ−５＋）応答とは対照的であった。
【０３０５】
図６Ｂは、ＲＮＡ／リポソームによる初回刺激により、機能的なＣＤ８＋Ｔ細胞応答が誘導され、それはタンパク質による追加刺激の影響を受けなかったことを示す。ＣＤ８＋Ｔ細胞媒介性免疫応答は、サイトカイン分泌細胞のレベルの上昇によって特徴付けた。図６Ｂに示されている通り、タンパク質による追加刺激を行う前に、ＲＮＡ／リポソーム製剤により、検出可能なＳＦ１６２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答が誘導された。ＣＤ８＋Ｔ細胞応答は、ＤＮＡ／リポソーム製剤またはＶＲＰ製剤によるものよりも低かったが、１５μｇの電気穿孔によって送達されたＤＮＡによるものと同程度であった。
【０３０６】
タンパク質による追加刺激を行った後、ＲＮＡ／リポソームによる初回刺激を受けた群におけるＣＤ８＋Ｔ細胞応答の大きさまたは質には、タンパク質による追加刺激による影響がなかった。ＤＮＡおよびＶＲＰによる初回刺激を受けた群については、追加刺激後、４ｗｐ２時点でＣＤ８＋エピトープ特異的Ｔ細胞（ＩＦＮγ分泌細胞およびＴＮＦα分泌細胞）の頻度の低下が明らかであった。
【０３０７】
図７は、表Ｉ−１に示されている製剤を投与したマウスの膣洗浄物におけるｇｐ１４０特異的ＩｇＡの力価を示す。タンパク質による追加刺激を行う前に、ＲＮＡ／リポソーム製剤を用いて２回マウスを初回刺激することにより、膣分泌物において検出可能なＳＦ１６２  ｇｐ１４０特異的ＩｇＡ抗体が誘導された。抗ｇｐ１４０  ＩｇＧ抗体の分泌は明らかではなかった。ＶＲＰまたはタンパク質／ＭＦ５９を用いて２回マウスを初回刺激することによっても、ＳＦ１６２  ｇｐ１４０特異的ＩｇＡ抗体が誘導され、ＩｇＡ力価の中央値はＲＮＡ／リポソーム群のものよりも高かった。ＤＮＡ／リポソームによる初回刺激（２×初回刺激）を受けた群では、ＳＦ１６２  ｇｐ１４０特異的ＩｇＡ抗体は検出可能でなかった。
【０３０８】
タンパク質による追加刺激を行った後、マウス５匹の異なるセットの膣洗浄物におけるＩｇＡ力価およびＩｇＧ力価を測定した。ＲＮＡ／リポソームによる初回刺激、タンパク質による追加刺激を受けた群のＩｇＡ力価の中央値は、ＤＮＡ／リポソームによる初回刺激、タンパク質による追加刺激を受けた群のものよりも高く、ＶＲＰによる初回刺激を受けた群またはタンパク質による初回刺激を受けた群のものと同程度であった。タンパク質による追加刺激後のＩｇＧ力価の中央値は、追加刺激前と比較してよりよくクラスター形成した。ＩｇＧ力価の中央値は全群について同程度であった。
（実施例ＩＩ）
ＨＩＶ  エンベロープタンパク質試験２−ｇｐ１４０（ＲＮＡとタンパク質との共投与）
【０３０９】
本実施例では、ＨＩＶクレードＣ（ＴＶ１）エンベロープタンパク質  ｇｐ１４０を抗原として使用した。ＨＩＶ  ｇｐ１４０をコードするＲＮＡ分子、およびそれにコードされるタンパク質（ｇｐ１４０）を組み合わせ、共投与し、この組合せの免疫原性効果を評価した。
１．試験デザイン
【０３１０】
以下のＲＮＡレプリコンを使用した
・Ｈ３５４−Ｔ７Ｇ−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ｕｎｃ−このＲＮＡレプリコンは、クレードＣ  ＴＶ１ｃ８．２株に由来する切断できないｇｐ１４０エンベロープタンパク質を発現する。ＲＮＡを転写するために使用するベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物が図２１に示されている。
ＲＮＡを実施例Ｉに記載の通り作製し、精製した。
【０３１１】
以下のＤＮＡベクターを使用してマウスを初回刺激した
・Ｈ４２５−ｐＣＭＶ−ＫＭ２−ＴＶ１ｃ８．２  ｇｐ１４０ｍｏｄ  ｕｎｃ−このＤＮＡベクターは、クレードＣ  ＴＶ１ｃ８．２株に由来する切断できないｇｐ１４０エンベロープタンパク質を発現する。発現ベクター、ベクターのアノテートされた配列および挿入物が図２２に示されている。
ＤＮＡを実施例Ｉに記載の通り作製した。
【０３１２】
以下のウイルス性レプリコン粒子（ＶＲＰ）を使用してマウスを初回刺激した
・ＶＲＰ  ｇｐ１４０．ＴＶ１ｃ８．２−このＶＲＰはクレードＣ  ＴＶ１ｃ８．２株に由来するｇｐ１４０エンベロープタンパク質を発現する。ＶＲＰの作製および特徴付けに関しては、例えば、Ｐｅｒｒｉら（２００３年）、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７７巻（１９号）：１０３９４〜１０４０３頁を参照されたい。
【０３１３】
クレードＣ  ＴＶ１ｃ８．２株に由来するｇｐ１４０タンパク質を、実施例ＩにおいてクレードＢ  ＳＦ１６２に由来するｇｐ１４０について記載されている通り作製した。
【０３１４】
種々のＨＩＶ  ｇｐ１４０製剤を、図８に示されているスケジュールに従ってマウスに投与した。ｇｐ１４０製剤を受けたＢＡＬＢ／ｃマウスの群が以下の表ＩＩ−１に要約されている。
表ＩＩ−１
【表２−１】
2015522580.tif 000012
２  ＲＮＡと、それにコードされるタンパク質とを共投与することにより、ロバストかつバランスのとれた免疫応答が誘導された。
【０３１５】
第１に、表ＩＩ−１に記載のＨＩＶ  ｇｐ１４０構成物を、潜在的な有害作用について評価した。図９は、ＲＮＡレプリコンと、それにコードされるタンパク質抗原とを共送達することによって有害作用は示されなかったことを示す。高用量（１０μｇ）の、リポソームに被包されたＲＮＡ製剤およびＤＮＡ製剤を投与した後に体重の一過性の減少および他の苦痛の視覚的徴候が観察されたが、１μｇのＲＮＡ／リポソーム、または１μｇのＲＮＡ／リポソーム／タンパク質を用いた場合には有害作用の証拠はなかった。さらに、体重減少および有害作用の他の視覚的徴候は、１０μｇのＲＮＡ／リポソームを用いた場合、１０μｇのＤＮＡ／リポソームの場合と比較して少なかった。
【０３１６】
第２に、抗ｇｐ１４０  ＩｇＧ抗体力価を測定して、表ＩＩ−１に記載のＨＩＶ  ｇｐ１４０構成物によって誘導される免疫応答を評価した。図１０に示されている通り、タンパク質による追加刺激の前に、１μｇ用量の、リポソームに被包されたＲＮＡレプリコン（ＲＮＡ／リポソーム）により、強力な免疫応答が誘導され、３ｗｐ２におけるｇｐ１４０特異的ＩｇＧ力価はウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）によるものと同程度であった。さらに、３ｗｐ２において、１μｇのＲＮＡ／リポソームと１０μｇのＲＮＡ／リポソームとの間でＩｇＧ力価に有意差はなかった。１μｇのＲＮＡ／リポソームおよび１０μｇのＲＮＡ／リポソームによって誘導されたＩｇＧ力価は、１μｇのＤＮＡ／リポソームおよび１０μｇのＤＮＡ／リポソームよりも優れており、同様に、電気穿孔によって送達された１０μｇのＤＮＡよりも優れていた。
【０３１７】
ＲＮＡレプリコンとｇｐ１４０タンパク質とを組み合わせること（ＲＮＡ／リポソーム／タンパク質）により、ＲＮＡ／リポソームと比較して、よりいっそう強力な免疫応答が誘導される。図１０に示されている通り、１μｇのＲＮＡ／リポソーム／タンパク質によって誘導された抗ｇｐ１４０  ＩｇＧ力価は、１μｇのＲＮＡ／リポソームによるものよりも有意に高く、同様に、ＶＲＰによるものよりも有意に高かった。１μｇのＲＮＡ／リポソーム／タンパク質群とタンパク質／ＭＦ５９群との間で抗ｇｐ１４０  ＩｇＧ力価に有意差はなかった。
【０３１８】
図１１は、追加刺激（１０μｇのタンパク質／ＭＦ５９、表ＩＩ−１を参照されたい）を行った後に測定された抗ｇｐ１４０  ＩｇＧ力価を示す。１μｇのＲＮＡ／リポソームによる初回刺激を受けた群のＩｇＧ力価は、１０μｇのＲＮＡ／リポソームによる初回刺激を受けた群、１μｇのＤＮＡ／リポソームによる初回刺激を受けた群、１０μｇのＤＮＡ／リポソームによる初回刺激を受けた群、またはＶＲＰによる初回刺激を受けた群のものと有意に異ならなかった。
【０３１９】
図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＲＮＡ／リポソーム製剤およびＲＮＡ／リポソーム／タンパク質製剤により、ＶＲＰによるものと類似したバランスのとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａ亜型プロファイルが誘導されたことを示す。力価がタンパク質／ＭＦ５９による追加刺激前には検出不可能であった裸のＲＮＡにより免疫された群でも、タンパク質による追加刺激後にバランスのとれたＩｇＧ１：ＩｇＧ２ａプロファイルが示された（図１２Ｃ）。対照的に、タンパク質／ＭＦ５９による初回刺激を受けた群では、ＩｇＧ１力価がＩｇＧ２ａ力価よりも有意に高かった。ＩｇＧ２ａはＴｈ１応答の代用物と考えられ、ＩｇＧ１はＴｈ２応答の代用物と考えられる。バランスのとれたＴｈ１：Ｔｈ２応答が望ましい。
【０３２０】
図１３は、ｇｐ１４０  ＤＮＡワクチンまたはＲＮＡワクチンを投与したマウスの膣洗浄物におけるｇｐ１４０特異的ＩｇＡの力価を示す。この試験では、タンパク質／ＭＦ５９による追加刺激は行わなかった。注目すべきことに、ＤＮＡ／リポソームを投与した群において非常に低いレベルのＩｇＡが検出された。
（実施例ＩＩＩ）
異種初回刺激−追加刺激ワクチン接種レジメンにおけるＨＩＶ−ＳＡＭ（商標）ワクチンの効力
【０３２１】
初回刺激−追加刺激レジメンにおいて使用した場合、自己増幅ＲＮＡを有する組換えアルファウイルスレプリコン粒子（ＶＲＰ）により、アカゲザルがＳＨＩＶＳＦ１６２Ｐ４による攻撃から保護された。細胞培養物作製の制約を回避し、ウイルスによらない合成ワクチン送達系を使用する、合成自己増幅ＲＮＡに基づくＳＡＭ（商標）ワクチンプラットフォームを使用した。
【０３２２】
マウスおよびウサギにおける全身免疫応答および粘膜免疫応答を、ＨＩＶ−１クレードＢのＥｎｖ抗原とＨＩＶ−１クレードＣのＥｎｖ抗原の両方に対して、ＨＩＶ−１  ｇｐ１４０を発現しているＳＡＭ（商標）プラットフォーム（ＨＩＶ−ＳＡＭ（商標）ワクチン）による初回刺激、タンパク質／ＭＦ５９ワクチンによる追加刺激のレジメンを使用して評価した。マウスでは、１μｇのＨＩＶ−ＳＡＭ（商標）ワクチンに対する、初回刺激されたＥｎｖ特異的ＩｇＧ応答は、１０μｇ用量の同じく製剤化されたＤＮＡワクチン、１０７ＩＵのＶＲＰ、および１０μｇのタンパク質／ＭＦ５９ワクチンと同程度であった。ＨＩＶ−ＳＡＭ（商標）ワクチンにより初回刺激された応答は、タンパク質／ＭＦ５９ワクチンによってロバストに追加刺激され得、ＶＲＰワクチンを用いた場合に認められたものと類似したバランスのとれたＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａサブクラス応答がもたらされたが、ＩｇＧ１応答が優性であったタンパク質／ＭＦ５９のみによるワクチン接種とは異なった。ＨＩＶ−ＳＡＭ（商標）によるワクチン接種を２回行った後、Ｅｎｖ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答とＥｎｖ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の両方が検出可能であった。ＨＩＶ−ＳＡＭ（商標）ワクチンにより初回刺激され、タンパク質により追加刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答について、ＤＮＡまたはＶＲＰにより初回刺激され、タンパク質により追加刺激された応答で認められるものと類似したＴＨ１型（ＩＦＮγ＋、ＩＬ−５−）プロファイルが実証でき、これは、タンパク質／ＭＦ５９によるワクチン接種を用いた場合にＴＨ２型（ＩＦＮγｌｏｗ、ＩＬ−５＋）応答が認められたのとは対照的であった。ウサギでは、２５μｇまたは５０μｇの製剤化されたＨＩＶ−ＳＡＭ（商標）ワクチンを用いて初回刺激することにより、ロバストかつ非常に強いＥｎｖ結合性ＩｇＧ、および５００μｇの製剤化されていないＤＮＡワクチンよりも優れ、ＶＲＰおよびタンパク質／ＭＦ５９ワクチンと同程度のＨＩＶ中和抗体が誘導された。さらに、ＨＩＶ−ＳＡＭ（商標）ワクチンを用いて免疫したマウスとウサギのどちらにおいても、タンパク質／ＭＦ５９により追加刺激することができるＥｎｖ特異的膣洗浄物Ｉｇが一貫して実証できた。
【０３２３】
まとめると、これらの結果により、ＨＩＶ−ＳＡＭ（商標）ワクチンが強力かつ多用途であり、新規の免疫初回刺激戦略を提供することが示される。
（実施例ＩＶ）
５μｇ用量、２５μｇ用量および５０μｇ用量のＣＮＥ−ＲＮＡワクチンを使用した、ウサギにおける投与試験
【０３２４】
５μｇ用量、２５μｇ用量および５０μｇ用量のＣＮＥ−ＲＮＡワクチン（クレードＣ  ＴＶ１．Ｃオリゴマーｇｐ１４０タンパク質を送達する）を使用した、ウサギにおける投与試験を行い、免疫原性を、ＬＮＰ−ＲＮＡワクチン、ＶＲＰワクチン、およびＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０ワクチンによって誘導される免疫原性と比較した。初回刺激−追加刺激ワクチン接種レジメンを使用し、ウサギを０週目および４週目に初回刺激し、１２週目および２４週目に追加刺激した。
表ＩＶ−１
【表４−１】
2015522580.tif 000013
【０３２５】
ＣＮＥ−ＲＮＡワクチンとＬＮＰ−ＲＮＡワクチンのどちらによっても、ウサギを免疫した際にロバストなＥｎｖ特異的結合抗体力価が誘導された（図１４）。２回の初回刺激の２週間後（２ｗｐ２）に、ＣＮＥ−ＲＮＡワクチンにより、平均で、ＬＮＰ−ＲＮＡワクチンよりも約１５〜２０倍高く、５００μｇ用量の裸のＤＮＡワクチンよりも約１０〜４０倍高く、ＶＲＰワクチンを用いた場合に認められたものと同程度の力価が誘導された（図１４）。ＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０ワクチンを用いた場合に認められた応答は、ＣＮＥ−ＲＮＡワクチンを用いた場合に認められたものよりも約４〜１０倍高かった（図１４）。ＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０ワクチンを用いて２回追加刺激すると、全てのワクチンについて同様の大きさの応答が実現された（図１４）。
【０３２６】
ＣＭＦ−３４ワクチンでは、結合抗体を用いた場合に認められたものと一致して、初回刺激後に、ＬＮＰ−ＲＮＡワクチンおよびＤＮＡワクチンと比較して優れた中和抗体が誘導された（図１５）。したがって、５０μｇ用量のＣＮＥ−ＲＮＡワクチンを用いて２回免疫した動物５匹中５匹の血清（２ｗｐ２）により、クレードＣウイルスＭＷ９６５が中和され、ＬＮＰ−ＲＮＡ高用量群または５００μｇのＤＮＡ群のいずれの動物でも中和抗体は実証されい（図１５）。ＬＮＰ−ＲＮＡにより初回刺激された動物を、ＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０ワクチンを用いて１回追加刺激すると（２ｗｐ３）、動物５匹中わずか２匹のみで中和が実証され、応答者の数を１００％まで増加させるためには、さらなる追加刺激（２ｗｐ４）が必要であった（図１５）。したがって、ウサギにおいて、ＣＮＥ−ＲＮＡワクチンにより、ＬＮＰ−ＲＮＡワクチンによって誘導されるよりも早く中和抗体が誘導された。同様に、ＣＮＥ−ＲＮＡワクチンを用いた場合に認められた中和応答は、ＶＲＰワクチンおよびＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０ワクチンによるものと同程度であった（図１５）。
【０３２７】
２ｗｐ２、２ｗｐ３および２ｗｐ４にウサギから膣洗浄物も回収した。洗浄物を、抗ウサギＩｇ（Ｈ＋Ｌ）抗体を使用してＥｎｖ特異的Ｉｇについてアッセイした。ＣＮＥ−ＲＮＡをワクチン接種された群およびＬＮＰ−ＲＮＡをワクチン接種された群の５０〜１００％で低レベルのＥｎｖ特異的Ｉｇ力価が実証され、動物の１００％が膣の応答を示すような初回刺激による応答のＥｎｖタンパク質による追加刺激の証拠が伴った（図１６）。
（実施例Ｖ）
アカゲザルにおけるワクチンの免疫原性プロファイル
【０３２８】
アカゲザルの試験において初回刺激−追加刺激ワクチン接種レジメンを使用し、それにより、霊長類を０週目、４週目および１２週目に初回刺激し、その後、２４週目、３６週目および５４週目に追加刺激した。攻撃は、ＳＨＩＶ１１５７ｉｐｄ３Ｎ４を使用して実施することができる。
表Ｖ−１
【表５−１】
2015522580.tif 000014
【０３２９】
アカゲザルにおけるワクチンの免疫原性プロファイルは、ウサギにおいて認められたものと同様であった。これらの試験では、霊長類を３回初回刺激し、その後にＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０で２回追加刺激した。ＣＮＥ−ＲＮＡワクチンを用いて初回刺激免疫を２回行った後、動物６匹全てが応答し、抗Ｅｎｖ結合力価は約１０００〜１００００の範囲であった（２ｗｐ２、６週目）（図１７）。この応答は、同じ時点で、約１０倍低い力価（力価の範囲、約１００〜１０００）が誘導された、ＶＲＰワクチンを用いた場合に認められたものと同程度であった（図１７）。対照的に、ＬＮＰ−ＲＮＡワクチンには動物６匹中２匹のみが抗Ｅｎｖ力価（約１００の力価）を伴って応答した（図１７）。動物６匹中５匹において応答を誘導するためにはＬＮＰ−ＲＮＡワクチンによる追加免疫が必要であった（２ｗｐ３、１４週目）（図１７）。ＬＮＰ−ＲＮＡにより初回刺激された応答を、ＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０ワクチンを用いて追加刺激することにより、動物６匹で全てにおいて実証できる抗Ｅｎｖ力価がもたらされたが（２ｗｐ４、２６週目）、力価の範囲は広かった（約１０００〜５０００００の範囲）（図１７）。対照的に、ＣＮＥ−ＲＮＡにより初回刺激され、ＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０ワクチンにより追加刺激された抗Ｅｎｖ力価は、密接にクラスター形成し（約５０００〜１００００の範囲）、ＶＲＰワクチンによって誘導されるものと同程度であった（図１７）。
【０３３０】
ＴＶ１  ｇｐ１４０に対する結合性ＩｇＧ抗体の平均力価を測定した。動物６匹中５匹が抗ＴＶ１力価を伴ってＬＮＰ−ＲＮＡワクチンに応答した。動物６匹で全てにおいて応答を誘導するためにはＬＮＰ−ＲＮＡワクチンによる追加免疫が必要であった。対照的に、ＣＮＥ−ＲＮＡにより初回刺激され、ワクチンにより追加刺激された抗ＴＶ１力価は密接にクラスター形成し、力価はＶＲＰワクチンによって誘導されるものよりもいっそう高かった。
【０３３１】
ＣＮＥ−ＲＮＡワクチンとＬＮＰ−ＲＮＡワクチンのどちらによっても、Ｔ細胞応答が誘導された（ｅｘ  ｖｉｖｏにおけるペプチドおよびタンパク質再刺激ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定したとおり）。ＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０による１回目の追加刺激の２週間後に（２ｗｐ４、２６週目）、動物６匹中６匹でＥｎｖ特異的Ｔ細胞ＩＦＮγ応答が実証され、１匹は低応答者（ＰＢＭＣ１０６個あたり約３００ＳＦＣ）であり、５匹は高応答者（ＰＢＭＣ１０６個あたり約１０００〜２０００ＳＦＣ）であった（図１８）。対照的に、ＬＮＰ−ＲＮＡにより初回刺激された応答を追加刺激すると、約５０〜１０００の範囲の分散したＴ細胞応答が実証できた（図１８）。ＶＲＰワクチンを用いて初回刺激した場合、弱いＴ細胞応答が認められ、追加刺激後に分散した応答が実現された（ＰＢＭＣ１０６個あたり約１００〜９００ＳＦＣの範囲）（図１８）。ＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０ワクチンを用いた場合にも弱いＴ細胞応答が観察された（図１８）。鼻洗浄物と直腸洗浄物の両方を、ＲＮＡワクチンを用いて初回刺激し、ＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０を用いて追加刺激した後の種々の時点で回収した。Ｅｎｖ特異的ＩｇＡ結合力価はＥＬＩＳＡを使用して評価されている。
【０３３２】
時間内にワクチンにより誘導されたＩＦＮγ、ＩＬ２およびＩＬ４応答に対する抗原特異的Ｔ細胞応答を測定した。群あたりの個々の動物全てのＰＢＭＣによるｇｐ１２０コンセンサスＣペプチドプール（ｐｐ）、ｇｐ４１  Ｃｏｎｓ  Ｃ  ｐｐ、または組換えＴＶ１  ｇｐ１４０に対するＩＦＮγ、ＩＬ２、およびＩＬ４の分泌をＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定した（図２４Ａ〜Ｃ）。ＩＦＮ−γを測定した場合、ＲＮＡ−ＣＮＥおよびＲＮＡ−ＬＮＰに対して強力な応答が認められた（図２４Ａ）。ＩＬ−２（図２４Ｂ）およびＩＬ４（図２４Ｃ）については分散した応答が認められた。
【０３３３】
ＣＮＥ−ＲＮＡワクチンとＬＮＰ−ＲＮＡワクチンのどちらによってもＢ細胞応答が誘導された（ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定したとおり）。ＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０による１回目の追加刺激の２週間後に（２ｗｐ４、２６週目）、動物６匹中６匹で抗原特異的な特異的Ｂ細胞応答が実証され、１匹は低応答者（ＰＢＭＣ１０６個あたり約３００ＳＦＣ）であり、５匹は高応答者（ＰＢＭＣ１０６個あたり約１０００〜２０００ＳＦＣ）であった（図１８）。
【０３３４】
ＣＮＥ−ＲＮＡワクチンおよびＬＮＰ−ＲＮＡワクチンにより誘導されたＢ細胞応答では同様の結果が認められた（ＴＶ１−ｇｐ１４０に特異的なＥＬＩＳｐｏｔアッセイによって測定したとおり）。ＭＦ５９でアジュバント処理したｏ−ｇｐ１４０による１回目の追加刺激の２週間後に（２ｗｐ４、２６週目）、ＬＮＰ−ＲＮＡを用いて初回刺激した動物では６匹中４匹で抗原特異的Ｂ細胞応答が実証され、ＣＮＥ−ＲＮＡを用いて初回刺激した動物では６匹中６匹で抗原特異的Ｂ細胞応答が実証された。
【０３３５】
４回目の免疫の２週間後（２６週目）および５回目の免疫の２週間後（３８週目）に採取した血清に対して中和（ＩＣ５０）アッセイを実施した（図２５）。血清を、クレードＣ  Ｔｉｅｒ２（ＳＨＩＶ１１５７ｉｐｄ３Ｎ４）シュードウイルス、Ｔｉｅｒ１（ＳＨＩＶ１１５７ｉｐＥＬ−ｐ）ＰＶ、Ｔｉｅｒ１  ＨＩＶ−１／ＴＶ１  ＰＶに対して、およびＴｉｅｒ１  クレードＢ  ＰＶ（ＳＨＩＶ  ＳＦ１６２Ｐ４）に対して評価した。ＲＮＡ−ＬＮＰにより初回刺激した動物６匹中２匹、ＣＮＥ−ＲＮＡにより初回刺激された動物６匹中３匹、およびタンパク質／ＭＦ５９により初回刺激された動物６匹中４匹で、３８週目にＴｉｅｒ１（ＳＨＩＶ１１５７ｉｐＥＬ−ｐ）に対して評価した血清において大きな中和力価が認められた。
【０３３６】
５回目の免疫の２週間後（３８週目）に採取した血清に対して追加的な中和（ＩＣ５０）アッセイを実施した。これらの血清をＴＺＭ−ｂｌ細胞においてクレードＣ  Ｔｉｅｒ１（ＭＷ９６５．２６）に対して評価し、Ａ３Ｒ５．７細胞においてＴｉｅｒ２ウイルス（ＴＶ１．２１．ＬｕｃＲ．Ｔ２Ａ．ｅｃｔｏおよびＣｅ１１７６＿Ａ３．ＬｕｃＲ．Ｔ２Ａ．ｅｃｔｏ）に対して評価した（図２６）。ＶＲＰ、ＲＮＡ−ＬＮＰ、ＲＮＡ−ＣＮＥ、およびタンパク質／ＭＦ５９のそれぞれについて、Ｔｉｅｒ１（ＭＷ９６５．２６）に対して検査される血清の採血前の観察されたバックグラウンドの３倍超（＞３×）の判定基準（ｃｒｉｔｅｒｉｏｒ）に基づいて、動物６匹中６匹が中和について陽性とスコア化された。
【０３３７】
大部分の抗原について、結合応答は３８週目（２回目の追加刺激後）にピークに達した。ＣＮＥ−ＲＮＡによる初回刺激により、Ｖ１／Ｖ２とエンベロープ抗原の両方に対してより高い結合応答が引き出されたことも示された。さらに、タンパク質による追加刺激後に（３８週目および５６週目）、ＬＮＰ−ＲＮＡ群およびＣＮＥ−ＲＮＡ群でｏ−ｇｐ１４０群に対してＶＲＰ群およびＥｎｖ群よりも有意に高い結合抗体が生じた。
【０３３８】
これらの試験により、製剤化された自己増幅ＲＮＡを用いたワクチン接種が安全かつ免疫原性であり、体液性免疫応答と細胞性免疫応答の両方を引き出すことの非ヒト霊長類における最初の証拠がもたらされる。
（実施例ＶＩ）
ＨＩＶ初回刺激−追加刺激  対  ＨＩＶ−ＳＡＭｇｐ１４０ワクチン／ＣＭＦ３４およびＥｎｖタンパク質（ＴＶ１  ｇｐ１４０）の同時投与
【０３３９】
本実施例では、初回刺激と追加刺激を使用したＨＩＶ  Ｅｎｖに対する抗体応答を同時投与と比較した。この試験では、初回刺激と追加刺激  対  同時投与について、ＭＦ５９の使用とミョウバンの使用との比較も行い、また、同時投与について、アジュバントの不使用またはミョウバンの使用とＭＦ５９の使用との比較も行った。この実施例の目的は、単一モダリティの免疫を用いて初回刺激、追加刺激と同時投与とを評価する（ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）ことであった。
【０３４０】
種々のＨＩＶ−ＳＡＭｇｐ１４０／ＣＭＦ３４およびＥｎｖタンパク質（ＴＶ１  ｐｇ１４０）製剤を、以下の表ＶＩ−１に従ってウサギに投与した。
表ＶＩ−１
【表６−１】
2015522580.tif 000015
【０３４１】
初回刺激−追加刺激ワクチン接種レジメンをウサギに使用し、０週目および４週目に初回刺激し、１２週目および２４週目に追加刺激した。血清ならびに膣洗浄物および糞便ペレット試料をさまざまな時点で回収した。Ｅｎｖ特異的結合ＩｇＧ力価が図２３に示されている。ＨＩＶ  Ｅｎｖに対する抗体応答は、初回刺激と追加刺激を受けた被験体と同時投与を受けた被験体との間で同程度であった。初回刺激と追加刺激または同時投与について、アジュバントを用いていないワクチンを受けたウサギ、ミョウバンを用いたワクチンを受けたウサギまたはＭＦ５９を用いたワクチンを受けたウサギの間で有意差は観察されなかった。
【０３４２】
本明細書は、本明細書内で引用される参考文献の教示に照らして最も完全に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提示するものであり、本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。当業者は、他の多くの実施形態が、本発明により包含されることを容易に認識する。本開示において引用されるすべての刊行物および特許は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。参照により組み込まれる材料が本明細書と相反するまたは矛盾する場合は、本明細書がこのようなあらゆる材料に優先されるであろう。本明細書におけるあらゆる参考文献の引用は、このような参考文献が本発明に先行することの容認ではない。
【０３４３】
当業者は、日常的な実験だけを使用して、本明細書で記載される本発明の特定の実施形態との多くの同等物を認識するであろう、または確認することが可能であろう。このような同等物は、以下の実施形態により包含されることを意図する。
【図１】
2015522580.tif 000016
【図２−１】
2015522580.tif 000017
【図２−２】
2015522580.tif 000018
【図２−３】
2015522580.tif 000019
【図３Ａ】
2015522580.tif 000020
【図３Ｂ】
2015522580.tif 000021
【図４Ａ】
2015522580.tif 000022
【図４Ｂ】
2015522580.tif 000023
【図４Ｃ】
2015522580.tif 000024
【図５】
2015522580.tif 000025
【図６Ａ】
2015522580.tif 000026
【図６Ｂ】
2015522580.tif 000027
【図７−１】
2015522580.tif 000028
【図７−２】
2015522580.tif 000029
【図８】
2015522580.tif 000030
【図９−１】
2015522580.tif 000031
【図９−２】
2015522580.tif 000032
【図９−３】
2015522580.tif 000033
【図１０】
2015522580.tif 000034
【図１１】
2015522580.tif 000035
【図１２Ａ】
2015522580.tif 000036
【図１２Ｂ】
2015522580.tif 000037
【図１２Ｃ】
2015522580.tif 000038
【図１３−１】
2015522580.tif 000039
【図１３−２】
2015522580.tif 000040
【図１４】
2015522580.tif 000041
【図１５】
2015522580.tif 000042
【図１６Ａ】
2015522580.tif 000043
【図１６Ｂ】
2015522580.tif 000044
【図１７Ａ】
2015522580.tif 000045
【図１７Ｂ】
2015522580.tif 000046
【図１７Ｃ】
2015522580.tif 000047
【図１７Ｄ】
2015522580.tif 000048
【図１８−１】
2015522580.tif 000049
【図１８−２】
2015522580.tif 000050
【図１９Ａ−１】
2015522580.tif 000051
【図１９Ａ−２】
2015522580.tif 000052
【図１９Ｂ−１】
2015522580.tif 000053
【図１９Ｂ−２】
2015522580.tif 000054
【図１９Ｂ−３】
2015522580.tif 000055
【図１９Ｃ−１】
2015522580.tif 000056
【図１９Ｃ−２】
2015522580.tif 000057
【図１９Ｃ−３】
2015522580.tif 000058
【図１９Ｄ−１】
2015522580.tif 000059
【図１９Ｄ−２】
2015522580.tif 000060
【図１９Ｄ−３】
2015522580.tif 000061
【図１９Ｅ−１】
2015522580.tif 000062
【図１９Ｅ−２】
2015522580.tif 000063
【図１９Ｅ−３】
2015522580.tif 000064
【図１９Ｆ−１】
2015522580.tif 000065
【図１９Ｆ−２】
2015522580.tif 000066
【図２０Ａ−１】
2015522580.tif 000067
【図２０Ａ−２】
2015522580.tif 000068
【図２０Ｃ−１】
2015522580.tif 000069
【図２０Ｃ−２】
2015522580.tif 000070
【図２０Ｃ−３】
2015522580.tif 000071
【図２０Ｄ−１】
2015522580.tif 000072
【図２０Ｄ−２】
2015522580.tif 000073
【図２０Ｄ−３】
2015522580.tif 000074
【図２０Ｅ−１】
2015522580.tif 000075
【図２０Ｅ−２】
2015522580.tif 000076
【図２０Ｅ−３】
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【図２０Ｆ−１】
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【図２０Ｆ−２】
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【図２１Ａ−１】
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【図２１Ａ−２】
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【図２１Ｂ−１】
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【図２１Ｂ−２】
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【図２１Ｂ−３】
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【図２１Ｃ−１】
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【図２１Ｃ−２】
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【図２１Ｃ−３】
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【図２１Ｄ−１】
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【図２１Ｄ−２】
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【図２１Ｄ−３】
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【図２１Ｅ−１】
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【図２１Ｅ−２】
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【図２１Ｆ−１】
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【図２１Ｆ−２】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ−１】
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【図２２Ｂ−２】
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【図２２Ｂ−３】
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【図２２Ｃ−１】
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【図２２Ｃ−２】
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【図２２Ｃ−３】
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【図２２Ｃ−４】
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【図２２Ｃ−５】
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【図２２Ｄ−１】
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【図２２Ｄ−２】
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【図２２Ｄ−３】
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【図２２Ｆ−１】
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【図２２Ｆ−２】
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【図２２Ｇ−１】
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【図２２Ｇ−２】
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【図２３】
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【図２４Ａ−１】
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【図２４Ａ−２】
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【図２４Ａ−３】
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【図２４Ａ−４】
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【図２４Ｂ−１】
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【図２４Ｂ−２】
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【図２４Ｂ−３】
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【図２４Ｂ−４】
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【図２４Ｃ−１】
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【図２４Ｃ−２】
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【図２４Ｃ−３】
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【図２４Ｃ−４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２０Ｂ−１】
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【図２０Ｂ−２】
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【図２０Ｂ−３】
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【図２２Ｅ−１】
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【図２２Ｅ−２】
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【図２２Ｅ−３】
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【国際調査報告】
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2015522580.tif 000136
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