(57)【要約】本開示は、アンタゴニスト性デュアル受容体抗原結合タンパク質、例えば抗体、および病的疾患の処置のためにデュアル受容体抗体を使用する方法に関する。デュアル受容体抗体は、ActRII受容体に対する抗体を含み得、かつ病的状態を処置するために使用され得る。病的状態は、筋消耗疾患または筋肉成長の刺激を必要とする任意の疾患を含み得る。2015525230.tif 000010
2015525230.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
SEQ ID NO:15に対して少なくとも97％の同一性を有する第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:16に対して少なくとも97％の配列同一性を有する第2のポリペプチドを含む、単離された抗原結合タンパク質。
【請求項２】
SEQ ID NO:15およびSEQ ID NO:16を含む、単離された抗原結合タンパク質。
【請求項３】
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合する、請求項1または2記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項４】
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合し、かつ結合すると筋肉の成長を刺激する、請求項1または2記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項1または2記載の抗原結合タンパク質。
【請求項６】
マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、またはマウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントである、請求項1または2記載の抗原結合タンパク質。
【請求項７】
2つのアクチビン受容体に結合する、単離された抗原結合タンパク質。
【請求項８】
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合する、請求項7記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項９】
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合し、かつ結合すると筋肉の成長を刺激する、請求項7記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項7記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、またはマウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントである、請求項7記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8を含む、単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合する、請求項12記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合し、かつ結合すると筋肉の成長を刺激する、請求項12記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項12記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、またはマウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントである、請求項12記載の抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5を含む、単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合する、請求項17記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合し、かつ結合すると筋肉の成長を刺激する、請求項17記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項17記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、またはマウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントである、請求項17記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２２】
SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8を含む、単離された抗原結合タンパク質。
【請求項２３】
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合する、請求項22記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項２４】
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合し、かつ結合すると筋肉の成長を刺激する、請求項22記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２５】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項22記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２６】
マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、またはマウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントである、請求項22記載の抗原結合タンパク質。
【請求項２７】
請求項1、2、7、12、17、22および52のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸。
【請求項２８】
請求項27記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２９】
請求項28記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項３０】
真核生物細胞または原核生物細胞である、請求項29記載の宿主細胞。
【請求項３１】
真核生物細胞が哺乳動物細胞である、請求項30記載の宿主細胞。
【請求項３２】
少なくともSEQ ID NO:3〜5またはSEQ ID NO:4〜6を含む、単離された抗原結合タンパク質。
【請求項３３】
抗原結合タンパク質を製造する方法であって、核酸を発現させ抗体を産生させるのに適した条件下で請求項29記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
【請求項３４】
宿主細胞の培養物から抗体を回収する工程をさらに含む、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
請求項1、2、7、12、17、22および52のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、組成物。
【請求項３６】
ミオスタチン、アクチビンAまたはGDF-11活性を減少させるまたはブロックする方法であって、そのような処置を必要とする対象に、治療有効量の、請求項1、2、7、12、17、22もしくは52のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質または該抗原結合タンパク質を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項３７】
そのような処置が必要な対象において除脂肪筋肉量を増大させるかまたは脂肪量に対する除脂肪筋肉量の比を増大させる方法であって、そのような処置を必要とする対象に、有効量の、請求項1、2、7、12、17、22もしくは52のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質または該抗原結合タンパク質を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項３８】
筋消耗疾患をそのような障害に罹患した対象において処置または予防する方法であって、請求項1、2、7、12、17、22または52のいずれか一項記載の抗原結合ポリペプチドを含む有効量の治療組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３９】
筋消耗疾患が、癌性悪液質、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、うっ血性閉塞性肺疾患、慢性心不全、化学性悪液質（chemical cachexia）、HIV/AIDSに起因する悪液質、腎不全、尿毒症、関節リウマチ、加齢に伴うサルコペニア、加齢に伴う虚弱（age-related frailty）、臓器萎縮（organ atrophy）、手根管症候群、アンドロゲン欠乏または長時間の床上安静、脊髄損傷、発作、骨折、火傷、加齢もしくはインスリン抵抗性による不活動性に起因する筋消耗を含む、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
BIAcoreアッセイにおいてActRIIBに対して10 pMまたはそれ未満のKDを有する、請求項1、2、7、12、17、22および52のいずれか一項記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項４１】
ActRIIBに対して1 pMまたはそれ未満のKDを有する、請求項40記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４２】
BIAcoreアッセイにおいてActRIIAに対して4 nMまたはそれ未満のKDを有する、請求項1、2、7、12、17、22および52のいずれか一項記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項４３】
ActRIIAに対して1 pMまたはそれ未満のKDを有する、請求項42記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４４】
BIAcoreアッセイにおいてActRIIBおよびActRIIAに対して1 pMまたはそれ未満のKDを有する、抗原結合タンパク質。
【請求項４５】
細胞ベースのアッセイにおいてActRIIBに対して8 nmまたはそれ未満のIC50を有する、請求項1、2、7、12、17、22および52のいずれか一項記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項４６】
ActRIIBに対して2 nMまたはそれ未満のIC50を有する、請求項40記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４７】
細胞ベースのアッセイにおいてActRIIAに対して2 nMまたはそれ未満のIC50を有する、請求項1、2、7、12、17、22および52のいずれか一項記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項４８】
ActRIIAに対して1 nMまたはそれ未満のIC50を有する、請求項42記載の抗原結合タンパク質。
【請求項４９】
細胞ベースのアッセイにおいてActRIIBに対して2 nMまたはそれ未満のIC50およびActRIIAに対して1 nMまたはそれ未満のIC50を有する、抗原結合タンパク質。
【請求項５０】
アンタゴニスト性デュアル受容体抗体である、請求項1、2、7、12、17、22および52のいずれか一項記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５１】
ヒト抗体である、請求項50記載のアンタゴニスト性デュアル受容体抗体。
【請求項５２】
SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:17に特異的に結合する、請求項7記載の単離された抗原結合タンパク質。
【請求項５３】
SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:17に特異的に結合し、かつ結合すると筋肉の成長を刺激する、請求項52記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５４】
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項52記載の抗原結合タンパク質。
【請求項５５】
マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体またはマウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントである、請求項52記載の抗原結合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2012年6月11日に出願された米国仮出願第61/658,237号の恩典を主張し、その全開示をあらゆる目的のために全体として参照により本明細書に組み入れる。
【０００２】
連邦政府による支援を受けた研究または開発に関する宣言
なし
【０００３】
配列表の参照
なし
【０００４】
発明の分野
本開示は、アンタゴニスト性デュアル受容体抗原結合タンパク質、例えば抗体、およびデュアル受容体抗体を使用する方法に関する。デュアル受容体抗体は、ActRII受容体に対する抗体を含み得、筋肉の成長を刺激するために使用され得る。
【背景技術】
【０００５】
発明の背景
形質転換成長因子β（TGF-β）タンパク質ファミリーは、形質転換成長因子-β（TGF-β）、アクチビン、骨形成タンパク質（BMP）、神経成長因子（NGF）、脳由来神経栄養因子（BDNF）および成長／分化因子（GDF）を含む。これらのファミリーメンバーは、細胞の増殖、分化およびその他の機能を含む幅広い生物学的プロセスの調節に関与している。
【０００６】
ミオスタチンとも称される成長／分化因子8（GDF-8）は、その大部分が発生期および成体の骨格筋組織の細胞において発現されるTGF-βファミリーメンバーである。ミオスタチンは、骨格筋成長の負の制御において必須の役割を果たしていると考えられている（McPherron et al., Nature (London), 387:83-90, (1997) （非特許文献1）; Zimmers et al., Science, 296:1486-1488, (2002) （非特許文献2））。ミオスタチンのアンタゴナイズは、動物において除脂肪筋肉量を増大させることが示されている。
【０００７】
TGF-βタンパク質ファミリーの別のメンバーは、関連する成長分化因子である成長／分化因子11（GDF-11）である。GDF-11は、ミオスタチンのアミノ酸配列に対しておよそ90％の配列同一性を有する。GDF-11は、動物の発生時の軸パターン形成における役割を有しており（Oh et al., Genes Dev., 11:1812-26, (1997) （非特許文献3））、また骨格筋の発生および成長においても役割を果たしていると考えられている。
【０００８】
アクチビンA、BおよびABは、それぞれ、2つのポリペプチド鎖βAおよびβBのホモ2量体およびヘテロ2量体である（Vale et al., Nature, 321:776-779, (1986) （非特許文献4）; Ling et al., Nature, 321:779-782, (1986) （非特許文献5））。アクチビンは、当初、卵胞刺激ホルモン合成の調節に関与する生殖腺ペプチドとして発見され、現在では、多くの生物学的活性の調節に関与していると考えられている。アクチビンAが、アクチビンの優勢型である。
【０００９】
アクチビン、ミオスタチン、GDF-11およびTGF-βスーパーファミリーのその他のメンバーは、どちらも膜貫通型セリン／スレオニンキナーゼであるアクチビンIIA型（ActRIIA）およびアクチビンIIB型（ActRIIB）受容体の組み合わせに結合し、そしてそれらを通じてシグナルを伝達する（Harrison et al., J. Biol. Chem., 279:28036-28044, (2004) （非特許文献6））。架橋研究は、ミオスタチンがインビトロでアクチビンII型受容体ActRIIAおよびActRIIBに結合できることを示した（Lee et al., PNAS USA, 98:9306-11, (2011) （非特許文献7））。GDF-11がActRIIAおよびActRIIBの両方に結合する証拠も存在する（Oh et al., Genes Dev., 16:2749-54, (2002) （非特許文献8））。
【００１０】
ActRIIBポリペプチドは、ActRIIB-Fcという可溶性変種として調製され得る。可溶性ActRIIB-Fcは、ミオスタチン、アクチビンおよびGDF11等の複数のリガンドを隔離することによって筋肉の成長を強く刺激する（Lee SJ, et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 102(50):18117-22, (2005 Dec 13)(Epub. 2005 Dec 5) （非特許文献9））。ミオスタチンを含むこれらのリガンドは、2つの高親和性受容体ActRIIBおよびActRIIAに結合する。これらの2つの受容体は、アミノ酸レベルで約65％の配列相同性を有する2つの別個の膜貫通型受容体タンパク質をコードする2つの異なる遺伝子によってコードされている。細胞膜上でのこれらの2つの受容体のいずれかへのリガンドの結合は、Smad 2/3をリン酸化し、その結果として細胞内での下流の転写変化を活性化することが示されている（Lee SJ, et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 102(50):18117-22, (2005 Dec 13)(Epub. 2005 Dec 5) （非特許文献9））。骨格筋細胞は、これらの受容体を両方とも発現する。例えばアンタゴニスト性デュアル受容体抗体を使用するアクチビン受容体の妨害は、アクチビンシグナル伝達経路をブロックすることによって生理学的効果をもたらし得る。
【００１１】
本発明は、少なくともアクチビン活性をブロックし、それによって骨格筋の成長を刺激することができる生物学的に活性な治療剤を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】McPherron et al., Nature (London), 387:83-90, (1997)
【非特許文献２】Zimmers et al., Science, 296:1486-1488, (2002)
【非特許文献３】Oh et al., Genes Dev., 11:1812-26, (1997)
【非特許文献４】Vale et al., Nature, 321:776-779, (1986)
【非特許文献５】Ling et al., Nature, 321:779-782, (1986)
【非特許文献６】Harrison et al., J. Biol. Chem., 279:28036-28044, (2004)
【非特許文献７】Lee et al., PNAS USA, 98:9306-11, (2011)
【非特許文献８】Oh et al., Genes Dev., 16:2749-54, (2002)
【非特許文献９】Lee SJ, et al., Proc Natl Acad Sci U S A., 102(50):18117-22, (2005 Dec 13)(Epub. 2005 Dec 5)
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、ActRII受容体に結合するアンタゴニスト性デュアルアクチビン受容体抗原結合タンパク質およびそのフラグメントに関する。様々な態様において、抗原結合タンパク質は抗体である。抗体は、ActRIIAおよびActRIIBに結合することができる。例えば骨格筋の成長の刺激のための、本明細書に記載される抗原結合タンパク質の使用が提供される。
【００１４】
様々な態様において、2つのアクチビン受容体に結合する単離された抗原結合タンパク質が提供される。抗原結合タンパク質は、2つのアクチビン受容体に同時に結合することができる。単離された抗原結合タンパク質は、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合する。あるいは、単離された抗原結合タンパク質は、SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:17に特異的に結合する。様々な局面において、抗原結合タンパク質は、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18またはSEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:17に結合したとき、筋肉の成長を刺激する。他の局面において、抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである。それはマウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体またはマウス抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントであり得る。
【００１５】
様々な態様において、SEQ ID NO:15およびSEQ ID NO:16を含む単離された抗原結合タンパク質が提供される。様々な局面において、単離された抗原結合タンパク質は、SEQ ID NO:15および16に対して97％の同一性を有し得る。単離された抗原結合タンパク質は、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に結合することができる。様々な局面において、抗原結合タンパク質は、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に結合したとき、筋肉の成長を刺激する。他の局面において、抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである。抗体はマウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体またはマウス抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントであり得る。
【００１６】
様々な態様において、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8を含む単離された抗原結合タンパク質が提供される。単離された抗原結合タンパク質は、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合することができる。抗原結合タンパク質は、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18の両方に結合したとき、筋肉の成長を刺激することができる。他の局面において、抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである。抗体はマウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体またはマウス抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントであり得る。
【００１７】
様々な態様において、単離された抗原結合タンパク質は、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5を含む。単離された抗原結合タンパク質は、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に結合することができる。様々な局面において、抗原結合タンパク質は、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に結合したとき、筋肉の成長を刺激する。他の局面において、抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである。抗体はマウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体またはマウス抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントであり得る。
【００１８】
様々な態様において、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8を含む単離された抗原結合タンパク質が提供される。単離された抗原結合タンパク質は、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に結合することができる。様々な局面において、抗原結合タンパク質は、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18の両方に結合したとき、筋肉の成長を刺激する。他の局面において、抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである。抗体はマウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体またはマウス抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントであり得る。
【００１９】
様々な態様において、抗原結合タンパク質のいずれかをコードする単離された核酸が提供される。核酸を含む発現ベクターおよび宿主細胞も提供される。宿主細胞は、真核生物細胞または原核生物細胞であり得る。真核生物細胞は、哺乳動物細胞であり得る。
【００２０】
様々な態様において、少なくともSEQ ID NO:3〜5またはSEQ ID NO:4〜6を含む単離された抗原結合タンパク質が提供される。様々な局面において、抗原結合タンパク質を製造する方法は、核酸を発現させ抗体を産生させるのに適した条件下で宿主細胞を培養する工程を含む。抗体は、宿主細胞の培養物から回収され得る。
【００２１】
様々な態様において、抗原結合タンパク質および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物が提供される。
【００２２】
他の態様において、ミオスタチン、アクチビンAまたはGDF-11活性を減少させるまたはブロックする方法であって、そのような処置を必要とする対象に、治療有効量の抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質を含む薬学的組成物を投与する工程を含む方法、が提供される。
【００２３】
さらに他の態様において、そのような処置が必要な対象において除脂肪筋肉量を増大させるかまたは脂肪量に対する除脂肪筋肉量の比を増大させる方法であって、有効量の抗原結合タンパク質または抗原結合タンパク質を含む薬学的組成物を投与する工程を含む方法、が提供される。
【００２４】
様々な態様において、筋消耗疾患をそのような障害に罹患した対象において処置または予防する方法であって、抗原結合タンパク質を含む有効量の治療組成物を対象に投与する工程を含む方法、が提供される。筋消耗疾患は、癌性悪液質、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、うっ血性閉塞性肺疾患、慢性心不全、化学性悪液質（chemical cachexia）、HIV/AIDSに起因する悪液質、腎不全、尿毒症、関節リウマチ、加齢に伴うサルコペニア、加齢に伴う虚弱（age-related frailty）、臓器萎縮（organ atrophy）、手根管症候群、アンドロゲン欠乏、または長時間の床上安静、脊髄損傷、発作、骨折、火傷、加齢もしくはインスリン抵抗性による不活動性に起因する筋消耗を含み得る。
【００２５】
様々な態様において、BIAcoreアッセイにおいてActRIIBに対して10 pMまたはそれ未満のKDを有する単離された抗原結合タンパク質が提供される。他の局面において、抗原結合タンパク質は、ActRIIBに対して1 pMまたはそれ未満のKDを有し得る。さらに他の局面において、単離された抗原結合タンパク質は、BIAcoreアッセイにおいてActRIIAに対して4 nMまたはそれ未満のKDを有する。抗原結合タンパク質はまた、ActRIIAに対して1 pMまたはそれ未満のKDを有し得る。
【００２６】
他の局面において、抗原結合タンパク質は、BIAcoreアッセイにおいてActRIIBおよびActRIIAの両方に対して1 pMまたはそれ未満のKDを有し得る。
【００２７】
様々な態様において、細胞ベースのアッセイにおいてActRIIBに対して8 nmまたはそれ未満のIC50を有する単離された抗原結合タンパク質が提供される。他の局面において、抗原結合タンパク質は、ActRIIBに対して2 nMまたはそれ未満のC50を有し得る。さらに他の局面において、単離された抗原結合タンパク質は、細胞ベースのアッセイにおいてActRIIAに対して2 nMまたはそれ未満のIC50を有し得る。抗原結合タンパク質はまた、ActRIIAに対して1 nMまたはそれ未満のIC50を有し得る。抗原結合タンパク質は、細胞ベースのアッセイにおいてActRIIBに対して2 nMまたはそれ未満のIC50およびActRIIAに対して1 nMまたはそれ未満のIC50を有し得る。
【００２８】
様々な態様において、抗原結合タンパク質は、アンタゴニスト性デュアル受容体抗体である。デュアル受容体抗体は、ヒト抗体であり得る。
【００２９】
様々な態様において、ミオスタチン、アクチビンAまたはGDF-11活性を減少させるまたはブロックする方法であって、そのような処置を必要とする対象に、デュアル受容体抗原結合タンパク質もしくはポリペプチドまたはこれらを含む薬学的組成物を投与する工程を含む方法、が提供される。抗原結合タンパク質は、アンタゴニスト性デュアル受容体抗体であり得る。抗体は、ActRIIBおよびActRIIAに対するものであり得る。
【００３０】
別の局面において、そのような処置が必要な対象において除脂肪筋肉量を増大させるまたは脂肪量に対する除脂肪筋肉量の比を増大させる方法であって、デュアル受容体抗原結合タンパク質またはポリペプチドを含む有効量の組成物または薬学的組成物を対象に投与する工程を含む方法、が提供される。抗原結合タンパク質は、アンタゴニスト性デュアル受容体抗体であり得る。抗体は、ActRIIBおよびActRIIAに対するものであり得る。
【００３１】
別の局面において、筋消耗疾患をそのような障害に罹患した対象において処置または予防する方法であって、デュアル受容体抗原結合タンパク質またはポリペプチドを含む治療組成物を対象に投与する工程を含む方法、が提供される。抗原結合タンパク質は、アンタゴニスト性デュアル受容体抗体であり得る。抗体は、ActRIIBおよびActRIIAに対するものであり得る。筋消耗疾患は、以下の状態：癌性悪液質、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、うっ血性閉塞性肺疾患、慢性心不全、化学性悪液質、HIV/AIDSに起因する悪液質、腎不全、尿毒症、関節リウマチ、加齢に伴うサルコペニア、加齢に伴う虚弱、臓器萎縮、手根管症候群、アンドロゲン欠乏、ならびに長時間の床上安静、脊髄損傷、発作、骨折、火傷、加齢、インスリン抵抗性およびその他の障害による不活動性に起因する筋消耗を含むがこれらに限定されない。筋消耗はまた、宇宙飛行による無重力に起因し得る。抗原結合タンパク質は、アンタゴニスト性デュアル受容体抗体であり得る。抗体は、ActRIIBおよびActRIIAに対するものであり得る。
【００３２】
別の局面において、アクチビンが過剰発現される状態をそのような処置を必要とする対象において処置する方法であって、デュアルアクチビン受容体抗原結合タンパク質またはポリペプチドを含む有効量の治療組成物を対象に投与する工程を含む方法、が提供される。1つの態様において、疾患は癌である。別の局面において、本発明は、代謝障害を処置する方法であって、そのような処置を必要とする対象に、抗原結合タンパク質またはポリペプチドを含む治療組成物を投与する工程を含み、代謝障害が骨量減少、糖尿病、肥満、耐糖能異常、高血糖および代謝症候群から選択される方法、が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図1は、抗体M43（SEQ ID NO:3〜8）およびR31-1（SEQ ID NO:9〜14）のHCおよびLCのCDRアミノ酸配列を示す。
【図２Ａ】図2Aは、M43 HC（SEQ ID NO:15）およびLC（SEQ ID NO:16）のアミノ酸配列を示す。太文字は、CDR領域を表す。下線付き文字は、R31-1に対するアミノ酸の違いを表す。
【図２Ｂ】図2Bは、M43 HC（SEQ ID NO:21）およびM43 LC（SEQ ID NO:22）の核酸配列を示す。
【図２Ｃ】図2Cは、本願のさらなる抗体の配列を提供する。太文字は、CDR領域を表す。下線付き文字は、R31-1に対するアミノ酸の違いを表す。
【図２Ｄ】図2Dは、ActRIIB（SEQ ID NO:2および20）ならびにActRIIB-huFc（SEQ ID NO:1および24）のアミノ酸および核酸配列を提供する。
【図３】図3は、細胞ベースのアッセイにおけるM43のアゴニスト活性の欠如を示す。
【図４】図4A〜4Cは、体重（図4A）、除脂肪量（図4B）および骨格筋量（図4C）に対するM43の用量依存的な効果を示す。
【図５】図5A〜5Dは、体重、体組成および筋肉量に対するM43の効果を示す。8週齢のオスのインヒビン-アルファKOマウス（n=7/グループ）を、2週間、M43またはsActRIIBのいずれかの単回注射（30 mg/kg、SC）で処置した。
【図６】図6A〜Bは、体重および除脂肪体重量に対するM43の効果を示す。8週齢のオスのCD1ヌードマウス；投与量：10 mg/kg/週、S.C. n=8/グループ。
【図７Ａ】図7Aは、親抗体のhuActRIIBおよびhuActRIIA結合の比較を示す。
【図７Ｂ】図7Bは、1つめの変異抗体のhuActRIIBおよびhuActRIIA結合の比較を示す。
【図７Ｃ】図7Cは、2つめの変異抗体のhuActRIIBおよびhuActRIIA結合の比較を示す。
【図７Ｄ】図7Dは、3つめの変異抗体のhuActRIIBおよびhuActRIIA結合の比較を示す。
【図７Ｅ】図7Eは、4つめの変異抗体のhuActRIIBおよびhuActRIIA結合の比較を示す。
【図７Ｆ】図7Fは、5つめの変異抗体のhuActRIIBおよびhuActRIIA結合の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
詳細な説明
ActRII受容体に結合するデュアル受容体アンタゴニスト性抗原結合タンパク質（例えば、抗体およびその機能的結合フラグメント）が、本明細書に開示されている。いくつかの態様において、ActRII受容体は、ActRIIAおよびActRIIB受容体である。抗原結合タンパク質は、アクチビン受容体に結合し、アクチビン受容体が機能するのを様々な面で妨げる。例えば、デュアル受容体結合タンパク質は、アクチビン受容体に結合し、受容体に対するアクチビンの結合を妨げ、そして生理学的効果を発揮し得る、例えば骨格筋の成長を刺激し得る。
【００３５】
上記の概要は本発明のあらゆる局面または態様を定義することを意図したものではなく、さらなる局面は他の節で説明され得る。本願全体が一体をなす開示として関連することが意図されており、本明細書に記載される特徴のすべての組み合わせが、たとえその特徴の組み合わせが本願の同一の文または段落または節の中で同時に見られない場合であっても、想定され得る、ということを理解されたい。
【００３６】
上記に加え、さらなる局面として、本明細書の特定の段落によって定義されるバリエーションよりも何らかのかたちで範囲が狭くなったすべての態様が、本開示に包含され得る。例えば、特定の局面が属（genus）として記載され、そしてその属のあらゆるメンバーが個々に1つの態様となり得ることを理解されたい。また、属として記載される局面または属のメンバーの選択は、その属の2つまたはそれ以上のメンバーの組み合わせを包含することを理解されたい。本明細書における様々な態様は、様々な状況下で、「含む（comprising）」という語を用いて表されているが、関連する態様は、「からなる（consisting of）」または「から本質的になる（consisting essentially of）」という語を用いても表現され得ることを理解されたい。
【００３７】
本明細書の記載は例示および説明にすぎず、特許請求の範囲に記載の発明を制限するものではないことが理解されるであろう。本願において、単数形の使用は、それ以外のことが個別に言及されていない限り、複数を含む。本願において、「または(or)」の使用は、それ以外のことが言及されていない限り、「および／または(and/or)」を意味する。さらに、「含む（including）」および他の形式、例えば「含む（includes）」および「含まれる（included）」の使用は、非限定的である。また、「要素（element）」、「成分（component）」等の用語は、それ以外のことが個別に言及されていない限り、1つのユニットを含む要素および成分ならびに1つより多いサブユニットを含む要素および成分の両方を包含する。また、「部分（portion）」という用語の使用は、部分（moiety）の一部分（part）または部分全体を含み得る。
【００３８】
範囲のある値が記載される場合、記載される特徴は、その範囲内で見出される個々の値であり得ることも理解されたい。例えば、「約pH 4〜約pH 6のpH」は、pH 4、4.2、4.6、5.1、5.5等およびそのような値の間の任意の値であり得るがこれらに限定されない。さらに、「約pH 4〜約pH 6のpH」は、そのpHがpH 4〜pH 6の2 pH単位分変化することを意味すると解釈されるべきでなく、それは、溶液のpHに関する2つのpHの範囲内から選択され得るものである。
【００３９】
いくつかの態様において、「約」という用語が使用される場合、それは、示されている値プラスまたはマイナス示されている値の5％、10％、15％もしくはそれ以上を意味する。意図されている実際のばらつきは、文脈から決定され得る。
【００４０】
本明細書で使用される節の見出しは、編集目的のものにすぎず、記載されている主題を限定するものと解釈されるべきでない。特許、特許出願、記事、書籍および論文を含むがこれらに限定されない、本願において引用されているすべての文書または文書の一部分は、明示的に、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。本願にしたがい利用される場合、以下の用語は、それ以外のことが示されていない限り、以下の意味を有するものと理解されたい。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「TGF-βファミリーメンバー」または「TGF-βタンパク質」という用語は、アクチビンおよび成長分化因子（GDF）タンパク質を含む、形質転換成長因子ファミリーの構造的に関連する成長因子を表す（Kingsley et al., Genes Dev., 8:133-146, (1994); McPherron et al. Growth factors and cytokines in health and disease, Vol. 1B, D. LeRoith and C. Bondy. ed., JAI Press Inc., Greenwich, Conn, USA, pp 357-393）。
【００４２】
ミオスタチンとも称されるGDF-8は、骨格筋組織の負の調節因子である（McPherron et al., PNAS USA, 94:12457-12461, (1997)）。ミオスタチンは、ヒトの場合GenBankアクセッション番号AAB86694を有する、およそ375アミノ酸長の不活性なタンパク質複合体として合成される。この前駆タンパク質は、四塩基プロセシング部位におけるタンパク質分解切断によって活性化され、N末端不活性プレドメインおよび2量体化して約25 kDaのホモ2量体を形成するおよそ109アミノ酸のC末端タンパク質を生じる。このホモ2量体が、成熟した生物学的に活性なタンパク質である（Zimmers et al., Science, 296:1486 (2002)）。
【００４３】
本明細書で使用される場合、GDF-11は、Swissprotアクセッション番号O95390（SEQ ID NO:50）を有するBMP（骨形成タンパク質）ならびにそのタンパク質の変種および種ホモログを表す。GDF-11は、アミノ酸レベルでミオスタチンに対しておよそ90％の同一性を有する。GDF-11は、軸骨格の前方／後方パターン形成の調節に関与する（McPherron, et al., Nature Genet., 22(93): 260-264, (1999); Gamer, et al., Dev. Biol., 208(1):222-232, (1999)）が、生後の機能は知られていない。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「ActRIIAおよびActRIIBポリペプチドの誘導体」という用語は、共有結合性または凝集性のコンジュゲートを形成する少なくとも1つのさらなる化学部分または少なくとも1つのさらなるポリペプチド、例えばグリコシル基、脂質、アセチル基またはC末端もしくはN末端融合ポリペプチドの付加、PEG分子へのコンジュゲートおよび以下で十分に説明されているその他の修飾、を表す。変種ActRIIB受容体ポリペプチド（vActRIIB）はまた、様々な細胞型、例えば哺乳動物細胞、大腸菌（E.coli）、酵母およびその他の組み換え宿主細胞における発現に由来するプロセシングから生じるCおよびN末端の修飾を含むさらなる修飾体および誘導体を含み得る。不活性化されたN-グリコシル化部位、不活性化されたプロテアーゼプロセシング部位または保存的アミノ酸置換を含むvActRIIBポリペプチドフラグメントおよびポリペプチドもさらに含まれる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、抗体または抗原結合フラグメントは、アゴニストまたはアンタゴニストであり得る。
【００４６】
「アゴニスト」は、ポリペプチド（例えば、受容体）またはポリヌクレオチドに結合し、そのポリペプチドまたはポリヌクレオチドを刺激する、増加させる、活性化する、促進する、その活性化を高める、高感度化するまたはその活性もしくは発現を上方調節する作用物質を表す。
【００４７】
「アンタゴニスト」は、ポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの発現を阻害しまたはそれらに結合し、部分的または完全に、そのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの刺激をブロックする、減少させる、妨げる、活性化を遅らせる、不活性化させる、低感度化するまたはその活性を下方調節する作用物質を表す。
【００４８】
「抗原結合タンパク質」（「ABP」）は、特定の標的抗原に結合する任意のタンパク質を表す。本明細書において、特定の標的抗原は、アクチビン受容体またはそのフラグメントもしくは一領域、例えばActRIIA、ActRIIB、ActRIIA-huFcまたはActRIIB-huFcであり得る。「抗原結合タンパク質」は、抗体およびその結合部分、例えば免疫学的に機能的なフラグメントを含むがこれらに限定されない。ペプチボディ（peptibody）は、抗原結合タンパク質の別の例である。
【００４９】
「デュアル受容体抗原結合タンパク質」は、2つの受容体に結合することができるタンパク質を表す。その結合は同時（at the same time）または同時的（simultaneously）であり得、あるいは同時ではなく受容体のいずれかであり得る。「デュアル受容体抗原結合タンパク質」は、2つの受容体に結合する「デュアル受容体アンタゴニスト性抗体」であり得る。受容体はミオスタチン／アクチビン受容体であり得、または受容体はActRIIAおよびActRIIBまたはActRIIA-huFcおよびActRIIB-huFcであり得る。デュアル受容体抗体は、ActRIIBおよびActRIIAの両方のシグナルを並行してブロックし得る。シグナルのブロックは、生理学的応答、例えば骨格筋または骨の成長の刺激、を示し得る。
【００５０】
「ポリヌクレオチド」または「核酸」という用語は、1本鎖および2本鎖の両方のヌクレオチドポリマーを含む。ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾型であり得る。該修飾は、塩基修飾、例えばブロモウリジンおよびイノシン誘導体、リボース修飾、例えば2',3'-ジデオキシリボース、ならびにヌクレオチド間連結修飾、例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホルアニラデート（phosphoraniladate）およびホスホロアミデートを含む。
【００５１】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、200個またはそれより少ないヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを意味する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、約10〜約60塩基長である。他の態様において、オリゴヌクレオチドは、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19または約20〜約40ヌクレオチド長である。オリゴヌクレオチドは、1本鎖または例えば変異遺伝子の構築に使用するために2本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、検出アッセイのために、放射性標識、蛍光標識、ハプテンまたは抗原性標識を含む標識を含み得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、PCRプライマー、クローニングプライマーまたはハイブリダイゼーションプローブとして使用され得る。
【００５２】
「単離された核酸分子」は、単離されたポリヌクレオチドと共に自然界において見出されるポリヌクレオチドのすべてもしくは一部を伴わないまたは自然界においては連結していないポリヌクレオチドに連結されている、ゲノムのDNAもしくはRNA、mRNA、cDNAまたはそれらの合成起源もしくはいくつかの組み合わせを意味する。本開示の目的上、特定のヌクレオチド配列「を含む核酸分子」は、インタクトな染色体を包含しないと理解されたい。特定の核酸配列「を含む」単離された核酸分子は、特定の配列に加えて、最大10個さらには最大20個の他のタンパク質もしくはその一部分のコード配列を含み得、または言及されている核酸配列のコード領域の発現を制御する機能的に連結された調節配列を含み得、および／またはベクター配列を含み得る。
【００５３】
それ以外のことが示されていない限り、本明細書で議論されているあらゆる1本鎖ポリヌクレオチドの左手側末端が5'末端であり、2本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向が5'方向と称される。新生RNA転写物の5'側から3'側への付加の方向は、転写方向と称され、RNA転写物の5'末端の5'側にあるRNA転写物と同一の配列を有するDNA鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され、RNA転写物の3'末端の3'側にあるRNA転写物と同一の配列を有するDNA鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。
【００５４】
単離された核酸は、本明細書の様々な態様に開示される抗原結合タンパク質、例えばデュアル受容体抗原結合タンパク質または抗アクチビンデュアル受容体抗体をコードし得る。核酸は、別の核酸配列との機能的関係の下に配置されているとき、「機能的に連結」されていると言われる。例えば、プレ配列もしくは分泌リーダーのDNAがポリペプチドのDNAに機能的に連結されているのは、それがそのポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合であり、プロモーターもしくはエンハンサーがコード配列に機能的に連結されているのは、それがその配列の転写に影響する場合であり、またはリボソーム結合部位がコード配列に機能的に連結されているのは、それが翻訳を促進するよう配置されている場合である。一般に、「機能的に連結」は、連結されるDNA配列が、相互の近くにあること、および分泌リーダーの場合は連続しておりリーディングフェーズ内にあること、を意味する。しかし、エンハンサーは、連続している必要はない。連結は、適当な制限部位におけるライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、従来的実務にしたがい合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが使用される。
【００５５】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するおよび／または天然に存在しないアミノ酸を表し、当技術分野におけるその通常の意味を含む。
【００５６】
「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、ネイティブタンパク質、すなわち天然に存在する非組み換え細胞によって産生されるタンパク質、のアミノ酸配列を有する高分子を意味し、またはタンパク質は遺伝子操作されたもしくは組み換え細胞によって産生され、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列を有する分子もしくはネイティブ配列の1つもしくは複数のアミノ酸からの欠失、該アミノ酸への付加および／もしくは該アミノ酸の置換を有する分子を含み得る。この用語はまた、1つまたは複数のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸およびポリマーの化学アナログであるアミノ酸ポリマーを含む。詳細には、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、特に、抗原結合タンパク質の1つまたは複数のアミノ酸からの欠失、該アミノ酸への付加および／または該アミノ酸の置換を有するアクチビンデュアル受容体抗原結合タンパク質、抗体または配列を包含する。「ポリペプチドフラグメント」という用語は、その全長ネイティブタンパク質と比較してアミノ末端欠失、カルボキシル末端欠失および／または内部欠失を有するポリペプチドを表す。そのようなフラグメントはまた、そのネイティブタンパク質と比較して修飾されたアミノ酸を含み得る。様々な態様において、フラグメントは、約5〜約500アミノ酸長であり得る。例えば、フラグメントは、少なくとも約5、約6、約8、約10、約14、約20、約50、約70、約100、約150、約200、約250、約300、約350、約400または約450アミノ酸長であり得る。有用なポリペプチドフラグメントは、結合ドメインを含む抗体の免疫学的に機能的なフラグメントを含む。デュアルアクチビン受容体結合抗体の場合、有用なフラグメントは、CDR領域、重鎖および／もしくは軽鎖の可変ドメイン、抗体鎖の一部分または1つ、2つ、3つ、4つ、5つもしくは6つのCDRを含むその可変領域のみ等を含むがこれらに限定されない。
【００５７】
「単離されたタンパク質」という用語は、対象タンパク質が、（1）通常そのタンパク質とともに見られる少なくともいくつかの他のタンパク質を含んでいないこと、（2）同一供給源由来、例えば同一種由来の他のタンパク質を本質的に含んでいないこと、（3）異なる種の細胞によって発現されること、（4）自然界で関連するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物または他の物質の少なくとも約50パーセントから分離されていること、（5）自然界では関連しないポリペプチドと（共有結合的または非共有結合的相互作用によって）機能的に関連づけられていること、または（6）自然界では生じないこと、を意味する。典型的に、「単離されたタンパク質」は、所定のサンプルの少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約25％もしくは少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約90％またはそれ以上を構成する。合成起源のゲノムDNA、cDNA、mRNAもしくはその他のRNAまたはそれらの任意の組み合わせが、そのような単離されたタンパク質をコードし得る。様々な態様において、単離されたタンパク質は、その治療、診断、予防、研究または他の用途と干渉するであろうその自然環境において見られるタンパク質もしくはポリペプチドまたはその他の混在物質を実質的に含まない。
【００５８】
ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質または抗体）の「変種」は、別のポリペプチド配列と比べて1つまたは複数のアミノ酸残基がそのアミノ酸配列に挿入されている、そのアミノ酸配列から欠失しているおよび／またはそのアミノ酸配列で置換されているアミノ酸配列を含む。変種は融合タンパク質を含む。
【００５９】
本明細書で使用される場合、20個の従来的な（例えば、天然に存在する）アミノ酸およびそれらの略称は、従来的な用法にしたがう。あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる、Immunology - A Synthesis (2nd Ed., E.S. Golub & D.R. Gren, Eds., Sinauer Assoc., Sunderland, Mass. (1991))を参照のこと。20個の従来的なアミノ酸の立体異性体（例えば、D-アミノ酸）、非天然アミノ酸、例えばα-,α-二置換アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸およびその他の非従来的なアミノ酸もまた、本明細書に記載される様々な態様のポリペプチドに適した成分であり得る。非従来的なアミノ酸の例は、4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、ε-N,N,N-トリメチルリジン、ε-N-アセチルリジン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリジン、σ-N-メチルアルギニンおよびその他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、4-ヒドロキシプロリン）を含む。本明細書で使用されるポリペプチドの表記法では、標準的な用法および慣習にしたがい、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
【００６０】
保存的アミノ酸置換は、天然に存在しないアミノ酸残基を含み得、これらは典型的には生物学的システムにおける合成による以外の化学ペプチド合成によって組み込まれる。これらはペプチド模倣体およびその他のアミノ酸部分の逆方向または逆位形態を含む。
【００６１】
天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づきクラス分けされ得る：
疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
酸性：Asp、Glu；
塩基性：His、Lys、Arg；
鎖の向きに影響する残基：Gly、Pro；および
芳香族：Trp、Tyr、Phe。
【００６２】
例えば、非保存的置換は、これらのクラスの1つのメンバーと別のクラスのメンバーとの交換を含み得る。そのような置換残基は、例えば非ヒト抗体と相同なヒト抗体の領域にまたはその分子の非相同領域に導入され得る。
【００６３】
特定の態様にしたがい抗原結合タンパク質（例えば、抗体）に変更を加える際、アミノ酸のヒドロパシー指数（hydropathic index）が考慮され得る。各アミノ酸は、その疎水性および電荷の特徴に基づきヒドロパシー指数を割り当てられている。それらは、イソロイシン（+4.5）、バリン（+4.2）、ロイシン（+3.8）、フェニルアラニン（+2.8）、システイン／シスチン（+2.5）、メチオニン（+1.9）、アラニン（+1.8）、グリシン（-0.4）、スレオニン（-0.7）、セリン（-0.8）、トリプトファン（-0.9）、チロシン（-1.3）、プロリン（-1.6）、ヒスチジン（-3.2）、グルタメート（-3.5）、グルタミン（-3.5）、アスパルテート（-3.5）、アスパラギン（-3.5）、リジン（-3.9）およびアルギニン（-4.5）である。
【００６４】
タンパク質に双方向的な生物学的機能を付与する上でのヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野で理解されている。Kyte, et al., J. Mol. Biol., 157:105-131, (1982)。特定のアミノ酸は類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸と置換され得、それでもなお類似の生物学的活性を保持することが知られている。ヒドロパシー指数に基づき変更を加える際、特定の態様において、そのヒドロパシー指数が±2以内であるアミノ酸の置換が含まれる。特定の態様において、±1以内であるそれらが含まれ、そして特定の態様において、±0.5以内のそれらが含まれる。
【００６５】
特にそれによって生成される生物学的に機能的なタンパク質またはペプチドが免疫学的態様において使用されることが意図されている場合に、同等のアミノ酸の置換が親水性に基づいて効果的に行われ得ることも当技術分野で理解されている。特定の態様において、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大局所平均親水性（greatest local average hydrophilicity）が、その免疫原性および抗原性、すなわちそのタンパク質の生物学的特性と相関する。
【００６６】
以下の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（+3.0）、リジン（+3.0）、アスパルテート（+3.0±1）、グルタメート（+3.0±1）、セリン（+0.3）、アスパラギン（+0.2）、グルタミン（+0.2）、グリシン（0）、スレオニン（-0.4）、プロリン（-0.5±1）、アラニン（-0.5）、ヒスチジン（-0.5）、システイン（-1.0）、メチオニン（-1.3）、バリン（-1.5）、ロイシン（-1.8）、イソロイシン（-1.8）、チロシン（-2.3）、フェニルアラニン（-2.5）およびトリプトファン（-3.4）。類似の親水性値に基づき変更を行う際、特定の態様において、その親水性値が±2以内であるアミノ酸の置換が含まれ、特定の態様において、±1以内であるそれらが含まれ、そして特定の態様において、±0.5以内のそれらが含まれる。当業者は、親水性に基づき、一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。これらの領域は、「エピトープコア領域」とも称される。
【００６７】
例示的なアミノ酸置換が表1に示されている。
【００６８】
（表１）アミノ酸置換
2015525230.tif 000003
【００６９】
「誘導体」という用語は、アミノ酸（または核酸）の挿入、欠失または置換以外の化学修飾を含む分子を表す。特定の態様において、誘導体は、ポリマー、脂質またはその他の有機もしくは無機部分との化学結合を含むがこれらに限定されない共有結合修飾を含む。特定の態様において、化学修飾された抗原結合タンパク質は、化学修飾されていない抗原結合タンパク質よりも大きな循環半減期を有し得る。特定の態様において、化学修飾された抗原結合タンパク質は、所望の細胞、組織および／または臓器に対して改善された標的化能力を有し得る。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質誘導体は、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールを含むがこれらに限定されない1つまたは複数の水溶性ポリマー付加物を含むよう共有結合修飾される。例えば、米国特許第4,640,835号、同第4,496,689号、同第4,301,144号、同第4,670,417号、同第4,791,192号および同第4,179,337号を参照のこと。特定の態様において、抗原結合タンパク質誘導体は、モノメトキシ-ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースまたはその他の炭水化物ベースのポリマー、ポリ-(N-ビニルピロリドン)-ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコールならびにそのようなポリマーの混合物を含むがこれらに限定されない1つまたは複数のポリマーを含む。
【００７０】
特定の態様において、誘導体は、ポリエチレングリコール（PEG）サブユニットで共有結合修飾される。特定の態様において、1つまたは複数の水溶性ポリマーが、誘導体の1つまたは複数の特定位置、例えばアミノ末端に結合される。特定の態様において、1つまたは複数の水溶性ポリマーは、誘導体の1つまたは複数の側鎖に無作為に付加される。特定の態様において、PEGは、抗原結合タンパク質の治療能力を改善するために使用される。特定の態様において、PEGは、ヒト化抗体の治療能力を改善するために使用される。特定のそのような方法は、例えば、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,133,426号で議論されている。
【００７１】
ペプチドアナログは、製薬業界において、テンプレートペプチドと類似の特性を有する非ペプチド薬として広く使用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体（peptide mimetics）」または「ペプチド模倣体(peptidomimetics）」と呼ばれる。あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられるFauchere, J., Adv. Drug Res., 15:29, (1986); Veber & Freidinger, TINS, p.392, (1985);およびEvans et al., J. Med. Chem., 30:1229, (1987)。そのような化合物は、しばしば、コンピュータ分子モデリングの下で開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣体は、類似の治療または予防効果を提供するために使用され得る。一般に、ペプチド模倣体は、パラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理学的活性を有するポリペプチド）、例えばヒト抗体と構造的に類似するが、1つまたは複数のペプチド連結が、任意で、当技術分野で周知の方法により、--CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH=CH--（シスおよびトランス）、--COCH2--、--CH(OH)CH2--ならびに--CH2SO--から選択される少なくとも1つの連結によって置換されているものである。特定の態様において、より安定なペプチドを生成するために、コンセンサス配列の1つまたは複数のアミノ酸から同一タイプのD-アミノ酸への置換（例えば、L-リジンに代えてD-リジン）が使用され得る。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列変種を含む拘束されたペプチド（constrained peptide）が、当技術分野で公知の方法（あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられるRizo & Gierasch, Ann. Rev. Biochem., 61:387, (1992)）によって、例えば、ペプチドを環化する分子間ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって、生成され得る。
【００７２】
本明細書を通して生物学的物質、例えばポリペプチド、核酸、宿主細胞等との関連で使用される場合、「天然に存在する」という用語は、自然界で見られる物質または自然界で見られる物質の形態を表す。
【００７３】
2つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列との関係で言う「同一」またはパーセント「同一性」という用語は、BLASTもしくはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを以下に記載される既定パラメータで用いてまたは手作業によるアラインメントおよび目視検査も通じて測定した場合に、2つまたはそれ以上の配列または部分配列が同一であることまたは同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを特定比率有すること（すなわち、比較ウィンドウまたは指定領域内で最大一致となるよう比較およびアラインメントを行った場合の、指定領域における約60％の同一性、約65％、約70％、約75％、約80％、約85％、約90％、約91％、約92％、約93％、約94％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％またはそれより高い同一性）を表す（例えば、NCBIウェブサイトhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST等を参照のこと）。そのような配列は、以降、「実質的に同一」と言われる。この定義はまた、試験配列の相補鎖を表すまたはそれに適用され得る。この定義はまた、欠失および／または付加を有する配列ならびに置換を有するそれらを含む。本明細書に記載される場合、アルゴリズムは、ギャップ等を考慮し得る。様々な態様において、同一性は、少なくとも約25アミノ酸、約50アミノ酸もしくはヌクレオチド長の領域にまたがってまたは50〜100アミノ酸もしくはヌクレオチド長の領域にまたがって存在する。
【００７４】
配列比較のために、典型的に1つの配列が、試験配列と比較する参照配列として扱われる。配列比較アルゴリズムが使用される場合、試験および参照配列がコンピュータに入力され、必要な場合、部分配列の座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメータが指定される。既定のプログラムパラメータが使用され得、または代替のパラメータが指定され得る。配列比較アルゴリズムは、次いで、プログラムのパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【００７５】
「比較ウィンドウ」は、望まれる連続位置数の任意の一つのセグメントの参照を含む。いくつかの態様において、「比較ウィンドウ」は、必要に応じて、約50〜約200、または約100〜約150、または150超からなる群より選択され得、その中で2つの配列の最適なアラインメントが行われた後に配列が同じ連続位置数の参照配列と比較され得る。比較のための配列のアラインメント方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482, (1981)のローカルホモロジーアルゴリズムによって、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol,. 48:443, (1970)のホモロジーアラインメントアルゴリズムによって、Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 85:2444, (1998)の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実施によって（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA）、または手作業によるアラインメントおよび目視検査によって（例えば、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995付録)を参照のこと）行われ得る。
【００７６】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するのに適したアルゴリズムの例は、Altschul et al., Nuc. Acids Res., 25:3389-3402, (1997)およびAltschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410, (1990)に記載される、それぞれ、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。BLASTおよびBLAST 2.0は、様々な態様の核酸およびタンパク質のパーセント配列同一性を決定するために、本明細書に記載されるパラメータで使用される。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて公開されている。このアルゴリズムでは、最初に、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントさせたときに一致するかまたは一定の正の値のしきいスコアTを充足するかのいずれかである、クエリー配列中の長さWの短いワードを同定することによって、高スコア配列対（HSP）を同定する。Tは、近傍ワードスコアしきい値（neighborhood word score threshold）（Altschul et al., 前記）と称される。これらの最初の近傍ワードヒットが、それらを含むより長いHSPを発見するための検索を開始するシードとして扱われる。このワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列の場合、パラメータM（一致する残基の対に対するリワードスコア；常に＞0）およびN（不一致残基に対するペナルティースコア；常に＜0）を用いて計算される。アミノ酸配列の場合、スコア行列が累積スコアの計算に使用される。各方向へのワードヒットの拡張は、累積アラインメントスコアがその最大到達値から量X低下したとき、累積スコアが1つもしくは複数の負スコアの残基のアラインメントの蓄積によりゼロもしくはそれ未満になったとき、またはいずれかの配列の末端に到達したとき、に停止される。BLASTアルゴリズムパラメータW、TおよびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、既定値として、ワード長（W）11、期待値（E）10、M=5、N=-4および両鎖比較を用いる。アミノ酸配列に関して、BLASTPプログラムは、既定値として、ワード長3および期待値（E）10ならびにBLOSUM62スコア行列（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915, (1989)を参照のこと）アラインメント（B)50、期待値（E）10、M=5、N=-4、ならびに両鎖比較を使用する。
【００７７】
「制御配列」という用語は、それにライゲートされたコード配列の発現およびプロセシングに影響し得るポリヌクレオチド配列を表す。そのような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の態様において、原核生物の制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含み得る。例えば、真核生物の制御配列は、1つまたは複数の転写因子認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列および転写終結配列を含み得る。「制御配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含み得る。
【００７８】
「ベクター」という用語は、タンパク質コード情報を宿主細胞に導入するために使用される任意の分子または実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージまたはウイルス）を意味する。
【００７９】
「発現ベクター」または「発現コンストラクト」という用語は、宿主細胞の形質転換に適しており、かつそれに機能的に連結された1つまたは複数の異種コード領域の発現を（宿主細胞と連動して）指示および／または制御する核酸配列を含むベクターを意味する。発現コンストラクトは、それに機能的に連結されたコード領域の転写、翻訳に影響し、それらを制御し、そしてイントロンが存在する場合はそのRNAスプライシングに影響する配列を含み得るがこれらに限定されない。本明細書に記載される様々な態様において有用な発現ベクターは、発現させるDNA配列またはフラグメントに機能的に連結された少なくとも1つの発現制御配列を含み得る。制御配列は、クローン化されたDNA配列の発現を制御および調節するためにベクターに挿入される。有用な発現制御配列の例は、lacシステム、trpシステム、tacシステム、trcシステム、ファージラムダの主要オペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、酵母の解糖系プロモーター、例えば3-ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター、例えばPho5、酵母アルファ-接合因子のプロモーター、ならびにポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルスおよびシミアンウイルス由来のプロモーター、例えば初期および後期プロモーターまたはSV40、ならびに原核生物細胞もしくは真核生物細胞およびそれらのウイルスまたはそれらの組み合わせの遺伝子の発現を制御することが知られているその他の配列である。
【００８０】
「宿主細胞」という用語は、核酸配列で形質転換されたまたは形質転換されることができ、それによって関心対象の遺伝子を発現する細胞を意味する。この用語は、関心対象の遺伝子が存在する限り、そのもととなった親細胞と形態学的にまたは遺伝子構造的に同一であるかどうかによらず、親細胞の子孫を含む。
【００８１】
「トランスフェクション」という用語は、細胞による外来または外因的DNAの取り込みを意味し、細胞は、外因的DNAが細胞膜の内側に導入された場合に「トランスフェクト」されたことになる。多くのトランスフェクション技術が当技術分野で周知であり、かつ本明細書に開示されている。例えば、Graham et al., 1973, Virology 52:456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 前記; Davis et al., 1986, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier; Chu et al., 1981, Gene 13: 197を参照のこと。そのような技術が、1つまたは複数の外因的DNA部分を適切な宿主細胞に導入するために使用され得る。トランスフェクションは、一過的なものであり得る。
【００８２】
「形質転換」という用語は、細胞の遺伝的特徴の変更を表し、細胞は、新しいDNAまたはRNAを含むよう改変された場合に形質転換されたことになる。例えば、細胞は、トランスフェクション、形質導入またはその他の技術を通じて新しい遺伝子物質を導入することによってそのネイティブ状態から遺伝的に改変されるよう形質転換される。トランスフェクションまたは形質導入の後、形質転換DNAは、細胞の染色体に物理的に統合することによって細胞のそれと組み換わり得る、または複製されないエピソーム要素として一過的に維持され得る、またはプラスミドとして独立して複製し得る。細胞は、形質転換DNAが細胞の分裂と共に複製される場合に「安定的に形質転換」されたとみなされる。
【００８３】
本明細書で使用される場合、抗体または免疫グロブリン鎖（重もしくは軽鎖）抗原結合タンパク質の「免疫学的に機能的なフラグメント」（または単に「フラグメント」）という用語は、全長鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠いているが依然として抗原に対して特異的に結合することができる抗体の一部分（その一部分が取得されたものか合成されたものかによらず）を含む抗原結合タンパク質の一種である。
【００８４】
「特異的結合」は、抗原結合タンパク質によって結合される主な抗原が、その抗原結合タンパク質を誘起したアクチビン受容体、例えばActRIIA（SEQ ID NO:1）およびActRIIB（SEQ ID NO:2）であることを意味するものと理解されるべきである。しかし、このことは必ずしも、アクチビン受容体以外のタンパク質に対する抗原結合タンパク質の結合を排除するものではない。様々な態様において、他のタンパク質に対する結合は、結合するタンパク質全体の約5％未満、約10％未満、約15％未満、約20％未満または約25％未満存在する。
【００８５】
抗原結合タンパク質のフラグメントは、それらが標的抗原に結合し、所定のエピトープまたは抗原に対する結合に関してインタクトな抗体を含む他の抗原結合タンパク質と競合し得る場合、生物学的に活性である。いくつかの態様において、フラグメントは、中和性フラグメントである。いくつかの態様において、フラグメントは、アクチビンとその受容体の間の相互作用をブロックするまたはその可能性を減少させ得る。1つの局面において、そのようなフラグメントは、全長の軽または重鎖に存在する少なくとも1つのCDRを保持し、そしていくつかの態様においては単一の重鎖および／もしくは軽鎖またはその一部分を含むであろう。これらの生物学的に活性なフラグメントは、組み換えDNA技術によって作製され得、またはインタクトな抗体を含む抗原結合タンパク質の酵素的もしくは化学的切断によって作製され得る。免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントは、Fab、ダイアボディ（同一鎖上の2つのドメイン間で対形成するには短すぎる短ペプチドリンカーを通じて接続された、軽鎖可変ドメインと同一ペプチド上の重鎖可変ドメイン）、Fab'、F(ab')2、Fv、ドメイン抗体および単鎖抗体を含むがこれらに限定されず、それらはヒト、マウス、ラット、ラクダまたはウサギを含むがこれらに限定されない任意の哺乳動物供給源から得ることができる。本明細書に開示される抗原結合タンパク質の機能的部分、例えば1つまたは複数のCDRが、体内の特定の標的に対する、二重機能的な治療特性を保持するまたは延長された血清半減期を有する治療剤を作製するために第2のタンパク質または低分子に共有結合により結合され得ることもさらに想定されている。当業者に理解されているように、抗原結合タンパク質は、非タンパク質成分を含み得る。
【００８６】
本明細書に記載される特定の抗原結合タンパク質は、抗体であるまたは抗体から得られる。特定の態様において、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、それぞれ、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書で「抗体模倣体」と称されることもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（本明細書で「抗体コンジュゲート」と称されることもある）およびそれらのフラグメントを含むがこれらに限定されない、抗体に基づくものである。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、アビマー（avimer）（強固に結合するペプチド）を含むまたはアビマーからなる。
【００８７】
「Fc」領域は、抗体のCH1およびCH2ドメインを含む2つの重鎖フラグメントを含む。2つの重鎖フラグメントは、2つまたはそれ以上のジスルフィド結合によっておよびCH3ドメインの疎水性相互作用によってひとまとめに保持されている。
【００８８】
「Fabフラグメント」は、1つの軽鎖ならびに1つの重鎖のCH1および可変領域を含む。Fab分子の重鎖は、別の重鎖分子とジスルフィド結合を形成することができない。
【００８９】
「Fab'フラグメント」は、1つの軽鎖ならびにVHドメインおよびCH1ドメインさらにはCH1ドメインとCH2ドメインの間の領域も含む1つの重鎖の一部分を含み、2つのFab'フラグメントの2つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合を形成しF(ab')2分子を形成することができるものである。
【００９０】
「F(ab')2フラグメント」は、2つの軽鎖およびCH1ドメインとCH2ドメインの間の定常領域の一部分を含む2つの重鎖を含み、2つの重鎖間で鎖間ジスルフィド結合が形成されるものである。したがってF(ab')2フラグメントは、2つの重鎖間のジスルフィド結合によってひとまとめに保持されている2つのFab'フラグメントから構成される。
【００９１】
「Fv領域」は、重鎖および軽鎖の両方由来の可変領域を含むが、定常領域を欠いているものである。
【００９２】
「単鎖抗体」は、重および軽鎖の可変領域が単一のポリペプチド鎖を形成するようフレキシブルリンカーによって接続されており、それによって抗原結合領域を形成しているFv分子である。単鎖抗体は、国際特許出願公開第WO 88/01649号ならびに米国特許第4,946,778号および同第5,260,203号で詳細に議論されており、それらの開示が参照により組入られる。
【００９３】
「ドメイン抗体」は、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含む免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントである。いくつかの例において、2つまたはそれ以上のVH領域が、ペプチドリンカーを用いて共有結合により連結され、2価ドメイン抗体が作製される。2価ドメイン抗体の2つのVH領域は、同一または異なる抗原を標的化し得る。
【００９４】
「2価抗原結合タンパク質」または「2価抗体」は、2つの抗原結合部位を含む。いくつかの例において、2つの結合部位は、同一の抗原特異性を有する。2価抗原結合タンパク質および2価抗体は、本明細書に定義されるように二重特異性であり得る。特定の態様において、「多特異性」または「多機能性」抗体以外の2価抗体は典型的に、その結合部位の各々が同一であるものと理解されている。
【００９５】
「多特異性抗原結合タンパク質」または「多特異性抗体」は、1つより多い抗原またはエピトープを標的化するものである。
【００９６】
「二重特異性（bispecific）」、「デュアル特異性（dual-specific）」または「二重機能性」抗原結合タンパク質または抗体は、2つの異なる抗原結合部位を有する、それぞれ、ハイブリッド抗原結合タンパク質または抗体である。二重特異性抗原結合タンパク質および抗体は、多特異性抗原結合タンパク質抗体の一種であり、ハイブリドーマの融合またはFab'フラグメントの連結を含むがこれらに限定されない様々な方法によって作製され得る。例えば、Songsivilai and Lachmann, 1990, Clin. Exp. Immunol., 79:315-321; Kostelny et al., 1992, J. Immunol., 148:1547-1553を参照のこと。二重特異性抗原結合タンパク質または抗体の2つの結合部位は、同一または異なるタンパク質標的上に存在し得る、2つの異なるエピトープに結合するであろう。
【００９７】
個々の免疫グロブリン鎖は各々、典型的に、いくつかの「免疫グロブリンドメイン」から構成される。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本単位である。ヒトにおいて、IgAおよびIgDアイソタイプは4つの重鎖および4つの軽鎖を含み、IgGおよびIgEアイソタイプは2つの重鎖および2つの軽鎖を含み、そしてIgMアイソタイプは5つの重鎖および5つの軽鎖を含む。重鎖C領域は、典型的に、エフェクター機能を担い得る1つまたは複数のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数は、アイソタイプに依存するであろう。IgG重鎖は、例えば、CH1、CH2およびCH3として公知の3つのC領域ドメインを含む。提供される抗体は、これらのアイソタイプおよびサブタイプのいずれかを有し得る。
【００９８】
「抗原結合領域」は、特定の抗原に特異的に結合するタンパク質またはタンパク質の一部分（例えば、パラトープ）を意味する。例えば、抗原と相互作用し抗原結合タンパク質にその抗原に対する特異性および親和性を付与するアミノ酸残基を含む抗原結合タンパク質の一部分は、「抗原結合領域」と称される。抗原結合領域は、典型的に、1つまたは複数の相補的結合領域（CDR）を含む。特定の抗原結合領域はまた、1つまたは複数の「フレームワーク」領域を含む。「CDR」は、抗原結合の特異性および親和性に寄与するアミノ酸配列である。「フレームワーク」領域は、抗原結合領域と抗原の間の結合を促進するCDRの適切な立体構造の維持を支援し得る。構造的に、フレームワーク領域は、抗体においてCDR間に位置し得る。
【００９９】
特定の局面において、デュアルアクチビン受容体に結合する組み換え抗原結合タンパク質が提供される。これに関連して、「組み換え抗原結合タンパク質」は、組み換え技術を用いて、すなわち本明細書に記載されるような組み換え核酸の発現を通じて作製されるタンパク質である。組み換えタンパク質を作製する方法および技術は、当技術分野で周知である。
【０１００】
「抗体」という用語は、任意のアイソタイプのインタクトな免疫グロブリン、または標的抗原に対する特異的結合に関してインタクトな抗体と競合し得るそのフラグメントを表し、例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒトおよび二重特異性抗体を含む。「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。インタクトな抗体は、一般に、少なくとも2つの全長重鎖および2つの全長軽鎖を含むが、いくつかの例においては、それより短い鎖を含み得る、例えば、ラクダにおいて天然に存在する抗体は重鎖のみを含み得る。抗体は、単一の供給源から単体で入手され得、または「キメラ」であり得る、すなわち、以下にさらに記載されているように抗体の異なる部分が2つの異なる抗体に由来し得る。抗原結合タンパク質、抗体または結合フラグメントは、ハイブリドーマにおいて、組み換えDNA技術によって、またはインタクトな抗体の酵素的もしくは化学的切断によって、作製され得る。それ以外のことが示されていない限り、「抗体」という用語は、2つの全長重鎖および2つの全長軽鎖を含む抗体に加えて、その誘導体、変種、フラグメントおよびムテインを含み、それらの例は以下に記載されている。さらに、明示的に除外されていない限り、抗体は、それぞれ、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書で「抗体模倣体」と称されることもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体融合体（本明細書で「抗体コンジュゲート」と称されることもある）、およびそれらのフラグメントを含む。いくつかの態様において、この用語は、ペプチボディを包含する。
【０１０１】
天然に存在する抗体の構造単位は、典型的に、4量体を含む。そのような4量体は各々、典型的に、各々の対が1つの全長「軽」および1つの全長「重」鎖を有する2つの同一のポリペプチド鎖対から構成される。各鎖のアミノ末端部分は、典型的に、典型的に抗原認識を担う可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的に、エフェクター機能を担い得る定常領域を規定する。各軽／重鎖対の可変領域は、典型的に、抗原結合部位を形成する。
【０１０２】
可変領域は、典型的に、相補性決定領域またはCDRとも呼ばれる3つの超可変領域によって連結された比較的保存されたフレームワーク領域（FR）という同一の一般構造を示す。各対の2つの鎖のCDRは、典型的に、フレームワーク領域によって整列されており、それによって特定のエピトープへの結合が実現し得る。N末端からC末端に向かって、軽および重の両方の鎖の可変領域は、典型的に、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、典型的に、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., (1987および1991)またはChothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917, (1987): Chothia et al., Nature, 342:878-883, (1989)）の定義にしたがう。
【０１０３】
特定の態様において、抗体重鎖は、抗体軽鎖の非存在下で抗原に結合する。特定の態様において、抗体軽鎖は、抗体重鎖の非存在下で抗原に結合する。特定の態様において、抗体結合領域は、抗体軽鎖の非存在下で抗原に結合する。特定の態様において、抗体結合領域は、抗体重鎖の非存在下で抗原に結合する。特定の態様において、個々の可変領域は、他の可変領域の非存在下で抗原に特異的に結合する。
【０１０４】
特定の態様において、CDRの明確な把握および抗体の結合部位を含む残基の同定は、抗体の構造を解析することによっておよび／または抗体-リガンド複合体の構造を解析することによって達成される。特定の態様において、それは、当業者に公知の様々な技術のいずれか、例えばX線結晶学によって達成され得る。特定の態様において、様々な分析方法が、CDR領域の同定または見積もりのために用いられ得る。そのような方法の例は、Kabatの定義、Chothiaの定義、「AbM」の定義および接触の定義（contact definition）を含むがこれらに限定されない。
【０１０５】
Kabatの定義は、抗体の残基の番号付けの標準であり、典型的にはCDR領域を同定するために使用される。例えば、Johnson & Wu, Nucleic Acids Res., 28:214-8, (2000)を参照のこと。Chothiaの定義は、Kabatの定義と似ているが、Chothiaの定義は特定のループ構造領域の位置を考慮する。例えば、Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901-17, (1986); Chothia et al., Nature, 342:877-83, (1989)を参照のこと。「AbM」の定義は、抗体構造をモデル化するOxford Molecular Group製のコンピュータプログラムの統合スイートを使用する。例えば、Martin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 86:9268-9272, (1989); "AbM(商標), A Computer Program for Modeling Variable Regions of Antibodies," Oxford, UK; Oxford Molecular, Ltdを参照のこと。AbMの定義は、知識データベースおよびアブイニシオ（ab initio）法の組み合わせ、例えばSamudrala et al., "Ab Initio Protein Structure Prediction Using a Combined Hierarchical Approach," in PROTEINS, Structure, Function and Genetics, Suppl.3;194-198, (1999)に記載されるもの、を用いて抗体の3次構造を1次配列からモデル化する。接触の定義は、実現可能な複合体結晶構造の分析に基づく。例えば、MacCallum et al., J. Mol. Biol., 5:732-45, (1996)を参照のこと。
【０１０６】
慣習により、重鎖のCDR領域は典型的にH1、H2およびH3と称され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって順に番号付けされる。軽鎖のCDR領域は典型的にL1、L2およびL3と称され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって順に番号付けされる。
【０１０７】
「特異的に結合」という用語は、抗原結合タンパク質が特定の標的または特定の配列に対して優先的に結合することを意味する。「特異的に結合」は、言及されている標的または特定配列以外への結合を排除するものと解釈されるべきではないが、主たる結合活性は特定の標的またはアミノ酸配列に対するものであるべきである。「同時的に結合」は、抗原結合タンパク質が2つの異なる標的、例えば2つの異なるアクチビン受容体に同時に結合できることを意味する。2つの異なるアクチビン受容体は、ActRIIAおよびActRIIBであり得る。抗原結合タンパク質は、アンタゴニスト性デュアル受容体抗体であり得る。デュアル受容体抗体は、2つの受容体に同時的に結合し得、あるいは2つの異なる受容体に個別に特異的に結合し得る。抗体は、ActRIIAホモ2量体、ActRIIBホモ2量体またはActRIIA/ActRIIBヘテロ2量体に結合し得る。受容体への結合によって、抗体は、その／それらの受容体を通じて媒介される生物学的活性を阻害するまたは妨げる。
【０１０８】
「軽鎖」という用語は、全長軽鎖および結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメントを含む。全長軽鎖は、可変領域ドメイン、VLおよび定常領域ドメイン、CLを含む。軽鎖の可変領域ドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にある。軽鎖は、カッパ鎖およびラムダ鎖を含む。
【０１０９】
様々な態様の抗体またはそのフラグメントのアクチビン受容体に対する特異性は、親和性および／または結合力に基づき決定され得る。抗原と抗体の解離の平衡定数（Kd）により表される親和性は、抗原性決定基と抗体結合部位の間の結合強度を示す。結合力は、抗体とその抗原の間の結合の強度の尺度である。結合力は、エピトープと抗体上のその抗原結合部位の間の親和性および特定のエピトープに特異的な抗原結合部位の数を表す抗体の価数の両方に関連する。Kdの値が低いほど、抗原性決定基と抗体結合部位の間の結合強度が強い。
【０１１０】
「重鎖」という用語は、全長重鎖および結合特異性を付与するのに十分な可変領域配列を有するそのフラグメントを含む。全長重鎖は、可変領域ドメイン、VHならびに3つの定常領域ドメイン、CH1、CH2およびCH3を含む。VHドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、CHドメインはカルボキシル末端にあり、CH3がポリペプチドのカルボキシ末端に最も近い。重鎖は、IgG（IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4サブタイプを含む）、IgA（IgA1およびIgA2サブタイプを含む）、IgMならびにIgEを含む任意のアイソタイプのものであり得る。
【０１１１】
二重特異性または二重機能性抗体は、典型的に、2つの異なる重／軽鎖対および2つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはFab'フラグメントの連結を含むがこれらに限定されない様々な方法によって作製され得る。例えば、Songsivilai et al., Clin. Exp. Immunol., 79:315-321 (1990); Kostelny et al., J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)を参照のこと。
【０１１２】
哺乳動物のいくつかの種はまた、単一の重鎖のみを有する抗体を産生し得る。
【０１１３】
個々の免疫グロブリン鎖は各々、典型的に、いくつかの「免疫グロブリンドメイン」から構成される。これらのドメインは、抗体ポリペプチドを構成する基本単位である。重鎖C領域は、典型的に、エフェクター機能を担い得る1つまたは複数のドメインを含む。重鎖定常領域ドメインの数は、アイソタイプに依存するであろう。提供される抗体は、いずれかのアイソタイプおよびサブタイプを有し得る。
【０１１４】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の軽および／または重鎖の一部分を表す。特定の態様において、異なる抗体の可変領域は、同じ種の抗体間でさえも、アミノ酸配列が大きく異なっている。抗体の可変領域は、典型的に、特定の抗体のその標的に対する特異性を決定する。
【０１１５】
「中和抗原結合タンパク質」または「中和抗体」という用語は、リガンドに結合しそのリガンドの結合パートナーに対する結合を妨げるまたは減少させる、それぞれ、抗原結合タンパク質または抗体を表す。これは、例えば、リガンド上の結合部位を直接ブロックすることによってまたはリガンドに結合し間接的手段（例えば、リガンドの構造的もしくはエネルギー的変化）を通じてリガンドの結合能力を変化させることによってなされ得る。いくつかの態様において、この用語はまた、それに結合したタンパク質が生物学的機能を発揮するのを妨げる抗原結合タンパク質を意味し得る。抗原結合タンパク質、例えば抗体または免疫学的に機能的なそのフラグメント、の結合および／または特異性の評価において、抗体またはフラグメントは、過剰な抗体がリガンドに結合した結合パートナーの量を（インビトロ競合結合アッセイによる測定で）少なくとも約1〜20、約20〜30％、約30〜40％、約40〜50％、約50〜60％、約60〜70％、約70〜80％、約80〜85％、約85〜90％、約90〜95％、約95〜97％、約97〜98％、約98〜99％またはそれ以上減少させたときに、その結合パートナーに対するリガンドの結合を実質的に阻害し得ることになる。いくつかの態様において、デュアルアクチビン受容体抗原結合タンパク質の場合、そのような中和性分子は、その受容体に結合するアクチビンの能力を低下させ得る。いくつかの態様において、中和能力は、競合アッセイを通じて特徴づけられるおよび／または説明される。いくつかの態様において、中和能力は、IC50またはEC50値の観点で説明される。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、非中和抗原結合タンパク質であり得る。
【０１１６】
「標的」という用語は、抗原結合タンパク質によって結合され得る分子または分子の一部分を表す。特定の態様において、標的は、1つまたは複数のエピトープを有し得る。特定の態様において、標的は抗原である。「抗原結合タンパク質」のフレーズにおける「抗原」の使用は、単に、そのタンパク質配列が抗体によって結合され得る抗原を含むことを意味する。この文脈で、それは、タンパク質が外来性であることまたはそれが免疫応答を誘導することができることを要しない。
【０１１７】
同じエピトープに関して競合する抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク質または中和抗体）との関連で使用される「競合する」という用語は、試験される抗原結合タンパク質（例えば、抗体または免疫学的に機能的なそのフラグメント）が共通の抗原（例えば、アクチビンまたはそのフラグメント）に対する参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンドまたは参照抗体）の特異的結合を妨げるまたは阻害する（例えば、減少させる）、アッセイによって決定される抗原結合タンパク質間の競合を意味する。1つの抗原結合タンパク質が別の抗原結合タンパク質と競合するかどうかを決定するための多くのタイプの競合結合アッセイ、例えば、固相直接または間接放射免疫アッセイ（RIA）、固相直接または間接酵素免疫アッセイ（EIA）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Stahli, et al., 1983, Methods in Enzymology, 9:242-253を参照のこと）、固相直接ビオチン-アビジンEIA（例えば、Kirkland, et al., 1986, J. Immunol,. 137:3614-3619を参照のこと）固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Harlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pressを参照のこと）、I-125標識を用いる固相直接標識RIA（例えば、Morel, et al., 1988, Molec. Immunol., 25:7-15を参照のこと）、固相直接ビオチン-アビジンEIA（例えば、Cheung, et al., 1990, Virology, 176:546-552を参照のこと）および直接標識RIA（Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol., 32:77-82）が使用され得る。典型的に、そのようなアッセイは、固相表面に結合された精製された抗原またはこれらの未標識の試験抗原結合タンパク質および標識された参照抗原結合タンパク質のいずれかを保有する細胞を使用する。競合的阻害は、試験抗原結合タンパク質の存在下で固相表面または細胞に結合された標識の量を決定することによって測定される。通常、試験抗原結合タンパク質は、過剰に存在させる。競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質（競合性の抗原結合タンパク質）は、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質および立体障害がおきる程度に参照抗原結合タンパク質によって結合されるエピトープに十分近い隣接エピトープに結合する抗原結合タンパク質を含む。競合的結合を決定する方法に関するさらなる詳細は、本明細書の実施例に提供されている。通常、競合性抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、それは共通抗原に対する参照抗原結合タンパク質の特異的結合を少なくとも約40〜45％、約45〜50％、約50〜55％、約55〜60％、約60〜65％、約65〜70％、約70〜75％または約75％以上阻害する（減少させる）であろう。いくつかの例において、結合は、少なくとも約80〜85％、約85〜90％、約90〜95％、約95〜97％または約97％以上阻害される。
【０１１８】
「抗原」という用語は、選択的な結合物質、例えば抗原結合タンパク質（例えば、抗体または免疫学的に機能的なそのフラグメントを含む）によって結合され得る分子または分子の一部分を表す。いくつかの態様において、抗原は、その抗原に結合することができる抗体を生成するために動物において使用され得る。抗原は、異なる抗原結合タンパク質、例えば抗体と相互作用することができる1つまたは複数のエピトープを保有し得る。
【０１１９】
「エピトープ」という用語は、抗原結合タンパク質、例えば抗体によって結合され得るまたはT細胞受容体に結合する任意の決定基を含む。エピトープは、その抗原を標的化する抗原結合タンパク質によって結合される抗原の一領域であり、抗原がタンパク質の場合、抗原結合タンパク質と直接接触する特定のアミノ酸を含む。エピトープはタンパク質上に存在することが最も多いが、いくつかの例においては他の種類の分子、例えば核酸上に存在し得る。エピトープ決定基は、化学的に活性な表面分子群、例えばアミノ酸、糖側鎖、ホスホリルまたはスルホニル基を含み得、かつ特定の3次元構造的特徴および／または特定の電荷的特徴を有し得る。一般に、特定の標的抗原に特異的な抗体は、タンパク質および／または高分子の複雑な混合物中で、その標的抗原上のエピトープを優先的に認識するであろう。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋」は、記載される種の分子が存在している主な種である、すなわち、モルベースで、同じ混合物中の任意の他の個々の種よりも豊富であることを意味する。特定の態様において、実質的に純粋な分子は、対象の種が存在するすべての高分子種の少なくとも約50％（モルベースで）を占める組成物である。他の態様において、実質的に純粋な組成物は、その組成物中の存在するすべての高分子種の少なくとも約80％、約85％、約90％、約95％または約99％を占めるであろう。他の態様において、対象の種は、従来的な検出方法ではその組成物において混入種を検出できずしたがってその組成物が単一の検出可能な高分子種からなっている本質的に均質な程度まで精製される。
【０１２１】
本明細書に使用される場合、「生物学的サンプル」という用語は、生きている物または以前は生きていた物由来の任意の量の物質を含むがこれらに限定されない。そのような生きている／生きていた物は、ヒト、マウス、サル、ラット、ウサギおよびその他の動物を含むがこれらに限定されない。そのような物質は、血液、血清、尿、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リンパ節および皮膚を含むがこれらに限定されない。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「薬剤組成物」（または剤もしくは薬物）という用語は、患者に適切に投与されたときに所望の治療効果を誘導することができる化学化合物、組成物、剤または薬物を表す。それは必ずしも1つより多いタイプの成分を必要としない。
【０１２３】
「治療有効量」および「治療有効用量」という用語は、哺乳動物において治療反応を生ずることが決定されたデュアルアクチビン受容体抗原結合タンパク質の量を表す。そのような治療有効量は、当業者によって確認され得る。正確な用量および製剤は処置の目的に依存するであろうし、それは公知の技術を用いて当業者により確認され得るであろう（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992); Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999); Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Gennaro, Editor (2003)およびPickar, Dosage Calculations (1999)を参照のこと）。
【０１２４】
「薬学的に許容される塩」または「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書に記載される化合物において見られる個々の置換基に依存して、比較的非毒性の酸または塩基を用いて調製される活性化合物の塩を含む意味を有する。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、「モジュレーター」という用語は、分子の活性または機能を変化させるまたは変更する化合物である。例えば、モジュレーターは、分子の特定の活性または機能の程度を、そのモジュレーターの非存在下で観察される活性または機能の程度と比較して増大または減少させ得る。特定の態様において、モジュレーターは、分子の少なくとも1つの活性または機能の程度を減少させる阻害剤である。分子の特定の例示的な活性および機能は、結合親和性、酵素活性およびシグナル伝達を含むがこれらに限定されない。特定の例示的な阻害剤は、タンパク質、ペプチド、抗原結合フラグメント、抗体、ペプチボディ、炭水化物または有機低分子を含むがこれらに限定されない。抗体はデュアルアクチビン受容体に対して作製され得る。ペプチボディは、例えば米国特許第6,660,843号（PCT出願第WO 01/83525号に対応する）に記載されている。
【０１２６】
「患者」および「対象」という用語は、言い換え可能に使用され、ヒトおよび非ヒト動物対象ならびに形式的に障害を診断されたそれら、形式的に障害が確認されていないそれら、医学的注意が払われているそれら、障害を発症する危険があるそれら等を含む。
【０１２７】
「処置する」および「処置」という用語は、治療的処置、予防的処置および対象が障害を発症するであろう危険または他の危険因子を減らす適用を含む。処置は、障害の完全な治癒を必要とするものではなく、症状または根底にある危険因子を減らす態様を包含する。
【０１２８】
「予防する、妨げる」は、事象の可能性の100％の排除を必要とするものではない。そうでなく、それは、化合物または方法の存在下でその事象が発生する可能性が減少することを意味する。
【０１２９】
組み換えDNA、オリゴヌクレオチド合成ならびに組織の培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）については標準的な技術が使用され得る。酵素反応および精製技術は、製造元の仕様にしたがいまたは当技術分野で一般に行われているようにもしくは本明細書に記載されるようにして実施され得る。上記の技術および手順は、通常、当技術分野で周知の従来法にしたがいならびに本明細書を通して引用および議論されている様々な一般的なおよびより具体的な参考文献に記載されるようにして実施され得る。例えば、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))を参照のこと。具体的な定義が提供されない限り、本明細書に記載される分析化学、合成有機化学および医薬化学に関連して使用される命名法ならびにそれらの実験手順および技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されているものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化および送達ならびに患者の処置については、標準的な技術が使用され得る。
【０１３０】
デュアルアクチビン受容体に結合する抗原結合タンパク質（ABP）が、本明細書に提供される。いくつかの態様において、提供される抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されるように、1つまたは複数の相補性決定領域（CDR）を含むポリペプチドである。いくつかの抗原結合タンパク質において、CDRは、CDRの適切な抗原結合特性が達成されるようCDRを方向付ける「フレームワーク」領域に埋め込まれる。いくつかの態様において、本明細書に提供される抗原結合タンパク質は、アクチビンとアクチビン受容体の間の相互作用と干渉する、該相互作用をブロックする、該相互作用を減少させるまたは該相互作用を調整することができる。そのような抗原結合タンパク質は、「中和性」と称される。いくつかの態様において、中和抗原結合タンパク質は、アクチビンがアクチビン受容体に結合するのを妨げる場所および／または様式でデュアルアクチビン受容体に結合する。
【０１３１】
いくつかの態様において、本明細書に提供される抗原結合タンパク質は、アクチビンを媒介する活性（結合を含む）を阻害することができる。いくつかの態様において、アクチビン受容体エピトープに結合する抗原結合タンパク質は、特に、アクチビンとアクチビン受容体の間の相互作用およびアクチビン／アクチビン受容体相互作用によって媒介される他の生理学的効果を阻害し得る。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、キメラ、例えばヒト／マウスキメラである。
【０１３２】
抗原結合タンパク質は、本明細書で説明されているように、様々な治療適用において使用され得る。例えば、いくつかの態様において、アクチビン受容体抗原結合タンパク質は、アクチビンおよび／またはアクチビン受容体に関連する疾患および状態、例えば筋消耗に関連する疾患を処置するのに有用である。筋消耗疾患は、以下の状態を含み得るがこれらに限定されない：癌性悪液質、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、うっ血性閉塞性肺疾患、慢性心不全、化学性悪液質、HIV/AIDSに起因する悪液質、腎不全、尿毒症、関節リウマチ、加齢に伴うサルコペニア、加齢に伴う虚弱、臓器萎縮、手根管症候群、アンドロゲン欠乏ならびに長時間の床上安静、脊髄損傷、発作、骨折、火傷、加齢、インスリン抵抗性およびその他の障害による不活動性に起因する筋消耗。筋消耗はまた、宇宙飛行による無重力に起因し得る。抗原結合タンパク質は、アンタゴニスト性デュアル受容体抗体であり得る。抗体は、ActRIIBおよびActRIIAに対するものであり得る。
【０１３３】
さらなる用途は、ミオスタチン、アクチビンAまたはGDF-11活性を減少させるまたはブロックする方法であって、そのような処置を必要とする対象に、デュアル受容体抗原結合タンパク質およびポリペプチドまたはこれらを含む薬学的組成物を投与する工程を含む方法、を含み得るがこれらに限定されない。抗原結合タンパク質は、アンタゴニスト性デュアル受容体抗体であり得る。抗体は、ActRIIBおよびActRIIAに対するものであり得る。
【０１３４】
別の局面において、デュアル受容体抗原結合タンパク質またはポリペプチドを含む有効量の組成物または薬学的組成物を対象に投与する工程を含む、そのような処置が必要な対象において除脂肪筋肉量を増大させるまたは脂肪量に対する除脂肪筋肉量の比を増大させる方法が提供される。抗原結合タンパク質は、アンタゴニスト性デュアル受容体抗体であり得る。抗体は、ActRIIBおよびActRIIAに対するものであり得る。
【０１３５】
別の局面において、抗原結合ポリペプチドまたはタンパク質を含む治療組成物を対象に投与する工程を含む、筋消耗疾患をそのような障害に罹患した対象において処置または予防する方法が提供される。
【０１３６】
別の局面において、抗原結合タンパク質またはポリペプチドを含む有効量の治療組成物を対象に投与する工程を含む、アクチビンが過剰発現される状態をそのような処置を必要とする対象において処置する方法が提供される。1つの態様において、疾患は癌である。別の局面において、本発明は、代謝障害を処置する方法であって、そのような処置を必要とする対象に抗原結合タンパク質またはポリペプチドを含む治療組成物を投与する工程を含み、代謝障害が骨量減少、糖尿病、肥満、耐糖能異常、高血糖および代謝症候群から選択される方法、を提供する。抗原結合タンパク質は、アンタゴニスト性デュアル受容体抗体であり得る。抗体は、ActRIIBおよびActRIIAに対するものであり得る。
【０１３７】
いくつかの態様において、提供される抗原結合タンパク質は、1つまたは複数のCDR（例えば、1、2、3、4、5または6つのCDR）を含む。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、（a）ポリペプチド構造ならびに（b）ポリペプチド構造に挿入および／または接続された1つまたは複数のCDRを含む。ポリペプチド構造は、様々な異なる形態をとり得る。例えば、それは、天然に存在する抗体のフレームワークまたはそのフラグメントもしくは変種であり得またはそれらを含み得、または完全に合成性であり得る。
【０１３８】
特定の態様において、抗原結合タンパク質のポリペプチド構造は、それぞれ、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書で「抗体模倣体」とも称される）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合体（「抗体コンジュゲート」とも称される）および各々の一部分またはフラグメントを含むがこれらに限定されない抗体であるまたは抗体由来である。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、抗体の免疫学的フラグメント（例えば、Fabフラグメント、Fab'フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fvフラグメント、ダイアボディまたは単鎖抗体分子、例えばscFv）である。
【０１３９】
抗原結合タンパク質が治療適用のために使用される態様において、抗原結合タンパク質は、アクチビンの1つまたは複数の生物学的活性を阻害し得る、該活性と干渉し得るまたは該活性を調整し得る。1つの態様において、抗原結合タンパク質は、アクチビン受容体に特異的に結合するおよび／またはアクチビン受容体に対するヒトアクチビンの結合を（例えば、インビトロ競合結合アッセイにおける結合を測定することによって）少なくとも約20％〜40％、約40〜60％、約60〜80％、約80〜85％またはそれ以上、実質的に阻害する。
【０１４０】
本明細書に提供される抗原結合タンパク質のいくつかは、抗体である。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、約10-7、約10-8、約10-9、約10-10、約10-11、約10-12、約10-13 Mより低い（より強固に結合する）Kdを有する。いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、アクチビン受容体に対するアクチビンの結合のブロックに関して、約１μM未満、約1000 nM〜約100 nM、約100 nM〜約10 nM、約10 nM〜約1 nM、約1000 pM〜約500 pM、約500 pM〜約200 pM、約200 pM未満、約200 pM〜約150 pM、約200 pM〜約100 pM、約100 pM〜約10 pM、約10 pM〜約1 pMのIC50を有する。
【０１４１】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質は、特定の立体構造状態のアクチビン受容体に結合し、アクチビンが受容体と相互作用するのを妨げる。アクチビンがアクチビン受容体との相互作用を妨げられる場合、これはアクチビンまたはアクチビン受容体を媒介する活性およびその相互作用から生じる病理を妨げまたはブロックし得る。
【０１４２】
本明細書に記載される場合、アクチビン受容体に対する抗原結合タンパク質は、ヒト化抗体および／またはその一部分を含み得る。そのような戦略の実際の適用は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。
【０１４３】
特定の態様において、ヒト化抗体は、ヒトにおいて実質的に非免疫原性である。特定の態様において、ヒト化抗体は、ヒト化抗体の由来となった別の種の抗体と実質的に同じ標的親和性を有する。例えば、米国特許第5,530,101号；米国特許第5,693,761号；米国特許第5,693,762号；および米国特許第5,585,089号を参照のこと。
【０１４４】
特定の態様において、抗原結合ドメインの本来の親和性を低下させずにその免疫原性を減少させるよう改変され得る抗体可変ドメインのアミノ酸が同定される。例えば、米国特許第5,766,886号および同第5,869,619号を参照のこと。
【０１４５】
特定の態様において、当技術分野で公知の方法による抗体の改変は、典型的に、標的に対する増大した結合親和性を達成するようおよび／またはレシピエントにおける抗体の免疫原性を減少させるよう設計される。特定の態様において、ヒト化抗体は、その同族抗原に対する抗体の親和性を増大させるために、グリコシル化部位を除去するよう改変され得る。例えば、Co et al., Mol. Immunol., 30:1361-1367, (1993)を参照のこと。特定の態様において、「リシェーピング（reshaping）」、「ハイパーキメライゼーション（hyperchimerization）」または「ベニアリング／リサーフェシング（veneering/resurfacing）」等の技術が、ヒト化抗体を作製するために使用される。例えば、Vaswami et al., Annals of Allergy, Asthma, & Immunol., 81:105, (1998); Roguska et al., Prot. Engin., 9:895-904, (1996); および米国特許第6,072,035号を参照のこと。特定のそのような態様において、そのような技術は典型的に、外来残基の数を減少させることによって抗体の免疫原性を減少させるが、その抗体の反復投与後の抗イディオタイプおよび抗アロタイプ反応は妨げない。免疫原性を減少させる特定の他の方法は、例えば、Gilliland et al., J. Immunol., 62(6):3663-71, (1999)に記載されている。
【０１４６】
特定の例において、抗体のヒト化は、抗原結合能を喪失させることがある。そのヒト化抗体はその後、「復帰変異」され得る。そのような態様において、ヒト化抗体は、ドナー抗体で見られるアミノ酸残基の1つまたは複数を含むよう変異され得る。例えば、Saldanha et al., Mol. Immunol., 36:709-19, (1999)を参照のこと。
【０１４７】
特定の態様において、アクチビン受容体に対する抗体の軽および重鎖可変領域の相補性決定領域（CDR）は、同じまたは別の種由来のフレームワーク領域（FR）に移植され得る。特定の態様において、アクチビン受容体に対する抗体の軽および重鎖可変領域のCDRは、コンセンサスヒトFRに移植され得る。コンセンサスヒトFRを作製するために、特定の態様において、いくつかのヒト重鎖または軽鎖アミノ酸配列由来のFRをアラインメントさせることで、コンセンサスアミノ酸配列が同定される。特定の態様において、アクチビン受容体に対する抗体の重鎖または軽鎖のFRは、異なる重鎖または軽鎖由来のFRと置換される。特定の態様において、アクチビン受容体に対する抗体の重および軽鎖のFRにおける希少アミノ酸は置換されず、残りのFRアミノ酸が置換される。希少アミノ酸は、それらが通常見られないFR内の位置にある特定のアミノ酸である。特定の態様において、アクチビン受容体に対する抗体由来の移植される可変領域は、アクチビン受容体に対する抗体の定常領域とは異なる定常領域と共に使用され得る。特定の態様において、移植される可変領域は、単鎖Fv抗体の一部分である。CDRの移植は、例えば、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,180,370号；同第6,054,297号；同第5,693,762号；同第5,859,205号；同第5,693,761号；同第5,565,332号；同第5,585,089号; および同第5,530,101号、ならびにJones, et al., Nature, 321:522-525, (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327, (1988); Verhoeyen, et al., Science, 239:1534-1536, (1988), Winter, FEBS Letts., 430:92-94, (1998)に記載されている。
【０１４８】
特定の態様において、抗原結合タンパク質（例えば、抗体）は、抗原（例えば、アクチビン受容体またはそのフラグメント）を用いた免疫により作製される。抗体は、全長受容体、該受容体の可溶性形態、触媒ドメイン単独、アクチビン受容体の成熟形態、該受容体のスプライス変種またはそれらのフラグメントを用いた免疫により作製され得る。特定の態様において、抗体は、ポリクローナルもしくはモノクローナルであり得、および／または組み換え抗体であり得る。
【０１４９】
特定の態様において、抗体の生来の特性、例えばその標的に対する抗体の親和性、を操作する戦略が採用され得る。そのような戦略は、抗体をコードするポリヌクレオチド分子の部位特異的または無作為変異誘発を使用する抗体変種の生成を含むがこれらに限定されない。特定の態様において、そのような生成が行われた後に、所望の変化、例えば増大または減少した親和性、を示す抗体変種のスクリーニングが行われる。
【０１５０】
特定の態様において、変異誘発戦略において標的化されるアミノ酸残基は、CDRのアミノ酸残基である。他の態様において、可変ドメインのフレームワーク領域のアミノ酸が標的化され得る。そのようなフレームワーク領域は、特定の抗体の標的結合特性に寄与することが示されている。例えば、Hudson, Curr. Opin. Biotech., 9:395-402, (1999)および同書における参考文献を参照のこと。
【０１５１】
特定の態様において、体細胞の親和性成熟プロセス中に変異を起こし易い領域に対応する部位であるCDRの超変異部位に対する無作為または部位特異的変異誘発を制限することによって、より小規模でありかつより効率的にスクリーニングされる抗体変種ライブラリが作製され得る。例えば、Chowdhury & Pastan, Nature Biotech., 17:568-572, (1999)および同書における参考文献を参照のこと。特定の態様において、特定の直接および逆位反復、特定のコンセンサス配列、特定の2次構造および特定の回文配列を含むがこれらに限定されない特定タイプのDNA要素が超変異部位を同定するために使用され得る。例えば、超変異部位を同定するために使用され得るそのようなDNA要素は、プリン（AまたはG）、その後にグアニン（G）、その後にピリミジン（CまたはT）、その後にアデノシンまたはチミジン（AまたはT）のいずれかを含む4塩基配列（すなわち、A/G-G-C/T-A/T）を含むがこれらに限定されない。超変異部位を同定するために使用され得るDNA要素の別の例は、セリンコドン、A-G-C/Tである。
【０１５２】
様々な態様における適当な抗体、例えば組み換え、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製のために、当技術分野で公知の多くの技術が使用され得る（例えば、Kohler & Milstein, Nature, 256:495-497, (1975); Kozbor et al., Immunology Today, 4:72, (1983); Cole et al., pp.77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., (1985); Coligan, Current Protocols in Immunology (1991); Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (1988); およびGoding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (2nd ed. 1986)を参照のこと）。関心対象の抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子は、細胞からクローニングされ得る、例えば、モノクローナル抗体をコードする遺伝子がハイブリドーマからクローニングされそして組み換えモノクローナル抗体を作製するために使用され得る。モノクローナル抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子ライブラリもまた、ハイブリドーマまたはプラズマ細胞から作製され得る。重および軽鎖遺伝子産物の無作為の組み合わせが、異なる抗原特異性を有する抗体の大きなプールを生成する（例えば、Kuby, Immunol., (3rd ed. 1997)を参照のこと）。単鎖抗体または組み換え抗体の作製技術（米国特許第4,946,778号；米国特許第4,816,567号）は、様々な態様においてポリペプチドに対する抗体を作製するよう適合され得る。また、トランスジェニックマウスまたはその他の生物、例えばその他の哺乳動物も、ヒト化またはヒト抗体を発現させるために使用され得る（例えば、米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号；Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783, (1992); Lonberg et al., Nature, 368:856-859, (1994); Morrison, Nature, 368:812-13, (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14:845-51, (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826, (1996); およびLonberg & Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93, (1995)を参照のこと）。あるいは、ファージディスプレイ技術が、選択された抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーFabフラグメントを同定するために使用され得る（例えば、McCafferty et al., Nature, 348:552-554, (1990); Marks, et al., Biotechnology, 10:779-783, (1992)を参照のこと）。抗体はまた、二重特異性に、すなわち、2つの異なる抗原を認識できるようにされ得る（例えば、WO 93/08829、Traunecker, et al., EMBO J., 10:3655-3659, (1991); およびSuresh, et al., Methods in Enzymology, 121:210, (1986)を参照のこと）。抗体はまた、ヘテロコンジュゲート、例えば2つの共有結合された抗体、または免疫毒素であり得る（例えば、米国特許第4,676,980号、WO 91/00360; WO 92/200373; およびEP 03089を参照のこと）。
【０１５３】
非ヒト抗体をヒト化または霊長類化（primatize）する方法は、当技術分野で周知である。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源から導入された1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、移入残基（import residue）と称され、これは典型的に、移入可変ドメインから取得される。ヒト化は本質的に、Winterらの方法にしたがい（例えば、Jones, et al., Nature, 321:522-525, (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327, (1988); Verhoeyen, et al., Science, 239:1534-1536, (1988)およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596, (1992)を参照のこと）、げっ歯類CDRまたはCDR配列をヒト抗体の対応配列で置換することによって行われ得る。したがって、そのようなヒト化抗体は、実質的にインタクトなヒト可変ドメイン未満が非ヒト種由来の対応配列によって置換されているキメラ抗体である（米国特許第4,816,567号）。現実には、ヒト化抗体は典型的に、いくつかのCDR残基およびおそらくいくつかのFR残基がげっ歯類抗体の類似部位由来の残基で置換されているヒト抗体である。
【０１５４】
代替のアプローチにおいて、GenPharm International, Inc.を含む他者は、「ミニローカス（minilocus）」アプローチを利用する。このミニローカスアプローチでは、外因性のIg遺伝子座が、そのIg遺伝子座由来の一部分（個々の遺伝子）の挿入を通じて模倣される。したがって、1つまたは複数のVH遺伝子、1つまたは複数のDH遺伝子、1つまたは複数のJH遺伝子、mu定常領域および通常は第2の定常領域（例えば、ガンマ定常領域）が、動物に挿入するためのコンストラクトを形成する。このアプローチは、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、Suraniらに対する米国特許第5,545,807号ならびに各々Lonberg & Kayに対する米国特許第5,545,806号；同第5,625,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号；同第5,770,429号；同第5,789,650号；同第5,814,318号；同第5,877,397号；同第5,874,299号；および同第6,255,458号、Krimpenfort & Bernsに対する米国特許第5,591,669号および同第6,023,010号、Bernsらに対する米国特許第5,612,205号、同第5,721,367号および同第5,789,215号、ならびにChoi & Dunnに対する米国特許第5,643,763号、ならびにGenPharm Internationalの米国特許出願第07/574,748号；同第07/575,962号；同第07/810,279号；同第07/853,408号；同第07/904,068号；同第07/990,860号；同第08/053,131号；同第08/096,762号；同第08/155,301号；同第08/161,739号；同第08/165,699号；同第08/209,741号に記載されている。その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられる、欧州特許第0 546 073 B1号、国際特許出願第WO 92/03918号；同第WO 92/22645号；同第WO 92/22647号；同第WO 92/22670号；同第WO 93/12227号；同第WO 94/00569号；同第WO 94/25585号；同第WO 96/14436号；同第WO 97/13852号；および同第WO 98/24884号、ならびに米国特許第5,981,175号もまた参照のこと。さらに、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、Taylor, et al., 1992, Chen, et al., 1993; Tuaillon, et al., 1993; Choi, et al., 1993, Lonberg, et al., (1994); Taylor, et al., (1994)およびTuaillon, et al., (1995)、Fishwild, et al., (1996)を参照のこと。
【０１５５】
1つの態様において、抗体は、「エフェクター」部分にコンジュゲートされる。エフェクター部分は、放射性標識または蛍光標識等の標識部分を含む任意の数の分子であり得、または治療部分であり得る。
【０１５６】
抗体は、さらなるアミノ酸残基に融合され得る。そのようなアミノ酸残基は、おそらく単離を容易にするための、ペプチドタグであり得る。特定の臓器または組織に抗体を誘導するための他のアミノ酸残基も想定され得る。
【０１５７】
特定の態様において、抗体または本明細書に記載されるモノクローナル抗体のいずれかの抗原結合領域が、癌または網膜症の処置のために使用され得る。
【０１５８】
「癌」は、周辺組織に侵襲し得る、複数部位に転移し得るおよび除去を試みた後も再発することがあり得る、任意の様々なタイプの悪性新生物を示すために使用され得る総称と理解されたい。この用語はまた、任意の癌腫または肉腫を表し得る。
【０１５９】
「網膜症」は、網膜炎と区別される、網膜の非炎症性疾患を意味すると理解されたい。「糖尿病性網膜症」は、断続的な出血、毛細血管瘤および明確に定義されるろう状滲出液によって特徴づけられ得る糖尿病において起こる網膜の変化を意味するものと理解されたい。
【０１６０】
癌の処置において、抗原結合領域は、治療活性を有する第2のタンパク質の少なくとも機能的に活性な部分に連結され得る。第2のタンパク質は、酵素、リンホカイン、オンコスタチンまたは毒素を含み得るがこれらに限定されない。適当な毒素は、ドキソルビシン、ダウノルビシン、タキソール、臭化エチジウム（ethiduim bromide）、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラセンジオン（dihydroxy anthracin dione）、アクチノマイシンD、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（PE)A、PE40、リシン、アブリン、グルココルチコイドおよび放射性同位元素を含む。
【０１６１】
理解されているように、抗体は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株において発現され得る。特定の抗体をコードする配列は、適当な哺乳動物宿主細胞を形質転換するために使用され得る。形質転換は、例えばポリヌクレオチドをウイルスに（もしくはウイルスベクターに）パッケージングし、該ウイルス（もしくはベクター）を用いて宿主細胞に形質導入する方法を含む、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する任意の公知の方法により、または米国特許第4,399,216号；同第4,912,040号；同第4,740,461号；および同第4,959,455号（これらの特許は参照により本明細書に組み入れられる）によって例示される、当技術分野で公知のトランスフェクション手順により、行われ得る。使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に依存する。哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチドを導入する方法は、当技術分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームによるポリヌクレオチドのカプセル化および核へのDNAの直接マイクロインジェクションを含む。
【０１６２】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当技術分野で周知であり、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、Hep G2）、ヒト上皮腎臓293細胞および多くの他の細胞株を含むがこれらに限定されない、American Type Culture Collection（ATCC）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高発現レベルの関心対象の抗体を有するかの決定を通じて選択される。
【０１６３】
特定の態様において、抗原結合タンパク質は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgDおよびIgMアイソタイプの少なくとも1つの免疫グロブリン分子を含み得る。特定の態様において、抗原結合タンパク質は、ヒトカッパ軽鎖および／またはヒト重鎖を含む。特定の態様において、重鎖は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgDおよびIgMアイソタイプである。特定の態様において、抗原結合タンパク質は、哺乳動物細胞における発現のためにクローニングされたものである。特定の態様において、抗原結合タンパク質は、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE、IgA、IgDおよびIgMアイソタイプの定常領域のいずれか以外の定常領域を含む。
【０１６４】
特定の態様において、アクチビン受容体に対する抗体の機能的および／または化学的特徴の実質的改変は、（a）置換する領域の分子骨格の構造、例えば、シートもしくはヘリカル構造、（b）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性または（c）側鎖の嵩の維持に対する効果が有意に異なる重および軽鎖のアミノ酸配列の置換を選択することによって達成され得る。
【０１６５】
例えば、「保存的アミノ酸置換」は、その位置のアミノ酸残基の極性または電荷に対する効果がほとんどまたは全くない非ネイティブ残基によるネイティブアミノ酸残基の置換を含み得る。さらに、ポリペプチド中の任意のネイティブ残基はまた、「アラニンスキャン変異誘発」に関して以前に記載されているように、アラニンで置換され得る。
【０１６６】
所望のアミノ酸置換（保存的であろうが非保存的であろうが）は、そのような置換が望まれるときに、当業者によって決定され得る。特定の態様において、アミノ酸置換は、本明細書に記載されるように、アクチビン受容体に対する抗体の重要な残基を同定するために、またはアクチビン受容体に対する抗体の親和性を増大もしくは減少させるために、使用され得る。
【０１６７】
特定の態様において、抗体または抗原結合タンパク質は、ハイブリドーマ細胞株以外の細胞株において発現され得る。特定の抗体をコードする配列は、適当な哺乳動物宿主細胞を形質転換するために使用され得る。特定の態様にしたがい、形質転換は、例えば、ポリヌクレオチドをウイルスに（もしくはウイルスベクターに）パッケージングし、該ウイルス（もしくはベクター）を用いて宿主細胞に形質導入する方法を含む、宿主細胞にポリヌクレオチドを導入する任意の公知の方法により、または米国特許第4,399,216号；同第4,912,040号；同第4,740,461号；および同第4,959,455号（これらの特許はあらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる）により例示される、当技術分野で公知のトランスフェクション手順により、行われ得る。特定の態様において、使用される形質転換手順は、形質転換される宿主に依存し得る。哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチドを導入する方法は、当技術分野で周知であり、デキストラン媒介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソームによるポリヌクレオチドのカプセル化および核へのDNAの直接マイクロインジェクションを含むがこれらに限定されない。
【０１６８】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当技術分野で周知であり、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞癌腫細胞（例えば、Hep G2）および多くの他の細胞株を含むがこれらに限定されない、American Type Culture Collection（ATCC）から入手可能な多くの不死化細胞株を含むがこれらに限定されない。特定の態様において、細胞株は、どの細胞株が高発現レベルを有し構成的なHGF結合特性を有する抗体を産生するかの決定を通じて選択され得る。哺乳動物宿主細胞に適した発現ベクターは、周知である。
【０１６９】
特定の態様において、抗原結合タンパク質は、1つまたは複数のポリペプチドを含む。任意の様々な発現ベクター／宿主システムが、1つもしくは複数の抗原結合タンパク質成分を含むポリペプチドまたは抗原結合タンパク質それ自体をコードするポリヌクレオチド分子を発現させるために利用され得る。そのようなシステムは、微生物、例えば組み換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌、酵母発現ベクターで形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞システム、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV、タバコモザイクウイルス、TMV）でトランスフェクトさせたもしくは細菌発現ベクター（例えば、TiもしくはpBR322プラスミド）で形質転換された植物細胞システム、または動物細胞システムを含むがこれらに限定されない。
【０１７０】
特定の態様において、１つもしくは複数の抗原結合タンパク質成分を含むポリペプチドまたは抗原結合タンパク質それ自体は、酵母において組み換え発現される。特定のそのような態様は、製造元の指示にしたがう市販の発現システム、例えばピチア（Pichia）発現システム（Invitrogen, San Diego, CA）である。特定の態様において、そのようなシステムは、分泌を指示するプレプロアルファ配列に基づいている。特定の態様において、インサートの転写は、メタノールにより誘導されるアルコールオキシダーゼ（AOX1）プロモーターによって促される。
【０１７１】
特定の態様において、1つまたは複数の抗原結合タンパク質成分または抗原結合タンパク質それ自体を含む分泌ポリペプチドが、酵母成長培地から精製される。特定の態様において、酵母成長培地からポリペプチドを精製するために使用される方法は、細菌および哺乳動物細胞の上清からポリペプチドを精製するために使用されるものと同じである。
【０１７２】
特定の態様において、１つもしくは複数の抗原結合タンパク質成分を含むポリペプチドまたは抗原結合タンパク質それ自体をコードする核酸は、バキュロウイルス発現ベクター、例えばpVL1393（PharMingen, San Diego, CA）にクローニングされる。特定の態様において、そのようなベクターは、製造元の指示（PharMingen）にしたがいsF9タンパク質非含有培地においてスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞に感染させ組み換えポリペプチドを産生させるために使用され得る。特定の態様において、ポリペプチドは、そのような培地からヘパリン-セファロースカラム（Pharmacia）を用いて精製および濃縮される。
【０１７３】
特定の態様において、１つもしくは複数の抗原結合タンパク質成分を含むポリペプチドまたは抗原結合タンパク質それ自体は、昆虫システムにおいて発現される。特定のポリペプチド発現用昆虫システムは、当業者に周知である。1つのそのようなシステムにおいて、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（AcNPV）が、スポドプテラ・フルギペルダ細胞においてまたはトリコプルシア・ラバエ（Trichoplusia larvae）において外来遺伝子を発現させるベクターとして使用される。特定の態様において、ポリペプチドをコードする核酸分子は、ウイルスの非必須遺伝子に、例えばポリへドリン遺伝子内に挿入され、そしてその遺伝子のプロモーターの制御下に置かれ得る。特定の態様において、核酸分子の適切な挿入は、その非必須遺伝子を不活性化するであろう。特定の態様において、その不活性化により、検出可能な特徴が示される。例えば、ポリへドリン遺伝子の不活性化は、コートタンパク質を欠くウイルスを生成する。
【０１７４】
特定の態様において、組み換えウイルスが、S.フルギペルダ細胞またはトリコプルシア・ラバエを感染させるために使用され得る。例えば、Smith, et al., J. Virol., 46: 584, (1983); Engelhard et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 91: 3224-7, (1994)を参照のこと。
【０１７５】
特定の態様において、細菌細胞において生成される１つもしくは複数の抗原結合タンパク質成分を含むポリペプチドまたは抗原結合タンパク質それ自体は、細菌内の不溶性の封入体として産生される。そのような封入体を含む宿主細胞は、遠心分離、0.15M NaCl、10mM Tris、pH 8、1mM EDTA中での洗浄、および室温で15分間の0.1 mg/mlリゾチーム（Sigma, St. Louis, MO）処置によって回収される。特定の態様において、溶解産物は、超音波処理により清浄化され、そして細胞の残骸が、12,000 X gで10分間の遠心分離によってペレット化される。特定の態様において、ポリペプチドを含むペレットは、50mM Tris、pH 8および10mM EDTAに再懸濁され、50％グリセロールに重層され、そして6000 X gで30分間遠心分離される。特定の態様において、そのペレットは、MG++およびCa++を含まない標準的なリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に再懸濁され得る。特定の態様において、ポリペプチドは、再懸濁させたペレットを変性SDSポリアクリルアミドゲル中で分画させることによってさらに精製される（例えば、Sambrook et al., 前記を参照のこと）。特定の態様において、そのようなゲルは、タンパク質を可視化するために0.4M KClに浸漬され得、SDSを欠くゲル泳動緩衝液中で切り出され電気溶離（electroelute）され得る。特定の態様にしたがい、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合タンパク質が、可溶性タンパク質として細菌中で産生される。特定の態様において、そのようなGST融合タンパク質は、GST精製モジュール（Pharmacia）を用いて精製される。
【０１７６】
特定の態様において、特定のポリペプチド、例えば１つもしくは複数の抗原結合タンパク質成分を含むポリペプチドまたは抗原結合タンパク質それ自体を「再フォールディング」させることが望ましい。特定の態様において、そのようなポリペプチドは、本明細書で議論されている特定の組み換えシステムを用いて生成される。特定の態様において、ポリペプチドは、所望の3次構造を形成するようおよび／またはジスルフィド連結を生成するよう「再フォールディング」および／または酸化される。特定の態様において、そのような構造および／または連結は、ポリペプチドの特定の生物学的活性に関連する。特定の態様において、再フォールディングは、当技術分野で公知の多くの手順のいずれかを用いて達成される。例示的な方法は、可溶化されたポリペプチド物質をカオトロピック剤の存在下で典型的には7より高いpHにさらす方法を含むがこれらに限定されない。例示的なカオトロピック剤は、グアニジンである。特定の態様において、再フォールディング／酸化溶液はまた、還元剤およびその還元剤の酸化型を含む。特定の態様において、還元剤およびその酸化型は、ジスルフィドシャッフリングが起こる特定の酸化還元電位を生じる比で存在する。特定の態様において、そのようなシャッフリングは、システイン架橋を形成する。例示的な酸化還元対は、システイン／シスタミン、グルタチオン／ジチオビスGSH、塩化第二銅、ジチオトレイトールDTT／ジチアンDTTおよび2-メルカプトエタノール（bME）／ジチオ-bMEを含むがこれらに限定されない。特定の態様において、再フォールディングの効率を高めるために共溶媒が使用される。例示的な共溶媒は、グリセロール、様々な分子量のポリエチレングリコールおよびアルギニンを含むがこれらに限定されない。
【０１７７】
特定の態様において、１つもしくは複数の抗原結合タンパク質成分を含むポリペプチドまたは抗原結合タンパク質それ自体が実質的に精製される。特定のタンパク質を精製する技術は当業者に公知である。特定の態様において、タンパク質精製は、非ポリペプチド画分からのポリペプチド画分の粗分画を含む。特定の態様において、ポリペプチドは、クロマトグラフィーおよび／または電気泳動技術を用いて精製される。例示的な精製方法は、硫酸アンモニウム沈降；PEG沈降；免疫沈降；熱変性後の遠心分離；親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテイン-A-セファロース）、イオン交換クロマトグラフィー、排除クロマトグラフィーおよび逆相クロマトグラフィーを含むがこれらに限定されないクロマトグラフィー；ゲルろ過；ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ならびにそのようなおよびその他の技術の組み合わせを含むがこれらに限定されない。特定の態様において、ポリペプチドは、高速タンパク質液体クロマトグラフィーによってまたは高圧液体クロマトグラフィー(HPLC）によって精製される。特定の態様において、精製工程は変更され得または特定の工程が省略され得るが、それでも実質的に精製されたポリペプチドを調製するのに適した方法であることに変わりはない。
【０１７８】
特定の態様において、ポリペプチド調製物の精製度が定量される。精製度を定量する特定の方法は、当業者に公知である。特定の例示的な方法は、調製物の比結合活性の決定およびSDS/PAGE分析による調製物中のポリペプチドの量の評価を含むがこれらに限定されない。ポリペプチド調製物の精製の量を評価する特定の例示的な方法は、調製物の結合活性の計算およびそれと初期抽出物の結合活性の比較を含む。特定の態様において、そのような計算の結果は、「倍精製」で表現される。結合活性の量を表すために使用される単位は、実施される個々のアッセイに依存する。
【０１７９】
特定の態様において、１つもしくは複数の抗原結合タンパク質成分を含むポリペプチドまたは抗原結合タンパク質それ自体が、部分的に精製される。部分精製は、少ない精製工程を使用することによってまたは同じ一般精製スキームの異なる形式を利用することによって達成され得る。例えば、特定の態様において、HPLC装置を用いて行われるカチオン交換カラムクロマトグラフィーは、一般に、低圧クロマトグラフィーシステムを利用する同一技術よりも高い「〜倍精製」を達成するであろう。特定の態様において、低い精製度をもたらす方法は、ポリペプチドの全体回収量またはポリペプチドの結合活性の維持の点で有利であり得る。
【０１８０】
特定の例において、ポリペプチドの電気泳動による移動は、SDS/PAGEの条件の違いにより、ときには有意に、変化し得る。例えば、Capaldi, et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 76: 425, (1977)を参照のこと。異なる電気泳動条件の下で、精製または部分精製されたポリペプチドの見かけの分子量が異なり得ることが理解されているであろう。
【０１８１】
本明細書に記載される様々な態様において、抗体は、当技術分野で周知の調査または診断方法のために、インビボおよびインビトロで使用され得る。診断方法は、様々な態様の抗体を含むキットを含む。他の態様において、本明細書に記載される抗体は、治療剤として使用され得る。
【０１８２】
デュアル受容体抗体は、予防または処置の目的で哺乳動物において使用される場合、薬学的に許容される担体をさらに含み得る組成物の形態で投与され得ることが理解されている。適切な薬学的に許容される担体は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびそれらの組み合わせの１つまたは複数を含む。
【０１８３】
薬学的に許容される担体はさらに、抗原結合タンパク質の有効期間または効能を増強する微量の補助物質、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤または緩衝液を含み得る。注射用組成物は、当技術分野で周知のように、哺乳動物への投与後に活性成分の迅速、持続的または遅延放出を提供するよう製剤化され得る。
【０１８４】
本明細書に記載される使用のための薬学的製剤、特に抗体の薬学的製剤は、所望の純度を有する抗体を任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって調製され得る。そのような製剤は、凍結乾燥された製剤または水性の溶液であり得る。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、使用される用量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。許容される担体、賦形剤または安定化剤は、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩およびその他の有機酸；抗酸化物質（例えば、アスコルビン酸）保存剤低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミンもしくはゼラチン、もしくは親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン；ならびにアミノ酸、単糖類、二糖類およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含むその他の炭水化物；キレート化剤；ならびにイオン性および非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート）；塩形成性対イオン、例えばナトリウム；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤であり得る。抗体は、0.5〜200 mg/mlの間の濃度で製剤化され得る。
【０１８５】
治療適用において、組成物は、「治療有効用量」で、疾患（例えば筋消耗疾患）に罹患した患者に投与される。この用途で有効な量は、疾患の重篤度および患者の一般的健康状態に依存するであろう。患者によって必要とされるおよび耐容される用量および頻度に依存して、単回または複数回投与分の組成物が投与され得る。本明細書で言う「患者」または「対象」は、ヒトおよびその他の動物、特に哺乳動物、の両方を含み得る。したがって、該方法は、ヒトの治療および獣医学的適用の両方に適用可能である。様々な態様において、患者は哺乳動物である。哺乳動物は、霊長類またはヒトでさえあり得る。
【０１８６】
薬学的組成物の投与経路は、公知の方法にしたがう、例えば、経口的、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋内、眼内、動脈内、門脈内、病巣内経路による注射を通じた、髄内、くも膜下腔内、心室内、経皮、皮下もしくは腹腔内；および鼻腔内、腸内、局所、舌下、尿道、膣もしくは直腸手段、持続放出システムによるまたは移植デバイスによるものである。所望の場合、組成物は、ボーラス注射によりもしくは注射により連続的にまたは移植デバイスにより投与され得る。あるいはまたは加えて、組成物は、所望の分子を吸収または捕捉させた膜、スポンジまたは別の適当な物質の移植を通じて局所投与され得る。移植デバイスが使用される場合、そのデバイスは、任意の適切な組織または臓器に移植され得、所望の分子の送達は、拡散、徐放ボーラスまたは連続投与であり得る。
【０１８７】
特定の態様において、製剤の成分は、投与部位に対して許容可能な濃度で存在する。特定の態様において、組成物を生理学的pHまたはわずかに低いpHで、典型的には約5〜約8のpH範囲内で維持するために、緩衝液が使用される。
【０１８８】
特定の態様において、非経口投与が想定される場合、治療組成物は、さらなる治療剤と共にまたはそれを伴わずに、薬学的に許容されるビヒクル中にアクチビンに対する所望のデュアル受容体抗原結合タンパク質を含む、発熱物質非含有の、非経口的に許容される水性溶液の形態であり得る。特定の態様において、非経口注射用のビヒクルは滅菌蒸留水であり、アクチビン受容体に対するデュアル受容体抗原結合タンパク質は、少なくとも1つのさらなる治療剤と共にまたはそれを伴わずに、適切に保存された滅菌等張溶液として製剤化される。特定の態様において、調製物は、製造物の制御または持続放出を提供し得る注射可能なマイクロスフィア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソーム等の剤を伴う所望分子の製剤を含み得、これが蓄積注射を通じて送達され得る。特定の態様において、ヒアルロン酸もまた使用され得、循環中での持続期間を向上させる効果を有し得る。特定の態様において、移植可能な薬物送達デバイスが、所望の分子を導入するために使用され得る。
【０１８９】
デュアル受容体抗原結合組成物の使用
本発明は、インビボおよびインビトロでミオスタチン、アクチビンまたはGDF-11の量または活性を減少させるまたは中和するための方法および薬学的組成物を提供する。アクチビンデュアル受容体抗原結合タンパク質は、ミオスタチン、アクチビンAおよびGDF-11の少なくとも1つの生物学的活性を減少させるおよび阻害することができる。
【０１９０】
1つの局面において、本発明は、有効用量のデュアルアクチビン受容体抗原結合タンパク質組成物を対象に投与することによって、そのような処置を必要とする対象においてミオスタチン関連および／またはアクチビンA関連障害を処置するための方法および試薬を提供する。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、任意の動物、例えばヒトを含む哺乳動物を表す。
【０１９１】
本発明の組成物は、対象における除脂肪筋肉量を増大させるのに有用である。組成物はまた、脂肪量に比例して除脂肪筋肉量を増大させる、したがって、対象の体重の百分率で脂肪量を減少させるために有用であり得る。実施例3は、本明細書に記載されるデュアルアクチビン抗体が動物において除脂肪筋肉量を増大され得ることを実証している。
【０１９２】
デュアルアクチビン受容体抗原結合タンパク質組成物によって処置され得る障害は、様々な形態の筋消耗ならびに代謝障害、例えば糖尿病および関連障害、ならびに骨変性疾患、例えば骨粗しょう症を含むがこれらに限定されない。
【０１９３】
筋消耗障害はまた、ジストロフィー、例えばデュシェンヌ筋ジストロフィー、進行性筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、デジュリン・ランドゥジー筋ジストロフィー、エルブ筋ジストロフィーおよび乳児神経軸索筋ジストロフィーを含む。さらなる筋消耗障害は、慢性疾患または障害、例えば筋萎縮性側索硬化症、うっ血性閉塞性肺疾患、癌、AIDS、腎不全、臓器萎縮、アンドロゲン欠乏および関節リウマチから引き起こされる。
【０１９４】
ミオスタチンおよび／またはアクチビンの過剰発現は、重度の筋消耗症候群である悪液質に寄与し得る。悪液質は、癌から引き起こされ、また関節リウマチ、糖尿病性ネフロパシー、腎不全、化学療法、火傷による損傷およびその他の原因に起因して発生する。別の例において、ミオスタチン免疫反応性タンパク質の血清および筋内濃度が、AIDS関連筋消耗を示す男性で増加することが見出され、そしてこれは無脂肪量に反比例した（Gonzalez-Cadavid, et al., PNAS USA, 95:14938-14943, (1998)）。ミオスタチンレベルはまた、火傷に反応して増加し、異化的な筋肉効果をもたらすことが示されている（Lang, et al., FASEB J., 15, 1807-1809, (2001)）。筋消耗を引き起こすさらなる状態は、身体障害、例えば車椅子常用、発作、疾病、脊髄損傷、骨折または心的外傷に起因する長時間の床上安静、ならびに微小重力環境（宇宙飛行）下での筋萎縮に起因する不活動性から発生し得る。例えば、血漿ミオスタチン免疫反応性タンパク質は、長時間の床上安静後に増加することが見出された（Zachwieja, et al. J. Gravit. Physiol., 6(2):11, (1999)）。スペースシャトル飛行中に微小重力環境にさらされたラットの筋肉がそれにさらされなかったラットの筋肉と比較して増大した量のミオスタチンを発現することも見出された（Lalani, et al., J. Endocrin., 167(3):417-28, (2000)）。
【０１９５】
さらに、脂肪対筋肉比の加齢に伴う増加および加齢に伴う筋萎縮もミオスタチンに関連するようである。例えば、平均血清ミオスタチン免疫反応性タンパク質は、若年（19〜35歳）、中年（36〜75歳）および老齢（76〜92歳）のグループの男性および女性において年齢と共に増加したが、平均筋肉量および無脂肪量はこれらのグループにおいて年齢と共に低下した（Yarasheski, et al., J. Nutr. Aging, 6(5):343-8, (2002)）。さらに、ミオスタチンは、現在、心筋において低レベルで発現されることが見出されており、発現は梗塞後の心筋細胞において上方調節される（Sharma, et al., J. Cell Physiol., 180(1):1-9, (1999)）。したがって、心筋におけるミオスタチンレベルを低下させることで、梗塞後の心筋の回復が改善される。
【０１９６】
ミオスタチンはまた、2型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、高血糖および肥満を含む代謝障害にも影響するようである。例えば、ミオスタチンの欠如は、2つのマウスモデルの肥満および糖尿病表現型を改善することが示されている（Yen, et al., FASEB J., 8:479, (1994)）。本開示の抗原結合タンパク質は、そのような代謝障害の処置に適している。したがって、本発明の組成物の投与は、適当な対象において糖尿病、肥満および高血糖状態を改善し得る。さらに、抗原結合タンパク質を含む組成物は、肥満者における食物摂取を減少させ得る。
【０１９７】
本明細書に記載される安定化された抗原結合タンパク質の投与は、骨の強度を改善し、骨粗しょう症およびその他の変性性骨疾患を軽減し得る。例えば、ミオスタチン欠損マウスは、マウス上腕骨の高いミネラル含量および密度ならびに海綿骨および皮質骨の両方の筋肉付着領域における高いミネラル含量、ならびに高い筋肉量を示すことが見出された（Hamrick, et al., Calcif. Tissue Int., 71(1):63-8, (2002)）。さらに、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、例えば前立腺癌の処置のために使用されるアンドロゲン除去療法等の例においてアンドロゲン欠乏の影響を処置するために使用され得る。
【０１９８】
有効用量の抗原結合タンパク質を動物に投与することによって、食用動物における筋肉量を増大させるための方法および組成物も提供される。成熟C末端ミオスタチンポリペプチドは試験されたすべての種で類似または同一であるので、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、ウシ、ニワトリ、シチメンチョウおよびブタを含む任意の農業的に重要な種において除脂肪筋肉量を増大させるおよび脂肪を減少させるのに有効であると考えられ得る。
【０１９９】
本発明の他の局面は、当業者により理解されるであろうし、かつ本明細書に記載されている。本明細書には、以下の実施例を含めて、本発明の様々な態様が記載されているが、当業者は、本明細書で詳述されている具体的な実施例および研究が例示にすぎないことを直ちに理解するであろう。本発明の意図から逸脱することなく様々な改変がなされ得ることを理解されたい。
【実施例】
【０２００】
マウスにおいて、変種ActRIIB-Fcによる処置は筋肉の成長をもたらし、これはミオスタチンを選択的に阻害することによって達成されるものの約3倍超であった。この大きな筋肉成長効果は、癌、腎不全、心不全、火傷、重度の感染および多くの他の異化疾患を有する患者における既存の筋肉喪失を好転させるために使用することができるため、治療的な価値がある。可溶性ActRIIB-Fc分子の開発に加えて、筋肉の成長を刺激するActRIIB/ActRIIA受容体ブロック抗体を開発した。細胞シグナルにおける機能重複に鑑み、ActRIIB-Fcと同等の筋肉成長効果を達成するために、ActRIIB（SEQ ID NO:2）（図2D）およびActRIIA（SEQ ID NO:18）の両方をブロックすることができるアンタゴニスト性抗体を開発した。
【０２０１】
以下の配列が、本願に関連する。
【０２０２】
（表２）
2015525230.tif 000004
*それ以外のことが示されていない限り、記載はアミノ酸配列に対するものである。
【０２０３】
実施例1：抗体の作製および成熟
デュアル受容体抗体を、最初に抗原としてActRIIB-huFc（SEQ ID NO:1）（図2D）を用いる抗体キャンペーンを行うことによって作製した。
【０２０４】
抗体をスクリーニングするため、ActRIIB（SEQ ID NO:20）（およびALK4、1型膜貫通受容体キナーゼ）もしくはActRIIA（およびALK4）またはActRIIBおよびActRIIA（SEQ ID NO:19）の両方（ならびにALK4）で安定的にトランスフェクトしたC2C12/PMARE-Luc細胞を含む細胞レポーターアッセイシステムを構築した。
2015525230.tif 000005
2015525230.tif 000006
【０２０５】
これにより、抗原としてActRIIBタンパク質を用いていくつかの抗ActRIIB抗体を同定した。しかし、マウスにおけるActRIIB結合に特異的な抗体の試験は、（抗体は筋肉の成長に対して一定の効果を有していたが）ActRIIB-Fcよりもずっと弱いインビボ筋肉成長効果を示した。これにより、ActRIIAおよびActRIIBの両方の受容体のシグナルを効果的にブロックすることができるデュアル受容体抗体のさらなる試験が求められた。
【０２０６】
その目的で、ActRIIBスクリーニング由来の抗体の注意深い試験により、抗体（R31-1）がActRIIBに対して強く結合し同時にActRIIAに対して弱いが明確な結合を示すことが明らかになった。
2015525230.tif 000007
【０２０７】
次に、ActRIIB（SEQ ID NO:2）に対する親和性を減少させずにActRIIAに対する親和性を改善するために、親分子としてR31-1を用いて親和性成熟を行った。
【０２０８】
R31-1からM43への親和性成熟
免疫原として可溶性ActRIIB-huFcを用いたXenomouseの免疫から得られた抗ActRIIBヒトIgG R31-1は、ActRIIB-huFcに対して＜10 pMの結合親和性およびActRIIAhuFcに対して-1 nMの結合親和性を有することが示された。
2015525230.tif 000008
【０２０９】
アクチビン受容体シグナル伝達経路を完全に取り除くために、ActRIIAおよびActRIIBの両方の同時的なブロックが必要であった。この目的を達成するために、ActRIIBに対する親和性に影響を与えずにActRIIAに対するR31-1の親和性を改善するための親和性成熟およびスクリーニング戦略を設計した。
【０２１０】
R31-1 IgG2分子の図1の3つすべてのHC-CDR（SEQ ID NO:9〜11）および図1の3つすべてのLC-CDR（SEQ ID NO:12〜14）の各残基に対する単一アミノ酸残基無作為変異誘発（NNKコドン）（N＝A、T、GまたはC；K＝TまたはG）を行った。
【０２１１】
変異誘発プライマーは、標的位置に対して5-プライム側の24野生型ヌクレオチドおよび3-プライム側の24野生型ヌクレオチドをNNKに隣接させることによって設計した。HC-CDRの31の位置およびLC-CDRの31の位置を変異させた。
【０２１２】
pTT5ベクター中にR31-1 IgG2γ鎖を含むプラスミドDNAおよびR31-1κ軽鎖を含むプラスミドDNAを、62の変異誘発反応のテンプレートとして使用した。合計1178個の各変異体を、配列決定によって同定し、単離した。293 6E細胞への96ウェル一過的トランスフェクションにより、単一残基変異体である1本の鎖を、親分子の他の鎖と対にした（変異HC：親LCまたは親HC：変異LC）。トランスフェクションの7日後に馴化培地（CM）を収集し、これを結合評価のためにELISAにおいて使用した。
【０２１３】
BO%飽和濃度（0.5μg/ml）のビオチン-ActRIIB-huFcおよび95％飽和濃度（3.33μg/ml）のビオチン-ActRIIA-huFcをコーティングしたNeutrAvidinプレートを、ELISAに使用した。抗原をコーティングしたプレート上でインキュベートする前に、変異体のCMを2％BSA/2％MPBSでブロックした。１時間のRT（室温）でのインキュベートの後、プレートをPBSTで5回洗浄した。結合した変異体を、1時間のインキュベートの後に、1:3000希釈の抗huIgG HRPで検出した。プレートをPBSTで5回洗浄した。LumiGLO化学発光基質（KPL, #54-61-01）を添加し、そしてプレートをEnvisionで読み取った。R31-1と比較してActRIIAおよびActRIIB結合活性が低下した変異体を除外した。
【０２１４】
有益な単一残基変異を同定する2次スクリーニングのために、0.1μg/mlのビオチン-ActRIIB-huFcおよび0.5μg/mlのビオチン-ActRIIA-huFcをコーティングしたNeutrAvidinプレートを用いてより高いストリンジェンシーでELISAを行った。R31-1と比較して同等または改善されたActRIIB結合活性および改善されたActRIIA結合活性を有する14個の有益な単一残基変異（5個の位置における11個のHC変異および3個の位置における3個のLC変異）を同定した。1個の変異はLC-CDR1におけるものであり（LC1-Y12W）、2個はLC-CDR3（LC3-Y3W、LC3-W9H）、3個はHC-CDR1（HC1-Y2S、HC1-Y2D、HC1S5A）、5個はHC-CDR2（HC2-G1D、HC2-G1V、HC2-G1S、HC2-G1A、HC2-Y10F）、そして3個はHC-CDR3におけるものであった（HC3-S4W、HC3-S4Y、HC3-S4T）。
【０２１５】
単一残基HC変異体を、96ウェルプレートにおける293 6Eへの一過的トランスフェクションのためのマトリクス内で単一残基LC変異体と対にし、LCおよびHeの各々に1個の変異を含む33個の二重変異IgGを作製した。粗CMサンプルのIgG2濃度を、プロテインAバイオセンサーを用いるForteBioによって測定し、正規化した。有意に改善されたActRIIA結合性および変わりのないActRIIB結合性を有する2重変異体を選択するため、10μg/ml〜0.001μg/mlの様々な濃度のビオチン-VMS hFc IgG1-ACTR-2B（E2BW）およびビオチン-hACTR-2A（E119Q、E121Q）-hFcをコーティングしたNeutrAvidinプレート上で滴定ELISAを行い、粗CMを1μg/ml IgG2に調節した。選択された二重変異体の結合速度研究を、ForteBioにおいて行った。BiaCoreにおいて、粗CM中のIgGをチップ上に捕捉し、可溶性の受容体を通過させることによって、K-offの順位の確認を行った。HC2-G1SおよびLC1-Y12Wに変異を有する31-1-16を、最上位クローンと同定した。31-1-27および31-1-43もまた、良いクローンであった。
【０２１６】
ActRIIAに対する親和性をさらに改善するために、LCまたはHCの異なるCDRの有益な単一残基変異を、オーバラップPCRによって組み合わせ、その鎖の2または3個のCDRに単一変異を有するHC変異体およびLC変異体を作製した。2または3個のCDRに単一変異を有する69個のHC複数部位変異体（mmHC）ならびにCDR1およびCDR3に単一変異を有する2個のLC複数部位変異体（mmLC）を構築した。96ウェル一過的トランスフェクションにより、各mmHCを、親LC、単一残基LC変異体およびmmLCと対にし、そしてmmLCを親HCと対にした。粗CMサンプルを、ForteBio速度研究に使用した。23個の変異体は、ベンチマーク分子311-16と同等かまたはそれよりも良好であった。BiaCoreによる確認の後、最終的に上位の変異体［M10（SEQ ID NO:25〜26）、M25（SEQ ID NO:27〜28）、M37（SEQ ID NO:29〜30）、M39（SEQ ID NO:31〜32）、およびM43（SEQ ID NO:15〜16）］を選択した（図2Aおよび図2Cに示されるLCおよびHCアミノ酸配列）。
【０２１７】
実施例2：抗体の特徴
細胞ベースのアッセイを使用して、ActRIIBおよびActRIIAに対する結合およびブロック活性を決定した。pMARE-lucコンストラクトを用いたC2C12筋芽細胞（ATCC No: CRL-1772）のトランスフェクションにより、ミオスタチン／アクチビン応答性レポーター細胞株を作製した。pMARE-lucコンストラクトは、ミオスタチン／アクチビン応答要素であるCAGA配列の12回反復（Dennler, et al., EMBO, 17: 3091-3100, (1998)）をpLuc-MCSレポーターベクター（Stratagene cat# 219087）のTATAボックス上流にクローニングすることによって作製した。この安定細胞株（C2C12/PMARE-Luc）を、アクチビンIIA型受容体（ActRIIA）およびアクチビン1型膜貫通レポーターキナーゼ（ALK4）またはアクチビンIIB型受容体（ActRIIB）およびALK4またはActRIIAおよびActRIIBの組み合わせならびにALK4でさらにトランスフェクトし、各々個々の安定細胞株を作製した。ミオスタチンまたはアクチビンAが細胞の受容体に結合したとき、Smad経路が活性化され、リン酸化Smadがこの応答要素に結合し（Macias-Silva et al. Cell 87: 1215 (1996)）、ルシフェラーゼ遺伝子が発現される。その後、ルシフェラーゼ活性を、市販のルシフェラーゼレポーターアッセイキット（cat# E4550, Promega, Madison, WI）を製造元のプロトコルにしたがい用いて測定した。ActRIIA + ALK4またはActRIIB + AlK4またはActRIIA/IIB + ALK4でトランスフェクトされたこれらのC2C12/pMARE-luc細胞の安定株を使用し、以下の手順にしたがい活性を測定した。レポーター細胞を96ウェル培養物にプレーティングした。上記のデュアル受容体抗体の希釈物を用いるスクリーニングを、4 nMミオスタチンまたはアクチビンで固定した濃度を用いて行った。ミオスタチンまたはアクチビンを、様々な濃度のデュアル受容体抗体とともにプレインキュベートした。ミオスタチンまたはアクチビン活性は、処置した培養物中のルシフェラーゼ活性を決定することによって測定した。IC50値を、抗体ごとに決定した。
【０２１８】
KinExaにおいて測定されたhuActRIIA-huFcに対するM43、M37およびM25の親和性は＜1 pMであり、これはその親分子R31-1の少なくとも1000倍の改善である。huActRIIB-huFcに対するM43の親和性は＜1 pMであり、これは約10倍の改善である（表3を参照のこと）。M43のHCおよびLCの配列が図2Aに提供されている。
【０２１９】
（表３）
2015525230.tif 000009
【０２２０】
これにより、ActRIIAおよびActRIIBに対して強い親和性を示したデュアル受容体ブロック抗体M43およびいくつかのその他の関連抗体分子を得た。
【０２２１】
このレポーター細胞システムを用いた細胞アッセイは、デュアル受容体抗体がActRIIBおよびActRIIAの両方の受容体により媒介されるミオスタチンおよびアクチビンの両方のリガンドのシグナルを強くブロックすることができることを実証した。M43を単独で細胞レポーターアッセイに添加した場合、非常に高い濃度でさえもシグナルを誘発しなかった。
【０２２２】
さらなる結合アッセイにより、親抗体と変異抗体（M10、M25、M37、M39、M43）の結合活性を比較した（図7B〜7F）。これらの図において、親の31-1（図7A）と5個の変異体のhuActRIIBおよびhuActRIIA結合比較を比較した。100 nM Abサンプルを、特定の密度になるまで、固定されたマウス抗ヒトIgG2、3、4 Ab表面に注入した。hFc(G1)-hActR2A(WT)、hActR2B(R64)-hFc(G1、hActR2A(E119Q)-hFc(G1)をそれぞれ3分間、その後に緩衝液を10分超、表面に流した。Y軸は、受容体結合反応（RU）を示し、時間（秒）がX軸に示されている。
【０２２３】
重要なことに、細胞ベースのアッセイは、図3に示されるように、ActRIIB受容体の本来のアゴニスト活性を示さなかった。したがってM43は、抗体媒介受容体活性化の活性を有していない。
【０２２４】
実施例3：体重および骨格量に対するM43の効果
インビボでM43は、ヌードマウスにおける体重および骨格筋量に対するM43の用量依存的な効果を示した（図4A〜4C）。3 mg、10 mgおよび30 mg/kgにおける体重、除脂肪量の変化および腓腹筋に対する効果が図に示されている。差は、すべての用量において有意であった。
【０２２５】
インヒビン-αノックアウトマウスにおけるヘッド・ツー・ヘッド（head to head）インビボ比較研究もまた、M43がActRIIB-Fcと同等の強い筋肉成長効果を有することを示した（図5A〜5D）。効果は、体重、体組成および筋肉量に関して確認された。
【０２２６】
ヌードマウスにおいてM43の活性をミオスタチンペプチボディおよびアクチビン受容体ポリペプチドと比較するさらなる研究を行った。体重変化に対する結果が図5A〜5Bに示されている。図6A〜Bにおいても、M43が対照に対する体重および除脂肪体重量の変化に関してミオスタチンペプチボディおよび可溶性アクチビン受容体に匹敵することを見ることができる。
【０２２７】
M43（および関連抗体）の同定ならびにインビトロおよびインビボデータは、ActRIIBおよびActRIIBの両方の受容体をブロックすることで筋肉成長効果が達成されることを明確に示している。ActRIIBおよびActRIIAタンパク質（それらのECD）の間の相同性の低さに鑑みて、アンタゴニスト性デュアル受容体モノクローナル抗体としてのM43の発見は予想外であった。M43は、完全ヒト抗体であり、間違いなく潜在的な臨床用途を有している。この経路のブロッカーとして、M43は、ミオスタチンシグナルを減弱化させるだけでなく、その増加が疾患の病理に関連づけられているアクチビンおよびその他のリガンド、例えばGDF-11のシグナルを阻害することができる。
【０２２８】
例えば、アクチビンAの発現の増加は、多くの癌と関連する。さらに、最近、アクチビンAの上昇が腫瘍微小環境における血管新生因子の過剰産生を強く媒介し、（sActRIIBまたは抗アクチビン抗体による）その遮断が腫瘍の進行を劇的に遅らせることから、アクチビンAが特定の腫瘍のインビボ成長の強力な刺激因子であることが、動物腫瘍モデルを用いて発見された。さらに、アクチビンAの過剰産生がマウスにおいて心不全を引き起こし、その遮断が心臓機能不全を好転させた。したがって、M43はまた、筋肉の喪失の処置を超える潜在的な臨床用途を有していると考えられる。
【０２２９】
本明細書を通して、様々な刊行物、特許および特許出願が参照されている。これらの書類の開示の全体が参照により本願に組み入れられる。しかし、そのような書類の参照は、そのような書類が本願に対する先行技術であることの承認とみなされるべきではない。さらに、書類が参考により組み入れられ得るということだけでは、これは必ずしも本願がその書類の内容と完全に一致することを示すものではない。
【図１】
2015525230.tif 000011
【図２Ａ】
2015525230.tif 000012
【図２Ｂ】
2015525230.tif 000013
【図２Ｃ】
2015525230.tif 000014
【図２Ｄ】
2015525230.tif 000015
【図３】
2015525230.tif 000016
【図４】
2015525230.tif 000017
【図５】
2015525230.tif 000018
【図６】
2015525230.tif 000019
【図７Ａ】
2015525230.tif 000020
【図７Ｂ】
2015525230.tif 000021
【図７Ｃ】
2015525230.tif 000022
【図７Ｄ】
2015525230.tif 000023
【図７Ｅ】
2015525230.tif 000024
【図７Ｆ】
2015525230.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成27年3月4日(2015.3.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
配列表の参照
本明細書はEFS-Web経由でASCIIフォーマットにて提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。2013年6月20日に作成された前記ASCIIコピーは24078PCT_CRF_sequencelisting.txtという名称であり、サイズは56,226バイトである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３２】
別の局面において、アクチビンが過剰発現される状態をそのような処置を必要とする対象において処置する方法であって、デュアルアクチビン受容体抗原結合タンパク質またはポリペプチドを含む有効量の治療組成物を対象に投与する工程を含む方法、が提供される。1つの態様において、疾患は癌である。別の局面において、本発明は、代謝障害を処置する方法であって、そのような処置を必要とする対象に、抗原結合タンパク質またはポリペプチドを含む治療組成物を投与する工程を含み、代謝障害が骨量減少、糖尿病、肥満、耐糖能異常、高血糖および代謝症候群から選択される方法、が提供される。
[本発明1001]
SEQ ID NO:15に対して少なくとも97％の同一性を有する第1のポリペプチドおよびSEQ ID NO:16に対して少なくとも97％の配列同一性を有する第2のポリペプチドを含む、単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1002]
SEQ ID NO:15およびSEQ ID NO:16を含む、単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1003]
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合する、本発明1001または1002の単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1004]
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合し、かつ結合すると筋肉の成長を刺激する、本発明1001または1002の抗原結合タンパク質。
[本発明1005]
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、本発明1001または1002の抗原結合タンパク質。
[本発明1006]
マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、またはマウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントである、本発明1001または1002の抗原結合タンパク質。
[本発明1007]
2つのアクチビン受容体に結合する、単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1008]
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合する、本発明1007の単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1009]
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合し、かつ結合すると筋肉の成長を刺激する、本発明1007の抗原結合タンパク質。
[本発明1010]
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、本発明1007の抗原結合タンパク質。
[本発明1011]
マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、またはマウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントである、本発明1007の抗原結合タンパク質。
[本発明1012]
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8を含む、単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1013]
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合する、本発明1012の単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1014]
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合し、かつ結合すると筋肉の成長を刺激する、本発明1012の抗原結合タンパク質。
[本発明1015]
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、本発明1012の抗原結合タンパク質。
[本発明1016]
マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、またはマウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントである、本発明1012の抗原結合タンパク質。
[本発明1017]
SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4およびSEQ ID NO:5を含む、単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1018]
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合する、本発明1017の単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1019]
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合し、かつ結合すると筋肉の成長を刺激する、本発明1017の抗原結合タンパク質。
[本発明1020]
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、本発明1017の抗原結合タンパク質。
[本発明1021]
マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、またはマウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントである、本発明1017の抗原結合タンパク質。
[本発明1022]
SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7およびSEQ ID NO:8を含む、単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1023]
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合する、本発明1022の単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1024]
SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:18に特異的に結合し、かつ結合すると筋肉の成長を刺激する、本発明1022の抗原結合タンパク質。
[本発明1025]
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、本発明1022の抗原結合タンパク質。
[本発明1026]
マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、またはマウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントである、本発明1022の抗原結合タンパク質。
[本発明1027]
本発明1001、1002、1007、1012、1017、1022および1052のいずれかの抗原結合タンパク質をコードする、単離された核酸。
[本発明1028]
本発明1027の核酸を含む、発現ベクター。
[本発明1029]
本発明1028のベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1030]
真核生物細胞または原核生物細胞である、本発明1029の宿主細胞。
[本発明1031]
真核生物細胞が哺乳動物細胞である、本発明1030の宿主細胞。
[本発明1032]
少なくともSEQ ID NO:3〜5またはSEQ ID NO:4〜6を含む、単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1033]
抗原結合タンパク質を製造する方法であって、核酸を発現させ抗体を産生させるのに適した条件下で本発明1029の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
[本発明1034]
宿主細胞の培養物から抗体を回収する工程をさらに含む、本発明1033の方法。
[本発明1035]
本発明1001、1002、1007、1012、1017、1022および1052のいずれかの抗原結合タンパク質ならびに薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む、組成物。
[本発明1036]
ミオスタチン、アクチビンAまたはGDF-11活性を減少させるまたはブロックする方法であって、そのような処置を必要とする対象に、治療有効量の、本発明1001、1002、1007、1012、1017、1022もしくは1052のいずれかの抗原結合タンパク質または該抗原結合タンパク質を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
[本発明1037]
そのような処置が必要な対象において除脂肪筋肉量を増大させるかまたは脂肪量に対する除脂肪筋肉量の比を増大させる方法であって、そのような処置を必要とする対象に、有効量の、本発明1001、1002、1007、1012、1017、1022もしくは1052のいずれかの抗原結合タンパク質または該抗原結合タンパク質を含む薬学的組成物を投与する工程を含む、方法。
[本発明1038]
筋消耗疾患をそのような障害に罹患した対象において処置または予防する方法であって、本発明1001、1002、1007、1012、1017、1022または1052のいずれかの抗原結合ポリペプチドを含む有効量の治療組成物を対象に投与する工程を含む、方法。
[本発明1039]
筋消耗疾患が、癌性悪液質、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、うっ血性閉塞性肺疾患、慢性心不全、化学性悪液質（chemical cachexia）、HIV/AIDSに起因する悪液質、腎不全、尿毒症、関節リウマチ、加齢に伴うサルコペニア、加齢に伴う虚弱（age-related frailty）、臓器萎縮（organ atrophy）、手根管症候群、アンドロゲン欠乏または長時間の床上安静、脊髄損傷、発作、骨折、火傷、加齢もしくはインスリン抵抗性による不活動性に起因する筋消耗を含む、本発明1038の方法。
[本発明1040]
BIAcoreアッセイにおいてActRIIBに対して10 pMまたはそれ未満のKDを有する、本発明1001、1002、1007、1012、1017、1022および1052のいずれかの単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1041]
ActRIIBに対して1 pMまたはそれ未満のKDを有する、本発明1040の抗原結合タンパク質。
[本発明1042]
BIAcoreアッセイにおいてActRIIAに対して4 nMまたはそれ未満のKDを有する、本発明1001、1002、1007、1012、1017、1022および1052のいずれかの単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1043]
ActRIIAに対して1 pMまたはそれ未満のKDを有する、本発明1042の抗原結合タンパク質。
[本発明1044]
BIAcoreアッセイにおいてActRIIBおよびActRIIAに対して1 pMまたはそれ未満のKDを有する、抗原結合タンパク質。
[本発明1045]
細胞ベースのアッセイにおいてActRIIBに対して8 nmまたはそれ未満のIC50を有する、本発明1001、1002、1007、1012、1017、1022および1052のいずれかの単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1046]
ActRIIBに対して2 nMまたはそれ未満のIC50を有する、本発明1040の抗原結合タンパク質。
[本発明1047]
細胞ベースのアッセイにおいてActRIIAに対して2 nMまたはそれ未満のIC50を有する、本発明1001、1002、1007、1012、1017、1022および1052のいずれかの単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1048]
ActRIIAに対して1 nMまたはそれ未満のIC50を有する、本発明1042の抗原結合タンパク質。
[本発明1049]
細胞ベースのアッセイにおいてActRIIBに対して2 nMまたはそれ未満のIC50およびActRIIAに対して1 nMまたはそれ未満のIC50を有する、抗原結合タンパク質。
[本発明1050]
アンタゴニスト性デュアル受容体抗体である、本発明1001、1002、1007、1012、1017、1022および1052のいずれかの抗原結合タンパク質。
[本発明1051]
ヒト抗体である、本発明1050のアンタゴニスト性デュアル受容体抗体。
[本発明1052]
SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:17に特異的に結合する、本発明1007の単離された抗原結合タンパク質。
[本発明1053]
SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:17に特異的に結合し、かつ結合すると筋肉の成長を刺激する、本発明1052の抗原結合タンパク質。
[本発明1054]
モノクローナル抗体またはそのフラグメントである、本発明1052の抗原結合タンパク質。
[本発明1055]
マウス抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体、多特異性抗体またはマウス抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体もしくは多特異性抗体のフラグメントである、本発明1052の抗原結合タンパク質。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
本明細書で使用される場合、GDF-11は、Swissprotアクセッション番号O95390を有するBMP（骨形成タンパク質）ならびにそのタンパク質の変種および種ホモログを表す。GDF-11は、アミノ酸レベルでミオスタチンに対しておよそ90％の同一性を有する。GDF-11は、軸骨格の前方／後方パターン形成の調節に関与する（McPherron, et al., Nature Genet., 22(93): 260-264, (1999); Gamer, et al., Dev. Biol., 208(1):222-232, (1999)）が、生後の機能は知られていない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０４】
抗体をスクリーニングするため、ActRIIB（SEQ ID NO:33）（およびALK4、1型膜貫通受容体キナーゼ）もしくはActRIIA（およびALK4）またはActRIIBおよびActRIIA（SEQ ID NO:19）の両方（ならびにALK4）で安定的にトランスフェクトしたC2C12/PMARE-Luc細胞を含む細胞レポーターアッセイシステムを構築した。
2015525230.tif 000026
2015525230.tif 000027
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015525230000001.app
【国際調査報告】
2015525230.tif 000028
2015525230.tif 000029
2015525230.tif 000030
2015525230.tif 000031