(57)【要約】遺伝子型６  Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）のレプリコンが提供される。これらのレプリコンは、ＨＣＶのｉｎ  ｖｉｔｒｏで複製する能力を生じさせる適応的突然変異を含有する。遺伝子型６レプリコンを調製する方法と、これらのレプリコンを使用して抗ウイルス剤をスクリーニングする方法も提供される。本開示の一実施形態は、ＲＮＡ配列が、５’ＵＴＲと、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂのうち１種または複数をコードする配列と、３’ＵＴＲとを含む、真核細胞において複製することができる遺伝子型６  Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡ構築物を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞において複製することができる遺伝子型６  Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡ構築物であって、該ＲＮＡ配列が、５’ＵＴＲと、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂのうち１種または複数をコードする配列と、３’ＮＴＲとを含む、ＲＮＡ構築物。
【請求項２】
野生型と比較して、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂにおける適応的突然変異を含む、請求項１に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項３】
前記突然変異が、ＮＳ５Ａにおいて残基２３２にイソロイシンを含む、請求項２に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項４】
前記突然変異が、ＮＳ３において残基２７２にアルギニンもしくはＮＳ４において残基３４にアルギニンまたはこれらの組合せを含む、前記請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項５】
前記遺伝子型６  ＨＣＶが、遺伝子型６ａ  ＨＣＶである、前記請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項６】
選択のためのマーカー遺伝子をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項７】
前記マーカー遺伝子が、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子またはＲｌｕｃレポーター遺伝子である、請求項６に記載のＲＮＡ構築物。
【請求項８】
５’から３’へと、前記５’ＵＴＲと、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂをコードする配列と、前記３’ＵＴＲとを含む、前記請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物。
【請求項９】
前記請求項のいずれかに記載のＲＮＡ構築物に転写され得る、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載のＲＮＡ構築物を含むウイルス粒子。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載のＲＮＡ構築物または請求項９に記載のＤＮＡを含む、単離された細胞。
【請求項１２】
残基２３２にイソロイシンを含む、ＨＣＶ遺伝子型６のＮＳ５Ａタンパク質。
【請求項１３】
請求項１２に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号１の核酸配列、または配列番号１と少なくとも約９０％の配列同一性を有する核酸配列を含むポリヌクレオチドであって、
（ａ）イソロイシンとしてのＮＳ５Ａの残基２３２、
（ｂ）アルギニンとしてのＮＳ３の残基２７２、または
（ｃ）アルギニンとしてのＮＳ４Ａの残基３４
から選択される１種または複数の突然変異をコードするための１種または複数の置換をさらに含む、ポリヌクレオチド。
【請求項１５】
ＲＮＡまたはＤＮＡである、請求項１３または１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含むＲＮＡ構築物またはＤＮＡ構築物。
【請求項１７】
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項１６に記載のＲＮＡ構築物もしくはＤＮＡ構築物を含む細胞。
【請求項１８】
請求項１２に記載のタンパク質を特異的に認識する抗体。
【請求項１９】
請求項１３〜１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプライマー、プローブまたは増幅産物であって、少なくとも１５ヌクレオチドの長さであるプライマー、プローブまたは増幅産物。
【請求項２０】
遺伝子型６  Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを含む単離された細胞であって、該ＲＮＡが該細胞において複製する、細胞。
【請求項２１】
前記細胞において、前記ＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物が存在しない、請求項２０に記載の細胞。
【請求項２２】
少なくとも１０コピーの前記ＲＮＡを含む、請求項２０または２１に記載の細胞。
【請求項２３】
前記ＲＮＡが、サブゲノムＨＣＶ配列を含む、請求項２０〜２２のいずれかに記載の細胞。
【請求項２４】
哺乳動物細胞である、請求項２０〜２３のいずれかに記載の細胞。
【請求項２５】
ヘパトーマ細胞である、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２６】
Ｈｕｈ７  １Ｃ細胞である、請求項２４に記載の細胞。
【請求項２７】
遺伝子型６  ＨＣＶウイルスＲＮＡの、真核細胞において複製する能力を改善する方法であって、
（ａ）ＮＳ５Ａの残基２３２をイソロイシンに置換するステップ、
（ｂ）ＮＳ３の残基２７２をアルギニンに置換するステップ、または
（ｃ）ＮＳ４Ａの残基３４をアルギニンに置換するステップ
のうち１または複数を含む、方法。
【請求項２８】
遺伝子型６  ＨＣＶの複製または活性を阻害する薬剤を同定する方法であって、請求項１〜８のいずれかに記載の細胞を候補薬剤と接触させるステップを含み、複製の減少または前記ＲＮＡにコードされるタンパク質の活性の減少が、該薬剤が該ＨＣＶの複製または活性を阻害することを示す、方法。
【請求項２９】
前記タンパク質が、プロテアーゼである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＲＮＡの複製または前記ＲＮＡにコードされる前記タンパク質の活性を測定するステップをさらに含む、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
遺伝子型６  ＨＣＶの活性を阻害する薬剤を同定する方法であって、請求項１〜８のいずれかに記載の細胞の溶解物を候補薬剤と接触させるステップを含み、前記ＲＮＡにコードされるタンパク質の活性の減少が、該薬剤が該ＨＣＶの活性を阻害することを示す、方法。
【請求項３２】
前記タンパク質が、プロテアーゼである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＲＮＡの複製または前記ＲＮＡにコードされる前記タンパク質の活性を測定するステップをさらに含む、請求項３１または３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６１／７２３，６７２号の優先権を請求し、これは、すべての目的について、その全体が本明細書において援用される。
【０００２】
本開示は、遺伝子型６のＣ型肝炎レプリコンならびに該レプリコンを調製および使用する方法を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
技術水準
慢性Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染は、依然として、世界中で推計１億６千万人が感染する顕著な世界的規模の健康（heath）上の負担である。現在の標準治療は、２４〜４８週間にわたるペグ化インターフェロン（ＰｅｇＩＦＮ）プラスリバビリン（ＲＢＶ）である。このレジメンの部分的な有効性および乏しい耐容性のため、新たな抗ウイルス剤の発見および開発が強く探究されてきた。近年、これらの努力は、慢性遺伝子型１  ＨＣＶ感染の処置のための、ペグ化インターフェロンおよびリバビリンと組み合わせた使用のための２種のＮＳ３プロテアーゼ阻害剤（ボセプレビルおよびテラプレビル）のＦＤＡ承認へと実を結んだ。多くの他の阻害剤が、先進臨床開発中であるが、その大部分は、遺伝子型１感染を処置するために開発されている。
【０００４】
ＨＣＶは、並外れた遺伝的多様性を呈するプラス鎖ＲＮＡウイルスである。６種の主要遺伝子型（すなわち、遺伝子型１〜６）が、複数のサブタイプ（例えば、遺伝子型１ａ、１ｂ、１ｃ等）と共に報告された。遺伝子型１、２および３は、世界規模で分布している。遺伝子型１ａまたは１ｂは、概して、北米、南米、欧州およびアジアにおいて優勢である。しかし、遺伝子型２および３が、一般的であり、これらの地域の多くにおける感染の２０〜５０％を構成し得る。遺伝子型４ａは、中東およびアフリカ諸国において優勢である；エジプトの人口の最大１５％が、ＨＣＶに感染し、感染の９３％が、遺伝子型４である。遺伝子型５が、南アフリカにおいて蔓延している一方、遺伝子型６は、アジアにおいて最も一般的である。殆どの大陸および国は、「優占」遺伝子型を有するが、感染集団は、ほぼ普遍的に、複数の遺伝子型の混合物で構成されている。さらに、ＨＣＶ感染の地理的分布および多様性（疫学）は、大規模移民および広範な静脈内薬物使用により、継続的に進化している。例えば、遺伝子型４ａは、中欧および北欧へと著しく伝播した。個々の遺伝子型が、現在の標準治療を含む直接的な抗ウイルス薬および免疫調節療法の両方に対し異なって応答することが十分に裏付けされたため、これは臨床課題を提示する。
【０００５】
ＨＣＶレプリコンは、ＨＣＶゲノムに由来する自己複製するＲＮＡ配列であり、分子ウイルス学研究および創薬の両方を牽引するものとして機能してきた。今日まで、レプリコンは、２種の遺伝子型および３種のサブタイプ（遺伝子型１ａ、１ｂおよび２ａ）から確立された。これらのレプリコンは、新規阻害剤クラスの同定、臨床候補の最適化および臨床抵抗性の特徴付けを含む、創薬および医薬開発の複数の側面において不可欠であった。近年、あらゆる主要なＨＣＶ遺伝子型に対し活性を有する次世代の薬物の開発への関心が高まってきた。理想的には、「汎遺伝子型（ｐａｎ−ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ）」薬物およびレジメンの承認は、ＨＣＶの処置を大幅に単純化するであろう。
【０００６】
遺伝子型６は、東南アジアおよび中国南部におけるその高いＨＣＶ疾患負担のため（３千２百万を超える人々が感染）、慢性ＨＣＶ感染に関連する世界的に満たされていない医学上の必要性の相当な部分を表す。さらに、北米および欧州とは対照的に、汚染された血液製剤への曝露および静脈内薬物使用のより高いリスクのため、ＨＣＶ感染の新たな発生率も、これらの領域において依然として高い。
【０００７】
現在、ＨＣＶ遺伝子型６患者の標準処置は、依然として、２４〜４８週間のＰｅｇＩＦＮおよびＲＢＶである。遺伝子型６感染は、遺伝子型１よりもＰｅｇＩＦＮ／ＲＢＶに対する応答性が高いが（それぞれ持続性ウイルス学的応答８６％および５２％）、現在の標準治療は、未だ部分的に有効でしかなく、多くの患者において禁忌とされる。遺伝子型６  ＨＣＶ感染を処置するための直接作用型抗ウイルス薬（ＤＡＡ；すなわち、ボセプレビルでもテラプレビルでもない）は承認されていない。多くのＨＣＶ  ＤＡＡは、先進臨床開発中であるが、遺伝子型６感染を処置するために開発されているものは殆どない。
【０００８】
遺伝子型６は、最も遺伝的に多様なＨＣＶ遺伝子型であり、少なくとも２３種のサブタイプが現在確認されており、新たなサブタイプが継続的に同定されることが予想される。遺伝子型間および遺伝子型内における高いＨＣＶ遺伝的多様性のために、個々のＨＣＶ遺伝子型が、直接作用型抗ウイルス薬に対し異なって応答することが十分に裏付けされた。例えば、テラプレビルを含む基本的にあらゆるＨＣＶ  ＮＳ３プロテアーゼ阻害剤は、遺伝子型１に対し強力であるが、ＮＳ３におけるＱ１６８多型のために、遺伝子型３に対し有意に低下した抗ウイルス活性を有する。ＮＳ５Ａ阻害剤に関して、第１世代化合物は、多くの場合、効率的に遺伝子型２ａ  ＪＦＨ−１ウイルスを阻害するが、ＮＳ５ＡにおけるＭ３１多型をコードする主要遺伝子型２ウイルス集団に対しはるかにより弱い効力（＞２００倍）を有する。一般的な遺伝子型１系統と比較して限定されたウイルス学的特徴付けと組み合わせた、遺伝子型６の極度の遺伝的多様性は、この遺伝子型に対するＤＡＡ開発に重大な課題を生じさせる。この課題に対応するには、新たな治療の同定および開発のための効率的な遺伝子型６ツールの確立が必要とされるであろう。
【０００９】
汎遺伝子型処置レジメンの探究における鍵となるステップは、あらゆる主要遺伝子型およびサブタイプの研究を可能にするｉｎ  ｖｉｔｒｏツールの開発であろう。しかし、追加的な主要遺伝子型（すなわち、遺伝子型１ａ、１ｂまたは２ａ以外のもの）の配列に由来するレプリコンは作製されていない。特に、遺伝子型６がＨＣＶ感染の最大５０％を構成し得る特に東南アジアおよび中国南部における遺伝子型（ＧＴ）６  Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の世界規模の蔓延にもかかわらず、この遺伝子型を処置するための直接作用型抗ウイルス薬は、承認されておらず、完全ゲノムＧＴ６  ＨＣＶレプリコンは、記載されていなかった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
サブゲノム遺伝子型６  ｃＤＮＡの転写およびＨＣＶ許容細胞株へのエレクトロポレーションにより、遺伝子型６レプリコンを安定的に複製するクローン細胞株が得られることが発見された。野生型ウイルスと比較した適応的突然変異が、これらのクローンから同定された。これらの突然変異が部位特異的突然変異誘発によって操作され、細胞株へと導入されると、結果としてＨＣＶ遺伝子型６複製が起こる。
【００１１】
遺伝子型６のこれらの適応的突然変異は、ＮＳ５ＡにおけるＳ２３２Ｉ、ＮＳ３におけるＫ２７２ＲおよびＮＳ４ＡにおけるＫ３４Ｒを含んだ。頑強な遺伝子型６レプリコン系の確立は、創薬および医薬開発努力を促進するための強力なツールをもたらす。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
したがって、本開示の一実施形態は、ＲＮＡ配列が、５’ＵＴＲと、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂのうち１種または複数をコードする配列と、３’ＵＴＲとを含む、真核細胞において複製することができる遺伝子型６  Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡ構築物を提供する。
【００１３】
一部の態様において、構築物は、残基２３２におけるイソロイシンである、ＮＳ５Ａにおける突然変異を含む。一部の態様において、構築物は、Ｓ２３２Ｉ突然変異の代わりにまたはそれに加えて、ＮＳ３の残基２７２におけるアルギニンへの突然変異、および／またはＮＳ４Ａの残基３４におけるアルギニンへの突然変異を含む。一部の態様において、構築物は、サブゲノムＨＣＶレプリコンまたは全長ＨＣＶレプリコンである。
【００１４】
さらに、ＲＮＡ構築物へと転写されるＤＮＡ、ＲＮＡ構築物を含むウイルス粒子およびこのようなＤＮＡまたはＲＮＡを含有する細胞も提供される。一態様において、構築物は、配列番号１の核酸配列、または配列番号１に対し少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する核酸配列を含み、ポリヌクレオチドは、適応的突然変異のうち１種または複数をコードするための１種または複数の置換をさらに含む。適応的突然変異を有する構築物またはこれをコードするＤＮＡに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプライマー、プローブまたは増幅産物であって、少なくとも１５ヌクレオチドの長さであるプライマー、プローブまたは増幅産物がさらに提供される。
【００１５】
一実施形態において、対応する適応的突然変異のうち１種または複数を含む、個々のＮＳ３、ＮＳ４ＡまたはＮＳ５Ａタンパク質も提供される。これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびこれらのタンパク質を特異的に認識する抗体も提供される。
【００１６】
別の実施形態において、本開示は、細胞において複製する遺伝子型６  Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを含む、単離された細胞を提供する。一態様において、細胞において、ＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物は存在しない。別の態様において、細胞は、少なくとも１０コピー、あるいは少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８または１×１０９コピーのＲＮＡを含む。このような態様のいずれかにおいて、ＲＮＡは、サブゲノムＨＣＶ配列または全長ＨＣＶ配列であり得、上述の適応的突然変異のうち１種または複数を含むことができる。
【００１７】
一態様において、細胞は、例えば、ヘパトーマ細胞、特に、Ｈｕｈ７  １Ｃ細胞であり得る哺乳動物細胞である。
【００１８】
遺伝子型６  ＨＣＶウイルスＲＮＡの、真核細胞において複製する能力を改善する方法であって、（ａ）ＮＳ５Ａの残基２３２をイソロイシンに置換するステップ、（ｂ）ＮＳ３の残基２７２をアルギニンに置換するステップ、または（ｃ）ＮＳ４Ａの残基３４をアルギニンに置換するステップのうち１または複数を含む方法も提供される。
【００１９】
さらにまた、一実施形態において、遺伝子型６  ＨＣＶの複製または活性を阻害する薬剤を同定する方法であって、上述の実施形態のいずれかに記載の細胞を候補薬剤と接触させるステップを含み、複製の減少またはＲＮＡにコードされるタンパク質の活性の減少が、薬剤がＨＣＶの複製または活性を阻害することを示す、方法が提供される。あるいは、この方法は、上述の実施形態のいずれかに記載の細胞の溶解物を候補薬剤と接触させるステップを含み、ＲＮＡにコードされるタンパク質の活性の減少は、薬剤がＨＣＶの活性を阻害することを示す。
【００２０】
本開示は、添付の図面と併せて読むと、以下の詳細な説明により最も良く理解される。図面には、以下の図が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１−１】図１は、遺伝子型６ａサブゲノムレプリコンのヌクレオチド（ｎｔ）配列を示す（８０２１塩基対、配列番号１）。レプリコン配列は、欧州ＨＣＶデータベースにおいて利用できる１６種の遺伝子型６ａゲノム（表１）のコンセンサス配列に基づく。このレプリコンは、以下の１２種のエレメントを含有する：１）ＧＴ６ａ  ５’−ＵＴＲ：１〜３４２ｎｔ；２）ＧＴ６ａ、コアの最初の４８ヌクレオチド：３４３〜３９０ｎｔ；３）ＡｓｃＩリンカー：３９１〜３９９ｎｔ；４）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｅｏ）遺伝子：４００〜１１９４ｎｔ；５）ＦｓｅＩリンカー：１１９５〜１２１２ｎｔ；６）脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ：１２１３〜１８１５ｎｔ；７）ＧＴ６ａ  ＮＳ３：１８１６〜３７１１ｎｔ；８）ＧＴ６ａ  ＮＳ４Ａ：３７１２〜３８７３ｎｔ；９）ＧＴ６ａ  ＮＳ４Ｂ：３８７４〜４６５６ｎｔ；１０）ＧＴ６ａ  ＮＳ５Ａ：４６５７〜６００９ｎｔ；１１）ＧＴ６ａ  ＮＳ５Ｂ：６０１０〜７７８２ｎｔ；および１２）ＧＴ２ａ  ＪＦＨ−１  ３’−ＵＴＲ：７７８３〜８０２１。
【図１−２】図１は、遺伝子型６ａサブゲノムレプリコンのヌクレオチド（ｎｔ）配列を示す（８０２１塩基対、配列番号１）。レプリコン配列は、欧州ＨＣＶデータベースにおいて利用できる１６種の遺伝子型６ａゲノム（表１）のコンセンサス配列に基づく。このレプリコンは、以下の１２種のエレメントを含有する：１）ＧＴ６ａ  ５’−ＵＴＲ：１〜３４２ｎｔ；２）ＧＴ６ａ、コアの最初の４８ヌクレオチド：３４３〜３９０ｎｔ；３）ＡｓｃＩリンカー：３９１〜３９９ｎｔ；４）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｅｏ）遺伝子：４００〜１１９４ｎｔ；５）ＦｓｅＩリンカー：１１９５〜１２１２ｎｔ；６）脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ：１２１３〜１８１５ｎｔ；７）ＧＴ６ａ  ＮＳ３：１８１６〜３７１１ｎｔ；８）ＧＴ６ａ  ＮＳ４Ａ：３７１２〜３８７３ｎｔ；９）ＧＴ６ａ  ＮＳ４Ｂ：３８７４〜４６５６ｎｔ；１０）ＧＴ６ａ  ＮＳ５Ａ：４６５７〜６００９ｎｔ；１１）ＧＴ６ａ  ＮＳ５Ｂ：６０１０〜７７８２ｎｔ；および１２）ＧＴ２ａ  ＪＦＨ−１  ３’−ＵＴＲ：７７８３〜８０２１。
【００２２】
【図２】図２Ａ〜Ｃは、遺伝子型６ａレプリコン構築物の模式図を提示する。遺伝子型６ａサブゲノムレプリコンは、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ遺伝子（ｎｅｏ）（Ａ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）−ｎｅｏ融合レポーター（Ｂ）またはポリオウイルスＩＲＥＳ（ＰＩ）駆動Ｒｌｕｃレポーター（Ｃ）をコードする。合成されたｎｅｏレプリコンは、５’から３’にかけて以下のエレメントを取り込んだ：ＧＴ６ａ  ５’−ＵＴＲ；Ｎｅｏレポーター遺伝子；ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ；ＮＳ５Ａ突然変異（Ｓ２３２Ｉ）を含むＧＴ６ａコンセンサス配列のＮＳ３〜ＮＳ５Ｂポリタンパク質領域；およびＧＴ２ａ  ＪＦＨの３’−ＵＴＲ。黒く塗った（ｓｏｌｉｄ  ｄａｒｋ）ボックスは、ＧＴ６ａコア配列を示す。斜線ボックスは、ＨＣＶポリタンパク質配列を示す。十字形は、ＮＳ５ＡにおけるＳ２３２Ｉ突然変異を示す。５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）およびＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを示す。
【００２３】
【図３】図３は、新規レプリコン単離のための戦略を図解する。
【００２４】
【図４】図４は、遺伝子型６ａレプリコンの安定的コロニー形成が、ＮＳ５Ａ突然変異Ｓ２３２Ｉを必要とすることを示すチャートを提示する。
【００２５】
【図５】図５は、ＧＴ６ａレプリコン細胞における高いＮＳ３プロテアーゼ活性を示すチャートを提示する。
【００２６】
【図６】図６は、ＧＴ６ａレプリコン細胞における高いＮＳ５Ａ発現を示す像を提示する。
【００２７】
【図７】図７は、ＮＳ３突然変異およびＮＳ４Ａ突然変異が、ＧＴ６ａレプリコン複製を増強したことを示す像を含む。
【００２８】
【図８】図８は、ＮＳ３突然変異およびＮＳ４Ａ突然変異が、高いＧＴ６ａ  ＨＣＶ複製を付与し、１Ｃが、Ｌｕｎｅｔ細胞よりも許容的であることを示す。
【００２９】
【図９】図９は、ＮＳ３適応的突然変異およびＮＳ４Ａ適応的突然変異が、効率的なＧＴ６ａ  ＨＣＶ複製を付与するためにＮＳ５Ａ突然変異Ｓ２３２Ｉを必要とすることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
本開示をより詳細に説明する前に、先ず以下の用語を定義する。
【００３１】
本開示は、記載されている特定の実施形態に限定されない（そのため当然ながら変動し得る）ことを理解されたい。本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲のみにより限定されるため、本明細書に使用されている用語法が、特定の実施形態を記載することのみを目的としており、限定を意図していないことも理解されたい。
【００３２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されている通り、文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、単数形（「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」）が、複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。よって、例えば、「１つの糸（ａ  ｔｈｒｅａｄ）」の言及は、複数の糸を含む。
【００３３】
１．定義
他に規定がなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書において使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有する。
【００３４】
本明細書において使用される場合、用語「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、組成物および方法が、列挙されている要素を含むが、それ以外を除外しないことを意味することが意図されている。「から本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用される場合、記述された目的のための組合せに対しいずれか本質的な意義を有する他の要素の除外を意味するものとする。よって、本明細書に定義されている要素から本質的になる組成物は、請求されている開示の基本的および新規特徴（複数可）に実質的に影響を与えない他の材料またはステップを除外しない。「からなる」は、他の成分の微量元素を超えるものおよび実質的方法ステップの除外を意味するものとする。これら移行句のそれぞれによって定義される実施形態は、本開示の範囲内に収まる。
【００３５】
用語「約」は、数字表記、例えば、範囲を含む温度、時間、量および濃度の前に使用される場合、（＋）または（−）１０％、５％または１％変動し得る近似値を示す。
【００３６】
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、互換的に使用されており、その最も広い意味において、２個以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸アナログまたはペプチド模倣物の化合物を指す。サブユニットは、ペプチド結合によって連結することができる。別の実施形態において、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテル等によって連結することができる。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含有する必要があり、アミノ酸の最大数に制約は設けられておらず、タンパク質またはペプチドの配列を含むことができる。本明細書において使用される場合、用語「アミノ酸」は、グリシンならびにＤおよびＬ光学異性体の両方、アミノ酸アナログおよびペプチド模倣物を含む、天然アミノ酸および／または非天然アミノ酸または合成アミノ酸のいずれかを指す。天然起源のアミノ酸の一文字および三文字の略語を下に示す。３個以上のアミノ酸のペプチドは、ペプチド鎖が短ければオリゴペプチドと一般的に呼ばれる。ペプチド鎖が長ければ、ペプチドは、ポリペプチドまたはタンパク質と一般的に呼ばれる。
【表Ａ】
2015534821.tif 000003
【００３７】
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用されており、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらのアナログのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドの多量体型を指す。ポリヌクレオチドは、いずれかの三次元構造を有することができ、公知または未知のいずれかの機能を実行し得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いずれかの配列の単離されたＤＮＡ、いずれかの配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログなどの修飾ヌクレオチドを含むことができる。ヌクレオチド構造に対する修飾は、存在するのであれば、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に与えることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識構成成分とのコンジュゲーション等により、重合後にさらに修飾することができる。この用語は、二本鎖および一本鎖分子の両方も指す。他に指定または要求がなければ、ポリヌクレオチドである本発明のいずれかの実施形態は、二本鎖型および二本鎖型を形成することが公知または予測される２本の相補的一本鎖型のそれぞれの両方を包含する。
【００３８】
ポリヌクレオチドは、４種のヌクレオチド塩基：アデニン（Ａ）；シトシン（Ｃ）；グアニン（Ｇ）；チミン（Ｔ）；およびポリヌクレオチドがＲＮＡの場合はチミンに代えてウラシル（Ｕ）の特定の配列で構成される。よって、用語「ポリヌクレオチド配列」は、ポリヌクレオチド分子のアルファベット表記である。このアルファベット表記は、中央処理装置を有するコンピュータにおけるデータベースに入力し、機能ゲノミクスおよび相同性検索などのバイオインフォマティクスの適用に使用することができる。
【００３９】
「相同性」または「同一性」または「類似性」は、２種のペプチド間または２種の核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、比較目的でアライメントされ得る各配列における位置を比較することにより決定することができる。比較されている配列における位置が、同じ塩基またはアミノ酸によって占められる場合、これら分子は、該位置において相同である。配列間の相同性の程度は、これら配列によって共有されるマッチングまたは相同位置の数の関数である。「無関係」または「非相同」配列は、本発明の配列の１種と、４０％未満の同一性、あるいは２５％未満の同一性を共有する。一実施形態において、相同ペプチドは、適応的突然変異のうち１種または複数を含む、記載されているものと同じ機能的特徴を共有するペプチドである。
【００４０】
ポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域（あるいはポリペプチドまたはポリペプチド領域）は、別の配列に対しある一定のパーセンテージ（例えば、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％）の「配列同一性」を有し、これは、アライメントされると、該パーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が、２配列の比較において同じになることを意味する。このアライメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ausubelら編（２００７年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙに記載のものを使用して決定することができる。好ましくは、デフォルトパラメータがアライメントのために使用される。アライメントプログラムの１種は、デフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴである。特に、プログラムは、以下のデフォルトパラメータを使用したＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰである：遺伝暗号＝標準；フィルタ＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；予想＝１０；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述＝５０配列；ソート法＝ＨＩＧＨ  ＳＣＯＲＥ；データベース＝非冗長、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ  ＣＤＳ翻訳＋ＳｗｉｓｓＰｒｏｔｅｉｎ＋ＳＰｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細は、以下のインターネットアドレスに見出すことができる：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi、２０１１年７月１５日に最終アクセス。生物学的に均等なポリヌクレオチドは、特定のパーセント相同性を有し、同じまたは同様の生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。
【００４１】
用語「核酸のホモログ」は、核酸またはその補体のヌクレオチド配列とある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を指す。二本鎖核酸のホモログは、その補体とある程度の相同性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を含むことが意図されている。一態様において、核酸のホモログは、核酸またはその補体にハイブリダイズすることができる。
【００４２】
「遺伝子」は、転写および翻訳された後の特定のポリペプチドまたはタンパク質をコードすることができる、少なくとも１個のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するポリヌクレオチドを指す。本明細書に記載されているポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列のいずれかを使用して、これらが関連する遺伝子のより大型の断片または全長コード配列を同定することができる。より大型の断片配列を単離する方法は、当業者に公知である。
【００４３】
用語「発現する」は、遺伝子産物の産生を指す。
【００４４】
本明細書において使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡへと転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質へと翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドが、ゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含むことができる。
【００４５】
用語「コードする」は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリペプチドを「コードする」とされるポリヌクレオチドを指し、その天然状態において、あるいは当業者に周知の方法によって操作されると、転写および／または翻訳されて、ｍＲＮＡもしくはポリペプチドおよび／またはそれらの断片を産生することができる。アンチセンス鎖は、このような核酸の補体であり、コード配列は、それから推定することができる。
【００４６】
「真核細胞」は、モネラ界を除くあらゆる生物界を含む。これらは、膜結合型の核により容易に区別することができる。動物、植物、真菌および原生生物は、真核生物またはその細胞が内膜および細胞骨格によって複雑な構造に組織化された生物である。最も特徴的な膜結合型構造は、核である。真核生物宿主は、例えば、酵母、高等植物、昆虫および哺乳動物細胞を含む、あるいは、上述の原核細胞に由来する。非限定的な例として、サル、ウシ、ブタ、マウス、ラット、鳥類、爬虫類およびヒトが挙げられる。
【００４７】
本明細書において使用される場合、「抗体」は、抗体全体およびそのいずれかの抗原結合性断片または単鎖を含む。よって、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の少なくとも一部分を含む分子を含有するいずれかのタンパク質またはペプチドを含む。このような例として、重鎖もしくは軽鎖の相補性決定領域（ＣＤＲ）またはそのリガンド結合部分、重鎖可変領域または軽鎖可変領域、重鎖定常領域または軽鎖定常領域、フレームワーク（ＦＲ）領域あるいはこれらのいずれかの部分、あるいは結合タンパク質の少なくとも一部分が挙げられるがこれらに限定されない。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、いずれかの適した生物学的供給源、例えば、マウス、ラット、ヒツジおよびイヌから単離することができる。
【００４８】
用語「ポリクローナル抗体」または「ポリクローナル抗体組成物」は、本明細書において、異なるＢ細胞株に由来する抗体の調製物を指す。これは、それぞれ異なるエピトープを認識する、特異的抗原に対して分泌される免疫グロブリン分子の混合物である。
【００４９】
用語「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、本明細書において使用される場合、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対し単一の結合特異性および親和性を呈する。
【００５０】
用語「単離された」は、本明細書において使用される場合、他の材料を実質的に含まない分子または生物学的材料もしくは細胞材料を指す、あるいはタンパク質またはポリヌクレオチドについて言及する場合、該タンパク質またはポリヌクレオチドをその天然環境から取り出すための共有結合の破壊を暗示する。一態様において、用語「単離された」は、天然源に存在するそれぞれ他のＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官から分離された、ＤＮＡもしくはＲＮＡなどの核酸、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官を指す。用語「単離された」は、細胞材料、ウイルス材料または組換えＤＮＡ技法によって産生される場合は培養培地または化学合成される場合は化学前駆物質もしくは他の化学物質が実質的にない核酸またはペプチドも指す。さらに、「単離された核酸」は、断片として天然起源ではなく、天然状態では存在しない核酸断片を含むことを意味する。用語「単離された」は、他の細胞タンパク質から単離されたポリペプチドを指すようにも本明細書において使用され、精製されたポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意味する。他の実施形態において、用語「単離されたまたは組換え」は、構成物、細胞、さもなければ、正常には本来会合している、細胞、組織、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片（複数可）から分離されていることを意味する。例えば、単離された細胞は、組織または異なる表現型もしくは遺伝子型の細胞から分離された細胞である。単離されたポリヌクレオチドは、その天然でまたは天然環境では、例えば、染色体上では正常には会合している３’および５’近接ヌクレオチドから分離されている。当業者には明らかな通り、非天然起源のポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体またはその断片（複数可）は、その天然起源の対応物から区別するために「単離」を必要としない。用語「単離された」は、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すようにも本明細書において使用されており、培養され操作された細胞または組織の両方を包含することを意味する。
【００５１】
Ｃ型肝炎ウイルスまたは「ＨＣＶ」は、フラビウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）科の小型の（５５〜６５ｎｍのサイズ）、エンベロープを有する、プラスセンス一本鎖ＲＮＡウイルスである。Ｃ型肝炎ウイルスは、ヒトにおけるＣ型肝炎の原因である。Ｃ型肝炎ウイルス粒子は、タンパク質の正二十面体保護殻で囲まれた遺伝的材料のコア（ＲＮＡ）からなり、細胞起源の脂質（脂肪性）エンベロープにさらに包まれている。２種のウイルスエンベロープ糖タンパク質、Ｅ１およびＥ２は、脂質エンベロープに包埋されている。
【００５２】
Ｃ型肝炎ウイルスは、プラスセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを有する。ゲノムは、９６００ヌクレオチド塩基の長さの単一のオープンリーディングフレームからなる。この単一のオープンリーディングフレームは、翻訳されて、単一のタンパク質産物を産生し、次にこれは、さらにプロセシングされて、より小型の活性タンパク質を産生する。
【００５３】
ＲＮＡの５’末端および３’末端はＵＴＲであり、タンパク質に翻訳されないが、ウイルスＲＮＡの翻訳および複製に重要である。５’ＵＴＲは、約３，０００アミノ酸を含有する非常に長いタンパク質の翻訳を開始するリボソーム結合部位（ＩＲＥＳ−配列内リボソーム進入部位）を有する。この大型の前タンパク質は、後に細胞およびウイルスのプロテアーゼによって切断されて、宿主細胞内でのウイルス複製または成熟ウイルス粒子へのアセンブルを可能にする１０個のより小型のタンパク質を生じる。
【００５４】
Ｃ型肝炎ウイルスによって作製される構造タンパク質は、コアタンパク質、Ｅ１およびＥ２を含む；非構造タンパク質は、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ４、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂを含む。
【００５５】
ＨＣＶ分離株間の遺伝的差異に基づき、Ｃ型肝炎ウイルス種は、６種の遺伝子型（１〜６）に分類され、各遺伝子型内に数種類のサブタイプ（文字で表す）を有する。サブタイプは、その遺伝的多様性に基づき疑似種にさらに分類される。ＨＣＶ遺伝子型の優勢および分布は、世界的に変動する。例えば、北米において、遺伝子型１ａが優勢であり、１ｂ、２ａ、２ｂおよび３ａが続く。欧州では、遺伝子型１ｂが優勢で、２ａ、２ｂ、２ｃおよび３ａが続く。遺伝子型４および５は、アフリカにおいてほぼ独占的に見られる。一方、遺伝子型６は、東南アジアにおいて優勢的に見られる。遺伝子型判定は、インターフェロンに基づく治療に対する潜在的な応答およびこのような治療に必要とされる持続時間の決定において臨床的に重要である。遺伝子型１および４は、他の遺伝子型（２、３、５および６）よりもインターフェロンに基づく処置に対する応答性が低い。遺伝子型１および４の標準的なインターフェロンに基づく治療の持続時間は、４８週間である一方、遺伝子型２および３の処置は、２４週間中に完了する。
【００５６】
異なるＨＣＶ遺伝子型由来の配列は、全ウイルスゲノムにわたり３３％も変動することができ、配列可変性は、高度に保存された５’ＵＴＲおよびコア領域ならびに高頻度可変性エンベロープ（Ｅ）領域を別として、ウイルスゲノムを通して等しく分布する。
【００５７】
ＨＣＶ遺伝子型は、当技術分野において公知の様々な方法により同定することができる。遺伝子型特異的プライマーによる、特に、コア領域を標的とするプライマーによるＰＣＲに基づく遺伝子型判定は、１９９２年に最初に導入された。市販のキット（例えば、Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｚｗｉｊｉｎｄｒｅ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）製のＩｎｎｏＬｉｐａ（登録商標））も利用できる。静脈における直接配列決定は、より信頼のおける高感度の遺伝子型判定のために使用することができる。
【００５８】
血清学的遺伝子型判定は、遺伝子型特異的抗体を使用し、間接的に遺伝子型を同定する。Ｃｈｉｒｏｎ  Ｃｏｒｐ．製のＲＩＢＡ  ＳＩＡアッセイおよびＮｕｒｅｘ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．製のＭｕｒｅｘ  ＨＣＶ血清型判定酵素免疫アッセイを含む、２種の市販の血清学的遺伝子型判定アッセイが導入された。
【００５９】
遺伝子型６  ＨＣＶの配列は同定されている。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００９８２７は、ゲノム配列を表す。遺伝子型６およびその配列に関するさらなる論述は臨床的影響があり、Ｐａｎｇ  ＰＳ，  Ｐｌａｎｅｔ  ＰＪ，  Ｇｌｅｎｎ  ＪＳ（２００９年）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ４巻（８号）：ｅ６５７９．  ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０００６５７９に見出すことができる。
【００６０】
用語「レプリコン」は、単一の複製起点から複製するＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子またはＤＮＡもしくはＲＮＡの領域を指す。大部分の原核生物染色体に関して、レプリコンは染色体全体である。一部の態様において、レプリコンは、細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで複製するＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を指す。一態様において、レプリコンは、複製して、細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで少なくとも約１０、あるいは、少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８または１×１０９コピーのレプリコンを産生することができる。あるいは、レプリコンの複製効率は、細胞ＲＮＡを含む全ＲＮＡにおけるある一定量のウイルスＲＮＡを産生することにより測定することができる。一態様において、レプリコンは、１マイクログラムの全ＲＮＡまたは細胞ＲＮＡにつき、少なくとも約１０００、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０、１×１０１１または１×１０１２コピーのレプリコンを産生することができる。
【００６１】
「サブゲノム」ＨＣＶ配列は、野生型ＨＣＶの全配列を含まないＨＣＶ配列を指す。一態様において、サブゲノムＨＣＶまたはサブゲノムＨＣＶレプリコンは、Ｅ１、Ｅ２またはＣ領域を含まない。別の態様において、サブゲノムＨＣＶまたはサブゲノムＨＣＶレプリコンは、５’ＵＴＲ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂおよび３’ＵＴＲ配列の全てまたは一部を含む。対照的に、「全長」もしくは「完全ゲノム」ＨＣＶまたはＨＣＶレプリコンは、Ｅ１、Ｅ２およびＣ領域を含む。一部の態様において、サブゲノムＨＣＶレプリコンおよび全長ＨＣＶレプリコンの両方は、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）、マーカー遺伝子（例えば、Ｎｅｏ）およびＩＲＥＳ（例えば、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ）配列のうち１種または複数を含むことができる。
【００６２】
ウイルス粒子（またはビリオン）は、ウイルスのＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかでできた遺伝的材料と、遺伝的材料を保護するタンパク質コートからなる。一態様において、脂質のエンベロープが、細胞の外部である場合、タンパク質コートを囲む。
【００６３】
ある特定の遺伝子型のＨＣＶレプリコンの、用語「適応的突然変異」は、細胞、特に、哺乳動物細胞などの真核細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで野生型レプリコンを複製させることができる、あるいは複製するＨＣＶレプリコンの能力を増強させる、該遺伝子型の野生型ＨＣＶ配列と比較した突然変異を指す。適応的突然変異が、宿主細胞特異的タンパク質とレプリカーゼ複合体とのアセンブリに有利に影響し得る、あるいは、宿主細胞抗ウイルス防御に関与する細胞タンパク質と適応的突然変異を含むタンパク質（例えば、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ等）との相互作用を促進し得ることが企図される。
【００６４】
「レポーター遺伝子」は、細胞培養、動物または植物において対象とする別の遺伝子の調節配列に付着させて、このような他の遺伝子の同定を容易にすることができる遺伝子を指す。レポーター遺伝子は、多くの場合、ある特定の遺伝子が、細胞もしくは生物集団によって取り込まれたかまたはそこで発現されたか否かの指標として使用される。レポーター遺伝子の非限定的な例として、ルシフェラーゼ遺伝子および緑色蛍光タンパク質遺伝子が挙げられる。
【００６５】
「マーカー遺伝子」または「選択可能マーカー」は、正常には生物を殺傷するまたはその成長を防止する選択的薬剤から生物を保護する遺伝子を指す。非限定的な一例は、発現されると、ゲンタマイシンＢ１と構造が同様のアミノグリコシド系抗生物質であるＧ４１８に対する抵抗性を付与する、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｎｅｏ）である。
【００６６】
ＨＣＶ遺伝子型６レプリコン構築物
本開示は、一般に、遺伝子型６レプリコンを安定的に複製するクローン細胞株が、サブゲノム遺伝子型６  ｃＤＮＡの転写およびＨＣＶ許容細胞株へのエレクトロポレーションによって得ることができるという予想外の発見に関する。次に、クローン細胞から、適応的突然変異が同定される。
【００６７】
これらの適応的突然変異は、ＮＳ３（Ｋ２７２Ｒ）、ＮＳ４Ａ（Ｋ３４Ｒ）またはＮＳ５Ａ（Ｓ２３２Ｉ）に位置した。これらの突然変異の同定により、これらの突然変異が、野生型ＨＣＶ遺伝子型６  ＲＮＡで観察されない現象である、細胞におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏで複製するＨＣＶの能力に寄与することが示唆される。次に、このような寄与は、突然変異の操作による遺伝子型６  ＲＮＡへの部位特異的突然変異誘発およびこれらの細胞株への導入により確認された。このような突然変異を有する遺伝子型６  ＨＣＶ  ＲＮＡは、細胞株において首尾よく複製した。したがって、本出願人は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで複製することができるＨＣＶ遺伝子型６レプリコンを調製し、このような能力をもたらす適応的突然変異を同定したことを実証した。
【００６８】
したがって、一実施形態において、本開示は、宿主細胞において複製することができる遺伝子型６  Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを提供する。一態様において、複製はｉｎ  ｖｉｔｒｏである。別の態様において、複製は、増殖性である。別の態様において、細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞などの真核細胞である。さらに別の態様において、細胞は、ヘパトーマ細胞である。一部の態様において、ＲＮＡは、複製して、細胞において少なくとも１０コピーのＲＮＡを産生することができる。別の態様において、コピー数は、少なくとも約１００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８または１×１０９である。
【００６９】
ＨＣＶ  ＲＮＡは、サブゲノムＨＣＶ配列であり得る。このような適応的突然変異のいずれかまたは複数を含有する全長ＨＣＶレプリコンも複製できることが特に企図される。さらにまた、適応的突然変異（複数可）を含有する対応する遺伝子型の全ＨＣＶウイルスは、感染性となり、複製することができる。このような場合のいずれかにおいて、ＲＮＡは、５’ＵＴＲ、必要に応じて配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂをコードする配列、ならびに３’ＮＴＲのうち１種または複数を含むことができる。一態様において、ＲＮＡは、プラスセンス核酸において５’から３’へと、最も５’末端の保存配列を含む機能的ＨＣＶ  ５’非翻訳領域（ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）（５’ＮＴＲ）または非翻訳領域（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）（５’ＵＴＲ）；ＨＣＶポリタンパク質コード領域；および最も３’末端の保存配列を含む機能的ＨＣＶ  ３’非翻訳領域（３’ＮＴＲ）または非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含む。
【００７０】
一実施形態において、遺伝子型６  ＨＣＶ  ＲＮＡ構築物は、真核細胞において複製することができる。ＲＮＡ配列は、５’ＵＴＲと、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂのうち１種または複数をコードする配列と、３’ＮＴＲとを含む。ＲＮＡ構築物は、野生型と比較してＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂに適応的突然変異を含有する。
【００７１】
上述の実施形態のいずれかにおいて、ＨＣＶ  ＲＮＡは、細胞においてＲＮＡを複製させることができる適応的突然変異を含むことができる。ＮＳＡ５におけるこのような適応的突然変異は、残基２３２にイソロイシンを含むことができる。
【００７２】
遺伝子型６の適応的突然変異の非限定的な例として、ＮＳ３の残基２７２におけるアルギニンへの突然変異、および／またはＮＳ４Ａの残基３４におけるアルギニンへの突然変異も挙げられる。
【００７３】
一実施形態において、表２に記載されている１種または複数の突然変異を有するレプリコンが提供される。一態様において、ＨＣＶ  ＲＮＡは、少なくともＮＳ３における適応的突然変異および少なくともＮＳ４Ａにおける適応的突然変異を含む。別の態様において、ＨＣＶ  ＲＮＡは、少なくともＮＳ３における適応的突然変異および少なくともＮＳ５Ａにおける適応的突然変異を含む。さらに別の態様において、ＨＣＶ  ＲＮＡは、少なくともＮＳ４Ａにおける適応的突然変異および少なくともＮＳ５Ａにおける適応的突然変異を含む。
【００７４】
ＨＣＶ  ＲＮＡが、対応する適応的突然変異（複数可）および／または活性を保持する限り、開示されている配列のいずれかに対し少なくとも約７５％または約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または約９９．５％の配列同一性を有するＲＮＡ配列であり得ることも企図されている。
【００７５】
よって、一態様において、５’ＵＴＲと、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂをコードする配列と、３’ＵＴＲとを含む遺伝子型６  ＨＣＶ  ＲＮＡ構築物であって、真核細胞において複製することができる構築物が提供される。一態様において、構築物は、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂに適応的突然変異を含む。
【００７６】
一態様において、構築物は、発見された適応的突然変異のうち１、２または３種を含む。一部の態様において、遺伝子型６は、遺伝子型６ａである。
【００７７】
上述の実施形態のいずれかにおいて、ＨＣＶ  ＲＮＡは、選択のためのマーカー遺伝子をさらに含むことができる。このようなマーカー遺伝子の非限定的な例は、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。他の例は、当技術分野において周知である。
【００７８】
上述の実施形態のいずれかにおいて、ＨＣＶ  ＲＮＡは、レポーター遺伝子をさらに含むことができる。このようなマーカー遺伝子の非限定的な例は、Ｒｌｕｃレポーター遺伝子などのルシフェラーゼ遺伝子である。他の例は、当技術分野において周知である。
【００７９】
上述の実施形態のいずれかに記載のＲＮＡ構築物は、Ｃ、Ｅ１またはＥ２のうち１種または複数をコードする配列をさらに含むことができる。一態様において、ＲＮＡ構築物は、全長ＨＣＶレプリコンである。
【００８０】
本開示は、また、上述の実施形態のいずれかに記載のＲＮＡ構築物へと転写され得る一本もしくは二本鎖ＤＮＡ、上述の実施形態のいずれかに記載のＲＮＡ構築物を含むウイルス粒子または上述の実施形態のいずれかに記載のＲＮＡ構築物を含む単離された細胞を提供する。
【００８１】
一実施形態において、本開示は、残基２７２にアルギニン（Ｋ２７２Ｒ）を含む、ＨＣＶ遺伝子型６のＮＳ３タンパク質を提供する。
【００８２】
一実施形態において、本開示は、残基３４にアルギニン（Ｋ３４Ｒ）を含む、ＨＣＶ遺伝子型６のＮＳ４Ａタンパク質を提供する。
【００８３】
一実施形態において、本開示は、残基２３２にイソロイシン（Ｓ２３２Ｉ）を含む、ＨＣＶ遺伝子型６のＮＳ５Ａタンパク質を提供する。
【００８４】
このような実施形態のいずれかの一態様において、遺伝子型６は、遺伝子型６ａである。さらに別の態様において、このような実施形態のいずれかに記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。別の態様において、ポリヌクレオチドを含むＲＮＡまたはＤＮＡ構築物が提供される。さらに別の態様において、ポリヌクレオチドを含む細胞が提供される。また、一態様において、上述の実施形態のいずれかのタンパク質を特異的に認識する抗体が提供される。
【００８５】
適応的突然変異のうち１種または複数を有する、これをコードする構築物またはＤＮＡに特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチドプライマー、プローブまたは増幅産物であって、少なくとも１５ヌクレオチドの長さであるプライマー、プローブまたは増幅産物も提供される。一部の態様において、最小の長さは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５または３０ヌクレオチドの長さである。このようなポリヌクレオチドは、適応的突然変異の存在の検出に有用である。
【００８６】
ＨＣＶ遺伝子型６レプリコンおよび該レプリコンを含有する細胞
本開示の別の実施形態は、細胞において複製する遺伝子型６  Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡを含む、単離された細胞を提供する。一態様において、細胞において、ＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物は存在せず、よって、ＨＣＶ  ＲＮＡのコピーは、ｃＤＮＡなどのＤＮＡ構築物から転写されない。
【００８７】
一態様において、細胞は、少なくとも１０コピーのＲＮＡを含む。別の態様において、細胞は、少なくとも１００、５００、１０００、２０００、５０００、１０，０００、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８または１×１０９コピーのＲＮＡを含む。
【００８８】
ＨＣＶ  ＲＮＡは、サブゲノムＨＣＶ配列または全長ＨＣＶ配列であり得る。どちらの場合においても、ＲＮＡは、５’ＮＴＲと、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡおよびＮＳ５Ｂをコードする配列と、３’ＮＴＲのうち１種または複数を含むことができる。
【００８９】
上述の実施形態のいずれかにおいて、ＨＣＶ  ＲＮＡは、細胞においてＲＮＡを複製させることができる適応的突然変異を含むことができる。このような適応的突然変異は、ＮＳ５Ａにおける位置２３２にイソロイシンを含むことができる。
【００９０】
遺伝子型６の適応的突然変異の非限定的な例として、ＮＳ３の残基２７２におけるアルギニンへの突然変異および／またはＮＳ４Ａの残基３４におけるアルギニンへの突然変異も挙げられる。
【００９１】
一実施形態において、適応的突然変異は、表２に提示されている。一態様において、ＨＣＶ  ＲＮＡは、少なくともＮＳ３における適応的突然変異および少なくともＮＳ４Ａにおける適応的突然変異を含む。別の態様において、ＨＣＶ  ＲＮＡは、少なくともＮＳ３における適応的突然変異および少なくともＮＳ５Ａにおける適応的突然変異を含む。さらに別の態様において、ＨＣＶ  ＲＮＡは、少なくともＮＳ４Ａにおける適応的突然変異および少なくともＮＳ５Ａにおける適応的突然変異を含む。
【００９２】
ＨＣＶ  ＲＮＡが、対応する適応的突然変異（複数可）を保持する限り、開示されている配列のいずれかに対し少なくとも約７５％または約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または約９９．５％の配列同一性を有するＲＮＡ配列であり得ることも企図されている。
【００９３】
一態様において、細胞は、哺乳動物細胞、特に、ヒト細胞などの真核細胞である。別の態様において、細胞は、これらに限定されないが、Ｈｕｈ７細胞（例えば、Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ、５１Ｃおよび１Ｃ）などのヘパトーマ細胞である。本明細書において、驚くべきことに、Ｈｕｈ７  １Ｃ細胞が、遺伝子型６レプリコンに対し特に許容的であることが発見され、よって、一態様において、細胞は、Ｈｕｈ７  １Ｃ細胞である。一部の態様において、細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ条件に置かれる。
【００９４】
遺伝子型６レプリコンを調製する方法
実施例１に示す通り、ＨＣＶ遺伝子型６レプリコンが同定された後、対応する遺伝子型ＨＣＶ  ＲＮＡへの関連する適応的突然変異の導入は、特に、ＲＮＡの、哺乳動物細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで複製する能力をもたらし得る。したがって、本開示は、遺伝子型６  ＨＣＶウイルスＲＮＡの、真核細胞において複製する能力を改善する方法であって、
（ａ）ＮＳ５Ａの残基２３２をイソロイシンに置換するステップ、
（ｂ）ＮＳ３の残基２７２をアルギニンに置換するステップ、または
（ｃ）ＮＳ４Ａの残基３４をアルギニンに置換するステップ
のうち１または複数を含む方法を提供する。一態様において、方法は、（ａ）〜（ｃ）のうち少なくとも２つの置換を含む。
【００９５】
一実施形態において、方法は、表２に記載されている１、２または３種以上の突然変異をさらに導入するステップを伴う。一態様において、導入される突然変異は、少なくともＮＳ４Ａにおける適応的突然変異、少なくともＮＳ３における適応的突然変異および／または少なくともＮＳ５Ａにおける適応的突然変異を含む。さらに別の態様において、導入される突然変異は、少なくともＮＳ４Ａにおける適応的突然変異および少なくともＮＳ５Ａにおける適応的突然変異を含む。
【００９６】
遺伝子型６を標的とするＨＣＶ阻害剤をスクリーニングする方法
多数の公知のＨＣＶ阻害剤および未知のＨＣＶ阻害剤が、遺伝子型１ｂと比較して、遺伝子型６  ＨＣＶの阻害におけるその効率に関して検査された（実施例１）。その一部は、遺伝子型６に対しより高い有効性を示し、一部は、それほど有効ではなかった。したがって、新たに同定された遺伝子型６レプリコンの有用性は、適切に実証される。
【００９７】
よって、本開示は、また、一実施形態において、遺伝子型６  ＨＣＶの複製または活性を阻害する薬剤を同定する方法であって、本開示のいずれかの実施形態の細胞を候補薬剤と接触させるステップを含み、複製の減少またはＲＮＡにコードされるタンパク質の活性の減少が、薬剤がＨＣＶの複製または活性を阻害することを示す方法を提供する。一部の態様において、タンパク質は、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂのいずれかまたは複数などのプロテアーゼである。ＲＮＡの複製は、一態様において、ルシフェラーゼ遺伝子などのＲＮＡにおけるレポーター遺伝子により測定することができる。
【００９８】
別の実施形態において、遺伝子型６  ＨＣＶの活性を減少または阻害する薬剤を同定する方法であって、本開示のいずれかの実施形態の細胞の溶解物を候補薬剤と接触させるステップを含み、ＲＮＡにコードされるタンパク質の活性の減少が、薬剤がＨＣＶの活性を阻害することを示す、方法が提供される。一態様において、タンパク質は、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５ＡまたはＮＳ５Ｂのいずれかまたは複数などのプロテアーゼである。別の態様において、方法は、ＲＮＡの複製またはＲＮＡにコードされるタンパク質の活性を測定するステップをさらに含む。
【００９９】
ＨＣＶ阻害剤（または「候補薬剤」）は、有機化合物である小分子薬物、抗体などのペプチドもしくはタンパク質、またはｓｉＲＮＡなどの核酸ベースであり得る。２０１１年５月、食品医薬品局は、Ｃ型肝炎のための２種の薬物、ボセプレビルおよびテラプレビルを承認した。どちらの薬物も、ウイルス繁殖を助ける酵素を遮断する。ボセプレビルは、Ｃ型肝炎遺伝子型１におけるＨＣＶ  ＮＳ３活性部位に結合するプロテアーゼ阻害剤である。テラプレビルは、Ｃ型肝炎ウイルスＮＳ３．４Ａセリンプロテアーゼを阻害する。
【０１００】
より従来的なＨＣＶ処置は、ペグ化インターフェロン−アルファ−２ａまたはペグ化インターフェロンアルファ−２ｂ（商標名ＰｅｇａｓｙｓまたはＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ）および抗ウイルス薬リバビリンの組合せを含む。ペグ化インターフェロン−アルファ−２ａプラスリバビリンは、ランダム化比較試験の系統的レビューによると、ペグ化インターフェロン−アルファ−２ｂプラスリバビリンと比較して、慢性Ｃ型肝炎を有する患者の間で持続性ウイルス学的応答を増加させることができる。
【０１０１】
これらのＨＣＶ阻害剤の全ておよび他のいずれかの候補薬剤は、開示されている方法により、ＨＣＶ遺伝子型６の阻害におけるその有効性に関して試験することができる。次に、細胞は、適した温度である期間インキュベートされて、細胞においてレプリコンを複製させる。レプリコンは、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子を含むことができ、このような場合において、インキュベーション期間の終わりに、細胞は、レプリコンレベルについてのマーカーとしてルシフェラーゼ活性に関してアッセイされる。ルシフェラーゼ発現は、市販のルシフェラーゼアッセイを使用して定量化することができる。
【０１０２】
その代わりに、ＨＣＶ阻害剤の有効性は、レプリコンにコードされるタンパク質の発現または活性により測定することができる。このようなタンパク質の一例は、ＮＳ３プロテアーゼであり、タンパク質発現または活性の検出は、当技術分野において公知の方法、例えば、Ｃｈｅｎｇら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ５５巻：２１９７〜２０５頁（２０１１年）により行うことができる。
【０１０３】
次に、ルシフェラーゼ活性レベルまたはＮＳ３プロテアーゼ活性レベルは、無処置であるまたはＨＣＶの阻害において既知の活性を有する薬剤により処置され得る、対照におけるレベルに対するパーセンテージに変換される。無処置対照と比較したＨＣＶ複製の減少またはＮＳ３活性の減少は、候補薬剤が、ＨＣＶの対応する遺伝子型を阻害することができることを示す。同様に、対照薬剤と比較したＨＣＶ複製のより大幅の減少またはＮＳ３活性のより大幅の減少は、候補が、対照薬剤よりも有効であることを示す。
【実施例】
【０１０４】
本開示は、以下の実施例を参照することによりさらに定義される。当業者であれば、本開示の範囲から逸脱することなく、組成物および方法の両方に対し多くの修正を実施してよいことが明らかとなろう。
【０１０５】
略語
特段の断りがなければ、あらゆる温度は摂氏温度（℃）で表記されている。また、これらの実施例および他の箇所において、略語は、以下の意味を有する。
【表Ｂ】
2015534821.tif 000004
【０１０６】
（実施例１）
頑強な遺伝子型６  Ｃ型肝炎ウイルスサブゲノムレプリコンの作製
本実施例は、Ｈｕｈ７細胞において複製することができる遺伝子型６  ＨＣＶウイルスレプリコンから適応的突然変異が同定されたことと、これらの適応的突然変異を有するＨＣＶレプリコンが、抗ウイルス薬スクリーニングに有用なツールであることを示す。
【０１０７】
材料と方法
細胞培養。ＲｅＢＬｉｋｏｎ  ＧｍｂＨ（Ｍａｉｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）からＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞を得た。Ｈｕｈ−７  Ｌｕｎｅｔに基づく遺伝子型１ａレプリコンクローンを治癒させることにより、５１Ｃ細胞を誘導し、これは以前に記載されている（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｍ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２０１０年；５４巻：３０９９〜１０６頁）。５１Ｃ細胞に由来する化合物Ｂ抵抗性遺伝子型１ａレプリコンクローンを治癒させることにより、１Ｃ細胞を誘導し、これは、遺伝子型１ａレプリコン複製に対し遥かにより高い許容性を示した２４。あらゆる細胞株は、以前に記載された通りにダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において増殖させた（Ｃｈｅｎｇ  Ｇ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２０１１年；５５巻：２１９７〜２０５頁）。０．２５〜０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８（ジェネテシン；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する完全ＤＭＥＭにおいてレプリコン細胞株を選択して維持した。
【０１０８】
遺伝子型６ａ  ＨＣＶサブゲノムレプリコンをコードするプラスミドの構築。欧州ＨＣＶデータベース（表１）において利用できる１６種の遺伝子型６ａゲノムのコンセンサス配列（配列番号１）（図１）に基づくサブゲノム遺伝子型６ａレプリコンをコードするプラスミド（ｐＧＴ６ａＮｅｏＳＧ）を、ＤＮＡ合成およびクローニング（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）により調製した。合成したレプリコンは、５’から３’へと以下のエレメントを取り込んだ（図２Ａ〜Ｃ）：（１）遺伝子型６ａコンセンサス５’ＵＴＲ（３４２ｎｔ）に加えて、コアの最初の４８ヌクレオチド、（２）ＡｓｃＩ制限部位（下線）を導入するヌクレオチド配列５’−ＧＧＣＧＣＧＣＣＣＡ−３’（配列番号２）を有するリンカー、（３）ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｅｏ）遺伝子、（４）ＦｓｅＩ制限部位（下線）を導入するヌクレオチド配列５’−ＧＧＣＣＧＧＣＣＡ−３’（配列番号３）を有するリンカー、（５）脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ＩＲＥＳ、（６）ＭｌｕＩ制限部位（下線）を導入するヌクレオチド配列５’−ＡＣＧＣＧＴＡＴＧ−３’（配列番号４）を有するリンカーおよびＨＣＶポリタンパク質発現のためのＡＴＧ開始コドン、（７）ＮＳ５Ａ適応的突然変異Ｓ２３２Ｉを含む、遺伝子型６ａコンセンサス配列のＮＳ３〜ＮＳ５Ｂポリタンパク質領域、および（８）遺伝子型２ａ  ＪＦＨ−１の３’−ＵＴＲ（２３９ｎｔ；遺伝子型６ａ  ３’−ＵＴＲは利用できない）。遺伝子型６ａレプリコンをコードする合成ＤＮＡ断片を、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ制限部位の間のｐＵＣ５７に挿入した。
【表１】
2015534821.tif 000005
Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴｉソフトウェア（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してコンセンサス配列を作製した。
【０１０９】
ヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ（ｈＲｌｕｃ）レポーター遺伝子を取り込んだサブゲノムレプリコンをコードする第２のプラスミド（ｐＧＴ６ａＲｌｕｃＮｅｏＳＧ）を以下の通りに作製した。ＡｓｃＩおよびＭｌｕＩ制限酵素を使用してｐＧＴ６ａＮｅｏＳＧプラスミド（上述）を切断し（ｎｅｏ遺伝子を除去）、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用してゲル精製した。Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  ｓｕｐｅｒ  ｍｉｘ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と以下のプライマー：２ａＲｌｕｃＮｅｏＡｓｃＩＦｏｒ：５’−ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＣＣＣ  ＡＴＧ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＧＴＧ  ＴＡＣ  ＧＡＣ−３’（プライマーによりＡｓｃＩ部位（下線）を導入、配列番号５）、２ａＥＭＣＶＩＲＥＳＭｌｕＩＲｅｖ：５’−ＴＣＧＧＧＧ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＧＣＧ  ＴＡＴ  ＣＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＴ  ＣＡＡ  ＡＧＧ−３’（ＭｌｕＩ部位に下線、配列番号６）を使用して、ｐｈＲｌｕｃＮｅｏＳＧ２ａプラスミド（後述）からＥＭＣＶ領域と共にｎｅｏ遺伝子と融合したｈＲｌｕｃ遺伝子をコードする遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。その後、ＰＣＲ断片をＡｓｃＩおよびＭｌｕＩで切断し、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲル精製した。メーカーのプロトコール（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）通りにＬｉｇａＦａｓｔ  Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、ベクターおよび挿入片をライゲーションした。得られたベクター、ｐＧＴ６ａＲｌｕｃＮｅｏＳＧを配列決定して、ｈＲｌｕｃ−Ｎｅｏの正しい配向性および配列を確認した。ｐｈＲｌｕｃＮｅｏＳＧ２ａプラスミドは、以前に記載された通りに、プラスミドｐＬｕｃＮｅｏＳＧ２ａにおけるＬｕｃ−Ｎｅｏ断片をプラスミドｈＲｌｕｃ−Ｎｅｏ  Ｆｌｅｘｉ（Ｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）から増幅されたｈＲｌｕｃ−Ｎｅｏ遺伝子に置き換えることにより構築された（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｍ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２０１０年；５４巻：３０９９〜１０６頁；Ｃｈｅｎｇ  Ｇ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２０１１年；５５巻：２１９７〜２０５頁）。
【０１１０】
ポリオウイルスＩＲＥＳ（ＰＩ）下流のｈＲｌｕｃレポーター遺伝子およびＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ下流の遺伝子型６ａコンセンサスＨＣＶ非構造遺伝子（ＮＳ３〜ＮＳ５Ｂ）を有するバイシストロニックレプリコンをコードする第３のプラスミド（Ｐｉ−ＧＴ６ａＲｌｕｃＳＧ）を、一過性トランスフェクション試験に使用した。以下の通りにプラスミドを作製した。ＡｓｃＩおよびＭｌｕＩ制限酵素を使用してｐＧＴ６ａＲｌｕｃＮｅｏＳＧプラスミド（上述）を切断し（Ｒｌｕｃ−Ｎｅｏ遺伝子を除去）、市販のキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲル精製した。Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ  ｓｕｐｅｒ  ｍｉｘ  Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と以下のプライマー：６ａＰｉＲｌｕｃＡｓｃＩＦｏｒ：５’−ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＡＴＣ  ＧＧＣ  ＧＣＧ  ＣＣＡ  ＡＡＣ  ＣＡＡ  ＧＴＴ  ＣＡＡ  ＴＡＧ−３’（プライマーによりＡｓｃＩ部位（下線）を導入、配列番号７）、１ｂＥＭＣＶＩＲＥＳＭｌｕＩＲｅｖ：５’−ＴＣＧ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＴＡＣ  ＧＣＧ  ＴＡＴ  ＣＧＴ  ＧＴＴ  ＴＴＴ  ＣＡＡ  ＡＧＧ−３’（ＭｌｕＩ部位に下線、配列番号８）を使用して、遺伝子型１ｂ  Ｐｉ−Ｒｌｕｃプラスミドから、ＰＩ、ｈＲｌｕｃ遺伝子およびＥＭＣＶ領域をコードする遺伝子断片をＰＣＲ増幅した。その後、上述の通りにＰＣＲ断片をクローニングしライゲーションして、その結果、ベクター、Ｐｉ−ＧＴ６ａＲｌｕｃＳＧを作製した。
【０１１１】
突然変異体レプリコンの構築。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用した部位特異的突然変異誘発により、ｐＧＴ６ａＮｅｏＳＧ、ｐＧＴ６ａＲｌｕｃＮｅｏＳＧまたはＰｉ−ＧＴ６ａＲｌｕｃＳＧレプリコンに適応的突然変異を導入した。Ｅｌｉｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によるＤＮＡ配列決定により全突然変異を確認した。
【０１１２】
ＲＮＡ転写。遺伝子型６ａサブゲノムＨＣＶレプリコンをコードするプラスミドをＸｂａＩで直鎖化し、ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。それぞれＴ７  ＭＥＧＡＳｃｒｉｐｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）およびＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）により、メーカーの説明書に従って、ＲＮＡを合成して精製した。２６０ｎｍにおける光学密度を使用してＲＮＡ濃度を測定し、０．８％アガロースゲル電気泳動（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により確認した。
【０１１３】
ＲＮＡトランスフェクションおよび安定的レプリコン細胞株の単離。１０マイクログラムのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写したＲＮＡを、エレクトロポレーションによりＨｕｈ７  Ｌｕｎｅｔまたは１Ｃ細胞にトランスフェクトした。簡潔に説明すると、トリプシン処理および遠心分離により細胞を収集し、次に氷冷リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、１０７細胞／ｍｌの濃度となるようＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に再懸濁した。Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）キュベット（０．４ｃｍギャップ）における４００μｌの細胞懸濁液に、レプリコンＲＮＡを添加した。２７０Ｖおよび９６０μＦにおいて細胞をエレクトロポレーションし、室温で１０分間インキュベートし、３０ｍｌの完全ＤＭＥＭに再懸濁し、次に、２枚の１００ｍｍ直径ディッシュに蒔いた。蒔いてから４８時間後に、０．２５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補充した完全ＤＭＥＭに培地を交換し、これを１週間に２回新しくした。３週間後、細胞クローンを単離し、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を用いて増やし、初期継代において凍結保存した。
【０１１４】
レプリコンコロニー形成アッセイ。Ｇ４１８抵抗性コロニー形成の効率を決定するために、表示量のレプリコンＲＮＡまたは抽出された細胞ＲＮＡにより細胞をエレクトロポレーションし、２×１０５〜２×１０６細胞／１００ｍｍディッシュに及ぶ複数の密度で蒔いた。蒔いてから４８時間後に、０．５ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を補充した完全ＤＭＥＭに培地を交換し、これを１週間に２回新しくした。３週間後、コロニープレートを細胞増殖に使用した、あるいはＧ４１８抵抗性のフォーカスを４％ホルムアルデヒドで固定し、０．０５％クリスタルバイオレットで染色した。
【０１１５】
ＨＣＶ  ＲＮＡの抽出、増幅および遺伝子型解析。以前に記載された通りに、ＨＣＶ  ＲＮＡ単離、ＲＴ−ＰＣＲおよび集団配列決定（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った（Ｃｈｅｎｇ  Ｇ．ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２０１１年；５５巻：２１９７〜２０５頁）。簡潔に説明すると、メーカーのプロトコールに従ってＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＨＣＶレプリコン細胞ＲＮＡを抽出して精製した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  １本鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＴ−ＰＣＲを行い、その後、Ｅｌｉｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ（Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）によりＰＣＲ産物を配列決定した。
【０１１６】
間接免疫蛍光法によるＮＳ５Ａタンパク質の検出。９６ウェルプレートにおいて、ウェル当たり１×１０４細胞の密度でレプリコン細胞を蒔いた。２４時間のインキュベーション後に、続いて以前に記載された通りに細胞のＮＳ５Ａタンパク質を染色した（Ｃｈｅｎｇ  Ｇ.ら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ２０１１年；５５巻：２１９７〜２０５頁）。簡潔に説明すると、４％パラホルムアルデヒドにおいて細胞を２０分間固定した。次に細胞をＰＢＳで３回洗浄し、３％ウシ血清アルブミン、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００および１０％ＦＢＳでブロッキングし、抗ＮＳ５Ａ抗体で染色した。１：１０，０００希釈のマウスモノクローナル抗体９Ｅ１０（Ａｐａｔｈ、Ｂｒｏｏｋｌｙｎ、ＮＹ）を使用して染色を行った。ＰＢＳにおいて３回洗浄した後に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５にコンジュゲートされた二次抗マウス抗体を使用して、抗ＮＳ５Ａ抗体標識細胞を検出した（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。核は、１μｇ／ｍｌヘキスト３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。細胞をＰＢＳで洗浄し、Ｚｅｉｓｓ蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）により画像化した。
【０１１７】
レプリコン抗ウイルスアッセイ。上述の通り、１Ｃ細胞にレプリコンＲＮＡをエレクトロポレーションした。トランスフェクション後に、細胞を１００ｍＬの予熱した培養培地へと素早く移し、３８４ウェルプレートにおいて２，０００細胞／ウェルの密度となるよう９０μｌを播種した。３倍系列薬物希釈により１０種の異なる濃度で細胞を処理した。細胞プレートを３７℃で３日間インキュベートし、その後、培養培地を除去し、レプリコンレベルのマーカーとしてルシフェラーゼ活性に関して細胞をアッセイした。市販のルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ルシフェラーゼ発現を定量化した。ルシフェラーゼレベルを、無処置対照におけるレベル（１００％として定義）に対するパーセンテージに変換し、ＸＬＦｉｔ４ソフトウェア（ＩＤＢＳ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を使用して、ロジスティック用量−応答式、ｙ＝ａ／［１＋（ｘ／ｂ）ｃ］にデータを当てはめた。
【０１１８】
抗ウイルス化合物。Ａｃｍｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｅｌｍｏｎｔ、ＣＡ）からテラプレビル、ボセプレビルおよび２−Ｃ−メチルアデノシン（２−ＣＭｅＡ）を購入した。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。Ｗｙｅｔｈ  ＨＣＶ  ＮＳ５Ｂ部位ＩＶ阻害剤ＨＣＶ−７９６は、Ｃｕｒｒａｇｈ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、ＯＨ）によって合成された。Ｇｉｌｅａｄ化合物、化合物Ｂ、テゴブビル（tegobuvir）、化合物Ａ、化合物Ｃおよびソフォスブビル（sofobusvir）、Ｐｆｉｚｅｒ  ＮＳ５Ｂ  ｔｈｕｍｂ部位ＩＩ阻害剤フィリブビル（filibuvir）、Ｍｅｒｃｋ  ＮＳ５Ｂ  ｔｈｕｍｂ部位Ｉ阻害剤ＭＫ−３２８１およびプロテアーゼ阻害剤ＭＫ−５１７２およびＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  ＮＳ５Ａ阻害剤ダクラタスビル（ＢＭＳ−７９００５２）は、Ｇｉｌｅａｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって合成された。ある特定のＧｉｌｅａｄ化合物の構造を下に提示する。
【化１】
2015534821.tif 000006
【０１１９】
結果
Ｈｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞へのＧＴ６ａレプリコンのトランスフェクションは、３５個の安定的レプリコンコロニーを生じさせ（図３において図解されているレプリコン単離戦略を参照）、これら全て、ＮＳ５Ａ  Ｓ２３２Ｉ突然変異を必要とした。レプリコンコロニーの遺伝子型解析は、複数の新たな適応的突然変異を明らかにした。Ｋ２７２Ｒ（ＮＳ３における）およびＫ３４Ｒ（ＮＳ４Ａにおける）が最も頻繁に観察され、ＧＴ６ａ複製を増強することが確認された。
【０１２０】
ＮＳ５Ａ突然変異Ｓ２３２Ｉを有する遺伝子型６ａレプリコンの安定的コロニー形成が明らかであった（図４）。Ｈｕｈ−７  Ｌｕｎｅｔまたは１Ｃ細胞への、ＮＳ５Ａ突然変異Ｓ２３２Ｉを有するＧＴ６ａＮｅｏＳＧレプリコンＲＮＡ（１０ｍｇ）のトランスフェクションは、それぞれ３５個および７５個の安定的コロニーを生じさせた。しかし、Ｓ２３２Ｉ突然変異の非存在下において、複数の独立的選択後に、いずれの細胞株においてもレプリコンコロニーは生存しなかった。これらの結果は、遺伝子型６ａ  ＨＣＶは、細胞培養における低い複製効率を有するが、安定的レプリコンコロニーを選択することができ、ＮＳ５Ａ突然変異Ｓ２３２Ｉがコロニー形成に必要とされたことを示唆する。それぞれ１ＣおよびＬｕｎｅｔ細胞から、１１および１３個のレプリコンコロニーを単離し増やした。残りのコロニーは、遺伝子型および表現型の特徴付けのためにプールした。
【０１２１】
適応的突然変異を持つレプリコンが、高いＮＳ３プロテアーゼ活性を示したことも観察された（図５）。９６ウェルプレートにおいて、ウェル当たり５×１０４細胞の濃度となるよう、プールされたＧＴ６ａレプリコン細胞を播種した。２４時間のインキュベーション後に、室温で２０分間プレート振盪機において、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを補充した９０μｌの１×Ｐｒｏｍｅｇａルシフェラーゼ溶解バッファーによりレプリコン細胞を溶解した。上述の溶解バッファー中の１０μｌの１μＭユーロピウム標識ＮＳ３基質を各ウェルに添加した。プロテアーゼ活性データを収集し解析した。これらの結果は、ＧＴ６ａレプリコン細胞が、標準ＧＴ１ａレプリコン細胞および標準ＧＴ１ｂレプリコン細胞に匹敵する、高レベルのＮＳ３プロテアーゼ活性を有することを示す。
【０１２２】
さらに、これらのレプリコンは、ＧＴ６ａレプリコン細胞における高いＮＳ５Ａ発現を呈した（図６）。プールされたＧＴ６ａレプリコン細胞を、抗ＮＳ５Ａ抗体（赤色、薄灰色として示す）およびヘキスト３３３４２（青色、核を示し、暗灰色として示す）で染色した。陰性対照として１Ｃ細胞を染色した。免疫組織化学的解析の結果は、特に、核周辺領域におけるＮＳ５Ａタンパク質の高い発現レベルを確認した。
【０１２３】
選択されたＧＴ６ａレプリコンクローンまたはプールされた細胞株を増やし、遺伝子型解析に付した。ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、全細胞ＲＮＡを抽出して精製した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  第１鎖合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＴ−ＰＣＲを行った。Ｅｌｉｍ  ＢｉｏｐｈａｒｍによりＰＣＲ産物を配列決定した。アミノ酸変化のみを示す（表２）。全クローンまたはプールは、ＮＳ５Ａ突然変異Ｓ２３２Ｉを保持した。集団配列決定からプールされた細胞株において、主要な突然変異は同定されなかった。これは、優性突然変異の欠如による可能性が高いが、複数の異なる適応的突然変異の共存は、集団配列決定の検出閾値を下回る。
【表２】
2015534821.tif 000007
【０１２４】
独立的に少なくとも２回出現した（ＮＳ３におけるＥ３０ＶおよびＫ２７２ＲならびにＮＳ４ＡにおけるＫ３４Ｒ）、あるいはＧＴ３ａ（例えば、ＮＳ３におけるＰ８９Ｌ）またはＧＴ４ａ（ＮＳ４ａにおけるＥ５２Ｖ）レプリコンにおいて同定されたある特定の適応的突然変異に対応した５種の突然変異（表３）のいずれかを選び、部位特異的突然変異誘発により個々にＧＴ６ａ−ＲｌｕｃＮｅｏまたはＰｉ−ＧＴ６ａ−Ｒｌｕｃレプリコン（ＮＳ５ＡにＳ２３２Ｉ突然変異を保有）に導入した。全てのレプリコンＲＮＡを、Ｌｕｎｅｔ細胞または１Ｃ細胞にトランスフェクトして、ＧＴ６ａ−ＲｌｕｃＮｅｏレプリコンによるコロニー形成アッセイにより、あるいはＰｉ−ＧＴ６ａ−Ｒｌｕｃレプリコンによるルシフェラーゼ活性測定により、ＧＴ６ａ  ＨＣＶ複製を増強するか決定した。
【表３】
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【０１２５】
これらのＮＳ３突然変異およびＮＳ４Ａ突然変異が、ＧＴ６ａレプリコン複製を増強したことがさらに示された（図７）。ＮＳ３突然変異（Ｅ３０Ｖ、Ｐ８９ＬおよびＫ２７２Ｒ）およびＮＳ４Ａ突然変異（Ｋ３４Ｒ突然変異およびＥ５２Ｖ突然変異）を、部位特異的突然変異誘発によりＧＴ６ａ−ＲｌｕｃＮｅｏ構築物に導入した。親ＧＴ６ａ−ＲｌｕＮｅｏレプリコンを含む全てのレプリコンＲＮＡ（各１０μｇ；全て、ＮＳ５Ａ突然変異Ｓ２３２Ｉを保有）をＬｕｎｅｔ細胞にトランスフェクトした。レプリコン毎に安定的コロニー形成効率を評価した。ＮｅｏをＲｌｕＮｅｏに置き換えると、安定的コロニー形成の有意な低下を生じ（３５個から１個のコロニーへ）、これは、ＲｌｕｃＮｅｏレポーターのより大型のサイズが原因である可能性が高い。重要なことに、ＮＳ３またはＮＳ４Ａのいずれかにおける全５種の突然変異は、５種の突然変異のいずれかを有するレプリコンから出現する多数の安定的コロニーによって証明される通り、親レプリコンによる１個のコロニーのみと比較して、ＧＴ６ａ  ＨＣＶ複製を有意に増強した。
【０１２６】
興味深い観察の１つは、ＮＳ３突然変異およびＮＳ４Ａ突然変異が、高いＧＴ６ａ  ＨＣＶ複製を付与し、１Ｃが、Ｌｕｎｅｔ細胞よりも許容的であることであった（図８）。ＧＴ６ａ  ＨＣＶ複製の増強をより良く定量化するために、ＮＳ３突然変異（Ｅ３０Ｖ、Ｐ８９ＬおよびＫ２７２Ｒ）およびＮＳ４Ａ突然変異Ｋ３４Ｒを、部位特異的突然変異誘発によりＰｉ−ＧＴ６ａ−Ｒｌｕｃ構築物に導入した。親ＧＴ６ａ−ＲｌｕＮｅｏレプリコンを含む全てのレプリコンＲＮＡ（各１０ｍｇ；全て、ＮＳ５Ａ突然変異Ｓ２３２Ｉを保有）を、それぞれＨｕｈ−７  Ｌｕｎｅｔ細胞または１Ｃ細胞にトランスフェクトした。適応させたＰｉ−ＧＴ１ｂ−Ｒｌｕｃレプリコンを比較のため並行してトランスフェクトした。５×１０３個のトランスフェクトした細胞を、９６ウェルプレートにおけるウェルに蒔いた。トランスフェクション後４時間目および１日目から７日目まで毎日、ウミシイタケルシフェラーゼ活性に関して細胞を解析した。Ｈｕｈ−７  Ｌｕｎｅｔ細胞および１Ｃ細胞の両方において、親レプリコンよりも遥かに高い（＞２０倍）これらのレプリコンのルシフェラーゼ活性によって証明される通り、ＮＳ３またはＮＳ４Ａのいずれかにおける全突然変異は、ＧＴ６ａ  ＨＣＶ複製を有意に増強した。さらに、１Ｃ細胞は、Ｌｕｎｅｔ細胞よりも許容的であった。Ｌｕｎｅｔ細胞において、適応的突然変異を有するレプリコンは、１×１０５ＲＬＵのピークルシフェラーゼ活性に達し、これは、ＧＴ１ｂレプリコンにより達せられるレベルよりもおよそ１０倍低かった。しかし、１Ｃ細胞において、ピークルシフェラーゼ活性は、１×１０６ＲＬＵであり、これは、高度に適応されたＧＴ１ｂレプリコンにより達せられるレベルに匹敵した。
【０１２７】
ＮＳ３適応的突然変異およびＮＳ４Ａ適応的突然変異は、効率的ＧＴ６ａ  ＨＣＶ複製を付与するために、ＮＳ５Ａ突然変異Ｓ２３２Ｉを必要とするように思われた（図９）。ＮＳ５Ａ突然変異Ｓ２３２Ｉが、ＮＳ３突然変異またはＮＳ４Ａ突然変異の適応的機能に必要とされるか確認するため、親Ｐｉ−ＧＴ６ａ−ＲｌｕｃレプリコンまたはＮＳ３に適応的突然変異Ｋ２７２ＲまたはＮＳ４ＡにＫ３４Ｒを保有するレプリコン構築物（全て、ＮＳ５Ａ突然変異Ｓ２３２Ｉを保有）を、部位特異的突然変異誘発によりＳ２３２Ｉ突然変異から野生型への復帰突然変異（ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ）に供した。全てのレプリコンＲＮＡ（各１０ｍｇ）を、個々に１Ｃ細胞にトランスフェクトし、５×１０３個のトランスフェクトした細胞を、９６ウェルプレートにおけるウェルに蒔いた。トランスフェクション後４時間目および１日目から７日目まで毎日、ルシフェラーゼ活性に関して細胞を解析した。突然変異Ｓ２３２Ｉの非存在下において、ＮＳ３突然変異Ｋ２７２ＲまたはＮＳ４Ａ突然変異Ｋ３４Ｒの存在にかかわらず、全レプリコンは、その複製効率を有意に低下させた。これらの結果は、ＮＳ３適応的突然変異およびＮＳ４Ａ適応的突然変異が、効率的ＧＴ６ａ  ＨＣＶ複製を付与するために、ＮＳ５Ａ突然変異Ｓ２３２Ｉを必要とすることを確認する。同様の結果は、Ｌｕｎｅｔ細胞においても観察された。
【０１２８】
これらの新たな適応的突然変異は、ＨＣＶ複製の再現性のある定量化のための、頑強なルシフェラーゼをコードするＧＴ６ａレプリコンの確立を可能にし、３８４ウェルフォーマットにおけるＨＣＶ阻害剤の５種のクラスのＥＣ５０値の決定を可能にした。ソフォスブビル、シクロスポリンＡ阻害剤およびＮＳ３プロテアーゼ阻害剤の大部分を含むヌクレオシド／ヌクレオチド（nucleos/tide）ＮＳ５Ｂ阻害剤は、ＧＴ６ａおよびＧＴ１ｂの両方に対し同様の抗ウイルス活性を有したが、ごく一部のＮＳ５Ａ阻害剤（ダクラタスビル）および僅かな非ヌクレオシドＮＳ５Ｂ阻害剤（ＨＣＶ−７９６）は、ＧＴ６ａに対し活性を保持した（表４）。
【表４】
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【０１２９】
ハイスループット３８４ウェル一過性トランスフェクションアッセイにおいてルシフェラーゼ活性を測定することにより、１列目に記載されているＨＣＶ阻害剤の５種の異なるクラスを、Ｐｉ−ＧＴ６ａ−ＲｌｕｃレプリコンおよびＰｉ−ＧＴ１ｂ−Ｒｌｕｃレプリコンに対するその抗ウイルス活性に関して評価した（表５）。データは、少なくとも２回の独立的実験の平均と標準偏差を表す。
【表５】
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【０１３０】
本実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗ウイルススクリーニングのために確立された、頑強なＧＴ６ａレプリコン系を提示する。他の遺伝子型レプリコンと併せて、この新たな試薬は、汎遺伝子型ＨＣＶレジメンの開発に役立つであろう。
【０１３１】
当業者であれば、本明細書において明示的に記載または示されていないが、本開示の原理を具体化し、その精神および範囲内に含まれる、様々なアレンジを考案できることが認められよう。さらに、本明細書に列挙されているあらゆる条件付きの語句は、本発明者らによる技術の前進により寄与される本開示の原理および概念を読者が理解するのを助けることを主に意図しており、このような具体的に列挙されている条件に限定されないものとして解釈されたい。さらに、本開示の原理、態様および実施形態を列挙する本明細書におけるあらゆる記載は、その構造的および機能的均等物の両方を包含することが意図されている。その上、このような均等物が、現在公知の均等物および将来開発される均等物（即ち、構造にかかわらず同じ機能を実行する任意の開発される要素）の両方を含むことが意図されている。したがって、本開示の範囲は、本明細書に示されている例示的な実施形態および記載されている例示的な実施形態に限定されることを意図しない。むしろ、本開示の範囲および精神は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年6月30日(2015.6.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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