(57)【要約】  0.1容量%以下の含水量を有する有機溶媒または有機溶媒混合物中で、(場合によってN保護された)保護オリゴペプチドエステルを、(場合によってC保護された)保護オリゴペプチド求核試薬と、任意の可能な形態のスブチリシンによりカップリングさせる工程を含む、オリゴペプチドを酵素合成するための方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴペプチドを酵素合成するための方法であって、i)をii)とカップリングする工程を含み、
i)4つ以上のアミノ酸残基を含むオリゴペプチドエステル、
-  保護基で保護された側鎖官能基をそれぞれ有する少なくとも2つのアミノ酸残基を含み、且つ式C(=O)-O-CX2-C(=O)N-R1R2(式中、各Xは、独立して、水素原子またはアルキル基またはアリール基を表し、R1は、水素原子またはアルキル基またはアリール基を表し、R2は、水素原子またはアルキル基またはアリール基、またはアミノ酸残基の側鎖官能基の上で、もしくはペプチド残基の側鎖官能基のうちの1つもしくは複数の上で、場合によって保護されている、C末端カルボキシアミド官能基もしくはカルボン酸官能基を有するアミノ酸残基もしくはペプチド残基を表す)で表される活性化したC末端エステルを含み、
-  N末端保護を場合によって含む、
ii)4つ以上のアミノ酸残基を含むオリゴペプチド求核試薬
-  N末端アミン基、および保護基で保護された側鎖官能基をそれぞれ有する少なくとも2つのアミノ酸残基を含み、
-  C末端保護を場合によって含む、
カップリングが、カップリング反応が主に起きる、液体の総量に対して0.1容量%以下の水を含む有機溶媒または有機溶媒混合物中で、スブチリシンの存在下で行われ、カップリング反応中に酵素により放出される水が除去される、方法。
【請求項２】
オリゴペプチドエステルが、リンカーを使用して固相合成により得られる、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
リンカーがSieberリンカーまたはRamageリンカーである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
すべての側鎖官能基の少なくとも50%が保護されている、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
各Xが水素原子を表す、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
R1およびR2の両方が水素原子を表す、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
R1が水素原子を表し、R2が、アミノ酸残基の側鎖官能基の上で、またはペプチド残基の側鎖官能基のうちの1つもしくは複数の上で、場合によって保護されている、C末端カルボキシアミド官能基またはカルボン酸官能基を有する、アミノ酸残基またはペプチド残基を表す、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
オリゴペプチドエステルのC末端アミノ酸残基の側鎖官能基を除いて、オリゴペプチドエステルおよびオリゴペプチド求核試薬のすべての側鎖官能基が保護されている、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
スブチリシンが野生型スブチリシンの変異体である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
スブチリシンが、固定された形態で使用される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
スブチリシンが、架橋酵素凝集体(CLEA)の形態で固定される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
有機溶媒または有機溶媒混合物が、MTBE、THF、Me-THF、1,2-ジメトキシエタン、ジクロロメタン、1,2-ジクロロエタン、TFE、DMF、NMP、DMAまたはDMSOを含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
有機溶媒または有機溶媒混合物が、MTBE、MTBEとDMFもしくはNMPもしくはDMAもしくはDMSOとの混合物、ジクロロメタン、またはジクロロメタンとDMFもしくはNMPもしくはDMAもしくはDMSOとの混合物を含む、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
有機溶媒または有機溶媒混合物が、0.05容量%以下の含水量を有する、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
酵素により放出される水が連続的に除去される、請求項1から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
酵素により放出される水がモレキュラーシーブを使用して除去される、請求項1から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
カップリング反応が塩の非存在下で実施される、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴペプチドを酵素合成するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ペプチド、特にオリゴペプチドは、例えば医薬品、食物または飼料成分、農薬または化粧品成分として多くの用途を有する。
【０００３】
オリゴペプチドは、非常に最適化された方法によって溶液中または固相上で化学的に合成できることが知られている。しかし、化学的ペプチド合成、特に大規模なものには、いくつかの制限が依然として存在する。例えば、10〜15アミノ酸より長いペプチドは、固相上で合成することが困難である。なぜなら、これらのペプチドは三次元構造を形成する傾向にあり(いわゆる「疎水性崩壊」により)、これによってペプチド延長が極めて難しくなり、大過剰の試薬およびアミノ酸構成ブロックが必要となるからである。加えて、最終生成物の精製は、同様の長さの有意な量のペプチドの存在により、多くの場合コスト効率が低い。したがって、10アミノ酸より長いペプチドは、多くの場合、保護されたオリゴペプチドフラグメントの固相合成の組合せにより合成され、これらのオリゴペプチドフラグメントは、続いて溶液中で化学的に縮合され、例えば、10+10の縮合により20アミノ酸のペプチドが作製される。化学的な、保護オリゴペプチドフラグメント縮合の主要な弱点は、C末端GlyまたはPro残基を使用する場合を除いて、C末端アミノ酸残基の活性化の際にラセミ化が生じることである。したがって、化学的な、保護オリゴペプチドフラグメント縮合ストラテジーは、C末端で活性化したGlyおよびPro残基の使用に限定されるか、または所望しないジアステレオ異性体の形成により、極めて困難な精製に取り組まなくてはならない。対照的に、酵素触媒されたオリゴペプチドカップリングは、完全にラセミ化を含まず、化学的ペプチド合成よりも他のいくつかの利点を有する。工業用途に対しては、動力学的手法に基づく酵素ペプチド合成概念、すなわち活性化したカルボキシ構成部分を使用することが最も魅力的である(例えばSewaldおよびH.-D. Jakubke、「Peptides: Chemistry and Biology」、第一版増刷、Wiley-VCH Verlag GmbH編、Weinheim、2002年を参照されたい)。
【０００４】
化学酵素ペプチド合成は、化学合成、発酵を使用して、または化学的および酵素カップリング工程の組合せにより個々に合成された、側鎖非保護のオリゴペプチドフラグメントの酵素カップリングを伴うことができる。いくつかの報告において、水性の環境における完全に側鎖非保護のオリゴペプチドの酵素的縮合が発表されている(Kumaranら、Protein Science、2000年、9巻、734頁;Bjorupら、Bioorg. Med. Chem. 1998年、6巻、891頁;Homandbergら、Biochemistry、1981年、21巻、3387頁;Komoriyaら、Int. J. Pep. Prot. Res. 1980年、16巻、433頁)。しかし、水系内でのこのような酵素的オリゴペプチドフラグメント縮合の主要な弱点は、オリゴペプチドアミド結合とC末端エステルに同時に加水分解が起きることによって、収率が低くなり、多くの副生物が生じることである。高価なオリゴペプチド出発物質およびペプチド製品の加水分解の量を低下させるために、多くの場合、大過剰のオリゴペプチド求核試薬を使用する(5〜10当量)ことにより、縮合速度を増加させ、したがって加水分解性副反応を低減させている。これは、経済的に極めて魅力のないストラテジーである。加水分解の量をさらに低下させるために、より高い製品収率およびより低い加水分解性副反応を示す有機共溶媒を使用して、水性の低い反応混合物中で、酵素的な、完全非保護オリゴペプチドフラグメント縮合が実施されてきた(Slomczynskaら、Biopolymers、1992年、32巻、1461頁;Xausら、Biotechnol. Tech. 1992年、6巻、69頁;Nishinoら、Tet. Lett. 1992年、33巻、3137頁;Clapesら、Bioorg. Med. Chem. 1995年、3巻、245頁、Kolobanovaら、Russian J. of Bioorg. Chemistry 2000年、26巻、6号、369頁)。これらの報告では、酵素活性に対して有意な量の水が必要とされるので(1〜5容量%の間の水)、加水分解性副反応は依然として完全に排除されていない。酵素による加水分解性副反応を実質的に排除するためには、ほぼ無水の反応混合物を使用することができる(1容量%未満の水)。しかしながら、これらの条件下で活性があり、安定した酵素は極めてわずかであり(G. Carrea、S. Riva、Fundamentals of Biocatalysis in Neat Organic Solvents、Whiley、2008年)、非保護の側鎖官能基を含有するオリゴペプチドは普通、これらの有機溶媒中で溶解度をほとんどまたはまったく示さない。いくつかの報告は、無水有機溶媒中でのジ-ペプチドおよびトリ-ペプチドの酵素合成について開示している(例えばChenら、J. Org. Chem. 1992年、57巻、6960頁)、しかし、オリゴペプチドフラグメント縮合は実施されていない。ほぼ無水の溶媒は加水分解性副反応を実質的に排除するが、最も多くの場合、多量の酵素活性が失われ、したがってオリゴペプチドカップリング反応は極めて遅くおよび不完全となる傾向にある。
【０００５】
溶液相での化学的ペプチド合成から知られているように、保護されたオリゴペプチドは、これらの疎水性の特徴により、いくつかの純正の有機溶媒中によく溶解する。したがって無水有機溶媒中での酵素的オリゴペプチドフラグメント縮合は、保護されたオリゴペプチドを使用して実施し得る。しかし、複数の立体的にかさ高い疎水性の側鎖保護基が酵素認識を遮断することが予想される。例えば、Yanら、Tetrahedron、2005年、61巻、5933頁により、プロテアーゼスブチリシンAを使用した場合に、側鎖保護されたアミノ酸との縮合物がまったく得られなかったことが報告された。彼らの観察によると、スブチリシンAは、側鎖官能基上にかさ高い保護基を有するアミノ酸残基を受け入れないが、これらのかさ高い保護基が除去されると、アミノ酸残基は容易に受け入れられる。
【０００６】
Gillら、(J. Am. Chem. Soc 1995年、117巻、6175〜6181頁)はまた、オリゴペプチドを酵素合成するための方法を記載している。しかし、Gillらにより記載されている合成は、フラグメントを合成するために個々のアミノ酸一つ一つに対して特定の酵素を添加しなければならず、2つのフラグメントのカップリングのためにも同様に別の酵素を添加しなければならない。2つのフラグメントの組み立てに異なる酵素を使用しなければならず、2つのフラグメントの縮合のために別の酵素を使用しなければならないという事実により、この方法の工業的規模での用途は魅力的ではなくなる。さらに、Gillらにより記載されているフラグメント縮合工程では、カップリングを達成するためにV8プロテアーゼを使用できるように、フラグメントのうちの1つの2つの側鎖アリル保護基を除去しなければならない。したがって、Gillらにより記載されている方法は、8つ以上のアミノ酸残基を含むオリゴペプチドの調製のための汎用的な方法ではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】US5,316,935
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】SewaldおよびH.-D. Jakubke、「Peptides: Chemistry and Biology」、第一版増刷、Wiley-VCH Verlag GmbH編、Weinheim、2002年
【非特許文献２】Kumaranら、Protein Science、2000年、9巻、734頁
【非特許文献３】Bjorupら、Bioorg. Med. Chem. 1998年、6巻、891頁
【非特許文献４】Homandbergら、Biochemistry、1981年、21巻、3387頁
【非特許文献５】Komoriyaら、Int. J. Pep. Prot. Res. 1980年、16巻、433頁
【非特許文献６】Slomczynskaら、Biopolymers、1992年、32巻、1461頁
【非特許文献７】Xausら、Biotechnol. Tech. 1992年、6巻、69頁
【非特許文献８】Nishinoら、Tet. Lett. 1992年、33巻、3137頁
【非特許文献９】Clapesら、Bioorg. Med. Chem. 1995年、3巻、245頁、
【非特許文献１０】Kolobanovaら、Russian J. of Bioorg. Chemistry 2000年、26巻、6号、369頁
【非特許文献１１】G. Carrea、S. Riva、Fundamentals of Biocatalysis in Neat Organic Solvents、Whiley、2008年
【非特許文献１２】Chenら、J. Org. Chem. 1992年、57巻、6960頁
【非特許文献１３】Yanら、Tetrahedron、2005年、61巻、5933頁
【非特許文献１４】Gillら、(J. Am. Chem. Soc 1995年、117巻、6175〜6181頁)
【非特許文献１５】Miyazawaら Protein & Peptide Letters、2008年、15巻、1050頁
【非特許文献１６】H. Rink、Tetrahedron letters、1987年、28巻、3787頁
【非特許文献１７】F. Albericioら J. Org. Chem.、1990年、55巻、3730頁
【非特許文献１８】Sieber、Tetrahedron letters、1987年、28巻、2107頁
【非特許文献１９】Ramageら Tetrahedron letters、1993年、34巻、6599頁
【非特許文献２０】Barlos、Tetrahedron Letters、1973年、95巻、1328頁
【非特許文献２１】Merglerら Tetrahedron Letters、1988年、68巻、239頁
【非特許文献２２】Cerovskyら J Pept Res.、2000年、55巻、325頁
【非特許文献２３】W.C. ChanおよびP.D. White、Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis、Oxford university press、2004年
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、加水分解性副反応を伴わない、またはほとんど伴わない、少なくとも8つのアミノ酸残基を含むペプチドの合成のための簡単で汎用的な酵素法に対する必要性が依然として存在する。驚いたことに、このような酵素法がここに発見された。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の枠組みの中で、オリゴペプチドエステルi)は、4つ以上のアミノ酸残基を含むオリゴペプチドエステルであって、
-  保護基で保護された側鎖官能基をそれぞれ有する少なくとも2つのアミノ酸残基を含み、且つ式C(=O)-O-CX2-C(=O)N-R1R2(式中、各Xは、独立して、水素原子またはアルキル基またはアリール基を表し、R1は、水素原子またはアルキル基またはアリール基を表し、R2は、水素原子またはアルキル基またはアリール基、またはアミノ酸残基の側鎖官能基の上で、もしくはペプチド残基の側鎖官能基のうちの1つもしくは複数の上で、場合によって保護されている、C末端カルボキシアミド官能基もしくはカルボン酸官能基を有するアミノ酸残基もしくはペプチド残基を表す)で表される活性化C末端エステルを含み、
-  N末端保護を場合によって含む、
オリゴペプチドエステルと定義する。
【００１１】
本発明の方法において使用されるオリゴペプチド求核試薬ii)は、4つ以上のアミノ酸残基を含むオリゴペプチド求核試薬であって、
-  N末端アミン基、および保護基で保護されている側鎖官能基をそれぞれ有する少なくとも2つのアミノ酸残基を含み、
-  C末端保護を場合によって含む、
オリゴペプチド求核試薬と定義する。
【００１２】
本発明の方法は、オリゴペプチドを酵素合成するための方法であって、上記に定義された4つ以上のアミノ酸残基のオリゴペプチドエステルi)を、上記に定義された4つ以上のアミノ酸残基を含むオリゴペプチド求核試薬ii)とカップリングする工程を含み、カップリングが、カップリング反応が主に起きている液体の総量に対して0.1容量%以下の水を含む有機溶媒または有機溶媒混合物中で、スブチリシンの存在下で行われ、カップリング反応中に酵素により放出される水が除去される、方法である。
【００１３】
本発明においては、溶媒混合物中の水の百分率とは、実験セクションに記載されている通りに正確に行ったKarl Fischer滴定により決定される水の百分率である。
【００１４】
i)の下に前述されているオリゴペプチドエステルは、本明細書中では「アシルドナー」と称することもあり、オリゴペプチド求核試薬ii)は多くの場合「求核試薬」と称する。
【００１５】
本発明の方法では、保護されたオリゴペプチドフラグメントを酵素により縮合することが可能なことが判明した。驚いたことに、特に、複数の側鎖保護基を有するオリゴペプチドアシルドナー(すなわち、上に記載のオリゴペプチドエステル)は、酵素により基質として受け入れられることが判明した。さらに、保護されたオリゴペプチドの縮合は、顕著な副反応なしで生じる。本発明による方法を用いて、80%超の収率を達成することができるが、この場合、百分率は所望の生成物へと変換されたアシルドナーの量(モル)を、残存するアシルドナー、所望の生成物および加水分解生成物(モル)の合計で割り、これに100%を掛けることで計算されている。好ましくは、90%超の収率、最も好ましくは95%超の収率が達成される。
【００１６】
驚いたことに、カップリングパートナーであるi)またはii)のうちの1つの極小過剰量または過剰でない量を使用した場合でさえも80%超の収率を達成することができる。これは、80%超の収率を得るために極めて大過剰の求核試薬、通常5〜10当量が必要とされる、水溶液または水性の低い溶液中での酵素ペプチド合成とは対照的である。
【００１７】
本発明の方法は、タンパク質を構成しないアミノ酸を含めて、カップリング反応に参加する末端アミノ酸残基が異なる様々な保護オリゴペプチドのカップリングの可能性を提供するという点で、有利である。化学的に保護されたフラグメントの縮合の場合、GlyまたはProがこの位置で使用される場合を除いて、ラセミ化は常に生じるが、これに対して、タンパク質を構成するアミノ酸またはタンパク質を構成しないアミノ酸のいずれかがC末端エステルのC末端残基において使用されても、この残基のラセミ化は起きない。したがって、本発明による方法により、フラグメント縮合ストラテジーにおいてかなりより多くの自由が得られる。
【００１８】
さらに、本発明の方法は、保護されたオリゴペプチドC末端エステルのエステル部分の加水分解の範囲が小さいという点で有利である。すなわち、加水分解の範囲がカップリングを達成するための典型的な時間枠内で小さく、少なくともいくつかの実験において、エステル検出可能な加水分解は観察されなかった。本発明においては、「小さい」とは、アシルドナーの5%未満と定義されるが、通常アシルドナーのはるか5%未満が本発明による方法の間に加水分解される。また、保護されたオリゴペプチドフラグメントの、または酵素により調製したペプチド生成物のアミド結合の加水分解の範囲は低い;少なくともいくつかの実験において、検出可能な加水分解は観察されなかった。
【００１９】
本発明においては、「オリゴペプチド」とは、本発明による方法において使用される、2〜200のアミノ酸に基づく、特に2〜100に基づく、さらに特に2〜50アミノ酸に基づくペプチド、好ましくは2〜200アミノ酸、より好ましくは2〜100または2〜50のアミノ酸の任意の直鎖を意味する。本発明においては、「ペプチド」とは、8つ以上のアミノ酸に基づくアミノ酸の任意の鎖を意味し、このペプチドは、本発明による方法の生成物である。
【００２０】
本発明においては、「保護されたオリゴペプチド」とは、少なくとも4つのアミノ酸残基の鎖を含む任意のオリゴペプチドを意味する(ここで、少なくとも2つのアミノ酸残基は側鎖官能基を有し、少なくとも2つのアミノ酸側鎖官能基は、保護基でそれぞれ保護されている)。側鎖官能基とは、例えばヒドロキシル、カルボン酸、第一級または第二級アミン(インドールおよびグアニジノを含む)、チオールまたはカルボキシアミド官能基である。好ましくは、存在するすべての側鎖官能基の60%超、より好ましくは70%超、さらにより好ましくは80%超が保護されている。
【００２１】
本発明においては、「非保護のオリゴペプチド」とは、その側鎖官能基が保護されている、2つ未満のアミノ酸残基を有する任意のオリゴペプチドを意味する。
【００２２】
本発明との関連で、「アミノ酸側鎖」とは、タンパク質を構成するまたはタンパク質を構成しない、任意のアミノ酸側鎖を意味する。
【００２３】
タンパク質を構成するアミノ酸とは、遺伝子コードによってコードされているアミノ酸である。タンパク質を構成するアミノ酸として以下が挙げられる:アラニン(Ala)、バリン(Val)、ロイシン(Leu)、イソロイシン(Ile)、セリン(Ser)、トレオニン(Thr)、メチオニン(Met)、システイン(Cys)、アスパラギン(Asn)、グルタミン(Gln)、チロシン(Tyr)、トリプトファン(Trp)、グリシン(Gly)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、ヒスチジン(His)、リシン(Lys)、アルギニン(Arg)、プロリン(Pro)およびフェニルアラニン(Phe)。
【００２４】
タンパク質を構成しないアミノ酸は、D-アミノ酸、フェニルグリシン、ドーパ(3,4-ジヒドロキシ-L-フェニルアラニン)、ベータ-アミノ酸、4-フルオロ-フェニルアラニン、またはCα-アルキル化アミノ酸の間で特に選択することができる。
【００２５】
本発明においては、縮合とは、2つのオリゴペプチドの間の新規ペプチド結合の形成を意味する。
【００２６】
本発明の枠組みの中で、アミノ酸残基またはペプチド残基とは、アミノ酸またはペプチドから、そのアミノ酸またはペプチドのN末端アミノ基を引いたものを意味する。
【００２７】
「C末端保護」という用語は、C末端カルボキシ官能基が保護基を備えていることを示すために本明細書中で使用され、一般的に、カルボキシル基が別の分子のアミン基にカップリングすることからカルボキシル基を実質的に保護する。C末端保護基はC末端エステルであってよく、これによって、C末端カルボキシル基は、使用されたペプチド合成条件下でアミンにカップリングすることから少なくとも実質的に保護される。t-アルキル基が一般的に使用される保護基である。C末端保護基はまたC末端カルボキシアミドであってもよい。第一級カルボキシアミドが一般的に使用される保護基である。C末端保護基はまた、ヒドラジド、カルバモイル-ヒドラジドまたはチオエステルであってもよい。C末端保護は一時的または永久的であってもよく、後者は、この保護的部分は所望の最終生成物の一部であることを意味する。
【００２８】
「N末端保護」という用語は、N末端アミン基が保護基を備えていることを示すために本明細書中で使用され、一般的にN末端アミン基が、C末端カルボキシル基のN末端アミン基へのカップリングに参加することからN末端アミン基を少なくとも実質的に保護する。
【００２９】
保護されたオリゴペプチドの酵素による縮合に使用される、保護されたオリゴペプチドC末端エステルi)の中のエステル-C(=O)O-CX2-C(=O)N-R1R2部分は活性化したエステルである。活性化したエステルは、カップリング反応に参加することができるカルボキシエステル基を提供するエステルである。
【００３０】
前記式において、各Xは、独立して、水素原子またはアルキル基またはアリール基を表す。特に、各Xが水素である(-O-CH2-C(=O)N-、Cam-エステルと称される)場合、本発明の方法において良好な結果が達成される。
【００３１】
前記エステル部分において、R1は、水素原子またはアルキル基またはアリール基を表し、R2は、水素原子またはアルキル基またはアリール基、またはアミノ酸残基の側鎖官能基の上で、もしくはペプチド残基の側鎖官能基のうちの1つもしくは複数の上で、場合によって保護されている、C末端カルボキシアミド官能基もしくはカルボン酸官能基を有するアミノ酸残基もしくはペプチド残基を表す。
【００３２】
本明細書中においては、「アルキル基」または「アリール基」という単語が使用される場合にはいつでも、以下の定義が適用される:各アルキル基は、独立して(置換または非置換の)C1〜C7アルキル基、好ましくは(置換または非置換の)直鎖C1〜C6アルキル基、より好ましくは(置換または非置換の)直鎖C1〜C3アルキル基、および最も好ましくはメチル基を表すことができる。
【００３３】
各アリール基は、独立して、(置換または非置換の)C4〜C13アリール基、好ましくは(置換または非置換の)C4〜C6アリール基、より好ましくは(置換または非置換の)C6アリール基、および最も好ましくはフェニル基を表すことができる。アリール基は、その環内に1つまたは複数のヘテロ原子を場合によって含むことができる。ヘテロ原子は、S、OおよびNの群から特に選択することができる。アルキル基またはアリール基上の置換基は、オリゴペプチドエステルi)とオリゴペプチド求核試薬ii)との間にカップリング反応が生じるのを妨げない任意の原子または原子の群であってよい。当業者であれば、どの置換基が本発明による方法に使用でき、どの置換基が使用できないか、容易に試験することができる。
【００３４】
特に、R1およびR2の両方が水素原子を表すか、またはR1が水素原子を表し、R2が、アミノ酸残基の側鎖官能基の上で、またはペプチド残基の側鎖官能基のうちの1つもしくは複数の上で、場合によって保護されている、C末端カルボキシアミド官能基またはカルボン酸官能基を有するアミノ酸残基またはペプチド残基を表す場合、良好な結果が本発明の方法において達成される。
【００３５】
別の実施形態では、保護されたオリゴペプチドエステルの、活性化したC末端エステル基は、高収率および高純度で、ラセミ化なしで固相上に導入できる。R1が水素原子を表し、R2が、アミノ酸残基の側鎖官能基の上で、またはペプチド残基の側鎖官能基のうちの1つもしくは複数の上で、場合によって保護されているC末端カルボン酸官能基を有するアミノ酸残基またはペプチド残基を表すエステルを使用する追加の利点は、これらの活性化したC末端エステル基は、安価で、工業的に入手可能な2-クロロトリチル樹脂上に導入できることである。
【００３６】
保護されたオリゴペプチドエステルi)のC末端アミノ酸は、原則として、タンパク質を構成するか、もしくはタンパク質を構成しなくてもよい任意のアミノ酸であってよく、オリゴペプチドエステルは、タンパク質を構成するおよび/またはタンパク質を構成しないアミノ酸からなることができる。
【００３７】
特に(場合によってN末端保護された)活性化したエステルi)は、式Iの化合物で表すことができる。
【００３８】
【化１】
2015508666.tif 000002
【００３９】
前記式において、Pは水素またはN末端保護基を表す。適切なN末端保護基は、(オリゴ)ペプチドの合成に対して使用することができるようなN-保護基である。このような基は当業者には公知である。適切なN保護基の例として、カルバメートまたはアシルタイプ保護基、例えば「Cbz」(ベンジルオキシカルボニル)、「Boc」(tert-ブチルオキシカルボニル)、「For」(ホルミル)、「Fmoc」(9-フルオレニルメトキシカルボニル)、「PhAc」(フェナセチル)および「Ac」(アセチル)が挙げられる。For、PhAcおよびAcなどの基は、それぞれ酵素ペプチドデホルミラーゼ、ペニシリンGアシラーゼまたはアシラーゼを使用して、酵素により導入および切断することができる。化学的切断方法は一般的に当技術分野で公知である。
【００４０】
式Iにおいて、nは少なくとも4の整数を表す。nは、特に少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8、少なくとも9または少なくとも10であってよい。nは、特に、100以下、75以下、50以下、25以下、20以下、15以下、例えば10以下であってよい。
【００４１】
式Iにおいて、各RAおよび各RBは、独立して、水素原子または有機部分、好ましくはアミノ酸側鎖を表す。したがって、すべてのn個のアミノ酸単位においてRAが同じである必要はない。同様に、すべてのn個のアミノ酸単位においてRBが同じである必要はない。式Iによるオリゴペプチドエステル中の少なくとも2つのアミノ酸残基はそれぞれ、保護基を有する側鎖を含む、すなわち、それらのアミノ酸残基のそれぞれに対して、RAまたはRBはHではなく、それぞれが保護された官能基、例えば保護されたヒドロキシル、カルボン酸、第一級または第二級アミン(例えばインドールおよびグアニジノを含む)、チオールまたは第一級アミド官能基を有し、すなわち保護された側鎖官能基を有する。好ましくは、RAおよびRBを一緒にして、これらの中に存在する官能基の少なくとも50パーセントが、当技術分野で公知の保護基で保護されるべきである。多くの異なる保護基が公知であり、本発明による方法において使用することができる。Fmocベースの固相ペプチド合成が使用される場合、側鎖保護基は、例えばt-Bu(tert-ブチル)、Boc、Trt(トリチル)、Mtt(4-メチルトリチル)、Acm(アセトアミドメチル)、Dnp(2,4-ジニトロフェニル)、Pmc(2,2,5,7,8-ペンタメチルクロマン-6-スルホニル)またはPbf(2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル)基から選択することができる。Bocベースの固相ペプチド合成が使用される場合、側鎖保護基は、例えば、Bzl(ベンジル)、Bz(ベンゾイル)、2Cl-Z(2-クロロベンジルオキシカルボニル)、cHex(シクロヘキシル)、Tos(トシル)、Xan(キサンテニル)、ForまたはMbzl(4-メトキシベンジル)および3-ベンジルオキシメチル基から選択することができる。
【００４２】
好ましい実施形態では、オリゴペプチドアシル-ドナーのC末端アミノ酸残基の側鎖官能基、すなわち活性化したC末端エステルを除いて、オリゴペプチドエステルi)のすべての側鎖官能基が保護される。本実施形態の利点は、オリゴペプチドアシルドナーi)のC末端アミノ酸残基の側鎖官能基が保護される実施形態よりも、より高い収率および/またはより短い反応時間が達成できることである。
【００４３】
活性化したエステルi)とカップリングされる(場合によってC末端保護された)保護オリゴペプチド求核試薬ii)は、原則として、タンパク質を構成するまたはタンパク質を構成しないアミノ酸に基づく任意のペプチドであってよい。
【００４４】
特に、(場合によってC末端保護された)保護オリゴペプチド求核試薬ii)は、式IIの化合物で表すことができる:
【００４５】
【化２】
2015508666.tif 000003
【００４６】
前記式において、n、RAおよびRBは上記に定義された通りである。式IIによるオリゴペプチド求核試薬の中の少なくとも2つのアミノ酸残基はそれぞれ、保護基を有する側鎖を含む、すなわち、それらのアミノ酸残基のそれぞれに対して、RAまたはRBはHではなく、それぞれ保護された官能基、例えば、保護されたヒドロキシル、カルボン酸、第一級または第二級アミン(例えばインドールおよびグアニジノを含む)、チオールまたは第一級アミド官能基を有し、すなわち保護された側鎖官能基を有する。好ましくは、RAおよびRBを一緒にして、これらの中に存在する官能基の少なくとも50パーセントが、当技術分野で公知の保護基で保護されるべきである。
【００４７】
前記式において、Qは、OR部分、アミン基、ヒドラジン基、カルバモイル-ヒドラジン基またはSR部分を表す。
【００４８】
QがOR部分を表す場合、Rは、C末端保護基、水素原子またはカチオン、例えば一価カチオン、例えば、三置換もしくは四置換されたアンモニウムイオンまたはアルカリ金属カチオンなどを表すことができる。RがC末端保護基である場合、これは特に(場合によって置換されている)アルキル基または(場合によって置換されている)アリール基となり得る。RがC末端保護基である場合、Rは好ましくはt-アルキル基であるが、ただし、原則として、Rは当業者に公知の任意の他の保護基であってもよい。t-アルキルは、原則として、任意の保護的第三級アルキル基であってよい。好ましくは、t-アルキルは、t-ブチル(2-メチル-2-プロピル)、t-ペンチル(2-メチル-2-ブチル)およびt-ヘキシル(2,3-ジメチル-2-ブチル)の群から選択される。
【００４９】
Qがアミン基を表す場合、アミン基は、式NR3R4(式中、R3およびR4は、それぞれ個々に、水素原子、任意の(置換または非置換の)アルキルまたは任意の(置換または非置換の)アリール基を表すことができる)で表すことができる。特に、R3およびR4のうちの一方は、水素原子であってよく、他方は、(置換または非置換の)アルキル基であってよい。R3およびR4の両方が水素原子である場合、特に良い結果が得られている。
【００５０】
Qがヒドラジン基を表す場合、ヒドラジン基は、式NR5-NR6R7(式中、R5、R6およびR7は、それぞれ個々に、水素原子、任意の(置換または非置換の)アルキルまたは任意の(置換または非置換の)アリール基を表すことができる)で表すことができる。好ましくは、R5、R6およびR7はすべて水素原子である。
【００５１】
Qがカルバモイル-ヒドラジン基を表す場合、カルバモイル-ヒドラジン基は、式NR8-NR9C(O)NR10R11(式中、R8、R9、R10およびR11は、それぞれ個々に、水素原子、任意の(置換または非置換の)アルキルまたは任意の(置換または非置換の)アリール基を表すことができる)で表すことができる。好ましくは、R8、R9、R10およびR11はすべて水素原子である。
【００５２】
QがSR部分を表す場合、Rは、C末端保護基、水素原子またはカチオン、例えば、一価カチオン、例えば、三置換もしくは四置換されたアンモニウムイオンまたはアルカリ金属カチオンなどを表すことができる。RがC末端保護基である場合、これは、特に(場合によって置換されている)アルキル基または(場合によって置換されている)アリール基となり得る。RがC末端保護基である場合、Rは好ましくはt-アルキル基であるが、ただし、原則として、Rはまた、当業者に公知の任意の他の保護基であってよい。t-アルキルは、原則として、任意の保護的第三級アルキル基であってよい。好ましくは、t-アルキルは、t-ブチル(2-メチル-2-プロピル)、t-ペンチル(2-メチル-2-ブチル)およびt-ヘキシル(2,3-ジメチル-2-ブチル)の群から選択される。
【００５３】
本発明の方法において、保護されたオリゴペプチドエステルと、保護されたオリゴペプチド求核試薬とのカップリングは、スブチリシン(E.C.3.4.21.62)で触媒する。原則として、カップリング反応を触媒することが可能な任意のスブチリシンを使用することができる。ある特定の供給源からのスブチリシンについて言及する場合、第1の生物から発生したものであるが、実際には(遺伝子操作された)第2の生物において生成された組換え型スブチリシンは、第1の生物からの酵素として含まれることが具体的に意図されている。
【００５４】
好ましくは、本発明の方法に使用されたスブチリシンはスブチリシンAである。
【００５５】
様々なスブチリシンが当技術分野で公知であり、例えば、US5,316,935をおよびその中に引用されている参考文献を参照されたい。このようなスブチリシンを本発明による方法において使用することができる。
【００５６】
C末端の位置にプロリン残基を含有するペプチドエステルi)が使用される、本発明による方法におけるスブチリシンAの使用は普通、極めて遅いカップリング反応を結果として生じる。したがって、好ましい実施形態では、本発明による方法は、反応が野生型スブチリシンAの存在下で行われる場合、オリゴペプチドエステルi)中のC末端アミノ酸残基がプロリン残基でないことを条件として行われる。また他のスブチリシンに対して、C末端アミノ酸残基がプロリン残基でないオリゴペプチドエステルi)を使用することが好ましい。しかし、スブチリシンAの変異体を使用すれば、許容可能なカップリング速度を達成することができることが予想される。
【００５７】
本発明の方法に使用するスブチリシンを得ることができる生物の例としては、トリコデルマ属(Trichoderma)の種、例えば、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)由来のもの;クモノスカビ属(Rhizopus)の種、例えば、リゾプス・オリーゼ(Rhizopus oryzae)由来のもの;バシラス属(Bacillus)の種、例えば、バシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・サブティリス(Bacillus subtilis)、バシラス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バシラス・クラウジイ(Bacillus clausii)、バシラス・レンタス(Bacillus lentus)、バシラス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バシラス・ハロデュランス(Bacillus halodurans)由来のもの;アスペルギルス属(Aspergillus)の種、例えば、アスペルギルス・オリザエ(Aspergillus oryzae)またはアスペルギルス・ニガー(Aspergillus niger)由来のもの;ストレプトマイセス属(Streptomyces)の種、例えば、ストレプトマイセス・カエスピトーサス(Streptomyces caespitosus)またはストレプトマイセス・グリセウス(Streptomyces griseus)由来のもの;カンジダ属(Candida)の種;真菌;フミコラ属(Humicola)の種;リゾクトニア属(Rhizoctonia)の種;サイトファーガ属(Cytophagia);ムコール属(Mucor)の種;および動物組織、特に膵臓、例えば、ブタの膵臓、ウシ属の膵臓またはヒツジ膵臓由来のものなどが挙げられる。
【００５８】
本発明による方法において天然(野生型)スブチリシンの変異体の使用も可能であることは平均的な当業者には明白である。野生型酵素の変異体は、例えば、当業者には公知の突然変異技術(ランダムな突然変異、部位特異的突然変異誘発、定向進化、遺伝子シャフリングなど)を使用して、DNAが少なくとも1つのアミノ酸が野生型酵素と異なる酵素をコード化するように、またはDNAが野生型と比較して短い酵素をコード化するように、野生型酵素をコード化しているDNAを改質することによって、および適切な(宿主)細胞内でこうして改質されたDNAの発現を実行することによって、作製することができる。酵素の変異体は、例えば以下の態様のうちの1つまたは複数について改善された特性を有することができる:基質の範囲、活性、安定性、有機溶媒耐性、温度プロファイル、合成/加水分解比および副反応プロファイル。
【００５９】
好ましい方法では、スブチリシンAを使用して、カップリング反応を触媒する。スブチリシンAは、Novozymesから市販のスブチリシンであり、保護されたカップリングパートナーを縮合させて、比較的短時間で、良い収率で所望のペプチド製品を得ることに関して特に有利なことが見出されている。
【００６０】
Alcalase(登録商標)は、スブチリシンAの適切な原料である。この製品はNovozymes(Bagsvaerd、Denmark)から入手可能である。Alcalase(登録商標)はバシラス・リケニフォルミス(主要な酵素構成部分としてスブチリシンAを含有する)により生成された、安価で、工業的に入手可能なタンパク質分解酵素混合物である。
【００６１】
Alcalase(登録商標)などの市販の酵素は、液体、特に水性の液体として製造元により提供され得る。このような場合、酵素は、所望しない液体、例えば、所望しない副反応を引き起こす過剰の水またはアルコールから最初に単離するのが好ましい。これは、沈殿、普通続いて、液体からの固体の分離、および/または乾燥により適切に遂行することができる。沈殿は、t-ブタノールなどのアルコールを使用して遂行することができる。別のアルコールが使用される場合、アルコールが不利にカップリング反応を妨げないように注意を払うべきである。
【００６２】
好ましい実施形態では、酵素は、固定化した形態で使用される。少なくとも一部の実施形態では、これは、比較的短い反応時間後、合成されたオリゴペプチドの収率を増加させる結果となり得る。Alcalaseの架橋酵素凝集体(Alcalase-CLEA)または固形粒子上に固定化したAlcalase、例えば、Alcalase-Imibond、Alcalase-Epobond、Alcalase-immozymeまたはAlcalase-Decaliteなどを用いて、特に良い結果が得られている。酵素の固定化はまたカップリング反応後の酵素の簡単な回収を可能にすることができ、これによって、酵素が再利用でき、逐次カップリング反応で繰り返し使用することができる。
【００６３】
不活性有機溶媒中で酵素カップリング反応を行うことができる。適切な溶媒のいくつかの例は、例えば、N,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、N-メチル-ピロリジノン(NMP)、N,N-ジメチルアセトアミド(DMA)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトニトリル、炭化水素、例えば、トルエン、ハロゲン化炭化水素、例えば、ジクロロメタン、1,2-ジクロロエタンなど、またはクロロホルム、エーテル、例えば、メチル-t-ブチルエーテル(MTBE)など、テトラヒドロフラン(THF)、2-メチル-テトラヒドロフラン(Me-THF)または1,2-ジメトキシエタン、または(ハロゲン化した)アルコール、例えば、2,2,2-トリフルオロエタノール(TFE)またはこれら有機溶媒の混合物などである。好ましくは、酵素カップリング反応は、MTBE、THF、Me-THF、1,2-ジメトキシエタン、ジクロロメタン、1,2-ジクロロエタン、TFE、DMF、NMP、DMAまたはDMSOを含めた有機溶媒または有機溶媒混合物中で行うことができる。最も好ましくは、酵素カップリング反応は、MTBE、MTBEとDMFもしくはNMPもしくはDMAもしくはDMSOとの混合物、ジクロロメタンまたはジクロロメタンとDMFもしくはNMPもしくはDMAもしくはDMSOとの混合物を含めた有機溶媒または有機溶媒混合物中で行うことができる。
【００６４】
酵素的フラグメント縮合は、実質的に非水性の条件下で通常行われる。当業者であれば理解しているように、酵素がその触媒活性を適切に実施することを可能にするため、酵素に応じて、少量の水が望まれることもある。
【００６５】
実質的に非水性とは、反応媒体が水を含まないか、または最小量の水、すなわち、反応媒体中の液体の総量に基づき0.1容量%以下の量の水を含有することを意味する。反応媒体は、第2の液相の中に分散していてもよいし、または別の液相が反応媒体の中に分散していてもよい。二相系または多相系の場合、特定された含水量は、カップリング反応が起きる相の中の液体の容量に基づき、または多相系が存在する場合、カップリング反応が少なくとも主に起きる相の中の液体の量に基づく。水濃度に対する所望の上限は、特定の酵素上のオリゴペプチドエステルi)およびオリゴペプチド求核試薬ii)の濃度、使用される溶媒、合成されるペプチドの性質(例えば、ペプチドのサイズおよびアミノ酸配列)、所望の最終変換ならびに所望の反応速度に依存する。
【００６６】
本発明による方法では、水濃度は0.1容量%以下、より好ましくは0.05容量%以下、さらにより好ましくは0.01容量%以下である。
【００６７】
水濃度に対する下限はここでは提示しない。なぜなら、存在するために必要となり得る最小量の水は、周知の分析法の検出限界より下であるからである。これはまた、本発明による方法に対する水濃度を決定するために使用されるKarl-Fischer滴定の検出限界にも当てはまる。有利な実施形態において、酵素により放出される水は、連続的または断続的に除去することができる。原則として、水の除去は、当技術分野で公知の方式により遂行することができる。水の除去に対して極めて適切なのは蒸発、例えば、真空または蒸留を使用した共沸除去などである。モレキュラーシーブを使用して良い結果が特に達成される。しかし、実質的に所望の酵素活性を保持することが重要である。
【００６８】
様々な量のモレキュラーシーブを酵素カップリング反応に添加することによって、その検出限界より下の、変化した水濃度を可能にする。例えば、多量のモレキュラーシーブの添加により得られる低すぎる水濃度は、場合によっては、カップリング反応中のゆっくりとした(部分的な)酵素の失活をもたらし得る。当業者であれば、モレキュラーシーブの量を変化させることにより、特定のカップリング反応に対する最適な水濃度を容易に決定することができる。酵素カップリング反応中の(部分的な)酵素の失活の場合、(部分的に)失活した酵素は、再水和により、例えば、(部分的に)失活した酵素を水溶液中で撹拌することにより、完全にまたはほぼ完全に再活性化させることができる。この再活性化は、逐次カップリング反応において酵素を繰り返し使用することにより可能となり得る。ある場合には、特に凍結乾燥された酵素の場合、十分な触媒活性を得るために、酵素は、酵素カップリング以前に水和しておかなければならない。非固定化した酵素の場合、このような水和は水溶液中で撹拌し、続いて、例えば、t-ブタノールなどの水混和性有機溶媒と共に沈殿させることによって実施することができる。固定化した酵素の場合、このような水和は、水溶液で洗浄し、続いて、1つまたは複数の有機溶媒、例えば、t-ブタノールなどの水混和性有機溶媒およびMTBEなどの水不混和性の溶媒で洗浄することにより実施することができる。
【００６９】
特に、本発明の方法は、比較的短時間で、許容可能な収率で合成されたペプチドを得るために、カップリングパートナーのうちの一方を、他方のカップリングパートナーに基づき大過剰に必要とすることなく、オリゴペプチドエステルi)と、オリゴペプチド求核試薬ii)とのカップリングを可能にする。オリゴペプチドエステルi)と、オリゴペプチド求核試薬ii)とのモル比は普通、2:1〜1:4の範囲、特に1:1〜1:3の範囲、好ましくは1:1〜1:2の範囲、より好ましくは1:1〜1:1.5、さらにより好ましくは1:1〜1:1.2から選ばれる。
【００７０】
好ましい実施形態では、カップリング反応は塩の非存在下で実施される。このような塩は、例えば、ジクロロメタン中1〜2.5容量%のトリフルオロ酢酸を使用して、保護されたオリゴペプチドを固相から酸性切断した後に形成される、(場合によってC末端保護された)保護されたオリゴペプチド求核試薬ii)の塩を中和させるための塩基の添加により普通形成される。(場合によってC保護された)保護されたオリゴペプチドアミン求核試薬ii)の中の塩の存在は、保護されたオリゴペプチドを固相から切断した後、ジクロロメタン層の水性アルカリ性抽出により便利に回避することができる。
【００７１】
原則として、使用されるpH(選ばれた反応媒体中にpHが存在する限りでは)は、酵素が十分な活性を示すpHが選ばれる限り、広い境界内から選択することができる。このようなpHは普通、使用される酵素に対して公知であり、水溶液中のその公知の加水分解性活性に基づいてもよいし、または、公知の反応条件下で酵素に対して公知の基質を利用してルーチン的に決定することもできる。pHは、特にほぼ中性となるように選択してもよい。所望する場合、酵素に応じて、アルカリ性条件または酸性条件を使用することができる。所望する場合、pHは、酸および/もしくは塩基を使用して調節してもよいし、またはpHは、酸および塩基の適切な組合せを用いて緩衝してもよい。適切な酸および塩基は特に、反応媒体において可溶性のもの、例えば、アンモニアおよび有機溶媒可溶性の酸の群由来のもの、例えば、酢酸およびギ酸などである。
【００７２】
原則として、使用される酵素が十分な活性および安定性を示す温度が選ばれる限り、使用する温度は重要ではない。このような温度は普通、使用される酵素に対して公知であるか、または、公知の反応条件下で、酵素に対して公知の基質を利用して、ルーチン的に決定することができる。一般的に、温度は、少なくとも0℃、特に少なくとも15℃または少なくとも25℃であってよい。特に、好熱性生物から発生する1種または複数の酵素が使用される場合、温度は、好ましくは少なくとも35℃であってよい。所望の最大温度は酵素によって異なる。一般的にこのような最大温度は、当技術分野で公知であり、例えば、市販の酵素の場合、製品データシートに示されているか、または共通一般知識に基づきルーチン的に決定することができる。温度は普通、70℃以下、特に60℃以下または50℃以下である。しかし、特に好熱性の生物由来の1種または複数の酵素使用される場合、温度は、より高い、例えば90℃までなどを選択することができる。
【００７３】
最適な温度条件は、共通一般知識に基づくルーチン実験によって当業者により、特定の酵素に対して容易に特定され得る。例えば、スブチリシン、特にスブチリシンA(例えば、Alcalase(登録商標))に対して、温度は有利には25〜60℃の範囲であってよい。
【００７４】
本発明による方法においてカップリングされるオリゴペプチドエステルi)およびオリゴペプチド求核試薬ii)は、好ましくは、固相合成法によって合成される。
【００７５】
ペプチドC末端カルバモイルメチル(Cam)およびCam-Xxx-NH2エステル(式中、Xxxは、任意の側鎖保護されたまたは非保護のタンパク質を構成するまたはタンパク質を構成しないアミノ酸を表す)は、プロテアーゼ触媒されるペプチド合成において初期に適用され(例えばMiyazawaら Protein & Peptide Letters、2008年、15巻、1050頁を参照されたい)、普通アルキルエステルより急速に酵素により縮合されるが、ずっと加水分解を受けやすい。
【００７６】
固相合成技術については、完全に側鎖非保護のオリゴペプチドC末端Cam-エステルの合成に関して記載されている(例えばBjorupら Bioorg. Med. Chem.、1998年、6巻、891頁を参照されたい)。これらのペプチドC末端Cam-エステルは、RinkまたはPalリンカーを含有する固相上で合成され(略図1、H. Rink、Tetrahedron letters、1987年、28巻、3787頁;F. Albericioら J. Org. Chem.、1990年、55巻、3730頁を参照されたい)、高濃度のTFA(例えば、TFA/H2O、95/5、v/v)を使用して、同時の側鎖脱保護により切断される。残念なことにこれらの厳しい切断および側鎖脱保護条件はまた、Cam-エステルの所望しない部分加水分解につながる。
【００７７】
略図1。
側鎖非保護のペプチドC末端Cam-エステルの固相合成
【００７８】
【化３】
2015508666.tif 000004
【００７９】
しかし、発明者らはこのたび、固相上で側鎖保護されたペプチドC末端CamおよびCam-Xxx-NH2エステルを合成することが可能であることを見出した。特別なSieberまたはRamageアミドリンカー(略図2、Sieber、Tetrahedron letters、1987年、28巻、2107頁;Ramageら Tetrahedron letters、1993年、34巻、6599頁を参照されたい)が使用され、ペプチドは極めて穏やかな酸性条件下で切断され(例えば、CH2Cl2中2.5vol%TFA)、側鎖保護基は影響を受けずに残る。これらのタイプのリンカーは、ペプチドC末端Cam-エステルの合成に使用されたことがない。
【００８０】
略図2:
側鎖保護されたペプチドC末端Cam-エステルの固相合成
【００８１】
【化４】
2015508666.tif 000005
【００８２】
有利なことに、側鎖保護されたペプチドC末端Cam-エステルの固相からの切断は、Cam-エステルの任意の所望しない加水分解が付随して起こらない。SieberまたはRamageリンカーを有する樹脂上でのCam-エステル合成に加えて、発明者らはこのたび、2-クロロトリチルクロリドまたはSASRINリンカーを含有する固相上で、側鎖保護されたペプチドC末端Cam-Xxx-OHエステル(式中、Xxxは、任意の側鎖保護されたまたは非保護のタンパク質を構成するまたはタンパク質を構成しないアミノ酸を表す)を合成することが可能なことを見出した(略図3、Barlos、Tetrahedron Letters、1973年、95巻、1328頁;Merglerら Tetrahedron Letters、1988年、68巻、239頁を参照されたい)。驚いたことに、これらのCam-Xxx-OHエステルは、酵素的フラグメント縮合反応において、Cam-Xxx-NH2エステルと同等に良好に機能した。
【００８３】
略図3:
2-クロロトリチルクロリドおよびSASRINリンカー
【００８４】
【化５】
2015508666.tif 000006
【００８５】
固相の化学的ペプチド合成技術を酵素的フラグメント縮合と組み合わせることが有利であることは文献において証明済みである。しかし、これらの例は、完全に側鎖非保護のペプチドの固相合成、およびそれに続く水溶液または部分的水溶液中でのこれらのペプチドフラグメントの酵素による縮合に基づいていた(例えばCerovskyら J Pept Res.、2000年、55巻、325頁を参照されたい)。
【００８６】
一方、好ましい本発明の方法では、側鎖保護されたペプチドフラグメントは、固相技術によって合成し、続いて無水有機溶媒中で酵素により縮合する。これは、これまで開示されていない。
【００８７】
したがって、本発明はまた、上に記載の式C(=O)-O-CX2-C(=O)N-R1R2(すなわちCam-エステル)で表されるエステル部分を含むオリゴペプチドエステルi)の合成のための方法に関する。
【００８８】
本発明はまた、
a)オリゴペプチド上に存在するいかなる側鎖保護基も保持しつつ、固相と、固相からのオリゴペプチドエステルの切断を可能にするために適切なオリゴペプチドとの間のリンカーを、穏やかな酸性条件下で使用して、固相合成により、以前に定義されたオリゴペプチドエステルi)を調製する工程であって、オリゴペプチドエステルが固相から切断される工程、
b)オリゴペプチド上に存在するいかなる側鎖保護基も保持しつつ、固相と、固相からのオリゴペプチド求核試薬の切断を可能にするために適切なオリゴペプチドとの間のリンカーを、穏やかな酸性条件下で使用して、固相合成により、以前に定義されたオリゴペプチド求核試薬ii)を調製する工程であって、オリゴペプチド求核試薬が固相から切断される工程、および
c)続いて、オリゴペプチドエステルi)を、オリゴペプチド求核試薬ii)とカップリングし、このカップリングが、液体総量に対して0.1容量%以下の水を含む有機溶媒または有機溶媒混合物中で行われる工程であって、このカップリング反応がスブチリシンの存在下で主に起き、カップリング反応中に酵素により放出された水が除去される工程、
によるペプチドの合成のための方法に関する。
【００８９】
驚いたことに、酵素的フラグメント縮合ストラテジーは、最も一般に適用されるFmocベースの固相ペプチド合成側鎖保護基と適合性がある。大きな「かさ高い」側鎖保護基、例えば、Trt、PbfまたはPmcなどを含有するペプチドでさえも、酵素により認識され、良い収率から優れた収率で縮合される。これらのタイプの保護基は今まで酵素ペプチド合成にまったく適用されたことがなかった。Fmoc/tBuベースの固相ペプチド合成のための最も一般的に使用される側鎖保護基は、
Asp、Glu、Thr、SerおよびTyrに対してはtBu、LysおよびTrpに対してはBoc、His、Asn、GlnおよびCysに対してはTrt、ならびにArgに対してはPmcまたはPbf
である。
【００９０】
Boc/Bzlベースの固相ペプチド合成に対して最も一般的に使用される側鎖保護基は、
Argに対してはTosまたはMts、Asp、Glu、ThrおよびSerに対してはBzlまたはCy、Cysに対してはAcm、Hisに対してはBomまたはDnp、Lysに対しては2-Cl-Cbz、Trpに対してはFor、ならびにTyrに対しては2-Br-Cbz
である。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】Alcalase-CLEA-OMの合成/加水分解(S/H)比に対する含水量の効果を示すグラフである。
【図２】3Åモレキュラーシーブを含有する3種の異なる有機溶媒(混合物)中でのAlcalase-CLEA-OMの失活を示すグラフである。
【図３】水性緩衝液中のAlcalase-CLEA-OMの再活性化を示すグラフである。
【図４】時間の経過と共に消費されるHydranal 2溶液の量を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
ここで、本発明を以下の例により例示するが、これらに限定するものではない。
【００９３】
実験
別途述べられていない限り、化学物質は販売元から得たもので、さらなる精製なしで使用した。Sieber(またはキサンテニルリンカー)樹脂および2-クロロトリチル樹脂はGL Biochen(China)から購入した。Savinase、EsperaseおよびEverlaseはNovozymesから購入した。バシラス属種由来のプロテアーゼ(3種の異なるバリアント)およびバシラス・リケニフォルミス由来のプロテアーゼは、Sigmaから購入した。Alcalase-immozymeは、ChiralVisionから購入した。1Hおよび13C NMRスペクトルは、Bruker Avance 300 MHz NMR分光器上に記録し、化学シフトは、TMS(0.00ppm)、DMSO-d6(1Hに対して2.50ppmまたは13Cに対して39.9ppm)またはCDCl3(13Cに対して77.0ppm)に対してppm(δ)で与えられている。薄層クロマトグラフィー(TLC)は、プレコートしたシリカゲル60 F254プレート(Merck)上で実施した;スポットは、紫外光またはニンヒドリンを使用して視覚化した。3Åモレキュラーシーブ(8〜12メッシュ、Acros)を減圧下、200℃で活性化した。Tert-ブタノール(tBuOH)をこれらのモレキュラーシーブ上に保存した。使用前に、tBuOHを液体(45℃)まで予熱した。シリカゲル、Merck等級9385 60Åを使用してカラムクロマトグラフィーを行った。逆相カラム(Inertsil ODS-3、C18、5μm、150×4.6mm)を40℃で使用して、HP1090液体クロマトグラフ上で分析用HPLCを実施した。UV-VIS 204線型分光器を使用して、220nmでUV検出を実施した。勾配プログラムは以下の通りであった:5%〜98%溶離液Bで0〜25分間の線型勾配ランプおよび5%溶離液Bで25.1〜30分(溶離液A:H2O中0.5mL/Lメタンスルホン酸(MSA)、溶離液B:アセトニトリル中0.5mL/L MSA)。流速は、1mL/分で0〜25.1分および2mL/分で25.2〜29.8分、次いで30分で停止するまで1mL/分に戻った。注入量は20μLであった。大きな保護された疎水性ペプチド(>10アミノ酸)の分析を、以下の勾配プログラムを使用して実施した:0%〜100%溶離液Bで0〜60分の線型勾配ランプおよび100%溶離液Bで60〜65分(溶離液A:水/アセトニトリル(80/20v/v%)中1mL/LTFA、溶離液B:アセトニトリル/2-プロパノール/水(50/45/5、v/v/v%)中1mL/LTFA)。分析用HPLCに対するものと同じ緩衝液および勾配プログラムを使用して、LC-MS分析を実施した。完全なスキャンモード:範囲300〜2000amuで、正イオンエレクトロスプレー(ESI)を使用してDeca XPイオントラップLC-MS(ThermoFisher Scientific)上で、クロマトグラムを記録した。製品ピークの統合された領域と、出発物質のものとを比較し、製品の減衰係数がアシルドナーのものと等しいと仮定することによって、縮合反応の製品収率を決定した。分取HPLCを静止型相カラム(Pursuit XRs、C18、10μm粒径、500×41.4mm)を使用するVarian PrepStarシステムで実施した。Alcalase-CLEA-OMは、CLEA-Technologiesから購入し、これは3.5重量%の水を含有した;明らかな活性は1グラム当たり650AGE単位であった(1AGE単位は、N-アセチル-グリシンエチルエステルから1μmolのN-アセチル-グリシンの形成を40℃およびpH7.5で触媒する)。このAlcalase-CLEA-OMを使用前に以下の通り処理した:1gのAlcalase-CLEA-OMを20mLのtBuOH中に懸濁させ、へらで粉砕した。濾過後、この手順を20mLのMTBEを用いて繰り返した。最後に酵素を篩い分けする(d=0.250mm)ことによって、大きな酵素粒子を除去した。液体Alcalaseを使用前に以下の通り処理した:10mLのAlcalase(茶色の液体溶液、Novozymesタイプ2.5LDX)を20mLのtBuOHで希釈し、続いて撹拌し、それに続いて沈殿物を遠心分離し(3.500rpm)、上清をデカントした。ペレットを30mLのtBuOH中に再懸濁させ、���いて撹拌し、遠心分離し、デカントした(3.500rpm)。生成したペレットを本発明による方法で使用した。Alcalase-imibondおよびAlcalase-epobondをSPRIN technologies(Trieste、Italy)から購入し、リン酸緩衝液(10mL/g、100mM、pH7.5、3×)、tBuOH(3×)およびMTBEで洗浄した。同じ洗浄手順をAlcalase-immozymeに対して適用した。スブチリシンAおよびプロテアーゼKの凍結乾燥粉末(Sigma)を使用前に以下の通り水和した:1グラムの凍結乾燥粉末を10mLのリン酸緩衝液(100mM、pH7.5)中に溶解し、続いて20mLのtBuOHを添加し、続いて撹拌し、それに続いて沈殿物を遠心分離し(3.500rpm)、上清をデカントした。ペレットを30mLのtBuOH中に再懸濁させ、続いて撹拌し、遠心分離し、デカントした(3.500rpm)。この手順を2回繰り返した。
【００９４】
反応混合物中の水の百分率を決定するために使用するKarl Fischer滴定の説明
Hydranal 2(Sigma)Karl Fischer滴定試薬を有するMetrohm titrino701 KFを使用して、含水量を自動的に測定した。不活性雰囲気下で反応混合物を濾過し、1.000グラムの液体試料をKarl Fischer滴定に対して使用した。ビュレットをHydranal 2ですすぎ、滴定パラメーターを以下に示されている通り設定した:
・  抽出時間=9999秒
・  停止判定基準=ドリフト
・  ドリフトでの停止=15(μL/分)
・  停止=40.0mL
・  最大速度=1.0mL/分。
・  最小量の増加=分(μL)
・  I(pol.)=10μA
・  エンドポイント=75mV
・  充填速度=20.0mL/分。
100mLのHydranal溶媒(Sigma)を、乾燥滴定容器に導入し、磁気棒で撹拌した。消費速度が通し時間で一定のままになるまで、Hydranal溶媒をHydranal 2で中和した。1.000gの試料を滴定容器に導入し、試料をHydranal 2で滴定した。消費されるHydranal 2溶液の量を図4のように求めた。
X軸:滴定剤の消費
Y軸:滴定の時間スケール
【００９５】
消費される標準的容積測定の溶液の量を、消費/時間曲線から推測する:
・  滴定線bをX軸との交点まで延長する
・  X軸との交点から、Y軸までの垂直の距離を、消費されたHydranal 2の量の尺度として測定する(X軸上の1cmが滴定剤1mLに相当する)。
【００９６】
試料中の水量(質量%)を以下の式
(v*Tt)/(10*a)
を使用して計算した。前記式において、
Tt=t℃において1.00mLのHydranal 2に相当する水(mg))
である。
【００９７】
オリゴペプチド-OCamエステル(オリゴペプチドエステルi))の合成
オリゴペプチド-OCamエステルを以下のプロトコルを使用して合成した:
1グラムのSieber樹脂(キサンテニルリンカー、0.5mmol/グラムの充填)をジクロロメタン(10mL、2×2分)、1-メチル-2-ピロリドン(NMP、10mL、2×2分)で洗浄し、ピペリジン/NMP(10mL、1/4、v/v、2×8分)を使用してFmoc-脱保護した。NMP(10mL、2×2分)、ジクロロメタン(10mL、2×2分)およびNMP(10mL、2×2分)で洗浄後、ジクロロメタン(10mL、45分)中でジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)(4当量)を使用して、ヨード酢酸(4当量)を樹脂にカップリングした。NMP(10mL、2×2分)、ジクロロメタン(10mL、2×2分)およびTHF(10mL、2×2分)で洗浄後、4当量のFmoc-Xxx-OH(式中、Xxxはアミノ酸を意味する)およびDMF/THF(10mL、1/4、v/v)中10当量のDiPEAを50℃で20時間使用して、樹脂にFmoc-保護したアミノ酸(側鎖官能基上に適当な保護基を有する)を充填した。DMF(10mL、2×2分)、ジクロロメタン(10mL、2×2分)およびNMP(10mL、2×2分)で洗浄後、標準的なSPPSプロトコル(W.C. ChanおよびP.D. White、Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis、Oxford university press、2004年を参照されたい)に従って、ペプチドを伸長させた。ジクロロメタン(樹脂1グラム当たり10mL)中2.5容量%のトリフルオロ酢酸(TFA)を使用して、15分間、樹脂からの切断を実施した。樹脂をジクロロメタンで洗浄し、合わせた濾液を、これらの元の量の1/3に真空中で濃縮した。続いて、イソプロパノール/水(1/3、v/v)を加え、混合物を、これらの元の量の1/2に真空中で濃縮した。沈殿したオリゴペプチド-O-Cam-エステルを濾別し、水で2回洗浄し、続いてアセトニトリル/水(3/1、v/v)から凍結乾燥した。生成物は、HPLC分析による収率>90%、純度>95%で一般的に得られた。
【００９８】
【表１Ａ】
2015508666.tif 000007
【００９９】
【表１Ｂ】
2015508666.tif 000008
【０１００】
Fmoc-Ala-O-CH2-COOHの合成
1mmolのFmoc-Ala-OHを100mLの無水THF/DMF(8/2、v/v)中に溶解し、続いて2当量のtert-ブチル2-ヨードアセテートおよび2.5当量のDiPEAを加えた。50℃において、150rpmで20時間この混合物を振盪させた。次いで、揮発物を真空中で除去し、残渣を、250mLのEtOAcと250mLの飽和した水性NaHCO3の混合物中に再び溶解した。2つの相を分離し、有機層を、飽和した水性NaHCO3(250mL、1×)、水性HCl(250mL、pH1、2×)、ブライン(250mL、1×)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、真空中で濃縮し、揮発物をトルエン(50mL、2×)およびCHCl3(50mL、2×)で同時蒸発させた。続いて、10mLのTFA/H2O(95/5、v/v)を加え、混合物を1時間撹拌し、続いて100mLのIPA/H2O(1/3、v/v)を加えた。50mLの揮発物を真空中で除去し、沈殿物を濾別し、50mLのH2O(2×)で洗浄した。残存する粗製エステルを分取HPLCで精製し、HPLC分析により、純度>98%、収率52%を得た。
【０１０１】
Fmoc-Gln(Trt)-O-CH2-COOHの合成
1mmolのFmoc-Gln(Trt)-OHを、100mLの無水THF/DMF(8/2、v/v)中に溶解し、続いて2当量のベンジル-2-ヨードアセテートおよび2.5当量のDiPEAを加えた。この混合物を、50℃において、150rpmで20時間振盪させた。次いで、揮発物を真空中で除去し、残渣を、250mLのEtOAcと250mLの飽和した水性NaHCO3の混合物中に再び溶解した。2つの相を分離し、有機層を、飽和した水性NaHCO3(250mL、1×)、水性HCl(250mL、pH1、2×)、ブライン(250mL、1×)で洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、真空中で濃縮し、揮発物をトルエン(50mL、2×)およびCHCl3(50mL、2×)で同時蒸発させた。残渣を250mLのMeOH/トルエン(1/1、v/v)中に溶解し、続いて一晩25℃で、5バールのH2で、1グラムの10% Pd/Cを使用して水素化分解した。濾過による固体の除去後、揮発物を真空中で除去した。生成した粗製エステルを分取HPLCで精製し、HPLC分析による純度>98%、収率63%でこれを得た。
【０１０２】
R2(C末端カルボキシアミド官能基を有するアミノ酸残基)を有するオリゴペプチド-OCam-Xxx-NH2エステル(オリゴペプチドエステルi)の合成
1グラムのSieber樹脂(キサンテニルリンカー、0.5mmol/グラムの充填)を、ジクロロメタン(10mL、2×2分)、NMP10mL、(2×2分)で洗浄し、ピペリジン/NMP(10mL、1/4、v/v、2×8分)を使用してFmoc-脱保護した。NMP(10mL、2×2分)、ジクロロメタン(10mL、2×2分)およびNMP(10mL、2×2分)で洗浄後、NMP(10mL、45分)中でHBTU(4当量)、HOBt(4当量)およびDiPEA(8当量)を使用して、Fmoc-Xxx-OH(4当量)を樹脂にカップリングした。NMP(10mL、2×2分)、ジクロロメタン(10mL、2×2分)およびNMP(10mL、2×2分)で洗浄後、ピペリジン/NMP(10mL、1/4、v/v、2×8分)を使用してアミノ酸をFmoc-脱保護し、樹脂をNMP(10mL、2×2分)、ジクロロメタン(10mL、2×2分)およびNMP(10mL、2×2分)で洗浄し、続いてNMP(10mL、90分)中でHBTU(2当量)、HOBt(2当量)およびDiPEA(4当量)を使用してFmoc-Xxx-O-CH2-COOH(2当量)をカップリングした。NMP(10mL、2×2分)、ジクロロメタン(10mL、2×2分)およびNMP(10mL、2×2分)で洗浄後、標準的SPPSプロトコル(W.C. ChanおよびP.D. White、Oxford university press、2004年によるFmoc Solid Phase Peptide Synthesisを参照されたい)に従って、ペプチドを伸長させた。オリゴペプチド-OCam-Xxx-NH2エステルの切断および精製は、プロトコル2と等しかった。生成物は、HPLC分析による純度>95%、収率>90%で一般的に得られた。
【０１０３】
【表２Ａ】
2015508666.tif 000009
【０１０４】
【表２Ｂ】
2015508666.tif 000010
【０１０５】
【表２Ｃ】
2015508666.tif 000011
【０１０６】
【表２Ｄ】
2015508666.tif 000012
【０１０７】
【表２Ｅ】
2015508666.tif 000013
【０１０８】
R2(C末端カルボン酸官能基を有するアミノ酸残基)を有するオリゴペプチド-OCam-Xxx-OHエステル(オリゴペプチドエステルi)の合成
1グラムのトリチル樹脂(2-クロロ-クロロトリチルリンカー、1.0mmol/グラムの充填)をジクロロメタン(10mL、2×2分)で洗浄し、ジクロロメタン(10mL、30分)中でDiPEA(5当量)を使用してFmoc-Xxx-OH(2当量)を樹脂にカップリングした。DMF(10mL、2×2分)で洗浄後、ジクロロメタン/MeOH/DiPEA(10mL、80/15/5、v/v/v、2×10分)を使用して、未反応のクロロトリチル基にキャッピングした。NMP(10mL、2×2分)、ジクロロメタン(10mL、2×2分)およびNMP(10mL、2×2分)で洗浄後、ピペリジン/NMP(10mL、1/4、v/v、2×8分)を使用して、アミノ酸をFmoc-脱保護し、続いてジクロロメタン(10mL、45分)中でDCC(4当量)を使用して、ヨード酢酸(4当量)とカップリングさせた。NMP(10mL、2×2分)、ジクロロメタン(10mL、2×2分)およびTHF(10mL、2×2分)で洗浄後、樹脂を、DMF/THF(10mL、1/4、v/v)中のFmoc-Xxx-OH(4当量)および10当量のDiPEAで、50℃で20時間処理した。DMF(10mL、2×2分)、ジクロロメタン(10mL、2×2分)およびNMP(10mL、2×2分)で洗浄後、標準的なSPPSプロトコル(W.C. ChanおよびP.D. White、Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis、Oxford university press、2004年を参照されたい)に従って、ペプチドを伸長させた。オリゴペプチド-OCam-Xxx-OHエステルの切断および精製は、プロトコル2と等しかった。生成物は、HPLC分析による純度>95%、収率>90%で一般的に得られた。
【０１０９】
【表３】
2015508666.tif 000014
【０１１０】
オリゴペプチドC末端アミド求核試薬(オリゴペプチド求核試薬ii))の合成
標準的SPPSプロトコル(W.C. ChanおよびP.D. White、Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis、Oxford university press、2004年を参照されたい)を使用して、オリゴペプチドC末端アミド求核試薬を、Sieber樹脂(キサンテニルリンカー、0.5mmol/グラムの充填)上に合成した。ジクロロメタン(樹脂1グラム当たり10mL)中2.5容量%のトリフルオロ酢酸(TFA)を使用して、15分間、樹脂からの切断を実施した。樹脂を10mLのジクロロメタンで2回洗浄し、合わせた濾液を10mLの飽和した水性NaHCO3で2回洗浄し、続いて真空中でこれらの元の量の1/3に濃縮した。沈殿、洗浄、乾燥はプロトコル2と等しかった。生成物は、HPLC分析による純度>95%、収率>90%で一般的に得られた。
【０１１１】
【表４Ａ】
2015508666.tif 000015
【０１１２】
【表４Ｂ】
2015508666.tif 000016
【実施例１】
【０１１３】
保護されたオリゴペプチド活性化エステルi)と、保護されたオリゴペプチドC末端アミド求核試薬ii)とのフラグメントカップリング。
【０１１４】
3μmolの保護されたオリゴペプチド活性化エステルおよび4.5μmolの保護されたオリゴペプチドC末端アミド求核試薬を0.5mLのジクロロメタン中に溶解し、10mgの粉砕したモレキュラーシーブを加えた。続いて、Alcalase-CLEA-OM(ジクロロメタン中20mg/mL)を含有する0.5mLの保存液(モレキュラーシーブ上に保存)を加えた。この混合物を37℃において、200rpmで24時間振盪させ、LC-MSで分析した。
【０１１５】
【表５】
2015508666.tif 000017
【０１１６】
Table 1(表5)は、様々な保護されたオリゴペプチドC末端エステルが、様々な保護されたオリゴペプチドC末端アミド求核試薬とカップリングして、少なくとも19アミノ酸の長さまでの高収率のペプチド生成物を付与することができることを実証している。さらに、縮合反応において使用される、化学量論的に大過剰のフラグメントのいずれかを使用せずに良い収率が得られた。
【実施例２】
【０１１７】
Ac-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln-OCam(オリゴペプチドi)(R1およびR2は水素)と、H-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-NH2(オリゴペプチドii)との様々な溶媒中でのフラグメントカップリング
2.2mmolのAc-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln-OCam(Seq.ID No:16)および3.3mmolのH-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-NH2(Seq.ID No:21)を100μLのDMF中に溶解した。続いて、10mgの粉砕したモレキュラーシーブ、10mgのAlcalase-CLEA-OMおよび900μLの溶媒を加えた。これらの混合物を、37℃において、200rpmで24時間振盪させ、HPLC分析した。
【０１１８】
【表６】
2015508666.tif 000018
【０１１９】
この表は、保護されたオリゴペプチドフラグメントカップリング反応に対して様々な溶媒が使用できることを実証している。
【実施例３】
【０１２０】
OCam-Xxx-NH2エステル(オリゴペプチドエステルi)とR2(C末端カルボキシアミド官能基を有するアミノ酸残基)との比較
様々なCbz-Val-Ala-OCam-Xxx-NH2エステルを、H-Phe-NH2とのカップリング反応におけるCbz-Val-Ala-OCamと比較した。0.028mmolのCBz-Val-Ala-OCam-Xxx-NH2またはCbz-Val-Ala-OCamを、5つのボールのモレキュラーシーブを有する1.5mLのTHF(10容量%のDMFを含有)中のH-Phe-NH2(1.5当量)に加えた。反応混合物を50℃で30分間撹拌し、続いてデカライト(decalite)上に固定化した50mgのAlcalaseを加えた。50℃で1時間の撹拌後、100μLアリコートの反応混合物を900μLのDMFに加え、試料をHPLCで分析した。Cbz-Val-Ala-Phe-NH2生成物の検量線図から収率を決定した。1時間後、様々なオリゴペプチド活性化したエステルの間の差がはっきりと現れることに注目されたい。長期の反応時間および/またはより多くの酵素を使用して、すべての反応を完全な変換まで導くことができた。
【０１２１】
【表７】
2015508666.tif 000019
【０１２２】
この表は、酵素カップリング反応に対して様々なC末端-OCam-Xxx-NH2エステルを使用することができることを示している。
【実施例４】
【０１２３】
OCam-エステルとOCam-Leu-NH2エステルの比較
3μmolの保護されたオリゴペプチドC末端エステルおよび4.5μmolのH-Met-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Glu(tBu)-Ala-NH2(Seq.ID No:21)を0.5mLのジクロロメタン中に溶解し、10mgの粉砕したモレキュラーシーブを加えた。続いて、Alcalase-CLEA-OM(ジクロロメタン中40mg/mL)を含有する0.5mLの保存液(モレキュラーシーブ上に保存)を加えた。この混合物を、37℃において、200rpmで48時間振盪させ、LC-MSで分析した。
【０１２４】
【表８】
2015508666.tif 000020
【０１２５】
この結果から、[2+1]カップリングに対して実施例3に示されている結果は、ペプチドフラグメントカップリングに変換することができ、少なくともいくつかの場合には、保護されたオリゴペプチドのC末端-OCam-Xxx-NH2エステルの使用は、非置換の-OCamエステルと比較して、カップリング速度および収率について有利であることが実証される。
【実施例５】
【０１２６】
オリゴペプチド-OCam-Xxx-NH2(C末端カルボキシアミド官能基)とオリゴペプチド-OCam-Xxx-OHエステル(C末端カルボン酸官能基)との比較
Cbz-Val-Ala-OCam-Leu-NH2およびCbz-Val-Ala-OCam-Leu-OHを、実施例3に記載されているように、H-Phe-NH2に酵素で縮合させた。Cbz-Val-Gln(Trt)-OCam-Gly-NH2およびCbz-Val-Gln(Trt)-OCam-Gly-OHを、実施例3に記載されているように、H-Phe-NH2に酵素で縮合させたが、ただし、5倍の量の酵素を使用した。ピペリジン(1当量)を使用することによって、酵素カップリング以前にカルボン酸部分を中和した。
【０１２７】
【表９】
2015508666.tif 000021
【０１２８】
この結果は、酵素カップリング反応に対して、C末端-OCam-Xxx-NH2エステルならびに-OCam-Xxx-OHエステルを使用することができ、少なくともいくつかの場合において同等の反応速度を表示することができることを示している。
【実施例６】
【０１２９】
様々な酵素および固定化形態の使用
2.2mmolのAc-Asp(OtBu)-Leu-Ser(tBu)-Lys(Boc)-Gln-OCamおよび3.3mmolのH-Met-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Val-NH2を100μLのDMF中に溶解した。続いて、10mgの粉砕したモレキュラーシーブ、10mgの酵素および900μLのMTBEを加えた。これらの混合物を37℃において、200rpmで24時間振盪させ、HPLCで分析した。以下の酵素から、優れた製品収率(>80%)を得た:Alcalase-CLEA-OM、Alcalase-imibond、Alcalase-epobond、Alcalase-immozyme、液体Alcalase、スブチリシンA、プロテイナーゼK。
【０１３０】
2.2mmolのCbz-Phe-OCamおよび3.3mmolのH-Phe-NH2を100μLのDMF中に溶解した。続いて、10mgの粉砕したモレキュラーシーブ、10mgの酵素および900μLのMTBEを加えた。これらの混合物を、37℃において、200rpmで24時間振盪させ、HPLCで分析した。以下の酵素から優れた製品収率(>80%)を得た:Savinase、Esperase、Everlase、バシラス属種由来のプロテアーゼ(3種の入手可能なバリアント)、バシラス・リケニフォルミス由来のプロテアーゼ。
【実施例７】
【０１３１】
保護されたオリゴペプチド活性化Cam-エステルi)とH-Leu-Phe-NH2とのフラグメントカップリング
3μmolの保護されたオリゴペプチドアシルドナーを0.5mLのジクロロメタン中に溶解し、10mgの粉砕したモレキュラーシーブを加えた。続いて、12μmol/mLのH-Leu-Phe-NH2および20mg/mLのAlcalase-CLEA-OMを含有するジクロロメタン中0.5mLの保存液(モレキュラーシーブ上に保存)を加えた。この混合物を37℃において、200rpmで24時間振盪させ、LC-MSで分析した。24時間後、様々なCam-エステルの間の差がはっきりと現れることに注目されたい。長期の反応時間および/またはより多くの酵素を使用して、すべての反応を完全な変換まで導くことができた。
【０１３２】
【表１０】
2015508666.tif 000022
【０１３３】
エントリー1〜4において観察することができるように、オリゴペプチドC末端エステルのC末端Gln残基に対して様々な側鎖保護基を使用することができるが、このC末端Gln残基が非保護の側鎖官能基を有していると有利である。エントリー5〜13は、様々なアミノ酸配列および側鎖保護基を有する、保護されたオリゴペプチドC末端エステルを酵素カップリング反応に使用することができることを裏付けている。
【実施例８】
【０１３４】
保護されたオリゴペプチドC末端アミド求核試薬ii)とCbz-Phe-OCamとのカップリング
3μmolの保護されたオリゴペプチドC末端アミド求核試薬を0.5mLのジクロロメタン中に溶解し、10mgの粉砕したモレキュラーシーブを加えた。続いて、12μmol/mLのCbz-Phe-OCamおよび20mg/mLのAlcalase-CLEA-OMを含有するジクロロメタン中0.5mLの保存液(モレキュラーシーブ上に保存)を加えた。この混合物を37℃において、200rpmで24時間振盪させ、LC-MSで分析した。24時間後、様々な保護されたオリゴペプチドC末端アミド求核試薬の間の差がはっきりと現れることに注目されたい。長期の反応時間および/またはより多くの酵素を使用して、すべての反応を完全な変換まで導くことができた。
【０１３５】
【表１１】
2015508666.tif 000023
【０１３６】
エントリー1〜9は、様々なアミノ酸配列および側鎖保護基を有する保護されたオリゴペプチドC末端アミド求核試薬を酵素カップリング反応に使用することができることを裏付けている。
【実施例９】
【０１３７】
含水量の合成/加水分解比に対する影響
2.2μmolのCbz-Phe-OCamおよび4.4μmolのH-Phe-NH2を1mLのジクロロメタン中に溶解し、5mgのAlcalase-CLEA-OMを加えた(これら等しい混合物を6つ調製した)。これらの混合物に、0、0.1、0.5、1.0、2.0および3.0μLのH2Oを加えた(反応混合物中≒0、0.01、0.05、0.1、0.2および0.3容量%の水に対応する)。すべての6種の混合物を37℃において、200rpmで2時間振盪させ、HPLCで分析した。
【０１３８】
S/H比は、形成されたジペプチド生成物Cbz-Phe-Phe-NH2の量(mmol)を、形成された加水分解生成物Cbz-Phe(mmol)の量(mmol)で割ったものと定義する。添付した図1から分かるように、低い水濃度は、Cam-エステルの加水分解を回避するために絶対必要である。
【実施例１０】
【０１３９】
再水和による酵素の再活性化
失活
5mgのAlcalase-CLEA-OMおよび25mgの3Åモレキュラーシーブを37℃において、1mLのDMF中で、および別々に1mLのジクロロメタン中で、および別々に1mLのDMF/MTBE(1/9、v/v)中で振盪させた。すべての3種の溶媒に対して、これらの等しい混合物を3つ調製した。すべての3種の溶媒に対して、3つの混合物を、それぞれ1、24および48時間後濾過し、いずれの場合も、5mgのCbz-Phe-OCamおよび1.5当量のH-Phe-NH2を含有する1mLのDMF/THF(1/9、v/v)を加え、反応混合物を37℃で振盪させた。比較のため、5mgのCbz-Phe-OCamおよび1.5当量のH-Phe-NH2を含有する1mLのDMF/THF(1/9、v/v)を、以前に有機溶媒中で振盪させていない5mgのAlcalase-CLEA-OMおよび25mgの3Åモレキュラーシーブと共に37℃において振盪させた。1時間後試料を取り、Cbz-Phe-Phe-NH2への変換をHPLCで判定した。有機溶媒で処理したAlcalase-CLEA-OMで得たCbz-Phe-Phe-NH2(mmol)の量を、未処理のAlcalase-CLEA-OMで得たCbz-Phe-Phe-NH2(mmol)の量で割り、×100%により相対活性を計算した。
【０１４０】
添付した図2において見ることができるように、Alcalase-CLEA-OMは、3Åモレキュラーシーブを含有する乾燥有機溶媒中でゆっくりと失活している。
【０１４１】
再活性化
5mgのAlcalase-CLEA-OMおよび25mgの3Åモレキュラーシーブを37℃で、1mLのDMF中、および1mLのジクロロメタン中で別々に、および1mLのDMF/MTBE(1/9、v/v)中で別々に振盪させた。すべての3種の溶媒に対して、これらの等しい混合物を3つ調製した。すべての3種の溶媒に対して、3つの混合物をそれぞれ1、24および48時間後濾過し、いずれの場合も、5mgのCbz-Val-Phe-OMeを含有する1mLの(1/1、v/v)DMF/リン酸緩衝液(100mM、pH=7.5)を加え、反応混合物を37℃で振盪させた。比較のため、5mgのCbz-Val-Phe-OMeを含有する、1mLの(1/1、v/v)DMF/リン酸緩衝液(100mM、pH=7.5)を、以前に有機溶媒中で振盪させていない5mgのAlcalase-CLEA-OMおよび25mgの3Åモレキュラーシーブと共に37℃において振盪させた。1時間後試料を取り、Cbz-Val-Phe-OHへの変換をHPLCで判定した。有機溶媒で処理したAlcalase-CLEA-OMによる加水分解で得たCbz-Val-Phe-OH(mmol)の量を、未処理のAlcalase-CLEA-OMによる加水分解で得たCbz-Val-Phe-OH(mmol)の量で割り、×100%により、相対活性を計算した。
【０１４２】
添付した図3において分かるように、3Åモレキュラーシーブを含有する乾燥有機溶媒中で失活させたAlcalase-CLEA-OMは、水性緩衝溶液中で再活性化することができる。
【実施例１１】
【０１４３】
様々な量のモレキュラーシーブを用いた酵素失活および水性緩衝溶液中での再活性化。
【０１４４】
失活
10mgのAlcalase-CLEA-OMの、0.5mLジクロロメタン中の4つの等しい混合物に、それぞれ、10、20、30および50mgのモレキュラーシーブ(3Å)を加えた。混合物を37℃において、200rpmで20時間振盪させた。続いて、0.2mMのCbz-Phe-OCamおよび0.3mMのH-Phe-NH2を含有する0.5mLのジクロロメタンを加え、反応混合物を37℃において、200rpmで振盪させた。1時間後、試料を取り、Cbz-Phe-Phe-NH2への変換をHPLCで判定した。酵素カップリング反応で得たCbz-Phe-Phe-NH2(mmol)の量を、最も高い変換(すなわち、10mgのモレキュラーシーブの場合)を有する酵素カップリング反応で得たCbz-Phe-Phe-NH2(mmol)の量で割り、×100%により相対活性を計算した。
【０１４５】
様々な量のモレキュラーシーブで失活させたAlcalase-CLEA-OMを使用したCbz-Phe-Phe-NH2の合成。
【０１４６】
【表１２】
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【０１４７】
上記の表において見ることができるように、より多量のモレキュラーシーブの使用による過度に乾燥した条件は、より高い酵素失活をもたらす可能性がある。
【０１４８】
再活性化
上記4種の反応混合物のジクロロメタンを、窒素流を使用して蒸発させた。続いて、5mgのCbz-Asn-OMeを含有する1mLの100mMリン酸緩衝液(pH8)を加え、反応混合物を、37℃において200rpmで振盪させた。1時間後、試料を取り、Cbz-Asn-OHへの変換を、HPLCを使用して判定した。酵素加水分解で得たCbz-Asn-OH(mmol)の量を、最も高い変換(すなわち、50mgのモレキュラーシーブの場合)を有する酵素加水分解で得たCbz-Asn-OH(mmol)の量で割り、×100%により相対活性を計算した。
【０１４９】
様々な量のモレキュラーシーブで失活させたAlcalase-CLEA-OMを使用したCbz-Asn-OMeの加水分解。
【０１５０】
【表１３】
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【０１５１】
上記の表において見ることができるように、加水分解性のAlcalase-CLEA-OMの活性は、同等であり、これらの以前の失活の程度に関係なく、酵素活性を水溶液中で回復することができることを示している。
【０１５２】
主要な物質を使用された順にリストする:
Ac=アセチル
Boc=tert-ブチルオキシカルボニル
NH2=アミン
OCam=カルボキサミドメチルエステル
OtBu=tertブチルエステル
Pbf=2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾ-フラン-5-スルホニル
tBu=tertブチル
Tmob=2,4,6-トリメトキシベンジル
Trt=トリチル
Xan=キサンテニル
【０１５３】
図：
図１：Alcalase-CLEA-OMの合成/加水分解(S/H)比に対する含水量の効果を示すグラフである。
図２：3Åモレキュラーシーブを含有する3種の異なる有機溶媒(混合物)中でのAlcalase-CLEA-OMの失活を示すグラフである。
図３：水性緩衝液中のAlcalase-CLEA-OMの再活性化を示すグラフである。
図４：時間の経過と共に消費されるHydranal 2溶液の量を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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