(57)【要約】  試験薬剤を皮膚色調効果の提供に有効であると特定するため及びスクリーニングするためのヒト皮膚組織サンプリング方法及びモデル、皮膚色素沈着を駆動する機構についての仮説を検証するための方法、並びにエックスビボ皮膚組織において皮膚色素レベルを駆動するための方法。この方法は、培養ヒト皮膚組織サンプルを試験薬剤と接触させる工程と、そのサンプルから転写プロファイルを生成する工程と、結果を対照と比較して、その試験薬剤が皮膚色調効果の提供に有効であるかどうかを決定する工程と、を含む。
2015505242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験薬剤を皮膚色調効果の提供に有効であると特定するためのスクリーニング方法であって、
第１のヒト皮膚組織サンプルを培養する工程であって、前記第１のヒト皮膚組織サンプルが表皮層及び真皮層を含む、工程と、
前記ヒト皮膚組織サンプルを前記試験薬剤と接触させる工程と、
前記第１のヒト皮膚組織サンプルから転写プロファイルを生成する工程であって、前記転写プロファイルが図１０から選択される少なくとも２つの遺伝子の転写に関連するデータを含む、工程と、
図１０から選択される前記少なくとも２つの遺伝子が対照と比較して発現レベルの指向的に適切な増加又は減少を示すとき、前記試験薬剤を皮膚色調効果の提供に有効であると特定する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
第２のヒト皮膚組織サンプルを、前記対照として使用するために基準色調薬剤と接触させる工程を更に含む、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記第１及び第２のヒト皮膚組織サンプルのうちの少なくとも１つがヒトドナー組織サンプルである、請求項１又は請求項２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記ヒトドナー組織サンプルから皮下脂肪層を除去する工程を更に含む、請求項３に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記基準色調薬剤が、前記第２のヒト皮膚組織サンプルにおいて、皮膚色調効果の提供に適切な方向に、図１０から選択される前記遺伝子のうちの少なくとも２つの発現レベルを上方調節又は下方調節する、請求項２〜４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記ヒト皮膚組織サンプルがＩＩ〜ＩＶのＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋスコアである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
前記第１のヒト皮膚組織サンプルが、３０℃〜４０℃の温度で、５０％〜９０％の相対湿度で、２４時間〜１０日間の期間、培養される、請求項１〜６のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記第１のヒト組織サンプルが、培養前に約４℃〜約１０℃で保存される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記サンプルを、前記真皮が湿った状態および前記表皮が乾燥した状態に保つために、等浸透圧溶液中に真皮側を下にして置く工程を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
前記第１のヒト皮膚組織サンプルを、皮膚組織表現型を模倣するために、エネルギー源又は１つ以上の化合物のうちの１つに供する工程を更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記第１のヒト皮膚組織サンプルを、培地中で、又は局所適用して、のいずれかで、パラクリン剤と接触させる工程を更に含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記試験薬剤がエンドセリン１及び幹細胞因子のうちの少なくとも１つである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
前記試験薬剤を含む化粧品スキンケア組成物を製剤化する工程を更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１４】
前記スクリーニング方法が一連の分析の一部であり、その一連の分析において、
前記第１のヒト皮膚組織サンプルへの前記試験薬剤の適用する工程の前に、前記試験薬剤が酵素分析、細胞培養分析、及び皮膚等価物分析のうちの少なくとも１つに供される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１５】
エックスビボヒト皮膚組織サンプルを、エンドセリン１、幹細胞因子、メラノサイト刺激ホルモン、ドブタミン、フォルスコリン、及び紫外光からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤と接触させることにより、前記エックスビボヒト皮膚組織サンプルにおける色素レベルを変える工程を更に含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の１つの態様は、化粧品組成物における使用に好適であり得る色調薬剤を特定するための、新規エックスビボ皮膚モデル及びスクリーニング方法に関する。本発明の別の態様は、エックスビボ皮膚サンプルにおいて色素レベルを駆動するための、エックスビボモデルの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚色素沈着レベル及び調節は相互に関連する遺伝子、タンパク質、並びに細胞内及び細胞外化合物の環境の複雑な系により決定され、制御され、そのうちのいくつかは更に解明されなければならない。皮膚色素沈着経路（単数又は複数）に不可欠な細胞プロセスの態様を模倣することができる皮膚モデルはそれゆえ、例えば、皮膚色素沈着の調整において有効な皮膚活性薬剤を特定するために所望される。
【０００３】
皮膚生理学及び薬剤への皮膚応答を研究するモデリング技術は歴史的に、単細胞種又は少数の共に混合された細胞種の培養から、ヒト組織等価物の製作、動物モデルの開発まで、様々な特有の技術を含んだ。しかしながら、これらの比較的単純なモデルは多くの場合、ヒト皮膚の細胞内及び細胞間複雑性の多くを欠く。例えば、単細胞種の細胞培養は容易に利用されるが、非常に単純化されたものであり、結果をヒト皮膚に一般化することについてはひどく制限される。第１に、そのような培養物は、単に培養されることにより変えられた細胞、及び特定の場合には、容易な細胞継代及び維持を促進するための遺伝子操作により変えられた細胞を含有する。第２に、そのような培養物は１単位として一定に相互作用する細胞の固有の複雑なマトリックスを説明することはできない。多細胞培養物は、天然組織の統合された機械的構造を作成すること、及びその細胞が正常な生理学的レベルでの細胞遺伝子発現を維持するために必要な細胞外成分を含むことを保証することにおける困難さのために制限される。ヒト皮膚を模倣するよう処理された幹細胞を含むモデルはそれらの意図された目的のために好適であるが、同様の問題及び制限を有する。
【０００４】
より複雑な皮膚モデルは動物モデル及び皮膚等価物モデルを含む。更なる複雑さを有する一方で、動物モデルはヒト皮膚についての遺伝的変異を含む制限に悩まされる。すなわち、得られた結果の分析において、ヒト組織は動物組織とは異なる反応をするという問題が常に存在し、結果を一般化する能力は低下する。例えば、皮膚の動物モデルは天然色素レベルにおいて、又は特定の遺伝子を上方調節する能力において、ヒトの皮膚と実質的に異なり得る。更に、受容体レベルでのわずかな変化でさえも、試験薬剤が異なる速度論で結合する、若しくは全く結合しない、又は様々な代替の内部経路若しくは遺伝子を活性化する若しくは不活性化するような様式で結合するかどうかにより、ヒト皮膚応答において見られ得るものに関連して、より少ない、より多い、又は外見上特異である応答を引き起こし得る。更に、外因性因子が動物での試験結果に影響することがあり、試験薬剤に関連しないストレッサーもまた結果に影響し得る。
【０００５】
皮膚等価物モデルは細胞の相互接続性、浸透性問題、及び解剖学的単純さの欠如により制限される。皮膚等価物モデルでのより最近の試みは器官型ヒト組織等価物として説明され、不活性ポリカーボネートフィルター上で培養されるケラチノサイト等のヒト細胞のインビトロ再構築を含み得る。これらのモデルはまさにそれらの性質により、それらが試験薬剤に対する異常な感受性を引き起こし得る、低下したバリア機能を有し得る点で制限される。このモデルはまた、（ケラチノサイト及び線維芽細胞、又はケラチノサイト及びメラノサイト等の）１つ又は２つの細胞種をおそらく有するが、内皮細胞、又は更にはケラチノサイト、線維芽細胞、及びメラノサイトの完全な組み合わせ等の追加の細胞を欠いており、ヒト皮膚より複雑でない。加えて、器官型皮膚等価物モデルはまた、皮膚応答に影響し得る腺等の正常な皮膚構造も欠いている。
【０００６】
最も複雑な皮膚モデルはヒト皮膚組織サンプルのエックスビボ培養物を含む。分析モデルとしてエックスビボヒト皮膚を利用する先行の試みは、低い活力又は生存能力での短い寿命等の制限を有した。そのようなモデルでの先行の試みは、皮膚の正常な環境と類似しない培地中に直接浮遊する皮膚の小生検を含み、そのため、その組織の寿命は制限された。一過性の培養物は、発明者及び研究者が、エックスビボブタ皮膚移植での試みが７日間に制限されることを示したように、不十分であり得ることが、本分野で知られる（Ｖｉｅｌｈａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｉｎ  Ｍｏｄｅｌ、米国特許公報第２００９／０２９８１１３号）。
【０００７】
更により最近のエックスビボモデルは金属格子上で皮膚外植片を培養する試み（Ｍｉｔｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ、米国特許公報第２００９／０１１０７０９号）、及び受精した卵巣卵の絨毛尿膜（ＣＡＭ）への皮膚移植（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｖｉａｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｒａｆｔｓ、米国特許公報第２００９／００６４３４９号）を伴った。しかしながら、そのようなモデルは構築の一過性、精巧さ、及び更に異種間問題によりやはり制限される。エックスビボ皮膚の寿命の長さを改善する１つの試みは欧州特許第ＥＰ  ２  ０１９  ３１６  Ｂ１号に記載される。
【０００８】
これらの進歩に関わらず、固有のドナー毎の組織変動性を扱うのに十分強固であり、弱い色調薬剤及び強い色調薬剤の両方を特定するのに十分な期間にわたり安定であり、かつドナー組織の遺伝子トランスクリプトミクスの分析に基づいて予測できる、敏感かつ予測的なエックスビボヒト皮膚組織スクリーニング方法についての要求が存在し続ける。遺伝子トランスクリプトミクスの計測は比較的速く、倍率変化はエックスビボ組織サンプル中で産出された又は阻害されたメラニン量の計測等の、他の終点より短い期間で確かに確認できるので、後者は色調薬剤の低スループットスクリーニング方法において特に有用である。
【０００９】
これ以降本明細書中により完全に議論されるように、色調薬剤の実際のスクリーニング方法の開発に関連する問題及び不確実性は多くある。非限定的な例としては、以下のものが挙げられる。ドナー毎の皮膚タイプ変動性の効果、外科的抽出後のドナー毎の皮膚状態変動性の効果（例えば、炎症状態及び生存能力）、培養条件が遅延活性色調薬剤及び即効活性色調薬剤の両方を評価するのに十分な期間、組織サンプルの生存能力を確立し得るかどうか、エックスビボ皮膚組織が必要とされる期間にわたり遺伝子トランスクリプトミクスレベルで適切に調節され得るかどうか、エックスビボ皮膚組織の遺伝子トランスクリプトミクスの分析がインビボ結果を予測し得るかどうか、適切な正の対照が満足なスクリーニング方法の開発のために十分に高い割合の組織サンプルでの使用のために特定され得るかどうか、及びこれらの変数が、エックスビボ皮膚組織サンプルに対する色調薬剤の効果が単離され、統計的有意性のレベルまで繰り返し可能であると解釈され得る点まで制御され得るかどうか。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本研究者は、色調特異的応答のために使用することができ、これらの問題及び不確実性のうちの１つ以上を扱う、エックスビボヒト皮膚モデル及びスクリーニング方法を開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本明細書中に開示される様々な実施形態により、ある薬剤を皮膚色調（例えば、美白）効果の提供に有効であると特定する方法が提供される。１つの実施形態によると、この方法は、第１のヒト皮膚組織サンプルを培養する工程であって、その第１のヒト皮膚組織サンプルが表皮層及び真皮層を含む、工程と、そのヒト皮膚組織サンプルを、その少なくとも１つの試験薬剤と接触させる工程と、その第１のヒト皮膚組織サンプルから転写プロファイルを生成する工程であって、その転写プロファイルが図１０から選択される少なくとも２つの遺伝子の転写に関連するデータを含む、工程と、図１０から選択されるその少なくとも２つの遺伝子が、無処理の対照組織サンプルと比較して発現レベルの指向的に適切な増加又は減少を示すとき、その少なくとも１つの試験薬剤を皮膚色調効果の提供に有効であると特定する工程と、を含む。
【００１２】
本明細書中に開示される追加の実施形態により、スクリーニング方法における使用ためのエックスビボ皮膚組織の調製方法が提供される。１つの実施形態によると、この方法は、成人ヒト皮膚組織サンプルを提供する工程と、その成人ヒト皮膚組織サンプルから皮下脂肪層を除去する工程と、その成人ヒト皮膚サンプルを均一な大きさにトリミングする工程と、その成人ヒト皮膚サンプルを約２℃〜約６℃で保存する工程と、を含み、その成人ヒト皮膚組織サンプルはＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋスケールで約２〜約４に格付けされたドナーからのものである。
【００１３】
本明細書中に開示される追加の実施形態は皮膚色素沈着を駆動する特定の機構についての仮説を検証する方法を提供する。１つの実施形態によると、方法は、皮膚色素沈着を駆動するための少なくとも１つの候補薬剤を特定する工程と、その少なくとも１つの候補薬剤が皮膚色素沈着を駆動すると仮定する工程と、皮膚色素沈着を駆動するための少なくとも１つの候補薬剤の効果を試験するために好適な条件下で、ある期間、培養ヒト皮膚組織サンプルを提供する工程であって、そのヒト皮膚組織サンプルが表皮層及び真皮層を含む、工程と、そのヒト皮膚組織サンプルをその少なくとも１つの候補薬剤とその期間中接触させる工程と、処理されたヒト皮膚組織サンプルから転写プロファイルを生成する工程であって、その転写プロファイルが図１０から選択される少なくとも２つの遺伝子の転写に関連するデータを含む、工程と、図１０から選択されたその少なくとも２つの遺伝子全てが無処理の対照組織サンプルと比較して発現レベルにおいて増加したもののうちの少なくとも１つであるか、又は図１０から選択されたその少なくとも２つの遺伝子全てが無処理の対照組織サンプルと比較して発現レベルにおいて減少するとき、その少なくとも１つの候補薬剤が皮膚色素沈着を駆動するという仮説を検証する工程と、を含む。
【００１４】
追加の実施形態は、エックスビボ皮膚組織における色素レベルの駆動剤（刺激剤）を特定する方法を提供する。１つの実施形態によると、方法は、エックスビボ皮膚組織における色素レベルを駆動する（刺激する）工程を含み、この工程は、ヒト皮膚組織サンプルを培養する工程であって、そのヒト皮膚組織サンプルが表皮層及び真皮層を含む、工程と、そのヒト皮膚組織サンプルを、その細胞の色素沈着機構を上方調節する、エンドセリン１、幹細胞因子、メラノサイト刺激ホルモン、フォルスコリン、又は紫外光からなる対照群から選択される少なくとも１つの薬剤と接触させる工程と、同様に色素沈着を上方調節する未知の物質の効果を分析する工程と、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】５％ナイアシンアミドを用いた２つのＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  ＩＩＩ組織サンプル、並びに５％ナイアシンアミド及び７．５％ナイアシンアミドを用いた１つのＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  Ｖ組織サンプルにおける、ある遺伝子の、媒体対照と比較した、倍率調節変化を示す図。
【図２Ａ】２４時間対照と比較した８日間にわたる無処理のＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  ＩＩＩ組織サンプルのある遺伝子の倍率変化を示す図。
【図２Ｂ】２４時間対照と比較した８日間にわたる無処理のＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  Ｖ組織サンプルのある遺伝子の倍率変化を示す図。
【図３Ａ】ＤＭＥＭ中で直接培養された皮膚組織の４ｍｍパンチについて、ＭＴＴ分析（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物分析）で評価された、エックスビボ皮膚組織の生存能力を示す棒グラフ。
【図３Ｂ】ＤＭＥＭ及びＳＷ培地中の膜上で培養された１ｃｍサンプルについて、ＭＴＴ分析で評価された、エックスビボ組織皮膚の生存能力を示す棒グラフ。
【図４Ａ】３３℃で組織により培地中に放出されたＩＬ−１βサイトカインのグラフ。
【図４Ｂ】３７℃で組織により培地中に放出されたＩＬ−１βサイトカインのグラフ。
【図５】８日間の過程にわたるＦｉｔｚｐａｔｉｃｋ  ＩＩＩ組織サンプルの、ある炎症及び色調遺伝子の倍率変化を示すヒートマップ。
【図６】無処理の対照と比較した、４日間及び７日間での、ある色調遺伝子の倍率調節変化を示すヒートマップ。
【図７ａ】１１日間の過程にわたり３７℃で９５％相対湿度で培養されたエックスビボ皮膚組織の一連の顕微鏡写真。
【図７ｂ】１０日間の過程にわたり３７℃で５０％相対湿度で培養されたエックスビボ皮膚組織のＨ＆Ｅ染色の一連の顕微鏡写真。
【図８】１１日間の過程にわたり３３℃で７０％相対湿度で培養されたエックスビボ皮膚組織の一連の顕微鏡写真。
【図９】１９日間の過程にわたり３３℃で７０％相対湿度で培養されたエックスビボ皮膚組織の一連の顕微鏡写真。
【図１０】特定の実施形態で、転写分析が行われ得る、特異的な、非限定的な色調遺伝子を示す表。
【図１１Ａ】２つの濃度のヘキサミジンでの処理後に内因的に駆動されたエックスビボ皮膚組織における、ある対象色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍率変化を示す棒グラフ。
【図１１Ｂ】図１１Ａ中に示されるデータについての倍率調節変化を示す表。
【図１２Ａ】ナイアシンアミドでの処理後に内因的に駆動されたエックスビボ皮膚組織における、ある対象色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍率変化を示す棒グラフ。
【図１２Ｂ】図１２Ａ中に示されるデータについての倍率調節を示す表。
【図１３Ａ】コウジ酸及びトラネキサム酸での処理後に内因的に駆動されたエックスビボ皮膚組織における、ある対象色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍率変化を示す棒。
【図１３Ｂ】図１３Ａ中に示されるデータについての倍率調節を示す表。
【図１４Ａ】２つの濃度のＮ−アセチルグルコサミンでの処理後に内因的に駆動されたエックスビボ皮膚組織における、ある対象色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍率変化を示す棒グラフ。
【図１４Ｂ】図１４Ａ中に示されるデータについての倍率調節を示す表。
【図１５Ａ】２つの濃度のウンデシレノイルフェニルアラニンでの処理後に内因的に駆動されたエックスビボ皮膚組織における、ある対象色調遺伝子についての、無処理の対照に対する倍率変化を示す棒グラフ。
【図１５Ｂ】図１５Ａ中に示されるデータについての倍率調節を示す表。
【図１６Ａ】色素沈着経路を上方調節することが知られる様々な化合物への曝露後のエックスビボ皮膚組織における、ある対象色調遺伝子の、倍率変化を示す棒グラフ。
【図１６Ｂ】図１６Ａ中に示されるデータについての倍率調節を示す表。
【図１７】無処理の対照に対する、幹細胞因子とエンドセリン１との組み合わせに曝露されたエックスビボ組織からの表皮組織染色を示す図。
【図１８】幹細胞因子とエンドセリン１との組み合わせに曝露されたエックスビボ組織からの顕微鏡写真を示す図であって、矢印はメラノファージと考えられる構造を示す図。
【図１９Ａ】２つの濃度のヘキサミジンでの処理後に内因的に駆動されたエックスビボ皮膚組織における、ある対象色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍率変化を示す棒グラフ。
【図１９Ｂ】図１９Ａ中に示されるデータについての倍率調節変化を示す表。
【図２０Ａ】ナイアシンアミドでの処理後の（幹細胞因子とエンドセリン１との組み合わせにより駆動された）エックスビボ皮膚組織における、ある対象色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍率変化を示す棒グラフ。
【図２０Ｂ】図２０Ａ中に示されるデータについての倍率調節変化を示す表。
【図２１Ａ】コウジ酸及びトラネキサム酸での処理後の（幹細胞因子とエンドセリン１との組み合わせにより駆動された）エックスビボ皮膚組織における、ある対象色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍率変化を示す棒グラフ。
【図２１Ｂ】図２１Ａ中に示されるデータについての倍率調節変化を示す表。
【図２２Ａ】２つの濃度のＮ−アセチルグルコサミンでの処理後の（幹細胞因子とエンドセリン１との組み合わせにより駆動された）エックスビボ皮膚組織における、ある対象色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍率変化を示す棒グラフ。
【図２２Ｂ】図２２Ａ中に示されるデータについての倍率調節変化を示す表。
【図２３Ａ】２つの濃度のウンデシレノイルフェニルアラニンでの処理後の（幹細胞因子とエンドセリン１との組み合わせにより駆動された）エックスビボ皮膚組織における、ある対象色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍率変化を示す棒グラフ。
【図２３Ｂ】図２３Ａ中に示されるデータについての倍率調節変化を示す表。
【図２４】紫外線への曝露後の、ある対象色調遺伝子の、無処理の対照に対する倍率変化を示す棒グラフ。
【図２５ａ】ヒトエックスビボ前臨床モデルにおける臨床製剤による顕著な下方調節を示す、エックスビボモデル倍率調節変化をそれぞれ示す、２つの表。
【図２５ｂ】ヒトエックスビボ前臨床モデルにおける臨床製剤による顕著な下方調節を示す、エックスビボモデル倍率調節変化をそれぞれ示す、２つの表。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本研究者は、色素特異的応答を計測し、かつ現在の技術の問題及び不確実性を克服するために使用され得るエックスビボヒト皮膚モデル及びスクリーニング方法を開発した。説明のために、本発明の特異的な、非限定的な実施形態が本明細書中に記載される。当業者は、本明細書中の装置及び方法は単に例示であり、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく変形がなされ得ることを、容易に理解するであろう。本明細書中で使用される専門用語は特定の実施形態を説明する目的のみのためであり、限定とは意図されないこともまた理解されるべきである。本発明の説明及び添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の意味を示さない限り、同様に複数形を含むものとする。
【００１７】
特に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の明細書で用いる用語は、特定の実施形態を説明するためのみであり、本発明を制限することを目的としていない。
【００１８】
別途記載のない限り、本明細書及び特許請求の範囲中で使用される、成分の量を表す全ての数値、分子量等の特性、反応条件等は用語「約」により全ての場合において修飾されると理解されるべきである。
【００１９】
更に、本明細書及び特許請求の範囲中の任意の範囲の開示は、その範囲それ自体及びまたその中に包含されるあらゆるもの、並びに終点も含むと理解されるべきである。別途記載のない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載の数値的性質は、本発明の実施形態において得ることが求められる所望の性質に応じて変化し得る近似値である。本発明の広い範囲を示している数値範囲及びパラメーターは近似値であるけれども、具体的な実施例に示される数値は、できる限り正確に報告されている。しかしながら、あらゆる数値は、それらのそれぞれの測定値に認められる誤差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に包含する。
【００２０】
エックスビボ皮膚スクリーニング方法の様々な実施形態の非限定的な態様及び実施例がこれより記載されるであろう。様々な実施形態がこれ以降で対照、培養条件、遺伝子トランスクリプトミクス、皮膚組織のプロセッシング、ｍＲＮＡプロセッシングの文脈において記載されるが、本明細書中に提供される詳細は単に例示であることが意図され、多くの改変、追加、削除、及び他の変更が本明細書中の教示に照らして可能であることが理解されるであろう。
【００２１】
エックスビボ皮膚スクリーニング方法／分析は概して、以下のもののうちの１つ以上を含む。外科的廃棄物ドナー組織を回収すること、その組織を培養のために調製すること、その組織を局所的に又は培養培地中で適用される試験物質で処理すること、その組織をある特定の期間培養すること、及び所望の（例えば、遺伝子転写等の）１つ以上の終点を計測すること。これらの様々な態様の非限定的な説明は以下のとおりである。
【００２２】
Ｉ．ドナー組織
ドナー組織サンプルは、腹壁形成術又は体全体のリフト手順を含むがこれに限定されない、広く様々な手順のいずれかからの外科的廃棄物組織であり得る。本研究者により発見された１つの態様は、組織サンプルを特定のＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋスコアに限定することが望ましいということである。特定の実施形態では、ＩＩ〜ＩＶのＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋスコアを有するか、又は更にスクリーニング方法においてＩＩ又はＩＩＩのいずれかであるスコアを有する、ドナー組織サンプルを使用することが所望され得る。Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋスコアは皮膚の色についての数値分類スキーマである。タイプＩは非常に色白である。タイプＩＩは色白である。タイプＩＩＩはベージュ色である。タイプＩＶは茶色の色合いを伴うベージュ色である。タイプＶは濃い茶色であり、タイプＶＩは色黒である。本研究者は、タイプＩの皮膚は対象色素沈着遺伝子について信頼性のあるトランスクリプトミクスデータを提供するのに十分なユーメラニン（色素）を生成しないこと、及びより高いＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋスコアは、それらは使用され得るが、ストレス／炎症により影響される色素沈着遺伝子についての分析に、より高い変動性を導入するように見受けられることを発見した。例えば、タイプＶは７．５％の濃度で正の対照に十分に応答し得るが（対象遺伝子がその正の対照により適切に調節されていることを意味する）、一方、この濃度の活性剤はタイプＩＩ及びＩＩＩにとって毒性であり得る。これは、より濃い色の皮膚組織は手術後にあまりストレスを受けず、それゆえ、優れた抗酸化保護としてはたらく、より大きい内蔵メラニン濃度のために、より高い濃度の正の対照により導入されるストレスに耐えることができるという、本研究者の観測結果のためと考えられる。また、本研究者は、少なくとも１つのタイプＶ組織サンプルにおいて、対象色調遺伝子が（おそらく組織全体におけるより少ないストレスを示して）上方調節される代わりに下方調節され、タイプＶ皮膚サンプルに関連する追加の所望されない変動性を示したことを観測した。図１を参照して、５％ナイアシンアミドでＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  Ｖドナーを、統計的有意性を伴って下方調節することは、同じ濃度のナイアシンアミドで２つのＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  ＩＩＩドナーを下方調節するより、困難であることが理解され得る。図２を参照して、無処理のＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  ＩＩＩドナーと無処理のＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  Ｖドナーとの比較が示される。図２中に見られ得るように、Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  ＩＩＩドナーの色素沈着遺伝子はＦｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  Ｖドナーにおけるより一貫して、一定時間にわたり上方調節された。
【００２３】
受け取りに際して、組織は約２℃〜約１０℃、又は約２℃〜約６℃等の室温を下回る温度で最大約２４時間保存され得る。本研究者は、より低温での保存は、組織復温に際して再び始まるであろう炎症の進行を休止し得ることを発見した。
【００２４】
組織サンプルをその後、皮下層を除去するためにトリミングすることができる。脂肪層の除去は培養中の組織への培地の吸収を改善し得る。脂肪層のトリミングはまた試験薬剤の局所送達又は培地送達のいずれかに好適である組織モデルを可能にする。組織サンプルをその後、より小さな断片（例えば、１．２５ｍｍ×１．２５ｍｍ角）に更に分けることができ、それらを多数ウェル組織プレートに入れる。特定の実施形態では、そのより小さな断片のそれぞれをウェル内の膜（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、８マイクロメートル、６ウェル膜インサート）上に置く。膜の使用は培養中の組織サンプルの生存能力を顕著に改善することができる。このことは図３Ａ及び３Ｂ中に示され、ここで、培地中で培養される４ｍｍエックスビボ皮膚パンチと、膜上で培養される１ｃｍ断片エックスビボ皮膚サンプルとの比較が示される。９６時間で、１ｃｍサンプルに対して、４ｍｍパンチの生存能力において著しい減少がある。
【００２５】
組織サンプルを、真皮が湿った状態及び表皮が乾燥した状態に保つために、等浸透圧溶液の上に真皮側を下にしてプレートウェルに置くことができる。等浸透圧（又は等張）溶液はＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）であってよい。更に、組織サンプルを非浸透圧（非等張）溶液中に入れることもできる。それらの溶液のいずれも、それらの中に、又は別に組織に提供される、抗真菌若しくは抗菌試薬を任意選択で有し得る。
【００２６】
ＩＩ．培養条件：温度、時間、湿度
本研究者は、温度、時間、及び湿度のうちの１つ以上を含む、エックスビボ組織培養条件は色調薬剤のエックスビボ皮膚スクリーニング方法のいくつかの関連する態様に影響し得ることを発見した。第１に、温度について、本研究者は、培養温度がドナー組織での（対象色調遺伝子の初期上方調節の量に影響し得る）内因性炎症の量に影響することを発見した。第２に、本研究者は、正の対照及び／又はより弱い色調薬剤が対象色調遺伝子を下方調節するのにかかる時間にはばらつきがあり、それは次に培養時間がどのくらい長く又は短くあるべきかに影響を与え得ることを発見した。第３に、本研究者は、湿度は組織生存能力に影響し得ること、及び湿度レベルの減少は組織生存能力及び／又は内因性炎症レベルに過度に影響を与えることなく、培養温度を上昇させる柔軟性を提供し得ることを発見した。
【００２７】
温度
内因的に調節される組織サンプル（対象色調遺伝子を上方調節する特別な意図を伴って組織に適用された化合物がないことを意味する）では、ドナー組織サンプルは、試験化合物による対象色調遺伝子の下方調節が観察され得るように、その遺伝子の上方調節をもたらすのに十分なレベルの内因性炎症を有するべきである。上方調節の量はドナー毎の変動性を説明するのに十分であるべきであり、これは、強固なスクリーニング方法は広いドナー集団にわたり対象色調遺伝子の十分な量の上方調節を引き起こす培養条件を利用するべきであることを意味する。これは、試験化合物が（正の対照がそうであるように）その色調遺伝子を下方調節することができるかどうかについての一貫した決定を可能にする。しかしながら、混乱させることに、本研究者は、ドナー組織があまりに強く上方調節された場合、より弱い色調薬剤及び／又は正の対照がドナー集団の十分な部分にわたり一貫して色調遺伝子を下方調節することができない場合がある可能性があることを観測した。本研究者はまた、温度選択は湿度レベルの関数でもあり得ることも発見した（例えば、湿度が低いほど、組織サンプルが生存したままで耐え得る温度が高くなる）。
【００２８】
概して、培養温度が高いほど、組織サンプルの炎症状態は大きくなる。例えば、図４Ａ（３３℃）及び４Ｂ（３７℃）中に示されるように、温度が（３３℃から３７℃に）上昇すると、ＩＬ−１βサイトカイン放出が増加することが見られ得る（本研究者は、培養前に、組織サンプルは２℃〜１０℃で保存され得ることを示した）。ＩＬ−１βサイトカイン放出の総量及び放出パターンは異なる温度では異なった（放出はより早い時点で３３℃におけるより３７℃において２倍高かった）。本研究者は、エックスビボ組織サンプルにおける炎症状態が高いほど、対象色調遺伝子が対応して、より上方調節されることを発見した。例えば、図５は、８日間の過程にわたり培養され、分析される組織を示す（無処理）。図５では、Ｆｉｔｚｐａｔｒｉｃｋ  ＩＩＩドナー組織における炎症遺伝子（ＩＬ−８、ＩＬ−６、及びＴＮＦ）が上方調節されるにつれて、対象色調遺伝子（例えば、ＰＯＭＣ、ＭＣ１Ｒ、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＤＣＴ、ＴＧＦＢ１、ＥＤＮ１、及びＳＬＣ１１Ａ２）も上方調節されることが見られ得る。興味深いことに、本研究者は少なくとも１つのタイプＶ組織ドナーにおいて同様の調節を観測しなかった。したがって、本研究者はエックスビボ組織サンプルの炎症状態と、対象色調遺伝子の上方調節との間の相関を示した。この相関は、大きなドナー集団にわたり内因的に色調遺伝子の十分な上方調節を有することが可能であることを意味するので、重要である。
【００２９】
上記考察に基づいて、特定の実施形態では、エックスビボ皮膚組織の培養温度は約３０℃〜約４０℃、又は約３３℃〜約３７℃である。これらの温度範囲は、スクリーニング方法における使用ための、かなり一貫した十分なレベルの内因性炎症及び組織生存能力を有する培養組織サンプルを可能にする。ヒトの皮膚は様々な場合に３７℃よりもっと低い温度に曝露されるので、皮膚の外部体温はこれより低いであろうから、およそ３７℃での成功は予想外である。更に、３３℃は代謝を遅め、皮膚が通常経験するよりずっと低い温度を提供するであろう。しかしながら、培養温度は、観察される組織毒性、所望のレベルの内因性炎症、湿度レベル、及び所望の培養時間の関数として、これらの範囲を超えて更に上昇又は下降し得ることが理解されるであろう。
【００３０】
時間
色調薬剤の強固なエックスビボ皮膚分析／スクリーニング方法は（短い期間で対象遺伝子の調節に影響し得る）強い色調薬剤と（対象遺伝子の観測可能な調節に影響するためにより長い期間を必要とし得る）より弱い色調薬剤とを特定するのに十分感受性であるべきである（必ずしもその必要はないが）。例えば、ある、より弱い色調薬剤は５〜１０日間、又はそれより長い日数まで、対象色調遺伝子の信頼性のある十分な下方調節を提供し得ない。理想的には、組織サンプルはより弱い色調薬剤を特定するのに十分な培養期間にわたり生存するべきである。更に、ドナー組織は、正の対照がドナー集団の大多数にわたり色調遺伝子の適切な調節を示すのに必要な期間にわたり生存するべきである。関連して、ドナー組織集団は概して、選択された期間中、対象遺伝子の一貫した調節を示すべきである。期間が長いほど、このことは益々そのようにあるべきである。
【００３１】
本研究者は、ナイアシンアミド、ウンデシレノイルフェニルアラニン、ヘキサミジン、トラネキサム酸、コウジ酸、及びＮ−アセチルグルコサミンを含む、いくつかの可能性のある正の対照を選択し、試験し、分析した。図６を参照して、本研究者は、４日間超、好ましくは６日間超の培養期間がドナー集団にわたり内因性炎症に対する色調遺伝子の一貫した下方調節を示すためにナイアシンアミドについて望ましいことを発見した。本研究者は、ある実施形態で、様々な基準について２４時間〜７日間の培養期間における一貫性を発見した。ウンデシレノイルフェニルアラニン等の、特定の正の対照はより速く応答することができ、一方で、他の正の対照は更に長い時間を必要とし得る。したがって、様々な場合における期間は２４時間〜１４日間、又はそれ以上であり得る。ある例示的な場合には、期間は６〜８日間である。薬剤がその組織にとってひどくストレスを与えると分かる、又は組織全体の生存能力を減少させる、又は非常に活性若しくは有効である場合には、有効で意味のある結果を得るために、時間過程を短縮することができ、又は用量応答のレベルを作成することができる（又は両方であり得る）。例えば、これらの場合、時間は２４〜２８時間であり得る。
【００３２】
湿度
本研究者は、培養物の寿命が独特な条件下でもっとより長い期間、かつ優れた結果の一貫性で維持され得ることを、驚くべきことに発見した。それは、例えば、湿度を低下させた条件である。これは、上記に議論されるように、より弱い色調薬剤を特定するために延長された期間、培養すること、及び／又は正の対照による対象色調遺伝子の適切で一貫した調節のために十分な時間を提供することが必要とされ得る場合に有用であり得る。更に、湿度を低下させることにより、本研究者は、組織生存能力及び一貫した遺伝子調節をなおも維持する一方で、別のより高い温度で培養することが可能であることを発見した。具体的には、湿度に関して、本研究者は、培養物の寿命が湿度を低下させた条件下でより長い期間維持され得ることを、驚くべきことに発見した。標準の培養技術は９５％以上に達する、非常に高い湿度を有する傾向がある。本研究者は、湿度を低下させることは皮膚サンプル生存能力に対して意味深い効果を有することを発見した。
【００３３】
図７ａを参照して、３７℃及び９５％湿度で培養されたエックスビボ皮膚組織が最小限ＤＭＥＭ中で到着日から１１日まで示される（最小限ＤＭＥＭは追加の変数を最小限にするために可能な限りほとんど成分を添加しないＤＭＥＭを指す）。観察され得るように、組織形態はこの期間にわたり実質的に退化した。比較として、図８は、１１日までの、７０％湿度及び３３℃で培養されたエックスビボ組織サンプルを示し、ここで、組織の形態はこの期間にわたり大部分は無傷のままである。
【００３４】
特定の実施形態では、ヒト皮膚組織サンプルは１００％未満の湿度環境で培養される。様々な場合、ヒト皮膚組織サンプルは約５０％〜約９０％、若しくは約５０％〜約７０％の相対湿度で、及び／又は約３０℃〜約４０℃、若しくは約３５℃〜約４０℃の培養温度との組み合わせで培養される。実際に、本研究者は、組織生存能力及び／又は形態をなおも維持しながら、エックスビボ皮膚組織を（例えば、７０％湿度及び３３℃で）１９日まで培養した（例えば、図９を参照のこと）。別の実施形態では、組織サンプルは約５０％相対湿度及び約３７℃で培養され得る（例えば、図７ｂを参照のこと）。培養物は密閉されてもされなくてもよく、内部湿度に影響し得るカバー又は上面を有しても有しなくてもよい。培養物はまた、特定の実施形態で、２４時間〜１０日間培養され得る。
【００３５】
温度、時間、及び湿度についてのある範囲が本明細書中で提供されるが、これら説明される範囲のうちの１つ以上が増加又は減少され得ることが理解されるであろう。例えば、温度、湿度、及び培養時間は、正の対照（単数又は複数）が利用される温度、湿度、及び培養時間により影響され得る。組織毒性は培養時間を制限することがあり、その制限された培養時間は今度はその組織サンプル中の所望のレベルの内因性炎症を提供するための温度及び湿度の選択を決定し得る。
【００３６】
試験薬剤及び組織供給
特定の実施形態では、エックスビボ皮膚組織を少なくとも１つの対象試験薬剤と接触させる。エックスビボ皮膚組織は、局所製剤の毎日の適用前、及び／又は以前に適用された任意の非吸収製剤若しくは化学物質を除去するためにサンプルを拭く前に乾燥され得る。ある場合には、サンプルの水和レベルを１回又は複数回試験することができ、サンプルを、最適な結果を生成するために１回若しくは複数回又は供給毎に乾燥することができる。エックスビボ皮膚組織は細胞代謝速度に基づいて供給され得る。供給は１日に多数回、毎日、１日おき、又は（２、３、又はそれ以上等の）多週期間中の特定の日であり得る。３７℃で維持される培養物については毎日の供給、３３℃で維持される培養物については１日おきのように、供給は温度依存的であり得る。
【００３７】
ＩＶ．遺伝子トランスクリプトミクス及び正の対照
エックスビボ皮膚分析を開発するとき、本研究者は、タンパク質終点（例えば、ユーメラニン）及び／又はｍＲＮＡ終点に対して分析するかどうかの選択に直面した。皮膚サンプルにおいて、タンパク質レベルは変動することがあり、タンパク質単離は大きな、可溶性の乏しいマトリックス分子の量のために複雑である。ｍＲＮＡ終点が現代のマイクロアレイ技術により提供される、より高い分析スループット速度のために魅力的である一方で、エックスビボ皮膚が十分な期間トランスクリプトミクスレベルで適切に調節され得るかどうか、ドナー集団の十分な割合にわたり対象色調遺伝子の一貫した適切な調節を提供した、適切な正の対照が特定され得るかどうか、トランスクリプトミクス分析がインビボ結果の予測となり得るかどうか、及び十分なＲＮＡが分析のために得られ、ＲＮＡを分解し得るＲＮアーゼの導入について多数の可能性のある源を考慮して維持され得るかどうか、を含むがこれらに限定されない、顕著な問題及び不確実性がこの終点の計測に関連している。正の対照は理想的には、必ずしも必要ではないが、概して、可能性のある対象試験薬剤と同じ効果／遺伝子調節の方向性（典型的には下方調節）を提供するよう選択されるべきである。正の対照としてこの役割を果たす既知の色調基準薬剤の能力は、追加の不確実性であった。
【００３８】
更に、エックスビボ皮膚組織は本質的にストレス状態にあるので、本研究者が直面した混乱させる要素は、可能性としてストレス関連遺伝子でもある（又はストレス関連遺伝子と相互作用する）、色調調節遺伝子の二重関係に関連した。制御された様式で遺伝子を増加させる又は減少させる薬剤の利用は投与、時間、及び色調遺伝子に対しても効果を有し、又は色調遺伝子によっても調節され得る、遺伝的ストレッサー応答により複雑化され得る固有の遺伝子状態により複雑化される。色調及びストレス応答を調節する遺伝子のそのような二重関係は容易に結果分析を混乱させ、データ結果及び解釈を複雑化させ得る。更なる不確実性は、基準が（臨床的な保証を示す、可能性のある基準でさえも）大きなドナー集団（例えば、組織サンプルの少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、又は更に８０％）にわたり正の対照として使用されるよう、遺伝子レベルで十分に一貫して働き得るかどうかであった。正の対照は、ドナー組織における対象色調遺伝子が試験条件下で適切に調節されるかどうか（例えば、対象遺伝子、又は組織状態について予想されるであろうように上方若しくは下方調節される遺伝子）を評価するために、及び試験化合物に関連するトランスクリプトミクスデータの解釈を援助するために使用される。したがって、正の対照として既知の基準色調化合物を選択し、利用することにより、皮膚色素沈着に関連する遺伝子配列について、遺伝子発現を決定することができ、ドナー集団の関連する部分にわたり一貫した、統計的に有意なトランスクリプトミクスパターンがおそらく得られたであろう。このパターンはその後、試験中のドナー組織の適切な調節を確実にするために、及び皮膚色素沈着に影響する新規薬剤の適用による同じ遺伝子に対する効果を分析し、遺伝子調節パターンにより臨床的成功を予測するために使用され得る。このようにして、組織サンプルのゲノム状態に関連するドナー毎の変動性はスクリーニング方法においてもまた取り扱われ得る。
【００３９】
本研究者は、いくつかの「ハウスキーピング」遺伝子と共に、ｍＲＮＡ終点分析の可能性のある候補として約１５個の真皮及び表皮遺伝子を特定した。これらの遺伝子は図１０中に列挙されている。文献中に記載される色素沈着プロセスに関連する真皮及び表皮遺伝子が概略され、試験に保証を与える候補遺伝子のリストが選択された。ハウスキーピング遺伝子は提供される処理を受けても変わらないままであると予想された遺伝子として選択された。このことを確認するために、多数のハウスキーピング遺伝子を選択した。サンプルはおよそ同じ大きさのものであり、サンプル当たりのおよそ等しい細胞数の考察を確実するために、結果をハウスキーピング遺伝子について正規化した。表皮遺伝子としては、プロオピオメラノコルチン、メラノコルチン１受容体、小眼球症関連転写因子、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、ドーパクロム互変異性化酵素、形質転換成長因子−β１、及びエンドセリン１が挙げられるが、これらに限定されない。これらの遺伝子は単純さの目的のために以降で議論されるが、これは本明細書中の方法での使用に好適な遺伝子の非限定的な選択であり、他の遺伝子が追加されるか、又は他の遺伝子で置換されることができ、図１０中に示される遺伝子の全てが本明細書中に記載される方法に組み込まれる必要はないことが理解されるであろう。
【００４０】
このリストから、本研究者は、表皮遺伝子間でさえもかなりの量の変動性はあったが、表皮遺伝子は概して、可能性のある正の対照（例えば、ナイアシンアミド、ヘキサミジン、Ｎ−アセチルグルコサミン、コウジ酸、及びトラネキサム酸、並びにウンデシレノイルフェニルアラニン等の基準色調化合物）により、真皮遺伝子より一貫して調節されることを発見した。図１１〜１５を参照して、ナイアシンアミド、ヘキサミジン、Ｎ−アセチルグルコサミン、コウジ酸、トラネキサム酸、及びウンデシレノイルフェニルアラニン（それぞれ、２〜１０回の実験）についての、３７℃及び７０％湿度で内因的に駆動されたエックスビボ組織系における無処理の対照に対する９個の表皮色調遺伝子の調節について、実施例が示される。データは、基準化合物の間でいくらかの変動性があることを示唆する。例えば、９個の表皮遺伝子のうち、少なくとも１つの化合物（ヘキサミジン）は９個の遺伝子を調節し（ｐ＜０．１、又はそれより良い統計的有意性で）、一方、２つの化合物は５個、又はそれ以下の遺伝子を調節した（ｐ＜０．１、又はそれより良い統計的有意性で）。以下の表１は、ｐ≦０．１の統計的有意性で、内因的に駆動された組織サンプルにおいて、ある物質により調節される表皮遺伝子の数を要約する。
【００４１】
【表１】
2015505242.tif 000003
【００４２】
スクリーニング方法の特定の実施形態では、転写プロファイルは、プロオピオメラノコルチン、メラノコルチン１受容体、小眼球症関連転写因子、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、ドーパクロム互変異性化酵素、形質転換成長因子１、及びエンドセリン１の群から選択される少なくとも２つの遺伝子の転写に関連するデータからなる。他の実施形態では、転写プロファイルはプロオピオメラノコルチン、メラノコルチン１受容体、小眼球症関連転写因子、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質１、ドーパクロム互変異性化酵素、形質転換成長因子１、及びエンドセリン１の転写に関連するデータからなる。
【００４３】
特定の実施形態では、エックスビボスクリーニング方法は、（特定の実施形態では、図１０からの２〜９個の遺伝子を含む）２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれ以上の対象遺伝子を、ｐ≦約０．１又はｐ≦約０．０５で調節する１、２、３、４、又はそれ以上の正の対照を利用する。正の対照の浸透特性により、薬剤（単数）若しくは薬剤（複数）は培地に添加されるか、又は局所適用され得る（非限定的な例として、表皮への局所適用を含む）。例えば、ヘキサミジンは局所でのその低い浸透のために培地に添加され得る。
【００４４】
特定の実施形態では、第２のヒト皮膚組織サンプルは正の対照として基準色調薬剤を伴ってスクリーニングされる（そして、ヒトドナー組織サンプルは、特定の場合、少なくとも第１及び第２のヒト組織サンプルに分けられ得る）。基準色調薬剤は、特定の実施形態では、ナイアシンアミド、ヘキサミジン、ウンデシレノイルフェニルアラニン、Ｎ−アセチルグルコサミン、コウジ酸、トラネキサム酸、及びそれらの組み合わせであり得る。第２のヒト皮膚組織サンプルについてのスクリーニングプロセスは図１０からの２つ以上の遺伝子に関連する転写プロファイルの生成を更に含むことができ、基準色調薬剤の使用を含むことができ、ここで、その基準色調薬剤は皮膚色調効果を上昇又は下降させる（図１０からの２つ以上の遺伝子等の）遺伝子を上方調節又は下方調節する。皮膚色調効果は全体的な又は局所的な皮膚色調及び／又は皮膚色素沈着における任意の変化であり得る（例えば、老化スポーツ又は老人性ほくろにおけるように）。
【００４５】
特定の実施形態では、図１０から選択される遺伝子に関連するｍＲＮＡ調節の分析は、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、チロシナーゼ関連タンパク質−１（ＴＹＲＰ１）、又はドーパクロム互変異性化酵素（ＴＹＲＰ１又はＤＣＴ）等の、メラニンレベルにおける変化を直接的に引き起こす遺伝子の概略を含み、分析は、（転写因子、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）等の）メラニンレベルに間接的に影響し得る遺伝子の分析から分離されるか、又はそれとの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、１つ以上のｍＲＮＡレベルの分析は、統計的分析（特定の実施形態では、ｐ値を含む）、又は（図形表示を通して又は表中のｍＲＮＡレベルから示されるように）視覚的に観測可能な統計的に有意な変化、傾向、若しくはパターンについての倍率変化若しくは倍率調節を含み得る。他の特定の実施形態では、ヒト皮膚組織サンプルが処理に対する応答を示さない場合、実験を繰り返すことができ、この場合、第２の実験は、実験結果が偽陰性のためではないことを確認するために行われ得る。
【００４６】
スクリーニングされた試験サンプルは、特定の場合、外科的廃棄物組織からのものであり、膜上で培養されるか、又は皮下脂肪層を含むか、若しくは皮下脂肪層を除去されたサンプルを含むことができる（そして、ヒトドナー組織サンプルが少なくとも第１及び第２のヒトドナー組織サンプルに分けられる特定の実施形態では、皮下脂肪層は分ける前に除去され得る）。ある実施形態におけるスクリーニングは複数の試験薬剤についての、同じ又は異なるドナーからの組織でのスクリーニングの繰り返しを含む。スクリーニングはまた、皮膚組織表現型を模倣するために組織にエネルギー源を適用する工程を含むことができ、老化しみ又は光応答である皮膚組織表現型を含むことができ、及び／又はパラクリン剤の局所適用を更に含み得る（例えば、ある場合には、幹細胞因子及び／又はエンドセリン−１はそれぞれ、４０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬである）。スクリーニングは試験薬剤を含む化粧品スキンケア組成物の製剤化もまた含み得る。スクリーニングは成人ヒト皮膚組織サンプルもまた含むことができ、ここで、そのサンプルは真皮及び表皮側を有し、真皮側を、真皮が湿った状態及び表皮が乾燥した状態に保つために等浸透圧溶液中に真皮側を下にして置く。
【００４７】
本研究者は、５０〜７５％の成功率を提供することができ、そのため、何百〜何千のエックスビボ組織サンプルを試験するとき、そのスクリーニング方法を利用することができる、正の対照を特定した。この成功レベルは、何百ものスクリーニングにわたる化合物スクリーニングのための器官系の使用が、以前に見られない、かつ統計的比較のために最小限のサンプルサイズしか典型的に必要としない初期の学究的な調査研究の一貫性のレベルを大きく超えた、あるレベルの一貫性を必要とするという事実のために有用である。
【００４８】
ＩＶ．化合物及びエネルギー駆動スクリーニング方法
内因的に駆動されたスクリーニング方法は基準の選択及びトランスクリプトミクス一貫性について、化合物駆動スクリーニング方法に優るある効果を有する一方で、特定の実施形態では、化合物又はエネルギー（例えば、電磁エネルギー又は光源）駆動スクリーニング方法が所望され得る。化合物駆動スクリーニング方法では、１つ以上の化合物が局所適用されるか、又は組織培養培地に添加され、内因性組織炎症により提供される上方調節を超えて、対象色調遺伝子のうちの１つ以上の上方調節を増加させるか、又は老化しみ等の組織表現型を模倣し得る。エネルギー駆動スクリーニング方法では、紫外光等の電磁エネルギー源が組織サンプルに与えられ、内因性組織炎症により提供される上方調節を超えて、対象色調遺伝子のうちの１つ以上の上方調節を増加させるか、又は組織表現型を模倣し得る。
【００４９】
化合物駆動エックスビボ皮膚組織方法
組織炎症を増加させる様々な薬剤を利用することができる。そのような薬剤として、インターロイキン１α、インターロイキン１β、腫瘍壊死因子α、インターロイキン１７、フォルスコリン、ＭＳＨ、エンドセリン１、幹細胞因子、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、インターロイキン１７若しくはインターロイキン１又は腫瘍壊死因子αは炎症を増加させるために皮膚組織サンプルに適用され得る。他の実施形態では、パラクリン剤又は１つ以上のサイトカインが様々な種類の炎症を駆動するために遺伝子を上方調節するよう利用され得る。利用される任意のストレッサーは培養開始２４時間以内に様々な実施形態で適用され得る。
【００５０】
図１６を参照して、色素沈着経路を刺激することが知られる様々な化合物（例えば、フォルスコリン、幹細胞因子、及びα−ＭＳＨ）はエックスビボ組織培養物において、ｐ≦０．１で、１つ以上の対象色調遺伝子をそのように上方調節し得ることを見ることができる（結果はそれぞれ最低２〜１０回の実験を含む）。このことは、対象色調遺伝子が、（おそらく何百又は何千の様々なドナーが使用される）生存能力のある市販のスクリーニング方法を作成するために十分な、ドナー集団の少なくとも一部にわたり一貫して、エックスビボ組織培養物において適切に調節され得ることを示すのみでなく、このある遺伝子の上方調節は例えば、老化しみ等の、ある組織表現型を模倣するためにもまた使用され得る。
【００５１】
幹細胞因子は老化しみの形成に関係があることが示唆されている（Ｈａｔｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  Ｏｖｅｒ−Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｌｅｎｔｉｇｏ  Ｓｅｎｉｌｉｓ：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ、２００４年５月５日、ｐｐ  １２５６〜６５を参照のこと）。エンドセリンもまた、老化しみの形成に関係があることが示唆されている（Ｉｍｏｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１  ａｓ  ａ  Ｎｅｗ  Ｍｅｌａｎｏｇｅｎ：Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｔｓ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ  Ｇｅｎｅ  ｉｎ  ＵＶＢ−Ｅｘｐｏｓｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（１９９５），１０５，ｐｐ  ３２〜３７）。
【００５２】
エックスビボ組織培養物への、エンドセリン１との組み合わせの幹細胞因子の適用は、驚くべきことに老化しみ表現型を模倣するように見える組織学的結果を生成した。図１７を参照して、エックスビボ組織培養物の表皮調製物のＦｏｎｔａｎａ−Ｍａｓｓｏｎ染色は、幹細胞因子／エンドセリン１の組み合わせへの曝露後に、対照に対して増加した色素沈着を示す。したがって、エックスビボ組織サンプルにおいて色調に関連する、ある組織表現型を複製することは可能であり得るように見える。スクリーニング方法の特定の実施形態では、エックスビボヒト皮膚組織サンプルがエンドセリン１又は幹細胞因子のうちの少なくとも１つに曝露される。エンドセリン１の濃度は約４０ｎｇ／ｍＬ〜約８０ｎｇ／ｍＬであることができ、幹細胞因子の濃度は約４０ｎｇ／ｍＬ〜約８０ｎｇ／ｍＬであることができる。
【００５３】
化合物又は物質はエックスビボ組織サンプルにおいて対象色調遺伝子を上方調節するために、局所的に又は培養培地に添加され得るが、本研究者は、ある場合に試験薬剤又は正の対照によるこれらの遺伝子の下方調節を一貫して検出することはより困難であり得ることを発見した。図１９〜２３を参照して、ナイアシンアミド、ヘキサミジン、Ｎ−アセチルグルコサミン、コウジ酸、トラネキサム酸、及びウンデシレノイルフェニルアラニンについて、３７℃及び７０％湿度で幹細胞因子とエンドセリンとの組み合わせにより駆動されたエックスビボ組織における、無処理の対照に対する９個の表皮色調遺伝子の調節について、（それぞれ２〜１０回の実験の）実施例が示される。データは、内因的に駆動された系についてよりも、基準化合物の中でより変動性があることを示す（例えば、図１１〜１５を参照のこと）。例えば、９個の表皮遺伝子のうち、少なくとも１つの化合物（ウンデシレノイルフェニルアラニン）は５個の遺伝子を調節し（ｐ＜０．１、又はそれより良い統計的有意性で）、一方、２つの化合物は２個、又はそれより少ない遺伝子を調節した（ｐ＜０．１、又はそれより良い統計的有意性で）。以下の表２は、ｐ≦０．１の統計的有意性で、幹細胞因子／エンドセリン１で駆動された組織サンプルにおいて、ある物質により調節された表皮遺伝子の数を要約する。
【００５４】
【表２】
2015505242.tif 000004
【００５５】
エックスビボ皮膚組織で化合物駆動スクリーニング方法を利用することは有益であり得る。しかしながら、そのようなスクリーニング方法は、内因的に駆動されたスクリーニング方法におけるものと同じレベルの、正の対照及び／又は試験化合物（両方とも下方調節化合物である）による対象色調遺伝子の、一貫した、かつ検出可能な調節を提供し得ないように見える。
【００５６】
エネルギー駆動エックスビボ皮膚組織方法
特定の実施形態では、例えば、スクリーニング方法において使用され得る、光応答又は日焼け表現型を誘発するためなど、エックスビボ組織サンプルを電磁放射源に供することが所望され得る。紫外光はヒト皮膚組織サンプルの１つ以上の対象色調遺伝子を上方調節するために使用することができ、その後、無処理の対照と比較した遺伝子発現変化を評価するために、遺伝子転写分析を行ってもよい。特定の実施形態では、組織サンプルを約５０ｍＪ〜約１０Ｊのエネルギーに約２時間〜約４８時間、又は約２時間〜約２４時間の期間、供することができ、ここで、エネルギーは紫外スペクトル（例えば、約１０ｎｍ〜約４００ｎｍ）内である。他の実施形態では、組織サンプルを約２Ｊ〜約１０Ｊのエネルギーに約２時間〜約４８時間の期間、供することができる。遺伝子転写分析は、電磁放射源への曝露後２時間〜約９６時間、又はそれ以上の間に、行われ得る。
【００５７】
図２４を参照して、２Ｊ及び６Ｊ処理は、ＵＶエネルギーに供されない対照と比較して、ＵＶ曝露２４時間後に計測されたとき、様々な対象色調遺伝子を上方調節したことが見られ得る。具体的には、図２８は、プロオピオメラノコルチン（ＰＯＭＣ）、メラノコルチン１受容体（ＭＣ１Ｒ）、小眼球症関連転写因子（ＭＩＴＦ）、チロシナーゼ（ＴＹＲ）、チロシナーゼ関連タンパク質１（ＴＹＲＰ１）、ドーパクロム互変異性化酵素（ＤＣＴ）、形質転換成長因子１（ＴＧＦＢ１）、及びエンドセリン１（ＥＮＤ１）の誘発を示す。図１Ｂは、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ｖ−ＫＩＴ（ＫＩＴ−幹細胞因子（ＳＣＦ）の受容体）、エンドセリン受容体Ｂ（ＥＤＮＲＢ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、Ｂ細胞ＣＬＬ／リンパ腫２（ＢＣＬ２）、ＢＣＬ−２関連タンパク質（ＢＡＸ）、リンパ様エンハンサ結合１因子（ＬＥＦ１）を示す。
【００５８】
エックスビボ皮膚組織は皮膚色調表現型を誘発させるために、化合物又は放射源のいずれかにより操作され得る。エックスビボ皮膚組織におけるこれらの表現型のうちの１つ以上の誘発はその後、これらの表現型を鎮静させる、減少させる、逆行させる、若しくは改善する、又はそうでなければ、駆動された皮膚組織において上方調節された１つ以上の対象色調遺伝子を下方調節する、試験化合物をスクリーニングするために使用され得る。
【００５９】
ＶＩ．ｍＲＮＡプロセッシング
本研究者はまた、このスクリーニング方法にとってあまり必須ではないことが分かったが、それでもなお利点を提供し、かつそのスクリーニング方法の進歩にとって必然であることが分かった変数を説明すること（とりわけ、データ分析のための組織収集、輸送、及び組織回収における変数を説明すること等）により、驚くべき画期的な点を提供した。
【００６０】
本明細書中に記載される方法及びモデルは（ＤＮＡ、ＲＮＡ、若しくは他の物質を得るために、又はこれらの物質を分析するために）物質の分析又は追加の分析のために粉砕されたか又は均質にされた、ヒト皮膚組織サンプルを含み得る。
【００６１】
本明細書中に記載される方法及びモデルは、完全な又は部分的なヒト皮膚組織サンプルからの、又は（例えば、レーザー顕微解剖、若しくは物理的な細胞若しくは細胞層の除去、又は本分野において既知の他の方法を通して）そのようなサンプルから除去された単細胞種からの、ＲＮＡの分析を含み得る。真皮及び表皮層を除去し、別々に又は共に分析することができる。プロファイルはヒト皮膚組織サンプル（単数）又はサンプル（複数）の、そのような個々の細胞、層から、又は複数の細胞、層、部分（又は全体）から生成され得る。
【００６２】
色調を調節することが知られる１パネルの遺伝子に関連する、薬剤の試験後のｍＲＮＡ調節の分析は、薬剤が皮膚色調効果の提供に有効であると特定するための基礎を提供し得る。例えば、非限定的な例では、色調を調節することが知られる遺伝子を含む、色素沈着遺伝子パネルを決定することができ、そのパネルはＰＯＭＣ、ＭＣＲ１、ＭＩＴＦ、ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＤＣＴ、ＴＧＦＢ１、及びＥＤＮ１等の遺伝子についてのｍＲＮＡ分析を含む。
【００６３】
様々な非限定的な例では、薬剤が皮膚色調効果の提供に有効であると特定することはこの遺伝子パネルに関連し、無処理の対照と比較した、発現レベルの指向的に適切な増加又は減少を観測し得る。薬剤が有効であるとの決定は（増加された又は減少された）それらの遺伝子のうちの２つに関連し得る。他の実施例では、このパネルのうちの５個の遺伝子又は８個全ては、適用された薬剤に応答して、発現レベルが変わった。他では、このパネルは１０個の遺伝子からなり、（２、３、５、８、１０等の）様々な数の遺伝子が有効性の決定に関連している。薬剤が有効であるという決定は、反復ウェル又は試験の、統計的試験及び／又は統計的有意性もまた含み得る。例えば、反復は３、又は５、又は１０、又はそれ以上のサンプルの大きさ（ｎ）に関連し得る。更に、ｍＲＮＡレベルの統計的有意性は０．０５、０．０１、０．０１、０．００１以下に設定することができるか、又は代替のレベルで設定することができる。
【００６４】
ＶＩＩ．階層的スクリーニング
ある実施形態では、スクリーニング方法は繰り返して使用される。スクリーニング方法は提供する工程、接触させる工程、生成する工程、比較する工程、及び特定する工程の繰り返しを含むことができ、ここで、各繰り返しのためのヒト皮膚組織サンプルは異なるドナーからのものである。各繰り返しはまた、異なる試験薬剤を含み得る。複数の試験薬剤をスクリーニングしてもよい。いくつかの実施形態では、約５、１０、２５、５０、１００、２００、４００、８００超、及び／又は約１０００若しくは８００未満の試験薬剤をスクリーニングしてもよい。
【００６５】
本明細書中に記載されるスクリーニング方法はまた、階層的スクリーニングプロセスを提供するために他のスクリーニング方法と組み合わせてもよい。階層は１レベル当たりの複雑性の増加に関連付けられる。各階層は追加のデータを提供するという事実のために、有望な薬剤に、より正確に集中して、結論が導かれ得る。それゆえ、より高次の階層は、有効であることのより高い確率を有する可能性のある、より少ない数の薬剤に関連付けられる。
【００６６】
階層は以下のように進み得る。酵素分析、細胞ベースの培養、インビトロ分析、及び本発明に係るエックスビボ皮膚分析。酵素分析はタンパク質機能の分析を含み、細胞ベースの培養は単に、主に培養プレート中の細胞培養を含み、インビトロ分析は組み合わされた細胞種でのより複雑な培養条件を含む。最初の階層はより高い出力で比較的より迅速に完了されることができ、一方で、高次の階層は追加の時間がかかり、かつスループットがより低い。各階層の徹底的な分析は色調関連薬剤の成功の確率を増加させる最終的なデータを提供する。
【００６７】
ＶＩＩＩ．化粧品組成物
様々な美容的皮膚色調効果を消費者に提供することが望ましいため、本明細書に記載されるスクリーニング方法のうちの１つ以上によって特定される試験薬剤又は化合物を、皮膚への局所適用に好適な化粧品組成物に組み込むことが有益であり得る。つまり、化粧品組成物中に成分として試験薬剤を含むことが所望され得る。ある実施形態では、化粧品組成物は、皮膚科学的に許容できる担体、試験薬剤、及び提供される特定の化粧品組成物に一般的に含まれる種類の１つ以上の任意の成分を含んでもよい。そのような任意の成分の非限定的な例としては、ビタミン、ペプチド及びペプチド誘導体、並びに糖アミンが挙げられる。他の任意の成分は日焼け止め活性剤（又は日焼け止め薬剤）及び／又は紫外光吸収体を含む。ある実施形態では、化粧品組成物は着色剤、界面活性剤、フィルム形成組成物、及び／又はレオロジー変性剤を含み得る。本明細書中の好適な化粧品組成物は例えば、乳濁液、ローション、乳、液体、固体、クリーム、ジェル、マウス、軟膏、ペースト、血清、スティック、スプレー、トニック、エアロゾル、フォーム、鉛筆形のもの等を含む、本分野において既知の様々な形態のうちの任意の１つであってよい。化粧品組成物はまた、例えば、ジェル、フォーム、ローション、及びクリームを含む、ひげ剃り予備製品に組み込まれることもでき、エアロゾルタイプと非エアロゾルタイプの両方を含む。他の化粧品組成物は発汗抑制剤、防臭剤、並びに石鹸及びシャンプー等の身体洗浄組成物を含む。
【００６８】
本明細書中に記載される方法を用いて特定された試験薬剤を組み込んだ組成物は概して、組成物及び局所組成物を作製する、本分野において知られるような従来の方法により調製され得る。かかる方法は、典型的には、加熱、冷却、真空の適用等を用いて、又はそれらを用いずに、１つ以上の工程で、成分を比較的均一な状態になるまで混合する工程を伴う。典型的に、乳濁液は、最初に水相物質を脂肪相物質とは別個に混合し、その後２相を適宜組み合わせて、所望の連続相を得ることにより調製される。組成物は、好ましくは、安定性（物理的安定性、化学的安定性、光安定性等）及び／又は活性物質の送達を最適化するように調製される。本組成物は、治療期間について十分な量の組成物を保存するように寸法設定されたパッケージ中で提供されてもよい。パッケージの寸法、形状、及びデザインは多岐にわたるものであり得る。あるパッケージの例は米国特許第Ｄ  ５７０，７０７号、同第Ｄ３９１，１６２号、同第Ｄ５１６，４３６号、同第Ｄ５３５，１９１号、同第Ｄ５４２，６６０号、同第Ｄ５４７，１９３号、同第Ｄ５４７，６６１号、同第Ｄ５５８，５９１号、同第Ｄ５６３，２２１号、米国特許公報第２００９／００１７０８０号、同第２００７／０２０５２２６号、及び同第２００７／００４０３０６号に記載される。
【実施例】
【００６９】
以下は、本明細書中に記載される方法の様々な態様の非限定的な実施例である。実施例は、その多くの変形が可能であるので、例示目的のみのために与えられ、本発明の限定として解釈されるべきでない。
【００７０】
（実施例１）
皮膚調製
個々の実験は概して、関連するエックスビボ（外植片）研究に使用されるヒト外科的廃棄物皮膚のプロセッシングを含む。実施形態例を本明細書中以下に示す。
【００７１】
調製のための材料は以下のものを含む。Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ及びＧｌｕｔａｍａｘ、抗生物質及び抗真菌剤、１Ｘリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ（−ｃａ、−ｍｇ））、１５０×１５ｍｍ滅菌培養皿、滅菌ゲージ４×４、使い捨て安全外科用メス、４ｍｍ使い捨て生検パンチ、６ウェル細胞培養インサート、消毒済みピンセット、綿棒、６ウェル培養皿罫線付き消毒済みまな板（１２×１２）、スクレーパーハンドル、組織凍結培地、生検カセット、凍結組織凍結容器、１０％ホルマリン、固定した組織を輸送するための容器、及びバイオハザード／鋭利物用の容器。
【００７２】
皮膚調製は、皮膚の到着に先立つ、培地の調製を含んだ。（５００ｍＬ  ＤＭＥＭ＋１５ｍＬ抗生物質及び抗真菌剤を含む、３Ｘ培地。３Ｘはインキュベーション開始時間に使用される抗生物質／抗真菌剤の３倍レベルについて言及したものである。１Ｘ培地は、５００ｍＬ  ＤＭＥＭ＋５ｍＬ抗生物質及び抗真菌剤である）。皮膚は滅菌培養皿中の滅菌ＤＭＥＭ浸漬ガーゼ上で真皮（脂肪）側を下にして到着した。培養皿はテープで閉じられ、バイオハザードジップロック袋に入れられ、二次容器内の氷のう上にあった。
【００７３】
到着に際して、皮膚を袋から取り出し、３Ｘ  ＤＭＥＭ培地中に浸漬し、４℃で１時間保存した。１時間後、皮膚を３Ｘ  ＤＭＥＭから取り出し、滅菌１Ｘ  ＰＢＳですすいだ。皮膚を１Ｘ  ＤＭＥＭに浸漬したガーゼを含有する清潔な培養皿に入れた。サンプルを到着と同日に培養し始めたが、ある実施形態ではサンプルを４℃で一晩置く。
【００７４】
培養のための調製において、以下のことを行った。まな板上で、表皮が下になり、脂肪が露出するように皮膚をひっくり返した。滅菌鋸歯状鉗子で皮膚の１つの角部を慎重につかみ、皮膚に対して４５°の角度に保持した刃で脂肪を削り取ることにより、使い捨て外科用メスで脂肪を除去した。脂肪を除去した後、スクレーパーを直定規ガイドのように用いて外科的端を外科用メスで切り落とし、皮膚はそこに保持した。スクレーパーをガイドとして用いて、皮膚を、幅を計測するために（まな板のもの等の）定規を用いて１．２５ｃｍ（格子上の２×２角）幅の条片に切った。この条片を１Ｘ  ＰＢＳを含有する１００ｍｍ培養皿中ですすいだ。条片を１．２５ｃｍ2角に切り、それらを３０分後に培養に供するまで（様々な非限定的な実施例において使用される１５分、３０分、４５分、又は１時間の時点で）、１００ｍｍ培養皿中の１Ｘ  ＤＭＥＭ浸漬ガーゼ上に置いた。
【００７５】
（実施例２）
培養
エックスビボ皮膚を用いた培養の実施形態例が本明細書中以下に記載される。
【００７６】
培養は培養プレートの設定を伴った。２．５ｍＬの培地又は処理物を６ウェル組織プレートの各ウェルに入れ、各ウェルに１つのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ培養インサートを加え、１００μＬの１Ｘ  ＤＭＥＭを各インサート膜の中心に入れた。角をランダムに選択し、膜上の培地の上の、各インサート内に置いた（１インサート当たり１片の皮膚）。プレートを３３℃で（追加の非限定的な実施例は実験終点により３７℃で）保存した。対照として、基準組織計測を余剰の廃棄物から回収した（急速凍結のために低温を使用した）。基準生検回収はＭＴＴのための２つの４ｍｍパンチを含んだ。１つの４ｍｍパンチを新鮮な組織構造のためにＯＣＴ中で急速凍結した。１つの４ｍｍパンチを１０％ホルマリン中で固定し、パラフィン包埋のために発送した。ＰＣＲ基準もまた、液体窒素中で急速凍結した６個の４ｍｍパンチで取った。
【００７７】
モデルの培養及び処理はｎ＝５の反復を含んだ（ｎ＝６等の追加の量の反復を使用してもよいが）。皮膚の培地投与は（ＰＢＳ、培地、アルコール、及びＤＭＳＯを含む）適切な溶媒中で使用される可溶化に関連した（ＤＭＳＯの使用では、プレート中の最終濃度は０．０１％に限定された）。処理のために適切な希釈を行った。処理のために１日当たり１プレート当たり、１５ｍＬの培地が必要とされ、細胞培養インサート下の１ウェル当たり、２．５ｍＬの培地が必要とされた。培地を事前に温め、実験中毎日交換した。
【００７８】
皮膚に局所投与した。そのようにするために、対象化合物の製剤を得た。可能な限り試験処方に近い媒体を有することにより、変動を最小限にした（グリセリン濃度が同じであったことを確認すること、処方中にビタミンパッケージがあったかどうかを決定すること、ナイアシンアミドがあったかどうかを決定すること、これらの全ては媒体対照処方と試験処方との間で同じであった）。（理想的な実施形態では、唯一の相違は未知の試験化合物である。）皮膚を２０μＬの製剤で容積流量ピペットを用いて処理した。適用後、処方を広げて擦りつけるために滅菌綿棒を使用した。培地を毎日交換した。培地を吸引し、１ウェル当たり２．５ｍＬのレベルで新鮮な温めた培地と置換した。
【００７９】
培養プロセスは生存能力のある培養物を維持し、評価する、及びｍＲＮＡ分析のための組織の回収のために前もって調製するプロセスを含んだ。これらのプロセスは、生存能力試験のための様々な調製工程を用いるために、及び（時点実験のための）培養物終点分析のために調製することにより、調製された。細胞生存能力を評価するために、ＭＴＴ比色分析を利用した（ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物））。サンプル回収のために低温を使用した。
【００８０】
実験を開始する前に、全ての管及びプレートに適切に標識を付けた。まな板、鉗子、４ｍｍパンチ、液体窒素バケツ、及びＭＴＴプレートセットを使用可能にした。また、１組の管をＲＮＡを得るために取得した（特定の実施形態では、６個の基準サンプルが回収された）。ＭＴＴプレートに事前に標識を付け、ＤＭＥＭ培地中の１ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴ  ６００μＬを各ウェルに添加した。全てのサンプルは４ｍｍ生検であった。（事前にアルコールで清潔にした）工芸用まな板上で（Ｓｋｌａｒ  ４ｍｍ生検パンチ等の）生検パンチ及びハンマーを用いて、ＲＮＡ用の２パンチ、及びＭＴＴ用の１パンチを取った。全ての必要なパンチを取るために、１度にマット上で（ｎ＝５又はｎ＝６等の）１つの処理群について作業して、生検を取るためにハンマーを軽くたたいた。２つのパンチをスクリューキャップ管に入れ、液体窒素中で急速凍結した。ＭＴＴプレート中の１ウェル当たり、１つのパンチを置いた。作業は迅速に行った。全てのサンプルを回収するための処理群当たりの時間は５分であった（５〜１０分が回収の時間の非限定的な例である）。全ての群がプロセスされたら、ＭＴＴプレートをインキュベーター内に２４時間入れた。
【００８１】
ＭＴＴ評価はインキュベーター内での２４時間のインキュベーションを伴った。ウェルプレート（２ｍＬの深さ）に１サンプル当たり１ｍＬのイソプロパノールを提供した。１ウェル当たり１つのサンプルを置き、そのウェルを密閉し、標識を付した。プレートを３日間の抽出のために４℃に置いた（サンプルは読み取り前に少なくとも３日間抽出しなければならず、ある実施形態ではより長い抽出が考えられる）。
【００８２】
ＭＴＴプレートを以下の様式で読み取った。９６ウェル透明平底プレートを使用した（任意の細胞培養プレートがおそらく使用され得る）。深いウェルプレート中でイソプロパノールを混合し、その後、１５０μＬの各サンプルを新規９６ウェルプレートにピペットで入れた。ＧＥＮ５ソフトウェアを伴うＥＰＯＣＨプレートリーダーを使用し、吸収終点を（１つの実施例では５６２で）使用のために選択した。プレートをリーダーに入れ、読み取った。データを操作及び使用のためにエクセルシートにエクスポートした。
【００８３】
（実施例３）
ｍＲＮＡプロセッシング、ナノドロップ定量及び純度評価、ＲＮＡ定量ゲルプロトコル、ｃＤＮＡ合成、並びにＰＣＲ設定
ｍＲＮＡプロセッシング
ｍＲＮＡをエックスビボ皮膚方法のためにプロセスした。実施形態例は本明細書中以下に記載される。
【００８４】
低温調製及び抽出のために、以下の装置を入手し、準備した。２ｍＬ丸底管に１ｍＬのＴＲＩＺＯＬを準備し、各サンプルについて１個の５ｍｍステンレススチールビーズを準備した。ドライアイスバケツを入手し、液体窒素をそのバケツに入れた。生検パンチをドライアイス上に維持し、サンプルを凍結したままにした。凍結袋及びｃｏｖａｒｉｓ  ｃｒｙｏｐｒｅｐをサンプルの凍結破砕において使用した。サンプルを凍結破砕するために、生検を凍結袋（サンプル当たり２つ）に入れ、液体窒素中に浸し、その後、ｃｒｙｏｐｒｅｐ（設定４）に入れた。サンプル袋を取り出し、窒素中に再び浸した。平坦なディスクを除去し、ＴＲＩＺＯＬを有する対応する２ｍＬ管に入れた。ディスクをＴＲＩＺＯＬ中で凍結したまま維持した。管を閉じ、急速凍結し、管全体を液体窒素に入れた。全てのサンプルでこのプロセスを繰り返した後、サンプルを箱に入れ、次の工程まで−８０で保存した。
【００８５】
サンプルを融解する前に、ＰＬＧ  Ｈｅａｖｙ管を準備し（１２０００ｒｐｍで２分間、事前に遠心分離）、（１度に２４個のサンプルについて作業して）準備した。サンプルを含有する凍結丸底管を融解した。サンプルを３０００ｒｐｍで３分間、ビーズ拍動させた。サンプルを１２０００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した。この時間の間、１．５ｍＬ管中に２００μＬクロロホルムを含有する管を準備した。ＴＲＩＺＯＬ上清を取り、クロロホルム管に添加し、その後ボルテックスした（１５秒間）。総量１．２ｍＬの上清及びクロロホルムをＰＬＧ管に添加した。サンプルを１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。水相をＰＬＧ管から除去し、２ｍＬの深いウェルに入れ、２４個の各セットを同じプレートに回収し、添加と添加との間、４℃で保存した（様々な実施形態では、サンプルが同じ日にＭａｇｍａｘ上に置かれない場合、プレートを凍結することができる）。
【００８６】
次に、Ｍａｇｍａｘ磁気ビーズＲＮＡ抽出を行った。水相を含有する深いウェルのプレートを融解した。プレートを以下に示す表３に示されるように準備した。緩衝液が瓶に添加された適切なアルコール量を有することを確認するために洗浄緩衝液のチェックを行った。調整洗浄１をマイクロＲＮＡ抽出を得るために使用した（瓶中の１２ｍＬ＋１２ｍＬイソプロピルアルコール）。二次洗浄もまた行った。溶離緩衝液は事前調製されたものであり、任意の添加物を必要としなかった。
【００８７】
【表３】
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【００８８】
プレートをＭａｇｍａｘ用に準備したら、機械を作動させ、適切なプロトコルを選択し、プレートをロードした。本研究者は、抽出が加熱工程であり、抽出場所での余分な時間はＲＮＡを分解するであろうことに気付いたので、３５分間のランサイクルを行い、プレートを除去した。溶離プレートをホイルで密閉し、蓋をホイルの上に置いた。必要になるまでＲＮＡを−８０で保存した。
【００８９】
ナノドロップ定量及び純度評価
ナノドロップ定量及び純度評価を行った。ＲＮＡを含有する溶離プレートを、ナノドロップ読み取りを行う前に、完全に融解した。ＥＰＯＣＨプレートリーダーを作動させ、ＴＡＫＥ３付属プレートを取り出し、リーダーに入れた。スライドを、使用前、サンプルとサンプルとの間、及び片付ける前に、水で、その後、アルコールで清潔にした。Ｇｅｎ５ソフトウェアを開き、ＴＡＫＥ３セッションを選択し、サンプルの種類についてナノドロップを選択した。３μＬの溶離緩衝液をスライドの両方のカラム上に多重チャネルピペットを用いて入れた。付属品を穏やかに閉じた。読み取りブランクをソフトウェア上で選択した。スライドを清潔にした。３μＬのサンプルを各カラムに添加した。読み取りをサンプルについて選択し、ソフトウェアは自動的に、データをエクセルにエクスポートした。結果をエクスポートし、保存した。
【００９０】
ＲＮＡ定量ゲルプロトコル
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｉｐ  ＲＮＡ−Ｎａｎｏを用いて、ＲＮＡ定量ゲルを行った。試薬を調製した。以下のＡｇｉｌｅｎｔ試薬を４℃の冷蔵庫から取り出した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｌｕｅ（色素）、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ（Ｎａｎｏラダー、使用前に７０°で２分間加熱し、氷上に置き、管に５μＬずつ等分し、−２０°で保存した）、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇｒｅｅｎ、及びＡｇｉｌｅｎｔ  Ｒｅｄ（ゲル）。試薬を１０分間、室温まで温めた。５５０μＬのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｒｅｄ（ゲル）をピペットでフィルターカラムに入れ、室温で１５００ｇで１０分間遠心分離した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｌｕｅ（色素）を１０秒間、ボルテックスした。６５μＬのフィルターを通したゲルを管に等分し、１μＬのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｌｕｅ（色素）を添加し、その管を１３０００ｇで１０分間遠心分離した。次に、Ａｇｉｌｅｎｔチップを９μＬのゲル−色素混合物と共にプライミングステーションにロードした。プライミングステーションを３０秒間閉じ、続いてプランジャを引いた。プライミングステーションの残りの２  Ｇウェルに９μＬのゲル−色素混合物をロードした。ラダーサンプルのロードに関して、以下のものを使用した。５μＬのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇｒｅｅｎを、ラダーウェルを含む、使用される各ウェルにピペットで入れ（使用されないウェルには、６μＬのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇｒｅｅｎを添加した）、１μＬのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ（Ｎａｎｏラダー）をラダーウェルに添加し、１μＬのサンプルを各ウェルに添加した。チップ振とう器内で１分間ボルテックスを行い、この際、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用した。
【００９１】
ｃＤＮＡ合成
ｍＲＮＡサンプルから、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ反応を、はじめにマスターミックス、その後、サンプル体積、最後に水を伴って、０．２ｍＬ  ＰＣＲストリップ管中で行った。蓋を閉じ、混合及びスピンダウンを行った。管をサーマルサイクラーに入れ、作動させ、サンプルを４度で保った。その後、続いてＰＣＲ反応に必要になるまで−２０で保存した。
【００９２】
ＰＣＲ設定
ＰＣＲを、ＲＯＸを伴うＱｕａｎｔａ  Ｐｅｒｆｅｃｔａ  Ｓｙｂｒ  ｇｒｅｅｎマスターミックスを用いて行った。ＰＣＲプレートにプロジェクト番号を付した。ＰＣＲに必要なプライマーを全てのプレートに事前に入れた。試薬を混合し、その後、反応混合物をプレート全体に等分して、１ウェル当たり２０μＬ入れた。プレート設定は１２×８サンプルであり、プレート下に向かって８サンプル、横に向かって１２遺伝子であった。設定反応を０．５ｍＬ管中で行った。ＰＣＲプレートを使用前に室温にした。マスターミックスを使用前に遠心分離した。ＰＣＲ分析はＳｔｅｐＯｎｅソフトウェア、並びにハウスキーピング遺伝子及び幾何学的手段の使用を伴った。
【００９３】
（実施例４）
エンドセリンでの色調駆動
実施形態例では、色調を幹細胞因子及び／又はエンドセリンの適用により駆動する（皮膚調製、培養、及びｍＲＮＡプロセッシングは上述のように完了した）。１つの実施形態例では、皮膚サンプルを、１ウェル当たり２．５ｍＬの培地を有する、６ウェルプレートに入れる。８０ｎｇ／ｍＬの濃度の幹細胞因子及び８０ｎｇ／ｍＬのエンドセリンをウェル中の組織に適用し、培地を毎日新しくした。培養物を７日間維持した。色調関連遺伝子の阻害剤を適用した。ヘキサミジン及びウンデシレノイルフェニルアラニンを、それぞれ０．１％及び０．２５％で媒体中で、局所的に毎日適用した。
【００９４】
（実施例５）
紫外光（ＵＶ）での色調駆動
本研究者は色調を駆動するためにＵＶ処理を利用した。１つの実施形態例が本明細書中以下に記載される。
【００９５】
皮膚を上述のように入手し、培養した。皮膚をＵＶ照射範囲で処理し、色素沈着機構のＵＶ駆動調節を調べるために時間過程を取った。ＵＶ処理を適用するために、プレートを日光刺激器に入れ、ＵＶＡ及びＵＶＢ光線を与えた。具体的には、皮膚を０、１、２、４、及び６Ｊで処理した。組織を５及び２４時間でＰＣＲ用に回収した。サンプルを２４及び９６時間まで維持した。２  ＆  ６ＪのＵＶ処理は外植片系においてＰＯＭＣ、ＭＣ１Ｒ、ＭＩＴＦ、Ｔｙｒ、ＴＲＰ２、及びＥＮＤＯ  １を上方調節した。より低い２Ｊの照射量を用いて、ＵＶ後９６時間まで待つと、以前に見られなかった、これらの遺伝子の劇的により高い倍率変化、及びＤＣＴ（ドーパクロム互変異性化酵素（ＴＹＲＰ２））の２倍増加が生成された。更に、成長因子ＦＧＦ２及びＨＧＦはこの条件で、エンドセリン受容体Ｂと同様に上方調節された。最後に、９６時間で（アポトーシスに対して保護する）ＢＣＬ２はほぼ３倍上がったが、一方で、Ｂａｘ（アポトーシスマーカー）は上方調節されなかった。
【００９６】
（実施例６）
スクリーニング方法により特定される薬剤、並びに特定された薬剤のインビトロ及びインビボデータ
エックスビボスクリーニング方法は、インビトロ研究と一致し、かつ臨床的に陽性であることが証明された、薬剤の特定を提供した。１つのそのような例はヘキシルデカノールである。ヘキシルデカノールはインビトロモデルで試験したとき、色調を修正することができる薬剤として保証された。例えば、メラニン総量分析を、メラニンを生成することが知られるラット黒色腫系を用いて行った。ヘキシルデカノールは対照と比較して、そのような細胞培養物により生成されるメラニン総量を減少させた。エックスビボモデルはこれらの結果を確認した（下方調節を示すエックスビボデータについては図２５ａ及び２５ｂを参照のこと）。それゆえ、インビトロモデル及びエックスビボモデルから特定されたヘキシルデカノール等の有望な色調薬剤を臨床設定で試験した。
【００９７】
例えば、ヘキシルデカノールを、９週間を通して、媒体対照及び正の対照（５％ナイアシンアミド＋１％ウンデシレノイルフェニルアラニン）と比較した。具体的には、試験は、３３０人の対象者が試験製品を与えられる、１週間の正規化期間を含む、ランダム化、二重盲検、総当たり、媒体対照、分割面設計での、９週間の臨床研究を含んだ。新規化合物処理は、媒体に対してｐ値＜０．１０（１面で）である場合、有意差があるとされた。ヘキシルデカノールは統計的に媒体対照より優れていた。この薬剤はしみ領域断片において対照とは顕著に異なること（顔面当たりのしみの総領域が対照群と比較して減少したこと）、及びメラニンは媒体対照と比較して同等であったことが分かった。
【００９８】
任意の相互参照又は関連特許若しくは関連出願を包含する本明細書に引用される全ての文献は、明確に除外ないしは別の方法で限定されない限り、その全てを本明細書中に参照により組み込まれる。いかなる文献の引用も、それが本明細書において開示されているか若しくは特許請求されているいずれかの発明に関する先行技術であることを認めるものではなく、あるいはそれが単独で又は他のいかなる参考文献（単数若しくは複数）とのいかなる組み合わせにおいても、かかる発明を教示する、提案する、又は開示することを認めるものではない。更に、本文書において、用語の任意の意味又は定義の範囲が、参考として組み込まれた文書中の同様の用語の任意の意味又は定義と矛盾する場合には、本文書中で用語に割り当てられる意味又は定義に準拠するものとする。
【００９９】
本発明は本明細書中に示される具体的な実施例に限定されると考えられるべきでない。種々の修正、同等のプロセス、並びに本発明が適用可能であり得る多くの構造及びデバイスは、当業者に容易に明らかとなるであろう。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の変更が行われてもよく、それが、本明細書に記載されるものに限定されると見なされるものではないことを理解するであろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【国際調査報告】
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