(57)【要約】  本発明は、一つには、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードしている核酸内の突然変異の存在または不存在についてアッセイすることに基づく、がんの選択的レジメンに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、対象がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンを有することに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ｃ）ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンの存在または不存在について対象由来の生体試料をアッセイし；
ｄ）試料が８５９位にグルタミンを有することに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことを含む、前記方法。
【請求項３】
がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）試料がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンを有することに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与し；または、
ｂ）試料がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンを有していないことに基づいて、異なるＰＩ３Ｋ阻害化合物の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことのいずれかを含む、前記方法。
【請求項４】
がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンの存在または不存在について対象由来の生体試料をアッセイすること；および
ｉ）試料が８５９位にグルタミンを有することに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与するか；または、
ｉｉ）試料が８５９位にグルタミンを有していないことに基づいて、異なるＰＩ３Ｋ阻害化合物の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことのいずれかを含む、前記方法。
【請求項５】
がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ｄ）ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンの存在または不存在について対象由来の生体試料をアッセイし；
ｅ）その後、対象がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンを有することに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩で治療するための対象を選択し；
ｆ）その後、対象がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンを有していることに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩を対象に投与する
ことを含む、前記方法。
【請求項６】
がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）対象由来の生体試料中のＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンの存在または不存在を判定し、ここで、８５９位におけるグルタミンの存在は、対象がＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応する可能性が高いことを示し；
ｂ）その後、対象由来の試料がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンを有することに基づいて、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩により治療するための対象を選択する
ことを含む、前記方法。
【請求項７】
がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
対象がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンをコードする核酸配列を有することに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことを含む、前記方法。
【請求項８】
がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニット内の核酸配列の突然変異の存在または不存在について対象由来の生体試料をアッセイし、ここで、突然変異はＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンのアミノ酸置換をもたらし；
ｂ）核酸配列試料が８５９位に突然変異を有しておらず、およびグルタミンをコードしていることに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことを含む、前記方法。
【請求項９】
がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）対象がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードする核酸配列を有することに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与するか；または、
ｂ）対象がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードしていない核酸配列を有することに基づいて、異なるＰＩ３Ｋ阻害化合物の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことのいずれかを含む、前記方法。
【請求項１０】
がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットにおける核酸配列の突然変異の存在または不存在について対象由来の生体試料をアッセイし、ここで、突然変異は、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンのアミノ酸置換をもたらすこと；および
ｉ）核酸配列がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードすることに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与するか；または、
ｉｉ）核酸配列がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位に突然変異を有し、およびグルタミンをコードしていないことに基づいて、異なるＰＩ３Ｋ阻害化合物の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことのいずれかを含む、前記方法。
【請求項１１】
がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットにおける核酸配列の突然変異の存在または不存在について対象由来の生体試料をアッセイし、ここで、突然変異は、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンのアミノ酸置換をもたらし；
ｂ）その後、対象由来の試料がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位に突然変異を有しておらず、およびグルタミンをコードすることに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩により治療するための対象を選択し；
ｃ）その後、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩を突然変異のない対象に投与する
ことを含む、前記方法。
【請求項１２】
がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットにおける核酸配列の突然変異の存在または不存在について対象由来の生体試料をアッセイし、ここで、突然変異は、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンのアミノ酸置換をもたらし、ここで、核酸配列における突然変異の不存在は、対象がＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応する可能性が高いことを示し；
ｂ）その後、対象由来の試料が核酸配列中に突然変異がないために、核酸配列がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードしていることに基づき、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩により治療するための対象を選択する
ことを含む、前記方法。
【請求項１３】
がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
コードされている触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンの置換をもたらす、ＰＩ３Ｋポリペプチドの触媒ｐ１１０αサブユニットをコードしている核酸分子中の突然変異の存在について、がんを有している対象由来の核酸試料をアッセイし；
その後、
ａ）核酸がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードしていることに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与するか；または、
ｂ）核酸がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードしていないことに基づいて、異なるＰＩ３Ｋ阻害化合物の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことのいずれかを含む、前記方法。
【請求項１４】
個体の遺伝子型を決定する方法であって、コードされているＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にアミノ酸変異をもたらす遺伝子変異を検出することを含み、ここで、８５９位に変異がないことは、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）を個体に投与すべきであることを示す、前記方法。
【請求項１５】
個体の遺伝子型を決定する方法であって、前記個体から得られたＰＩ３Ｋ遺伝子の触媒ｐ１１０αサブユニット内の２５７５〜２５７７位におけるＣＡＡの不存在または存在を検出することを含み、ここで、ＣＡＡの存在は、個体が（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）に反応する可能性が高いことを示す、前記方法。
【請求項１６】
がんが膠芽腫、黒色腫、卵巣がん、乳がん、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、子宮内膜がん、前立腺がん、結腸がん、および骨髄腫からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
試料が腫瘍試料である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
腫瘍試料が新鮮な凍結試料またはパラフィン包埋組織試料である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
検出がイムノアッセイ、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、ＨＰＬＣ、および質量分析法によって行なわれ得る、請求項１〜６および請求項１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットをコードしている核酸分子中の突然変異の存在または不存在が、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＴａｑＭａｎ系アッセイ、直接配列決定、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、高密度オリゴヌクレオチドＳＮＰアレイ、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイ、プライマー伸長アッセイ、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ、一本鎖高次構造多型分析、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、変性高速液体クロマトグラフィー、高分解能融解分析、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質アッセイ、ＳＮＰＬｅｘ（登録商標）、キャピラリー電気泳動、サザンブロットからなる群から選択される技術により検出され得る、請求項７〜１３および請求項１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
検出ステップが、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニット遺伝子またはその一部を配列決定することを含む、請求項７〜１２または請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）による治療に対するがんを有している対象の反応性を予測するための情報の伝達可能形態を形成する方法であって、
ａ）（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）による治療に対して患者が反応する高い可能性を対象が有しているか否かを判定し、ここで、対象は、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニット遺伝子の８５９位にグルタミンを有することに基づいた高い可能性を有し、
ｂ）伝達に使用するための有形または無形のメディア形態に判定ステップの結果を記録する
ことを含む、前記方法。
【請求項２３】
（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）による治療に対するがんを有している対象の反応性を予測するための情報の伝達可能形態を形成する方法であって、
ａ）（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）による治療に対して患者が反応する高い可能性を対象が有しているか否かを判定し、ここで、対象は、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニット遺伝子の８５９位にグルタミンをコードしている核酸配列に基づいて高い可能性を有し、
ｂ）伝達に使用するための有形または無形のメディア形態に判定ステップの結果を記録する
ことを含む、前記方法。
【請求項２４】
ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害物質化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による治療に腫瘍が反応するか否かを判定するためのキットであって、ＰＩ３Ｋ遺伝子座における突然変異の存在を検出するための１つまたは複数のプローブまたはプライマーおよび使用説明書を提供することを含む、前記キット。
【請求項２５】
がんを有している対象がＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による治療から効果を得ることができるか否かを予測するためのキットであって、
ｃ）ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位における突然変異の存在を判定するための複数の薬剤と；
ｄ）使用説明書
とを含む、前記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、２０１２年３月２９日に出願の米国仮特許出願第６１／６１７２８４号、および２０１３年２月２２日に出願の米国仮特許出願第６１／７６７，８４８号に対する優先権を主張するものであり、そのそれぞれの開示は、参照によりその全体を本明細書に組み入れるものとする。
【０００２】
本発明は、新規な個人向けの治療法、キット、情報の伝達可能形態、およびがんを有している患者の治療で使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ(ＰＩ３Ｋ)は、リン酸のイノシトール脂質のＤ−３'位への転位を触媒しホスホイノシトール−３−ホスフェート(ＰＩＰ)、ホスホイノシトール−３,４−ジホスフェート(ＰＩＰ２)およびホスホイノシトール−３,４,５−トリホスフェート(ＰＩＰ３)を産生し、これは次いで、プレクストリン相同、ＦＹＶＥ、Ｐｈｏｘおよび他のリン脂質結合ドメインを含有するタンパク質を、多くの場合、原形質膜で様々なシグナル伝達複合体に結合させることによりシグナル伝達カスケードで二次メッセンジャーとして作用する、脂質キナーゼのファミリーを構成する（Vanhaesebroeck et al., Annu. Rev. Biochem 70: 535(2001); Katso et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17: 615(2001)）。２種のクラス１ ＰＩ３Ｋのうち、クラス１Ａ ＰＩ３Ｋは、ｐ８５α、ｐ５５α、ｐ５０α、ｐ８５βまたはｐ５５γであり得る制御サブユニットと構成的に結合している触媒ｐ１１０サブユニット(α、β、δアイソフォーム)からなるヘテロダイマーである。クラス１Ｂサブクラスは、２種の制御サブユニットのｐ１０１またはｐ８４のいずれか一方と結合している触媒ｐ１１０γサブユニットからなるヘテロダイマーである、１種のファミリーメンバーを有する（Fruman et al., Annu Rev. Biochem. 67:481(1998); Suire et al., Curr. Biol. 15:566(2005)）。ｐ８５／５５／５０サブユニットのモジュラードメインは、活性化受容体および細胞質チロシンキナーゼ上の特異的配列内容内のホスホチロシン残基と結合し、クラス１Ａ ＰＩ３Ｋを活性化し局在化させる、Ｓｒｃ相同(ＳＨ２)ドメインを含む。クラス１Ｂ、ならびにいくつかの状況におけるｐ１１０βは、ペプチドリガンドおよび非ペプチドリガンドの種々のレパートリーと結合するＧタンパク質共役受容体により直接活性化される（Stephens et al., Cell 89:105(1997)); Katso et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 17: 615-675(2001)）。したがって、得られたクラスＩ ＰＩ３Ｋのリン脂質生成物は、上流受容体と下流細胞の活性、例えば、増殖、生存、走化性、細胞輸送、運動性、代謝、炎症反応およびアレルギー反応、転写および翻訳などを結びつける（Cantley et al., Cell 64:281(1991); Escobedo and Williams, Nature 335:85(1988); Fantl et al., Cell 69:413(1992)）。
【０００４】
ＰＩＰ３は、ウイルス癌遺伝子ｖ−Ａｋｔのヒトホモログの産物であるＡｋｔを、原形質膜に集め、そこでそれは、増殖および生存にとって重要な多くの細胞内シグナル伝達経路のための節点として作用する（Fantl et al., Cell 69: 413-423(1992); Bader et al., Nature Rev. Cancer 5: 921 (2005); Vivanco and Sawyer, Nature Rev. Cancer 2: 489 (2002)）。Ａｋｔ活性化を介して生存を高めることが多いＰＩ３Ｋの異常制御は、ヒトのがんにおける最も一般的な事象の一つであり、多重的に起こることが示唆されている。ホスホイノシチドをイノシトール環の３’位で脱リン酸化し、そこでＰＩ３Ｋ活性に拮抗する腫瘍抑制遺伝子ＰＴＥＮは、様々な腫瘍で機能的に欠損している。別の腫瘍において、ｐ１１０αアイソフォームのＰＩＫ３ＣＡ遺伝子、およびＡｋｔの遺伝子は増幅され、それらの遺伝子産物のタンパク質発現が増加することがいくつかのヒトのがんで証明されている。さらに、ｐ８５−ｐ１１０複合体のアップレギュレートに作用するｐ８５αの突然変異および転座がヒトのがんで記載されている。最後に、下流シグナル伝達経路を活性化するＰＩＫ３ＣＡにおける体細胞ミスセンス突然変異が広範囲のヒトのがんでかなりの頻度で記載されている（Kang at el., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 802 (2005); Samuels et al., Science 304: 554 (2004); Samuels et al., Cancer Cell 7: 561-573 (2005)）。これらの知見から、ホスホイノシトール−３キナーゼとこのシグナル伝達経路の上流および下流構成の調節解除が、ヒトのがんおよび増殖性疾患に関連する最も一般的な調節解除の一つであることが明らかである（Parsons et al., Nature 436: 792(2005); Hennessey at el., Nature Rev. Drug Disc. 4: 988-1004(2005)）。
【０００５】
患者の遺伝子プロファイルが患者の処置的治療に対する患者の反応性の決定要因となり得ることを示唆する証拠が増え、集まってきている。がんを有している個体に多くの処置を施すことができることを前提として、例えば、特定の薬剤に対する反応に影響を及ぼす遺伝因子の判定を使用して、個人向けのレジメンを患者に提供することができる。このような個人向けのレジメンは、代替の効果の低いレジメンに随伴し得る関連の副作用を最小限に抑えながら、患者に対して処置的効果を最大限に発揮する可能性を提供する。したがって、患者が特定の治療的療法に反応し得るか否かの予測に使用することができる因子を同定することが求められている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットにおける８５９位のアミノ酸をコードしている核酸の同一性を使用して、アルファ−アイソフォーム特異的ＰＩ３Ｋ阻害化合物、例えば、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量による治療に反応し得る、がんを有している個体を選択することができるという知見に基づくものである。特に、がんを有している個体由来の試料中のＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットにおける８５９位のグルタミン残基（本明細書においてＱまたはＧｌｎともいう）の変化を使用して、個体がアルファ−アイソフォーム特異的ＰＩ３Ｋ阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応するか否かを選択することができるという知見であった。判定ステップは、対象の目的物（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質など）について個体由来の生体試料を直接アッセイすることによって行うことができる。
【０００７】
一態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、対象がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンを有することに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与することを含む、前記方法を包含する。
【０００８】
別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンの存在または不存在について対象由来の生体試料をアッセイし；
ｂ）試料が８５９位にグルタミンを有することに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことを含む、前記方法を包含する。
【０００９】
さらに別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）試料がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンを有することに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与し；または、
ｂ）試料がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンを有していないことに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）以外の異なるＰＩ３Ｋ阻害化合物の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことのいずれかを含む、前記方法を包含する。
【００１０】
別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンの存在または不存在について対象由来の生体試料をアッセイすること；および
ｉ）試料が８５９位にグルタミンを有することに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与し；または、
ｉｉ）試料が８５９位にグルタミンを有していないことに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）以外の異なるＰＩ３Ｋ阻害化合物の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことのいずれかを含む、前記方法を包含する。
【００１１】
さらに別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンの存在または不存在について対象由来の生体試料をアッセイし；
ｂ）その後、対象がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンを有することに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩で治療するための対象を選択し；
ｃ）その後、対象がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンを有していることに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩を対象に投与する
ことを含む、前記方法を包含する。
【００１２】
別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）対象由来の生体試料中のＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンの存在または不存在を判定し、ここで、８５９位におけるグルタミンの存在は、対象がＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応する可能性が高いことを示し；
ｂ）その後、対象由来の試料がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンを有することに基づいて、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩により治療するための対象を選択する
ことを含む、前記方法を包含する。
【００１３】
別の態様において、本発明は、がんを有している、治療の対象を選択する方法であって、
対象由来の生体試料中のＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンの存在または不存在を判定し、ここで、８５９位におけるグルタミンの存在は、対象がＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応する可能性が高いことを示す、
ことを含む、前記方法を包含する。
【００１４】
別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
対象がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードする核酸配列を有することに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことを含む、前記方法を包含する。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）基準配列と比較して、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの２５７５〜２５７７位における核酸配列の突然変異の存在または不存在について対象由来の生体試料をアッセイし；
ｂ）核酸配列試料が８５９位に突然変異を有しておらず、およびグルタミンをコードする核酸配列を有する対象に基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことを含む、前記方法を包含する。
【００１６】
さらに別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）対象がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードする核酸配列を有することに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与するか；または、
ｂ）対象がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードしていない核酸配列を有することに基づいて、異なるＰＩ３Ｋ阻害化合物の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことのいずれかを含む、前記方法を包含する。
【００１７】
さらに別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットにおける核酸配列の突然変異の存在または不存在について対象由来の生体試料をアッセイし、ここで、突然変異は、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンのアミノ酸置換をもたらすこと；および
ｉ）核酸配列がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードすることに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与するか；または、
ｉｉ）核酸配列がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位に突然変異を有し、およびグルタミンをコードしていないことに基づいて、異なるＰＩ３Ｋ阻害化合物の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことのいずれかを含む、前記方法を包含する。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットにおける核酸配列の突然変異の存在または不存在について対象由来の生体試料をアッセイし、ここで、突然変異は、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンのアミノ酸置換をもたらし；
ｂ）その後、対象由来の試料がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位に突然変異を有しておらず、およびグルタミンをコードすることに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩により治療するための対象を選択し；
ｃ）その後、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩を突然変異のない対象に投与する
ことを含む、前記方法を包含する。
【００１９】
別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
ａ）ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットにおける核酸配列の突然変異の存在または不存在について対象由来の生体試料をアッセイし、ここで、突然変異は、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンのアミノ酸置換をもたらし、ここで、核酸配列における突然変異の不存在は、対象がＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応する可能性が高いことを示し；
ｂ）その後、対象由来の試料の核酸配列に突然変異がないために、核酸配列がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードしていることに基づき、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩により治療するための対象を選択する
ことを含む、前記方法を包含する。
【００２０】
さらに別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、
コードされている触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンの置換をもたらす、ＰＩ３Ｋポリペプチドの触媒ｐ１１０αサブユニットをコードしている核酸分子中の突然変異の存在について、がんを有している対象由来の核酸試料をアッセイし；
その後、
ａ）核酸がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードしていることに基づいて、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩の治療有効量を対象に選択的に投与するか；または、
ｂ）核酸がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードしていないことに基づいて、異なるＰＩ３Ｋ阻害化合物の治療有効量を対象に選択的に投与する
ことのいずれかを含む、前記方法を包含する。
【００２１】
別の態様において、本発明は、がんを有している、治療の対象を選択する方法であって、コードされている触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンの置換をもたらす、ＰＩ３Ｋポリペプチドの触媒ｐ１１０αサブユニットをコードしている核酸分子中の突然変異の存在について、がんを有している対象由来の核酸試料をアッセイすることを含み、ここで、８５９位のグルタミンの存在は、患者がＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応する可能性が高いことを示す、前記方法を包含する。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、個体の遺伝子型を決定する方法であって、コードされているＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にアミノ酸変異をもたらす遺伝子変異を検出することを含み、ここで、８５９位に変異がないことは、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）を個体に投与すべきであることを示す、前記方法を包含する。
【００２３】
さらに別の態様において、本発明は、個体の遺伝子型を決定する方法であって、前記個体から得られたＰＩ３Ｋ遺伝子の触媒ｐ１１０αサブユニット内の２５７５〜２５７７位におけるＣＡＡの不存在または存在について検出することを含み、ここで、ＣＡＡの存在は、個体が（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）に反応する可能性が高いことを示す、前記方法を包含する。
【００２４】
また本明細書に記載の本発明の方法において、がんはいかなるがんであってもよく、例えば、膠芽腫；黒色腫；卵巣がん；乳がん；非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）；子宮内膜がん、前立腺がん；結腸がん；および骨髄腫が挙げられる。典型的には、試料は腫瘍試料であり、新鮮な凍結試料またはパラフィン包埋組織試料であり得る。
【００２５】
本明細書に記載の本発明の方法において、グルタミンまたは変異アミノ酸を検出する方法は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば、イムノアッセイ、免疫組織化学、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、ＨＰＬＣ、および質量分析などによって予形成することができる。さらに、本明細書に記載の本発明の方法において、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットをコードしている核酸分子中の突然変異を検出する方法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ＴａｑＭａｎ系アッセイ、直接配列決定、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、高密度オリゴヌクレオチドＳＮＰアレイ、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）アッセイ、プライマー伸長アッセイ、オリゴヌクレオチドリガーゼアッセイ、一本鎖高次構造多型分析、温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）、変性高速液体クロマトグラフィー、高分解能融解分析、ＤＮＡミスマッチ結合タンパク質アッセイ、ＳＮＰＬｅｘ（登録商標）、またはキャピラリー電気泳動を含む。
【００２６】
本発明は、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）による治療に対するがんを有している患者の反応性を予測するための情報の伝達可能形態を形成する方法であって、
ａ）（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）による治療に対して患者が反応する高い可能性を対象が有しているか否かを判定し、ここで、対象は、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニット遺伝子の８５９位にグルタミンを有することに基づいた高い可能性を有し、
ｂ）伝達に使用するための有形または無形のメディア形態に判定ステップの結果を記録する
ことを含む、前記方法をさらに包含する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）による治療に対するがんを有している患者の反応性を予測するための情報の伝達可能形態を形成する方法であって、
ａ）（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）による治療に対して患者が反応する高い可能性を対象が有しているか否かを判定し、ここで、対象は、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニット遺伝子の８５９位にグルタミンをコードしている核酸配列に基づいた高い可能性を有し、
ｂ）伝達に使用するための有形または無形のメディア形態に判定ステップの結果を記録する
ことを含む、前記方法をさらに包含する。
【００２８】
また別の態様において、本発明は、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による治療に腫瘍が反応するか否かを判定するためのキットであって、ＰＩ３Ｋ遺伝子座（配列番号２の核酸２５７５〜２５７７）における突然変異の存在を検出するための１つまたは複数のプローブまたはプライマーおよび使用説明書を提供することを含む、前記キットを包含する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、がんを有している対象がＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による治療から効果を得ることができるか否かを予測するためのキットであって、
ａ）ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位における変異をコードしている突然変異の存在を判定するための複数の薬剤と；
ｂ）使用説明書
とを含む、前記キットを包含する。
【００３０】
本明細書に記載の本発明の方法において、ＰＩ３Ｋ阻害剤は、当該技術分野で公知の任意のＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害剤である。特に、本化合物は、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩であり得る；また、式（Ａ）
【００３１】
【化１】
2015514080.tif 000002
として下記に示され得るもの、またはその薬学的に許容される塩であり得る。
【００３２】
別の態様において、本発明は、腫瘍がＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応するか否かを判定するためのキットであって、８５９位におけるＰＩ３Ｋ遺伝子の触媒ｐ１１０αサブユニットの変異をコードしている突然変異の存在または不存在を検出するための１つまたは複数のプローブまたはプライマーを提供することを含む、前記キットを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】図１は、ＰＩ３Ｋ野生型（ｗｔ）に関するＡＴＰ活性化キネティクス曲線（ミカエリス定数（Ｋｍ）＝６０±６μＭ）と、ＰＩ３Ｋα Ｑ８５９Ａ突然変異体に関するＡＴＰ活性化キネティクス曲線（Ｋｍ＝７２±８μＭ）を示すグラフを表す。
【図２】図２は、ＰＩ３Ｋ野生型（ｗｔ）と、ＰＩ３Ｋα Ｑ８５９Ａ突然変異体に関する阻害曲線を示すグラフを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位においてグルタミンをコードしている核酸配列の突然変異の存在または不存在を使用して、アルファ−アイソフォーム特異的ＰＩ３Ｋ阻害化合物、例えば、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による療法に対する患者の反応可能性を判定することができるという知見に基づくものである。特に、ＰＩ３Ｋの野生型触媒ｐ１１０αサブユニットをコードしている、すなわち、８５９位にグルタミンを有する、患者試料由来の核酸配列は、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）による治療に反応する可能性がより高いという知見であった。対照的に、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位における変異をコードしている、すなわち、アラニンなどの８５９位におけるグルタミン以外のアミノ酸をコードしている、突然変異を有する患者の試料由来の核酸配列は、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）による治療に反応する可能性が低い。このような患者は、異なるＰＩ３Ｋ阻害剤などの代替がん療法（本明細書で使用する場合、異なるタイプのＰＩ３Ｋ阻害剤は、（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）でない阻害剤であるものとする）で治療するものとし、限定するものではないが、化学治療的療法または代替のＰＩ３Ｋ阻害剤療法、例えば、ＰＩ３Ｋサブユニットのα型以外のアイソフォームを選択的に阻害可能な阻害剤またはＰＩ３Ｋサブユニットの複数のアイソフォームを阻害可能な阻害剤であり得る。
【００３５】
本発明の方法の一部の実施形態において、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンをコードしている核酸配列内の突然変異の存在または不存在は、ゲノム配列、核酸産物、ポリペプチド産物、または同等の遺伝マーカーに対して生体試料をアッセイすることによって検出することができる。
【００３６】
一例において、本発明は、個体由来の試料の遺伝子型を決定することを包含する。遺伝子型決定において、８５９位におけるグルタミンをコードするヌクレオチド文字は、ＰＩ３Ｋ遺伝子の触媒ｐ１１０αサブユニットの一対立遺伝子または両対立遺伝子のいずれかで決定される。ＰＩ３Ｋ遺伝子の触媒ｐ１１０αサブユニットに関しては、突然変異は、一対立遺伝子または両対立遺伝子におけるＰＩ３Ｋ遺伝子の触媒ｐ１１０αサブユニットのヌクレオチド２５７５から２５７７で生じる。遺伝子型は、ホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。本発明の方法において、８５９位における核酸配列、またはタンパク質の相同性の決定は、必要に応じて、野生型のタンパク質配列（ＧｅｎｅＩＤ：５２９０；例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００６２０９．２；配列番号１を有するタンパク質をコードしているもの）またはＤＮＡ塩基配列（配列番号２）または野生型の核酸配列（ｍＲＮＡ；ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＭ＿００６２１８．２）またはゲノムＤＮＡ（ＮＣＢＩ基準配列番号ＮＧ＿０１２１１３．１）と比較することができる。ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位における変異（すなわち、グルタミン以外のアミノ酸）は、タンパク質をコードしている、ＰＩ３Ｋ遺伝子配列の触媒ｐ１１０αサブユニット内の遺伝子突然変異に起因する、８５９位における基準（野生型）タンパク質配列中の変化を意味するものとして使用される。一実施形態において、変異は８５９位におけるアラニンであり得る。
【００３７】
本開示は、したがって、ＰＩ３Ｋ発現性がんに罹患している患者が、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による療法に有効な反応を示す可能性を予測するための方法を提供する。このような評価を受ける患者としては、以下が挙げられる：１）まだがんに対していかなる治療も受けていない、ＰＩ３Ｋ−発現性がんを有している患者；２）ＰＩ３Ｋ発現性がんを有しており、および、がんの完全または部分的切除を受けている患者、例えば、臨床的に可能な範囲でがん組織の外科的除去を受けた患者；３）ＰＩ３Ｋ発現性がんを有しており、およびＰＩ３Ｋ阻害剤レジメン以外のレジメンで治療されている患者。
【００３８】
本発明の方法において、試料は、ＰＩ３Ｋ遺伝子ＰＩＫ３ＣＡの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンをコードしている突然変異の存在または不存在についてアッセイする。一例において、突然変異は、ＰＩ３Ｋ遺伝子ＰＩＫ３ＣＡ（Ｑ８５９Ａ）［ＧｅｎｅＩＤ：５２９０；例えば、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿００６２０９．２（配列番号１）を有するタンパク質をコードしているもの）のヒト触媒ｐ１１０αサブユニットにおける８５９位におけるアラニンに対するグルタミンの置換／変異をもたらす。
【００３９】
一態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミンの存在または不存在について、対象由来の生体試料をアッセイし；試料が８５９位にグルタミンを有することに基づいて、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩を対象に選択的に投与することを含む、前記方法を包含する。
【００４０】
別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位における変異をコードしている突然変異の存在または不存在について、対象由来の生体試料をアッセイし；対象由来の試料がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位に突然変異を有していないことに基づいて、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩を対象に選択的に投与することを含む、前記方法を包含する。
【００４１】
別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位における変異をコードしている突然変異の存在または不存在について、対象由来の生体試料をアッセイし；その後、対象由来の試料がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位に突然変異を有していない（すなわち、核酸配列がグルタミンをコードしている）ことに基づいて、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩により治療するための対象を選択し；対象が突然変異を有していないことの結果としてＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、前記方法を包含する。
【００４２】
また別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、対象由来の生体試料中のＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位における変異をコードしている突然変異の存在または不存在を判定し、ここで、突然変異の存在は、対象がＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応しない可能性が高いことを示し；その後、対象由来の試料がＰＩ３Ｋのｐ１１０αサブユニットの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位に突然変異を有していないことに基づいて、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩により治療するための対象を選択することを含む、前記方法を包含する。
【００４３】
またさらに別の態様において、本発明は、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩によりがんを有している対象を選択的に治療する方法であって、対象がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミン（Ｑ）の存在を有することに基づいて、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することを含む、前記方法を包含する。
【００４４】
またさらに別の態様において、本発明は、がんを有している対象を選択的に治療する方法であって、ＰＩ３Ｋポリペプチドの触媒ｐ１１０αサブユニットの２５７５〜２５７７位における核酸分子の１または複数の突然変異の存在について、がんを有している対象由来の核酸試料をアッセイし；その後、対象が配列に突然変異の存在を有しておらず、およびコードされているＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードしていることに基づいて、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩を対象に選択的に投与することを含む、前記方法を包含する。
【００４５】
またさらに別の態様において、本発明は、患者がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンを有することに基づいて、治療有効量の化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与することを特徴とする、がんの治療で使用するためのＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩を包含する。
【００４６】
またさらに別の態様において、患者が、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンから選択されるＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンを有していること、またＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンを有していないことに基づいて、治療有効量の化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与することを特徴とする、がんの治療で使用するためのＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩を包含する。
【００４７】
またさらに別の態様において、本発明は、患者がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードしている核酸を有することに基づいて、治療有効量の化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与することを特徴とする、がんの治療で使用するためのＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩を包含する。
【００４８】
またさらに別の態様において、本発明は、患者が、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードしている核酸およびＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードしていない核酸から選択される、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位にグルタミンをコードしている核酸を有することに基づいて、治療有効量の化合物またはその薬学的に許容される塩を患者に投与することを特徴とする、がんの治療で使用するためのＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩を包含する。
【００４９】
ＰＩ３Ｋ阻害剤
本明細書に記載の方法を使用して評価されている患者は、ＰＩ３Ｋ阻害剤による治療が考慮されている患者である。本発明によれば、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの野生型形態を発現する腫瘍に罹患している患者は、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による治療に反応する可能性が高い。
【００５０】
本明細書では、「ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害剤」という用語は、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットを阻害することができる分子である。ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害剤は、ベータおよび／またはデルタおよび／またはガンマサブタイプをはじめとする他のサブタイプを阻害するその能力と比べて、ＰＩ３Ｋのアルファサブタイプを選択的に阻害することができると理解されたい。
【００５１】
ＷＯ２０１０／０２９０８２には特定の２−カルボキサミドシクロアミノ尿素誘導体が開示されており、有利な薬理学的特性を有し、他のタイプと比べて、ＰＩ３−キナーゼアルファサブタイプに対する選択性が改善されたことが明らかなことを確認することができる。本発明に適する、特定の２−カルボキサミドシクロアミノ尿素誘導体、その調製法、およびそれを含有する適切な製剤は、ＷＯ２０１０／０２９０８２に開示されている。本明細書に記載の本発明の方法において、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害剤は、化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩であり得る。本発明で使用されるＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害剤は、式（Ａ）
【００５２】
【化２】
2015514080.tif 000003
の化合物、またはその薬学的に許容される塩である。この化合物は、ＷＯ２０１０／０２９０８２で詳しく開示されている。この化合物の合成は、ＷＯ２０１０／０２９０８２に実施例１５として開示されている。
【００５３】
本明細書に記載のＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物は、薬剤そのもの、その薬学的に許容される塩、その薬学的に許容されるエステル、ならびに、ステロアイソマー（steroisomer）、エナンチオマー、ラセミ混合物などであり得る。
【００５４】
試料の調製
本発明は、とりわけ、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットのアミノ酸８５９をコードしている核酸配列の同一性を検出するためのアッセイを提供する。核酸が野生型アミノ酸グルタミンをコードしている場合、これは、対象は選択され、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（上記）で治療されるべきであることを示す。しかし、核酸が突然変異を有しており、変異アミノ酸をコードしている場合、すなわち、グルタミン以外のアミノ酸をコードしている場合は、対象は（上記のような）ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（上記）で治療すべきではない。
【００５５】
本方法は、体液、例えば、血液（例えば、血清または血漿）、骨髄、脳脊髄液、腹水／胸水、リンパ液、腹水、漿液、痰、涙液、便、尿で、または腫瘍組織などの組織で突然変異を検出することを含み得る。腫瘍組織は、新鮮な組織またはパラフィン包埋組織であり得る。
【００５６】
本明細書では、「対象」とはヒトまたは動物を意味し、すべての哺乳動物、例えば、霊長類（特に高等霊長類）、ヒツジ、イヌ、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、モルモット、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、およびウシが挙げられる。好ましい実施形態において、対象はヒトである。別の実施形態において、対象は、実験動物または疾患モデルとして適した動物である。
【００５７】
体液試料は、当該分野で公知の任意の方法を用いて対象から得ることができる。体液試料から細胞ＤＮＡを抽出するための方法は当該分野で周知である。典型的には、細胞を界面活性剤で溶解される。細胞溶解後、タンパク質は、様々なプロテアーゼを使用して、ＤＮＡから除去される。ＤＮＡは、その後、アルコールで沈殿させ、フェノールで抽出し、水溶液中に溶解させる。体液試料から無細胞のＤＮＡを抽出する方法も当技術分野で公知である。一般に、体液試料中の無細胞ＤＮＡをアルコール中に沈殿させ、細胞から分離し、水溶液中に溶解させる。
【００５８】
一般に、固形腫瘍試料は、生検または外科的切除によりがんを有する対象から得られた細胞または組織の試験試料であり得る。細胞または組織の試料は、針吸引生検によって除去することができる。この目的において、注射器に取り付けた微細針が皮膚を通して目的の組織に挿入される。針は、典型的には、超音波またはコンピュータ断層撮影（ＣＴ）画像を用いて目的とする領域に導かれる。針が組織に挿入された場合、真空が注射器により形成され、細胞または流体が針を介して吸引され、注射器に収集され得る。細胞または組織の試料はまた、切開またはコア生検によって取り出すことができる。この目的において、組織の円錐、円柱、または小型ビットは、目的とする領域から取り出される。一般に、ＣＴ画像診断、超音波または内視鏡を用いてこの種の生検をガイドする。より具体的には、全体がん病変を切除生検または外科的切除によって取り出すことができる。本発明では、試験試料は、典型的には、外科的切除の一部として取り出された細胞試料である。
【００５９】
例えば組織の試験試料はまた、例えば、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ；  Ａｕｓｔｉｎ  Ｔｅｘ．）または急速凍結で保存され、後で使用するために−８０℃で保管され得る。生検組織試料はまた、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、または酢酸／エタノールのような固定液で固定してもよい。固定された組織試料は、ワックス（パラフィン）またはプラスチック樹脂中に埋め込むことができる。埋め込まれた組織試料（または凍結組織試料）は、薄い切片にカットすることができる。ＲＮＡまたはタンパク質はまた、固定またはワックス包埋組織試料から抽出することができる。
【００６０】
本発明に係る治療に有用なＰＩ３Ｋ発現性がんは、がんまたは細胞増殖性疾患、例えば、腫瘍および／またはＰＩ３Ｋにより媒介されるがん細胞増殖などが含まれる。疾患には、ＰＩ３Ｋアルファの過剰発現または増幅、ＰＩＫ３ＣＡの体細胞突然変異または生殖細胞突然変異またはＰＴＥＮの体細胞突然変異、またはＰ８５−Ｐ１１０複合体を上方制御するように機能するＰ８５αの突然変異または転位を示す疾患を含み得る。特に、がんとしては、例えば、肉腫；肺がん；気管支がん；前立腺がん；乳がん（散発性乳がんおよびコーデン病の患者を含む）；膵臓がん；胃腸がん；結腸がん；直腸がん；結腸カルシノーマ；結腸直腸腺腫；甲状腺がん；肝臓がん；肝内胆管がん；肝細胞性がん；副腎がん；胃（stomach）がん；胃（gastric）がん；神経膠腫；膠芽腫；子宮内膜がん；黒色腫；腎臓がん；腎盂がん；膀胱がん；子宮体がん；子宮頚がん；膣がん；卵巣がん；多発性骨髄腫；食道がん；白血病；急性骨髄性白血病；慢性骨髄性白血病；リンパ性白血病；骨髄性白血病；脳腫瘍；脳カルシノーマ；口腔咽頭がん；喉頭がん；小腸がん；非ホジキンリンパ腫；黒色腫；絨毛結腸アデノーマ；新生物；上皮形質の新生物；リンパ腫；乳癌（mammary carcinoma）；基底細胞癌；扁平上皮癌；紫外線角化症；固形腫瘍を含む腫瘍疾患；頸部または頭部の腫瘍；真性赤血球増加；本態性血小板血症；骨髄様化生を伴う骨髄線維症；およびヴァルデンシュトレーム病（Walden-stroem disease）が挙げられる。
【００６１】
本発明の方法はがんに限定するものではなく、（例えば、ＰＩ３Ｋが媒介する）他の症状または障害を含むことができ、例えば、真性多血症、本態性血小板血症、骨髄異形成、骨髄線維症、喘息、ＣＯＰＤ、ＡＲＤＳ、レフラー症候群、好酸球性肺炎、寄生虫（特に後生動物）感染（熱帯性好酸球増加症を含む）、気管支肺アスペルギルス症、結節性多発性動脈炎（チャーグ−ストラウス症候群を含む）、好酸球肉芽腫、薬物反応によって引き起こされた気道に影響する好酸球関連の障害、乾癬、接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、円形脱毛症、多形性紅斑、疱疹状皮膚炎、強皮症、尋常性白斑、過敏性脈管炎、蕁麻疹、水疱性類天疱瘡、紅斑性狼瘡、天疱瘡（pemphisus）、後天性表皮水疱症、自己免疫性血液疾患（例えば溶血性貧血、再生不良性貧血、純粋な赤血球貧血および特発性血小板減少症）、全身性エリテマトーデス、多発性軟骨炎、強皮症、ヴェグナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、スティーヴン＝ジョンソン症候群、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸感染（例えば潰瘍性大腸炎とクローン病）、内分泌性眼、グレーヴス病、サルコイドーシス、胞隔炎、慢性過敏性肺炎、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、ブドウ膜炎（前部および後部）、間質性肺線維症、乾癬性関節炎、糸球体腎炎、心血管疾患、アテローム性動脈硬化、高血圧、深部静脈血栓症、卒中発作、心筋梗塞、不安定狭心症、血栓塞栓症、肺塞栓症、血栓溶解疾患、急性動脈虚血、末梢血栓性閉塞、および冠動脈疾患、再潅流障害、網膜症、例えば、糖尿病性網膜症または高圧酸素誘発性網膜症および上昇した眼内圧または眼房水の分泌を特徴とする症状、例えば緑内障などである。
【００６２】
検出
本発明の方法は、ＰＩ３Ｋ遺伝子のヒトｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるアミノ酸グルタミンをコードしている核酸配列内の突然変異の存在または不存在を検出することを含む。一例において、この方法は、ＰＩ３Ｋの薬物治療に対する患者の反応を予測するために、８５９位における突然変異アミノ酸をコードしている核酸を検出することを含む。ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットにおける突然変異は、一般的にＤＮＡレベルで発生するので、本発明の方法は、ゲノムＤＮＡ、ならびに転写産物（ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）およびタンパク質そのものにおける突然変異の検出に基づくことができる。
【００６３】
本明細書に記載の、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニットの突然変異は、当技術分野における任意の公知の方法により検出することができる。本発明のＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニット突然変異を説明するにあたり、突然変異には、８５９位での野生型配列中に存在するグルタミン（Ｑ）アミノ酸の任意のアミノ酸置換が含まれ、例えば、置換はアラニン（Ａ）に対するグルタミン（Ｑ）であり得る。さらに、本明細書に関連のＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニット突然変異は、便宜上遺伝子のセンス鎖にある。しかし、当業者において認識されるように、遺伝子を含む核酸分子は相補的二本鎖分子であってもよく、したがって、センス鎖上の特定の部位を示す言及は、相補的なアンチセンス鎖上の対応する部位にも言及するものとする。すなわち、一方の鎖上の同一突然変異位置を参照することができ、オリゴヌクレオチドは、多型および／または突然変異部位を含む標的領域のいずれかの鎖に特異的にハイブリダイズするように設計することができる。したがって、本発明はまた、一本鎖ポリヌクレオチドと、本明細書に記載のゲノム変異のセンス鎖に相補的な突然変異を含む。
【００６４】
様々な技術を用いて、核酸配列がＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０αサブユニット中の８５９位に突然変異をコードしているか否かを同定することができ、例えば、一本鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、変性高速液体クロマトグラフィーによるヘテロ二本鎖分析（ＤＨＰＬＣ）、直接ＤＮＡ配列決定およびコンピュータによる方法（Shi et al, Clin Chem A1U6AA12 (2001)）などの技術が含まれる。現在、最も一般的な方法は、ハイブリダイゼーション、プライマー伸長、および切断方法が挙げられる。これらの方法のそれぞれは、適切な検出システムに接続しなければならない。検出技術としては、蛍光偏光（Chan et ah, Genome Res. 9:492-499 (1999)）、ピロリン酸放出の発光測定検出（パイロシーケンシング）（Ahmadiian et ah, Anal. Biochem. 280:103-10 (2000)）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）系切断アッセイ、ＤＨＰＬＣ、および質量分析法（Shi, Clin Chem 47:164-172 (2001)；米国特許第６，３００，０７６号Ｂ１）が挙げられる。
【００６５】
一実施形態において、自動分析装置（例えば、ＰＣＲ装置または自動配列決定装置）は、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０アルファサブユニット内の２５７５から２５７７位（８５９位のＧｌｎをコードしているコドン）における突然変異の存在または不存在を判定するために使用される。このようなすべての方法は、当業者に公知である。
【００６６】
特に好ましい実施形態において、突然変異はＩＮＶＡＤＥＲ（商標）技術（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．  Ｍａｄｉｓｏｎ製、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  ＵＳＡから販売されている）を用いて検出することができる。このアッセイにおいて、相補的ＤＮＡ鋳型に結合した場合、特定の上流「インベーダー」オリゴヌクレオチドおよび部分的に重複する下流のプローブは一緒になって、特定の構造を形成する。この構造は、認識され、開裂酵素によって特異的部位で切断され、プローブオリゴヌクレオチドの５’フラップを放出する。この断片は、反応混合物に含まれている合成二次標的および二次蛍光標識シグナルプローブに関する「インベーダー」オリゴヌクレオチドとして機能する。これは、開裂酵素により二次シグナルプローブの特異的切断をもたらす。蛍光シグナルは、（蛍光共鳴エネルギー移動が可能な色素分子で標識された）この二次プローブが切断されると生成される。開裂は、重複ＤＮＡ配列またはフラップにより形成されている構造に比べてストリンジェントな条件を有しており、したがって、特に下流ＤＮＡ鎖上の切断部位のすぐ上流の単一塩基対ミスマッチの検出に使用することができる。Ryan D et ah, Molecular Diagnosis 4(2): 135-144 (1999)、およびLyamichev V et ah. Nature Biotechnology 17: 292-296 (1999)、ならびに米国特許第５，８４６，７１７号および第６，００１，５６７号も参照されたい。
【００６７】
本発明はさらに、オリゴヌクレオチドプローブと、触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位におけるグルタミン（gluatmine）もしくは変異ポリペプチドをコードしているか、突然変異部位に隣接されている、核酸配列に特異的にハイブリダイズするように設計されたプライマーとを含有する組成物を含む。目的の突然変異を含有する領域は、限定するものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，９６５，１８８号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Barany et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA 88:189-193 (1991)；公表ＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／０１０６９、およびオリゴヌクレオチド連結反応アッセイ（ＯＬＡ）（Landegren et al, Science 241: 1077-1080 (1988)）をはじめとする、任意のオリゴヌクレオチド指向性増幅法を用いて増幅することができる。このような方法でプライマーまたはプローブとして有用なオリゴヌクレオチドは、多型／突然変異部位を含有する、または多型／変異部位に隣接している核酸の領域に特異的にハイブリダイズするはずである。一般的に、オリゴヌクレオチドは、長さが１０〜３５ヌクレオチド、好ましくは、長さが１５〜３０ヌクレオチドである。最も好ましくは、オリゴヌクレオチドは２０〜２５ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドの正確な長さは、当業者によって通常考慮され、実施される、多くの要因に依存する。
【００６８】
他の公知の核酸増幅方法も、８５９位に触媒ｐ１１０αサブユニット突然変異を含む領域を増幅するために使用することができ、例えば、転写に基づく増幅システム（米国特許第５，１３０，２３８号；ＥＰ  ３２９，８２２；米国特許第５，１６９，７６６号、公表ＰＣＴ特許出願ＷＯ８９／０６７００）および等温法（Walker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396 (1992)）が挙げられる。
【００６９】
触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位における突然変異は、当技術分野で公知のいくつかのハイブリダイゼーション系の方法の１つを使用して、増幅前または増幅後にアッセイすることができる。典型的には、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、そのような方法の実施に利用される。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは異なって標識されたプローブ対として使用することができ、対の一方のメンバーは標的配列の一つの変異に完全な一致を示し、他のメンバーは異なる変異に完全な一致を示す。好ましくは、このセットのメンバーは、検出しようとする多型または突然変異部位のそれぞれにハイブリダイズする場合、相互の５℃以内、より好ましくは２℃以内の融解温度を有する。標的ポリヌクレオチドの対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、溶液中の両構成要素を用いて行うことができるか、または、このようなハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチドもしくは標的ポリヌクレオチドのいずれかが、共有結合または非共有結合的に固体支持体に固定されている場合に行うことができる。付着は、例えば、抗体抗原相互作用、ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓ、ストレプトアビジンまたはアビジンビオチン、塩橋、疎水的相互作用、化学結合、ＵＶ交差結合、ベーキングなどにより介在され得る。対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドは、固体支持体上で直接合成または合成後に固体支持体に結合させることができる。本発明の検出方法での使用に適した固体支持体としては、シリコン、ガラス、プラスチック、紙等からなる基材が挙げられ、これらは、例えば、ウェル（例えば９６ウェルプレート）、スライド、シート、膜、繊維、チップ、皿、およびビーズへ形成させることができる。固体支持体は、処理し、コーティングし、または誘導体化して、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドまたは標的核酸の固定化を促進することができる。
【００７０】
触媒ｐ１１０サブユニットの８５９位にグルタミンを有するポリペプチドまたは８５９位に置換を有するポリペプチドはまた、当技術分野で公知の方法を用いてアッセイすることができる。例えば、放射免疫定量法または酵素免疫測定法、競合的結合酵素免疫測定法、質量分析法、ポイントオブケア技術／プラットフォーム、ドットブロット、ウェスタンブロット、クロマトグラフィー、好ましくは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの方法がある。標識抗体、その結合部分、または他の結合パートナーを使用することができる。抗体は、起源がモノクローナルまたはポリクローナルであり得るか、または生合成的に製造することができる。結合パートナーはまた、天然分子であってもよいし、合成的に製造することもできる。複合体化タンパク質の量は、当該技術分野において記載されている標準的なタンパク質検出方法を使用して決定される。免疫学的アッセイの設計、理論およびプロトコルの詳細な概説は、当該分野における多数のテキストに記載されており、例えば、Practical Immunology, Butt, W. R., ed., Marcel Dekker, New York, 1984が挙げられる。
【００７１】
直接標識をはじめとする、異なる多数の標識を本発明のアッセイで使用することができる。例えば、抗体に付着される、蛍光性または発光性タグ、金属、色素、放射性核種などがある。間接標識は当技術分野で公知の様々な酵素が挙げられ、例えば、アルカリホスファターゼ、水素ペルオキシダーゼなどがある。ワンステップアッセイにおいては、標的タンパク質（すなわち、８５９位にグルタミンを有する触媒ｐ１１０サブユニット）を固定化し、標識抗体とインキュベートする。標識抗体は、固定化された標的分子に結合する。洗浄して非結合分子を除去した後、標識の存在について試料をアッセイする。数多くの免疫組織化学的手法は、ポイントオブケアフォーマットおよびハンドヘルドに組み込まれ、これらの全ては、タンパク質の存在を決定するために使用することができる。
【００７２】
タンパク質またはポリペプチドに特異的な固定化抗体の使用もまた、本開示によって企図されるものである。抗体は、様々な固体支持体上、例えば、磁気またはクロマトグラフィーマトリックス粒子、アッセイ場所（例えばマイクロタイターウェル）の表面、固体基板材料（例えばプラスチック、ナイロン、紙）のピースなどに固定化することができる。アッセイストリップは、抗体または固体支持体上のアレイ内の複数の抗体をコーティングすることによって調製することができる。このストリップは、試験試料中に浸漬され、洗浄および検出工程を介して処理され、測定可能なシグナル、例えば、着色されたスポットを生成させることができる。
【００７３】
ツーステップアッセイにおいては、固定化した標的タンパク質（例えば、８５９位にグルタミンを有する触媒ｐ１１０サブユニット）は、非標識抗体とインキュベートすることができる。非標識抗体複合体は、存在する場合、非標識抗体に特異的な第二の標識抗体に結合する。試料を洗浄し、標識の存在についてアッセイする。抗体への標識に使用されるマーカーの選択は、用途に応じて変わる。しかし、マーカーの選択は、当業者により容易に決定される。
【００７４】
ドットブロット法は、プローブとして抗体を用いて所望のタンパク質を検出するために、日常的に当業者によって実施されている（Promega Protocols and Applications Guide, Second Edition, 1991, Page 263, Promega Corporation）。試料は、ドットブロット装置を用いて膜にアプライされる。標識プローブは膜と一緒にインキュベートされ、タンパク質の存在が検出される。
【００７５】
ウェスタンブロット分析は当業者に公知である（Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 1989, Vol. 3, Chapter 18, Cold Spring Harbor Laboratory）。ウェスタンブロットでは、試料はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって単離される。ゲルを膜に転写される。膜は、所望のタンパク質を検出するための標識抗体と共にインキュベートされる。
【００７６】
投与および医薬組成物
ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩は、治療有効量で、当技術分野で公知の任意の通常の許容される方法を介して、単独でまたは１種または複数の治療剤と組み合わせて投与することができる。治療有効量は、対象の疾患の重症度、年齢および相対的健康、使用する化合物の効力および他の因子に依存して幅広く変化し得る。上記の使用に関し、必要な用量は、投与方法、治療すべき特定の症状および所望の効果に依存して当然変化する。
【００７７】
一般的に、満足のいく結果については、化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩を体重当たり約０．０３から約１００．０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０３から約１０．０ｍｇ／ｋｇの１日投与量で全身的に投与することから得られることが指示される。大型哺乳動物、例えばヒトにおいて指示される一日の投与量は、約０．５ｍｇから約３ｇ、例えば、約５ｍｇから約１．５ｇの範囲の化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩が、例えば、１日当たり４回以下の分割投与において、または徐放形態で簡便に投与される。経口投与に適した単位投与剤形は、約０．１から約５００ｍｇ、例えば、約１．０から約５００ｍｇの化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩を含む。
【００７８】
本明細書に記載のＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩は、任意の慣用の経路、特に腸内投与、例えば経口投与によって、例えば、錠剤またはカプセル剤の形態で、または非経口投与によって、例えば、注射用溶液もしくは懸濁液の形態で、局所的に、例えば、ローション、ゲル、軟膏またはクリームの形態で、または経鼻剤形もしくは坐薬剤形で、医薬組成物として投与することができる。遊離形態または薬学的に許容される塩形態の本発明のＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物を少なくとも一つの薬学的に許容される担体または希釈剤と共に含む医薬組成物は、混合、造粒またはコーティング法による慣用の方法で製造することができる。例えば、経口組成物は、活性成分を次に記載のものと一緒に含む錠剤またはゼラチンカプセルとすることができる：ａ）希釈剤、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン；ｂ）滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸、そのマグネシウムまたはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコール（poly ethylenegly col）；また錠剤用としてｃ）結合剤、例えば、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび  またはポリビニルピロリドン；所望によりｄ）崩壊剤、例えば、デンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または発泡性混合物；および／またはｅ）吸収剤、着色剤、着香料および甘味料。注射可能な組成物は、水性等張溶液または懸濁液であってよく、坐薬は脂肪エマルジョンまたは懸濁液から調製することができる。
【００７９】
ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩は滅菌されていてもよく、および／またはアジュバント、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を制御するための塩類および／またはバッファーなどを含んでいてもよい。さらに、それらは他の治療上有用な物質を含有していてもよい。経皮適用に適切な製剤は、有効量の本発明の化合物を担体と共に含む。担体としては、宿主の皮膚の透過を促進する吸収可能な薬理学的に許容される溶媒を挙げることができる。例えば、経皮デバイスは、バッキング材と、本化合物を所望により担体と共に含有するリザーバーとを含み、場合によっては、長期間にわたって所定の制御された速度で宿主の皮膚に本化合物を送達するための速度制御バリアと、皮膚に本デバイスを固定する手段とを含む、包帯の形態である。マトリックス経皮製剤も使用することができる。例えば、皮膚および眼部への局所適用に適した製剤は、好ましくは、当技術分野で公知の水溶液、軟膏、クリームまたはゲルである。これらは可溶化剤、安定化剤、張性増強剤、バッファーおよび防腐剤を含有し得る。
【００８０】
データ
判定が求められる本明細書に記載する方法のいずれかを実施する際に、ＰＩ３Ｋの触媒ｐ１１０サブユニットの２５７５位から２５７７位における核酸の突然変異の存在または不存在が判定され、医師または遺伝子学カウンセラーまたは患者または他の研究者はその結果を知ることができる。具体的には、結果は、他の研究者または医師、または遺伝子学カウンセラーまたは患者に連絡または伝達可能な情報の伝達可能形態で送ることができる。このような形態は変更することができ、また有形であっても無形であってもよい。結果は、記述文、図、写真、図表、画像、または任意の他の視覚的形態で具体的に表現することができる。例えば、ＰＣＲ産物のゲル電気泳動の画像を、結果の説明時に使用することができる。変異が存在または不存在であることを示す図も、試験結果を示すのに有用である。これらの記述および視覚の形態は、有形メディア、例えば、紙、フロッピー（登録商標）ディスク、コンパクトディスク等のコンピュータ読み取り可能なメディア、または無形メディア、例えば、インターネットもしくはイントラネット上の電子メールやウェブサイトの形態の電子メディア上に記録することができる。さらに、結果はまた、音の形態で記録され、任意の適切なメディア、電話、ファクシミリ、無線携帯電話、インターネット電話等により、例えば、アナログまたはデジタルケーブル線、光ファイバーケーブルを介して伝達することができる。すべての（有形および無形の）このような形態は、「情報の伝達可能形態」を構成する。したがって、テスト結果に関する情報およびデータは、世界中のいずれにおいても作成され、別の場所に伝達することができる。例えば、遺伝子型決定アッセイが外国で実施された場合、テスト結果に関する情報およびデータを作成し、上記のように伝達可能な形態で送ることができる。伝達可能な形態のテスト結果はこうして米国に送ることができる。したがって、本開示はさらに、突然変異が個体の触媒ｐ１１０ドメインの８５９位に生じるか否かのデータを含む情報の伝達可能な形態を形成するための方法を包含する。この情報の形態は、その情報に基づいて治療のコースを選択し、その情報に基づいて患者を選択的に治療するための、ＰＩ３Ｋ阻害剤による治療に対する患者の反応性を予測するのに有用である。
【００８１】
キット
本発明はさらに、ＰＩ３Ｋ遺伝子のヒトの触媒ｐ１１０αサブユニットの２５７５から２５７７位に突然変異が存在するか否かを判定するためのキットを提供する。本キットは、ＰＩ３Ｋアルファサブユニット阻害化合物（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）またはその薬学的に許容される塩による治療によって得られる特別な効果を受ける患者の選択に有用である。キットは、ＰＩ３Ｋ遺伝子のヒト触媒ｐ１１０αサブユニットの８５９位における突然変異の検出に有用なプライマーおよび／  プローブを含むことができる。キットは、核酸対照、バッファーおよび使用説明書をさらに含む。
【００８２】
本発明の実施において使用可能である、本明細書に記載のものと類似のまたは同等の様々な方法および材料は当業者に理解されよう。実際、本発明は、記載した方法および材料に限定されるものではない。本発明の目的のために、以下の用語を下記に定義する。
実施例
【実施例１】
【００８３】
ｐ８５アイソフォーム１による触媒ｐ１１０α野生型および突然変異体Ｑ８５９Ａをクローニングおよび発現のための材料および方法
ＤＮＡ処理およびプラスミド：標準的な分子生物学的方法を使用して、記載のプラスミドを構築する。酵素はすべて、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓから入手する。ＤＮＡ断片は、ＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐ  ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて精製するか、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ＩＩ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）によって分取アガロースゲルから単離する。ＤＮＡ連結反応は、Ｒａｐｉｄ  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて室温で１〜４時間実施し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５アルファ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ形質転換させる。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐ  ８  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）またはＧｅｎＥｌｕｔｅ  ＨＰ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）により精製する。すべての手順は、それぞれのマニュアルに記載のように実施する。
【００８４】
プラスミドＨｉｓ−Ｎａｔｉｖ  ｈＰＩ３ｋ−アルファ／ｐ８５  ｐＤＵＡＬコンセンサスを調製する。この構築物については、ウシＰＩ３−Ｋ  ｐ１１０αアイソフォーム（ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿１７４５７４．１）の全オープンリーディングフレームを含む３２４３ｂｐのウシＤＮＡ断片を、表１に示したＧＡＴＥＷＡＹ適合プライマーを用いて、Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｗｙｍａｎｎ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｆｒｅｉｂｏｕｒｇ）によって提供されたプラスミドからＰＣＲにより増幅する。簡単に説明すると、フォワードプライマーＰＩ３Ｋａ＿ＦＯＲ＿ＧＡＴＥは、ＢａｍＨ  Ｉ制限部位（一重下線）、Ｋｏｚａｋ認識部位（二重下線）、およびＧＡＴＥＷＡＹクローニングに必要なａｔｔＢ１配列（イタリック体）を含み、リバースプライマーＰＩ３＿Ｋａ＿ＲＥＶ＿ＧＡＴＥは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ制限部位（一重下線）およびａｔｔＢ２  ＧＡＴＥＷＡＹ配列（イタリック体）を含んでいた。ＰＣＲ増幅は、メーカーのプロトコルに従って、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｐｆｘ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて実施した。
【００８５】
【表１】
2015514080.tif 000004
【００８６】
ＰＣＲに続いて、フラグメントを３０％ＰＥＧ８０００；３０ｍＭ ＭｇＣｌ2を使用して精製しａｔｔＢプライマーダイマーを除去し、ＧＡＴＥＷＡＹエントリーベクターｐＤＯＮＯＲ  ２０１中に移す。簡単に説明すると、４μＬのｐｆ  ＰＣＲ産物（１０ｎｇ／μＬ）を、２μＬのＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ、１μＬのｐＤＯＮＯＲ  ２０１（１５０ｎｇ／Ｌ）、２μＬのＢＰ  Ｃｌｏｎａｓｅ、および１μＬのＴＥと混合し、６０分間室温でインキュベートした後、プロテイナーゼＫ（２μｇ／μＬ）２μＬを添加する。次いで、試料を３７℃でさらに６０分間インキュベートし、その後、これを用いてＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換する。陽性組換えＰＩ３−ＫαｐＤＯＮＯＲプラスミドは、その後、制限酵素分析により同定され、配列が検証される（ＳＯＬＶＩＡＳ）。次いで、調製した新鮮なＰＩ３−Ｋα  ｐＤＯＮＯＲ ２μＬを、２μＬのｐＤＥＳＴ  ２０（１５０ｎｇ／μＬ）、２μＬのＲｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｉｘ、２μＬのＬＲ  Ｃｌｏｎａｓｅ、および２μＬのＴＥと混合する。試料を上記のように室温でインキュベートした後、ＤＨ５αコンピテント細胞へ転換し、ＧＳＴ−ＰＩ３−Ｋα ｐＤＥＳＴ  ２０を作製する。
【００８７】
ＧＳＴ−ＰＩ３−Ｋαの全オープンリーディングフレームを含む３９３３ｂｐのＰＣＲ産物は、ＧＳＴ−ＰＩ３−Ｋα ｐＤＥＳＴ  ２０からのＳｐｅ  ＩおよびＨｉｎｄ  ＩＩＩ（下線）隣接部位を含有する遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（表２）を使用して増幅させ、上記のようにしてｐ５０  ｐＦａｓｔＢａｃ  ＤＵＡＬへライゲートさせる。
【００８８】
【表２】
2015514080.tif 000005
【００８９】
次いで、ＧＳＴ−ＰＩ３−Ｋαおよび切断型ｐ８５アダプタータンパク質（ｂｏｖＧＳＴ−ＰＩ３−Ｋα／ｐ８５  ｐＦａｓｔｂａｃ  ＤＵＡＬ）の両方を含有する陽性組換えプラスミドを制限消化分析により確認し、配列確認した（ＳＯＬＶＩＡＳ）。
【００９０】
ウシＰＩＫ３ＣＡ（ｐ１１０α）およびヒトＰＩＫ３Ｒ１（ｐ８５αアイソフォーム１）に関するＲｅｆＳｅｑアクセッション番号は、それぞれ、ＮＭ＿１７４５７４．１とＮＭ＿１８１５２３である。
【００９１】
ＰＣＲ由来のすべての構築物の一次配列は、Ｓｏｌｖｉａｓ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌによる配列決定を行い確認される。
【００９２】
ＰＣＲ増幅：ＰＣＲ増幅は、Ｐｗｏ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）を含む１００μＬ全容量中で、ＭＪ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  ＰＴＣ−２００サーマルサイクラーを用いて実施する。
【００９３】
完全長アダプタータンパク質ｐ８５α（ＰＩＫ３Ｒ１、１〜７２４ａａ）は、１ｎｇのプラスミドｐＣＭＶ６＿ＸＬ５：：ｐ８５αアイソフォーム１（カタログ番号ＴＣ１１３２０、Ｏｒｉｇｅｎｅ）から、最終濃度５００ｎＭのいずれかのプライマー、１×Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、５％ ＤＭＳＯと、次のプライマー：ｐ８５ｕｐｎｅｗ：５’−ＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＴＧＡＧＴＧＣＴＧＡＧＧＧＧＴＡＣＣＡＧ−３’（配列番号７）およびｐ８５ｄｏ：５’−ＧＣＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＣＧＣＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＣＡＴＡＴＡＣ−３’（配列番号８）を用いて増幅させる。サイクルパラメーターは次のとおりである：９４℃、２分；（９４℃、１５秒；５３℃、３０秒；７２℃、６０秒）１０；（７２℃、６０秒＋５秒／サイクル））１９；７２℃、７分。
【００９４】
プライマーｐ８５ｕｐｎｅｗおよびｐ８５ｄｏは、それぞれ、Ｎ末端とＣ末端にＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩに対する制限酵素部位を導入する。
【００９５】
クローニング：
ｐＦａｓｔＢａｃ１中のｐ８５アルファアイソフォーム１（ＰＩ３ＫＲ１）のクローニング
バキュロウイルスベクターｐＦａｓｔＢａｃ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および増幅したｐ８５αアイソフォーム１ＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで切断し、ゲル精製する。ライゲーションは室温で１時間実施し、コンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞を形質転換してプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ：：ｐ８５αアイソフォーム１を取得する。
【００９６】
ｐＦａｓｔＢａｃ１中の触媒ｐ１１０アルファ（ＰＩＫ３ＣＡ）のクローニング
プラスミドＨｉｓ−Ｎａｔｉｖ  ｈＰＩ３ｋ−アルファｐ８５  ｐＤＵＡＬをＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化する。得られた断片をアガロースゲルから精製し、同一制限酵素で切断したｐＦａｓｔＢａｃ１中へ２〜４時間室温でライゲートする。コンピテントＥ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ５α細胞への転換によりプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ：：ｐ１１０αが得られる。
【００９７】
突然変異誘発
ＰＩ３Ｋα（ｐ１１０α）突然変異体Ｑ８５９Ａを産生するための突然変異誘発は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カタログ番号２００５２３）と、オリゴヌクレオチドｐ１１０Ｑ８５９Ａｕｐ（５’−ＧＡＡＡＴＴＣＴＣＡＣＡＣＴＡＴＡＡＴＧＧＣＴＡＴＴＣＡＧＴＧＴＡＡＡＧＧＡＧＧＣＣＴＧ−３’）（配列番号９）、およびｐ１１０Ｑ８５９Ａｄｏ（５’−ＣＡＧＧＣＣＴＣＣＴＴＴＡＣＡＣＴＧＡＡＴＡＧＣＣＡＴＴＡＴＡＧＴＧＴＧＡＧＡＡＴＴＴＣ−３’）（配列番号１０）を用いて、製造者のプロトコルに従い実施する。
【００９８】
タンパク質発現：
（ａ）ウイルス作製およびタンパク質発現
組換えバキュロウイルスＤＮＡは、Ｅ．  ｃｏｌｉ  ＤＨ１０  Ｂａｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）において遺伝子転位により作製する。Ｂａｃｍｉｄ  ＤＮＡを単一コロニーから単離し、次いで、Ｓｆ９細胞へトランスフェクトする。トランスフェクション、増幅およびプラーク検定は、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のマニュアルに従い、１０％ＦＣＳを補充したＴＣ−１００培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）で実施する。ウイルス力価は、標準的なプラークアッセイによって決定する。発現は、０．５×ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｓｉｇｍａ）を補充したＥｘＣｅｌｌ−４２０培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｌｔｄ）中で１×１０６細胞／ｍｌから出発し、振盪フラスコで実施する。
【００９９】
発現中に触媒サブユニットｐ１１０およびアダプタータンパク質ｐ８５の活性ホロ酵素を再構成するため、Ｓｆ９細胞を両ウイルスに同時感染させる。タンパク質は、別記のＴＩＰＳプロトコル（例えばErdmann et al (2010), J.Biomol.Tech.; 21 (1):9-17）に従い、２７℃で７２時間、１００ｍｌの培養培地中で発現させる。ｐ１１０とｐ８５の相対的な同時感染比率は変動するが、最適な同時感染比率は１：１である。タンパク質発現は、ウェスタンブロッティングによって全細胞溶解物を検査することによって可視化する。ＰＩ３Ｋαタンパク質の溶解度は高い（可溶性８５〜９０％）。
【０１００】
タンパク質精製：
組換えタンパク質は、バキュロウイルス感染Ｓｆ９昆虫細胞から精製する。１００ｍｌの一発酵物から得た約１．５×１０８細胞は、１２ミリリットルの溶解緩衝液（５０ｍＭ  トリス  ｐＨ＝７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１０％  グリセロール、６μｌ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（２５Ｕ／μｌ）、１×完全プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭの活性化オルトバナジウム酸ナトリウム）中に再懸濁させ、氷／エタノール浴中で計３分間、超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ  Ｗ−４５０Ｄ）により破壊する（パルス３０秒、パルスの間の冷却１分間）。細胞破片を１４０００×ｇで遠心分離して除去し（Ｓｏｒｖａｌｌ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ＲＣ５−Ｂ、ＳＳ−３４ローター、１１０００ｒｐｍ、４５分、４℃）、上清を新しいチューブに移す。
【０１０１】
ｐ１１０α／ｐ８５αのヒスチジンアフィニティータグの精製には、ＡｋｔａエクスプローラーＦＰＬＣシステムに取り付けられた１ｍｌのＨｉｓ−Ｔｒａｐ  ＨＰ  Ｎｉ−セファロースカラム（カタログ番号１７−５２４７−０１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いる。カラムは２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．５ＭのＮａＣｌで平衡化し、透明溶解液は０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速でスーパーループによりロードされる。１０ＣＶの２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５、０．５ＭのＮａＣｌ、２５ｍＭイミダゾールで洗浄した後、結合したタンパク質を、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、２５０、および５００ｍＭイミダゾールの段階的なイミダゾール勾配で溶出する。溶出されたタンパク質は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５スピンカラムによる遠心分離を行って約１０倍に濃縮し、最終濃度３０％（ｖ／ｖ）までグリセリンを加えた後、分注し、液体窒素中で凍結させる。
【０１０２】
タンパク質濃度は、マイクロタイタープレート中でＢＣＡタンパク質アッセイキット（カタログ番号２３２２７、Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて、キットで提供されているプロトコルに従い、二連で判定する。
【０１０３】
酵素ＨＴＲＦ（登録商標）アッセイの材料および方法
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼまたはＰＩ３Ｋ）Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ（ＨＴＲＦ（登録商標））アッセイキッはＵｐｓｔａｔｅ（現在、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入する。ＰＩＰ２およびＰｉＰ３はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、Ａｌａｂａｍａ、ＵＳＡ）から購入し、マイクロプレートはＧｒｅｉｎｅｒ（Ｆｒｉｃｋｅｎｈａｕｓｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ；カタログ番号７８１２０７）から購入する。他のすべての試薬はＳｉｇｍａ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入する。
【０１０４】
酵素Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ｔｉｍｅ−Ｒｅｓｏｌｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓｅ（ＨＴＲＦ（登録商標））アッセイ（Ｕｐｓｔａｔｅ（現在、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ、ＵＳＡ）から入手したもの）は、本質的に、Sugita et al.(2008), Biochem. Biophys. Res. Commun. 377(3):941-5に記載されているようにして実施する。ＰＩ３Ｋα（０．２５〜１．５ｎｇ）を、３８４ウェルのホワイトプレートに入れた、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、３０μＭのＡＴＰ、２０μＭの１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−４’，５’−二リン酸）（アンモニウム塩）（ＰＩＰ２）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭの（ｄｌ−ジチオトレイトール）ＤＴＴ、および２５ｍＭのトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含有する２０μｌバッファー中で、室温にて６０分間インキュベートする。キナーゼ反応は、阻害試験に関してはＡＴＰ（３０μＭ）を添加することにより、またＡＴＰキネティクス（０〜２００μＭのＡＴＰ）に関してはＰＩ３Ｋαを添加することにより開始する。
【０１０５】
ＰＩ３Ｋ阻害剤（Ｓ）−ピロリジン−１，２−ジカルボン酸２−アミド１−（｛４−メチル−５−［２−（２，２，２−トリフルオロ−１，１−ジメチル−エチル）−ピリジン−４−イル］−チアゾール−２−イル｝−アミド）（以下「化合物Ｉ」という）は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）と、バッファー（最終濃度：２．５％ＤＭＳＯ）で連続して希釈する。キナーゼ反応は、製造者の使用説明書に従い、ＨＴＲＦ試薬を添加することよって停止する。プレートは密閉して蒸発を防ぎ、１６時間室温にて暗所で保管する。プレートは、Ｔｅｃａｎ’ｓ  ＧｅｎｉｏｓＰｒｏ（登録商標）マルチラベルリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用し、時間分解蛍光モードで読み取る（励起フィルター：３４０ｎｍ；発光フィルター１：６２０ｎｍ；発光フィルター２：６６５ｎｍ；ミラー：ｄｉｃｈｒｏｉｃ２；ラグ時間：１５０マイクロ秒；積算時間：５００マイクロ秒；１０フラッシュ）。
【０１０６】
ＨＴＲＦシグナルは次式：
ＨＴＲＦシグナル＝１００００×（６６５ｎｍでの発光／６２０ｎｍでの発光）
により判定する。
【０１０７】
ＨＴＲＦシグナルは徐々にＰＩＰ３依存的に減少し、３０μＭの１，２−ジオクタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ミオイノシトール−３’，４’，５’−三リン酸）（アンモニウム塩）（ＰＩＰ３）で得られる最大減少％として標準化される。標準曲線はＰＩＰ３（ＥＣ５０＝２００ｎＭ）で調製し、これを用いて、キナーゼ反応によって産生されたＰＩＰ３の量を次式により算出する：
［ＰＩＰ３］＝ＥＣ５０×（１００−ｙ）／ｙ
式中、ｙは標準化されたＨＴＲＦシグナルを表し、ＥＣ５０は標準曲線の５０％シグナルでのＰＩＰ３濃度を表す。ＡＴＰおよびＰＩＰ２の消費は決して５％を超えない。
【０１０８】
ＡＴＰキネティクスは、非線形回帰によりミカエリス−メンテン式と一致しており、化合物Ｉ阻害曲線は４−パラメーターロジスティック式と一致している。Ｘｌｆｉｔ（登録商標）（ＩＤ  Ｂｕｓｉｎｅｓｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｇｕｉｌｄｆｏｒｄ、ＵＫ）のグローバルフィット機能を用いて、すべての複製実験を全体的に一致させる。
【０１０９】
結果：
上記の材料および方法を使用し、実験により、図１に示すＰＩ３ＫαのＡＴＰ活性化キネティクスと、図２に示す化合物ＩによるＰＩ３Ｋα野性型（ｗｔ）およびＱ８５９Ａ突然変異の阻害を明らかにする。
【０１１０】
図１は、ＰＩ３Ｋ野生型（ｗｔ）に関する１４の実験の平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）（ミカエリス定数（Ｋｍ）＝６０±６μＭ）と、ＰＩ３Ｋα Ｑ８５９Ａ突然変異体に関する５つの実験の平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）（Ｋｍ＝７２±８μＭ）を提供する。図１でここにまとめたように、ＰＩ３Ｋ野生型（ｗｔ）およびＰＩ３Ｋα Ｑ８５９Ａ突然変異体は、ＰＩ３Ｋαの類似ＡＴＰ活性化キネティクスを示す。
【０１１１】
図２は、ＰＩ３Ｋ野生型（ｗｔ）に関する１０の実験の平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）と、ＰＩ３Ｋα Ｑ８５９Ａ突然変異体に関する７つの実験の平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．）を提供する。図２でここにまとめたように、野生型（ＩＣ５０＝８．４±１．０ｎＭ）と比べると、ＰＩ３Ｋα中のＱ８５９Ａの突然変異は有意にＩＣ５０を１２２±２８ｎＭまで増加させる。ＩＣ５０におけるこの１２２±２８ｎＭに至る１４．５倍の増加は、ＰＩ３Ｋα中のＱ８５９の突然変異が、化合物Ｉを投与する際の有効性を評価する重要な残基であることを明白に示すものである。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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