(57)【要約】本発明は、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７を含めたｍｉＲ−１５ファミリーのｍｉＲＮＡの発現（例えば、存在量）を阻害することができる化学修飾されたオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、一部の実施形態では、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７の各々の発現または存在量を特定の様式で阻害することができるオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、さらに、オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、および心血管系の状態など、ｍｉＲ−１５ファミリーのｍｉＲＮＡに関連または関係する状態または障害を有する患者を処置する方法を提供する。種々の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、効力、送達の効率、標的特異性、毒性、および／または安定性のうちの１つまたは複数において利点をもたらす。
2015525081.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのロックドヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドであって、
該ヌクレオチドが、ヌクレオチド配列５’−ＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’を含み、１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーのヌクレオチド配列と実質的に相補的であり、
ｉｎ  ｖｉｔｒｏルシフェラーゼアッセイにおいて約５０ｎＭ以下のオリゴヌクレオチド濃度で、またはげっ歯類モデルにおいて約２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの活性を低下させまたは阻害する、
オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーがｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７から選択される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
少なくとも８つのロックドヌクレオチドを含有する、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
約８ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチドの長さである、請求項１から３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
約１２ヌクレオチド〜約１７ヌクレオチドの長さである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
約１６ヌクレオチドの長さである、請求項５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
５’−ＡＣＣＡＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１）、５’−ＡＣＣＡＴＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号２）、５’−ＡＴＡＴＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号３）、および５’−ＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号４）から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項５または６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
９つのロックドヌクレオチドおよび／または７つの非ロックドヌクレオチドを含有する、請求項６または７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
少なくとも１位、５位、８位、１０位、および１６位がロックドヌクレオチドである、請求項６から８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
約１２ヌクレオチドの長さである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
５’−ＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号５）、５’−ＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号６）、５’−ＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号７）、５’−ＴＴＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号８）、５’−ＴＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号９）、５’−ＴＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１０）、５’−ＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１１）、および５’−ＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１２）から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項４または１０に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
８つのロックドヌクレオチドおよび／または４つの非ロックドヌクレオチドを含有する、請求項１０または１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
少なくとも１位、４位、９位、および１２位がロックドヌクレオチドである、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
約８ヌクレオチドの長さである、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
実質的に全てのロックドヌクレオチドおよび５’−ＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’のヌクレオチド配列を有する、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーのシード領域と相補的な領域が、少なくとも４つのロックドヌクレオチドを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
３つより多く連続した非ロックドヌクレオチドおよび／または３つより多く連続したロックドヌクレオチドを有するひと続きのヌクレオチドを含有しない、請求項１から１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドが２’デオキシ、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−アルキル、２’−ハロ、および２’−フルオロヌクレオチドから選択される、請求項１から１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドが２’デオキシである、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
非ロックドヌクレオチドの全てが２’デオキシである、請求項１９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記ロックドヌクレオチドがエチレン基またはメチレン基を含む２’−４’架橋を有する、請求項１から２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
前記ロックドヌクレオチドが２’−４’メチレン架橋を有する、請求項２１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
５’および／または３’キャップ構造を有する、請求項１から２２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含有する、請求項１から２３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
完全にホスホロチオエート結合している、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
１つ〜３つのリン酸結合を有する、請求項２４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
化合物Ｍ−１０１１３、Ｍ−１０１３４、Ｍ−１０５６４、Ｍ−１０５６６、Ｍ−１０５６７、Ｍ−１０６７０、Ｍ−１１２０６、Ｍ−１１２０７、Ｍ−１１２０８、Ｍ−１１２０９、Ｍ−１１２１０、Ｍ−１１２１１、Ｍ−１１２１２、Ｍ−１１２１３、Ｍ−１１２１４、Ｍ−１１２１５、Ｍ−１１２１６、Ｍ−１１２１７、Ｍ−１１２１８、Ｍ−１１２１９、Ｍ−１１２２０、Ｍ−１１２２１、Ｍ−１１２２２、Ｍ−１１２２３、またはＭ−１１２２４の構造を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
ペンダント親油基をさらに含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
有効量の請求項１から２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項３０】
前記薬学的に許容される担体が、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記薬学的に許容される担体または希釈剤が、生理食塩水から本質的になる、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
細胞における１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの活性を低下させまたは阻害する方法であって、該細胞を請求項１から２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項２９から３１のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項３３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞が心臓細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにある、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
対象における１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーに付随するまたはそれによって媒介される状態を予防または処置する方法であって、該対象に少なくとも１つのｍｉＲ−１５ファミリーの阻害剤をＰｉｍ１の標的抑制解除のために十分な用量で投与することを含む、方法。
【請求項３７】
前記ｍｉＲ１５ファミリーの阻害剤が請求項１から２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象に請求項２９から３１のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記医薬組成物を、非経口投与することによって、または心臓組織に直接注射することによって投与する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記非経口投与が静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、または筋肉内投与である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記組成物を、経口投与、経皮投与、持続放出投与、制御放出投与、遅延放出投与、坐薬投与、カテーテル投与、または舌下投与によって投与する、請求項３８から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記状態が心臓の状態である、請求項３６から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記心臓の状態が病的心肥大、心筋梗塞、心不全、虚血、または虚血再灌流傷害である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記心臓の状態が心臓移植に付随するものである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象がヒトである、請求項３６から４４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
２０１２年６月２１日に出願された米国仮特許出願第６１／６６２，７７２号および２０１３年３月１３日に出願された米国仮特許出願第６１／７８０，３５２号に対する優先権および利益を請求し、その各々は、本明細書によってその全体が参照によって組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出されたテキストファイルについての記載
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読フォーマットのコピー（ファイル名：ＭＩＲＧ−０３７＿０２ＵＳ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１３年６月１９日、ファイルサイズ１０キロバイト）。
【０００３】
本発明は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）阻害剤の化学モチーフに関する。より詳細には、本発明は、１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーを標的とし、患者に投与した際の効力、送達の効率、標的特異性、安定性、および／または毒性において利点を有する、化学修飾されたオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００４】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）は、心機能の調節および維持を含めたいくつもの生物学的プロセスに関係づけられている（Ｅ．  Ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１７巻（９号）：２３６９〜２３７６頁（２００７年）；Ｋ．  Ｃｈｉｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ４４７巻：３８９〜３９０頁（２００７年）を参照されたい）。したがって、ｍｉＲは、とりわけ、心肥大、心筋梗塞、心不全、血管損傷、および病的心臓線維症などの状態についての比較的新しいクラスの治療上の標的になる。ｍｉＲは、約１８ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチドの長さの小さな、タンパク質をコードしていないＲＮＡであり、標的ｍＲＮＡの配列と完全に相補的である場合には標的ｍＲＮＡの分解を促進することによって、または、標的ｍＲＮＡの配列にミスマッチが含有される場合には翻訳を阻害することによって、標的ｍＲＮＡのリプレッサーとしての機能を果たす。この機序は、成熟ｍｉＲＮＡ鎖がＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み入れられることを含み、そこでその標的ＲＮＡと塩基対相補性によって会合することを伴う。
【０００５】
ｍｉＲＮＡの機能を、アンチセンスポリヌクレオチドによって、またはｍｉＲＮＡの機能を模倣するポリヌクレオチド（「ｍｉＲＮＡ模倣物」）によって治療的に標的とすることができる。しかし、オリゴヌクレオチドベースの薬剤を用いてｍｉＲＮＡを治療的に標的とすることには、ＲＮＡ結合親和性および特異性、細胞内取り込みの効率、およびヌクレアーゼ抵抗性を含めた、いくつかの難題が生じる。例えば、ポリヌクレオチドをインタクトな細胞に導入すると、ポリヌクレオチドはヌクレアーゼによる攻撃を受け、分解され、これにより活性が失われる。それらの分解を回避する試みの中で、例えば２’置換によってポリヌクレオチド類似体が調製されてきたが（Ｂ．  Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７巻：３３７３〜３３８６頁、（１９８９年））、修飾により、多くの場合、ポリヌクレオチドの意図された生物学的作用についてのその効力が影響を受ける。そのような効力の低下は、それぞれの場合において、修飾されたポリヌクレオチドが標的ＲＮＡと安定な二重鎖を形成することができないこと、および／または細胞機構との相互作用が失われることに起因する可能性がある。他の修飾として、ＲＮＡ結合親和性を改善する潜在性を有するロックド核酸の使用が挙げられる（Ｒ．  Ｖｅｅｄｕら、ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６巻（３号）：３２１〜３２３頁（２００９年）を参照されたい）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｅ．  Ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊら、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  １１７巻（９号）：２３６９〜２３７６頁（２００７年）
【非特許文献２】Ｋ．  Ｃｈｉｅｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ４４７巻：３８９〜３９０頁（２００７年）
【非特許文献３】Ｂ．  Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７巻：３３７３〜３３８６頁、（１９８９年）
【非特許文献４】Ｒ．  Ｖｅｅｄｕら、ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６巻（３号）：３２１〜３２３頁（２００９年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
ｍｉＲＮＡ阻害剤についてのオリゴヌクレオチドの化学パターンまたはモチーフは阻害剤の送達、安定性、効力、特異性、および／または毒性プロファイルを改善する潜在性を有し、それが、治療の状況下でｍｉＲＮＡの機能を有効に標的とするために必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７を含めた１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの活性を低下させまたは阻害することができる化学修飾されたオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、さらに、オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、および１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーに関連または関係する状態または障害を有する対象を処置する方法を提供する。種々の実施形態では、開示されているオリゴヌクレオチドは、効力、送達の効率、標的特異性、毒性、および／または安定性のうちの１つまたは複数において利点をもたらす。
【０００９】
一態様では、本発明は、１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの活性を低下させまたは阻害することができる化学修飾されたオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドの活性または効力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで決定することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、約５０ｎＭ以下、または他の実施形態では、約４０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下の濃度で、１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの活性を有意に阻害し得る（例えば、約５０％阻害）（例えば、二段階リアルタイムＰＣＲアッセイまたは二重ルシフェラーゼアッセイにおいて決定される）。その代わりに、またはそれに加えて、オリゴヌクレオチドの活性は、適切なマウスモデルまたはラットモデル、あるいは非ヒト霊長類モデルにおいて決定することができ、その場合、約５０ｍｇ／ｋｇ以下、例えば、約２５ｍｇ／ｋｇ以下、約１０ｍｇ／ｋｇ以下、または約５ｍｇ／ｋｇ以下などの用量で１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの阻害（例えば、少なくとも約５０％）を観察する。標的抑制解除を決定するための例示的なマーカーは本明細書に記載されている。これらの実施形態では、オリゴヌクレオチドは皮下または静脈内に（および本明細書に記載の通り）投薬することができ、そして、水性調製物（例えば、生理食塩水）中に製剤化されていてよい。
【００１０】
オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５’−ＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’を含み、１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーのヌクレオチド配列と実質的に相補的である。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのロックドヌクレオチド（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）をさらに含有する。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つのロックドヌクレオチドを含有する。ロックドヌクレオチドは、全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／０８３００５に記載されている２’−４’架橋構造を有してよい。例えば、ロックドヌクレオチドは、エチレン基またはメチレン基を含む２’−４’架橋を有してよい。別の例では、ロックドヌクレオチドは、２’−４’メチレン架橋を有してよい。
【００１１】
一般に、オリゴヌクレオチドの長さならびにロックドヌクレオチドの数および位置は、本明細書に記載の通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏリアルタイムＰＣＲアッセイもしくはルシフェラーゼアッセイにおいて約５０ｎＭ以下のオリゴヌクレオチド濃度で、または適切なげっ歯類モデルもしくは非ヒト霊長類モデルにおいて約２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で、オリゴヌクレオチドにより１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの活性が低下するようなものである。ある実施形態では、オリゴヌクレオチドは約８ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチドの長さである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは約１２ヌクレオチド〜約１７ヌクレオチドの長さである。
【００１２】
例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは約１６ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、５’−ＡＣＣＡＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１）、５’−ＡＣＣＡＴＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号２）、５’−ＡＴＡＴＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号３）、および５’−ＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号４）から選択されるヌクレオチド配列を含んでもよく、それから本質的になってもよい。オリゴヌクレオチドは、９つのロックドヌクレオチドおよび７つの非ロックドヌクレオチドを含んでよい。ロックドヌクレオチドのパターンは、少なくとも１位、５位、８位、１０位、および１６位がロックドヌクレオチドになるようなものであってよい。
【００１３】
別の例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは約１２ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、５’−ＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号５）、５’−ＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号６）、５’−ＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号７）、５’−ＴＴＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号８）、５’−ＴＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号９）、５’−ＴＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１０）、５’−ＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１１）、および５’−ＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１２）から選択されるヌクレオチド配列を含んでもよく、それから本質的になってもよい。オリゴヌクレオチドは、８つのロックドヌクレオチドおよび４つの非ロックドヌクレオチドを含んでよい。ロックドヌクレオチドのパターンは、少なくとも１位、４位、９位、および１２位がロックドヌクレオチドになるようなものであってよい。
【００１４】
さらに別の例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは約８ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５’−ＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’から本質的になってもよく、それからなってもよく、その全てまたは実質的に全て（例えば、少なくとも約６つまたは少なくとも約７つ）がロックドヌクレオチドである。
【００１５】
種々の実施形態では、１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーのシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）と相補的な領域は、少なくとも約４つのロックドヌクレオチドを含む。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３つより多く連続した非ロックドヌクレオチドおよび／または３つより多く連続したロックドヌクレオチドを有するひと続きのヌクレオチドを含有しない。
【００１６】
非ロックドヌクレオチドに関して、ヌクレオチドは、２’ヒドロキシルに対して２’修飾を含有してよい。一部の実施形態では、２’修飾は、独立に、デオキシ、Ｏ−アルキル、Ｏ−メチル、ハロ、およびフルオロから選択することができる。例えば、２’修飾はデオキシであってよい。ある実施形態では、オリゴヌクレオチド内の全ての非ロックドヌクレオチドが２’デオキシである。
【００１７】
オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエート結合も含有してよい。例えば、オリゴヌクレオチドは完全にホスホロチオエート結合していてもよく、ホスホロチオエート結合を約半分または４分の３含有してもよい。
【００１８】
例示的なオリゴヌクレオチド阻害剤が表１に示されている。
【００１９】
他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’および／または３’キャップ構造を含有してよい。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ペンダント（ｐｅｎｄｅｎｔ）親油基をさらに含んでよい。
【００２０】
別の態様では、本発明は、細胞への送達用の種々の高分子集合体、ミセル、またはリポソーム組成物内にオリゴヌクレオチドを組み入れることを伴ってよい、本発明のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物および製剤を提供する。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドを、従来の静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与用に製剤化する。そのような製剤は従来の水性調製物、例えば、生理食塩水中の製剤などであってよい。ある特定の実施形態では、組成物は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射もしくは静脈内注射、または標的組織（例えば、心臓組織）への直接注射に適するものである、またはそのために製剤化される。
【００２１】
さらに他の態様では、本発明は、例えば、哺乳動物対象における状態の進行を処置する、好転させる、または予防するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかでオリゴヌクレオチドおよび医薬組成物を哺乳動物細胞に送達するための方法を提供する。当該方法は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む組成物を、Ｐｉｍ１の標的抑制解除のために有効な用量で標的細胞の集団または哺乳動物対象に投与することを含んでよい。対象は、１つまたは複数のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの発現に付随する、それによって媒介される、またはそれによって生じる状態を有してよい。そのような状態としては、例えば、心肥大、心筋梗塞、心不全（例えば、うっ血性心不全）、虚血、虚血再灌流傷害、血管損傷、再狭窄、病的心臓線維症、または心臓移植に付随する状態が挙げられる。したがって、本発明は、そのような状態を処置するため、およびそのような処置用の医薬を調製するための、修飾されたオリゴヌクレオチドおよび組成物の使用を提供する。
【００２２】
本発明の他の態様および実施形態は、以下の本発明の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】心臓細胞におけるｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの存在量。細胞当たりのマイクロＲＮＡのコピー数をリアルタイムＰＣＲ分析によって測定し、市販の標準物質（Ａｍｂｉｏｎ）に対して正規化する。
【００２４】
【図２】心臓組織におけるｍｉＲ−１５の標的。リアルタイムＰＣＲ分析により、マウスにおいて、２５ｍｇ／ｋｇの抗ｍｉＲ１５ｂ（Ｍ−１０１３４）を皮下送達することによりＢｃｌ２Ｌ２、Ｂｉｒｃ５、Ｇｒｎ、およびＣｄｃ２Ａの発現の強い変化が誘導されることが実証されている。
【００２５】
【図３】抗ｍｉＲ１５ｂ（Ｍ−１０１３４）処置により、標的遺伝子の発現が用量依存的な様式で影響を受ける。リアルタイムＰＣＲ分析により、マウスにおいて、ｍｉＲ−１５の標的、特に、Ｂｉｒｃ５、Ｇｒｎ、およびＣｄｃ２Ａが用量依存的に抑制解除されることが実証されている。Ｍ−１０５９１は非標的化の対照オリゴヌクレオチドである。
【００２６】
【図４−１】リアルタイムＰＣＲ分析によって測定された、ｍｉＲ−１５の標的に対するｍｉＲ−１５阻害剤の有効性。阻害剤であるＭ−１０６７０、Ｍ−１１２１１、Ｍ−１１２１３、Ｍ−１１２１４、Ｍ−１１２１５、Ｍ−１１２２０、Ｍ−１１２２１、およびＭ−１１２２２が、マウスにおいてｍｉＲ−１５の標的遺伝子に対する最も強力な効果を発揮すると思われる。エラーバーはＳＥＭを示す。ｐ値＜０．００１である群がアスタリスクで示されている。
【図４−２】リアルタイムＰＣＲ分析によって測定された、ｍｉＲ−１５の標的に対するｍｉＲ−１５阻害剤の有効性。阻害剤であるＭ−１０６７０、Ｍ−１１２１１、Ｍ−１１２１３、Ｍ−１１２１４、Ｍ−１１２１５、Ｍ−１１２２０、Ｍ−１１２２１、およびＭ−１１２２２が、マウスにおいてｍｉＲ−１５の標的遺伝子に対する最も強力な効果を発揮すると思われる。エラーバーはＳＥＭを示す。ｐ値＜０．００１である群がアスタリスクで示されている。
【００２７】
【図５】リアルタイムＰＣＲ分析を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける阻害剤の活性を定量化するためのＴａｑＭａｎ（登録商標）マイクロＲＮＡアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）。
【００２８】
【図６Ａ−１】図６Ａは、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、およびｍｉＲ−１９５についての二段階リアルタイムＰＣＲ分析によって測定されたｍｉＲ−１５阻害剤の有効性を示す。図６Ｂは、各ｍｉＲ−１５阻害剤の有効性が要約されたチャートである。
【図６Ａ−２】図６Ａは、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、およびｍｉＲ−１９５についての二段階リアルタイムＰＣＲ分析によって測定されたｍｉＲ−１５阻害剤の有効性を示す。図６Ｂは、各ｍｉＲ−１５阻害剤の有効性が要約されたチャートである。
【図６Ｂ】図６Ａは、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、およびｍｉＲ−１９５についての二段階リアルタイムＰＣＲ分析によって測定されたｍｉＲ−１５阻害剤の有効性を示す。図６Ｂは、各ｍｉＲ−１５阻害剤の有効性が要約されたチャートである。
【００２９】
【図７】二重ルシフェラーゼアッセイを使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける阻害剤の活性を定量化するためのｐｓｉＣＨＥＣＫ（商標）−２構築物（Ｐｒｏｍｅｇａ）。
【００３０】
【図８Ａ−１】図８Ａは、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、およびｍｉＲ−１９５についての二重ルシフェラーゼアッセイによって測定されたｍｉＲ−１５阻害剤の有効性を示す。図８Ｂは、各ｍｉＲ−１５阻害剤の有効性が要約されたチャートである。
【図８Ａ−２】図８Ａは、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、およびｍｉＲ−１９５についての二重ルシフェラーゼアッセイによって測定されたｍｉＲ−１５阻害剤の有効性を示す。図８Ｂは、各ｍｉＲ−１５阻害剤の有効性が要約されたチャートである。
【図８Ｂ】図８Ａは、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、およびｍｉＲ−１９５についての二重ルシフェラーゼアッセイによって測定されたｍｉＲ−１５阻害剤の有効性を示す。図８Ｂは、各ｍｉＲ−１５阻害剤の有効性が要約されたチャートである。
【００３１】
【図９Ａ】ｍｉＲ−１５阻害剤のパネルの標的遺伝子の抑制解除に対する有効性。図９Ａは、マウスにおいて、ｍｉＲ−１５阻害剤を３回投与する（投与１回当たり２５ｍｇ／ｋｇ）治療レジメンにより標的遺伝子の抑制解除が誘導されることを示す。示されているｐ値で統計的に有意な群がアスタリスクで示されている。図９Ｂは、ｍｉＲ−１５阻害剤を３回投与する（投与１回当たり２５ｍｇ／ｋｇ）治療レジメンが単回投与レジメン（投与１回当たり２５ｍｇ／ｋｇ）よりも強力であることを示す。
【図９Ｂ−１】ｍｉＲ−１５阻害剤のパネルの標的遺伝子の抑制解除に対する有効性。図９Ａは、マウスにおいて、ｍｉＲ−１５阻害剤を３回投与する（投与１回当たり２５ｍｇ／ｋｇ）治療レジメンにより標的遺伝子の抑制解除が誘導されることを示す。示されているｐ値で統計的に有意な群がアスタリスクで示されている。図９Ｂは、ｍｉＲ−１５阻害剤を３回投与する（投与１回当たり２５ｍｇ／ｋｇ）治療レジメンが単回投与レジメン（投与１回当たり２５ｍｇ／ｋｇ）よりも強力であることを示す。
【図９Ｂ−２】ｍｉＲ−１５阻害剤のパネルの標的遺伝子の抑制解除に対する有効性。図９Ａは、マウスにおいて、ｍｉＲ−１５阻害剤を３回投与する（投与１回当たり２５ｍｇ／ｋｇ）治療レジメンにより標的遺伝子の抑制解除が誘導されることを示す。示されているｐ値で統計的に有意な群がアスタリスクで示されている。図９Ｂは、ｍｉＲ−１５阻害剤を３回投与する（投与１回当たり２５ｍｇ／ｋｇ）治療レジメンが単回投与レジメン（投与１回当たり２５ｍｇ／ｋｇ）よりも強力であることを示す。
【００３２】
【図１０】ｍｉＲ−１５阻害剤による標的遺伝子の抑制解除の動態。図１０は、マウスにおいて、Ｍ−１１２１５の単回用量の送達（２５ｍｇ／ｋｇ）により、ｍｉＲ−１５の標的の強力なサイレンシングが早ければ注射の２４時間後に誘導されることを示す。
【００３３】
【図１１】ｍｉＲ−１５阻害剤による全体的な標的遺伝子の抑制解除および特異的な標的遺伝子の抑制解除。図１１は、Ｍ−１１２１４により、ｍｉＲ−１５ファミリーに特異的な標的遺伝子の抑制解除（ｐ値：０．０１）が誘発されることを示す。エンリッチメント（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）についてのｐ値を、超幾何分布関数を使用して算出した。
【００３４】
【図１２Ａ】ラットにおけるｍｉＲ−１５阻害剤のパネルの、標的遺伝子の抑制解除に対する有効性。図１２Ａは、ｍｉＲ−１５阻害剤の単回用量を皮下注射すること（２５ｍｇ／ｋｇ）により、処置の４日後に標的遺伝子の抑制解除が誘導されることを示す。ラットでは、１６−ｍｅｒの阻害剤は１２−ｍｅｒの阻害剤よりも強力であると思われる。図１２Ｂは、処置の２日後のラット対マウスにおけるｍｉＲ−１５阻害剤による標的遺伝子の抑制解除を比較している。左側のグラフのデータはラットにおいて生成したものであり、右側のグラフのデータはマウスにおいて生成したものである。一般に、ｍｉＲ−１５阻害剤は、ラットにおいては効果的でないと思われる１２−ｍｅｒの阻害剤を除いて、ラットにおいてマウスにおける効果よりも強力な効果を有すると思われる。
【図１２Ｂ−１】ラットにおけるｍｉＲ−１５阻害剤のパネルの、標的遺伝子の抑制解除に対する有効性。図１２Ａは、ｍｉＲ−１５阻害剤の単回用量を皮下注射すること（２５ｍｇ／ｋｇ）により、処置の４日後に標的遺伝子の抑制解除が誘導されることを示す。ラットでは、１６−ｍｅｒの阻害剤は１２−ｍｅｒの阻害剤よりも強力であると思われる。図１２Ｂは、処置の２日後のラット対マウスにおけるｍｉＲ−１５阻害剤による標的遺伝子の抑制解除を比較している。左側のグラフのデータはラットにおいて生成したものであり、右側のグラフのデータはマウスにおいて生成したものである。一般に、ｍｉＲ−１５阻害剤は、ラットにおいては効果的でないと思われる１２−ｍｅｒの阻害剤を除いて、ラットにおいてマウスにおける効果よりも強力な効果を有すると思われる。
【図１２Ｂ−２】ラットにおけるｍｉＲ−１５阻害剤のパネルの、標的遺伝子の抑制解除に対する有効性。図１２Ａは、ｍｉＲ−１５阻害剤の単回用量を皮下注射すること（２５ｍｇ／ｋｇ）により、処置の４日後に標的遺伝子の抑制解除が誘導されることを示す。ラットでは、１６−ｍｅｒの阻害剤は１２−ｍｅｒの阻害剤よりも強力であると思われる。図１２Ｂは、処置の２日後のラット対マウスにおけるｍｉＲ−１５阻害剤による標的遺伝子の抑制解除を比較している。左側のグラフのデータはラットにおいて生成したものであり、右側のグラフのデータはマウスにおいて生成したものである。一般に、ｍｉＲ−１５阻害剤は、ラットにおいては効果的でないと思われる１２−ｍｅｒの阻害剤を除いて、ラットにおいてマウスにおける効果よりも強力な効果を有すると思われる。
【００３５】
【図１３】ラットストレスモデルにおける標的遺伝子の抑制解除に対するｍｉＲ−１５阻害剤の有効性。図１３は、虚血再灌流傷害のラットモデルにおいて、ｍｉＲ−１５阻害剤を単回投与すること（２５ｍｇ／ｋｇ）により、標的遺伝子の抑制解除が誘導されることを示す（ｎ＝４；ベースラインに対してｐ値＜０．０５）。ｐ値はＡＮＯＶＡ  Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ事後検定を使用して算出した。ベースラインは梗塞性ではない対照を示す。ＩＲ／生理食塩水は生理食塩水で処置した対照を示す。Ｍ−１０５９１は非標的化の対照オリゴヌクレオチドである。
【００３６】
【図１４】ラットストレスモデルにおける炎症マーカーの発現に対するｍｉＲ−１５阻害剤の有効性。図１４は、虚血再灌流傷害のラットモデルにおける（ｎ＝４）、ｍｉＲ−１５阻害剤を単回投与すること（２５ｍｇ／ｋｇ）の、種々の炎症マーカーの発現に対する効果を示す。ベースラインは梗塞性ではない対照を示す。ＩＲ／生理食塩水は生理食塩水で処置した対照を示す。Ｍ−１０５９１は非標的化の対照オリゴヌクレオチドである。
【００３７】
【図１５】ラットストレスモデルにおける心筋梗塞に対するｍｉＲ−１５阻害剤の有効性。図１５Ａおよび図１５Ｂは、それぞれ、虚血再灌流傷害のラットモデルにおける（ｎ＝１０）、リスクがあるエリアおよび心筋梗塞のサイズに対するｍｉＲ−１５阻害剤の効果を示す。生理食塩水は生理食塩水で処置した対照を示す。Ｍ−１０５９１は非標的化の対照オリゴヌクレオチドである。
【００３８】
【図１６】ラットストレスモデルにおける駆出率に対するｍｉＲ−１５阻害剤（Ｍ−１１２１１およびＭ−１１２１４）の有効性。図１６は、虚血再灌流傷害のラットモデルにおける駆出率に対するｍｉＲ−１５阻害剤の効果を示す。ＡＭＣは傷害を有さない年齢を合わせた対照を示す。ＩＲ／生理食塩水は生理食塩水で処置した対照を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
（発明の詳細な説明）
本発明は、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７を含めたｍｉＲ−１５ファミリーのｍｉＲＮＡの発現（例えば、存在量）を阻害することができる化学修飾されたオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、一部の実施形態では、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７の各々の発現または存在量を特定の様式で阻害することができるオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、さらに、オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、および種々の心血管系の状態など、ｍｉＲ−１５ファミリーのｍｉＲＮＡに関連または関係する状態または障害を有する患者を処置する方法を提供する。種々の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、効力、送達の効率、標的特異性、毒性、および／または安定性のうちの１つまたは複数において利点をもたらす。
【００４０】
一態様では、本発明は、ｍｉＲ−１５ファミリーのｍｉＲＮＡの発現または存在量を低下させることができるオリゴヌクレオチドを提供する。オリゴヌクレオチドの活性はｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで決定することができる。例えば、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７の活性の阻害をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する場合、本明細書に記載の二段階リアルタイムＰＣＲアッセイまたは二重ルシフェラーゼアッセイを使用して活性を決定することができる。オリゴヌクレオチドは、例えば二重ルシフェラーゼアッセイにおいて決定して、約７５ｎＭ以下、または他の実施形態では、約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下の濃度でそのような活性を有意に阻害する。例えば、オリゴヌクレオチドは、二重ルシフェラーゼアッセイにおいて決定して、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７の活性の阻害に関して、約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、または約２０ｎＭ以下のＩＣ５０を有し得る。
【００４１】
二段階ＰＣＲ分析では、市販のＴａｑＭａｎ（登録商標）ＭｉｃｒｏＲＮＡ  Ａｓｓａｙ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって例示される通り、定量的ＰＣＲ読み取りを含み、これは、オリゴヌクレオチド阻害剤によって二段階：１）ｃＤＮＡの合成の間に逆転写酵素プライマーが伸長する能力を阻害することによって；および２）ＰＣＲプライマーがｃＤＮＡ産物を増幅する能力を阻害することによって阻害される可能性がある。
【００４２】
二重ルシフェラーゼアッセイでは、市販されている製品であるＰｓｉＣＨＥＣＫ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって例示される通り、検出可能なタンパク質（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ）の遺伝子の３’ＵＴＲにｍｉＲ認識部位を配置させることを含む。構築物を標的ｍｉＲＮＡと同時発現させ、したがって、阻害剤活性をシグナルの変化によって決定することができる。検出可能なタンパク質（例えば、ホタルルシフェラーゼ）をコードする第２の遺伝子を同じプラスミド上に含め、シグナルの比を抗ｍｉＲ活性の指標として決定することができる。
【００４３】
その代わりに、またはそれに加えて、オリゴヌクレオチドの活性は、本明細書に記載されているものなどの適切なマウスモデルまたはラットモデルにおいて決定することができ、その場合、約５０ｍｇ／ｋｇ以下、約２５ｍｇ／ｋｇ以下、例えば、約１０ｍｇ／ｋｇ以下または約５ｍｇ／ｋｇ以下などのオリゴヌクレオチドの用量におけるｍｉＲ−１５ファミリーのｍｉＲＮＡの阻害（例えば、少なくとも約５０％）を観察する。一部の実施形態では、その記載が本明細書によって参照により組み込まれるＷＯ２００８／０１６９２４に記載されている動物モデルにおいてオリゴヌクレオチドの活性を決定する。例えば、オリゴヌクレオチドは、約５０ｍｇ／ｋｇ以下、約２５ｍｇ／ｋｇ以下、例えば、約１０ｍｇ／ｋｇ以下または約５ｍｇ／ｋｇ以下などの用量で、少なくとも約５０％の標的ｍｉＲＮＡの阻害または標的抑制解除を示し得る。そのような実施形態では、オリゴヌクレオチドをマウスまたはラットの静脈内または皮下に投与することができ、オリゴヌクレオチドは、生理食塩水中に製剤化されていてよい。
【００４４】
これらまたは他の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは投与後に安定であり、投与後少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、または少なくとも約６週間、またはそれ以上にわたって循環および／または標的臓器において検出可能である。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、より頻度の低い投与、より低い用量、および／またはより長い治療効果の持続時間をもたらす潜在性を有する。
【００４５】
オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５’−ＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’を含み、ヒトｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７のヌクレオチド配列と実質的に相補的である。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのロックドヌクレオチドをさらに含有する（複数可）。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも８つまたは少なくとも９つのロックドヌクレオチドを含有してよい。一般に、オリゴヌクレオチドの長さならびにロックドヌクレオチドの数および位置は、各々本明細書に記載の通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏルシフェラーゼアッセイにおいて約５０ｎＭ以下のオリゴヌクレオチド濃度で、または適切なマウスモデルもしくはラットモデルにおいて約５０ｍｇ／ｋｇ以下、もしくは約２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で、オリゴヌクレオチドによりｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７の活性が低下するようなものである。実質的に相補的なオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７のその標的配列に対して約１つ〜約５つのミスマッチ（例えば、１つまたは約２つまたは約３つまたは約４つまたは約５つのミスマッチ）を有してよい。
【００４６】
ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７を含めたｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの構造およびプロセシング、ならびに心肥大、心不全、または心筋梗塞（他の状態のなかでも）を処置するためのそれらの潜在性は、本明細書によって参照により組み込まれるＷＯ２００９／０６２１６９に記載されている。本発明による阻害性ｍｉＲＮＡを設計するために使用することができるヒトｍｉＲ−１５ファミリーメンバーのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列（例えばステムループ配列）を以下に列挙する：
【化１】
2015525081.tif 000003
【００４７】
ｍｉＲ−１５ファミリーの各メンバーのｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ配列は各々プロセシングされて成熟配列およびスター配列（ｓｔａｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）になる。スター配列はステムループ構造の他の鎖からプロセシングされる。ｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの各々の成熟配列およびスター配列を以下に示す：
【化２】
2015525081.tif 000004
【化３】
2015525081.tif 000005
【００４８】
ファミリーの全てのメンバーのシード領域（例えば、成熟ｍｉＲＮＡ配列の２〜８ヌクレオチドにわたる塩基）は高度に保存されているが（ＡＧＣＡＧＣＡＣ）、成熟ｍｉＲＮＡの３’末端はファミリーの異なるメンバーの間で異なる。
【００４９】
単一のｍｉＲ−１５阻害剤を投与することによって、または複数の阻害剤を投与することによって、ｍｉＲ−１５ファミリーの複数のメンバーを同時に阻害することができることが意図されている。例えば、各阻害剤はｍｉＲ−１５ファミリーの単一のメンバーを標的としてもよく、またはｍｉＲ−１５ファミリーの複数のメンバーを標的としてもよい。一部の実施形態では、単一のｍｉＲ−１５阻害剤により、ｍｉＲ−１５ファミリーの２つ以上のメンバーの発現または活性を阻害する。そのような阻害剤としては、これだけに限定されないが、Ｍ−１０６７０、Ｍ−１１２１１、Ｍ−１１２１３、Ｍ−１１２１４、Ｍ−１１２１５、Ｍ−１１２２０、Ｍ−１１２２１、およびＭ−１０２２２が挙げられる。他の実施形態では、単一のｍｉＲ−１５阻害剤により、ｍｉＲ−１５ファミリーの３つ以上のメンバーの発現または活性を阻害する。そのような阻害剤としては、これだけに限定されないが、Ｍ−１０６７０、Ｍ−１１２１１、Ｍ−１１２１３、Ｍ−１１２１４、Ｍ−１１２１５、Ｍ−１１２２０、Ｍ−１１２２１、およびＭ−１０２２２が挙げられる。さらなる実施形態では、単一のｍｉＲ−１５阻害剤により、ｍｉＲ−１５ファミリーの４つ以上のメンバーの発現または活性を阻害する。そのような阻害剤としては、これだけに限定されないが、Ｍ−１１２１１、Ｍ−１１２１３、Ｍ−１１２１４、Ｍ−１１２１５、Ｍ−１１２２０、およびＭ−１１２２１を挙げることができる。
【００５０】
オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）残基、または「ロックドヌクレオチド」を含有する。ＬＮＡは、例えば、全てが本明細書によってその全体が参照により組み込まれる米国特許第６，２６８，４９０号、米国特許第６，３１６，１９８号、米国特許第６，４０３，５６６号、米国特許第６，７７０，７４８号、米国特許第６，９９８，４８４号、米国特許第６，６７０，４６１号、および米国特許第７，０３４，１３３号に記載されている。ＬＮＡは、「ロックド」コンフォメーションをもたらすリボース糖部分の２’炭素と４’炭素との間の追加的な架橋、および／または二環構造を含有する修飾されたヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、下の構造Ａによって示される構造を有するＬＮＡを１つまたは複数含有する。その代わりにまたはそれに加えて、オリゴヌクレオチドは、下の構造Ｂによって示される構造を有するＬＮＡを１つまたは複数含有してよい。その代わりにまたはそれに加えて、オリゴヌクレオチドは、下の構造Ｃによって示される構造を有するＬＮＡを１つまたは複数含有する。
【化４】
2015525081.tif 000006
【００５１】
本発明のオリゴヌクレオチドに組み入れることができる他の適切なロックドヌクレオチドとしては、どちらも本明細書によってその全体が参照により組み込まれる米国特許第６，４０３，５６６号および米国特許第６，８３３，３６１号に記載されているものが挙げられる。
【００５２】
例示的な実施形態では、ロックドヌクレオチドは、例えば構造Ａに示されている２’−４’メチレン架橋を有する。さらに他の実施形態では、ロックドヌクレオチドは、２’位にエーテル結合を有しても有さなくてもよいエチレン基を含む架橋を有する。
【００５３】
オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの全長または切断型のアンチセンス配列を含んでもよく、それから本質的になってもよく、それからなってもよい。本明細書で使用される場合、「全長」という用語は、ｍｉＲＮＡ配列に関しては、成熟ｍｉＲＮＡアンチセンス対応物の長さを指す。したがって、本明細書に記載の阻害剤は切断型または全長のアンチセンス成熟ｍｉＲＮＡ配列であってもよく、これらの配列を他のポリヌクレオチド配列と組み合わせて含んでもよい。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の化学修飾モチーフにより、全長のアンチセンスｍｉＲＮＡ（成熟）配列が必要なくなる。これらの実施形態では、オリゴヌクレオチドは約８ヌクレオチド〜約２０ヌクレオチドの長さ、または約８ヌクレオチド〜約１８ヌクレオチドの長さ、または約１２ヌクレオチド〜約１７ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約８ヌクレオチド、約９ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１３ヌクレオチド、約１４ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１６ヌクレオチドの長さである。切断型オリゴヌクレオチドは、５’−ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＵＡＡＵＧＧＵ−３’（配列番号３３）の範囲内のｍｉＲ−１５ａ配列、５’−ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＵＣＡＵＧＧＵ−３’（配列番号３４）の範囲内のｍｉＲ−１５ｂ配列、５’−ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＧＵＡＡＡＵＡＵ−３’（配列番号３５）の範囲内のｍｉＲ−１６配列、ＵＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＡＡＡＵＡＵ−３’（配列番号３６）の範囲内のｍｉＲ−１９５配列、５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＡＵＵＣＡＵＧＵＵ−３’（配列番号３７）の範囲内のｍｉＲ−４２４配列、または５’−ＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＣＵＧＵＧＧＵ−３’（配列番号３８）の範囲内のｍｉＲ−４９７配列をアンチセンス阻害によって標的とする配列を有してよい。
【００５４】
オリゴヌクレオチドは、一般に、成熟ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７を標的とするように設計されたヌクレオチド配列を有する。これらまたは他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、同様にまたはその代わりに、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの形態を標的とするように設計することができる。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドを、完全に相補的な（成熟）ｍｉＲ−１５配列と比較して約１つ〜約５つ（例えば、約１つ、約２つ、約３つ、または約４つ）のミスマッチを含有する配列を有するように設計することができる。ある特定の実施形態では、そのようなアンチセンス配列は、例えば、ｓｈＲＮＡまたはステム部分およびループ部分を含有する他のＲＮＡ構造に組み入れることができる。
【００５５】
例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは約１６ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、５’−ＡＣＣＡＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１）、５’−ＡＣＣＡＴＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号２）、５’−ＡＴＡＴＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号３）、および５’−ＡＴＡＴＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号４）から選択されるヌクレオチド配列を含んでもよく、それから本質的になってもよい。オリゴヌクレオチドは、ロックドヌクレオチドと非ロックドヌクレオチドとの混合物を含んでよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、９つのロックドヌクレオチドおよび７つの非ロックドヌクレオチドを含んでよい。ロックドヌクレオチドのパターンは、少なくとも１位、５位、８位、１０位、および１６位がロックドヌクレオチドになるようなものであってよい。
【００５６】
別の例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは約１２ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、５’−ＴＴＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号５）、５’−ＴＴＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号６）、５’−ＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号７）、５’−ＴＴＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号８）、５’−ＴＧＡＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号９）、５’−ＴＧＡＣＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１０）、５’−ＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１１）、および５’−ＴＧＣＣＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’（配列番号１２）から選択されるヌクレオチド配列を含んでもよく、それから本質的になってもよい。オリゴヌクレオチドは、ロックドヌクレオチドと非ロックドヌクレオチドとの混合物を含んでよい。例えば、オリゴヌクレオチドは、８つのロックドヌクレオチドおよび４つの非ロックドヌクレオチドを含んでよい。ロックドヌクレオチドのパターンは、少なくとも１位、４位、９位、および１２位がロックドヌクレオチドになるようなものであってよい。
【００５７】
さらに別の例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは約８ヌクレオチドの長さである。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列５’−ＧＴＧＣＴＧＣＴ−３’から本質的になってもよく、それからなってもよく、その全てまたは実質的に全て（例えば、少なくとも約６つまたは少なくとも約７つ）がロックドヌクレオチドである。
【００５８】
オリゴヌクレオチドは、一般には、少なくとも約８つのロックドヌクレオチドを含有するが、種々の実施形態では完全にロックドヌクレオチドで構成されるのではない。一般に、ロックドヌクレオチドの数および位置は、記載の通りｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで決定して、オリゴヌクレオチドによりｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７の活性が低下するようなものである。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約４つより多く、または、約３つより多く連続した非ロックドヌクレオチドを有するひと続きのヌクレオチドを含有しない。これらまたは他の実施形態では、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７のシード領域と相補的な領域は、少なくとも３つまたは少なくとも４つのロックドヌクレオチドを含む。
【００５９】
非ロックドヌクレオチドについては、ヌクレオチドは、２’ヒドロキシルに対して２’修飾を含有してよい。例えば、２’修飾は２’デオキシであってよい。２’修飾されたヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み入れることにより、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼに対する抵抗性とそれらの相補的なＲＮＡとの熱安定性の両方が増大し得る。２’位における種々の修飾は、独立に、ＲＮＡ標的または細胞機構との分子相互作用を損なうことなくヌクレアーゼ感受性の増大をもたらす修飾から選択することができる。そのような修飾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの効力の増大に基づいて選択することができる。ｍｉＲＮＡの阻害に関する効力の増大（例えば、ＩＣ５０）を決定するための例示的な方法は、二重ルシフェラーゼアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍｉＲＮＡの発現または標的抑制解除を含め、本明細書に記載されている。
【００６０】
一部の実施形態では、２’修飾は、独立に、Ｏ−アルキル（置換されていてもよい）、ハロ、およびデオキシ（Ｈ）から選択することができる。ある特定の実施形態では、非ロックドヌクレオチドの実質的に全てまたは全てのヌクレオチドの２’位を、例えば、独立に、Ｏ−アルキル（例えば、Ｏ−メチル）、ハロ（例えば、フルオロ）、デオキシ（Ｈ）、およびアミノから選択される通り修飾することができる。例えば、２’修飾は、各々独立に、Ｏ−メチルおよびフルオロから選択することができる。例示的な実施形態では、プリンヌクレオチドは各々２’ＯＭｅを有し、ピリミジンヌクレオチドは各々２’−Ｆを有する。ある特定の実施形態では、１つ〜約５つの２’位、または約１つ〜約３つの２’位が修飾されていないままである（例えば、２’ヒドロキシルのように）。
【００６１】
本発明による２’修飾は、小さな炭化水素置換基も含む。炭化水素置換基としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアルコキシアルキルが挙げられ、アルキル（アルコキシのアルキル部分を含む）、アルケニルおよびアルキニルは置換されていても置換されていなくてもよい。アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル、アルケニルまたはアルキニル、例えば、Ｃ１、Ｃ２、またはＣ３などであってよい。炭化水素置換基は、１つまたは２つまたは３つの非炭素原子を含んでよく、これは、独立に、Ｎ、Ｏ、および／またはＳから選択することができる。２’修飾は、アルキル、アルケニル、およびアルキニルをＯ−アルキル、Ｏ−アルケニル、およびＯ−アルキニルとしてさらに含んでよい。
【００６２】
本発明による例示的な２’修飾としては、２’−Ｏ−アルキル（Ｃ１〜３アルキル、例えば、２’ＯＭｅまたは２’ＯＥｔなど）置換、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）置換、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）置換、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）置換が挙げられる。
【００６３】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−ハロ修飾（例えば、２’ヒドロキシルの代わりに）、例えば、２’−フルオロ、２’−クロロ、２’−ブロモ、および２’−ヨードなどを含有する。一部の実施形態では、２’ハロ修飾はフルオロである。オリゴヌクレオチドは、１つ〜約５つの２’−ハロ修飾（例えば、フルオロ）、または１つ〜約３つの２’−ハロ修飾（例えば、フルオロ）を含有してよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、全ての２’−フルオロヌクレオチドを非ロックド位に含有する、または全ての非ロックドピリミジンヌクレオチド上に２’−フルオロを含有する。ある特定の実施形態では、２’−フルオロ基は、独立に、ジメチル化されている、トリメチル化されている、またはメチル化されていない。
【００６４】
オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の２’−デオキシ修飾（例えば、２’ヒドロキシルについてのＨ）を有してよく、一部の実施形態では、約２〜約１０個の２’−デオキシ修飾を非ロックド位に含有する、または、全ての非ロックド位に２’デオキシを含有する。
【００６５】
例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’ＯＭｅに修飾された２’位を非ロックド位に含有する。あるいは、非ロックドプリンヌクレオチドは２’位で２’ＯＭｅに修飾されており、非ロックドピリミジンヌクレオチドは２’位で２’−フルオロに修飾されている。
【００６６】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの末端修飾または「キャップ」をさらに含む。キャップは、５’および／または３’キャップ構造であってよい。「キャップ」または「末端キャップ」という用語は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端における化学修飾（末端リボヌクレオチドに関して）を含み、そして、５’末端上の最後の２つのヌクレオチドと３’末端上の最後の２つのヌクレオチドとの間の結合における修飾を含む。本明細書に記載のキャップ構造により、ＲＮＡ標的または細胞機構との分子相互作用を損なうことなくオリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼに対する抵抗性を増大させることができる。そのような修飾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの効力の増大に基づいて選択することができる。キャップは５’末端に存在してもよく（５’キャップ）、３’末端に存在してもよく（３’キャップ）、両末端上に存在してもよい。ある特定の実施形態では、５’キャップおよび／または３’キャップは、独立に、ホスホロチオエートモノホスフェート、脱塩基残基（部分）、ホスホロチオエート結合、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、反転ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）または反転脱塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ａｂａｓｉｃ）部分（２’−３’または３’−３’）、ホスホロジチオエートモノホスフェート、およびメチルホスホネート部分から選択される。ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合（複数可）は、キャップ構造の一部である場合、一般に、５’末端上の２つの末端ヌクレオチドと３’末端上の２つの末端ヌクレオチドとの間に配置される。
【００６７】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの末端ホスホロチオエートモノホスフェートを有する。ホスホロチオエートモノホスフェートは、エキソヌクレアーゼの作用を阻害することによってより高い効力を支持し得る。ホスホロチオエートモノホスフェートは、オリゴヌクレオチドの５’末端および／または３’末端にあってよい。ホスホロチオエートモノホスフェートは以下の構造によって定義され、式中、Ｂは塩基であり、Ｒは上記の２’修飾である：
【化５】
2015525081.tif 000007
【００６８】
キャップ構造によりロックドヌクレオチドの化学的性質を支持することができる場合、キャップ構造に本明細書に記載のロックドヌクレオチドを組み入れることができる。
【００６９】
一部の実施形態では、ホスホロチオエート結合は、例えば、５’末端および３’末端上の最後の２つのヌクレオチド間に存在してもよく（例えば、キャップ構造の一部として）、リン酸ジエステル結合と交互に存在してもよい。これらまたは他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端と３’末端のいずれかまたはその両方に少なくとも１つの末端脱塩基残基を含有してよい。脱塩基部分は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンなどの一般に認識されているプリンヌクレオチド塩基またはピリミジンヌクレオチド塩基を含有しない。したがって、そのような脱塩基部分はヌクレオチド塩基を欠く、または１’位にヌクレオチド塩基ではない他の化学基を有する。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、例えば、逆脱塩基（ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｂａｓｉｃ）ホスホルアミダイトが５’アミダイト（３’アミダイトの代わりに）を介してカップリングし、それにより５’−５’リン酸結合が生じる、逆脱塩基ヌクレオチドであってよい。ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端の逆脱塩基ヌクレオシドの構造が下に示されている。
【化６】
2015525081.tif 000008
【００７０】
オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含有してよい。ホスホロチオエート結合は、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼによる切断に対してより抵抗性にするために使用されてきた。例えば、ポリヌクレオチドは部分的にホスホロチオエート結合していてよく、例えば、ホスホロチオエート結合とリン酸ジエステル結合が交互になっていてよい。しかし、ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは完全にホスホロチオエート結合している。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは約１つ〜約５つまたは約１つ〜約３つのリン酸結合を有する。
【００７１】
一部の実施形態では、ヌクレオチドは、本明細書によって参照により組み込まれるＷＯ２０１２／０６１８１０に記載されている１つまたは複数のカルボキシアミド修飾塩基を、そこに複素環置換基と共に開示されている例示的なピリミジンカルボキシアミド修飾の全てに関しても含めて有する。
【００７２】
例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、以下の表１に列挙されている化合物の構造を有する。表１に示されている通り、プラス記号（例えば、＋Ａ）はＬＮＡ塩基を示す。他の塩基は全てＤＮＡである。ｍｉＲ−１５阻害剤は各々、完全にホスホロチオエート結合した骨格を有する。
【表１】
2015525081.tif 000009
【００７３】
修飾されたポリヌクレオチドを含めたオリゴヌクレオチドの固相合成による合成は周知であり、Ｎｅｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨ、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＳＬ、Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ  ＪＷ、Ｆｉｓｈｅｒ  ＥＦ、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ＭＤ、Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ  Ｙ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．（７）巻：２１５〜２３頁、（１９８０年）に概説されている。
【００７４】
オリゴヌクレオチドは種々の高分子集合体または組成物に組み入れることができる。そのような送達用の複合体としては、患者に送達するために製剤化された種々のリポソーム、ナノ粒子、およびミセルを挙げることができる。複合体は、細胞膜透過を開始させるための１つまたは複数の融合性分子または親油性分子を含んでよい。そのような分子は、例えば、本明細書によってそれらの全体が参照により組み込まれる米国特許第７，４０４，９６９号および米国特許第７，２０２，２２７号に記載されている。あるいは、オリゴヌクレオチドは、細胞への送達を補助するためのペンダント親油基、例えば、本明細書によって参照により組み込まれるＷＯ２０１０／１２９６７２に記載されているものなどをさらに含んでよい。
【００７５】
組成物または製剤には、本明細書に記載されている少なくとも１種を含めた複数の治療用オリゴヌクレオチドを用いることができる。例えば、組成物または製剤には本明細書に記載されているｍｉＲＮＡ阻害剤の少なくとも約２種、約３種、約４種、または約５種を用いることができる。
【００７６】
本発明のオリゴヌクレオチドは、種々の医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、意図された適用のために適した形態に調製する。一般に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物に対して有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴う。例示的な送達／製剤系としては、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含めた脂質ベースの系が挙げられる。本発明の核酸を心臓組織および骨格筋組織に送達するために適した市販の脂肪エマルション（ｆａｔ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）としては、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、および他の類似した脂質エマルション（ｌｉｐｉｄ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達ビヒクルとして使用するために好ましいコロイド系はリポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。そのような系の調製および使用は当該技術分野において周知である。例示的な製剤は、本明細書によってその全体が参照により組み込まれる、米国特許第５，９８１，５０５号；米国特許第６，２１７，９００号；米国特許第６，３８３，５１２号；米国特許第５，７８３，５６５号；米国特許第７，２０２，２２７号；米国特許第６，３７９，９６５号；米国特許第６，１２７，１７０号；米国特許第５，８３７，５３３号；米国特許第６，７４７，０１４号；およびＷＯ２００３／０９３４４９にも開示されている。
【００７７】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドを従来の皮下投与または静脈内投与用に、例えば、滅菌水および通常の生理食塩水を含めた適切な水性希釈剤を用いて製剤化することによって製剤化する。
【００７８】
医薬組成物および製剤には、送達ビヒクルを安定にするために適当な塩および緩衝液を用いることができ、それにより、標的細胞による取り込みが可能になる。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散させた阻害剤オリゴヌクレオチド（例えば、リポソームまたは他の複合体）を含む送達ビヒクルを有効量で含む。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という句は、動物またはヒトに投与した際に有害な反応、アレルギー性反応、または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、ヒトに投与するために適した医薬品などの医薬品の製剤化において使用するために許容される１種または複数種の溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含み得る。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は当該技術分野において周知である。補足的な活性成分も組成物に組み入れることができる。
【００７９】
本発明による医薬組成物の投与または送達は、標的組織がその経路によって利用可能である限りはいかなる経路によるものであってもよい。例えば、投与は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射または静脈内注射によるものであってもよく、標的組織（例えば、心臓組織）への直接注射によるものであってもよい。本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドの安定性および／または効力により、皮下、皮内、および筋肉内を含めた簡便な投与経路が可能になる。ｍｉＲＮＡ阻害剤を含む医薬組成物は、カテーテルシステムまたは治療剤を心臓に送達するために冠循環を隔離するシステムによって投与することもできる。治療剤を心臓および冠血管系に送達するための種々のカテーテルシステムが当該技術分野で公知である。本発明において使用するために適したカテーテルに基づく送達方法または冠血管の隔離方法のいくつかの非限定的な例は、全て本明細書によってその全体が参照により組み込まれる米国特許第６，４１６，５１０号；米国特許第６，７１６，１９６号；米国特許第６，９５３，４６６号、ＷＯ２００５／０８２４４０、ＷＯ２００６／０８９３４０、米国特許公開第２００７／０２０３４４５号、米国特許公開第２００６／０１４８７４２号、および米国特許公開第２００７／００６０９０７号に開示されている。
【００８０】
組成物または製剤は非経口的にまたは腹腔内に投与することもできる。例示として、遊離塩基または薬理学的に許容される塩としてコンジュゲートの溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合されている水中で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中、ならびに油中で分散液を調製することもできる。保管および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、一般に、微生物の成長を予防するために防腐剤を含有する。
【００８１】
注射用の使用またはカテーテルによる送達のために適した医薬形態としては、例えば、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液を即時調製するための滅菌粉末が挙げられる。一般に、これらの調製物は、滅菌されており、容易に注射可能な程度に流動性である。調製物は製造および保管の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有してよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散液の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤または抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
【００８２】
滅菌注射用溶液は、所望の通り、適量のコンジュゲートを任意の他の成分（例えば、上に列挙されているもの）と一緒に溶媒中に組み入れることによって調製することができる。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒および所望の他の成分、例えば、上に列挙されているものを含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法として、活性成分（複数可）と任意の追加的な所望の成分の粉末を、予め滅菌濾過したその溶液から得る真空乾燥技法および凍結乾燥技法が挙げられる。
【００８３】
製剤化されたら、溶液は、投薬製剤と適合する様式で、かつ治療的に有効な量で投与されることが好ましい。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセル剤などの種々の剤形で容易に投与することができる。水溶液中で非経口投与するためには、例えば、一般に、溶液を適切に緩衝し、液体希釈液を、まず、例えば、十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張性にする。そのような水溶液は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与のために使用することができる。滅菌水性媒体を当業者に公知の通り、特に本開示に照らして用いることが好ましい。例示として、単一用量を等張性ＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解させ、皮下注入用液１０００ｍｌに添加するか、または提案される注入部位に注射することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照されたい）。治療されている対象の状態に応じて投与量のいくらかの変動が必ず生じる。投与を担当する人は、いかなる場合においても、個々の対象に適した用量を決定する。さらに、ヒトに投与するためには、調製物は、必要に応じてＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによって求められる滅菌、発熱性、一般的な安全性および純度の基準に適合するべきである。
【００８４】
本発明は、オリゴヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達する（例えば、本明細書に記載の組成物または製剤の一部として）ための方法、および哺乳動物患者における状態の進行を処置する、好転させる、または予防するための方法を提供する。オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで標的細胞（例えば、哺乳動物細胞）と接触させることができる。細胞は心臓細胞であってよい。
【００８５】
当該方法は、一般には、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む組成物を哺乳動物患者または標的細胞の集団に投与することを含む。オリゴヌクレオチドは、すでに記載の通り、ｍｉＲＮＡ阻害剤（例えば、ｍｉＲ−１５ファミリーのｍｉＲＮＡの発現または活性を阻害するように設計されたヌクレオチド配列を有する）である。したがって、患者は、ｍｉＲ−１５ファミリーの発現に付随する、それによって媒介される、またはそれによって生じる状態を有してよい。そのような状態は、本明細書によって参照により組み込まれるＷＯ２００９／０６２１６９に記載されている。これらの状態としては、例えば、心肥大、心筋梗塞、心不全（例えば、うっ血性心不全）、血管損傷、虚血、虚血再灌流傷害、再狭窄、または病的心臓線維症ならびに心臓移植に付随する状態が挙げられる。したがって、本発明は、本発明の修飾されたオリゴヌクレオチドおよび組成物の、そのような状態を処置するため、およびそのような処置用の医薬を調製するための使用を提供する。
【００８６】
ある特定の実施形態では、患者（例えば、ヒト患者）は、例えば、長期にわたる制御されていない高血圧症、矯正されていない弁膜疾患、慢性狭心症、最近の心筋梗塞、うっ血性心不全、心疾患に対する先天性の素因および病的肥大を含めた１つまたは複数の危険因子を有する。その代わりにまたはそれに加えて、患者は、例えば心肥大に対する遺伝的素因を有すると診断されていてもよく、例えば心肥大の家族歴を有してもよい。
【００８７】
この態様では、ｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの阻害剤を投与することにより、対象における、例えば、心肥大、心不全、虚血、虚血再灌流傷害、もしくは心筋梗塞の１つまたは複数の症状が改善される、または心肥大から心不全への移行が遅延する。１つまたは複数の症状の改善は、例えば、運動能力の増大、心駆出体積（ｃａｒｄｉａｃ  ｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ）の増加、左心室拡張終期圧の低下、肺毛細血管楔入圧の低下、心拍出量の増加、心係数の増加、肺動脈圧の低下、左心室収縮終期径および拡張終期径の減少、左心室および右心室の壁応力の低下、壁張力の低下、生活の質の増大、および疾患に関連する罹患率または死亡率の低下であり得る。さらに、ｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの阻害剤を使用することにより、心肥大およびそれに付随する症状の発生を予防することができる。
【００８８】
本発明の一部の実施形態では、ｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの阻害剤は、他の治療様式と組み合わせて投与することができる。例えば、本発明のｍｉＲ−１５阻害剤を、例えば、抗高リポタンパク血症剤、抗動脈硬化剤、抗血栓性／線維素溶解剤、血液凝固薬、抗不整脈剤、抗高血圧剤、うっ血性心不全に対する処置剤、抗狭心症剤、抗細菌剤、血管拡張薬、ホルモンアンタゴニスト、変力物質（ｉｏｎｔｒｏｐｅ）、利尿薬、エンドセリン受容体アンタゴニスト、カルシウムチャネル遮断薬、ホスホジエステラーゼ阻害剤、アンジオテンシンＩＩ変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤、サイトカイン遮断薬／阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤またはそれらの組合せなどの他の型の治療剤と併せて投与することができる。併用療法は、その内容が本明細書によって参照により組み込まれるＷＯ２０１２／０８３００５およびＷＯ２００９／０５８８１８に記載されている、心臓リモデリングに関与する追加的なｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ−４９９、ｍｉＲ−２０８、ｍｉＲ−２０８ｂおよびｍｉＲ−２１などの発現または活性を阻害することも伴ってよい。さらに、ｍｉＲ−１５阻害剤は、外科手術と併せて投与することができる。ｍｉＲ−１５阻害剤は、非薬理学的処置手段と一緒に投与することもできる。例えば、心臓障害に関して、非薬理学的処置は、食事中のナトリウムを減少させることを含んでよい。
【００８９】
種々の実施形態では、医薬組成物を、非経口投与することによって、または心臓組織に直接注射することによって投与する。非経口投与は静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与であってよい。一部の実施形態では、組成物を、経口投与、経皮投与、持続放出投与、制御放出投与、遅延放出投与、坐薬投与、カテーテル投与、または舌下投与によって投与する。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドを約２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量、または約１０ｍｇ／ｋｇ以下の用量、または約５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与する。これらの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは組成物は、筋肉内注射もしくは皮下注射によって、または静脈内に投与することができる。
【００９０】
ある特定の実施形態では、心臓組織における、または患者の血清において決定されるｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−４９７の活性が低下するまたは阻害される。
【００９１】
ある実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドであり得るｍｉＲ−１５ファミリーの阻害剤を標的細胞の集団または哺乳動物対象にＰｉｍ１の標的抑制解除のために有効な用量で投与することを含んでよい。さらなる実施形態では、本発明は、細胞におけるＰｉｍ１および他の標的遺伝子、例えば、Ｂｃｌ２Ｌ２、Ｂｉｒｃ５、Ｇｒｎ、およびＣｄｃ２Ａなどの発現を調節する方法であって、細胞をｍｉＲ−１５阻害剤と接触させることを含む方法も提供する。ある実施形態では、Ｐｉｍ１、Ｂｃｌ２Ｌ２、Ｂｉｒｃ５、Ｇｒｎ、およびＣｄｃ２Ａの発現がｍｉＲ−１５阻害剤を投与した後に増加する。Ｐｉｍ１および／または本明細書に記載の他のマーカーの発現を処置前、処置中または処置後にモニターして、処置応答を決定することができる。
【００９２】
一部の実施形態では、当該方法は、処置後にｍｉＲＮＡ阻害剤を除去するまたは取り除くことをさらに含む。例えば、阻害剤の機能を減弱または停止させるために、阻害剤と相補的なヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチドを治療後に投与することができる。
【００９３】
本発明を、限定するものと解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに例示する。本出願ならびに図面を通して引用されている全ての参考文献、特許および公開特許出願の内容は、あらゆる目的についてその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００９４】
（実施例１）
心臓組織におけるｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの存在量
心臓組織におけるｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの存在量をリアルタイムＰＣＲ分析によって評価した。詳細には、ヒト心臓細胞（ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅ）（ｎ＝６）、ブタ心臓細胞（ｎ＝６）、およびマウス心臓細胞（ｎ＝３０）から全ＲＮＡを抽出した。次いで、リアルタイムＰＣＲを使用して細胞当たりのマイクロＲＮＡのコピー数を決定し、市販の標準物質（Ａｍｂｉｏｎ）に対して正規化した。
【００９５】
結果（図１）により、心臓組織におけるｍｉＲ−１５ファミリーメンバーのうちｍｉＲ−１６が最も豊富であり、細胞当たりおよそ１０，０００コピーであることが示されている。ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−３２２を含めた他のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーは細胞当たりおよそ１，０００コピーで発現される。さらに、ｍｉＲ−３２２はげっ歯類においてのみ発現されると思われ、一方ｍｉＲ−４２４の発現はより大きな動物（例えば、ヒトおよびブタ）に限られると思われる。
【００９６】
（実施例２）
ｍｉＲ−１５ファミリーメンバーによって調節される遺伝子標的の同定
ｍｉＲ−１５ファミリー（ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−４２４、およびｍｉＲ−３２２）を標的とするｍｉＲＮＡ阻害剤（一本鎖オリゴヌクレオチド）のパネルを合成した。配列および修飾パターンが表１に示されている。パネルは８ヌクレオチドから１６ヌクレオチドまでにわたる複数の長さの逆相補物阻害剤を含んだ。オリゴヌクレオチドにおけるＬＮＡ修飾の位置と同様にＬＮＡ修飾の数も変動させた。
【００９７】
以前の試験により、ｍｉＲ−１５ファミリーメンバーによって調節される潜在的な遺伝子標的が同定された。心臓組織におけるｍｉＲ−１５ファミリーの特定の標的を同定するために、野生型Ｃ５７ＢＬ６マウスに、生理食塩水、または２５ｍｇ／ｋｇの対照オリゴヌクレオチドもしくは抗ｍｉＲ１５ｂオリゴヌクレオチド（Ｍ−１０１３４）のいずれかを皮下注射した。３日間の処置期間中に３回投与した。最後の注射の２４時間後に心臓組織を回収し、標的遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲによって評価した。結果（図２）により、ｍｉＲ１５ｂの阻害後にＢｃｌ２Ｌ２、Ｂｉｒｃ５、Ｇｒｎ、およびＣｄｃ２Ａの発現が有意に増加することが示され、これにより、心臓組織においてこれらの遺伝子がｍｉＲ−１５ファミリーメンバーによって調節されることが示唆される。
【００９８】
ｍｉＲ−１５ファミリーの標的をさらに検証するために、野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、生理食塩水、または２．８ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、もしくは２５ｍｇ／ｋｇの対照オリゴヌクレオチドもしくは抗ｍｉＲ１５ｂオリゴヌクレオチド（Ｍ−１０１３４）のいずれかを皮下注射した。３日間の処置期間中に３回投与した。最後の注射の２４時間後に心臓組織を回収し、標的遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲによって評価した。結果（図３）により、Ｂｉｒｃ５、Ｃｄｃ２Ａ、およびＧｒｎがｍｉＲ−１５ｂの阻害に対して特に感受性であることが示されている。詳細には、これらの遺伝子の発現は、ｍｉＲ−１５ｂの阻害に用量依存的に応答して増加する。
【００９９】
（実施例３）
ｍｉＲ−１５ファミリーを標的とするｍｉＲＮＡ阻害剤の活性
２５種のｍｉＲＮＡ阻害剤（表１に示されている通り）を、ｍｉＲ−１５ファミリーメンバーを阻害するそれらの能力について試験した。
【０１００】
Ａ．ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍｉＲＮＡ阻害剤によるｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの阻害
ｍｉＲ１５の標的遺伝子の発現に対するｍｉＲ１５阻害剤の有効性を決定するために、野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、生理食塩水、または２５ｍｇ／ｋｇの対照オリゴヌクレオチドもしくは個々の抗ｍｉＲ１５オリゴヌクレオチドのいずれかを皮下注射した。３日間の処置期間中に３回投与した。最後の注射の２４時間後に心臓組織を回収し、標的遺伝子の発現をリアルタイムＰＣＲによって評価した。図４に示されている通り、ｍｉＲＮＡ阻害剤の長さならびにＬＮＡパターンにより別個の阻害活性が付与される。特に、阻害剤Ｍ−１０６７０、Ｍ−１１２１１、Ｍ−１１２１３、Ｍ−１１２１４、Ｍ−１１２１５、Ｍ−１１２２０、Ｍ−１１２２１、Ｍ−１１２２２が、Ｂｉｒｃ５、Ｃｄｃ２Ａ、Ｇｒｎ、ＣｃｎＤ１、およびＣｃｎＤ２などのｍｉＲ−１５の標的遺伝子の発現に強力に影響を及ぼす。これらの阻害剤は１２ヌクレオチドの長さから１６ヌクレオチドの長さまで様々である。これらのうち、１２−ｍｅｒの阻害剤であるＭ−１１２１１が、最も強力な阻害活性を示すと思われ、ｍｉＲ−１５の標的遺伝子５つのうち４つの発現に影響を及ぼす。
【０１０１】
二段階リアルタイムＰＣＲアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して、ｍｉＲＮＡ阻害剤の個々のｍｉＲ−１５ファミリーメンバーを阻害する能力を評価した。詳細には、Ｍ−１０６７０、Ｍ−１１２１１、Ｍ−１１２１３、Ｍ−１１２１４、Ｍ−１１２１５、Ｍ−１１２２０、Ｍ−１１２２１、Ｍ−１１２２２を含めた、予め同定された強力な化合物を、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ１６、およびｍｉＲ−１９５の発現に対するそれらの効果について試験した。野生型Ｃ５７／ＢＬ６マウスに、生理食塩水、または２５ｍｇ／ｋｇの対照オリゴヌクレオチドもしくは抗ｍｉＲ１５オリゴヌクレオチドのいずれかを上記の通り皮下注射した。３日間の処置期間中に３回投与した。結果（図６Ａおよび図６Ｂ）により、１２−ｍｅｒの阻害剤であるＭ−１１２２０が、試験された最良の阻害剤であり、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ１６、およびｍｉＲ１９５を含めた４つのｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの全てを阻害することが示されている。１６−ｍｅｒの阻害剤（すなわち、Ｍ−１０６７０、Ｍ−１１２１１、Ｍ−１１２１３、Ｍ−１１２１４、およびＭ−１１２１５）はファミリーメンバーの３つ以上を様々な程度に阻害する。
【０１０２】
Ｂ．ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるｍｉＲＮＡ阻害剤によるｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの阻害
ｍｉＲＮＡ阻害剤の活性を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで二重ルシフェラーゼアッセイを利用して試験した。詳細には、ＨｅＬａ細胞に、種々の濃度のｍｉＲ−１５阻害剤ならびウェル当たり２５ｎｇのレポータープラスミドをトランスフェクトした。具体的には、ｍｉＲ−１９５二重ルシフェラーゼ構築物は、必要なトランスフェクト阻害剤の濃度が、他の構築物では０．３１〜８．３ｎＭであったのと比較して２〜５０ｎＭにわたったことによって実証された通り、マイクロＲＮＡの阻害に関して他の構築物ほど感受性ではないと思われた。結果（図８Ａおよび図８Ｂ）により、１２−ｍｅｒの阻害剤であるＭ−１１２２０が試験された最良の阻害剤であり、４つのｍｉＲ−１５ファミリーメンバーの全てを阻害したことが示されている。１６−ｍｅｒの阻害剤（すなわち、Ｍ−１０６７０、Ｍ−１１２１１、Ｍ−１１２１３、Ｍ−１１２１４、およびＭ−１１２１５）は、ファミリーメンバーの３つ以上を様々な程度に阻害する。
【０１０３】
（実施例４）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍｉＲ−１５ファミリーを標的とするｍｉＲＮＡ阻害剤の活性
Ａ．ｍｉＲＮＡ阻害剤によるｍｉＲ−１５の標的の投薬依存性の抑制解除
ｍｉＲ−１５阻害剤の種々の投薬レジメンを比較するために試験を実施した。詳細には、マウスの１つの群に阻害剤Ｍ−１０６７０、Ｍ−１１２１１、Ｍ−１１２１３、Ｍ−１１２１４、Ｍ−１１２１５、Ｍ−１１２２０、Ｍ−１１２２１、またはＭ−１１２２２を２５ｍｇ／ｋｇの投与量で皮下注射した。阻害剤を３日の間に３回投与した（３×２５ＭＰＫレジメン）（図９Ａ）。比較として、マウスの第２の群に対して、ｍｉＲ−１５阻害剤を２５ｍｇ／ｋｇの単回投与のみで処置を行った（１×２５ＭＰＫレジメン）。結果（図９Ｂ）により、標的遺伝子の発現に影響を及ぼすことに関して、３×２５ＭＰＫレジメンの方が１ｘ２５ＭＰＫレジメンよりも強力であることが示されている。
【０１０４】
Ｂ．ｍｉＲＮＡ阻害剤による標的抑制解除の動態
経時的試験を実施して、ｍｉＲ−１５阻害剤による標的抑制解除の動態を決定した。詳細には、マウスに、２５ｍｇ／ｋｇのＭ−１１２１５を皮下注射した。単回投与のみを投与した。注射の２４時間後、４８時間後、７２時間後、または９８時間後のいずれかに心臓組織を回収した。図１０に示されている通り、Ｍ−１１２１５の単回投与により、早ければ処置の２４時間後に、標的遺伝子、例えばＢｉｒｃ５などの抑制解除が誘発される。
【０１０５】
Ｃ．ｍｉＲＮＡ阻害剤による全体的な標的抑制解除および特異的な標的抑制解除
全ゲノムマイクロアレイプロファイリングを実施して、ｍｉＲ−１５阻害剤による標的抑制解除の特異性を決定した。詳細には、Ｍ−１１２１４で処置したマウスの心臓組織および生理食塩水で処置したマウスの心臓組織から全ＲＮＡを抽出した。その後、ＲＮＡを全ゲノムマイクロアレイプロファイリングに供した。Ｍ−１１２１４で処置した心臓の全ＲＮＡを生理食塩水で処置した全ＲＮＡと比較した場合に上方制御された遺伝子のうち、ｍｉＲ−１５シード含有遺伝子に、上方制御された遺伝子サインがエンリッチ（ｅｎｒｉｃｈ）された（ｐ値：０．０１；図１１）。この結果は、Ｍ−１１２１４により、ｍｉＲ−１５ファミリーに特異的な標的遺伝子の抑制解除が誘発されることを実証している。
【０１０６】
（実施例５）
ラットにおけるｍｉＲ−１５阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性
ラットにおいてｍｉＲ−１５阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性をさらに試験した。より詳細には、スプラーグドーリーラット（４９〜５２日齢）に、Ｍ−１０６７０、Ｍ−１１２１１、Ｍ−１１２１３、Ｍ−１１２１４、Ｍ−１１２１５、Ｍ−１１２２０、Ｍ−１１２２１、またはＭ−１１２２２を含めたｍｉＲ−１５阻害剤を２５ｍｇ／ｋｇで注射した。単回投与のみを投与した。注射の４日後に心臓組織を回収し、標的遺伝子の発現を分析した。結果（図１２Ａ）により、ラットにおいて、１６−ｍｅｒの阻害剤が標的遺伝子の発現に対してより強力な効果を有すると思われることが示されている。
【０１０７】
結果から、Ｐｉｍ１がｍｉＲ−１５ファミリーの新規の遺伝子標的になることも示唆される。Ｐｉｍ１の過剰発現により、心臓前駆細胞（ＣＰＣ）の増殖活性が増大することが以前に示されている。ＣＰＣは、心臓に新しい筋細胞および血管を供給し、それにより心筋の再生を刺激する娘細胞を産生する自己再生性細胞である。ｍｉＲ−１５とＰｉｍ１との間の関連性から、ｍｉＲ−１５の阻害によって新しい心筋細胞（ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ）の産生がもたらされ、これは、心臓の損傷を修復するために潜在的に有益であり得ることが示唆される。
【０１０８】
さらに、比較試験を行ってラットおよびマウスにおけるｍｉＲ−１５阻害剤の有効性を調査した。スプラーグドーリーラットを、ｍｉＲ−１５阻害剤を用いて上記の通り処置し、注射の４８時間後に心臓組織をｍｉＲ−１５の標的遺伝子の発現について分析した。図１２Ｂに示されている通り、ｍｉＲ−１５阻害剤は、ラットにおいては有効ではないと思われる１２−ｍｅｒの阻害剤を除いて、ラットにおいてマウスにおける効果よりも強力な効果を有すると思われる。
【０１０９】
（実施例６）
ラット虚血再灌流傷害モデルにおけるｍｉＲ−１５阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性
Ａ．ｍｉＲ−１５阻害剤による標的遺伝子の抑制解除
ラット虚血再灌流傷害モデルにおいてｍｉＲ−１５阻害剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を試験した。詳細には、虚血／再灌流モデルにおいて、ラットに、Ｍ−１０６７０、Ｍ−１１２１１、Ｍ−１１２１４、またはＭ−１０５９１を含めたｍｉＲ−１５阻害剤を単一用量（２５ｍｇ／ｋｇ）で静脈内注射した。再灌流の７２時間後にラットを屠殺し、組織を回収し、標的遺伝子の発現について分析した（リアルタイムＰＣＲによって測定される）。図１３に示されている通り、全てのｍｉＲ−１５阻害剤により、梗塞が起こっていない対照（ベースライン）と比較して、Ｂｉｒｃ５、Ｃｄｃ２ａ、およびグラニュリンを含めた標的遺伝子の有意な抑制解除が誘導された。
【０１１０】
Ｂ．ｍｉＲ−１５阻害剤による炎症マーカーの抑制
虚血再灌流傷害により、心筋梗塞の境界部においてＶＣＡＭ、ＩＴＧＡＭ、およびＣＤ４０を含めた種々の炎症マーカーのｍＲＮＡの発現が上昇した。境界部における炎症マーカーの発現に対するｍｉＲ−１５阻害剤の効果が図１４に示されている。
【０１１１】
Ｃ．ｍｉＲ−１５阻害剤による心筋梗塞の低下
この試験では、心筋梗塞に対するｍｉＲ−１５阻害剤の効果を評価する。詳細には、虚血再灌流傷害の３日後に、リスクがあるエリアならびに心筋梗塞のサイズを分析した。リスクがあるエリアおよび心筋梗塞のサイズに対するｍｉＲ−１５阻害剤の効果がそれぞれ図１５Ａおよび図１５Ｂに示されている。
【０１１２】
Ｄ．ｍｉＲ−１５阻害剤による駆出率の改善
この試験では、ラット虚血再灌流傷害モデルを使用して、駆出率に対するｍｉＲ−１５阻害剤の効果を評価する。詳細には、ラットに、Ｍ−１１２１１およびＭ−１１２１４を含めたｍｉＲ−１５阻害剤を単一用量（２５ｍｇ／ｋｇ）で、再灌流時、ならびに再灌流の１週間後、２週間後、および３週間後に静脈内注射した（合計４回の注射）。図１６に示されている通り、ｍｉＲ−１５阻害剤により、生理食塩水で処置した動物と比較して、虚血再灌流傷害の４週間後に駆出率が有意に改善された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５】
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【図６Ａ−１】
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【図６Ａ−２】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ−１】
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【図８Ａ−２】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ−１】
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【図９Ｂ−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ−１】
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【図１２Ｂ−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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