(57)【要約】  グルカゴンに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供する。これらの抗体は、グルカゴンレベルのイムノアッセイにおいておよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫化学方法において、ならびにグルカゴンレベルを検出するため、診断、予後と予防の目的のため、およびグルカゴンシグナル伝達が病因にかかわっている患者の治療レジメンを最適化するための他の画像診断方法において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT（配列番号２９）からなるグルカゴンに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントは、
アミノ酸配列KASENAGTYVA（配列番号１）、NGSHRYD（配列番号２）およびGQSYSYPWT（配列番号３）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列GYNFNDYWLN（配列番号４）、NAYPGWGIINYNEKFKS（配列番号５）およびDYDNAY（配列番号６）をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と
を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項２】
配列番号７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、
配列番号９に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）と
を含む、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項３】
配列番号１１に示すアミノ酸配列を含む軽鎖と、
配列番号１３に示すアミノ酸配列を含む重鎖と
を含む、請求項１または２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項４】
２つの軽鎖と２つの重鎖を含み、前記軽鎖の各々が配列番号１１に示すアミノ酸配列からなり、および前記重鎖の各々が配列番号１３に示すアミノ酸配列からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項５】
配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるグルカゴンに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体またはそのフラグメントは、
アミノ酸配列RSPKSLVGPMGRTYLY（配列番号１５）、RRNNLAP（配列番号１６）およびMQHLEFPLT（配列番号１７）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列GYNFTDYWIH（配列番号１８）、YFSTHSDYAIINQKFRD（配列番号１９）およびGGLGLSY（配列番号２０）をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と
を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項６】
配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるグルカゴンに特異的に結合する請求項５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントであって、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
前記アミノ酸配列がそれぞれRSPKSLVGPMGRTYLY（配列番号１５）、RRNNLAP（配列番号１６）およびMQHLEFPLT（配列番号１７）である軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
前記アミノ酸配列がそれぞれGYNFTDYWIH（配列番号１８）、YFSTHSDYAIINQKFRD（配列番号１９）およびGGLGLSY（配列番号２０）である重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と
を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項７】
配列番号２１に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、
配列番号２３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）とを含む、請求項５に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項８】
配列番号２５に示すアミノ酸配列を含む軽鎖と、
配列番号２７に示すアミノ酸配列を含む重鎖と
を含む、請求項５、６または７に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項９】
２つの軽鎖と２つの重鎖とを含み、前記軽鎖の各々が配列番号２５に示すアミノ酸配列からなり、および前記重鎖の各々が配列番号２７に示すアミノ酸配列からなる、請求項５〜８のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１０】
検出可能な標識をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１１】
前記検出可能な標識が発色団、色素原、色素、蛍光剤、蛍光発生剤、蓄光剤、化学発光剤、生物発光剤、放射性核種、ポジトロン放出断層撮影画像形成剤、および磁気共鳴画像形成剤からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメント、および診断上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物。
【請求項１３】
配列番号２９に示すグルカゴンアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む容器を備えるキットであって、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントが、
アミノ酸配列RSPKSLVGPMGRTYLY（配列番号１５）、RRNNLAP（配列番号１６）およびMQHLEFPLT（配列番号１７）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列GYNFTDYWIH（配列番号１８）、YFSTHSDYAIINQKFRD（配列番号１９）およびGGLGLSY（配列番号２０）をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と
を含む、キット。
【請求項１４】
前記モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントに結合する二次抗体と、任意に、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでグルカゴンを検出するために前記二次抗体の有無にかかわらず前記モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを使用するための説明書とを含む容器をさらに備える請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
前記二次抗体が酵素に結合されている、請求項１４に記載のキット。
【請求項１６】
前記酵素の発色基質を有する容器をさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
体液中のグルカゴンレベルを決定する方法であって、
（ａ）配列番号２９に示すアミノ酸配列、前記抗体またはその抗原結合性フラグメントからなるグルカゴンに特異的に結合し、アミノ酸配列RSPKSLVGPMGRTYLY（配列番号１５）、RRNNLAP（配列番号１６）およびMQHLEFPLT（配列番号１７）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、アミノ酸配列GYNFTDYWIH（配列番号１８）、YFSTHSDYAIINQKFRD（配列番号１９）およびGGLGLSY（配列番号２０）をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３とを含む、抗グルカゴン診断用モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントと体液とを接触させることと；
（ｂ）任意に、非特異的に結合したモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを除去することと；
（ｃ）グルカゴンに特異的に結合しているモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの量を検出および／または定量化することと
を含む、方法。
【請求項１８】
前記体液が血液、血清または血漿であり、および前記接触することがｅｘ  ｖｉｖｏで生じる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
血清または血漿中のグルカゴンの量を定量化する方法であって、
ａ．プレートまたはビーズに捕捉抗体ＩＢＡ００９をコーティングすることであって、前記捕捉抗体が直接的にコーティングされ得る、またはビオチン標識されて、ストレプトアビジン、ニュートラアビジンもしくはアビジンをコーティングされたビーズまたはプレートにコーティングされ得る、コーティングすることと；
ｂ．前記捕捉抗体のコーティングの前もしくは後に、Ｔｗｅｅｎ２０などの界面活性剤を含むもしくは含まないＴｒｉｓ緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水などの適切な緩衝液に溶解させたニワトリ卵白アルブミンまたは他の非哺乳類タンパク質を用いて前記プレートをブロックすることと；
ｃ．決定される血清試料を、ＨＥＰＥＳ、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、塩化ナトリウム、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む緩衝液、および１％卵白アルブミン、または緩衝剤、塩、二価カチオンキレート剤、界面活性剤および担体もしくはブロッキングタンパク質の組み合わせを含む別の適切な希釈緩衝液で希釈することであって、前記希釈緩衝液がヘテロ親和性ブロッキング試薬Ｉなどのブロッキング剤を含んでもまたは含まなくともよい、希釈することと；
ｄ．前記捕捉抗体をコーティングしたプレートまたはビーズを希釈血清試料または希釈血漿試料と接触させることと；
ｅ．前記プレートを適切な洗浄緩衝液で洗浄して非結合タンパク質を除去することと；
ｆ．結合グルカゴンを、検出できるように標識されている第２の抗グルカゴン検出抗体ＩＢＡ０３２と接触させることと；
ｇ．前記プレートを適切な洗浄緩衝液で洗浄して、非結合抗グルカコン検出抗体を除去することと；
ｈ．既知量のグルカゴンの標準曲線に対して比較することによって結合標識を定量化することと
を含む、方法。
【請求項２０】
グルカゴン受容体拮抗剤による治療前、治療中、または治療後に糖尿病患者においてグルカゴンレベルを決定する方法であって、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法によるグルカゴン定量化を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医療分野に関する。より詳しくは、本発明は、グルカゴンの標識、マーキング、特定または定量化を必要とする診断技術、例えばグルカゴンレベルの画像診断および決定において有用な検出可能なグルカゴン／抗グルカゴンモノクローナル抗体複合体を形成するようにグルカゴンに結合する抗体に関する。本発明の抗体は、グルカゴンレベルの変化をもたらす状態の患者を特定する、ならびにグルカゴン受容体拮抗剤または他の治療薬による患者の治療をモニターするおよび／または改善する際に役立つ診断用途に有用である。
【背景技術】
【０００２】
グルカゴンは、２９残基のポリペプチドホルモンであり、膵臓中でランゲルハンス島のα細胞によって生成され、このペプチドのアミノ酸配列は哺乳類において完全に保存されている。グルカゴンペプチドおよびグルカゴン様ペプチドは、膵臓、腸および脳で発現される共通のプログルカゴン遺伝子から転写される。基礎的な量のグルカゴンは、正常血糖を維持するために不可欠であり、かつグルカゴンの主要な生理的役割は低血糖を防ぐことである。グルカゴンレベルは低血糖に反応して急速に増加し、かつグルカゴン反応は、血糖を正常レベルに戻すために体が活用する一次防御機構である。
【０００３】
グルカゴン分泌の適切な調節にはシグナル伝達因子の複雑な相互作用が必要とされる。グルコース、ランゲルハンス島内のパラクリン因子（例えばインスリンおよびＧＬＰ−１）および中枢神経系と自律神経系を含むこれらの制御因子は、協調的な様式で相互作用して、グルカゴン分泌を調節する。グルカゴン受容体は肝臓で主に発現され、その活性化によりグルコース産生の増加がもたらされる。また、グルカゴン受容体は多くの他の組織でも低いレベルで発現される。
【０００４】
グルカゴンは、糖尿病の病理における重要な因子であると考えられてきた。グルカゴンの発現が不適当であると、糖尿病において高血糖症の発症の一因となり得ることが提唱されてきた。近年の研究でも、エネルギー代謝の調節の過程において重要な成分としてグルカゴンを意味づけている。グルコースホメオスタシスおよび糖尿病におけるグルカゴンの重要性を考慮して、グルカゴンは糖尿病および抗糖尿病療法の発達に関連した重要なバイオマーカーと考えられてきた（Ｒ．  Ｋｒｉｓｈｎａ，  Ｇ．  Ｈｅｒｍａｎ，およびＪ．  Ａ．  Ｗａｇｎｅｒ．，  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｕｓｉｎｇ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ：  Ａ  Ｃａｓｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ，  Ａ  Ｎｏｖｅｌ  ＤＰＰ４  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ＡＡＰＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  Ｖｏｌ．  １０，  Ｎｏ．  ２，  ｐ４０１−４０９，  Ｊｕｎｅ  ２００８）。
【０００５】
正常血糖を調節する際のグルカゴンシグナル伝達の役割、および正常血糖を維持できないことから起こる病的状態に起因して、グルカゴンシグナル経路は、抗糖尿病療法の魅力的な標的として考えられている。例えば、近年、グルカゴン受容体拮抗剤からの試験結果は、糖尿病患者における血糖値およびヘモグロビンＡ１ｃレベルの有意な減少を表している。しかし、グルカゴン受容体拮抗剤はグルカゴンレベルを上昇させることも報告されており、したがって、グルカゴンレベルを決定するための高感受性で正確な技術が、糖尿病患者のグルカゴンレベルの分析と、グルカゴン受容体拮抗剤および／または他の治療薬の開発との両方で必要とされている。
【０００６】
グルカゴンを検出する諸方法は当技術分野で既知であるが、これらの方法は、所望の特性の特定の組み合わせおよび本発明で見いだされた利点が欠如している。グルカゴンを測定するラジオイムノアッセイは、５０年前に初めて記述された。その時以来、ランゲルハンス島からのインスリン、グルカゴンおよび膵島アミロイドポリペプチド（ＩＡＰＰ）分泌物の同時定量化についてのキャピラリー電気泳動競合イムノアッセイを詳述するＧｕｉｌｌｏらに記述されているものなどのイムノアッセイ方法に進歩があった（Simultaneous capillary electrophoresis competitive immunoassay for insulin, glucagon, and islet amyloid polypeptide secretion from mouse islets of Langerhans. Journal of Chromatography. Guillo C. Roper MG., 1218(26): 4059-64, July 2011）。だが、ＧｕｉｌｌｏおよびＲｏｐｅｒの方法は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから販売されており、ラジオイムノアッセイにおいて６．１×１０８Ｍ−１の親和定数でグルカゴンに結合すると報告されているモノクローナル抗体Ｋ７９ｂＢ１０（製品番号Ｇ２６５４）を利用している（製品番号Ｇ２６５４の製品添付文書およびWitt, S.,ら, Acta Histochem., Suppl XXXV, 217 (1988)を参照されたい）。
【０００７】
糖尿病患者におけるグルカゴンの重要な役割を考慮して、グルカゴンレベルの変化を特定およびモニタリングするためにグルカゴンの生体レベルを検出および／または定量化し、ならびにこれらの変化を考慮して治療介入を改善するためには、特異性、親和性および感受性を含む所望の特性の組み合わせを改善することによる診断用抗体技術の必要性が存在する。例えば、１または複数のグルカゴン受容体拮抗剤、または他の治療薬による治療が患者のグルカゴンレベルの変化をもたらしたかどうかを決定するには、技術が必要である。
【０００８】
特に、グルカゴンに特異的であり、向上した結合親和性を有する抗グルカゴン抗体が必要である。より具体的には、グルカゴンに特異的であり、向上した結合親和性を有し、かつグルカゴン決定において感受性の増大を示す抗グルカゴン抗体が必要である。より具体的には、グルカゴンに特異的であり、向上した結合親和性を有し、かつグルカゴン決定において感受性の増大と、最小干渉および広範な希釈直線性をもたらすＥＬＩＳＡアッセイ条件の改善とを示す抗グルカゴン抗体が必要である。好ましくは、抗体はモノクローナル抗体であって、グルカゴン上で２つの異なるエピトープを認識する２つの異なる抗体を含む。
【０００９】
本発明の抗体は、Ｋ７９ｂＢ１０と比較するとグルカゴンへの親和性が驚くほど向上していることがわかる。本発明の抗グルカゴン抗体によるグルカゴンの結合により、最小の血漿タンパク質干渉および感受性の向上による患者の治療前、治療中、および／または治療後のグルカゴンレベルの診断評価が可能になる。したがって、本発明は、グルカゴンのＣ末端に結合するものを含むグルカゴンの別個のエピトープに特異的に結合する代替の抗グルカゴン抗体を提供する。本発明は、さらに、高スループット形式でグルカゴンを定量化するための迅速な従来の方法を提供する、優れた感受性、回収率および希釈直線性を有する特異性の高い電気化学発光（ＥＣＬ）サンドイッチイムノアッセイを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】グルカゴン抗体特異性。（Ａ）捕捉抗体ＩＢＡ００９のＢｉａｃｏｒｅ分析。１０ｎＭグルカゴン（「ＧＣＧ  １０ｎＭ」と呼ぶ）、１００ｎＭオキシントモジュリン（「Ｏｘｙ  １００ｎＭ」と呼ぶ）および緩衝液のみの負の対照（「緩衝液」と呼ぶ）による結合を示す。捕捉抗体ＩＢＡ００９はグルカゴンの内部領域に結合し、オキシントモジュリンと交差反応することが決定される（図１Ａ）。
【図１Ｂ】グルカゴン抗体特異性。（Ｂ）検出／結合抗体ＩＢＡ０３２のＢｉａｃｏｒｅ分析。１０ｎＭグルカゴン（「ＧＣＧ  １０ｎＭ」と呼ぶ）、１００ｎＭオキシントモジュリン（「Ｏｘｙ  １００ｎＭ」と呼ぶ）および緩衝液のみの負の対照（「緩衝液」と呼ぶ）による結合を示す。検出抗体ＩＢＡ０３２はオキシントモジュリンとの交差反応を示さず、したがって、グルカゴンのＣ末端に特異的である（図１Ｂ）が、同時に結合親和性の大幅な増加を示す。
【図２】グルカゴンサンドイッチＥＬＩＳＡ方法の展開。図２は、実施例３に記述のＥＬＩＳＡで得られた典型的な標準曲線を示す。グルカゴンペプチド（配列番号２９）を用いて、１９５０ｐｍｏｌ／Ｌの濃度で開始し、１：３段階希釈により検量線を作成する（図２、曲線「ＩＢＡ００９捕捉−ＩＢＡ０３２検出」）。抗中間領域抗体ＩＢＡ００９は捕捉抗体であり、および抗グルカゴンＣ末端抗体ＩＢＡ０３２は検出抗体である。図２が示すように、実施例３のＥＬＩＳＡは広範なダイナミックレンジ、低バックグラウンドおよび高感受性を有する。実施例３のＥＬＩＳＡも、最低１：２希釈までおよび最高１：１６希釈までの許容される希釈直線性を示す。比較のために、市販のＭｅｓｏｓｃａｌｅ  ＤｉｓｃｏｖｅｒｙグルカゴンＥＬＩＳＡキット（カタログＫ１１１６０Ｃ−１）用の製品添付文書に報告されているデータを「ＭＳＤ  ＫＩＴ」として示す。
【図３】グルカゴン濃度の相関。血漿グルカゴン濃度間の相関は、実施例３のＥＬＩＳＡならびにＡＬＰＣＯ（Salem, New Hampshire）から販売されている競合ＲＩＡによって決定される。グルカゴン濃度は２６の試料に対して決定され、および図３は両アッセイで分割試料を分析した後に得られた結果を示す。図３に図示するように、２つの異なるアッセイで得られたグルカゴン値は、相関が高かった（ｒ＝０．９７、Ｐ＜０．００１）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の一態様は、配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるグルカゴンに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントに関し、前述の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
アミノ酸配列KASENAGTYVA（配列番号１）、NGSHRYD（配列番号２）およびGQSYSYPWT（配列番号３）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列GYNFNDYWLN（配列番号４）、NAYPGWGIINYNEKFKS（配列番号５）およびDYDNAY（配列番号６）をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３とを含む。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるグルカゴンに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、前述のモノクローナル抗体は、
配列番号７に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、
配列番号９に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）とを含む。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるグルカゴンに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、前述のモノクローナル抗体は、
配列番号１１に示すアミノ酸配列を含む軽鎖と、
配列番号１３に示すアミノ酸配列を含む重鎖とを含む。
【００１４】
本発明の別の態様は、配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるグルカゴンに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントに関し、前述の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
アミノ酸配列RSPKSLVGPMGRTYLY（配列番号１５）、RRNNLAP（配列番号１６）およびMQHLEFPLT（配列番号１７）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列GYNFTDYWIH（配列番号１８）、YFSTHSDYAIINQKFRD（配列番号１９）およびGGLGLSY（配列番号２０）をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３とを含む。
【００１５】
本発明の別の態様は、配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるグルカゴンに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントに関し、前述の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
アミノ酸配列がそれぞれRSPKSLVGPMGRTYLY（配列番号１５）、RRNNLAP（配列番号１６）およびMQHLEFPLT（配列番号１７）である軽鎖相補性決定領域ＬＣＲＤ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列がそれぞれGYNFTDYWIH（配列番号１８）、YFSTHSDYAIINQKFRD（配列番号１９）およびGGLGLSY（配列番号２０）である重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３とを含む。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるグルカゴンに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントであり、前述のモノクローナル抗体は、
配列番号２１に示すアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）と、
配列番号２３に示すアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）とを含む。
【００１７】
別の実施形態において、本発明は、配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるグルカゴンに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを提供し、前述のモノクローナル抗体は、
配列番号２５に示すアミノ酸配列を含む軽鎖と、
配列番号２７に示すアミノ酸配列を含む重鎖とを含む。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態は、（配列番号１３）の重鎖を２つおよび（配列番号１１）の軽鎖を２つ含む、本明細書でＩＢＡ００９と称する抗体である。本発明のより好ましい実施形態は、（配列番号２７）の重鎖を２つおよび（配列番号２５）の軽鎖を２つ含む、本明細書でＩＢＡ０３２と称する抗体である。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、本発明の前述の抗グルカゴンモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントのうちの少なくとも１つ、および診断上許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含む診断上有用な組成物を提供する。そのような一実施形態において、本発明の抗グルカゴンモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、標識に共有結合、非共有結合、または部分的に共有結合および部分的に非共有結合される。
【００２０】
別の実施形態において、本発明は、配列番号２９に示すグルカゴンアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合した本発明の前述の抗グルカゴンモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントのうちの少なくとも１つを含む組成物を包含する。好ましくは、本発明の抗グルカゴンモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、配列番号２９のＣ末端を含むエピトープで配列番号２９に示すグルカゴンアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合される。より好ましくは、本発明は、配列番号２９に示すグルカゴンアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合した本発明の前述の抗グルカゴンモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントのうちの少なくとも１つを含み、かつ診断上許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含む組成物を包含する。
【００２１】
他の実施形態において、本発明は、配列番号２９に示すグルカゴンアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む容器を備えるキットを提供し、前述のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、
アミノ酸配列RSPKSLVGPMGRTYLY（配列番号１５）、RRNNLAP（配列番号１６）およびMQHLEFPLT（配列番号１７）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列GYNFTDYWIH（配列番号１８）、YFSTHSDYAIINQKFRD（配列番号１９）およびGGLGLSY（配列番号２０）をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３とを含む。
【００２２】
他の実施形態において、本発明は、配列番号２９に示すグルカゴンアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する第１のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む容器であって、前述のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントが、
アミノ酸配列RSPKSLVGPMGRTYLY（配列番号１５）RRNNLAP（配列番号１６）およびMQHLEFPLT（配列番号１７）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列GYNFTDYWIH（配列番号１８）、YFSTHSDYAIINQKFRD（配列番号１９）およびGGLGLSY（配列番号２０）をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３とを含む容器と；
ならびに配列番号２９に示すグルカゴンアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合する第２のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む容器であって、前述のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントが、
アミノ酸配列KASENAGTYVA（配列番号１）、NGSHRYD（配列番号２）およびGQSYSYPWT（配列番号３）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列GYNFNDYWLN（配列番号４）、NAYPGWGIINYNEKFKS（配列番号５）およびDYDNAY（配列番号６）をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３とを含む容器とを備えたキットを提供する。
【００２３】
特定の実施形態において、前述のキットは、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでグルカゴンを検出するために、本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントに結合する二次抗体と、任意に、二次抗体の有無にかかわらず前述のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを使用するための説明書とを含む第２の容器を備えることもある。一部の実施形態において、二次抗体はイムノアッセイで用いられることが知られている酵素に結合されることができる。他の実施形態において、前述のキットは、上述の酵素の発色基質を含む別の容器をさらに備えることができる。
【００２４】
他の実施形態において、本発明は、哺乳類細胞によって発現されるグルカゴンを検出する方法も包含し、該方法は、
（ａ）配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるグルカゴンに特異的に結合し、検出可能なように標識されたモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントと細胞とを接触させることであって、前述のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントが、
アミノ酸配列RSPKSLVGPMGRTYLY（配列番号１５）、RRNNLAP（配列番号１６）およびMQHLEFPLT（配列番号１７）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列GYNFTDYWIH（配列番号１８）、YFSTHSDYAIINQKFRD（配列番号１９）およびGGLGLSY（配列番号２０）をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３とを含む、接触させることと；
（ｂ）任意に、非特異的に結合したモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを除去することと；
（ｃ）当技術分野で既知の任意の方法、例えば細胞数測定技法または免疫組織化学技法を用いて、グルカゴンに特異的に結合している標識モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの量を検出および／または定量化することとを含む。
好ましくは、グルカゴンは、尿、腹水、リンパ液、髄液、気管支液など、より好ましくは血液、血清または血漿などの糖尿病患者由来の生物組織または体液中で検出される。
【００２５】
本発明は、体液中のグルカゴンレベルを決定する方法も提供し、該方法は、（ａ）配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるグルカゴンに特異的に結合する抗グルカゴン診断用モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントと体液とを接触させることであって、前述の抗体またはその抗原結合性フラグメントが、
アミノ酸配列RSPKSLVGPMGRTYLY（配列番号１５）、RRNNLAP（配列番号１６）およびMQHLEFPLT（配列番号１７）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列GYNFTDYWIH（配列番号１８）、YFSTHSDYAIINQKFRD（配列番号１９）およびGGLGLSY（配列番号２０）をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３とを含む、接触させることと； 
（ｂ）任意に、非特異的に結合したモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを除去することと；
（ｃ）グルカゴンに特異的に結合しているモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの量を検出および／または定量化することとを含む。好ましくは、本方法で用いられる抗体はＩＢＡ０３２である。
【００２６】
本発明は、哺乳類の生物組織または糖尿病患者もしくは糖尿病を発症するリスクのある患者由来の体液（例えば尿、腹水、リンパ液、髄液、気管支液、および好ましくは血液、血清または血漿）中のグルカゴンレベルを検出および／または定量化する方法も提供し、該方法は、
検出可能なグルカゴン／抗グルカゴンモノクローナル抗体複合体の形成を可能にする条件下で、グルカゴンに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原特異的フラグメントと前述の組織を接触させることであって、前述のモノクローナル抗体またはその抗原特異的フラグメントが、
アミノ酸配列RSPKSLVGPMGRTYLY（配列番号１５）、RRNNLAP（配列番号１６）およびMQHLEFPLT（配列番号１７）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列GYNFTDYWIH（配列番号１８）、YFSTHSDYAIINQKFRD（配列番号１９）およびGGLGLSY（配列番号２０）をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３とを含む、接触させることと；
前述の複合体（単数または複数）を検出および／または定量化することとを含む。好ましくは、本方法で用いられる抗体はＩＢＡ０３２である。好ましくは、試料と本発明の抗体とを接触させることは、ｅｘ  ｖｉｖｏで起こる。より好ましくは、本方法で用いられる抗体はＩＢＡ０３２であり、および試料と本発明の抗体とを接触させることは、ｅｘ  ｖｉｖｏで起こる。
【００２７】
種々の実施形態において、接触させることはｉｎ  ｖｉｖｏで実施されることができ、抗グルカゴンモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、注射または注入によって非経口的に投与されることができる。さらに、種々の実施形態において、抗グルカゴンモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、本明細書に記述される標識または当技術分野で既知の標識を含むがこれらに限定されない少なくとも１つの検出可能な標識で標識される。検出は、特定の検出可能な標識に適していることが当技術分野で知られている方法、技術および／または装置を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで実施されることができ、これらはγ計数器、シンチレーション計数器、オートラジオグラフィによって、例えば、蛍光測定装置、生物発光測定装置、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）装置、磁気装置、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）装置、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）装置、超音波装置、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）装置および／または単一光子放射型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）装置を含む装置が挙げられるがこれらに限定されない。
【００２８】
別の実施形態では、本発明は、
（ａ）細胞中または細胞上のグルカゴンを検出および／または定量化するため；
（ｂ）患者内で細胞を発現させるグルカゴンを検出および／または定量化するため；
（ｃ）患者の組織試料中で細胞を発現させるグルカゴンを検出および／または定量化するため；
（ｄ）血液、血漿、血清、尿、腹水、リンパ液、髄液および気管支液などの患者由来の体液中のグルカゴンを検出および／または定量化するため；
（ｅ）グルカゴン発現が健康な対照被験者中のそれよりも高いまたは低い個人が糖尿病であるか、または糖尿病発症のリスクがあるかどうかを評価するため；
（ｆ）グルカゴン受容体拮抗剤での治療の条件を有する患者を選択するため；
（ｇ）グルカゴン受容体拮抗剤での治療に対する反応を決定するため；および／または
（ｈ）糖尿病を治療するために、
グルカゴン（配列番号２９）に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを含むキットの使用を提供し、前述のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントが、
アミノ酸配列RSPKSLVGPMGRTYLY（配列番号１５）、RRNNLAP（配列番号１６）およびMQHLEFPLT（配列番号１７）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、
アミノ酸配列GYNFTDYWIH（配列番号１８）、YFSTHSDYAIINQKFRD（配列番号１９）およびGGLGLSY（配列番号２０）をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３とを含む。
【００２９】
好ましくは、上記の（ｇ）および（ｈ）に関して、治療は、下記の構造１（Petersen, K F. Sullivan, J T., Effects of a novel glucagon receptor antagonist (Bay 27-9955), on glucagon-stimulated glucose production in humans. Diabetologia. 44(11): 2018-24, 2001 Nov）に示すＢａｙ−２７−９９５５などのグルカゴン受容体拮抗剤の投与を含む。
【００３０】
構造１：
【化１】
2015505828.tif 000002
【００３１】
このように、本明細書に記述の抗グルカゴン抗体は、診断法として有用であり、グルカゴンレベルの変化によって糖尿病患者を特定する、またはグルカゴンのレベルの上昇をもたらすことが知られている他の状態を診断するのに役立つことができる。さらに、本発明の抗グルカゴン抗体を用いて、Ｂａｙ２７−９９５５などの治療薬または国際公開第２００５／１２３６６８号に記載のグルカゴン受容体の小分子拮抗剤ならびに国際公開第２００９／１２０５３０号に記載のものなどのグルカゴン受容体の抗体拮抗剤を標的にするグルカゴンシグナル伝達による糖尿病患者の治療をモニターするおよび／または最適化することが可能である。
【００３２】
本発明の別の態様は、本発明の抗グルカゴン抗体をコードする単離された核酸分子と、該核酸分子を含む発現ベクターと、該核酸分子を含む宿主細胞とを提供する。
【００３３】
本明細書で用いる場合、グルカゴンは、特に明記しない限り、いかなる哺乳類種のグルカゴン１−２９を言う。グルカゴンの配列は、以下のように示される；
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT、および本明細書では配列番号２９と呼ぶ。
【００３４】
全長抗体は、ジスルフィド結合によって相互連結した２つの重（Ｈ）鎖と２つの軽（Ｌ）鎖とを含む免疫グロブリン分子である。各鎖のアミノ末端部分は、その中に含まれる相補性決定領域（ＣＤＲ）を介して、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。軽鎖はκまたはλとして分類され、これらは当技術分野で既知のように特定の定常領域によって特徴づけられる。重鎖はγ、μ、α、δまたはεとして分類され、それぞれ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥとして抗体のアイソタイプを規定する。ＩｇＧ抗体は、さらに、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のサブクラスに分けられることができる。各重鎖のタイプも、当技術分野で周知の配列を有する特定の定常領域によって特徴づけられる。本明細書で用いる場合、「抗原結合性フラグメント」とは、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、およびグルカゴンに結合する一本鎖Ｆｖフラグメントをいう。本明細書で用いる場合、用語「グルカゴンに結合する」とは、グルカゴン（配列番号２９）のエピトープとの相互作用をいう。本明細書で用いる場合、用語「エピトープ」とは、本発明の抗体または抗原結合性フラグメントによって認識される抗原上の不連続な三次元部位をいう。
【００３５】
ＣＤＲはより保存されている、フレームワーク領域（「ＦＲ」）と称する領域によって分散されている。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、アミノ末端からカルボキシ末端にＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順番に配列した３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成される。軽鎖の３つのＣＤＲは、「ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３」と呼ばれ、および重鎖の３つのＣＤＲは、「ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３」と呼ばれる。ＣＤＲは、抗原と特定の相互作用を形成する残基の大部分を含んでいる。本発明の抗体または抗原結合性フラグメントのＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域内のＣＤＲアミノ酸残基の番号付けと位置決めは、周知のＫａｂａｔ番号付け規約によって、またはＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの番号付け規約によって決定される。
【００３６】
本明細書で用いる場合、用語「抗体」とは、特に明記しない限りモノクローナル抗体をいう。用語「モノクローナル抗体」、その省略形「ｍＡｂ」およびその文法的に正しい型は、例えば、いかなる真核生物クローン、原核生物クローンまたはファージクローンを含む単一コピーもしくはクローンに由来する抗体をいうことを意図し、かつそれが生成される方法は意図しない。本発明のモノクローナル抗体は、好ましくは、均質集団または実質的に均質集団中に存在する。完全なｍＡｂは、２つの重鎖と２つの軽鎖を含む。そのようなモノクローナル抗体の「抗原結合性フラグメント」としては、例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖Ｆｖフラグメント、および単一ドメイン可変フラグメントが挙げられる。本発明のモノクローナル抗体およびその抗原結合性フラグメントは、例えば、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術（例えばＣＤＲ移植技術）もしくはそのような技術の組み合わせ、または当技術分野で既知の他の技術によって生成されることができる。抗原結合性フラグメントが特定されるかどうかに関係なく、本明細書で用いる場合、用語「抗体」および「モノクローナル抗体」とは、特に明記しない限り、そのようなフラグメント、ならびに一本鎖型を含むと理解されよう。
【００３７】
本発明の別の態様は、上述の抗グルカゴン抗体のいずれかをコードする単離された核酸分子と、該核酸分子を含む発現ベクターと、該核酸分子を含む宿主細胞とに関する。さらに、本発明は、発現配列、プロモーター配列および／またはエンハンサー配列などの制御配列に機能的に結合した前述のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。細菌系および真核細胞系などの原核細胞系中での抗体ポリペプチドの効率的な合成のための種々の発現ベクターは、酵母培養系および哺乳類細胞培養系を含むがこれらに限定されずに開発されてきた。本発明のベクターは、染色体配列、非染色体配列および合成ＤＮＡ配列のセグメントを含むことができる。
【００３８】
抗体および抗原結合性フラグメントを生成して精製する方法は、当技術分野で周知であり、例えば、Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, chapters 5-8 and 15, ISBN 0-87969-314-2に見出すことができる。抗原結合性フラグメントは、従来の方法によって調製されることもできる。ヒトフレームワーク生殖系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のウェブサイトhttp://imgt.cines.frから、またはMarie-Paule Lefranc and Gerard LefrancによるThe Immunoglobulin Facts Book, Academic Press, 2001, ISBN 012441351から取得することができる。本発明は、前述の組換えベクターを含む組換え宿主細胞も提供する。特定の好みの細胞系は、高レベルの発現、目的タンパク質の恒常的発現、および宿主タンパク質からの最小限度の混入に基づいて選択される。発現用の宿主として利用可能な哺乳類細胞系は当技術分野で周知であり、ＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、およびリンパ腫細胞、骨髄腫細胞またはハイブリドーマ細胞などのリンパ球由来の細胞系を含む多くの他の細胞などの多くの不死化細胞系が挙げられるがこれらに限定されない。ベクターの形質転換用および本発明の抗体の発現用の好ましい宿主細胞は、例えば、ＮＳ０細胞（非分泌性（０）マウス骨髄腫細胞）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３、ＳＰ２０およびチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ならびにリンパ腫細胞、骨髄腫細胞またはハイブリドーマ細胞などのリンパ球由来の他の細胞系の哺乳類細胞である。本発明の抗体は、ハイブリドーマ以外の細胞系で発現することができる。酵母などの他の真核生物宿主は、代わりに使用されることができる。抗体およびより具体的にはその抗原結合性フラグメントも、大腸菌（Eschericia coli）などの原核細胞から生成されることができる。本発明による抗体をコードする配列を含む核酸は、好適な哺乳類宿主細胞の形質転換で用いられることができる。例えば、重鎖（例えば、配列番号２７により与えられるアミノ酸配列）および軽鎖（例えば、配列番号２５により与えられるアミノ酸配列）をコードするｃＤＮＡ配列は、クローン化されて、好適な一過性トランスフェクション発現ベクターに設計されることも可能である。設計された免疫グロブリン発現ベクターは、次いで、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトされることができる。トランスフェクタントは、グルカゴンに特異的に結合する抗体の発現について検証されることができる。
【００３９】
本発明は、さらに、上述の抗グルカゴン抗体のいずれかを精製する方法を提供する。本発明の改変抗体または抗原結合性フラグメントは、既知の方法を用いて調製され、精製されることができる。抗グルカゴン抗体に関して「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から特定されて、分離および／または回収されたものである。その自然環境の混入成分は、その抗体に関する診断用途を妨げる可能性のある物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質であり得る。好適な実施形態において、本発明の抗体は、（１）ローリー法で決定される場合、抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用により、Ｎ末端または内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）還元または非還元条件下でクーマシーブルー、または好ましくは銀染色を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。本発明の抗グルカゴン抗体に関して用語「単離される」とは、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しなくなるので、組換え細胞内にｉｎ  ｓｉｔｕで抗体を含むことがある。本発明の抗グルカゴン抗体は、当技術分野で既知の任意の方法によって単離または精製されることができ、それらの方法としては生理食塩水に対する透析に続く硫酸アンモニウムまたは硫酸ナトリウムによる沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーもしくは免疫アフィニティークロマトグラフィー（プロテインＡおよび／またはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを含むがこれらに限定されない）、ならびにゲル濾過またはゾーン電気泳動が挙げられる。
【００４０】
本明細書に開示される抗グルカゴン抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでおよび／または種々の形状のｅｘ  ｖｉｖｏ調製物にかかわらず、細胞、組織または臓器の内部もしくは表面に、および体液中に存在するグルカゴンのレベルを検出することによって、診断手法、予後方法および／または患者のモニタリング手法に有用である。用語「体液」とは、健常人または患者の身体に由来するいかなる流体または流体様物質、例えば血液、血清、血漿、リンパ液、髄液、尿、唾液、涙、脳脊髄液、乳、羊水、胆汁、尿、気管支液、腹水、膿および他のいかなる生物分泌物をいう。また、流体様物質が意味する範囲内には、臓器または組織の抽出物、および被験者由来の細胞または組織調製物がインキュベートされた培地が含まれる。本明細書に記述の抗グルカゴンモノクローナル抗体は、酵素に結合させて、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）で用いることができる。そのようなアッセイは、例えば、Butler (1994) "ELISA" (Chapter 29), In: van Oss, C. J.ら, 編集, Immunochemistry, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 759-803に詳細に記述されている。本発明の抗グルカゴン抗体は、グルカゴン発現についてのラジオイムノアッセイおよび蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）分析でも用いられることができる。
【００４１】
グルカゴン用の抗グルカゴン抗体の親和性に関して本明細書で用いる場合、語句「特異的に結合する」とは、特に明記しない限り、基本的には本明細書に記述のＳＰＲバイオセンサを用いることを含み当技術分野で既知の一般的な方法で決定される場合、好ましくは、約１×１０−１０Ｍ未満のＫＤ、より好ましくは、約１×１０−１０Ｍと約１×１０−１１Ｍの間、さらにより好ましくは、約１×１０−１０Ｍと約１×１０−１３Ｍの間、さらにより好ましくは、約１×１０−１１Ｍと約１×１０−１３Ｍの間を意味するように意図される。
【００４２】
本明細書で用いる場合、用語「接触させること」とは、抗体、例えば本発明の抗体を、グルカゴン抗原、例えばグルカゴンレベルが決定されることになる試料中の分析物に、前述のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントがグルカゴンに結合できる条件下で一時の間、曝すことをいう。そのような時間および条件は、当業者には既知であり、および／または本明細書に引用される参考文献によれば当技術分野で既知の方法によって日常的に決定されることができる。
【００４３】
本明細書で用いる場合、感受性とは、許容される正確度および精度で測定されることができる分析物（この場合、グルカゴン）の最も低いレベルをいう。感受性は、例えば、本発明により、グルカゴンの試料を採取し、％ＣＶ（変動係数）が２０％を超えるまで該試料を段階的に希釈することによって決定される定量化の下限（ＬＬＯＱ）によって反映される。
【００４４】
用語「糖尿病」および「糖尿病性」とは、異常なグルコース調節によって典型的に特徴づけられる哺乳類での生理的状態をいうまたは説明する。例としては、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、高血糖症、高インスリン血症、β細胞休止、第１相反応の回復によるβ細胞機能の改善、食事高血糖症、代謝症候群、低血糖症、高カリウム血症／低カリウム血症、正規化するグルカゴンレベル、糖尿病の結果としての肥満、膵島炎、膵島移植、小児糖尿病、妊娠糖尿病、糖尿病性後期合併症、微量／顕性アルブミン尿、グルカゴン投与に起因する腸運動の低下、インスリン抵抗性症候群、シンドロームＸ、グルカゴン産生腫瘍、急性膵炎、肥満の結果としての糖尿病、糖尿病性脂質異常症が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、糖尿状態は、Ｉ型またはＩＩ型糖尿病である。より好ましくは、糖尿状態は、ＩＩ型糖尿病である。
【００４５】
抗体組成物と方法
安定した検出可能な抗原抗体複合体を形成するために当業者が使用することができる周知の方法が当技術分野にはある（例えば、Antibodies, A Laboratory Manual by Harlow and Lane (現行版), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, for conditions permitting formation of detectable antigen/antibody complexesを参照されたい）。
【００４６】
本発明の抗グルカゴンモノクローナル抗体または本明細書に記述のグルカゴン／抗グルカゴンモノクローナル抗体複合体は、当技術分野で周知の任意の方法を用いて、検出できるように標識されることができる（例えば、Antibody Engineering Volume 2, Kontermann, Roland; Dubel, Stefan (編集)を参照されたい）。これに限定されないが、グルカゴンまたは検出できるように標識されたグルカゴン／抗グルカゴンモンクローナル抗体の複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのいずれかで、細胞上またはそのフラグメント上に存在することができる。例えば、これに限定されないが、そのような細胞またはそのフラグメントは、ｉｎ  ｓｉｔｕでその自然起源の状態から単離されることができる、または例えば、細胞ペレット、異種移植片、組織、臓器、体液、またはその濃縮、精製、強化されたいずれの形状の試料中に存在し得る。これらの方法のいずれにおいて、接触させることおよび検出することとは、各々ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われることができ、または接触させることはｉｎ  ｖｉｖｏで行われることができ、および検出することとは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われることができ、または接触させることおよび検出することとは各々ｉｎ  ｖｉｖｏで行われることができる。標識としては、例えば、発光剤または吸光剤、発色団、色素原、磁性粒子または鉄粒子、色素、蛍光剤、フルオロフォア、蓄光剤、化学発光剤、生物発光剤、放射性核種、酵素、ポジトロン放出断層撮影画像形成剤、磁気マイクロビーズ、磁性流体ナノ粒子、二次抗体、および磁気共鳴画像形成剤であってもよいが、これらに限定されない。
【００４７】
用語「検出できるように標識された」とは、本発明の抗グルカゴン抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、またはグルカゴン／抗グルカゴンモノクローナル抗体の複合体が、有用な検出可能な標識に共有結合的または非共有結合的のいずれかで付着していることを意味する。直接的な結合標識抗体方法において、多くの異なる有用な標識を使用することができ、そのような標識には、例えば、補欠分子族複合体、発色団、色素原（発色基質）、色素、蛍光化合物、蛍光発生化合物、放射性同位体、常磁性同位体、およびポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）と磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって撮像されることができる化合物が挙げられる。γ計数器、シンチレーション計数器、ＰＥＴスキャンまたはオートラジオグラフィによって簡単に検出される有用な放射標識としては、３Ｈ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓおよび１４Ｃが挙げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏ診断の場合、放射性核種は、ＤＴＰＡおよびＥＤＴＡなどのキレート剤を用いて、直接的または間接的のいずれかでモノクローナル抗体または抗原結合性フラグメントに結合されることができる。そのような放射性核種の例としては、９９Ｔｃ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙおよび２０１Ｔｌが挙げられる。他の好適な標識は当技術分野で周知である、または日常的な実験で決定されることができる。間接的な方法では、二次抗体は、例えば酵素を用いて結合されることができる。
次いで、標的抗原に結合される一次抗体との二次抗体の結合は、検出可能なシグナルを得るための適切な条件下で、酵素の発色基質との反応によって検出されることができる。
【００４８】
高消衰係数で発色団を有する、または発色団をもたらし、したがって容易に検出することができる発色性化合物を使用して、比色検出を用いることができる。後で、適切な反応条件下でその基質にさらされると、酵素は、その基質と反応して、例えば、分光光度法、蛍光定量法または視覚的方法によって検出されることができる化学標識を生成する。
【００４９】
この目的で一般的に用いられる酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸脱水素酵素、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、δ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコール脱水素酵素、α−グリセロリン酸脱水素酵素、トリオースリン酸イソメラーゼ、アスパラギナーゼ、グルコース酸化酵素、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。好適な補欠分子族複合体の例としては、例えば、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられるがこれらに限定されない。これらの複合体を使用するアッセイは臨床診断検査室で容易に行われることができ、およびこれらの検査室で一般的に利用可能な機器で病理学者によって精査されることができるので、色素原の使用は好まれる。一般的に用いられる色素原としては、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）；増感型ＤＡＢ；３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）；４−クロロ−１−ナフトール（４−ＣＮ）；ハンカー−イエーツ試薬；α−ナフトールピロニン；３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）；ファストブルーＢＢ；ファストレッドＴＲ；ニューフクシン；ＢＣＩＰ−ＮＢＴ；テトラゾリウム；テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ）；および銀増感によるイムノゴールドが挙げられる。
【００５０】
有用な蛍光標識としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ローダミン、ダンシル基、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレサミンおよびＣｙ５が挙げられる（Haugland (1996) Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, 第６版, Molecular Probes, Eugene, OR）。
【００５１】
本発明の抗グルカゴン抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、またはグルカゴン／抗グルカゴンモノクローナル抗体複合体は、検出できるように、１５２Ｅｕ＋、またはランタニド系統の他のメンバーなどの蛍光発光金属を用いて、これらを、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などの金属キレート基を用いて付着させることによって標識されることもできる。
【００５２】
本発明の抗グルカゴン抗体もしくはその抗原結合性フラグメント、またはグルカゴン／抗グルカゴンモノクローナル抗体複合体は、リン光化合物または化学発光化合物に結合させることによって検出されるように標識されることができ、次いで化学反応の過程において生じるリン光または発光によって検出されることができる。有用な化学発光化合物の例としては、ルミノール、イソルミノール、セロマティックアクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩およびシュウ酸エステルが挙げられる。同様に、ルシフェリン、ルシフェラーゼまたはエクオリンなどの生物発光化合物を用いて、抗体ペプチドを標識することができる。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することで決定される。
【００５３】
本発明は、融合タンパク質を生成するために、ポリペプチド（またはその部分、該ポリペプチドの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００の連続アミノ酸を含むことが好ましい）に組換えで融合された、または化学的に結合（共有結合および非共有結合の両方を含む）された抗体を包含する。融合は必ずしも直接的である必要はないが、リンカー配列を介してもよい。
【００５４】
本発明のモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントは、標的抗原のイムノアッセイまたは精製に特に有用である固体支持体に付着させることもできる。そのような固体支持体としては、例えば、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが挙げられるがこれらに限定されない。
【００５５】
ポリペプチドに融合または結合された抗体は、当技術分野で既知の方法を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ内でのイムノアッセイでおよび精製方法で使用されてもよい（例えば、Harborら、上掲、および国際公開第９３１２１２３２号；欧州特許第４３９，０９５号；Naramuraら (1994) Immunol. Lett. 39:9 l-9; U.S. Patent No. 5,474,981; Gillies,ら 1992 PNAS 89:1428-32; Fell,ら 1991 J. Immunol. 146:2446-52を参照されたい）。
【００５６】
本発明は、可変領域以外の抗体ドメインに融合または結合したポリペプチド（またはそのフラグメント）を含む組成物をさらに含む。ポリペプチド（またはそのフラグメント）を抗体または抗体部分に融合または結合する方法は、既知である（例えば、米国特許第５，３３６，６０３号；同第５，６２２，９２９号；同第５，３５９，０４６号；同第５，３４９，０５３号；同第５，４４７，８５１号；同第５，１１２，９４６号；欧州特許第３０７，４３４号；同第３６７，１６６号；国際公開第９６／０４３８８号；同第９１０６，５７０号；Ashkenazi,ら(1991) PNAS 88: 10535-10539; Zheng,ら(1995) J. Immunol. 154:5590-5600;およびVie,ら(1992) PNAS 89: 11337- 11341を参照されたい）。
【００５７】
ポリペプチド、ポリペプチドフラグメントを本明細書に記述の抗体またはその抗原結合性フラグメントに融合または結合して、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させてもよい。さらに、ポリペプチド、ポリペプチドフラグメントを抗体またはその抗原結合性フラグメントに融合または結合して、精製を促進させてもよい。好適な実施形態において、ポリペプチドは、その多くが市販されている他のポリペプチドの中でｐＱＥベクター（QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA）に備えられているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドである。ヘキサヒスチジンは、タンパク質の簡便な精製を提供する（Gentz,ら(1989) PNAS 86:821-824）。精製に有用な他のペプチドタグとしては、例えば、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する「ＨＡ」タグ（Wilson,ら (1984) Cell 37:767）および「フラグ」タグが挙げられる。
【００５８】
本発明の抗体を用いる諸方法
本発明の抗体を診断上用いて、例えば、確立された技法を用いる所定の治療レジメンの有効性を決定するために、臨床試験手法の一部として糖尿病の発症または進行をモニターすることができる。本発明の抗グルカゴンモノクローナル抗体は、臓器の組織に関係なくグルカゴンを標的にする。グルカゴンは膵α細胞上で比較的大きく発現するために、膵β細胞または他の細胞とα細胞を区別することは可能である。また、α細胞によるグルカゴンの発現のために、グルカゴンの画像診断は、細胞型数および／または分布における膵臓の変化をモニターするのに一般的に有用であり得る。ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの画像診断を用いて、患者内のグルカゴン発現細胞またはグルカゴン過剰発現細胞の増殖、遊走もしくは減少を検出することができる。グルカゴンの発現は、前糖尿病患者または糖尿病患者のそれぞれにおいて疾病リスクまたは疾病進行と相関があり得る。グルカゴン標的画像診断を用いて、前糖尿病患者または糖尿病患者の糖尿病の進行を段階分けすることができることもあり、またはグルカゴンレベルの上昇が認められることと関連する別の疾病を検出することができ得る。
本発明の一実施形態は、グルカゴン受容体拮抗剤または他の抗糖尿病剤による治療について前糖尿病を有する患者を診断する方法を提供し、該方法は、（ａ）配列番号２９に示すアミノ酸配列からなるグルカゴンに特異的に結合する抗グルカゴン診断用モノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを体液と接触させることによって体液中のグルカゴンのレベルを決定することであって、前述の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、アミノ酸配列RSPKSLVGPMGRTYLY（配列番号１５）、RRNNLAP（配列番号１６）およびMQHLEFPLT（配列番号１７）をそれぞれ含む軽鎖相補性決定領域ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と、アミノ酸配列GYNFTDYWIH（配列番号１８）、YFSTHSDYAIINQKFRD（配列番号１９）およびGGLGLSY（配列番号２０）をそれぞれ含む重鎖相補性決定領域ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３とを含む、体液中のグルカゴンのレベルを決定することと；（ｂ）任意に、非特異的に結合したモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを除去することと；（ｃ）グルカゴンに特異的に結合しているモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントの量を検出および／または定量化することを含み、グルカゴンに特異的に結合した抗体またはその抗原結合性フラグメントが健康な個人で認められる範囲外で存在すると、選択のための患者における前糖尿病の診断、および適切なグルカゴン受容体拮抗剤または他の抗糖尿病剤による治療が特定される。前糖尿病の段階には、例えば、空腹時高血糖および耐糖能障害が挙げられる。空腹時高血糖または空腹時血糖異常（ＩＦＧ）とは、空腹時血糖が正常レベルと考えられるレベルを超えて上昇しているが、真性糖尿病として分類されるのには不十分である状態をいう。耐糖能障害（ＩＧＴ）よりはリスクが少ないが、ＩＦＧはインスリン抵抗性および心血管病理学のリスク増大に関連している前糖尿病状態と考えられる。耐糖能異常は、インスリン抵抗性および心血管病理学のリスクの増大に関連している糖代謝障害の前糖尿病状態である。ＩＧＴは、２型真性糖尿病に何年も先行することがある。他の抗糖尿病剤は当技術分野で既知であり、例えば、インスリン、メトホルミン、グリメピリドなどのスルホニル尿素、またはシタグリプチンなどのＤＰＰＩＶ阻害剤が挙げられる。
【００５９】
グルカゴンおよびインスリンのレベルは、例えば、シタグリプチンの開発中に用いられた。さらに、バイオマーカーとしてのグルカゴンは、膵臓の神経内分泌腫瘍（ＮＥＴ）の診断および／または有効な治療、ならびに膵臓の悪性腫瘍の診断にも有用であり得る（Kolb, A.,ら Glucagon/insulin ratio as a potential biomarker for pancreatic cancer in patients with new-onset diabetes mellitus. Cancer Biol Ther. 2009 Aug;8(16): 1527-33）。
【００６０】
通常、ｉｎ  ｖｉｖｏでの診断用途の検出性で必要とされる標識抗体の量は、患者の年齢、状態、性別、疾患の程度、もしあれば禁忌、および他の変数によって変化し、および主治医または診断医によって容易に調整されることができる。好ましい診断方法は、ラジオイムノ−シンチグラフィ分析である。これは、連続全身ガンマカメラ画像をもたらし、かつ定量「関心領域（ＲＯＩ）」分析によって領域活性の決定ができる方法で行われるのが好ましい。
【００６１】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの用途の場合、本発明の検出できるように標識した抗グルカゴン抗体またはその抗原結合性フラグメントは、投与のために簡便な形状に製剤化されることができる。診断の場合、本発明の検出できるように標識した抗グルカゴン抗体またはその抗原結合性フラグメントは、注射または注入によって、例えば非経口的に、全身的に投与されることができる。そのような注射または注入は、いかなる既知の経路、好ましくは静脈内注射もしくは注入、皮下注射、筋肉内注射もしくは注入、頭蓋内注射もしくは注入、またはくも膜下腔内注射もしくは注入、または腹腔内投与によってなされることができる。注射剤は、液剤もしくは懸濁剤として、または固形剤としてのいずれかの従来の形状で調製されることができる。そのような組成物は、当技術分野で周知の方法によって調製されることができ（例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th ed. (1995), A. Gennaro ら, Mack Publishing Co.,を参照されたい）、および本明細書に開示の抗グルカゴン抗体、および薬剤的もしくは診断上許容される担体、希釈剤または賦形剤を含むことができる。投与量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重まで変えることができる。画像診断用の適切な用量に関するさらなるガイダンスは、Smithら(1977) Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber ら,編集, Raven Press, New York, pages 365-389に見出すことができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでのグルカゴン検出目的のために、本抗グルカゴンモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントについての用語「有効量」とは、患者に単回投与または繰り返し投与すると、ｉｎ  ｖｉｖｏでグルカゴンを検出できる能力をもたらす抗体の量をいう。
【００６２】
イムノアッセイにおける本発明の抗体の使用
グルカゴンなどの特定のタンパク質は、種々のイムノアッセイによって測定されることができ、そのような方法としては、ウエスタンブロットの技術を用いる競合および非競合アッセイ系、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインＡイムノアッセイが挙げられるがこれらに限定されない。免疫学的手法およびイムノアッセイ手法の概要については、例えば、Stites and Terr (編集) (1991) Basic and Clinical Immunology (第７版)を参照されたい。さらに、本発明のイムノアッセイは、当技術分野で既知の多くの構成で行われることができる（例えば、Maggio (編集) (1980) Enzyme Immunoassay CRC Press, Boca Raton, Florida; Gosling J P 2000 Immunoassays: A Practical Approach (Practical Approach Series) Oxford Univ Press; Diamandis & Christopoulus, 1996 Immunoassay Academic Press, San Diego, CAを参照されたい）。
【００６３】
定量化のためのイムノアッセイは、当技術分野で既知の種々の方法によって行われることができる。手短に言えば、グルカゴンを測定するイムノアッセイは、競合または非競合結合アッセイである。競合結合アッセイにおいて、分析される試料は、固体の表面に結合された捕捉剤上で標識分析物と特異的結合部位において競合する。好ましくは、捕捉剤は、本明細書に記述のグルカゴンと特異的に反応するＩＢＡ０３２などの本発明の抗体である。捕捉剤に結合される標識分析物の濃度は、試料中に存在する遊離分析物の量と反比例する。
【００６４】
競合的結合イムノアッセイにおいて、試料（すなわちグルカゴン）中に存在する標的タンパク質は、標識グルカゴンと、ＩＢＡ００３２などの本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントにおいて競合する。ＩＢＡ０３２などの本発明の抗体またはその抗原結合性フラグメントは、固体表面に結合して、非結合標識タンパク質から結合標識タンパク質の分離をもたらすことができる。あるいは、競合結合アッセイは液相で行われてもよく、および当技術分野で既知の種々の技術を用いて、非結合した標識タンパク質から結合した標識タンパク質を分離することができる。分離に続いて、結合された標識タンパク質の量が決定される。試料中に存在するタンパク質の量は、標識タンパク質の結合量に反比例する。
【００６５】
あるいは、均質イムノアッセイは、分離ステップを必要とせずに実施されることもある。これらのイムノアッセイにおいて、タンパク質上の標識は、その特異的結合組成物へのタンパク質の結合によって変えられる。標識タンパク質のこの変更により、標識によって発せられるシグナルの増減がもたらされ、その結果イムノアッセイの最後に標識を測定することでそのタンパク質の検出または定量化が可能になる。
【００６６】
タンパク質への結合親和性が知られている１２５Ｉ−抗体などの標識抗体と細胞を接触させてインキュベートし、次いで結合組成物への試験試料の結合親和性を測定する場合、競合アッセイも特に有用である。次いで、結合した遊離標識結合組成物を分離して、タンパク質結合の程度を評価する。結合した試験化合物の量は、標識した結合パートナーの既知のソースへの結合量に反比例する。多数の技法のいずれかを用いて、遊離タンパク質から結合を分離して、タンパク質の結合程度を評価することができる。この分離ステップは、通常は、フィルターへの付着とそれに続く洗浄、プラスチックへの付着とそれに続く洗浄、または細胞膜の遠心などの手法を含むことがある。
【００６７】
特定の抗原を免疫沈降させる本発明の抗体の能力は、例えば、ウエスタンブロット分析によって評価されることができる。抗体の抗原への結合を増大させる、およびバックグラウンドを減少させる（例えば、細胞可溶化物をセファロースビーズで前もって除去することによって）ようにパラメータは変更可能であることについて当業者は周知である。免疫沈降プロトコルに関するさらなる考察は、例えば、Ausubelら, 編集., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkに見出すことができる。
【００６８】
ＥＬＩＳＡにおける本発明の抗体の使用
ＥＬＩＳＡ分析は、抗原を調製することと、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを該抗原でコーティングすることと、酵素基質（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ）などの検出できる標識に結合した関心の抗体を該ウェルに添加して一定時間インキュベートすることと、該抗原の存在を検出することとを含む。ＥＬＩＳＡにおいて、関心の抗体は、検出可能な標識に結合させる必要はないが、代わりに、検出可能な標識に結合した第２の抗体（関心の抗体を認識する）をウェルに添加してもよい。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、捕捉抗体をウェルにコーティングしてもよい。この場合、第２の抗体、すなわち、分析物の区別できる非競合エピトープに特異的であり、かつ検出可能な標識に結合された検出抗体は、コーティングしたウェルに関心の抗原を添加した後に添加されてもよい。当業者は、過度の実験を実施することなく、例えば、シグナルを増大させるためにどのパラメータを調整するか、ならびにＥＬＩＳＡの場合、どのような他の変化を用いるべきであるかを決定することができる（例えば、Ausubelら, 編集, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New Yorkを参照されたい）。
【００６９】
例えば、ＩＢＡ０３２はグルカゴン１−２９分子のＣ末端に特異的であり、およびグルカゴン１−２９ペプチドの中間領域に特異的なＩＢＡ００９または当技術分野で既知の他のグルカゴン捕捉抗体などのグルカゴン捕捉抗体と組み合わせて用いる場合、ヒト血液、血清または血漿中の総グルカゴンを測定するためのグルカゴン検出抗体として有用であり得る。
【００７０】
あるいは、当技術分野で既知の抗グルカゴンモノクローナル抗体などの第２のグルカゴン検出抗体と組み合わせて用いる場合、ＩＢＡ０３２は、ヒト血液中の総グルカゴンを測定するためのグルカゴン捕捉抗体として有用である。さらに、当技術分野で既知の他の抗グルカゴン検出抗体と組み合わせて用いる場合、ＩＢＡ００９は、血液、血漿または血清中のグルカゴン前駆体または部分的に処理された前駆体を測定するためのグルカゴン検出抗体として有用であり得る。
【００７１】
抗体の抗原への結合親和性および抗体−抗原相互作用の結合および解離速度は、例えば、競合結合アッセイを用いて決定されることができる。一非限定例は、非標識抗原の量を増加させて関心の抗原と共に標識抗原（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉを用いて）をインキュベートすることと、標識抗原に結合した抗体の量を検出することとを含むラジオイムノアッセイである。特定の抗原への関心の抗体の親和性および結合解離速度は、例えば、スキャッチャードプロット分析によってデータから決定されることができる。第２の抗体との競合は、例えば、ラジオイムノアッセイを用いて決定されることもできる。
【００７２】
製造物品およびキットにおける本発明の抗体の使用
本発明は、可溶性グルカゴンまたはグルカゴン陽性細胞を診断、検出、定量化および／または画像処理するのに有用な組成物を含む製造物品およびキットも提供する。製造物品は、ラベルが書かれた容器を含むこともある。容器は、検出できるように標識されている、または非標識されている本発明の抗グルカゴンモノクローナル抗体またはその抗原結合性フラグメントを含む組成物を保持してもよい。容器のラベルは、該組成物が糖尿病を予知するもしくはモニターするために、またはグルカゴンを発現させる特定タイプの細胞を診断するもしくはモニターするために、またはグルカゴンレベルが前兆となる状態をモニターするために、または治療の効果的な標的を予測するために用いられることを表示してもよい。別の実施形態において、該組成物がグルカゴンを検出および／または定量化するのに有用であることを表示してもよく、およびｉｎ  ｖｉｖｏ使用またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用のいずれかの使用説明を表示することもできる。
【００７３】
本発明のキットは、二次抗体またはグルカゴン抗原さえ含む容器も含むことができ、好ましくは、グルカゴン抗原は配列番号２９に示すヒトグルカゴンのＣ末端を含む。二次抗体またはグルカゴン抗原は、酵素または他の標識に結合されることができる。酵素の発色基質も、キットに含まれることができる。キットは、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、およびｉｎ  ｖｉｖｏ使用、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用または両方用の説明書と共に添付文書を含む、商業上およびユーザの観点から望ましい他の材料を含んでもよい。
【００７４】
本発明のモノクローナル抗体およびその抗原結合性フラグメントは、診断手法で有用であり、および例えば、前糖尿病患者および糖尿病患者を選択し層別化するため、所定の方法で採取された血液または組織試料を用いてグルカゴン受容体拮抗剤または他の糖尿病治療薬への患者の反応をモニターするために用いられることができる。
【００７５】
したがって、本方法は、新たに診断された糖尿病患者に、非侵襲的方法を用いて所与の状態がその後に糖尿病を進行させ得る可能性を評価するリスク層別化の方式を提供する。そのような情報により、個別の患者ベースで、適切なモニタリングおよび治療プロトコルを設計する能力が改善される。
【００７６】
本明細書に開示の本発明のグルカゴン抗体またはグルカゴン／抗グルカゴンモノクローナル抗体複合体および方法は、種々の哺乳類種の診断において使用されることができ、およびヒト医学または獣医学の実践において同じように適用できる。したがって、これらの抗体、複合体および方法は、家畜および商業用動物と共に、最も好ましくはヒトと共に使用されることができる。
【００７７】
以下の実施例は、例示目的だけに提供され、本発明の範囲を限定することを目的としない。
【００７８】
実施例１  抗体発現と精製
マウス抗グルカゴン抗体のパネルを、標準ハイブリドーマ技術を用いて得て、スクリーニングし、ＥＬＩＳＡベースアッセイを展開するのに用いることが可能な一対の試薬を特定する。突然変異を各抗体の個々の相補性決定領域（ＣＤＲ）に系統的に導入し、次いで親和性が向上したクローンを単離するために、得られたライブラリーを、抗原の濃度を低下させるおよび／または解離時間を増加させることで複数回の選択ラウンドにかける。個々の変異体の配列を決定し、コンビナトリアルライブラリーを構築するために用いる。このライブラリーを、個々のＣＤＲ領域間での相加変異または相乗変異の組み合わせを特定するために、ストリンジェンシーを増大させてさらなる選択ラウンドにかける。個々のコンビナトリアルクローンを配列決定して、結合特性を決定する。
【００７９】
下記の表題「アミノ酸配列およびヌクレオチド配列」の節に収載するように、重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸配列と、完全重鎖および軽鎖のアミノ酸配列と、同鎖をコードするヌクレオチド配列とを有する、本明細書でＩＢＡ００９およびＩＢＡ０３２と呼ぶ改変および／または最適化した抗グルカゴン抗体を得る。これらのフラグメントに対応する配列番号ならびに軽鎖と重鎖のＣＤＲアミノ酸配列を下記の表１に示す。
【００８０】
表１Ａ：抗体ＩＢＡ００９のＣＤＲアミノ酸配列
【表１】
2015505828.tif 000003
【００８１】
表１Ｂ：抗体ＩＢＡ０３２のＣＤＲアミノ酸配列
【表２】
2015505828.tif 000004
【００８２】
表１Ｃ：ＩＢＡ００９およびＩＢＡ０３２のアミノ酸配列
【表３】
2015505828.tif 000005
【００８３】
表１Ｄ：ＩＢＡ００９およびＩＢＡ０３２アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列
【表４】
2015505828.tif 000006
【００８４】
ＩＢＡ００９（配列番号１２と配列番号１４）およびＩＢＡ０３２（配列番号２６と配列番号２８）を含むがこれらに限定されない本発明の抗グルカゴン抗体またはその抗原結合性フラグメントは、標準トランスフェクション手法に続いてＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（Edge BioSystems, #90500130）中の発現に好適な当技術分野で既知のベクターを用いて、一時的に発現することができる。簡潔にいうと、配列番号１２と配列番号１４、または配列番号２６と配列番号２８を含む組換えベクターまたはベクター類を構築し、それを用いてＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を一時的にトランスフェクトすることができる。トランスフェクション後、トランスフェクトした細胞をジェネテシン（Ｇ４１８）およびトブラマイシンを含む標準無血清培地で４８〜１２０時間、３７℃で培養する。抗グルカゴン抗体を６０ｍＬ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Amersham Biosciences; #17-1279-04）上で製造業者の説明書に従って精製してもよく、およびさらに濃縮して、移動相としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４を用いて分子ふるいクロマトグラフィー（XK50/60 Superdex200, Pharmacia）で精製してもよい。次に、Ｍｉｌｌｅｖ−ＧＶ、ＰＶＤＦ膜、０．２２μｍ、３３ｍｍ（Millipore; #SLGV033RS）を用いて抗体調製物を濾過して、４〜８℃で貯蔵または−２０〜−８０℃で凍結保存してもよい。
【００８５】
実施例２  抗体ＩＢＡ００９およびＩＢＡ０３２の結合反応速度および親和性
グルカゴンに対する本発明の抗グルカゴンモノクローナル抗体の結合反応速度は、当技術分野で既知の方法により、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）２０００、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）３０００またはＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００（GE Health Care, Piscataway, NJ）などの表面プラズモン共鳴バイオセンサによって決定してもよい。注記がある場合を除いて、すべての試薬と材料をＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）から購入することが可能であり、測定は２５℃で行ってもよい。
【００８６】
簡潔に説明すると、抗グルカゴンモノクローナル抗体ＩＢＡ００９またはＩＢＡ０３２をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１５０ｍＭ  塩化ナトリウム、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％（ｗ／ｖ）界面活性剤Ｐ−２０、および１０ｍＭ  Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．４）；＃ＢＲ−１００１−８８）中で溶解させてもよい。抗グルカゴン抗体を捕捉するためにアミンカップリングケミストリーを用いて、ヤギ抗マウスＦｃ抗体をＣＭ５センサチップのフローセル１〜４上に４０００応答単位（ＲＵ）のレベルで固定する。結合を複数の分析サイクルを用いて評価してもよい。各サイクルは５０μＬ／分の流速で行い、以下のステップからなってもよい：４０〜１００ＲＵの捕捉を目標として約１０μＬの抗グルカゴンモノクローナル抗体ＩＢＡ００９またはＩＢＡ０３２を１０μｇ／ｍＬで注入、２５０μＬのグルカゴン（１−２９）（Anaspec 22456）の注入−（１００ｎＭで開始して、各サイクルに対して２倍段階希釈法を用いる）続いて２０分間の解離、および約３０μＬの１０ｍＭグリシン塩酸塩（ｐＨ１．５）を用いる再生。各サイクルの結合および解離速度は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア４．１での「１：１（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）結合」モデルを用いて評価されることができる。
【００８７】
抗グルカゴンモノクローナル抗体ＩＢＡ００９およびＩＢＡ０３２をグルカゴンへの結合反応速度について試験してもよい。下記の表２に示すように、ＩＢＡ００９およびＩＢＡ０３２は、極めて高い結合親和性（ＫＤ）でグルカゴンに結合する。表２にも結合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）のデータを示す。実施例１の抗体ＩＢＡ００９は、７．３×１０−１３ＭのＫＤを有すると決定した。実施例１の抗体ＩＢＡ０３２は、８．７×１０−１２ＭのＫＤを有すると決定した。これらのデータは、抗体ＩＢＡ００９およびＩＢＡ０３２の各々が高親和性でグルカゴンに結合することを示している。ＩＢＡ００９は、グルカゴンへの親和性が当技術分野で２Ｄ３−２Ｂ１１（Sigma-Aldrichから入手可能、製品番号WH0002641M1）として知られている抗グルカゴン抗体よりも約１３０倍強力であることを示している。ＩＢＡ０３２は、グルカゴンへの親和性が当技術分野でＫ７９ｂＢ１０（Sigma-Aldrichから入手可能、製品番号G2654）として知られている抗グルカゴン抗体よりも約８００倍強力であることを示している。
【００８８】
表２：抗体ＩＢＡ００９およびＩＢＡ０３２の結合反応速度と親和性
【表５】
2015505828.tif 000007
【００８９】
実施例３  ＩＢＡ００９およびＩＢＡ０３２を用いるヒトグルカゴンＥＬＩＳＡ
実施例１の抗体ＩＢＡ００９およびＩＢＡ０３２を利用して、患者におけるグルカゴンレベルについての酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を開発して検証する。グルカゴンサンドイッチＥＬＩＳＡをＭＳＤストレプトアビジン９６ウェルプレート上で行い、該プレートをＴＢＳＴ（１ｍＬのＴｗｅｅｎ２０／Ｌと共に１０ｍｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４０）、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌを含むＴｒｉｓ緩衝生理食塩水）で３回洗浄し、次いでＴＢＳに溶解させた１％卵白アルブミン（Sigma）を用いて室温で１時間ブロックする。該プレートの洗浄に続いて、５０μＬのビオチン標識ＩＢＡ００９捕捉抗体（１μｇ／ｍＬ）を添加して、１時間軽く振盪しながら該プレートに結合させる。その後、ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、次いで検量線を作成するために、５０ｍｍｏｌ／ＬのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４０）、１５０ｍｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１０ｍＬ／ＬのＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡおよび５ｍｍｏｌ／ＬのＥＧＴＡならびに１％卵白アルブミンからなり、１００μｇ／ｍＬのヘテロ親和性ブロッキング試薬（Scantibodies）を補充してあるアッセイ緩衝液に溶解させた種々の濃度のグルカゴンタンパク質（例えば、配列番号２９）からなる各標準グルカゴン１００μＬを各ウェルに添加する。血漿サンプルを同じアッセイ緩衝液で１：８に希釈して、それぞれのウェルに添加し、軽く搖動させながら室温で２．５時間インキュベートする。吸引に続いて、ウェルをＴＢＳＴで３回洗浄し、５０μＬの１μｇ／ｍＬルテニウム標識結合グルカゴン特異的検出抗体ＩＢＡ０３２を各ウェルに添加して、これらを室温で２．５時間インキュベートする。再度、プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、各ウェルに１５０μＬの２Ｘ−ＭＳＤ  Ｒｅａｄ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｔを添加する。次いでプレートを、ルテニウム電気化学発光を記録するＭＳＤリーダー上でプレートを読み取る。４ＰＬフィット（ＭＳＤディスカバリーワークベンチ）を用いて、試料中のグルカゴンの濃度を参照標準グルカゴン（Eli Lilly and Company）で作成した標準曲線に対して補間する。ＥＬＩＳＡ検量線のフィッティングおよび未知値の補間のためにＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙソフトウェアを使用する（図２を参照されたい）。
【００９０】
インクレチンペプチドスーパーファミリーの他の密接に関連したメンバーに対するＥＬＩＳＡの特異性も、オキシントモジュリン、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２、セクレチンおよび血管作用性小腸ペプチドを用いて、例えば、各々１００ｎｇ／ｍＬの濃度で試験してもよい。これらの他のペプチドのいずれでも交差反応性は観察されず、実施例３のＥＬＩＳＡがグルカゴンに対する特異性を備えていることを示す。本発明のＥＬＩＳＡは、優れた回収率、精度および直線性、ならびに０．１４ｐｍｏｌ／Ｌから１９５０ｐｍｏｌ／Ｌの広範なダイナミックレンジを示す。２０％のＣＶでのＬＬＯＱが０．１４ｐｍｏｌ／Ｌであると決定する。分析の前に試料を１：８で希釈するので、これは報告できる下限の１．１２ｐｍｏｌ／Ｌに相当する。
【００９１】
５８の健康な単一ドナー血漿試料を分析して参照範囲を確立する。平均グルカゴンレベルが１３．１±０．７ｐｍｏｌ／Ｌであり、観察範囲が５．３〜３７．４ｐｍｏｌ／Ｌであると決定し、正常な個人においてグルカゴンレベルを検出するための適切な感受性を超える感受性をＥＬＩＳＡが有することを示す。
【００９２】
アセトン抽出に続いて、正常で健康な被験者からの血漿中のグルカゴンの測定により１２ｐｍｏｌ／Ｌの平均値が示されている（Von Schenck H, Nilsson OR. Radioimmunoassay of extracted glucagon compared with three non-extraction assays. Clinica Chimica Acta 1981; 109:183-191）。これは実施例３のＥＬＩＳＡで測定した同様の試料から得られた値と一致する。
【００９３】
サンドイッチＥＬＩＳＡ形式での本発明の高親和性の改変モノクローナル抗体の使用により、感受性が高くかつ特異的なグルカゴンの濃度を測定するための確実で高感受性でありかつ簡便な高スループット方法を提供する。本明細書に記述のＥＬＩＳＡ方法には、現在利用できるＲＩＡ方法に勝るいくつかの利点がある。第一に、このアッセイは、グルカゴンに結合する２つの高親和性モノクローナル抗体を用いる。これのため、モノクローナル抗体の持続可能な生産が可能になり、かつポリクローナル抗血清に依存しない。ポリクローナル抗血清を避けることで、ポリクローナル血清の１バッチの量が限定される問題およびそのような抗血清バッチ間の変わりやすい品質を解決する。ＩＢＡ０３２およびＩＢＡ００９を含む本発明のＥＬＩＳＡは、Ａｌｐｃｏ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから現在入手できるラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）キットに勝るいくつかの重要な利点を提供する。例えば、ＲＩＡで測定する場合、血漿グルカゴンレベルは、使用される特定の抗血清によって変化することがわかっている。Ｃ末端に向けられるポリクローナル抗血清を利用する当技術分野でのＲＩＡ方法は、恐らくグルカゴンペプチドの保存特質のせいで、特に短いダイナミックレンジ（約５ｐｍｏｌ／Ｌから１５０ｐｍｏｌ／Ｌ）を有し、したがって免疫原性が不十分である。対照的に、実施例３のサンドイッチＥＬＩＳＡによる高親和性最適化モノクローナル抗体およびＭｅｓｏｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）電気化学発光（ＥＣＬ）形式を利用すると、拡張範囲と優れた感受性を有するアッセイが提供される。さらに、ガラス管で行う必要のあるＲＩＡの形式と対照的に、実施例３の９６ウェルプレートをベースにするアッセイ形式により、より大きなスループットと良好な自動化が可能になる。加えて、実施例３のサンドイッチＥＬＩＳＡは、さらに、放射性廃棄物に関連する経費、有効期限が短い標識トレーサー、および１〜２ヵ月ごと製造する必要のあるトレーサーのロット間の差異を回避する。
【００９４】
本モノクローナル抗体の別の利点は、抗体ＩＢＡ０３２のＣ末端特異性であり、結果として本抗体はオキシントモジュリンに結合しない。オキシントモジュリンは、グルカゴン１−２９配列および８アミノ酸カルボキシ末端伸長を含むペプチドであり、かつこのＣ末端特異性がない当技術分野で既知の他のグルカゴンアッセイでは、偽陽シグナルの原因になり得る。
【００９５】
ＥＬＩＳＡアッセイは感受性の増大を示し、当技術分野で既知の諸方法よりおよそ１０倍感受性が高い。さらに、ＥＬＩＳＡが必要とする試料は、少ない量、すなわちおよそ１０倍少ない量を必要とし、およびアッセイが必要とする完了するまでの時間もＲＩＡの３日と比べて、およそ６時間と短い。加えて、本発明のＥＬＩＳＡは、確実なダイナミックレンジを示し、かつ試料レベルが当技術分野のＲＩＡ方法のハイエンドの定量化範囲を超え、したがって一貫性のない結果をもたらすことが多いさらなる凍結融解と、より高い希釈度での再実行とを必要とする際に経験する問題を回避する。
【００９６】
図２に示すように感受性およびダイナミックレンジの増大のため、本発明のＥＬＩＳＡは、同様に、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）から販売されているキットに勝る利点を示す。本発明のＥＬＩＳＡは、驚くほど向上した感受性を示し、かつ既存のＭＳＤグルカゴンアッセイキットで試験可能であると報告されているレベルを下回るレベルで、血漿および／または血清の試料中のベースライングルカゴンを検出することができる。さらに、本発明のＥＬＩＳＡは、著しく広範囲（４ｌｏｇを超える）のグルカゴン濃度にわたるグルカゴンレベルにおいて比較的小さい変化を検出することができる。通常の希釈が１：８であり、結果として生じる１２．５％血清または血漿マトリックスおよび８７．５％緩衝液濃度が「マトリックス干渉」としても知られている混乱させる交差反応性を最小限に抑えるような感受性を本発明のＥＬＩＳＡは示す。
【００９７】
アミノ酸配列およびヌクレオチド配列
＜配列番号１；ＰＲＴ１、人工＞［ＩＢＡ００９  ＬＣＤＲ１］
KASENAGTYVA 
＜配列番号２；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ００９  ＬＣＤＲ２］
NGSHRYD
＜配列番号３；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ００９  ＬＣＤＲ３］
GQSYSYPWT
＜配列番号４；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ００９  ＨＣＤＲ１］
GYNFNDYWLN
＜配列番号５；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ００９  ＨＣＤＲ２］
NAYPGWGIINYNEKFKS
＜配列番号６；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ００９  ＨＣＤＲ３］
DYDNAY
＜配列番号７；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ００９  ＬＣＶＲ］
NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENAGTYVAWYQQKPEQSPKLLIYNGSHRYDGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYYCGQSYSYPWTFGGGTKLEMKR
＜配列番号８；ＤＮＡ；人工＞［ＩＢＡ００９  ＬＣＶＲ］
AACATTGTGATGACCCAGAGCCCGAAAAGCATGAGCATGAGCGTGGGCGAACGTGTGACCCTGACCTGCAAAGCGAGCGAGAACGCTGGCACCTATGTTGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGAACAGTCTCCGAAACTGCTGATCTATAATGGGAGCCACCGGTATGACGGCGTGCCGGATCGTTTTACCGGCAGCGGCAGCGCGACCGATTTCACCCTGACCATTAGCAGCGTGCAGGCGGAAGATCTGGCGGATTATTACTGCGGCCAGAGCTATAGCTATCCGTGGACCTTTGGCGGTGGGACCAAGCTGGAAATGAAACGG
＜配列番号９；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ００９  ＨＣＶＲ］
QVQLLQPGAELVKPGASVKLSCKASGYNFNDYWLNWVKQRPGQGLEWIGNAYPGWGIINYNEKFKSKVTLTVDTSSSTVYMQLSSLTSDDSAVYYCARDYDNAYWGQGTTVTVSS
＜配列番号１０；ＤＮＡ；人工＞［ＩＢＡ００９  ＨＣＶＲ］
CAGGTGCAGCTGCTGCAGCCGGGTGCCGAACTGGTTAAACCGGGTGCCAGCGTGAAACTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAACTTCAACGACTATTGGCTTAACTGGGTGAAACAGCGTCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCAATGCCTATCCGGGCTGGGGCATCATTAACTATAACGAAAAATTCAAAAGCAAAGTGACCCTGACCGTGGATACCAGCAGCAGCACCGTGTATATGCAGCTGTCTAGCCTGACCAGCGATGATAGCGCGGTGTATTATTGCGCGCGTGATTATGATAACGCGTATTGGGGTCAGGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCA
【００９８】
＜配列番号１１；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ００９  ＬＣ］
NIVMTQSPKSMSMSVGERVTLTCKASENAGTYVAWYQQKPEQSPKLLIYNGSHRYDGVPDRFTGSGSATDFTLTISSVQAEDLADYYCGQSYSYPWTFGGGTKLEMKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
＜配列番号１２；ＤＮＡ；人工＞［ＩＢＡ００９１  ＬＣ］
AACATTGTGATGACCCAGAGCCCGAAAAGCATGAGCATGAGCGTGGGCGAACGTGTGACCCTGACCTGCAAAGCGAGCGAGAACGCTGGCACCTATGTTGCGTGGTATCAGCAGAAACCGGAACAGTCTCCGAAACTGCTGATCTATAATGGGAGCCACCGGTATGACGGCGTGCCGGATCGTTTTACCGGCAGCGGCAGCGCGACCGATTTCACCCTGACCATTAGCAGCGTGCAGGCGGAAGATCTGGCGGATTATTACTGCGGCCAGAGCTATAGCTATCCGTGGACCTTTGGCGGTGGGACCAAGCTGGAAATGAAACGGGCTGATGCGGCGCCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
＜配列番号１３；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ００９  ＨＣ］
QVQLLQPGAELVKPGASVKLSCKASGYNFNDYWLNWVKQRPGQGLEWIGNAYPGWGIINYNEKFKSKVTLTVDTSSSTVYMQLSSLTSDDSAVYYCARDYDNAYWGQGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
【００９９】
＜配列番号１４；ＤＮＡ；人工＞［ＩＢＡ００９  ＨＣ］
CAGGTGCAGCTGCTGCAGCCGGGTGCCGAACTGGTTAAACCGGGTGCCAGCGTGAAACTGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAACTTCAACGACTATTGGCTTAACTGGGTGAAACAGCGTCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCAATGCCTATCCGGGCTGGGGCATCATTAACTATAACGAAAAATTCAAAAGCAAAGTGACCCTGACCGTGGATACCAGCAGCAGCACCGTGTATATGCAGCTGTCTAGCCTGACCAGCGATGATAGCGCGGTGTATTATTGCGCGCGTGATTATGATAACGCGTATTGGGGTCAGGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCGCTAGCCCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCATGGTGACCCTGGGCTGTCTGGTGAAGGGCTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGACCTGGAACAGCGGCTCTCTGTCTAGCGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGTACACCCTGAGCAGCAGCGTGACCGTGCCTAGCAGCACATGGCCTAGCGAGACCGTGACATGCAACGTGGCCCACCCTGCCTCTTCTACCAAGGTGGACAAGAAGATCGTGCCCAGAGACTGCGGCTGCAAGCCTTGCATCTGCACCGTGCCTGAGGTGAGCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAAGCCCAAGGACGTGCTCACCATCACCCTCACCCCCAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAA
＜配列番号１５；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ０３２  ＬＣＤＲ１］
RSPKSLVGPMGRTYLY
＜配列番号１６；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ０３２  ＬＣＤＲ２］
RRNNLAP
＜配列番号１７；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ０３２  ＬＣＤＲ３］
MQHLEFPLT
＜配列番号１８；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ０３２  ＨＣＤＲ１］
GYNFTDYWIH
＜配列番号１９；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ０３２  ＨＣＤＲ２］
YFSTHSDYAIINQKFRD
＜配列番号２０；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ０３２  ＨＣＤＲ３］
GGLGLSY
【０１００】
＜配列番号２１；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ０３２  ＬＣＶＲ］
DIVMTQAAPSVLVTPGESVSISCRSPKSLVGPMGRTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRRNNLAPGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGIYYCMQHLEFPLTFGAGTKLEIKR
＜配列番号２２；ＤＮＡ；人工＞［ＩＢＡ０３２  ＬＣＶＲ］
GATATTGTGATGACCCAGGCAGCGCCGAGCGTTCTGGTTACCCCGGGTGAAAGCGTGAGCATTAGCTGCCGAAGCCCAAAAAGCCTAGTGGGTCCCATGGGAAGGACCTATCTATATTGGTTTCTGCAGCGTCCGGGTCAGAGCCCGCAGCTGCTGATTTATCGTCGGAACAACCTGGCACCAGGTGTGCCGGATCGTTTTAGCGGCAGCGGTAGCGGCACCGCGTTTACCCTGCGTATTAGCCGTGTGGAAGCGGAAGATGTGGGCATTTATTATTGCATGCAGCACCTGGAATTCCCGCTGACCTTTGGTGCGGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGG
＜配列番号２３；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ０３２  ＨＣＶＲ］
QVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYNFTDYWIHWVKERPGQGLEWIGYFSTHSDYAIINQKFRDKATLTADKSSRLAYMQLSSLTSEDSAIYYCARGGLGLSYWGQGTTVTVSS
＜配列番号２４；ＤＮＡ；人工＞［ＩＢＡ０３２  ＨＣＶＲ］
CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCGGAACTGGTGAAACCGGGTGCGAGCGTGAAAATGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAACTTTACAGATTATTGGATTCACTGGGTGAAAGAACGTCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATTTTAGTACGCATAGCGATTATGCCATCATTAACCAGAAATTCAGAGATAAAGCGACCCTGACCGCGGATAAAAGCAGCCGTCTGGCCTATATGCAGCTGTCTAGCCTGACCAGCGAAGATAGCGCGATTTATTACTGCGCGCGTGGCGGCTTAGGCCTGAGCTATTGGGGCCAGGGTACCACGGTCACAGTCTCCTCA
＜配列番号２５；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ０３２  ＬＣ］
DIVMTQAAPSVLVTPGESVSISCRSPKSLVGPMGRTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRRNNLAPGVPDRFSGSGSGTAFTLRISRVEAEDVGIYYCMQHLEFPLTFGAGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
【０１０１】
＜配列番号２６；ＤＮＡ；人工＞［ＩＢＡ０３２  ＬＣ］
GATATTGTGATGACCCAGGCAGCGCCGAGCGTTCTGGTTACCCCGGGTGAAAGCGTGAGCATTAGCTGCCGAAGCCCAAAAAGCCTAGTGGGTCCCATGGGAAGGACCTATCTATATTGGTTTCTGCAGCGTCCGGGTCAGAGCCCGCAGCTGCTGATTTATCGTCGGAACAACCTGGCACCAGGTGTGCCGGATCGTTTTAGCGGCAGCGGTAGCGGCACCGCGTTTACCCTGCGTATTAGCCGTGTGGAAGCGGAAGATGTGGGCATTTATTATTGCATGCAGCACCTGGAATTCCCGCTGACCTTTGGTGCGGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCGGCGCCCACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCTAGCGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
＜配列番号２７；ＰＲＴ１；人工＞［ＩＢＡ０３２  ＨＣ］
QVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYNFTDYWIHWVKERPGQGLEWIGYFSTHSDYAIINQKFRDKATLTADKSSRLAYMQLSSLTSEDSAIYYCARGGLGLSYWGQGTTVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
【０１０２】
＜配列番号２８；ＤＮＡ；人工＞［ＩＢＡ０３２  ＨＣ］
CAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGTGCGGAACTGGTGAAACCGGGTGCGAGCGTGAAAATGAGCTGCAAAGCGAGCGGCTATAACTTTACAGATTATTGGATTCACTGGGTGAAAGAACGTCCGGGCCAGGGCCTGGAATGGATTGGCTATTTTAGTACGCATAGCGATTATGCCATCATTAACCAGAAATTCAGAGATAAAGCGACCCTGACCGCGGATAAAAGCAGCCGTCTGGCCTATATGCAGCTGTCTAGCCTGACCAGCGAAGATAGCGCGATTTATTACTGCGCGCGTGGCGGCTTAGGCCTGAGCTATTGGGGCCAGGGTACCACGGTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCGCTAGCCCCTGGATCTGCCGCCCAGACCAACAGCATGGTGACCCTGGGCTGTCTGGTGAAGGGCTACTTCCCTGAGCCTGTGACAGTGACCTGGAACAGCGGCTCTCTGTCTAGCGGCGTGCACACATTCCCTGCCGTGCTGCAGAGCGACCTGTACACCCTGAGCAGCAGCGTGACCGTGCCTAGCAGCACATGGCCTAGCGAGACCGTGACATGCAACGTGGCCCACCCTGCCTCTTCTACCAAGGTGGACAAGAAGATCGTGCCCAGAGACTGCGGCTGCAAGCCTTGCATCTGCACCGTGCCTGAGGTGAGCAGCGTGTTCATCTTCCCACCCAAGCCCAAGGACGTGCTCACCATCACCCTCACCCCCAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAA
＜配列番号２９；ＰＲＴ１；ヒト＞［グルカゴン］
HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNT
【図１Ａ】
2015505828.tif 000008
【図１Ｂ】
2015505828.tif 000009
【図２】
2015505828.tif 000010
【図３】
2015505828.tif 000011
【配列表】
2015505828000001.app
【国際調査報告】
2015505828.tif 000012
2015505828.tif 000013
2015505828.tif 000014