(57)【要約】  本発明は、対象の目に移植された組織における経時的な形態変化をモニタリングすることにより、対象の臓器の生理学的状態をモニタリングする方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の臓器の生理学的状態をモニタリングする方法であって、前記対象の目に移植された組織における経時的な形態変化をモニタリングすることを含み、前記組織が目的の臓器由来であり、および前記対象の目に移植された組織における経時的な形態変化が前記対象における前記目的の臓器の生理学的状態を示す、方法。
【請求項２】
前記対象における障害の処置過程の効能をモニタリングするために用いられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記処置過程が前記対象への治療薬の投与を含む、請求項２に記載の方法であって、前記対象における前記治療薬の効能をモニタリングする、方法。
【請求項４】
前記処置過程が食事および／または運動レジメンを含む、請求項２または３に記載の方法であって、前記対象における前記食事および／または運動レジメンの効能をモニタリングする、方法。
【請求項５】
前記移植された組織が前記対象から得られる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記目的の臓器が膵臓、肺、心臓、脳、腎臓、肝臓、小腸、大腸、結腸、胃、胆嚢、食道、尿管、尿道、卵巣、子宮、乳房、脊髄、前立腺、視床下部、副腎、脳下垂体、甲状腺、副甲状腺、松果腺、脾臓、胸腺、直腸、乳腺、精嚢、糸球体、脂肪組織、腫瘍、および精巣からなる群より選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記目的の臓器が外分泌腺を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記外分泌腺が汗腺、唾液腺、乳腺、胃、肝臓、および膵臓からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記目的の臓器が内分泌腺を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記内分泌腺が脳下垂体、膵臓、卵巣、精巣、甲状腺、および副腎からなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記目的の臓器が、膵臓である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記組織が単離された膵ランゲルハンス島を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記形態変化が前記組織の細胞サイズ、前記組織の細胞容積、前記組織の細胞面積、前記組織の細胞形状、前記組織の細胞死、前記組織の細胞増殖、前記組織の細胞量、前記組織の血液灌流、前記組織の細胞の光反射性、および前記組織の細胞の顆粒化からなる群より選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記対象が非ヒト哺乳動物である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記非ヒト哺乳動物がヒト疾患の動物モデルを有する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象が霊長類であって、前記霊長類が前記目的の臓器に関連する疾患を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象がヒトであって、前記ヒトが前記目的の臓器に関連する疾患を有する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒトが糖尿病を有し、および前記目的の臓器が膵臓である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記目的の臓器が腫瘍である、請求項１〜５および１３〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
治療薬または試験化合物を前記対象に投与すること、および前記投与により生じた形態変化をモニタリングすること、を更に含む、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記移植された組織における形態変化が前記投与後の２つ以上の時点で決定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記形態変化が顕微鏡検査によりモニタリングされる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記組織が前記対象の前眼房に移植される、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本願は、全体として参照により本明細書に組み入れられる、２０１２年７月２７日出願の米国特許仮出願第６１／６７６５７８号への優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
背景
数多くの異なる実験的アプローチが、β細胞量の定量と、最終的には膵島のリモデリングの表示を可能にする。インビトロ技術には、ポイントカウント形態計測法による膵臓の組織切片の分析、および切除された膵臓組織の膵島寸法の直接測定がある。エクスビボ撮像技術は、共焦顕微鏡検査または光干渉顕微鏡検査による露出された膵臓の撮像を含む。最後に、複数の非侵襲性インビボ撮像技術は、総β細胞量の縦断的定量、即ち、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）、バイオルミネセンスイメージング、または複合的な多モード撮像法を目指すものである。しかし、これらの様々な技術は、個々の膵島における経時的な形態変化を追跡する可能性を示していないため、これらの技術は、膵島の可塑性に関する間接的証拠を提供するに過ぎない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
発明の概要
本発明は、対象の臓器の生理学的状態をモニタリングする方法であって、対象の目に移植された組織における経時的な形態変化をモニタリングすることを含み、該組織が目的の臓器のものであり、対象の目に移植された組織における経時的な形態変化が対象における目的の臓器の生理学的状態を示す、方法を提供する。一実施形態において、該方法は、対象における障害の処置過程の効能をモニタリングするために用いられる。この実施形態において、処置過程は、対象への治療薬の投与を含んでいてもよく、該方法は、個体における治療薬の効能をモニタリングする。更なる実施形態において、処置過程は、食事および／または運動レジメンを含んでいてもよく、該方法は、個体における食事および／または運動レジメンの効能をモニタリングする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
別の実施形態において、移植組織は対象から得られてもよい。更なる実施形態において、目的の臓器は、膵臓、肺、心臓、脳、腎臓、肝臓、小腸、大腸、結腸、胃、胆嚢、食道、尿管、尿道、卵巣、子宮、乳房、脊髄、前立腺、視床下部、副腎、脳下垂体、甲状腺、副甲状腺、松果腺、脾臓、胸腺、直腸、乳腺、精嚢、糸球体、脂肪組織、腫瘍、および精巣からなる群より選択されてもよい。
【０００５】
別の実施形態において、目的の臓器は、非限定的に汗腺、唾液腺、乳腺、胃、肝臓、および膵臓をはじめとする外分泌腺を含んでいてもよい。別の実施形態において、目的の臓器は、非限定的に脳下垂体、膵臓、卵巣、精巣、甲状腺、および副腎をはじめとする内分泌腺を含んでいてもよい。一実施形態において、目的の臓器は膵臓である。この実施形態において、組織は単離された膵ランゲルハンス島を含んでいてもよい。
【０００６】
様々な実施形態において、形態変化は、組織の細胞サイズ、組織の細胞容積、組織の細胞面積、組織の細胞形状、組織の細胞死、組織の細胞増殖、組織の細胞量、組織の血液灌流、組織の細胞の光反射性、および組織の細胞の顆粒化からなる群より選択されてもよい。別の実施形態において、形態変化は、顕微鏡検査によりモニタリングしてもよい。更なる実施形態において、対象は非ヒト哺乳動物である。一実施形態において、非ヒト哺乳動物は、ヒト疾患の動物モデルを有する。別の実施形態において、対象は、目的の臓器に関連する疾患を有するヒトである。様々な実施形態において、疾患は糖尿病を含んでいてもよく、目的の臓器は膵臓であってもよく、または疾患は癌を含んでいてもよく、つまり目的の臓器は腫瘍を含む。更なる実施形態において、方法は、治療薬または試験化合物を対象に投与すること、および投与により生じた形態変化をモニタリングすること、を更に含んでいてもよい。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】ｏｂ／ｏｂマウスの膵臓における高いインスリン要求量に適合する膵島サイズの増加。（Ａ）対照の同腹子（右）と比較したｏｂ／ｏｂマウス（左）の代表的な形態学的外観であり、顕著な肥満表現型を示す；（Ｂ）異なる年齢のｏｂ／ｏｂマウスおよび対照マウスの空腹時体重により、ｏｂ／ｏｂマウスにおける急速な体重増加が示される；（Ｃ）ｏｂ／ｏｂマウスおよび対照マウスにおける空腹時血糖レベルおよび血漿インスリンレベル；ヘマトキシリンおよびエオジンにより染色された（Ｄ）ｏｂ／ｏｂマウスおよび（Ｅ）対照同腹子の膵臓の５μｍ厚切片の画像モンタージュ。膵島切片の淡灰色の染色に留意されたい；（Ｄ、Ｅ）の挿入図は、典型的な膵島の寸法および形態の拡大図を示す。マウスは、（Ａ）４ヶ月齢、（Ｃ）３ヶ月齢、および（Ｄ、Ｅ）８ヶ月齢であった。（Ｂ、Ｃ）：オスおよびメスを混合した場合の値（ｏｂ／ｏｂマウスおよび対照同腹子で、それぞれｎ＝雄５匹＋雌４匹、および雄５匹＋雌５匹）。スケール＝１ｍｍ、挿入図の寸法は、１ｍｍ×１ｍｍである。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍである；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２】膵島の成長のインビボ縦断的撮像。（Ａ）４週齢のマウスの膵島を４週齢の対照マウス（上列）およびｏｂ／ｏｂマウス（下列）の前眼房に移植した。異なる時点での移植された目の写真から、個々の膵島が同定され得て縦断的に追跡され得ることが示される（黄色い破線の円を参照）；（Ｂ）膵島移植片の拡大図（Ａで赤い枠が付されている）から、ｏｂ／ｏｂレシピエントの虹彩に生着された膵島内に、はっきりと分かる大きな蛇行した血管が示され；（Ｃ）共焦顕微鏡検査による移植後１ヶ月目の単一膵島のインビボ撮像から、対照マウスとｏｂ／ｏｂマウスとの間に、膵島移植片の形態学的差異が示される。ＦＩＴＣ標識デキストランの予備静脈内注射により、血管形成を画像化している。後方散乱の強度および脈管径の差に留意されたい；（Ｄ）共焦顕微鏡検査による、異なる移植後時点での膵島移植片のインビボ撮像；（Ｅ）後方散乱画像の分析による膵島容積の定量から、対照（破線）と比較して、ｏｂ／ｏｂマウス（実線）の有意な成長増加が明らかである。灰色の線は、一匹のマウスの平均膵島容積を表し、黒色の線は、遺伝子型ごとに得られた平均値を表す（ｎ＝３）；（Ｆ）免疫組織化学的分析から、インスリンおよびＫｉ６７染色により見られる通り、ｏｂ／ｏｂマウスの移植された目および膵臓の両方で、β細胞の顕著な増殖が示される；（Ｇ）β細胞の平均面積を、インスリンおよびＤＡＰＩ染色から定量しており、ｏｂ／ｏｂマウスのβ細胞（実線）が対照同腹子のもの（破線）よりも有意に大きいことが実証された。この肥大は類似しており、膵島が膵臓の生体内原位置に存在するか、または移植された目に存在するかにかかわらない（有意差がない）。画像は全て、代表的である。共焦画像は、光学Ｚスタックの最大値投影法（ＭＩＰ）で示されている。免疫組織化学的実験は、４ヶ月齢マウス（ｎ≧３／群）を用いて実施した。サイズバー＝１００μｍ。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍ．を表す；＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１。
【図３】ｏｂ／ｏｂマウスに及ぼすレプチン処置の生理学的影響。（Ａ）ｏｂ／ｏｂマウスは、３ヶ月齢〜４ヶ月齢にレプチンの連日腹腔内注射を受けた。体重、血糖値および血漿インスリンレベルを、処置前、処置中、および処置後にモニタリングした（処置の開始および終了を垂直な破線により表す）；（Ｂ）腹腔内耐糖能試験から、４ヶ月齢の対照同腹子と比較して、ｏｂ／ｏｂマウスでのグルコース処理障害が示され（上の図）、それはレプチン処理により正常化されるが、偽処置では正常化されない（中央の図）。下の棒グラフは、先の図の曲線下面積（ＡＵＣ）値を示しており、グルコース処理に及ぼすレプチンの有益な影響が実証される。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である；＊ｐ＜０．０１；＊＊ｐ＜０．００１。
【図４】レプチン処置はｏｂ／ｏｂマウス膵島を調節不全から回復させる。（Ａ）３ヶ月齢〜４ヶ月齢の間のレプチン処置（上図）または偽処置（下図）を受けたｏｂ／ｏｂマウスの膵島移植片の縦断的インビボ撮像。デキストラン−ＦＩＴＣの尾静脈注射により、脈管を視覚化した；（Ｂ）膵島容積の分析により、偽処置（白色のバー）と比較して、レプチン処置（灰色のバー）時の膵島成長の後退が示され；レプチン処置または偽処置の終了後の膵島成長に差異は存在しなかった。（Ｃ）レプチン処置の終了時の、ｏｂ／ｏｂマウスの移植された目および膵臓での免疫組織化学検査から、インスリンおよびＫｉ６７の免疫染色によりβ細胞増殖の減弱が実証された（比較として図２Ｆ参照）。共焦画像は代表であり、ＭＩＰとして示されている。サイズバー＝１００μｍ。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図５】膵島内の血管形成に及ぼすレプチン処置の影響。膵島を４週齢のｏｂ／ｏｂマウスの前眼房に移植した。マウスは３ヶ月齢でレプチンの連日腹腔内注射を受けた。（Ａ）レプチン投与は、処置の開始前および処置の１週間後に、同じ膵島のインビボ撮像により見られる通り、血管径への急速な影響を有した（血管形成をデキストラン−ＦＩＴＣの尾静脈注射により視覚化した）。同じ脈管区分を異なる時点で同定でき、その径を測定できた（赤色の線を参照）。本発明者らがレプチン投与後の血管新生を観察し得たことに留意されたい（矢印）；（Ｂ）個々の脈管径の縦断的分析から、レプチン処置前、処置中および処置後の脈管の形態変化が示される（上図、ｏｂ／ｏｂマウスの膵島移植片の２０の脈管区分を経時的に表し、下の棒グラフは１月あたりの対応する平均径増加量を示す）。共焦画像は代表的であり、ＭＩＰとして示されている。サイズバー＝１００μｍ。値は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．である；＊＊＊ｐ＜０．００１。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な記載
引用された参考資料は全て、全体として参照により本明細書に組み入れられる。この出願内では、他に断りがなければ、用いられた技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１８５，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｄ．Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９１．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｈｃｅｒ，ｅｄ．，（１９９０）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）内“Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”、ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ，ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ．１９８７．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｐｐ．１０９−１２８，ｅｄ．Ｅ．Ｊ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｃｌｉｆｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ならびにｔｈｅ  Ａｍｂｉｏｎ  １９９８  Ｃａｔａｌｏｇ（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）などの複数の周知の参考資料のいずれかに見出され得る。
【０００９】
本明細書で用いられる単数形態の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に明確な断りがなければ、複数のものを含む。本明細書で用いられる「ａｎｄ」は、他に明白な断りがなければ、「ｏｒ」と互換的に用いられる。
【００１０】
本発明の任意の態様の全ての実施形態は、他に明確な断りがなければ、組み合わせて用いることができる。
【００１１】
第一の態様において、本発明は、対象の臓器の生理学的状態をモニタリングする方法であって、対象の目に移植された組織における経時的な形態変化をモニタリングすることを含み、該組織が目的の臓器のものであり、および対象の目に移植された組織における経時的な形態変化が対象における目的の臓器の生理学的状態を示す、方法を提供する。
【００１２】
以下の実施例に示される通り、本発明者らは、前眼房に移植され、数ヶ月の過程で膵島集団の生体内原位置で生じる形態変化のインビボ指標として働く、２、３個の「レポーター膵島（ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｉｓｌｅｔｓ）」の使用に基づく新規な方法論を実証した。この概念は、実施例において、肥満による膵島成長の縦断的視覚化および定量によって示され、かつ続いて薬物処置後に正常化される血管形成パターンによって示され、特定の必要性に適合してインスリン分泌能の拡大または低減により個々の膵島がリモデリングするという証拠を初めて示している。つまり「レポーター膵島」は、膵臓における膵島機能の光学的にアクセス可能な指標として働き、膵島の機能不全を診断すること、ならびに膵島細胞量および機能状態の調節に及ぼす特定の処置の影響をモニタリングすること、の両方にとって効率的な読み出し情報として働く個体別のインビボ生物学的マーカとして用いることができる。
【００１３】
対象は、目的の任意の対象、好ましくは非限定的にマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、霊長類、チンパンジー、ヒヒ、およびヒトをはじめとする哺乳動物であってもよい。
【００１４】
該方法は、膵臓の生理学的状態を評価するようなレポーター膵島の使用により例証されるが、本明細書の技術に基づき、該方法が目的の臓器からの移植組織の使用により広範囲の臓器タイプに適用可能であることは、当業者に理解されよう。目的の任意の適切な臓器の生理学的状態を、本発明の方法により評価できる。一実施形態において、目的の臓器は、膵臓、肺、心臓、脳、腎臓、肝臓、小腸、大腸、結腸、胃、胆嚢、食道、尿管、尿道、卵巣、子宮、乳房、脊髄、前立腺、視床下部、副腎、脳下垂体、甲状腺、副甲状腺、松果腺、脾臓、胸腺、直腸、汗腺、唾液腺、乳腺、精嚢、糸球体、腫瘍、脂肪組織、および精巣からなる群より選択される。
【００１５】
別の実施形態において、目的の臓器は外分泌腺を含む。この実施形態において、外分泌腺の非限定的例としては、汗腺、唾液腺、乳腺、胃、肝臓、および膵臓が挙げられる。更なる実施形態において、目的の臓器は内分泌腺を含む。この実施形態において、内分泌腺の非限定的例としては、脳下垂体、膵臓、卵巣、精巣、甲状腺、および副腎が挙げられる。
【００１６】
移植組織は、個別の細胞、複数の同じ型の細胞、または複数の異なる細胞型、例えば組織／組織部分を含んでいてもよい。移植組織は、任意の適切な供給源から得られてもよい。１つの好ましい実施形態において、移植組織は、目への移植の前に対象から得られる。目的の臓器から少量の組織を得る方法は、当業者に周知である。
【００１７】
対象の視力または他の目の機能に及ぼす移植片の任意の負の影響を最小にする、任意の適切な量の組織を移植してもよい。本明細書に示されたデータに例証された通り、１０〜２０の膵島が、マウスの前眼房に移植された。本明細書の技術に基づけば、当業者は、所与の対象に移植される組織の適切な量を決定できる。
【００１８】
一実施形態において、移植組織の形態変化のモニタリングは、移植組織の完全な血管形成および神経支配を可能にするために、移植の約１ヶ月後に開始する。別の実施形態において、移植組織の形態変化のモニタリングは、移植後、所望時に直ちに開始でき、この実施形態は、例えば移植組織の完全な血管形成が、所与の試験で必要でない場合に（例えば、血管形成および／または神経支配に及ぼす試験化合物の影響を検査する場合に）利用できる。全ての実施形態において、モニタリングは、所与の試験に所望の期間実施できる。所望なら、移植細胞は、処置の完了後または任意の他の理由で、除去されてもよい。
【００１９】
１つの好ましい実施形態において、目的の臓器は腫瘍である。この実施形態において、該方法は、例えば抗腫瘍能、副作用などについて候補化合物または他の治療薬を試験するために非ヒト哺乳動物対象で用いられてもよい。
【００２０】
更に好ましい実施形態において、目的の臓器は膵臓である。この実施形態において、組織は非限定的に、単離された膵ランゲルハンス島をはじめとする、任意の適切な膵臓組織であってもよい。ランゲルハンス島は、α細胞、β細胞、およびδ細胞をはじめとする、複数の異なる細胞型で構成されている。これらの細胞クラスターは膵臓内分泌部を表し、グルコース恒常性にとって非常に重要である。血糖レベルの上昇に応答したβ細胞からのインスリン放出が不十分であれば、糖尿病が誘発される。グルコースによるβ細胞からのインスリン分泌の調節は複雑な工程であり、自己分泌、パラ分泌、ホルモンおよび神経因子によりモジュレートされる。
【００２１】
任意の形態変化は、所与の試験に適するように評価でき、少なくとも一部は、移植組織および目的の臓器のタイプに依存する。非限定的実施形態において、形態変化としては非限定的に、組織の細胞サイズ、組織の細胞容積、組織の細胞面積、組織の細胞形状、組織の細胞死、組織の細胞増殖、組織の細胞量、組織の血液灌流、組織の細胞の光反射性、および組織の細胞の顆粒化が挙げられる。
【００２２】
例えば目的の臓器が膵臓であり、移植組織が単離されたランゲルハンス島を含む実施形態において、模範的な形態変化としては：
（ａ）β細胞量の変化（膵臓の生理学的状態を反映する）；
（ｂ）β細胞の破壊（膵臓の病態を反映する場合がある）
（ｃ）β細胞の過形成および／または細胞の肥大（インスリン量増加を反映する）；
（ｄ）β細胞の増殖（膵臓の生理学的状態を反映する）；
（ｅ）膵島の寸法（膵臓の生理学的状態を反映する）；
（ｆ）膵島の障害（膵臓の病態を反映する場合がある）；
（ｇ）膵島内の血管径（高血糖状態で微小血管内血液灌流を増加するように設定された代償機序を反映する場合がある）；
（ｈ）膵島の脱顆粒（インスリン分泌レベルを反映する）；ならびに
（ｉ）膵島の光反射性（インスリン放出の指標）、
が挙げられる。
【００２３】
本発明の任意の実施形態の一実施形態、または実施形態の組み合わせにおいて、該方法は、対象に投与される治療薬または試験化合物が目的の臓器に及ぼす影響をモニタリングするために用いることができる。１つの非限定的例において、該方法は、対象における障害の処置過程の効能を評価することを含む。１つの非限定的実施形態において、対象は糖尿病（１型または２型糖尿病）に罹患しているか、対象は糖尿病の動物モデルであり、該方法は対象が糖尿病を処置するために受けている処置過程の効能をモニタリングするために用いられる。一実施形態において、処置過程は対象への治療薬または候補治療薬の投与を含み、該方法は、個体における治療薬の効能、治療薬の副作用、投薬量変更の影響、および／または目的の任意の他のエンドポイントをモニタリングする。別の実施形態において、治療過程は食事および／または運動レジメンを含み、ここで該方法は個体における食事および／または運動レジメンの効能をモニタリングする。
【００２４】
以下に例証する通り、移植された膵島のインビボ撮像は、移植後の所与の時点で様々な膵島パラメータの正確な定量を可能にする三次元形態情報を提供する。例えば経時的な平均膵島容積の定量により、移植後１ヶ月目に始まるｏｂ／ｏｂ対象と対照対象との有意差が示され、ｏｂ／ｏｂ対象における劇的な膵島成長が例示される。この成長は対象ドナーの遺伝子型と無関係であることが立証されており、即ち、対照対象の膵島をｏｂ／ｏｂ対象に移植した場合に同様の成長が観察されており、ｉ）レシピエント対象由来のシグナル伝達因子が移植された膵島の形態変化を決定すること、およびii）移植された膵島がレシピエントの生体内原位置にある膵島の形態学的挙動を反映すること、を示している。以下に示す試験により、この観察された可塑性が膵臓内に存在する膵島の生体内原位置で起こる可塑性を反映していること、および障害の処置により生じたこれらの形態学的パラメータのインビボ変化が移植された膵島においても見出されること、が更に実証される。
【００２５】
こうしてこれらの実施例により、「レポーター膵島」が代理的方法で、それらのインスリン分泌能を増大または低減して、生体内原位置の膵島集団のリモデリングを明らかにし得ることが実証される。つまりこの技術は、個々の膵島の試験を膵島集団の試験と「融合」でき、および複数の横断実験を縦断試験に置き換える可能性を有する。こうして本発明者らは、目への「レポーター」移植組織のインビボ撮像を、移植片、つまり目的の臓器における形態変化を誘導する因子を同定する多目的ツールとして提案する。
【００２６】
目への移植は、好ましくは前眼房への移植を含む。前眼房は目の前方部分を含み、硝子体の前方の構造と、角膜、虹彩、毛様体、および水晶体を含む。前眼房への組織移植は、これらの前眼房コンパートメントの任意の１つ以上への細胞の配置を含み得る。１つの非限定的例において、組織移植片は注射により角膜から移植され、移植された膵島を虹彩に生着させ、角膜を通した観察および撮像を可能にする。前眼房に移植されて虹彩に生着された膵島は、血管形成され、細胞内組成を保持し、かつ刺激に応答した。更に、それらは非侵襲性レーザ走査顕微鏡検査（ＬＳＭ）によりモニタリングでき、形態変化のインビボ撮像を可能にする。例えば、米国特許出願公開第２００９００６０８４３号を参照されたい。前眼房を移植部位として用いることが、移植組織における形態変化の継続的なモニタリングを可能にし、例えばホルモンおよび神経系からの、そして内分泌または血管細胞の自己分泌／パラ分泌シグナルからの、調節性入力の影響を明らかにするために用いられ得る。
【００２７】
移植組織の形態変化は非限定的に、直接視覚化をはじめとする任意の適切な技術によりモニタリングできる。好ましい実施形態において、形態変化は顕微鏡検査によりモニタリングされる。例えば、米国特許出願公開第２００９００６０８４３号を参照されたいが、その方法は以下の実施例に開示されている。１つの好ましい実施形態において、形態変化は、三次元形態情報を提供する共焦顕微鏡検査および／または二光子顕微鏡検査によりモニタリングされる。
【００２８】
該方法は、対象の目に移植された組織における経時的な形態変化をモニタリングすることを含む。一実施形態において、対象は目的の治療薬または試験化合物を任意の適切な投与経路を介して投与され、移植組織の形態変化がその後の１つ以上の時点（即ち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）で決定される。実施される方法の特性を考慮して適切と思われる、任意の適切な形態変化測定間隔を用いることができる。
【００２９】
別の実施形態において、該方法は、移植組織の経時的な形態変化を、対象から得られた生検において表されるのと同じ時間枠に起こる生体内原位置変化と比較することを更に含む。生体内原位置変化は非限定的に、以下の実施例に記載される組織切片の組織化学的分析をはじめとする、任意の適切な技術により評価できる。
【００３０】
実施例：レポーター膵島は生体内原位置の膵島の適応的可塑性を明らかにする
概要
ランゲルハンス島は膵臓内分泌部を構成し、血糖恒常性の維持を担う。それらは膵臓内分泌部の深部に埋め込まれており、それゆえ機能的試験でのアクセシビリティーが限定される。機能および生存の調節を理解し、かつ糖尿病の個体別処置戦略の臨床転帰を評価するために、膵臓内分泌部について継続的に知らせるモニタリングシステムが必要とされる。本発明者らは、生体内原位置の膵島の特性についてうまく報告するナチュラル・ボディー・ウィンドウ（ｎａｔｕｒａｌ  ｂｏｄｙ  ｗｉｎｄｏｗ）の適用を記載する。原理の証明として、「レポーター膵島」をレプチン欠損マウスの前眼房に移植した。「レポーター膵島」は、肥満による成長および血管形成パターンを示し、それらはレプチン処置により後退した。つまり「レポーター膵島」は、膵臓における膵島機能の光学的にアクセス可能な指標として働き、膵島の可塑性をインビボで調節する特定の処置レジメンの効率を反映する。
【００３１】
序論
血糖濃度の正常な変動は、膵臓内分泌部であるランゲルハンス島の様々な細胞からの統合的なホルモン放出を惹起する。β細胞が、グルコース取り込みを調節する必須ホルモンであるインスリンを産生および分泌する。機能的β細胞量の減少は、グルコース恒常性を損傷して、蔓延的に広がる破滅的疾患である糖尿病を誘発する。このためβ細胞量の適切な調節は、様々な機能的要求に適合して正常な血糖濃度の維持を常に確保するのに最も重要である（１）。健康および疾患におけるランゲルハンス島の機能研究の主要な難題は、それが膵臓内分泌部の深部に埋め込まれており、それゆえアクセシビリティーが限定されるという事実にある。このため機能および生存の調節を理解して、糖尿病の個体別処置戦略の臨床転帰を評価するために、生存生物体の膵臓内分泌部の状態を継続的に報告するモニタリングシステムが究極的に求められている。
【００３２】
本発明者らは、単一細胞の解像度で非侵襲的縦断的にインビボ撮像するための技術的プラットフォームを開発した（２、３）。このインビボ撮像技術を本試験に適用することにより、本発明者らは、前眼房に移植された膵島が内在性膵臓内分泌部の機能的状態について報告でき、およびランゲルハンス島における病理工程の介入が実際に目でモニタリングできる、という仮説の検証を欲した。この目的で本発明者らは、肥満の突然変異マウス（ｏｂ／ｏｂ）をモデルシステムとして利用した。このマウスは１９５０年に初めて報告されており（４）、一生を通して顕著な膵島可塑性を示し、肥満およびインスリン抵抗性のモデルとして詳細に研究されてきた。非常に若年の時期、これらのマウスは高インスリン血症、高血糖症であり、平均よりも高い体重を示す（５）。旺盛な食欲と組み合わされた明らかな肥満に加えて、これらのマウスは、複数の機能的損傷、例えば代謝速度の低下、熱産生障害、免疫障害および不妊を示す（６）。１９９４年に、Ｆｒｉｅｄｍａｎとその共同研究者らは、主に脂肪組織で産生されるレプチンホルモンをコードするｏｂ遺伝子を同定した（７）。この遺伝子はｏｂ／ｏｂマウスでは突然変異を受けており、その結果このマウスは、いかなる機能的レプチンも発現できない。正常な状態ではレプチンは多くの異なる生理学的役割を有するが、その最も顕著な機能の１つは食欲の調節である。栄養摂取に応答して、レプチンは脂肪組織から放出されて視床下部のレプチン受容体を活性化し、食欲を抑制して、その結果食物摂取を低減する。加えて、レプチン受容体はβ細胞内で発現され、食物摂取後のインスリン発現および放出を阻害するアディポ−インスラーフィードバックループ（ａｄｉｐｏ−ｉｎｓｕｌａｒ  ｆｅｅｄｂａｃｋ  ｌｏｏｐ）に関与する（８、９）。ｏｂ／ｏｂマウスにおけるレプチン欠乏はしたがって、体重の急速な増加と、インスリン要求の増加を代償するために、β細胞の過形成をもたらす（１０）。その結果ｏｂ／ｏｂマウスの膵島細胞集団が変化し、β細胞の割合が他の内分泌細胞と比較して特に高くなり、全膵島細胞の９０％超を占めるようになる（１１）。ｏｂ／ｏｂマウスにおいて、レプチンによるフィードバックループの欠如は、明らかな脱顆粒をもたらすβ細胞からの観察された強いインスリン放出（１０）およびインスリン抵抗性の発達の両者を説明する。
【００３３】
ｏｂ／ｏｂマウスをモデル系として適用することにより、本発明者らは、前眼房での光学的にアクセス可能な「レポーター膵島」の多様で興味深い適用法を実証することができた。これらのレポーター膵島は、膵臓内分泌部の生体内原位置のβ細胞可塑性をうまくモニタリングし、特定の処置レジメンの追跡も可能にする。
【００３４】
結果
ｏｂ／ｏｂマウスは異常な生理学的性質を示す
ｏｂ／ｏｂマウスは、既に４週齢で対照同腹子と形態学的に識別でき、その体重増加は年齢を経ると益々顕著になる（図１Ａ、Ｂ）。生理学的試験から、対照同腹子と比較して、空腹時血糖値およびインスリンレベルの増加が明らかとなった（図１Ｃ）。これは、以前の報告と一致しており（５）、過剰な食物摂取およびインスリン抵抗性を示している。ｏｂ／ｏｂマウスおよび対照マウスの膵臓のパラフィン包埋切片をヘマトキシリンおよびエオジンで染色して、膵島形態の差異を観察した。膵島の寸法は、食物摂取の増加を代償するために強力なインスリン分泌能をもたらすようｏｂ／ｏｂマウスで増加した（図１Ｄ、Ｅ）。膵臓の切片の観察により特定時点での膵島の形態学的状態に関する情報が得られるが、動的変化を認識することはできない。
【００３５】
眼内膵島移植片は生体内原位置に内在する膵島の適応的形態可塑性を反映する
これらの膵島の形態可塑性を経時的に試験するため、本発明者らはしたがってマウスの前眼房に、縦断的インビボ撮像のために光学的にアクセスできる２、３個の「レポーター膵島」を移植した。膵島は、４週齢のドナーマウスから単離され、年齢の適合するレシピエントの前眼房に移植した。このインビボ環境は、生着された膵島に連結し、それにより細胞間パラ分泌のみならず内分泌および神経入力も許容する、密な毛細血管と神経網を含む（２、１２）。移植された膵島は虹彩に急速に生着し、個々の膵島移植片は移植後の異なる時点で繰り返し同定できた（図２Ａ）。成長の増加に加えて、これらの膵島は、インビトロでの切除された膵臓組織から過去に報告された（１３、１４）ように、ｏｂ／ｏｂレシピエントにおいて膵島内脈管径の増加を示した（図２Ｂ）。膵島内脈管径の増加は、高血糖状態で血液灌流を増加させるように設計された代償機序と関連すると考えられる（１５）。それは、内分泌系のシグナル伝達を最適化して、β細胞のそれぞれがこの強力な増殖条件下で血流との直接連通を確保するための１つのアプローチでもあり得る。個々の膵島は、共焦顕微鏡検査により同系的に移植されたマウスにおいて異なる時点にインビボで撮像され、ｏｂ／ｏｂ膵島移植片の大きな蛇行した血管が蛍光撮像により確認された（図２Ｃ）。後方散乱撮像から、膵島の形態に加え、ｏｂ／ｏｂマウスの膵島において外観的に脱顆粒していて不均一なパターンが明らかとなった。光反射の不足は急速なインスリン分泌を示しており、このことはレプチン欠損状態でのアディポ−インスラーフィードバックループの破壊により説明できる（９）。パラフィン包埋切片での免疫組織化学的検査による生体内原位置の膵島の分析は、膵臓内の膵島が同様のｏｂ／ｏｂマウスと対照マウスの間の特徴的な性質に従うことを示し、即ちＣＤ３１染色はｏｂ／ｏｂ膵島内の大きな脈管を示し、インスリン染色は不規則であった。
【００３６】
共焦顕微鏡検査による移植された膵島のインビボ撮像は、移植後の任意の所与の時点での膵島容積を初めて正確に定量できる三次元形態情報を提供する。経時的な平均膵島容積の定量は、移植の１ヶ月後に始まるｏｂ／ｏｂマウスと対照マウスとの有意差を示し、ｏｂ／ｏｂマウスにおける劇的な膵島成長が示された（図２Ｄ、Ｅ）。興味深いことに、この成長はマウスドナーの遺伝子型とは無関係であることが立証されており、即ち本発明者らは、対照マウスの膵島をｏｂ／ｏｂマウスに移植した時に同様の成長を観察しており、この特別な例において、ｉ）レシピエントマウス由来のシグナル伝達因子が移植された膵島の形態変化を決定すること、およびii）移植された膵島がレシピエントの生体内原位置の膵島の形態学的挙動を反映していること、を示している。
【００３７】
前眼房において観察されたこの可塑性が、膵臓に存在する生体内原位置の膵島で生じる可塑性を実際に反映しているのかを検証するために、本発明者らは、免疫組織化学検査により膵島移植片と内在性の膵島とでパラフィン包埋切片を比較した。本発明者らは、インスリンおよびＫｉ６７の染色によりｏｂ／ｏｂマウス膵島のβ細胞の顕著な増殖を観察した（図２Ｆ）。この増殖率は、生体内原位置の膵島から測定されたか、または前眼房に生着された膵島から測定されたか、による有意差はなかった（それぞれ平均±ｓ．ｅ．ｍ．＝０．８２±０．１０％、ｎ＝５、および０．９５±０．１５％、ｎ＝４）。β細胞の形態変化を免疫組織化学検査によっても評価し、膵臓に存在する生体内原位置の膵島と膵島移植片の両方で、対照マウスと比較してｏｂ／ｏｂマウスで細胞面積のおよそ１．３５倍の増加が明らかとなった（図２Ｇ）。レプチンシグナル伝達の欠如がこの容積の増大に寄与した可能性がある。実際に、膵臓特異性レプチン受容体ノックアウトマウスを使用すると、膵島におけるレプチン作用の破壊がＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達を増強し、それがβ細胞サイズおよび膵島量の増大に関連することが示された（１６）。この代償的な膵島成長はインビトロで実証されているが、今や単一の「レポーター膵島」の分析により、生きているｏｂ／ｏｂマウスでこのパターンを縦断的に確認できる。重要なことに、本発明者らのデータは過去の試験と一致しており、それらの試験では、単離された膵島に基づく試験によるもの（１７）または膵臓全体にわたる組織切片の撮像によるもの（１８）のいずれかで、平均膵島容積が２ヶ月齢の対照とｏｂ／ｏｂマウスの間で４倍の差を示した。
【００３８】
レプチン処置はｏｂ／ｏｂマウスの体重を低下させ、血糖恒常性を修正する
食物過剰消費およびインスリン抵抗性に応答した個々の膵島の挙動が検証され、本発明者らは次に、この成長がｏｂ／ｏｂマウスをレプチンで処置することにより抑制または後退され得るかを課題とした。マウスは、３ヶ月齢〜４ヶ月齢の間、毎日腹腔内注射された。この処置の生理学的影響を、異なるパラメータを用いて規則的にモニタリングした。本発明者らは、目に見えて低下した食欲と並行して、処置中の体重、血糖値およびインスリン濃度の低下を測定した（図３Ａ）。しかし体重は処置期間の終了後に急速に増加して、約１ヶ月後には年齢が一致する未処置ｏｂ／ｏｂマウスと同様の体重に達したことから、レプチンのこの有利な影響は恒久的ではなかった（比較のために図１Ｂを参照）。この処置はまた、インスリン感受性への有益な影響も有した。処置期間の終了時において、ｏｂ／ｏｂマウスでの腹腔内耐糖能試験は、年齢が一致する対照マウスから得られたものと同様の血糖変動を示した（図３Ｂ）。
【００３９】
縦断的インビボ撮像がレプチンによるｏｂ／ｏｂマウス膵島の調節不全からの回復を明らかにする
レプチン処置はまた、膵島成長への影響も発揮する。偽処置マウスは膵島移植片の連続した適合成長を示したが、以前の報告（１９、２０）と一致して、この成長は、レプチン処置下では消失して一部は後退した（図４Ａ、Ｂ）。処置の終了時においてβ細胞の増殖は、レプチン処置されたｏｂ／ｏｂマウスの生着された膵島および生体内原位置の膵島の両方で事実上消失した（図４Ｃ）。レプチン処置後の平均β細胞サイズは後退し、膵島が移植されたか、または内在的に膵臓に存在したかにかかわらず、年齢が一致する未処置対照マウスと比較して有意差を示さなかった（データは示さない）。膵島サイズの減少は、過去に報告された通り（２１）、個々のβ細胞サイズのこの減少によって、および膵島内血管構造の形態変化（図５）によって部分的に説明され得る。本発明者らは、血糖レベルの低下と並行した膵島移植片の脈管径減少を測定した。興味深いことに、本発明者らはレプチン処置後の早期段階で膵島移植片における血管新生を観察できたが、この現象は血液灌流を増大させることが知られ、かつ血管新生因子ＦＧＦ−２およびＶＥＧＦとの相乗的刺激によりレプチンから正の影響を受けることが知られる生物学的現象である（２２）。
【００４０】
レプチンによるアディポ−インスラーフィードバックループの回復および血糖レベルの低下のために、本発明者らはその結果生じる移植された膵島におけるインビボの膵島細胞の再顆粒（ｒｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を、それらのより強く反映する光学特性により観察できたが（図４Ａ）、これはレプチン処置ｏｂ／ｏｂマウスからの膵島で検出されたインスリン免疫染色の増加（１９）と一致する。ｏｂ／ｏｂマウスにおけるレプチン処置後のインビボインスリン放出の正常化は、食物摂取に依存的および非依存的メカニズムの両方の結果であることが示されている（２０）。
【００４１】
考察
生体内原位置の膵臓内分泌部の状態に関して報告する「レポーター膵島」の新規概念を検証するために、本発明者らは、レプチン欠損ｏｂ／ｏｂマウスには膵臓内分泌部の顕著なリモデリング能が存在する、という事実を利用した。ｏｂ／ｏｂマウスモデルから得た「レポーター膵島」をしたがって、膵臓内分泌部での挙動を表す膵島細胞量調節の研究のために、同様のタイプのマウスの前眼房に移植した。「レポーター膵島」は、膵臓内の生体内原位置で観察されたものと同一の肥満による成長および血管形成パターンを示した。これらの肥満による成長および血管形成パターンは、前眼房および生体内原位置の膵臓の両方で、レプチン処置により後退し、インスリン分泌能の増大または低下による非常に効果的な膵島リモデリングの証拠が示された。そのようなリモデリング能はこれまで、横断試験により、またはインビトロの相対的に低い分解能での膵島集団の分析により、間接的にのみ示唆されていた。したがって「レポーター膵島」により、インビボでの膵臓内分泌部の適応的可塑性を調節する分子機序をうまく解明できる。
【００４２】
複数の異なる実験アプローチにより、β細胞量の定量と、最終的には膵島のリモデリングの表示が可能になる。インビトロ技術には、ポイントカウント形態計測法による膵臓の組織切片の分析（１８）、および切除された膵臓組織における膵島寸法の直接測定（２３、２４）がある。エクスビボ撮像技術は、共焦顕微鏡検査（２５）または光干渉顕微鏡検査（２６）による露出された膵臓の撮像を含む。最後に、複数の非侵襲性インビボ撮像技術は、総β細胞量の縦断的定量、即ち、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ（２７））、陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ（２８））、バイオルミネセンスイメージング（２９）、または複合的な多モード撮像法（３０）を目指すものである。これらの技術はいずれも個々の膵島における経時的な形態変化を追跡する可能性を示さない。
【００４３】
本発明者らはここに、２、３個の「レポーター膵島」が代理的方法で、それらのインスリン分泌能を増大または低減して、生体内原位置の膵島集団のリモデリングを明らかにし得ることを示す。つまりこの技術は、個々の膵島の試験を膵島集団の試験と「融合」でき、および複数の横断実験を縦断試験に置き換える可能性を有する。こうして本発明者らは、前眼房に移植された「レポーター膵島」のインビボ撮像を、分子機序を解明するため、そしてβ細胞の機能および生存の調節における薬理学的化合物を同定するための多目的ツールとして提案する。重要なことに、ヒトにおいて、膵島機能不全を診断すること、および専用の個体別処置レジメンの効果をモニタリングすることの両方のための「レポーター膵島」の同種の使用を、新規な個人的薬品アプローチとして想定できる。「レポーター膵島」の本発明者らの概念は、生理学および病理学の両方に関連する細胞および臓器レベルでの分子相互作用および適合機序を詳細に同定および理解するという野心をもって、機能および増殖のための複数の高度な経時的細胞マーカの導入により更に発展させることができ、かつ他の臓器にも拡大させることができる。
【００４４】
方法の概要
トランスジェニックマウスモデル
本発明者らの実験で用いられたｏｂ／ｏｂマウスは、スウェーデンのウメオ由来であり、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌにある動物コア施設で交配されている。実験は全て、研究における動物の世話および使用に関するＫａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔのガイドラインに従って実施され、かつＫａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔの動物実験倫理委員会（ｌｏｃａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｅｔｈｉｃｓ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ）により認可された。
【００４５】
前眼房への膵島移植
膵島を雌ドナーマウスから単離して、雄レシピエントの前眼房に移植した。本発明者らは、イソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ）を用いてマウスに麻酔をかけて、およそ１０〜２０個の膵島をマウスの前眼房に移植した。移植に用いられた膵島は、マウス遺伝子型とは別に、各実験で同様のサイズになるように選択した。術後鎮痛のために、マウスにＴｅｍｇｅｓｉｃ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）を皮下注射した。
【００４６】
眼内膵島移植片のインビボ撮像
マウスの体内の膵島移植片を、移植後の特定の時点でインビボ撮像した。本発明者らは、長作動距離水浸対物レンズ（Ｌｅｉｃａ  ＨＸＣ−ＡＰＯ  １０Ｘ／０．３０ＮＡ）を備えたＴＣＳ−ＳＰ２−ＡＯＢＳ（Ｌｅｉｃａ）に基づく倒立レーザ走査共焦顕微鏡、および生着した膵島を含むマウスの目を対物レンズに向かって配置させるカスタムビルトの定位ヘッドホールダーを用いた。Ｖｉｓｃｏｔｅａｒｓ（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を目と対物レンズの間の浸漬液として用い、イソフルランをインビボ撮像の際にマウスに麻酔をかけるために用いた。膵島形態の撮像を、６３３ｎｍでのレーザ照射および同じ波長での後方散乱光の回収により実施した。
【００４７】
レプチン処置
レプチン処置は１．５μｇ／ｇ体重の組換えヒトレプチン（Ａｍｙｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）の連日腹腔内注射により実施し、偽処置はレプチンの代わりに水の腹腔内注射により実施した。
【００４８】
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１８．  Ｂｏｃｋ  Ｔ．，Ｐａｋｋｅｎｂｅｒｇ  Ｂ．，Ｂｕｓｃｈａｒｄ  Ｋ．（２００３）  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｓｌｅｔ  ｖｏｌｕｍｅ  ｂｕｔ  ｕｎｃｈａｎｇｅｄ  ｉｓｌｅｔ  ｎｕｍｂｅｒ  ｉｎ  ｏｂ／ｏｂ  ｍｉｃｅ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２：１７１６−１７２２．
１９．  Ｋｈａｎ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｌｅｐｔｉｎ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｂ／ｏｂ  ｍｉｃｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ  Ｒｅｌａｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２５：８１６−８２１．
２０．  Ｌｅｅ  Ｊ−Ｗ，Ｒｏｍｓｏｓ  ＤＲ（２００３）  Ｌｅｐｔｉｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｉｓｌｅｔｓ  ｏｆ  Ｌｅｐ（ｏｂ）／Ｌｅｐ（ｏｂ）  ｍｉｃｅ  ｂｙ  ｆｏｏｄ  ｉｎｔａｋｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｎｄ  −ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ（Ｍａｙｗｏｏｄ）  ２２８：１８３−１８７．
２１．  Ｐａｒｋ  Ｓ，Ｈｏｎｇ  ＳＭ，Ｓｕｎｇ  ＳＲ，Ｊｕｎｇ  ＨＫ（２００８）  Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｌｅｐｔｉｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｉｓｔｉｎ  ｏｎ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ，  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ａｎｄ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｓｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｌｅｐｔｉｎ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４９：４４５−４５４．
２２．  Ｃａｏ  Ｒ，Ｂｒａｋｅｎｈｉｅｌｍ  Ｅ，Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  Ｃ，Ｔｈｙｂｅｒｇ  Ｊ，Ｃａｏ  Ｙ（２００１）  Ｌｅｐｔｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ＦＧＦ−２  ａｎｄ  ＶＥＧＦ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８：６３９０−６３９５．
２３．  Ｐａｒｓｏｎｓ  ＪＡ，Ｂａｒｔｋｅ  Ａ，Ｓｏｒｅｎｓｏｎ  ＲＬ（１９９５）  Ｎｕｍｂｅｒ  ａｎｄ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｉｓｌｅｔｓ  ｏｆ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｉｎ  ｐｒｅｇｎａｎｔ，ｈｕｍａｎ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ，ａｎｄ  ｐｉｔｕｉｔａｒｙ  ｄｗａｒｆ  ｍｉｃｅ：  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｌａｃｔｏｇｅｎｉｃ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３６：２０１３−２０２１．
２４．  Ａｌａｎｅｎｔａｌｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｉｓｌｅｔ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔａｃｔ  ａｄｕｌｔ  ｍｏｕｓｅ  ｐａｎｃｒｅａｓ．Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｏｐｔ  １３：０５４０７０．
２５．  Ｎｙｍａｎ  Ｌ，Ｆｏｒｄ  Ｅ，Ｐｏｗｅｒｓ  Ａ，Ｐｉｓｔｏｎ  Ｄ（２０１０）  Ｇｌｕｃｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２９８：Ｅ８０７−１４．
２６．  Ｖｉｌｌｉｇｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｉｓｌｅｔｓ  ｏｆ  Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ  ｗｉｔｈ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｆｏｃｕｓ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ．  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ５２：１５９９−１６０７．
２７．  Ｌａｍｐｒｉａｎｏｕ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ  ｄｅｔｅｃｔｓ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６０：２８５３−２８６０．
２８．  Ｓｉｎｇｈａｌ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ  ＰＥＴ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ［１１Ｃ］ＤＴＢＺ  ａｎｄ  ［１８Ｆ］ＦＰ−（＋）−ＤＴＢＺ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｂｉｏｌ  １３：９７３−９８４．
２９．  Ｐａｒｋ  Ｓ−Ｙ，Ｂｅｌｌ  ＧＩ（２００９）  Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌ  ｍａｓｓ  ｂｙ  ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ＭＩＰ−ｌｕｃ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｉｃｅ．Ｈｏｒｍ  Ｍｅｔａｂ  Ｒｅｓ  ４１：１−４．
３０．  Ｖｉｒｏｓｔｋｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  ｉｍａｇｅ  ｃｏｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ａｂｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｅｖａｌｕａｔｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０８：２０７１９−２０７２４．
３１．  Ｅｌｌｅｔｔ  Ｊ，Ｅｖａｎｓ  Ｚ，Ｚｈａｎｇ  Ｇ，Ｃｈａｖｉｎ  Ｋ，Ｓｐｙｒｏｐｏｕｌｏｓ  Ｄ（２００９）  Ａ  ｒａｐｉｄ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｂ  ｍｕｔａｎｔ  ｍｉｃｅ．Ｏｂｅｓｉｔｙ（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ）  １７：４０２−４０４．
【００４９】
材料と方法
マウスモデル
本発明者らの実験で用いられたｏｂ／ｏｂマウスは、スウェーデンのウメオ由来であり、Ｋａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｈｏｓｐｉｔａｌにある動物コア施設で交配されている。対照の痩せた同腹子との識別は、表現型および遺伝子型分析により遂行した（３１）。実験は全て、研究における動物の世話および使用に関するＫａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔのガイドラインに従って実施され、かつＫａｒｏｌｉｎｓｋａ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｔの動物実験倫理委員会により認可された。
【００５０】
生理学的測定およびレプチン処置
体重および血糖レベルを、最少７匹のマウスで測定した。グルコース濃度は、Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｋ（商標）Ａｖｉｖａモニタリングシステム（Ｒｏｃｈｅ）を用いて得た。耐糖能試験は、１６時間絶食させたマウスでグラム体重あたりグルコース２ｍｇの腹腔内注射により実施した（ｎ≦５）。１条件あたり最少３匹のマウスからの血漿インスリン濃度を、マウスインスリンＥＬＩＳＡプレート（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）を用いて測定した。レプチン処置は組換えヒトレプチン（Ａｍｙｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）１．５μｇ／ｇ体重の連日腹食内注射により実施し、偽処置はレプチンの代わりに水の腹腔内注射により実施した。
【００５１】
前眼房への膵島移植
過去に記載された技術（２）を用いて、膵島を雌ドナーマウスから単離して雄レシピエントの前眼房に移植した。本発明者らは、イソフルラン（Ｂａｘｔｅｒ）を用いてマウスに麻酔をかけて、およそ１０〜２０個の膵島をマウスの前眼房に移植した。移植に用いられた膵島は、マウス遺伝子型とは別に、各実験で同様のサイズになるように選択した。術後鎮痛のために、マウスにＴｅｍｇｅｓｉｃ（商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）を皮下注射した。
【００５２】
眼内膵島移植片のインビボ撮像
過去に記載された通り（２）、マウスの体内の膵島移植片を、移植後の特定の時点でインビボ撮像した。本発明者らは、長作動距離水浸対物レンズ（Ｌｅｉｃａ  ＨＸＣ−ＡＰＯ  １０Ｘ／０．３０ＮＡ）を備えたＴＣＳ−ＳＰ２−ＡＯＢＳ（Ｌｅｉｃａ）に基づく倒立レーザ走査共焦顕微鏡、および生着した膵島を含むマウスの目を対物レンズに向かって配置させるカスタムビルトの定位ヘッドホールダーを用いた。Ｖｉｓｃｏｔｅａｒｓ（商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）を、目と対物レンズの間の浸漬液として用い、イソフルランをインビボ撮像の間にマウスに麻酔をかけるために用いた。膵島形態の撮像を、６３３ｎｍでのレーザ照射および同じ波長での後方散乱光の回収により実施した。血管の視覚化のために、本発明者らは、５００ｋＤａ  ＦＩＴＣ標識デキストラン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２．５ｍｇ／ｍｌを含む溶液１００μｌを尾静脈に注射し、４９６ｎｍ励起波長を用いて蛍光を撮像した。走査速度およびレーザ強度は、マウスの目または膵島の移植片に対するいかなる細胞損傷も回避するように調整した。
【００５３】
組織切片および免疫組織化学検査
切除された組織をＰＢＳで簡単にすすぎ、ホルマリンを用いて室温で４８時間固定し、それから脱水してパラフィンに包埋した。プレコートされた顕微鏡スライドに載せた５ミクロン厚の切片をキシリンにより脱ロウして、処理の前に漸次、脱水した。インスリンは、ニワトリ抗インスリン（１：２００希釈、Ａｃａｍ）を用い、続いてヤギ抗ニワトリＡｌｅｘａ（商標）４８８（１：１０００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）抗体を用いて染色し；血管は、ラット抗マウスＣＤ３１（１：５０希釈、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用い、続いてビオチン化ヤギ抗ラット（５μｇ／ｍｌ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）のインキュベートおよびＨＲＰ−ストレプトアビジン／Ａｌｅｘａ（商標）６４７−チラミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での増幅により染色し；増殖は、マウス抗ヒトＫｉ６７（１：５０希釈、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）をＭ．Ｏ．Ｍ．ビオチン化抗マウスＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）と共に使用し、ＨＲＰ−ストレプトアビジン／Ａｌｅｘａ  ６４７−チラミドを用いて増幅することにより評価した。核を染色してＰｒｏＬｏｎｇ（商標）  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてカバーガラスを装着することによりスライドを保存した。スライドを、ＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ  ８５５システム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて撮像した。インスリン、ＣＤ３１、Ｋｉ６７およびＤＡＰＩ染色は、２０Ｘ／０．７５ＮＡ  ＵＡｐｏ／３４０  Ｏｌｙｍｐｕｓ対物レンズを用いて撮像し、ヘマトキシリン／エオジンにより染色された膵臓切片の概観は、４Ｘ／０．１６ＮＡ  ＵＰｌａｎ  ＳＡｐｏ  Ｏｌｙｍｐｕｓ対物レンズを用いたモンタージュキャプチャモードにより得た。
【００５４】
画像の処理および分析
ＡｕｔｏＱｕａｎｔ  Ｘ２（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を全てのインビボ共焦画像のブラインドデコンボリューションに用いた後に、画像を分析した。膵島容積は、Ｍａｔｌａｂ（商標）およびＩｍａｇｅ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｔｏｏｌｂｏｘ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）を用い、後方散乱シグナルチャネルに基づき分析した。膵島の「赤道容積（ｅｑｕａｔｏｒｉａｌ  ｖｏｌｕｍｅ）」、即ち膵島の最上部から計算された赤道までの容積を用いて容積を表し、および膵島の成長を計算した。本発明者らは、動物１匹あたり最少３個の膵島移植片を分析し、１分類あたり最少３匹のマウスで膵島の成長を決定した。個々の脈管区分を異なる撮像時点で同定し、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ（商標）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いてそれらの径を測定した。本発明者らは、組織切片の自動分析のために、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ（商標）での画像分析プロトコルを確立した。平均β細胞断面積は、インスリン染色面積をこの面積に封入されたＤＡＰＩ染色核の総数で除算することにより得た（組織あたり最少１０００個の細胞）。β細胞増殖率は、Ｋｉ６７陽性の核を計数してインスリン陽性細胞中のＤＡＰＩ染色核の総数で除算することにより得た（移植された目または膵臓あたり最少１００００個の細胞）。Ｖｏｌｏｃｉｔｙ（商標）を画像ディスプレイに用い、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ＣＳ５（Ａｄｏｂｅ）を画像構成に用いた。
【００５５】
統計解析
結果は全て、平均±ＳＥＭとして表す。統計学的有意性を決定するのにスチューデントｔ検定を利用し、Ｐ値＜０．０５を有意と見なした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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