(57)【要約】  本発明は、標的キナーゼに対するＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の有効性を決定するための方法、アッセイ、及びシステムを提供する。方法、アッセイ、及びシステムは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤（例えば、ＢＴＫ阻害剤）による標的キナーゼの占有率を決定することに関連する。このような定量的測定法を使用して、対象者の治療法、及び全体的な健康管理法についての情報を提供する。例えば、疾患を診断、予測、及びモニタリングするため、又はＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を用いる治療による効果が見込まれることを示すための、診断キットが提供される。別の例では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤療法に対する応答を特定するため、治療レジメンを決定するため、及びＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤に対する耐性を検出するための診断キットも提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩ）の構造を有するプローブを含むＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤療法を受けている患者における薬剤標的の占有率を決定するためのキットであって、式（ＩＩ）の構造は
【化１】
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式（ＩＩ）
からなり、
（式中、
Ｌａは、ＣＨ２、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
Ａｒは、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Ｙは、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Ｚは、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＯＳ（Ｏ）ｎ、ＮＨＳ（Ｏ）ｎであり、式中、ｎは１又は２であり、
Ｒ６及びＲ８は、独立して、Ｈ、場合により置換されたアルキル、又は場合により置換されたヘテロアルキルから選択され、
Ｌ１は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、
Ｌ２は、結合、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、又は−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−であり、式中、ｍは２〜６であり、
Ｌ３は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、かつＸは検出可能な標識である）、前記プローブはＴＥＣファミリーキナーゼに結合する、キット。
【請求項２】
Ｘが
【化２】
2015536446.tif 000026
である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記プローブが、
【化３】
2015536446.tif 000027
の構造を有する、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記プローブは、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、ＩＴＫ、ＴＥＣ、ＢＭＸ、ＴＸＫ、又はＢＬＫに結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５】
プレート、マイクロプレート、ビーズ、又は複数のビーズから選択される１つ以上の固体支持体を更に含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６】
前記固体支持体を捕捉剤によりコートしてコート固体支持体を作製し、ここで、前記捕捉剤はプローブに結合するものである、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
前記捕捉剤がストレプトアビジン又は抗体である、請求項６に記載のキット。
【請求項８】
一次検出剤、及び場合により、前記一次検出剤に結合する二次検出剤を更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項９】
前記一次検出剤又は二次検出剤が、抗体、ビーズ、染料、標識、タグ、フルオロフォア、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項８に記載のキット。
【請求項１０】
前記一次検出剤が、抗ＢＴＫ抗体、抗ＩＴＫ抗体、抗ＴＥＣ抗体、抗ＴＸＫ抗体、抗ＢＭＸ抗体、又は抗ＢＬＫ抗体である、請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
前記一次又は二次検出剤に電気化学発光タグを複合させる、請求項８〜１０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２】
ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤療法を受けている患者における薬剤標的の占有率を決定するための方法であって、
（ａ）ＴＥＣファミリーキナーゼを含むサンプルをプローブと接触させて、プローブの結合しているキナーゼを形成させることと、
（ｂ）前記サンプル中の、プローブの結合しているキナーゼの量を検出することと、
（ｃ）前記サンプルにおいて検出されたプローブの結合しているキナーゼの量に基づき前記ＴＥＣファミリーキナーゼの標的占有率を決定することと、を含み、
前記サンプルは、不可逆的ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の少なくとも一回量を投与された患者から得たものであり、前記プローブは、式（ＩＩ）
【化４】
2015536446.tif 000028
式（ＩＩ）
の構造を含む
（式中、
Ｌａは、ＣＨ２、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
Ａｒは、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Ｙは、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Ｚは、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＯＳ（Ｏ）ｎ、ＮＨＳ（Ｏ）ｎであり、式中、ｎは１又は２であり、
Ｒ６及びＲ８は、独立して、Ｈ、場合により置換されたアルキル、又は場合により置換されたヘテロアルキルから選択され、
Ｌ１は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、
Ｌ２は、結合、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、又は−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−であり、式中、ｍは２〜６であり、
Ｌ３は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、かつ
Ｘは検出可能な標識である）、方法。
【請求項１３】
Ｘが
【化５】
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である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記プローブが
【化６】
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の構造を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
標的占有率を決定することが、ｉ）前記サンプル中に検出された前記プローブの結合しているキナーゼの量に基づき、前記ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の結合していない結合部位の数を求めることと、ｉｉ）前記サンプル中の活性型ＴＥＣファミリーキナーゼの総量に対し前記数を比較することと、を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＴＥＣファミリーキナーゼの標的占有率に基づき治療レジメンを決定すること又は修正することを更に含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤療法を受けている患者における薬剤標的の占有率をモニタリングする方法であって、治療過程の２つ以上の時点で、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の方法を実施する、方法。
【請求項１８】
ｉ）前記標的占有率が約５０％未満の場合に、前記ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の投与量を増加させることと、ｉｉ）前記標的占有率が少なくとも約７０％を上回る場合に、前記ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の投与量を減少させることと、ｉｉｉ）前記ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の同等の治療レジメンを維持すること、又はｉｖ）前記治療レジメンを中断することと、を更に含む、請求項１６又は１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記標的占有率に基づき前記ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤療法の有効性を決定することを更に含み、前記ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤が、ｉ）前記ＴＥＣファミリーキナーゼの占有率が少なくとも約７０％であるとき有効であり、又はｉｉ）前記ＴＥＣファミリーキナーゼの占有率が約５０％未満であるとき有効ではない、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤がブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤である、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤がイブルチニブである、請求項１２〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
プローブの結合しているキナーゼを捕捉剤により捕捉することを更に含む、請求項１２〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記捕捉剤がストレプトアビジン又は抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記捕捉剤が固体支持体に付加されている、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記固体支持体がプレート、マイクロプレート、ビーズ、又は複数のビーズである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プローブの結合しているキナーゼを、一次検出剤、及び場合により、該一次検出剤に結合する二次検出剤と接触させることを更に含む、請求項１２〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記一次検出剤又は二次検出剤が、抗体、ビーズ、染料、標識、タグ、フルオロフォア、又はこれらの任意の組み合わせを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記一次検出剤が、抗ＢＴＫ抗体、抗ＩＴＫ抗体、抗ＴＸＫ抗体、抗ＴＥＣ抗体、抗ＢＭＸ抗体、又は抗ＢＬＫ抗体である、請求項２６又は２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記一次又は二次検出剤に化学発光タグを複合させる、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
患者が癌に罹患している、請求項１２〜２９のいずれか一項に記載の方法
【請求項３１】
癌が、ホジキンリンパ腫若しくは非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ワルデンストレームマクログロブリン血症、又は多発性骨髄腫（ＭＭ）である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記サンプルが血液サンプル、リンパ液サンプル、又は腫瘍生検サンプルである、請求項１２〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願番号第６１／７１２，６７５号（２０１２年１０月１１日出願）の利益に関する優先権を請求し、前記仮出願特許は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本明細書には、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の投与を含む治療と組み合わせて使用するための、コンパニオン診断法及びキットが記載される。
【背景技術】
【０００３】
ＴＥＣキナーゼファミリーは、非受容体型タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）のサブファミリーである。ＴＥＣキナーゼファミリーは、ＴＥＣ、ＢＴＫ（ブルトン型チロシンキナーゼ）、ＩＴＫ（インターロイキン２誘導型Ｔ細胞キナーゼ）／ＥＭＴ／ＴＳＫ、ＢＭＸ、及びＴＸＫ／ＲＬＫの５つのメンバーからなる。このファミリーは、ホスホイノシチドに結合することが既知であるプレクストリン相同（ＰＨ）ドメインが存在することを特徴とする。ＴＥＣファミリーキナーゼは、ホスホチロシン介在性及びリン脂質介在性のシグナル伝達システムに関与する。多くのＴＥＣファミリータンパク質は、造血組織において豊富に発現し、血液細胞の増殖及び分化過程において重要な役割を果たす。ＢＴＫ遺伝子の変異により、ヒトにおいてはＸ染色体連鎖無ガンマグロブリン血症（ＸＬＡ）及びマウスにおいてはＸ染色体連鎖免疫不全（Ｘｉｄ）が生じることから、ＢＴＫ活性はＢ細胞の発生過程に不可欠であることが示唆されている。ＩＴＫは、Ｔｈ２及びＴｈ１７細胞の発達及びエフェクター機能にとって機能上重要である。加えて、ＴＥＣファミリーキナーゼは、サイトカイン受容体、リンパ球表面抗原、ヘテロ三量体Ｇタンパク質共役型受容体及びインテグリン分子の細胞内シグナル伝達機序に関与することが示されている。これまでに、癌、自己免疫障害、及び炎症性疾患など、ＴＥＣファミリーキナーゼの活性と関連する多様な疾患の治療のために、ＴＥＣキナーゼの阻害剤が開発されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の投与を含む治療と組み合わせて使用するためのコンパニオン診断法及びキットが記載される。いくつかの実施形態では、提供されるコンパニオン診断法は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上の阻害剤に関するタンパク質占有率アッセイを包含する。したがって、本明細書では、ＴＥＣキナーゼファミリーのキナーゼ阻害剤に関するタンパク質占有率アッセイが記載される。本明細書では更に、ＴＥＣキナーゼファミリーの不可逆的キナーゼ阻害剤に関するタンパク質占有率アッセイが記載される。本明細書では更に、ＴＥＣキナーゼファミリーの可逆的キナーゼ阻害剤に関するタンパク質占有率アッセイが記載される。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のキナーゼの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＢＴＫ、ＩＴＫ、ＢＭＸ、ＴＸＫ、ＴＥＣ、又はこれらの任意の組み合わせの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のキナーゼの阻害剤であり、構造的に相同な１種以上のキナーゼの阻害剤でもある。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のキナーゼの阻害剤であり、構造的に相同な１種以上のチロシンキナーゼ（例えば、構造的に相同な活性部位を有するキナーゼ）の阻害剤でもある。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のキナーゼの阻害剤であり、ＥＧＦＲファミリーのキナーゼの阻害剤でもある。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のキナーゼの阻害剤であり、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）、又はＪＡＫ３の阻害剤でもある。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のキナーゼの阻害剤であり、ＳＲＣファミリーのチロシンキナーゼの阻害剤でもある。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のキナーゼの阻害剤であり、Ｂリンパ球キナーゼ（ＢＬＫ）の阻害剤でもある。本明細書は、提供されるタンパク質占有率アッセイに使用するための例示的な試薬及びプローブを更に記載する。
【０００５】
本明細書における特定の実施形態では、ＥＬＩＳＡプローブアッセイであるタンパク質占有率アッセイが記載される。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡプローブアッセイは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の結合していないＴＥＣファミリーキナーゼの相対量を定量するための、プレートベースの電気化学発光アッセイである。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は不可逆的ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤である。例えば、いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は、ＴＥＣファミリーキナーゼの活性部位に結合し、システイン残基によりジスルフィド結合を形成する。いくつかの実施形態では、アッセイは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の結合していないＴＥＣファミリーキナーゼに対しプローブを結合させることを包含する。いくつかの実施形態では、プローブは、リンカー（例えば、長鎖リンカー）により、検出可能な標識（例えば、ビオチン）が付加されたＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤はＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は不可逆的ＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤はイブルチニブである。いくつかの実施形態では、プローブは本明細書に記載の化合物Ｉ−５であり、長鎖リンカーによりビオチンに連結されているイブルチニブからなる。プローブによるサンプル標識は、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤により占有されないＢＴＫの検出を可能にする。いくつかの実施形態では、プローブは、ストレプトアビジンコートプレートにより捕捉されたＴＥＣファミリーキナーゼ（すなわち、プローブの結合しているキナーゼ）と複合体形成する。いくつかの実施形態では、複合体を形成していない過剰なプローブは、ストレプトアビジンに対する結合に関し、プローブの結合しているキナーゼと競合する。
【０００６】
本明細書では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤の有効性を決定するための方法も記載される。本明細書は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のメンバーの阻害により、疾患を有する患者に治療効果がもたらされる疾患を含む、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のメンバーの活性と関連する疾患の治療における診断、予測、並びに治療レジメンの決定及び修正においてタンパク質占有率アッセイを使用するための方法を更に記載する。いくつかの実施形態では、特許（patent）は、例えば、癌、自己免疫障害、及び／又は炎症性疾患など、ＴＥＣファミリーキナーゼの異常な活性化と関連する疾患又は障害を有するとして診断される。
【０００７】
一態様では、本明細書では、プレートベースのシステムを含む、タンパク質占有率アッセイが提供される。いくつかの実施形態では、プレートベースのタンパク質占有率アッセイは、電気化学発光アッセイを含む。
【０００８】
本明細書には、サンプル中の、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の結合していない（例えば、活性部位が阻害剤により占有されていない）ＴＥＣファミリーキナーゼの量を定量するための方法が記載される。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の結合していないＢＴＫの量を定量することを含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤はＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤はＡＶＬ−２９２である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤はＯＮＯ−ＷＧ−３０７である。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、イブルチニブに結合していないＴＥＣファミリーキナーゼの量を定量することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、イブルチニブに結合していないＢＴＫの量を定量することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、イブルチニブに結合していないＩＴＫの量を定量することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、イブルチニブに結合していないＢＭＸの量を定量することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、イブルチニブに結合していないＴＥＣの量を定量することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、イブルチニブに結合していないＴＸＫの量を定量することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、イブルチニブに結合していないＢＬＫの量を定量することを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤に結合されていないＢＴＫキナーゼ活性部位の数を求めることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤に結合されていないＩＴＫキナーゼ活性部位の数を求めることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤に結合されていないＢＭＸ活性部位の数を求めることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤に結合されていないＴＸＫ活性部位の数を求めることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤に結合されていないＴＥＣ活性部位の数を求めることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤に結合されていないＢＬＫ活性部位の数を求めることを含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は、ＴＥＣキナーゼファミリーの２種以上のメンバーを阻害する。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ、ＩＴＫ、ＢＭＸ、ＴＸＫ、ＴＥＣ、又はこれらの任意の組み合わせを阻害する。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は、ＥＧＦＲ又はＳＲＣファミリーのチロシンキナーゼを阻害する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、イブルチニブに結合されていないＢＴＫキナーゼ活性部位の数を求めることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、イブルチニブに結合されていないＩＴＫキナーゼ活性部位の数を求めることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、イブルチニブに結合されていないＢＭＸ活性部位の数を求めることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、イブルチニブに結合されていないＴＸＫ活性部位の数を求めることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、イブルチニブに結合されていないＴＥＣ活性部位の数を求めることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、サンプル中の、イブルチニブに結合されていないＢＬＫ活性部位の数を求めることを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、タンパク質占有率アッセイは、サンプルをプローブと接触させることと、プローブに結合するＴＥＣファミリーキナーゼ（すなわち、プローブの結合しているキナーゼ）を検出することと、を含み、ここで、プローブは、リンカーにより標識が付加されたＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、プローブはイブルチニブの誘導体であり、イブルチニブにはリンカーにより標識が付加される。いくつかの実施形態では、標識はビオチン又はその誘導体である。いくつかの実施形態では、プローブは、本明細書に記載の通りの式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）のプローブから選択される。いくつかの実施形態では、プローブは、本明細書に記載の通りのプローブ化合物Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−４、又はＩ−５から選択される。いくつかの実施形態では、プローブはプローブ化合物Ｉ−５である。
【００１２】
本明細書のいくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を投与された患者由来のサンプルにおけるタンパク質占有率を検出するためのコンパニオン診断キットが開示される。いくつかの実施形態では、キットは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤に結合していないＴＥＣファミリーキナーゼに結合するプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、ＴＥＣファミリーキナーゼに結合する阻害剤を含む（例えば、プローブは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の誘導体である）。いくつかの実施形態では、阻害剤には標識を付加する。いくつかの実施形態では、プローブは、更にリンカーを含み、リンカーは、標識を阻害剤に付加させ得る。いくつかの実施形態では、プローブは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の誘導体である。いくつかの実施形態では、プローブは、リンカーにより標識が付加されたＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、プローブは、イブルチニブの誘導体である。いくつかの実施形態では、プローブは、リンカーにより標識が付加されたイブルチニブからなる。いくつかの実施形態では、プローブは、リンカーによりビオチンを付加したイブルチニブからなる。いくつかの実施形態では、プローブは、式（Ｉ）、（ＩＩ）、又は（ＩＩＩ）の化合物である。いくつかの実施形態では、プローブは、化合物Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−４、又はＩ−５である。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の固体支持体を更に含む。
【００１３】
本明細書では、（ａ）ＴＥＣファミリーキナーゼ、又はチロシンキナーゼ相同体を含むサンプルをプローブと接触させることと、（ｂ）プローブの結合しているキナーゼの量を検出することと、（ｃ）サンプル中の、プローブの結合しているキナーゼの量に基づき、キナーゼの占有率を決定することと、を含む、方法が更に開示される。いくつかの実施形態では、方法は、プローブの結合しているキナーゼを一次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、一次検出剤を二次検出剤と接触させることを更に含む。
【００１４】
本明細書では、（ａ）ＴＥＣファミリーキナーゼを含むサンプルをプローブと接触させることと、（ｂ）プローブの結合しているキナーゼの量を検出することと、（ｃ）プローブの結合しているキナーゼの量に基づきキナーゼの占有率を決定することと、（ｄ）キナーゼの占有率に基づき治療レジメンを決定することと、を含む、治療レジメンを決定するための方法が更に開示される。いくつかの実施形態では、治療レジメンを決定することは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、治療レジメンを決定することは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を用い治療レジメンを修正することを含む。いくつかの実施形態では、治療レジメンを修正することは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を用い、治療レジメンを増加、減少、開始又は終了することを含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を用いる治療レジメンは、標的の占有率が上昇したときに修正される。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を用いる治療レジメンは、標的の占有率が低下したときに修正される。いくつかの実施形態では、方法は、プローブの結合しているキナーゼを一次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、一次検出剤を二次検出剤と接触させることを更に含む。
【００１５】
本明細書では、（ａ）ＴＥＣファミリーキナーゼを含むサンプルをプローブと接触させることと、（ｂ）プローブの結合しているキナーゼの存在又は非存在を検出することと、（ｃ）プローブの結合しているキナーゼの量に基づきキナーゼの占有率を決定することと、（ｄ）キナーゼの占有率に基づきＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の有効性を決定することと、を含む、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の有効性を決定するための方法が更に開示される。いくつかの実施形態では、標的の占有率が少なくとも約７０％であるとき、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は有効である。いくつかの実施形態では、標的の占有率が約５０％未満であるとき、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は有効ではない。いくつかの実施形態では、方法は、プローブの結合しているキナーゼを一次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、一次検出剤を二次検出剤と接触させることを更に含む。
【００１６】
本明細書は、（ａ）ＴＥＣファミリーキナーゼを含むサンプルをプローブと接触させることと、（ｂ）プローブの結合しているキナーゼの量を検出することと、（ｃ）プローブの結合しているキナーゼの量に基づきＴＥＣファミリーキナーゼの占有率を決定することと、（ｄ）キナーゼの占有率に基づき、対象者を、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤レスポンダー又はＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤非レスポンダーとして識別することと、を含む、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤療法のレスポンダーを識別するための方法を更に開示し、ここで、サンプルは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の少なくとも１回の投与を受けた対象者由来のものである。いくつかの実施形態では、対象者は、標的の占有率が少なくとも約７０％であるとき、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤のレスポンダーであるとして識別される。いくつかの実施形態では、対象者は、標的の占有率が約５０％未満であるとき、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤のレスポンダーではないとして識別される。いくつかの実施形態では、方法は、プローブの結合しているキナーゼを一次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、一次検出剤を二次検出剤と接触させることを更に含む。
【００１７】
本明細書では、（ａ）ＴＥＣファミリーキナーゼを含むサンプルをプローブと接触させることと、（ｂ）プローブの結合しているキナーゼの量を検出することと、（ｃ）プローブの結合しているキナーゼの量に基づきＴＥＣファミリーキナーゼの占有率を決定することと、（ｄ）ＴＥＣファミリーキナーゼの占有率に基づきＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤耐性を決定することと、を含む、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤耐性を決定するための方法が更に開示される。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤耐性は、標的の占有率が約５０％未満であるとき、決定される。いくつかの実施形態では、方法は、プローブの結合しているキナーゼを一次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、一次検出剤を二次検出剤と接触させることを更に含む。
【００１８】
本明細書では、（ａ）ＴＥＣファミリーキナーゼを含むサンプルをプローブと接触させて、プローブの結合しているキナーゼを形成させることと、（ｂ）プローブの結合しているキナーゼの量を検出することと、（ｃ）プローブの結合している標的の量に基づき、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤によりキナーゼの占有率を決定することと、（ｄ）ＴＥＣファミリーキナーゼの占有率に基づき、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を検証することと、を含む、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を検証するための方法が更に開示される。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を検証することは、ＴＥＣファミリーキナーゼに対するＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の有効性を決定することを含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤によりＴＥＣファミリーキナーゼの占有率を決定することは、プローブの結合しているキナーゼの量を定量することを含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼの占有率が少なくとも約７０％であるとき、製剤は有効である。いくつかの実施形態では、方法は、プローブの結合しているキナーゼを一次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、一次検出剤を二次検出剤と接触させることを更に含む。
【００１９】
本明細書では、（ａ）ＴＥＣファミリーキナーゼを含むサンプルをプローブと接触させることと、（ｂ）プローブの結合しているキナーゼの存在又は非存在を検出することと、（ｃ）プローブの結合しているキナーゼの量に基づきＴＥＣファミリーキナーゼモジュレータを識別することと、を含む、ＴＥＣファミリーキナーゼに結合するＴＥＣファミリーキナーゼモジュレータを識別するための方法が更に開示される。いくつかの実施形態では、方法は、プローブの結合しているキナーゼを一次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、一次検出剤を二次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、推定上のＴＥＣファミリーキナーゼモジュレータにより前処理されたサンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは生体外で前処理される。いくつかの実施形態では、サンプルは、推定上のＴＥＣファミリーキナーゼモジュレータを投与された対象者（例えば、患者）由来のサンプルである。
【００２０】
本明細書では、（ａ）ＴＥＣファミリーキナーゼを含むサンプルをプローブと接触させることと、（ｂ）プローブの結合しているキナーゼの存在又は非存在を検出することと、（ｃ）プローブの結合しているキナーゼの量に基づきＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を識別することと、を含む、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を識別するための方法が更に開示される。いくつかの実施形態では、方法は、プローブの結合しているキナーゼを一次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、一次検出剤を二次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、推定上のＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤により前処理されたサンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは生体外で前処理される。いくつかの実施形態では、サンプルは、推定上のＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を投与された対象者（例えば、患者）由来のサンプルである。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット又は組成物は、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、阻害剤は、不可逆的ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＴＥＣファミリーキナーゼに共有結合する。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ＴＥＣファミリーキナーゼのシステイン残基に結合する。いくつかの実施形態では、阻害剤は、低分子、ポリペプチド、抗体、又は核酸である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤はブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤である。いくつかの実施形態では、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤はイブルチニブである。いくつかの実施形態では、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤は、ＡＶＬ−２９２、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−１０１、ＣＮＸ−７７４、ＯＮＯ−ＷＧ−３０７である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は、ＩＴＫの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は、ＴＥＣキナーゼの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は、ＢＭＸキナーゼの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤はＢＬＫの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４及びＪＡＫ３から選択されるキナーゼの阻害剤である。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット又は組成物は、標的キナーゼを含む。いくつかの実施形態では、標的キナーゼは、ＴＥＣファミリーキナーゼである。いくつかの実施形態では、キナーゼは、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）である。いくつかの実施形態では、キナーゼはＩＴＫである。いくつかの実施形態では、キナーゼはＢＬＫである。いくつかの実施形態では、キナーゼはＴＥＣキナーゼである。いくつかの実施形態では、キナーゼはＴＸＫである。いくつかの実施形態では、キナーゼはＢＭＸキナーゼである。いくつかの実施形態では、キナーゼはＩＴＫである。いくつかの実施形態では、キナーゼはＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、又はＪＡＫ３である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット又は組成物は、１つ以上の固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の固体支持体はプレートである。いくつかの実施形態では、１つ以上の固体支持体は、１個又は複数個のビーズである。いくつかの実施形態では、キットは２つ以上の固体支持体を含む。いくつかの実施形態では、２つ以上の固体支持体は、（ａ）プレート及び（ｂ）１個又は複数個のビーズを含む。いくつかの実施形態では、プレートはマイクロプレートである。いくつかの実施形態では、マイクロプレートはストレプトアビジンコートしたマイクロプレートである。いくつかの実施形態では、マイクロプレートはＭＳＤマイクロプレートである。いくつかの実施形態では、ビーズはストレプトアビジンビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズは磁気ビーズである。いくつかの実施形態では、固体支持体は、コートされて、コートされた固体支持体を形成する。いくつかの実施形態では、コートされた固体支持体は、ストレプトアビジンによりコートされる。いくつかの実施形態では、コートされた固体支持体は抗体によりコートされる。いくつかの実施形態では、コートされた固体支持体は、プローブを捕捉できる。いくつかの実施形態では、コートされた固体支持体は、標識を捕捉できる。いくつかの実施形態では、コートされた固体支持体は、標的（例えば、ＴＥＣファミリーキナーゼ）を捕捉できる。
【００２４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法は、プローブの結合している標的を一次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、一次検出剤は、抗体、ビーズ、染料、標識、タグ、フルオロフォア、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、一次検出剤は抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＢＴＫ抗体である。いくつかの実施形態では、一次検出剤はタグと複合されている。いくつかの実施形態では、一次検出剤は、電気化学発光タグと複合されている。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）二塩化物を含む。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。いくつかの実施形態では、一次検出剤は、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧと複合されている。いくつかの実施形態では、一次検出剤はビーズである。
【００２５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法は、一次検出剤を二次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、二次検出剤は、抗体、ビーズ、染料、標識、タグ、フルオロフォア、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、二次検出剤は抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＩｇＡ抗体である。いくつかの実施形態では、二次検出剤はタグと複合されている。いくつかの実施形態では、二次検出剤は、電気化学発光タグと複合されている。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）二塩化物を含む。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。いくつかの実施形態では、二次検出剤は、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧと複合されている。いくつかの実施形態では、二次検出剤はビーズである。
【００２６】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット又は組成物は一次検出剤を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット又は組成物は、二次検出剤を含む。いくつかの実施形態では、検出剤は、抗体、ビーズ、染料、標識、タグ、フルオロフォア、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、検出剤検出剤は抗体を含む。いくつかの実施形態では、検出剤はタグと複合されている。いくつかの実施形態では、検出剤は、電気化学発光タグと複合されている。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）二塩化物を含む。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。いくつかの実施形態では、検出剤はＳＵＬＦＯ−ＴＡＧと複合されている。いくつかの実施形態では、検出剤はビーズである。いくつかの実施形態では、検出剤は酵素と複合されている。いくつかの実施形態では、抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）又はアルカリホスファターゼ（ＡＰ）と複合されている。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＢＴＫ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はＴＥＣファミリーキナーゼを標的とする。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＩＴＫ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＴＥＣ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＢＭＸ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＢＬＫ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＨＥＲ１抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、又は抗ＨＥＲ４抗体である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット又は組成物は標識を含む。いくつかの実施形態では、標識はビオチンである。いくつかの実施形態では、標識はフルオロフォアである。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法は、標的キナーゼを捕捉することを更に含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法は、プローブの結合している標的キナーゼを更に含む。いくつかの実施形態では、標的は抗体により捕捉される。いくつかの実施形態では、抗体は抗標的抗体である。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的はビーズにより捕捉される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット又は組成物は抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体を固体支持体に付着させる。いくつかの実施形態では、ビーズを固体支持体に付着させる。いくつかの実施形態では、固体支持体はマイクロプレートである。いくつかの実施形態では、マイクロプレートはＭＳＤマイクロプレートである。いくつかの実施形態では、固体支持体はビーズである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物はビーズを含む。いくつかの実施形態では、ビーズはストレプトアビジンビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズは磁気ビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズはコートされたビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズはコートされたストレプトアビジンビーズである。いくつかの実施形態では、コートされたビーズはタグによりコートされている。いくつかの実施形態では、タグは電気化学発光タグである。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）二塩化物を含む。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。いくつかの実施形態では、ビーズはＳＵＬＦＯ−ＴＡＧストレプトアビジンビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズはＳＵＬＦＯ−ＴＡＧビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズはプローブと相互作用する。いくつかの実施形態では、プローブは標識を含む。いくつかの実施形態では、ビーズは標識と相互作用する。いくつかの実施形態では、標識はビオチンを含む。いくつかの実施形態では、ビーズはプローブの結合している標的と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ビーズはプローブに結合する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法は、プローブの結合している標的又はそれらの一部の存在又は非存在を検出することを含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することは、プローブの結合している標的又はそれらの一部を検出することを含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することは、ビーズ又はそれらの一部を検出することを含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することは、コートされたビーズを検出することを含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することは、電気化学発光タグを検出することを含む。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）二塩化物を含む。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することは、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧを検出することを含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することは発光を含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することは、電気化学発光を含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的は未占有の標的である。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的は製剤により占有されている標的である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法は、プローブの結合している標的の精製を更に含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的の精製は、プローブの結合していない標的からのプローブの結合している標的の磁気分離を含む。いくつかの実施形態では、サンプルは前処理されたサンプルであり、ここで、前処理されたサンプルは、プローブとの接触の前にＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤と接触している。いくつかの実施形態では、サンプルは未処理サンプルであり、ここで、サンプルは、標識との接触の前にＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤と接触していない。いくつかの実施形態では、サンプルは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を投与された患者由来のサンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を投与されていない患者由来の対照サンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血サンプル、末梢血サンプル、リンパ液サンプル、組織サンプル、腫瘍生検サンプル、又は骨髄サンプルである。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血サンプル、末梢血サンプル、リンパ液サンプル、組織サンプル、腫瘍生検サンプル、又は骨髄サンプルに由来する１種以上の細胞型、又はそれらの可溶化液を含有するサンプルである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物は、プローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブは阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、阻害剤は標的に結合する。いくつかの実施形態では、阻害剤は不可逆的阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、標的に共有結合する。いくつかの実施形態では、阻害剤は、標的のシステイン残基に結合する。いくつかの実施形態では、阻害剤は、低分子、ポリペプチド、抗体、又は核酸である。いくつかの実施形態では、阻害剤はＴＥＣファミリーキナーゼの阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤はブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤である。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）のシステイン残基に結合する。いくつかの実施形態では、阻害剤は、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）のシステイン４８１に結合する。いくつかの実施形態では、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤はイブルチニブである。いくつかの実施形態では、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤は、ＡＶＬ−２９２、ＡＶＬ−２９１  ＡＶＬ−１０１、ＣＮＸ−７７４、ＯＮＯ−ＷＧ−３０７である。いくつかの実施形態では、製剤はＩＴＫの阻害剤である。いくつかの実施形態では、製剤はＴＥＣキナーゼの阻害剤である。いくつかの実施形態では、製剤はＢＭＸキナーゼの阻害剤である。いくつかの実施形態では、製剤はＢＬＫの阻害剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４及びＪＡＫ３から選択されるキナーゼの阻害剤である。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物は標的を含む。いくつかの実施形態では、標的はキナーゼである。いくつかの実施形態では、キナーゼは、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）である。いくつかの実施形態では、キナーゼはＩＴＫ、ＢＬＫ、ＴＥＣ、ＴＸＫ、又はＢＭＸである。いくつかの実施形態では、キナーゼはＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、又はＪＡＫ３である。いくつかの実施形態では、標的はタンパク質である。
【００３５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物はサンプルを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは癌に罹患している対象者由来のものである。いくつかの実施形態では、癌は肉腫である。いくつかの実施形態では、癌は細胞腫である。いくつかの実施形態では、癌はリンパ腫である。いくつかの実施形態では、リンパ腫はホジキンリンパ腫である。いくつかの実施形態では、リンパ腫は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。いくつかの実施形態では、癌は白血病である。いくつかの実施形態では、癌は慢性リンパ性白血病である。いくつかの実施形態では、癌は小リンパ球性リンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌はワルデンシュトレームマクログロブリン血症である。いくつかの実施形態では、癌は濾胞性リンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌はマントル細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、癌は、多発性骨髄腫である。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、サンプルは、自己免疫性又は炎症性障害に罹患している対象者由来である。
【００３６】
本明細書に記載の特定の実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤療法を受けている患者において、製剤標的の占有率を決定するためのキットが記載され、キットは、式（ＩＩ）の構造を有するプローブを含み、プローブはＴＥＣファミリーキナーゼに結合する
【００３７】
【化１】
2015536446.tif 000003
式（ＩＩ）
（式中、
ＬａはＣＨ２、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
Ａｒは、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Ｙは、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
ＺはＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＯＳ（Ｏ）ｎ、ＮＨＳ（Ｏ）ｎであり、式中、ｎは１又は２であり、
Ｒ６及びＲ８は、独立して、Ｈ、場合により置換されたアルキル又は場合により置換されたヘテロアルキルから選択され、
Ｌ１は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、
Ｌ２は、結合、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、又は−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）であり、式中、ｍは２〜６であり、
Ｌ３は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、Ｘは検出可能な標識である）。いくつかの実施形態では、Ｘは
【００３８】
【化２】
2015536446.tif 000004
である。いくつかの実施形態では、プローブは
【００３９】
【化３】
2015536446.tif 000005
の構造を有する。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼはブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）、ＩＴＫ、ＴＥＣ、ＢＭＸ、又はＴＸＫである。いくつかの実施形態では、プローブはＢＬＫ、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４又はＪＡＫ３に結合する。いくつかの実施形態では、キットは、１つ以上の固体支持体を更に含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の固体支持体は、プレート、マイクロプレート、１個又は複数個のビーズから選択される。いくつかの実施形態では、固体支持体を捕捉剤によりコートして、コートされた固体支持体を生成する。この捕捉剤がプローブに結合する。いくつかの実施形態では、捕捉剤はストレプトアビジン又は抗体である。いくつかの実施形態では、キットは、一次検出剤、及び場合により、一次検出剤に結合する二次検出剤を更に含む。いくつかの実施形態では、一次検出剤又は二次検出剤は、抗体、ビーズ、染料、標識、タグ、フルオロフォア、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、一次検出剤は、抗ＢＴＫ抗体、抗ＩＴＫ抗体、抗ＴＥＣ抗体、抗ＴＸＫ抗体、抗ＢＭＸ抗体、又は抗ＢＬＫ抗体である抗体である。いくつかの実施形態では、一次検出剤は、抗ＨＥＲ１抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、又は抗ＨＥＲ４抗体である抗体である。いくつかの実施形態では、一次又は二次検出剤は、電気化学発光タグに複合される。いくつかの実施形態では、化学発光タグは、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドタグである。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼ阻害剤治療剤は、不可逆的ＴＥＣキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼ阻害剤治療剤は、不可逆的ＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼ阻害剤治療剤は、イブルチニブである。
【００４０】
本明細書の特定の実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤療法を受けている患者において、製剤標的の占有率を決定するための方法が記載され、方法は、（ａ）ＴＥＣファミリーキナーゼを含むサンプルをプローブと接触させて、プローブの結合しているキナーゼを形成させることと、（ｂ）サンプル中の、プローブの結合しているキナーゼの量を検出することと、（ｃ）サンプルにおいて検出されたプローブの結合しているキナーゼの量に基づき、ＴＥＣファミリーキナーゼの標的占有率を決定することと、を含み、ここで、サンプルは、不可逆的ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の少なくとも一回量を投与された患者から得られたものであり、プローブは式（ＩＩ）の構造を有し、プローブはＴＥＣファミリーキナーゼに結合する
【００４１】
【化４】
2015536446.tif 000006
式（ＩＩ）
（式中、
ＬａはＣＨ２、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
Ａｒは、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Ｙは、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
ＺはＣ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＯＳ（Ｏ）ｎ、ＮＨＳ（Ｏ）ｎであり、式中、ｎは１又は２であり、
Ｒ６及びＲ８は、独立して、Ｈ、場合により置換されたアルキル又は場合により置換されたヘテロアルキルから選択され、
Ｌ１は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、
Ｌ２は、結合、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、又は−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）であり、式中、ｍは２〜６であり、
Ｌ３は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、かつＸは検出可能な標識である）。いくつかの実施形態では、Ｘは
【００４２】
【化５】
2015536446.tif 000007
である。いくつかの実施形態では、プローブは
【００４３】
【化６】
2015536446.tif 000008
の構造を有する。いくつかの実施形態では、標的占有率を決定することは、ｉ）サンプルにおいて検出されたプローブの結合しているキナーゼの量に基づき、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤に結合していない結合部位の数を求めることと、ｉｉ）サンプル中の活性型ＴＥＣファミリーキナーゼの総量と前記数を比較することと、を含む。いくつかの実施形態では、対照は、未処理のサンプルに対し本方法を実施したときに存在する、プローブの結合しているキナーゼの量である。いくつかの実施形態では、方法は、ＴＥＣファミリーキナーゼの標的占有率に基づき、治療レジメンを決定又は修正することを更に含む。本明細書には、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤療法を受けている患者における製剤標的占有率をモニタリングするための方法が記載され、方法は、治療過程の２つ以上の時点で、キナーゼのタンパク質占有率を決定するために、本明細書に提供される方法を実施することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、治療過程にわたって標的占有率が上昇又は低下した場合に、治療レジメンを修正することを更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、ｉ）標的占有率が約５０％未満の場合に、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の投与量又は頻度を増加させることと、ｉｉ）標的占有率が少なくとも約７０％を上回る場合に、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の投与量又は頻度を減少させることと、ｉｉｉ）ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の同等の治療レジメンを維持することと、又はｉｖ）治療レジメンを中断することと、を更に含む。いくつかの実施形態では、標的占有率が約５０％未満の場合に、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の投与量を増加させる。いくつかの実施形態では、標的占有率が少なくとも約７０％を上回る場合に、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の投与量を減少させる。いくつかの実施形態では、標的占有率が少なくとも約７０％を上回る場合に、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の投与量を維持する。いくつかの実施形態では、標的占有率が約５０％未満の場合に、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の投与頻度を増加させる。いくつかの実施形態では、標的占有率が少なくとも約７０％を上回る場合に、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の投与頻度を減少させる。いくつかの実施形態では、標的占有率が少なくとも約７０％を上回る場合に、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の投与頻度を維持する。いくつかの実施形態では、方法は、標的占有率に基づき、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤療法の有効性を決定することを更に含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼの占有率が少なくとも約７０％であるとき、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は有効である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼの占有率が約５０％未満であるとき、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は有効ではない。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は、イブルチニブ、ＡＶＬ−２９２、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−１０１、ＣＮＸ−７７４、又はＯＮＯ−ＷＧ−３０７である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤はイブルチニブである。いくつかの実施形態では、イブルチニブの少なくとも１回の投与量は、約１０ｍｇ〜約２０００ｍｇ、例えば、１４０ｍｇ、４２０ｍｇ、５６０ｍｇ又は８４０ｍｇなどである。いくつかの実施形態では、タンパク質占有率が治療過程にわたってモニタリングされる場合、患者に投与されるイブルチニブの一日用量は、１日当り約１０ｍｇ〜約２０００であり、例えば、１日当り約１４０ｍｇ、４２０ｍｇ、５６０ｍｇ、又は８４０ｍｇなどの一日用量である。特定の実施形態では、患者には、イブルチニブの投与量、一日当たり約４２０ｍｇを維持して投与する。いくつかの実施形態では、方法は、捕捉剤によりプローブの結合しているキナーゼを捕捉することを更に含む。いくつかの実施形態では、捕捉剤はストレプトアビジン又は抗体である。いくつかの実施形態では、捕捉剤は固体支持体に付着させる。いくつかの実施形態では、固体支持体はプレート、マイクロプレート、１個又は複数個のビーズである。いくつかの実施形態では、方法は、プローブの結合しているキナーゼを、一次検出剤、及び場合により、一次検出剤に結合する二次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、一次検出剤又は二次検出剤は、抗体、ビーズ、染料、標識、タグ、フルオロフォア、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、一次検出剤は、ＴＥＣファミリーキナーゼに結合する抗体である。いくつかの実施形態では、一次検出剤は、抗ＢＴＫ抗体、抗ＩＴＫ抗体、抗ＴＸＫ抗体、抗ＴＥＣ抗体、抗ＢＭＸ抗体、又は抗ＢＬＫ抗体である抗体である。いくつかの実施形態では、一次検出剤は、抗ＨＥＲ１抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＨＥＲ３抗体、又は抗ＨＥＲ４抗体である抗体であるいくつかの実施形態では、方法は、一次検出剤を二次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、二次検出剤は、抗体、ビーズ、染料、標識、タグ、フルオロフォア、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、一次又は二次検出剤は、化学発光タグに複合される。いくつかの実施形態では、化学発光タグは、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドタグである。いくつかの実施形態では、患者は、癌、自己免疫疾患、又は炎症性障害に罹患しているいくつかの実施形態では、癌は、肉腫、細胞腫、骨髄腫、白血病、又はリンパ腫であるいくつかの実施形態では、癌はホジキンリンパ腫又は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。いくつかの実施形態では、癌は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、又は多発性骨髄腫（ＭＭ）である。いくつかの実施形態では、サンプルは血液サンプル、リンパ液サンプル又は腫瘍生検サンプルである。
【００４４】
参照による援用
本明細書において言及される全ての出版物及び特許出願は、それぞれの個別の出版物又は特許出願が、参照により援用されることが具体的にかつ個別に記載されているのと同等に、参照によりその全体が本明細書に援用される。本明細書で説明される開示は、本開示の出願日よりも先に開示されているという意味合いでのみ提供される。本明細書では、本発明者らによる本明細書における記載は、先行技術の効力により、又は任意のその他の理由から、係る開示を先行するものとして認めることを承認するものと解釈されない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
当業者であれは、以下に記載の図面は例示目的のみのものであることを理解されるであろう。図面は、決して、本教示の範囲を制限することを意図するものではない。
【図１】タンパク質占有率アッセイの概略図を示す。
【図２】タンパク質占有率アッセイキットの構成要素を示す。
【図３】製剤の結合している標的を検出するためのタンパク質占有率アッセイ法の概略図を示す。
【図４】未占有の標的を検出するためのタンパク質占有率アッセイの概略図を示す。
【図５】製剤の結合している標的を検出するためのプレートベースのタンパク質占有率アッセイの概略図を示す。
【図６】プローブの結合している標的を検出するためのプレートベースのタンパク質占有率アッセイの概略図を示す。
【図７】製剤の結合している標的を検出するためのプレートベースのタンパク質占有率アッセイの概略図を示す。
【図８】未占有の標的を検出するためのプレートベースのタンパク質占有率アッセイの概略図を示す。
【図９】プローブの結合している標的を検出するための、プローブコートされたプレートベースのタンパク質占有率の概略図を示す。
【図１０】未占有の標的を検出するためのプローブコートされたプレートベースのタンパク質占有率アッセイの概略図を示す。
【図１１】例示的な、ＢＴＫ占有率のアッセイフォーマットを示す。図１１Ａは、例示的な、ストレプトアビジン検出法の概略図を示す。図１１Ｂは、例示的な、ストレプトアビジン捕捉法の概略図を示す。
【図１２】ストレプトアビジン検出によるＢＴＫ占有率アッセイを示す。図１２Ａは、例示的なプレートレイアウトを示す。図１２Ｂは、ストレプトアビジン検出法の結果を示す例示的なデータを表す。
【図１３】２種の異なるＢＴＫ捕捉抗体を使用するストレプトアビジン検出によるＢＴＫ占有率アッセイの例示的な結果を表す。
【図１４】ストレプトアビジン捕捉によるＢＴＫ占有率アッセイを示す。図１４Ａは、ストレプトアビジン捕捉法の概略図を示す。図１４Ｂは、例示的なプレートレイアウトを示す。図１４Ｃは、ストレプトアビジン捕捉法の結果を示す例示的なデータを表す。
【図１５】２種の異なるＢＴＫ検出抗体を使用するストレプトアビジン捕捉によるＢＴＫ占有率アッセイの例示的な結果を表す。
【図１６】ストレプトアビジン検出及びストレプトアビジン捕捉法の比較を示す。
【図１７】ストレプトアビジン捕捉によるＢＴＫ占有率アッセイのためのプローブ最適化実験の例示的な結果を表す。
【図１８】ストレプトアビジン捕捉によるＢＴＫ占有率アッセイの用量設定実験の結果を示す。
【図１９】ストレプトアビジン捕捉によるＢＴＫ占有率アッセイの用量設定実験の結果を示す。
【図２０】ＳＩ２４００  ＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ  ＩＭＡＧＥＲプレートを示す。
【図２１】例示的なプローブ化合物Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−４及びＩ−５を示す。
【図２２】ストレプトアビジン捕捉によるＢＴＫ占有率アッセイのためのプローブ最適化実験のための、例示的なプローブ化合物Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、Ｉ−４及びＩ−５の例示的な結果を表す。
【図２３】総ＢＬＫの定量に関し試験した各種捕捉抗体／検出抗体対のシグナルの生データを示す。１つ目の表はＭＳＤ高結合プレートについての表である。２つ目の表はＭＳＤ標準プレートについての表である。
【図２４】総ＢＬＫの定量に関し試験したそれぞれの捕捉抗体／検出抗体対の、バックグラウンドに対するシグナルを示す。１つ目の表はＭＳＤ高結合プレートについての表である。２つ目の表はＭＳＤ標準プレートについての表である。
【図２５】総ＢＬＫの定量に関し試験した各種捕捉抗体／検出抗体対の用量漸増実験（dose titration）の、シグナルの生データを示す。
【図２６】総ＢＬＫの定量に関し試験したそれぞれの捕捉抗体／検出抗体対の用量漸増実験の、バックグラウンドに対するシグナルを示す。
【図２７】１μｇ／ｍＬ捕捉抗体及び０．５μｇ／ｍＬ検出抗体を用い、組み換え型ＢＬＫタンパク質のシグナル値のプロットを示す。
【図２８】ストレプトアビジン捕捉ＢＬＫ占有率アッセイ（Ａ）及びＩＴＫ占有率アッセイ（Ｂ）のためのプローブの用量設定実験の結果を示す。
【図２９】ストレプトアビジン捕捉ＩＴＫ占有率アッセイ（Ａ）及びＩＴＫ阻害率（％）（Ｂ）の薬剤用量設定実験の結果を示す。
【図３０】ＰＢＭＣ溶解物を用い、ストレプトアビジン捕捉ＩＴＫ占有率アッセイの薬剤用量設定実験の結果を示す。結果はＩＴＫ阻害率（％）として表す。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本明細書では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の投与を含む治療と組み合わせて使用するためのコンパニオン診断法及びキットが記載される。いくつかの実施形態では、提供されるコンパニオン診断法は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上の阻害剤に関するタンパク質占有率アッセイを包含する。したがって、本明細書では、ＴＥＣキナーゼファミリーのキナーゼ阻害剤に関するタンパク質占有率アッセイが記載される。本明細書では更に、ＴＥＣキナーゼファミリーの不可逆的キナーゼ阻害剤に関するタンパク質占有率アッセイが記載される。本明細書では更に、ＴＥＣキナーゼファミリーの可逆的キナーゼ阻害剤に関するタンパク質占有率アッセイが記載される。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のキナーゼの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＢＴＫ、ＩＴＫ、ＢＭＸ、ＴＸＫ、ＴＥＣ、又はこれらの任意の組み合わせの阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のキナーゼの阻害剤であり、構造的に相同な１種以上のキナーゼの阻害剤でもある。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のキナーゼの阻害剤であり、構造的に相同な１種以上のチロシンキナーゼの阻害剤でもある。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のキナーゼの阻害剤であり、ＥＧＦＲファミリーのキナーゼの阻害剤でもある。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のキナーゼの阻害剤であり、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）、又はＪＡＫ３の阻害剤でもある。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のキナーゼの阻害剤であり、ＳＲＣファミリーチロシンキナーゼの阻害剤でもある。いくつかの実施形態では、ＴＥＣキナーゼファミリー阻害剤は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のキナーゼの阻害剤であり、Ｂリンパ球キナーゼ（ＢＬＫ）の阻害剤でもある。本明細書では、提供されるタンパク質占有率アッセイに使用するための例示的な試薬及びプローブが更に記載される。
【００４７】
本明細書における特定の実施形態では、タンパク質占有率アッセイはＥＬＩＳＡプローブアッセイである。いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡプローブアッセイは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の結合していないＴＥＣファミリーキナーゼの相対量を定量するための、プレートベースの電気化学発光アッセイである。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は不可逆的ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤である。例えば、いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は、ＴＥＣファミリーキナーゼの活性部位に結合し、システイン残基によりジスルフィド結合を形成する。いくつかの実施形態では、アッセイは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の結合していない遊離のＴＥＣファミリーキナーゼに対し活性プローブを結合させることを包含する。いくつかの実施形態では、活性プローブは、リンカー（例えば、長鎖リンカー）により検出可能な標識（例えば、ビオチン）を付加したＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤ＢＴＫ阻害剤。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は不可逆的ＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤はイブルチニブである。いくつかの実施形態では、プローブは化合物Ｉ−５であり、長鎖リンカーによりビオチンに連結されているイブルチニブからなる。プローブによるサンプル標識は、製剤により占有されていないＢＴＫの検出を可能にする。いくつかの実施形態では、プローブは、ストレプトアビジンコートプレートにより捕捉されたＴＥＣファミリーキナーゼと複合体形成する。いくつかの実施形態では、複合体を形成していない過剰なプローブは、ストレプトアビジンとの結合に関し、プローブ標識されたＢＴＫと競合する。
【００４８】
本明細書では、ＴＥＣキナーゼファミリーの阻害剤の有効性を決定するための方法も記載される。本明細書は、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のメンバーの阻害により、疾患を有する患者に治療効果がもたらされる疾患を含む、ＴＥＣキナーゼファミリーの１種以上のメンバーの活性と関連する疾患の治療における診断、予測、並びに治療レジメンの決定及び修正においてタンパク質占有率アッセイを使用するための方法を更に記載する。いくつかの実施形態では、患者（patent）は、例えば、癌、自己免疫障害、及び／又は炎症性疾患など、ＴＥＣファミリーキナーゼの異常な活性化と関連する疾患又は障害を有するとして診断される。
【００４９】
本明細書では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤による治療が有効である疾患又は病状を診断、予測、及びモニタリングするための診断検査が更に開示される。本明細書では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤療法に対するレスポンダーを識別するため、治療レジメンを決定するため、及びＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤療法に対する耐性を検出するための、診断検査も開示される。
【００５０】
特定の用語
別途記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、請求される主題の属する技術分野の者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。本明細書に記載の用語について複数の定義が存在する場合、用語の節に記載のものが優先される。ＵＲＬ又はその他のこのような識別子若しくはアドレスに対し参照がなされた場合、このような識別子は変化し得るものであり、インターネット上の個々の情報は掲載された後に非掲載とされ得るものの、インターネットを検索すれば等価な情報を発見できることは理解されたい。それらに対する参照は、このような情報の可用性及び公共への普及度の証拠となる。
【００５１】
前述の一般的な記述及び以降の詳細な記載は例示的なものであり、単に説明的なものであり、請求されるあらゆる主題を制限するものではないことは理解されるであろう。別途記載のない限り、本出願では、単数形の使用には、複数形が包含される。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用するとき、単数冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈上明記されない限り複数形も含む。別途記載のない限り、「又は」の使用は「及び／又は」を意味する。更に、用語「含む（including）」並びにその他の形態「include」、「includes」及び「included」は制限するものではない。
【００５２】
本明細書で使用される節見出しは、単に構成目的のものであり、記載される主題を制限するものとして解釈されるものではない。特許、特許出願、記事、書籍、マニュアル、及び論文が挙げられるがこれらに限定されない、本願に引用される全ての文書、又は文書の一部は、あらゆる目的のため、参照によりその全体が明示的に本明細書に援用される。
【００５３】
標準的な化学用語に関する定義は、Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ「ＡＤＶＡＮＣＥＤ  ＯＲＧＡＮＩＣ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ  ４ＴＨ  ＥＤ．」Ｖｏｌｓ．Ａ（２０００）及びＢ（２００１）（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）などの参考書に見ることができる。別途記載のない限り、当該技術の範囲内の、マススペクトロスコピー、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ法及び薬理学の従来法が採用される。別途定義のない限り、本明細書に記載の、分析化学、有機合成化学、並びに薬学及び製薬化学と組み合わせて採用される専門用語、並びにこれらの実験手順及び技術は、当該技術分野において既知のものである。化学合成、化学分析、医薬品、製剤、及び送達、並びに患者の治療には標準的な技術を使用できる。組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、並びに組織培養及び形質転換（例えば、電気穿孔法、リポフェクション法）には標準的な技術を使用できる。反応及び精製法は、例えば、製造元の仕様によるキットを使用して、又は当該技術分野において一般的に実施される通りに、若しくは本明細書に記載される通りに実施できる。前出の技術及び手法は、一般的に、当業者に周知の従来法により、並びに本願明細書を通して引用及び議論される各種一般的な及びより専門的な参照において記載される通りに、実施することができる。
【００５４】
本明細書に記載の方法及び組成物は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、コンストラクト、及び試薬に限定されないこと、並びにそのため変更可能であることは理解されるであろう。本明細書で使用される専門用語は、具体的な実施形態を記載するという目的でのみ使用されるものであり、添付の特許請求の範囲によってのみ制限される本明細書に記載の方法及び組成物の範囲を制限することを意図するものではないことも理解されるであろう。
【００５５】
本明細書に記載の方法、組成物、及び化合物と関連させて使用され、本明細書において言及される全ての出版物及び特許は、例えば、本出願において記載される構成及び方法論を記載及び開示する目的のため、参照によりその全体が援用される。本明細書で述べる開示は、本出願の出願日よりも先に開示されているという意味合いでのみ提供される。本明細書では、本発明者らによる本明細書における記載は、先行技術の効力により、又は任意のその他の理由から、係る開示が先行するものとして認められないことを承認するものと解釈されない。
【００５６】
「アルキル」は、不飽和基を含有せず、１〜１５個の炭素原子（例えば、Ｃ１〜Ｃ１５アルキル）を有する、単に炭素及び水素原子からなる線状又は分岐状炭化水素鎖基を意味する。特定の実施形態では、アルキルは１〜１３個の炭素原子から構成される（例えば、Ｃ１〜Ｃ１３アルキル）。特定の実施形態では、アルキルは１〜８個の炭素原子から構成される（例えば、Ｃ１〜Ｃ８アルキル）。他の実施形態では、アルキルは５〜１５個の炭素原子から構成される（例えば、Ｃ５〜Ｃ１５アルキル）。他の実施形態では、アルキルは５〜８個の炭素原子から構成される（例えば、Ｃ５〜Ｃ８アルキル）。アルキルは、例えば、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、ｎ−プロピル、１−メチルエチル（イソ−プロピル）、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、１，１−ジメチルエチル（ｔ−ブチル）、３−メチルヘキシル、２−メチルヘキシル及び同様物などの分子の他の部分と一重結合により結合している。本明細書において別途特に記載のない限り、アルキル基は、次の置換基、ハロ、シアノ、ニトロ、オキソ、チオキソ、トリメチルシラニル、−ＯＲａ、−ＳＲａ、−ＯＣ（Ｏ）−Ｒａ、−Ｎ（Ｒａ）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（Ｏ）ｔＲａ（式中、ｔは１又は２である）、−Ｓ（Ｏ）ｔＯＲａ（式中、ｔは１又は２である）及び−Ｓ（Ｏ）ｔＮ（Ｒａ）２（式中、ｔは１又は２である）のうちの１つ以上により場合により置換されており、ここで、各Ｒａは、独立して水素、アルキル、フルオロアルキル、カルボシクリル、カルボシクリルアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルである。
【００５７】
アルキル基は、１〜６個の炭素原子を有する「低級アルキル」にもなり得る。
【００５８】
本明細書で使用するとき、Ｃ１〜Ｃｘは、Ｃ１〜Ｃ２、Ｃ１〜Ｃ３．．．Ｃ１〜Ｃｘを包含する。
【００５９】
「アリール」は、環の炭素原子から水素原子を除去することにより単環芳香族又は多環炭化水素環系から誘導される基を意味する。単環芳香族又は多環炭化水素環系は、水素と、６〜１８個の炭素原子とのみを含有し、環系における少なくとも１つの環は完全に不飽和であり、すなわち、Ｈｕｃｋｅｌ理論に従い、環式、非局在化（４ｎ＋２）π−電子系を含有する。アリール基としては、フェニル、フルオレニル、及びナフチルなどが挙げられるがこれに限定されない。本明細書において別途特に記載のない限り、用語「アリール」又は接頭辞「ａｒ−」は、（「アラルキル」におけるものなど）は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、フルオロアルキル、シアノ、ニトロ、場合により置換されたアリール、場合により置換されたアラルキル、場合により置換されたアラルケニル、場合により置換されたアラルキニル、場合により置換されたカルボシクリル、場合により置換されたカルボシクリルアルキル、場合により置換されたヘテロシクリル、場合により置換されたヘテロシクリルアルキル、場合により置換されたヘテロアリール、場合により置換されたヘテロアリールアルキル、−Ｒｂ−ＯＲａ、−Ｒｂ−ＯＣ（Ｏ）−Ｒａ、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｏ−Ｒｃ−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（Ｏ）ｔＲａ（式中、ｔは１又は２である）、−Ｒｂ−Ｓ（Ｏ）ｔＯＲａ（式中、ｔは１又は２である）及び−Ｒｂ−Ｓ（Ｏ）ｔＮ（Ｒａ）２（式中、ｔは１又は２である）から選択された１つ以上の置換基により場合により置換されたアリール基を包含すること意味し、ここで、各Ｒａは、独立して、水素、アルキル、フルオロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール（場合により、１つ以上のハロ基により置換されている）、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルであり、各Ｒｂは、独立して、直接結合であるか、あるいは線状又は分岐状アルキレン又はアルケニレン鎖であり、かつＲｃは線状又は分岐状アルキレン又はアルケニレン鎖であり、上記置換基のそれぞれは、別途記載のない限り未置換である。
【００６０】
「炭素環」は、単に炭素及び水素原子からなり、３〜１５個の炭素原子を有する縮合又は架橋環系を包含する安定な非芳香族単環式又は多環式炭化水素基を意味する。特定の実施形態では、炭素環は３〜１０個の炭素原子を含む。他の実施形態では、炭素環は５〜７個の炭素原子を含む。炭素環は一重結合により分子の残りの部分に結合する。炭素環は、場合により飽和（すなわち、一重Ｃ−Ｃ結合のみを含有する）又は不飽和（すなわち、１つ以上の二重結合又は三重結合を含有する）である。完全飽和炭素環基は、「シクロアルキル」とも呼ばれる。単環式シクロアルキルの例としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、及びシクロオクチルが挙げられる。不飽和カルボシクリルは、「シクロアルケニル」とも呼ばれる。単環式シクロアルケニルの例としては、例えば、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、及びシクロオクテニルが挙げられる。多環状炭素基としては、例えば、アダマンチル、ノルボルニル（すなわち、ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル）、ノルボルネニル、デカリニル、７，７−ジメチル−ビシクロ［２．２．１］ヘプタニル及び同様物などが挙げられる。本明細書において別途記載のない限り、用語「カルボシクリル」は、独立して、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、フルオロアルキル、オキソ、チオキソ、シアノ、ニトロ、場合により置換されたアリール、場合により置換されたアラルキル、場合により置換されたアラルケニル、場合により置換されたアラルキニル、場合により置換されたカルボシクリル、場合により置換されたカルボシクリルアルキル、場合により置換されたヘテロシクリル、場合により置換されたヘテロシクリルアルキル、場合により置換されたヘテロアリール、場合により置換されたヘテロアリールアルキル、−Ｒｂ−ＯＲａ、−Ｒｂ−ＳＲａ、−Ｒｂ−ＯＣ（Ｏ）−Ｒａ、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｏ−Ｒｃ−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（Ｏ）ｔＲａ（式中、ｔは１又は２である）、−Ｒｂ−Ｓ（Ｏ）ｔＯＲａ（式中、ｔは１又は２である）及び−Ｒｂ−Ｓ（Ｏ）ｔＮ（Ｒａ）２（式中、ｔは１又は２である）から選択される１つ以上の置換基により場合により置換されたカルボシクリル基を包含することを意味し、各Ｒａは、独立して、水素、アルキル、フルオロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルであり、各Ｒｂは、独立して、直接結合であるか、あるいは線状又は分岐状アルキレン又はアルケニレン鎖であり、かつＲｃは線状又は分岐状アルキレン又はアルケニレン鎖であり、上記置換基のそれぞれは別途記載のない限り未置換である。
【００６１】
「ハロ」又は「ハロゲン」は、ブロモ、クロロ、フルオロ又はヨード置換基を意味する。
【００６２】
用語「ハロアルキル」、「ハロアルケニル」、「ハロアルキニル」及び「ハロアルコキシ」には、少なくとも１つの水素がハロゲン原子により置き換えられているアルキル、アルケニル、アルキニル及びアルコキシ構造が包含される。２つ以上の水素原子がハロゲン原子により置き換えられている特定の実施形態では、ハロゲン原子は全て互いに同一である。２つ以上の水素原子がハロゲン原子により置き換えられている他の実施形態では、ハロゲン原子は全て互いに同一ではない。
【００６３】
本明細書で使用するとき、用語「非芳香族複素環」、「ヘテロシクロアルキル」又は「ヘテロ脂環式環」は、環を形成する１つ以上の原子がヘテロ原子である非芳香族環を意味する。「非芳香族複素環」又は「ヘテロシクロアルキル」基は、窒素、酸素及び硫黄から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有するシクロアルキル基を意味する。基はアリール又はヘテロアリールとともに縮合されてもよい。ヘテロシクロアルキル環は、３、４、５、６、７、８、９、又は９超の原子により形成され得る。ヘテロシクロアルキル環は場合により置換され得る。特定の実施形態では、非芳香族複素環は、例えば、オキソ及びチオ含有基などの１つ以上のカルボニル又はチオカルボニル基を含有する。ヘテロシクロアルキルの例としては、ラクタム、ラクトン、環式イミド、環式チオイミド、環式カルバマート、テトラヒドロチオピラン、４Ｈ−ピラン、テトラヒドロピラン、ピペリジン、１，３ジオキシン、１，３−ジオキサン、１，４ジオキシン、１，４−ジオキサン、ピペラジン、１，３−オキサチアン、１，４−オキサチイン、１，４−オキサチアン、テトラヒドロ−１，４−チアジン、２Ｈ−１，２−オキサジン、マレイミド、スクシンイミド、バルビツール酸、チオバルビツール酸、ジオキソピペラジン、ヒダントイン、ジヒドロウラシル、モルホリン、トリオキサン、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジン、テトラヒドロチオフェン、テトラヒドロフラン、ピロリン、ピロリジン、ピロリドン、ピロリジオン（pyrrolidione）、ピラゾリン、ピラゾリジン、イミダゾリン、イミダゾリジン、１，３−ジオキソール、１，３−ジオキソラン、１，３−ジチオール、１，３−ジチオラン、イソオキサゾリン、イソオキサゾリジン、オキサゾリン、オキサゾリジン、オキサゾリジノン、チアゾリン、チアゾリジン、及び１，３−オキサチオランが挙げられるがこれに限定されない。ヘテロシクロアルキル基の具体例は、非芳香族複素環とも呼ばれ、
【００６４】
【化７】
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及び同様物を包含する。用語ヘテロ脂環式環は、単糖、二糖及びオリゴ糖が挙げられるがこれらに限定されない、炭化水素を形成する全ての環も包含する。構造に応じ、ヘテロシクロアルキル基はモノラジカル又はジラジカル（すなわち、ヘテロシクロアルキレン基）になり得る。
【００６５】
「ヘテロアリール」は、２〜１７個の炭素原子を含む３〜１８員芳香環基と、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜６個のヘテロ原子とに由来する基を意味する。本明細書で使用するとき、ヘテロアリール基は、単環式、二環式、三環式、又は四環式環系であり、環系における少なくとも１つの環は完全に不飽和であり、すなわち、Ｈｕｃｋｅｌ理論に従って環状、非局在化（４ｎ＋２）π−電子系を含む。ヘテロアリールは、縮合又は架橋環系を包含する。ヘテロアリール基中のヘテロ原子（１つ以上）は、場合により酸化される。存在する場合、１つ以上の窒素原子は場合により四級化される。ヘテロアリールは、環（１つ以上）の任意の原子を介し、分子の残りの部分に結合する。ヘテロアリールの例としては、アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル（benzimidazolyl）、ベンゾインドリル（benzindolyl）、１，３−ベンゾジオキソリル、ベンゾフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾ［ｄ］チアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキセピニル、ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジニル、１，４−ベンゾジオキサニル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾジオキソリル、ベンゾジオキシニル、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル、ベンゾフラニル、ベンゾフラノニル、ベンゾチエニル（ベンゾチオフェニル）、ベンゾチエノ［３，２−ｄ］ピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、シクロペンタ［ｄ］ピリミジニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、５，６−ジヒドロベンゾ［ｈ］キナゾリニル、５，６−ジヒドロベンゾ［ｈ］シンノリニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［６，７］シクロヘプタ［１，２−ｃ］ピリダジニル、ジベンゾフラニル、ジベンゾチオフェニル、フラニル、フラノニル、フロ［３，２−ｃ］ピリジニル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジニル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリジニル，イソチアゾリル、イミダゾリル、インダゾリル、インドリル、インダゾリル、イソインドリル、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、５，８−メタノ−５，６，７，８−テトラヒドロキナゾリニル、ナフチリジニル、１，６−ナフチリジノニル、オキサジアゾリル、２−オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、５，６，６ａ，７，８，９，１０，１０ａ−オクタヒドロベンゾ［ｈ］キナゾリニル、１−フェニル−１Ｈ−ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル、ピリジル、ピリド［３，２−ｄ］ピリミジニル、ピリド［３，４−ｄ］ピリミジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリニル、イソキノリニル、テトラヒドロキノリニル、５，６，７，８−テトラヒドロキナゾリニル、５，６，７，８−テトラヒドロベンゾ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−シクロヘプタ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８−テトラヒドロピリド［４，５−ｃ］ピリダジニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、チエノ［３，２−ｄ］ピリミジニル、チエノ［２，３−ｃ］ピリジニル（pridinyl）、及びチオフェニル（すなわち、チエニル）が挙げられるがこれに限定されない。本明細書において別途特に記載のない限り、用語「ヘテロアリール」は、場合により、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、フルオロアルキル、ハロアルケニル、ハロアルキニル、オキソ、チオキソ、シアノ、ニトロ、場合により置換されたアリール、場合により置換されたアラルキル、場合により置換されたアラルケニル、場合により置換されたアラルキニル、場合により置換されたカルボシクリル、場合により置換されたカルボシクリルアルキル、場合により置換されたヘテロシクリル、場合により置換されたヘテロシクリルアルキル、場合により置換されたヘテロアリール、場合により置換されたヘテロアリールアルキル、−Ｒｂ−ＯＲａ、−Ｒｂ−ＳＲａ、−Ｒｂ−ＯＣ（Ｏ）−Ｒａ、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｒｂ−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｏ−Ｒｃ−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒａ）２、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａ、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）Ｒａ、−Ｒｂ−Ｎ（Ｒａ）Ｓ（Ｏ）ｔＲａ（式中、ｔは１又は２である）、−Ｒｂ−Ｓ（Ｏ）ｔＯＲａ（式中、ｔは１又は２である）及び−Ｒｂ−Ｓ（Ｏ）ｔＮ（Ｒａ）２（式中、ｔは１又は２である）から選択された１つ以上の置換基により場合により置換された上記の通りのヘテロアリール基を包含すること意味し、ここで、各Ｒａは、独立して、水素、アルキル、フルオロアルキル、シクロアルキル、シクロアルキルアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルキルアルキル、ヘテロアリール又はヘテロアリールアルキルであり、各Ｒｂは、独立して、直接結合であるか、あるいは線状又は分岐状アルキレン又はアルケニレン鎖であり、かつＲｃは線状又は分岐状アルキレン又はアルケニレン鎖であり、上記置換基のそれぞれは、別途記載のない限り未置換である。
【００６６】
「スルファニル」は、−Ｓ−基を意味する。
【００６７】
「スルフィニル」は、−Ｓ（＝Ｏ）−基を意味する。
【００６８】
「スルホニル」は、−Ｓ（＝Ｏ）２−基を意味する。
【００６９】
「アミノ」は、−ＮＨ２基を意味する。
【００７０】
「シアノ」は、−ＣＮ基を意味する。
【００７１】
「ニトロ」は、−ＮＯ２基を意味する。
【００７２】
「オキサ」は、−Ｏ−基を意味する。
【００７３】
「オキソ」は、＝Ｏ基を意味する。
【００７４】
「アルコキシ」基は、（アルキル）Ｏ−基を意味し、ここでアルキルは上記の通りのものである。
【００７５】
「アリールオキシ」基は、（アリール）Ｏ−基を意味し、ここでアリールは上記の通りのものである。
【００７６】
本明細書で使用するとき、用語「ヘテロアルキル」「ヘテロアルケニル」及び「ヘテロアルキニル」には、１つ以上の骨格鎖原子がヘテロ原子、例えば、酸素、窒素、硫黄、ケイ素、リン、又はこれらの組み合わせである、場合により置換されたアルキル、アルケニル及びアルキニル基が包含される。ヘテロ原子（１つ以上）は、ヘテロアルキル基の任意の内側の部分、又はヘテロアルキル基が分子の残部と結合している部分に配置されてよい。例としては、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３、及び−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられるがこれに限定されない。加えて、例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３などのように２個までのヘテロ原子が連続してもよい。
【００７７】
用語「ヘテロ原子」は、炭素又は水素以外の原子を意味する。ヘテロ原子は、典型的には、独立して、酸素、硫黄、窒素、ケイ素及びリンから選択されるものの、これらの原子に限定されない。２つ以上のヘテロ原子が存在する実施形態において、２つ以上のヘテロ原子は全て互いに同一であってよく、あるいは２つ以上のヘテロ原子の幾つか又は全てが互いに異なるものであってよい。
【００７８】
用語「結合」又は「一重結合」は、原子が結合により連結されるとき、２つの原子又は２つの部分の間の化学結合が、より大きな部分構造の一部としてみなされることを意味する。
【００７９】
用語「部分」は、分子の特定のセグメント又は官能基を意味する。化学的部分は、多くの場合、分子に埋め込まれた又は分子に付加される化学物質として認識される。
【００８０】
「カルボキシ」は、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ基を意味する。
【００８１】
本明細書で使用するとき、置換基「Ｒ」は、それそのもので、かつ数表記をせずとも、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（環炭素を介して結合される）及び非芳香族複素環（環炭素を介して結合される）から選択される置換基を意味する。
【００８２】
「アミド」は、式−Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ又は−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒを有する化学的部分であり、式中、Ｒはアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（環炭素を介して結合される）及びヘテロ脂環式環（環炭素を介して結合される）から選択される。アミド部分は、プロドラッグを形成する結合を、アミノ酸又はペプチド分子及び本明細書に記載の化合物間に形成することもできる。本明細書に記載の化合物上の任意のアミン又はカルボキシル側鎖をアミド化することもできる。このようなアミドを作製するための手順及び具体的な基は当業者に既知であり、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９９などの、参照により全体が本明細書に援用される参照文献において、容易に見ることができる。
【００８３】
用語「エステル」は、式−ＣＯＯＲの化学的部分を意味し、式中、Ｒはアルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール（環炭素を介して結合される）及びヘテロ脂環式環（環炭素を介して結合される）から選択される。本明細書に記載の化合物上の任意のヒドロキシ又はカルボキシル側鎖をエステル化することもできる。このようなエステルを作製するための手順及び具体的な基は当業者に既知であり、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９９などの、参照により全体が本明細書に援用される参照文献において、容易に見ることができる。
【００８４】
本明細書で使用するとき、用語「環」は、任意の共有結合により閉鎖された構造を意味する。環としては、例えば、炭素環（例えば、アリール及びシクロアルキル）、複素環（例えば、ヘテロアリール及び非芳香族複素環）、芳香族（例えば、アリール及びヘテロアリール）、並びに非芳香族（例えば、シクロアルキル及び非芳香族複素環）が挙げられる。環は場合により置換され得る。環は単環式又は多環式であってよい。
【００８５】
本明細書で使用するとき、用語「環系」は、１つ以上の環を意味する。
【００８６】
用語「員環」は、任意の環構造を抱持し得る。用語「員」は、環を構成する骨格原子の数を示すことを意味する。したがって、例えば、シクロヘキシル、ピリジン、ピラン及びチオピランは６員環であり、シクロペンチル、ピロール、フラン、及びチオフェンは５員環である。
【００８７】
用語「縮合」は、２つ以上の環が１つ以上の結合を共有している構造を指す。
【００８８】
用語「場合により置換された」又は「置換された」は、参照された基が、（１つ以上）個別に、かつ独立して、アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロ脂環式環、ヒドロキシ、アルコキシ、アリールオキシ、アルキルチオ、アリールチオ、アルキルスルホキシド、アリールスルホキシド、アルキルスルホン、アリールスルホン、シアノ、ハロ、アシル、ニトロ、ハロアルキル、フルオロアルキル、一及び二置換アミノ基を含むアミノ、及びそれらの保護誘導体から選択される、１つ以上の追加の基により置換され得ることを意味する。例えば、場合により置換基はＬｓＲｓであってよく、式中、各Ｌｓは、独立して、結合、−Ｏ−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｓ−、−Ｓ（＝Ｏ）−、−Ｓ（＝Ｏ）２−、−ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、Ｓ（＝Ｏ）２ＮＨ−、−ＮＨＳ（＝Ｏ）２、−ＯＣ（Ｏ）ＮＨ−、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｏ−、−（置換又は未置換Ｃ１〜Ｃ６アルキル）、又は−（置換又は未置換Ｃ２〜Ｃ６アルケニル）から選択され、各Ｒｓは、独立して、Ｈ、（置換又は未置換Ｃ１〜Ｃ４アルキル）、（置換又は未置換Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル）、ヘテロアリール、又はヘテロアルキルから選択される。上記置換基の保護誘導体を形成し得る保護基は当業者に既知であり、上掲Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓなどを参照することにより見ることもできる。
【００８９】
用語「標的」は、タンパク質モジュレータが相互作用することのできる生物学的分子を意味する。標的の非限定例としては、細胞周期制御因子、転写因子、翻訳開始因子、サイクリン、受容体、細胞シグナル伝達タンパク質、配位子、酵素、及びキナーゼなどのタンパク質が挙げられる。
【００９０】
本明細書で使用するとき、用語「薬剤」は、タンパク質モジュレータを指す。タンパク質モジュレータの非限定例としては、キナーゼ阻害剤、キナーゼ拮抗剤、及びキナーゼ刺激剤が挙げられる。例えば、薬剤はＢＴＫ阻害剤であり得る。別の例では、薬剤はＢＭＫ拮抗剤であり得る。
【００９１】
用語「製剤」は、標的と相互作用する化合物を指す。いくつかの例では、製剤は薬剤と同一である。他の例では、製剤は薬剤に類似する。別の例では、製剤は薬剤とは異なる。
【００９２】
用語「プローブ」は、標的を検出するための化合物又は分子を指す。いくつかの例では、プローブは製剤、リンカー、標識、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの例では、プローブは製剤を含む。他の例では、プローブは製剤及びリンカーを含む。別の例では、プローブは製剤及び標識を含む。別の例では、プローブは標識を含む。いくつかの例では、プローブは標識及びリンカーを含む。いくつかの例では、プローブは製剤、リンカー及び標識を含む。いくつかの例では、製剤にはリンカーが付加されている。別の例では、標識にはリンカーが付加されている。いくつかの実施形態では、製剤にはリンカーにより標識が付加されている。あるいは、製剤には標識が付加されている。
【００９３】
用語「未占有の標的」は、薬剤が結合していない標的を指す。
【００９４】
本明細書で使用するとき、用語「薬剤により占有されている標的」又は「薬剤により結合されている標的」は、１つ以上の薬剤が結合している標的を指す。結合には、共有、非共有、イオン、水素、ジスルフィド、又はファンデルワールスが挙げられるがこれらに限定されない、任意の種類の結合が含まれる。結合には、親水性又は疎水性相互作用も含まれ得る。
【００９５】
用語「プローブの結合している標的」又は「プローブの結合しているキナーゼ」は、１つ以上のプローブが結合している標的、又はキナーゼを指す。結合には、共有、非共有、イオン、水素、ジスルフィド、ファンデルワールスが挙げられるがこれらに限定されない、任意の種類の結合が含まれる。結合には、親水性又は疎水性相互作用も含まれ得る。いくつかの例では、「プローブの結合している標的」は、プローブが付加されており、薬剤により占有されている標識を含む。他の例では、「プローブの結合している標的」は、プローブが付加されており、占有されていない標識を含む。
【００９６】
「処理サンプル」は、１つ以上の薬剤が投与されているサンプルを指す。本明細書で使用するとき、患者由来の処理サンプルとは、サンプルが、１つ以上の薬剤（例えば、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤）の投与を受けた患者に由来することを意味する。
【００９７】
「未処理サンプル」は、薬剤が投与されていないサンプルを指す。本明細書で使用するとき、患者由来の未処理サンプルとは、サンプルが、１つ以上の薬剤（例えば、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤）の投与を受けていない患者に由来することを意味する。
【００９８】
タンパク質占有率アッセイ
本明細書では、標的（例えば、標的プロテインキナーゼ）に対するタンパク質モジュレータ（例えば、阻害剤）の有効性を決定するための方法が開示される。いくつかの実施形態では、標的キナーゼ（例えば、ＴＥＣファミリーキナーゼ又は相同キナーゼ）に対するＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の有効性を決定するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）ＴＥＣファミリーキナーゼを含むサンプルをプローブと接触させて、プローブの結合している標的キナーゼを形成させることと、（ｂ）サンプル中の、プローブの結合している標的キナーゼの量を検出することと、（ｃ）プローブの結合している標的キナーゼの量に基づき、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の有効性を決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、方法は、工程（ａ）の前にサンプルをＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤と接触させる（例えば、サンプルをプローブと組み合わせる）ことを更に含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的キナーゼの量を検出することは、化合物、試薬又は緩衝剤を投与して、プローブの結合しているキナーゼを検出することを含む。いくつかの実施形態では、化合物、試薬又は緩衝剤は、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、検出抗体緩衝液、読み取り緩衝液、洗浄緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的キナーゼの存在又は非存在を検出することは、プローブの結合している標的キナーゼの量を定量することを含む。いくつかの実施形態では、定量する工程は、蛍光、免疫蛍光、化学発光、又は電気化学発光を含む。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の有効性を決定することは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤による標的キナーゼの占有率を決定することを含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的キナーゼの量は、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の有効性と逆相関する。例えば、図８及び１０に示される通り、薬剤処理されたサンプル（例えば、プローブと接触させる前に薬剤と接触させたサンプル）をプローブと接触させた後、検出される、プローブの結合している標的キナーゼ（例えば、未占有の標的キナーゼ）の量が増加した場合、薬剤の有効性は減少する。別の例では、薬剤処理されたサンプルをプローブと接触させた後、検出される、プローブの結合している標的キナーゼの量（例えば、未占有の標的キナーゼ）が減少した場合、薬剤の有効性は増加する。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的キナーゼの量は、薬剤の有効性と直接相関する。例えば、図９に示す通り、未処理サンプル（例えば、プローブと接触させる前に薬剤と接触させていないサンプル）をプローブと接触させた後、検出される、プローブの結合している標的キナーゼの量が増加した場合、薬剤の有効性も増加する。別の例では、未処理サンプル（例えば、プローブと接触させる前に薬剤と接触させていないサンプル）をプローブと接触させた後、検出される、プローブの結合している標的キナーゼの量が減少した場合、薬剤の有効性は減少する。いくつかの実施形態では、標的キナーゼの少なくとも約５０％に薬剤が結合したとき、薬剤は有効であるものとして決定される。あるいは、標的キナーゼの少なくとも約６０％に薬剤が結合したとき、薬剤は有効であるものとして決定される。いくつかの実施形態では、標的の少なくとも約６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％に薬剤が結合したとき、薬剤は有効であるものとして決定される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼを投与された患者から得られたサンプルに対し、アッセイが実施される。いくつかの実施形態では、サンプルは、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の投与の約１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間又は２週間超後に得られる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、プローブは製剤及び標識を含む。いくつかの例では、製剤は標識と融合している。他の例では、製剤には標識が付加されている。別の例では、製剤にはリンカーにより標識が付加されている。いくつかの実施形態では、製剤及び薬剤は本質的に同一である。いくつかの実施形態では、プローブは標識を含む。いくつかの実施形態では、プローブは標識及びリンカーを含む。いくつかの実施形態では、製剤及び薬剤は少なくとも約２０％同一、少なくとも約３０％同一、少なくとも約４０％同一、少なくとも約５０％同一、少なくとも約６０％同一、少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、又は少なくとも約９５％同一である。他の実施形態では、製剤及び薬剤は異なる。いくつかの実施形態では、製剤及び薬剤は少なくとも約５％異なり、少なくとも約１０％異なり、少なくとも約２０％異なり、少なくとも約３０％異なり、少なくとも約４０％異なり、少なくとも約５０％異なり、少なくとも約６０％異なり、少なくとも約７０％異なり、少なくとも約８０％異なり、少なくとも約９０％異なり、又は少なくとも約９５％異なる。
【０１０１】
標的
本明細書では、標的キナーゼ（例えば、ＴＥＣファミリーキナーゼ又はチロシンキナーゼ相同体）に対するＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤の有効性を決定するための方法、アッセイ及びシステムが開示される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、細胞周期制御因子、受容体、配位子、転写調節因子、転写開始因子、酵素、細胞シグナル伝達タンパク質、及びその他のプロテインキナーゼなどが挙げられるがこれらに限定されない、その他の標的タンパク質のために構成することができる。特定の実施形態では、標的キナーゼはチロシンキナーゼである。特定の実施形態では、標的キナーゼは、セリン／スレオニンキナーゼである。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、標的キナーゼは非受容体型チロシンキナーゼのＴＥＣファミリーのメンバーである。ＴＥＣキナーゼファミリーは、ＴＥＣ、ＢＭＸ（Ｘ染色体上の骨髄キナーゼ；Ｅｔｋとも呼ばれる）、ＢＴＫ（ブルトン型チロシンキナーゼ）、ＩＴＫ（ＩＬ−２誘導性Ｔ細胞キナーゼ；Ｅｍｔとしても既知）、及びＲｌｋ（静止期リンパ球キナーゼ；ＴＸＫとも表記）を含む。いくつかの例では、標的キナーゼはＢＴＫである。他の例では、標的キナーゼはＩＴＫである。他の例では、標的キナーゼはＴＸＫである。他の例では、標的キナーゼはＢＭＸである。他の例では、標的キナーゼはＴＥＣである。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、標的キナーゼは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）のメンバーである。いくつかの実施形態では、標的キナーゼは、ＨＥＲ１（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１）、ＨＥＲ２／ｃ−ｎｅｕ（ＥｒｂＢ２）、ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ３）及びＨＥＲ４（ＥｒｂＢ４）、又はＪＡＫ３である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、標的キナーゼはＳＲＣキナーゼファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、標的キナーゼはＢＬＫである。
【０１０５】
方法及び組成物における使用のための追加の例示的な標的キナーゼとしては、Ａｂｌ、活性型Ｃｄｃ４２関連キナーゼ１（ＡＣＫ１）、Ａｋｔ／ＰＫＢ、Ａｂｌ関連遺伝子（Ａｒｇ）、アポトーシスシグナル調節キナーゼ（Ａｓｋ−１）、オーロラＡ、オーロラＢ、オーロラＣ、Ａｘｌ、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼ−Ｉδ（ＣａＭＫＩδ）、カルシウム／カルモジュリン依存性キナーゼＩＩβ（ＣａＭＫＩＩβ）、ＣａＭＫＩＩγ、ＣａＭＫＩＩδ、カゼインキナーゼ（ＣＫ、ＣＫ１γ１、ＣＫ１γ２、ＣＫ１γ３）、サイクリン依存性キナーゼ（Ｃｄｋ）、サイクリン依存性プロテインキナーゼ−９／サイクリンＴ１（ＣＤＫ９／サイクリンＴ１）、カゼインキナーゼ２α２（ＣＫ２α２）、Ｃｈｋ、ｃ−ｋｉｔ、ｃｄｃ様キナーゼ２（ＣＬＫ２）、Ｃｏｔ１、Ｃ末端ｃ−Ｓｒｃキナーゼ（Ｃｓｋ）、細胞死関連プロテインキナーゼ−１（ＤＡＰＫ１）、ダブルコルチン及びＣＡＭキナーゼ様２（ＤＣＡＭＫＬ２）、ジスコイジンドメイン受容体１及び２（ＤＤＲ１及びＤＤＲ２）、Ｅｐｈ受容体、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）、Ｆｅｒ、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、Ｆｇｒ、Ｆｎｓ様チロシンキナーゼ（Ｆｌｔ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ４（Ｆｌｔ４）、Ｆｍｓ／ＣＳＦ−１Ｒ、Ｆｙｎ、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫｓ）、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ−７（ＧＲＫ７）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ（ＧＳＫ）、造血細胞キナーゼ（Ｈｃｋ）、ホメオドメイン相互作用プロテインキナーゼ−１（ＨＩＰＫ１）、ＨＩＰＫ２、ＨＩＰＫ３、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、ＩＫＢキナーゼ（ＩＫＫ）、インスリン受容体、ＩＬ−１受容体関連キナーゼ（ＩＲＡＫ）、ストレス活性化プロテインキナーゼ１（ＳＡＰＫ）、キナーゼ挿入ドメイン含有受容体（ＫＤＲ）、ｃ−Ｋｉｔ、Ｌｃｋ、ＬＩＭキナーゼ（ＬＩＭＫ）、リンパ球配向キナーゼ（Lymphocyte-oriented kinase）（ＬＯＫ）、Ｌｙｎ、ＭＡＰＫ／Ｅｒｋ、ＭＡＰＫ活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫＡＰ  Ｋ又はＭＫ）、ＭＡＰキナーゼ／Ｅｒｋキナーゼ（ＭＥＫ）、母性胚性ロイシンジッパーキナーゼ（ＭＥＬＫ）、Ｍｅｔ、Ｍｅｒ、Ｍｉｓｓｈａｐｅｎ／ＮＩＫ関連キナーゼ（ＭＩＮＫ）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＫＫ）、混合系統キナーゼ（Mixed lineage kinase）−１（ＭＬＫ１）、筋ジストロフィーキナーゼ関連Ｃｄｃ４２結合キナーゼα（ＭＲＣＫα）、マイトジェン及びストレス活性化プロテインキナーゼ１（ＭＳＫ１）、哺乳類ＳＴＥ２０様キナーゼ（ＭＳＴ）、哺乳類ＳＴＥ２０様プロテインキナーゼ３（ＭＳＴ３）、ラパマイシンの標的（ｍＴＯＲ、ＦＲＡＰ、ＲＡＦＴ）、ｍＴｏｒ／ＦＫＢＰ１２、ＮＩＭＡ−関連プロテインキナーゼ３（ＮＥＫ３）、ＮＥＫ９、Ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）、ＰＡＫ３、ＰＡＲ−１キナーゼ、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、ＰＩ（３，４，５）Ｐ３依存性キナーゼ１（ＰＤＫ１）、ホスホリラーゼキナーゼ（ＰｈＫ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）３キナーゼ、ｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ１）、ＰＩＭキナーゼ、プロテインキナーゼＣ、ＰＫＤ２、ｃＧＭＰ依存性プロテインキナーゼ１α（ＰＫＧ１α）、二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、Ｐ３８調節／活性化プロテインキナーゼ（ＰＲＡＫ）、プロテインチロシンキナーゼ−５（ＰＴＫ５）、プロリンリッチキナーゼ（Ｐｙｋ）２、Ｒａｆキナーゼ（Ｒａｆ−１、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ）、Ｒｅｔ、受容体共役型セリン／スレオニンキナーゼ２（ＲＩＰＫ２）、Ｒｏｎ、Ｒｏｓ、Ｒｓｅ（Ｂｒｔ、ＢＹＫ、Ｄｔｋ、Ｅｔｋ３、Ｓｋｙ、Ｔｉｆ、又はｓｅａ関連受容体チロシンキナーゼ）、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ−４（Ｒｓｋ４）、Ｐ７０  Ｓ６キナーゼ、ＳＡＰＫ、血清及びグルココルチコイド誘導キナーゼ（ＳＧＫ）、ｃ−Ｓｒｃ、Ｓｙｋ、ＴＧＦ−β活性化キナーゼ（ＴＡＫ１）、サウザンド・アンド・ワン（thousand and one）アミノ酸プロテインキナーゼ−１（ＴＡＯ１）、Ｉｇ及びＥＧＦ相同ドメインを有するチロシンキナーゼ−２（Ｔｉｅ２／ＴＥＫ）、Ｔｏｕｓｌｅｄ様キナーゼ（ＴＬＫｓ）、Ｔｒｋ、精巣特異的セリンキナーゼ（ＴＳＳＫ）、Ｕｎｃ−５１様キナーゼ２（ＵＬＫ２）、ＵＬＫ３、ワクシニア関連キナーゼ−２、Ｗｅｅ、Ｙｅｓ、ＺＡＰ−７０、及びジッパー相互作用プロテインキナーゼ（ＺＩＰＫ）が挙げられるがこれに限定されない。
【０１０６】
薬剤
本明細書では、標的に対する薬剤の有効性を決定するための方法、アッセイ及びシステムが開示される。本明細書で開示される好適な薬剤はタンパク質モジュレータを含む。タンパク質モジュレータは、タンパク質阻害剤、タンパク質拮抗剤、及びタンパク質刺激剤を包含する。いくつかの実施形態では、薬剤はタンパク質阻害剤である。タンパク質阻害剤の例としては、プロテインキナーゼ阻害剤が挙げられるがこれに限定されない。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、薬剤はプロテインキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、プロテインキナーゼ阻害剤はチロシンキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、ダサチニブ、イマチニブ、ニロチニブ、スニチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブのいずれかである。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は可逆的ＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、可逆的ＢＴＫ阻害剤はＬＦＭ−Ａ１３又はテレイン酸である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は不可逆的ＢＴＫ阻害剤である。不可逆的ＢＴＫ阻害剤の例としては、イブルチニブ、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９２、又はＯＮＯ−ＷＧ−３０７が挙げられる。いくつかの実施形態では、不可逆的ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。いくつかの例では、ＢＴＫ阻害剤はＲＮ４８６である。いくつかの実施形態では、薬剤はＩＴＫ阻害剤である。いくつかの例では、ＩＴＫ阻害剤はＣＴＡ０５６である。いくつかの実施形態では、薬剤はＴＥＣキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、薬剤はＴＸＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、薬剤はＢＭＸ阻害剤である。いくつかの実施形態では、薬剤はＢＬＫ阻害剤である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、薬剤はキナーゼを阻害する。いくつかの実施形態では、薬剤はチロシンキナーゼを阻害する。いくつかの実施形態では、薬剤は受容体チロシンキナーゼを阻害する。いくつかの実施形態では、薬剤は非受容体型チロシンキナーゼを阻害する。いくつかの実施形態では、薬剤はセリン／スレオニンキナーゼを阻害する。
【０１１０】
いくつかの例では、キナーゼはＡＧＣキナーゼファミリーのメンバーである。他の例では、キナーゼはＣａＭキナーゼファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、キナーゼはＴＫキナーゼファミリーのメンバーである。あるいは、キナーゼは、ＣＫＩキナーゼファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、キナーゼは、ＣＭＧＣキナーゼファミリーのメンバーである。いくつかの例では、キナーゼは、ＳＴＥキナーゼファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、キナーゼは、ＳＴＫキナーゼファミリーのメンバーである。いくつかの例では、キナーゼはＴＫＬキナーゼファミリーのメンバーである。
【０１１１】
タンパク質占有率アッセイキット
本明細書において、リンカー、標識、製剤、又はこれらの任意の組み合わせを含むタンパク質占有率アッセイキットが開示される。一態様は、リンカー及び標識を含むタンパク質占有率アッセイキットであり、ここで、リンカーは、標識を製剤に付加し得るものであり、製剤はタンパク質モジュレータである。別の態様は、製剤、リンカー及び標識を含むタンパク質占有率アッセイキットであり、ここで、リンカーは、製剤と標識とに付加することにより製剤を標識に付加させ得るものである。いくつかの実施形態は、プローブを含むタンパク質占有率アッセイキットであり、ここで、プローブは標識に付加されている製剤を含む。いくつかの実施形態は、プローブを含むタンパク質占有率アッセイキットであり、ここで、プローブはリンカーに付加されている製剤を含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態は、製剤及び固体支持体を含むタンパク質占有率アッセイキットであり、ここで、製剤は固体支持体に付着している。別の実施形態は、標識及び固体支持体を含むタンパク質占有率アッセイキットであり、ここで、標識は固体支持体に付着している。別の実施形態は、プローブ及び固体支持体を含むタンパク質占有率アッセイキットであり、ここで、プローブは、製剤、リンカー、標識、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態は、標的（例えば、タンパク質）及び固体支持体を含むタンパク質占有率アッセイキットであり、ここで、標的は固体支持体に付着している。
【０１１３】
いくつかの態様では、本明細書で開示される任意のキットは更に標識を含む。いくつかの態様では、本明細書で開示される任意のキットは更にリンカーを含む。いくつかの態様では、本明細書で開示される任意のキットは更に製剤を含む。いくつかの態様では、本明細書で開示される任意のキットは更に複数のリンカーを含み、ここで、リンカーは別のリンカー、製剤、標識、又はこれらの任意の組み合わせに付加され得るものである。いくつかの態様では、本明細書で開示される任意のキットは更にプローブを含む。いくつかの態様では、プローブは製剤、リンカー、標識、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、本明細書で開示される任意のキットは更に標的（例えば、タンパク質）を含む。製剤、リンカー、標識、プローブ、固体支持体、及び標的の例示的な実施形態は本明細書に開示される。本明細書では、プローブ又は標的を固体支持体に付着させるための例示的な方法が更に開示される。
【０１１４】
プローブ
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物は、プローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブは製剤及び標識を含む。いくつかの実施形態では、製剤及び標識は付加されている。他の実施形態では、プローブは製剤及びリンカーを含む。いくつかの実施形態では、製剤及びリンカーは付加されている。別の実施形態では、プローブは製剤、リンカー及び標識を含む。いくつかの実施形態では、製剤、リンカー及び／又は標識は互いに付加されている。いくつかの実施形態では、プローブは標識を含む。別の実施形態では、プローブは標識及びリンカーを含む。いくつかの実施形態では、標識及びリンカーは付加されている。いくつかの実施形態では、付加は化学的方法、酵素による方法、又は架橋による方法によるものである。いくつかの実施形態では、プローブを固体支持体に付着させる。製剤、リンカー、標識、及び固体支持体の例示的な実施形態が本明細書に開示される。
【０１１５】
製剤
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物は製剤を含む。好適な製剤はタンパク質モジュレータ（例えば、阻害剤、拮抗剤、及び刺激剤）を含む。いくつかの実施形態では、製剤は薬剤である。本明細書で開示される好適な製剤はタンパク質モジュレータを含む。タンパク質モジュレータは、タンパク質阻害剤、タンパク質拮抗剤、及びタンパク質刺激剤を包含する。いくつかの実施形態では、薬剤はタンパク質阻害剤である。タンパク質阻害剤の例としては、プロテインキナーゼ阻害剤が挙げられるがこれに限定されない。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、薬剤はプロテインキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、プロテインキナーゼ阻害剤はチロシンキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、ダサチニブ、イマチニブ、ニロチニブ、スニチニブ、ゲフィチニブ、エルロチニブのいずれかである。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、チロシンキナーゼ阻害剤は、ＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は可逆的ＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、可逆的ＢＴＫ阻害剤はＬＦＭ−Ａ１３又はテレイン酸である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は不可逆的ＢＴＫ阻害剤である。不可逆的ＢＴＫ阻害剤の例としては、イブルチニブ、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９２、又はＯＮＯ−ＷＧ−３０７が挙げられる。いくつかの実施形態では、不可逆的ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。いくつかの例では、ＢＴＫ阻害剤はＲＮ４８６である。いくつかの実施形態では、製剤はＩＴＫ阻害剤である。いくつかの例では、ＩＴＫ阻害剤はＣＴＡ０５６である。いくつかの実施形態では、薬剤はＴＥＣキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、薬剤はＴＸＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、薬剤はＢＭＸ阻害剤である。いくつかの実施形態では、薬剤はＢＬＫ阻害剤である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、薬剤はキナーゼを阻害する。いくつかの実施形態では、薬剤はチロシンキナーゼを阻害する。いくつかの実施形態では、薬剤は受容体チロシンキナーゼを阻害する。いくつかの実施形態では、薬剤は非受容体型チロシンキナーゼを阻害する。いくつかの実施形態では、薬剤はセリン／スレオニンキナーゼを阻害する。
【０１１９】
いくつかの例では、キナーゼはＡＧＣキナーゼファミリーのメンバーである。他の例では、キナーゼはＣａＭキナーゼファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、キナーゼはＴＫキナーゼファミリーのメンバーである。あるいは、キナーゼは、ＣＫＩキナーゼファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、キナーゼは、ＣＭＧＣキナーゼファミリーのメンバーである。いくつかの例では、キナーゼは、ＳＴＥキナーゼファミリーのメンバーである。いくつかの実施形態では、キナーゼは、ＳＴＫキナーゼファミリーのメンバーである。いくつかの例では、キナーゼはＴＫＬキナーゼファミリーのメンバーである。
【０１２０】
リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物はリンカーを含む。好適なリンカーは、本明細書で開示される標識及び／又は製剤に付加され得る任意の化学的又は生物学的化合物を含む。リンカーが標識及び製剤の両方に付加される場合、好適なリンカーは、標識及び製剤を十分に分離させ得るものである。好適なリンカーは、製剤の標的（例えば、タンパク質）結合能に著しく干渉しない。好適なリンカーは、標識の被検出能に著しく干渉しない。いくつかの実施形態では、リンカーは剛体である。他の実施形態では、リンカーは可動性である。別の実施形態では、リンカーは半剛体である。いくつかの実施形態では、リンカーはタンパク質分解に安定性である（例えば、タンパク質切断に耐性を示す）。別の実施形態では、リンカーはタンパク質分解に不安定性である（例えば、タンパク質切断を受けやすい）。いくつかの実施形態では、リンカーはらせん状である。いくつかの実施形態では、リンカーはらせん状ではない。いくつかの実施形態では、リンカーはコイル状である。いくつかの実施形態では、リンカーはβ−ストランド化されている。いくつかの実施形態では、リンカーはターン構造を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは単一鎖である。いくつかの実施形態では、リンカーは長鎖である。いくつかの実施形態では、リンカーは短鎖である。いくつかの実施形態では、リンカーは少なくとも約５残基、少なくとも約１０残基、少なくとも約１５残基、少なくとも約２０残基、少なくとも約２５残基、少なくとも約３０残基、又は少なくとも約４０残基からなる。
【０１２１】
リンカーの例としては、ヒドラゾン、ジスルフィド、チオエーテル、及びペプチドリンカーが挙げられるがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーはプロリン残基を含む。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、アルギニン、フェニルアラニン、スレオニン、グルタミン、グルタミン酸、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、リンカーはヘテロ二官能性架橋剤である。いくつかの実施形態では、ヘテロ二官能性架橋剤はＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣである。
【０１２２】
標識
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物は標識を含む。例示的な標識としては、当該技術分野において周知の、化学的、生化学的、生物学的、比色的、酵素的、蛍光、発光標識、化学発光標識、及び電気化学発光標識が挙げられるがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、標識は、染料、光架橋剤、細胞毒性化合物、薬剤、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、抗体又は抗体断片、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的又は非共有結合的相互作用する基、光ケージド部分、化学線励起性部分、配位子、光異性化部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子を取り込んでいる部分、化学分解性基、光分解性基、酸化還元活性剤、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度基、磁性基、挿入基（intercalating group）、発色団、エネルギー移動剤、生物活性物質、検出可能な標識、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、標識は化学標識である。化学標識の例としては、ビオチン及び放射性同位体（例えば、ヨウ素、炭素、リン酸、水素）が挙げられるがこれに限定されない。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物は生物学的な標識を含む。いくつかの実施形態では、生物学的な標識は、生体直交型アジド修飾アミノ酸、糖、及びその他の化合物が挙げられるがこれらに限定されない代謝標識を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物は酵素標識を含む。酵素標識としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ、及びβ−ガラクトシダーゼが挙げられるがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、酵素標識はルシフェラーゼである。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物は蛍光標識を含む。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、有機染料（例えば、ＦＩＴＣ）、生物学的フルオロフォア（例えば、緑色蛍光タンパク質）、又は量子ドットである。蛍光標識の比限定的な一覧としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ＤｙＬｉｇｈｔ  Ｆｌｕｏｒｓ、フルオレセイン、ローダミン（テトラメチルローダミンイソチオシアネート、ＴＲＩＴＣ）、クマリン、Ｌｕｃｉｆｅｒ  Ｙｅｌｌｏｗ、及びＢＯＤＩＰＹが挙げられる。いくつかの実施形態では、標識はフルオロフォアである。例示的なフルオロフォアとしては、インドカルボシアニン（Ｃ３）、インドジカルボシアニン（Ｃ５）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、テキサスレッド、パシフィックブルー、オレゴングリーン４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）−３５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、ＪＯＥ、Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ、ローダミングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、カルボキシ−フルオレセイン（ＦＡＭ）、フィリコエリトリン、ローダミン、ジクロロローダミン（ｄローダミン）、カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ（商標））、ＬＩＺ（商標）、ＶＩＣ（商標）、ＮＥＤ（商標）、ＰＥＴ（商標）、ＳＹＢＲ、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ及び同様物などが挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、蛍光標識は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質、フィコビリンタンパク質（例えば、アロフィコシアニン、フィコシアニン、フィリコエリトリン、及びフィコエリトロシアニン）である。
【０１２７】
固体支持体
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物は固体支持体を含む。固体支持体は、プローブ又は抗体を付着させることのできる任意の固体プラットフォームを含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズ、プレート、及びアレイを含む。いくつかの実施形態では、固体支持体はプレートに付着しているビーズを含む。例えば、図１１Ｂに示す通り、ストレプトアビジンビーズがプレートに付着している。いくつかの実施形態では、固体支持体はプレートを含む。別の実施形態では、固体支持体はプレートに付着している抗体を含む。例えば、図１１Ａに示す通り、抗ＢＴＫ抗体がプレートに付着している。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物はビーズを含む。ビーズの例としては、ストレプトアビジンビーズ、アガロースビーズ、磁気ビーズ、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）、ＭＡＣＳ（登録商標）マイクロビーズ、抗体複合ビーズ（例えば、抗免疫グロブリンマイクロビーズ）、プロテインＡ複合ビーズ、プロテインＧ複合ビーズ、プロテインＡ／Ｇ複合ビーズ、プロテインＬ複合ビーズ、オリゴｄＴ複合ビーズ、シリカビーズ、シリカ様ビーズ、抗ビオチンマイクロビーズ、抗蛍光色素マイクロビーズ、及びＢｃＭａｇ（商標）カルボキシ末端化磁気ビーズが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物はプレートを含む。例示的なプレートとしては、ＭＳＤマルチアレイプレート、ＭＳＤ  Ｍｕｌｔｉ−Ｓｐｏｔ（登録商標）プレート、マイクロプレート、ＰｒｏｔｅＯｎマイクロプレート、ＡｌｐｈａＰｌａｔｅ、ＤＥＬＦＩＡプレート、ＩｓｏＰｌａｔｅ、及びＬｕｍａＰｌａｔｅが挙げられるがこれに限定されない。
【０１３０】
製剤、リンカー及び／又は標識を付加させるための方法
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、キット、及び組成物は、製剤、リンカー、標識、又はこれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、製剤、リンカー、及び／又は標識は付加されている。製剤、リンカー、及び／又は標識を付加させるための方法としては、化学標識及び酵素標識が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、標識をリンカー及び／又は製剤に付加させるための方法は、化学標識による手法を含む。いくつかの実施形態では、化学標識による手法は、化学的反応基を含む。一般的な反応基としては、ＦＩＴＣを含むアミン反応性イソチオシアネート誘導体、ＮＨＳ−フルオレセイン又はＮＨＳ−ローダミンなどのアミン反応性スクシンイミジルエステル、及びフルオレセイン−５−マレイミドなどのスルフヒドリル反応性マレイミド活性化蛍光物質が挙げられるがこれに限定されない。いくつかの実施形態では、これらの反応性染料のいずれかと、別の分子との反応により、フルオロフォアと、リンカー及び／又は製剤との間に安定な共有結合が形成される。いくつかの実施形態では、反応基はイソチオシアネートである。いくつかの実施形態では、標識は、リシン側鎖の一級アミンを介して製剤に付加されている。いくつかの実施形態では、化学標識は、ＮＨＳ−エステル化学法を含む。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、標識をリンカー及び／又は製剤に付加させる方法は、酵素標識及び親和標識を含む。酵素標識としては、アシルキャリアータンパク質／ホスホパンテテイントランスフェラーゼ（ＡＣＰ／ＰＰＴａｓｅ）、Ｑタグ／トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ）（Ｌｉｎ，Ｃ．Ｗ．ａｎｄ  Ｔｉｎｇ，Ａ．Ｙ．Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ−ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｐｒｏｂｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００６，１２８，４５４２〜４５４３），ビオチン受容体ペプチド／ビオチンリガーゼ（ＡＰ／Ｂｉｒ  Ａ）（Ｃｈｅｎ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｒｏｂｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｂｉｏｔｉｎ  ｌｉｇａｓｅ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．２００５，２，９９〜１０４）、ファルネシル化モチーフ／タンパク質ファルネシルトランスフェラーゼ（ＰＦＴａｓｅ）（Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ，Ｂ．Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２００７，８，９８〜１０５）、アルデヒドタグ／ホルミルグリシン生成酵素（Ｃａｒｒｉｃｏ，Ｉ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ａｌｄｅｈｙｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２００７，３，３２１〜３２２）、ヒトＯ６−アルキルグアニントランスフェラーゼ（ｈＡＧＴ）（Ｋｅｐｐｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，２１，８６〜８９；Ｋｅｐｐｌｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００４，１０１，９９５５〜９９５９）、及び変異型原核生物デハロゲナーゼ（ＨａｌｏＴａｇ（商標））法（Ｌｏｓ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈａｌｏｔａｇ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ｃｅｌｌ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  Ｎｏｔｅｓ  ２００６，１４，１０〜１４）を挙げることができるがこれらに限定されない。親和標識としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を利用する非共有結合法（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔａｇ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２００４，４３，１６７２〜１６７５；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｔｅ���ｎ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｍｅｔｈｏｐｒｉｍ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｔａｇ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈ．２００５，２，２５５〜２５７）及びＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２（Ｆ３６Ｖ））のＰｈｅ３６Ｖａｌ変異体（Ｍａｒｋｓ，Ｋ．Ｍ．，Ｂｒａｕｎ，Ｐ．Ｄ．，Ｎｏｌａｎ，Ｇ．Ｐ．，Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｒａｐｉｄ，ｓｐａｔｉａｌｌｙ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００４，１０１，９９８２〜９９８７）、並びに金属キレート法を挙げることができるがこれらに限定されない。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、標識、リンカー及び／又は製剤の付加には架橋剤を使用する。いくつかの実施形態では、架橋剤はグルタルアルデヒドである。いくつかの実施形態では、グルタルアルデヒドはアミン基と反応して、数種類の経路のうちのいずれかにより架橋を生成する。いくつかの実施形態では、還元条件下で、グルタルアルデヒドの両端のアルデヒドがアミンと連結され、二級アミン結合が形成される。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、標識、リンカー、及び／又は製剤の付加は、過ヨウ素酸塩活性化後の還元的アミノ化を含む。例えば、過ヨウ素酸塩（preiodate）活性化後の還元的アミノ化を用い、ＨＲＰ及びその他の糖タンパク質をリンカー及び／又は製剤に対し複合させる。いくつかの例では、過ヨウ素酸によるグリコシル化酵素の処理により、糖のｃｉｓ−ジオール基の酸化が生じ（特に、糖タンパク質、多糖類において一般的であるシアル酸）、アルデヒド基が形成される。いくつかの例では、これらのアルデヒド基は、穏やかな還元剤のシアノ水素化ホウ素の存在下で、加えた抗体又はその他の分子の一級アミンと反応する。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ又はその他のヘテロ二官能性架橋剤を使用して、標識をリンカー及び／又は製剤に複合させる。例えば、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣを使用して、酵素を薬剤に複合させる。いくつかの実施形態では、第１工程で酵素を活性化させかつ精製し、次に第２工程で薬剤に複合させる。いくつかの実施形態では、架橋の指向性は、１つの特定の方向に限定される（例えば、酵素上のアミンは抗体上のスルフヒドリル基に指向する）。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、連結は、リンカーと、標識及び／又は製剤との間で形成される。本明細書で使用するとき、用語「連結」は、リンカーの官能基と別の分子（例えば、標識、製剤）との間の化学反応から形成される結合又は化学部分を指す。いくつかの実施形態では、このような結合としては、限定するものではないが共有結合及び非共有結合が挙げられるのに対し、このような化学部分としては、限定するものではないが、エステル、炭酸塩、イミン、リン酸エステル、ヒドラゾン、アセタール、オルトエステル、ペプチド結合、及びオリゴヌクレオチド結合が挙げられる。加水分解に安定な結合は、その結合が、水中で実質的に安定であり、かつ有用なｐＨ値にて（限定するものではないが、長期間、更に、恐らくは無期限に、生理的条件下で）、水と反応しないことを意味する。加水分解に不安定である又は分解可能な結合は、その結合が、水又は水性溶液（例えば、血液）中で分解可能であることを意味する。他の実施形態では、酵素学的に不安定である又は分解可能な結合は、その結合が１つ以上の酵素により分解されることを意味する。例えば、ＰＥＧ及び関連するポリマーは、ポリマー主鎖中、又はポリマー主鎖とポリマー分子の１つ以上の末端官能基との間の結合基中に分解可能な結合を含む。このような分解可能な結合としては、限定するものではないが、ＰＥＧカルボン酸又は活性型ＰＥＧカルボン酸と、生物活性物質のアルコール基との反応により形成されるエステル結合が挙げられ、このようなエステル基は、一般的に、生理的条件下で加水分解され生物活性物質を放出する。その他の加水分解により分解可能な結合としては、限定するものではないが、カーボネート結合、アミン及びアルデヒドの反応により生じるイミン結合、アルコールとリン酸基との反応により形成されるリン酸エステル結合、ヒドラジドとアルデヒドとの反応生成物であるヒドラゾン結合、アルデヒドとアルコールとの反応生成物であるアセタール結合、ギ酸塩とアルコールとの反応生成物であるオルトエステル結合、ＰＥＧなどのポリマーの末端及びペプチドのカルボキシル基などを含むがこれらに限定されないアミン基により形成されるペプチド結合、並びにポリマーの末端及びオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基などを含むがこれらに限定されないホスホラミダイト基により形成されるオリゴヌクレオチド結合が挙げられる。
【０１３７】
プローブ又は標的（例えば、タンパク質）を固体支持体に付着させる方法
いくつかの実施形態では、プローブ又は標的（例えば、タンパク質）を固体支持体に付着させるための方法としては、化学的及び／又は酵素学的方法が挙げられる。本明細書におけるいくつかの実施形態では、化学的方法が開示される。本明細書におけるいくつかの実施形態では、酵素学的方法が開示される。いくつかの実施形態では、プローブ又は標的を固体支持体に付着させるための方法は、固体支持体を、プローブ又は標的によりコートすることを含む。マイクロプレートを抗体によりコートするための方法は当該技術分野において周知であり、かつコート緩衝液に抗体を希釈し、希釈した抗体をマイクロプレートにおけるウェルに加えることを含み得る。未結合の抗体は、プレートを洗浄緩衝液で洗浄することにより除去することができる。
【０１３８】
ＴＥＣファミリーキナーゼプローブ化合物
本明細書に記載のＴＥＣファミリーキナーゼプローブ化合物は、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤を含む部分、リンカー部分、及び検出可能な標識から構成される。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤は不可逆的ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼ阻害剤はＢｔｋ阻害剤である。いくつかの実施形態では、Ｂｔｋ阻害剤は不可逆的阻害剤である。別の実施形態では、Ｂｔｋの不可逆的阻害剤は、ＢｔｋのＡＴＰ結合ポケットの非触媒残基に結合する。更なる実施形態では、非触媒残基はシステイン残基である。いくつかの実施形態では、Ｂｔｋプローブは、Ｂｔｋの少なくとも１つの非触媒残基と共有結合を形成する。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼプローブ化合物は、不可逆的Ｂｔｋ阻害剤の誘導体である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼプローブ化合物はイブルチニブの誘導体である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼプローブ化合物はイブルチニブの誘導体である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼプローブ化合物は、リンカーにより標識が付加されたイブルチニブからなる。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼプローブ化合物は、ＡＶＬ−２９２、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−１０１、ＣＮＸ−７７４、又はＯＮＯ−ＷＧ−３０７の誘導体である。いくつかの実施形態では、ＴＥＣファミリーキナーゼプローブ化合物は、リンカーにより標識が付加されたＡＶＬ−２９２、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−１０１、ＣＮＸ−７７４、又はＯＮＯ−ＷＧ−３０７からなる。
【０１３９】
一態様は、式（Ｉ）のＴＥＣファミリーキナーゼプローブである
【０１４０】
【化８】
2015536446.tif 000010
式（Ｉ）
（式中、
Ｌａは、ＣＨ２、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
Ａｒは、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Ｙは、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Ｚは、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＯＳ（Ｏ）ｎ、ＮＨＳ（Ｏ）ｎであり、式中、ｎは１又は２であり、
Ｒ６及びＲ８は、独立して、Ｈ、場合により置換されたアルキル、又は場合により置換されたヘテロアルキルから選択され、
Ｌ１は、結合、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリール、場合により置換されたヘテロアリール、場合により置換されたアミド部分、場合によりケトン部分、場合により置換されたカルバマート部分、及び場合によりエステル部分、又はこれらの任意の組み合わせからなる群から選択され、かつＸは検出可能な標識である）。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、Ｌａは、ＣＨ２、Ｏ、又はＮＨである。他の実施形態では、Ｌａは、Ｏ又はＮＨである。いくつかの実施形態では、ＬａはＯである。いくつかの実施形態では、Ａｒは、置換又は未置換アリールである。いくつかの実施形態では、Ａｒは６員アリールである。いくつかの他の実施形態では、Ａｒはフェニルである。いくつかの実施形態では、Ｚは、Ｃ（＝Ｏ）、ＯＣ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）ｘ、ＯＳ（＝Ｏ）２、又はＮＨＳ（＝Ｏ）２である。いくつかの実施形態では、Ｚは、Ｃ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝Ｏ）、又はＳ（＝Ｏ）２である。いくつかの実施形態では、ＺはＣ（＝Ｏ）である。いくつかの実施形態では、ＺはＮＨＣ（＝Ｏ）である。いくつかの実施形態では、Ｙは、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、及びヘテロシクロアルキルから選択される、場合により置換された基である。いくつかの実施形態では、Ｙは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、４、５、６又は７員シクロアルキル、及び４、５、６又は７員ヘテロシクロアルキルから選択される、場合により置換された基である。いくつかの実施形態では、Ｙは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、５又は６員シクロアルキル、及び１又は２個のＮ原子を含有する５又は６員ヘテロシクロアルキルから選択される、場合により置換された基である。いくつかの実施形態では、Ｙは５又は６員シクロアルキル、あるいは１又は２個のＮ原子を含有する５又は６員ヘテロシクロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙはピロリジン環である。いくつかの実施形態では、Ｙはピペリジン環である。いくつかの実施形態では、Ｒ６及びＲ８は、独立して、Ｈ、未置換Ｃ１〜Ｃ４アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、未置換Ｃ１〜Ｃ４ヘテロアルキル、及び置換されたＣ１〜Ｃ４ヘテロアルキルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ６及びＲ８はそれぞれＨである。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、結合、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリール、場合により置換されたヘテロアリール、場合により置換されたアミド部分、場合によりケトン部分、場合により置換されたカルバマート部分、及び場合によりエステル部分、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリール、場合により置換されたヘテロアリール、場合により置換されたアミド部分、場合によりケトン部分、場合により置換されたカルバマート部分、及び場合によりエステル部分、から選択される、少なくとも２つの基の任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリール、場合により置換されたヘテロアリール、場合により置換されたアミド部分、場合によりケトン部分、場合により置換されたカルバマート部分、及び場合によりエステル部分から選択される、少なくとも３つの基の任意の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリール、場合により置換されたヘテロアリール、場合により置換されたアミド部分、場合によりケトン部分、場合により置換されたカルバマート部分、及び場合によりエステル部分、から選択される、少なくとも４つの基の任意の組み合わせから選択される。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、Ｘは、染料、光架橋剤、細胞毒性化合物、薬剤、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、抗体又は抗体断片、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的又は非共有結合的相互作用する基、光ケージド部分、化学線励起性部分、配位子、光異性化部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子を取り込んでいる部分、化学分解性基、光分解性基、酸化還元活性剤、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度基、磁性基、挿入基（intercalating group）、発色団、エネルギー移動剤、生物活性物質、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される検出可能な標識である。いくつかの実施形態では、Ｘはフルオロフォアである。いくつかの実施形態では、Ｘはビオチンである。いくつかの実施形態では、Ｘはビオチン類似体である。
【０１４４】
別の実施形態は、式（ＩＩ）のＴＥＣファミリーキナーゼプローブである
【０１４５】
【化９】
2015536446.tif 000011
式（ＩＩ）
（式中、
Ｌａは、ＣＨ２、Ｏ、ＮＨ又はＳであり、
Ａｒは、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Ｙは、場合により置換されたアルキル、場合により置換されたヘテロアルキル、場合により置換されたシクロアルキル、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、場合により置換されたアリールであるか、又は場合により置換されたヘテロアリールであり、
Ｚは、Ｃ（Ｏ）、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、Ｃ（Ｓ）、Ｓ（Ｏ）ｎ、ＯＳ（Ｏ）ｎ、ＮＨＳ（Ｏ）ｎであり、式中、ｎは１又は２であり、
Ｒ６及びＲ８は、独立して、Ｈ、場合により置換されたアルキル、又は場合により置換されたヘテロアルキルから選択され、
Ｌ１は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、
Ｌ２は、結合、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、又は−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−であり、式中、ｍは２〜６であり、
Ｌ３は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、かつ
Ｘは検出可能な標識である）。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、Ｌａは、ＣＨ２、Ｏ、又はＮＨである。他の実施形態では、Ｌａは、Ｏ又はＮＨである。いくつかの実施形態では、ＬａはＯである。いくつかの実施形態では、Ａｒは、置換又は未置換アリールである。いくつかの実施形態では、Ａｒは６員アリールである。いくつかの他の実施形態では、Ａｒはフェニルである。いくつかの実施形態では、Ｚは、Ｃ（＝Ｏ）、ＯＣ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝Ｏ）、Ｓ（＝Ｏ）ｘ、ＯＳ（＝Ｏ）２、又はＮＨＳ（＝Ｏ）２である。いくつかの実施形態では、Ｚは、Ｃ（＝Ｏ）、ＮＨＣ（＝Ｏ）、又はＳ（＝Ｏ）２である。いくつかの実施形態では、ＺはＣ（＝Ｏ）である。いくつかの実施形態では、ＺはＮＨＣ（＝Ｏ）である。いくつかの実施形態では、Ｙは、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、及びヘテロシクロアルキルから選択される、場合により置換された基である。いくつかの実施形態では、Ｙは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、４、５、６又は７員シクロアルキル、及び４、５、６又は７員ヘテロシクロアルキルから選択される、場合により置換された基である。いくつかの実施形態では、Ｙは、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、５又は６員シクロアルキル、及び１又は２個のＮ原子を含有する５又は６員ヘテロシクロアルキルから選択される、場合により置換された基である。いくつかの実施形態では、Ｙは５又は６員シクロアルキル、あるいは１又は２個のＮ原子を含有する５又は６員ヘテロシクロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙはピロリジン環である。いくつかの実施形態では、Ｙはピペリジン環である。いくつかの実施形態では、Ｒ６及びＲ８は、独立して、Ｈ、未置換Ｃ１〜Ｃ４アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、未置換Ｃ１〜Ｃ４ヘテロアルキル、及び置換されたＣ１〜Ｃ４ヘテロアルキルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ６及びＲ８はそれぞれＨである。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、場合により置換されたアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、場合により置換されたヘテロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ２は結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、場合により置換されたヘテロシクロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、場合により置換されたピペラジンである。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、場合により置換されたピペリジンである。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）４Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、場合により置換されたアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、場合により置換されたヘテロアルキルである。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、Ｘは、染料、光架橋剤、細胞毒性化合物、薬剤、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、抗体又は抗体断片、生体材料、ナノ粒子、スピン標識、フルオロフォア、金属含有部分、放射活性部分、新規官能基、他の分子と共有結合的又は非共有結合的相互作用する基、光ケージド部分、化学線励起性部分、配位子、光異性化部分、ビオチン、ビオチン類似体、重原子を取り込んでいる部分、化学分解性基、光分解性基、酸化還元活性剤、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光基、化学発光基、高電子密度基、磁性基、挿入基（intercalating group）、発色団、エネルギー移動剤、生物活性物質、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される検出可能な標識である。いくつかの実施形態では、Ｘはフルオロフォアである。いくつかの実施形態では、Ｘはビオチンである。いくつかの実施形態では、Ｘはビオチン類似体である。
【０１４９】
別の実施形態は、式（ＩＩＩ）のＴＥＣファミリーキナーゼプローブである
【０１５０】
【化１０】
2015536446.tif 000012
式（ＩＩＩ）
（式中、
ＬａはＯであり、
Ａｒは場合により置換されたフェニルであり、
Ｙは、場合により置換されたシクロアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロシクロアルキルであり、
ＺはＣ（Ｏ）又はＮＨＣ（Ｏ）であり、
Ｒ６及びＲ８は、独立して、Ｈ、場合により置換されたアルキル、又は場合により置換されたヘテロアルキルから選択され、
Ｌ１は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、
Ｌ２は、結合、場合により置換されたヘテロシクロアルキル、又は−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−であり、式中、ｍは２〜６であり、
Ｌ３は、場合により置換されたアルキルであるか、又は場合により置換されたヘテロアルキルであり、かつ
Ｘは
【０１５１】
【化１１】
2015536446.tif 000013
である）。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＺはＣ（＝Ｏ）である。いくつかの実施形態では、ＺはＮＨＣ（＝Ｏ）である。いくつかの実施形態では、Ｙは場合により置換されたシクロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙは場合により置換されたヘテロシクロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙは５又は６員シクロアルキル、あるいは１又は２個のＮ原子を含有する５又は６員ヘテロシクロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｙはシクロヘキシル環である。いくつかの実施形態では、Ｙはピロリジン環である。いくつかの実施形態では、Ｙはピペリジン環である。いくつかの実施形態では、Ｒ６及びＲ８は、独立して、Ｈ、未置換Ｃ１〜Ｃ４アルキル、置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、未置換Ｃ１〜Ｃ４ヘテロアルキル、及び置換されたＣ１〜Ｃ４ヘテロアルキルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ６及びＲ８はそれぞれＨである。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、Ｌ１は、場合により置換されたアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、場合により置換されたヘテロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ２は結合である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、場合により置換されたヘテロシクロアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、場合により置換されたピペラジンである。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、場合により置換されたピペリジンである。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）４Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）５Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−である。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、−Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）−である。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、場合により置換されたアルキルである。いくつかの実施形態では、Ｌ３は、場合により置換されたヘテロアルキルである。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、プローブは、リンカーによりイブルチニブに付加されたビオチンを含む（すなわち、ビオチン化イブルチニブ）。いくつかの実施形態では、プローブは、次のＩ−１〜Ｉ−５から選択される。
【０１５５】
【表１】
2015536446.tif 000014
【０１５６】
検出方法
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムは、標的（例えば、標的キナーゼ）の検出を含む。いくつかの例では、標的はプローブの結合している標的である。いくつかの例では、プローブの結合している標的は、薬剤に占有されている標的である。他の例では、プローブの結合している標的は、未占有の標的である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、標的の検出は、サンプルと抗体を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、抗体は標識化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は電気化学発光タグにより標識される。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）二塩化物を含む。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。いくつかの実施形態では、標識化抗体はＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識化抗体である。いくつかの実施形態では、標識化抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼ標識化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は一次抗体として使用される。別の実施形態では、抗体は二次抗体として使用される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、標的の検出は化学発光、発光、蛍光、免疫蛍光、熱量測定、又は電気化学発光法を含む。いくつかの実施形態では、標的の検出は蛍光検出装置を含む。いくつかの実施形態では、蛍光検出装置は励起光源を含む。いくつかの実施形態では、光源はレーザー、光ダイオード、又はランプである。いくつかの実施形態では、ランプはキセノンアーク又は水銀である。いくつかの実施形態では、蛍光検出装置はフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態では、蛍光検出装置はフィルターを含む。いくつかの実施形態では、フィルターは特定の波長を分離して異なるフルオロフォアを励起する。いくつかの実施形態では、蛍光検出装置は、出力を記録する検出器を含む。いくつかの実施形態では、出力は電子信号である。いくつかの実施形態では、蛍光検出装置は蛍光顕微鏡である。いくつかの実施形態では、蛍光顕微鏡は、局在している蛍光を検出する。いくつかの実施形態では、検出は二次元及び／又は三次元で行われる。いくつかの実施形態では、蛍光検出装置は蛍光スキャナーである。いくつかの実施形態では、蛍光スキャナーはマイクロアレイリーダーである。いくつかの実施形態では、マイクロアレイリーダーは、局在している蛍光を二次元で検出する。いくつかの実施形態では、蛍光検出装置は分光蛍光光度計である。いくつかの実施形態では、蛍光検出装置はマイクロプレートリーダーである。いくつかの実施形態では、蛍光検出装置は平均蛍光を記録する。いくつかの実施形態では、蛍光検出装置はフローサイトメーターである。いくつかの実施形態では、フローサイトメーターは、サンプル集団中の個々の細胞の蛍光を解析する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、標的の検出はマイクロプレートリーダーの使用を含む。いくつかの例では、マイクロプレートリーダーはｘＭａｒｋ（商標）マイクロプレート吸光分光光度計、ｉＭａｒｋマイクロプレート吸光度リーダー、ＥｎＳｐｉｒｅ（登録商標）マルチモードプレートリーダー、ＥｎＶｉｓｉｏｎマルチラベルプレートリーダー、ＶＩＣＴＯＲ  Ｘマルチラベルプレートリーダーである。Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ  ＦＬマイクロプレート蛍光光度計及び照度計、Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔマイクロプレート蛍光光度計、Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔマイクロプレート照度計、Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸマイクロプレート光度計、Ｍｕｌｉｓｋａｎ  ＦＣマイクロプレート光度計、及びＭｕｌｉｓｋａｎ  ＧＯマイクロプレート光度計。いくつかの例では、マイクロプレートリーダーは、吸光度、蛍光、発光、時間分解蛍光、及び光散乱を検出する。いくつかの実施形態では、マイクロプレートリーダーは、動的光散乱を検出する。別の方法としては、マイクロプレートリーダーは、静的光散乱を検出する。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、標的の検出はマイクロプレートイメージャーの使用を含む。いくつかの例では、マイクロプレートイメージャーは、ＶｉｅｗＬｕｘ  ｕＨＴＳマイクロプレートイメージャー及びＢｉｏＲａｄマイクロプレートイメージングシステムを含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、コンピューター系システムは、本明細書に記載のタンパク質占有率を決定するための検出方法において採用される。いくつかの実施形態では、コンピューター系システムは、マルチウェルプレートアッセイなどのデバイス又は装置から得られるデータ及びシグナルを分析するデジタル処理装置を含む。いくつかの実施形態では、本明細書では、本明細書に記載のタンパク質占有率を決定するための検出方法を実施するための、デジタル処理デバイスによる実行可能な命令を含む、コンピュータープログラムによりコードされたコンピューター読み取り可能な記録媒体が提供される。
【０１６２】
更なる実施形態では、デジタル処理デバイスは、装置の機能を遂行する１つ以上のハードウェア、中央処理装置（ＣＰＵ）を含む。尚更なる実施形態では、デジタル処理デバイスは、実行可能な命令を実行するよう構成されたオペレーティングシステムを更に含む。いくつかの実施形態では、デジタル処理デバイスは、場合によりコンピューターネットワークに接続する。更なる実施形態では、デジタル処理デバイスは、場合により、ワールド・ワイド・ウェブにアクセスさせるなどしてインターネットに接続する。尚更なる実施形態では、デジタル処理デバイスは、場合により、クラウド・コンピューティングインフラに接続する。他の実施形態では、デジタル処理デバイスは、場合により、イントラネットに接続する。他の実施形態では、デジタル処理デバイスは、場合により、データ記憶装置に接続する。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本明細書では、標的キナーゼのタンパク質占有率を決定するための分析系が提供され、システムは（ａ）本明細書に記載の通りの標的キナーゼ及びプローブを含む患者サンプルを含むプローブＥＬＩＳＡアッセイと、（ｂ）タンパク質占有率を決定するためのプローブの結合している標的キナーゼを検出するための分析装置と、（ｃ）実行可能な命令を実施するよう構成されたオペレーティングシステム、及びメモリを含むデジタル処理デバイスと、（ｄ）（ｉ）標的占有率の閾値のデータベース、（ｉｉ）分析装置から信号データを受信するよう構成されたソフトウェアモジュール、及び（ｉｉｉ）信号データに対してアルゴリズムを適用してサンプル中の標的キナーゼの占有率の度合いを特定するソフトウェアモジュールを含む、標的占有率のアプリケーションを作成する実行可能な命令を含み、デジタル処理デバイスに提供されたコンピュータープログラムと、を含む。
【０１６４】
応用
薬剤の探索及び検証
本明細書で開示されるアッセイ及びシステムは、いずれも薬剤の探索及び検証において有用であり得る。本明細書では、（ａ）標的を含むサンプルをプローブと接触させて、プローブの結合している標的を形成させることと、（ｂ）プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することと、（ｃ）プローブの結合している標的の存在又は非存在に基づき、薬剤による標的の占有率を決定することにより、薬剤を検証することと、を含む、薬剤を検証するための方法が提供される。
【０１６５】
本明細書では、ａ）標的を含むサンプルをプローブと組み合わせることと、ｂ）プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することと、ｃ）プローブの結合している標的の存在又は非存在に基づき、薬剤による標的の占有率を決定することと、を含む、標的の占有率を決定するための方法が更に提供される。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、方法は、工程（ａ）のサンプルをプローブと接触させることより前に、標的を捕捉することを更に含む。いくつかの実施形態では、標的は抗体により捕捉される。いくつかの実施形態では、抗体は抗標的抗体である。いくつかの実施形態では、抗体を固体支持体に付着させる。いくつかの実施形態では、固体支持体はマイクロプレートである。いくつかの実施形態では、マイクロプレートはＭＳＤマイクロプレートである。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、方法は、プローブの結合している標的を一次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、一次検出剤は、抗体、ビーズ、染料、又はフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態では、一次検出剤は抗体を含む。いくつかの実施形態では、抗体は抗ＢＴＫ抗体である。いくつかの実施形態では、方法は、検出剤を二次検出剤と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態では、二次検出剤は、抗体、ビーズ、染料、又はフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態では、一次検出剤は標識されている。いくつかの実施形態では、二次検出剤は標識されている。いくつかの実施形態では、標識は電気化学発光タグである。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）二塩化物を含む。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。いくつかの実施形態では、標識はＳＵＬＦＯ−ＴＡＧである。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することは、サンプルを固体支持体と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、固体支持体はビーズを含む。いくつかの実施形態では、ビーズはストレプトアビジンビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズは磁気ビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズは標識化ビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズは標識化ストレプトアビジンビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズは電気化学発光タグにより標識されている。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）二塩化物を含む。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。いくつかの実施形態では、ビーズはＳＵＬＦＯ−ＴＡＧビーズである。いくつかの実施形態では、ビーズはＳＵＬＦＯ−ＴＡＧストレプトアビジンビーズである。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、ビーズはプローブと相互作用する。いくつかの実施形態では、プローブは標識を含む。いくつかの実施形態では、標識はビオチンを含む。いくつかの実施形態では、ビーズはビオチンと相互作用する。いくつかの実施形態では、ビーズはプローブの結合している標的と複合体を形成する。いくつかの実施形態では、ビーズはプローブと複合させる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することは、プローブの結合している標的又はそれらの一部を検出することを含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することは、ビーズ又はそれらの一部を検出することを含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することは、標識化ビーズを検出することを含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することは、電気化学発光タグを検出することを含む。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）二塩化物を含む。いくつかの実施形態では、電気化学発光タグは、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することは、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧを検出することを含む。いくつかの実施形態では、検出する工程は、発光を含む。いくつかの実施形態では、検出する工程は、電気化学発光を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、方法は、プローブの結合している標的の精製を更に含む。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的は未占有の標的である。いくつかの実施形態では、プローブの結合している標的は製剤により占有されている標的である。別の実施形態では、プローブの結合している標的の精製は、プローブの結合していない標的からのプローブの結合している標的の磁気分離を含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、サンプルは、前処理されたサンプルであり、ここで、前処理されたサンプルは、プローブと接触させる前に薬剤と接触させている。いくつかの実施形態では、サンプルは未処理サンプルであり、ここで、サンプルは、標識と接触させる前に薬剤と接触させていない。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、プローブは製剤を含む。いくつかの実施形態では、プローブは製剤及びリンカーを含む。いくつかの実施形態では、プローブは標識を含む。いくつかの実施形態では、プローブは標識及びリンカーを含む。いくつかの実施形態では、製剤はＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は可逆的ＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は不可逆的ＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は選択的共有ＢＴＫ阻害剤（selective, covalent BTK inhibitor）である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）のシステイン残基と共有結合を形成する。いくつかの実施形態では、システイン残基はシステイン４８１である。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤は、ＬＦＭ−Ａ１３、ＡＶＬ−２９１、ＡＶＬ−１０１、ＡＶＬ−２９２、及びＯＮＯ−ＷＧ−３０７を含むリストから選択される。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。いくつかの実施形態では、製剤はＩＴＫ阻害剤である。いくつかの実施形態では、製剤はＢＭＸキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、製剤はＴＥＣキナーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、製剤はＢＬＫ阻害剤である。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、製剤は薬剤と同一である。例えば、薬剤及び製剤は、いずれもＢＴＫ阻害剤（例えば、イブルチニブ、ＡＶＬ−２９２、ＯＮＯ−ＷＧ−３０７）であり得る。いくつかの実施形態では、製剤は薬剤と同様である。例えば、製剤はＢＴＫ阻害剤であってよく、かつ製剤はＢＴＫ阻害剤の塩誘導体であり得る。いくつかの実施形態では、製剤は薬剤とは異なる。例えば、薬剤はイブルチニブであってよく、かつ製剤はＡＶＬ−２９２であってよい。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、標的は受容体である。いくつかの実施形態では、標的は配位子である。いくつかの実施形態では、標的はキナーゼである。いくつかの実施形態では、キナーゼはＢＴＫである。いくつかの例では、キナーゼはＩＴＫである。他の実施形態では、キナーゼはＢＭＸ又はＢＬＫである。いくつかの例では、キナーゼはＴＥＣ又はＴＸＫである。いくつかの実施形態では、キナーゼはＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＨＥＲ４である。あるいは、キナーゼはＪＡＫ３である。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、薬剤を検証することは、標的に対する薬剤の有効性を決定することを含む。いくつかの実施形態では、薬剤による標的の占有率を決定することは、プローブの結合している標的の存在又は非存在を定量することを含む。いくつかの実施形態では、標的の占有率が少なくとも約５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％であるときに薬剤は有効である。
【０１７７】
診断
任意の方法、アッセイ及びシステムを使用して、対象者の治療法及び全体的なヘルスケアマネジメントについての情報を提供でき、治療レジメンを決定するための方法についての情報を提供する。いくつかの実施形態は、（ａ）標的を含むサンプルをプローブと組み合わせることと、（ｂ）プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することと、（ｃ）プローブの結合している標的の存在又は非存在に基づき治療レジメンを決定することと、を含む、治療レジメンを決定するための方法である。
【０１７８】
本明細書は、（ａ）標的を含むサンプルをプローブと組み合わせることと、（ｂ）プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することと、（ｃ）プローブの結合している標的の存在又は非存在に基づき被検製剤の有効性を決定することと、を含む、被検製剤の有効性を決定するための方法が更に開示される。
【０１７９】
本明細書では、（ａ）標的を含むサンプルをプローブと組み合わせることと、（ｂ）プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することと、（ｃ）プローブの結合している標的の存在又は非存在に基づき薬剤のレスポンダーを識別することと、を含む、薬剤のレスポンダーを特定するための方法を更に開示する。
【０１８０】
本明細書では、（ａ）標的を含むサンプルをプローブと組み合わせることと、（ｂ）プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することと、（ｃ）プローブの結合している標的の存在又は非存在に基づきキナーゼモジュレータを識別することと、を含む、キナーゼモジュレータを特定するための方法が更に開示される。
【０１８１】
本明細書では、（ａ）標的を含むサンプルをプローブと組み合わせることと、（ｂ）プローブの結合している標的の存在又は非存在を検出することと、（ｃ）プローブの結合している標的の存在又は非存在に基づき薬剤耐性を決定することと、を含む、薬剤耐性を決定するための方法が更に開示される。
【０１８２】
サンプル
いくつかの実施形態では、本明細書において開示される方法、アッセイ、及びシステムは、標的を含むサンプルをプローブと接触させることを含む。本明細書で開示される任意の方法、アッセイ、及びシステムで使用される好適なサンプルは、限定するものではないが、全血サンプル、末梢血サンプル、リンパ液サンプル、組織サンプル、腫瘍生検サンプル、骨髄サンプル、又はその他の体液サンプルを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、全血サンプル、末梢血サンプル、リンパ液サンプル、組織サンプル、腫瘍生検サンプル、骨髄サンプル、又はその他の体液サンプルに由来する１種以上の細胞型、又はそれらの溶解物を含むサンプルである。体液の例としては、なすりつけ標本、痰、生検、分泌物、脳脊髄液、胆汁、血液、リンパ液、唾液、及び尿が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、提供される方法に使用するより前に、サンプルの細胞がサンプルのその他の成分から単離される。いくつかの実施形態では、提供される方法に使用するより前に、サンプルの特定の細胞型が、サンプルのその他の細胞型から単離される。例えば、いくつかの実施形態では、提供される方法に使用するより前に、血液サンプルの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、例えば、リンパ球、単球及びマクロファージ）が、血液サンプルのその他の細胞型から単離される。例えば、いくつかの実施形態では、提供される方法に使用するより前に、サンプルのリンパ球（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞又はＮＫ細胞）が、サンプルのその他の細胞型から単離される。例えば、いくつかの実施形態では、提供される方法に使用するより前に、サンプルのＢ細胞が、サンプルのその他の細胞型から単離される。いくつかの実施形態では、提供される方法に使用するより前に、サンプルの細胞が可溶化される。例えば、いくつかの実施形態では、提供される方法に使用するより前に、癌細胞がサンプルの正常な細胞から単離される。
【０１８３】
本明細書で開示されるサンプルは、いずれも、集団としてアッセイされ得る、又は亜集団へと分類され得る複雑な細胞集団からなる。このような細胞及び無細胞サンプルは、遠心分離、水簸、密度勾配分離、アフェレーシス、親和性による選別、パニング、ＦＡＣＳ、濾過、Ｈｙｐａｑｕｅによる遠心分離などにより分離され得る。特定の細胞型に関し識別されるマーカーに特異的な抗体を使用することにより、相対的に均質な細胞集団を得ることができる。あるいは、不均質な細胞集団が使用され得る。
【０１８４】
得られたサンプルは、直ちに使用でき、凍結でき、又は短期間適切な培養培地で維持できる。本発明の方法に従って使用するため１つ以上の細胞を単離するための方法は、当該技術分野で周知の標準法及びプロトコルに従って実施される。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、サンプルは対象者から得られる。このような対象者は、ヒトとすることができ、又は乳牛、ニワトリ、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ又はヤギなどの家畜とすることができる。いくつかの実施形態では、本発明で使用される細胞は患者から採取される。動物（例えば、ヒト）由来のサンプルとしては、例えば、全血、汗、涙、唾液、耳漏（ear flow）、痰、リンパ液、骨髄懸濁液、リンパ液、尿、唾液、精液、膣分泌液、脳脊髄液、脳液、腹水、乳汁、呼吸器、消化器又は泌尿管生殖管からの液体の分泌、組織又は器官（例えば、肺）の洗浄液、又は乳房、肺、腸、肌、子宮頸部、前立腺、膵臓、心臓、肝臓及び胃などの器官から摘出された組織が挙げられる。
【０１８６】
血液サンプルを得るためには、当該技術分野において既知の任意の技術、例えば、注射器又はその他の真空式吸引デバイスを使用できる。サンプルは、場合により前処理でき、又は濃縮前に処理することができる。前処理工程の例としては、安定剤、防腐剤、定着液、溶解剤、希釈剤、薬剤、抗アポトーシス剤、抗凝固剤、抗血栓剤、磁性調節剤、緩衝剤、浸透圧調節剤、ｐＨ調節剤、及び／又は架橋剤などの試薬の添加が挙げられる。例えば、血液サンプルを得るとき、富化前に、抗疑固剤及び／又は安定剤などの防腐剤をサンプルに加えることができる。
【０１８７】
血液サンプルなどのサンプルは、サンプルの得られた時点から１週間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間、１日、１２時間、６時間、３時間、２時間、又は１時間以内に本明細書に開示されるいずれかの方法、アッセイ、及びシステム下で分析できる。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、サンプルは、サンプル中の１種以上の細胞又は成分を選択的に可溶化する酵素又は化合物と組み合わせることができる。例えば、血液サンプルでは、血小板及び／又は脱核された赤血球細胞が選択的に可溶化されて、有核細胞富化サンプルが生成される。続いて、当該技術分野において既知の方法を使用して、サンプルから対象とする細胞を分離することができる。
【０１８９】
対照者由来のサンプル（例えば、血液サンプル）を得るとき、量は、選別される対象者の体格及び状態に応じ変更することができる。いくつかの実施形態では、５０、４０、３０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１ｍＬまでのサンプルが得られる。いくつかの実施形態では、１〜５０、２〜４０、３〜３０、又は４〜２０ｍＬのサンプルが得られる。いくつかの実施形態では、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ｍＬ超のサンプルが得られる。
【０１９０】
疾患及び徴候
いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるサンプルは、いずれも、疾患又は徴候に罹患している対象者から得られる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されるサンプルは、いずれも、ＴＥＣファミリーキナーゼにより介在される疾患又は徴候に罹患している対象者から得られる。いくつかの実施形態では、サンプルは、自己免疫疾患、炎症性障害、又は癌などの増殖性疾患に罹患している対象者に由来する。いくつかの実施形態では、癌は固形腫瘍である。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、サンプルは癌に罹患している対象者由来のものである。癌としては、肉腫、細胞腫、及び血液系の癌が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、血液癌は白血病、リンパ腫、又は骨髄腫である。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、癌は肉腫である。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、又はその他の結合組織若しくは支持組織の癌である。肉腫としては、骨癌、線維肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン腫、両側性前庭神経鞘腫、骨肉腫、軟部肉腫（例えば、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢胞性肉腫（cystosarcoma phylloides）、皮膚線維肉腫、類腱腫、類上皮肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、及び滑膜肉腫）が挙げられるがこれに限定されない。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、癌は細胞腫である。細胞腫は、上皮細胞から発生する癌である。上皮細胞は、体表を覆い、ホルモンを産生し、腺を形成する細胞である。非限定例として、細胞腫としては、乳癌、膵癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝癌、卵巣癌、脳癌、腟癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、輸卵管の癌、頭頸部癌、消化管間葉性癌、腺癌、皮膚黒色腫又は眼球内黒色腫、肛門領域の癌、小腸の癌、内分泌腺系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、頸部の癌、脳下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、及び脊髄の軸の腫瘍が挙げられる。いくつかの例では、癌は、基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、非黒色腫、又は光線性（日光性）角化症などの皮膚癌である。いくつかの実施形態では、癌は膵臓、結腸癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、甲状腺癌、膀胱癌、又は近位若しくは遠位胆管癌である。いくつかの実施形態では、癌は乳癌である。
【０１９４】
いくつかの例では、癌は肺癌である。肺癌は、気管から分岐して肺（気管支）又は肺の小型空気嚢（肺胞）に分布する気道で生じ得る。肺癌としては、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、及び中皮腫が挙げられる。ＮＳＣＬＣの例としては、扁平上皮細胞癌、腺癌、及び大細胞癌が挙げられる。いくつかの実施形態では、中皮腫は、肺及び胸腔（胸膜）内膜、又は腹部（腹膜）内膜の癌性腫瘍である。いくつかの例では、癌は神経膠芽腫などの脳癌である。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、癌は中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍である。ＣＮＳ腫瘍は、神経膠腫又は非神経膠腫として分類することができる。いくつかの例では、神経膠腫は、悪性神経膠腫、高悪性度神経膠腫、びまん性内在性橋膠腫である。神経膠腫の例としては、星状細胞腫、乏突起神経膠腫（又は乏突起神経膠腫と星状細胞腫の要素の混在）、及び上衣腫が挙げられる。星状細胞腫としては、低悪性度星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形神経膠芽腫、毛様細胞性星状細胞腫、多形黄色星状膠細胞腫、及び上衣下巨細胞性星状細胞腫が挙げられるがこれに限定されない。乏突起神経膠腫としては、低悪性度乏突起神経膠腫（又は乏突起星細胞腫）及び退形成乏突起膠腫が挙げられる。非神経膠腫としては、髄膜腫、下垂体腺腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、及び髄芽腫が挙げられる。いくつかの例では、癌は髄膜腫である。
【０１９６】
いくつかの例では、癌は白血病である。いくつかの例では、白血病は、急性リンパ球性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、前駆Ｂリンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、又は急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）である。追加の種類の白血病としては、有毛細胞白血病、慢性骨髄単球性白血病、及び若年性骨髄単球性白血病が挙げられるがこれに限定されない。
【０１９７】
いくつかの例では、癌はリンパ腫である。いくつかの例では、リンパ腫はホジキンリンパ腫である。他の例では、リンパ腫は非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）である。いくつかの実施形態では、リンパ腫はＢ細胞ＮＨＬである。Ｂ細胞ＮＨＬの非限定的なリストには、バーキットリンパ腫（例えば、地域性バーキットリンパ腫及び散発性バーキットリンパ腫）、皮膚Ｂ細胞リンパ腫、皮膚辺縁帯リンパ腫（ＭＺＬ）、びまん性大細胞型リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、びまん性混合型小細胞及び大細胞型リンパ腫、びまん性小切れ込み核細胞、びまん性小リンパ球性リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、濾胞性小切れ込み核細胞（グレード１）、濾胞性混合型小切れ込み核細胞及び大細胞（グレード２）、濾胞性大細胞（グレード３）、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内リンパ腫、大細胞型免疫芽球性リンパ腫、大細胞型リンパ腫（ＬＣＬ）、リンパ芽球性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、免疫芽球性大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫−粘膜内リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓周辺帯Ｂ細胞リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、リンパ形質細胞性（lymphoplasmocytic）リンパ腫、有毛細胞白血病、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、前駆体Ｂ細胞リンパ芽球性リンパ腫、原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫、及びＡＩＤＳ関連リンパ腫が含まれる。更なる非ホジキンリンパ腫が本発明の範囲内で想到され、当業者には明らかである。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、癌はＴ細胞リンパ腫である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞リンパ腫は、節外性Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、セザリー症候群、菌状息肉症、未分化大細胞リンパ腫、又は血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫である。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、対象者は、自己免疫疾患、例えば、炎症性腸疾患、関節炎、狼瘡、関節リウマチ、乾癬性関節炎、変形性関節症、スチル病、若年性関節炎、糖尿病、重症筋無力症、橋本病、Ｏｒｄ’ｓ甲状腺炎、グレーブス病シェーグレン症候群、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、急性散在性脳脊髄炎、アジソン病、眼球クローヌス・ミオクローヌス運動失調、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、再生不良性貧血、自己免疫性肝炎、セリアック病、グッドパスチャー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、視神経炎、強皮症、原発性胆汁性肝硬変、ライター症候群、高安動脈炎、側頭動脈炎、温式自己免疫性溶血性貧血、ウェゲナー肉芽腫症、乾癬、汎発性脱毛症、ベーチェット病、慢性疲労、自律神経障害、子宮内膜症、間質性膀胱炎、神経性筋強直症、強皮症、又は外陰部痛に罹患している。
【０２００】
他の実施形態では、対象者は、異種免疫状態又は疾患、例えば、移植片対宿主病、移植、輸血、即時型過敏反応、過敏症、Ｉ型過敏症、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、又はアトピー性皮膚炎に罹患している。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、対象者は、炎症性疾患、例えば、ぜんそく、虫垂炎、眼瞼炎、細気管支炎、気管支炎、滑液包炎、子宮頸管炎、胆管炎、胆嚢炎、大腸炎、結膜炎、膀胱炎、涙腺炎、皮膚炎、皮膚筋炎、脳炎、心内膜炎、子宮内膜炎、腸炎、小腸結腸炎、上顆炎、精巣上体炎、筋膜炎、結合織炎、胃炎、胃腸炎、肝炎、化膿性汗腺炎、喉頭炎、乳腺炎、髄膜炎、脊髄炎、心筋炎、筋炎、腎炎、卵巣炎、精巣炎、骨炎、耳炎、膵炎、耳下腺炎、心膜炎、腹膜炎、咽頭炎、胸膜炎、静脈炎、肺炎、肺炎、直腸炎、前立腺炎、腎盂腎炎、鼻炎、卵管炎、副鼻腔炎、口内炎、滑膜炎、腱炎、扁桃炎、ブドウ膜炎、腟炎、血管炎、又は外陰炎を有する。
【０２０２】
更なる実施形態では、対象者は、血栓塞栓性疾患、例えば、心筋梗塞、狭心症、血管形成後再閉塞、血管形成後再狭窄、大動脈冠状動脈バイパス後再閉塞、大動脈冠状動脈バイパス後再狭窄、脳卒中、一過性虚血、末梢動脈閉塞性疾患、肺塞栓症、又は深部静脈血栓症に罹患している。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、対象者は、疾患又は病状を治療するための１種以上の治療剤を投与され、又は投与を受けている。いくつかの実施形態では、対象者は、疾患又は病状を治療するためのＢＴＫ阻害剤を投与され、又は投与を受けている。いくつかの実施形態では、対象者は、疾患又は病状を治療するためのＢＴＫ阻害剤に加えて１種以上の治療剤が投与され、又は投与を受けている。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、対象者は、癌を治療するための１種以上の化学療法剤が投与され、又は投与を受けている。いくつかの実施形態では、対象者は、癌を治療するためのＢＴＫ阻害剤を投与され、又は投与を受けている。いくつかの実施形態では、対象者は、癌を治療するためのＢＴＫ阻害剤に加え、１種以上の化学療法剤が投与され、又は投与を受けている。いくつかの実施形態では、ＢＴＫ阻害剤はイブルチニブである。
【０２０５】
方法、アッセイ及びシステムのその他の特徴
本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムのその他の特徴が本明細書において開示される。本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムの有効性は、現在のタンパク質占有率に関する方法、アッセイ、及びシステム（例えば、ゲル系のアッセイ）にほぼ匹敵する。いくつかの実施形態では、方法、アッセイ、及びシステムの有効性は、現在のタンパク質占有率法よりも良好である。いくつかの例では、方法、アッセイ、及びシステムは、現在のタンパク質占有率法と比較した場合に改良されている特異性を提供する。例えば、プローブにより標識した陰性対照Ｊｕｒｋａｔ溶解物のシグナルが、試験した全ての溶解物のバックグラウンド程度であったとき、アッセイは、良好な特異性を提供する。いくつかの例では、特異性は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又は９９％である。
【０２０６】
いくつかの例では、本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムは、改良されている感度を提供する。いくつかの例では、改良されている感度は、必要とされるサンプル量から判定できる。いくつかの例では、方法、アッセイ、及びシステムにより、従来の方法と比較して、可溶化液の使用量を、少なくとも約１／２、少なくとも約１／３、少なくとも約１／４、少なくとも約１／５、少なくとも約１／６、少なくとも約１／７、少なくとも約１／８、少なくとも約１／９、又は少なくとも約１／１０に減少させることができる。いくつかの実施形態では、従来の方法と比較して、約１／２〜１／１０、約１／３〜１／７、約１／３〜１／６の可溶化液が使用される。例えば、本アッセイの改良された感度により、可溶化液の使用をウェスタンブロット／ＥＬＩＳＡと比較して１／３〜１／５として、貴重なサンプルを保存することができる。
【０２０７】
本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムは直接的なものである。本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムは、従来の方法（例えば、ウェスタンブロット）よりも迅速である。本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムは、約１０時間未満、約８時間未満、約７時間未満、約６時間未満、約５時間未満、約４時間未満で完了できる。好ましくは、本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムは、約２〜７時間未満、約３〜６時間未満、約３〜５時間未満で完了できる。
【０２０８】
本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムは、スループットの向上のためにも提供される。いくつかの実施形態では、スループットは、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％増加される。
【０２０９】
本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムは、より均一な試験条件の提供のためにも提供される。例えば、プレートベースのアッセイにおいて、単一のゲルにおけるよりもたくさんのサンプルに対しアッセイをなすことができる。したがって、単一プレート上のサンプルは、複数のゲル上のサンプルよりも一様な試験条件を有することになる。更に、複数プレートベースのアッセイの均一性は、複数ゲルの均一性よりも良好である。いくつかの例では、試験条件の均一性は、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％向上する。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムにより、従来の方法（例えば、ゲルベースのフォーマット）よりもプローブの使用量を減少させることができる。いくつかの実施形態では、従来の方法（例えば、ゲルベースのフォーマット）と比較して、プローブの使用量を少なくとも約１／１０、１／２０、１／３０、１／４０、１／５０、１／６０、１／７０未満に減少させることができる。例えば、本アッセイでは、ゲルベースのフォーマットと比較してプローブの必要量が１／４０となることから、試薬が節約される。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムは大型のシグナルウインドウを提供する。一部の実施形態では、大型のシグナルウインドウは、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、３００：１、４００：１、５００：１、６００：１、７００：１、８００：１、９００：１、１０００：１でウェル当たり９μｇの溶解物を含む。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムは良好な再現性を提供する。いくつかの実施形態では、再現性は、約１０％  ＣＶ未満、約８％  ＣＶ未満、約６％  ＣＶ未満、約５％  ＣＶ未満、約４％  ＣＶ未満、約３％  ＣＶ未満である。好ましくは、再現性は約４〜６％  ＣＶ未満である。
【０２１３】
本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムを最適化するための手法及び提案としては、セクターでのプレートのイメージング、セクターへの１回の通電、及びサンプル中への気泡の混入の回避、抗体の検出及び緩衝液の読み取りが挙げられるがこれに限定されない。本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムを最適化するための更なる方法は、暗所での抗体ストックの検出を維持することを含む。しかしながら、希釈液を遮光する必要はない。更に、約２５μＬ程度の少量を加えるときには、ウェル底部の隅に加える。いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムは、ブロッキング、サンプルのインキュベート、インキュベートした抗体の検出中、プレートを振盪することを含む。最適化するためには、アッセイに洗浄緩衝液又は読み取り緩衝液を長時間残したままにしてはならない。しかしながら、追加の時間が必要とされる場合には、サンプル又は検出抗体は残したままにする。好ましくは、サンプルの取り扱いにはポリプロピレンプレート及びチューブが使用される。好ましくは、サンプル取り扱いに関してはポリスチレンは回避すべきである。いくつかの実施形態では、プローブと接触させるより前に、サンプルをボルテックスし、及び／又は遠心分離することができる。サンプルのボルテックス及び／又は遠心分離により、サンプル中の何らかの残渣を確実に除去できる。いくつかの例では、プレートは４℃で一晩ブロッキングできる。いくつかの例では、プレートは室温で１時間ブロッキングできる。一晩ブロッキングする場合、プレートに対しアッセイを行う前に、プレートを室温に平衡化させる。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムは、プレートの一部を使用することを含む。いくつかの例では、プレートの一部を使用するための指示書が提供され得る。いくつかの例では、本明細書で開示される方法、アッセイ、及びシステムは、プレートの包装を開封する前に、プレートを室温へと平衡化させることを含む。ＳＩ２４００  ＭＳＤ  ＳＥＣＴＯＲ  ＩＭＡＧＥＲに関しては、ＭＳＤプレートは２４セクターに分割する（２×２＝４ウェル／セクター−図２０を参照されたい）。セクターには一度だけ通電でき、プレートの一部を使用するときには、サンプルはセクターに割り当てる必要がある。いくつかの例では、全ての試薬の用量は、使用するプレート部分をもとに調整される。いくつかの例では、使用しないセクターはプレートシールで覆い、アッセイ工程中に乾燥を維持する必要がある。いくつかの例では、プレートシールはプレートの読み取り前に外す必要がある。
【実施例】
【０２１５】
実施例１．抗タンパク質抗体コートプレートとストレプトアビジンコートプレートのアッセイフォーマットの比較
既存のゲルベースのＢＴＫ占有率アッセイを、プレートベースの電気化学発光アッセイに変更して、アッセイのスループットを増加させることを試験の目的とした。アッセイの目的は、以降「薬剤」又はイブルチニブとして参照する共有結合阻害剤（イブルチニブ）の結合していないＢＴＫの相対量を定量することである。この薬剤はＢＴＫの活性部位に結合し、システイン残基によりジスルフィド結合を形成する。以降「プローブ」として参照とする化合物Ｉ−５は、長鎖リンカーによりビオチンに連結されているイブルチニブからなる。ゲル系アッセイにおいて、プローブは蛍光レポーターにより標識される。プローブにより標識されたサンプルを標識することで、製剤により占有されていないＢＴＫを検出できる。２つの有望なアッセイフォーマットを図１１に示す。
【０２１６】
実験１
本実験では、感度、特異性、レンジに関しアッセイフォーマットを試験し、最も好適な抗ＢＴＫ抗体を決定した。
【０２１７】
サンプル
陽性対照：ＤＯＨＨ２細胞溶解物（１ｍｇ／ｍＬ）のアリコートを１μＭイブルチニブで阻害し、次にプローブ（１μＭ）で標識した。
【０２１８】
陰性対照：プローブ（１μＭ）により標識した未処理ＤＯＨＨ２及びＪｕｒｋａｔ細胞溶解物（１ｍｇ／ｍＬ）と、未処理ＤＯＨＨ２細胞溶解物
【０２１９】
使用した材料：
標準ストレプトアビジンプレート（５パック）カタログ番号Ｌ１５ＳＡ−２；読み取り緩衝液Ｔ（５０ｍＬ）、カタログ番号Ｒ９２ＴＣ−３；ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧヤギ抗マウス（５０μｇ）、カタログ番号Ｒ３２ＡＣ−５；ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧヤギ抗ウサギ（５０μｇ）、カタログ番号Ｒ３２ＡＢ−５；ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧストレプトアビジン（５０ｕｇ）、カタログ番号Ｒ３２ＡＤ−５；ＭＳＤ標準プレート、カタログ番号Ｌ１５ＸＡ−３；ＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ、カタログ番号Ｒ９３ＡＡ−２；プロテアーゼ阻害剤カクテル（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ／Ｐｉｅｒｃｅ  Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテルＥＤＴＡ不含、カタログ番号８７７８５、又はＲｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔａｂｌｅｔ、カタログ番号１８３６１７０）；ＢＴＫ発現細胞株（ＤＯＨＨ２）由来の陽性対照可溶化液；陰性対照可溶化液（Ｊｕｒｋａｔ）；イブルチニブ（ＰＣＩ）；プローブ化合物Ｉ−５（ビオチン化プローブ）
【０２２０】
ＢＴＫ抗体：
次の抗体を試験した：
【０２２１】
【表２】
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【０２２２】
溶液：
ブロッキング溶液：３％（ｗ／ｖ）ＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ／１ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液：３ｇ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ＋１００ｍＬ  １ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液４℃で最大１４日間保管する。ＰＢＳ−Ｔでブロッキング溶液も調製できる。
洗浄緩衝液：１ｘ  ＭＳＤ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液：５０ｍＬ  １０ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液＋４５０ｍＬ  Ｈ２Ｏ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０）洗浄緩衝液としてはＰＢＳ−Ｔも使用できる。
捕捉抗体希釈緩衝液：ＰＢＳ（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋不含有）
検出抗体希釈緩衝液：１％  ＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ／１ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液：１０ｍＬブロッキング溶液＋２０ｍＬ  １ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液又は１０ｍＬブロッキング溶液＋２０ｍＬ  ＰＢＳ−Ｔ
読み取り緩衝液：１ｘ  ＭＳＤ読み取り緩衝液Ｔ：プレート当たり５ｍＬ  ４ｘ読み取り緩衝液Ｔ＋１５ｍＬ  Ｈ２Ｏ；２ｘ  ＭＳＤ読み取り緩衝液Ｔ：プレート当たり１０ｍＬ  ４ｘ読み取り緩衝液Ｔ＋１０ｍＬ  Ｈ２Ｏ
細胞溶解物：複数回凍結融解させた細胞ペレットをＰＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤に再懸濁することにより溶解物を調製した。ＰＣＩ及びプローブ標識反応をＰＢＳ−Ｔ＋１％  ＢＳＡ（アッセイ緩衝液）で実施した。溶解物をアッセイ緩衝液＋プロテアーゼ阻害剤で希釈した。
【０２２３】
フォーマット１：ストレプトアビジン検出
図１１Ａは、ストレプトアビジン検出アッセイ（例えば、アッセイフォーマット１）の概略図である。簡潔に述べると、方法は、標的（例えば、ＢＴＫキナーゼ）を含む、薬剤処理されたサンプルを、抗ＢＴＫ抗体コートプレートと接触させることを含み、ＢＴＫキナーゼは抗ＢＴＫ抗体により捕捉される。抗ＢＴＫ抗体により捕捉されたＢＴＫキナーゼは、薬剤により占有されたＢＴＫキナーゼと、未占有のＢＴＫキナーゼとを含む。捕捉されたＢＴＫキナーゼをプローブと接触させる。プローブは、未占有のＢＴＫキナーゼに結合する製剤を含む。この実施例では、プローブは、薬剤により占有されたＢＴＫキナーゼに結合できない。プローブを、未占有のＢＴＫキナーゼと結合させて、プローブの結合しているＢＴＫキナーゼを検出する。この実施例では、プローブは、プローブの結合しているＢＴＫキナーゼを検出可能な標識を含む。プローブの結合しているＢＴＫキナーゼは、標識化ビーズ（例えば、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧストレプトアビジン）を加えることにより検出する。プローブの結合しているキナーゼの量は、電気化学発光により定量する。プローブの結合しているキナーゼの定量により、ＢＴＫキナーゼの占有率及び薬剤の有効性を決定できる。より詳細なプロトコルが本明細書で開示される。
【０２２４】
プロトコル−アッセイフォーマット１
１．ＭＳＤ標準プレートを、各ウェル３０μＬの抗ＢＴＫ捕捉抗体溶液（ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈）でコートする。抗体溶液をウェル底部の隅に配置した後、プレートを軽く叩き、各ウェルの底部全体に確実に均一に分散させる。粘着性プレートシールでシールし、４℃で一晩インキュベートする。プレートは振盪させない。
２．プレートを軽く叩いて中身を除去し、ウェル当たり１５０μＬのブロッキング溶液（３％［ｗ／ｖ］Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ）を加える。シールし、室温で１時間以上振盪しながらインキュベートする。
３．各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを１回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
４．プレートのレイアウトに従い、３０μＬの溶解物を加える。溶解物の溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし、室温で３００〜５００ｒｐｍで１時間振盪させる。
５．各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
６．プレートのレイアウトに従い、各ウェルに、１％（ｗ／ｖ）Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで０．５μｇ／ｍＬに希釈したＳＵＬＦＯ−ＴＡＧストレプトアビジンを２５μＬ加える。プレートをシールし、室温で３００〜５００ｒｐｍで３０〜６０分間振盪させる。
７．ウェル当たり１５０μＬ以上の１ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
８．各ウェルに１５０μＬの１ｘ読み取り緩衝液Ｔ（Ｈ２Ｏに希釈）を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをＳＩ２４００で読み取る。
【０２２５】
プレートのレイアウト及び結果を図１２に示す。
全３種の被検捕捉抗体に関し、陽性対照（ＤＯＨＨ２＋プローブ）のシグナルを溶解物の濃度により定量する。抗ＢＴＫ捕捉抗体ＢＤ６１１１１６及びＢＤ６１１１１７を使用したときに最も高いシグナルが得られた。抗ＢＴＫ捕捉抗体ＢＤ６１１１１６及びＢＤ６１１１１７は同等であった。
【０２２６】
抗ＢＴＫ捕捉抗体ＢＤ６１１１６を使用したところ、１μｇ／μＬ陽性対照可溶化液では、陽性対照（ＤＯＨＨ２＋プローブ）の最大シグナル：バックグラウンド比１２５：１が得られた。
【０２２７】
試験した全てのＤＯＨＨ２（プローブ非添加）溶解物濃度でバックグラウンドが低かったことから、溶解物タンパク質に対するＳＵＬＦＯ−ＴＡＧストレプトアビジンの非特異的な結合はなかったことが示唆される。
【０２２８】
抗ＢＴＫ捕捉抗体のＢＤ  ６１１１１６（図１３Ａを参照されたい）及びＢＤ６１１１１７（図１３Ｂを参照されたい）を使用したときには、陽性対照（ＤＯＨＨ２＋プローブ）溶解物のシグナルは、陰性対照（ＤＯＨＨ２＋ＰＣＩ＋プローブ）及び（Ｊｕｒｋａｔ＋プローブ）と区別することができるが、Ｓｉｇｍａ抗ＢＴＫを捕捉抗体として使用したときには区別できないことから、Ｓｉｇｍａ抗ＢＴＫはプローブにより標識した細胞溶解物のその他のタンパク質に結合し得ることが示唆される。陽性対照：陰性対照の具体的な比率を表１に示す。
【０２２９】
【表３】
2015536446.tif 000016
【０２３０】
以降の実験ではＳｉｇｍａ抗ＢＴＫ抗体は使用しなかった。
【０２３１】
フォーマット２：ストレプトアビジン捕捉
図１１Ｂ及び１４Ａは、ストレプトアビジンコートしたプレートアッセイ（例えば、アッセイフォーマット２）の概略図を示す。簡潔に述べると、方法は、ＭＳＤ標準ストレプトアビジンプレートをプローブでブロッキングすること、又はプローブの結合しているプレートを提供することを含む。この実施例では、プローブは、標識及び製剤を含み、この標識（例えば、ビオチン）がストレプトアビジンにより捕捉され、プローブがプレートに付加される。標的（例えば、ＢＴＫ）を含むサンプルをプレートに適用する。標的は製剤（例えば、ＢＴＫ阻害剤などの薬剤）を介しプローブに結合し又は付加され、プローブの結合している化合物を形成する。プローブの結合している標的は、抗標的（例えば、抗ＢＴＫ）抗体などの一次検出剤により検出できる。一次検出試薬を標識し、続いて直接検出できる。図１１Ｂに示す通り、一次検出試薬をＳＵＬＦＯ−ＴＡＧと複合させて、標識付加一次検出試薬を生成する。しかしながら、図１４Ａに示す通り、一次検出試薬は未標識としてもよい。方法には、図１４Ａに示す通り、二次検出剤（例えば、抗種抗体）の付加を更に含ませることができる。二次検出剤は標識し（例えば、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗種抗体）、続いて検出できる。ＳＵＬＦＯ標識付加検出剤は、プローブの結合しているキナーゼの定量を可能にする電気化学発光により検出できる。プローブの結合しているキナーゼの定量により、ＢＴＫキナーゼの占有率及び薬剤の有効性を決定できる。より詳細なプロトコルが本明細書で開示される。
【０２３２】
プロトコル−アッセイフォーマット２
１．ＭＳＤ標準ストレプトアビジンプレートの各ウェルに、１５０μＬのブロッキング溶液（３％［ｗ／ｖ］Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ）を加える。シールし、室温で１時間以上振盪しながらインキュベートするか、又は４℃で一晩ブロッキングする。
２．各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを１回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
３．プレートのレイアウトに従い、３０μＬの溶解物を加える。溶解物の溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし、室温で３００〜５００ｒｐｍで１時間振盪させる。
４．各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
５．プレートのレイアウトに従い、各ウェルに、１％（ｗ／ｖ）Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで０．５μｇ／ｍＬに希釈した抗ＢＴＫ抗体を２５μＬ加える。シールし室温で１時間振盪する。
６．各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。プレートのレイアウトに従い、各ウェルに、１％（ｗ／ｖ）Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで１μｇ／ｍＬに希釈したＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ複合抗種抗体を２５μＬ加える。プレートをシールし室温で１時間振盪する。
７．ウェル当たり１５０μＬ以上の１ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
８．各ウェルに１５０μＬの１ｘ読み取り緩衝液Ｔ（Ｈ２Ｏに希釈）を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをＳＩ２４００で読み取る。
【０２３３】
結果
プレートのレイアウト及び結果を図１４Ｂ〜Ｃに示す。
【０２３４】
抗ＢＴＫのＢＤ６１１１１６及びＢＤ６１１１１７を検出抗体として使用したとき、陽性対照（ＤＯＨＨ２＋プローブ）のシグナルは、６２μｇ／ｍＬ溶解物までは溶解物濃度により定量され、これ以上の溶解物濃度では、過剰に存在するプローブが、プローブにより標識したＢＴＫと、ストレプトアビジン表面に関し競合することに起因し、フック効果が生じている可能性がある。サンプル中最終プローブ濃度を＞６２ｎＭとしたときにフックが生じる。
【０２３５】
抗ＢＴＫ検出抗体ＢＤ６１１１６を使用したところ、０．０６μｇ／μＬ陽性対照可溶化液では、陽性対照（ＤＯＨＨ２＋プローブ）の最大シグナル：バックグラウンド比２４０：１が得られた。
【０２３６】
抗ＢＴＫのＢＤ６１１１１６及びＢＤ６１１１１７を検出抗体として使用したとき、試験した全てのＤＯＨＨ２（プローブ非添加）溶解物濃度でバックグラウンドは低かったことから、溶解物のタンパク質に対するこれらの抗体の非特異的結合はなかったことが示唆される。対照的に、Ｓｉｇｍａ抗ＢＴＫ抗体では、試験した全ての条件で高いバックグラウンドシグナルが生じた。
【０２３７】
抗ＢＴＫ検出抗体のＢＤ  ６１１１１６（図１５Ａを参照されたい）及びＢＤ６１１１１７（図１５Ｂを参照されたい）を使用したときには、陽性対照（ＤＯＨＨ２＋プローブ）溶解物のシグナルは、陰性対照（ＤＯＨＨ２＋ＰＣＩ＋プローブ）及び（Ｊｕｒｋａｔ＋プローブ）と区別することができるが、Ｓｉｇｍａ抗ＢＴＫを検出抗体として使用したときには区別できないことから、Ｓｉｇｍａ抗ＢＴＫはプローブにより標識した細胞溶解物のその他のタンパク質に結合し得ることが示唆される。陽性対照：陰性対照の具体的な比率を表２に示す。
【０２３８】
【表４】
2015536446.tif 000017
【０２３９】
以降の実験ではＳｉｇｍａ抗ＢＴＫ抗体は使用しなかった。
【０２４０】
陰性対照のシグナルは１μＭプローブのみのウェルからのシグナルと同程度である。
【０２４１】
抗ＢＴＫ検出抗体ＢＤ６１１１１６及びＢＤ６１１１１７は同程度であった。
【０２４２】
図１６は、アッセイフォーマット１（ストレプトアビジン検出法）及びアッセイフォーマット２（ストレプトアビジン捕捉法）の比較を示す。図１６に示す通り、アッセイフォーマット２では、アッセイフォーマットと比べ良好な感度及び良好な特異性が提供される。
【０２４３】
実験２−プローブ濃度の最適化
更なる最適化にはアッセイフォーマット２（例えば、ストレプトアビジンコートしたプレートによるストレプトアビジン捕捉法−図１４Ａを参照されたい）を使用した。プローブ濃度＞６２ｎＭ及び溶解物濃度＞６２μｇ／ｍＬでフック効果が観察されたことから、チェッカーボード実験を実施して、フック効果が過剰なプローブに関係するのか又は過剰なタンパク質濃度に関係するのかを判定した。プレートの結合能が飽和すれば、複合体を形成していない過剰なプローブは、ストレプトアビジン表面に対する結合に関し、ＢＴＫ結合プローブと競合し得る。
【０２４４】
目的：
必要とされる最適プローブ濃度を決定する
様々なプローブ：溶解物比を比較する
【０２４５】
サンプル
陽性対照：アッセイ緩衝液を用い１ｍｇ／ｍＬ  ＤＯＨＨ２溶解物を調製する。
陰性対照：１μＭ  ＰＣＩにより１ｍｇ／ｍＬ  ＤＯＨＨ２溶解物のアリコートを処理し、ＢＴＫにＰＣＩが最大限に結合するよう過剰量のＰＣＩを含有させる。
【０２４６】
ＤＯＨＨ２のみ、及びＤＯＨＨ２＋ＰＣＩ溶解物を、アッセイ緩衝液により１００、５０、２５、１２．５、６．２５及び３．１２μｇ／ｍＬに希釈する。
【０２４７】
プローブを１００００、２５００、６２５、１５６、３９、９及び２ｎＭ（１００ｘ濃度）に希釈する。
【０２４８】
９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて、１μＬ  １００ｘプローブを１００μＬ希釈溶解物に加え、インキュベートする。
【０２４９】
プロトコル
１．ＭＳＤ標準ストレプトアビジンプレートを、ウェル当たり１５０μＬの３％  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａにより室温で１時間又は４℃で一晩ブロッキングする。
２．各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを１回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
３．プレートのレイアウトに従い、５０μＬの溶解物を加える。溶解物の溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし、室温で３００〜５００ｒｐｍで１時間振盪させる。
４．各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
５．各ウェルに、１％（ｗ／ｖ）Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで０．５μｇ／ｍＬに希釈した抗ＢＴＫ抗体ＢＤ６１１１１７を２５μＬ加える。シールし室温で１時間振盪する。
６．各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
７．各ウェルに、１％（ｗ／ｖ）Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで１μｇ／ｍＬに希釈したＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ複合抗マウス抗体を２５μＬ加える。プレートをシールし室温で１時間振盪する。
８．ウェル当たり１５０μＬ以上の１ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
９．各ウェルに１５０μＬの２ｘ読み取り緩衝液Ｔ（Ｈ２Ｏに希釈）を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをＳＩ２４００で読み取る。
【０２５０】
結果：
最適化実験の結果を図１７に示す。
【０２５１】
プローブ濃度２５ｎＭまでの陰性対照（ＤＯＨＨ２＋１μＭ  ＰＣＩ）サンプルに関しては、バックグラウンドは低い。
【０２５２】
プローブ濃度２５ｎＭを超えるとバックグラウンドは上昇する。この現象に関する１つの可能性のある説明には、プローブのみのときにゲルベースアッセイ及び／又はシグナル寄与で見られる通り、溶解物中の、同様にプローブにより高プローブ濃度で標識されたその他のタンパク質に由来するシグナルが寄与するというものがある。
【０２５３】
過剰なプローブが存在するとき、陽性対照（未処理ＤＯＨＨ２）に関し、プローブ濃度を２５ｎＭまで増加させるに伴いシグナルは増加し、この濃度を超えると、シグナルは減少するか又はプラトーに達する。
【０２５４】
最終プローブ濃度は２５ｎＭが推奨される。
【０２５５】
実験３：薬剤滴定による阻害
目的：一連のＰＣＩ滴定と、それに続いて最終プローブ濃度２５ｎＭでプローブを用いることによる溶解物の標識により、阻害実験を実施する。
【０２５６】
サンプル：
陽性対照：アッセイ緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ  ＤＯＨＨ２溶解物
陰性対照：アッセイ緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ  Ｊｕｒｋａｔ溶解物
溶解物を、アッセイ緩衝液で３００、１５０、及び７５μｇ／ｍＬに希釈する。
【０２５７】
ＰＣＩの希釈系列を調製する。１００ｘ  ＰＣＩ濃度は、１００、２５、６．２５、１．５６、０．３９、０．０９及び０．０２μＭである。
【０２５８】
ポリプロピレンプレート中で、ＤＯＨＨ２溶解物をＰＣＩにより処理する（例えば、１００μＬ溶解物＋１μＬ  １００ｘ  ＰＣＩ溶液）。
【０２５９】
ＰＣＩ阻害剤にプローブを加えて、全てのサンプルを最終濃度２５ｎＭ（２μＬ  １．２５μＭプローブストック＋１００μＬサンプル）とし、振盪しながらインキュベートする。
【０２６０】
プロトコル：
１．ＭＳＤ標準ストレプトアビジンプレートを、ウェル当たり１５０μＬの３％  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａにより室温で１時間又は４℃で一晩ブロッキングする。
２．各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを１回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
３．プレートのレイアウトに従い、３０μＬの溶解物を加える。溶解物の溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし室温で１時間振盪する。
４．各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
５．各ウェルに、１％（ｗ／ｖ）Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで０．５μｇ／ｍＬに希釈した抗ＢＴＫ抗体ＢＤ６１１１１７を２５μＬ加える。シールし室温で１時間振盪する。
６．各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。各ウェルに、１％（ｗ／ｖ）Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで１μｇ／ｍＬに希釈したＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ複合抗マウス抗体を２５μＬ加える。プレートをシールし室温で１時間振盪する。
７．ウェル当たり１５０μＬ以上の１ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
８．ウェル当たり１５０μＬの１ｘ読み取り緩衝液Ｔ（Ｈ２Ｏに希釈）を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをＳＩ２４００で読み取る。
【０２６１】
結果：
結果を図１８〜１９に示す。
【０２６２】
プローブで標識した陰性対照Ｊｕｒｋａｔ溶解物のシグナルは、試験した全ての条件に関し、バックグッラウンド程度に留まった。
【０２６３】
一連のＰＣＩ滴定で処理した後２５ｎＭプローブで標識した陽性対照ＤＯＨＨ２溶解物に関しては、用量依存性のシグナル減少が観察された。
【０２６４】
ＰＣＩ阻害プロファイルは、試験した全３種のＤＯＨＨ２溶解物濃度（３００、１５０及び７５μｇ／ｍＬ）に関し同等であり、参照のゲルベースアッセイに対し同等であった。
【０２６５】
アッセイでは、試験した全ての溶解物濃度で大型のシグナルウインドウを提供する。
【０２６６】
【表５】
2015536446.tif 000018
【０２６７】
アッセイの再現性は非常に良好であり、平均ＣＶ％は＜５％であった。本アッセイは、高い特異性（陰性対照とは良好に区別される）、感度（ウェスタンブロット法と比較して溶解物の使用が少ない（５０μｇに対して０．６μｇ））及び効率（必要とされるプローブがゲルベースフォーマットよりも少ない（２．５μＭに対して２５ｎＭ））を可能にした。
【０２６８】
実施例２．タンパク質占有率アッセイプロトコル
代替的なタンパク質占有率アッセイプロトコルを提供する。
１．最終濃度２５ｎＭとなるよう、アッセイ緩衝液中サンプルにプローブを加え（２μＬの１．２５μＭプローブストック＋１００μＬサンプル）、振盪しながらインキュベートする。
２．ＭＳＤ標準ストレプトアビジンプレートを、ウェル当たり１５０μＬの３％  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａにより室温で１時間又は４℃で一晩ブロッキングする。
３．各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを１回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
４．各ウェルに３０μＬの溶解物を加える。溶解物の溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし室温で１時間振盪する。
５．各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
６．各ウェルに、１％（ｗ／ｖ）Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで０．５μｇ／ｍＬに希釈した抗ＢＴＫ抗体ＢＤ６１１１１７又はＢＤ６１１１１６を２５μＬ加える。シールし室温で１時間振盪する。
７．各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。各ウェルに、１％（ｗ／ｖ）Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで１μｇ／ｍＬに希釈したＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ複合抗マウス抗体を２５μＬ加える。プレートをシールし室温で１時間振盪する。
８．ウェル当たり１５０μＬ以上の１ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
９．各ウェルに１５０μＬの１ｘ読み取り緩衝液Ｔ（Ｈ２Ｏに希釈）を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをＳＩ２４００で読み取る。
【０２６９】
必要に応じて、次のパラメーターを更に最適化できる（例えば、抗ＢＴＫ検出抗体の濃度、ＭＳＤ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗マウス二次検出抗体の濃度、又は１回のインキュベーション工程において抗ＢＴＫ検出抗体とＭＳＤ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗マウス二次検出抗体を組み合わせること）。
【０２７０】
実施例３．選択されたビオチン化プローブの抗タンパク質抗体コートプレート及びストレプトアビジンコートプレートアッセイフォーマットにおける比較
抗タンパク質抗体コートプレート又はストレプトアビジンコートプレートアッセイフォーマットのいずれかを使用し、選択されたビオチン化プローブを、標的占有率アッセイにおける使用に関し試験した。次のプローブを試験した：
化合物Ｉ−１，ＭＷ＝８０８．０１（合計８０ｍｇ）
化合物Ｉ−２，ＭＷ＝７９３．３８（合計６０ｍｇ）
化合物Ｉ−３，ＭＷ＝７８０．９８（合計３２ｍｇ）
化合物Ｉ−４，ＭＷ＝７６６．９５（合計２７ｍｇ）
化合物Ｉ−５，ＭＷ＝１０９７．３７（合計２４ｍｇ）
試験したプローブの構造を図２１に示す。
【０２７１】
プローブの原液（５ｍＭ及び１０ｍＭ）は次の通りに調製した。化合物Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３、及びＩ−４に関しては、プローブ２又は４ｍｇを５００μＬ  ＤＭＳＯに加え、化合物Ｉ−５に関しては、１２又は２４ｍｇを２．２ｍＬ  ＤＭＳＯに加え、１００μＬに分注した。５０ｘプローブアッセイに関しては、アッセイ当日に新しく調製した：１μＬの５ｍＭプローブを３９μＬ  ＰＢＳに加えた。
【０２７２】
アッセイには次の試薬を採用した：ＢＴＫ抗体：ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６１１１１７；二次抗体：ヤギ抗マウスＨＲＰ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＳＣ−２３０２；ストレプトアビジン−ＨＲＰ、Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号２１１３０、０．５ｍＬ、１−ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号３４０２８、２５０ｍＬ；停止液：０．１６Ｍ  Ｈ２ＳＯ４、Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号Ｎ６００、５５ｍＬ；ストレプトアビジンコートプレート：Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号１５５００、５枚；ＤＯＨＨ２対照溶解物；洗浄緩衝液：０．０５％  ＰＢＳＴ；１％  ＢＳＡ。
【０２７３】
以降のプロトコルに従い検量線を作成した。
１）５０ｘプローブを５０μＬ溶解物に加え（１ｕｇ／μｌ）、３７℃で１時間インキュベートする。
２）ストレプトアビジンコートプレートを１％  ＢＳＡにより室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄する。
３）サンプルを氷上に移し１０分間反応を停止させた後、室温に戻す。
４）プローブ標識したＤＯＨＨ２溶解物の希釈系列を調製する。１％  ＢＳＡを用いて５００μＬとし、１ｕｇ、０．５μｇ、０．２５ｕｇ、１２５ｎｇ、６２．５ｎｇ、３１．２５ｎｇ、１５．６ｎｇ／μＬの順に調製する。
５）プローブ処理した溶解物１００μＬを各ウェルに三つ組で加える。
６）室温で２時間インキュベートする。
７）ＰＢＳＴで７回洗浄する。
８）二次抗体−ＨＲＰを加え、室温で１時間インキュベートする。
９）２００μＬ  ＰＢＳＴで５回洗浄する。
１０）１００μＬ  ＴＭＢを加え、室温で１５分間インキュベートする。
１１）５０μＬ  停止液を加える。
１２）４５０ｎｍで読み取る。
【０２７４】
プロトコルフォーマット１：（ストレプトアビジンコートプレート）
１）最終用量（５００μＬ）になるよう、溶解物をＰＢＳにより所望の濃度に希釈する。
２）ビオチン化プローブ（最終濃度２．５μＭ）を溶解物に加え、３７℃で１時間置く。
３）ストレプトアビジンプレートを１％  ＢＳＡで室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄する。
４）サンプルを氷上に移し１０分間反応を停止させた後、室温に戻す。
５）１００ｕＬ処理溶解物（三つ組）をストレプトアビジンプレートに加え、室温で２時間静置する。
６）２００μＬ  ＰＢＳＴで５回洗浄する。
７）１００μＬ二次抗体−ＨＲＰを加え、室温で１時間インキュベートする。
８）２００μＬ  ＰＢＳＴで３回洗浄する。
９）１００μＬ  ＴＭＢを加え、室温で１０分間インキュベートする。
１０）５０μＬ停止液を加える。
１１）４５０ｎｍで読み取る。
【０２７５】
プロトコルフォーマット２：（ＢＴＫ抗体をコートしたプレート）
１）９６ウェルプレートを、１００μＬ抗ＢＴＫ（１：１０００ＰＢＳ）で４℃で一晩コートする。
２）プレートをＰＢＳＴで５回洗浄する。
３）プレートを固定して、室温で１時間ブロッキングし、ＰＢＳＴで３回洗浄する。
４）最終用量（５００μＬ）になるよう、溶解物をＰＢＳにより所望の濃度に希釈する。
５）ビオチン化プローブ（最終濃度２．５μＭ）を溶解物に加え、３７℃で１時間置く。
６）サンプルを氷上に移し１０分間反応を停止させた後、室温に戻す。
７）１００μＬ処理溶解物（三つ組）をストレプトアビジンプレートに加え、室温で２時間静置する。
８）２００μＬ  ＰＢＳＴで５回洗浄する。
９）ストレプトアビジン−ＨＲＰを加え、固定して室温で１時間インキュベートする。
１０）２００μＬ  ＰＢＳＴで３回洗浄する。
１１）１００μＬ  ＴＭＢを加え、室温で１５分間インキュベートする。
１２）５０μＬ停止液を加える。
１３）４５０ｎｍで読み取る。
【０２７６】
結果：
高及び低プローブ濃度ストレプトアビジンアッセイに関し、各種プローブを比較する占有率アッセイから得られた結果を、図２２に示す。データは、アッセイに使用したプローブの中では、化合物Ｉ−５が、ＢＴＫに対する結合に関し最も高いシグナルを示したことを示す。
【０２７７】
実施例４．化合物Ｉ−５及び親化合物イブルチニブのキナーゼ阻害剤活性の比較
Ｎａｎｏｓｙｎにより実施された標準キナーゼ阻害アッセイを用い、化合物Ｉ−５のＴＥＣファミリーキナーゼ及び相同性チロシンキナーゼ阻害能を生体外でアッセイした。次の表４に従い以降のキナーゼをアッセイした。
【０２７８】
【表６】
2015536446.tif 000019
【０２７９】
１２ｐｔ（３倍希釈）用量反応フォーマットを使用して、化合物を１つ組で試験した。最大濃度は１０ｍＭ又は１ｍＭとした。
【０２８０】
結果を表５に示す。データは、プローブの化合物Ｉ−５がＴＥＣファミリーキナーゼ阻害に関し示したＩＣ５０プロファイルが、親化合物のイブルチニブと類似することを示す。
【０２８１】
【表７】
2015536446.tif 000020
【０２８２】
実施例５．総ＢＬＫタンパク質アッセイの開発
本実験では、臨床サンプル中の総ＢＬＫをＭＳＤプラットフォームで定量するためのサンドウィッチイムノアッセイ法を開発するために、抗ＢＬＫ抗体を選別する方法を示すことを目的とした。
【０２８３】
選別にはＭＳＤ  ＥＬＩＳＡ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｐａｃｋ  Ｉ（カタログ番号Ｋ１５Ａ０１−１）を使用した。このキットには、９６ウェル高結合プレート、９６ウェル標準プレート、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒ（１５０ｎｍｏｌｅ）、４  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識ストレプトアビジン（５０μｇ）、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識抗マウス抗体（５０μｇ）、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識抗ウサギ抗体（５０μｇ）、Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａキット（１Ｌ）、ブロッキング剤Ｂ（２ｇ）、読み取り緩衝液Ｔ  ４Ｘ（２００ｍＬ）が含まれる。
【０２８４】
次のＢＬＫ抗体を試験した。
【０２８５】
【表８】
2015536446.tif 000021
【０２８６】
溶液：
ブロッキング溶液：１ｘ  ＰＢＳ中３％（ｗ／ｖ）ＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ：３ｇ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ＋１００ｍＬ  ＰＢＳ４℃で最大１４日間保管する。
洗浄緩衝液：ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）
捕捉抗体希釈緩衝液：ＰＢＳ（Ｃａ２＋及びＭｇ２＋不含有）
捕捉抗体：捕捉抗体希釈緩衝液で各抗体の４μｇ／ｍＬ溶液１ｍＬを調製する。
検出抗体希釈緩衝液：１ｘ  ＰＢＳ中１％  ＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ：１０ｍＬブロッキング溶液＋２０ｍＬ  １ｘ  ＰＢＳ
検出抗体：１％  ＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ／１ｘ  ＰＢＳで、各抗体の２μｇ／ｍＬ  溶液１〜２ｍＬを調製する。
ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識二次抗体：それぞれ１μｇ／ｍＬの抗マウス及び抗ウサギＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗体の、１％  ＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ／１ｘ  ＰＢＳを３ｍＬ調製する。
読み取り緩衝液：１ｘ  ＭＳＤ読み取り緩衝液Ｔ：プレート毎に５ｍＬ  ４ｘ読み取り緩衝液Ｔ＋１５ｍＬ  Ｈ２Ｏを反転混和し、ボルテックス処理はしない。
標準法：１％  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａを用い、組み換え型ＢＬＫの１０μｇ／ｍＬ原液を調製する。次に、検量線用に以降の希釈液を調製する。それぞれの希釈には新しいチップを使用する。それぞれの希釈後に十分にボルテックスする。
【０２８７】
方法：
実験１
目的：更なるアッセイ構築のための好適な抗体対を特定するために抗体を選別する。
【０２８８】
プロトコル：
１．ＭＳＤ高結合プレート及び標準プレートのそれぞれを、プレートレイアウトの通りにウェル当たり２５μＬの捕捉抗体溶液（４μｇ／ｍＬ）で溶液コートする（工程１）。ウェルの隅に抗体溶液を加え、プレートを優しく叩いて液体を均一に分散させ、プレートをシールし、振盪はせずに４℃で一晩インキュベートする。
２．翌日、プレートの中身を除去し、ウェル当たり１５０μＬのブロッキング溶液（３％［ｗ／ｖ］Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ）を加える。シールし、室温で１時間以上振盪しながらインキュベートする。
３．ウェル当たり１５０μＬ以上のＰＢＳ−Ｔによりプレートを１回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
４．プレートレイアウトに従い、２５μＬの希釈した組み換えタンパク質を加える（工程２）。溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし、室温で３００〜５００ｒｐｍで１〜２時間振盪させる。
５．ウェル当たり１５０μＬ以上のＰＢＳ−Ｔによりプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
６．プレートレイアウトに従い、２５μＬ検出抗体溶液を加える（工程３）。抗体溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし、室温で３００〜５００ｒｐｍで１時間振盪させる。
７．ウェル当たり１５０μＬ以上のＰＢＳ−Ｔによりプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
８．２５μＬのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗種検出抗体を１μｇ／ｍＬ検出抗体希釈液に希釈し、工程３のプレートレイアウトに従い加える。プレートをシールし、室温で３００〜５００ｒｐｍで３０分間振盪させる。
９．ウェル当たり１５０μＬ以上のＰＢＳ−Ｔによりプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
１０．ウェル当たり１５０μＬの１ｘ読み取り緩衝液Ｔ（Ｈ２Ｏに希釈）を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをＳＩ２４００で直接読み取る。
【０２８９】
結果：
それぞれの抗体対の生シグナルを図２３に示す。それぞれの抗体対のバックグラウンドに対するシグナル（Ｓ／Ｂ）を図２４に示す。Ｈ０００００６４０−Ｍ０２で最も高いＳ／Ｂ比が観察された。ＢＬＫ用の４種の抗体対に関し、タンパク質濃度に伴う、シグナル及びＳ／Ｂの良好な定量が観察された。総ＢＬＫアッセイを更に最適化するために、抗体対（捕捉用としてＡＦ２６７９、及び検出用としてＨ０００００６４０−ＭＯ２）及び最も高いＳ／Ｂ比を有する配向（orientation）を選別した。標準プレートでは、同様の抗体対、高Ｓ／Ｂ比が観察された。
【０２９０】
実験２
目的：
１）捕捉抗体としてＡＦ２６７９、及び検出抗体としてＨ０００００６４０−Ｍ０２を使用し、ＢＬＫアッセイのためのアッセイ条件を構築する。
２）ＢＬＫの発現について、陽性（ＤＯＨＨ２）及び陰性（Ｊｕｒｋａｔ）細胞溶解物を試験する。
【０２９１】
製造元の指示書に従い、抗体をＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）ＮＨＳ  Ｅｓｔｅｒに複合させる。
【０２９２】
プロトコル：
１．ＭＳＤ標準プレートを、プレートレイアウトの通りにウェル当たり２５μＬの捕捉抗体溶液（４μｇ／ｍＬ）で溶液コートする。ウェルの隅に抗体溶液を加え、プレートを優しく叩いて液体を均一に分散させ、プレートをシールし、振盪はせずに４℃で一晩インキュベートする。２．翌日、プレートの中身を除去し、ウェル当たり１５０μＬのブロッキング溶液（５％［ｗ／ｖ］Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ）を加える。シールし、室温で１時間以上振盪しながらインキュベートする。
３．ウェル当たり１５０μＬ以上のＰＢＳ−Ｔによりプレートを１回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
４．プレートレイアウトに従い、２５μＬの希釈した組み換えタンパク質を加える。溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし、室温で３００〜５００ｒｐｍで１〜２時間振盪させる。
５．ウェル当たり１５０μＬ以上のＰＢＳ−Ｔによりプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
６．プレートレイアウトに従い２５μＬ検出抗体溶液を加える。抗体溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし、室温で３００〜５００ｒｐｍで１時間振盪させる。
７．ウェル当たり１５０μＬ以上のＰＢＳ−Ｔによりプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
８．プレート２の各ウェルに１ｘ読み取り緩衝液Ｔ（Ｈ２Ｏに希釈）１５０μＬを加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをＳＩ２４００で直接読み取る。
９．２５μＬのＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ抗種検出抗体を１μｇ／ｍＬ検出抗体希釈液に希釈し、プレートレイアウトに従いプレート１に加える。プレートをシールし、室温で３００〜５００ｒｐｍで３０分間振盪させる。
１０．ウェル当たり１５０μＬ以上のＰＢＳ−Ｔによりプレート１を３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
１１．ウェル当たり１５０μＬの１ｘ読み取り緩衝液Ｔ（Ｈ２Ｏに希釈）を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをＳＩ２４００で直接読み取る。
【０２９３】
結果：
アッセイの生シグナルを図２５に示す。本アッセイのバックグラウンドに対するシグナル（Ｓ／Ｂ）を図２６に示す。ＢＬＫアッセイは、タンパク質濃度に伴うシグナル定量を示す。１μｇ／ｍＬ捕捉抗体及び０．５μｇ／ｍＬ検出抗体を使用して、組み換え型ＢＬＫタンパク質のシグナル値を図２７にプロットする。細胞溶解物中のＢＬＫに関し、陽性対陰性比を以降の表に示す。
【０２９４】
【表９】
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【０２９５】
１μｇ／ｍＬ捕捉抗体（ＡＦ２６７９、Ｒ＆Ｄ）及び０．５μｇ／ｍＬ（Ｈ０００００６４０−ＭＯ２、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）検出抗体を用いるＢＬＫアッセイでは、最大４６倍までのシグナルウインドウを観察した。アッセイのダイナミックレンジは３．５ｌｏｇまでであることが明らかであることが分かる。一部最適化した条件を使用した細胞溶解物では、ＢＬＫに関して約２倍のＰ／Ｎ比が観察された。
【０２９６】
実施例６：ＩＴＫ及びＢＬＫタンパク質占有率アッセイ
ＭＳＤストレプトアビジンプレートでのＩＴＫ及びＢＬＫ占有率アッセイに必要とされるプローブを最適化すること、及び溶解物の薬剤処理を用いアッセイ性能を実証することをこの実験の目的とした。アッセイの目的は、以降「薬剤」として参照する共有結合阻害剤の結合していないＩＴＫ及びＢＬＫの相対量を定量することである。「プローブ」は、長鎖リンカーによりビオチンに結合させた薬剤からなる。プローブによるサンプル標識は、製剤により占有されないＩＴＫ及びＢＬＫの検出を可能にする。ＢＴＫについてこれまでに首尾よく使用されてきたアッセイフォーマットは、ストレプトアビジンプレート上で、プローブ標識されたタンパク質を補足し、抗タンパク質抗体を使用し検出を行うものである。ＩＴＫ及びＢＬＫ占有率アッセイと類似のフォーマットを試験した。
【０２９７】
材料：
標準ストレプトアビジンプレート（５パック）カタログ番号Ｌ１５ＳＡ−２、読み取り緩衝液Ｔ（５０ｍＬ）カタログ番号Ｒ９２ＴＣ−３、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧヤギ抗マウス（５０μｇ）カタログ番号Ｒ３２ＡＣ−５、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧヤギ抗ウサギ（５０μｇ）カタログ番号Ｒ３２ＡＢ−５、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧストレプトアビジン（５０ｕｇ）カタログ番号Ｒ３２ＡＤ−５、ＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａカタログ番号Ｒ９３ＡＡ−２、プロテアーゼ阻害剤カクテル（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ／Ｐｉｅｒｃｅ  Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテルＥＤＴＡ不含カタログ番号８７７８５又はＲｏｃｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｔａｂｌｅｔ、カタログ番号１８３６１７０）、ＩＴＫ及びＢＬＫ発現細胞株由来の陽性対照溶解物細胞株（ＤＯＨＨ２及びＪＵＲＫＡＴ）、陰性対照溶解物（ＴＨＰ−１細胞）、ＢＬＫ、ＩＴＫ阻害薬剤イブルチニブ「ＰＣＩ」；ビオチン化プローブ化合物Ｉ−５「プローブ」。
【０２９８】
溶液：
ブロッキング溶液：３％（ｗ／ｖ）ＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ／１ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液：３ｇ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ＋１００ｍＬ  １ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液４℃で最大１４日間保管する。ＰＢＳ−Ｔでブロッキング溶液も調製できる。
洗浄緩衝液：１ｘ  ＭＳＤ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液：５０ｍＬ  １０ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液＋４５０ｍＬ  Ｈ２Ｏ（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）／０．０２％  Ｔｗｅｅｎ−２０）洗浄緩衝液としてはＰＢＳ−Ｔも使用できる。
検出抗体希釈緩衝液：１％  ＭＳＤ  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａ／１ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液：１０ｍＬブロッキング溶液＋２０ｍＬ  １ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液又は１０ｍＬブロッキング溶液＋２０ｍＬ  ＰＢＳ−Ｔ
読み取り緩衝液：１ｘ  ＭＳＤ読み取り緩衝液Ｔ：プレート毎に５ｍＬ  ４ｘ読み取り緩衝液Ｔ＋１５ｍＬ  Ｈ２Ｏ
細胞溶解物：複数回凍結融解させた細胞ペレットをＰＢＳ＋プロテアーゼ阻害剤に再懸濁することにより溶解物を調製した。
アッセイ緩衝液：１％  ｂｌｏｃｋｅｒ／Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液＋プロテアーゼ阻害剤
【０２９９】
実験１−プローブ濃度の最適化
目的：必要とされる最適プローブ濃度を決定し、異なるプローブ：溶解物比で比較する
【０３００】
サンプル：
陽性対照：ＤＯＨＨ２及びＪｕｒｋａｔ細胞溶解物
陰性対照：１ｕＭ  ＰＣＩで処理したＤＯＨＨ２及びＪｕｒｋａｔ細胞
【０３０１】
ＤＯＨＨ２のみ、及びＤＯＨＨ２＋ＰＣＩ溶解物を、アッセイ緩衝液により６００；３００；１５０；７５；３７．５；１８．７５ｕｇ／ｍＬに希釈する。
【０３０２】
プローブを、６０００；１５００；３７５；９３．８；２３．４；５．９、及び１．５ｎＭ（５０×濃度）に希釈する。
【０３０３】
９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて、１μＬ  １００ｘプローブを５０μＬ希釈溶解物に加え、インキュベートする。
【０３０４】
プロトコル：
１）Ｂｌｏｃｋ  ＭＳＤプレートを、９００ｒｐｍで振盪しながら室温で１〜３時間、１５０μＬ  ３％  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａでブロッキングする。
２）９６ウェルポリプロピレンプレートにおいて、５０ｕＬ用量で、定量したタンパク質溶解物と定量したプローブとを、振盪しながら１時間インキュベートする。
３）ＭＳＤプレートを洗浄緩衝液で２回洗浄する。
４）それぞれのプレートレイアウトの通りにプローブ溶解混合物３０ｕＬをＭＳＤプレートに移し、１時間インキュベートする。
５）プレートを１５０μＬ洗浄緩衝液で３回洗浄する。
６）１％  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで２ｕｇ／ｍＬに希釈した２５ｕＬの抗ＢＬＫ又は抗ＩＴＫ抗体を加える。９００ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間インキュベートする。
７）プレートを１５０μＬ洗浄緩衝液で３回洗浄する。
８）１％  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで１ｕｇ／ｍＬに希釈した２５ｕＬ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識抗ウサギ抗体を加える。９００ｒｐｍで振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
９）プレートをＭＳＤ洗浄緩衝液で３回洗浄し、１５０μＬ  １ｘ読み取り緩衝液を加え、ｓｅｃｔｏｒイメージャーで直接読み取る。
【０３０５】
結果：
ＢＬＫ及びＩＴＫプローブアッセイの結果を図２８に示す。ＢＴＫ及びＩＴＫアッセイの両方に関し、シグナルは、使用した溶解物中のタンパク質濃度により定量されることが観察された。陽性対照の溶解物に関しては、プローブ濃度の増加に伴いシグナルは増加し、約３０ｎＭ超でプラトーに達する。陰性対照（細胞溶解物＋薬剤）サンプルに関しては、１２０ｎＭプローブでも上昇は非常に僅かであり、バックグラウンドシグナルは低い。以降の実験に関してはプローブ濃度は５０ｎＭが推奨された。
【０３０６】
実験２：薬剤による阻害を定量するシリーズ（Series）
目的：一連の薬剤を定量し、次に溶解物を５０ｎＭプローブで標識して、阻害実験を実施する
【０３０７】
サンプル：
陽性対照：ＤＯＨＨ２及びＪｕｒｋａｔ溶解物（アッセイ緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ）
陰性対照：ＴＨＰ−１溶解物（アッセイ緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ）
【０３０８】
溶解物を、アッセイ緩衝液で５００、２５０及び１２５μｇ／ｍＬに希釈する。
【０３０９】
ＰＣＩの希釈系列を調製する。１００ｘ  ＰＣＩ濃度は、１００、２５、６．２５、１．５６、０．３９、０．０９μＭとする；ポリプロピレンプレートにおいて、溶解物をＰＣＩにより１時間処理する（例えば、１００μＬ溶解物＋１μＬ  １００ｘ  ＰＣＩ溶液）；ＰＣＩ阻害後に全てのサンプルにプローブを加え、最終濃度５０ｎＭとし、振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
【０３１０】
プロトコル：
１）ＭＳＤ標準ストレプトアビジンプレートを、ウェル当たり１５０μＬの３％  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａにより室温で１時間又は４℃で一晩ブロッキングする。
２）各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを１回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
３）プレートのレイアウトに従いプローブ標識溶解物３０μＬを加える。溶解物の溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし室温で１時間振盪する。
４）各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
５）各ウェルに、１％（ｗ／ｖ）Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで２μｇ／ｍＬに希釈した抗ＩＴＫ抗体を２５μＬ加える。シールし、９００ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間インキュベートする。
６）各ウェルに、１％（ｗ／ｖ）Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで２μｇ／ｍＬに希釈したＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ複合抗種抗体を２５μＬ加える。プレートをシールし室温で１時間振盪する。
７）ウェル当たり１５０μＬ以上の１ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
８）ウェル当たり１５０μＬの１ｘ読み取り緩衝液Ｔ（Ｈ２Ｏに希釈）を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをＳＩ２４００で読み取る。
【０３１１】
結果：
ＩＴＫプローブアッセイの結果を、以下の図２９及び表８に示す。全ての薬剤濃度において、観察された陰性対照細胞株ＤＯＨＨ２のシグナルはバックグラウンド程度であった。薬剤処理陽性対照のＪｕｒｋａｔ細胞溶解物は、薬剤濃度の増加に伴いシグナルの低下を示した。阻害率（％）は使用した溶解物濃度と関連しなかった。アッセイの再現性は非常に良好であり、平均ＣＶ％は＜５％であった。
【０３１２】
【表１０】
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【０３１３】
実験３：ＰＢＭＣ溶解物におけるＩＴＫ阻害の反復性
目的：一連の薬剤を定量し、次に溶解物を５０ｎＭプローブで標識して、阻害実験を実施する。
【０３１４】
サンプル：
陽性対照：ＤＯＨＨ２、Ｊｕｒｋａｔ及びＰＢＭＣ溶解物（アッセイ緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ）
陰性対照：ＴＨＰ−１溶解物（アッセイ緩衝液中１ｍｇ／ｍＬ）
【０３１５】
溶解物を、アッセイ緩衝液で５００；２５０及び１２５μｇ／ｍＬに希釈する。
【０３１６】
ＰＣＩの希釈系列を調製する。１００ｘ  ＰＣＩ濃度は、１００、２５、６．２５、１．５６、０．３９、０．０９μＭとする；ポリプロピレンプレートにおいて、溶解物をＰＣＩにより１時間処理する（例えば、１００μＬ溶解物＋１μＬ  １００ｘ  ＰＣＩ溶液）；ＰＣＩ阻害後に全てのサンプルにプローブを加え、最終濃度５０ｎＭとし、振盪しながら室温で１時間インキュベートする。
【０３１７】
プロトコル：
１）ＭＳＤ標準ストレプトアビジンプレートを、ウェル当たり１５０μＬの３％  Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａにより室温で１時間又は４℃で一晩ブロッキングする。
２）各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを１回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
３）プレートのレイアウトに従いプローブ標識溶解物３０μＬを加える。溶解物の溶液をウェル底部の隅に配置する。プレートをシールし室温で１時間振盪する。
４）各ウェル１５０μＬ以上の洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
５）各ウェルに、１％（ｗ／ｖ）Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで２μｇ／ｍＬに希釈した抗ＩＴＫ抗体を２５μＬ加える。シールし、９００ｒｐｍで振盪しながら室温で２時間インキュベートする。
６）プレートを１５０μＬ洗浄緩衝液で３回洗浄する。
７）各ウェルに、１％（ｗ／ｖ）Ｂｌｏｃｋｅｒ  Ａで２μｇ／ｍＬに希釈したＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ複合抗種抗体を２５μＬ加える。プレートをシールし室温で１時間振盪する。
８）ウェル当たり１５０μＬ以上の１ｘ  Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液を用いプレートを３回洗浄する。プレートを軽く叩いて中身を除去し、乾燥させる。
９）ウェル当たり１５０μＬの１ｘ読み取り緩衝液Ｔ（Ｈ２Ｏに希釈）を加える。気泡の混入は避ける−読み取り緩衝液を加えるときにはリバースピペッティングを用いる。プレートをＳＩ２４００で読み取る。
【０３１８】
結果：
ＩＴＫプローブアッセイの結果を、以下の図３０及び表９に示す。ＰＢＭＣ溶解物では用量依存性のＩＴＫシグナルの減少が観察されたことから、薬剤によるＰＢＭＣ溶解物におけるＩＴＫ阻害が示唆される。ＩＴＫアッセイの再現性は非常に良好であり、こちらもＣＶ％＜５％であった。
【０３１９】
【表１１】
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【０３２０】
実施例７：ＩＴＫタンパク質占有率アッセイ
電気化学的刺激に基づくＥＬＩＳＡ  ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ  ＩＴＫプローブアッセイを使用して、イブルチニブの結合していないＩＴＫの相対量を定量することもできるであろう。イブルチニブは、ＩＴＫの活性部位に結合し、システイン残基（ＩＴＫ−Ｃｙｓ４４２）とのジスルフィド結合を形成する。化合物Ｉ−５は、長鎖リンカーによりビオチンに結合しているイブルチニブからなるプローブである。回収したタンパク質溶解物を化合物Ｉ−５により標識する。プローブによるサンプル標識は、薬剤により占有されないＩＴＫの検出を可能にする。ＩＴＫと複合しているプローブ（及び複合していないプローブ）をストレプトアビジン（ＳＡ）プレートにより捕捉し、次にマウス抗ＩＴＫ（ＢＤ番号５５０５０３）及びＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ複合抗マウス抗体（ＭＳＤ、カタログ番号Ｒ３２ＡＣ−５）とともにインキュベートする。各ウェルにおいて電極で電気化学的な刺激を開始し、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ標識を発光させ、シグナルを測定する。より大きいシグナルはサンプルのＩＴＫ部位がより未占有であることと相関する一方、より小さいシグナルはＩＴＫ部位がよりイブルチニブにより占有されていることと相関する。
【０３２１】
ＩＴＫ占有率のベースラインは、添加前第１サイクル第１日目のサンプルに設定し、規定の時点でのＩＴＫ占有率はベースラインの値をもとに算出した。この割合を薬力学的な結果として利用し、異なる投与量の患者コホート間で比較した。イブルチニブ投与コホートと、ＩＴＫ占有率との間の関係を定義した。
【０３２２】
イブルチニブの第ＩＩ相臨床試験下のＣＬＬ患者におけるＩＴＫ占有率を決定した。サンプルは、イブルチニブ投与の直前、及び連日経口投与（４２０ｍｇ／ｄａｙ）の８日後に試験した。ＰＢＭＣを回収し、４回凍結融解し溶解させた。最後の融解後、細胞を４℃で１６，０００ｇで１０分間遠心分離し、不溶性材料をペレット化した。タンパク質溶解物にプロテアーゼ阻害剤を添加し、タンパク質溶解物を薬剤のビオチン化誘導体、化合物Ｉ−５、により室温で１時間標識し、ブロッキング溶液で１時間ブロッキングしたストレプトアビジンコートプレート（ＭＳＤ、カタログ番号Ｌ１５ＳＡ−２）に入れた。インキュベートの１時間後、プレートを３回洗浄し、続いてマウス抗ＩＴＫ（ＢＤ番号５５０５０３）で更に１時間インキュベートした。プレートを３回洗浄し、ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ複合抗マウス抗体（ＭＳＤ，カタログ番号Ｒ３２ＡＣ−５）により１時間インキュベートし、洗浄し、製造元の指示書に従いＳＩ２４００で３分間読み取りした。４０及び８０％  ＩＴＫ間のデータにより、生体外で得られたものに類似する、イブルチニブによる共有結合が明らかとなった。
【図１】
2015536446.tif 000031
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2015536446.tif 000040
【図１１】
2015536446.tif 000041
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
2015536446.tif 000049
【図２０】
2015536446.tif 000050
【図２１】
2015536446.tif 000051
【図２２】
2015536446.tif 000052
【図２３】
2015536446.tif 000053
【図２４】
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【図２５】
2015536446.tif 000055
【図２６】
2015536446.tif 000056
【図２７】
2015536446.tif 000057
【図２８】
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【図２９】
2015536446.tif 000059
【図３０】
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【国際調査報告】
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