(57)【要約】  Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路の破壊を介して哺乳類にて卵胞を刺激するための方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類の卵胞を刺激する方法であって、
哺乳類の卵胞の発育及び発達を刺激するのに十分な用量及び時間、Ｈｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤の少なくとも一方の有効用量に哺乳類の卵胞を接触させることを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
卵胞が無処置の卵巣に存在することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
接触工程が生体内で行われることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
接触が試験管内で行われることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
卵胞がヒトの卵胞であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
剤がアクチンの重合を高めることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
剤がジャスプラキノリドであることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
剤がスフィンゴシン−１−リン酸受容体調節因子であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
剤がスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
剤がフィンゴリモドであることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
剤がリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
剤がＣＣＮ２、３、５及び６から選択されるＣＣＮタンパク質であることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
卵胞を１時間から４日間までの期間で接触させることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
接触工程に続いて、卵母細胞の成熟を誘導するのに有効な用量及び時間で卵胞をＦＳＨ又はその類似体に接触させる工程を実施することをさらに含むことを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
接触工程に続いて、卵胞を回収する工程を実施することをさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項１６】
活性化された卵胞の生体内レシピエントへの移植をさらに含むことを特徴とする請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
移植に続いて前記レシピエントにＦＳＨ又はその類似体を投与することをさらに含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
レシピエントが卵胞に対して自己であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
移植に続いて前記レシピエントにＬＨアゴニストを投与することをさらに含むことを特徴とする請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記接触工程がさらに、ＰＴＥＮ阻害因子及びＰＩ３Ｋ活性化因子の少なくとも一方の有効用量に卵胞を接触させることを含むことを特徴とする請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
哺乳類の生殖細胞の発育及び成熟は、下垂体前葉によって分泌される性腺刺激ホルモンを含むホルモン及び局所の傍分泌因子によって複雑に制御される。成人卵巣の中での卵母細胞の大半は、第１減数分裂前期の長い段階で維持され、周りの卵胞体細胞に包まれている。周期的に、原始卵胞の一群が卵胞発育の段階に入る。この時期の間に、卵母細胞は容量が非常に大きくなり、卵胞顆粒膜細胞の数が増える。成熟している卵母細胞は卵胞細胞を増殖させる傍分泌因子を合成し、卵胞細胞は血管形成を高め、卵母細胞を発育させる発育及び分化の因子を分泌する。特定の段階に進んだ後、体細胞アポトーシスを阻む性腺刺激ホルモンにさらされない限り、卵母細胞及びその卵胞は死滅する。
【０００２】
哺乳類の卵巣は基本的な機能単位としての卵胞から成る。卵胞の総数は生命の早期に決定され、このプールの枯渇は生殖老化をもたらす。各卵胞は発達して排卵する又は変性を受ける。個々の卵胞は最内の卵母細胞と、取り囲んでいる顆粒膜細胞と、莢膜細胞の外層とから成る。各卵胞の運命は内分泌因子と同様に傍分泌因子によって制御される。卵胞は、原始段階、一次段階及び二次段階を経て発達した後、卵胞腔を獲得する。胞状段階で、２、３の卵胞が思春期発動の後生じる周期的な性腺刺激ホルモンの刺激のもとで排卵前期に達し、生殖年齢の女性における卵巣エストロゲンの周期的な分泌の主な供給源になる。各生殖周期の間での排卵前期の性腺刺激ホルモンの急上昇に応答して、優勢なグラーフ卵胞が排卵して受精のために成熟卵母細胞を放出するが、残りの莢膜細胞及び顆粒膜細胞は転換を受けて黄体になる。
【０００３】
発育プールにいったん入ると、卵胞は最小限の損失で一次段階、二次段階及び前胞状段階に進み続ける。主として前胞状卵胞のアポトーシスを抑制することによって不妊患者にて排卵前期卵胞を生成するのにＦＳＨ治療が広く使用されているが、月経周期の３日目にて高い血清ＦＳＨ及び低いＡＭＨのレベルによって反映されるように卵巣がわずかな前胞状卵胞しか含有しないために、一部の患者はＦＳＨ治療に対して低応答者である。
【０００４】
生殖生命の全体を通して、原始卵胞は一次卵胞の生育プールに入るように当初の動員を受ける。ヒトの卵巣では、一次卵胞が二次卵胞段階に達するのに１２０日を超える日数が必要とされると推定されるのに対して二次卵胞から前胞状段階に発育するには７１日が必要であると推定される。いったん発育プールに入り始めると、卵胞は胞状段階に達するように進み、前胞状段階までに最小限の卵胞の損失が見いだされた。周期的な動員の間、循環するＦＳＨの増加は、胞状卵胞の集団がアポトーシス死を逃れるのを可能にする。この集団の間で、下垂体ＦＳＨの放出を抑える高レベルのエストロゲンとインヒビンを分泌することによって首位にいる卵胞が主席として浮上する。結果は残りの集団のネガティブ選択であり、最終的な死に至る。付随して、局所の増殖因子及び血管系の増加は、主席卵胞のポジティブ選択を可能にするので、その最終的な発育及び最終的な排卵及び黄体化が確保される。周期的な動員の後、胞状卵胞が主席グラーフ卵胞になるのにたった２週間しかかからない。原始段階から排卵前期段階までのヒト卵胞の発達全体には６ヵ月を超える日数が必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０１９１０４０号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
最小の原始卵胞及び一次卵胞から最大の排卵前期の卵胞までの卵胞の発達には異なる段階に応じた刺激因子及び生存因子が必要とされる。一次段階から二次段階、胞状段階及び排卵前期段階を介して卵胞を効率的に成熟させる方法は、試験管内及び生体内の卵胞成熟の方法を含めて大いに関心を集める。本発明はこの課題に対処する。
【０００７】
卵胞が排卵前期状態に発育するのに十分な時間の間、Ｈｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤、又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤の少なくとも一方の有効用量に卵胞を接触させることによって哺乳類の卵胞の排卵前期段階までの発育を促進するための組成物及び方法が提供される。接触することは、卵巣の物理的破壊の非存在下で実施され得るので、卵巣は無処置である。一部の実施形態では、卵胞は生体外培養にて剤と接触させる。他の実施形態では、卵胞は生体内で剤と接触させる。接触が生体内で実施される場合、剤は卵巣に、たとえば、早期閉経を患う女性、多嚢性卵巣症候群を患う女性、中年不妊の女性等に局所で投与され得る。有効用量は、卵巣が排卵前期に達する十分な発育を経験できる用量である。
【０００８】
Ｈｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤には、アクチンを重合する又は重合したアクチンを安定化する剤が挙げられる。そのような剤には、限定しないで、環状ペプチドジャスプラキノリド（ＪＡＳＰ）及びスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）受容体調節因子、たとえば、Ｓ１Ｐ、ＦＴＹ７２０、リゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）等が挙げられる。破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤にはＣＣＮ成長因子タンパク質、たとえば、ＣＣＮ２、３、５又は６が挙げられる。
【０００９】
本発明の方法はさらに、限定しないで、追加の効果を提供するホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害因子及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）活性化因子の少なくとも１つに卵胞を接触させることを含む、卵胞の発育を活性化する追加の剤に卵胞を接触させる工程と組み合わせられ得る。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一部の実施形態では、暴露は、試験管内で、たとえば、器官培養又は組織培養にて行われ、その際、少なくとも１つの卵胞が、Ｈｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤、又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤の少なくとも一方の有効用量に暴露される。処理した卵胞を試験管内目的で、たとえば、体外受精、胚性幹細胞の生成等のために利用してもよく、又は移植して生体内用途を提供してもよい。当該移植様式には、限定しないで、物理的に破壊されていない卵巣に存在する卵胞を含む１以上の卵胞の腎被膜への、皮下部位への、卵管近傍への、卵巣部位への移植が挙げられ、たとえば、一方の卵巣が保持され、他方の卵巣が生体外処理のために取り出されている場合、１以上の処理された卵胞は残っている卵巣の部位に移植され得る。
【００１１】
一部の実施形態では、試験管内での処理には、排卵前の卵母細胞の生成のために卵胞を活性化するための卵巣移植が続き、それには、試験管内又は生体内での受精が続き得る。
【００１２】
当該個体には、絶滅危惧種、経済的に重要な動物、早発閉経を患う女性、多嚢性卵巣症候群を患う女性、中年不妊の女性、ヒト胚性幹細胞及び原始生殖細胞に由来する卵胞、等が挙げられる。他の実施形態では、暴露は生体内で局所に、たとえば、卵巣内注射によって、又は個体への全身性の投与によって行われる。
【００１３】
Ｈｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤、又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤の少なくとも一方の有効用量への個体の暴露に続いて、卵胞の発育を開始させるのに有効である濃度にて、組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、生体内宿主動物にて天然に存在するＦＳＨ、ＦＳＨ類似体、たとえば、ＦＳＨ／ＣＴＰ、ペグ化ＦＳＨ等を含むＦＳＨ又はＦＳＨ類似体によって個体を治療し得る。
【００１４】
卵胞が排卵前期まで刺激されている場合、排卵用量での個体は黄体形成ホルモン（ＬＨ）又はそのアゴニストによって治療されてもよく、アゴニストには具体的に、排卵用量での絨毛性性腺刺激ホルモン、たとえば、ウマ絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）等が挙げられる。加えて、卵胞は、ｃ−Ｋｉｔリガンド、神経栄養因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−４、ＢＭＰ７、白血病阻害因子、塩基性ＦＧＦ、角化細胞増殖因子等の１以上に生体内で又は試験管内で暴露され得る。
【００１５】
本発明の方法に係るＨｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤、又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤の少なくとも一方の有効用量による刺激に有効な期間は普通、少なくとも約１時間及び約５日以下であり、少なくとも約１２時間及び約４日以下、たとえば、２、３、４又は５日であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】マウスにおける卵巣の断片化及び移植が促進する卵胞の発育を示す図である。若年マウスの対の卵巣を成熟卵巣除去マウスの腎臓に移植した（無処置：ＩＮ、小片：ＰＩ）。移植片回収の前５日間毎日、宿主にＦＳＨを注射した。（Ａ）３つの小片への断片化を伴った又は伴わない対の卵巣移植片の形態。上の図：腎被膜の中での移植片、下の図：単離した対の移植片。（Ｂ）１０日齢（Ｄ１０）のマウスに由来する２〜４の小片への断片化後の、及び移植前に１〜２４時間インキュベートした対の卵巣の重量。移植前（Ｄ１０）及びＦＳＨ処理を伴った移植後５日（Ｄ１５ＦＳＨ）又はＦＳＨ処理を伴わない移植後５日（Ｄ１５）の卵巣重量は対照として役立った。ｎ＝８〜２２。（Ｃ）１０日齢マウスに由来する無処置の卵巣及び断片化（３小片）した卵巣の移植前後の卵胞の動態。左：卵胞の総数、右：卵胞の動態。ｎ＝５。Ｐｍｄ＝原始、Ｐｒｍ＝一次、Ｓｅｃ＝二次、ＰＯ＝排卵前。（Ｄ）３〜４の小片への断片化及び移植の後の異なる日齢でのマウスの対の卵巣の重量。平均値±ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５、ｎ＝８〜２２。
【図２】マウス卵巣の断片化はアクチンの重合を増やし、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達を破壊し、ＣＣＮ成長因子とアポトーシス阻害因子を増やしたことを示す図である。（Ａ）卵巣の断片化はＦ−アクチンのレベルを高めた。１０日齢マウスの対の卵巣を３つの小片に切断した又は無処置のまま保持した後、Ｆ−アクチン及びＧ−アクチンのレベルの免疫ブロット解析を行った（上の図）。下の図：Ｆ−アクチンとＧ−アクチンの比。Ｎ＝６〜１１。（Ｂ）卵巣の断片化はホスホＹＡＰ（ｐＹＡＰ）のレベル及びｐＹＡＰと総ＹＡＰの比を低下させた。切断を伴った又は伴わない対の卵巣を１時間インキュベートし、その後免疫ブロットを行った。左の図：代表的な免疫ブロット、右の図：異なる抗原の比。ｎ＝８対。（Ｃ）卵巣の断片化はＣＣＮ成長因子及びＢＩＲＣアポトーシス阻害因子の発現を高めた。切断を伴った又は伴わない対の卵巣を１時間インキュベートし、続いて移植し、その後、ＧＡＰＤＨによって基準化した転写因子のレベルを解析した。無処置の卵巣：実線、プールした３つの小片：点線。ｎ＝１０〜１５。（Ｄ）卵巣の断片化はＣＣＮ２タンパク質を増やした。切断を伴った又は伴わない対の卵巣を３〜５時間インキュベートし、その後免疫ブロットを行った。上の図：代表的なブロット、下の図：定量的解析。Ｎ＝３〜５。（Ｅ）ＣＣＮ２、３、５及び６による処理は卵巣外植片重量を高めた。１０日齢マウスからの外植片を様々なＣＣＮ成長因子と共に４日間培養し、その後秤量した。ｎ＝５〜６。平均値±ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５。ＩＮ＝無処置、ＰＩ＝小片。
【図３】Ｈｉｐｐｏシグナル伝達の破壊及びＡｋｔ刺激の追加の効果は二次卵胞の発育を促進したことを示す図である。（Ａ）二次卵胞はＩＶＡ処理に応答性である。二次卵胞（直径１１５μｍ）を１０日齢のマウスから単離し、標準のＩＶＡプロトコール（３ｍＭでのｂＰＶ（Ｈｏｐｉｃ）及び１５μｇ／ｍｌでの７４０ＹＰによる第１日、次いで７４０ＹＰのみでさらに１日）によって試験管内で培養し、その後さらに２日毎日ＦＳＨ（１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した（ＩＶＡ＋ＦＳＨ）。対照群は培地のみで４日間処理し、又はＩＶＡ試薬で２日間、その後培地のみで処理した（ＩＶＡのみ）。（Ｂ）卵巣の断片化及びＩＶＡ処理は卵巣の重量増加及び二次卵胞の発育に対して追加の効果をもたらした。１０日齢のマウスからの対の卵巣を３つの小片に断片化した。一方側の断片をＩＶＡプロトコール（３０μＭでのｂｐＶ（Ｈｏｐｉｃ）及び１５０ｎｇ／ｍｌでの７４０ＹＰによって１日、次いで７４０ＹＰのみでさらに１日）によって処理したのに対して、反対側の断片を培地のみとともにインキュベートした。次いで卵巣除去した成熟マウスの腎被膜に卵巣断片を同種移植し、宿主にはＦＳＨ（１ＩＵ／動物で毎日）を注射した。５日後、卵巣移植片を取り出し、固定し、秤量した。左の図：移植片の重量、右の図：移植した卵巣断片の卵胞の動態。異なる段階での卵胞の比率は移植片の連続切片に基づいて決定した。（Ｃ）Ａｋｔ刺激因子による処理を伴った又は伴わない無処理の又は断片化したマウスの卵巣を移植する前及び移植した後の卵胞の動態。左：卵胞の総数、右：卵胞の動態。ｎ＝４。同一文字記号は有意差を示す（ｐ＜０．０５）。（Ｄ〜Ｆ）ガラス固化した皮質細片を融解し、立方体に断片化した後、Ａｋｔ刺激因子で２日間処理し、その後、４週間、免疫不全マウスに移植した。（Ｄ）移植前の皮質細片。矢印：二次卵胞、矢頭：原始／一次卵胞。尺度棒：１００μｍ。（Ｅ）その場での腎移植片（左）及び単離後移植片、胞状卵胞を示す。（Ｆ）卵核胞段階での卵母細胞（矢印）を示すものの側面図を伴った２つの大きな胞状卵胞の組織像。尺度棒：１ｍｍ。平均値±ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５。
【図４】卵巣の断片化／移植が生存可能な仔につながることを示す図である。（Ａ）３つの小片への切断を伴った又は伴わない、その後５日間移植した１０日齢マウスからの卵巣移植片の代表的な組織像。棒＝２００μｍ。（Ｂ）１０日齢マウスに由来する無処置の及び断片化した（３つの小片）卵巣の移植前及び移植後の卵胞の絶対数。左：卵胞の総数、右：卵胞の動態。ｎ＝５卵巣。同一星印は有意差を示す（ｐ＜０．０５）。（Ｃ）受精及び胚発生のための１０日齢マウスに由来する卵巣の切断／移植後の卵母細胞の回収（左の図）。成熟卵母細胞の比率（真ん中の図）及び受精し、異なる胚段階に発生した卵母細胞の分画（右の図）を示す。右の図における対照はｅＣＧ、その後排卵（３）を誘導するｈＣＧで２３日齢マウスを処理した後得られた卵母細胞を表す。ｎ＝８卵巣。ＧＶＢＤ＝卵核胞崩壊。（Ｄ）卵巣の断片化／移植後に得られた成熟卵母細胞に由来する胚の移植に続く健常な仔の出産。１０日齢のＢ６Ｄ２Ｆ１マウスの卵巣を３つの小片に断片化した後、毎日ＦＳＨ処理しながら５日間移植した。次いで動物をｅＣＧ（４８時間）及びｈＣＧ（１２時間）で順次処理した後、受精及び胚培養のために卵母細胞を取り出した。２細胞期の胚をＣＤ１系統の代理母に移植し、その後、妊娠及び出産させた。卵巣の断片化に由来する仔は健常であり、繁殖力があった。（Ｅ及びＦ）卵巣の断片化及び移植はラットにて卵胞の発達を促進した。１０日齢のラットからの対の卵巣を無処置で又は３つの断片で同じ動物の腎臓に自家移植した。動物をＦＳＨで５日間処理した後、卵巣の重量を測定した。（Ｅ）単離した卵巣の形態。（Ｆ）卵巣の重量。括弧内の数は使用した卵巣の数である。平均値±ＳＥＭ；ｐ＜０．０５。
【図５】Ｈｉｐｐｏ経路遺伝子の卵巣での発現及び卵巣の断片化に続く核ＹＡＰ局在化の増加を示す図である。（Ａ）１０日齢マウスの卵巣におけるＨｉｐｐｏ経路遺伝子の転写産物のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析。ｎ＝６。（Ｂ）１０日齢（ｄ１０）マウスの卵巣におけるＨｉｐｐｏ経路のタンパク質の免疫ブロット。３Ｔ３細胞からの抽出物は対照として役立った（３Ｔ３）。特異的なシグナルは矢印で記す。ｐＹＡＰ：ホスホＹＡＰ（Ｓｅｒ１２７）。（Ｃ）成熟マウスの卵巣におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達遺伝子の免疫組織化学染色。シグナルは特異的な抗体を用いて検出した。抗原はすべて顆粒膜細胞、莢膜細胞、及び原始（Ｐｍｄ）卵胞、一次（１°Ｆ）卵胞、二次（２°Ｆ）卵胞及び胞状（ＡＦ）卵胞の卵母細胞の主として細胞質で見いだされたが、黄体（ＣＬ）で低レベルで見いだされた。尺度棒は、低拡大（左の図）及び高拡大（右の図）についてそれぞれ２００μｍ及び１００μｍである。（Ｄ）一次卵胞及び二次卵胞の顆粒膜細胞における断片化が誘導した核ＹＡＰの上昇。左の図：ほとんどの一次卵胞及び二次卵胞の顆粒膜細胞におけるＹＡＰの優勢な細胞質の局在化を示す、１０日齢マウスからの無処置の卵巣におけるＹＡＰ染色。右の図：ほとんどの一次卵胞及び二次卵胞の顆粒膜細胞におけるＹＡＰの核局在化を示す断片化の４時間後の卵巣におけるＹＡＰ染色。原始卵胞における顆粒膜細胞の限定された細胞質のために、原始卵胞におけるＹＡＰの細胞分布を測定するのは難しい。尺度棒：低拡大（上の図）及び高拡大（真ん中と下の図）についてそれぞれ１００μｍ及び５０μｍ。矢印：二次卵胞、矢頭：一次卵胞。
【図６】卵巣の断片化の後のＣＣＮ成長因子及びＢＩＲＣ阻害因子の発現の上昇、並びに卵胞発達を促進するＣＣＮ成長因子の能力を示す図である。（Ａ）その後の移植を伴わない卵巣の断片化はカギとなるＣＣＮ成長因子（ＣＣＮ２、３、５及び６）及びアポトーシス阻害因子（ＢＩＲＣ１及び７）の発現を高めた。３つの小片への切断を伴う又は伴わない１０日齢マウスからの対の卵巣を異なる遺伝子の転写レベルの解析の前に７時間までインキュベートした。無処置の卵巣：実線、３つの小片：点線。ｎ＝１０〜１５。（Ｂ）断片化した卵巣の体細胞におけるＣＣＮ２発現の上昇。３つの小片への切断を伴う又は伴わない１０日齢マウスからの対の卵巣を１時間培養し、次いで腎被膜下に移植した。移植の３時間後、卵巣を切断し、その後、以前記載された（２）のように卵母細胞及び体細胞を単離した。ＣＣＮ２及びＧＡＰＤＨのｍＲＮＡレベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した（ｎ＝４）。無処置に対して＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）ＣＣＮ成長因子による処理は卵巣の外植片にて前胞状卵胞の発達を促進した。様々なＣＣＮ成長因子との外植片の培養に続いて、異なる発達段階での卵胞の比率を数えることによって卵胞の動態を測定した。平均値±ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５、ｎ＝５。
【図７】ベルテポルフィン及びＣＣＮ２抗体による事前処理は断片化が誘導する卵巣の発育を抑制したことを示す図である。（Ａ）ベルテポルフィンによる事前処理は断片化が誘導するＣＣＮ２の上昇を抑えたが、ＡＭＨを転写産物レベルを抑えなかった。断片化のために卵巣を取り出す前に若年マウスにベルテポルフィンをｉ．ｐ．で３時間注射した。インキュベートの４時間後、ＣＣＮ２及びＡＭＨの転写産物レベルをリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ｎ＝６〜１２。（Ｂ）ベルテポルフィンによる事前処理は断片化が誘導する移植片重量の増加を部分的に抑制した。ベルテポルフィンを事前に３時間注射した若年マウスからの卵巣を断片化し、１時間インキュベートした後、ＦＳＨ処理した宿主に５日間移植し、その後、移植片重量を測定した。括弧内の数は使用した試料の数である。（Ｃ）ベルテポルフィン（ＶＰ）による事前処理を伴う又は伴わない動物からの無処置の及び断片化した卵巣移植片の卵胞の動態。ｎ＝３〜５。（Ｄ）ＣＣＮ２抗体との断片化した卵巣のインキュベートは卵巣重量の増加を抑制した。対の卵巣を３つの小片に断片化し、その後ＣＣＮ２抗体又は非免疫性のＩｇＧと共に１８時間インキュベートした後、５日間移植した。平均値±ＳＥＭ；＊ｐ＜０．０５。
【図８】Ａｋｔ刺激因子による処理を伴う又は伴わない無処置の及び断片化した卵巣の移植後の卵胞の絶対数を示す図である。若年マウスからの対の卵巣を断片化し、Ａｋｔ刺激因子と共に又はＡｋｔ刺激因子なしで２日間インキュベートし、その後５日間同種移植し、移植片重量を測定した。ｎ＝４。同一文字記号は有意差を示す（ｐ＜０．０５）。
【図９】ヒトの卵巣におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達遺伝子の発現を示す図である。（Ａ）ヒトの卵巣皮質におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達遺伝子の転写産物の発現。良性卵巣腫瘍の患者から卵巣皮質組織を得て、ＲＴ−ＰＣＲ解析に使用した。（Ｂ）ヒトの卵巣皮質におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達タンパク質の免疫組織化学染色。卵巣皮質におけるＳＡＶ１、ＬＡＴＳ１／２、ＹＡＰ及びＴＡＺ抗原の発現が実行された。抗原はすべて原始卵胞（ｂ）、一次卵胞（ｃ）、及び二次卵胞（ｄ）の顆粒膜細胞、莢膜細胞及び卵母細胞にて見いだされた。尺度棒、１００μｍ。（Ｃ）ヒトの卵巣組織の断片化の後のＣＣＮ転写産物の増加。融解した皮質細片を小片に切断し又は無処置のままにし、その後様々な間隔でインキュベートした後、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって解析した。ｎ＝４〜８。
【図１０】卵巣の断片化、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達及び卵胞の発育に関与する遺伝子は卵巣の生理学及び病態生理学に重要であることを示す図である。卵巣の断片化は細胞間張力の変化につながり、Ｇ−アクチンのＦ−アクチンへの変換を促進した。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達のその後の破壊は総ＹＡＰに対するｐＹＡＰの比を下げ、下流のＣＣＮ成長因子及びＢＩＲＣアポトーシス阻害因子の発現の上昇をもたらした。ＣＣＮ成長因子の分泌は卵胞の発育を刺激した。遺伝的研究はＰＯＩファミリーにおけるＤＩＰＡＨ２及びＦＯＸＬ２の変異を見いだしたのに対してＬＡＴＳ１又はＣＣＮ２の欠損はマウスにおける不妊表現型につながった。ゲノム規模での関連試験は卵胞予備能及び閉経年齢に関する候補遺伝子としてＤＩＡＰＨ２及びＤＡＩＰＨ３を特定したのに対してＢＩＲＣ１についてのコピー数の変化がＰＯＩ患者で見いだされた。ＹＡＰはＰＣＯＳのための候補遺伝子としてだけでなく、卵巣表面の上皮癌の癌遺伝子としても見いだされた。
【図１１】（Ａ、Ｂ）ＪＡＳＰによる処理はアクチンの重合及びＣＣＮ２の発現を高めた。左上の図：１０日齢マウスに由来する対の卵巣をＪＡＳＰ（１０μＭ）で３０分間処理した又は処理せず、その後Ｆ−アクチン及びＧ−アクチンの含量を分析した。左下の図：ＪＡＳＰに３０分間暴露した後のＣＣＮ２転写産物レベルのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析。右の図：ＪＡＳＰで３０分間処理した後のＣＣＮ２タンパク質レベルの免疫ブロット解析。上の図：免疫ブロット解析。下の図：デンシトメトリー走査データの定量的解析。括弧内の数は使用した試料の数である。＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）卵巣のＪＡＳＰへの暴露は卵巣移植片の重量を増やした。１０日齢マウスに由来する卵巣を様々な濃度のＪＡＳＰで３０分間処理し、又は処理しないで、その後毎日ＦＳＨで処理した成熟宿主に移植した。５日後、移植片重量を測定した。
【図１２】卵巣の外植片培養へのＳ１Ｐの添加は卵巣重量の主要な増加につながる。１０日齢の卵巣をＳ１Ｐ（６μＭ）と共に１８時間培養し、その後卵巣除去した成熟宿主に５日間移植することも移植片重量の増加につながる（右の図）。Ｓ１Ｐに加えてＩＶＡ薬剤（ＰＴＥＮ阻害剤及びＰＩ３Ｋ刺激剤）で卵巣を処理すると、移植片重量の追加の増加が見いだされる。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
哺乳類の卵胞の発育及び成熟を調節するための組成物及び方法が提供される。Ｈｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤、又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤の少なくとも一方の有効用量に卵胞を暴露することによって卵胞の発育及び結果として生じる卵母細胞の成熟を操作することができる。
【００１８】
本発明の方法は、特に哺乳類種を含む多種多様な動物種での用途が見いだされる。動物モデル、特に小型哺乳類、たとえば、ネズミ類、ウサギ類等は実験的検討について興味深い。他の動物種、たとえば、ウマ、ウシ、たとえば、パンダ、大型ネコ科動物のような希少動物園動物は体外受精における改善から恩恵を受け得る。ヒトは、体外受精の方法を含む卵母細胞の成熟を高めることに関して特に興味深い。本発明の方法による治療に関する当該個体には、限定しないで、早発閉経、閉経周辺期、ＦＳＨ低応答性、多嚢性卵巣症候群、加齢に関連する不妊を患う者、すなわち、４０歳を超える女性等が挙げられる。
【００１９】
本発明の実施形態は哺乳類の膨大な種の卵胞を包含することができる。本発明は、この特許出願の中での特定の実施例によって引用される哺乳類の種に限定されないように理解されるべきである。本発明の実施形態は、たとえば、ブタ類、ウシ類、オビド類、ウマ類、スイギュウ類等のような肉及び酪農生産のために商業的な価値を有する動物（当然、肉及び酪農生産のために使用される哺乳動物は文化ごとに変化し得る）の新鮮な卵胞又は凍結融解した卵胞を含み得る。それはまた、稀な又は卓越した特質、たとえば、重量、サイズ若しくは構成を含む形態的な特徴、又は速度、敏捷性、知性等のような他の所望の特徴を有する個体に由来する卵胞も含み得る。それは、たとえば、動物園検体又は絶滅危惧種のような、死亡したドナー又は稀な若しくは外国産の哺乳類に由来する卵胞を含み得る。本発明の実施形態はまた、チンパンジー、ゴリラ等を含むが、これらに限定されない霊長類から採取された新鮮な又は凍結融解した卵胞も含み得るし、クジラ又はイルカのような海洋哺乳類に由来する卵胞も含み得る。
【００２０】
主題の発明がさらに記載される前に、特定の実施形態の変形が為され得るし、添付のクレームの範囲内に入るので、本発明は以下に記載される本発明の特定の実施形態に限定されないことが理解されるべきである。採用される専門用語は特定の実施形態を記載する目的のためのものであり、限定するようには意図されないことも理解されるべきである。代わりに、本発明の範囲は添付のクレームによって確立されるであろう。
【００２１】
本明細書及び添付のクレームでは、文脈が明瞭に指示しない限り、単数形態「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の参照を含む。特に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて本発明が属する技術の当業者に対して共通して理解されるものと同じ意味を有する。
【００２２】
卵胞
卵胞は、女性の生殖生物学の基本単位であり、卵巣で見いだされる細胞のおおまかに球形の集合体で構成される。１つの卵胞は単一の卵母細胞を含有する。卵胞は周期的に発育及び発達を開始し、普通、単一の優秀な卵母細胞の排卵で終わる。卵胞の細胞は、卵母細胞、顆粒膜細胞、及び内部及び外部の莢膜層の細胞である。卵胞における卵母細胞は原始卵母細胞の段階にある。そのような卵母細胞の核は卵核胞と呼ばれる。卵胞内の顆粒膜細胞は卵母細胞を取り囲み、性腺刺激ホルモンに応答してその数を増す。それらはまた卵巣のホルモン合成の調節に関与するペプチドも産生する。卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は顆粒膜細胞に作用して細胞表面上で黄体形成ホルモン（ＬＨ）受容体を発現させる。顆粒膜細胞は同様に、細胞外マトリクスの薄層−卵胞基底膜又は基底膜に被包される。基底膜の外では、莢膜内層及び莢膜外層が見いだされる。
【００２３】
卵巣の試験管内培養  哺乳類の卵巣又はその断片を培養する方法は当該技術で既知であり、本発明の目的では断片は少なくとも１つの卵胞を含む。通常、卵巣のすべて又は一部を組織培養培地に入れ、培地は卵胞細胞の発育又は維持に有用な因子を含んでもよく、本明細書で記載されるように、さらに、Ｈｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤、又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤の少なくとも一方の有効用量を含んでもよい。本明細書で提供される実施例を参照のこと。追加の記載は、とりわけ、Ｈｏｙｅｒら、（２００７）  Ｂｉｒｔｈ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  Ｒｅｓ  Ｂ  Ｄｅｖ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．８０（２）：１１３−２５にて見いだされ得る（参考文献のそれぞれは参照によって具体的に本明細書に組み入れられる）。イヌの卵巣の試験管内培養は、Ｌｕｖｏｎｉら、（２００５）  Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ．；６３（１）：４１−５９によって記載されている。ウシの卵胞の培養はＨａｎｓｅｌ（２００３）  Ａｎｉｍ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｓｃｉ．；７９（３−４）：１９１−２０１によって記載されている。
【００２４】
試験管内での卵巣の組織培養及び器官培養の概説はＤｅｖｉｎｅら（２００２）  Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ．７：ｄ１９７９−８９；及びＳｍｉｔｚら、（２００２）  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．１２３（２）：１８５−２０２にて見いだされ得る。齧歯類の胎児又は新生児からの卵巣全体が器官培養系にてインキュベートされている。この技法の適応には、培地で連続的に潅流されたチャンバー又は無処置の脈管系を介した培地の潅流における卵巣のインキュベートが含まれる。別のアプローチは酵素的な又は機械的な分離によって単離された個々の卵胞を培養することである。ヒトの原始卵胞及び一次卵胞の凍結保存はＨｏｖａｔｔａ（２０００）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１６９（１−２）：９５−７によって記載されている。
【００２５】
卵巣移植
卵巣の腎臓への移植は動物試験で定評がある手段である。卵巣の皮質組織の自家移植は、ヒトにおいて、特に不妊化癌療法又は不妊化手術を受ける女性の文脈で広く報告されている。卵巣組織は新鮮に又は低温保存後に移植され得る。概説については、参照によって具体的に本明細書に組み入れられるＧｒｙｎｂｅｒｇら（２０１２）  Ｆｅｒｔｉｌ．Ｓｔｅｒｉｌ．９７（６）：１２６０−８を参照のこと。
【００２６】
Ｈｉｐｐｏシグナル伝達を破壊する剤  アクチンの重合を高める剤はＨｉｐｐｏシグナル伝達を破壊する。１又は２のアクチンプロトマーについて１分子の比率でアクチンフィラメントに結合し、隣接するアクチンサブユニットを一緒に本質的にロックするファロイジンを含む多数のそのような剤が当該技術で知られる。これはフィラメントの分解よりもフィラメントの形成を好むように平衡を変える。たとえば、参照によって具体的に本明細書に組み入れられるＣｏｏｐｅｒ（１９８７）  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５（４）：１４７３−８を参照のこと。
【００２７】
ジャスプラキノリドはアクチン細胞骨格に対して多数の効果を有することが示されている１５炭素の大環状ペプチドである。これらには、Ｇ−アクチン単量体の自然発生的な核生成及びアクチンの重合を誘導することが含まれる。ファロイジンと同様に、ジャスプラキノリドはフィラメントの分解を阻害することによってＦ−アクチンのフィラメントを安定化する。２つの薬剤は実質的に異なる構造を有する一方で、ジャスプラキノリドがファロイジンと競合してＦ−アクチンに結合することが示されているということは、類似の結合メカニズムを示唆し、多分作用の類似の様式を示唆している。たとえば、参照によって具体的に本明細書に組み入れられるＢｕｂｂら、（１９９４）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（２１）：１４８６９−７１を参照のこと。試験管内培養でのＪＡＳＰの有効な濃度は約０．１μＭ、約１μＭ、約１０μＭ、約５０μＭ、及び約１ｍＭ以下であり得る。生体内目的では、用量は個体及び投与の方法に応じて変化してもよく、たとえば、標的組織にてより高い濃度を達成するように剤を局在化することが望ましくてもよい。
【００２８】
スフィンゴシン−１−リン酸受容体調節因子  Ｈｉｐｐｏシグナル伝達を破壊する剤の中に含まれるのはスフィンゴシン−１−リン酸受容体調節因子である。スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は、哺乳類細胞で細胞内セカンドメッセンジャー及び細胞外メディエータの双方として作用する生物活性があるスフィンゴ脂質である。Ｓ１Ｐが細胞内メッセンジャーとして作用する細胞型では、スフィンゴシンキナーゼの活性化の結果生じるＳ１Ｐの刺激依存性の合成が必須である。
【００２９】
細胞外Ｓ１Ｐは５つの関連するＧタンパク質共役受容体、Ｓ１ＰＲ１〜５（Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）．  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７８：７４３−７６８）のファミリーを介して作用する。これらのＳ１Ｐ受容体は、差別的に発現され、種々のＧタンパク質と共役し、血管形成、血管成熟、心臓の発生及び免疫を調節する（Ｓｐｉｅｇｅｌ  ＆  Ｍｉｌｓｔｉｅｎ  （２００３）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４，  ３９７−４０７）。Ｓ１Ｐは、Ｇ１２／１３と共役するＳ１Ｐ受容体を介して作用してアクチンの重合を高め、キナーゼＬａｔｓ１／２を阻害し、それによってＹＡＰ及びＴＡＺの転写共活性化因子を活性化し、細胞増殖を促進する。
【００３０】
Ｓ１Ｐは血小板にて豊富に貯蔵され、ヒトの血清及び卵胞液の正常な構成成分である（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ８４，  ６０４−６１２）。興味深いことに、顆粒膜細胞は５つのＳ１Ｐ受容体のうち４つを発現し、卵胞液高密度リポタンパク質に関連するＳ１Ｐはアクチンの重合及びヒト顆粒膜黄体細胞の移動を促進する。
【００３１】
この目的で興味深い剤には、限定しないで、Ｓ１Ｐ、フィンゴリモド（ＦＴＹ７２０、商品名Ｇｉｌｅｎｙａ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、及びリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が挙げられる。フィンゴリモドは、リンパ節にてリンパ球を隔離してそれらが自己免疫反応に寄与するのを妨げるスフィンゴシン−１−リン酸受容体調節因子である。吉富製薬によって１９９２年に初めて合成され、化学修飾を介した免疫抑制性の天然産物、ミリオシンに由来する。
【００３２】
試験管内培養のためのＳ１Ｐ、ＦＴＹ７２０、ＬＰＡの有効な濃度は、約０．１μＭから、約１μＭから、約５μＭから、約５０μＭまで、及び約１ｍＭ以下であり得る。生体内目的では、用量は個体及び投与の方法に応じて変化してもよく、たとえば、標的組織にてより高い濃度を達成するように剤を局在化することが望ましくてもよい。一部の実施形態では、剤は、たとえば、約０．０１ｍｇ／ｋｇから、約０．０５ｍｇ／ｋｇから、約０．１ｍｇ／ｋｇから、約０．５ｍｇ／ｋｇから、約１ｍｇ／ｋｇから、約５ｍｇ／ｋｇから、約１００ｍｇ／ｋｇまで、約５０ｍｇ／ｋｇまで、約１０ｍｇ／ｋｇまでの用量で卵巣に直接注入される。
【００３３】
破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤には、ＣＣＮタンパク質、特にＣＣＮ２、３、５及び６が挙げられる。ＣＣＮ細胞間シグナル伝達タンパク質は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）に関連するシグナル伝達タンパク質（マトリクス細胞タンパク質としても知られる）のＣＣＮファミリーを指す。ＣＣＮタンパク質ファミリーのメンバーは、４つの保存されたシステインリッチのドメインを有することを特徴とし、それには、インスリン様の増殖因子を結合するドメイン（ＩＧＦＢＰ）、ヴォン・ヴィレブランド因子Ｃ型ドメイン（ＶＷＣ）、トロンボスポンジン１型反復（ＴＳＲ）、及びシステインノットモチーフを持つＣ末端ドメイン（ＣＴ）が含まれる。まとめて、これらのタンパク質は、有糸分裂、接着、アポトーシス、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）産生、成長停止及び移動を刺激し、血管形成、腫瘍増殖、胎盤形成、着床、胚形成及び軟骨内骨化を調節する。ＣＣＮタンパク質はアポトーシスを阻止する。
【００３４】
ＣＣＮ２はＣＴＧＦ（結合組織増殖因子）としても知られ、ＣＣＮ３はＮＯＶ（腎芽細胞腫で過剰発現される）としても知られ、ＣＣＮ５はＷＩＳＰ２（ＷＮＴ１が誘導可能なシグナル伝達経路タンパク質２）としても知られ、ＣＣＮ６はＷＩＳＰ３（ＷＮＴ１が誘導可能なシグナル伝達経路タンパク質３）としても知られる。
【００３５】
本発明の目的で、ＣＣＮタンパク質は天然の供給源から単離してもよく、組換えで産出してもよい。タンパク質は、当該技術で知られるような、たとえば、カラムクロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ等によって任意で精製される。場合によっては、１つの種に由来するタンパク質が別の種のタンパク質と共同する交差反応性があり得るけれども、一般にタンパク質は卵胞と同じ種に由来する、すなわち、ヒトの卵胞等にはヒトのタンパク質である。
【００３６】
試験管内培養については、ＣＣＮタンパク質の有効な用量は普通、少なくとも約１ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約５０ｎｇ／ｍｌ、少なくとも約１００ｎｇ／ｍｌ、及び約１００μｇ／ｍｌ以下である。生体内目的では、用量は個体及び投与の方法に応じて変化させてもよく、たとえば、標的組織にてより高い濃度を達成するように剤を局在化することが望ましくてもよい。
【００３７】
ＦＳＨ
卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）は下垂体前葉における性腺刺激ホルモン産生細胞によって合成され、分泌されるホルモンである。ＦＳＨは人体の発生、成長、思春期成熟及び生殖過程を調節する。ＦＳＨ及び黄体形成ホルモン（ＬＨ）は生殖にて相乗的に作用する。女性では、卵巣にてＦＳＨは未成熟な卵胞の成熟への発育を刺激する。卵胞は発育するにつれて、インヒビンを放出し、それはＦＳＨの産生を停止する。
【００３８】
ＦＳＨは二量体の糖タンパク質である。ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ及びｈＣＧのαサブユニットは同一であり、９２のアミノ酸を含有する。ＦＳＨは１１８アミノ酸のβサブユニット（ＦＳＨＢ）を有し、それは特異的な生物作用を付与し、ＦＳＨ受容体との相互作用に関与する。ネイティブＦＳＨの半減期は３〜４時間である。その分子量は３０，０００である。
【００３９】
ＦＳＨの種々の製剤が臨床用途で利用可能である。それは一般に不妊治療、特にＩＶＦ療法にてと同様に、子宮腔内受精（ＩＵＩ）と共に使用されて卵胞の発達を刺激する。ＦＳＨは、ペルゴナル又はメノプールの形態でＬＨと混合して、及び尿中性腺刺激ホルモンの他のさらに精製した形態と共に混合して、同様に組換えＦＳＨ（ゴナールＦ、フォリスチム）のような及びフォリスチムＡＱ、ゴナールＦ、ゴナール−ｆＲＦＦ、ゴナール−ｆＲＦＦペンのような純粋な形態で利用可能である。
【００４０】
ＦＳＨの類似体も臨床上有用であり、類似体には、たとえば、１、２、３以上のアミノ酸がネイティブな形態から変化する生物学的に活性がある変異体形態、ペグ化されたＦＳＨ、単鎖二官能性変異体、ＦＳＨ／ＣＴＰ等が挙げられる。卵巣の応答を高める取り組みの中で、ＦＳＨβサブユニットがヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）に由来するＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）部分によって連結されるＦＳＨ／ＣＴＰ（コリフォリトロピンアルファ）及び単鎖二官能性ＶＥＧＦ／ＦＳＨ／ＣＴＰ（ＶＦＣ）類似体を含む幾つかの長時間作用型のＦＳＨ療法が開発されている。ＦＳＨ／ＣＴＰは生体内で長い半減期を有し、たとえば、投与間で１〜４週間の間隔をもって投与され得る。たとえば、それぞれ参照によって具体的に本明細書に組み入れられるＬａｐｏｌｔら、（１９９２）  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、１３１：２５１４−２５２０；及びＤｅｖｒｏｅｙら、（２００４）  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、Ｖｏｌ．８９，Ｎｏ．５  ２０６２−２０７０を参照のこと。
【００４１】
ＬＨ及びアゴニスト
ＬＨはヘテロ二量体の糖タンパク質である。その構造は、他の糖タンパク質ホルモン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、及びヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣＧ）のそれに類似する。タンパク質二量体は、非共有結合する標識されたαサブユニットとβサブユニットである２つの糖ペプチドサブユニットを含有する。ＬＨ、ＦＳＨ、ＴＳＨ及びｈＣＧのαサブユニットは同一であり、ヒトでは９２のアミノ酸を含有するが、他の脊椎動物種のほとんどすべてでは９６のアミノ酸を含有する。βサブユニットは変化する。ＬＨは、特異的な生物作用を付与し、ＬＨ受容体との相互作用の特異性に関与する１２０アミノ酸のβサブユニット（ＬＨＢ）を有する。このβサブユニットはｈＣＧのβサブユニットに対して相同性が高く、双方が同じ受容体を刺激する。ＬＨはペルゴナルの形態でＦＳＨと混合して、及び尿中性腺刺激ホルモンの他の形態と混合して利用可能である。組換えＬＨはルトロピンα（Ｌｕｖｅｒｉｓ）として利用可能である。これらの薬物はすべて非経口で投与される。
【００４２】
ｈＣＧ薬物は、それが同じ受容体を活性化し、コストがかからず、ＬＨより長い半減期を有するのでＬＨ代用品として使用されることが多い。ヒトの絨毛性性腺刺激ホルモンは２４４アミノ酸の糖タンパク質である。ｈＣＧ性腺刺激ホルモンのβサブユニットは１４５のアミノ酸を含有する。他の性腺刺激ホルモンと同様に、ｈＣＧは尿から又は遺伝子操作によって抽出することができる。妊娠女性の尿に由来するプレグニール、フォルテイン、プロファシー、コラゴン及びノバレルは以前の方法を使用する。オビドレルは組換えＤＮＡの製品である。代替品としてウマの絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ）は妊娠雌ウマの絨毛膜で産生される性腺刺激ホルモンである。
【００４３】
ＰＴＥＮ阻害因子
ポリペプチドＰＴＥＮ（テンシン相同性を持つホスファターゼ）は、高頻度で多数の癌にて変異する腫瘍抑制因子として特定された。この遺伝子にコードされるタンパク質はホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸３−ホスファターゼである。それは、テンシン様ドメインと同様に、二重特異性タンパク質チロシンホスファターゼのそれに類似する触媒ドメインを含有する。ほとんどのタンパク質チロシンホスファターゼとは異なって、このタンパク質はホスホイノシチド基質を優先的に脱リン酸化する。それは、細胞にてホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸の細胞内レベルを負に調節し、ＡＫＴ／ＰＫＢシグナル伝達経路を負に調節することによって腫瘍抑制因子として機能する。ヒトのタンパク質の遺伝子配列は、それぞれ参照によって具体的に本明細書に組み入れられるＶｏｌｉｎｉａら、（２００８）、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３（１０），Ｅ３３８０；Ｌｉら、（１９９７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７（１１），２１２４−２１２９；Ｓｔｅｃｋら、（１９９７）  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５（４），３５６−３６２；及びＬｉら、（１９９７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７５（５３０８），１９４３−１９４７によって記載されたようにＧｅｎｂａｎｋ受入番号ＮＭ＿０００３１４にて見いだされ得る。当該ＰＴＥＮ阻害因子は、約０．１ｎＭ〜約１００μＭの、約１ｎｍ〜約１０μＭであってもよい、約１０ｎＭ〜約１μＭの、約１ｎＭ〜約１００ｎＭのＩＣ５０を有し得る。
【００４４】
ビスペルオキソバナジウム化合物（たとえば、Ｓｃｈｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ５６６（１−３）：３５−８を参照）を含むが、限定されない多数のＰＴＥＮ阻害因子が当該技術で知られる。含まれるのは、ＩＣ５０＝１８ｎＭにてＰＴＥＮを阻害するビスペルオキソ（ビピリジン）オキソバナジウム酸カリウム（Ｖ）、ＩＣ５０＝１４ｎＭにてＰＴＥＮを阻害するビスペルオキソ（５−ヒドロキシピリジン−２−カルボキシ）オキソバナジウム酸二カリウム（Ｖ）、ＩＣ５０＝３８ｎＭにてＰＴＥＮを阻害するビスペルオキソ（１，１０−フェナントロリン）オキソバナジウム酸カリウム（Ｖ）、ＩＣ５０＝３１ｎＭにてＰＴＥＮを阻害するビスペルオキソ（ピコリナト）オキソバナジウム酸二カリウム（Ｖ）；ＣＤＣ２５ホスファターゼファミリーを阻害するＮ−（２−ヒドロキシ−３−メトキシ−５−ジメチルアミノ）ベンジル、Ｎ’−（２−（４−ニトロフェネチル））、Ｎ”−メチルアミン；競合的ＰＴＰ阻害剤であるデフォスタチン；ＰＴＰ阻害剤である（ＩＣ５０＝１８μＭ）モノペルオキソ（ピコリナト）オキソバナジウム酸塩（Ｖ）及びホスファターゼのスペクトルの広い阻害剤であるオルソバナジウム酸ナトリウムである。
【００４５】
追加のＰＴＥＮ阻害剤は、とりわけ、Ｍｙｅｒｓら、（１９９８）、ＰＮＡＳ  ９５：１３５１３−１３５１８；Ｇａｒｌｉｃｈら、ＷＯ／２００５／０９７１１９；及びＲｏｓｉｖａｔｚら、（２００７）  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１，７８０−７９０によって記載されている。
【００４６】
或いは、ＰＴＥＮの阻害剤は、ホスファターゼ活性を有することが分かっているＰＴＥＮの酵素活性を阻害する剤、たとえば、ポリヌクレオチド、抗体、小分子等についての化合物スクリーニングによって特定され得る。化合物スクリーニングは、試験管内モデル、遺伝子操作した細胞若しくは動物、又は精製したＰＴＥＮ１タンパク質を用いて実施され得る。ホスファターゼ活性に結合する又はそれを阻害するリガンド又は基質を特定することができる。標識された試験管内のタンパク質／タンパク質結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ、タンパク質結合のために免疫アッセイ等を含む多種多様なアッセイがこの目的で使用され得る。合成の又は天然の化合物のライブラリを含む多種多様な供給源から候補の剤が得られる。たとえば、無作為化したオリゴヌクレオチド及びオリゴペプチドの発現を含む、多種多様な有機化合物及び生体分子の無作為合成及び指定合成のために多数の手段が利用可能である。或いは、細菌、真菌、植物及び動物の抽出物の形態での天然の化合物のライブラリが利用可能であり、容易に産出される。或いは、従来の化学的な、物理的な及び生化学的な手段を介して、天然に又は合成で産出したライブラリ及び化合物を容易に修飾し、コンビナトリアルライブラリを産出するのに使用し得る。既知の医薬剤を指定の又は無作為の化学修飾、たとえば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等に供して構造的類似体を産出し得る。種々の他の試薬をスクリーニングアッセイに含め得る。これらには、最適なタンパク質／タンパク質結合を促進し、及び／又は非特異的な若しくはバックグランドの相互作用を減らすのに使用される塩、中性タンパク質、たとえば、アルブミン、界面活性剤等のような試薬が挙げられる。アッセイの効率を改善する試薬、たとえば、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤等が使用され得る。必要な結合を提供する成分の混合物が任意の順序で添加される。任意の好適な温度、通常、４〜４０℃の間でインキュベートが行われる。インキュベート時間は最適な活性について選択されるが、迅速な高処理能力スクリーニングを円滑にするようにも最適化され得る。通常、０．１〜１時間の間が十分である。
【００４７】
ＰＩ３Ｋ活性化因子
ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３−キナーゼ又はＰＩ３Ｋ）は、ホスファチジルイノシトール（ＰｔｄＩｎｓ）のイノシトール環の３位のヒドロキシル基をリン酸化することが可能である、細胞の成長、増殖、分化、運動性、生存及び細胞内輸送のような細胞性機能に関与する酵素のファミリーである。
【００４８】
クラスＩのＰＩ３Ｋは、ホスファチジルイノシトール３−リン酸（ＰＩ（３）Ｐ）、ホスファチジルイノシトール（３，４）−二リン酸（ＰＩ（３，４）Ｐ２）及びホスファチジルイノシトール（３，４，５）−三リン酸（ＰＩ（３，４，５）Ｐ３）の生成に関与する。ＰＩ３ＫはＧタンパク質共役受容体及びチロシンキナーゼ受容体によって活性化される。
【００４９】
クラスＩのＰＩ３Ｋは、配列類似性にてＩＡとＩＢのサブセットにさらに分けられる調節サブユニットと触媒サブユニットから構成されるヘテロ二量体分子である。クラスＩのＰＩ３キナーゼはｐ１１０として知られる触媒サブユニットとｐ８５又はｐ１０１のいずれかに関連する調節サブユニットで構成される。ｐ８５サブユニットはＳＨ２ドメインとＳＨ３ドメインを含有する。
【００５０】
ＰＩ３Ｋの活性化因子は酵素の活性を高める。当該活性化因子には、限定しないで、ＰＩ３Ｋのｐ８５調節サブユニットのＳＨ２ドメインに結合して酵素活性を刺激することが可能である細胞透過性のホスホ−ペプチド（７４０Ｙ−Ｐ）が挙げられる（市販のペプチド、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＳＤＧＧＹＭＤＭＳ、修飾：Ｔｙｒ−２５＝ｐＴｙｒ）。他の活性化因子には、ｆＭＬＰ（Ｉｎｏｕｅ、Ｔ，  Ｍｅｙｅｒ、Ｔ．（２００８）  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＰＩ３Ｋ  ａｎｄ  Ｒａｃ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ａｎ  ＡＮＤ−Ｇａｔｅ  Ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ．  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ３（８）：ｅ３０６８を参照のこと。参照によって本明細書に組み入れられるＢａｓｔｉａｎら、Ｍｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００６；４（６）．Ｊｕｎｅ、２００６；Ｐａｒｋら、Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌｕｍｅ  ２６５，Ｉｓｓｕｅ  ３，３０、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００９，８０−８６ページも参照のこと）が挙げられる。
【００５１】
治療のための候補
生きている卵胞を保有するヒト女性対象は誰でも本発明の方法による治療の候補である。通常、対象は、早発閉経を含む何らかの形態の不妊を患う。たとえば、対象は正常な卵母細胞の産生を経験し得るが、たとえば、ＰＣＯＳの又はＰＣＯＳ様の卵巣のような受精の障害を有し得る。本発明の方法は、卵巣の刺激プロトコールを含む従来の体外受精法の好適な候補ではない女性にて特に有用であり得る。含まれるのは従来のＦＳＨ治療に低応答の患者である。
【００５２】
上記で記載されたように、本発明の方法は、種々の非ヒト動物、普通、哺乳類、たとえば、ウマ、イヌ、ウシ等での不妊の治療にも有用である。
【００５３】
早発閉経（ＰＯＦ）は女性の１％に生じる。ＰＯＦの既知の原因には、Ｘ染色体又は常染色体が関与する遺伝子異常と同様に自己免疫性の卵巣損傷が挙げられる。現在のところ、ＰＯＦ患者における不妊治療について判明している唯一の手段には供与された卵母細胞による補助受胎が関与する。癌の治療を受けている女性のような卵巣不全が予想される場合、胚の冷凍保存、卵巣の冷凍保存及び卵母細胞の冷凍保存が期待できるが、他の選択肢はほとんどない。ＰＯＦの病因の不均質性のために、様々な量の残存原始卵胞が活性化のために患者の卵巣でそのまま存在する。
【００５４】
卵胞枯渇の程度はＰＯＦ患者の間で様々である。本発明の方法は、本発明の方法を用いてＰＯＦ患者における残った卵胞の活性化を可能にして早期卵胞の排卵前期までの発達を促進する。これには、ＩＶＦ及び胎児の移動に続くその後の妊娠のために成熟卵母細胞の回収が続き得る。
【００５５】
現代社会における出産年齢の遅延のために、多くの女性、たとえば、約４０〜４５歳の不妊女性が加齢の間に卵巣予備能を減らした結果としての不妊も経験している。初期胞状卵胞の排卵前期への発達を促進するのに性腺刺激ホルモン治療が広く使用されているが、多数の閉経周辺期患者は性腺刺激ホルモン療法に応答しない。これらの女性はまだ種々の数の原始卵胞を有するので、彼女らも本発明の方法から恩恵を受ける。
【００５６】
多嚢性卵巣症候群は、軽い肥満、月経不順又は無月経、及びアンドロゲン過剰の兆候（たとえば、多毛症、ニキビ）を特徴とする臨床症候群である。ほとんどの患者では、卵巣は複数の嚢胞を含有する。診断は妊娠検査、ホルモン測定及び男性化腫瘍を排除するための画像診断による。治療は症候性である。多嚢性卵巣症候群は女性の５〜１０％で生じ、無排卵又は排卵不全、及び不明瞭な病因のアンドロゲン過剰が関与する。それは普通、臨床症候群として定義され、卵巣嚢胞の存在によっては定義されない。卵巣は平滑で肥厚した被膜を伴って肥大し得る、又は正常な大きさであり得る。通常、卵巣は多数の２〜６ｍｍの卵胞嚢胞を含有し、時には閉鎖細胞を含有する大きな嚢胞を含有する。エストロゲンのレベルは上昇し、子宮内膜増殖症のリスク及び最終的には子宮内膜癌のリスクが高まる。アンドロゲンのレベルは上昇することが多く、メタボリック症候群のリスクが高まり、多毛症を起こす。長期的に見ると、アンドロゲン過剰は、高血圧症を含む循環器疾患のリスクを高める。
【００５７】
卵母細胞の成熟を高める方法
胞状卵胞及び排卵前卵胞までの発達を刺激するのに十分な時間、Ｈｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤、又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤の少なくとも一方の有効用量に卵胞を接触させることによって試験管内又は生体内で哺乳類の卵胞の発達を促進する方法が提供される。
【００５８】
任意で、発育を開始するように卵胞を追加的に誘導するのに十分である濃度にてＰＴＥＮの阻害因子及びＰＩ３Ｋの活性化因子の一方又は双方も卵胞に接触させる。
【００５９】
本発明の一部の実施形態では、暴露は試験管内で、たとえば、器官培養又は組織培養にて実施され、その際、少なくとも１つの卵胞がＨｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤、又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤の少なくとも一方の有効用量に一時的に暴露される。一部の実施形態では、無処置の卵巣がこのように処理される。
【００６０】
処理された卵胞を試験管内目的で、たとえば、体外受精、胚性幹細胞の生成等に利用してもよく、又は移植して生体内用途を提供してもよい。当該移植様式には、限定しないで、卵巣のすべて又は分画を腎被膜に、卵管に、皮下部位に、卵巣部位に移植することを含む１以上の卵胞の移植が挙げられ、たとえば、一方の卵巣が保持され、一方は生体外処理のために取り出されている場合、１以上の処理された卵胞は残っている卵巣の部位に移植され得る。
【００６１】
一部の実施形態では、卵巣を切断してＨｉｐｐｏシグナル伝達を破壊することによって、又は少なくとも１つの卵胞をＨｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤の少なくとも一方に接触させることによって、並びにさらに、卵胞の発育と分化を刺激する追加の効果を提供するホスファターゼ・テンシンホモログ（ＰＴＥＮ）阻害因子及びホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）活性化因子の少なくとも一方に卵胞を接触させることによって試験管内の方法は、Ｈｉｐｐｏ経路の破壊による処理を組み合わせる。
【００６２】
一部の実施形態では、試験管内の処理には卵巣の移植が続き、それには体外受精又は体内受精が続き得る。
【００６３】
Ｈｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤の少なくとも一方の有効用量への暴露に続いて、個体は、卵胞の発育を開始するのに有効である濃度にて組換え卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、体内宿主動物にて天然に存在するＦＳＨ、ＦＳＨ類似体、たとえば、ＦＳＨ／ＣＴＰ、ペグ化ＦＳＨ等を含むＦＳＨ又はＦＳＨ類似体で治療され得る。
【００６４】
卵胞が胞状段階まで刺激されている場合、個体は、排卵用量での黄体形成ホルモン（ＬＨ）又はそのアゴニストで治療され得るが、そのアゴニストには具体的には絨毛性性腺刺激ホルモン、たとえば、ウマ絨毛性性腺刺激ホルモン（ｅＣＧ）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ＨＣＧ）等が挙げられる。加えて、卵胞は、ｃ−ｋｉｔリガンド、神経栄養因子、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−４、ＢＭＰ−７、白血病阻害因子、塩基性ＦＧＦ、角化細胞増殖因子等の１以上に生体内で又は試験管内で暴露され得る。
【００６５】
Ｈｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤の用量は、上述のように前胞状卵胞を刺激して胞状卵胞への発達を誘導するのに十分であり、そのようなものとして、使用される特定の剤、それが培養に提供される期間の長さ、卵胞の状態等に従って変化するであろう。濃度の経験的な決定について当該技術で既知の方法が使用され得る。有効成分の毒性及び治療有効性は、たとえば、ＬＤ５０（集団の５０％まで致死である用量）及びＥＤ５０（集団の５０％にて治療上有効な用量）を決定することを含む細胞培養及び／又は実験動物にて標準的な薬学手順に従って決定することができる。毒性効果と治療効果の間の比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を呈する化合物が好まれる。
【００６６】
例として、少なくとも約１時間〜約２４時間、及び約６〜約１２時間であってもよい一時的な期間、以前示した濃度にてＨｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤の一方又は双方に卵胞培養物を接触させ得る。濃度は剤の効能を反映するように調整され得る。
【００６７】
卵胞の成熟に続いて、卵胞に存在する卵母細胞は試験管内目的で利用され得る。一部の実施形態では、卵母細胞は直接利用され、他では、卵母細胞の成熟を調節する１以上の因子に卵胞を接触させ、たとえば、卵母細胞の試験管内での成熟を誘導するのに十分な濃度のＦＳＨ又はＦＳＨ類似体に培養物を接触させてもよく、その際、ＦＳＨ又はＦＳＨ類似体は、組換えであってもよく、修飾されてもよく、ネイティブ等であってもよい。試験管内での成熟に続いて、卵母細胞は着床のために体外受精させてもよく、幹細胞株の生成のために体外受精させてもよく、受精させずに種々の研究目的等に利用されてもよい。
【００６８】
ｃ−ｋｉｔリガンド（Ｈｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６；  Ｐａｒｒｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｋｉｎｎｅｒ，  １９９９）、神経栄養因子（Ｏｊｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）、血管内皮増殖因子（Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）−４（Ｔａｎｗａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）、ＢＭＰ７（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）、白血病阻害因子（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）、塩基性ＦＧＦ（Ｎｉｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）、角化細胞増殖因子（Ｋｅｚｅｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）等の１以上の存在下で卵胞をさらに培養し得るし、その際、因子は、Ｈｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤と併せて加え得る、又はＨｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤の一方若しくは双方への暴露に続いて加え得る。たとえば、ＦＳＨによる卵母細胞の成熟に続いてｅＣＧ及び／又はＨＣＧを含むＬＨアゴニストが投与され得る。
【００６９】
他の実施形態では、成熟のために卵胞が動物レシピエントに移植され得る。上記で記載したように、卵巣部位、腎臓部位、皮下部位等に卵巣又はその断片を移植するための方法は当該技術で既知であり、用途を見いだし得る。卵巣組織が卵巣に移植される場合、追加の体外操作をすることなく受精は進行し得る。卵巣組織が非卵巣部位、たとえば、皮下部位に移植される場合、卵母細胞はその後、体外受精のために取り出され得る。レシピエントは卵母細胞の成熟のために内在性のＦＳＨを提供し得る、又は組換えの長期作用型ＦＳＨ／ＣＴＰ等を含む外来性のＦＳＨ又はＦＳＨ類似体がこの目的で提供され得る。
【００７０】
他の実施形態では、暴露は生体内で卵巣に対して局所で行われ、又は個体に対して全身的に投与される。ヒトの投与量の範囲を定式化するのに細胞培養及び／又は動物試験から得られたデータを使用することができる。有効成分の投与量は通常、毒性がほとんどない又は毒性がないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は採用される剤形及び利用される投与経路に応じてこの範囲の中で変化することができる。個体は通常、少なくとも約６時間、普通少なくとも約１２時間有効濃度と接触し、少なくとも１日及び約１週間以下、普通約３日以下で接触し得る。
【００７１】
組成物は所望の製剤に応じて、動物又はヒトへの投与のために医薬組成物を製剤化するのに一般に使用されるビヒクルとして定義される薬学上許容可能な非毒性のキャリア又は希釈剤も含むことができる。希釈剤は組み合わせの生物活性に影響を及ぼさないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、緩衝液、生理的な生理食塩水、ＰＢＳ、リンガー溶液、デキストロース溶液、及びハンクス溶液である。加えて、医薬組成物又は製剤は、他のキャリア、補助剤、又は非毒性の非治療用の非免疫性の安定剤、賦形剤等を含むことができる。組成物は、たとえば、ｐＨ調整剤、及び緩衝剤、毒性調整剤、湿潤剤及び界面活性剤のようなほぼ生理的な状態に対する追加の物質を含むこともできる。
【００７２】
組成物は、たとえば、抗酸化剤のような種々の安定剤のいずれかを含むこともできる。医薬組成物がポリペプチドを含む場合、ポリペプチドは、ポリペプチドの生体内の安定性を高める、又はさもなければ、医薬特性を高める（たとえば、ポリペプチドの半減期を延ばす、毒性を低減する、溶解度又は取り込みを高める）種々の周知の化合物と複合体化することができる。そのような修飾剤又は複合体化剤の例には、硫酸塩、グルコン酸塩、クエン酸塩、及びリン酸塩が挙げられる。組成物のポリペプチドは生体内の特質を高める分子とも複合体化することができる。そのような分子には、たとえば、炭水化物、ポリアミン、アミノ酸、他のペプチド、イオン（たとえば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、マンガン）及び脂質が挙げられる。
【００７３】
種々の型の投与に好適である製剤に関するさらなる指針は、ＲｅｍｉｎｇｔｏｎのＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，第１７版（１９８５）にて見いだすことができる。薬剤送達の方法の手短な概説については、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９：１５２７−１５３３（１９９０）を参照のこと。
【００７４】
Ｈｉｐｐｏ経路におけるシグナル伝達を破壊する剤又は破壊されたＨｉｐｐｏシグナル伝達の下流で作用する剤の少なくとも一方の有効用量を種々の異なる経路で投与することができる。例には、経口、局所、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮下、経皮、卵巣内の方法を介して組成物を投与することが挙げられる。医薬剤形では、薬学上許容可能な塩の形態で化合物が投与され得る、又はそれらは単独で使用され得る、又は他の医薬活性化合物との併用でと同様に適当な関連で使用され得る。
【００７５】
用語「単位剤形」は本明細書で使用されるとき、ヒト及び動物の対象にとっての単位投与量として好適な物理的に別々の単位を指し、各単位は、薬学上許容可能な希釈剤、キャリア又はビヒクルとの関連で所望の効果を生じるのに十分な量で算出された所定の量の本発明の化合物を含有する。本発明の新規の単位剤形の仕様は、採用される特定の化合物、及び達成される効果、及び宿主における各化合物に関連した薬物動態に左右される。
【００７６】
全身性投与のための典型的な投与量は、投与当たり対象の体重ｋｇ当たり０．１μｇ〜１００ミリグラムの範囲に及ぶ。典型的な投与量は、１日２〜６回服用される錠剤１つ、又は１日１回服用され、比例的に高い有効成分の含量を含有する徐放性のカプセル若しくは錠剤１つであり得る。徐放性の効果は、異なるｐＨ値で溶解するカプセル材料によって、浸透圧によりゆっくり放出するカプセルによって、又は制御放出の他の既知の手段によって得られ得る。
【００７７】
当業者は、用量レベルが特定の化合物、症状の重症度、及び副作用に対する対象の感受性の関数として変化し得ることを容易に十分に理解する。特定の化合物の一部は他よりも強力である。所与の化合物の好まれる投与量は種々の手段により当業者によって容易に決定できる。好まれる手段は所与の化合物の生理的な効能を測定することである。
【００７８】
そのような暴露に続いて、個体は、成熟卵母細胞を放出するのに有効である濃度にて、制限しないで生体内宿主動物にて天然に存在するＦＳＨ、たとえば、ＦＳＨ／ＣＴＰ、単鎖類似体、ペグ化ＦＳＨ等のようなＦＳＨ類似体を含む組換えＦＳＨ又はＦＳＨ類似体で治療され得る。個体は、上述のようなＬＨアゴニストによっても治療され得る。或いは、卵母細胞が卵巣から取り出され、上述のように体外操作に利用され得る。
【００７９】
実験
以下の実施例は、主題の発明をどのように為し、使用するのかの完全な開示及び記載を当業者に提供するために提示されるのであって、発明として見なされるものの範囲を限定することが意図されるものではない。使用される数（たとえば、量、温度、濃度等）に関して精度を保証するように努力が為されたが、若干の実験誤差及び実験偏差は許されるべきである。特に指示されない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。
【００８０】
実施例１
卵巣の断片化はＨｉｐｐｏシグナル伝達を破壊して卵巣の発育を促進する。
原発性卵巣不全（ＰＯＩ）及び多嚢性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）は不妊の原因となる卵巣疾患である。ＰＯＩの有効な治療はないが、ＰＣＯＳの治療法には卵胞の発育を誘導する卵巣楔状切除又はレーザー穴あけが挙げられる。これらの破壊的な手順の根底にあるメカニズムは不明瞭である。ここでは、我々は、臓器及び種を越えて最適なサイズを維持するのに役立つ保存されたＨｉｐｐｏシグナル伝達経路の役割を探索した。我々は、マウス卵巣の断片化がアクチンの重合を促進し、卵巣のＨｉｐｐｏシグナル伝達を破壊して下流の成長因子の高い発現、卵胞発育の促進、及び成熟卵母細胞の生成をもたらすことを見いだした。卵巣の損傷によって引き出される卵胞の発育の根底にあるメカニズムを解明することに加えて、我々はさらに卵巣の断片化をＡｋｔ刺激因子の処理と組み合わせた場合の追加の卵胞の発育を明らかにした。卵巣の断片化による試験管内での活性化のアプローチは、ＰＯＩ患者の不妊を治療するために価値があるだけでなく、中年の不妊女性、不妊化治療を受けている癌患者、及び低下した卵巣予備能の他の状態にも有用である。
【００８１】
生殖年齢の５〜１０％の女性が多嚢性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）のために不妊であるのに対して、彼女らの１％は原発性卵巣不全（ＰＯＩ）のために不妊を患っている。彼女らは異常な卵胞発育のために不妊である。早くも１９３０年代には、卵巣楔状切除をＰＣＯＳ治療に用いて卵巣発育を誘導し、その後、ジアテルミー又はレーザーによる卵巣の穴あけに基づく最近の成功が続いた。加えて、卵巣皮質を日常的に断片化して不妊化治療を受けた癌患者にて受精能の維持のためのさらに良好な凍結及び移植を可能にする。卵巣断片のその後の自家移植は自然発生的な卵胞発育に関連する。しかしながら、卵胞発育を促進するこれらの破壊的な手順の根底にあるメカニズムは不明瞭である。
【００８２】
Ｈｉｐｐｏシグナル伝達経路は最適な器官サイズを維持するのに必須であり、後生動物すべてにおいて保存されている。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達は、カギとなるＨｉｐｐｏシグナル伝達のエフェクター、ＹＡＰ（Ｙｅｓ関連のタンパク質）／ＴＡＺ（ＰＤＺ結合モチーフを持つ転写共活性化因子）を最終的にリン酸化し、不活化するキナーゼカスケードで作用する幾つかの負の成長調節因子から成る。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達が破壊されると、ＹＡＰリン酸化の低下がＹＡＰの核内レベルを高める。ＹＡＰはＴＥＡＤ転写因子と協調して作用し、下流のＣＣＮ成長因子及びＢＩＲＣアポトーシス阻害因子を増やす。ＣＣＮタンパク質は同様に細胞の成長、生存及び増殖を刺激する。
【００８３】
マウスのモデルを用いて、我々は卵巣の断片化及び同種移植に続く卵胞発育の促進を実証した。卵巣の断片化は、アクチンの重合を高め、ホスホＹＡＰレベルを下げ、ＹＡＰの核局在化を高め、同様にＣＣＮ成長因子及びＢＩＲＣアポトーシス阻害因子の発現を高めた。断片化が誘導する卵胞の発育はＣＣＮ２抗体及びベルテポルフィン、ＹＡＰのＴＥＡＤ転写因子との相互作用を阻害する小分子によって部分的に阻止された。ＰＴＥＮ欠損マウスを用いた試験は原始卵胞及び二次卵胞の発達におけるＡｋｔシグナル伝達の刺激性の役割を示した。
【００８４】
結果
卵巣の断片化は卵胞発育を促進した。我々は二次卵胞及びさらに小さい卵胞を含有する若年（１０日齢）マウスの卵巣を断片化し、その後成熟宿主の腎被膜下に同種移植した。図１Ａに示すように、対の無処置の卵巣に比べて、３つの小片に卵巣を切断し、５日間移植した後の移植片サイズの大きな増加が明らかだった。移植片の重量は、卵巣を２〜４の小片に切断した後、又は移植前に断片を２４時間までインキュベートした後、増加した（図１Ｂ）。組織学的な解析（図４Ａ）及び移植片の卵胞計数（図１Ｃ及び４Ｂ）は断片化／移植の後の卵胞総数の損失を示した。しかしながら、後期二次卵胞及び胞状／排卵前の卵胞の比率の大きな増加は、原始卵胞の低下を伴って明らかだった（図１Ｃ）。１０日齢の卵巣に比べて、移植手順は原始卵胞、一次卵胞及び早期二次卵胞の絶対数の低下につながった（図４Ｂ）。さらに２３日齢の動物に由来する初期胞状卵胞を含有するものを含む年長マウスの卵巣の切断／移植も移植片重量を増やした（図１Ｄ）。
【００８５】
５日間移植した後、宿主は排卵用量のｈＣＧを投与された。図４Ｃに示すように、卵巣当たりの断片化した移植片から回収された卵母細胞の数は無処置の移植片のそれの３．１倍であり、成熟卵母細胞の高い比率を伴った。断片化した移植片から回収された成熟卵母細胞を受精させ、早期胚の発生は対照に匹敵した。胚移植の後、健常な仔を出産させた（図４Ｄ）。マウスの試験と同様に、ラットからの卵巣の断片化／自家移植も移植片重量を増やした（図４Ｅ、Ｆ）。
【００８６】
卵巣の断片化はアクチン重合を高め、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達を破壊した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ及び免疫ブロット解析（図５Ａ、Ｂ）は若年マウスの卵巣にてカギとなるＨｉｐｐｏシグナル伝達遺伝子の転写産物及びタンパク質の発現を示した。また、成熟マウスからの卵巣の免疫組織化学染色（図５Ｃ）は、あらゆるサイズでの卵胞の顆粒膜細胞、莢膜細胞及び卵母細胞の主として細胞質にて、しかし、黄体では低レベルでのＭＳＴ１／２、ＳＡＶ１、ＬＡＴ４／２及びＴＡＺの発現を示した。
【００８７】
球状アクチン（Ｇ−アクチン）のフィラメント状アクチン（Ｆ−アクチン）への重合は、細胞の形状維持及び移動に重要である。最近のゲノム規模でのＲＮＡｉスクリーニングは、ショウジョウバエの成虫原基及びヒトＨｅＬａ細胞にてＦ−アクチンの過剰形成の誘導がＨｉｐｐｏシグナル伝達を破壊し、過剰成長を誘導することを明らかにした。図２Ａに示すように、卵巣断片化の１時間後にＦ−アクチンとＧ−アクチンの比における一時的な上昇が検出された。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達キナーゼカスケードはＹＡＰをリン酸化してその細胞質の局在及び分解を促進するので、その転写作用を低下させる。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達が破壊されると、ホスホＹＡＰ（ｐＹＡＰ）の低下が核ＹＡＰレベルを高める。卵巣の断片化及び１時間のインキュベートの後、ｐＹＡＰのレベルの低下及びｐＹＡＰと総ＹＡＰの比の低下が明らかであった（図２Ｂ）ということは、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達の破壊を示唆している。１０日齢マウスに由来する無処置の卵巣では、免疫組織化学染色は、ＹＡＰが一次段階及び二次段階でのほとんどの卵胞の顆粒膜細胞の細胞質に局在する（図５Ｄ）ことを示した。断片化の４時間後、ＹＡＰの核染色は一次卵胞及び二次卵胞の顆粒膜細胞にて見いだされた。
【００８８】
Ｈｉｐｐｏシグナル伝達の破壊は下流のＣＣＮ成長因子及びＢＩＲＣアポトーシス阻害因子の高い発現につながる。図２Ｃに示すように、卵巣の断片化及びその後の移植は、断片化した卵巣にて幾つかのＣＣＮ成長因子（ＣＣＮ２、３、５及び６）及びアポトーシス阻害因子（ＢＩＲＣ１及び７）の転写産物レベルを高めた。移植をしない連続培養に続いて同様の変化が見いだされた（図６Ａ）。高度に発現されたＣＣＮ２の免疫ブロットは断片化した卵巣でのＣＣＮ２タンパク質の増加を明らかにした（図２Ｄ）。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は、体細胞での、しかし、卵母細胞においてではない断片化が誘導したＣＣＮ２転写産物の増加を示した（図６Ｂ）。
【００８９】
ＣＣＮ２、３、５及び６との培養の後の卵巣の外植片重量における用量依存性の増加によってＣＣＮタンパク質の卵巣発育を促進する能力をさらに明らかにした（図２Ｅ）。卵胞の動態の解析が卵巣外植片における一次卵胞の後期二次段階への発達を促進するＣＣＮ因子の能力を示した（図６Ｃ）ということは、卵巣成長因子としてのＣＣＮタンパク質の役割を強調している。
【００９０】
断片化が誘導した卵胞発育におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達及びＣＣＮ２の役割を述べる。ＹＡＰは転写活性を有さず、その作用は下流の転写因子に依存する。最近の薬剤ライブラリのスクリーニングは、ＴＥＡＤ転写因子とのＹＡＰの関連を阻害し、ＹＡＰが誘導する肝臓の過剰増殖を抑えることが可能である小分子、ベルテポルフィンを特定した。断片化が誘導するＣＣＮ及びＢＩＲＣの変化が一時的だったので、我々は断片化のために卵巣を得る前に３時間、１０日齢のマウスにベルテポルフィンを注射した。図７Ａに示すように、ベルテポルフィンによる事前処理は、二次卵胞のマーカーである抗ミュラー管ホルモン（ＡＭＨ）の転写産物に影響することなく、ＣＣＮ２転写産物の断片化が誘導する増加を阻止した。
【００９１】
ビヒクルで事前処理した動物に由来する無処置卵巣対及び断片化した卵巣対の間で見られた移植片重量の増加とは対照的に、ベルテポルフィンによる事前処理後の無処置卵巣対及び断片化した卵巣対の間では移植片重量の有意な変化は見いだされなかった（図７Ｂ）。移植片の卵胞の計数はベルテポルフィンの事前処理による卵胞総数の損失がないことを示した（図７Ｃ）。それに対して、ベルテポルフィンの事前処理は、胞状卵胞／排卵前卵胞の軽い抑制を伴って後期二次卵胞の断片化が誘導する増加を妨げた。我々はさらに移植の前に１８時間、ＣＣＮ２抗体と共に卵巣断片をインキュベートした。内在性ＣＣＮ２の中和は断片化が誘導する移植片重量の増加を７５％抑えた（図７Ｄ）。これらの知見は、断片化が誘導する卵胞の発育におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達の役割を強調している。
【００９２】
二次卵胞の発育に対するＨｉｐｐｏシグナル伝達の破壊及びＡｋｔ刺激の追加の効果を述べる。原始卵胞の発達におけるＡｋｔシグナル伝達の刺激性の役割に加えて、二次卵胞の顆粒膜細胞におけるＰＴＥＮ遺伝子の条件付きの欠損も卵胞の発育を促進した。我々は、若年マウスから二次卵胞を単離し、二次卵胞の発育を促進するＡｋｔ刺激薬剤（ＰＴＥＮ阻害剤及びＰＩ３Ｋ活性化剤）の能力を明らかにした（図３Ａ）。我々はさらに、卵巣移植片の発育に対するＡｋｔ刺激薬剤とＨｉｐｐｏシグナル伝達破壊の併用効果を調べた。二次卵胞及びそれより小さい卵胞を含有する１０日齢マウスから得た卵巣を用いて、我々は、断片化した卵巣をＡｋｔ刺激薬剤と共にインキュベートし、その後移植した場合、卵巣移植片重量の相加的な増加を見いだした（図３Ｂ）。卵胞の計数は、断片化及びＡｋｔ刺激によって誘導された後期二次卵胞及び胞状／排卵前卵胞の増加を示した（図３Ｃ及び図８）。
【００９３】
我々は、二次卵胞及びそれより小さい卵胞を含有するヒト卵巣皮質立方体を入手した。ＲＴ−ＰＣＲ解析はカギとなるＨｉｐｐｏシグナル伝達遺伝子の発現を明らかにした（図９Ａ）のに対して免疫組織化学解析は原始卵胞から二次卵胞までの顆粒膜細胞、莢膜細胞及び卵母細胞におけるＳＡＶ１、ＬＡＴ４／２、ＹＡＰ及びＴＡＺの発現を示した（図９Ｂ）。次いで我々は、凍結保存したヒトの卵巣皮質細片（１〜２ｍｍの厚さ及び１×１ｃｍ）を融解し、インキュベートの前にそれらを小さな立方体（１〜２ｍｍ２）に切断した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析はＣＣＮ２、３、５及び６の転写産物レベルでの時間依存性の増加を示した（図９Ｃ）。細片に由来するさらなる断片化の後の卵巣立方体にてさらに高いＣＣＮ成長因子の発現が見いだされたということは、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達の、断片化が誘導した破壊を示唆している。次いで我々は二次卵胞及びそれより小さい卵胞を含有するヒト卵巣皮質細片を切断し（図３Ｄ）、Ａｋｔ刺激因子と共にインキュベートした後、免疫不全マウスに異種移植した。４週間以内に胞状卵胞が検出されたということは、迅速な卵胞発育を実証している（図３Ｅ、Ｆ）。
【００９４】
複数の器官系及びモデル生物にわたる知見は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達を器官サイズの維持に関係付けている。しかしながら、我々の結果は哺乳類の卵巣におけるＨｉｐｐｏシグナル伝達の役割を独特に実証している。我々のデータは、ＹＡＰの核局在の増加と一緒にｐＹＡＰレベルを低下させてＣＣＮ成長因子とＢＩＲＣアポトーシス阻害因子の発現の上昇につなげることによって卵巣の断片化がアクチンの重合を高め、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達を破壊したことを示している。分泌されたＣＣＮ２及び関連する因子は移植後の卵胞の発育を促進した（図１０）。
【００９５】
ほとんどの卵胞が局所のＨｉｐｐｏシグナル伝達に起因する生理的な条件下での発育に拘束されるのは明らかである。卵胞の発育を抑えることにおけるＨｉｐｐｏシグナル伝達遺伝子の役割に一致して、肝細胞におけるＳＡＶ１遺伝子又はＭＳＴ１／２遺伝子の特異的な欠損は肥大した肝臓を生じた。同様に、ＳＡＶ１の条件付きの欠損は肥大した心臓をもたらした。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達は組織の再生及び組織特異的な前駆細胞の増殖にも重要である。卵巣については、ＬＡＴ４を持たないメスマウスはＰＯＩの表現型を示すのに対してＬＡＴ４は一部のＰＯＩ患者において変異した遺伝子であるＦＯＸＬ２の転写活性を調節する（図１０、四角で囲った）。ゲノム規模の関連試験もＰＣＯＳの感受性遺伝子としてのＹＡＰを関係付けたのに対して、マウスの卵巣顆粒膜細胞におけるＣＣＮ２／ＣＴＧＦの欠損は低受精率及び異常な卵胞発達をもたらした。また、ゲノム規模の解析はＰＯＩ患者におけるＢＩＲＣ１の遺伝子コピー数の変化を特定した。
【００９６】
Ｈｉｐｐｏシグナル伝達の破壊及び核ＹＡＰの蓄積には、張線維におけるＦ−アクチンの形成が必要とされる。Ｈｉｐｐｏシグナル伝達遺伝子であるＭＳＴ１／２、マーリン及びＡｍｏｔがすべてアクチンに結合するので、Ｆ−アクチンは多分Ｈｉｐｐｏシグナル伝達成分の足場として機能する。上流のｄｉａｐｈａｎｏｕｓ（ＤＩＡＰＨ）遺伝子はアクチンの核生成を加速し、アクチンの脱重合を抑制する。興味深いことに、ＤＩＡＰＨ２コーディング領域の破壊はＰＯＩファミリーで見いだされたのに対して、ゲノム規模の関連試験は卵胞予備能及び閉経を調節することにおける候補遺伝子としてもＤＩＡＰＨ２及びＤＩＡＰＨ３を特定した（図１０）。デキストラン硫酸ナトリウムを用いた腸管の損傷は陰窩の再生にて総ＹＡＰに対するｐＹＡＰの比を低下させる。また、ＣＣＮ１／ＣＹＲ６１は腎臓の虚血性潅流の損傷に続いて近位直尿細管にて誘導された。閉鎖膀胱では、ＣＣＮ２／ＣＴＧＦ及びＣＣＮ１／ＣＹＲ６１の発現も誘導された。
【００９７】
アクチン重合に続くＨｉｐｐｏシグナル伝達の破壊は、組織の損傷及びリモデリングを調節すること、構造成分の機械的な変化を細胞内シグナル伝達につなげることにおける一般的なメカニズムを表しているようである。卵巣の断片化によって誘導されるアクチン重合及び下流の事象における変化は実際一時的であったし、ＣＣＮ２／３／５／６の転写産物レベルの上昇は、凍結したヒトの卵巣細片を融解の後、断片化した場合でさえ生じた。
【００９８】
ＣＣＮ成長因子及びアポトーシス阻害因子はＰＩ３Ｋ／ＴＯＲシグナル伝達経路を含む追加の下流の変化を誘導して卵胞の発育を促進するようである。移植の間での血管新生の変化を排除することはできないが、ＣＣＮ２抗体又はベルテポルフィンによる処理が断片化によって誘導される移植片重量の増加を部分的に抑えるということは、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達の役割を強調している。一部のＰＣＯＳの卵巣における硬い硬化性被膜に関連する機械的な張力は、卵胞発達の停止を招き得る。ＰＣＯＳ患者における卵巣楔状切除又はジアテルミー／レーザーによる「穴あけ」は卵胞の発育を生じ、評判が良い性腺刺激ホルモン治療と比べて匹敵する生児出生率を生じる。我々の試験は、ＰＣＯＳの卵巣の切断又は穴あけによって被る損傷がアクチン重合を高め、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達を破壊して卵胞発育を促進することができることを示している。アクチン重合剤又はＣＣＮ成長因子の局所投与はＰＣＯＳ患者に新しい治療を提供し、卵巣の損傷に関連する卵胞の損失をできるだけ少なくし得る。
【００９９】
マウスの二次卵胞の顆粒膜細胞におけるＰＴＥＮ遺伝子の条件付き欠損は卵胞発育を促進した。我々は、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達の破壊（断片化）及びＡｋｔ刺激（ＰＴＥＮ阻害因子及びＰＩ３Ｋ活性化因子による処理）に続く卵巣移植片重量及び卵胞発育における相加的増加を明らかにした。現在のＩＶＡプロトコールを用いて、免疫不全マウスにてヒトの二次卵胞の胞状段階までの迅速な発育が見いだされた。個々のＰＯＩ卵巣における残存卵胞の正確な段階は不明であるけれども、我々は数人の患者から２、３週間で排卵前卵胞を生成した。現在のアプローチはＰＯＩ患者のための新しい不妊治療法に相当する。
【０１００】
ＰＯＩに加えて、現在のアプローチは不妊化治療を受けている癌患者及び卵巣予備能の低下の他の状態における受精率維持に使用することができる。閉経は平均５１歳で生じるが、４０〜４５歳の間の多くの中年女性は加齢に関連する不妊に悩まされている。彼女らの卵巣は依然として二次卵胞及びそれより小さな卵胞を含有するので、我々のアプローチは有効であるはずである。卵母細胞における遺伝的損傷の年齢又は環境に関連する増加を克服することなく、現在のアプローチは胚発生のためにさらに多くの成熟卵母細胞を提供する。
【０１０１】
方法
動物：ＣＤ１マウス及びＢ６Ｄ２Ｆ１マウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（マサチューセッツ州、ウィルミントン）から購入し、餌と水を自由摂取にして１２時間明暗のもとでスタンフォード大学の動物施設で飼育した。現地の動物研究委員会の指針に従ってマウスを処理した。
【０１０２】
患者試料：ヒトの卵巣皮質立方体は良性の卵巣腫瘍があるが、正常な月経周期を呈する３人の患者（３２歳、３３歳及び３６歳）から得た。加えて、皮質立方体（５×５ｍｍ）は、将来妊娠を計画していない帝王切開患者（２３〜３７歳）から得た。患者からのインフォームドコンセント及び秋田大学のヒト対象委員会からの認可を得た。試料はすべて直ちに−７０℃で保存した。腫瘍を持つ患者に由来する原始卵胞、一次卵胞及び二次卵胞を含有する皮質立方体をＲＴ−ＰＣＲ及び免疫組織化学染色に使用してＨｉｐｐｏシグナル伝達遺伝子の発現を測定した。帝王切開患者に由来する皮質立方体を用いて断片化後のＣＣＮ成長因子の発現を評価した。
【０１０３】
卵巣の断片化及び移植：様々な日齢のＣＤ−１マウスに由来する対の卵巣をＬ−１５培地にて摘出した。各動物に由来する一方の卵巣を２〜４の小片に切断したのに対して反対側のものは無処置のままにした。卵巣を培養プレートインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州、ベッドフォード）に移し、３ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ、０．２３ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌのビタミンＣ、３０ｍＩＵ／ｍｌのＦＳＨ、５０ｍｇ／Ｌの硫酸ストレプトマイシン及び７５ｍｇ／ＬのペニシリンＧを伴ったＭＥＭα培地で培養した。３０分間のインキュベートの後、培地を置き換え、さらに３０分間インキュベートした。インキュベートの終了時、同じドナーに由来する対の卵巣（無処置及び断片化した）を卵巣除去した同じ成熟宿主（９〜１０週齢）の腎被膜に挿入した。宿主には、移植後の日から開始して５〜７日間、毎日１ＩＵのＦＳＨを注射した。移植の終了時、重量測定及び組織学的解析の前に移植片を固定のために回収した。アクチン重合の効果を調べるために、１０日齢マウスの対の卵巣をＪＡＳＰと共に又はそれを伴わずに３０分間インキュベートし、その後、Ｆ−アクチンとＧ−アクチンのレベル及びＣＣＮ２の発現を測定した。一部の対の卵巣は５日間成熟宿主に移植した後、移植片重量を測定した。ラットの試験については、１０日齢ラットの卵巣を断片化し、１時間培養した後、同じ動物の腎臓に５日間自家移植した。
【０１０４】
卵胞の計数：卵巣の移植片を回収し、１０％の緩衝化ホルマリンにて一晩固定し、パラフィンに包埋し、８μｍで連続切片にし、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。明瞭に染色された卵母細胞の核を持つ卵胞のみを数え、記載した。
【０１０５】
ＩＶＦ及び胚移植：移植の５日後、Ｂ６Ｄ２Ｆ１宿主マウスを１０ＩＵのｅＣＧで４８時間処理し、その後ｈＣＧ（１０ＩＵ）を単回注射して卵母細胞の成熟を誘導した。１２時間後、移植した卵巣断片を回収し、Ｍ２培地にて移植片を刺すことによって、増殖した卵丘細胞を伴った卵母細胞を回収した（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。対照として、２３日齢のＢ６Ｄ２Ｆ１メスマウスをｅＣＧで４８時間感作し、その後ｈＣＧを単回注射して排卵を誘導した。ＩＶＦについては、Ｂ６Ｄ２Ｆ１オスマウスの精子をヒト卵管液培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に回収し、記載されたように３７℃で１時間事前インキュベートした。卵母細胞を精子（２〜３×１０５／ｍｌ）と６時間受精させ、受精させた卵母細胞をＫＳＯＭ−ＡＡ培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、胚盤胞に発生させた。加えて、卵巣断片化の後の卵巣移植片から得た一部の２細胞期胚を、同じ系統の精管切除したオスと事前交配させた８週齢の偽妊娠ＣＤ１マウスの卵管に移植した。妊娠をモニターし、仔が生まれた。
【０１０６】
免疫ブロット解析：プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏ）を含有するＭ−ＰＥＲ哺乳類タンパク質抽出試薬（Ｔｈｅｒｍｏ、イリノイ州、ロックフォード）を用いてＮＩＨ３Ｔ３細胞又は１０日齢マウスの卵巣からタンパク質を抽出した。タンパク質を４〜１５％のＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州、ハーキュリーズ）に負荷しＨｙｂｏｎｄ−Ｐ膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ニュージャージー州、ピスカタウエイ）に電気ブロットした。室温で１時間ブロックした後、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｂｇｙ（カリフォルニア州、サンタクルーズ）から入手したＣＣＮ２抗体を除いてＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（マサチューセッツ州、バーバリー）から入手した一次抗体と共に膜をインキュベートした。これに二次抗体とのインキュベートが続いた。増感化学発光（ＥＣＬキット、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてシグナルを発生させ、デンシトメータを用いて定量した。
【０１０７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析：Ｈｉｐｐｏシグナル伝達遺伝子の発現を検出するために、１０日齢マウスからの卵巣を得て、Ｍｅｒ、Ｅｘ、ＭＳＴ１、ＭＳＴ２、ＳＡＶ１、Ｍｏｂ１ａ、Ｍｏｂ１ｂ、ＬＡＴＳ１、ＬＡＴＳ２、ＹＡＰ、及びＴＡＺについての転写産物レベルを測定した。ＣＣＮ成長因子の発現に関する試験については、インキュベートと移植の後の又は培養のみの後の様々な時間で１０日齢マウスに由来する対の卵巣を得た。ＲＮｅａｓｙマイクロキット（ＱＩＡＧＥＮ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，カリフォルニア州、バレンシア）を用いて卵巣又は移植片からの全ＲＮＡを抽出し、製造元のプロトコールに従ってＳｅｎｓｉｃｒｉｐｔ  ＲＴキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｃＤＮＡを合成した。スマートサイクラーＴＤシステム（Ｃｅｐｈｅｉｄ）上でｉＴａｑ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて、以下、９５℃で１５分と、９５℃で１５秒及び６０℃で６０秒を４５サイクルのようにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを行った。特定の転写産物の相対量をβ−アクチンのレベルの相対量に対して基準化した。
【０１０８】
良性卵巣腫瘍を持つ患者に由来するヒト卵巣皮質断片をＨｉｐｐｏシグナル伝達遺伝子のＲＴ−ＰＣＲに用いた。断片化の後のＣＣＮ成長因子の発現の変化を測定するために、帝王切開患者の卵巣試料を用いた。融解した後、卵巣立方体をさらに４つの断片（２×２ｍｍ）に切断し、Ｌ−１５培地で３回洗浄した。卵巣断片を培養プレートインサートに移し、１０％のヒト血清アルブミン、１％の抗生剤／抗真菌剤溶液、０．３ＩＵ／ｍｌのＦＳＨを伴ったＭＥＭα培地にて０、１及び３時間培養した。培養培地を３０分間隔で新鮮なものと置き換えた。インキュベートの後、試料をＰＢＳで３回洗浄し、ＣＣＮ成長因子の転写産物レベルについてのリアルタイム定量ＲＴ−ＰＣＲに供した。患者間でのベースレベルを基準化するために、データは１．０として表される０時間のデータに対する倍率変化として表した。
【０１０９】
卵巣外植片の培養：１０日齢マウスの卵巣を培養プレートインサート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に入れ、０．１％のＢＳＡ、０．１％のＡｌｂｕｍａｘＩＩ、インスリン／トランスフェリン／セレニウム、０．０５ｍｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸、及びペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２にて４日間培養し、記載したように培養の２日後培地を交換した。培養の終了時、卵巣重量を測定し、卵巣の幾つかを卵胞動態の組織学的解析のために包埋した。
【０１１０】
Ｆ−アクチンのレベルの測定：Ｆ−アクチン／Ｇ−アクチンの生体内アッセイキット（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ、コロラド州、デンバー）によって無処置の卵巣及び断片化した卵巣におけるＧ−アクチンに対するＦ−アクチンの比を測定した。１時間のインキュベートの後、５０ｍＭのＰＩＰＥＳ、ｐＨ６．９、５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＥＧＴＡ、５％のグリセロール、０．１％のＮｏｎｉｄｅｔＰ４０、０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．１％のＴｗｅｅｎ２０、０．１％の２−メルカプトエタノール、０．０００１％のＡｎｔｉｆｏａｍＣ、１ｍＭのＡＴＰ、０．０００４ｍＭのトシルアルギニンメチルエステル、０．０１５ｍＭのリューペプチン、０、００１ｍＭのペプスタチンＡ、及び０．００１Ｍのベンザミジンを含有するＦ−アクチン安定化緩衝液にて無処置の卵巣及び断片化した卵巣をホモジネートした。３７℃で１０分間インキュベートした後、溶解物を３５０×ｇで５分間遠心し、破壊されていない組織残渣を取り除いた。１００，０００×ｇでの３７℃で１時間のさらなる遠心の後、上清を回収した。８Ｍ尿素を含有する氷冷した分子等級の水にペレットを再懸濁し、１５分ごとに穏やかに混合しながら１時間氷上でインキュベートした。Ｆ／Ｇ−アクチン比を測定するために、等量の上清（Ｇ−アクチン）及び再懸濁ペレット（Ｆ−アクチン）を、汎アクチン抗体（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ）を用いた免疫ブロット解析に供した。
【０１１１】
免疫染色解析：抗ＳＡＶ１抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ、イリノイ州、シカゴ）、抗ＬＡＴＳ１／２抗体（Ａｂｎｏｖａ、カリフォルニア州、ウォールナット）、抗ＹＡＰ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、又は抗ＴＡＺ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をそれぞれ１：１００、１：５０、１：２００又は１：２００の希釈で用いてＳＡＶ１、ＬＡＴＳ１／２、ＹＡＰ及びＴＡＺの免疫組織化学染色を行った。マウスのＭＳＴ１／２については、一次抗体はＡｂＦＲＯＮＴＩＥＲ（韓国、ソウル）からで１：１００の希釈で使用した。脱パラフィン化及び脱水の後、抗原賦活化は１０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ６）にて１２１℃で１０分間オートクレーブ加熱することによって行った（３分で３回）。内在性のペルオキシダーゼ活性はメタノール中０．３％の過酸化水素によって３０分間で失活させた。１０％ＢＳＡ／トリス緩衝化生理食塩水（Ｓｉｇｍａ）による３０分間のブロッキングの後、４℃にて一晩スライドを一次抗体と共にインキュベートした。トリス緩衝化生理食塩水における３回の洗浄の後、室温にて３０分間スライドをビオチン化二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にインキュベートした。３回の洗浄の後、ＨｉｓｔｏｓｔａｉｎＳＰキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて結合した抗体を視覚化した。陰性対照については、一次抗体を非免疫性ＩｇＧ（Ｄａｋｏ）で置き換えた。
【０１１２】
統計的な解析：結果は３以上の独立したアッセイの平均値±ＳＥＭとして表す。統計的有意性は一元配置ＡＮＯＶＡを用い、その後、P＜０．０５が統計的有意差であるＦｉｓｈｅｒの保護された有意差検定によって決定した。
【０１１３】
実施例２
Ｓ１Ｐ  Ｈｉｐｐｏシグナル伝達
我々はＳ１Ｐの卵胞発育を促進する能力を調べた。図１２（左の図）に示すように、１０日齢マウスから得た卵巣の外植片培養への４日間のＳ１Ｐ（６μＭ）の添加は卵巣重量の大きな増加につながった。加えて、Ｓ１Ｐ（６μＭ）と共に１０日齢卵巣を１８時間培養し、その後、卵巣除去した成熟宿主に５日間移植することも移植片重量の増加につながった（図１２、右の図）。一部の卵巣をＳ１ＰにＩＶＡ薬剤（ＰＴＥＮ阻害因子及びＰＩ３Ｋ活性化因子）を加えて処理した場合、移植片重量に相加的な増加が見いだされた。我々は、Ｓ１Ｐは顆粒膜細胞におけるその受容体を介して作用してアクチンの重合を引き起こし、Ｈｉｐｐｏシグナル伝達を破壊し、卵胞発育を促進するという仮説を立てた。
【０１１４】
Ｘ線照射によって誘導される卵胞細胞のアポトーシスは、Ｓ１Ｐによる嚢内処理によって抑制される（Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ６，  １１０９−１１１４）。卵巣内カニューレ挿入を用いたＦＴＹ７２０（Ｓ１Ｐ模倣体）の生体内送達は成熟メス非ヒト霊長類における放射線が誘導する卵巣不全及び不妊を防ぐ（Ｚｅｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ  ９５，  １４４０−１４４５．  ｅ１４４７）。ＦＴＹ７２０（商品名：ギレンヤ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）は多発性硬化症を治療するために認可された免疫調節薬剤である。
【０１１５】
Ｓ１Ｐ及びそのアゴニストの卵巣Ｈｉｐｐｏシグナル伝達を破壊し、卵胞発育を促進する能力の実証は、よく見られるＰＣＯ症候群の治療のための認可された低毒性の薬剤の使用についての基礎を提供する。Ｓ１Ｐ又はその模倣体が多嚢性卵巣に局所で送達されて卵胞発育を促進するので、損傷する手順（楔状切除及びレーザー穴あけ）の現在の使用が置き換えられる。
【０１１６】
本明細書で引用された出版物及び特許出願はすべて、各個々の出版物又は特許出願が具体的に及び個々に参照によって組み入れられるように指示されたかのように参照によって本明細書に組み入れられる。本明細書で議論された出版物は本出願の出願日に先だったその開示のために単に提供される。先行発明に基づいてそのような開示に本発明が先行する権利がないという承認として解釈されるべきものは本明細書にはない。
【０１１７】
理解の明瞭性の目的で説明及び例示のために前述の発明を若干詳細に記載してきたが、添付のクレームの精神及び範囲から逸脱することなく特定の変更及び改変がそれに為され得ることは、本発明の教示の観点から当業者に容易に明らかであろう。
【０１１８】
連邦支援の研究及び開発
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成ＨＤ０６８１５８のもとで政府の支援によって為された。政府は本発明にて特定の権利を有する。
【図２】
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【図３】
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【図７】
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【図８】
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【図１２】
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【図１】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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