(57)【要約】  薬剤が皮膚老化防止利益を提供するために有効であることを特定するためのスクリーニング方法が提供される。このスクリーニング方法は、第１のヒト皮膚サンプル及び第２のヒト皮膚サンプルを約３日間〜約１９日間培養することを含み、ここで、この第１のヒト皮膚サンプル及び第２のヒト皮膚サンプルはヒト皮膚外科手術廃棄物組織に由来する。第１のヒト皮膚サンプルを少なくとも１つの試験薬剤と接触させる。第２のヒト皮膚サンプルを正の対照と接触させる。第１のヒト皮膚サンプル及び第２のヒト皮膚サンプルからの転写プロファイルを作成し、少なくとも２つの遺伝子の転写プロファイルが、１つ以上の未処理の対照組織サンプルと比較して同様の方向の変化を示すとき、この少なくとも１つの試験薬剤が皮膚老化防止利益を提供するために有効であることを特定する。
2015521474.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤が皮膚老化防止利益を提供するために有効であることを特定するためのスクリーニング方法であって、
ａ．第１のヒト皮膚サンプル及び第２のヒト皮膚サンプルを約３日間〜約１９日間培養する工程であって、
前記第１のヒト皮膚サンプル及び前記第２のヒト皮膚サンプルがそれぞれ、表皮層及び真皮層を含み、ヒト皮膚組織に由来する、工程と、
ｂ．前記第１のヒト皮膚サンプルを少なくとも１つの試験薬剤と接触させる工程と、
ｃ．前記第２のヒト皮膚サンプルを正の対照と接触させる工程と、
ｄ．前記第１のヒト皮膚サンプル及び前記第２のヒト皮膚サンプルからの転写プロファイルを作成する工程であって、
前記第１のヒト皮膚サンプルの前記転写プロファイルが図３に列挙される少なくとも２つの遺伝子の転写に関連したデータを含み、かつ前記第２のヒト皮膚サンプルの前記転写プロファイルが前記少なくとも２つの遺伝子の転写に関連したデータを含む、工程と、
ｅ．前記第１のヒト皮膚サンプルの前記転写プロファイル及び前記第２のヒト皮膚サンプルの前記転写プロファイルが、未処理の対照皮膚サンプルと比較して前記少なくとも２つの遺伝子について同様の方向の変化を示すとき、前記試験薬剤が皮膚老化防止利益を提供するために有効であることを特定する工程と、
を含む、スクリーニング方法。
【請求項２】
前記少なくとも２つの遺伝子が、２つ〜９つの遺伝子を含む、請求項１に記載のスクリーニング方法。
【請求項３】
前記少なくとも２つの遺伝子が、ＦＢＮ１、ＦＢＬＮ１、ＴＮＸＢ、ＦＮ１、ＬＯＸＬ２、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＥＬＮ、及びＬＯＸＬ１からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
【請求項４】
前記正の対照が、ビタミンＢ3化合物、ペプチド、ビタミンＡ化合物、ＴＧＦ、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項５】
前記第１のヒト皮膚サンプル、前記第２のヒト皮膚サンプル、及び前記対照皮膚サンプルのうちの少なくとも１つが、ドナー組織から得られる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項６】
前記第１のヒト皮膚サンプルがドナー組織から得られ、ＴＧＦ化合物を含む正の対照で処理されたときに前記２つ以上の遺伝子の発現レベルの方向的に適切な変化を示し、これにより、前記ドナー組織が前記試験薬剤のスクリーニングのために許容されることを示す、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項７】
工程ａ）〜ｄ）を繰り返すことを更に含み、各反復のための前記第１のヒト皮膚サンプル及び前記第２のヒト皮膚サンプルが、様々なヒトドナーからのドナー組織に由来する、請求項５に記載のスクリーニング方法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの試験薬剤が、各反復ごとに異なる、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項９】
前記正の対照が、前記第２のヒト組織サンプルの少なくとも５０％で、前記少なくとも２つの遺伝子の発現レベルの方向的に適切な増加又は減少を誘発する、請求項７に記載のスクリーニング方法。
【請求項１０】
酵素アッセイ、細胞培養アッセイ、又は皮膚均等物アッセイからなる群から選択されるアッセイで、前記少なくとも１つの試験薬剤を試験することを更に含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１１】
前記第１のヒト皮膚サンプル及び前記第２のヒト皮膚サンプルが、約５０％〜約９０％の相対湿度、及び約３０℃〜約４０℃の温度で培養される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１２】
前記第１のヒト皮膚サンプル及び前記第２のヒト皮膚サンプルのうちの少なくとも１つが、膜上で培養される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項１３】
化粧品スキンケア組成物の製造方法であって、
ａ．請求項１に記載のスクリーニング方法に従って、薬剤が、皮膚老化防止利益を提供するために有効であることを特定する工程と、
ｂ．前記化粧品スキンケア組成物を生成するために、前記薬剤と皮膚科学的に許容される担体とを混合する工程と、
ｃ．前記化粧品組成物の少なくとも一部を容器内に保存する工程と、
を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の１つの態様は、化粧品組成物での使用に好適であり得る老化防止剤を特定するための、新しいエックスビボ皮膚モデル及びスクリーニング方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
皮膚は、複雑な、多層な、かつ動的なシステムであり、それは体の最も大きな器官であり、健康及び自己像の両方にとって極めて重要である。３つの主要な層（例えば、表皮、真皮、及び皮下組織又は皮下層）を含む皮膚は、多種多様な細胞種及び構造を含有し、それらは、血管及びリンパ管を伴う、表皮及び真皮結合組織、皮下脂肪組織、並びに皮下組織の下の弾性筋膜を含む。そして、これらの構造は、ケラチノサイト、メラノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、及び脂肪細胞を含む、いくつかの異なる細胞種からなる。
【０００３】
皮膚の老化は、複雑な、多要因プロセスであり、それは数十年にわたって起こる様々な内因性及び外因性要因により引き起こされ得る、未修復の細胞及び組織損傷から生じ得る。皮膚の老化に関わっていると考えられる生物学的主題／経路のいくつかは、脂質生合成、表皮細胞分化、細胞外マトリックス組織化及び生合成、創傷治癒、免疫応答、並びに炎症応答を含む。例えば、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｓｋｉｎ  Ａｇｉｎｇ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，Ｖｏｌ．８，Ｉｓｓｕｅ  ７（２００９）を参照のこと。長い時間をかけて、皮膚の老化は、例えば、小じわ及びしわの外観（その例は、眼窩周囲領域の目尻のしわである）、皮膚の乾燥をもたらす皮膚バリア特性の損傷、皮膚のたるみ、皮膚の強度及び弾性の低下などをもたらす場合がある。
【０００４】
皮膚の老化が個人の外観及び自尊心に対して有し得る顕著な影響のために、老化皮膚の外観の治療又は改善で有効な化粧品薬剤を特定することが継続して所望される。皮膚老化に不可欠な細胞プロセスの態様を模倣することができる皮膚モデルはそれゆえ、例えば、これらの薬剤を特定するために所望される。皮膚生理学及び薬剤への皮膚応答を研究するモデリング技術は歴史的に、単細胞種又は少数の共に混合された細胞種の培養から、ヒト組織均等物の製作、動物モデルの開発まで、様々な特有の技術を含んだ。しかしながら、これらの比較的単純なモデルは多くの場合、ヒト皮膚の細胞内及び細胞間複雑性の多くを欠く。例えば、単細胞種の細胞培養は容易に利用されるが、非常に単純化されたものであり、結果をヒト皮膚に一般化することについては限定される場合がある。第１に、そのような培養物は、単に培養されることにより変えられ、場合によっては、容易な細胞継代及び維持を促進するための遺伝子操作により変えられた細胞を含有する。第２に、そのような培養物は、１単位として定常的に相互作用する、細胞の固有の複雑なマトリックスを説明することができない。多細胞培養物は、天然組織の統合された機械的構造を創成することと、それらの細胞が、正常な生理学的レベルでの細胞遺伝子発現レベルを維持するために必要な細胞外成分を含むことを確実にすることとにおける困難さのために限定される場合がある。ヒト皮膚を模倣するように処理された幹細胞を含むモデルは、それらの意図された目的のために好適であるが、これらもまた、同様の問題及び限定に見舞われる場合がある。
【０００５】
より複雑な皮膚モデルは、動物モデル及び皮膚均等物モデルを含む。追加の複雑さを有する一方で、動物モデルは、ヒト皮膚に関する遺伝的変異を含む限定に悩まされる場合がある。すなわち、得られた結果の解析において、ヒト組織は動物組織とは異なって反応するという問題が存在する場合があり、結果を一般化する能力は妥協される場合がある。
【０００６】
皮膚均等物モデルは、細胞の相互接続性、浸透性問題、及び解剖学的単純さの欠如により限定される場合がある。皮膚均等物モデルでのいくつかの最近の試みは器官型ヒト組織均等物として示され、不活性ポリカーボネートフィルター上で培養されたケラチノサイトなどの、ヒト細胞のインビトロ再構築を含み得る。これらのモデルは、まさにそれらの性質により、それらが、試験薬剤に対する異常な感受性を引き起こし得る、バリア機能の低下を有し得る点で限定される場合がある。このモデルはまた、（ケラチノサイト及び線維芽細胞、又はケラチノサイト及びメラノサイトなどの）１つ又は２つの細胞種をおそらく有するが、内皮細胞、又は更にはケラチノサイト、線維芽細胞、及びメラノサイトの完全な組み合わせなどの追加の細胞を欠いており、ヒト皮膚より複雑でない場合がある。加えて、器官型皮膚均等物モデルは、皮膚応答に影響し得る腺などの正常な皮膚構造もまた欠いている場合がある。
【０００７】
最も複雑な皮膚モデルは、ヒト皮膚組織サンプルのエックスビボ培養物を含む。このようなモデルでのいくつかの先行の試みは、直接的に培地中に浮遊する皮膚の小生検を含んだ。発明者及び研究者が、エックスビボブタ皮膚移植での試みが７日間に限定されることを示したように、一過性の培養物は不十分であり得ることが当該技術分野において知られる（Ｖｉｅｌｈａｂｅｒら、Ｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｋｉｎ  Ｍｏｄｅｌ、米国特許公報第２００９／０２９８１１３号）。エックスビボ皮膚の寿命を改善する試みは探求されており、１つの例は欧州特許第２  ０１９  ３１６  Ｂ１号で説明される。
【０００８】
更により最近のエックスビボモデルは、金属格子上で皮膚外植片を培養する試み（Ｍｉｔｔｓら、Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ、米国特許公報第２００９／０１１０７０９号）、及び受精した卵巣卵の絨毛尿膜（ＣＡＭ）への皮膚移植（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｖｉａｎ−Ｂａｓｅｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｒａｆｔｓ、米国特許公報第２００９／００６４３４９号）を含んだ。しかしながら、そのようなモデルは構築の一過性、精巧さ、及び更には異種間問題により、やはり限定される場合がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許公報第２００９／０２９８１１３号明細書
【特許文献２】欧州特許第２  ０１９  ３１６  Ｂ１号明細書
【特許文献３】米国特許公報第２００９／０１１０７０９号明細書
【特許文献４】米国特許公報第２００９／００６４３４９号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
これらの進歩にもかかわらず、多数の組織ドナーでの活性選択のための数十又は数百の化合物のスクリーニングに好適な、感受性かつ予測的なエックスビボヒト皮膚組織スクリーニング方法及びモデルについて要求が存在し続ける。しかしながら、大きな組織ドナー集団にわたる多数の試験化合物について予測的かつ繰返し可能である、エックスビボ組織培養モデル及び方法の開発に関連付けられる多くの問題／不確実性がある。いくつかの非限定的な例としては、ドナー毎の変動性の効果、エックスビボ皮膚組織が必要な培養期間にわたり適切に調節され得るかどうか、エックスビボ皮膚組織の遺伝子トランスクリプトミクス、プロテオミクス、及び／又はメタボミクスの解析がインビボ結果の予測であり得るかどうか、満足のいくスクリーニング方法を開発するのに十分に高い割合のエックスビボ組織サンプルでの使用のために適切な正の対照が特定され得るかどうか、十分に高い割合のエックスビボ組織サンプルでの十分に強い組織応答を可能にする培養条件が特定され得るかどうか、並びにこれらの変数が、エックスビボ皮膚組織サンプルに対する試験薬剤の効果が単離され、解釈され得るところまで制御され得るかどうか、のうちの１つ以上を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の１つの態様では、薬剤が皮膚老化防止利益を提供するために有効であることを特定するためのスクリーニング方法が提供される。このスクリーニング方法は、第１のヒト皮膚サンプル及び第２のヒト皮膚サンプルを約３日間〜約１９日間培養する工程を含み、ここで、この第１のヒト皮膚サンプル及び第２のヒト皮膚サンプルはヒト皮膚外科手術廃棄物組織に由来する。第１のヒト皮膚サンプルを少なくとも１つの試験薬剤と接触させる。第２のヒト皮膚サンプルを正の対照と接触させる。第１のヒト皮膚サンプル及び第２のヒト皮膚サンプルからの転写プロファイルを作成し、少なくとも２つの遺伝子の転写プロファイルが、１つ以上の未処理の対照組織サンプルと比較して同様の方向の変化を示すとき、少なくとも１つの試験薬剤が皮膚老化防止利益を提供するために有効であることを特定する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＭＴＴアッセイ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物アッセイ）で評価された、エックスビボ皮膚組織の生存能力を示す棒グラフである。
【図２】ＴＧＦβ−１での処理から７日間の時間過程にわたる、真皮遺伝子パネルのエックスビボ皮膚組織での倍率変化を示す棒グラフである。
【図３】本明細書で説明されるモデル及び方法での包含に好適な、いくつかの遺伝子の非限定的なリストを示す表である。
【図４】４日間及び７日間の時間過程にわたる、図３で列挙された遺伝子のうちのいくつかの、エックスビボ皮膚組織サンプルでの倍率変化を示す熱マップである。
【図５Ａ】５日間の時間過程にわたる、図３で列挙された遺伝子のうちのいくつかの、エックスビボ皮膚組織サンプルでの倍率変化を示す棒グラフである。
【図５Ｂ】図５Ａで示される倍率変化データのｐ値を示す表である。
【図６Ａ】ｔＲＡ及びレチノールプロピオネートでの処理から４８時間の時間過程にわたる、エックスビボ皮膚組織サンプルでの倍率変化を示す熱マップである。
【図６Ｂ】ｔＲＡ及びレチノールプロピオネートでの処理から５日間の時間過程にわたる、エックスビボ皮膚組織サンプルでの倍率変化を示す熱マップである。
【図６Ｃ】ｔＲＡ及びレチノールプロピオネートでの処理から７日間の時間過程にわたる、エックスビボ皮膚組織サンプルでの倍率変化を示す熱マップである。
【図７Ａ】ナイアシンアミドでの処理後５日間の時間過程にわたる、エックスビボ皮膚組織サンプルでの倍率変化を示す熱マップである。
【図７Ｂ】ナイアシンアミドでの処理後７日間の時間過程にわたる、エックスビボ皮膚組織サンプルでの倍率変化を示す熱マップである。
【図８Ａ】ＴＧＦβ−１の培地適用から７日間の時間過程にわたる、単一ドナーからのエックスビボ皮膚組織サンプルでの倍率変化を示す熱マップである。
【図８Ｂ】図８Ａで示される倍率変化を示す棒グラフである。
【図９Ａ】３７Ｃでの、複数のドナーからのエックスビボ皮膚組織サンプルでの倍率変化を示す熱マップである。
【図９Ｂ】３３Ｃでの、複数のドナーからのエックスビボ皮膚組織サンプルでの倍率変化を示す熱マップである。
【図１０】３３Ｃ及び３７Ｃの培養温度での、いくつかの物質での処理からの、エックスビボ皮膚組織サンプルでの倍率変化を示す熱マップである。
【図１１】１１日間の時間過程にわたり３７Ｃで９５％相対湿度にて培養された、エックスビボ皮膚組織の一連の顕微鏡写真である。
【図１２】１０日間の時間過程にわたり３７Ｃで５０％相対湿度にて培養された、エックスビボ皮膚組織の一連の顕微鏡写真である。
【図１３】１９日間の時間過程にわたり３３Ｃで７０％相対湿度にて培養された、エックスビボ皮膚組織の一連の顕微鏡写真である。
【図１４】１１日間の時間過程にわたり３３Ｃで７０％相対湿度にて培養された、エックスビボ皮膚組織の一連の顕微鏡写真である。
【図１５】ＴＧＦβ−１での処理からの、複数のドナーからのエックスビボ皮膚組織サンプルでの倍率変化を示す熱マップである。
【図１６】正の対照及び試験化合物での処理からの、エックスビボ皮膚組織サンプルでの倍率変化を示す熱マップである。
【図１７】チョウセンアザミ葉抽出物、イナゴマメ果実抽出物、及びこれらの組み合わせでの処理からの、エックスビボ皮膚組織サンプルでの倍率変化を示す表である。
【図１８】オリーブ油抽出物、チョウセンアザミ葉抽出物、及びこれらの組み合わせでの処理からの、エックスビボ皮膚組織サンプルでの倍率変化を示す熱マップである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
現在の技術の問題及び不確実性を克服するために使用され得る、エックスビボヒト皮膚モデル及びスクリーニング方法が本明細書で開示される。本明細書で使用される専門用語は特定の実施形態を説明する目的のみのために示され、限定であるとは意図されないことを理解すべきである。本発明の説明及び添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他の意味を示さない限り、同様に複数形を含むものとする。本明細書及び特許請求の範囲におけるあらゆる範囲の開示は、その範囲自体及びその中に包含されるあらゆるもの、並びにエンドポイントも含むものと理解すべきである。
【００１４】
このエックスビボ皮膚スクリーニング方法／モデルは概して、以下のもの：外科手術廃棄物ドナー組織を回収すること、培養のためにこの組織を調製すること、この組織を局所適用で又は培養培地中に適用して試験薬剤で処理すること、この組織を特定の期間培養すること、及び１つ以上の目的とするエンドポイント（例えば、遺伝子転写など）を測定すること、のうちの１つ以上を含む。
【００１５】
エックスビボ皮膚スクリーニング方法の様々な実施形態の非限定的な態様及び実施例がこれより記載されるであろう。様々な実施形態がこれ以降、対照、培養条件、遺伝子トランスクリプトミクス、皮膚組織のプロセッシング、ｍＲＮＡプロセッシングの文脈において記載されるが、本明細書に提供される詳細は単に例示であることが意図され、多くの改変、追加、削除、及び他の変更が本明細書の教示に照らして可能であることが理解されるであろう。
【００１６】
Ｉ．ドナー組織
いくつかの実施形態では、多種多様な外科的処置（例えば、腹壁形成術又は全身リフト手術）のうちのいずれかからのヒト外科手術廃棄物組織などのドナー組織が、ヒト皮膚サンプルの源として使用される場合がある。受容に際して、ドナー組織は、室温未満（例えば、２℃〜１０℃、又は２℃〜６℃）の温度で最大２４時間保存される場合がある。より低温での保存は、組織復温に際して再び始まるであろう炎症の進行を休止する場合がある。
【００１７】
ドナー組織又はそれから得られたヒト皮膚サンプルは、皮下層を除去するためにプロセスされる場合がある。皮下層の除去は培養中の皮膚サンプルへの培地の吸収を改善することができ、また、試験薬剤の局所送達又は培地送達のいずれかに好適なエックスビボ皮膚モデルを可能にする場合がある。皮膚サンプルをその後、より小さな断片（例えば、１．２５ｍｍ×１．２５ｍｍ角）に更に分けてよく、それらを多数ウェル組織プレートに入れてもよい。これらのより小さな断片のいくつかに正の対照を投与してよく、一方で、他の断片にスクリーニングされるべき試験薬剤（単数又は複数）を投与してよい。いくつかの実施形態では、これらのより小さな断片のいくつかは対照を提供するために処理されない場合がある。皮膚サンプルを、真皮が湿った状態及び表皮が乾燥した状態に保つために、等浸透圧溶液上に真皮側を下にしてプレートウェルに置く場合がある。好適な等浸透圧（又は等張）溶液の非限定的な例としては、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（「ＤＭＥＭ」）が挙げられ得る。いくつかの実施形態では、組織サンプルを非浸透圧（非等張）溶液中に入れてよい。任意選択で、抗真菌又は抗細菌試薬をこの溶液中に含めるか、又は別個にこのサンプルに適用してよい。エックスビボ組織調製物の非限定的な例は、以下の実施例１で説明される。いくつかの実施形態では、皮膚サンプルをプレートウェル内の多孔性又は半多孔性膜（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）ブランド、８マイクロメートル、６ウェル膜挿入物）上に置いてよく、それは培養中の組織サンプルの生存能力を改善する場合がある。皮膚サンプルのサイズ及び／又は種類に基づいて、培地が特定の速度で膜を通過することを許容する膜を選択することが所望される場合がある。
【００１８】
図１は、好適な膜上での培養の、可能性のある利点を示す、様々な培養方法を用いたエックスビボ皮膚組織の生存能力を示す。生存能力を、当該技術分野において既知の、従来のＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物）アッセイにより評価する。直径４ｍｍのエックスビボ皮膚パンチを直接的に培地中に入れた（すなわち、浸した）、又は培地が下から膜を通して毛管現象により組織に供給されるように培地上の膜上に置いた。加えて、サンプルのサイズがいくつかの実施形態（例えば、より長い実験）で果たし得る重要な役割を示すために、１ｃｍ2皮膚サンプルを膜上で培養した。２４及び９６時間の２つの時点が示される。基準の生存能力レベルのアッセイ対照（基準）及び３回凍結融解された基礎環境組織（全死滅）もまた、示される。図１で示されるように、膜上で培養した細胞の生存能力は、２４時間〜９６時間、直接的に培地中に入れた細胞より顕著に減少した。加えて、１ｃｍ2サンプルは、４ｍｍパンチ生検サンプルと比較したとき、２４〜９６時間、生存能力の顕著な改善を示した。
【００１９】
ＩＩ．エックスビボ組織生物学及び遺伝子選択
エックスビボスクリーニング方法及びモデルの開発での１つの不確実性は、ドナー組織が外科抽出後に好適に調節され得るかどうか、及び／又はどの程度まで調節され得るかである。この質問に答えるために、内因性遺伝子刺激化合物による１組の遺伝子の調節を研究した。ＴＧＦβ−１は、コラーゲン及びエラスチンの生成と関連付けられた真皮マトリックス遺伝子の既知の調節剤であるので、刺激化合物として選択された。図２を参照して、２４時間〜７日間の時間過程にわたり、培地適用ＴＧＦβ−１（２０ｎｇ／ｍＬ）に供された、単一ドナーからの組織サンプルについて、真皮遺伝子パネルの応答が示される。時間過程にわたり、このドナー組織は、ＦＮ１、ＣＯＬ１Ａ１、及びＣＯＬ３Ａ１について良好な応答を示し、それらは時間過程にわたり増加的に上方調節される。このことは、エックスビボ組織を外科抽出後の関連する時間過程にわたり好適に調節することが可能であることを確実にする傾向がある。
【００２０】
エックスビボ組織が関連遺伝子刺激化合物により好適に調節され得るという確証は顕著な進展である一方で、エックスビボスクリーニング方法／モデルの開発の別のステップは、培養期間にわたり適切に調節され得る、スクリーニング方法及びモデルでの使用のための適切なマーカーセットの特定及び／又は選択である。図３を参照して、エックスビボスクリーニング方法及びモデルでの包含に好適ないくつかの遺伝子のリストが列挙される。このリストは、皮膚老化と関連付けられた様々な経路に関連していると考えられる遺伝子、及び／又はその調節が皮膚老化防止利益を有益に提供し得る遺伝子を含む。本明細書で使用されるとき、皮膚老化防止利益としては、より滑らかで、より平坦な外観及び／若しくは感触を提供することによる皮膚の外観及び／若しくは感触の改善；皮膚の１つ以上の層の厚さの増加；皮膚の弾性若しくは弾力性の改善；皮膚の引締りの改善；及び皮膚のくすんだ外観の低減、皮膚の水和状態若しくは保湿の改善、小じわ及び／若しくはしわの外観の改善、皮膚の質感若しくは滑らかさの改善、皮膚の剥脱若しくは剥離の改善、皮膚をふっくらさせること、皮膚のバリア特性の改善、皮膚の色調の改善、赤み若しくは皮膚のしみの外観の低減、並びに／又は皮膚の明るさ、輝き、若しくは透明性の改善が挙げられるが、これらに限定されない。図３で列挙される遺伝子は、５つのパネル（例えば、真皮遺伝子パネル、増殖因子／老化遺伝子パネル、レチノイド代謝遺伝子パネル、基底膜遺伝子パネル、及び表皮遺伝子パネル）に大まかにグループ分けすることができる。
【００２１】
図４は、７日間の時間過程にわたり４つの物質と共に３３℃及び５５％相対湿度でインキュベートした、エックスビボ組織サンプル（１物質当たりＮ＝６）の培地投与後の、図３からの遺伝子のうちのいくつかの倍率変化の熱マップを示す。図４の表の細胞のうちのいくつかで、斜交平行線模様は、統計的に有意な上方調節（ｐ値≦０．０５及びｐ値≦０．１）及び統計的に有意な下方調節ｐ値≦０．０５及びｐ値≦０．１）を示す。ＴＧＦβ−１に加えて、１つ以上のインビボ、皮膚老化防止利益を提供すると考えられる３つの外因性物質を試験した。試験された３つの外因性物質は、ビタミンＢ３化合物（すなわち、ナイアシンアミド）、ペプチド（すなわち、ＰＡＬ−ＫＴブランドペプチド（パルミトイル−リジン−スレオニン））、及びオリーブ油抽出物（すなわち、ＯＬＩＶＥＭ  ４６０ブランドオリーブ油抽出物）であった。ナイアシンアミドは、いくつかの化粧品スキンケア利益を提供すると考えられている（例えば、Ｂｉｓｓｅｔｔら、「Ｎｉａｃｉｎａｍｉｄｅ：Ａ  Ｂ  Ｖｉｔａｍｉｎ  ｔｈａｔ  Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ａｇｉｎｇ  Ｆａｃｉａｌ  Ｓｋｉｎ  Ａｐｐｅａｒａｎｃｅ」、及びＤｒａｅｌｏｓ、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｓｉｔｕａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｄｕｃｉｖｅ  ｔｏ  Ｐｒｏａｃｔｉｖｅ  Ｓｋｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ａｎｔｉ−Ａｇｉｎｇ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ」を参照のこと）。また、ＰＡＬ−ＫＴなどの特定のペプチドは、小じわ及びしわの外観の改善などの皮膚老化防止利益を提供し得る物質として認識される（例えば、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ａ  Ｎｅｗ  Ａｎｔｉ−Ａｇｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，ＰＡＬ−ＫＴ、Ｏｓｂｏｒｎｅら、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  ６７th  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉａ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、２００９を参照のこと）。また、ＯＬＩＶＥＭブランドオリーブ油誘導体などの特定のオリーブ油誘導体は、抗酸化活性を提供すると考えられ、それは環境傷害に対する保護をもたらし得る（例えば、Ｓｋｉｎ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｃｏｎｆｉｒｍ  ｔｈｅ  Ａｎｔｉ−Ｏｘｉｄａｎｔ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｌｉｖｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｙｅａｓｔ  Ｆｅｒｍｅｎｔ  Ｆｉｌｔｒａｔｅ、Ｆｉｎｌａｙら、Ｐ＆Ｇ  ６７th  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（２００９）を参照のこと）。
【００２２】
４及び７日間の終わりに、２つの４ｍｍパンチ生検を組織サンプルのそれぞれから除去し、ＲＮＡ単離、続いてＰＣＲ解析を行った。いくつかの観察は、図４で示されるデータの概観から顕著である。時間過程にわたり有意に調節された遺伝子の数の全体的な増加があるように見え、それは、皮膚老化防止利益を提供すると考えられる、ＴＧＦβ−１（真皮マトリックス遺伝子を直接的に刺激すると考えられる物質）及び３つの外因性物質に対する適切な生物学的応答であるように見えるものを示す。例えば、ＣＯＬ４Ａ１及びＬＡＭＡ５は時間過程にわたり上方調節され、真皮コラーゲン調節、及び試験物質に対する適切な生物学的応答であるように見えるものと一致する。オリーブ油抽出物及びペプチドは両方ともＴＧＦβ−２及びＴＧＦβ−３を上方調節し、これは線維芽細胞によるＴＧＦβ−１の発現を増加させ、コラーゲン生成をもたらすと考えられる。ここでも、このことは、これらの物質に対する適切な生物学的応答であるように見える。したがって、エックスビボ組織生物学及び図４で列挙される遺伝子は、試験物質から予測され得る調節と一致して、時間過程にわたり適切な様式で応答しているように見える。
【００２３】
図５Ａを参照して、棒グラフは、５日間の時間過程にわたる、トランスレチノイン酸（ｔＲＡ）、レチノール、又はレチノールプロピオネート（ＲＰ）の培地投与後の、図３の表皮遺伝子パネルの（未処理の対照と比較した）倍率変化を示す。図５Ｂは、図５Ａの倍率変化データを示すｐ値の表である。投与を５日間の時間過程にわたり適用し、その間、ｔＲＡは培地適用し、一方で、レチノール及びレチノールプロピオネートはエックスビボ組織サンプルに局所適用し（１物質当たりＮ＝６）、３３℃及び７０％相対湿度でインキュベートした。５日間の終わりに、２つの４ｍｍパンチ生検を組織サンプルのそれぞれから除去し、ＲＮＡ単離、続いてＰＣＲ解析を行った。このデータから、試験化合物は表皮遺伝子パネルを適切に調節したように見える。例えば、ＫＲＴ１０及びＦＬＧは有意に下方調節され、ＡＱＰ３は上方調節される。加えて、ｔＲＡ＞レチノール＞レチノールプロピオネートの相対的倍率変化は適切であるように見える。これらの観察は、５日間の時間過程にわたる、ビタミンＡ化合物に対する適切な生物学的応答であるように見えることを示す。本明細書で使用されるとき、「ビタミンＡ化合物」は、ビタミンＡ化合物、それらの前駆体及び代謝産物を指す。したがって、エックスビボ組織生物学は、試験物質から予測され得る調節と一致して、時間過程にわたり適切な様式で応答しているように見える。表皮遺伝子パネルがビタミンＡ化合物により大きく下方調節され、これにより増殖性応答を示す一方で、エックスビボモデル及び方法でのこれらの遺伝子のうちの１つ以上の上方調節は、バリア及び／又は角質層構造の改善を誘発する他の物質から生じ得ることが理解される。
【００２４】
図６Ａ、６Ｂ、及び６Ｃは、ｔＲＡ及びレチノールプロピオネートの培地投与後７日間の時間過程にわたる、図３の遺伝子パネルの倍率変化を示す熱マップを提供する。図６Ａ、６Ｂ、及び６Ｃの細胞は、図４の細胞と同じように斜交平行線模様で示される（すなわち、図４で提供される凡例を参照のこと）。ｔＲＡを培地適用し、レチノールプロピオネートをエックスビボ組織サンプルに局所適用し（１物質当たりＮ＝６）、３７℃及び５０％相対湿度でインキュベートした。４８時間、５日間、及び７日間の終わりに、２つの４ｍｍパンチ生検を組織サンプルのそれぞれから除去し、ＲＮＡ単離、続いてＰＣＲ解析を行った。ｔＲＡ及びレチノールプロピオネートの両方が類似した調節パターンを示したことを意味する、レチノイド遺伝子パネルの相互に関連した調節は、５日目〜７日目で現れることが見られ得る。しかしながら、ｔＲＡは、ＲＰよりもこれらのレチノイド代謝遺伝子の強い応答を刺激する。７日目までに、余分のレチノイドを分解するｐ４５０酵素であるＣｙｐ２６Ｂ１は、両方の物質により強く上方調節される。また、７日目までに両方の物質は、ＣＲＡＢＰ２、ＲＡＲＧ、及びＣＥＢＰＡ、レチノイドトランスポータ、受容体、及び転写因子を強く上方調節する。これらの遺伝子は、ヒト皮膚成長及び分化のレチノール酸仲介調節において全て重要である。ここでもまた、これらのデータは、試験物質に対する適切な生物学的応答であるように見えるものを示す。したがって、図３で列挙される様々な遺伝子は、既知の内因性及び外因性刺激物質での試験により示されるように、エックスビボ皮膚組織で適切に調節され得るように見える。
【００２５】
ＩＩＩ．培養条件：時間、温度、湿度
本明細書に記載されるエックスビボスクリーニング方法及びモデルでの１つの進展は、対象遺伝子を適切に調節することが可能であるスクリーニング方法及びモデルの適切な培養条件の調査／特定である。重要なことに、エックスビボ組織培養条件（例えば、時間、温度、及び湿度）は、図３で列挙される遺伝子のうちの１つ以上の応答性を含む、エックスビボモデル及びスクリーニング方法の性能に影響する場合がある。温度、時間、及び湿度の特定の範囲が以下に説明されるが、条件のこれらの範囲及び組み合わせは説明されるものから変化することができると理解されるであろう。本明細書に記載される時間、温度、及び湿度の条件は好ましくは、最も良い培養条件の組であり得るものを達成するように全体として又は部分的に組み合わせられる場合がある。本明細書に記載されるスクリーニングモデル及び方法のためのエックスビボ組織培養の非限定的な例は、実施例２で提供される。
【００２６】
時間
培養期間は、エックスビボ皮膚組織の遺伝子調節の指向性及び／又は有意性に影響し得る。例えば、再び図４を参照して、データは、遺伝子のうちの多くが、４日目で未処理の対照と比較して、試験物質について下方調節され、及び／又は統計的に上方調節されないことを示すように見える。しかしながら、これらの同じ遺伝子のうちのより多くは試験物質にわたり７日目で上方調節され、より多くの遺伝子は（４日目と比較して）７日目で統計的有意性を伴って上方調節される。図７Ａ及び７Ｂを参照して、５日及び７日後の真皮遺伝子パネルであるが、（図４で示されるデータを作成するために使用されたドナー組織とは）異なるドナーからの組織で、観察された倍率変化を示す熱マップが提供される。図７Ａ及び７Ｂの細胞は、図４の細胞と同じように斜交平行線模様で示される（すなわち、図４で提供される凡例を参照のこと）。７日目では、５日目より下方調節された遺伝子は少なく、上方調節された統計的に有意な遺伝子の数の全体的な増加があり、このことは再び、より強い応答が７日目までに観察され、５日目〜７日目で起こるようであることを確証する。
【００２７】
図８Ａ及び８Ｂを参照して、単一ドナーからのエックスビボ組織への２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ−１の培地適用後７日間の時間過程にわたる、倍率変化データが示される。組織を、３７℃で、かつ５０％相対湿度で１〜７日間インキュベートした。図８Ａの細胞は、図４の細胞と同じように斜交平行線模様で示される（すなわち、図４で提供される凡例を参照のこと）。図８Ｂは、図８Ａからのデータを示す棒グラフである。遺伝子のうちのいくつか（例えば、ＦＮ１、ＬＯＸＬ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＥＬＮ、及びＬＯＸＬ１）は２４時間で有意に調節されたが、最も強い応答は５日目〜７日目で起こり、これは上記に説明したデータと一致するように見える。
【００２８】
図６Ａ、６Ｂ、及び６Ｃを再び参照して、ｔＲＡの培地適用及びレチノールプロピオネートの局所適用についての７日間の時間過程にわたる、単一ドナーからの倍率変化データが示される。レチノイド遺伝子パネルの遺伝子のうちのいくつかは５日目までに下方調節されたが、７日目までにはｔＲＡとレチノールプロピオネートとの間のもっとより深い、かつ相互に関係する調節パターンが存在した。例えば、７日目までに、ＣＹＰ２６Ａ１、ＡＬＤＨ１Ａ２、ＲＤＨ１０、ＲＡＲＲＥＳ１、及びＬＲＡＴは、５日目と比較して両方の物質にわたり統計的有意性を伴って下方調節された。
【００２９】
上記に基づいて、約５日間〜約１９日間、又は約６日間〜約１０日間、又は約６日間〜約８日間の培養期間が好ましいと考えられるが、より短い又はより長い期間がいくつかの状況では適切であり得る。
【００３０】
温度
培養温度もまた、エックスビボ組織サンプルでの遺伝子調節のパターン及び大きさに影響する場合がある。図９Ａ及び９Ｂを参照して、熱マップは、３３℃及び５０％相対湿度で７日間インキュベートした５つの様々なドナー組織サンプル、並びに３７℃及び５０％相対湿度で７日間インキュベートした５つの様々なドナー組織サンプルの、９つの真皮遺伝子の倍率変化を示す。図９Ａ及び９Ｂの細胞は、図４の細胞と同じように斜交平行線模様で示される（すなわち、図４で提供される凡例を参照のこと）。組織サンプルを２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ−１の培地供給用量で処理した。３７℃で上方調節された統計的に有意な遺伝子の数は３３℃で調節された統計的に有意な遺伝子の数に優り、劇的に増加したが、例えば、ＦＮ１、ＣＯＬ１Ａ１、及びＣＯＬ３Ａ１はいくつかのドナーにわたり３３℃で有意に上方調節された。対照的に、例えば、ＥＬＮ及びＬＯＸＬ２は３３℃では大部分のドナーにわたり統計的に有意な上方調節を示さなかったが、３７℃では示した。
【００３１】
図１０を参照して、更に２つの熱マップは、３３℃及び３７℃で、５０％相対湿度で７日間インキュベート後の、９つの真皮遺伝子の倍率変化を示す。組織サンプルは、０．２％ナイアシンアミド及び０．００１％のオリーブ油抽出物の培地供給用量で処理した。特に、オリーブ油抽出物は３３℃では真皮遺伝子を概ね下方調節し、３７℃では真皮遺伝子を優勢に上方調節し、３３℃と比較して、３７℃で上方調節された統計的に有意な遺伝子の数の明白な全体的増加があった。このデータは、より高い培養温度は試験物質に対する適切なトランスクリプトーム応答を作成するためにより好ましいという観察を更に支持する傾向があるが、組織生存能力は温度が増加するにつれて減少する傾向がある。
【００３２】
上記に基づいて、いくつかの実施形態では、３３℃〜４０℃、３５℃〜４０℃、又は更に３６℃〜３８℃の培養温度が好適であり得るが、個々の遺伝子応答はこれらの範囲内で変化する場合があり、より低い培養温度（例えば、最低約３２℃）はいくつかの遺伝子を観察するために有用であり得る。
【００３３】
湿度
エックスビボ組織の寿命は湿度低下条件下で改善することができる。湿度を低下させることにより、比較的より高い温度で培養し、それでも組織生存能力及び／又は一貫した遺伝子調節を維持することが可能であると考えられる。図１１を参照して、最小限ＤＭＥＭ中で、３７℃及び９５％湿度で培養されたエックスビボ皮膚組織が、到着日から１１日目まで示される（最小限ＤＭＥＭは追加の変数を最小限にするために可能な限りほとんど成分を添加しないＤＭＥＭを指す）。図１１で示されるように、組織の形態は１１日の期間にわたり実質的に劣化した。比較として、図１２は、１０日までの、５０％湿度及び３７Ｃで培養されたエックスビボ組織サンプルを示し、ここで、組織の形態はこの期間にわたり大部分は無傷のままである。図１１と１２とを比較して、組織の形態は、より低い湿度条件でかなり改善されることが観察され得る。実際に、（例えば、７０％湿度及び３３℃で）少なくとも１９日までエックスビボ皮膚組織を培養し、一方で、それでも組織生存能力及び／又は形態を維持することは可能であるように見える（例えば、図１３を参照のこと）。図１４を参照して、約７０％相対湿度及び約３３℃で約１１日間培養されたエックスビボ組織サンプルの組織学が示される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、１００％未満の湿度の相対湿度が提供される。例えば、エックスビボヒト皮膚組織サンプルは、４０％〜９０％、又は５０％〜７０％の相対湿度で培養される場合がある。
【００３５】
ＩＶ．正の対照
このエックスビボスクリーニング方法及びモデルでの追加の進展は、このスクリーニング方法／モデルへの包含のために適切なレスポンダーである組織サンプルを特定するための、１つ以上の正の対照の特定及び／又は使用法である。いくつかの実施形態では、正の対照は、適切に調節される組織と捨てられるべき非レスポンダーとを有効に区別するために、強い信号対雑音比を有し、ドナー集団の十分に大きな一部で適切な応答をもたらすべきであり、これにより、偽陽性、偽陰性、又はそうでなければ可能性として不正確な観察を最小限にする。このことは、大きなドナー集団にわたる一貫性が有用である、市販のスクリーニング方法／モデルでは重要な要因であり得る。いくつかの実施形態では、正の対照はドナー組織の５０％、６０％、若しくは７０％超、及び／又はドナー組織の９０％未満若しくは８０％未満で、２つ以上の遺伝子の統計的に有意な調節を提供する。この成功レベルは数百の試験薬剤をスクリーニングするために有用であり、典型的に統計的比較のために最小限のサンプルサイズを必要とする初期の学術研究の一貫性レベルを超えた一貫性レベルを必要とする。また、組織サンプルの状態に関連するドナー毎の変動性もまた、スクリーニング方法で取り扱われる場合がある。
【００３６】
いくつかの実施形態では、正の対照は既知の老化防止物質（例えば、ナイアシンアミド、ペプチドなど）又は内因性遺伝子刺激化合物（例えば、ＴＧＦβ−１、ＴＧＦβ−２、ＴＧＦβ−３）であってよい。ＴＧＦβは真皮マトリックス遺伝子の既知の調節剤であるが、初めは、どのようにエックスビボ組織が培養期間／温度にわたりＴＧＦβ（又は他の可能性のある正の対照）に応答し得るか、並びに／又はエックスビボドナー集団の十分な一部がエックスビボスクリーニング方法及びモデルを可能にするために十分に応答性であり得るかどうかは明らかでなかった。図２、４、７、及び８を再び参照して、真皮遺伝子は、培地に供給したＴＧＦβ−１に対して強い、一貫した上方調節応答を示し、これにより、ＴＧＦβ化合物が満足のいく正の対照として使用され得ることを示した。図１５を参照して、２０ｎｇ／ｍＬ  ＴＧＦβ−１の培地適用後、３３℃の温度及び７０％相対湿度で１１日間の時間過程にわたる、８つの異なるドナー組織の倍率変化の熱マップが示される。図１５の図表の細胞は、図４の細胞と同じように斜交平行線模様で示される（すなわち、図４で提供される凡例を参照のこと）。サンプル間でいくらかの変動性があるが、データは驚くべきことに、ドナー組織の８０％が少なくともＦＮ１、ＣＯＬ１Ａ１、及びＥＬＮの統計的に有意な上方調節を有したことを示す。ドナー組織番号６は非レスポンダーであり、通常、スクリーニングアッセイで使用される場合、任意の妥当な結論を引き出すのに十分良好であるとは考えることができない（例えば、不十分な数の遺伝子が上方調節、調節され、及び／又はＦＮ１のみが有意に上方調節された）。ＥＬＮ、ＣＯＬ１Ａ１、ＦＮ１、ＬＯＸＬ１、及びＦＢＮ１の統計的に有意な上方調節があるので、ドナー組織番号５は中程度のレスポンダーと考えることができた。加えて、９つの遺伝子のうちの７つは上方調節された。このように、この組織サンプルは真皮調節可能な組織として認定されることができ、それゆえ、スクリーニング方法での使用に妥当であると考えられ得る。遺伝子のうちの８つ又は９つが上方調節される（そのうちの７つは統計的に有意である）ので、ドナー組織番号７及び番号９は強いレスポンダーと考えることができた。上記から、ＴＧＦβはドナー組織の有意な一部で真皮遺伝子の十分な、及び／又は統計的に有意な調節を提供することができるように見える。ＴＧＦβなどの内因性真皮遺伝子調節剤は正の対照として使用することができると考えられるが、外因性物質もまた、例えば、図４で表される調節パターンにより示されるように、正の対照として使用してよいことが企図される。
【００３７】
他の実施形態では、正の対照はビタミンＡ化合物であってよい。いくつかの実施形態では、ビタミンＡ化合物はビタミンＡ化合物の代謝産物、例えば、ｔＲＡである。いくつかの実施形態では、正の対照は皮膚老化防止利益を提供することが知られる物質、例えば、ペプチド、ビタミンＡ化合物、ビタミンＢ３化合物（例えば、ナイアシンアミド）、又は他の周知の物質であってよい。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ドナー組織はエックスビボスクリーニング方法及び／又はモデルへの包含のために許容され、ここで、図３から選択される遺伝子のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又はそれ以上は、正の対照により皮膚老化防止利益を提供するために適切な方向に調節される。例えば、真皮遺伝子パネルは概して、許容可能なドナーでＴＧＦβ−１により上方調節され得るが、レチノイド代謝遺伝子パネルは概して、許容可能なドナーでｔＲＡにより下方調節され得る。いくつかの実施形態では、指向性は統計的に有意であり、及び／又は倍率変化は１、２、３、４、又は５超である。いくつかの実施形態では、少なくとも３つ、４つ、又はそれ以上の遺伝子が、ＦＢＮ１、ＦＢＬＮ１、ＴＮＸＢ、ＦＮ１、ＬＯＸＬ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＥＬＮ、ＬＯＸＬ１、ＡＬＤＨ１Ａ２、ＲＤＨ１０、ＲＡＲＲＥＳ１、及びＬＲＡＴからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又はそれ以上の遺伝子は、ＦＮ１、ＣＯＬＡ１、及びＥＬＮのうちの１つ以上を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、第２のヒト皮膚組織サンプルは正の対照でスクリーニングされ、対象遺伝子が適切に調節され得ること、及びドナー組織が妥当な応答を提供することができることを確証する。第２のヒト皮膚組織サンプルは、スクリーニング方法で使用された他の皮膚サンプルと同じヒトドナー外科手術廃棄物組織に由来することができる。
【００４０】
Ｖ．物質が皮膚利益を提供することを特定するために有用な遺伝子転写パターン
エックスビボスクリーニング方法及びモデルの更に別の進展は、試験薬剤が可能性としてインビボ利益を提供することを特定し得る、遺伝子転写パターンの特定である。本明細書の様々な図で表されるパターンに基づいて、いくつかの実施形態では、試験薬剤が可能性としてインビボ皮膚老化防止利益を提供することが特定される場合があり、ここで、図３で列挙される遺伝子のうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、１０個、１２個、１４個、１６個、又はそれ以上の転写プロファイルは、正の対照により誘発される調節と類似の様式で調節される。例えば、対象遺伝子は試験薬剤及び正の対照により同じ方向に調節され得る、並びに／又は倍率変化の大きさ（及びおそらくその統計的有意性）は同じ若しくは類似であり得る。他の実施形態では、対象遺伝子（単数又は複数）は皮膚老化防止利益を提供するために適切な方向に調節される。いくつかの実施形態では、調節は統計的に有意（例えば、ｐ≦０．１又は０．０５）であってよく、いくつかの実施形態では、倍率変化は１、２、３、４、５超、又はそれ以上であってよい。いくつかの実施形態では、倍率変化は、正の対照で観察された倍率変化より大きい場合がある。図４で示される遺伝子について、皮膚老化防止利益を提供する調節の１つの方向は、未処理の組織サンプルと比較して上方調節である。図３で示されるレチノイド代謝遺伝子パネルについて、皮膚老化防止利益を提供する、遺伝子のうちの多くについての調節の１つの方向は下方調節である（レチノイド型の応答が考えられるとき）。図３で示される表皮遺伝子パネルについて、調節の方向は、考えられる応答により上方又は下方のいずれかであってよい（例えば、レチノイドは概して、下方調節をもたらし得る）。
【００４１】
いくつかの実施形態では、対象遺伝子は、コラーゲン、エラスチン、ミクロフィブリルなどを含む、結合性及び細胞外マトリックス組織の形成と関連付けられる。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子は、ＦＢＮ１、ＦＢＬＮ１、ＴＮＸＢ、ＦＮ１、ＬＯＸＬ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＥＬＮ、ＬＯＸＬ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＲ１、ＴＧＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＣＴＧＦ、ＣＯＬ４Ａ１、及びＬＡＭＡ５からなる群から選択され、いくつかの実施形態では、対象遺伝子は、ＦＢＮ１、ＦＢＬＮ１、ＴＮＸＢ、ＦＮ１、ＬＯＸＬ２、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＥＬＮ、及びＬＯＸＬ１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、皮膚老化防止利益は、小じわ及び／又はしわの外観の改善、皮膚のたるみの改善、並びに質感のうちの１つ以上に関連する。
【００４２】
図１６を参照して、単一ドナーからの組織サンプルの倍率変化の熱マップが示される。組織サンプルを３７℃で５０％相対湿度にて７日間インキュベートし、ＴＧＦβ−１（正の対照として）及び試験薬剤を培地投与した。ドナー組織は、正の対照（図４の凡例を参照のこと）と関連付けられた調節パターンにより示されるように、良好な〜強いレスポンダーであったので、この結果は妥当であると考えられ得る。試験薬剤は、列挙された真皮遺伝子のうちの９つ全てを上方調節し、そのうちの８つは統計的に有意な様式で上方調節された。遺伝子のうちのいくつか（例えば、ＥＬＮ、ＬＯＸＬ１、及びＬＯＸＬ２）は、正の対照による調節の程度より大きな程度まで、試験薬剤により上方調節された。調節パターンに基づいて、この試験薬剤は皮膚老化防止利益を提供し得る物質として認定される。試験薬剤を、１３週ランダム化、二重盲検、溶媒対照、分割顔面小じわ及びしわ研究に供した。試験薬剤を、組成物の３．５重量％の濃度で組成物中に調合した。２３９人の試験被験者がこの研究に登録され、この被験者のうちの８８％がこの研究を完了した。測定した一次エンドポイントは、基準の像に対して、８及び１２週目で取られた専門家による画像の等級付けによる、小じわ及びしわの改善であった。しわ領域比率の画像解析は、測定された二次エンドポイントであった。試験薬剤は、専門家による画像の等級付けに従って、基準と比較して統計的に有意な量だけ小じわ及びしわの外観を改善した。また、試験薬剤は、３％グリセリン対照と比較して統計的に有意な量だけ、１２週間後、計算されたしわ領域比率を低下させた。このインビボ試験結果は、この試験薬剤が皮膚老化防止利益を提供することができることを示す。
【００４３】
本明細書のエックスビボモデル及び方法は驚くべきことに、２つ以上の薬剤の組み合わせが相乗剤転写応答を提供し得るかどうかを決定するために使用することができる。本明細書で使用されるとき、相乗的転写応答という句は、個々の試験薬剤により提供される転写応答とは異なる、又は更にはおそらく実質的に異なる転写応答を意味する。例えば、１つの相乗的応答は、個々の試験薬剤による一方向への遺伝子の調節、及び試験薬剤の組み合わせによる反対方向へのこの遺伝子の調節である。別の相乗的応答は、試験薬剤の組み合わせからの転写応答が各試験薬剤からの個々の転写応答の相加より、相加的に多い又は少ない場合である。
【００４４】
図１７を参照して、チョウセンアザミ葉抽出物、イナゴマメ果実抽出物、及びチョウセンアザミ葉とイナゴマメ種子抽出物との組み合わせを、本明細書に記載される方法に従って評価した。３７℃で及び５５％の相対湿度でインキュベートした７日間の時間過程にわたる、単一ドナーからのエックスビボ組織の、図３で示される表皮遺伝子パネルについて、未処理の対照に対する発現の倍率増加／減少を決定した。試験薬剤を局所適用した。正の倍率増加は、その遺伝子の所望される上方調節を示し、それはこの遺伝子の組では表皮分化の改善、皮膚バリア及び保湿状態、並びにしたがって正の老化防止利益のために重要であり得る。図１７で示されるように、チョウセンアザミ葉抽出物とイナゴマメ果実抽出物との組み合わせからの転写応答は概して、各試験薬剤からの個々の転写応答の相加から予測され得る転写応答より大きい（すなわち、相乗的応答）。加えて、いくつかの遺伝子は個々の試験薬剤両方により下方調節されるが、組み合わせにより上方調節された（例えば、ＫＲＴ１０、ＫＲＴ６Ａ、ＣＬＤＮ１、及びＫＲＴ１０を参照のこと）。
【００４５】
図１８を参照して、オリーブ油抽出物、チョウセンアザミ葉抽出物、及びこれらの抽出物の配合物を、本明細書に記載される方法に従って評価した。図１８の表の細胞は、図４の表の細胞と同じように斜交平行線模様で示される（すなわち、図４で提供される凡例を参照のこと）。７日間の時間過程にわたる、単一ドナーからのエックスビボ組織の、図３で示される真皮遺伝子パネルについて、未処理の対照に対する発現の倍率増加／減少を決定した。皮膚サンプルを３７℃の温度及び５５％の相対湿度でインキュベートした。試験薬剤を皮膚サンプルに局所適用した。図１８で示される熱マップは、両方の個々の抽出物に対する、このドナー皮膚のかなり制限された応答を示す。しかしながら、これらの２つの抽出物を混合したとき、図１８で示されるように有意性及び指向性の変化がある。これは、オリーブ油抽出物の濃度を０．００１％まで増加させたとき、更により強く明白である。これは、老化防止利益を相乗的に提供し得る活性剤を特定する別の例である。
【００４６】
ＶＩ．ｍＲＮＡプロセッシング
ｍＲＮＡプロセッシングは、ヒト皮膚組織サンプルを微粉砕又は均質化し、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は解析のための他の物質を得ることを含んでよい。本明細書に記載される方法及びモデルは、完全な又は部分的なヒト皮膚組織サンプルからの、又はこのようなサンプルから除去された単細胞種からのＲＮＡの解析を含むことができる。真皮層及び表皮層を除去し、別個に又は共に解析してよい。転写プロファイルはヒト皮膚組織サンプル（単数）又はサンプル（複数）の、そのような個々の細胞、層から、又は複数の細胞、層、部分（又は全体）から作成することができる。遺伝子発現測定は、任意の好適なプロファイリング技術を用いて行ってよい。例えば、マイクロアレイ技術を用いて対象遺伝子のｍＲＮＡ発現を決定してよい。使用可能な他の新たな技術としては、ＮｅｘｔＧｅｎ配列決定法を用いるＲＮＡ−Ｓｅｑ又は全トランスクリプトームの配列決定が挙げられる。本明細書で使用されるとき、「マイクロアレイ」という用語は、生体サンプルの遺伝子発現プロファイリングを可能にする基板上の核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質、小分子、大分子、及び／又はそれらの組み合わせのあらゆる順序配列を広く指す。マイクロアレイの非限定的な例としては、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｉｎｃ．、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．などから入手可能である。
【００４７】
ｍＲＮＡプロセッシングの非限定的な例は実施例３で提供される。
【００４８】
ＶＩＩ．スクリーニング方法及びモデル
上記に説明したように、ヒトドナー組織は外科手術廃棄物組織に由来することができる。外科手術廃棄物組織が少なくとも第１のヒト皮膚サンプル及び第２のヒト皮膚サンプルに分けられる実施形態では、皮下脂肪層は、組織を個々のサンプルに分ける前に除去することができる（必ずしも除去する必要はないが）。皮下脂肪層が除去されるいくつかの実施形態では、ヒト皮膚サンプルは、主に表皮層及び真皮層からなる場合がある。皮膚サンプルは、正の対照物質、１つ以上の試験薬剤を投与され、又は比較対照としての使用のために未処理のまま（正の対照又は試験薬剤（単数又は複数）のいずれかで処理されないことを意味する）であってよい。いくつかの実施形態では、組織サンプルの全て又は一部のみに、試験薬剤（単数又は複数）、又は正の対照を投与してよい。上記に説明されるように、複数の試験薬剤及び試験薬剤の組み合わせを、相乗的転写応答を特定するためにスクリーニングする場合がある。
【００４９】
いくつかの実施形態では、このスクリーニング方法は反復して使用してよい。このスクリーニング方法は以下のもの、１）皮膚サンプルを提供すること、２）皮膚サンプルを正の対照又は試験薬剤と接触させること、３）正の対照及び／又は試験薬剤で処理した皮膚サンプルの転写プロファイルを作成すること、４）正の対照で処理した皮膚サンプルの転写プロファイルを試験薬剤で処理した皮膚サンプルの転写プロファイルと比較すること、並びに５）試験薬剤が老化防止利益を提供するために好適であることを特定すること、のうちの１つ以上を繰り返すことを含み得る。上記反復で使用した皮膚サンプルは様々なドナーからであってよい。また、各反復は、様々な試験薬剤及び／又は様々な正の対照を含んでよい。複数の試験薬剤を本方法に従ってスクリーニングしてよい。いくつかの実施形態では、約５、１０、２５、５０、１００、２００、４００、８００超、及び／又は約１０００、２５００、５０００、１００００、２００００、若しくは５００００未満の試験薬剤をスクリーニングしてよい。いくつかの実施形態では、様々なドナーからのエックスビボ組織を用いてスクリーニングした試験薬剤のうちの２、４、６、１０、２５、５０、１００、２００、５００、又はそれ以上の効果を互いに比較し、どの試験薬剤が互いと比較して又は正の対照と比較して、対象遺伝子の最も良好な調節を提供し、化粧品皮膚老化防止利益を提供するかを特定する場合がある。
【００５０】
試験薬剤又は正の対照は、局所適用するか、又は培地を介して適用してよい。局所適用のために、エックスビボ皮膚組織を薬剤の適用前に乾燥させてよい。いくつかの実施形態では、試験薬剤は毎日又は所望されるように別の好適な間隔で（例えば、毎時、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１０、若しくは２０時間毎、１日おき、又は複数週にわたる特定の日に）局所適用してよい。本明細書の試験薬剤はエックスビボ組織サンプルへの適用のために好適な任意の物質の形態であり、任意の化合物、化学物質、成分、抽出物、賦形剤、混合物、調合物、又は組成物を含むが、これらに限定されない。パーソナルケア組成物への組み込みのために好適な試験薬剤を選択することが所望され得る。例えば、多種多様な画分又は化合物を含み得る植物抽出物は本明細書の試験薬剤と考えられ、場合によっては、化粧品組成物に組み込まれることが知られる。
【００５１】
エックスビボ皮膚組織はその組織の細胞の代謝速度に基づいて供給され得る。供給は、１日に複数回、毎日、１日おき、又は（２、３週間、又はそれ以上などの）複数週間全体での特定の日であり得る。供給は温度依存的であることができ、例えば、３７Ｃの温度で維持された培養物に毎日、又は３３Ｃの温度で維持された培養物に１日おきに供給する。
【００５２】
エックスビボ皮膚組織モデルは、本明細書に記載される方法のうちの１つ以上に従って培養された１つ以上のエックスビボ皮膚組織サンプルを含んでよい。１つの実施形態では、このモデルは、正の対照としてのＴＧＦ化合物で処理された、ヒト皮膚外科手術廃棄物組織に由来する培養されたエックスビボ皮膚組織サンプルを含み、ここで、方向的に適切な様式での更に２つの遺伝子の調節は、このヒト外科手術廃棄物組織が試験薬剤をスクリーニングするために許容されることを示す。いくつかの実施形態では、この２つ以上の遺伝子はＴＧＦ化合物により調節されることが知られる又はそのように考えられる遺伝子である。いくつかの実施形態では、この２つ以上の遺伝子は図４に列挙される遺伝子から選択される。いくつかの実施形態では、この２つ以上の遺伝子は図３の真皮遺伝子パネルから選択される。いくつかの実施形態では、この方向的に適切な調節は、この２つ以上の遺伝子の上方調節を含む。このモデルはヒト外科手術廃棄物組織に由来する１つ以上の追加のヒト皮膚サンプルを更に含む場合があり、それは試験薬剤をスクリーニングするために好適な様式で培養してよい。
【００５３】
また、本明細書に記載されるスクリーニング方法は、階層的スクリーニングプロセスを提供するために他のスクリーニング方法と組み合わせてよい。階層的スクリーニング方法は典型的に、各階層での複雑性の増加のアッセイと関連付けられる。階層的スクリーニング方法の各階層は追加のデータを提供し、これにより、試験薬剤が皮膚老化防止利益を提供する可能性に対してより正確に焦点を合わせる結論が引き出されることを許容する。それゆえ、この方法のより高次の階層は、有効であるというより高い確率を有する可能性のある、より少ない数の薬剤と関連付けられる。階層は、いくつかの実施形態では、以下のように進んでよい。酵素アッセイ、細胞ベースの培養、インビトロアッセイ、及び本発明の１つ以上のエックスビボ皮膚アッセイ。酵素アッセイはタンパク質機能の解析を含み、細胞ベースの培養は単に、主に培養プレート中の細胞培養を含み、インビトロアッセイは、組み合わされた細胞種でのより複雑な培養条件を含む。最初の階層はより高い出力で比較的より迅速に完了することができ、一方で、高次の階層は典型的に、追加の時間がかかり、かつスループットがより低い。各階層の徹底的な解析は、試験薬剤の成功の確率を増加させる最終的なデータを提供する。
【００５４】
ＶＩＩＩ．化粧品組成物
様々な化粧品皮膚老化防止利益を消費者に提供することが望ましいため、本明細書に記載されるスクリーニング方法及びモデルのうちの１つ以上によって特定された試験薬剤を、皮膚への局所適用に好適な化粧品組成物に組み込むことが有益であり得る。インビボ試験のために化粧品組成物を調合することに加えて、化粧品組成物を商用流通のために繰り返し製造する、又は調合する場合がある。この化粧品組成物は本明細書に記載されるモデル及び／又はスクリーニング方法により特定された試験薬剤（単数又は複数）を、皮膚科学的に許容される担体と混合することにより形成され得る。いくつかの実施形態では、この化粧品組成物の商用量又はバルク量が製造される場合がある。例えば、この化粧品組成物はバッチプロセスにより製造される場合があり、ここで、比較的大きな体積の成分が１つ以上の器中で混合され、その後、商用／小売り流通のために好適な複数の容器又は包装中に入れられる、又は保存される。いくつかの実施形態では、これらの成分は、製品容器／包装中で全体として又は部分的に混合される場合がある。特定の実施形態では、この化粧品組成物は、提供される特定の化粧品組成物に一般的に含まれる種類の１つ以上の任意選択の成分を含んでよい。
【００５５】
皮膚科学的に許容される担体は、ヒト皮膚組織と接触して使用するために安全であるべきである。いくつかの好適な担体は水及び／又は水混和性溶剤を含む場合があるが、当該技術分野において知られるように他の担体を使用してよい。化粧品スキンケア組成物は、約１重量％〜約９５重量％の水及び／又は水混和性溶剤を含んでよい。特定の実施形態では、パーソナルケア組成物は、水、ジオール、グリセリン、及びこれらの組み合わせを含んでよい。スキンケア組成物が乳状液の形態であるとき、水及び／又は水混和性溶剤は典型的に、水相と関連付けられる担体である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本明細書の組成物は１重量％〜９５重量％の量の油担体を含む場合がある。油は、水又は水溶性溶剤に好適ではない物質を可溶化、分散、又は担持するために使用してよい。好適な油としては、シリコーン、炭化水素、エステル、アミド、エーテル、及びこれらの混合物が挙げられる。油は室温で流体であってよい。油は、揮発性又は不揮発性であってよい。スキンケア組成物が乳状液の形態であるとき、油は典型的に、油相と関連付けられる担体である。
【００５７】
本明細書の組成物は乳化剤を含んでよい。乳化剤は、組成物が乳状液の形態であるとき、又は不混和性物質が混合されているときに、特に好適である。スキンケア組成物は、約０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．５％、又は１％〜約２０％、１０％、５％、３％、２％、又は１％の乳化剤を含んでよい。乳化剤は、非イオン性、陰イオン性、又は陽イオン性であってよい。乳化剤の非限定的な例は、米国特許第３，７５５，５６０号、同第４，４２１，７６９号、及びＭ．Ｃ．Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．から発行されたＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ，Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ，２０１０  Ａｎｎｕａｌ  Ｅｄ．に開示されている。他の好適な乳化剤は、Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｃａｒｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｏｕｎｃｉｌ’ｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ａｎｄ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｔｈｉｒｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００６（「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ−Ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  Ａｇｅｎｔｓ」の機能的カテゴリ下）で更に説明される。直鎖又は分枝鎖型シリコーン乳化剤もまた、使用してよい。特に有用なポリエーテル修飾シリコーンとしては、Ｓｈｉｎ  ＥｔｓｕからのＫＦ−６０１１、ＫＦ−６０１２、ＫＦ−６０１３、ＫＦ−６０１５、ＫＦ−６０１５、ＫＦ−６０１７、ＫＦ−６０４３、ＫＦ−６０２８、及びＫＦ−６０３８が挙げられる。また、特に有用なものは、Ｓｈｉｎ  ＥｔｓｕからのＫＦ−６１００、ＫＦ−６１０４、及びＫＦ−６１０５を含むポリグリセロール化直鎖又は分枝鎖シロキサン乳化剤である。また、乳化剤としては、乳化シリコーン弾性体も挙げられる。
【００５８】
スキンケア組成物は概して、組成物及び局所組成物の製造分野において既知であるような従来の方法によって調製してよい。このような方法は、加熱、冷却、真空の適用などを用いて、又はこれらを用いずに、１つ以上の工程で、成分を比較的均一な状態になるまで混合することを含んでよい。乳状液は、最初に水相物質を脂肪相物質とは別個に混合し、その後、２相を適宜組み合わせて、所望の連続層を得ることにより調製される場合がある。組成物を、処理期間中、十分な量の組成物を保存するためのサイズの包装又は容器中に提供又は保存してよい。容器又は包装のサイズ、形状、及び設計は多種多様であってよい。特定の包装の例は、米国デザイン特許第Ｄ５７０，７０７号、同第Ｄ３９１，１６２号、同第Ｄ５１６，４３６号、同第Ｄ５３５，１９１号、同第Ｄ５４２，６６０号、同第Ｄ５４７，１９３号、同第Ｄ５４７，６６１号、同第Ｄ５５８，５９１号、同第Ｄ５６３，２２１号、米国特許公開第２００９／００１７０８０号、同第２００７／０２０５２２６号、及び同第２００７／００４０３０６号に記載されている。
【実施例】
【００５９】
以下は、本明細書に記載される方法及びモデルの様々な態様の非限定的な実施例である。本発明の多くの変形が可能であるので、実施例は例示目的のみのために与えられ、本発明の限定として解釈されるべきでない。
【００６０】
実施例１：エックスビボ組織調製
調製のための材料は、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ及びＧｌｕｔａｍａｘ、抗生物質及び抗真菌剤、１Ｘリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ（−ｃａ、−ｍｇ））、１５０ｍｍ×１５ｍｍ滅菌培養皿、滅菌ガーゼ４×４、使い捨て安全外科用メス、４ｍｍ使い捨て生検パンチ、６ウェル細胞培養インサート、消毒済みピンセット、綿棒、６ウェル培養プレート、１２×１２定規を任意選択で伴う罫線付き消毒済みまな板、スクレーパーハンドル、組織凍結培地、生検カセット、凍結組織凍結器、１０％ホルマリン、固定組織用の輸送用容器、及びバイオハザード／鋭利物容器を含んだ。
【００６１】
皮膚調製は、皮膚の到着に先立つ培地調製を含んだ（３Ｘ培地は、５００ｍＬ  ＤＭＥＭ、並びに１５ｍＬの抗生物質及び抗真菌剤を含み、３Ｘは、インキュベーションの最初の１時間に使用された抗生物質／抗真菌剤の３倍レベルについて言及したものであり、１ｘ培地は、５００ｍＬ  ＤＭＥＭ、並びに５ｍＬの抗生物質及び抗真菌剤である）。皮膚は、滅菌培養皿中の滅菌ＤＭＥＭ浸漬ガーゼ上で真皮（脂肪）側を下にして到着した。培養皿はテープで閉じられ、バイオハザードジップロック袋に入れられ、二次容器内の氷の上にあった。
【００６２】
到着に際して、皮膚を袋から取り出し、３Ｘ  ＤＭＥＭ培地に浸漬し、４℃で１時間保存した。１時間後、皮膚を３Ｘ  ＤＭＥＭから取り出し、滅菌１Ｘ  ＰＢＳですすいだ。皮膚を１Ｘ  ＤＭＥＭに浸漬したガーゼを含有する清潔な培養皿に入れた。サンプルを到着と同日に培養に供した。ただし、所望の場合は、サンプルを４℃で一晩保存してよい。
【００６３】
培養のための調製では、以下のことを皮膚組織に対して行った。まな板上で、表皮が下になり、脂肪が露出するように皮膚組織を位置付けた。脂肪を、滅菌鋸歯状鉗子で皮膚の１つの角部を慎重につかみ、皮膚に対して４５度の角度で握った刃で脂肪を削り取ることにより、使い捨て外科用メスで除去した。脂肪を除去した後、スクレーパーを直定規ガイドとして用いて外科的縁部を外科用メスで切り落とし、皮膚はそこに保持した。スクレーパーをガイドとして用いて、幅を測定するために（まな板上に任意選択で提供される定規などの）定規を用いて、皮膚を１．２５ｃｍ幅の条片に切った。この条片を１Ｘ  ＰＢＳを含有する１００ｍｍ培養皿中ですすいだ。これらの条片を１．２５ｃｍ角に切り、それらを３０分後に培養に供するまで（１５分、３０分、４５分、又は１時間の時点が様々な非限定的な実施例で使用される）、１００ｍｍ培養皿中の１Ｘ  ＤＭＥＭ浸漬ガーゼ上に置いた。
【００６４】
実施例２
エックスビボ組織培養
培養は、２．５ｍＬの培地又は処理を６ウェル組織プレートの各ウェルに入れること、各ウェルに１つのＭｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）ブランド培養インサートを加えること、及び１００μＬの１Ｘ  ＤＭＥＭを各インサート膜の中心上に入れることを含んだ。皮膚サンプル角を無作為に選択し、膜上の培地の上部上のインサートのそれぞれに置いた（１インサート当たり１つの皮膚サンプル）。これらのプレートを３３℃で保存した（ただし、追加の非限定的な実施例は実験エンドポイントにより３７℃である場合がある）。対照として、基準組織測定を余剰の廃棄物から回収した（急速凍結のために低温を使用した）。基準生検の回収は各組織片からのものを含んだ。１つの４ｍｍパンチはＭＴＴ用であり、１つの４ｍｍパンチ（ＯＣＴ内で急速凍結された）は新鮮な状態の組織学用であり、１つの４ｍｍパンチはパラフィン埋め込み用に１０％ホルマリン中に固定され、２つの４ｍｍパンチ（液体窒素中で急速凍結された）はＰＣＲ用であった。
【００６５】
モデルの培養及び処理は、ｎ＝６の複製を含んだ（ただし、ｎ＝５などの追加の量の複製を使用してもよい）。皮膚の培地投与は（ＰＢＳ、培地、アルコール、及びＤＭＳＯを含む）適切な溶剤中で使用される可溶化化合物を含んだ（ＤＭＳＯの使用では、プレート中の最終濃度は０．０１％に制限された）。適切な希釈を処理のために行った。処理のために１日当たり１プレート当たり１５ｍＬの培地が必要とされ、細胞培養インサート下の１ウェル当たり２．５ｍＬの培地が必要とされた。培地を事前に温め、実験中毎日交換した。培地を吸引し、１ウェル当たり２．５ｍＬのレベルで新鮮な温めた培地と置換した。組織に、ＤＭＥＭ対照、溶媒のみ、及び個々の可溶化処理行程を毎日投与した。
【００６６】
実験を開始する前に、全ての管及びプレートに適切に標識を付けた。まな板、鉗子、４ｍｍパンチ、液体窒素バケツ、及びＭＴＴプレートセットを使用可能にした。また、１組の管を、ＲＮＡを得るために取得した（特定の実施形態では、６つの基準サンプルが回収された）。ＭＴＴプレートに事前に標識を付け、ＤＭＥＭ培地中の１ｍｇ／ｍＬ  ＭＴＴ  ６００μＬを各ウェルに添加した。全てのサンプルは４ｍｍ生検であった。（事前にアルコールで清潔にした）工芸用まな板上で（Ｓｋｌａｒ  ４ｍｍ生検パンチなどの）生検パンチ及びハンマーを用いて、ＲＮＡ用の２パンチ、及びＭＴＴ用の１パンチを取った。全ての必要なパンチを取るために、１度にマット上で（ｎ＝５又はｎ＝６などの）１つの処理群について作業して、生検を取るためにハンマーを軽くたたいた。２つのパンチをスクリューキャップ管に入れ、液体窒素中で急速凍結した。ＭＴＴプレート中の１ウェル当たり、１つのパンチを置いた。作業は手早く行った。全てのサンプルを回収するための処理群当たりの時間は５分であった（５〜１０分が回収時間の非限定的な例である）。全ての群がプロセスされたら、ＭＴＴプレートをインキュベーター内に２４時間入れた。
【００６７】
ＭＴＴ評価は、インキュベーター内での２４時間のインキュベーションを含んだ。ウェルプレート（２ｍＬの深さ）に１サンプル当たり１ｍＬのイソロパノールを添加した。１ウェル当たり１つのサンプルを置き、そのウェルを密閉し、標識を付した。プレートを３日間の抽出のために４Ｃに入れた。
【００６８】
ＭＴＴプレートを以下の様式で読み取った。９６ウェル透明平底プレートを使用した（ただし、任意の細胞培養プレートをおそらく使用することができる）。深いウェルプレート中でイソプロパノールを混合し、その後、１５０μＬの各サンプルを新しい９６ウェルプレートにピペットで入れた。ＧＥＮ５ソフトウェアを伴うＥＰＯＣＨプレートリーダーを使用し、吸収エンドポイントを（１つの例では５６２で）使用のために選択した。
【００６９】
実施例３
ｍＲＮＡプロセッシング、ナノドロップ定量及び純度評価、ＲＮＡ定量ゲルプロトコル、ｃＤＮＡ合成、並びにＰＣＲ設定
凍結調製及び抽出のために、以下の装置を得て、調製した。２ｍＬ丸底管に１ｍＬのＴＲＩＺＯＬを調製し、各サンプルについて５ｍｍのステンレススチールビーズを準備した。ドライアイスバケツを得て、液体窒素をそのバケツに入れた。生検パンチをドライアイス上で維持し、サンプルを凍結したままにした。凍結袋及びｃｏｖａｒｉｓ  ｃｒｙｏｐｒｅｐをサンプルの凍結破砕で使用した。サンプルを凍結破砕するために、生検を凍結袋（１サンプル当たり２つ）に入れ、液体窒素中に浸し、その後、ｃｒｙｏｐｒｅｐ（設定４）に入れた。サンプル袋を取り出し、窒素中に再び浸した。平坦なディスクを除去し、ＴＲＩＺＯＬを有する、対応する２ｍＬ管に入れた。このディスクをＴＲＩＺＯＬ中で凍結したまま維持した。管を閉じ、急速凍結し、管全体を液体窒素に入れた。全てのサンプルでこのプロセスを繰り返した後、サンプルを箱に入れ、次の工程まで−８０で保存した。
【００７０】
サンプルを融解する前に、ＰＬＧ  Ｈｅａｖｙ管を準備し（１２０００ｒｐｍで２分間、事前に遠心分離）、（１度に２４個のサンプルについて作業して）準備した。サンプルを含有する凍結丸底管を融解した。サンプルを３０００ｒｐｍで３分間、ビーズ拍動させた。サンプルを１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。この時間の間、１．５ｍＬ管中に２００μＬクロロホルムを含有する管を準備した。ＴＲＩＺＯＬ上清を取り、クロロホルム管に添加し、その後、ボルテックスした（１５秒間）。総量１．２ｍＬの、上清及びクロロホルムをＰＬＧ管に添加した。サンプルを１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。水相をＰＬＧ管から除去し、２ｍＬの深いウェルに入れ、２４個の各セットを同じプレートに回収し、添加と添加との間、４度で保存した（様々な実施形態では、サンプルが同じ日にＭａｇｍａｘ上に置かれない場合、プレートを凍結することができる）。
【００７１】
次に、Ｍａｇｍａｘ磁気ビーズＲＮＡ抽出を行った。水相を含有する深いウェルのプレートを融解した。緩衝液が瓶に添加された適切なアルコール量を有することを確認するために洗浄緩衝液のチェックを行った。調整洗浄１を、マイクロＲＮＡ抽出を得るために使用した（瓶中の１２ｍＬ＋１２ｍＬイソプロピルアルコール）。二次洗浄もまた行った。溶離緩衝液は事前調製されたものであり、任意の添加物を必要としなかった。
【００７２】
プレートをＭａｇｍａｘ用に準備したら、機械を作動させ、適切なプロトコルを選択し、プレートをロードした。３５分間の作動周期を行い、プレートを除去した。抽出は加熱工程であり、抽出プレート上での余分の時間はＲＮＡを分解するであろう。溶離プレートをホイルで密閉し、蓋をホイルの上に置いた。必要になるまでＲＮＡを−８０で保存した。
【００７３】
ＲＮＡ定量ゲルプロトコル
Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｃｈｉｐ  ＲＮＡ−Ｎａｎｏを用いて、ＲＮＡ定量ゲルを行った。試薬を調製した。以下のＡｇｉｌｅｎｔ試薬を４Ｃの冷蔵庫から取り出した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｌｕｅ（色素）、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ（ナノラダー、使用前に７０°で２分間加熱し、氷上に置き、管に５μＬずつ等分し、−２０Ｃで保存した）、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｇｒｅｅｎ、及びＡｇｉｌｅｎｔ  Ｒｅｄ（ゲル）。試薬を１０分間、室温まで温めた。５５０μＬのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｒｅｄ（ゲル）をピペットでフィルターカラムに入れ、１５００ｇで室温にて１０分間遠心分離した。Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｌｕｅ（色素）を１０秒間、ボルテックスした。６５μＬのフィルターを通したゲルを管に等分し、１μＬのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｌｕｅ（色素）を添加し、その管を１３０００ｇで１０分間遠心分離した。次に、Ａｇｉｌｅｎｔチップを９μＬのゲル−色素混合物と共にプライミングステーションにロードした。プライミングステーションを３０秒間閉じ、続いてプランジャを引いた。プライミングステーションの残りの２Ｇウェルに９μＬのゲル−色素混合物をロードした。ラダーサンプルのロードに関して、以下のものを使用した。ラダーウェルを含む各ウェルに５μＬのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇｒｅｅｎをピペットで入れ（使用されないウェルには、６μＬのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｇｒｅｅｎを添加した）、１μＬのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ（ナノラダー）をラダーウェルに添加し、１μＬのサンプルを各ウェルに添加した。チップ振とう器内でのボルテックスを１分間行い、それに際して、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用した。
【００７４】
ｃＤＮＡ合成
ｍＲＮＡサンプルから、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ反応を、最初にマスターミックス、その後サンプル体積、最後に水を伴って、０．２ｍＬ  ＰＣＲストリップ管中で行った。蓋を閉じ、混合及びスピンダウンを行った。管をサーマルサイクラーに入れ、作動させ、サンプルを４度で保ち、その後続いて、ＰＣＲ反応に必要になるまで−２０で保存した。
【００７５】
ＰＣＲ設定
ＰＣＲを、ＲＯＸを伴うＱｕａｎｔａ  Ｐｅｒｆｅｃｔａ  Ｓｙｂｒ  ｇｒｅｅｎマスターミックスを用いて行った。ＰＣＲプレートにプロジェクト番号を付した。ＰＣＲに必要なプライマーを全てのプレートに事前に入れた。試薬を混合し、その後、反応混合物をプレート全体に等分して、１ウェル当たり２０μＬ入れた。プレート設定は１２×８であり、プレート下に向かって８サンプル、横に向かって１２遺伝子であった。設定反応を０．５ｍＬ管中で行った。ＰＣＲプレートを使用前に室温にした。マスターミックスを使用前に遠心分離した。ＰＣＲ解析は、ＳｔｅｐＯｎｅソフトウェア、並びにハウスキーピング遺伝子及び幾何学的手段の使用を伴った。
【００７６】
本明細書に開示した寸法及び値は、記載された正確な数値に厳密に限定されるものと理解すべきでない。むしろ、特に断らないかぎり、そのような寸法のそれぞれは、記載された値及びその値の周辺の機能的に同等の範囲の両方を意味するものとする。例えば、「４０ｍｍ」として開示される寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することを意図する。
【００７７】
相互参照されるか又は関連する全ての特許又は特許出願を含む、本明細書に引用される全ての文書を、特に除外すること又は限定することを明言しない限りにおいて、その全容にわたって本明細書に援用するものである。いかなる文献の引用も、それが本明細書において開示されているか若しくは特許請求の範囲に記載されているいずれかの発明に関する先行技術であることを認めるものではなく、あるいはそれが単独で又は他のいかなる参考文献（単数若しくは複数）とのいかなる組み合わせにおいても、かかる発明を教示する、提案する、又は開示することを認めるものではない。更に、本文書において、用語の任意の意味又は定義の範囲が、参考として組み込まれた文書中の同様の用語の任意の意味又は定義と矛盾する場合には、本文書中で用語に割り当てられる意味又は定義に準拠するものとする。
【００７８】
本発明の特定の実施形態が例示され記載されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の様々な変更及び修正を実施できることが当業者には自明であろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのようなすべての変更及び修正を添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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