(57)【要約】空間（２０）内に含まれる液体媒体中のマクロイオン、例えばＤＮＡ、を検出する方法であって、ａ）上記液体媒体を刺激する電場に掛けて、マクロイオンの塊の形成を誘発する段階であって、マクロイオンの上記形成された塊は好ましくは、何らの追加のラベリング剤を含まない、上記誘発する段階と、ｂ）上記空間の検出ゾーンにおいて、上記液体媒体中の上記マクロイオンの上記濃度に依存する少なくとも一つの変数の、上記液体媒体内の空間的な及び／又は時間的なゆらぎ、例えば電気的又は光学的、を測定する段階と、ｃ）これらゆらぎに基づいて、上記マクロイオンの存在を決定する段階であって、段階ｃ）は好ましくは、段階ｂ）で測定された上記ゆらぎを、時間依存若しくは空間依存解析により、より好ましくはウェーブレット解析により、又は、自己相関により、処理することを含む、上記決定する段階とを含む、上記方法。【選択図】図１Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
空間（２０）内に含まれる液体媒体中のマクロイオンを検出する方法であって、
ａ）前記液体媒体を刺激する電場に掛けて、マクロイオンの塊の形成を誘発する段階であって、前記塊の形成は、前記液体媒体中の前記マクロイオンの濃度のランダムな空間的ゆらぎを生成し、マクロイオンの前記形成された塊は好ましくは、何らの追加のラベリング剤を含まない、前記誘発する段階と、
ｂ）前記空間の検出ゾーンにおいて、前記液体媒体中の前記マクロイオンの前記濃度に依存する少なくとも一つの変数の、前記液体媒体内の空間的な及び／又は時間的なゆらぎを測定する段階と、
ｃ）これらゆらぎに基づいて、前記マクロイオンの存在を決定する段階であって、段階ｃ）は好ましくは、段階ｂ）で測定された前記ゆらぎを、時間依存若しくは空間依存解析により、より好ましくはウェーブレット解析により、又は、自己相関により、処理することを含む、前記決定する段階と
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記マクロイオンが多価電解質であり、及び多価電解質の塊が段階ａ）で形成され、前記多価電解質が好ましくは、核酸、より好ましくは５キロ塩基以上、又は５キロ塩基対以上、好ましくは１０キロ塩基以上、又は１０キロ塩基対以上、を有する核酸鎖を含み、前記核酸の塊は好ましくは、段階ａ）で形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記多価電解質が、核酸、より好ましくは５キロ塩基以上、又は５キロ塩基対以上、好ましくは１０キロ塩基以上、又は１０キロ塩基対以上、を有する核酸鎖を含み、及び、段階ａ）での前記液体媒体中に存在する前記多価電解質は好ましくは、核酸増幅の段階の後に又はその間に得られ、前記増幅は好ましくは、リアルタイム定量増幅であり、又は、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応増幅、核酸等温増幅、ローリング・サークル増幅、分岐ローリング・サークル増幅、サークル−サークル増幅、LAMP、NASBA、TMA、SMART、HAD、RPA、CPA、SMART-AMP、RCA、HRCA、RAM、SDA、NEAR、NEMA、ICA、EXPAR、BAD  AMP、若しくはPG-RCA増幅、又は、Phi29  ＤＮＡポリメラーゼを使用する核酸増幅方法のうちの少なくとも一つを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
段階ｂ）で測定される前記空間的な及び／又は時間的なゆらぎが、電気的変数、好ましくは、伝導度又はインピーダンス、複素インピーダンス、複素伝導度、電流又は電圧、より好ましくは伝導度、のゆらぎであり、
又は、
段階ｂ）で測定される前記空間的な及び／又は時間的なゆらぎが、光学的変数、好ましくは、光学吸収、蛍光、発光、二色性、複屈折、光散乱、又は旋光能の中から選択される光学的変数のゆらぎである、
請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記段階ａ）で施与される刺激する電場が、
−  直流の電場又は、1000Hz以下、好ましくは100Hz以下の周波数の交流の電場であり、及び／又は、
−  50V/cm以上、好ましくは100V/cm以上、より好ましくは200V/cm以上の強度を有し、及び／又は、
−  異なる周波数を有する少なくとも第１及び第２の電場成分の重畳を含み、前記第２の電場成分は前記第１の電場成分の振幅よりも低い振幅を有し、及び、前記第２の電場成分は、直流であり又は、前記第１の電場成分の周波数よりも低い周波数を有する、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記変数が電気的であり、及び、前記電気的変数の前記ゆらぎが、前記液体媒体と直接電気接触する少なくとも２つの電極（１０）により段階ｂ）で測定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記電気的変数の前記ゆらぎが、前記刺激する電場の方向に対して横である、好ましくは垂直である、軸に沿って、互いに向かい合う、少なくとも２つの電極（１０）により段階ｂ）で測定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記変数が電気的であり、及び、前記電気的変数の前記ゆらぎが、前記電場の方向に対して平行な軸に沿って異なる位置で配置された少なくとも２つの電極により段階ｂ）で測定され、段階ａ）で施与される前記刺激する電場が好ましくは、前記電気的変数の前記ゆらぎを段階ｂ）で測定する電極と同じ電極により施与される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
段階ａ）で施与される前記刺激する電場が、前記電気的変数の前記ゆらぎを段階ｂ）で測定する電極（１０）と異なる電極（３０）により施与される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記変数が電気的であり、及び、前記電気的変数の前記ゆらぎが、段階ａ）で施与される前記刺激する電場の最高周波数成分と異なる周波数を有する交流分極信号により分極された少なくとも２つの電極（１０）により段階ｂ）で測定され、前記分極信号の前記周波数は好ましくは、前記周波数成分よりも大きく、より好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは１００倍、より好ましくは１０００倍大きい、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記変数の前記ゆらぎは前記刺激する電場が施与される間に測定され、又は、前記変数の前記ゆらぎは前記刺激する電場が施与されていない間に測定され、前記刺激する電場が好ましくは、第１の期間の間に施与されず、前記第１の期間は、前記刺激する電場がその間に施与される第２の期間と交互に起こる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記核酸が、前記核酸増幅の段階の間、緩衝液を含む媒体中に存在し、及び、段階ａ）で使用される前記液体媒体がまた、同じ前記緩衝液を含む、請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝液が、1000mS/m以下、好ましくは500mS/m以下、より好ましくは350mS/m以下、特には300mS/m以下、特には275mS/m以下の伝導度を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記緩衝液が、３７℃又はそれ未満、好ましくは３０℃又はそれ未満、の温度で活性なポリメラーゼを含む、請求項１２及び１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記緩衝液がさらにリガーゼを含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項１４及び１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記空間（２０）が複数の検出ゾーン（100a；…；100n）を備えており、前記検出ゾーン（100a；…；100n）のそれぞれが、前記液体媒体中の前記マクロイオンの前記濃度に依存する少なくとも一つの変数の検出器（10a；10b；10c）を備えている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記液体媒体が、検出されるべきマクロイオン、特には核酸、の種々のタイプを含み、及び、前記マクロイオンと相互作用するように構成された複数の化合物（110a；…；110n）は、前記検出ゾーン（100a；…；100n）のそれぞれに存在し、一つの検出ゾーンに存在する該複数の化合物は、他の検出ゾーンに存在する複数の化合物と異なる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
検出されるべき前記マクロイオンが核酸であり、及び、前記化合物（110a；…；110n）は、前記核酸の種々のヌクレオチド配列と相互作用するように、特にはそれにハイブリダイズするように、構成されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記空間（２０）が縦軸（X）に沿って延在し、及び、前記検出ゾーン（100a；…；100n）が前記縦軸（X）に沿って互いに続く、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記空間（２０）は、それぞれが検出ゾーンを含む複数のサブチャンネル（20a；…；20n）を備えている、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記液体媒体中の前記マクロイオンの前記濃度に依存する少なくとも一つの変数の前記液体媒体内の前記空間的及び／又は時間的ゆらぎが、前記検出ゾーン（100a；…；100n）のそれぞれの間で同時に測定される、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記液体媒体中の前記マクロイオンの前記濃度に依存する少なくとも一つの変数の前記液体媒体内の前記空間的及び／又は時間的ゆらぎが、前記検出ゾーン（100a；…；100n）のそれぞれの間で逐次的に測定される、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記液体媒体中の前記マクロイオンの前記濃度に依存する少なくとも一つの変数の前記液体媒体内の前記空間的及び／又は時間的ゆらぎが、前記検出ゾーン（100a；…；100n）のそれぞれの間で測定され、及び、段階ｃ）が、前記複数の検出ゾーン（100a；…；100n）から測定された前記空間的及び／又は時間的ゆらぎを処理することを含む、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
塊にされ且つ検出されるべき前記核酸、特にはＤＮＡ、が、挿入剤、特にはＤＮＡ挿入剤、を含む、請求項３〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記電極が、表面処理剤を含む少なくとも一つの層で被覆されている、請求項６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記表面処理剤が、ヒドロゲル又は界面活性剤である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記刺激する電場がまた、前記液体媒体中の前記マクロイオン塊の移動を誘発する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
段階ｂ）で測定される前記空間的な及び／又は時間的なゆらぎが非周期的である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
段階ｂ）で測定される前記空間的な及び／又は時間的なゆらぎがランダムである、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法を実行するための装置であって、
−液体媒体を受ける為の空間（２０）であって、前記空間は好ましくは、複数のマクロイオン、好ましくは多価電解質、を含む液体媒体を含む、前記空間（２０）と、
−前記液体媒体中のマクロイオン分散物からマクロイオン塊の形成を誘発する為に、刺激する電場を生成する為の少なくとも２つの電極（３０）であって、前記電極の対は第１の電源（４０）に接続されている、前記少なくとも２つの電極（３０）と、
−前記液体媒体中の前記マクロイオン塊の存在により誘発された電気的変数の空間的及び／又は時間的ゆらぎを測定する為の複数の電極（１０）を備えている電気的変数の検出器、好ましくは伝導度又はインピーダンス検出器、であって、前記複数の電極は、前記刺激する電場を生成する為の前記電極（３０）と同じであり又はそれと異なり、好ましくは前記第１の電源と共通の電位参照を有さない第２の電源（５０）に接続されている、前記検出器と、
−時間依存的若しくは空間依存的解析、好ましくはウェーブレット解析、を、又は、前記電気的変数の変動について、若しくは画像検出器から発行された画像について、若しくは統合的光学検出器の出力について自己相関を実行する為のデジタル・プロセッサ（９０）と、
−前記検出器の前記電極（１０）は、好ましくは前記液体媒体と接触するように構成されており、前記検出器は好ましくは、差分増幅器（５７）の反転入力及び非反転入力にそれぞれ接続されている２つの電極を備えており、各電極は好ましくは、前記差分増幅器の個々の入力に及び対応する抵抗器（５６）を介して定電流源に接続されており、前記検出器電極は好ましくは、前記液体媒体中の１の場所で前記電気的変数の変動を測定するように構成されており、ここで、前記刺激する電場を誘発する前記電位の絶対値が最小であり、好ましくは実質的にゼロである、
−前記第１の電源は、好ましくは対称の電源（Vs,-Vs）である、
−前記２つの電極は、好ましくは互いに向かい合う、前記２つの検出器電極（１０）であって、好ましくは、前記刺激する電場の方向に対して横であり、好ましくは垂直であり、且つ前記検出記の前記電極（１０）は好ましくは、前記電気的変数の変動を測定する場合に、前記刺激する電場の周波数と異なる周波数を有する交流分極信号により分極され、前記分極信号の前記周波数は好ましくは、前記刺激する電場の主成分の周波数よりも大きく、より好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍大きく、前記第２の電源（５０）は好ましくは、浮動接地を有する、
を備えている、前記装置。
【請求項３２】
請求項1〜３０のいずれか一項に記載の方法を実行する為の装置であって、
−液体媒体を受ける為の空間（２０）であって、前記空間は好ましくは、複数のマクロイオン、好ましくは多価電解質、を含む液体媒体を含む、前記空間（２０）と、
−前記液体媒体中のマクロイオン分散物からマクロイオン塊の形成を誘発する為に、刺激する電場を生成する為の少なくとも２つの電極（３０）であって、前記電極の対は電源（４０）に接続されている、前記少なくとも２つの電極（３０）と、
−光学検出器、好ましくはイメージング検出器、カメラ、又は統合的光学検出器と、
−ウェーブレット解析を、又は、上記変動について、若しくは前記光学検出器、好ましくはイメージング検出器、から発行された画像について、若しくは前記統合的光学検出器の出力について自己相関を実行する為のデジタル・プロセッサ（９０）と
を備えている、前記装置。
【請求項３３】
前記空間（２０）が複数の検出ゾーン（100a；…；100n）を備えており、前記検出ゾーン（100a；…；100n）のそれぞれが、前記液体媒体中の前記マクロイオンの前記濃度に依存する電気的変数及び／又は光学的変数の検出器（10a；10b；10c）を備えている、請求項３１及び３２のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３４】
前記空間（２０）が縦軸（X）に沿って延在し、及び、前記検出ゾーン（100a；…；100n）が前記縦軸（X）に沿って互いに続く、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３５】
前記空間（２０）が、それぞれが検出ゾーンを含む複数のサブチャンネル（20a；…；20n）を備えている、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の装置。
【請求項３６】
空間（２０）内に含まれる液体媒体中の荷電種を検出する方法であって、
ｉ．請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の装置を使用して、前記検出ゾーンにおいて、前記電気的変数の変動、又は、統合的光学検出器の前記出力の変動、又は、イメージング検出器から発行された画像の強度の空間的ゆらぎを測定する段階と、
ｉｉ．これらの変動に基づいて、前記荷電種の存在、及び好ましくは、前記液体媒体中の前記荷電種濃度を決定する段階であって、前記段階ｉｉ）は好ましくは、時間依存的若しくは空間依存的解析により、好ましくはウェーブレット解析により、又は、前記段階ｉ）で測定された前記変動の自己相関解析により、処理することを含む、前記決定する段階と
を含む、前記方法。
【請求項３７】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法を実行する為の、特には、液体媒体中のマクロイオン分散物からのマクロイオン塊の形成又はイオン分散物中のイオンの移動を誘発する為に、刺激する電場生成器と組み合わせて使用されるべき、伝導度又はインピーダンス検出器であって、
ａ）液体媒体を受ける為の空間（２０）であって、前記空間は好ましくは、イオン、好ましくはマクロイオン、好ましくは多価電解質、を含む液体媒体を含む、前記空間（２０）と、
ｂ）少なくとも２つの電極（１０）であって、前記電極は：
−前記液体媒体と直接的な又は間接的な電気的接続、好ましくは直接的な電気的接続、にあり、及び
−差分増幅器の（５７）の反転入力及び非反転入力にそれぞれ接続されている、好ましくは差分増幅器の（５７）の入力に及び対応する抵抗器（５６）を介して定電流源に接続されている、
前記少なくとも２つの電極と
を備えている、前記検出器。
【請求項３８】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法を実行する観点の方法においてＲＣＡ及び／又はＨＲＣＡ増幅において使用されるために構成される緩衝液であって、前記液は、３７℃又はそれ未満、好ましくは３０℃又はそれ未満、の温度で活性なポリメラーゼを含み、及び、前記液は、1000mS/m以下、好ましくは500mS/m以下、より好ましくは350mS/m以下、特には300mS/m以下、特には275mS/m以下の伝導度を有する、前記緩衝液。
【請求項３９】
リガーゼをさらに含む、請求項３８に記載の緩衝液。
【請求項４０】
前記ポリメラーゼが、８０℃よりも高い、好ましくは６０℃よりも高い、温度で活性でない、請求項３８及び３９のいずれか一項に記載の緩衝液。
【請求項４１】
前記ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼである、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の緩衝液。
【請求項４２】
前記ポリメラーゼが下記リストの中から選択される、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の緩衝液：AmpliTAQ、Phi29、「Pol」の種々のタイプ、特には、Pol  I、Pol  II、Pol  III、Pol  IV、Pol  V、Pol  B、Pol  アルファ、Pol  デルタ、Pol  エプシロン、Pol  カッパ、Pol  イオタ、Pol  ベータ、Pol  シグマ、Pol  ラムダ、Pol  ミュー、種々のバクテリオファージのポリメラーゼ、例えばバクテリオファージT4のポリメラーゼ、バクテリオファージT7のポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び、突然変異生成により得られるその種々の変異体、並びに、それらの混合物。
【請求項４３】
前記リガーゼが下記リストの中から選択される、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の緩衝液：T4  DNAリガーゼ、Ampligase、CircLigase  ssDNAリガーゼ、CircLigase  II  ssDNAリガーゼ、E.  Coli  DNAリガーゼ、Taq  DNA  リガーゼ、T3  DNA  リガーゼ、T7  DNAリガーゼ、9°NTM  DNAリガーゼ、及び、それらの混合物。
【請求項４４】
空間（２０）内に含まれる液体媒体中のマクロイオンを検出する方法であって、
ａ）前記液体媒体を刺激する電場に掛けて、マクロイオンの塊の形成及び前記液体媒体中の前記マクロイオン塊の移動を誘発する段階であって、マクロイオンの前記形成された塊は好ましくは、何らの追加のラベリング剤を含まない、前記誘発する段階と、
ｂ）前記空間の検出ゾーンにおいて、前記液体媒体中の前記マクロイオンの前記濃度に依存する少なくとも一つの変数の前記液体媒体内の空間的な及び／又は時間的なゆらぎを測定する段階と、
ｃ）これらゆらぎに基づいて、前記マクロイオンの存在を決定する段階であって、段階ｃ）は好ましくは、段階ｂ）で測定された前記ゆらぎを、時間依存若しくは空間依存解析により、より好ましくはウェーブレット解析により、又は、自己相関により、処理することを含む、前記決定する段階と
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、液体媒体中のマクロイオンを検出する為の方法及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡ又はＲＮＡの非常に少ない量の配列特異的検出は、臨床診断、食品安全性試験、法医学、又は環境微生物学を含む、広範囲の用途のために有用である。
【０００３】
より一般的には、関心のある最も生物学的な種、特にはタンパク質、多糖類、核酸、リン脂質、及びそれらの組み合わせが溶液中で荷電され、すなわちイオン又はほとんどの場合マクロイオンを構成し、それらは荷電の多様性を生じることを意味する。これはまた、コロイド、又は細胞、又は包括的でない様式において、ウイルス、細胞核、エンドソーム、エキソソーム、ミトコンドリア、バクテリア、小胞を含む細胞小器官についてもまた当てはまる。マクロイオンはまた、例えば、ラテックス、コロイド、ナノ又はマイクロ粒子、ナノロッド、ファイバー、荷電ポリマー、多価電解質、小胞、ミセルとして、化学においてしばしば遭遇する。これら種の荷電は上記種の本質的な特性であり且つラベリングの追加の段階を課さない故に、それは上記種を検出する為の便利な方法である。
【０００４】
荷電が、電気泳動法、電気クロマトグラフィー、又は等速電気泳動の知られている方法と同じように、種を分離する為の手段として使用されうる。しかしながら、生物学的又は化学的バッファーはまた高伝導度バックグラウンドを生成する多数の小さいイオンを一般的に含む故に、種検出の荷電に基づく知られている方法はあまり感度が良くなく且つまた特異性を欠きうる。
【０００５】
酵素増幅方法は感度において途方もない可能性を提供しており、及び、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が特には、遺伝解析の為の主要且つルーチン・ツールになっている。
【０００６】
数千ユーロの費用が掛かるベンチトップ機械から数千万ユーロの費用が掛かるより精巧且つ高いスループットの定量ＰＣＲ機械までの多数のシステムが現在存在する。しかしながら、これらシステムのほとんどは、蛍光に基づく検出を使用し、そして幹線からの電源に相変わらず依存する。
【０００７】
例えば遠隔環境における病原体検出、バイオセーフティ又は法医学に関して重要な用途が、携帯可能な「ポイント・オブ・ケア」（point of care）又は「ポイント・オブ・サンプリング」（point of sampling）アッセイを要求し、すなわち、過去数十年間に亘る努力が、例えばA.  K.  White  et  al.,  Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences,  2011,  108,  2-7に記載されているように、このタイプのアッセイをマイクロ流体システムに統合する為に向けられている。
【０００８】
これを達成する為に、例えばダイオード技術を使用して若しくは免疫凝集のＤＮＡ等価物（J.  Li,  H.  Alshammari  et  al, proc.  Microtas 2011,  CBMS Publ.,  pp.1959-1961）を使用して、蛍光に基づくＰＣＲ（P.  J.  Asiello  and  A.  J.  Baeumner,  Lab  on  a  chip,  2011,  11,  1420-30）の電力消費を減少させること、又は、電気化学による何らかの光学をより徹底的に避けること、のいずれかを目指す種々の方策が提案された。
【０００９】
蛍光検出器は、感度の観点から今までのところまだ未挑戦である。しかしながら、蛍光検出がラベル剤を要求し、特に発展途上世界の為に、非常に低コストの技術を開発することはまだ挑戦中である（例えば、P.  Yager  et  al.,  Nature,  2006,  442,  412-8を参照）。
【００１０】
従って、ラベル剤又は高価な検出技術を使用すること無しに、核酸増幅、及びより一般的には、生物学的、医学的、環境的、法医学的、又は化学的関心のマクロイオン、を検出し且つモニターする為の方法を提供することが非常に関心のあることであろう。不幸なことに、これは、最先端において可能でない。なぜならば、核酸の増幅は、溶液の全体的な伝導度を変化させないからである。幾つかの電気化学的方法が、例えば、Defeaver  T  et  al,  J  Am  Chem  Soc.  2009  Aug  19;  131(32):  11433-41において引用されているように存在し、しかし、それらは、ラベル剤を要求する。従って、ラベル剤無しに且つ、直接的な電気的読み込み、例えば伝導度測定、によりマクロイオンを検出する為の方法、特には核酸の増幅をモニターする為の方法、を提供することが、本発明の第１の目的である。
【００１１】
その上、定量ＰＣＲの慣用的な方法が、相対的に短いフラグメント（2kbp未満（例えば、M.  Stegger  et  al.,  Clinical  Microbiology  and  Infection,  18:  395-400.  doi:  10.1111/j.1469-0691.2011.03715.xを参照））のみに施与されることができる。ロング・レンジＰＣＲ（long  range  PCR）（例えば、O.  Harismendy  et  al.,  Genomebiology,  2009,  10,  R32）又は等温増幅を含む、研究において益々使用されている多くの新しい増幅方法が、長い核酸フラグメントを生成する。核酸増幅方法の包括的でないリストが、例えばA.  Niemz  et  al;  Trends  in  Biotechnology,  May  2011,  Vol.  29,  No.  5,  pp  240-250において概説され且つリストされる。しかしながら、これらの新しい方法は、それらの複雑さ又はそれらの定量性の欠如のいずれかの理由で、診断又はルーチンにおいて滅多に使用されない。
【００１２】
巨大な核酸分子はまた、電気泳動によって解析されることができる。巨大な核酸を分離する為に使用される周知の方法は、例えば国際公開第WO8402001号パンフレット（Schwartz及びCantor）において記載されているように、ゲルにおけるパルス・フィールド電気泳動である。しかしながら、この方法は、分離の為に非常に時間がかかり（例えば、典型的に２４時間）、労働集約的であり、及び、多くの材料を必要とする。
【００１３】
これをキャピラリーに電気泳動に置き換える試みがなされている。しかし、Mitnik  et  al.  Science,  1995,  267,  5195,  219-22に示されているように、キャピラリー中のマクロイオン溶液に施与される高い電場は、フィールド線に沿ったイオンの通常の輸送と異なる他の動電学的な現象をもたらす。この現象は、非直線的な電気流体力学的な不安定性であり、それは塊中にＤＮＡを集め、多くのノイズを生成し、そして分離を台無しにする。この現象は、非常に非直線的であり、及び、その開始は、フィールド周波数、フィールド強度、並びに、核酸の濃度及びサイズに依存する。
【００１４】
キャピラリー電気泳動について強烈に厄介者であるこれらの塊を抑える為の両性バッファを使用する試みが、例えばMagnusdottir  et  al.  Biopolymers,  49,  385-401,  (1999)において提案されているが、それでも電場が慣用のキャピラリー電気泳動と比較して減少されていなければならず、且つ、分離時間が余りにも長い。
【００１５】
この制限の他に、キャピラリー電気泳動システムは、高価であり、巨大であり、且つ大電力消費を有する、ＵＶ吸収に又はレーザー誘起蛍光（LIF：Laser Induced Fluorescence）のいずれかに基づく光学的検出方法を一般的に使用する。それ故に、電気泳動で分離された種は一般的に荷電されている故に、これら検出方法を直接伝導度検出に置換する試みがなされてきている。
【００１６】
特に、動電学的分離及び解析方法、例えば、キャピラリー電気泳動、マイクロチャンネル、電気泳動又は等速電気泳動、の文脈において伝導度検出の為の多数の方法が、文献において提案されてきている。
【００１７】
総括が例えば、V.  Solinova  et  al.,  J.  Sep.  Sci.  2006,  29,  1743-1762及びR.  M.  Guijt  et  al.,  Electrophoresis  2004,  25,  4032-4057において見られることができる。伝導度検出が、試験下で上記媒体と電気的接続において、少なくとも２つの電極を必要とする。典型的に、伝導度検出は、２つの異なるファミリーにおいて実施されることができ、それにおいて上記電極が直接電気接続であり、それらは、溶液を介して直流若しくは交流又は非接触検出を伝導し、それにおいて上記電極は、誘電体層を介して溶液と電気的関係にあり、従って、それは、交流のみ又は主に交流を伝導することができる。非接触検出測定は、高い励起周波数（典型的に、kHz又はMHz範囲である）及び電極と溶液との間の容量結合に依存する。伝導度が生じる周波数は典型的に、誘電体層の厚さに依存する。この方法は、誘電体を介して溶液の外側の電極を配置すること、（ＤＣ）高電場及び接地ループからの干渉を最小化することの有利点を有する。
【００１８】
接触伝導度が、溶液伝導度を測定する為に、電極溶液接触を使用する。このアプローチは、非接触検出よりもより感度が高い。しかし、関心のある種を動かす為の強電場、特にキャピラリー電気泳動、マイクロチャンネル、電気泳動、を包含する方法において、分離場と検出電子機器との間の相互作用する傾向にあり、望ましくない電気化学的反応、水の電気分解、泡形成、及び増加したノイズを結果として生じる。これを避ける為に、Prest  et  al.,  in  Analyst,  2002,  127,  1413-1419は、検出に基づく接触を提案する。しかし、それらは、感度を減少させる分離チャンネルから離れた場所にある別個のバイアルにおいて測定電極を有することが必要である。Mo  et  al.,  Anal.  Commun,  1998,  35,  365-367はまた、電気絶縁性がオプトカプラ（optocoupler）によって実行されシステムを開示し、しかし、全てのこれら電子システムは若干の漏電を有し、且つ感度はmM範囲において低いままである。
【００１９】
検体が電場において閉じ込められる検出方法を教える書類  米国特許第2002/0070114号明細書及び米国特許第2005/0136466号明細書（以上、MILES）並びに米国特許第2010/0203580号明細書（BRYNING）がまた知られている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
従って、外部の刺激する場の存在下において伝導度測定検出の感度を改善する為の必要性がある。特には低濃度での検体のための、低コストな、携帯可能な検出技術を得る必要性がまた存在し、「チップ・イン・ラボ」（chip in the lab）から「ラボ・オン・チップ」（lab on a chip）パラダイムへの進化を許す。
【００２１】
溶液中のマクロイオン、好ましくは核酸、及び特には新たな増幅方法で得られるようなＤＮＡ、の存在のラベル剤不要な直接的読み取りの為の必要性がまた存在する。
【００２２】
マクロイオンを検出する為の、及び特には核酸の上記増幅をモニターする為の、ラベル剤不要な方法を提供する為の必要性がまた存在する。
【００２３】
相対的に伝導性のバッファ且つ高い外部の刺激する場が使用される場合でさえ高い感度を有するマイクロチップにおいて接触伝導度測定を満たすことを保証することが可能な、新規な、簡単な、且つ低コストの電子装置を得る為の必要性がまた存在する。
【００２４】
本発明は、上記した必要性の１以上を満たすことを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２５】
本発明の幾つかの目的及び特徴が、請求項１〜４４において定義されている。
【００２６】
第一の観点に従うと、本発明は、空間内に含まれる液体媒体中のマクロイオンを検出する方法であって、
ａ）上記液体媒体を刺激する電場に掛けて、マクロイオンの塊の形成を誘発する段階であって、マクロイオンの上記形成された塊は好ましくは、何らの追加のラベリング剤を含まない、上記誘発する段階と、
ｂ）上記空間の検出ゾーンにおいて、上記液体媒体中の上記マクロイオンの上記濃度に依存する少なくとも一つの変数の、上記液体媒体内の空間的な及び／又は時間的なゆらぎを測定する段階と、
ｃ）これらゆらぎに基づいて、上記マクロイオンの存在を決定する段階と
を含む、上記方法に関する。
【００２７】
「追加のラベリング剤」により、追加の発光性の、特には蛍光性の、ラベリング剤が意味される。
【００２８】
好ましい実施態様において、本発明は、マクロイオンの検出を実行する為に、特には核酸を検出し又は核酸増幅をモニターする為に、これまで厄介者として考えられてきた電気流体力学の不安定性現象による塊の形成を使用する（Magnusdottir  et  al.  Biopolymers,  49,  385-401,  (1999)を参照）。
【００２９】
本発明は有利に、核酸増幅の終点検出の為の低コストな方法を提供し、ある場合には100fg/μlよりも良い感度に達する。それはまた有利に、核酸増幅のリアルタイムの及び／又は量的なモニタリングの為の低コストな方法を提供する。本発明はまた有利に、マクロイオン、特には生物学的マクロイオン、の検出の為の、特には生物学的、医学的、環境的、法医学的、化学的、又は安全用途の為の、低コストな方法を提供する。
【００３０】
好ましくは、上記マクロイオンが多価電解質であり、及び多価電解質の塊が段階ａ）で形成され、上記多価電解質が好ましくは、核酸、より好ましくは５キロ塩基以上、又は５キロ塩基対以上、好ましくは１０キロ塩基以上、又は１０キロ塩基対以上、を有する核酸鎖を含み、及び上記核酸の塊は好ましくは、段階ａ）で形成される。
【００３１】
本発明は、何らの追加のラベリング剤を使用すること無しに、マクロイオンの検出及びマクロイオンの生産のモニタリングを可能にし、従って相対的に低コストな方法を提供する。
【００３２】
好ましい実施態様において、塊にされ且つ検出されるべき上記核酸、特にはＤＮＡ、が、挿入剤、特にはＤＮＡ挿入剤、を含む。
【００３３】
挿入剤は、化合物、特には核酸を構成する複数のヌクレオチド間に挿入することができる化合物、に対応する。
【００３４】
挿入剤の使用は有利に、核酸の剛性を増加し、且つ、塊の取得を促進する。これは有利に、より良い感度を本発明に従う検出方法に提供する。
【００３５】
上記挿入剤は、蛍光でありうる。しかし、好ましくは、上記挿入剤は、非発光性であり、特には、非蛍光である。
【００３６】
上記挿入剤は、非制限的に、下記リストの中から選択されうる：臭化エチジウム、SYBR  グリーン  I、SYTO-9、SYTO-13、SYTO-16、SYTO-60、SYTO-62、SYTO-64、SYTO-82、POPO-3、TOTO-3、BOBO-3、PO-PRO-3、TO-PRO-3、YO-PRO-1、SYTOX  オレンジ（Life  Technologiesによって提供される）、QuantiFluor  dsDNAシステム（Promegaによって提供される）、Quant-iT  PicoGreen（Life Technologiesによって提供される）、AccueBlue（Biotiumによって提供される）、DAPI（Life Technologiesによって提供される）、Hoechst  33258、Hoechst  33342、Hoechst  34580（Life  Technologiesによって提供される）、https://en.wikipedia.org/wiki/Intercalation_(chemistry)（その内容は参照によって本明細書中に取り込まれる）において引用される挿入剤、及び、それらの混合物。
【００３７】
上記比（挿入剤の量対塊にされ且つ検出されるべきDNAの量）は、1000〜0.01、好ましくは100〜0.1で含まれうる。高親和性挿入剤、例えばTOTO又はYOYO、について、それは好ましくは、低親和性を有する剤、例えば臭化エチジウム、ヨウ化プロピジウム、を挿入する為に、20〜0.1で含まれ（例えば、MA  Marino  et  al.,  Anal  Chem,  1998  70,  4514-9を参照）、それはより一般的には100〜1で含まれる。
【００３８】
段階ａ）の全て又は一部の間の液体媒体中の上記挿入剤の濃度は、0.01μmol/l〜200μmol/l、好ましくは0.1μmol/l〜10μmol/l、（例えば、G.T.  Irons  et  al,  Cytometry,  15:129  (1994)を参照）、又は1000μg/ml〜0.01μg/ml、好ましくは100μg/ml〜0.1μg/ml（例えば、Biorad  instructions:http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4006020b.pdfを参照、その内容は参照により本明細書中に取り込まれる）で含まれうる。
【００３９】
本明細書の下記において詳細に述べられるように、段階ａ）で液体媒体中に存在する核酸は、核酸増幅の段階の後に得られうる。そして、上記挿入剤は、核酸増幅の上記段階の後に液体媒体中に導入されうる。変形として、上記挿入剤は、核酸増幅の段階の間、核酸を含む上記媒体中に存在することができる。
【００４０】
段階ｂ）で測定される上記空間的な及び／又は時間的なゆらぎが好ましくは、非周期的である。段階ｂ）で測定される上記空間的な及び／又は時間的なゆらぎが好ましくは、ランダムである。
【００４１】
好ましくは、上記液体媒体中の上記マクロイオンの上記濃度に依存する少なくとも一つの変数の液体媒体内の時間的なゆらぎが、段階ｂ）で測定される。
【００４２】
段階ｂ）で測定される錠記空間的な及び／又は時間的なゆらぎが好ましくは、電気的変数、好ましくは伝導度又はインピーダンス、複素インピーダンス、複素伝導度、電流又は電圧、より好ましくは伝導度、のゆらぎである。
【００４３】
簡潔さの為に、語「伝導度」は、電流を輸送する為の媒体の能力の検出の全ての異なる変形、すなわちオーム性伝導度、インピーダンス、複素伝導度、又は複素インピーダンス、を包含するべきである。
【００４４】
上記測定は、電気的検出手段によって実行されうる。当該電気的検出手段の例が、下記に記載される。
【００４５】
好ましい実施態様の仲間において、上記電気的変数の上記ゆらぎは、上記刺激する電場の方向に対して横である、好ましくは垂直である、軸に沿って、互いに向かい合う、少なくとも２つの電極により段階ｂ）で測定される。
【００４６】
好ましくは、段階ａ）で施与される上記刺激する電場は、上記電気的変数の上記ゆらぎを段階ｂ）で測定する電極と異なる電極によって施与される。
【００４７】
伝導度測定が、特に好ましい。事実、伝導度測定は、普遍的であり、低コストであり、且つ直接電子検出と互換性があり、従って、それを最小化し且つ統合することを容易にする。
【００４８】
変形において、段階ｂ）で測定される錠記空間的な及び／又は時間的なゆらぎが、光学的変数、好ましくは、光学吸収、蛍光、発光、二色性、複屈折、光散乱、又は旋光能の中から選択される光学的変数のゆらぎである。
【００４９】
段階ｃ）は好ましくは、段階ｂ）で測定される上記ゆらぎを、時間依存若しくは空間依存解析により、好ましくはウェーブレット解析により、又は、自己相関により、処理することを含む。
【００５０】
本発明に従う方法は、マクロイオンのサイズに対して、従来技術である量的核酸増幅方法よりもより大きな感度を許す。
【００５１】
従って、他の観点に従って、本発明はまた、核酸のリアルタイム増幅をモニターする為の方法であって、
・核酸を核酸増幅の段階に掛けること、
・上記増幅の後に又は上記増幅の間に得られた核酸を上記した検出方法に掛けて、検出の結果を取得すること、
・検出の結果の関数として、核酸の増幅のレベルについての情報、又は核酸の初期濃度についての情報を提供すること
を含む、上記方法に関する。
【００５２】
上記増幅によって得られた上記核酸は好ましくは、５キロ塩基以上、又は５キロ塩基対以上、好ましくは１０キロ塩基以上、又は１０キロ塩基対以上、を有する核酸鎖を含む。
【００５３】
上記した核酸の上記増幅をリアルタイムにモニターする為の方法は好ましくは、増幅に掛けられたサンプル中の核酸の初期濃度を、巨大な核酸の生産の測定された速度から計ることを含む。
【００５４】
「巨大な核酸」により、５キロ塩基以上、又は５キロ塩基対以上、が意味される。
【００５５】
本発明はまた、本発明に従う上記方法を実施する為に特に有用な装置を提供する。
【００５６】
他の観点に従って、本発明は、伝導度又はインピーダンス検出器、特には本発明に従う方法を実行する為の、又は、特には液体媒体中のマクロイオン分散物からマクロイオン塊の形成若しくはイオン分散物中のイオンの移動を誘発する為に、刺激する電場生成器と組み合わせて使用されるべき、伝導度又はインピーダンス検出器であって、
−  液体媒体を受ける為の空間であって、上記空間は好ましくは、複数のマクロイオン、好ましくは多価電解質、を含む液体媒体を含む、上記空間と、
−  少なくとも２つの電極であって、当該電極は、
ｉ．上記液体媒体と直接的又は非直接的な電気的接続、好ましくは直接的電気的接続、にあり、及び、
ｉｉ．差分増幅器の入力に且つ対応する抵抗器を介して定電流に接続されている、
上記電極と
を備えている、上記伝導度又はインピーダンスに関する。
【００５７】
他の観点に従って、本発明は、装置、特には本発明の上記方法を実行する為の装置であって、
−液体媒体を受ける為の空間であって、上記空間は好ましくは、複数のマクロイオン、好ましくは多価電解質、を含む液体媒体を含む、上記空間と、
−上記液体媒体中のマクロイオン分散物からマクロイオン塊の形成を誘発する為に、刺激する電場を生成する為の少なくとも２つの電極であって、上記電極の対は第１の電源に接続されている、上記少なくとも２つの電極と、
−上記液体媒体中の上記マクロイオン塊の存在により誘発された電気的変数の空間的な及び／又は時間的なゆらぎを測定する為の複数の電極を備えている電気的変数の検出器、好ましくは伝導度又はインピーダンス検出器、であって、上記複数の電極は、上記刺激する電場を生成する為の上記電極と同じであり又はそれと異なる、上記検出器と
を備えている上記装置に関する。
【００５８】
好ましくは、上記検出器の上記電極は、上記液体媒体と接触しているように構成される。変形として、それはそうでない。
【００５９】
２つの電極は、差分増幅器の反転入力及び非反転入力にそれぞれ接続されており、各電極は好ましくは、上記差分増幅器の個々の入力に及び対応する抵抗器を介して定電流源に接続されている。
【００６０】
装置、特には本発明の上記方法を実行する為の装置、であって、
−  液体媒体を受ける為の空間であって、上記空間は好ましくは、複数のマクロイオン、好ましくは多価電解質、を含む液体媒体を含む、上記空間と、
−  上記液体媒体中のマクロイオン分散物からマクロイオン塊の形成を誘発する為に、刺激する電場を生成する為の少なくとも２つの電極であって、上記電極の対は電源に接続されている、上記少なくとも２つの電極と、
−  上記液体媒体中の上記マクロイオン塊の存在により影響される光学的特性の空間的な及び／又は時間的なゆらぎを測定することが出来る、光学的変数の検出器であって、上記光学的特性は、発光若しくは蛍光強度、光吸収、光偏光、複屈折、回転電源、好ましくは光吸収、複屈折又は回転電源、の間で選択される、上記検出器と
を備えている上記装置を提案することがまた、本発明の目的である。
【００６１】
本発明は、生命科学、薬学研究、診断、ポイント・オブ・ケア（point of care）、法医学、バイオセキュリティ、環境又は食品産業における簡単、低コスト、できる限り携帯可能な応用の為のＤＮＡ検出器を提供する。
【００６２】
その観点の他において、本発明はまた、種を分離し且つ検出する為の装置であって、上記分離が動電学的処理により達成され、及び、上記検出が、上記した装置の１つによって達成される、上記装置に関する。特には、本発明は、改善された感度を有し且つ小さいイオンの解析を許すキャピラリー電気泳動の為の検出器を提供する。
【００６３】
本発明は、低コストの、簡単な、且つ携帯可能な検出器を提供する。
【００６４】
本発明は、上記刺激する電場と上記検出装置との間で優れた電気的非干渉化を維持しながら、マイクロチップにおいて高感度な接触伝導度測定を保証することが可能な装置を提供する。
【００６５】
本発明はまた、伝導度又はインピーダンス検出器、特には本発明の方法を実行する為の伝導度又はインピーダンス検出器、特にはイオン分散物中のイオンの移動、及び好ましくは液体媒体中のマクロイオン分散物からマクロイオン塊の形成、を誘発する為に、刺激する電場生成器と組み合わせて使用されるべき伝導度又はインピーダンス検出器、であって、
−液体媒体を受ける為の空間であって、上記空間は好ましくは、複数のマクロイオン、好ましくは多価電解質、を含む液体媒体を含む、上記空間と、
−少なくとも２つの電極であって、当該電極は、
ｉ．上記液体媒体と直接的又は非直接的な電気的接続、好ましくは直接的電気的接続、にあり、及び、
ｉｉ．差分増幅器の反転入力及び非反転入力にそれぞれ接続されている、
上記電極と
を備えている、上記伝導度又はインピーダンス検出器に関する。
【００６６】
本発明の他に観点において、本発明はまた、空間内に含まれる液体媒体中の種を分離する為の方法であって、
−  装置を使用して、刺激する電場を施与することによって上記種を分離すること、
−  上記検出ゾーンにおいて、少なくとも２つの電極を備えている本発明の装置を使用してインピーダンス又は伝導度の変動を測定することであって、上記電極は、
ｉ．上記液体媒体と直接的又は非直接的な電気的接続、好ましくは直接的電気的接続、にあり、及び、
ｉｉ．差分増幅器の入力に且つ対応する抵抗器を介して定電流に接続されている、
上記電極と
を備えている、上記方法に関する。
【００６７】
本発明の更なる目的は、装置であって、
ａ）液体媒体を受ける為の空間と、
ｂ）電場生成器であって、
ｉ．第１の電源と、
ｉｉ．上記液体媒体中の第１の刺激する電場を生成する為に、上記第１の電源に接続された電極の対と
を備えている、上記電場生成器と、
ｃ）検出ゾーンにおいて、上記電気的変数の上記液体媒体内の変数を測定する為の電気的変数の検出器であって、上記検出器は、上記第１の電源と共通の電位参照を有さない第２の電源に接続されている、上記検出器と
を備えている装置である。
【００６８】
本発明の更なる目的は、装置、特には上記方法を実行する為の装置、であって、
−液体媒体を受ける為の空間であって、上記空間は好ましくは、複数のマクロイオン、好ましくは多価電解質、を含む液体媒体を含む、上記空間と、
−上記液体媒体中のマクロイオン分散物からマクロイオン塊の形成を誘発する為に、刺激する電場を生成する為の少なくとも２つの電極であって、上記電極の対は電源に接続されている、上記少なくとも２つの電極と、
−光学検出器、好ましくはイメージング検出器、カメラ、又は統合的光学検出器、と
を備えている、上記装置である。
【００６９】
好ましくは、上記装置はさらに、時間依存若しくは空間依存解析、好ましくはウェーブレット解析、を、又は、上記電気的変数の変動について、若しくは画像検出器から発行された画像について、若しくは統合的光学検出器の出力について自己相関を実行する為のデジタル・プロセッサを備えている。
【００７０】
本発明の更なる目的は、空間内に含まれる液体媒体中の荷電された種を検出する方法であって、
上記で定義された装置を使用して、上記検出ゾーンにおいて、上記電気的変数の変動、又は、統合的光学検出器の上記出力の変動、又は、イメージング検出器から発行された画像の強度の空間的ゆらぎを測定すること、
時間依存若しくは空間依存解析により、好ましくはウェーブレット解析により、又は、上記変動の自己相関解析により、これらの変動に基づいて、上記荷電種の存在、及び好ましくは、上記液体媒体中の上記荷電種濃度を決定すること
含む、上記方法である。
【００７１】
本発明の更なる目的は、空間内に含まれる液体媒体中の種を分離する為の方法であって、
ａ）刺激する電場を施与することによって上記種を分離すること、
ｂ）本発明の装置を使用して、上記検出ゾーンにおいて、インピーダンス又は伝導度の変動を測定すること
を含む、上記方法である。
【００７２】
本発明の更なる目的は、上記に定義される方法を実行する観点においてＲＣＡ及び／又はＨＲＣＡ増幅において使用される為に構成される緩衝液であり、上記液が、３７℃又はそれ未満、好ましくは３０℃又はそれ未満、の温度で活性なポリメラーゼを含み、及び、上記液が、1000mS/m以下、好ましくは500mS/m以下、より好ましくは350mS/m以下、特には300mS/m以下、特には275mS/m以下の伝導度を有する。
【００７３】
有利な実施態様において、本発明に従うマクロイオンを検出する上記方法において使用され、塊にされるべきマクロイオンを含む上記液体媒体は、本発明に従う緩衝液を含む。
【００７４】
高伝導度を有する緩衝液の使用は、電気分解現象がこの場合において上記刺激する電極近くで生じうる故に、本発明に従うマクロイオンを検出する方法を実行することを複雑にしうる。
【００７５】
そのため、本発明に従い低伝導度緩衝液を使用することは有利に、電気分解現象を制限することを許し、従ってマクロイオンの検出を簡単にする。
【００７６】
有利な実施態様において、上記緩衝液は、本発明に従う検出の上記方法の段階ａ）の間に塊にされるべき核酸を得ることを許す予備増幅方法、好ましくはＲＣＡ又はＨＲＣＡ増幅方法、の間に緩衝液として使用される。
【００７７】
他の有利な実施態様において、上記緩衝液は、上記予備増幅方法において及び本発明に従う検出の方法において使用される塊にされるべき核酸を含む液体媒体においての両方において緩衝液として使用される。
【００７８】
本発明に従う上記緩衝液は有利に、本発明に従う上記方法を簡単にする。事実、本発明に従う上記緩衝液を使用する場合に、上記予備増幅方法と上記マクロイオンの上記検出との間の脱イオン化段階が、上記電気分解現象を制限する為に必要でない。
【００７９】
好ましくは、上記緩衝液はさらに、リガーゼを含む。
【００８０】
例えば予備的なＲＣＡ又はＨＲＣＡ増幅方法におけるそのような緩衝液の使用は有利に、ライゲーション及び増幅段階為の為に同じ緩衝液を使用すること、従ってこれらの２つの段階を同時に実行することを許す。
【００８１】
上記ポリメラーゼは、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼでありうる。
【００８２】
本発明の特定の実施態様において、上記ポリメラーゼは、下記リストの中から選択される：AmpliTAQ、Phi29、"Pol"の種々のタイプ、特には、Pol  I、Pol  II、Pol  III、Pol  IV、Pol  V、Pol  B、Pol  アルファ、Pol  デルタ、Pol  エプシロン、Pol  カッパ、Pol  イオタ、Pol  ベータ、Pol  シグマ、Pol  ラムダ、Pol  ミュー、種々のバクテリオファージのポリメラーゼ、例えばバクテリオファージT4のポリメラーゼ、バクテリオファージT7のポリメラーゼ、Taqポリメラーゼ、及び、突然変異生成により得られるその種々の変異体（例えば、https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_polymeraseを参照：その内容は参照によって本明細書中に取り込まれる）、並びに、それらの混合物。
【００８３】
特定の実施態様において、上記ポリメラーゼは、８０℃よりも高い、好ましくは６０℃よりも高い、温度で活性でない。
【００８４】
本発明の特定の実施態様において、上記リガーゼは、下記リストの中から選択される：T4  DNA  リガーゼ（例えば、Epicentre(Illumina  company)，New  England  Biolab(NEB)，Promega，Life  Technologies，ThermoScientificによって提供される）、Ampligase（例えば、Epicentre(Illumina  company)によって提供される）、CircLigase  ssDNA  ligase（例えば、Epicentre (Illumina  company)によって提供される）、CircLigaseII ssDNA Ligase（例えば、Epicentre(Illumina  company)によって提供される）、E.  Coli  DNA  Ligase（例えば、Epicentre(Illumina  company)によって提供される）、Taq  DNA  Ligase（例えば、New  England  Biolab(NEB), Life  Technologiesによって提供される）、T3  DNA  Ligase（例えば、New  England  Biolab(NEB)によって提供される）、T7  DNA  Ligase（例えば、New  England  Biolab(NEB)によって提供される）、9°NTM  DNA  Ligase（例えば、New  England  Biolab(NEB)によって提供される）、並びに、それらの混合物。
【００８５】
本発明の更なる目的は、空間内に含まれる液体媒体中の荷電された種を検出する方法であって、
ａ）上記液体媒体を刺激する電場に掛けて、マクロイオンの塊の形成及び上記液体媒体中の上記マクロイオン塊の移動を誘発する段階であって、マクロイオンの上記形成された塊は好ましくは、何らの追加のラベリング剤を含まない、上記誘発する段階と、
ｂ）上記空間の検出ゾーンにおいて、上記液体媒体中の上記マクロイオンの上記濃度に依存する少なくとも一つの変数の上記液体媒体内の空間的な及び／又は時間的なゆらぎを測定する段階と、
ｃ）これらゆらぎに基づいて、上記マクロイオンの存在を決定する段階であって、段階ｃ）は好ましくは、段階ｂ）で測定された上記ゆらぎを、時間依存若しくは空間依存解析により、より好ましくはウェーブレット解析により、又は、自己相関により、処理することを含む、上記決定する段階と
を含む、上記方法である。
【００８６】
好ましくは、上記変数が電気的であり、当該電気的変数の上記ゆらぎが、上記液体媒体と直接電気接触する少なくとも２つの電極により段階ｂ）で測定され、及び、当該塊は、段階ｂ）の全て又は一部の間に上記電極に相対的に移動することを引き起こされる。
【００８７】
本発明の更なる目的は、空間内に含まれる液体媒体中の核酸を検出する方法であって、
ａ）上記液体媒体を刺激する電場に掛けて、核酸の塊の形成を誘発する段階であって、上記核酸は、５０キロ塩基以上、又は５０キロ塩基対以上、を有する核酸鎖を含み、核酸の上記形成された塊は好ましくは、何らの追加のラベリング剤を含まない、上記誘発する段階と、
ｂ）上記空間の検出ゾーンにおいて、上記液体媒体中の上記核酸の上記濃度に依存する少なくとも一つの変数の上記液体媒体内の空間的な及び／又は時間的なゆらぎを測定する段階と、
ｃ）これらゆらぎに基づいて、上記核酸の存在を決定する段階であって、段階ｃ）は好ましくは、段階ｂ）で測定された上記ゆらぎを、時間依存若しくは空間依存解析により、より好ましくはウェーブレット解析により、又は、自己相関により、処理することを含む、上記決定する段階と
を含む、上記方法である。
【００８８】
本発明は、下記発明の詳細な説明、及びその実行の為の非制限的な実施例を読むことから、及び添付の図面を吟味することから十分に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１Ａ】図１Ａは、上記電場を作成する為に且つ荷電種を検出する為に使用される電圧の構成を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、関連付けられた検出ゾーンでの接触モード（ECMC）における伝導度測定の為の３対の電極を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本発明に従う装置の概略図を示す。
【図２】図２は、本発明に従う装置において使用される検出電子機器の例を示す。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明において実装される検出電子機器において使用される前置増幅器に対応する上記回路を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２の上記回路において使用されるロー・パス・フィルターに対応する上記回路を示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、上記増幅器のオフセット電圧を最小にする為に使用される回路を示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、増幅回路を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、電圧制御された電流源に対応する回路を示す。
【図３】図３は、高圧電源（HVPS）の為に設計された平衡回路の略図を示す。
【図４】図４は、本発明に従う方法を実行した後に得られた伝導度測定信号を示す。
【図５】Ａ）は、双直交のウェーブレット・ファミリーからのbior2.2ウェーブレットを示す。正確な再構成（情報の損失無し）を達成する為に、このウェーブレット・ファミリーは２つのウェーブレットを使用（１つは分解の為、及び１つは上記信号の上記再構成為）；Ｂ）概略再スケール。
【図６】Ａ）は、bior2.2分解ウェーブレットを使用して０≦ｊ≦１１に対する図４の陽性対照及び陰性対照信号の離散ウェーブレット変換スペクトラム（ｄｓ（ｊ，ｋ）係数）を示す。Ｂ）は、検出されたＤＮＡ塊の対応する重み及び重量差（デルタ重み（deltaweight））を示す。
【図７】図７は、0.002よりも大きい振幅についてのカットオフ無し（Ａ）及び有り（Ｂ）でのスケール時間２３τ０（４番目のモード・レベル）に基づく上記再構成された信号（陽性及び陰性の対照）を示す。
【図８】10kbp  DNAの量を増加させる為に、ＰＣＲ混合物から抽出され、TE（1倍）緩衝液中に懸濁され、そしてSyber Goldでラベル付され、比較が、Ａ）蛍光画像と、Ｂ）検出ゾーンにおいて測定された蛍光強度とその時間平均値との比の時間導関数と、Ｃ）ウェーブレット解析手順（SE）により抽出されたＤＮＡ塊に基づく伝導度信号（SE）との間で示される。（0.002でのカット・オフを有する４番目のモード・レベル（j=3）から再構成された）。
【図９Ａ】図９Ａは、Ａ）様々な増幅サイクル（10，20，26，32，38，41）でのターゲットＤＮＡの様々な量（10fg，100fg，1pg，100pg，2.5ng）についてのウェーブレット解析手順（QDna）を使用するＤＮＡのラベル剤無しでの数量化。パネル中の各点についての標準偏差が３回、３つの異なるアリコート（aliquots）から計算された。
【図９Ｂ】図９Ｂは、ラベル無し検出の為に使用されるサンプルに対して対照として実行されたゲルの対応する濃度解析を示す。
【図９Ｃ】Ｃ）ゲルの完全な画像及び濃度測定と考えられる領域を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａは、分岐ローリング・サークル増幅（ＲＣＡ）の原理を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、分岐ローリング・サークル増幅の為のパドロック・プローブ（padlock  probes）及びライゲーション・テンプレートを示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、巨大な且つ分岐したＤＮＡ生成物の生成を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、電気泳動分離の結果を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、電気泳動分離の結果を示す。
【図１２】図１２は、動電モードの関数として印加電圧を示す。
【図１３】図１３は、異なる濃度（A  1mM  B  50μM）でのRuBipyの動電学的な分離を示す。異なる検出方法が使用された：蛍光（赤）及び伝導度測定（黒）
【図１４】図１４は、緩衝液の注入と比較した20μMでのK+の動電学的な分離を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、上記検出モジュールから得られた原信号（raw signal）とウェーブレット解析により処理された後に得られた対応する信号との比較を示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、蛍光信号と伝導度測定信号との間の相関を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａは、異なるインキュベーション時間（それぞれ、１５分及び３０分）についてＨＲＣＡ増幅方法を実行した後に得られる塊の蛍光顕微鏡画像を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、異なるインキュベーション時間（それぞれ、１５分及び３０分）についてＨＲＣＡ増幅方法を実行した後に得られる塊の蛍光顕微鏡画像を示す。
【図１７】図１７は、異なる増幅持続時間についてウェーブレット解析後のパラメータQDnaの展開を示す。
【図１８】図１８は、検出が複数の検出ゾーンにおいて実行される本発明に従う方法の他の実施態様素を示す。
【図１９】図１９は、検出が複数の検出ゾーンにおいて実行される本発明に従う方法の他の実施態様素を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
マクロイオン
【００９１】
１又複数のタイプのマクロイオンが、上記液体媒体中に存在しうる。マクロイオンは、典型的に、多様な荷電、好ましくはオブジェクト当たり１０よりも多い荷電、を生じるオブジェクトである。
【００９２】
マクロイオンは、追加のラベリング剤を含み又は除かれうる。好ましくは、上記マクロイオンは、何らの追加のラベル剤を含まない。
【００９３】
従って、上記マクロイオンは、内在的であることができる又は追加のラベリング剤によって与えられることができる特性を有しうる。
【００９４】
追加のラベリング剤は次のリストの間で選ばれうる：SYBR  グリーン  I、SYTO-9、SYTO-13、SYTO-16、SYTO-60、SYTO-62、SYTO-64、SYTO-82、POPO-3、TOTO-3、BOBO-3、PO-PRO-3、TO-PRO-3、YO-PRO-1、SYTOX  オレンジ（Life Technologiesによって提供される）、QuantiFluor  dsDNAシステム（Promegaによって提供される）、Quant-iT  PicoGreen（Life Technologiesによって提供される）、AccueBlue（Biotiumによって提供される）、DAPI（Life Technologiesによって提供される）、Hoechst  33258、Hoechst  33342、Hoechst  34580（Life Technologiesによって提供される）、及び、それらの混合物。
【００９５】
段階ａ）の全体又は一部の間、上記液体媒体中の上記追加のラベリング剤の濃度は、0.01μmol/l〜200μmol/l、好ましくは0.1μmol/l〜10μmol/l（例えば、G.T.  Irons  et  al,  Cytometry,  15:129  (1994)を参照）、又は1000μg/ml〜0.01μg/ml、好ましくは100μg/ml〜0.1μg/ml（例えば、Biorad instructions:  http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4006020b.pdfを参照、その内容は参照により本明細書中に取り込まれる）で含まれうる。
【００９６】
マクロイオンの上記濃度に関連する全ての光学的量、例えば光学吸収、蛍光、発光、二色性、複屈折、旋光能、又は光散乱、及び好ましくは、刺激する電場により誘発された上記特性のゆらぎ、が本発明において使用され、但し、上記特性の空間的ゆらぎが、幾つかの検出手段、好ましくは光学的手段、によって記録されることができる。
【００９７】
マクロイオンの上記濃度に関する全ての電気又は誘電又は電磁の特性が例えば、例えば、荷電、pI、伝導度、電気泳動移動度、分極率、磁気モーメント、及び好ましくは、刺激する電場により誘発された上記特性のゆらぎ、が本発明において使用され、ここで、上記特性の空間的ゆらぎが、幾つかの検出手段、好ましくは光学的手段、によって記録されることができる。
【００９８】
上記マクロイオンは、多価電解質、荷電されたコロイド、又はナノ粒子でありうる。
【００９９】
「コロイド」によって、分離された場合（すなわち、塊状でない）に、50nm〜100μm、好ましくは50nm〜10μmで構成される平均サイズを有するオブジェクトが意味される。ナノ粒子は典型的に、2nm〜100nmの範囲の粒子である。
【０１００】
「平均サイズ」によって、D50として知られている、集団の半分での統計的粒度分析の次元が意味される。
【０１０１】
本明細書において使用される場合に、語「コロイド状オブジェクト」は、細胞、オルガネラ、ウイルス、細胞塊、細胞島、胚、花粉粒、人工又は天然の有機粒子、例えばラテックス粒子、デンドリマー、小胞、磁気粒子、ナノ粒子、量子ドット、金属マイクロ粒子、金属ナノ粒子、有機金属マイクロ又はナノ粒子、ナノチューブ、人工又は天然の巨大分子、ミクロゲル、高分子塊、タンパク質又はタンパク質塊、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチド塊、核タンパク質塊、多糖類、若しくは超分子集合、又は、上記化合物の組み合わせを含む、多種多様の、天然の若しくは人工の、有機又は無機の化合物を表しうる。語「粒子」は、「コロイド状オブジェクト」と同じ意味で、本発明の詳細な説明において使用される。
【０１０２】
本明細書で使用される場合に、語「コロイド流体」又は「コロイド懸濁液」は、コロイド状オブジェクトを含む流体をいう。
【０１０３】
多価電解質及び核酸
【０１０４】
多価電解質は、荷電された巨大分子である。ある場合には、上記多価電解質における荷電は、弱い酸性又は塩基性特徴を有し、及び、従って、pHの幾つかの条件において非荷電であることができる。それにもかかわらず、それらが幾つかの溶媒及びpHにおいて又は緩衝液条件で荷電を生じることができる限り、それらは本発明において多価電解質として見なされる。
【０１０５】
本発明は特に、核酸を解析する為に有利である。上記核酸は、一本鎖又は二本鎖DNA、RNA、メッセンジャーRNA、マイクロRNA、干渉RNA、天然若しくは人工のオリゴヌクレオチドであることができ、及びまた、全ての種類の天然若しくは人工の核酸、例えば非制限的に、リン酸化された又はメチル化されたDNA若しくはRNA、LNA、PNA、蛍光的にラベル付されたDNA、又はオリゴヌクレオチドを包含することができる。
【０１０６】
他の好ましい実施態様において、本発明における多価電解質は、タンパク質、ポリペプチド、多糖類、オリゴ糖、糖タンパク質、リン脂質、脂質、及び、例えば非制限的に、リン酸化、メチル化、グリコシル化によるそれらの修飾物でありうる。
【０１０７】
段階ａ）で上記液体媒体中に存在する多価電解質は、核酸増幅の後に又はその間に得られうる。上記増幅は好ましくは、リアルタイム定量増幅（a  real-time  quantitative  amplification）であり、又は、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応増幅、核酸等温増幅（an  isothermal  nucleic acid  amplification）、ローリング・サークル増幅（a rolling  circle  amplification）、分岐ローリング・サークル増幅（a  branched  rolling  circle  amplification）、サークル−サークル増幅（a  circle to circle amplification）、ループ媒介性増幅（a LAMP：loop-mediated  amplification）、核酸配列ベース増幅（NASBA：nucleic  acid  sequence-based amplification）、転写媒介性増幅（TMA：Transcription-mediated  amplification）、RNA技術のシグナル媒介性増幅（SMART：Signal-mediated amplification  of  RNA technology）、ヘリカーゼ依存増幅（HDA：Helicase-dependent  amplification）、リコンビナーゼ・ポリメラーゼ増幅（RPA：recombinase  polymerase amplification）、クロスプライミング増幅（CPA：Cross-priming  amplification）、スマート増幅（SMART-AMP：Smart  amplification）、ローリング・サークル増幅（RCA：Rolling-Circle  Amplification）、超分岐ローリング・サークル増幅（HRCA：Hyperbranched  Rolling-Circle  Amplification）、ラミフィケーション増幅（RAM：ramification  amplification）、鎖置換増幅（SDA：strand  displacement  amplification）、ニッキング酵素増幅反応（NEAR：Nicking  enzyme amplification  reaction）、ニッキング酵素媒介性増幅（NEMA：Nicking  enzyme-mediated  amplification）、等温鎖増幅（ICA：Isothermal  chain  amplification）、指数関数的増幅反応（EXPAR：Exponential  amplification reaction）、ビーコンで支援された検出増幅（BAD  AMP：Beacon-assisted  detection  amplification）、若しくはPhi29  ＤＮＡポリメラーゼを使用する核酸増幅方法のうちの少なくとも一つを含む。
【０１０８】
ＨＲＣＡ増幅方法が選択的に且つ迅速にＤＮＡを増幅する故に、この方法を実行することが有利である。
【０１０９】
増幅
【０１１０】
本発明は特には、核酸の増幅をモニターすることについて関心があり、従って、核酸を増幅する為の方法、特には、非制限的なリストとして、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応増幅、核酸等温増幅、ローリング・サークル増幅、分岐ローリング・サークル増幅、サークル−サークル増幅、a  LAMP  NASBATMA、SMART、HAD、RPA、CPA、SMART-AMP、RCA、HRCA、RAM、SDA、NEAR、NEMA、ICA、EXPAR、BAD  AMP、若しくはPG-RCA増幅、又は、長い核酸フラグメントを導きPhi29  ＤＮＡポリメラーゼ方法を使用する核酸増幅方法、例えばロング−レンジPCR、RCA、分岐RCA、HRCA、C2CA、LAMP、RAM、Smart-AMP、CPA、Smart-AMP、と組み合わせることが特に、本発明の為に適している。
【０１１１】
特定の実施態様において、上記核酸は、核酸増幅の段階の間、緩衝液を含む媒体中に存在し、及び、段階ａ）で使用される上記液体媒体はまた、同じ上記緩衝液を含む。
【０１１２】
特定の実施態様において、上記緩衝液は、1000mS/m以下、好ましくは500mS/m以下、より好ましくは350mS/m以下、特には300mS/m以下、特には275mS/m以下の伝導度を有する。
【０１１３】
特定の実施態様において、上記緩衝液は、３７℃又はそれ未満、好ましくは３０℃又はそれ未満、の温度で活性なポリメラーゼを含む。
【０１１４】
上記緩衝液はさらに、リガーゼ及び／又はＤＮＡポリメラーゼを含みうる。
【０１１５】
変形として、上記核酸は、上記核酸増幅の上記段階の間、第１の緩衝液を含む媒体中に存在し、及び、段階ａ）で使用される上記液体媒体は、上記第１の緩衝液と異なる第２の緩衝液を含む。
【０１１６】
上記第２の緩衝液は好ましくは、上記第１の緩衝液よりもより低い伝導度である。上記第２の緩衝液は好ましくは、1000mS/m以下、好ましくは500mS/m以下、より好ましくは350mS/m以下、特には300mS/m以下、特には275mS/m以下の伝導度を有する。
【０１１７】
上記第２の緩衝液は、第１の緩衝液の脱イオン化の後に得られうる。
【０１１８】
流体システム
【０１１９】
本発明は好ましくは、マイクロ流体システム、ミリ流体システム、若しくはナノ流体システム、又は等価的に、マイクロ流体装置に適用される。なぜならば、これらシステムは、サンプル及び試薬消費及びジュール加熱を減らすことを許しうるからである。
【０１２０】
本明細書において使用される場合に、「マイクロ流体装置」は、500マイクロン（マイクロメータ）未満の少なくとも一つのそれらの寸法を有するマイクロチャンネルを含む実施態様をいう。同じ「ミリ流体装置」は、少なくとも一つのミリチャンネル、すなわち、5mm未満の少なくとも一つの寸法を有するチャンネル、を含む本質的に厳正な実施態様をいう。同じ「ナノ流体装置」は、1μm未満の少なくとも一つの寸法を有する少なくとも一つのチャンネルを含む本質的に厳正な実施態様をいう。しかしながら、今までのところ、マイクロ流体装置がミリ流体装置又はナノ流体装置よりもより広く使用されており、従って、簡潔さの為に、他に特に言及されない場合には、我々は、「マイクロ流体」という一般的な形容詞の下で、下記語、マイクロ流体、ミリ流体、又はナノ流体装置を包含するだろう。
【０１２１】
本明細書において使用される場合に、我々はまた、マイクロ流体装置、ミリ流体装置、又はナノ流体装置それぞれを含む、装置及び接続要素の集合体を、「マイクロ流体システム」（簡潔さの為に、また、「ミリ流体システム又はナノ流体システム」を包含する）として定義する。典型的に、マイクロ流体（ミリ流体又はナノ流体）システムは、少なくともマイクロ流体（ミリ流体又はナノ流体）装置を備えており、及び、それはまた、サンプル又は試薬を含む容器（reservoirs）、上記容器から上記マイクロ流体（ミリ流体又はナノ流体）装置に流体を能動的に移す為の１つ又は幾つかのポンプ装置、及び流体接続要素を備えうる。任意的に、そのような流体システムはまた、1つ又は幾つかの検出器を備えうる。上記検出器は、上記流体装置内に統合され、又は独立でありうる。
【０１２２】
任意的に、本発明のマイクロ流体システムはまた、バルブ、ホルダー、観察手段、及び、任意の種類のその異なる成分及び装置を互いにまとめる為の接続具を備えうる。
【０１２３】
任意的に、本発明のマイクロ流体システムはまた、その成分の上記温度及び機能を制御し、その操作を自動化し、データを記録するなど（非制限的例）の為に、任意の種類のコンピュータ、電子、電気若しくは空気圧制御器を備えうる。
【０１２４】
空間
【０１２５】
上記空間は好ましくは、チャンバにより、好ましくはウェルにより、例えばマイクロタイター・プレートからのウェルにより、又は、チャンネルにより、より好ましくはマイクロチャンネルにより定義される。
【０１２６】
上記空間は、種々のサイズ、性質、及び形状でありうる。
【０１２７】
上記空間は好ましくは、1mm以下、好ましくは1μm〜100μm、特に好ましくは5μm〜50μmの少なくとも一つのその寸法を有する。
【０１２８】
本発明は有利には、チャンバ、好ましくはマイクロチャンバ、のアレイにおいて、又はウェルのアレイ、好ましくはマイクロウェル、例えばマイクロタイタープレート、好ましくは、９６ウェル若しくは３６４ウェルのマイクロタイタープレート、及びより好ましくは、プレート当たり１０００ウェルよりも多いマイクロタイタープレートのウェル、において、部分的に又は逐次的に実行される。
【０１２９】
上記空間を定義するチャンバ、好ましくはウェル、の、又はチャンネル、好ましくはマイクロチャンネル、の少なくとも一つの壁が好ましくは、非導体物質を含み、特にそれから構成される。
【０１３０】
上記空間を定義するチャンバ、好ましくはウェル、の、又はチャンネル、好ましくはマイクロチャンネル、の少なくとも一つの壁が好ましくは、透明物質を含み、特にそれから構成される。すなわち、上記ウェルは、透明検出ウィンドウを備えうる。
【０１３１】
そのような透明物質の使用は、光学的変数のゆらぎ又は変動が測定される場合に、特に好ましい。
【０１３２】
好ましくは、上記空間は、上記検出ゾーンで拡張を示し、当該空間は好ましくはチャンバ又はチャネルによって定義される。上記検出ゾーンで示される拡張は有利には、当該検出ゾーンにおける上記電極の配置を容易にする。
【０１３３】
上記検出ゾーンで示される拡張は有利には、塊形成に有意に影響を与えること無しに、駆動場強度を局所的に減らすことによって上記電極と高電圧電源との間の非干渉化を容易にする。
【０１３４】
特定の実施態様において、上記空間は複数の検出ゾーンを備えており、当該検出ゾーンのそれぞれが、上記液体媒体中の上記マクロイオンの濃度に依存する少なくとも１の変数の検出器を備えている。
【０１３５】
特定の実施態様において、上記液体媒体は、検出されるべきマクロイオン、特には核酸、の種々のタイプを含み、及び、上記マクロイオンと相互作用するように構成された複数の化合物は、上記検出ゾーンのそれぞれに存在し、一つの検出ゾーンに存在する化合物は、他の検出ゾーンに存在する化合物と異なる。
【０１３６】
特定の実施態様において、検出されるべき上記マクロイオンが核酸であり、及び、上記化合物は、上記核酸の種々のヌクレオチド配列と相互作用するように、特にはそれにハイブリダイズするように、構成されている。
【０１３７】
特定の実施態様において、上記空間が縦軸に沿って延在し、及び、上記検出ゾーンが上記縦軸に沿って互いに続く。
【０１３８】
特定の実施態様において、上記空間は、それぞれが検出ゾーンを含む複数のサブチャンネルを備えている。
【０１３９】
特定の実施態様において、上記液体媒体中の上記マクロイオンの上記濃度に依存する少なくとも一つの変数の上記液体媒体内の空間的及び／又は時間的ゆらぎが、上記検出ゾーンのそれぞれの間で同時に測定される。
【０１４０】
特定の実施態様において、上記液体媒体中の上記マクロイオンの上記濃度に依存する少なくとも一つの変数の上記液体媒体内の空間的及び／又は時間的ゆらぎが、上記検出ゾーンのそれぞれの間で逐次的に測定される。
【０１４１】
特定の実施態様において、上記液体媒体中の上記マクロイオンの上記濃度に依存する少なくとも一つの変数の上記液体媒体内の空間的及び／又は時間的ゆらぎが、上記検出ゾーンのそれぞれの間で測定され、及び、段階ｃ）が、上記複数の検出ゾーンから測定された上記空間的及び／又は時間的ゆらぎを処理することを含む。
【０１４２】
複数の検出ゾーンの使用は有利に、それが例えば上記異なる検出ゾーンから得られた上記ゆらぎ信号を例えば相互に関連付けることを許す故に、種々のマクロイオン、例えばバイオマーカー、を同時に検出すること、及び／又は、検出の品質を同時に改善することを許す。
【０１４３】
特定の実施態様において、異なる検出ゾーンから得られた上記ゆらぎ信号の平均は、段階ｃ）の間、作られることができる。
【０１４４】
特定の実施態様において、本発明に従う上記装置は、複数の検出ゾーンを含む空間を備えており、上記検出ゾーンのそれぞれは、上記液体媒体中の上記マクロイオンの上記濃度に依存する電気的変数の及び／又は光学的変数の検出器を備えている。
【０１４５】
特定の実施態様において、本発明に従う上記装置は、縦軸に沿って延在された空間を含み、及び、上記検出ゾーンは、上記縦軸にそって互いに続く。
【０１４６】
特定の実施態様において、本発明に従う上記装置は、それぞれが検出ゾーンを含む複数のサブチャンネルを備えている空間を備えている。
【０１４７】
液体媒体
【０１４８】
上記液体媒体は、生物学的液体、例えば血液若しくは血漿、又は血清、尿、胸水、脳脊髄液、又は有機体から抽出される何らかのサンプルでありうる。それはまた、細胞の、培養の生きている有機体からの懸濁液又は再懸濁液であることができる。任意的に、上記液体媒体は、任意の種類の予め処置された、例えば非制限的例として、精製、抽出、遠心分離、ろ過、培養、インキュベーション、温度処置など、に掛けられていてもよい。好ましい実施態様において、上記液体は、核酸増幅からの混合物を含む。好ましい実施態様において、それは、１又は幾つかのプライマー、ポリメラーゼ、リガーゼ、酵素などを含みうる。
【０１４９】
他の好ましい実施態様において、上記液体媒体は、人工又は天然のポリマーの懸濁である。他の好ましい実施態様において、それは、有機、無機、若しくは組み合わされた有機−無機のコロイド、又はナノ粒子の懸濁液である。
【０１５０】
変形として、上記液体媒体は、水（脱イオン化された又はそうでない）であり、及び、ｐＨ緩衝液を含みうる。
【０１５１】
上記液体媒体は、可視光に対して透過的でありうる。
【０１５２】
上記液体媒体は、本発明に従う上記方法の全体又は一部の間に、流れないかもしれない。
【０１５３】
実施態様に従うと、上記液体媒体は、本発明に従う上記方法の全体又は一部の間に流れており、上記液体媒体の上記流れのレイノルズ数は、好ましくは１０未満である。
【０１５４】
好ましくは、上記液体媒体は、何らの追加のラベリング剤を含まない。
【０１５５】
塊
【０１５６】
マクロイオンにおける均一な濃度ｃを有する溶液から形成されたマクロイオン塊は典型的に、ｃよりも大きいマクロイオンにおける濃度を有し、及び、マクロイオンからのそれらの環境を使い果たし、従ってそのような環境は上記塊の存在においてｃよりも小さいマクロイオンにおける濃度を有する。
【０１５７】
それ故に、塊形成は、上記刺激する電場の非存在における上記空間的なゆらぎよりも有意に大きいマクロイオンにおける濃度の空間的ゆらぎを生成する。
【０１５８】
上記液体媒体中の上記マクロイオンの総濃度は好ましくは、塊形成によって変更されない。
【０１５９】
塊形成は好ましくは、上記液体媒体における上記マクロイオン濃度のランダムな空間的ゆらぎを生成する。
【０１６０】
上記塊は好ましくは、上記検出電極に相対的に特定の配置を有しない。特には、当該塊は、段階ｂ）及び／又はｃ）の間に上記電極に近接に閉じ込められない。
【０１６１】
本発明者らは、驚くべきことに、及び、例えば、Magnusdottir  et  al.  Biopolymers,  Vol.  49,  385-401  (1999)（その中には、この注目に値する現象の発生への依存を使用することによって、これらゆらぎがＤＮＡ解析を阻む）において記載された先行技術と対照的に、適切な特性を有する刺激する電場をＤＮＡ溶液上に施与し、そのような塊を産出し、次に、これら塊の形成を記録することすることによって、それは、ＤＮＡを検出すること、及び特に、ラベル無しにＤＮＡ増幅をモニターすることが事実可能であった。
【０１６２】
統合的な検出方法による塊の測定
【０１６３】
マクロイオンを検出する為に知られている伝導度方法と対照的に、本発明の上記方法は、上記媒体の平均伝導度を測定しえないかもしれないが、変数、好ましくは電気的又は光学的変数、の上記ゆらぎにより反映された塊のレベルを使用しうる。上記ゆらぎは、上記刺激する電場を施与する前のマクロイオンの濃度に依存し、且つ上記刺激する電場の特徴に依存する。
【０１６４】
例えば図８において見られる本発明において使用される塊の観察は、空間、例えばチャンバ又はマイクロチャンネル、において含まれる場合に、それらが空間壁に出くわすまで、それらは一般的には、上記刺激する場の方向に関して横断又は傾いた方向において延在された形状をとり、従って、大体一定のサイズを維持する。
【０１６５】
また、一般に、塊の多様性の存在及びそれらのランダムな性質のために、上記信号を最大化する為に、上記塊の典型的なサイズの次数の大きさを有する容量又は領域要素における上記変数の測定の多様性を作ることによって、上記刺激する電場の活動下での変数、特には電気的又は光学的変数、の上記ゆらぎを記録することが関心のあることでありうる。このように、上記信号の上記振幅は、幾つかの場合において、塊の全体を含み、又は代替的には塊を全く含みえない。
【０１６６】
それ故に、好ましい実施態様において、信号測定の認識がその中で行われる領域Ａのサイズ又は容量Ｖが、上記場に垂直の方向にある、刺激する場がその中に施与される空間の最小次元のそれと同じ次数である。好ましい実施態様において、それは、0.1〜10倍の上記最小次元、好ましくは0.1〜1倍の上記最小次元、で構成される。
【０１６７】
例えば、上記変数が電気的変数である幾つかの好ましい実施態様において、上記変数を記録する複数の電極間の上記空間は好ましくは、上記場に垂直の方向にある、上記刺激場がその中で施与される空間の0.02〜20倍の上記最小次元、好ましくは0.1〜10倍の上記最小空間、好ましくは0.3〜3倍の上記空間、好ましくは0.3〜1倍の上記空間、で構成される。
【０１６８】
上記変数が光学的変数であり且つこの光学的変数が統合的光学検出器により記録される幾つかの好ましい実施態様において、上記検出器の観察領域のサイズは好ましくは、上記場に垂直の方向にある、上記刺激場がその中で施与される空間の0.02〜20倍の上記最小次元、好ましくは0.1〜10倍の上記最小空間、好ましくは0.3〜3倍の上記空間、好ましくは0.3〜1倍の上記空間、で構成される。
【０１６９】
積分又は統合的光学検出器は、領域又は空間の容量から提供される光を積分し且つ上記積分された光強度を反映する信号（一般的に、電気信号）を運ぶ光学検出器である。典型的な統合的光学検出器は、フォトダイオード、光電子増倍管、アバランシェ（avalanche）・フォトダイオードである。
【０１７０】
イメージング装置による塊の測定
【０１７１】
幾つかの好ましい実施態様において、マクロイオンの濃度の空間的ゆらぎは、直接的に記録され、及び、信号を抽出する為に、例えば多くの塊を包含する瞬間的な画像を撮るイメージング装置を使う為に、及び空間的画像解析を実行する為に用いられることができる。
【０１７２】
上記励起電場に掛けられた、上記空間の領域の画像が、作成され且つ記録される。次に、上記領域において光強度の又は明色のゆらぎを抽出することを目的とする解析が適用される。任意的に、参照として、上記刺激する場の適用の間、上記解析の上記結果が、上記刺激する電場のｖ適用前の上記解析の結果と、又は検出する上記種の非存在において得られる参照値と比較されることが出来る。
【０１７３】
我々は、観察された領域の空間的解像画像を提供する装置であるイメージング装置又はイメージング光検出器を定義する。典型的なイメージング光検出器は、慣用的なチューブ・カメラ、銀塩カメラ、ＣＣＤカメラ、ＣＭＯＳカメラ、フォトダイオード・アレイなどである。特定の実施態様において、図８及び実施例６に例示されるように、上記イメージング装置は、ＣＣＤカメラである。
【０１７４】
イメージング装置を備えているそのような実施態様において、上記画像は、上記刺激する場の方向に延在された容量において記録され、及び、上記場に垂直な方法において上記場がその中で施与されるチャンバ又はチャンネルの寸法と比較可能な幅を有しうる。次に、複数の塊が同時に記録され、及び、画像解析アルゴリズムが、詳細には下記において説明されているような、上記塊の典型的なサイズに対応する上記画像から上記ゆらぎを抽出する為に使用される。好ましくは、上記画像解析アルゴリズムは、２次元ウェーブレット解析を含む。
【０１７５】
刺激する電場
【０１７６】
上記刺激する電場の特性
【０１７７】
上記刺激する電場の上記特性は、マクロイオン、特にはＤＮＡターゲット、の性質、濃度又はサイズに、及び、上記液体媒体の上記伝導度特性に従って変わりうる。
【０１７８】
本発明の上記方法の段階ａ）で施与される刺激する電場が好ましくは、
−  直流の電場又は、1000Hz以下、好ましくは100Hz以下の周波数の交流の電場であり、及び／又は、
−  50V/cm以上、好ましくは100V/cm以上、より好ましくは200V/cm以上の強度を有し、及び／又は、
−  異なる周波数を有する少なくとも第１及び第２の電場成分の重畳を含み、上記第２の電場成分は上記第１の電場成分の振幅よりも低い振幅を有し、及び、上記第２の電場成分は、直流であり又は、上記第１の電場成分の周波数よりも低い周波数を有する。
【０１７９】
上記刺激する電場の上記強度は、上記検出ゾーンで測定されるか、又は、空間又はマイクロチャンネルの２つの側上に電位を与え、そしてラプラスの方程式に従って上記場を計算することによって予め決定されうる。例えば、一定断面積を有する線状のマイクロチャンネルの場合には、当該場振幅は、上記与えられた電位を上記マイクロチャンネル長さで割ったものにほぼ等しい。
【０１８０】
上記刺激する場において異なる周波数を有する少なくとも２つの電場成分の重畳の使用は有利的に、マクロイオン塊を形成すること、及び上記液体媒体中に上記マクロイオン塊を置換することを許す。典型的に、主成分と呼ばれる第１の成分は第１の振幅及び第１の周波数を有し、及び、バイアスと呼ばれる第２成分は、上記第１の振幅よりも小さい振幅を有し、且つ、第２の種は数は、上記第１の周波数よりも小さいか、又は、直流の場成分である。
【０１８１】
このように、上記場の第１の成分は上記塊を生成し、及び、上記第２成分は上記検出領域を横断してそれらを駆動する。すなわち、２つの電極場成分の重畳の使用は有利に、塊の自発的移動のみが使用される場合よりもより高いゆらぎ割合を有する変数の時間的なゆらぎを上記検出ゾーンにおいて生成する。
【０１８２】
このより高いゆらぎ割合は上記ゆらぎの上記統計的解析を簡単にし、それをより正確にし、且つ、より早い検出を許す。なぜならば、上記塊の自発的運動は比較的遅くありうるからである。
【０１８３】
塊の形成が上記液体媒体中の上記マクロイオン濃度のランダムな空間的ゆらぎを生成する場合に、２つの電場のそのような重畳の使用が特に好ましい。
【０１８４】
より一般的には、上記塊は、流体力学的流れを介して、又はより一般的には、上記空間の２つに地点間の圧力相違のおかげで、移動されることができる。この場合は、１つの電場のみが上記塊を形成する為に使用されうる。これらの塊の上記移動は、圧力相違又は流れのおかげで保証される。
【０１８５】
上記電気的変数の上記ゆらぎは好ましくは、段階ａ）で施与される上記刺激する電場の最高周波数と異なる周波数を有する交流分極信号により分極された少なくとも２つの電極により段階ｂ）で測定され、上記分極信号の上記周波数は好ましくは、上記周波数成分よりも大きく、より好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、より好ましくは少なくとも１０００倍、それよりも大きい。
【０１８６】
上記刺激する電場を生成する電極
【０１８７】
実施態様の１つの好ましいファミリーにおいて、上記電場を生成する為の上記電極は、検出のために使用される上記電極と異なる。
【０１８８】
幾つかの実施態様において、上記刺激する場を生成する上記電極は、マクロイオンを含む溶液を含むチャンバ又はマイクロチャンネル中に、且つ、後者との直接接触にあり、他の実施態様において、それらは、チャンバ又はマイクロチャンネルと流体的接続にある個々のリザーバ中にある。好ましくは、それらは、複数の測定電極間の距離と比較してはるかに離れている。
【０１８９】
実施態様の他の好ましいファミリーにおいて、同じ電極が、上記電場を生成する為に且つ上記検出の為に使用されうる。
【０１９０】
そのような構成が相対的に簡単な装置を使用することを許す故に、当該構成は有利でありうる。
【０１９１】
事実、そのような構成において、単一の電源が必要とされうる。さらに、上記電極が十分に近い場合には、マクロイオンの塊の形成を誘発することができる刺激する電場が、高圧電源を必要すること無しに生成されうる。
【０１９２】
２よりも多い電極、例えば３、４又は何十もの電極、が使用されうる。
【０１９３】
上記刺激する電場の生成の為の電極は、浮動接地を有する１つ又は複数のアンカプラー、好ましくは分離増幅器、を備えている基板に接続されうる。
【０１９４】
この構成は有利には、施与される上記刺激する電場と上記検出装置との間の干渉を減らすことを許しうる。
【０１９５】
刺激する電場を生成する為の電力
【０１９６】
刺激する電場を生成する為に使用される電力は、平衡回路を備えており、特には平衡回路からなりうる。言い換えれば、上記電力は好ましくは、対称の電源でありうる。
【０１９７】
平衡回路の使用は、干渉を減らすのを助ける。
【０１９８】
幾つかの実施態様において、上記電源は、少なくとも１の、好ましくは２の、高電圧増幅器を備えている。他の好ましい実施態様において、上記電源は、少なくとも１の、好ましくは２の、DC／DC電圧コンバータを備えている。
【０１９９】
上記電力は好ましくは、標準的なバッテリー、例えば標準９Ｖバッテリー、から作動される。
【０２００】
検出器
【０２０１】
測定電極
【０２０２】
上記電極の構成
【０２０３】
上記電気的変数の上記ゆらぎが好ましくは、上記液体媒体と直接電気接触する少なくとも２つの電極により段階ｂ）で測定される。
【０２０４】
他の実施態様において、上記電気的変数の上記ゆらぎは、誘電体層を通じて上記液体媒体と非直接電気接触する少なくとも２つの電極により段階ｂ）で測定される。
【０２０５】
これらの構成は、施与される上記刺激する電場と上記検出装置との間の干渉を減らすことを許す。
【０２０６】
上記電気的変数の上記ゆらぎはまた、幾つかの実施態様において、上記電場の方向に対して平行な軸に沿って、異なる位置で配置された少なくとも２つの電極により段階ｂ）で測定される。
【０２０７】
また、段階ａ）で施与される上記刺激する電場が、上記電気的変数の上記ゆらぎを段階ｂ）で測定する電極と同じ電極により施与されるうる。
【０２０８】
このように、単一の電源が必要とされ、及び、上記電極の近接近の故に、塊を生成する為に十分高い刺激する電場が、高圧電源の必要なしに達成されることができる。しかしながら、この実施態様において、上記塊は、上記複数の電極間に局在され、統計的解析をより困難にする。これを補償する為に、２よりも多い電極、例えば３、４又は何十もの電極、を含む複雑な電極構成が良い統計的解析を回収する為に有利でありうる。
【０２０９】
上記検出器が少なくとも２つの電極を備えている実施態様において、上記検出器電極は好ましくは、上記液体媒体中の１の場所で上記電気的変数の変動を測定するように構成されており、ここで、上記刺激する電場を誘発する上記電位の絶対値が最小であり、好ましくは実質的にゼロである。
【０２１０】
この構成は、施与される上記刺激する電場と上記検出装置との間の干渉を減らすことを許す。
【０２１１】
好ましくは、上記第１の電源は、対称の電源である。
【０２１２】
他の好ましい実施態様において、上記第１の電源が対称の電源でない場合に好ましくは、上記電気的変数の上記ゆらぎ又は変動を測定する為に使用される電極は、上記第１の電源によって生成される電位の絶対値が上記第１の電源の参照の電位に実質的に等しい、好ましくは等しい、上記液体媒体中の位置で配置されうる。
【０２１３】
好ましくは、上記第１の電源は、基底基準に接続される。好ましくは、上記基底基準はまた、上記電力の参照の電位である。後者は、アーク、不安定な電位、及びユーザの危険を低減しうる。
【０２１４】
上記電極のサイズ
【０２１５】
上記検出器電極は好ましくは、200μm以下、好ましくは100μmよりも小さい、幅を有し、相対的に小さい幅を有する電極は、施与される上記刺激する電場と上記検出装置との間の干渉を減らすことを許す。
【０２１６】
上記検出器電極の寸法及び／又はそれらの間隔は好ましくは、上記刺激する電場の方向に対して垂直な方向において測定される検出ゾーンの寸法の0.1〜10倍、好ましくは0.3〜3倍、最大の寸法からなる。
【０２１７】
好ましい実施態様において、上記電極が、表面処理剤を含む少なくとも一つの層で被覆されている。
【０２１８】
そのような表面処理剤の使用は有利に、上記電極上の、核酸増幅、例えばＨＲＣＡ増幅、後に得られた核酸の吸着を減らすことを許す。
【０２１９】
上記表面処理剤が、ヒドロゲル又は界面活性剤でありうる。
【０２２０】
特定の実施態様において、上記表面処理剤は下記リストの間で選択される：水溶性セルロース誘導体、例えばヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、置換された又は置換されていないアクリル及びメタクリル誘導体、例えばポリジメチルアクリルアミド、ポリジメチルアクリルアミド−アリルグリシジルエーテルポリアクリルアミド、置換された又は置換されていない種々のタイプのアクリルの、アルキルアクリルのモノマーから得られたコポリマー、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリエチレン及びポリプロピレングリコールのコポリマー、特には、商業名Pluronics（登録商標）下で販売されているもの、アクリルの又はメタクリルの誘導体により機能化されたポリマーの重合化の生成物、シラン置換基を有し、好ましくは水溶性のポリマー、オリゴマー又は分子、チオール置換基を有し、好ましくは水溶性のポリマー、オリゴマー又は分子、及び、それらの混合物。
【０２２１】
光学的検出
【０２２２】
電極についての上記された実施態様と同様に、光学的変数のゆらぎ又は変動が、例えば統合的光検出器を使用して測定される場合に、上記検出器の上記観測領域は好ましくは、上記刺激する電場の方向に対して垂直の方向に置いて測定された検出ゾーンの最大次元の0.1〜10倍、好ましくは0.3〜3倍からなる寸法を有する。
【０２２３】
塊の全体（しかし、１つの塊に過ぎない場合）が上記検出ゾーンを包含する場合に、上記信号変動が一般的に最大で或ることが注目されることができる。
【０２２４】
測定タイミング
【０２２５】
幾つかの好ましい実施態様において、上記変数のゆらぎが好ましくは、上記刺激する電場が施与されていない間に測定され、上記刺激する電場が、好ましくは第１の期間の間に施与されず、上記第１の期間は、上記刺激する電場がその間に施与される第２の期間と交互に起こる。
【０２２６】
この実施態様は、上記刺激する場を生成する為に使用される上記電極が伝導度ゆらぎを検出する為に使用されるものと同じである場合に、特に適切である。
【０２２７】
濃度の上記ゆらぎは、相対的に急速に、典型的に1〜100秒内に、緩和しうる。この緩和は、上記測定されたゆらぎの上記振幅を小さくしうる。
【０２２８】
それ故に、上記刺激する電場が施与されない期間は好ましくは、100秒以下、好ましくは10秒以下、の持続時間を有する。
【０２２９】
変形として、上記刺激する電場が施与される間に、上記変数の上記ゆらぎが測定される。
【０２３０】
この場合に、本明細書中に記載された上記溶液の全て又は一部を使用して、上記刺激する電場と上記検出器との間の干渉を減らすことは興味深いものでありうる。
【０２３１】
また、幾つかの実施態様において、上記電気的変数は、上記刺激する電場中に存在する周波数又は周波数成分を拒絶するフィルタリングを使用し、上記測定電極の分極の周波数で測定される。好ましくは、また、上記測定電極の分極周波数は、上記刺激する電場の上記周波数の倍数でない。
【０２３２】
分極信号
【０２３３】
好ましくは、上記電気的変数の上記ゆらぎが、段階ａ）で施与される上記刺激する電場の最高周波数成分と異なる周波数を有する交流分極信号により分極された少なくとも２つの電極により段階ｂ）で測定され、上記分極信号の上記周波数は好ましくは、上記周波数成分よりも大きく、より好ましくは少なくとも１０倍、より好ましくは１００倍、より好ましくは１０００倍大きい。
【０２３４】
これは、上記刺激する電場と上記検出器との間に、より良い非干渉化を得ることを許す。
【０２３５】
上記分極信号の上記周波数は好ましくは、特に検出器電極が液体媒体と接触している場合に、1kHz〜100kHz、好ましくは1kHz〜50kHzで構成される。
【０２３６】
そのような周波数の使用は、上記電極表面での電気化学的反応の回避及びファラデー電流の生成を可能にする。上記非接触検出モードにおいて、上記分極周波数は、1kHz〜100MHz、好ましくは10kHz〜50MHz、より好ましくは100kHz〜10MHzから構成されうる。
【０２３７】
上記分極信号の上記周波数は好ましくは、上記刺激する電場の周波数のゼロ以外の倍数と異なる。
【０２３８】
電子回路
【０２３９】
上記電気的変数の変動又はゆらぎが測定される場合に、上記検出器は、複数の検出器電極及び、電子回路を備えうる。上記電極は、上記電子回路に接続される。
【０２４０】
上記電子回路は好ましくは、上記述された分極信号を検出器電極に施与する。
【０２４１】
上記電子回路は、
・少なくとも一つの、好ましくは２つの、より好ましくは３の、アンカプラーであって、上記アンカプラーは好ましくは、分離増幅器である、上記アンカプラー、及び／又は、
・少なくとも一つの、好ましくは少なくとも２つの、電圧制御された電流源、及び／又は、
・抵抗のブリッジ、及び／又は、
・差分増幅器、又は、
上記４つのタイプの成分の任意の組み合わせ
を備えうる。
【０２４２】
好ましい実施態様において、上記電子回路は、
・少なくとも一つの、好ましくは２つの、より好ましくは３の、アンカプラーであって、上記アンカプラーは好ましくは、分離増幅器である、上記アンカプラー、及び、
・少なくとも一つの、好ましくは少なくとも２つの、電圧制御された電流源、及び、
・抵抗のブリッジ、及び、
・差分増幅器
を備えている。
【０２４３】
分離増幅器の使用が好ましい。なぜならは、分離増幅器は特には、感度が良く、直線的であるという利点を有し、且つ、他のタイプのアンカプラーと比較して満足する分離を提供するからである。
【０２４４】
上記電子回路は、バッテリーで作動される電源を好ましくは備えている電源を備えうる。
【０２４５】
上記第２の電源は好ましくは、浮動接地を有する。
【０２４６】
上記アンカプラーは好ましくは、浮動接地を有する。
【０２４７】
好ましくは、上記刺激する電場を生成する為に上記回路において使用されるアンカプラー及び上記検出器の上記回路において使用される上記アンカプラーが、浮動接地を有する。そのような構成は、上記検出器と上記刺激する電場との間の干渉を減らすことを許す。
【０２４８】
上記検出器は好ましくは、差分増幅器の反転入力及び非反転入力にそれぞれ接続されている２つの電極を備えており、各電極は好ましくは、上記差分増幅器の個々の入力に及び対応する抵抗器を介して定電流源に接続されている。
【０２４９】
上記電子回路は好ましくは、対称である。
【０２５０】
測定された信号の処理
【０２５１】
上記処理は、任意のコンピュータ、例えばパーソナル・コンピュータ、マイクロプロセッサ、スマートフォン、又は、微積分を実行することが可能な任意の統合信号処理装置によって実行されることができる。任意のアナログ−デジタル・カードが、上記コンピュータに加えて使用されうる。
【０２５２】
本発明はまた、上記種を検出し又は解析する為に使用される現象の斬新さによりその観点の他において特徴付けられる。上記現象は、濃度の、疑似のアーティファクト及び厄介なものとして従来技術において見なされてきたタイプのランダムなゆらぎであり、それは、本発明において有用な作業を働かせる。このゆらぎの有用な測定はまた、幾つかの特定の解析方法を要求する。従って、特には、その観点の幾つかにおいて、本発明は、信号がその中で記録される方法に関連し、及び当該信号のランダム且つ非周期的なゆらぎ部分のみが種の濃度のレポーターとして使用される。
【０２５３】
この方法はまた、同じく幾つかの特定の信号処理方法を要求する。従って、その実施態様の他において、本発明は、信号からランダム且つ非周期的成分を抽出し、且つ上記成分から当該成分の上記平均された又は統合された振幅を反映する値を抽出するような方法においてプログラミングされたデジタル的又はアナログ的データプロセッサに関する。好ましくは、上記振幅は、上記媒体中の幾つかの選択された種の濃度に依存する。
【０２５４】
任意の予備処理
【０２５５】
上記検出器電極又は、上記光学検出器、例えば統合光検出器、から得られた上記信号は好ましくは、時間の関数として記録される。
【０２５６】
幾つかの実施態様において、上記信号は、例えばノイズ減少、フィルタリング、復調、又は統合方法により、及びより一般的に、当分野において知られている信号処理方法（数学的又はアナログ的）により、予備処置されうる。
【０２５７】
上記検出器電極又は上記光学検出器から得られた信号は、フィルターされうる。
【０２５８】
上記検出器電極又は上記光学検出器から得られた信号は、振幅において変調されうる。上記信号は好ましくは、上記分極信号と同じ周波数を有する。
【０２５９】
好ましくは、上記検出電極が上記したように上記分極信号によって分極化される場合には、上記フィルタリングは、上記分極信号の周波数と異なる周波数、例えば上記刺激する電場の周波数、を減らし、好ましくは除去しうる。
【０２６０】
上記検出器電極又は上記光学検出器から得られた上記信号は、記憶ユニット中に、例えば収集カードを介するコンピュータ中に、格納されうる。上記収集カードは、上記検出器及び上記刺激する電場生成器を制御しうる。上記収集カードは、ソフトウェア、例えばLabview Signal Express、或いはMatlab、若しくは他の数学的な若しくは実験ソフトウェア、又は、C、C++、Java（登録商標）ような他のより一般的なソフトウェア、及び当分野のそれらから周知である多種多様なプログラミング・ソフトウェアの、を介して、上記コンピュータによって制御されうる。
【０２６１】
上記検出器電極又は上記光学検出器から得られた信号は、1kHz未満、好ましくは100Hz未満、及び場合により10Hzよりも低い、及び時々100〜1Hz、の周波数で、周波数復調されうる。
【０２６２】
復調の為のそのような周波数の使用は有利に、上記検出ゾーンにおいて塊の通過をDC信号中で確実に再トレースすることを許す。
【０２６３】
上記変数の上記ゆらぎ又は変動は好ましくは、そのような復調の後に得られる。
【０２６４】
上記変数のゆらぎ又は変動の解析
【０２６５】
上記装置は好ましくは、時間依存若しくは空間依存解析、好ましくはウェーブレット解析、を、又は、電気的変数の変動について、又は画像検出器から発行された画像について、又は統合的光学検出器の出力について自己相関を実行する為のデジタル・プロセッサを備えている。
【０２６６】
好ましくは、段階ｂ）は、時間依存若しくは空間依存解析により、好ましくはウェーブレット解析により、又は段階ａ）で測定された変動の自己相関解析により、処理することを含む。
【０２６７】
ランダムの上記強度及び／又は非周期的特徴についての情報を上記伝導度信号の又は統合光学信号の上記ゆらぎ又は変動から抽出することを可能にする、及び好ましくは上記特徴の強度を反映する量値を上記情報から抽出することを可能にする、デジタル又はアナログ・プロセッサを使用することが可能である。特に好ましくは、上記成分の上記振幅は、上記液体媒体中の上記荷電種の上記濃度についての情報を提供する。
【０２６８】
幾つかの好ましい実施態様において、上記量的情報は、自己相関関数、例えば平均２乗偏差、の時間での積分である。
【０２６９】
幾つかの他の好ましい実施態様において、上記量的情報は、自己相関関数、例えば平均２乗偏差、の上記空間の画像での空間積分である。
【０２７０】
幾つかの更に好ましい実施態様において、上記量的情報は、ウェーブレット・ベースの所与のウェーブレットに対応する係数、又はそのような係数のセット、又はそのような係数の関数であり、上記係数は、上記信号にウェーブレット解析を施与することによって得られる。
【０２７１】
幾つかの他の好ましい実施態様において、上記量的情報は、上記ウェーブレット・ベースの所与のウェーブレットに対応する係数、又はそのような係数のセット、又はそのような係数の関数であり、上記係数は、画像に空間的ウェーブレット解析を施与することによって得られる。
【０２７２】
そのようなプロセッサの使用は有利に、上記測定された変数のゆらぎ又は変動を、例えば電子ノイズ又はベースライン・ドリフトから区別することを許す。
【０２７３】
上記ゆらぎ又は変動は、それらの時間的ゆらぎを抽出することを目的とする解析によって処理されうる。
【０２７４】
任意的に、刺激する電場が施与されている間に測定されたゆらぎ又は変動に対して実行されたそのような解析の結果が、上記刺激する電場が施与されていない場合に測定されたゆらぎ又は変動に対して実行されたそのような解析の結果及び／又は検出する種の非存在において得られた参照値と比較される。
【０２７５】
時間的解析
【０２７６】
特に好ましい実施態様において、上記変数の上記時間的ゆらぎ又は変動が、ウェーブレット解析によって処理される。
【０２７７】
要するに、ウェーブレット解析は、共通の形状を有し、しかし異なる特徴的な時間スケールを有する、ウェーブレットと呼ばれる関数のセット（ウェーブレット・ベース）とともに、関数、本明細書における変数の時間的なゆらぎ又は変動、を畳み込むことを含む。
【０２７８】
上記ウェーブレットは、ゼロ平均であり、及び、例えばフーリエ変換と比較して、単一のポイント又は「中心」から距離でゼロに減少するという特性を有する。
【０２７９】
これらの共通の特性の他に、ウェーブレットは様々な形状をとることができ、従って、複雑且つノイズ信号から、形状又は持続時間の幾つかの特定の特徴を有する特性を抽出するように調整されることができる。
【０２８０】
ウェーブレット解析は特に、本発明を実行する場合に、得られた上記変数のゆらぎの処理に十分に適合されている。
【０２８１】
ウェーブレットの種々の形状が、上記空間の刺激する電場の特徴に依存して、本発明において使用されうる。幾つかの例示的な且つ非制限的なものが、実施例５において例示される。
【０２８２】
本発明の上記方法は、ウェーブレット・ベース上に上記信号を分解すること、ブランクの陰性信号と陽性信号との間のウェーブレット振幅の違いが最大になる上記ウェーブレット・ベースのサブセットを選択すること、及び、上記サブセットから上記最終信号を抽出すること、を含みうる。
【０２８３】
好ましい実施態様において、このサブセットからのウェーブレットの上記振幅は、ブランク又は陰性対照に適用された場合に、基本的にゼロであり、及び、（例えば、光学的に検出可能な塊を有する）陽性信号上の上記ウェーブレットの上記振幅は、非ゼロである。
【０２８４】
１つの実施態様において、上記解析は、自己相関解析を実行することを含む。例示的な及び非制限的な例として、上記自己相関解析は、上記信号の全て又は一部に関して<(I(t)-<I(t)>)2>/<I(t)2>の積分を計算すること、ここで、I(t)は、時間tでの光の強度であり、及び括弧は時間での平均を表す。
【０２８５】
これは、平均平方解析に対応し、しかし、積分の他の異なるモードが使用されうる。但し、上記積分は、例えばマクロイオン塊の展開に関連した、量的な値又は一連の量的な値をデータから抽出する。
【０２８６】
空間解析
【０２８７】
上記変数の空間的ゆらぎが、例えば複数の塊を包含する瞬間的な画像を撮るイメージング装置を使用し且つ空間的画像解析を実行して測定され、そして信号を抽出する為に使用されうる。
【０２８８】
実施態様において、上記イメージング装置は、ＣＣＤ又はＣＭＯＳカメラでありうる。
【０２８９】
上記刺激する電場に掛けられた上記空間の領域の画像が、図８又は図１１Ｂにおいて例示されているように、撮られ、そして任意的に記録されうる。
【０２９０】
次に、上記領域における光光強度の及び／又は明色のゆらぎを抽出することを目的とする解析が、適用されうる。
【０２９１】
任意的に、刺激する電場が施与されている間に測定されたゆらぎ又は変動に対して実行されたそのような解析の結果が、上記刺激する電場が施与されていない場合に測定されたゆらぎ又は変動に対して実行されたそのような解析の結果又は検出する種の非存在において得られた参照値と比較される。
【０２９２】
１つの実施態様において、上記解析は、自己相関解析を実行することを含む。例示的な及び非制限的な例として、上記自己相関解析は、上記画像の全て又は一部に関して<(I(r)-<I(r)>)2>/<I(r)2>の積分を計算すること、ここで、I(r)は、ポイントrでの光の強度であり、及び括弧は上記画像での又は上記画像の選択された領域Aでの平均を表す。
【０２９３】
これは、平均平方解析に対応し、しかし、積分の他の異なるモードが使用されうる。但し、上記積分は、例えばマクロイオン塊の展開に関連した、量的な値又は一連の量的な値をデータから抽出する。
【０２９４】
特に好ましい実施態様において、上記変数の上記空間ゆらぎ又は変動が、ウェーブレット解析によって処理される。
【０２９５】
この実施態様において、我々が空間依存光強度マップを開始関数として使用することを除き、我々は、時間依存的ゆらぎ又は変動について上記操作をし、且つ、共通の形状を有し、しかし異なる特徴スケールを有する２次元関数又はウェーブレット（ウェーブレット・ベース）のセットとともにそれを巻き込む。
【０２９６】
ウェーブレット解析は、本発明を実行するときに得られた変数のゆらぎの処理に十分に適合される。
【０２９７】
種々の形状のウェーブレットが、上記刺激する電場の及び上記空間の特徴に依存して、本発明において使用されうる。
【０２９８】
好ましくは、上記解析がその中で実行される領域Ａが、カメラによって視られる総画像の一部のみを包含するように選択され、その中にマクロイオンを含む媒体が存在する。
【０２９９】
好ましくは、また、良い平均効果を有する為に、上記領域Ａは、任意の所与の瞬間で、多様な塊を含む為に選択される。
【実施例】
【０３００】
検出の原理
【０３０１】
μチップ−ＣＥにおける接触伝導度測定又は動電学的ベースの方法が、上記マイクロチャンネルにおけるバックグラウンド電解液と直接接触する統合された電極を使用することにより液体において伝導度変化を検出する為の比較的簡単な方法を提供する。
【０３０２】
上記電場は、異なる外部参照電位を使用することによりＨＶＰＳ及び伝導度検出器から非干渉化された。これは、本明細書において、下記において特定されるように、浮動参照、分離増幅器のおかげで達成された。
【０３０３】
検出器電極１０が、図１Ａに従い、印加電圧に相対的に配置され且つ構成され、及び、検出電子装置５０に接続された。電極１０は、下記に詳述されるように、Pt平面微小電極でありうる。
【０３０４】
この図は、平衡電圧(Vs，-Vs)が高圧電源４０（ＨＶＰＳ）からマイクロチャンネル２０の両側面供給されること、及び、平衡伝導度検出電圧(Vd，-Vd)が上記検出装置によって横チャンネル電極１０上に施与されることを示す。
【０３０５】
検出器電極１０は、主励起場に対して垂直である構成に、且つ、励起電極３０の参照システムにおけるゼロ電位に対応するマイクロチャンネル２０に沿う場所で配置される。
【０３０６】
検出器電極１０を横切る電位降下がまた、チャンネル寸法から独立してこれら電極を狭くしておくことを維持することによって最小化される。
【０３０７】
実施例１：伝導度検出モードにおいて本発明において使用されるべきマイクロ流体システムの為の構造及び製造工程
【０３０８】
上記マイクロチップは、ラピッド・プロトタイピング、下記D.  C.  Duffy  et  al,  Analytical  chemistry,  1998,  704974-84、により製造されたGlass/PDMS（ポリジメチルシロキサン）ハイブリッド・マイクロ流体チップである。
【０３０９】
それは２つの層：PDMS層及びリフト−オフ（lift-off）によって製造された接触における伝導度測定の為の電極（ECMC：electrodes for conductivity measurement in contact）を支持するガラス基体、からなる。
【０３１０】
上記PDMS層は、頂上に、溶液注入の為のその２つの先端で２つのリザーバを有するマイクロチャンネル（2.5mmの直径）を含む。接触モードにおける伝導度測定の為の電極（ECMC：Electrodes for conductivity measurement in contact mode）は、上記マイクロチャンネルに垂直で互いに向かい合う、及び50μm幅、25μmギャップ、及び200nm厚さを有する、２つの平面の且つ小型化されたPt電極からなる。
【０３１１】
図１Ｂは、検出ゾーンに関連付けられた、接触モードにおける伝導度測定の為の電極（ECMC）の為の３対の電極１０を示す。１つのみが測定の為に使用される。
【０３１２】
電極が、2μm  1813  フォトレジスト層上にスパッタリングする（Emitech, K575）ことにより堆積された200nm  Pt層（20nmのCr層が吸着層として使用される）のリフト・オフにより調製される。上記ＰＤＳ及びガラス層は、３０秒の酸素プラズマ処理（Harrick plasma）を使用して、位置合わせされ且つ不可逆的に結合される。
【０３１３】
上記マイクロチャンネルは、幅が160μmであるマイクロチャンネルの上記中央における上記検出ゾーンを除き、5mm長、40μm高さ且つ150μm幅である。
【０３１４】
上記に記載されているように、上記検出ゾーンで上記チャンネルを局所的に拡張することは、塊形成に有意に影響を与えること無しに上記チャンネルに沿って全てで生じる上記駆動場強度を局所的に減らすことによって、ＥＣＭＣと高電圧電源（ＨＶＰＳ）との間の非干渉化を容易にする。加えて、この拡張２１はまた、上記検出ゾーンにおいてＥＣＭＣの配置を容易にする。
【０３１５】
実施例２：本発明において使用されるべき検出電子機器
【０３１６】
上記に記載されているように、ＨＶＰＳと上記検出電子装置との間の効率的な非干渉化を達成することは、全てのメインに動力を与えられた電子装置において存在する保護的な接地コンダクターを介する残余の漏れ電流の故に、容易な仕事でない。
【０３１７】
上記ＥＣＭＣを介する微細な電気的漏れ電流は電気分解を生じ得、上記マイクロチャンネル内にガス・バブルの形成を結果として生じる。
【０３１８】
例えば６個のリチウム・バッテリ（ultralife, 9V）に基づく浮動接地を備えているシステムが、図２において示されるように使用された。このシステムは、高感度を有し、全ての電子的、携帯可能な且つ簡易な装置を得る為に、３個の分離増幅器、例えばISO124P、２個の電圧制御された電流源５５、抵抗器５６の１個のブリッジ、及び１個の差分増幅器５７により電源として使用された。
【０３１９】
上記装置の測定バンド幅は、上記分離増幅器のそれによって制限される。 
【０３２０】
このシステムは、図１Ｃにおいて提供された一般的な合成スキームに従って、マイクロチップ内に埋められた電極対１０に接続されている。
【０３２１】
上記使用された検出装置は、接触における伝導度の検出の間に、電磁妨害に対するキャピラリー電気泳動の上記マイクロ流体システムの非常に高い感度を克服する為に、２つの分離技術（第１の分離技術は、分離５３、５４及び測定の増幅器を有し、電気的であり、第２の分離技術は、対称を有し、幾何学的である）を組み合わせる。
【０３２２】
上記装置は、電気泳動高電圧を有する優れた電気的デカップリング及び優れた検出感度を保証する。
【０３２３】
このシステムの詳細な各部分が以下に記載される。分離増幅器５３、５４のそれぞれは、１のゲインを有し、及び、全てのシステムが、二重電源
2015523568.tif 000003
を使用する。
【０３２４】
分離増幅器
【０３２５】
分離及び測定増幅器５３、５４が、コモン・モード干渉に対するそれらの免疫、それらの低コスト、それらの優れた線形性、それらの制限されたサイズ及びそれらの高い測定感度故に選択された。
【０３２６】
例えば、ISO124分離増幅器が使用され、それは、低周波数において160dBのコモン・モード除去比及び50kHzのバンド幅を有する。
【０３２７】
分離増幅器５３、５４の存在が、リーク電流に起因して接地ループを取り除く。
【０３２８】
前置増幅器
【０３２９】
上記検出装置入力での前置増幅器８０は、演算増幅器（OPA：operational amplifiers）OPA2132（Burr Brown）で作られている。
【０３３０】
上記処理チェーンが対称モードにおいて機能するために、前置増幅器は、調整信号振幅の正確な調整を許す。
【０３３１】
抵抗器が好ましくは、
2015523568.tif 000004
の許容量を有する。上記回路は図２Ａで与えられており、下記式が満足される：
【数１】
2015523568.tif 000005
【０３３２】
ロー・パス・フィルター（Low pass filters）
【０３３３】
上記ISO124は、約５００kHz周波数のノイズ信号を届ける。
【０３３４】
上記有用な信号のみを得る為に、およそ５０kHzのバンド幅を有する第２オーダー・ロー・パス・フィルターが、上記分離増幅器のそれぞれの上記出力に配置された。
【０３３５】
このロー・パス・フィルター８１に対応する上記回路が、図２Ｂにおいて示される。
【０３３６】
線形領域において、OPAが理想的であると仮定し、且つρ＝ｊｗであることに注目し、及び、上記ロー・パス・フィルターが下記伝達関数を有する：
【０３３７】
【数２】
2015523568.tif 000006
【０３３８】
この伝達関数Ｈは、下記カット・オフ波動を有する第２のオーダーのロー・パスフィルターの伝達関数である：
【０３３９】
【数３】
2015523568.tif 000007
【０３４０】
使用された上記装置において、カット・オフ周波数
【０３４１】
【数４】
2015523568.tif 000008
【０３４２】
は、約50kHzであった。
【０３４３】
上記ロー・パス・フィルターは、分離増幅器からリップル電圧を抑制する。
【０３４４】
オフセット制御
【０３４５】
上記処理チェーンの上記増幅器の上記オフセット電圧を最小化する為に、グローバル・オフセット制御８２が使用された。
【０３４６】
上記回路は、１に等しいゲインを有する加算非インバータＯＰＡを使用する（図２Ｃ）。
【０３４７】
【数５】
2015523568.tif 000009
【０３４８】
オフセット信号Ｖｏｆｆｓｅｔは、デバイダ・ブリッジ（divider bridge）Ｒ１、Ｒ２及びＰａ（potentiometer cursor）によって設定される。
【０３４９】
上記電位差計カーソルがＡである場合には、
【０３５０】
【数６】
2015523568.tif 000010
【０３５１】
であり、及び、それがＢである場合には、
【０３５２】
【数７】
2015523568.tif 000011
【０３５３】
であり、及び、それがＣである場合には、Ｖｏｆｆｓｅｔ＝０である。当該信号ＶＯＵＴは、入力信号ＶＩＮを有するオフセット信号の合計である。
【０３５４】
使用された上記回路において、ＶＳ２及び−ＶＳ２は、±９Ｖバッテリである。従って、上記オフセット制御の上流の上記処理チェーンのグルーバル・オフセットを＋３Ｖ〜−３Ｖで制御することが可能であり、従って高制御原動力を構成する。
【０３５５】
電圧制御された電流源（VCCS）
【０３５６】
負荷（すなわち、複数の検出器間の溶液）の上記インピーダンスは、ＣＥにおけるほとんどのバッファについて、約数十Ｍオーム（例えば、TE1Xについて、30Mオーム〜50Mオーム）であり、上記分離増幅器の上記出力インピーダンスは、低周波数において約数Ｍオームであり、及び高周波数で減少する。
【０３５７】
ソースの上記出力インピーダンスが負荷の上記インピーダンスよりも少なくとも１０倍大きいならば、当該ソースは上記負荷内に電流を適切に伝導しうる。
【０３５８】
分離増幅器、例えばISO124、は、数kHzから500kオームよりも多い負荷において電流を送りえない。
【０３５９】
従って、電圧制御された電流源５５（VCCS）が使用された。電流源は事実、外見上無限大の出力インピーダンスを有し、従って、非常に高いインピーダンス負荷において電流を送ることができる。
【０３６０】
使用される上記回路は、図２において示されており、及び、線形領域において、下記関係を満たす。
【０３６１】
【数８】
2015523568.tif 000012
【０３６２】
電圧Ｖ１（ｔ）が形状、振幅、及び周波数において設定される場合には、その結果、上記電流ｉ２（ｔ）は形状、振幅、及び周波数において設定される。
【０３６３】
従って、上記制御された電源により送られる上記電流の特性は、上記制御電圧にのみ依存する。従って、使用される上記回路において、上記２つの電源により送られる上記電流は、上記分離増幅器の制御電圧と対称である。
【０３６４】
抵抗器のブリッジ及び伝導度測定
【０３６５】
複数の検出器間の上記溶液の上記伝導度の上記測定は、入力として、制御された二重の電流源の上記出力を有する抵抗器ブリッジを介して実行される。
【０３６６】
上記抵抗器ブリッジは、電流分割の役割を果たす。当該２つのＶＣＣＳは、二極の電流生成器の役割を果たす。
【０３６７】
図２の上記等価回路は、下記である（上記抵抗器ブリッジの上記回路上流は、二極の電流生成器によりモデル化される）（図２Ｅ）。
【０３６８】
【数９】
2015523568.tif 000013
【０３６９】
を伴う、ｉ０＝ｉ１＋ｉ２
【０３７０】
負荷ＲＣＨ（複数の検出器間の溶液）終点での電圧Ｖｃｈは、下記を満たす：
【０３７１】
Ｖｃｈ＝Ｒｃｈ×ｉ１
【０３７２】
上記差分増幅器の上記出力での電圧Ｖｄｉｆｆは、下記である：
【０３７３】
Ｖｄｉｆｆ＝Ｖｃｈ×ゲイン
【０３７４】
ｉ０の特徴（形状、強度及び周波数）は、上記源により設定され、及び、上記測定の間変化しない。
【０３７５】
従って、上記負荷終点（上記複数の検出器間の溶液）での上記電圧の何らかの変動が、上記負荷の上記抵抗の上記変動（上記複数の検出器間の上記溶液の上記伝導度の変動）にリンク付けされる。
【０３７６】
我々は、上記負荷の上記インピーダンスの上記変動がまた、電流ｉ１及びｉ２の上記ゆらぎ、例えばｉ０＝ｉ１＋ｉ２＝一定、を導くことに注目することができる。
【０３７７】
負荷終点での電圧ΔＶｃｈの上記変動は、下記式を満たす：
【０３７８】
【数１０】
2015523568.tif 000014
【０３７９】
上記統合された差分増幅器は、電流ｉ１と干渉すること無しに、上記ノイズの抑制及び上記有用な信号を増幅することを許す。
【０３８０】
上記分離増幅器の上記入力は、上記差分増幅器の上記差動出力電圧である。上記分離増幅器は、解析の為に周囲のデータ取得に対する信号の送信（分離モードにおける）を保証する。上記フィルタは、上記分離増幅器の上記ゆらぎに対する内部雑音（noise inherent）を抑制する。
【０３８１】
実施例３：高圧電源（HVPS；Highvoltage power supply）
【０３８２】
この電源はまた、平衡回路である。それは例えば、コンバータEMCO  FS05CT-15（Condatas AG、スイス）によって動く、低コストの二重高電圧増幅器PA242/APEX（Farnell、フランス）に含まれる２個の高電圧増幅器からなる。当該コンバータの中心リード線が上記接地に接続され（図３）、外部場に関してシステムの安定性及びユーザ安全性を保証する。
【０３８３】
５０オーム抵抗減衰器４１が好ましくは、ＨＶＰＳを介するアライメンテーション線（５０オーム）と上記検出電子装置との間の上記インピーダンス・ミスマッチに起因する干渉を防ぐ為に、上記ＥＣＭＣと上記電子検出電子装置との間で使用される。
【０３８４】
このシステムは、実施例１において記載されているように、上記マイクロチャンネルの入口及び出口の壁において配置された刺激する電極３０に接続される。上記刺激する電極は、Ｐｔワイヤで作られうる。
【０３８５】
実施例４：ロング・レンジＰＣＲによるＤＮＡ増幅の検出の為のＤＮＡサンプルの準備
【０３８６】
ＤＮＡ配列  −  上記ＰＣＲプライマーは、位置22179〜32161に基づくＤＮＡラムダのターゲット領域についてのパール・プライマー（Perl Primer）により設計された。上記フォワード・プライマーは5’-GACCATCGGGGTAAAACCGTCTATGAC-3’（配列ＩＤ：Ｎｏ．１）であり、及び、上記リバース・プライマーは、5’-ATGACGACTTATTGCCGCTCTGTTCCC-3’（配列ＩＤ：Ｎｏ．２）である（Sigma Aldrich、フランス）。
【０３８７】
ＰＣＲプロトコル  −  ＤＮＡラムダが、lambda  cl857  Sam7  （Roche、フランス）から得られ、そして様々な濃度でDNase/RNase無しの水（Gibco、フランス）中で再構成された。当該ＰＣＲ混合物（50μl）は、１倍のロング・レンジＰＣＲバッファ（QIAGEN、フランス）、400nmolのフォワード及びリバース・プライマー、様々な量のラムダＤＮＡ、２ユニットのロング・レンジＰＣＲ酵素ミックス（QIAGEN、フランス）からなる。
【０３８８】
上記温度サイクリングは、３分間、９３℃での初期変成、引き続き２回の増幅順序に関与する。最初の１０サイクロが下記熱順序で実行される：１５秒で９３℃（変成）、３０秒で62℃（アニーリング）、そして１０分間で６８℃（伸長）。下記サイクルが設定された：１５秒で９３℃（変成）、３０秒で６２℃（アニーリング）、１０分＋（ｎ−１０）×２０秒で６８℃（伸長）、ここで、ｎは、サイクル数である。熱サイクリングが、Biometra  T-プロフェッショナル・サーモサイクラーにおいて実行された。
【０３８９】
幾つかの検証（相関測定、結果の項を参照）の為に、上記ＰＣＲ混合物からの上記生産されたＤＮＡを分離することが有用であった。その為に、我々は最初に500μlのTE（１倍）バッファにおける温度サイクリング後に、生の（raw）ＰＣＲ混合物を懸濁し、次に、１２分間、12000ｇで、100K膜（centrifugal filter，Millipore、フランス）を使用することによって、この懸濁液から10Kpb  ＤＮＡを分離した。
【０３９０】
もちろん、上記配列、ＤＮＡ源、増幅キット、サーモサイクラー及びサイクル・プロトコルは、一例に過ぎず、且つ制限するものでない。
【０３９１】
上記方法は、十分に一般的であり、且つ、多くの異なるサンプル及びキットに適用されることができる。また、本明細書で記載された実施例において、上記増幅はチップ外で実行され、次に、上記生成物が上記検出チップ内にロードされる。10kpb  ＰＣＲ反応からの10μLのＤＮＡ溶液が、上記マイクロチップの上記リザーバの１つ内に導入され、そして、圧力によって上記マイクロチャンネルを通じて流される。次に、上記リザーバ内の駆動電極を備え且つ上記検出マイクロ電極に接続された上記関連付けられた機器が、図１Ｃに従って上記マイクロチップに接続される。
【０３９２】
幾つかの他の好ましい実施態様において、上記増幅は、熱制御モジュールにおいてそのようなチップを置くことによって、チップ上で直接的に実行される。
【０３９３】
実施例５：伝導度ゆらぎ検出モードを使用して本発明に従う伝導度データの解析の例
【０３９４】
最初に、サイクル数依存Q-PCR戦略をロング・レンジＰＣＲに展開する為に本発明に従う上記方法を使用する可能性が試験された。
【０３９５】
本発明に従う上記方法を検証する為に、上記ＰＣＲがチップ外で実行され、上記生成物が、慣用的なゲル電気泳動によりチェックされ、及び、上記反応の上記生の生成物が上記マイクロ流体チップ内に注入された。
【０３９６】
図１Ｃは、セットアップの概略図を示す。10kpb  ＰＣＲ反応からの10μLのＤＮＡ溶液が、上記マイクロチップの上記リザーバの１つ内に導入され、そして、圧力によって上記マイクロチャンネルを通じて流される。
【０３９７】
次に、上記リザーバ内の駆動電極を備え且つ上記検出マイクロ電極に接続された上記関連付けられた機器が、図１Ｃに従って上記マイクロチップに接続される。
【０３９８】
ＤＮＡ塊を生成し且つモニターする為に、上記ＤＮＡ溶液が、低周波数、小さい直流電流（DC-オフセット）信号（40V/cm）を有する高電圧交流電流（AC）信号（方形波、20V/cm  最大振幅、15Hz周波数）に掛けられた。上記AC信号が、そのＤＮＡ含有物からマイクロチャンネルをあまりに早く使い果たすこと無しに最大の効率でＤＮＡ塊を生成する為に使用され、及び上記ＤＣオフセットが、一定速度で上記検出電極を横切って塊を塊を駆動し且つ上記電極領域における上記溶液を一定に新しくすることによって、モニタリングを容易にする。
【０３９９】
伝導度測定について、上記ECMC上に、電子検出装置の測定出力Ｂで１〜２Ｖ範囲の最大振幅を有する32kHzでの均衡されたAC信号（正弦波）からなる分極信号が適用された。
【０４００】
この周波数で且つ接触モードにおいて、上記インピーダンスは本質的に伝導性である。全ての電子装置はアナログ−デジタル・コンバータ・カード９１、例えばNI-USB  6380X、及びNI信号表現ソフトウェア（National Instruments、フランス）を介してコンピュータ９０によって制御された。
【０４０１】
上記サンプリング周波数は、320kサンプル／秒で設定され、及び、伝導度測定からのデータが、周波数復調の前にコンピュータ上に格納された。上記周波数復調は、NI信号表現ソフトウェアのトーン抽出関数を使用して、10Hzの有効な収集割合を与える為にフーリエ変換によって32000サンプルの各セットを処理した。下記において、この10Hz復調信号が伝導度信号として言及される。
【０４０２】
当分野において知られているように（例えばH. Isambert, et al, Physical Review Letters, 1997, 78, 971-974を参照）、溶液中のＤＮＡ塊が、バルクよりも高いイオン密度を有し、これら塊が上記検出ゾーンを横切る際に、上記伝導度信号の振幅の変化を生じる。この検出原理は、ラベル剤無しの有利点を有する。
【０４０３】
図４は、増幅の３８サイクルサイクル後に実施例４において調製された陰性（ＤＮＡなし）及び陽性（ＤＮＡターゲットあり）対照の生のＰＣＲ溶液から得られた32kHz伝導度測定の10Hz周波数復調に基づく伝導度信号の例を示す。
【０４０４】
陽性サンプル及び陰性対照の両方について、単調なベースライン・ドリフト、及び一様でない、おおざっぱな周期的なパターンを有する高周波数ノイズが観察された。これらのアーチファクトの故に、上記信号の堅牢な抽出が特定の信号処理ツールを必要とする。
【０４０５】
ウェーブレット変換に基づく解析が使用された（下記結果及び議論の項を参照）。
【０４０６】
ウェーブレット解析の手順
【０４０７】
現在の検出スキームにおいて、10Hzの伝導度信号Ｓ（ｔ）が時点ｔ∈｛０，τ０，２τ０，・・・，Ｔ＝Ｎτ０，｝＝Ωでサンプリングされ、及び、ＤＮＡ塊の流れが、トランジエント・ジャンプのランダム列として現れる（図４）。
【０４０８】
これらジャンプは、高周波数ノイズ、低周波数ベースライン・ドリフト、巨大な振幅トラジエント上に重畳される。これらの種々の成分を分離し且つ物理的に有意なもののみを維持する為に、ウェーブレット解析が使用された。上記入力信号は、関心のあるトランジエント・イベントに最も合致する適切なローカル関数パターンから生成される一組の関数（ウェーブレット・ベース）で巻き込まれた。試行錯誤によって、「bior2.2」と呼ばれる双直交のウェーブレットが選択された。このウェーブレットは、基本的なリアル分解関数Ψ（ｔ）及び再構成関数φ（ｔ）によって定義される（図５Ａ）。上記ベースが、下記の時間トランスレーション及び再スケーリングΨ（ｔ）により２Ｄセットの関数｛Ψα，δ（ｔ）｝として生成される（図５Ｂ）。
【０４０９】
【数１１】
2015523568.tif 000015
【０４１０】
ａ∈｛２ｊ｝ｊ∈Ｎ及びδ∈Ω．ａτ０は、尺度であり、しかしそれはさらに、無次元スケールａと呼ばれる。
【０４１１】
この基礎において、Ｓ（ｔ）は、個別のウェーブレット変換、すなわち下記畳み込みにより得られた一組の係数ｄｓ（ｊ、ｋ）により表される。
【０４１２】
【数１２】
2015523568.tif 000016
【０４１３】
典型的な信号について、上記分解が、図６Ａにおいて示されるように、色分けされたスペクトラムとして表され、時間（ｋ）の関数としてモード・レベル（ｊ）の観点において係数ｄｓ（ｊ、ｋ）を示す。この表現から、及び、フーリエ解析において計算されたパワースペクトラムを有する類推により、各モデルレベルについての重み２ｊ０が下記で計算される：
【０４１４】
【数１３】
2015523568.tif 000017
【０４１５】
重み関数が、ＤＮＡの有り又は無しで得られたスペクトルから計算され（図６Ａ）、次に、比較された（図６Ｂ）。ＤＮＡトランジエントは、４番目のモードレベル（Ｊ０＝３）に対応する時間スケール２３τ０で最大の信号対ノイズ比に一貫して貢献した。それ故に、当該信号は、下記によってこのスケールで再構成された。
【０４１６】
【数１４】
2015523568.tif 000018
【０４１７】
ここで、φ２ｊ、ｋτ０（ｔ）は、変換され、且つφから再スケールされる。
【０４１８】
上記再構成された信号Ｓ３（ｔ）は、ＤＮＡ塊の存在を反映することを期待される（図７Ａ）。
【０４１９】
Ｓ３（ｔ）は、ほとんどの時点で変化しないＳ３（ｔ）を残す0.002でのカット・オフで切られた。この閾値は、最大ＤＮＡ濃度（４１増幅サイクル後）で、時間平均の｜Ｓ３（ｔ）｜を超え、及び、上記関連ある伝導度ゆらぎのほとんどが、上記カット・オフよりも低いままである（図７Ｂ）。
【０４２０】
ＤＮＡの量ＱＤｎａは、
【０４２１】
【数１５】
2015523568.tif 000019
【０４２２】
の上記時間平均により相対期間において最終的に評価され、当該信号は、４番目のモード（ｊ０＝３）から再構成され、且つ0.002でカット・オフされた。同じカット・オフが、全てのサンプルに適用される。
【０４２３】
【数１６】
2015523568.tif 000020
【０４２４】
実施例６：光学的イメージング検出モード、及びイメージング検出モードと電気的検出モードとの間の比較を有する本発明の実施
【０４２５】
顕微鏡検査
【０４２６】
マクロイオンの塊は、イメージング蛍光顕微鏡検査を使用してモニターされる。
【０４２７】
上記方法を検証する為のＤＮＡ塊の独立したモニタリングを有する為に、幾つかの実験において、実施例１で準備された上記チップが、落射蛍光モードにおいて、１０倍の対物レンズ（ニコン）を有する倒立顕微鏡  Aviovert  135TV  （Zeiss）の頂上に置かれた。ＤＮＡは、実施例４において調製され、及び、引き続きSybergoldにより蛍光的にラベル付けされ、蛍光及び伝導度による同時検出を許す。１倍下での蛍光染料濃度について、伝導度検出に対する上記ラベルの有意な影響が観察されなかった。
【０４２８】
相関観察
【０４２９】
ＤＮＡ塊を選択的に検出する為の本発明の能力は、上記複数の電極間の上記ギャップにおける、上記伝導度信号、蛍光画像及びローカルな蛍光信号を同時に記録することによってテストされた。
【０４３０】
これらの実験は、ＰＣＲ混合物から以前に抽出され（実施例４を参照）、ＴＥ（１倍）内に懸濁され、そしてSybrGoldでラベル付けされた（図８）、ＰＣＲ反応からの10kpb  ＤＮＡの種々の濃度について実行された。各測定は、１３０秒の間実行され、上記信号の最初の３０分間は、上記システムがその安定な状態（典型的に、塊が、初期の均一溶液から数秒内にそれらの最大サイズ及び強度に到達する）に到達するために捨てられた。10Hz伝導度信号は、実施例５において記載された時間依存のウェーブレット解析手順に従って処理された。
【０４３１】
上記蛍光信号が、上記マイクロチャンネル外部のそれに対する上記検出ゾーンにおいて測定された上記蛍光強度の割合の時間導関数として処理された。このバッファにおいてＤＮＡ塊を生成する為の濃度閾値は、200ng/μlであった。良好な相関が、塊の外観、上記処理された蛍光信号、及び上記処理された伝導度信号の間で観察された。
【０４３２】
図８において与えられた上記画像の２次元ウェーブレット解析がまた、２次元ウェーブレットの現在一組であるウェーブレットベースを除いて、実施例５において記載されたように上記同じウェーブレット解析を使用して処理されることができる。
【０４３３】
実施例７：ラベル剤無しの量的なロング・レンジＰＣＲを実施する為の本発明の使用
【０４３４】
ＰＣＲにおいて、ｎサイクル後のＤＮＡの濃度は、ターゲットＤＮＡの量に及びサイクルｎの数に依存する。固定値ｎについて初期のＤＮＡ量で直線的に増加することが予想される。ｎの関数として、この量は、最初の相において指数的に増加し（対数期と呼ぶ）、次に、上記初期のＤＮＡの濃度と独立的に有限値を飽和することが予想される。
【０４３５】
定量ＰＣＲ（qPCR）において、ＤＮＡ濃度のプロットの変曲点対サイクルの数（又は、幾つかの他の処理アルゴリズムについて、上記強度が所定の閾値に到達する時点）が、上記初期ＤＮＡ濃度を定量化する為の信頼する様式と見なされる。
【０４３６】
上記検出方法の上記感度は、それをロング・レンジＰＣＲ増幅生成物の定量化に適用することによって評価された。実施例４において記載された上記プロトコルに従い調製され、ロング・レンジＰＣＲ反応からの10kbpＤＮＡ溶液が、上記ＰＣＲ混合物からの分離無しに且つラベル剤無しにロードされた。様々な混合物が、ＤＮＡラムダの種々の初期量（0〜2.5ngまで）及び増幅サイクルの種々の数（0〜41サイクル）で調製された。各測定の総持続時間は、530秒であった。
【０４３７】
ＤＮＡ増幅が、ウェーブレット解析により定量化された（図９Ａ）。10fg/μlよりも多いＤＮＡを初期に含む全てのサンプルについて、ＤＮＡの量ＱＤｎａ（実施例５を参照）は、サイクル数を有意に増加し、本発明の方法の検出の制限（ＬＯＤ：limit of detection）が初期ＤＮＡの10〜100fg/μlにあることを示す。
【０４３８】
この検出感度は、上記同じサンプル上で対照として実行されるゲル電気泳動に引き続く蛍光検出によって得られたそれよりも約一桁大きく良い（図９Ｂ）。
【０４３９】
追加的に、上記チップ中の溶液の全容積は、ＰＣＲ生成物の上記初期50μlからの1μlのみである。従って、上記チップ中のＰＣＲの完全統合とともに、これが100ラムダＤＮＡコピーよりも少ない生成物に対応する故に、この技術は初期ＤＮＡの数fgの感度を容易に生成するべきである。
【０４４０】
上記曲線の上記変曲点はまた、サイクルのより少ない数に向かってシフトし、本発明は定量ロング・レンジＰＣＲを実行する為に使用されることができること、定量ＰＣＲは小さい、典型的に1000kbpよりも小さい、フラグメントでのみ実行される従来技術の蛍光方法で可能でない達成を示す。
【０４４１】
実施例８：分枝ＲＣＡによるＤＮＡの等温性増幅と併用しての本発明の使用
【０４４２】
本発明は特に、等温核酸増幅方法と併用して有利である。なぜならば、第１に上記方法は、マイクロチャンネル又はマイクロチャンバーにおいて実行することが容易であり、温度サイクリングを要求しないからであり、及び、なぜならば第２にこれらの方法の幾つかは、短いテンプレートから開始する場合でさえ、巨大なＤＮＡ生成物を自然にもたらし、従って、本発明の応用の範囲を拡張する。
【０４４３】
ここでは、我々は、例えばNilsson  et  al.,  Nucleic  Acids  Research,  vol.  30,  no.  14  e66,  pp.  1-7,  2002に記載されているような、分岐ローリング・サークル増幅（RCA）でこれを示す。
【０４４４】
上記方法の原理は、当分野に知られており、且つ、図１０Ａによって要約されることが出来る。ターゲットＤＮＡ（ライゲーション・テンプレート）が、線形の「パドロック・プローブ」の存在下に置かれており、その末端は、上記ライゲーション・テンプレートの２つの側に個々に相補的である。第１の段階において、上記２つのＤＮＡがハイブリダイズし、十分に対をなす二重ＤＮＡの部分を生成し、及び、上記パドロック・プローブが、リガーゼによって環状化される。本明細書において使用されるパドロック・プローブ及びライゲーション・テンプレートの例が、図１０Ｂにおいて示されている。
【０４４５】
パドロック・プローブ（200nM）が、600nM  ライゲーション・テンプレートの存在下において、３７℃で３０分間、10mM  トリスアセテート（Tris-acetate）バッファ  pH7.5、10mM酢酸マグネシウム50mM、1mM  ATP、1μgμl  BSA、及び0.2  U/μl  T4  DNAリガーゼ（Ameresham Pharmacia Uppsala、スウェーデン）中でライゲーションされた。
【０４４６】
次に、上記環状化ＤＮＡは、ユニバーサル・プライマー（ランダム・プライミング）を有するPhi29ポリメラーゼを使用して増幅された。この増幅は、上記キットkIllustraTempliphi（GE Healthcare life sciences）及びこのキットで配布されたプロトコルを使用して実行された。
【０４４７】
上記キットは、サンプル・バッファー、反応バッファ、及び酵素混合物を含む。上記サンプル・バッファはランダム・プライマーを含み、上記反応バッファは、塩及びバッファ及びデオキシヌクレオチドを含む。
【０４４８】
簡潔には、上記入力ＤＮＡサンプル0.5μlが、5μlのサンプル・バッファに添加され、そして当該混合物が９５℃で３分間加熱される（活性化相）。冷却後。この混合物は、５μｌの反応バッファで再び混合され、そして、３０℃で４時間、インキュベーションされた（増幅相）。
【０４４９】
このキットの操作の上記原理は、図１０Ｃにおいて例示化されており、それは巨大な且つ分岐ＤＮＡ生成物をどのように生成するかを示す。
【０４５０】
対照として、生成物のアリコート（aliquot）が電気泳動ゲル上にロードされ、そして分離された（図１１Ａ）。対照が左側（テンプレート無しに実行された）、サイズ参照1kbラダー（中央）、及び陽性反応生成物（右側）である上記。右のレーンにおいて、上記バンドが、上記ローディング・ウェル中に残り、ほとんどの巨大なＤＮＡ（上記ラダー中の上記ＤＮＡよりもはるかに大きい）は、上記反応において成功裡に生成される。
【０４５１】
次に、上記増幅生成物の他のアリコットが、実施例１に従い調製されたマイクロチャンネル内にロードされ、実施例４において使用されたそれに類似する刺激する場に掛けられる。上記場により誘発される濃度の上記ゆらぎは、実施例６において記載された上記イメージング・モードにおいて、時間の関数として記録される。上記観察領域において異種の光強度の当該記録された画像（図１１Ｂ）は１５〜３０秒の時間内における様子を示し、塊の存在、及び等温増幅に引き続く本発明の成功裡の操作を示す。図１１Ｂにおける４番目のパネルは、ＤＮＡが上記チャンネルから使い果たされる場合に、一様な且つ暗いバックグラウンドが回復されることを示す。
【０４５２】
他の実施態様において、上記反応は、直接の伝導度読み込みによる上記増幅を検出する為に、上記電極を含む上記マイクロチャンネルにおいて等温的に直接的に実行され、引き続き、実施例５において見られるような同じプロトコルが実行されうる。
【０４５３】
実施例９：無機イオン検出への応用
【０４５４】
チップ構造
【０４５５】
上記マイクロチップは、ガラス/PDMS（ポリジメチルシロキサン）ハイブリッドであり且つ２つの層からなる。上記PDMS層は、頂上で、溶液注入の為のその２つの先端で２つのリザーバ（2.5mmの直径）を有するマイクロチャンネルを備えている。接触モードにおける伝導度測定の為の電極は、上記マイクロチャンネルに垂直に互いに向かい合う、50μm幅、25μmギャップ、及び200nm厚さを有する２つの平面のPt電極からなる。電極が、2μm  1813フォトレジスト層上にスパッタリングする（Emitech，K575）ことにより堆積された200nm  Pt層（20nm  Cr層が接着層として使用される）のリフト・オフにより調製される。上記ＰＤＳ及ガラス相は、３０秒の酸素プラズマ処理（Harrick plasma）を使用して、位置合わせされ且つ不可逆的に結合される。上記マイクロチャンネルは、幅が160μmである上記検出ゾーンを除き、40μm高さ且つ150μm幅である。他のマイクロチップ寸法は、図１２において報告される。蛍光及び伝導度検出についての両方の有効長は、2cmである。
【０４５６】
検出電子機器
【０４５７】
図１Ｃに関連して記載された上記システムは、高感度を有し、全ての電子的、携帯可能な且つ簡易な装置を得る為に、６個のリチウムバッテリー（ultralife，9V）に基づく浮動接地、３個の低コスト分離増幅器ISO124Pによる電源、２個の電圧制御された電流源、抵抗の１個のブリッジ、及び１個の差分増幅器で使用された。上記装置の上記測定バンド幅が、上記分離増幅器のそれ（すなわち、50kHz）により制限される。
【０４５８】
高圧電源
【０４５９】
実施例３において見られる同じ電源が使用された。
【０４６０】
異なる動電モードが実行され、このHVPSを使用して施与された電圧が図１２において報告される。
【０４６１】
バックグラウンド電解液（BGE；Background Electrolyte）
【０４６２】
バックグラウンド電解液は、MES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)/His(ヒスチジン)バッファからなる。
【０４６３】
サンプル：トリス(2.2’-Ru(bipy)32+リジル)ジクロロルテニウム(II)（Tris(2.2’-Ru(bipy)32+ridyl)dichlororuthenium(II)：下記構造を参照）は、それが伝導度測定により並びに蛍光（FITCフィルタ）により検出されることができるようにモデル化合物として最初に使用された。
【０４６４】
【化１】
2015523568.tif 000021
【０４６５】
トリス(2.2’-Ru(bipy)32+リジル)ジクロロルテニウム(II)構造
【０４６６】
RuBiPyは、それが伝導度測定及び蛍光の検出により検出されることができるようにモデル化合物として最初に使用された。
【０４６７】
ローディング及び分離の両方について施与される上記電圧が、図１２において報告される。これらの実験は、その疑似の等電特性故にそれが低い伝導度バッファであるようにMES/Hisバッファ中で実行された。
【０４６８】
蛍光及び伝導度測定の検出で達成された感度を比較する為に、Rubipyの異なる濃度が50μM（図１３Ｂ）〜1mM（図１３Ａ）の範囲で注入された。
【０４６９】
これらの結果は、このモデル陽イオンの低電気泳動移動度にもかかわらず、上記信号対ノイズ比が、蛍光検出でのものよりも伝導度測定による検出を使用して１０倍高いことを、低いサンプル濃度で示した。
【０４７０】
その後、関心のある無機の陽イオン、Ｋ＋、が、20μMで個々に最初に注入され（図１４）、そして、上記サンプルを上記バッファにより置換する場合のブランクと比較された。
【０４７１】
この低濃度においてさえ、上記信号対ノイズ比は、本発明に従う方法で非常に高く、従って、我々はそのような無機陽イオンについて低い感度を予期する。
【０４７２】
実施例１０：ウェーブレット解析による伝導度測定法信号処理
【０４７３】
図１５Ａは、上記検出モジュールから取得された原信号の及びウェーブレット解析による処理後に取得された上記対応する信号の比較を示す。上記信号は、レベル４ウェーブレットにより処理された（0.8秒の時間的サポート）。
【０４７４】
1.842Vのオフセットは、原信号と同じレベルで表示されるようにする為に、それに対して上記処理された信号に追加された。上記原信号は、69μg/mlでラムダ−ＤＮＡ溶液（5kbp）から得られた塊の検出後に取得された。
【０４７５】
電気的パラメータは下記の通りであった：
刺激する電圧:  440V/cm
刺激する電圧の周波数:  15Hz
媒体伝導度:  約50mS/m
【０４７６】
実施例１１：蛍光信号と伝導度測定法信号との間の相関
【０４７７】
図１５Ｂは、レベル４ウェーブレットにより処理された蛍光信号と伝導度測定法信号との間の相関を示す。当該ユニットは、任意である。
【０４７８】
上記信号は、インキュベーションの３０分で分岐ＲＣＡ溶液から得られた塊の検出から得られた。上記ＤＮＡは、0.25倍濃度でSyBrグリーンを添加することにより蛍光にされた。
【０４７９】
電気的パラメータは下記の通りであった：
刺激する電圧:  440V/cm
刺激する電圧の周波数:  10Hz
媒体伝導度：  500mS/mよりも多く、又は100mS/mよりも少ない。
【０４８０】
図１５Ｂの為に使用されるバッファは、下記に詳述される実施例１２の第２の緩衝液である。
【０４８１】
実施例１２：緩衝液
【０４８２】
下記詳細な組成物を有する緩衝液は、本発明に従う方法を実行することを考慮して、ＨＲＣＡ増幅方法において使用されることが出来る。
【０４８３】
第１の緩衝液は、20μLについて、
ロング・レンジPCR酵素ミックス  １０倍（QIAGEN）：  1.75μL、及び、
精製水：18.25μL
を含む。
【０４８４】
上記第１の緩衝液は、下記詳細な濃度で下記成分をさらに含む：
ウシ血清アルブミン（BSA） ：  0.1mg/mL、
トリスHCl：  6mM、
MgCl2：  1.25mM、
(NH4)2SO4：  1.25mM、及び
ジチオスレイトール(DTT)：  0.5 mM
【０４８５】
第２の緩衝液は、20μLについて、
ロング・レンジPCR酵素ミックス  １０倍（QIAGEN）：  2μL、及び
精製水：  18.25μL
を含む。
【０４８６】
上記第２の緩衝液は、0.1mmg/mLの濃度で、ウシ血清アルブミン（BSA）をさらに含む。
【０４８７】
上記第１の緩衝液は、630mS/mよりも多く又は100mS/mよりも少ない伝導度を有し、及び、好ましい実施態様に対応する。第２の緩衝液は、400mS/mよりも多く又は100mS/mよりも少ない伝導度を有する。
【０４８８】
実施例１３：ＨＲＣＡによるＤＮＡの増幅と併用しての本発明の使用
【０４８９】
この実施例において、上記検出マイクロ流体チップの外側で、エクス・シチュー（exsitu）で得られたＨＲＣＡ生成物の検出の試験が報告される。
【０４９０】
オフ・チップＨＲＣＡの為に使用されるプロトコルが、下記において詳述される。
【０４９１】
ＨＲＣＡプロトコル
【０４９２】
Nilsson（M.  Nilsson,  M.  Gullberg,  F.  Dahl,  K.  Szuhai,  and  A.  K.  Raap.  Real-time  monitoring  of  rolling-circle  amplification  using  a  modified  molecular  beacon  design,  Nucleic  Acids  Research,  vol.  30,  no.  14  e66,  pp.  1-7,  2002）の環状化プロトコルが実行された。陽性対照として、我々は、上記ターゲット及び下記に記載される配列を有するプローブ（Eurogentec,  Belgiumによって提供された）を採用した。陰性対照として、上記ターゲットは、上記環状化反応の上記バッファにより置換された。
プローブ（ppWT）：P-CTGCCATCTTAACAAACCCTTTCCTCTATGATTACTGACCTACGACCTCAATGCTGCTGCTGTACTACTCTTCTATGCGATTACCGGGCT
【０４９３】
ターゲット（tWT）：GTTTGTTAAGATGGCAGAGCCCGGTAATCG
【０４９４】
上記プローブ（200nM）が、600nMのライゲーション・テンプレートで、３０分間、３７℃で、10mM  トリスアセテート  pH7.5、10mM  酢酸マグネシウム、50mM  塩化ナトリウム、1mM  ATP、1μg/μl  BSA、及び0.2U/μl  T4  DNAリガーゼ（Amersham Pharmacia  Biotech,  Uppsala,  スウェーデン）中でリガチュレートされた（ligaturated）。
【０４９５】
上記増幅は、ランダム・プライマー（ランダム・ヘキサマー）を有するPhi29ポリメラーゼを使用し、且つ、先行の工程で得られた環状ＤＮＡを入力として採用する。この増幅は、増幅キットIllustra Templiphi（GE-Healthcare Life sciences）を使用して実行され、及び、分岐二重鎖ＤＮＡを得ることを許す。上記増幅キットは、サンプル・バッファ、反応バッファ、及び酵素混合物を含む。上記反応バッファは、塩、デオキシヌクレオチドを含み、ＤＮＡ合成の為に都合の良いｐＨに調整され、及び、0.02mg/mLの最終濃度でランダム・プライマーを含む。
【０４９６】
非常に簡単には、入力ＤＮＡの0.5μlの容量がサンプル・バッファの5μlに添加され、そして結果として得られた容量が、二重鎖ＤＮＡの変性を得る為に、３分間、９５℃で加熱された。一旦冷やされたこの容量が、5μlの反応バッファと混合され、そして当該混合物が異なる持続時間（１０分〜２時間と変わる）の間、３０℃でインキュベーションされた。上記反応は、サーモサイクラー中で行われ、そして当該酵素は、当該反応の終わりに６５℃で不活性化された。
【０４９７】
最初の実験において、1,7S/mの伝導度を有する食塩バッファが、塊にされるべきＤＮＡを含む液体媒体中で使用された。これは、本発明に従う検出方法の正確さを減少させる刺激する電極の周りで電気分解現象をもたらした。
【０４９８】
しかしながら、ロング−レンジＰＣＲバッファ（Qiagen）及び0.1mg/mlでのBSAからなる本発明に従う緩衝液（上記実施例１２の第２のバッファ溶液に対応する）の使用は、増幅効率に影響を与えること無しに、0,25S/mまで溶液の伝導度の減少をもたらした。このバッファは、刺激する電極の周りに電気分解現象を生成すること無しに不安定の生成を許す（図１６Ａ及び図１６Ｂ）。
【０４９９】
小さい塊は、増幅の１５分から可視可能である。それらは、およそ３０分で最適なサイズに到達する。
【０５００】
ウェーブレット・モード３及び４を用いて、３０分よりも多い増幅持続時間後に得られたＨＲＣＡ生成物の塊の存在を検出することが可能である（図１７）。上記検出は、ＨＲＣＡ生成物の上記塊がそれらの増幅バッファ中に存在していた間に実行された。誤差バーは、行われた測定の標準偏差に対応する。
【０５０１】
パラメータＱはウェーブレット解析後に得られた再構成信号の時間平均に対応し、及び、このパラメータは、上記装置におけるＤＮＡ濃度の量測定をする為に使用されることができる。
【０５０２】
上記測定は、２０分のインキュベーション後に、上記測定された信号の明かな増加を伴う量的である。
【０５０３】
実施例１４：複数の検出ゾーンの使用
【０５０４】
図１８は、マイクロチャンネル２０が縦軸Ｘに沿って延在し、複数の検出ゾーン100a、100b及び100cが当該縦軸Ｘに沿って続くところの本発明の実施態様を示す。
【０５０５】
電極10a、10b及び10cの組が、上記液体媒体中の核酸の濃度に依存する電気的変数の当該液体媒体内のゆらぎを測定する為に、検出ゾーン100a、100b及び100cのそれぞれに存在する。
【０５０６】
検出ゾーン100a、100b及び100cのそれぞれは、種々の化合物110a、110b及び110cを含み、当該化合物は例えば、検出されるべき核酸のヌクレオチドの種々の配列と相互に作用することが可能なプライマーである。
【０５０７】
化合物110a、110b及び110cは、マイクロチャンネル２０の壁に及び／又は入力チャンネル22a、22b及び22cの壁に及び／又は出力チャンネル23a、23b及び23cの壁に結合され、例えば固定されることができる。
【０５０８】
交流の電場が、検出の為に適切な持続時間の間に、マクロイオンを検出ゾーンに滞在させるために施与されることができる。
【０５０９】
図１９は、検出ゾーン100a、100b、及び100cが、流体路中に存在しない異なるサブチャンネル20a、20b、及び20cにおいて存在する変形を示す。
【０５１０】
表現「を（一つ）を含む」は、「を少なくとも一つ含む」として理解されるべきである。
【０５１１】
表現「・・・〜・・・を含む」は、両終端が含まれることを理解されるべきである。
【０５１２】
表現「を含む」は「を少なくとも含む」として理解されるべきである。
【図１Ａ】
2015523568.tif 000022
【図１Ｂ】
2015523568.tif 000023
【図１Ｃ】
2015523568.tif 000024
【図２】
2015523568.tif 000025
【図２Ａ】
2015523568.tif 000026
【図２Ｂ】
2015523568.tif 000027
【図２Ｃ】
2015523568.tif 000028
【図２Ｄ】
2015523568.tif 000029
【図２Ｅ】
2015523568.tif 000030
【図３】
2015523568.tif 000031
【図４】
2015523568.tif 000032
【図５】
2015523568.tif 000033
【図６】
2015523568.tif 000034
【図７】
2015523568.tif 000035
【図８】
2015523568.tif 000036
【図９Ａ】
2015523568.tif 000037
【図９Ｂ】
2015523568.tif 000038
【図９Ｃ】
2015523568.tif 000039
【図１０Ａ】
2015523568.tif 000040
【図１０Ｂ】
2015523568.tif 000041
【図１０Ｃ】
2015523568.tif 000042
【図１１Ａ】
2015523568.tif 000043
【図１１Ｂ】
2015523568.tif 000044
【図１２】
2015523568.tif 000045
【図１３】
2015523568.tif 000046
【図１４】
2015523568.tif 000047
【図１５Ａ】
2015523568.tif 000048
【図１５Ｂ】
2015523568.tif 000049
【図１６Ａ】
2015523568.tif 000050
【図１６Ｂ】
2015523568.tif 000051
【図１７】
2015523568.tif 000052
【図１８】
2015523568.tif 000053
【図１９】
2015523568.tif 000054
【配列表】
2015523568000001.app
【国際調査報告】
2015523568.tif 000055
2015523568.tif 000056
2015523568.tif 000057
2015523568.tif 000058