(57)【要約】  本発明は、血液を運ぶための体外血液循環系（１０２、２０２、３０２、４０２、５０２、６０２、７０２）と、血漿を運ぶための濾液循環系（１０５、２０５、３０５、４０５、５０５、６０５、７０５）と、コントローラ（１１０、２１０、３１０、４１０、５１０、６１０、７１０）とを備えた体外灌流装置（１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００）に関する。濾液循環系（１０５、２０５、…、７０５）はフィルタ（１０４、２０４、３０４、４０４、５０４、６０４、７０４）を用いて体外血液循環系（１０２、２０２、…、７０２）に接続され、フィルタ（１０４、２０４、…、７０４）は３４０，０００ｇ／モルのモル質量（３４０ｋＤａの相対分子質量）を有する物質に対し５％のふるい係数を有し、濾液循環系（１０５、２０５、…、７０５）には、中性の疎水性表面を有する第１担体（１０７ａ、２０７ａ、３０７ａ、４０７ａ、５０７ａ、６０７ａ、７０７ａ）を含む枯渇剤（１０７、２０７、３０７、４０７、５０７、６０７、７０７）が配置され。灌流装置はエンドトキシン結合リポペプチドを体外血液循環系（１０２、２０２、…、７０２）に供給するための分注手段（１０７、２０７、３０８、４０８、５０８、６０７、７０８）を備え、エンドトキシン結合リポペプチドはポリミキシン、ポリミキシン誘導体、それらのプロドラッグ、およびそれらの組合せから成る群から選択される。【選択図】  図１および図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液を運ぶための体外血液回路（１０２、２０２、３０２、４０２、５０２、６０２、７０２）と、
血漿を運ぶための濾液回路（１０５、２０５、３０５、４０５、５０５、６０５、７０５）と、
コントローラ（１１０、２１０、３１０、４１０、５１０、６１０、７１０）と、を備え、
前記濾液回路（１０５、２０５、…、７０５）がフィルタ（１０４、２０４、３０４、４０４、５０４、６０４、７０４）を用いて体外血液回路（１０２、２０２、…、７０２）に接続され、前記フィルタ（１０４、２０４、…、７０４）が３４００００ｇ／モルのモル質量（３４０ｋＤａの相対分子質量）を有する物質に対して５％のふるい係数を有し、かつ中性の疎水性表面を有する第１担体（１０７ａ、２０７ａ、３０７ａ、４０７ａ、５０７ａ、６０７ａ、７０７ａ）を含む枯渇剤（１０７、２０７、３０７、４０７、５０７、６０７、７０７）が前記濾液回路（１０５、２０５、…、７０５）に配置されて成る、体外灌流装置（１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００）であって、
前記灌流装置は、エンドトキシン結合リポペプチドを前記体外血液回路（１０２、２０２、…、７０２）に供給するための分注手段（１０７、２０７、３０８、４０８、５０８、６０７、７０８）を備え、前記エンドトキシン結合リポペプチドは、ポリミキシン、ポリミキシン誘導体、それらのプロドラッグ、およびそれらの組合せから成る群から選択されることを特徴とする、体外灌流装置。
【請求項２】
前記エンドトキシン結合リポペプチドは、ポリミキシンＢ、コリスチン、およびそれらのプロドラッグから成る群から選択されるポリミキシンであることを特徴とする、請求項１に記載の体外灌流装置。
【請求項３】
前記枯渇剤（１０７、２０７、６０７）は前記エンドトキシン結合リポペプチドを供給するための分注手段（１０７、２０７、６０７）を含み、前記第１担体（１０７ａ、２０７ａ、６０７ａ）の表面は、前記エンドトキシン結合リポペプチドから形成される吸着性コーティングを有することを特徴とする、請求項１または２に記載の体外灌流装置（１００、２００、６００）。
【請求項４】
前記エンドトキシン結合リポペプチドを供給するための分注手段（５０８）は前記枯渇剤（５０７）の下流で前記濾液回路（５０５）に配置され、前記分注手段（５０８）は中性の疎水性表面を有する第２担体（５０８ａ）を含み、前記第２担体（５０８ａ）の表面は前記エンドトキシン結合リポペプチドから形成された吸着性コーティングを有することを特徴とする、請求項１または２に記載の体外灌流装置（５００）。
【請求項５】
前記第１または第２担体（１０７ａ、２０７ａ、５０８ａ、６０７ａ）の表面に吸着された前記エンドトキシン結合リポペプチドは、リポペプチドが供給されたときに０．０１μｇ／ｍｌから０．８μｇ／ｍｌのリポペプチド血清中濃度をもたらす量が存在することを特徴とする、請求項３または４に記載の体外灌流装置（１００、２００、５００、６００）。
【請求項６】
前記第１または第２担体（１０７ａ、２０７ａ、５０８ａ、６０７ａ）は１００から１５００ｍ2／ｇの全表面を有し、前記全担体表面に関連して５０から２０００ｍｇのエンドトキシン結合リポペプチドが前記第１または第２担体（１０７ａ、２０７ａ、５０８ａ、６０７ａ）の表面に吸着結合されることを特徴とする、請求項３または４に記載の体外灌流装置（１００、２００、５００、６００）。
【請求項７】
前記エンドトキシン結合リポペプチドを供給するための分注手段（３０８、４０８）は、前記体外血液回路（３０２、４０２）に関連するリポペプチド供給ポイント（３１３、４１３）で前記エンドトキシン結合リポペプチドを前記体外血液回路（３０２、４０２）に供給するための投与装置（３０８、４０８）を含むことを特徴とする、請求項１または２に記載の体外灌流装置（３００、４００）。
【請求項８】
前記リポペプチド供給ポイント（３１３、４１３）は前記フィルタ（３０４、４０４）の下流で前記体外血液回路（３０２、４０２）に配置されることを特徴とする、請求項７に記載の体外灌流装置（３００、４００）。
【請求項９】
前記フィルタの下流で前記体外血液回路に透析器が配置され、前記リポペプチド供給ポイントは前記透析器の下流で体外血液回路に配置されることを特徴とする、請求項８に記載の体外灌流装置。
【請求項１０】
前記エンドトキシン結合リポペプチドの濃度を測定するための測定手段（３１４、４１４）が前記フィルタ（３０４、４０４）または前記透析器の下流および前記リポペプチド供給ポイント（３１３、４１３）の上流に配置されることを特徴とする、請求項８または９に記載の体外灌流装置（３００、４００）。
【請求項１１】
前記灌流装置の前記コントローラ（３１０、４１０）は、前記体外血液回路（３０２、４０２）内を運ばれる血液に前記リポペプチドが投与されるときに、身体のリポペプチドクリアランス、前記枯渇剤（３０７、４０７）のリポペプチドクリアランス、および／または前記透析器のリポペプチドクリアランスを考慮するように構成されることを特徴とする、請求項７ないし１０の一項に記載の体外灌流装置（３００、４００）。
【請求項１２】
前記エンドトキシン結合リポペプチドを供給するための分注手段は、前記フィルタ（７０４）の下流で前記体外血液回路（７０２）に配置された透析器（７０８）を含み、前記透析器は、前記透析器（７０８）を介して運ばれる透析液を用いて前記エンドトキシン結合リポペプチドを前記体外血液回路（７０２）に供給するように構成されることを特徴とする、請求項１または２に記載の体外灌流装置（７００）。
【請求項１３】
前記第１および第２担体（１０７ａ、２０７ａ、３０７ａ、４０７ａ、５０７ａ、５０８ａ、６０７ａ、７０７ａ）は中性の好ましくは合成ポリマから形成されることを特徴とする、請求項１ないし１２の一項に記載の体外灌流装置。
【請求項１４】
前記ポリマは、架橋ポリスチレンポリマまたは架橋エチレンジビニルベンゼンポリマ、好ましくはポリスチレンジビニルベンゼンコポリマまたはエチルビニルベンゼンジビニルベンゼンコポリマから選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の体外灌流装置。
【請求項１５】
前記第１または第２担体（１０７ａ、２０７ａ、３０７ａ、４０７ａ、５０７ａ、５０８ａ、６０７ａ、７０７ａ）は多孔性であり、１００ｎｍ以下の平均細孔径を有することを特徴とする、請求項１ないし１４の一項に記載の体外灌流装置。
【請求項１６】
前記第１または第２担体（１０７ａ、２０７ａ、３０７ａ、４０７ａ、５０７ａ、５０８ａ、６０７ａ、７０７ａ）は２０ｎｍ以下の平均細孔径または８０から１００ｎｍの平均細孔径を有することを特徴とする、請求項１５に記載の体外灌流装置。
【請求項１７】
前記第１または第２担体（１０７ａ、２０７ａ、３０７ａ、４０７ａ、５０７ａ、５０８ａ、６０７ａ、７０７ａ）は繊維様または粒子状であることを特徴とする、請求項１ないし１６の一項に記載の体外灌流装置。
【請求項１８】
前記第１または第２担体（１０７ａ、２０７ａ、３０７ａ、４０７ａ、５０７ａ、５０８ａ、６０７ａ、７０７ａ）は、３００μｍ以下の平均粒径を有する微粒子の形状を有することを特徴とする、請求項１７に記載の体外灌流装置。
【請求項１９】
前記第１担体（１０７ａ、２０７ａ、３０７ａ、４０７ａ、５０７ａ、６０７ａ、７０７ａ）は、１０から２０ｎｍまたは８０から１００ｎｍの平均細孔径および７５から１５０μｍの平均粒径、好ましくは１１０から１３０μｍの平均粒径、理想的には１２０μｍの平均粒径を有することを特徴とする、請求項１８に記載の体外灌流装置。
【請求項２０】
前記濾液回路（６０５）は前記フィルタ（６０４）に通じていること、および前記第１担体（６０７ａ）は微粒子の形状を有し、かつ前記濾液回路（６０５）はこれらの微粒子の懸濁液を含み、前記微粒子は２０μｍ以下の平均粒径、好ましくは８μｍ以下の平均粒径、理想的には５μｍ以下の平均粒径を有することを特徴とする、請求項３、７、または１２に記載の体外灌流装置（６００）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液を運搬するための体外血液回路と、血漿を運搬するための濾液回路と、制御器とを備えた体外灌流装置であって、濾液回路はフィルタを用いて体外血液回路に接続され、フィルタは３４００００ｇ／モルのモル質量（３４０ｋＤａの相対分子質量）を有する物質に対し５％のふるい係数を有し、かつ中性の疎水性表面を有する第１担体を含む枯渇剤が濾液回路に配置された、体外灌流装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
敗血症および関連する合併症は、ヒトの罹病率および死亡率に少なからず寄与している。多くの場合、高濃度のエンドトキシンが身体を冒し、全身作用をもたらすときに、敗血症はグラム陰性細菌の感染に起因すると考えることができる。
【０００３】
エンドトキシンはグラム陰性細菌の細胞壁のリポ多糖類（ＬＰＳ）であり、細胞溶解および細胞分裂によって放出される。実際、リポ多糖類はグラム陰性細菌の外側細胞膜の最も一般的脂質成分である。エンドトキシンは発熱物質であり、感染者は、例えば微生物中毒の経過中にエンドトキシンが体内に侵入すると、強い炎症反応および発熱で反応し、重要なメディエータとして、単核食細胞系の非制御活性化を引き起こす。内毒血症の結果、血液回路にエンドトキシンが蓄積し、免疫細胞の非制御活性化および凝固系の不均衡を導く。これは、とりわけ高熱、低血圧、および重篤な場合には多臓器不全を特徴とする敗血症を導くことがあり得る。敗血症は非常に深刻に受け止められる状態であり、重症敗血症または敗血症性ショックの患者の致死率は、状態の重症度によって約３０〜６０％である。グラム陰性細菌の感染の結果としての内毒血症は、全身性炎症反応（「全身性炎症反応症候群」、ＳＩＲＳ）、敗血症、重症敗血症、または敗血症性ショック、および結果的重症合併症の発症の最も一般的な原因の１つである。肝臓病患者または化学療法患者のような免疫防御が危険にさらされた患者は、細菌感染症にかかり易く、そうするとエンドトキシン中毒の症状を示す。
【０００４】
内毒血症はまた、急性肝不全、または慢性肝不全による急性代償不全の場合にも発生することがあり、そうすると結果的に（生化学的観点から）敗血症に非常によく似た状態を発症する。例として、急性代償不全は慢性肝不全の患者に発生することがある。この状態で、正常な腸管内細菌叢に由来するエンドトキシンは腸管バリアを通過し、体内の炎症メディエータの放出を刺激し、したがって敗血症様状態を引き起こす。
【０００５】
さらに、敗血症状態はグラム陽性細菌、ウィルス、および真菌によっても誘発されることがあり得る。
【０００６】
上述の通り、免疫細胞の非制御活性化および凝固系の不均衡は、敗血症および他の重篤な状態の場合に発生することが一般的に知られている。単核食細胞系の非制御活性化は、炎症メディエータ、特にサイトカインの過剰な放出（サイトカインストームまたは高サイトカイン血症とも呼ばれる）を刺激する。サイトカインは敗血症および敗血症性ショックの場合の重要なメディエータである。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ‐α、しばしば単にＴＮＦとも呼ばれる）およびインターロイキン‐１β（ＩＬ‐１β）は、最も重要な炎症促進性サイトカインの例として挙げることができる。さらなる重要な炎症促進性サイトカインはＩＬ？６およびＩＬ‐８を含む。最初に放出されるサイトカインＴＮＦ‐αは、メディエータカスケードを介して生物学的シグナル増幅を誘発し、こうして結果的に、生物学的均衡の重篤な破壊ならびにそれに続く循環虚脱および多臓器不全を含む生理学的変化を引き起こす。敗血症の臨床像は重要なメディエータＴＮＦ‐αの高い血中濃度に相関するだけでなく、例えば炎症促進期のＩＬ‐１β、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐８のような、あるいは炎症促進性メディエータがサイトカインを含めて非常に低濃度になる抗炎症期の発生によるＩＬ‐１０またはＩＬ‐１３のような他のサイトカインの高い血中濃度にも相関する。さらに、慢性炎症性腸疾患、乾癬、およびリウマチ性関節炎のような他の重篤な状態もまた、過度のＴＮＦ‐αの放出に関連付けられる。
【０００７】
標準として適用される集中治療に加えて、抗生物質または副腎皮質ステロイド、免疫グロブリン、および特に循環補助剤もまた、敗血症の治療に使用される。
【０００８】
抗生物質治療の不利点は抗生物質耐性菌の蔓延である。さらに、エンドトキシンは抗生物質およびそれに随伴する細菌細胞の破壊によってますます放出され、それは次に炎症メディエータの分布の増大を導く。加えて、抗生物質の投与は往々にして、腸管内細菌叢の変化またはアレルギー反応のような副作用を伴う。主要因子ＴＮＦ‐αに対して抗生物質を使用する試みは失敗した。なぜなら、この方法によりＴＮＦ濃度を零または非常に低い値に低下させることが、アネルギ状態を誘発したようであり、それは対照群に比べて高い死亡率を伴ったからである。ＬＰＳおよびＴＮＦ‐αに対する特定の抗生物質の治療用法は技術的に非常に複雑であり、したがって高コストを伴う。
【０００９】
したがって、体外血液または血漿浄化システム（アフェレーシス療法）を用いて、以下でさらに詳述する通り、上述したサイトカイン、特にＴＮＦ‐α因子を除去して、これらのサイトカインの濃度を正常化し、こうしてアネルギ（抗炎症）期を回避するように試みる。エンドトキシンは、ＬＰＳ吸着体として知られる物（例えばToraymyxin（登録商標）吸着材）によって除去することができ、こうして炎症促進サイトカインの放出が回避され、それは当然、抗炎症反応をも低減する。
【００１０】
アフェレーシス法は体外で実行される方法であり、そこで病態生理学的に関連する血液および血漿成分、例えば（グリコール）タンパク質、ペプチド、脂質、リポタンパク質、およびリポ多糖類のような生体分子だけでなく、血液細胞および血漿もまた除去される。アフェレーシス法は一方では診断および治療目的に使用することができるが、他方では、健康な個人から充分な量の充分に高純度の特定の血液成分を得る非常に効果的な可能性をも構成する。特定の適応症では、これは非常に効果的な代替法であり、同時に、薬物による治療と比較して副作用がほとんど無いため、多大なる重要性はアフェレーシス療法に帰する。血漿アフェレーシス法の場合、血漿を完全に分離するかあるいは代用溶液に置換することができ、またはサイトカインＬＤＬ、エンドトキシン、もしくは免疫グロブリンのような特定の成分だけが吸着体によってそこから除去され、次いで血漿は再びドナー／患者に戻される。薬剤を使用する上述した治療戦略と比較して、アフェレーシス療法はまた、アフェレーシス装置の作動を停止させることによって、いつでも即座に治療が停止されるという利点をも有する。
【００１１】
有毒かつ／または有害な血液成分を除去するためのアフェレーシス法および吸着体材料は先行技術で周知である。サイトカイン、特にＴＮＦ‐α、および／またはエンドトキシン（ＬＰＳ）を特に吸着し、これらを血液または血漿のような体液から除去する吸着体材料もまた公知である。
【００１２】
米国特許公開US 2001/0070424 A1は、直径が２５から２００ｎｍの少なくとも１つの輸送細孔および直径が１０から２５ｎｍの有効細孔をも有する、多孔性ポリマに基づく吸着体材料を開示している。とりわけ、ポリマは非イオン性樹脂（中性樹脂）とすることもできる。吸着体はタンパク質分子、特にサイトカインおよびβ２ミクログロブリンを除去するために使用される。
【００１３】
国際公開WO 2011/123767 A1は、炎症メディエータを吸着するための多孔性吸着体粒子の治療上有効な用量を患者に投与し、５から３００ｎｍの細孔径の全細孔容積が０．５ｃｃ／ｇより大きく３．０ｃｃ／ｇまでであるようにした、炎症を治療するための方法を開示している。
【００１４】
国際公開WO 2003/090924 A1には、炎症過程に関連して血液成分を分離するための多孔性分離マトリックスが記載されている。分離マトリックスは、５μｍから５００μｍの細孔径、およびマトリックス上に配設された少なくとも１つの官能基をも有する。
【００１５】
ドイツ特許公開DE 19515554 A1は、全血および／または血漿からＴＮＦ‐αおよびリポ多糖類を同時体外除去するための方法および装置を開示している。ここで、血液または血漿は、多孔性カチオン交換体材料およびアニオン交換体材料を介して、体外灌流システムに誘導される。そこに記載された多孔性担体材料は、３０ｎｍより小さい平均細孔径、および／または１０6ダルトンより小さく、かつ特に２×１０4ダルトンより小さい球状タンパク質のための分子排除サイズを有する。
【００１６】
サイトカインをはじめとする有毒成分を体液から除去するための中性樹脂は、国際公開WO 2005/082504 A2にも開示されている。国際公開WO 2005/082504 A2は、活性炭と、３０ｎｍの平均細孔径および３５〜１２０μｍの平均粒径（Amberchrom CG300C）または４５ｎｍの平均細孔径および５６０μｍの平均粒径（脂肪族エステル系樹脂‐Amberlite XAD‐7HP）を有する少なくとも１つの非イオン性樹脂とを備えた、解毒装置を記載している。
【００１７】
欧州特許EP 0787500 B1および欧州特許EP 0958839 B1は、体液から有毒成分、特にサイトカインを除去するための、１０から３０ｎｍの細孔径および２０から３５０μｍ、好ましくは１０から１００μｍ、または２５０から３５０μｍの粒径を有する、疎水性担体材料を開示している。
【００１８】
欧州特許EP 1944046 B1は、３０ｎｍの細孔径および７５から１２０μｍの粒径を有するポリスチレンジビニルベンゼンコポリマ系の担体材料を開示している。
【００１９】
Tettaら（Tetta et al.1998.Nephrol Dial Transplant13:1458‐1464）は、体液からサイトカインを除去するための、３０ｎｍの細孔径を有するAmberchrom CG300md型の吸着体を記載している。
【００２０】
Cantaluppiらによる文献（Cantaluppi et al.2010.Critical Care14:R4）は、サイトカイン吸着のためのAmberchrom CG161m型の吸着体を記載している。
【００２１】
アニオン交換体樹脂（例えばセルロースに結合されたＤＥＡＥまたはＰＥＩ基）は、エンドトキシン結合に非常によく適することも明らかになった。しかし、タンパク質Ｃおよびタンパク質Ｓのような体内凝固系の主要因子の望ましくない結合、および関連する凝固問題は不都合である。これらの凝固問題は、エンドトキシンに対する固定化抗体を含む特定の吸着体を使用することによって回避することができる。しかし、この可能性は、経済的な理由から限定的にしか適用することができない。
【００２２】
ドイツ特許公開 DE 19913707 A1には、有機または合成ポリマと、それに結合され、補体因子、リポ多糖類、ならびにＴＮＦ‐αおよびインターロイキンのようなさらなる敗血症メディエータに対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体とから形成された担体材料で構成される、敗血症治療で使用するためのプラズマフェレーシス用の免疫吸着体が記載されている。
【００２３】
ドイツ特許公開DE 102004029573 A1は、アフェレーシス用材料または吸着、およびサイトカインＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）を血液、血漿、または他の体液から除去し、枯渇させ、または不活化するための方法をも開示している。吸着剤は固定担体材料を含み、その表面にＭＩＦ結合分子または官能基が固定化される。
【００２４】
ドイツ特許公開DE 102005046258 A1は、インスリン抵抗性および／または代謝異常症候群を治療するための免疫吸着体を開示しており、免疫吸着体はＩＬ‐６、ＩＬ‐４、およびＣ５ａに特異的な結合リガンドを持つ担体材料を含む。
【００２５】
臨床用途に既に長年使用されている治療形態は、ポリミキシンの非経口投与によって構成される。ポリミキシンは、最初は細菌バシラス・ポリミキサに由来し、グラム陰性細菌の感染を治療するためにヒトおよび動物に既に数十年間使用されてきた、抗生物質である。ポリミキシンは細胞膜の透過性を高めることによって細胞壁構造を妨害し、こうして細胞溶解を引き起こす。ポリミキシンはリン脂質のみならず、エンドトキシン（ＬＰＳ）にも結合し、高親和性のポリミキシン‐エンドトキシン（ＬＰＳ）複合体を形成する。ポリミキシンの抗菌メカニズムは、例えばTony Velkovらによる文献（Tony Velkov et al.2010.Journal of Medicinal Chemistry:53(5):1898‐1916）に詳細に記載されている。
【００２６】
ポリミキシンの神経毒性および腎毒性作用のため、ポリミキシンＢおよびポリミキシンＥ（コリスチン）だけが抗生物質としての特定の治療上の重要性を高めてきた。今まで、これらの２つのポリミキシンはそれらの物質クラスの治療に許容できる唯一の代表であった。ポリミキシンＢおよびコリスチンは米国で非経口注入用としてＦＤＡに認可されている。ポリミキシンＢおよびコリスチンは、経口または外用治療形態に数十年使用されてきた。しかし、グラム陰性細菌の感染によって生じる状態および状況の非経口全身治療に対しては、それらの神経毒性および腎毒性副作用のため、それらは治療上の文脈で最後の手段として抗生物質としてのみ使用される。コリスチンはポリミキシンＢより腎毒性が低いようであるが、これは少なくとも部分的に、より高い所要投与量により相殺され、したがって腎毒性反応は日常的な臨床業務ではほぼ同程度になると予想される。しかし、２つの抗生物質の腎毒性に関して充分なデータが現在得られていない。ニューヨーク（米国）の感染症専門医（Infectologists）は、ポリミキシンＢで治療した６０名の患者の１４％の腎不全を記載している。ギリシャの医師は、治療の開始時に既に腎機能不全が存在した患者の大多数における顕著な腎毒性を記載している。対照的に、正常な腎機能の患者では、顕著な変化は立証されなかった。ポリミキシンの毒性に関する詳細な概要は、FalagasおよびKasiakouによる文献に見ることができる（Falagas and Kasiakou.2006.Critical Care10:R27）。したがって、ポリミキシンの投与量は毒性副作用、特に腎毒性副作用の回避または最小化に中心的な役割を果たす。
【００２７】
近年頻繁に観察される、多剤耐性病原菌株の感染によって生じる疾患の重篤な進行の発生のため、例えば細菌緑膿菌の菌株による急性感染の場合、ポリミキシンは、それらの毒性にも関わらず、必然的に抗生物質として非経口的に投与されることが多くなっている。非経口投与のためのポリミキシンＢ１およびＢ２の硫酸塩の形のポリミキシンＢの供給源は現在、Bedford Laboratoriesによって提供されている（「注射用ポリミキシンＢ５０００００単位」の製造者Bedford Laboratories）。製造者情報によると、非経口投与は静脈内、筋肉内、または髄膜炎の場合には髄腔内に実行され、指定された最大一日投与量は一般的に、二回から三回に分けて一日当たり体重１ｋｇにつき２．５ｍｇである。投与後のポリミキシンの血清中濃度は通常、１ないし６μｇ／ｍｌの範囲である。重篤な場合、これはより高い６ないし５０μｇ／ｍｌの範囲になることもある。コリスチンは主にコリスチンメタンスルホン酸塩の形で投与され、血清中濃度は約１ないし３μｇ／ｍｌの範囲である。コリスチン（ポリミキシンＥ）は、ポリミキシンＢと同様の方法で、通常はより高い用量で使用される。
【００２８】
ポリミキシンＢに対する耐性はかなり珍しいが、外膜の変化のため、抗生物質が細胞質膜に達しない場合には発生することがある。ポリミキシンは大腸菌、エンテロバクタ、クレブシエラ属のような多くのグラム陰性病原菌に対し、かつ通常は耐性菌である緑膿菌、プロテウス型、およびＳ．マルセセンスに対しても有効である。Ｂ．フラジリスの感受性は多様である。大腸菌の場合、最小阻害濃度は０．０４〜３．７ｍｇ／ｌの範囲であり、緑膿菌の場合、１．２から３３．３ｍｇ／ｌの間である（Garidel and Brandenburg.2009.Anti‐Infective Agents in Medicinal Chemistry, 8:367‐385）。
【００２９】
非経口投与の場合に臨床用途に以前使用されたポリミキシンＢおよびコリスチンの用量は、腎毒性および神経毒性副作用を誘発するので、ポリミキシンのようなエンドトキシン結合リポペプチドの適用に関連して、新しい治療戦略および治療法が過去に開発された。
【００３０】
適切な吸着体材料を使用する、既に前述した体外血液および／または血漿浄化法は、薬剤の形態によるポリミキシンの投与に対し、頻繁に適用される代替法として確立されている。
【００３１】
公知の吸着体材料は多孔性または繊維状担体材料を含み、その表面にポリミキシンＢが固定化される。公知の神経毒性および腎毒性副作用は、敗血症状態の治療にかなりの程度使用されるこのタイプの吸着体材料に関連して、以前から報告されてきた。
【００３２】
欧州特許公開EP 0110409 Aには、多孔性ガラスから形成されたポリミキシンＢ固定化担体（ＦＰＧ２０００）およびセルロース系のポリミキシンＢ固定化多糖担体（Cellulofine A‐3）が開示されている。セルロースまたは誘導体化セルロースから形成され、ポリミキシンＢが共有結合された微小粒子もまた公知である（Weber V.,Loth F.,Linsberger I.,Falkenhagen D.:Int.J.Artif.Organs25(7)、679）。欧州特許公開EP 0129786 A2は、ポリミキシンが共有結合により固定化された繊維状担体を持つエンドトキシン解毒材を記載している。繊維状担体は、担体の表面にポリミキシンを共有結合するために官能基を備える。記載されたエンドトキシン吸着体の不利点として、低いエンドトキシン結合能および速度が挙げられる。ポリミキシンＢが共有結合された繊維状担体に関連する治療の有効性および質は最適以下であった（Cruz DN et al.2007.Effectiveness of polymyxin B‐immobilized fiber column in sepsis:a systematic review.Crit.Care11(3):137）。
【００３３】
国際公開WO 2010/083545および国際公開WO 2011/160149は、ポリミキシンが非共有結合的相互作用（吸着）を介して疎水性担体表面に固定される吸着体材料を記載している。国際公開WO 2007/142611 A1および米国特許US 5510242は、ポリミキシンが吸着結合された疎水性担体表面を記載している。サルモネラ・チフィムリウムのＬＰＳ抗原を結合するためのポリミキシン被覆ポリエステル繊維の使用は、BlaisおよびYamazakiによって記載された（Blais and Yamazaki.1990.Use of polymyxin‐coated polyester cloth in the enzyme immunoassay of Salmonella lipopoly‐saccharide antigens. International journal of Food Microbiology11:195‐204）。
【００３４】
国際公開WO 2011/133287 A1は、微小流体分離装置を備え、毒素、薬剤、病原体等のような望ましくない物質を血液から除去することのできる、血液濾過装置を開示している。装置は、望ましくない物質の有無または濃度に関して血液を監視するセンサを備えることができる。監視は、抗生物質のような治療に有効な成分の患者の血液への注入を含むこともできる。
【００３５】
序論に示した種類の体外灌流装置は、例えばFalkenhagenらによって記載されている（Falkenhagen et al.2006.Fluidized Bed Adsorbent System for Extracorporeal Liver Support.Therapeutic Apheresis and Dialysis10(2):154‐159）。そこに記載されたフィルタは「Albuflow（登録商標）」の商品名で入手可能である（Fresenius Medical Care, Germany）。
【００３６】
内毒血症誘発病状、特に敗血症を患っている患者の致死率は、上述したポリミキシン系吸着体材料の臨床応用によって低減することができるが、重症敗血症および敗血症性ショックの患者の致死率は、最大限の治療にも関わらず、依然として非常に高い。この理由のため、および抗生物質に対する細菌の多剤耐性のますます増大する問題、およびそれに関連して増加する疾患の重篤な進行の発生のため、臨床応用においてきわめて安全でもある、改善された治療形態およびより効率的な体外灌流装置に対する高い要求も存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３７】
【特許文献１】米国特許公開US 2001/0070424 A1
【特許文献２】国際公開WO 2011/123767 A1
【特許文献３】国際公開WO 2003/090924 A1
【特許文献４】ドイツ特許公開DE 19515554 A1
【特許文献５】国際公開WO 2005/082504 A2
【特許文献６】欧州特許EP 0787500 B1
【特許文献７】欧州特許EP 0958839 B1
【特許文献８】欧州特許EP 1944046 B1
【特許文献９】ドイツ特許公開 DE 19913707 A1
【特許文献１０】ドイツ特許公開DE 102004029573 A1
【特許文献１１】ドイツ特許公開DE 102005046258 A1
【特許文献１２】欧州特許公開EP 0110409 A
【特許文献１３】欧州特許公開EP0129786
【特許文献１４】国際公開WO 2010/083545
【特許文献１５】国際公開WO 2011/160149
【特許文献１６】国際公開WO 2007/142611 A1
【特許文献１７】米国特許US 5510242
【特許文献１８】国際公開WO 2011/133287 A1
【非特許文献】
【００３８】
【非特許文献１】Tetta et al.1998.Nephrol Dial Transplant13:1458‐1464
【非特許文献２】Cantaluppi et al.2010.Critical Care14:R4
【非特許文献３】Tony Velkov et al.2010.Journal of Medicinal Chemistry:53(5):1898‐1916
【非特許文献４】Falagas and Kasiakou.2006.Critical Care10:R27
【非特許文献５】Garidel and Brandenburg.2009.Anti‐Infective Agents in Medicinal Chemistry, 8:367‐385
【非特許文献６】Weber V.,Loth F.,Linsberger I.,Falkenhagen D.:Int.J.Artif.Organs25(7)、679
【非特許文献７】Cruz DN et al.2007.Effectiveness of polymyxin B‐immobilized fiber column in sepsis:a systematic review.Crit.Care11(3):137
【非特許文献８】Blais and Yamazaki.1990.Use of polymyxin‐coated polyester cloth in the enzyme immunoassay of Salmonella lipopoly‐saccharide antigens. International journal of Food Microbiology11:195‐204
【非特許文献９】Falkenhagen et al.2006.Fluidized Bed Adsorbent System for Extracorporeal Liver Support.Therapeutic Apheresis and Dialysis10(2):154‐159
【発明の概要】
【００３９】
したがって、本発明の目的は、敗血症および敗血症様状態の改善された治療を可能にする、序論に示されたタイプの体外灌流装置を提供することである。
【００４０】
この目的は、本発明に従って灌流装置がエンドトキシン結合リポペプチドを体外血液回路に供給するための分注手段を含み、かつエンドトキシン結合リポペプチドがポリミキシン、ポリミキシン誘導体、それらのプロドラッグ、およびそれらの組合せから成る群から選択されることを特徴とする、序論に示されたタイプの体外灌流装置によって達成される。
【００４１】
本発明のおかげで、以前から公知の治療方法と比較して、敗血症および敗血症様状態の改善された治療が可能になる。
【００４２】
本発明に係る灌流装置の第１の主要な利点は、フィルタがエンドトキシンおよび他の高分子血漿成分のためのバリアだけでなく、形成されたエンドトキシン‐リポペプチド複合体のためのバリアをも構成するので、肝臓で分解される前に体外血液回路を循環する患者の血液に存在するエンドトキシン‐リポペプチド複合体が濾液回路に流入することができず、担体に到達することができないということにある。複合体と第１担体表面との間の競合的相互作用プロセスのため、担体との接触はエンドトキシン‐リポペプチド複合体の溶解を導き、よってこれは敗血症による患者の状態を悪化させるであろう。リポペプチド‐エンドトキシン複合体の解離によって生じるエンドトキシンの新たな供給は、エンドトキシンによって引き起こされる補体系または凝固系および細胞系（単核細胞）の活性化プロセスの新たな激化をもたらし、これらの活性化プロセスは、多臓器不全の開始もしくは激化、または敗血症のアネルギ期すなわち免疫系が衰弱する段階の開始のような対応する臨床的帰結を伴う。この帰結は、エンドトキシンの放出はいかなる場合でも防止すべきであることを意味する。
【００４３】
本発明のおかげで、エンドトキシン結合リポペプチドは分注手段によって血液に送ることができ、エンドトキシンは複合体の形成によって除去することができ、かつ同時に、望ましくない血液成分、特にサイトカインは枯渇剤によって枯渇させることができ、よって患者にとって追加的な安全上の危険性無く、最大限の治療が可能になる。
【００４４】
本発明に係る灌流装置のさらなる重要な利点はまた、濾液回路に配置された枯渇剤のため、望ましくない血液成分、特にサイトカインを第１担体の表面における吸着によって血漿から除去することができることにある。発明者らは驚くことに、本発明に従って使用されるフィルタの使用により、体外血液回路からのわずかなサイトカインがフィルタを通過して、濾液回路に運ばれる分画血漿内に送られるが、サイトカイン、なによりもまずＴＮＦ‐αに対する吸着効率は、細胞血液成分だけを残す血漿フィルタと比較して著しく向上することを発見した。本発明に従って使用されるフィルタは、３００，０００より高い相対モル質量を有するタンパク質またはリポタンパク質および糖タンパク質の透過を事実上完全に防止する。この利点は、細胞成分だけを保持する血漿フィルタを使用する場合と比較して、サイトカインの除去のずっと高い再現性を保証することが明らかになった。
【００４５】
本発明に従って使用されるフィルタは分画血漿を通過させるので、高分子血液成分、エンドトキシン、およびエンドトキシン‐リポペプチド複合体も保持される一方、より小さい血液成分はフィルタ膜を通過することができる。適切なフィルタは、「Albuflow（登録商標）」の商品名で入手可能である（製造者：Fresenius Medical Care；材料：ポリスルホン中空ファイバ；ふるい係数はアルブミンに対しては０．６以上、フィブリノゲンに対しては０．１以下）。
【００４６】
本書で使用する用語「血漿」は、これが本発明に係る装置の濾液回路内を運搬される限りにおいて、したがって分画された血液血漿に関連する。
【００４７】
本開示の範囲内で「中性の疎水性表面を有する担体」という表現は、中性かつ疎水性の表面を有する不水溶性固体に関係する。用語「中性」は非イオン性と理解される。担体は繊維状または粒子状の形を取ることができる。担体はまた多孔性であってもよく、かつ外表面および内表面を有することができる。外表面および内表面は中性かつ疎水性である。担体の「内表面」という用語は細孔の表面の全体を表す。用語「外表面」は対照的に、外側から直接アクセス可能な担体の表面の全体に関係する。
【００４８】
本書で使用する場合、用語「ポリミキシン」および「ポリミキシン類」は、当初は細菌バシラス・ポリミキサ由来（ポリミキシンＢ）およびバシラス・コリスチナス由来（ポリミキシンＥ）である公知の天然由来の化合物に関係する。ポリミキシンは細菌から単離することができ、あるいは人工的に生産することができる。細菌に由来するポリミキシンＢは、ポリミキシンＢ１、ポリミキシンＢ２、ポリミキシＢ３、ポリミキシンＢ４、ポリミキシンＢ５、およびポリミキシンＢ６と呼ばれる６つの誘導体から構成される。対照的に、ＦＤＡによって非経口注入が認可されたポリミキシンは、ポリミキシンＢ１ないしＢ４のみで構成される。前述の通り、ポリミキシンＢおよびポリミキシンＥ（コリスチン）だけが臨床的に関連する。
【００４９】
本書で使用する用語「プロドラッグ」は、上に定義したポリミキシンの前駆体化合物に関係する。前駆体化合物はインビボで活性ポリミキシンに変換される。代表例として、コリスチンメタンスルホン酸塩およびポリミキシンＢメタンスルホン酸ナトリウムなどのプロドラッグが挙げられる。
【００５０】
用語「ポリミキシン誘導体」は、ポリミキシンから誘導される化合物に関係し、この化合物は、天然由来のポリミキシンの修飾によって、例えばポリミキシン分子構造のＤａｂ側鎖、環状ペプチド環または脂肪酸鎖の化学的修飾によって得られる。ポリミキシン系抗生物質、類似物、および誘導体の詳細な概要は、Velkovらによる文献に記載されている（Velkov et al.2010.Journal of Medicinal Chemistry,53(5):1898‐1916）。本発明における使用に対するポリミキシン誘導体の適合性は、当業者が簡単な日常的試験に基づいて試験することができる。
【００５１】
用語「内毒血症」は本書では、臨床的関連量のエンドトキシンが患者の血液中に発見されかつその後に敗血症およびＳＩＲＳのような疾患パターンにつながる、全ての疾患に対して使用される。
【００５２】
用語「枯渇剤」は、濾液回路内を運ばれる血漿から望ましくない成分を除去することのできる薬剤に関係する。中性の疎水性表面を有する担体を含む枯渇剤は、その担体表面における吸着によるサイトカインのような炎症メディエータの除去に特に有益であることが過去に証明されている。これらのサイトカインは、潜在的に有害な炎症促進性サイトカインであることが好都合である。炎症促進性サイトカインの代表例としてＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１１３、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐８が挙げられ、ＴＮＦ‐αは初期炎症促進性炎症メディエータとして特に重要である。本発明に従って使用される枯渇剤はしたがって、ＴＮＦ‐αの毒性作用に起因する状態および状況の治療に特に有益である。例として、敗血症の場合、炎症促進期におけるＴＮＦ‐αの値は、少なくとも１００〜２００ｎｇ／ｍｌより大きい。下に示す例は、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐１β、ＩＬ‐６、ＩＬ‐８、および抗炎症性ＩＬ‐１０も最大限有効に除去され、かつ本発明に係る装置が敗血症、敗血症性ショック、および敗血症様状態の治療に極めてよく適していることを立証する。
【００５３】
「エンドトキシン結合リポペプチドを体外血液回路内に供給するための分注手段」という表現は、一方ではリポペプチドを体外血液回路に直接供給するための分注手段に関係する。他方で、この表現は、リポペプチドが分注手段によって濾液回路内に分注され、次いでリポペプチドがそこから体外血液回路内に移動するという点において、リポペプチドを体外血液回路内に間接的に供給するための分注手段にも関係する。
【００５４】
最初は細菌バシラス・ポリミキサおよびバシラス・コリスチナスから得られた天然由来のポリミキシンは、かなりの程度研究されかつ内毒血症によって引き起こされた状態および状況の治療に既に数十年使用されてきたペプチド抗生物質に属するので、エンドトキシン結合リポペプチドはポリミキシンであることが好ましい。リポペプチドは、臨床用に既に認可されているポリミキシンのみ、すなわちポリミキシンＢおよびコリスチン（ポリミキシンＥ）ならびにそれらのプロドラッグから構成される群から選択されることが特に好ましい。代表例としてプロドラッグであるコリスチンメタンスルホン酸塩およびポリミキシンＢメタンスルホン酸ナトリウムが挙げられる。しかし、ポリミキシンＢおよびそのプロドラッグが最も好適であり、これはヒト用医薬の分野における使用に最も成功していることから明らかである。
【００５５】
第１の有利な実施形態によると、枯渇剤はエンドトキシン結合リポペプチドを供給するための分注手段を含み、枯渇剤の第１担体の表面は、エンドトキシン結合リポペプチドから形成された吸着性コーティングを有する。この実施形態では、第１担体はリポペプチドで吸着コーティングされるので、枯渇剤はしたがってエンドトキシン結合リポペプチドのための分注手段としても働く。リポペプチドは、脱着によって少量ずつ連続的に濾液回路内に放出され、さらにそこから体外血液回路に供給される。リポペプチドはこうして、濾液回路へのリポペプチドの分注（第１担体からの脱着）によって体外血液回路内に供給され、それは次いで血液回路内に送られる。小変形例では、濾液回路は、フィルタの下流で体外血液回路に通じる開放型濾液回路として形成することができる。別の小変形例では、濾液回路は、濾液領域で閉じた回路であってフィルタに通じる回路として形成することができる。実験室試験では、リポペプチドによる担体表面の吸着性コーティングはサイトカインの吸着に対し不利に影響しないことが明らかになっている（下の実施例１１参照）。
【００５６】
本開示で使用される用語「吸着性コーティング」は、エンドトキシン結合リポペプチドが非共有結合性吸着プロセスおよび相互作用を介して中性の疎水性担体表面に結合することを意味すると理解される。特に、疎水性相互作用は重要な役割を果たすと考えられる。疎水性相互作用は生化学的に非常に重要であり、極性環境において疎水性分子が会合する傾向があるという現象に基づいている。したがって、疎水性相互作用は本質的に力ではないが、極性環境によって強制される。イオン結合、水素架橋結合、およびファン・デル・ワールス相互作用をはじめ、それらに限らず、他の非共有結合的相互作用もまた、ポリミキシンのようなエンドトキシン結合リポペプチドの吸着に重要な役割を果たす。-非共有結合性相互作用を介してポリミキシンのようなエンドトキシン結合リポペプチドを様々な細孔および粒径の疎水性担体表面に結合することは、国際公開第2010/083545号パンフレット、国際公開第2011/160149号パンフレット、国際公開第2007/142611号パンフレット、および米国特許第5510242号明細書に既に記載されている。担体に吸着結合されたエンドトキシン結合リポペプチドは、本発明によれば、ポリミキシン、そのプロドラッグ、およびそれらの組合せから成る群から選択される。
【００５７】
第１実施形態とは代替的に、第２の有利な実施形態では、エンドトキシン結合リポペプチドを供給するための分注手段は、濾液回路の枯渇剤の下流に配置され、分注手段は中性の疎水性表面を有する第２担体を含み、第２担体の表面はエンドトキシン結合リポペプチドで形成された吸着性コーティングを有する。リポペプチドは脱着によって少量ずつ連続的に濾液回路内に放出され、次いでそこからさらに体外血液回路に送られる。リポペプチドはこうして濾液回路へのリポペプチドの分注（第２担体からの脱着）によって体外血液回路内に供給され、それは次いで血液回路内に移動する。第２実施形態の小変形例では、濾液回路は、フィルタの下流で体外血液回路に通じる開放型濾液回路として形成することができる。第２実施形態の別の小変形例では、濾液回路は、濾液領域で閉じた回路であってフィルタに通じる回路として形成することができる。しかし、設計／装置の費用が低いため、第２実施形態と比較して第１実施形態の方が好ましい。
【００５８】
本発明に係る灌流装置の上述した２つの実施形態（第１および第２実施形態）の展開は、中性の疎水性表面を有する担体であって、ポリミキシンで形成された吸着性コーティングを有する担体を用いて、エンドトキシンの除去は、以前に考えられていたように担体に固定化されたポリミキシン分子におけるエンドトキシンの吸着によってではなく、血液または血漿内に移送された非常に少量の脱着されたポリミキシン分子を介して実現されるという驚くべき事実に基づいている。この驚くべきかつ予測不可能な発見は、ポリミキシンが吸着コーティングされた担体の選択的な洗浄の後に、エンドトキシンの吸着は、担体表面に依然として固定化されたポリミキシン分子によって特定することができなかったという事実に基づいている。したがって発明者らは、ポリミキシンが表面に吸着結合された中性の疎水性担体ポリマの優れたエンドトキシン除去効率は、担体材料から脱着しかつ体液すなわち血液または血漿内に放出される非常に少量の自由ポリミキシン分子に起因すると判断することができた。担体に吸着されたポリミキシンの量に応じて、約０．０１μｇ／ｍｌから約０．８μｇ／ｍｌのポリミキシン血清中濃度をもたらす、少量の放出されたポリミキシンは、エンドトキシンの活性を阻止するのに既に充分であり、神経毒性および腎毒性副作用が排除されるという発見もまた、驚くべきことであった。
【００５９】
この驚くべき発見のみに基づいて、発明者らは、本発明に係る灌流装置の第１および第２の有利な実施形態を展開することができた。それまでは、エンドトキシンの除去は、担体に吸着されたポリミキシン分子にエンドトキシンが結合することによって実現されると常に考えられていた。モル質量が３４００００ｇ／モル（相対分子質量が３４０ｋＤａ）の物質に対しふるい係数が５％のフィルタはエンドトキシン（ＬＰＳ）に対するバリアを構成し、したがってエンドトキシンは、濾液回路に配置されたエンドトキシン用の吸着体材料に到達することができないという事実に鑑みて、この新しい驚くべき事実を知ることで、このタイプのフィルタに、エンドトキシン結合リポペプチドによる吸着性コーティングを施した担体であってかつ予め定めることのできる量のリポペプチドを血漿内に分注する担体を組み合せることに、初めて誘因が生じた。したがって、濾液回路に配置された分注手段のため、非常に少量でかつ何よりもまず均等な量のエンドトキシン結合リポペプチドを、濾液回路で運ばれる血漿内に全治療期間にわたって、好ましくは２ないし８日の期間にわたって毎日４ないし１０時間、長期放出することが、濾液回路に配置された分注手段によって達成される。ここから、リポペプチドは体外血液回路内に入り、そこでそれらは血液中に存在するエンドトキシン（ＬＰＳ）との複合体を形成し、したがってこれらを無害にする。フィルタのおかげで、上で既述の通りこれらの複合体はもはや濾液回路内に入って再び溶解することができず、よって患者の安全性が高く維持される。エンドトキシン‐リポペプチド複合体は次いで、患者の肝臓で大部分が分解される。
【００６０】
第１または第２担体の表面に吸着されたエンドトキシン結合リポペプチドは、既述の通り、リポペプチドが分注されたときに０．０１μｇ／ｍｌから０．８μｇ／ｍｌのリポペプチド血清中濃度をもたらす量が存在することが好ましい。驚くことに、第１または第２担体からのリポペプチドの非常に低い脱着は、０．０１μｇ／ｍｌから０．８μｇ／ｍｌのリポペプチド血清中濃度を得るのに充分であることが明らかになった。これらの血清中濃度でエンドトキシンの活性は阻害され、神経毒性および腎毒性効果は排除されることが明らかになった。リポペプチド血清中濃度は好ましくは０．１μｇ／ｍｌから０．６μｇ／ｍｌの範囲、好ましくは０．１μｇ／ｍｌから０．４μｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．１μｇ／ｍｌから０．２５μｇ／ｍｌの間である。これらの血清中濃度では、敗血症、重症敗血症、または敗血症性ショックのような疾患が重篤に進行している場合でも、神経毒性および腎毒性副作用無しに、効率的な治療を実行することができる。
【００６１】
第１または第２担体は、１００ないし１５００ｍ2／ｇの全表面を有することが好ましく、全担体表面に対して、５０ないし２０００ｍｇは第１または第２担体の表面でエンドトキシン結合リポペプチドに吸着結合される。このようにして、担体表面からエンドトキシン結合リポペプチドを脱着することによって、約０．０１μｇ／ｍｌないし約０．８μｇ／ｍｌのリポペプチド血清中濃度を得ることができる。当業者は、平均細孔径および／または平均粒径の考慮中の使用された担体に関連して、簡単な日常的試験および計算に基づいて、予想されるリポペプチド血清中濃度を決定することができる。計算例は以下の実施例でさらに詳しく述べる。
【００６２】
上述した実施形態とは代替的に、非常に低量のリポペプチドの担体表面からの脱着に基づいて、エンドトキシン結合リポペプチドを供給するための分注手段は、エンドトキシン結合リポペプチドを体外血液回路に関連するリポペプチド供給ポイントで体外血液回路に供給するための、第３の有利な実施形態に関わる投与装置を含む。リポペプチド供給ポイントは、フィルタの下流に配置することが好ましい。透析器を追加的にフィルタの下流で体外血液回路に配置する場合には、体外血液回路におけるリポペプチド供給ポイントが透析器の下流に配置されると好都合である。第３実施形態の小変形例では、濾液回路は、フィルタの下流で体外血液回路に通じる開放型濾液回路として形成することができる。第３実施形態の別の小変形例では、濾液回路は、濾液領域が閉鎖された回路であってフィルタに通じる回路として形成することができる。
【００６３】
この実施形態では、リポペプチドは投与装置によって体外血液回路に注入される。リポペプチドは、非経口投与用製剤の形で、例えば輸液として存在することが好ましい。製剤は任意選択的に少なくとも１つの薬学的に許容される担体および／または賦形剤を含むことができる。製剤は１種類だけのエンドトキシン結合リポペプチド、または２種類以上のリポペプチドの混合物、例えばポリミキシンＢ１、Ｂ２、Ｂ３、およびＢ４の混合物を含むことができる。「薬学的に許容される担体および／または賦形剤」は、注射、輸液等のような非経口投与形態の生産用に公知のいずれかの物質とすることができる。本発明に適した輸液の処方は、以下の実施例４および５でさらに明記する。
【００６４】
エンドトキシン結合リポペプチドは無菌水性注射剤または輸液製剤の生産用の凍結乾燥粉末の形で存在することが好ましく、粉末は例えば無菌水、５％デキストロース溶液、リンゲル液、または生理食塩水に溶解することができる。ポリミキシンＢは硫酸ポリミキシンＢの形で使用することが好ましい。リポペプチドは、好ましくは０．０４ｍｇ／ｌから１３ｍｇ／ｌ、より好ましくは０．１ｍｇ／ｌから７ｍｇ／ｌ、最も好ましくは０．５ｍｇ／ｌから４ｍｇ／ｌの濃度で溶解された形で製剤に存在する。用量は、リポペプチド血清中濃度が０．１μｇ／ｍｌから０．６μｇ／ｍｌ、好ましくは０．１μｇ／ｍｌから０．４μｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．１μｇ／ｍｌから０．２５μｇ／ｍｌの範囲になるように設定することが好ましい。それは、これらの血清中濃度で、敗血症、重症敗血症、または敗血症性ショックのような疾患が重篤に進行している場合でも、神経毒性および腎毒性副作用無しに効果的な治療を実行することができるためである。
【００６５】
投与装置は、当業者にはそれ自体公知の通り、輸液が入った容器（例えば輸液バッグまたは輸液ボトル）と、チューブシステムと、単位時間当たりの所望量を投与するためのポンプ手段とを一般的に含む輸液ユニットによって形成される。
【００６６】
注入速度は患者におけるリポペプチドの血清中半減期に依存する。例として、正常な腎機能の患者におけるポリミキシンＢの血清中半減期は一般的に１３時間であり、コリスチンの血清中半減期は文献によると６から７．４時間である。灌流装置による治療の場合、以下でさらに詳述する通り、投与されたリポペプチドのフィルタのクリアランスおよび／または枯渇剤のクリアランスもまた考慮に入れなければならない。この目的に適した輸液の処方および投与指示についても、以下の実施例でさらに明記する。
【００６７】
エンドトキシン結合リポペプチドの濃度を監視するため、かつそれに応じて輸液の用量を調整できるようにするために、エンドトキシン結合リポペプチドの濃度を測定するための測定手段がフィルタまたは透析器の下流およびリポペプチド供給ポイントの上流に配置されると有利である。この目的に使用することのできる適切な測定手段、例えばセンサは、例えばJiangらによる先行技術（Jiang et al.2004.A synthetic peptide derived from bactericidal/permeability‐increasing protein neutralizes endotoxin in vitro and in vivo. International Immunopharmacology4:527‐537）に記載されている。測定のために、少量の血液が体外血液回路から分岐管路を介して測定手段／センサに運ばれ、濃度が決定された後、廃棄されることが好ましい。測定手段／センサを体外血液回路に直接挿入することは原理的に実際可能であるが、この場合、無菌性および生体適合性に関して測定手段／センサの状態に高い要求が課せられるので、あまり好ましくない。これらの理由から、測定手段／センサへの分岐管路を持つ形が好ましい。
【００６８】
灌流装置にはコントローラによって制御される制御回路を割り当てることもでき、その場合、注入ポンプを作動させることによって、測定手段によって測定されたリポペプチド現在値（リポペプチド血清中濃度）に応じて、予め定められた目標値または目標値範囲に関して、リポペプチドの注入量が制御される。リポペプチド血清中濃度の目標値または目標値範囲は一般的に０．０１〜０．８μｇ／ｍｌの範囲にある。
【００６９】
第３実施形態では、体外血液回路で運ばれる血液中にリポペプチドを投与するときに、身体のリポペプチドクリアランス、枯渇剤のリポペプチドクリアランス、および／または透析器のリポペプチドクリアランスを考慮するように、灌流装置のコントローラが設計されることも有利である。例として、サイトカインのような病態生理学的関連成分のほかに、ポリスチレンジビニルベンゼンコポリマから形成された担体もまたポリミキシンのようなリポペプチドを吸着することは公知であるので、第１の担体（すなわち枯渇剤の担体）のリポペプチドクリアランスを考慮することは注入リポペプチドの投与に有利である。
【００７０】
上述した実施形態に代わって、エンドトキシン結合リポペプチドを供給するための分注手段は、第４実施形態では、フィルタの下流で体外血液回路に配置された透析器であって、透析器を介して運ばれる透析液によってエンドトキシン結合リポペプチドを体外血液回路に供給するように設計された透析器を含む。小変形例では、濾液回路は、フィルタの下流で体外血液回路に通じる開放型濾液回路として形成することができる。別の小変形例では、濾液回路は、濾液領域で閉鎖されかつフィルタに通じる回路として形成することができる。使用される透析器は、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）を配合することによって生成された、１．４〜２．０ｍ2の表面を持つ親水性ポリスルホン膜であることが好ましい。例として、これらの膜は、Fresenius Medical Care社によって提供されるフィルタに、とりわけＡＦ１０００およびＦＸ６０モデルに使用されている。これらの透析用フィルタは、アルブミンに対して０．１％未満のふるい係数を有する。アルブミンに対し約４％のふるい係数を有する、同じく親水性ポリスルホン膜の使用に基づく、ハイカットオフフィルタ（high cut‐off filter）として知られるものを使用することも考えられる。透析条件下で、すなわち除去するように意図された物質の拡散制御除去が主に使用されるときに、アルブミン損失は１回の処置当たり５〜１０ｇ未満である。そのような透析用フィルタの例は、Fresenius Medical Care社によって製造されたＥＭｉＣ2フィルタによって構成される。そのようなフィルタが臨床用途で動作する流動条件は、使用条件に応じて８０〜３００ｍｌ／分の血流量が得られるように適切に選択される。持続的静静脈血液透析として知られる条件下では、６０〜８０ｍｌ／分の血流量が使用される一方、透析ユニット支援間欠的血液透析の場合、敗血症でも非常に頻繁に発生する、急性症例すなわち急性腎不全の患者では、１５０〜３００ｍｌ／分の血流量が使用される。間欠的血液透析の場合、透析液の流量は５００ｍｌ／分に設定することが好ましい一方、持続的静静脈血液透析の場合、血流量に対し１：１の比率の透析液流量が一般的である。上述した透析用フィルタのふるい係数は０．８（ＡＦ１０００）から０．９（ＥＭｉＣ2）の間、すなわち８０％から９０％の間であるので、透析液中のリポペプチド／ポリミキシンの濃度は０．２〜１．０μｇ／ｌの範囲とすべきであり、すなわち治療対象患者の管理された血清中濃度値よりわずかに高くすべきである。
【００７１】
実際には、第１または第２担体が中性の好ましくは合成ポリマであるならば、特に好都合である。こうして担体材料の高い再現性を確保することができる。それが多孔性ポリマであれば、特に空隙率および粒径に関して高い再現性を確保することができる。加えて、多種多様な空隙率および粒径にすることができる。ポリマはホモポリマおよびヘテロポリマのどちらでもよい。これらのポリマは「非イオン性巨大網状ポリマ樹脂」の名前でも知られており、例えば「Amberchrom」および「Amberlite XAD」の商品名（Rohm&Haas/Dow Chemical Company）で入手可能である。
【００７２】
実際の適用には、架橋ポリスチレンポリマおよび架橋エチルビニルベンゼンポリマが特に有用であることが立証された。体外血液浄化の場合、患者の体液と接触する装置部品の無菌性について高い要求が課せられる。架橋ポリスチレンポリマおよび架橋エチルビニルベンゼンポリマは熱および薬品に対する高い安定性を特徴とし、臨床業務で既に確立されている。有利な小変形例では、架橋ポリスチレンポリマはポリスチレンジビニルベンゼンコポリマである。さらなる有利な小変形例では、架橋エチルビニルベンゼンポリマはエチルビニルベンゼンジビニルベンゼンコポリマである。
【００７３】
言うまでもなく、好適なポリスチレンジビニルベンゼンコポリマまたはエチルビニルベンゼンジビニルベンゼンコポリマの代わりに、当業者には周知の高疎水性の他の中性樹脂を使用することも可能である。本発明に適した他の中性疎水性ポリマの代表例として、例えばトリビニルシクロヘキサン、トリビニルベンゼン、ジビニルナフタレン、ジビニルスルホン、トリメチロールプロパントリアクリレート、トリメチルプロパントリメタクリレートにより架橋したスチレンおよびエチルビニルベンゼンモノマからのポリマ、または脂肪族エステル系の樹脂、およびそれらの混合物が挙げられる。
【００７４】
第１または第２担体は多孔性であって、１００ｎｍ以下、好ましくは１から１００ｎｍの範囲の平均粒径を有することが有利である。こうして、サイトカインのような望ましくない成分の枯渇のために、あるいはエンドトキシン結合リポペプチドとの吸着性コーティングのために、特に大きい内表面が形成される。
【００７５】
当業者は用語「平均細孔径」の意味および意図的に空隙率または平均細孔径を調整することのできる方法を熟知しているが、それでもなお、明確を期すために、現段階でこの用語を定義する。平均細孔径は細孔の平均直径に関係する。多孔性材料の細孔径のガウス粒度分布を用いて、平均細孔径は分布曲線の最大値に相応する。平均細孔径は例えば窒素吸着（Weber et al.2008;Neutral styrene divinylbenzene copolymers for adsorption of toxins in liver failure. Biomacromolecules 9(4):1322〜1328に記載）を用いて、または水銀圧入法を用いて決定することができる。ポリマの細孔径は関係するモノマまたはコモノマ、溶媒、またはモジュレータの濃度を変えることによって調整される。選択されるポリマの細孔が小さければ小さいほど、分子（この場合、サイトカインおよび／またはエンドトキシン結合リポペプチドのような望ましくない血液成分）の吸着に利用可能なポリマの内表面は大きくなる。細孔が大きければ大きいほど、より大きい分子にとっての細孔のアクセシビリティが高くなる。本発明に使用することのできる所定の細孔径の合成疎水性ポリマの生産方法は、上述したWeberらによる文献に記載されている。
【００７６】
懸濁重合として実行されるモノビニルおよびポリビニル芳香族モノマの共重合によるそのような担体の生産もまた米国特許第4382124号明細書から公知である。ポリビニル芳香族モノマはポリマの架橋剤として使用される。例えばスチレンおよび／またはエチルスチレン、好ましくはエチルスチレンはモノビニル芳香族化合物として使用される。ジビニルベンゼンは好ましくはポリビニル芳香族化合物として使用される。多孔性はモノマにポロゲンを添加することによって得られ、ポロゲンは重合の後で再び除去される。ポロゲンは疎水特性または親水特性を持つことができる。例として、疎水性ポロゲンにはトルエンおよびキシレンがあり、親水性ポロゲンにはＣ４‐Ｃ１０アルコールがある。しかし、これらの２種類のポロゲンの混合物を使用することもできる。ポリマ担体の細孔径は、ポリマの架橋度、ポロゲンの種類および量、ならびに重合中の反応条件によって広範囲で変化することができる。所望の細孔径の中性の疎水性担体を得るためにどのパラメータを選択すべきかが、当業者には分かるであろう。
【００７７】
多孔性疎水性担体の生産の特別な実施形態は、「ハイパー架橋」（Davankov et al. J.Polymer Science,47,95‐101(1974)によりスチレンジビニルベンゼンコポリマを好ましくは後架橋することによって構成される。そのような担体の例として、Purolite CompanyによるHypersol‐Macronet吸着剤がある。こうして、事実上２ｎｍ未満の微小孔だけを含む、内表面が非常に大きい担体を生産することができる。
【００７８】
中性の疎水性表面ならびに様々な平均細孔径および粒径を持つ担体は、例えばRohm&Haas/Dow Chemical Companyから入手することができ、かつ商品名「Amberchrom CG」および「Amberlite XAD」の商品名で市販されている。中性の疎水性表面および約２．５ｎｍ以下の平均細孔径を持つ微細孔担体は、Purolite社から入手できる（例えばHypersol‐Macronet MN270、平均細孔径が２．５ｎｍ（２５Å）のポリスチレンジビニルベンゼンポリマ）。
【００７９】
１ないし１００ｎｍの平均細孔径を有する担体の全空隙率は、ポリマ１ｇにつき０．３〜０．８ｃｍ3であることが好ましい。内表面（または全表面）は１００から１５００ｍ2／ｇの範囲であることが好ましい。
【００８０】
第１または第２担体の平均細孔径は、２０ｎｍ以下の範囲、好ましくは１ないし２０ｎｍ、または８０ないし１００ｎｍの範囲にあることが有利である。これらの特定の細孔径範囲では、第１担体または第２担体によるタンパク質Ｃの吸着が、２０ｎｍ超および８０ｎｍ未満の細孔径範囲よりずっと目立たないためである。２０ｎｍより小さい細孔径では、細孔内に移動するタンパク質Ｃは少なくなる。担体によるタンパク質Ｃの吸着は細孔径が大きくなるにつれて増加し、細孔径が８０ｎｍより大きくなると再び減少する。より大きい細孔径（８０ｎｍ超）を選択することによりタンパク質Ｃ結合を最小限まで低下することができるが、平均細孔径が１００ｎｍを超えると担体の内表面が小さくなりすぎるため、そうならないように選択すると、臨床用途には好都合である。血漿中のビタミンＫ依存タンパク質であるタンパク質Ｃは、本発明に従って使用されるフィルタを通過することができ、したがって濾液回路に配置された第１または第２担体と接触する。タンパク質Ｃは血液凝固プロセスの重要な制御因子であり、抗凝固作用を有する。タンパク質Ｓ（６２０００Ｄａ）はタンパク質Ｃ（６９０００Ｄａ）と比較して同様の相対分子量を有するので、タンパク質Ｓの吸着もずっと低くなると考えることができる。同様の考察は、同様の分子量の凝固因子、例えばＶＩＩ因子、ＩＸ因子、およびＸ因子にも当てはまる。
【００８１】
２０ｎｍ以下の平均細孔径を有する担体の全空隙率は、ポリマ１ｇにつき０．４ないし０．８ｃｍ3であることが好ましい。内表面（または全表面）は、３００ないし１５００ｍ2／ｇの範囲であることが好ましい。
【００８２】
８０ないし１００ｎｍの平均細孔径を有する担体の全空隙率は、ポリマ１ｇにつき０．４ないし０．８ｃｍ3であることが好ましい。内表面（または全表面）は、１００ないし５００ｍ2／ｇの範囲であることが好ましい。
【００８３】
さらなる変形例では、第１および第２担体は繊維状とすることができ、あるいは粒子状とすることができる。しかし、第１および第２担体は、粒子状であることが好ましい。粒子状の担体は繊維状の担体と比較して取扱いが容易である。加えて、粒子の空隙率はより容易に生成しかつ調整することができる。
【００８４】
ポリマ担体の平均粒径は、重合中に公知の方法で、例えば懸濁安定剤の種類および量ならびに撹拌器の形状および回転速度によって、調整することができる。中性の疎水性表面ならびに多様な平均細孔径および平均粒径を持つ疎水性担体は、例えばRohm/Haas/Dow Chemical Companyから入手することができ、「Amberchrom CG」および「Amberlite XAD」の商品名で販売されている。多様な平均細孔径および平均粒径の微細孔担体は例えばPurolite社によって生産されている。
【００８５】
Mast Carbon（ＵＫ）社製のＡＣ繊維は、適切な繊維状担体の実施例を構成する。
【００８６】
第１または第２担体は、３００μｍ以下、好ましくは２ないし３００μｍの平均粒径を有する微粒子の形態を有することが好ましい。この範囲より大きい粒径の場合、外表面を小さくすることにより血液適合性の改善がもたらされる一方、粒子が小さくなるほど動的有効性が高くなる特徴がある。
【００８７】
特に好適な実施形態では、第１担体は１０ないし２０ｎｍの平均細孔径または８０ないし１００ｎｍの平均細孔径、および７５ないし１５０μｍの平均粒径を有する。この粒径範囲は、タンパク質Ｃの望ましくない吸着の点から有利であることが明らかになった（以下の実施例８参照）。望ましくないタンパク質Ｃの吸着によって引き起こされる血液凝固合併症（静脈血栓症、肺塞栓症）は、こうして最小限に抑えることができる。７５ないし１５０μｍの粒径では、担体の外表面は依然として、タンパク質Ｃの結合を零ではなくともわずかな程度に止めるのに充分小さいようである。しかし、それでも吸着すべき物質の拡散経路を小さくしておくのに充分な大きさであることは明らかである。この好適な実施形態では、タンパク質Ｃの生理学的関連量はここで依然として、比較的長い潜伏期間後も血液または血漿中に維持されるので、粒径は少なくとも７５μｍである。有利な小変形例では、第１担体は１０ないし２０ｎｍの平均細孔径および７５ないし１５０μｍの平均粒径を有する。１０ｎｍ未満の平均細孔径では、サイトカイン、特にＴＮＦ‐αのような除去すべき炎症メディエータの吸着効率は、再び低下する。２０ｎｍを越える細孔径では、内表面が小さくなり、サイトカインに対する吸着能力が低下する。本書で後述する有利な小変形例を含めて本発明に係る灌流装置のこの実施形態は、したがって、敗血症、特に敗血症性ショックおよび敗血症様状態の治療に極めてよく適している。
【００８８】
この実施形態の特に有利かつ好適な小変形例では、第１担体は１０ないし２０ｎｍの平均細孔径または８０ないし１００ｎｍの平均細孔径、好ましくは１０ないし２０ｎｍの平均細孔径、および７５ないし１５０μｍの平均粒径を有し、第１担体の表面はエンドトキシン結合リポペプチドから形成された吸着性コーティングを有する。すなわち、この小変形例では、枯渇剤は、第１実施形態に関連して上で詳述した通り、エンドトキシン結合リポペプチドのための分注手段としても働く（さらに以下の図１および図２も参照）。既述の通り、実験室試験で、リポペプチドの担体表面の吸着性コーティングは、サイトカインの吸着に対し不利に作用しないことが明らかになっている。第２担体が提供される実施形態では（上記または図５に関連する以下の所見を参照されたい）、さらなる小変形例にしたがって第２担体が２０ｎｍ以下の細孔径を有すると有利である。
【００８９】
平均粒径が増大するとタンパク質Ｃの吸着は減少するので、さらなる有利な小変形例の第１担体は、１００ないし１５０μｍの平均粒径を有する。担体は、より好ましくは１１０ないし１３０μｍの平均粒径を有し、理想的には約１２０μｍの平均粒径を有する。これらの粒径では、たとえ体液（血漿）を比較的長時間にわたって第１担体に接触させても、一方ではサイトカインのような毒性物質を、かつ他方ではタンパク質Ｃのような重要な凝固因子を吸着させ続けることはほとんどできないためである。
【００９０】
体外灌流装置の変形例では、濾液回路はフィルタの下流の位置で体外血液回路に通じる。この変形例では、濾液回路は開放型であり、分画血漿は濾液回路を通過することによってフィルタの下流で体外血液回路に直接供給される（図１、３、５、および７におけるこの変形例の略図を参照されたい）。この変形例の基本原理は免疫吸着で現在使用されている（例えば日本の旭化成社製のアフェレーシス装置）。枯渇剤または分注手段（第１または第２担体）はこの変形例では、濾液回路に配置される装置であって、血漿がそれを通過して流れることができかつ例えばカラムまたはカートリッジとして形成することのできる装置に配置することが好ましい。
【００９１】
体外血液回路の別の変形例では、濾液回路は閉鎖型であり、分画血漿はフィルタの膜を介して、体外血液回路を流れる血液に戻る（図２、４、および６におけるこの変形例の略図を参照されたい）。第２変形例の基本原理は血液浄化システムPrometheus（登録商標）（ドイツのFresenius Medical Care GmbH）によって公知である［Falkenhagen D,Strobl W,Vogt G,Schrefl A,Linsberger I,Gerner FJ,Schoenhofen M.:Fractionated plasma separation and adsorption system:a novel system for blood purification to remove albumin bound substances. Artif Organs.1999 Jan;23(1):81-6］）。枯渇剤または分注手段（第１または第２担体）は、濾液回路に配置される装置であって、血漿がそれを通過して流れることができかつ例えばカラムまたはカートリッジとして形成することのできる装置に配置することができる。
【００９２】
有利な実施形態では、濾液回路はフィルタに通じ、こうして濾液領域で閉じられた回路を形成し、第１担体は微粒子の形態を有し、濾液回路はこれらの微粒子の懸濁液を含み、微粒子は２０μｍ以下の平均粒径、好ましくは８μｍ以下の平均粒径、理想的には５μｍ以下の平均粒径を有する。この実施形態は上述した実施形態の発展形であり、第１担体（エンドトキシン結合リポペプチドによる吸着性コーティングの有無に関わらず）だけが濾液回路に配置される。微粒子状の第１担体（リポペプチドコーティングの有無に関わらず）はここでは懸濁液として濾液回路内を循環する。非常に小さくなるように選択された粒径のため、微粒子が例えばフィルタリークによって体外血液回路内に移動し、次いで患者の体内に移動すると、肺塞栓症のリスクを回避することができる。微粒子の懸濁液が含まれる体外血漿回路は、微小球体ベースの解毒システム（ＭＤＳ）の重要な構成要素を構成し、欧州特許第0776223号明細書および米国特許第5855782号明細書に既に記載されている。
【００９３】
本発明は、グラム陰性細菌による感染症の治療、特に全身性炎症反応（ＳＩＲＳ）、敗血症、重症敗血症、または敗血症性ショックの予防または治療に有利に使用される。本発明に係る灌流装置によって治療可能な疾患パターンの代表例は、グラム陰性細菌の感染後に発生し、かつＳＩＲＳ、敗血症、多臓器不全を伴う重症敗血症、または敗血症性ショックにつながるおそれのあるものである。
【００９４】
グラム陰性細菌の代表例としてエシェリキア属菌、ヘモフィルス・インフルエンザ、緑膿菌、パスツレラ、エンテロバクタ属菌、サルモネラ属菌、およびシゲラ属菌が挙げられる。本発明は特に、多剤耐性株の発生増大が観察されてきたグラム陰性細菌の場合に有利であり、ここでは特に関連する例として緑膿菌に重点を置く。
【００９５】
既に上述の通りグラム陰性細菌に感染した場合に抗生物質を使用することにより、かつ抗生物質の投与によって誘発される細胞溶解の結果として、エンドトキシン分布の増大が発生しており、あるいは発生するおそれがある。エンドトキシン分布の増大は、例えば好ましくはＰＢＰ‐３（ペニシリン結合タンパク質３）に結合する抗生物質、例えばセファロスポリン類で最も一般的に使用されるセフタジジムのような抗生物質に対して記載されている。したがって本発明は、抗生物質の投与およびサイトカインの誘発によって引き起こされるエンドトキシン分布に対抗するために、細菌感染症の抗生物質による従来の治療の範囲で、追加の治療または予防手段として有利に使用される。
【００９６】
さらなる態様では、本発明は、慢性肝不全の場合に、急性肝不全または急性代償不全の結果としての炎症反応、特に全身性炎症反応（ＳＩＲＳ）、敗血症、多臓器不全を伴う重症敗血症、または敗血症性ショックの予防または治療に有利に使用される。肝機能が無傷の患者では、腸管から血流内に入り込んだエンドトキシンは、エンドサイトーシスによって細網内皮系（ＲＥＳ）またはクッパー細胞から除去される。慢性肝不全のある患者では急性代償不全が発生することがある。この場合、正常な腸管内細菌叢のエンドトキシンは腸管バリアを通過し、かつしたがって妨害されずに肝臓に入り込み、全身性炎症反応（ＳＩＲＳ）、敗血症、多臓器不全を伴う重症敗血症、または敗血症性ショックを導く。
【００９７】
本発明はまた、内毒血症により引き起こされる状態または状況を本発明に係る体外灌流装置によって予防または治療する方法にも関する。上述の定義および展開は、この方法にも同等に適用される。
【００９８】
本発明に係る灌流装置によって患者の治療を開始する前に、迅速に分解ししかつリポペプチド血清中濃度を好ましくは０．０１μｇ／ｍｌから０．８μｇ／ｍｌに調整するために、一度ボーラス投与を行うことが好ましい。この開示の範囲内で、用語「ボーラス」は、製剤の形、好ましくは注射または輸液製剤の形によるエンドトキシン結合リポペプチドの単回非経口投与を意味すると理解される。ボーラス投与は、本発明に係る装置の上述した全ての実施形態に関連して有利に使用することができる。ボーラス投与のための注射液の例は、以下の実施例４に明記する。
【００９９】
本発明について、非限定実施例および図面に基づいて以下で詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】開放型濾液回路を備え、濾液回路に配置された枯渇剤がポリミキシンＢのための分注手段としても働く、本発明に係る体外灌流装置の実施形態の略図を示す。
【図２】閉鎖型濾液回路を備え、濾液回路に配置された枯渇剤がポリミキシンのための分注手段としても働く、本発明に係る体外灌流装置のさらなる実施形態の略図を示す。
【図３】開放型濾液回路およびポリミキシン用の投与装置を備えた、本発明に係る体外灌流装置のさらなる実施形態の略図を示す。
【図４】閉鎖型濾液回路およびポリミキシン用の投与装置を備えた、本発明に係る体外灌流装置の２つのさらなる実施形態の略図を示す。
【図５】開放型濾液回路を備え、ポリミキシン用の分注手段が濾液回路の枯渇剤の下流に配置された、本発明に係る体外灌流装置のさらなる実施形態の略図を示す。
【図６】閉鎖型濾液回路を備え、ポリミキシン用の分注手段が微粒子懸濁液として濾液回路に存在する、本発明に係る体外灌流装置のさらなる実施形態の略図を示す。
【図７】開放型濾液回路と、体外血液回路のフィルタの下流に配置されたポリミキシンを分注するための透析器とを備えた、本発明に係る体外灌流装置のさらなる実施形態の略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【０１０１】
図１は体外灌流装置１００（体外血液浄化装置１００）の略図を示す。灌流装置１００は、患者１０１からフィルタ１０４までの動脈流入部１０２ａ（動脈分枝）と、フィルタ１０４から患者１０１までの静脈流出部１０２ｂ（静脈分枝）とを備えた体外血液回路１０２を有する。患者の血液は血液ポンプ１０３（治療方法によってポンプ速度ＱBlut＝６０〜３００ｍｌ／分）によって血液回路１０２内を運ばれる。フィルタ１０４は、モル質量が３４００００ｇ／モル（３４０ｋＤａ）の物質に対し５％のふるい係数を有し、ここではAlbuflow（登録商標）型のフィルタ（製造者：Fresenius Medical Care；材料：ポリスルホン中空繊維；ふるい係数はアルブミンに対しては０．６以上、フィブリノゲンに対しては０．１以下）である。血漿の一部（＝分画血漿）はフィルタ１０４によって濾別され、濾液回路１０５に送られる。相対モル質量が３４０ｋＤａの物質に対するふるい係数が５％のフィルタは、フィブリノゲン、免疫グロブリン、ＬＤＬ、ＨＤＬ等のような高分子血漿成分が保持される一方、アルブミンまたはタンパク質Ｃのようなより小さい血液成分がフィルタ膜を通過するように、分画血漿を通過させる。濾液回路１０５は、フィルタ１０４の下流で静脈分枝１０２ｂ内に通じる開放型回路として形成される。分画血漿は濾液ポンプ１０６（ポンプ速度Ｑfrakt.Plasma＝ＱBlutの１５〜２０％）によって濾液回路１０５内を運ばれる。灌流装置１００には装置１００の自動制御のためのコントローラ１１０も割り当てられ、前記コントローラは信号接続を介してポンプ１０３、１０６にも接続される。コントローラ１１０はまた中央データ収集およびデータ出力もできるように構成されることが有用である。
【０１０２】
濾液回路１０５内を運ばれる分画血漿は、濾液回路１０５に配置されたカラム１０７に誘導される。カラム１０７は中性の疎水性表面を有する担体から形成された吸着床１０７ａを含み、担体表面はリポペプチド分子、ここではポリミキシンから形成された吸着性コーティングを有する。図１において、担体は１２０μｍの平均粒径および１５ないし２０ｎｍの平均細孔径を有するポリスチレンジビニルベンゼンポリマであり、ポリマの表面はポリミキシンによる吸着性コーティングを有する（ポリミキシンで被覆されたポリマの生産、実施例１参照）。したがって吸着床１０７ａは一方では、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１０のようなサイトカインのための枯渇剤として機能し、これらは担体に吸着され、血漿から除去される。他方では、吸着床１０７ａは、濾液回路１０５内を運ばれる分画血漿に非常に少量のポリミキシンを連続的に分注することによって、ポリミキシンを血漿中に連続的に分注するための分注手段としても働く（脱着）。ポリミキシンはそこから体外血液回路１０２の静脈流出部１０２ｂ内に入り、そこで血液中に存在するエンドトキシンとの複合体を形成し、これらを無害にする。
【０１０３】
図２は体外灌流装置２００（体外血液浄化装置２００）の略図を示す。灌流装置２００は、患者２０１からフィルタ２０４までの動脈流入部２０２ａ（動脈分枝）と、フィルタ２０４から患者２０１までの静脈流出部２０２ｂ（静脈分枝）とを備えた体外血液回路２０２を有する。患者の血液は、血液ポンプ２０３（ポンプ速度ＱBlut＝３０〜７０ｍｌ／分）によって血液回路２０２内を運ばれる。フィルタ２０４は、モル質量が３４００００ｇ／モル（３４０ｋＤａ）の物質に対し５％のふるい係数を有し、ここではAlbuflow（登録商標）型のフィルタ（製造者：Fresenius Medical Care；材料：ポリスルホン中空繊維；ふるい係数はアルブミンに対しては０．６以上、フィブリノゲンに対しては０．１以下）である。血漿の一部（＝分画血漿）は血漿フィルタ２０４によって濾別され、濾液回路２０５に送られる。相対モル質量が３４０ｋＤａの物質に対するふるい係数が５％のフィルタは、フィブリノゲン、免疫グロブリン、ＬＤＬ、ＨＤＬ等のような高分子血漿成分が保持される一方、アルブミンまたはタンパク質Ｃのようなより小さい血液成分はフィルタ膜を通過するように、分画血漿を通過させる。濾液回路２０５は濾液領域で閉鎖型回路として形成され、分画血漿は濾液ポンプ２０６（ポンプ速度Ｑfrakt.Plasma＝ＱBlutの１５〜２５％）によって濾液回路２０５内を運ばれる。灌流装置２００には装置２００の自動制御のためのコントローラ２１０も割り当てられ、前記コントローラは信号接続を介してポンプ２０３、２０６にも接続される。コントローラ２１０はまた中央データ収集およびデータ出力もできるように構成されることが有用である。
【０１０４】
濾液回路２０５内を運ばれる分画血漿は、濾液回路２０５に配置されたカラム２０７に誘導される。カラム２０７は中性の疎水性表面を有する担体から形成された吸着床２０７ａを含み、担体表面はリポペプチド分子、ここではポリミキシンから形成された吸着性コーティングを有する。図２において、担体は１２０μｍの平均粒径および１５ないし２０ｎｍの平均細孔径を有するポリスチレンジビニルベンゼンポリマであり、ポリマの表面はポリミキシンによる吸着性コーティングを有する（ポリミキシンで被覆されたポリマの生産、実施例１参照）。したがって吸着床２０７ａは一方では、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１０のようなサイトカインのための枯渇剤として機能し、これらは担体に吸着され、血漿から除去される。他方では、吸着床２０７ａは、濾液回路２０５内を運ばれる分画血漿に非常に少量のポリミキシンを連続的に分注することによって、ポリミキシンを血漿中に連続的に分注するための分注手段としても働く（脱着）。ポリミキシンはそこから体外血液回路２０２内に入る。次いでポリミキシン分子は、血液中に存在するエンドトキシンとの複合体を形成する。
【０１０５】
図３は体外灌流装置３００（体外血液浄化装置３００）の略図を示す。灌流装置３００は、患者３０１からフィルタ３０４までの動脈流入部３０２ａ（動脈分枝）と、フィルタ３０４から患者３０１までの静脈流出部３０２ｂ（静脈分枝）とを備えた体外血液回路３０２を有する。患者の血液は、血液ポンプ３０３（ポンプ速度ＱBlut＝６０〜３００ｍｌ／分）によって血液回路３０２内を運ばれる。フィルタ３０４は、モル質量が３４００００ｇ／モル（３４０ｋＤａ）の物質に対し５％のふるい係数を有し、ここではAlbuflow（登録商標）型のフィルタ（製造者：Fresenius Medical Care；材料：ポリスルホン中空繊維；ふるい係数はアルブミンに対しては０．６以上、フィブリノゲンに対しては０．１以下）である。血漿の一部（＝分画血漿）はフィルタ３０４によって濾別され、濾液回路３０５に送られる。相対モル質量が３４０ｋＤａの物質に対するふるい係数が５％のフィルタは、フィブリノゲン、免疫グロブリン、ＬＤＬ、ＨＤＬ等のような高分子血漿成分が保持される一方、アルブミンまたはタンパク質Ｃのようなより小さい血液成分がフィルタ膜を通過するように、分画血漿を通過させる。濾液回路３０５は、フィルタ３０４の下流で静脈分枝３０２ｂ内に通じる開放型回路として形成される。分画血漿は濾液ポンプ３０６（ポンプ速度Ｑfrakt.Plasma＝ＱBlutの１５〜２５％）によって濾液回路３０５内を運ばれる。
【０１０６】
濾液回路３０５内を運ばれる分画血漿は、濾液回路３０５に配置されたカラム３０７に誘導される。カラム３０７は中性の疎水性表面を有する担体から形成された吸着床３０７ａを含む。図３において、担体は１２０μｍの平均粒径および１５ないし２０ｎｍの平均細孔径を有するポリスチレンジビニルベンゼンポリマである。吸着床３０７ａは、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１０のようなサイトカインを担体に吸着させ、それらを血漿から除去することによって、これらの枯渇剤として機能する。
【０１０７】
エンドトキシン結合リポペプチドを分注するために、灌流装置３００には、リポペプチド輸液、ここではポリミキシン輸液が入った輸液容器３０９（例えば輸液ボトルまたは輸液バッグ）と、輸液チューブ３１１と、輸液ポンプ３１２とを備えた、それ自体公知の輸液装置３０８が割り当てられる。適切な輸液については以下に実施例５でさらに詳述する。ポリミキシンは、リポペプチド供給ポイント３１３で体外血液回路３０２の静脈流出部３０２ｂに注入される。次いでポリミキシン分子は、血液中に存在するエンドトキシンと複合体を形成する。
【０１０８】
図３はまた、ポリミキシンセンサ３１４がフィルタ３０４の下流およびリポペプチド供給ポイント３１３の上流に配置された、有利な展開を示す。例として、Jiangらによって以前に記載されたポリミキシンセンサ（Jiang et al.2004.A synthetic peptide derived from bactericidal/permeability‐increasing protein neutralizes endotoxin in vitro and in vivo.International Immunopharmacology 4:527‐537）をこの目的に使用することができる。測定のために、体外血液回路３０２から分岐管を介して少量の血液をセンサ３１４に運び、ポリミキシンの濃度が決定された後、廃棄することが好ましい。灌流装置３００には装置３００の自動制御のためのコントローラ３１０も割り当てられ、前記コントローラはポンプ３０３、３０６、３１１にも接続され、該当する場合には、信号接続を介してポリミキシンセンサ３１４にも接続される。コントローラ３１０は中央データ収集およびデータ出力もできるように構成することが好都合である。灌流装置３００にはコントローラ３１０によって制御される制御回路を割り当てることもでき、輸液ポンプ３１２を作動させることによって、ポリミキシンの注入量は、センサ３１４によって測定されたポリミキシン現在値（ポリミキシン血清中濃度）に応じて、予め定められた目標値または目標値範囲に関連して制御される。ポリミキシン血清中濃度の目標値または目標値範囲は通常、０．０１〜０．８μｇ／ｍｌの範囲である。
【０１０９】
図４は体外灌流装置４００（体外血液浄化装置４００）の略図を示す。灌流装置４００は、患者４０１からフィルタ４０４までの動脈流入部４０２ａ（動脈分枝）と、フィルタ４０４から患者４０１までの静脈流出部４０２ｂ（静脈分枝）とを備えた体外血液回路４０２を有する。患者の血液は血液ポンプ４０３（ポンプ速度ＱBlut＝６０〜３００ｍｌ／分）によって血液回路４０２内を運ばれる。フィルタ４０４は、モル質量が３４００００ｇ／モル（３４０ｋＤａ）の物質に対し５％のふるい係数を有し、ここではAlbuflow（登録商標）型のフィルタ（製造者：Fresenius Medical Care；材料：ポリスルホン中空繊維；ふるい係数はアルブミンに対しては０．６以上、フィブリノゲンに対しては０．１以下）である。血漿の一部（＝分画血漿）はフィルタ４０４によって濾別され、濾液回路４０５に送られる。相対モル質量が３４０ｋＤａの物質に対するふるい係数が５％のフィルタは、フィブリノゲン、免疫グロブリン、ＬＤＬ、ＨＤＬ等のような高分子血漿成分が保持される一方、アルブミンまたはタンパク質Ｃのようなより小さい血液成分がフィルタ膜を通過するように、分画血漿を通過させる。濾液回路４０５は濾液領域で閉鎖型回路として形成され、分画血漿は濾液ポンプ４０６（ポンプ速度Ｑfrakt.Plasma＝ＱBlutの１５〜２５％）によって濾液回路４０５内を運ばれる。
【０１１０】
濾液回路４０５内を運ばれる分画血漿は、濾液回路４０５に配置されたカラム４０７に誘導される。カラム４０７は中性の疎水性表面を有する担体から形成された吸着床４０７ａを含む。図４において、担体は１２０μｍの平均粒径および１５ないし２０ｎｍの平均細孔径を有するポリスチレンジビニルベンゼンポリマである。吸着床４０７ａは、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１０のようなサイトカインを担体に吸着させてそれらを血漿から除去することによって、それらの枯渇剤として機能する。
【０１１１】
エンドトキシン結合リポペプチドを分注するために、灌流装置４００は、リポペプチド輸液、ここではポリミキシン輸液が入った輸液容器４０９（例えば輸液ボトルまたは輸液バッグ）と、輸液チューブ４１１と、輸液ポンプ４１２とを備えたそれ自体公知の輸液装置４０８である。適切な輸液については以下に実施例５でさらに詳述する。ポリミキシンは、リポペプチド供給ポイント４１３で体外血液回路４０２の静脈流出部４０２ｂに注入される。次いでポリミキシン分子は、血液中に存在するエンドトキシンと複合体を形成する。
【０１１２】
図３と同様に、図４はさらに、フィルタ４０４の下流およびリポペプチド供給ポイント４１３の上流にポリミキシンセンサ４１４が配置された有利な展開を示す。例として、Jiangらによって以前に記載されたポリミキシンセンサ（Jiang et al.2004.A synthetic peptide derived from bactericidal/permeability‐increasing protein neutralizes endotoxin in vitro and in vivo.International Immunopharmacology 4:527‐537）をこの目的に使用することができる。測定のために、体外血液回路４０２から分岐管を介して少量の血液をセンサ４１４に運び、ポリミキシンの濃度が決定された後、廃棄することが好ましい。灌流装置４００には装置４００の自動制御のためのコントローラ４１０も割り当てられ、前記コントローラはポンプ４０３、４０６、４１１にも接続され、該当する場合には、信号接続を介してポリミキシンセンサ４１４にも接続される。コントローラ４１０は中央データ収集およびデータ出力もできるように構成することが好都合である。灌流装置４００にはコントローラ４１０によって制御される制御回路を割り当てることもでき、輸液ポンプ４１２を作動させることによって、ポリミキシンの注入量は、センサ４１４によって測定されたポリミキシン現在値（ポリミキシン血清中濃度）に応じて、予め定められた目標値または目標値範囲に関連して制御される。ポリミキシン血清中濃度の目標値または目標値範囲は通常、０．０１〜０．８μｇ／ｍｌの範囲である。
【０１１３】
図５は体外灌流装置５００（体外血液浄化装置５００）の略図を示す。灌流装置５００は、患者５０１からフィルタ５０４までの動脈流入部５０２ａ（動脈分枝）と、フィルタ５０４から患者５０１までの静脈流出部５０２ｂ（静脈分枝）とを備えた体外血液回路５０２を有する。患者の血液は血液ポンプ５０３（ポンプ速度ＱBlut＝６０〜３００ｍｌ／分）によって血液回路５０２内を運ばれる。フィルタ５０４は、モル質量が３４００００ｇ／モル（３４０ｋＤａ）の物質に対し５％のふるい係数を有し、ここではAlbuflow（登録商標）型のフィルタ（製造者：Fresenius Medical Care；材料：ポリスルホン中空繊維；ふるい係数はアルブミンに対しては０．６以上、フィブリノゲンに対しては０．１以下）である。血漿の一部（＝分画血漿）はフィルタ５０４によって濾別され、濾液回路５０５に送られる。相対モル質量が３４０ｋＤａの物質に対するふるい係数が５％のフィルタは、フィブリノゲン、免疫グロブリン、ＬＤＬ、ＨＤＬ等のような高分子血漿成分が保持される一方、アルブミンまたはタンパク質Ｃのようなより小さい血液成分がフィルタ膜を通過するように、分画血漿を通過させる。濾液回路５０５は、フィルタ５０４の下流で静脈分枝５０２内に通じる開放型回路として形成される。分画血漿は濾液ポンプ５０６（ポンプ速度Ｑfrakt.Plasma＝ＱBlutの１５〜２５％）によって濾液回路５０５内を運ばれる。灌流装置５００には、装置５００の自動制御のためのコントローラ５１０も割り当てられ、前記コントローラは信号接続を介してポンプ５０３、５０６にも接続される。コントローラ５１０はまた中央データ収集およびデータ出力もできるように構成されることが有用である。図５において、濾液回路５０５は開放型回路として形成される。しかし、濾液回路５０５は閉鎖型回路として形成することもできる。
【０１１４】
濾液回路５０５内を運ばれる分画血漿は、濾液回路５０５に配置されたカラム５０７に誘導される。カラム５０７は中性の疎水性表面を有する担体から形成された吸着床５０７ａを含む。図５において、担体は１２０μｍの平均粒径および１５ないし２０ｎｍの平均細孔径を有するポリスチレンジビニルベンゼンポリマである。吸着床５０７ａは、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１０のようなサイトカインを担体に吸着させてそれらを血漿から除去することによって、それらの枯渇剤として機能する。
【０１１５】
リポペプチドを分注するために、さらなるカラム５０８がカラム５０７の下流で濾液回路５０５に配置される。カラム５０８は、中性の疎水性表面を有する担体から形成された担体床５０８ａを含み、担体表面はリポペプチド分子、ここではポリミキシンから形成された吸着性コーティングを有する。図５において、担体は１２０μｍの平均粒径および１５ないし２０ｎｍの平均細孔径を有するポリスチレンジビニルベンゼンポリマであり、ポリマの表面はポリミキシンによる吸着性コーティングを有する（ポリミキシンで被覆されたポリマの生産、実施例１参照）。担体床５０８ａは、濾液回路５０５内を運ばれる分画血漿に非常に少量のポリミキシンを連続的に分注することによって、ポリミキシンを血漿中に連続的に分注するための分注手段として働く（脱着）。ポリミキシンはそこから体外血液回路５０２内に入る。次いでポリミキシン分子は、血液中に存在するエンドトキシンと複合体を形成する。
【０１１６】
図６は体外灌流装置６００（体外血液浄化装置６００）の略図を示す。灌流装置６００は、患者６０１からフィルタ６０４までの動脈流入部６０２ａ（動脈分枝）と、フィルタ６０４から患者６０１までの静脈流出部６０２ｂ（静脈分枝）とを備えた体外血液回路６０２を有する。患者の血液は、血液ポンプ６０３（ポンプ速度ＱBlut＝６０〜３００ｍｌ／分）によって血液回路６０２内を運ばれる。フィルタ６０４は、モル質量が３４００００ｇ／モル（３４０ｋＤａ）の物質に対し５％のふるい係数を有し、ここではAlbuflow（登録商標）型のフィルタ（製造者：Fresenius Medical Care；材料：ポリスルホン中空繊維；ふるい係数はアルブミンに対しては０．６以上、フィブリノゲンに対しては０．１以下）である。血漿の一部（＝分画血漿）はフィルタ６０４によって濾別され、濾液回路６０５に送られる。相対モル質量が３４０ｋＤａの物質に対するふるい係数が５％のフィルタは、フィブリノゲン、免疫グロブリン、ＬＤＬ、ＨＤＬ等のような高分子血漿成分が保持される一方、アルブミンまたはタンパク質Ｃのようなより小さい血液成分がフィルタ膜を通過するように、分画血漿を通過させる。濾液回路６０５は濾液領域で閉鎖型回路として形成され、分画血漿は濾液ポンプ６０６（ポンプ速度Ｑfrakt.Plasma＝ＱBlutの１５〜２５％）によって濾液回路６０５内を運ばれる。
【０１１７】
灌流装置６００には装置６００の自動制御のためのコントローラ６１０も割り当てられ、前記コントローラは信号接続を介してポンプ６０３、６０６にも接続される。コントローラ６１０はまた中央データ収集およびデータ出力もできるように構成されることが好都合である。
【０１１８】
ここで、枯渇剤／分注手段６０７としての濾液回路６０５は、担体６０７ａの懸濁液（詳細には図示せず）を含み、すなわち枯渇剤／分注手段６０７つまり担体６０７ａは微粒子状であり、分画血漿中に分散された懸濁液として存在し、懸濁液として濾液回路６０５内を循環する。微粒子状の担体６０７ａは中性の疎水性表面を有し、担体表面はリポペプチド分子、ここではポリミキシンから形成された吸着性コーティングを有する。図６において、担体６０７ａは、５μｍ＋／−３〜４μｍの平均粒径および１５ないし２０ｎｍの平均細孔径を持つポリスチレンジビニルベンゼンポリマ（ポリマ入手源：Rohm&Haas）であり、ポリマの表面はポリミキシンによる吸着性コーティングを有する（ポリミキシンで被覆されたポリマの生産、実施例１参照）。したがって、微粒子状の担体６０７ａは一方では、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１０のようなサイトカインを担体に吸着させてそれらを血漿から除去することによって、それらの枯渇剤として機能する。他方では、微粒子状の担体６０７ａは、濾液回路６０５内を運ばれる分画血漿に非常に少量のポリミキシンを連続的に分注することによって、ポリミキシンを血漿中に連続的に分注するための分注手段としても働く（脱着）。そこからポリミキシンは体外血液回路６０２内に移動する。次いでポリミキシン分子は、血液中に存在するエンドトキシンと複合体を形成する。
【０１１９】
図７は体外灌流装置７００（体外血液浄化装置７００）の略図を示す。灌流装置７００は、患者７０１からフィルタ７０４までの動脈流入部７０２ａ（動脈分枝）と、フィルタ７０４から患者７０１までの静脈流出部７０２ｂ（静脈分枝）とを備えた体外血液回路７０２を有する。患者の血液は、血液ポンプ７０３（ポンプ速度ＱBlut＝６０〜３００ｍｌ／分）によって血液回路７０２内を運ばれる。フィルタ７０４は、モル質量が３４００００ｇ／モル（３４０ｋＤａ）の物質に対し５％のふるい係数を有し、ここではAlbuflow（登録商標）型のフィルタ（製造者：Fresenius Medical Care；材料：ポリスルホン中空繊維；ふるい係数はアルブミンに対しては０．６以上、フィブリノゲンに対しては０．１以下）である。血漿の一部（＝分画血漿）はフィルタ７０４によって濾別され、濾液回路７０５に送られる。相対モル質量が３４０ｋＤａの物質に対するふるい係数が５％のフィルタは、フィブリノゲン、免疫グロブリン、ＬＤＬ、ＨＤＬ等のような高分子血漿成分が保持される一方、アルブミンまたはタンパク質Ｃのようなより小さい血液成分がフィルタ膜を通過するように、分画血漿を通過させる。濾液回路７０５は、フィルタ７０４の下流で静脈分枝７０２ｂ内に通じる開放型回路として形成される。分画血漿は濾液ポンプ７０６（ポンプ速度Ｑfrakt.Plasma＝ＱBlutの１５〜２５％）によって濾液回路７０５内を運ばれる。図７において、濾液回路７０５は開放型回路として形成される。しかし、濾液回路７０５は閉鎖型回路として形成することもできる。
【０１２０】
濾液回路７０５内を運ばれる分画血漿は、濾液回路７０５に配置されたカラム７０７に誘導される。カラム７０７は中性の疎水性表面を有する担体から形成された吸着床７０７ａを含む。図７において、担体は１２０μｍの平均粒径および１５ないし２０ｎｍの平均細孔径を有するポリスチレンジビニルベンゼンポリマである。吸着床７０７ａは、ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１０のようなサイトカインを担体に吸着させてそれらを血漿から除去することによって、それらの枯渇剤として機能する。
【０１２１】
リポペプチドを分注するために、透析器７０８（透析用フィルタ７０８）が体外血液回路７０２の静脈分枝７０２ｂに配置される。透析器で、血液は半透膜を介して透析液と接触する。透析液は透析液ポンプ７０９によって透析液流入部７０８ａを介して透析器７０８に送り込まれる。透析器７０８内を通過した後、透析液は透析液流出部７０８ｂを介して取り出され、廃棄される。リポペプチド、ここではポリミキシンは、透析液によって血液に送られる。図７に示す実施形態では、透析器７０８はリポペプチド（ポリミキシン）を体外血液回路７０２内に分注するための分注手段として働く。次いでポリミキシン分子は、血液中に存在するエンドトキシンと複合体を形成する。
【０１２２】
透析器７０８は、ＰＶＰ（ポリビニルピロリドン）を配合することによって製造された、１．４〜２．０ｍ2の表面を持つ親水性ポリスルホン膜を備えることが好ましい。例として、これらの膜は、Fresenius Medical Care社製のフィルタ、とりわけモデルＡＦ１０００およびＦＸ６０に使用されている。これらの透析用フィルタは、アルブミンに対し０．１％未満のふるい係数を有する。アルブミンに対し約４％のふるい係数を有する、同じく親水性ポリスルホン膜の使用に基づいた、ハイカットオフフィルタとして知られるものを使用することも考えられる。透析条件下で、すなわち除去するように意図された物質の拡散制御除去が主に使用されるときに、アルブミン損失は１回の処置当たり５〜１０ｇ未満である。Fresenius Medical Care社によって製造されたＥＭｉＣ2フィルタは、このタイプの透析用フィルタの例として挙げることができる。このタイプのフィルタが臨床用途で動作する流動条件は、使用条件によって６０〜３００ｍｌ／分の血流量が得られるようにそれに応じて選択される。持続的静静脈血液透析として知られる条件下では、６０〜８０ｍｌ／分の血流量が使用される一方、敗血症の場合にも非常に頻繁に発生する、急性症例すなわち急性腎不全の患者における透析装置支援間欠的血液透析の場合、１５０〜３００ｍｌ／分の血流量が使用される。間欠的血液透析の場合の透析液の流量は５００ｍｌ／分に設定することが好ましい一方、持続的静静脈血液透析の場合、血流量に対し１：１の比率の透析液流量が一般的である。上述した透析用フィルタのふるい係数は０．８（ＡＦ１０００）から０．９（ＥＭｉＣ2）の間、すなわち８０％から９０％の間であるので、透析液中のリポペプチド／ポリミキシンの濃度は０．２〜１．０μｇ／ｌの範囲とすべきであり、すなわち治療対象患者の管理された血清中濃度値よりわずかに高くすべきである。
【０１２３】
灌流装置７００は、装置７００の自動制御のために、コントローラ７１０も割り当てられる。コントローラ７１０は信号接続を介してポンプ７０３、７０６、７０９にも接続される。コントローラ７１０はまた中央データ収集およびデータ出力ができるように構成されることも好都合である。
【０１２４】
１．実施例１：  様々にＰＭＢを被覆された担体（平均粒径：１２０μｍ、平均細孔径：１５〜２０ｎｍ）による血漿および分画血漿のポリミキシンＢ（ＰＭＢ）脱着（Albuflowフィルタの使用）
１．１  ＰＭＢコーティング
担体：Amberchrom CG161c（ポリスチレンジビニルベンゼンコポリマ、Dow Chemical Company）、平均粒径１２０μｍ、平均細孔径１５ｎｍ；アクセス可能な表面はポリマ（乾燥）１ｇ当たり９００ｍ2。湿潤担体１ｍｌ当たりの乾燥重量は１８％（ｗ／ｖ）。
ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）：硫酸ポリミキシンＢ（Sigma Aldrich）
【０１２５】
ＰＭＢ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ蒸留水）を１２１℃で３０分間オートクレーブし、次いで１５ｍｌのグライナーチューブ（Greiner tube）内で担体にＰＭＢを以下（表１．１）の通り、すなわち３ｍｌの担体に７．５ｍｌのＰＭＢ溶液を用いて、被覆させる。
【表１】
2015522577.tif 000003
【０１２６】
室温でロールミキサでコーティングを一晩かけて実行する。次いで担体を１０ｍｌのＮａＣｌ溶液（無菌）で二回洗浄して、５０％懸濁液を生成する。
【０１２７】
１．２  バッチ試験
Albuflow（登録商標）フィルタ（ドイツ国Fresenius Medical Care社製）を用いて新鮮凍結血漿（クエン酸血漿）を分画化し、全血漿と共に−２０℃で凍結した。
Ａ：全血漿
Ｂ：分画血漿
【表２】
2015522577.tif 000004
【０１２８】
デュプリケート法で（表１．２参照）、Enviro‐genieを用いて、担体を０．５ｍｌずつ、４．５ｍｌ血漿＝１０％（ｖ／ｖ）法により３７℃で６０分培養する。次いで担体を遠心分離し、上澄みを使用してＥＬＩＳＡによりＰＭＢを定量する（中国Beijing Kwinbon Biotechnology Co.,Ltd.社製ポリミキシンＥＬＩＳＡ）。
【０１２９】
１．３  結果
ＰＭＢ濃度が高くなると、担体を被覆するために使用されたＰＭＢ溶液は、血漿中の多量のＰＭＢを脱着する。結果を図８に示す（ＰＭＢコーティング濃度によるＰＭＢの脱着）。
【０１３０】
脱着により分画血漿で約１５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＢ血漿レベルを達成するために、この試験に使用する担体は、吸着体１ｍｌ当たり１０ｍｇのＰＭＢを被覆しなければならない。
【０１３１】
２．実施例２：  血清中に様々なＰＭＢ被覆担体を含むエンドトキシンバッチ
２．１  試験構造
コンディショニングされた担体（Amberchrom CG161c：エチルビニルベンゼンジビニルベンゼンコポリマ（Dow Chemical Company、平均粒径１２０μｍ、平均細孔径１５ｎｍ）に、様々な量のポリミキシンＢ（ＰＭＢ）すなわち湿潤担体１ｇ当たり０、５、１０、１５、および２５ｍｇを被覆する。これらをエンドトキシンバッチ試験でトリプリケート法により血清中のＬＰＳの不活化について試験する。
【０１３２】
２．２  試験の実施
ＰＭＢコーティング
様々なＰＭＢ濃度（湿潤担体１ｇ当たり５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、および２５ｍｇ）の担体試料を作成する（上記実施例１のプロトコール参照）。ＰＭＢ溶液（１０ｍｇ／ｍｌ蒸留水）および５０％懸濁液中の担体を１２１℃で３０分間オートクレーブし、１５ｍｌのグライナーチューブで担体に次の通りＰＭＢを被覆する（表２．２）。
【表３】
2015522577.tif 000005
【０１３３】
オーバヘッドシェーカ（overhead shaker）（Enviro‐Genie、振動数：２５：５０）で室温で４時間コーティングを実行する。次いで担体を１０ｍｌのＮａＣｌ溶液（無菌）で二回洗浄し、５０％の懸濁液を生成する。
【０１３４】
血清の生成：
８ｍｌを測定する７本の採血管（凝固活性化用の血清ビーズ入りvacuette）をドナーから取り外す。血液が充填された管を３０分間静置する。次いで凝固した血液を遠心分離して血清を得る（無菌三角フラスコ内で冷却する）。
エンドトキシン（ＬＰＳ）溶液：
ＬＰＳ：緑膿菌、Ｌ‐７０１８、Sigma社バッチ：１２８Ｋ４１１５、−７０℃で保存、１０-3ｇ／ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）で１００μｌ
【０１３５】
このＬＰＳ保存液から無菌ＮａＣｌ溶液で濃度１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ溶液を生成する。ＬＰＳを５ｎｇ／ｍｌの最終濃度でバッチに使用する。濃度１０μｇ／ｍｌのＬＰＳ溶液１０μｌをピペットで２０ｍｌの血清に移す。バッチ試験は２ｍｌの血液試料採取管でトリプリケート法で実施する。
【０１３６】
２．３  結果：
最低濃度の被覆ＰＭＢでも５０％を超えるＬＰＳ不活化を達成することができた。結果を図９に示す（ＥＵ＝エンドトキシン単位）。
【０１３７】
３．実施例３：  大腸菌および緑膿菌由来のエンドトキシンに基づくポリミキシン濃度によるエンドトキシン（ＬＰＳ）の不活化
３．１．目的
この試験の目的は、血漿中のポリミキシンＢ（ＰＭＢ）濃度依存エンドトキシン活性化を決定することである（バッチ試験Ｉ）。さらに、このエンドトキシン活性化の結果サイトカイン分布が阻害される程度を調査する（バッチ試験ＩＩ）。
【０１３８】
３．２  血液ドナー
５ＩＵのヘパリンを添加した９本の血液試料採取管（各管が９ｍｌを測定）をドナーから取り外す。血漿を遠心分離し、細胞ペレットをロールミキサで培養する。血漿にエンドトキシン（ＬＰＳ）を添加し、バッチ試験Ｉに使用する：
【０１３９】
３．３  ＬＰＳ添加ポリミキシンＢ溶液およびバッチ試験Ｉ
ＬＰＳ：緑膿菌（Ｌ‐７０１８、Sigma社バッチ：１２８Ｋ４１１５、−７０℃、１０-3ｇ／ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）で１００μｌ）
ＬＰＳ：大腸菌（Ｌ‐４１３０、Sigma社バッチ：１１０Ｍ４０８６Ｍ、？７０℃、１０-3ｇ／ｍｌ（１ｍｇ／ｍ）で１００μｌ）
【０１４０】
ＬＰＳを０．５ｎｇ／ｍｌの最終濃度でバッチに使用する。３ｍｌの発熱物質を含まないガラスバイアルで試験を実行する。バッチ試験Ｉでは、デュプリケート法で異なるＰＭＢ濃度（Sigma社、Ｐ‐１００４）を加え、オーバヘッドシェーカで３７℃で６０分間培養する（表３．５参照）。
【０１４１】
バッチ試験Ｉでは、０（ＰＭＢ無し）、１０、１００、２５０、５００、および１０００ｎｇ／ｍｌのＰＭＢ濃度を使用する。この目的のために、下記の濃度の無菌ＰＭＢ溶液（１２１℃で９０分間オートクレーブ処理された発熱物質を含まないもの）を生成する（表３．３）：
【表４】
2015522577.tif 000006
【０１４２】
３．４  エンドトキシン分析
Charles Riverによるリムルス・アメボサイト・ライセート（Limulus Amebocyte Lysate）試験（ＬＡＬ）を用いて、エンドトキシンをＥＵ／ｍｌの形式で測定した。
【０１４３】
３．５  サイトカインバッチ（バッチ試験ＩＩ）
バッチ試験Ｉの後、ＬＰＳおよびＰＭＢを添加した血漿を、比率１：１で血液ドナーから得た細胞濃縮液に戻す（表３．５参照）。サイトカインバッチ、バッチ試験Ｉからの試料を０（ＰＭＢ無し）、２５０、５００、および１０００ｎｇ／ｍｌのＰＭＢ濃度で使用した。対照として、ＬＰＳを含まず、１０００ｎｇ／ｍｌのＰＭＢを含む試料を使用した。ロールミキサ（５回転／分）における３７℃での４時間および１２時間の培養時間後に、試料を採取し、遠心分離し、その後のサイトカイン定量化のために、５０μｌの血漿を−８０℃で凍結した。サイトカインバッチのための試験データを表３．５に記載する。
【表５】
2015522577.tif 000007
【０１４４】
３．６  結果
エンドトキシンバッチ（バッチ試験Ｉ）：
図１０は、６０分の培養後のＰＭＢ濃度（ｎ＝２）による血漿中の大腸菌由来のＬＰＳ（原ＬＰＳ濃度：０．５ｎｇ／ｍｌ）の阻害を示す。
【０１４５】
図１１は、６０分の培養後のＰＭＢ濃度（ｎ＝２）による血漿中の緑膿菌由来のＬＰＳ（原ＬＰＳ濃度：０．５ｎｇ／ｍｌ）の阻害を示す。
【０１４６】
結果は明らかに、血漿中の非常に低いＰＭＢ濃度でも、すなわち５０から３００ｎｇ／ｍｌ（０．０５から０．３μｇ／ｍｌ）の範囲で、大腸菌および緑膿菌由来のＬＰＳの強い阻害が起きることを示し、ＰＭＢ濃度が増加しても、ＬＰＳ阻害は著しく増加しなくなる。その結果、非常に低い濃度のＰＭＢでも、ＬＰＳ（エンドトキシン）の活性を阻害するのに充分である。これらの低い濃度では、神経毒性および腎毒性副作用は除外される。
【０１４７】
サイトカインバッチ（バッチ試験ＩＩ）：
４時間培養後のＬＰＳ（大腸菌）添加血漿中のＰＭＢ濃度（ＰＭＢ無し、２５０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、および１０００ｎｇ／ｍｌ；対照は１，０００ｎｇ／ｍｌでＬＰＳを含まない）毎の血液細胞によるサイトカインＴＮＦ‐アルファ（図１２）、ＩＬ‐１ベータ（図１３）、ＩＬ‐６（図１４）、およびＩＬ‐８（図１５）の分布を図３ないし図４に示す。バッチ試験ＩＩの結果は、非常に低いＰＭＢ濃度でも、ＬＰＳの強い阻害（バッチ試験Ｉ参照）だけでなく、その後もサイトカイン分布の強い阻害が起きることをはっきりと示している。これは、重要なメディエータであるＴＮＦ‐アルファの阻害の場合に特に顕著である（図１２）。
【０１４８】
４．実施例４：  ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）注射液（ボーラス投与用）の非経口投与用の製剤の調製実施例：
４．１  ＰＭＢ血清中濃度１００ｎｇ／ｍｌ血漿のボーラス投与
前提：  体重７０ｋｇで体重の６０％がＰＭＢの分布量の患者→４２０００ｍｌ分布量。
血漿１ｍｌ当たりＰＭＢ１００ｎｇのＰＭＢ血清中濃度が求められる→全部で４．２ｍｇのＰＭＢが必要である。
【０１４９】
６０分の期間にわたるボーラス投与用の注射液：  生理食塩水１００ｍｌに４．２ｍｇのＰＭＢ＝６０分の期間にわたるボーラス投与用の最終注射液。
【０１５０】
４．２  ＰＭＢ血清中濃度２５０ｎｇ／ｍｌ血漿のボーラス投与
前提：  体重７０ｋｇで体重の６０％がＰＭＢの分布量の患者→４２０００ｍｌ分布量。
血漿１ｍｌ当たりＰＭＢ２５０ｎｇのＰＭＢ血清中濃度が求められる→全部で１０．５ｍｇのＰＭＢが必要である。
【０１５１】
１２０分の期間にわたるボーラス投与用の注射液：  生理食塩水１００ｍｌに１０．５ｍｇのＰＭＢ＝１２０分の期間にわたるボーラス投与用の最終注射液。
ボーラス投与により所望のＰＭＢ血清中濃度がセットされるやいなや、これは、上述の通り、本発明に係る灌流装置に関連付けられる分注手段を用いてＰＭＢ放出により維持される。
【０１５２】
５．実施例５：  脂質供給ポイントから体外血液回路へのポリミキシンＢ（ＰＭＢ）の注入用輸液および投与指示の実施例
前提：  体重７０ｋｇの患者→ＰＭＢの分布量（体重の６０％）、体液４２０００ｍｌにＰＭＢ１００ｎｇ／ｍｌ→分布量に４．２ｍｇのＰＭＢ（２．１．１参照）。
【０１５３】
血清半減期６時間の２４時間注入用輸液：  血清中ＰＭＢの半減期を６時間と想定する：６時間にＰＭＢ２．１ｍｇすなわちＰＭＢ８．４ｍｇ／日が分解される→生理食塩水１ＬにＰＭＢ８．４ｍｇ＝２４時間注入用輸液。
【０１５４】
血清半減期１４時間の２４時間注入用輸液：  血清中ＰＭＢの半減期は１４時間：１４時間にＰＭＢ４．２ｍｇすなわちＰＭＢ７．２ｍｇ／日が分解される→生理食塩水１ＬにＰＭＢ７．２ｍｇ＝２４時間注入用輸液。
【０１５５】
６．実施例６：  灌流装置のＰＭＢ全クリアランスを考慮に入れた脂質供給ポイントから体外血液回路へのポリミキシンＢ（ＰＭＢ）注入の投与指示
以下の計算実施例は、ＰＭＢの患者クリアランスの他に、体外血液回路に配置された透析器（透析用フィルタ）のクリアランスおよび枯渇剤の担体のクリアランスをも考慮に入れている。計算実施例は既存のＰＭＢの血清中濃度を前提とする。これは処置の開始前のボーラスの投与によってもたらされ、実施例４で記載した注射液をこの目的に使用することができる。
【０１５６】
脂質供給ポイントから体外血液回路への注入を介するポリミキシンＢの投与の計算のために、患者の身体、透析器、および枯渇剤のＰＭＢクリアランスを考慮する。
―ＰＭＢの透析クリアランス（ＣＤｉａｌ）は実験で決定することができ、血漿流量  および使用する透析用フィルタの種類にも依存する。特定の実施例では、これは６０ｍ  ｌ／分である。
―枯渇剤のＰＭＢクリアランス（Ｃａｄｓ）は使用する担体材料および濾液流量にも  依存する。特定の実施例ではこれは４５ｍｌ／分である。
―ＰＭＢの患者クリアランスは、特定の実施例で、１３．６のＰＭＢの半減期から決  定された。それは３６ｍｌ／分である。
【０１５７】
ＰＭＢの全クリアランス（Ｃｔｏｔａｌ）は、個々のＰＭＢクリアランス速度から加算によって得られる。結果としてのＰＭＢの低下を図１６に示す。図１６で明瞭な特定の瞬間におけるＰＭＢ減少（Ｃｔｏｔａｌ）の明らかな低下は、関連する瞬間のＰＭＢ血清中濃度を維持するために必要なＰＭＢの注入に対応する。
【０１５８】
特定の実施例に対し次の注入速度が与えられる：
＝＞透析および吸着による処置中、ＰＭＢ０．８４ｍｇ／時
６時間の体外処置により、以下の注入しなければならないＰＭＢ量がここから得られる。
６時間の透析および吸着による処置：  ５．１ｍｇ
【０１５９】
７．実施例７：  Albuflowフィルタの使用によるサイトカインの吸着の改善（血漿および分画血漿の比較）
７．１  サイトカイン吸着バッチ試験
試験の説明：
異なる細孔径（３０ｎｍおよび１５-２０ｎｍ）の吸着体を、全血漿および分画血漿中のＴＮＦα、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１０の吸着に関して試験する。
【０１６０】
試験構造：
担体：ポリスチレンジビニルベンゼンコポリマ、ＣＧ３００ｃ（担体Ａ）、ＣＧ１６１ｃ（担体Ｂ）、Dow Chemical Group
担体Ａ：粒径：１２０μｍ、細孔径：３０ｎｍ
担体Ｂ：粒径：１２０μｍ、細孔径：１５〜２０ｎｍ
血漿：深温凍結された非分画クエン酸血漿（血液の遠心分離によって得られた新鮮凍結血漿）
分画クエン酸血漿：Albuflowフィルタ（ドイツ国Fresenius Medical Care）の使用により得られる。
下の表７．１によるサイトカイン添加（ＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、ＩＬ‐１０）。
【０１６１】
担体ＡおよびＢをコンディショニングする：  担体を２．５倍量の無水エタノールで洗浄し、担体を遠心分離する。上澄みを除去し、担体を２．５倍量の無水エタノールにより室温で１時間培養し、次いで遠心分離し、再び上澄みを除去する。次いで同じ手順を二回蒸留水を使用し、最後に生理食塩水を使用して実行する。コンディショニング後に、担体をさらに再度、０．９％ＮａＣｌ溶液で３回洗浄する。
【０１６２】
トリプリケート法で全血漿および分画血漿（Albuflowフィルタにより前処理済み）の両方でバッチ試験を実施する。
【０１６３】
試験を開始する前に、担体を非添加全血漿または分画血漿で１５分間培養し、ＮａＣｌで１回洗浄し、次いでバッチ試験に使用する。
【０１６４】
バッチ試験：いずれの場合も、１ｍｌの吸着体（湿潤）＋９ｍｌのクエン酸血漿をロールミキサ上で３７℃で６０分間。
【表６】
2015522577.tif 000008
【０１６５】
分析：
R&D Systems社製の市販のＥＬＩＳＡを用いてＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１０を定量した。
【０１６６】
７．２  結果
分画血漿における改善されたサイトカイン吸着を決定することができた。
【０１６７】
図１７〜図１９は、血漿フィルタと比較してAlbuflowフィルタを使用することによるサイトカインＴＮＦ‐α、ＩＬ‐６、およびＩＬ‐１０の改善された吸着を示す。
【０１６８】
８．実施例８：  同一細孔径で異なる粒径のエチルビニルベンゼンジビニルベンゼンコポリマの吸着特性の試験
同一の平均細孔径（１５〜２０ｎｍ）を持つが、３〜５μｍ、３５μｍ、７５μｍ、および１２０μｍの異なる平均粒径を持つエチレンビニルベンゼンジビニルベンゼンコポリマ（担体）を、タンパク質Ｃに対する吸着特性に関して比較した。
【０１６９】
８．１  中性の疎水性ポリマの準備
この実施例で使用する同一平均細孔径および異なる平均粒径を持つエチレンビニルベンゼンジビニルベンゼンコポリマ（Amberchrom CG161、Rohm&Haas/Dow Chemical Company）を表８．１に記載する。
【表７】
2015522577.tif 000009
【０１７０】
８．２  担体調製およびバッチ試験
表８．１に記載された担体＃２０００、＃１７８５、＃１７６０、および＃２００４をバッチ試験で、タンパク質Ｃに対するそれらの吸着特性に関して試験し、相互に比較した。
【０１７１】
担体をコンディショニングし、バッチ試験の直前に血漿中で１５分間培養し、遠心分離し、次いでバッチ試験に使用した。
【０１７２】
担体のコンディショニング：乾燥担体は、水溶液または血漿による適切な湿潤化を可能にするために、使用前にコンディショニングする必要がある。乾燥疎水性担体は次の通り前処理する。所要量の乾燥担体を５０ｍｌのグライナーチューブに入れ、５倍量の未変性エタノールで洗浄する（懸濁させ、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離する）。上澄みを取り除いて捨て、再び新鮮な未変性エタノールで懸濁させ、１時間培養する（Enviro‐Genie、振動数２５：５０）。培養後に、担体懸濁液を遠心分離し（４０００ｒｐｍで５分間遠心分離）、上澄みを捨てる。次いで担体を５倍量の蒸留水で洗浄する（懸濁させ、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離する）。上澄みを取り除いて捨て、再び新鮮な蒸留水で懸濁させ、１時間培養する（Enviro‐Genie、振動数２５：５０）。培養後に、担体懸濁液を遠心分離し（４０００ｒｐｍで５分間遠心分離）、上澄みを捨てる。次いで担体を５倍量の生理食塩水で洗浄する（懸濁させ、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離する）。上澄みを取り除いて捨て、新鮮な生理食塩水で再び懸濁させ、１時間培養する（Enviro‐Genie、振動数２５：５０）。培養後に、担体懸濁液を遠心分離し（４０００ｒｐｍで５分間遠心分離）、上澄みを捨てる。最終的に生理食塩水で５０％担体懸濁液を生成し、使用するまで冷蔵庫で保存する。
【０１７３】
バッチ法（トリプリケート法、ｎ＝３）のために、１５ｍｌのグライナーチューブ内で１５０μｌの担体（湿潤）を各々１３５０μｌのクエン酸血漿で被覆した。チューブはEnviro-Genie内で２５／５０ｒｐｍで３７℃で６０分間振動させた。対照（１２０μｌのＮａＣｌ＋１３５０μｌのクエン酸血漿）として、担体無しのチューブが加えられた。
【０１７４】
タンパク質Ｃ分析のために１５分後および６０分後に各々５００μｌの試料を採取した。Sysmex（Siemens、CA560）および関連試薬（Siemens、OUVV17）によりタンパク質Ｃを分析した。
【０１７５】
８．３  分析および結果
図２０は、個々の担体について時間の経過によるタンパク質Ｃの濃度（ヒト血漿中の生理的タンパク質Ｃ濃度に対する［％］単位で表記）を示す。曲線に基づいて、平均粒径に対するタンパク質Ｃ吸着の依存性は明確である。担体＃２０００および＃１７８５では顕著なタンパク質Ｃの吸着が決定された。担体＃２０００の場合、タンパク質Ｃはわずか１５分後に血漿から略完全に除去された。対照的に、担体＃１７６０および＃２００４による血漿からのタンパク質Ｃの吸着の程度はずっと小さかった。担体＃１７６０（６０分の培養後）に観察された〜２５％のタンパク質Ｃの減少は依然として、生理的関連量のタンパク質Ｃが血漿に残る範囲である。６０分の培養後に、タンパク質Ｃの開始濃度に対しわずか８％という最低のタンパク質Ｃの吸着は、担体＃２００４に対して決定された。個々の担体によるタンパク質Ｃの吸着（タンパク質Ｃの開始濃度に対する％で表す）を表８．３に記載する。
【表８】
2015522577.tif 000010
【０１７６】
９．実施例９：  細孔および粒径が異なり、したがって利用可能な吸着表面が異なる吸着体間の血漿中のＰＭＢの脱着の比較
９．１  担体
ＣＧ１６１ｃ：
担体（Rohm&Haas/Dow Chemical Company；本書では以下、吸着体ともいう）は多孔性ポリスチレンジビニルベンゼンマトリックスから構成される。平均細孔径は１５ｎｍであり、平均粒径は１２０μｍであり、アクセス可能な表面は吸着体（乾燥）１ｇにつき９００ｍ2である。湿潤吸着体１ｍｌ当たりの乾燥重量は１８％（ｗ／ｖ）である。
【０１７７】
ＨＰＲ１０：
担体（Rohm&Haas/Dow Chemical Company；本書では以下、吸着体ともいう）は、多孔性ポリスチレンジビニルベンゼンマトリックスから構成される。平均細孔径は３０〜４０ｎｍであり、平均粒径は１０μｍであり、アクセス可能な表面は吸着体（乾燥）１ｇにつき５００ｍ2である。湿潤担体１ｍｌ当たりの乾燥重量は３０％（ｗ／ｖ）である。
【０１７８】
９．２  ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）による担体のコーティング
ＰＭＢ溶液（Sigma Aldrich、１０ｍｇ／ｍｌ蒸留水）を１２１℃で３０分間オートクレーブし、次いで１５ｍｌのグライナーチューブ内でそれぞれの担体（ＣＧ１６１ｃまたはＨＰＲ１０）にＰＭＢを以下（表９．２）の通り、すなわち３ｍｌの担体に７．５ｍｌのＰＭＢ溶液を用いて、被覆させる。
【表９】
2015522577.tif 000011
【０１７９】
室温でロールミキサ上でコーティングを一晩かけて実行する。次いで吸着体を１０ｍｌのＮａＣｌ溶液（無菌）で二回洗浄して、５０％懸濁液を生成する。
【０１８０】
９．３  バッチ試験
デュプリケート法で、Enviro‐genie内で０．５ｍｌの担体懸濁液を各々４．５ｍｌクエン酸血漿＝１０％（ｖ／ｖ）を用いて３７℃で６０分培養する。次いで担体を遠心分離し、上澄みを使用してＥＬＩＳＡによりＰＭＢを定量する（中国Beijing Kwinbon Biotechnology Co.,Ltd.社製ポリミキシンＥＬＩＳＡ）。
【０１８１】
９．４  結果
結果（図２１、図２２、図２３、および図２４参照）から、血漿中のポリミキシンの脱着率は利用可能な担体表面に非常に大きく依存することが明らかである。これは、ポリミキシンの脱着が、１ｍ2当たりの疎水結合ポリミキシンの量に依存することを意味する。これは、以下の計算表（表９．４．１および表９．４．２）からも明らかである。
【表１０】
2015522577.tif 000012
【表１１】
2015522577.tif 000013
【０１８２】
９．５  計算実施例
担体（以下、吸着体ともいう）からのＰＭＢの脱着による処置中の血漿中のＰＭＢ濃度を正確に決定するために、それぞれの吸着体についてインビトロ脱着実験（実施例９で実施した通り）を行う必要がある。実験で得たデータに基づいて、担体のコーティングの程度によって（吸着体１ｇ当たりのＰＭＢの量）によって、血漿中の脱着およびしたがって血漿中のＰＭＢ濃度を非常に正確に調整することが可能である（図２１ないし図２４参照）。実施例１に示す通り、分画血漿中の脱着率はより低くすることができ、したがって別々に決定することができる。
【０１８３】
計算実施例１：
体外血液回路でＰＭＢ被覆吸着体ＨＰＲ１０を使用することによって、０．８μｇ／ｍｌの血漿中ＰＭＢ濃度を得る。予備試験（図２３参照）のおかげで、吸着体１ｇ当たりの被覆ＰＭＢの量と血漿中の脱着ＰＭＢの量との間の相関を記述する関数を実験によって決定することができる。この場合、それは次の通りである。
PMB[mg/g吸着体]=0.00000001x2 + 0.0012x + 1.258
ｘ＝所望の血漿中ＰＭＢ濃度＝０．８μｇ／ｍｌ＝８００ｎｇ／ｍｌ
ｘ＝８００ｎｇ／ｍｌを使用すると、担体１ｇにつき疎水結合しなければならないＰＭＢの量は、２．２２４ｍｇ／ｇ担体（ＨＰＲ１０）となる。
【０１８４】
計算実施例２：
体外血液回路でＰＭＢ被覆吸着体ＣＧ１６１ｃを使用することによって、０．８μｇ／ｍｌの血漿中ＰＭＢ濃度を得る。予備試験（図２３参照）のおかげで、吸着体１ｇ当たりの被覆ＰＭＢの量と血漿中の脱着ＰＭＢの量との間の相関を記述する関数を実験によって決定することができる。この場合、それは次の通りである。
PMB[mg/g吸着体]=0.00000003x2 + 0.0048x + 3.0442
ｘ＝所望の血漿中ＰＭＢ濃度＝０．８μｇ／ｍｌ＝８００ｎｇ／ｍｌ
ｘ＝８００ｎｇ／ｍｌを使用すると、吸着体１ｇにつき疎水結合しなければならないＰＭＢの量は、７．０７６ｍｇ／ｇ吸着体（ＣＧ１６１ｃ）となる。
【０１８５】
計算実施例３：
体外血液回路でＰＭＢ被覆吸着体ＨＰＲ１０を使用することによって、０．１μｇ／ｍｌの血漿中ＰＭＢ濃度を得る。予備試験（図２３参照）のおかげで、吸着体１ｇ当たりの被覆ＰＭＢの量と血漿中の脱着ＰＭＢの量との間の相関を記述する関数を実験によって決定することができる。この場合、それは次の通りである。
PMB[mg/g吸着体]=0.00000001x2 + 0.0012x + 1.258
ｘ＝所望の血漿中ＰＭＢ濃度＝０．１μｇ／ｍｌ＝１００ｎｇ／ｍｌ
ｘ＝１００ｎｇ／ｍｌを使用すると、吸着体１ｇにつき疎水結合しなければならないＰＭＢの量は、１．３７８ｍｇ／ｇ吸着体（ＨＰＲ１０）となる。
【０１８６】
計算実施例４：
体外血液回路でＰＭＢ被覆吸着体ＣＧ１６１ｃを使用することによって、０．１μｇ／ｍｌの血漿中ＰＭＢ濃度を得る。予備試験（図２３参照）のおかげで、吸着体１ｇ当たりの被覆ＰＭＢの量と血漿中の脱着ＰＭＢの量との間の相関を記述する関数を実験によって決定することができる。この場合、それは次の通りである。
PMB[mg/g吸着体]=0.00000003x2 + 0.0048x + 3.0442
ｘ＝所望の血漿中ＰＭＢ濃度＝０．１μｇ／ｍｌ＝１００ｎｇ／ｍｌ
ｘ＝１００ｎｇ／ｍｌを使用すると、吸着体１ｇにつき疎水結合しなければならないＰＭＢの量は、３．５２７ｍｇ／ｇ吸着体（ＣＧ１６１ｃ）となる。
【０１８７】
計算実施例５（分画血漿）
体外血液回路でＰＭＢ被覆吸着体ＣＧ１６１ｃを使用することによって、０．１５μｇ／ｍｌの血漿中ＰＭＢ濃度を得る。予備試験（図２４参照）のおかげで、吸着体１ｇ当たりの被覆ＰＭＢの量と分画血漿中の脱着ＰＭＢの量との間の相関を記述する関数を実験によって決定することができる。この場合、それは次の通りである。
PMB[mg/g吸着体]=2.6718 ln(x) − 3.3628
ｘ＝所望の血漿中ＰＭＢ濃度＝０．１５μｇ／ｍｌ＝１５０ｎｇ／ｍｌ
ｘ＝１５０ｎｇ／ｍｌを使用すると、吸着体１ｇにつき疎水結合しなければならないＰＭＢの量は、１０．０２５ｍｇ／ｇ吸着体（ＣＧ１６１ｃ）となる。
【０１８８】
計算実施例６（分画血漿）：
体外血液回路でＰＭＢ被覆吸着体ＣＧ１６１ｃを使用することによって、０．８μｇ／ｍｌの血漿中ＰＭＢ濃度を得る。予備試験（図２４参照）のおかげで、吸着体１ｇ当たりの被覆ＰＭＢの量と分画血漿中の脱着ＰＭＢの量との間の相関を記述する関数を実験によって決定することができる。この場合、それは次の通りである。
PMB[mg/g吸着体]=2.6718 ln(x) − 3.3628
ｘ＝所望の血漿中ＰＭＢ濃度＝０．８μｇ／ｍｌ＝８００ｎｇ／ｍｌ
ｘ＝８００ｎｇ／ｍｌを使用すると、吸着体１ｇにつき疎水結合しなければならないＰＭＢの量は、１４．４９７ｍｇ／ｇ吸着体（ＣＧ１６１ｃ）となる。
【０１８９】
１０．実施例１０：  時間の経過によるポリミキシンＢ（ＰＭＢ）の脱着
この試験は、血漿中の平衡反応（ポリミキシン（Ｂ）の吸着および脱着）が迅速かつ安定的であることを実証するように意図されている。
１０．１  担体
ＨＰＲ１０：  担体ＨＰＲ１０（Rohm&Haas/Dow Chemical Company；以下、吸着体ともいう）は、多孔性ポリスチレンジビニルベンゼンマトリックスから構成される。平均細孔径は３０〜４０ｎｍであり、平均粒径は１０μｍであり、アクセス可能な表面は担体（乾燥）１ｇにつき５００ｍ2である。湿潤担体１ｍｌ当たりの乾燥重量は３０％（ｗ／ｖ）である。
【０１９０】
１０．２  ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）による担体のコーティング
ＰＭＢ溶液（Sigma、１０ｍｇ／ｍｌ蒸留水）を１２１℃で３０分間オートクレーブし、次いで１５ｍｌのグライナーチューブ内で担体（ＨＰＲ１０）にＰＭＢを以下（表１０．２）の通り、すなわち３ｍｌの担体に７．５ｍｌのＰＭＢ溶液を用いて、被覆させる。
【表１２】
2015522577.tif 000014
【０１９１】
室温でロールミキサ上でコーティングを一晩かけて実行する。次いで被覆された担体を１０ｍｌのＮａＣｌ溶液（無菌）で二回洗浄して、５０％懸濁液を生成する。吸着体無しのチューブを対照として含める。
【０１９２】
１０．３  バッチ試験
５ＩＵのヘパリン入り血漿に５ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｌ‐７０１８緑膿菌、Sigma社、バッチ：１２８Ｋ４１１５）を添加する。トリプリケート法で、１％ＰＭＢ被覆担体をＬＰＳ添加血漿と共に（３０μｌの担体＋２９７０μｌのＬＰＳ添加血漿）、オーバヘッドシェーカ内で３７℃で培養し、次いでＬＡＬ分析用の試料を（５分、１５分、および６０分）間隔で採取した。
【０１９３】
１０．４  分析
ＬＡＬ試験を用いて分析を実行した。
バッチ試験およびＬＡＬ試験に使用した材料：
【表１３】
2015522577.tif 000015
【０１９４】
１０．５  結果
血漿中の脱着ＰＭＢの平衡濃度に非常に迅速に到達する。５分後のＬＰＳ不活化は培養６０分後と略同一である（図２５参照）。
【０１９５】
１１．実施例１１：  ポリミキシンＢ（ＰＭＢ）を被覆された担体のコーティングのサイトカイン吸着に対する影響
１１．１  試験の説明
非被覆吸着体ＣＧ１６１ｃと比較してＰＭＢ被覆吸着体ＣＧ１６１ｃがサイトカインの吸着に適している程度を、１０％（ｖ／ｖ）バッチ試験で試験した。緑膿菌由来の５ｎｇ／ｍｌエンドトキシン（ＬＰＳ）も追加した。
【０１９６】
１１．２  試験構造
担体：Amberchrom CG161（平均粒径１２０μｍ、平均細孔径１５ｎｍ）
ＰＭＢによるコーティング：
ＰＭＢ溶液（Sigma Aldrich、１０ｍｇ／ｍｌ蒸留水）および５０％懸濁液中の担体を１５ｍｌのグライナーチューブ内でＰＭＢで次の通り（表１１．２．１）被覆する。
【表１４】
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【０１９７】
コーティングをEnviro‐Genie（２５：５０）で室温で一晩かけて実行した。次いで担体を１０ｍｌのＮａＣｌ溶液（無菌）で二回洗浄し、５０％懸濁液を生成した。
【０１９８】
バッチ法：
トリプリケート法：各々の場合に１ｍｌの吸着体（湿潤）＋９ｍｌのスパイク
１５ｍｌのグライナーチューブをEnviro‐Genieで２５／５０ｒｐｍ、３７℃で、６０分間振動させる。
【０１９９】
サイトカイン：
保存液を１：１０で血漿（新鮮な凍結血漿、血漿ドナーセンターRetz）中に希釈する（１：１０；保存液５μＬ＋血漿４５μＬ）。使用したサイトカインに対する血漿スパイク（１００ｍＬ）の最終濃度を下の表１１．２．２に示す。
【表１５】
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【０２００】
エンドトキシン（ＬＰＳ）：
緑膿菌：Ｌ‐７０１８、Sigma社、バッチ：１２８Ｋ４１１５、−７０℃、１０-3ｇ／ｍｌ（１ｍｇ／ｍｌ）で１００μｌ。
ＬＰＳを５ｎｇ／ｍｌの最終濃度でバッチに使用する。
→１００ｍｌの血漿中に５０μｌの１０-5溶液（表１１．２．３および表１１．２．４参照）
【表１６】
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【表１７】
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＝８個の試料、すなわち１００ｍｌのクエン酸血漿スパイク
【０２０１】
１１．３  分析：
Ｂｉｏｒａｄ社製のＬｕｍｉｎｅｘ装置（抗体ベース）を用いてサイトカイン分析を実行する。
【０２０２】
１１．４  結果：
結果を図２６に示す。この図から、ポリミキシンＢによる担体表面の吸着性コーティングがサイトカインの吸着に影響しないことが明瞭に分かる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【国際調査報告】
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