(57)【要約】  本発明は、β−アミロイドにより誘発された毒性と関連する疾患又は状態、例えばアルツハイマー病等を治療するために、化合物３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピランを新たに使用することに関連する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態の治療に使用するための、化合物３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン、又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物。
【請求項２】
前記化合物が、（１Ｒ，３Ｓ）３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン、又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が、（１Ｒ，３Ｓ）３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン塩酸塩である、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態の治療に使用するための、請求項１から３のいずれか１項に規定した化合物、又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物と、１つ又は複数の薬学的に許容される添加剤とを含む、医薬組成物。
【請求項５】
前記β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態が、アルツハイマー病、封入体筋炎、及び血管性認知症、及び脳アミロイド血管障害より選択される、請求項１から３のいずれか１項に記載の化合物、又は請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態が、アルツハイマー病である、請求項１から３のいずれか１項に記載の化合物、又は請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態を治療する方法であって、請求項１から３に規定した化合物、又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物、又は請求項４に記載の医薬組成物の治療上有効な量を、かかる治療を必要とする対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項８】
前記β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態が、アルツハイマー病、封入体筋炎、及び血管性認知症、及び脳アミロイド血管障害より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態が、アルツハイマー病である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
β−アミロイドにより誘発された毒性の阻害に使用するための、化合物３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン、又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物。
【請求項１１】
（インビトロ又はインビボでの）β−アミロイドにより誘発された毒性を阻害する方法であって、前記方法が、３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン、又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物の有効量を投与するステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、公知化合物の新規の治療的使用に関連する。より具体的には、本発明は、例えばアルツハイマー病等の、β−アミロイドにより誘発された毒性と関連する疾患又は状態を治療するために公知化合物を使用することに関連する。
【背景技術】
【０００２】
β−アミロイド（Ａβ）は、アミロイド前駆体タンパク質（ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ、ＡＰＰ）の細胞内タンパク質分解により生成される３９〜４３個のアミノ酸を含むペプチドである。ＡＰＰは、最初にβ−セクレターゼにより切断されて膜結合型Ｃ９９ペプチドとなり、次にγ−セクレターゼによりＡβとなる。
【０００３】
Ａβは、これがアルツハイマー病と関連することが臨床的に最も一般的に知られている。アルツハイマー病は、死滅ニューロン及び末期ニューロンにおける異常に高レベル（濃度）の脳病変（老人斑）及び神経原線維のもつれ、並びに大脳血管壁内におけるアミロイド沈積物の数の増加により、病理学的に特徴付けられる。老人斑の主要な成分はＡβタンパク質であり、これはアミロイド原線維に容易に自己組織化する。Ａβの変異体が長くなるほど、アミロイドを形成する傾向が強い。有力な証拠は、Ａβの生成を高める因子、特にそのアミロイド生成性がより強い変異体、又はアミロイド沈積物の沈着を促進する又は除去を阻害する因子は、アルツハイマー病を引き起こす、又は同病のリスク因子であることを示唆する１。
【０００４】
β−アミロイドの凝集及び沈着は、封入体筋炎２、及び血管性認知症３、及び脳アミロイド血管障害等のその他の疾患又は状態とも関わっている。
【０００５】
インビトロ及びインビボでの証拠から、可溶性でオリゴマー型のＡβであることが明らかにされており４〜８、そのＡβは、強力な神経毒活性を有し、またアルツハイマー病に生ずる神経細胞障害及び細胞死の主原因である。従って、Ａβに基づく療法では、その他の低毒性又は無毒性の種ではなく、Ａβオリゴマーを一次標的とすべきことが提案された。
【０００６】
従って、Ａβにより誘発された毒性を低下させる又は除去することができる新規の療法が必要である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、化合物、３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピランは、β−アミロイドにより誘発された毒性の強力な阻害剤であるという認識に依拠する。
【０００８】
この化合物の特定の形態、（１Ｒ，３Ｓ）３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン塩酸塩は、「Ａ−７７６３６」と呼ばれるドーパミン１（Ｄ１）受容体作動薬として当技術分野において公知である。Ａ−７７６３６は、動物モデル９を対象としてパーキンソン病に対して活性を有することが明らかにされており、またコカイン中毒治療についても提案されている１０。Ａ−７７６３６は、血液脳関門を通過することも公知であり、それはアルツハイマー病治療薬の重要な要件である１６。
【０００９】
従って、第１の態様では、本発明は、β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態の治療に使用するための、３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン、又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物を提供する。
【００１０】
更なる態様では、本発明は、β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態の治療に使用するための、３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン、又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物と、１つ又は複数の薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
更なる態様では、本発明は、β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態の治療に使用するための薬剤の製造における、３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン、又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物の使用を提供する。
【００１２】
別の態様では、本発明は、β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態を治療する方法を提供し、前記方法は、３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン、又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物の治療上有効な量を、かかる治療を必要とする対象に投与するステップを含む。
【００１３】
別の態様では、本発明は、β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態を治療する方法を提供し、前記方法は、３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン、又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物と、１つ又は複数の薬学的に許容される添加剤とを含む医薬組成物の治療上有効な量をかかる治療を必要とする対象に投与するステップを含む。
【００１４】
更なる態様では、本発明は、β−アミロイドにより誘発された毒性の阻害に使用するための、３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン、又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物を提供する。
【００１５】
更なる態様では、本発明は、（インビトロ又はインビボでの）β−アミロイドにより誘発された毒性を阻害する方法を提供し、前記方法は、３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン、又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物について、その有効量を投与するステップを含む。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[定義]
別途記載がなければ、本明細書及び特許請求の範囲で用いられる下記の用語は、以下に記載する意味を有する。
【００１７】
「治療すること」又は「治療」は、疾患又は状態の確立した症状を予防並びに緩和することを意味するものと理解される。従って、「治療すること」又は「治療」は、（１）疾患若しくは状態に苦しんでいる若しくは罹患していると考えられるが、疾患若しくは状態の臨床的若しくは亜臨床的症状をまだ経験していない若しくは呈さない対象において発症している疾患若しくは状態の臨床症状の発現を予防する若しくは遅延させるステップ、（２）疾患若しくは状態を阻害するステップ、すなわち、疾患若しくは状態の発症若しくはその再発（維持療法の場合）、若しくはその少なくとも１つの臨床的若しくは亜臨床的症状を阻止する、抑える、若しくは遅延させるステップ、又は（３）疾患若しくは状態を軽減若しくは減弱するステップ、すなわち、疾患若しくは状態若しくはその少なくとも１つの臨床的若しくは亜臨床的症状の後退を引き起こすステップが含まれる。
【００１８】
「治療上有効な量」は、本明細書において参照する疾患又は状態を治療するために対象に投与した際に、疾患又は状態に対するそのような治療を有効とするのに十分な化合物の量を意味する。「治療上有効な量」は、化合物の形態（例えば、塩の形態）や、対象とする疾患又は状態及びその重症度、並びに治療される対象の年齢、体重等に応じて変化する。
【００１９】
用語「対象」は、本明細書では、温血の哺乳動物を意味する。従って、本発明の化合物は、ヒト及び／又は獣医学的用途で利用可能である。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００２０】
[本発明の化合物]
本発明の化合物は、３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピランである。この化合物の構造を以下に示す。
【化１】
2015514742.tif 000002
【００２１】
本発明の化合物は、１つ又は複数のエナンチオマー型又はジアステレオマー型として存在し得る。特に、本発明の化合物は、ベンゾピラン環の１位及び３位において、Ｒ又はＳの立体配置で存在し得る。
【００２２】
化合物は、単一のエナンチオマー型／ジアステレオマー型、又はエナンチオマー型／ジアステレオマー型の混合物として存在し得る。
【００２３】
β−アミロイドにより誘発された毒性を阻害する能力を有する全てのエナンチオマー型／ジアステレオマー型の３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン化合物は、本発明に含まれる。
【００２４】
一実施形態では、化合物は、（１Ｒ，３Ｓ）３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン、又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物である。この化合物は以下の構造を有する。
【化２】
2015514742.tif 000003
【００２５】
本発明の化合物に適する薬学的に許容される塩は、例えば塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ギ酸、クエン酸、又はマレイン酸等の酸を用いて形成される化合物の酸付加塩である。
【００２６】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、塩酸塩の形態である。
【００２７】
本発明の特定の実施形態では、本発明の化合物は、（１Ｒ，３Ｓ）３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン塩酸塩である。
【００２８】
また、本発明の化合物は、溶媒和形態並びに非溶媒和形態で、例えば水和した形態等でも存在し得ると、やはり理解される。本発明は、β−アミロイドにより誘発された毒性を阻害する能力を有する、全てのかかる溶媒和形態を含むものと理解される。
【００２９】
また、本発明の化合物は、多形性（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）も示す可能性があり、また、本発明は、β−アミロイドにより誘発された毒性を阻害する能力を有する全てのかかる多形形態を含むものと、やはり理解される。
【００３０】
本発明の化合物は、ヒト又は動物の体内で分解されて本発明の化合物を放出するプロドラッグの形態でも投与可能である。プロドラッグは、本発明の化合物の物理的特性及び／又は薬物動態的特性を変化させるのに利用可能である。プロドラッグは、本発明の化合物が、特性修飾基（ｐｒｏｐｅｒｔｙ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）が連結可能な適当な基又は置換基を含有する場合に、形成可能である。プロドラッグの例として、本発明の化合物のヒドロキシ基の１つにおいて形成可能であるインビボで開裂可能なエステル誘導体、及び／又は、本発明の化合物のアミノ基において形成可能であるインビボで開裂可能なアミド誘導体が挙げられる。
【００３１】
従って、本発明には、プロドラッグが開裂した時にヒト又は動物の体内で利用可能となる、本明細書でこれまでに規定した本発明の化合物が含まれる。従って、本発明には、前駆体化合物の代謝によりヒト又は動物の体内で生成される本発明の化合物が含まれ、すなわち本発明の化合物は代謝的に生成され得る。
【００３２】
本発明の化合物に適する薬学的に許容されるプロドラッグは、望ましくない薬理活性もまた過度の毒性も有さず、ヒト又は動物の身体に投与するのに適するという合理的な医学的な判断に基づくものである。
【００３３】
プロドラッグの様々な形態について、例えば下記の文献に記載されている。
ａ）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第４２巻、３０９〜３９６頁、Ｋ．Ｗｉｄｄｅｒら編（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８５年）；
ｂ）Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ、Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５年）；
ｃ）Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、Ｋｒｏｇｓｇａａｒｄ−Ｌａｒｓｅｎ及びＨ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編、Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄによる第５章「Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏ−ｄｒｕｇｓ」、１１３〜１９１頁（１９９１年）；
ｄ）Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、第８巻、１〜３８頁（１９９２年）；
ｅ）Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第７７巻、２８５頁（１９８８年）；
ｆ）Ｎ．Ｋａｋｅｙａら、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．、第３２巻、６９２頁（１９８４年）；
ｇ）Ｔ．Ｈｉｇｕｃｈｉ及びＶ．Ｓｔｅｌｌａ、「Ｐｒｏ−Ｄｒｕｇｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」、Ａ．Ｃ．Ｓ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ、第１４巻；及び
ｈ）Ｅ．Ｒｏｃｈｅ（編者）、「Ｂｉｏｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７年。
【００３４】
本発明の化合物のインビボでの効果は、本発明の化合物を投与した後に、ヒト又は動物の体内で形成される１つ又は複数の代謝物により、一部分発揮され得る。本明細書においてこれまでに記載したように、本発明の化合物のインビボでの効果は、前駆体化合物（プロドラッグ）の代謝によっても発揮され得る。
【００３５】
[合成]
本発明の化合物は、商業的に調達可能であり、及び／又は、当技術分野において公知の合成技術により調製可能である。
【００３６】
[医薬組成物]
本発明の更なる態様によれば、β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態の治療に用いるための、薬学的に許容される賦形剤又は担体と関連する、本明細書でこれまでに規定した本発明の化合物、又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物を含む医薬組成物が提供される。
【００３７】
本発明の組成物は、経口用途（例えば、錠剤、ロゼンジ、ハード又はソフトカプセル、水性又は油性の懸濁物、エマルジョン、分散型の粉末又は粒剤、シロップ又はエリキシル剤）、局所用途（例えば、クリーム、軟膏、ゲル、又は水性若しくは油性の溶液若しくは懸濁物）、吸入法による投与用途（例えば、微粉末又は液体エアゾールとして）、通気法による投与用途（例えば、微粉末として）、又は非経口投与用途（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、腹腔内、又は筋肉内投与用途の滅菌された水性若しくは油性の溶液として、又は直腸投与用途の坐薬として）に適する形態であり得る。
【００３８】
本発明の組成物は、当技術分野において周知の従来型の医薬品添加剤を用いて、従来方式の手順により取得可能である。従って、経口用途として意図されている組成物は、例えば１つ又は複数の着色料、甘味料、香味料、及び／又は防腐剤を含み得る。
【００３９】
１つ又は複数の添加剤と併用して単一の剤形を形成する有効成分の量は、治療される個人及び個々の投与経路に依存して必然的に変化する。例えば、ヒトに経口投与するように意図されている処方物は、一般的に、例えば０．５ｍｇ〜０．５ｇの活性薬剤（より好適には０．５〜１００ｍｇ、例えば１〜３０ｍｇ）を含み、活性薬剤は全組成物の約５〜約９８重量百分率（％）で変化し得る適切で好都合な量の添加剤と調合されている。
【００４０】
治療又は予防を目的とした本発明の化合物の用量サイズは、薬剤に関する周知の原則に基づき、状態の性質及び重症度、動物又は患者の年齢及び性別、及び投与経路に応じて当然変化する。
【００４１】
治療又は予防を目的として本発明の化合物を用いる際には、当該化合物は、例えば体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜７５ｍｇの範囲の日用量が服用されるように一般的に投与され、必要な場合には分割した用量で投与される。非経口経路が採用される場合には、一般的に低めの用量が投与される。従って、例えば静脈内又は腹腔内投与の場合、例えば体重１ｋｇ当たり０．１ｍｇ〜３０ｍｇの範囲の用量が一般的に用いられる。同様に、吸入法により投与する場合、例えば体重１ｋｇ当たり０．０５ｍｇ〜２５ｍｇの範囲の用量が用いられる。経口投与も、特に錠剤形態の場合、適すると考えられる。一般的に、単位投与剤形は、約０．５ｍｇ〜０．５ｇの本発明の化合物を含む。
【００４２】
[β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態]
下記の実施例に記載する生物学的アッセイ（分析）法により、本発明の化合物が、β−アミロイドにより誘発された毒性の強力な阻害剤であることは実証される。
【００４３】
従って、本発明の化合物は、β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態の治療（予防療法を含む）に適する。かかる状態の例として、アルツハイマー病、封入体筋炎２、及び血管性認知症３、及び脳アミロイド血管障害が挙げられる。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、アルツハイマー病の治療（予防療法を含む）に使用可能である。
【００４５】
本発明の化合物は、治療を必要とする患者に治療上有効な量で好適に投与される。
【００４６】
[作用機序]
これまでに記載したように、本発明の化合物は、Ｄ１受容体作動薬として公知である。しかし、本発明の化合物がβ−アミロイドにより誘発された毒性を阻害する機構は、同化合物が有するＤ１受容体作動薬活性により介在されるとは考えられていない。その他のＤ１受容体作動薬に関するデータは、本明細書の実施例５に提示されており、このデータは、Ａβ毒性の阻害は、Ｄ１ドーパミン受容体作動薬の一般的特性ではないことを明確に示している。
【００４７】
本明細書の実施例４に提示するデータは、本発明の化合物が作用していると考えられる１つの説明可能な機構は、ＲＡＣＫ１タンパク質との結合によることを示唆する。ＲＡＣＫ１は、グルタミン酸作動性及びドーパミン作動性神経伝達物質系を調節する他、Ａβ４２が凝集し、その結果破綻（ｄｉｓｒｕｐｔ）すると思われるＣａ２＋ホメオスタシスの維持にも役立つことが公知である１８、１９、２１。ＲＡＣＫ１の下方制御も、ＡＤと関連した公知の現象である２０。従って、いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、本発明の化合物は、β−アミロイドの存在下でもＲＡＣＫ１のレベル回復に役立ち、同様にこの化合物は、β−アミロイドの凝集と関連して変化を受けた神経伝達物質系を間接的に改善可能であり、それによっておそらくはβ−アミロイドに誘発された細胞毒性（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）の発現を低減するものと考えることができる。
【００４８】
[投与経路]
本発明の化合物又はこの化合物を含む医薬組成物は、任意の好都合な投与経路により対象に投与可能である。投与経路として、経口（例えば、摂取による）；バッカル；舌下；経皮的（例えばパッチ、膏薬等による場合を含む）；経粘膜的（例えば、パッチ、膏薬等による）；鼻腔内（例えば、鼻腔スプレーによる）；眼球（例えば、点眼薬による）；肺（例えば口腔又は鼻腔を経由する、例えばエアゾールを用いた、例えば吸入又は通気療法による）；直腸（例えば、坐薬又は浣腸剤による）；膣（例えば、ペッサリーによる）；非経口、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、クモ膜下腔内、髄腔内、嚢内、嚢下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、クモ膜下、及び胸骨内を含む注射による；デポ又はリザーバーの、例えば皮下又は筋肉内インプラントによる投与が挙げられるが、但しこれらに限定されない。
【００４９】
[併用療法]
本発明の化合物は、単独療法として使用可能、又は本発明の化合物に加えて１つ若しくは複数の追加の治療薬を用いる療法と関係し得る。
【００５０】
従って、別の態様では、本発明は、１つ又は複数の追加の治療薬と併用して、β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した疾患又は状態の治療に用いられる、本明細書で規定した本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物を提供する。
【００５１】
別の態様では、本発明は、β−アミロイドにより誘発された毒性と関連した状態の治療における、１つ又は複数の追加の治療薬と併用して用いられる薬剤の製造での、本明細書で規定した本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物の使用を提供する。
【００５２】
かかる共同（ｃｏｎｊｏｉｎｔ）の治療は、個々の治療成分を同時に、連続又は分離して投与することにより達成され得る。かかる複合製剤は、本発明の化合物を本明細書にすでに記載した用量範囲内で、及びその他の薬学的に活性な薬剤をその承認された用量範囲内で使用する。
【００５３】
本発明の更なる態様によれば、本明細書ですでに規定した本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物と、１つ若しくは複数の追加の治療薬とを含む、β−アミロイドにより誘発された毒性の治療で使用するのに適する併用物が提供される。
【００５４】
本明細書において、用語「併用」が用いられる場合、これは同時投与、分離又は連続投与を意味するものと理解される。本発明の１つの態様では、「併用」は同時投与を意味する。本発明の別の態様では、「併用」は、分離した投与を意味する。本発明の更なる態様では、「併用」は、連続投与を意味する。投与が連続又は分離している場合、第２の成分の投与が遅延した場合、かかる遅延は、併用の有益な効果を損なうようであってはならない。
【００５５】
本発明の更なる態様によれば、本発明の化合物又はその薬学的に許容される塩若しくはそれらの溶媒和化合物と、１つ若しくは複数の追加の治療薬と、薬学的に許容される賦形剤若しくは担体とを含む医薬組成物が提供される。
【００５６】
本発明について、以下の付随する図を参照しながら更に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】ＳＨＳＹ５Ｙ細胞を用いた時の、細胞外Ａβ４２凝集に対する（１Ｒ，３Ｓ）３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン塩酸塩（Ａ−７７６３６）の濃度依存性の反応を示す図である。
【図２】実施例３の表３に示すデータを図式的に示す図である。
【図３】Ａβ４２及びＡ−７７６３６処理後のＲＡＣＫ１タンパク質発現を分析するためのＩｎ  Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイを示す図である。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を１．５×１０４個／ウェルで播種した。細胞を２条件、すなわちＡβ４２（１μＭ）のみ、及び、Ａβ４２（１μＭ）：Ａ−７７６３６（１μＭ）で、２４時間処理した。また、並行対照細胞もＡ−７７６３６（１μＭ）のみで処理した。（Ａ）Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイでは、Ａβ４２で処理した場合、対照細胞と比較してＲＡＣＫ１の発現量について５５％の低下が認められることから、ＲＡＣＫ１発現が下方制御されることが実証された。１μＭのＡ−７７６３６をＡβ４２（１μＭ）で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に投与すると、Ａβ４２（１μＭ）のみと比較して、ＲＡＣＫ１のレベルについて３１％の増加を示すことから、かかる投与はＲＡＣＫ１発現の部分的なエンハンサーとして作用する。（Ｂ）Ａβ４２及びＡ−７７６３６で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞についてのＲＡＣＫ１発現レベルの差異を、強度を４．５に設定して７００ｎｍで取得したＯｄｙｓｓｅｙ赤外線画像システムにより測定した。データを、ローディング対照のα−チューブリンに標準化した後、ｎ＝３での、ＲＡＣＫ１発現量に比例する蛍光強度の平均割合（％）で表し、エラーバーは標準誤差を表し、対照細胞（Ａβ−ｖｅ）と比較した場合、ｐ＜０．０５であったが、Ａ−７７６３６（１μＭ）で処理されたＡβ４２−ｖｅ細胞の場合、ｐ＞０．０５であった。
【図４】Ａβ４２毒性阻害剤に該当するものを識別するために行われた更なるドーパミン受容体作動薬のスクリーニングを示す図である。Ｄ１受容体に対して選択性を有するドーパミン受容体作動薬として作用する９個の化合物を、Ａβ４２（１μＭ）で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞上で２４時間スクリーニングした。化合物及び標的ペプチドを同時に添加し、３７℃でインキュベーションした後、ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を測定した。化合物Ａは、８１％の細胞生存率を示し、Ａβ４２毒性の部分的阻害を示したが（ｐ＜０．０５）、残りの他の化合物は、細胞外Ａβ４２毒性からＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を救済することができなかった。データを、無処理対照を１００％に設定して、ｎ＝３での、平均生存率（％）として示し、エラーバーは標準誤差を表す。
【実施例】
【００５８】
本発明を下記の実施例にて説明する。
【００５９】
［材料］
（１Ｒ，３Ｓ）３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン塩酸塩（Ａ−７７６３６）を、市販のＬｏｐａｃ化合物ライブラリ（極めて多様な構造及び作用機序を有する１２８０種類の薬学的に活性な化合物のコレクション）から調達した。Ｌｏｐａｃライブラリは、Ｌｕｍｏｐｈｏｒｅ  Ｌｔｄ．より寄贈品として提供されたが、もともとはＳｉｇｍａ  Ｌｔｄ．から購入された。
【００６０】
Ａβ４２ペプチドは、ｒＰｅｐｔｉｄｅから購入した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｐｅｐｔｉｄｅ．ｃｏｍ／）。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞は、ＡＴＣＣから購入した（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＡＴＣＣＡｄｖａｎｃｅｄＣａｔａｌｏｇＳｅａｒｃｈ／ＰｒｏｄｕｃｔＤｅｔａｉｌｓ／ｔａｂｉｄ／４５２／Ｄｅｆａｕｌｔ．ａｓｐｘ？ＡＴＣＣＮｕｍ＝ＣＲＬ−２２６６＆Ｔｅｍｐｌａｔｅ＝ｃｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ）。
【００６１】
［Ａβペプチドのストック調製物：］
Ａβ４２を高グレード１００％の１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）（Ｓｉｇｍａ）に溶解した後、３サイクルのボルテックス処理を各３０秒間行って、ペプチドを単量体の状態で維持した。これに続いて、Ａβ４２をしかるべき容積のＨＦＩＰに溶解して１ｍＭの濃度とし、必要とされる時まで４℃で保管した。次に、ペプチドを液体Ｎ２中で乾燥し、一晩中凍結乾燥した。次に、凍結乾燥形態のＡβ４２をパラフィルムで密閉し、更なる実験アッセイで必要となる時まで−２０℃で保管した。
【００６２】
＜実施例１＞
[Ａβ４２存在下におけるＳＹＳＨＹ５Ｙ細胞生存率のＭＴＴ毒性評価。]
ＭＴＴ毒性アッセイ法は、Ａβ毒性を測定する試験で幅広く用いられる１１、１２。
【００６３】
［ＭＴＴアッセイ：］
ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム臭化物）アッセイ法を、細胞外Ａβ４２で処理した細胞に対する化合物の効果を観察するために、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実験対象として実施した。ＭＴＴアッセイ法は、ミトコンドリア酵素のコハク酸デヒドロゲナーゼによりＭＴＴをホルマザン生成物に変換し、この変換に基づき細胞生存率の比色分析を提供する。細胞の毒性実験では、細胞をＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳで２回洗浄し、これに続いて細胞のトリプシン処理をし、１８００ｒｐｍにて遠心分離を行い、そして細胞を、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）上の、１．５％のＦＣＳ、１％のＬ−グルタミン、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、及び１％の非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）が補充されたフェノールレッドを含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地内に播種した。
【００６４】
細胞を１×１０５個／ｍｌの密度で９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種し、そして５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーター内で２４時間インキュベーションした。これに続いて培地を取り出し、そして細胞に、１μＭのＡβ４２及び１μＭのＡ−７７６３６を含有する、新鮮な培地を添加した。
【００６５】
２４時間後、５０μｌの培地を除去し、そして１０μｌのＭＴＴ（２．５ｍｇ／ｍｌ）を細胞に添加した。これに続いて、３７℃、５％のＣＯ２で更に４時間インキュベーションした。ＭＴＴの還元は、イソプロピルアルコール５０ｍｌと３７％のＨＣｌ１９７μｌとを含有する可溶化溶液を１００μｌ添加することにより特徴付けた。細胞毒性は、Ｐｏｌａｒｓｔａｒ  ＢＭＧ  ｌａｂｔｅｃｈプレートリーダーを用いて、５７０ｎｍでの吸収を測定することにより評価した。Ａβ４２を含まない細胞（健康な細胞）の平均生存率を、各実験で１００％とみなし、一方、０．１％のトリトンＸ−１００を生存細胞に添加して０％の生存細胞を得、これを１００％生存不能細胞又は死滅細胞に対応する対照とした。
【００６６】
[結果]
ＭＴＴ結果を下記の表１に示す。
【表１】
2015514742.tif 000004
【００６７】
上記結果から、本発明の化合物（Ａ−７７６３６）は、（Ａ−７７６３６を含む及び含まないＡβ４２と比較して）Ａβ４２の毒性効果を阻害する能力を有することが実証される。
【００６８】
＜実施例２＞
[Ａβ４２及び種々の濃度の（１Ｒ，３Ｓ）３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン塩酸塩（Ａ−７７６３６）が存在した時のＳＹＳＨＹ５Ｙ細胞生存率のＭＴＴ毒性評価。]
化合物Ａ−７７６３６を、細胞外Ａβ４２で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実験対象として種々の濃度でスクリーニングした。ＭＴＴ細胞毒性分析では、Ａ−７７６３６を、１．５％のＦＣＳ、１％のＰ／Ｓ、１％のＬ−グルタミン、及び１％のＮＥＡＡが補充されたＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で希釈した。標的の化合物を、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、及び１ｎＭの濃度でＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に添加した。
【００６９】
細胞を１×１０５個／ｍｌの密度で９６ウェル平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）に播種し、そして５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーター内で２４時間インキュベーションした。これに続いて培地を取り出し、そして細胞に、Ａβ４２及びＡ−７７６３６を含有する、新鮮な培地を添加した。細胞内の標的のペプチド及び化合物Ａ−７７６３６の最終濃度は、１μＭ：１００μＭ、１μＭ：１０μＭ、１μＭ：１μＭ、１μＭ：１００ｎＭ、１μＭ：１０ｎＭ、及び１μＭ：１ｎＭであった。次に、細胞を５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーター内で２４時間インキュベーションした。
【００７０】
２４時間後、５０μｌの培地を取り出し、そして１０μｌのＭＴＴ（２．５ｍｇ／ｍｌ）を細胞に添加した。これに続いて、３７℃及び５％のＣＯ２で更に４時間インキュベーションした。ＭＴＴの還元は、イソプロピルアルコール５０ｍｌと３７％のＨＣｌ１９７μｌとを含有する可溶化溶液を１００μｌ添加することにより特徴付けた。９６ウェルプレートを室温で６時間保って、ホルマザン結晶を溶解した。細胞毒性は、Ｐｏｌａｒｓｔａｒ  ＢＭＧ  ｌａｂｔｅｃｈプレートリーダーを用いて、５７０ｎｍでの吸収を測定することにより評価した。Ａβ４２を含まない細胞（健康な細胞）の平均生存率を、各実験で１００％とみなし、一方、０．１％トリトンＸ−１００を生存細胞に添加して０％の生存細胞とし、これを１００％生存不能細胞又は死滅細胞に対応する対照とした。
【００７１】
[結果]
ＭＴＴ結果を下記の表２及び図１に示す。
【表２】
2015514742.tif 000005
【００７２】
本発明の化合物（Ａ−７７６３６）は、１００μＭで毒性を有し、１０ｎＭ〜１０μＭで活性、及び１ｎＭでは不活性である。
【００７３】
＜実施例３＞
[Ａβ４２及び種々の濃度の（１Ｒ，３Ｓ）３−（１’−アダマンチル）−１−アミノメチル−３，４−ジヒドロ−５，６−ジヒドロキシ−１Ｈ−２−ベンゾピラン塩酸塩（Ａ−７７６３６）が存在した時のＳＹＳＨＹ５Ｙ細胞生存率のＬＤＨ毒性評価。]
[化合物Ａ−７７６３６を用いたＳＨＳＹ５Ｙ細胞を対象とする濃度依存性ＬＤＨアッセイ：]
Ａβ４２（１μＭ）で処理したＳＨＳＹ５Ｙ細胞を実験対象として、種々の濃度のＡ−７７６３６を用いて、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素、ｌａｃｔａｔｅ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）アッセイを実施した。ＬＤＨは、遍在的に存在する細胞質の酵素であり、神経細胞株内でも豊富にみられる１４。ＬＤＨアッセイは、細胞毒性の指標を提供し、放出されるＬＤＨの量から、アポトーシス又は壊死により引き起こされる細胞膜の損傷が定量化される１３，１５。ここでは、ＬＤＨ放出の蛍光測定を可能にする市販のＣｙｔｏ  Ｔｏｘ−Ｏｎｅアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｇ７８９０）を用いたが、この場合、レサズリン色素のレゾフリンへの還元反応は、ＮＡＤＨが関与する酵素的変換を経由して組み合わせられる。蛍光色素のレゾフリンの生成量は、ＬＤＨ放出量に比例する。
【００７４】
１μＭの細胞外Ａβ４２で処理したＳＨＳＹ５Ｙ細胞を実験対象として、Ａ−７７６３６を種々の濃度でスクリーニングした。ＬＤＨ細胞毒性分析では、Ａ−７７６３６を、１．５％のＦＣＳ、１％のＰ／Ｓ、１％のＬ−グルタミン、及び１％のＮＥＡＡが補充されたＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で希釈した。Ａ−７７６３６を、１００μＭ、１０μＭ、１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、及び１ｎＭの濃度でＳＨＳＹ５Ｙ細胞に添加した。
【００７５】
細胞を１×１０５個／ｍｌの密度で９６ウェル黒色平底プレート（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に播種し、そして５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーター内で２４時間インキュベーションした。これに続いて培地を取り出し、そして細胞に、Ａβ４２：Ａ７７６３６を含有する、新鮮な培地を添加した。細胞内の標的のペプチド及びＡ−７７６３６の最終濃度は、それぞれ１μＭ：１００μＭ、１μＭ：１０μＭ、１μＭ：１μＭ、１μＭ：１００ｎＭ、１μＭ：１０ｎＭ、及び１μＭ：１ｎＭであった。次に、細胞を、５％のＣＯ２を含む３７℃の加湿インキュベーター内で２４時間インキュベーションした。
【００７６】
２４時間後、９６ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、２２℃で３０分間平衡化（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｅ）した。Ｃｙｔｏ  Ｔｏｘ−Ｏｎｅ試薬を、製造業者のプロトコールに基づいて、基質混合物を２２℃で平衡化し、アッセイバッファーを水浴中、３７℃で解凍することにより調製した。これに続き、１１ｍｌのアッセイバッファーを基質混合物の各バイアルに添加した。１００μｌのＣｙｔｏ  Ｔｏｘ−Ｏｎｅ試薬を各ウェルに添加した。Ｃｙｔｏ  Ｔｏｘ−Ｏｎｅ試薬の調製及び添加は、バックグラウンドの蛍光が増加するのを避けるために暗所で実施し、そして必要とされる時まで−２０℃で保管した。細胞を２２℃で１０分間、更にインキュベーションした後、結果の変動の増加を避けるために、Ｃｙｔｏ  Ｔｏｘ−Ｏｎｅ試薬の場合と同じ順番で、停止溶液をウェルに添加した。停止溶液は、蛍光生成物であるレゾフリンの形成を停止する。Ｃｙｔｏ  Ｔｏｘ−Ｏｎｅ試薬添加前に、２μｌの溶解溶液（９％トリトンＸ１００、Ｐｒｏｍｅｇａ）を細胞に添加して、各実験の最大ＬＤＨ放出量（１００％として設定される）を評価して、死滅細胞対照とした。Ａβ４２を含まない細胞（健康な細胞）を、ＬＤＨ放出量が最小の対照又は生存細胞対照とみなした。次に、９６ウェルプレートをシェイカー上で１０秒間保持し、そしてＰｏｌａｒｓｔａｒ  ＢＭＧプレートリーダーを用いて、５６０ｎｍでの励起及び５９０ｎｍでの発光による蛍光を速やかに測定した。
【００７７】
ＬＤＨアッセイの結果を下記の表３及び図２に示す。
【表３】
2015514742.tif 000006
【００７８】
ＳＨＳＹ５Ｙ細胞を１μＭのＡβ４２で処理し、種々の濃度の化合物Ａ−７７６３６の効果を、Ｃｙｔｏ  Ｔｏｘ−Ｏｎｅ  ＬＤＨアッセイ法を用いて２４時間後に測定した。その結果より、Ａβ−ｖｅ又は健康な細胞については９％のＬＤＨ放出、また１μＭのＡβ４２で処理した細胞については８９％のＬＤＨ放出が実証され、すなわち細胞外Ａβ４２（１μＭ）で処理した場合、８９％の細胞毒性を示すことが実証された。Ａ−７７６３６は、１００μＭ〜１ｎＭの全ての濃度においてＡβ４２毒性を低減する。１００μＭのＡ−７７６３６は、１μＭのＡβ４２単独と比較して、なおも１μＭのＡβ４２毒性を低減するが、ＬＤＨ放出量の増加（５９％）が示す通り、Ａ−７７６３６は、１００μＭでは毒性を有する可能性がある。
【００７９】
従って、本発明の化合物（Ａ−７７６３６）は、アルツハイマー病及びＡβ毒性により引き起こされるその他の疾患の治療用途に適する候補薬物である。
【００８０】
＜実施例４＞
[細胞外Ａβ４２及びＡ−７７６３６処理の存在下におけるＲＡＣＫ１タンパク質の差次的発現。]
[Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイ：]
Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイ（ＩＣＷ）は、細胞ベースの免疫蛍光検査技法であり、マイクロプレートを用いた迅速かつ高感度のタンパク質発現の指標を提供する。マイクロプレートを用いて、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞をＡβ４２で２４時間処理した後、固定して、一次抗体及び蛍光標識された二次抗体を用いた細胞の免疫染色を行い、その後、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線画像システムを用いてプレートをスキャニングした。このアッセイは、Ａβ４２及びＡ−７７６３６存在下でＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を用いて、ＲＡＣＫ１タンパク質の発現（発現量）を測定するために実施した。化合物Ａ−７７６３６はＬＯＰＡＣライブラリに属し、細胞外Ａβ４２で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞に投与すると、細胞外Ａβ４２が介在する細胞毒性を阻害することが実証された。ＩＣＷアッセイにより、Ａβ４２（１μＭ）及びＡ−７７６３６（１μＭ）で処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞についてＲＡＣＫ１の差次的発現が実証され、これは妥当性のある作用機序の解明に役立ち、Ａ−７７６３６はその作用機序を通じて細胞外Ａβ４２細胞毒性の低減に作用すると考えられる。
【００８１】
[方法：]
[ＲＡＣＫ１発現を確認するためのＩｎ  Ｃｅｌｌ  Ｗｅｓｔｅｒｎアッセイ：]
ＲＡＣＫ１発現を、Ａβ４２及びＡ−７７６３６で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実験対象として、ＩＣＷアッセイ法を用いて分析した。ＩＣＷアッセイでは、９６ウェル透明平底マイクロプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を用いて、１ウェル当たり１．５×１０４個の細胞を、１．５％のＦＣＳ、１％のＬ−グルタミン、及び１％のペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたフェノールレッドを含まないＯｐｔｉ−ＭＥＭに播種（ｉｎｏｃｕｌａｔｅ）した。これに続いて、培地を取り出し、Ａβ４２（１μＭ）を含有する新鮮な培地を添加した。並行して、Ａβ４２（１μＭ）及び化合物Ａ−７７６３６（１μＭ）を含有する新鮮な培地に細胞を添加し、一方、対照細胞には１μＭのＡ−７７６３６のみを添加した。更に２４時間後、培地を廃棄し、そして４％のホルムアルデヒドを含むＰＢＳで細胞を速やかに固定した。固定は、４℃で一晩中行われた。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、０．１％トリトンＸ−１００を含むＰＢＳを２００μｌ添加して透過処理した。細胞を５分ずつ３回洗浄した。これに続いて、Ｏｄｙｓｓｅｙブロックキングバッファー（ＬＩ−ＣＯＲ）中、室温にて１．５時間、７０ｒｐｍのプレートシェイカー上で緩やかに揺動させながら、細胞をブロックキングした。Ｏｄｙｓｓｅｙブロックキングバッファー（ＬＩ−ＣＯＲ）で希釈したウサギ抗ヒトＲＡＣＫ１抗体（１：３００）（ａｂ７２４８３）を細胞に添加した後、４℃で一晩中インキュベーションした。α−チューブリン（１：２００）（ａｂ１５２４６）をこれらの実験のローディング対照として用いた。これに続いて、細胞を０．１％のツイーン２０を含むＰＢＳで各５分間、３回洗浄した。細胞に、Ｏｄｙｓｓｅｙブロックキングバッファーで１：８００に希釈した蛍光標識された二次抗体、抗ウサギＩＲＤｙｅ  ６８０  ＬＴ（ＬＩ−ＣＯＲ）を５０μｌ添加した後、緩やかに揺動させながら、室温で１時間インキュベーションした。この段階では、細胞を光から保護した。次に、細胞を０．１％のツイーン２０を含むＰＢＳで、各５分間、３回洗浄した。最終洗浄した後、ツイーン２０を含有する洗浄溶液を完全に除去した。マイクロプレートをペーパータオル上で軽く拭い、そしてＯｄｙｓｓｅｙ赤外線スキャナー（ＬＩ−ＣＯＲ）を用いて速やかにスキャンした。上記実験では、７００ｎｍチャンネルとして感度４．５に設定した。Ｏｄｙｓｓｅｙソフトウェアを用いてデータを取得し、エクセルにエクスポートして分析を行い、そして二次抗体のみで処理した細胞から得たバックグラウンドを数値から差し引いた。
【００８２】
[結果：]
[細胞外Ａβ４２及びＡ−７７６３６処理の存在下におけるＲＡＣＫ１タンパク質の差次的発現：]
ＲＡＣＫ１タンパク質の発現を調べるために、ＩＣＷアッセイを、Ａβ４２（１μＭ）及びＡ−７７６３６（１μＭ）で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実験対象として実施した。ＲＡＣＫ１は、ＰＫＣの活性化及び転位に必要であることが公知である１７。更に、ＲＡＣＫ１は、グルタミン酸作動性及びドーパミン作動性神経伝達物質系を調節すること、並びにＡβ４２が凝集した結果、破綻すると思われるＣａ２＋ホメオスタシスを維持するのに役立っていることも公知である１８、１９、２１。ＲＡＣＫ１の下方制御は、ＡＤと関連した公知の現象である２０。本試験では、Ａβ４２（１μＭ）のみで処理した細胞、及びＡ−７７６３６（１μＭ）で処理した細胞について、ＩＣＷアッセイを通じてＲＡＣＫ１タンパク質の差次的発現が認められた。
【００８３】
Ａβ４２（１μＭ）のみで処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞、細胞内の最終濃度が１μＭ：１μＭのＡβ４２：Ａ−７７６３６で処理した同細胞、及びＡ−７７６３６（１μＭ）のみで処理した同細胞について、ＲＡＣＫ１発現を２４時間測定した。結果を無処理対照細胞と比較した。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を１μＭのＡβ４２で２４時間処理すると、対照細胞（１３６％）と比較してＲＡＣＫ１タンパク質の発現の低下（８１％）、ｐ＜０．０５が実証された。一方、Ａβ４２（１μＭ）で処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を、Ａ−７７６３６を用いて１μＭで処理すると、ＲＡＣＫ１のレベルが１１２％まで部分的に改善することが実証された。このことから、この作用機序を通じてＡ−７７６３６は、Ａβ４２が介在する細胞毒性を改善するのに役立っているものと考え得る（図３）。ＩＣＷアッセイは、ＭＴＴ及びＬＤＨ細胞毒性アッセイから得られた結果を確認するのに更に役立ち、両細胞毒性アッセイにより、Ａ−７７６３６は、細胞外Ａβ４２細胞毒性の部分的な阻害剤として潜在能力を有することが実証された。更に、対照細胞に１μＭのＡ−７７６３６を単独投与しても、対照細胞と比較して、ＲＡＣＫ１の発現（１３０％）、ｐ＞０．０５に何らの変化も認めることはできなかった。これは、細胞外Ａβ４２細胞毒性の低減におけるＡ−７７６３６の考え得る役割を示唆しており、Ａ−７７６３６は、ＲＡＣＫ１タンパク質との結合により、また更にＲＡＣＫ１のレベル回復に役立つことにより作用しているものと考えられる。こうして、Ａβ４２凝集と関連して変化を受けた神経伝達物質系を間接的に改善しておそらくはＡβ４２細胞毒性を低減する。
【００８４】
＜実施例５＞
[Ａβにより誘発された毒性に対する代替的Ｄ１受容体作動薬の効果。]
更なるＤ１ドーパミン受容体作動薬（下記の表４に詳記する）について、これらが細胞外Ａβ４２毒性の阻害剤として作用するかを評価するために、スクリーニングした。これらの化合物は、Ａβ４２細胞毒性に対するその効果を観察するために、Ａβ４２（１μＭ）で処理したＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実験対象として、個別にスクリーニングした。ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を実験対象として、合計９個の化合物を、Ａβ４２（１μＭ）で同時処理してスクリーニングした。化合物Ａが、８１％の細胞生存率を示すことにより（ｐ＜０．０５）、Ａβ４２毒性を部分的に阻害することが実証されたが、他の全ての化合物は、統計的に有意性のない結果から明らかなようにＡβ４２毒性を阻害することができなかった（図４）。
【００８５】
このデータから、Ａβ毒性の阻害は、Ｄ１ドーパミン受容体作動薬の一般的特性ではないことが明らかである。
【表４】
2015514742.tif 000007
【００８６】
【表５Ａ】
2015514742.tif 000008
【表５Ｂ】
2015514742.tif 000009
【図１】
2015514742.tif 000010
【図２】
2015514742.tif 000011
【図３】
2015514742.tif 000012
【図４】
2015514742.tif 000013
【国際調査報告】
2015514742.tif 000014
2015514742.tif 000015
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