(57)【要約】本明細書は、HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を認識する能力を有するCD8+ T細胞を作製するための方法および材料を提供する。例えば、HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を認識および溶解する能力を有するCD8+ T細胞を作製するために、インビボまたはインビトロでSLAFLPESFDのアミノ酸配列からなるポリペプチドを使用するための方法および材料が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列がSEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項２】
配列がSEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む、ワクチン組成物。
【請求項３】
アジュバントを含む、請求項2記載のワクチン組成物。
【請求項４】
アジュバントが油と水の混合物である、請求項3記載のワクチン組成物。
【請求項５】
アジュバントがモンタナイド（Montanide）ISA-51である、請求項3記載のワクチン組成物。
【請求項６】
IL-2、IL-12、GM-CSF、またはリンタトリモド（rintatolimod）を含む、請求項2記載のワクチン組成物。
【請求項７】
CD8+ T細胞の集団をポリペプチドと接触させる工程であって、該ポリペプチドの配列がSEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列からなる、工程
を含む、HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を殺す能力を有するCD8+ T細胞の数を増加させる方法。
【請求項８】
接触工程がエクスビボの方法で行われる、請求項7記載の方法。
【請求項９】
接触工程がインビボの方法で行われる、請求項7記載の方法。
【請求項１０】
ポリペプチドを含むワクチン組成物をヒトに投与する工程であって、該ポリペプチドの配列がSEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列からなる、工程
を含む、HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を殺す能力を有するCD8+ T細胞の数をヒトにおいて増加させる方法。
【請求項１１】
ヒトがHER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
組成物がアジュバントを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
アジュバントが油と水の混合物である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
アジュバントがモンタナイドISA-51である、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
組成物が、IL-2、IL-12、GM-CSF、またはリンタトリモドを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１６】
IL-2、IL-12、GM-CSF、リンタトリモド、またはそれらの組み合わせをヒトに投与する工程を含む、請求項10記載の方法。
【請求項１７】
トラスツズマブをヒトに投与する工程をさらに含む、請求項10記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2012年2月17日に出願された米国仮特許出願第61/600,480号の恩典を主張するものである。先願の開示は、本出願の開示の一部として考慮される（または本出願の開示に参照により組み入れられる）。
【背景技術】
【０００２】
背景
1.技術分野
本明細書は、HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を認識する能力を有するCD8+ T細胞を作製するための方法および材料に関する。例えば、本明細書は、HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を認識する能力を有するCD8+ T細胞を作製するために、インビボまたはインビトロでSLAFLPESFDのアミノ酸配列からなるポリペプチドを使用するための方法および材料に関する。
【０００３】
2.背景情報
癌ワクチンは、癌と闘うことができるように免疫系を刺激または回復する能力を有する。いくつかの場合、癌ワクチンは、癌に対する患者の防御を強化することによって存在する癌を治療するために設計され得る。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本明細書は、HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を認識する能力を有するCD8+ T細胞を作製するための方法および材料を提供する。例えば、本明細書は、HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を認識および溶解する能力を有するCD8+ T細胞を作製するために、インビボまたはインビトロでSLAFLPESFDのアミノ酸配列（SEQ ID NO: 1）からなるポリペプチドを使用するための方法および材料を提供する。SLAFLPESFDのアミノ酸配列からなるポリペプチドは、SLAFLPESFDポリペプチド、p373-382ポリペプチド、またはSEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと呼ばれ得る。本明細書に記載されるように、SLAFLPESFDポリペプチドまたはSLAFLPESFDポリペプチドを含むワクチン組成物は、HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を有する癌患者に、該患者がこれらの癌細胞を認識および溶解する能力を有するCD8+ T細胞を産生する条件下で投与され得る。いくつかの場合、そのようなCD8+ T細胞は、SLAFLPESFDポリペプチドを使用して作製されたCD8+ T細胞と呼ばれ得る。
【０００５】
HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を認識および溶解する能力を有するCD8+ T細胞を作製する能力を有することは、臨床医が、癌患者に追加の有効な治療の選択肢を提供することを可能にする。例えば、本明細書に提供されるワクチンは、HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を殺すように設計されたCD8+ T細胞の有効な集団を有する癌患者を提供するために、単独または他の癌治療の選択肢と組み合わせて使用され得る。
【０００６】
概して、本明細書の一局面は、配列がSEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（例えば、精製されたポリペプチド）を特徴とする。いくつかの場合、ポリペプチドは、N末端および／またはC末端の修飾を含み得る。
【０００７】
別の局面において、本明細書は、配列がSEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（例えば、精製されたポリペプチド）を含むか、または該ポリペプチドから本質的になるワクチン組成物を特徴とする。いくつかの場合、ポリペプチドは、N末端および／またはC末端の修飾を含み得る。組成物はアジュバントを含み得る。アジュバントは油と水の混合物であり得る。アジュバントは、モンタナイド（Montanide）ISA-51であり得る。組成物は、IL-2、IL-12、GM-CSF、またはリンタトリモド（rintatolimod）を含み得る。
【０００８】
別の局面において、本明細書は、HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を殺す能力を有するCD8+ T細胞の数を増加させる方法を特徴とする。本方法は、CD8+ T細胞の集団を、配列がSEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（例えば、精製されたポリペプチド）と接触させる工程を含むか、または該工程から本質的になる。接触工程はエクスビボの方法で行われてもよい。接触工程はインビボの方法で行われてもよい。
【０００９】
別の局面において、本明細書は、HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を殺す能力を有するCD8+ T細胞の数をヒトにおいて増加させる方法を特徴とする。本方法は、配列がSEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド（例えば、精製されたポリペプチド）を含むか、または該ポリペプチドから本質的になるワクチン組成物をヒトに投与する工程を含むか、または該工程から本質的になる。いくつかの場合、ポリペプチドは、N末端および／またはC末端の修飾を含み得る。ヒトは、HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を含み得る。組成物はアジュバントを含み得る。アジュバントは油と水の混合物であり得る。アジュバントは、モンタナイドISA-51であり得る。組成物は、IL-2、IL-12、GM-CSF、またはリンタトリモドを含み得る。本方法は、IL-2、IL-12、GM-CSF、リンタトリモド、またはそれらの組み合わせをヒトに投与する工程を含み得る。本方法は、トラスツズマブをヒトに投与する工程をさらに含み得る。
【００１０】
特に定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料が使用され得るが、適切な方法および材料は以下に記載される。本明細書に引用される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の文献は、その全体が参照により組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が制御する。さらに、材料、方法、および例は、説明することのみを目的としており、限定することを意図してはいない。
【００１１】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
（図１Ａ）プロテアソームまたは免疫プロテアソーム触媒作用によりHER-2/neu 19-merポリペプチド
2015508778.tif 000002
に由来するポリペプチドを同定する、全イオンクロマトグラムの例を示す。
（図１Ｂ）19-merポリペプチド由来のHER-2/neu p369-377のプロセシングを調べる、図1Aに記載の反応からの抽出されたイオンクロマトグラムの例を示す。
（図１Ｃ）p373-382（SLAFLPESFD）が、プロテアソームまたは免疫プロテアソーム触媒作用によりHER-2/neu由来の23-mer
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からプロセシングされることを示す、抽出されたイオンクロマトグラムの例を示す。
（図２）図2Aは、TAP欠損T2細胞に結合するHER-2/neuポリペプチドp373-382を示す。図2Bは、T2細胞とHER-2/neuポリペプチドp373-382との用量依存的な飽和結合を示す。図2Cは、高親和性のインフルエンザ由来HLA-A2結合ポリペプチドであるGILGFVFTL（p58-66）と比較した、HER-2/neuポリペプチドp373-382およびp369-377の相対的結合親和性を示す。
（図３）図3Aは、HER-2/neuポリペプチドp373-382に対して作製されたCD8 T細胞が、p373-382またはp369-377のいずれかを負荷された自己細胞に応答することを示す、IFN-γ ELIspot解析を示す。図3Bは、HER-2/neuポリペプチドp373-382に対して作製されたCD8 T細胞が、IFN-γの放出を有するHER-2/neu発現腫瘍細胞に応答することを示す、IFN-γ ELIspot解析を示す。図3Cは、HER-2/neuポリペプチドp373-382に対して作製されたCD8 T細胞が、HER-2/neu発現腫瘍細胞を溶解することを実証する、細胞傷害性T細胞解析を示す。
（図４）A〜Bは、IFN-γ ELIspot解析を用いて、HER-2/neuポリペプチドp373-382に対して作製されたCD8 T細胞のIFN-γ反応が、MHCクラスIブロッキング抗体によってブロックされることを示す（図4A：抗HLA-A2；および図4B：抗HLA-ABC）。C〜Dは、細胞傷害性T細胞アッセイ法を用いて、HER-2/neuポリペプチドp373-382に対して作製されたCD8 T細胞の溶解反応が、MHCクラスIブロッキング抗体によってブロックされることを示す（図4C：抗HLA-A2；および図4D：抗HLA-ABC）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
本明細書は、HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を認識する能力を有するCD8+ T細胞を作製するための方法および材料を提供する。例えば、本明細書は、HER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を認識および溶解する能力を有するCD8+ T細胞を作製するために、インビボまたはインビトロでSEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドを使用するための方法および材料を提供する。いくつかの場合、本明細書は、SLAFLPESFDポリペプチドおよびSLAFLPESFDポリペプチドを含むワクチン組成物、ならびにHER2/neuポリペプチドを発現する癌細胞を認識する能力を有するCD8+ T細胞を作製するために、SLAFLPESFDポリペプチドまたはSLAFLPESFDポリペプチドを含むワクチン組成物を使用するための方法を提供する。
【００１４】
いくつかの場合、本明細書に提供されるポリペプチド（例えば、SEQ ID NO: 1に示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド）は、癌を治療するために、樹状細胞と組み合わせて使用され得る。例えば、SLAFLPESFDポリペプチドと接触させた樹状細胞は、癌を治療するために使用され得る。
【００１５】
本明細書に提供されるSLAFLPESFDポリペプチドは、実質的に純粋なものであり得る。ポリペプチドに関して「実質的に純粋な」との用語は、天然に付随するものである細胞構成要素から分離されたポリペプチドを言う。例えば、合成的に作製されたポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチドであり得る。典型的には、本明細書に提供されるポリペプチドは、天然に関連するものであるタンパク質および天然起源の有機分子を、重量にして、少なくとも60％（例えば、65％、70％、75％、80％、90％、95％、または99％）含まない場合に、実質的に純粋である。一般に、実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上に単一の主要なバンドを生じる。
【００１６】
本明細書に提供されるSLAFLPESFDポリペプチドは、広範囲の様々な方法で調製され得る。SLAFLPESFDポリペプチドは、比較的短いサイズであるために、公知のプロトコールに従い、液相または固相の自動合成装置において合成され得る。例えば、Stewart and Young, Solid Phase Polypeptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105:6442 (1983); Merrifield, The Polypeptides, Gross and Meienhofer, ed., academic Press, New York, pp. 1-284 (1979)を参照のこと。いくつかの場合、本明細書に提供されるポリペプチド（例えば、SLAFLPESFDポリペプチド）は、いずれもHLA-A2を結合する能力を有し得るアミド（例えばNH2）または遊離酸（例えばCOOH）C末端のいずれかで合成され得る。
【００１７】
いくつかの場合、本明細書に提供されるSLAFLPESFDポリペプチドをコードする核酸配列が発現ベクターに挿入され、適当な宿主細胞に（例えば、形質転換またはトランスフェクションにより）導入され、および発現に適した条件下で培養される、組換えDNA技術が使用され得る。それらの方法は、例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1982)、Ausubel et al., (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., New York (1987)、ならびに米国特許第4,237,224号; 4,273,875号; 4,431,739号; 4,363,877号;および4,428,941号に記載のように、当技術分野において周知である。
【００１８】
本明細書はまた、表1に示されるアミノ酸配列の1つからなるポリペプチド（例えば、実質的に純粋なポリペプチド）を提供する。そのようなポリペプチドは、SLAFLPESFDポリペプチドについて本明細書に記載された方法と同じ方法で作製および使用され得る。
【００１９】
いくつかの場合、本明細書に提供されるポリペプチドは、p373-382またはHER2/neuポリペプチドを認識する能力を有するCD8+ T細胞の活性化プールを作製するために、CD8+ T細胞の集団とインキュベートされ得る。例えば、本明細書に提供される1つまたは複数のポリペプチド（例えば、SLAFLPESFDポリペプチド）は、癌を治療するために使用され得る抗原特異的CD8+ T細胞を作製するために、エクスビボの方法で使用され得る。いくつかの場合、本明細書に提供されるポリペプチドは、癌を治療するために、モノクローナル抗体治療、CTL治療、またはモノクローナル抗体治療とCTL治療の両方を単独または組み合わせて使用され得る活性化HER2/neuポリペプチド特異的CD8+ T細胞のプールを作製するために使用され得る。例えば、抗HER-2/neuモノクローナル抗体治療を、癌（例えば、乳癌）を治療するために、p373-382ポリペプチドを使用して作製されるCD8+ T細胞の注入と組み合わせることができる。いくつかの場合、ハーセプチン（トラスツズマブ）治療を、癌（例えば、乳癌）を治療するために、p373-382ポリペプチドを使用して作製されるCD8+ T細胞の注入と組み合わせることができる。
【００２０】
本明細書はまた、本明細書に提供される1つまたは複数のポリペプチドの免疫原性有効量を含むワクチン組成物を提供する。本明細書に提供されるワクチン組成物は、予防的または治療的ワクチンの両方として使用され得る。本明細書に提供されるワクチン組成物は、他に記載された技術（例えば、US特許出願公開第2010-0310640号の[0132]〜[0173]を参照のこと）を含むが、これらに限定されない任意の適当な技術を用いて投与および製剤化され得る。
【００２１】
いくつかの場合、本明細書に提供されるワクチン組成物は、GM-CSF（例えば、サルグラモスチム）、リンタトリモド（例えば、アンプリゲン（Ampligen）（登録商標））、IL-2、IL-12、アジュバント、またはそれらの組み合わせを含み得る。例えば、本明細書に提供されるワクチン組成物は、GM-CSFおよびアジュバントを含み得る。アジュバントの例には、CpGオリゴヌクレオチド、モノホスホリルリピドA、およびモンタナイドISA-51が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合、アジュバントは、モンタナイドISA-51のような油と水の混合物であり得る。
【００２２】
いくつかの場合、本明細書に提供されるワクチン組成物は、ポリペプチドの組み合わせを含み得る。例えば、本明細書に提供されるワクチン組成物は、US特許出願公開第2010-0310640号、Karyampudi et al.の文献 {Clin. Cancer Res., 16(3):825-34 (2010))、Holmes et al.の文献 (J. Clin. Oncol., 26(20):3426-33 (2008))、Gritzapis et al.の文献 (Vaccine, 28(l):162-70 (2009))、Perez et al.の文献 (Cancer Immunol. Immunother., 50(11):615-24 (2002))、Knutson et al.の文献 (J. Clin. Invest., 107(4):477-84 (2001))、またはSalazar et al.の文献 (Clin. Cancer Res., 9(15):5559-65 (2003))に示される1つもしくは複数のポリペプチドと組み合わせた、SLAFLPESFDポリペプチドおよび／または表1に示される1つもしくは複数の他のポリペプチドを含み得る。
【００２３】
本明細書に提供されるワクチン組成物を哺乳動物（例えばヒト）に投与するために、任意の適当な方法を使用することができる。例えば、本明細書に提供されるワクチン組成物またはポリペプチドを、単独または他のポリペプチドと組み合わせて、100〜10,000マイクログラムの用量範囲で、合計4〜12ヶ月間（例えば、4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間、7ヶ月間、8ヶ月間、9ヶ月間、10ヶ月間、11ヶ月間、または12ヶ月間）、毎月、皮内または皮下経路により投与することができる。
【００２４】
本明細書に提供される方法および材料は、HER2/neuポリペプチドを発現する任意のタイプの癌を治療するために使用され得る。例えば、本明細書に提供される方法および材料は、乳癌、卵巣癌、結腸癌、食道癌、または肺癌を治療するために使用され得る。
【００２５】
本発明は、以下の実施例においてさらに記載されるが、これは特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００２６】
実施例1−HER2/neuポリペプチドの強力なクラスI MHC分子エピトープの同定
HER-2/neuは、広範囲の様々な癌において過剰発現されるポリペプチドであり、特に乳癌における治療標的である。例えば、NeuVaxは、HER-2/neuの細胞外ドメインに由来するHER-2/neu由来ポリペプチドp369-377（アミノ酸配列：KIFGSLAFL（SEQ ID NO: 2）、E75とも呼ばれる）を含み、GM-CSFと混合された、以前に開発されたワクチンである。このワクチンは、MHCクラスI分子と関連する細胞表面上の同ペプチドを提示すると推定される患者の癌細胞を認識および殺すことができるT細胞が作製されるように、E75に対する免疫応答を刺激することを目的としている。
【００２７】
以下は、E75が、MHCクラスI分子上のポリペプチドの負荷（loading）を必要とする、プロテアソームおよび免疫プロテアソームと呼ばれる多サブユニット酵素による、HER-2/neuまたはHER-2/neu断片からプロセシングされるかどうかを決定するために行った。これを決定するために、19-merポリペプチド
2015508778.tif 000004
を合成した。このポリペプチドは、HER-2/neuのアミノ酸364〜382位と一致し、E75（下線部）を完全に含む。次に19-merを、精製された20Sプロテアソームおよび免疫プロテアソームを用いて切断した。E75は、プロテオソームアルゴリズムによって決定されたように切断されると報告されているが、本明細書に示されるインビボのデータでは、長いHER-2/neuポリペプチドからこのポリペプチドへのプロセシングは示されなかった（図1Aおよび図1B）。しかし、19-merポリペプチドは、いくつかの他の短いポリペプチドにプロセシングされることが一貫して見出された（図1Aおよび表1）。これらの短いポリペプチドはいずれも、数学アルゴリズムを用いたHLA-A2への結合について、E75ほどの高さではスコア化されなかった（表1）。
【００２８】
（表１）
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HER-2/neu由来の19 mer配列は、免疫プロテアソームおよびプロテアソームによって短いポリペプチドにプロセシングされ、これらの断片は、HLA-A*0201に結合すると予測される。記号（＋）は、インビトロアッセイにおいて、ポリペプチドがそれぞれの酵素によって産生されたことを示す。記号（−）は、それぞれの酵素を含む試料におけるインビトロアッセイにおいて、ペプチドの検出は無かったことを示す。SYFPEITHIサーバーは、HLA-A*0201に結合する九量体および十量体のポリペプチドを予測するために使用された。短いポリペプチドが長い19 mer配列から酵素によってプロセシングされ得るかどうかを予測するために、インビトロのデータには関わりなく、Netchop 3.1サーバーならびにプロテアソームおよび免疫プロテアソーム酵素のためのモデル1、2、および3を有するプロテアソーム切断予測サーバー（Proteasome Cleavage Prediction Server）上において、20SおよびC末端3.0予測方法を使用した。NA（該当なし（not applicable））は、ポリペプチドが欠失を有する産物であるか、出発材料であり、したがってアッセイにおいて作製されていないか、またはHLA-A*0201への結合予測のためには大きすぎたかのいずれかであることを示す。数字とアスタリスクは、図1Aのペプチドの表示を示す。
【００２９】
観察されたプロセシングされたポリペプチドの1つ（p373-382）は、19-merの末端10アミノ酸を示した。このポリペプチドが長いペプチドからプロセシングされ得るかどうかを決定するために、p373-382を含む23-merを合成して、プロテアソームと共に処理した。図1Cに示されるように、p373-382は23-merから実際に放出された。
【００３０】
アッセイにおいてプロセシングされたポリペプチドの多くを合成し、標準T2 HLA-A2安定化アッセイを用いて、クラスI MHC分子であるHLA-A2への結合について試験した。HLA-A2は、コーカサス人種集団の約30〜40％において見られるMHCクラスI分子である。それは、多数の乳癌患者に利点がある可能性を有するため、ワクチン治験における標的としてしばしば使用される。合成されたポリペプチドの1つであるp373-382（SLAFLPESFD）は、陽性対照であるインフルエンザウイルス由来のポリペプチド（FLU）と同等なレベルで、HLA-A2分子と強く結合することができた（図2）。驚くべきことに、高濃度を要求されるp369-377と比較して、低レベルのp373-382でも結合した（図2）。
【００３１】
総合すれば、これらの結果は、HER-2/neuポリペプチドであるp373-382が、長いHER-2/neuポリペプチドからプロセシングされ、HLA-A2と結合することを示している。
【００３２】
p373-382エピトープが、癌細胞における細胞内機構によって天然にプロセシングされるかどうかを決定するため、ならびにそれが、刺激および活性化された免疫細胞に対する標的として使用され得る癌細胞の表面でHLA-A2に結合する可能性を有するかどうかを決定するため、ELIspotを行った。特定の免疫細胞が、癌細胞上でp373-382：HLAクラスI複合体を認識することができる場合、それらは癌細胞を殺し、患者における癌の進行を予防することができる。p373-382ポリペプチドが、細胞内機構によってインビトロでプロセシングされ、HLA-A2分子に強く結合できたことが示されたことから、p373-382ポリペプチドを用いて作製されたCD8+ T細胞が作製され得るかどうか、およびこれらのT細胞がHER-2/neu+乳癌細胞を認識することができるかを決定するために、ELIspotを実施した。
【００３３】
図3Aは、CD8+ T細胞系をpFLUポリペプチド（対照）、p369-377、およびp373-382を用いて作製したことを示す。予想されたように、対照のFLU T細胞はFLUポリペプチドでパルスされた標的細胞のみを認識した。HER-2/neu p369-377ポリペプチドで作製されたT細胞は、p369-377ポリペプチドでパルスされた標的細胞およびp373-382でパルスされた標的細胞を認識した。p373-382で作製されたT細胞は、p373-382ポリペプチドまたはp369-377ポリペプチドのいずれかでパルスされた標的細胞を認識した。これは、2つのポリペプチドの間には、5アミノ酸を共有するとの事実によるであろう交叉反応性が存在することを示している。
【００３４】
次に、産生されたT細胞系は、それらが表面で様々なレベルのHER-2/neuを発現する乳癌細胞系のパネルを認識できるかどうかを決定するために、インビトロのELISPOTアッセイにおいて評価された。全ての場合において、p373-382で作製されたCD8+ T細胞は、p369-377で作製されたCD8+ T細胞および対照のFLU CD8+ T細胞と比較して、非常に高いレベルで乳癌細胞を認識することができた（図3B）。BT20細胞はHER-2/neuを発現するがHLA-A2を発現せず、したがって、陰性対照として使用された。これらの結果は、乳癌細胞が、HLA-A2との関係で表面上でp373-382を発現すること、およびp373-382を用いて作製されたCD8+ T細胞がそれらの癌細胞を認識する能力を有することを示す。
【００３５】
T細胞による乳癌細胞の溶解を測定するために、別のインビトロアッセイを実施した。再び、p373-382ポリペプチドを用いて作製されたCD8+ T細胞は、p369-377ポリペプチドを用いて作製されたCD8+ T細胞と比較して、非常に高いレベルで試験された全ての乳癌細胞系を認識および溶解した（図3C）。このアッセイでは、BT20細胞は、HLA-A2を発現するがHER-2/neuを発現しないFLO細胞と同様に陰性対照であった。
【００３６】
最後に、p3737-382ポリペプチドがHLA制限方法においてCD8 T細胞を活性化したことを確認するために、図3で使用された3つのポリペプチドで作製されたT細胞系を、HLA-A2またはHLA-ABCモノクローナル抗体の中和存在下で、ペプチド特異的反応性または溶解活性についてアッセイした。図4A〜Bに示されるように、IFN-γ放出によって評価されるようなp373-382で作製されたT細胞の反応性は、対照アイソタイプ一致抗体と共に処理されたT細胞と比較して、いずれかの抗体の包含によって顕著に抑制された。同時に、図4C〜Dにそれぞれ示されるように、HLA-A2またはHLA-ABCモノクローナル抗体の中和は、p373-382で作製されたT細胞による腫瘍細胞の溶解をブロックしたことも観察された。
【００３７】
先の3つのパラグラフに記載される発見は、3人のHLA-A2+ドナーのうち2人から作製されたT細胞を用いて2〜4回繰り返された。
【００３８】
HLA-A2に加えて他のHLAアレルがp373-382またはいくつかの他の記載されたポリペプチドに結合する可能性を決定するために、アルゴリズムを使用した。使用されたアルゴリズムは、SYPE1THIおよびNetMHCpanであった。この試験の結果は、p373-382またはいくつかの断片が他のHLAクラス分子に結合する可能性があることを示唆している（表2）。
【００３９】
（表２）p373-382内の予測されるエピトープ
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アルゴリズム：SYFPEITHI [ワールドワイドウェブ"syfpeithi.de/"]、閾値スコア：10
アルゴリズム：NetMHCpan [ワールドワイドウェブ"cbs.dtu.dk/"]、閾値5％
- なし
【００４０】
総合すれば、本明細書に提供される結果は、p373-382（SLAFLPESFD）が、HER-2/neu患者に対する癌ワクチンおよび治療剤のための重要な候補として提供されることを示している。p373-382は細胞内酵素によってインビトロでプロセシングされ、一般的に用いられるMHCクラスI分子であるHLA-A2と結合する。ヒト血液由来のCD8+ T細胞はこのポリペプチドに対して産生され得、それらのT細胞は乳癌細胞を認識し得る。これは、乳癌細胞が、発現されたHER-2/neuポリペプチドからp373-382を天然にプロセシングして、HLA-A*0201との関係で細胞表面上にp373-382を提示することを示している。
【００４１】
他の態様
本発明はその詳細な説明と共に記載されるが、先の記載は説明することを意図しており、特許請求の範囲によって示される発明の範囲を制限するものではないことを理解すべきである。他の局面、利点、および改変は、特許請求の範囲の範囲内である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2015508778.tif 000008
【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年1月29日(2015.1.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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