(57)【要約】  本発明は、パテラミド生合成酵素等のシアノバクテリア酵素を用いた環状ペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ作製に関する。直鎖ペプチド基質を単離シアノバクテリアマクロシクラーゼ、例えばプロクロロン属由来のＰａｔＧを用いて環化する。環化の前に、直鎖ペプチド基質中の残基を単離シアノバクテリアヘテロシクラーゼ、例えばＰａｔＤヘテロシクラーゼ又はＴｒｕＤヘテロシクラーゼを用いて複素環化することができる。例えば、本発明の方法は、例えば治療薬の開発に使用されるカラタ等のシクロチド、並びにパテラミド及びテロメスタチン等のシアノバクチンを含む環状ペプチジル分子の作製に有用であり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状ペプチドを作製する方法であって、
（ｉｉｉ）直鎖ペプチド基質を準備すること、及び
（ｉｖ）前記ペプチド基質を単離シアノバクテリアマクロシクラーゼで処理して環状ペプチドを作製すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記直鎖ペプチド基質が標的ペプチド及びＣ末端環化シグナルと含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ペプチドが少なくとも６個の残基からなる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記環化シグナルに隣接する前記標的ペプチド中の残基がプロリン、シュードプロリン、複素環残基又はＮ−Ｍｅ残基である、請求項２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記環化シグナルがＡＹＤを含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記シアノバクテリアマクロシクラーゼが、ＰａｔＧ（配列番号１）の残基４９２〜８５１のアミノ配列に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記シアノバクテリアマクロシクラーゼがＰａｔＧのＡｓｐ５４８、Ｈｉｓ６１８及びＳｅｒ７８３に相当する位置にＡｓｐ残基、Ｈｉｓ残基及びＳｅｒ残基を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記シアノバクテリアマクロシクラーゼがＰａｔＧ（配列番号１）の残基４９２〜８５１のアミノ配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記シアノバクテリアマクロシクラーゼがＰａｔＧ（配列番号１）のＲ５８９、Ｋ５９４、Ｋ５９８及びＨ７４６に相当する１つ又は複数の残基に置換を含み、前記直鎖ペプチド基質が修飾環化シグナルを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記シアノバクテリアマクロシクラーゼがＰａｔＧのＫ５９８に相当する残基にＫ５９８Ｄ置換を含み、前記直鎖ペプチド基質が環化シグナルＡＹＲを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記直鎖ペプチド基質及び前記シアノバクテリアマクロシクラーゼの一方が固体支持体に固定化されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記直鎖ペプチド基質を５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び／又はｐＨ９において前記シアノバクテリアマクロシクラーゼで処理する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（ｉｉｉ）プロペプチドを準備すること、及び
（ｉｖ）前記プロペプチドを単離プロテアーゼで処理して直鎖ペプチド基質を作製すること、
を含む方法によって、前記直鎖ペプチド基質を準備する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
直鎖プロペプチドがプロテアーゼ認識部位によってプロ配列に連結したペプチド基質を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
直鎖プロペプチドがプロテアーゼ認識部位によって連結した１つ、２つ、３つ又はそれ以上のペプチド基質を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記プロテアーゼ認識部位がＧ（Ｌ／Ｖ）Ｅ（Ａ／Ｐ）Ｓであり、前記プロテアーゼがシアノバクテリアプロテアーゼである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記プロテアーゼ認識部位が異種プロテアーゼ認識部位であり、前記プロテアーゼが異種プロテアーゼである、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記異種プロテアーゼ認識部位がＫ残基であり、前記異種プロテアーゼがトリプシンであるか、前記異種プロテアーゼ部位がＹであり、前記プロテアーゼがキモトリプシンであるか、又は前記異種プロテアーゼ部位がＥＮＬＹＦＱ（Ｇ／Ｓ）であり、前記プロテアーゼがタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記プロペプチド及び前記プロテアーゼの一方が固体支持体に固定化されている、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
（ｉｉｉ）１つ又は複数の複素環化可能なアミノ酸を含むプレプロペプチドを準備すること、及び
（ｉｖ）前記プレプロペプチドをＰａｔＤヘテロシクラーゼ又はＴｒｕＤヘテロシクラーゼで処理して前記複素環化可能なアミノ酸を複素環残基に変換し、それにより直鎖ペプチド基質又はプロペプチドを作製すること、
を含む方法によって、前記直鎖ペプチド基質又は前記プロペプチドを準備する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＰａｔＤヘテロシクラーゼ又はＴｒｕＤヘテロシクラーゼが前記プレプロペプチド中のシステイン残基をチアゾリンに変換する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰａｔＤヘテロシクラーゼが前記プレプロペプチド中のトレオニン残基又はセリン残基をオキサゾリンに変換する、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＰａｔＤヘテロシクラーゼが前記プレプロペプチド中のセレノシステインをセレナゾリンに変換する、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＰａｔＤヘテロシクラーゼが前記プレプロペプチド中のアミノアラニンをイミダゾリンに変換する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記プレプロペプチドがＮ末端リーダー配列を含む、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記プレプロペプチドがＰａｔＥ１−３４リーダー配列又はＰａｔＥ２６−３４リーダー配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プレプロペプチドを水溶液中、常温でＰａｔＤヘテロシクラーゼにより処理する、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰａｔＤヘテロシクラーゼが、ＰａｔＤ（配列番号３）又はＴｒｕＤ（配列番号４）に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰａｔＤヘテロシクラーゼがＰａｔＤ（配列番号３）又はＴｒｕＤ（配列番号４）のアミノ配列を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記直鎖ペプチド基質、プロペプチド又は環状ペプチドを処理して前記複素環残基を酸化することを含む、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記複素環残基を化学酸化剤で酸化する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記複素環残基をオキシダーゼ酵素での処理により酸化する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記複素環残基をシアノバクテリアオキシダーゼでの処理により酸化する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記シアノバクテリアオキシダーゼが、ＰａｔＧ（配列番号１）の残基１〜４９１に対して少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ配列を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＰａｔＧオキシダーゼがＰａｔＧ（配列番号１）の残基１〜４９１のアミノ配列を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
シアノバクテリアヘテロシクラーゼ及び／又は前記シアノバクテリアオキシダーゼが固体支持体に固定化されている、請求項２０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記プレプロペプチド、前記プロペプチド及び／又は前記直鎖ペプチド基質が固体支持体に固定化されている、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記プレプロペプチド、プロペプチド及び／又は直鎖ペプチド基質が直接的又は間接的にタグに連結している、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記環状ペプチドをシアノバクテリアプレニラーゼで処理して、プレニル化又はゲラニル化環状ペプチドを作製する、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
プレプロペプチド、プロペプチド、直鎖ペプチド基質及び／又は環状ペプチドを更なる化学修飾に供する、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記環状ペプチドが検出可能な標識で標識されている、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記直鎖ペプチド基質、プレプロペプチド及び／又はプロペプチドがビーズに固定化されている、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記直鎖ペプチド基質、プレプロペプチド及び／又はプロペプチドの参照コピーが前記ビーズに付加的に固定化され、該参照コピーが環化シグナルを欠いている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記シアノバクテリアマクロシクラーゼによる処理の後に前記環状ペプチドが前記ビーズから放出され、前記参照コピーが該ビーズに固定化されたままである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
生物活性を同定するために、前記環状ペプチドを単離すること、及びスクリーニングすることを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記環状ペプチドを放出したビーズを特定すること、及び該ビーズに固定化された参照コピーをシークエンシングすることを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
環状ペプチドライブラリーをスクリーニングする方法であって、
（ｉ）ビーズに付着した多様な標的ペプチドの集団を準備することであって、各々のビーズに該標的ペプチドの第１及び第２のコピーが付着し、該第２のコピーではなく該第１のコピーが環化シグナルを介して該ビーズに付着すること、
（ｉｉ）前記ビーズをシアノバクテリアマクロシクラーゼで処理して前記標的ペプチドの第１のコピーを環状ペプチドに変換し、該環状ペプチドを前記ビーズから放出させること、
（ｉｉｉ）前記環状ペプチドの活性についてスクリーニングすること、
（ｉｖ）活性のある環状ペプチドを特定すること、
（ｖ）前記環状ペプチドが放出されたビーズを特定すること、及び
（ｖｉ）前記ビーズに付着した前記標的ペプチドの第２のコピーをシークエンシングすること、
を含む、方法。
【請求項４８】
前記環状ペプチドが放出されたビーズを特定することができるように、前記標的ペプチドの集団が空間的に配列している、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記方法の工程（ｉ）が、前記標的ペプチドをシアノバクテリアヘテロシクラーゼで処理して前記標的ペプチド中の１つ又は複数の複素環化可能な残基を複素環残基に変換することを更に含む、請求項４７又は４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記方法の工程（ｉ）が、前記標的ペプチド又は前記環状ペプチドをシアノバクテリアオキシダーゼ又は細菌オキシダーゼで処理してその複素環残基を酸化することを更に含む、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、環状ペプチドをｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
環状ペプチドは、新規の医薬としての使用についてバイオテクノロジー及び製薬産業で長年興味を持たれていた。環状ペプチドは直鎖ペプチドよりもはるかに安定した化合物であり、細胞膜をより効率的に通過することができるため、理想的な薬物分子である（非特許文献１）。環状ペプチドは特に合成的に作製するのが困難である。海洋シアノバクテリアは環状ペプチド天然産物であるシアノバクチン（cyanobactins）を産生することが示されている（非特許文献２；様々な環状ペプチド構造例については図１（ａ）及び図１（ｂ）を参照されたい）。シアノバクチンは、プレプロペプチドがアミノ酸の複素環化、エピマー化、プレニル化及びゲラニル化を含む複数の翻訳後修飾を受けるリボソーム生合成経路によって産生される（非特許文献３）。
【０００３】
シアノバクチンスーパーファミリーの成員であるパテラミドは、ホヤのリッソクリヌム・パテラ（Lissoclinum patella）の偏性未培養共生細菌であるプロクロロン属によって産生される（非特許文献４、非特許文献５）。これらの化合物は細胞毒性（非特許文献６）及びヒト白血病細胞において多剤耐性を無効にする能力を示す（非特許文献７）。パテラミドは、チアゾールへと更に酸化され得るオキサゾリン及びチアゾリンをもたらす複素環化残基（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ、Ｃｙｓ）を含有する環状オクタペプチドである（非特許文献４）。
【０００４】
パテラミドの遺伝子クラスターが同定され、遺伝子ｐａｔＡ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＧが産物を生じるのに不可欠であることが報告されている（非特許文献８、非特許文献３）。プレプロペプチドＰａｔＥは、３７残基のリーダー配列（残基１３〜２８の単一ヘリックスを含有する（非特許文献９））並びに各々Ｎ末端及びＣ末端プロテアーゼ認識部位が隣接し、最終産物を形成する８残基の１つ、２つ又は３つのカセットからなる（非特許文献４）。
【０００５】
パテラミド合成のいくつかの工程が完全に特性化されている。特定のアミノ酸の複素環化がＮ末端及びＣ末端切断の前に生じ、大環状化が産物への最終工程であるはずである。どの段階でエピマー化、チアゾリンのチアゾールへの酸化、並びにプレニル化及び／又はゲラニル化が生じるかは未だ明らかではないが、エピマー化は自発的であることが報告されており、大環状化の後に起こる。酸化が最後であるはずである（非特許文献１０）。本願では複素環化、カセット切断及び大環状化の工程に着目する。
【０００６】
複素環化はＰａｔＥプレプロペプチドテーラリングの最初の工程であり、３ドメインタンパク質ＰａｔＤによって触媒される。ＰａｔＤはＰａｔＥの３７アミノ酸リーダー配列に対して基質特異性を有し、システイン残基及びトレオニン／セリン残基を複素環化して、それぞれチアゾリン及びオキサゾリンを形成する。このプロセスは１つの複素環につき１つの水分子の喪失をもたらす。トルンカミド経路によるＰａｔＤホモログであるＴｒｕＤはシステイン残基のみを複素環化することが示されている（非特許文献１１）。
【０００７】
カセットのＮ末端切断は、Ｎ末端サブチリシン様プロテアーゼドメイン及び未知の機能のＣ末端ドメイン（ＤＵＦ）からなる２ドメインタンパク質であるＰａｔＡによって触媒される。プロテアーゼドメイン（ＰａｔＡｐｒ）は、Ｐ１’位のカセットの最初の残基により切断認識配列「Ｇ（Ｌ／Ｖ）Ｅ（Ａ／Ｐ）Ｓ」に作用する（非特許文献１２）。
【０００８】
パテラミド産生の最終工程はＣ末端切断及び大環状化である。この工程は、Ｎ末端オキシダーゼドメイン、サブチリシン様プロテアーゼ／マクロシクラーゼドメイン及びＣ末端ＤＵＦからなる３ドメインタンパク質であるＰａｔＧによって触媒される。プロテアーゼ／マクロシクラーゼドメイン（ＰａｔＧｍａｃ）は、カセットのＣ末端の切断及び切断カセットのパテラミドへの大環状化の両方に関与する（非特許文献１２）。ＰａｔＧｍａｃは配列ＸＡＹＤＧ（ＸがＰ１位に位置するカセットの最後の残基である）を認識する（非特許文献１３）。カセットの最後の残基がＰｒｏ又は複素環であるはずであると以前に報告されている（非特許文献１３）。
【０００９】
この経路の以前のｉｎ  ｖｉｖｏ研究から、最大３２０μｇ／Ｌの収率の環状産物が産生され得ることが示されている（非特許文献１４）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Driggers, E. M. et al. Nat Rev Drug Discov 7, 608-624 (2008)
【非特許文献２】Sivonen et al., 2010, Appl Microbiol Biotechnol, 86, 1213-25
【非特許文献３】Donia et al, 2006, Nat Chem Biol, 2, 729-35
【非特許文献４】Schmidt et al., 2005, Proc Natl Acad Sci U S A, 102, 7315-20
【非特許文献５】Long et al.2005, Chembiochem, 6, 1760-5
【非特許文献６】Kohda et al., 1989, Biochem Pharmacol, 38, 4497-500
【非特許文献７】Williams and Jacobs, 1993, Cancer Lett, 71, 97-102
【非特許文献８】Donia et al., 2008, Nat Chem Biol, 4, 341-3
【非特許文献９】Houssen, W.E. et al. - Chembiochem 11, 1867-1873
【非特許文献１０】Milne, B. F. et al Org Biomol Chem 4, 631-638 (2006)
【非特許文献１１】McIntosh, J. A. et al (2010). Chembiochem 11(10): 1413-1421
【非特許文献１２】Lee et al., 2009, J. Am. Chem. Soc., 131, 2122-2124
【非特許文献１３】McIntosh et al., 2010, J Am Chem Soc, 132, 15499-501
【非特許文献１４】Tianero MD et al. JACS (2012) 418-425
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、パテラミド生合成酵素等のシアノバクテリア酵素を用いて環状ペプチドを作製するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法の開発及び最適化に関する。これは例えばペプチジル分子の作製、候補治療薬の生合成及びスクリーニング、並びにナノテクノロジー用途に有用であり得る。
【００１２】
本発明の一態様は、環状ペプチドを作製するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、
（ｉ）直鎖ペプチド基質を準備すること、及び
（ｉｉ）上記ペプチド基質を単離シアノバクテリア（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌ）マクロシクラーゼで処理して環状ペプチドを作製すること、
を含む、方法を提供する。
【００１３】
環状ペプチドは、シクロチド及びシアノバクチン、例えばパテラミド及びテロメスタチンを含む環化ペプチジル化合物である。パテラミドはパテラミドＡ、Ｂ、Ｃ及びＤを含むプロクロロン属によって産生される環状オクタペプチドである。
【００１４】
シアノバクテリアマクロシクラーゼは、環化シグナルを含有するペプチド基質の環化を触媒するシアノバクテリア酵素である。
【００１５】
好適なシアノバクテリアマクロシクラーゼとしては、プロクロロン由来のＰａｔＧマクロシクラーゼ（ＡＡＹ２１１５６．１  ＧＩ：６２９１０８４３；配列番号１の残基４９２〜８５１）及びＴｒｕＧ（ｇｉ｜１６７８５９１０１｜ｇｂ｜ＡＣＡ０４４９４．１）、並びにアナベナ属由来のマクロシクラーゼ、例えばＡＤＡ００３９５．１  ＧＩ：２８０９８７２３２、ＡＣＫ３７８８９．１  ＧＩ：２１７３１６９５６及びＡＥＤ９９４４６．１  ＧＩ：３３２００２６３３、オスキラトリア属、例えばＧＩ：３００８６６５２９  ＺＰ＿０７１１１２１９．１、ミクロキスティス属、例えばＧＩ：３８９８３２５２７  ＣＣＩ２３７６４．１、ＧＩ：１５８９３４３７６  ＣＡＯ８２０８９．１、ＧＩ：３８９７８８４４３  ＣＣＩ１５９０２．１、ＧＩ：３８９６７８１５４  ＣＣＨ９２９６４．１、ＧＩ：３８９８０２０７２  ＣＣＩ１８８３２．１、ＧＩ：３８９８８２３９５  ＣＣＩ３７１４４．１、ＧＩ：３８９８２６３７０  ＣＣＩ２３１１１．１、ＧＩ：３８９７３１２１９  ＣＣＩ０４７０３．１、ＧＩ：３８９７１６３２８  ＣＣＨ９９４３２．１、ＧＩ：３８９８３１５９７  ＣＣＩ２５５２４．１及びＧＩ：１５９０２７５５０  ＣＡＯ８６９２０．１、ノストック・スポンギアエフォルメ（Nostoc spongiaeforme）種、例えばＴｅｎＧ（ＧＩ：１６７８５９０９２  ＡＣＡ０４４８６．１）、リングビア属、例えばＧＩ：１１９４９２３７４  ＺＰ＿０１６２３７１０．１、ノドゥラリア属、例えばＧＩ：１１９５１２４７４  ＺＰ＿０１６３１５５５．１、アナベナ属、例えばＡｃｙＧ（ＧＩ：２８０９８７２３２  ＡＤＡ００３９５．１）、プランクトスリックス属、例えばＧＩ：３３２００２６３３  ＡＥＤ９９４４６．１、トリコデスミウム属、例えばＧＩ：１１３４７５９９７  ＹＰ＿７２２０５８．１、並びにアルスロスピラ属、例えばＺＰ＿０６３８４６５４．１  ＧＩ：２８４０５４４４４、ＧＩ：２８４０５４０７１  ＺＰ＿０６３８４２８１．１、ＧＩ：２９１５７１０７５  ＢＡＩ９３３４７．１、ＧＩ：２８４０５４４４４  ＺＰ＿０６３８４６５４．１及びＧＩ：３７６００２２９４  ＺＰ＿０９７８０１３０．１が挙げられる。表４の配列アラインメントに他の好適なシアノバクテリアマクロシクラーゼの配列を提示する。
【００１６】
他の好適なシアノバクテリアマクロシクラーゼが当該技術分野で利用可能である（Lee, S. W. et al (2008). Discovery of a widely distributed toxin biosynthetic gene cluster, PNAS 105(15), 5879-5884）。
【００１７】
シアノバクテリアマクロシクラーゼは、上記の参照シアノバクテリアマクロシクラーゼ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでいても、又はその変異体であってもよい。例えばシアノバクテリアマクロシクラーゼは、配列番号１の残基４９２〜８５１若しくは表４に示される他のマクロシクラーゼのアミノ酸配列を含むか、又はその断片若しくは変異体であるアミノ酸配列を含むＰａｔＧマクロシクラーゼであり得る。
【００１８】
いくつかの実施の形態では、ＰａｔＧマクロシクラーゼは１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上の残基が挿入、欠失又は置換された配列番号１の配列を含み得る。例えば最大１５個、最大２０個、最大３０個、最大４０個、最大５０個又は最大６０個の残基が挿入、欠失又は置換されていてもよい。置換に好適な残基としてはＲ５８９、Ｋ５９４、Ｋ５９８及びＨ７４６が挙げられる。
【００１９】
位置Ｒ５８９、Ｋ５９４、Ｋ５９８、Ｈ７４６又は配列番号１のＰａｔＧ配列の他の位置に相当するシアノバクテリアマクロシクラーゼ中の位置は、日常的な配列分析法を用いて容易に決定することができる。この位置のアミノ酸を、日常的な部位特異的突然変異誘発法を用いて異なるアミノ酸残基に置き換えることができる（例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Russell et al. (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい）。
【００２０】
参照配列の断片及び変異体は本明細書の他の部分で説明する。いくつかの実施の形態では、上記の参照配列のいずれかの変異体である配列を含むシアノバクテリアマクロシクラーゼは、配列番号１のＡｓｐ５４８、Ｈｉｓ６１８及びＳｅｒ７８３に相当する位置にＡｓｐ残基、Ｈｉｓ残基及びＳｅｒ残基を含み得る。
【００２１】
上記の参照配列のいずれかの変異体である配列を含むシアノバクテリアマクロシクラーゼは、表４のアラインメントに示されるマクロシクラーゼ配列において黒色で示される残基を変異体配列の相当位置に含み得る。
【００２２】
いくつかの実施の形態では、シアノバクテリアマクロシクラーゼは修飾環化シグナルを認識する修飾認識配列を含み得る。マクロシクラーゼ中の認識配列及びペプチド基質中の環化シグナルは、それらが相補的であり、マクロシクラーゼと基質との結合が起こるように修飾されていてもよい。例えば、マクロシクラーゼ及び環化シグナルの一方がＲＲＲ又はＫＫＫ等のポジティブ配列であり、他方がＤＤＤ又はＥＥＥ等のネガティブ配列であってもよい。いくつかの実施の形態では、シアノバクテリアマクロシクラーゼは環化配列ＡＹＤＧを認識する認識配列ＲＫＫを含み得る。
【００２３】
いくつかの実施の形態では、シアノバクテリアマクロシクラーゼは配列番号１のＨ７４６及び／又はＦ７４７に相当する残基に置換を含み得る。これらの残基は環化シグナルＡＹＤのＹと相互作用する。例えば、マクロシクラーゼにおける荷電残基へのＦ７４７の置換は、環化シグナルにおける反対の電荷を有する残基のＹへの置換を可能にし得る。
【００２４】
いくつかの実施の形態では、シアノバクテリアマクロシクラーゼは配列番号１のＫ５９８に相当する残基に置換を含み得る。例えば、シアノバクテリアマクロシクラーゼはＫ５９８Ｄ置換を含んでいてもよく、環化シグナルＡＹＲを認識し得る。
【００２５】
例えばＲ５８９、Ｋ５９４、Ｋ５９８及びＨ７４６、又は他の置換等（or equivalents）によるシアノバクテリアマクロシクラーゼ配列の修飾は、ネイティブ酵素配列に対して活性及び／又は動態を改善することができる。これは生合成プロセスを適当な時間で実行可能とするのに役立ち得る。
【００２６】
修飾環化配列を認識させるようなシアノバクテリアマクロシクラーゼ配列の修飾は、環化の標的ペプチド配列が非修飾環化配列（例えばＸＡＹＤ（Ｘは複素環又はＰｒｏである））を含有する場合に必要であり得る。
【００２７】
ペプチド基質は標的ペプチド及びＣ末端環化シグナルを含み得る。
【００２８】
標的ペプチドはマクロシクラーゼによる環化を受け、環状ペプチドを形成する配列である。
【００２９】
好適な標的ペプチドは少なくとも４個、５個、６個、７個又は８個の残基を有し得る。好適な標的ペプチドは最大１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個若しくは３０個、又はそれ以上の残基を有し得る。例えば、好適な標的ペプチドは４個〜３０個の残基、好ましくは４個〜２３個の残基、より好ましくは６個〜２３個、６個〜２０個又は６個〜１１個の残基を有し得る。
【００３０】
標的ペプチド配列は天然物、例えば天然のシアノバクチン配列若しくはその前駆体、若しくは天然のシクロチド配列若しくはその前駆体であってもよく、又は標的ペプチド配列は合成物であってもよい。例えば標的ペプチド配列は、通常はシアノバクチン環化シグナルとは結びつかない異種配列であってもよい。
【００３１】
標的ペプチドは修飾アミノ酸、非修飾アミノ酸、複素環アミノ酸、非複素環アミノ酸、自然発生アミノ酸及び／又は非自然発生アミノ酸を含み得る。
【００３２】
本発明の方法は、下記のような単離シアノバクテリア酵素を用いた標的ペプチド配列への複素環アミノ酸の導入、及び任意に導入された複素環アミノ酸の酸化ももたらす。
【００３３】
標的ペプチド配列は０個、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又はそれ以上の複素環アミノ酸を含み得る（Shin-ya, K. et al J. Am. Chem. Soc. 2001, 123, 1262-1263）。
【００３４】
標的ペプチド配列中の環化シグナルに対して直接Ｎ末端の残基は複素環アミノ酸であるのが好ましい。例えば、チアゾリン（Ｔｈｎ）、チアゾール（Ｔｈｚ）、オキサゾリン（Ｏｘｎ）、オキサゾール（Ｏｘｚ）、プロリン及びシュードプロリン（pseudoproline）（ΨＰｒｏ）から選択されるアミノ酸が挙げられる。
【００３５】
他の実施の形態では、標的ペプチド配列中の環化シグナルに対して直接Ｎ末端の残基はＮ−メチル化アミノ酸、又は標的ペプチド配列を十分に大環状化に向けるＮＨ２基及びＣＯＯＨ基を有する部分であり得る。
【００３６】
好適な標的ペプチド配列としてはＩＴＡＣＩＴＦＣ、ＩＴＡＣＩＳＦＣ、ＩＣＡＣＩＴＦＣ、ＩＡＡＣＩＴＦＣ、ＩＴＡＣＩＴＹＣ、ＩＴＡＣＩＴＡＣ、ＩＴＡ（ＳｅＣｙｓ）ＩＴＦ（ＳｅＣｙｓ）、ＩＭＡＣＩＭＡＣ、ＩＤＡＣＩＤＦＣ、ＩＴＶＣＩＴＶＣ、ＩＴＡＡＩＴＦＣ、ＶＰＡＰＩＰＦＰ、ＶＴＶＣＶＴＶＣ、ＶＧＡＧＩＧＦＰ、ＡＣＩＭＡＣ、ＩＡＣＩＭＡＣ、ＩＩＴＡＣＩＭＡＣ、ＡＴＡＣＩＴＦＣ及びＧＶＡＧＩＧＦＰが挙げられる。他の好適な標的ペプチド配列、例えばシアノバクチン又は他の環状及び大環状ペプチドは当該技術分野で既知であり（例えば、Houssen, W. E. & Jaspars, M. Chembiochem 11, 1803-1815 (2010)、非特許文献２を参照されたい）、及び／又は本明細書の他の部分で説明する。
【００３７】
他の好適な標的ペプチド配列としては、ＧＬＰＶＣＧＥＴＣＶＧＧＴＣＮＴＰＧＣＴＣＳＷＰＶＣＴＲＮ（カラタＢ１）等のシクロチド配列が挙げられる。
【００３８】
いくつかの実施の形態では、標的ペプチド配列中の１つ又は複数の残基は、更なる化学修飾を可能にすることができる反応性官能基を含み得る。好適な残基はＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＯＨ及びＳＨ等の側鎖連結基を有する側鎖を含有し得る。
【００３９】
環化シグナルは、好ましくは標的ペプチドに隣接してペプチド基質のＣ末端に位置する。環化シグナルはシアノバクテリアマクロシクラーゼの認識部位である。ペプチド基質中の環化シグナルの配列は、使用するシアノバクテリアマクロシクラーゼに応じて異なり得る。典型的には、環化シグナルが小残基−嵩高い残基−酸性残基の配列を含む。好適な環化シグナルとしては、ＡＹＤ、ＡＹＥ、ＳＹＤ、ＡＦＤ及びＦＡＧが挙げられる。
【００４０】
一部の好ましい実施の形態では、シアノバクテリアマクロシクラーゼがＰａｔＧマクロシクラーゼであり、環化シグナルがＡＹＤである。
【００４１】
いくつかの実施の形態では、環化シグナルは異種である、すなわち天然には標的ペプチド配列とは結びつかないものであってもよい。
【００４２】
環化シグナルは天然の環化シグナル又は合成若しくは修飾環化シグナルであり得る。修飾環化シグナルは、上記のように修飾シアノバクテリアマクロシクラーゼによって認識されることができる。
【００４３】
直鎖ペプチド基質は、ペプチドの環化に好適な条件下でシアノバクテリアマクロシクラーゼにより処理することができる。好適な条件は当業者に明らかである。一部の好ましい実施の形態では、条件は５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び／又はｐＨ９を含み得る。例えば、直鎖ペプチド基質は５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５％ＤＭＳＯ中、ｐＨ８でシアノバクテリアマクロシクラーゼにより処理することができる。
【００４４】
マクロシクラーゼが耐えられる最高の温度が、概して反応速度の増大をもたらすため好ましい。規定の一連の条件下で反応に最適な温度は実験により決定することができる。
【００４５】
いくつかの実施の形態では、直鎖ペプチド基質が例えば固体支持体に固定化され、シアノバクテリアマクロシクラーゼが溶液中で遊離していてもよい。これは例えば環状ペプチドの精製を容易にするうえで有用であり得る。
【００４６】
他の実施の形態では、直鎖ペプチド基質が溶液中で遊離し、シアノバクテリアマクロシクラーゼが例えばビーズ等の固体支持体に固定化されていてもよい。これは例えばマクロシクラーゼの再利用を容易にするうえで有用であり得る。
【００４７】
いくつかの実施の形態では、直鎖ペプチド基質を例えば下記のような化学合成又は組み換え手段によって作製し、シアノバクテリアマクロシクラーゼで直接処理することができる。これは例えば複素環を含有しない環状ペプチドを作製するうえで有用であり得る。
【００４８】
他の実施の形態では、直鎖ペプチド基質はプロペプチドから作製することができる。例えば、
（ｉ）直鎖プロペプチドを準備すること、及び
（ｉｉ）上記直鎖プロペプチドを単離プロテアーゼで処理して直鎖ペプチド基質を作製すること、
を含む方法によって、直鎖ペプチド基質を準備することができる。
【００４９】
直鎖プロペプチドがプロテアーゼ認識部位によってプロ配列、例えばＮ末端リーダー配列に連結した直鎖ペプチド基質を含み得る。
【００５０】
いくつかの実施の形態では、プロテアーゼ認識部位がＧ（Ｌ／Ｖ）Ｅ（Ａ／Ｐ）Ｓであり、プロテアーゼがＰａｔＡプロテアーゼ等のシアノバクテリアプロテアーゼであり得る。他の好適なプロテアーゼ認識部位としては、ＧＬＥＡＳ、ＧＶＥＰＳ、ＧＶＥＰＰ、ＧＶＤＡＳ、ＧＶＧＡＳ、ＧＡＧＡＳ、ＧＡＥＡＳ、ＱＶＱＡＱ、ＱＶＥＡＱ、ＱＶＱＡＬ、ＱＶＴＡＱ、ＱＶＴＡＨ、ＱＶＴＰＨ、ＧＰＧＰＳ及びＲＶＴＶＱが挙げられる。
【００５１】
シアノバクテリアプロテアーゼは、ペプチド鎖をプロテアーゼ認識部位で切断するシアノバクテリア由来の酵素である。
【００５２】
好適なシアノバクテリアプロテアーゼとしては、プロクロロン属由来のＰａｔＡプロテアーゼ（ＡＡＹ２１１５０．１  ＧＩ：６２９１０８３７）、ＴｒｕＡプロテアーゼ（ＡＣＡ０４４８７．１  ＧＩ：１６７８５９０９４）、並びにリングビア属由来のプロテアーゼ、例えばＺＰ＿０１６２３６９９．１  ＧＩ：１１９４９２３６３、ミクロキスティス属、例えばＣＡＯ８６９１２．１  ＧＩ：１５９０２７５４２及びＣＡＯ８２０８１．１  ＧＩ：１５８９３４３６８、ノストック・スポンギアエフォルメ種、例えばＴｅｎＡ（ＡＣＡ０４４８０．１  ＧＩ：１６７８５９０８６）、アナベナ属、例えばＡｃｙＡ（ＡＣＫ３７８８８．２  ＧＩ：２８０９８７２２１）、オスキラトリア属、例えばＺＰ＿０７１１１２１４．１  ＧＩ：３００８６６５２４、トリコデスミウム属、例えばＹＰ＿７２２０５５．１  ＧＩ：１１３４７５９９４、ノドゥラリア属、例えばＺＰ＿０１６３１５５９．１  ＧＩ：１１９５１２４７８、シアノセイス属、例えばＹＰ＿００３９００３７１．１  ＧＩ：３０７５９１５７２及びＹＰ＿００２４８１２５８．１  ＧＩ：２２０９０５９４７、並びにアルスロスピラ属、例えばＢＡＩ９３３６９．１  ＧＩ：２９１５７１０９７が挙げられる。他の好適なシアノバクテリアプロテアーゼは表５に示す。
【００５３】
シアノバクテリアプロテアーゼは上記の参照シアノバクテリアプロテアーゼ配列のいずれか１つのアミノ配列を含んでいても、又はその変異体であってもよい。例えば、シアノバクテリアプロテアーゼは配列番号２のアミノ配列を含む、又はその変異体であるＰａｔＡプロテアーゼであり得る。参照配列の変異体は本明細書の他の部分で説明する。
【００５４】
いくつかの実施の形態では、シアノバクテリアプロテアーゼは修飾及び／又は異種プロテアーゼ認識部位を認識する修飾配列を含み得る。ペプチド基質中のプロテアーゼ配列及びプロテアーゼ認識部位は、それらが相補的であり、結合が起こるように修飾されていてもよい。
【００５５】
より好ましい実施の形態では、プロテアーゼ認識部位が異種プロテアーゼ認識部位を更に含み、プロテアーゼが異種プロテアーゼであってもよい。
【００５６】
例えば、異種プロテアーゼ認識部位がＫ残基又はＲ残基であり、プロテアーゼがトリプシンであってもよく、異種プロテアーゼ部位がＹであり、プロテアーゼがキモトリプシンであってもよく、異種プロテアーゼ部位がＬＶＰＲＧＳであり、プロテアーゼがトロンビンであってもよく、異種プロテアーゼ部位がＩ（Ｅ／Ｄ）ＧＲであり、プロテアーゼが因子Ｘａであってもよく、又は異種プロテアーゼ部位がＥＮＬＹＦＱ（Ｇ／Ｓ）若しくはＥＮＬＹＦＱであり、プロテアーゼがタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼであってもよい。他の好適な部位特異的プロテアーゼは当該技術分野で既知であり、残基選好性を有する任意の部位特異的エンドプロテアーゼを使用することができる。例えば、ＧｌｕＣはＥの後で切断するため、異種プロテアーゼ認識部位中のＫ又はＲをＥで置き換えることでＧｌｕＣによる切断が可能となる。
【００５７】
ＴＥＶプロテアーゼ、トリプシン及びキモトリプシン等の異種部位特異的プロテアーゼは当該技術分野で既知であり、商業的供給源から入手可能である。
【００５８】
シアノバクテリアプロテアーゼ認識部位は、シアノバクテリアヘテロシクラーゼの認識部位であってもよい。異種プロテアーゼ認識部位が存在する場合、下記のように標的ペプチド配列への複素環の導入を可能にするために、シアノバクテリアプロテアーゼ認識部位が保持されていてもよい。例えば、直鎖プロペプチドは配列ＧＬＥＡＳＫ（ペプチド配列）又はＧＬＥＡＳＥＮＬＹＦＱ（ペプチド配列）を含み得る。
【００５９】
複素環が標的ペプチド配列に導入されない実施の形態では、プロペプチドはシアノバクテリアプロテアーゼ認識部位を欠いていてもよい。
【００６０】
いくつかの実施の形態では、直鎖プロペプチドは、プロテアーゼ認識部位によって連結した１つ、２つ、３つ又はそれ以上のペプチド基質を含む。プロテアーゼでの直鎖プロペプチドの処理により１つ、２つ、３つ又はそれ以上の直鎖ペプチド基質がプロペプチドから放出される。直鎖プロペプチドにおける２つ、３つ又はそれ以上のペプチド基質の放出は同じであっても又は異なっていてもよい。
【００６１】
いくつかの実施の形態では、プロペプチドが固定化され、プロテアーゼが溶液中で遊離していてもよい。例えばこれは例えば環化前のペプチド基質の精製を容易にするうえで有用であり得る。
【００６２】
他の実施の形態では、プロペプチドが溶液中で遊離し、プロテアーゼが固定化されていてもよい。これは例えばプロテアーゼの再利用を容易にするうえで有用であり得る。
【００６３】
環化及び任意にタンパク質分解の前に、直鎖ペプチド基質又はプロペプチドを処理して、標的ペプチド配列中のアミノ酸残基を複素環化してもよい。例えば、
（ｉ）１つ又は複数の複素環化可能なアミノ酸を含むプレプロペプチドを準備すること、及び
（ｉｉ）上記プレプロペプチドをシアノバクテリアヘテロシクラーゼで処理して複素環化可能なアミノ酸を複素環残基に変換し、それにより直鎖ペプチド基質又はプロペプチドを作製すること、
を含む方法によって、直鎖ペプチド基質又は直鎖プロペプチドを準備することができる。
【００６４】
複素環化可能なアミノ酸としては、システイン、セレノシステイン、テルロシステイン、トレオニン、セリン、２，３−ジアミノプロパン酸、並びにα位及びβ位に付加的なＲ基を有するその合成誘導体が挙げられる。
【００６５】
シアノバクテリアヘテロシクラーゼは、直鎖プレプロペプチド中のシステイン残基をチアゾリンに、トレオニン／セリン残基をオキサゾリンに、セレノシステインをセレナゾリンに、テルロシステインをテルラゾリンに、及び／又はアミノアラニンをイミダゾリンに変換することができる。
【００６６】
複素環アミノ酸としては、プロリンが挙げられる。
【００６７】
シアノバクテリアヘテロシクラーゼは、複素環化可能な残基を複素環に変換するシアノバクテリア由来の酵素である。シアノバクテリアヘテロシクラーゼは、本明細書に記載のようにＮ末端リーダー配列及び／又はシアノバクテリアプロテアーゼ認識部位を認識することができる。
【００６８】
好適なシアノバクテリアヘテロシクラーゼとしては、プロクロロン属由来のＰａｔＤヘテロシクラーゼ（配列番号３；ＡＡＹ２１１５３．１  ＧＩ：６２９１０８４）又はＴｒｕＤプロテアーゼ（配列番号４；ＡＣＡ０４４９０．１  ＧＩ：１６７８５９０９７）、及びノストック・スポンギアエフォルメ種由来のヘテロシクラーゼ、例えばＴｅｎＤ（ＡＣＡ０４４８３．１  ＧＩ：１６７８５９０８）が挙げられる。他の好適なヘテロシクラーゼは表６に示される。
【００６９】
いくつかの実施の形態では、シアノバクテリアヘテロシクラーゼは、複素環化される直鎖プレプロペプチド中の残基に応じて選択することができる。例えば、ＰａｔＤを使用して直鎖プレプロペプチド中のＣｙｓ残基、Ｔｈｒ残基及びＳｅｒ残基を複素環化することができ、ＴｒｕＤを使用して直鎖プレプロペプチド中のＣｙｓ残基を複素環化することができるが、Ｔｈｒ残基又はＳｅｒ残基は複素環化されない。
【００７０】
シアノバクテリアヘテロシクラーゼは、上記の参照シアノバクテリアヘテロシクラーゼ配列のいずれか１つのアミノ配列を含んでいてもよく、又はその変異体であってもよい。例えば、シアノバクテリアヘテロシクラーゼは、配列番号３若しくは配列番号４のアミノ配列又はその変異体を含むＰａｔＤヘテロシクラーゼ又はＴｒｕＤヘテロシクラーゼであり得る。参照アミノ酸配列の変異体は本明細書の他の部分で説明する。
【００７１】
いくつかの実施の形態では、プレプロペプチドはリーダー配列を含み得る。リーダー配列はＮ末端にあっても又はＣ末端にあってもよく、ヘテロシクラーゼによって認識される。Ｎ末端リーダー配列は、上記のように複素環化の後にプロテアーゼから除去することができる。
【００７２】
リーダー配列の選択は、用いられるヘテロシクラーゼによって決まる。好適なＮ末端リーダー配列としては、ＰａｔＤヘテロシクラーゼ及びＴｒｕＤヘテロシクラーゼによって認識されるＰａｔＥ１−３４又はＰａｔＥ２６−３４が挙げられる。
【００７３】
リーダー配列は異種であってもよい。
【００７４】
他の実施の形態では、リーダー配列は存在しなくてもよい。
【００７５】
いくつかの実施の形態では、シアノバクテリアヘテロシクラーゼは認識ドメインを結合対の第１の成員で置き換えることによって修飾され得る。プレプロペプチド上のリーダー配列は、結合対の他の成員に置き換えることができる。好適な結合対は当該技術分野で既知であり、グルタチオン／グルタチオン結合タンパク質及びビオチン／ストレプトアビジンが挙げられる。例えば、プレプロペプチドがＮ末端グルタチオンを含み、シアノバクテリアヘテロシクラーゼがグルタチオン結合タンパク質ドメインを含んでいてもよい。
【００７６】
複素環化のためのプレプロペプチドは、ヘテロシクラーゼによって認識される本明細書に記載のシアノバクテリアプロテアーゼ認識部位を更に含み得る。
【００７７】
シアノバクテリアヘテロシクラーゼを作製する方法を下記により詳細に説明する。
【００７８】
プレプロペプチドは、その１つ又は複数の複素環化可能な残基を複素環化するのに好適な条件下でシアノバクテリアヘテロシクラーゼにより処理することができる。例えば、プレプロペプチドは常温の水溶液中、Ｍｇ２＋及びＡＴＰの存在下でＰａｔＤヘテロシクラーゼ又はＴｒｕＤヘテロシクラーゼにより処理することができる。ヘテロシクラーゼが耐えられる最高の温度が、概して反応速度の増大をもたらすため好ましい。規定の一連の条件下で反応に最適な温度は実験により決定することができる。
【００７９】
いくつかの実施の形態では、プレプロペプチドが固体支持体に固定化され、シアノバクテリアヘテロシクラーゼが溶液中で遊離していてもよい。他の実施の形態では、直鎖プレプロペプチドが溶液中で遊離し、シアノバクテリアヘテロシクラーゼが固体支持体に固定化されていてもよい。
【００８０】
プレプロペプチド、プロペプチド、直鎖ペプチド基質又は環状ペプチド中のチアゾリン、オキサゾリン、セレナゾリン、テルラゾリン及びイミダゾリン等の複素環残基を酸化に供して、標的ペプチド配列中の１つ又は複数の複素環残基を酸化してもよい。
【００８１】
直鎖プレプロペプチド、プロペプチド、直鎖ペプチド基質又は環状ペプチド中のチアゾリン（Ｔｈｎ）残基は、チアゾール（Ｔｈｚ）へと酸化することができ、直鎖プレプロペプチド、プロペプチド、直鎖ペプチド基質又は環状ペプチド中のオキサゾリン残基（Ｏｘｎ）は、オキサゾール（Ｏｘｚ）へと酸化することができ、直鎖プレプロペプチド、プロペプチド、直鎖ペプチド基質又は環状ペプチド中のセレナゾリン（Ｓｅｎ）は、セレナゾール（Ｓｅｚ）へと酸化することができ、直鎖プレプロペプチド、プロペプチド、直鎖ペプチド基質又は環状ペプチド中のテルラゾリン（Ｔｅｎ）は、テルラゾール（Ｔｅｚ）へと酸化することができ、直鎖プレプロペプチド、プロペプチド、直鎖ペプチド基質又は環状ペプチド中のイミダゾリン（Ｉｍｎ）は、イミダゾール（Ｉｍｚ）へと酸化することができる。
【００８２】
細菌オキシダーゼ、シアノバクテリアオキシダーゼ若しくは他の酵素オキシダーゼ、又は化学酸化剤を用いることができる。
【００８３】
いくつかの実施の形態では、プレプロペプチドを複素環化後にシアノバクテリアオキシダーゼ若しくは他の酵素オキシダーゼ又は化学酸化剤で処理することができる。標的ペプチド配列中の１つ又は複数の複素環残基を酸化するために処理を複素環化の直後に行ってもよく、又は酸化を異なる段階で行ってもよい。例えば、大環状化後に環状ペプチドをオキシダーゼ又は化学酸化剤で処理してもよい。
【００８４】
シアノバクテリアオキシダーゼは、１つ又は複数の複素環アミノ酸残基を酸化するシアノバクテリアに由来する酵素である。
【００８５】
シアノバクテリアオキシダーゼは、本明細書に記載の全ての複素環残基又はその組合せ、例えばオキサゾリン及びチアゾリン、又はチアゾリンのみを酸化することができる。
【００８６】
好適なシアノバクテリアオキシダーゼとしては、プロクロロン属に由来するＰａｔＧオキシダーゼ（配列番号１の残基１〜４９１）が挙げられる。
【００８７】
シアノバクテリアオキシダーゼは上記の参照シアノバクテリアオキシダーゼ配列のいずれか１つのアミノ配列を含んでいてもよく、又はその変異体であってもよい。例えば、シアノバクテリアオキシダーゼは、配列番号１の残基１〜４９１のアミノ配列又はその断片、対立遺伝子若しくは変異体を含むＰａｔＧオキシダーゼであり得る。
【００８８】
いくつかの実施の形態では、細菌オキシダーゼを用いて１つ又は複数の複素環アミノ酸残基を酸化することができる。好適な細菌オキシダーゼは当該技術分野で既知であり、チアゾール／オキサゾール修飾ミクロシンクラスターに由来するＢｃｅｒＢオキシダーゼが挙げられる（Melby et al J. Am. Chem. Soc, 2012, 134, 5309）。
【００８９】
参照配列の断片又は変異体である配列を下記に説明する。
【００９０】
いくつかの実施の形態では、プレプロペプチドをフラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）の存在下でシアノバクテリアオキシダーゼにより処理してもよい。
【００９１】
いくつかの実施の形態では、直鎖プレプロペプチドが固体支持体に固定化され、シアノバクテリアオキシダーゼが溶液中で遊離していてもよく、又は直鎖プレプロペプチドが溶液中で遊離し、シアノバクテリアオキシダーゼが固体支持体に固定化されていてもよい。
【００９２】
代替的には、複素環化の後、プレプロペプチド、プロペプチド、ペプチド基質又は環状ペプチドをＭｎＯ２等の化学酸化剤で処理することができる。この酸化剤による処理は複素環化の直後、又は異なる段階で、例えば大環状化の後に行うことができる。好適な酸化条件は日常的な実験によって決定することができる。例えば、ＭｎＯ２を用いて環状ペプチドをジクロロメタン中、２８℃で３日間酸化し、複素環を酸化することができる。
【００９３】
任意に、本発明の方法は、チアゾリンに隣接する標的ペプチド配列中の１つ又は複数のアミノ酸がＤ−エピマーに変換されるようにプレプロペプチド、プロペプチド又はペプチド基質をエピメラーゼで処理することを更に含み得る。
【００９４】
代替的には、チアゾリン残基に隣接する標的ペプチド配列中のアミノ酸のエピマー化は自発的であり、エピメラーゼによる処理を必要としないものであってもよい（非特許文献１０）。
【００９５】
直鎖プレプロペプチド、プロペプチド、ペプチド基質及び／又は環状ペプチドは直接的又は間接的にタグに連結し得る。タグは検出及び精製に有用であり得る。好適なタグを下記に説明する。
【００９６】
いくつかの実施の形態では、直鎖ペプチド又は環状ペプチド、例えば大環状ペプチドを上記の酵素工程の１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上を含む方法によって作製することができる。例えば、本明細書に記載の環状ペプチドを作製する方法は、
プレプロペプチドを準備すること、
上記プレプロペプチドをシアノバクテリアヘテロシクラーゼで処理すること、
上記プロペプチドをプロテアーゼで処理して直鎖ペプチド基質を作製すること、及び
上記ペプチドをシアノバクテリアマクロシクラーゼで処理して環状ペプチドを作製すること、
を含み得る。
【００９７】
プロペプチド、ペプチド基質又は環状ペプチドをシアノバクテリアオキシダーゼ又は化学酸化剤で処理して、標的ペプチド配列中の複素環を酸化することができる。
【００９８】
上記の方法は１ｍｇ／Ｌを超える環状ペプチドの作製を可能にし得る。例えば、シアノバクテリアマクロシクラーゼによる環化後の反応溶液中の環状ペプチドの力価は５００ｍｇ／Ｌ超又は１ｇ／Ｌを超え得る。いくつかの実施の形態では、上記の方法を用いて本明細書に記載の環状ペプチドのいずれか１つを作製することができる。
【００９９】
上記の方法を用いた環状ペプチドの作製の後、環状ペプチドを更に処理してもよい。
【０１００】
環状ペプチドを二量体形態で作製し、還元して二量体ペプチドを単量体に変換することができる。好適な還元剤及び条件は当該技術分野で既知であり、ＴＣＥＰ、ＤＴＴ及びβ−メルカプトエタノールが挙げられる。
【０１０１】
環状ペプチドをプレニル化及び／又はゲラニル化することができる。例えば、環状ペプチドをシアノバクテリアプレニラーゼで処理してもよい。
【０１０２】
シアノバクテリアプレニラーゼは、ファルネシル又はゲラニル−ゲラニルイソプレノイドを本明細書に記載の環状ペプチド又はプレプロペプチド、プロペプチド若しくはペプチド前駆体に転移させる。
【０１０３】
好適なシアノバクテリアプレニラーゼとしては、プロクロロン属由来のＰａｔＦプレニラーゼ（ＧＩ：６２９１０８４２  ＡＡＹ２１１５５．１、配列番号５）、ＧＩ：１６７８５９１００  ＡＣＡ０４４９３．１（ＴｒｕＦ２）及びＧＩ：１６７８５９０９９  ＡＣＡ０４４９２．１（ＴｒｕＦ１）、ミクロキスティス属由来のＧＩ：１５９０２７５４７  ＣＡＯ８６９１７．１、ＧＩ：１５８９３４３７３  ＣＡＯ８２０８６．１、ＧＩ：３８９７８８４４５  ＣＣＩ１５９０６．１、ＧＩ：３８９６７８１５５  ＣＣＨ９２９６５．１（ＴｅｎＦ）、ＧＩ：１６６３６２７９１  ＹＰ＿００１６５５０６４．１、ＧＩ：３８９８３１６１０  ＣＣＩ２５４９９．１、ＧＩ：３８９８２６３７７  ＣＣＩ２３１２０．１、ＧＩ：３８９８２６３８３  ＣＣＩ２３１３１．１、ＧＩ：３８９８３２５３０  ＣＣＩ２３７６７．１、ＧＩ：３８９７１６３４３  ＣＣＨ９９４２０．１、ＧＩ：３８９８８２３８６  ＣＣＩ３７１３５．１、ＧＩ：３８９７２０２９９  ＣＣＨ９５９８８．１、ＧＩ：３８９７３２８９６  ＣＣＩ０３２５３．１、ＧＩ：３８９７３４２４０  ＣＣＩ０２０７１．１、ＧＩ：３８９８０１７４８  ＣＣＩ１９１２７．１及びＧＩ：３８９８０２０８２  ＣＣＩ１８８４２．１、ノストック・スポンギアエフォルメ種由来のＧＩ：１６７８５９０９１  ＡＣＡ０４４８５．１（ＴｅｎＦ）、リングビア属由来のＧＩ：１１９４９２３７１  ＺＰ＿０１６２３７０７．１、アナベナ属由来のＧＩ：２８０９８７２２７  ＡＤＡ００３９０．１（ＡｃｙＦ）、アルスロスピラ属由来のＧＩ：３７６００２２８３  ＺＰ＿０９７８０１１９．１、ＧＩ：２８４０５４２０６  ＺＰ＿０６３８４４１６．１、プランクトスリックス属由来のＧＩ：３３２００２６１６  ＡＥＤ９９４２９．１、オスキラトリア属由来のＧＩ：３００８６６５２７  ＺＰ＿０７１１１２１７．１、並びにシアノセイス属由来のＧＩ：２２０９０５９４９  ＹＰ＿００２４８１２６０．１が挙げられる。
【０１０４】
シアノバクテリアプレニラーゼは上記の参照シアノバクテリアプレニラーゼ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでいてもよく、又はその変異体であってもよい。例えば、シアノバクテリアプレニラーゼは、配列番号５のアミノ酸配列又はその断片、対立遺伝子若しくは変異体を含むＰａｔＦプレニラーゼであり得る。
【０１０５】
環状ペプチドを更なる化学修飾に供してもよい。好適な修飾としては、異種部分、例えばＯＨ、ＮＨ２、ＣＯＯＨ、ＳＨ等の天然側基、又はカップリング反応及びクリックケミストリーに好適な非天然側基を含有する部分による誘導体化が挙げられる。
【０１０６】
クリックケミストリーは、トリアゾール環を形成する、一方がアジド基を含有し、他方が末端アセチレン基を含有する２つの成分間のＣｕ（Ｉ）触媒カップリングを含む。アジド基及びアルキン基が他のカップリング手順の条件に対して不活性であり、ペプチド中に見られる他の官能基がクリックケミストリー条件に対して不活性であるため、クリックケミストリーは穏和な条件下での環状ペプチドへの殆どのリンカーの付着の制御を可能にする。例えば、環状ペプチドの非環化システイン残基は、チオール特異的反応性基を一方の端に含有し（例えばヨードアセトアミド、マレイミド又はフェニルチオスルホネート）、アジド又はアセチレンを他方の端に含有する二官能性試薬と反応し得る。クリックケミストリーを用いて標識基を末端アジド又はアセチレンに付着させることができる。例えば、アセチレン基又はアジド基をリンカーの一方の端に有し、キレート（金属同位元素）又は脱離基（ハロゲン標識）を他方の端に有する第２のリンカー（Baskin, J. (2007) PNAS 104(43)16793-97）を用いることができる。
【０１０７】
環状ペプチドを検出可能な標識で標識してもよい。
【０１０８】
検出可能な標識は分子イメージング法によってｉｎ  ｖｉｖｏで検出可能な任意の分子、原子、イオン又は基であり得る。好適な検出可能な標識としては、金属、放射性同位元素及び放射線不透過剤（例えば、ガリウム、テクネチウム、インジウム、ストロンチウム、ヨウ素、バリウム、臭素及びリン含有化合物）、放射線透過剤、造影剤並びに蛍光色素が挙げられ得る。
【０１０９】
検出可能な標識の選択は、用いられる分子イメージング法によって決まる。用いることのできる分子イメージング法としては、Ｘ線撮影法、蛍光透視法、蛍光イメージング、高分解能超音波イメージング、バイオルミネセンスイメージング、核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）及び核イメージング、例えばポジトロン断層法（ＰＥＴ）及び単一光子放射コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）等のシンチグラフィー法が挙げられる。
【０１１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏ蛍光イメージング法は、使用される特定の検出可能な蛍光標識に適切な発光スペクトル及び吸光度スペクトルを用いた画像の作成を含む。画像は従来の技法によって可視化することができ、従来の技法に含まれる蛍光イメージング法としては、蛍光反射イメージング（ＦＲＩ）、蛍光分子トモグラフィー（ＦＭＴ）、ハイパースペクトル３Ｄ蛍光イメージング（Guido Zavattini et al. Phys. Med. Biol. 51:2029, 2006）及び拡散光スペクトロスコピー（Luker & Luker. J Nucl Med. 49(1):1, 2008）を挙げることができる。
【０１１１】
好適な蛍光検出可能な標識としては、フルオレセイン、フィコエリトリン、ユーロピウム、ＴｒｕＲｅｄ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、ＰｅｒＣＰ、リッサミン、ローダミン、ＢＸ−ローダミン、ＴＲＩＴＣ、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＦｌｕｏｒＸ、レッド６１３、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）、ＮＢＤ、ルシファーイエロー、カスケードブルー、メトキシクマリン、アミノクマリン、テキサスレッド、ヒドロキシクマリン、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  色素（Molecular Probes）、例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００、スルホネートシアニン色素（AP Biotech）、例えばＣｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５及びＣｙ７、ＩＲＤ４１  ＩＲＤ７００（Li-Cor, Inc.）、ＮＩＲ−１（Dejindom、Japan）、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｂｌｕｅ（Diatron）、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４０５、４８８、５４９、６３３、６４９、６８０及び８００反応性色素（Pierce/Thermo Fisher Scientific Inc）又はＬＩ−ＣＯＲ  色素、例えば、ＩＲＤｙｅ  （LI-COR Biosciences）が挙げられる。
【０１１２】
他の好適な蛍光検出可能な標識としては、テルビウム及びユーロピウム等のランタニドイオンが挙げられる。ランタニドイオンは、本明細書の他の部分で説明されるようにキレートを用いてシナプトタグミンポリペプチドに付着させることができる。
【０１１３】
他の好適な蛍光検出可能な標識としては、量子ドット（例えばＱｄｏｔ、Invitrogen）が挙げられる。タンパク質を量子ドットで標識する技法は当該技術分野で既知である（Michalet, X. et al. Science 307:538, 2005、Alivisatos, P. Nat Biotechnol 22:47-52, 2004）。
【０１１４】
核磁気共鳴画像ベースの技法では、独自の化学環境における水プロトンの相対緩和速度に基づいて画像を作成する。好適なＭＲＩ法はGadian, D. 'NMR and its applications to living systems'. （Oxford Univ. Press, 1995, 2ndedition）により詳細に記載されている。核磁気共鳴画像法としては、従来の核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、磁化移動画像法（ＭＴＩ）、核磁気共鳴スペクトロスコピー（ＭＲＳ）、拡散強調画像法（ＤＷＩ）及び機能的ＭＲ画像法（ｆＭＲＩ）を挙げることができる（Rovaris et al. (2001) JNeurol Sci 186 Suppl 1 : S3-9、Pomper & Port (2000) Magn Reson Imaging Clin N Am 8: 691-713、Kean & Smith, (1986) Magnetic Resonance Imaging: Principles and Applications, Williams and Wilkins, Baltimore, Md）。
【０１１５】
核磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）標識としての使用に好適な標識としては、常磁性又は超常磁性イオン、酸化鉄粒子及び水溶性造影剤を挙げることができる。超常磁性及び常磁性イオンとしては、鉄、銅、マンガン、クロム、エルビウム、ユーロピウム、ジスプロシウム、ホルミウム及びガドリニウム等の遷移元素、ランタニド元素及びアクチニド元素を挙げることができる。好ましい検出可能な常磁性標識としては、ガドリニウムが挙げられる。
【０１１６】
環状ペプチドを、例えば抗体介在性薬物療法における使用のために抗体又は抗体の断片若しくは誘導体等の抗体分子に付着させることができる。環状ペプチドと抗体とのコンジュゲーションに好適な技法は当該技術分野で既知である。
【０１１７】
本明細書に記載のように作製された環状ペプチドは、治療薬、ナノテクノロジー用途及び光学／電子又は収縮性材料に有用であり得る。
【０１１８】
単離酵素又は他のタンパク質はそれが天然に生じる、又はそれが組換えにより作製された環境とは異なる物理的環境に存在する。例えば、単離ペプチドはそれが天然に生じる複雑な細胞環境に対して実質的に単離され得る。純度の絶対レベルは重要ではなく、当業者はタンパク質を供する用途に応じて適切な純度レベルを容易に決定することができる。
【０１１９】
異種要素はその天然環境で対象の特徴部とは結びつかない又は連結しない要素である。すなわち異種要素との結びつきは人工的なものであり、要素は人間の介入によってのみ対象の特徴部と結びつく又は連結する。
【０１２０】
１つ又は複数の異種アミノ酸、例えば異種ペプチド又は異種ポリペプチド配列は、直鎖ペプチド基質、プロペプチド、プレプロペプチド、マクロシクラーゼ、オキシダーゼ、ヘテロシクラーゼ、プロテアーゼ又は本明細書で述べる他のタンパク質と結合又は融合することができる。例えば、プレプロペプチドは１つ又は複数の異種アミノ酸に連結又は融合した上記のようなプレプロペプチドを含み得る。１つ又は複数の異種アミノ酸は、シアノバクテリア以外の供給源に由来する配列を含み得る。
【０１２１】
いくつかの実施の形態では、直鎖ペプチド基質、プロペプチド、プレプロペプチド、マクロシクラーゼ、オキシダーゼ、ヘテロシクラーゼ、プロテアーゼ又は本明細書で述べる他のタンパク質は、精製タグを有する融合タンパク質として発現させることができる。融合タンパク質は酵素配列と精製タグとの間にプロテアーゼ認識部位を含むのが好ましい。発現の後、融合タンパク質を、精製タグに結合する固定化された作用物質を用いた親和性クロマトグラフィーによって単離することができる。
【０１２２】
精製タグは、特定の結合対の一成員を形成する異種アミノ酸配列である。精製タグを含有するポリペプチドは、ポリペプチドへの特定の結合対の他の成員の結合によって検出、単離及び／又は精製することができる。一部の好ましい実施の形態では、タグ配列は抗体分子が結合するエピトープを形成し得る。
【０１２３】
様々な好適な精製タグが当該技術分野で既知であり、例えばＭＲＧＳ（Ｈ）６、ＤＹＫＤＤＤＤＫ（ＦＬＡＧ）、Ｔ７−、Ｓ−（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）、ｐｏｌｙ−Ａｒｇ（Ｒ５−６）、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ（Ｈ２−１０）、ｐｏｌｙ−Ｃｙｓ（Ｃ４）ｐｏｌｙ−Ｐｈｅ（Ｆ１１）ｐｏｌｙ−Ａｓｐ（Ｄ５−１６）、Ｓｔｒｅｐｔ−ｔａｇ  ＩＩ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ）、ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、インフルエンザ−ＨＡタグ（(Murray, P. J. et al  (1995) Anal Biochem 229, 170-9）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅタグ（Stammers, D. K. et al (1991) FEBS Lett 283, 298-302）、ＳＵＭＯ（Marblestone et al Protein Sci. 2006 January; 15(1): 182-189）、Ｃｈｅｒｒｙタグ（Eurogentec）、Ｔａｇ．１００（Qiagen；哺乳動物ＭＡＰキナーゼ２に由来する１２ａａタグ）、Ｃｒｕｚタグ０９（ＭＫＡＥＦＲＲＱＥＳＤＲ、Santa Cruz Biotechnology Inc.）及びＣｒｕｚタグ２２（ＭＲＤＡＬＤＲＬＤＲＬＡ、Santa Cruz Biotechnology Inc.）が挙げられる。既知のタグ配列はTerpe (2003) Appl. Microbiol. Biotechnol. 60 523-533に概説されている。精製後の除去を容易にするためにタグ配列をプロテアーゼ認識部位、例えばＴＥＶプロテアーゼ部位を介して標的タンパク質に連結することができる。
【０１２４】
一部の好ましい実施の形態では、精製タグはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼである。発現の後に、直鎖ペプチド基質、プロペプチド、プレプロペプチド、マクロシクラーゼ、オキシダーゼ、ヘテロシクラーゼ、プロテアーゼ又は本明細書で述べる他のタンパク質及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼを含む融合タンパク質を、固定化グルタチオンを用いた親和性クロマトグラフィーによって単離することができる（逆の場合も同じである）。グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質の精製は当該技術分野で既知である。
【０１２５】
他の好ましい実施の形態では、精製タグは低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）タグ又はＨｉｓ６−ＳＵＭＯタグである。発現の後、直鎖ペプチド基質、プロペプチド、プレプロペプチド、マクロシクラーゼ、オキシダーゼ、ヘテロシクラーゼ、プロテアーゼ又は本明細書で述べる他のタンパク質及びＳＵＭＯ又はＨｉｓ６−ＳＵＭＯタグを含む融合タンパク質を、固定化グルタチオンを用いた親和性クロマトグラフィーによって単離することができる（逆の場合も同じである）。ＳＵＭＯタグ付き融合タンパク質の精製は当該技術分野で既知である。
【０１２６】
単離の後、融合タンパク質をタンパク質分解によって切断し、直鎖ペプチド基質、プロペプチド、プレプロペプチド、マクロシクラーゼ、オキシダーゼ、ヘテロシクラーゼ、プロテアーゼ又は本明細書で述べる他のタンパク質を作製することができる。
【０１２７】
本明細書に記載の直鎖ペプチド基質、プロペプチド及びプレプロペプチドは、化学合成によって完全に又は部分的に生成することができる。例えば、ペプチド及びポリペプチドは液相合成法又は固相合成法を用いて、溶液中で、又は固相化学、液相化学及び溶液化学の任意の組合せによって、例えば初めにそれぞれのペプチド部分を完成させ、続いて必要に応じて及び適切な場合に、存在する任意の保護基を除去した後、それぞれの炭酸若しくはスルホン酸又はその反応性誘導体の反応により残基Ｘを導入することによって合成することができる。
【０１２８】
ペプチド及びポリペプチドの化学合成は当該技術分野で既知である（J.M. Stewart and J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)、M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)、J. H. Jones, The Chemical Synthesis of Peptides. Oxford University Press, Oxford 1991、Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California、G. A. Grant, (Ed.) Synthetic Peptides, A User’s Guide.  W. H. Freeman & Co., New York 1992, E. Atherton and R.C. Sheppard, Solid Phase Peptide Synthesis, A Practical Approach.  IRL Press 1989、及びG.B. Fields, (Ed.) Solid-Phase Peptide Synthesis (Methods in Enzymology Vol. 289). Academic Press, New York and London 1997）。
【０１２９】
本明細書に記載の直鎖ペプチド基質、プロペプチド及びプレプロペプチドは、完全に又は部分的に組み換え法によって生成することができる。例えば、本明細書に記載の直鎖ペプチド基質、プロペプチド及びプレプロペプチドをコードする核酸を宿主細胞において発現させ、発現ポリペプチドを細胞培養物から単離及び／又は精製することができる。
【０１３０】
マクロシクラーゼ、オキシダーゼ、ヘテロシクラーゼ、プロテアーゼ及び上述の他の酵素は完全に又は部分的に組み換え法によって生成することができる。例えば、酵素をコードする核酸を宿主細胞において発現させ、発現ポリペプチドを細胞培養物から単離及び／又は精製することができる。酵素を大腸菌（E. coli）における発現にコドンを最適化した核酸から発現させるのが好ましい。
【０１３１】
上記の核酸配列及び構築物は発現ベクターに含まれ得る。プロモーター配列、ターミネーター断片、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、及び必要に応じて他の配列を含む適切な調節配列を含有する好適なベクターを選択又は構築することができる。ベクターが宿主細胞における核酸の発現を誘導するのに適切な調節配列を含有するのが好ましい。発現系において異種核酸コード配列の発現を誘導するのに好適な調節配列は当該技術分野で既知であり、構成的プロモーター、例えばＣＭＶ又はＳＶ４０等のウイルスプロモーター、及びＴｅｔ−ｏｎ制御プロモーター等の誘導プロモーターが挙げられる。ベクターは、大腸菌及び／又は真核細胞等の細菌宿主におけるその選択及び複製及び発現を可能にする複製起点及び選択可能なマーカー等の配列を含んでいてもよい。
【０１３２】
ベクターは必要に応じてプラスミド、ウイルスベクター、例えばファージ又はファージミドであってもよい。更なる詳細については、例えば、Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Russell et al., 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Pressを参照されたい。細胞培養における組み換えポリペプチドの発現並びにその後の単離及び精製に関する多くの技法及びプロトコルが当該技術分野で既知である（例えば、Protocols in Molecular Biology, Second Edition, Ausubel et al. eds. John Wiley & Sons, 1992; Recombinant Gene Expression Protocols Ed RS Tuan  (Mar 1997) Humana Press Incを参照されたい）。
【０１３３】
いくつかの実施の形態では、マクロシクラーゼ、オキシダーゼ、ヘテロシクラーゼ、プロテアーゼ及び上述の他の酵素を、上記のように精製タグを有する融合タンパク質として発現させることができる。
【０１３４】
マクロシクラーゼ、オキシダーゼ、ヘテロシクラーゼ、プロテアーゼ及び上述の他の酵素、並びに直鎖ペプチド基質、プロペプチド及びプレプロペプチドを固体支持体に固定化させてもよい。
【０１３５】
固体支持体は、ペプチド又はタンパク質を固定化することができる表面を提示する不溶性の非ゼラチン質である。好適な支持体の例としては、スライドガラス、マイクロウェル、膜又はビーズが挙げられる。支持体は例えばプレート、試験管、ビーズ、ボール、フィルター、織物、ポリマー又は膜を含む微粒子形態又は固体形態であり得る。ペプチド又はタンパク質を例えば不活性ポリマー、９６ウェルプレート、他のデバイス、装置又は材料に固定することができる。固体支持体表面へのペプチド及びタンパク質の固定化は当該技術分野で既知である。
【０１３６】
上記のように、シアノバクテリアマクロシクラーゼ、オキシダーゼ、ヘテロシクラーゼ及びプロテアーゼは参照アミノ酸配列の変異体又は断片であるアミノ酸配列を含み得る。
【０１３７】
参照アミノ酸配列の変異体は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【０１３８】
シアノバクテリアマクロシクラーゼ、オキシダーゼ、ヘテロシクラーゼ及びプロテアーゼに好適な参照アミノ酸配列は上記に提示している。
【０１３９】
アミノ酸配列同一性は概して、アルゴリズムＧＡＰ（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Accelrys、San Diego CA）を参照して規定される。ＧＡＰは、マッチの数を最大限に高め、ギャップの数を最小限に抑えるＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）を用いて２つの完全配列をアラインメントするものである。概して、ギャップ生成ペナルティ＝１２及びギャップ伸長ペナルティ＝４のデフォルトパラメーターが用いられる。ＧＡＰの使用が好ましいが、他のアルゴリズム、例えばＢＬＡＳＴ又はＴＢＬＡＳＴＮ（Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 405-410の方法を用いる）、ＦＡＳＴＡ（Pearson and Lipman (1988) PNAS USA 85: 2444-2448の方法を用いる）、又はＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム（Smith and Waterman (1981) J. Mol Biol. 147: 195-197）を、概してデフォルトパラメーターを用いて使用することができる。
【０１４０】
特定のアミノ酸配列の変異体は１個のアミノ酸、２個、３個、４個、５個〜１０個、１０個〜２０個又は２０個〜３０個のアミノ酸の挿入、付加、置換又は欠失により所与の配列とは異なっていてもよい。いくつかの実施の形態では、変異体配列は１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上の残基が挿入、欠失又は置換された参照配列を含み得る。例えば、最大１５個、最大２０個、最大３０個、最大４０個、最大５０個又は最大６０個の残基が挿入、欠失又は置換され得る。
【０１４１】
断片は完全長未満のアミノ酸配列を含有するが、完全長タンパク質配列の活性を保持する切断タンパク質である。断片は完全長配列に由来する少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸又は少なくとも３００個の連続アミノ酸を含み得る。
【０１４２】
本明細書に記載の方法は、生物活性又は他の活性についての環状ペプチドのスクリーニングに有用であり得る。
【０１４３】
直鎖ペプチド基質、直鎖プレプロペプチド及び／又は直鎖プロペプチドはビーズに固定化することができる。いくつかの実施の形態では、環化シグナルを含まない参照直鎖ペプチド基質、直鎖プレプロペプチド及び／又は直鎖プロペプチドが同じビーズに固定化されていてもよい。
【０１４４】
ビーズは、直鎖ペプチドが環化し、環状ペプチドがビーズから放出され得るが、環化シグナルを欠く参照ペプチド基質が付着したままであるように本明細書に記載のシアノバクテリアマクロシクラーゼで処理することができる。
【０１４５】
次いで、放出された環状ペプチドを単離し、生物活性についてスクリーニングすることができる。
【０１４６】
環状ペプチドが生物活性を示すことが判明した場合、環状ペプチドが放出されたビーズを特定し、参照ペプチド基質をシークエンシングするか又は他の方法で分析し、生物活性のある環状ペプチドの特性化を行うことができる。
【０１４７】
本明細書に記載の方法は、環状ペプチドのライブラリーの作成及びスクリーニングにも有用であり得る。環状ペプチドライブラリーをスクリーニングする方法は、
（ｉ）ビーズに付着した多様な標的ペプチドの集団を準備することであって、各々のビーズに標的ペプチドの第１及び第２のコピーが付着し、該第２のコピーではなく第１のコピーが環化シグナルを介してビーズに付着すること、
（ｉｉ）上記ビーズをＰａｔＧｍａｃマクロシクラーゼで処理して標的ペプチドの第１のコピーを環状ペプチドに変換し、環状ペプチドをビーズから放出させること、
（ｉｉｉ）環状ペプチドの活性についてスクリーニングすること、
（ｉｖ）活性のある環状ペプチドを特定すること、
（ｖ）環状ペプチドが放出されたビーズを特定すること、及び
（ｖｉ）ビーズに付着した標的ペプチドの第２のコピーをシークエンシングすること、
を含み得る。
【０１４８】
環状ペプチドが放出されたビーズを特定することができるように、多様な標的ペプチドの集団を空間的に、例えば１つ又は複数のマルチウェルプレート内に配列することができる。例えば、マルチウェルプレートの個々のウェルの各々が標的ペプチドの均質集団を含有し得る。
【０１４９】
スクリーニングされる環状ペプチドは、１個、２個、３個又はそれ以上の複素環アミノ酸残基を含有し得る。例えば、上記のスクリーニング方法の工程（ｉ）は、
上記標的ペプチドをシアノバクテリアヘテロシクラーゼで処理して標的ペプチド中の複素環化可能な残基を環状残基へと変換すること、及び
任意に、標的ペプチドをシアノバクテリアオキシダーゼで更に処理してその環状残基を酸化すること、
を更に含み得る。
【０１５０】
本発明の他の態様は、環状ペプチドの作製に使用される本明細書に記載のペプチド基質、及び環状ペプチドライブラリーの作成に使用される多様なペプチド基質の集団を提供する。
【０１５１】
ペプチド基質は、Ｎ末端プロテアーゼ認識部位及びＣ末端環化シグナルを有する標的ペプチド配列を含み得る。
【０１５２】
プロテアーゼ認識部位及び／又は環化シグナルは標的配列に対して異種であってもよい。プロテアーゼ認識部位がトリプシン認識部位又はキモトリプシン認識部位であるのが好ましい。
【０１５３】
ペプチド基質はＮ末端リーダー配列又はＮ末端結合部分を更に含み得る。
【０１５４】
いくつかの実施の形態では、ペプチド基質は直接的又は間接的にＮ末端タグ及び／又はＣ末端タグに連結し得る。
【０１５５】
いくつかの実施の形態では、ペプチド基質をビーズ等の固体支持体に固定化してもよい。上記のように、標的ペプチド配列の参照コピーを環化シグナルなしに固体支持体に固定化してもよい。
【０１５６】
集団は集団内の標的ペプチド配列が多様な上記のペプチド基質を含み得る。例えば、標的ペプチド配列中の１つ、２つ、３つ、４つ若しくはそれ以上、又は全ての位置が多様性を示し得る。すなわち、集団の異なる成員が或る位置で異なる残基を示し得る。
【０１５７】
集団内の環化シグナルに隣接するペプチド中の残基が、上記のようにＰｒｏ、複素環、Ｎ−Ｍｅ残基又は正確な配座特性を有する他の人工残基であるのが好ましい。
【０１５８】
好適な直鎖ペプチド基質は上記により詳細に説明されている。
【０１５９】
本発明の他の態様は、環状ペプチド及びその集団の作製に使用される材料、試薬及びキット及び試薬、並びにかかる環状ペプチドの例えばスクリーニング法における使用を提供する。
【０１６０】
材料は、上記の単離プレプロペプチド、プロペプチド、ペプチド基質、並びに組み換えマクロシクラーゼ、プロテアーゼ、オキシダーゼ及びヘテロシクラーゼのそれぞれ又は組合せであり得る。試薬を固体支持体に固定化してもよい。
【０１６１】
キットは上記のようなペプチド基質又は基質のライブラリーを含み得る。例えば、キットは、
個々のウェルの各々がビーズに付着した標的ペプチドの均質集団を含有し、
各々のビーズに該標的ペプチドの第１及び第２のコピーが付着し、該第２のコピーではなく第１のコピーが環化シグナルを介してビーズに付着し、
異なるウェルで標的ペプチドの配列が異なる、
マルチウェルプレートを含み得る。
【０１６２】
キットは上記の方法に使用される単離酵素調製物を更に含み得る。
【０１６３】
本発明の他の態様及び実施の形態により、「含む（comprising）」という用語を「からなる（consisting of）」という用語に置き換えた上記の態様及び実施の形態、及び「含む（comprising）」という用語を「から本質的になる（consisting essentially of）」という用語に置き換えた上記の態様及び実施の形態が提供される。
【０１６４】
本発明の様々な更なる態様及び実施の形態が本開示を鑑みて当業者に明らかである。
【０１６５】
本明細書で言及される全ての文献及びデータベースエントリは、その全体が全ての目的で引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【０１６６】
本明細書に使用される「及び／又は」は、一方を含む又は含まない２つの規定の特徴又は構成要素の具体的な開示とみなすものとする。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、各々が本明細書に個別に提示されるかのように（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示とみなすものとする。
【０１６７】
文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、上述の特徴の説明及び定義は本発明の任意の特定の態様又は実施の形態に限定されず、記載される本発明の全ての態様及び実施の形態に等しく適用される。このため、本発明で使用される上述の特徴は全ての組合せ及び順列で開示される。
【０１６８】
ここで、本発明の或る特定の態様及び実施形態を、本明細書に記載の図面及び表を例とし、参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【０１６９】
【図１】ＬＣ−ＭＳによって決定される種々の緩衝剤及び温度でのＰａｔＧｍａｃ及びＶＧＡＧＩＧＦＰＡＹＤＧの相対反応速度を示す図である。
【図２】ＬＣ−ＭＳによって決定される直鎖生成物及び大環状化生成物のＰａｔＧｍａｃ野生型及びＰａｔＧｍａｃ  Ｋ５９８ＤでプロセシングしたＶＧＡＧＩＧＦＰＡＹＲＧのイオンカウントを示す図である。
【図３】ペプチド基質ＶＧＡＧＩＧＦＰＡＹＲＧの大環状化のＬＣ−ＭＳを示す図である。
【図４】パテラミド大環状化を示す図である。図４（ａ）は、Ｎ末端リーダー配列に続く２つの８残基カセットと、Ｃ末端マクロシクラーゼ認識シグナルＡＹＤＧとからなるＰａｔＥプレプロペプチドを示す。ＰａｔＧの大環状化ドメインはプレプロペプチド１つ当たり２つの環状ペプチドの形成を触媒する（破線）。図４（ｂ）は、ＰａｔＧｍａｃがＰ１位に複素環又はプロリン（Ｚで表される）、及びＰ１’位〜Ｐ４’位にＡＹＤＧモチーフをそれぞれ必要とすることを示す。付加的なＥがＰ５’に見られることが多いが、その必要はない。図４（ｃ）は、この研究に使用される試験基質が、質量が７１６．３７５Ｄａの直鎖ペプチド（曲線）又は質量が１８Ｄａ軽い大員環（八角形）のいずれかをもたらし得ることを示す。
【図５】大環状化ＰａｔＧｍａｃ野生型による大環状化反応のＬＣ−ＭＳを示す図であり、直鎖生成物を八角形及び曲線のそれぞれで示す。観測質量と算出質量との誤差を［Ｍ＋Ｈ］＋種及び［Ｍ＋Ｎａ］＋種の下に示す。
【図６】図５に従うＰａｔＧｍａｃΔｍによる大環状化反応のＬＣ−ＭＳを示す図である。
【図７】図５に従うＰａｔＧｍａｃ  Ｋ５９４Ｄによる大環状化反応のＬＣ−ＭＳを示す図である。
【図８】ＰａｔＧｍａｃと基質との間の安定なアシル−酵素中間体（ＡＥＩ）の存在を示すＰａｔＧｍａｃによる大環状化反応のＬＣ−ＭＳを示す図である。
【図９】大環状化反応のＭＳ分析において決定されるシクロ［ＶＧＡＧＩＧＦＰ］の断片化パターンを示す図である。
【図１０】ＰａｔＧｍａｃΔ１（ｉ）、ＰａｔＧｍａｃ  Ｋ５９８Ｄ（ｉｉ）及びＰａｔＧｍａｃ三重突然変異体Ｒ５８９Ｄ  Ｋ５９４Ｄ  Ｋ５９８Ｄ（ｉｉｉ）による大環状化反応のＬＣ−ＭＳを示す図である。直鎖生成物のみが観察される（曲線）。観測質量と算出質量との誤差を［Ｍ＋Ｈ］＋種の下に示す。
【図１１】改変ＰａｔＥプレプロペプチド（ＰａｔＥ２）を示す図である。
【図１２】ＰａｔＥ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ複素環化に関するデータを示す図である。ＰａｔＤ反応については、３つの複素環しか有しない種が独自の特性を有する可能性があり、ＨＰＬＣによって４つの複素環を有する種から分離することができることに留意されたい。
【図１３】ＰａｔＥ２とＴｒｕＤとのインキュベーション後の水の喪失を示す図である。図１３Ａは複素環化前の改変リシン残基を有するＰａｔＥを示し、図１３ｂは複素環化後のＰａｔＥ２を示す。
【図１４】複素環化反応の完了後に作成されるＳ２００ゲル濾過トレースを示す図である。
【図１５】トリプシンによるＮ末端切断及びＴｒｕＤによる複素環化後のＰａｔＥ２のＬＣ−ＭＳを示す図である。
【図１６】ペプチド基質ＩＴＡＣＩＴＦＣから作製されるパテラミド（シクロ（Ｉ（ＭｘＯｘｎ）Ａ（Ｔｈｎ）Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ｆ（Ｔｈｎ））のＬＣＴ−ＥＳＩ  ＭＳデータを示す図である。データから最終生成物が４つの複素環を有し、大環状化する（期待質量７８１Ｄａ）ことが確認される。７７６Ｄａの種は酸化生成物である。
【図１７】提唱される大環状化の機構を示す図である。（ａ）ＡＹＤＧが活性部位に結合したままのアシル−酵素中間体のモデル。（ｂ）アシル−酵素中間体は基質と平衡状態にある。ＰａｔＧｍａｃにおいては基質のアミノ末端が活性部位に入り、ＡＹＤＧに置き換わり、大環状化をもたらす。ＡＹＤＧの結合を破壊する突然変異は、水によって加水分解されるため直鎖生成物を生じる。入り込んだアミノ末端を脱プロトン化するＨｉｓの役割は推測である。
【図１８】ＰａｔＧ大環状化を含む２つのｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムを示す図である。（１）全ての酵素にタグ付けすることにより、それらを各工程の終了時に単純に除去する。（２）Ｃ末端タグ付けＰａｔＥを使用することによりＰａｔＡ切断ペプチドをビーズに担持し、ＰａｔＧｍａｃを可溶性酵素として添加する。どちらのアプローチも利点及び欠点を有する。第１のアプローチは貴重な酵素を回収し、過剰に使用することを可能にするが、生成物の精製が必要となる。第２のアプローチは、終了時に溶液中に大員環及びＰａｔＧしか存在しないことから精製を単純化し、更にはビーズ上の基質の化学修飾がはるかに容易である。欠点はコスト効率のよいマクロシクラーゼ酵素の回収が不可能であり得ること、及び結合工程中間プロセス（モニタリングの必要がある）の導入である。
【図１９】シクロ−（ＩＴＦ（Ｔｈｎ）ＩＴＡ（Ｔｈｎ））を生じるヘテロシクラーゼＴｒｕＤ及びマクロシクラーゼＰａｔＧで処理したＰａｔＥペプチド中のカセットＩＴＦＣＩＴＡＣの考え得るＭＳ断片化経路を示す図である。分子イオン及び断片の正確な質量は、提唱される構造及び表３に示されるＭＳデータと一致する。
【図２０】ＰａｔＥペプチド中のカセットＩＴＶＣＩＴＶＣをヘテロシクラーゼＰａｔＤ及びマクロシクラーゼＰａｔＧで処理する場合に生じる精製生成物（シクロ−Ｉ（ＭｘＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ）Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ））の１Ｈ  ＮＭＲを示す図である。この１Ｈ  ＮＭＲと天然に得られる物質の１Ｈ  ＮＭＲとの比較及び２Ｄ  ＮＭＲスペクトルの分析によって構造を確認した（表８）。
【図２１】同様にＰａｔＥペプチド中のカセットＩＴＡＣＩＴＦＣをヘテロシクラーゼＴｒｕＤ及びマクロシクラーゼＰａｔＧで処理する場合に生じる精製生成物（シクロ−（ＩＴＡ（Ｔｈｎ）ＩＴＦ（Ｔｈｎ）））の１Ｈ  ＮＭＲを示す図である。２Ｄ  ＮＭＲデータの分析によって構造を検証した（表７）。
【図２２】パテラミドＡ（１）及びパテラミドＣ（２）の生合成経路を示す図である。７１アミノ酸構造遺伝子産物（ＰａｔＥプレプロペプチド）をリボソーム合成する。テーラリング酵素は、ＰａｔＥプレプロペプチドのＮ末端リーダー配列（ＰａｔＥ１−３４、イタリック体）及び開始／停止環化シグナルを認識する。下流の配列（ＰａｔＥ４２−７１）中の４つのシステイン残基、３つのトレオニン残基及び１つのセリン残基（ボールド体）は、チアゾール及びオキサゾリン複素環へと翻訳後修飾される。切断及び大環状化によりパテラミドＡ（１）及びパテラミドＣ（２）が形成される。
【図２３】ＰａｔＥペプチド中のカセットＩＴＶＣＩＴＶＣをヘテロシクラーゼＴｒｕＤ、トリプシン及びマクロシクラーゼＰａｔＧｍａｃで処理する場合に生じる大環状化生成物（シクロ−（ＩＴＶ（Ｔｈｎ）ＩＴＶ（Ｔｈｎ））のＬＣ−ＭＳを示す図である。
【図２４】ＰａｔＥペプチド中のカセットＩＴＡＣＩＴＦＣをヘテロシクラーゼＴｒｕＤ、トリプシン及びマクロシクラーゼＰａｔＧｍａｃで処理する場合に生じる大環状化生成物（シクロ−（ＩＴＡ（Ｔｈｎ）ＩＴＦ（Ｔｈｎ））のＬＣ−ＭＳを示す図である。
【図２５】シクロ−Ｉ（ＭｘＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ）Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ）の酸化を示す図である。
【図２６】ペプチド基質ＩＴＶＣＩＴＶＣから生じたシクロ−Ｉ（ＭｘＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ）Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ）（還元型）及びシクロ−Ｉ（ＭｘＯｘｚ）Ｖ（Ｔｈｚ）Ｉ（ＭｅＯｘｚ）Ｖ（Ｔｈｚ）（酸化型）、並びにリッソクリヌム・パテラから単離されたアシジアシクラミド及び１００％ＭｅＯＨの遠紫外線ＣＤスペクトルを示す図である。シクロ−Ｉ（ＭｘＯｘｚ）Ｖ（Ｔｈｚ）Ｉ（ＭｅＯｘｚ）Ｖ（Ｔｈｚ）のスペクトルがアシジアシクラミドのスペクトルと一致することが示される。
【図２７】環状ペプチド二量体（２１）のその単量体型（６）への還元を示す図である。
【図２８】ＴｒｕＤ又はＰａｔＤを用いたペプチドＩＴＡＳＩＴＦＸＡＹＤＧ（Ｘが２，３−ジアミノプロパン酸である）中の２，３−ジアミノプロパン酸の複素環化のＭＡＬＤＩ  ＭＳデータを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１７０】
表１はＰａｔＧｍａｃのデータ収集及び精緻化の統計（分子置換）を示す。
【０１７１】
表２は直鎖切断及び大環状化ペプチド基質の相対イオンカウントを示す。
【０１７２】
表３は、ヘテロシクラーゼＴｒｕＤ及びマクロシクラーゼＰａｔＧで処理したＰａｔＥペプチド中のカセットＩＴＦＣＩＴＡＣのＭＳデータを示す。この表に示される分子イオン及び断片の正確な質量は提唱される構造と一致し（図１９及び図２０を参照されたい）、図１８に示される断片化経路に概説されるように説明することができる。
【０１７３】
表４はＰａｔＧｍａｃとそのホモログとの配列アラインメントを示す。二次構造要素は赤色で示される。活性部位残基は黄色の星形で示され、ジスルフィド結合に関与するシステインは緑色の三角形で示され（一致する方向はジスルフィド対を表す）、Ｓ３部位及びＳ４部位を遮断する残基は青色の菱形で示され、基質と塩架橋を形成するリシンは紫色の円形で示され、基質結合に関与するＨｉｓ残基及びＰｈｅ残基は赤紫色の四角形で表される。
【０１７４】
表５は公開データベース上のシアノバクテリアプロテアーゼを示す。
【０１７５】
表６は公開データベース上のシアノバクテリアヘテロシクラーゼを示す。
【０１７６】
表７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成によって得られるシクロ−Ｉ（ＭｘＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ）Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ）のＣＤＣｌ３中、６００／１５０ＭＨｚでの１Ｈ／１３Ｃ  ＮＭＲデータを示す。
【０１７７】
表８は、リッソクリヌム・パテラに由来し、ペプチド基質ＩＴＡＣＩＴＦＣを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ生合成によって得られるシクロ−ＩＴＡ（Ｔｈｎ）ＩＴＦ（Ｔｈｎ）のＣＤＣｌ３中、６００／１５０ＭＨｚでの１Ｈ／１３Ｃ  ＮＭＲデータを示す。
【０１７８】
実験
材料及び方法
１．  タンパク質のクローニング、発現及び精製
１．１  ヘテロシクラーゼ
コドンを最適化した完全長ＰａｔＤ及びＴｒｕＤを、Ｎ末端Ｈｉｓ６−タグを有するｐＪｅｘｐｒｅｓｓ  ４１１プラスミド（DNA2.0 Inc.，USA）にクローニングしたが、ＴｒｕＤは付加的なタバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位を含有する。どちらの酵素も自己誘導培地（微量元素を含有するテリフィックブロスベース）上、２０℃で４８時間成長させた大腸菌（Escherichia coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で発現させる。細胞を４０００×ｇ、４℃で１５分間の遠心分離によって採取する。ペレットを５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭイミダゾール及び３ｍＭ  ＢＭＥに再懸濁し、細胞の湿重量１ｇ当たり０．４ｍｇのＤＮアーゼ（Sigma）及びコンプリートプロテアーゼ阻害剤錠（ＥＤＴＡ無含有、Roche）を添加する。細胞を細胞破壊器に３０ｋＰＳＩで通すか又は超音波処理を行うことによって溶解し、溶解物を４００００×ｇ、４℃で４５分間の遠心分離に続く０．４μｍ膜フィルターでの濾過によって清澄化する。清澄化溶解物を溶解緩衝剤で予洗したＮｉ−セファロースＦＦカラム（GE Healthcare）にアプライし、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールで溶出する。ＴｒｕＤのＨｉｓ６−タグを、１０ｍｇのＴｒｕＤにつき１ｍｇのＴＥＶプロテアーゼを添加することによって除去し、室温で２時間インキュベートし、第２のＮｉ−セファロースＦＦカラムに通すことによって切断タンパク質を単離する（注記：Ｈｉｓ６−タグが除去されない場合、ＴｒｕＤは依然として有効に機能する）。次いで、両方の酵素を、予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ゲル濾過カラム（GE Healthcare）にロードし、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＴＣＥＰで流した。ピーク画分をプールし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応に使用するためにタンパク質を１００μＭまで濃縮した。
【０１７９】
１．２  マクロシクラーゼ
ＰａｔＧｍａｃ（ＰａｔＧ残基４９２〜８５１）をゲノムＤＮＡ（プロクロロン属）からｐＨＩＳＴＥＶベクター（Liu, H. & Naismith, J. H 2009）にクローニングし、自己誘導培地（微量元素を含有するテリフィックブロスベース；Studier, F.W., 2005）上、２０℃で４８時間成長させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。
【０１８０】
細胞を４０００×ｇ、２０℃で１５分間の遠心分離によって採取し、溶解緩衝剤（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭイミダゾール及び３ｍＭ  β−メルカプトエタノール（BME））に再懸濁し、ＥＤＴＡ無含有コンプリートプロテアーゼ阻害剤錠（Roche）及び細胞の湿重量１ｇ当たり０．４ｍｇのＤＮアーゼ（Sigma）を添加した。細胞を細胞破壊器に３０ｋＰＳＩで通すか（Constant Systems Ltd）、又は超音波処理を行うことによって溶解し、溶解物を４００００×ｇ、４℃で４５分間の遠心分離に続く０．４μｍ膜フィルターでの濾過によって清澄化した。清澄化溶解物を溶解緩衝剤で予洗したＮｉ−ＮＴＡ（Qiagen）カラム又はＮｉ−セファロースＦＦカラム（GE Healthcare）にアプライし、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールで溶出した。
【０１８１】
いくつかの方法では、タンパク質を続いて１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭイミダゾール、３ｍＭ  βＭＥ中で脱塩カラム（Ｄｅｓａｌｔ  １６／１０、GE Healthcare）に通した。タバコエッチ病ウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼを１：１０の質量対質量比でタンパク質に添加し、タンパク質を２０℃で１時間消化し、Ｈｉｓ−タグを除去した。消化したタンパク質を第２のＮｉ−カラムに通し、通過画分を１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３ｍＭ  ＢＭＥ中で平衡化したｍｏｎｏＱカラム（GE Healthcare）にロードした。タンパク質を、３５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶出する直線ＮａＣｌ勾配によりｍｏｎｏＱカラムから溶出した。最後に、タンパク質を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３ｍＭ  βＭＥ中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５、GE Healthcare）に供し、６０ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。
【０１８２】
他の方法では、タンパク質を続いて１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＴＣＥＰ中でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（GE Healthcare）に通し、１ｍＭまで濃縮した。
【０１８３】
全てのＰａｔＧｍａｃ点突然変異体はＰｈｕｓｉｏｎ  部位特異的突然変異誘発キット（Finnzymes）を用いて製造業者のプロトコルに従って作製し、ｌｉｄ欠失突然変異体はフュージョンＰＣＲにより作製した。全ての突然変異体タンパク質を上記のように発現させ、精製した。
【０１８４】
１．３  前駆体ペプチド
各々が２つのタンデムパテラミドコアペプチドの代わりに１つのコアペプチドのみをコードするＰａｔＥの変異体を、プロセシング生成物の分析をより容易にするためにＣ末端Ｈｉｓ６−タグとともにｐＢＭＳ２３３にクローニングした。より効率的なＮ末端切断を可能にするために、場合によってはトリプシン（Ｋ／Ｒ）又はＴＥＶ（ＥＮＬＹＦＱ）による切断を可能にする付加的な残基をコアペプチドの直前に付加した。タンパク質を自己誘導培地（微量元素を含有するテリフィックブロスベース）上、３７℃で一晩成長させたＢＬ２１（ＤＥ３）細胞で発現させた。細胞を４０００×ｇ、２０℃で１５分間の遠心分離によって採取し、８Ｍ尿素、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭイミダゾール及び３ｍＭ  ＢＭＥに再懸濁した。細胞を超音波処理によって溶解させ、溶解物を４００００×ｇ、２０℃で４５分間の遠心分離に続く５μｍ、０．８μｍ及び０．４μｍのそれぞれの膜フィルターでの濾過によって清澄化した。清澄化溶解物を、溶解緩衝剤で予洗したＮｉ−セファロースＦＦカラム（GE Healthcare）にアプライし、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールで溶出した。ＤＤＴを溶出したＰａｔＥに１０ｍＭの最終濃度で添加し、溶液を室温で３時間インキュベートした。ＰａｔＥを更に精製し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＴＣＥＰ中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５、GE Healthcare）によってタンパク質凝集体から分離し、１ｍＭまで濃縮した。
【０１８５】
２．  複素環化反応
複素環化反応は１００μＭ  ＰａｔＥ、５μＭ  ＴｒｕＤ／ＰａｔＤ、５ｍＭ  ＡＴＰ（ｐＨ７）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＴＣＥＰを含むものであった。ＴｒｕＤを使用する場合は２４時間、ＰａｔＤについては４８時間にわたって反応物を２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃でインキュベートした。場合によってはＰａｔＥは或る程度の沈殿を示した。これらの場合、上記のような８Ｍ尿素中での変性に続くＮｉ親和性クロマトグラフィー及びサイズ排除によってペプチドを沈殿物から回収した。反応をＭＡＬＤＩによってモニタリングした。
【０１８６】
プロセシングしたＰａｔＥを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＴＣＥＰ中でのＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５（GE Healthcare）で精製し、濃縮した。
【０１８７】
３．  大環状化反応
基質枯渇後に最終生成物比を比較する大環状化反応については、１００μＭのペプチド（ＶＧＡＧＩＧＦＰＡＹＤＧ）を５０μＭの酵素とともに１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８）、１ｍＭ  ＴＣＥＰ中、３７℃で１２０時間インキュベートした。サンプルをＥＳＩ又はＭＡＬＤＩ  ＭＳ（ＬＣＴ、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ又は４８００  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ  Ａｎａｌｙｓｅｒ、ABSciex）によって分析した。
【０１８８】
他の大環状化反応については、１００μＭのペプチド（例えばＶＧＡＧＩＧＦＰＡＹＤＧ、ＶＧＡＧＩＧＦＰＡＹＲＧ又はＧＶＡＧＩＧＦＰＡＹＲＧ）を２０μＭの酵素とともに様々な緩衝剤中、３７℃で２４時間インキュベートした（図１〜図３を参照されたい）。
【０１８９】
１００μＭのペプチド（ＰａｔＥ）を含む他の大環状化反応については、５％ＤＭＳＯ、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０μＭ  ＰａｔＧｍａｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び２０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．０）を２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で４日間インキュベートし、ＭＳによってモニタリングした。
【０１９０】
４．  生成物のＬＣ−ＭＳ分析
Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｕｎｆｉｒｅ  Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ）を用いてＬＣ−ＭＳを行った。溶媒Ａは０．１％ギ酸を含有するＨ２Ｏとし、溶媒Ｂは０．１％ギ酸を含有するＭｅＯＨとした。勾配：０分〜２分  １０％のＢ；２分〜２２分  １０％のＢから１００％のＢへ；２２分〜２７分  １００％のＢ；２７分〜３０分  １００％のＢから１０％のＢへ。高分解能質量スペクトルデータを、Thermo InstrumentsのＨＰＬＣシステム（Ａｃｃｅｌａ  ＰＤＡ検出器、Ａｃｃｅｌａ  ＰＤＡオートサンプラ及びＡｃｃｅｌａ  Ｐｕｍｐ）に接続したThermo InstrumentsのＭＳシステム（ＬＴＱ  ＸＬ／ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で得た。以下の条件を使用した：キャピラリー電圧４５Ｖ、キャピラリー温度３２０℃、補助ガス流量１０〜２０任意単位、シースガス流量４０〜５０任意単位、スプレー電圧４．５ｋＶ、質量範囲１００ａｍｕ〜２０００ａｍｕ（最高分解能３００００）。
【０１９１】
５．  結晶化、データ収集及び結晶学的分析
ＰａｔＧｍａｃの結晶を１９％ＰＥＧ６０００、０．０７Ｍ酢酸カルシウム、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ９．０）中で得た。結晶を３０％グリセロール中で凍結防止処理し（cryoprotected）、液体窒素中でフラッシュ冷却した。これらの結晶はセル寸法ａ＝１３２．１Å、ｂ＝６７．６Å、ｃ＝９７．３Å、β＝１１５．０度の空間群Ｃ２に属していた。
【０１９２】
ペプチドを含むＰａｔＧｍａｃの結晶を、１．２Ｍクエン酸ナトリウム、０．１Ｍカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７．０）中でＰａｔＧｍａｃとペプチドとの混合物（ＶＰＡＰＩＰＦＰＡＹＤＧ、１：４のモル比）から得た。活性部位の１つでペプチドの電子密度が存在するが、マップの品質は不十分であった。これはペプチドの占有率が低いことに起因すると推論されるため、複合体結晶をデータ収集前に７．５ｍＭのペプチドに一晩浸漬した。これらの結晶はａ＝１３５．６Å、ｂ＝６７．３Å、ｃ＝１３７．９Å、β＝１１６．８度の空間群Ｃ２に属していた。両方の構造の回折データを、各々１００Ｋでの単結晶についてＳａｔｕｒｎ  ９４４  ＣＣＤ検出器を備える株式会社リガクの００７ＨＦＭ回転陽極Ｘ線発生装置で自家収集し、ｘｉａ２でプロセシングした（Winter、G., 2009）。
【０１９３】
ＰａｔＧｍａｃの構造は、ＡｋＰ（ＰＤＢエントリ１ＤＢＩ）の構造を検索モデルとして用いたＰＨＡＳＥＲによる分子置換（Storoni, L. C., McCoy, A. J. & Read, R. J., 2004、McCoy, A. J., Grosse-Kunstleve, R. W., Storoni, L. C. & Read, R. J., 2005）、その後のＰｈｅｎｉｘによる自動再構成（Adams, P. D. et al., 2004）によって解明した。ペプチドを含むＰａｔＧｍａｃの構造は、ＰａｔＧｍａｃ構造を検索モデルとして用いた分子置換によって解明した。手動再構成はＣＯＯＴ（Emsley, P. & Cowtan, K. Coot, 2004）を用いて行い、精緻化はＣＣＰ４プログラム群（Acta Crystallographica Section D 50, 760-763 (1994)）で実行されるＲＥＦＭＡＣ５（Murshudov, G. N., Vagin, A. A. & Dodson, E. J., 1997）を用いて行った。データ収集及び精緻化の統計を表１にまとめる。分子グラフィックス図はＰｙｍｏｌプログラム（DeLano Scientific, LLC）によって生成した。
【０１９４】
６．  ペプチド基質の合成
Ｆｍｏｃアミノ酸誘導体２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）及びＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＮｏｖａＳｙｎ  ＴＧＴ樹脂はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  （Merck Biosciences，UK）から購入した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びピペリジンはSigma-Aldrich（UK）から入手し、更に精製することなく使用した。
【０１９５】
ＶＧＡＧＩＧＦＰＡＹＤＧ、ＶＰＡＰＩＰＦＰＡＹＤＧ及びＧＶＡＧＩＧＦＰＡＹＲＧを含むペプチドを、標準的なＦｍｏｃベース戦略（Cammish, L. E. & Kates, S. A., 2000）を用いて手動合成した。アミノ酸を各サイクルでのＦｍｏｃ保護基の除去後に順次カップリングした。Ｆｍｏｃ脱保護工程をＤＭＦ中２０％のピペリジン（ｖ／ｖ）を用いて１２分間行い、カップリング反応をＤＭＦ中で５：５：１０：１というアミノ酸：ＨＢＴＵ：ＤＩＥＡ：樹脂のモル比を用いて行った。Ｋａｉｓｅｒ試験を用いて反応をモニタリングした。
【０１９６】
ペプチドを支持体から切断し、９５％ＴＦＡ、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）及び２．５％Ｈ２Ｏからなる混合物での処理によって脱保護した（ペプチド樹脂１ｇ当たり２０ｍＬの混合物、室温で３時間）。次いで、樹脂を濾過し、ＴＦＡで洗浄した。合わせた濾液を減圧下で濃縮した。ペプチドを冷ジエチルエーテルで沈殿させ、遠心分離によって回収した。ペプチド配列をＭＳＭＳ分析によって検証した。
【０１９７】
ペプチドＶＧＡＧＩＧＦＰＡＹＲＧはPeptide Protein Research Ltdから購入した。
【０１９８】
７．  タンパク質分解的切断
作製するＰａｔＥ配列に応じて、トリプシン及びＴＥＶプロテアーゼを含む種々のプロテアーゼを使用した。１ｍｇの精製プロセシングＰａｔＥにつき４μｇのトリプシンを使用した。対応するＴＥＶプロテアーゼの数値は各１０ｍｇのＰａｔＥにつき１ｍｇである。反応物を２００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で最大４時間インキュベートした。反応生成物を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．０）中でＳｕｐｅｒｄｅｘ  ３０（GE Healthcare）を用いて精製した。精製生成物をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｔｒａｔａ  Ｃ１８−Ｅ、５５μｍ、７０Å、２ｇ／１２ｍＬ  Ｇｉｇａ  ＳＰＥチューブカートリッジを用いて濃縮した。サンプルをロードした後、緩衝塩を取り除く脱イオン水による洗浄工程を行い、続いて５×カラム容量のメタノール及び５×カラム容量のアセトニトリルを用いた溶出工程を行った。カラムをアセトニトリル中５×容量の０．１％ＴＦＡで同様に洗浄した。水又は酸性化アセトニトリルによる洗浄を全てのペプチドについてＭＳにより別個に試験した。ペプチドが有機溶媒により完全に溶出することが見出された。
【０１９９】
８．  パテラミドの精製
大環状化反応物をＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｓｔｒａｔａ  Ｃ１８−Ｅ、５５μｍ、７０Å、２ｇ／１２ｍＬ  Ｇｉｇａ  ＳＰＥチューブカートリッジで上記の手順に従って濃縮した。続いて生成物の最終精製をＣ４  ＡＣＥカラム１０×２５０ｍｍ、５μｍでの水中のアセトニトリル勾配を用いたＨＰＬＣを用いて行った。水は脱イオン化標準としたが、メタノール及びアセトニトリルはどちらもＬＣＭＳ標準とする。全てのガラス製品を１．０モル硝酸に浸漬し（１２時間）、脱イオン水ですすぎ、空気乾燥又は炉乾燥した。波長２１０ｎｍ、２２０ｎｍ、２３０ｎｍ、２４０ｎｍ及び２５４ｎｍのＤＡＤを用いて精製プロセスをモニタリングした。ＮＭＲ及びＭＳを用いて精製生成物の構造を確認した。得られた２つの化合物のＮＭＲデータを表にした（表７及び表８）。精製化合物を、ジクロロメタン中のＭｎＯ２を用いて２８℃で３日間化学的に酸化した。
【実施例】
【０２００】
結果
実施例１：ＰａｔＧマクロシクラーゼドメインの全体構造
ＰａｔＧのマクロシクラーゼドメイン（ＰａｔＧｍａｃ、残基４９２〜８５１）を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞において過剰発現し、確立されたプロトコル（Liu, H. & Naismith, J. H., 2009）を用いて精製した。ゲル濾過による保持プロファイルからドメインが単量体であることが示された。
【０２０１】
上記タンパク質は、非対称単位の２つの生物学的単量体を有する空間群Ｃ２に属する結晶を形成した。サブチリシン桿菌Ａｋ．１プロテアーゼ（ＡｋＰ）（ＰＤＢエントリ１ＤＢＩ）を検索モデルとして用いた分子置換によって、構造を２．１９Åの分解能で決定した。表１にデータ収集及び精緻化の統計を示す。精緻化モデル（ＰＤＢエントリ４ＡＫＳ）はＡ鎖中に残基５１４〜６５３、６５９〜６８５、６９４〜７１７、７２８〜７４５、７５４〜８２２及び８３５〜８５１、Ｂ鎖中に５１５〜６５０、６６０〜６８８及び６９２〜８５０を含む。欠損残基はループ及びＮ末端に存在し、不規則であると推定される。
【０２０２】
ＰａｔＧｍａｃは寸法がおよそ５３Å×４２Å×４８Åの球状である。このタンパク質は全てのサブチリシン様プロテアーゼに共通したフォールドである各面に２つのαヘリックスを有する七本鎖パラレルβシートを含有する。しかしながら、結合部位が配列変化によって破壊されるため、サブチリシン様プロテアーゼの保存金属イオンはＰａｔＧｍａｃに存在しない。
【０２０３】
ＰａｔＧｍａｃはβ鎖β１のＣ末端に位置するＡｓｐ５４８、α４の中央のＨｉｓ６１８及びα７のＮ末端のＳｅｒ７８３からなる触媒三残基を含有する。Ａｓｐ５４８のカルボキシル基はＨｉｓ６１８（２．９Å）の側鎖に水素結合し、これがＳｅｒ７８３（２．７Å）の側鎖に水素結合する。ＰａｔＧｍａｃはβ２からループとして伸びる挿入を有し、ヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフを形成し、Ｈｉｓ６１８を有するヘリックスであるα４のＮ末端伸長を生じる。この挿入は他のマクロシクラーゼに見られるが、長さ又は配列は保存されない。
【０２０４】
実施例２：サブチリシン様プロテアーゼＡｋＰ及びＰａｔＧｍａｃの比較
ＡｋＰ及びＰａｔＧｍａｃのアミノ酸配列は２８％同一であり、ペアワイズの重ね合わせにより１４５個の構造的に同等の残基で１．２３ÅのＣα  ｒｍｓｄが得られる。最も顕著な違いは、ＰａｔＧｍａｃが活性部位の上に位置するα２とα４との間（Ａ５７４〜Ｋ６１０）にヘリックス−ターン−ヘリックス挿入を含有することである。これを大環状化挿入と称する。これらの残基のうち８個が、典型的なサブチリシン構造と比較してα４の２つのターンＮ末端伸長を形成する。これにより、このヘリックスの末端ではなく中央に触媒Ｈｉｓが生じる。他の２９個の残基がヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフを形成する。
【０２０５】
ＰａｔＧ及びそのホモログにおいて高度に保存される４つのシステイン（表４）は、２つのジスルフィド結合：Ｃｙｓ６８５／７２４及びＣｙｓ８２３／８３４を生じる。ＰａｔＧｍａｃ中のＣｙｓ６８５／７２４ジスルフィド結合はサブチリシンに見られるものとは異なる。ＡｋＰのＣｙｓ１３７はＰａｔＧｍａｃのＣｙｓ６８５に相当し、Ｃｙｓ１３９とループ内ジスルフィド結合を形成し、活性部位を強固にすることが提唱される１１原子環を生成する。
【０２０６】
対照的に、ＰａｔＧｍａｃ  Ｃｙｓ６８５／７２４は２つのループを架橋し、その一方がα４と活性部位に隣接するα６とを接続する。結果として、Ｐｈｅ６８４及びＡｒｇ６８６がＭｅｔ６６０の側鎖に固まり、Ｓ４及びＳ３基質結合ポケットを完全に埋める。Ｃｙｓ８２３／８３４は、α８とドメインのＣ末端にあり、活性部位から離れたα９とを接続するループの末端を連結する。
【０２０７】
実施例３：ＰａｔＧｍａｃ基質複合体
ＶＰＡＰＩＰＦＰＡＹＤＧペプチドを、８残基カセット及びＣ末端４残基大環状化シグネチャーであるＰ８−Ｐ４’に相当する残基に適合させるために選択した。プロリン残基を天然基質の複素環を模倣するために選択し、ペプチドは実際にＰａｔＧｍａｃによって（ゆっくりとではあるが）大環状化することができる。
【０２０８】
ＰａｔＧｍａｃＨ６１８Ａ（不活性突然変異体）の複合体の構造を、ＰａｔＧｍａｃネイティブを検索モデルとして用いた分子置換によって２．６３Åで決定した（表１）。１つのプロモーターの活性部位における結合ペプチドの電子密度差はＰＩＰＦＰＡＹＤＧ（Ｐ５−Ｐ４’）で明白であり、基質模倣体の３個のＮ末端残基（ＶＰＡ）が無秩序であることが示された。精緻化モデル（ＰＤＢエントリ４ＡＫＴ）はＡ鎖中に残基５１４〜６８６、６９４〜７１９、７２７〜７４７、７５４〜８２３及び８３３〜８５１、Ｂ鎖中に５１５〜６５１、６５７〜６８８及び６９２〜８５１を含有する。
【０２０９】
基質の残基Ｐ５及びＰ４（Ｐｒｏ及びＩｌｅ）はタンパク質と接触しないが、Ｐ３（Ｐｒｏ）はＴｙｒ２１０と弱いファンデルワールス相互作用を有する。Ｐ２（Ｐｈｅ）も限られたファンデルワールス接触を生じ、側鎖は浅いポケットに位置する。Ｐ１のＰｒｏは、タンパク質とは別の方向を向いた基質をもたらすシスペプチド立体配座を取り、側鎖はＨｉｓ６１８Ａｌａ及びＶａｌ６２２とファンデルワールス接触を生じる。Ｐ１−Ｐ１’ペプチドのカルボニルは４．３Å離れ、Ｓｅｒ７８３のヒドロキシルによる求核攻撃に対して正確に配向する。Ｍｅｔ７８４の側鎖はカルボニルのこの面に位置し、完全に保存されたＡｓｎ７１７の側鎖は四面体中間体を安定させる正確な位置で反対面の方向を向く。Ｐ１’Ａｌａ  Ｃα及び側鎖は、Ｍｅｔ７８４及びタンパク質骨格との接触を含む僅かな疎水性相互作用しか生じない。これはより嵩高い残基に十分なほど大きく見えるキャビティに位置する。Ｐ２’（Ｔｙｒ）残基はタンパク質と下記の広範な接触を生じる：高度に保存されたＰｈｅ７４７とのπ−スタッキング相互作用、Ｈｉｓ７４６（ホモログにおいてはＨｉｓ又はＬｙｓとして保存される）との水素結合、及びＴｙｒ主鎖酸素とＴｈｒ７８０の窒素との間の水素結合。Ｐ３’（Ａｓｐ）の側鎖はＡｒｇ５８９、Ｌｙｓ５９４及びＬｙｓ５９８によって生じる大きな陽性パッチに向かって配向する。これはＬｙｓ５９８及び場合によってはＬｙｓ５９４と塩架橋を生じるが、Ｌｙｓ５９４の側鎖は秩序だっていない。Ｐ４’Ｇｌｙ残基はタンパク質と接触しないが、末端カルボキシル基はＬｙｓ５９４に近い。ペプチドの結合は、主鎖がＣα位で２Å移動し、基質との衝突を回避するためＰｈｅ６８４でのＰａｔＧｍａｃの変化を伴う。Ｍｅｔ６６０、Ｐｈｅ６８４及びＡｒｇ６８６の側鎖は伸張立体配座を取る基質の結合を阻止する。
【０２１０】
アシル−酵素中間体が形成される活性部位は、大環状化挿入及びＡＹＤＧペプチドによって溶媒から遮られている。
【０２１１】
大環状化中、アシル−酵素中間体は基質と平衡状態にある。ＰａｔＧｍａｃにおいては基質のアミノ末端が活性部位に入り、ＡＹＤＧに置き換わり、大環状化をもたらす。ＡＹＤＧの結合を破壊する突然変異は、水によって加水分解されるため直鎖生成物を生じる。入り込んだアミノ末端を脱プロトン化するＨｉｓの役割は推測である。
【０２１２】
実施例４：大環状化の生化学的特性化
ペプチドＶＧＡＧＩＧＦＰＡＹＤＧを生化学的アッセイにおいてＰａｔＧｍａｃの基質として使用した（図４ｃ）。この基質ペプチドを使用した大環状化生成物と直鎖生成物との比率を、液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＬＣ−ＥＳＩ  ＭＳ）により得られるイオンカウントによって決定した。ネイティブタンパク質については、大環状化生成物（シクロ［ＶＧＡＧＩＧＦＰ］）のみが検出された（表２、図５〜図１０）。
【０２１３】
ＰａｔＧｍａｃは緩徐型酵素である。これまでに報告されたターンオーバー率は１日当たり約１である（Lee, J., McIntosh, J., Hathaway, B. J. & Schmidt, E. W., 2009、McIntosh, J. A. et al., 2010）。１５０ｍＭから５００ｍＭへの塩化ナトリウム濃度の増大は、ターンオーバー率の１桁を超える改善をもたらした。８から９へのｐＨの増大はターンオーバー率を更に３倍にした。ＤＭＳＯの添加はターンオーバー率の僅かな増大をもたらしたが、最適ｐＨをシフトし、５００ｍＭ  ＮａＣｌ及び５％ＤＭＳＯ（ｐＨ８）を含有する緩衝剤は５０倍超大きな反応速度をもたらした（図１）。これらの条件下で、ＨＰＬＣによってシクロ［ＶＧＡＧＩＧＦＰ］から分離することができる約７％の線形化ＶＧＡＧＩＧＦＰ副生成物が観察された。
【０２１４】
部位特異的突然変異体Ｋ５９４Ｄ及びＫ５９８Ｄ、並びに２つの欠失突然変異体５７８−６０８（ヘリックス−ループ−ヘリックス挿入モチーフ、ＰａｔＧｍａｃΔ１）及び５７８−６１４（ヘリックス−ループ−ヘリックス挿入及びα４のＮ末端伸長、ＰａｔＧｍａｃΔ２）は、ネイティブタンパク質とほぼ等しい速度で基質を消費した（図５〜図８及び図１０）。Ｋ５９４Ｄについては、生成物のおよそ３分の１が大環状化し、３分の２が直鎖ペプチドであった。Ｋ５９８Ｄ及び両方の欠失は直鎖ＶＧＡＧＩＧＦＰのみをもたらした（図５〜図８及び図１０）。三重突然変異体Ｒ５８９Ｄ／Ｋ５９４Ｄ／Ｋ５９８Ｄは相当遅く、直鎖基質のみを生じた。全ての突然変異体を通常通り精製し、ＣＤ分光法に従ってフォールディングした。
【０２１５】
基質ＶＧＡＧＩＧＦＰＡＹＲＧは修飾認識配列（ＡｓｐからＡｒｇへ）を有する。予想されるように、ＰａｔＧｍａｃ野生型（並びにＫ５９４Ｄ及びＲ５８９Ｄ／Ｋ５９４Ｄ／Ｋ５９８Ｄ）は基質と極めて遅く反応し、等量の大環状化生成物及び直鎖生成物をもたらした。ＰａｔＧｍａｃ  Ｋ５９８Ｄは、ＶＧＡＧＩＧＦＰＡＹＤＧと野生型ＰａｔＧｍａｃよりも１桁超速い速度でシクロ［ＶＧＡＧＩＧＦＰ］を生じ、僅か８％が直鎖生成物であった（図２及び図３）。基質のＮ末端の正確な性質が速度に影響を与え、ＶＧＡＧＩＧＦＰＡＹＲＧはＧＶＡＧＩＧＦＰＡＹＲＧよりも１桁速くプロセシングされた。
【０２１６】
部位特異的突然変異体Ｓ７８３Ａ及びＨ６１８Ａ（どちらも触媒三残基）は検出可能な反応を生じなかった。質量分析から、ターンオーバーにおいてアシル−酵素中間体（ＶＧＡＧＩＧＦＰ−ＰａｔＧｍａｃ）が明らかに特定された（図８）。
【０２１７】
大環状化を更に調査するために、天然産物パテラミドＤに対応する単一カセット（ＩＴＡＣＩＴＦＣ）に隣接する３７残基のＮ末端リーダー配列並びにＮ末端及びＣ末端切断認識部位からなるＰａｔＥプレプロペプチド（ＰａｔＥ２）を改変した。加えて、精製プロセスの助けとなるＣ末端Ｈｉｓ６−タグを付加した（図１１）。
【０２１８】
前駆体ペプチドＰａｔＥ２、ＰａｔＤ及びＴｒｕＤ（ヘテロシクラーゼ）、ＰａｔＡｐｒ（サブチリシン様プロテアーゼドメイン）及びＰａｔＧｍａｃ（サブチリシン様プロテアーゼ／マクロシクラーゼドメイン）を大腸菌にクローニングし、発現させ、生化学反応に使用するために精製した（上記の材料及び方法を参照されたい）。
【０２１９】
実施例５：ＰａｔＥ２の精製及びリフォールディング
ＰａｔＥ２をｐＢＭＳベクターにクローニングし、自己誘導培地中、３０℃で２４時間成長させた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において発現させ、タンパク質を封入体に移した。細胞を４０００×ｇ、２０℃で１５分間の遠心分離によって採取し、尿素溶解緩衝剤（８Ｍ尿素、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２０ｍＭイミダゾール及び３ｍＭ  β−メルカプトエタノール（βＭＥ））に再懸濁し、超音波処理によって１５ミクロンで溶解させた（ＳｏｎｉＰｒｅｐ  １５０、MSE）。溶解物を４００００×ｇ、２０℃での遠心分離に続いて０．４５μｍフィルターに通すことによって清澄化した。清澄化溶解物を溶解緩衝剤で平衡化したＨｉｓ選択カラム（GE Healthcare）にアプライし、タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールで溶出させた。次いで、タンパク質にリフォールディングを誘導する１０ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）を添加し、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＴＣＥＰ中でのサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５、GE Healthcare）に供した。タンパク質は単一の単量体ピークとして溶出し、最終収量は培養物１Ｌ当たり２５０ｍｇ〜３００ｍｇであった。
【０２２０】
実施例６：ＰａｔＥ２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ複素環化
本発明の単一カセットＰａｔＥの複素環化を評価するために、いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ反応を行った。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１ｍＭ  ＴＣＥＰ、５ｍＭ  ＡＴＰ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２中、３７℃で３０分間の１００μＭ  ＰａｔＥ２と５μＭ  ＰａｔＤとのインキュベーションは、予想される４つの水の喪失に対応する７２ａｍｕの喪失をもたらし、カセット内のトレオニン残基及びシステイン残基の両方が複素環化されることが示される（図１２）。
【０２２１】
代替的には、同じ条件下での１００μＭ  ＰａｔＥ２と５μＭ  ＴｒｕＤとのインキュベーションは、予想される２つの水の喪失に対応する３６ａｍｕの喪失をもたらし、システイン残基のみが複素環化されることが確認された（図１３）。
【０２２２】
使用した全ての酵素の中でも、２つのヘテロシクラーゼの発現及び精製が圧倒的に困難である（培養物１Ｌ当たり４０ｍｇの純粋タンパク質）。したがって、それらをより少量で使用し、再利用することができるか否か調査しようとした。複素環化反応物を３７℃で一晩インキュベートする場合、酵素の量を１：２０から１：２００（酵素：基質）まで低減することができるが、反応時間は顕著に長くなる。
【０２２３】
最終反応物をＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００ゲル濾過カラム（GE Healthcare）に通すと、酵素、基質及びＡＴＰ／ＡＤＰの３つのピークが得られる（図１４）。酵素ピークをプールし、濃縮し、別の反応に使用したところ、依然として完全に機能的であり、長い反応時間を短縮しなくとも酵素の再利用が可能であることが明らかに示される。
【０２２４】
実施例７：Ｎ末端切断
カセットのＮ末端切断はＰａｔＡのサブチリシン様プロテアーゼドメインによって媒介される。プロテアーゼドメインは認識部位「ＧＬＥＡＳ」に作用し、Ｓとカセットの第１の残基との間で切断する。この反応のｉｎ  ｖｉｔｒｏでのターンオーバーは緩徐なプロセスであることが見出された。実際に、１００μＭ  ＰａｔＥ２（事前のヘテロシクラーゼ処理を行う又は行わない）と２０μＭ  ＰａｔＡｐｒとの３７℃で２００時間のインキュベーションが完全な切断に必要とされる。反応物を１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．１）で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ３０カラム（GE Healthcare）に投入することによって、カセット部分をＰａｔＡｐｒ及び切断リーダー配列から精製する。ＰａｔＡｐｒは大腸菌において高度に発現され、収量は培養物１リットル当たり２５０ｍｇ超の精製タンパク質である。
【０２２５】
ＰａｔＡｐｒの緩徐な性質のために、ＰａｔＥ２プレプロペプチドをＰａｔＡ認識配列「ＧＬＥＡＳ」とカセット残基との間にリシン残基（ＰａｔＥ２Ｋ）を含有し、トリプシン切断が可能となるように再改変した（図１１）（例えばＸｎ−ＧＬＥＡＳＫ［カセット］−Ｘｍ）。この付加がヘテロシクラーゼ活性に影響を及ぼすか否かを試験するために、１００μＭのＰａｔＥ２Ｋを０．５μＭのＰａｔＤ及びＴｒｕＤの両方と３７℃で一晩別々にインキュベートした。予想される４つ及び２つの水の喪失がそれぞれＭＳによって見出された。複素環化ペプチドを先に記載のように精製し、１０００倍トリプシンを用いて３７℃で２時間切断した。完全な切断がＭＳによって確認され（図１５）、得られる断片を上記のように精製し、ＰａｔＧｍａｃによる大環状化に供した。ペプチド基質の大環状化をＭＳによって確認した。
【０２２６】
同様に、ＰａｔＥ２プレプロペプチドを、ＴＥＶプロテアーゼシグナル（ＥＮＬＹＦＱ）をＰａｔＡ認識配列「ＧＬＥＡＳ」とカセット残基との間に含有し、ＴＥＶ切断が可能となるように再改変した（例えばＸｎ−ＧＬＥＡＳＥＮＬＹＦＱ［カセット］−Ｘｍ＿）。この付加がヘテロシクラーゼ活性に影響を及ぼすか否かを試験するために、１００μＭのＰａｔＥ２ＴＥＶを０．５μＭのＰａｔＤと３７℃で一晩別々にインキュベートした。予想される４つ及び２つの水の喪失がそれぞれＭＳによって見出された。複素環化ペプチドを先に記載のように精製し、１０００倍ＴＥＶを用いて３７℃で２時間切断した。完全な切断がＭＳによって確認され、得られる断片を上記のように精製し、ＰａｔＧｍａｃによる大環状化に供した。ペプチド基質の大環状化をＭＳによって確認した。
【０２２７】
実施例８：Ｃ末端切断及び大環状化
パテラミド作製の最終段階はＣ末端切断及び大環状化である。この工程はＰａｔＧｍａｃドメインによって触媒される。本発明の単一カセットを大環状化するために、１００μＭの（ＰａｔＤ又はＴｒｕＤで）複素環化された及びＮ末端切断したＰａｔＥ２／ＰａｔＥ２Ｋを２０μＭのＰａｔＧｍａｃとともに２０ｍＭ  Ｂｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．１）、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５％ＤＭＳＯ中、３７℃で２４時間インキュベートし、反応を完了した。反応の完全性をＬＣＴ−ＥＳＩ  ＭＳによって確認した（図１６）。イオンカウント分析によりサンプルが１００％大環状化され、直鎖生成物又は非切断基質が存在しなかったことが示される。ＰａｔＧｍａｃは大腸菌でも高度に発現され、培養物１リットル当たり２００ｍｇ〜２５０ｍｇの精製タンパク質が得られた。最終大員環をＣ１８ペプチドカラムでのＨＰＬＣによって精製した。ＰａｔＤ及びＴｒｕＤ複素環化大員環をＨＲＭＳに供し、それらの構造を断片化によって確認した（図１９〜図２１；表３を参照されたい）。ＮＭＲ分析を図２０及び図２１に示されるようにＴｒｕＤ及びＰａｔＤ複素環化大員環について行った）（表７及び表８）。
【０２２８】
実施例９：パテラミドの精製
コア配列カセットであるＩＴＶＣＩＴＶＣ（ＴｒｕＤ）、ＩＴＡＣＩＴＦＣ（ＴｒｕＤ、ＰａｔＤ）、ＩＴＡＣＩＴＹＣ（ＴｒｕＤ、ＰａｔＤ）、ＩＭＡＣＩＭＡＣ（ＴｒｕＤ）、ＩＤＡＣＩＤＦＣ（ＴｒｕＤ）、ＶＴＶＣＶＴＶＣ（ＴｒｕＤ、ＰａｔＤ）、ＩＴＡ（ＳｅＣｙｓ）ＩＴＦ（ＳｅＣｙｓ）（ＴｒｕＤ）、ＡＣＩＭＡＣ（ＴｒｕＤ）、ＩＡＣＩＭＡＣ（ＴｒｕＤ）、ＩＩＴＡＣＩＭＡＣ（ＴｒｕＤ）、ＩＣＡＣＩＴＦＣ（ＴｒｕＤ）、ＩＡＡＣＩＴＦＣ（ＴｒｕＤ）、ＩＴＡＣＩＴＡＣ（ＴｒｕＤ）、ＡＴＡＣＩＴＦＣ（ＴｒｕＤ）、ＩＴＡＡＩＴＦＣ（ＴｒｕＤ）及びＩＴＡＣＩＳＦＣ（ＴｒｕＤ）を有するＰａｔＥ基質を、示されたように、ＰａｔＤヘテロシクラーゼ又はＴｒｕＤヘテロシクラーゼのいずれかにより処理した後、上記のように、トリプシンによるタンパク質分解及びＰａｔＧｍａｃによる大環状化に供した。続けて、環状生成物であるシクロ（ＩＴＶ（Ｔｈｎ）ＩＴＶ（Ｔｈｎ））、シクロ（ＩＴＡ（Ｔｈｎ）ＩＴＦ（Ｔｈｎ））、シクロ（Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ａ（Ｔｈｎ）Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ｆ（Ｔｈｎ））、シクロ（ＩＴＡ（Ｔｈｎ）ＩＴＹ（Ｔｈｎ））、シクロ（Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ａ（Ｔｈｎ）Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ｙ（Ｔｈｎ））、シクロ−（ＩＭＡ（Ｔｈｎ）ＩＭＡ（Ｔｈｎ））、シクロ−（ＩＤＡ（Ｔｈｎ）ＩＤＦ（Ｔｈｎ））、シクロ−（ＶＴＶ（Ｔｈｎ）ＶＴＶ（Ｔｈｎ）、シクロ−（Ｖ（ＭｅＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ）Ｖ（ＭｅＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ））、シクロ−（ＩＴＡ（Ｓｅｎ）ＩＴＦ（Ｓｅｎ））、シクロ−（Ａ（Ｔｈｎ）ＩＭＡ（Ｔｈｎ））、シクロ−（ＩＡ（Ｔｈｎ）ＩＭＡ（Ｔｈｎ））、シクロ−（ＩＩＴＡ（Ｔｈｎ）ＩＭＡ（Ｔｈｎ））、シクロ−（Ｉ（Ｔｈｎ）Ａ（Ｔｈｎ）ＩＴＦ（Ｔｈｎ））、シクロ−（ＩＡＡ（Ｔｈｎ）ＩＴＦ（Ｔｈｎ））、シクロ−（ＩＴＡ（Ｔｈｎ）ＩＴＡ（Ｔｈｎ））、シクロ−（ＡＴＡ（Ｔｈｎ）ＩＴＦ（Ｔｈｎ））、シクロ−（ＩＴＡＡＩＴＦ（Ｔｈｎ））及びシクロ−（ＩＴＡ（Ｔｈｎ）ＩＳＦ（Ｔｈｎ））を精製し、ＮＭＲ及びＭＳにより分析した。
【０２２９】
複素環を含有する大環状構造の作製をこれら全てのペプチド基質について確認した。
【０２３０】
基質ペプチドＩＴＶＣＩＴＶＣから作製されたシクロ−（Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ）Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ））（Ｃｍｐｄ  ３２）、及び基質ペプチドＩＴＡＣＩＴＦＣから作製されたシクロ−（ＩＴＡ（Ｔｈｎ）ＩＴＦ（Ｔｈｎ））（Ｃｍｐｄ３３）のＮＭＲデータを表にした（表７及び表８）。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏシクロ−（Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ）Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ））のＮＭＲスペクトルは、リッソクリヌム・パテラによって産生される天然テトラヒドロアシジアシクラミドのＮＭＲスペクトルと一致することが見出された。大環状化後に複素環を酸化する能力を、チアゾリンからチアゾールへの変換を評価することによって決定した。基質ペプチドＩＴＶＣＩＴＶＣから作製された還元型シクロ−（Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ）Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ））を、ジクロロメタン中のＭｎＯ２を用いた２８℃で３日間の酸化に供した。得られる混合物をシリカゲル及びセライトカラムクロマトグラフィー、続いてＨＰＬＣクロマトグラフィーに供し、酸化生成物を得た（図２５）。シクロ−（Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ）Ｉ（ＭｅＯｘｎ）Ｖ（Ｔｈｎ））（還元型）、シクロ−Ｉ（ＭｅＯｘｚ）Ｖ（Ｔｈｚ）Ｉ（ＭｅＯｘｚ）Ｖ（Ｔｈｚ））（酸化型）及びリッソクリヌム・パテラから単離されたアシジアシクラミドの遠紫外線ＣＤスペクトルを、光路長０．０２ｃｍの石英キュベットにおいて約１ｍｇ／ｍＬの想定濃度を用いて室温で記録した。酸化型シクロ−Ｉ（ＭｅＯｘｚ）Ｖ（Ｔｈｚ）Ｉ（ＭｅＯｘｚ）Ｖ（Ｔｈｚ））のＣＤスペクトルは、アシジアシクラミドのＣＤスペクトルに一致することが見出された（図２６）。
【０２３１】
実施例１０：ＳＵＭＯ（低分子ユビキチン様修飾因子）タグの使用
ペプチド基質を、ＳＵＭＯタグ（Marblestone et al Protein Sci. 2006 January; 15(1): 182-189）及びこれまでに可溶性発現が示されてこなかったカセット配列を用いて改変した。ＳＵＭＯタグは、標的タンパク質の可溶性発現レベルの増大に使用することができる全体サイズ１３．６ｋＤａ（ＭＢＰ＝４２ｋＤａ、ＧＳＴ＝３０ｋＤａ）の（Ｈｉｓ６タグに連結した）小さな可溶性タグである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析から、ペプチド基質が可溶型で発現され、ＳＵＭＯタグをＴＥＶプロテアーゼによって基質から除去することができることが示された。
【０２３２】
実施例１１：還元型リーダー配列の使用
ＰａｔＥのリーダー配列が複素環化に不可欠であることが以前に報告されている。１５Ｎ−ＰａｔＥとＴｒｕＤとの相互作用を調べた（ＰａｔＥに対してＴｒｕＤが２倍モル過剰となるまで滴定する）。
【０２３３】
残基１〜１５は変化を受けないため、ＴｒｕＤの結合に関与しないようである。残りの残基シグナルは不可視となる程度にまで広がり、結合が残基１６以降で生じることが示された。ＰａｔＥのリーダー領域において最も高度に保存される配列は残基２６〜３４にわたる。ＰａｔＥの最初の２５残基が欠失した合成ペプチド（Δ２５ＰａｔＥ）は、ＴｒｕＤによってネイティブＰａｔＥとして効率的にプロセシングされる。Δ３７ＰａｔＥ（コアペプチド前に５残基プロテアーゼシグネチャーのみを有する）、Δ４２ＰａｔＥ（最初の残基がコアペプチドである）及び８残基コアペプチド自体という３つの付加的なペプチドを試験した。コアペプチド単独では反応は見られず、驚くべきことにΔ３７ＰａｔＥ及びΔ４２ＰａｔＥペプチドの両方がネイティブの１桁以内の速度でプロセシングされるが、コアペプチドの残基の１つ（末端システイン）しか反応しない。
【０２３４】
保存されるリーダー領域内の個々の残基の標的化により、Ｓ３０は重要でないが（Ｓ３０Ｆは野生型活性を有する）、Ｌ２９及びＥ３１が重要であることが明らかとなった。Ｌ２９Ｒ及びＥ３１Ｒはどちらもより遅くプロセシングされ、１つ及び２つの複素環の混合物を生じた。突然変異Ｇ３８Ｉ、Ｌ３９Ｎ及びＡ４１Ｉ（ＧＬＥＡＳプロテアーゼシグネチャー内）は複素環化に影響を有しないが、Ｓ４２Ｑははるかに遅い速度でプロセシングされ、興味深いことに０及び２つの複素環の混合物を生じ、一方でＳ４２Ｃは野生型のようにプロセシングされた。突然変異Ａ５２Ｄははるかに遅く、Ｓ４２Ｑの速度でプロセシングされ、同様に０及び２つの複素環の混合物を生じた。対照的に、同様にＣ末端にすぐ接する大環状化配列「ＡＹＤＧ」内の突然変異Ｙ５３Ａ及びＤ５４Ｒはどちらもプロセシングされた。
【０２３５】
コアペプチド配列ＩＴＡＣＩＴＦＰ（Ｃ５１Ｐ）及びＩＴＡＣＩＴＦＡ（Ｃ５１Ａ）を有する２つのＰａｔＥ突然変異体を分析した。Ｃ５１Ｐの内部システインは３７℃で６０分以内（ネイティブと同様）に複素環化された（質量分析で判断される）。一方で、Ｃ末端に五員環を有しないＣ５１Ａ突然変異体ＰａｔＥははるかに遅く反応し、約５０％の生成物形成のために３７℃で１６時間必要であった。
【０２３６】
実施例１２：Ｃｙｓ含有環状ペプチドからの二量体形成
新規のシクロ［ＶＧＩＣＡＧＦＰ］大環状ペプチド（６；図２７）のＭＡＬＤＩ質量スペクトルは１５０９Ｄａにピークを示し、それが２つの環状ペプチドがシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結した（図２７）二量体形態であることが示された（２１；図２７）。ＶＧＩＣＡＧＦＰ環状単量体の質量は７４４Ｄａであり、チオールを介した二量化は２×７４４（環状単量体）−２（ジスルフィド結合形成で喪失する２つの水素）＝１４８６Ｄａの質量をもたらし、ナトリウム化（sodiated）イオンは１４８６＋２３＝１５０９Ｄａでピークを生じる。
【０２３７】
システイン残基でのペプチドの修飾は初めにジスルフィド結合を還元せずには行うことができなかった。樹脂に固定化したいくつかの異なる還元剤、すなわちＴＣＥＰ、ＤＴＴ、β−メルカプトエタノール及びＴＣＥＰを用いて還元を試みた。ＴＣＥＰ及びＤＴＴによる還元は最も効果的であることが示され、ｔ＝１時間での二量体の完全な還元が達成され、この場合１５０９Ｄａのピークが完全に消失し、７４５Ｄａ及び７６７Ｄａのピーク（それぞれ単量体環状ペプチドのプロトン化形態及びナトリウム化形態に対応する）が現れた。樹脂に固定化したＴＣＥＰ及びβ−メルカプトエタノールは部分的な還元をもたらした。
【０２３８】
実施例１３：改変ＰａｔＧｍａｃを用いたシクロチドの形成
シクロチド、例えばカラタＢ１は環状ペプチド骨格と、ＣＣＫ（環状システインノット）モチーフを形成し、８０を超える既知のシクロチドを非常に安定したものにする強く結び付けられたジスルフィドネットワークとを組み合わせた独自のトポロジーを有する植物タンパク質ファミリー（２８〜４０アミノ酸）である。シクロチドは熱的アンフォールディング、化学的変性剤及びタンパク分解に抵抗性を示す。広範な用途のためのこれらの化合物の作製に幅広い関心が持たれている。
【０２３９】
カラタＢ１の直鎖ペプチド配列を大環状化する改変ＰａｔＧｍａｃの能力を試験し、ＭＡＬＤＩを用いて反応をモニタリングし、合成生成物のＭＳと精製ネイティブカラタＢ１のＭＳとを比較した。反応基質は酸化型及び還元型の直鎖ペプチド配列であり、そのＣ末端にＰａｔＧの認識シグナル（ＡＹＤＧ）を含有する。ＰａｔＧｍａｃは還元型前駆体及び酸化型前駆体の両方を環化することが見出された。還元型前駆体は酵素との反応後に追跡可能な出発物質を生じず、酸化型はあまり効率的でない。
【０２４０】
実施例１４：ＰａｔＤ又はＴｒｕＤを用いたイミダゾリンの形成
最小ペプチドＩＴＡＳＩＴＦＸＡＹＤＧ（Ｘは非天然アミノ酸２，３−ジアミノプロパン酸のｇである）を、上記のようにＴｒｕＤ又はＰａｔＤとともにインキュベートした。反応をＭＡＬＤＩ  ＭＳによって分析し、両方の反応で複素環形成（イミダゾリンの形成）と一致する１８Ｄａの喪失が示されたが、酵素ＴｒｕＤはこの反応でより効率的であった（図２８）。
【０２４１】
【化１】
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【０２４２】
【化２】
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【０２４３】
【表１】
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【０２４４】
【表２】
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【０２４５】
【表３】
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【０２４６】
【表４】
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【０２４７】
【表５】
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【０２４８】
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【０２４９】
【表６】
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【０２５０】
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【０２５１】
【表７】
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【０２５２】
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【０２５３】
【表８】
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【０２５４】
【表９】
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【０２５５】
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【０２５６】
【表１０】
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【０２５７】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図１】
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【図２】
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【図１８】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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