(57)【要約】  前立腺癌のような被検者の疾患の存在を診断する方法が提供され、この方法は被検者から得た生体試料中のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度をＲＮＡ−ｓｅｑ技術で検知するステップと、その発現の相対レベルを予め定められた閾値レベルと比較するステップとを備える。少なくとも２個のＲＮＡバイオマーカーの発現レベルが予め定められた閾値レベルを超えると、それは被検者に前立腺癌が存在することの指標となる。【選択図】図１
2015522277.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者の疾患の存在を検知し且つ病気の進行を観察するか、またはそのいずれかの方法であって：
（ａ）前記被検者から得られた生体試料中の少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を測定するステップを備え、前記発現頻度はＲＮＡ配列法を使用して測定され；さらに
（ｂ）前記生体試料中の少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を予め定められた閾値と比較するステップを備え、前記生体試料中の少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度の増減が前記被検者の疾患の存在および疾患の進行、またはそのいずれかを示すことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記方法が、さらに：
（ａ）前記生体試料中の複数のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を測定するステップと；
（ｂ）前記生体試料中の複数のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を予め定められた閾値と比較するステップとを備え、前記生体試料中の少なくとも二つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度の増減が前記被検者の疾患の存在を示すことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度が、
（ａ）前記生体試料から全ＲＮＡを単離するステップと；
（ｂ）前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーに特異的な第一のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して前記全ＲＮＡから第一ストランドｃＤＮＡを生成するステップと；
（ｃ）第二ストランドｃＤＮＡを合成して二本鎖ｃＤＮＡを準備するステップと；
（ｄ）少なくとも一つのシークエンシングアダプターを前記二本鎖ｃＤＮＡに付加するステップと；
（ｅ）前記二本鎖ｃＤＮＡを増幅してｃＤＮＡライブラリーを準備するステップと；
（ｆ）前記ｃＤＮＡライブラリーを配列して前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を測定するステップと；によって測定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第一のオリゴヌクレオチドプライマーが配列識別番号の７６乃至２２３と２９３乃至３２６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｂ）の後、ステップ（ｄ）の前に、前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーに特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により前記二本鎖ｃＤＮＡを増幅するステップをさらに備えることを特徴とする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーが配列識別番号の７６乃至２２３と２９３乃至３２６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度が：
（ａ）前記生体試料から全ＲＮＡを単離するステップと；
（ｂ）第一ストランドｃＤＮＡを作成して一本鎖ｃＤＮＡを準備するステップと；
（ｃ）前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーに特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により前記一本鎖ｃＤＮＡを増幅して、増幅二本鎖ｃＤＮＡを準備するステップと；
（ｄ）少なくとも一つのシークエンシングアダプターを前記増幅二本鎖ｃＤＮＡに付加するステップと；
（ｅ）前記少なくとも一つのシークエンシングアダプターに特異的なプライマーを使用して、前記増幅二本鎖ｃＤＮＡをさらに増幅してｃＤＮＡライブラリーを準備するステップと；
（ｆ）前記ｃＤＮＡライブラリーを配列して前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を測定するステップと；により測定されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドプライマー対の構成要素の少なくとも一個が配列識別番号の７６乃至２２３と２９３乃至３２６からなる群から選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患が癌であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患が前立腺癌であり、前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーが、配列識別番号の１乃至７５と２３５乃至２８７からなる群から選択されるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記生体試料が尿、血液、血清、細胞株、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）、生検組織、前立腺切除組織からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
被検者の疾患の進行を観察する方法であって、前記方法は：
（ａ）一回目に前記被検者から得られた生体試料中の少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を測定し、それに続いて二回目に前記被検者から得られた生体試料中の前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を測定するステップを備え、前記相対発現頻度はＲＮＡ配列法を使用して測定され、さらに
（ｂ）前記生体試料中の前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を予め定められた閾値と比較するステップを備え、一回目と比較した二回目の前記生体試料中の前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度の増減が被検者の疾患の進行を示すことを特徴とする、方法。
【請求項１３】
前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度が：
（ａ）前記生体試料から全ＲＮＡを単離するステップと；
（ｂ）前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーに特異的な第一のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して全ＲＮＡから第一ストランドｃＤＮＡを生成するステップと；
（ｃ）第二ストランドｃＤＮＡを合成して二本鎖ｃＤＮＡを準備するステップと；
（ｄ）少なくとも一つのシークエンシングアダプターを前記二本鎖ｃＤＮＡに付加するステップと；
（ｅ）前記二本鎖ｃＤＮＡを増幅してｃＤＮＡライブラリーを準備するステップと；
（ｆ）前記ｃＤＮＡライブラリーを配列して前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を測定するステップと；により測定されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第一のオリゴヌクレオチドプライマーが配列識別番号の７６乃至２２３と２９３乃至３２６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ｂ）の後、ステップ（ｄ）の前に、前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーに特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により前記二本鎖ｃＤＮＡを増幅するステップをさらに備えることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度が：
（ａ）前記生体試料から全ＲＮＡを単離するステップと；
（ｂ）第一ストランドｃＤＮＡを生成して一本鎖ｃＤＮＡを準備するステップと；
（ｃ）前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーに特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により前記一本鎖ｃＤＮＡを増幅して、増幅二本鎖ｃＤＮＡを準備するステップと；
（ｄ）少なくとも一つのシークエンシングアダプターを前記二本鎖ｃＤＮＡに付加するステップと；
（ｅ）前記シークエンシングアダプターに特異的なプライマーを使用して、前記二本鎖ｃＤＮＡを増幅してｃＤＮＡライブラリーを準備するステップと；
（ｆ）前記ｃＤＮＡライブラリーを配列して前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を測定するステップと；を備えることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
オリゴヌクレオチドプライマー対の構成要素の少なくとも１個が配列識別番号の７６乃至２２３と２９３乃至３２６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記疾患が癌であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患が前立腺癌であり、前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーが、配列識別番号の１乃至７５と２３５乃至２８７からなる群から選択されるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列からなることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記生体試料が尿、血液、血清、細胞株、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）、生検組織、前立腺切除組織からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
配列識別番号の７６乃至２３２と２９３乃至３２６からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーであって、長さが３０ヌクレオチド以下であることを特徴とする、オリゴヌクレオチドプライマー。
【請求項２２】
配列識別番号の７６乃至２３２と２９３乃至３２６からなる群から選択される配列からなるオリゴヌクレオチドプライマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は前立腺癌のような疾患の病期や進行を診断し定義する方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
前立腺特異抗原（ＰＳＡ）を前立腺癌の診断用バイオマーカーとして使用することは、１９９４年に米国連邦医薬局に承認された。この承認からおよそ２０年近くＰＳＡ試験は前立腺癌診断、前立腺癌再発観察、治療効果追跡の主要手段となっている。しかし、ＰＳＡ試験は多くの欠点があり、広く使用されているにもかかわらず進行性前立腺癌による死亡率にわずかの変化しかもたらしていない。前立腺癌による死亡率と生活の質への悪影響を減らすために、より正確な一次診断だけでなく初期前立腺癌の拡大の危険性を評価し、治療行為への反応を観察する新たな手段が必要とされている。
【０００３】
今日、ＰＳＡの血清中濃度が１ミリリットル当たり約４ナノグラムであれば前立腺癌の兆候であると考えられていて、１０ナノグラム以上であれば前立腺癌である可能性が極めて高い。前立腺癌検査には、ＰＳＡ血液試験だけが実施されているのではなく、直腸内触診（ＤＲＥ）も実施されている。ＰＳＡ試験やＤＲＥの結果が異常であれば、一般に生体組織検査が実施され、組織の小さな試料が前立腺から採取されて調査される。その結果が前立腺癌の陽性を示す場合、癌の進行期を判定するために、骨のスキャン、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨盤内リンパ節の切開といった試験が更に必要となる。                                                                                
【０００４】
ＰＳＡ試験の検出感度は高い（８０％）が、７５％に近い偽陽性率が問題である。例えば、ＰＳＡ値が１ミリリットル当たり４乃至１０ナノグラムの場合、約４件の生体組織検査中ただ１件だけが真の前立腺癌であると診断される。（Catalona et al. J. Urol. 151(5):1283-90, 1994）ＰＳＡ全量（例えば遊離ＰＳＡと結合ＰＳＡの合計）に対する遊離ＰＳＡの割合を測定する試験は、標準ＰＳＡ試験に比較して有意的に優れた特異性や感度があるわけではない。
【０００５】
ＰＳＡ濃度が高いと、前立腺中の癌細胞の有無を判定する生体組織検査が行われ、前立腺の一部が外科手術で取り除かれる。手術で局部癌を取り除くと前立腺癌による死亡率は改善するが、たとえ手術をしなくても前立腺癌の患者が転移や死亡といった病気の進行を経験しないという事実が隠される。
【０００６】
ＰＳＡ試験に伴う偽陽性率の高さは、不必要な生体組織検査につながる。生体組織検査に伴う身体的不快と心理的苦痛に加え、生体組織検査は癌組織に炎症を起こし癌転移の危険性を高めることが示唆されている。
【０００７】
現在、生体組織検査結果から得られる組織学的悪性度と癌の病期についての従来の予後因子、および診断時の前立腺特異抗原の血中濃度は、癌の進行リスクが高い前立腺癌患者と他の原因で死亡すると思われる患者とを区別するには不十分である。
【０００８】
危険性の高いまたは悪性の前立腺癌が診断されると、それへの対応戦略として、転移前に発見された場合には外科手術による前立腺除去、放射線による前立腺内の癌細胞破壊、一般的にアンドロゲン除去療法と呼ばれる薬剤によるテストステロンの抑制がある。これら多様な治療法は、いくつかの例では治癒をもたらし、また死亡時期を遅らせることがある。しかし、最も悪性の前立腺癌では、外科手術や放射線治療の後で癌が再発し、またアンドロゲン除去療法に抵抗力を持つようになってしばしば死に至る。
【０００９】
悪性の前立腺癌の早期発見は重要であるが、悪性になって進行し平均余命を脅かす癌を持つ患者を進行性の遅い癌患者と区別するには、ＰＳＡ試験のみでは不十分であると専門医は結論づけている。
下記は、ＰＳＡ試験が男性の健康に関する要件を満たさないことの主要な理由である。
【００１０】
ｉ）癌の種類
前立腺癌には少なくとも二種類の基本的な細胞型がある。腺ガンは前立腺内の上皮細胞の癌で前立腺癌のおよそ９５％を占める。神経内分泌癌は前立腺の内分泌腺（ホルモンの）と神経系の細胞に発生し、前立腺癌のおよそ５％を占める。神経内分泌細胞は、特殊な分泌顆粒といった共通の特徴を有し、生体アミンとポリペプチド・ホルモンを生成し、腸、肺、唾液腺、脳下垂体、膵臓、肝臓、乳房、前立腺に最も一般的にみられる。神経内分泌細胞は悪性の腺癌と共に繁殖し、腺癌細胞の成長を刺激する因子を分泌する。神経内分泌細胞癌は発生例が少なく、ＰＳＡを分泌せずまたアンドロゲンに依存せず成長すると考えられている。
【００１１】
ｉｉ）  無症状の男性
前立腺癌のある男性の１５乃至１７％は、癌が成長していてもＰＳＡの血中濃度が増加しないかまたは高くならない。このような患者は無症状と呼ばれ、癌が成長していてもＰＳＡ試験ではよく偽陰性となる。
【００１２】
ｉｉｉ）  ＢＰＨ、前立腺炎、ＰＩＮ
良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、上皮細胞の非悪性成長、前立腺炎は通常、前立腺の感染によって起こる前立腺の病気である。ＢＰＨと前立腺炎は５０歳以上の男性によくみられ、ＰＳＡの濃度が増加することがある。発生率は、４５歳から４９歳までの男性での年間１０００人中３人から、７５歳から７９歳までの男性での年間１０００人中３８人へと増加する。有病率が４５歳から４９歳までの男性で２．７％であるのに対して、８０歳までの男性では少なくとも２４％に増加する。前立腺癌が上皮細胞の無秩序な繁殖に起因する一方、ＢＰＨは一般的に正常な上皮細胞の繁殖に起因し、多くの場合悪性腫瘍には至らない。（Ziada et al. (1999) Urology 53(3 Suppl 3D):1-6)）前立腺の細菌感染は、慢性前立腺炎・慢性骨盤痛症候群の症状を持つ男性の約１０％に過ぎないことが証明されている。慢性細菌性前立腺炎に苦しむ患者から採取培養できる細菌は、主にグラム陰性尿路疾患性細菌である。ブドウ球菌や腸球菌のようなグラム陽性菌やクラミジア、ウレアプラズマ、マイコプラズマのような変種の役割はいまだ議論の余地がある。
【００１３】
前立腺上皮内新生物（ＰＩＮ）のような他の状態は、前立腺癌よりも５乃至１０年早く発生する。この潜在的な前期癌状態を検知し観察する機能は前立腺癌の早期発見と生存率の向上に寄与すると思われるが、現在ＰＩＮについては特定の診断試験がない。
【００１４】
ｉｖ）  前立腺癌の表現型
前立腺癌の表現型は、患者ごとに異なる。詳しくいうと、各々の患者において前立腺癌の細胞形態、成長率、アンドロゲンやアンドロゲン遮断薬への反応性が異なり、転移能が多様である。それぞれの前立腺癌は、局所限定の癌種から侵襲性の癌種、転移までの多数の段階を含む独自の進行を遂げる。前立腺癌の進行は他の癌にもみられるように、癌抑制物質のような細胞調節物質、細胞周期と細胞自然死の調節物質、代謝とストレス反応に関与するタンパク質、転移に関連する分子等の機能が失われることを含む事象によって開始するようである。（Abate-Shen et al. Polypeptides Dev. 14(19):2410-34, 2000; Ciocca et al. Cell Stress Chaperones 10(2):86-103, 2005）
【００１５】
現在、保健機関はＰＳＡ試験による広範な前立腺癌の検査を一般的には勧めていない。検査によって、多数の男性が診断され不必要な治療を受け、医療制度に多大のコストがかかり、失禁やインポテンスなどにより患者の生活の質を危険にさらすことが懸念されている。このような懸念にもかかわらず、前立腺癌は最も蔓延している種類の癌であり、ニュージーランド、オーストリア、北アメリカの男性の癌死亡原因の第２位である。（Jemal et al.  CA Cancer J. Clin., 57(1):43-66, 2007）現実には、国家的規模の検査の経済コスト、不必要な過剰治療を避ける必要、および／またはＰＳＡ濃度が低いか誤差範囲内になる進行性癌の存在などが原因で、生命を脅かす形の前立腺癌を抱えている男性の少なくとも何人かは、癌が過度に進行するまで発見されない。より良い診断試験の必要性は消えていない。
【００１６】
生命に危険のない癌と生命に危険な癌とを区別する診断試験がないことが、局所的な前立腺癌を持つ患者をどの程度積極的に治療するかという重要な臨床治療上の疑問を提起している。悪性癌の治療法の選択肢は侵襲的で、前立腺の完全切除および／または放射線治療を含む。ゴナドトロピン放出ホルモン作動薬（例、ロイプロリド、ゴセレリン）などを用いたアンドロゲン除去療法は、前立腺に入り込むテストステロンの量を低下させるために考案され、転移性の癌患者、ＰＳＡが増加していて手術や放射線治療を選択しない患者、手術や放射線治療後にＰＳＡが増加している患者に使用されている。治療法の選択肢は通常、前立腺癌の病期によって決まる。余命が１０年以下の男性で、生体組織検査のグリソンスコアが低く癌が前立腺の外に拡がっていない患者は治療されないことが多い。グリソンスコアの低い若い患者で癌が前立腺内に止まっている場合は「静観」の段階に入り、癌の進行兆候が確認されるまで治療は中断される。しかし、この予後の指標は個々の患者の臨床転帰を正確に予測しない。
【００１７】
個々の患者にとって重要と思われる候補遺伝子や経路が多数確認されているが、多くの癌型と同様、前立腺癌の進行において遺伝子発現の特定パターンが一貫して確認されることはない。（Tomlins et al., Annu. Rev.
Pathol. 1:243-71, 2006）いくつかの研究グループが、原発性癌の遺伝子発現を正常な前立腺組織と比較することにより前立腺癌の進行を検査しようと試みた。技術の相違、使用した組織試料の完全性および前立腺癌の生物学的多様性により、この研究では数千の候補遺伝子が報告されたが、それらは単に中程度の一致を示しただけであった。また、試料の種類の相違はこの研究における不一致の一因となった。たとえば、ホルマリン固定パラフィン埋包（ＦＦＰＥ）組織は腫瘍と隣接組織の簡易な比較を可能にするが、多くのｃＤＮＡマイクロアレイ研究では瞬間凍結組織を使用した。（Bibikova et al., Genomics 89:666-72,
2007; van't Veer et al., Nature 415:530-6, 2002）さらに、他の研究では潜在的な場所的影響を克服するために、事故の犠牲者から提供された組織を加えた。（Aryee et al. Sci Transl Med 5, 169ra10 2013;
Chandran et al. BMC Cancer, 5:45 doi:10.1186/1471-2407-5-45, 2005）しかし、ヘプシン（HPN;
Rhodes et al., Cancer Res. 62:4427-33, 2002）、アルファメチルアシルＣｏＡラセマーゼ （AMACR; Rubin et al., JAMA
287:1662-70, 2002, Lin et al. Biosensors 2:377-387, 2012）、ゼストホモログ２（Zeste homolog 2）のエンハンサー （EZH2; Varambally et al. Nature,
419:624-9, 2002）、Ｌドーパデカルボキシラーゼ（DDC; Koutalellis et al. BJU
International, 110:E267-E273, 2012）およびアンテリア・グラジエント２（anterior-gradient 2）（AGR2;
Hu et al. Carcinogenesis 33:1178-1186, 2012）を含む少数の遺伝子が明らかになり、それらは実験において前立腺癌の発癌に役割を果たしている可能性があることが証明された。
さらに最近、マイクロアレイとＲＮＡ−ｓｅｑの両方による遺伝子発現プロファイリングから得られたデータを利用した生物情報工学的手法で、前立腺癌中の無調節な遺伝子のリストが作成された。ＲＮＡ−ｓｅｑは次世代配列手法を使用したＲＮＡ転写物の計数法に基づく技術である。しかし、実験手法が異なっているため、それらの研究では一致のみられる遺伝子がほとんどない。（Aryee et al. Sci Transl Med 5, 169ra10, 2013; Chandran et al. BMC Cancer, 5:1471-2407 2005; Pflueger et al. Genome Res. 21:56-67, 2011; Prensner et al. Nature Biotechnology 29:742-749, 2011; Shancheng Ren et al. Cell Research 22:806-821, 2012） 
【００１８】
多数の研究により、遺伝子発現プロフィールで区分できる前立腺癌の種類が明確になった。（Glinsky et al., J. Clin. Invest. 113:913-23, 2004; Hsieh et al., Nature doi:10.1038/nature.10912,  2012; Lapointe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:811-6, 2004; LaTulippe et al., Cancer Res. 62:4499-506, 2002; Markert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. doi:10.1073/pnas.1117029108, 2012; Rhodes et al., Cancer Res. 62:4427-33, 2002; Singh et al., Cancer Cell 1:203-9, 2002; Yu et al., J. Clin. Oncol. 22:2790-9, 2004; Varambally et al., Nature 419:624-9, 2002）さらに、この手法は、赤芽球変形特異（ＥＴＳ）ＤＮＡ転写因子ファミリーの物質と共に膜貫通プロテアーゼであるセリン２(TMPRSS2)を含むアンドロゲンで調節された遺伝子のゲノム融合を識別するのに使用されている。（Tomlins et al., Science 310:644-8, 2005, Tomlins, Nature 448: 595-599, 2007）この融合は前立腺癌に一般的に現れ、より悪性の癌の中に蔓延することが証明されている。（Attard et al., Oncogene 27:253-63, 2008; Barwick et al. Br. J. Cancer 102:570-576, 2010; Demichelis et al., Oncogene 26:4596-9, 2007; Nam et al., Br. J. Cancer 97:1690-5, 2007）ＴＭＰＲＳＳ２−ＥＲＧ融合の転写調節は、前立腺癌のバイオマーカーとＴＧＦ−ｂｅｔａ信号伝達に関連することが証明されている。（Brase et al., BMC Cancer 11:507 doi: 10.1186/1471, 2011）特定の遺伝子融合に加えて、コピー数の変化を含む多数の突然変異が前立腺癌腫瘍に関連している。（Berger et al., Nature 470:214-220, 2011; Demichellis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. doi:10.1073/pnas.117405109, 2012; Kumar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 108:17087-17092, 2011）腫瘍内異質性も発見されていて、これは腫瘍の異質性度を過少評価させる結果となることが示唆されている。（Gerlinger et al., New Eng, J. Med. 66:883-892, 2012）特に、前立腺腫瘍の６乃至１５％に見つかるＳＰＯＰの基質結合裂け目を含む突然変異には、ＥＴＳファミリー遺伝子の再配列が欠けていて、それはＳＰＯＰの突然変異を伴う腫瘍が前立腺腫瘍の新種を定義することを示唆している。また、ＳＰＯＰの突然変異を伴う腫瘍では転移性腫瘍ではなく原発腫瘍にＰＴＥＮの欠失がない。（Barbieri et al., Nature Gen. 44:685-689, 2012）
【００１９】
遺伝子発現は、ＲＮＡポリメラーゼによるメッセンジャーＲＮＡへのＤＮＡの転写である。上方調節は、ある遺伝子について、ある試料（例えば癌細胞からの）中に他の試料（通常、対照試料からの健全な組織）と比較して高い発現（ＲＮＡレベルが高い）が見られることをいう。下方調節は、ある遺伝子について、ある試料（例えば癌細胞からの）中に他の試料（通常、対照試料からの健全な組織）と比較して低い発現（ＲＮＡレベルが低い）が見られることをいう。
【００２０】
ＲＮＡの量を測定するのに使用する一般的な技術はＲＴ−ｑＰＣＲであり、逆転写（ＲＴ）に続いてリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）が行われる。逆転写で先ずＲＮＡからＤＮＡ鋳型が作られる。この一本鎖の鋳型はｃＤＮＡと呼ばれる。次にｃＤＮＡ鋳型は定量段階で増幅され、その時に標識化されたハイブリダイゼーションプローブまたは挿入色素が放出する蛍光がＤＮＡ増幅過程の進行に従って変化する。定量ＰＣＲでは、元のＲＮＡのコピーの増減が測定され、類似の健康な細胞と比較した際の癌細胞中の遺伝子発現の変化を明らかにするために使用されている。（Nolan T, et al. Nat Protoc 1:1559-1582, 2006; Paik S. The Oncologist 12:631-635, 2007; Costa C, et al. Transl Lung Cancer Research 2:87-91, 2013）
【００２１】
次世代配列技術で可能になった大量の同時配列は、組織試料中のＲＮＡ転写の計数に取り組むための別の手法であり、ＲＮＡ−ｓｅｑはこれを利用した手法である。この手法は現在、異種の生理的条件下での遺伝子発現レベルの相違や病気の進行中や進行過程全体に起こる変化を含むトランスクリプトーム解析に使用される最強の分析手段である。特に、ＲＮＡ−ｓｅｑは遺伝子発現変化、選択的スプライシング、対立遺伝子特異遺伝子発現、および遺伝子融合、新規の転写、ＲＮＡの編集を含むキメラ転写のような現象の研究に使用できる。しかし、現在のところ、診断分野での信頼性のある用途として、多種特異的ＲＮＡの正確で再現性のある定量にＲＮＡ−ｓｅｑの使用を可能にする方法はない。
複数のバイオマーカーを検知することがなぜ重要か。
以下の理由により、診断試験や予後診断試験における複数のバイオマーカーの使用は、単一のバイオマーカーの使用よりも好ましい。
個々の腫瘍は、そのゲノム、トランスクリプトーム、プロテオームの様々な性状のすべてに関して異質である。
通常、多数の腫瘍病巣が組織に見られる。
単一のバイオマーカーでは、異なる致死性、攻撃性、特異性を有する腫瘍の識別が可能にならない。
単一のバイオマーカーは、治療計画やその他の環境影響に影響を受ける。
単一のバイオマーカーは、病気の進行の一部としての場所的効果に影響されたり、腫瘍自体による影響を受ける。
単一のバイオマーカーは、特定の人種には効果が少ない。
【００２２】
なぜＲＴ−ｑＰＣＲは複数のバイオマーカーの正確な検知ができないか。
一回の測定で一つの遺伝子について発現の相違を測定するために、ＲＴ−ｑＰＣＲは時間のかかる技術であり、複数のバイオマーカーの比較や評価を一回でできない。
いくつもの実験に渡って遺伝子発現レベルを比較するのが困難なことが多く、また複雑な正規化手法を必要とするため、診断に導入するのに適さない。
【００２３】
ＲＴ−ｑＰＣＲは、ＮＧＳによる方法に比べて蛍光検知範囲が限られているため、下方調節された遺伝子の正確な検知ができない。このため、遺伝子の量が少ないおよび／または多い場合に問題になる。この転写は、それに関する差次的発現の測定が難しいが、診断および／または予後診断上の価値が高いもののひとつである。ＲＴ−ｑＰＣＲでは多重化ができないので、ＲＮＡバイオマーカー一点当たりのコストが増加し、それによって診断試験のコストが増加する。
このように、当該分野には前立腺癌の正確な試験方法への要求がある。
【発明の概要】
【００２４】
本発明は、被検者の抱える疾患の存在と進行状態を測定する方法を提供する。この方法では、修正を加えたＲＮＡ−ｓｅｑ技術を、健康な対照試料と比較して被検者の疾患に特異的な一つ以上のＲＮＡバイオマーカー（遺伝子転写バイオマーカーとも呼ばれる）の相対頻度を測定するのに使用する。本明細書に開示した方法を使用してＲＮＡバイオマーカーの特定の組合せの発現レベルの相対頻度を測定する手法は、疾患の種類および／または病期を判定し、疾患の進行および／または治療法の効果を観察するのにも使用できる。本明細書に開示した方法を使用して診断、観察できる疾患には、前立腺癌や乳癌が含まれそれらに限定されない。
【００２５】
本明細書に開示した方法は、多重化として知られるプロセスを使用して、同時に複数のＲＮＡバイオマーカーの頻度測定を可能にする。多重化は複数のバイオマーカーに特異的な複数のオリゴヌクレオチドが一緒に増幅されて単位複製配列の集団を作る工程である。多重化の利点は、一本あるいは少数本の試験管中で同時に複数のＲＮＡバイオマーカーの試験が可能になることである。それはすなわち、
コスト削減
必要な組織量の削減
直接手に触れる操作が少ないため再現性レベルが向上する
準備時間の削減
処理量の増加、である。
【００２６】
具体的には、開示された方法は、前立腺癌などの疾患の存在および／または進行に関連することが知られているＲＮＡバイオマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドを、ＲＮＡ−ｓｅｑ手順の特定の段階でＲＮＡバイオマーカーについて選択的にｃＤＮＡを特定するために使用し、その発現の相対頻度を前立腺癌の試料提供者と健康な試料提供者の間で比較し、また疾患段階の違いによる発現の違いを定義する。
【００２７】
従来のＲＮＡ−ｓｅｑ手法では、それぞれの転写の実際の発現頻度がずべてのゲノムについて測定されている。この頻度は、それぞれの転写についてのｃＤＮＡ生成効率とそれに続くＰＣＲ増幅段階の相違によって偏りが生じる。発明者らはここに開示した方法が、ＲＮＡバイオマーカー発現の実際の頻度ではなく相対頻度を測定することで、この偏りを回避できると確信する。この偏りは、それが比較に関して中立である限りは無関係である。前立腺癌に特異的なＲＮＡバイオマーカーの発現頻度の相対的変化は、前立腺癌の検知、前立腺癌と良性前立腺肥大（ＢＰＨ）や前立腺炎との識別、前立腺癌が低レベルのＰＳＡを生産している無症状の男性の前立腺癌の検知などを、高い感度と特異度で可能にする。ある実施態様では、開示された方法でＲＮＡバイオマーカーの発現頻度の変化を測定し、致命的な病気に進行する可能性の低い不活性の癌と、生命を脅かし治療を必要とする前立腺癌のより悪性の形態とを識別する。
【００２８】
ある態様では、本開示により被検者の疾患の存在を検知する方法を提供し、その方法は、（ａ）ＲＮＡ配列法を使用して、被検者から得られた生体試料中の少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度の測定と、（ｂ）その生体試料中の少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度と予め定められた閾値との比較からなり、その方法においてはその生体試料中の少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度の増減が被検者の疾患の存在を示す。関連する態様では、開示された方法は、（ａ）生体試料中の複数のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度の測定と、（ｂ）その生体試料中の複数のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度と予め定められた閾値との比較からなり、その方法においてはその生体試料中の少なくとも二つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度の増減が被検者の疾患の存在を示す。
【００２９】
ある実施態様では、少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度は以下の手順により測定される。（ａ）生体試料から全ＲＮＡを単離し、（ｂ）少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーに特異的な第一のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して全ＲＮＡから第一ストランドｃＤＮＡを生成し、（ｃ）第二ストランドｃＤＮＡを合成して二本鎖ｃＤＮＡを準備し（ｄｓＤＮＡ）、（ｄ）少なくとも一つのシークエンシングアダプターをその二本鎖ｃＤＮＡに付加し、（ｅ）二本鎖ｃＤＮＡを増幅して二本鎖ｃＤＮＡからｃＤＮＡライブラリーを準備し、（ｆ）ｃＤＮＡライブラリーを配列して少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を測定する。この方法は以下の手順を任意に含む。（ｉ）ステップ（ｂ）の前に全ＲＮＡからｒＲＮＡを分離し、（ｉｉ）ステップ（ｃ）の後、ステップ（ｄ）の前に二本鎖ｃＤＮＡの末端を修復して、二本鎖ｃＤＮＡの３’末端にアデニン（Ａ）塩基のオーバーハングを付加し、および／または（ｉｉｉ）ステップ（ｅ）の後、ステップ（ｆ）の前にｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡを精製し任意でサイズを選択する。
【００３０】
関連する実施態様では、この方法はさらにステップ（ｂ）の後、ステップ（ｄ）の前に少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの一対を使用するか、あるいは標準的な方法によって、ポリメラーゼの連鎖反応（ＰＣＲ）を行ってｃＤＮＡを合成する任意の工程を含む。ある実施態様では、一対のプライマーの片方のオリゴヌクレオチドが、第一ストランドｃＤＮＡの生成に使用したオリゴヌクレオチドプライマーと同じである。
【００３１】
さらに別の実施態様では、少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度は以下の手順で測定される。（ａ）生体試料から全ＲＮＡを単離し、（ｂ）全ＲＮＡから第一ストランドｃＤＮＡを生成し、（ｃ）少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーに特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応によりｃＤＮＡを増幅して、増幅二本鎖ｃＤＮＡを準備し、（ｄ）少なくとも一つのシークエンシングアダプターをその増幅二本鎖ｃＤＮＡに付加し、（ｅ）少なくとも一つのシークエンシングアダプターに特異的なプライマーを使用して、増幅二本鎖ｃＤＮＡをさらに増幅してｃＤＮＡライブラリーを準備し、（ｆ）ｃＤＮＡライブラリーを配列して少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を測定する。この方法は以下の手順を任意に含む。（ｉ）ステップ（ｂ）の前に全ＲＮＡからｒＲＮＡを分離し、（ｉｉ）ステップ（ｃ）の後、ステップ（ｄ）の前に二本鎖ｃＤＮＡの末端を修復して、二本鎖ｃＤＮＡの３’末端にアデニン（Ａ）塩基のオーバーハングを付加し、および／または（ｉｉｉ）ステップ（ｅ）の後、ステップ（ｆ）の前にｃＤＮＡライブラリー中のｃＤＮＡを精製し任意でサイズを選択する。
【００３２】
ある実施態様では、開示された方法は、表１、２、３に記載の物質からなる群から選ばれるポリヌクレオチドバイオマーカーに対応する複数のＲＮＡバイオマーカーの発現レベルの測定を含む。本明細書に開示された方法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、配列識別番号の７６乃至２３２と２９３乃至３２６で示されるものを含みそれらに限定されない。ある実施態様では、本明細書に開示された方法は、配列識別番号の１乃至７５と２３５乃至２８７のＤＮＡまたはその変異形と対応するＲＮＡ配列からなるＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度をここに定義したように検知する手順を含む。当業者には、開示されたＲＮＡバイオマーカーのＲＮＡ配列が、チミン（Ｔ）残基がウラシル（Ｕ）残基で置換されているほかは、ここに開示されたｃＤＮＡの配列と同一であることが理解できるであろう。
【００３３】
さらに別の態様では、本開示は配列識別番号の７６乃至２３２と２３９乃至３２６の配列またはその変異形からなる群から選ばれる配列からなるオリゴヌクレオチドプライマーを提供する。ある実施態様では、このオリゴヌクレオチドプライマーは３０ヌクレオチド以下の長さを持つ。開示されたオリゴヌクレオチドプライマーは、リアルタイム定量ＰＣＲや小規模オリゴヌクレオチドマイクロアレイを含む当業者に知られた方法を使用して、前立腺癌の存在の診断および／または前立腺癌の進行の観察に効果的に使用される。
【００３４】
開示された方法で効果的に使用される生体試料には尿、血液、血清、細胞株、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）、生検組織、前立腺切除組織が含まれ、それらに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は開示された方法で使用される、従来ＲＮＡ−ｓｅｑ技術を修正した４種の技術である。    定義 
【００３６】
本明細書で使用される用語である「バイオマーカー」は、定量的または定性的に生物学的変化と関連する分子をいう。バイオマーカーの例にはポリペプチド、タンパク質、ポリペプチドやタンパク質の断片、遺伝子産物やＲＮＡまたはＲＮＡの断片などのポリヌクレオチド、その他身体の代謝産物が含まれる。
【００３７】
本明細書で使用される用語である「ＲＮＡバイオマーカー」または「遺伝子転写バイオマーカー」は、遺伝子の転写で生成されるＲＮＡ分子で、定量的または定性的に生物学的変化と関連するものをいう。
【００３８】
本明細書で使用される用語である「ＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列」は、すべてのチミン（Ｔ）残基がウラシル（Ｕ）残基で置換されているほかはＤＮＡ配列と同一である配列をいう。
【００３９】
本明細書で使用される用語である「バイオマーカーに特異的なオリゴヌクレオチド」は、ポリヌクレオチドバイオマーカーまたはポリペプチドバイオマーカーをコードするポリヌクレオチドと特異的にハイブリッド化し、関連しないポリヌクレオチドとは実質的にハイブリッド化しないオリゴヌクレオチドをいう。ある実施態様では、このオリゴヌクレオチドは遺伝子、遺伝子断片あるいは遺伝子転写物とハイブリッド化する。またある実施態様では、このオリゴヌクレオチドは当該のポリヌクレオチドと厳しい条件下でハイブリッド化する。その条件には以下のようなものがあるがそれらに限定されない。６Ｘ  ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液での予備洗浄、６５℃、６Ｘ  ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液中での一晩のハイブリッド化、ついで６５℃、１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液での３０分ずつ二度の洗浄、さらに６５℃、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液での３０分ずつ二度の洗浄。
【００４０】
本明細書で使用される用語の「オリゴヌクレオチドプライマー対」は、同種のＲＮＡバイオマーカー中のイントロンを橋渡しする一対のオリゴヌクレオチドプライマーをいう。
【００４１】
本明細書で使用される用語である「ポリヌクレオチド」は一本鎖または二本鎖のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基をいい、ＤＮＡとそれに対応するｈｎＲＮＡ分子、ｍＲＮＡ分子、非コードＲＮＡ分子を含むＲＮＡ分子、分子、センス鎖とアンチセンス鎖、さらにｃＤＮＡ，ゲノムＤＮＡ、組み換えＤＮＡ、そして全体的または部分的に合成されたポリヌクレオチドが含まれる。ｈｎＲＮＡ分子はイントロンを含み一般的に一対一の形でＤＮＡ分子と対応している。ｍＲＮＡ分子は、ｈｎＲＮＡ分子とＤＮＡ分子とに対応し、そこからイントロンが存在している。非コードＲＮＡはタンパク質に翻訳されない機能ＲＮＡ分子で、環境によって非コードＲＮＡはコードできて、またその逆もある。
【００４２】
本明細書で使用される用語である「被検者」は、哺乳類、好ましくは人類であり、前立腺癌のような疾患を有するかまたは有さなくてもよい。通常は、「被検者」と「患者」という用語は、人間の被検者に言及する際に相互に代替して使用される。
本明細書で使用される用語の「健康な被検者」は検査対象の疾患に罹患していない被検者のことをいう。
【００４３】
本明細書で前立腺癌との関連で使用される用語である「健康な男性」は、血清中に検出できないレベルのＰＳＡを有するか、１ミリリットル当たり１ナノグラムまでの増加傾向にないＰＳＡレベルを有し、直腸内触診では前立腺異常の証拠がなく、前立腺疾患の臨床症状がない男性をいう。
【００４４】
本明細書で前立腺癌との関連で使用される用語である「無症状の男性」は、前立腺癌を示すと考えられる１ミリリットル当たり４ナノグラム超の血清中ＰＳＡレベルを有し、直腸内触診では結論が出ず、疾患の臨床症状がない男性をいう。
【００４５】
本明細書で使用される用語である「良性前立腺肥大（ＢＰＨ）」は、前立腺内で上皮細胞が非悪性増殖を起こす前立腺疾患をいい、「前立腺炎」は別の前立腺疾患で通常、前立腺の細菌感染によるものをいう。ＢＰＨも前立腺炎もＰＳＡレベルの増加をもたらす。
本明細書で使用される用語である「転移性前立腺癌」はリンパ節や骨のように前立腺の外の離れた部位に拡がる前立腺癌をいう。
【００４６】
本明細書で使用される用語である「生検組織」は、組織（例えば前立腺組織）の試料で、癌組織を含んでいるかどうかを判定する目的で被検者から採取されるものである。生検組織は癌の存在または不在を確認するために調べられる（例えば顕微鏡法で）。
本明細書で使用される用語である「前立腺切除」は、前立腺の外科的除去をいう。
【００４７】
本明細書で使用される用語である「試料」は、最も広い意味で使われていて、あらゆる採取源から得られた試料、検査物、培養物をいう。生体試料には、血液生成物（血漿、血清、全血など）、尿、唾液等も含まれる。また生体試料には生検試料や病理組織のような組織試料も含まれ、それらは前もって（例えばホルマリン、瞬間凍結、細胞学的処理などで）固定される。
【００４８】
本明細書で使用される用語であるＲＮＡバイオマーカーの「予め定められた発現閾値」は、前立腺癌に罹患していない男性など正常または健康な被検者から得られた対応する対照試料である正常な試料や試料群中での、そのＲＮＡバイオマーカーの発現レベルをいう。
【００４９】
本明細書で使用される用語であるＲＮＡバイオマーカーの試験用生体試料における「発現頻度の変化」は、当該ＲＮＡバイオマーカーの対照試料中での発現頻度が予め定められた発現閾値よりも高いか低いことをいい、高い（増加した）発現レベルと低い（減少した）発現レベルのいずれをも包含する。
【００５０】
本明細書で使用される用語である「相対発現頻度」は、ＲＮＡバイオマーカーの試験用生体試料中での発現頻度で、前立腺癌に罹患していない男性など正常または健康な被検者（例えば、前立腺癌に罹患していない男性など）から得られた対応する対照試料である正常な試料や試料群中でのそのＲＮＡバイオマーカーの発現頻度と比較した発現頻度をいう。好ましい実施態様では、ＲＮＡバイオマーカーの発現頻度は、内部参照転写の頻度に正規化されている。
【００５１】
本明細書で使用される用語である、前立腺癌などの疾患の「予後診断」や「予後診断を行う」は、被検者の将来の健康（例えば転移のリスク）について前立腺癌の存在が及ぼす悪影響（例えば診断方法で判定されるもの）について情報を提供することをいう。
発明の詳細な説明 
【００５２】
上記に概要を述べたように、本開示は、被検者から得た生体試料中での特定のＲＮＡバイオマーカーの発現頻度を測定することによって、被検者の前立腺癌などの疾患の有無を検知し、疾患の病期および／または疾患の表現型を判定し、疾患の進行を観察し、および／または疾患の治療を観察する方法を提供する。本明細書に開示した方法では、標準ＲＮＡ−ｓｅｑ手順に修正を加えた手法を一つ以上使用する。ＲＮＡ−ｓｅｑは比較的新しい技術で、トランスクリプトーム全体を大量配列するのに使用されていて、マイクロアレイなどトランスクリプトームの配列に使用される他の方法よりも大きな利点があり、それには低レベルの背景ノイズ、低レベルの発現を検知する性能、新規の突然変異や転写を検知する性能、比較的少量のＲＮＡを使用する性能が含まれる。（ＲＮＡ−ｓｅｑの参考としては、Wang et al., Nat. Rev. Genet. (2009) 10:57-63を参照のこと）
【００５３】
開示された方法では、一つ以上のＲＮＡバイオマーカーに特異性をもつオリゴヌクレオチドをＲＮＡ−ｓｅｑ技術と組み合わせて使用して直接配列を行い、それによってＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を判定している。このような方法は、ポリヌクレオチドバイオマーカーの発現レベル判定に一般的に使用される他の技術よりも大きな利点があり、それにはよりすぐれた精度と再現性と速度、多数の試料中の多数のＲＮＡバイオマーカーの発現頻度を比較的低コストで容易に判定する性能、新規の突然変異や転写を識別する性能が含まれる。
特定の実施態様では、この方法は表１，２、３に示す、一つ以上のバイオマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドから選択されるものを使用する。
【００５４】
ある実施態様では、開示された方法が、被検者から得た生体試料の配列識別番号７６乃至２２３および２９３乃至３２６からなる群から選択される少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個あるいはそれ以上の数のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度レベルを測定し、その相対発現頻度レベルを予め定められた閾値と比較する過程からなる。
【００５５】
開示された方法は、初期の前立腺癌を持つ被検者、前立腺を手術で除去（前立腺の完全切除）した被検者、前立腺癌を放射線治療した被検者、アンドロゲン除去療法中または完了した被検者、ホルモン除去療法に耐性のできた被検者、および／または化学療法中または化学療法を経験した被検者における前立腺癌の存在を診断するのに使用できる。
【００５６】
ある実施態様では、本明細書で開示したＲＮＡバイオマーカーが、前立腺癌を持つ被検者において、正常で健康な人の平均値の少なくとも二倍以上高いか低いレベルで、あるいは平均値よりも標準偏差２個分高くまたは低く発現し、または発現頻度の予め定められた閾値よりも二倍高いか低いレベルで、あるいは標準偏差２個分高くまたは低く発現した。
【００５７】
本明細書に開示したすべてのバイオマーカーとオリゴヌクレオチドは、この用語が当該技術分野で通例使用されている意味のとおりに、単離精製されている。バイオマーカーとオリゴヌクレオチドの純度は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９９％以上である。
【００５８】
ある実施態様において、開示された方法に使用されるオリゴヌクレオチドは、本明細書に開示したポリヌクレオチドバイオマーカーの変異形と特異的にハイブリッド化する。本明細書で使用する用語「変異形」は、特定されている配列と異なるヌクレオチドやアミノ酸の配列を含み、その配列では一つ以上のヌクレオチドやアミノ酸残基が取り除かれたり、置換されたり、付加されたりしている。変異形は自然的に発生する対立遺伝子の変異形や非自然的に発生する変異形であってもよい。変異形の配列（ポリヌクレオチドやポリペプチド）は好ましくは本明細書中に開示した配列に対し、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の一致を示す。一致のパーセンテージは、下記のように二個の配列を並べて比較し、並んだ部分の同一の残基の数を測定し、その個数を本発明の（問題の）配列中の残基の総数で除して、その結果を１００倍して求める。
【００５９】
列挙した配列の一致を示すことに加えて、好ましくは開示されたバイオマーカーの変異形自体が前立腺癌を持つ被検者において、正常で健康な人での発現レベルよりも高いまたは低い頻度で発現される。
【００６０】
ポリペプチドとポリヌクレオチドの配列 は並べられて、特定領域における同一のアミノ酸またはヌクレオチドの他のポリペプチドやポリヌクレオチドの配列に対するパーセンテージが、公知のコンピュータアルゴリズムを使用して測定される。ポリペプチドやポリヌクレオチド配列の同一部分のパーセンテージは、ポリペプチドとポリヌクレオチドの配列を、それぞれ初期設定パラメータに設定したＢＬＡＳＴＩＮやＢＬＡＳＴＰのような適当なアルゴリズムを使用して並べて、並んだ部分にある同一の核酸やアミノ酸の数を確認し、同一の核酸やアミノ酸の数を本発明のポリヌクレオチドやポリペプチドの核酸やアミノ酸の総数で除して、１００を掛けて決められる。
【００６１】
ポリヌクレオチド配列を並べて同一性を確認するためのアルゴリズムの二つの例は、ＢＬＡＳＩＮとＦＡＳＴＡのアルゴリズムである。ポリペプチド配列の配置と一致は、ＢＬＡＳＴＰアルゴリズムを使用して調べられる。ＢＬＡＳＴＸとＦＡＳＴＸのアルゴリズムはポリペプチド配列に対してすべての読み枠で翻訳された問題のヌクレオチド配列を比較する。ＦＡＳＴＡとＦＡＳＴＸのアルゴリズムはPearson とLipmanの報告（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448, 1988）およびPearsonの報告（Methods in Enzymol. 183:63-98, 1990）に記載されている。ＦＡＳＴＡのソフトウェアパッケージはバージニア州２２９０６−９０２５、シャーロッツビルのバージニア大学から入手できる。ＦＡＳＴＡのアルゴリズムは説明書に記載されアルゴリズムと共に配布される初期パラメータに設定され、ポリヌクレオチド変異形の測定に使用できる。ＦＡＳＴＡとＦＡＳＴＸのバージョン２．０ｘのリードミー・ファイル（readme files）はアルゴリズムと共に配布され、アルゴリズムの使用法と初期設定のパラメータを説明している。
【００６２】
ＢＬＡＳＴＩＮのソフトウェアはＮＣＢＩの匿名ＦＴＰサーバから入手できて、また、メリーランド州２０８９４、ベセスダ、３８Ａビルディング、８Ｎ８０５号室、国立医学図書館内、全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）からも入手できる。ＢＬＡＳＴＩＮのアルゴリズムのバージョン２．０．６（１９９８年９月１０日）とバージョン２．０．１１（２０００年１月２０日）は説明書に記載されアルゴリズムと共に配布される初期設定パラメータに設定されていて、本発明の変異形測定に好適に使用される。ＢＬＡＳＴＩＮを含むＢＬＡＳＴファミリーのアルゴリズムの用途はＮＣＢＩのウェブサイトに記載され、またAltschulらの出版物である、「Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs,」（Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997）にも記載されている。
【００６３】
一般的に変異形の配列は、控えめの置換、削除、変更の点において特定された配列と異なっている。アミノ酸配列に関して本明細書で使用されている「控えめの置換」とは、一個のアミノ酸が類似の性質を持つアミノ酸で置換されていて、そのためペプチド化学を知る当業者がポリペプチドの二次構造と水治療的性質は本質的に変化していないと予想する程度のものである。一般的に、下記のアミノ酸の群が控えめな置換を代表するものである。（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ、（３）ｖａｌ、  ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ、（５）  ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。変異形はまた、ポリペプチドの抗原性、二次構造、水治療的性質にごくわずかな影響を与えるアミノ酸の削除や追加を含む他の改変も上記の改変に加えて、あるいはその代わりに含む。例えば、ポリペプチドは、たんぱく質のＮ末端のシグナル（またはリーダー）配列に接合されて、その配列は翻訳時または翻訳後にタンパク質の転移を指示する。またポリペプチドはリンカーやその他の配列に接合されて、そのポリペプチドの合成、精製、特定（例えばｐｏｌｙ−Ｈｉｓs）が容易になったり、固定物への付着が促進されたりする。例えば、ポリペプチドは免疫グロブリンのＦｃ領域に接合される。
【００６４】
他の実施態様において、変異形のポリヌクレオチドは、暴露されたポリヌクレオチド厳しい条件下でとハイブリッド化するポリヌクレオチド配列によってコードされる。相補性を決める厳しいハイブリッド化条件には、１モル未満、より一般的には約５００ミリモル未満、好ましくは約２００ミリモル未満の塩分がある。ハイブリッド化温度は５℃まで低くできるが、一般的には約２２℃超で、好ましくは約３０℃超であり、さらに好ましくは約３７℃超である。ＤＮＡ断片は長いほど、特異的なハイブリッド化のために高いハイブリッド化温度を必要とする。ハイブリッド化の厳しさは、プローブの組成、有機溶媒の存在、塩基の不一致度といった他の要因の影響を受けるため、パラメータの組合せは他の単独要因の絶対尺度よりも重要である。「厳しい条件」の例は、６Ｘ  ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液での予備洗浄、６５℃、６Ｘ  ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳ溶液での一晩のハイブリッド化、次いで６５℃、１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液での３０分間ずつ二度の洗浄、６５℃、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液での３０分間ずつ二度の洗浄である。
【００６５】
生体試料中での一つ以上のＲＮＡバイオマーカーの発現レベルは、例えばそのＲＮＡバイオマーカーに特異的な一つ以上のオリゴヌクレオチドを使用して測定できる。ある方法では、本明細書に開示した一つ以上のＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを、直腸からの触診または自転車か運動用自転車で前立腺マッサージをした後、最初に被検者の尿を採取して測定している。ＲＮＡは尿試料から単離され、ＲＮＡバイオマーカーの発現頻度が、下記のように修正ＲＮＡ−ｓｅｑ技術とＲＮＡバイオマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドとの組み合わせを使用して測定される。
【００６６】
他の実施態様において、本明細書に開示された前立腺癌バイオマーカーと対応するｍＲＮＡのレベルは、サザンハイブリッド化、in situハイブリッド形成法、あるいは定量リアルタイムＰＣＲ増幅法（ｑＲＴ−ＰＣＲ）で作成されたオリゴヌクレオチドを使用して検知できる。この試験で効果的に使用される固体相の基質または担体は、当業者にはよく知られていて、例えばニトロセルロース、ナイロン、ポリフッ化ビニリデン、ポリエステル、セルロースアセテート、混合セルロースエステル、ポリカーボネートなどで作られた微多孔膜を含み、それらに限定されない。適した微多孔膜としては、例えば米国公開特許公報ＵＳ２０１０／００９３５５７Ａ１に記載されているものがある。この試験の実施方法は当業者には公知である。
【００６７】
ここに記載の方法で使用されるオリゴヌクレオチドは一般的に合成アンチセンス分子やｃＤＮＡの断片のような一本鎖の分子で、長さは例えば６乃至６０ｎｔ、１５乃至３０ｎｔあるいは２０乃至２５ｎｔである。
【００６８】
ここに開示した、ポリヌクレオチドバイオマーカーまたはＲＮＡバイオマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドは、当業者によく知られている技術を使用して作成される。例えば、オリゴヌクレオチドは、特定の長さを持ち当該のポリヌクレオチドに特有で、ハイブリッド化に適した範囲のＧＣを含有し、ハイブリッド化を妨げる予測的二次構造を持たないオリゴヌクレオチドを特定する公知のコンピュータアルゴリズムを使用して設計できる。オリゴヌクレオチドは、当業者によく知られている方法で合成できる。具体的な実施態様では、開示された方法において使用されるオリゴヌクレオチドと組成物は、配列識別番号７６乃至２２３と２９３乃至３２６からなる群から選択される。
【００６９】
ＲＮＡ発現レベルの改変を含む試験では、適切な標準化を確保することが重要である。従って、本明細書に開示の修正ＲＮＡ−ｓｅｑ技術、定量リアルタイムＰＣＲ、あるいは小規模オリゴヌクレオチドマイクロアレイのような試験では、少なくとも一つの発現基準が使用される。これらの方法に使用される発現基準は下記の表３に記載のものを含み、それらに限定されない。
本開示は、さらに本明細書で開示された複数の前立腺癌ＲＮＡバイオマーカーに特異的な複数のオリゴヌクレオチドを使用した方法を提供する。
以下の実施例は、本開示の説明を意図するものであり、本開示を限定するものではない。             
実施例
物質と方法 
ＲＮＡの抽出
a)         細胞株
【００７０】
ＲＮＡはＬＮＣａＰとＡ５４９の細胞系株から単離され、細胞培養から採取され、ＺＹＭＯ  Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌＴＭキット（Ngaio Diagnostics Ltd.）を使用して製品説明書に従ってＴｒｉｚｏｌ中に保存された。ＲＮＡの品質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｓｅｒとＡｇｉｌｅｎｔ  ＲＮＡ  ６０００ナノ試験手順を使用して評価された。ＬＮＣａＰとＡ５４９はＲＩＮ値がそれぞれ９．５と９．８であった。また、ＲＮＡはＮａｎｏＤｒｏｐ２０００分光光度計（Thermo Scientific）で検査され、その濃度はＱｕｉｂｉｔ（登録商標）２．０蛍光光度計（Life Technologies）で確認された。
b)      ＦＦＰＥ前立腺切除組織
【００７１】
被検者から得た組織学的な区分が臨床組織病理学者によって検査され、腫瘍と組織学的にそれに隣接する領域が「正常である」とみなされることが確認された。これらの切片は次に切り取られてパラフィン中に再置された。１０ミクロンの厚さに新たに切り分けられたおよそ１５個の切片は、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  ＦＦＰＥキット（カタログ番号７４４０４、７３５０４）を使って処理された。パラフィン除去工程での抽出作業すべてに使用された方法は、カタログ番号７４４０４のキット独自の方法で、残りの手順は製品説明書に従って行われた。ＲＮＡはＮａｎｏＤｒｏｐで検査され、その濃度はＱｕｉｂｉｔ（登録商標）２．０蛍光光度計（Life Technologies）で確認された。
c)      尿
【００７２】
１０００グラム、４℃、５分間の遠心分離で細胞物質を沈降させることにより、提供者から得たそれぞれの尿からＲＮＡを単離した。尿の上澄みを別容器に移し、細胞ペレットを、２．５％のウシ胎仔血清（Invitrogen）を含む１．８ミリリットルの氷冷１Ｘ  ＰＢＳ中で再懸濁した。細胞懸濁物を２ミリリットル容量のエッペンドルフチューブに移し、４００グラム、４℃、５分間の遠心分離で細胞物質を集めた。上澄みを取り除き（およそ５０マイクロリットルを残し）、細胞ペレットを２．５％のウシ胎仔血清（Invitrogen）を含む１．８ミリリットルの氷冷１Ｘ  ＰＢＳ中で再懸濁した。４００グラム、４℃、５分間の遠心分離で細胞を再び集めた。上澄みを取り除き（およそ５０マイクロリットルを残し）、細胞ペレットを２．５％のウシ胎仔血清（Invitrogen）を含む１．８ミリリットルの氷冷１Ｘ  ＰＢＳ中で再懸濁した。４００グラム、４℃、５分間の遠心分離で細胞を集め、１００マイクロリットル以外の上澄みをすべて取り除いた。残っている１００マイクロリットルの上澄みに細胞を再懸濁させ、顕微分析用に８マイクロリットル採取した。３００マイクロリットルのＴｒｉｚｏｌ  ＬＳ（Invitrogen）と５マイクロリットルのＥ．ｃｏｌｉ  ５Ｓ  ｒＲＮＡをすべて加え、細胞懸濁物を−８０℃で保存した。ＺＹＭＯに記載されているようにしてＤｉｒｅｃｔ−ｚｏｌＴＭキットを使用するか、Invitrogenの説明する方法で、ＲＮＡを抽出し、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙＴＭスピンカラムを使用してさらに精製した。ＲＮＡは使用までの間−８０℃で保存した。
ｃＤＮＡ調製物
【００７３】
ｃＤＮＡは、細胞株、生検組織または尿抽出物から得た約１乃至１．５マイクロリットルの全ＲＮＡから、ｃＤＮＡの第一ストランド作成用ランダムプライマーとＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ  ｃＤＮＡ合成キット（Life Technologies）またはＲＮＡバイオマーカー特異的プライマーを使用して作成した。作成したｃＤＮＡ調製物は、使用までの間−８０℃で保存し、ｑＲＴ−ＰＣＲの前に滅菌水で５倍に薄めた。
ｑＲＴ−ＰＣＲ法
【００７４】
ＲＮＡバイオマーカー特異プライマーは、細胞株、生検組織あるいは尿に由来するｃＤＮＡについて、増幅の特異性と効率を測定するために、Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０を使用し標準手順に従ってＳＹＢＲグリーン使用リアルタイムＰＣＲ定量を行う目的に使用された。各試験試料中のマーカー遺伝子の相対量は、サイクル閾値（Ｃｔ値、ＳＹＢＲグリーンの蛍光信号が、増幅曲線の急上昇増殖期内において、閾値を横断しバックグランドレベルを越えるのに要するＰＣＲのサイクル数）と比較して測定された。３０サイクルのＲＴ−ＰＣＲ反応に続いて、単位複製配列が２％アガロースゲル上で電気泳動され、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ３１３０ｘｌＤＮＡ配列装置を使用して標準サンガー法により配列された。
ＲＮＡバイオマーカー単位複製配列の作成
【００７５】
特定のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度は、単離したＲＮＡを使用して下記の４つの方法の一つ以上によって測定した。これらの方法はそれぞれが、従来ＲＮＡ−ｓｅｑ技術の修正技術を一つ以上有している。従来ＲＮＡ−ｓｅｑ技術は当業者に公知で、例えばWangらの報告（Nat. Rev. Genet. (2009) 10:57-63）やMargueratとBahlerの報告（Cell. Mol. Life Sci. (2010) 67:569-579）に記載されている。
方法１
【００７６】
第一の方法では、第一ストランドｃＤＮＡを生成する際に配列特異的プライミングを使用する。この方法では第一段階の選択肢として、必要に応じて業界が提供するキットを使用して全ＲＮＡのｒＲＮＡを欠失させてもよい。業界が提供する第一ストランドｃＤＮＡキットは、全ＲＮＡまたはｒＲＮＡ欠失全ＲＮＡを少なくとも一つのストランド特異的オリゴヌクレオチドプライマー（例えば、当該のＲＮＡバイオマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー）と結合させ、製品説明書の手順に従って第一ストランドｃＤＮＡを生成させるのに使用される。次に、第二ストランドｃＤＮＡが標準手法を使用して偏りのない手法で合成される。得られた二本鎖ｃＤＮＡは必要に応じて標準方法で断片化され、ｃＤＮＡの末端は標準方法で修復されて、ｃＤＮＡ末端のオーバーハングはいずれもＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑な末端に変換される。アデニン（Ａ）塩基のオーバーハングは、クレノウ断片（Klenow fragment）を使用して平滑なＤＮＡ断片の３’末端に付加され、配列工程に必要なアダプターのライゲーションを支援する。アダプターは標準方法を使用してｃＤＮＡ断片の末端にライゲートされ、ｃＤＮＡ断片はゲル上に流されて精製され余分なアダプターが除かれる。クラスタ生成と配列のためにｃＤＮＡはアダプタープライマーを使用して増幅され、精製され、変性されてさらに希釈されるが、このようなクラスタ生成と配列の例としては、Illumina Corporationの標準手順（２０８サイクルの配列プログラム、インデックスが付けられた一対の末端）に従ってＨｉＳｅｑ２０００上で行われるものがある。ｃＤＮＡライブラリは配列され、癌患者と健康な対照被検者の特定のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度が測定される。
方法２
【００７７】
方法１にあるように、配列特異プライミングは第一ストランドｃＤＮＡ生成の際に使用される。この生成は、業界の提供する第一ストランドｃＤＮＡキットと一つ以上のストランド特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、製品説明書の手順に従って全ＲＮＡ（または必要に応じてｒＲＮＡ欠失全ＲＮＡ）から第一ストランドｃＤＮＡを生成させることで達成される。第二ストランドｃＤＮＡを標準手法を使用して偏りのないやり方で作成するか、または第二ストランドｃＤＮＡを一組の特異的オリゴヌクレオチドプライマー（例えば当該ＲＮＡバイオマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー）で直接増幅し、プライマー限定またはサイクル限定のＰＣＲによって特異的なＰＣＲ単位複製配列の一組を増幅してもよい。好ましい実施態様では、第一ストランドｃＤＮＡ生成に使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、第二ストランドｃＤＮＡを増幅するのに使用される一対のオリゴヌクレオチドプライマーの片方と同じであってもよい。つぎに、ｃＤＮＡは、余分のＰＣＲ試薬を除くために清浄化工程で精製される。ｃＤＮＡは必要に応じて標準方法で断片化され、ｃＤＮＡの末端は標準方法で修復されて、ｃＤＮＡ末端のオーバーハングはいずれもＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑な末端に変換される。アデニン（Ａ）塩基のオーバーハングは、クレノウ断片（Klenow fragment）を使用して平滑なＤＮＡ断片の３’末端に付加され、配列工程に必要なアダプターのライゲーションを支援する。アダプターは標準方法を使用してｃＤＮＡ断片の末端にライゲートされ、ｃＤＮＡ断片は余分なアダプターを除くために精製される。クラスタ生成と配列のためにｃＤＮＡはアダプタープライマーを使用して増幅され、精製され、変性されてさらに希釈されるが、このような例としては、Illumina Corporationの標準手順（２０８サイクルの配列プログラム、インデックスが付けられた一対の末端）に従ってＨｉＳｅｑ２０００上で行われるものがある。ｃＤＮＡライブラリは配列され、癌患者と健康な対照被検者の特定のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度が測定される。
方法３
【００７８】
この方法は、必要に応じて全ＲＮＡまたはｒＲＮＡ欠失全ＲＮＡを使用する。第一ストランドｃＤＮＡは標準手法を使用して合成される。次に、第一ストランドｃＤＮＡは一組の特異的オリゴヌクレオチドプライマー（例えば当該ＲＮＡバイオマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー）を使用して直接増幅され、プライマー限定またはサイクル限定のＰＣＲによって特定のＰＣＲ単位複製配列が増幅される。ｃＤＮＡは、余分のＰＣＲ試薬を除くために清浄化工程で精製される。ｃＤＮＡは必要に応じて標準方法で断片化され、ｃＤＮＡの末端は標準方法で修復されて、ｃＤＮＡ末端のオーバーハングはいずれもＴ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑な末端に変換される。アデニン（Ａ）塩基のオーバーハングは、クレノウ断片（Klenow fragment）を使用して平滑なＤＮＡ断片の３’の末端に付加され、配列工程に必要なアダプターのライゲーションを支援する。アダプターは標準方法を使用してｃＤＮＡ断片の末端にライゲートされ、ｃＤＮＡ断片は余分なアダプターを除くために精製される。次にｃＤＮＡはアダプタープライマーを使用して増幅され、精製される。ｃＤＮＡは、必要に応じて標準方法によってゲル電気泳動でサイズ選択される。ｃＤＮＡライブラリは配列され、癌患者と健康な対照被検者の特定のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度が測定される。
方法４
方法４は、次世代配列手法に必要なすべての配列が一段階または二段階ＰＣＲ増幅法によって組み入れられる点で、方法３と異なっている。
【００７９】
この方法では第一段階の選択肢として、必要に応じて業界が提供するキットを使用して全ＲＮＡのｒＲＮＡを欠失させてもよい。次に、第一ストランドＤＮＡが標準手法を使用して合成される。第一ストランドｃＤＮＡは、次世代配列（ＮＧＳ）プライマー領域を持つ一組の特異的オリゴヌクレオチドプライマー（例えば当該ＲＮＡバイオマーカーに特異的なオリゴヌクレオチドプライマー）を使用し、プライマー限定またはサイクル限定のＰＣＲによって直接増幅される。次に、ｃＤＮＡは、余分のＰＣＲ試薬を除くために清浄化工程で精製され、必要に応じて次世代配列（ＮＧＳ）に必要なプライマー領域を追加するために、別の一組のプライマーを使用してプライマー限定またはサイクル限定のＰＣＲによって再び増幅される。次に、ｃＤＮＡは、余分のＰＣＲ試薬を除くために精製され、必要に応じてアダプターライマーを使用して再び増幅され、精製される。クラスタ生成と配列のためにｃＤＮＡはアダプタープライマーを使用して増幅され、精製され、変性されてさらに希釈されるが、このような例としては、Illumina Corporationの標準手順（２０８サイクルの配列プログラム、インデックスが付けられた一対の末端）に従ってＨｉＳｅｑ２０００上で行われるものがある。ｃＤＮＡライブラリは配列され、癌患者と健康な対照被検者の特定のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度が測定される。
前立腺癌バイオマーカーの特定
【００８０】
ＲＮＡバイオマーカーは、ＮＣＢＩのデータベースＧＳＥ６９１９とＧＳＥ３８２４１にある公的に入手可能なＲＮＡ発現プロフィールデータの注釈と解析を使用して選択され、そのデータには癌を持たない提供者のデータが含まれている。下記表１に示すバイオマーカーは、前立腺癌を持つ被検者に過剰に発現していることが確認された独特の群の一つである。同様に、表２に示すバイオマーカーは、前立腺癌を持つ被検者に過剰に発現していることが確認された独特の群の二つ目である。
【００８１】
ＮＣＢＩのデータベースＧＳＥ６９１９はピッツバーグ大学で開発され、三つのアフィメトリクスチップ（Affymetrix chips）（Ｕ９５Ａ、Ｕ９５Ｂ、Ｕ９５Ｃ）から得たデータを含み、３６，０００以上のレポーター遺伝子を表している。このデータベースはChandranら（BMC Cancer 2005, 5:45; BMC Cancer 2007, 9:64）とYu（J Clin Oncol 2004, 22:2790-2799）らによって解析され、２００人以上の前立腺腫瘍試料から得たＲＮＡのプロフィールを含み、その腫瘍試料は隣接する「正常」または「健康な」組織あるいは前立腺癌を持たないと判断された人の前立腺組織と組み合わされている。
【表１】
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【表２】
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【００８２】
ＲＮＡ発現レベルの頻度変化を測定する試験には、適切な標準化を確保することが重要である。このため発明者は、表３に示すように、前立腺癌のある提供者の組織と健康な提供者の組織の間での遺伝子発現プロフィールの相違が最少であるレポーターを特定する目的でＮＣＢＩのデータベースを解析した。レポーターは確かなＲＮＡ発現基準群を形成し、それは本明細書に記載の修正ＲＮＡ−ｓｅｑ技術のようなＲＮＡ発現の定量試験を含む試験に適切に使用できる。
【表３】
2015522277.tif 000010
【００８３】
ＲＮＡバイオマーカー特異的単位複製配列の作成に使用するプライマーは、多段階プライマー設計戦略を使用して作出した。次世代配列に使用できる特定のサイズ（６０乃至３００ｂｐ）の単位複製配列を増幅するために、イントロンの橋渡しをする特別なプライマーを作出した。
プライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ３（ｖ．０．４０）ソフトウェアを使用して設計し、以下の基準を満たすことを確認するために検査した。
最後の５個の塩基対に３個を超えるＣ’とＧ’が含まれていない。
どのプライマーにもＧ’の配列（３個を超える）がない。
自己相補性またはヘアピン形成がないか限られている。
プライマーの群のプライマーＢＬＡＳＴが、望ましいサイズの同属の標的ＲＮＡを見出す。
【００８４】
これらＲＮＡ特異的単位複製配列プライマー群を、ＲＮＡバイオマーカー単位複製配列の配列法（ＲＢＡＳ）に使用するために、配列プライマーを組み込むヌクレオチドを、下記の表４に示すように第１回ＰＣＲにおいてプライマーの５’末端に付加し、第２回ＰＣＲに使用する第二のプライマー群は、インデックスとアダプター配列を含む配列をさらに付加するために使用した。
【表４】
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【００８５】
本明細書に記載の研究に使用したプライマーのすべては、Hesselsら（European Urology 44: 8-16, 2003）に教わったＰＳＡ（ＫＬＫ３）用プライマー群のほかは、発明者らが設計し、InvitrogenまたはIDTが供給した。
実施例１
【００８６】
前立腺の腺癌細胞株（ＬＮＣａＰ）と肺癌の腺癌細胞株（Ａ５４９）におけるＲＮＡバイオマーカー発現プロフィールを比較するためのＲＮＡバイオマーカー単位複製配列の配列法の使用

複数のＲＮＡバイオマーカーの正確な検知と相対的定量に使用される、ＲＮＡバイオマーカー単位複製配列の配列法（ＲＢＡＳ）の性能を以下に説明する。
【００８７】
ａ）ＬＮＣａＰ細胞（アンドロゲン反応性ヒト前立腺癌リンパ節転移から抽出した上皮細胞株）とＡ５４９細胞（肺胞基部組織から抽出した上皮細胞株）から選択された２５個の特定のＲＮＡバイオマーカー単位複製配列の群を作成する。
ｂ）ＬＮＣａＰとＡ５４９に由来するＲＮＡバイオマーカー特異的単位複製配列の相対量を、大量同時配列により検知し測定する。
１）単位複製配列の作成
【００８８】
単位複製配列は、特定のＲＮＡバイオマーカーを標的とする一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲによって得られる特定の増幅物であると定義する。単位複製配列の作成に使用した鋳型は一本鎖ＤＮＡで、ＬＮＣａＰとＡ５４９から抽出したＲＮＡ（上記の方法を参照）と相補的であった。ｃＤＮＡは本実施例においてランダムプライマーを使用して作成されたが、バイオマーカー特異的プライマーは、抽出ＲＮＡからの逆転写を開始するためにも使用できる。
【００８９】
Illumina Corporationの次世代配列（ＮＧＳ）技術に適合するＤＮＡ単位複製配列が本実施例で作成された。他のＮＧＳ技術を使用した配列法に適合する単位複製配列も同じ原理で作成できる。前記２５個の特定のプライマー対は、２１個の前立腺癌ＲＮＡバイオマーカーと４個の参照ＲＮＡバイオマーカーを標的とし、Illuminaの仕様（ＲＮＡバイオマーカーの選択とプライマー設計戦略は上記の方法に示されている）に従って単位複製配列の５’と３’の末端にアダプター導入のために付加された配列を含んでいた。
【００９０】
それぞれのＲＮＡバイオマーカーの技術的な３個組の複製は第１回ＰＣＲで作成された。ＬＮＣａＰまたはＡ５４９細胞のＲＮＡから作られた同じｃＤＮＡが、３個の第１回ＰＣＲ増幅物のそれぞれの鋳型として使用された。これら６個の単位複製配列群すなわち二つの細胞種のそれぞれに作られた技術的な３個組の複製は、残留のプライマーとｄＮＴＰを除去するためにAgencourt AMPureXPシステム（Beckman Coulter, Inc.）を使用して精製され、ついで、それぞれの品質、平均サイズ分布、単位複製配列濃度を確認するために、２１００バイオアナライザ（Agilent Technologies Inc.）と Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０蛍光光度計（Life Technologies）で分析された。
２）単位複製配列ライブラリーの作成
【００９１】
希釈後に、清浄化された６個の単位複製配列群は、第１回ＰＣＲの際に付加されたアダプターに特異的な配列プライマーを使用して行われた第２回ＰＣＲの各々の鋳型として使用された。配列プライマーもインデックス付け用バーコード配列とクラスタ化用タグ配列を含んでいた。第２回ＰＣＲで作成された単位複製配列ライブラリは解析され、その濃度は２１００バイオアナライザ（Agilent Technologies Inc.）と Ｑｕｂｉｔ（登録商標）２．０蛍光光度計（Life Technologies -Invitrogen）を使用して測定された。残留のプライマーとｄＮＴＰをAgencourt AMPureXPシステム（Beckman Coulter, Inc.）を使用して除去し、同一モル濃度で一つにまとめ、単一の単位複製配列ライブラリ配列用群とした。配列用群は変性され、さらにクラスタ生成のために希釈され、Illumina Corporationの標準手順（２０８サイクルの配列プログラム、インデックスが付けられた一対の末端）に従ってＨｉＳｅｑ２０００上で配列された。
３）単位複製配列に関する定量
【００９２】
配列プログラムとベースコールをfastq対末端の読みとりデータに変換する際に得られた配列の読みを多重化するために、Illuminaのbcl2fastq 変換ソフトウェア（version 1.8.3）を使用した。全部の読みについてのＱ３０より大きい塩基のパーセンテージと平均Ｑスコアの品質統計は、すべての単位複製配列ライブラリが非常によく配列され逆多重化されていることを示した。このデータセットは、１個の単位複製配列ごとの読み回数（読み回数（Ｒｃ）、表５、表６）を作成するために使用された。これは、対応する単位複製配列の５０ｂｐ以上の長さの配列の読み数である。この数はライブラリ中の単位複製配列の量と正比例し、また単位複製配列が由来する特定のＲＮＡバイオマーカーの量に比例する。
各単位複製配列から得られた読み数を使用すると、各調査試料に含まれる対応ＲＮＡバイオマーカーの相対量を詳細に推定することが可能になる。
【００９３】
大量同時配列により分布域の広い読み数を得ることで生じる偏りを最小にするために、別の方法を使用して読み数を正規化することができる。前立腺癌ＲＮＡバイオマーカーに特異的な２１対のプライマーを使用してＬＮＣａＰとＡ５４９のＲＮＡから作られた単位複製配列の生の読み数を正規化するのに、４個の参照用単位複製配列から得た読み数の平均が使用された。参照用単位複製配列は、前立腺癌のある提供者の組織と健康な提供者の組織の間での発現の相違が低いレベルであることから選択された４種類のＲＮＡバイオマーカーを標的とする特定のプライマーを使用して作られた。Ａ５４９とＬＮＣａＰのＲＮＡから作られた4個の参照単位複製配列の生の読み数は、別々の複製の間および比較された２種類の細胞種の間で一貫していた。（表５）このデータは、これら参照用ＲＮＡの差次的発現のレベルが低いことを裏付け、また参照用単位複製配列としてこれらのＲＮＡを選択したことの正当性を立証している。
【表５】
2015522277.tif 000012
【００９４】
表６において、ＬＮＣａＰとＡ５４９のＲＮＡから作られたそれぞれの非参照ＲＮＡバイオマーカー特異的単位複製配列（標的単位複製配列と呼ぶ）の読み数の正規化は、各標的の読み数を、ＬＮＣａＰとＡ５４９のいずれかから得られた４個の参照用単位複製配列の平均値から計算された平均読み数で除して計算された。この正規化は、それぞれの複製について行われた。（表６  標的単位複製配列読み数／平均参照読み数）
【００９５】
ＬＮＣａＰとＡ５４９の細胞の間のＲＮＡバイオマーカー差次的発現の倍率変化（fold change）（ＦＣ）の評価は、正規化された単位複製配列ごとの読み数をｌｏｇ２の数に変換し、比較して行われた。ｌｏｇ２のＦＣは正規化前の読み数（生の読み数）と正規化後の読み数（正規化読み数）について計算され、差次的発現の査定に与える単位複製配列ライブラリの読み数分布の影響を評価するために比較された。（表６）表６のデータはＬＮＣａＰとＡ５４９の細胞中の２１個の標的ＲＮＡバイオマーカーの発現を比較している。ｌｏｇ２の負の数はＲＮＡバイオマーカーの減少または下方調節を示し、ｌｏｇ２の正の数はＲＮＡバイオマーカーの増加または上方調節を示す。
【表６】
2015522277.tif 000013
2015522277.tif 000014
【００９６】
このデータは、生の読み数についてｌｏｇ２の値を使って計算したＦＣ値と、正規化した読み数をｌｏｇ２を使って計算したＦＣ値との間の差異が大きくないことを示している。しかし、正規化プロセスはＡ５４９とＬＮＣａＰの細胞にあるＲＮＡバイオマーカーの発現の相対的差異をより正確に検知することを可能にする。
【００９７】
表７のデータについて、発明者は２より大きいｌｏｇ２のＦＣ値が有意であることを認め、ＬＮＣａＰとＡ５４９のＲＮＡを使用して試験した２１個の前立腺癌特異的ＲＮＡバイオマーカーの発現レベルを、Ｌｏｇ２ＦＣ＞２とＬｏｇ２ＦＣ＜２の二つのグループに分けた。
【表７】
2015522277.tif 000015
このデータは、Ｌｏｇ２ＦＣ＞２であるＲＮＡバイオマーカーが二つのＲＮＡの間で均等に分割されていることを明らかにしている。
【００９８】
表８のデータは、ＬＮＣａｐとＡ５４９のＲＮＡに発現する２１個のＲＮＡバイオマーカーのＬｏｇ２ＦＣの相違の基礎統計学による解析であり、ＬＮＣａｐのＲＮＡから得た各ＲＮＡバイオマーカーの正規化したＬｏｇ２ＦＣを、対応するＡ５４９のＲＮＡのＬｏｇ２ＦＣで除して計算したものである。ＬＩＭＭＡにもとづく線形モデルの適合解析（Ｔ＝ＬＩＭＭＡによる調整ｔ統計量）によって計算された差次的発現レベルは、ＬＮＣａｐとＡ５４９の細胞種間でのＲＮＡバイオマーカーの有意性のある差次的発現レベル（Ｔ値）の一部を対応するＰ値と共に強調している。
【表８】
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【００９９】
ＬＮＣａｐとＡ５４９の二種の細胞は、前立腺から得られた細胞（ＬＮＣａｐ細胞）と肺から得られた細胞（Ａ５４９細胞）の二種の細胞におけるＲＮＡバイオマーカーの発現を比較して概念を証明する目的で本実施例のために選ばれた。予想されるように、前立腺癌に含まれる可能性にもとづいて選ばれたこの二種の細胞のＲＮＡバイオマーカーの間には有意の差次的発現がある。
【０１００】
上記の実施例に示すデータは、次世代ＤＮＡ配列技術を使用した計数に続いて行われる単位複製配列の定量的合成により、特定ＲＮＡバイオマーカーの発現の相違を検知することが可能であることを示している。
実施例２
【０１０１】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ヒト前立腺組織の前立腺癌組織を使用した遺伝子差次的発現プロフィールの解析におけるＲＮＡ単位複製配列バイオマーカーの配列法（ＲＢＡＳ）

【０１０２】
本実施例は、ＲＮＡ単位複製配列バイオマーカーの配列法（ＲＢＡＳ）が診断と予後診断に関連性があることを、単位複製配列の作成とＮＧＳを使用して７９個のＲＮＡバイオマーカーの相対的発現を定量化し、前立腺癌組織におけるＲＮＡ発現プロフィールを確立することによって証明する。
【０１０３】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）した前立腺切除組織の区分が臨床組織病理学者によって検査され、分析用の試料が選択された。二人の被検者から得られた前立腺切除組織が選択された。
【０１０４】
被検者の一人は６３歳の老人男性で、２００７年に前立腺切除手術を受け、グリソンスコアが４＋５で前立腺癌と診断された。この被検者は５８歳で前立腺の完全除去手術を受けた。元の前立腺切除組織を含む保存されたＦＦＰＥ組織は再検査され、グリソンスコアが４＋５の腫瘍部分が確認された。その確認された部分は再びパラフィン固定され、切片化された。ＲＮＡを抽出するために３個の組織試料、すなわち４＋５の腫瘍組織（Ｔ）、隣接の腺組織（隣接Ｇ）、組織学的に正常とみられる隣接の筋組織（隣接Ｔ）が被検者１から選択された。
【０１０５】
被検者２は６７歳の老人男性で、２０１２年に前立腺切除手術を受け、グリソンスコアが３＋４で前立腺癌と診断された。この被検者は６６歳で前立腺の完全除去手術を受けた。その前立腺切除組織を含む保存されたＦＦＰＥ組織は再検査され、グリソンスコアがそれぞれ４＋５（Ｔ１）、３＋４（Ｔ２）、３＋３（Ｔ３）の３個の腫瘍部分が確認された。その確認された部分は再びパラフィン固定され、切片化された。３個の腫瘍部分のそれぞれから組織試料が選択され、また、組織学的に正常とみられる隣接の腺組織（隣接Ｇ）からも組織試料が選択された。被検者２の組織試料には隣接の筋組織（隣接Ｔ）が確認されなかった。
【０１０６】
被検者１と２から選択された７個の組織試料から、Ｑｉａｇｅｎ  ＦＦＰＥ  ＲＮ簡易抽出キット（ カタログ番号７４４０４、７３５０４）を使用して、別々に全ＲＮＡが抽出された。次に、ＲＮＡは、上記段落に記載した方法でそれぞれの組織試料からｃＤＮＡを作成するのに使用された。このｃＤＮＡは、４個のＲＮＡバイオマーカーから得られた５個の参照用単位複製配列を含む７９対のＲＮＡバイオマーカープライマーをすべて使用して、単位複製配列の３個組の複製を作成するのに使用された。第一回ＰＣＲで作成した７９個のＲＮＡバイオマーカー特異的単位複製配列の、第二回ＰＣＲにおける配列は２つに分けて実施した。第二回ＰＣＲの際に、インデックス付け用バーコード配列とタグ配列が付加され、単位複製配列ライブラリは、実施例１に記載したようにIllumina のＨｉｓｅｑ２５００装置でクラスタ化し配列するために一つにまとめられた。
【０１０７】
実施例１に記載したように、単位複製配列ごとの配列の読み数（読み数）を得るために、Illuminaのbcl2fastq 変換ソフトウェア（version 1.8.3）を使用した。
【０１０８】
それぞれの配列実施（Ｒｕｎ１、Ｒｕｎ２）から得た５個の参照用単位複製配列の生の読み数を表９に示す。すべての参照用単位複製配列の配列数は、Ｒｕｎ１のほうがＲｕｎ２よりも低かった。しかし、個々の参照用ＲＮＡバイオマーカーの他との比率は、二つの配列実施の間で類似していた。
【表９】
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【０１０９】
表９に示した参照用単位複製配列について得られた生の読み数は、前立腺切除由来のＲＮＡ試料の複製間で概ね一貫性があり、このデータは参照用単位複製配列としてこれらＲＮＡバイオマーカーを選択したことの立証となっている。
【０１１０】
５個の参照用単位複製配列の読み数の平均は、腫瘍、隣接腺組織、隣接筋組織の適切な組み合せから得られた単位複製配列の生の読み数を正規化するのに使用された。
被検者１のＲＮＡバイオマーカー解析
【０１１１】
被検者１の解析のため、腫瘍組織と、隣接腺組織と隣接筋組織の両者との間のＲＮＡバイオマーカーの相対的発現を比較した。腫瘍組織と、隣接腺組織と隣接筋組織の両者の３個組複製試料の生の読み数を示し、次いで正規化された読み数のｌｏｇ２の数を示す。前立腺切除組織の腫瘍部分のＲＮＡ試料から得られたＲＮＡバイオマーカーそれぞれのｌｏｇ２ＦＣの表現を、隣接腺組織と筋隣接筋組織のＲＮＡと比較して示す。最後に隣接腺組織のｌｏｇ２ＦＣを、筋隣接筋組織のＲＮＡと比較して示す。（表１０）  
【０１１２】
被検者１から得られた単位複製配列数の区分（Ｌｏｇ２  ＦＣ＞２）のあるＲＮＡバイオマーカーは、表１１に示すデータを有する腫瘍、隣接腺組織、隣接筋組織それぞれの試料から選択した。
【表１０】
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【表１１】
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多数のバイオマーカーが、腫瘍試料または隣接腺組織や隣接筋組織中で差次的発現を示すことがわかり、それらは下記の表１２にグループ化されている。
【表１２】
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【０１１３】
癌研究のこの分野、特に保存されたＦＥＰＥ試料を腫瘍組織の採取源として使用する場合には、差次的発現の研究に腫瘍の隣接組織を対照健康組織として使用することが一般的な方法である。しかし、前立腺腫瘍組織の遺伝子発現プロフィールやクロマチンの状態を隣接組織や前立腺癌の証拠がない臓器提供脳死者からの健全な前立腺組織のそれと比較した研究では、隣接組織は提供者の対照組織よりも腫瘍のものにより類似したゲノムやトランスクリプトームを有することが示唆され、場所的影響があることを示唆している。（Chandran et al. 2005, Aryee et al. 2013）
【０１１４】
被検者１の組織を使用したＲＢＡＳ解析は、腺隣接組織が腫瘍のものにより類似したＲＮＡ発現プロフィールを示し、それは前立腺癌についてChandran ら（(2005）やRizziら（(PLoS One 3(10):e3617, 2008）が説明し、Trujilloら（Prostate Cancer, 2012）が論評したように、場所的影響によるものと思われることを示している。
被検者２のＲＮＡバイオマーカー解析
【０１１５】
被検者２の解析には、前立腺切除組織を使用し、グリソンスコアの異なる３個の腫瘍組織（Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３とする）のＲＮＡバイオマーカーの相対的発現を、隣接腺組織のみと比較した。Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３の腫瘍組織と隣接腺組織から得られた試料の３個組複製の生の読み数を示し、次いで正規化された読み数のｌｏｇ２の数を示す。最後に前立腺切除組織の腫瘍部分のＲＮＡ試料から得られた各ＲＮＡバイオマーカーの発現のｌｏｇ２ＦＣを、隣接腺組織のＲＮＡと比較して示す。
被検者２の試料から得られた各単位複製配列の生の読み数を、正規化した数およびＦＣの計算結果と共に表１３に示す。
【表１３】
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【０１１６】
表１４において、腫瘍中にＬｏｇ２ＦＣ＞２の差次的発現を示すこれらのＲＮＡバイオマーカーが、隣接腺組織のそれと比較されている。殆どのＲＮＡバイオマーカーが腫瘍中では隣接腺組織に比較して上方調節されている。腫瘍中のすべてのバイオマーカーと比べて、隣接腺組織中では２個のバイオマーカーのみがそれらより高い量であることが検知されている。悪性度の異なる腫瘍の間には、例えばＯＰＲＫ１のＲＮＡバイオマーカーとＰＳＭＡのＲＮＡバイオマーカーのように、何らかの区別が設けられ得る。
【表１４】
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被検者１と２のＲＮＡバイオマーカー発現に関するコメント
【０１１７】
ＲＢＡＳ解析のために単位複製配列を行う前に、すべてのＲＮＡ特異的プライマーの能力を、リアルタイムＰＣＲまたは予期するサイズに作成された単位複製配列の視覚化により試験した。故に、前立腺切除組織のＲＮＡから作成された単位複製配列の一部に観察された低配列数が、単位複製配列の作成効率の悪さに起因すると考えることはできない。実施例１に見られるように、９００と１３，０００の配列数の生の読み数は、ＬＮＣａＰ細胞とＡ５４９細胞のＲＮＡからそれぞれ作成されたＭＵＣ１単位複製配列から得られた。（表６）
【０１１８】
本明細書に開示したＲＮＡバイオマーカー選択に使用した方法は、すべての前立腺腫瘍中ではなく少数の前立腺腫瘍中で上方調節または下方調節されたものの中から選択する手法である。そのため、ここに示すすべてのＲＮＡバイオマーカーの差次的発現があらゆる前立腺腫瘍やその隣接組織に見られることは期待できない。被検者１と２について調査した腫瘍がその組織中で異常調節されたＲＮＡの一部を持っていないと思われることをデータは示している。一群の被検者から得た腫瘍を解析すれば、これらおよびその他のＲＮＡバイオマーカーの発現に差がみられるであろう。それが、診断や予後用に、多数のＲＮＡバイオマーカーからＲＮＡバイオマーカーのパネルを選択する主な理由である。ＲＢＡＳ手法は、腫瘍の試料を同時に多数のＲＮＡバイオマーカーについて迅速にスクリーニングすることを可能にするために開発された。
【０１１９】
結論として、ここに記載した観察結果は、前立腺癌の病期分類に関する問題を強調し、複数のＲＮＡバイオマーカーによる診断方法開発の理由を説明しているが、それは、単一のＲＮＡバイオマーカーで前立腺癌を診断し病期分類することや前立腺癌を良性の前立腺肥大や前立腺炎と区別することができそうにないためである。
【０１２０】
本発明はその特定の実施態様を参照して説明されているが、本発明の真の技術思想や範囲から逸脱することなく、多種の変更を行い、均等物との置き換えを行い得ることは、当業者には当然理解されるであろう。また、本発明の実施のために、特定の状況、材料、組成物、方法、方法の段階を適合させるための改変が行われ得る。このような改変はすべて本明細書に付記された請求項の範囲にある。
【０１２１】
本明細書に引用した出版物、特許出願、特許はその全文を本願明細書に援用し、その範囲は、各々の出版物、特許出願、特許の全文をそれぞれ具体的かつ個別に本願明細書に援用することと同一である。
【０１２２】
配列識別番号の１乃至３２６は添付の配列表に示す。添付配列表中に使用したヌクレオチド配列のコードは、記号「ｎ」も含めてＷＩＰＯ標準ＳＴ２５（１９９８年）付属書２、表１に従う。
【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年6月17日(2015.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検者の疾患の存在を検知し且つ疾患の進行を観察するか、またはそのいずれかの方法であって：
（ａ）前記被検者から得られた生体試料中の少なくとも一つ複数のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を同時に測定するステップを備え、前記発現頻度は複数のＲＮＡバイオマーカーに特異的な複数のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して作成された単位複製配列ｃＤＮＡライブラリーのＲＮＡ次世代配列法を使用して測定され；さらに
（ｂ）前記生体試料中の複数のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を予め定められた閾値と比較するステップを備え、前記生体試料中の複数のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度の予め定められた閾値と比較した増減が前記被検者の疾患の存在および疾患の進行、またはそのいずれかを示すことを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記単位複製配列ｃＤＮＡライブラリーが、
（ａ）前記生体試料から全ＲＮＡを単離するステップと；
（ｂ）複数のＲＮＡバイオマーカーに特異的な複数の第一のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して前記全ＲＮＡから第一ストランドｃＤＮＡを生成するステップと；
（ｃ）第二ストランドｃＤＮＡを合成して二本鎖ｃＤＮＡを準備するステップと；
（ｄ）少なくとも一つのシークエンシングアダプターを前記二本鎖ｃＤＮＡに付加するステップと；さらに
（ｅ）前記二本鎖ｃＤＮＡを増幅して前記単位複製配列ｃＤＮＡライブラリーを準備するステップと；
によって作成されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第一のオリゴヌクレオチドプライマーが配列識別番号の７６乃至２２３と２９３乃至３２６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｃ）の後、ステップ（ｄ）の前に、前記複数のＲＮＡバイオマーカーに特異的な複数対のｎオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により前記二本鎖ｃＤＮＡを増幅するステップをさらに備えることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
複数対のオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも一対が配列識別番号の７６乃至２２３と２９３乃至３２６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記単位複製配列ｃＤＮＡライブラリーが：
（ａ）前記生体試料から全ＲＮＡを単離するステップと；
（ｂ）第一ストランドｃＤＮＡを作成して一本鎖ｃＤＮＡを準備するステップと；
（ｃ）前記複数のＲＮＡバイオマーカーに特異的な複数対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により前記一本鎖ｃＤＮＡを増幅して、増幅二本鎖ｃＤＮＡを準備するステップと；
（ｄ）少なくとも一つのシークエンシングアダプターを前記増幅二本鎖ｃＤＮＡに付加するステップと；さらに
（ｅ）前記少なくとも一つのシークエンシングアダプターに特異的なプライマーを使用して、前記増幅二本鎖ｃＤＮＡをさらに増幅して前記単位複製配列ｃＤＮＡライブラリーを準備するステップと；
により作成されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記複数のオリゴヌクレオチドプライマー対の構成要素の少なくとも一個が配列識別番号の７６乃至２２３と２９３乃至３２６からなる群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記疾患が癌であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記疾患が前立腺癌であり、前記複数のＲＮＡバイオマーカーが、配列識別番号の１乃至７５と２３５乃至２８７からなる群から選択されるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列からなることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記生体試料が尿、血液、血清、細胞株、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）、生検組織、前立腺切除組織からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
被検者の疾患の進行を観察する方法であって、前記方法は：
（ａ）一回目に前記被検者から得られた生体試料中の複数のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を同時に測定し、それに続いて二回目に前記被検者から得られた生体試料中の前記複数のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を同時に測定するステップを備え、前記相対発現頻度は複数のＲＮＡバイオマーカーに特異的な複数のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して作成された単位複製配列ｃＤＮＡライブラリーのＲＮＡ次世代配列法を使用して測定され、さらに
（ｂ）前記生体試料中の前記複数のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度を予め定められた閾値と比較するステップを備え、一回目の複数のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度と比較した二回目の前記生体試料中の前記複数のＲＮＡバイオマーカーの相対発現頻度の増減が被検者の疾患の進行を示すことを特徴とする、方法。
【請求項１２】
前記単位複製配列ｃＤＮＡライブラリーが：
（ａ）前記生体試料から全ＲＮＡを単離するステップと；
（ｂ）前記複数のＲＮＡバイオマーカーに特異的な複数の第一のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して全ＲＮＡから第一ストランドｃＤＮＡを生成するステップと；
（ｃ）第二ストランドｃＤＮＡを合成して二本鎖ｃＤＮＡを準備するステップと；
（ｄ）少なくとも一つのシークエンシングアダプターを前記二本鎖ｃＤＮＡに付加するステップと；さらに
（ｅ）前記二本鎖ｃＤＮＡを増幅して前記単位複製配列ｃＤＮＡライブラリーを準備するステップと；
により作成されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第一のオリゴヌクレオチドプライマーが配列識別番号の７６乃至２２３と２９３乃至３２６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｃ）の後、ステップ（ｄ）の前に、前記少なくとも一つのＲＮＡバイオマーカーに特異的な一対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により前記二本鎖ｃＤＮＡを増幅するステップをさらに備えることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記単位複製配列ｃＤＮＡライブラリーが：
（ａ）前記生体試料から全ＲＮＡを単離するステップと；
（ｂ）第一ストランドｃＤＮＡを生成して一本鎖ｃＤＮＡを準備するステップと；
（ｃ）前記複数のＲＮＡバイオマーカーに特異的な複数対のオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ連鎖反応により前記一本鎖ｃＤＮＡを増幅して、増幅二本鎖ｃＤＮＡを準備するステップと；
（ｄ）少なくとも一つのシークエンシングアダプターを前記二本鎖ｃＤＮＡに付加するステップと；さらに
（ｅ）前記少なくとも一つのシークエンシングアダプターに特異的なプライマーを使用して、前記二本鎖ｃＤＮＡを増幅して前記単位複製配列ｃＤＮＡライブラリーを準備するステップと；
を備えることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
複数のオリゴヌクレオチドプライマー対の構成要素の少なくとも１個が配列識別番号の７６乃至２２３と２９３乃至３２６からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記疾患が癌であることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記疾患が前立腺癌であり、前記複数のＲＮＡバイオマーカーが、配列識別番号の１乃至７５と２３５乃至２８７からなる群から選択されるＤＮＡ配列に対応するＲＮＡ配列からなることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記生体試料が尿、血液、血清、細胞株、末梢血単核球（ＰＢＭＣｓ）、生検組織、前立腺切除組織からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記複数のＲＮＡバイオマーカーが少なくとも１０個のＲＮＡバイオマーカーからなることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記複数のＲＮＡバイオマーカーの発現頻度が少なくとも一つの発現基準に正規化されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも一つの発現基準が表３に示すレポーターから選択されることを特徴とする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記単位複製配列ｃＤＮＡライブラリー中の単位複製配列のサイズが６０乃至３００ｂｐであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記複数のＲＮＡバイオマーカーが少なくとも１０個のＲＮＡバイオマーカーからなることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記複数のＲＮＡバイオマーカーの発現頻度が少なくとも一つの発現基準に正規化されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも一つの発現基準が表３に示すレポーターから選択されることを特徴とする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記単位複製配列ｃＤＮＡライブラリー中の単位複製配列のサイズが６０乃至３００ｂｐであることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【国際調査報告】
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