(57)【要約】  結合組織細胞を含む、操作した、生きている、三次元の結合組織構成物が開示される。幾つかの実施形態では、結合組織細胞は、間葉系幹／間質細胞などの多能性細胞に由来する。幾つかの実施形態では、細胞は、互いに凝集する。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、生きている、三次元の結合組織構成物を提供するために、１つ以上の分化シグナルにさらされた。幾つかの実施形態では、前記構成物は、使用時に予め形成されたスキャフォールドがほぼない。また、移植のための移植片、インビトロでの実験のための結合組織構成物、およびそれらを製造する方法も開示される。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
操作した、生きている、三次元の結合組織構成物であって、前記構成物は、
生きている、三次元の結合組織構成物を提供するために互いに凝集した、結合組織細胞を含み；ここで、前記構成物は、使用時に予め形成されたスキャフォールドがほぼない、ことを特徴とする、操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項２】
前記構成物が、神経支配されていないことを特徴とする、請求項１に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項３】
結合組織細胞が、インビトロで多能性細胞に由来する結合組織細胞を含むことを特徴とする、請求項１に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項４】
多能性細胞が、組織特異的な前駆体、間葉系幹／間質細胞、人工多能性幹細胞、および胚性幹細胞の１つ以上を含むことを特徴とする、請求項３に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項５】
多能性細胞が、哺乳動物の脂肪組織に由来することを特徴とする、請求項３に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項６】
多能性細胞が、哺乳動物の骨髄に由来することを特徴とする、請求項３に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項７】
多能性細胞が、非脂肪の、非骨髄組織源に由来することを特徴とする、請求項３に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項８】
多能性細胞が、前記構成物の成形前に、１つ以上の分化シグナルにさらされたことを特徴とする、請求項３に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項９】
多能性細胞が、前記構成物の成形中に、１つ以上の分化シグナルにさらされたことを特徴とする、請求項３に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項１０】
多能性細胞が、前記構成物の成形後に、１つ以上の分化シグナルにさらされたことを特徴とする、請求項３に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項１１】
前記構成物が、バイオプリントされたことを特徴とする、請求項１に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項１２】
押出化合物をさらに含み、該押出化合物が、バイオプリンティングに対する細胞の適合性を改善することを特徴とする、請求項１１に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項１３】
結合組織が、骨、軟骨、腱、および靭帯から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項１４】
以下の細胞タイプ：血管細胞、内皮細胞、線維芽細胞、周細胞、幹／前駆細胞、免疫細胞、の１つ以上をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項１５】
実質的に、シート、パッチ、環、チューブ、立方体、多面体、または球体の形態であることを特徴とする、請求項１に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項１６】
実質的に、インビボでの天然のヒト結合組織の形状または構造を模倣する形状の形態であることを特徴とする、請求項１に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項１７】
損傷、疾患、または変性の部位での被験体における移植のための、請求項１に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項１８】
別々の補填体の１つ以上をさらに含み、各補填体が、生体適合材料を含み、ここで１つ以上の補填体は、凝集した細胞において間隙または空間を作り出すことを特徴とする、請求項１に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項１９】
各補填体が、実質的に、細胞の移動および内方成長に抵抗することを特徴とする、請求項１に記載の操作した、生きている、三次元の結合組織構成物。
【請求項２０】
操作した、生きている、三次元の結合組織構成物のアレイであって、
各構成物は、生きている、三次元の結合組織構成物を提供するために、多能性細胞を１つ以上の分化シグナルにさらす工程、を含むプロセスによって成形され；ここで各結合組織構成物は、使用時に予め形成されたスキャフォールドがほぼなく、培養中に維持されることを特徴とする、アレイ。
【請求項２１】
各構成物が、神経支配されていないことを特徴とする、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項２２】
多能性細胞が、組織特異的な前駆体、間葉系幹／間質細胞、人工多能性幹細胞、および胚性幹細胞の１つ以上を含むことを特徴とする、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項２３】
多能性細胞が、哺乳動物の脂肪組織に由来することを特徴とする、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項２４】
多能性細胞が、哺乳動物の骨髄に由来することを特徴とする、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項２５】
多能性細胞が、非脂肪の、非骨髄組織源に由来することを特徴とする、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項２６】
多能性細胞が、前記構成物の成形前に、１つ以上の分化シグナルにさらされたことを特徴とする、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項２７】
多能性細胞が、前記構成物の成形中に、１つ以上の分化シグナルにさらされたことを特徴とする、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項２８】
多能性細胞が、前記構成物の成形後に、１つ以上の分化シグナルにさらされたことを特徴とする、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項２９】
各構成物が、バイオプリントされたことを特徴とする、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項３０】
結合組織が、骨、軟骨、腱、および靭帯から成る群から選択されることを特徴とする、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項３１】
１つ以上の結合組織構成物が、以下の細胞タイプ：内皮細胞、線維芽細胞、幹／前駆細胞、周細胞、衛星細胞、または血管細胞、の１つ以上をさらに含むことを特徴とする、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項３２】
１つ以上の結合組織構成物が、１つ以上の結合組織を含む複組織構成物であることを特徴とする、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項３３】
１つ以上の結合組織構成物が、結合組織および非結合組織を含む複組織構成物であることを特徴とする、請求項３２に記載のアレイ。
【請求項３４】
１つ以上の結合組織構成物が、骨組織および非結合組織を含む複組織構成物であることを特徴とする、請求項３３に記載のアレイ。
【請求項３５】
インビトロでのアッセイに使用するための、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項３６】
創薬、薬物検査、毒性学的検査、疾患モデル、三次元の生物学研究、および細胞スクリーニング、の１つ以上における使用のための、請求項３５に記載のアレイ。
【請求項３７】
１つ以上の分化シグナルが、機械的シグナル、生体力学的シグナル、可溶性シグナル、または物理的シグナル、あるいはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項３８】
１つ以上の結合組織構成物が、１つ以上の別々の補填体をさらに含み、各補填体が、生体適合材料を含み、ここで１つ以上の補填体は、凝集した細胞において間隙または空間を作り出すことを特徴とする、請求項２０に記載のアレイ。
【請求項３９】
各補填体が、実質的に、細胞の移動および内方成長に抵抗することを特徴とする、請求項３８に記載のアレイ。
【請求項４０】
生きている、三次元の結合組織構成物を成形するための方法であって、該方法は、
支持体上に堆積され、１つ以上の分化シグナルにさらされた多能性細胞を含む、バイオインクをインキュベートする工程であって、それによって、バイオインクが、凝集することができ、生きている、三次元の結合組織構成物を形成することができる工程を含み、ここで、前記インキュベートする工程は、約１時間から約３０日間の期間を有することを特徴とする、方法。
【請求項４１】
多能性細胞が、間葉系幹／間質細胞、人工多能性幹細胞、および胚性幹細胞の１つ以上を含むことを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
多能性細胞が、哺乳動物の脂肪組織に由来することを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
多能性細胞が、哺乳動物の骨髄に由来することを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
多能性細胞が、非脂肪の、非骨髄組織源に由来することを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
結合組織細胞が、バイオインクを支持体上に堆積させる約１−２１日前とバイオインクを支持体上に堆積させた約１−２１日後との間の１つ以上の時間間隔で、１つ以上の分化シグナルにさらされることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
バイオインクが、バイオプリンティングによって堆積されることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
前記構成物が、バイオプリンティング使用時に、任意の予め形成されたスキャフォールドがほぼないことを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
前記構成物が、神経支配されていないことを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
結合組織が、骨、軟骨、腱、および靭帯から成る群から選択されることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項５０】
バイオインクが、以下の細胞タイプ：血管細胞、内皮細胞、線維芽細胞、周細胞、幹／前駆細胞、免疫細胞、の１つ以上をさらに含むことを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項５１】
バイオインクが、押出化合物をさらに含むことを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項５２】
１つ以上の分化シグナルが、機械的シグナル、生体力学的シグナル、可溶性シグナル、または物理的シグナル、あるいはそれらの組み合わせを含むことを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項５３】
１つ以上の別々の補填体を堆積させる工程をさらに含み、各補填体が、生体適合性材料を含み、ここで１つ以上の補填体は、凝集した細胞において間隙または空間を作り出すことを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項５４】
各補填体が、実質的に、細胞の移動および内方成長に抵抗することを特徴とする、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
複数の、生きている、三次元の結合組織構成物を、生体適合性の表面上に又はその中に空間的に閉じ込めることによって、複数の、生きている、三次元の結合組織構成物をアレイへと構築する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【請求項５６】
前記構成物が、損傷、疾患、または変性の部位での被験体における移植に適していることを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１２年６月１９日に出願の米国特許第６１／６６１，７６８号、および２０１３年３月１３日に出願の米国特許第１３／８０１，７８０号の利益を主張し、これら各々は、その全体が引用によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
医療産業は、多くの切迫した問題に直面している。２０１２年６月時点で、１１４，６３６人の患者が、臓器移植を必要とする人として、全米臓器配分ネットワーク（ＵＮＯＳ）に登録されていた。ＵＮＯＳによると、２０１２年１月から３月の間に、６，８３８の移植のみが行われた。毎年、移植が行われる件数よりも多い患者が、ＵＮＯＳリストに加えられ、その結果、移植を待つ患者の数の純増加をもたらしている。
【０００３】
さらに、新しい医薬品化合物の研究開発費は、およそ１８億ドルである。Ｐａｕｌ， ｅｔ ａｌ． （２０１０）． Ｈｏｗ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ Ｒ＆Ｄ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ： ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｙ'ｓ ｇｒａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ９（３）：２０３−２１４を参照。創薬は、薬物が発見される及び／又は設計されるプロセスである。創薬のプロセスは、一般に少なくとも次の工程を含んでいる：治療上の有効性に関する、候補の識別、合成、特徴づけ、スクリーニング、およびアッセイ。技術の進歩および生物系の理解にもかかわらず、創薬はまだ、新しい治療上の発見の率が低い、長い、高価で、非能率的なプロセスである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
１つの態様では、本明細書には、操作した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）、生きている、三次元の結合組織構成物が開示され、該三次元の結合組織構成物は、生きている、三次元の結合組織構成物を提供するために互いに凝集した、結合組織細胞、を含み；ここで、三次元の結合組織構成物は、予め形成されたスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、使用時に任意の予め形成されたスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、神経支配されていない（ｎｏｎ−ｉｎｎｅｒｖａｔｅｄ）。幾つかの実施形態では、結合組織細胞は、インビトロで多能性細胞に由来する結合組織細胞を含む。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、組織特異的な前駆体、間葉系幹／間質細胞、人工多能性幹細胞、および胚性幹細胞の１つ以上を含む。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、哺乳動物の脂肪組織に由来する。他の実施形態では、多能性細胞は、哺乳動物の骨髄に由来する。さらに他の実施形態では、多能性細胞は、非脂肪の、非骨髄組織源に由来する。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、三次元の結合組織構成物の成形前に、１つ以上の分化シグナルにさらされた。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、三次元の結合組織構成物の成形中に、１つ以上の分化シグナルにさらされた。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、三次元の結合組織構成物の成形後に、１つ以上の分化シグナルにさらされた。幾つかの実施形態において、三次元の結合組織構成物は、バイオプリントされた。さらなる実施形態では、三次元の結合組織構成物は、押出化合物をさらに含み、該押出化合物は、バイオプリンティングに対する細胞の適合性を改善する。幾つかの実施形態では、結合組織は、骨、軟骨、腱、および靭帯から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、以下の細胞タイプ：血管細胞、内皮細胞、線維芽細胞、周細胞、幹／前駆細胞、免疫細胞、の１つ以上をさらに含む。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、実質的に、シート、パッチ、環、チューブ、立方体、多面体、または球体の形態である。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、実質的に、インビボでの天然のヒト結合組織の形状または構造を模倣する形状の形態である。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、損傷、疾患、または変性の部位での被験体における移植のためのものである。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、別々の補填体の１つ以上をさらに含み、各補填体は、生体適合材料を含み、ここで１つ以上の補填体は、凝集した細胞において間隙または空間を作り出す。さらなる実施形態では、各補填体は、実質的に、細胞の移動および内方成長に抵抗する。
【０００５】
別の態様では、本明細書には、操作した、生きている、三次元の結合組織構成物のアレイが開示され、各三次元の結合組織構成物は：生きている、三次元の結合組織構成物を提供するために、多能性細胞を１つ以上の分化シグナルにさらす工程、を含むプロセスによって作り上げられ；ここで、各三次元の結合組織構成物は、予め形成されたスキャフォールドがほぼなく、培養中に維持される。幾つかの実施形態では、各三次元の結合組織構成物は、使用時に任意の予め形成されたスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態では、各三次元の結合組織構成物は、神経支配されていない。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、組織特異的な前駆体、間葉系幹／間質細胞、人工多能性幹細胞、および胚性幹細胞の１つ以上を含む。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、哺乳動物の脂肪組織に由来する。他の実施形態では、多能性細胞は、哺乳動物の骨髄に由来する。また他の実施形態では、多能性細胞は、非脂肪の、非骨髄組織源に由来する。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、三次元の結合組織構成物の成形前に、１つ以上の分化シグナルにさらされた。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、三次元の結合組織構成物の成形中に、１つ以上の分化シグナルにさらされた。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、三次元の結合組織構成物の成形後に、１つ以上の分化シグナルにさらされた。幾つかの実施形態において、各三次元の結合組織構成物は、バイオプリントされた。幾つかの実施形態では、結合組織は、骨、軟骨、腱、および靭帯から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、１つ以上の結合組織構成物は、以下の細胞タイプ：内皮細胞、線維芽細胞、幹／前駆細胞、周細胞、衛星細胞、または血管細胞、の１つ以上をさらに含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の結合組織構成物は、１つ以上の結合組織を含む複組織構成物である。さらなる実施形態では、１つ以上の結合組織構成物は、結合組織および非結合組織を含む複組織構成物である。またさらなる実施形態では、１つ以上の結合組織構成物は、骨組織および非結合組織を含む複組織構成物である。幾つかの実施形態では、アレイは、インビトロでのアッセイに使用するためのものである。さらなる実施形態では、アレイは、創薬、薬物検査、毒性学的検査、疾患モデル、三次元の生物学研究、および細胞スクリーニング、の１つ以上に使用するためのものである。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルは、機械的シグナル、生体力学的シグナル、可溶性シグナル、または物理的シグナル、あるいはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の結合組織構成物は、１つ以上の別々の補填体をさらに含み、各補填体は、生体適合材料を含み、ここで１つ以上の補填体は、凝集した細胞において間隙または空間を作り出す。さらなる実施形態では、各補填体は、実質的に、細胞の移動および内方成長に抵抗する。
【０００６】
別の態様において、本明細書には、生きている、三次元の結合組織構成物を成形する方法が開示され、該方法は：支持体（ｓｕｐｐｏｒｔ）上に堆積され、１つ以上の分化シグナルにさらされた多能性細胞を含む、バイオインクをインキュベートする工程であって、それによって、バイオインクが、凝集することができ、生きている、三次元の結合組織構成物を形成することができる工程を含み、ここで、前記インキュベートする工程は、約１時間から約３０日間の期間を有する。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、間葉系幹／間質細胞、人工多能性幹細胞、および胚性幹細胞の１つ以上を含む。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、哺乳動物の脂肪組織に由来する。他の実施形態では、多能性細胞は、哺乳動物の骨髄に由来する。さらに他の実施形態では、多能性細胞は、非脂肪の、非骨髄組織源に由来する。幾つかの実施形態では、結合組織細胞は、バイオインクを支持体上に堆積させる約１−２１日前とバイオインクを支持体上に堆積させた約１−２１日後との間の１つ以上の時間間隔で、１つ以上の分化シグナルにさらされる。幾つかの実施形態では、バイオインクは、バイオプリンティングによって堆積される。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、使用時に任意の予め形成されたスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、神経支配されていない。幾つかの実施形態では、結合組織は、骨、軟骨、腱、および靭帯から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、バイオインクは、以下の細胞タイプ：血管細胞、内皮細胞、線維芽細胞、周細胞、幹／前駆細胞、免疫細胞、の１つ以上をさらに含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、押出化合物をさらに含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルは、機械的シグナル、生体力学的シグナル、可溶性シグナル、または物理的シグナル、あるいはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、前記方法は、１つ以上の別々の補填体を堆積させる工程をさらに含み、各補填体は、生体適合性材料を含み、ここで１つ以上の補填体は、凝集した細胞において間隙または空間を作り出す。さらなる実施形態では、各補填体は、実質的に、細胞の移動および内方成長に抵抗する。幾つかの実施形態では、前記方法は、複数の、生きている、三次元の結合組織構成物を、生体適合性の表面上に又はその中に空間的に閉じ込めることによってアレイへと構築する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、損傷、疾患、または変性の部位での被験体における移植に適している。
【０００７】
別の態様では、本明細書には、生きている、三次元の結合組織構成物を成形する方法が開示され、該方法は：多能性細胞を含むバイオインクを調製する工程；バイオインクを支持体上に堆積させる工程；およびバイオインクをインキュベートする工程であって、それによって、バイオインクが、凝集することができ、生きている、三次元の結合組織構成物を形成することができる工程、を含み、ここで前記インキュベートする工程は、約１時間から約３０日間の期間を有し；但し、多能性細胞が、１つ以上の分化シグナルにさらされることを条件とする。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、間葉系幹／間質細胞、人工多能性幹細胞、および胚性幹細胞の１つ以上を含む。幾つかの実施形態では、多能性細胞は、哺乳動物の脂肪組織に由来する。他の実施形態では、多能性細胞は、哺乳動物の骨髄に由来する。さらに他の実施形態では、多能性細胞は、非脂肪の、非骨髄組織源に由来する。幾つかの実施形態では、結合組織細胞は、バイオインクを支持体上に堆積させる約１−２１日前とバイオインクを支持体上に堆積させた約１−２１日後との間の１つ以上の時間間隔で、１つ以上の分化シグナルにさらされる。幾つかの実施形態では、バイオインクは、バイオプリンティングによって堆積される。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、使用時に任意の予め形成されたスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、神経支配されていない。幾つかの実施形態では、結合組織は、骨、軟骨、腱、および靭帯から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、バイオインクは、以下の細胞タイプ：血管細胞、内皮細胞、線維芽細胞、周細胞、幹／前駆細胞、免疫細胞、の１つ以上をさらに含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、押出化合物をさらに含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルは、機械的シグナル、生体力学的シグナル、可溶性シグナル、または物理的シグナル、あるいはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、前記方法は、１つ以上の別々の補填体を堆積させる工程をさらに含み、各補填体は、生体適合性材料を含み、ここで１つ以上の補填体は、凝集した細胞において間隙または空間を作り出す。さらなる実施形態では、各補填体は、実質的に、細胞の移動および内方成長に抵抗する。幾つかの実施形態では、前記方法は、複数の、生きている、三次元の結合組織構成物を、生体適合性の表面上に又はその中に空間的に閉じ込めることによってアレイへと構築する工程をさらに含む。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、損傷、疾患、または変性の部位での被験体における移植に適している。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
本発明の新規な特徴は、特に、添付の特許請求の範囲内に明記される。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が利用される、具体例を明記する後述する詳細な説明を引用することによって、および以下の添付図面によって得られるであろう。
【０００９】
【図１】図１は、幹細胞分化の限定しない典型的なタイムラインを描写し；この場合、分化のタイムラインは、分化前、分化前後（ｐｅｒｉ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）、および分化後の期間を実証し、ここで幹細胞は、骨分化培地に接してインキュベートされる。
【図２Ａ】図２Ａは、バイオプリントされたＭＳＣ構成物の限定しない例を描写する画像である；この場合、分化培地中で培養されたバイオプリントされたＭＳＣ構成物のインサイツのアルカリフォスファターゼ染色。この図は、分化培地にさらされた構成物中のアルカリフォスファターゼの発現を実証する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、バイオプリントされたＭＳＣ構成物の限定しない例を描写する画像である；この場合、基本ＭＳＣ培地中で培養されたバイオプリントされたＭＳＣ構成物のインサイツのアルカリフォスファターゼ染色。アルカリフォスファターゼの発現は、基本ＭＳＣ培地にさらされた構成物では観察されなかった。
【図２Ｃ】図２Ｃは、バイオプリントされたＭＳＣ構成物の限定しない例を描写する、２０ｘでの顕微鏡写真である；この場合、プリント直後の分化培地中で培養され、カルシウム沈着を特定するためにアリザリンレッドＳで染色された、バイオプリントされたＭＳＣ構成物。
【図２Ｄ】図２Ｄは、バイオプリントされたＭＳＣ構成物の限定しない例を描写する、２０ｘでの顕微鏡写真である；この場合、プリント直後の基本ＭＳＣ培地中で培養され、カルシウム沈着を特定するためにアリザリンレッドＳで染色された、バイオプリントされたＭＳＣ構成物。カルシウム沈着は、基本ＭＳＣ培地にさらされた構成物では観察されなかった。
【図３】図３は、オステオポンチンの発現を検出する分化培地中のバイオプリントのインキュベーションの５日後に、ホルマリン固定された、パラフィンに組み込まれたＭＳＣ構成物の組織切片の蛍光免疫染色の限定しない顕微鏡写真であり、これは、ＭＳＣの分化および骨形成を暗示している。
【図４】図４のＡおよびＢは、骨分化培地または基本間葉系幹細胞培地のみのいずれかにおいてバイオプリントおよび培養された、間葉系幹細胞を含有している構成物を描写する、２０ｘでの顕微鏡写真である。バイオプリントされた構成物の組織学的なアルカリフォスファターゼ染色は、骨芽細胞の活性を検出するために利用された。図４のＡは、基本間葉系幹細胞培地のみにさらされた構成物中にアルカリフォスファターゼの発現がほとんど又はまったくないことを例証している。図４のＢは、骨分化培地にさらされた構成物中のアルカリフォスファターゼの発現を例証する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
２００８年の初めに、７５，８３４人が、腎臓を必要とする人として登録され、その年の終わりに、その数は、８０，９７２人に増大した。１６，５４６件の移植腎が、その年に行われたが、３３，００５人の新しい患者がリストに加えられた。腎臓を必要とする人としてＵＮＯＳによって登録された患者の２００８年の移植率は、２０％であった。待ちリストの患者の死亡率は７％であった。さらに、多くの個体が、慢性変性疾患に苦しみ、そのための移植は、現在のヘルスケアパラダイムではない。したがって、生きている、機能的な結合組織（骨、腱、靭帯など）は、大きな臨床的価値があるだろう。移植可能な組織および臓器の緊急の必要性を取り除くための、再生医療および組織工学技術の適用を促進する、材料、ツール、および技術が必要とされている。より具体的には、創傷治癒、組織修復、組織増大、臓器修復、および臓器移植に適した移植可能な組織および臓器が必要とされている。また重要なことに、持続不可能な研究開発費を課すことなく、革新的でコスト効率の良い新薬の数および品質を実質的に増加させる、材料、ツール、および技術も必要とされている。
【００１１】
以前のモデルは、意図した適用に合わせるために予め形成され形作られる、三次元のスキャフォールド材料上に細胞を蒔くことによって、操作した組織構成物を提供することに焦点を当ててきた。スキャフォールド材料上に蒔かれた細胞は、一次細胞、細胞株、操作した細胞、及び／又は幹／前駆細胞であった。多能性幹細胞または前駆細胞は、利用されるときに、三次元のスキャフォールド材料上に蒔かれる前に、二次元の単層培養において分化プログラムを受けるか、あるいは最初にスキャフォールド材料上に蒔かれ、その後、分化プログラムを受けて、インサイツのまたはインビトロで、所望の組織を生成する。従来の手法は、細胞収率、構成物内の細胞の終末分化に必要とされる時間、および結果として生じる三次元構造の全体的な細胞性の点で、面倒且つ非能率的である。
【００１２】
本発明は、再生医療および組織工学の分野に関する。より具体的には、本発明は、生きている、三次元の結合組織構成物、そのアレイ、および成形の方法に関する。三次元の結合組織構成物は、インビトロの実験（すなわち、薬剤開発、化合物スクリーニング、毒性学および疾患モデル）のために、埋込装置／治療装置として、または配置された（ａｒｒａｙｅｄ）組織構成物として有用である。
【００１３】
本明細書には、特定の実施形態において、操作した、生きている、三次元の結合組織構成物が開示され、前記三次元の結合組織構成物は：生きている、三次元の結合組織構成物を提供するために互いに凝集した、結合組織細胞を含み；ここで、三次元の結合組織構成物は、予め形成されたスキャフォールドがほぼない。
【００１４】
本明細書にはまた、特定の実施形態において、操作した、生きている、三次元の結合組織構成物のアレイが開示され、各三次元の結合組織構成物は：生きている、三次元の結合組織構成物を提供するために、多能性細胞を１つ以上の分化シグナルにさらす工程、を含むプロセスによって作り上げられ；ここで、各三次元の結合組織構成物は、予め形成されたスキャフォールドがほぼなく、培養中に維持される。
【００１５】
本明細書にはまた、特定の実施形態において、生きている、三次元の結合組織構成物を成形する方法が開示され、該方法は：支持体上に堆積され、１つ以上の分化シグナルにさらされた多能性細胞を含む、バイオインクをインキュベートする工程であって、それによって、バイオインクが、凝集することができ、生きている、三次元の結合組織構成物を形成することができる工程を含み、ここで、前記インキュベートする工程は、約１時間から約３０日間の期間を有する。
【００１６】
本明細書にはまた、特定の実施形態において、生きている、三次元の結合組織構成物を成形する方法が開示され、該方法は：多能性細胞を含むバイオインクを調製する工程；
バイオインクを支持体上に堆積させる工程；およびバイオインクをインキュベートする工程であって、それによって、バイオインクが、凝集することができ、生きている、三次元の結合組織構成物を形成することができる工程、を含み、ここで前記インキュベートする工程は、約１時間から約３０日間の期間を有し；但し、多能性細胞が、１つ以上の分化シグナルにさらされることを条件とする。
【００１７】
特定の定義
特に他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明の属する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書および添付の請求項に使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈がはっきりと特に指示していない限り、複数の言及を含む。本明細書の「または」へのあらゆる言及は、特に他に明記のない限り、「及び／又は」を包含するように意図される。
【００１８】
本明細書で使用されるように、「アレイ」は、複数の試験がサンプル上で行われることを可能にする、１つ以上の試験が複数のサンプル上で行われることを可能にする、またはその両方を可能にするように空間的に配置された、複数の要素の関連性を含む科学的ツールを意味する。
【００１９】
本明細書で使用されるように、「アッセイ」は、有機または生体のサンプル（例えば、細胞集合体、組織、臓器、有機体など）において、物質（例えば、化学物質、分子、生化学物質、タンパク質、ホルモン、または薬物など）の存在または活性を試験または測定するための手順を意味する。
【００２０】
本明細書で使用されるように、「生体適合性の」は、細胞に対する損傷または毒性の危険性が限られていることを意味する。明細書および請求項で示されるように、「生体適合性のマルチウェル容器」および「生体適合性の膜」は、哺乳動物細胞に対する損傷または毒性の危険性を限定するが、その定義は、生体適合性の要素がインビボで哺乳動物へと注入され得ると示唆するまでには至らない。
【００２１】
本明細書で使用されるように、「バイオプリンティング」は、自動化した、コンピューター支援の、三次元のプロトタイピングデバイス（例えば、バイオプリンター）と適合性のある方法を介して、細胞の三次元の、正確な堆積（例えば、細胞溶液、細胞を含有するゲル剤、細胞懸濁液、細胞濃縮液、多細胞集合体、多細胞体など）を利用することを意味する。
【００２２】
本明細書で使用されるように、「凝集する（ｃｏｈｅｒｅ）」、「凝集した（ｃｏｈｅｒｅｄ）」、および「凝集（ｃｏｈｅｓｉｏｎ）」は、細胞、多細胞集合体、多細胞体、およびそれらの層に結合する細胞間の接着特性を指す。前記用語は、「融合する（ｆｕｓｅ）」、「融合した（ｆｕｓｅｄ）」、および「融合（ｆｕｓｉｏｎ）」と交換可能に使用される。
【００２３】
本明細書で使用されるように、「多能性細胞」は、２つ以上の細胞タイプへの分化を受けることができる細胞を指す。多能性細胞は、例えば、間葉系幹／間質細胞、人工多能性幹細胞、および胚性幹細胞を含む。
【００２４】
本明細書で使用されるように、「間葉系幹／間質細胞」は、様々な細胞タイプへと潜在的に分化し、本明細書でさらに記載される特性および特徴を示す、多能性細胞の具体的なタイプを指す。幾つかの実施形態では、「間葉系幹細胞」および「間葉系間質細胞」という用語は、「間葉系幹／間質細胞」と交換可能に使用される。
【００２５】
本明細書で使用されるように、「スキャフォールド」は、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲルなどの合成のスキャフォールド、予め形成された細胞外マトリックスの層および脱細胞化組織などの非合成のスキャフォールド、および操作した組織及び／又は臓器の物理的構造にとって不可欠であり、組織及び／又は臓器の損傷／破壊なしで組織及び／又は臓器から取り除くことができない、任意の他の種類の予め形成されたスキャフォールドを指す。それ故、用語「スキャフォールドがない（ｓｃａｆｆｏｌｄｌｅｓｓ）」は、スキャフォールドが、使用時に操作した組織の不可欠な部分ではなく、取り除かれたか、または操作した組織の不活性の成分として残っているかを示唆するように意図される。「スキャフォールドがない」は、「スキャフォールドのない（ｓｃａｆｆｏｌｄ−ｆｒｅｅ）」および「予め形成されたスキャフォールドのない（ｆｒｅｅ  ｏｆ  ｐｒｅ−ｆｏｒｍｅｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄ）」と交換可能に使用される。
【００２６】
本明細書で使用されるように、「被験体」は、ヒト、ヒト以外の動物、任意の哺乳動物、または任意の脊椎動物であり得る、任意の個体を意味する。前記用語は、「患者」、「レシピエント」、および「ドナー」と交換可能である。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「組織」は、細胞の集合体を意味する。組織の例は、限定されないが、結合組織（例えば、疎性結合組織、強靭結合組織、弾性組織、網様結合組織、および脂肪組織）、筋組織（例えば、骨格筋、平滑筋および心筋）、尿生殖器組織、胃腸組織、肺組織、骨組織、神経組織、および上皮組織（例えば、単層上皮および重層上皮）、外胚葉組織、内胚葉組織、または中胚葉組織の組織を含む。
【００２８】
組織工学
組織工学は、臓器の増強、修復、または置換を介して組織機能を回復、維持、または改善する生物学的代替物の開発に向けて、工学とライフサイエンスの原理を適用して組み合わせる学際的分野である。
典型的な組織工学に対する基本的なアプローチは、生体適合性である且つ最終的に生体分解性である環境（例えば、スキャフォールド）に生細胞を蒔き、その後、始原細胞の個体群がさらに拡大する且つ成熟するように、この構成物をバイオリアクター内で培養し、移植後に標的組織をもたらすことである。生物学的な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を模倣する適切なスキャフォールドによって、発達中の組織は、インビトロおよびインビボの成熟後に所望の臓器の形態および機能の両方を取り入れ得る。しかしながら、天然組織様の構造を有する十分に高い細胞密度を達成することは、スキャフォールドの全体にわたって細胞の分布および空間的配置を制御する能力が限定されるため、困難である。これらの限定によって、結果的に、機械的性質が乏しい及び／又は機能が不十分な組織または臓器がもたらされ得る。さらなる困難は、スキャフォールドの生体分解、残留ポリマーの捕捉、および製造プロセスの工業上のスケールアップに関係している。スキャフォールドがないアプローチが試みられてきた。現在のスキャフォールドがないアプローチは、いくつかの制限を受ける：
・各層が異なる細胞型を含む、または空間的に閉じ込められる具体的な細胞区画を含む、多層構造などの、複雑な幾何学的構造は、天然組織様の結果を再生可能に達成するために、具体的なアーキテクチャー内で細胞タイプの明確で高分解能の配置を必要とし得る。
・尺度および幾何学的形状は、拡散及び／又は栄養供給に対する機能的な血管網のための必要条件によって限定される。
・組織の生存能力は、拡散を限定し、栄養に対する細胞のアクセスを制限する制限物質によって損なわれ得る。
【００２９】
本明細書には、特定の実施形態において、操作した組織、操作した結合組織構成物、それらのアレイ、および成形の方法が開示される。本明細書に開示される組織工学の方法は、以下の利点を有する：
・複合体の広いアレイ（ａ ｂｒｏａｄ ａｒｒａｙ）、三次元のトポロジーを有する、細胞を含む組織及び／又は臓器を生成することができる。
・発生生物学の原則を活用することによって、天然の組織形成プロセスの環境条件を模倣する。
・製造の自動化した手段と適合性があり、スケーラブルである。
【００３０】
バイオプリンティングは、組織修復、組織増大、および組織置換に有用な、細胞を含む移植可能な組織を生成する方法を改善することができる。バイオプリンティングはさらに、インビトロのアッセイに有用な組織を含むマイクロスケールの組織アナログを生成する方法を改善することができる。
【００３１】
バイオプリンティング
幾つかの実施形態では、結合組織部分を含む、操作した組織の少なくとも１つの成分およびそのアレイが、バイオプリントされた。さらなる実施形態では、培養組織は全体的にバイオプリントされた。またさらなる実施形態では、バイオプリントされた構成物は、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲルまたはペースト、細胞濃縮液、多細胞体（例えば、シリンダー、スフェロイド、リボンなど）（総称して「バイオインク」）、および随意に、三次元の送達装置（例えば、バイオプリンター）による生体適合性の表面上の制限物質（例えば、ヒドロゲル及び／又は多孔質膜から成る）を含む、細胞の、三次元の、自動化された、コンピューター支援の堆積に基づいて、急速なプロトタイピング技術を利用する方法で作られる。本明細書で使用されるように、幾つかの実施形態では、組織及び／又は臓器に言及するために使用されるときの、用語「操作した（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」は、細胞、細胞溶液、細胞懸濁液、細胞を含むゲルまたはペースト、細胞濃縮液、多細胞集合体（例えば、バイオインク）、およびそれらの層が、コンピュータースクリプトに従うコンピューター支援のデバイス（例えば、バイオプリンター）によって、三次元構造を形成するために位置付けられることを意味する。さらなる実施形態では、コンピュータースクリプトは、例えば、１つ以上のコンピュータープログラム、コンピューターアプリケーション、またはコンピューターモジュールである。またさらなる実施形態では、三次元の組織構造は、初期の形態形成における自己集合現象に類似した細胞またはバイオインクのプリンティング後の融合を介して形成される。
【００３２】
手動での配置を含む三次元構造をもたらすために、生体適合性の表面上に、細胞、バイオインク（例えば、多細胞体）、及び／又はそれらの層を配置する多くの方法が利用可能であるが、バイオプリンターなどの、自動化した、コンピューター支援の機器による位置決めが利点となっている。この技術による細胞または多細胞体の送達の利点は、細胞、バイオインク（例えば、多細胞体）、及び／又は様々な組成物を有するそれらの層の、計画された又は予め決められた配向またはパターンを示す構成物をもたらすために、細胞またはバイオインク（例えば、多細胞体）の、急速で、正確で、および再生可能な配置を含むことである。利点はまた、細胞損傷を最小限にしながら、確かな高い細胞密度を含むこともある。
【００３３】
幾つかの実施形態では、バイオプリンティングの方法は、連続的及び／又はほぼ連続的である。連続的なバイオプリンティング方法の限定しない例は、バイオインクの貯蔵器に接続された分注チップ（例えば、注射器、キャピラリーチューブなど）を介してバイオプリンターからバイオインクを分注（ｄｉｓｐｅｎｓｅ）することである。さらに限定しない実施形態では、連続的なバイオプリンティング方法は、機能ユニットの繰り返しのパターンでバイオインクを分注することである。様々な実施形態では、繰り返しの機能ユニットは、例えば、円、正方形、長方形、三角形、多角形、および不規則な幾何学的形状を含む、任意の適切な幾何学的構造を有する。さらなる実施形態では、バイオプリントされた機能ユニットの繰り返しのパターンは、層を含み、複数の層は、隣接してバイオプリントされ（例えば、積み重ねられ）、操作した組織または臓器を形成する。様々な実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上の層は、隣接してバイオプリントされ（例えば、積み重ねられ）、操作した組織または臓器を形成する。
【００３４】
幾つかの実施形態では、バイオプリントされた機能ユニットは、碁盤目状のパターンで繰り返す。「碁盤目状のパターン」は、重なりや間隙で平面を満たさない図の平面である。
連続的な及び／又は碁盤目状のバイオプリンティングの利点は、バイオプリントされた組織の増加した生産性を含むということである。別の限定しない潜在的な利点は、バイオプリンターを、以前に堆積したバイオインクの要素と並べる必要性を排除することであり得る。連続的なバイオプリンティングはまた、随意に注射器の機構を使用して、バイオインクの大きな貯蔵器からのより大きな組織の印刷を促進し得る。
【００３５】
連続的なバイオプリンティングでの方法は、印刷高さ、ポンプ速度、ロボット速度、またはそれらの組み合わせなどのパラメーターを、独立してまたは互いに関連させて、最適化及び／又は平衡化することを含み得る。一例では、堆積のためのバイオプリンターヘッドの速度は、３ｍｍ／ｓであり、分注の高さは、第１層に関しては０．５ｍｍであり、各々の続く層に関しては、０．４ｍｍ増加した。幾つかの実施形態では、分注の高さは、バイオプリンターの分注チップの直径とほぼ等しい。限定することなく、適切及び／又は最適な分注の距離によって、結果的に物質が分注針にぴったり付く（ｆｌａｔｔｅｎｉｎｇ）または接着することはない。様々な実施形態では、バイオプリンターの分注チップは、約２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００μｍ、またはそれ以上の内径を有し、それらにおいてインクリメント（ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｓ）を含む。様々な実施形態において、バイオプリンターのバイオインク貯蔵器は、約．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００立方センチメートル、またはそれ以上の容積を有し、それらにおいてインクリメントを含む。ポンプ速度は、システムにおける残留圧力の上昇が低いときに、適切及び／又は最適であり得る。好都合なポンプ速度は、貯蔵器と分注針の断面積間の比率に依存し得、比率が大きいほど、より低いポンプ速度を必要とする。幾つかの実施形態では、適切な及び／又は最適なプリント速度によって、物質の機械的完全性に影響を与えることなく、一様な線の堆積が可能となる。
【００３６】
本明細書に開示される本発明は、ビジネス方法を含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される技術および方法の速度およびスケーラビリティーは、移植のための操作した組織及び／又は臓器の作成、またはインビトロでのアッセイなどの、調査および開発のための細胞ベースのツールの作成における使用のための、産業施設及び／又は商業施設を設計、建築、かつ経営するために利用される。さらなる実施形態では、操作した組織及び／又は臓器およびそれらのアレイは、例えば、創傷治癒、組織修復、組織増大、臓器修復、および臓器置換のための移植可能な組織として、生成、保存、分配され、市場に出され、広告、および販売される。またさらなる実施形態では、操作した組織及び／又は臓器およびそれらのアレイは、例えば、バイオアッセイおよび高スループットの薬物スクリーニングのための、細胞アレイ（例えば、マイクロアレイまたはチップ）、組織アレイ（例えば、マイクロアレイまたはチップ）、およびキットとして、作成、保存、分配され、市場に出され、広告、および販売される。他の実施形態では、操作した組織及び／又は臓器およびそれらのアレイは、サービスとしてバイオアッセイ及び／又は薬物スクリーニングを行うために生成される且つ利用される。
【００３７】
結合組織構成物を含む操作した組織
本明細書には、幾つかの実施形態において、生きている、三次元の組織構成物が開示され、該三次元の組織構成物は：互いに凝集した、結合組織細胞を含み；ここで、三次元の結合組織構成物は、予め形成されたスキャフォールドがほぼない。さらなる実施形態では、構成物は、成形時及び／又は使用時に、予め形成されたスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態では、組織は、結合組織構成物である。それ故、本明細書にはまた、幾つかの実施形態において、生きている、三次元の結合組織構成物が開示され、該三次元の結合組織構成物は：生きている、三次元の結合組織構成物を提供するために互いに凝集した、結合組織細胞を含み；ここで、三次元の結合組織構成物は、使用時に予め形成されたスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態では、結合組織細胞は、間葉系幹／間質細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞などの、多能性細胞に由来する。
【００３８】
幾つかの実施形態では、結合組織を含む操作した組織は、バイオプリントされ、本明細書に方法論が記載される。さらなる実施形態では、組織は、プリンティング時及び／又は使用時に、本明細書でさらに記載されるような任意の予め形成されたスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態では、バイオプリンティングを含む、組織工学技術によって作り上げられた結果として、本発明の組織は、有機体の一部として、インビボで発達した組織とはさらに区別される。幾つかの実施形態では、本明細書に記載される操作した組織は、有機体の一部として、インビボで発達した組織との構造的な及び構成上の違いによって特徴付けられる。限定しない例として、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される操作した組織は、神経支配されていないか、または機能的な神経系を欠いている。さらに限定しない例として、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される操作した組織は、機能的な免疫系を欠いている。さらに限定しない例として、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される操作した組織は、血液構成成分を欠いている。
【００３９】
幾つかの実施形態では、結合組織を含む操作した組織は、任意のタイプの哺乳動物細胞を含む。様々なさらなる実施形態では、結合組織を含む操作した組織は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の細胞タイプを含む。幾つかの実施形態では、操作した組織は、幹細胞を含む。さらなる実施形態では、操作した組織は、間葉系幹／間質細胞、人工多能性幹細胞、及び／又は胚性幹細胞などの、多能性細胞を含む。
【００４０】
幾つかの実施形態では、多能性細胞（例えば、間葉系幹／間質細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞など）の幾つか又はすべては、組織の成形時に、未分化される且つ多能性である。さらなる実施形態では、多能性細胞の幾つか又はすべては、例えば、組織の成形時に、骨細胞、軟骨細胞、または脂肪細胞と一致して、ある程度、１つ以上の組織特異的な表現型へと部分的に分化される。さらなる実施形態では、多能性細胞の幾つか又はすべては、例えば、組織の成形時に、骨細胞、軟骨細胞、または脂肪細胞と一致して、１つ以上の組織特異的な表現型に完全に分化される。
【００４１】
幾つかの実施形態では、多能性細胞（例えば、間葉系幹／間質細胞、人工多能性幹細胞、胚性幹細胞など）は、生きている、三次元の結合組織構成物を提供するために、１つ以上の分化シグナルにさらされた。様々な実施形態では、多能性細胞は、組織構成物を形成するために、バイオインクを堆積させる前、間、または後の１つ以上の時間間隔で、１つ以上の分化シグナルにさらされた。さらなる実施形態では、多能性細胞は、細胞を使用するバイオインクの調製前に、１つ以上の分化シグナルにさらされた。さらなる実施形態では、多能性細胞は、バイオインクを使用する組織の成形前に、１つ以上の分化シグナルにさらされた。さらなる実施形態では、多能性細胞は、バイオインクを使用する組織の成形後に、１つ以上の分化シグナルにさらされた。
【００４２】
他の実施形態では、操作した組織は、例えば、哺乳動物の内皮細胞及び／又は哺乳動物の線維芽細胞をさらに含む。幾つかの実施形態では、結合組織を含む操作した組織の細胞は、互いに「凝集」または「接着」している。さらなる実施形態では、凝集または接着は、細胞およびバイオインク（例えば、多細胞集合体、多細胞体など）、及び／又はそれらの層を結合する細胞間の接着特性を指す。
【００４３】
結合組織構成物を含む操作した組織は、様々な実施形態において、任意の適切な大きさである。幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含むバイオプリントされた組織の大きさは、時間とともに変化する。さらなる実施形態では、バイオプリントされた組織は、例えば、細胞移動、細胞死、細胞間の相互作用、収縮、または縮化の他の形態が原因で、バイオプリンティング後に縮化または収縮する。他の実施形態では、バイオプリントされた組織は、例えば、細胞移動、細胞の成長および増殖、細胞成熟、または拡大の他の形態が原因で、バイオプリンティング後に成長または拡大する。
【００４４】
幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む操作した組織の物理的な寸法は、結合組織構成物を内部に拡散するために、酸素を含む栄養素に対する能力によって限定される。様々な実施形態では、結合組織構成物を含む操作した組織は、バイオプリンティング時に、最小の寸法で、少なくとも約、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、または１０００μｍであり、それらにおいてインクリメントを含む。様々な実施形態では、結合組織構成物を含む操作した組織は、バイオプリンティング時に、最小の寸法で、少なくとも約０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、１．７５、２．０、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、または５．０ｍｍであり、それらにおいてインクリメントを含む。
さらなる実施形態では、結合組織構成物を含む操作した組織は、バイオプリンティング時に、最小の寸法で、約５０μｍと約５００μｍの間である。
【００４５】
幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む操作した組織の物理的な寸法は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、または５００ｍｍの幅であり、それらにおいてインクリメントを含む。
【００４６】
幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む操作した組織の物理的な寸法は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、または５００ｍｍの長さであり、それらにおいてインクリメントを含む。
【００４７】
結合組織構成物を含む操作した組織は、様々な実施形態において、任意の適切な形状である。幾つかの実施形態では、形状は、特定の天然の組織または臓器を模倣するために選択される。さらなる実施形態では、形状は、特定の病理、疾病、または疾患の状態を模倣するために選択される。幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む操作した組織は、ほぼ平面の形状を有する。さらなる実施形態では、平面の組織は、限定しない例として、四角形、長方形、多角形、円形、卵形、または不規則な形状を含む、任意の適切な平面の幾何学的形状を有する。幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む操作した組織は、実質的にシートまたはパッチの形状を有する。幾つかの実施形態では、操作した組織は、実質的にチューブ、環、ディスク、またはサックの形状を有する。さらなる実施形態では、サックは、１つの閉じた端部を有する、ロールドシート、またはチューブである。
【００４８】
幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む操作した組織は、空間に限局される、生体適合材料によって１つ以上の側面上に空間的に閉じ込められる。さらなる実施形態では、結合組織構成物を含む操作した組織は、表面に付けられる。さらなる実施形態では、操作した組織は、生体適合性の表面に付けられる。またさらなる実施形態では、複数の組織は、本明細書に記載されるように、表面に付けられることによって関連付けられ、アレイを形成するように空間的に配置される。幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む操作した組織は、機械的または生体力学的な力にさらされる。さらなる実施形態では、可溶性の、機械的または生体力学的な力の適用は、組織の分化、成熟、および発達を促進する、及び／又は組織内の細胞の移動、分化、または増殖を促進する役割を果たす。
【００４９】
細胞
本明細書には、幾つかの実施形態において、１つ以上のタイプの哺乳動物細胞を含む操作した結合組織が開示される。幾つかの実施形態では、操作した組織は、結合組織細胞を含む。幾つかの実施形態では、結合組織細胞は、多能性細胞に由来する。さらなる実施形態では、結合組織細胞は、間葉系幹／間質細胞に由来する。さらなる実施形態では、結合組織細胞は、人工多能性幹細胞に由来する。さらなる実施形態では、結合組織細胞は、胚性幹細胞に由来する。またさらなる実施形態では、操作した組織は、ヒト多能性細胞を含む。またさらなる実施形態では、操作した組織は、ヒト間葉系幹／間質細胞を含む。またさらなる実施形態では、操作した組織は、ヒト人工多能性幹細胞を含む。またさらなる幾つかの実施形態では、操作した組織は、ヒト胚性幹細胞を含む。
【００５０】
本明細書にはまた、幾つかの実施形態において、多能性細胞を含む、生きている、三次元の組織構成物が開示され、ここで、多能性細胞は、結合組織細胞または結合組織関連の細胞を生成するために、１つ以上の分化シグナルにさらされた。さらなる実施形態では、操作した組織は、例えば、哺乳動物の内皮細胞及び／又は哺乳動物の線維芽細胞をさらに含む。
【００５１】
幾つかの実施形態では、操作した組織は、未分化細胞を含む。さらなる実施形態では、「未分化細胞」は、例えば、骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、線維芽細胞、または内皮細胞の明確な組織特異的な特性を有さない又は失くした細胞である。幾つかの実施形態では、非分化細胞は、幹細胞を含む。幾つかの実施形態では、「幹細胞」は、効能および自己複製を示す細胞である。幹細胞は、限定されないが、全能細胞、万能細胞、多能性細胞、少能性細胞、単能性細胞、および前駆細胞を含む。幹細胞は、胚性幹細胞、成体幹細胞、羊膜の幹細胞、および人工多能性幹細胞であり得る。さらに他の実施形態では、細胞は、分化細胞および未分化細胞の混合物である。幾つかの実施形態では、操作した組織は、間葉系幹／間質細胞を含む。さらなる実施形態では、「間葉系幹／間質細胞」は、様々な細胞タイプへと潜在的に分化し、本明細書でさらに記載される特性および特徴を示す、多能性細胞である。またさらなる実施形態では、用語「間葉系間質細胞」は、「間葉系幹／間質細胞」と交換可能に使用される。
【００５２】
幾つかの実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞へと分化する能力を含む、多系列の間葉系分化の可能性を有するヒト細胞である。またさらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、標準のインビトロでの組織培養を分化する条件を使用して、骨芽細胞、軟骨芽細胞、および脂肪細胞に分化する可能性を有している。幾つかの実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、特定可能な表面抗原の発現パターンを示す。さらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、表面抗原ＣＤ１０５（エンドグリンとしても知られる）、ＣＤ７３（エクト ５’−ヌクレオチダーゼとしても知られる）およびＣＤ９０（Ｔｈｙ−１としても知られる）を発現する。幾つかの実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、間葉系幹細胞の培養物中に恐らく存在するであろう、他の細胞に特異的な表面抗原の発現を欠いている。さらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、ＣＤ４５（全（ｐａｎ−）白血球マーカー）；ＣＤ３４（初期の造血前駆細胞および内皮細胞上に存在する）；ＣＤ１４およびＣＤ１１ｂ（単球およびマクロファージ上で顕著に発現される）；ＣＤ７９ａおよびＣＤ１９（Ｂ細胞のマーカー）；およびＨＬＡ−ＤＲの発現を欠いている。幾つかの実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、組織培養フラスコを使用して標準の培養条件で維持されたときに、プラスチックへの付着を示す。幾つかの実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、「間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ）」の最も広く許容された定義を提供する、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ （ＩＳＣＴ）に対応するヒト細胞である。Ｄｏｍｉｎｉｃｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ．Ｍｉｎｉｍａｌ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｆｏｒ ｄｅｆｉｎｉｎｇ ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ． Ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｔａｔｅｍｅｎｔ． Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ （２００６） Ｖｏｌ． ８， Ｎｏ． ４， ３１５−３１７を参照。
【００５３】
幾つかの実施形態では、適切な多能性細胞（例えば，幹細胞）は、限定しない例として、脂肪組織、骨髄、羊水、および臍帯組織を含む組織に由来する。さらなる実施形態では、幹細胞の幾つか又はすべては、哺乳動物の吸引脂肪組織に由来する。幾つかの実施形態では、適切な幹細胞は、哺乳動物の脂肪組織または骨髄に由来する間葉系幹／間質細胞である。他の実施形態では、間葉系幹／間質細胞の幾つか又はすべては、非脂肪の、非骨髄組織源に由来する。他の実施形態では、非脂肪の、非骨髄組織源（間葉系幹／間質細胞はこれらに由来する）は、血液、尿、泌尿器組織（膀胱、尿管、尿道など）、腎臓、肺、肝臓、胃、腸、気管、食道、膵臓、皮膚、口腔粘膜、歯系組織（歯、髄など）、軟骨、骨、脳、神経、胎盤、筋組織、網、中皮、腹膜、鼻通路の内膜、または生殖組織（子宮、卵管など）から選択される。
【００５４】
幾つかの実施形態では、操作した組織は、１つ以上のタイプの分化細胞を含む。さらなる実施形態では、「分化細胞」は、分離時に、例えば、平滑筋細胞、線維芽細胞、または内皮細胞と一致した、組織特異的な表現型を有する細胞であり、ここで、組織特異的な表現型（または表現型を示す可能性）は、分離時から使用時まで維持される。
【００５５】
幾つかの実施形態では、任意の哺乳動物細胞は、操作した組織およびそのアレイにおける更なる包含に適している。さらなる実施形態では、哺乳動物細胞は、限定しない例として、収縮細胞または筋細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、および筋芽細胞）、結合組織細胞（例えば、骨細胞、軟骨細胞（ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｃｅｌｌｓ）、線維芽細胞、および骨形成細胞および軟骨細胞へと分化する細胞）、骨髄細胞、内皮細胞、皮膚細胞、上皮細胞、乳腺細胞、血管細胞、血液細胞、リンパ細胞、神経細胞、シュワン細胞、胃腸細胞、肝細胞、膵細胞、肺細胞、気管細胞、角膜細胞、尿生殖器細胞、腎細胞、生殖細胞、脂肪細胞、実質細胞、周細胞、中皮細胞、間質細胞、未分化細胞（例えば、胚細胞、幹細胞、および前駆細胞）、内胚葉由来の細胞、中胚葉由来の細胞、外胚葉由来の細胞、およびそれらの組み合わせである。１つを超える細胞タイプを含む実施形態では、細胞タイプは、多くの適切な比率で存在し、それらの例は本明細書に記載される。
【００５６】
１つの実施形態では、操作した組織は、内皮細胞を含む。別の実施形態では、操作した組織は、線維芽細胞を含む。別の実施形態では、操作した組織は、内皮細胞および線維芽細胞を含む。幾つかの実施形態では、内皮細胞は、ヒト内皮細胞である。幾つかの実施形態では、適切な内皮細胞は、組織を含むことから生じた、限定しない例として、血液、血管、リンパ管を含む組織、消化管の組織、尿生殖路の組織、脂肪組織、気道の組織、生殖器系の組織、骨髄、および臍帯の組織から生じた。幾つかの実施形態では、線維芽細胞は、ヒト線維芽細胞である。幾つかの実施形態では、適切な線維芽細胞は、皮膚線維芽細胞などの、非血管性の線維芽細胞である。他の実施形態では、適切な線維芽細胞は、血管外膜に由来する。幾つかの実施形態では、細胞の幾つか又はすべては、哺乳動物の吸引脂肪組織に由来する。さらなる実施形態では、細胞の幾つか又はすべては、哺乳動物の吸引脂肪組織の間質血管細胞群から培養される。
【００５７】
様々な実施形態では、細胞タイプ及び／又は細胞源は、具体的な研究目的または対象に基づいて、選択、構成、処理、または調節される。幾つかの実施形態では、１つ以上の具体的な細胞タイプは、特定の疾患または疾病の検査を促進するために、選択、構成、処理、または調節される。幾つかの実施形態では、１つ以上の具体的な細胞タイプは、特定の被験体の疾患または疾病の検査を促進するために、選択、構成、処理、または調節される。幾つかの実施形態では、１つ以上の具体的な細胞タイプは、２つ以上の異なるヒトのドナーに由来する。幾つかの実施形態では、１つ以上の具体的な細胞タイプは、特定の脊椎動物の被験体に由来する。さらなる実施形態では、１つ以上の具体的な細胞タイプは、特定の哺乳動物の被験体に由来する。またさらなる実施形態では、１つ以上の具体的な細胞タイプは、特定のヒト被験体に由来する。
【００５８】
細胞を培養する方法
本発明の操作した組織で使用される細胞タイプは、当該技術分野に既知の任意の方法で培養され得る。細胞および組織の培養の方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｃｅｌｌ ＆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ； Ｆｒｅｓｈｎｅｙ （１９８７）， Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ： Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓに記載され、それらの内容は、そのような情報のための引用によって本明細書に組み込まれる。本発明と併用して使用され得る、一般的な哺乳動物の細胞培養技術、細胞株、および細胞培養系も、Ｄｏｙｌｅ， Ａ．， Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ， Ｊ． Ｂ．， Ｎｅｗｅｌｌ， Ｄ． Ｇ．， （ｅｄｓ．） Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ， Ｗｉｌｅｙ （１９９８）に記載され、それらの内容は、そのような情報のための引用によって本明細書に組み込まれる。
【００５９】
培養中の哺乳動物細胞のための適切な成長条件は、当該技術分野に周知である。細胞培養培地は、一般に、必須栄養素を含み、随意に、成長因子、塩、ミネラル、ビタミンなどの、追加の要素を含み、これらは培養されている細胞タイプに従って選択され得る。特定の成分は、細胞の増殖、分化、特異タンパク質の分泌などを増強するために選択され得る。一般に、標準的な成長培地は、１０−２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、子ウシ血清、またはヒト血清が補足された、１１０ｍｇ／Ｌのピルベートおよびグルタミンを用いる、低グルコースのダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含み、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンが、当業者に周知の様々な他の標準的な培地として適切である。好ましくは、細胞は、細胞の起源の動物の体温で又はそれに近い温度で、１−２１％のＯ２および好ましくは３−５％のＣＯ２の大気中において無菌条件下で培養される。例えば、ヒト細胞は、好ましくは、およそ３７℃で培養される。間葉系幹／間質細胞に関して、適切な培養培地は、Ｌ−グルタミンが補足された低グルコースのＤＭＥＭにおいて５−１０％（ｖ：ｖ）のウシ胎児血清を含有している基本培地を含む。随意に、間葉系幹／間質細胞は、酸素張力が（大気中の酸素張力と同等の）２１％未満である条件において、培養且つ拡大される。幾つかの実施形態では、細胞は、３−５％の酸素条件で培養される。
【００６０】
細胞はまた、所望の株（ｌｉｎｅ）に沿って細胞の分化を誘発する細胞の分化剤によって培養され得る。例えば、幾つかの実施形態では、幹細胞は、様々な細胞タイプを生成するために、分化培地に接してインキュベートされる。多くのタイプの分化培地が適切である。様々な実施形態では、幹細胞は、限定しない例として、骨分化培地、軟骨分化培地、脂肪分化培地、神経分化培地、心筋細胞分化培地、および腸細胞分化培地（例えば、腸上皮）を含む、分化培地に接してインキュベートされる。間葉系幹／間質細胞に関して、幾つかの実施形態では、細胞は、限定しない例として、骨分化培地、軟骨分化培地、または脂肪分化培地を含む、分化培地に接してインキュベートされる。
【００６１】
さらに、細胞は、成長因子、サイトカインなどで培養され得る。幾つかの実施形態では、用語「成長因子」は、細胞によって生成され、それ自体に及び／又は様々な他の隣接する又は離れた細胞に影響を与える、タンパク質、ポリペプチド、またはサイトカインを含むポリペプチドの複合体を指す。典型的に、成長因子は、特異的なタイプの細胞の成長及び／又は分化に、発達上で、または複数の生理学的または環境上の刺激に反応してのいずれかで、影響を与える。すべてではないが、幾つかの成長因子は、ホルモンである。典型的な成長因子は、インスリン、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）を含む線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＰＤＧＦ−ＡＡおよびＰＤＧＦ−ＡＢを含む血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、形質転換成長因子アルファ（ＴＧＦ−α）、ＴＧＦβ１およびＴＧＦβ３を含む形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、表皮成長因子（ＥＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、ＩＬ−８などである。成長因子は、とりわけ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ， Ｄａｒｎｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， １９８６； Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， ２ｄ ｅｄ．， Ｌａｎｚａ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ２０００において議論される。当業者は、本明細書に記載される調整培地中の任意の及びすべての培養由来の成長因子が本発明の範囲内にあると理解するであろう。
【００６２】
バイオインクおよび多細胞集合体
本明細書には、特定の実施形態において、結合組織構成物を含む組織、そのアレイ、およびバイオプリントされた細胞を含む方法が開示される。幾つかの実施形態では、細胞は、バイオプリンターからバイオインクを堆積させる又は押し出すことによってバイオプリントされる。幾つかの実施形態では、「バイオインク」は、複数の細胞を含む、液体、半固体、または固体の組成物を含む。
【００６３】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、液体または半固体の細胞溶液、細胞懸濁液、または細胞濃縮液を含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、半固体または固体の多細胞集合体または多細胞体を含む。さらなる実施形態では、バイオインクは、１）結果的にバイオインクをもたらすために、予め決められた割合で複数の細胞または細胞集合体を生体適合性の液体またはゲルと混合することによって、および２）所望の細胞密度および粘性を有するバイオインクを生成するために、バイオインクを圧縮する（ｃｏｍｐａｃｔｉｎｇ）ことによって生成される。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、遠心分離、タンジェント流ろ過（「ＴＦＦ」）、またはそれらの組み合わせによって達成される。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、結果的に、押し出し成形できる組成物をもたらし、多細胞集合体または多細胞体の形成を可能にする。幾つかの実施形態では、「押し出し成形できる」は、ノズルまたは開口部（ｏｒｉｆｉｃｅ）（例えば、１つ以上の穴またはチューブ）を通して押し進める（ｆｏｒｃｉｎｇ）（例えば、圧力下で）ことによって形作られることが可能であることを意味する。幾つかの実施形態では、バイオインクの圧縮は、適切な密度まで細胞を成長させることから結果的に生じる。バイオインクに必要な細胞密度は、使用されている細胞および生成されている組織または臓器に応じて異なる。幾つかの実施形態では、バイオインクの細胞は、凝集及び／又は接着される。幾つかの実施形態では、「凝集する」、「凝集した」、および「凝集」は、細胞、多細胞集合体、多細胞体、及び／又はそれらの層を結合する細胞間の接着特性を指す。さらなる実施形態では、前記用語は、「融合する」、「融合した」、および「融合」と交換可能に使用される。幾つかの実施形態では、バイオインクはさらに、支持材、細胞培養培地、細胞外マトリックス（またはその成分）、細胞接着剤、細胞死抑制剤、抗アポトーシス性薬剤、抗酸化剤、押出化合物、およびそれらの組み合わせを含む。
【００６４】
様々な実施形態では、細胞は、任意の適切な細胞である。さらなる様々な実施形態では、細胞は、脊椎動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞、またはそれらの組み合わせである。
幾つかの実施形態では、細胞は、幹細胞を含む。さらなる実施形態では、幹細胞は、ヒト幹細胞である。幾つかの実施形態では、細胞は、間葉系幹／間質細胞を含む。さらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、ヒト間葉系幹／間質細胞である。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法に使用される細胞のタイプは、生成されている構成物または組織のタイプに依存する。幾つかの実施形態では、バイオインクは、１つのタイプの細胞を含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、１つを超えるタイプの細胞を含む。
【００６５】
細胞培養培地
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞培養培地を含む。細胞培養培地は、任意の適切な培地である。様々な実施形態では、適切な細胞培養培地は、限定しない例として、ダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水、Ｅａｒｌｅ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔｓ、Ｈａｎｋｓ’  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔｓ、Ｔｙｒｏｄｅ’ｓ  Ｓａｌｔｓ、オルシーバー液、Ｇｅｙ’ｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｋｒｅｂ’ｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ、Ｋｒｅｂ’ｓ−Ｒｉｎｇｅｒ  Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｐｕｃｋ’ｓ  Ｓａｌｉｎｅ、ダルベッコ変法イーグル培地、ダルベッコ変法イーグル培地／栄養素Ｆ−１２Ｈａｍ、栄養素混合物Ｆ−１０Ｈａｍ（Ｈａｍ’ｓ  Ｆ−１０）、培地１９９、最少必須培地イーグル、ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ａｍｅｓ’  Ｍｅｄｉａ、ＢＧＪｂ培地（Ｆｉｔｔｏｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｃｌｉｃｋ’ｓ培地、ＣＭＲＬ−１０６６培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、Ｇｌａｓｃｏｗ最少必須培地（ＧＭＥＭ）、Ｉｓｃｏｖｅ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ変法培地、ＮＣＴＣ媒体、Ｓｗｉｍ’ｓ Ｓ−７７培地、Ｗａｙｍｏｕｔｈ培地、Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ培地Ｅ、あるいはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は、変更されるか又は補足される。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は、アルブミン、セレン、トランスフェリン、フェチュイン、砂糖、アミノ酸、ビタミン、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗生物質、脂質、脂質担体、シクロデキストリン、またはそれらの組み合わせをさらに含む。幾つかの実施形態では、細胞培養培地は、幹細胞分化培地である。さらなる実施形態では、幹細胞分化培地は、限定しない例として、骨分化培地、軟骨分化培地、または脂肪分化培地である。
【００６６】
細胞外マトリックス
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞外マトリックスまたはその誘導体の１つ以上の成分をさらに含む。幾つかの実施形態では、「細胞外マトリックス」は、細胞によって生成され、細胞から細胞外空間へと輸送されるタンパク質を含み、ここで、タンパク質は、組織を一緒に保持するための支持として機能することで、引っ張り強度を提供し、及び／又は細胞シグナル伝達を促進する。細胞外マトリックス成分の例は、限定されないが、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ヒアルロナート、エラスチン、およびプロテオグリカンを含む。例えば、多細胞集合体は、様々なＥＣＭタンパク質（例えば、ゼラチン、フィブリノゲン、フィブリン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、エラスチン、及び／又はプロテオグリカン）を含み得る。ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、多細胞集合体を形成するために使用される細胞ペーストに加えられ得る。細胞ペーストに加えられたＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、ヒトまたは動物源から精製され得るか、または当該技術分野に既知の組換え方法によって生成され得る。あるいは、ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、細長い細胞体中の細胞によって自然に分泌され得るか、または細長い細胞体を作るために使用される細胞は、当該技術分野に公知の任意の適切な方法によって遺伝子操作され得ることで、１以上のＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体及び／又は１以上の細胞接着分子または細胞基質接着分子（例えば、セレクチン、インテグリン、免疫グロブリン、およびアドヒリン（ａｄｈｅｒｉｎｓ））の発現レベルを変化させることができる。ＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分の誘導体は、多細胞集合体中の細胞の凝集を促進し得る。例えば、ゼラチン及び／又はフィブリノゲンは、細胞ペーストに適切に加えられ得、多細胞集合体を形成するために使用される。その後、フィブリノゲンは、トロンビンを加えることによってフィブリンに転換され得る。
【００６７】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞接着を促進する薬剤をさらに含む。
【００６８】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、細胞死（例えば、壊死、アポトーシス、または自己貪食）を阻害する薬剤をさらに含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、抗アポトーシス性薬剤をさらに含む。細胞死を阻害する薬剤は、限定されないが、小分子、抗体、ペプチド、ペプチ体（ｐｅｐｔｉｂｏｄｉｅｓ）、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、細胞死を阻害する薬剤は、抗ＴＮＦ薬剤、インターロイキンの活性を阻害する薬剤、インターフェロンの活性を阻害する薬剤、ＧＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）の活性を阻害する薬剤、マクロファージ炎症タンパク質の活性を阻害する薬剤、ＴＧＦ−Ｂ（形質転換成長因子Ｂ）の活性を阻害する薬剤、ＭＭＰ（マトリックスメタロプロテアーゼ）の活性を阻害する薬剤、カスパーゼの活性を阻害する薬剤、ＭＡＰＫ／ＪＮＫシグナル伝達カスケードの活性を阻害する薬剤、Ｓｒｃキナーゼの活性を阻害する薬剤、ＪＡＫ（ヤヌス・キナーゼ）の活性を阻害する薬剤、またはそれらの組み合わせから選択される。幾つかの実施形態では、バイオインクは、抗酸化剤を含む。
【００６９】
押出化合物
幾つかの実施形態では、バイオインクは、押出化合物（すなわち、バイオインクの押出特性を変更する化合物）をさらに含む。押出化合物の例は、限定されないが、ゲル、ヒドロゲル、界面活性剤ポリオール（例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７またはＰＦ−１２７）、熱応答性ポリマー、ＵＶ光応答性ポリマー、ヒアルロナート、アルギナート、細胞外マトリックス成分（およびその誘導体）、ゼラチン、コラーゲン、ペプチドヒドロゲル、他の生体適合性の天然または合成のポリマー、ナノファイバー、および自己集合性ナノファイバーを含む。
【００７０】
ときにゼリーとも呼ばれるゲルは、様々な方法で定義されてきた。例えば、米国薬局方（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ）は、ゲルを、液体がしみこんだ小さな無機粒子または大きな有機分子のいずれかで構成された懸濁液から成る半固体系として定義している。ゲルは、単相系または二相系を含む。単相ゲルは、分散した巨大分子と液体との間に明らかな境界が存在しないような方法で、液体全体に均一に分布される有機巨大分子から成る。幾つかの単相ゲルは、合成巨大分子（例えば、カルボマー）または天然ゴム（例えば、トラガカント）から調製される。幾つかの実施形態では、単相ゲルは、一般的に水性であるが、アルコールおよび油を用いても作成されるであろう。二相ゲルは、小さな別個の分子の網目（ｎｅｔｗｏｒｋ）から成る。
【００７１】
ゲルはまた、疎水性ゲルまたは親水性ゲルとして分類することができる。特定の実施形態では、疎水性ゲルの基材（ｂａｓｅ）は、ポリエチレンを有する液体パラフィンまたはコロイド状シリカでゲル化された脂肪油、またはアルミニウム石鹸または亜鉛石鹸から成る。対照的に、疎水性ゲルの基材は、通常、水、グリセロール、または適切なゲル化剤（例えば、トラガカント、デンプン、セルロースの誘導体、カルボキシビニルポリマー、マグネシウム−アルミニウムシリケート）でゲル化したプロピレングリコールから成る。特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物またはデバイスのレオロジーは、擬プラスチック、プラスチック、チキソトロピック、またはダイラタントである。
【００７２】
適切なヒドロゲルは、コラーゲン、ヒアルロナート、フィブリン、アルギナート、アガロース、キトサン、およびそれらの組み合わせに由来するものを含む。他の実施形態では、適切なヒドロゲルは、合成ポリマーである。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体、ポリ（酸化エチレン）およびそのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、およびそれらの組み合わせに由来するものを含む。様々な具体的な実施形態では、制限物質は、ヒドロゲル、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）、アガロース、アルギナート、ゼラチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ヒアルロナン、ポロクサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ（イソプロピルｎ−ポリアクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリラート（ＰＥＧ−ＤＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ（乳酸）、シリコン、シルク、ペプチドヒドロゲル、またはそれらの組み合わせから選択される。
【００７３】
幾つかの実施形態では、ヒドロゲルベースの押出化合物は、（熱応答性のゲルまたは温熱ゲル（ｔｈｅｒｍｏｇｅｌｓ）としても知られる）熱可逆性のゲルである。幾つかの実施形態では、適切な熱可逆性のヒドロゲルは、室温で液体ではない。具体的な実施形態では、適切なヒドロゲルのゲル化温度（Ｔｇｅｌ）は、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃に、約３５℃、および約４０℃であり、それらにおいてインクリメントを含む。特定の実施形態では、適切なヒドロゲルのＴｇｅｌは、約１０℃乃至約２５℃である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるバイオインク（例えば、ヒドロゲル、１つ以上の細胞タイプ、他の添加剤などを含む）は、室温で液体ではない。具体的な実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのゲル化温度（Ｔｇｅｌ）は、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、および約４０℃であり、それらにおいてインクリメントを含む。特定の実施形態では、本明細書に記載されるバイオインクのＴｇｅｌは、約１０℃乃至約２５℃である。
【００７４】
ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンで構成されたポリマーは、水溶液に組み入れられると、熱可逆性のゲルを形成する。これらのポリマーは、バイオプリンター機器において維持することができる温度で、液態からゲル状態まで変化する能力を有する。液態からゲル状態の相転移は、ポリマー濃度および溶液中の成分に依存する。
【００７５】
ポロクサマー４０７（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ１２７またはＰＦ‐１２７）は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーから成る非イオン性界面活性剤である。他のポロクサマーは、１８８（Ｆ−６８グレード）、２３７（Ｆ−８７グレード）、３３８（Ｆ−１０８グレード）を含む。ポロクサマーの水溶液は、酸、アルカリ、および金属イオンの存在下で安定している。ＰＦ−１２７は、市販で入手可能な、１３，０００の平均分子量を有する、一般式Ｅ１０６ Ｐ７０ Ｅ１０６のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレントリブロックコポリマーである。このポリマーは、ポリマーのゲル化性を増強する適切な方法によってさらに精製することができる。前記ポリマーは、その親水性の割合を占める、約７０％のエチレンオキシドを含有している。前記ポリマーは、ポロクサマーＡＢＡ型ブロックコポリマーのシリーズの１つである。ＰＦ−１２７は、良好な可溶化能力を有し、毒性が低く、したがって、適切な押出化合物と考えられる。
【００７６】
幾つかの実施形態では、本明細書で示されるヒドロゲルおよびバイオインクの粘度は、記載される任意の手段で測定される。例えば、幾つかの実施形態では、ＬＶＤＶ‐ＩＩ＋ＣＰ Ｃｏｎｅ ＰｌａｔｅＶｉｓｃｏｍｅｔｅｒおよびＣｏｎｅ Ｓｐｉｎｄｌｅ ＣＰＥ‐４０が、ヒドロゲルおよびバイオインクの粘度を算出するために使用される。他の実施形態では、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（スピンドルおよびカップ）の粘度計が、ヒドロゲルおよびバイオインクの粘度を算出するために使用される。幾つかの実施形態では、本明細書で参照される粘度範囲は、室温で測定される。他の実施形態では、本明細書で参照される粘度範囲は、体温（例えば、健康なヒトの平均体温）で測定される。
【００７７】
さらなる実施形態では、ヒドロゲル及び／又はバイオインクは、約５００乃至１，０００，０００センチポアズ、約７５０乃至１，０００，０００センチポアズ；約１０００乃至１，０００，０００センチポアズ；約１０００乃至４００，０００センチポアズ；約２０００乃至１００，０００センチポアズ；約３０００乃至５０，０００センチポアズ；約４０００乃至２５，０００センチポアズ；約５０００乃至２０，０００センチポアズ；または約６０００乃至１５，０００センチポアズの間の粘度を有していることを特徴とする。
【００７８】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、連続的なバイオプリンティングに適した細胞および押出化合物を含む。具体的な実施形態では、バイオインクは、約１５００ｍＰａ・ｓの粘度を有する。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７と細胞物質の混合物は、連続的なバイオプリンティングに適し得る。そのようなバイオインクは、４８時間にわたる冷たい（４℃）リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の連続混合によるＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７の粉末を、３０％（ｗ／ｖ）まで溶解することによって調製され得る。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７はまた、水中で溶解され得る。細胞は、標準の無菌の細胞培養技術を使用して、培養且つ拡大され得る。細胞は、例えば２００ｇでペレットにされ（ｐｅｌｌｅｔｅｄ）得、３０％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７中で再懸濁され、および約１０乃至約２５℃のゲル化温度で凝固することを可能にするバイオプリンターに付けられたリザーバーへと吸引される。バイオプリンティング前のバイオインクのゲル化は随意である。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７を含有するバイオインクを含む、バイオインクは、液体として分注され得る。
【００７９】
様々な実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７の濃度は、適切な粘度及び／又は細胞毒性の特性を有する任意の値であり得る。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７は、その適切な濃度によって、バイオプリントされたときに、その形状を保持しながら重さを支えることも可能であり得る。幾つかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７の濃度は、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％である。幾つかの実施形態では、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７の濃度は、約３０％と約４０％の間、または約３０％と約３５％の間である。
【００８０】
幾つかの実施形態では、バイオインクの細胞構造がない成分（例えば、押出化合物など）は、使用前に取り除かれる。さらなる実施形態では、細胞構造がない成分は、例えば、ヒドロゲル、界面活性剤ポリオール、熱応答性ポリマー、ヒアルロナート、アルギナート、コラーゲン、または他の生体適合性の天然または合成のポリマーである。またさらなる実施形態では、細胞構造がない成分は、物理的、化学的、または酵素的な手段によって取り除かれる。幾つかの実施形態では、細胞構造がない成分の割合（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ）は、使用時の細胞成分と関連したままである。
【００８１】
幾つかの実施形態では、細胞は、細胞間相互作用を増加させるように予め処理される。
例えば、細胞は、バイオインクを形作る前に、細胞間相互作用を増強するために、遠心分離後に遠心管の内部で適切にインキュベートされ得る。
【００８２】
典型的な細胞の比率
幾つかの実施形態では、バイオインクは、多細胞体を含み、これはさらに、間葉系幹／間質細胞を含む。さらなる実施形態では、バイオインクは。多細胞体を含み、これはさらに、間葉系幹／間質細胞および１つ以上の他の細胞タイプを含む。またさらなる実施形態では、バイオインクは多細胞体を含み、これはさらに、間葉系幹／間質細胞および内皮細胞、線維芽細胞、または内皮細胞および線維芽細胞の両方を含む。
【００８３】
幾つかの実施形態では、バイオインクは、間葉系幹／間質細胞の、他の細胞タイプに対する任意の適切な比率を用いて調製される。例えば、幾つかの実施形態では、バイオインクは、約５：１から約２０：１の間の、間葉系幹／間質細胞の内皮細胞に対する比率を用いて調製される。様々なさらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞の内皮細胞に対する比率は、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１、約１５：１、約１６：１、約１７：１、約１８：１、約１９：１、または約２０：１であり、それらにおいてインクリメントを含む。またさらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞の内皮細胞に対する比率は、約９：１である。
【００８４】
さらなる例として、幾つかの実施形態では、バイオインクは、約５：１から約２０：１の間の、間葉系幹／間質細胞の線維芽細胞に対する比率を用いて調製される。様々な更なる実施形態では、間葉系幹／間質細胞の線維芽細胞に対する比率は、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１、約１５：１、約１６：１、約１７：１、約１８：１、約１９：１、または約２０：１であり、それらにおいてインクリメントを含む。またさらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞の線維芽細胞に対する比率は、約９：１である。
【００８５】
細胞の自己選別（Ｓｅｌｆ−ｓｏｒｔｉｎｇ）
幾つかの実施形態では、構成物または組織を形成するために使用される多細胞集合体は、操作した組織に含められるすべての細胞タイプ（例えば、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞など）を含み；このような例では、各細胞タイプは、結合組織構成物などの操作した組織を形成するために、（例えば、成熟の間に）適切な位置へと遊走する。他の実施形態では、構造を形成するために使用される多細胞集合体は、操作した組織に含められるすべての細胞タイプより少ない細胞タイプを含む。幾つかの実施形態では、各タイプの細胞は、多細胞集合体または組織の領域または層内に均一に分散される。他の実施形態では、各タイプの細胞は、多細胞集合体または組織の領域または層内の特定の領域に局在化する。
【００８６】
分化シグナル
幾つかの実施形態において、本明細書には、互いに凝集した結合組織細胞を含む、操作した組織およびそのアレイが開示され、ここで、結合組織細胞は多能性細胞に由来する。
本明細書にはまた、互いに凝集した多能性細胞を含む、操作した組織およびそのアレイが開示され、ここで、多能性細胞は１つ以上の分化シグナルにさらされた。様々な実施形態では、多能性細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の分化シグナルにさらされた。
【００８７】
分化シグナルのタイプ
幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルは、機械的シグナル、生体力学的シグナル、または物理的シグナル、またはそれらの組み合わせを含む。さらなる実施形態では、機械的シグナル、生体力学シグナル、または物理的シグナルは、限定しない例として、伸長、曲げ、圧縮、増加した大気圧、流動によって引き起こされた剪断力、およびそれらの組み合わせを含む。
【００８８】
幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルは、化学的シグナルまたは生化学的シグナル、またはその組み合わせを含む。さらなる実施形態では、化学的シグナルまたは生化学的シグナルは、限定しない例として、栄養素、ホルモン、成長因子、または化学薬剤への露出を含む。
【００８９】
幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルは、分化培地中のインキュベーションを含む。さらなる実施形態では、分化培地は、１つ以上の具体的な表現型への幹細胞のインビトロでの培養物の分化を支持、促進する、及び／又は引き起こす。またさらなる実施形態では、分化培地は、骨形成、軟骨形成、及び／又は脂肪形成を介する、１つ以上の結合組織の表現型への間葉系幹／間質細胞のインビトロでの培養物の分化を支持、促進する、及び／又は引き起こす。
【００９０】
１つ以上の分化シグナルへの露出には、広範囲の適切な持続時間がある。様々な実施形態では、幹細胞は、限定しない例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０秒間、またはそれ以上の間、１つ以上の分化シグナルにさらされ、それらにおいてインクリメントを含む。様々な実施形態では、幹細胞は、限定しない例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０分間、またはそれ以上の間、１つ以上の分化シグナルにさらされ、それらにおいてインクリメントを含む。幾つかの実施形態では、幹細胞は、限定しない例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、またはそれ以上の間、１つ以上の分化シグナルにさらされ、それらにおいてインクリメントを含む。幾つかの実施形態では、幹細胞は、限定しない例として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間、またはそれ以上の間、１つ以上の分化シグナルにさらされ、それらにおいてインクリメントを含む。
【００９１】
分化シグナルへの露出の期間
操作した組織構成物の成形に関連した、多くの期間が、１つ以上の分化シグナルへの多能性細胞（例えば、幹細胞）の露出に適している。幾つかの実施形態では、幹細胞は、組織構成物の成形前に、１つ以上の分化シグナルにさらされる。さらなる実施形態では、細胞は、バイオインクの生成前に、または組織構成物を形成するために細胞／バイオインクの堆積の前（例えば堆積前（ｐｒｅ−ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ））に、細胞培養中に１つ以上の分化シグナルにさらされる。またさらなる実施形態では、１つ以上の分化シグナルへの堆積前の露出は、組織構成物を形成するために、細胞／バイオインクの堆積の、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日目前、またはそれより前にある。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルへの堆積前の露出は、組織構成物を形成するために、細胞／バイオインクの堆積の、約５日前から約２１日前にある。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルへの堆積前の露出は、組織構成物を形成するために、細胞／バイオインクの堆積の、約０日前から約５日前にある。
【００９２】
幾つかの実施形態では、幹細胞は、組織構成物及の成形時ごろに、及び／又は成形の間に、１つ以上の分化シグナルにさらされる。さらなる実施形態では、細胞は、バイオインクの生成時ごろに、及び／又は生成の間に、１つ以上の分化シグナルにさらされる。さらなる実施形態では、細胞は、組織構成物を形成するために、細胞／バイオインクの堆積時ごろに、及び／又は堆積の間（例えば、堆積前後）に、１つ以上の分化シグナルにさらされる。またさらなる実施形態では、１つ以上の分化シグナルへの堆積前後の露出は、組織構成物を形成するために、細胞／バイオインクの堆積の、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間以内、またはそれより前にある。またさらなる実施形態では、１つ以上の分化シグナルへの堆積前後の露出は、組織構成物を形成するために、細胞／バイオインクの堆積の、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、日以内、またはそれより前にある。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルへの堆積前後の露出は、組織構成物を形成するために、細胞／バイオインクの堆積の約５日間以内にある。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルへの堆積前後の露出は、組織構成物を形成するために、細胞／バイオインクの堆積の約２日間以内にある。
【００９３】
幾つかの実施形態では、幹細胞は、組織構成物の成形後に、１つ以上の分化シグナルにさらされる。さらなる実施形態では、細胞は、組織構成物（例えばポスト沈着）を形成するために、細胞／バイオインクの堆積後に、培養物中で１つ以上の分化シグナルにさらされる。またさらなる実施形態では、１つ以上の分化シグナルへの堆積後の露出は、組織構成物を形成するために、細胞／バイオインクの堆積の、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日後、またはそれより後にある。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルへの堆積後の露出は、組織構成物を形成するために、細胞／バイオインクの堆積の、約１日後から約２１日後にある。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルへの堆積後の露出は、組織構成物を形成するために、細胞／バイオインクの堆積の、約０日後から約５日後にある。
【００９４】
幾つかの実施形態では、バイオインク及び／又は結合組織構成物中の間葉系幹／間質細胞の幾つかの部分は、限定しない例として、骨細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞を含む、哺乳動物の結合組織中に存在する細胞タイプへの部分的または完全な分化を特徴とする。様々な実施形態では、間葉系幹／間質細胞の、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８、９９、または１００パーセントは、分化の程度を示す。
【００９５】
図１を参照すると、特定の実施形態において、様々な期間が、骨分化培地への間葉系幹／間質細胞の露出に適している。本実施形態では、３つの適切な期間が、例えば、バイオプリンターを介する細胞の堆積による組織構成物の成形に関連して定義される。本実施形態ではさらに、間葉系幹／間質細胞は、随意に、堆積前、堆積前後、及び／又は堆積後に、骨分化培地にさらされる。この場合、堆積前の期間は、堆積の５日前から堆積の日まで及び；堆積前後の期間は、堆積の２日前から堆積の３日後まで及び；および堆積前後の期間は、堆積の日から堆積の５日後まで及ぶ。
【００９６】
幾つかの実施形態において、本明細書には、互いに凝集した間葉系幹／間質細胞を含む、操作した結合組織およびそのアレイが開示され、ここで、間葉系幹／間質細胞は、生きている、三次元の結合組織構成物を提供するために、１つ以上の分化シグナルにさらされた。
【００９７】
幾つかの実施形態では、結合組織は、限定しない例として、骨、軟骨、腱、靭帯、およびそれらの組み合わせである。幾つかの実施形態では、結合組織、例えば、骨、軟骨、腱、靭帯、それらの組み合わせ、および非結合組織を含む、複組織である。さらなる実施形態では、軟骨および骨は、関節修復に使用される結合組織を形成するために、層状組織において組み合わせられ得る。さらなる実施形態では、操作した結合組織構成物は、移植可能な医療機器または医療用補装具と適合するように設計され得、医療機器または医療用補装具の移植または機能を増強する。幾つかの実施形態では、靭帯は、手術分娩または移植を助けるために、または分娩後に機能を増強するために、一端または両端上に涙骨組織を含むように操作され得る。またさらなる実施形態では、腱は、手術分娩または移植を助けるために、または分娩後に機能を増強するために、一端上の涙骨組織、及び／又は対向する他端上の筋組織を用いて操作され得る。
【００９８】
分化の評価
種々様々な技術および方法は、具体的な組織表現型への多能性細胞（例えば、幹細胞）の分化の評価に適している。幾つかの実施形態では、顕微鏡法および染色は、具体的な化学物質、細胞表面抗原、細胞小器官、細胞構造、及び／又は細胞群を特定することによって、分化を評価するために使用される。結合組織の表現型への間葉系幹／間質細胞の分化の評価に関して、幾つかの実施形態では、（カルシウム結晶を染色する）アリザリンレッドＳ及び／又はフォン・コッサ（リン酸カルシウム堆積物を染色する）が、骨形成を特定する、および随意に定量化するために利用される。さらなる例として、アルカリフォスファターゼの高まったレベルは、この酵素が骨芽細胞活性の副産物であるために生じる活性な骨形成を示し；それ故、幾つかの実施形態では、アルカリフォスファターゼ染色が、骨表現型への分化を検出するために使用される。幾つかの実施形態では、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）が、具体的な化学物質、細胞表面抗原、細胞小器官、細胞構造、及び／又は細胞群を特定することによって、分化を評価するために使用される。結合組織の表現型への間葉系幹／間質細胞の分化の評価に関して、幾つかの実施形態では、オステオポンチン（骨芽細胞中で発現された細胞外の構造タンパク質）のためのＥＬＩＳＡが、骨形成を特定する、および随意に定量化するために利用される。
【００９９】
図２Ａおよび２Ｂを参照すると、特定の実施形態では、間葉系幹細胞を含有している構成物は、骨分化培地または基本間葉系幹細胞培地のみのいずれかにおいてバイオプリントおよび培養された。バイオプリントされた構成物のインサイツのアルカリフォスファターゼ染色が、骨芽細胞活性を検出するために利用された。図２Ａは、骨分化培地にさらされた構成物中のアルカリフォスファターゼの発現を例証する。図２Ｂは、基本間葉系幹細胞培地のみにさらされた構成物中にアルカリフォスファターゼの発現がほとんど又はまったくないことを例証している。
【０１００】
図２Ｃおよび２Ｄを参照すると、特定の実施形態では、間葉系幹細胞を含有している構成物は、バイオプリンティング直後に、骨分化培地または基本間葉系幹細胞培地のみのいずれかにおいてバイオプリントおよび培養された。カルシウム沈着は、アリザリンレッドＳ染色によって特定された。図２Ｃは、骨分化培地にさらされた構成物中のカルシウム沈着を例証する。図２Ｄは、基本間葉系幹細胞培地のみにさらされた構成物中に存在するカルシウムがほとんど又はまったくないことを例証している。
【０１０１】
図３を参照すると、特定の実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、バイオインクを生成するために培養および使用され、これは、組織構成物を形成するためにバイオプリントされた。分化培地中の５日間のプリント後のインキュベーション後、結果として生じる組織は、切断され、ホルマリン固定され、およびパラフィン包埋された。オステオポンチンの発現のための構成物の蛍光免疫染色が行われた。例証された反応は、間葉系幹細胞の分化および骨形成を暗示している。
【０１０２】
図４のＡおよびＢを参照すると、特定の実施形態では、間葉系幹細胞を含有している構成物は、骨分化培地または基本間葉系幹細胞培地のみのいずれかにおいてバイオプリントおよび培養された。バイオプリントされた構成物の組織学的なアルカリフォスファターゼ染色が、骨芽細胞活性を検出するために利用された。図４のＡは、基本間葉系幹細胞培地のみにさらされた構成物中にアルカリフォスファターゼの発現がほとんど又はまったくないことを例証している。図４のＢは、骨分化培地にさらされた構成物中のアルカリフォスファターゼの発現を例証する。
【０１０３】
予め形成されたスキャフォールド
幾つかの実施形態では、本明細書には、結合組織構成物を含む、操作した結合組織、およびそのアレイが開示され、これらは、任意の予め形成されたスキャフォールドがほぼない。さらなる実施形態では、「スキャフォールド」は、ポリマースキャフォールドおよび多孔性ヒドロゲルなどの合成のスキャフォールド、予め形成された細胞外マトリックスの層および脱細胞化組織などの非合成のスキャフォールド、および操作した組織及び／又は臓器の物理的構造に不可欠である、および組織及び／又は臓器から取り除かれない、任意の他のタイプの予め形成されたスキャフォールドを指す。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む、操作した結合組織、およびそのアレイは、例えば、組織の形成、組織の任意の層、または組織の形状の形成のために、予め形成されたスキャフォールドを利用しない。限定しない例として、本発明の操作した組織は、ポリマースキャフォールドなどの、予め形成された合成のスキャフォールド、予め形成された細胞外マトリックス層、または任意の他のタイプの予め形成されたスキャフォールドを利用しない。幾つかの実施形態では、操作した組織は、予め形成されたスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態では、組織の細胞成分は、検出可能であるが、微量または取るに足らない量のスキャフォールド、例えば、全組成物の２．０％未満、全組成物の１．０％未満、全組成物の０．５％未満、または全組成物の０．１％未満を含む。またさらなる実施形態では、微量または取るに足らない量のスキャフォールドは、組織、またはそのアレイの長期的な作用に影響を与える、またはその主要な生体機能を妨害するには不十分である。さらなる実施形態では、スキャフォールド成分は、物理的、化学的、または酵素的な方法によって、プリンティング後に取り除かれ、スキャフォールド成分がない又はほぼない、操作した組織をもたらす。
【０１０５】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示される、予め形成されたスキャフォールドのない又はほぼない操作した組織は、スキャフォールド材が最初に形成される組織工学の特定の他の方法によって発達された組織とは対照的であり、その後、細胞は、スキャフォールド上へと蒔かれ、続いて、例えば、スキャフォールドの形状を満たす及びとるために増殖する。１つの態様では、本明細書に記載されるバイオプリンティングの方法は、予め形成されたスキャフォールドがほぼない、生存可能で有用な組織の生成を可能にする。別の態様では、本発明の細胞は、幾つかの実施形態において、制限物質を使用して、所望の三次元形状で保持される。制限物質は、少なくとも、制限物質が細胞及び／又は組織からの一時的なものであり及び／又は除去可能であるという事実から、スキャフォールドとは異なる。
【０１０６】
アレイ
幾つかの実施形態では、本明細書には、結合組織構成物を含む、操作した組織のアレイが開示される。幾つかの実施形態では、「アレイ」は、複数の試験がサンプル上で行われることを可能にする、１つ以上の試験が複数のサンプル上で行われることを可能にする、またはその両方を可能にするように空間的に配置された、複数の要素の関連性を含む科学的ツールである。幾つかの実施形態では、アレイは、スクリーニングの方法および機器に適応しているか又は適合性があり、これは、高スループットのスクリーニングに関連するアレイを含む。さらなる実施形態では、アレイによって、複数の試験を同時に行うことができる。さらなる実施形態では、アレイによって、複数のサンプルを同時に試験することができる。幾つかの実施形態では、アレイは、細胞のマイクロアレイである。さらなる実施形態では、細胞のマイクロアレイは、固体担体の表面上の生細胞の多重の照合（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）を可能にする研究ツールである。他の実施形態では、アレイは、組織のマイクロアレイである。さらなる実施形態では、組織のマイクロアレイは、アレイにおいて集められた複数の個別の組織または組織サンプルを含み、これによって、複数の生化学的、代謝的、分子的、または組織学的な解析の実施が可能となる。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む、操作した組織は、各々、生体適合性のマルチウェル容器のウェル中に存在する。幾つかの実施形態では、各組織は、ウェルに入れられる。他の実施形態では、各組織は、ウェルへとバイオプリントされる。さらなる実施形態では、ウェルは、コーティングされる。様々なさらなる実施形態では、ウェルは、生体適合性のヒドロゲル、１つ以上のタンパク質、１つ以上の化学薬品、１つ以上のペプチド、１つ以上の抗体、および１つ以上の成長因子の１つ以上、またはそれらの組み合わせでコーティングされる。幾つかの実施形態では、ウェルは、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）でコーティングされる。他の実施形態では、ウェルは、アガロースでコーティングされる。幾つかの実施形態では、各組織は、生体適合性のマルチウェル容器のウェル内の、多孔性の、生体適合性の膜上に存在する。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む、操作した組織は、１つ以上の側面上の生体適合性の表面によって制限される（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ）。幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む、操作した組織は、１つ以上の側面上の生体適合性の表面によって制限されることにより、アレイ形状で保持される。またさらなる実施形態では、組織は、１、２、３、４、またはそれ以上の側面上の生体適合性の表面によって制限される。
【０１０９】
幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む、操作した組織は、１つ以上の側面上の生体適合性の表面に付けられる。幾つかの実施形態では、生体適合性の表面は、組織または組織に接触する有機体に対する損傷または毒性の大きな危険をもたらさない任意の表面である。さらなる実施形態では、生体適合性の表面は、従来の組織培養法に適した任意の表面である。適切な生体適合性の表面は、限定しない例として、処理されたプラスチック、膜、多孔質膜、コーティングされた膜、コーティングされたプラスチック、金属、コーティングされた金属、ガラス、およびコーティングされたガラスを含み、ここで、適切なコーティングは、ヒドロゲル、ＥＣＭ成分、化学薬品、タンパク質などを含む。
【０１１０】
幾つかの実施形態では、１つ以上の側面上の生体適合性の表面に操作した組織を付けることによって、機械的または生体力学的な力に組織をさらすことが促進される。さらなる実施形態では、結合組織構成物を含む、操作した組織は、機械的または生体力学的な力にさらされる。様々な実施形態では、操作した組織は、１、２、３、４、またはそれ以上の側面上で機械的または生体力学的な力にさらされる。
【０１１１】
幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む、操作した組織のアレイは、２つ以上の要素の関連を含む。様々な実施形態では、アレイは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００の要素の関連を含み、それらにおいてインクリメントを含む。さらなる実施形態では、各要素は、１つ以上の細胞、多細胞集合体、組織、臓器、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１１２】
幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む、操作した組織のアレイは、予め決められたパターンで空間的に配置された複数の要素を含む。さらなる実施形態では、パターンは、要素の任意の適切な空間的配置である。様々な実施形態では、配置のパターンは、限定しない例として、二次元のグリッド、三次元のグリッド、１本以上の線、アーク（ａｒｃ）、または円、一連の列またはカラムなどを含む。さらなる実施形態では、パターンは、高スループットのバイオアッセイまたはスクリーニングの方法または機器との適合性のために選択される。
【０１１３】
様々な実施形態では、アレイにおいて１つ以上の組織を成形するために使用される細胞タイプ及び／又は細胞源は、具体的な研究目的または対象に基づいて選択される。さらなる様々な実施形態では、アレイにおける具体的な組織は、具体的な研究目的または対象に基づいて選択される。幾つかの実施形態では、１つ以上の具体的な操作した組織は、特定の疾患または疾病の検査を促進するために、アレイに含まれる。幾つかの実施形態では、１つ以上の具体的な操作した組織は、特定の被験体の疾患または疾病の検査を促進するために、アレイに含まれる。さらなる実施形態では、アレイ内の１つ以上の具体的な操作した組織は、２以上の異なるヒトのドナーに由来する１つ以上の細胞タイプを用いて生成される。幾つかの実施形態では、アレイ内の各組織は、細胞タイプ、細胞源、細胞の層、細胞の比率、構成の方法、サイズ、形状などに関してほぼ類似している。他の実施形態では、アレイ内の組織の１つ以上は、細胞タイプ、細胞源、細胞の層、細胞の比率、構成の方法、サイズ、形状などに関して特有である。様々な実施形態では、アレイ内の組織の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、またはそれ以上は、特有である。他の様々な実施形態では、アレイ内の組織の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％は、特有である。
【０１１４】
幾つかの実施形態では、アレイ内の１つ以上の組織は、人体における１つ以上の具体的な組織を表わす。さらなる実施形態では、アレイ内の１つ以上の個々の組織は、限定しない例として、血管またはリンパ管、筋肉、子宮、神経、粘膜、中皮、網、角膜、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、気管、肺、骨、骨髄、脂肪、結合組織、膀胱、胸、膵臓、ひ臓、脳、食道、胃、腸、結腸、直腸、卵巣、前立腺、内胚葉、外胚葉、および中胚葉を含む、ヒト組織を表わす。１つの実施形態では、アレイ内の組織は、被験体におけるすべての主要な組織タイプを表わすために選択される。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、アレイ内の各組織は、培養下で独立して維持される。さらなる実施形態では、アレイ内の各組織の培養条件は、それらが他の組織から分離され、培地または培地において可溶性である因子に取って代わる（ｅｘｃｈａｎｇｅ）ことができないような条件である。他の実施形態では、アレイ内の２つ以上の個々の組織は、可溶性因子に取って代わる。さらなる実施形態では、アレイ内の２つ以上の個々の組織の培養条件は、それらが培地および培地において可溶性である因子を他の組織と交換するような条件である。様々な実施形態では、アレイ内の組織の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、またはそれ以上は、培地及び／又は可溶性の因子に取って代わる。他の様々な実施形態では、アレイ内の組織の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％は、培地及び／又は可溶性の因子に取って代わる。
【０１１６】
インビボでのアッセイ
幾つかの実施形態では、本明細書で開示される、結合組織構成物を含む、操作した結合組織、およびそのアレイは、インビボでのアッセイに使用される。幾つかの実施形態では、「アッセイ」は、有機サンプルまたは生体サンプル（例えば、細胞集合体、組織、臓器、有機体など）において、物質（例えば、化学物質、分子、生化学物質、薬物など）の存在または活性を試験または測定するための手順である。さらなる実施形態では、アッセイは、定性的アッセイおよび定量的アッセイを含む。またさらなる実施形態では、定量的アッセイは、サンプル中の物質の量を測定する。
【０１１７】
様々な実施形態では、結合組織構成物を含む、操作した組織およびアレイは、分子結合（放射リガンド結合を含む）、分子摂取、活性（例えば、酵素活性および受容体活性など）、遺伝子発現、タンパク質発現、受容体のアゴニズム、受容体拮抗、細胞シグナル伝達、アポトーシス、抗癌剤感受性、トランスフェクション、細胞移動、走化性、細胞の生存率、細胞増殖、安全性、有効性、代謝、毒性、および乱用傾向、の１つ以上を検出または測定するためのアッセイに使用される。
【０１１８】
幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む、操作した組織およびそのアレイは、免疫学的アッセイに使用される。さらなる実施形態では、免疫学的アッセイは、競合的な免疫学的アッセイまたは非競合的な免疫学的アッセイである。競合的な免疫学的アッセイでは、例えば、サンプル中の抗原は、抗体と結合するために標識抗原と競合し、その後、抗体の部位に結合した標識抗原の量が測定される。（「サンドイッチアッセイ」とも呼ばれる）非競合的な免疫学的アッセイでは、例えば、サンプル中の抗原は、抗体の部位に結合され；続いて、標識抗体が、抗原に結合され、その後、部位上の標識抗体の量が測定される。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、結合組織構成物を含む、操作した組織およびそのアレイは、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で使用される。さらなる実施形態では、ＥＬＩＳＡは、サンプル中の抗体または抗原の存在を検出するために使用される生化学的な技術である。ＥＬＩＳＡでは、例えば、特定の抗原に対する特異性を有する少なくとも１つの抗体が利用される。さらなる例として、未知の量の抗原を有するサンプルは、非特異的に（表面への吸収を介して）または特異的に（「サンドイッチ」のＥＬＩＳＡにおいて同じ抗原に特異的な別の抗体による捕捉を介して）のいずれかで、固体担体（例えば、ポリスチレン・マイクロタイタープレート）上で不動化される。またさらなる例として、抗原が不動化された後、検出抗体が加えられ、抗原との複合物を形成する。検出抗体は、例えば、酵素に共有結合され得るか、またはバイオ結合を介して酵素に結合される第２抗体によって、それ自体が検出され得る。
【０１２０】
例えば、幾つかの実施形態では、細胞の、アレイ、マイクロアレイ、またはチップ、多細胞集合体、または組織は、薬物スクリーニングまたは創薬に使用される。さらなる実施形態では、組織の、アレイ、マイクロアレイ、またはチップは、薬物スクリーニングまたは創薬のためのキットの一部として使用される。幾つかの実施形態では、各結合組織構成物は、生体適合性のマルチウェル容器のウェル内に存在し、ここで、容器は、１つ以上の自動化した薬物スクリーニングの方法及び／又は機器と適合性がある。さらなる実施形態では、自動化した薬物スクリーニングの方法及び／又は機器は、コンピューターまたはロボット支援である任意の適切な手順または機器を含む。
【０１２１】
さらなる実施形態では、薬物スクリーニングのアッセイまたは創薬のアッセイのためのアレイは、任意の治療分野に潜在的に有用な薬物を調査また開発するために使用される。またさらなる実施形態では、適切な治療分野は、限定しない例として、伝染病、血液学、腫瘍学、小児科学、心臓学、中枢神経系疾患、神経病学、消化器病学、肝臓学、泌尿器学、不妊症、眼科学、腎臓病学、整形外科、疼痛管理、精神医学、肺臓学、ワクチン、創傷治癒、生理学、薬理学、皮膚科学、遺伝子療法、毒性学、および免疫学を含む。
【０１２２】
方法
本明細書には、幾つかの実施形態において、結合組織構成物を含む組織を構成する方法が開示され、該方法は、随意に間葉系幹／間質細胞に由来する、結合組織細胞を含むバイオインクを調製する工程；バイオインクを支持体上に堆積させる工程；およびバイオインクをインキュベートする工程であって、それによって、バイオインクが、凝集することができ、生きている、三次元の結合組織構成物を形成することができる工程、を含み、ここで前記インキュベートする工程は、約１時間から約３０日間の期間を有する。本明細書にはまた、幾つかの実施形態において、結合組織構成物を含む組織を構成する方法が開示され、該方法は、間葉系幹／間質細胞を含むバイオインクを調製する工程；バイオインクを支持体上に堆積させる工程；およびバイオインクをインキュベートする工程であって、それによって、バイオインクが、凝集することができ、生きている、三次元の結合組織構成物を形成することができる工程、を含み、ここで前記インキュベートする工程は、約１時間から約３０日間の期間を有する。幾つかの実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、バイオインクを支持体上に堆積させる約１−２１日前と、バイオインクを支持体上に堆積させた約１−２１日間後との間の１以上の時間間隔で、１つ以上の分化シグナルにさらされる。幾つかの実施形態では、前記方法は、バイオプリンティングを利用する。さらなる実施形態では、前記方法は、使用時に任意の予め形成されたスキャフォールドのない又はほぼない、結合組織構成物を含む操作した組織を生成する。
【０１２３】
バイオインクの調製
幾つかの実施形態では、前記方法は、１つ以上のタイプの哺乳動物細胞を含むバイオインクを調製する工程を含む。さらなる実施形態では、前記方法は、結合組織細胞を含むバイオインクを調製する工程を含む。さらなる実施形態では、前記方法は、結合組織細胞を含むバイオインクを調製する工程を含み、ここで結合組織細胞は、間葉系幹／間質細胞に由来する。幾つかの実施形態では、前記方法は、間葉系幹／間質細胞をさらに含むバイオインクを調製する工程を含む。さらなる実施形態では、前記方法は、間葉系幹／間質細胞を含むバイオインクを調製する工程を含み、ここで間葉系幹／間質細胞は、１つ以上の分化シグナルにさらされた。幾つかの実施形態では、前記方法は、内皮細胞及び／又は線維芽細胞をさらに含むバイオインクを調製する工程を含む。
【０１２４】
本明細書に記載される特徴を有するバイオインクを製造するための様々な方法がある。幾つかの実施形態では、バイオインクは、複数の生細胞を含有している又は所望の細胞密度および粘度を有する細胞ペーストから成形される。さらなる実施形態では、細胞ペーストは、所望の形状および成熟（例えば、インキュベーション）によって形成された多細胞体へと形作られる。特定の実施形態では、細長い多細胞体は、複数の生細胞を含む細胞ペーストを細長い形状（例えば、シリンダー）へと形作ることによって生成される。さらなる実施形態では、細胞ペーストは、細胞が互いに接着及び／又は凝集して、細長い多細胞体を形成することができる、制御環境においてインキュベートされる。別の特定の実施形態では、多細胞体は、細胞ペーストを保持する機器中の複数の生細胞を含む細胞ペーストを三次元形状に形作ることによって生成される。さらなる実施形態では、細胞ペーストは、制御環境においてインキュベートされるが、一方で、平面上でそれ自体を支持するのに十分な凝集を有する体を生成するために十分な時間、三次元形状に保持される。
【０１２５】
様々な実施形態では、細胞ペーストは：（Ａ）（１つ以上の細胞タイプの）細胞または細胞凝集物を、細胞培養培地などの、生体適合性のゲルまたは液体と、（例えば、予め決められた比率で）混合して、結果として細胞懸濁液をもたらすこと、および（Ｂ）細胞懸濁液を圧縮して、所望の細胞密度および粘度を有する細胞ペーストを生成すること、によって提供される。様々な実施形態では、圧縮は、細胞培養から結果として生じた特定の細胞懸濁液を濃縮して、胞ペーストに必要とされる、所望の細胞濃度（密度）、粘度、および整合性を達成することなどの、多くの方法によって達成される。特定の実施形態では、細胞培養からの比較的希薄な細胞懸濁液は、金型（ｍｏｌｄ）における成形を可能にするペレット中の細胞濃度を達成するために予め決められた時間、遠心分離にかけられる。
タンジェント流ろ過（「ＴＦＦ」）は、細胞を濃縮または圧縮する別の適切な方法である。幾つかの実施形態では、化合物は、必要とされる押出特性をもたらすために細胞懸濁液と混合される。適切な化合物は、限定しない例として、界面活性剤ポリオール、コラーゲン、ヒドロゲル、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ナノファイバー、自己集合性ナノファイバー、ゼラチン、フィブリノゲンなどを含む。
【０１２６】
幾つかの実施形態では、細胞ペーストは、複数の生細胞を組織培養培地と混合し、生細胞を（例えば遠心分離によって）圧縮することよって生成される。１つ以上のＥＣＭ成分（またはＥＣＭ成分の誘導体）は、随意に、ＥＣＭ成分（またはＥＣＭ成分の誘導体）を含有している１つ以上の生理学的に許容可能な緩衝液を懸濁することによって、および細胞ペーストを再び形成するために遠心分離にかけられた、結果として生じる細胞懸濁液によって含まれる。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、さらなる処理には所望される細胞ペーストの細胞密度は、細胞タイプによって様々であり得る。さらなる実施形態では、細胞間の相互作用は、細胞ペーストの特性を決定し、異なる細胞タイプは、細胞密度と細胞間相互作用との間の異なる関連性を有するだろう。またさらなる実施形態では、細胞は、細胞ペーストを形作る前に、細胞間相互作用を増加させるために前処理され得る。例えば、細胞は、細胞ペーストを形作る前に、細胞間相互作用を増強するために、遠心分離後に遠心管の内部でインキュベートされ得る。
【０１２８】
様々な実施形態では、多くの方法が、細胞ペーストを形作るために使用される。例えば、特定の実施形態では、細胞ペーストは、所望の形状を達成するために、手動で成型されるか、または押しつけられる（例えば、濃縮／圧縮後に）。さらなる例として、細胞ペーストは、細胞ペーストを器具の内表面に一致するように形作る、マイクロピペット（例えば、毛管ピペット）などの器具へと取り上げられる（例えば、吸引される）。マイクロピペット（例えば、毛管ピペット）の断面形状は、代替的に、円形、四角形、矩形、三角形、または他の非円形の断面形状である。幾つかの実施形態では、細胞ペーストは、プラスチック用金型、金属型、またはゲル金型などの、予め形成された金型へと堆積されることによって形作られる。幾つかの実施形態では、遠心鋳造または連続鋳造が、細胞ペーストを形作るために使用される。
【０１２９】
幾つかの実施形態では、ほぼ球状の多細胞集合体は、単独でまたは細長い細胞体と組み合わせて、本明細書に記載される、結合組織構成物を含む、組織を構築するのにも適している。球状の多細胞集合体は、限定されないが、細胞の自己集合、金型の使用、および懸滴法を含む、様々な方法によって生成され得る。さらなる実施形態では、ほぼ球状の多細胞集合体を生成する方法は、１）所望の細胞密度および粘度を有する複数の予め選択された細胞または細胞集合体を含む細胞ペーストを提供する工程、２）細胞ペーストを円筒形状へと操作する工程、３）シリンダーを等しいフラグメントへと切断する工程、４）フラグメントを旋回シェーカー上に一晩かき集める工程、および５）ほぼ球状の多細胞集合体を成熟によって形成する工程、を含む。
【０１３０】
幾つかの実施形態では、部分的に接着及び／又は凝集した細胞ペーストは、成形装置（例えば、毛管ピペット）から第２成形装置（例えば、金型）に移され、これによって、栄養素及び／又は酸素は、細胞に提供されることが可能となるが、さらなる成熟期間の間、第２成形装置において保持される。細胞に栄養素および酸素を提供することが可能な適切な成形装置の一例は、複数の多細胞集合体（例えば、ほぼ同一な多細胞集合体）を生成するための金型である。さらなる例として、そのような金型は、基質への細胞の移動および内方成長に耐性があり、基質への細胞の付着に耐性のある材料で作られた、生体適合性の基質を含む。様々な実施形態では、基質は、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）、（ＰＴＦＥ）、ステンレス鋼、アガロース、ポリエチレングリコール、ガラス、金属、プラスチック、またはゲル材料（例えば、アガロースゲルまたは他のヒドロゲル）、および同様の材料から適切に作られ得る。幾つかの実施形態では、金型はまた、（例えば、組織培養培地を金型の上部に分注することによって）細胞ペーストへの組織培養培地の供給を可能にするように適切に構成される。
【０１３１】
したがって、第２成形装置が使用される実施形態では、部分的に接着及び／又は凝集した細胞ペーストは、第１成形装置（例えば、毛管ピペット）から第２成形装置（例えば、金型）に移される。さらなる実施形態では、部分的に接着及び／又は凝集した細胞ペーストは、第１成形装置（例えば、毛管ピペット）によって金型の溝へと移され得る。またさらなる実施形態では、金型が制御環境においてその中に保持された細胞ペーストとともにインキュベートされることで、細胞ペースト中の細胞が互いに接着及び／又は凝集して多細胞集合体を形成する成熟期間後に、細胞の凝集は、結果として生じる多細胞集合体が器具（例えば、毛管ピペット）によって拾い上げられることを可能にするのに十分強力となる。またさらなる実施形態では、毛管ピペットは、適切に、多細胞集合体を三次元の構成物に自動的に入れるために操作可能な、バイオプリンターまたは同様の装置のプリンターヘッドの部分である。
【０１３２】
幾つかの実施形態では、多細胞集合体の断面形状および大きさは、実質的に、多細胞集合体を製造するために使用される、第１成形装置および随意に第２成形装置の断面形状および大きさに対応し、当業者は、上に議論された、断面形状、断面積、直径、および長さを有する多細胞集合体を作り出すのに適切な、適切な断面形状、断面積、直径、および長さを有する適切な成形装置を選択することができるだろう。
【０１３３】
幾つかの実施形態では、バイオプリンティングの方法は、連続的及び／又はほぼ連続的である。連続的なバイオプリンティングの方法の限定しない例は、バイオインクの貯蔵器に接続された分注チップ（例えば、注射針、キャピラリーチューブなど）を介して、バイオプリンターからバイオインクを分注することである。幾つかの実施形態では、細胞ペーストは、貯蔵器に充填され、定義された形状を有する容器または支持体へと直接バイオプリントされる。さらなる実施形態では、貯蔵器または支持体は、堆積後の約１５分から約６時間以内に、バイオインクの形成を可能にする。さらなる実施形態では、貯蔵器または支持体は、バイオインクの形成および三次元の組織の形成の両方に適している。さらなる実施形態では、貯蔵器または支持体は、成形後の三次元の組織のインビトロでの維持および成熟と適合性がある。幾つかの実施形態では、１つ以上の細胞ペーストは、定義されたパターンで、直接貯蔵器または支持体へとバイオプリントされる。幾つかの実施形態では、複数のバイオインクは、具体的なパターンで堆積され、それによって、組織の各層内でｘ軸およびｙ軸における具体的な平面の幾何学的形状が生成される。またさらなる実施形態では、第１バイオインクが、分注された一連の（ａ ｄｉｓｐｅｎｓｅｄ ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ）線または縁を介して幾何学的な又はユーザ定義のパターンを作り出すために利用され、さらなる別個のバイオインクが、第１バイオインクによって作り出された縁内の充填材（ｆｉｌｌｓ）として利用される。またさらなる実施形態では、縁は、２つ以上の別個のバイオインクによって作り出され得、２つ以上の別個のバイオインクは、パターンの縁内の充填材として利用される。結果として生じる組織は、モザイク状の又はステンドグラスでできた窓に類似している区画化された組織であり、縁（例えばフレーム）および充填材（例えばペイン（ｐａｎｅｓ））から成る。さらなる実施形態では、多層は、第１層の上部に加えられ得、各層は、第１層の同じ幾何学的形状または第１層とは別の幾何学的形状を含む。
【０１３４】
支持体上へとバイオインクを堆積させる工程；
所望の三次元構造を生成するために、多くの方法が、支持体上へとバイオインクを堆積させるのに適切である。例えば、幾つかの実施形態では、多細胞集合体は、互いに接して手動で置かれるか、ピペット、ノズル、または針からの押出によって適所に堆積されるか、またはバイオプリンターなどの、自動化した、コンピューター支援の機器によって位置付けられる。
【０１３５】
本明細書に記載されるように、様々な実施形態では、バイオインクは、多くの適切な形状および大きさを有する多細胞集合体を含む。幾つかの実施形態では、多細胞集合体は、限定しない例として、円形、卵形、四角形、三角形、多角形、および不規則な形状を含む、幾つかの適切な断面形状のいずれかを有して細長い。さらなる実施形態では、多細胞集合体は、細長く、シリンダーの形態である。幾つかの実施形態では、細長い多細胞集合体は、類似した長さ及び／又は直径を有する。他の実施形態では、細長い多細胞集合体は、異なる長さ及び／又は直径を有する。幾つかの実施形態では、多細胞集合体は、ほぼ球状である。幾つかの実施形態では、操作した組織（例えば、結合組織構成物など）は、大きさがほぼ類似したほぼ球状の多細胞集合体を含む。他の実施形態では、操作した組織（例えば、結合組織構成物など）は、異なる大きさを有するほぼ球状の多細胞集合体を含む。幾つかの実施形態では、異なる形状および大きさの操作した組織（例えば、結合組織構成物など）は、様々な形状および大きさの多細胞集合体を調整することによって形成される。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、凝集した多細胞集合体は、支持体上へと堆積させる。様々な実施形態では、支持体は、任意の適切な生体適合性の表面である。またさらなる実施形態では、適切な生体適合性の表面は、限定しない例として、ポリマー材料、多孔質膜、プラスチック、ガラス、金属、ヒドロゲル、およびそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、支持体は、限定しない例として、ヒドロゲル、タンパク質、化学薬品、ペプチド、抗体、成長因子、またはそれらの組み合わせを含む、生体適合性の物質でコーティングされる。１つの実施形態では、支持体は、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）でコーティングされる。別の実施形態では、支持体は、アガロースでコーティングされる。１つの実施形態では、凝集した多細胞集合体は、生体適合性のマルチウェル容器のウェルに入れられる。
【０１３７】
一旦バイオインクの堆積が完了すると、幾つかの実施形態では、組織培養培地は構成物の上部にわたって注がれる。さらなる実施形態では、組織培養培地は、多細胞体において細胞を支持するために、多細胞体間の空間に入る。
【０１３８】
バイオインク及び／又は組織構成物をインキュベートする工程
幾つかの実施形態では、堆積したバイオインクは、インキュベートされる。さらなる実施形態では、インキュベーションによって、バイオインクは、凝集して、生きている、三次元の結合組織構成物を形成することができる。幾つかの実施形態では、バイオインクは、凝集して、細胞培養環境（例えば、ペトリ皿、細胞培養フラスコ、バイオリアクターなど）において組織を形成する。さらなる実施形態では、バイオインクは、凝集して、バイオインクに含まれる細胞タイプの成長を促進するのに適切な条件を有する環境において組織を形成する。１つの実施形態では、バイオインク／組織構成物は、付着及び／又は凝集を促進する細胞培養培地を含有している因子及び／又はイオンの存在下で、約５％のＣＯ２を含有している湿気のある環境において、約３７℃でインキュベートされる。他の実施形態では、バイオインク／組織構成物は、０．１％−２１％のＯ２を含有している環境で維持される。
【０１３９】
インキュベーションは、様々な実施形態において、任意の適切な持続時間を有する。さらなる様々な実施形態では、インキュベーションは、約２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０分、またはそれ以上の持続時間を有し、それらにおいてインクリメントを含む。さらなる様々な実施形態では、インキュベーションは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、３６、４８時間、またはそれ以上の持続時間を有し、それらにおいてインクリメントを含む。様々な実施形態では、インキュベーションは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０日、またはそれ以上の持続時間を有し、それらにおいてインクリメントを含む。幾つかの因子は、限定しない例として、細胞タイプ、細胞タイプの比率、培養条件、および成長因子などの添加剤の存在を含む、組織を形成するために、バイオインクが凝集するのに必要な時間に影響を及ぼす。
【０１４０】
操作した組織の生存率を増加させるためのさらなる工程
幾つかの実施形態では、方法は、操作した組織の生存率を増加させるための工程をさらに含む。さらなる実施形態では、これらの工程は、制限物質の一時的または半永久的な格子状構造（ｌａｔｔｉｃｅ）を介して組織と培養培地との間の直接的な接触を提供する工程を含む。幾つかの実施形態では、組織は、多孔性の又は間隙のある（ｇａｐｐｅｄ）材料において制限される。栄養素に対する操作した組織の細胞の少なくとも幾つかの直接的なアクセスによって、操作した組織の生存率は増加する。
【０１４１】
さらなる実施形態では、操作した組織の生存率を増加させるための追加および随意の工程は：１）随意に、凝集した多細胞集合体を置く前に制限物質の基層を分配する（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ）工程；２）随意に、制限物質の周辺（ａ ｐｅｒｉｍｅｔｅｒ ｏｆ）を分配する工程。３）定義された幾何学的形状内の組織の細胞をバイオプリントする工程；および４）格子、網目、またはグリッドなどの、制限物質中の間隙を導入するパターンで発生期の組織を覆う制限物質の細長い体（例えば、シリンダー、リボンなど）を分配する工程、を含む。
【０１４２】
多くの制限物質が、本明細書に記載される方法における使用に適している。幾つかの実施形態では、ヒドロゲルは、以下を含む１つ以上の有利な特性を有する典型的な制限物質である：非付着性、生体適合性、押し出し成形可能、バイオプリント可能、非細胞性、適切な強度、および水性条件で非水溶性。幾つかの実施形態では、適切なヒドロゲルは、天然ポリマーである。１つの実施形態では、制限物質は、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）で構成される。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、Ｐｌｕｔｏｎｉｃ Ｆ−１２７、コラーゲン、ヒアルロナート、フィブリン、ゼラチン、ペプチドヒドロゲル、アルギナート、アガロース、キトサン、およびそれらの誘導体および組み合わせなどの、界面活性剤ポリオールに由来するものを含む。他の実施形態では、適切なヒドロゲルは、合成ポリマーである。さらなる実施形態では、適切なヒドロゲルは、ポリ（アクリル酸）およびその誘導体、ポリ（酸化エチレン）およびそのコポリマー、ポリ（ビニルアルコール）、ポリホスファゼン、およびそれらの組み合わせに由来するものを含む。様々な具体的な実施形態では、制限物質は、ヒドロゲル、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）、アガロース、アルギナート、ゼラチン、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ヒアルロナン、ポロクサマー、ペプチドヒドロゲル、ポリ（イソプロピルｎ−ポリアクリルアミド）、ポリエチレングリコールジアクリラート（ＰＥＧ−ＤＡ）、ヒドロキシエチルメタクリレート、ポリジメチルシロキサン、ポリアクリルアミド、ポリ（乳酸）、シリコン、シルク、またはそれらの組み合わせから選択される。
【０１４３】
幾つかの実施形態では、パターンを覆う間隙は、組織の表面のまわりに均一に又はほぼ均一に分配される。他の実施形態では、間隙は、不均一に分配され、それによって、組織の細胞は、栄養素に不均一にさらされる。不均一の実施形態では、栄養素に対する差次的な（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）アクセスは、組織の１つ以上の特性に影響を与えるように利用され得る。例えば、バイオプリントされた組織の一表面上の細胞を、バイオプリントされた組織の別の表面上の細胞より速く増殖させることが望ましいかもしれない。幾つかの実施形態では、栄養素への組織の様々な部分の露出は、所望のエンドポイントへの組織の発達に影響を与えるために、様々な時間で変更され得る。
【０１４４】
幾つかの実施形態では、制限物質は、限定されないが、バイオプリンティング直後（例えば、１０分以内）、バイオプリンティング後（例えば、１０分後）、細胞が実質的に互いに凝集する前、細胞が実質的に互いに凝集した後、細胞が細胞外マトリックスを生成する前、細胞が細胞外マトリックスを生成した後、使用の直前などを含む、任意の適切な時間に除去される。様々な実施形態では、制限物質は、任意の適切な方法によって除去される。例えば、幾つかの実施形態では、制限物質は、切除されるか、細胞からはぎ取られるか、消化されるか、または溶解される。
【０１４５】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され記載されているが、このような実施形態が、ほんの一例として提供されることは当業者に明白となるであろう。多数の変更、変化、および置換が、本発明から逸脱することなく、当業者によってここで想到されるであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態の様々な代替案が、本発明を実行する際に利用され得ることを理解されたい。
【０１４６】
様々な非限定の実施形態
１つの実施形態では、本明細書には、生きている、三次元の結合組織構成物が開示され、該三次元の結合組織構成物は、生きている、三次元の結合組織構成物を提供するために互いに凝集した、結合組織細胞を含み；ここで、三次元の結合組織構成物は、使用時に予め形成されたスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態では、結合組織細胞は、間葉系幹／間質細胞に由来する。さらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、哺乳動物の脂肪組織に由来する。さらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、哺乳動物の骨髄に由来する。他の実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、非脂肪の、非骨髄組織源に由来する。幾つかの実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、三次元の結合組織構成物の成形前に、１つ以上の分化シグナルにさらされた。幾つかの実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、三次元の結合組織構成物の成形中に、１つ以上の分化シグナルにさらされた。幾つかの実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、三次元の結合組織構成物の成形後に、１つ以上の分化シグナルにさらされた。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、バイオプリントされた。さらなる実施形態では、三次元の結合組織構成物は、押出化合物をさらに含み、該押出化合物は、バイオプリンティングに対する細胞の適合性を改善する。幾つかの実施形態では、結合組織は、骨、軟骨、腱、および靭帯から成る群から選択される。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、哺乳動物の内皮細胞をさらに含む。さらなる実施形態では、結合組織細胞の内皮細胞に対する割合は、約５：１から約２０：１の間である。またさらなる実施形態では、結合組織細胞の内皮細胞に対する割合は、約９：１である。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、哺乳動物の線維芽細胞をさらに含む。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、シートまたはパッチの形態である。幾つかの実施形態では、三次元の結合組織構成物は、別々の補填体の１つ以上をさらに含み、各補填体は、生体適合材料を含み、ここで１つ以上の補填体は、凝集した細胞において間隙または空間を作り出す。特定の実施形態では、各補填体は、実質的に、細胞の移動および内方成長に抵抗する。
【０１４７】
幾つかの実施形態において、本明細書には、生きている、三次元の結合組織構成物が開示され、該三次元の結合組織構成物は、互いに凝集した間葉系幹／間質細胞を含み、ここで、間葉系幹／間質細胞は、生きている、三次元の結合組織構成物を提供するために、１つ以上の分化シグナルにさらされ、ここで、三次元の結合組織構成物は、予め形成されたスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態では、構成物は、バイオプリントされた。幾つかの実施形態では、構成物は、押出化合物をさらに含み、該押出化合物は、バイオプリンティングに対する細胞の適合性を改善する。幾つかの実施形態では、結合組織は、骨、軟骨、腱、および靭帯から成る群から選択される。さらなる実施形態では、結合組織は、骨である。幾つかの実施形態では、構成物は、哺乳動物の内皮細胞をさらに含む。さらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞の内皮細胞に対する割合は、約５：１から約２０：１の間である。またさらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞の内皮細胞に対する割合は、約９：１である。幾つかの実施形態では、構成物は、哺乳動物の線維芽細胞をさらに含む。幾つかの実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、哺乳動物の脂肪組織に由来する。幾つかの実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、哺乳動物骨髄に由来する。他の実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、非脂肪の、非骨髄組織源に由来する。幾つかの実施形態では、細胞は、構成物の成形前に、１つ以上の分化シグナルにさらされた。幾つかの実施形態では、細胞は、構成物の成形中に、１つ以上の分化シグナルにさらされた。幾つかの実施形態では、細胞は、構成物の成形後に、１つ以上の分化シグナルにさらされた。幾つかの実施形態において、構成物は、シートまたはパッチの形態である。幾つかの実施形態では、構成物は、別々の補填体の１つ以上をさらに含み、各補填体は、細胞の移動および内方成長に実質的に抵抗する生体適合材料を含み、ここで１つ以上の補填体は、凝集した細胞において間隙または空間を作り出す。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルは、分化培地中のインキュベーションを含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルは、機械的シグナル、生体力学的シグナル、または物理的シグナル、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、間葉系幹／間質細胞の幾つかの部分は、哺乳動物の結合組織中に存在する細胞タイプへの部分的または完全な分化を特徴とする。
【０１４８】
幾つかの実施形態において、本明細書には、生きている、三次元の結合組織構成物が開示され、該三次元の結合組織構成物は、間葉系幹／間質細胞、線維芽細胞、および内皮細胞を含み、ここで、これらの細胞は互いに凝集し、間葉系幹／間質細胞は、三次元の結合組織構成物の成形の約１−２１日前と、三次元の結合組織構成物の成形の約１−２１日後との間の１つ以上の時間間隔で、１つ以上の分化培地にさらされ、生きている、三次元の結合組織構成物を提供し、ここで、三次元の結合組織構成物は、予め形成されたスキャフォールドがほぼない。
【０１４９】
幾つかの実施形態において、本明細書には、生きている、三次元の結合組織構成物が開示され、該三次元の結合組織構成物は、哺乳動物細胞を含み、該三次元の結合組織構成物は、間葉系幹／間質細胞を１つ以上の分化シグナルにさらして、生きている、三次元の結合組織構成物を提供することを含む、プロセスによって成形され、ここで、三次元の結合組織構成物は、細胞物質から本質的に成り、被験体において移植可能である。幾つかの実施形態では、細胞は、バイオプリントされた。幾つかの実施形態では、構成物は、予め形成されたスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態では、結合組織は、骨、軟骨、腱、および靭帯から成る群から選択される。さらなる実施形態では、結合組織は、骨である。幾つかの実施形態では、構成物は、損傷、疾患、または変性の部位での被験体における移植のためのものである。幾つかの実施形態では、構成物は、哺乳動物の内皮細胞をさらに含む。さらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞の内皮細胞に対する割合は、約５：１から約２０：１の間である。またさらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞の内皮細胞に対する割合は、約９：１である。幾つかの実施形態では、構成物は、哺乳動物の線維芽細胞をさらに含む。幾つかの実施形態では、構成物は、１つ以上の結合組織を含む複組織構成物である。さらなる実施形態では、構成物は、結合組織および非結合組織を含む複組織構成物である。さらなる実施形態では、構成物は、骨組織および非結合組織を含む複組織構成物である。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルは、分化培地中のインキュベーションを含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルは、機械的シグナル、生体力学的シグナル、または物理的シグナル、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１５０】
幾つかの実施形態において、本明細書には、生きている、三次元の結合組織構成物のアレイが開示され、各三次元の結合組織構成物は、哺乳動物細胞を含み、該三次元の結合組織構成物は、間葉系幹／間質細胞を１つ以上の分化シグナルにさらして、生きている、三次元の結合組織構成物を提供することを含む、プロセスによって成形され、ここで、各三次元の結合組織構成物は、使用時に予め形成されたスキャフォールドがほぼなく、培養中に維持される。幾つかの実施形態では、アレイ内の各三次元の結合組織構成物は、バイオプリントされた。幾つかの実施形態では、結合組織は、骨、軟骨、腱、および靭帯から成る群から選択される。さらなる実施形態では、結合組織は、骨である。幾つかの実施形態では、アレイ内の１つ以上の結合組織構成物は、哺乳動物の内皮細胞をさらに含む。さらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞の内皮細胞に対する割合は、約５：１から約２０：１の間である。またさらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞の内皮細胞に対する割合は、約９：１である。幾つかの実施形態では、アレイ内の１つ以上の結合組織構成物は、哺乳動物の線維芽細胞をさらに含む。幾つかの実施形態では、アレイ内の１つ以上の結合組織構成物は、１つ以上の結合組織を含む複組織構成物である。さらなる実施形態では、アレイ内の１つ以上の結合組織構成物は、結合組織および非結合組織を含む複組織構成物である。さらなる実施形態では、アレイ内の１つ以上の結合組織構成物は、骨組織および非結合組織を含む複組織構成物である。幾つかの実施形態では、アレイは、インビトロでのアッセイに使用される。さらなる実施形態では、アレイは、創薬、薬物検査、毒性学的検査、疾患モデル、三次元の生物学研究、および細胞スクリーニング、から成る群から選択される１つ以上に使用される。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルは、分化培地中のインキュベーションを含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルは、機械的シグナル、生体力学的シグナル、または物理的シグナル、またはそれらの組み合わせを含む。
【０１５１】
幾つかの実施形態において、本明細書には、生きている、三次元の結合組織構成物を成形する方法が開示され、該方法は：間葉系幹／間質細胞を含むバイオインクを調製する工程；バイオインクを支持体上に堆積させる工程；およびバイオインクをインキュベートする工程であって、それによって、バイオインクが、凝集することができ、生きている、三次元の結合組織構成物を形成することができる工程、を含み、ここで前記インキュベートする工程は、約１時間から約３０日間の期間を有し；但し、間葉系幹／間質細胞が、バイオインクを支持体上に堆積させる約１−２１日前と、バイオインクを支持体上に堆積させた約１−２１日間後との間の１以上の時間間隔で、１つ以上の分化シグナルにさらされることを条件とする。幾つかの実施形態では、バイオインクは、バイオプリンティングによって堆積される。幾つかの実施形態では、構成物は、予め形成されたスキャフォールドがほぼない。幾つかの実施形態では、結合組織は、骨、軟骨、腱、および靭帯から成る群から選択される。さらなる実施形態では、結合組織は、骨である。幾つかの実施形態では、バイオインクは、哺乳動物の内皮細胞をさらに含む。さらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞の内皮細胞に対する割合は、約５：１から約２０：１の間である。またさらなる実施形態では、間葉系幹／間質細胞の内皮細胞に対する割合は、約９：１である。幾つかの実施形態では、バイオインクは、哺乳動物の線維芽細胞をさらに含む。幾つかの実施形態では、バイオインクは、押出化合物をさらに含む。幾つかの実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、哺乳動物の脂肪組織に由来する。幾つかの実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、哺乳動物の骨髄に由来する。他の実施形態では、間葉系幹／間質細胞は、非脂肪の、非骨髄組織源に由来する。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルは、分化培地中のインキュベーションを含む。幾つかの実施形態では、１つ以上の分化シグナルは、機械的シグナル、生体力学的シグナル、または物理的シグナル、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、方法は、１つ以上の別々の補填体を堆積させる工程をさらに含み、各補填体は、細胞の移動および内方成長に実質的に抵抗する生体適合材料を含み、ここで１つ以上の補填体は、凝集した細胞において間隙または空間を作り出す。幾つかの実施形態では、方法は、複数の、生きている、三次元の結合組織構成物を、生体適合性の表面に付けることによってアレイへと構築する工程をさらに含む。さらなる実施形態では、生体適合性の表面は、多孔質膜である。
【実施例】
【０１５２】
以下の具体的な例は、単に例示的なものとして解釈されるべきであり、方法はどうであれ、開示の残りを限定するものとして、解釈されるべきではない。さらなる精錬なしで、当業者は、本明細書の記載に基づいて、本発明をその十分な程度まで利用することができると考えられる。
【０１５３】
実施例１−ＭＳＣ培養物
ＭＳＣを、Ｌ−グルタミンが補足された低グルコースのＤＭＥＭにおいて５−１０％（ｖ：ｖ）のウシ胎児血清を含有した基本培地を使用して、標準的な細胞培養条件下で培養且つ拡大した。幾つかの場合は、ＭＳＣを、低い（３−５％）酸素条件下で培養した。
【０１５４】
実施例２−ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液および金型
２％および４％（ｗ／ｖ）のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液の調製
１ｇまたは２ｇ（それぞれ２％または４％に対して）のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を、５０ｍｌのダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｌｓｂａｄ， ＣＡ）中に溶解した。簡潔に言うと、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）が完全に溶解するまで、ＤＰＢＳおよびＮｏｖｏＧｅｌ（商標）を、持続的に撹拌しながら、ホットプレート上で８５℃まで加熱する。ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液を、２５分間１２５℃で、蒸気滅菌によって殺菌する。温度が３６．５℃を超えて維持される限り、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液は液相にとどまる。この温度以下で、相転移が生じ、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液の粘度が増加し、およびＮｏｖｏＧｅｌ（商標）は固形ゲルを形成する。
【０１５５】
ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の金型の調製
ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の金型を、１０ｃｍのペトリ皿に合うＴｅｆｌｏｎ（登録商標）の金型を使用して、（細胞シリンダーの形態での）バイオインクのインキュベーションのために成形した。簡潔に言うと、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）の金型を、７０％のエタノール溶液を使用して、および４５分間、金型をＵＶ光にさらして、予め殺菌した。殺菌した金型を、１０ｃｍのペトリ皿（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）の上部に置き、しっかりと取り付けた。このアセンブリ（Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）の金型＋ペトリ皿）を、縦に維持し、４５ｍｌの予め暖められた、無菌の２％のＮｏｖｏＧｅｌ（商標）溶液を、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）の金型とペトリ皿との間の空間に注いだ。その後、アッセンブリを１時間室温で横に置き、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の完全なゲル化を可能にした。ゲル化後、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）のプリントを取り除き、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の金型を、ＤＰＢＳを使用して２回洗浄した。その後、１７．５ｍｌのＨＡＳＭＣ培地を、バイオインクをインキュベートするために、ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の金型に加えた。
【０１５６】
実施例３−ＭＳＣ−ＨＡＥＣバイオインクの成形
（混合した細胞のシリンダーの形態で）バイオインクを調製するために、ＭＳＣおよびＨＡＥＣを、個々に収集し、その後、予め決められた比率で混合した。簡潔に言うと、培養培地を、コンフルエントな培養フラスコから取り除き、細胞を、ＤＰＢＳ（１ｍｌ／５ｃｍ２の成長地域）で洗浄した。細胞を、１０分間、トリプシン（１ｍｌ／１５ｃｍ２の成長地域；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の存在下で、インキュベーションによって培養フラスコの表面から分離した。ＭＳＣを、０．１５％のトリプシンを使用して分離し、一方で、ＨＡＥＣを、０．１％のトリプシンを使用して分離した。インキュベーション後に、適切な培養培地を、フラスコに加えた（トリプシンの容積に対して２Ｘ容積）。細胞懸濁液を、６分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。細胞ペレットを、それぞれの培地中に再懸濁し、血球計を使用して数えた。適切な容積のＭＳＣおよびＨＡＥＣを混合して、（総細胞集団の％として）１０％のＨＡＥＣおよび残りの９０％のＭＳＣを含有する混合した細胞懸濁液を得た。混合した細胞懸濁液を、５分間２００ｇで遠心分離にかけ、その後、上清溶液を完全に除去した。混合した細胞ペレットを、６ｍｌのＭＳＣ培地中に再懸濁し、２０ｍｌのガラスバイアル（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）に移動させ、その後、６０分間１５０ｒｐｍで、および３７℃および５％のＣＯ２で、オービタルシェーカー上でインキュベートした。これによって、細胞が互いに凝集し、細胞−細胞接着を開始することが可能となる。インキュベーション後に、細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心分離管に移動させ、５分間２００ｇで遠心分離にかけた。上清培地の除去後、細胞ペレットを、４００μｌのＭＳＣ培地中に再懸濁し、数回ピペットアップおよびピペットダウンすることで、すべての細胞塊が壊れたことを確認した。細胞懸濁液を、１５ｍｌの遠心管の内部に置いた０．５ｍｌのマイクロチューブ（ＶＷＲ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＬＬＣ，Ｗｅｓｔ Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）へ移動させ、その後、４分間２０００ｇで遠心分離にかけ、高密度の及びコンパクトな細胞ペレットを形成した。上清培地を吸収し、５０ｍｍの長さの細胞シリンダーを生み出すように、細胞を、吸収によってキャピラリーチューブ（ＯＤ １．５ｍｍ、ＩＤ ０．５ｍｍ、Ｌ ７５ｍｍ；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．，Ｂｒｏｏｍａｌｌ，ＰＡ）へ移動させた。キャピラリーチューブの内部の細胞ペーストを、２０分間、３７℃および５％のＣＯ２で、ＭＳＣ培地中にインキュベートした。その後、細胞シリンダーを、キャピラリーが供給されたプランジャーを使用して、キャピラリーチューブから（ＭＳＣ培地によって覆われた）ＮｏｖｏＧｅｌ（商標）の金型の溝へと押し出した。バイオインクを、２４時間３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートした。
【０１５７】
実施例４−骨分化培地でのインキュベーションを介する堆積前のＭＳＣ分化
培養したＭＳＣを、バイオプリンターでの堆積前の５日間継続的に、１ｘ骨分化培地（ＣｏｍｂｉＣｕｌｔ（商標）Ｍｅｄｉａ；Ｐｌａｓｔｉｃｅｌｌ，Ｉｎｃ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ）によって処理した。１日目に、ＭＳＣを、本明細書に記載される方法を使用して、バイオインクを生成するために使用した。０日目に、バイオインクを、バイオプリントして、組織構成物を形成した。バイオインク融合に続いて、組織構成物を、細胞分化のために評価した。
【０１５８】
実施例５−結合組織構成物のバイオプリンティング
操作した結合組織構成物を、バイオインク押出機構を使用するＮｏｖｏＧｅｎ ＭＭＸ Ｂｉｏｐｒｉｎｔｅｒ（商標）（Ｏｒｇａｎｏｖｏ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を利用してバイオプリントした。バイオインクを、９０％のＭＳＣ：１０％のＨＡＥＣの比率で、ＭＳＣおよびヒト大動脈の内皮細胞（ＨＡＥＣ）から構成した。構成物を、５ｍｍ ｘ ８ｍｍのシートの形態で、Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）の透過性の支持膜上へと直接バイオプリントした。
【０１５９】
実施例６−骨分化培地でのインキュベーションを介する堆積前後のＭＳＣ分化
培養したＭＳＣを、以下の実験プロトコルに従って、骨分化培地によって処理した：
【０１６０】
１）堆積前の露出なし；０日目（堆積）に始まり、堆積の３日または６日後まで継続する、１ｘ骨分化培地への露出。
【０１６１】
２）堆積の３日前に始まり、堆積の３日または６日後まで継続する、０．５ｘ骨分化培地への堆積前の露出。
【０１６２】
３）堆積の３日前に始まり、堆積の３日または６日後まで継続する、１ｘ骨分化培地への堆積前の露出。
【０１６３】
バイオインク融合に続いて、組織構成物を、細胞分化のために評価した。
【０１６４】
実施例７−ＭＳＣ分化の評価
骨分化培地にさらしたＭＳＣを含む結合組織構成物を、結合組織に特異的な分化の程度のために評価した。結合組織構成物を、切断し、ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、およびアリザリンレッドＳ染色（カルシウム結晶を染色する）およびフォン・コッサ染色（リン酸カルシウム堆積物を染色する）にさらし、その後、顕微鏡法が続いた。結合組織構成物を、オステオポンチン発現のためのアルカリフォスファターゼ染色およびＥＬＩＳＡにもさらした。例えば、図２および３を参照。
【図２Ａ】
2015523142.tif 000003
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図１】
2015523142.tif 000009
【国際調査報告】
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