(57)【要約】  本発明は、軟骨組織修復用組成物と製造方法及びその使用方法に関するものである。本発明はこのために、水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜６０ｍｇ／ｍＬのコラーゲン、水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、及び上記コラーゲンとヒアルロン酸とを両方向注射器または混合器を用いて相互混合してなされた軟骨組織修復用組成物を提供する。
2015514752.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜６０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンと、
水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸と、
前記コラーゲンとヒアルロン酸とを両方向注射器または混合器を用いて相互混合してなされることを特徴とする、軟骨組織修復用組成物。
【請求項２】
水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜６０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを製造するステップと、
水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸を製造するステップと、
前記コラーゲンとヒアルロン酸とを両方向注射器または混合器を用いて相互混合するステップと、
前記混合された軟骨組織修復用組成物を遠心分離機を用いて気泡を除去するステップと、を含むことを特徴とする、軟骨組織修復用組成物の製造方法。
【請求項３】
前記遠心分離は１〜３０℃の室温を維持し、２，０００〜５，０００Ｇで遠心分離することを特徴とする、請求項２に記載の軟骨組織修復用組成物の製造方法。
【請求項４】
豚の脚を据置台に固定した後、外科的装備を用いて関節軟骨を欠損させ、ドリルを用いて２〜４ｃｍ２の欠損部位を誘発するステップと、
コラーゲンが充填された注射容器に注射針を連結するステップと、
縫合糸を用いて切断部位を縫合し、注射器に入っている濃度が５〜６０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンと濃度が５〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、そしてこれらを相互混合した軟骨組織修復用組成物を豚膝の関節腔（滑液で満たされた空間）に直接注射するステップと、
を経てなされる軟骨組織修復用組成物の使用方法。
【請求項５】
水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜６０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを製造するステップと、
水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸を製造するステップと、
コラーゲン６０ｍｇ／ｍＬとヒアルロン酸５ｍｇ／ｍＬとが９：１〜１：９の割合で混合された検体、またはコラーゲン６０ｍｇ／ｍＬとヒアルロン酸２０ｍｇ／ｍＬとが５：５の割合で混合された検体を製造するステップと、
を含むことを特徴とする、軟骨組織修復用組成物の製造方法。
【請求項６】
（１）注射容器に含まれたコラーゲン溶液とフィブリングルー製品を用意するステップと、
（２）豚の脚を据置台に固定した後、外科的装備を用いて関節軟骨を欠損させ、ドリルを用いて２〜４ｃｍ２の欠損部位を誘発するステップと、
（３）注射器に入っているコラーゲン製品を豚膝軟骨欠損部位に注射して満たした後、フィブリングルーをコラーゲンの上に覆ってゲル化させて堅く固定するステップと、
（４）前記（３）の方式と反対に、豚軟骨欠損部位にフィブリングルーを塗布してゲル化させた後、コラーゲンをフィブリングルーゲルの内部に注入して軟骨欠損部位を満たすステップと、
（５）注射部位１０ｃｍの上から注射器を用いて滅菌注射用水を下方に撒いて（２５ｍＬ）、流れる用水に対する抵抗性を確認してゲル状態を確認するステップと、
を含むことを特徴とする、軟骨組織修復用組成物の使用方法。
【請求項７】
高粘度のコラーゲンとヒアルロン酸、またはコラーゲンとヒアルロン酸との混合組成物である軟骨修復用組成物をプレフィールドシリンジ注射器に注入して注射が可能な形態に使用することを特徴とする、軟骨組織修復用組成物の使用方法。
【請求項８】
注射型軟骨注入剤に注射針を連結して適用部位の外科的切開無しで注射針で適用部位に直接挿入して豚膝の関節腔（滑液で満たされた空間）に直接軟骨修復用組成物を注入することを特徴とする、軟骨組織修復用組成物の使用方法。
【請求項９】
軟骨２〜４ｃｍ２を人為的に欠損して実験体を作って、軟骨修復用組成物を青色で染色して実験体に注入し、以後、移植部位を開けて直接欠損部位に満たされた性状を肉眼で確認すると共に、組成物が欠損部位に固着する程度を水に対する洗われ性でも確認することを特徴とする、軟骨組織修復用組成物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、軟骨組織修復用組成物と製造方法及びその使用方法に関し、より詳しくは生体適合物質であるコラーゲンを基盤とする組成物を軟骨欠損部位に移植可能な注射形態に製造して外科的切開無しで注射針で適用部位に直接挿入により組織修復を図れば、軟骨組織再生を効果的に誘導するので、人間を除外した動物に手術と関連した負担を減らしながら、容易かつ速く軟骨修復及び再生を誘導できるようにしたものであり、これによって製品の品質と信頼性を大幅向上させるので、使用者である消費者の多様な欲求（ニーズ）を充足させて、よいイメージを植え付けることができるようにしたものである。
【背景技術】
【０００２】
周知の通り、軟骨損傷の原因は裂傷と直接打撃または回転力などの外傷と、関節炎、骨壞死、炎症性関節炎、または剥離性骨軟骨炎などがある。関節軟骨はリンパ、血管神経分布のない組織であって、自ら治癒能力が他の組織に比べて顕著に低い方であり、病変の大きさ及び位置によって多様な手術方法による効果の差を示す。
【０００３】
関節軟骨は滑らかであり、極度に滑り、白く明るい光を帯びる物質であって、関節の運動時、摩擦及び摩耗抵抗を最小化して維持する役割をし、一度損傷した関節軟骨は正常に生体内で再生できないことが知られている。生体内組織として軟骨の損傷は激しい痛みを伴って日常生活の困難性と、慢性化した場合、退行性関節炎に進んで、軟骨損傷時、損傷した軟骨組織を再生するようにする治療が行なわれなければ退行性関節炎への進行を食い止めることができない。
【０００４】
損傷した軟骨欠損部位を治療する方法は、非手術的な方法の薬物や物理治療、関節内のステロイドあるいはヒアルロン酸注射などの症状の痛みを緩和することを目的としているが、病気の治療には効果を及ぼすことができない。そして、手術的な方法の骨髄刺激施術、骨軟骨片移植術が施行されるが、軟骨が破損されて軟化されるか、または骨が表れる部分に一次的な骨刺戟施術後に破損された軟骨を修復して痛みを緩和し、骨から滑液に流れる血液が滑液を分解し、滑液性能を低下させることを防ぐ。しかしながら、骨刺戟施術は効果が微々であり、ヒアルロン酸は単純に一時的な痛みを減少し、そして適合した新生軟骨組織へ誘導できないという問題がある。そして、骨軟骨片移植術は外科的手術が必要な方法であって、難易度が高く、費用的な面で負担になる施術方法である。最近は損傷した軟骨関節を治療するために患者の軟骨組織を採取して軟骨細胞を分離培養して損傷した部位にまた移植する自家軟骨細胞移植術が施行されている。この施術は、２回の手術と組織を採取して移植することに長い間の時間がかかるので、患者そして医療関係者の負担により容易にアクセスできない方法である。
【０００５】
したがって、軟骨欠損のための簡単な手術方法であるコラーゲンを基盤とする混合組成物である生体適合物質を移植する新たな方法が要求され、初期に軟骨欠損を治療する方法に有用であり、今後に発生する軟骨細胞移植及び人工関節手術のような大きい手術を要求する患者の数を減少させることができる。
【０００６】
最近、生体適合物質を軟骨欠損部位に適用しようとする試みが多くなされる。
【０００７】
人体の構造は、細胞と生物学的に生成された高分子形態に構成されている。蛋白質が代表的な物質であり、人体内に存在する物質に天然材料を利用するならば、天然状態に近い形態に適用され、人体組織の再生を期待することができる。天然組織を医療用生体組織に使用して、人工材料に欠如している生物学的機能を提供することによって、人体内に挿入
されて周囲組織の間に生体適合性を有するように環境を提供するか、延いては、天然組織のような生体組織としての役割をすることができる。
【０００８】
特に、コラーゲンは構造蛋白質成分であって、真皮、腱／筋、血管、軟骨のように、人体を構成する軟組織と硬組織を構成する哺乳類の全体蛋白質の１／３を占める蛋白質である。
【０００９】
コラーゲンを現在医療用に使用している分野は、止血剤、創傷被覆材、シワ改善などの多様な目的に使われている。長い期間の間医療用に使われたコラーゲン製品は未だ安全性の問題無しで使われている。
【００１０】
コラーゲンの特性である低い抗原性／高い生体適合性及び生体吸収性／細胞の付着、成長、分化誘導、血液凝固、止血効果、他の高分子との適合性の長所がある。
【００１１】
そして、コラーゲンを基盤とする物質は、コラーゲンとヒアルロン酸、フィブリングルーを混合する組成物を用いた組成物が軟骨修復及び再生に卓越した効果を発揮することができる。
【００１２】
生体適合物質であるヒアルロン酸は生体高分子の一種である高粘度の線形多糖類物質であって、鶏のとさか、関節液、皮膚などから発見された。ヒアルロン酸は高い潤滑力などにより、現在、眼科手術補助剤及び変形性関節炎治療薬に使われてきた。
【００１３】
現在、市中に販売されるヒアルロン酸１０ｍｇ／ｍＬ濃度の製品は、変形性膝関節症、肩関節周囲炎による痛みをなくしてくれる関節機能改善剤であって、一時的な痛み緩和効果及び炎症が激しい場合などの問題点がある。
【００１４】
上記の問題点を解決するために、従来には先行技術が出願及び登録されたことがある。即ち、先行技術１は、大韓民国特許登録第１１１４７７３号（２０１２年０２月０２日）（出願番号第２００９−０１０１３８８号）（名称：軟骨組織修復用組成物の製造方法）が登録されたことがある。
【００１５】
そして、先行技術２は、大韓民国公開特許第２００４−０００８１２５号（２００４年０１月２８日）（出願番号第２００３−７０１０１０８号）（名称：滑液誘導された組織または細胞を使用して関節軟骨内の欠陥または病変を治療及び修復するための組成物及び方法）が出願されたことがある。
【００１６】
また、先行技術３は、大韓民国特許登録第６８４９３２号（２００７年０２月１３日）（出願番号第２００５−００３０８３７号）（名称：中間葉幹細胞と超音波刺激を用いて軟骨組織を再生する方法）が登録されたことがある。
【００１７】
しかしながら、上記の従来技術も次のような多くの問題点が発生した。
【００１８】
即ち、上記の従来技術は新生軟骨再生のための身体適合したコラーゲンと混合組成物を提供できないという大きな問題点が発生した。
【００１９】
また、上記の従来技術は混合組成物を注射方式に適用できなくて不便であるので、便利かつ効果的に損傷した軟骨組織部位を安定化させて軟骨再生誘導を促進させることができないという大きな問題点も発生した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
本発明は、上記のような従来技術の諸般問題点を解消するために案出したものであって、水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜６０ｍｇ／ｍＬのコラーゲン、水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、及び上記コラーゲンとヒアルロン酸を両方向注射器または混合器を用いて相互混合してなされた軟骨組織修復用組成物が備えられることを第１目的としたものであり、上記の技術的構成による本発明の第２目的は、生体適合物質であるコラーゲンを基盤とする組成物を軟骨欠損部位に移植可能な注射形態に組織修復を図れば、軟骨組織再生を効果的に誘導するので、人間を除外した動物に手術と関連した負担を減らしながら、容易かつ速く軟骨修復及び再生を誘導できるようにしたものであり、また、第３目的は、新生軟骨再生のための身体適合したコラーゲンと混合組成物を開発したものであり、特に、第４目的は混合組成物を注射方式に適用して外科的手術を伴わない簡便かつ効果的に損傷した軟骨組織部位を安定化させることができるようにしたものであり、そして、第５目的は軟骨欠損による痛みを減少させることができるようにしたものであり、併せて、第６目的は軟骨再生誘導を促進させることができるようにしたものであり、第７目的は、これによって製品の品質と信頼性を大幅向上させるので、使用者である消費者の多様な欲求（ニーズ）を満たして、よいイメージを植え付けることができるようにした軟骨組織修復用組成物と製造方法及びその使用方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
このような目的の達成のために、本発明は水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜６０ｍｇ／ｍＬのコラーゲン、水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、及び上記コラーゲンとヒアルロン酸を両方向注射器または混合器を用いて相互混合してなされることを特徴とする、軟骨組織修復用組成物を提供する。
【００２２】
また、本発明は水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜６０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを製造するステップ、水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸を製造するステップ、上記コラーゲンとヒアルロン酸を両方向注射器または混合器を用いて相互混合するステップ、及び上記混合された軟骨組織修復用組成物を遠心分離機を用いて気泡を除去するステップが含まれることを特徴とする、軟骨組織修復用組成物の製造方法を提供する。
【００２３】
また、本発明は豚の脚を据置台に固定した後、外科的装備を用いて膝関節軟骨を欠損させるためにドリルを用いて２〜４ｃｍ２の欠損部位を誘発するステップ、コラーゲン基盤の組成物が充填された注射容器に注射針を連結するステップ、及び縫合糸を用いて切欠部位を縫合し、注射器に入っている濃度が５〜６０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンと濃度が５〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、そしてこれらを相互混合した軟骨組織修復用組成物を豚膝の関節腔（滑液で満たされた空間）に直接注射するステップを経てなされる軟骨組織修復用組成物の使用方法を提供する。
【発明の効果】
【００２４】
前述したように、本発明は水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜６０ｍｇ／ｍＬのコラーゲン、水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、及び上記コラーゲンとヒアルロン酸とを両方向注射器または混合器を用いて相互混合してなされた軟骨組織修復用組成物が備えられるものである。
【００２５】
上記の技術的構成による本発明は、生体適合物質であるコラーゲンを基盤とする組成物を軟骨欠損部位に移植可能な注射形態に組織修復を図れば、軟骨組織再生を効果的に誘導
するので、人間を除外した動物に手術と関連した負担を減らしながら容易かつ速く軟骨修復及び再生を誘導できるようにしたものである。
【００２６】
また、本発明は新生軟骨再生のための身体適合したコラーゲンと混合組成物を開発したものである。
【００２７】
特に、本発明は混合組成物を注射方式に適用して簡便かつ効果的に損傷した軟骨組織部位を安定化させることができるようにしたものである。
【００２８】
そして、本発明は軟骨欠損による痛みを減少させることができるようにしたものである。
【００２９】
併せて、本発明は軟骨再生誘導を促進させることができるようにしたものである。
【００３０】
本発明は、上記の効果によって製品の品質と信頼性を大幅向上させるので、使用者である消費者の多様な要求（ニーズ）を充足させて、よいイメージを植え付けることができるようにした非常に有用な発明である。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】軟骨組織修復用組成物を混合する方法の図面代用写真である。
【図２】軟骨組織修復用組成物を両方向注射器で混合する図面代用写真である。
【図３】注射型に製造された軟骨修復材の図面代用写真である。
【図４】注射後、効果確認のための修復材の青色染色の図面代用写真である。
【図５】注射用修復材の効果確認のための軟骨欠損誘発図面代用写真である。
【図６】体内直接注射のために注射針を連結して用意する図面代用写真である。
【図７】豚膝軟骨欠損部位に直接注射して使用する図面代用写真である。
【図８】注入後、効果を確認した結果、欠損部位が修復材で満たされた図面代用写真である。
【図９】満たされた組成物は水に洗われなくて維持された図面代用写真である。
【図１０】コラーゲンとフィブリングルー混合組成物の移植後、移植物の形態の図面代用写真である。
【図１１】フィブリングルーでの軟骨細胞増殖の蛍光顕微鏡図面代用写真である。
【図１２】フィブリングルーでの軟骨細胞増殖の蛍光顕微鏡図面代用写真である。
【図１３】３％コラーゲン／フィブリングルー混合組成物での軟骨細胞増殖の蛍光顕微鏡図面代用写真である。
【図１４】３％コラーゲン／フィブリングルー混合組成物での軟骨細胞増殖の蛍光顕微鏡図面代用写真である。
【図１５】６％コラーゲン／フィブリングルー混合組成物での軟骨細胞増殖の蛍光顕微鏡図面代用写真である。
【図１６】６％コラーゲン／フィブリングルー混合組成物での軟骨細胞増殖の蛍光顕微鏡図面代用写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下、上記の効果達成のための本発明の好ましい実施形態を添付した図面により詳細に説明すれば、次の通りである。
【００３３】
本発明に適用された軟骨組織修復用組成物と製造方法及びその使用方法は、図１から図１０に図示したように構成される。
【００３４】
以下、本発明を説明するに当たって、関連した公知機能または構成に対する具体的な説
明が本発明の要旨を曖昧にすることがあると判断される場合には、その詳細な説明は省略する。
【００３５】
そして、後述する用語は本発明での機能を考慮して設定された用語であって、これは生産者の意図または慣例によって変わることがあるので、本明細書の全般に亘る内容に基づいて定義されるべきである。
【００３６】
まず、本発明は水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜６０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンと、水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、及び上記コラーゲンとヒアルロン酸とを両方向注射器または混合器を用いて相互混合してなされた軟骨組織修復用組成物を提供する。
【００３７】
上記の本発明の軟骨組織修復用組成物は、水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜６０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを製造するステップ、水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸を製造するステップ、上記コラーゲンとヒアルロン酸とを両方向注射器または混合器を用いて相互混合するステップ、及び上記混合された軟骨組織修復用組成物を遠心分離機を用いて気泡を除去するステップを経て製造する。
【００３８】
特に、上記遠心分離は１〜３０℃の室温を維持し、２，０００〜５，０００Ｇで遠心分離することを特徴とする。
【００３９】
上記のように製造された軟骨組織修復用組成物は、豚の脚を据置台に固定した後、外科的装備を用いて膝関節軟骨を欠損させ、ドリルを用いて２〜４ｃｍ２の欠損部位を誘発するステップ、コラーゲン基盤の組成物が充填された注射容器に注射針を連結するステップ、及び縫合糸を用いて切断部位を縫合し、注射器に入っている濃度が５〜６０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンと濃度が５〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、そしてこれらを相互混合した軟骨組織修復用組成物を豚膝の関節腔（滑液で満たされた空間）に直接注射するステップを経て軟骨組織修復用組成物を使用するようになる。
【００４０】
一方、本発明は水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜６０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを製造するステップ、水または生理学的リン酸塩緩衝液を除外した希釈された濃度が５〜２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸を製造するステップ、及びコラーゲン６０ｍｇ／ｍＬとヒアルロン酸５ｍｇ／ｍＬが９：１〜１：９の割合で混合された検体、またはコラーゲン６０ｍｇ／ｍＬとヒアルロン酸２０ｍｇ／ｍＬが５：５の割合で混合された検体を製造するステップにより軟骨組織修復用組成物を製造できることは勿論である。
【００４１】
一方、本発明は、
（１）注射容器に入っているコラーゲン溶液とフィブリングルー製品を用意するステップ、
（２）豚の脚を据置台に固定した後、外科的装備を用いて膝関節軟骨を欠損させ、ドリルを用いて２〜４ｃｍ２の欠損部位を誘発するステップ、
（３）注射器に入っているコラーゲン製品を豚膝軟骨欠損部位に注射して満たした後、フィブリングルーをコラーゲンの上に覆ってゲル化させて堅く固定するステップ、
（４）上記（３）の方式と反対に、豚軟骨欠損部位にフィブリングルーを塗布してゲル化させた後、コラーゲンをフィブリングルーゲルの内部に注入して軟骨欠損部位を満たすステップ、
（５）注射部位１０ｃｍの上から注射器を用いて滅菌注射用水を下方に撒いて（２５ｍＬ）、流れる用水に対する抵抗性を確認してゲルの欠損部位固着状態を観察するステップを
経て軟骨組織修復用組成物を使用するようになる。
【００４２】
そして、本発明は高粘度のコラーゲンとヒアルロン酸、またはコラーゲンとヒアルロン酸との混合組成物である軟骨修復用組成物をプレフィールドシリンジ注射器に充填して注射が可能な形態に軟骨組織修復用組成物を使用するようにする。
【００４３】
また、本発明は注射型軟骨注入剤に注射針を連結して適用部位の外科的切開無しで注射針で適用部位に直接挿入して豚膝の関節腔（滑液で満たされた空間）に直接軟骨修復用組成物を注入して軟骨組織修復用組成物を使用するようになる。
【００４４】
最後に、本発明は軟骨２〜４ｃｍ２を人為的に欠損して実験体を作って、軟骨修復用組成物を青色で染色して実験体に注入し、以後、移植部位を開けて直接欠損部位に満たされた性状を肉眼で確認すると共に、欠損部位固着状態を水に対する洗われ性で確認して軟骨組織修復用組成物を使用するようになる。
【００４５】
一方、本発明は上記の構成部を適用するに当たって、多様に変形されることができ、多様な形態を取ることができる。
【００４６】
そして、本発明は上記の詳細な説明で言及される特別な形態に限定されるものでないことと理解されるべきであり、むしろ添付の請求範囲により定義される本発明の精神と範囲内にある全ての変形物と均等物及び代替物を含むことと理解されるべきである。
【００４７】
上記のように構成された本発明の軟骨組織修復用組成物と製造方法及びその使用方法の作用効果を説明すれば、次の通りである。
【００４８】
まず、本発明は生体適合物質であるコラーゲンを基盤とする組成物を軟骨欠損部位に移植可能な注射形態に組織修復を図って再生を効果的に誘導するので、人を除外した動物に手術と関連した負担を減らしながら、容易かつ速く軟骨修復及び再生を誘導できるようにしたものである。
【００４９】
そして、本発明は軟骨欠損を簡単な手術により可能にしたものであって、外科的切開手術無しで簡単な注入式組成物移植方法により進行する簡便な手術方法であって、軟骨欠損治療が初期に可能であるので、関節手術を必要とする患者数を減少させることができるようにしたものである。さらに、上記した予防的な治療方法により骨関節炎が発生する患者数が減少する効果を提供するようになる。
【００５０】
このための本発明の実施形態は、次の通りである。
【００５１】
（実施形態１）
コラーゲンとヒアルロン酸との混合製品を用いて動物の軟骨欠損部位に適用する方法
【００５２】
目的：豚膝の軟骨欠損部位に注射方式のコラーゲンとヒアルロン酸との混合組成物の適用可能性確認
【００５３】
１．濃度５、１０、２０、３０、６０ｍｇ／ｍＬコラーゲンと、５、１０、２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸を製造する。
【００５４】
コラーゲン濃度：本製品の用途である軟骨修復のために欠損部位に満たされて形態を維持するために、コラーゲン濃度は５ｍｇ／ｍＬ以上が要求され、医療用目的（注射型）の製品製造工程特性（無菌製造）上、６０ｍｇ／ｍＬ超の超高粘度で製造、実使用、及び適
用が困難である。上記の理由によりコラーゲン濃度は５ｍｇ／ｍＬ以上、そして６０ｍｇ／ｍＬ以下に範囲を設定する。
【００５５】
ヒアルロン酸濃度：ヒアルロン酸本来の特性（粘性など）を維持したまま医療用目的製造（無菌製造）に２０ｍｇ／ｍＬ超の製造は困難であり、コラーゲンとの混合が容易ではない。また、製品に要求される性質（粘性）を維持するためには最小５ｍｇ／ｍＬ以上が要求される。そして、コラーゲン基盤にヒアルロン酸を添加して軟骨部位に作用して潤滑力を上昇させて軟骨の曲げ運動に助けになる。上記の理由によりコラーゲンにヒアルロン酸を添加し、ヒアルロン酸濃度は５ｍｇ／ｍＬ以上、そして２０ｍｇ／ｍＬ以下に範囲を設定する。
【００５６】
コラーゲン、コラーゲンとヒアルロン酸との混合組成物製造
【００５７】
混合方法Ａ：コラーゲン溶液と原料溶液との混合方法
【００５８】
１）用意されたコラーゲンを水または生理学的リン酸塩緩衝液で希釈して所望の濃度のコラーゲン溶液を製造する。
【００５９】
２）用意されたヒアルロン酸（粉末形態）を水または生理学的リン酸塩緩衝液で適正な濃度で希釈して製造する。
【００６０】
３）用意された溶液は短い時間の混合が容易な両方向注射器混合方式、または混合器（rolling）を用いて混合する（図１、図２）。
【００６１】
４）混合に使われる原料及び溶液は予め冷蔵条件（２〜８℃）で保管されたものを使用すれば、混合が容易かつ円滑になされる。
【００６２】
混合方法Ｂ：コラーゲン溶液に原料（粉末）を直接混合する方法
【００６３】
１）用意されたコラーゲンを水または生理学的リン酸塩緩衝液で希釈して所望の濃度のコラーゲン溶液を製造する。
【００６４】
２）適正濃度のコラーゲンを溶媒にしてヒアルロン酸（粉末形態）を入れて混合する。
【００６５】
３）用意された溶液は短い時間の混合が容易な両方向注射器混合方式、または混合スティックを用いて直接混合する。
【００６６】
４）高濃度の製品を製造することに必要な混合方式であり、混合時、周囲環境が低温維持状態で混合が容易かつ円滑になされる。
【００６７】
コラーゲン基盤の組成物を注入が可能な注射型に製造
【００６８】
１）コラーゲン及び混合されたコラーゲン基盤の組成物を遠心分離を用いて気泡を除去する。
【００６９】
２）遠心分離条件は、室温（１〜３０℃）を維持し、遠心分離効果（Ｇ値）は２，０００〜５，０００Ｇ。
【００７０】
３）注射容器に高粘度ポンプを用いて充填する。この際、下部から少しずつ上部にノズルを上げて空いた空間が生じないように注意する。
【００７１】
４）注射容器の後面に真空を用いて吸子を投入して完全に封入して注射容器から液が漏出しないようにする（図３）。
【００７２】
５）充填された注射容器はコラーゲン固有の特性を保存するために室温保管（１〜３０℃）する。
【００７３】
溶液は凍ってはならず、高温により変性が起こらない条件で保管が必須。
【００７４】
２．体内注入後、効果を確認するために用意された検体は少量の青色染色薬（Trypan blue、蛋白質に結合）で染色する（図４）。
【００７５】
３．使用方法及び効果確認
【００７６】
１）豚の脚を据置台に固定した後、外科的装備を用いて膝関節軟骨を欠損させ、ドリルを用いて大（約４ｃｍ２）、小（約２ｃｍ２）の欠損部位を誘発する（図５）。
【００７７】
２）コラーゲンなどが充填された注射容器に注射針を連結する。この際、注射針の長さは１１／２ｉｎｃｈ（３８ｍｍ）以上のものを使用する（図６）。
【００７８】
３）縫合糸を用いて切断部位を縫合し、注射器に入っている各々の濃度の製品を豚膝の関節腔（滑液で満たされた空間）に直接注射する（図７）。
【００７９】
４）膝関節運動（ＣＰＭ：Continuous Passive Motion）を進行して欠損部位に自然的に満たされて注入された物質が作用するように助ける。そして、縫合された部分を切断して製品を注入した軟骨部分を露出させて観察する。
【００８０】
４．結果：軟骨欠損部位に注入した製品が欠損誘発部位に自ら満たされて施術者が好む効果を示した（図８）。
【００８１】
（実施形態２）
コラーゲンとヒアルロン酸との混合組成物の粘着性確認実験
【００８２】
１．実施形態１と同一な方法により注射器に入っている濃度１０、３０、６０ｍｇ／ｍＬ（１、３、６％）コラーゲンと、５、１０、２０ｍｇ／ｍＬ（０．５、１．０、  ２．０％）のヒアルロン酸を用意する。そして、コラーゲン６０ｍｇ／ｍＬとヒアルロン酸５ｍｇ／ｍＬとが９：１〜１：９の割合で混合された検体と、コラーゲン６０ｍｇ／ｍＬとヒアルロン酸２０ｍｇ／ｍＬとが５：５の割合で混合された検体を用意する。この際、コラーゲンとヒアルロン酸との混合組成物の効果は、既存のコラーゲンの特性（生体適合した軟骨構成成分、生分解）とヒアルロン酸の特性である優れる潤滑力などの効果を加えて軟骨修復に適合した組成物を製造する。
【００８３】
２．コラーゲンとヒアルロン酸との混合割合に従う粘度測定
【００８４】
各々の検体は粘度測定器（Viscometer、ＤＶ−１＋ＰＲＯ）を用いて粘度を測定する。
【００８５】
−測定項目：粘度測定
−測定温度：４℃
−測定ＲＰＭ：０．５
−Spindle：＃ＳＣ４−１５
【００８６】
【表１】
2015514752.tif 000003
【００８７】
３．コラーゲンとヒアルロン酸との混合割合に従う粘着性試験
【００８８】
各々の検体は物性測定器（Rheometer、ＣＲ−５００ＤＸ）を用いて物質粘着距離を測定して粘着性を比較する。
【００８９】
試料台移動速度（１０ｍｍ／ｓｅｃ．）
【００９０】
試料台移動中、粘着が切れる地点の移動距離を測定する。
【００９１】
【表２】
2015514752.tif 000004
【００９２】
結果：コラーゲンとヒアルロン酸との混合組成物の粘着力が確認され、コラーゲン含有量が高いほど粘着性が高く観察された。
【００９３】
（実施形態３）
コラーゲンとヒアルロン酸を各々移植後、水に対する洗われ性確認試験
【００９４】
目的：注入された製品が欠損部位を持続的に付着（固着）して満たされる効果を妨害する要素に対する抵抗性確認。
【００９５】
１．実施形態１のような方法により注射器に入っている濃度３０、６０ｍｇ／ｍＬ（３％、６％）のコラーゲンと、１０、２０ｍｇ／ｍＬ（１％、２％）のヒアルロン酸を用意する。
【００９６】
２．豚の脚を据置台に固定した後、外科的装備を用いて関節軟骨を欠損させ、 ドリルを用いて大（約４ｃｍ２）、小（約２ｃｍ２）の欠損部位を誘発する。
【００９７】
３．注射器に入っている各々の濃度の製品を豚膝軟骨欠損部位に注射して満たす。
【００９８】
４．注射部位１０ｃｍの上から注射器を用いて注射用水を下方に撒く（２５ｍＬ）。
【００９９】
５．軟骨欠損部位に満たされた製品が流れる注射用水に対する抵抗性を肉眼で確認する。
【０１００】
６．結果：軟骨欠損部位に満たされた製品は流れる水に抵抗（洗われない）して持続的に付着して欠損部位の満たされた状態を維持する（図９）。
【０１０１】
（実施形態４）
軟骨欠損部位にコラーゲンとフィブリングルー適用方法及び組成物での細胞増殖試験
【０１０２】
目的：注射方式のコラーゲンとフィブリングルー適用方法の可能性確認とコラーゲンとフィブリングルーが適用された軟骨欠損修復に助けになる。
【０１０３】
１．実施形態１のような方法により注射容器に含まれた６％コラーゲン溶液を用意し、フィブリングルー製品を用意する。この際、使われるフィブリングルー製品の基本規格はフィブリノゲン濃度７１〜１２７ｍｇ／ｍＬ、トロンビン濃度４００〜６００ＩＵ／ｍＬ（一般的な商業用製品規格）。
【０１０４】
２．豚の脚を据置台に固定した後、外科的装備を用いて膝関節軟骨を欠損させ、ドリルを用いて大（約４ｃｍ２）、小（約２ｃｍ２）の欠損部位を誘発する。
【０１０５】
３．注射器に入っている６％濃度のコラーゲン製品を豚膝軟骨欠損部位に注射して満たした後、フィブリングルーをコラーゲンの上に覆ってゲル化させて堅く固定する。
【０１０６】
４．“３”の方式と反対に、豚軟骨欠損部位にフィブリングルーを塗布してゲル化させた後、６％コラーゲンをフィブリングルーゲルの内部に注入して軟骨欠損部位を満たす。
【０１０７】
５．注射部位１０ｃｍの上から注射器を用いて滅菌注射用水を下方に撒いて（２５ｍＬ）、流れる用水に対する抵抗性を確認してゲル状態を観察する。
【０１０８】
結果：軟骨欠損部位に満たされて堅いジェル形態を維持し、流れる水に抵抗して持続的に付着して欠損部位を満たされたまま維持する（図１０）。
【０１０９】
６．コラーゲンとフィブリングルーとの混合組成物での軟骨細胞の細胞増殖実験を進行する。
【０１１０】
混合組成物に用意された軟骨細胞（１．２×１０７ｃｅｌｌｓ／２ｍＬ）を混合する。
【０１１１】
３７℃条件で７日間ＣＯ２培養を進行する。
【０１１２】
Ｃａｌｃｅｉｎ−ＡＭ分析方法を通じての軟骨細胞の増殖を蛍光顕微鏡で観察する（左側から：フィブリングルー、３％コラーゲン／フィブリングルー混合組成物、６％コラーゲン／フィブリングルー混合組成物）。
【０１１３】
【表３】
2015514752.tif 000005
【０１１４】
結果：組成物での細胞増殖確認結果、フィブリングルーのみ使用したものよりコラーゲン３％、コラーゲン６％とフィブリングルーとの混合組成物での細胞増殖が高く観察された。
【産業上の利用可能性】
【０１１５】
本発明の軟骨組織修復用組成物と製造方法及びその使用方法の技術的思想は、実際に同一結果を反復実施可能なものであって、特にこのような本発明を実施することによって、技術発展を促進して産業発展に貢献することができるので、保護する価値が十分にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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