(57)【要約】細胞培養支援装置を製造および使用するためのシステムおよび方法が、本明細書において開示される。この装置は、各ポリマー層を通過するように画成された少なくとも1つのフローチャンバーをそれぞれ有する複数のポリマー層を含む。この装置はまた、異なるポリマー層のチャネル間にクロスチャネル境界面も含む。クロスチャネル境界面は、複数の細孔および該複数の細孔とは無関係に選択されるトポグラフィカルパターンを含む。さらに、トポグラフィカルパターンの形成は、細孔を維持する。2015508669.tif 000003
2015508669.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1のポリマー層を通過するように画成された第1のフローチャンバーを有する第1のポリマー層と;
第2のポリマー層を通過するように画成された第2のフローチャンバーを有する第2のポリマー層と;
第1のポリマー層と第2のポリマー層の間にあり、第1のフローチャンバーを第2のフローチャンバーから隔てている面であって、
第1のフローチャンバーと第2のフローチャンバーの間の連通および輸送を可能にするように構成された複数の細孔、ならびに
該面の少なくとも1つの表面上に形成された第1のパターンであって、該複数の細孔の幾何学的形態とは無関係であり、かつ該複数の細孔を維持する、第1のパターン
をさらに含む、面と
を含む、細胞培養支援装置。
【請求項２】
前記面が膜である、請求項1に記載の装置。
【請求項３】
第1のフローチャンバーおよび第2のフローチャンバーのうちの少なくとも1つが細胞チャンバーである、請求項1に記載の装置。
【請求項４】
最上層が、第1のポリマー層に結合しており、前記面の画像化を可能にするように構成されている、請求項1に記載の装置。
【請求項５】
第1のパターンが、トポグラフィックパターンおよび化学的パターンのうちの1つである、請求項1に記載の装置。
【請求項６】
第1のパターンが、第1の型の細胞をその上で増殖させるために選択される、請求項1に記載の装置。
【請求項７】
第2のパターンが、前記面の少なくとも1つの表面上に形成される、請求項1に記載の装置。
【請求項８】
第2のパターンが、第2の型の細胞をその上で増殖させるために選択される、請求項7に記載の装置。
【請求項９】
第1のパターンが、細孔の幾何学的形態を変えるように選択される、請求項1に記載の装置。
【請求項１０】
複数の細孔の構成が、第1のフローチャンバーと第2のフローチャンバーの間に特定のタイプの相互作用をもたらすように選択される、請求項1に記載の装置。
【請求項１１】
複数の細孔のサイズが、第1のフローチャンバーと第2のフローチャンバーの間の細胞移動を妨げ、かつ細胞栄養物および細胞シグナル伝達分析物が第1のフローチャンバーと第2のフローチャンバーの間を移動するのを可能にするように選択される、請求項1に記載の装置。
【請求項１２】
複数の細孔のサイズが、約3μm〜約15μmの間である、請求項11に記載の装置。
【請求項１３】
第1のパターンが、細胞増殖の特定の配置、機能、形状、並び、または密度を生じさせるように選択される、請求項1に記載の装置。
【請求項１４】
複数の細孔の幾何学的形態が、細胞増殖の特定の配置、機能、形状、並び、または密度を生じさせるように選択される、請求項1に記載の装置。
【請求項１５】
第1のポリマー層および第2のポリマー層のうちの少なくとも1つが生分解性ポリマーを含む、請求項1に記載の装置。
【請求項１６】
前記面が生分解性ポリマーを含む、請求項1に記載の装置。
【請求項１７】
第1のパターンが、前記面の分解速度に影響を及ぼすように選択される、請求項1に記載の装置。
【請求項１８】
第1のパターンが、前記面の特定の位置への細胞付着を促進するように選択される、請求項1に記載の装置。
【請求項１９】
第1のポリマー層中に第1のフローチャンバーを形成する段階、
第2のポリマー層中に第2のフローチャンバーを形成する段階;
面を貫通する特定のサイズの複数の細孔を形成する段階;
該面の少なくとも1つの表面のための第1のパターンを選択する段階であって、第1のパターンの選択が、細孔サイズの選択とは無関係である、段階;
該面の該少なくとも1つの表面上に、選択されたパターンを形成する段階であって、選択されたパターンの形成が、該面を貫通する該複数の細孔を維持する、段階;および
該面が第1のフローチャンバーを第2のフローチャンバーから隔てるように、第1のポリマー層および第2のポリマー層に該面を結合させる段階
を含む、細胞培養支援装置を製作するための方法。
【請求項２０】
第1のフローチャンバーおよび第2のフローチャンバーのうちの少なくとも1つに細胞を播種する段階をさらに含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
前記面が膜である、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
複数の細孔のサイズが、約3μm〜約15μmの間である、請求項19に記載の方法。
【請求項２３】
複数の細孔が、特定の細孔密度を有する、請求項19に記載の方法。
【請求項２４】
第1のパターンが、トポグラフィックパターンおよび化学的パターンのうちの1つである、請求項19に記載の方法。
【請求項２５】
第1のパターンの選択が、前記面上で増殖させる細胞の型に基づいている、請求項19に記載の方法。
【請求項２６】
前記面の少なくとも1つの表面のための第2のパターンを選択する段階であって、第2のパターンの選択が、細孔サイズの選択とは無関係である、段階;および
該面の該少なくとも1つの表面上に、選択された第2のパターンを形成する段階であって、選択された第2のパターンの形成が、該面を貫通する複数の細孔を維持する、段階
をさらに含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２７】
第1のパターンが第2のパターンとは異なっている、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
第1のパターンが、前記面上で増殖させる細胞の特定の配置、機能、形状、または密度を生じさせるように選択される、請求項19に記載の方法。
【請求項２９】
第1のポリマー層および第2のポリマー層のうちの少なくとも1つが生分解性ポリマーを含む、請求項19に記載の方法。
【請求項３０】
前記面が生分解性ポリマーを含む、請求項19に記載の方法。
【請求項３１】
第1のパターンが、前記面の分解速度に影響を及ぼすように選択される、請求項19に記載の方法。
【請求項３２】
前記面の特定の位置への細胞付着を促進するように第1のパターンを選択する段階;および
複数の細孔が、該細胞付着の位置と整列するように、複数の細孔の位置を選択する段階
をさらに含む、請求項19に記載の方法。
【請求項３３】
第1のポリマー層を通過するように画成された第1のフローチャンバーを有する第1のポリマー層と;
第2のポリマー層を通過するように画成された第2のフローチャンバーを有する第2のポリマー層と;
第1のフローチャンバーと第2のフローチャンバーの間の連通および輸送を可能にするように構成された複数の細孔、ならびに面の少なくとも1つの表面上に形成された第1のパターンを含む、面であって、第1のパターンが該複数の細孔の幾何学的形態とは無関係であり、かつ該複数の細孔を維持する、面と;
該面の表面を画像化するように構成されたイメージャーと
を含む、細胞培養支援システム。
【請求項３４】
前記面が第1のフローチャンバーを第2のフローチャンバーから隔てるように、第1のポリマー層と第2のポリマー層の間に該面を結合させるための手段をさらに含む、請求項33に記載のシステム。
【請求項３５】
第1のフローチャンバーおよび第2のフローチャンバーのうちの少なくとも1つを通過する流れを測定するように構成された流量計をさらに含む、請求項33に記載のシステム。
【請求項３６】
第1のフローチャンバーおよび第2のフローチャンバーのうちの少なくとも1つの入口および出口における圧力を測定するように構成された圧力センサーをさらに含む、請求項33に記載のシステム。
【請求項３７】
第1のフローチャンバーおよび第2のフローチャンバーのうちの少なくとも1つを通して流体を流すように構成された流体ポンプをさらに含む、請求項33に記載のシステム。
【請求項３８】
第1のフローチャンバーおよび第2のフローチャンバーのうちの少なくとも1つの入口に高分子を注入するための手段、ならびに第1のフローチャンバーおよび第2のフローチャンバーのうちの少なくとも1つの出口から流体を採取するための手段をさらに含む、請求項33に記載のシステム。
【請求項３９】
イメージャーが顕微鏡である、請求項33に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる2012年3月2日に出願された米国特許仮出願第61/606087号に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
開示の背景
インビボでの再吸収輸送は、輸送を司る基底膜(BM)によって支持された極性化上皮細胞の単層によって形成された天然バリアを通って起こる。溶質および分子は、経細胞経路または傍細胞経路によって上皮バリアを横切って間質腔および周囲の血管に至り、その結果、必須である水および溶質の再吸収が起こる。体内の再吸収バリアまたは吸収バリアの一般的な例には、気道、消化管、および尿管のものが含まれる。流体および溶質の輸送はこれらのバリアを横断して行われるため、循環中の毒素、病原性抗体、またはある種の薬物による傷害の影響を特に受けやすくなっている。
【発明の概要】
【０００３】
開示の要約
本開示の1つの局面によれば、細胞培養支援装置は、各ポリマー層を通過するように画成されたフローチャンバーをそれぞれ有する第1のポリマー層および第2のポリマー層を含む。さらに、細胞培養支援装置は、第1のポリマー層と第2のポリマー層の間に面(クロスチャネル境界面とも呼ばれる)も含む。この面は、第1のフローチャンバーを第2のフローチャンバーから隔てている。この面は、フローチャンバー間の連通および輸送を可能にするように構成された複数の細孔を含む。さらに、この面は、複数の細孔の幾何学的形態とは無関係なパターンを含む。
【０００４】
いくつかの実施形態において、前記面は膜であり、フローチャンバーは細胞チャンバーとなるように構成される。いくつかの実施形態において、装置の最上層は、いくつかの実施形態における面の画像化を可能にするように構成される。
【０００５】
ある種の実施形態において、パターンは、トポグラフィックパターンおよび/または化学的パターンである。パターンは、特定の細胞型の増殖を促進するように選択され得る。いくつかの実施形態において、複数のパターンが、前記面の表面上および/またはフローチャンバーの表面上に形成される。
【０００６】
他の実施形態において、細孔は、フローチャンバー間に特定のタイプの相互作用をもたらすように選択される。いくつかの実施形態において、細孔のサイズは、フローチャンバー間の細胞移動は妨げるが、細胞栄養物および細胞シグナル伝達分析物がフローチャンバー間を移動するのは可能にするように選択される。いくつかの実施形態において、細孔のサイズは、約3μm〜約15μmの間である。他の実施形態において、パターンおよび/または細孔の幾何学的形態は、細胞増殖の特定の配置、機能、形状、または密度を生じさせるように選択される。
【０００７】
さらに他の実施形態において、ポリマー層のうちの少なくとも1つおよび/または前記面は、生分解性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、パターンは、前記面の分解速度に影響を及ぼすように、かつ/または細胞培養支援装置内の特定の位置への細胞付着を促進するように、選択される。
【０００８】
開示の別の局面によれば、細胞培養支援装置を製作するための方法は、第1のポリマー層中に第1のフローチャンバーを形成する段階、および第2のポリマー層中に第2のフローチャンバーを形成する段階を含む。さらに、特定のサイズの細孔が、面を貫通して形成される。次いで、選択されたパターンが前記面に適用される。パターンの選択は、細孔のサイズおよび位置の選択とは無関係である。前記形成は、面上でのパターンの形成が複数の細孔を維持するように行われる。さらに、この方法は、前記面が第1のフローチャンバーを第2のフローチャンバーから隔てるように、第1のポリマー層および第2のポリマー層を結合させる段階も含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも1つのフローチャンバー中に播種される。ある種の実施形態において、細孔は、細孔が前記面上で特定の細孔密度を有するように、形成される。他の実施形態において、パターンは、前記面上で増殖させる細胞の型に応じて選択されたトポグラフィックパターンおよび/または化学的パターンである。
【００１０】
いくつかの実施形態において、この方法はまた、付加的なパターンを選択し、それらを前記面およびまたはフローチャンバーの壁の上に形成する段階も含む。付加的なパターンは、最初に選択されたパターンと同じでもよく、または異なってもよい。いくつかの実施形態において、パターンは、前記面上で増殖させる細胞の特定の配置、機能、形状、または密度を生じさせるように選択される。
【００１１】
さらに他の実施形態において、ポリマー層および/または前記面は、生分解性ポリマーを含む。いくつかの実施形態において、パターンは、前記面の分解速度に影響を及ぼすように選択される。
【００１２】
本開示のさらに別の局面によれば、細胞培養支援システムは、各ポリマー層を通過するように画成されたフローチャンバーをそれぞれ有する第1のポリマー層および第2のポリマー層、ならびに第1のポリマー層のフローチャンバーを第2のポリマー層のフローチャンバーから隔てている面を含む。この面は、フローチャンバー間の連通および輸送を可能にするように構成された複数の細孔を含む。さらに、この面の少なくとも1つの表面がパターン付けされる。このパターンは、細孔の幾何学的形態とは無関係であり、形成される際に細孔のサイズを維持する。また、このシステムは、前記面の表面を画像化するように構成されたイメージャーも含む。
【００１３】
ある種の実施形態において、このシステムは、第1のポリマー層と第2のポリマー層の間に前記面を結合させるための手段、少なくとも1つのフローチャンバーを通過する流れを測定するように構成された流量計、フローチャンバーの入口および/または出口における圧力を測定するように構成された圧力センサー、フローチャンバーを通して流体を流すように構成された流体ポンプ、ならびにフローチャンバーの入口に連結された高分子注入器を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本明細書において説明する図面は例示目的にすぎないことを当業者は理解するであろう。場合によっては、説明される実施形態の様々な局面は、説明される実施形態を理解するのを容易にするために強調または拡大して示され得ることを理解すべきである。図面において、通常、同様の参照符号は、同様の特徴、機能的に類似したかつ/または構造的に類似した要素を、様々な図面において一貫して意味する。これらの図面は必ずしも一定の縮尺ではなく、その代わりに本願の教示の本質を例示することに重点が置かれている。図面は、本発明の教示の範囲を限定することを決して意図しない。システムおよび方法は、以下の図面を参照して、以下の例示的な説明からより良く理解することができる。
【図１】細胞培養支援装置が使用される例示的なシステムのブロック図である。
【図２】図1のシステムで使用され得る例示的な細胞培養支援装置のソリッドモデルである。
【図３】フローチャンバーに細胞が播種された例示的な細胞培養支援装置の横断面図である。
【図４】例示的なクロスチャネル境界面の細孔のトポグラフィーを示す一連のソリッドモデルである。
【図５】図2の装置に類似した細胞培養支援装置を製造するための例示的方法のフローチャートである。
【図６】図1のシステムに類似したシステムにおいて細胞培養支援装置を使用するための例示的方法のフローチャートである。
【図７】図7Aは、例示的な細胞培養支援装置の横断面概略図である。図7Bは、図7Aに示した概略図に基づいて製造された細胞培養支援装置の画像である。図7C〜7Eは、図7Bに示した細胞培養支援装置の様々な拡大率での一連の走査型電子顕微鏡写真である。
【図８】様々な例示的クロスチャネル境界面のトポグラフィーを示す一連の走査型電子顕微鏡写真である。
【図９】図9Aは、細孔径の変化とホットエンボス加工のドエルタイムとの関係を示すプロット図である。図9Bは、ホットエンボス加工される際に、細孔径がクロスチャネル境界面のトポグラフィーによりどのように影響を受けるかを示すプロット図である。図9Cは、様々なトポグラフィーを有する例示的クロスチャネル境界面の一連の走査型電子顕微鏡写真である。図9Dは、細孔の伸長がクロスチャネル境界面のトポグラフィーおよび細孔径によりどのように影響を受けるかを示すプロット図である。
【図１０】図10Aは、HK-2細胞を播種された細胞培養支援装置のフローチャンバーの明視野顕微鏡画像である。図10Bは、図10Aで示したのと同じフローチャンバーをより高い倍率で見た明視野顕微鏡画像である。図10Cは、図10Aで示したフローチャンバーに播種された細胞の一連の共焦点顕微鏡画像である。図10Dは、初代腎近位尿細管上皮細胞を播種された細胞培養支援装置のフローチャンバーの明視野顕微鏡画像である。図10Eは、図10Dで示したのと同じフローチャンバーをより高い倍率で見た明視野顕微鏡画像である。図10Fは、図10Dで示したフローチャンバーに播種された細胞の一連の共焦点顕微鏡画像である。
【図１１】図11Aは、細胞を播種する前の例示的なクロスチャネル境界面の走査型電子顕微鏡写真である。図11Bは、クロスチャネル境界面上に細胞マットが形成された後の例示的なクロスチャネル境界面の走査型電子顕微鏡写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
詳細な説明
上記で説明し、下記でより詳細に考察する様々な概念は、多数の方法のいずれかで実施されてよく、説明される概念は、いかなる特定の実施様式にも限定されない。具体的な実施形態および応用の例は、主として例示目的で提供される。
【００１６】
気道、消化管、および尿管中の吸収バリアのモデルは、再吸収バリアの生物学および機能をより良く理解するため、それらのバリアに影響を与える潜在的な疾患メカニズムを調べるため、ならびにそれらのバリアを含む器官に対する毒性作用およびそれらの器官による排泄に関する薬物の迅速なスクリーニングを提供するためのプラットフォームを提供するであろう。特に、腎臓は薬物毒性の影響を受けやすく、薬物の排泄を司っているため、その腎臓上皮構造体は、再吸収バリアのインビトロモデルの貴重なテストケースとなる。このようなバリアをインビトロで製造および使用するためのシステムおよび方法が、本明細書において開示される。いくつかの実施形態において、本明細書において開示されるシステムおよび方法は、器官機能を補助するための医療装置として使用される。
【００１７】
図1は、細胞培養支援システム100を示す。システム100は、少なくとも1つの細胞培養支援装置101を含む。また、システム100は、第1の流体リザーバー102からの流体を細胞培養支援装置101の入口に送り込む少なくとも1つのポンプ103も含む。流体がポンプ103から細胞培養支援装置101へと進む際、流体は流量計104を通過し、分子注入器105を通り越す。細胞培養支援装置101を出て行く際、流体は流体試料採取器108を通り過ぎ、第2の流量計109を通過し、次いで、第2の流体リザーバー110中に蓄えられる。圧力センサー106は、細胞培養支援装置101の入口および出口の、または入口および出口の近くの圧力を測定する。さらに、システム100はイメージャー107も含み、これは、細胞培養支援装置101内部の細胞を見るのに使用される。
【００１８】
上述したように、システム100は、細胞培養支援装置101を支援するためのいくつかの構成要素を含む。ポンプ103は、第1の流体リザーバー102からの流体を押し流して細胞培養支援装置101を通過させる。いくつかの実施形態において、ポンプ103は、ぜん動ポンプまたはシリンジポンプである。シリンジポンプを使用する実施形態において、流体リザーバー102は、シリンジのバレルである。ポンプ103は、細胞培養支援装置101を通って流れる流体を制御する。例えば、ポンプは、流体の流速および細胞培養支援装置101を通過する流れの持続時間を制御することができる。いくつかの実施形態において、流れは連続的であり、他の実施形態において、流れはパルス状である。ポンプ103は、細胞培養支援装置101内の細胞に対して流体が及ぼす剪断応力を制御するように構成され得る。細胞培養支援装置101を通過させる流体には、細胞培養培地、細胞栄養物、試薬、試験物質、緩衝液流体、反応物流体、固定剤、染色剤、模擬および本物の生物学的流体、例えば、血液ろ液、全血、血清、血漿、尿、希釈した尿が含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。
【００１９】
いくつかの実施形態において、上記の作用物質および/または他の分子は、分子注入器105によって、細胞培養支援装置101中へ流れる流体に添加される。ある種の実施形態において、分子注入器105は、第2のシリンジポンプである。他の実施形態において、流体による栄養物の連続的な送達により、細胞培養支援装置101内での長期間の細胞培養にとって好都合な状態が作り出される。システム100はまた、流体試料採取器108も含む。流体試料採取器108は、細胞培養支援装置101の出口の近くに位置付けられる。いくつかの実施形態において、流体試料採取器108は、細胞培養支援装置101を出る流体を少量、サイホンで吸い上げるように構成されている。採取された流体は、特定の分子マーカー、試薬、または他のそのような分子に関して試験され得る。
【００２０】
システム100は、細胞培養支援装置101の入口近くの流量計104、細胞培養支援装置101の出口近くの流量計109、および圧力センサー106をさらに含む。圧力センサー106は、細胞培養支援装置101に入る際およびそれから出る際の流体の圧力を測定する。ある種の実施形態において、流量計104および流量計109ならびに圧力センサー106から得られる測定値は、細胞培養支援装置101内の細胞に加えられる剪断応力を算出するのに使用される。
【００２１】
イメージャー107は、細胞培養支援装置101内の細胞を観察するのに使用される。いくつかの実施形態において、流体が細胞培養支援装置101を通って流れている間に、細胞を画像化する。他の実施形態において、実験の最後に、固定液を細胞培養支援装置101に通過させて、実験法の完了時に細胞を画像化する。他の実施形態において、イメージャー107は、クロスチャネル境界面の完全性をモニターするように構成される。例えば、イメージャー107は、クロスチャネル境界面202が分解した程度を測定するように構成され得る。
【００２２】
図2は、細胞培養支援装置101をより詳しく示すソリッドモデルである。図に示したように、細胞培養支援装置101は、多層ポリマー装置である。細胞培養支援装置101は、第1のポリマー層203を通過するように画成された第1のフローチャンバー206を有する第1のポリマー層203を含み、第2のポリマー層201は、第2のポリマー層201を通過するように画成された第2のフローチャンバー205を有する。細胞培養支援装置101の第1のポリマー層203はまた、クロスチャネル境界面202も含む。他のいくつかの実施形態において、クロスチャネル境界面202は、第1のポリマー層203と第2のポリマー層201の間に結合されている付加的なポリマー層である。ある種の実施形態において、クロスチャネル境界面202は、熱可塑性物質、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン;ポリカプロラクトン(PCL)などの生分解性ポリエステル;ポリグリセロールセバケート(PGS)などの軟性エラストマー;またはポリジメチルシロキサン(PDMS)およびポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)などの他のポリマーでできている膜である。さらに他の実施形態において、クロスチャネル境界面202は、ケイ素、ガラス、または窒化ケイ素から作られている。いくつかの実施形態において、クロスチャネル境界面202は、トラックエッチング、エレクトロスピニング、超微細加工、マイクロモールディング、ゲルデポジション、相分離、粒子リーチング、および溶媒リーチングなどの加工方法によって製造される。さらに他の実施形態において、クロスチャネル境界面202は、いくつかの材料の層を含む多層膜である。例えば、前記材料は、構造支持体、外被層、多孔質層、透過性スペーサーとしての機能を果たすかまたは横方向の流動を可能にする層であってよい。
【００２３】
上述したように、ある種の実施形態において、細胞培養支援装置101の内部は、イメージャー107を用いて画像化される。したがって、いくつかの実施形態において、第1のフローチャンバー206の屋根204は、第1のフローチャンバー206、クロスチャネル境界面202、および/または第2のフローチャンバー205の目視検査を可能にするように構成されている。他の実施形態において、屋根204は、ポリマー層に類似した、またはポリマー層と同じ材料から製造されたポリマー層である。ある種の実施形態において、細胞培養支援装置101は、ポリマー層内に複数のフローチャンバーを含む。さらに、いくつかの実施形態において、細胞培養支援装置101は、フローチャンバーを有するポリマー層を3つ以上含む。例えば、細胞培養支援装置101は、異なるクロスチャネル境界面202によって互いからそれぞれ隔てられた3つまたはそれ以上のポリマー層を含み得る。ポリマー層には、熱可塑性物質、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリイミド;ポリカプロラクトン(PCL)などの生分解性ポリエステル;ポリグリセロールセバケート(PGS)などの軟性エラストマー;またはポリジメチルシロキサン(PDMS)およびポリ(N-イソプロピルアクリルアミド)などの他のポリマーが含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。ある種の実施形態において、ポリマー材料は、微細機械加工されて細胞増殖を支援できる能力に関して選択される。いくつかの実施形態において、フローチャンバーの長さ、幅、および高さは、腎臓構造を模倣するように選択される。他の実施形態において、フローチャンバーの高さは、約10μm〜約100μmの間であり、幅は約250μm〜約2mmの間であり、長さは約5mm〜約10mmの間である。
【００２４】
図3および図4A〜4Cに関してより詳細に考察するが、簡単に説明すると、クロスチャネル境界面202は、第1のフローチャンバー206と第2のフローチャンバー205の間の連通を可能にする。複数の細孔207は、クロスチャネル境界面202を貫通するように画成され、クロスチャネル境界面202の少なくとも1つの表面は、細孔207とは無関係であるトポグラフィーを含む。トポグラフィーとは無関係に作製される細孔207を有するクロスチャネル境界面202により、基底膜(BM)に似た構造を容易にする多孔質膜が生成され、実験の変数をより良好に調節することが可能になる。いくつかの実施形態において、トポグラフィーは、細孔207に対して特定の効果を有するように選択される。例えば、トポグラフィーは、クロスチャネル境界面202の特定の領域において細孔の占有率を変更するかもしくは細孔を閉じるか、または細孔207のサイズを特定の大きさだけ小さくするように選択され得る。
【００２５】
いくつかの実施形態において、クロスチャネル境界面202の細孔207は、トラックエッチングによって作製される。トラックエッチングは、均一性の高い細孔207を作製する。細孔のサイズは、幅が約3μm〜15μmの間の範囲である。クロスチャネル境界面202は、厚さが約6μm〜30μmの間である。
【００２６】
上記に示したように、クロスチャネル境界面202の少なくとも1つの表面は、選択されたトポグラフィーでパターン付けされる。ある種の実施形態において、第1のフローチャンバー206および/または第2のフローチャンバー205の少なくとも1つの壁もまた、選択されたトポグラフィーでパターン付けされる。いくつかの実施形態において、パターン付けされた表面(例えば、クロスチャネル境界面202の表面および第1のフローチャンバー206の壁)は、異なるトポグラフィーでパターン付けされる。さらに他の実施形態において、同じ表面の異なる部分が、異なるトポグラフィーでパターン付けされる。
【００２７】
図3は、図2の細胞培養支援装置101に類似した細胞培養支援装置300の横断面図である。細胞培養支援装置300は、第1のフローチャンバー206が中に画成された第1のポリマー層、および第2のフローチャンバー205が中に画成された第2のポリマー層201を含む。クロスチャネル境界面202は、第2のフローチャンバー205の屋根および第1のフローチャンバー206の床を形成する。最上面のポリマー層204は、第1のフローチャンバー206の屋根を形成する。先に考察したように、クロスチャネル境界面202は、複数の細孔207を含む。例示したように、細胞培養支援装置300は、第1のフローチャンバー206中に播種された第1の複数の細胞302および第2のフローチャンバー205中に播種された第2の複数の細胞303を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、フローチャンバー206および205のうちの1つの中に播種されるのみである。流れの矢印301によって示されるように、流体連通は、細孔207を通じて起こる。流体連通には、高分子、栄養物、および試験物質の受動輸送が含まれ得るが、それに限定されるわけではない。いくつかの実施形態において、細孔207のサイズは、細胞がクロスチャネル境界面202を横断して移動するのを可能にするものであり、他の実施形態において、細孔207のサイズおよび/または形状は、細胞がチャンバーを越えて移動するのを阻害するが、チャンバー間での栄養物および細胞シグナル伝達分析物の移動は可能にするものである。細孔207は、クロスチャネル境界面202の全長にわたってランダムにまたは秩序のある様式で、分散していてよく、いくつかの実施形態において、細孔207は、クロスチャネル境界面202の特定の領域に限定されている。いくつかの実施形態において、その配置、形状、およびサイズは、細孔の幾何学的形態と呼ばれる。
【００２８】
図4A〜4Cは、クロスチャネル境界面に適用され得るトポグラフィカルパターンを例示するソリッドモデルである。説明の目的のため、クロスチャネル境界面は、3つの細孔207を含む;しかし、細孔の間隔も、並びも、密度も、同様である必要はない。クロスチャネル境界面202のトポグラフィーは、細胞培養支援装置101中に播種される予定の細胞に基づいて選択され、細胞の特定の配置、機能、形状、および/または密度をもたらすように選択され得る。いくつかの実施形態において、クロスチャネル境界面202は、生分解性ポリマーから製造される。これらの実施形態のいくつかにおいて、表面パターンは、クロスチャネル境界面202の分解を促進および/または制御するように選択される。ある種の実施形態において、トポグラフィーは、それらが特定の速度でまたは特定の化学薬剤に曝露された場合に分解するように、選択され製造される。例えば、パターン付けされるトポグラフィーおよびクロスチャネル境界面202は、細胞マットがクロスチャネル境界面202上に一度広がるとクロスチャネル境界面202が完全に溶解するように、構成され得る。したがって、このような実施形態において、クロスチャネル境界面202の分解後、第1のポリマー層203および第2のポリマー層201は、細胞マットのみによって隔てられている。
【００２９】
図4Aは、滑らかで、トポグラフィカルパターンを含まないクロスチャネル境界面410の一部分を例示する。図4Bは、隆起および溝のパターンを有するクロスチャネル境界面420を例示する。隆起および溝のパターンは、フローチャンバーを通過する流体の流れに対して垂直に、平行に、または角度をつけて整列させてよい。他の実施形態において、隆起は、幅が約0.5μm〜約1.0μmの間であり、ピッチは約1.0μm〜約2μmの間であり、高さは約0.5μm〜1.0μmの間である。いくつかの実施形態において、隆起の寸法および間隔は、パターン付けされた面の全体を通じて一定である。他の実施形態において、隆起パラメーターのうちの1つまたは複数は、パターン付けされた面の長さに沿って変化する。例えば、隆起間の間隔は、1.0μmから始まって、フローチャンバーの出口において2.0μmの間隔に移行してよい。ある種の実施形態において、隆起および/または溝は、丸みを帯びている。
【００３０】
図4Cは、くぼみのパターンを有するクロスチャネル境界面430を例示する。例示したように、くぼみは円柱状であるが、他の実施形態において、くぼみは、長方形、正方形、円錐台形、円錐形、および/または半球形であってよい。さらに、上記のくぼみパターンを逆さにして、柱を作製してもよい。くぼみおよび柱は、秩序のある規則的な様式で、またはランダムに、パターン付けされてよい。例えば、秩序のある規則的な様式では、半球形の柱は、1列の各柱の間が1.0μmであり、各列の間が1.5μmである、秩序立った列の状態で整列させてよい。いくつかの実施形態において、クロスチャネル境界面202のトポグラフィーは、複数の前述のトポグラフィーを含む。
【００３１】
図5は、システム100のものなどの細胞培養支援装置を製造するための方法500のフローチャートである。方法500は、第1のポリマー層中に第1のフローチャンバーを形成する段階(段階501)を含み、第2のポリマー層中に第2のフローチャンバーを形成する段階(段階502)も含む。さらに、方法500は、クロスチャネル境界面に細孔を形成する段階(段階503)も含む。トポグラフィカルパターンが、選択され(段階504)、クロスチャネル境界面に形成される(段階505)。いくつかの実施形態において、クロスチャネル境界面は、第1のポリマー層と第2のポリマー層の間に結合される(段階506)。
【００３２】
前記のように、第1のフローチャンバーは第1のポリマー層中に製造され(段階501)、第2のフローチャンバーは第2のポリマー層中に製造される(段階502)。フローチャンバーは、フォトリソグラフィー技術、射出成形、直接的微細機械加工、深掘りRIEエッチング、熱エンボス加工、またはそれらの任意の組合せによって製造され得る。いくつかの実施形態において、図2に例示するように、クロスチャネル境界面202は、第1のポリマー層203に属する構成要素である。他の実施形態において、クロスチャネル境界面202は、別個に製造され、その後第1のポリマー層と第2のポリマー層の間に結合される、独立した構成要素である。
【００３３】
細胞培養支援装置を製造する方法500では、クロスチャネル境界面における細孔の形成へと進む(段階503)。いくつかの実施形態において、クロスチャネル境界面202の細孔207は、クロスチャネル境界面202からの微粒子のリーチング、相分離マイクロモールディング、トラックエッチング、またはそれらの任意の組合せによって製造される。ある種の実施形態において、クロスチャネル境界面202は、細孔207が既製の状態で得られる。
【００３４】
方法500では、クロスチャネル境界面に適用するためのトポグラフィカルパターンの選択(段階504)、および次いで、選択されたパターンのクロスチャネル境界面への適用(段階505)へと進む。上述したように、パターンの選択は、クロスチャネル境界面202上で増殖させる細胞、ならびに/または播種される細胞の所望の配置、機能、形状、および密度に依存し得る。トポグラフィカルパターンの選択に応じて、このパターンがクロスチャネル境界面202に適用される。
【００３５】
クロスチャネル境界面202およびパターン付けされるフローチャンバーの任意の壁は、熱エンボス加工を用いてパターン付けされてよい。熱エンボス加工は、2段階の成形工程として遂行され得る。最初に、フォトリソグラフィーおよび反応性イオンエッチングを用いて、シリコン鋳型が製作される。工程のこの第1の段階では、選択されたパターンのポジ型を生成する。次に、このポジ型からネガ型を作製する。ネガ型は、ポジ型鋳型にニッケルを電鋳することによって形成する。電鋳は、ニッケル源とシリコン鋳型の間に電圧差を加えることによって、遂行される。これにより、ニッケルがシリコン鋳型の中に流れ込む。いくつかの実施形態において、エンボス加工に先立って、ニッケル鋳型のパターン付けされた表面は、1mMヘキサデカンチオール(HDT)溶液に浸される。この溶液は、自己組織化単分子膜(SAM)を形成して表面エネルギーを減少させて、その後のポリマー遊離を助ける。
【００３６】
熱エンボス加工方法の第2の段階は、トポグラフィーをパターン付けされたニッケル鋳型の表面と接触するようにクロスチャネル境界面202を配置する段階を含む。鋳型およびクロスチャネル境界面202は、粘着を減らし伸展性を加えるために、2枚のKaptonポリイミドフィルムとシリコーンゴムシートの間に挟まれる。次いで、この積み重ねたものを、均等に加熱され温度および圧力を管理された自動液圧プレス中に置く。温度が約150℃に設定されている間、軽い負荷が、この積み重ねに加えられる。負荷は、定圧下で60℃まで冷却される前に、指定されたドエルタイムの間、加えられる。冷却すると、新しくパターン付けされた膜がニッケル鋳型から離れ、細孔のサイズおよび幾何学的形態の変化について解析される。トポグラフィカルパターンがクロスチャネル境界面202に完全に作製されるが、ポリマー材料を細孔207中に流れさせないように、ドエルタイム、圧力、および温度の組合せが選択される。いくつかの実施形態において、ドエルタイムは、約700kPa〜約850kPaの間の圧力下、約125℃〜約175℃の間の温度において、約10〜約20分の間であるように選択された。例えば、820kPa、150℃において15分のドエルタイムでは、細孔の構造が維持される。他の実施形態において、代替的なエンボス加工パラメーターおよび工程が使用され得る。
【００３７】
いくつかの実施形態において、細胞培養支援装置を製造する方法500は、第1のポリマー層と第2のポリマー層の間にクロスチャネル境界面を結合させる段階を含む(段階506)。上述したように、いくつかの実施形態において、クロスチャネル境界面202は、第1のポリマー層または第2のポリマー層に属する構成要素であり、したがって、これらの実施形態において、第1のポリマー層203は、第2のポリマー層201に対して直接的に完成させる。他の実施形態において、クロスチャネル境界面202は、第1のポリマー層と第2のポリマー層の間に結合される。ある種の実施形態において、細胞培養支援装置101の構成要素は、可逆的に互いに結合される。例えば、クランプを用いて、実験中に構成要素を相互に結合させ、実験後にさらに解析するためにクロスチャネル境界面202を取り外すのを可能にすることができる。
【００３８】
図6は、システム100に類似したシステムにおいて細胞培養支援装置を使用するための方法600のフローチャートである。方法600は、細胞培養支援装置を提供する段階から始まる(段階601)。次いで、細胞培養支援装置の少なくとも1つのフローチャンバー中に細胞が播種される(段階602)。方法600では、細胞培養支援装置のフローチャンバーを通して流体を流す段階(段階603)および少なくとも1つのフローチャンバーの入口に分子を注入する段階(段階604)へと進む。フローチャンバーを通して流体を流す段階に対応して、少なくとも1つの流動パラメーターが測定され(段階605)、注入された分子の濃度が、少なくとも1つのフローチャンバーの出口で測定される(段階606)。
【００３９】
上述したように、方法600は、図2の細胞培養支援装置101のような細胞培養支援装置を提供する段階によって始まる(段階601)。次に、細胞培養支援装置中に細胞が播種される(段階602)。いくつかの実施形態において、細胞培養支援装置101は、あらかじめ組み立てられて提供され、他の実施形態において、細胞培養支援装置101は、組み立てられていない状態で提供される。例えば、細胞は、細胞培養支援装置101を組み立てる前にクロスチャネル境界面202上に播種され得る。次いで、細胞を播種されたクロスチャネル境界面202は、細胞が実験法に適切な成熟レベルに達するまで、インキュベーター中で培養され得る。他の実施形態において、細胞は、シリンジを用いて細胞培養支援装置101中に注入され、クロスチャネル境界面202および/またはフローチャンバーの他の面に付着させる。ある種の実施形態において、細胞培養支援装置101は、細胞播種の前に滅菌される。例えば、細胞培養支援装置101は、酸化エチレンを用いて滅菌され、次いで70％エタノールですすがれてよい。また、ある種の実施形態において、細胞播種の前に、クロスチャネル境界面202および/または細胞培養支援装置101の残りの構成要素は、細胞増殖を阻害または促進するための作用物質などの作用物質でコーティングされる。例えば、細胞に曝露される細胞培養支援装置101の面は、細胞外マトリックス、コラーゲンIV、コラーゲンI、ラミニン、フィブロネクチン、アグリン、ネフリン、もしくは類似タンパク質、アルギニン-グリシン-アスパラギン酸もしくは類似ペプチド、または接着性モチーフでコーティングされてよい。
【００４０】
方法600では、細胞培養支援装置を通して流体を流す段階(段階603)へと進む。図1に関連して前述したように、細胞培養支援装置101のチャンバーを通過する流体の流れは、ポンプ103を用いて制御される。いくつかの実施形態において、流体は、フローチャンバーのうちの1つを通してのみ流される。例えば、第1のチャンバーは、流れる流体によって引き起こされる剪断応力にチャンバー内の細胞が曝露されないように、灌流を伴わない細胞ウェルの役割を果たし得る。この例において、栄養物または他の作用物質は、細胞ウェルの下のフローチャンバー中を流れる流体から細胞ウェルを隔てるクロスチャネル境界面202の細孔207を通じて細胞ウェルに輸送され得る。
【００４１】
方法600はまた、少なくとも1つのフローチャンバーの入口に分子を注入する段階も含む(段階604)。分子は、細胞培養培地、細胞栄養物、試薬、試験物質、緩衝液流体、反応物流体、固定剤、および/または染色剤であってよい。いくつかの実施形態において、分子の注入および/またはポンプ103は、特定の流速および分子濃度が細胞培養支援装置101内で実現されるように、コンピューター制御されている。注入される分子の例には、水、ナトリウム、カリウム、塩素、および他のイオン;尿素クレアチニン、および他の代謝産物;酸素、二酸化炭素、窒素、および他の気体;所定の分子量の高分子、例えば、イヌリン、フィコール、デキストラン、アルブミン、および他のタンパク質;薬学的作用物質およびそれらの代謝によって変化した形態;毒素;細胞および細胞内生物学的成分、例えば、血小板および微粒子;マイクロ粒子およびナノ粒子を含む固形物の大型粒子;合成または天然由来いずれかの脂質および他の小胞;気泡または他の気相粒子が含まれ得るが、それらに限定されるわけではない。
【００４２】
細胞培養支援装置を通して流体を流す段階に対応して、少なくとも1つの流動パラメーターが測定される(段階605)。流動パラメーターの測定は、直接的に測定されるパラメーター、例えば、流体の流速および流体圧力か、演繹された測定値、例えば、剪断応力測定値、のいずれかであるパラメーターを含み得る。ある種の実施形態において、測定は、細胞培養支援装置の入口、出口、および/または内部で行われる。他の実施形態において、クロスチャネルの透過性が測定される。例えば、所与の膜間差圧において膜を通過する化学物質、分子、または作用物質の流束を測定する水力学的透過率が測定され得る。ある種の実施形態において、膜間差圧は、直接測定することによって、またはチャネルの入口および出口における圧力レベルに基づいて測定値を導き出すことによって、測定される。流体の流速は、サイズが公知である管の充填の程度(filling)の測定、入口/出口の質量の経時的測定、流れの可視化技術、粒子画像速度測定法、およびトレーサー元素または造影剤を用いる技術によって、定量することができる。
【００４３】
さらに、方法600は、少なくとも1つのフローチャンバーの出口における注入された分子の濃度を測定する段階を含む(段階606)。いくつかの実施形態において、クロスチャネル境界面202(いくつかの実施形態においては、クロスチャネル境界面202に播種された細胞の層)を通過する輸送は、第1のフローチャネルの入口に分子を注入し、次いで、第2のフローチャネルの出口における分子の濃度を測定することによって、測定される。
【００４４】
いくつかの実施形態において、膜を横断する特定の化学種の輸送は、細胞フローチャンバーの入口および/または細胞フローチャンバーの出口において、細胞フローチャンバー中の溶質、粒子、および流体の他の成分の濃度を評価することによって解析される。ある種の実施形態において、分子の濃度は、センサー、分子選択的色素、可溶性ナノセンサー、分子標識、例えば、放射性標識またはトレーサーを用いて測定される。いくつかの実施形態において、濃度および流れの評価は、装置、クロスチャネル境界面202、および/または膜-細胞構築物おける分子または成分のふるい係数が定められるように構成され得る。ふるい係数とは、膜を通過する流体中の特定の分析物の濃度を、膜に送り込まれる際の流体中の同じ分析物の濃度で割ったものである。ふるい係数は、多孔質膜の選択性を反映することができる。
【実施例】
【００４５】
I  トポグラフィックパターニング
図7A〜7Eは、前述の熱エンボス加工方法を用いて製造された細胞培養支援装置の様々な拡大率での一連の画像を示す。本実施例において、クロスチャネル境界面は、細胞培養支援装置に組み入れられる、トポグラフィーをパターン付けされた独立した膜として製造した。図7Aは、細胞培養支援装置の全体的な横断面構造の概略図である。図2の細胞培養支援装置101の場合のように、概略図は、第1のポリマー層中に画成された上側細胞チャンバーおよび第2のポリマー層中に画成された下側細胞チャンバーを示す。クロスチャネル境界面は、第1のポリマー層と第2のポリマー層の間に結合され、カバースライドが、上側細胞チャンバーの屋根となっている。図7Bは、組み立てられた細胞培養支援装置を示し、図7C〜7Eは、さらにその細部を提供している。
【００４６】
図7Cは、図7Bの装置の断面を示す走査型電子顕微鏡写真である。この顕微鏡写真は、上側チャンバーと下側チャンバーを隔てているクロスチャネル境界面の多孔質の性質を示している。図7Dおよび7Eは、図7Cの囲み部分を拡大した走査型電子顕微鏡写真である。図7Dおよび7Eは、多孔質構造と共に存存している、輪郭のはっきりした溝トポグラフィーを示す。
【００４７】
II  トポグラフィーの例
図8A〜Eは、直径8μmの細孔を有するクロスチャネル境界面上に前述の熱エンボス加工方法を用いて作製した例示的なパターントポグラフィーを示す一連の走査型電子顕微鏡写真である。図8Aは、3つの細孔および滑らかなトポグラフィーを含むクロスチャネル境界面202の画像である。図8B〜8Dは、図4A〜4Cに関連して考察した隆起および溝のトポグラフィーを示す。また、図8B〜8Dは、隆起の幅がトポグラフィーに与える影響も示す。隆起の幅は、図8Bで0.5μmであり、図8Cで0.75μmであり、図8Dで1.0μmである。同様に、図8Eは、均等に間隔のあいた1.0μmのくぼみを有するクロスチャネル境界面を示す。図8B〜8Eにおいて、トポグラフィックな特徴は、深さ0.75μmである。
【００４８】
III  熱エンボス加工のパラメーター
上述したように、クロスチャネル境界面へのトポグラフィカルパターンのエンボス加工は、細孔の構造を変えないように管理された様式で行われる。適切なエンボス加工パラメーターを決定するために、150℃で820kPaの一定負荷をかけて、一連のクロスチャネル境界面を熱エンボス加工した。これらの試験の際、ドエルタイムは10〜30分の範囲であった。図9Aは、細孔径(y軸)がドエルタイム(x軸)に伴ってどのように変化するかを示すグラフである。図9Aのプロット図は、予めエンボス加工されたクロスチャネル境界面と比べた場合、15分未満のドエルタイムでは呼び細孔サイズが有意に変化しなかったことを示す。しかし、ドエルタイムが長くなって20分を超えると、細孔径は、予めエンボス加工された直径と比べて有意に減少した。
【００４９】
図9Bは、異なるトポグラフィーがエンボス加工工程の間に細孔径にどのように影響を与えるかを示す、一連の棒グラフである。この実験のために、直径3μm、5μm、8μm、または12μmの細孔を有するクロスチャネル境界面を作製した。各クロスチャネル境界面上の細孔の直径を測定し、平均して、実験の対照とした。次いで、ドエルタイム20分、150℃で820kPaの条件を用いて、クロスチャネル境界面を熱エンボス加工した。結果として生じる細孔径を測定し、平均した。
【００５０】
図9Bは、エンボス加工により、直径8μmの細孔および直径12μmの細孔などの大きな細孔を有する膜の細孔径は減少するが、直径3μmの細孔および直径5μmの細孔などの細孔径が小さな細孔の細孔径は減少しないことを示す。8μmおよび12μmの細孔を有するクロスチャネル境界面は、エンボス加工後、全てのトポグラフィーに渡って細孔径の減少を示した。また、細孔径12μmが4番目の群(12μmの群)にとって望ましかったものの、実際の細孔径を測定したところ、10μmにより近かった。したがって、熱エンボス加工工程によって引き起こされた12μmクロスチャネル境界面における細孔径の減少は、統計学的に有意ではないものの、所望の対照細孔径と実際に測定された細孔径12μmの間の差よりも小さかった。
【００５１】
細孔径のいくらかの減少は、高い温度および圧力下でポリマーが流れることが原因の、エンボス加工後のものと予想される。細孔の変形は、パターンのタイプとは無関係であった。10〜15分のドエルタイムは、細孔径を有意に変えることなくクロスチャネル境界面にパターンを転写する良いバランスを実現した。
【００５２】
いくつかの実験において、細孔は完全な円ではなく、細孔の伸長は、熱エンボス加工工程の間に悪化した。図9Cは、隆起および溝のトポグラフィー(10Gratのトポグラフィーは、2.0μmの間隔を空けて配置された1.0μm幅の隆起に対応する)をエンボス加工された3〜12μmの細孔の伸長の差を示す、一連の走査型電子顕微鏡写真である。図9Dは、図9Bに表したのと同じグループ分けの棒グラフであり、ドエルタイム20分、150℃で820kPaの条件を用いた熱エンボス加工によって誘導された伸長の量を割合として表して示している。エンボス加工されていない対照クロスチャネル境界面の標準的な細孔は、少し伸びた形状を示し、伸長割合の範囲は、12μmの細孔の場合の0.16から3μmの細孔の場合の0.34であった。図9Dは、エンボス加工後の細孔の伸長割合が、最初の細孔径および場合によってはトポグラフィーに、どのように依存していたかを示す。細孔径が小さい、すなわち3μmおよび5μmであるクロスチャネル境界面の方が、大きい細孔サイズと比べて、細孔の伸長の割合が有意に高かった。細孔サイズ3μmのクロスチャネル境界面は、10Gratパターンをエンボス加工された場合、平均伸長割合がほぼ0.5、すなわち対照から49％増加した細孔を示した。平均して、3μm細孔の伸長は、全ての線状パターンの全般において、37％増加した。大きな細孔サイズ、すなわち8μmおよび12μmの場合、細孔伸長の変化は、対照細孔の幾何学的形態と比べて、大半のトポグラフィーの全般において微々たるものとなった。8μm細孔の伸長は、線状パターンにおいて平均して15.3％しか増加しなかった。12μm細孔を有するクロスチャネル境界面の伸長割合は最も低く、線状パターンでの平均伸長は0.23であった。1μmのくぼみの形態のトポグラフィックな特徴は、細孔のサイズが小さい膜および大きい膜の細孔伸長に与える影響が最も小さく、3μmの細孔の場合の0.37から12μmの細孔の場合の0.22までの範囲であった。
【００５３】
IV  細胞は、多孔質膜トポグラフィー上で増殖し、それに応答する
パターン付けされた多孔質クロスチャネル境界面(膜とも呼ばれる)によって隔てられた2つのチャネルからなる、図7A〜7Eの装置のものに類似した細胞培養支援装置は、パターン付けされた多孔質膜上で培養された腎臓上皮細胞の応答を特徴付けるためのプラットフォームとして役立った。この装置の性能は、3つの方法で評価した。第1に、細胞の並びを解析することによって、装置の外側のパターン付けされていない膜およびパターン付けされた膜に対するHK-2の応答の特徴を明らかにした。第2に、チャネルの幾何学的形態および並びを検証するための走査型電子顕微鏡観察および光学顕微鏡観察によって、細胞培養支援装置を評価した。第3に、免疫蛍光技術を用いて、細胞培養支援装置中で培養された細胞に対して再吸収性上皮層を示唆するマーカーを標識した。
【００５４】
実験の間、HK-2細胞および腎近位尿細管上皮細胞(RPTEC)は、最初の播種からコンフルエントになるまで、約4日間に渡って細胞培養支援装置内で増殖した。最初の播種密度を均一にし、培養を適切な時間行うことによって、HK-2およびRPTECの両方とも、1.25mm2の細胞培養支援装置チャネル領域の全体に渡って完全にコンフルエントになった。これらは図10Aおよび図10Dにそれぞれ明視野合成写真を示し、高倍率の写真を図10Bおよび10Fに提供した。HK-2単層およびRPTEC単層は、接着斑の典型的な上皮マーカーであるパキシリン(図10C(i)および10F(i));ZO-密着結合複合体(図10C(ii)および10F(ii));ならびに一次繊毛および細胞質微小管の指標であるアセチル化チューブリン(図10C(iii)および10F(iii))を発現した。HK-2試料におけるパキシリン発現は、RPTEC試料より弱いシグナルを伴い分散の度合いが低い接着斑を表した。HK-2およびRPTECの両方とも、細胞の周囲の輪郭を描くはっきりした境界線においてZO-1を発現したことから、密着結合に基づいて密閉された上皮バリアの初期の形成が示唆された。アセチル化チューブリンの形態は、HK-2とRPTECとで異なっていた。HK-2は、いくらか分布した細胞質微小管を示したが、はっきりした一次繊毛は頂端面において発現されなかった。RPTECは、各細胞の頂端面上の単一の点状の斑中にアセチル化チューブリンを発現したことから、一次繊毛の形成が示唆された。
【００５５】
チャネル層内に完全なコンフルエント細胞単層が形成されると、再吸収バリアの必須条件である透過性に関してその層を調べることが可能になる。層はコンフルエントであるため、細胞培養支援装置において、フローチャンバーの任意の箇所への流体接近および/または電気的接近、ならびにしたがって、細胞輸送の直接測定が可能になる。したがって、細胞培養支援装置において、再吸収特性を定量することが可能になる。ZO-1結合の形成により、能動輸送ができる上皮バリアが示唆される。細胞結合は、機械的刺激および/または他の刺激を用いて細胞の状態を調整することによって改善することができる。HK-2細胞は、培養時間がより長いために、より成熟した単層を形成して、パキシリン発現にわずかな差をもたらした。著しく発達した単層中の接着斑は分散しておらず、弱いシグナルを有する傾向があり、RPTECと比べるとHK-2試料においてこの傾向が認められた。HK-2細胞に一次繊毛がないことは異常ではなかった。一次繊毛は、血清飢餓または剪断応力によってそれらの形成が促進されない場合、HK-2集団において十分に発現されない場合がある。細胞質チューブリンは、RPTECと比べて、より広くに行き渡っており、繊毛の発達の核となり得る微小管形成中心の徴候を伴っていた。RPTEC中に一次繊毛が存在したことから、繊毛は機械的シグナルを化学的活性に変換するのに役立ち得るため、細胞が剪断応力などの機械的刺激に応答すると考えられることが示唆された。栄養物に富む流体が細胞培養支援装置を通って連続的に流動することにより、栄養物が細胞集団に送達され、それによって、小さなチャネル体積中で長期間細胞培養をするのにより好都合な条件が作り出され、一方で、インビボで近位尿細管細胞によって認められるろ液流動が同時に模倣される。最終的に、図11Aおよび11Bの走査型電子顕微鏡写真によって示されるように、細胞は膜の細孔をふさぐ。図11Aは、細胞播種前の膜の走査型電子顕微鏡写真であり、図11Bは、播種された細胞が膜の細孔をふさぐことを示す膜である。図11Bは、密着結合および他の細胞間結合の形成によって傍細胞輸送が制限される場合、膜-細胞層構築物を横断する輸送が経細胞輸送に限定され得ることを示す。機械的に細胞を刺激すること;画像化手段、電気的手段、および流体工学的手段を用いて細胞を調べること;ならびに機械的応答性再吸収バリアの指標を発現する上皮層の増殖を支援することができるため、細胞培養支援装置のパターン付けされた多孔質膜によって、再吸収バリアの機能の定量が可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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