(57)【要約】  本発明は、新規のフェニルトリアゾール誘導体、この化合物を含有する医薬組成物、及び上記医薬組成物を用いた治療方法に関する。本発明の化合物は、α５サブユニットを含有するＧＡＢＡA受容体の調節に反応する中枢神経系疾患及び障害の治療に特に有用であると考えられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１−［６−［［５−（２−フルオロフェニル）−３−メチル−トリアゾール−４−イル］メトキシ］−３−ピリジル］イミダゾール−４−カルボニトリル；又は
その薬学的に許容可能な塩
である、フェニルトリアゾール誘導体。
【請求項２】
治療的に有効な量の請求項１に記載のフェニルトリアゾール誘導体、又はその薬学的に許容可能な塩を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤と共に含む医薬組成物。
【請求項３】
α５サブユニットを含有するＧＡＢＡA受容体の調節に反応する、ヒトを含む哺乳類の疾患若しくは障害若しくは健康状態の治療、予防又は緩和において使用するための、１−［６−［［５−（２−フルオロフェニル）−３−メチル−トリアゾール−４−イル］メトキシ］−３−ピリジル］イミダゾール−４−カルボニトリル；又はその薬学的に許容可能な塩である、フェニルトリアゾール誘導体。
【請求項４】
α５サブユニットを含有するＧＡＢＡA受容体の調節に反応する、ヒトを含む哺乳類の疾患若しくは障害若しくは健康状態の治療方法において使用するための、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記疾患、障害又は健康状態は、急性及び慢性神経障害、認知障害、アルツハイマー病、記憶欠損、統合失調症、統合失調症に関連する陽性症状、陰性症状及び／又は認知症状、双極性障害、自閉症、ダウン症、神経線維腫症１型、睡眠障害、概日リズム障害、筋萎縮性側索硬化症、エイズに起因する認知症、精神異常、物質誘導性精神異常、不安障害、全般性不安障害、パニック障害、妄想性障害、強迫性障害、急性ストレス障害、薬物依存、運動障害、パーキンソン病、下肢静止不能症候群、認知欠損障害、多発梗塞性認知症、気分障害、うつ病、神経精神状態、精神病、注意欠陥多動性障害、神経障害性疼痛、脳卒中、注意欠陥障害、摂食障害、拒食症、神経性食欲不振、悪液質、体重減少、筋萎縮、疼痛状態、慢性疼痛、侵害受容性疼痛、術後疼痛、骨関節炎性疼痛、リウマチ性関節炎性疼痛、筋骨格痛、火傷の痛み、眼の痛み、炎症による痛み、骨折による痛み、痛覚過敏、神経障害性疼痛、ヘルペス関連の痛み、ＨＩＶ関連の神経障害性疼痛、外傷性神経損傷、脳卒中後の痛み、局所貧血後の痛み、線維筋痛症、慢性頭痛、偏頭痛、緊張型頭痛、糖尿病性神経障害性疼痛、幻肢痛、内臓痛、皮膚痛の群から選択される
請求項３又は４に記載の化合物。
【請求項６】
前記疾患、障害又は健康状態は、アルツハイマー病、統合失調症、ダウン症からなる群から選択される、請求項３又は４に記載の化合物。
【請求項７】
α５サブユニットを含有するＧＡＢＡA受容体の調節に反応する、ヒトを含む哺乳類の生体の疾患若しくは障害若しくは健康状態の治療、予防又は緩和のための方法であって、
前記方法は、前記方法を必要とする動物の生体に、治療的に有効な量の請求項１に記載のフェニルトリアゾール誘導体、又はその薬学的に許容可能な塩を投与するステップを含む
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のフェニルトリアゾール誘導体、上記化合物を含有する医薬組成物、及び上記医薬組成物を用いた治療方法に関する。本発明の化合物は、α５サブユニットを含有するＧＡＢＡA受受容体の調節に反応する中枢神経系疾患及び障害の治療に特に有用であると考えられる。
【背景技術】
【０００２】
ＧＡＢＡA受容体タンパク質複合体は、精神安定薬のベンゾジアゼピンクラスを含む多数のリガンドの分子標的である。ＧＡＢＡA受受容体の多数のイソ型が存在し、各受容体はα−1-6、β−1-3、γ−1-3、δ、ε、θサブユニットイソ型から選択されるサブユニットを含む五量体の複合体である。しかしながら、古典的なベンゾジアゼピンクラスはサブタイプの選択性を示さない。更に、（鎮静作用、依存、認知障害等の）古典的なベンゾジアゼピンの欠点の原因である主要素の１つは、ＧＡＢＡA受容体のα１サブユニットと関係があると考えられている。
【０００３】
更に、ＧＡＢＡAα５サブユニットは様々な中枢神経系の疾患及び障害治療のための治療標的の典型として提示されており、文献は、治療標的としてのＧＡＢＡAα５サブユニットと、様々な急性及び慢性神経障害、認知障害、アルツハイマー病、記憶欠損、統合失調症、統合失調症に関連する陽性症状、陰性症状及び／又は認知症状、双極性障害、自閉症、ダウン症、神経線維腫症１型、睡眠障害、概日リズム障害、筋萎縮性側索硬化症、エイズに起因する認知症、精神異常、物質誘導性精神異常、不安障害、全般性不安障害、パニック障害、妄想性障害、強迫性障害、急性ストレス障害、薬物依存、運動障害、パーキンソン病、下肢静止不能症候群、認知欠損障害、多発梗塞性認知症、気分障害、うつ病、神経精神状態、精神病、注意欠陥多動性障害、神経障害性疼痛、脳卒中、注意欠陥障害、摂食障害、拒食症、神経性食欲不振、悪液質、体重減少、筋萎縮、疼痛状態、慢性疼痛、侵害受容性疼痛、術後疼痛、骨関節炎性疼痛、リウマチ性関節炎性疼痛、筋骨格痛、火傷の痛み、眼の痛み、炎症による痛み、骨折による痛み、痛覚過敏、神経障害性疼痛、ヘルペス関連の痛み、ＨＩＶ関連の神経障害性疼痛、外傷性神経損傷、脳卒中後の痛み、局所貧血後の痛み、線維筋痛症、慢性頭痛、偏頭痛、緊張型頭痛、糖尿病性神経障害性疼痛、幻肢痛、内臓痛、皮膚痛との関係を立証しており、α５サブユニットを含有するＧＡＢＡA受容体を調節できる化合物は、とりわけ認知障害、アルツハイマー病、統合失調症、統合失調症に関連する陽性症状、陰性症状及び／又は認知症状、並びにダウン症、自閉症及び神経線維腫症１型に関連する認知欠損又は脳卒中後の認知欠損の治療に有用な候補となることが期待されている。
【０００４】
ＧＡＢＡA受容体複合体を調節できるイソオキサゾール誘導体は、例えば特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６、特許文献７、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、特許文献１４、特許文献１５、特許文献１６、特許文献１７、特許文献１８、特許文献１９から公知であり、ＧＡＢＡA受容体複合体を調節できるトリアゾール誘導体は、例えば特許文献２０から公知である。更に、特許文献２１、特許文献２２、特許文献２３、特許文献２４は、ＮＲ１  Ｈ４（ＦＸＲ）受容体のアゴニストとして有用である特定のフェニルトリアゾール誘導体を含む複素環式化合物を記載している。しかしながら、本発明のトリアゾール誘導体は未だ報告されていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００７／０３９３８９号
【特許文献２】国際公開第２００７／０４２４２０号
【特許文献３】国際公開第２００７／０５４４４４号
【特許文献４】国際公開第２００７／０７１５９８号
【特許文献５】国際公開第２００７／０７４０７８号
【特許文献６】国際公開第２００７／０７４０８９号
【特許文献７】国際公開第２００７／１３７９５４号
【特許文献８】国際公開第２００９／０００６６２号
【特許文献９】国際公開第２００９／０７１４６４号
【特許文献１０】国際公開第２００９／０７１４７６号
【特許文献１１】国際公開第２００９／０７１４７７号
【特許文献１２】国際公開第２０１０／０９７３６８号
【特許文献１３】国際公開第２０１０／１１２４７５号
【特許文献１４】国際公開第２０１０／１２５０４２号
【特許文献１５】国際公開第２０１０／１２７９６８号
【特許文献１６】国際公開第２０１０／１２７９７４号
【特許文献１７】国際公開第２０１０／１２７９７５号
【特許文献１８】国際公開第２０１０／１２７９７６号
【特許文献１９】国際公開第２０１０／１２７９７８号
【特許文献２０】国際公開第２０１２／０６２６８７号
【特許文献２１】国際公開第２００８／０２５５３９号
【特許文献２２】国際公開第２００８／０２５５４０号
【特許文献２３】国際公開第２００９／１４９７９５号
【特許文献２４】国際公開第２０１１／０２０６１５号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様では、本発明は以下の構造（I）：
【０００７】
【化１】
2015521642.tif 000002
【０００８】
のフェニルトリアゾール誘導体、即ち１−［６−［［５−（２−フルオロフェニル）−３−メチル−トリアゾール−４−イル］メトキシ］−３−ピリジル］イミダゾール−４−カルボニトリル、及びその薬学的に許容可能な塩を提供する。
【０００９】
本発明の第２の態様では、本発明は、治療的に有効な量の本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を、少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は希釈剤と共に含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
更なる態様では、本発明は、ヒトを含む哺乳類の疾患又は障害又は健康状態の治療、予防又は緩和のための医薬組成物の製造のための、本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体又はその薬学的に許容可能な塩の使用に関し、上記疾患、障害又は健康状態はα５サブユニットを含有するＧＡＢＡA受容体の調節に反応するものである。
【００１１】
更なる態様では、本発明は、ヒトを含む動物の生体の疾患又は障害又は健康状態の治療、予防又は緩和のための方法を提供し、上記疾患若しくは障害若しくは健康状態はα５サブユニットを含有するＧＡＢＡA受容体の調節に反応するものである。上記方法は、上記方法を必要とする動物の生体に、治療的に有効な量の本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を投与するステップを含む。
【００１２】
本発明の他の目的は、以下の詳細な説明及び実施例から、当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、アフリカツメガエル卵母細胞における、本発明の式（I）の化合物によるα5β2γ2ＧＡＢＡA受容体の調節の流れを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
フェニルトリアゾール誘導体
本発明の第１の態様では、本発明は以下の構造（I）：
【００１５】
【化２】
2015521642.tif 000003
【００１６】
のフェニルトリアゾール誘導体、即ち１−［６−［［５−（２−フルオロフェニル）−３−メチル−トリアゾール−４−イル］メトキシ］−３−ピリジル］イミダゾール−４−カルボニトリル、及びその薬学的に許容可能な塩を提供する。 
【００１７】
薬学的に許容可能な塩
本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体を、意図した投与に適したいずれの形態において提供できる。適した形態は、本発明の化合物の薬学的に（即ち生理学的に）許容可能な塩を含む。
【００１８】
薬学的に許容可能な塩の例は、限定するものではないが、塩酸由来の塩酸塩、臭化水素酸由来の水素酸塩、硝酸由来の硝酸塩、過塩素酸由来の過塩素酸塩、リン酸由来のリン酸塩、硫酸由来の硫酸塩、蟻酸由来の蟻酸塩、酢酸由来の酢酸塩、アコニット酸由来のアコネート、アスコルビン酸由来のアスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸由来のベンゼンスルホン酸塩、安息香酸由来の安息香酸塩、桂皮酸由来の桂皮酸塩、クエン酸由来のクエン酸塩、エンボン酸由来のエンボン酸塩、エナント酸由来のエナント酸塩、フマル酸由来のフマル酸塩、グルタミン酸由来のグルタミン酸塩、グリコール酸由来のグリコール酸塩、乳酸由来の乳酸塩、マレイン酸由来のマレイン酸塩、マロン酸由来のマロン酸塩、マンデル酸由来のマンデル酸塩、メタンスルホン酸由来のメタンスルホン酸塩、ナフタレン‐２‐スルホン酸由来のナフタレン‐２‐スルホン酸塩、フタル酸由来のフタル酸塩、サリチル酸由来のサリチル酸塩、ソルビン酸由来のソルビン酸塩、ステアリン酸由来のステアリン酸塩、コハク酸由来のコハク酸塩、酒石酸由来の酒石酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸由来のｐ−トルエンスルホン酸塩等の、非毒性無機及び有機酸付加塩を含む。このような塩は、当該技術分野において周知の、文献に記載されている手順により形成できる。
【００１９】
このような薬学的に許容可能な塩及びこれらを調製するための一般的な方法は、当該技術分野において公知である。更なる詳細はＳｔａｈｌ  ＰらによるＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ；Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２において確認できる。
【００２０】
更に、本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体は多形体の形態で存在できるか、又はこの化合物を、水、エタノール等の薬学的に許容可能な溶媒を用いて溶解できる若しくは溶解できない形態で提供できる。溶解できる形態は、一水和物、二水和物、半水和物、三水和物、四水和物等の水和物の形態も含み得る。一般に、溶解できる形態は本発明の目的のための溶解できない形態と同等であると考えられる。
【００２１】
標識化合物
本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体は、その標識形態又は非標識形態において使用してよい。本発明の文脈において、標識化合物は、通常自然に発見される原子質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を有する原子で置換された１つ又は複数の原子を有する。標識づけにより、上記化合物の定量検出が容易になる。
【００２２】
本発明の標識化合物は、診断ツール、放射性トレーサ又は様々な診断方法における監視用作用剤として、及びインビボ受容体イメージングのために有用であり得る。
【００２３】
本発明の標識異性体は好ましくは、標識としての少なくとも１つの放射性核種を含有する。陽電子放出核種は全て利用可能な候補である。本発明の文脈において、放射性核種は好ましくは、2Ｈ（重水素）、3Ｈ（三重水素）、11Ｃ、13Ｃ、14Ｃ、131Ｉ、125Ｉ、123Ｉ、18Ｆから選択される。
【００２４】
本発明の標識異性体を検出するための物理的方法は、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）、単一光子放射断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、磁気共鳴分光（ＭＲＳ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、コンピュータＸ線体軸断層撮影（ＣＡＴ）又はこれらの組み合わせから選択してよい。
【００２５】
重水素化類似体
本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体は、その重水素化類似体の形態で提供できる。重水素化形態は炭素と結合し、この結合波比較的低い周波数で振動し、よってＣ−Ｈ結合よりも強い。従って、「重水素」（ジュウテリウム）型の薬剤は、分解に対してより安定であり、生体においてより長く存続する。
【００２６】
調製方法
本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体は、例えば実施例に記載されるもの等の化学合成のための従来の方法によって調製してよい。本出願に記載のプロセスのための開始材料は公知であるか、又は従来の方法によって市販の化学物質から容易に調製できる。
【００２７】
本明細書に記載する反応の最終生成物は、例えば抽出、結晶化、蒸留、クロマトグラフィ等の従来の技術によって分離してよい。
【００２８】
生物活性
本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体は、α５サブユニットを含有するＧＡＢＡA受容体を調節できる。よって更なる態様では、本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体は、特に中枢神経系における、α５サブユニットを含有するＧＡＢＡA受容体の調節に反応する疾患、障害又は健康状態の治療、予防又は緩和に有用であると考えられる。
【００２９】
一実施形態では、本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体は、急性神経障害、慢性神経障害、認知障害、アルツハイマー病、記憶欠損、統合失調症、統合失調症に関連する陽性症状、陰性症状及び／又は認知症状、双極性障害、自閉症、ダウン症、神経線維腫症１型、睡眠障害、概日リズム障害、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、エイズに起因する認知症、精神異常、物質誘導性精神異常、不安障害、全般性不安障害、パニック障害、妄想性障害、強迫性障害、急性ストレス障害、薬物依存、運動障害、パーキンソン病、下肢静止不能症候群、認知欠損障害、多発梗塞性認知症、気分障害、うつ病、神経精神状態、精神病、注意欠陥多動性障害、神経障害性疼痛、脳卒中、注意欠陥障害の群から選択される疾患、障害又は健康状態の治療、予防又は緩和に有用であると考えられ、また向知性薬としての使用にも有用であると考えられる。
【００３０】
別の実施形態では、本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体は、摂食障害、拒食症、神経性食欲不振、悪液質、体重減少、筋萎縮、疼痛状態、慢性疼痛、侵害受容性疼痛、術後疼痛、骨関節炎性疼痛、リウマチ性関節炎性疼痛、筋骨格痛、火傷の痛み、眼の痛み、炎症による痛み、骨折による痛み、痛覚過敏、神経障害性疼痛、ヘルペス関連の痛み、ＨＩＶ関連の神経障害性疼痛、外傷性神経損傷、脳卒中後の痛み、局所貧血後の痛み、線維筋痛症、慢性頭痛、偏頭痛、緊張型頭痛、糖尿病性神経障害性疼痛、幻肢痛、内臓痛、皮膚痛の群から選択される疾患、障害又は健康状態の治療、予防又は緩和に有用であると考えられる。
【００３１】
第３の実施形態では、本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体は、認知障害、アルツハイマー病、統合失調症、統合失調症に関連する陽性症状、陰性症状及び／又は認知症状、並びにダウン症、自閉症及び神経線維腫症１型に関連する認知欠損又は脳卒中後の認知欠損の群から選択される疾患、障害又は健康状態の治療、予防又は緩和に有用であると考えられる。
【００３２】
第４の実施形態では、本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体は、アルツハイマー病、統合失調症、ダウン症の群から選択される疾患、障害又は健康状態の治療、予防又は緩和に有用であると考えられる。
【００３３】
第５の実施形態では、本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体は、向知性薬として有用であると考えられる。
【００３４】
更に、本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体は、α５サブユニットを含有するＧＡＢＡA受容体を調節できる化合物を検出するためのアッセイにおいて、放射性リガンドとして有用であり得る。
【００３５】
現在のところ、溶媒和物及び無水物を含む式（I）の化合物又はその薬学的に許容可能な塩である医薬品活性成分（ａｃｔｉｖｅ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ：ＡＰＩ）の適切な用量は、約０．１〜約１０００ｍｇＡＰＩ／日、より好ましくは約１０〜約５００ｍｇＡＰＩ／日、最も好ましくは約３０〜約１００ｍｇＡＰＩ／日であると考えられているが、的確な投与方法、投与時の形態、問題となっている適応症、対象、特に関与する対象の体重、更に担当する医師又は獣医の好みや経験に左右される。
【００３６】
医薬組成物
別の態様では、本発明は、治療的に有効な量の本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体を含む新規の医薬組成物を提供する。
【００３７】
治療において使用する本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体は、未加工の化合物の形態で投与してよいが、活性成分を、任意に生理学的に許容可能な塩の形態で、１つ又は複数のアジュバント、賦形剤、担体、緩衝剤、希釈剤及び／又は他の一般的な医薬品助剤と共に医薬組成物に導入するのが好ましい。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体又はその薬学的に許容可能な塩若しくは誘導体を含む医薬組成物を、１つ若しくは複数の薬学的に許容可能な担体、そして任意に、当該技術分野で公知でありかつ使用されている他の治療的及び／又は予防的成分と共に提供する。１つ又は複数の担体は、処方の他の成分と適合可能であるという意味において「許容可能（ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」でなければならず、需要者にとって有害でないものでなければばらない。
【００３９】
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、気管支、経鼻、肺、局所的（頬及び舌下を含む）、経皮、膣若しくは非経口（皮膚、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、動脈内、脳内、眼内注射若しくは注入を含む）投与に適したものであってよく、又は粉末及び液体エアロゾル投与を含む吸入若しくは吹送、若しくは持続放出系による投与に適した形態のものであってよい。持続放出系の適切な例は、本発明の化合物を含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリクスを含み、上記マトリクスは、例えばフィルム又はマイクロカプセルである成形された物品の形態であってよい。
【００４０】
よって本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体を、従来のアジュバント、担体又は希釈剤と共に、医薬組成物の形態及びその単位用量中に配置できる。上記形態は：経口使用のための固体（特に錠剤、充填カプセル、粉末及びペレット形態）、液体（特に水溶液及び非水溶液、懸濁液、エマルジョン、エリキシル）、及び上記を充填したカプセル；直腸投与のための坐剤；非経口使用のための無菌注射用溶液を含む。このような医薬組成物及びその単位剤形は、追加の活性化合物及び活性成分の有無にかかわらず、従来の成分を従来の割合で含んでよく、また上記単位剤形は、採用されることになる意図した１日の用量範囲に相応ないずれの適切な有効量の活性成分を含有してよい。
【００４１】
本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体は、多種多様な経口及び非経口剤形において投与できる。当業者には、以下の剤形が、活性成分として本発明の化合物又は本発明の式（I）の化合物の薬学的に許容可能な塩を含むことが明らかになるであろう。
【００４２】
本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体から医薬組成物を調製するために、薬学的に許容可能な担体は固体又は液体であってよい。固体形態の製剤は粉末、錠剤、丸薬、カプセル、カシェ剤、坐剤、分散性顆粒を含む。固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、潤滑剤、沈殿防止剤、結合剤、防腐剤、錠剤崩壊剤又はカプセル化材料としても作用し得る１つ又は複数の物質であり得る。
【００４３】
粉末中では、担体は微粉化された固体であり、これは微粉化された活性成分と混合されている。
【００４４】
錠剤中では、活性成分は、必要な結合能力を有する担体と適切な割合で混合され、所望の形状及びサイズに圧縮される。
【００４５】
粉末及び錠剤は好ましくは、５又は１０〜約７０％の活性化合物を含有する。適切な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、乳糖、ペクチン、デキストリン、セルロース、澱粉、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオ脂等である。用語「製剤（ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）」は、カプセルを提供する担体としてカプセル化材料を用いた活性化合物の処方を含むことを意図しており、このカプセル中では、担体を含む又は含まない活性成分が担体に包囲され、その結果担体は活性成分と結びつく。同様に、カシェ剤、トローチ剤（ｌｏｚｅｎｇｅ）も含む。錠剤、粉末、カプセル、丸薬、カシェ剤、トローチ剤を、経口投与に適した固体形態として使用できる。
【００４６】
坐剤を調製するために、まず脂肪酸グリセリド又はカカオ脂の混合物等の低融点ワックスを融解し、その中に活性成分を撹拌によって均質に分散させる。続いて、融解した均質な混合物を、都合よくサイズ設定した型に注ぎ入れ、冷却して固める。
【００４７】
膣投与に適した組成物は、活性成分に加えて、当該技術分野において適切であることが公知の担体を含有する腟坐剤、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、泡又はスプレーとして提示してよい。
【００４８】
液体製剤は、例えば水又は水‐プロピレングリコール溶液である溶液、懸濁液、エマルジョンを含む。例えば非経口注射液体製剤は、水性ポリエチレングリコール溶液中の溶液として処方できる。
【００４９】
よって本発明による化合物を（例えば大量注射又は連続注入等の例えば注射による）非経口投与用に処方してよく、またアンプル、予備充填注射器、少量注入における単位用量で、又は防腐剤が添加された多用量容器として提示してよい。組成物は、懸濁液、溶液又は油性若しくは水性ビヒクル中のエマルジョン等の形態を取ってよく、沈殿防止剤、安定化剤及び／又は分散剤等の製剤用作用剤を含有してよい。代替として、活性成分は、無菌、ピロゲンフリー水等の適切なビヒクルを有する構成のために、使用前の無菌固体の無菌単離又は溶液からの凍結乾燥によって得られた粉末形態であってよい。
【００５０】
経口使用に適した水溶液は、水中で活性成分を溶解し、必要に応じて適切な着色剤、着香剤、安定化剤及び増稠剤を添加することにより、調製できる。
【００５１】
経口使用に適した水性懸濁液は、天然若しくは合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム又は他の周知の沈殿防止剤等の粘稠材料を含む水中に、微粉化された活性成分を分散させることにより、作製できる。
【００５２】
また、使用直前に経口投与のための液体形態製剤へと転化させることを意図した、固体形態製剤も含まれる。このような液体形態は、溶液、懸濁液、エマルジョンを含む。上記製剤は、活性成分に加えて、着色剤、着香剤、安定化剤、緩衝剤、人工及び天然甘味料、分散剤、増稠剤、可溶化剤等を含んでよい。
【００５３】
表皮への局所投与のために、本発明の化合物を、軟膏、クリームとして、又は経皮パッチとして処方してよい。軟膏及びクリームは例えば、適切な増稠剤及び／若しくはゲル化剤を添加した水性又は油性基材を用いて処方してよい。外用水薬は、水性又は油性基材を用いて処方してよく、また一般に１つ又は複数の乳化剤、安定化剤、分散剤、沈殿防止剤、増稠剤又は着色剤を含有する。
【００５４】
口腔内の局所投与に適した組成物は、通常は蔗糖、アカシア又はトラガントである風味づけした基材中に活性薬剤を含むトローチ剤；ゼラチン及びグリセリン又は蔗糖及びアカシアなどの不活性基材中に活性成分を含む香錠；並びに適切な液体担体中に活性成分を含むマウスウォッシュを含む。
【００５５】
溶液又は懸濁液は、例えばドロッパ、ピペット又はスプレーを用いた従来の手段によって、直接鼻腔に塗布される。この組成物は、単一又は多用量形態で提供できる。
【００５６】
また、呼吸気管への投与はエアロゾル処方によっても達成でき、エアロゾル処方では、活性成分は、クロロフルオロカーボン（ＣＦＣ）（例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン又はジクロロテトラフルオロエタン）、二酸化炭素又は他の適切な気体等の適切な推進薬を含む加圧パック中において提供される。エアロゾルは好都合には、レシチン等の界面活性剤も含んでよい。薬剤の用量は、定量バルブを提供することにより、制御してよい。
【００５７】
代替として、活性成分を乾燥粉末の形態で、例えば乳糖、澱粉、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等の澱粉誘導体等の適切な粉末基材中の化合物の混合粉末として提供できる。好都合なことに、粉末担体は鼻腔内でゲルを形成する。粉末組成物は、例えばゼラチンのカプセル若しくは薬包又はブリスターパック（ここから粉末を吸入器によって投与できる）中の単位用量として提示できる。
【００５８】
鼻腔用組成物を含む気道への投与を意図した組成物では、化合物は一般に例えば５ミクロン以下のオーダーの小さな粒径を有する。このような粒径は、例えば微粒子化といった当該技術分野において公知の手段によって得られる。
【００５９】
必要な場合、活性成分の持続放出を提供するために適合された組成物を採用してよい。
【００６０】
医薬製剤は好ましくは、単位剤形である。このような形態では、製剤は、活性成分の適切な量を含有する単位用量に細分化されている。単位剤形は包装された製剤であってよく、包装は、包装された錠剤、カプセル、バイアル瓶又はアンプル内の粉末等の、分割された量の製剤を含む。また単位剤形は、カプセル、錠剤、カシェ剤若しくはトローチ剤自体であってよいか、又はこれらのうちのいずれかを適切な個数だけ包装形態としたものであってよい。
【００６１】
一実施形態では、本発明は、経口投与用の錠剤又はカプセルを提供する。
【００６２】
別の実施形態では、本発明は、静脈内投与及び連続注入用の液体を提供する。
【００６３】
処方及び投与に関する技術についての更なる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  イーストン、ペンシルベニア州）において確認できる。
【００６４】
投与する用量は当然、年齢、体重、治療を受ける個体の状態、そして投与経路、剤形、レジメン、所望の結果に対して、慎重に調整しなければならない。当然、正確な用量は専門家によって決定されるべきである。
【００６５】
実際の用量は、治療する疾患の特性及び重症度に左右され、医師の裁量の範囲内であり、また所望の治療効果を得るために、本発明の特定の状況に対する用量設定によって変動し得る。しかしながら現在のところ、式（I）の活性成分を、個々の１用量あたり約０．１〜約５００ｍｇ、好ましくは約１〜約１００ｍｇ、最も好ましくは約１〜約１０ｍｇを含有する医薬組成物が治療的処置に適切であると考えられている。
【００６６】
式（I）の活性成分を、活性成分は、１日に１用量又は複数用量投与してよい。特定の実例では、０．１μｇ／ｋｇ（点滴）、１μｇ／ｋｇ（経口）といった低い用量において満足できる結果を得ることができる。用量範囲の上限は現在、約１０ｍｇ／ｋｇ（点滴）、１００ｍｇ／ｋｇ（経口）であると考えられている。好ましい範囲は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ／日（点滴）、及び約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日（経口）である。
【００６７】
治療の方法
別の態様では、本発明は、ヒトを含む動物の生体の疾患又は障害又は健康状態の治療、予防又は緩和のための方法を提供し、上記疾患若しくは障害若しくは健康状態はα５サブユニットを含有するＧＡＢＡA受容体の調節に反応するものである。上記方法は、上記方法を必要とする、ヒトを含む動物の生体に、治療的に有効な量の本発明の式（Ｉ）のフェニルトリアゾール誘導体又はその薬学的に許容可能な塩を投与することを含む。
【００６８】
現在のところ、適切な用量範囲は通常、的確な投与方法、投与時の形態、投与の対象となっている適応症、関与する対象、関与する対象の体重、更に担当する医師又は獣医の好みや経験に応じて、１日０．１〜１０００ミリグラム、１日１０〜５００ミリグラム、特に１日３０〜１００ミリグラムである。
【実施例】
【００６９】
以下の実施例を参照して、本発明を更に説明する。これらの実施例は、本出願が請求する本発明の範囲をいずれの様式でも制限することを意図したものではない。
【００７０】
実施例１  調製例
１-｛６-［５-（２-フルオロ-フェニル）-３-メチル-３Ｈ-［１，２，３］トリアゾール-４-イルメトキシ］-ピリジン-３-イル｝-１Ｈ-イミダゾール-４-カルボニトリル（化合物７）の調製
【００７１】
【化３】
2015521642.tif 000004
【００７２】
４−（２−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール（化合物３）の調製
ＴＨＦ（１５００ｍｌ）中のジイソプロピルアミン（１９３．１３ｇ、１８９９．０４ｍｍｏｌ）の予備冷却（−７８℃、内部温度−７０℃）した溶液に、ｎ−ブチルリチウム（７５９．６１７ｍｌ、１８９９．０４ｍｍｏｌ、ヘキサン中の２．５Ｍ溶液）を添加し、９０分間撹拌した。次に、ＴＨＦ（５００ｍｌ）中のＮ，Ｎ−ジメチルニトロソアミド（化合物２）（１３４．５７ｇ、１８１６．４８ｍｍｏｌ）を、３０分かけて一部分ずつカニューレ処置し、１時間撹拌した。続いてＴＨＦ（５００ｍｌ）中の２−フルオロベンゾニトリル（化合物１）（１００．０ｇ、８２５．６７１ｍｍｏｌ）の溶液を、３０分かけて一部分ずつカニューレ処置し、−７８℃（内部温度−７０℃）で１時間撹拌した。冷却浴を除去し、室温で２時間撹拌した。ＴＬＣ及びＵＰＬＣで反応を監視した。上記反応物を、塩化アンモニウム飽和溶液（２０００ｍｌ）を用いてゆっくりとクエンチし、水性層をジクロロメタン（５×２０００ｍｌ）で抽出した。化学結合した有機層を硫化ナトリウム上で乾燥させ、濾過及び濃縮して、粗物質を得た（１７０．０ｇ、物質収支１１６．２１％）。これを重力カラムにより、溶離剤としてポリエチレンエーテル中の３０％酢酸エチルを用いて精製し、所望の産物４−（２−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾールを赤みがかったガムとして得た（６４．５２ｇ、物質収支４４．１０％）。これを、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１０００ｍｌ）及びヘキサン（５００ｍｌ）を用いて粉砕し、上澄層をデカンタして固体を乾燥させ、所望の産物４−（２−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾールを黄色がかった固体として得た（３２．９ｇ、２２．４９％）。
【００７３】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ８．３０（ｔ，Ｊ＝７．６４Ｈｚ，１Ｈ），７．９４（ｄ，Ｊ＝３．７２Ｈｚ，１Ｈ），７．３４-７．２４（ｍ，２Ｈ），７．１５（ｔ，Ｊ＝６．７２Ｈｚ，１Ｈ），４．１７（ｓ，１Ｈ）；ＭＨ+＝１７８．１／１７９．２
【００７４】
４−（２−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−カルバルデヒド（化合物４）の調製
窒素雰囲気下のＴＨＦ（１２００ｍｌ）中の４−（２−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール（化合物３）（５１ｇ、２８７．８４ｍｍｏｌ）の予備冷却（−７０℃〜−７８℃）した溶液に、ｎ−ブチルリチウム（１３８．１６ｍｌ、３４５．４１ｍｍｏｌ、ヘキサン中の２．５Ｍ溶液）を添加し、２時間撹拌した。次に、ＤＭＦ（１２００ｍｌ、１４７９４．８４４ｍｍｏｌ）を添加して、−７８℃で３０分間撹拌した。ＴＬＣ及びＵＰＬＣで反応を監視した。上記反応混合物を、氷冷却水（１０００ｍｌ）を用いてゆっくりとクエンチし、水性層を酢酸エチル（５×１０００ｍｌ）で抽出した。化学結合した有機層を硫化ナトリウム上で乾燥させ、濾過及び濃縮して、粗物質を得た（５０ｇ、物質収支８４．６６％）。これを重力カラムにより、溶離剤としてポリエチレンエーテル中の２０％酢酸エチルを用いて精製し、所望の産物４−（２−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−カルバルデヒドを赤みがかった固体として得た（４０、物質収支６７．７２％）。これを、ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（１０００ｍｌ）及びヘキサン（５００ｍｌ）を用いて粉砕し、上澄層をデカンタして固体を乾燥させ、所望の産物４−（２−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−カルバルデヒドを白色固体として得た（３２ｇ、収率５４．１８％）。
【００７５】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）：δ１０．００（ｄ，Ｊ＝３．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｔｄ，Ｊ＝７．６＆１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｔｄ，Ｊ＝７．６＆０．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３７-７．３３（ｍ，１Ｈ），７．２８（ｔ，Ｊ＝９．８８Ｈｚ，１Ｈ），４．４０（ｓ，３Ｈ）；ＭＨ+＝２０６．１／２０７．１；ＩＲ：１６８６．３ｃｍ-1
【００７６】
（４−（２−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−イル）メタノール（化合物５）の調製
メタノール（３００ｍｌ）中に４−（２−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−カルバルデヒド（化合物４）（３８ｇ、１８５．１９ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で撹拌した溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（８．４０７ｇ、２２２．２３ｍｍｏｌ）を０℃において一部分ずつ添加し、反応物を２０分間撹拌した。ＴＬＣ及びＵＰＬＣで反応を監視した。反応混合物を、水（５００ｍｌ）を用いてクエンチし、濃縮してメタノール及び水を除去した。次にこれを酢酸エチル（４×５００ｍｌ）で抽出し、化学結合した有機層を食塩水（５０ｍｌ）で洗浄し、硫化ナトリウム上で乾燥させ、濾過及び濃縮して、粗物質を得た（３４ｇ、物質収支８８．６％）。この固体をヘキサン（３×１００ｍｌ）を用いて粉砕し、上澄層をデカンタして固体を乾燥させ、所望の産物（４−（２−フルオロフェニル）−１−メチル−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−５−イル）メタノールを灰白色固体として得た（３１ｇ、８０．７７％）。
【００７７】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣＩ3）：δ７．６７（ｄｔ，Ｊ＝７．６０＆１．７６Ｈｚ，１Ｈ），７．４０-７．３７（ｍ，１Ｈ），７．２６（ｄｔ，Ｊ＝７．５０＆１．００Ｈｚ，１Ｈ），７．１７（ｔ，Ｊ＝８．３２Ｈｚ，１Ｈ），４．７６（ｓ，２Ｈ），４．７１７（ｓ，３Ｈ），２．６０（ｓ，１Ｈ，Ｄ2Ｏと置換可能）；ＵＰＬＣ（ｍ／ｚ）：２０８（ＭＨ+）；ＨＰＬＣ純度：９９．４４％；．ＩＲ：３２０１．３ｃｍ-1；ＭＰ：９９．１-１０２．２℃
【００７８】
２-［５-（２-フルオロ-フェニル）-３-メチル-３Ｈ-［１，２，３］トリアゾール-４-イルメトキシ］-５−ヨード-ピリジン（化合物６）の調製
０℃かつＮ2雰囲気下のＤＭＦ（１０ｍｌ）中のＮａＨ（０．７３ｇ、１８．１ｍｍｏｌ、無機油中に６０％）の懸濁液に、［５-（２-フルオロ-フェニル）-３-メチル-３Ｈ-［１，２，３］トリアゾール-４-イル］-メタノール（２．５ｇ、１２．０６ｍｍｏｌ）を添加し、１時間撹拌した。続いて２−クロロ−５−ヨードピリジン（３．１７ｇ、１３．２７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温までゆっくりと加熱し、４時間撹拌した。ＴＬＣで反応を監視した。反応混合物を、氷水を用いてクエンチし、酢酸エチル（５０ｍｌ）で抽出し、食塩水（１０ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗物質を得た（４．４ｇ、物質収支８８．９％）。これをヘキサンを用いて粉砕し、固体を濾過して真空下で乾燥させ、
２-［５-（２-フルオロ-フェニル）-３-メチル-３Ｈ-［１，２，３］トリアゾール-４-イルメトキシ］-５−ヨード-ピリジンを黄色の固体として得た（２．４ｇ、４８．４８％）。
【００７９】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-Ｄ6）：δ８．２８（ｄ，Ｊ＝２．００Ｈｚ，１Ｈ），８．００（ｑab，Ｊ＝８．６４＆２．１６Ｈｚ，１Ｈ），７．５８（ｔ，Ｊ＝７．４４Ｈｚ，１Ｈ），７．４９（ｑ，Ｊ＝５．６８Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｑ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ，２Ｈ），６．７０（ｄ，Ｊ＝８．６８Ｈｚ，１Ｈ），５．４４（ｓ，２Ｈ），４．１５（ｓ，３Ｈ）
【００８０】
１-｛６-［５-（２-フルオロ-フェニル）-３-メチル-３Ｈ-［１，２，３］トリアゾール-４-イルメトキシ］-ピリジン-３-イル）-１Ｈ-イミダゾール-４-カルボニトリル（化合物７）の調製
ＤＭＦ（１０ｍｌ）中の、２-［５-（２-フルオロ-フェニル）-３-メチル-３Ｈ-［１，２，３］トリアゾール-４-イルメトキシ］-５−ヨード-ピリジン（０．５ｇ、１．２２ｍｍｏｌ）、１Ｈ−イミダゾール−４−カルボニトリル（０．１７０ｇ、１．８２ｍｍｏｌ）、炭酸セシウム（０．７９ｇ、２．４３ｍｍｏｌ）、酸化銅（I）（０．０１７ｇ、０．１２２８２ｍｍｏｌ）、アセチルアセトン酸鉄（０．１２９ｇ、０．３６５８２ｍｍｏｌ）の混合物を、９０℃で２０時間加熱した。ＴＬＣ及びＵＰＬＣで反応を監視した。反応混合物を減圧下で濃縮し、水を添加し、酢酸エチル（３×５０ｍｌ）で抽出した。化学結合した有機層を食塩水（１５ｍｌ）で洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、減圧下で濃縮して、粗物質を得た（５００ｍｇ、物質収支１０９％）。これを、溶離剤としてクロロホルム中の２％メタノールを使用して、Ｇｒａｃｅカラム中で精製し、所望の１-｛６-［５-（２-フルオロ-フェニル）-３-メチル-３Ｈ-［１，２，３］トリアゾール-４-イルメトキシ］-ピリジン-３-イル）-１Ｈ-イミダゾール-４-カルボニトリルを灰白色固体として得た（０．１８０ｇ、３９．３８％）。
【００８１】
1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ-Ｄ6）：δ８．６８（ｄ，Ｊ＝１．１６Ｈｚ，１Ｈ），８．４６（ｄ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），８．４２（ｄ，Ｊ＝１．１２Ｈｚ，１Ｈ），８．０６（ｄｄ，Ｊ＝８．８８＆２．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｄｔ，Ｊ＝７．４＆１．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５２-７．４８（ｍ，１Ｈ），７．３５（ｑ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，２Ｈ），７．０５（ｄ，Ｊ＝８．８４Ｈｚ，１Ｈ），５．５３（ｓ，２Ｈ），４．１８（ｓ，３Ｈ）．ＵＰＬＣ（ｍ／ｚ）：３７５／３７７（ＭＨ+）；ＨＰＬＣ純度：９６．９６％；ＭＰ：１７８．０-１８１．５℃
【００８２】
実施例２
ヒトＧＡＢＡAα5β3*γ2S受容体を発現するＨＥＫ細胞を結合する3Ｈ−フルマゼニル（3Ｈ−Ｒｏ  １５−１７８８）のインビトロ阻害
ベンゾダイアゼピンモジュレータユニットを、アンタゴニストである3Ｈ‐フルマゼニルによって選択的に標識化できる。
【００８３】
異なるサブユニットの組み合わせに関する3Ｈ‐フルマゼニルの親和性は、α1β2γ2，α2β2γ2、α3β2γ2、α5β2γ2受容体に関して１．０ｎＭ、１．１ｎＭ、１．５ｎＭ、０．４ｎＭ、α4β2γ2、α6β2γ2受容体に関して１０７ｎＭ、９０ｎＭであると報告されている（Ｓｉｅｇｈａｒｔ；Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．１９９５  ４７  １８１−２３４参照）。
【００８４】
変異したα5β3*γ2SＧＡＢＡA受容体の薬理は、各3Ｈフルマゼニル結合を有する野生型受容体の薬理と同様である。
【００８５】
細胞培養及び膜調製
組換型ヒトＧＡＢＡAα5β3*γ2S受容体（プラスミドＨ４６／Ｅ９Ｂ１０）の安定した発現を有するＨＥＫ−２９３細胞株を、Ｔ１７５ポリスチレンフラスコ又はローラボトル（１７００ｃｍ2，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＣＣＩ−４３１  １９１）に播種し、１０％のウシ胎仔血清及び以下の抗生物質：ハイグロマイシンＢ（５０μｇ／ｍｌ；γ2サブユニット）又はＧ４１８（０．５ｍｇ／ｍｌ；α5サブユニット）のうちの一方又は両方を補充したＧｌｕｔａＭＡＸ（登録商標）培地を有するダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ：ＤＭＥＭ）に培養した。
【００８６】
培養がある培養密度を達成すると、ＤＭＥＭを除去し、細胞をダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ：ＤＰＢＳ）で一度洗浄した（Ｔ１７５フラスコの場合１０ｍｌ；ローラボトルの場合５０ｍｌ）。続いてＤＰＢＳを約５分間培養物に添加すると（Ｔ１７５フラスコの場合１０ｍｌ；ローラボトルの場合１００ｍｌ）、細胞はフラスコを揺らす又は軽くたたくことにより表面から容易に分離した。細胞懸濁液をＦａｌｃｏｎチューブに移し、２℃で１０分間２３，５００ｘｇで遠心分離した。ペレットをＵｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーを用いて１５ｍｌのトリス−クエン酸緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．１）で洗浄し、２℃で１０分間２７，０００ｘｇで遠心分離した。洗浄したペレットを、１５ｍｌのトリス−クエン酸緩衝液に再懸濁し、結合実験の日まで−８０℃で凍結させた。
【００８７】
アッセイ
実験の日に、細胞膜調製物を解凍し、２℃で１０分間２７，０００ｘｇで遠心分離した。Ｕｌｔｒａ−Ｔｕｒｒａｘホモジナイザーを用いて、ペレットをトリス−クエン酸緩衝液に、１回のアッセイあたり１５〜５０μｇのタンパク質まで再懸濁し、結合アッセイのために使用した。
【００８８】
５００μｌの細胞懸濁液のアリコートを２５μｌの試験化合物溶液及び２５μｌの3Ｈ‐フルマゼニル（１ｎＭ、最終濃度）に添加し、混合して２℃で４０分間インキュベートした。クロナゼパム（１μＭ、最終濃度）を用いて、非特異的結合を決定した。
【００８９】
試験化合物の全ての希釈及びアッセイのインキュベーションは、ガラスバイアル／９６−バイアルプレートにおいて実施した。試験化合物の溶液及び3Ｈ‐フルマゼニルを、２２ｘの所望の最終遠心分離によって調製した。化合物を１００％ＤＭＳＯ（１０ｍＭ  原液）に溶解し、４８％エタノール‐水で希釈し、１：３又は１：１０の希釈で順番に３重試験した。多数の化合物をスクリーニングする場合は、各化合物の１つのみの濃度を単一のウェルにおいて試験する。基準化合物は常に含まれるわけではないが、実施する試験ごとに、結合全体及び非特異的結合を、アッセイの検証中に得られたデータと比較する。
【００９０】
結合を、以下の急速濾過法によって終了させた：
１）Ｂｒａｎｄｅｌ  Ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いたワットマンＧＦ／Ｃガラス繊維濾紙上での急速濾過、その後１ｍｌの氷冷緩衝液による５回の洗浄；又は
２）Ｔｏｍｔｅｃ  ｃｅｌｌ  ｈａｒｖｅｓｔｅｒを用いたＵｎｉＦｉｌｔｅｒ  ＧＦ／Ｃガラス繊維濾紙上での急速濾過、その後約５ｍｌの氷冷緩衝液を用いた洗浄。
【００９１】
濾紙上の放射能の量を、以下を用いた従来の液体シンチレーション計算によって決定した：
１）別個の大きな濾紙の場合、Ｔｒｉ−Ｃａｒｂ（登録商標）カウンタ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；又は
２）９６‐ウェル濾板の場合、Ｔｏｐｃｏｕｎｔ（登録商標）カウンタ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。特異的結合は結合全体から非特異的結合を引いたものである。
【００９２】
計算
ＩＣ50（3Ｈ‐フマルゼニルの特異的結合を５０％まで阻害する試験化合物の濃度（μＭ））の計算の前に、特異的結合の２５〜７５％の阻害が得られなければならない。
【００９３】
試験化合物に関するＩＣ50値は等式：Ｂ＝１００−（１００＊Ｃn（ＩＣ50n＋Ｃn））に基づいて決定され、ここでＢは特異的結合全体に対する上記結合の百分率であり；Ｃは試験化合物の濃度であり；ｎはヒル係数である。スクリーニング目的の場合、ｎは１に設定する。ＩＣ50値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍのカーブフィッティングプログラムを用いた非線型回帰法によって、濃度反応曲線から計算する。
【００９４】
試験化合物に関するＫｉ値は、Ｃｈｅｎｇ及びＰｒｕｓｏｆｆによる等式：Ｋi＝ＩＣ50／（１＋Ｌ／Ｋd）を用いて計算でき、ここで3Ｈ‐フマルゼニルに関するＫdは０．３６ｎＭであり、Ｌは阻害アッセイにおける3Ｈ‐フマルゼニルの測定濃度である。
【００９５】
この実験の試験結果を以下の表１に示す。
【００９６】
【表１】
2015521642.tif 000005
【００９７】
実施例３
医薬組成物
本発明の式（I）のフェニルトリアゾール誘導体は、いずれの形態の組成物に適用してよく、いずれの所望の量で投与してよい。この実施例は、標準的なカプセル処方の製剤を示す。
【００９８】
標準的なカプセル処方
式（I）の医薬品原料（ＡＰＩ）をカプセル１つあたり１ｍｇ含有するカプセルは、以下の組成を用いて得られる：
【００９９】
【表２】
2015521642.tif 000006
【０１００】
計算された量の製剤原料、活性製剤原料１ｍｇに対応するフィラー、カプセル１つあたり１１７ｍｇのフィラーを量り分け、乾燥混合した。続いて、混合物を計算した数のカプセル（好ましくはサイズ４）に詰める。
【０１０１】
実施例４
図１は、アフリカツメガエル卵母細胞における、本発明の式（I）の化合物によるα5β2γ2ＧＡＢＡA受容体の調節の流れを示す。化合物（１）（遊離塩基としての式（I）の化合物）の調節有効性は、Ｍｉｒｚａら（Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２００８；３２７：９５４−６８）に記載の同様の技術によって決定した。簡潔に言うと、卵母細胞に、１：１：２の比率のヒトＧＡＢＡA受容体サブユニットα5、β2、γ2のためのｃＲＮＡを接種し、調節有効性はＧＡＢＡｃｏｎｔｒｏｌと呼ばれる準最大ＥＣ5-20ＧＡＢＡ濃度（０．５μＭ）との同時投与によって上昇した。５つの濃度（３．１６、０．３１６、０．０３１６、０．００３１６、０．０００３１６μΜ）の上記化合物を、濃度が最も低いものから初めて、各卵母細胞に対して試験した。バックグラウンドを差し引いたピーク電流振幅を各ＧＡＢＡｃｏｎｔｒｏｌ電流に対して正規化し、％変化に変換し、上昇する化合物の濃度の関数として±Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表した。プロットしたデータポイントは実験に基づいたヒルの式に一致した。最大有効性に関する９５％の信頼区間（Ｂｏｔｔｏｍ）及び効力（ＬｏｇＥＣ５０）がこのフィッティングルーチンによって導かれた。
【図１】
2015521642.tif 000007
【国際調査報告】
2015521642.tif 000008
2015521642.tif 000009