(57)【要約】  胎児が第１の染色体に関係する異数性を有しているかどうかが、母親及び胎児ＤＮＡの混合物を含有する母親サンプル中で検出される対立遺伝子比を使用して検出される。サンプルからのＤＮＡは、多形性遺伝子座に関連している標的領域について富化され、そして、配列決定される。胎児特異的対立遺伝子を伴う標的領域の多形性遺伝子座（例えば、一塩基多型）が、第１の染色体上、及び１若しくは複数の基準染色体上で同定される。胎児特異的対立遺伝子と共有対立遺伝子との第１の比は、第１の染色体上の遺伝子座に関して決定される。胎児特異的対立遺伝子と共有対立遺伝子との第２の比は、基準染色体上の遺伝子座に関して決定される。第１の比と第２の比に関する第３の比が、異数性が存在しているか、そして、その異数性が母親由来であるか又は父親由来であるかを決定するためにカットオフと比較される。
2015521028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児を妊娠している女性対象からの生物学的サンプルを、前記胎児が第１の染色体に関係する異数性を有しているか否かを決定するために分析する方法であって、前記生物学的サンプルが、前記胎児と女性対象からのＤＮＡ分子の混合物を含んでおり、以下のステップ：
複数の標的領域からＤＮＡ分子について生物学的サンプルを富化し；
前記生物学的サンプルからＤＮＡ分子を配列決定して、複数の配列読み取りを得；
複数の配列読み取りを分析するが、ここで、前記配列読み取りの分析が：
前記配列読み取りを基準ゲノムと整列させることによって、基準ゲノム内の配列読み取りの位置を同定し；そして
前記配列読み取りのそれぞれの対立遺伝子を決定すること、
を含み；
第１の染色体上の、標的領域の一部に相当する複数の第１の遺伝子座を同定し；
１若しくは複数の基準染色体上の、標的領域の一部に相当する複数の第２の遺伝子座を同定するが、ここで、前記妊婦は、第１及び第２の遺伝子座のそれぞれにおけるそれぞれの母系対立遺伝子についてホモ接合であり、且つ、ここで、前記胎児は、第１及び第２の遺伝子座のそれぞれにおけるそれぞれの母系対立遺伝子及びそれぞれの父系対立遺伝子についてヘテロ接合であって、それぞれの父系対立遺伝子がそれぞれの母系対立遺伝子と異なっており；
複数の第１の遺伝子座においてそれぞれの母系対立遺伝子の第１の母系の量を決定し；
複数の第１の遺伝子座においてそれぞれの父系対立遺伝子の第１の父系の量を決定し；
第１の母系の量と第１の父系の量に関して第１の比を計算し；
複数の第２の遺伝子座においてそれぞれの母系対立遺伝子の第２の母系の量を決定し；
複数の第２の遺伝子座においてそれぞれの父系対立遺伝子の第２の父系の量を決定し；
第２の母系の量と第２の父系の量に関して第２の比を計算し；
第１の比と第２の比に関して第３の比を計算し；そして
第３の比を１若しくは複数のカットオフ値と比較して、前記胎児が第１の染色体に関係する異数性を有しているか否か決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記生物学的サンプルを富化することが、
複数の標的領域に相当する固定されたプローブを用いて、前記生物学的サンプル中のＤＮＡ分子を捕捉すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的サンプルを富化することが：
複数の標的領域に相当するプライマーを用いて、生物学的サンプル中のＤＮＡ分子を増幅すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の染色体上の複数の第１の遺伝子座のうちの第１の遺伝子座を同定することが、
複数の配列読み取りを第１の遺伝子座と整列させ；そして
第１の遺伝子座に整列させた複数の配列読み取りの中から２つの対立遺伝子を同定すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に相当する第１の配列読み取りの数を決定し；
前記第１の遺伝子座の第２の対立遺伝子に相当する第２の配列読み取りの数を決定し；
第１の数と第２の数に関して対立遺伝子比を計算し；
前記対立遺伝子比が第１の閾値を上回り、且つ、第２の閾値を下回るか否かを決定すること、
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第１の染色体上の複数の第１の遺伝子座のうちの第１の遺伝子座を同定することが、
前記胎児の父親が、第１の遺伝子座において第１の対立遺伝子に関してホモ接合であることを同定し；そして
妊婦が、第１の遺伝子座にいて第２の対立遺伝子に関してホモ接合であることを同定すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の比が、第１の母系の量と第１の父系の量から決定される、混合物中の胎児ＤＮＡ分子の第１のパーセンテージに合致し；そして、前記第２の比が、第２の母系の量と第２の父系の量から決定される、混合物中の胎児核酸分子の第２のパーセンテージに合致する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の比として、第１の父系の量と第１の母親の量の合計によって割られた第１の父親の量が挙げられる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の比として、第１の母系の量によって割られた第１の父系の量が挙げられ、そして、前記第２の比として、第２の母系の量によって割られた第２の父系の量が挙げられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第１のカットオフ値が、母親由来である異数性に対応し、そして、第２のカットオフ値が、父親由来である異数性に対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
異数性が父親由来であるときに、前記第３の比が、約２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
異数性が母親由来であるときに、前記第３の比が、約１−ｆ／２｛式中、ｆが、混合物中の分画胎児ＤＮＡ濃度である｝である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の父系の量と第２の母系の量から、分画胎児ＤＮＡ濃度ｆを決定すること、
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の染色体が、第２１染色体、第１３染色体、又は第１８染色体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の遺伝子座のうちの少なくとも１つが、ＳＮＰである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の第２の遺伝子座が、複数の基準染色体上に位置している、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
胎児を妊娠している女性対象からの生物学的サンプルを、前記胎児が第１の染色体に関係する異数性を有しているか否か決定するための分析方法を行うためにコンピュータシステムの制御が実行されるときに複数の命令を保存している持続的コンピュータ可読媒体を含むコンピュータ製品であって、前記生物学的サンプルが、前記胎児と女性対象からのＤＮＡ分子の混合物を含んでおり、前記方法が、以下のステップ：
複数の標的領域からＤＮＡ分子について富化された生物学的サンプルからのＤＮＡ分子の配列決定から得られた複数の配列読み取りを受信し；
複数の配列読み取りを分析するが、ここで、前記配列読み取りの分析が：
前記配列読み取りを基準ゲノムと整列させることによって、基準ゲノム内の配列読み取りの位置を同定し；そして
前記配列読み取りのそれぞれの対立遺伝子を決定すること、
を含み；
第１の染色体上の、標的領域の一部に相当する複数の第１の遺伝子座を同定し；
１若しくは複数の基準染色体上の、標的領域の一部に相当する複数の第２の遺伝子座を同定するが、ここで、前記妊婦は、第１及び第２の遺伝子座のそれぞれにおけるそれぞれの母系対立遺伝子についてホモ接合であり、且つ、ここで、前記胎児は、第１及び第２の遺伝子座のそれぞれにおけるそれぞれの母系対立遺伝子及びそれぞれの父系対立遺伝子についてヘテロ接合であって、それぞれの父系対立遺伝子がそれぞれの母系対立遺伝子と異なっており；
複数の第１の遺伝子座においてそれぞれの母系対立遺伝子の第１の母系の量を決定し；
複数の第１の遺伝子座においてそれぞれの父系対立遺伝子の第１の父系の量を決定し；
第１の母系の量と第１の父系の量に関して第１の比を計算し；
複数の第２の遺伝子座においてそれぞれの母系対立遺伝子の第２の母系の量を決定し；
複数の第２の遺伝子座においてそれぞれの父系対立遺伝子の第２の父系の量を決定し；
第２の母系の量と第２の父系の量に関して第２の比を計算し；
第１の比と第２の比に関して第３の比を計算し；そして
第３の比を１若しくは複数のカットオフ値と比較して、前記胎児が第１の染色体に関係する異数性を有しているか否か決定すること、
を含む、前記コンピュータ製品。
【請求項１８】
第１のカットオフ値が、母親由来である異数性に対応し、そして、第２のカットオフ値が、父親由来である異数性に対応している、請求項１７に記載のコンピュータ製品。
【請求項１９】
異数性が父親由来であるときに、前記第３の比が、約２である、請求項１８に記載のコンピュータ製品。
【請求項２０】
異数性が母親由来であるときに、前記第３の比が、約１−ｆ／２｛式中、ｆが、混合物中の分画胎児ＤＮＡ濃度である｝である、請求項１８に記載のコンピュータ製品。
【請求項２１】
前記第１の比として、第１の母系の量によって割られた第１の父系の量が挙げられ、そして、前記第２の比として、第２の母系の量によって割られた第２の父系の量が挙げられる、請求項１７に記載のコンピュータ製品。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年４月６日付で出願された、「標的大規模並列配列決定法を使用した対立遺伝子比分析による胎児トリソミーの非侵襲的出生前診断」と題された米国特許仮出願第６１／６２１，４５４号の非仮出願であり、そして、その恩恵を主張するものである。かかる仮出願の全ての内容をあらゆる目的のために参照により本明細書中に援用する。
【０００２】
背景
トリソミー２１（Ｔ２１）などの胎児異数性の出生前スクリーニング及び診断は、現代の産科ケアの定着した要素である。従来の出生前スクリーニングは、母親の年齢、超音波及び生化学的マーカーなどのパラメータにより構築されている［１］。これらのパラメータは表現型特性に主に基づいており、そしてそれは本来、中心となる分子病理に関連している付帯的徴候であるため、それらの診断能力は通例、次善的なものである。上記のスクリーニング方法により高いリスクに分類された妊娠では、絨毛膜標本採取（ＣＶＳ）や羊水穿刺のような侵襲的手技によって得られた胎児遺伝物質の更なる調査を必要とする。これらの後者の手技には、わずかではあるが、しかし、一定の流産の危険性を伴う［２］。１９９７年に母親の血漿中の胎児ＤＮＡに関する証拠が、非侵襲的出生前診断（ＮＩＰＤ）の可能性を切り開いた［３］。
【０００３】
母親の血漿ＤＮＡには、断片化した母親のゲノムＤＮＡと胎児のゲノムＤＮＡの混合物が含まれている［４］。母親のＤＮＡの高いバックグラウンドは、胎児の染色体状態の取り調べに関する課題を意味している。Ｔ２１のＮＩＰＤに関する初期研究は、多型性に基づくものであり、対立遺伝子比を決定し、その後、予想される正常値とそれらを比較することを必要とした［５−７］。これらの初期の方法は、ＤＮＡメチル化マーカー［５］やＲＮＡマーカー［６］などの胎児特異的分子署名に基づいたか、又は母親の血漿のホルムアルデヒド処理を使用するなど、分画胎児ＤＮＡ濃度を十分高いレベルまで高めるための方法を必要とした［７］。しかしながら、最後のアプローチに関して、この方法が別のグループによると常に複製されるわけではないので、ホルムアルデヒド処理の有効性に対して論争がある［８−１０］。そのため、こうした方法についての臨床上の適用可能性は不明確なままである。
【０００４】
そのため、対立遺伝子比を使用した非侵襲的出生前診断のための新規技術の提供が望まれる。
【発明の概要】
【０００５】
簡単な概要
実施形態では、無細胞胎児ＤＮＡと母親ＤＮＡの混合物を含んでいる生物学的サンプルを分析することによって、胎児が第１の染色体に関係する異数性を有するか否かを非侵襲的に決定法するための方法、装置、及びシステムを提供する。例えば、第１の対立遺伝子比が第１の染色体について決定でき、第２の対立遺伝子比が１若しくは複数の基準染色体について決定できる。その比を決定するために、ＤＮＡは多形性遺伝子座に関係する標的領域が富化され、その後、配列決定される。胎児特異的対立遺伝子を伴う標的領域内の遺伝子座は、第１の染色体上、及び１若しくは複数の基準染色体上で同定される。これらの遺伝子座は、それぞれの対立遺伝子比を決定するのに使用できる。第１の対立遺伝子比と第２の対立遺伝子比から成る第３の比は、異数性が第１の染色体に存在しているか、及び異数性が母親由来又は父親由来であるか判断するために、カットオフと比較され得る。
【０００６】
他の実施形態は、本明細書中に記載した方法に関連するシステム、携帯用の一般消費者向けデバイス、及びコンピュータ可読メディアに関する。
【０００７】
本発明の性質及び実施形態の利点の更なる理解は、以下の詳細な説明及び添付図面を参照して得られる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】母親及び正倍数性胎児の遺伝子座における対立遺伝子、並びに本発明の実施形態による計算例に関する略図１００を示す。
【図１Ｂ】母親及び父親由来の異数性胎児の遺伝子座における対立遺伝子、並びに本発明の実施形態による計算の例に関する略図１２０を示す。
【図１Ｃ】母親及び母親由来の異数性胎児の遺伝子座における対立遺伝子、並びに本発明の実施形態による計算の例に関する略図１４０を示す。
【図２】胎児を妊娠している女性対象からの生物学的サンプルを、その胎児が異数性を有しているか否か決定するために分析する方法２００を例示するフローチャートである。
【図３】本発明の実施形態による１４人の妊婦の配列決定の結果に関する表を示す。
【図４】非標的及び標的配列決定データのＦ−Ｓ比によるＴ２１検出を示す。ＦＳＲ21Ref値は、非標的（Ａ）及び標的（Ｂ）配列決定データ内の正倍数性胎児からの父親由来のＴ２１と母親由来のＴ２１（Ｍａ−Ｔ２１：母親由来のＴ２１、Ｐａ−Ｔ２１：父親由来のＴ２１）を識別するために計算された。
【図５】Ａ及びＢは、本発明の実施形態による５％（図５Ｂ）及び１５％（図５Ａ）の分画胎児ＤＮＡ濃度のためのＴ２１検出に関するコンピュータシミュレーションのプロットを示す。
【図６】Ｔ２１検出のための最少数の情報提供対立遺伝子数を調査するためのコンピュータシミュレーションのプロット６００を示す。
【図７】本発明の実施形態によるシステム及び方法で使用可能な例としてのコンピュータシステム７００のブロックダイアグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
定義
本明細書で使われる用語の「生物学的サンプル」は、対象（例えば、妊婦などのヒト）から採取される任意のサンプルを意味し、１つ又は複数の目的の核酸分子を含む。例としては、血漿、唾液、胸水、汗、腹水、胆汁、尿、血清、膵液、糞便及び子宮頸部塗抹サンプルが挙げられる。
【００１０】
用語の「核酸」又は「ポリヌクレオチド」は、単鎖又は二重鎖型のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）及びそれらのポリマーを意味する。特に制限されていなければ、この用語は、基準核酸と類似の結合特性を有し、天然ヌクレオチドに類似の方式で代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む核酸を包含する。別段の記載がなければ、特定の核酸配列は、また、保存的に改変されたそれらの変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オーソログ、ＳＮＰ、及び相補的配列を暗に包含し、また同様に明示的に示された配列も含む。具体的には、縮重コドン置換は、１つ又は複数の選択（又は全ての）コドンの第３の位置が、混合塩基、及び／又はデオキシイノシン残基で置換される配列を生成することにより実現できる（Batzer MA et al, Nucleic Acid Res 1991, 19:5081; Ohtsuka E et al., J Biol Chem 1985; 260:2605-2608; and Rossolini GM et al., Mol Cell Probes 1994; 8:91-98）。用語の核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、小分子ノンコーディングＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ結合ＲＮＡ、及び遺伝子又は遺伝子座によりコードされる低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と同義に使用される。
【００１１】
用語の「遺伝子」は、ポリペプチド鎖の産生に関与するＤＮＡのセグメントを意味する。これは、コード領域（リーダー及びトレーラー）前後の領域、ならびに各コードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）を含んでもよい。
【００１２】
本明細書で使われる用語の「遺伝子座（locus）」又はその複数形「遺伝子座（loci）」は、ゲノム全域にわたり変化する、任意の長さのヌクレオチド（又は塩基対）の位置又はアドレスである。ＳＮＰは、それが母親でホモ接合（例えば、遺伝子型ＡＡ）及び胎児でヘテロ接合（例えば、遺伝子型ＡＢ）であれば情報提供となる。
【００１３】
用語の「配列決定されたタグ」は、全ての又は一部の核酸分子、例えば、ＤＮＡ断片から得られる配列を意味する。一実施形態では、例えば、約３０ｂｐの断片の一方の末端のみが配列決定される。配列決定されたタグは、次に、基準ゲノムに整列させることができる。あるいは、断片の両末端が配列決定されて２つの配列決定がなされたタグが生成でき、より高い正確さで整列化でき、また、断片の長さを与えることができる。さらに別の実施形態では、直鎖ＤＮＡ断片を、例えば、連結反応により環状化でき、連結反応部位をまたぐ部分が配列決定できる。
【００１４】
「普遍的な配列決定法」という用語は、アダプターが断片の末端に付加され、配列決定用プライマーがそのアダプターに付加されている場合の配列決定法を意味する。従って、いずれの断片も同じプライマーを使って配列決定でき、配列決定をランダムに行うことができる。
【００１５】
分画胎児ＤＮＡ濃度という用語は、胎児ＤＮＡ割合や胎児ＤＮＡ画分といった用語と互換的に使用され、母親の血漿又は胎児由来の血清サンプル中に存在しているＤＮＡ分子の割合を指す（YMD et al. Am J Hum Genet 1 98;62:768-775; Lun FMF et al. Clin Chem 2008; 54 : 1664-1672を参照のこと）。
【００１６】
本明細書で使われる用語「過剰出現核酸配列」は、生物学的サンプル中の２つの目的の配列（例えば、臨床的に関連する配列及びバックグラウンド配列）の間で、他の配列よりも多い存在量である核酸配列を意味する。例えば、母親の（共有対立遺伝子）は、情報提供遺伝子座において過剰出現するであろう。
【００１７】
本明細書で使われる用語の「パラメータ」は、定量的データセット、及び／又は定量的データセット間の数値的関係を特徴付ける数値を意味する。例えば、第１の核酸配列の第１の量及び第２の核酸配列の第２の量の間の比率（又は比率の関数）は、パラメータである。
【００１８】
本明細書で使われる用語の「カットオフ値」は、生物学的サンプルの分類上の２つ以上の状態（例えば、疾患及び非疾患）の間の判定を行うのに使用される数値を意味する。例えば、パラメータがカットオフ値よりも大きい場合は、定量データに対し第１の分類が適用され（例えば、疾患状態）；又はパラメータがカットオフ値より小さい場合は、定量データの異なる分類が適用される（例えば、非疾患状態）。
【００１９】
本明細書で使用される用語「染色体異数性」は、倍体ゲノムのもの由来の染色体量における変異を意味する。当該変異は、増加又は欠失であり得る。それは、１つの染色体の全体又は染色体の領域に関連し得る。
【００２０】
一般的でない略語は、以下のとおり：ＮＩＰＤ、非侵襲的出生前診断；ＭＰＳ、大規模並列配列決定法；ｃｈｒ２１、第２１染色体；ｃｈｒＲｅｆ、基準染色体；Ｔ２１、トリソミー２１；ＳＮＰ、一塩基多型；ＦＳＲ、Ｆ−Ｓ比、胎児特異的対立遺伝子と共有対立遺伝子の間の比；ＦＣ、胎児特異的対立遺伝子の数；及びＳＣ、共有対立遺伝子の数。
【００２１】
詳細な説明
妊婦から得られた血漿ＤＮＡは、無細胞母親ＤＮＡ及び無細胞胎児ＤＮＡの混合物を含んでいる。母親の血漿中の胎児ＤＮＡ割合は、正倍数体の妊娠において様々な染色体にわたる多形性遺伝子マーカーを使用して決定される場合、比較的一貫している。例えば、第１の遺伝子座の第１の胎児特異的対立遺伝子数の割合は、その他の遺伝子座の第２の胎児特異的対立遺伝子数の割合と比較的一致している。胎児ＤＮＡ割合は、ある母親サンプルと他のサンプルでは異なっている可能性があるが、（同じ染色体又は異なった染色体上の）異なった多形性遺伝子マーカーに関する胎児ＤＮＡ割合は、サンプル内で比較的一貫している。
【００２２】
異数性の妊娠において、異数性染色体のための多形性遺伝子マーカーを使用することで評価した観察された胎児ＤＮＡ割合は、混乱させられるであろう。実施形態では、異数性胎児（例えば、トリソミー２１胎児）を妊娠している母親のそのような不安を検出するために、胎児特異的対立遺伝子に関する多型性（例えば、一塩基多型）を使用する。胎児ＤＮＡのパーセンテージは通常、母親のＤＮＡのパーセンテージに比べて低いが、その胎児ＤＮＡパーセンテージであっても通常、その心配を確認するには十分に高い。しかし、胎児ＤＮＡ割合はあるサンプルと他のサンプルとでは異なっている可能性があり、その結果、複雑系の同定に多少の複雑さが加わる。
【００２３】
この複雑さに対処するために、実施形態では、異数性染色体に関する多形性遺伝子マーカーからの第１の胎児ＤＮＡ割合と、異数性に関与しない基準染色体の第２の胎児ＤＮＡ割合を使用した比を決定できる。基準染色体上の多形性遺伝子マーカーに関する胎児ＤＮＡ割合は、異数性によって乱されない。基準染色体上の遺伝子マーカーから決定されるそのような第２の割合を使用することで、特にゲノムの特定の部分が既知の多形性部位に関して富化されるとき、異数性を同定するために正確なパラメータ（例えば、２つの割合の比）を提供できる。そうした富化は、パラメータを決定する際に使用されない他のＤＮＡ分子に対して、使用可能な多形性マーカーに相当する分析ＤＮＡ分子の数を増強することによって、より高い効率を提供できる。
【００２４】
Ｉ．序論
（Ｔ２１などの）異数性のＮＩＰＤのためのアプローチは、母親の血漿サンプル中の第２１染色体（ｃｈｒ２１）由来のＤＮＡ分子の割合を計測することである。母親がＴ２１の胎児を妊娠しているのであれば、胎児からのｃｈｒ２１の付加コピーが、母親の血漿のサンプルに対して付加量のｃｈｒ２１ＤＮＡ分子に寄与し、そして、高い割合のｃｈｒ２１配列につながるであろう［１１］。大規模並列配列決定法（ＭＰＳ）は、ＤＮＡ定量の精度を上げ、その上、異数性染色体由来の莫大な量の胎児ＤＮＡの検出を可能にした［１１−１４］。
【００２５】
実施形態では、ＭＰＳを使用することによって、（Ｔ２１などの）異数性のＮＩＰＤのために対立遺伝子比アプローチを使用する。ヒトについてのｄｂＳＮＰ Ｂｕｉｌｄ１３５によれば、一塩基多型（ＳＮＰ）はヒトゲノムのわずか約１．６％を占めるにすぎないので（www. ncbi. nlm. nih.gov/projects/SNP/）、従来の非標的ＭＰＳでは、配列読み取りのわずかな割合にしかＳＮＰ対立遺伝子を含んでいなかった。そのため、実施形態では、胎児の異数性検出のために生物学的サンプル（例えば、母親の血漿）中で優先的に選択されたＳＮＰ遺伝子座を配列決定するやめに標的ＭＰＳを使用することができる。以前の刊行物において、ハイブリダイゼーションベースの標的ＭＰＳプラットフォームを使用するのによって、発明者らは、標的領域内のＤＮＡ分子の富化、並びに標的富化後の母親の血漿中での標的ＳＮＰの対立遺伝子比の保存を実証した［１５］。
【００２６】
ＳＮＰ（又は他の多型性）は、それが母親ではホモ接合（例えば、遺伝子型ＡＡ）そして、胎児ではヘテロ接合（例えば、遺伝子型ＡＢ）であれば情報提供となる。このシナリオでは、Ｂ対立遺伝子は胎児特異的対立遺伝子であり、Ａ対立遺伝子は母親と胎児によって共有される対立遺伝子である。情報提供ＳＮＰの胎児特異的対立遺伝子数と共有対立遺伝子数は、血漿ＤＮＡを配列決定することによって得ることができ、そして、胎児特異的対立遺伝子と共有対立遺伝子との間の数の比を計算するのに使用できる。比の例は標識ＦＳＲである。
【００２７】
着目の染色体が第２１染色体である一実施態様では、比は、ｃｈｒ２１（ＦＳＲ21と表される）と基準染色体（ＦＳＲRefと表される）のＦ−Ｓ比として表されることができる。母親が正倍数性胎児を妊娠している場合には、ＦＳＲ21とＦＳＲRefの間の比（ＦＳＲ21Refと表される）は、１に等しくなるはずである（図１Ａ）。母親が父親からの付加ｃｈｒ２１を有するＴ２１胎児（この原稿では、父親由来のＴ２１と呼ばれる）を妊娠している場合、胎児のｃｈｒ２１の遺伝子型がＡＢＢになるであろう。胎児特異的対立遺伝子の付加コピーが、ＦＳＲ21Refを２まで高めるであろう（図１Ｂ）。ｃｈｆ２１の追加コピーが、母親からである場合（この原稿では、母親由来のＴ２１と呼ばれる）、胎児のｃｈｒ２１の遺伝子型はＡＡＢになるであろう。共有対立遺伝子の付加コピーは、ＦＳＲ21Refを１未満に低減するであろう（図１）。
【００２８】
Ａ．正倍数性
図１Ａは、母親と正倍数性胎児の遺伝子座における対立遺伝子、並びに本発明の実施形態による計算例に関する略図１００を示す。遺伝子座１０３は基準染色体に関するものであり、遺伝子座１０６は第２１染色体（しかし、それは任意の着目の染色体であってもよい）に関するものである。母親のゲノムは各遺伝子座においてホモ接合であり、そして、胎児は各遺伝子座においてヘテロ接合である。示されているように、２つの遺伝子座についての実際の配列とは異なるであろうが、母系対立遺伝子は各遺伝子座においてＡと標識される。これにより、ＡとＢは、同じ遺伝子座における２つの異なった対立遺伝子（すなわち、染色体の２つの異なったコピーからの対立遺伝子）、そしてこの場合、胎児のゲノム内の２つの対立遺伝子を目立たせる、分かりやすい標識である。
【００２９】
父系対立遺伝子Ｂは、胎児によって父親から引き継がれ、その結果、胎児を２つの遺伝子座においてヘテロ接合にする。他の同様に位置した遺伝子座（情報提供遺伝子座）は、基準染色体と着目の染色体上で見られる。これにより、遺伝子座１０３は、実際に遺伝子座１０３であり、そして、遺伝子座１０６は遺伝子座１０６である。２つ以上の基準染色体も存在し得る。
【００３０】
正倍数性のケースについて、胎児は、遺伝子座１０３及び遺伝子座１０６に１つの対立遺伝子Ａと１つの対立遺伝子Ｂを有する。胎児のＤＮＡパーセンテージが５０％（すなわち、母親ＤＮＡと胎児ＤＮＡが等量）である例において、父系対立遺伝子Ｂの２５％の割合が遺伝子座１０３で、そして、父系対立遺伝子Ｂの２５％の割合が遺伝子座１０６で検出されることになる。そのため、２つの割合の比（すなわち、２５％を２５％で割る）は、１になるであろう。同様に、Ｂ対立遺伝子対Ａ対立遺伝子の比は、遺伝子座１０３及び１０６に関して１／３なので、１／３を１／３で割って１になるであろう。もちろん、検出される対立遺伝子のサンプルセットの統計的性質のため、おそらく、比は、ちょうど１にはならないであろう。これにより、遺伝子座１０３における父系対立遺伝子Ｂの割合（例えば、対立遺伝子数の任意の比）は、父系対立遺伝子Ｂの割合と同じはずである。
【００３１】
図１Ａは、異なった分画胎児ＤＮＡ濃度ｆについて、より一般的な定式化を提供している。示されているとおり、各遺伝子座１０３において、胎児は、遺伝子座１０３で検出されたすべての対立遺伝子の中からｆ／２の割合の対立遺伝子Ｂに寄与するであろう。以上のように、ｆが０．５である場合、割合は、．２５又は２５％であろう。同様に、胎児は、対立遺伝子Ａのｆ／２に寄与するであろう。分画胎児ＤＮＡ濃度が高ければ高いほど、対立遺伝子Ｂの割合は高くなるであろう。ここで、ｆは、胎児のどちらかの遺伝子型のＤＮＡと規定され、そのため、２の係数である。
【００３２】
母親に関して、染色体の各コピーは、同じ割合寄与する（１−ｆ／２）。ｆが０．５であるとき、割合は、先に触れたとおり．２５（２５％）である。０％の胎児ＤＮＡの制限において、各対立遺伝子Ａは、５０％に寄与し、母親はホモ接合なので、Ａ配列だけが検出される。
【００３３】
各遺伝子座１０３及び１０６で検出されるＡ対立遺伝子に対するＢ対立遺伝子の比は、ｆ／（２−ｆ）として与えられる。例えば、ｆが０．５である場合、それぞれのＡ対立遺伝子あたり１つのＢ対立遺伝子が存在するので、比は１／３である。他の比、例えば、Ｂ／（Ａ＋Ｂ）又は２Ｂ／（Ａ＋Ｂ）｛ここで、Ａ及びＢは対応する対立遺伝子の数である｝によって与えられるすべての遺伝子座１０３に関して検出される父系対立遺伝子Ｂのパーセンテージ、が使用されてもよい。胎児特異的（父系）対立遺伝子と共有（母系）対立遺伝子との数の比として示された比は、標識ＦＳＲである。
【００３４】
Ｂ．父親由来の異数性
図１Ｂは、母親及び父親由来の異数性胎児遺伝子座における対立遺伝子、並びに本発明の実施形態による計算例の略図１２０を示す。遺伝子座１２３は基準染色体のためのものであり、そして、遺伝子座１２６は染色体２１のためのものである。図１Ａに関して、母親のゲノムは各遺伝子座においてホモ接合であり、そして、胎児は各遺伝子座においてヘテロ接合である。
【００３５】
この異数性ケースについて、胎児は、遺伝子座１２３において１つの対立遺伝子Ａと１つの対立遺伝子Ｂを有するが、父親からの第２１染色体の追加コピーがあるので、遺伝子座１２６において１つの対立遺伝子Ａと２つの対立遺伝子Ｂを有する。胎児ＤＮＡパーセンテージが５０％（すなわち、母親ＤＮＡと胎児ＤＮＡとが等量）の例において、遺伝子座１２３についてのＢ対立遺伝子対Ａ対立遺伝子の比は、１／３であるが、遺伝子座１２６については、２つのＢ対立遺伝子があるので、２／３であろう。
【００３６】
一般式において、胎児の濃度が（単数若しくは複数の）基準染色体に関して決定されるので、染色体の各コピーがｆ／２に寄与すると考えることができる。これにより、対立遺伝子Ｂ数の合計が、ｆ／２＋ｆ／２＝ｆを与える。対立遺伝子Ａ数の合計が、ｆ／２＋１−ｆを与える。これらの比は、示されているように、２ｆ／（２−ｆ）を与える。基準染色体に関する比であるＦＳＲRefは、この染色体がまだ正倍数体であるので、図１Ａとまだ同じである。
【００３７】
比ＦＳＲ21とＦＳＲRefの比は、２である。もちろん、検出された対立遺伝子のサンプルセットの統計的な性質のため、おそらく、比はちょうど２にはならないであろう。父親由来の異数性は、以下で記載する母親由来の異数性を検出するより簡単である。
【００３８】
Ｃ．母親由来の異数性
図１Ｃは、母親及び父親由来の異数性胎児遺伝子座における対立遺伝子、並びに本発明の実施形態による計算例の略図１４０を示す。遺伝子座１４３は基準染色体のためのものであり、そして、遺伝子座１４６は染色体２１のためのものである。図１Ａに関して、母親のゲノムは各遺伝子座においてホモ接合であり、そして、胎児は各遺伝子座においてヘテロ接合である。
【００３９】
この異数性ケースについて、胎児は、遺伝子座１４３において１つの対立遺伝子Ａと１つの対立遺伝子Ｂを有するが、母親からの第２１染色体の追加コピーがあるので、遺伝子座１４６において２つの対立遺伝子Ａと１つの対立遺伝子Ｂを有する。胎児ＤＮＡパーセンテージが５０％（すなわち、母親ＤＮＡと胎児ＤＮＡとが等量）の例において、遺伝子座１４３についてのＢ対立遺伝子対Ａ対立遺伝子の比は、１／３であるが、遺伝子座１４６については、１つの対立遺伝子Ａにつき１つのＢ対立遺伝子があるので、１／４であろう。
【００４０】
一般式において、胎児の濃度が（単数若しくは複数の）基準染色体に関して決定されるので、染色体の各コピーがｆ／２に寄与すると考えることができる。これにより、対立遺伝子Ｂ数の合計が、ｆ／２を与える。対立遺伝子Ａ数の合計が、１−ｆ＋ｆ／２＋ｆ／２を与える、そしてそれは、単に１になる。これらの比は、示されているように、ｆ／２を与える。基準染色体に関する比であるＦＳＲRefは、この染色体がまだ正倍数体であるので、図１Ａとまだ同じである。比ＦＳＲ21とＦＳＲRefの比は、１−ｆ／２である。もちろん、検出された対立遺伝子のサンプルセットの統計的な性質のため、おそらく、比はちょうど１−ｆ／２になることはないであろう。
【００４１】
サンプルがこれらのカテゴリのうちのどれに相当するか決定するために、最終的な比がカットオフ値と比較される。例えば、１〜２のどこかのカットオフが、父親由来の異数性を有するケースと正倍数性ケースを識別し得る。２つ以上のカットオフ値が、１〜２の間で使用される場合もあり、その結果、決定に関して異なったレベルの信頼性を提供する。正倍数性と母親由来の異数性の間のカットオフ値は、２つの値の間の間隔がより狭いので、より難しく、且つ、分画胎児濃度ｆに依存する。カットオフは、胎児が母親由来の異数体であった場合、期待値を決定するように、ｆの別々の計測から決定されることもある。別の例として、ｆの最小値が必要であることもあり、その後、同じカットオフ値が、最小限の胎児濃度が使用される場合に好適である。
【００４２】
従って、Ｔ２１の例について、ｃｈｒＲｅｆの分画胎児ＤＮＡ濃度がｆであると仮定すると、Ｆ−Ｓ比は、胎児の異数性状態に関係なくｃｈｒＲｅｆに対してｆ／（２−ｆ）であろう。その一方、ｃｈｒ２１のＦ−Ｓ比は、母親が正倍数性胎児を妊娠している場合、ｆ／（２−ｆ）であり、母親が父親由来のＴ２１胎児を妊娠している場合、２ｆ／（２−ｆ）であり、そして、母親が母親由来のＴ２１胎児を妊娠している場合、ｆ／２であろう。そのため、ＦＳＲ21Refは、母親が正倍数性胎児を妊娠している場合、１になり、母親が父親由来のＴ２１胎児を妊娠している場合、２になり、そして、母親が母親由来のＴ２１胎児を妊娠している場合、（１−ｆ／２）になるであろう。
【００４３】
ＩＩ．方法
図２は、胎児が異数性を有しているか否か決定するために、胎児を妊娠している女性対象からの生物学的サンプルを分析する方法２００を例示するフローチャートである。生物学的サンプルは、胎児及び女性対象からのＤＮＡ分子の混合物を含んでいる。方法２００の一部は、コンピュータシステムによって実施されてもよい。
【００４４】
ブロック２１０では、生物学的サンプルが、複数の標的領域からのＤＮＡ分子を富化される。富化は、ハイブリダイゼーション技術、増幅技術、又はその両方の組み合わせで行われ得る。標的領域は、多形性部位を有することが知られているゲノム領域であり得る。そのような領域としては、Genome-Wide Human SNP Array6.0（Affymetrix）の領域を挙げることができる。
【００４５】
ブロック２２０では、生物学的サンプルからのＤＮＡ分子が、配列決定されて、多くの配列読み取りが得られる。配列決定法がさまざまな方法で行われ得る。例えば、普遍的な配列決定法は、いずれのＤＮＡ分子を配列決定するにも、その分子末端に連結される同じアダプターを使用できる。一実施形態では、大規模並列配列決定法、例えば、これだけに限定されるものではないが、Illumina Genome Analyzerプラットフォーム（Bentley DR et al. Nature 2008; 456: 53-59）、Roche 454プラットフォーム（Margulies et al. Nature 2005; 437: 376-380）、AΒΙ SOLIDプラットフォーム（McKernan J et al. Genome Res 2009; 39: 1527- 1543）、Helicos単一分子配列決定法プラットフォーム（Harris TD et al. Science 2008, 320: 306-309）、単一のポリメラーゼ分子を使用したリアルタイム配列決定法（Science 2009; 323: 133-138）及びナノ孔配列決定法（Clarke J et al. Nat Nanotechnol. 2009; 4: 265-70）によって実施されるものなどを使用する。一実施態様では、配列決定法は、配列決定したそれぞれのＤＮＡ分子について１組の読み取りを提供する両末端（paired-end）配列決定法である。
【００４６】
ブロック２３０では、複数の配列読み取りが分析される。配列読み取りの分析は、配列読み取りを基準ゲノムに整列させることによって、基準ゲノム内の配列読み取りの位置を同定し、そして、配列読み取りのそれぞれの対立遺伝子を決定することを含む。それぞれの対立遺伝子は、読み取りの配列から決定される。ヘテロ接合の遺伝子座について、配列読み取りが、対立遺伝子がその配列読み取りに相当する情報を提供し得る。基準ゲノムは、多型性が存在するのが知られている位置を含んでいて、どちらの対立遺伝子についても整列を可能にする。
【００４７】
ブロック２４０では、第１の染色体上の複数の第１の遺伝子座は、その複数の第１の遺伝子座が標的領域の一部に相当する場合、同定される。母親が遺伝子座においてホモ接合であり、そして、胎児がヘテロ接合である第１の遺伝子座は、情報を提供する。これらの遺伝子座は、２つの異なった対立遺伝子を有する読み取りが、基準ゲノム内の同じ位置に整列されるとき、且つ、１つの対立遺伝子が著しく大部分を占める場合、配列決定法読み取りによって決定され得る。胎児濃度が５％〜２０％であると予想されるので、情報提供遺伝子座は、約２．５％〜１０％で現れる少数派の対立遺伝子を有すると予想される。これらのパーセンテージは例示的なので、他のパーセンテージが使用されてもよい。標的領域内にあるそれらの第１の遺伝子座（すなわち、富化された領域）が、更なる分析のために同定されることができる。
【００４８】
ブロック２５０では、１若しくは複数の基準染色体上の複数の第２の遺伝子座は、その複数の第２の遺伝子座が標的領域の一部に相当する場合、同定される。妊婦は、それぞれの第１及び第２の遺伝子座におけるそれぞれの母系対立遺伝子についてホモ接合であり、そして、胎児は、それぞれの母系対立遺伝子とそれぞれの父系対立遺伝子について、それぞれの第１及び第２の遺伝子座においてヘテロ接合である。父系対立遺伝子は、胎児特異的対立遺伝子であり、これにより、それぞれの父系対立遺伝子は、それぞれの母系対立遺伝子と異なっている。
【００４９】
ブロック２６０では、第１の母系の量と第１の父系の量との第１の比が計算される。第１の母系の量は、複数の第１の遺伝子座におけるそれぞれの母系対立遺伝子の量である。例えば、それぞれの第１の遺伝子座でカウントされた母系対立遺伝子数がカウントされ得る。第１の父系の量は、複数の第１の遺伝子座におけるそれぞれの父系対立遺伝子の量である。先に記載したように、その比は、いずれかの分母による、２つの量の厳密な除法であり得るが、例えば、分母が２つの値の合計を含んでいる場合、他の比にもなり得る。
【００５０】
ブロック２７０では、第２の母系の量と第２の父系の量との第２の比が計算される。第２の母系の量は、複数の第２の遺伝子座におけるそれぞれの母系対立遺伝子の量である。第２の父系の量は、複数の第２の遺伝子座におけるそれぞれの父系対立遺伝子の量である。第２の比は、第１の比と同じ形態でなければならず、且つ、比を決定するための式も同じでなければならない。例えば、対立遺伝子Ａの合計は、対立遺伝子Ｂの合計で割られる。
【００５１】
ブロック２８０では、第１の比と第２の比との第３の比が計算される。第３の比はまた、第２の比のうちのいずれかの第１の比が分母にある、簡単な比である。その比はまた、分母又は分子に合計を伴い、並びに第１の比と第２の比の間の相対値をさらに伝え得るので、第１及び第２の比の関数の比でもあり得る。
【００５２】
ブロック２９０では、胎児が第１の染色体に関係する異数性を有しているか否か決定するために、第３の比が、１若しくは複数のカットオフ値と比較される。例えば正倍数性、母親由来の異数性、及び父親由来の異数性を識別するために、２つ以上カットオフが使用され得る。カットオフ値はさまざまな方法でもたらされ得る。例えば、その結果が知られている試験サンプルの間の分配は、それぞれケースの第３の比（例えば、ＦＳＲ21Ref）の統計的分布を決定するのに使用でき、そして、カットオフ値は、既知の分配内に収まるであろう新しいケースを正確に識別するために選ばれ得る。理論値はまた、例えば、予想された分配に基づいて使用されることもある。
【００５３】
カットオフ値は、図１Ａ〜１Ｃ概説されているように決定される。例えば、カットオフ値は、第３の比が約２であるとき、識別でき、これにより異数性が父親由来であることを決定する。約２であることの決定は、１の値と２の値を識別することを意味するカットオフを上回っている第３の比によってなされ得る。別の例として、第３の比が約１−ｆ／２｛ここで、ｆは混合物中の分画胎児ＤＮＡ濃度である｝であるとき、カットオフ値は識別ができ、これにより、異数性が母親由来であることを決定する。分画胎児ＤＮＡ濃度ｆは、第２の父系の量と第２の母系の量から決定され得る。例えば、以下の式が使用される：分画胎児ＤＮＡ濃度＝第２の父系の量×２／（第２の父系の量＋第２の母系の量）×１００％。カットオフ値は、２つのケースを識別するために１と１−ｆ／２の間の適当な値に置かれることができる。
【００５４】
ＩＩＩ．富化
富化は、配列決定前にＤＮＡサンプルから標的領域を選択的に増幅すること、及び／又は捕捉することによって行われる。富化は、ゲノム内の特定の位置にハイブリダイズするように設計されたプローブ及び／又はプライマーによって達成される。これらのプローブ／プライマーの多くが、ゲノム内の複数の領域を標的とするのに使用され得る。様々な領域が、着目の染色体上で標的とされ、そして、様々な領域が１つの基準染色体上で、又は複数の基準染色体にわたって標的とされる。
【００５５】
一実施態様では、標的領域は、多型性を有することが知られている領域を含んでいる。このように、当業者は、あらかじめ胎児の特異的な多型性を知る必要がある。しかし、多型性に相当する標的領域は集団内で通常見出されているので、父親が胎児にそれらの多型性の１つを渡す十分な可能性がある。父親と母親はまた、遺伝子型を決定されることもあり、その結果、本明細書中に記載したように、胎児の多形性部位に関する特定の知見が可能になる。
【００５６】
Ａ．捕捉
（例えば、アレイを使用した）捕捉の理論的根拠は、固定されたプローブにＤＮＡライブラリがハイブリダイズすることである。例えば、標的領域に相当するプローブ、及びこれらの標的領域からのＤＮＡ分子が、固定されたプローブにハイブリダイズした。これにより、標的ＤＮＡは固定され、非標的ＤＮＡは固定されない。
【００５７】
非標的ＤＮＡ断片は、洗浄によって取り除かれ、標的断片は溶出によって採取され得る。プローブの量を超えるライブラリ内のかなり過剰な量のＤＮＡ（１サンプルあたり２０ｇ）が、完全なハイブリダイゼーションを確実にするために必要とされ得る。技術例としては、アレイ上での捕捉（２０）及び溶液中での捕捉（２１）が挙げられる。いくつかの実施形態において、プローブは、集団内で高い多形性率を示すことが知られているＳＮＰ遺伝子座のために設計され得る。情報を提供することが明らかなＳＮＰ遺伝子座だけが、計算に使用されるであろう。異なった対立遺伝子に関して両親がホモ接合である部位を同定することによって行われ得るので、例えば、胎児特異的対立遺伝子に関して特定の位置が知られているとき、あらゆる妊娠についてプローブのカスタム選択を必要とするアプローチは一般に、臨床現場で実行することがより簡単である。
【００５８】
非標的領域からの一部のＤＮＡ分子が残留し得るので、捕捉は完全ではあり得ず、標的領域からのＤＮＡ分子のパーセンテージが富化前のパーセンテージに対して増加する。この様式において、配列読み取りが標的領域に相当する見込みがより高くなる。そのため、種々遺伝子座に関して同じ数の対立遺伝子数を得るために、より少ない配列決定法しか必要としない。
【００５９】
Ｂ．増幅
増幅のために、プライマーは、ゲノムの標的領域を増幅するように設計されている。捕捉技術が非標的領域からＤＮＡを取り除く一方で、増幅技術は、標的領域からＤＮＡ分子数を優先的に増強する。このように、同じように、配列読み取りが標的領域に相当する見込みがより高くなる。
【００６０】
増幅は、配列決定のため標的領域からより多くのＤＮＡコピーを提供するが、全般的な精度は原サンプルの統計的精度に関連したままである。すなわち、原サンプルが比較的少ない（これによりサンプルサイズによる統計的な誤りに感受性を有する）場合、より多くのＤＮＡコピーが現在、存在しているとしても、増幅ではそのような問題を克服できない。
【００６１】
一実施形態では、その２つの技術を組み合わせてもよい。例えば、当業者は、標的領域に関するＤＮＡ分子を捕捉し、そして、非標的ＤＮＡを取り除き得る。残ったＤＮＡは、標的領域からの増強されたパーセンテージを有する。そして、当業者は、残ったＤＮＡ分子を増幅して、標的パーセンテージをさらに高く増強し、そして、標的領域からより多くのＤＮＡコピーを得ることができる。
【００６２】
ＩＶ．遺伝子座の同定
上記のとおり、実施形態では、母親がホモ接合であり、そして、胎児がヘテロ接合である場合、情報提供遺伝子座を使用する。これらの遺伝子座は、いろいろな方法により同定される。例えば、情報提供遺伝子座（例えば、ＳＮＰ）は、母親及び胎児の遺伝子型決定の情報に従って同定され得る。しかしながら、そのようなプロセスは、例えば、侵襲的技術によって、胎児細胞を得ることを伴うであろう。例えば、遺伝子型決定は、侵襲的に得られる母親の血球細胞及び胎児の組織サンプルに対して行われ得る。他の実施形態では、非侵襲的技術により情報提供遺伝子座を同定できる。しかし、この遺伝子型決定は、非侵襲的方法の妥当性を比較するためのゴールドスタンダードとして使用され得る。以下の非標的配列決定の結果について、読み取り深度は、配列決定だけに基づく、多くの情報提供遺伝子座の同定には不十分であり、これにより、情報提供遺伝子座に関する以前の遺伝子型決定情報が使用された。
【００６３】
標的配列決定法の実施形態について、当業者が２つの対立遺伝子の存在を同定できたにもかかわらず、一方が少量である場合、より多くのＳＮＰ遺伝子座において十分な深度が存在するので、これらは情報提供遺伝子座であり得る。例えば、遺伝子座について、当業者は、第１の対立遺伝子に相当する第１の配列読み取り数をカウントでき、且つ、第２の対立遺伝子に相当する第２の配列読み取り数をカウントできる。過剰出現配列（対立遺伝子）は、共有対立遺伝子に相当するであろうし、過小発現対立遺伝子は、胎児特異的対立遺伝子に相当するであろう。母親がヘテロ接合（すなわち、約５０−５０の２つの対立遺伝子）である場合、遺伝子座は、２つの対立遺伝子の比が約１である遺伝子座を棄却することによって識別され得る。胎児濃度が５〜２０％の間にあると予想されるので、情報提供遺伝子座は、遺伝子座に整列されるすべての配列読み取りのうちの約２．５％〜１０％で現れる少数派の対立遺伝子を有すると予想される。これらのパーセンテージは例示的なので、他のパーセンテージが使用されてもよい。
【００６４】
一実施形態において、第１の遺伝子座における第１の対立遺伝子に相当する第１の配列読み取り数が決定される。第１の遺伝子座における第２の対立遺伝子に相当する第２の配列読み取り数が決定される。第１の数と第２の数から成る対立遺伝子比は、さまざまな方法で（例えば、第１の対立遺伝子を用いた読み取りのパーセンテージとして）計算され得る。対立遺伝子比が第１の閾値を超え、且つ、第２の閾値を下回る場合、第１の遺伝子座が情報提供遺伝子座であると同定される。例えば、第２の閾値が、遺伝子座が母親において単純にヘテロ接合ではないことを確実にするように使用されることができ、そして、第１の閾値は０（又は、配列読み取りが絶対に間違っていないことを確実にする他の値）であることもある。
【００６５】
Ｖ．結果
ＤＮＡは、単胎胎児を妊娠している１４人の妊婦から回収された血漿サンプルから抽出された。ハイブリダイゼーションベースの標的配列決定法を使用して、ｃｈｒ７、ｃｈｒｌ３、ｃｒｒ１８、及びｃｈｒ２１上の２，９０６の一塩基多型遺伝子座を富化した。標的富化した又はしていない血漿ＤＮＡライブラリが、大規模並列配列決定法で分析された。各ケースについて母親と胎児の両方のゲノムＤＮＡのサンプルが、一塩基多型マイクロアレイ解析によって遺伝子型を決定された。
【００６６】
図３は、本発明の実施形態による１４人の妊婦の配列決定の結果に関する表３００を示す。表３００は、第２１染色体が着目の染色体であるデータを示す。胎児の状態は、遺伝子型決定データから決定された。データの残りは、配列決定の結果から決定される。
【００６７】
標的領域について、富化サンプルの平均配列決定深度は、非富化サンプルのものより２２５倍高かった。配列決定深度は、各塩基が特定領域内で配列決定された平均回数と規定される。平均的に、非富化及び富化サンプルにおいて、３００万両末端読み取りが、基準ヒトゲノム（Ｈｇ１８）に対して一意的にマッピングされた。複製両末端読み取りのフィルタリング後に、標的領域の配列決定深度が、標的領域内の配列決定塩基の総数を標的領域の長さで割ることによって計算できる。平均配列決定深度は、非富化サンプルで０．１２回であり、富化サンプルで２７回であり、２２５倍の平均富化を示した。この知見は、我々の以前の刊行物と一致していた［１５］。
【００６８】
非富化サンプル中の分画胎児ＤＮＡ濃度（胎児ＤＮＡパーセンテージとも呼ばれる）は、方程式：分画胎児ＤＮＡ濃度＝胎児特異的対立遺伝子数ｘ２／（胎児特異的対立遺伝子数＋共有対立遺伝子数）×１００％、に従って、ｃｈｒ２１以外のすべての常染色体から情報提供ＳＮＰを使用することによって計算された。この試験で分析された１４のケースに関する分画胎児ＤＮＡ濃度の中央値は、１５．５％（範囲９．１％〜１９．７％）であった。分画胎児ＤＮＡ濃度は、母親由来の異数性に関する１の値からの、方法２００の第３の比（例えば、ＦＳＲ21Ref）において予想される低下を決定するのに使用できる（図１Ｃ）。本明細書中で言及される場合、カットオフ値は、分画胎児ＤＮＡ濃度に基づいて決定され得る。あるいは、カットオフは、サンプル中に存在している最少分画胎児ＤＮＡ濃度の仮定又は計測に基づいて選択され得る。
Ａ．非標的配列決定データを使用したＦ−Ｓ比の計算
【００６９】
図４Ａは、ＦＳＲ21Ref値が本発明の実施形態による非標的配列決定データによる正倍数性胎児と父親及び母親由来のＴ２１とを識別するために計算されたことを示す。母親及び胎児の遺伝子型決定情報に基づいて、情報提供ＳＮＰが、ｃｈｒ２１（サンプル内の範囲：１，０４４〜１，７７５ＳＮＰ）、及びｃｈｒ２１以外のすべての常染色体を含むｃｈｒＲｅｆ（サンプル内の範囲：９９，５８１〜１０６，９５０ＳＮＰ）において同定された。上記情報提供ＳＮＰ内で、胎児特異的対立遺伝子数（ＦＣと表される）及び共有対立遺伝子数（ＳＣと表される）がｃｈｒ２１（ＦＣ21＝２〜１９、ＳＣ21＝８７〜２１３）とｃｈｒＲｅｆ（ＦＣRcf＝３９０〜１，６２２、ＳＣRef＝６，８８０〜１８，８９２）について決定された。図３は、ＦＳＲ21、ＦＳＲRef、及びＦＳＲ21Refについて計算された結果を示す。
【００７０】
図４Ａに示されているように、父親由来のＴ２１ケース（ＦＳＲ21Ref＝２．３５）は、正倍数性群（ＦＳＲ21Ref平均９．９１、中央値０．９６、範囲０．７０〜１．１０）と識別されることがある。その一方で、母親由来のＴ２１ケース（ＦＳＲ21Ref平均１．１０、中央値１．３０、範囲０．３３〜１．５７）は、正倍数性ケースと重複した（マン−ホイットニー順位和検定、ｐ＝０．３６６）。
【００７１】
Ｂ．標的配列決定データを使用したＦ−Ｓ比の計算
図４Ｂは、ＦＳＲ21Ref値が本発明の実施形態による非標的配列決定データによる正倍数性胎児と父親及び母親由来のＴ２１とを識別するために計算されたことを示す。ｃｈｒ２１上の１，４３７の標的ＳＮＰ遺伝子座及び（ｃｈｒ７、ｃｈｒ１３、及びｃｂｒ１８を含めた）ｃｈｒＲｅｆ上の１，４６９のＳＮＰ遺伝子座の中で、各ケースについて、情報提供ＳＮＰ（ｃｈｒ２１＝１５１〜２７３ＳＮＰ、ｃｈｒＲｅｆ＝１４５〜１８２ＳＮＰ）が同定された。胎児特異的及び共有対立遺伝子を有する配列読み取り数が、表３００中に示されているように、ｃｈｒ２１（ＦＣ21＝１９７〜７６１、ＳＣ21＝３，６１０〜７，７４０）及びｃｈｒＲｅｆ（ＦＣRcf＝１５４〜４７３、ＳＣRef＝２，７８６〜５，５５７）について決定された。
【００７２】
図４Ｂに示されているように、父親由来のＴ２１ケース（ＦＳＲ21Ref＝１．６８）は、正倍数性群（ＦＳＲ21Ref平均３．０６、中央値１．０６、範囲０．９５〜１．２９）と識別されることがある。母親由来のＴ２１群は、低いＦＳＲ21Ref値（ＦＳＲ21Ref平均０．９４、中央値０．９３、範囲０．７８〜１．１７）（マン−ホイットニー順位和検定、ｐ＝０．０５１）を有するが、正倍数性群との重複はまだ存在した。しかしながら、重複は減少していた。重複の存在は、遺伝子座数が増やされなければならないか、又は配列決定深度のレベルが増強されなければならないことを示唆している。
【００７３】
Ｃ．比較
父親由来のＴ２１ケースは、非標的配列決定データと標的配列決定データの両方で首尾よく検出された。母親由来のＴ２１ケースについて、このアプローチは、有効でなくなった。平均ＦＳＲ21Ref値は母親由来のＴ２１ケースで低かったが、正倍数性と母親由来のＴ２１ケースの間でＦＳＲ21Ref値の顕著な重複があった。父親由来のＴ２Ｉ検出と母親由来のＴ２Ｉ検出の間の能力の相違点は、主にＦＳＲ21Refの変化の程度に起因し、そしてそれは、父親由来のＴ２１について２倍に増強され、そして、母親由来のＴ２１についてｆ／２倍に減少した（図１Ｂ及び１Ｃ）。これにより、父親の遺伝性異数体は、母親の遺伝性異数体より低い配列決定深度で非侵襲的に識別されることができた。
【００７４】
胎児ＤＮＡは母親の血漿中で少数集団に相当するので、胎児ＤＮＡの低い分画濃度は、母親由来のＴ２１においてＦＳＲ21Ref変化の程度を低下させるであろう。例えば、分画胎児ＤＮＡ濃度が５％であると仮定すると、母親由来のＴ２１のＦＳＲ21Refは０．９７５になり、そしてそれは、正倍数性ケース（ＦＳＲ21Ref＝１）に非常に近似している。
【００７５】
ＶＩ．コンピュータシミュレーション
コンピュータシミュレーションは、Ｔ２１検出のためのＦ−Ｓ比分析の精度を調査するために利用された。統計モデルは、父親及び母親由来のＴ２１モデルの両方の分画胎児ＤＮＡ濃度によれば、胎児特異的対立遺伝子の数及び共有対立遺伝子数の数が二項分布に従うはずであるという仮定に基づいている。例えば、基準染色体（ｃｈｒＲｅｆ）の分画胎児ＤＮＡ濃度がｆであると仮定すると、情報提供ＳＮＰの胎児特異的対立遺伝子を検出する確率は、胎児の異数性状態にかかわらずｃｈｒＲｅｆのｆ／２であろう。その一方で、母親が正倍数性胎児を妊娠している場合、ｃｈｒ２１上に胎児特異的対立遺伝子を検出する確率はｆ／２であり、母親が父親由来のＴ２１胎児を妊娠している場合、それは２ｆ／（２＋ｆ）であり、母親が母親由来のＴ２１胎児を妊娠している場合、それはｆ／（２＋ｆ）である（図１Ａ〜１Ｃ）。
【００７６】
例示目的のために、我々は、ｃｈｒ２１及びｃｈｒＲｅｆから等量の情報提供対立遺伝子数（胎児特異的対立遺伝子数と共有対立遺伝子数の合計）を得たと仮定した。上記の仮定に基づいて、１，０００の正倍数性と１，０００のＴ２１ケースを、様々な分画胎児ＤＮＡ濃度について、その都度シミュレートし、父親及び母親由来のＴ２１モデルの両方で検出精度を調査した。
【００７７】
図５Ａ及び５Ｂは、本発明の実施形態による、５％（図５Ｂ）及び１５％（図５Ａ）の分画胎児ＤＮＡ濃度に関するＴ２１検出のコンピュータシミュレーションについてプロットを示す。我々は、Ｔ２１検出のための対立遺伝子比アプローチの精度をさらに改善するパラメータを決定するためにコンピュータシミュレーションを使用した。コンピュータシミュレーションでは、胎児ＤＮＡ割合と、情報提供対立遺伝子数と、配列決定深度との相関が明らかになった。
【００７８】
９９％超の特異性を得るために、Ｔ２１識別のためのカットオフは、正倍数性群の平均Ｆ−Ｓ比を上回るものと下回るものの３つの標準偏差で選ばれた。父親及び母親由来のＴ２１検出のための感度は、それぞれ１５％（Ａ）の分画胎児ＤＮＡ濃度について、ｃｈｒ２１とｃｈｒＲｅｆの様々な数の情報提供対立遺伝子数で調査された。同様の分析が、５％の分画胎児ＤＮＡ濃度について行なわれた（Ｂ）。（Ｍａ−Ｔ２１：母親由来のＴ２１。Ｐａ−Ｔ２１：父親由来のＴ２１。Ｓｅｎ＝感度。Ｆｅ％＝分画胎児ＤＮＡ濃度。Ｉｎｆｏ ＡＣ＝ｃｈｒ２１及びｃｈｒＲｅｆのそれぞれの情報提供対立遺伝子数。Ｉｎｆｏ ＳＮＰ＝ｃｈｒ２１及びｃｈｒＲｅｆのそれぞれの情報提供ＳＮＰ。Ｓｅｑ深度＝配列決定深度。Ｉｎｆｏ ＡＣ＝Ｉｎｆｏ ＳＮＰ×Ｓｅｑ深度）。
【００７９】
図５Ａのプロットを得るために、分画胎児ＤＮＡ濃度が、１５％に固定され、胎児Ｔ２１に関する検出精度を調査するために、ｃｈｒ２１及びｃｈｒＲｅｆの情報提供対立遺伝子数を徐々に増やした。付加情報提供対立遺伝子数は、父親及び母親由来のＴ２１モデルの両方で検出精度を改善するであろう。正確な検出（感度＞９９％、特異性＞９９％）を得るために、より多くの情報提供対立遺伝子数が、父親由来のＴ２１検出（情報提供対立遺伝子数＝１，１００）に比べて、母親由来のＴ２１検出のために必要であった（情報提供対立遺伝子数＝１３０，０００）（図５Ａ）。分画胎児ＤＮＡ濃度が５％に低下した場合、対応する情報提供対立遺伝子数が、母親由来のＴ２１を検出するために３，６００，０００まで、そして、父親由来のＴ２１を検出するために３，５００まで増やすことが必要であろう（図５Ｂ）。
【００８０】
図６は、Ｔ２１検出のための情報提供対立遺伝子数の最少数を調査するためのコンピュータシミュレーションのプロット６００を示す。実線の曲線は、所定の分画胎児ＤＮＡ濃度（Ｘ軸）による、母親由来のＴ２１の信頼できる検出（感度＞９９％、特異性＞９９％）を達成するために、それぞれｃｈｒ２１及びｃｈｒＲｅｆ（Ｙ軸）について必要とされる情報提供対立遺伝子数の最少数を表している。破線の曲線は、父親由来のＴ２１モデルを表している。
【００８１】
母親の血漿中の分画胎児ＤＮＡ濃度が４０％から１％まで徐々に低下したとき、情報提供対立遺伝子数の最少数は、高い検出率（感度＞９９％、特異性＞９９％）を維持するために、父親及び母親由来のＴ２１シナリオの両方で増強されることが必要であろうが、その数の増加は、母親由来のＴ２１シナリオでより際立っていた。この分析のために選択された感度及び特異性は、最近報告された非多形性タグ計数アプローチの能力を反映するように選択された［１２−１４］。
【００８２】
ＶＩＩ．精度の向上
先に概説されているとおり、当業者が検出精度を改善できる様々な方法が存在する。１つのアプローチは、分画胎児ＤＮＡ濃度を高めることであり、そしてそれは、母親由来のＴ２１におけるＦＳＲ21Refの変化の程度を拡大するであろう。初期の研究は、母親の血漿のホルムアルデヒド処理によって胎児ＤＮＡ割合を富化することを試みたが［７］、この方法は、別のグループによって一貫して再現されなかったので、使用が容易ではなかった［８−１０］。あるいは、母親由来のＴ２１検出の精度が、情報提供対立遺伝子数を増やすことによって改善できる。我々のシミュレーション分析によると、付加情報提供対立遺伝子数は、ある程度、分画胎児ＤＮＡ濃度の減少によって引き起こされた検出精度の喪失を補うであろう（図６）。２つのアプローチ、すなわち、より多くの情報提供ＳＮＰの動員及び各遺伝子座のより深い配列決定が、情報提供対立遺伝子数を増やすために使用できる。一実施形態において、両アプローチが使用される。
【００８３】
Ａ．情報提供遺伝子座の決定
情報提供ＳＮＰ数は、一般に、２つの要因：検出のための着目の染色体上のＳＮＰの総数及び情報提供ＳＮＰの頻度、によって決定される。後者は、分析したＳＮＰ群の中の検出可能な情報提供ＳＮＰのパーセンテージである。調査するために、絨毛膜絨毛ＤＮＡのマイクロアレイベースの分析で決定される胎児の遺伝子型情報は、情報提供ＳＮＰの頻度を最大化するのに使用され、そしてそれの平均値は、この試験の全１４ケースにおいて約１２％である。しかしながら、胎児のゲノム材料は、実際のＮＩＰＤのためにあらかじめ入手可能ではないであろう。そのため、情報提供ＳＮＰは、例えば、親が共にホモ接合であるにもかかわらず、異なった対立遺伝子を伴う状況（例えば、母親がＡＡであり、そして、父親がＢＢである）でＳＮＰを選択することによって間接的に推定される必要があろう。このシナリオでは、そういったアプローチは父親がヘテロ接合であるあらゆるＳＮＰを除くであろうから、情報提供ＳＮＰの頻度は１２％から６％に減少するであろう。
【００８４】
ＳＮＰ動員に関して、ハイブリダイゼーションベースの富化システムが使用されてもよい。上記の実施例では、我々は、標的染色体上の２，９０６のＳＮＰ遺伝子座を得るために比較的少数のプローブしか用いていない。しかしながら、分析ＳＮＰ遺伝子座の数を増やすことが可能である。例えば、Genome-Wide Human SNP Array 6.0（Affymetrix）によりすべてのｃｈｒ２１ＳＮＰ遺伝子座（１２，９３０ＳＮＰ）を網羅するようにプローブを設計する場合、我々は、ｃｈｒ２１の情報提供ＳＮＰの数を、現在のデータセットの各ケースあたり約１，５００ＳＮＰまで増やすこともできる。我々がｃｈｒＲｅｆ上に同数の情報提供ＳＮＰを得、そして、血漿ＤＮＡを８７回の深度まで配列決定する場合、我々は、それぞれｃｈｒ２１及びｃｈｒＲｅｆ上の約１３０，０００の情報提供対立遺伝子数（１，５００×８７）を採取するであろう。
【００８５】
そういった数は、１５％以上の分画胎児ＤＮＡ濃度を仮定することで、正倍数性ケースからの母親遺伝性Ｔ２１の比較的ロバストな分類を可能にするであろう（図５Ａ）。この試験で、情報提供ＳＮＰの平均頻度が約１２％であり、且つ、約５０％の読み取りが元の標的領域にマッピングされる（残りの読み取りが標的を外れている）のであれば、１３０，０００の情報提供対立遺伝子数を得るのに必要とされる読み取りの総数は、４３０万（１３０，０００の読み取り×２／（１２％×５０％））であろう。
【００８６】
しかしながら、分画胎児ＤＮＡ濃度が５％に低下する場合、読み取り数は、約１億２０００万まで増やすことが必要であろう（図５Ｂ）。５％は、最近の試験の多くで使用される配列決定深度にて非多型性ベースのタグ計算アプローチの下限に近く、そして、１５％はタグ計算アプローチに基づく確立された臨床試験において大まかな平均分画胎児ＤＮＡ濃度であるので［１２−１４］、５％と１５％がここで分析された。
【００８７】
Ｂ．より深い配列決定
十分な数の対立遺伝子を得るために、代替アプローチは、比較的少数の情報提供ＳＮＰを用いてより深く各遺伝子座を配列決定することである。我々の以前の刊行物によると、我々は、１ミリリットルの血漿あたり約１，０００ゲノム等量のＤＮＡが含まれており、そしてそれが、各遺伝子座あたり２，０００の対立遺伝子数をもたらすであろうことを実証した［４］。我々が５ｍＬの血漿中の各遺伝子座について対立遺伝子のすべてを計数できた場合、我々は、各遺伝子座につき１万の対立遺伝子数を得るであろう。このシナリオでは、２６の情報提供ＳＮＰ（ｃｈｒ２１上に１３ＳＮＰ、ｃｈｒＲｅｆ上に３３ＳＮＰ）が、１５％の胎児ＤＮＡを含むサンプルにおける母親由来のＴ２１検出に十分な情報提供対立遺伝子数を提供する可能性があり、そしてそれは、ｃｈｒ２１及びｃｈｒＲｅｆのそれぞれに１３０，０００の情報提供対立遺伝子数（１０，０００×１３）を意味する。情報提供ＳＮＰの数は、５％の分画胎児ＤＮＡ濃度を含むサンプルのために７２０（ｃｈｒ２１上に３６０ＳＮＰ、ｃｈｒＲｅｆ上に３６０ＳＮＰ）まで増やされる必要がある。このストラテジーに必要とされる高い読み取り深度（すなわち、情報提供対立遺伝子あたり１０，０００の数）のため、標的富化のためのＰＣＲベースのアプローチ（すなわち、増幅法）が、このタイプの適用のための代替法であるかもしれない［１８、１９］。
【００８８】
ＶＩＩＩ．材料と方法
我々は、単胎胎児を妊娠している１４人の妊婦（１２週間〜１３週間及び５日間の在胎月齢）を採用した。母親の末梢血サンプルは、ＣＶＳの前に回収された。ＣＶＳに続いて、胎児ゲノムＤＮＡサンプルを絨毛膜絨毛から得た。異数性又は正倍数性状態は、完全な核型分析によって確認された。１４ケースの中で、７ケースがＴ２１胎児であり、残りが正倍数性であった。
【００８９】
一実施態様では、ＤＮＡは以下の方法で抽出される。母親の末梢血サンプル（５〜１０ｍＬ）は、４℃、１，６００ｇにて３０分間遠心分離された。血漿部分（２〜５ｍｌ）は、４℃、１６，０００ｇで１０分間再び遠心分離された。我々は、２５００ｇで５分間再び遠心分離」することによって、血球細胞部分から残留血漿の全てを取り除いた［１６］。血漿ＤＮＡは、以前に記載したように、DSP DNA Blood Mini Kit（Qiagen）で抽出された［１１］。胎児及び母親のゲノムＤＮＡは、製造業者のプロトコールに従って、QIAamp DNA Blood Mini Kit（Qiagen）を用いて、絨毛膜絨毛及び末梢血液細胞からそれぞれ抽出された。抽出された血漿ＤＮＡは、ABI 7300 Sequence Deiecior（Applied Biosystems）を使用したリアルタイムＰＣＲによって定量化された。β−グロビンのリアルタイムＰＣＲアッセイが、以前記載したとおり行われた［４］。１細胞あたり６．６ｐｇのＤＮＡの変換係数は、抽出された血漿ＤＮＡの量を計算するのに使用された。
Ａ．血漿ＤＮＡライブラリの標的配列決定法
【００９０】
以下のものは、実施形態で使用可能な配列決定技術の例である。血漿ＤＮＡ分子が既に自然に断片化されている場合、この例には追加的な断片化ステップは必要なかった。各ケースにつき１０〜３０ｎｇの血漿ＤＮＡが、Multiplexing Sample Preparation Oligonucleotide Kit（Illumina）及びSureSelec Target Enrichment System Kit（Agilent）製のオリゴヌクレオチドでアダプター及びプライマーを置き換えることを除いて、以前に記載したように、製造業者の取扱説明書に従って、Genomic DNA Sample Preparation Kit（Illumina）によるＤＮＡライブラリー構築に使用された［１５］。
【００９１】
ＳＮＰを網羅した高倍率配列決定を得るために、SureSelect Target Enrichment System（Agilent）が、標的領域内のＳＮＰを補足するのに適用された。原理証明試験として、プローブの約５％が、ｃｈｒ７（３１３ＳＮＰ）、ｃｈｒ１３（５６４ＳＮＰ）、ｃｈｒ１８（５９２ＳＮＰ）、及びｃｈｒ２１（１４３７ＳＮＰ）上の合計２９０６ＳＮＰ遺伝子座を標的とするように設計された一方で、残りのプローブは別のプロジェクトのために設計された。５００ｎｇのそれぞれの構築血漿ＤＮＡライブラリが、そのプローブと共に６５℃で２４時間インキュベートされた。ハイブリダイゼーションの後に、捕捉されたＤＮＡ分子が溶出され、そして、製造業者の取扱説明書に従って１２サイクルのＰＣＲで増幅された。標的富化を伴った又は伴っていないライブラリは、５０ｂｐ×２の両末端形式でのGenome Analyzer IIx（Illumina）による多重配列決定のためにインデックスが付された。さらに７サイクルの配列決定が行われて、インデックス配列が解読された。
【００９２】
すべての配列読み取りが、SOAPaligner/soap2（soap.genomics.org.cn）を用いて無標識ヒト基準ゲノム（Ｈｇ１８）（genome.ucsc.edu）と整列された。２つのミスマッチが、整列中に許容された。両末端読み取りの断片サイズの範囲は、５０〜６００ｂｐと規定された。複製両末端読み取り（例えば、同一配列及び開始末端座標を有する読み取り）が、同じ本来の血漿ＤＮＡ鋳型のクローンであると見なされた。複製読み取りの１つを残してすべてをフィルターにかけ、以前に記載したその後の生命情報工学分析のために、１コピーだけ残した［１５］。
【００９３】
Ｂ．マイクロアレイ遺伝子型決定
遺伝子型決定は、配列決定技術の精度を確認するために使用された。母親及び胎児のゲノムＤＮＡサンプルが、Genome-Wide Human SNP Array 6.0（Asymetrix）を用いて遺伝子型決定された。７人のＴ２１胎児のｃｂｒ３の付加コピーの親起源を、ｃｈｒ２１上のＳＮＰの対立遺伝子シグナル強度が分析される、絨毛膜絨毛サンプルのマイクロアレイ解析を使用して決定される。胎児が父親由来のＴ２１を有する場合、胎児特異的対立遺伝子（Ｂ対立遺伝子）のシグナル強度は、胎児の遺伝子型がｃｈｒ２１上でＡＢＢになっおり、逆もまた同様であるから、共有対立遺伝子（Ａ対立遺伝子）に比べて２倍高くなるはずである。このアプローチを使用すると、１の胎児が父親由来のＴ２１と同定されるのに対して、６が母親由来のＴ２１と同定される。
ＩＸ．コンピュータシステム
【００９４】
本明細書に記載のいずれのコンピュータシステムに関しても、任意の適切な数のサブシステムを利用することが可能である。このようなサブシステムの例を、図７のコンピュータ装置７００に示す。一部の実施形態では、コンピュータシステムは、ただ１つのコンピュータ装置を含み、この場合、サブシステムは、コンピュータ装置の構成要素でありうる。他の実施形態では、コンピュータシステムは、複数のコンピュータ装置を含み、それぞれが内部構成要素を含むサブシステムであってもよい。
【００９５】
図７に示すサブシステムは、システムバス７７５を介して相互接続される。例えば、プリンター７７４、キーボード７７８、固定ディスク７７９、ディスプレイアダプター７８２に接続されたモニター７７６などの追加のサブシステム、が示されている。Ｉ／Ｏ制御装置７７１に接続された周辺装置及び入／出力（Ｉ／Ｏ）装置を、当技術分野で既知の任意の数のシリアルポート７７７、等の手段によりコンピュータシステムに接続できる。例えば、シリアルポート７７７又は外部インターフェイス７８１（例えば、イーサネット、Ｗｉ−Ｆｉなど）を使って、コンピュータシステム７００をインターネット等の広域ネットワーク、マウス入力装置、又はスキャナーに接続できる。システムバス７７５を介した相互接続は、中央処理装置７７３のそれぞれのサブシステムとの通信、及びシステムメモリー７７２又は固定ディスク７７９からの命令の実行の制御、ならびにサブシステム間の情報交換の制御を可能とする。システムメモリー７７２及び／又は固定ディスク７７９は、コンピュータ可読メディアを組み入れることができる。本明細書に記載のいずれのデータも、１つの装置から別の装置に出力でき、また、ユーザーにも出力できる。
【００９６】
コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェイス７８１又は内部インターフェイスにより接続された複数の同じ装置又はサブシステムを含むことができる。一部の実施形態では、コンピュータシステム、サブシステム、又は装置は、ネットワークを介して通信できる。このような場合は、１つのコンピュータをクライアント、別のコンピュータをサーバーと見なすことができ、この場合、それぞれは、同じコンピュータシステムの一部となりうる。クライアント及びサーバーは、それぞれ複数のシステム、サブシステム、又は装置を含んでもよい。
【００９７】
本発明のいずれの実施形態も、モジュール又は集積方式のハードウェア（例えば、適用業務に特化された集積回路又はフィールドプログラマブルゲートアレイ）及び／又は一般的にプログラム可能なプロセッサを有するコンピュータソフトウェアを使った制御論理の形で実装できることは理解されよう。本明細書で提供される開示と教示に基づいて、当業者なら、ハードウェア及びハードウェアとソフトウェアの組み合わせを使って、本発明の実施形態を実施する他の手段、及び／又は方法を知り、理解するであろう。
【００９８】
本出願に記載のいずれのソフトウェア成分又は機能も、例えば、Ｊａｖａ、Ｃ＋＋又はＰｅｒｌ等のいずれかの適切なコンピュータ言語を使い、例えば、従来の、又はオブジェクト指向技術を使って、プロセッサにより実行されるソフトウェアコードとして実装可能である。ソフトウェアコードは、保存、及び／又は送信用のコンピュータ可読メディア上の一連の指令又は命令として保存できる。適切なメディアには、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ハードドライブもしくはフロッピーディスク、等の磁気メディア、又はコンパクトディスク（ＣＤ）もしくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）等の光学メディア、フラッシュメモリ、等が含まれる。コンピュータ可読メディアは、このような保存又は送信装置のいずれかの組み合わせであってもよい。
【００９９】
このようなプログラムは、また、インターネットを含む種々のプロトコルに準拠した有線、光学、及び／又は無線ネットワークを介した送信に適応したキャリアシグナルを使って、コード化及び送信できる。従って、本発明の実施形態によるコンピュータ可読メディアは、このようなプログラムでコードされたデータシグナルを使って作成できる。プログラムコードでコードされたコンピュータ可読メディアは、互換性のある装置と一緒にパッケージされても、又は他の装置から別々に（例えば、インターネットのダウンロードで）提供されてもよい。いずれのこのようなコンピュータ可読ディアも、単一コンピュータプログラム製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、又は全体コンピュータシステム）上にあっても、内部にあってもよく、また、システム又はネットワーク内の異なるコンピュータプログラム製品上にあっても、内部にあってもよい。コンピュータシステムは、モニター、プリンター、又は本明細書記載のいずれかの結果をユーザーに提供するための他の適切なディスプレイを含んでもよい。
【０１００】
本明細書記載の方法のいずれかは、全体的に、又は部分的に、ステップを実行するように構成できる、１若しくは複数のプロセッサを含むコンピュータシステムを使って行うことができる。従って、実施形態は、本明細書記載の方法のいずれかのステップを実行するように構成され、場合によっては、それぞれのステップ又はそれぞれのステップグループを実行する異なる装置を備えた、コンピュータシステムを対象にできる。番号を付けたステップとして示したが、本明細書にある方法のステップは、同時に又は異なる順で行うことができる。さらに、これらのステップの一部は、他の方法由来の他のステップの一部と一緒に使用できる。また、全部又は一部のステップは、任意に選択できる。さらに、いずれかの方法のいずれかのステップは、モジュール、回路、又はこれらのステップを実行する他の手段と一緒に行うことができる。
【０１０１】
特定の実施形態の特定の詳細は、本発明の実施形態の趣旨及び範囲を逸脱することなく、いずれかの適切な方法で組み合わせることができる。しかし、本発明の他の実施形態は、それぞれの個別態様、又はこれらの個別態様の特定の組み合わせ、に関連する具体的実施形態を対象にできる。
【０１０２】
本発明の代表的実施形態の上記説明は、例示と説明の目的で提示されている。それは、網羅的とする意図、又は本発明を記載された通りの形態に限定する意図はなく、上記教示を考慮すると多くの修正及び変形が可能である。実施形態は、本発明の原理及びその実際的適用を最良に説明し、それにより、種々の実施形態で、特定の意図された用途に適合されるように種々の変形を用いて、他の当業者が本発明を最良に利用するのを可能とするように選択及び記載された。
【０１０３】
特に逆の指示がなければ、「a」、「an」又は「the」の記述は、「１つ又は複数の」を意味することが意図されている。
【０１０４】
全ての特許、特許出願、出版物、及び本明細書中の記載は、参照によってその全体が、あらゆる目的において、本明細書に組み込まれる。これらのいずれも先行技術であることを認めるものではない。
【表１】
2015521028.tif 000003
【表２】
2015521028.tif 000004
【表３】
2015521028.tif 000005
【図１Ａ】
2015521028.tif 000006
【図１Ｂ】
2015521028.tif 000007
【図１Ｃ】
2015521028.tif 000008
【図２】
2015521028.tif 000009
【図３】
2015521028.tif 000010
【図４】
2015521028.tif 000011
【図５】
2015521028.tif 000012
【図６】
2015521028.tif 000013
【図７】
2015521028.tif 000014
【手続補正書】
【提出日】平成27年4月23日(2015.4.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎児を妊娠している女性対象からの生物学的サンプルを、前記胎児が第１の染色体に関係する異数性を有しているか否かを決定するために分析する方法であって、前記生物学的サンプルが、前記胎児と女性対象からのＤＮＡ分子の混合物を含んでおり、以下のステップ：
複数の標的領域からＤＮＡ分子について生物学的サンプルを富化し；
前記生物学的サンプルからＤＮＡ分子を配列決定して、複数の配列読み取りを得；
複数の配列読み取りを分析するが、ここで、前記配列読み取りの分析が：
前記配列読み取りを基準ゲノムと整列させることによって、基準ゲノム内の配列読み取りの位置を同定し；そして
前記配列読み取りのそれぞれの対立遺伝子を決定すること、
を含み；
第１の染色体上の、標的領域の一部に相当する複数の第１の遺伝子座を同定し；
１若しくは複数の基準染色体上の、標的領域の一部に相当する複数の第２の遺伝子座を同定するが、ここで、前記妊婦は、第１及び第２の遺伝子座のそれぞれにおけるそれぞれの母系対立遺伝子についてホモ接合であり、且つ、ここで、前記胎児は、第１及び第２の遺伝子座のそれぞれにおけるそれぞれの母系対立遺伝子及びそれぞれの父系対立遺伝子についてヘテロ接合であって、それぞれの父系対立遺伝子がそれぞれの母系対立遺伝子と異なっており；
複数の第１の遺伝子座においてそれぞれの母系対立遺伝子の第１の母系の量を決定し；
複数の第１の遺伝子座においてそれぞれの父系対立遺伝子の第１の父系の量を決定し；
第１の母系の量と第１の父系の量に関して第１の比を計算し；
複数の第２の遺伝子座においてそれぞれの母系対立遺伝子の第２の母系の量を決定し；
複数の第２の遺伝子座においてそれぞれの父系対立遺伝子の第２の父系の量を決定し；
第２の母系の量と第２の父系の量に関して第２の比を計算し；
第１の比と第２の比に関して第３の比を計算し；そして
第３の比を１若しくは複数のカットオフ値と比較して、前記胎児が第１の染色体に関係する異数性を有しているか否か決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記生物学的サンプルを富化することが、
複数の標的領域に相当する固定されたプローブを用いて、前記生物学的サンプル中のＤＮＡ分子を捕捉すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的サンプルを富化することが：
複数の標的領域に相当するプライマーを用いて、生物学的サンプル中のＤＮＡ分子を増幅すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の染色体上の複数の第１の遺伝子座のうちの第１の遺伝子座を同定することが、
複数の配列読み取りを第１の遺伝子座と整列させ；そして
第１の遺伝子座に整列させた複数の配列読み取りの中から２つの対立遺伝子を同定すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第１の遺伝子座の第１の対立遺伝子に相当する第１の配列読み取りの数を決定し；
前記第１の遺伝子座の第２の対立遺伝子に相当する第２の配列読み取りの数を決定し；
第１の数と第２の数に関して対立遺伝子比を計算し；
前記対立遺伝子比が第１の閾値を上回り、且つ、第２の閾値を下回るか否かを決定すること、
をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第１の染色体上の複数の第１の遺伝子座のうちの第１の遺伝子座を同定することが、
前記胎児の父親が、第１の遺伝子座において第１の対立遺伝子に関してホモ接合であることを同定し；そして
妊婦が、第１の遺伝子座にいて第２の対立遺伝子に関してホモ接合であることを同定すること、
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の比が、第１の母系の量と第１の父系の量から決定される、混合物中の胎児ＤＮＡ分子の第１のパーセンテージに合致し；そして、前記第２の比が、第２の母系の量と第２の父系の量から決定される、混合物中の胎児核酸分子の第２のパーセンテージに合致する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１の比として、第１の父系の量と第１の母親の量の合計によって割られた第１の父親の量が挙げられる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第１の比として、第１の母系の量によって割られた第１の父系の量が挙げられ、そして、前記第２の比として、第２の母系の量によって割られた第２の父系の量が挙げられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
第１のカットオフ値が、母親由来である異数性に対応し、そして、第２のカットオフ値が、父親由来である異数性に対応する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
異数性が父親由来であるときに、前記第３の比が、約２である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
異数性が母親由来であるときに、前記第３の比が、約１−ｆ／２｛式中、ｆが、混合物中の分画胎児ＤＮＡ濃度である｝である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の父系の量と第２の母系の量から、分画胎児ＤＮＡ濃度ｆを決定すること、
をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の染色体が、第２１染色体、第１３染色体、又は第１８染色体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の遺伝子座のうちの少なくとも１つが、ＳＮＰである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の第２の遺伝子座が、複数の基準染色体上に位置している、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
胎児を妊娠している女性対象からの生物学的サンプルを、前記胎児が第１の染色体に関係する異数性を有しているか否か決定するための分析を行うためのプログラムであって、前記生物学的サンプルは、前記胎児と女性対象からのＤＮＡ分子の混合物を含んでおり、前記プログラムが、以下のプロセスを実行する：
複数の標的領域からＤＮＡ分子について富化された生物学的サンプルからのＤＮＡ分子の配列決定から得られた複数の配列読み取りを受信し；
複数の配列読み取りを分析するが、ここで、前記配列読み取りの分析が：
前記配列読み取りを基準ゲノムと整列させることによって、基準ゲノム内の配列読み取りの位置を同定し；そして
前記配列読み取りのそれぞれの対立遺伝子を決定すること、
を含み；
第１の染色体上の、標的領域の一部に相当する複数の第１の遺伝子座を同定し；
１若しくは複数の基準染色体上の、標的領域の一部に相当する複数の第２の遺伝子座を同定するが、ここで、前記妊婦は、第１及び第２の遺伝子座のそれぞれにおけるそれぞれの母系対立遺伝子についてホモ接合であり、且つ、ここで、前記胎児は、第１及び第２の遺伝子座のそれぞれにおけるそれぞれの母系対立遺伝子及びそれぞれの父系対立遺伝子についてヘテロ接合であって、それぞれの父系対立遺伝子がそれぞれの母系対立遺伝子と異なっており；
複数の第１の遺伝子座においてそれぞれの母系対立遺伝子の第１の母系の量を決定し；
複数の第１の遺伝子座においてそれぞれの父系対立遺伝子の第１の父系の量を決定し；
第１の母系の量と第１の父系の量に関して第１の比を計算し；
複数の第２の遺伝子座においてそれぞれの母系対立遺伝子の第２の母系の量を決定し；
複数の第２の遺伝子座においてそれぞれの父系対立遺伝子の第２の父系の量を決定し；
第２の母系の量と第２の父系の量に関して第２の比を計算し；
第１の比と第２の比に関して第３の比を計算し；そして
第３の比を１若しくは複数のカットオフ値と比較して、前記胎児が第１の染色体に関係する異数性を有しているか否か決定すること、
を含む、前記プログラム。
【請求項１８】
第１のカットオフ値が、母親由来である異数性に対応し、そして、第２のカットオフ値が、父親由来である異数性に対応している、請求項１７に記載のプログラム。
【請求項１９】
異数性が父親由来であるときに、前記第３の比が、約２である、請求項１８に記載のプログラム。
【請求項２０】
異数性が母親由来であるときに、前記第３の比が、約１−ｆ／２｛式中、ｆが、混合物中の分画胎児ＤＮＡ濃度である｝である、請求項１８に記載のプログラム。
【請求項２１】
前記第１の比として、第１の母系の量によって割られた第１の父系の量が挙げられ、そして、前記第２の比として、第２の母系の量によって割られた第２の父系の量が挙げられる、請求項１７に記載のプログラム。
【請求項２２】
胎児を妊娠している女性対象からの生物学的サンプルを、前記胎児が第１の染色体に関係する異数性を有しているか否か決定するための分析を行うための装置であって、前記生物学的サンプルは、前記胎児と女性対象からのＤＮＡ分子の混合物を含んでおり、
請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のプログラムを保存するコンピュータ可読媒体；及び
該コンピュータ可読媒体に保存されたプログラムを実行ように構成された１又はそれ以上のプロセッサ
を含む、装置。
【国際調査報告】
2015521028.tif 000015
2015521028.tif 000016
2015521028.tif 000017
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