(57)【要約】  炎症性疾患を処置する方法が開示される。前記方法は、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）のプロドメインを含むポリペプチドの治療効果的な量を対象に投与し、それにより、前記炎症性疾患を処置することを含み、前記ポリペプチドは、前記ＴＡＣＥの触媒ドメインを欠き、かつ、前記ポリペプチドをフリン分解に対して抵抗性にする、Ｒ５８、Ｒ５６およびＫ５７からなる群から選択される部位における改変を含み、かつ、ＴＡＣＥの活性をダウンレギュレーションすることができる。【選択図】図６Ａ−６Ｂ
2015522532.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症性疾患を処置する方法であって、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）のプロドメインを含むポリペプチドの治療効果的な量を対象に投与し、それにより、前記炎症性疾患を処置することを含み、前記ポリペプチドは、前記ＴＡＣＥの触媒ドメインを欠き、かつ、前記ポリペプチドをフリン分解に対して抵抗性にする、Ｒ５８、Ｒ５６およびＫ５７からなる群から選択される部位における改変を含み、かつ、ＴＡＣＥの活性をダウンレギュレーションすることができる、方法。
【請求項２】
ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）のプロドメインを含む単離されたポリペプチドであって、前記ＴＡＣＥの触媒ドメインを欠き、かつ、前記ポリペプチドをフリン分解に対して抵抗性にする、Ｒ５８、Ｒ５６およびＫ５７からなる群から選択される部位における改変を含み、かつ、ＴＡＣＥの活性をダウンレギュレーションすることができる単離されたポリペプチド。
【請求項３】
活性成分としてポリペプチドを含み、かつ、医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物であって、前記ポリペプチドは、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）のプロドメインを含み、かつ、前記ＴＡＣＥの触媒ドメインを欠き、かつ、前記ポリペプチドをフリン分解に対して抵抗性にする、Ｒ５８、Ｒ５６およびＫ５７からなる群から選択される部位における改変を含み、かつ、ＴＡＣＥの活性をダウンレギュレーションすることができる、医薬組成物。
【請求項４】
前記改変はＲ５８においてである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法、単離されたポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項５】
炎症性疾患を処置することにおいて使用するためのものである、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
細菌細胞において発現されるとき、可溶性である、請求項２に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
前記細菌細胞の細胞質ゾルにおいて発現され、封入体において発現されない、請求項６に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
前記炎症性疾患は自己免疫疾患である、請求項１または５に記載の方法または単離されたポリペプチド。
【請求項９】
前記自己免疫疾患はクローン病または関節リウマチである、請求項８に記載の方法または単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
前記炎症性疾患は癌である、請求項１または５に記載の方法または単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
前記炎症性疾患は肝炎である、請求項１または５に記載の方法または単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
前記炎症性疾患は、細胞移植、組織移植または臓器移植に伴う免疫応答に関連する、請求項１または５に記載の方法または単離されたポリペプチド。
【請求項１３】
前記ＴＡＣＥプロドメインは、初期設定済みパラメーターを使用するＢｌａｓｔＰによって決定される場合、配列番号５に示される配列に対して少なくとも９０％相同的であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１４】
前記ポリペプチドはさらに、Ｒ２１１、Ｒ２１４およびＣ１８４からなる群から選択される位置において改変を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１５】
５８位における前記改変は、アルギニンからアラニンへの置換である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１６】
２１１位における前記改変は、アルギニンからアラニンへの置換である、請求項１４に記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１７】
２１４位における前記改変は、アルギニンからグリシンへの置換である、請求項１４に記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１８】
１８４位における前記改変は、システインからアラニンへの置換である、請求項１４に記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項１９】
ＴＡＣＥの前記プロドメインは、配列番号６〜配列番号８からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２０】
前記ポリペプチドはさらに、Ｒ２１１、Ｒ２１４およびＣ１８４からなる群から選択される位置において改変を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２１】
前記ポリペプチドは組換えポリペプチドである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２２】
前記組換えポリペプチドは細菌において作製される、請求項２１に記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２３】
ＴＡＣＥの前記プロドメインは異種ポリペプチドに結合させられている、請求項１〜３のいずれかに記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２４】
前記異種ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン、免疫グロブリンおよびトランスフェリンからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２５】
前記免疫グロブリンはＦｃドメインを含む、請求項２４に記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２６】
ＴＡＣＥの前記プロドメインはポリマーに結合させられている、請求項１〜３のいずれかに記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２７】
前記ポリマーは、ポリカチオン性ポリマー、非イオン性水溶性ポリマー、ポリエーテルポリマーおよび生体適合性ポリマーからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２８】
前記ポリマーはポリ（エチレングリコール）である、請求項２６に記載の方法、ポリペプチドまたは医薬組成物。
【請求項２９】
請求項２に記載のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３０】
細菌における発現のために最適化されるコドン使用頻度を有する、請求項２９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３１】
配列番号１１〜配列番号１６からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項２９に記載の単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３２】
ＴＡＣＥプロドメインを封入体においてではなく、細胞質ゾルに含む細菌細胞。
【請求項３３】
前記ＴＡＣＥプロドメインは可溶性である、請求項３２に記載の細菌細胞。
【請求項３４】
前記ＴＡＣＥプロドメインの前記アミノ酸配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８に示される、請求項３２に記載の細菌細胞。
【請求項３５】
前記可溶性ＴＡＣＥプロドメインは、配列番号１１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を含む核酸配列によってコードされる、請求項３２に記載の細菌細胞。
【請求項３６】
ＴＡＣＥプロドメインを作製する方法であって、請求項２に記載の単離されたポリペプチドを細胞において発現させ、それにより、前記ＴＡＣＥプロドメインを作製することを含む方法。
【請求項３７】
前記細胞は細菌細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
改変をＣ１８４の位置に含むＴＡＣＥプロドメインを作製する方法であって、前記ＴＡＣＥプロドメインを細菌細胞の細胞質において発現させ、それにより、前記ＴＡＣＥプロドメインを作製することを含む方法。
【請求項３９】
前記細菌細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記発現させることが、前記ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物を前記細胞に導入することによって行われる、請求項３６または３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記核酸配列は配列番号１１〜配列番号１６からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記プロドメインは封入体において発現されない、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はそのいくつかの実施形態において、クローン病および関節リウマチを含む炎症性障害を処置するためのＴＮＦα転換酵素阻害剤（ＴＡＣＥ阻害剤）に関連する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＤＡＭファミリーのメンバーは主要なエクトドメインシェディング・プロテイナーゼとして認識されている。ＡＤＡＭはほとんどが、プロドメイン、触媒ドメイン、ディスインテグリンドメイン、ＥＧＦ様（システインリッチ）ドメイン、１回膜貫通ドメインおよび細胞質部分からなる多ドメイン構造を特徴とするＩ型膜貫通タンパク質である（図１）。プロドメインは、触媒的Ｚｎ（ＩＩ）と結合することによってＡＤＡＭプロテイナーゼ活性を阻害し、一方で、酵素の活性部位表面との特異的なタンパク質−タンパク質相互作用を媒介する。このドメインが、酵素活性を取り戻すために、細胞内または細胞外のどちらのものであれ、別のプロテイナーゼによって切断される。ＡＤＡＭのディスインテグリンドメインは場合によっては様々なインテグリンと相互作用して、細胞接着および細胞−細胞相互作用に影響を与えることができる。ディスインテグリンドメインおよび／またはＥＧＦ様ドメインは基質認識および／または（ヘテロ）二量体化に関与すると考えられている。膜貫通領域の後にはＣ末端の細胞質領域が続き、この領域には、細胞内のシグナル伝達タンパク質と相互作用するＳＨ３結合モチーフが含まれる。
【０００３】
今日まで、細胞表面における調べられたシェディング活性のほとんどがＡＤＡＭ１７およびその近縁体ＡＤＡＭ１０によって媒介される。非常に多数のタンパク質がＡＤＡＭ１７のための基質として特定され、これらのタンパク質には、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６のような重要な免疫調節性サイトカイン、ならびに、それらの受容体のＴＮＦＲおよびＩＬ−６Ｒ、ガン関連分子（例えば、ＥｒｂＢリガンドおよびそれらの受容体など）、Ｎｏｔｃｈ−１のようなシグナル伝達分子、細胞接着分子（例えば、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）またはＩＣＡＭ−１など）、また、それどころか、アミロイド前駆体タンパク質が含まれた。ＡＤＡＭ１７は、ＴＮＦ−αのための一次シェダーゼ（ｓｈｅｄｄａｓｅ）として特定されていたので、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）と呼ばれた。したがって、広い可変的な生物学的機能がＡＤＡＭ１７に関連づけられている（例えば、発達、軸索ガイダンス、細胞−細胞相互作用、シグナル伝達、および、ＴＮＦ−αを炎症において放出することにおけるその主要な役割など）。
【０００４】
この１０年間に特定されたＡＤＡＭ１７基質の数が著しく多いにもかかわらず、このメタロプロテイナーゼの提案された病理学的役割のほとんどが、プロＴＮＦ−α、ＥＧＦＲのリガンドおよびアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）を含むほんの少数の基質に関連している（図２）。多くの生物学的プロセスにおけるこれらの分子の中心的役割を考えると、ＡＤＡＭ１７が治療標的として示唆されている疾患の数が、この数年において指数関数的に増えている。異なる化学的部類に属する多くの化合物が選択的ＴＡＣＥ阻害剤として合成されている。しかしながら、試験された小分子は、効力、特異性の欠如およびインビボにおける肝毒性のために、関節リウマチのための第ＩＩ相臨床試験から撤退している［ＤａｓＧｕｐｔａ，Ｓ．他、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、２００９、１７（２）：ｐ．４４４〜５９］。この結果は驚くべきものではない。合成された小分子阻害剤の使用では、特異性の欠如に悩まされる。これらの小分子阻害剤は、メツジンシンファミリーのすべてのメンバーの中では高度に保存されるＴＡＣＥの活性部位を標的とした（図３）。したがって、多くの予測されていない副作用が、望まれない交差阻害によって生じた［Ｍｏｓｓ，Ｍ．Ｌ．他、Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、２００８、４（６）：ｐ．３００〜９］。
【０００５】
インビボでの阻害が、天然に存在する内因性のＭＭＰ阻害剤によって、すなわち、メタロプロテイナーゼ組織阻害剤ファミリー（ＴＩＭＰ）によって達成される。このファミリーは、大きい配列相同性を示す４つのメンバーから、すなわち、ＴＩＭＰ１〜ＴＩＭＰ４からなる。正常な生理学的条件のもとでは、各種ＭＭＰの活性はほとんどがこれらのＴＩＭＰによって調節される。誤調節により、関節炎、ガン、多発性硬化症および心臓血管疾患が引き起こされる可能性がある。興味深いことに、Ｎ端側のドメインは独立して折り畳むことができ、かつ、標的となったＭＭＰまたはＡＤＡＭの活性を完全に阻害することができる。この阻害機構には、ＴＩＭＰのＮ端側システインを介する触媒作用Ｚｎ（ＩＩ）の直接的な配位、同様にまた、酵素の広がった触媒作用クレフトとのタンパク質−タンパク質相互作用が伴う。このことから、Ｎ末端アミノ基による金属キレート化がメタロプロテイナーゼ阻害活性において機構的に重要であることが確認される。標的となったＭＭＰに対する選択性が、基質の結合を模倣する骨格接触により触媒作用クレフトに存在するＮ末端における４つの残基によって達成される。興味深いことに、全体をトポロジー的に見ることにより、ＭＭＰおよびＴＩＭＰの表面残基の間で生じる「鍵および鍵穴」のタンパク質−タンパク質相互作用が明らかにされる（図４）。ＴＡＣＥは自然界では、Ｗｉｓｎｉｅｗｓｋａ他（２００８）［Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、２００８、３８１（５）：ｐ．１３０７〜１９］によって結晶構造において示されるように、ＴＩＭＰ−３によって阻害される。
【０００６】
ＭＭＰファミリーの他のメンバーと同様に、ＴＡＣＥは潜在型チモーゲンとして生じ、阻害性プロドメインが放出されたときに活性化される。ＴＡＣＥチモーゲンの活性化が、プロドメインと触媒ドメインとの接合部におけるフリンコンセンサス部位である２１１ＲＶＫＲ２１４／Ｒ２１５を介して後期ゴルジ区画において、主にフリン様プロテアーゼ（プロタンパク質転換酵素）によって行われる。ＴＡＣＥのプロドメインがこの酵素の機能的形態での分泌のために必須であることが見出されている。プロドメインを欠くＴＡＣＥ発現構築物は昆虫細胞において機能的酵素として分泌することができず、タンパク質が小胞体に保持され、分解を受けた。ＴＡＣＥのプロドメインは分子間シャペロンとして働き、これにより、このプロテイナーゼの分泌を助けていると結論された。
【０００７】
サイトカインのＴＮＦ−αが、大きな役割を炎症性腸疾患および関節リウマチにおける自己免疫疾患プロセスにおいて果たす。したがって、ＴＨＮ−αが、クローン病および関節リウマチを処置するための治療戦略を開発するための重要な標的となっている。自己免疫障害を処置するための臨床使用について承認されているＴＮＦ−α阻害剤が、インフリキシマブ、アダリムマブおよびエタネルセプトである。インフリキシマブおよびアダリムマブは、ＴＮＦ−αについて特異的な改変型抗体であり、これに対して、エタネルセプトは、ヒトｐ７５  ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲＩＩ）のリガンド結合部分と、ヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメントとを含む融合タンパク質である。これらのＴＮＦ−α阻害剤は、ＴＮＦ−αと細胞表面受容体との相互作用を阻止する（図５）。
【０００８】
異なる戦略が、小分子阻害剤の設計によって強調されるものであり、可溶性ＴＮＦ−αがその膜結合型前駆体から放出されることを妨げることである。ＴＡＣＥが免疫適格細胞においてＴＮＦ−αのための主たるシェダーゼであるということが、この戦略のための理論的根拠の標的となった。経口利用可能な小分子阻害剤が開発され、これらは、近縁関係にあるマトリックスメタロプロテイナーゼを上回ってＴＡＣＥについての改善された選択性を明らかにする［Ｇｅｏｒｇｉａｄｉｓ，Ｄ．およびＡ．Ｙｉｏｔａｋｉｓ、Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、２００８、１６（１９）：ｐ．８７８１〜９４］。しかしながら、それらのすべてが、ＭＭＰファミリーの他のメンバーの交差阻害の非特異的な副作用によって引き起こされる肝臓毒性のために失敗した。
【０００９】
ＴＡＣＥを阻害するためのプロドメインの使用が下記において開示されている：Ｌｅｏｎａｒｄ，Ｊ．Ｄ．他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、２００５、３８７（Ｐｔ  ３）：ｐ．７９７〜８０５；Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｐ．Ｅ．他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００４、２７９（３０）：ｐ．３１６３８〜４５；Ｍａｓｋｏｓ，Ｋ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１９９８、９５（７）：ｐ．３４０８〜１２；Ｌｉ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ、２００９（１２月）、１０（１２）：５４４２〜５４５４；Ｂｕｃｋｌｅｙ、Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ、２８８：Ｌ１１３２〜Ｌ１１３８、２００５。米国特許第７６５５７５２号は、ガンおよび他の疾患を処置するためのＴＡＣＥプロドメインおよびそのフラグメントを教示する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、炎症性疾患を処置する方法であって、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）のプロドメインを含むポリペプチドの治療効果的な量を対象に投与し、それにより、前記炎症性疾患を処置することを含み、前記ポリペプチドは、前記ＴＡＣＥの触媒ドメインを欠き、かつ、該ポリペプチドをフリン分解に対して抵抗性にする、Ｒ５８、Ｒ５６およびＫ５７からなる群から選択される部位における改変を含み、かつ、ＴＡＣＥの活性をダウンレギュレーションすることができる、方法が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）のプロドメインを含む単離されたポリペプチドであって、前記ＴＡＣＥの触媒ドメインを欠き、かつ、該ポリペプチドをフリン分解に対して抵抗性にする、Ｒ５８、Ｒ５６およびＫ５７からなる群から選択される部位における改変を含み、かつ、ＴＡＣＥの活性をダウンレギュレーションすることができる単離されたポリペプチドが提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＴＡＣＥプロドメインを作製する方法であって、本明細書中に記載される単離されたポリペプチドを細胞において発現させ、それにより、前記ＴＡＣＥプロドメインを作製することを含む方法が提供される。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、活性成分としてポリペプチドを含み、かつ、医薬的に許容され得る担体を含む医薬組成物であって、前記ポリペプチドは、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）のプロドメインを含み、かつ、前記ＴＡＣＥの触媒ドメインを欠き、かつ、該ポリペプチドをフリン分解に対して抵抗性にする、Ｒ５８、Ｒ５６およびＫ５７からなる群から選択される部位における改変を含み、かつ、ＴＡＣＥの活性をダウンレギュレーションすることができる、医薬組成物が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、本明細書中に記載されるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、ＴＡＣＥプロドメインを封入体においてではなく、細胞質ゾルに含む細菌細胞が提供される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態の１つの局面によれば、改変をＣ１８４の位置に含むＴＡＣＥプロドメインを作製する方法であって、前記ＴＡＣＥプロドメインを細菌細胞の細胞質において発現させ、それにより、前記ＴＡＣＥプロドメインを作製することを含む方法が提供される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記改変はＲ５８においてである。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離されたポリペプチドは、炎症性疾患を処置することにおいて使用するためのものである。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離されたポリペプチドは、細菌細胞において発現されるとき、可溶性である。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離されたポリペプチドは上記細菌細胞の細胞質ゾルにおいて発現され、封入体において発現されない。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記炎症性疾患は、自己免疫疾患である。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記自己免疫疾患はクローン病または関節リウマチである。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記炎症性疾患は、癌である。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記炎症性疾患は、肝炎である。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記炎症性疾患は、細胞移植、組織移植または臓器移植に伴う免疫応答に関連する。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＴＡＣＥプロドメインは、初期設定済みパラメーターを使用するＢｌａｓｔＰによって決定される場合、配列番号５に示される配列に対して少なくとも９０％相同的であるアミノ酸配列を含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリペプチドはさらに、Ｒ２１１、Ｒ２１４およびＣ１８４からなる群から選択される位置において改変を含む。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、５８位における上記改変は、アルギニンからアラニンへの置換である。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、２１１位における上記改変は、アルギニンからアラニンへの置換である。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、２１４位における上記改変は、アルギニンからグリシンへの置換である。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、１８４位における上記改変は、システインからアラニンへの置換である。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴＡＣＥの上記プロドメインは、配列番号６〜配列番号８からなる群から選択される配列を含む。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリペプチドはさらに、Ｒ２１１、Ｒ２１４およびＣ１８４からなる群から選択される位置において改変を含む。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリペプチドは組換えポリペプチドである。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記組換えポリペプチドは細菌において作製される。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴＡＣＥの上記プロドメインは異種ポリペプチドに結合させられている。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記異種ポリペプチドは、ヒト血清アルブミン、免疫グロブリンおよびトランスフェリンからなる群から選択される。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記免疫グロブリンはＦｃドメインを含む。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、ＴＡＣＥの上記プロドメインはポリマーに結合させられている。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリマーは、ポリカチオン性ポリマー、非イオン性水溶性ポリマー、ポリエーテルポリマーおよび生体適合性ポリマーからなる群から選択される。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ポリマーはポリ（エチレングリコール）である。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離されたポリヌクレオチドは、細菌における発現のために最適化されるコドン使用頻度を有する。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１１〜配列番号１６からなる群から選択される核酸配列を含む。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＴＡＣＥプロドメインは可溶性である。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記ＴＡＣＥプロドメインの上記アミノ酸配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号７または配列番号８に示される。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記可溶性ＴＡＣＥプロドメインは、配列番号１１〜配列番号１６からなる群から選択される配列を含む核酸配列によってコードされる。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細胞は細菌細胞である。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記細菌細胞はＥ．ｃｏｌｉ細胞である。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記発現させることが、上記ポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸構築物を上記細胞に導入することによって行われる。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記核酸配列は、配列番号１１〜配列番号１６からなる群から選択される。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、上記プロドメインは封入体において発現されない。
【００５２】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および／または科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、例示的な方法および／または材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
本明細書では本発明のいくつかの実施形態を単に例示し添付の画像を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の実施形態を例示考察することだけを目的としていることを強調するものである。この点について、図面について行う説明によって、本発明の実施形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００５４】
【図１】図１は、ＴＡＣＥのドメインを概略的に示す図である。ＳＰ−ＴＡＣＥを膜に向かわせることに関わるシグナルペプチド。ＴＡＣＥプロドメイン−触媒活性およびシャペロンの不活性化をもたらす。矢印はチモーゲン成熟化のためのフリンの切断部位を示す。触媒ドメイン−基質の切断。ディスインテグリン−インテグリンとの相互作用。Ｃｙｓリッチ−成熟化。細胞質−シグナル分子との相互作用。
【００５５】
【図２】図２は、ＥＧＦ様リガンド、プロＴＮＦ−αおよびβＡＰＰの切断を介して、ＡＤＡＭ１７が関与する疾患のタイプを示す概略図である。
【００５６】
【図３】図３は、ＭＭＰ１、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９、ＭＴ１およびＴＡＣＥの触媒ドメインの構造アラインメントである。灰色部分はそれぞれの構造における触媒作用Ｚｎ（ＩＩ）を表す。青色−小分子阻害剤。
【００５７】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ〜図４Ｂは、ＴＡＣＥおよびＭＴ１に対するＴＩＭＰ阻害を例示する。図４Ａ（ＰＤＢファイル、１ＢＢＱ）、ＴＩＭＰ−２（赤色）によって阻害されるＭＴ１（緑色）、灰色部分は触媒作用Ｚｎ（ＩＩ）を表す。図４Ｂ（ＰＤＢファイル、３ＣＫＩ）、ＴＩＭＰ−３（赤色）によって阻害されるＴＡＣＥ（緑色）、灰色部分は触媒作用Ｚｎ（ＩＩ）を表しており、Ｚｎ（ＩＩ）が、３つのヒスチジン残基との３つの配位相互作用と、関連ＴＩＭＰにより与えられるシステイン残基とによって保持される。
【００５８】
【図５】図５は、抗ＴＮＦ治療法およびＴＮＦ−αに対するそれらの影響を例示する。エタネルセプト（ＴＮＦＲＩＩとＩｇＧ１のＦｃ領域との融合タンパク質）ならびに抗ＴＮＦ抗体のインフリキシマブおよびアダリムマブはＴＮＦ−αに結合し、分子が受容体に結合することを妨げる。
【００５９】
【図６Ａ−６Ｂ】図６Ａ〜図６Ｂは、ＴＡＣＥプロドメインのインビトロでの選択的阻害を例示する。（Ａ）ＴＡＣＥプロドメインの存在下における蛍光発生ペプチドに対する触媒活性、ＴＡＣＥ（黒四角）、ＭＭＰ７（赤丸）、ＭＴ１−ＭＭＰ（青三角）およびＭＭＰ９（緑三角）。（Ｂ）計算されたＩＣ５０値、ＴＡＣＥ（１１９ｎＭ）、ＭＭＰ７（８７９２ｎＭ）、ＭＴ１−ＭＭＰ（決定されず）およびＭＭＰ９（４４８０ｎＭ）。
【００６０】
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ〜図７Ｂは、ＴＡＣＥプロドメインがＴＮＦ−α分泌を細胞型アッセイにおいて阻害することを例示するグラフである。ＴＮＦ−αトランスフェクションＣＨＯ細胞（Ａ）および初代マクロファージ（Ｂ）におけるＴＮＦ−αの分泌。ＬＰＳ（リポ多糖）が、細胞表面におけるＴＡＣＥ提示を刺激するために使用される。ＴＡＰＩ（ＴＡＣＥを標的とする小分子阻害剤）がこのアッセイにおける陽性コントロールとして使用される。
【００６１】
【図８Ａ−８Ｆ】図８Ａ〜図８Ｆは、ＴＡＣＥプロドメインによる処置がＴＮＢＳ大腸炎発達から保護することを例示する。Ａ〜Ｆ：臨床での大腸炎重篤度が、体重減少（Ａ）、生存（Ｂ）、肉眼的スコア（Ｃ）、結腸のヘマトキシリン／エオシン染色切片において行われる組織病理学的分析（Ｄ）、代表的な結腸特徴群（Ｅ）、ならびに、ＴＮＢＳ誘導コントロールの結腸、および、ＴＡＣＥプロドメインにより処置されるＴＮＢＳ誘導マウスの結腸の×１０の倍率での代表的な結腸切片の組織学的特徴（Ｆ）によってモニターされた。
【００６２】
【図９Ａ−９Ｃ】図９Ａ〜図９Ｃは、標識されたＴＡＣＥプロドメインを使用する、新鮮な組織に対する蛍光画像化分析を例示する。蛍光標識されたＴＡＣＥプロドメイン（１．５ｎｍｏｌのＳＤＳ３−ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０）または蛍光色素のみ（１．５ｎｍｏｌのＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０）の静脈内注入の２時間後または１０時間後に屠殺されるＴＮＢＳ処置マウスまたは健康なマウスの解剖された臓器（Ａ）または展開された結腸（Ｂ）の代表的な画像。（Ｃ）注入の２時間後および１０時間後に屠殺されるマウスについての蛍光の結腸対心臓比。
【００６３】
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ〜図１０Ｂは、フリンによるタンパク質分解に対するｐｒｏ−Ｒ５８Ａの抵抗性を例示する。（Ａ）フリン添加（＋）／フリン非添加（−）でのｐｒｏ−ＷＴおよびｐｒｏ−Ｒ５８Ａの反応。（Ｂ）Ｐｒｏ−ＷＴ存在下（四角）およびｐｒｏ−Ｒ５８Ａ存在下（丸）におけるＴＡＣＥのタンパク質分解活性。計算されたＩＣ５０が、ｐｒｏ＝２３ｎＭ、および、ｐｒｏ５８＝５５ｎＭである。
【００６４】
【図１１Ａ−１１Ｂ】図１１Ａ〜図１１Ｂはｐｒｏ−Ｆｃの精製および阻害を例示する。（Ａ）精製されたｐｒｏ−ＦｃのＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析。（Ｂ）ｐｒｏ−ＦｃはＴＡＣＥ触媒活性を２５％阻害する。
【００６５】
【図１２】図１２は、ＷＴ型ＴＡＣＥプロドメインおよび４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインが血清中のＴＮＦ−αレベルをＬＰＳ誘導の敗血症性ショックモデルにおいて低下させることを例示する。無処置のＣ５７／ＢＬマウス、ならびに、コントロールＰＢＳおよび異なる濃度のＴＡＣＥプロドメインが１００μｇのＬＰＳ注射の１時間前に注射されたＣ５７／ＢＬマウスにおけるＴＮＦ−αの血清中レベル。血液を注射後１．５時間で採取し、血清を標準的なＴＮＦ−αＥＬＩＳＡキットにより調べた。
【００６６】
【図１３Ａ−１３Ｃ】図１３Ａ〜図１３Ｃは、ＴＡＣＥプロドメインによる処置がコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）から保護することを例示する。関節炎を、ＩＩ型コラーゲンによる免疫化、および、ＴＡＣＥプロドメインの静脈内注射をＩＩ型コラーゲンの追加免疫の１日後に行い、１０日間の毎日の注射の後で停止することによってＤＢＡ／１マウスにおいて誘導した。肉眼的臨床スコア（Ａ）、関節のヘマトキシリン／エオシン染色切片において行われる組織病理学的分析（Ｂ）、無処置のＰＢＳコントロール関節炎マウスおよびＴＡＣＥプロドメイン処置から得られる血清を抗コラーゲン抗体について分析した（Ｃ）。
【００６７】
【図１４】図１４は、Ｃ１８４Ａ改変が二量体化を還元性条件および非還元性条件のもとで妨げたことを例示する、ＳＤＳ  Ｐａｇｅゲルの写真である。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本発明はそのいくつかの実施形態において、クローン病および関節リウマチを含む炎症性障害を処置するためのＴＮＦα転換酵素阻害剤（ＴＡＣＥ阻害剤）に関連する。
【００６９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明に示されるかまたは実施例において例示される細部に必ずしも限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行されることが可能である。
【００７０】
ＴＡＣＥ（腫瘍壊死因子−α−変換酵素；ＥＣ番号３．４．２４．８６）は、ＡＤＡＭメタロペプチダーゼドメイン１７（ＡＤＡＭ１７）とも呼ばれるものであり、ディスインテグリンおよびメタロプロテアーゼのＡＤＡＭタンパク質ファミリーに属する７０ｋＤａの酵素である。
【００７１】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリーの他のメンバーと同様に、ＴＡＣＥは潜在型チモーゲンとして生じ、阻害性プロドメインが放出されたときに活性化される。ＴＡＣＥチモーゲンの活性化が、プロドメインと触媒ドメインとの接合部におけるフリンコンセンサス部位である２１１ＲＶＫＲ２１４／Ｒ２１５を介して後期ゴルジ区画において、主にフリン様プロテアーゼ（プロタンパク質転換酵素）によって行われる。
【００７２】
本発明者らは今回、第２の非標準的なフリン切断部位、すなわち、Ｒ５６ＫＲ５８／Ｄ５９を発見している。この第２の切断部位は、明確に定義された最小のフリンコンセンサス部位、すなわち、Ｍｏｌｌｏｙ，Ｓ．Ｓ．他（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９２、２６７、１６３９６）によって定義されるようなＡｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ／Ｘに似ていない。
【００７３】
Ｎａｋａｙａｍａ，Ｋ．［Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、１９９７、３２７（Ｐｔ  ３）、６２５］によれば、フリン認識のための他の要件として、下記が挙げられる：
（ｉ）Ｐ１の位置において、Ａｒｇが必須である；
（ｉｉ）Ｐ１のＡｒｇに加えて、Ｐ２、Ｐ４およびＰ６における３つの残基のうちの少なくとも２つが、効率的な切断のために塩基性であることが要求される；
（ｉｉｉ）Ｐ’１の位置において、疎水性側鎖を有するアミノ酸は適していない。
【００７４】
Ｒ５６ＫＲ５８／Ｄ５９の部位は、ＡｒｇをＰ１位に有することを除いて、塩基性要件に適合していない。ＡｒｇがＰ２位に存在せず（Ｌｙｓ）、Ｐ４位に存在せず（Ｖａｌ）、かつ、Ｐ６位に存在しない（Ｈｉｓ）（ＨＳＶＲＫＲ／Ｄ）。
【００７５】
本発明者らは、改変をタンパク質のＲ５６位に有するＴＡＣＥプロドメインが野生型ＴＡＣＥプロメインよりもフリン分解に対して抵抗性であることを示している（図１０Ａ〜図１０Ｂ）。
【００７６】
発現および精製の新規なシステムを使用して、本発明者らは、多量の可溶性ＴＡＣＥプロドメインを細菌の細胞質ゾルにおいて合成することに成功している。このプロドメインはその生来的な折り畳まれた状態で存在しており、このことはそれにより、その後の込み入ったリフォールディング工程が必要であることを除いている。
【００７７】
ＴＡＣＥプロドメインの大量供給を武器にして、本発明者らは今回、このタンパク質を治療活性について、関連性があるインビボモデルにおいて試験することができた。
【００７８】
それによれば、本発明者らは、改変をタンパク質のＲ５８位に有するＴＡＣＥプロドメインの投与が、野生型ＴＡＣＥプロドメインと比較した場合、敗血症をインビボモデルにおいて防止することにおいてより効果的であることを明らかにしている（図１２）。
【００７９】
ＴＡＣＥプロドメインの治療的可能性を自己免疫疾患において評価するために、ＴＮＢＳ／エタノールの投与によって誘導される炎症性腸疾患マウスモデルを使用した。ＴＡＣＥプロドメインにより処置されるマウスの方が、コントロールマウスと比較した場合、低い死亡率および少ない体重減少を示した（図８Ａ、図８Ｂ）。プロドメインの効力はまた、肉眼的スコアおよび組織学的スコアにおける改善により明らかであった（図８Ｃ、図８Ｄ）。ＴＡＣＥプロドメイン処置のマウスは、より長い結腸長さ、固形便、および、より少ない病変部を示した（図８Ｅ）。そのうえ、この処置はまた、ＰＢＳコントロールにおいて見られるような、マクロファージおよび免疫細胞の結腸内腔への広範囲にわたる浸潤を防止した（図８Ｆ）。
【００８０】
図９は、ＴＡＣＥプロドメインが、結腸に沿って限局性斑点で突き止められてＴＮＢＳ処置マウスの結腸において、静脈内投与後１０時間から検出できたことを明らかにする（図９Ａ、図９Ｂ）。
【００８１】
全体として、これらの結果は、阻害性のＴＡＣＥプロドメインがかなりの効力をＴヘルパー細胞依存的な炎症性腸疾患状態において有することを示している。
【００８２】
ＴＡＣＥプロドメインの治療的可能性をさらなる自己免疫疾患において評価するために、ＩＩ型コラーゲンの免疫化によって誘導される関節炎マウスモデルを使用した。
【００８３】
図１３Ａ〜図１３Ｃに例示されるように、ＴＡＣＥプロドメインにより処置されるマウスの方が、コントロールと比較した場合、有意に低い関節炎重篤度指数（Ａ）、組織学的スコア（Ｂ）、同様にまた、濃度依存的様式でのＩＩ型コラーゲンに対して特異的である低下した血清中抗体（Ｃ）を示した。
【００８４】
したがって、本発明の１つの局面によれば、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）のプロドメインを含む単離されたポリペプチドであって、前記ＴＡＣＥの触媒ドメインを欠き、かつ、該ポリペプチドをフリン分解に対して抵抗性にする、Ｒ５８、Ｒ５６およびＫ５７からなる群から選択される部位における改変を含み、かつ、ＴＡＣＥの活性をダウンレギュレーションすることができる単離されたポリペプチドが提供される。
【００８５】
本明細書中で使用される場合、表現「ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）のプロドメイン」は、当該酵素をその不活性形態で維持すること（すなわち、触媒活性を含まないこと）を担うＴＡＣＥのポリペプチド部分を示す。
【００８６】
１つの実施形態によれば、変異させたプロドメインがヒトＴＡＣＥに由来し、だが、ＴＡＣＥの他の哺乳動物型配列もまた意図される。
【００８７】
ヒトＴＡＣＥについてのｍＲＮＡ配列およびアミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００３１８３のもとで見出され得る。
【００８８】
特定の実施形態によれば、ＴＡＣＥプロドメインは、全長型ＴＡＣＥのＡｓｐ２３〜Ａｒｇ２１４に由来するポリペプチド配列を含む。
【００８９】
述べられたように、本発明のこの局面のプロドメインはＴＡＣＥ触媒活性（シェダーゼ活性）を欠いている。
【００９０】
述べられたように、本明細書中に記載されるＴＡＣＥプロドメインは、ＴＡＣＥの活性（例えば、シェダーゼ活性またはディスインテグリン活性）をダウンレギュレーションすることができる（例えば、阻害することができる）。阻害によって、ＴＡＣＥ活性が、プロドメインの非存在下における活性に対して、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％または９８％低い活性であることを意味することが意図される。ＴＡＣＥプロドメインポリペプチドがＴＡＣＥを阻害することができるかどうかを分析する様々な方法が、本明細書中下記の実施例の節において記載される。
【００９１】
表現「フリン分解に対して抵抗性（である）」は、本明細書中で使用される場合、フリン分解に対する抵抗性が、同じ反応条件のもとでの生来的配列よりも大きいこと（少なくとも１０％大きい抵抗性であること、少なくとも２０％大きい抵抗性であること、少なくとも３０％大きい抵抗性であること、少なくとも４０％大きい抵抗性であること、少なくとも５０％大きい抵抗性であること）を示す。当該ポリペプチドのフリン抵抗性を分析することが、ポリペプチドをフリンの存在下でインキュベーションし、（例えば、ＳＤＳゲル分析によって）フラグメントの生成について分析することによって行われる場合がある。
【００９２】
Ｒ５８、Ｒ５６およびＫ５７の位置における意図される改変には、欠失または置換が含まれる。これらの変異の番号表記は全長型ＴＡＣＥ酵素に対応しており、ＴＡＣＥプロドメインに対応しないことが理解されるであろう。
【００９３】
特定の実施形態によれば、Ｒ５８、Ｒ５６および／またはＫ５７が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンによって置換される場合がある。
【００９４】
別の実施形態によれば、代替アミノ酸は正荷電アミノ酸（例えば、アルギニンまたはリシン）ではない。
【００９５】
好ましくは、５８位におけるアルギニンが、例えば、配列番号６に示されるように、アラニンによって置換される。
【００９６】
本発明では、標準的なフリン切断部位を含めて、ＴＡＣＥプロドメインにおけるさらなる改変（例えば、置換または欠失）が意図され、これらには、Ｒ２１１、Ｒ２１４を含む位置のいずれか１つにおける改変が含まれるが、これに限定されない。本発明者らはさらに、Ｃ１８４位におけるアミノ酸改変を意図する。
【００９７】
本発明では、本明細書中上記で記載される改変のどのような組合せも意図され、例えば、本明細書中上記で記載される少なくとも２つの改変、少なくとも３つの改変、または、４つすべての改変が意図されることが理解されるであろう（例えば、配列番号８を参照のこと）。
【００９８】
特定の実施形態によれば、Ｒ２１１および／またはＲ２１４が、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンによって置換される場合がある。
【００９９】
特定の実施形態によれば、Ｃ１８４が、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシンまたはバリンによって置換される場合がある。
【０１００】
より好ましくは、２１１位における改変は、アルギニンからアラニンへの置換である。
【０１０１】
より好ましくは、２１４位における改変は、アルギニンからグリシンへの置換である。
【０１０２】
より好ましくは、改変には、２１１位におけるアルギニンからアラニンへの置換、および、２１４位におけるアルギニンからグリシンへの置換が含まれる（例えば、配列番号７を参照のこと）。
【０１０３】
より好ましくは、１８４位における改変は、システインからアラニンへの置換である。
【０１０４】
特定の実施形態によれば、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）のプロドメインは改変を上記で規定された位置のそれぞれにおいて含む。ＴＡＣＥプロドメインのアミノ酸配列は、初期設定済みパラメーターを使用する全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウエアを使用して決定される場合、配列番号５に記載されるＴＡＣＥプロドメイン配列に対して、好ましくは、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも８９％、少なくとも９１％、少なくとも９３％、少なくとも９５％またはそれ以上、例えば、１００％の相同性を有しており、ＴＡＣＥの酵素活性を阻害することができる（ただし、パーセント相同性は、本明細書中に記載される変異を含まない）。相同性を、ペプチドと、より大きいサイズのタンパク質との間で測定する際には、相同性は、対応する領域においてのみ測定される；すなわち、タンパク質は、ギャップおよび挿入を考慮してペプチドと同じ全体的な長さを有するのみであると見なされる。
【０１０５】
相同体はまた、欠失変化体、挿入変化体または置換変化体（それらのアミノ酸置換を含む）およびそれらの生物学的に活性なポリペプチドフラグメントを参照する場合がある。
【０１０６】
さらなる改変および変化を、現時点で開示された主題のＴＡＣＥプロドメインの構造において行うことができ、これらの改変および変化により、ＴＡＣＥを阻害することができる分子を依然として得ることができる。例えば、特定のアミノ酸を、ペプチド活性の認められるほどの喪失を伴うことなく、配列において他のアミノ酸の代わりに使用することができる。当該ポリペプチドの生物学的な機能的活性を定義することはポリペプチドの相互作用的な能力および性質であるので、特定のアミノ酸配列置換をポリペプチド配列（または、当然のことながら、その根本的なＤＮＡコード配列）において行うことができ、それにもかかわらず、そのようなアミノ酸配列置換により、同様な性質を有するポリペプチドを得ることができる。
【０１０７】
そのような変化を行う際には、アミノ酸のヒドロパシー指標を検討することができる。相互作用的な生物学的機能をポリペプチドに与えることにおけるアミノ酸のヒドロパシー指標の重要性がこの技術分野では一般に理解されている。ある特定のアミノ酸を、類似するヒドロパシー指標またはヒドロパシースコアを有する他のアミノ酸の代わりに使用することができ、かつ、そのような特定のアミノ酸は依然として、類似する生物学的活性を有するポリペプチドをもたらすことができることが知られている。それぞれのアミノ酸には、ヒドロパシー指標がその疎水性および電荷特性に基づいて割り当てられている。それらの指標は下記の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【０１０８】
アミノ酸の相対的なヒドロパシー特性により、生じたポリペプチドの二次構造が決定され、このことが結果として、当該ポリペプチドと他の分子（例えば、酵素、基質、受容体、抗体および抗原など）との相互作用を明確にすると考えられる。アミノ酸を、類似するヒドロパシー指標を有する別のアミノ酸によって置換することができ、かつ、機能的に同等なポリペプチドを依然として得ることができることがこの技術分野では知られている。そのような変化において、ヒドロパシー指標が±２の範囲内であるアミノ酸同士の置換が好ましく、±１の範囲内であるものが特に好ましく、±０．５の範囲内であるものが一層より特に好ましい。
【０１０９】
似ているアミノ酸の置換はまた、それによりもたらされる生物学的または機能的で、同等なポリペプチドまたはペプチドが免疫学的実施形態における使用のために意図される場合には特に、親水性に基づいて行うことができる。米国特許第４５５４１０１号（これは参照によって本明細書中に組み込まれる）は、その隣接アミノ酸の親水性によって左右されるようなポリペプチドの最大局所的平均親水性が、その免疫原性および抗原性と相関すること、すなわち、当該ポリペプチドの生物学的性質と相関することを述べている。米国特許第４５５４１０１号において詳述されるように、下記の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０．＋−．１）；グルタミン酸（＋３．０．＋−．１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；プロリン（−０．５．＋−．１）；トレオニン（−０．４）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。アミノ酸を、類似する親水性値を有する別のアミノ酸の代わりに使用することができ、生物学的に同等なポリペプチド、特に、免疫学的に同等なポリペプチドを依然として得ることができることが理解される。そのような変化において、親水性値が±２の範囲内であるアミノ酸同士の置換が好ましく、±１の範囲内であるものが特に好ましく、±０．５の範囲内であるものが一層より特に好ましい。
【０１１０】
上記で概略されるように、したがって、アミノ酸置換は一般には、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づいており、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷およびサイズなどに基づく。前記特徴のいくつかを考慮に入れる様々な例示的な置換が当業者には広く知られており、これらには、アルギニンおよびリシン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびトレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；そして、バリン、ロイシンおよびイソロイシンが含まれる。したがって、現時点で開示された主題には、上記で示されるようなＴＡＣＥプロドメインの機能的または生物学的な同等物が意図される。
【０１１１】
ポリペプチドの生物学同等物または機能的同等物を、部位特異的変異誘発をこの技術分野では広く知られている手順に従って使用して調製することができる。それによれば、アミノ酸残基を、ペプチドの機能性を変化させることなく、標準的な分子生物学的技術の使用により、現時点で開示された主題のＴＡＣＥプロドメインに付加することができ、または、現時点で開示された主題のＴＡＣＥプロドメインから欠失することができる。
【０１１２】
１つの実施形態によれば、プロドメインのアミノ酸配列が、その安定性、生物学的利用能および／または薬理学的効力を増大させるために改変される。
【０１１３】
なおさらなる局面において、プロドメインポリペプチドは、第１の成分（これはプロドメインポリペプチドである）と、第２の成分（これは異種のペプチドまたはタンパク質である）とを有する融合タンパク質を構成する場合がある。融合タンパク質は、ｍｙｃ、ＨＡタグまたはＨｉｓ６タグを含む場合がある。融合タンパク質はさらに、ヒトＩｇＧのＦｃドメインに融合されるプロドメインを含む。特定の局面において、免疫グロブリン融合体は、ＩｇＧ１分子のヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域、または、ヒンジ領域、ＣＨ１領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、米国特許第５４２８１３０号もまた参照のこと。Ｆｃ成分はマウスＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ２Ｍ４に由来することができる。ヒトＩｇＧ２Ｍ４（米国特許出願公開第２００７０１４８１６７号および米国特許出願公開第２００６０２２８３４９号を参照のこと）は、抗体が、当該変異により、正常な薬物動態学的プロフィルを維持し、しかし、知られているエフェクター機能を何ら有しない、変異を有するＩｇＧ２由来の抗体である。
【０１１４】
Ｆｃドメインに融合されるプロドメインの例示的なアミノ酸配列が配列番号９および配列番号１０に示される。
【０１１５】
融合タンパク質はさらに、ヒト血清アルブミン、トランスフェリンまたは抗体に融合されるプロドメインを含む。
【０１１６】
さらにさらなる局面において、プロドメインが、キャリアタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、トランスフェリンまたは抗体分子など）にコンジュゲート化される。
【０１１７】
本明細書において使用される用語「ポリペプチド」は、天然または合成のアミノ酸のポリマーに言及し、天然のペプチド（分解産物または合成的に合成されたポリペプチドまたは組換えポリペプチドのいずれか）、ペプチド模倣体（典型的には合成的に合成されたペプチド）そしてポリペプチドアナログであるペプトイドおよびセミペプトイドが含まれ、これらは、例えば、ポリペプチドを体内でより安定化させる修飾、またはポリペプチドの細胞浸透能力を高める修飾を有し得る。
【０１１８】
そのような修飾には、Ｎ末端修飾、Ｃ末端修飾、ポリペプチド結合の修飾（ＣＨ２−ＮＨ、ＣＨ２−Ｓ、ＣＨ２−Ｓ＝Ｏ、Ｏ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ２−Ｏ、ＣＨ２−ＣＨ２、Ｓ＝Ｃ−ＮＨ、ＣＨ＝ＣＨまたはＣＦ＝ＣＨを含むが、これらに限定されない）、骨格の修飾、および残基の修飾が含まれるが、これらに限定されない。ペプチド模倣体化合物を調製するための方法はこの分野では十分に知られており、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ  Ｇｄ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １７．２，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に具体的に記載される（これは、全体が本明細書中に示されるように参考として組み込まれる）。これに関するさらなる詳細が本明細書中下記に示される。
【０１１９】
ポリペプチド内のポリペプチド結合（−ＣＯ−ＮＨ−）は、例えば、Ｎ−メチル化結合（−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＯ−）、エステル結合（−Ｃ（Ｒ）Ｈ−Ｃ−Ｏ−Ｏ−Ｃ（Ｒ）−Ｎ−）、ケトメチレン結合（−ＣＯ−ＣＨ２−）、ｏ−アザ結合（−ＮＨ−Ｎ（Ｒ）−ＣＯ−）（式中、Ｒは任意のアルキル（例えば、メチル）である）、カルバ結合（−ＣＨ２−ＮＨ−）、ヒドロキシエチレン結合（−ＣＨ（ＯＨ）−ＣＨ２−）、チオアミド結合（−ＣＳ−ＮＨ−）、オレフィン二重結合（−ＣＨ＝ＣＨ−）、レトロアミド結合（−ＮＨ−ＣＯ−）、ポリペプチド誘導体（−Ｎ（Ｒ）−ＣＨ２−ＣＯ−）（式中、Ｒは、炭素原子において自然界で示される「通常」の側鎖である）によって置換することができる。
【０１２０】
これらの修飾は、ポリペプチド鎖に沿った結合の任意のところに存在させることができ、そして同時に数カ所（２カ所〜３カ所）においてさえ存在させることができる。
【０１２１】
天然の芳香族アミノ酸（Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）は、フェニルグリシン、Ｔｉｃ、ナフチルアラニン（Ｎａｌ）、Ｐｈｅの環メチル化誘導体、Ｐｈｅのハロゲン化誘導体、またはｏ−メチル−Ｔｙｒなどの合成された非天然型の酸に置換することができる。
【０１２２】
上述のことに加えて、本発明のポリペプチドは一以上の修飾されたアミノ酸または一以上の非アミノ酸モノマー（例えば脂肪酸、複合体炭水化物など）も含むことができる。
【０１２３】
従って、本明細書において使用される用語「アミノ酸」には、２０個の天然に存在するアミノ酸；インビボで多くの場合には翻訳後修飾されたそのようなアミノ酸（例えば、ヒドロキシプロリン、ホスホセリンおよびホスホトレオニンを含む）；および他の非通常型アミノ酸（２−アミノアジピン酸、ヒドロキシリシン、イソデスモシン、ノルバリン、ノルロイシンおよびオルニチンを含むが、これらに限定されない）が含まれることが理解される。さらに、用語「アミノ酸」には、この用語が本明細書中で定義されるように少なくとも１つの付加アミノ酸にペプチド結合またはペプチド結合アナログを介して連結されるＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸（立体異性体）の両方が含まれる。
【０１２４】
下記の表１〜表２には、天然に存在するアミノ酸のすべて（表１）および非通常型アミノ酸または修飾型アミノ酸（表２）が示される。
【０１２５】
2015522532.tif 000003
【０１２６】
2015522532.tif 000004
2015522532.tif 000005
2015522532.tif 000006
【０１２７】
組換え技術が典型的には、本発明のプロドメインポリペプチドを作製するために使用される。これは、これらの技術は、比較的長いポリペプチド（例えば、２０アミノ酸よりも長いもの）およびその比較的多い量を作製するためにより良く適しているからである。そのような組換え技術が、Ｂｉｔｔｅｒ他（１９８７）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６〜５４４）、Ｓｔｕｄｉｅｒ他（１９９０）（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１８５：６０〜８９）、Ｂｒｉｓｓｏｎ他（１９８４）（Ｎａｔｕｒｅ、３１０：５１１〜５１４）、Ｔａｋａｍａｔｓｕ他（１９８７）（ＥＭＢＯ  Ｊ．、６：３０７〜３１１）、Ｃｏｒｕｚｚｉ他（１９８４）（ＥＭＢＯ  Ｊ．、３：１６７１〜１６８０）、Ｂｒｏｇｌｉ他（１９８４）（Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２４：８３８〜８４３）、Ｇｕｒｌｅｙ他（１９８６）（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、６：５５９〜５６５）、および、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ＆Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ（１９８８、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ、第ＶＩＩＩ節、４２１頁〜４６３頁）によって記載される。
【０１２８】
本発明のポリペプチドを、組換え技術を使用して製造するために、本発明のプロドメインポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが核酸発現ベクターに連結される。この場合、核酸発現ベクターは、ポリヌクレオチド配列を、宿主細胞における本発明のポリペプチドの構成的転写、組織特異的転写または誘導可能な転写を行わせるために好適なシス調節配列（例えば、プロモーター配列）の転写制御下に含む。
【０１２９】
表現「単離されたポリヌクレオチド」は、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列および／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組合せ）の形態で単離および提供される一本鎖または二本鎖の核酸配列を示す。
【０１３０】
本明細書中で使用される表現「相補的ポリヌクレオチド配列」は、逆転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してメッセンジャーＲＮＡの逆転写から生じる配列を示す。そのような配列は続いて、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用してインビボまたはインビトロで増幅することができる。
【０１３１】
本明細書中で使用される表現「ゲノムポリヌクレオチド配列」は、染色体に由来する（染色体から単離される）配列を示し、従って、ゲノムポリヌクレオチド配列は染色体の隣接した一部分を表す。
【０１３２】
本明細書中で使用される表現「複合ポリヌクレオチド配列」は、少なくとも一部分が相補的であり、かつ、少なくとも一部分がゲノムである配列を示す。複合配列は、本発明のポリペプチドをコードするために要求されるいくつかのエキソン配列、ならびに、エキソン配列の間に介在するいくつかのイントロン配列を含むことができる。イントロン配列は、他の遺伝子のものを含めて、任意の供給源のものが可能であり、典型的には、保存されたスプライシングシグナル配列を含む。そのようなイントロン配列はさらに、シス作用の発現調節エレメントを含むことができる。
【０１３３】
本明細書中上記で述べられたように、本発明のポリヌクレオチド配列は、組換えポリペプチドの発現を可能にするために発現ベクター（すなわち、核酸構築物）に挿入される。本発明の発現ベクターは、このベクターを原核生物または真核生物または好ましくは両方における複製および組込みのために好適にするさらなる配列（例えば、シャトルベクター）を含むことができる。典型的なクローニング用ベクターは、転写開始配列および翻訳開始配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）、ならびに、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含有する。発現ベクターはまた、本発明の核標的化ペプチドに転写的に連結される他のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む場合があることが理解されるであろう。そのようなポリペプチドが本明細書中下記においてさらに記載される。
【０１３４】
発現ベクターにおいて使用されるプロモーターは構成的または誘導可能である場合がある。組織特異的プロモーターもまた意図される。
【０１３５】
様々な原核生物細胞または真核生物細胞を、本発明のペプチドを発現させるための宿主−発現システムとして使用することができる。これらには、微生物、例えば、ポリペプチドコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクターまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換される細菌；ポリペプチドコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターにより形質転換される酵母など；ポリペプチドコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）が感染させられるか、または、ポリペプチドコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミドなど）により形質転換される植物細胞システムが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
本発明のこの局面のこの実施形態によれば、本発明のプロドメインポリペプチドをコードする核酸配列が、発現レベルを発現系（例えば、細菌発現系）においてさらに改善するために変化させられる場合がある。したがって、プロドメインをコードするポリヌクレオチド配列が細菌のための好ましいコドン使用頻度に従って改変される場合がある。したがって、特定の系におけるプロドメインポリペプチドの増大した発現が、改変されたヌクレオチド配列または誘導体ヌクレオチド配列を利用することによって得られる場合がある。そのような配列改変の例には、関連系において典型的に見出されるＧ／Ｃ含有量により近づけるための変化させたＧ／Ｃ含有量、および、コドン最適化として一般に示される、関連系において典型的に見出されないコドンの除去が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３７】
語句「コドン最適化」は、関連系におけるコドン使用頻度に近づける、構造遺伝子またはそのフラグメントにおける使用のための適切なＤＮＡヌクレオチドの選択をいう。
【０１３８】
本発明のプロドメインを発現させるために使用されることがあるポリヌクレオチド配列の例が配列番号１１〜配列番号１６において提供される。
【０１３９】
本発明者らは、細菌発現系を使用した場合、細胞質ゾルにおいて発現され、封入体において発現されない組換えＴＡＣＥプロドメインを作製することが可能であることを示している。このＴＡＣＥプロドメインは可溶性であり、かつ、正しく折り畳まれ、その結果、さらなる折り畳み工程がその単離のために何ら要求されなかった。
【０１４０】
本発明のポリヌクレオチドはまた、対象において直接に発現させられる場合があり（すなわち、インビボ遺伝子治療）、または、細胞系（自己または非自己）においてエクスビボ発現させられ、その後、対象に投与される場合があることが理解されるであろう。様々な遺伝子治療技術が本明細書中下記でさらに記載される。
【０１４１】
（ポリペプチドをコードする）挿入されたコード配列の転写および翻訳のための必要なエレメントを含有すること以外に、本発明の発現構築物はまた、発現ペプチドの安定性、産生、精製、収量または活性を最適化するために操作される配列を含むことができる。
【０１４２】
様々な方法を、本発明の発現ベクターを宿主細胞系に導入するために使用することができる。そのような方法が、一般には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）；Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９８９）；Ｃｈａｎｇ他、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｇａ他、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）；および、Ｇｉｌｂｏａ他［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４〜５１２、１９８６］に記載され、そのような方法には、例えば、組換えウイルスベクターを用いた安定的トランスフェクションまたは一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が含まれる。加えて、陽性−陰性の選択法については米国特許第５４６４７６４号および同第５４８７９９２号を参照のこと。
【０１４３】
形質転換された細胞が、多量の組換えポリペプチドの発現を可能にする効果的な条件のもとで培養される。効果的な培養条件には、タンパク質の産生を可能にする効果的な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨおよび酸素条件が挙げられるが、これらに限定されない。効果的な培地は、細胞が、本発明の組換えポリペプチドを産生するために培養される任意の培地を示す。そのような培地には典型的には、同化可能な炭素源、窒素源およびリン酸源、ならびに、適切な塩、ミネラル、金属および他の栄養分（例えば、ビタミンなど）を有する水溶液が含まれる。本発明の細胞は、従来の発酵用バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュおよびペトリ皿で培養することができる。培養を、組換え細胞に適切な温度、ｐＨおよび酸素含有量において行うことができる。そのような培養条件は当業者の専門的知識の範囲内である。
【０１４４】
産生のために使用されるベクターおよび宿主の系に依存して、得られる本発明のペプチドおよび／またはポリペプチドは組換え細胞内に留まり得るか、または、発酵培地に分泌され得るか、または、２つの細胞膜の間の空間（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉにおける細胞膜周辺腔など）に分泌され得るか、または、細胞膜もしくはウイルス膜の外側表面に保持され得るかのいずれかである。
【０１４５】
培養での所定期間の後、組換えペプチドおよび／またはポリペプチドの回収が行われる。
【０１４６】
本明細書中で使用されるとき、語句「組換えポリペプチドを回収する」は、ポリペプチドを含有する発酵培地全体を集めることを示し、分離または精製のさらなる工程を意味する必要はない。
【０１４７】
したがって、本発明のプロドメインポリペプチドは、様々な標準的なタンパク質精製技術を使用して、例えば、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、クロマトフォーカシングおよび示差的可溶化など（これらに限定されない）を使用して精製することができる。
【０１４８】
回収を容易にするために、発現したコード配列は、本発明のポリペプチドと、融合された切断可能な成分とをコードするように操作することができる。そのような融合タンパク質は、ポリペプチドがアフィニティークロマトグラフィーによって、例えば、切断可能な成分に対して特異的なカラムでの固定化によって容易に単離され得るように設計することができる。切断部位が、ポリペプチドと、切断可能な成分との間で操作される場合、ポリペプチドは、融合タンパク質をこの部位において特異的に切断する適切な酵素または薬剤による処理によってクロマトグラフィーカラムから遊離させることができる［例えば、Ｂｏｏｔｈ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．、１９：６５〜７０（１９８８）；および、Ｇａｒｄｅｌｌａ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６５：１５８５４〜１５８５９（１９９０）を参照のこと］。
【０１４９】
本発明の目的のための例示的な精製タグには、ポリヒスチジン、Ｖ５、ｍｙｃ、プロテインＡ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）およびセルロース結合ドメイン（ＣＤＢ）［Ｓａｓｓｅｎｆｅｌｄ、１９９０、ＴＩＢＴＥＣＨ、８、８８〜９］が含まれるが、これらに限定されない。ＣＢＤ融合タンパク質の場合、プロドメインポリペプチドがポリサッカリダーゼ（セルラーゼ、キチナーゼおよびアミラーゼ、同様にまた、キシラナーゼおよびｂｅｔａ．−１，４−グリカナーゼ）の基質結合領域に融合される。基質（例えば、セルロースなど）を含有する親和性マトリックスを、プロドメインポリペプチドを固定化するために用いることができる。プロドメインポリペプチドを、プロテアーゼ切断部位を使用してマトリックスから除くことができる。
【０１５０】
プロテアーゼ部位と一緒での例示的なポリヒスチジンタグ配列が配列番号１８において提供される。
【０１５１】
ポリヒスチジンタグを含む例示的なプロドメインアミノ酸配列が配列番号１７に示される。
【０１５２】
本発明のポリペプチドは好ましくは、「実質的に純粋な」形態で回収される。
【０１５３】
本明細書中で使用されるとき、語句「実質的に純粋な」は、本明細書中に記載される適用におけるタンパク質の効果的な使用を可能にする純度を示す。
【０１５４】
本発明のいくつかの実施形態のプロドメインは、生物学的利用能を増大させるために発現後に化学的に改変される場合がある。
【０１５５】
したがって、例えば、本発明では、プロドメインポリペプチドがポリマーに連結される改変が意図される。選択されるポリマーは通常、ただ１つの反応性基（例えば、アシル化のための活性エステル、または、アルキル化のためのアルデヒドなど）を有するように改変され、その結果、改変の程度が制御され得るようにされる。ポリマーの範囲には、ポリマーの混合物が含まれる。好ましくは、最終製造物調製物の治療的使用のためには、ポリマーは医薬的に許容可能であろう。
【０１５６】
そのようなポリマーまたはその混合物が、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、デキストラン、セルロースまたは他の炭水化物系ポリマー、ポリ−（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化されたポリオール（例えば、グリセロール）、および、ポリビニルアルコールからなる群から選択される場合がある。
【０１５７】
さらにさらなる実施形態において、プロドメインポリペプチドは、ＰＥＧ化、ＨＥＳ化ＣＴＰ（Ｃ末端ペプチド）、アルブミンへの架橋、カプセル化、多糖による改変、および、多糖交代によって改変される。改変は、プロドメインポリペプチドにおけるどのアミノ酸残基に対してでも可能である。
【０１５８】
１つの実施形態によれば、改変がプロドメインポリペプチドのＮ末端アミノ酸またはＣ末端アミノ酸に対してである。これは、直接的に、あるいは、Ｎ末端もしくはＣ末端に付加されるシステイン残基のチオール基、または、Ｎ末端もしくはＣ末端に付加されるリンカー（例えば、Ｔｔｄｓなど）へのカップリングを介してそのどちらでも行われる場合がある。さらなる実施形態において、プロドメインポリペプチドのＮ末端またはＣ末端は、保護基がシステイン残基のＮ端側アミノ基にカップリングされるシステイン残基を含み、システインチオラート基が官能基（例えば、Ｎ−エチルマレイミド、ＰＥＧ基、ＨＥＳ化ＣＴＰなど）により誘導体化される。
【０１５９】
特定のタンパク質の性質がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーの結合によって調節され得ることが広く知られており、この場合、ポリエチレングリコールはタンパク質の流体力学的容積を増大させ、かつ、それにより、腎臓ろ過によるそのクリアランスを遅くする（例えば、Ｃｌａｒｋ他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１：２１９６９〜２１９７７（１９９６）を参照のこと）。したがって、コアペプチド残基が、強化された治療的利益（例えば、半減期を生体内で延ばすことによる増大した効力など）を提供するためにＰＥＧ化され得ることが想定される。したがって、プロドメインポリペプチドをＰＥＧ化することにより、プロドメインポリペプチドの薬物動態学および薬力学が改善されるであろう。
【０１６０】
様々なＰＥＧ化方法が文献において広く知られており、また、下記の参考文献（それらのそれぞれが参照によって本明細書中に組み込まれる）に記載される：Ｌｕ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．、４３：１２７〜３８（１９９４）；Ｌｕ他、Ｐｅｐｔ．Ｒｅｓ．、６：１４０〜６（１９９３）；Ｆｅｌｉｘ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．、４６：２５３〜６４（１９９５）；Ｇａｅｒｔｎｅｒ他、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．、７：３８〜４４（１９９６）；Ｔｓｕｔｓｕｍｉ他、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．、７７：１６８〜７３（１９９７）；Ｆｒａｎｃｉｓ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、６８：１〜１８（１９９８）；Ｒｏｂｅｒｔｓ他、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、８７：１４４０〜４５（１９９８）；および、Ｔａｎ他、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．、１２：４５〜５２（１９９８）。ポリエチレングリコールまたはＰＥＧは、モノ−（Ｃ．ｓｕｂ．１〜１０）アルコキシ−ポリエチレングリコールまたはアリールオキシ−ポリエチレングリコール（これらに限定されない）を含めて、他のタンパク質を誘導体化するために使用されている形態のＰＥＧのいずれをも包含することが意味される。好適なＰＥＧ成分には、例えば、４０ｋＤａのメトキシポリ（エチレングリコール）プロピオンアルデヒド（Ｄｏｗ、Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｍｉｃｈ．）、６０ｋＤａのメトキシポリ（エチレングリコール）プロピオンアルデヒド（Ｄｏｗ、Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｍｉｃｈ．）、４０ｋＤａのメトキシポリ（エチレングリコール）マレイミド−プロピオンアミド（Ｄｏｗ、Ｍｉｄｌａｎｄ、Ｍｉｃｈ．）、３１ｋＤａのアルファ−メチル−ｗ−（３−オキソプロポキシ），ポリオキシエチレン（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ）、ｍＰＥＧ．ｓｕｂ．２−ＮＨＳ−４０ｋ（Ｎｅｋｔａｒ）、ｍＰＥＧ２−ＭＡＬ−４０ｋ（Ｎｅｋｔａｒ）、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＧＬ２−４００ＭＡ（（ＰＥＧ）．ｓｕｂ．２４０ｋＤａ）（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ）、ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ  ＭＥ−２００ＭＡ（ＰＥＧ２０ｋＤａ）（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｔｏｋｙｏ）が含まれる。ＰＥＧ基は一般に、プロドメインポリペプチド上の反応性基（例えば、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基またはチオール基）に対するＰＥＧ成分上の反応性基（例えば、アルデヒド基、アミノ基、カルボキシル基またはチオール基）を介したアシル化、アミド化、チオエーテル化または還元的アルキル化によりプロドメインポリペプチドに結合させられる。
【０１６１】
ＰＥＧ分子は、プロドメインポリペプチドにおけるいずれか位置においていずれかのＬｙｓ残基またはＣｙｓ残基に対して共有結合により結合させられる場合がある。使用することができる他のアミノ酸がＴｙｒおよびＨｉｓである。選択肢として、カルボン酸側鎖を有するアミノ酸もまた挙げられる。本明細書中に記載されるプロドメインポリペプチドは、Ｎ末端アミノ基を介してＮ末端におけるどのようなアミノ酸に対してでも直接にＰＥＧ化することができる。「リンカーアーム」が、ＰＥＧ化を容易にするためにプロドメインポリペプチドに付加される場合がある。システインのチオール側鎖におけるＰＥＧ化が広範囲に報告されている（例えば、Ｃａｌｉｃｅｔｉ＆Ｖｅｒｏｎｅｓｅ、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、５５：１２６１〜７７（２００３）を参照のこと）。システイン残基がプロドメインポリペプチドに存在しないならば、システイン残基を、置換を介して、または、システインをＮ末端アミノ酸に付加することによって導入することができる。他の選択肢には、チオールをポリペプチドに付加する試薬（例えば、トラウト試薬およびＳＡＴＡなど）が含まれる。
【０１６２】
特定の局面において、ＰＥＧ分子は分岐しており、一方、他の局面において、ＰＥＧ分子は線状である場合がある。特定の局面において、ＰＥＧ分子は分子量が１ｋＤａ〜１５０ｋＤａの間である。より具体的には、ＰＥＧ分子は分子量が１ｋＤａ〜１００ｋＤａの間である。さらなる局面において、ＰＥＧ分子は、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、３０ｋＤａ、４０ｋＤａ、５０ｋＤａおよび６０ｋＤａから選択される。
【０１６３】
プロドメインポリペプチドのＰＥＧ化のための有用な戦略が、共役連結を溶液中で形成することを介して、ペプチドおよびＰＥＧ成分（それぞれが、他方に対して相互に反応性である特別な機能性を有する）を組み合わせることからなる。プロドメインポリペプチドを本明細書中上記で記載されるような組換え手段によって容易に調製することができる。
【０１６４】
１つの実施形態によれば、ＰＥＧが、プロドメインポリペプチドへの結合に先立って「事前に活性化される」。例えば、カルボキシル末端を有するＰＥＧが、当該ＰＥＧをリシンおよびＮ末端に対してより反応性にする活性化のためにＮＨＳエステルに変換される場合がある。
【０１６５】
別の実施形態によれば、プロドメインポリペプチドが、特定の部位において、適切な官能基により「事前に活性化される」。プロドメインポリペプチドのＰＥＧとのコンジュゲート化が水相または有機共溶媒において行われる場合があり、このコンジュゲート化を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点フォーカシング（ＩＥＦ）、ＳＥＣおよび質量分析によって容易にモニターすることができる。ＰＥＧ化されたプロドメインポリペプチドがその後、精製される。小さいＰＥＧが限外ろ過によって除かれる場合がある。より大きいＰＥＧが典型的には、アニオンクロマトグラフィー、カチオンクロマトグラフィーまたはアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製される。ＰＥＧ化ポリペプチドの特徴づけが、分析的ＨＰＬＣ、アミノ酸分析、ＩＥＦ、酵素活性の分析、電気泳動、ＰＥＧ：タンパク質比の分析、レーザー脱離質量分析およびエレクトロスプレー質量分析によって行われる場合がある。
【０１６６】
過剰なフリーＰＥＧの除去が、カラム（Ｔｒｉｃｏｒｎ  Ｅｍｐｔｙ  Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｏｌｕｍｎ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に、ＰＯＲＯＳ  ５０  ＨＱ担体（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を詰め、その後で、カラムを平衡化緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２）により平衡化することによって行われる場合がある。ＰＥＧ化プロドメインが、平衡化されたカラムに負荷され、その後、カラムが５ＣＶの平衡化緩衝液により洗浄される。これらの条件のもとで、プロドメインがカラムに結合する。ＰＥＧ化プロドメインが溶出緩衝液（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．２）によって次工程において溶出される。この段階のピーク部がプールされ、短期間については２℃〜８℃で貯蔵される場合があり、または、長期間の貯蔵のために−２０℃で凍結される場合がある。
【０１６７】
本明細書中上記で述べられたように、本発明のポリヌクレオチドはまた、ポリヌクレオチドが標的細胞において翻訳される対象に直接に投与される場合がある（すなわち、遺伝子治療）。
【０１６８】
用語「遺伝子治療」は、本願で使用する場合、対象の遺伝物質（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）を宿主中に移送して、遺伝的又は後天的な病気又は症状又は表現型を治療又は予防することを意味する。その対象の遺伝物質は、生体内で産生されることが要望されている産物（例えばタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、機能性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）をコードしている。例えば、対象の遺伝物質は、治療のために価値のあるホルモン、受容体、酵素、ポリペプチド又はペプチドをコードできる。総説については、一般にテキストの「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ」（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ４０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７）を参照されたい。
【０１６９】
遺伝子治療は、二つの基本的な方法：（１）エクスビボ及び（２）生体内の遺伝子治療が発達してきた。エクスビボ遺伝子治療では、細胞を患者から取り出し、培養しながら生体外で処置する。一般に、機能性置換遺伝子が、遺伝子を送達する適切なベクター／方法（トランスフェクション、形質導入、相同組換えなど）及び必要な発現系によって細胞中に導入され、次いでその修飾された細胞を培養で増殖させて宿主／患者に戻す。これらの遺伝的に再移植された細胞は、そのトランスフェクトされた遺伝物質をその場で発現することが分かったのである。細胞は、対象に対して自己または非自己である場合がある。非自己細胞は、身体に投与されたときには免疫反応を誘導する可能性があるので、いくつかの取り組みが、非自己細胞を拒絶する可能性を軽減するために開発されている。これらには、レシピエントの免疫系を抑制すること、または、非自己細胞を移植前に、免疫隔離する半透過性膜でカプセル化することのどちらかが含まれる。
【０１７０】
生体内の遺伝子治療では、標的細胞は被験者から取り出すことなく、移送すべき遺伝物質が患者内にある患者の器官の細胞に、その場で導入される。別の実施態様では、宿主の遺伝子に欠陥がある場合、その遺伝子は、その場で修復される（Ｃｕｌｖｅｒ，１９９８．（Ａｂｓｔｒａｃｔ）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＤＮＡ  ＆  ＲＮＡ  ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １９９８，Ｃｏｒｏｎａｄｏ，ＣＡ）。
【０１７１】
これらの遺伝学的に変化させた細胞は、トランスフェクトされた遺伝物質をその場で発現することが分かった。
【０１７２】
特異性を与えるために、好ましくは、本発明のペプチドおよび／またはポリペプチドを発現させるために使用される核酸構築物は細胞特異的なプロモーター配列エレメントを含み、例えば、ガン特異的プロモーター（例えば、サバイビンプロモーター−Ｃｈｅｎ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、２００４、第１１巻（１１月１１日）、７４０頁〜７４７頁）などを含む。
【０１７３】
遺伝子治療のために、核酸は典型的には、ウイルス性作用因による感染によって細胞に導入される。これは、より大きい効率をそれらの感染性に起因して得ることができるからである。そのうえ、ウイルスは非常に特殊化されており、典型的には、特定の細胞タイプにおいて感染し、伝播する。したがって、それらの天然の特異性を、ベクターをインビボあるいは組織内または細胞の混合培養において特定の細胞タイプに対して標的化するために使用することができる。ウイルスベクターはまた、受容体媒介事象を介して標的特異性を変化させるために、特異的な受容体またはリガンドにより改変することができる。
【０１７４】
加えて、組換えウイルスベクターが、所望される核酸のインビボ発現のために有用である。これは、組換えウイルスベクターにより、側方感染および標的化特異性などの利点がもたらされるからである。側方感染は、例えば、レトロウイルスの生活環において固有的であり、１個の感染細胞が、出芽し、周りの細胞に感染する多くの子孫ビリオンを生じさせるプロセスである。その結果が、ほとんどが元のウイルス粒子によって最初に感染しなかった大きな面積が迅速に感染することである。これは、感染性病原体が娘子孫を介してのみ広がる垂直型の感染とは対照的である。側方に広がることができないウイルスベクターもまた作製することができる。所望される目的が、指定の遺伝子を局在化した数の標的化された細胞だけに導入することであるならば、この特徴は有用であり得る。
【０１７５】
実施例１において例示されるように、本発明者らは、本発明のＴＡＣＥプロドメインが、過敏性腸疾患を処置するために使用され得ることを示している。
【０１７６】
過敏性腸疾患（ＩＢＤ）は、頻度が増大し、患者を無能力化することがある腸の炎症および組織リモデリングによって特徴づけられる重篤な胃腸障害である。ＩＢＤの主要の形態、すなわち、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病は、腹部の痛み、下痢、直腸出血および発熱によって臨床的に特徴づけられる慢性の再発する状態である。
【０１７７】
本発明者らは、ＴＡＣＥプロドメインが、他の炎症性障害を処置するために使用されることがあることを意図する。
【０１７８】
したがって、本発明の別の局面によれば、炎症性疾患を処置する方法であって、ＴＮＦ−α変換酵素（ＴＡＣＥ）のプロドメインを含むポリペプチドで、前記ＴＡＣＥの触媒ドメインを欠き、かつ、該ポリペプチドをフリン分解に対して抵抗性にする、Ｒ５８における改変を含み、かつ、ＴＡＣＥの活性をダウンレギュレーションすることができるポリペプチドの治療効果的な量を対象に投与し、それにより、前記炎症性疾患を処置することを含む方法が提供される。
【０１７９】
本発明による好ましい個々の対象が、動物、例えば、哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウマ、ウシ、霊長類）などであり、好ましくはヒトである。
【０１８０】
下記は、本発明者らが、本明細書中に記載されるプロドメインにより処置することを意図する炎症性疾患の列挙である。
【０１８１】
炎症性疾患−この疾患としては、慢性の炎症性疾患および急性の炎症性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８２】
過敏症に関連する炎症性疾患
過敏症の例としては、Ｉ型過敏症、ＩＩ型過敏症、ＩＩＩ型過敏症、ＩＶ型過敏症、即時過敏症、抗体媒介過敏症、免疫複合体媒介過敏症、Ｔリンパ球媒介過敏症およびＤＴＨが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８３】
Ｉ型過敏症または即時過敏症、例えば、喘息など。
【０１８４】
ＩＩ型過敏症としては、リウマチ様疾患、リウマチ様自己免疫疾患、慢性関節リウマチ（Ｋｒｅｎｎ  Ｖ．ら、Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  ２０００  Ｊｕｌ；１５（３）：７９１）、脊椎炎、強直性脊椎炎（Ｊａｎ  Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  ２００１；３（３）：１８９）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ  Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  １９９８；１７（１−２）：４９）、硬化症、全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ  Ｙ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  Ｍａｒ；６（２）：１５６）；Ｃｈａｎ  ＯＴ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９９９  Ｊｕｎ；１６９：１０７）、腺疾患、腺の自己免疫疾患、膵臓の自己免疫疾患、糖尿病、Ｉ型糖尿病（Ｚｉｍｍｅｔ  Ｐ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  １９９６  Ｏｃｔ；３４  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ  Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ２０００  Ｊｕｎ；２９（２）：３３９）、甲状腺炎、自発性自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ  Ｈ．およびＹｕ  Ｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｄｅｃ  １５；１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ  Ｎ．ら、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  １９９９  Ａｕｇ；５７（８）：１８１０）、粘液水腫、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ  Ｔ．Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ．１９９９  Ａｕｇ；５７（８）：１７５９）、自己免疫性生殖疾患、卵巣疾患、卵巣の自己免疫性（Ｇａｒｚａ  ＫＭ．ら、Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８  Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ  ＡＢ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｍａｒ；４３（３）：１３４）、反復した胎児消失（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７−９）、神経変性疾患、神経学的疾患、神経学的自己免疫疾患、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ  ＡＨ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１  Ｊａｎ  １；１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ  Ｌ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ．１９９７；４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ  ＡＪ．およびＫｒａｉｇ  Ｅ、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；１８（１−２）：８３）、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ＡＪ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００  Ｍａｙ；７（３）：１９１）、ギラン・バレー症候群、神経障害および自己免疫性神経障害（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ  Ｓ．、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２０００  Ａｐｒ；３１９（４）：２３４）、筋無力症疾患、ランバード・イートン筋無力症症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ  Ｍ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２０００  Ａｐｒ；３１９（４）：２０４）、腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮症、腫瘍随伴性小脳萎縮症、腫瘍非随伴性スティッフマン症候群、小脳萎縮症、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群、多発性内分泌腺症、自己免疫性多発性内分泌腺症���Ａｎｔｏｉｎｅ  ＪＣ．およびＨｏｎｎｏｒａｔ  Ｊ．Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）２０００  Ｊａｎ；１５６（１）：２３）、神経障害、異常免疫性神経障害（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ  Ｅ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｕｐｐｌ  １９９９；５０：４１９）；ニューロミオトニー、後天性ニューロミオトニー、先天性多発性関節拘縮症（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａ．ら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９８  Ｍａｙ  １３；８４１：４８２）、心臓血管疾患、心臓血管の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｅ．ら、Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ  Ｏ．Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７−９）、肉芽腫症、ヴェーゲナー肉芽腫症、動脈炎、高安動脈炎および川崎症候群（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ  Ｓ．ら、Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  ２０００  Ａｕｇ  ２５；１１２（１５−１６）：６６０）；抗第ＶＩＩＩ因子の自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ  Ｓ．ら、Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．２０００；２６（２）：１５７）；血管炎、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、糸球体腎炎、少免疫性巣状壊死性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ  ＬＨ．Ａｎｎ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）．２０００  Ｍａｙ；１５１（３）：１７８）；抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ  Ｒ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ、１９９９；１４（４）：１７１）；心不全、心不全におけるアゴニスト様β−アドレナリン作動性受容体抗体（Ｗａｌｌｕｋａｔ  Ｇ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ、１９９９  Ｊｕｎ  １７；８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑病（Ｍｏｃｃｉａ  Ｆ．Ａｎｎ  Ｉｔａｌ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔ．１９９９  Ａｐｒ−Ｊｕｎ；１４（２）：１１４）；溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ  ＤＧ．ら、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  １９９８  Ｊａｎ；２８（３−４）：２８５）、胃腸疾患、胃腸管の自己免疫疾患、腸疾患、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ  Ｈｅｒｏｌａ  Ａ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２０００  Ｊａｎ；２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ  ＹＥ．およびＳｈｏｅｎｆｅｌｄ  Ｙ．Ｈａｒｅｆｕａｈ  ２０００  Ｊａｎ  １６；１３８（２）：１２２）、筋組織の自己免疫疾患、筋炎、自己免疫性筋炎、シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ  Ｅ．ら、Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｓｅｐ；１２３（１）：９２）；平滑筋の自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ  Ｄ．ら、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  １９９９  Ｊｕｎ；５３（５−６）：２３４）、肝疾患、肝臓の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ  ＭＰ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２０００  Ａｕｇ；３３（２）：３２６）および原発性胆汁性肝硬変（Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ  ＣＰ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、１９９９  Ｊｕｎ；１１（６）：５９５）��挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８５】
ＩＶ型過敏症またはＴ細胞媒介過敏症としては、リウマチ様疾患、慢性関節リウマチ（Ｔｉｓｃｈ  Ｒ、ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ＨＯ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９４  Ｊａｎ  １８；９１（２）：４３７）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（Ｄａｔｔａ  ＳＫ．、Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７（９）：５９１）、腺疾患、腺の自己免疫疾患、膵臓疾患、膵臓の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ  Ｌ．およびＥｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ＧＳ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６４７）、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Ｓａｋａｔａ  Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １９９３  Ｍａｒ；９２（１）：７７）、卵巣疾患（Ｇａｒｚａ  ＫＭ．ら、Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８  Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、前立腺炎、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＲＢ．ら、Ｕｒｏｌｏｇｙ、１９９７  Ｄｅｃ；５０（６）：８９３）、多腺性症候群、自己免疫性多腺性症候群、Ｉ型自己免疫性多腺性症候群（Ｈａｒａ  Ｔ．ら、Ｂｌｏｏｄ、１９９１  Ｍａｒ  １；７７（５）：１１２７）、神経学的疾患、自己免疫性神経学的疾患、多発性硬化症、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ  Ｍ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１９９４  Ｍａｙ；５７（５）：５４４）、重症筋無力症（Ｏｓｈｉｍａ  Ｍ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９０  Ｄｅｃ；２０（１２）：２５６３）、スティッフマン症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ＨＳ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００１  Ｍａｒ  ２７；９８（７）：３９８８）、心臓血管疾患、シャガス病における心臓の自己免疫性（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ  Ｅ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９６  Ｏｃｔ  １５；９８（８）：１７０９）、自己免疫性血小板減少性紫斑病（Ｓｅｍｐｌｅ  ＪＷ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １９９６  Ｍａｙ  １５；８７（１０）：４２４５）、抗ヘルパーＴリンパ球自己免疫性（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ  ＡＰ．ら、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８；１１（１）：９）、溶血性貧血（Ｓａｌｌａｈ  Ｓ．ら、Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、１９９７  Ｍａｒ；７４（３）：１３９）、肝疾患、肝臓の自己免疫疾患、肝炎、慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ  Ａ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  １９９０  Ｍａｒ；５４（３）：３８２）、胆汁性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ  ＤＥ．、Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）１９９６  Ｎｏｖ；９１（５）：５５１）、腎疾患、腎臓の自己免疫疾患、腎炎、間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ  ＣＪ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １９９０  Ａｕｇ；１（２）：１４０）、結合組織疾患、耳疾患、自己免疫性結合組織疾患、自己免疫性耳疾患（Ｙｏｏ  ＴＪ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９４  Ａｕｇ；１５７（１）：２４９）、内耳の疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ  Ｂ．ら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９９７  Ｄｅｃ  ２９；８３０：２６６）、皮膚疾患、皮膚病、真皮の疾患、水疱性皮膚疾患、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡および落葉状天疱瘡が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８６】
遅発型過敏症の例としては、接触性皮膚炎および薬疹が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８７】
Ｔリンパ球媒介過敏症型の例としては、ヘルパーＴリンパ球および細胞障害性Ｔリンパ球が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８８】
ヘルパーＴリンパ球媒介過敏症の例としては、Ｔｈ１リンパ球媒介過敏症およびＴｈ２リンパ球媒介過敏症が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８９】
自己免疫疾患
自己免疫疾患としては、心臓血管疾患、リウマチ様疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝疾患、神経学的疾患、筋疾患、腎疾患、生殖関連疾患、結合組織疾患および全身性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
自己免疫性による心臓血管疾患の例としては、アテローム性動脈硬化（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｅ．ら、Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ  Ｏ．Ｌｕｐｕｓ．１９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７〜９）、ヴェーゲナー肉芽腫症、高安動脈炎および川崎症候群（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ  Ｓ．ら、Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ  ２０００  Ａｕｇ  ２５；１１２（１５−１６）：６６０）、抗第ＶＩＩＩ因子による自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ  Ｓ．ら、Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ．２０００；２６（２）：１５７）、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、少免疫性巣状壊死性糸球体腎炎および半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ  ＬＨ．Ａｎｎ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）．２０００  Ｍａｙ；１５１（３）：１７８）、抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ  Ｒ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  １９９９；１４（４）：１７１）、抗体誘導の心不全（Ｗａｌｌｕｋａｔ  Ｇ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ．１９９９  Ｊｕｎ  １７；８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑病（Ｍｏｃｃｉａ  Ｆ．Ａｎｎ  Ｉｔａｌ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔ．１９９９  Ａｐｒ−Ｊｕｎ；１４（２）：１１４；Ｓｅｍｐｌｅ  ＪＷ．ら、Ｂｌｏｏｄ  １９９６  Ｍａｙ  １５；８７（１０）：４２４５）、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ  ＤＧ．ら、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  １９９８  Ｊａｎ；２８（３−４）：２８５；Ｓａｌｌａｈ  Ｓ．ら、Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  １９９７  Ｍａｒ；７４（３）：１３９）、シャガス病における心臓の自己免疫性（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ  Ｅ．ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９６  Ｏｃｔ  １５；９８（８）：１７０９）、および、抗ヘルパーＴリンパ球による自己免疫性（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ  ＡＰ．ら、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８；１１（１）：９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９１】
自己免疫によるリウマチ様疾患の例としては、慢性関節リウマチ（Ｋｒｅｎｎ  Ｖ．ら、Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  ２０００  Ｊｕｌ；１５（３）：７９１；Ｔｉｓｃｈ  Ｒ、ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ＨＯ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ｕｎｉｔｓ  Ｓ  Ａ  １９９４  Ｊａｎ  １８；９１（２）：４３７）および強直性脊椎炎（Ｊａｎ  Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  ２００１；３（３）：１８９）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９２】
自己免疫による腺疾患の例としては、膵臓疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーヴス病、甲状腺炎、突発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣の自己免疫性、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎およびＩ型自己免疫性多腺性症候群が挙げられるが、これらに限定されない。自己免疫疾患としては、膵臓の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ  Ｌ．およびＥｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ＧＳ．Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：６４７；Ｚｉｍｍｅｔ  Ｐ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  １９９６  Ｏｃｔ；３４  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴス病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ  Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ２０００  Ｊｕｎ；２９（２）：３３９；Ｓａｋａｔａ  Ｓ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  １９９３  Ｍａｒ；９２（１）：７７）、突発性自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ  Ｈ．およびＹｕ  Ｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｄｅｃ  １５；１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ  Ｎ．ら、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  １９９９  Ａｕｇ；５７（８）：１８１０）、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ  Ｔ．Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ．１９９９  Ａｕｇ；５７（８）：１７５９）、卵巣の自己免疫性（Ｇａｒｚａ  ＫＭ．ら、Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９８  Ｆｅｂ；３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ  ＡＢ．ら、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００  Ｍａｒ；４３（３）：１３４）、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＲＢ．ら、Ｕｒｏｌｏｇｙ  １９９７  Ｄｅｃ；５０（６）：８９３）およびＩ型自己免疫性多腺性症候群（Ｈａｒａ  Ｔ．ら、Ｂｌｏｏｄ．１９９１  Ｍａｒ  １；７７（５）：１１２７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９３】
自己免疫による胃腸疾患の例には、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ  Ｈｅｒｏｌａ  Ａ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２０００  Ｊａｎ；２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ  ＹＥ．およびＳｈｏｅｎｆｅｌｄ  Ｙ．Ｈａｒｅｆｕａｈ  ２０００  Ｊａｎ  １６；１３８（２）：１２２）、大腸炎、回腸炎およびクローン病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９４】
自己免疫による皮膚疾患の例としては、自己免疫による水疱性の皮膚疾患（例えば、尋常性天疱瘡、水疱性天疱瘡および落葉状天疱瘡など、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９５】
自己免疫による肝疾患の例としては、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ  Ａ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ  １９９０  Ｍａｒ；５４（３）：３８２）、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ  ＤＥ．Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）  １９９６  Ｎｏｖ；９１（５）：５５１；Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ  ＣＰ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９９  Ｊｕｎ；１１（６）：５９５）および自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ  ＭＰ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ２０００  Ａｕｇ；３３（２）：３２６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９６】
自己免疫による神経学的疾患の例としては、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ  ＡＨ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ  ２００１  Ｊａｎ  １；１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ  Ｌ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ．１９９７；４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ  ＡＪ．およびＫｒａｉｇ  Ｅ、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９９；１８（１−２）：８３；Ｏｓｈｉｍａ  Ｍ．ら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９０  Ｄｅｃ；２０（１２）：２５６３）、神経障害、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ＡＪ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２０００  Ｍａｙ；７（３）：１９１）；ギラン・バレー症候群および自己免疫性神経障害（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ  Ｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２０００  Ａｐｒ；３１９（４）：２３４）、筋無力症、ランバード・イートン筋無力症症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ  Ｍ．Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．２０００  Ａｐｒ；３１９（４）：２０４）；腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮症、腫瘍随伴性の小脳萎縮症およびスティッフマン症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ＨＳ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ｕｎｉｔｓ  Ｓ  Ａ  ２００１  Ｍａｒ  ２７；９８（７）：３９８８）；腫瘍非随伴性スティッフマン症候群、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群および自己免疫性多発性内分泌腺症（Ａｎｔｏｉｎｅ  ＪＣ．およびＨｏｎｎｏｒａｔ  Ｊ．Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）２０００  Ｊａｎ；１５６（１）：２３）；異常免疫による神経障害（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ  Ｅ．ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｕｐｐｌ  １９９９；５０：４１９）；後天性ニューロミオトニー、先天性多発性関節拘縮症（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａ．ら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．１９９８  Ｍａｙ  １３；８４１：４８２）、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ  Ｍ．ら、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  １９９４  Ｍａｙ；５７（５）：５４４）および神経変性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９７】
自己免疫による筋疾患の例としては、筋炎、自己免疫性筋炎および原発性シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ  Ｅ．ら、Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０００  Ｓｅｐ；１２３（１）：９２）、および、平滑筋の自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ  Ｄ．ら、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  １９９９  Ｊｕｎ；５３（５−６）：２３４）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９８】
自己免疫による腎疾患の例としては、腎炎、および、自己免疫性間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ  ＣＪ．Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  １９９０  Ａｕｇ；１（２）：１４０）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
生殖に関連する自己免疫疾患の例としては、反復した胎児消失（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ．ら、Ｌｕｐｕｓ  １９９８；７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７〜９）が挙げられるが、これに限定されない。
【０２００】
自己免疫による結合組織疾患の例としては、耳の疾患、自己免疫による耳の疾患（Ｙｏｏ  ＴＪ．ら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９９４  Ａｕｇ；１５７（１）：２４９）、および、内耳の自己免疫疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ  Ｂ．ら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １９９７  Ｄｅｃ  ２９；８３０：２６６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０１】
自己免疫全身性疾患の例としては、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ  Ｊ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  １９９８；１７（１−２）：４９）および全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ  Ｙ．ら、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９  Ｍａｒ；６（２）：１５６；Ｃｈａｎ  ＯＴ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １９９９  Ｊｕｎ；１６９：１０７）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０２】
感染性疾患
感染性疾患の例としては、慢性の感染性疾患、亜急性の感染性疾患、急性の感染性疾患、ウイルス疾患、細菌疾患、原虫疾患、寄生虫疾患、真菌疾患、マイコプラズマ疾患およびプリオン疾患が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０３】
移植片拒絶疾患
移植片の移植に関連する疾患の例としては、移植片拒絶、慢性の移植片拒絶、亜急性の移植片拒絶、超急性の移植片拒絶、急性の移植片拒絶および移植片対宿主病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０４】
アレルギー性疾患
アレルギー性疾患の例としては、喘息、皮疹、じんま疹、花粉アレルギー、ほこり・ダニアレルギー、毒液アレルギー、化粧品アレルギー、ラテックスアレルギー、化学物質アレルギー、薬物アレルギー、昆虫咬傷アレルギー、動物鱗屑アレルギー、刺毛植物アレルギー、ツタウルシアレルギーおよび食物アレルギーが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０５】
癌性疾患
癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。癌性疾患の具体的な例としては、骨髄性白血病、例えば、慢性骨髄性白血病、成熟に伴う急性骨髄性白血病、急性前骨髄球性白血病、増大した好塩基球を伴う急性非リンパ球性白血病、急性単球性白血球、好酸球増加症を伴う急性骨髄単球性白血病など；悪性リンパ腫、例えば、バーキットリンパ腫、非ホジキンリンパ腫など；リンパ性白血病、例えば、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病など；骨髄増殖性疾患、例えば、固形腫瘍、良性髄膜腫、唾液腺の混合腫瘍、慢性腺腫など；腺癌、例えば、小細胞肺癌、腎臓癌、子宮癌、前立腺癌、膀胱癌、卵巣癌、結腸癌、肉腫、脂肪肉腫、粘液様肉腫、滑膜肉腫、横紋筋肉腫（肺胞）、骨外性粘液様軟骨肉腫、ユーイング肉腫などが挙げられ、他の癌には、精巣および卵巣の未分化胚細胞腫、網膜芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、悪性メラノーマ、中皮腫、乳癌、前立腺癌および卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０６】
本明細書中に記載されるプロドメインにより処置されることがあるさらなる意図される疾患には、下記の疾患が含まれる：急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管性浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性じんま疹、軸索性＆ニューロン性のニューロパチー、バロー病、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多巣性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、クレスト病、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状狼瘡、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性食道炎、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維筋痛症、線維性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、巨細胞性心筋炎、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）（以前はヴェーゲナー肉芽腫症と呼ばれた）、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、間質性膀胱炎、若年性関節炎、若年性糖尿病（１型糖尿病）、若年性筋炎、川崎症候群、ランバート・イートン症候群、白血球破壊性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質性結膜炎、線状ＩｇＡ病（ＬＡＤ）、狼瘡（ＳＬＥ）、ライム病、慢性メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーベルマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック）、好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（溶連菌に関連した小児自己免疫性精神神経障害）、腫瘍随伴性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、パリー・ロンベルク症候群、パーソネージ・ターナー症候群、扁平部炎（周辺部ブドウ膜炎）、天疱瘡、末梢神経障害、静脈周囲脳脊髄炎、悪性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型＆ＩＩＩ型の自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球ろう、レイノー現象、反応性関節炎、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子＆精巣の自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、１型糖尿病、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、小胞水疱性皮膚症、白斑、ヴェーゲナー肉芽腫症（現在では多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）と呼ばれる）。
【０２０７】
本発明のＴＡＣＥプロドメインまたは該ＴＡＣＥプロドメインをコードする発現構築物は、処置されている対象（すなわち、哺乳動物）にそれ自体で（例えば、精製されて、または、発現系の一部として直接に）与えることができ、または、本発明のＴＡＣＥプロドメインを含む医薬組成物において与えることができる。本明細書中で使用される場合、「医薬組成物」は、１つまたは複数の本明細書中に記載される有効成分と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適な担体および賦形剤など）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、化合物の生物への投与を容易にすることである。
【０２０８】
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、生物学的効果を説明することができる本発明の組換えＴＡＣＥプロドメイン（またはそれをコードするポリヌクレオチド）を示す。
【０２０９】
本明細書中以降、表現「生理学的に許容され得る担体」および表現「医薬的に許容され得る担体」は、交換可能に使用され得るが、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された化合物の生物学的な活性および性質を妨げない担体または希釈剤を示す。アジュバントはこれらの表現に包含される。
【０２１０】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例としては、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが挙げられる。
【０２１１】
薬物の配合および投与のための技術が「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）に見出されることができ、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０２１２】
好適な投与抹消経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達、特に経鼻送達、腸管送達、または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれることができる。
【０２１３】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られているプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥のプロセスによって製造されることができる。
【０２１４】
従って、本発明に従って使用される医薬組成物は、医薬品として使用されることができる調製物への有効成分の加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容され得る担体を使用して従来の様式で配合されることできる。適正な配合は、選ばれた投与経路に依存する。
【０２１５】
注射の場合、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合しうる緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な食塩緩衝液など）において配合されることができる。経粘膜投与の場合、浸透されるバリヤーに対して適切な浸透剤が配合において使用される。そのような浸透剤はこの分野では一般に知られている。
【０２１６】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性化合物をこの分野でよく知られている医薬的に許容され得る担体と組み合わせることによって容易に配合されることができる。そのような担体は、医薬組成物が、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤および懸濁物などとして配合されることを可能にする。経口使用される薬理学的調製物は、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、錠剤または糖衣錠コアを得るために、望ましい好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製されることができる。好適な賦形剤は、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に許容され得るポリマーである。もし望むなら、架橋されたポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤が加えられることができる。
【０２１７】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液、および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。色素または顔料は、活性化合物の量を明らかにするために、または活性化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに加えられることができる。
【０２１８】
経口使用されうる医薬組成物としては、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびに、ゼラチンおよび可塑剤（例えば、グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟いシールされたカプセルが挙げられる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（例えば、ラクトースなど）、結合剤（例えば、デンプンなど）、滑剤（例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）、および場合により安定化剤との混合で有効成分を含有することができる。軟カプセルでは、有効成分は、好適な液体（例えば、脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁されることができる。さらに、安定化剤が加えられることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路について好適な投薬形態でなければならない。
【０２１９】
口内投与の場合、組成物は、従来の方法で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０２２０】
鼻吸入による投与の場合、本発明による使用のための有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投与量は、計量された量を送達するためのバルブを備えることによって決定されることができる。ディスペンサーにおいて使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジは、化合物および好適な粉末基剤（例えば、ラクトースまたはデンプンなど）の粉末混合物を含有して配合されることができる。
【０２２１】
本明細書中に記載される医薬組成物は、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与のために配合されることができる。注射用配合物は、場合により保存剤が添加された、例えば、アンプルまたは多回用量容器における単位投薬形態で提供されることができる。組成物は、油性ビヒクルまたは水性ビヒクルにおける懸濁物または溶液剤またはエマルションにすることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散化剤などの配合剤を含有することができる。
【０２２２】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態の活性調製物の水溶液が含まれる。さらに、有効成分の懸濁物は、適切な油性または水性の注射用懸濁物として調製されることができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油（例えば、ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（例えば、オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが挙げられる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有することができる。場合により、懸濁物はまた、高濃度溶液の調製を可能にするために、有効成分の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有することができる。
【０２２３】
あるいは、有効成分は、好適なビヒクル（例えば、無菌の、パイロジェン不含水溶液）を使用前に用いて構成される粉末形態であることができる。
【０２２４】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合されることができる。
【０２２５】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物として、有効成分が、その意図された目的を達成するために有効な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、「治療有効量」は、処置されている対象の障害（例えば、虚血）の症状を予防、緩和あるいは改善するために効果的であるか、または、処置されている対象の生存を延ばすために効果的である、有効成分（核酸構築物）の量を意味する。
【０２２６】
治療有効量の決定は、特に本明細書中に与えられた詳細な開示に鑑みて、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０２２７】
本発明の方法において使用されるいかなる調製物についても、投与量または治療有効量は、生体外および細胞培養アッセイから最初に推定されることができる。例えば、投与量は、所望の濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて決定されることができ、そのような情報は、ヒトにおける有用な投与量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０２２８】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、生体外、細胞培養物、または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定されることができる。これらの生体外、細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投与量範囲を定めるために使用されることができる。投与量は、用いられる投薬形態および利用される投与経路に依存して変化しうる。正確な配合、投与経路および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択されることができる（例えば、Ｆｉｎｇｌら、（１９７５）「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ．１  ｐ．１を参照のこと）。
【０２２９】
投薬量および投薬間隔を、生物学的な効果を誘導または抑制するために十分である活性な成分の血漿または脳中レベル（これは最小有効濃度（ＭＥＣ）と呼ばれる）を提供するために個々に調節することができる。ＭＥＣはそれぞれの調製物について変化するが、インビトロデータから推定することができる。ＭＥＣを達成するために必要な投薬量は個々の特性および投与経路に依存する。検出アッセイを使用して、血漿中濃度を求めることができる。
【０２３０】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は、単回または複数回投与で行われることができ、この場合、処置期間は、数日から数週間まで、または治療が達成されるまで、または疾患状態の軽減が達成されるまで続く。
【０２３１】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、処方医の判断などに依存するだろう。
【０２３２】
本発明の組成物は、所望されるならば、有効成分を含有する１つまたは複数の単位投薬形態物を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス（例えば、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）承認キットなど）で提供され得る。パックは、例えば、金属ホイルまたはプラスチックホイルを含むことができる（例えば、ブリスターパック）。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が付随し得る。パックまたはディスペンサーデバイスはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局によって定められた形式で、容器に関連した通知によって適応させることがあり、この場合、そのような通知は、組成物の形態、あるいはヒトまたは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物について米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されたラベル書きであり得るか、または、承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用担体に配合された本発明の調製物を含む組成物もまた、上でさらに詳述されたように、示された症状を処置するために調製され、適切な容器に入れられ、かつ標識され得る。
【０２３３】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を示す。
【０２３４】
用語「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、およびそれらの同根語は、「含むが、それらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２３５】
用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、「含み、それらに限定される（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」ことを意味する。
【０２３６】
表現「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、さらなる成分、工程および／または部分が、主張される組成物、方法または構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にだけ、組成物、方法または構造がさらなる成分、工程および／または部分を含み得ることを意味する。
【０２３７】
本明細書中で使用される用語「方法（ｍｅｔｈｏｄ）」は、所与の課題を達成するための様式、手段、技術および手順を示し、これには、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者に知られているそのような様式、手段、技術および手順、または、知られている様式、手段、技術および手順から、化学、薬理学、生物学、生化学および医学の技術分野の実施者によって容易に開発されるそのような様式、手段、技術および手順が含まれるが、それらに限定されない。
【０２３８】
本明細書で使用される場合、用語「治療する／処置する」には、状態の進行を取り消すこと、実質的に阻害すること、遅くすること、または、逆向きにすること、状態の臨床的症状または審美的症状を実質的に改善すること、あるいは、状態の臨床的症状または審美的症状の出現を実質的に防止することが含まれる。
【０２３９】
明確にするため別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴が、単一の実施形態に組み合わせて提供されることもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで、あるいは本発明の他の記載される実施形態において好適なように提供することもできる。種々の実施形態の文脈において記載される特定の特徴は、その実施形態がそれらの要素なしに動作不能である場合を除いては、それらの実施形態の不可欠な特徴であると見なされるべきではない。
【０２４０】
本明細書中上記に描かれるような、および、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０２４１】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０２４２】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技術は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編（１９９４）；Ａｕｓｕｂｅｌら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、米国メリーランド州バルチモア（１９８９）；Ｐｅｒｂａｌ「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、米国ニューヨーク（１９８８）；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８）；米国特許の第４６６６８２８号、同第４６８３２０２号、同第４８０１５３１号、同第５１９２６５９号および同第５２７２０５７号に記載される方法；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ」、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）、第３版；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０）；利用可能な免疫アッセイ法は、特許と科学文献に広範囲にわたって記載されており、例えば：米国特許の第３７９１９３２号、同第３８３９１５３号、同第３８５０７５２号、同第３８５０５７８号、同第３８５３９８７号、同第３８６７５１７号、同第３８７９２６２号、同第３９０１６５４号、同第３９３５０７４号、同第３９８４５３３号、同第３９９６３４５号、同第４０３４０７４号、同第４０９８８７６号、同第４８７９２１９号、同第５０１１７７１号および同第５２８１５２１号；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編（１９８４）；「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８５）；「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」Ｈａｍｅｓ，Ｂ．���．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編（１９８４）；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編（１９８６）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６）；「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．（１９８４）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０）；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９６）；これらの文献の全ては、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その他の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。それらの文献に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらの文献に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０２４３】
炎症性腸疾患モデルにおけるＴＡＣＥプロドメインの治療効果
材料および方法
ＴＡＣＥプロドメイン構築物
ｐＥＴ２８  ＴＡＣＥプロドメインの構築を、触媒ドメインをｐＥＴ２８  ｐｒｏ−ｃａｔ  ＴＡＣＥ構築物から除くことによって行った。ｐＥＴ２８  ｐｒｏ−ｃａｔは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるコドン使用頻度のために作製される合成遺伝子である。これを、下記のプライマーを用いてｐＥＴ２８−ＴｅｖＨのＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩにクローン化した：
ｓＴＡＣＥＫｐｎＩＦ−ＴＣＡＣＧＧＴＡＣＣＧＡＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＧＣＣＣＧ（配列番号１）
ｓＴＡＣＥＢａｍＨＩＲ−ＧＣＴＣＧＧＡＴＣＣＴＣＡＡＡＣＴＴＴＧＴＴＧＣＴＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＡ（配列番号２）
【０２４４】
触媒ドメインの除去を、下記の２つのプライマーを使用してインバースＰＣＲによって行った：
ＤｅｌＣａｔＦ−ＴＧＡＧＧＡＴＣＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＴＣＣＧ（５’がリン酸化される；配列番号３）
ＤｅｌＣａｔＲ−ＡＣＧＴＴＴＣＡＣＡＣＧＡＴＧＣＡＣＣＡＧＴＴＣ（配列番号４）。
【０２４５】
反応およびＤｐｎＩ処理の後、線状のＰＣＲ生成物を形質転換に先立って連結した。プロＴＡＣＥの配列は配列番号５に示される通りである。
【０２４６】
ＴＡＣＥプロドメインの発現および精製
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）のエレクトロコンピテント細胞を、対応するＴＡＣＥプロドメインプラスミドにより形質転換し、３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有するＬＢ平板に置床した。３７℃での一晩のインキュベーションの後、細胞を３０μｇ／ｍｌのカナマイシンとともに１リットルのＬＢに再懸濁した。細胞を３７℃で成長させ、０．６の光学密度で２００μＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドにより誘導し、１５℃での一晩の誘導の後で集めた。細胞ペレットを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、０．１ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、１μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅおよび１錠の阻害剤プロテアーゼカクテルとともに再懸濁し、その後、細胞ペレットを超音波処理し、４℃で４５分間、１５０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を５ｍｌのＮｉ＋２カラムに加えた。カラムを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２０ｍＭイミダゾールにより洗浄した。タンパク質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２５０ｍＭイミダゾールにより溶出した。溶出されたタンパク質を、４℃で一晩、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）に対して透析し、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰカラムに加えた。カラムを、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）により洗浄し、溶出を、１ＭのＮａＣｌを含有する同じ緩衝液に対するグラジエントを用いて行った。分画物を集め、１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおいて分析した。ＴＡＣＥプロドメインを含有する画分を、１００００のＭＷカットオフを有するＶｉｖａｓｐｉｎによって濃縮して、所望される濃度にした。この構築物におけるプロドメインの発現は、以前の報告［Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｐ．Ｅ．他、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００４、２７９（３０）：ｐ．３１６３８〜４５；Ｌｉ他、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ、２００９（１２月）、１０（１２）：５４４２〜５４５４］（この場合、発現が封入体において行われ、続いて、リフォールディング工程が行われた）とは対照的に、生来的な可溶性形態である。リフォールディングされたＴＡＣＥプロドメインの以前の変化体は、リフォールディング後、０．０９〜０．１４ｍｇ／ｍｌよりも高い濃度で存在することができず、これに対して、この可溶性プロドメインは動物研究目的のためのより高い濃度に濃縮することができた。
【０２４７】
活性アッセイ、ＴＡＣＥプロドメインによる阻害
触媒活性を、増大する蛍光強度を放射＝３４０および励起＝４００においてモニターして、３７℃で、ＴＡＣＥの触媒ドメインによる蛍光発生基質（Ｍｃａ−ＰＬＡＧＡＶ−Ｄｐａ−ＲＳＳＳＲ）の加水分解プロセシング、ならびに、ＭＭＰ９、ＭＭＰ７およびＭＴ１−ＭＭＰの触媒ドメインによる蛍光発生基質（Ｍｃａ−ＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ）の加水分解プロセシングによって試験した。反応を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５μＭ  ＺｎＣｌ２および０．０５％Ｂｒｉｊ−３５を含有する蛍光発生緩衝液において行い、酵素濃度は下記の通りであった：１０ｎＭのＴＡＣＥ、１ｎＭのＭＭＰ９、１０ｎＭのＭＭＰ７および５ｎＭのＭＴ１−ＭＭＰ。ＴＡＣＥプロドメインによる阻害アッセイを、３７℃での３０分間のプレインキュベーションの後、プロドメインの上昇する濃度で行った。
【０２４８】
細胞型アッセイにおける阻害
初代マクロファージをＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるチオグリコラート注射の４日後の腹膜から抽出し、９６ウエルにおいてウエルあたり５００００個の細胞を、血清を含まないＤＭＥＭにおいて播種した。細胞をＤＭＥＭ培地において１００ｎｇのＬＰＳおよび種々の濃度のＴＡＣＥプロドメインまたは２０ｍＭのＴＡＰＩとともに３時間インキュベーションし、ＴＮＦ−αをＴｈｅｒｍｏマウスＴＮＦ−αＥＬＩＳＡキットにより測定した。ヒトＴＮＦ−αにより安定的にトランスフェクションされた１０００個のＣＨＯ細胞を９６ウエルにおいて一晩播種し、述べられた濃度のＴＡＣＥプロドメインおよびＴＡＰＩと２時間にわたってプレインキュベーションし、その後、培地を洗い流し、同じ物質を含有する新鮮な培地により取り換えた。培地を４時間後に集め、ＴＮＦ−αをＴｈｅｒｍｏヒトＴＮＦ−αＥＬＩＳＡキットにより測定した。
【０２４９】
ＴＮＢＳ大腸炎の誘導およびＴＡＣＥプロドメインによる処置
ＴＮＢＳ大腸炎を、記載の通り［２］、メスのｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢〜１０週齢）において誘導し、コントロールのマウスは５０％エタノールだけを受けた。ＴＡＣＥプロドメインを、０日目から開始して、１ｍｇ／ｋｇおよび４ｍｇ／ｋｇで７日間にわたって毎日、静脈内注射した（ＴＮＢＳ投与）。陰性コントロールとして、マウスをビヒクルＰＢＳにより処置し、陽性コントロールをＤｅｘａにより処置した。それぞれの処置群が１０匹のマウスを含有した。ＴＮＢＳ投与後７日での全体的な結腸損傷の肉眼的スコアづけをＲｅｕｔｅｒ他［３］に従って盲検様式で採点した。顕微鏡的スコアづけ：結腸の近位部分、中間部分および遠位部分を１０％リン酸塩緩衝化ホルマリンにおいて固定処理した。パラフィン包埋切片をヘマトキシリンおよびエオシンにより染色した。組織学的損傷および炎症の程度をＥｌｓｏｎ他［４］に従って盲検様式で採点した。すべての動物研究がＷｅｉｚｍａｎｎ動物管理使用委員会によって承認された。
【０２５０】
新鮮な組織の光学的画像化
ＴＡＣＥプロドメインを、製造者の説明書に従って、ＡｎａＴａｇ  Ｈｉｌｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０（ＡｎａＳｐｅｃ）にコンジュゲート化した。ＴＮＢＳ大腸炎が誘導されたマウスに、１．５ｎｍｏｌのＴＡＣＥプロドメイン−ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０（マウスあたり４．５ｎｍｏｌ相当のＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０）または４．５ｎｍｏｌのＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０のみを尾静脈経由で注射した。１匹のＴＮＢＳ処置マウスには注射されず、これをブランクコントロールとして使用した。１つのマウス群を、蛍光性マーカータグ化ＴＡＣＥプロドメインおよび蛍光性マーカーのみの静脈内注射の２時間後に屠殺し、他のマウス群を１０時間後に屠殺した。解剖された組織（心臓、肺、腎臓、肝臓、胃、脾臓、腸、結腸）を直ちに画像化した。それぞれの組織サンプルの平均蛍光強度を、ブランクマウスからの対応する組織の平均蛍光強度を差し引くことによって得た。心臓における蛍光強度を使用して、血液における蛍光強度を反映させた。蛍光の結腸対心臓比を計算した。蛍光画像化を、ＩＶＩＳ（ＩＶＩＳ（登録商標）１００／ＸＦＯ−１２、Ｘｅｎｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、米国）を用いて行った。近赤外蛍光（光子数／秒の単位で）を、７１０／５０ｎｍおよび８００／７５ｎｍのフィルターセットを励起および放射のためにそれぞれ使用して、１秒の積算時間により検出した。
【０２５１】
結果
ＴＡＣＥに対するＴＡＣＥプロドメインの選択性を調べるために、ＭＭＰファミリーの種々のメンバーのインビトロ阻害活性を、蛍光発生基質の切断をモニターすることによって試験した。ＴＡＣＥ、ＭＭＰ７、ＭＴ１−ＭＭＰおよびＭＭＰ９の触媒ドメインは、類似するトポロジーを互いに有しており（図３）、しかしながら、ＴＡＣＥプロドメインを使用する阻害研究では、ＴＡＣＥに対する選択的阻害が示される。ＴＡＣＥに対するＴＡＣＥプロドメイン阻害のＩＣ５０値が約１１９ｎＭであり、これに対して、ＭＭＰ９に対しては４０倍より大きく、ＭＭＰ７は８０倍より大きく、ＭＴ１−ＭＭＰの場合には、決定することができなかった（図６）。この結果は、活性なＺｎ（ＩＩ）の金属キレート化のほかに、阻害はまた、ＴＡＣＥ触媒ドメインに対して最も適合し得るＴＡＣＥプロドメインにおいて示される特異的なタンパク質−タンパク質阻害を伴ったことを示している。
【０２５２】
ＴＮＦ−αが活性化マクロファージによって主に産生され、だが、他の細胞タイプも同様に、ＴＮＦ−αを産生することができる。最初に、ＴＡＣＥプロドメインの阻害活性を、２つのタイプの細胞株を使用して、すなわち、ヒトＴＮＦ−αにより安定的にトランスフェクションされたＣＨＯ細胞、および、ｂａｌｂ／ｃマウスから集められた初代マクロファージを使用して細胞型アッセイにおいて試験した。ＴＡＣＥプロドメインは阻害性影響をＣＨＯ細胞において用量依存的様式で示した。５μＭの濃度は、非処理と比較した場合、ＴＮＦ−αの分泌を５分の１に低下させた。さらに、有意な影響が０．３１２５μＭもの低い濃度において何ら見出されなかった（図７Ａ）。１μｇ／ｍｌのＬＰＳによる刺激が、初代マクロファージ細胞におけるＴＮＦ−α分泌のために要求される。この刺激により、休止細胞と比較して、ＴＮＦ−αにおける５０倍〜６０倍の増大が引き起こされる。ＴＡＣＥプロドメインによる処置はＴＮＦ−α分泌を最大濃度（１μＭ）において６倍〜７倍妨げた。この影響が、プロドメインのレベルが低くなるにつれて低下した。０．２５μＭでは、ＴＮＦ−α分泌における低下が何ら見出されなかった（図７Ｂ）。
【０２５３】
ＴＡＣＥプロドメインの治療的可能性を自己免疫疾患において評価するために、ＴＮＢＳ／エタノールの投与によって誘導される炎症性腸疾患マウスモデルを使用した。ＴＮＢＳは結腸の自己のタンパク質または微生物叢のタンパク質をハプテン化し、これにより、これらのタンパク質を宿主免疫系に対して免疫原性にしていると考えられる。このモデルは、Ｔヘルパー細胞依存的な粘膜免疫応答を研究するために有用である。ＴＮＢＳの直腸内投与に供されるマウスは、予想された症状（例えば、血性下痢および１６％までの重度の体重減少など）を伴う重症疾患を発症させ、４０％の死亡率をもたらした（図８Ａ、図８Ｂ）。ＴＡＣＥプロドメインの１ｍｇ／ｋｇおよび４ｍｇ／ｋｇの毎日の注射により処置されるマウスは２０％および１０％のより低い死亡率をそれぞれ示し、また、１５％〜１４％のより少ない体重減少を示した（図８Ａ、図８Ｂ）。プロドメインの効力はまた、肉眼的スコアおよび組織学的スコアにおける改善により明らかであった（図８Ｃ、図８Ｄ）。ＴＡＣＥプロドメイン処置のマウスは、より長い結腸長さ、固形便、および、より少ない病変部を示した（図８Ｅ）。そのうえ、この処置はまた、ＰＢＳコントロールにおいて見られるような、マクロファージおよび免疫細胞の結腸内腔への広範囲にわたる浸潤を防止した（図８Ｆ）。全体として、これらの結果は、阻害性のＴＡＣＥプロドメインがかなりの効力をＴヘルパー細胞依存的なＩＢＤ疾患状態において有することを示している。このことはおそらく、炎症病巣部における分泌されたＴＮＦ−αの阻止が炎症プロセスの発達を停止させることによって引き起こされる。
【０２５４】
ＴＡＣＥプロドメインが炎症結腸に達するかどうかを研究するために、新鮮な組織の蛍光画像化を、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０により標識されたプロドメインを使用して行った。図９は、プロドメインが、結腸に沿って限局性斑点で突き止められてＴＮＢＳ処置マウスの結腸において、静脈内投与後１０時間から検出できたことを明らかにする（図９Ａ、図９Ｂ）。蛍光性色素自体もまた結腸において検出することができ、このことは、近年では高分解能ＭＲＩ研究によって示される、大腸炎に伴う炎症結腸の大きい血管系透過性によって説明することができる。蛍光性色素によるコントロール実験（この場合、色素が結腸中に拡散した）とは対照的に、蛍光標識されたプロドメインの著しい蓄積が限局性炎症様斑点において投与後１０時間で認められた（図９Ｂ）。
【０２５５】
このことから、プロドメインが、病変領域において、特異性を活性化免疫細胞に対して明らかにすることが示唆される。結腸／心臓比は、投与後の２時間および１０時間における４倍および１６倍のプロドメインの特異的な蓄積をそれぞれ示している。他方で、蛍光性色素のみが注射されたときには、変化がほとんど検出されなかった（図９Ｃ）。
【０２５６】
実施例２
ＴＡＣＥプロドメインの改変
フリン（セリンプロテアーゼ）は、ＴＡＣＥプロドメインを細胞内で切断することを担う主要な転換酵素である。ＴＡＣＥプロドメインは、フリン様セリンプロテアーゼの認識のための２つの異なる配列を有する。第１のものが、プロドメインと触媒ドメインとの間にある古典的なフリン部位のＲ２１１ＶＫＲ２１４／Ｒ２１５である。第２の切断部位が、本発明者らによって発見されたものであり、非標準的なＲ５６ＫＲ５８／Ｄ５９であり、これは、昆虫細胞発現系でのＴＡＣＥ触媒ドメインの精製の期間中に生成物の１つとしてＨｏｔｈ他（２００７）によって認められたものである。この第２の切断部位は、明確に定義された最小のフリンコンセンサス部位、すなわち、Ａｒｇ−Ｘ−Ｘ−Ａｒｇ／Ｘ［Ｍｏｌｌｏｙ，Ｓ．Ｓ．他、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９２、２６７、１６３９６］に似ていない。
【０２５７】
Ｎａｋａｙａｍａ，Ｋ．［Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ、１９９７、３２７（Ｐｔ  ３）、６２５］によれば、フリン認識のための他の要件として、下記が挙げられる：
（ｉ）Ｐ１の位置において、Ａｒｇが必須である；
（ｉｉ）Ｐ１のＡｒｇに加えて、Ｐ２、Ｐ４およびＰ６における３つの残基のうちの少なくとも２つが、効率的な切断のために塩基性であることが要求される；
（ｉｉｉ）Ｐ’１の位置において、疎水性側鎖を有するアミノ酸は適していない。
【０２５８】
Ｒ５６ＫＲ５８／Ｄ５９の部位は、ＡｒｇをＰ１位に有することを除いて、塩基性要件に適合していない。ＡｒｇがＰ２位に存在せず（Ｌｙｓ）、Ｐ４位に存在せず（Ｖａｌ）、かつ、Ｐ６位に存在せず（Ｈｉｓ）（ＨＳＶＲＫＲ／Ｄ）、このことがこの部位を非標準的なフリン部位にしている。
【０２５９】
ＴＡＣＥプロドメインの終わりが、プロドメインを触媒ドメインから区別するＣ末端境界部位のＲ２１１ＶＫＲ２１４／Ｒ２１５である。ＴＡＣＥプロドメインを安定化するために、本発明者らは、プロテアーゼによるプロセシングを妨げるようにＲ５６ＫＲ５８／Ｄ５９部位を変異させている。変異が、アルギニン５８をアラニンに変えることによって挿入された：すなわち、ｐｒｏ−Ｒ５８Ａ（配列番号６に示されるアミノ酸配列、配列番号１２に示されるポリヌクレオチド配列）。
【０２６０】
ｐｒ−Ｒ５８Ａが実際に、フリンによる切断に対して抵抗性であるかどうかを試験するために、精製されたｐｒｏ−Ｒ５８Ａおよびｐｒｏ−ＷＴをフリンとインキュベーションした。ｐｒｏ−ＷＴのみがフリンによってプロセシングされ、これにより、Ｒ５６ＫＲ５８／Ｄ５９での切断の後におけるＤ５８〜Ｒ２１４に対応する約１７ｋＤａのより小さいフラグメントが生じ、これに対して、ｐｒｏ−Ｒ５８Ａ変異体はフリンによって切断されなかった（図１０Ａ）。ｐｒｏ−Ｒ５８Ａ変異体は、ＷＴと類似する効率でＴＡＣＥ触媒活性を阻害し、このことは、この変異体が適正に折り畳まれ、完全に機能的であることを示している（図１０Ｂ）。
【０２６１】
抗体のＦｃ領域は、Ｆｃ受容体および他の免疫分子（例えば、補体タンパク質など）に結合することによって適正な免疫応答を助ける。Ｆｃ領域は、血液循環におけるタンパク質の半減期を延ばすことを含む種々の生理学的事象を媒介しており、したがって、ＦＣ部分は、タンパク質に融合されるとき、利点を所与の分子に与えることができる。
【０２６２】
本発明者らは、ＴＡＣＥプロドメインを、ＴＡＣＥ活性をインビボで阻害するための治療剤として利用することを検討したので、Ｆｃ融合分子を作出した。プロドメインを、上述されるような安定化のためのＲ５８Ａ変異を含有して、マウスのＦｃ  ＩｇＧ２ａにＣ末端において融合した。そのうえ、Ｆｃタンパク質を作製することは、システイン残基を介する重鎖の二量体化が必要であり、したがって、本発明者らは、プロドメインの「システインスイッチ」配列に埋め込まれるシステインをセリンに変異させ、Ｆｃ融合分子全体の誤った折り畳みを防止した。融合タンパク質を、Ｉｇκ鎖のリーダー配列を適正な折り畳みおよび不可欠な翻訳後修飾のために含有するｐＳＥＣプラスミドでＨＥＫ２９３哺乳動物細胞において発現させた。このプロドメインポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号９に示される通りであり、この配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列番号１５に示される通りである。
【０２６３】
ｐｒｏ−Ｆｃを含有するｐＳＥＣプラスミドをＨＥＫ２９３においてリン酸カルシウムとともに一過性にトランスフェクションし、細胞を発現培地においてその後７２時間成長させた。培地を集め、プロテインＡのアフィニティーカラムに供した（図１１Ａ）。精製タンパク質を触媒ＴＡＣＥの阻害について試験した。５００ｎＭのｐｒｏ−Ｆｃの存在下において、触媒ＴＡＣＥの活性が２５％低下する（図１１Ｂ）。
【０２６４】
加えて、本発明者らは、別のｐｒｏ−Ｆｃを発現する安定なＨＥＫ２９３細胞株を作出した。この細胞は、Ｃ末端のヒトＦｃ領域に対するｐｒｏ−ＷＴ  ＴＡＣＥ融合を有する。構築物は、Ｎ末端においてマウスのシグナルペプチドが隣接した。このプロドメインポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号１０に示される通りであり、この配列をコードするポリヌクレオチド配列は配列番号１６に示される通りである。ＴＡＣＥプロドメインとフリンプロテアーゼとの何らかの起こり得る相互作用を除くために、ＴＡＣＥプロドメインをさらに変異させた。具体的には、アルギニン２１１をアラニンに変異させ、かつ、アルギニン２１４をグリシンンに変異させた。加えて、アラニン残基へのシステイン１８４における別の変異が含まれた。この変異は、ＷＴと比較として、異なる阻害影響を何ら有していないとして、Ｇｏｎｚａｌｅｓ（２００４、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、２００４、２７９（３０））によって以前に記載された。
【０２６５】
まとめると、下記の４つの点変異を有するＴＡＣＥプロドメインが作出された：Ｒ５８Ａ、Ｒ２１１Ａ、Ｒ２１４ＧおよびＣ１８４Ａ（本明細書中では４ｍｕｔとして示される）。
【０２６６】
実施例３
ＬＰＳ敗血症性ショックモデルにおけるＴＡＣＥプロドメイン４ｍｕｔの治療効果
ＴＮＦ−αの分泌におけるＴＡＣＥプロドメインおよびＴＡＣＥプロドメイン４ｍｕｔの阻害効果をインビボで評価するために、ＬＰＳ敗血症性ショックモデルを適用した。敗血症性ショックは、重篤な感染および敗血症の結果である医学的状態であり、その後には全身的な炎症状態が続き、これにより、多臓器不全および死亡が引き起こされる場合がある。敗血症性ショックのほとんどの場合が、エンドトキシンを産生するグラム陰性桿菌のリポ多糖（ＬＰＳ）によって引き起こされる。敗血症ショックおよびエンドトキシンショックの期間中は、恒常性が完全に失われ、炎症が抗炎症経路よりも優位になり、また、凝固が線維素溶解よりも優位になる。ＴＮＦ−αが前炎症性媒介因子として主要な役割を果たしており、敗血症性ショックの期間中は、そのレベルが上昇し、このことにより、発端となる圧倒的な免疫応答が誘発される。エンドトキシン（ＬＰＳ）の注射が、敗血症性応答を動物モデルにおいて模倣するために使用されている。
【０２６７】
材料および方法
簡単に記載すると、Ｃ５７／ＢＬマウスに、ＴＡＣＥプロドメインまたはＰＢＳコントロールを１００ｍｇのＬＰＳ注射の１時間前に注射した。血液をＬＰＳ注射の１．５時間後に採取し、血清中のＴＮＦ−αレベルを標準的なＥＬＩＳＡキットによって検出した。
【０２６８】
結果
全身のＴＮＦ−αが、ＴＮＦ−αが検出不能であった無処置マウスと比較して、ＰＢＳコントロールにおいて上昇した（約３０００ｐｇ／ｍｌ）。ＷＴ型ＴＡＣＥプロドメインの処置は、１ｍｇ／ｋｇの濃度で投与されたとき、ＴＮＦ−αレベルを約６００ｐｇ／ｍｌに低下させ、しかし、ＴＮＦ−αの低下が、４ｍｇ／ｋｇの濃度で投与されたときには認められなかった。驚くべきことに、４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインによる処置は血清中ＴＮＦ−αにおけるより大きい低下レベルを両方の濃度で示した：１ｍｇ／ｋｇの４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインについては約４００ｐｇ／ｍｌ、および、４ｍｇ／ｋｇの４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインについては約３５０ｐｇ／ｍｌ（図１２）。この実験は、ＴＡＣＥプロドメインがインビボにおけるＴＮＦ−α分泌の効果的な調節因子であること、および、４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインが、ＷＴ型ＴＡＣＥプロドメインと比較した場合、ＴＮＦ−αをＬＰＳ敗血症性ショック・インビボモデルにおいて低下させることにおける増大した治療効力を有することを証明する。
【０２６９】
実施例４
コラーゲン誘導関節炎インビボマウスモデルにおけるＴＡＣＥプロドメイン
関節炎を処置するためのＴＡＣＥプロドメインの効力を半治療的なマウスのコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルにおいて評価した。ＴＡＣＥプロドメインによる処置を、動物の４０％が疾患の徴候を発症したときに開始した。
【０２７０】
材料および方法
オスのＤＢＡ／１ＬａｃＪマウスをＣＦＡにおける１００μｇのウシＩＩ型コラーゲンにより０日目に免疫化し、これらのマウスを２１日目に１００μｇのウシＩＩ型コラーゲンにより追加免疫した。ＴＡＣＥプロドメインまたはビヒクルコントロールのどちらかによる処置を３ｍｇ／ｋｇの用量で２３日目に開始した。
【０２７１】
結果
図１３において明らかにされるように、ＴＡＣＥプロドメインによる１０日間の処置は、１８日（処置終了後８日）までの全研究期間を通して、コントロール群における効果と著しく異なった長期の治療効果をもたらした。ＴＡＣＥプロドメインにより処置されるマウスの方が、有意に低い関節炎重篤度指数スコア（Ａ）、組織学的スコア（Ｂ）、同様にまた、濃度依存的様式でのＩＩ型コラーゲンに対して特異的である低下した血清中抗体（Ｃ）を示した。
【０２７２】
実施例５
４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインによる、炎症性腸疾患、クローン病を有する被験者の処置
４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインの安全性、耐容性および効力を評価するためのプラシボ対照研究を、クローン病の症状を有する患者の臨床試験において評価した。軽度〜中程度の活動性クローン病を有する患者が、クローン病のそれらの症状および生活の質を改善するであろう。主要評価項目測定基準：クローン病の寛解を１０週の処置の後で有した参加者の数［時間枠：ベースラインから１０週まで］。寛解が、≦１５０のクローン病活動指数（ＣＤＡＩ）スコアによって定義される。すなわち、参加者が１５０以下のＣＤＡＩスコアを８週の処置の後で有したならば、この参加者はクローン病の寛解を有した。別の評価項目測定基準：クローン病の寛解を２週の処置の後で有した参加者の数。クローン病の寛解（すなわち、≦１５０の同じＣＤＡＩスコア）を、２週の処置、４週の処置または６週の処置の後で有した参加者の数。統計学的分析がカプラン・マイヤー法によって行われる場合がある。ベースラインから８週までのＣＤＡＩスコアにおける変化［時間枠：ベースラインから８週まで］。
【０２７３】
患者は、例えば、０ｍｇ（プラセボ群）、１０ｍｇおよび１００ｍｇの投薬量レベルにおける、８回の処置に対して８週間にわたるＩＶでの４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインの用量を受ける。他の服用、間隔および頻度および投薬量レベルならびに配合物が、≦１５０のＣＤＡＩスコアを改善するために、進行速度を低下させるために、または、進行を止めるために、また、必要な場合には、進行の危険性を防止するために、または低下させるために有用である場合があることには留意される。
【０２７４】
実施例６
４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインによる、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）を有する被験者の処置
被験者は、軽度〜中程度の潰瘍性大腸炎の記録された診断を有する。有害事象の頻度および重篤度によって効力を評価するための研究が、臨床的および内視鏡検査によって明らかにされるように、８週間にわたる４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインによる処置の後で、潰瘍性大腸炎疾患の症状を有する患者の臨床試験において評価される。患者被験者は、潰瘍性大腸炎の記録された病歴、ならびに、ベースラインにおける４〜１０の修正ＵＣＤＡＩスコア、１以上の直腸出血スコア（被験者の日誌に基づく）および１ポイント以上の粘膜外観スコア（内視鏡検査に基づく）を有するであろう。主要評価項目測定基準：８週の処置期間が終了したときの修正潰瘍性大腸炎疾患活動指数（修正ＵＣＤＡＩ）スコアにおけるベースラインからの変化。
【０２７５】
患者は、例えば、０ｍｇ（プラセボ群）、１０ｍｇおよび１００ｍｇの投薬量レベルにおける、８回の処置の８週間にわたるＩＶでの４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインの用量を受ける。他の服用、間隔および頻度および投薬量レベルならびに配合物が、ＵＣＤＡＩスコアを改善するために、また、必要な場合には、進行の危険性を防止するために、または低下させるために有用である場合があることには留意される。
【０２７６】
実施例７
４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインによる、敗血症性ショックを有する被験者の処置
敗血症性ショックについての微小循環および臓器機能に対する４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインの影響を評価するための研究。試験には、感染の疑われる部位または記録された部位を有し、かつ、３つの全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）判断基準のうちの２つを有する患者が登録されるであろう。患者はまた、標準治療を受けるであろう（プラセボ比較群）。敗血症性ショックについて支援されながら、輸液蘇生、適切かつ早期の抗生物質、感染源管理、および、適切であると見なされる場合にはドロトレコギンアルファについての評価（これらに限定されない）を含む早期目標指向療法。
【０２７７】
すべての群において、ノルエピネフリンが、６５ｍｍＨｇ〜７５ｍｍＨｇの間の平均動脈圧（ＭＡＰ）を達成するために用量設定されるであろう。右心カテーテル法からのデータ、微小循環からのデータ（ＳＤＦ画像化）および臓器機能からのデータ、同様にまた、ノルエピネフリン要求が、ベースラインにおいて、また、２４時間後、４８時間後、７２時間後に得られるであろう。
【０２７８】
患者は、例えば、０ｍｇ（プラセボ群）、１０ｍｇおよび１００ｍｇの投薬量レベルにおける、最初の２４時間にわたるＩＶでの４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインの単回用量を受ける。他の服用、間隔および頻度および投薬量レベルならびに配合物が、全身血行力学、微小循環および臓器機能を改善するために有用である場合があることには留意される。
【０２７９】
実施例８
４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインによる、関節リウマチを有する被験者の処置
関節リウマチにおける４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインの効力を評価するための研究。対象となる患者は、関節リウマチ発症が１６歳を超えること、疾患継続期間の合計が少なくとも６ヶ月であることにより定義されるであろう。患者は、例えば、０ｍｇ（プラセボ群）、１０ｍｇおよび１００ｍｇの投薬量レベルにおける、８回の処置の８週間にわたるＩＶでの４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインの用量を受けるであろう。修正疾患活動スコア（ＤＡＳ２８）が主要評価項目測定基準となるであろう。他の服用、間隔および頻度および投薬量レベルならびに配合物が、改善のために有用である場合があることには留意される。
【０２８０】
実施例９
４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインによる、全身性エリテマトーデスを有する被験者の処置
４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインを使用してＴＡＣＥを阻害することによってループス腎炎を処置するための無作為化二重盲検プラセボ対照研究。試験には、米国リウマチ学会（ＡＣＲ）の１９８２年改訂ＳＬＥ分類基準の１１個のうちの少なくとも４つを満たす患者が登録されるであろう。患者は、例えば、０ｍｇ（プラセボ群）、１０ｍｇおよび１００ｍｇの投薬量レベルにおける、８回の処置の８週間にわたるＩＶでの４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインの用量を受けるであろう。評価項目測定基準：ベースラインにおける参加者の体系的紅斑性狼瘡疾患活動指数（ＳＬＥＤＡＩ）スコア。他の服用、間隔および頻度および投薬量レベルならびに配合物が、改善のために有用である場合があることには留意される。
【０２８１】
実施例１０
４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインによる、ＩＩ型糖尿病を有する被験者の処置
本研究は二重盲検無作為化プラセボ対照試験である。目的が、２型糖尿病の管理における４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインの治療効果を８週間の期間において評価することである。試験には、ＨｂＡ１ｃが１０％未満であり、ヘマトクリットが３４％を越え、血清クレアチニンが１．８ｍｇ／ｄｌ未満である患者が登録されるであろう。主要評価項目測定基準：ＨｂＡ１ｃによって測定されるような血糖管理：コントロール群と処置群との間における平均低下における差が評価されるであろう。副次評価項目測定基準：デバイス／手順関連の有害事象；低血糖事象；ＨｂＡ１ｃが７．０未満である被験者の割合；両群についての体重の減少；ＨｂＡ１ｃによって測定されるような血糖管理の改善。患者は、例えば、０ｍｇ（プラセボ群）、１０ｍｇおよび１００ｍｇの投薬量レベルにおける、８回の処置の８週間にわたるＩＶでの４ｍｕｔ型ＴＡＣＥプロドメインの用量を受けるであろう。
【０２８２】
実施例１１
アラニンへのシステイン１８４の変異はＴＡＣＥプロドメインの二量体化をＥ．ｃｏｌｉ発現系において妨げた
単離されたＴＡＣＥプロドメイン（ＷＴ型およびＣ１８４Ａ型）を、還元性サンプル緩衝液（ジスルフィド結合を還元するためにＤＴＴを含有する）または非還元性サンプル緩衝液のどちらをも用いてＳＤＳ  ＰＡＧＥに供した。予想されるように、還元性緩衝液におけるＴＡＣＥプロドメインは約２５ｋＤａ付近の明瞭なバンドとして現れた。しかしながら、非還元性緩衝液では、別のバンドが約５０ｋＤａで現れ、このことは二量体の形成を示している。対照的に、ＴＡＣＥプロドメインのＣ１８４Ａ変異体は、還元性サンプル緩衝液および非還元性サンプル緩衝液のどちらにおいても、単量体プロドメインに対応する約２５ｋＤａの単一バンドを示す。この結果から、ＴＡＣＥプロドメインのＣ１８４Ａ変異体はタンパク質の二量体を妨げることが明らかにされる。
【０２８３】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。
【０２８４】
本明細書で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。節の見出しが使用されている程度まで、それらは必ずしも限定であると解釈されるべきではない。
【０２８５】
2015522532.tif 000007
【図７Ａ−７Ｂ】
2015522532.tif 000008
【図１２】
2015522532.tif 000009
【図１３Ａ−１３Ｃ】
2015522532.tif 000010
【図１】
2015522532.tif 000011
【図２】
2015522532.tif 000012
【図３】
2015522532.tif 000013
【図４Ａ−４Ｂ】
2015522532.tif 000014
【図５】
2015522532.tif 000015
【図６Ａ−６Ｂ】
2015522532.tif 000016
【図８Ａ−８Ｆ】
2015522532.tif 000017
【図９Ａ−９Ｃ】
2015522532.tif 000018
【図１０Ａ−１０Ｂ】
2015522532.tif 000019
【図１１Ａ−１１Ｂ】
2015522532.tif 000020
【図１４】
2015522532.tif 000021
【配列表】
2015522532000001.app
【国際調査報告】
2015522532.tif 000022
2015522532.tif 000023
2015522532.tif 000024