(57)【要約】  本発明の様々な実施態様は、腫瘍細胞を特異的に標的化するための治療用組成物を提供する。いくつかの実施態様において、治療用組成物は、一般的に：（１）複数のナノベクターと；（２）ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの活性物質であり、ここで１種またはそれより多くの活性物質は腫瘍細胞に対する活性を有する、上記活性物質と；（３）ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの活性物質増強剤と；（４）ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの標的化物質であり、ここで１種またはそれより多くの標的化物質は腫瘍細胞の１種またはそれより多くのマーカーに関する認識活性を有する、上記標的化物質とを包含する。本発明の追加の実施態様は、１種またはそれより多くの上述の治療用組成物を対象に投与することによって、対象において腫瘍細胞を標的化する方法に関する。本発明のさらなる実施態様は、上述の対象において腫瘍細胞を標的化するための治療用組成物を個別化された方式で配合する方法に関する。【選択図】図１
2015536319.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞を標的化するための治療用組成物であって、
複数のナノベクターと；
腫瘍細胞に対する活性を有する、ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの活性物質と；
ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの活性物質増強剤と；
腫瘍細胞の１種またはそれより多くのマーカーに関する認識活性を有する、ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの標的化物質と；
を含む、上記治療用組成物。
【請求項２】
１種またはそれより多くの活性物質および１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、同じナノベクター分子に連結されている、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項３】
１種またはそれより多くの活性物質および１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、異なるナノベクター分子に連結されている、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項４】
１種またはそれより多くの活性物質が、第一の標的化物質に連結されている第一のナノベクター分子に連結されており、
１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、第二の標的化物質に連結されている第二のナノベクター分子に連結されている、請求項３に記載の治療用組成物。
【請求項５】
１種またはそれより多くの活性物質が、ナノベクターに非共有結合で連結されている、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項６】
１種またはそれより多くの活性物質が、ナノベクターに共有結合で連結されている、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項７】
１種またはそれより多くの標的化物質が、ナノベクターに非共有結合で連結されている、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項８】
１種またはそれより多くの標的化物質が、ナノベクターに共有結合で連結されている、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項９】
１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、ナノベクターに非共有結合で連結されている、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１０】
１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、ナノベクターに共有結合で連結されている、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１１】
ナノベクターが、疎水性ドメインと親水性ドメインとを含み、
１種またはそれより多くの活性物質および１種またはそれより多くの活性物質増強剤は、疎水性ドメインに連結されており、
１種またはそれより多くの標的化物質は、親水性ドメインに連結されている、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１２】
ナノベクターが、単層カーボンナノチューブ、２層ナノチューブ、３層ナノチューブ、多層ナノチューブ、極めて短いナノチューブ、グラフェン、グラフェンナノリボン、グラファイト、酸化黒鉛ナノリボン、カーボンブラック、酸化カーボンブラック、親水性カーボンクラスター、グラフェン量子ドット、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１３】
ナノベクターが、複数の可溶化基で官能化されている、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１４】
可溶化基が、ポリエチレングリコール、ポリ（ｐ−フェニレンオキシド）、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアミン）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１４に記載の治療用組成物。
【請求項１５】
ナノベクターが、極めて短い単層カーボンナノチューブを含み、ここで該ナノチューブは、複数の可溶化基で官能化されている、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１６】
ナノベクターが、ポリエチレングリコールで官能化された親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）を含む、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１７】
１種またはそれより多くの活性物質が、疎水性である、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１８】
１種またはそれより多くの活性物質が、シスプラチン、ＳＮ−３８、ビンブラスチン、ダウノルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、ビンクリスチン、イダルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、トポテカン、エトポシド、エルロチニブ、エチステロン、エチニルエストラジオール、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−２，３−ジアミン、２，２−ジクロロ−オクタヒドロシクロヘキサ１，３−ジアザ−２−プラチナシクロペンタン、２，２−ジクロロ−ヘキサヒドロ−ナフト１，３−ジアザ−２−プラチナシクロペンタン、４，４−ジクロロ−３，５−ジアザ−４−プラチナテトラシクロヘプタデカヘキサエン、ナイトロジェンマスタード、スペルミンマスタード、エストロゲンマスタード、コレステロールマスタード、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項１９】
１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、１種またはそれより多くの薬物輸送ポンプ阻害剤を含む、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項２０】
１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、生体異物の薬物ポンプ阻害剤を含む、請求項１９に記載の治療用組成物。
【請求項２１】
１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、フミトレモルギンＣ、インドメタシン、６−チオグアニン、スルフェート、ググルステロン、トルメチン、ハロペリドール、スルフィンピラゾン、クリシン、グリーベック、ネラチニブ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２０に記載の治療用組成物。
【請求項２２】
１種またはそれより多くのマーカーが、腫瘍細胞表面上の受容体を含む、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項２３】
受容体が、上皮増殖因子受容体、サイトカイン受容体、インターロイキン受容体、インターロイキン−１３受容体、インターロイキン−４受容体、トランスフェリン受容体、ニューロピリン受容体、血管内皮増殖因子受容体、インテグリン、ガストリン放出ペプチド受容体、肝細胞増殖因子受容体、ＨＥＲ−２受容体、前立腺特異的膜抗原、ｃ−ｍｅｔ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２２に記載の治療用組成物。
【請求項２４】
１種またはそれより多くの標的化物質が、抗体、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アプタマー、小分子、デンドリマー、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項２５】
１種またはそれより多くの標的化物質が、腫瘍細胞のマーカーに向けられた抗体を含む、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項２６】
１種またはそれより多くの標的化物質が、腫瘍細胞のマーカーに向けられたペプチドを含む、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項２７】
１種またはそれより多くの標的化物質が、腫瘍細胞のマーカーに向けられた小分子を含む、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項２８】
腫瘍細胞が、子宮頸癌、脳癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つに関連するものである、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項２９】
腫瘍細胞が、脳腫瘍と関連するものである、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項３０】
腫瘍細胞が、癌幹細胞を含む、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項３１】
対象に治療用組成物を投与することを含む、対象において腫瘍細胞を標的化する方法であって、
治療用組成物が：
複数のナノベクターと、
腫瘍細胞に対する活性を有する、ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの活性物質と、
ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの活性物質増強剤と、
腫瘍細胞の１種またはそれより多くのマーカーに関する認識活性を有する、ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの標的化物質と、
を含む、上記方法。
【請求項３２】
１種またはそれより多くの活性物質および１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、同じナノベクター分子に連結されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
１種またはそれより多くの活性物質および１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、異なるナノベクター分子に連結されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
ナノベクターが、疎水性ドメインと親水性ドメインとを含み、
１種またはそれより多くの活性物質および１種またはそれより多くの活性物質増強剤は、疎水性ドメインに連結されており、
１種またはそれより多くの標的化物質は、親水性ドメインに連結されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
ナノベクターが、単層カーボンナノチューブ、２層ナノチューブ、３層ナノチューブ、多層ナノチューブ、極めて短いナノチューブ、グラフェン、グラフェンナノリボン、グラファイト、酸化黒鉛ナノリボン、カーボンブラック、酸化カーボンブラック、親水性カーボンクラスター、グラフェン量子ドット、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
ナノベクターが、複数の可溶化基で官能化されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
可溶化基が、ポリエチレングリコール、ポリ（ｐ−フェニレンオキシド）、ポリエチレンイミン、ポリ（ビニルアミン）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ナノベクターが、極めて短い単層カーボンナノチューブを含み、ここで該ナノチューブは、複数の可溶化基で官能化されている、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
ナノベクターが、ポリエチレングリコールで官能化された親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
１種またはそれより多くの活性物質が、シスプラチン、ＳＮ−３８、ビンブラスチン、ダウノルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、ビンクリスチン、イダルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、トポテカン、エトポシド、エルロチニブ、エチステロン、エチニルエストラジオール、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−２，３−ジアミン、２，２−ジクロロ−オクタヒドロシクロヘキサ１，３−ジアザ−２−プラチナシクロペンタン、２，２−ジクロロ−ヘキサヒドロ−ナフト１，３−ジアザ−２−プラチナシクロペンタン、４，４−ジクロロ−３，５−ジアザ−４−プラチナテトラシクロヘプタデカヘキサエン、ナイトロジェンマスタード、スペルミンマスタード、エストロゲンマスタード、コレステロールマスタード、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４１】
１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、１種またはそれより多くの薬物輸送ポンプ阻害剤を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、フミトレモルギンＣ、インドメタシン、６−チオグアニン、スルフェート、ググルステロン、トルメチン、ハロペリドール、スルフィンピラゾン、クリシン、グリーベック、ネラチニブ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４３】
１種またはそれより多くのマーカーが、腫瘍細胞表面上の受容体を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４４】
１種またはそれより多くの標的化物質が、抗体、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アプタマー、小分子、デンドリマー、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４５】
腫瘍細胞が、子宮頸癌、脳癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つに関連するものである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４６】
対象が、ヒトである、請求項３１に記載の方法。
【請求項４７】
治療用組成物を投与することが、静脈内投与を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項４８】
腫瘍細胞の１種またはそれより多くのマーカーの発現レベルを決定することと；治療用組成物を配合することと；を含む、対象において腫瘍細胞を標的化するための治療用組成物を配合する方法であって、
配合される治療用組成物が：
複数のナノベクターと、
腫瘍細胞に対する活性を有する、ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの活性物質と、
ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの活性物質増強剤と、
腫瘍細胞の１種またはそれより多くのマーカーに関する認識活性を有する、ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの標的化物質と、
を含み、１種またはそれより多くの標的化物質が、腫瘍細胞の１種またはそれより多くのマーカーの決定された発現レベルに基づいて選択される、上記方法。
【請求項４９】
対象から腫瘍細胞を単離する工程をさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
腫瘍細胞を単離することは、対象から腫瘍の一部を切り出すことを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
１種またはそれより多くの活性物質に対する腫瘍細胞の感受性を決定する工程と、１種またはそれより多くの活性物質に対する腫瘍細胞の決定された感受性に基づいて１種またはそれより多くの活性物質を選択する工程とをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
１種またはそれより多くの活性物質に対する腫瘍細胞の感受性が、様々な活性物質の存在下で腫瘍細胞の様々なバッチを成長させて、異なるバッチの成長速度を未処置の腫瘍細胞の成長速度と比較することによって決定される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
１種またはそれより多くの活性物質に対する腫瘍細胞の感受性が、１種またはそれより多くの活性物質増強剤の存在下で決定される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
腫瘍細胞の１種またはそれより多くのマーカーの発現レベルが、マーカーに特異的な１種またはそれより多くの標的化物質で腫瘍細胞を処置することによって決定される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
１種またはそれより多くの活性物質および１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、同じナノベクター分子に連結されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
１種またはそれより多くの活性物質および１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、異なるナノベクター分子に連結されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
ナノベクターが、単層カーボンナノチューブ、２層ナノチューブ、３層ナノチューブ、多層ナノチューブ、極めて短いナノチューブ、グラフェン、グラフェンナノリボン、グラファイト、酸化黒鉛ナノリボン、カーボンブラック、酸化カーボンブラック、親水性カーボンクラスター、グラフェン量子ドット、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５８】
ナノベクターが、極めて短い単層カーボンナノチューブを含み、ここで該カーボンナノチューブは、複数の可溶化基で官能化されている、請求項４８に記載の方法。
【請求項５９】
ナノベクターが、ポリエチレングリコールで官能化された親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項６０】
１種またはそれより多くの活性物質が、シスプラチン、ＳＮ−３８、ビンブラスチン、ダウノルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、ビンクリスチン、イダルビシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、トポテカン、エトポシド、エルロチニブ、エチステロン、エチニルエストラジオール、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−２，３−ジアミン、２，２−ジクロロ−オクタヒドロシクロヘキサ１，３−ジアザ−２−プラチナシクロペンタン、２，２−ジクロロ−ヘキサヒドロ−ナフト１，３−ジアザ−２−プラチナシクロペンタン、４，４−ジクロロ−３，５−ジアザ−４−プラチナテトラシクロヘプタデカヘキサエン、ナイトロジェンマスタード、スペルミンマスタード、エストロゲンマスタード、コレステロールマスタード、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項６１】
１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、１種またはそれより多くの薬物輸送ポンプ阻害剤を含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項６２】
１種またはそれより多くの活性物質増強剤が、フミトレモルギンＣ、インドメタシン、６−チオグアニン、スルフェート、ググルステロン、トルメチン、ハロペリドール、スルフィンピラゾン、クリシン、グリーベック、ネラチニブ、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項６３】
１種またはそれより多くの標的化物質が、抗体、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アプタマー、小分子、デンドリマー、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項６４】
腫瘍細胞が、子宮頸癌、脳癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つに関連するものである、請求項４８に記載の方法。
【請求項６５】
腫瘍細胞が、脳腫瘍に関連するものである、請求項４８に記載の方法。
【請求項６６】
対象が、ヒトである、請求項４８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
[0001]本出願は、２０１２年１０月１６日付けで出願された米国仮特許出願第６１／７１４，４７８号の優先権を主張する。上述の出願の全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
[0002]本出願は、２０１１年４月２６日付けで出願された米国仮特許出願第６１／４７９，２２０号の優先権を主張する２０１２年４月２６日付けで出願された特許協力条約出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／３５２６７号に関する。本出願はまた、２００９年１０月２７日付けで出願された米国仮出願第６１／２５５，３０９号の優先権を主張する２０１０年１０月２７日付けで出願された特許協力条約出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／５４３２１号にも関する。本出願はまた、２００７年１０月３日付けで出願された米国仮出願第６０／９７７，３１１号の優先権を主張する２００８年１０月３日付けで出願された特許協力条約出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８７７６号にも関する。上述の各出願の全体は、参照により本明細書に組み入れられる。
【技術分野】
【０００３】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
[0003]該当なし。
【背景技術】
【０００４】
[0004]現在の様々な種類の腫瘍の処置方法には様々な制限がある。このような制限としては、所望の薬物を腫瘍部位に効果的且つ特異的に送達できないことが挙げられる。このような制限はさらに、所望の薬物が疎水性の場合や、腫瘍が複数の薬物に対して耐性を示す場合にいっそう増大する。追加の障害としては、特定の対象において所望の腫瘍を効果的に標的化する個別化された薬物送達組成物を作製する有効な方法がないことが挙げられる。それゆえに、様々な種類の腫瘍を処置するためには、標的化された薬物送達へのより効率的且つ有効なアプローチが望ましい。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]いくつかの実施態様において、本発明の開示は、腫瘍細胞を標的化するための治療用組成物を提供する。いくつかの実施態様において、治療用組成物としては、一般的に下記が挙げられる：
（１）複数のナノベクター。
（２）ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの活性物質であって、１種またはそれより多くの活性物質は腫瘍細胞に対する活性を有している上記活性物質。
（３）ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの活性物質増強剤。
（４）ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの標的化物質であって、１種またはそれより多くの標的化物質は腫瘍細胞の１種またはそれより多くのマーカーに関する認識活性を有している上記標的化物質。
【０００６】
いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの活性物質および１種またはそれより多くの活性物質増強剤は、同じナノベクター分子に連結されている。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの活性物質および１種またはそれより多くの活性物質増強剤は、異なるナノベクター分子に連結されている。
【０００７】
[0006]いくつかの実施態様において、ナノベクターとしては、複数の可溶化基で官能化された極めて短い単層カーボンナノチューブが挙げられる。いくつかの実施態様において、ナノベクターとしては、ポリエチレングリコールで官能化された親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）が挙げられる。
【０００８】
[0007]いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの活性物質としては、１種またはそれより多くの抗癌剤、例えばビンブラスチン、ドセタキセル、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの活性物質増強剤としては、１種またはそれより多くの薬物輸送ポンプ阻害剤、例えば生体異物の薬物ポンプ阻害剤が挙げられる。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くのマーカーとしてとしては、腫瘍細胞表面上の受容体、例えば上皮増殖因子受容体、インターロイキン受容体、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０００９】
[0008]いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの標的化物質としては、抗体、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アプタマー、小分子、デンドリマー、およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１種が挙げられる。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの標的化物質としては、抗体、ペプチドまたは小分子が挙げられる。
【００１０】
[0009]本発明の開示の追加の実施態様は、１種またはそれより多くの上述の治療用組成物を対象に投与することによって、対象において腫瘍細胞を標的化する方法に関する。いくつかの実施態様において、対象は、癌に罹っているヒトである。いくつかの実施態様において、治療用組成物を投与することは、静脈内投与で行ってもよい。
【００１１】
[0010]本発明の開示のさらなる実施態様は、上述の対象において腫瘍細胞を標的化するための治療用組成物の１種またはそれより多くを個別化された方式で配合する方法に関する。いくつかの実施態様において、このような方法は：（１）腫瘍細胞の１種またはそれより多くのマーカーの発現レベルを決定すること；および（２）１種またはそれより多くのマーカーの決定された発現レベルに基づいて、治療用組成物を配合することを包含する。いくつかの実施態様において、このような方法はさらに、様々な活性物質に対する腫瘍細胞の感受性を決定する工程、およびこれらの活性物質に対する腫瘍細胞の決定された感受性に基づいて、１種またはそれより多くの活性物質を選択する工程も包含していてもよい。いくつかの実施態様において、活性物質に対する腫瘍細胞の感受性は、１種またはそれより多くの活性物質増強剤の存在下で決定されてもよい。
【００１２】
[0011]本明細書でより詳細に記載されているように、本発明の開示の方法および組成物は、様々な種類の腫瘍を効果的に且つ特異的に標的化するのに使用できる。いくつかの実施態様において、標的化された腫瘍細胞は、子宮頸癌、脳癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つに関連するものでもよい。いくつかの実施態様において、標的化された腫瘍細胞は、脳腫瘍に関連するものでもよい。いくつかの実施態様において、標的化された腫瘍細胞としては、癌幹細胞が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、培養した初代ヒト多形性膠芽腫（ＧＢＭ）細胞が、ローダミン１２３（Ｒｈ１２３）、カルボキシ−２’，７’−ジクロロフルオレセイン（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ）、ヘキスト（Hoechst）３３３４２、およびカルボキシ−２’，７’−ジクロロフルオレセイン−酢酸エステル（ＤＣＦＤＡ−ＡＭ）などの様々な色素を搬出することが可能な活性な一連の生体異物ポンプを有することを示す画像を提供する。
【図２Ａ】図２は、親水性カーボンクラスター（ＨＣＣ）抗体薬物強化システム（ＨＡＤＥＳ）におけるビンブラスチン（Ｖｉｎ）、ドセタキセル（Ｄｏｃ）、およびＳＮ−３８の毒性の相乗作用に関するデータを示す。Ｖｉｎ、Ｄｏｃ、およびＳＮ−３８を、生体異物ポンプ阻害剤であるハロペリドール（Ｈａｌｏ）またはインドメタシン（Ｉｎｄｏ）と組み合わせた。次いでこの組成物を、抗ＩＬ−１３ＲのＩｇＧに連結されたポリエチレングリコール親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）中でＧＢＭに送達した。図２Ａは、ＶｉｎおよびＤｏｃと生体異物ポンプ阻害剤のいずれか（ＨａｌｏまたはＩｎｄｏ）とを使用したところ色素の蓄積において相乗効果があることを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｈａｌｏの存在下でＶｉｎまたはＤｏｃで細胞を処置する場合、生細胞のレベルが約５０％より多く低下することを示す。ウェル（ｎ＝５）の中心部分を使用して細胞数を計数した。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｈａｌｏの存在下でＶｉｎまたはＤｏｃで細胞を処置する場合、死細胞数が上昇することを示す。
【図２Ｄ】図２Ｄは、ＨＡＤＥＳ組成物におけるＶｉｎ、Ｄｏｃ、およびＳＮ３８毒性のＨａｌｏが介在する相乗作用に関する追加のデータを示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、ＨＡＤＥＳ組成物におけるＶｉｎ、Ｄｏｃ、およびＳＮ３８毒性のＨａｌｏが介在する相乗作用に関する追加のデータを示す。
【図２Ｆ】図２Ｆは、ＧＢＭ細胞における色素保持の関数としての、薬物ポンプ阻害に関するデータを示す。ＰＥＧ−ＨＣＣにＨａｌｏ、スルフィンピラゾン（Ｓｕｌｆ）またはＩｎｄｏを含有させた。次いでこのコンストラクトを、ＰＥＧ−ＨＣＣに結合したＩＬ−１３ＲのＩｇＧによりＧＢＭ細胞に標的化した。
【図３Ａ】図３は、ＧＢＭ細胞におけるＩｇＧ／ＰＥＧ−ＨＣＣ送達を介したＶｉｎまたはＤｏｃの毒性とＨａｌｏまたはＩｎｄｏとの相乗作用をまとめたデータを示す。図３Ａは、ＧＢＭ細胞をＩｎｄｏ／ＰＥＧ−ＨＣＣ中で２４時間成長させたところ（抗体の標的化の存在下または非存在下）、Ｈａｌｏ／ＰＥＧ−ＨＣＣの存在下での成長（抗体の標的化の存在下または非存在下）と比べて統計学的に有意ではない細胞数のわずかな低下しか引き起こさないことを示す。白色のバーは、塩類溶液の対照を表す。青色のバーは、ＩＬ１３ＲＡＢ／Ｐｅｇ−ＨＣＣとしてのＤｏｃを表す。赤色のバーは、ＩＬ１３ＲＡＢ／Ｐｅｇ−ＨＣＣとしてのＶｉｎを表す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、図３Ａに記載のデータの改変されたバージョンを示し、ここでは増強作用のみが示される。このデータは、標的化されていないポンプ阻害剤の存在下における細胞数が平均して１００％となるように、標的化された生体異物ポンプ阻害剤と標的化されていない生体異物ポンプ阻害剤とを比較したものである。結果から、Ｈａｌｏによるポンプ阻害は、ＤｏｃとＶｉｎ両方の毒性をおよそ５０％増加させるが。対照的にＩｎｄｏは優先的にＶｉｎの毒性を７０％増加させＤｏｃの毒性を４０％増加させることが示される。
【図４Ａ】図４Ａは、ＨａｌｏおよびＩｎｄｏが、子宮頸癌細胞においてＶｉｎおよびＤｏｃの両方の作用を増強することを示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＨａｌｏおよびＩｎｄｏが、乳癌細胞においてＶｉｎおよびＤｏｃの両方の作用を増強することを示す。
【図４Ｃ】図４Ｃは、子宮頸癌細胞の色素保持を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、乳癌細胞の色素保持を示す。
【図５Ａ】図５は、様々なＨＡＤＥＳ組成物を作製するためのスキームを提供する。図５Ａは、典型的にはカルボジイミドカップリングを使用してＮ３−ＰＥＧ−ＨＣＣ／Ｎ３−ＰＥＧ−ＨＣＣ−ビオチンを生成するためのアジド−ＰＥＧ−アミンのＨＣＣ／ビオチンへのカップリングを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、典型的にはカルボジイミドカップリングを使用してＮ３−ＰＥＧ−ＨＣＣ／Ｎ３−ＰＥＧ−ＨＣＣ−ビオチンを生成するためのアジド−ＰＥＧ−アミンのＨＣＣ／ビオチンへのカップリングを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、Ｎ３−ＰＥＧ−ＨＣＣ／ビオチンの表面の受容体基質へのクリックカップリングを示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、Ｎ３−ＰＥＧ−ＨＣＣ／ビオチンのペプチドへのクリックカップリングを示す。
【図６Ａ】図６は、様々なＨＡＤＥＳ組成物を作製するための追加のスキームを提供する。図６Ａは、クリックケミストリーを介した、ＥＧＦＲアンタゴニストであるエルロチニブのアジド−ＰＥＧ−ＨＣＣ／ビオチンへのカップリングを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、クリックケミストリーを介して有力な多重標的化されたＨＡＤＥＳ組成物を生成するのに使用できる、エチン基を有するＣＵＤＣ−１０１の構造を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、膜のアンドロゲン受容体が、どのようにして治療抵抗性前立腺癌を処置するためのエチステロン（左のパネル）、および乳癌または結腸直腸癌を処置するためのエチニルエストラジオール（右のパネル）とライゲートできるかを示す。
【図７】図７は、クリックケミストリーを介してペプチジル−ＰＥＧ−ＨＣＣを作製するためのスキームを例示する。
【図８】図８は、クリックケミストリーを介してペプチジル−ＰＥＧ−ビオチンを作製するためのスキームを例示する。
【図９】図９は、クリックケミストリーによる実用的なヒアルロン酸を作製するためのスキームを例示する。
【図１０】図１０は、ビオチン−ＰＥＧ−ペプチド分子がＧＢＭ細胞（すなわち、ＢＴ１１１細胞からの生検サンプル）に結合することを例示する画像を提供する。
【図１１】図１１は、ビオチン−ＰＥＧ−ペプチド分子がＧＢＭ細胞（すなわち、ＢＴ１１１細胞からの生検サンプル）の表面に結合することを例示する追加の画像を提供する。
【図１２Ａ】図１２は、ペプチジル−ＰＥＧ−ＨＣＣがＨＡＤＥＳ組成物として利用できることを示すデータを提供する。図１２Ａは、例えば、ＶｉｎまたはＤｏｃを含有させたペプチジル−ＰＥＧ−ＨＣＣがＧＢＭ細胞（すなわち、ＢＴ１１１細胞）を標的化できることを示すチャートを提供する。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、薬物ポンプ阻害剤であるＨａｌｏおよびＩｎｄｏが、ＧＢＭ細胞に対するＶｉｎおよびＤｏｃの作用を増強することを例示するデータを提供する。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、薬物ポンプ阻害剤であるＨａｌｏおよびＩｎｄｏが、ＧＢＭ細胞に対するＶｉｎおよびＤｏｃの作用を増強することを例示するデータを提供する。
【図１３】図１３は、ヌードマウスモデルにおいて、Ｖｉｎ、Ｄｏｃ、Ｈａｌｏ、およびＩｎｄｏを含有するＨＡＤＥＳ組成物が乳癌を処置するのに使用できることを示す画像を提供する。
【図１４】図１４は、脳癌患者におけるＧＢＭ細胞を様々なＨＡＤＥＳ組成物に対する感受性に関してスクリーニングすることによる個別化された医薬的アプローチの概説を提供する。
【図１５Ａ】図１５は、ＨＡＤＥＳ組成物が癌を処置できるメカニズムを提供する。図１５Ａは、血流にＨＡＤＥＳ組成物を添加することによって、ＨＡＤＥＳ組成物は癌を標的化できるようになることを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、処置後、ＨＡＤＥＳ組成物は、癌細胞に化学療法薬および薬物ポンプ阻害剤の両方を送達することを示す。化学療法薬および薬物ポンプ阻害剤に結合する癌細胞（加えてその近傍にある隣接する細胞）が死亡し始めると、細胞の内容物と膜の断片が放出される。これらの死亡マーカーが免疫系を刺激して、腫瘍本体に浸潤する。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
[0027]前述の全般的な説明と以下の詳細な説明はいずれも例示的で説明的なものであり、特許請求された主題を限定しないと理解されるものとする。本出願において、特に他の規定がない限り、単数形の使用は複数形を包含し、「ａ」または「ａｎ」という語は「少なくとも１つの」を意味し、「または」の使用は「および／または」を意味する。さらに、用語「〜を包含する（などの）」の使用、加えて他の形態、例えば「包含する」および「包含される」は、非限定的である。また、「要素」または「構成要素」などの用語は、特に他の規定がない限り、１つの単位を含む要素または構成要素と、１つより多くの単位を含む要素または構成要素との両方を包含する。
【００１５】
[0028]本明細書で使用される章の見出しは系統化のためであり、説明される主題を限定すると解釈されないものとする。これらに限定されないが、特許、特許出願、論文、書籍、および専門書などの本出願で引用された全ての文書、または文書の一部は、それによりそれらの全体があらゆる目的で参照により明確に本明細書に組み入れられる。組み入れられた文献および類似の資料のうち１つまたはそれより多くが、本出願に記載のその用語の定義と矛盾するように用語を定義するような場合、本出願を優先させる。
【００１６】
[0029]癌は、世界中で主な死亡原因であり、年間約５６０，０００人の米国人を含む全死亡例の１３％が癌である。多くの化学療法薬が開発されており、その大半は、迅速に増殖する細胞に対して高い毒性を示す。しかしながら、多くの場合において、これらの化学療法薬は、要素の組み合わせによってはうまくいっていない。
【００１７】
[0030]特に、化学療法用抗癌剤がうまくいかない理由は主に２つある。第一に、正常であるがよく増殖するタイプの細胞（例えば、腸の内側の細胞や免疫細胞）に死が及ばないように、化学療法用組成物は通常、低い投薬量で与えられることである。第二に、多くの癌細胞は化学療法耐性を獲得することである。理論にとらわれずにいえば、化学療法耐性は、様々な生体異物の細胞膜ポンプがアップレギュレートされることに起因する可能性が考えられる。例えば、表１は、Ｐ−糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）、乳癌耐性タンパク質（ＢＣＲＰ）、および多剤耐性タンパク質−１、−２、および−７（それぞれＭＲＰ１、ＭＲＰ２、およびＭＲＰ７）などの化学療法用化合物に対する薬剤耐性を与える作用がある５種の主要な薬物輸送体を示す。
【００１８】
【表１】
2015536319.tif 000003
【００１９】
[0031]例えば、原発性の神経膠腫では、腫瘍中の様々なポンプのレベルにおいて顕著な不均質性がみられる。さらに化学療法剤耐性の一部は、癌細胞それ自身の薬物ポンプ輸送活性の存在による作用に加えて、腫瘍に栄養を与える内皮細胞に存在するポンプによる作用である可能性がある。特に、神経膠腫に栄養補給する内皮細胞は、４Ｆ２重鎖抗原および前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の存在などの異常な表面タンパク質発現を示すことが示されている。
【００２０】
[0032]上述した化学療法用抗癌剤の有効性に対する障害はさらに、所望の薬物が疎水性である場合にいっそう増大する。追加の障害としては、特定の対象において所望の腫瘍を効果的に標的化する個別化された薬物送達組成物を作製する有効な方法がないことが挙げられる。それゆえに、様々な種類の腫瘍を処置するためには、標的化された薬物送達へのより効率的且つ有効なアプローチが望ましい。本発明の開示の方法および治療用組成物は、上述の制限に取り組むものである。
【００２１】
[0033]特に、本発明の開示の様々な実施態様は、腫瘍細胞を特異的に標的化するための治療用組成物に関する。本発明の開示のさらなる実施態様は、本発明の開示の治療用組成物を対象に投与することによる、対象において腫瘍細胞を標的化する方法に関する。本発明の開示の追加の実施態様は、特定の対象において腫瘍細胞を標的化するための治療用組成物を配合する個別化された方法に関する。
【００２２】
[0034]治療用組成物
[0035]本発明の開示の様々な実施態様は、脳腫瘍細胞などの１種またはそれより多くの腫瘍細胞を標的化するための治療用組成物に関する。いくつかの実施態様において、本発明の開示の治療用組成物は、一般的に：（１）複数のナノベクターと；（２）ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの活性物質であり、ここで１種またはそれより多くの活性物質は腫瘍細胞に対する活性を有する、上記活性物質と；（３）ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの活性物質増強剤と；（４）ナノベクターに連結された１種またはそれより多くの標的化物質であり、ここで１種またはそれより多くの標的化物質は腫瘍細胞の１種またはそれより多くのマーカーに関する認識活性を有する、上記標的化物質とを包含する。
【００２３】
[0036]本発明の開示の治療用組成物は、多数のバリエーションが存在し得る。例えば、いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの活性物質および１種またはそれより多くの活性物質増強剤は、同じナノベクター分子に連結されている。他の実施態様において、１種またはそれより多くの活性物質および１種またはそれより多くの活性物質増強剤は、異なるナノベクター分子に連結されている。例えば、いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの活性物質は、第一の標的化物質に連結された第一のナノベクター分子に連結されている。同様に、１種またはそれより多くの活性物質増強剤は、第二の標的化物質に連結された第二のナノベクター分子に連結されている。追加のバリエーションも考えられる。さらに、以下でより詳細に説明されるように、本発明の開示の治療用組成物において様々なナノベクター、活性物質、標的化物質、および活性物質増強剤を利用することが可能である。
【００２４】
[0037]ナノベクター
[0038]本発明の開示の治療用組成物で使用するのに好適なナノベクターは、一般的に、活性物質、活性物質増強剤、および標的化物質に連結できる粒子を指す。また本発明の開示におけるナノベクターは、標的化された領域に１種またはそれより多くの活性物質および活性物質増強剤を送達できる粒子も指す。
【００２５】
[0039]いくつかの実施態様において、好適なナノベクターとしては、これらに限定されないが、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）、２層ナノチューブ（ＤＷＮＴ）、３層ナノチューブ（ＴＷＮＴ）、多層ナノチューブ（ＭＷＮＴ）、極めて短いナノチューブ、極めて短い単層カーボンナノチューブ（ＵＳ−ＳＷＮＴ）、親水性カーボンクラスター（ＨＣＣ）、グラフェンナノリボン、グラファイト、酸化黒鉛ナノリボン、グラフェン量子ドット、カーボンブラック、それらの誘導体、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００２６】
[0040]いくつかの実施態様において、本発明の開示のナノベクターは、様々な方式で改変させることができる。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示のナノベクターは、酸化されていてもよい。いくつかの実施態様において、本発明の開示のナノベクターは、１種またはそれより多くの分子、ポリマー、化学成分、可溶化基、官能基、およびそれらの組み合わせで官能化されていてもよい。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示のナノベクターは、ケトン、アルコール、エポキシド、カルボン酸、およびそれらの組み合わせで官能化されていてもよい。
【００２７】
[0041]より具体的な実施態様において、本発明の開示のナノベクターは、複数の可溶化基で官能化されていてもよい。さらなる実施態様において、可溶化基としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリ（ｐ−フェニレンオキシド）（ＰＰＯ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）、ポリ（ビニルアミン）、およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１種が挙げられる。より具体的な実施態様において、本発明の開示のナノベクターとしては、ＰＥＧ官能化ＨＣＣ（すなわちＰＥＧ−ＨＣＣ、以下でより詳細に説明される通り）が挙げられる。
【００２８】
[0042]本発明の開示のナノベクターはまた、様々な特性を有していてもよい。例えば、いくつかの実施態様において、ナノベクターは、親水性（すなわち水溶性）であってもよい。いくつかの実施態様において、本発明の開示のナノベクターは、親水性部分と疎水性部分の両方を有していてもよい。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示のナノベクターは、親水性ドメイン（例えば、親水性表面）と疎水性ドメイン（例えば、疎水性の空孔）を有していてもよい。本発明の開示のナノベクターはまた、高い水溶性と疎水性化合物を吸着する能力とを組み合わせることによって疎水性ドメインと親水性ドメインの両方を有するように加工することもできる。いくつかの実施態様において、この親水性ドメインと疎水性ドメインとの二重特性は、ミセルまたはリポソームに似た構造の形成をもたらすことができる。続いてさらなるこのような構造は、所望の部位に送達するために活性物質を閉じ込めることもできる。
【００２９】
[0043]さらなる実施態様において、本発明の開示の治療用組成物は、疎水性ドメインと親水性ドメインとを有していてもよい。さらなる実施態様において、１種またはそれより多くの活性物質および活性物質増強剤が疎水性ドメインに連結されており、１種またはそれより多くの標的化物質が親水性ドメインに連結されている。
【００３０】
[0044]より具体的な実施態様において、本発明の開示のナノベクターとしては、ＵＳ−ＳＷＮＴが挙げられる。またＵＳ−ＳＷＮＴは、親水性カーボンクラスター（ＨＣＣ）とも称される。それゆえに、本発明の開示の目的に関して、ＵＳ−ＳＷＮＴはＨＣＣと同義である。いくつかの実施態様において、ＨＣＣとしては、長さが約３０ｎｍ〜約４０ｎｍであり、幅がおよそ１〜３ｎｍの酸化カーボンナノ粒子が挙げられる。
【００３１】
[0045]いくつかの実施態様において、発煙硫酸中でＳＷＮＴを硝酸と反応させて、ナノチューブ端部が開口していることを特徴とする短いカーボンナノチューブを生産することによって、ＵＳ−ＳＷＮＴ（すなわちＨＣＣ）を生産してもよい。このような方法は、「短い官能化した可溶性カーボンナノチューブ、それらの製造方法、およびそれから製造した高分子複合材料（Short Functionalized, Soluble Carbon Nanotubes, Methods of Making Same, and Polymer Composites Made Therefrom）」という名称の出願人の同時係属中の米国特許出願第１２／２８０，５２３号に開示されている。それに続いて、複数のカルボン酸基の官能化を行ってもよい。いくつかの実施態様において、ＨＣＣは、酸化グラフェンであってもよい。
【００３２】
[0046]いくつかの実施態様において、ＨＣＣは、１種またはそれより多くの可溶化基、例えばＰＥＧ、ＰＰＧ、ＰＰＯ、ＰＥＩ、ＰＶＡ、ＰＡＡ、ポリ（ビニルアミン）、およびそれらの組み合わせ（上述した通り）で官能化されていてもよい。より具体的な実施態様において、本発明の開示のナノベクターとしては、ポリエチレングリコールで官能化されたＨＣＣ（ＰＥＧ−ＨＣＣ）が挙げられる。様々なＰＥＧ−ＨＣＣおよびそれらの作製方法は、以下の論文および出願に開示されている：Berlinら、ACS Nano 2010、4、4621〜4636；Lucente-Schultzら、J. Am. Chem. Soc. 2009、131 、3934〜3941；Chenら、J. Am. Chem. Soc. 2006、128、10568〜10571；Stephensonら、Chem. Mater. 2007、19、3491〜3498；Priceら、Chem. Mater. 2009、21、3917〜3923；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８７７６；およびＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５４３２１。
【００３３】
[0047]様々な実施態様において、ＰＥＧ−ＨＣＣ（およびＨＣＣの他の官能化された形態）は、ナノベクターとして使用するのに有利な様々な特性を有していてもよい。例えば、ＰＥＧ−ＨＣＣ（およびＨＣＣの他の官能化された形態）は、低い生物学的毒性を示し、主として腎臓を介して排除され得る。またＰＥＧ−ＨＣＣ（およびＨＣＣの他の官能化された形態）は、疎水性活性物質などの活性物質を非共有結合によって含有させることができる疎水性ドメインを含有していてもよい。加えて、ＰＥＧ−ＨＣＣ（およびＨＣＣの他の官能化された形態）は、標的化物質の活性を有意に妨害することなく様々な標的化物質（例えばペプチドまたは抗体）に強く結合する能力を有していてもよい。したがって、標的化物質と組み合わされた活性物質含有ＰＥＧ−ＨＣＣ（およびＨＣＣの他の官能化された形態）は、選ばれた細胞表面抗原に結合して、選択されたエピトープを発現する細胞中に、またはその上に疎水性、親油性活性物質を送達するのに使用できる。
【００３４】
[0048]また他の好適なＰＥＧ化または官能化されたカーボンナノ材料も、ナノベクターとして使用できる。非限定的な例としては、ＰＥＧ化酸化黒鉛ナノリボン（ＰＥＧ−ＧＯＮＲ）、ＰＥＧ化酸化カーボンブラック（ＰＥＧ−ＯＣＢ）、およびＰＥＧ化カーボンブラック（ＰＥＧ−ＣＢ）が挙げられる。追加の好適なナノベクター、例えばＰＥＧ−ＨＣＣなどは、米国特許出願第１２／２４５，４３８号；ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８７７６；およびＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０５４３２１に開示されている。ここで開示されていない他の好適なナノベクターの使用も考えられる。
【００３５】
[0049]活性物質
[0050]本発明の開示の活性物質は、一般的には生物学的に活性な化合物を指し、例えば脳腫瘍細胞などの様々な腫瘍細胞に対する活性（例えば、抗アポトーシス活性、抗血管増殖活性、抗酸化活性など）を有する化合物を指す。例えば、様々な実施態様において、本発明の開示の活性物質は、抗抗癌剤、化学療法剤、抗酸化剤、および抗炎症薬を指す場合もある。さらに本発明の開示の活性物質は、様々な化合物から得てもよい。例えば、様々な実施態様において、本発明の開示の活性物質としては、これらに限定されないが、小分子、タンパク質、ペプチド、アプタマー、ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【００３６】
[0051]より具体的な実施態様において、本発明の開示の活性物質は、シスプラチン、ＳＮ−３８、ビンブラスチン、ダウノルビシン、パクリタキセル、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、ビンクリスチン、イダルビシン（iadarubicin）、ミトキサントロン、オキサリプラチン、トポテカン、エトポシド、エルロチニブ、エチステロン、エチニルエストラジオール、１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン−２，３−ジアミン、２，２−ジクロロ−オクタヒドロシクロヘキサ１，３−ジアザ−２−プラチナシクロペンタン、２，２−ジクロロ−ヘキサヒドロ−ナフト１，３−ジアザ−２−プラチナシクロペンタン、４，４−ジクロロ−３，５−ジアザ−４−プラチナテトラシクロヘプタデカヘキサエン、ナイトロジェンマスタード、スペルミンマスタード、エストロゲンマスタード、コレステロールマスタード、それらの組み合わせ、およびそれらの誘導体のうち少なくとも１つであってもよい。
【００３７】
[0052]さらに本発明の開示の活性物質は、様々な特性を有していてもよい。例えば、いくつかの実施態様において、活性物質は、疎水性であってもよい。実際に、本発明の開示の利点は、別の方法では不溶性であったかもしれない疎水性活性物質を有効に送達することである。以下でより詳細に説明されるように、このような疎水性物質は、活性物質の有効性を制限せずに溶解性を増加させる部分の使用を必要とすることなく、所望の腫瘍部位に直接送達するために様々なナノベクターに連結できる。
【００３８】
[0053]また本発明の開示の活性物質は、様々な方式でナノベクターに連結されていてもよい。例えば、いくつかの実施態様において、活性物質は、ナノベクターに非共有結合で連結されていてもよく、例えば捕捉、吸着、イオン結合、双極子間相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、および他のタイプの非共有結合を介して連結されていてもよい。
【００３９】
[0054]いくつかの実施態様において、活性物質は、ナノベクターの空孔、ドメインまたは表面内に非共有結合によって封鎖されていてもよい。いくつかの実施態様において、活性物質は、ナノベクターの可溶化基との非共有結合によってそれらの周囲の環境から封鎖されていてもよい。ナノベクターが疎水性ドメインと親水性ドメインとを包含するより具体的な実施態様において、活性物質は、疎水性ドメインに連結されていてもよい。さらなる実施態様において、疎水性活性物質は、ナノベクターの疎水性ドメインに連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、この親水性ドメインと疎水性ドメインとの二重特性は、送達のために活性物質をさらに閉じ込めることができるミセルまたはリポソームに似た構造の形成をもたらすことができる。
【００４０】
［００５５］さらなる実施態様において、本発明の開示の活性物質は、ナノベクターに共有結合で連結されていてもよい。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の活性物質は、リンカー分子を介して、化学成分を介して、または活性物質とナノベクターとの直接の化学結合を介して活性物質に共有結合で連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、活性物質は、エステル結合またはアミド結合などの切断可能な部分を介してナノベクターに共有結合で連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、切断可能な部分は、光切断可能な部分またはｐＨ感受性の切断可能な部分であってもよい。活性物質がナノベクターに共有結合または非共有結合で連結可能な追加の様式も考えられる。
【００４１】
[0056]いくつかの実施態様において、本発明の開示の治療用組成物は、単一の活性物質を包含していてもよい。いくつかの実施態様において、本発明の開示の治療用組成物は、複数の活性物質を包含していてもよい。以下に記載のさらなる実施態様において、本発明の開示の治療用組成物はさらに、１種またはそれより多くの活性物質増強剤を包含していてもよい。
【００４２】
[0057]活性物質増強剤
[0058]活性物質増強剤は、一般的に、活性物質の活性を強化するあらゆる化合物または分子を指す。いくつかの実施態様において、活性物質増強剤としては、薬物輸送ポンプ阻害剤、例えば生体異物ポンプ阻害剤が挙げられる。いくつかの実施態様において、薬物輸送ポンプ阻害剤は、ＡＢＣ輸送体、例えばＡＢＣＢ１、ＡＢＣＣ１、ＡＢＣＣ２、ＡＢＣＣ３、ＡＢＣＣ４、ＡＢＣＧ２、およびそれらの組み合わせの活性を阻害する。いくつかの実施態様において、活性物質増強剤としては、フミトレモルギンＣ（fumitremorgan C）、インドメタシン、６−チオグアニン、スルフェート、ググルステロン、トルメチン、ハロペリドール、スルフィンピラゾン、クリシン、グリーベック、ネラチニブ、およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１種が挙げられる。理論にとらわれずにいえば、このような薬物輸送ポンプ阻害剤を使用することにより、細胞からの活性物質のポンプ輸送が阻止されて、それらの細胞内での活性が強化されると考えられる。薬物輸送ポンプ阻害剤のさらなる例は、以下の実施例に記載される。
【００４３】
[0059]また本発明の開示の活性物質増強剤は、様々な方式でナノベクターに連結されていてもよい。例えば、いくつかの実施態様において、活性物質増強剤は、ナノベクターに非共有結合で連結されていてもよく、例えば捕捉、吸着、イオン結合、双極子間相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、および他のタイプの非共有結合を介して連結されていてもよい。
【００４４】
[0060]いくつかの実施態様において、活性物質増強剤は、ナノベクターの空孔、ドメインまたは表面内に非共有結合によって封鎖されていてもよい。いくつかの実施態様において、活性物質増強剤は、ナノベクターの可溶化基との非共有結合によってそれらの周囲の環境から封鎖されていてもよい。ナノベクターが疎水性ドメインと親水性ドメインとを包含するより具体的な実施態様において、活性物質増強剤は、疎水性ドメインに連結されていてもよい。さらなる実施態様において、疎水性活性物質増強剤は、ナノベクターの疎水性ドメインに連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、この親水性ドメインと疎水性ドメインとの二重特性は、送達のために活性物質増強剤をさらに閉じ込めることができるミセルまたはリポソームに似た構造の形成をもたらすことができる。
【００４５】
[0061]さらなる実施態様において、本発明の開示の活性物質増強剤は、ナノベクターに共有結合で連結されていてもよい。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の活性物質増強剤は、リンカー分子を介して、化学成分を介して、または活性物質とナノベクターとの直接の化学結合を介してナノベクターに共有結合で連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、活性物質増強剤は、エステル結合またはアミド結合などの切断可能な部分を介してナノベクターに共有結合で連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、切断可能な部分は、光切断可能な部分またはｐＨ感受性の切断可能な部分であってもよい。活性物質増強剤がナノベクターに共有結合または非共有結合で連結可能な追加の様式も考えられる。
【００４６】
[0062]いくつかの実施態様において、本発明の開示の治療用組成物は、単一の活性物質増強剤を包含していてもよい。いくつかの実施態様において、本発明の開示の治療用組成物は、複数の活性物質増強剤を包含していてもよい。いくつかの実施態様において、本発明の開示の活性物質増強剤は、活性物質に連結されている同じナノベクター分子に連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、本発明の開示の活性物質増強剤は、活性物質に連結されていない異なるナノベクター分子に連結されていてもよい。
【００４７】
[0063]トレーサー
[0064]本発明の開示の治療用組成物はさらに、例えばＭＲＩトレーサーなどの１種またはそれより多くのトレーサーに連結されていてもよい。より具体的な実施態様において、治療用組成物に連結されるトレーサーとしては、ガドリニウムトレーサー、例えばＧｄ３＋が挙げられる。さらなる実施態様において、トレーサーとしては、これらに限定されないが、蛍光分子、量子ドット（Ｑｄｏｔ）、放射性同位体、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも１種が挙げられる。様々な実施態様において、このようなトレーサーは、投与された治療用組成物の位置、分布、および送達をリアルタイムで追跡するのに使用できる。したがって、このような実施態様により、医師が、腫瘍に結合する治療用組成物の程度を追跡し、治療用組成物の生物学的な半減期をモニターしたり、腎臓や肝臓などの非標的臓器における蓄積をモニターしたりできるようになると予想される。
【００４８】
[0065]標的化物質
[0066]本発明の開示の標的化物質は、一般的に、特定のマーカーを指し、例えば腫瘍細胞に連結されるマーカーを標的化する化合物を指す。様々な実施態様において、標的化物質としては、これらに限定されないが、抗体、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アプタマー、小分子、デンドリマー、タンパク質、ペプチド、およびそれらの組み合わせが挙げられる。より具体的な実施態様において、標的化物質としては、ペプチドが挙げられる。特定の実施態様において、ペプチドとしては、合成ペプチド、例えばファージディスプレイライブラリーから選択される合成ペプチドが挙げられる。より具体的な実施態様において、標的化物質は、腫瘍細胞でアップレギュレートされる細胞表面の受容体に向けられたペプチドである。例えば実施例３の表２を参照されたい。
【００４９】
[0067]いくつかの実施態様において、標的化物質としては、上皮増殖因子受容体を特異的に標的化するペプチドが挙げられる。以下でより詳細に説明されるように、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、多くのタイプの癌細胞株で過剰発現される。したがって、様々な実施態様において、ＥＧＦＲに結合するペプチドを使用すれば、癌細胞に活性物質と活性物質増強剤とを送達することが可能である。
【００５０】
[0068]いくつかの実施態様において、標的化物質としては、腫瘍細胞のマーカーに向けられた小分子が挙げられる。より具体的な実施態様において、小分子としては、ヒアルロネート、例えばヒアルロン酸が挙げられる。
【００５１】
[0069]標的化物質は、様々な方式でナノベクターに連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、標的化物質は、ナノベクターに非共有結合で連結されていてもよく、例えば捕捉、吸着、イオン結合、双極子間相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、および他のタイプの非共有結合を介して連結されていてもよい。
【００５２】
[0070]より具体的な実施態様において、標的化物質は、ナノベクターの表面上に非共有結合によって封鎖されていてもよい。いくつかの実施態様において、標的化物質は、ナノベクターに共有結合で連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、標的化物質は、ナノベクターに共有結合で連結されていてもよいし、非共有結合で連結されていてもよい。
【００５３】
[0071]より具体的な実施態様において、本発明の開示の標的化物質は、リンカー分子を介して、化学成分を介して、または標的化物質とナノベクターとの直接の化学結合を介してナノベクターに共有結合で連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、標的化物質は、エステル結合またはアミド結合などの切断可能な部分を介してナノベクターに共有結合で連結されていてもよい。いくつかの実施態様において、切断可能な部分は、光切断可能な部分またはｐＨ感受性の切断可能な部分であってもよい。標的化物質がナノベクターに共有結合または非共有結合で連結可能な追加の様式も考えられる。
【００５４】
[0072]マーカー
[0073]上述したように、本発明の開示の標的化物質は、腫瘍細胞に連結される様々なマーカーを標的化できる。いくつかの実施態様において、このようなマーカーは、腫瘍細胞表面上にあってもよい。いくつかの実施態様において、このようなマーカーは、腫瘍細胞内にあってもよい。いくつかの実施態様において、このようなマーカーとしては、腫瘍細胞に連結されるエピトープが挙げられる。いくつかの実施態様において、このようなエピトープは、他の細胞型と比べて腫瘍細胞で過剰発現またはアップレギュレートされていてもよい。
【００５５】
[0074]いくつかの実施態様において、マーカーは、腫瘍細胞表面上の受容体である。このような受容体の例としては、これらに限定されないが、上皮増殖因子受容体、サイトカイン受容体、インターロイキン受容体、インターロイキン−１３受容体、インターロイキン−４受容体、トランスフェリン受容体、ニューロピリン受容体、血管内皮増殖因子受容体、インテグリン、ガストリン放出ペプチド受容体、肝細胞増殖因子受容体、ＨＥＲ−２受容体、前立腺特異的膜抗原、ｃ−ｍｅｔ、およびそれらの組み合わせが挙げられる。さらなる実施態様において、マーカーは、インターロイキン−１３受容体（ＩＬ−１３Ｒ）であり、これは多形性膠芽腫（ＧＢＭ）などの広範囲の脳腫瘍でアップレギュレートされるサイトカイン受容体である。より具体的な実施態様において、マーカーは、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）であり、これはＧＢＭなどの多くの癌において全長またはトランケートされた形態のいずれかで過剰発現される受容体である。様々な腫瘍細胞に好適な標的として追加のマーカーも考えられる。
【００５６】
[0075]腫瘍細胞
[0076]本発明の開示の治療用組成物を使用して、様々な腫瘍細胞を標的化することが可能である。いくつかの実施態様において、腫瘍細胞としては、癌幹細胞が挙げられる。いくつかの実施態様において、腫瘍細胞は、子宮頸癌、脳癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、およびそれらの組み合わせのうち少なくとも１つに関連するものでもよい。様々な実施態様において、癌は、悪性、良性、原発性、または転移性であってもよい。
【００５７】
[0077]いくつかの実施態様において、腫瘍細胞は、脳腫瘍に関連するものでもよい。脳腫瘍のタイプの非限定的な例としては、これらに限定されないが、神経膠腫、髄膜腫、下垂体腺腫、およびそれらの組み合わせが挙げられる。神経膠腫の非限定的な例としては、上衣細胞腫、星状細胞腫、乏突起細胞腫、混合膠腫（例えば、乏突起星細胞腫）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。本発明の開示の治療用組成物によって標的化できる腫瘍のより具体的な例としては、これらに限定されないが、神経膠腫、膠芽腫、星状細胞腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、髄芽細胞腫、乏突起細胞腫、上衣細胞腫、脈絡叢乳頭腫、およびそれらの組み合わせが挙げられる。より具体的な実施態様において、標的化しようとする脳腫瘍は、原発性多形性膠芽腫（ＧＢＭ）である。
【００５８】
[0078]様々な実施態様において、標的化された脳腫瘍は、悪性、良性、原発性、または転移性であってもよい。いくつかの実施態様において、標的化された脳腫瘍は、脳の様々な部位に位置していてもよい。いくつかの実施態様において、標的化された脳腫瘍は、体の様々な部位に広がっていてもよい。
【００５９】
[0079]腫瘍細胞を標的化する方法
[0080]本発明の開示のさらなる実施態様は、対象において腫瘍細胞（例えば、脳腫瘍）を標的化する方法に関する。このような方法は、一般的に、１種またはそれより多くの上記で説明した治療用組成物を対象に投与することを包含する。
【００６０】
[0081]対象
[0082]本発明の開示の治療用組成物は、様々な対象に投与されてもよい。いくつかの実施態様において、対象は、ヒトである。いくつかの実施態様において、対象は、神経膠腫などの脳腫瘍を有するヒトである。いくつかの実施態様において、対象は、ヒト以外の動物、例えばマウス、ラット、他のげっ歯類であってもよいし、またはより大きい哺乳動物、例えばイヌ、サル、ブタ、ウシ、およびウマであってもよい。
【００６１】
[0083]投与様式
[0084]本発明の開示の治療用組成物は、様々な方法で対象に投与できる。例えば、本発明の開示の治療用組成物は、経口投与（胃管栄養を含む）、吸入法、皮下投与（ｓｕｂ−ｑ）、静脈内投与（Ｉ．Ｖ．）、腹膜内投与（Ｉ．Ｐ．）、筋肉内投与（Ｉ．Ｍ．）、髄腔内注射、およびこのような様式の組み合わせによって投与してもよい。本発明の開示のさらなる実施態様において、本発明の開示の治療用組成物は、局所適用（例えば、経皮、軟膏、クリーム、軟膏、点眼剤など）によって投与してもよい。追加の投与様式も考えられる。
【００６２】
[0085]バリエーション
[0086]様々な実施態様において、本発明の開示の治療用組成物は、他の療法と共投与されてもよい。例えば、いくつかの実施態様において、本発明の開示の治療用組成物は、他の抗抗癌剤と共に共投与されてもよい。いくつかの実施態様において、本発明の開示の治療用組成物は、化学療法を受けている患者に投与されてもよい。他の共投与様式も考えられる。
【００６３】
[0087]治療用組成物を配合する個別化された方法
[0088]本発明の開示の追加の実施態様は、治療用組成物を配合する個別化された方法に関する。このような方法は、一般的に、以下の工程：（１）対象から腫瘍細胞を単離する工程；（２）１種またはそれより多くの活性物質に対する腫瘍細胞の感受性を決定する工程；（３）腫瘍細胞の１種またはそれより多くのマーカーの発現レベルを決定する工程；および（４）上述の工程のうち１つまたはそれより多くに基づいて治療用組成物を配合する工程のうち１つまたはそれより多くを包含する。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの活性物質に対する腫瘍細胞の感受性は、１種またはそれより多くの活性物質増強剤の存在下で決定されてもよい。
【００６４】
[0089]例えば、配合された治療用組成物は、活性物質増強剤の存在下で決定された活性物質に対する腫瘍細胞の感受性に基づいて選択された１種またはそれより多くの活性物質および活性物質増強剤を包含していてもよい。同様に、配合された治療用組成物は、マーカーの決定された発現レベルに基づいて選択された１種またはそれより多くの腫瘍細胞のマーカーに関する認識活性を有する１種またはそれより多くの標的化物質を包含していてもよい。有利なことに、このような条件に合わせた方法により、活性物質を送達するために特定のエピトープ状況を有する腫瘍細胞を特異的に標的化できる治療用組成物の配合が可能になる。
【００６５】
[0090]上述の条件に合わせた治療用組成物を配合する方法は、追加のバリエーションを有する。例えば、いくつかの実施態様において、本方法は、腫瘍細胞の１種またはそれより多くのマーカーの発現レベルを決定する工程、およびこのような決定に基づいて治療用組成物を配合する工程のみを包含していてもよい。同様に、他の実施態様において、本方法は、１種またはそれより多くの活性物質に対する腫瘍細胞の感受性を決定する工程、およびこのような決定に基づいて治療用組成物を配合する工程のみを包含していてもよい。他の実施態様において、本方法は、腫瘍細胞の１種またはそれより多くのマーカーの発現レベルを決定する工程、１種またはそれより多くの活性物質に対する腫瘍細胞の感受性を決定する工程、およびこのような決定に基づいて治療用組成物を配合する工程を包含していてもよい。
【００６６】
[0091]同様に、様々な方法を使用して、対象から腫瘍細胞を単離できる。いくつかの実施態様において、単離方法は、対象から腫瘍の一部を切り出すことを包含する。いくつかの実施態様において、標準的な生検技術を利用して、このような切り出しを行ってもよい。
【００６７】
[0092]様々な方法を使用して、１種またはそれより多くの活性物質に対する腫瘍細胞の感受性を決定することもできる。例えば、いくつかの実施態様において、感受性は、様々な活性物質の存在下で腫瘍細胞の様々なバッチを成長させて、異なるバッチの成長速度を未処置の脳腫瘍細胞の成長速度と比較することによって決定される。このような方法には、標準的な組織培養技術が使用できる。いくつかの実施態様において、腫瘍細胞に最も遅い成長速度を付与する１種またはそれより多くの活性物質が、治療用組成物への取り込みに選択されてもよい。様々な実施態様において、上述の方法は、１種またはそれより多くの活性物質増強剤の存在下または非存在下で行ってもよい。
【００６８】
[0093]様々な方法を使用して、腫瘍細胞の１種またはそれより多くのマーカーの発現レベルを決定することもできる。例えば、いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くのマーカーの発現レベルは、マーカーに特異的な標的化物質で腫瘍細胞を処置することによって決定されてもよい。様々な実施態様において、このような発現レベルを決定するために、標準的なエピトープマッピング技術を利用することが可能である。いくつかの実施態様において、マーカーは、他の細胞と比べて腫瘍細胞の表面上で過剰発現またはアップレギュレートされるエピトープ、受容体、またはタンパク質（例えば、ＩＬ−１３Ｒ、ＧＦＡＰ、ＥＧＦＲなど）であってもよい。いくつかの実施態様において、治療用組成物への取り込みに選択される標的化物質は、このような過剰発現されたマーカーに特異的であってもよい。
【００６９】
[0094]本発明の開示における治療用組成物を配合する個別化された方法は、様々な対象に適合させてもよい。いくつかの実施態様において、対象は、ヒトである。いくつかの実施態様において、ヒトは、膠芽腫などの脳癌に罹っているヒトでもよい。さらなる実施態様において、対象は、上述したようなヒト以外の動物であってもよい。
【００７０】
[0095]図１４に、治療用組成物を配合するより具体的に個別化された方法を例示する。図１４に記載のスキームでは、脳腫瘍（例えばＧＢＭ）を有する患者を処置するための治療用組成物を配合する方法を概説する。脳腫瘍は、標準的な生検手法で切り出される。切り出し後、腫瘍の一部を固定し、ワックス処理し、スライスし、マウントし、ワックスを除去し、水分を加えて元に戻した。また、個体の腫瘍が最も高い感受性を有する化学療法薬を同定するために、切り出した腫瘍の一部を組織培養で成長させることもできる。次に処置された腫瘍切片をペプチドベースのスクリーニングで処理して、個体の腫瘍における腫瘍特異的表面抗原のレベルを同定する。その後、得られた情報を使用して、特定の治療剤を配合できる。次いで選択された標的化物質（例えばペプチド）を、活性物質と活性物質増強剤とを予め含有させたナノベクター（例えばＰＥＧ−ＨＣＣ）と混合する。この方法論を使用すれば、多数の異なる活性物質が含有されたナノベクターを製造し保存できる。次いで医師は、対象の腫瘍の特性（例えば、様々なマーカーの発現レベルや様々な活性物質に対する腫瘍の感受性）に基づき特定の対象に活性物質、活性物質増強剤、および標的化物質を使用するインフォームドチョイスを行うことができる。
【００７１】
[0096]治療用組成物の配合
[0097]様々な方法を使用して、本発明の開示の治療用組成物を配合することもできる。このような方法は、一般的に：（１）ナノベクターを、１種またはそれより多くの活性物質および活性物質増強剤に連結させること；および（２）１種またはそれより多くの標的化物質をナノベクターに連結させることを包含する。いくつかの実施態様において、上述の連結の１つまたはそれより多くは、非共有結合によって、例えば捕捉、吸着、イオン結合、双極子間相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、および他のタイプの非共有結合の相互作用によってなされてもよい。さらなる実施態様において、連結のうち１つまたはそれより多くは、共有結合によってなされてもよい。
【００７２】
[0098]様々な実施態様において、上述の連結は、同時になされてもよいし、または連続的になされてもよい。いくつかの実施態様において、連結は、ナノベクターを１種またはそれより多くの活性物質、活性物質増強剤、および標的化物質と混合することによってなされてもよい。いくつかの実施態様において、ナノベクターの第一のバッチを、１種またはそれより多くの活性物質および１種またはそれより多くの標的化物質と混合してもよい。次いでナノベクターの第二のバッチを、１種またはそれより多くの活性物質増強剤および１種またはそれより多くの標的化物質と混合してもよい。次いで第一および第二のバッチを一緒に混合してもよい。
【００７３】
[0099]また本発明の開示の治療用組成物は、従来の方式で配合してもよい。いくつかの実施態様において、１種またはそれより多くの生理学的に許容できるキャリアーまたは添加剤を配合に利用してもよい。また医薬組成物は、ｐＨ、浸透圧モル濃度、粘度、透明度、色、等張性、臭い、滅菌状態、安定性、溶解もしくは放出速度、および／または組成物の吸着もしくは浸透などの様々な条件を改変したり、維持したり、または保存したりするための配合材料を包含していてもよい。好適な配合材料としては、これらに限定されないが：アミノ酸（例えばグリシン）；抗菌剤；抗酸化剤（例えばアスコルビン酸）；緩衝液（例えばトリス−ＨＣｌ）；充填剤（例えばマンニトールおよびグリシン）；キレート剤（例えばＥＤＴＡ）；錯化剤（例えばジヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン）；などが挙げられる。治療用組成物を配合する追加の方法も考えられる。
【００７４】
[00100]利点
[00101]いくつかの実施態様において、本発明の開示は、化学療法の２つの主要な問題を解決することが可能である。第一に、本発明の開示の方法および組成物は、化学療法剤の腫瘍中の局所濃度を体の他の組織と比較して増加させることによって、これらの薬物で癌細胞を特異的に標的化できる。第二に、薬物ポンプ阻害剤との併用療法で癌細胞を処理することによって、本発明の開示の方法および組成物は、癌細胞内の主要な薬物解毒方法（すなわち、癌細胞が化学療法用化合物をそれらのサイトゾルまたは細胞核からポンプ輸送する能力）を阻害できる。したがって、本発明の開示の方法および組成物は既存の化学療法剤の治療域を拡張でき、それによって患者に、正常な組織または細胞との化学療法剤の相互作用に起因する副作用を最小にしながらより一層多くの投薬量を与えることができる。加えて、本発明の開示の方法および組成物は、これらの化学療法剤の癌細胞に対する毒性を増加させることができる。
【００７５】
[00102]追加の実施態様
[00103]ここで本発明の開示のより具体的な実施態様とこのような実施態様の裏付けをもたらす実験結果について記載する。しかしながら、出願人は、以下の開示は例示的な目的にすぎず、どのような方式であれ特許請求された主題の範囲を限定することは意図していないことを特記する。
【実施例】
【００７６】
[00104]実施例１．薬物ポンプ阻害剤による抗癌剤の有効性の相乗作用
[00105]この実施例において、出願人は、３種のヒト癌のタイプ（多形性膠芽腫またはＧＢＭ、子宮頸癌、および乳癌）は化学療法剤で処置できることを実証する。この実施例において、出願人はまた、ハロペリドール（Ｈａｌｏ）やインドメタシン（Ｉｎｄｏ）などの生体異物ポンプ阻害剤を使用することによって化学療法剤の毒性を改善できることも実証する。また出願人は、抗体誘導性のＰＥＧ化疎水性／親水性カーボンクラスター（ＰＥＧ−ＨＣＣ）を使用して、どのようにしてこれらの薬物およびポンプ阻害剤を癌細胞の表面に送達できるかも示す。
【００７７】
[00106]ヒト原発性膠芽腫が薬物ポンプを有すること
[00107]出願人は、公知の薬物ポンプ阻害剤の非存在および存在下で色素を保持するヒト原発性神経膠腫細胞の能力を調査した。ヒトＧＢＭ細胞を密集化するまで成長させ、次いで、AszalosおよびTaylor（Methods Mol Biol. 596（2010）123〜139）によって説明された方式で、１００μＭのローダミン１２３（Ｒｈ１２３）、１００μＭの２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン、アセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ）、１０μＭのヘキスト３３３４２（Ｈｏｅ）、および公知の生体異物ポンプ阻害剤と共に９０分インキュベートした。９０分後、氷冷した２％パラホルムアルデヒドを使用して細胞を固定した。固定した細胞を冷蔵庫で一晩保存した。次いで細胞をｐＨ７．４（ＰＢＳ）のリン酸緩衝生理食塩水中で３回洗浄し、蛍光顕微鏡で画像化した。
【００７８】
[00108]図１に、出願人は、ＢＣＲＰ阻害剤である２０μＭのフミトレモルギンＣの存在下、ならびにＢＣＲＰ、ＭＤＲ１、およびＭＤＲ２の阻害剤である２００μＭのインドメタシン（Ｉｎｄｏ）の存在下での色素の保持における変化を示す４倍の倍率で撮られた代表的な画像を示す。図１は、阻害されていない癌細胞による色素の保持は、これら２種の阻害剤の存在下での色素の保持よりもかなり少なく、さらにこれらのポンプは不均一に存在しており、単一のポンプ阻害剤の存在下で極めて明るい細胞はわずかであることを実証する。図１の左のパネルの挿入図は、対照細胞のＲＧＢ蛍光レベルを１０倍にしたものを示す。生体異物ポンプ阻害剤とインキュベートしたＧＢＭ細胞でみられる放出レベルに類似した放出レベルにするために、このような乗算が望ましい。対照パネルの下にある個々のＲＧＢの差し込み図は、３種全ての色素、Ｒｈ１２３（赤色）、ＢＣＥＣＦ（緑色）、およびＨｏｅ（青色）が、対照細胞のサイトゾルに低いレベルで存在することを示す。フミトレモルギンＣおよびＩｎｄｏはいずれも、程度は異なるが全ての色素の色素保持を増加させる。したがって、図１は、公知の薬物ポンプ阻害剤が色素保持を変更することから、これらのヒト原発性ＧＢＭ細胞において生体異物ポンプが活発に発現されることを実証する。
【００７９】
[00109]図２Ｆは、ＧＢＭ細胞における色素保持の関数としての、薬物ポンプ阻害に関する追加のデータを示す。この実験において、ＰＥＧ−ＨＣＣにＨａｌｏ、スルフィンピラゾン（Ｓｕｌｆ）またはＩｎｄｏを含有させた。上記で概説したのと同じ方法論を使用した。次いでこのコンストラクトをＩＬ−１３ＲのＩｇＧによってＧＢＭ細胞に標的化した。同じ実験結果が得られた。
【００８０】
[00110]ＧＢＭにおける薬物ポンプ阻害が化学療法薬の作用を増強すること
[00111]出願人はこれまでに、ＰＥＧ−ＨＣＣにおける化学療法薬化合物であるビンブラスチン（Ｖｉｎ）およびドセタキセル（Ｄｏｃ）などの疎水性化合物を吸着する能力を実証した。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／３５２６７、ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／５４３２１、およびＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７８７７６を参照されたい。
【００８１】
[00112]さらに出願人は、ＰＥＧ−ＨＣＣと、細胞表面のエピトープに結合できる抗体とを混合することによって、これらのナノベクターを細胞の表面に特異的に標的化する能力を示した。例えば上記で参照したＰＣＴ出願およびACS Nano 6（2012）3114〜3120を参照されたい。
【００８２】
[00113]図２において、出願人は、化学療法薬およびポンプ阻害剤は、単独または一緒のどちらでも、培養で成長させた膠芽腫細胞において生体異物ポンプの色素基質の保持を変更することが可能であることを実証する。薬物（ＶｉｎおよびＤｏｃ）は、ＧＦＡＰＡＢ／薬物／ＰＥＧ−ＨＣＣの形態で最終濃度１００ｎＭまで送達された。いくつかの実験では、ポンプ阻害剤であるハロペリドール（Ｈａｌｏ）およびインドメタシン（Ｉｎｄｏ）を、Ｉｌ−１３ＲＡＢ／阻害剤／ＰＥＧ−ＨＣＣの形態で、２μＭの最終濃度で添加した。何も含有させていないＰＥＧ−ＨＣＣ、薬物／阻害剤を含有させたＰＥＧ−ＨＣＣ、ＧＦＡＰＡＢ、または塩類溶液からなる対照も使用した。ＧＦＡＰＡＢ／薬物／ＰＥＧ−ＨＣＣおよび／またはＩｌ−１３ＲＡＢ／Ｈａｌｏ／ＰＥＧ−ＨＣＣで細胞を２４時間処置した。次にこれまでに述べられたようにして細胞をＲｈ１２３、ＢＣＥＣＦ−ＡＭおよびＨｏｅと共に１時間インキュベートした。次いでＲｈ１２３、ＢＣＥＣＦ、およびＨｏｅ用のフィルターを使用して細胞を３０倍の倍率で画像化した。
【００８３】
[00114]図２Ａは、２種の化学療法薬および生体異物ポンプ阻害剤のいずれかを使用したところ、色素の蓄積において相乗効果があることを示す。細胞をＩｌ−１３ＲＡＢ／阻害剤／ＰＥＧ−ＨＣＣとインキュベートした場合、色素保持の増加がみられた。さらに、両方のケースで色素保持のパターンが異なることも観察できる。同様に、ＤｏｃおよびＶｉｎはどちらも、生体異物ポンプ輸送体での３種の色素との競合により色素保持を差次的に増加させる。特筆すべきことに、薬物および阻害剤の組み合わせにおいて、色素、特にＢＣＥＣＦの最大レベルは、ＤｏｃおよびＨａｌｏの存在下で観察される。
【００８４】
[00115]図２Ｂは、細胞をＨａｌｏの存在下でＶｉｎまたはＤｏｃで処置した場合、ＶｉｎまたはＤｏｃだけの場合と比較して、生細胞のレベルが約５０％超から約７０％未満の範囲に入ることを示す。さらに図２Ｃにおいて、ＶｉｎおよびＤｏｃの両方と共にＨａｌｏを使用した場合に死細胞数が上昇することが示される。
【００８５】
[00116]図２Ｄ〜２Ｅは、ＨＡＤＥＳ組成物におけるＶｉｎ、Ｄｏｃ、およびＳＮ３８毒性のＨａｌｏが介在する相乗作用に関する追加のデータを示す。これらのデータは、ＳＮ−３８の毒性は、Ｈａｌｏによって最小限の影響しか受けないことを示す。理論にとらわれずにいえば、このような結果は、この化合物は、表１で概説したように、大部分がＰ−ｇｐ以外のポンプによって輸送されることを示唆する。
【００８６】
[00117]化学療法剤とポンプ阻害剤との相乗作用を確認するために、出願人は、図２に示される実験と類似の実験を行った。これらの実験において、出願人は両方の化学療法剤に対する両方の阻害剤の作用を試験した。また出願人は、ＧＦＡＰＡＢ／（ＩｎｄｏまたはＨａｌｏ）／ＰＥＧ−ＨＣＣおよびＩｌ−１３ＲＡＢ／（ＤｏｃまたはＶｉｎ）／ＰＥＧ−ＨＣＣを利用して抗体の標的化を逆に行った。対照として、２μＭのＨａｌｏ／ＰＥＧ−ＨＣＣおよびＩｎｄｏ／ＰＥＧ−ＨＣＣ（抗体の標的化なし）を使用し、これをＩｌ−１３ＲＡＢ／薬物／ＰＥＧ−ＨＣＣとして１００ｎＭのＶｉｎまたはＤｏｃの存在下または非存在下で添加した。図３に結果を要約する。
【００８７】
[00118]図３Ａは、（抗体の標的化の存在下または非存在下で）Ｉｎｄｏ／ＰＥＧ−ＨＣＣ中でＧＢＭ細胞を２４時間成長させたところ、（抗体の標的化の存在下または非存在下での）Ｈａｌｏ／ＰＥＧ−ＨＣＣの存在下での成長と比べて、細胞数の統計学的に有意ではないわずかな低下が起こったことを示す。２００ｎＭのＩｌ−１３ＲＡＢ／Ｄｏｃ／ＰＥＧ−ＨＣＣは、（標的化されていない）Ｈａｌｏ／ＰＥＧ−ＨＣＣおよびＩｎｄｏ／ＰＥＧ−ＨＣＣの存在下でそれぞれ７５％および７２％（対照で観察されたレベル）への細胞数の低下を引き起こした。しかしながら、Ｈａｌｏの標的化は、Ｄｏｃの毒性に大きい変化をもたらした。Ｈａｌｏ／ＰＥＧ−ＨＣＣと共に抗体を包含させることにより、毒性を７５％から３７％に変化させた。Ｉｎｄｏ／ＰＥＧ−ＨＣＣと共に抗体を包含させることは、Ｄｏｃの毒性を７２％から５０％に変化させた。
【００８８】
[00119]Ｖｉｎの毒性も、標的化された生体異物ポンプ阻害剤の存在下で増強された。さらに、Ｈａｌｏの標的化は、４５％（対照の細胞数、標的化なし）から２７％（標的化あり）に細胞数を低下させた。ＶｉｎとＩｎｄｏとの組み合わせは最大の毒性を有し、Ｖｉｎは、標的化されていないＩｎｄｏの存在下で細胞数を対照の値の５３％に低下させたことが証明された。しかしながら、ＩｎｄｏをＧＢＭ細胞に標的化したところ、細胞数は１４％にしか低下しなかった。図３Ｂに、同じデータをわずかに改変した形態で表示する。標的化されていないポンプ阻害剤の存在下における細胞数が平均して１００％となるように、標的化された生体異物ポンプ阻害剤と標的化されていない生体異物ポンプ阻害剤とを比較したところ、増強作用のみが示される。これは、Ｈａｌｏによるポンプ阻害は、ＤｏｃおよびＨａｌの両方の毒性をおよそ５０％増加させるが、それに対してＩｎｄｏは、優先的にＶｉｎの毒性を７０％増加させたが、Ｄｏｃの毒性を４０％しか増加させなかったことを示す。
【００８９】
[00120]薬物ポンプ阻害が、乳房および子宮頸癌細胞において化学療法薬の作用を増強すること
[00121]出願人はさらに、ＶｉｎおよびＤｏｃの毒性の（ＨａｌｏおよびＩｎｄｏによる）相乗作用は他の癌タイプにも適用可能であるかどうかについても調査した。出願人は、ＡＴＣＣからヒト乳房および子宮頸癌細胞を入手し、９６ウェルのフォーマットでそれらを成長させた。予備実験で、出願人は、いずれの細胞型も、ＤｏｃおよびＶｉｎの両方に対してヒトＧＢＭ細胞ほど高い感受性を有さないことを見出した。したがって、出願人は、実証実験でＤｏｃおよびＶｉｎの両方をより高レベルで使用した。
【００９０】
[00122]一対の９６ウェルプレートで、集密化した癌細胞を、１μＭの（ＩｎｄｏまたはＨａｌｏ）／ＰＥＧ−ＨＣＣおよび／もしくは１μＭの（ＤｏｃまたはＶｉｎ）／ＰＥＧ−ＨＣＣで処置した。抗ＨＥＲ２抗体を使用して阻害剤を細胞表面に誘導した。ＥＧＦＲ抗体を使用して化学療法剤を誘導した。２４時間インキュベートした後、一方のプレートを使用して細胞タンパク質の総量を測定して、他方のプレートを色素の標識付けの研究に使用した（上記で説明した通り）。これをＨＥＲ２−ｎｅｕ＋乳房およびＨＥＲ２−ｎｅｕ＋子宮頸癌細胞の両方で行った（ここでＨＥＲ２−ｎｅｕは、ヒト上皮増殖因子受容体−２である）。
【００９１】
[00123]図４において、出願人は、ＨａｌｏおよびＩｎｄｏが、両方の細胞型においてＶｉｎおよびＤｏｃの両方の作用を増強することを示す。いずれの場合においても、Ｈａｌｏ／ＤｏｃおよびＩｎｄｏ／Ｖｉｎの組み合わせは、最大の相乗作用を示す。図４Ａは、１μＭの（ＩｎｄｏまたはＨａｌｏ）／ＰＥＧ−ＨＣＣは、細胞タンパク質総量（生細胞の尺度）に作用を示さないことを示す。ＥＧＦＲのＩｇＧを使用して送達された１００ｎＭのＤｏｃは対照の７８％を達成し、それに対して１００ｎＭのＶｉｎは対照の８７％を達成した。ＨａｌｏはＤｏｃの毒性を増加させ、タンパク質総量を対照の２５％に低下させた。しかしながら、Ｈａｌｏだけが、Ｖｉｎの毒性にわずかな作用を有していた。Ｉｎｄｏは、Ｄｏｃの毒性をわずかに増加させ（７８％から６８％に）、Ｖｉｎの毒性を大きく増加させた（８７％から３６％に）。図４Ｃのパネルにおいて、これらの子宮頸癌細胞の色素保持を同じ条件下で示す。４種全ての化合物が、細胞の有意な発光を引き起こした。さらに、Ｄｏｃ／Ｈａｌｏ、Ｖｉｎ／ＨａｌｏおよびＶｉｎ／Ｉｎｄｏは、ＲＢＧ色素保持において有意な増加を示すことは明らかである。
【００９２】
[00124]図４Ｂは、１μＭの（ＩｎｄｏまたはＨａｌｏ）／ＰＥＧ−ＨＣＣは、細胞タンパク質総量の予想外の２５％の増加を引き起こすことを示す。ＥＧＦＲのＩｇＧを使用して送達された１００ｎＭのＤｏｃは対照の５１％を達成し、それに対して１００ｎＭのＶｉｎは対照の６５％を達成した。ＨａｌｏはＤｏｃの毒性を増加させることにより、タンパク質総量を対照の３０％に低下させた。しかしながら、Ｈａｌｏは、Ｖｉｎの毒性には増強作用を有していなかった。ＩｎｄｏはＤｏｃの毒性をわずかに減少させ（５１％から６８％に）、Ｖｉｎの毒性を大きく増加させた（６５％から３３％に）。図４Ｄのパネルにおいて、これらの乳癌細胞の色素保持を同じ条件下で示す。４種全ての化合物が、細胞の有意な発光を引き起こした。また阻害剤と化学療法剤との組み合わせのパネルも、４種全ての組み合わせ／順列において色素保持が増強されたことを示す。
【００９３】
[00125]まとめると、実施例１は、化学療法薬と生体異物の薬物ポンプ阻害剤との対は、癌処置の毒性を高めるように選択できることを実証する。さらに、色素保持における変化は、様々な癌タイプにおける生体異物の薬物ポンプ機能に基づく化学療法薬耐性メカニズムの指標である。
【００９４】
[00126]実施例２．癌を処置するための治療用組成物の調製および使用
[00127]この実施例は、治療用組成物を送達するためのＰＥＧ−ＨＣＣコンストラクトの調製を例示する。特にこの実施例は、二機能性の細胞型特異的な標的化レポーターまたはベクタードッキングリンカーの調製に関する。図５は、標的化されたナノベクターと同じ細胞表面結合特性を有するレポータープローブをどのようにして迅速且つ効率的に合成することを可能にするかを示す。
【００９５】
[00128]ＰＥＧまたはＰＥＧ−ＨＣＣの遊離の端部に多様な官能基を付与することができ、それにより標的部分または他の機能を有する部分の共有結合が可能になる。例えば、Chemical Society Reviews 41（2012）：2971〜3010を参照されたい。これらの部分は、例えば、そのようなものとしてアダマンテ（Adamante）を添加することにより、ＰＥＧ−ＨＣＣナノベクターが無傷の血液脳関門を容易に通過できるようにする。
【００９６】
[00129]同様に、一方の端部に、特定の細胞表面タンパク質に対する特異性が付与され、他方の端部が、以下の分子：１）組織切片／細胞培養／タンパク質ホモジネート中で特異的な膜タンパク質の定量化に使用するためのレポーター；および／または２）ＨＣＣ薬物を有するナノベクターのうち１種またはそれより多くに結合されるように共通のリンカー鎖を作製するために、ＰＥＧを使用できる。レポーター機能は、異なるペプチドまたはドッキング分子の表面結合能力に関して癌生検サンプルを予備スクリーニングできるようにするという点で有用である。これは、特定の患者、または特定の腫瘍で異なる表面タンパク質のレベルをスクリーニングし定量することを医師ができるようにすると予想される。次いで医師は、最良の薬剤標的方策について十分な情報に基づく決定をなすことができる。
【００９７】
[00130]この実施例において、ビオチンがレポーターであり、ＨＣＣがナノベクターである。出願人は、癌細胞で過剰発現されることが公知の表面タンパク質に結合する標的化ペプチドまたは公知の化合物のいずれかにレポーター／ナノベクターをどのようにしてカップリングさせるかを示すことができる。
【００９８】
[00131]リンカー
[00132]この実施例において、リンカーは、アジド−ＰＥＧ−アミン（Ｎ３−ＰＥＧ−ＮＨ２）である。ＨＣＣは、酸化カーボンナノチューブであり、それらの二次元グラフェン構造は、典型的にはカルボジイミドカップリングを使用したアミド形成を介してポリ（エチレングリコール）ビス（アミン）（ＮＨ２−ＰＥＧ−ＮＨ２）に共有結合したカルボキシル基が点在した構造である。しかしながら、他の多くの方法論が利用可能である（Tetrahedron 60（2004）2447〜2467）。出願人は、以前にこれと同じアジド−ＰＥＧ−アミン（Ｎ３−ＰＥＧ−ＮＨ２）リンカーを調製し使用している（Nano 4（2010）4621〜4636）。
【００９９】
[00133]リンカーとＨＣＣとの連結
[00134]図５Ａにおいて、出願人は、どのようにしてＮ３−ＰＥＧ−ＮＨ２をＨＣＣに連結してＮ３−ＰＥＧ−ＨＣＣを生成するのかを示す。したがって、ナノベクターは、柔軟なリンカーの端部でアジド基に連結される。
【０１００】
[00135]リンカーとレポーターとの連結
[00136]ナノベクターがＮ３−ＰＥＧ−ＮＨ２に連結されるのと同じ方式で、ビオチンレポーターも、Ｎ３−ＰＥＧ−ＨＣＣと同じ共通の構造を有するＰＥＧリンカーにカップリングできる。図５Ｂに典型的なスキームを例示する。
【０１０１】
[00137]ドッキング部分のＨＣＣへの結合
[00138]標的部分とＨＣＣとの共有結合の一例として、出願人は典型的な「クリック」反応を利用した。このクリック反応は、１，４−二置換１，２，３−トリアゾール結合を形成するための銅触媒によるアジド−アルキン付加環化を含む（Angewandte Chemie International 第48版（2009）9879〜9883）。
【０１０２】
[00139]標的化ペプチド
[00140]特異的な表面発現タンパク質に結合する能力を有する標的化ペプチドを、それらのＮ、ＸまたはＣ末端にエチン（−Ｃ≡ＣＨ）が包含されるように合成できる。このようなペプチドをクリック反応を使用して結合させて、安定なトリアゾール結合を形成できる。図５Ｃを参照されたい。
【０１０３】
[00141]標的化基質／阻害剤化合物
[00142]過剰発現された細胞膜タンパク質に結合してエチン基（−Ｃ≡ＣＨ）を取り込むか、またはそのような部分が包含されるように改変されていてもよい医薬化合物は、同じクリックケミストリーを使用して結合させることができる。本明細書において出願人は、ＷＴ受容体（および一般的な突然変異体）に１２ｎＭ未満のＫＤで結合する上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤であるエルロチニブの例を使用する。また出願人は、このタンパク質の一般的に見出されているトランケーション型であるＥＧＦＲｖＩＩＩも利用する。図５Ｄを参照されたい。
【０１０４】
[00143]追加の標的化
[00144]また出願人は、癌細胞上の様々なＥＧＦＲを標的化できるＨＡＤＥＳ組成物も作製した。例えば、図６Ａは、クリックケミストリーを介したＥＧＦＲアンタゴニストであるエルロチニブのアジド−ＰＥＧ−ＨＣＣ／ビオチンへのカップリングを示す。また図６Ａは、エルロチニブの天然構造も示しており、この構造は、アンタゴニスト／ＥＧＦＲ複合体のＸ線結晶構造において外部のバルク相に向かって突き出ていることが公知のエチン基を含有する（プロテイン・データ・バンク（Protein Data Bank）（http://www.rcsb.org/pdb/）登録番号１Ｍ１７）。
【０１０５】
[00145]同様に、図６Ｂは、有力な多重標的化されたＨＡＤＥＳ組成物を生成するのに使用できるクリックケミストリーで利用可能なエチン基を含有するＣＵＤＣ−１０１の構造を示す。図６Ｃは、治療抵抗性前立腺癌を処置するために膜のアンドロゲン受容体がどのようにしてエチステロンとライゲートできるのか（左のパネル）、および乳癌または結腸直腸癌を処置するためにどのようにしてエチニルエストラジオールとライゲートできるのか（右のパネル）を示す。
【０１０６】
[00146]これらの実施例は、本発明の開示のＨＡＤＥＳ組成物を使用すれば、様々な癌細胞表面受容体を標的化できることを実証する。また本組成物を使用して、細胞表面抗原を標的化して同時に可視化することもできる。
【０１０７】
[00147]実施例３．癌細胞表面受容体を標的化するためのペプチドの使用
[00148]出願人は以前に、抗体を使用して、ＰＥＧ−ＨＣＣを細胞表面に標的化できることを実証している。特に、出願人は、各ＰＥＧ−ＨＣＣに約１〜２種の抗体を付加できることを実証した。例えば、ACS Nano 6（2012）3114〜3120を参照されたい。
【０１０８】
[00149]しかしながら、標的化目的での抗体の使用は多数の制限がある。例えば、不利な免疫応答のために、マウス抗体は患者に注射できない。さらに、ヒト化マウスモノクローナル抗体は１種につき２５０，０００ドルのコストを要する。加えて、このようなヒト化抗体は、様々な特異性および親和性を有する可能性がある。
【０１０９】
[00150]出願人は、ＰＥＧ−ＨＣＣを細胞表面に標的化するための抗体の使用に代わる実用的な代替物は、ペプチドの使用であると決定した。ファージディスプレイライブラリーは、目的とする特定のエピトープに結合するペプチジル配列を生成するための補助的な進化的選択圧を利用する。上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ニューロピリン−１、インターロイキン−４受容体α、血管内皮増殖因子受容体、インテグリンαｖβ３およびα５β、ガストリン放出ペプチド受容体、ｃ−Ｍｅｔ、ならびに前立腺特異的膜抗原などの、特定のチロシンキナーゼ受容体に高親和性および特異性で結合すると同定された多数のペプチドがある。多くの特異的なチロシンキナーゼ受容体は、癌細胞でアップレギュレートされているかまたはただ存在するだけかのいずれかであることから（すなわちＥＧＦＲｖＩＩＩ）、チロシンキナーゼ受容体結合ペプチドは、これらの癌細胞を標的化することにも使用される可能性がある。
【０１１０】
[00151]本明細書でより詳細に記載されているように、出願人は、活性物質および増強剤を所望の癌細胞に有効且つ特異的に送達するために、ペプチド／薬物アンタゴニストをＰＥＧ−ＨＣＣナノベクターに共有結合でカップリングさせ得ることを示した。
【０１１１】
[00152]チロシンキナーゼ受容体複合体に結合することが実証されているペプチドを、Ｎ末端のエチン部分で改変し、「クリック」カップリング化学を使用してアジドで改変されたＰＥＧに結合させた。それにより出願人は、２つのタイプのコンストラクト、すなわちペプチジル−ＰＥＧ−ＨＣＣおよびペプチジル−ＰＥＧ−ビオチンの作製を可能にした。本方法はまた、抗体の使用および免疫原性に関する問題も回避する。
【０１１２】
[00153]特に出願人は、癌細胞でアップレギュレートされる表面受容体に結合する人工および天然ペプチドを使用できることを示した。実際に、癌細胞表面上でアップレギュレートされる多くの受容体が、高親和性で特異的なペプチドに結合する。例えば、表２は、癌細胞表面上で高度に発現されることが公知の多数の細胞表面受容体、およびこれらの受容体に高親和性で結合する特異的なペプチド配列を示す。
【０１１３】
【表２】
2015536319.tif 000004
【０１１４】
[00154]さらに上記ペプチドは、表３および図５Ｄで例示されるような「クリックケミストリー」の使用によって合成してもよい。例えば、Ｎ末端およびＣ末端部分を含有するエチン基を使用して、ペプチド合成またはカップリング反応を増大させることができる。いくつかの実施態様において、エチン基は、従来のアジドカップリングにより別の分子にカップリングされてもよい。
【０１１５】
【表３】
2015536319.tif 000005
【０１１６】
[00155]図７〜８に、「クリックケミストリー」の使用によってペプチジルＰＥＧ−ＨＣＣおよびペプチジルＰＥＧ−ビオチンを合成するための追加の反応スキームを例示する。図９は、「クリックケミストリー」によりアジド−ＰＥＧ−ＨＣＣおよびアジド−ＰＥＧ−ビオチンに連結されるように、どのようにヒアルロン酸をアミノペンチンで改変できるかを示す。
【０１１７】
[00156]さらに、図１０〜１１で例示されるように、ＨＡＤＥＳ組成物に連結される様々なペプチドが、癌細胞表面受容体に結合できる。例えば、図１０は、ビオチン−ＰＥＧ−ペプチド分子がＧＢＭ細胞（すなわち、ＢＴ１１１細胞からの生検サンプル）に結合することを例示する画像を提供する。この実験では、ＧＢＭ細胞を固定し、ワックス処理し、スライスした。その後、ＧＢＭ細胞をスライド上に置き、ワックスを除去し、水分を加えて元に戻した。ＧＢＭ細胞の核を、洗浄剤を利用せずにヘマトキシリンで標識した。その後、細胞をアビジン／ビオチンと共にブロットし、ビオチン化−ＰＥＧ−ペプチドと共にインキュベートした。ストレプトアビジン−ＨＲＰで標識を洗浄した後、ダコ（Dako）製のＤＡＢ（ジアミノベンジジン）キット（ダコ（Dako）、米国カリフォルニア州カーピンテリア）を使用して細胞を可視化した。同様に図１１は、ビオチン−ＰＥＧ−ペプチド分子がＧＢＭ細胞（すなわち、ＢＴ１１１細胞からの生検サンプル）の表面に結合することを例示する追加の画像を提供する。この実験において、ＧＢＭ細胞培養を、核のＤＮＡを青色に標識するヘキストで処置し、これを洗浄剤を利用せずにＰＦＡ中で固定した。次いで細胞をビオチン化−ＰＥＧ−ペプチドと共に３０分インキュベートした。細胞の半分を、ビオチン−マーカーを緑色に標識するＦＩＴＣ−アビジンで標識した。細胞の残りの半分を、ビオチン−マーカーを赤色に標識するテキサスレッド−アビジンで標識した。細胞を赤／緑／青色光で可視化した。結果から、赤色または緑色（テキサスレッドまたはＦＩＴＣ）はどちらも、非特異的なアビジン結合／バックグラウンドの蛍光よりも数桁高かったことが示された。
【０１１８】
[00157]より重要なことに、出願人は、ペプチド連結ＰＥＧ−ＨＣＣが、癌細胞を標的化するための有効なＨＡＤＥＳ組成物として利用できることを実証した。図１２Ａは、例えば、ＶｉｎまたはＤｏｃを含有させたペプチジル−ＰＥＧ−ＨＣＣがＧＢＭ細胞（すなわち、ＢＴ１１１細胞）を標的化できることを示すチャートを提供する。いずれの場合においても、ｎ＝６の個々のウェルで生細胞数を計算し、Ｈｏｅを使用してアッセイした。細胞をＤｏｃまたはＶｉｎと共に２４時間インキュベートし、ペプチジル−ＰＥＧ−ＨＣＣで細胞表面に標的化した。標的化ペプチジル配列は、インテグリンαｖβ３およびα５βを標的化するＤＦＫＬＦＡＶＴＩＫＹＲであった。図１２Ｂ〜１２Ｃは、薬物ポンプ阻害剤であるＨａｌｏおよびＩｎｄｏが、ＧＢＭおよび乳癌細胞に対するＶｉｎおよびＤｏｃの作用を増強することを例示するデータを提供する。細胞を、ＰＥＧ−ＨＣＣ（対照）、５０ｎＭのＤｏｃもしくはＶｉｎ、またはペプチジル−ＰＥＧ−ＨＣＣとしてＤｏｃおよびＶｉｎ（インテグリンαｖβ３およびα５βを標的化するＤＦＫＬＦＡＶＴＩＫＹＲを使用）と共にインキュベートした。加えて、これら４種のインキュベート対象物を、ＰＥＧ−ＨＣＣ（対照）、１μＭのＨａｌｏもしくはＩｎｄｏ、またはペプチジル−ＰＥＧ−ＨＣＣとしてＨａｌｏおよびＩｎｄｏ（ＥＧＦＲを標的化するＹＲＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩを使用）で処置した。
【０１１９】
[00158]神経膠腫細胞では、これらの低いレベルの化学療法用化合物単独は２４時間で限定的なレベルの細胞死しか引き起こさなかったが、乳癌細胞では個々にそれより高い毒性を示した（黒色のバー）。神経膠腫細胞では、Ｈａｌｏ（赤色のバー）とのコインキュベートによりＶｉｎの毒性は中度に強化され、Ｉｎｄｏの存在下では２倍高くなった（青色のバー）。両方のポンプ阻害剤が存在しても（ピンク色のバー）、Ｉｎｄｏ単独より大きいレベルの毒性は生じなかった。神経膠腫細胞では、Ｄｏｃの毒性は、Ｈａｌｏ（赤色のバー）とコインキュベートしたことにより、Ｉｎｄｏ（青色のバー）とコインキュベートした場合よりも強化されたが、両方のポンプ阻害剤は、ＨａｌｏまたはＩｎｄｏ単独より大きいレベルの毒性をもたらした。最終的に、神経膠腫において、ＤｏｃとＶｉｎとを一緒にコインキュベートすることは、個々の化合物より高い毒性を示す。この毒性はＨａｌｏおよびＩｎｄｏの存在によって大いに強化されたが、これらの薬物ポンプ阻害剤単独では強化されなかった。
【０１２０】
[00159]ＤｏｃおよびＶｉｎの相乗作用の様々なパターンは、神経膠腫で観察した場合よりもヒト乳癌細胞で見出されている。一緒に添加されたＶｉｎおよびＤｏｃは、個々の化学療法薬よりもわずかに高い毒性を示しただけであった。ＶｉｎはＩｎｄｏによって増強され、ＤｏｃはＩｎｄｏおよびＨａｌｏの両方によって増強されたが、両方の組み合わせが顕著な増大をもたらした。乳癌細胞は、両方の薬物と両方の薬物ポンプ阻害剤との組み合わせに極めて高い感受性を示した。
【０１２１】
[00160]アジドポリエチレングリコールアミンの合成
[00161]厚肉の反応チューブをオーブンで乾燥させ、撹拌子および隔壁を取り付け、窒素を３回ポンプ輸送／充填した。１０ｍＬの新たに蒸留したＴＨＦおよび４．４４ｍＬのカリウムビス（トリメチルシリル）アミド（２．２２ｍｍｏｌ）を添加した。次にこの溶液をドライアイス／アセトン槽を使用して−７８℃に冷却した。別々に２５ｍＬのメスシリンダーに２００ｍｇのＣａＨ２を充填し、隔壁を取り付け、−７８℃に冷却した。シリンダー中でエチレンオキシド（５ｍＬ、１００ｍｍｏｌ）を濃縮し、カニューレを介して反応チューブに移した。反応チューブの隔壁を除去し、チューブを迅速に密封した。この反応液を６０℃で１６時間撹拌したところ、その間に反応混合物は次第にさび色がかったオレンジから茶色に変化し、見た目に粘性になった。次いでこの反応液を室温に冷却した。次いでこの反応液にＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．２ｍＬ、７ｍｍｏｌ）、続いて塩化ｐ−トルエンスルホニル（１．２７ｇ、６．６７ｍｍｏｌ）を１回で添加した。淡褐色の反応混合物を６０℃で１６時間撹拌した。次いでこの混合物をアジ化ナトリウム水溶液に注ぎ入れ、二相混合物を得た。この混合物を９０℃で４時間加熱し、次いでジエチルエーテル（３×４０ｍＬ）およびクロロホルム（４×４０ｍＬ）で抽出した。クロロホルム抽出物を合わせ、硫酸マグネシウム下で乾燥させ、減圧下で蒸発させて３０ｍＬにし、ジエチルエーテル（１５０ｍＬ）で処置した。生成物は−２０℃で冷却させたところ白色の針状に結晶化した。ＰＴＦＥ膜で固体を収集し、ジエチルエーテルで洗浄し、真空中で乾燥させて、３．７ｇのアジドポリエチレングリコールアミンを得た。ＧＰＣ分析により５８６４の分子量であることがわかった。
【０１２２】
[00162]ビオチン化したポリエチレングリコールの合成
[00163]ビオチン（９．４ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）およびＮ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（７．９ｍｇ、０．０３８ｍｍｏｌ）を無水Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに溶解させた。得られた溶液を室温で３０分間撹拌した。この溶液に次いで４−ジメチルアミノピリジン（２フレーク）をに添加した。そこに続いてアジドポリエチレングリコールアミン（０．１５０ｇ、０．０２６ｍｍｏｌ）を添加した。次に反応混合物を室温で１６時間撹拌した。次いで反応混合物を透析用の管（１０００ＭＷＣＯ）に移し、連続的に脱イオン水を流動させながら５日間透析した。水をろ過して減圧下で蒸発させた。残留物を２ｍＬのクロロホルムに溶解させ、冷たいジエチルエーテルで沈殿させたところ、０．１２０ｇのビオチン化したポリエチレングリコールが生成した。
【０１２３】
[00164]ペプチド官能化ビオチン化したポリエチレングリコールの一般的な合成
[00165]アルキニル官能化ペプチド（例えば、ＨＣ≡Ｃ−ＣＯ−ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ、０．２ｍｇ、０．１３μｍｏｌ）を、ｔｅｒｔ−ブタノールと脱イオン水との１：１混合物０．２ｍＬに溶解させた。ビオチン化したポリエチレングリコール（１０ｍｇ）を、ｔｅｒｔ−ブタノールと脱イオン水との１：１混合物６ｍｌに溶解させた。次いで硫酸銅（５２μＬの２．５ｍＭ水溶液）およびアスコルビン酸ナトリウム（５２μＬの２．５ｍＭ水溶液）を添加した。この反応液を室温で２日間撹拌した。次にこの混合物を連続的に脱イオン水を流動させながら２日間透析した。
【０１２４】
[00166]アジド官能化ＰＥＧ−ＨＣＣの合成
[00167]ＨＣＣ（３０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌの炭素）を、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミドに、槽型の超音波発生装置で３０分処理することにより溶解させた。次いで、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（２０５ｍｇ、１ｍｍｏｌ）、メトキシポリエチレングリコールアミン（１２５ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）、アジドポリエチレングリコールアミン（１４７ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）、および４−ジメチルアミノピリジン（２フレーク）を添加した。この反応液を２４時間撹拌した。この溶液をＮ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド中で２日間透析することにより精製した。その後、５日間連続的に補給された脱イオン水中で透析した。次いで得られた溶液をＰＤ−１０カラムに通すことにより、アジド官能化ＰＥＧ−ＨＣＣの溶液を得た。
【０１２５】
[00168]ペプチド官能化ＰＥＧ−ＨＣＣの合成
[00169]アルキニル官能化ペプチド（例えば、ＨＣ≡Ｃ−ＣＯ−ＹＨＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ、０．８ｍｇ、０．５２μｍｏｌ）を、ｔｅｒｔ−ブタノールの１：１混合物０．８ｍＬに溶解させた。次いで脱イオン水をアジド官能化ＰＥＧ−ＨＣＣの溶液３ｍＬに添加した。この溶液に、ｔｅｒｔ−ブタノール（３ｍＬ）、硫酸銅（２０８μＬの２．５ｍＭ水溶液）およびアスコルビン酸ナトリウム（２０８μＬの２．５ｍＭ水溶液）を添加した。この反応液を室温で２日撹拌した。この混合物を連続的に脱イオン水を流動させながら１日間透析した。硫化ナトリウムおよび水酸化カルシウムでの処置によって過量の銅を除去した。
【０１２６】
[00170]ペプチド官能化ＰＥＧ−ＨＣＣへの薬物（例えばドセタキセル）の充填
[00171]ドセタキセル（０．２ｍＬの１ｍｇ／ｍＬメタノール溶液）を、ペプチド−ＰＥＧ−ＨＣＣの迅速に撹拌される脱イオン水中の溶液に（２ｍＬ、３３１ｍｇ／Ｌ濃度のコアＨＣＣ）一滴ずつ添加した。この混合物を室温で１６時間撹拌した。メタノールを除去するためにこの溶液を減圧下で濃縮して１ｍＬにし、脱イオン水で再溶解して２ｍＬにして、最終的なドセタキセル濃度０．１ｍｇ／ｍＬを達成した。
【０１２７】
[00172]実施例４．インビボでの乳房癌処置へのＨＡＤＥＳ組成物の利用
[00173]この実施例において、出願人は、ヒト乳癌のヌードマウスモデルにおいて、本発明の開示のＨＡＤＥＳ組成物が乳癌を処置するのに使用できることを実証した。図１３は、例えば、ヒト乳癌のヌードマウスモデルにおいて、Ｖｉｎ、Ｄｏｃ、Ｈａｌｏ、およびＩｎｄｏを含有するＨＡＤＥＳ組成物が乳癌を処置するのに使用できることを示す画像を提供する。
【０１２８】
[00174]まず５００，０００個の乳癌細胞（ＺＲ−７５）をマトリゲル（Matrigel（商標））に懸濁した。次いでヌードマウスの脇腹に細胞を注射した。２５日後、８２０ｍｍ３の腫瘍が成長した。インテグリン標的化ペプチジル−ＰＥＧ−ＨＣＣ（ＤＦＫＬＦＡＶＴＩＫＹＲ）に化学療法薬であるＶｉｎおよびＤｏｃを含有させた。ＥＧＦＲ標的化ペプチジル−ＰＥＧ−ＨＣＣ（ＹＲＷＹＧＹＴＰＱＮＶＩ）にポンプ阻害剤であるＨａｌｏおよびＩｎｄｏを含有させた。マウスに、２００ｎＭのＤｏｃおよびＶｉｎ、ならびに９００ｎＭのＨａｌｏおよびＩｎｄｏからなる１回の尾静脈注射を行った。処置７日後に、腫瘍体積から、腫瘍が８０％より多く縮小したことが実証された。
【０１２９】
[00175]実施例５．処置メカニズム
[00176]図１５において、出願人は、どのようにして処置が個別の方式で作用できるのかを実証する。この実施例において、患者を４種の異なる標的化ナノベクターで処置した。標的化の選択は、生検のスクリーニング、または患者の腫瘍から得られた初代培養の試験に基づいてなされるか、またはビオチン化−リンカー−プローブがＭＲＩ／ＰＥＴで検出可能な可視化基に連結されている場合はインビボでのイメージングに基づいてもなされる。標的化の個別化された選択は、ＰＥＧ−ＨＣＣに結合したヒト化ＩｇＧ、ペプチド、または小さい受容体アンタゴニストを包含していてもよい。これらには化学療法薬およびポンプ阻害剤が含有されており、血管系に送達されるか、場合によっては部位への直接的な注射により送達される。その後、ナノベクターの薬物／ポンプ阻害剤の内容物は、癌細胞の原形質膜表面に放出される。次に内容物はコンストラクトを結合させている細胞に拡散する。また内容物のうち一部がすぐ近くの細胞にも拡散する可能性がある。
【０１３０】
[00177]当業者は、さらなる詳細がなくとも、本明細書に記載の説明を使用して、本発明の開示をその最大の程度まで利用できると考えられる。本明細書で説明された実施態様は例示的であり、開示の残りの部分をどのような形であれ決して制限するものとして解釈されないものとする。実施態様を示し説明したが、当業者であれば本発明の本質および教示から逸脱することなくそれらの多くのバリエーションおよび改変を作製することが可能である。したがって、保護の範囲は上記の説明によって限定されないが、特許請求の範囲の主題のあらゆる等価体を包含する特許請求の範囲によってのみ限定される。本明細書において引用された全ての特許、特許出願、および出版物の開示は、それらが本明細書に記載の内容と一致しそれらを補足する手続き上または他の詳細が提供される程度に、ここでの参照により本明細書に組み入れられる。
【図２Ｂ】
2015536319.tif 000006
【図２Ｃ】
2015536319.tif 000007
【図２Ｄ】
2015536319.tif 000008
【図２Ｅ】
2015536319.tif 000009
【図５Ａ】
2015536319.tif 000010
【図５Ｂ】
2015536319.tif 000011
【図５Ｃ】
2015536319.tif 000012
【図５Ｄ】
2015536319.tif 000013
【図６Ａ】
2015536319.tif 000014
【図６Ｂ】
2015536319.tif 000015
【図６Ｃ】
2015536319.tif 000016
【図８】
2015536319.tif 000017
【図９】
2015536319.tif 000018
【図１】
2015536319.tif 000019
【図２Ａ】
2015536319.tif 000020
【図２Ｆ】
2015536319.tif 000021
【図３Ａ】
2015536319.tif 000022
【図３Ｂ】
2015536319.tif 000023
【図４Ａ】
2015536319.tif 000024
【図４Ｂ】
2015536319.tif 000025
【図４Ｃ】
2015536319.tif 000026
【図４Ｄ】
2015536319.tif 000027
【図７】
2015536319.tif 000028
【図１０】
2015536319.tif 000029
【図１１】
2015536319.tif 000030
【図１２Ａ】
2015536319.tif 000031
【図１２Ｂ】
2015536319.tif 000032
【図１２Ｃ】
2015536319.tif 000033
【図１３】
2015536319.tif 000034
【図１４】
2015536319.tif 000035
【図１５Ａ】
2015536319.tif 000036
【図１５Ｂ】
2015536319.tif 000037
【国際調査報告】
2015536319.tif 000038