(57)【要約】  本発明は、プロバイオティクスを投与するための担体としての蜂花粉/粘土複合体の使用、ならびに1種または複数のプロバイオティクスおよび前記蜂花粉/粘土複合体を含む組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
-  プロバイオティクス用途の1種または複数の微生物、加えて
- 蜂花粉および粘土をベースとする複合体
を含む組成物。
【請求項２】
前記微生物が凍結乾燥されている、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記微生物が乳酸菌から選択される、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
前記微生物がビフィドバクテリウム属およびラクトバチルス属菌から選択される、請求項1、2または3に記載の組成物。
【請求項５】
- 0.1%から70%の凍結乾燥させた微生物、および
- 30%から99.9%の前記複合体
を含み、割合が質量によるものと理解される、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
- 3%から30%の凍結乾燥させた微生物、および
- 70%から97%の前記複合体
を含み、割合が質量によるものと理解される、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記複合体が、
- 20%から40%の蜂花粉、および
- 60%から80%の粘土
を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
粉末として生じる、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
胃耐性製剤での、請求項1から8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
胃耐性ゼラチンカプセル剤として製剤化される、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
-  蜂花粉および粘土を混合する工程、ならびに
- 微生物を加え、混合する工程
を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法。
【請求項１２】
請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物を含む、食品、化粧用、および/またはガレヌス組成物。
【請求項１３】
食料品、機能性食料品または栄養補助食品である、請求項12に記載の食品組成物。
【請求項１４】
請求項1から10のいずれか一項に記載の組成物を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
プロバイオティクス用途の微生物の生物学的利用能および/または活性を改善するための、蜂花粉および粘土をベースとする複合体の使用。
【請求項１６】
プロバイオティクス用途の微生物の生物学的利用能および/または活性を改善するために使用する、請求項14に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、蜂花粉および粘土をベースとする担体によるプロバイオティクス用途の微生物(細菌または酵母)の投与、ならびに前記微生物および前記蜂花粉/粘土複合体を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明によれば、微生物という用語は、プロバイオティクス用途の微生物(細菌または酵母)を指す。
【０００３】
プロバイオティクスは、例えば、非病原性および非毒性細菌の微生物または酵母であって、生きたまま十分な量で腸に送達され、微生物叢の平衡維持および腸粘膜の強化に寄与する。現在、プロバイオティクスは、栄養および健康の観点から提供されるであろう有益な効果のために強く要求されている。
【０００４】
したがって、2001年10月には、食糧農業機関(FAO)/WHOの専門家による、プロバイオティクスの健康および栄養特性の評価に関する協議により、プロバイオティクスは、≪十分な量で投与された場合に、消費者に健康上の利点をもたらす生きた微生物≫と定義され、プロバイオティクスが、免疫学的、消化および呼吸機能に重要な役割を果たし、とりわけ小児における感染性疾患の処置に著しい効果を有し得ることが報告されている。
【０００５】
プロバイオティクス用途の商用の微生物は、一般に凍結乾燥され、異なる形態で包装されている(ゼラチンカプセル剤、サシェ剤など)。それでもなお、産業化、胃内酸度ならびに胆汁および膵液と接触させることは、これらの微生物の大多数が失われる原因となり、さらに、凍結乾燥させた場合は、再活性化されなければならない。文献において、複数の研究では、酸性生息環境におけるプロバイオティクスの生存能力に注力している。したがって、特定のプロバイオティクス株(ビフィズス菌(Bifido bacterium)および乳酸桿菌(Lactobacillus))の生存率における酸度の有害効果が、とりわけSunら、International Journal of Food Microbiology、61、17-25頁(2000年)、Sultanaら、International Journal of Food Microbiology、62、47-55頁(2000年)、Favaro-Trindadeら、Journal of Microencapsulation、19(4)、485-494頁(2002年)およびHansenら、Food Microbiology、19、35-45頁(2002年)により報告されている。
【０００６】
発酵乳およびヨーグルトを作るために乳業に使用される乳酸桿菌の中でさえも、多数が、胃の酸性環境では生存できないので、プロバイオティクスの定義の名称を得られない。実際、「プロバイオティクスの」と記載するために、微生物の株は、十分な量で生きたまま腸に到着させるべきであり、腸の微生物叢において定着させるべきである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際出願PCT/EP2011/072756
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Sunら、International Journal of Food Microbiology、61、17-25頁(2000年)
【非特許文献２】Sultanaら、International Journal of Food Microbiology、62、47-55頁(2000年)
【非特許文献３】Favaro-Trindadeら、Journal of Microencapsulation、19(4)、485-494頁(2002年)
【非特許文献４】Hansenら、Food Microbiology、19、35-45頁(2002年)
【非特許文献５】Heinzら、1987年、J. Gen. Virol. 68、2495-2499頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、プロバイオティクスの利点を考慮に入れると、微生物が、十分な量で生きたまま宿主の腸に到着できるようにした入手可能な製剤を作ることが望ましい。
【００１０】
したがって、生物学的利用能および生物学的活性を確保することにより、蜂花粉に加えられる微生物のプロバイオティクスの効果を保証する組成物を提供することが不可欠である。
【００１１】
国際出願PCT/EP2011/072756は、本明細書で蜂花粉/粘土複合体と表され、安定化でき、一回量として配合でき、未加工の蜂花粉を投与できる蜂花粉および粘土の組合せを記載しているが、事前に特徴付けられ、培養され、とりわけ凍結乾燥された、プロバイオティクス用途の微生物を投与するための担体としての使用については熟慮されていない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
粘土および蜂花粉の前記組合せが、プロバイオティクス用途の微生物の理想的な投与系を形成し、この形成は、胃の酸度、胆汁および膵液からの必要な保護を組合せに与えること;発現に必須な、および凍結乾燥させた微生物の場合は再活性化の前に必須な食品を用意し、強靭な生命力を有する微生物を体内で生じさせ、消化環境に自然に適合できるようにすること;微生物を生きたまま腸に送達し、腸内で留めさせ、放出することによると今般発見されており、これが本発明の目的の1つである。
【００１３】
したがって、第1の目的によれば、本発明は、
- プロバイオティクス用途の1種または複数の微生物、および
- 蜂花粉および粘土をベースとする複合体を含む組成物に関する。
【００１４】
別の目的によれば、本発明は、とりわけ凍結乾燥させた、プロバイオティクス用途の微生物を投与するため、特に前記微生物のバイオロード(bioload)および生物学的利用能を改善するための担体として、蜂花粉/粘土をベースとする複合体を使用することにも関する。
【００１５】
したがって、本発明によれば、蜂花粉/粘土複合体は、胃の通過時、胆汁および膵液との接触時に保護を確保し、発現に必要な、および微生物が凍結乾燥されている場合は、再活性化の前に必要な食品を用意できる、プロバイオティクス用途の微生物に理想的な保護生息環境および栄養的な生息環境を形成することが実証された。
【００１６】
複合体に関しては、微生物を生きたまま腸まで維持し、生物学的特性、ひいては宿主の腸の微生物叢における平衡について生理学的な利点を保存することができる。
【００１７】
特に、蜂花粉/粘土複合体は、生命力が強靭であり、消化環境に適合する、プロバイオティクス用途の生きた微生物が体内で増殖するために好都合な環境を用意する。さらに、プロバイオティクス用途の微生物の生存率がpH3を下回ることが問題となる場合、本発明による組成物の蜂花粉/粘土担体は、緩衝液の効果で細胞寿命と適合する値でpHを維持することにより胃内酸度から微生物を保護できる可能性を示し、したがって胃のpHから微生物を単離し、胃の通過の終了時に微生物が体内で発生できるようになることが実証された。この保護は腸内へと通過するときに続くことが実証された。
【００１８】
体内での発生は、蜂花粉/粘土複合体における微生物の増加能力、および複合体を投与される宿主の生理学的な環境(とりわけ消化器系の条件)への適応能力により理解される。
【００１９】
≪蜂花粉/粘土複合体≫は、あらゆる植物種に由来する蜂花粉がケイ酸塩のラメラ構造に結合することにより生じる、あらゆる安定な、または≪無水≫材料を意味する。国際出願PCT/EP2011/072756は、蜂花粉および粘土の組合せについて記載しており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００２０】
本発明の意味において、≪蜂花粉≫は、蜂が得た花粉を意味する。これは、蜂により花の雄器から抽出された植物の受粉媒介要素であり、花から花へと塊になり、巣まで運搬される。通常の方法によれば、あらゆる手段で、とりわけ巣に入る直前に(花粉ハッチにより)得ることができる。
【００２１】
本発明の意味において、この≪蜂花粉≫という用語は、抽出方法および/または保存に関係なく、蜂によって採取された花粉に当てはまる。
【００２２】
本発明の意味において、≪蜂花粉≫という用語は、未加工の花粉の特性を維持できるあらゆる形態の蜂花粉を表す。したがって、とりわけ、未加工の蜂花粉ならびに事前に冷凍した蜂花粉を含む。
【００２３】
本発明の範囲内において、蜂花粉は、様々な植物種から生じる可能性があり、特定の花に限定されない。したがって、ライムギ、トウモロコシ、ヒマワリ、ハンニチバナ、クリ、キウイフルーツ、ヤナギ、ケシ、ラベンダーおよびヘザーなどからの蜂花粉が挙げられる。
【００２４】
蜂花粉、とりわけ冷凍蜂花粉は、商用、例えばPollenergieのものであってもよい。
【００２５】
蜂花粉は、元の植物の性質ならびに収穫期間、収穫方法またはさらに地理上の区域(国、地方)に、土地ごとに応じて、様々な組成のものであってよい。
【００２６】
したがって、本発明に適している未加工の蜂花粉は、一般に、5%から36%の水、および64%から95%の乾燥材料を含有し、そのうち、後者は:
- 2.5%から3.8%の鉱物塩;
- 4.2%から19.8%の脂質;
- 8%から30%のアルブミン;
- 5%から7%のデンプン;
- ビタミン;
- 増殖因子;
- 葉酸;
- ポリフェノール;
- 植物ステロール;
- 発酵体および酵母を含有する。
【００２７】
≪粘土≫は、粘土鉱物、例えばケイ酸塩水和物、とりわけケイ酸アルミニウムまたはマグネシウムを含む材料を意味する。1つまたは複数のシートからなる積層構造を有するフィロケイ酸塩がとりわけ好ましい。
【００２８】
シート構造の厚さに基づくJozjaの分類に従って、4種類の粘土が識別される:
i)7Åの鉱物:厚さが約7Å、これは、カオリナイト類である(カオリン、ハロイサイト…)
ii)10Åの鉱物:厚さが約10Å、これは、イライト類である(イライト、海緑砂…)
iii)14Åの鉱物:厚さが約14Å、これは、スメクタイト類である(モンモリロナイト、ベントナイト、ガスール…)
iv)繊維鉱物:シートの厚さが様々である;これらは、緑泥石または繊維鉱物と呼ばれる(海泡石、アタパルジャイト…)。
【００２９】
したがって、本発明による≪粘土≫という用語は、これらの4種の粘土を指す。粘土質の鉱物として、イライト、緑泥石;海緑砂、カオリナイト、アタパルジャイト、海泡石およびモンモリロナイトが挙げられる。粘土として、カオリン、イライト、モンモリロナイト、アタパルジャイトがとりわけ好ましく、より具体的にはモンモリロナイトが好ましい。
【００３０】
本発明の意味において、微生物は、とりわけ非病原性および非毒性の細菌および酵母をとりわけ含む顕微鏡的生物を意味する。
【００３１】
本発明の意味において、プロバイオティクス用途の微生物は、配合する前に特徴付けられ、培養される微生物を意味し、十分な量で生きたまま腸に送達される場合、宿主に健康および/または栄養上の利点を与えることになる。
【００３２】
本明細書で使用される≪特徴付けられる≫という用語は、本明細書では、とりわけ株(複数可)の性質、および場合により濃度(複数可)を知るべく同定されている株(複数可)により構成される微生物を指す。
【００３３】
ある実施形態によれば、本発明に従って特徴付けられる微生物は、蜂花粉に加えられる。ある実施形態によれば、蜂花粉に加えられる微生物は、とりわけ蜂花粉に自然に存在する微生物の性質、数、構造と区別できる。ある実施形態によれば、凍結乾燥させた微生物が加えられる。
【００３４】
酵母として、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)が挙げられる。細菌として、基本的に乳酸菌、例えば乳酸桿菌、ビフィズス菌および他の乳酸菌が挙げられる。
【００３５】
本発明によれば:
- 乳酸桿菌として、とりわけ、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・アミロボラス(Lactobacillus amylovorus)、乳酸短杆菌(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・セロビオス(Lactobacillus cellobiose)、ラクトバチルス・クリスパトゥス(Lactobacillus crispatus)、ラクトバチルス・クルバトゥス(Lactobacillus curvatus)、デルブリュック菌(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・ファルシミニス(Lactobacillus farciminis)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス・ガセリ(Lactobacillus gasseri)、ラクトバチルス・ガリナラム(Lactobacillus gallinarum)、ラクトバチルス・ヘルベティカス(Lactobacillus helveticus)、ラクトバチルス・ジョンソニー(Lactobacillus johnsonii)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・プランタラム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ルーテリ(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・ラクティス(Lactobacillus lactis)が挙げられる。
【００３６】
- ビフィズス菌として、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス(Bifidobacterium adolescentis)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム・ラクティス(Bifidobacterium lactis)(ビフィドバクテリウム・アニマリス(Bifidobacterium animalis)として再分類される)、ビフィドバクテリウム・ラテロスポラス(Bifidobacterium laterosporus)、ビフィドバクテリウム・ロンガム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム(Bifidobacterium thermophilum)が挙げられる。
【００３７】
- 他の乳酸菌は、とりわけ、大便レンサ球菌(Enterococcus faecalis)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、乳酸連鎖球菌(Lactococcus lactis)、ロイコノストック・メセンテロイデス(Leuconostoc mesenteroides)、ペディオコッカス・アシディラクティシ(Pediococcus acidilactici)、スポロラクトバチルス・イヌリナス(Sporolactobacillus inulinus)、ストレプトコッカス・ジアセチラクティス(Streptococcus diacetylactis)、ストレプトコッカス・インターメディウス(Streptococcus intermedius)、ストレプトコッカス・サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)を含む。
【００３８】
- 乳酸菌でないものとして、バチルス属菌(Bacillus spp)、大腸菌(Nissle株)、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ(Propionibacterium freudenreichii)が挙げられる。
【００３９】
乳酸桿菌およびビフィズス菌は、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(ビフィダス(bifidus))、ビフィドバクテリウム・ラクティス、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ラクトバチルス・ルーテリ、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・プランタラム、ラクトバチルス・ラムノサス種がとりわけ好ましい。
【００４０】
これらのプロバイオティクス用途の微生物は、一般に、商用である。
【００４１】
本発明に適している前記微生物は、一般に、蜂花粉/粘土複合体に加えられる前および含まれる前に、単離され、凍結乾燥され、特徴付けられ、および/または培養される。
【００４２】
実際に、好ましい実施形態によれば、この定義は、蜂花粉/粘土複合体に自然に存在し、複合体に包含される前に、単離されていない、特徴付けられていない、培養されていない、および/または凍結乾燥されていない微生物をカバーしていない。
【００４３】
凍結乾燥させたプロバイオティクス用途の微生物は、本発明の範囲に入る。
【００４４】
プロバイオティクス用途の微生物は、凍結乾燥形態で販売されるものが大多数を占める。凍結乾燥、または低温条件下での乾燥は、室温において安定にし、それにより保存しやすくするために、材料、食料品または生成物に含有される水を除去できるようにする細分に基づく方法である。
【００４５】
凍結乾燥は、他の乾燥または保存方法と比較して多くの利点を含む。
・食料品が、昇華中に氷点下の温度に置かれる場合、凍結乾燥により、大部分の食料品の品質を保存できる可能性が得られる。凍結乾燥の使用は、乳酸菌の場合、熱に高度に感受性があるため特に重要である。
・凍結乾燥させた食料品は、一般に、それらを保持するための冷蔵を必要としない。したがって、保存および運搬コストをかなり低下させることができる。
・凍結乾燥により、質量の著しい減少が引き起こされ、凍結乾燥させた食料品、例えば、水を90%まで含有する複数の食料品が大幅に運搬しやすくなる。したがって、これらは凍結乾燥後に10分の1に軽量化する。
・凍結乾燥させた食料品の大半は、多孔テクスチャにより、きわめて急速に戻る。実際に、凍結乾燥は、体積の大幅な減少を一切引き起こさない。したがって、水は、食料品の分子構造において、容易に本来の位置に戻る。
【００４６】
凍結乾燥させた微生物は、乾燥させることにより休眠状態になる。したがって、本発明に従って、生きたまま到着させるためには微生物を腸で再活性化されなければならず、宿主の腸で健康に有益な作用を発揮させなければならない。
【００４７】
本発明によれば、蜂花粉/粘土複合体は、これらの凍結乾燥させた細菌の再活性化を可能にする担体の典型となることが実証されている。
【００４８】
したがって、この担体は、好都合な環境の典型であり、栄養摂取、保護、発現に理想的であり、微生物が経口的に投与される場合は凍結乾燥させた微生物、微生物の再活性化に理想的である。
【００４９】
一般に、本請求による組成物は、
- 0.1%から70%の凍結乾燥させたプロバイオティクス、および
- 30%から99.9%の前記複合体を含み、
割合は、質量によるものと理解され、
より具体的には、
- 3%から30%の凍結乾燥させたプロバイオティクス、および
- 70%から97%の前記複合体を含み、
割合は、質量によるものと理解される。
【００５０】
蜂花粉/粘土複合体は、一般に、
- 4%から90%の蜂花粉、および
- 10%から96%の粘土を含み、
割合は、質量によるものと理解される。
【００５１】
より優先的には、本発明による複合体は、
- 20%から40%の蜂花粉
- 60%から80%の粘土を含み、
より具体的には、
- 30%から35%の蜂花粉、および
- 65%から70%の粘土を含む。
【００５２】
本発明による複合体は、有利には、500μm未満の粒径、15%未満の湿度および/または0.75未満の水分活性(aw)を有する。
【００５３】
一般に、本発明による組成物は、とりわけ以下の特性を有する粉末として生じる:
【００５４】
【表１】
2015514720.tif 000002
【００５５】
有利には、本発明による組成物は、胃耐性形態、とりわけ胃耐性ゼラチンカプセル剤の形態で製剤化してもよい。
【００５６】
本発明によれば、プロバイオティクス用途の微生物および蜂花粉/粘土複合体の胃耐性製剤により、体内で生じる発酵体と共にバイオロードを増加させることができる一方で、蜂花粉/粘土複合体を伴わずに胃耐性ゼラチンカプセル剤の形態で配合した微生物は、生存能力水準にかなり影響を受けることも想定外に実証された。
【００５７】
有利には、凍結乾燥させたプロバイオティクスと共に投入される蜂花粉/粘土複合体は、胃耐性ゼラチンカプセル剤に配合され、胃の通過を、増殖にとって好都合な因子として組み込む。胃に含有される胃液の流れと接触するとき、胃耐性ゼラチンカプセル剤は、透過性になり;水が浸透し、微生物が増殖相を始めるために必要な湿度が得られる。
【００５８】
本発明によれば、プロバイオティクス用途の微生物を経口的に投与する担体として蜂花粉/粘土複合体を使用することにより、
- 包装による有害効果から、プロバイオティクス用途の微生物を保護できる可能性;
- 組成物に含まれる、凍結乾燥させたプロバイオティクス用途の微生物を、再活性化できる可能性;
- 組成物に含まれる、プロバイオティクス用途の微生物を供給し、生存能力を維持できる可能性;
- 胃内酸度から、プロバイオティクス用途の微生物を保護できる可能性;
- 胆汁および膵液から、プロバイオティクス用途の微生物を保護できる可能性;
- 体内でプロバイオティクス用途の微生物を生じさせて、消化環境に適合させることができる可能性;
- 微生物の腸粘膜への付着および相互反応を促進する場合、腸の生息環境に微生物を放出できる可能性が得られる。
【００５９】
微生物は、腸のバリアの強化に寄与し、宿主の健康に有益な作用を発揮するために、腸に留まるべきである。したがって、例えば、ビフィズス菌は、腸粘膜に付着する能力を有し、腸の上皮の様々な受容体を認識する。受容体に関して、乳酸菌は、病原体がコロニー化する見込みがある部位を塞ぎつつ、有害な抗原の通過を予防し、ひいては病原菌の増殖を避ける。乳酸菌は、利用可能な栄養素を消費し、病原体に対する栄養素の供給源を限定し、宿主の受容体につながる病原体と競合する。さらに、乳酸菌は抗微生物分子、例えばバクテリオシンを、上皮表面において、また、生息環境(例えば酸敗)においても分泌する。
【００６０】
腸において、プロバイオティクス用途の微生物の保持を増加させることにより、蜂花粉/粘土複合体は、これらの微生物および腸粘膜の有益な相互反応を促進する。腸の微生物相は、宿主の健康を維持するために有益な、必要とされる多くの生理学的機能を働かせる。腸の微生物叢の平衡を維持すること、および腸のバリアを強化することが大きな利点となる。プロバイオティクス用途の微生物は、この目標を達成するための良好な候補である。しかし、大きな難題により、微生物がプロバイオティクス活性を発揮するのが一般に妨げられる:微生物を生きたまま維持するために、微生物を適切に供給する必要があること;凍結乾燥させた微生物を再活性化させる必要があること;産業化の衝撃に対して微生物の耐性が低いこと;胃内酸度、胆汁および膵液に対して微生物の耐性が低いこと:微生物が消化環境に適応していないこと、ならびに微生物の粘膜への付着およびそれらの相互作用に障害となる微生物のプランクトン様の性質である。これらの難題を回避する方略は存在するが、すべての難題を回避できる可能性を示すものはない。例えば、単離し、培養した、胃内酸度に耐性の有益な細菌株は、再活性化されず、腸に達するであろう割合はわずかであり、そこに留まることができず、腸において効率的に相互作用しないであろう。現在、標的部位への作用を保証することにより、様々な生物学的および/または生理学的な障害を同時に克服できる担体はない。本発明は、これらの難題を大幅に取り除く可能性を示し、腸におけるプロバイオティクスの作用に必要とされる環境を微生物に提供する。
【００６１】
蜂花粉/粘土複合体は、以下の要素を得ることにより、プロバイオティクスの作用に対する、産業上の、生物学的および/または生理学的な障害すべてを同時に取り除ける可能性を示す:
・細菌を持続させるために必要とされる栄養環境
・凍結乾燥させた細菌を再活性化させるために必要とされる栄養環境
・胃内酸度への耐性
・胆汁および膵液への耐性
・消化環境への適応
・腸壁への留まりおよび送達
【００６２】
本発明は、本発明に従って組成物を調製する方法であって、
- 蜂花粉および粘土を混合する工程、
- プロバイオティクス用途の微生物を加え、混合する工程を含む方法にも関する。
【００６３】
プロバイオティクスの標的を有する前記微生物は、とりわけ粉末として凍結乾燥できる。
【００６４】
好ましくは、得られた混合物は、望ましい粒径を得るためにより分けられ得る。有利には、500μmのメッシュを有するふるいが使用される。
【００６５】
本発明は、プロバイオティクス用途の微生物を腸まで運び、それらを留まらせ、生物学的利用能および/またはプロバイオティクスの生物学的活性を腸で改善するための、蜂花粉および粘土をベースとする複合体の使用にも関する。したがって、前記複合体は、プロバイオティクス用途の微生物を投与するための生物学的ベクターである。
【００６６】
≪生物学的活性≫は、本明細書では、栄養的(とりわけ規定食の効果)および/または生理学的な効果、例えば、消費した対象において前記微生物によって発揮されるプロバイオティクスおよび治療の効果を意味する。
【００６７】
したがって、本発明は、とりわけ食品、化粧用、医薬および/もしくはガレヌス組成物、ならびに/または本発明による組成物を含む医療デバイスに関する。
【００６８】
したがって、本発明による前記組成物/装置は、ヒトおよび/または動物への使用に対して、予防および/または治癒、治療および/または栄養用途(とりわけ規定食用途)に有用である。製品の産業的形態に必要とされる賦形剤は、規制に従った許容できるすべての材料から選択されてよく(食料品、栄養補助食品、機能性食料品、化粧品、医療品(medical)、医薬デバイス)、これらの製品に影響を与える。
【００６９】
したがって、賦形剤として、とりわけ、セルロースまたは微結晶セルロースの誘導体、アルカリ土類炭酸塩、リン酸マグネシウム、デンプン、加工デンプン、固形のラクトース、水、水溶液、生理食塩水、等張溶液などを挙げることもできる。
【００７０】
ある実施形態によれば、組成物は、糖、例えば細菌が発現できるグルコースの供給源も含む。
【００７１】
本発明による組成物は、経口、舌下、局所(topical)、局所(local)、気管内、鼻腔内または直腸経路、とりわけ経口経路を経由した投与を意図した形態で目にすることができる。
【００７２】
したがってそれらは、とりわけ溶質または多用量フラスコ(multidose flask)として、あるいはコーティングしていないもしくはコーティングした錠剤、糖衣錠、カプセル剤、ソフトもしくはハードゼラチンカプセル剤、粒剤、丸剤、錠剤、粉剤、坐剤または直腸投与カプセル剤、液剤もしくは懸濁剤、またはさらにクリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、ペースト、貼付剤、食品製品、例えばヨーグルトなどで存在できる。
【００７３】
本発明は、より具体的には、胃耐性製剤、例えばペースト剤またはゼラチンカプセル剤、とりわけ、本発明の組成物を含む胃耐性ゼラチンカプセル剤を対象とする。
【００７４】
好ましくは、前記組成物は、本発明による有効量の組成物を含有する。
【００７５】
一回量および/または投与量は、広い範囲内(0.5mgから1,000mg)で様々であってよく、投与経路ならびに年齢および対象の体重によって決まってよい。
【００７６】
高い、または低い投与量が適切な場合は、特殊な例が存在し得る;そのような投与量は、本発明の範囲から逸脱する。慣行に従って、各対象に適している投与量は、投与方法、前記対象の体重および反応に従って、ならびに前記組成物における微生物の濃度に従って測定される。
【００７７】
本発明による食品組成物は、とりわけ食料品、機能性食品(functional food)(機能性食品(nutraceutical))または栄養補助食品であってよい。
【００７８】
機能性食料品または機能性食品(nutraceutical)は、一般に、従来の食料品と定義される、または、従来の食料品の側面を有するもの、通常の規定食の一部であるもの、通常の栄養機能を上回る、もしくは慢性疾患の危険性を低下させる有益な生理学的な効果が得られる特性を有するもの。
【００７９】
したがって本発明は、本発明による組成物を含む機能性食料品、例えばヨーグルトを対象とする。
【００８０】
前記組成物は、欧州指針2002/46/ECの意味において、栄養補助食品も形成する。
【００８１】
前記栄養補助食品は、有利には、一回量として、すなわち欧州指針2002/46/ECで定義した現行の形態、例えば「ゼラチンカプセル剤、ロゼンジ剤、錠剤、丸剤および他の類似した形態、ならびに少量単位で摂取されることを意図した、粉末サシェ剤、液体アンプル、スポイトを備えたフラスコおよび他の類似した液体または粉末調製物の形態」で配合される。
【００８２】
前記組成物は、欧州指針2001/83/ECの意味において、医薬品(pharmaceutical specialty)をとりわけ形成し得る。
【００８３】
前記組成物は、一般にプロバイオティクスが有益になると考えられている障害の予防および/または処置に有用になり得る。したがって、とりわけ、骨粗鬆症、心血管疾患、癌、肝臓および代謝障害、疲労、循環器障害、関節障害、更年期の症状、中枢神経系障害、胃腸系障害、眼障害、泌尿器障害、および前立腺の障害、例えば良性の前立腺発育不全、慢性前立腺炎、前立腺痛および前立腺癌、栄養、皮膚および美容皮膚科学的障害、無力症および易疲労感、回復期および術後外科、水電解質の不均衡(hydroelectrolytic unbalance)、身体的状態の改善などが挙げられる。
【００８４】
本発明による医薬組成物は、1つまたは複数の活性成分も含む。
【００８５】
本発明は、本発明による組成物を含む医療デバイスにも関する。したがって、前記組成物は、欧州指針93/42 EECの意味において、医療デバイスを形成し得る。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】理想的な生息環境中において、および蜂花粉/粘土複合体内において、凍結乾燥させた細菌(ビフィドバクテリウム・ロンガム)の発現を例示する図である。
【図２】胃耐性ゼラチンカプセル剤の形態で製剤化された組成物4種が、胃へと通過した後における発酵体の割合の増減を例示する図である:i)蜂花粉/粘土の担体において;ii)Bion Transitという製品、iii)Lactibiane ref 2.5Gという製品、iv)Arkoprobiotics defense+
【図３】胃耐性ゼラチンカプセル剤中の凍結乾燥させた細菌が、胃へと通過した後における生存率を例示する図である。
【図４】胃耐性ゼラチンカプセル剤中の蜂花粉/粘土複合体を伴う凍結乾燥させた細菌が、胃へと通過した後における再活性化を例示する図である。
【図５】胃へと通過した後における発酵体の増減、ならびに複合体を伴う、または伴わない胆汁および膵臓の作用を例示する図である。
【図６】胃、糜粥粘膜および腸液における発酵体の増加に対する蜂花粉および粘土の相乗効果を例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００８７】
以下の実施例は本発明を例示するが、本発明を限定するものではない。使用される出発生成物は公知の生成物である、または公知の作業手順に従って調製される。
【００８８】
別段指示されない限り、割合は質量によって表現される。
【実施例】
【００８９】
- 設備:
正確な電子天秤Mettler Toledo PG803
WTBバインダーオーブン(binder oven)
撹拌機-IKA Labotechnik Eurostar
pH測定器  HANNA instruments
250mLのガラスビーカー-Bomex
湾曲したスプーン状のへら、ステンレス鋼18/8 - Labo-moderne
- 原料の購買先
窒素ガス下で冷凍させたヒマワリ花粉
Pollenergie
La Grabere-47450 St Hilaire de Lusignan
電話05 53 68 11 11-Fax. 05 53 68 11 12
モンモリロナイト粘土
Argiletz
14 route d'Echampeau-77 440 Lizy sur Ourcq
電話01 60 61 20 88-Fax. 01 60 61 27 39。
【００９０】
複合体を以下の方法で調製した。
【００９１】
蜂花粉/粘土複合体150gの調製について:各成分の比率は、蜂花粉33.33パーセントに対して粘土66.66パーセントである。
- 200mlのビーカーで粘土100gを秤量する;
- 250mlのビーカーで冷凍蜂花粉50gを秤量する;
- 撹拌機の部品は、好ましくは、複合体の水和を避けるために乾燥させる;
- 粘土を混合する;
- 蜂花粉を加え、それらを30秒間混合する。
500μmメッシュを有するふるいを用いてより分けることにより、望ましい粒径が得られる。
【００９２】
10%の微生物を有する最終生成物166.67gのために、蜂花粉/粘土をベースとする組成物およびプロバイオティクス用途の微生物を、以下の方法で調製する:
- 200mlのビーカーで粘土100gを秤量する;
- 250mlのビーカーで冷凍蜂花粉50gを秤量する;
- 200mlのビーカーで微生物16.67gを秤量する;
- 撹拌機の部品は、好ましくは、複合体の水和を避けるために乾燥させる;
- 粘土を混合する;
- 蜂花粉を加え、それらを30秒間混合する;
- 微生物を加え、それらを30秒間混合する;
500μmメッシュを有するふるいを用いてより分けることにより、望ましい粒径が得られる。
【００９３】
(実施例1)
蜂花粉/粘土複合体が、栄養的な生息環境をもたらし、凍結乾燥させた細菌を再活性化できる能力の実証
凍結乾燥させた細菌を再活性化するために不可欠な原料の必要性は、文献で報告されている。
【００９４】
これらの原料(糖、タンパク質、ナトリウムなど)、および凍結乾燥させた細菌を再活性化するために最適な比率(必要量%)が、下表にて最初の2つの欄で示されている。この表の3つめの欄は、蜂花粉/粘土複合体に含有されるこれらの様々な原料の割合を示す。
【００９５】
【表２】
2015514720.tif 000003
【００９６】
したがって、文献で、および蜂花粉/粘土担体に含有されている要素で報告されているように、凍結乾燥させた細菌を再活性化するために不可欠な要素の間で完全な一致が見出される。
【００９７】
理想的な栄養生息環境内および蜂花粉/粘土複合体内における、ビフィドバクテリウム・ロンガム菌の発現は、以下の方法により実証された。
1-その細菌を理想的な培地に播種し、他の菌を蜂花粉/粘土複合体と共に当量で播種した。
2-これらの例の両方に対して計数を行った。
【００９８】
図1に例示されている結果から、蜂花粉/粘土複合体は、細菌を再活性化および増殖させることが示される。
【００９９】
(実施例2)
商用製品と比較した蜂花粉/粘土の酸度に対する耐性の実証
以下の商用製品3つを使用した。
Bion transit
特定のプロバイオティクスの株:ラクトバチルス・プランタラム299vを備えたBion transit。
Bion transitは、腸が過敏であり、頻繁に腸障害:不快感、困難、消化異常、鼓腸、不規則な腸輸送などが起きやすい人を対象とすることを意図されている。
【０１００】
この製品では、ゼラチンカプセル剤当たり10,000,000,000(100億個)のプロバイオティクスが提供されると主張されている。
【０１０１】
Lactibiane Reference 2.5G
Lactibiane Referenceのプロバイオティクス株は、GRAS (Generally Regarded As Safe)であると保証され、「Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes de l'institut Pasteur」で預けられていた。これらは、以下の株4種である:
- ビフィドバクテリウム・ロンガム  LA 101
- ラクトバチルス・アシドフィルス  LA 102
- 乳酸連鎖球菌  LA 103
- ストレプトコッカス・サーモフィラスLA 104
【０１０２】
Lactibiane Reference  2.5Gは、腸の微生物叢の維持に寄与し、最初の週からすぐに消化の快適さを改善し、消化管輸送を調節する。これは、消化障害(鼓腸など)の場合、および冬季に障害を予防する場合に助けとなることがある。
【０１０３】
この製品では、ゼラチンカプセル剤当たり10,000,000,000(100億個)のプロバイオティクスが提供されると主張されている。
【０１０４】
Arkoprobiotics defenses +
Arkoprobiotics defenses +は、複数の株から生じた凍結乾燥させたプロバイオティクスの選抜を含有する:
- ラクトバチルス・パラカゼイ
- ラクトバチルス・プランタラム
- ラクトバチルス・ラムノサス
【０１０５】
Arkoprobiotics defense +は、とりわけ冬の間および季節の変わり目に、生物の自然防御を強化し、ならびに腸の微生物叢で再度均衡を取る助けとなる。これは、微生物の生命力の平衡に寄与する。
【０１０６】
この製品では、ゼラチンカプセル剤当たり50,000,000,000(500億個)のプロバイオティクスが提供されると主張されている。
【０１０７】
操作手順:
胃耐性ゼラチンカプセル剤であるApproPharm(254 chemin de la  Farlede-83500 La Seyne sur Mer)の調製キットを用いて、蜂花粉/粘土複合体または商用製品の細菌株を含有する胃耐性ゼラチンカプセル剤を製造した。
【０１０８】
コーティングの操作手順は以下の通りである:
・蜂花粉/粘土複合体および商用製品で満たしたゼラチンカプセル剤を、液体に10秒間浸す。
・いかなる付着も避けるために頻繁に撹拌することにより、カプセル剤をふるい上で乾燥させる。
・10分待ち、次いで第2の層を加える:ゼラチンカプセル剤を溶液に5秒間浸し、次いでカプセルを先述のように乾燥させる。
・10分待ち、次いで第3の層を加える:ゼラチンカプセル剤を溶液に5秒間浸し、次いでカプセルを先述のように乾燥させる。
・10分待ち、次いで第4の層を加える:ゼラチンカプセル剤を溶液に5秒間浸し、次いでカプセルを先述のように乾燥させる。
・10分待ち、次いで第5の層を加える:ゼラチンカプセル剤を溶液に5秒間浸し、次いでカプセルを先述のように乾燥させる。
【０１０９】
ゼラチンカプセル剤の酸性生息環境における耐性について確信を得るために、試験を実施した。4時間後でもカプセル剤は破れなかったので、酸性生息環境に対して優れた耐性を示した。
【０１１０】
実験条件
それにより調製した胃耐性ゼラチンカプセル剤に、以下の実験条件を施した。
【０１１１】
したがって、ゼラチンカプセル剤は、
- 500ml(胃の食前体積)の
- 温度37℃(体温)のオーブンで維持した
- pH2(胃含有物の酸度)の酸性溶液に
- 合計4時間(胃における輸送の持続時間)にわたり
- 機械的撹拌下(胃の収縮)で置いた。
【０１１２】
実験終了時、ゼラチンカプセル剤は無傷のままであった(破れていないゼラチンカプセル剤は、含有物を分散させる)が、わずかに透過性になった。乳酸発酵体の計数を達成するために、ゼラチンカプセル剤の含有物を単離し、分析した。
【０１１３】
乳酸発酵体の計数
QSA-Qualite Securite Alimentation-Site d'Agropole-BP 125-47931 Agen Cedex 9により乳酸発酵体の計数を実行した。
【０１１４】
胃耐性ゼラチンカプセル剤内の、および消化前における蜂花粉/粘土複合体に存在する乳酸発酵体の計数は、グラム当たり60,000CFUを示す。消化後、蜂花粉/粘土複合体は、グラム当たり80,000CFUの数の乳酸菌を有する。
【０１１５】
複合体を一切伴わずに、胃耐性ゼラチンカプセル剤に入れられた商用製品に対する、消化後における乳酸発酵体の計数は以下の通りである:
Bion Transit 40CFU/g
Lactibiane reference 2.5G 190,000CFU/g
Arkoprobiotics defenses + 40,000CFU/g
【０１１６】
蜂花粉/粘土複合体における、消化中における発酵体の変化、および商用製品3種が図2で例示されている。胃耐性ゼラチンカプセル剤に配合された商用製品により、1%未満の発酵体が再活性化されたことが示された。胃耐性ゼラチンカプセル剤としての蜂花粉/粘土担体により、発酵体の数が消化中に33%増加した可能性が示される。
【０１１７】
(実施例3)
凍結乾燥させた細菌の再活性化における蜂花粉/粘土複合体の影響
1)バッチの調製
- 凍結乾燥させた細菌単体(純粋な商用の株)
対
- 蜂花粉/粘土複合体に含まれる、同一の凍結乾燥させた細菌
【０１１８】
対照製品の量および/またはガレヌス形態(1,000,000から2,000,000個の間)とは別個に、類似した量の微生物が、各バッチに含まれる。
【０１１９】
蜂花粉/粘土複合体に含まれる凍結乾燥させた細菌を、以下の方法で調製した:
【０１２０】
1,000,000-2,000,000個の量に相当する体積の凍結乾燥させた細菌を、複合体に加えた。混合物を撹拌機によって30秒間均一化した。
【０１２１】
2)実施例2の手順に従って、胃耐性ゼラチンカプセル剤を調製した。
【０１２２】
3)次いで、ゼラチンカプセル剤に以下の実験条件を施した。したがって、ゼラチンカプセル剤を:
- 500ml(胃の食前体積)の
- 温度37℃(体温)のオーブンで維持した
- pH2(胃含有物の酸度)の酸性溶液に
- 合計4時間(胃における輸送の持続時間)にわたり
- 機械的撹拌下(胃の収縮)で置いた。
【０１２３】
実験の前後で、承認第1344号(approval agreement no.1344)の範囲内であるプログラム59-農産供給品の微生物学的分析(program 59 - microbiological analysis of agri-feed products)についてCOFRAC (French Approval Committee)により承認された、ある独立した微生物学分析研究所により、乳酸発酵体の計数が実行された。
【０１２４】
得られた結果は以下の通りである:
1.蜂花粉/粘土複合体を伴わない試料
胃へと通過させる前にゼラチンカプセル剤に入れる前の、凍結乾燥させた商用の細菌(手順の工程2および3は実行されない):
胃へと通過させる前の凍結乾燥させた細菌:
ビフィドバクテリウム・ロンガム800CFU/g
ラクトバチルス・アシドフィルス41,000,000CFU/g
ビフィドバクテリウム・ビフィダム75,000,000CFU/g
胃へと通過した後の、胃耐性ゼラチンカプセル剤に入れた、凍結乾燥させた商用の細菌(手順の工程1、2および3):
ビフィドバクテリウム・ロンガム40CFU/g
ラクトバチルス・アシドフィルス160,000CFU/g
ビフィドバクテリウム・ビフィダム32,000CFU/g
【０１２５】
胃へと通過した後で、乳酸発酵体の増減の割合を計算した。各細菌に対する割合が、図3において例示されている。
【０１２６】
2.蜂花粉/粘土複合体を伴う試料
胃へと通過させる前にゼラチンカプセル剤に入れる前の、複合体を伴う凍結乾燥させた細菌(手順の工程2および3は実行されない):
ビフィドバクテリウム・ロンガム1,900,000CFU/g
ラクトバチルス・アシドフィルス1,800,000CFU/g
ビフィドバクテリウム・ビフィダム1,100,000CFU/g
胃へと通過した後の、胃耐性ゼラチンカプセル剤に入れた、凍結乾燥させた商用の細菌(手順の工程2および3は実行されない):
ビフィドバクテリウム・ロンガム7,400,000CFU/g
ラクトバチルス・アシドフィルス2,600,000CFU/g
ビフィドバクテリウム・ビフィダム2,600,000CFU/g
【０１２７】
胃へと通過した後で、乳酸発酵体の増減の割合を計算した。単独または蜂花粉/粘土複合体を伴う、各細菌に対する割合が図4に例示されている。
【０１２８】
胃耐性ゼラチンカプセル剤に配合される蜂花粉/粘土複合体により、凍結乾燥させたプロバイオティクスにおいて消化中に発酵体が増加する。
【０１２９】
胃耐性ゼラチンカプセル剤として配合される凍結乾燥させたプロバイオティクスは、少なくとも95%の発酵体を消化中に失う。
【０１３０】
これらの結果により、以下が示される:
-  蜂花粉/粘土複合体によって導入された発酵体が増殖したことによる、未加工の蜂花粉に自然に含まれる細菌への効果は、凍結乾燥させた細菌にも及び得る。
- 蜂花粉/粘土複合体は、凍結乾燥させたプロバイオティクスを再活性化するための最適な担体である。
- 蜂花粉/粘土複合体は、増殖、植え付けひいてはプロバイオティクスの投与のために担体として使用される。
【０１３１】
(実施例4)
腸の研究
腸に達する細菌が、様々な分泌液によって分解されないこと、および腸粘膜に付着する細菌が重大な課題であると実証することは、科学的および産業上の潜在性を表す。
【０１３２】
実際に、プロバイオティクスが腸に達する場合、健康に対して作用を発揮させるために、プロバイオティクスは、細菌の特異性に応じて、担体と相互作用できるように腸壁に付着するために、胃から十二指腸までのpHの上昇に耐えなければならず、胆汁塩および膵臓酵素の影響に耐えなければならない。
【０１３３】
本発明の研究は、評価する目的を有する:
- pH(胃および腸のpH)変化、ならびに様々な流体(胆汁塩および膵臓酵素)に対するプロバイオティクス耐性
- 腸壁へのプロバイオティクスの付着
したがって、試験は2つの実験を含む:
- 人工的な生息環境についての試験は、胃から十二指腸までのpHの生理学的な変化、および酵素的な影響に対するプロバイオティクスの耐性を測定できる可能性を示す:この試験は、胃の生息環境に対するプロバイオティクスの耐性について(および以前から再確認されていた結果について)研究した、以前の研究における腸の値である程度完了するであろう;
- 腸におけるex-vivo研究は、腸管腔におけるプロバイオティクスの生存率および腸粘膜に対する付着の両方を測定するために、外植する。
【０１３４】
手順
1.試験される試料
この研究中に試験されなければならないであろう試料は:
- 粘土単体
- 花粉単体
- プロバイオティクス単体(ビフィドバクテリウム・ロンガム)
- 蜂花粉/粘土複合体
- 蜂花粉/粘土複合体+プロバイオティクス
- Bion、Lactibiane、Arkoprobiotics製品
【０１３５】
対照(生理食塩水)は、これらの試料と同時に、並行して生成されることになる。
【０１３６】
均一性のために、すべての試料を1号サイズのゼラチンカプセル剤に入れ、4℃で保持した。
【０１３７】
ビフィドバクテリウム・ロンガムのような、商用のプロバイオティクスを胃耐性ゼラチンカプセル剤に入れたことを示した実施例1-3は、従来のゼラチンカプセル剤の使用と比較して、生存率に関して何も利点を有しておらず、蜂花粉/粘土複合体、およびプロバイオティクスを伴う蜂花粉/粘土複合体を含む試料だけを、以下の手順に従った胃耐性ゼラチンカプセル剤へと包装した。
・プロバイオティクスを伴う、または伴わない蜂花粉/粘土複合体で満たしたゼラチンカプセル剤を液体中に10秒間浸す。
・いかなる付着も避けるために頻繁に撹拌することにより、カプセル剤をふるい上で乾燥させる。
・10分待ち、次いで第2の層を加える:ゼラチンカプセル剤を溶液に5秒間浸し、次いでカプセル剤を先述のように乾燥させる.
・10分待ち、次いで第3の層を加える:ゼラチンカプセル剤を溶液に5秒間浸し、次いでカプセル剤を先述のように乾燥させる.
・10分待ち、次いで第4の層を加える:ゼラチンカプセル剤を溶液に5秒間浸し、次いでカプセル剤を先述のように乾燥させる.
・10分待ち、次いで第5の層を加える:ゼラチンカプセル剤を溶液に5秒間浸し、次いでカプセル剤を先述のように乾燥させる.
【０１３８】
2.胃相のin vitro模擬実験
試料の全体に実施例2の手順を施す。
胃において、試料に、以下の方法で再現された多くの生理学的なパラメータを施した:
- 500ml(胃の食前体積)の
- 温度37℃(体温)のオーブンで維持した
- pH2(胃含有物の酸度)の酸性溶液に
- 合計4時間(胃における輸送の持続時間)にわたり
- 撹拌下(胃の収縮)で、試料を希釈した。
インキュベーション後:
- ビフィドバクテリウム・ロンガムを伴う蜂花粉/粘土複合体の場合、これらのゼラチンカプセル剤の含有量を、微生物学的観点から分析した;
- 非胃耐性ゼラチンカプセル剤の場合、胃液も微生物学的観点から分析した;
- 62.5mlの胆汁および膵液の抽出物を胃液に加えた。この液体の試料(腸の糜粥)を微生物学的観点から分析した。
【０１３９】
3.胃のpHから腸のpHへの通過
4時間のインキュベーションの終了時、1.2%の胆汁抽出物および0.2%の膵液を有する0.2Mの重炭酸ナトリウム溶液からなる62.5mlの溶液を胃液に加えた。
【０１４０】
4.外植片についての研究:予備試験
4.1.動物モデルの選択
動物モデルとしてブタを選択した。この動物は、ヒトに最も近い消化の生理機能を伴う:ブタの胃腸管は、構造的な観点からヒトのものと類似している(Heinzら、1987年、J. Gen. Virol. 68、2495-2499頁)。
【０１４１】
4.2.ブタの腸の回収
食品用を意図して、この動物を食肉解体した後に回収した腸(いかなる病変も認められない)を生理学的な溶液に入れた。溶液は、蒸留水、および1,000分の9に希釈した塩化ナトリウム(NaCl)(=NaClの質量/体積で0.9%、すなわち9g/lの溶液)からなる。使用する前に、溶液に、154ミリ当量/lのNa+およびCl-を含有させ、次いで、リンガー溶液を用いて腸を洗浄する。
【０１４２】
十二指腸空腸で6cm×27cmの縦切片を調製し、リンガー溶液中で保持した。
【０１４３】
5.腸相の模擬実験
微小細菌の腸粘膜への付着を考察するために、ある器具を開発し、以下のパラメータを用いてブタの腸の外植片における消化の模擬実験を行った:
【０１４４】
適正なpHに調整した胃の糜粥の含有物を、700mmのステンレス鋼容器の1種に入れる。プロペラを用いて胃腸の動きを模倣するように、含有物を継続的に撹拌した(1分当たり20回転)。
【０１４５】
ブタの腸を、以下の特徴を有する板に配置する:
- 6.8cm×22cmの、傾斜した(11°)ステンレス鋼板であり、蠕動をモデリングできる柔軟かつ歯状の膜で覆われている。この動きは、速度0.5cm/分のコンベヤーベルトで生み出される。
【０１４６】
次いで、腸を板に配置する。腸が板に適切に配置されると、ベルトが稼働し、以下の条件下で、腸液が2時間にわたり持続して流れる:
- 37℃の一定温度でブタの腸を維持すること
- ブタの腸を乾燥させないように、湿度測定を制御する(80%)こと
- チャンバの内部空気が、窒素(N2)95%および空気5%からなること
- 実験相中は暗所でブタの腸を維持すること。
【０１４７】
6.測定
2時間後、腸は
- 支えから除去する;
- 横断面に切り取る;
- 顕微鏡下で観察し、微生物学的計数を行うために塗擦する。
【０１４８】
腸を通過し、回収パン中に収集された液体を微生物学的観点から分析する。
【０１４９】
腸を通過する前の液体も、微生物学的観点から分析する。試料において、乳酸微生物叢の微生物学的分析を実行する(NF ISO 15214).
【０１５０】
腸を通過する前、通過中および通過後の、微生物学的計数に関する結果は、グラム当たりのコロニー形成単位(CFU)として伝達される。これにより、様々な値が比較でき、見込まれる増殖が評価できる。分析した腸の表面積が腸全体の表面積を上回り:この比が考慮される。
【０１５１】
細胞形態を評価した。花粉粒の一体性も評価する。
【０１５２】
結果および検討
この研究の目標は、胃内酸度、次いで輸送中におけるpHの上昇、胆汁塩および膵臓酵素との接触に対するプロバイオティクスの耐性、様々な腸の流体に対するプロバイオティクスの生存率ならびに腸壁への付着を評価することである。
【０１５３】
1.胃相に対する発酵体の生存率の評価
実施例1-3により、細菌が蜂花粉/粘土複合体を伴わない場合は、消化により、細菌が生存できなかったことが示される。
【０１５４】
同一の生理学的な背景において、蜂花粉/粘土複合体は、摂取したプロバイオティクスの量の増加を促進する。バイオロードは、複合体が存在すると増加する一方、同時に、複合体の保護なしでは、プロバイオティクス(ビフィドバクテリウム・ロンガム)は外見上すべて死滅する。
【０１５５】
したがって、胃を通過することは、複合体により保護される場合は、細菌の増殖にとって好都合な因子として含まれる。胃に含有される水と接触する際に、胃耐性ゼラチンカプセル剤は透過性になり、水が浸透し、再活性化されるために細菌が必要とする湿度をもたらし増殖相を開始する、但し、複合体のように、細菌が十分な栄養蓄積を有する場合に限られる。
【０１５６】
このきわめて重要な再活性化、および複合体内における増殖工程は、複合体のプロバイオティクス活性における主な中心線である。
【０１５７】
1.胆汁塩および膵液に対する発酵体の生存率の評価
胃内酸度および胆嚢-膵臓の分泌液は、摂取されたプロバイオティクスの細菌を再活性化するための主な内因性機構である。
【０１５８】
複合体は、胃相になり次第、新たな細菌の発現を体内で促進し、さらに、胆汁および酵素液と接触している間に改善される。腸を通過する前の、腸液に含有される微生物叢の計数は、胆汁および膵液と接触する際のプロバイオティクスの生存率に対する複合体の寄与を測定できる可能性を示す。プロバイオティクスは、生存どころか増殖を続け、増進させる。
【０１５９】
得られた結果により、複合体を一切伴わずに、78,750個のプロバイオティクス(ビフィドバクテリウム・ロンガム)が、腸液において存続することが示される。細菌を含有する複合体の場合、101,250,000個が計数される。これは、複合体を伴わずに試験した商用製品と比較して、それぞれ46、>100,000,000、600倍の数を表す(それぞれBion、Lactibiane、Arkoprobiotics)。
【０１６０】
それらを生きたまま維持するという事実に加え、蜂花粉/粘土複合体は、腸液において乳酸菌を発現できる。
【０１６１】
さらにそれどころか:胃の生息環境における生存率および増殖は基本的かつ測定できる特徴であるが、体内での耐性および増殖といった現象は、胆汁に接触させると増進する。したがって、胃相の末端から腸相の始端まで7.79倍で増加が観察される。
【０１６２】
これらの結果は、複合体は細菌を保護するだけではなく、複合体はさらに細菌の発現を確保することを示す。
【０１６３】
実際、図5に例示したように、保護されていない場合は、胃を通過し、胆汁および膵臓酵素の影響を受けた後に、初期のプロバイオティクスのわずか0.05%しか残存しない。一方、同一条件を施した、同一のプロバイオティクスは、それらが複合体に含まれる場合、1,165.63%増加する。
【０１６４】
これらの結果により、蜂花粉/粘土複合体が、消化中の胃内酸度または膵液および胆汁の両方から細菌を保護し、発現を促進することが示される。
【０１６５】
3.流れの末端で収集した腸液に存在するプロバイオティクスの評価
腸および大腸に沿って通過し続けるであろう腸液に含有される数を観察することも重要である。
【０１６６】
得られた結果により、流れの末端で収集された腸液に含有されるバイオロードは、複合体を有する発酵体が7700万個あることが示される。複合体がなければ、腸液に細菌は340万個しかおらず、すなわち22.65分の1である。
【０１６７】
複合体は、細菌を、商用製品(それぞれBion、LactibianeおよびArkoprobiotics)よりもそれぞれ23,424および636倍多く有することができる可能性も示す。
【０１６８】
4.腸粘膜における複合体の付着の評価
研究の別の測定点は、腸粘膜における複合体および細菌の付着に関する。粘膜における有益な作用を有するために、プロバイオティクスは粘膜に付着しなければならない。
【０１６９】
4.1.顕微鏡的評価
研究した腸相の前後、すなわち、ビフィドバクテリウム・ロンガムを伴う複合体を含有する腸液の流れの前後に写真を撮影した。粘膜の、流の前と後にきわめて著しい差異が認められる。実際に、オレンジ色の被覆は、腸液と接触している腸の全面にわたって目にすることができる。写真は、花粉の特徴である黄色が存在することを鮮明に示し、粘土の「マント」から放出される瞬間である。
【０１７０】
この視覚的観察により、以下が確認されると考えられる:
- 流れ、およびそれに伴う機械力を伴うがあるにもかかわらず、腸壁において複合体が存在する。
- 複合体の能力はin situで分離するようになること。
【０１７１】
顕微鏡下での腸の観察は、単離した粘土および花粉(粘土の「マント」によって取り巻かれていてもいなくても)が存在することを正確に考察できる可能性を示す。
【０１７２】
大きく拡大すると、粘膜において、粘土の「マント」を伴う花粉粒を見ることができるが、特に粘土の構造を除いた花粉粒も特に見ることができ、粘土コーティングを取り除いた花粉粒の能力が実証される。この段階で放出されていない花粉粒は、いずれも腸の道筋に沿って放出できるであろう。
【０１７３】
これらの観察により、花粉および粘土の間の連結は腸で破壊されることがあり、発酵体および花粉の含有物が放出されることが示される。ある花粉粒は、依然として粘土で覆われている場合、腸の道筋を進み続け、徐々に消化管から解離することがある。
【０１７４】
4.2.微生物学的評価
ブタの腸は異種であるため、調査した腸の表面に加えられた3つの切片の計数の平均を用いて、微生物学的なデータを分析する。
【０１７５】
腸全体にわたる腸液の流れの末端(消化終了)で、粘膜を塗擦して試料採取した、腸の粘液に含有されるバイオロードは、凍結乾燥させた細菌(ビフィドバクテリウム・ロンガム)について582,650CFU/gであり、それに対してこの細菌が複合体に含まれると5,160,000である。したがって、蜂花粉/粘土複合体が、ベクターとして使用される場合、腸粘膜における細菌は9倍多く見出される。複合体は、腸粘膜に、商用製品(それぞれLactibiane、BionおよびArkoprobiotics)よりそれぞれ69、301および818倍多く細菌を有することができる可能性が示される。
【０１７６】
腸を通過した後で採取した液体において、複合体に存在する細菌および複合体を一切伴わない細菌の比は、22倍以上であった。これらの比の両方におけるこの差異は、複合体をプロバイオティクスの担体として使用する最中において、腸液におけるきわめて多数のバイオロードが、微小発酵体(microferments)を有する腸粘膜を満たしているということにより説明される。
【０１７７】
さらに、これにより細菌を腸液に含有させて(進ませ続けて増加させることになり、その後腸の道筋に沿って)消化管の後続部分をコロニー化できる。
【０１７８】
したがって、蜂花粉/粘土複合体は、プロバイオティクスが腸粘膜へと付着することを促進する良好な因子である。
【０１７９】
4.3.インプリント(imprint)の評価
乳酸微生物叢は、複合体を伴う場合は、より優れた付着性を有する。末梢作用も、全体の微生物叢において観察される。乳酸微生物叢に対する複合体の利点に加えて、複合体は全体の微生物叢の制御にも作用するとみられ、複合体が存在すると後者は著しく減少する。
【０１８０】
全体の微生物叢の発現は、複合体の有無を問わず腸の一部のインプリントにおいて全体的に異なる。ビフィドバクテリウム・ロンガム菌は単体で、全体の微生物叢のきわめて著しい発現を伴うインプリントを生み出す(インプリントは無数)。一方、複合体がビフィドバクテリウム・ロンガム菌を伴う場合、ごく少数のコロニー(10から20の間)しか発現しない。反対に、乳酸微生物叢では著しい発現が観察される。これは、望ましくは植えつけられた微生物叢(プロバイオティクス)は、消化粘膜において、全体の微生物叢と実際に競合することになり、全体の微生物叢の損傷部分に植えつけられることを意味する:これは、正確には、プロバイオティクスの使用中が望ましいものである。
【０１８１】
したがって、この部のパラグラフ2から4で言及された結果の包括的結論は、以下の通りである:
- 複合体により、胆汁および膵液の害からプロバイオティクスを生存させることができる;
- それどころか、これらのプロバイオティクスを高度に著しく増殖させ、生息環境に適合させることができる;
- 複合体により、これらのプロバイオティクスを腸粘膜に付着させることができる;
- 花粉は、細菌を放出するために、複合体から徐々に離れることができる;
- きわめて大量の備わった微生物叢、およびその強靭な生存能力により、局所(local)微生物叢を備わった微生物叢に植えつけることができる。
【０１８２】
5.蜂花粉/粘土複合体原料の相乗効果の評価
この研究に使用される試料のうち、あるものは粘土単体に含まれ、またあるものは花粉単体に含まれる。したがって、個々に摂取される成分の効果および研究によって得られた結果を計算し、重み付けをすることで予想される効果を比較して、複合体の利点を見積もることができる:複合体の相乗効果を観察する:
【０１８３】
【表３】
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【０１８４】
したがって、それにより、複合体のすべての段階で相乗効果を考察できる:
【０１８５】
胃、糜粥、粘膜、腸液における発酵体の増加における蜂花粉および粘土の相乗効果が、図6で例示される。
【０１８６】
複合体により、乳酸菌の数が、評価した値と比較して、糜粥で92.683%、腸粘膜で489%、および腸液で2.271%増加する。
【０１８７】
ブタの腸で得られた、これらのex-vivoの結果により、胃内酸度および輸送中におけるpHの上昇、胆汁塩および膵液との接触に対するプロバイオティクスの耐性ならびに様々な腸の流体に対する生存率および腸壁への付着に対する生存率に対するプロバイオティクスの耐性を評価できる。
【０１８８】
蜂花粉/粘土複合体の有益な寄与は、消化のすべての相で実証された。
【０１８９】
結論:
胃相中では、胃耐性ゼラチンカプセル剤に包装される場合、蜂花粉/粘土複合体により、それらを伴う発酵体を再活性化できる。これは、「新たな」乳酸菌を再活性化させ、増殖させるための担体の選択である。
【０１９０】
腸相中では、最初の相で、複合体は、胆汁および膵液と接触させられ、これは細胞生存能力に影響を及ぼさず、ひいてはそれどころか増殖能力はそのままであり、増加する。
【０１９１】
腸の輸送中、複合体は粘膜に容易に付着する。顕微鏡的観察により、花粉粒は、粘土の「マント」から放出され、in situで細胞質を放出することが示される。腸粘膜における発酵体の計数により、複合体が、腸壁および腸管腔の流れの両方で、腸におけるバイオロードの放出を実際に開始できる可能性を示す。主な利点は、成分、例えば粘土の効果を吸収する、ある内因系の特徴である相乗効果にみられる複合体により異なる。したがって、花粉の栄養的な寄与は、粘土で細菌の不可逆的な吸着を妨げる能力により完了される。腸粘膜表面におけるプロバイオティクスのこの増加により、全体の微生物叢において役割も果たし、その発現は減少する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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