(57)【要約】本明細書に開示されるのは、新規な可溶性ＩＧＦレセプターＦｃ融合タンパク質および組成物、ならびに血管新生関連疾病ならびに癌および転移のような悪性疾患を治療するためのその使用方法であって、前記融合タンパク質は特異的にＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２に結合する。【選択図】図２８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体のＦｃ部分および可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質を含む融合タンパク質であって、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、または配列番号１８の配列を含む、前記融合タンパク質。
【請求項２】
抗体のＦｃ部分および可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質を含む融合タンパク質であって、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、または配列番号１８の配列からなる、前記融合タンパク質。
【請求項３】
請求項１または２に定義される融合タンパク質の生物活性フラグメントまたは類似体。
【請求項４】
前記生物活性フラグメントまたは類似体が、前記融合タンパク質に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項３の生物活性フラグメントまたは類似体。
【請求項５】
前記生物活性フラグメントまたは類似体が、前記融合タンパク質の結合特異性を保持する、請求項３または４の生物活性フラグメントまたは類似体。
【請求項６】
請求項１から５のいずれかに定義される融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体をコードする核酸。
【請求項７】
前記核酸が配列番号１１、１３、１５、もしくは１７の配列を有する、またはその縮重改変体である、請求項６の核酸。
【請求項８】
配列番号１１、１３、１５、もしくは１７の配列、またはその縮重改変体を含む、核酸。
【請求項９】
配列番号１１、１３、１５、もしくは１７の配列、またはその縮重改変体からなる、核酸。
【請求項１０】
配列番号１１、１３、１５、または１７の配列と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸。
【請求項１１】
前記核酸が、請求項１または２に定義される融合タンパク質の生物活性または結合特異性を有するポリペプチドをコードする請求項８〜１０のいずれかに記載の核酸。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれかに定義される融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体、および薬学的に許容可能な担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１３】
対象における血管新生関連疾病または転移疾患を治療するための、請求項１から５のいずれか１項の融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体、または、請求項１２の薬学的組成物の使用。
【請求項１４】
前記融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体、または組成物が、腫瘍転移、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、多発性骨髄腫、多形膠芽細胞腫、肝癌、肝臓癌、膀胱癌、肺腫瘍、または膵臓癌の治療に用いられる請求項１３の使用。
【請求項１５】
前記肝癌が肝臓転移である、請求項１４の使用。
【請求項１６】
治療に有効な量の、請求項１から５のいずれか１項の融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を、血管新生関連疾病を有する対象に投与することを含む、前記対象における血管新生を阻害する方法。
【請求項１７】
前記血管新生関連疾病が癌である、請求項１６の方法。
【請求項１８】
前記血管新生関連疾病が、腫瘍転移、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、多発性骨髄腫、多形膠芽細胞腫、肝癌、肝臓癌、膀胱癌、肺腫瘍、または膵臓癌である、請求項１６の方法。
【請求項１９】
前記肝癌が肝臓転移である、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を、他の血管新生阻害剤と組み合わせて投与することをさらに含む、請求項１６から１９のいずれか１項の方法。
【請求項２１】
請求項１から５のいずれか１項の融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を発現するように遺伝子組換えされた自己細胞を、血管新生関連疾病を有する対象に投与することを含む、前記対象における血管新生を阻害する方法。
【請求項２２】
前記自己細胞は、骨髄由来間葉系間質細胞である請求項２１の方法。
【請求項２３】
前記血管新生関連疾病が癌である、請求項２１または２２の方法。
【請求項２４】
前記癌が腫瘍転移、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、多発性骨髄腫、多形膠芽細胞腫、肝癌、肝臓癌、膀胱癌、肺腫瘍、または膵臓癌である、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記肝癌が肝臓転移である、請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を、他の血管新生阻害剤と組み合わせて投与することをさらに含む、請求項２１から２５のいずれか１項の方法。
【請求項２７】
請求項１から５のいずれか１項の融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を前記対象に投与することを含む、治療を必要とする対象において癌を治療する方法。
【請求項２８】
前記癌が転移疾患である、請求項２７の方法。
【請求項２９】
前記癌が、腫瘍転移、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、肝臓癌、膀胱癌、肺腫瘍、膵臓癌、多発性骨髄腫、多形膠芽細胞腫、または肝臓転移である、請求項２７の方法。
【請求項３０】
前記融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を、血管新生阻害剤と組み合わせて投与することをさらに含み、前記血管新生阻害剤および前記融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体が同時にまたは連続的に投与される、請求項２７から２９のいずれか１項の方法。
【請求項３１】
前記融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体および前記他の血管新生阻害剤が、同時にまたは連続的に投与される、請求項２０または２６の方法。
【請求項３２】
対象における血管新生関連疾病を予防または治療する方法であって、請求項１から５のいずれか１項の前記融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を、前記対象に投与することを含み、血管新生は、前記血管新生関連疾病が予防または治療されるように、前記対象において阻害される、前記方法。
【請求項３３】
対象における、腫瘍転移、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、多発性骨髄腫、多形膠芽細胞腫、肝癌、肝臓癌、膀胱癌、肺腫瘍、または膵臓癌を予防または治療する方法であって、腫瘍転移、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、多発性骨髄腫、多形膠芽細胞腫、肝癌、肝臓癌、膀胱癌、肺腫瘍、または膵臓癌が予防または治療されるように、請求項１から５のいずれか１項の前記融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３４】
前記融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体が、注入を介して投与される、請求項１６から３３のいずれか１項の方法。
【請求項３５】
前記注入が静脈内または腹腔内である、請求項３４の方法。
【請求項３６】
前記融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体が経口投与される、請求項１６から３３のいずれか１項の方法。
【請求項３７】
前記融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を、１つまたはそれ以上の他の抗癌剤または療法と組み合わせて投与することをさらに含む、請求項１６から３６のいずれか１項の方法。
【請求項３８】
前記融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体および１つまたはそれ以上の他の抗癌剤または療法は、同時にまたは連続的に投与される、請求項３７の方法。
【請求項３９】
前記抗癌剤または療法は、外科手術、放射線、化学療法、または標的癌治療である、請求項３７または３８の方法。
【請求項４０】
前記標的癌治療は、小分子、モノクローナル抗体、癌ワクチン、アンチセンスヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、または遺伝子治療である、請求項３９の方法。
【請求項４１】
請求項１から５のいずれか１項の融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体、および薬学的に許容可能な担体を含む、対象における転移を治療するための薬学的組成物。
【請求項４２】
請求項１から５のいずれか１項の融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体、および薬学的に許容可能な担体を含む、対象における癌を治療するための薬学的組成物。
【請求項４３】
前記癌が腫瘍転移、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、多発性骨髄腫、多形膠芽細胞腫、肝癌、肝臓癌、膀胱癌、肺腫瘍、または膵臓癌である、請求項４２の薬学的組成物。
【請求項４４】
前記肝癌が肝臓転移である、請求項４３の薬学的組成物。
【請求項４５】
配列番号１１、１３、１５、もしくは１７の配列、またはその縮重改変体を含むベクター。
【請求項４６】
抗体のＦｃ部分および可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項４７】
前記抗体はヒトＩｇＧ抗体である、請求項４６の融合タンパク質。
【請求項４８】
前記抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である、請求項４７の融合タンパク質。
【請求項４９】
前記融合タンパク質はＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２と特異的に結合する、請求項４６から４８のいずれか１項の融合タンパク質。
【請求項５０】
前記融合タンパク質はＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２と少なくともほぼ同じ親和性で結合する、または、前記融合タンパク質のＩＧＦ−２に対する親和性は前記融合タンパク質のＩＧＦ−１に対する親和性よりも高い、請求項４６から４９のいずれか１項の融合タンパク質。
【請求項５１】
前記融合タンパク質のインスリンに対する親和性は、前記融合タンパク質のＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２に対する親和性よりも少なくとも約１０００倍低い、請求項４６から５０のいずれか１項の融合タンパク質。
【請求項５２】
前記融合タンパク質は、インスリンに検出可能に結合しない、請求項４６から５１のいずれか１項の融合タンパク質。
【請求項５３】
前記可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質は、配列番号１もしくは６のアミノ酸配列を有するＩＧＦ−ＩＲ細胞外ドメイン、またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を含み、および／または前記可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質は配列番号１または６の四量体構造を形成する、請求項４６から５２のいずれか１項の融合タンパク質。
【請求項５４】
前記可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質は、配列番号１もしくは６、またはその生物活性フラグメントもしくは類似体からなる、請求項４６から５３のいずれか１項の融合タンパク質。
【請求項５５】
前記可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＩＧＦ−ＩＲ細胞外ドメイン、またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を含む、請求項４６から５４のいずれか１項の融合タンパク質。
【請求項５６】
前記可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質は配列番号１または６の四量体構造を形成する、請求項４６から５５のいずれか１項の融合タンパク質。
【請求項５７】
前記可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質は、配列番号１もしくは６、またはその生物活性フラグメントもしくは類似体からなる、請求項４６から５２および５６のいずれか１項の融合タンパク質。
【請求項５８】
前記融合タンパク質は配列番号８または１０の配列を含む、請求項４６の融合タンパク質。
【請求項５９】
前記融合タンパク質は配列番号８または１０の配列からなる、請求項１の融合タンパク質。
【請求項６０】
請求項４６から５９のいずれか１項に定義される融合タンパクの生物活性フラグメントまたは類似体。
【請求項６１】
前記生物活性フラグメントまたは類似体が、前記融合タンパク質に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または、少なくとも９８％の配列同一性を有する、請求項６０の生物活性フラグメントまたは類似体。
【請求項６２】
前記生物活性フラグメントまたは類似体が前記融合タンパク質の結合特異性を保持する、請求項６０または６１の生物活性フラグメントまたは類似体。
【請求項６３】
請求項４６から６２のいずれか１項に定義される融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体をコードする核酸。
【請求項６４】
前記融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体は、配列番号５、７、もしくは９の配列またはその縮重改変体を有する核酸によりコードされる、請求項４６から６３のいずれか１項に定義される融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体。
【請求項６５】
配列番号５、７、もしくは９の核酸配列またはその縮重改変体を有する核酸。
【請求項６６】
請求項４６から６２および６４のいずれか１項に定義される融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体、および薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物。
【請求項６７】
請求項４６から６２および６４のいずれか１項に定義される融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体、および薬学的に許容可能な担体を含む、対象において癌を治療するための薬学的組成物。
【請求項６８】
請求項４６から６２および６４のいずれか１項に定義される融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体の治療に有効な量を、対象に投与することを含む、血管新生関連疾病を有する対象において血管新生を阻害するための方法。
【請求項６９】
請求項４６から６２および６４のいずれか１項に定義される融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を、対象に投与することを含む、治療を必要とする対象において癌を治療する方法。
【請求項７０】
前記血管新生関連疾病が癌である、請求項６８の方法。
【請求項７１】
前記癌が、腫瘍転移、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、肝臓癌、膀胱癌、肺腫瘍、膵臓癌、多発性骨髄腫、多形膠芽細胞腫、または肝臓転移、である請求項７０の方法。
【請求項７２】
前記融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体が、注入を介して静脈内、腹腔内、または経口的に投与される、請求項６８から７１のいずれか１項の方法。
【請求項７３】
前記融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体が１つまたはそれ以上の他の抗癌剤または療法と組み合わせて投与される、請求項６８から７２のいずれか１項の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１１年１２月１５日出願の米国仮出願第６１／５７６，０３４号の優先権を主張し、その全体の内容が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、新規な可溶性ＩＧＦレセプターＦｃ融合タンパク質および組成物、並びに、癌および転移を治療するためのこれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｉ型インスリン様成長因子レセプター（ＩＧＦ−ＩＲ）は、悪性疾患の進行における重要な役割を果たす。増加したＩＧＦ−ＩＲおよび／またはそのリガンドの発現は、多くのヒト悪性腫瘍で記録され、高血漿ＩＧＦ−Ｉレベルは、乳癌、前立腺癌、結腸癌のような悪性腫瘍の潜在的なリスク因子として識別された（非特許文献１）。近年のデータは、ＩＧＦ軸（ＩＧＦ  ａｘｉｓ）はいくつかのメカニズムを通じて腫瘍浸潤および転移を促進し、いくつかの臓器の部位、特にリンパ節および肝臓に対する転移の決定因子として識別される、ということを示している（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献１、非特許文献４）。ＩＧＦレセプターは、腫瘍細胞の生存および第２の部位での増殖を調節することにより、また、内皮細胞への直接の作用を通じて、もしくは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ＡおよびＣの転写調節により、血管新生およびリンパ血管新生を促進することによっても、転移に影響を与え得る（（非特許文献５)において見直された）。
【０００３】
ＩＧＦ−ＩＲリガンドは、３つの構造的に相同なペプチドＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、およびインスリンを含むが、レセプターは、ＩＧＦ−Ｉと最も高い親和性で結合する。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩに関する内分泌物産生の主要な部位は肝臓である（非特許文献６）が、心臓、筋肉、脂肪、脾臓、および腎臓のような肝臓外の部位におけるオートクリン／パラクリンＩＧＦ−Ｉ産生が記載されている。ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩの生理活性およびバイオアベイラビリティーが、６つの分泌される、高親和性結合タンパク（ＩＧＦＢＰ１−６）との関連を通じて調節される。
【０００４】
ＩＧＦ−ＩＲは、種々の腫瘍タイプにおける抗癌療法に関する標的として検証される。多くのＩＧＦ−ＩＲ阻害剤は、臨床または前臨床開発されている（例えば、非特許文献７、非特許文献８、非特許文献５）。しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＩＧＦ−Ｉシステムの標的化は、いくつかの課題を提起する：第１に、ＩＧＦ−Ｉおよびインスリンレセプター間の高い程度の相同性により、ＩＧＦ軸を標的とする薬物が、グルコースおよび脂質代謝上の望ましくない効果により、インスリンレセプター／インスリン軸にも影響を及ぼすかもしれない。高血糖は、実は、抗ＩＧＦ−ＩＲ療法の望ましくない効果の１つとして観察されてきた（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。さらに、ＩＧＦ−Ｉシグナリングの阻害が、インスリン非感受性を導く、変化した血清の成長ホルモンレベルをもたらすかもしれず、膵臓のインスリン産生の低下と糖尿病を引き起こす可能性があり得る（非特許文献７）。第２に、抗体ベースの療法の使用は、いくつかの実験にみられるような、血液毒性を導くＡＤＣＣ反応をもたらすかもしれない（非特許文献１３、非特許文献７）。さらに、腫瘍のいくつかは高い親和性を有するＩＧＦ−ＩＩと結合し得る、インスリンレセプター（ＩＲ−Ａ）のアイソフォームＡも発現し、このことが、ＩＧＦ−ＩＲが抗体治療またはキナーゼ阻害剤により中和された、癌細胞に関する代替的な生存メカニズムを提供するかもしれない（非特許文献７）。
【０００５】
悪性疾患の治療のために、可溶性リガンドの活性をアンタゴナイズするための可溶性のレセプター（デコイ（ｄｅｃｏｙ））の使用が、可能性のある療法処置として教示され、いくつかの病状に関して、受け入れられた療法の形態なってきている。デコイレセプターは、後者のレセプターに関する、結合およびリガンドバイオアベイラビリティーの減少により、同族の、膜結合レセプターの生物活性を阻害し得る（非特許文献１４）。現在の例は、炎症病状の治療に関し、日常的に臨床で用いられる可溶性のＴＮＦレセプター（エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ））（非特許文献１５）、並びに、癌および他の病状の治療に関し臨床実験中であるＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ（アフリベルセプト（Ａｆｌｉｂｅｒｃｅｐｔ））（非特許文献１６）を含む。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Samani et al., 2007, Endocr Rev, 28: 20-47
【非特許文献２】Long et al., 1998, Exp Cell Res, 238: 116-121
【非特許文献３】Wei, et al., 2006, Ann Surg Oncol, 13: 668-676
【非特許文献４】Reinmuth et al., 2002, Clin Cancer Res, 8: 3259-3269
【非特許文献５】Li, S. et al., In: Liver metastasis:Biology and Clinical Management 2011; Brodt P., Editor: 233-72
【非特許文献６】Werner & Le Roith, 2000, Cell Mol Life Sci 57: 932-942
【非特許文献７】Zha, J. and Lackner, M.R., Clinical Cancer Research 2010; 16: 2512-7
【非特許文献８】Gualberto, A. and Pollak, M., Oncogene 2009; 28: 3009-21
【非特許文献９】Karp, D.D. et al., J. Thorac. Oncol. 2009; 4: 1397-403
【非特許文献１０】Bruchim, I., et al., Expert Opinion on Therapeutic Targets 2009; 13: 1179-92
【非特許文献１１】Sachdev, D. and Yee, D., Mol. Cancer Ther. 2007; 6: 1-12
【非特許文献１２】Rodon, J. et al., Mol. Cancer Ther. 2008; 7: 2575-88
【非特許文献１３】Reidy, D.L., et al., Journal of Clinical Oncology; 28: 4240-6;
【非特許文献１４】Rudge, et al., 2007, Proc Natl Acad Sci USA, 104: 18363-18370
【非特許文献１５】Richard-Miceli, C. and Dougados, M., BioDrugs 2001; 15: 251-9
【非特許文献１６】Rudge, J.S. et al., Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology 2005; 70: 411-8
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
これらの薬剤は、高い特異性があり、高い親和性でリガンドに結合し、薬剤のいくつかの望ましくない効果をオフターゲット活性で回避するので、それらは抗体ベースの療法を超えて利点がある。
このように、可溶性ＩＧＦ−Ｉレセプターは、例えば、インスリン系との交叉反応、ＡＤＣＣ関連血液毒性、およびインスリンレセプターアイソフォームＡ（ＩＲ−Ａ）の補整効果（ｃｏｍｐｅｎｓａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ）のような、現在のＩＧＦ標的化薬物のいくつかの欠点を、潜在的に克服し得る。
【０００８】
よって、癌および転移を含む、血管新生関連疾病および悪性疾患を治療するための、可溶性ＩＧＦ−１レセプターが提供されることが非常に望ましい。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の広い態様によれば、抗体のＦｃ部分および可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質を含む融合タンパク質が提供される。Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体のような、例えば、ヒトＩｇＧ抗体由来であることとしてもよい。
【００１０】
ある態様では、本明細書で提供される融合タンパク質は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、少なくともほぼ同じ親和性でＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に結合する。いくつかの実施形態では、インスリンに対する融合タンパク質の親和性は、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２に対するものより少なくとも約１０００倍低い。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、インスリンに対して検出可能に結合されない。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質のＦｃ部分は、変更されたＦｃ部分を含む。一実施形態では、融合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＣｙｓ残基を取り除くために、例えば、１つまたはそれ以上のＣｙｓ残基をＳｅｒ残基で置換するために、変更されたＦｃドメインを含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、１１ａａリンカーを、より長い、さらなるフレキシブルリンカー、例えば、２２ａａまたは３７ａａフレキシブルＧＳリンカーで置換するために、変更されたＦｃドメインを含む。一実施形態では、融合タンパク質は、１つまたはそれ以上のＣｙｓ残基を取り除くため、例えば、１つまたはそれ以上のＣｙｓ残基をＳｅｒ残基で置換するため、および、１１ａａリンカーを、より長い、さらなるフレキシブルリンカー、例えば、２２ａａまたは３７ａａフレキシブルＧＳリンカーで置換するため、の両方のために、変更されたＦｃドメインを含む。いくつかの実施形態では、変更されたＦｃドメインを有する融合タンパク質は、ＨＭＷ種（ＨＭＷ  ｓｐｅｃｉｅｓ）を産生せず、または、変更されていないＦｃドメインと比較して低減された量のＨＭＷ種を産生する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質は、配列番号１もしくは６のアミノ酸配列を有するＩＧＦ−ＩＲの細胞外ドメイン、またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を含む、または、これらからなる。他の実施形態では、可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を有する全長ＩＧＦ−ＩＲの細胞外ドメインのアミノ酸配、またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を含む、または、これらからなる。可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質は、配列番号１、４、または６の四量体構造を形成することとしてもよい。
【００１３】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８（Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ、ＩｇＧ１）もしくは配列番号１０（Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ、ＩｇＧ２）の配列、またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を含む、または、これらからなる。融合タンパク質の生物活性フラグメントまたは類似体は、例えば、融合タンパク質に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有することとしてもよい。生物活性フラグメントまたは類似体は、融合タンパク質の結合特異性をも保持することとしてもよい。
【００１４】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２（ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１  Ｍｏｄ＃１）、配列番号１４（ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１  Ｍｏｄ＃２），配列番号１６（ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１  Ｍｏｄ＃３）、配列番号１８（ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１  Ｍｏｄ＃４）の配列、またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を含む、または、これらからなる。融合タンパク質の生物活性フラグメントまたは類似体は、例えば、融合タンパク質に対する、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有することとしてもよい。生物活性フラグメントまたは類似体は、融合タンパク質の結合特異性を保持をもすることとしてもよい。
【００１５】
融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体をコードする核酸もまた提供される。例えば、融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体は、配列番号５、７、もしくは９の配列、またはその縮重改変体（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｖａｒｉａｎｔ）を有する核酸にコードされることとしてもよい。実施形態では、融合タンパク質が、配列番号１１、１３、１５、もしくは１７の配列、またはこれらの縮重改変体、を有する核酸によりコードされる。一実施形態では、配列番号５、７、９、１１、１３、１５、もしくは１７の配列に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する核酸が、本明細書で提供される。本明細書に開示される核酸を含むベクターも提供される。
【００１６】
他の態様では、融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体、および薬学的に許容可能な担体、を含む薬学的組成物が提供される。
【００１７】
さらに他の態様では、対象における、癌または転移のような血管新生関連疾病または悪性疾患を治療するための、融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体、またはその組成物、の使用を提供する。例えば、本発明の融合タンパク質または組成物は、腫瘍転移、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、肝臓癌、膀胱癌、肺腫瘍、膵臓癌、多発性骨髄腫、多形膠芽細胞腫、または肝臓転移を治療するために用いられることとしてもよい。腫瘍転移、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、肝臓癌、膀胱癌、肺腫瘍、膵臓癌、多発性骨髄腫、多形膠芽細胞腫、または肝臓転移のような、血管新生関連疾病を有する対象における血管新生を阻害する方法もまた、本明細書で提供される。癌または腫瘍転移を予防または治療する方法および組成物もまた、本明細書で提供される。
【００１８】
さらなる態様では、融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を発現するために遺伝子組換えされた、自己細胞、例えば、樹状細胞、肝細胞、または間質細胞を、対象に投与することを含む、血管新生関連疾病を有する患者において血管新生を阻害する方法が提供される。自己細胞は、例えば、間質細胞、例えば、骨髄由来間葉系間質細胞であることとしてもよい。
【００１９】
さらに、さらなる態様では、本明細書で提供される方法は、融合タンパク質またはその生物活性フラグメントもしくは類似体、またはその組成物を、他の血管新生阻害剤と組み合わせて、および／または１つまたはそれ以上の他の抗癌剤と組み合わせて、投与することをさらに含む。２つまたはそれ以上の因子を同時にまたは連続的に投与することとしてもよい。
【００２０】
さらに他の態様では、融合タンパク質もしくは生物活性フラグメントまたは類似体、またはその組成物は、注入、例えば、静脈内または腹腔内注入を介して投与される。他の態様では、融合タンパク質もしくは生物活性フラグメントまたは類似体、またはその組成物は、経口投与される。
【００２１】
一実施形態では、本明細書では、抗体のＦｃ部分および可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質を含む融合タンパク質が提供される。一実施形態では、融合タンパク質は、ヒトＩｇＧである抗体を含む。一実施形態では、抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ２抗体である。一実施形態では、融合タンパク質は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に特異的に結合する。一実施形態では、融合タンパク質は、少なくともほぼ同じ親和性でＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２と結合する。他の実施形態では、ＩＧＦ−２に対する融合タンパク質の親和性は、ＩＧＦ−１に対する融合タンパク質の親和性より高い。さらに他の実施形態では、インスリンに対する融合タンパク質の親和性は、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−２に対する融合タンパク質の親和性より少なくとも約１０００倍低い。一実施形態では、融合タンパク質は、インスリンに対して検出可能に結合しない。
【００２２】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１もしくは６のアミノ酸配列を有するＩＧＦ−ＩＲの細胞外ドメイン、またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を含む可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質を含む。一実施形態では、可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質は、配列番号１または６の四量体構造を形成する。他の実施形態では、可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質は、配列番号１もしくは６、またはその生物活性フラグメントもしくは類似体からなる。さらに他の実施形態では、可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質は、配列番号４のアミノ酸配列を有するＩＧＦ−ＩＲの細胞外ドメイン、またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を含む。
【００２３】
一実施形態では、融合タンパク質は、抗体のＦｃ部分および可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質を含み、可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質は、配列番号１もしくは６、またはその生物活性フラグメントもしくは類似体からなる。
【００２４】
一実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８または配列番号１０の配列を含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２、１４、１６、または１８の配列を含む。さらなる他の実施形態では、本明細書では、配列番号８、１０、１２、１４、１６、または１８の配列からなる融合タンパク質が提供される。さらなる実施形態では、本明細書では、配列番号７、９、１１、１３、１５もしくは１７の核酸、またはその縮重改変体によりコードされる、アミノ酸配列を含む融合タンパク質が提供される。さらに、さらなる実施形態では、本明細書では、配列番号７、９、１１、１３、１５、もしくは１７の核酸またはその縮重改変体によりコードされる、アミノ酸配列からなる融合タンパク質が提供される。
【００２５】
本発明の性質をこのように一般的に記載し、参照は、図示、その好ましい実施形態を経て示される、添付の図面に対してなされるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、ｓＩＧＦ１Ｒ（ＴｒａｐＤ）およびＦｃ−ｓＩＧＦ１Ｒ（ＴｒａｐＥ）の最良の生産者を識別するために、安定して形質導入される細胞株のＣＨＯプールのサブクローニングを示す。ＣＨＯ細胞プールの３つのサブクローンが分離される：ＣＨＯ−Ｃｕｍ２−ＣＲ５−ＩＧＦ１Ｒ−９−３３−１−６；ＣＨＯ−Ｃｕｍ２−ＣＲ５−ＩＧＦ１Ｒ−１０−４８−２−５；およびＣＨＯ−Ｃｕｍ２−ＣＲ５−ＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−１６−１３−１−６。各サブクローンに関し、６００，０００細胞／ｍｌが３７℃で２日間および３００℃で７日間培養された。サンプルを、変性、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、１２μｌ／レーン、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）トリス−グリシン１０％ＴＧ１．５により分析した。レーンは以下のとおりである。１：ＩＧＦ１Ｒ−９−３３−１−６プール；２：ＩＧＦ１Ｒ−９−３３−１−６クローン＃５；３：ＩＧＦ１Ｒ−９−３３−１−６クローン＃６；４：ＩＧＦ１Ｒ−９−３３−１−６クローン＃１０；５：ＩＧＦ１Ｒ−１０−４８−２−５プール；６：ＩＧＦ１Ｒ−１０−４８−２−５クローン＃５；７：ＩＧＦ１Ｒ−１０−４８−２−５クローン＃８；８：ＩＧＦ１Ｒ−１０−４８−２−５クローン＃１２；９：ＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−１６−１３−１−６プール；１０：ＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−１６−１３−１−６クローン＃４；１１：ＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−１６−１３−１−６クローン＃５；１２：ＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−１６−１３−１−６クローン＃７。
【図２】図２は、その後ゲル濾過される、カルシウムハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムを用いるｓＩＧＦ１Ｒ（ＴｒａｐＤ）の精製を示す。ハイドロキシアパタイトカラムに関し、１７０ｍｌの４００倍に濃縮され、かつ透析濾過された（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｅｄ）ｓＩＧＦ１Ｒが２５ｍｌのＣＨＴカラムにロードされた。サンプルを、変性、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）トリス−グリシン１０％ＴＧ１．５により分析した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは（Ａ）に示される。レーン１〜９のサンプルはＣＨＴカラム由来であり、レーン１０〜１７はゲル濾過カラム由来であり、表示されるようにラン＃３から４である。レーンは以下のように示される。１：フィード（Ｆｅｅｄ）（非濃縮），５μｇ／レーン；２：浸透（Ｐｅｒｍｅａｔｅ）；３：フィード（濃縮）；４：フロースルー（Ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ），０から１１５ｍｌ；５：フロースルー＋チェイス（ｃｈａｓｅ）；６：プールＡ２−Ａ７，１５％Ｂ１；７：プールＡ３−Ａ５，１５％Ｂ１；８：プールＡ１０−Ｂ１，２０％Ｂ１；９：プールＢ３−Ｂ７，１００％Ｂ２（ＣＩＰ）；１０：高分子量マーカー（詳細は図のＢ部分に示される）；１１：ラン＃３  Ａ６（５μｇ）；１２：ラン＃３  Ａ７（５μｇ）；１３：ラン＃３  Ａ１０（範囲外）；１４：ラン＃４  Ａ６（５μｇ）；１５：ラン＃４  Ａ７（５μｇ）；１６：ラン＃４  Ａ１１（範囲外）；１７：精製ＩＧＦ１Ｒ−ＣＨＴ−ＧＦ，２．６μｇ。分子量マーカーは、（Ｂ）に詳細に示される。カラムから取集された分画に関する文字および番号（Ａ２〜Ａ７、Ｂ１、Ａ３〜Ａ５、Ａ１０〜Ｂ１、Ｂ３〜Ｂ７、Ｂ２）、文字および番号は分画収集器のラックのチューブの位置を示す。
【図３】図３は、その後ゲル濾過される、カルシウムハイドロキシアパタイト（ＣＨＴ）カラムを用いるＦｃ（ＩｇＧ１）−ｓＩＧＦ１Ｒ（ＴｒａｐＥ）の精製を示す。サンプルは、変性、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）トリス−グリシン１０％ＴＧ１．５により分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、（Ａ）に示される。レーン１〜５のサンプルはＣＨＴカラム由来であり、レーン６〜１５はゲル濾過カラム由来である。レーンは以下のように示される。１：Ａ９−Ａ１２；２：Ｂ１−Ｂ６；Ｂ７−Ｃ１；４：Ｃ１０−Ｄ３；５：Ｅ５−Ｅ８；６：フィード（５μｌ）；７：フィード（２μｌ）；８：Ａ９−Ａ１０；９：Ａ１１−Ａ１２；１０：Ｂ１−Ｂ３；１１：Ｂ６；１２：Ｂ８−Ｂ９；１３：Ｂ１０−Ｂ１１；１４：Ｂ１２−Ｃ１；および１５：精製ＩＧＦ１Ｒ−ＣＨＴ−ｈＦｃ−ＧＦ，２．６μｇ。赤の矢印は、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ四量体の予想される位置；ＨＭＷ：高分子量マーカーを示す。分子量マーカーは、（Ｂ）に詳細に示される。カラムから取集された分画に関する文字および番号（Ａ９〜Ａ１２、Ｂ１〜Ｂ６、Ｂ７〜Ｃ１、Ｃ１０〜Ｄ３、Ｅ５〜Ｅ８等）、文字および番号は分画収集器のラックのチューブの位置を示す。
【図４】図４は、プロテインＡクロマトグラフィーを用いるＦｃ（ＩｇＧ１）−ｓＩＧＦ１Ｒ（ＴｒａｐＦおよびＧ）の精製を示す。サンプルは、変性、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）トリス−グリシン４〜２０％ＴＧ１．５により分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは（Ａ）に示される。レーン１〜４のサンプルは、ＴｒａｐＦの精製由来であり（ｐＨ４で溶出）、レーン１：２μｌ；レーン２：１μｌ；レーン３：０．５μｌ；レーン４：０．２５μｌ／レーン；レーンＨＭＷ：高分子量マーカーである。レーン５〜８のサンプルは、ＴｒａｐＧの精製由来であり（ｐＨ３．５で溶出）、レーン５：１μｌ；レーン６：０．５μｌ；レーン７：０．２５μｌ；レーン８：０．１２５μｌ／レーンである。レーン９〜１４のサンプルは、ＩｇＧ２（Ｓｉｇｍａから購入）を示し、レーン９：３μｇ；レーン１０：２μｇ；レーン１１：１μｇ；レーン１２：０．５μｇ；レーン１３：０．２５μｇ；レーン１４：０．１２５μｇである。赤い矢印はＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ四量体の予想される位置を示し、黒い矢印は高分子量（ＨＭＷ）種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を示す。
【図５】図５は、プロテインＡクロマトグラフィーを用いるエンドトキシンフリーＦｃ（ＩｇＧ１）−ｓＩＧＦ１Ｒ（ＴｒａｐＨおよびＩ）の精製を示す。サンプルは、変性、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、Ｎｏｖｅｘ（登録商標）トリス−グリシン４〜２０％ＴＧ１．５により分析された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは（Ａ）に示される。１４μｌ／レーンでロードした。レーン５〜８のサンプルは、ＴｒａｐＨの精製由来である（ｐＨ４で溶出）。レーン９〜１２のサンプルは、ＴｒａｐＩの精製由来である（ｐＨ３．５で溶出）。レーン１：フィード；レーンＸ：ロードなし；レーン２：フロースルー（Ｆ．Ｔ．）；レーン３：Ａ１−Ａ２；レーン４：Ａ３−Ａ４；レーン５：Ａ６−Ａ７；レーン６：Ａ８−Ａ１０；レーン７：Ａ１１−Ａ１２；レーン８：Ｂ１−Ｂ２；レーン９：Ｂ３−Ｂ４；レーン１０：Ｂ５−Ｂ６；レーン１１：Ｂ７−Ｂ１０；レーン１２：Ｂ１１−Ｂ１２。赤い矢印はＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ四量体の予想される位置を示す。カラムから取集された分画に関する文字および番号（Ａ１−Ａ２、Ａ３−Ａ４、Ａ６−Ａ７、Ａ８−Ａ１０、Ａ１１−Ａ１２、Ｂ１−Ｂ２等）、文字および番号は分画収集器のラックのチューブの位置を示す。
【図６】図６は、本発明のＴｒａｐタンパク質を作成するために用いるベクターの略図を示す。（Ａ）に示されるように、ｓＩＧＦ１Ｒ配列がｐＭＰＧ−ＣＲ５ベクターに挿入され、（Ｂ）および（Ｃ）にそれぞれ示されるように、ヒトＩｇＧ１ＦｃまたはＩｇＧ２Ｆのいずれかに融合するｓＩＧＦ１Ｒ配列がｐＭＰＧ−ＣＲ５ベクターに挿入された。これらのベクターは、ＣＨＯ細胞におけるＴｒａｐタンパク質の一時的または安定的な発現のために用いられた。
【図７】図７は、質量分析による、もっとも有力なｓＩＧＦ1ＲおよびｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃのグリコペプチドの比較を示す。（Ａ）では、相対的パーセンテージは、各グリコシル化部位に結合する糖のタイプを指し、部位４、５、７、８、１２、１５および１６は、ペプチドにおけるグリコシル化部位であり、（Ｂ）に示される凡例において示されるように、塗りつぶされたバーはｓＩＧＦ−ＩＲ（ＴｒａｐＤ）を表し、クロスハッチをつけたバーはｓＩＧＦ−ＩＲ−ｈＦｃ（ＴｒａｐＥ）を表し、色付きは、グリコシル化の性質を表す。
【図８】図８は、ＴｒａｐＤおよびＥが、ｈＩＧＦ−Ｉへの等しい反応において、腫瘍細胞の増殖を阻害することを示す。（Ａ）は１０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉが使用された場合のＯＤ対時間のプロットを示し、（Ｂ）は５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＧＦ−Ｉが使用された場合のＯＤ対時間のプロットを示す。◆はＩＧＦＩを示し、■はｓＩＧＦ−ＩＲ（ＴｒａｐＤ）＋ＩＧＦＩを示し、▲はｓＩＧＦ−ＩＲ−ｈＦｃ（ＴｒａｐＥ）＋ＩＧＦＩを示し、****は試験された全ての時点におけるｐ＜０．００１を示す。
【図９】図９は、ＴｒａｐＤの存在におけるアノイキス（剥離起因性アポトーシス）の容量依存性の増加を示す。ＦＢＳ：ウシ胎児血清；ＳＦ：無血清“ＩＧＦ−Ｉ：ＴｒａｐＤは、ＩＧＦ−ＩとＴｒａｐＤのモル比であり、表示されるように２：１，１：１、または１：２であり、*はｐ＜０．０５を示し、**はｐ＜０．０１を示し、および****はｐ＜０．００１を示す。
【図１０】図１０は、ＴｒａｐＤおよびＥの存在におけるアノイキス（剥離起因性アポトーシス）の容量依存性の増加、並びに、ＴｒａｐＤおよびＥの比較を示す。ウシ胎児血清；ＳＦ：無血清；比はＩＧＦ−I：ｓＩＧＦＩＲモル比（表示されるように、２：１、１：１、または１：２）；、*はｐ＜０．０５を示し、**はｐ＜０．０１を示し、および****はｐ＜０．００１を示す。データは、ＴｒａｐＥ（Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ）の優れた性能を図示する。
【図１１】図１１は、ＩＧＦ−ＴｒａｐＥ、Ｆ、およびＧの存在におけるアノイキスの増加を示し、プロテインＡ精製の効果を図示する。ＦＢＳ：ウシ胎児血清；ＳＦ：無血清；ＩＧＦ−I：Ｔｒａｐタンパク質のモル比は示されるとおりである；****はｐ＜０．００１を示す。
【図１２】図１２は、ＴｒａｐＤおよびＥの存在における低減されたアンカ−レ−ジ（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）非依存性成長、並びに、ＴｒａｐＤおよびＥ間の比較を示す。（Ａ）では、Ｔｒａｐの存在でコロニーの数が有意に減少したことが示され、試験された全ての条件下で、*はｐ＜０．０５を示し、ｐは＜０．０１であった。色は、（Ｂ）に示される凡例において示されるように、試験されたタンパクを示す。データはＦｃ融合タンパク質の優れた性能を図示する。
【図１３】図１３は、腫瘍細胞浸潤におけるＴｒａｐＤおよびＥの効果を表す時間経過解析、およびＴｒａｐＤおよびＥ間の比較を示す。青のライン（◆）はベースラインを表し（ＩＧＦ−Ｉなし）、ピンクのライン（■）はＩＧＦ−Ｉでの浸潤を示し、緑のライン（▲）はＴｒａｐＤを示し、赤のライン（●）はＴｒａｐＥを示す。
【図１４】図１４は、（Ａ）において、４８時間の腫瘍細胞浸潤におけるＴｒａｐＤ、Ｅ、Ｆ、およびＧの効果が示され、****はｐ＜０．０００５を示す。（Ｂ）は腫瘍細胞浸潤におけるＴｒａｐＤ、Ｅ、Ｆ、およびＧの効果に関する時間経過解析が示され、青のライン（◆）はＩＧＦ−Ｉであり、緑のライン（■）はベースラインであり（ＩＧＦ−Ｉなし）、明るい茶色のライン（◆）はＴｒａｐＤであり、濃い緑のライン（▲）はＴｒａｐＥであり、赤のライン（■）はＴｒａｐＦであり、明るい青のラインは（●）ＴｒａｐＧである。
【図１５】図１５は、（Ａ）において、４８時間の腫瘍細胞浸潤におけるＴｒａｐＥ、Ｈ、およびＩの効果が示され、プロテインＡ精製前後のＴｒａｐＥの比較を図示し、****はｐ＜０．００１を示す。（Ｂ）は腫瘍細胞浸潤におけるＴｒａｐＥ、Ｈ、およびＩの効果に関する時間経過解析が示され、青のライン（◆）はＩＧＦ−Ｉであり、ピンクのライン（■）はＴｒａｐＥであり、緑のライン（■）はＴｒａｐＨであり、赤のライン（■）はＴｒａｐＩであり、オレンジのライン（■）はベースラインである（ＩＧＦ−Ｉなし）。
【図１６】図１６は、マルチサイクルＳＰＲ滴定に適するカーブを示す。アミン結合ＴｒａｐＢ（９５００ＲＵ）に結合するｈＩＧＦ−I（０〜６６ｎＭ；２倍希釈系列）に関する「１：１動力学的」モデル（グローバルフット（ｇｌｏｂａｌ  ｆｉｔ）、黒い点線）に対する実験データ（塗りつぶされた色のライン）の代表的な分析を示す。
【図１７】図１７は、シングルサイクルＳＰＲ滴定に適するカーブを示す。アミン結合ＴｒａｐＥ（６４００ＲＵ）に結合するｍＩＧＦ−I（緑）、ｈＩＧＦ−I（赤）、およびｈＩＧＦ−II（青）に関する「１：１滴定」モデル（ローカルフィット（ｌｏｃａｌ  ｆｉｔ）、黒い点線）に対する実験データ（塗りつぶされた色のライン、０〜５３０ｎＭ、２倍希釈系列）の代表的な分析を示す。
【図１８】図１８は、ＴｒａｐＤおよびＥの薬物動態学的分析を示し、ｓＩＧＦ1Ｒ（ＴｒａｐＤ）と比較してＦｃ−ｓＩＧＦ１Ｒ（ＴｒａｐＥ）の半減期における２倍より多い増加を示す。ＴｒａｐＤは（Ａ）に示され、ＴｒａｐＥは（Ｂ）に示され、赤い丸は観察された値を表し、青いラインは予測された値を示す。
【図１９−１】図１９は、ＴｒａｐＤ、Ｅ、Ｈ、およびＩの薬物動態学的分析を示し、ＨＭＷ種に関して濃縮された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）プロテインＡ精製Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲのｉｎ  ｖｉｖｏの性能が劣っていることを示す。ＴｒａｐＤは（Ａ）に示され、ＴｒａｐＥは（Ｂ）に示され、ＴｒａｐＨは（Ｃ）に示され（ｐＨ４．０）、ＴｒａｐＩは（Ｄ）に示される（ｐＨ３．５）。赤い丸は観察された値を表し、青いラインは予測された値を示す。
【図１９−２】同上。
【図２０】図２０は、結腸癌ＭＣ−３８細胞を接種し、ＩＧＦ−ＴｒａｐＨで治療したマウスにおける低減した腫瘍の量を示す。腫瘍注入後１９日目の、結腸癌ＭＣ−３８注入マウス由来の肝臓の、代表的なＨ＆Ｅ染色ホルマリン固定パラフィン包埋部を示す。上の列：ＩＧＦ−ＴｒａｐＨで治療していないマウスの肝臓（治療なし）；下の列：ＩＧＦ−ＴｒａｐＨで治療したマウスの肝臓（Ｔｒａｐで治療）；Ｌは肝臓を示し；Ｔは腫瘍を示し；Ｍａｇ-×２０〜５０、インセット（ｉｎｓｅｔ）×４００である。上の列の離れた右のパネルは、表示された転移の拡大された視野（X４００）を示す。
【図２１】図２１は、微小転移における低減したＩＧＦ−ＩＲリン酸化反応を示す。Ｃ５７ＢＬ６雌マウスは、脾臓内に１０5ＧＦＰ標識Ｈ−５９細胞を注入され、その後、腫瘍注入後１および３日目に、５ｍｇ／ｋｇＩＧＦ−ＴｒａｐＨ（Ｔｒａｐで治療）またはビヒクルのみ（治療なし）を注入された（１グループあたり３匹のマウス）。マウスは６日目に殺処分され、肝臓を取り出して急速に凍結し、１０μMの凍結切片（凍結切片）が準備され、ウサギポリクローナル抗マウスｐＩＧＦ１Ｒ抗体で、その後ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（遠赤色（ｆａｒ−ｒｅｄ））抗体で免疫染色された。切片を洗浄し、ＧＯＬＤ  抗退色（ａｎｔｉ−ｆａｄｅ）薬剤をマウントし、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ，共焦点顕微鏡で分析した。（Ａ）では、以下のように、代表的なマージされた共焦点像が示される。治療なしのマウスからのＡ．切片；Ｔｒａｐで治療したマウスからのＢ．切片；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は緑で示され、ＤＡＰＩ染色は青で示され、ｐＩＧＦ１Ｒは白で示され、画像はＭａｇ．X２００で撮像された。（Ｂ）では、各グループ（表示されるように、治療なしまたは５ｍｇ／Ｋｇ  Ｔｒａｐで治療）におけるｐＩＧＦ−ＩＲ+緑色蛍光腫瘍細胞のパーセントの算出手段が示され、Ｐ＜０．００１である。
【図２２】図２２は、ＩＧＦ−ＴｒａｐＨ治療マウスにおける増加した腫瘍細胞のアポトーシスを示す。肝臓凍結切片を上記図２１について記載するように得た。切片は、まずウサギポリクローナル抗マウス開裂カスパーゼ−３抗体（ａｂ４５０１−Ａｂcａｍ）で、その後ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７抗体でインキュベートした。（Ａ）では、以下のように、代表的なマージされた共焦点像が示される：治療なしのマウスからのａ．切片（治療なし）；Ｔｒａｐで治療したマウスからのｂ．切片（ＩＧＦ−Ｔｒａｐで治療）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は緑で示され、ＤＡＰＩ染色は青で示され、開裂カスパーゼ３+細胞は赤で示され、画像はＭａｇ．X２００で撮像された。（Ｂ）では、各グループ（表示されるように、治療なしまたは５ｍｇ／Ｋｇ  Ｔｒａｐで治療）における開裂カスパーゼ３+緑色蛍光腫瘍細胞のパーセントの算出手段が示され、Ｐ＜０．００１である。
【図２３】図２３は、ＩＧＦ−ＴｒａｐＨ治療マウスにおける減少した腫瘍細胞の増殖を示す。肝臓凍結切片を上記図２１について記載するように得た。切片は、まずウサギポリクローナル抗マウスＫｉ６７抗体で、その後ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７抗体でインキュベートした。Ｋｉ６７陽性（増殖のマーカー）であるＧＦＰ+腫瘍細胞のパーセンテージを算出した。（Ａ）では、以下のように、代表的なマージされた共焦点像が示され、左のパネル：治療なしのマウスからの切片（治療なし）；右のパネル：Ｔｒａｐで治療したマウスからの切片（ＩＧＦ−Ｔｒａｐで治療）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は緑で示され、Ｋｉ６７陽性細胞は赤で示され、画像はＭａｇ．X２００で撮像された。（Ｂ）では、各グループ（表示されるように、治療なしまたは５ｍｇ／Ｋｇ  Ｔｒａｐで治療）におけるＫｉ６７+緑色蛍光腫瘍細胞のパーセントの算出手段が示され、ｐ＝０．００１２である。
【図２４】図２４は、ＩＧＦ−ＴｒａｐＨ注入マウスにおける減少した血管総数（血管新生）を示す。肝臓凍結切片を上記図２１について記載するように得た。切片は、まずラットモノクローナル抗マウスＣＤ３１抗体で、その後ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（オレンジ−レッド）抗体でインキュベートした。一視野（２０X対物レンズ）あたりの腫瘍微小転移内のＣＤ３１+内皮細胞の数を、一治療群あたり１６箇所カウントし、平均数を算出した。（Ａ）では、以下のように、代表的なマージされた共焦点像が示される。治療なしのマウスからのＡ．切片（治療なし）；Ｔｒａｐで治療したマウスからのＢ．切片（ＩＧＦ−Ｔｒａｐで治療）；緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は緑で示され、ＤＡＰＩ染色は青で示され、ＣＤ３１+細胞は赤で示され、画像はＭａｇ．X２００で撮像された。（Ｂ）では、各グループ（表示されるように、治療なしまたは５ｍｇ／Ｋｇ  ＩＧＦ−Ｔｒａｐで治療）における一視野あたりのＣＤ３１+細胞の算出手段が示され、ｐ＝０．００５７である。
【図２５】図２５は、同所性マウス乳癌（４Ｔ１）モデルの動物の生存における腫瘍成長の低減と増加を示す。１０5マウス乳癌４Ｔ１細胞を、Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスは、乳房の脂肪パッド（ＭＦＰ）内に注入された。４時間および３日後に、治療群は、１０ｍｇ／ｋｇのＩＧＦ−ＴｒａｐＨのｉ．ｖ．注入、その後、腫瘍接種後６および１０日目の５ｍｇ／ｋｇ（部分（Ａ）で矢印により示される）の２回の注入を受けた。腫瘍は、キャリパーおよび式１／２（長さ×幅2）を用いて算出された腫瘍量を用いて、週３回測定された。（Ａ）では、表示されるように、治療なし（コントロール）またはＩＧＦ−Ｔｒａｐで治療された（ＩＧＦ−Ｔｒａｐ）マウスに関する、腫瘍量（ｍｍ3）対腫瘍接種後の日数のグラフが示される。（Ｂ）では、表示されるように、コントロールまたはＩＧＦ−Ｔｒａｐで治療されたマウスの生存率対腫瘍接種後の日数のプロットが示され、ｐ＜０．０１でＭａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定およびＧｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定の両方が用いられる。
【図２６−１】図２６は、ヒト乳癌細胞を同所的にインプラントされたマウスをＩＧＦ−Ｔｒａｐで治療したときの腫瘍成長の阻害を示す。１００万のＭＤ−ＭＢＡ−２３１ヒト乳癌細胞が、ｎｕ／ｎｕマウスの乳房の脂肪パッドにマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）で同所的にインプラントされた。腫瘍は、キャリパーおよび式１／２（長さ×幅2）を用いて算出された腫瘍量を用いて、週３回測定された。腫瘍が確立した時（５０〜１００ｍｍ3）（１１日目、部分（Ａ）で矢印により示される）、動物はランダム化され、５ｍｇ／ｋｇのＩＧＦ−ＴｒａｐＨまたはビヒクル（ｉ．ｖ．）で週２回、３３日目まで治療された。コントロール群のマウスは全て、４４日目までに瀕死であった（部分（Ａ）で点線により示される）。（Ａ）では、表示されるように、治療なし（コントロール）またはＩＧＦ−Ｔｒａｐで治療された（ＩＧＦ−Ｔｒａｐで治療）マウスに関する、腫瘍量（ｍｍ3）対腫瘍接種後の日数のグラフが示される。（Ｂ）では、縦方向のバイオルミネセンスイメージングが示され、これは腫瘍をモニターするために用いられた。バイオルミネセンスに関するカラースケールがパネル（Ｂ）の左側に示され、表示される腫瘍接種後の日数のマウスが示され、左側のパネルは治療なしのマウスを示し、右側のパネルはＴｒａｐで治療マウスを示す。バイオルミネセンスは定量化され、コントロール（治療なし；黒い線）およびＴｒａｐで治療した（赤いライン）マウスに関し、（Ｃ）に示される。測定の単位ｐ／ｓｅｃ／ｃｍ2／ｓｒは、ｃｍ2／ステラジアン（ｓｔｅｒａｄｉａｎ）あたりの１秒あたりの光子（ｐｈｏｔｏｎ）を表す。
【図２６−２】同上。
【図２７】図２７は、変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｅｄ−Ｆｃ構造のデザインに関するテンプレートとして提供される分子モデルを示す。ＩＲ−ｅｄおよびＦｃｇＲＩＩＩ−ｅｄのＦｃ複合体に関する結晶構造は、ＰＤＢ（括弧内で付与されるコード）から回収された。左側の写真は、構造体Ｍｏｄ＃２およびＭｏｄ＃３で用いられる２２ａａフレキシブルリンカー（白いライン）が、Ｆｃフラグメント（シアン／グリーンリボン）の分子内のペアを可能にするように、さらにＦｃｇＲＩＩＩ−ｅｄ（表面レンダリング）への結合を可能にするために、十分に長いということを示す。右側の写真は、Ｆｃのヒンジ切断（ｈｉｎｇｅ−ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）バージョンを用いるＭｏｄ＃４変更変異体タンパク質の２７ａａリンカーに関する同じコンセプトを図示する。
【図２８】図２８は、設計されたｓＩＧＦ１  Ｒ−ｅｄ−Ｆｃ変更変異体タンパク質の概略図を示す。ヒトＩｇＧ  Ｆｃフラグメントに融合されたインスリン成長ホルモンの配列モデルリングに基づき、ｓＩＧＦ１ＲおよびＩｇＧ１配列の接合部における異なる変更で、４つの新たな構造体を設計し、生成した。変更は以下のとおりである：（１）：コアヒンジにおける両方のシステインがセリンで置換された（ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃１を指す）；（２）：１１ａａ−クローニングアーティファクトは、２２ａａ−フレキシブルリンカーで置換された（ｓＩＧＦ１  Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃２を指す）；（３）：１と２の組み合わせ（ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃３を指す）；および（４）：１１ａａ−クローニングアーティファクト、上側ヒンジ、およびコアヒンジの最初の３ａａ（最初のシステインを含む）が２７ａａ−フレキシブルリンカーで置換された（ｓＩＧＦ１  Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃４を指す）。
【図２９】図２９は、融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。５μｇ（レーン１〜６）および１０μｇ（レーン８〜１３）の各親および変更ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクが変性および非還元状態下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された。レーン１および８：ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーとその後のゲル濾過により精製したｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１（親構造体，ＴｒａｐＨ）；レーン２および９：プロテインＡにより精製されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１（親構造体，ＴｒａｐＨ）；レーン３および１０：プロテインＡにより精製されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ−Ｍｏｄ＃１；レーン４および１１：プロテインＡにより精製されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃２；レーン５および１２：プロテインＡにより精製されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃３；レーン６および１３：プロテインＡにより精製されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃４；レーン７：Ｈｉ−Ｍａｒｋ  Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  ＨＭＷタンパク標準（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ）（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）；レーン１４：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（登録商標）非染色標準（Ｕｎｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）（ＢｉｏＲａｄ）。
【図３０】図３０は、細胞で発現される設計変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクのウエスタンブロット解析を示す。ＣＨＯ−ＢＲＩ−ｒｃＴＡ−ＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃１（レーン２、７および１２）、Ｍｏｄ＃２（レーン３、８および１３）、Ｍｏｄ＃３（レーン４、９および１４）およびＭｏｄ＃４（レーン５、１０および１５）の２０ｍｌの上清が、変性および非還元状態下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離された。膜ブロット（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｌｏｔ）が、抗α鎖（レーン１〜５）、抗β鎖（レーン６〜１０）または抗−Ｆｃ（レーン１１〜１５）抗体でプローブ（ｐｒｏｂｅ）された。レーン１、６および１１：Ｅｚ−Ｒｕｎ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｒｅｃプロテインラダー（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌａｄｄｅｒ）（Ｆｉｓｈｅｒ）。β＋Ｆｃは約８０〜９０ｋＤであり；Ｆｃ＋β＋αは約２１０〜２２０ｋＤ（モノマー）であり；Ｆｃ＋β＋α＋α＋β＋Ｆｃは約４２０〜４４０ｋＤ（ホモダイマー）であることに留意されたい。
【図３１】図３１は、融合タンパク質のウエスタンブロット解析を示す。非精製または精製親融合タンパク質（ＴｒａｐＨ）または精製変更ｓＩＧＦ1Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１は、変性および非還元（レーン１〜７および９〜１５）または還元（レーン１６〜２２）状態下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの対象であった。膜は、抗α（レーン１〜７）および抗Ｆｃ抗体（レーン９〜２２）でプローブされた。表示されるレーンは以下のとおりである：レーン１、９および１６：非精製親ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１の上清；レーン２、１０および１７：ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーとその後のゲル濾過により精製した親構造体；レーン３、１１および１８：プロテインＡにより精製された親構造体；レーン４、１２および１９：精製されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃１；レーン５、１３および２０：精製されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃２；レーン６、１４および２１：精製されたＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃３；レーン７、１５および２２：精製されたＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃４；レーン８：ＥＺ−Ｒｕｎ*Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｒｅｃプロテインラダー（Ｆｉｓｈｅｒ）。
【図３２】図３２は、ＣＨＯ−Ｃｕｍ２−ＣＲ５−ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１（非変更（親）Ｔｒａｐタンパク質）の９つのサブクローンの安定性試験を示す。ＣＨＯ−Ｃｕｍ２−ＣＲ５−ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１の９つのサブクローンは、２か月間培養で維持された。０、１か月、および２か月の時点で、Ｐｏｗｅｒ−ＣＨＯ培地中の各サブクローンの７ｍｌの１．５×１０6細胞／ｍｌが、３７℃で１日間および３０℃で７日間、種子（ｃｕｍａｔｅ）の存在下で培養された。それぞれの１４ｍｌの上清が、変性，非還元状態下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにロードされた。
【図３３】図３３は、表示されるアミン結合ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクに結合する、表示されるリガンド（ｈＩＧＦ−１、ｈＩＧＦ−２、ｍＩＧＦ−１、ｈ−インスリン、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）；３倍段階希釈）（Ｍｏｄ＃１、Ｍｏｄ＃２、Ｍｏｄ＃３、Ｍｏｄ＃４、ＴｒａｐＨ；２５μＬ／分×５分間結合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）＋１〜１０分間分離（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ））に関する、代表的な単一サイクル表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を示す。
【図３４】図３４は、表示されるアミン結合ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクに結合する表示されるリガンド（ｈＩＧＦ−１、ｈＩＧＦ−２、ｍＩＧＦ−１、ｈ−インスリン、およびコントロールＭＢＰ；３倍段階希釈）に関する、代表的なマルチサイクルＳＰＲを示す（Ｍｏｄ＃３、Ｍｏｄ＃４、ＴｒａｐＨ；２５μＬ／分×５分間結合＋１０分間分離）。
【図３５】図３５は、表示されるアミン結合ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクに結合する表示されるリガンド（ｈＩＧＦ−１、ｈＩＧＦ−２；２倍段階希釈）に関する代表的なマルチサイクルＳＰＲを示す（Ｍｏｄ＃３、Ｍｏｄ＃４、ＴｒａｐＨ；２５μＬ／分×５分間結合＋１０分間分離）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、血管新生関連疾病、並びに、癌および転移を含む悪性疾患を治療するための、新規な可溶性ＩＧＦレセプターＦｃ融合タンパク質（Ｆｃ−ｓＩＧＦＲ）、および組成物、並びにその使用方法を提供する。
【００２８】
３つの異なる腫瘍タイプに対する抗腫瘍化／抗転移活性、並びに、抗血管新生特性の効能を示す９３３のアミノ酸可溶型のＩＧＦ−ＩＲを以前記載した（Wang, N., et al., Mol. Ther. 2009; 17: 1241-9; WO 2010/012088）。ここで、我々は、９３３のアミノ酸可溶型ＩＧＦ−ＩＲおよびヒトＩｇＧ抗体のＦｃ部分（Ｆｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲ融合タンパク質）を含む新規な遺伝子組換え型融合タンパク質を報告する。
【００２９】
我々は、本明細書に記載のＦｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲ融合タンパク質が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方に高い特異性および親和性で結合する場合もあるかもしれないことの発見をも報告する。いくつかの場合には、ＩＧＦ−２に関するｓＩＧＦＩＲ−Ｆｃ融合の親和性は、予想外に、ＩＧＦ−１に関する親和性とほぼ同じであるかもしれない。いくつかの場合には、ｓＩＧＦＩＲ−Ｆｃ融合は、予想外に、ＩＧＦ−１よりもＩＧＦ−２に関してより高い親和性を有するかもしれない。いくつかの場合には、ＩＧＦ−１に関するｓＩＧＦＩＲ−Ｆｃ融合の親和性も、可溶性ｓＩＧＦ−ＩＲ単体の親和性と比較して増加される。このように、ＩＧＦ−ＩＲが、ＩＧＦ−１と結合するよりも約６〜１０倍低い親和性でＩＧＦ−２と結合するとの文献における報告とは対照的に、我々は、Ｆｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲ融合タンパク質は、いくつかの実施形態では、高い親和性で、およびＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の両方に対して少なくとも略同じ親和性で結合するかもしれないことの発見を報告する（例えば、Surinya et al JBC, 2008, 283: 5355-5363; Forbes, B.E., et al., Eur. J. Biochem. 2002; 269: 961-8;およびJansson, M., et al., J. Biol. Chem. 1997; 272: 8189-97参照。）。いくつかの実施形態では、しかしながら、Ｆｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲ融合タンパク質は、予想されるように、文献の報告に基づいてＩＧＦ−１に対して高い親和性で結合し、ＩＧＦ−１に関するよりも約６〜７倍低い親和性でＩＧＦ−２と結合する。
【００３０】
さらに、我々は、Ｆｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲ融合タンパク質が、いくつかの場合には、インスリンと比較してＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２に対して予想外に高い特異性で結合することを本明細書で報告する。本明細書で報告するように、ｓＩＧＦＩＲ−Ｆｃ融合の結合親和性は、表面プラズモン共鳴を用いて測定されるように、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２リガンドに関するよりも、インスリンに関して約１〜２０００倍低い。
【００３１】
本明細書で提供されるＦｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲタンパクは、治療応用に関し十分に満足する、ヒトにおいての半減期を提供することが予想されるであろう、３５から４８時間のマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ安定性（半減期）をも有する。
【００３２】
本明細書では、Ｆｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲタンパクは、抗癌効果に関するアッセイにおいて、ｓＩＧＦ−ＩＲタンパクと比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増強された効能を示すことがさらに報告され、このｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性は、精製により向上された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける安定性の増加は、Ｆｃ部分の追加により予想されるが、このことがｉｎ  ｖｉｔｒｏの抗癌アッセイにおける活性の増加をも導くであろうことは予想されなかった。
【００３３】
本発明のＦｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲタンパクは、よって、ｓＩＧＦ−ＩＲプロテインＡ単体と比較して、重要な治療的利点があるかもしれない。予想外に、Ｆｃ部分は、リガンドに関するタンパクの親和性を増加させた（例えば、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）。予想より有意に高いＩＧＦ−２に関するＦｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲの結合親和性だけでなく、いくつかの実施形態では（例えば、いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１に対する結合親和性と同様またはより高い）、ＩＧＦ−１に関するＦｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲの結合親和性も、いくつかの場合には、天然ｓＩＧＦＩＲ単体のそれよりも約２倍高い。理論に束縛されることを望むことなく、両方のリガンド（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）に対するＦｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲタンパクの高い親和性は、いくつかの実施形態では、重要な治療利益を提供することが考えられる。例えば、腫瘍が、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、およびＩＲ−Ａへの発現を増加させることにより、ＩＧＦＩＲに対するモノクローナル抗体への耐性を発生させ得ることが報告されている（例えば、BioCentury, The Bernstein Report on BioBusiness, April 11, 2011, page A5参照。）。同様に、因子が、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２の１つのみに結合して阻害する場合には、その後、腫瘍は耐性を発生し得る。より高い結合特異性は、オフーターゲット効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ）を制限することによる治療利益の増加も期待されるであろう。最後に、インスリンと比較して、リガンド（ＩＧＦ−１／２）に対するいくつかのＦｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲタンパクの高い特異性の結合は、インスリンによる相互作用を通じてグルコースおよび脂質代謝上の望ましくない効果のような、他の因子（例えば、抗体、キナーゼ阻害剤）の多くの望まない副作用を排除または低減するかもしれない。さらに、変更Ｆｃドメインを有する融合タンパク質は、本明細書に開示するような、さらなる利点が存在するかもしれない。
【００３４】
本明細書で用いられるように、用語「血管新生」は、組織もしくは臓器内、または癌腫内を通る、新しい血管の増加を意味する。通常の生理的条件下では、ヒトまたは動物は、非常に限られた状況でのみ血管新生が行われる。例えば、血管新生は、通常、創傷治癒、胎児および胚発生、並びに黄体、子宮内膜、および胎盤の形成で観察される。
【００３５】
病的な血管新生は、例えば、腫瘍転移および内皮細胞による成長異常のような多くの病気の状態で発生し、これらの病状でみられる病的ダメージを支持する。異常な血管新生が存在する多様な病理学上の病気の状態は、「血管新生依存性」または「血管新生関連」疾病としてともに分類される。
【００３６】
血管新生は、正および負のシグナルの両方により厳密に調節されている。線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）のような血管新生刺激物質は、内皮細胞の増殖に効能のある分裂促進因子であり、内皮細胞の遊走に関する強力な走化性因子である。これらの正調節因子は、原発および転移腫瘍の両方の拡張を持続させる、新血管新生を促進し得る。これまで記述される負調節因子の中で、アンギオスタチンは、血管新生の最も有効な内在性阻害因子の１つとしてランク付けされる。
【００３７】
１型インスリン様成長因子に関するレセプター（ＩＧＦ−ＩＲ）は、抗癌療法に関するターゲットとして確認されている。ＩＧＦ−ＩＲは、いくつかのα−αおよびα−βジスルフィド架橋とともに、２つの１３０〜１３５ｋＤａのαおよび２つの９０〜９５ｋＤａのβ鎖からなるヘテロ四量体レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。グリコシル化され、かつタンパク分解性に開裂される１３６７のアミノ酸のポリペプチド鎖として合成され、四量体を形成するためにα−およびβ−サブユニットに二量化する。ドメインに結合するリガンドは、細胞外αサブユニット上にあり、βサブユニットは、ジスルフィド結合を通じてαサブユニットに結合する細胞外部分、膜貫通ドメイン、並びにキナーゼドメインおよびリガンド誘発シグナルの伝達に関わるいくつかの重要なセリンおよびチロシンを有する細胞質部分からなる（Samani et al., 2004, Cancer Research, 64: 3380-3385）。
【００３８】
原発腫瘍から脱離して第２の臓器の部位で転移を確立する癌細胞の性能は、悪性疾患の管理に対する最も大きな課題を残す。肝臓は、最も頻発するヒト悪性腫瘍のいくつかに関する主要な転移の部位、特に上部および下部消化管（ＧI）のカルシノーマである。ＩＧＦ−ＩＲの発現および機能は、異なる腫瘍タイプにおける肝臓転移の形成に関して重要である。可溶性形態のＩＧＦ−ＩＲ（ｓＩＧＦＩＲ）を発現するように設計される腫瘍細胞は、肝臓に対して転移する性能を失う（Samani etal., 2004, Cancer Res, 64: 3380-3385）。
【００３９】
細胞のレセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の活動をブロックするための効果的なストラテジーは、高い特異性で、同族のレセプターに結合してリガンドのバイオアベイラビリティーを低減し得るこれらのレセプターの可溶性変異体の使用である（Kong & Crystal, 1998, J Natl Cancer Inst, 90: 273-286; Tseng et al., 2002, Surgery, 132: 857-865; Trieu et al., 2004, Cancer Res, 64: 3271- 3275）。このストラテジーの成功した適用の一例は、新たなタイプの抗血管新生、抗癌剤として、現在臨床実験中であるＶＥＧＦＲ１／ＶＥＧＦＲ２−Ｆｃデコイレセプター（ＶＥＧＦＴｒａｐ）の産生である（Rudge et al., 2005, Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 70: 411-418）。
【００４０】
高い特異性で、同族のレセプターに結合してリガンドのバイオアベイラビリティーを低減する、そのような細胞レセプターチロシンキナーゼの可溶性変異体は、本明細書では、「デコイ」レセプターまたは（それらはリガンドを「トラップ」するので）「Ｔｒａｐ」タンパク質を指す。用語「デコイレセプター」、「Ｔｒａｐタンパク質」（または単に「Ｔｒａｐ」）、および「可溶性レセプター」は、本明細書では互換的に使用される。
【００４１】
米国特許第６，０８４，０８５号は、アポトーシスを誘導し、腫瘍形成を阻害する可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質の使用を開示する。米国特許第６，０８４，０８５号で開示される可溶性ＩＧＦ−ＩＲタンパク質は、Ｃ末端膜貫通ドメインが完全に欠失するか、または、膜貫通ドメインの一部を含むタンパクが細胞膜に係留されない程度に存在するように、ＩＧＦ−ＩＲのＮ末端の約８００までのアミノ酸を含む。米国特許第６，０８４，０８５号は、シグナルペプチドを有しないＩＧＦ−ＩＲのＮ末端の４８６のアミノ酸（１から４８６のアミノ酸）を含む、またはシグナルペプチドを有する５１６のアミノ酸（−３０から４８６のアミノ酸）を含む、タンパクの好ましい使用を開示した。米国特許第６，０８４，０８５号で開示されるタンパクは、二量体化および多量体化に必要とされるＩＧＦ−ＩＲの領域を含まない。
【００４２】
国際公開第２０１０／０１２０８８号は、遺伝子治療セッティング時およびマウスに直接注入したときの両方における、３つの異なる腫瘍のタイプに対して効能のある抗腫瘍化／抗転移活性を示す９３３のアミノ酸可溶型のＩＧＦ−ＩＲを記載する（Wang, N., et al., Mol. Ther. 2009; 17: 1241-9も参照。）。この９３３のアミノ酸可溶型のＩＧＦ−ＩＲは、本明細書では、可溶性ＩＧＦ−ＩＲ、ｓＩＧＦＩＲ、ｓＩＧＦ−ＩＲ、ｓＩＧＦＩＲ９３３、またはｓＩＧＦＲを指し、これらの用語は全体を通して互換的に使用される。ｓＩＧＦＲが循環するマウスＩＧＦ−Ｉで複合体を形成すること、可溶性ＩＧＦ−Ｉレセプターを産生する骨髄間質細胞が実験的な肝臓の転移の発生並びに関連する血管新生およびアポトーシスを阻害すること、肝臓転移はｓＩＧＦＩＲを注入したマウスで低減されることが以前示された。これらの実験は、精製ｓＩＧＦＲの投与が転移を低減し、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導した最初の実証を示した。
【００４３】
しかしながら、以前記載した研究において、ｓＩＧＦＩＲは腫瘍細胞の注入前に注入したため、治療は予防のみであったことは留意すべきである。対照的に、我々は本明細書で本発明の融合タンパク質の初めての治療的使用を報告する。本明細書に報告されるように、本発明の融合タンパク質、例えば、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲタンパクは、腫瘍を治療するために治療目的で用いられ得る。腫瘍細胞の注入後に注入された融合タンパク質が治療的効果を有することを初めて示した。
【００４４】
我々は、可溶性ＩＧＦ−ＩＲレセプターおよびヒトＩｇＧ抗体Ｆｃ部分を含む融合タンパク質が、インスリンと比較して、リガンド（例えば、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２）に関して高い結合特異性を有し、よって、可溶性ＩＧＦ−ＩＲレセプター単体と比較して重要な効能のある治療的利点を有することを初めて本明細書に報告する。
【００４５】
さらに、我々は、変更されたＦｃドメインを有する新規なＦｃ融合タンパク質を本明細書に初めて報告する。望ましくない高い分子量種（ＨＭＷ）のＦｃ融合タンパク質の産生を避けるために、新規なＦｃ−変更融合タンパク質（本明細書では変異体タンパク質をも指す）が設計され産生された。例えば、いくつかの変更されたＦｃドメインにおいて、Ｆｃのヒンジ領域のシステインは、セリン残基で置換された。他の変更されたＦｃドメインにおいて、１１ａａリンカーは２２ａａフレキシブル（ＧＳ）リンカーで置換された。いくつかの変更されたＦｃドメインにおいて、これらのアプローチの両方（ＦｃヒンジＣｙｓ残基の突然変異およびより長いフレキシブルリンカーの利用）が組み合わせられた。さらなる変更されたＦｃドメインにおいて、Ｆｃヒンジ領域は下部Ｃｙｓ残基のみ保持するように切断され、フレキシブルリンカーの長さは２７ａａに増加した。本明細書に報告されるように、これらの新規なＦｃドメインは、本発明の融合タンパク質におけるＨＭＷ種を低減させる。さらにいくつかの実施形態では、変更されたＦｃリンカーおよび融合タンパク質は、向上した薬物動態学的な特性（半減期）に関するＦｃＲｎレセプターに結合することを可能にするのみならず、他の有益な特性（例えば、補体機能）を与えるかもしれないＦｃＲγIIIレセプターエクトドメインにＦｃ部分を同時に結合することを可能にする、十分に長くかつフレキシブルである利点を有するかもしれない。我々の結果は、ヒンジＣｙｓ残基が分子内オリゴマー形成に関わること、およびいくつかの場合には、より長いリンカーがタンパク質分解からＦｃフラグメントを保護するかもしれない分子内二量体化を促進することを示す。いくつかの実施形態では、本発明のＦｃ融合タンパク質はいくつかまたは全てのこれらの利点を有する。
【００４６】
このように、いくつかの実施形態では、可溶性ＩＧＦ−ＩＲレセプターおよびヒトＩｇＧ抗体のＦｃ部分を含む融合タンパク質が本明細書では提供され、Ｆｃ部分変更されている。例えば、１つまたはそれ以上Ｃｙｓ残基を除くために、例えば１つまたはそれ以上Ｃｙｓ残基をＳｅｒ残基で置換するため、および／または１１ａａリンカーを、より長いよりフレキシブルなリンカー、例えば、２２ａａまたは３７ａａフレキシブルＧＳリンカーで置換するために、Ｆｃ部分は変更されることとしてもよい。実施形態では、変更されたＦｃ部分を有する融合タンパク質は、ＨＭＷ種を産生しない、または変更されていないＦｃ部分を有する融合タンパク質と比較して低減されたＨＭＷ種を産生する。
【００４７】
従って、本明細書では、抗腫瘍化、抗転移、および／または抗血管新生特性を有するＦｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲ融合タンパク質が提供される。
【００４８】
可溶性ＩＧＦ−ＩＲレセプターは、ｓＩＧＦＩＲ、ｓＩＧＦ−ＩＲ、可溶性ＩＧＦＩＲ、可溶性ＩＧＦ−ＩＲ、ｓＩＧＦＲ、またはｓＩＧＦＩＲ９３３として本明細書に示され、これらの用語は互換的に使用される。可溶性ＩＧＦ−ＩＲレセプターを含む融合タンパク質は、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ、Ｆｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲ、可溶性Ｆｃ−ＩＧＦＩＲ、可溶性Ｆｃ−ＩＧＦ−ＩＲ、Ｆｃ−ｓＩＧＦＲ、ｓＩＧＦＩＲ−Ｆｃ、ｓＩＧＦＲ−Ｆｃ、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ９３３等として本明細書に示され、これらの用語は互換的に使用される。
【００４９】
いくつかの実施形態では、例えば、「ほぼ同じ結合親和性」のような、用語「ほぼ同じ」は、実験の測定または定量の誤差の範囲内でほぼ同じである２つの値を指す。例えば、標準誤差に関して収取した後に互いに約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、または約３０％離れている２つの値は、「ほぼ同じ」であると考えられる。「ほぼ同じ」である２つの値は、本明細書では、例えば、同様の結合親和性を有する２つのタンパクのような「同様の」も指すこととしてもよい。一実施形態では、「ほぼ同じ」または「同様の」結合親和性は、１つの親和性が他よりも２または３倍大きくない結合親和性を指す。他の実施形態では、少なくとも約６倍または少なくとも約１０倍の結合親和性の差は、２つの結合親和性が「ほぼ同じ」または「同様の」ではないことを意味する。
【００５０】
本明細書で用いられる用語「遺伝子改変間質細胞」または「遺伝子導入間質細胞」は、レトロウイルス感染または当業者によく知られる他の手段により外因性の遺伝子が導入された間質細胞を意味することを意図する。用語「遺伝子改変の」は、トランスフェクトされた、形質転換された、遺伝子導入された、感染された、または形質導入されたことを意味することも意図することとしてもよい。他の自己細胞を遺伝子改変または遺伝子導入することとしてもよく、例えば、樹状細胞または肝細胞は本発明の方法および組成物に用いられることとしてもよい。
【００５１】
用語「ｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療」は、哺乳類への移植前に、トランスフェクトされた細胞、例えば、トランスフェクトされた間質細胞を形成するための細胞、例えば、間質細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションまたはレトロウイルス感染を意味することを意図する。
【００５２】
表現「骨髄間質細胞の形質導入」は、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスを用いて細胞内への核酸転写のプロセスを指す。核酸を細胞内に転写するためのＲＮＡウイルス（つまり、レトロウイルス）は、本明細書では形質導入キメラレトロウイルスを指す。レトロウイルス内に含まれる外因性の遺伝子物質は、形質導入された骨髄間質細胞のゲノム内に組み込まれる。キメラＤＮＡウイルス（例えば、治療因子をコードするｃＤＮＡを運ぶアデノウイルス）で形質導入された骨髄間質細胞は、ゲノム内に組み込まれた外因性の遺伝子物質を有しないが、細胞内の染色体外に保持された外因性の遺伝子物質を発現できるであろう。
【００５３】
本明細書で用いられる用語「間質細胞」は、内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、血漿細胞、マスト細胞、脂肪細胞、等を含むがこれらに限定されない疎性結合組織にみられる他の細胞および／または要素ありまたはなしで組織培養処理されたペトリ皿で接着および増殖するそれらの性能により定義される骨髄由来線維芽細胞様の細胞を意味することを意図する。他の細胞のタイプ、例えば、樹状細胞、肝細胞もまた、本発明の組成物および方法に用いられることとしてもよく、本明細書に包含されることが意図される。用語「自己細胞」は、このような細胞を指すように本明細書で用いられ、例えば、間質細胞、樹状細胞、および肝細胞を含む。
【００５４】
再生能力を有し、遺伝子改変して有効な濃度の望ましいタンパクを産生し得る自己細胞の使用は、見込みのある治療ストラテジーである（Buckley, 2000, Nat Med, 6: 623-624; Cavazzana-Calvo etal., 2000, Science, 288: 669-672; Dobson, 2000, Bmj, 320: 1225; Stephenson, 2000, Jama, 283: 589-590）。骨髄由来間葉系間質細胞（ＢＭＳＣ）はこれまで用いられてきており、デリバリービヒクルとしていくつかの利点を有する：それらは、豊富であり全ての年代のグループのヒトに使用可能であり、最小限の罹患と不快感で収集され得、増殖性能を有し、適切な効率で遺伝子改変され得、放射線療法、化学療法、または免疫抑制のような「毒性」状態になる治療方式なしにドナーに容易に再移植される。ＢＭＳＣは、免疫不全および免疫適格性ホストの両方におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの種々の有益なタンパクの分泌に関する能率的な自己細胞ビヒクルとして検証されており、臨床診療におけるタンパク質デリバリーに関する有効なツールとなり得る（Stagg & Galipeau, 2007, Handb Exp Pharmacol, 45-66）。このように、ＢＭＳＣ自己細胞は、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ９３３の分泌に関するビヒクルとして用いられ得る。当該分野で知られるタンパクを発現するためのあらゆる他のビヒクルもまた本明細書に包含され、よって、ＢＭＳＣは本発明の１つの実施形態を示すものであり、ＢＭＳＣに制限されるものではない。
【００５５】
我々は、遺伝子的に変更された間質細胞は、移植後数週間までの間に血清中で検出可能な高いレベルの可溶性レセプターを産生し、分泌したことを以前示した（国際公開第１０／０１２０８８号）。コントロールの間質細胞ではなく、これらの細胞を移植されたマウスにおいては、肝臓転移の数の顕著な低減が、マウスの結腸直腸癌ＭＣ−３８（８２％まで低減）および肺癌Ｈ−５９（９５％まで）細胞、並びに、ヌードマウスに接種されたヒト結腸直腸癌ＫＭ１２ＳＭ細胞（６４％まで）注入の後にみられた。これらの結果は、効能のある抗血管新生剤として、および治療用、抗転移剤としてもｓＩＧＦＩＲを確認した。
【００５６】
また、本発明の範囲内に包含されるものは、生物活性フラグメント、およびアミノ酸欠失、付加、および／または置換を伴う生物活性類似体を含む、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ９３３の変形物およびフラグメントである。「生物活性フラグメント」は、フラグメントが由来するＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ９３３と本質的に同じ生物活性を維持する、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ９３３のフラグメントを含む。「生物活性類似体」は、類似体が由来するＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ９３３の生物活性（つまり、抗血管新生もしくは抗転移活性、または結合特異性）が実質的に変化していないＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ９３３領域の変形物を含む。本発明の範囲内に含まれるのは、抗血管新生活性および／または抗転移活性および／または結合特異性を増加させる、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ９３３およびＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ９３３フラグメントに対してなされた変化である。
【００５７】
一実施形態では、本発明のＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ融合タンパク質は、α−αおよびα−βジスルフィド架橋を形成する性能を保持するｓＩＧＦＩＲの生物活性フラグメントを含む。特に、ｓＩＧＦＩＲの生物活性フラグメントは、四量体を形成するために二量体化するα−およびβ−サブユニットを含むこととしてもよい。他の実施形態では、本発明は、天然（野生型）レセプターの細胞外ドメインでジスルフィド結合を保持し、および／または天然（野生型）レセプターの３Ｄ構造を模倣するｓＩＧＦＩＲの生物活性フラグメントを含むＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ融合タンパク質を包含する。他の実施形態では、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲの生物活性フラグメントは、高い親和性のリガンド結合特異性を保持する。さらなる実施形態では、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲの生物活性フラグメントは、インスリンと比較して、ＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２に関する結合特異性を保持する。例えば、一実施形態では、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲの生物（ｂｉｏｌｏｇｆｉｃａｌｌｙ）活性フラグメントは、インスリンと結合する親和性よりも、少なくとも約１００倍または少なくとも約１０００倍高い親和性でＩＧＦ−１および／またはＩＧＦ−２と結合する。
【００５８】
いくつかの実施形態は、ｓＩＧＦＩＲ９３３領域および／またはフラグメントに対する変更を包含する類似体を含む。得られた配列は、１つまたはそれ以上の保守的アミノ酸置換により、または、１つまたはそれ以上の非保守的アミノ酸置換、欠失、または挿入により、ｓＩＧＦＩＲ９３３の野生型配列とは異なり、置換、欠失、または挿入は、野生型配列の生物活性を消滅させない。保守的置換は、典型的には、１つのアミノ酸を、類似する特性を有する他のものへの置換、例えば、以下のグループ内での置換を含む：バリン，グリシン；グリシン，アラニン；バリン，イソロイシン，ロイシン；アスパラギン酸，グルタミン酸；アスパラギン，グルタミン；セリン，スレオニン；リジン，アルギニン；およびフェニルアラニン，チロシン。他の保守的アミノ酸置換は当該技術分野で知られており、本明細書に含まれる。塩基性アミノ酸を疎水性のもので置換されているような非保守的置換もまた、当該技術分野でよく知られる。
【００５９】
本発明の範囲内の他の類似体は、タンパクまたはペプチド安定性を増加させる変更を有するものであり、そのような類似体は、例えば、タンパクまたはペプチド配列における、１つまたはそれ以上の（ペプチド結合を置換する）非ペプチド結合を含むこととしてもよい。天然由来のＬアミノ酸以外の残基、例えば、Ｄアミノ酸または非天然由来もしくは合成アミノ酸、例えば、βまたはγアミノ酸を含む類似体もまた含まれる。
【００６０】
種々の構成を有するＦｃ−ｓＩＧＦＲ融合タンパク質もまた含まれる。例えば、ｓＩＧＦＩＲのＮ末端は、ポリペプチド結合により、免疫グロブリン重鎖定常領域のＣ末端に結合されることとしてもよい。代替的に、ｓＩＧＦＩＲのＣ末端は、ポリペプチド結合により、免疫グロブリン重鎖定常領域のＮ末端に結合されることとしてもよい。
【００６１】
本明細書で用いられる場合には、用語「免疫グロブリン重鎖定常領域」は、用語「Ｆｃ」、「Ｆｃ領域」、および「Ｆｃドメイン」と互換的に使用され、免疫グロブリン重鎖定常領域のカルボキシル末端部、または、Ｆｃレセプターに結合可能な類似体もしくはその一部を意味することが理解される。知られているように、各免疫グロブリン重鎖定常領域は、４つまたは５つのドメインを含む。ドメインは、連続して以下のように名づけられる：ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３（−ＣＨ４）。ＣＨ４はＩｇＭに存在し、ヒンジ領域がない。本発明の融合タンパク質に有用な免疫グロブリン重鎖定常領域は、免疫グロブリンヒンジ領域、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むこととしてもよい。本明細書で用いられる場合には、用語免疫グロブリン「ヒンジ領域」は、免疫グロブリンヒンジ領域全体、または、第２の免疫グロブリンヒンジ領域で１つまたはそれ以上のジスルフィド結合を形成するのに十分な免疫グロブリンヒンジ領域の少なくとも一部を意味することが理解される。
【００６２】
本明細書で用いられる場合には、いくつかの実施形態では、「Ｆｃ」は、変更されたＦｃドメイン、例えば、１つまたはそれ以上のＣｙｓ残基を取り除くために、例えば、１つまたはそれ以上のＣｙｓ残基をＳｅｒ残基で置換するために、および／または、１１ａａリンカーを、より長い、さらなるフレキシブルリンカーで、例えば、２２ａａまたは３７ａａフレキシブルＧＳリンカーで置換するために、変更されたＦｃドメインを含む。一実施形態では、変更されたＦｃドメインを有する融合タンパク質は、ＨＭＷ種を産生しない、または、非変更Ｆｃドメインを有する融合タンパク質と比較して、低減された量のＨＭＷ種を産生する。
【００６３】
適切な免疫グロブリン重鎖定常領域は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭとして参照される各免疫グロブリンクラスに属する抗体由来であるが、ＩｇＧクラス由来の免疫グロブリン重鎖定常領域が好ましいかもしれないということが考えられる。さらに、免疫グロブリン重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４として当該技術分野で示される、いずれかのＩｇＧ抗体サブクラス由来かもしれないことが考えられる。一実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＧ１由来である。他の実施形態では、Ｆｃ領域はＩｇＧ２由来である。
【００６４】
免疫グロブリン重鎖定常領域ドメインは、免疫グロブリンクラス間のクロス相同性を有する。例えば、ＩｇＧのＣＨ２ドメインは、ＩｇＡおよびＩｇＤのＣＨ２ドメイン、並びに、ＩｇＭおよびＩｇＥのＣＨ３ドメインに対して相同である。好ましい免疫グロブリン重鎖定常領域は、ＩｇＧのＣＨ２領域およびＣＨ３領域、もしくは機能部分、またはその誘導体に対応するタンパク質ドメインを含む。特定の結果を得るための、ある免疫グロブリンクラスおよびサブクラスからの特定の免疫グロブリン重鎖定常領域配列の選択は、当業者のレベルの範囲内で考えられる。本発明のＦｃ領域は、例えば、他のＩｇクラス、つまり、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、もしくは軽鎖定常ドメインから、ＩｇＧ−Ｆｃ、ＩｇＧ−ＣH、ＦｃまたはＣHドメインのような定常領域を含むこととしてもよい。トランケーションおよびアミノ酸変異体、またはこれらのドメインの置換もまた含まれることとしてもよい。
【００６５】
Ｆｃ融合タンパク質をコードする種々の核酸配列もまた、本発明のＦｃ−ｓＩＧＦＲ融合タンパク質を作成するために用いられることとしてもよい。例えば、核酸配列は、５’から３’方向で、免疫グロブリン重鎖定常領域およびｓＩＧＦＲポリペプチド、または、ｓＩＧＦＲポリペプチドおよび免疫グロブリン重鎖定常領域のいずれかをコードすることとしてもよい。さらに、核酸配列は、例えば、免疫グロブリン重鎖定常領域のヒンジ領域に対して直接融合された免疫グロブリン軽鎖配列に基づく「リーダー」または「シグナル」配列を、任意に含むこととしてもよい。特定の実施形態では、Ｆｃ領域がＩｇＧ配列に基づく場合、Ｆｃ領域は、５’から３’方向で、少なくとも免疫グロブリンヒンジ領域（つまり、第２の免疫グロブリンヒンジ領域配列とともに、ジスルフィド結合を形成できる少なくとも１つのシステインアミノ酸含むヒンジ領域）、免疫グロブリンＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインをコードする。さらに、Ｆｃ−ｓＩＧＦＲ融合タンパク質をコードする核酸配列は、例えば、宿主細胞内で、Ｆｃ融合タンパク質を発現するかもしれない、複製可能な発現ベクター内で統合されることとしてもよい。
【００６６】
一実施形態では、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ融合タンパク質の免疫グロブリン重鎖定常領域構成物は、対象において非免疫原性または弱い免疫原性である。Ｆｃ領域は、免疫グロブリン重鎖定常領域が、免疫グロブリン重鎖定常領域に対する検出可能な抗体反応を直接発生しない場合、非または弱免疫原性と考えられる。従って、免疫グロブリン重鎖定常領域は、融合タンパク質の指定された受け取り者（ｉｎｔｅｎｄｅｄ  ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）として、同じ種に存在する免疫グロブリンに対応するアミノ酸配列に存在するまたはこれに基づく免疫グロブリン由来であるべきである。いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン定常重鎖配列は、ヒトに対して投与される、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ融合タンパク質に関して用いられる。ヒトＦｃＩｇＧのアミノ酸配列およびヌクレオチドは、当該技術分野で知られ、例えば、Ellison et al., Nucleic Acids Res. 10:4071-4079 (1982)に開示される。
【００６７】
本発明のＦｃ−ｓＩＧＦＲ融合タンパク質は、当該技術分野で知られる従来の方法論を用いて作成されることとしてもよい。例えば、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ融合構造体は、遺伝子組換え型ＤＮＡ技術、および、発現ベクター内に統合された結果として生じるＤＮＡを用いてＤＮＡレベルで生成され、本発明のＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ融合タンパク質を産生するための発現されることとしてもよい。本明細書で用いられる場合には、用語「ベクター」は、宿主細胞内に取り込まれるのに適応能があり、宿主細胞ゲノム内で組み替えられかつ統合される、またはエピソームとして自律的に複製されるヌクレオチド配列を含むあらゆる核酸を意味することが理解される。このようなベクターは、直鎖状の核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター等を含む。ウイルスベクターの非限定的な例は、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを含む。本明細書で用いられる場合には、用語Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ融合タンパク質の「遺伝子発現」または「発現」は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳、およびＦｃ融合タンパク質産生物の分泌を意味することが理解される。遺伝子工学技術によるタンパク質の融合に代えて、従来の化学的架橋剤を用いる化学的結合を、タンパク部分を融合するために用いることとしてもよい。
【００６８】
一実施形態では、本発明のＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ融合タンパク質は、配列番号：８、１０、１２、１４、１６、または１８の配列を有する、および／または配列番号：５、７、９、１１、１３、１５、または１７の配列を含む核酸によりコードされる、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１Ｆｃである。他の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２Ｆｃである。イントロン配列、例えば、Ｆｃ領域におけるイントロンは、融合タンパク質に含まれることとしてもよく、または含まれないこととしてもよい。ｓＩＧＦＩＲおよびＦｃ間のリンカー配列は、含まれることとしてもよく、または含まれないこととしてもよい。
【００６９】
他の実施形態では、本発明のＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ融合タンパク質は、配列番号：８または１０のアミノ酸配列からなる。他の実施形態では、本発明のＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ融合タンパク質は、配列番号：１２、１４、１６、または１８のアミノ酸配列からなる。
【００７０】
一態様では、血管新生依存性もしくは血管新生関連疾病、および／または、可溶性Ｆｃ−ＩＧＦＲ融合タンパク質の持続性のｉｎ  ｖｉｖｏ送達に基づく転移疾患、例えば、肝臓転移の予防および／または治療に関する治療のアプローチが本明細書で提供される。
【００７１】
一実施形態では、血管新生依存性もしくは血管新生関連疾病および／または転移の治療に有用な、本明細書に記載されるＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ９３３融合タンパク質、またはその生物活性フラグメントもしくは類似体を含む組成物が、本明細書で提供される。このような組成物は、薬学的に許容可能な担体、アジュバント、またはビヒクルをも含むこととしてもよい。
【００７２】
一態様では、本発明の組成物および方法は、それを必要とする対象、例えば、血管新生依存性または血管新生関連疾病を有する対象における血管新生を阻害するために用いられる。一態様では、血管新生関連疾病は、腫瘍転移、結腸直腸癌、肺癌、もしくは肝癌、または肝臓転移である。他の態様では、本発明の組成物および方法は、それを必要とする対象における転移の治療に用いられる。
【００７３】
本発明は、有効な量のＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ融合タンパク質またはその組成物により、血管新生依存性または血管新生関連疾病を治療する方法を含む。本発明は、また、有効な量のＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ融合タンパク質またはその組成物により、転移疾患を治療する方法を含む。
【００７４】
血管新生依存性および／または血管新生関連疾病は、固形腫瘍、白血病のような血液由来癌（ｂｌｏｏｄ−ｂｏｒｎ  ｔｕｍｏｒ）；腫瘍転移；良性腫瘍、例えば、血管腫、音響性アキュローマ（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ａｃｕｒｏｍａ）、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫；慢性関節リウマチ；乾癬；眼球の血管新生疾患、例えば、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、黄斑変性症、角膜移植後拒絶反応、血管新生緑内障、後水晶体線維増殖症、ルベオーシス；オスラーウエバーシンドローム（Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；心筋の血管新生；プラーク新血管新生；毛細血管拡張症；血友病関節症（ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａｃ  ｊｏｉｎｔ）；血管線維腫；および創傷肉芽形成（ｗｏｕｎｄ  ｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ）を含むが、これらに限定されない。本発明の組成物は、内皮細胞の過剰なまたは異常な刺激の疾病の治療に有用である。これらの疾病は、腸管癒着、粥状動脈硬化、強皮症、および肥厚性瘢痕、つまりケロイドを含むが、これらに限定されない。組成物は、胚移植のために必要とされる血管新生化を防止することにより受胎調節剤として用いることもできる。
【００７５】
追加的な実施形態は、哺乳類における悪性腫瘍または転移の治療の方法を含む。これらの方法は、悪性腫瘍または転移の治療を必要とする哺乳類を選択すること、および治療に有効な量のＦｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲ融合タンパク質またはその組成物を哺乳類に投与することを含み得る。いくつかの態様では、動物はヒトである。いくつかの態様では、融合タンパク質は、配列番号８、１０、１２、１４、１６、または１８の配列を有し、または生物活性フラグメントまたはその類似体である。
【００７６】
治療可能な疾病の非限定的な例は、メラノーマ、非小細胞性肺癌、神経膠腫、肝細胞性（肝臓）癌、甲状腺腫瘍、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（ｓｔｏｍａｃｈ））癌、前立腺癌（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ）、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肺癌、神経膠芽腫、子宮内膜癌、腎癌、結腸癌、膵臓癌、ユーイング肉腫、骨肉腫、膵癌、および類表皮癌を含む。一態様では、対象に、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ融合タンパク質またはその組成物を投与することを含む、結腸癌、乳癌、肝臓転移、多形膠芽細胞腫、および／または多発性骨髄腫を治療する方法が提供される。他の態様では、乳癌、肝臓癌、膀胱癌、肺癌および／または膵臓癌を治療する方法が提供される。
【００７７】
本発明の組成物および方法は、血管新生依存性もしくは血管新生関連疾病および／または転移の治療に関する他の組成物、方法、および／または手順と組み合わせて用いられることとしてもよい。例えば、腫瘍は、外科手術、放射線、化学療法、または標的（生物学的）治療（例えば、モノクローナル抗体、ＴＫＩ等）で従来の方式で治療されることとしてもよく、その後、続けて、本明細書に開示されるＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ９３３融合タンパク質を含む組成物を、微小転移の休止状態を延ばすため、およびあらゆる残留原発腫瘍を安定化させるために、患者に投与することとしてもよい。
【００７８】
本発明は、また、少なくとも１つの追加的な活性化合物、および／またはあらゆる薬学的に許容可能な担体、アジュバント、もしくはビヒクルと任意に組み合わされる、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲまたはその生物活性フラグメントもしくは類似体を含む薬学的（つまり、治療用）組成物、を提供する。「追加的な活性化合物」は、免疫抑制剤または抗癌剤のような１つの因子または複数の因子を包含するが、これに限定されるものではない。
【００７９】
本発明の方法および組成物と組み合わせて用いられることとしてもよい、抗癌剤の非限定的な例は、発癌および腫瘍成長に関与する特定のメカニズムに干渉する、標的癌療法および治療を含む。標的癌療法の非限定的な例は、（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）、Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標）およびＧｌｅｅｖｅｃ（登録商標）のような）チロシンキナーゼ関連標的、ホルモン、サイトカイン、および成長因子（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））に関する細胞外レセプター結合部のインヒビター、プロテアソームインヒビター（Ｖｅｌｃａｄｅ（登録商標））、並びにアポトーシスの刺激因子（Ｇｅｎａｓｅｎｓｅ（登録商標）を阻害する治療を含む。このような標的療法は、例えば、小分子、モノクローナル抗体、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、遺伝子治療および／または癌ワクチンを介して達成し得る。
【００８０】
本発明の組成物および方法と組み合わせて用いられることとしてもよい、抗癌治療および手順の非限定的な例は、外科手術、放射線、化学療法、または標的癌治療を含む。より具体的には、標的癌治療は、小分子、モノクローナル抗体、癌ワクチン、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、アプタマー、および遺伝子治療からなる群から選択される。対象は、治療、手順、または治療方式を組み合わせて受けることとしてもよい。当該技術分野で知られるあらゆる他の治療、手順、または治療方式を、単体でまたは他の治療もしくは治療方式と組み合わせて、本明細書に記載する方法で用いることができる。
【００８１】
用語「薬学的に許容可能な担体、アジュバント、またはビヒクル」は、本発明の組成物に組み込まれた対象に投与されることとしてもよい担体、アジュバント、またはビヒクルを指し、これらはその薬理学的活性を滅失させない。本発明の薬学的組成物に用いられることとしてもよい薬学的に許容可能な担体、アジュバント、およびビヒクルは、以下、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、自己乳化薬物送達系（ｓｅｌｆ−ｅｍｕｌｓｉｆｙｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）（「ＳＥＤＤＳ」）、Ｔｗｅｅｎまたは他の類似の高分子送達マトリックスのような薬学的剤形で用いられる界面活性物質、ヒト血清アルブミンのような血清タンパク質、リン酸塩のような緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和した植物脂肪酸、水、塩、またはプロタミン硫酸塩のような電解質の部分的なグリセリドの混合物、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂を含むが、これらに限定されない。α−、β−、およびγ−シクロデキストリンのようなシクロデキストリン、もしくは、２−および３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含むヒドロキシアルキルシクロデキストリンのような化学的に変更された誘導体、または他の可溶化された誘導体はまた、本発明の組成物の送達を高めるために用いられることとしてもよい。
【００８２】
本発明の組成物は、本明細書に記載されるような他の治療因子を含むこととしてもよく、例えば、従来の固体もしくは液体ビヒクル、または、希釈剤、並びに、薬学的製剤の分野でよく知られている技術に従って、所望の投与形態に適切なタイプの薬学的添加剤（例えば、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、香料等）を採用することにより処方されることとしてもよい。
【００８３】
本発明の組成物は、例えば、錠剤、カプセル、果粒、または粉末の形状のような経口的に；舌下に；口腔に；皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、または胸骨内（ｉｎｔｒａｓｔｅｍａｌ）への注射または注入技術によるような非経口的に（例えば、無菌の注入可能な水溶液もしくは非水溶液または懸濁液として）；吸入スプレーによるような経鼻的に；クリームまたは軟膏の形態によるような局所的に；坐剤の形態によるような直腸に；非毒性の、薬学的許容可能なビヒクルまたは希釈剤を含む用量単位製剤内に、のようなあらゆる適切な手段により投与されることとしてもよい。本発明の組成物は、例えば、即時放出または延長放出（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）に適する形態で投与されることとしてもよい。即時放出または延長放出は、適切な薬学的組成物の使用により、または、特に延長放出の場合には、皮下インプラントもしくは浸透圧ポンプのような装置により、達成されることとしてもよい。
【００８４】
経口投与のための代表的な組成物は、例えば、懸濁剤としてバルク、アルギン酸、またはアルギン酸ナトリウムを加える微結晶性セルロース、粘度増強剤としてのメチルセルロース、および当該技術分野で知られるような甘味剤または香料を含むこととしてもよい懸濁液；および、例えば、微結晶性セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウムおよび／またはラクトースおよび／または当該技術分野で知られる他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤、および潤滑剤を含むこととしてもよい即時放出の錠剤を含む。本発明の化合物は、舌下および／または頬側投与による口腔を通じて送達されることとしてもよい。成形された錠剤、圧縮された錠剤、凍結乾燥された錠剤は、使用されることとしてもよい代表的な形態である。代表的な組成物は、マンニトール、ラクトース、スクロースおよび／またはシクロデキストリンのような速溶性希釈剤で、本発明の組成物を処方するものを含む。そのような処方に含まれるものはまた、セルロース（アビセル）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような高分子量賦形剤であることとしてもよい。そのような処方は、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、カルボキシルメチルセルロースナトリウム（ＳＣＭＣ）、無水マイレン酸コポリマー（例えば、Ｇａｎｔｒｅｚ）、およびポリアクリルコポリマー（例えば、Ｃａｒｂｏｐｏｌ９３４）のような放出をコントロールする薬剤、のような粘膜接着を補助する賦形剤を含むこととしてもよい。潤滑剤、滑剤、香料、着色剤、および安定剤もまた、製造および使用の容易性のために添加されてもよい。
【００８５】
本発明の化合物の有効な量は、当業者により決定されることとしてもよく、１日当たり、体重の約０．１から５００ｍｇ／ｋｇの活性化合物のヒト成人に関する代表的な用量を含み、単一用量で、または、１日当たり１〜５回のように、個々に分割された用量の形態で投与されることとしてもよい。あらゆる特定の対象に関する、特定の用量レベルおよび投薬の頻度が変更され得ることが理解され、採用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および反応の長さ、対象の種、年齢、体重、一般的な健康、性別、および食事、投与の方式と時間、排出およびクリアランス率、薬物の組み合わせ、並びに特定の病状の重症度、を含む種々の因子に依存するであろう。治療に関する好ましい対象は、血管新生依存性または血管新生関連疾病にかかる動物、最も好ましくは、ヒト、イヌやネコ等のような飼育動物のような哺乳類を含む。
【００８６】
本発明の組成物は、単体で、または、本発明のこれら以外の血管新生阻害剤のような血管新生依存性または血管新生関連疾病の治療に有用な他の適切な治療因子と組み合わせて採用されることとしてもよい。
【００８７】
本発明は、その範囲を限定するというよりもむしろ、本発明を図示するために示される以下の実施例を参照することにより容易に理解されるであろう。
【００８８】
実施例
表１は、実施例に記載されるように調製および試験された、精製ｓＩＧＦＩＲおよびＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ  Ｔｒａｐタンパク質を示す。
表１  精製Ｔｒａｐタンパク質の説明
【表１−１】
2015505843.tif 000003
【表１−２】
2015505843.tif 000004
1ＴｒａｐＡ〜Ｃは、同じＴｒａｐタンパク質の異なるバッチである。
2ＴｒａｐＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、およびＩは、異なる精製条件を用いて産生された、同じＴｒａｐタンパク質（配列番号：８）である。
【００８９】
表１ならびに図２７および２８に記載されるように、Ｍｏｄ＃１、Ｍｏｄ＃２、Ｍｏｄ＃３、およびＭｏｄ＃４は、親ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパク質（配列番号：７のＤＮＡ配列によりコードされるＴｒａｐＨ；配列番号：８）を変更することにより作成された、変更ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパク質（本明細書では、ｈ−ｓＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃおよびｈ−ｓＩＧＦ１Ｒ−ＦｃＩｇＧ１タンパク質も指す）である。４つの変更されたタンパク質は、配列番号：１１、１３、１５、および１７のＤＮＡ配列によりそれぞれコードされる。
代表的なｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ２タンパク質の配列は配列番号：１０であり、配列番号：９のＤＮＡ配列によりコードされる。
【００９０】
実施例１  Ｔｒａｐタンパク質の産生および精製
我々は、まず、Ｈｉｓ標識ｓＩＧＦＩＲの精製方法を開発し、最適化した。１３リットルのｓＩＧＦ1Ｒを発現する２９３細胞を産生し、濃縮した。Ｈｉｓ標識ｓＩＧＦ1Ｒは、ＩＭＡＣ−クロマトグラフィーを用いて、濃縮されたストックから精製された。精製タンパクは、ｓＩＧＦ1Ｒ捕獲のためにインスリンを用いる、親和性クロマトグラフィー精製手順を開発するためのコントロールとして使用された。インスリンカラム上のｓＩＧＦ1Ｒを捕獲するための不成功な試みの後に、新たな２つのステップの精製方法：ハイドロキシアパタイトカラム上の捕獲ステップ、その後に続くゲル濾過、を開発した。試験のために、精製タンパクが得られた（「ＴｒａｐＡ、Ｂ、Ｃ」；表１）。２９３細胞で産生されたＨｉｓ−標識ｓＩＧＦＩＲによる方法を開発した後、ｓＩＧＦＩＲおよびＦｃ−ｓＩＧＦＩＲを発現する、プールされたＣＨＯ細胞から産生された標識のない（ｔａｇ−ｆｒｅｅ）ｓＩＧＦＩＲ（つまり、ＦｃありおよびＦｃなしのそれぞれ）を用いて、下記のように検証した。
【００９１】
ＣＨＯ細胞プールからのｓＩＧＦＩＲの精製のために、２つの独立した、ｓＩＧＦ1Ｒを発現するレンチウイルスベクターが、２９３−ＰａｃＬＶ細胞の一過性導入により、および、他で記載されかつ説明される生産プール（ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｐｏｏｌ）により（Gaillet, B. et al., Biotechnol. Bioeng.; 106: 203-15）、生成された。ＣＨＯ細胞株は、ｓＩＧＦＩＲ遺伝子を内部に持つレンチウイルスにより６回まで形質導入された。安定発現株のＣＨＯプールは、最良の生産クローンを分離するためにサブクローニングされた（図１）。生産がスケールアップされ、ＣＨＯの上清は濃縮され、ｓＩＧＦＩＲは、（上述のように）ハイドロキシアパタイトカラム、その後のゲル濾過を用いて精製された。精製されたｓＩＧＦＩＲ（「ＴｒａｐＤ」）が試験のために得られ；代表的な結果は図２に示される。
【００９２】
ＣＨＯプールからのＦｃ−ｓＩＧＦＩＲの精製のために、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ（ヒトＩｇＧ１のＦｃ）を発現する２つの独立したレンチウイルスベクターは、２９３−ＰａｃＬＶ細胞の一過性導入により、および、他で記載されかつ説明される生産クローン（ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｃｌｏｎｅ）により（Gaillet, B. et al., Biotechnol. Bioeng.; 106: 203-15）、生成された。ＣＨＯ細胞株は、その後、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ遺伝子を内部に持つレンチウイルスベクターにより６回まで形質導入された。安定的に形質導入されたＣＨＯ細胞株のプールは、最良の生産クローン（ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｃｌｏｎｅ）を選択するためにサブクローニングされた（図１）。その後、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲのラージスケールの産生が開始され、ＣＨＯ上清を採取して濃縮し、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲがハイドロキシアパタイトカラム、その後のゲル濾過を用いて精製した。精製したＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ（「ＴｒａｐＥ」）が試験のために得られ；代表的な結果は図３に示される。
【００９３】
Ｆｃ−ｓＩＧＦ１Ｒに分画はまた、プロテインＡクロマトグラフィーを用いて精製された。高分子量（ＨＭＷ）種は、加工しない状態で検出され、調製物を精製したが、低ｐＨでの溶出（４．０〜４．５）が調製物におけるＨＭＷタンパク質分画を部分的に低減した（図４および５）。プロテインＡに結合するＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃのｐＨ段階溶出を用いることにより、高分子量（ＨＭＷ）種の約半分がは取り除かれ得ることは特筆すべきことである。
【００９４】
精製されたＦｃ−ｓＩＧＦ１Ｒは、試験のためにｐＨ４．０（「ＴｒａｐＦ」）およびｐＨ３．５（「ＴｒａｐＧ」）で溶出され；代表的な結果が図４に示される。精製されたＴｒａｐＦに関し（ｐＨ４）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＤＣプロテインマイクロアッセイは２．７ｍｇ／ｍｌ（合計２．２７ｍｌ）を示し；ゲルスキャニング（ｇｅｌ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）の結果は、１００％の純度で３から３．２ｍｇ／ｍｌを示した。
【００９５】
追加的なｉｎ  ｖｉｖｏでの研究に関し、これらのＦｃ−ｓＩＧＦ１Ｒ調製物のエンドトキシンフリーのバッチもまた、産生され、ｐＨ４．０（「ＴｒａｐＨ」）およびｐＨ３．５（「ＴｒａｐＩ」）で溶出され；代表的な結果は図５に示される。図５のエンドトキシンフリーＴｒａｐＨ（ｐＨ４．０）およびＴｒａｐＩ（ｐＨ３．５）に関し、３０４ｍｌのＣＨＯ−ｃｕｍ２−ＣＲ５−ＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−（ＩｇＧ１）−１６−１３−１−６＃７の産生物が、ｍａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ２．０８ｍｌ、１０．７５ｃｍＨ、ｌｏｔ＃１００２９７９１にロードされた。衛生化は、０．５Ｍ  ＮａＯＨ、Ａ１１からＡ１４、ポンプ６９０、Ｆ２、Ｆ８  ＯＮ；Ａ１５および、カラム、０．５Ｍ  ＮａＯＨで１時間３０分＋０．１Ｍ  ＮａＯＨで一晩でなされ；結合緩衝液は２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７であり；溶出はクエン酸ナトリウム０．１Ｍ、ｐＨ４．５、４、３．５、および２．５でなされる。（Ａ１からＡ１５、Ｂ１からＢ１５、Ｃ１、Ｄ１、Ｅ１等の文字および数字はカラムから収集された分画を指し；文字および数字は分画収集器のラック上のチューブの位置を示す。２つのタイプの分画収集器が用いられ、小さいチューブに関しては、位置はＡ１からＡ１５，Ｂ１からＢ１５等であり、大きいチューブに関しては、位置はＡ１からＡ１２，Ｂ１からＢ１２等であった。）
【００９６】
我々は、ヒトＩｇＧ2のＦｃ領域を用いて、代替的なＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ融合タンパク質もまた生成した。この融合タンパク質によるＨＭＷ種の産生は、ヒンジ領域における増加した安定性が原因で低減され得、これにより、ＨＭＷ種の効能のある第２の効果に関する影響が排除される。
【００９７】
産業グレードのＴｒａｐタンパク質の生産を可能にする安定したＣＨＯ株は、当該技術分野で知られる標準的な方法を用いて産生され得ることが理解されるであろう。
【００９８】
実施例２  Ｔｒａｐタンパク質の品質管理に関する分析的アッセイ
Ｔｒａｐタンパク質の特徴づけに関し、例えば、タンパクの純度、完全性、凝集、およびグリコシル化を測定するための分析的アッセイが開発された。ｓＩＧＦＩＲおよびＦｃ−ｓＩＧＦＩＲタンパクの両方が、ゲルスキャニングに基づいて、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲ調製物におけるＨＭＷ種の存在を除いて、有意に純粋なようであった（ゲルスキャニングがレーン１７のｓＩＧＦＲに関して９５から９７％の純度を示した図２、ゲルスキャニングがレーン１５のＦｃ（ＩｇＧ1）−ｓＩＧＦ１Ｒ関して９４％の純度を示した図３を参照）。いずれのタンパクも、４℃または−７０℃での保存の数か月後に、凝集は観察されなかった。
【００９９】
２つのタンパクにおけるグリコシル化のパターンは、質量分析により分析された（図７）。分析は、ｓＩＧＦＩＲ（「ＴｒａｐＤ」）およびＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ（「ＴｒａｐＥ」）がそれぞれ１９および２０の効能のあるＮ結合部位を有するということを示した。各部位は、サイズおよびシアリル化（ｓｉａｌｉｌａｔｉｏｎ）の程度の異なる種々のグリカンで修飾されている。グリコフォームの分布は部位間で異なるが、小さな、二分岐型グリコフォームは、ほとんどの部位で最も共通する。グリコフォームの分布およびグリカン型ではないシアリル化の程度は、ｓＩＧＦＩＲおよびＦｃ−ｓＩＧＦＩＲ間で異なることが分かった。概して、Ｆｃ−ｓＩＧＦ１Ｒは、ｓＩＧＦＩＲよりも、より複雑な（より長い）、より少ないシアリル化グリカンを含むことが発見された。
【０１００】
実施例３  ｓＩＧＦＲおよびＦｃ−ｓＩＧＦＲタンパクに関する機能的ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
本発明のデコイタンパク質を試験するための、もっとも感受性が高く機能性があるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを選択するために、我々は、まず、４つの異なるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、悪性腫瘍の進行および転移に関連する腫瘍細胞特性における、精製したＴｒａｐタンパク質の効果を測定した（表１）。つまり、我々は、ＩＧＦ−Ｉの存在下で腫瘍増殖、細胞生存性、足場非依存性増殖、および浸潤をブロックするＴｒａｐタンパク質の性能を測定した。全ての実験に関し、我々は、高転移性ルイス肺癌亜系Ｈ−５９細胞を用いた。最初のスクリーニング後に、我々は、それらが、（ｉ）半自動化され、（ｉｉ）ユーザに依存する変異を受けにくく、（ｉｉｉ）優れた再現性を有し、かつ（ｉｖ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの腫瘍細胞の転移の潜在性のより高い相関性が考えられる、という理由により、全てのＴｒａｐタンパク質の完全な分析のためにアノイキスおよび浸潤分析を選択した。全ての機能性ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおけるの結果は以下に要約される。
【０１０１】
増殖は、比色分析の（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ）アッセイを用いて測定された。分析条件を最適化するための予備的分析後に、細胞は一晩血清を欠乏させ、その後、精製されたＴｒａｐＤおよびＥの存在下または非存在下で、１：１のＩＧＦ−I：Ｔｒａｐモル比を送達するために算出された濃度で、１０または５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉでインキュベートした。結果（図８）は、１０ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉ（全ての時点におけるｐ＜０．００１）のいずれかの存在下で、細胞増殖の完全な阻害を示した。
【０１０２】
細胞生存性は、以前記載したように、アノイキス（分離誘発（ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ）アポトーシス）分析を用いて分析された（Burnier, J.V., et al., Oncogene, 30: 3766-83, 2011]）。簡潔にいうと、腫瘍細胞（２．５×１０5／ウェル）は、それらの接着を防ぐために１０ｍｇ／ｍｌのＰｏｌｙＨＥＭＡ（Ｓｉｇｍａ）で予めコートされた２４ウェルプレートにまかれ、それらはその後、ＴｒａｐＤおよびＥはありまたはなしで、ＩＧＦ−Ｉを含む血清の存在下で、または無血清培地で、３７℃で４８時間インキュベートされた。インキュベート期間の最後に、アポトーシスを、Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ−ＲＥＤ染色キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｎａｄａ）を用いて、メーカーの指示にしたがって分析した。この分析において生存因子として明らかにＩＧＦ−Ｉを識別し、ＴｒａｐＥによるアノイキス（つまり、ＩＧＦ−Ｉの生存促進性／抗アポトーシスの効果の阻害）での容量依存性の増加を示したこの分析の結果は、ＴｒａｐＤ（図９；ｐ＜０．０５）と比較してより有意であった。さらに、その後のプロテインＡカラムを用いたＴｒａｐ精製（つまり、ＴｒａｐＦおよびＧ）は、ＩＧＦ−Ｉの抗アポトーシスの効果をブロックするためのそれらの性能を、特に１：２の下部Ｔｒａｐ：ＩＧＦ−Ｉ比で、いくらか向上させた（図１０；ｐ＜０．０５）。
【０１０３】
足場非依存性腫瘍細胞の成長は、以前記載したように、半流動寒天クローン形成分析を用いて測定された（Brodt, P. et al., J. Biol. Chem. 2001; 276: 33608-15）。簡潔にいうと、ＩＧＦ−Ｉありまたはなしで、表示された濃度のＦＣＳを含む、ＲＰＭＩ培地における腫瘍細胞は、０．８％アガロース溶液（１：１の割合で）で混合され、３５ｍｍの培養ディッシュの凝固した１％アガロース層の上にまかれた（２×１０4細胞／ディッシュ）。オーバーレイに対して、同じ濃度のＦＣＳを含むＲＰＭＩ培地が添加され、プレートは３７℃で１４日間でインキュベートされ、そのとき細胞は固定され、直径８０μMを超えるコロニーが接眼レンズ用グリッドを備える顕微鏡を用いて点数化された。この分析の結果（図１１）は、ＴｒａｐＤおよびＴｒａｐＥが、半流動寒天にコロニーを形成するための腫瘍細胞の性能を有意に低減させたということを示し（全ての条件において、ｐ＜０．０１）、これらの分析条件下では２つのＴｒａｐの活性は微小な差があるのみであった（１％のＦＣＳの存在下においてのみ、ｐ＜０．０５）。
【０１０４】
腫瘍細胞の浸潤は、新たな、自動化されたｘＣＥＬＬＩｉｇｅｎｃｅ（商標）システム（Ｒｏｃｈｅ）を用いる、リアルタイムの、電気的インピーダンスに基づく技術を用いて測定された。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ（商標）機器は、（悪性の）細胞の集団がマトリゲル層に浸潤し、ボイデンチャンバーシステムの下部チャンバーに移動するときの、電極／細胞の異相間で電気的インピーダンスにおける変化を測定する。他者により記載されかつ説明されているように（Ungefroren, H. et al., Int. J. Oncol.; 38:797-805; Rahim, S. and Uren, A., J. Vis. Exp., 50: 1-4, 2011）、インピーダンスは、細胞により覆われている組織培養ウェルの合計エリアに対する直接的な比率である、セルインデックス（または細胞単位）とよばれる無次元パラメータとして表示される。腫瘍Ｈ−５９細胞は（上部チャンバにおいて）、細胞外マトリクス混合物ＭａｔｒｉｇｅｌＴＭ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で予めコートされたウェルに、最適な浸潤を可能にするための予め測定された濃度でまかれた（５×１０4細胞／ウェル）。それらは、その後、表示されるＩＧＦ−Ｔｒａｐが異なる（近似の）ＩＧＦ：Ｔｒａｐモル比で添加された（またはされていない）５０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ−Ｉを含む下部チャンバの上部に配置された。細胞浸潤におけるＴｒａｐＤ（ｓＩＧＦ１Ｒ）およびＴｒａｐＥ（Ｆｃ−ｓＩＧＦ１Ｒ）の抑制効果が１：１のＴｒａｐ：ＩＧＦ−Iモル比で比較された時（図１３）、それらはＴｒａｐＥに関する明らかに増加した活性を示した（３６時間で、ｐ＜０．０５）。エンドトキシン除去を伴わない（つまり、ＴｒａｐＦおよびＧ；図１２）、または伴う（ＴｒａｐＨおよびＩ；図１３）プロテインＡ精製に続いて、これら全ての調製物の高められた活性は、みられた有意な阻害はエンドトキシンの非特異的な影響に関連しないことを示した。浸潤分析において、ｐＨ３．５で溶出された分画（つまり、高分子量種が豊富、図５および６参照）は、高分子量種が枯渇したものよりも、より活性化しているようであった（ｐ＜０．０１）ことは特筆すべきことであり、高分子量タンパクがＩＧＦ−Ｉ「トラップ」性能を保持したことを示唆する。
【０１０５】
驚くべきことに、Ｆｃ−ｓＩＧＦＲタンパクは、ｓＩＧＦＲタンパクと比較して、これらの抗癌分析において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増加した効能を示し、Ｆｃ−ｓＩＧＦＲタンパクのこの増強された効能が精製により向上したことが、ここに示される結果からみられ得る。
【０１０６】
実施例４  ｓＩＧＦＲ対Ｆｃ−ｓＩＧＦＲの結合特異性および親和性
精製Ｔｒａｐレセプター（「Ａ」〜「Ｉ」）およびＩＧＦ−ＩＲリガンド（ｍＩＧＦ−１、ｈＩＧＦ−１、ｈＩＧＦ−２、およびヒトインスリン）間の結合が、標識なし、リアルタイム表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて測定された。実験は、他者により記載されるＢＩＡＣＯＲＥ（商標）３０００計測手段（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて２５℃で行われた（Forbes, B.E., et al., Eur. J. Biochem. 2002; 269: 961-8; Jansson, M., et al., J. Biol. Chem. 1997; 272: 8189-97; Surinya, K.H., et al., J. Biol. Chem. 2008; 283: 5355-63）。最初に、リガンドをデキストランコートセンサーチップに固定化し（〜１２５ＲＵ；Ｂｉａｃｏｒｅ  Ａｍｉｎｅ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｋｉｔ）、レセプターを、参照（つまり、リガンドなし）およびリガンド表面上でタンデムに（ｉｎ  ｔａｎｄｅｍ）滴定した。相互的な実験では、リガンドは固定されたＴｒａｐ表面上で滴定された（〜８０００ＲＵ）。質量輸送−独立データは二重に参照（ｄｏｕｂｌｅ−ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｄ）され（Myszka DG. Improving biosensor analysis. J Mol Recognit 1999; 12: 279-84）、２つの独立した実験から取得された代表的な２回の注入（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）であった。マルチサイクル滴定に関し、平衡解離定数（ＫD）が、「１：１動力学的」モデル（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｖ４．１ソフトウェア）または「定常状態親和性」モデル（ヒトインスリン滴定のみに関する）に対するデータのグローバルフィッティング（ｇｌｏｂａｌ  ｆｉｔｔｉｎｇ）により測定された。単一サイクル滴定に関し、ＫD値が「１：１滴定」モデルに対するデータのローカルフィッティング（ｌｏｃａｌ  ｆｉｔｔｉｎｇ）により測定された（Karlsson, R., et al., Anal. Biochem. 2006; 349: 136-47）。
【０１０７】
Ｈｉｓ標識ｓＩＧＦＩＲ変異体（「ＴｒａｐＡ、Ｂ、Ｃ」）は、最初に試験され、その後Ｔｒａｐタンパク質分析のための調製物におけるアミン結合リガンド表面に結合しているＴｒａｐに関し、分析条件を標準化するために用いられた。ナノモル滴定の範囲を超えて、ＴｒａｐＢは最良の全体的な活性を示し、マウスまたはヒトＩＧＦ−Ｉを固定するためのその結合は、ヒトインスリン（特異性のコントロール；マイクロモル親和性）または、マルトース結合タンパク質（陰性コントロール；親和性なし）とほどんどまたは全くない反応と比較して有意であった。相互的な実験においては、ｈＩＧＦ−ｌは滴定されて、ナノモル親和性でＨＥＫ２９３−精製ＴｒａｐＢおよびＣＨＯ−精製ＴｒａｐＤおよびＥ表面に結合され、全ての場合において、ヒトインスリンは、より弱い、マイクロモル親和性で結合した（表２）。これらのマルチサイクル試験では、平均して、ＴｒａｐＢ、Ｄ、および，Ｅは類似の結合および解離速度定数（それぞれ、ｋa〜２．６×１０5Ｍ-1ｓ-1およびｋd〜２×１０-3ｓ-1）を示した。結果は、ＴｒａｐＤおよびＥがｈＩＧＦ−ｌリガンドと高い親和性で特異的に結合し得、ＴｒａｐＥのｈＩＧＦ−Iとの相互作用はＴｒａｐＤと比較してわずかにより強いということを確認した。
【０１０８】
表２  マルチサイクル分析を用いた最初のＳＰＲスクリーニングの結果（ｎ＝４）
示されるのは、Ｔｒａｐタンパク質およびリガンド間の結合に関する、算出された平衡解離定数（ＫD＋／−ＳＥ）である。これらの結果は、インスリンと比較されたｈＩＧＦ−ｌに関するＴｒａｐの特異性を明らかに示す。Ｆｃ−ｓＩＧＦ−ＩＲ融合は、ヒトインスリンに関する親和性よりも約１０００〜２０００倍高い、ｈＩＧＦ−１に関する親和性を示した。
【表２】
2015505843.tif 000005
【０１０９】
プロテインＡ−精製ＴｒａｐＦおよびＧ（コントロールとしてのＤとともに）がリガンド−固定表面上で流され、ｈＩＧＦ−I並びにｍＩＧＦ−IおよびｈＩＧＦ−IIに関する低いナノモル親和性が示された（表３）。これらのマルチサイクル実験において、ＴｒａｐＤ（ｋd〜８×１０-4ｓ-1）と比較して、ＴｒａｐＦが緩徐な解離速度定数（ｋd〜４．３×１０-4ｓ-1）を有し、ＴｒａｐＦと比較して、ＴｒａｐＧがさらに緩徐な解離（ｋd〜１．５×１０-4ｓ-1）であったことも特筆すべきことである。最後に、エンドトキシンフリーのバージョンのＴｒａｐＦおよびＧ（つまり、それぞれＴｒａｐＨおよびＩ、コントロールとしてのＥとともに）は、ＳＰＲ分析のために固定された。ＴｒａｐＥ（図１４）、Ｈ、およびＩは、これらの単一サイクル実験における、類似する結合および解離反応速度を共有し、ＴｒａｐＩに関して予測されたナノモルＫＤ値はＴｒａｐＥおよびＨのものとは全く異なるものであった（表３）。この発見は、ＴｒａｐＩ調製物の増加したサンプルの複合体（つまり、ＨＭＷ種）およびＴｒａｐＩ調製物における非常に少ない量の所望の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）によるようであった（図５、レーン９〜１２参照；赤い矢印は所望の種を示す）。
【０１１０】
概して、ＴｒａｐＩおよびＥが高分子量種により混入されることは特筆すべきである。この混入が、ＴｒａｐｓＩおよびＥとＴｒａｐＨ（例えば、表３および他において）間にみられる差、および本明細書に報告される結果における変化性の多くを占めるということが考えられる。実施形態では、よって、ＴｒａｐＨは、好ましい実施形態を代表する。
【０１１１】
表３  ＩＧＦ−ＩＲリガンドに関するＴｒａｐＤ、Ｅ、Ｈ、およびＩの親和性
示されるのは、精製したＴｒａｐおよびＩＧＦ−ＩＲリガンド間の結合に関する算出された平衡解離定数（ＫD＋／−ＳＥ）である。***マルチサイクルＳＰＲにおいてｎ＝４
【表３】
2015505843.tif 000006
【０１１２】
要約すると、ＳＰＲの結果は、２つの異なる結合の配向を用いる、精製したＴｒａｐタンパク質およびＩＧＦ−ＩＲリガンド間の結合を、成功的に示した。可変の構造体および異なるＴｒａｐ調製物を生成するために採用された精製手順にも関わらず（つまり、「Ａ」〜「Ｉ」、表１参照）、ｔｒａｐは、大部分が類似の結合および解離反応速度を示した。しかしながら、豊富な、天然四量体タンパクを含むプロテインＡ−精製調製物（例えば、ｐＨ４．０で溶出されたＴｒａｐＦおよびＨ）は、より高い相対的割合の高分子量種を含む調製物（例えば、ｐＨ３．５で溶出されたＴｒａｐＧおよびＩ）と比較して、よりよい品質のＳＰＲフィット（ｆｉｔ）を生成した。
【０１１３】
概して、ＴｒａｐＡ〜Ｉに関する親和性の定数は、固定されたｈＩＧＦ−ＩＲに結合するリガンドが報告されている、同様に発行されたＳＰＲデータ、例えば、Forbes et al. (Forbes, B.E., et al., Eur. J. Biochem. 2002; 269: 961-8)が報告したＫＤ（ｈＩＧＦ−Ｉ→ｈＩＧＦ−ＩＲ）＝４．５ｎＭおよびＫＤ（ｈＩＧＦ−ＩＩ→ｈＩＧＦ−ＩＲ）＝２３ｎＭ； Jansson et al. (Jansson, M., et al., J. Biol. Chem. 1997; 272: 8189-97)が報告したＫＤ（ｈＩＧＦ−Ｉ→ｈＩＧＦ−ＩＲ）＝３．５ｎＭおよびＫＤ（ｈＩＧＦ−ＩＩ→ｈＩＧＦ−ＩＲ）＝２０ｎＭと一致した。しかしながら、驚くべきことに、ＴｒａｐＥ、Ｆ、Ｈ、およびＩは、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２リガンドの両方に関して類似の結合親和性を示し、または、いくつかの場合には、ＩＧＦ−１よりもＩＧＦ−２に関してより高い親和性さえ示した。さらに、いくつかの場合には、ＩＧＦ−１に関するＴｒａｐＦｃ融合タンパク質の親和性は、可溶性ｓＩＧＦＩＲ単体のそれよりも高かった。ＴｒａｐＨおよびＦがそうであったように、ＴｒａｐＥが両方のリガンドに関して類似の親和性を示さなかったことは特筆すべきことであり、これは使用された精製手順によるようである。
【０１１４】
実施例５  ＳＩＧＦＲ対Ｆｃ−ｓＩＧＦＲのｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性および薬物動態学的特性
上記のように、４℃または−７０℃で数か月保存した後も、タンパクのいずれにも凝集は観察されなかった。しかしながら、我々は、−７０℃での保存の最初の３〜６か月以内にこれらのタンパクの機能的活性が最適となったことを特筆する。これは、前のものと比較して（例えば、３か月の保存後、表４参照）、後の分析（例えば、９か月の保存後、表５参照）で観察されたＴｒａｐＤおよびＥの低減された半減期を説明するかもしれない。
【０１１５】
表４  ＴｒａｐＤおよびＥに関する最終的な薬物動態学的パラメーター
（Ｎ／Ａ：適用不可能）
【表４】
2015505843.tif 000007
【０１１６】
表５  ＴｒａｐＤ、Ｅ、Ｉ、およびＨに関する最終的な薬物動態学的パラメーター
（Ｎ／Ａ：適用不可能）
【表５】
2015505843.tif 000008
【０１１７】
マウスは、各試験Ｔｒａｐタンパク質を１０ｍｇ／ｋｇで静脈内に注入された。マウスは、３匹のマウスごとにいくつかのグループに分けられ、血液が、注入後５分で開始し、０．３３、１、３、６、１２、１６、および２４時間まで続けて、その後１４日目まで毎日、交互の群から採取された。血漿が調製され、可溶性ＩＧＦ−ＩＲレベルがＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定された。同じ間隔で出血したマウスの各グループのデータがプールされた。
【０１１８】
結果（図１５）は、Ｈｉｓ標識Ｔｒａｐタンパク質（２９３細胞−産生ＴｒａｐＡ）と比較して、ＣＨＯ細胞−産生Ｔｒａｐタンパク質ＤおよびＥに関する優れたｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を示した。それらは、ＴｒａｐＤおよびＥに関するｉｎ  ｖｉｖｏの安定性プロファイルおよび別個のクリアランスをも示した。これらのデータ上でその後行われた薬物動態学的分析は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける優れた安定性示すＴｒａｐＥにより、半減期において２倍よりも大きな差を示した（ＴｒａｐＤの２１．８時間と比較して４７．５時間、表４参照）。これらのデータは、追加的なＦｃ−ＩｇＧ1フラグメントがＴｒａｐタンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を増加させたことを確認した。エンドトキシンフリーである場合、プロテインＡ−精製、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲタンパク（ＴｒａｐＨおよびＩ）はその後、同様の方式で分析され、我々は、ｐＨ４．０で溶出された分画（ＴｒａｐＨ、高分子量種枯渇）が、ｐＨ３．５で溶出したもの（ＴｒａｐＩ、豊富にある高分子量種）に対する、優れた薬物動態学的性能（半減期において３．５倍増加、表５）を有したということを発見した（図１６）。
【０１１９】
これらの結果は、可溶性ＩＧＦ−ＩＲに対するＦｃフラグメントの追加が、Ｔｒａｐタンパク質の結合親和性および薬物動態学的特性の両方を有意に向上させたということを示す。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲは、天然ｓＩＧＦ−ＩＲと比較して活性が増加し、Ｆｃ−ｓＩＧＦＩＲの活性は以下のプロテインＡ精製の後増加した。プロテインＡ精製は、高分子量種から単一の四量体Ｔｒａｐタンパク質を分離することにおいて有効ではなかった。しかしながら、ｐＨ４．０での溶出は、調製物における相対的割合の低減に有効であった。最終的に、高分子量種の存在がｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパクのＩＧＦトラップ活性に顕著な影響を及ぼさない（高分子量タンパクに対して可能性があるわずかな利点を有する）と同時に、それらは、試験された全てのＴｒａｐタンパク質に関し観察された最も低いものを形成する１０時間の半減期の値により、顕著に薬物動態学的プロファイルを低減させた。
【０１２０】
実施例６  マウスモデルにおける肝臓転移の低減
マウスは、実験的な肝臓転移を生成するために、５×１０4肺癌Ｈ−５９または結腸癌ＭＣ−３８細胞を、脾臓内／門脈のルートを介して注入された。以下の日に、それらは、５ｍｇ／ｋｇのＴｒａｐＨ（またはコントロールのビヒクル）の最初のｉ．ｖ．注入を受け、その後、５日目に同じ投与量で第２の注入を受けた。腫瘍注入後１８日目に、マウスは安楽死させられ、転移が数えられて採寸された。
【０１２１】
結果が以下の表および図２０に示される。ＴｒａｐＨは、マウスモデルにおいて、ビヒクル単体と比較して、Ｈ−５９およびＭＣ−３８腫瘍に関する肝臓転移の数およびサイズを低減させた。
【表６】
2015505843.tif 000009
コントロールと比較して*ｐ＜０．０５（マン−ホイットニー検定）
【０１２２】
図２０に示されるのは、腫瘍注入後１９日目の、ＭＣ−３８結腸癌注入マウス由来の肝臓の代表的なＨ＆Ｅ染色ホルマリン固定パラフィン包埋部である。
【０１２３】
実施例７  ＩＧＦ−Ｔｒａｐタンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍細胞におけるＩＧＦ−ＩＲシグナリングを阻害する。
Ｃ５７ＢＬ６雌のマウスは、脾臓内に１０5ＧＦＰ標識Ｈ−５９細胞を注入され、その後、５ｍｇ／ｋｇのＩＧＦ−Ｔｒａｐまたはビヒクルのみ（治療なし）を、腫瘍注入後１日目および３日目に注入された（１グループあたり３匹のマウス）。マウスは、６日目に殺処分され、肝臓が取り出されて急速に凍結され、１０μＭの凍結切片が準備され、１：１００に希釈したウサギポリクローナル抗マウスｐＩＧＦ1Ｒ抗体（ａｂ３９３９８−Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で、その後、１：２００に希釈したヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（遠赤色）抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で免疫染色された。インキュベーションは、ＤＡＰＩ（１：２０００）の存在下で、加湿チャンバにおいて、それぞれ室温で１時間であった。切片を洗浄してＧＯＬＤ  抗退色（ａｎｔｉ−ｆａｄｅ）薬剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をマウントし、Ｚｅｎ画像分析ステーションを備える、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ５１０  Ｍｅｔａ、共焦点顕微鏡で分析した（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｃａｎａｄａ  Ｌｔｄ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）。各治療グループは、１２〜１６の部位が分析され、ｐＩＧＦＩＲが陽性であるＧＦＰ+腫瘍細胞のパーセンテージが算出された。代表的なマージされた共焦点像が図２１Ａに示され、各グループにおける算出されたｐＩＧＦ−ｌＲ+緑色蛍光腫瘍細胞のパーセンテージの平均が図２１Ｂに示される。この結果は、ＩＧＦ−Ｔｒａｐによる治療の結論として、腫瘍細胞上のＩＧＦ−Ｉレセプターの活性およびシグナリングは有意に低減されたことを示す。
【０１２４】
実施例８  ＩＧＦ−Ｔｒａｐはｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞アポトーシスを増加させる。
肝臓凍結切片は、上記実施例７に記載のように得られた。切片は、まず、１：１００に希釈したウサギポリクローナル抗マウス開裂カスパーゼ３抗体（ａｂ４５０１−Ａｂcａｍ）で、その後、１：２００に希釈したヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）でインキュベートされた。切片のインキュベーションおよび処理は、実施例７に記載のとおりであった。各治療グループ１１〜１４の切片が分析され、開裂カスパーゼ３陽性（アポトーシスのインジケーター）である、ＧＦＰ+腫瘍細胞のパーセンテージが算出された。代表的なマージされた共焦点像が図２２Ａに示され、各グループにおける、開裂カスパーゼ３+緑色蛍光腫瘍細胞の割合の算出された平均が図２２Ｂに示される。結果は、ＩＧＦ−Ｔｒａｐによる治療が、アポトーシスが生じる腫瘍細胞の割合の有意な増加を引き起こしたことを示す。
【０１２５】
実施例９  ＩＧＦ−Ｔｒａｐは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞の増殖を阻害する。
肝臓凍結切片は、上記実施例７に記載のように得られた。切片は、まず、１：１００に希釈したウサギポリクローナル抗マウスＫｉ６７抗体（ａｂ１５５８０−Ａｂｅａｍ）で、その後、１：２００に希釈したヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）でインキュベートされた。切片のインキュベーションおよび処理は、実施例７に記載のとおりであった。各治療グループに関し、１４の切片が分析され、Ｋｉ６７陽性（増殖のマーカー）である、ＧＦＰ+腫瘍細胞のパーセンテージが算出された。代表的なマージされた共焦点像が図２３Ａに示され、各グループにおける、Ｋｉ６７+緑色蛍光腫瘍細胞の割合の算出された平均が図２３Ｂに示される。結果は、腫瘍細胞増殖がＩＧＦ−Ｔｒａｐで治療マウスで有意に低減したということを示す。
【０１２６】
実施例１０  ＩＧＦ−Ｔｒａｐがｉｎ  ｖｉｖｏで血管新生をブロックする。
肝臓凍結切片は、上記実施例７に記載のように得られた。切片は、まず、１：１００に希釈したラットモノクローナル抗マウスＣＤ３１抗体（Ｃｌｏｎｅ  ＭＥＣ  １３．３，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡより）で、その後、１：２００に希釈したヤギ抗ラットＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（オレンジ−レッド）抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でインキュベートされた（図２４）。腫瘍微小転移の一視野（２０×対物レンズ）内のＣＤ３１+内皮細胞の数（図２４Ａ）は、治療グループあたり１６部位でカウントされ、平均数が算出された。代表的なマージされた共焦点像が図２４Ａに示され、各グループにおける算出されたＣＤ３１+細胞の一視野の平均は図２４Ｂに示される。結果は、腫瘍関連血管新生がＩＧＦ−Ｔｒａｐ治療マウスにおいて有意に低減したということを示す。
【０１２７】
実施例１１  マウス乳癌４Ｔ１細胞を注入されたマウスにおける腫瘍成長の抑止
Ｂａｌｂ／ｃ雌のマウスが乳房の脂肪パッド（ＭＦＰ）内に１０5マウス乳癌４Ｔ１細胞を注入された（Tabaries, S. et al., Oncogene 30(11): 1318-28, 2011）。４時間および３日後に、治療グループは、１０ｍｇ／ｋｇのＩＧＦ−Ｔｒａｐのｉ．ｖ．注入を受け、その後の、腫瘍接種後６日目および１０日目の５ｍｇ／ｋｇの２回の注入を受けた（図２５Ａ矢印）。腫瘍はキャリパーを用いて毎週３回測定され、腫瘍量は式１／２（長さ×幅2）を用いて算出された。全ての治療なしのマウスにおいて、腫瘍は急速に成長し、腫瘍注入後１４日目までに（図２５Ａ，Ｂ）肉眼で確認できる肝臓転移により、全てのマウスの死をもたらした。治療グループでは、腫瘍は、ＩＧＦ−Ｔｒａｐが投与されている間、有意に進行しなかった。腫瘍の成長は、治療の停止後にのみみられた（１４日目以降、図２５Ａ）。マウスは腫瘍注入後３５日目まで生存した（図２５Ｂ）（ｐ＜０．０１  Ｍａｎｔｅｌ−ＣｏｘおよびＧｅｈａｎ−Ｂｒｅｓｌｏｗ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定の両方を用いる）。
【０１２８】
実施例１２  ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を注入したヌードマウスにおける成長の抑止および退縮
１００万のＭＤ−ＭＢＡ−２３１ヒト乳癌細胞（Mourskaia, A.A. et al., Oncogene, 28(7): 1005-15, 2009）が、マトリゲルにより、ｎｕ／ｎｕマウスの乳房の脂肪パッドに、同所的に移植された。腫瘍はキャリパーを用いて毎週３回測定され、腫瘍量は式１／２（長さ×幅2）を用いて算出された。腫瘍が確立されたとき（５０〜１００ｍｍ3）（図２６Ａ  １１日目の矢印）、動物はランダム化され、５ｍｇ／ｋｇのＩＧＦ−Ｔｒａｐまたはビヒクル（ｉ．ｖ．）により、週２回、３３日目まで治療された。コントロールグループのマウスは、４４日目までに全て瀕死の状態であった（図２６Ａ  点線）。ＩＧＦ−Ｔｒａｐのグループでは、全ての腫瘍の成長が治療の間抑止された。何匹かの動物では、腫瘍は最後の治療の投与後２０日で進行し始めた（５５日目）。全ての治療されたマウスは、少なくとも７０日目まで生存した（研究はまだ進行中である）。完全な退縮（治癒）は１／５のマウスでみられ、腫瘍の安定化（成長の抑止）は１／５のマウスでみられた。全てのマウスにおいて、腫瘍はまた、コントロールグループにおけるバイオルミネセンスシグナル強度の増加、および、ＩＧＦ−Ｔｒａｐ治療グループにおけるシグナルの著しい低減を示す、長手方向のバイオルミネセンスイメージングを用いて時間をかけてモニターされた（図２６Ｂ）。
【０１２９】
細胞をベースにした分析における有効性、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２リガンドの両方に結合する高い親和性のリガンド、ｉｎ  ｖｉｖｏ安定性、およびマウス腫瘍モデルにおける効能に基づき、本発明に記載されるＦｃ−Ｔｒａｐタンパク質は、癌、転移、および／もしくは血管新生関連疾病の治療および／または予防のための、魅力的な治療の候補である。
【０１３０】
実施例１３  高分子量（ＨＭＷ）種を除くためのｓＩＧＦ１Ｒ−ｅｄ−Ｆｃ変異体の合理的な設計
上記に示すように、ＣＨＯ細胞で発現される、ＦｃＩｇＧ１またはＩｇＧ２に対するｓＩＧＦ１Ｒの融合形態（それぞれ、ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１またはｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ２）は、約５０％のジスルフィド結合された高分子量種（ＨＭＷ）を示した。還元条件下では、これらのＨＭＷは、非ジスルフィド結合されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ中に分離され得た。
【０１３１】
ｓＩＧＦＩＲエクトドメイン（ｓＩＧＦ１Ｒ−ｅｄ）およびＩｇＧ−Ｆｃフラグメント間の１１アミノ酸（ａａ）リンカーを有する、もとのｓＩＧＦ１Ｒ−Ｆｃ融合のＨＭＷ不等質を処理するために、我々はいくつかの可能性を調査した。相同のインスリンレセプターエクトドメイン（ＩＲ−ｅｄ）の結晶構造を用いて、我々は、ｓＩＧＦ１Ｒ−ｅｄ二量体Ｃ末端間の距離が約１２０Åであるべきであることを推測した（図２７）。よって、ｓＩＧＦ１Ｒ−ｅｄ二量体により課せられた幾何拘束があるとすれば、もとの１１ａａ結合構造体では、２つのＦｃ部分の分子内ペアが生じ得ることはありそうもないことを我々は仮定した。不対のＦｃ鎖は、特にＦｃのヒンジ領域における利用できるシステイン残基の存在により高められた、オープンエンドの分子内連合が可能となるかもしれず、これにより観察されたＨＭＷラダーを説明する。
【０１３２】
この考えを試験するために、および変更ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１変異体タンパク質を設計するために、我々は、まず、Ｆｃのヒンジ領域におけるシステインをセリン残基で置換した（変異体Ｍｏｄ＃１；図２７参照）。代替として、リンカーの長さを増加させることにより分子内Ｆｃ二量体化を促進するために、我々は、１１ａａリンカーを、Ｍｏｄ＃２とよばれる変更された変異体タンパク質に組み込まれた２２ａａフレキシブル（ＧＳ）リンカーで効果的に置換した（図２７、２８）。これらのアプローチ（ＦｃヒンジＣｙｓ残基の突然変異、および、より長いフレキシブルリンカーの利用）の両方が結合して第３の変更されたタンパク、Ｍｏｄ＃３変異体となった（図２８）。最後に、我々は、下部Ｃｙｓ残基のみを保持するためにＦｃヒンジ領域を切断することにより、かつ、したがって２７ａａに対するフレキシブルリンカー（Ｍｏｄ＃４；図２７、２８）の長さをさらに増加させることにより、ＨＭＷジスルフィド結合種を低減させることを試みた。ＨＭＷ種の意図的な低減に加えて、設計されたより長いリンカー（Ｍｏｄ＃２およびＭｏｄ＃３における２２ａａ、およびＭｏｄ＃４における２７ａａ）は、向上した薬物動態学的特性（半減期）のためにＦｃＲｎレセプターに結合可能とするためのみならず、他の有益な特性を付与する（例えば、補体機能）ＦｃＲγＩＩＩレセプターエクトドメインへのＦｃ部分の同時結合を可能とするために、十分長くかつフレキシブルとなることが意図される。
【０１３３】
このための材料と方法および追従する実施例は以下の通りである。
【０１３４】
４つの変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１配列を発現するｐＭＰＧ−ＣＲ５ベクターの生成
４つ変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１配列を発現するｐＭＰＧ−ＣＲ５ベクターを生成するために、異なるサブクローニングステップが各構造体で必要とされた。簡潔に言うと、ＰＵＣ１９のＳｍａｌ部位が、サブシーケンスのサブクローニングを受容するために、Ｓｍａｌ−Ｎｄｅｌ消化により取り出された。次のステップでは、ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１の全長が変更されたＰＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位内にクローン化された。ｓＩＧＦ1ＲおよびｈＦｃの接合部を含む、５４２ｎｔＳｍａｌフラグメントは、ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１配列から取り出された。Ｓｍａｌ欠失フラグメントを有するこの変更されたＰＵＣ１９−ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１ベクターは、さらなるサブクローニングのための主鎖として用いられた。４つの変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１のフラグメントは、Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔにより合成された。これらのフラグメントは、Ｓｍａｌフラグメント欠失を有する、変更されたＰＵＣ１９−ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１のＳｍａｌ部位内に挿入された。最後に、４つの変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１の全長は、ＢａｍＨＩ消化により切除され、ｐＭＰＧ−ＣＲ５発現ベクター内でサブクローニングされて、ｐＭＰＧ−ＣＲ５−ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃１、ｐＭＰＧ−ＣＲ５−ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃２、ｐＭＰＧ−ＣＲ５−ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃３、およびｐＭＰＧ−ＣＲ５−ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃４を生成した。
【０１３５】
ＣＨＯ−ＢＲＩ−ｒｃＴＡ−５５Ｅ３細胞株における、４つの変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクの一時的な発現
ＣＨＯ−ＢＲＩ−ｒｃＴＡ細胞は、４つの変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクをコードするそれぞれのプラスミド（ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃１、Ｍｏｄ＃２、Ｍｏｄ＃３、およびＭｏｄ＃４）で、ＰＥＩｐｒｏを用いてトランスフェクトされた。トランスフェクション後５日目に、４つの変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクの発現レベルおよび高分子量種の生成が、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）およびウエスタンブロット法により分析された。２００ｍｌの各上清がプロテインＡカラムを用いて精製された。
【０１３６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法
４つの変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクのゲル泳動パターンを評価するために、精製タンパク（それぞれ５および１０μｇ）が４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された。ＨＭＷ種の強度または欠損を比較するために、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより、その後ゲル濾過により精製された親ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１のサンプル、及びプロテインＡにより精製された親ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１のサンプルは、コントロールとして用いられた（図２９）。２０μｌのＣＨＯ−ＢＲＩ−ｒｃＴＡ−ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃１、Ｍｏｄ＃２、Ｍｏｄ＃３、およびＭｏｄ＃４の上清が４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離され、膜状に転写された。免疫ブロット法に関し、一次抗体ウサギポリクローナル抗αＩＧＦ１Ｒ鎖（ＳＣ−７９５２  Ｓａｎｔａ−ｃｒｕｚ  １／６００）またはウサギポリクローナル抗αＩＧＦ１Ｒ鎖（ＳＣ−９０３８，Ｓａｎｔａ−ｃｒｕｚ，１／４００）が用いられた。Ｃｙ５−抗ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ，１／１００）は、２次抗体として用いられた。ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１融合タンパク質のＩｇＧ１−Ｆｃ部分は、Ｃｙ５−ヤギ−抗ヒトＩｇＧにより検出された（Ｈ＋Ｌ，Ｊａｃｋｓｏｎ，１／４００）（図３０）。
【０１３７】
プロテインＡを用いた４つの変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクの精製後に、各タンパク２００ｎｇがＳＤＳ−ＰＡＧＥ、その後のウエスタンブロット法に供された。融合タンパク質のｓＩＧＦ１Ｒ−α鎖およびＦｃ部分は、上記パラグラフで記載したように検出された。精製および非精製親構造体は、コントロールとして用いられた（図３１）。さらに、サンプルのセットは、還元条件下で流された（３００ｍＭのＤＴＴ）。
【０１３８】
親タンパクを産生する４つの産業グレードのＣＨＯ−Ｃｕｍ２−ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１細胞株の生成
ＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１を発現する、４つのプールの産業グレードの安定発現株は、ｐＭＰＧ−ＣＲ５−ＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１ベクターを用いて、ＣＨＯ−Ｃｕｍ２−Ｌ７２細胞株(Mullick, A. et al., BMC Biotechnol. 6 :43, 2006）のトランスフェクションにより生成された。細胞は、３週間のあいだ、ハイグロマイシン選択下で維持された。ＣＨＯ−Ｃｕｍ２プールの安定発現株は、最良の生産クローン（ｂｅｓｔ  ｐｒｏｄｕｃｅｒ  ｃｌｏｎｅ）を分離するためにサブクローニングされた。より高い発現レベルを有するサブクローンは、安定性試験のために２か月間のあいだ培養で維持された。最も高い安定性および生産性を有するサブクローンはスケールアップされ、ＣＨＯ上清は濃縮されて、ｓＩＧＦＩＲ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１はプロテインＡ精製方法を用いて精製された（図３２）。
【０１３９】
実施例１４  配列モデリングにより示唆された、４つの変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクのエンジニアリングおよび試験
＞１％でのＨＭＷ種の存在は、遺伝子組換え型タンパクの製造のためには推奨されない。上記のように、残念なことに、親調製物のうち、約半分のもとのｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１およびｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ２融合タンパク質は、ＨＭＷ種として存在する。プロテインＡクロマトグラフィー後のｐＨ４．５での溶出のステップを追加することによる、これらのＨＭＷ種を取り除くための我々の成功は部分的であり、タンパクの小さな分画のみがこのｐＨで溶出されたので、計測できなかった。
【０１４０】
ＨＭＷ種の形成を防止または少なくとも低減させるために、ｓＩＧＦ1ＲおよびＩｇＧ１配列の接合部において異なる変更を有する４つの変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクは、上記のように構造化された。ｓＩＧＦ１Ｒ配列の３’に１つのＳｍａｌ制限部位、およびｈＦｃ−ＩｇＧ１配列の５’端部に他の１つがある。これらの２つの部位の存在は、我々に、あらゆる新たに合成されたＳｍａｌフラグメントを、もとの配列で交換することにより、この領域を変更する機会を与えた。最初のステップとして、ＰＵＣ−１９の配列が、全長のｓＩＧＦ1Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１サブクローニングのサブシーケンスを収容するように変更され、もとの配列を、合成された（変更された）Ｓｍａｌフラグメントで交換した。最後に全長の変更された配列は、ｐＭＰＧ−ＣＲ５発現ベクター内にサブクローニングされた。
【０１４１】
ＣＨＯ−ＢＲＩ−ｒＣＴＡ−５５Ｅ３細胞の上清（本明細書では、簡潔さのためにＣＨＯ−ＢＲＩ−ｒＣＴＡ細胞ともいう）では、４つの変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクで一時的にトランスフェクトされ、タンパクはＳＤＳ−ＰＡＧＥによっては検出できなかった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のための十分な材料のために、２００ｍｌのそれぞれの上清がその後プロテインＡで精製された。ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、その後のゲル濾過により精製された親ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１、およびプロテインＡにより精製された親ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１におけるＨＭＷ種のレベルは、４つの変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクと比較された（図２９）。ＨＭＷ種の形成は、変更されたタンパクＭｏｄ＃１およびＭｏｄ＃３において完全に非存在であり、コアヒンジにおける両方のシステインは、セリンで置換された。ＨＭＷ種は、ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃２およびＭｏｄ＃４タンパクではまだ存在したが、それらの産生のレベルは、それらタンパクの親の形態（ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１）よりも低かった。しかしながら、ＭＷ約８０〜９０ｋＤａおよび２１０〜２２０ｋＤａの２つの低分子量（ＬＭＷ）バンドが、Ｍｏｄ＃１およびＭｏｄ＃３のゲルでみられ、より少ない量でＭｏｄ＃４のゲルでみられた。これらのＬＭＷバンドに加え、約３０ｋＤのタンパクもまたＭｏｄ＃１に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥプロファイルで検出された。
【０１４２】
４つの変更されたｓＩＧＦ1Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１構造体を含む上清でのウエスタンブロット法が、融合タンパク質のＩＧＦ−ＩＲのαおよびβ鎖、およびＦｃ部分に対する抗体を用いて行われた（図３０）。Ｍｏｄ＃１およびＭｏｄ＃３を含む上清では、ＨＭＷバンドは検出されなかった。Ｍｏｄ＃４含有上清におけるＨＭＷバンドのレベルは、融合タンパク質の親形態を含む上清よりも低かった。抗βおよび抗Ｆｃ抗体もまたいくつかのＬＭＷ種を検出した。ウエスタンブロット法の結果に基づき、約８０〜９０ｋＤのバンドは、Ｆｃに融合する単一のβ鎖のようであり、２１０〜２２０ｋＤａのバンドは、おそらくモノマー形態のｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１（Ｆｃ＋β＋α鎖）である。ＣＨＯ細胞の上清におけるこれらのＬＭＷ形態の強度は、ウエスタンブロット法により評価された四量体＋Ｆｃタンパクの約半分であった。
【０１４３】
精製タンパク分画におけるこれらのバンドの存在量を測定するために、および、親構造体で得られたレベルとそれを比較するために、非精製および精製親ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１ならびに４つの変更されたｓＩＧＦ1Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクが、抗αサブユニットおよび抗Ｆｃ抗体を用いて、ウエスタンブロット法により分析された（図３１）。非還元状態下で、親ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１、非精製または精製分画は類似のパターンを示し、ＬＭＷ種は検出されなかった。しかしながら、非還元状態下では、抗Ｆｃ抗体が用いられた場合、ＬＭＷバンドは、変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパク（Ｍｏｄ＃１およびＭｏｄ＃３）の精製調製物において検出可能であった。これらのＬＭＷ種の形成のメカニズムは明らかではない。おそらく、コアヒンジにおける両方のＣｙｓ残基を（Ｍｏｄ＃１およびＭｏｄ＃３における）Ｓｅｒで置き換えることが、細胞培養培地における低減に対して、ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃの残りのジスルフィド結合をより敏感にする。興味深いことに、１つのシステイン（つまり、１つのジスルフィド結合）が保持されるＭｏｄ＃４に関し、ＬＭＷ種の濃度は（Ｍｏｄ＃１およびＭｏｄ＃３に対して）低減したが、いくつかのＨＭＷ種は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウエスタンブロット法にて現れた。しかしながら、特に、ＬＭＷバンドのレベルは、プロテインＡカラムの以下の分画で有意に減少し、それらは、プロテインＡに対して異なる結合力学性（例えば親和性）を有することが示唆され、プロテインＡ生成により除去され得た。
【０１４４】
完全な還元条件下で、全てのジスルフィド結合が還元される場合、ＨＭＷ種は、１つはα鎖の全長に対応する１３０〜１４０ｋＤａ（抗Ｆｃ抗体により検出されない）、もう１つはβサブユニット−Ｆｃ融合タンパク質に対応する８０〜９０ｋＤａ、の２つのバンドとして現れるべきである。しかしながら、２１０〜２２０ｋＤａのバンド（ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１モノマーに対応する）はゲルにて検出可能であった。この発見は、各モノマーのα鎖およびβ−Ｆｃ融合タンパク質間に形成されたジスルフィド結合が、２つの個々のモノマーのα鎖間のジスルフィド結合よりも、３００ｍＭのＤＤＴによる還元に対してより耐性があるということを示唆した。約３０ｋＤａの低いＭＷバンドは非精製タンパク質分画およびＭｏｄ＃１でも検出され、おそらく切断された形態のＦｃ−β−融合タンパク質を表す。
【０１４５】
全ての４つの変更されたタンパクを構成する際に合理的な設計が採用されたが、結果は、新たな構造体のうち２つのみがＨＭＷ種を形成しないタンパクを産生したことを示した。例えば、より長いリンカーが導入されていたがヒンジＣｙｓ残基は置換されていなかった、変更されたタンパクＭｏｄ＃２の場合には、ＨＭＷ種は、親タンパクよりも低いレベルであっても、まだ観察することができた。この発見は、いくつかの分子内Ｆｃ二量体は（仮定されたように）Ｍｏｄ＃２変異体で確立されたかもしれず、一方、いまだ分子間会合を可能にするＦｃタンパクの重要なレベルであった、ということを示唆する。一方、ＦｃのヒンジドメインにおけるＣｙｓ−Ｓｅｒ置換が、２つのヒンジＣｙｓのうち１つのみを保持したＭｏｄ＃４における中間レベルのＨＭＷ種の発見とともに、変更されたタンパクＭｏｄ＃１およびＭｏｄ＃３におけるＨＭＷ種の完全な除去をもたらしたという事実（図２９、３０、３１）は、我々の分子モデリングにより予想されたように、ヒンジＣｙｓ残基が分子間のオリゴマー形成を促進することに実際に関連していることを示す。興味深いことに、Ｆｃフラグメント由来の３０ｋＤａタンパクは、Ｍｏｄ＃１でのみみられ、Ｍｏｄ＃３ではみられなかった。これは、より長いリンカーが原因でＭｏｄ＃３タンパクにて発生する分子内二量体化がタンパク質分解からＦｃフラグメントを保護するということを示すかもしれない。タンパク分解性の開裂は、Ｆｃフラグメントが、短いリンカーによる分子内、および、ヒンジシステインがないことによる分子間の両方と不対である、Ｍｏｄ＃１タンパクにおいてより容易に発生したようである。
【０１４６】
要約すると、これらの結果は、変更されたタンパクＭｏｄ＃３が、治療法としての開発が望まれる、シングルのバンドであるタンパクのスケールアップ生産のために最も適切な候補かもしれないということを示唆する。
【０１４７】
実施例１５  産業グレードの４つの変更されたＣＨＯ−Ｃｕｍ２−ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１細胞株の生成
変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１−Ｍｏｄ＃１、Ｍｏｄ＃２、Ｍｏｄ＃３、およびＭｏｄ＃４タンパクを発現する、４つのプールの産業グレードの安定発現株は、ＣＨＯ−ＢＲＩ−ｒｃＴＡ−５５Ｅ３細胞で生成された。トランスフェクトされた細胞は、ハイグロマイシン選択下で２〜３週間維持された。各変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクの産生レベルは、１μｇ／ｍｌのｃｕｍａｔｅ（ｃｕｍ）（タンパク産生の誘導用）の存在下で培養された細胞の上清にて測定された。培養８日後に、馴化培地におけるタンパク濃度は、変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１  Ｍｏｄ＃１、Ｍｏｄ＃２、Ｍｏｄ＃３、およびＭｏｄ＃４に関してそれぞれ２１、１７、２０、および３１μｇ／ｍｌであった。これらの産生細胞プールのサブクローニングおよび高い産生クローンの選択は、選択されたタンパクの産生レベルにおける３〜５倍の増加の結果が期待される。
【０１４８】
実施例１６  表面プラズモン共鳴を用いる変更されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクに関する結合親和性の測定
上述のように、変更された融合タンパク質Ｍｏｄ＃１およびＭｏｄ＃３は、ｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクに関して予想されるＭＷで１つの主要なバンドを産生し、ＨＭＷ種の産生は検出されなかった。これらの変更されたタンパクの結合親和性（および、その結果の生物活性）が、親タンパクと比較して変化しなかったかどうかを測定するために、全ての４つの変更されたタンパク（Ｍｏｄ＃１、Ｍｏｄ＃２、Ｍｏｄ＃３、およびＭｏｄ＃４）は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーに対してアミン結合され、４つの変更されたタンパクのプロファイルを比較するために、迅速な、単一サイクルのスクリーニングが用いられた（図３３）。これらの結果は、４つの変更されたタンパク（Ｍｏｄ＃１、Ｍｏｄ＃２、Ｍｏｄ＃３、およびＭｏｄ＃４）は、リガンドに対する類似の結合親和性を有し、それらの結合親和性は、ＴｒａｐＨ（陽性対照として用いられる、親Ｔｒａｐタンパク質）のそれらとも非常に類似していたということを示した。特に、全ての場合において、ｈＩＧＦ−１との容量依存性結合反応は最も強く（表７）、他のリガンド（ｈＩＧＦ−２、ｍＩＧＦ−１、ヒトインスリン）に関してはより弱く、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ；陰性対照）との結合反応は観察されなかった。
【０１４９】
表７  固定されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクに対するＩＧＦ１Ｒリガンド結合に関する平衡解離定数（ＫD＋／−標準誤差）
実験データ（５ポイント単一サイクル  ＳＰＲ滴定；ｎ＝２）は、ＢＩＡ評価ソフトウェアにおける「１：１滴定」モデルに適合された。
【表７】
2015505843.tif 000010
【０１５０】
４つの変更されたタンパクのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析および迅速な単一サイクルスクリーニングの結果に基づき、我々は、より広範囲のマルチサイクル試験のために、Ｍｏｄ＃３およびＭｏｄ＃４タンパクを選択した（図３４、３５；表８）。ＴｒａｐＨに関してみられる結果に一致して、Ｍｏｄ＃３およびＭｏｄ＃４に対するｈＩＧＦ−１の結合親和性が最も高く（〜６ｎＭ；表８）；ｈＩＧＦ−２（〜３７ｎＭ）およびｍＩＧＦ−１（〜１５０ｎＭ）とのより弱い結合が観察され；ヒトインスリン（〜７ｕＭ）に対する結合親和性は、ｈＩＧＦ−Iに対するそれよりも約１００倍低かった。
【０１５１】
表８  固定されたｓＩＧＦ１Ｒ−ｈＦｃ−ＩｇＧ１タンパクに結合するＩＧＦ１Ｒリガンドに関する平衡解離定数（ＫD＋／−標準誤差）
実験データ（１０−ポイント（ｈＩＧＦ−１およびｈＩＧＦ−２）または５ポイント（ｍＩＧＦ−１およびｈ−インスリン）マルチサイクルＳＰＲ滴定；ｎ＝２）は、ＢＩＡ評価ソフトウェアにおける「１：１動力学的」モデルに適合された。
【表８】
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【０１５２】
本明細書で参照される全ての参照および文献はその全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
本発明はその具体的な実施形態に関連して説明した一方、上述した本質的特徴に適用される場合として、および、添付の請求の範囲に従うものとして、さらなる変更が可能であること、およびこの出願が以下の発明、概して、本発明の原理および本発明が属する技術分野の範囲内で既知または慣行の範囲内に該当する本開示からのそのような離脱を含む、あらゆるバリエーション、使用、または適応を包含することが意図されることが理解されるであろう。
【図４】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図３０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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