(57)【要約】  本発明は、ライム病ボレリアのＯｓｐＡタンパク質の抗原フラグメントおよびライム病ボレリアのＯｓｐＣタンパク質の異なるファイロタイプの抗原フラグメントを含むキメラタンパク質を含む免疫原性組成物を提供する。また、本発明の免疫原性組成物を組み込むワクチン、並びに前記ワクチンを用いて、イヌにおけるライム病を防止するおよび／またはライム病からイヌを保護する方法が提供される。【選択図】図３Ａ
2015514776.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａ）配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む第１のタンパク質と、
Ｂ）ＯｓｐＣファイロタイプＦおよびＮの免疫優性エピトープを含む第２のタンパク質と、
を含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記第１のタンパク質が配列番号１を含む、請求項１の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記第２のタンパク質は、
ｉ）ＯｓｐＣファイロタイプＩ、Ｈ、Ｃ、Ｍ、およびＤの、ループ５領域（ループペプチド）およびアルファヘリックス５領域（ヘリックスペプチド）由来の免疫優性エピトープと少なくとも９５％同一の複数のペプチドと、
ｉｉ）少なくとも１つの
ａ）互いに隣り合う、ＯｓｐＣファイロタイプＦのループペプチドおよびＯｓｐＣファイロタイプＦのヘリックスペプチド、または
ｂ）配列番号３２と９５％同一のアミノ酸配列、
を含む、請求項１または２の免疫原性組成物。
【請求項４】
ループペプチドＩは配列番号４であり；
ヘリックスペプチドＩは配列番号５であり；
ループペプチドＨは配列番号６であり；
ヘリックスペプチドＨは配列番号７であり；
ループペプチドＮは配列番号８であり；
ヘリックスペプチドＮは配列番号９であり；
ループペプチドＣは配列番号１０であり；
ヘリックスペプチドＣは配列番号１１であり；
ループペプチドＭは配列番号１２であり；
ヘリックスペプチドＭは配列番号１３であり；
ループペプチドＤは配列番号１４であり；
ヘリックスペプチドＤは配列番号１５である、請求項１および２のいずれか１つの免疫原性組成物。
【請求項５】
前記第２のタンパク質は、該第２のタンパク質のカルボキシ末端で、配列番号３２と９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１から３のいずれか１つの免疫原性組成物。
【請求項６】
前記第２のタンパク質は、Ｉ構造体、Ｈ構造体、Ｎ構造体、Ｃ構造体、Ｍ構造体、Ｄ構造体を、ＮからＣ方向に含む、請求項１から５のいずれか１つの免疫原性組成物。
【請求項７】
前記第２のタンパク質は、ＯｓｐＣファイロタイプＴ、Ｕ、Ｅの、ループ５領域（ループペプチド）およびアルファヘリックス５領域（ヘリックスペプチド）由来の免疫優性エピトープと９５％同一の複数のペプチドをさらに含む、請求項１から６のいずれか１つの免疫原性組成物。
【請求項８】
前記第２のタンパク質は、Ｔ構造体、Ｕ構造体、Ｅ構造体を、ＮからＣ方向に含む、請求項７の免疫原性組成物。
【請求項９】
ループペプチドＴは配列番号１８であり；
ヘリックスペプチドＴは配列番号１９であり；
ループペプチドＵは配列番号２０であり；
ヘリックスペプチドＵは配列番号２１であり；
ループペプチドＥは配列番号２２であり；
ヘリックスペプチドＥは配列番号２３である；請求項７または８の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記第２のタンパク質は、ＯｓｐＣファイロタイプＡ、Ｂ、Ｋの、ループ５領域（ループペプチド）およびアルファヘリックス５領域（ヘリックスペプチド）由来の免疫優性エピトープと９５％同一の複数のペプチドをさらに含む、請求項１から９のいずれか１つの免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記第２のタンパク質は、Ａ構造体、Ｂ構造体、Ｋ構造体を、ＮからＣ方向に含む、請求項１０の免疫原性組成物。
【請求項１２】
ループペプチドＡは配列番号２４であり；
ヘリックスペプチドＡは配列番号２５であり；
ループペプチドＢは配列番号２６であり；
ヘリックスペプチドＢは配列番号２７であり；
ループペプチドＫは配列番号２８であり；
ヘリックスペプチドＫは配列番号２９である、請求項１１の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記第２のタンパク質は、前記Ｔ構造体、前記Ｕ構造体、前記Ｅ構造体、前記Ａ構造体、前記Ｂ構造体、前記Ｋ構造体を、ＮからＣ方向に含む、請求項１０から１２のいずれか１つの免疫原性組成物。
【請求項１４】
前記第２のタンパク質は、前記Ｔ構造体、前記Ｕ構造体、前記Ｅ構造体、前記Ａ構造体、前記Ｂ構造体、前記Ｋ構造体、前記Ｉ構造体、前記Ｈ構造体、前記Ｎ構造体、前記Ｃ構造体、前記Ｍ構造体、前記Ｄ構造体を、ＮからＣ方向に含む、請求項１３の免疫原性組成物。
【請求項１５】
前記Ｆ構造体は前記Ｔ構造体の上流であり、配列番号３２と９５％同一の前記アミノ酸配列は前記Ｄ構造体の下流である、請求項１２の免疫原性組成物。
【請求項１６】
ループペプチドＦは配列番号１６であり；
ヘリックスペプチドＦは配列番号１７である、請求項１５の免疫原性組成物。
【請求項１７】
各ファイロタイプ由来の前記ループペプチドと前記ヘリックスペプチドは互いに隣接している、請求項１から１６のいずれか１つの免疫原性組成物。
【請求項１８】
各ファイロタイプについての前記ループペプチドおよび前記ヘリックスペプチドは連続的に配置されている、請求項１から１７のいずれか１つの免疫原性組成物。
【請求項１９】
各ファイロタイプについての前記ループペプチドは、そのファイロタイプについての対応する前記ヘリックスペプチドの上流である、請求項１から１８のいずれか１つの免疫原性組成物。
【請求項２０】
ａ．前記第１のタンパク質は配列番号１であり；
ｂ．前記第２のタンパク質は配列番号３０である、請求項１から１９のいずれか１つの免疫原性組成物。
【請求項２１】
ａ．前記第１のタンパク質は配列番号１であり；
ｂ．前記第２のタンパク質は配列番号３１である、請求項１から１９のいずれか１つの免疫原性組成物。
【請求項２２】
イヌにおいて疾病を生じさせ得る微生物による感染の病理学的作用を防止または低減する、少なくとも１つのさらなる抗原をさらに含む、請求項１から２１のいずれか１つの免疫原性組成物。
【請求項２３】
前記微生物は、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌヘルペスウイルス、および狂犬病ウイルスからなる群から選択される、請求項２２の免疫原性組成物。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか１つの前記免疫原性組成物およびアジュバントを含む、ワクチン組成物。
【請求項２５】
前記アジュバントは、岩塩、界面活性剤および微粒子、細菌産生物、サイトカインおよびホルモン、担体、水中油型乳剤および油中水型乳剤からなる群から選択される、請求項２４のワクチン組成物。
【請求項２６】
免疫学的に効果のある投与量の、請求項２４および２５のいずれか１つの前記ワクチン組成物を、それを必要とする前記イヌに投与することを含む、イヌにおけるライム病ボレリアによる感染の病理学的作用を防止または低減する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、獣医学の分野におけるものである。より具体的には、本発明は、イヌにおけるライム病を治療または防止するワクチンの分野におけるものである。
【背景技術】
【０００２】
ライム病は、ボレリア属の病原性スピロヘータに起因するバクテリア感染である。感染は、ヒト、イヌ、シカ、マウス、および他の動物において発生し得、媒介節足動物、最も特にイクソデス属のダニにより伝染される。ライム病ボレリア、北アメリカにおけるもっとも一般的なライム病の原因は、１９８２年に最初に培養された。ボレリアは、ダニ咬傷の部位で宿主内に導入され、ここが、最初の特徴的な皮膚病変、慢性遊走性紅斑（ＥＣＭ）の位置でもある。イヌにおいて、ライム病は、関節炎によって誘発された跛行、食欲不振、発熱、嗜眠、リンパ節腫脹、および場合によっては、致命的な糸球体腎炎となって現れる。近年の研究は、流行地で能動的に感染したイヌのパーセンテージは１１％と同じくらい高くなり得るということを明らかにした。
【０００３】
感染は、ペニシリン、エリスロマイシン、テトラサイクリン、およびセフトリアキソンのような抗生物質により、どんなときでも治療されるかもしれない。しかしながら、いったん感染が発生すると、薬物は、スピロヘータの宿主を一掃しないかもしれず、慢性型の疾病をコントロールするために作用するのみかもしれない。関節炎および倦怠のような合併症は、診断および治療後数年間継続するかもしれない。
【０００４】
イヌライム病ワクチンは、主にＯｓｐＡ殺ボレリア菌抗体を誘導することによる保護を提供するために開発された。ライム病ボレリアのＯｓｐＣは、殺ボレリア菌抗体性免疫に関する他の標的候補である。このタンパク質は、殺ボレリア菌抗体を誘導する動因であるエピトープを有すると思われ、病原性ボレリア菌種間で保存されない。ＯｓｐＣタンパク質の具体的な機能は未知のままであるが、ＯｓｐＣの発現が哺乳類の感染に関しては必要とされるが、ダニの感染に関しては必要とされない、ということが示唆された。ボレリアは、ダニが摂食を開始後すぐにＯｓｐＣを発現し、哺乳類における感染を確立するためにＯｓｐＣを発現することを継続しなければならない。よって、ＯｓｐＣ殺ボレリア菌抗体の「有効性のウインドウ（ｗｉｎｄｏｗ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ）」は、ＯｓｐＡ殺ボレリア菌抗体と比較して有意に増加した。
【０００５】
Ｃａｌｌｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（本明細書で参照により組み込まれる、米国特許第６，２１０，６７６号および米国特許第６，４６４，９８５号）は、ライム病に対してヒトおよび他の哺乳類を保護するためのワクチンを調製するために、ＯｓｐＣの免疫原性ポリペプチドフラグメントを単体で、またはＯｓｐＡポリペプチドと組み合わせて採用することを示唆した。また、Ｌｉｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（本明細書で参照により組み込まれる、米国特許第６，８７２，５５０号）は、組換えＯｓｐＡ、ＯｓｐＢ、およびＯｓｐＣタンパク質の組み合わせから調製される、ライム病に対して免疫するためのワクチンを提案した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、成功したワクチンが作製され得る前に、少なくとも２つの障害が克服される必要がある。第１に、２０以上のＯｓｐＣファイロタイプがあり、どのものがワクチンに含まれるべきなのかが不明である。第２に、殺ボレリア菌抗ＯｓｐＣ抗体の開発のための適切なエピトープが決定される必要がある。
【０００７】
よって、哺乳類、特にイヌをライム病から保護するための改良されたワクチンに関する分野において、長年の必要性が残存している。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、一態様において、配列番号１（ＭＤＰＮＴＶＳＳＦＱＶＤＳＦＬＷＨＶＲＫＲＶＡＤＱＥＬＧＤＡＰＦＬＤＲＬＲＲＤＱＫＳＬＲＧＲＧＳＴＬＧＬＤＩＥＴＡＴＲＡＧＫＱＩＶＥＲＩＬＫＥＥＳＤＥＡＬＫＭＴＭＧＫＱＮＶＳＳＬＤＥＫＮＳＶＳＶＤＬＰＧＥＭＮＶＬＶＳＫＥＫＮＫＤＧＫＹＤＬＩＡＴＶＤＫＬＥＬＫＧＴＳＤＫＮＮＧＳＧＶＬＥＧＶＫＡＤＫＳＫＶＫＬＴＩＳＤＤＬＧＱＴＴＬＥＶＦＫＥＤＧＫＴＬＶＳＫＫＶＴＳＫＤＫＳＳＴＥＥＫＦＮＥＫＧＥＶＳＥＫＩＩＴＲＡＤＧＴＲＬＥＹＴＥＩＫＳＤＧＳＧＫＡＫＥＶＬＫＳＹＶＬＥＧＴＬＴＡＥＫＴＴＬＶＶＫＥＧＴＶＴＬＳＫＮＩＳＫＳＧＥＶＳＶＥＬＮＤＴＤＳＳＡＡＴＫＫＴＡＡＷＮＳＧＴＳＴＬＴＩＴＶＮＳＫＫＴＫＤＬＶＦＴＫＥＮＴＩＴＶＱＱＹＤＳＮＧＴＫＬＥＧＳＡＶＥＩＴＫＬＤＥＩＫＮＡＬＫ）と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む第１のタンパク質と；ＯｓｐＣファイロタイプＦおよびＮの免疫優性エピトープを含む第２のタンパク質とを含む、免疫原性組成物を提供することにより、これらにおよび他の必要性に取り組む。
【０００９】
１組の実施形態において、前記第２のタンパク質は、１つまたはそれ以上のＯｓｐＣファイロタイプＩ、Ｈ、Ｃ、Ｍ、およびＤのループ５（ループペプチド）およびアルファヘリックス５（ヘリックスペプチド）由来の免疫優性エピトープと少なくとも９５％同一の複数のペプチドを含み、さらに、各ファイロタイプ由来の前記ループペプチドおよび前記ヘリックスペプチドが互いに隣接し、および前記ループペプチドと前記ヘリックスペプチドが連続的に配置され；互いに隣接している、ＯｓｐＣファイロタイプＦのループペプチドおよびヘリックスペプチド、または配列番号３２と９５％同一のアミノ酸配列の少なくとも１つを含む。１組の実施形態において、配列番号３２と９５％同一の前記アミノ酸配列が存在する場合には、前記第２のタンパク質のカルボキシ末端においてである。
【００１０】
１組の実施形態において、前記第１のタンパク質は配列番号１である。他の組の実施形態において、ファイロタイプＩ、Ｈ、Ｎ、Ｃ、Ｍ、Ｄ、およびＦの前記ループおよびヘリックスペプチドは、配列番号４〜１７のそれぞれと少なくとも９５％同一である。
【００１１】
また、他の組の実施形態において、免疫原性組成物は、いくつかの実施形態おいて配列番号１６〜２９とそれぞれ同一である、１つまたはそれ以上のＯｓｐＣファイロタイプＦ、Ｔ、Ｕ、Ｅ、Ａ、Ｂ、およびＫ由来の追加のループおよびヘリックスペプチドを含むこととしてもよい。
【００１２】
さらに他の組の実施形態において、免疫原性組成物は、イヌにおいて疾病を生じさせ得る微生物に対する少なくとも１つのさらなる抗原保護剤をさらに含むこととしてもよい。前記微生物は、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌヘルペスウイルス、および狂犬病ウイルスを含む群から選択されることとしてもよい。本発明のワクチン組成物における使用に関するこれらの病原体由来の抗原は、変更された生きているウイルス調製物または不活化されたウイルス調製物の形態におけるものであり得る。また、他の病原体は、レプトスピラ・ブラチスラバ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）、レプトスピラ・キャニコーラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・グリポチフォサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、レプトスピラ・イクテラヘモラジエ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、レプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｐｏｍｏｎａ）、レプトスピラ・ハージョボビス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｈａｒｄｊｏｂｏｖｉｓ）、ポルフィロモナス菌種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、バクテロイデス菌種（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｓｐｐ．）、リーシュマニア菌種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．）、エーリキア菌種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、マイコプラズマ菌種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｓｐ．）、およびミクロスポラム・カニス（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ）を含む。
【００１３】
具体的な実施形態において、前記免疫原性組成物は、配列番号１および配列番号３０または配列番号３１のいずれかを含む。
【００１４】
他の態様において、本発明は、上記のような免疫原性組成物を含むワクチン組成物を提供する。また、前記ワクチンは、アジュバントおよび薬学的に許容可能な担体を含み得る。異なる実施形態では、アジュバントは、限定されることなく、岩塩、界面活性剤および微粒子、細菌産生物、サイトカインおよびホルモン、担体、水中油型乳剤および油中水型乳剤を含む。
【００１５】
また、さらに他の態様では、本発明は、免疫学的に効果のある投与量の前記ワクチン組成物を、それを必要とするイヌに投与することを含む、前記イヌにおけるライム病を防止する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、イヌから採取された皮膚生検サンプルからのクローニングにより確認される、ＯｓｐＣタイプのネイバージョイニングツリー（ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｊｏｉｎｉｎｇ  ｔｒｅｅ）を示す。
【図２】図２は、イヌから採取された皮膚生検から分離されたライム病ボレリアクローンをシーケンシングすることにより確認される、ＯｓｐＣタイプのネイバージョイニングツリーを示す。
【図３Ａ】図３Ａおよび図３Ｂは、本明細書に記載される免疫原性組成物の第２のタンパク質として適切である、キメラ配列（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）Ａ１２ＣＦおよびＡ１０ＣＦ（それぞれ、配列番号３１および３０）を示す。
【図３Ｂ】図３Ａおよび図３Ｂは、本明細書に記載される免疫原性組成物の第２のタンパク質として適切である、キメラ配列（ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）Ａ１２ＣＦおよびＡ１０ＣＦ（それぞれ、配列番号３１および３０）を示す。
【図４−１】図４は、ＯｓｐＣファイロタイプＡストレインのＢ３１および他のＯｓｐＣファイロタイプについてのタンパク質配列を示す。
【図４−２】図４は、ＯｓｐＣファイロタイプＡストレインのＢ３１および他のＯｓｐＣファイロタイプについてのタンパク質配列を示す。
【図４−３】図４は、ＯｓｐＣファイロタイプＡストレインのＢ３１および他のＯｓｐＣファイロタイプについてのタンパク質配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本出願をより理解するために、以下の非限定的な定義が提供される。
【００１８】
用語「少なくとも９５％同一」は、９５％および１００％を含み、かつその間、例えば９６％、９７％、９８％、９９％等の全ての同一性のパーセンテージを含む。
【００１９】
用語「アルファヘリックス５領域」または「ヘリックス５領域」は、ＯｓｐＣファイロタイプＡストレインのＢ３１の残基１６０と２００の間に位置するアミノ酸配列を指し、ループ６、アルファヘリックス５、および不定形のＣ末端ドメインの一部を含む二次構造要素を含む（Ｋｕｍａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。
【００２０】
用語「保存的置換」は、コードされたアミノ酸残基が変化しないように、または他の生物学的に類似の残基になるように、他の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換、または核酸配列におけるヌクレオチドの置換を示す。保存的置換の例は、他の疎水性残基に関する、イソロイシン、バリン、ロイシンもしくはメチオニンのような１つの疎水性残基の置換、またはリシンに関するアルギニン、アスパラギン酸に関するグルタミン酸、もしくはアスパラギンに関するグルタミン等の置換のような他の極性の残基に関する１つの極性の残基の置換を含む。また、用語「保存的置換」は、置換されたポリペプチドに対して生じる抗体が非置換のポリペプチドとも免疫反応することが提供される、非置換の親アミノ酸の代わりに置換されたアミノ酸の使用を含む。
【００２１】
参照タンパク質または参照核酸の用語「保存的変化」は、保存的置換（複数を含む）のみによる参照分子とは異なる、タンパク質または核酸をそれぞれ指す。
【００２２】
ファイロタイプ名により先行される用語「構造体」（例えば、Ｎ構造体またはＩ構造体）は、ループペプチドおよびヘリックスペプチドを含むアミノ酸配列を指す。
【００２３】
ＯｓｐＣのあるファイロタイプの用語「ヘリックスペプチド」または「アルファヘリックスペプチド」は、そのファイロタイプのＯｓｐＣタンパク質のアルファヘリックス５領域由来の免疫優性エピトープと少なくとも９５％同一であるペプチドを指す。このように、例えば、ヘリックスペプチドＮは、ＯｓｐＣファイロタイプＮのアルファヘリックス５領域由来の免疫優性エピトープと少なくとも９５％同一であるペプチドを指す。
【００２４】
用語「免疫優性エピトープ」は、ＢおよびＴ細胞反応の１つまたは両方を含む、他のエピトープと比較したときに、優性なまたは著しい免疫応答を誘導する分子上のエピトープを指す。
【００２５】
用語「直鎖状エピトープ」は、ペプチドまたはポリペプチドを形成するためのペプチド結合により結合される、アミノ酸の単一の非中断の連続する鎖を含むエピトープを指す。このようなエピトープは、鎖における、その一次構造、つまり、アミノ酸の直鎖状配列により記載され得る。このようなエピトープは、ＯｓｐＣの組換えタンパク質サブユニットにおいて発現されるときに、野生型タンパク質の結合に類似する態様で、感染‐誘導抗体に結合する性能を保持する。
【００２６】
ＯｓｐＣのあるファイロタイプの用語「ループペプチド」は、そのファイロタイプのＯｓｐＣタンパク質のループ５領域由来の免疫優性エピトープと少なくとも９５％同一であるペプチドを指す。よって、例えば、ループペプチドＮはＯｓｐＣファイロタイプＮの、ループ５領域由来の免疫優性エピトープと少なくとも９５％同一であるペプチドを指す。
【００２７】
用語「ループ５領域」は、ＯｓｐＣファイロタイプＡストレインのＢ３１の残基１３１と１５９の間に一般的に配置されるアミノ酸配列を指し、アルファヘリックス３、ループ５、およびアルファヘリックス４の一部を含む、二次構造要素を含む。Ｋｕｍａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１参照。ＯｓｐＣファイロタイプＡストレインのＢ３１に関する配列は、配列番号３５および図４において提供される。
【００２８】
本明細書で使用される用語「治療に有効な量」は、投与される対象における免疫応答を誘発するために十分な、微生物、またはサブユニット抗原、またはポリペプチド、またはポリヌクレオチド分子、およびその組み合わせの量を意味する。免疫応答は、限定されることなく、細胞性および／または体液性免疫の誘導を含み得る。
【００２９】
本明細書で使用される用語「ワクチン」および「ワクチン組成物」は、感染を防止または低減する、または１つまたはそれ以上の感染のサインまたは徴候を防止または低減する組成物を意味する。病原体に対するワクチン組成物の保護的効果は、通常、細胞性もしくは体液性免疫応答または両方の組み合わせのいずれかの免疫応答を、対象において誘導することにより達成される。概して、無効もしくは低減された感染の発生、サインもしくは徴候の寛解、または感染した対象からの微生物の排除の促進がワクチン組成物の保護的効果を暗示している。
【００３０】
広い態様では、本発明は、ライム病ボレリアのＯｓｐＡおよびＯｓｐＣタンパク質に対する抗体を誘導することを可能にする免疫原性組成物を提供する。よって、組成物は、２つのタンパク質：ＯｓｐＡまたはそのフラグメントを含む第１のタンパク質、およびＯｓｐＣタンパク質またはそのフラグメントを含む第２のタンパク質を含むであろう。いくつかの実施形態では、第２のタンパク質は、異なるファイロタイプのＯｓｐＣタンパクの複数のフラグメントを含むキメラタンパク質である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、第１のタンパク質は、例えば、配列番号３（ＭＤＰＮＴＶＳＳＦＱＶＤＳＦＬＷＨＶＲＫＲＶＡＤＱＥＬＧＤＡＰＦＬＤＲＬＲＲＤＱＫＳＬＲＧＲＧＳＴＬＧＬＤＩＥＴＡＴＲＡＧＫＱＩＶＥＲＩＬＫＥＥＳＤＥＡＬＫＭＴ）であるインフルエンザウイルスＮＳ１タンパク質のフラグメントのようなウイルスタンパク質のすぐ下流である、ＯｓｐＡタンパク質（配列番号２）（ＭＧＫＱＮＶＳＳＬＤＥＫＮＳＶＳＶＤＬＰＧＥＭＮＶＬＶＳＫＥＫＮＫＤＧＫＹＤＬＩＡＴＶＤＫＬＥＬＫＧＴＳＤＫＮＮＧＳＧＶＬＥＧＶＫＡＤＫＳＫＶＫＬＴＩＳＤＤＬＧＱＴＴＬＥＶＦＫＥＤＧＫＴＬＶＳＫＫＶＴＳＫＤＫＳＳＴＥＥＫＦＮＥＫＧＥＶＳＥＫＩＩＴＲＡＤＧＴＲＬＥＹＴＥＩＫＳＤＧＳＧＫＡＫＥＶＬＫＳＹＶＬＥＧＴＬＴＡＥＴＴＬＶＶＫＥＧＴＶＴＬＳＫＮＩＳＫＳＧＥＶＳＶＥＬＮＤＴＤＳＳＡＡＴＫＫＴＡＡＷＮＳＧＴＳＴＬＴＩＴＶＮＳＫＫＴＫＤＬＶＦＴＫＥＮＴＩＴＶＱＱＹＤＳＮＧＴＫＬＥＧＳＡＶＥＩＴＫＬＤＥＩＫＮＡＬＫ）のフラグメントを含む。第１のタンパク質に関する重要な要件は、ワクチン接種を受けた動物において抗ＯｓｐＡ抗体を生成するための性能である。よって、ＯｓｐＡフラグメントの全長の配列は必要ではなく、配列番号２と１００％同一でもない。
【００３２】
本出願における他の箇所でも特筆されているように、９５％の配列の同一性は、適切なレベルの抗体産生を提供するために十分なようである。異なるアミノ酸は、保存的置換であり得、および／またはＯｓｐＡフラグメントの免疫優性エピトープ（複数を含む）の外側に配置される。
【００３３】
他の実施形態では、より短いＯｓｐＡフラグメントが使用され得る。当業者は、どのＯｓｐＡフラグメントが殺ボレリア菌抗体を生成することが可能な免疫優性エピトープを含むのかをどのように測定するのかを知っているであろう。
【００３４】
発明者は、驚くべきことに、そのシグナル配列が除去されたＯｓｐＡタンパク質へと続く、インフルエンザウイルスＮＳ−１タンパク質のフラグメントを、ＮからＣ末端にかけて含む第１のタンパク質が特に本発明の免疫原性組成物に適しているということを発見した。
【００３５】
先行技術の研究は、どのファイロタイプのＯｓｐＣがイヌにおける侵襲的なライム病において流行しているのかについて沈黙している。ほとんどの研究は、ヒトのサンプルで行われてきた。Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌは、関節炎を有するヒト患者の関節滑液で発見された最も流行しているファイロタイプはＫおよびＡであり、典型的には、ファイロタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｎが発見されたということを報告している。 Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００９  ６０（７）  ２１７４。Ｅａｒｎｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌは、血液および／またはＣＳＦサンプルにおけるファイロタイプＡ、Ｂ、Ｉ、Ｋ、Ｃ、Ｄ、Ｎを発見した。Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  ２００５  ７３（１２）：  ７８６９。他の研究は、典型的に、ヒトにおけるライム病の侵襲的な形態を有するファイロタイプＡ、Ｂ、ＩおよびＫと関連した。
【００３６】
しかしながら、驚くべきことに、イヌにおいて、最も流行しているファイロタイプは、ヒトにおいてかイヌにおいてかに関わらず、ライム病の侵襲的な形態とこれまで関連していなかったＯｓｐＣ  Ｆであることが発見された。また、ヒトにおける侵襲的なライム病に関連するファイロタイプＮは、イヌにおける侵襲的なライム病に関連した。さらに、発明者は、ヒトにおける侵襲的なライム病にこれまで関連していないファイロタイプＴおよびＵがイヌにおける侵襲的なライム病を引き起こしているかもしれないということを発見した。
【００３７】
いくつかの実施形態によれば、第２のタンパク質は、異なるＯｓｐＣタンパク質ファイロタイプに対する免疫応答を生成することが可能な免疫優性エピトープを含む。より具体的には、本発明で請求されている免疫原性組成物の第２のタンパク質は、ＯｓｐＣファイロタイプＦおよびＮの免疫優性エピトープを含むキメラタンパク質である。免疫優性エピトープは以下に記載するようにループおよび／またはヘリックスペプチドの形態であることとしてもよく、またはそれらは標的ＯｓｐＣタンパク質のより長いフラグメント内に存在することとしてもよい。そのようなフラグメントの適切な非限定的例は、ＯｓｐＣファイロタイプＦタンパク質のフラグメントである、配列番号３２（ＮＮＳＧＫＤＧＮＴＳＡＮＳＡＤＥＳＶＫＧＰＮＬＴＥＩＳＫＫＩＴＥＳＮＡＶＶＬＡＶＫＥＩＥＴＬＬＳＳＩＤＥＬＡＴＫＡＩＧＱＫＩＤＡＮＧＬＧＶＱＡＮＱＮＧＳＬＬＡＧＡＹＡＩＳＴＬＩＴＱＫＬＳＡＬＮＳＥＤＬＫＥＫＶＡＫＶＫＫＣＳＥＤＦＴＮＫＬＫＮＧＮＡＱＬＧＬＡＡＡＴＤＤＮＡＫＡＡＩＬＫＴＮＧＴＮＤＫＧＡＫＥＬＫＤＬＳＤＳＶＥＳＬＶＫＡＡＱＶＭＬＴＮＳＶＫＥＬＴＳＰＶＶＡＥＳＰＫＫＰ）である。
【００３８】
これまでの研究は、ＯｓｐＣタンパク質の保存領域（つまり、異なるファイロタイプ間で保存されている）の含有が、イヌにおいてではなく、マウスおよびヒトにおいて、抗殺ボレリア菌の（ａｎｔｉ‐ｂｏｒｒｅｌｉｃｉｄａｌ）抗体の生成にとって重要であるということを論証する。Ｌｏｖｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｌｉｎ  ．ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍａｙ  ２００７，  ｐ．  ６３５‐６３７参照。それにもかかわらず、発明者は、驚くべきことに、１つのＯｓｐＣファイロタイプ（例えば、ファイロタイプＦ）のより長いフラグメントの追加が発現レベルに関して有益であり、よって、第２のタンパク質の製造をより効率的にするということを発見した。
【００３９】
Ｂｕｃｋｌｅｓ  ｅｔ  ａｌは、ＯｓｐＣタンパク質のループ５が表面に露出し、殺ボレリア菌抗体を生成することに関する適切な標的となるかもしれないということを論証した。Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２００６  Ｏｃｔ；１３（１０）：１１６２−５。また、国際公開第０９１３５１１８号参照。しかしながら、ＯｓｐＣの少なくとも２１のファイロタイプが発見された（Ｓｅｉｎｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．  １９９９  Ｊｕｌ；６７（７）：３５１８−２４  １９９９）ということを考慮すると、どの組み合わせがライム病に対して適切な保護を提供するのかは、まだ測定されていない。
【００４０】
よって、いくつかの実施形態では、第２のタンパク質が、異なるファイロタイプのＯｓｐＣタンパク質のループ５領域（ループペプチド）およびヘリックス５領域（ヘリックス５ペプチド）由来の直鎖状エピトープを含む。現在考えられるファイロタイプは、Ｔ、Ｕ、Ｅ、Ａ、Ｂ、Ｋ、Ｉ、Ｈ、Ｎ、Ｃ、Ｍ、Ｄ、およびＦである。第２のタンパク質は、ＯｓｐＣの２〜１３ファイロタイプ、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３ファイロタイプ由来のループおよびヘリックスペプチドを含むこととしてもよい。ペプチドの順序は重要ではない。いくつかの実施形態では、ループペプチドは、ヘリックスペプチドと間を置き、および逆もまた同様である。言い換えると、ループおよびヘリックスペプチドは、このような実施形態で連続的に配置されており、どの２つのループペプチドもそれらの間にヘリックスペプチドなく第２のタンパク質において存在すべきではなく、どの２つのヘリックスペプチドもそれらの間にループペプチドなく存在すべきではない。
【００４１】
当業者は、種々のＯｓｐＣファイロタイプのループ領域およびヘリックス領域由来の免疫優性エピトープをどのように測定するのかを知っているであろう。例えば、異なるファイロタイプのライム病ボレリアに感染した対象由来の血清は、対応するファイロタイプのループ領域およびヘリックス領域由来の特定のペプチドと反応するかもしれず、ループペプチドおよび／またはヘリックスペプチドに対する血清に存在する抗体の結合が定量化され得（例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット等）、よって、ペプチドが所与のＯｓｐＣファイロタイプ由来の免疫優性の直鎖状エピトープを含むことに関する糸口を提供する。
【００４２】
同様に、抗体の殺ボレリア菌活性は、当該技術分野でよく知られる方法、例えば、一般的には、上述のような免疫優性の直鎖状エピトープによりチャレンジされた対象由来の血清とともに共インキュベート培養されたライム病ボレリア、ならびに生きているおよび死んでいるボレリアの定量化により測定されることとしてもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ループペプチドおよびヘリックスペプチドに関する配列は、以下の通りである：
ループペプチドＩは、配列番号４と少なくとも９５％同一であり
（ＡＫＬＫＧＥＨＴＤＬＧＫＥＧＶＴ）；
ヘリックスペプチドＩは、配列番号５と少なくとも９５％同一であり
（ＫＧＡＤＥＬＥＫＬＦＥＳＶＫＮＬＳＫＡＡＫＥＭＬＴＮＳＶＫＥ）；
ループペプチドＨは、配列番号６と少なくとも９５％同一であり
（ＳＥＫＦＡＧＫＬＫＮＥＨＡＳＬＧＫＫＤＡＴ）；
ヘリックスペプチドＨは、配列番号７と少なくとも９５％同一であり
（ＫＧＡＫＥＬＫＤＬＳＤＳＶＥＳＬＶＫＡ）；
ループペプチドＮは、配列番号８と少なくとも９５％同一であり
（ＳＤＤＦＴＫＫＬＱＳＳＨＡＱＬＧＶＡＧＧＡＴＴ）；
ヘリックスペプチドＮは、配列番号９と少なくとも９５％同一であり
（ＡＤＥＬＥＫＬＦＫＳＶＥＳＬＡＫＡＡＱＤＡＬＡＮＳＶＮＥＬＴＳ）；
ループペプチドＣは、配列番号１０と少なくとも９５％同一であり
（ＫＫＬＫＥＫＨＴＤＬＧＫＫＤＡＴ）；
ヘリックスペプチドＣは、配列番号１１と少なくとも９５％同一であり
（ＡＡＥＬＥＫＬＦＥＳＶＥＮＬＡＫＡＡＫＥＭＬＳＮＳ）；
ループペプチドＭは、配列番号１２と少なくとも９５％同一であり
（ＮＫＡＦＴＤＫＬＫＳＳＨＡＥＬＧＩＡＮＧＡＡＴ）；
ヘリックスペプチドＭは、配列番号１３と少なくとも９５％同一であり
（ＫＧＡＱＥＬＥＫＬＦＥＳＶＫＮＬＳＫＡＡＱＥＴＬＮＮＳＶＫＥ）；
ループペプチドＤは、配列番号１４と少なくとも９５％同一であり
（ＳＥＳＦＴＫＫＬＳＤＮＱＡＥＬＧＩＥＮＡＴ）；
ヘリックスペプチドＤは、配列番号１５と少なくとも９５％同一であり
（ＫＧＡＥＥＬＶＫＬＳＥＳＶＡＧＬＬＫＡＡＱＡＩＬＡＮＳＶＫＥＬＴＳＰＶＶＡＥＳＰＫＫＰ）；
ループペプチドＦは、配列番号１６と少なくとも９５％同一であり
（ＳＥＤＦＴＮＫＬＫＮＧＮＡＱＬＧＬＡＡＡＴ）；
ヘリックスペプチドＦは、配列番号１７と少なくとも９５％同一であり
（ＫＧＡＫＥＬＫＤＬＳＤＳＶＥＳＬＶＫＡＡＱＶＭＬＴＮＳ）；
ループペプチドＴは、配列番号１８と少なくとも９５％同一であり
（ＳＴＧＦＴＮＫＬＫＳＧＨＡＥＬＧＰＶＧＧＮＡＴ）；
ヘリックスペプチドＴは、配列番号１９と少なくとも９５％同一であり
（ＫＧＡＫＥＬＫＤＬＳＥＳＶＥＡＬＡＫＡＡＱＡＭＬＴＮＳ）；
ループペプチドＵは、配列番号２０と少なくとも９５％同一であり
（ＳＥＫＦＴＫＫＬＳＥＳＨＡＤＩＧＩＱＡＡＴ）；
ヘリックスペプチドＵは、配列番号２１と少なくとも９５％同一であり
（ＫＧＡＥＥＬＤＫＬＦＫＡＶＥＮＬＳＫ）；
ループペプチドＥは、配列番号２２と少なくとも９５％同一であり
（ＳＴＥＦＴＮＫＬＫＳＥＨＡＶＬＧＬＤＮＬＴ）；
ヘリックスペプチドＥは、配列番号２３と少なくとも９５％同一であり
（ＫＧＡＡＥＬＥＫＬＫＡＶＥＮＬＳＫＡＡＱＤＴＬＫＮＡＶＫＥＬＴＳＰＩＶＡＥＳＰＫＫＰ）；
ループペプチドＡは、配列番号２４と少なくとも９５％同一であり
（ＳＥＴＦＴＮＫＬＫＥＫＨＴＤＬＧＫＥＧＶＴ）；
ヘリックスペプチドＡは、配列番号２５と少なくとも９５％同一であり
（ＫＧＡＥＥＬＧＫＬＦＥＳＶＥＶＬＳＫＡＡＫＥＭＬＡＮＳＶＫＥＬＴＳ）；
ループペプチドＢは、配列番号２６と少なくとも９５％同一であり
（ＳＥＥＦＳＴＫＬＫＤＮＨＡＱＬＧＩＱＧＶＴ）；
ヘリックスペプチドＢは、配列番号２７と少なくとも９５％同一であり
（ＫＧＶＥＥＬＥＫＬＳＧＳＬＥＳＬＳ）；
ループペプチドＫは、配列番号２８と少なくとも９５％同一であり
（ＳＥＤＦＴＫＫＬＥＧＥＨＡＱＬＧＩＥＮＶＴ）；および
ヘリックスペプチドＫは、配列番号２９と少なくとも９５％同一である
（ＡＡＥＬＥＫＬＦＫＡＶＥＮＬＡＫＡＡＫＥＭ）。
【００４４】
いくつかの実施形態では、同じファイロタイプ由来のループおよびヘリックスペプチドは、ともに配置されており、つまり、互いに隣接している。例えば、ＯｓｐＣファイロタイプＡ由来のループペプチドおよびＯｓｐＣファイロタイプＡのヘリックスペプチドは、あらゆる他のＯｓｐＣファイロタイプ由来のループまたはヘリックスペプチドのいずれかにより分離されるべきではない。
【００４５】
さらに、いくつかの実施形態では、同じＯｓｐＣファイロタイプ由来のループおよびヘリックスペプチドは互いに隣接しているが、他の実施形態では、ループペプチドおよびヘリックスペプチドは、最終的なタンパク質の構造に影響を及ぼさないリンカー配列により分離されることとしてもよい。アミノ酸の特性およびタンパク質構造上のそれらの効果は当該技術分野でよく知られ、当業者は、どのアミノ酸がリンカーに適するのかを認識することができるであろう。
【００４６】
実施例において論証されるように、発明者は、驚くべきことに、ＦおよびＮがイヌにおけるライム病に関連する最も流行しているＯｓｐＣファイロタイプであるということを発見した。また、発明者は、ファイロタイプＩ、Ｈ、Ｎ、Ｃ、Ｍ、Ｄ、およびＦ由来のループおよびヘリックスペプチドの存在が、イヌにおけるライム病に対する保護の非常によいレベルを提供するということを発見した。異なるファイロタイプ由来のループおよびヘリックスペプチドの順序は重要ではないが、いくつかの実施形態では、第２のタンパク質は、ＯｓｐＣファイロタイプＦタンパク質（例えば、配列番号３２）のフラグメントと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列へと続く、Ｉ構造体、Ｈ構造体、Ｎ構造体、Ｃ構造体、Ｍ構造体、Ｄ構造体を、ＮからＣ方向に含む。よって、いくつかの実施形態では、第２のタンパク質は、配列番号３１（Ａ１２ＣＦ）と少なくとも９５％（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％、および好ましくは１００％）同一のアミノ酸配列を含むであろう。
【００４７】
他の実施形態では、ファイロタイプＦ、Ｔ、Ｕ、Ｅ、Ａ、Ｂ、Ｋ由来のループおよびヘリックスペプチドは、第２のタンパク質内に含まれる。いくつかの実施形態では、よって、第２のタンパク質は、ＮからＣ方向に、以下のＴ構造体、Ｕ構造体、Ｅ構造体、Ａ構造体、Ｂ構造体、Ｋ構造体、Ｉ構造体、Ｈ構造体、Ｎ構造体、Ｃ構造体、Ｍ構造体、およびＤ構造体を含むであろう。また、任意に、第２のタンパク質は、いくつかの実施形態では、Ｔ構造体の上流にあるＦ構造体を含み得る。代替的に、または追加的に、第２のタンパク質は、ＯｓｐＣファイロタイプＦタンパク質（配列番号３２）のフラグメントと少なくとも９５％（例えば、９６％、９７％、９８％、９９％）同一であるアミノ酸配列を含み得る。
【００４８】
第２のタンパク質の他の適切な実施例、並びにその製造および使用方法は、国際出願ＵＳ２０１１／０５６８５４号（２０１１年１０月１９日に出願、発明者Ｒ．  Ｍａｒｃｏｎｉ  ａｎｄ  Ｃ．  Ｅａｒｎｈａｒｔ）において提供される。
【００４９】
ある実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号１および配列番号３０または配列番号３１のいずれか１つを含むであろう。
【００５０】
本明細書に記載される配列は、当該技術分野でよく知られている方法により製造されることとしてもよい。ポリペプチドは、固相法を使用する直接のペプチド合成により産生されることとしてもよい（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （１９６９）  Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｃｏ，  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ；  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ  Ｊ．  （１９６３）  Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ８５：２１４９−２１５４参照。）。ペプチド合成は、手動の技術を用いてまたは自動化により行われることとしてもよい。自動化された合成は、例えば、製造業者により提供された指示に従って、アプライドバイオシステムズ４３１Ａペプチドシンセサイザー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）を用いて達成されることとしてもよい。例えば、サブシーケンスは、全長のポリペプチドまたはそのフラグメントを提供するために、個々に化学的に合成され、および化学的方法を用いて組み合わされることとしてもよい。代替的に、このような配列は、ポリペプチドの産生を専門に扱ういくつもの組織から順序付けられることとしてもよい。最も一般的には、ポリペプチドは、以下に記載されるように、コードする核酸を発現させ、ポリペプチドを回収することにより産生されることとしてもよい。
【００５１】
また、例えば、ループペプチドおよびヘリックスペプチドが標的ファイロタイプのＯｓｐＣタンパク質のフラグメントと１００％同一である実施形態では、このようなループおよびヘリックスペプチドの核酸配列は公知であり、または一般的に利用可能なデータベース、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ（ジェンバンク）から容易にアクセスできる。選択されたループ／ヘリックスペプチドがＯｓｐＣタンパク質の天然由来のフラグメントとはいくぶん異なる場合、コードする核酸配列は、よく知られる遺伝暗号を用いて容易に設計され得る。
【００５２】
多くの生物が、成長しているペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入に関してコードするための特定のコドンの使用に関するバイアスを表示する。コドンの選択またはコドンバイアス、生物間のコドンの使用における差異は、多くの生物間で十分に記述されている。コドンバイアスは、翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用率に順に依存すると考えられているメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）翻訳の効率性と関連することが多い。細胞における選択されたｔＲＮＡの優位性は、一般的に、ペプチド合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。従って、大半のアミノ酸は複数のコドンによりコードされるので（メチオニンは例外である）、核酸配列は、コドンの最適化に基づく所与の生物における最適な遺伝子発現に関して適合され得る。
【００５３】
組換えポリペプチドを産生する方法も含まれる。１つのこのような方法は、コードされたポリペプチドを産生するために有効な制御配列に操作的に結合される、上述のようなあらゆる核酸を細胞の個体群に導入することと、ポリペプチドを発現するための培地において、宿主細胞（例えば、酵母、昆虫、哺乳類の細胞、植物の細胞等）を培養することと、細胞からまたは培地からポリペプチドを分離することとを含む。核酸は、例えば、形質転換、遺伝子導入、インジェクション、遺伝子銃、受動的な取り込み等を含む、当該技術分野で知られているようなあらゆる送達方法によりこのような細胞内に導入される。当業者は、核酸が、ＤＮＡプラスミドベクター、または当該技術分野で知られるあらゆるベクターを含む、組換え発現ベクターのようなベクターの一部となるかもしれないことを認識するであろう。
【００５４】
代替的に、無細胞の原核生物または真核生物に基づく発現システムが用いられることとしてもよい。
【００５５】
いくつかの実施形態では、第１のおよび／または第２のタンパク質をコードする核酸配列は、第１のおよび／または第２のタンパク質と融合し、これにより融合タンパク質の精製を促進させるポリペプチドをコードする配列（「融合パートナー」）をさらに含むこととしてもよい。本発明の本態様のある実施形態においては、融合パートナーは、ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）において提供される、ヘキサヒスチジンペプチド（配列番号４７、ＨＨＨＨＨＨ）であり、Ｇｅｎｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：８２１−８２４  （１９８９）に記載され、または、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質由来のエピトープに対応するＨＡタグであることとしてもよい（Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｉ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ３７：７６７，  １９８４）。また、ポリヌクレオチドは、転写された非翻訳配列、スプライシングおよびポリアデニレーションシグナル、ｍＲＮＡを安定化させるリボソーム結合部位および配列のような、非翻訳領域の５’および３’配列を含むこととしてもよい。
【００５６】
本明細書に記載される免疫原性組成物は、イヌにおけるライム病の徴候の重症度を防止または減少させるために特に適する。よって、他の態様においては、本発明は、上記のあらゆる実施形態による免疫原性組成物を含むワクチン、および適切なアジュバントを提供する。
【００５７】
本発明の免疫原性組成物の第１および第２のタンパク質は、免疫学的に効果のある量で、つまり、イヌにおいて免疫応答を引き起こすために十分な量で存在すべきである。いくつかの実施形態では、第１のタンパク質の濃度は、１と１００ｕｇ／ｍｌの間（例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０ｕｇ／ｍｌ）であり、第２のタンパク質の濃度は、１と２００ｕｇ／ｍｌの間（例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０ｕｇ／ｍｌ）である。いくつかの実施形態では、第１のタンパク質の量は約１０と５０ｕｇ／ｍｌの間であり、第２のタンパク質の量は２０と１００ｕｇ／ｍｌの間である。
【００５８】
本発明による使用に関して適切なアジュバントは、岩塩、例えば、ミョウバン、水酸化アルミニウム、水酸化アルミニウムゲル（例えば、Ｒｅｈｙｄｒａｇｅｌ（登録商標））、リン酸アルミニウムおよびリン酸カルシウム；界面活性剤および微粒子、例えば、非イオンブロックポリマー型界面活性剤、コレステロール、ビロソーム、サポニン（例えば、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ−２１およびＧＰＩ−０１００）、プロテオソーム、免疫刺激複合体、コクリエート（ｃｏｃｈｌｅａｔｅｓ）、第４級アミン（ジメチルジオクタデシル（ｄｉｏｃａｔａｄｅｃｙｌ）アンモニウムブロミド（ＤＤＡ））、ピリジン、ビタミンＡ、ビタミンＥ；細菌産生物、例えば、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．）、マイコバクテリウム・フレイ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｕｍ  ｐｈｌｅｉ）の細胞壁骨格（Ｄｅｔｏｘ（登録商標））、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびトリペプチド（ＭＴＰ）、モノホスホリルリピッドＡ、無菌化ウシ型結核菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）、熱不安定性の大腸菌のエンテロトキシン、コレラトキシン、トレハロースジミコレート、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）；サイトカインおよびホルモン、例えば、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、デヒドロエピアンドロステロン、１，２５‐ジヒドロキシビタミンＤ３；ポリアニオン、例えば、デキストラン；ポリアクリル（例えば、ポリメチルメタクリレート、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９３４Ｐ）；担体、例えば、破傷風トキソイド（ｔｅｔａｎｕｓ  ｔｏｘｉｄ）、ジフテリア（ｄｉｐｔｈｅｒｉａ）トキソイド、コレラトキシンＢサブユニット（ｓｕｂｎｕｉｔ）、腸内毒素原性の大腸菌の（ｒｍＬＴ）変異した熱不安定性のエンテロトキシン、熱ショックタンパク質；水中油型乳剤、例えば、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）（Ｈｙｄｒｏｎｉｃｓ，ＵＳＡ）；並びに油中水型乳剤、例えば、フロイント完全および不完全アジュバントのようないくつかのアジュバントのクラスを含むがこれらに限定されない。他の実施形態では、また、ＳＰオイルが使用されることとしてもよい。本明細書で使用されるように、用語「ＳＰオイル」は、ポリオキシエチレン‐ポリオキシプロピレンブロックコポリマー、スクアラン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、および緩衝塩溶液を含むオイルエマルジョンを示す。一般的に、ＳＰオイルエマルジョンは、約１〜３％ｖｏｌ／ｖｏｌのブロックコポリマー、約２〜６％ｖｏｌ／ｖｏｌのスクアラン、とりわけ約３〜６％のスクアラン、および約０．１〜０．５％ｖｏｌ／ｖｏｌのポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートを、緩衝塩溶液となる残りとともに含むであろう。
【００５９】
本明細書に記載されるワクチンは、そのような他の病原体に起因する疾病に対してイヌにおける保護的な免疫応答を誘導することが可能な、他のイヌ病原体由来の少なくとも１つの抗原と組み合わされる、上記免疫原性組成物を含むコンビネーションワクチンとしてもよい。
【００６０】
このような他の病原体は、イヌジステンパー（ＣＤ）ウイルス、イヌアデノウイルス２型（ＣＡＶ−２）、イヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、イヌコロナウイルス（ＣＣＶ）、イヌヘルペスウイルス、および狂犬病ウイルスを含むがこれらに限定されない。本発明のワクチン組成物における使用に関するこれらの病原体由来の抗原は、変更された生きているウイルス調製物、不活化されたウイルス調製物、またはサブユニットタンパク質調製物の形態におけるものであり得る。また、他の実施形態では、組換えＣＤＶ（イヌジステンパーウイルス）が使用されることとしてもよい。これらのウイルスの毒性株を弱毒化する方法、および不活化されたウイルス調製物を作製する方法は、当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第４，５６７，０４２号および米国特許第４，５６７，０４３号に記載されている。
【００６１】
また、他の病原体は、レプトスピラ・ブラチスラバ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）、レプトスピラ・キャニコーラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・グリポチフォサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、レプトスピラ・イクテラヘモラジエ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、レプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｐｏｍｏｎａ）、レプトスピラ・ハージョボビス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｈａｒｄｊｏｂｏｖｉｓ）、ポルフィロモナス菌種（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、バクテロイデス菌種（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ  ｓｐｐ．）、リーシュマニア菌種（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｓｐｐ．）、エーリキア菌種（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、マイコプラズマ菌種（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｓｐ．）、アナプラズマ菌種（Ａｎａｐｌａｓｍａ  ｓｓｐ．）、およびミクロスポラム・カニス（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ  ｃａｎｉｓ）を含む。本発明のワクチン組成物における使用に関するこれらの病原体由来の抗原は、当該技術分野において十分知られている方法を用いて、不活化された全体または部分的な細胞調製物の形態であり得る。例えば、不活化された全体または部分的なレプトスピラ細胞調製物を作製する方法は、当該技術分野において知られており、例えば、Ｙａｎ，  Ｋ−Ｔ，  「Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｂｏｒｇｐｅｔｅｒｓｅｎｉｉ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｈａｒｄｊｏ」，  ＰｈＤ  Ｔｈｅｓｉｓ，  Ａｐｐｅｎｄｉｘ  Ｉ，  １９９６．  Ｆａｃｕｌｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｔｈｅ  Ｑｕｅｅｎ’ｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｅｌｆａｓｔ；Ｍａｃｋｉｎｔｏｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｈａｒｄｊｏ−ｐｏｍｏｎａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｌｅｐｔｏｓｐｉｒｕｒｉａ  ｉｎ  ｃａｔｔｌｅ  ｅｘｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒｈａｒｄｊｏ」，  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ  Ｖｅｔ．  Ｊ．  ２８：１７４−１７７，  １９８０；Ｂｏｌｉｎ  ｅｔ．  ａｌ．，  「Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｎｔａｖａｌｅｎｔ  ｌｅｐｔｏｐｓｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｏｎ  Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ  ｓｅｒｏｖａｒ  ｈａｒｄｊｏ  ｔｙｐｅ  ｈａｒｄｊｏ−ｂｏｉｖｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｅｇｎａｎｔ  ｃａｔｔｌｅ」，  Ａｍ．  Ｊ．  Ｖｅｔ．  Ｒｅｓ．  ５０：１６１−１６５，  １９８９に記載されている。
【００６２】
本発明によれば、少なくとも６週齢、または少なくとも７週齢、または少なくとも８もしくは９週齢のイヌにワクチンを投与することができる。投与は、経口、鼻腔内、粘膜局所、経皮、および非経口（例えば、静脈内、腹腔内、皮内、皮下、または筋肉内）を含む、あらゆる公知のルートによりなされ得る。また、投与は、針を用いない送達装置を用いて達成され得る。また、投与は、例えば、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）ルートを用いる最初の投与、および粘膜ルートを用いる後の投与のルートの組み合わせを用いて達成され得る。いくつかの実施形態では、投与のルートは皮下および筋肉内投与を含む。
【００６３】
本明細書に挙げられる全ての文献、特許文献および非特許文献はともに、本発明が属する当業者の技術のレベルを示す。これらの全ての文献は、参照により組み込まれる個々の文献がそれぞれ具体的におよび個別に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に十分に組み込まれる。
【００６４】
本発明の理解をより明確にするために、以下の実施例が以下に挙げられる。これらの実施例は、単に例示であって、いかなる方法においても、本発明の範囲または基礎原理を限定しないことが理解される。実際に、本明細書に示されかつ記載されるものに加えて、本発明の種々の変更が、以下に示される実施例および上述の記載から当業者にとってあきらかとなるであろう。また、このような変更は、付加された請求の範囲の範囲内に属することが意図される。
【実施例】
【００６５】
実施例１  イヌにおけるライム病に関するライム病ボレリアＯｓｐＣファイロタイプの測定
成体のイクソデス・スカプラリス（Ｉｘｏｄｅｓ  ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ）マダニは、南ロードアイランドでフラッギング法（ｆｌａｇｇｉｎｇ）により採取された。ライム病ボレリアに感染したマダニのパーセンテージは、一般的な方法を用いて直接蛍光顕微鏡検査法を通じて測定され、抗ライム病ボレリア抗体を標識した。
【００６６】
全ての手順が動物保護法の規則に準じて行われ、イヌは農場犬の農業標準操作手順（Ｆａｒｍ  Ｃａｎｉｎｅ  Ｈｕｓｂａｎｄｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）に従って維持された。１５の目的で育てられた両方の性別のイヌ（７匹の雄、８匹の雌；９〜１０週齢；Ｍａｒｓｈａｌｌ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）は、識別番号が与えられ、Ｔ０１（ｎ＝４）、Ｔ０２（ｎ＝４）、Ｔ０３（ｎ＝４）およびＴ０４（ｎ＝３）のように示される４つの研究グループに分けられた。イヌはエリザベスカラーを取り付けられ、１つの上に１つのコンドミニアムスタイルのケージに収容された。マダニ寄生の１日前に、各イヌから血清が採取された。研究グループＴ０１、Ｔ０２、Ｔ０３、およびＴ０４におけるイヌは、中央の胸部の両側に配置された固定寄生チャンバを用いて、０、２５、５０、または７５の成体のイクソデス・スカプラリスマダニにそれぞれ寄生された。マダニは、満腹になるまで食べさせられて除去され、血清サンプルおよび皮膚生検が（寄生の開始に対して）４９および９０日目で採取された。抗体陽転がＳＮＡＰ  ４ＤＸテスト（ＩＤＥＸＸ）により評価された。スピロヘータを培養するために、各皮膚生検の一部が、ＢＳＫ‐Ｈ培地（６％ウサギ血清；３７ＥＣ、５％ＣＯ２）中に配置された。クローンの個体群が、以前に記載したように、表面下のプレーティング（ｓｕｂ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｔｉｎｇ）による培地から得られた。コロニーはプレートから採取され、培養のためにＢＳＫ‐Ｈ培地中に配置された。
【００６７】
サプライヤーにより指示されたようにＱｉａｇｅｎ  ＤＮｅａｓｙ  Ｋｉｔを用いて皮膚生検からＤＮＡを抽出した。さらに、以前に記載したように、ライム病ボレリアのクローンの個体群の培養物からＤＮＡを抽出した。ｏｓｐＣ遺伝子は、組織（１００ｎｇ）から抽出されたＤＮＡおよびボイルしたライム病ボレリア細胞溶解物（１：ｌ上清；ＧｏＴａｑポリメラーゼ）から得られたＤＮＡを用いてＰＣＲ増幅された。全てのＰＣＲは、標準的な条件を用いて実行された。各反応の一部は、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色により評価された。残りのＰＣＲ産物は、ゲルから切除され（Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ；ＱＩＡＧＥＮ）、ｐＥＴ４６Ｋｋ／ＬＩＣベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）によりアニールされた。プラスミドは、大腸菌ＮｏｖａＢｌｕｅ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）において増殖された。コロニーは、ＰＣＲによりｏｓｐＣ遺伝子に関してスクリーニングされた。ＰＣＲに関するテンプレートは、各ｏｓｐＣ陽性、大腸菌コロニーの一部をボイルすることにより生成された。また、コロニーの一部は、ＬＢ培地（２ｍｌ）内に播種され、一晩培養され、遠心分離により収穫され、Ｑｉａｇｅｎ  ＭｉｎｉＰｒｅｐ  ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてプラスミド抽出された。ＰＣＲに使用されたプライマーは以下のとおりである（５’から３’）：
ＯｓｐＣ−Ｆ１
ＧＡＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＡＴＴＧＡＡＴＡＣＡＴＴＡＡＧＴＧＣＡＡＴＡＴＴＡＡＴＧＡＣ（配列番号３３）
ＯｓｐＣ−Ｒ１
ＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＴＴＴＡＣＡＡＡＴＴＡＡＴＣＴＴＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＴＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧ（配列番号３４）
【００６８】
ＤＮＡシーケンシングがＥｕｒｏｆｉｎｓのＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎにより行われた。ネイバージョイニングツリーは、デフォルトセッティングによるマルチプルアライメントモードにおいて、ＣｌｕｓｔａｌＸ２．０．１０ソフトウェアおよびＧｏｎｎｅｔマトリクスを用いて生成され、Ｎ−Ｊ  Ｐｌｏｔバージョン２．２を用いて視覚化された。
【００６９】
結果
ロードアイランドから採取されたマダニにおけるライム病ボレリアの罹患率の分析。直接蛍光顕微鏡検査法を用いて、南ロードアイランドにおいてフィールド採取されたイクソデス・スカプラリスマダニの約５０％がライム病ボレリアに感染していることが測定された。このことは、これまでに報告されているこのエリアにおけるマダニ感染率と一貫性がある。
【００７０】
マダニの寄生を通じたライム病ボレリアによるイヌの感染。この研究の開始時に、全てのイヌが、免疫ブロット分析を通じておよびＳＮＡＰ  ４ＤＸ分析（ＩＤＥＸＸ）を用いるライム病ボレリアの使用を通じて血清陰性であることが確認された。天然の伝染経路を介してライム病ボレリアにイヌを感染させるために、フィールド採取されたマダニはイヌを食糧にした。マダニにおける感染率は約５０％であったため、増加させた数のマダニ（０、２５、５０、または７５）がイヌに配置された。血清サンプルがマダニの寄生後４９日で採取され、免疫学的なステータスが評価された。マダニに寄生されたイヌの１１匹のうち１０匹がライム病ボレリアに関して血清陽性であった。全ての陰性対照の（マダニにより寄生されていない）イヌは、血清陰性であった。トータルのＤＮＡが各イヌから採取された皮膚生検から抽出され、ｏｓｐＣおよびｆｌａＢプライマーセットを用いたＰＣＲにより、ライム病ボレリアに関して試験された。全ての血清陽性のイヌが予測されたサイズのｏｓｐＣおよびｆｌａＢアンプリコンをもたらした。全ての血清陰性イヌは、両方の遺伝子に関してＰＣＲ陰性であった。
【００７１】
感染したイヌ組織において発見されたストレインにおけるＯｓｐＣの多様性の分析。マダニにさらされたイヌの皮膚において持続したストレインのｏｓｐＣの遺伝子型を測定するために、ｏｓｐＣは、皮膚生検から抽出されたＤＮＡからＰＣＲ増幅された。結果として得られたアンプリコンはｐＥＴ４６  Ｅｋ／ＬＩＣ内でクローン化され、プラスミドは大腸菌で増殖した。プラスミドは、その後、５以上の別個の大腸菌コロニーから分離され、ｏｓｐＣ配列が測定された。配列アラインメントおよびデンドログラム（ｄｅｎｄｏｇｒａｍ）構造（図１）は、１０匹のうち６匹のイヌにおけるいくつかの異なるｏｓｐＣタイプを産生するストレインの持続性を論証した（表１）。複数のマダニが各イヌを感染させるために使用されたため、この観察は驚くべきことではない。ＯｓｐＣタイプＡ、Ｂ、Ｆ、Ｉ、およびＮは、最も流行しているタイプＦおよびＮ（それぞれ、５／１０匹および７／１０匹のイヌ）とともに確認された。
【００７２】
感染したイヌにおいて存在するｏｓｐＣ遺伝子型の範囲をさらに定義するために、皮膚生検由来の培養物が、クローンの個体群を得るためにプレートに播かれた。このアプローチにより、バイオプシー（ｂｉｏｓｐｙ）サンプルのＰＣＲにより検出されなかったｏｓｐＣタイプを発現するストレインを確認することができる。個々のライム病ボレリアコロニーは、その後、ＰＣＲによりｏｓｐＣに関して試験された（図２）。追加のｏｓｐＣタイプは、６匹のうち３匹のイヌにおいて確認された。ともに同じイヌから発生した、２つの確認されたＯｓｐＣタイプは、これまで確認されていなかった。これらの系統発生のタイプは、ＤＲＩ８５ａおよびＤＲＩ８５ｅとして示された。このアプローチによって確認される他のｏｓｐＣタイプは、タイプＥ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｎ、Ｕ、およびＴを含んだ（表１）。まとめると、これらの分析において、合計で１１の異なるＯｓｐＣタイプが検出された。
【００７３】
【表１】
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【００７４】
本研究では、発明者は、イヌにおいてうまく感染を確立して持続したライム病スピロヘータストレインのｏｓｐＣ遺伝子型を決定した。ロードアイランド由来のフィールド採取されたイクソデス・スカプラリスマダニは、実験用のイヌを食糧にし、４９日後に皮膚に存在するストレインのｏｓｐＣ遺伝子型を測定した。合計で１１の異なるＯｓｐＣタイプが確認された。ヒトにおいてこれまで検出されなかったＯｓｐＣタイプＦは、最も頻繁に検出されたＯｓｐＣタイプであった（感染したイヌの５０％）。ヒトにおいて非常に低い頻度で発生するタイプＢ、Ｎ、およびＵも検出された。これまで定義されなかった２つのｏｓｐＣタイプ（ＤＲＩ８５ａおよびＤＲＩ８５ｅ）も回収された。本研究で観察された多様性は、ローカルのライム病ボレリア個体群内のいくつかのｏｓｐＣ系統発生のタイプの持続を論証した早期の研究と一貫性がある。本研究で使用されるマダニが単一の地理的領域から採取されたという点で、ロードアイランドにおいて十分に現れない他のＯｓｐＣタイプを発現するストレインはまた、イヌを感染させるための適格性があり得る。この注意にもかかわらず、本研究は、ヒト感染にこれまで関連のなかったＯｓｐＣタイプがイヌに効率的に感染し得、これにより新たな生成イヌライム病ワクチンの合理的な設計を促進することを最初に論証する。
【００７５】
実施例２  イヌにおける、組換えキメラライム病ボレリア（ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｆｅｒｉ）ＯｓｐＣ／ＯｓｐＡワクチンの有効性
全て一般的に健康な、３０匹のイヌが、研究のために選択された。血液サンプルが、最初のワクチン接種の前に採取された。イヌは、表２に記載されるような、以下のワクチンの１つを受けた。Ｔ０１：ＰＢＳ（対照製品）；Ｔ０２：２０ｕｇ／ｍｌ  ＯｓｐＡ＋３０ｕｇ／ｍｌ  Ａ１２ＣＦ（配列番号３１）；Ｔ０３：２０ｕｇ／ｍｌ  ＯｓｐＡ＋３０ｕｇ／ｍｌ  Ａ１０ＣＦ（配列番号３０）。（Ａ１２ＣＦは、単一のポリペプチドを形成するために結合された複数のＯｓｐＣファイロタイプ由来のエピトープからなる。また、Ａ１０ＣＦは、複数のＯｓｐＣファイロタイプ由来のエピトープからなり；その設計はＡ１２ＣＦのそれと類似している。）イヌは、８および１１週齢で、２度のワクチン接種を受け、その後１４週齢でチャレンジした。ワクチン接種後、イヌは、反応または異常に関して２０分間観察された。注入部位は、腫脹、痛み、熱、膿瘍、排液等に関して、１、２、３、および２２、２３、２４日目に観察された。各イヌは、マダニを配置する１日前に、エリザベス（Ｅ）カラーを取り付けられ、イヌは、決まった位置にＥカラーを付けたままで移動し、食べて飲むためのそれらの能力に関してモニタリングされた。米国北東から採取された、イクソデス・スカプラリスの成体マダニの２０から４０のペア（雄、雌）が、各イヌの背部の中央に沿って配置され、７〜１０日の期間、満腹になるまで食べさせた。血清サンプルおよび皮膚生検が所定の間隔で採取され、感染をモニタリングするために分析された。飽食しまたは付着していない、生育不能なマダニが採取され、４℃で保管された。チャレンジの最後に、残っているマダニが取り除かれて保存され、イヌは、ラベルに従って局所ダニ駆除剤で処理され、３０日後に２回目の適用が続いた。イヌは、外見と行動の全体に関して毎日観察された。臨床的観察が行われ（跛行および運動失調）、いずれかが観察される場合には、臨床徴候が低下するまで、イヌの体温（鼓膜）が測定され／毎日記録された。血液採取および皮膚生検は、マダニの受け取りおよびその後の寄生に基づいて、スケジュール／タイミングのずれを除いて、プロトコールごとに行われた。パンチ皮膚生検は、背部の頚部領域上のマダニが付着している一般的な部位に近くで採取され、血液採取と同時となるように時間を定めた。最後の生検は、安楽死後で検死前にすぐに採取された。
【００７６】
【表２】
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【００７７】
結果
ワクチン接種後にいずれのイヌにおいても反応または異常は観察されず、注入部位におけるあらゆる異常（腫脹、痛み、熱、膿瘍、排液等）もなかった。鼓膜プローブを用いて測定された体温は、明らかなまたは持続した上昇を示さなかった。断続的な跛行は、Ａ１２ＣＦ＋ＯｓｐＡ（Ｔ０２）によるワクチン接種を受けた２匹のイヌにおいて発生し、ワクチン接種を受けていないグループ（Ｔ０１）における１匹のイヌは、１９２〜１９３日目に足が不自由になった。運動失調は、研究中のいずれのイヌにおいても観察されなかった。皮症、咬傷、擦過傷、軟便、外耳炎等を含む異常な健康事象は、研究中の何匹かのイヌにおいて観察されたが、いずれもワクチンまたはワクチン接種に起因するものではなかった。
【００７８】
活性化したライム病ボレリア（ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｆｅｒｉ）感染を示す血清学的応答が、１４６日目に、対照のイヌの１０匹のうち８匹（Ｔ０１）、およびＴ０２における１匹のイヌにおいて観察された。９匹の対照のイヌ（Ｔ０１）は血清学的に１７７日目で陽性であり、Ｔ０１における全てのイヌが研究の結果において陽性であった。対照的に、研究の結果に対して、１７７日目から陽性であった各ワクチン接種を受けた群における１匹のイヌのみであった。
【００７９】
本研究において使用されるマダニは、ライム病ボレリア（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｆｅｒｉ）およびアナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）により二重に感染されていた。血清学的分析の結果は、マダニがうまくイヌに対してアナプラズマを伝染させたことを示す。このことは、ライム病ボレリア（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｆｅｒｉ）に対するワクチン構造体（Ｔ０２、Ｔ０３）の特異性を支持する。
【００８０】
ＯｓｐＡおよびＯｓｐＣのそれぞれに対する幾何平均力価として表されるＥＬＩＳＡ値が、全ての日におけるＴ０１対Ｔ０２、およびＴ０１対Ｔ０３を、１４６日目のＯｓｐＣに関するＴ０１対Ｔ０２の比較の例外と比較したとき、有意に異なった（表３）。
【００８１】
【表３】
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【００８２】
対照のイヌ（Ｔ０１）およびＴ０２におけるイヌ（Ａ１２ＣＦ＋ＯｓｐＡ）由来のチャレンジ後段階中に採取された血清サンプルは、生きているライム病ボレリア（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｆｅｒｉ）生物に特異的である、ＥＬＩＳＡにおいて分析された。Ｔ０１対Ｔ０２に関する幾何平均力価は、１４６日目で９０対６；１７７日目で１１６対７；および１９８日目で８７対７であった。よって、これらの結果は、ライム病ボレリア（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｆｅｒｉ）に対するワクチンの保護的効果をサポートする。
【００８３】
皮膚パンチ生検サンプルは、生存に適したスピロヘータに関して培養された。グループＴ０１において、１４６日目の４匹のイヌ、１７７日目の５匹のイヌは、培養陽性であった。Ｔ０２およびＴ０３のそれぞれにおける１匹のイヌは、１７７日目にスピロヘータ陽性皮膚培養を有していた。非陽性の培養は、研究の結果におけるいずれのグループからも得られなかった。また、皮膚パンチ生検は、１４６日目に、ライム病ボレリア（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｆｅｒｉ）の存在に関する、ｆｌａＢおよびｏｓｐＣ特異的プライマーを用いるＰＣＲにより評価された。Ｔ０１における５匹のイヌはｆｌａＢに関して陽性であり、一方、３匹はｏｓｐＣに関して陽性であった。Ｔ０２またはＴ０３におけるいずれのイヌも、ＰＣＲ反応のいずれに関しても陽性ではなかった。
【００８４】
関節および皮膚部位の試験は、Ｔ０２またはＴ０３のいずれかによるワクチン接種は、感染に対してワクチン保護された（データは示されない）ということを微視的に論証した。ワクチン接種を受けたイヌは、ライム病の特徴であるような、それらの関節および皮膚においてほとんど変化がなかった。このような変化があった場合には、ワクチン接種を受けていない対照のイヌ由来の組織と比較したとき、ワクチン接種を受けたイヌにおいて、それらはより少ない重症度であった。関節における病変を有するイヌの数に基づいて、２つのワクチン（Ｔ０２；Ｔ０３）間でわずかに差があった（Ｔ０２に関して６；Ｔ０３に関して７）。しかしながら、どの構造体がよりよい保護を提供したのかについての最終的な結論を記載することはできない。
【００８５】
結論として、Ａ１２ＣＦ＋ＯｓｐＡ（Ｔ０２）およびＡ１０ＣＦ＋ＯｓｐＡ（Ｔ０３）の両方が、イクソデス・スカプラリスマダニにより伝染される、ライム病ボレリア（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｆｅｒｉ）感染に対してイヌを保護するのに有効であった。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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