(57)【要約】  本発明は、リソソーム酵素とターゲティング部分とを含む化合物、例えば特定のクリックケミストリー反応により形成されたリンカーを介してAngiopep-2にコンジュゲートされたイズロン酸-2-スルファターゼを含む化合物に関する。特定の実施形態において、これらの化合物は、ターゲティング部分の存在のため、酵素単独よりも効率的に、脳血管関門を通過することができる又はリソソーム内に蓄積することができる。本発明はまた、かかる化合物を含有する医薬組成物並びに、かかる化合物を用いたリソソーム蓄積症（例えば、ムコ多糖症II型）の治療方法に関する。【選択図】図２４Ｄ
2015536658.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)150アミノ酸未満のペプチド又はペプチド性ターゲティング部分と、(b)イズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)、IDS活性を有するIDS断片、又はIDS類似体からなる群より選択される酵素とを含む化合物であって、前記ターゲティング部分は血液脳関門を横断して前記酵素、断片又は類似体を輸送することができ、前記化合物はIDS酵素活性を示し、前記ターゲティング部分と前記酵素、断片又は類似体とはリンカーで連結されており、前記酵素と前記ペプチドターゲティング部分とを連結する前記リンカーは、クリックケミストリー反応対間のクリックケミストリー反応により形成することができるものであり、該リンカーは構造：
【化１】
2015536658.tif 000075
を有しない、前記化合物。
【請求項２】
前記リンカーが、モノフルオロシクロオクチン(MFCO)含有リンカー、ジフルオロシクロオクチン(DFCO)含有リンカー、(DBCO)含有リンカー、シクロオクチン(OCT)含有リンカー、ジベンゾシクロオクチン(DIBO)含有リンカー、ジアリールアザシクロオクチン(BARAC)含有リンカー、ジフルオロベンゾシクロオクチン(DIFBO)含有リンカー、及びビシクロ[6.1.0]ノニン(BCN)含有リンカーからなる群より選択される、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ターゲティング部分が配列番号1〜105及び107〜117のいずれかと少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ターゲティング部分がAngiopep-2（配列番号97）の配列を含む、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記ターゲティング部分が、場合により配列番号97に記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含む、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記ターゲティング部分が式Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys（式Ia）を含み、
式中、
X3はAsn又はGlnであり、
X4はAsn又はGlnであり、
X5はPhe、Tyr、又はTrpであり、
前記ターゲティング部分が、場合により式Iaに記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含む、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項７】
前記ターゲティング部分が式Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2（式Ib）を含み、
式中、
X3はAsn又はGlnであり、
X4はAsn又はGlnであり、
X5はPhe、Tyr、又はTrpであり、
Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり、
Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr、又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり、
前記ターゲティング部分が、場合により式Ib、Z1又はZ2に記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含む、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項８】
前記ターゲティング部分が式Ib、Z1、又はZ2に記載のアミノ酸の少なくとも3つのD-異性体を含む、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
前記ターゲティング部分が式Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyrを有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
前記ターゲティング部分が式Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyrを有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
前記ターゲティング部分が式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6（式IIa）を含み、
式中、
X1はLys又はD-Lysであり、
X2はArg又はD-Argであり、
X5はPhe又はD-Pheであり、
X6はLys又はD-Lysであり、
X1、X2、X5、又はX6の少なくとも1つがD-アミノ酸である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ターゲティング部分が式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7（式IIb）を含み、
式中、
X1はLys又はD-Lysであり、
X2はArg又はD-Argであり、
X5はPhe又はD-Pheであり、
X6はLys又はD-Lysであり、
X7はTyr又はD-Tyrであり、
X1、X2、X5、X6、又はX7の少なくとも1つがD-アミノ酸である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項１３】
前記ターゲティング部分が式Z1-X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2（式IIc）を含み、
式中、
X1はLys又はD-Lysであり、
X2はArg又はD-Argであり、
X5はPhe又はD-Pheであり、
X6はLys又はD-Lysであり、
X7はTyr又はD-Tyrであり、
Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり、
Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr、又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり、
X1、X2、X5、X6、又はX7の少なくとも1つがD-アミノ酸であり、
前記ターゲティング部分が、場合によりZ1又はZ2に記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含む、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項１４】
リンカーがビシクロ[6.1.0]ノニン(BCN)含有リンカーである、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項１５】
リンカーがモノフルオロシクロオクチン(MFCO)含有リンカーである、請求項１〜１３のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項１６】
一般構造
【化２】
2015536658.tif 000076
[式中、R1は、
【化３】
2015536658.tif 000077
であり、酵素はIDS、IDSの活性断片、又はIDSの活性類似体を表し、nは1〜6の整数であり、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導される]
を有する化合物。
【請求項１７】
酵素に結合した1つ以上のNH基が1つ以上のリジン残基の一級アミノ基から誘導される、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
酵素に結合した1つ以上のNH基が完全長ヒトIDSアイソフォームaに対応するリジン199及び/又はリジン376の一級アミノ基から誘導される、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
nが1である、請求項１６〜１８のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項２０】
nが2である、請求項１６〜１８のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項２１】
nの平均値が1〜6である、請求項１６〜２０のいずれか1項に記載の式IIIの化合物の集団。
【請求項２２】
一般構造
【化４】
2015536658.tif 000078
[式中、R1は、
【化５】
2015536658.tif 000079
であり、酵素はIDS、IDSの活性断片、又はIDSの活性類似体を表し、nは1〜6の整数であり、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導される]
を有する化合物。
【請求項２３】
nの平均値が1〜6である、請求項２２に記載の式VIの化合物の集団。
【請求項２４】
nの平均値が約2.3である、請求項２３に記載の化合物の集団。
【請求項２５】
酵素に結合した1つ以上のNH基が1つ以上のリジン残基の一級アミノ基から誘導される、請求項２２〜２４のいずれか1項に記載の化合物又は化合物の集団。
【請求項２６】
酵素に結合した1つ以上のNH基が完全長ヒトIDSアイソフォームaに対応するリジン199及び/又はリジン479の一級アミノ基から誘導される、請求項２５に記載の化合物又は化合物の集団。
【請求項２７】
一般構造
【化６】
2015536658.tif 000080
[式中、R2は、
【化７】
2015536658.tif 000081
であり、酵素はIDS、IDSの活性断片、又はIDSの活性類似体を表し、nは1〜6の整数であり、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導される]
を有する化合物。
【請求項２８】
nの平均値が1〜6である、請求項２７に記載の式VIIの化合物の集団。
【請求項２９】
nの平均値が約2.3、約4.4又は約5.0である、請求項２８に記載の化合物の集団。
【請求項３０】
一般構造
【化８】
2015536658.tif 000082
[式中、R2は、
【化９】
2015536658.tif 000083
であり、酵素はIDS、IDSの活性断片、又はIDSの活性類似体を表し、nは1〜6の整数であり、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導される]
を有する化合物。
【請求項３１】
nの平均値が1〜6である、請求項３０に記載の式VIIIの化合物の集団。
【請求項３２】
nの平均値が約4.9である、請求項３１に記載の化合物の集団。
【請求項３３】
酵素に結合した1つ以上のNH基が1つ以上のリジン残基の一級アミノ基から誘導される、請求項３０〜３２のいずれか1項に記載の化合物又は化合物の集団。
【請求項３４】
酵素に結合した1つ以上のNH基が完全長ヒトIDSアイソフォームaに対応するリジン199、リジン211及び/又はリジン376の1つ以上の一級アミノ基から誘導される、請求項３３に記載の化合物又は化合物の集団。
【請求項３５】
一般構造
【化１０】
2015536658.tif 000084
[式中、R3は、
【化１１】
2015536658.tif 000085
であり、酵素はIDS、IDSの活性断片、又はIDSの活性類似体を表し、nは1〜6の整数であり、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導される]
を有する化合物。
【請求項３６】
nの平均値が1〜6である、請求項３５に記載の式IXの化合物の集団。
【請求項３７】
nの平均値が約1.3である、請求項３６に記載の化合物の集団。
【請求項３８】
一般構造
【化１２】
2015536658.tif 000086
[式中、酵素はIDS、IDSの活性断片、又はIDSの活性類似体を表し、nはリンカーを介してIDSに結合したAngiopep-2部分の数であり、1〜6の整数であり、An2Cysに結合したS部分はAngiopep-2-Cys中のシステイン上の側鎖スルフィドを表し、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導される]
を有する化合物。
【請求項３９】
nの平均値が0.5〜6である、請求項３８に記載の式Xの化合物の集団。
【請求項４０】
nの平均値が約0.8である、請求項３９に記載の化合物の集団。
【請求項４１】
一般構造
【化１３】
2015536658.tif 000087
[式中、酵素はIDS、IDSの活性断片、又はIDSの活性類似体を表し、nはリンカーを介してIDSに結合したAngiopep-2部分の数であり、1〜6の整数であり、Cys-An2はCys-Angiopep-2であり、Cys-An2に結合したS部分はCys-Angiopep-2中のシステイン上の側鎖スルフィドを表し、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導される]
を有する化合物。
【請求項４２】
nの平均値が0.5〜6である、請求項４１に記載の式XIの化合物の集団。
【請求項４３】
nの平均値が約0.9である、請求項４２に記載の化合物の集団。
【請求項４４】
一般構造
【化１４】
2015536658.tif 000088
[式中、Aは、イズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)、IDS活性を有するIDS断片、又はIDS活性を有するIDS類似体からなる群より選択され；Aに結合したNH基はA中の一級アミノ基の反応から誘導され；nは1〜8の整数であり；Bはヒドロキシル、置換されていてもよいC1〜10アルキル、置換されていてもよいC1〜10アルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいアリール、ヘテロ環、置換されていてもよいC1〜10アルコキシ、置換されていてもよいC1〜10アルキルアミノ、置換されていてもよいC3〜10シクロアルキル、置換されていてもよいC4〜10シクロアルケニル、置換されていてもよいC4〜10シクロアルキニル、アミノ酸、又は2〜5アミノ酸のペプチドである]
を有する化合物。
【請求項４５】
Bがアミノ酸、2〜5アミノ酸のペプチドであるか、又は
【化１５】
2015536658.tif 000089
から選択される、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４６】
Bが、
【化１６】
2015536658.tif 000090
である、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４７】
nの平均値が1〜8である、請求項４４に記載の式XIIIの化合物の集団。
【請求項４８】
Aに結合した1つ以上のNH基が1つ以上のリジン残基の一級アミノ基から誘導される、請求項４６又は４７に記載の化合物又は化合物の集団。
【請求項４９】
Aに結合した1つ以上のNH基が完全長ヒトIDSアイソフォームaに対応するリジン199、リジン240、リジン295、リジン347、リジン479及びリジン483の1つ以上の一級アミノ基から誘導される、請求項４８に記載の化合物又は化合物の集団。
【請求項５０】
Aに結合した1つ以上のNH基が完全長ヒトIDSアイソフォームaに対応するリジン199、リジン479及びリジン483の1つ以上の一級アミノ基から誘導される、請求項４９に記載の化合物又は化合物の集団。
【請求項５１】
Bが、
【化１７】
2015536658.tif 000091
である、請求項４４に記載の化合物。
【請求項５２】
nの平均値が1〜8である、請求項５１に記載の式XIIIの化合物の集団。
【請求項５３】
Aに結合した1つ以上のNH基が1つ以上のリジン残基の一級アミノ基から誘導される、請求項５１又は５２に記載の化合物又は化合物の集団。
【請求項５４】
Aに結合した1つ以上のNH基が完全長ヒトIDSアイソフォームaに対応するリジン479の一級アミノ基から誘導される、請求項５３に記載の化合物又は化合物の集団。
【請求項５５】
IDS又は前記IDS断片がヒトIDSアイソフォームa若しくはその断片のアミノ酸配列を有するか、又は前記IDS類似体が完全長ヒトIDSアイソフォームaの配列に対する少なくとも70%の同一性を有する、請求項１〜５４のいずれか1項に記載の化合物又は化合物の集団。
【請求項５６】
IDSがヒトIDSアイソフォームa又は成熟形態のアイソフォームa(アイソフォームaのアミノ酸26〜550)の配列を有する、請求項５５に記載の化合物又は化合物の集団。
【請求項５７】
1つ以上のナノ粒子を含む組成物であって、前記ナノ粒子が請求項１〜５６のいずれか1項に記載の化合物のいずれか1つにコンジュゲートされている組成物。
【請求項５８】
請求項１〜５６のいずれか1項に記載の化合物のいずれか1つのリポソーム製剤を含む組成物。
【請求項５９】
請求項１〜５６のいずれか1項に記載の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項６０】
ムコ多糖症II型（MPS-II）を有する被験体の治療又は予防的処置方法であって、前記被験体に請求項１〜５６のいずれか1項に記載の化合物又は請求項５７〜５９のいずれか1項に記載の組成物を投与することを含む方法。
【請求項６１】
前記被験体が重篤形態のMPS-IIを有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記被験体が減衰形態のMPS-IIを有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記被験体が神経症状を有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
前記被験体が5歳未満で治療を開始する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記被験体が3歳未満で治療を開始する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記被験体が乳幼児である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記投与が非経口投与を含む、請求項６０〜６６のいずれか1項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リソソーム酵素及びターゲティング部分を含む化合物、並びに、かかる酵素の欠乏により生じる障害の治療におけるかかる化合物の使用に関する。本発明はさらに、これらの化合物の製造における改変されたリソソーム酵素中間体に関する。
【背景技術】
【０００２】
リソソーム蓄積症（lysosomal storage disorder）は、約50の希有な遺伝性障害の群であり、この障害において対象は、適切な代謝に必要なリソソーム酵素を欠損している。これら疾患は典型的には、常染色体又はX連鎖劣性遺伝子により生じる。群として、これら障害の発症率は約1:5000〜1:10,000である。
【０００３】
Hunter症候群又はムコ多糖症II型（MPS-II）は、ヘパリン硫酸（heparin sulfate）及びデルマタン硫酸のリソソーム分解に必要な酵素である、イズロン酸-2-スルファターゼ（IDS;イデュルスルファーゼとしても知られる）の欠乏により生じる。この障害はX連鎖劣性であるので、主に男性に影響する。この障害に罹患している人は、グリコサミノグリカン又はGAGとしても知られるこれらムコ多糖の分解及び再利用ができない。この欠乏は、全身にわたるGAGの蓄積をもたらし、これは神経系、関節や、心臓、肝臓、及び皮膚を含む様々な器官系に深刻な影響をもたらす。粗大化顔貌特徴、肥大した頭部及び腹部、並びに皮膚障害を含む、数々の身体症状もある。最も重症な場合には、この疾患はティーンエイジで致死性となり得るのであり、重症の精神遅滞を伴う。
【０００４】
MPS-IIに治癒法はない。対症処置に加えて、治療的アプローチには骨髄移植及び酵素補充療法がある。骨髄移植は、心血管異常、肝脾腫大（肝臓及び脾臓の肥大）、関節硬直を含むMPS-IIの周辺症状を安定化することが観察されてきた。しかし、このアプローチは、この疾患に関連する神経心理学的症状を安定化又は解決しなかった（Guffonら、J. Pediatr. 154:733-7、2009）。
【０００５】
IDSの静脈内投与による酵素補充療法もまた、皮膚障害（Marinら、(出版前にオンライン公開)Pediatr. Dermatol. Oct. 13、2011）、内臓サイズ、胃腸機能の改善、及び上気道感染症を治療するための抗生物質の必要性の減少（Hoffmanら、Pediatr. Neurol. 45:181-4、2011）を含む利点のあることが示されてきた。骨髄移植と同様に、このアプローチはMPS-IIと関連する中枢神経系欠陥を改善しない。なぜなら、酵素が血液脳関門（BBB;Wraithら、Eur. J. Pediatr. 1676:267-7、2008）を通過しないと予測されるからである。
【０００６】
くも膜下腔内送達（Feliceら、Toxicol. Pathol. 39:879-92、2011）を含む、脳へのIDSの送達を増加させる方法が研究されてきたのであり、現在も研究されている。しかし、くも膜下腔内送達は高度に侵襲的な技術である。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Guffonら、J. Pediatr. 154:733-7、2009
【非特許文献２】Marinら、(出版前にオンライン公開)Pediatr. Dermatol. Oct. 13、2011
【非特許文献３】Hoffmanら、Pediatr. Neurol. 45:181-4、2011
【非特許文献４】Wraithら、Eur. J. Pediatr. 1676:267-7、2008
【非特許文献５】Feliceら、Toxicol. Pathol. 39:879-92、2011
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、他の症状に加えて神経性疾患症状に対処する、より非侵襲的で効果的なMPS-II治療方法が、きわめて望ましいといえよう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ターゲティング部分及びリソソーム酵素を含む化合物に関する。これら化合物は、MPS-IIを治療するために使用され得るIDS-Angiopep-2コンジュゲート及び融合タンパク質により例示される。これらコンジュゲート及び融合タンパク質はBBBを通過できるので、周辺疾患症状を治療できるだけでなく、CNS症状の治療にも有効であり得る。加えて、ターゲティング部分（標的化部分）、例えばAngiopep-2は、酵素をリソソームにターゲティングすることができるので、これらコンジュゲート及び融合タンパク質は、酵素単体より有効であることが予測される。
【００１０】
したがって、第1の態様において、本発明は、（a）ターゲティング部分（例えば、200、150、125、100、80、60、50、40、35、30、25、24、23、22、21、20、又は19アミノ酸未満であってもよいペプチド又はペプチド模倣体ターゲティング部分）と、（b）リソソーム酵素、その活性断片、又はその類似体とを含む化合物であって、ターゲティング部分と酵素、断片又は類似体とがリンカーで連結されており、ここで該ターゲティング部分は、前記酵素、断片又は類似体をリソソームへ及び／又は血液脳関門を超えて輸送する能力を有し、ここで該化合物はIDS酵素的活性を示し、該酵素と該ペプチドターゲティング部分を連結する該リンカーは、クリックケミストリー対の間のクリックケミストリー反応により形成することができ、該リンカーは次の構造
【００１１】
【化１】
2015536658.tif 000003
【００１２】
を有しないものである、前記化合物を特徴とする。
【００１３】
より具体的な態様において、本発明は（a）150アミノ酸未満であるペプチド又はペプチド模倣体ターゲティング部分と、（b）イズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)、IDS 活性を有するIDS断片、またはIDS 活性を有するIDS類似体からなる群より選択される酵素とを含む化合物を特徴とし、ここで該ターゲティング部分は、前記酵素、断片又は類似体をリソソームへ及び／又は血液脳関門を超えて輸送する能力を有し、該ターゲティング部分と該酵素とはモノフルオロシクロオクチン(MFCO)含有リンカー、ジフルオロシクロオクチン(DFCO)含有リンカー、シクロオクチン(OCT)含有リンカー、ジベンゾシクロオクチン(DIBO)含有リンカー、ジアリールアザシクロオクチン(BARAC)含有リンカー、ジフルオロベンゾシクロオクチン(DIFBO)含有リンカー、及びビシクロ[6.1.0]ノニン(BCN)含有リンカーからなる群より選択されるリンカーにより連結されている。
【００１４】
リソソーム酵素はイズロン酸-2-スルファターゼ（IDS）、IDS活性を有するIDS断片、又はIDS類似体であってもよい。ある実施形態において、IDS酵素又はIDS断片は、ヒトIDSアイソフォームa又はその断片（例えば、アイソフォームaのアミノ酸26〜550）のアミノ酸配列を有し、あるいは、IDS類似体は、ヒトIDSアイソフォームa、アイソフォームb、アイソフォームcの配列、又はアイソフォームaのアミノ酸26〜550と実質的に同一（例えば、少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一）である。特定の実施形態において、IDS酵素は、ヒトIDSアイソフォームa又はアイソフォームaの成熟形態（アイソフォームaのアミノ酸26〜550）の配列を有する。
【００１５】
第1の態様において、ターゲティング部分は、配列番号1〜105又は107〜117のいずれか（例えば、Angiopep-2（配列番号97））と実質的に同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。他の実施形態において、ターゲティング部分は式Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys（式Ia）を含み、式中、X3はAsn又はGlnであり、X4はAsn又はGlnであり、X5はPhe、Tyr、又はTrpであり、ターゲティング部分は、場合により式Iaに記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体をを含んでもよい。他の実施形態において、ターゲティング部分は式Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2（式Ib）を含み、式中、X3はAsn又はGlnであり、X4はAsn又はGlnであり、X5はPhe、Tyr、又はTrpであり、Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり、Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr、又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり、ターゲティング部分は、場合により式Ib、Z1又はZ2に記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含んでもよい。他の実施形態において、ターゲティング部分は式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6（式IIa）を含み、式中、X1はLys又はD-Lysであり、X2はArg又はD-Argであり、X5はPhe又はD-Pheであり、X6はLys又はD-Lysであり、X1、X2、X5、又はX6の少なくとも1つがD-アミノ酸である。他の実施形態において、ターゲティング部分は式X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7（式IIb）を含み、式中、X1はLys又はD-Lysであり、X2はArg又はD-Argであり、X5はPhe又はD-Pheであり、X6はLys又はD-Lysであり、X7はTyr又はD-Tyrであり、X1、X2、X5、X6、又はX7の少なくとも1つがD-アミノ酸である。他の実施形態において、ターゲティング部分は式Z1-X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7-Z2（式IIc）を含み、式中、X1はLys又はD-Lysであり、X2はArg又はD-Argであり、X5はPhe又はD-Pheであり、X6はLys又はD-Lysであり、X7はTyr又はD-Tyrであり、Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり、Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr、又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり、X1、X2、X5、X6、又はX7の少なくとも1つがD-アミノ酸であり、該ペプチド又はペプチド模倣体は、場合によりZ1又はZ2に記載のアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含んでもよい。
【００１６】
第1の態様において、リンカーは共有結合（例えばペプチド結合）又は1つ以上のアミノ酸である。化合物は融合タンパク質（例えば、Angiopep-2-IDS、IDS-Angiopep-2、又はAngiopep-2-IDS-Angiopep-2、又は図1に示す構造を有する）であってもよい。化合物は、第2のリンカーにより化合物に連結されている第2のターゲティング部分をさらに含んでいてもよい。
【００１７】
本発明はまた、第1の態様の化合物及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を特徴とする。
【００１８】
別の態様において、本発明は、リソソーム蓄積症（例えばMPS-II）を有する対象の治療又は予防的処置方法を特徴とする。この方法は、被験体に第1の態様の化合物又は本明細書に記載の医薬組成物を投与することを含む。化合物中のリソソーム酵素は、IDSであってもよい。被験体は、重症形態のMPS-II又は減衰形態のMPS-IIのいずれを有していてもよい。被験体は、神経症状（例えば精神遅滞）を経験していてもよい。この方法は、6ヶ月齢、又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15若しくは18歳未満の被験体に対して実施又は開始してもよい。対象は乳幼児（例えば、1歳未満）であってもよい。
【００１９】
ある実施形態において、ターゲティング部分は抗体（例えば、内因性BBB受容体、例えばインスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、リポタンパク質受容体、及びIGF受容体等に特異的な抗体又は免疫グロブリン）ではない。
【００２０】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、表1の配列のいずれか又はその断片と実質的に同一のものである。特定の実施形態において、ペプチドは、Angiopep-1（配列番号67）、Angiopep-2（配列番号97）（An2）、Angiopep-3（配列番号107）、Angiopep-4a（配列番号108）、Angiopep-4b（配列番号109）、Angiopep-5（配列番号110）、Angiopep-6（配列番号111）、Angiopep-7（配列番号112）又は逆Angiopep-2（配列番号117）の配列を有する。ターゲティング部分又は化合物を、特定の細胞型（例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓、及び筋肉のいずれか1、2、3、4、若しくは5種）に効率的に輸送するか、又はそれは哺乳動物のBBBを効率的に通過することができる（例えば、Angiopep-1、-2、-3、-4a、-4b、-5、及び-6）。別の実施形態において、ターゲティング部分又は化合物は、特定の細胞型（例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓、及び筋肉のいずれか1、2、3、4、若しくは5種）に進入することができるが、BBBを効率的に通過することはできない（例えば、Angiopep-7を含むコンジュゲート）。ターゲティング部分は、任意の長さのもの、例えば、少なくとも6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、35、50、75、100、200、若しくは500アミノ酸、又はこれらの数の間の任意の範囲であってよい。特定の実施形態において、ターゲティング部分は、200、150、125、100、90、80、70、60、50、40、30、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7又は6未満のアミノ酸（例えば10〜50アミノ酸長）である。ターゲティング部分は、組換え遺伝子技術又は化学合成により製造することができる。
【００２１】
【表１】
2015536658.tif 000004
【００２２】
2015536658.tif 000005
【００２３】
2015536658.tif 000006
【００２４】
2015536658.tif 000007
【００２５】
ポリペプチド番号５、６７、７６及び９１は、それぞれ配列番号５、６７、７６及び９１の配列を含み、C末端でアミド化されている。    
ポリペプチド１０７、１０９及び１１０は、それぞれ配列番号９７、１０９及び１１０の配列を含み、N末端でアセチル化されている。
【００２６】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、式：
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19
〔式中、X1〜X19の各々（例えば、X1〜X6、X8、X9、X11〜X14、及びX16〜X19）は、独立して、任意のアミノ酸（例えば、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr、及びValなどの天然アミノ酸）であるか、又は存在せず、X1、X10及びX15のうちの少なくとも1個（例えば、2個若しくは3個）はアルギニンである。〕
を有するアミノ酸配列を含みうる。いくつかの実施形態において、X7はSer若しくはCysであるか；又はX10及びX15はそれぞれ独立して、Arg若しくはLysである。いくつかの実施形態において、X1〜X19の残基は、包括的に、配列番号1〜105及び107〜116（例えば、Angiopep-1、Angiopep-2、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、及びAngiopep-7）のいずれか1つの任意のアミノ酸配列と実質的に同一である。いくつかの実施形態において、アミノ酸X1〜X19のうちの少なくとも1個（例えば、2、3、4若しくは5個）はArgである。いくつかの実施形態において、前記ペプチドは、該ペプチドのN末端、該ペプチドのC末端、又はその両方に1個以上の追加のシステイン残基を有する。
【００２７】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys（式Ia）〔式中、X3はAsn又はGlnであり；X4はAsn又はGlnであり；X5はPhe、Tyr又はTrpであり；該ポリペプチドは、場合により長さが200アミノ酸未満（例えば、150、100、75、50、45、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、12、10、11、8若しくは7アミノ酸未満、又はこれらの数値の間の任意の範囲）であり；該ペプチド又はペプチド模倣体は、場合により式Iaに記載されたアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体（例えば、Lys、Arg、X3、X4、X5又はLysのD-異性体）を含んでもよく；該ペプチド又はペプチド模倣体は表２におけるペプチドではない。〕を含みうる。
【００２８】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、アミノ酸配列Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys（式Ia）〔式中、X3はAsn又はGlnであり；X4はAsn又はGlnであり；X5はPhe、Tyr又はTrpであり；該ペプチド又はペプチド模倣体は、長さが19アミノ酸未満（例えば、18、17、16、15、14、12、10、11、8若しくは7アミノ酸未満、又はこれらの数値の間の任意の範囲）であり；該ペプチド又はペプチド模倣体は、場合により式Iaに記載されたアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体（例えば、Lys、Arg、X3、X4、X5又はLysのD-異性体）を含んでもよい。〕を含みうる。
【００２９】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2（式Ib）〔式中、X3はAsn又はGlnであり；X4はAsn又はGlnであり；X5はPhe、Tyr又はTrpであり；Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり；Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり；該ペプチド又はペプチド模倣体は、場合により式Ib、Z1又はZ2に記載されたアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含んでもよい。〕のアミノ酸配列を含みうる。
【００３０】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分はアミノ酸配列Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lysを含みうる。他の実施形態において、ターゲティング部分はLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyrのアミノ酸配列を有する。さらに他の実施形態において、ターゲティング部分はLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cysのアミノ酸配列を有する。
【００３１】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、X1-X2-Asn-Asn-X5-X6（式IIa）〔式中、X1はLys又はD-Lysであり；X2はArg又はD-Argであり；X5はPhe又はD-Pheであり；X6はLys又はD-Lysであり；X1、X2、X5又はX6の少なくとも1つ（例えば少なくとも2つ、3つ又は4つ）はD-アミノ酸である。〕のアミノ酸配列を有し得る。
【００３２】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、X1-X2-Asn-Asn-X5-X6-X7（式IIb）〔式中、X1はLys又はD-Lysであり；X2はArg又はD-Argであり；X5はPhe又はD-Pheであり；X6はLys又はD-Lysであり；X7はTyr又はD-Tyrであり；X1、X2、X5、X6又はX7の少なくとも1つ（例えば少なくとも2つ、3つ、4つ又は5つ）はD-アミノ酸である。〕のアミノ酸配列を有し得る。
【００３３】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、Z1-Lys-Arg-X3-X4-X5-Lys-Z2（式IIc）〔式中、X3はAsn又はGlnであり；X4はAsn又はGlnであり；X5はPhe、Tyr又はTrpであり；Z1は不在、Cys、Gly、Cys-Gly、Arg-Gly、Cys-Arg-Gly、Ser-Arg-Gly、Cys-Ser-Arg-Gly、Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Ser-Arg-Gly、Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Cys-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly又はCys-Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Glyであり；Z2は不在、Cys、Tyr、Tyr-Cys、Cys-Tyr、Thr-Glu-Glu-Tyr又はThr-Glu-Glu-Tyr-Cysであり；X1、X2、X5、X6又はX7の少なくとも1つはD-アミノ酸であり；該ペプチド又はペプチド模倣体は、場合によりZ1又はZ2に記載されたアミノ酸の1又はそれ以上のD-異性体を含んでもよい。〕のアミノ酸配列を有し得る。
【００３４】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr（An2）〔式中、任意の1又はそれ以上のアミノ酸がD-異性体である。〕のアミノ酸配列を有し得る。例えば、ターゲティング部分は、D-異性体である1、2、3、4又は5個のアミノ酸を有することができる。好ましい実施形態において、位置8、10及び11の1若しくはそれ以上又は全てがD-異性体でありうる。また別の実施形態において、位置8、10、11及び15の1若しくはそれ以上又は全てがD-異性体でありうる。
【００３５】
上記態様のいずれかにおいて、ターゲティング部分は、以下：Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr（3D-An2）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1a）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1b）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys（P1c）；D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys（P1d）；Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P2）；Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P3）；Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P4）；Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P5）；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P5a）；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P5b）；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys（P5c）；Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Tyr-Cys（P6）；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Tyr-Cys（P6a）；D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Tyr-Cys（P6b）；Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr；及びD-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-D-Tyr-Cys（P6c）；又はこれらの断片でありうる。他の実施形態において、ターゲティング部分は、0〜5個（例えば、0〜4個、0〜3個、0〜2個、0〜1個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、1〜2個、2〜5個、2〜4個、2〜3個、3〜5個、3〜4個又は4〜5個）のアミノ酸の置換、欠失又は付加を有する上記ペプチド又はペプチド模倣体の1つの配列を有する。
【００３６】
上記態様のいずれかにおいて、ペプチドは、以下：Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu；若しくはLys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys、又はこれらの断片でありうる。
【００３７】
上記態様のいずれかにおいて、ペプチド模倣体は、以下：Thr-Phe-Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr（3D-An2）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-Lys-Arg-Asn-Asn-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1a）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-Tyr-Cys（P1b）；Phe-Tyr-Gly-Gly-Ser-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-Glu-D-Tyr-Cys（P1c）；D-Phe-D-Tyr-Gly-Gly-Ser-D-Arg-Gly-D-Lys-D-Arg-Asn-Asn-D-Phe-D-Lys-Thr-Glu-D-Glu-D-Tyr-Cys（P1d）、又はこれらの断片（例えば、P1、P1a、P1b、P1c又はP1dのN末端から1〜7アミノ酸の欠失； P1、P1a、P1b、P1c又はP1dのC末端からの1〜5アミノ酸の欠失；あるいはP1、P1a、P1b、P1c又はP1dのN末端から1〜7アミノ酸の欠失とP1、P1a、P1b、P1c又はP1dのC末端からの1〜5アミノ酸の欠失）でありうる。
【００３８】
本明細書において記載するターゲティング部分のいずれかにおいて、この部分は、本明細書に記載するアミノ酸配列から（例えば、Lys-Arg-X3-X4-X5-Lysから）作製することができる、1、2、3、4又は5アミノ酸（例えば、1〜3アミノ酸）の付加又は欠失を含んでもよい。
【００３９】
本明細書において記載するターゲティング部分のいずれかにおいて、この部分は、ペプチド又はペプチド模倣体のN末端、ペプチド又はペプチド模倣体のC末端又はその両方に、1又はそれ以上の追加のシステイン残基を有してもよい。他の実施形態において、ターゲティング部分は、ペプチド又はペプチド模倣体のN末端、ペプチド又はペプチド模倣体のC末端又はその両方に、1又はそれ以上のチロシン残基を有してもよい。またさらなる実施形態において、ターゲティング部分は、ペプチド又はペプチド模倣体のN末端、ペプチド又はペプチド模倣体のC末端又はその両方に、アミノ酸配列Tyr-Cys及び／又はCys-Tyrを有してもよい。
【００４０】
上記態様のいずれかの特定の実施形態において、ターゲティング部分は、15より少ないアミノ酸長（例えば、10より少ないアミノ酸長）である。
【００４１】
上記態様のいずれかの特定の実施形態において、ターゲティング部分は、アミド化されたC末端を有してもよい。他の実施形態において、ターゲティング部分は、BBBを通過して効率的に輸送される（例えば、Angiopep-2よりも効率的にBBBを通過して輸送される）。
【００４２】
上記態様のいずれかの特定の実施形態において、融合タンパク質、ターゲティング部分、又はリソソーム酵素（例えばIDS）、若しくは断片を類似体又はペプチド模倣体となるよう改変（修飾）する（例えば、本明細書に記載のように）。融合タンパク質、ターゲティング部分、又はリソソーム酵素、断片若しくは類似体を、アミド化、アセチル化するか、又はその両方を行うことができる。そのような改変を、ペプチドまたは酵素ののアミノ又はカルボキシ末端で行うことができる。融合タンパク質、ターゲティング部分、又はリソソーム酵素、断片若しくは類似体は、多量体形態、例えば、二量体形態（例えば、システイン残基を介してジスルフィド結合により形成される）にあってもよい。
【００４３】
特定の実施形態では、ターゲティング部分、リソソーム酵素（例えばIDS）、酵素断片若しくは酵素類似体は、本明細書に記載のアミノ酸配列を有するが、ただし少なくとも１つのアミノ酸置換（例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、若しくは12の置換）、挿入、又は欠失を有する。ペプチドは、例えば、1〜12、1〜10、1〜5、又は1〜3のアミノ酸置換、例えば、1〜10（例えば9、8、7、6、5、4、3、2まで）のアミノ酸置換を有しうる。アミノ酸置換は、保存的又は非保存的でありうる。例えば、ターゲティング部分は配列番号1、Angiopep-1、Angiopep-2、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、及びAngiopep-7のいずれかのアミノ酸配列の位置1、10、及び15に対応する位置の1、2又は3箇所にアルギニンを有しうる。
【００４４】
上記態様のいずれかにおいて、前記化合物は特に、配列番号1〜105及び107〜117のいずれかを含むか、又はそれからなるペプチド（例えば、Angiopep-1、Angiopep-2、Angiopep-3、Angiopep-4a、Angiopep-4b、Angiopep-5、Angiopep-6、及びAngiopep-7）を含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、本発明のペプチド及びコンジュゲートは、配列番号102、103、104、及び105のペプチドを含まない。
【００４５】
上記態様のいずれかにおいて、リンカー（X）は、当技術分野で公知であるか、又は本明細書に記載の任意のリンカーであってよい。特定の実施形態において、リンカーは、共有結合（例えば、ペプチド結合）、化学連結剤（例えば、本明細書に記載のもの）、アミノ酸又はペプチド（例えば、2、3、4、5、8、10個以上のアミノ酸）である。誤解を避けるために記載すると、化学的連結物質は、非アミノ酸部分の他に1以上のアミノ酸を含みうる。
【００４６】
特定の実施形態において、リンカーは、式：
【００４７】
【化２】
2015536658.tif 000008
【００４８】
〔式中、nは2〜15の整数（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14若しくは15）であり；及びYはA上のチオールであり、ZはB上の一級アミンであるか、又はYはB上のチオールであり、ZはA上の一級アミンである。〕
を有する。特定の実施形態において、リンカーは、N-スクシンイミジル(アセチルチオ)アセテート（SATA）リンカー又はヒドラジドリンカーである。リンカーは、酵素（例えば、IDS）又はターゲティング部分（例えば、Angiopep-2）と、遊離アミン、システイン側鎖（例えば、Angiopep-2-Cys若しくはCys-Angiopep-2のもの）を介して又はグリコシル化部位を介してコンジュゲートしうる。
【００４９】
特定の実施形態において、化合物は、式：
【００５０】
【化３】
2015536658.tif 000009
【００５１】
〔式中、「Lys-NH」基は、酵素中に存在するリジン、又はN末端若しくはC末端リジンを表す。〕
を有する。別の例において、化合物は、構造：
【００５２】
【化４】
2015536658.tif 000010
【００５３】
〔式中、各−NH−基は、それぞれターゲティング部分及び酵素に存在する一級アミノを表す。〕
を有する。特定の実施形態において、酵素はIDSであってもよいし、又はターゲティング部分はAngiopep-2であってもよい。
【００５４】
特定の実施形態において、化合物は、ターゲティング部分（例えば、Angiopep-2）と、リソソーム酵素（例えば、IDS）、酵素断片又は酵素類似体を含む融合タンパク質である。
【００５５】
特定の実施形態において、リンカーは、クリックケミストリー反応対の反応により形成され、ここで該クリックケミストリー反応は、トリアゾール含有リンカーを形成する、アルキニル基とアジド基との間のヒュスゲン1,3-双極性環化付加反応；4π電子系を有するジエン（例えば、場合により置換されていてもよい1,3-不飽和化合物、例として場合により置換されていてもよい1,3-ブタジエン、1-メトキシ-3-トリメチルシリルオキシ-1,3-ブタジエン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン又はフランなど）と2π電子系を有する親ジエン体（dienophile）又はヘテロ親ジエン体（heterodienophile）（例えば、場合により置換されていてもよいアルケニル基又は場合により置換されていてもよいアルキニル基）との間のディールス・アルダー反応；求核試薬及び歪み（strained）ヘテロシクリル求電子試薬による開環反応；ホスホロチオエート基及びヨード基によるスプリントライゲーション（splint ligation）反応；並びにアルデヒド基及びアミノ基による還元的アミノ化反応からなる群より選択される。本発明の一態様において、該クリックケミストリー反応はアルキニル基とアジド基との間のヒュスゲン1,3-双極性環化付加反応である。かかる実施形態においてアルキニル基は、モノフルオロシクロオクチン（MFCO）、ジフルオロシクロオクチン（DFCO）、シクロオクチン（OCT）、ジベンゾシクロオクチン（DIBO）、ビアリールアザシクロオクチン（BARAC）、ジフルオロベンゾシクロオクチン（DIFBO）、又はビシクロ[6.1.0]ノニン（BCN）を含む。
【００５６】
特定の実施形態において、ターゲティング部分は、ポリペプチドのN末端又はC末端においてアジド基で誘導体化されて、そのアジド基が、クリックケミストリー反応においてアルキン誘導体化リンカーと反応し、ターゲティング部分をリンカーに結合することができる。より特定の実施形態において、Angiopep-2は、ポリペプチドのN末端又はC末端においてアジド基で(場合によりN末端又はC末端においてアミノ酸側鎖上で)誘導体化されて、そのアジド基が、クリックケミストリー反応において、酵素に結合したアルキン誘導体化リンカーと反応し、Angiopep-2をリンカー及び酵素に結合することができる。
【００５７】
別の態様において、リンカーは、マレイミド基又はS-アセチルチオアセテート(SATA)基である。
【００５８】
一実施形態において、化合物は、BCN含有リンカーを介して酵素(例えば、IDS、活性IDS断片、又はIDS類似体)に連結されたAngiopep-2を含む。この化合物は、一般構造
【００５９】
【化５】
2015536658.tif 000011
【００６０】
[式中、R1は、
【００６１】
【化６】
2015536658.tif 000012
【００６２】
であり、nは1〜6であり、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導される]
を有してもよい。nが1である場合、化合物は、構造：
【００６３】
【化７】
2015536658.tif 000013
【００６４】
を有する。
【００６５】
nが2である場合、化合物は、構造：
【００６６】
【化８】
2015536658.tif 000014
【００６７】
を有する。式IV及びVの化合物において、酵素に結合したNH基は、酵素中の一級アミノ基の反応から誘導され、R1は、
【００６８】
【化９】
2015536658.tif 000015
【００６９】
である。
【００７０】
本発明はまた、nの平均値が1〜6(例えば、1、1.2、1.5、2、2.4、2.5、2.8、3、3.5、4、4.5、5、5.5、又は6)である式IIIの化合物の集団を特徴とする。より特には、本発明は、nの平均値が1〜4である式IIIの化合物の集団を特徴とする。さらにより特には、本発明は、nの平均値が約1、約2.4又は約3である式IIIの化合物の集団を特徴とする。
【００７１】
特定の実施形態においては、式IIIの化合物において酵素に結合した1つ以上のNH基は、1つ以上のリジン残基の一級アミノ基から誘導される。化合物IIIのさらなる実施形態において、酵素に結合した1つ以上のNH基は、リジン199及び/又はリジン376の1つ以上の一級アミノ基から誘導される(完全長ヒトIDSアイソフォームaの番号付けを用いる)。
【００７２】
BCN含有リンカーを有する化合物はまた、構造：
【００７３】
【化１０】
2015536658.tif 000016
【００７４】
[式中、R1は、
【００７５】
【化１１】
2015536658.tif 000017
【００７６】
であり、酵素はIDS、IDSの活性断片又はIDSの活性類似体を表し、nは1〜6の整数であり、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導される]
を有してもよい。
【００７７】
本発明は、nの平均値が1〜6(例えば、1、1.5、2、2.3、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5又は6)である式VIの化合物の集団を特徴とする。より特には、本発明は、nの平均値が約2.3である式VIの化合物の集団を特徴とする。
【００７８】
特定の実施形態においては、式VIの化合物中で酵素に結合した1つ以上のNH基は、リジン残基の1つ以上の一級アミノ基から誘導される。化合物VIのさらなる実施形態において、酵素に結合した1つ以上のNH基は、リジン199及び/又はリジン479の1つ以上の一級アミノ基から誘導される(完全長ヒトIDSアイソフォームaの番号付けを用いる)。
【００７９】
一実施形態において、化合物は、MFCO含有リンカーを介してIDS、活性IDS断片又は活性IDSに連結されたAngiopep-2を含む。化合物は、一般構造：
【００８０】
【化１２】
2015536658.tif 000018
【００８１】
[式中、R2は、
【００８２】
【化１３】
2015536658.tif 000019
【００８３】
であり、酵素はIDS、IDSの活性断片又はIDSの活性類似体を表し、nは1〜6の整数であり、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導される]
を有してもよい。
【００８４】
本発明はまた、nの平均値が1〜6(例えば、1、1.5、2、2.3、2.5、2.6、3、3.5、4、4.2、4.4、4.5、5、5.3、5.5又は6)である式VIIの化合物の集団を特徴とする。より特には、本発明は、nの平均値が約2.3、約4.4、又は約5.0である式VIIの化合物の集団を特徴とする。
【００８５】
MFCO含有リンカーを有する化合物はまた、構造
【００８６】
【化１４】
2015536658.tif 000020
【００８７】
[式中、R2は、
【００８８】
【化１５】
2015536658.tif 000021
【００８９】
であり、酵素はIDS、IDSの活性断片又はIDSの活性類似体を表し、nは1〜6の整数であり、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導される]
を有してもよい。
【００９０】
本発明は、nの平均値が1〜6(例えば、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、4.8、4.9、5、5.5又は6)である式VIIIの化合物の集団を特徴とする。より特には、本発明は、nの平均値が約4.9である式VIIIの化合物の集団を特徴とする。
【００９１】
特定の実施形態において、式VIIIの化合物中の酵素に結合した1つ以上のNH基は、リジン残基の一級アミノ基から誘導される。化合物VIIIのさらなる実施形態において、酵素に結合した1つ以上のNH基は、リジン199、リジン211及びリジン376の1つ以上の一級アミノ基から誘導される(完全長ヒトIDSアイソフォームaの番号付けを用いる)。
【００９２】
本発明の別の実施形態において、化合物は、DBCO含有リンカーを介してIDS、活性IDS断片又は活性IDS類似体に連結されたAngiopep-2を含み、構造
【００９３】
【化１６】
2015536658.tif 000022
【００９４】
[式中、R3は、
【００９５】
【化１７】
2015536658.tif 000023
【００９６】
であり、酵素はIDS、IDSの活性断片又はIDSの活性類似体を表し、nは1〜6の整数であり、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導される]
を有する。
【００９７】
本発明は、nの平均値が1〜6(例えば、1、1.3、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6)である式IXの化合物の集団を特徴とする。より特には、本発明は、nの平均値が約1.3である式IXの化合物の集団を特徴とする。
【００９８】
本発明はまた、Angiopep-2-Cysがマレイミド含有基を介してIDS、活性断片又は活性IDS類似体に連結され、構造
【００９９】
【化１８】
2015536658.tif 000024
【０１００】
[式中、酵素はIDS、IDSの活性断片又は活性類似体を表し、nはリンカーを介してIDSに結合したAngiopep-2部分の数であり、1〜6の整数であり、An2Cysに結合したS部分はAngiopep-2-Cys中のシステイン上の側鎖スルフィドを表し、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導される]
を有する。
【０１０１】
本発明は、nの平均値が0.5〜6(例えば、0.5、0.8、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5又は6)である式Xの化合物の集団を特徴とする。より特には、本発明は、nの平均値が約0.8である式Xの化合物の集団を特徴とする。
【０１０２】
代替的な実施形態において、Cys-Angiopep-2は、マレイミド含有基を介してIDS、IDSの活性断片又は活性類似体に連結され、構造
【０１０３】
【化１９】
2015536658.tif 000025
【０１０４】
[式中、酵素はIDS、IDSの活性断片又はIDSの活性類似体を表し、nはリンカーを介してIDSに結合したAngiopep-2部分の数であり、1〜6であり、Cys-An2はCys-Angiopep-2であり、Cys-An2に結合したS部分はCyc-Angiopep-2中のシステイン上の側鎖スルフィドを表し、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導される]
を有する。
【０１０５】
本発明は、nの平均値が0.5〜6(例えば、0.5、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、又は6)である式XIの化合物の集団を特徴とする。より特には、本発明は、nの平均値が約0.9である式XIの化合物の集団を特徴とする。
【０１０６】
一態様において、リンカーは、モノフルオロシクロオクチン(MFCO)、ジフルオロシクロオクチン(DFCO)、シクロオクチン(OCT)、ジベンゾシクロオクチン(DIBO)、ビアリールアザシクロオクチン(BARAC)、ジフルオロベンゾシクロオクチン(DIFBO)、およびビシクロ[6.1.0]ノニン(BCN)からなる群から選択されるアルキン基で官能化されたマレイミド含有基であってもよく、アルキン官能化マレイミドはAngiopep-2に結合したアジド基を介してAngiopep-2に結合する。
【０１０７】
本発明の一実施形態において、化合物は、S-アセチルチオアセテート(SATA)基を介してIDSに連結されたAngiopep-2を含み、構造
【０１０８】
【化２０】
2015536658.tif 000026
【０１０９】
[式中、nはリンカーを介してIDSに結合したAngiopep-2部分の数であり、1〜6であり、An2はAngiopep-2であり、An2に結合したNH基はAngiopep-2のN末端アミノ基であり、IDSに結合したNH基はIDS中の一級アミノ基を表す]
を有する。本発明は、nの平均値が1〜6(例えば、1、1.5、2、2.5、2.6、3、3.5、4、4.5、5、5.5又は6)である式XIIの化合物を含む組成物を特徴とする。
【０１１０】
上記の式III〜XIIの化合物は、リンカーを介して酵素に結合した1、2、3、4、5又は6つのペプチドターゲティング部分を有してもよい。一実施形態において、酵素はヒト完全長IDSアイソフォームa又はヒト成熟IDSアイソフォームaである。
【０１１１】
別の態様において、本発明は、一般構造：
【０１１２】
【化２１】
2015536658.tif 000027
【０１１３】
[式中、R2は、
【０１１４】
【化２２】
2015536658.tif 000028
【０１１５】
であり、酵素はIDS、IDSの活性断片又はIDSの活性類似体を表し、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導され、nの平均値は1〜6である]
を有する化合物の集団を特徴とする。いくつかの実施形態において、nの平均値は4.5〜5.5である。他の実施形態において、nの平均値は約4.9である。
【０１１６】
別の態様において、本発明は、一般構造：
【０１１７】
【化２３】
2015536658.tif 000029
【０１１８】
[式中、R1は、
【０１１９】
【化２４】
2015536658.tif 000030
【０１２０】
であり、酵素はIDS、IDSの活性断片又はIDSの活性類似体を表し、酵素に結合したNH基は酵素中の一級アミノ基の反応から誘導され、nの平均値は1〜6である]
を有する化合物の集団を特徴とする。いくつかの実施形態において、nの平均値は2〜3である。他の実施形態において、nの平均値は約2.3である。
【０１２１】
さらなる態様において、本発明は、一般式：
【０１２２】
【化２５】
2015536658.tif 000031
【０１２３】
[式中、Aはイズロン酸−2−スルファターゼ(IDS)、IDS活性を有するIDS断片、又はIDS活性を有するIDS類似体からなる群から選択される酵素であり；Aに結合したNH基はA中の一級アミノ基の反応から誘導され；nは1〜8の整数であり；Bはヒドロキシル、置換されていてもよいC1〜10アルキル、置換されていてもよいC1〜10アルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいアリール、ヘテロ環、置換されていてもよいC1〜10アルコキシ、置換されていてもよいC1〜10アルキルアミノ、置換されていてもよいC3〜10シクロアルキル、置換されていてもよいC4〜10シクロアルケニル、置換されていてもよいC4〜10シクロアルキニル、アミノ酸、又は2〜5アミノ酸のペプチドである]
を有する本発明の化合物の製造における中間体である化合物を特徴とする。
【０１２４】
特定の実施形態において、Bは、アミノ酸、2〜5アミノ酸のペプチドであるか、又は
【０１２５】
【化２６】
2015536658.tif 000032
【０１２６】
から選択される。いくつかの実施形態において、Bは、
【０１２７】
【化２７】
2015536658.tif 000033
【０１２８】
である。
【０１２９】
本発明のこれらの中間体の特定の実施形態において、Aは、リジンの１つ以上の側鎖一級アミン基の誘導体化を介して改変される。
【０１３０】
Bが
【０１３１】
【化２８】
2015536658.tif 000034
【０１３２】
である場合、Aに結合した1つ以上のNH基は、1つ以上のリジン残基の一級アミノ基から誘導されてもよい。より特には、Aに結合した1つ以上のNH基は、リジン199、リジン240、リジン295、リジン347、リジン479及びリジン483(完全長ヒトIDSアイソフォームaの番号付けを用いる)の1つ以上の一級アミノ基から誘導される。一実施形態において、Aに結合した1つ以上のNH基は、リジン199、リジン479及びリジン483(IDSアイソフォームaの番号付けを用いる)の1つ以上の一級アミノ基から誘導される。
【０１３３】
Bが
【０１３４】
【化２９】
2015536658.tif 000035
【０１３５】
である場合、Aに結合した1つ以上のNH基は、リジン残基の一級アミノ基から誘導されてもよい。より特には、Aに結合したNH基は、リジン479(完全長ヒトIDSアイソフォームaの番号付けを用いる)から誘導される。
【０１３６】
本発明の特定の中間体は、対応する非修飾IDS、IDS断片又はIDS類似体よりも高レベルのIDS活性を示す。
【０１３７】
本発明は、上述した化合物のいずれかにコンジュゲートされたナノ粒子を含む組成物を特徴とする。本発明はまた、上述した化合物のいずれかのリポソーム製剤を特徴とする。
【０１３８】
本発明は、上に記載した化合物のいずれか1種と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を特徴とする。本発明はまた、リソソーム蓄積症を有する被験体を治療する又は予防的に処置する方法であって、被験体に、上に記載した化合物又は組成物のいずれかを投与することを含む方法を特徴とする。この方法の一態様において、リソソーム蓄積症はムコ多糖症II型（MPS-II）であり、リソソーム酵素はIDS、活性フラグメントまたはその活性なアナログ（類似体）である。この方法の別の態様において、被験体は、MPS-IIの重篤形態又はMPS-IIの減衰形態を有する。この方法のまた別の態様において、被験体は神経症状を有する。被験体は、5歳未満の年齢、好ましくは3歳未満の年齢で治療（処置）を開始することができる。被験体は乳幼児であってもよい。本発明の方法はまた、本発明の化合物及び組成物の非経口投与を含む。
【０１３９】
「被験体」は、ヒト又は非ヒト動物（例えば哺乳動物）を意味する。
【０１４０】
「リソソーム酵素」は、リソソームに存在するあらゆる酵素を意味し、この酵素の欠損はリソソーム蓄積症の原因となりうる。
【０１４１】
「リソソーム蓄積症（障害）」は、リソソーム酵素の欠損により引き起こされる任意の疾患を意味する。およそ50のかかる障害が同定されている。
【０１４２】
「ターゲティング部分（標的化部分）」とは、特定の細胞型（例えば、肝臓、肺、腎臓、脾臓、若しくは筋肉）に、特定の細胞区画（例えばリソソーム）に、又はBBBを通過して、輸送されることができるペプチド又はペプチド模倣物質などの化合物又は分子を意味する。特定の実施形態において、ターゲティング部分は、脳の内皮細胞上に存在する受容体に結合し、それによって、トランスサイトーシスによりBBBを通過して輸送することができる。ターゲティング部分は、細胞又はBBBの完全性に影響することなく、高レベルの経内皮輸送が得られる分子であってよい。ターゲティング部分は、ペプチド又はペプチド模倣物質であってよく、天然のものであっても、又は化学合成若しくは組換え遺伝子技術により製造されたものであってもよい。
【０１４３】
被験体における疾患、障害又は症状を「治療すること」とは、治療薬を被験体に投与することにより、疾患、障害又は症状の少なくとも1種の症候を減少させることを意味する。
【０１４４】
被験体における疾患、障害又は症状を「予防的に処置すること」とは、疾患症候の発症の前に、治療薬を被験体に投与することにより、疾患、障害又は症状の発生頻度を低下させる又は重症度を低減することを意味する。
【０１４５】
「BBBを通過して効率的に輸送される」ペプチドとは、少なくともAngiopep-6と同程度に効率的にBBBを通過する（すなわち、参照により本明細書に組み入れられるものとする、2007年5月29日に提出された米国特許出願第11/807,597号に記載のin situ脳灌流アッセイにおいて、Angiopep-1（250 nM）よりも38.5％以上高い）ことができるペプチドを意味する。従って、「BBBを通過して効率的に輸送されない」ペプチドは、より低いレベルで脳に輸送される（例えば、Angiopep-6よりも低い効率で輸送される）。
【０１４６】
「特定の細胞型に効率的に輸送される」ペプチド又は化合物とは、ペプチド又は化合物が、対照物質より、又はコンジュゲートの場合、コンジュゲートされていない薬剤と比較して、少なくとも10％（例えば、25％、50％、100％、200％、500％、1,000％、5,000％、若しくは10,000％）を超える程度で、その細胞型に蓄積することができる（細胞への輸送の増加、細胞からの排出の減少、又はその組合せのいずれかによる）ことを意味する。そのような活性は、参照により本明細書に組み入れられるものとする国際特許出願公開第WO 2007/009229号に詳細に記載されている。
【０１４７】
「実質的な同一性」又は「実質的に同一の」は、2つの配列（参照配列と対象の配列）を最適に整列した場合、参照配列と同じペプチド、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列をそれぞれ有するか、あるいは、参照配列内の対応する位置において同じであるアミノ酸残基又はヌクレオチドが規定したパーセントであるペプチド、ポリペプチド又はポリヌクレオチド配列を意味する。例えば、参照配列と実質的に同一であるアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列に対して少なくとも50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、又は100％同一性を有する。ペプチドまたはポリペプチドについては、比較配列の長さは、一般に少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、50、75、90、100、150、200、250、300、又は350個の連続するアミノ酸（例えば、全長配列）であろう。核酸については、比較配列の長さは一般に少なくとも5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、又は25個の連続するヌクレオチド（例えば、全長ヌクレオチド配列）であろう。配列同一性は配列分析ソフトウエア（例えば、Genetics Computer Group、University of Wisconsin Biotechnology Center、1710 University Avenue、Madison、WI 53705の配列分析ソフトウエアパッケージ）を用いてデフォルト設定で測定することができる。かかるソフトウエアは様々な置換、欠失、及び他の改変に対して相同性の程度を割り当てることにより類似配列をマッチさせることができる。
【０１４８】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１４９】
【図１】作製したIDS構築物を示す概略図である。
【図２】示した構築物でトランスフェクトしたCHO-S細胞からの細胞培養培地の、抗IDS抗体を用いたウエスタンブロットを示すイメージである。
【図３】以下に記載する実施例においてIDS活性を検出するために用いた蛍光アッセイを示す概略図である。
【図４】示した構築物でトランスフェクトしたCHO-S細胞からの細胞培養培地におけるIDS活性を示すグラフである。
【図５】Aは、示した構築物でのCHO-S細胞のトランスフェクション後7日間にわたるIDS活性を示すグラフである。Bは、CHO-S細胞における7日間にわたるIDS-His又はIDS-An2-Hisのいずれかの発現を示す一連のウエスタンブロットイメージである。
【図６】Aは、示した構築物を発現するCHO-S細胞からの培地での処理の際の、MPS-II線維芽細胞における35S-GAG蓄積の低減を示すグラフである。Bは、精製IDS-An2-Hisによる処理の際の、MPS-II線維芽細胞におけるGAG蓄積の低減を示すグラフである。
【図７】A〜Cは、IDSのアイソフォームの配列（アイソフォームa、図7A；アイソフォームb；図7B；アイソフォームc、図7C）である。
【図８】IDS（JR-032）及びIDS-Angiopep-2コンジュゲートのクーマシーブルー染色及びウエスタンブロット検出を示す一連のイメージである。
【図９Ａ】A〜Cは、70-56-1B、70-56-2B及び68-32-2コンジュゲートのMALDI-TOF分析を示す一連のグラフである。
【図９Ｂ】〜Cは、70-56-1B、70-56-2B及び68-32-2コンジュゲートのMALDI-TOF分析を示す一連のグラフである。
【図９Ｃ】A〜Cは、70-56-1B、70-56-2B及び68-32-2コンジュゲートのMALDI-TOF分析を示す一連のグラフである。
【図１０Ａ】68-32-2、70-56-1B、70-56-2B、及び70-66-1BのSEC分析を示す図である。
【図１０Ｂ】68-32-2、70-56-1B、70-56-2B、及び70-66-1BのSP分析を示す図である。
【図１１】共焦点顕微鏡を用いてAlexa 488標識コンジュゲートの細胞内移動を測定するためのプロトコールを示す概略図である。
【図１２】lysotracker色素と比較した、U87細胞におけるAlexa標識IDS（上パネル）及びAlexa標識Angiopep-2-IDS（70-56-2B、下パネル）の局在を示す一連の共焦点顕微鏡写真である。16時間取込み後の共局在化を4つ目のパネル（融合）に示す。酵素を50nMの濃度で37℃にて16時間インキュベートした。倍率は100Xである。
【図１３】lysotracker色素と比較した、U87細胞におけるAlexa標識IDS（上パネル）及びAlexa標識Angiopep-2-IDS（70-56-2B、下パネル）の局在を示す一連の共焦点顕微鏡写真である。共局在化の欠如を4つ目のパネル（融合）に示す。酵素を100nMの濃度で37℃にて1時間インキュベートした。倍率は100Xである。
【図１４】lysotracker色素と比較した、U87細胞におけるAlexa標識IDS（上パネル）及びAlexa標識Angiopep-2-IDS（70-56-2B、下パネル）の局在を示す一連の共焦点顕微鏡写真である。共局在化を4つ目のパネル（融合）に黄色で示す。酵素を100nMの濃度で37℃にて16時間インキュベートした。倍率は100Xである。
【図１５】lysotracker色素と比較した、U87細胞におけるAlexa標識IDS及びAlexa標識Angiopep-2-IDS（70-56-1B）の局在を示す共焦点顕微鏡写真である。酵素を50nMの濃度で37℃にて一晩インキュベートした。倍率は100Xである。右パネルは左パネルの拡大版である。
【図１６】U-87細胞におけるAlexa標識IDS、並びにAlexa488標識An2-IDSコンジュゲート：68-32-2、70-66-1B、70-56-2B及び68-27-3の取込み及び局在を示す一連の共焦点顕微鏡写真である。
【図１７】A及びBは、1時間及び16時間におけるU87細胞によるAlexa488-IDS及びAlexa488-An2-IDS(70-56-2B)の取込みを示すグラフである。
【図１８】Angiopep-2-IDSコンジュゲートがU87細胞への取込み増大を示すこと、そしてAngiopep-2-IDSコンジュゲートの取込み比の増大が、細胞への取込み増大と相関していることを示すグラフである。
【図１９】Angiopep-2-IDSコンジュゲートがU87細胞への取込み増大を示すこと、そしてAngiopep-2-IDSコンジュゲートの取込み比の増大が、細胞への取込み増大と相関していることを示すグラフである。
【図２０Ａ】JR-032と比較したIDS-Angiopep-2コンジュゲートの酵素活性を示すグラフである。酵素活性はJCR-032対照に対する%として表す。コンジュゲートに関して、測定の回数は4〜8であり、JR-032についての各バーは15回の測定の平均である。
【図２０Ｂ】JR-032と比較したコンジュゲート70-56-2B、70-66-1B及び68-32-2の大規模合成の酵素活性を示すグラフである。
【図２１】コンジュゲート化されていないJR-032又は個々のコンジュゲート（4ng/ml）で処理されたMPSII患者の線維芽細胞において測定されたGAG濃度を示すグラフである。GAGレベルは健常患者の線維芽細胞において測定されたGAGの割合(%)として表す。
【図２２】Angiopep-2-IDSコンジュゲートがコンジュゲート化されていないJR-032と同様の効力でMPSII線維芽細胞におけるGAG濃度を低減させることを示すグラフである。GAG濃度は、種々の濃度の3つのコンジュゲートのJR-032で処理されたMPSII患者の線維芽細胞において測定した。GAGレベルは健常患者の線維芽細胞において測定されたGAGの割合(%)として表す。
【図２３】単一時点（2分）におけるコンジュゲート化されていないJR-032及び15のコンジュゲートのそれぞれの脳分布を示すグラフである。C末端が特定されていない限り、すべてのリンカーはN末端結合によってAn2に連結されている。
【図２４Ａ】A及びBは、脳の種々の部位におけるJR-032の分布を示す一連のグラフである。
【図２４Ｂ】A及びBは、脳の種々の部位におけるJR-032の分布を示す一連のグラフである。
【図２４Ｃ】C及びDは、An2-IDSコンジュゲートのKin及び脳分布をコンジュゲート化されていないJR-032のものと比較したグラフである。
【図２４Ｄ】C及びDは、An2-IDSコンジュゲートのKin及び脳分布をコンジュゲート化されていないJR-032のものと比較したグラフである。
【図２５】JR-032及びイヌリンの脳取込み及び分布を比較したグラフである。
【図２６】全脳、毛細血管及び脳実質における70-56-2B、70-66-1B及び68-32-2の大規模合成の脳分布を比較するグラフである。
【図２７−１】A〜Cは、放射標識されたJR-032及びAn2 IDSコンジュゲートに関する血漿濃度時間曲線を示す図である。
【図２７−２】A〜Cは、放射標識されたJR-032及びAn2 IDSコンジュゲートに関する血漿濃度時間曲線を示す図である。
【図２８Ａ】A〜Cは、1時間、8時間及び48時間での組織中の放射標識されたJR-032及びAn2-IDSコンジュゲートの濃度を示す図である。
【図２８Ｂ】A〜Cは、1時間、8時間及び48時間での組織中の放射標識されたJR-032及びAn2-IDSコンジュゲートの濃度を示す図である。
【図２８Ｃ】A〜Cは、1時間、8時間及び48時間での組織中の放射標識されたJR-032及びAn2-IDSコンジュゲートの濃度を示す図である。
【図２９】脳における放射標識されたJR-032及びAn2-IDSコンジュゲートの濃度を示す図である。
【図３０】投与後1時間及び投与後8時間での脳、心臓、肝臓、肺、腎臓(皮質)、筋肉(脚外転筋)、皮膚、骨(骨髄を含む大腿骨)及び脾臓におけるJR-032と比較したコンジュゲートの濃度を示す図である。
【図３１】血漿、脳、肝臓及び甲状腺における0.5時間、1時間、4時間及び24時間でのJR-032、70-66-1B及び68-32-2の濃度を示す図である。
【図３２Ａ】A及びBは、PK分布実験からの肝臓試料におけるJR-032、ANG3402、及びANG3403のプロセッシングを示す図である。
【図３２Ｂ】A及びBは、PK分布実験からの肝臓試料におけるJR-032、ANG3402、及びANG3403のプロセッシングを示す図である。
【図３３】MPSII線維芽細胞におけるJR-032、ANG3402及びANG3403のプロセッシングを示す図である。
【図３４】血漿におけるJR-032、ANG3402及びANG3403のプロセッシングを示す図である。
【図３５Ａ】A〜Cは、ビヒクル、JR-032又はAn2-IDSコンジュゲートを投与した半接合体ノックアウトマウスの肝臓、心臓及び脳におけるGAG濃度を示すグラフである。
【図３５Ｂ】A〜Cは、ビヒクル、JR-032又はAn2-IDSコンジュゲートを投与した半接合体ノックアウトマウスの肝臓、心臓及び脳におけるGAG濃度を示すグラフである。
【図３５Ｃ】A〜Cは、ビヒクル、JR-032又はAn2-IDSコンジュゲートを投与した半接合体ノックアウトマウスの肝臓、心臓及び脳におけるGAG濃度を示すグラフである。
【図３６】それぞれのコンジュゲートに関するそれぞれの用量におけるGAG低減を示すグラフである(JR-032により達成された低減のパーセンテージとして表す)。
【０１５０】
詳細な説明
本発明は、リンカー（例えばペプチド結合）で連結されたリソソーム酵素（例えば、IDS）及びターゲティング部分（例えば、Angiopep-2）を含む化合物に関する。ターゲティング部分は、リソソームへ及び／又はBBBを通過して酵素を輸送することができる。そのような化合物の例として、Angiopep-2-IDSコンジュゲート及び融合タンパク質がある。これらのタンパク質は、酵素アッセイ及びMPS-IIの細胞モデルの両方においてIDS酵素活性を維持する。ターゲティング部分（Angiopep-2など）は、BBBを通過してタンパク質を輸送することができるため、これらのコンジュゲートは、末梢活性を有するだけではなく、中枢神経系（CNS）においても活性を有すると予想される。さらに、ターゲティング部分（Angiopep-2など）は、リソソームへの受容体媒介輸送機構（例えばLRP-1）によって細胞に取り込まれる。従って、本発明者は、これらのターゲティング部分はリソソーム内の酵素濃度を高め、それによって、特にLRP-1受容体を発現する組織及び器官（例えば肝臓、腎臓及び脾臓）において、より有効な治療をもたらすことができると考える。
【０１５１】
これらの特徴は、IDSの静脈内投与はそれ自体がCNS疾患の症候を治療するものではないため、現在の治療方法の最大の欠点の一部を克服することができる。BBBをバイパスする物理的方法、例えば高度に侵襲的でありそのため一般的にはCNS送達の問題の魅力的な解決手段とはならない髄腔内又は頭蓋内投与とは対照的に、本発明は非侵襲的な脳送達を可能にする。さらに、リソソームへの治療薬の輸送の改善によって、標準的な酵素補充療法と比較して、用量の低減又は投与頻度の低減が可能となる。
【０１５２】
リソソーム蓄積症（障害）
リソソーム蓄積症は、脂質、糖タンパク質又はムコ多糖の代謝が酵素機能不全に基づいて妨害される障害の群である。この機能不全は、正確に代謝されることができない物質の細胞内集積に至る。症候は疾患ごとに異なるが、臓器系（肝臓、心臓、肺、及び脾臓）、骨における問題、並びに神経学的問題はこれらの疾患の多くに存在する。典型的には、これらの疾患は、関連する酵素の稀な遺伝的欠陥により引き起こされる。これらの疾患の大部分は、常染色体劣性形式で遺伝するが、一部、例えばMPS-IIは、X染色体連鎖劣性疾患である。
【０１５３】
リソソーム酵素
本発明は、リソソーム蓄積症の治療に有用である当技術分野で公知の任意のリソソーム酵素を用いることができる。本発明の化合物の例は、イズロン酸-2-スルファターゼ（IDS；イデュルスルファーゼとしても知られる）である。この化合物としては、IDS、酵素活性を保持しているIDSの断片、又はヒトIDS配列に対して実質的に同一（例えば、少なくとも70、80、85、90、95、96、97、98又は99％の同一性）であるアミノ酸配列を含みかつ酵素活性を保持しているIDS類似体が挙げられる。
【０１５４】
IDSの3つのアイソフォーム、すなわちアイソフォームa、b及びcが知られている。アイソフォームaは、550アミノ酸のタンパク質であり、図7のAに示す。アイソフォームb（図7のB）は、343アミノ酸のタンパク質であり、より長いアイソフォームaと比較して異なるC末端領域を有している。アイソフォームc（図7のC）は、下流開始コドンの使用のためにN末端に変化を有する。これらのアイソフォームのいずれをも本発明の化合物において用いることができる。
【０１５５】
組換えイズロン酸-2-スルファターゼ酵素（例えばJR-032）は当技術分野において知られている。JR-032は、米国特許第5,932,211号に記載のように製造される、組換えヒトIDS全長アイソフォーム a (INN: idursulfase)である。
【０１５６】
特定の断片又は類似体が酵素活性を有するかどうか試験するために、当業者は、適当な任意のアッセイを用いることができる。IDS活性を測定するためのアッセイは、例えば、Hopwood, Carbohydr. Res. 69:203-16, 1979；Bielicki et al., Biochem. J. 271:75-86, 1990；及びDean et al., Clin. Chem. 52:643-9, 2006に記載されたものを含み当技術分野で公知である。同様の蛍光分析アッセイもまた以下に記載する。これらのアッセイのいずれかを使用して、当業者は特定のIDS断片又は類似体が酵素活性を有するかどうか決定することができる。これらのアッセイはまた、本発明の化合物が酵素活性を有するか同定することができる。
【０１５７】
特定の実施形態において、酵素断片（例えば、IDS断片）を使用する。IDS断片は、少なくとも50、100、150、200、250、300、350、400、450又は500アミノ酸長とすることができる。特定の実施形態において、酵素は、例えば本明細書に記載するポリペプチド修飾のいずれかを用いて、修飾されていてもよい。
【０１５８】
ターゲティング部分
本発明の化合物は、本明細書に記載の任意のターゲティング部分、例えば、表1に記載の任意のペプチド（例えば、Angiopep-1、Angiopep-2若しくは逆Angiopep-2）、又はその断片若しくはペプチド模倣体を特徴とする。特定の実施形態において、ペプチドは、本明細書に記載のペプチドに対して少なくとも35％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％又はさらには100％の同一性を有してもよい。ポリペプチドは、本明細書に記載の配列の1つと比較して1個以上（例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、又は15個）の置換を有してもよい。他の改変を、以下でより詳細に説明する。
【０１５９】
本発明はまた、これらのペプチドまたはペプチド模倣体の断片（例えば、機能的断片）をも特徴とする。特定の実施形態において、この断片を、特定の細胞型（例えば、肝臓、眼、肺、腎臓、若しくは脾臓）に効率的に輸送するか、若しくはその中に蓄積させるか、又はBBBを通過して効率的に輸送することができる。前記ペプチドまたはペプチド模倣体のトランケーションは、ペプチドのN末端、ペプチドのC末端、又はその組合せから1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個又はそれ以上のアミノ酸であってよい。他の断片としては、前記ペプチドまたはペプチド模倣体の内部部分が欠失した配列が挙げられる。
【０１６０】
さらなるペプチドまたはペプチド模倣体を、本明細書に記載のアッセイ又は方法の1つを用いることにより同定することができる。例えば、候補ペプチドまたはペプチド模倣体を、従来のペプチド合成により製造し、パクリタキセルとコンジュゲートさせ、実験動物に投与することができる。生物学的に活性なポリペプチドコンジュゲートは、例えば、腫瘍細胞を注入され、コンジュゲートで処置されなかった（例えば、コンジュゲート化されていない薬剤で処置された）対照と比較してコンジュゲートで処置された動物の生存率を増加させる能力に基づいて同定することができる。別の例として、生物学的に活性なペプチドまたはペプチド模倣体を、in situ脳灌流アッセイにおいて、実質中のその位置に基づいて同定することができる。
【０１６１】
他の組織での蓄積を決定するためのアッセイも同様に実施することができる。ペプチドまたはペプチド模倣体の標識されたコンジュゲートを動物に投与し、様々な器官における蓄積を測定することができる。例えば、検出可能な標識（例えば、Cy5.5などの近赤外線蛍光分光標識）にコンジュゲートさせたペプチドまたはペプチド模倣体は、生存しているin vivoでの可視化を可能にする。そのようなペプチドまたはペプチド模倣体を動物に投与し、器官中のペプチドまたはペプチド模倣体の存在を検出し、かくして、所望の器官におけるペプチドまたはペプチド模倣体の蓄積の速度及び量を決定することができる。他の実施形態において、ペプチドまたはペプチド模倣体を放射性アイソトープ（例えば、125I）で標識することができる。次いで、ペプチドまたはペプチド模倣体を動物に投与する。一定時間後、動物を犠牲にし、器官を取り出す。次いで、各器官における放射性アイソトープの量を、当技術分野で公知の任意の手段を用いて測定することができる。特定の器官における標識された候補ペプチドまたはペプチド模倣体の量と、標識された対照ペプチドまたはペプチド模倣体の量とを比較することにより、候補ペプチドまたはペプチド模倣体が特定の組織に接近し、そこに蓄積する能力を確認することができる。好適な陰性対照としては、特定の細胞型に効率的に輸送されないことが知られた任意のペプチド又はポリペプチド（例えば、BBBを通過しないAngiopepと関連するペプチド、又は任意の他のペプチド）が挙げられる。
【０１６２】
さらなる配列は、米国特許第5,807,980号（例えば、本明細書に記載の配列番号102）、第5,780,265号（例えば、配列番号103）、第5,118,668号（例えば、配列番号105）に記載されている。アプロチニン類似体をコードするヌクレオチド配列の例は、atgagaccag atttctgcct cgagccgccg tacactgggc cctgcaaagc tcgtatcatc cgttacttct acaatgcaaa ggcaggcctg tgtcagacct tcgtatacgg cggctgcaga gctaagcgta acaacttcaa atccgcggaa gactgcatgc gtacttgcgg tggtgcttag（配列番号106；Genbankアクセッション番号X04666）である。アプロチニン類似体の他の例を、国際特許出願第PCT/CA2004/000011号に開示された合成アプロチニン配列（又はその一部）を用いてタンパク質BLAST（Genbank: www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）を実施することにより見出すことができる。アプロチニン類似体の例は、アクセッション番号CAA37967（GI:58005）及び1405218C（GI:3604747）の下でも見出される。
【０１６３】
改変ポリペプチド
本発明において用いられる融合タンパク質、ターゲティング部分、及びリソソーム酵素、若しくは断片は、改変アミノ酸配列を有してもよく、類似体（アナログ）またはペプチド模倣体（模倣物質）であり得る。特定の実施形態において、前記改変は所望の生物活性（例えば、BBBを通過する能力又は酵素活性）を有意に破壊しない。この改変は、元のポリペプチドの生物活性を減少させる（例えば、少なくとも5％、10％、20％、25％、35％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、若しくは95％）、それに対する影響を有しないか、又はそれを増加させる（例えば、少なくとも5％、10％、25％、50％、100％、200％、500％、若しくは1000％）ことができる。改変は、in vivoでの安定性、生体利用能、毒性、免疫学的活性、免疫学的同一性、及びコンジュゲーション特性などの化合物、融合タンパク質、ターゲティング部分、リソソーム酵素又は断片の特性を有するか、又はそれを最適化することができる。
【０１６４】
改変としては、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによるもの、又は当技術分野で公知の化学的改変技術によるものが挙げられる。改変は、（ポリ）ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖及びアミノ又はカルボキシ末端を含む（ポリ）ペプチド中のどこでも行うことができる。同じ型の改変が、所与の（ポリ）ペプチド中のいくつかの部位に同じ又は異なる程度で存在してもよく、（ポリ）ペプチドは2種以上の改変を含んでもよい。（ポリ）ペプチドは、ユビキチン化の結果として分枝状であってもよく、それらは分枝鎖を含むか又は含まない環状であってもよい。環状、分枝状、及び分枝環状（ポリ）ペプチドは、翻訳後の天然プロセスの結果生じてもよいし、又は合成的にそれを作製することもできる。他の改変としては、PEG化、アセチル化、アシル化、アセトシドメチル（Acm）基の付加、ADP-リボシル化、アルキル化、アミド化、ビオチン化、カルバモイル化、カルボキシエチル化、エステル化、フラビンへの共有結合、ヘム部分への共有結合、ヌクレオチド若しくはヌクレオチド誘導体の共有結合、薬剤の共有結合、マーカー（例えば、蛍光若しくは放射性）の共有結合、脂質若しくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタミン酸の形成、ホルミル化、γ-カルボキシル化、糖鎖付加、GPIアンカー形成、ヒドロキシル化、ヨード化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質溶解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、アルギニル化及びユビキチン化などのタンパク質へのアミノ酸の転移RNA媒介性付加が挙げられる。
【０１６５】
改変（ポリ）ペプチドはまた、ポリペプチド配列中の保存的又は非保存的な、アミノ酸挿入、欠失、又は置換（例えば、Dアミノ酸、デスアミノ酸）を含んでもよい（例えば、そのような変化が（ポリ）ペプチドの生物活性を実質的に変化させない場合）。特に、本発明の（ポリ）ペプチドのいずれかのアミノ又はカルボキシ末端への1個以上のシステイン残基の付加は、例えば、ジスルフィド結合による、これらの（ポリ）ペプチドのコンジュゲーションを容易にすることができる。例えば、Angiopep-1（配列番号67）、Angiopep-2（配列番号97）又はAngiopep-7（配列番号112）を、アミノ末端に1個のシステイン残基（それぞれ、配列番号71、113及び115）又はカルボキシ末端に1個のシステイン残基（それぞれ、配列番号72、114及び116）を含むように改変することができる。アミノ酸置換は、保存的（すなわち、ある残基を同じ一般型若しくは基の別の残基により置換する場合）又は非保存的（すなわち、ある残基を別の型のアミノ酸により置換する場合）であってよい。さらに、非天然アミノ酸を、天然アミノ酸に置換することができる（すなわち、非天然保存的アミノ酸置換又は非天然非保存的アミノ酸置換）。
【０１６６】
合成的に作製された（ポリ）ペプチドは、DNAによって天然にコードされないアミノ酸の置換（例えば、天然にはない又は非天然アミノ酸）を含んでもよい。非天然アミノ酸の例としては、D-アミノ酸、システインの硫黄原子に結合したアセチルアミノメチル基を有するアミノ酸、PEG化アミノ酸、式NH2(CH2)nCOOH（式中、nは2〜6である）のωアミノ酸、サルコシン、t-ブチルアラニン、t-ブチルグリシン、N-メチルイソロイシン、及びノルロイシンなどの中性非極性アミノ酸が挙げられる。フェニルグリシンはTrp、Tyr、又はPheに置換することができる；シトルリン及びメチオニンスルホキシドは中性非極性であり、システイン酸は酸性であり、オルニチンは塩基性である。プロリンをヒドロキシプロリンで置換することができ、それはコンフォメーション付与特性を保持する。
【０１６７】
置換的突然変異誘発により類似体又はペプチド模倣体を作製することができ、それは元の（ポリ）ペプチドの生物活性を保持する。「保存的置換」として同定された置換の例を表2に示す。そのような置換が望ましくない変化をもたらす場合、表2に「例示的置換」として特色付けられるか、又はアミノ酸クラスを参照して本明細書にさらに記載される他の型の置換を導入し、生成物をスクリーニングする。
【０１６８】
機能又は免疫学的同一性における実質的な改変を、（a）例えば、シート若しくはらせんコンフォメーションとしての、置換領域中の（ポリ）ペプチド主鎖の構造、（b）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性、又は（c）側鎖のかさ高さ、の維持に対するその影響が大きく異なる置換を選択することにより達成する。天然残基は、一般的な側鎖特性に基づいて以下の群に分割される：
（1）疎水性：ノルロイシン、メチオニン（Met）、アラニン（Ala）、バリン（Val）、ロイシン（Leu）、イソロイシン（Ile）、ヒスチジン（His）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、フェニルアラニン（Phe）、
（2）中性疎水性：システイン（Cys）、セリン（Ser）、トレオニン（Thr）、
（3）酸性／負荷電：アスパラギン酸（Asp）、グルタミン酸（Glu）、
（4）塩基性：アスパラギン（Asn）、グルタミン（Gln）、ヒスチジン（His）、リジン（Lys）、アルギニン（Arg）、
（5）鎖の向きに影響する残基：グリシン（Gly）、プロリン（Pro）、
（6）芳香族：トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、フェニルアラニン（Phe）、ヒスチジン（His）、
（7）極性：Ser、Thr、Asn、Gln、
（8）塩基性／正荷電：Arg、Lys、His、及び
（9）荷電：Asp、Glu、Arg、Lys、His。
【０１６９】
他のアミノ酸置換を表2に列挙する。
【０１７０】
【表２】
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【０１７１】
ポリペプチド誘導体及びペプチド模倣物質
天然アミノ酸からなる（ポリ）ペプチドに加えて、ペプチド模倣物質又は（ポリ）ペプチド類似体も本発明により包含され、本発明の化合物において用いられる融合タンパク質、ターゲティング部分、又はリソソーム酵素、酵素断片若しくは酵素類似体を形成することができる。（ポリ）ペプチド類似体は、鋳型ポリペプチドのものと類似する特性を有する非ペプチド薬剤として製薬業界において一般的に用いられている。非ペプチド化合物は「ペプチド模倣物質」又はペプチド模倣剤と呼ばれる（Fauchereら、Infect. Immun. 54:283-287, 1986及びEvansら、J. Med. Chem. 30:1129-1239, 1987）。治療上有用なペプチド又はポリペプチドと構造的に関連するペプチド模倣物質を用いて、等価な、又は増強された治療又は予防効果をもたらすことができる。一般的には、ペプチド模倣物質は、天然受容体結合（ポリ）ペプチドなどの模範的（ポリ）ペプチド（すなわち、生物活性若しくは薬理活性を有する（ポリ）ペプチド）と構造的に類似するが、当技術分野で周知の方法（Spatola, Peptide Backbone Modifications, Vega Data, 1:267, 1983；Spatolaら、Life Sci. 38:1243-1249, 1986；Hudsonら、Int. J. Pept. Res. 14:177-185, 1979；及びWeinstein, 1983, Chemistry and Biochemistry, of Amino Acids, Peptides and Proteins, Weinstein(編)Marcel Dekker, New York）によって、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-（シス及びトランス）、-CH2SO-、-CH(OH)CH2-、-COCH2-などの結合により置換されていてもよい1個以上のペプチド結合を有する。そのようなペプチド模倣物質は、より経済的な生産、より高い化学的安定性、増強された薬理学的特性（例えば、半減期、吸収、効力、効率）、低下した抗原性などの天然（ポリ）ペプチドを超える有意な利点を有しうる。
【０１７２】
本明細書に記載のペプチドターゲティング部分はBBBを効率的に通過するか、又は特定の細胞型（例えば、本明細書に記載のもの）に標的化することができるが、その有効性はプロテアーゼの存在により減少し得る。同様に、本発明の化合物において用いられるリソソーム酵素、又は酵素断片の有効性も同様に減少し得る。血清プロテアーゼは、切断のためのL-アミノ酸及びペプチド結合などの特定の基質要求性を有する。さらに、血清中のプロテアーゼ活性の多くの顕著な成分であるエキソペプチダーゼは通常、ポリペプチドの第1のペプチド結合に対して作用し、遊離N末端を要する（Powellら、Pharm. Res. 10: 1268-1273, 1993）。これに照らせば、改変された型のターゲティングペプチド酵素または酵素断片を使用することが有利であることが多い。ペプチド模倣体または類似体（アナログ）は、元のL-アミノ酸（ポリ）ペプチドの構造特性を保持するが、有利には、プロテアーゼ及び／又はエキソペプチダーゼによる切断の影響を容易に受けない。
【０１７３】
コンセンサス配列の1個以上のアミノ酸の同じ型のD-アミノ酸との体系的置換（例えば、エナンチオマー；L-リジンの代わりにD-リジン）を用いて、より安定な（ポリ）ペプチドを作製することができる。かくして、本明細書に記載の（ポリ）ペプチド誘導体、類似体又はペプチド模倣物質は、全てのL-、全てのD-又は混合D,Lポリペプチドであってよい。ペプチダーゼは基質としてD-アミノ酸を用いることができないため、N末端又はC末端D-アミノ酸の存在は、（ポリ）ペプチドのin vivoでの安定性を増加させる（Powellら、Pharm. Res. 10:1268-1273, 1993）。逆-D（ポリ）ペプチドは、L-アミノ酸を含む（ポリ）ペプチドと比較して、逆配列に整列された、D-アミノ酸を含む（ポリ）ペプチドである。かくして、L-アミノ酸（ポリ）ペプチドのC末端残基は、D-アミノ酸（ポリ）ペプチドにとってN末端になるなどである。逆D-（ポリ）ペプチドは、L-アミノ酸ポリペプチドと同じ三次コンフォメーション、従って、同じ活性を保持するが、in vitro及びin vivoで酵素的分解に対してより安定であり、かくして、元の（ポリ）ペプチドよりも高い治療効力を有する（Brady及びDodson, Nature 368:692-693, 1994；Jamesonら、Nature 368:744-746, 1994）。逆-D-（ポリ）ペプチドに加えて、コンセンサス配列又は実質的に同一のコンセンサス配列変異を含む制限付きの（constrained）（ポリ）ペプチドを、当技術分野で周知の方法により作製することができる（Rizoら、Ann. Rev. Biochem. 61:387-418, 1992）。例えば、制限付きの（ポリ）ペプチドを、ジスルフィド架橋を形成することができるシステイン残基を付加することにより作製し、それによって環状（ポリ）ペプチドを得ることができる。環状（ポリ）ペプチドは遊離N又はC末端を有しない。従って、それらはエキソペプチダーゼによるタンパク質溶解の影響を受けにくいが、それらは勿論、エンドペプチダーゼの影響を受けやすく、（ポリ）ペプチド末端で切断しない。N末端若しくはC末端D-アミノ酸を有する（ポリ）ペプチドと環状（ポリ）ペプチドのアミノ酸配列は通常、それぞれ、N末端若しくはC末端D-アミノ酸残基の存在、又はその環状構造を除いて、それらが対応する（ポリ）ペプチドの配列と同一である。
【０１７４】
分子内ジスルフィド結合を含む環状誘導体を、アミノ及びカルボキシ末端などの環化のために選択される位置に好適なS-保護されたシステイン又はホモシステイン残基を組込みながら、従来の固相合成により調製することができる（Sahら、J. Pharm. Pharmacol. 48:197, 1996）。鎖集合の完了後、（1）S-保護基を選択的に除去して、対応する2個の遊離SH-官能基の結果として生じる支持体上での酸化を用いてS-S結合を形成させた後、支持体から生成物を従来通り除去し、好適な精製手順を行うか、又は（2）側鎖を完全に脱保護すると共に支持体からポリペプチドを除去した後、高度に希釈した水性溶液中で遊離SH-官能基を酸化することにより、環化を実施することができる。
【０１７５】
分子内アミド結合を含む環状誘導体を、環化のために選択される位置に、好適なアミノ及びカルボキシル側鎖保護されたアミノ酸誘導体を組込みながら、従来の固相合成により調製することができる。分子内-S-アルキル結合を含む環状誘導体を、環化のために選択される位置に、好適なアミノ保護側鎖を有するアミノ酸残基及び好適なS保護システイン又はホモシステインを組込みながら、従来の固相化学により調製することができる。
【０１７６】
（ポリ）ペプチドのN末端又はC末端残基に作用するペプチダーゼに対する抵抗性を付与するための別の有効な手法は、改変（ポリ）ペプチドが最早ペプチダーゼの基質ではなくなるように、ポリペプチド末端に化学基を付加することである。1つのそのような化学的改変は、いずれかの末端、又は両方の末端での（ポリ）ペプチドのグリコシル化である。特定の化学的改変、特に、N末端グリコシル化は、ヒト血清中での（ポリ）ペプチドの安定性を増加させることが示された（Powellら、Pharm. Res. 10:1268-1273, 1993）。血清安定性を増強する他の化学的改変としては、限定されるものではないが、アセチル基などの1〜20個の炭素の低級アルキルからなるN末端アルキル基の付加、及び／又はC末端アミド若しくは置換アミド基の付加が挙げられる。特に、本発明は、N末端アセチル基及び／又はC末端アミド基を担持するポリペプチドからなる改変（ポリ）ペプチドを含む。
【０１７７】
また、誘導体、類似体若しくはペプチド模倣体が（ポリ）ペプチドの所望の機能的活性を保持するという条件で、通常は（ポリ）ペプチドの一部ではないさらなる化学部分を含む他の型の（ポリ）ペプチド誘導体、類似体若しくはペプチド模倣体も本発明に含まれる。そのような誘導体、類似体若しくはペプチド模倣体の例としては、（1）アミノ末端若しくは別の遊離アミノ基のN-アシル誘導体（ここで、アシル基はアルカノイル基（例えば、アセチル、ヘキサノイル、オクタノイル）、アロイル基（例えば、ベンゾイル）若しくはF-moc（フルオレニルメチル-O-CO-）などのブロッキング基であってよい）；（2）カルボキシ末端又は別の遊離カルボキシ若しくはヒドロキシル基のエステル；（3）アンモニア若しくは好適なアミンとの反応により産生されたカルボキシ末端若しくは別の遊離カルボキシル基のアミド；（4）リン酸化誘導体；（5）抗体又は他の生物学的リガンドとコンジュゲートした誘導体、及び他の種の誘導体、が挙げられる。
【０１７８】
本明細書に記載のポリペプチドへの追加アミノ酸残基の付加の結果生じるより長い（ポリ）ペプチド配列も、本発明に包含される。そのようなより長いポリペプチド配列は、上記のポリペプチドと同じ生物活性及び特異性（例えば、細胞指向性）を有すると期待することができる。実質的な数の追加アミノ酸を有するポリペプチドは除外されないが、いくつかの大きいポリペプチドは有効な配列を隠す配置をとり、それによって標的（例えば、LRP受容体ファミリーのメンバー）への結合を阻害し得ると認識されている。これらの誘導体は競合的アンタゴニストとして作用し得る。かくして、本発明はポリペプチド又は伸長を有する本明細書に記載のポリペプチドの誘導体を包含するが、この伸長は化合物の細胞標的化活性又は酵素活性を破壊しないのが望ましい。
【０１７９】
本発明に含まれる他の誘導体は、短いストレッチのアラニン残基又はタンパク質溶解のための推定部位などにより（例えば、カテプシンによる、例えば、米国特許第5,126,249号及び欧州特許第495 049号を参照されたい）、直接的に、又はスペーサーを介して互いに共有結合した、本明細書に記載のような、2個の同じか、又は2個の異なるポリペプチドからなる二重ポリペプチドである。本明細書に記載のポリペプチドの多量体は、同じか、又は異なるポリペプチド又はその誘導体から形成された分子のポリマーからなる。
【０１８０】
本発明はまた、そのアミノ若しくはカルボキシ末端、又はその両方で、異なるタンパク質のアミノ酸配列に連結された、本明細書に記載のポリペプチド、又はその断片を含むキメラ又は融合タンパク質であるポリペプチド誘導体も包含する。そのようなキメラ又は融合タンパク質を、該タンパク質をコードする核酸の組換え発現により製造することができる。例えば、キメラ又は融合タンパク質は、等価な、又はより高い機能的活性を有するキメラ又は融合タンパク質をもたらすことが望ましい1個の記載のポリペプチドと共有される少なくとも6個のアミノ酸を含んでもよい。
【０１８１】
ペプチド模倣物質を同定するためのアッセイ
上記のように、本明細書に記載のポリペプチドの主鎖形状及びファーマコフォア展示を複製するために作製された非ペプチジル化合物（ペプチド模倣物質）は、より高い代謝安定性、より高い効力、より長い作用期間、及びより良好な生体利用能の特性を有することが多い。
【０１８２】
ペプチド模倣化合物を、生物ライブラリー、空間的にアドレス指定可能な平行固相若しくは液相ライブラリー、解析を要する合成ライブラリー方法、「1ビーズ1化合物」ライブラリー方法、及びアフィニティクロマトグラフィー選択を用いる合成ライブラリー方法などの、当技術分野で公知のコンビナトリアルライブラリー方法におけるいくつかの手法のいずれかを用いて取得することができる。生物ライブラリー手法はペプチドライブラリーに限られるが、他の4つの手法はペプチド、非ペプチドオリゴマー、又は化合物の小分子ライブラリーにも適用可能である（Lam, Anticancer Drug Des. 12:145, 1997）。分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当技術分野で、例えば、DeWittら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909, 1993）；Erbら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422, 1994）；Zuckermannら（J. Med. Chem. 37:2678, 1994）；Choら（Science 261:1303, 1993）；Carellら（Angew. Chem, Int. Ed. Engl. 33:2059, 1994及び同書、2061）；及びGallopら（Med. Chem. 37:1233, 1994）に見出すことができる。化合物のライブラリーを、溶液中（例えば、Houghten, Biotechniques 13:412-421, 1992）又はビーズ（Lam, Nature 354:82-84, 1991）、チップ（Fodor, Nature 364:555-556, 1993）、細菌若しくは胞子（米国特許第5,223,409号）、プラスミド（Cullら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869, 1992）上若しくはファージ（Scott及びSmith, Science 249:386-390, 1990）上、又はルシフェラーゼ上で提供し、酵素標識を好適な基質の生成物への変換の決定により検出することができる。
【０１８３】
本明細書に記載のポリペプチドを同定した後は、限定されるものではないが、溶解度の差（例えば、沈降）、遠心分離、クロマトグラフィー（例えば、アフィニティ、イオン交換、及びサイズ排除）などの任意の数の標準的な方法、又はペプチド、ペプチド模倣物質、若しくはタンパク質の精製のために用いられる任意の他の標準的な技術により単離及び精製することができる。同定された目的のポリペプチドの機能特性を、当技術分野で公知の任意の機能アッセイを用いて評価することができる。細胞内シグナル伝達における下流の受容体機能を評価するためのアッセイを用いるのが望ましい（例えば、細胞増殖）。
【０１８４】
例えば、本発明のペプチド模倣化合物を、以下の3段階プロセス：（1）本明細書に記載のポリペプチドを走査して、本明細書に記載の特定の細胞型に標的化するのに必要な二次構造の領域を同定すること；（2）コンフォメーションが制限されたジペプチド代理物を用いて、主鎖形状を改良し、これらの代理物に対応する有機プラットフォームを提供すること；及び（3）最良の有機プラットフォームを用いて、天然ポリペプチドの所望の活性を模倣するように設計された候補のライブラリー中の有機ファーマコフォアを展示すること、を用いて取得することができる。より詳しくは、この3段階は以下の通りである。段階1においては、リード候補ポリペプチドを走査し、その構造を短縮して、その活性のための要件を同定する。一連の元のポリペプチド類似体を合成する。段階2においては、最良のポリペプチド類似体を、コンフォメーションが制限されたジペプチド代理物を用いて調査する。ヨードリジジン-2-オン、ヨードリジジン-9-オン及びキノリジジノンアミノ酸（それぞれ、I2aa、I9aa及びQaa）を、最良のペプチド候補の主鎖形状を研究するためのプラットフォームとして用いる。これらの、及び関連するプラットフォーム（Halabら、Biopolymers 55:101-122, 2000及びHanessianら、Tetrahedron 53:12789-12854, 1997に概説されている）を、ポリペプチドの特定の領域に導入して、異なる向きのファーマコフォアの方向を合わせることができる。これらの類似体の生物学的評価により、活性のための形状要件を模倣する改良されたリードポリペプチドを同定する。段階3においては、最も活性の高いリードポリペプチドに由来するプラットフォームを用いて、天然ペプチドの活性を担うファーマコフォアの有機代理物を展示する。このファーマコフォアと足場を、平行合成形式で混合する。ポリペプチドの誘導及び上記段階を、当技術分野で公知の方法を用いる他の手段により達成することができる。
【０１８５】
前記ポリペプチド、ポリペプチド誘導体、ペプチド模倣物質又は本明細書に記載の他の小分子から決定された構造機能相関を用いて、類似するか、又はより良好な特性を有する類似体分子構造をリファインし、調製することができる。従って、本発明の化合物はまた、本明細書に記載のポリペプチドの構造、極性、電荷特性及び側鎖特性を共有する分子も含む。
【０１８６】
まとめると、本明細書の開示に基づいて、当業者であれば、薬剤を特定の細胞型（例えば、本明細書に記載のもの）に対して標的化するための化合物を同定するのに有用であるペプチド及びペプチド模倣物質スクリーニングアッセイを開発することができる。本発明のアッセイを、低スループット、高スループット、又は超高スループットスクリーニング形式のために開発することができる。本発明のアッセイは、自動化に従うアッセイを含む。
【０１８７】
リンカー
リソソーム酵素（例えばIDS）、酵素断片又は酵素類似体を、ターゲティング部分に直接的に（例えば、ペプチド結合などの共有結合を介して）結合してもよいし、又はリンカーを介して結合することもできる。リンカーとしては、化学的連結剤（例えば、切断可能なリンカー）及びペプチドが挙げられる。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、リンカーは化学的連結剤である。リソソーム酵素（例えばIDS）、酵素断片又は酵素類似体とターゲティング部分を、スルフヒドリル基、アミノ基（アミン）、及び／若しくは炭水化物又は任意の好適な反応基を介してコンジュゲートさせることができる。ホモ二官能性及びヘテロ二官能性架橋剤（コンジュゲーション剤）が、多くの商業的起源から利用可能である。架橋連結に利用可能な領域を、本発明のポリペプチド上に見出すことができる。架橋剤は、可撓性アーム、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14又は15個の炭素原子を含んでもよい。架橋剤の例としては、BS3（[ビス(スルホスクシンイミジル)スベレート]；BS3は、接近可能な一級アミンを標的化するホモ二官能性N-ヒドロキシスクシンイミドエステルである）、NHS/EDC（N-ヒドロキシスクシンイミドとN-エチル-(ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド；NHS/EDCは一級アミン基とカルボキシル基とのコンジュゲーションを可能にする）、スルホ-EMCS（[N-e-マレイミドカプロン酸]ヒドラジド；スルホ-EMCSは、スルフヒドリル基及びアミノ基に対して反応するヘテロ二官能性反応基(マレイミド及びNHS-エステル)である）、ヒドラジド（多くのタンパク質は露出した炭水化物を含み、ヒドラジドは一級アミンにカルボキシル基を連結するための有用な試薬である）、並びにSATA（N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート；SATAは、アミンと反応し、保護されたスルフヒドリル基を付加する）が挙げられる。
【０１８９】
共有結合を形成するために、化学反応基として、ヒドロキシル部分が、ペプチドを改変するのに必要なレベルで生理学的に許容し得る、様々な活性カルボキシル基（例えば、エステル）を用いることができる。具体的な薬剤としては、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、N-ヒドロキシ-スルホスクシンイミド（スルホ-NHS）、マレイミド-ベンゾイル-スクシンイミド（MBS）、γ-マレイミド-ブチリルオキシスクシンイミドエステル（GMBS）、マレイミドプロピオン酸（MPA）、マレイミドヘキサン酸（MHA）、及びマレイミドウンデカン酸（MUA）が挙げられる。
【０１９０】
一級アミンは、NHSエステルのための主要な標的である。タンパク質のN末端上に存在する接近可能なα-アミン基及びリジンのε-アミンはNHSエステルと反応する。NHSエステルコンジュゲーション反応物が一級アミンと反応する時にアミド結合が形成され、N-ヒドロキシスクシンイミドを遊離する。これらのスクシンイミドを含有する反応基を、本明細書ではスクシンイミジル基と呼ぶ。本発明の特定の実施形態において、タンパク質上の官能基はチオール基であり、化学反応基はγ-マレイミド-ブチリルアミド（GMBA若しくはMPA）などのマレイミド含有基であろう。そのようなマレイミド含有基を、本明細書ではマレイド基と呼ぶ。
【０１９１】
マレイミド基は、反応混合物のpHが6.5〜7.4である場合、ペプチド上のスルフヒドリル基に対して最も選択的である。pH 7.0では、マレイミド基とスルフヒドリル（例えば、血清アルブミン又はIgGなどのタンパク質上のチオール基）との反応速度は、アミンとの反応速度よりも1000倍速い。かくして、マレイミド基とスルフヒドリルとの間に安定なチオエーテル結合を形成させることができる。
【０１９２】
他の実施形態において、リンカーは、少なくとも1個のアミノ酸（例えば、少なくとも2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、40又は50個のアミノ酸のペプチド）を含む。特定の実施形態において、リンカーは1個のアミノ酸（例えば、Cysなどの任意の天然アミノ酸）である。他の実施形態において、米国特許第7,271,149号に記載のような、配列[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n（式中、nは1、2、3、4、5又は6である）を有するペプチドなどのグリシン-リッチペプチドを用いる。他の実施形態において、米国特許第5,525,491号に記載のような、セリン-リッチペプチドリンカーを用いる。セリンリッチペプチドリンカーとしては、式[X-X-X-X-Gly]y（式中、Xのうち最大2個はThrであり、残りのXはSerであり、yは1〜5である）のもの（例えば、Ser-Ser-Ser-Ser-Gly（式中、yは2以上である））が挙げられる。いくつかの事例においては、リンカーは1個のアミノ酸（例えば、Gly又はCysなどの任意のアミノ酸）である。他のリンカーとしては、固定リンカー（例えば、PAPAP及び(PT)nP、ここでnは2、3、4、5、6又は7である）、並びにα-へリックスリンカー（例えば、A(EAAAK)nA、ここでnは1、2、3、4又は5である）が挙げられる。
【０１９３】
好適なリンカーの例は、コハク酸、Lys、Glu、及びAsp、又はGly-Lysなどのジペプチドである。リンカーがコハク酸である場合、その1個のカルボキシル基は、アミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成し、その他のカルボキシル基は、例えば、ペプチド又は置換基のアミノ基とアミド結合を形成することができる。リンカーがLys、Glu、又はAspである場合、そのカルボキシル基はアミノ酸残基のアミノ基とアミド結合を形成し、そのアミノ基は、例えば、置換基のカルボキシル基とアミド結合を形成することができる。Lysをリンカーとして用いる場合、さらなるリンカーを、Lysのε-アミノ基と置換基との間に挿入することができる。1つの特定の実施形態において、さらなるリンカーは、例えば、Lysのε-アミノ基と、及び置換基に存在するアミノ基と、アミド結合を形成するコハク酸である。一実施形態において、さらなるリンカーは、Glu又はAsp（例えば、Lysのε-アミノ基とアミド結合を形成し、置換基に存在するカルボキシル基と別のアミド結合を形成する）である、すなわち、置換基はNε-アシル化リジン残基である。
【０１９４】
クリックケミストリーリンカー
特定の実施形態において、リンカーは、クリックケミストリー反応対の間の反応によって形成される。クリックケミストリー反応対とは、高収量及び高熱力学利益のモジュラー反応に関与し、それによりクリックケミストリーリンカーを生成する反応基の対を意味する。この実施形態において、その反応基の一方を酵素部分に結合し、他方の反応基をターゲティングポリペプチドに結合する。反応及びクリックケミストリー対の例としては、トリアゾール含有リンカーを形成する、アルキニル基とアジド基との間のヒュスゲン1,3-双極性環化付加反応；4π電子系を有するジエン（例えば、場合により置換されていてもよい1,3-不飽和化合物、例として場合により置換されていてもよい1,3-ブタジエン、1-メトキシ-3-トリメチルシリルオキシ-1,3-ブタジエン、シクロペンタジエン、シクロヘキサジエン又はフランなど）と2π電子系を有する親ジエン体（dienophile）又はヘテロ親ジエン体（heterodienophile）（例えば、場合により置換されていてもよいアルケニル基又は場合により置換されていてもよいアルキニル基）との間のディールス・アルダー反応；求核試薬及び歪み（strained）ヘテロシクリル求電子試薬による開環反応；ホスホロチオエート基及びヨード基によるスプリントライゲーション（splint ligation）反応；並びにアルデヒド基及びアミノ基による還元的アミノ化反応が挙げられる（Kolb et al., Angew. Chem. Int. Ed., 40:2004-2021 (2001)；Van der Eycken et al., QSAR Comb. Sci., 26:1115-1326 (2007)）。
【０１９５】
本発明の特定の実施形態において、ポリペプチドは、アルキニル基とアジド基のクリックケミストリー対の間の反応により形成されたトリアゾール含有リンカーによって酵素部分に連結される。このような場合、アジド基はポリペプチドに結合され、アルキニル基は酵素部分に結合される。あるいは、アジド基が酵素部分に結合され、アルキニル基がポリペプチドに結合される。特定の実施形態において、アジド基とアルキニル基との反応は触媒されず、他の実施形態において、この反応は、銅(I)触媒（例えばヨウ化銅(I)）、還元剤の存在下における銅(II)触媒（例えば、アスコルビン酸ナトリウムと共に硫酸銅(II)若しくは酢酸銅(II)）又はルテニウム含有触媒（例えば、Cp*RuCl(PPh3)2若しくはCp*RuCl(COD)）により触媒される。
【０１９６】
リンカーの例としては、モノフルオロシクロオクチン（MFCO）、ジフルオロシクロオクチン（DFCO）、シクロオクチン（OCT）、ジベンゾシクロオクチン（DIBO）、ビアリールアザシクロオクチン（BARAC）、ジフルオロベンゾシクロオクチン（DIFBO）、及びビシクロ[6.1.0]ノニン（BCN）を含有するリンカーが挙げられる。
【０１９７】
リソソーム蓄積症の治療（処置）
本発明はまた、リソソーム蓄積症、例えばMPS-IIの治療方法に関する。MPS-IIは、グリコサミノグリカン（GAG）の細胞蓄積（個体がこれらの産物を分解する能力がないことによって生じる）を特徴とする。
【０１９８】
特定の実施形態において、治療（処置）は、IDS遺伝子に変異を有すると診断されたが、まだ疾患症候はない被験体（例えば、乳幼児又は2歳未満の被験体）に対して行う。他の実施形態において、治療（処置）は、少なくとも1つのMPS-II症候（例えば、本明細書に記載した症候のいずれか）を有する個体に対して行う。
【０１９９】
MPS-IIは一般的に2つの一般群、すなわち重篤疾患及び減衰（attenuated）疾患に分類される。本発明は、いずれの種類の疾患を有する被験体の治療も含む。重篤疾患は、CNSの関与を特徴とする。重篤疾患では、通常、気道及び心臓疾患を伴う認識低下によって成人前の死に至る。減衰形態の疾患は全般に、CNSの関与がないか又は最小限にすぎない。重篤及び減衰疾患の両方において、非CNS症候は「重篤」形態のものと同程度に重篤でありうる。
【０２００】
初期MPS-II症候は、約18カ月齢から約5歳で現れ始め、腹部ヘルニア、耳感染、鼻水及び風邪がある。症候としては、粗大化顔貌（例えば、前額突出、鞍鼻及び舌肥大）、大きな頭部（大頭）、腹部腫脹、例えば肥大肝（肝腫大）及び肥大した脾臓（脾腫）等、並びに難聴が挙げられる。本発明の方法は、本明細書に記載した症候のいずれかを有する被験体の治療を含みうる。MPS-IIはまた、骨の肥厚に関連した関節異常を生じる。
【０２０１】
治療（処置）は、任意の年齢、乳幼児から始まり成人までの被験体に行うことができる。被験体は、出生時、6ヵ月齢又は1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15若しくは18歳に治療を開始することができる。
【０２０２】
投与及び用量
本発明はまた、治療上有効な量の本発明の化合物を含む医薬組成物を特徴とする。本組成物を、様々な薬剤送達系における使用のために製剤化することができる。1種以上の生理学的に許容される賦形剤又は担体を、適切な製剤のために本組成物中に含有させることもできる。本発明における使用のための好適な製剤は、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 第17版、1985に見出される。薬剤送達のための方法の簡単な概説については、例えば、Langer（Science 249:1527-1533, 1990）を参照されたい。
【０２０３】
医薬組成物は、予防的及び／又は治療的処置のための、非経口、鼻内、局所、経口、又は経皮手段などによる局所投与のために意図される。医薬組成物を、非経口的に（例えば、静脈内、筋肉内、若しくは皮下注射）、又は経口摂取によるか、又は血管症状若しくは癌症状に罹患した領域での局所適用若しくは関節内注入により投与することができる。さらなる投与経路としては、血管内、動脈内、腫瘍内、腹腔内、心室内、硬膜内、並びに鼻、眼、強膜内、眼窩内、直腸、局所、若しくはエアロゾル吸入投与が挙げられる。デポー注射又は浸食性埋込み物若しくは成分などの手段による、持続放出投与も本発明に特に含まれる。かくして、本発明は、許容される担体、好ましくは、水性担体、例えば、水、緩衝化水、生理食塩水、PBSなどに溶解又は懸濁した上記薬剤を含む非経口投与のための組成物を提供する。前記組成物は、pH調節剤及び緩衝化剤、等張性調節剤、湿潤剤、界面活性剤などの生理学的条件を近似するように必要な製薬上許容される補助物質を含んでもよい。本発明はまた、錠剤、カプセル剤などの製剤化のための結合剤又は充填剤などの不活性成分を含んでもよい、経口送達のための組成物も提供する。さらに、本発明は、クリーム、軟膏などの製剤化のための溶媒又は乳化剤などの不活性成分を含んでもよい局所投与のための組成物を提供する。
【０２０４】
これらの組成物を、従来の滅菌技術により滅菌するか、又は滅菌濾過することができる。得られる水性溶液を、使用のために充填するか、又は凍結乾燥し、凍結乾燥調製物を投与前に滅菌水性担体と混合することができる。調製物のpHは、典型的には、3〜11、より好ましくは5〜9又は6〜8、最も好ましくは7〜8、例えば、7〜7.5であろう。固体形態の得られる組成物を、それぞれ固定量の上記薬剤（1又は複数）を含む複数の単回用量単位中、例えば、錠剤又はカプセル剤の密閉包装中に充填することができる。固体形態の前記組成物を、局所適用可能なクリーム又は軟膏のために設計された絞れるチューブなどの、自在量のための容器中に充填することもできる。
【０２０５】
有効量を含む組成物を、予防的又は治療的処置のために投与することができる。予防的適用においては、組成物を、リソソーム蓄積症に関連した変異（例えばIDS遺伝子における変異）を有すると診断された被験体に投与することができる。本発明の組成物を、被験体（例えば、ヒト）に、上記障害の発症を遅延させる、減少させる、又は好ましくは防止するのに十分な量で投与することができる。治療的適用においては、リソソーム蓄積症（例えばMPS-II）に既に罹患している被験体（例えば、ヒト）に、その障害及びその合併症の症候を治癒するか、又は少なくとも部分的に停止させるのに十分な量で投与する。この目的を達成するのに十分な量を、「治療上有効な量」、疾患又は医学的症状に関連する少なくとも1つの症候を実質的に改善するのに十分な量と定義する。例えば、リソソーム蓄積症の治療においては、前記疾患又は症状の任意の症候を減少させ、防止し、遅延させ、抑制するか、又は停止させる薬剤又は化合物は治療上有効であろう。薬剤若しくは化合物の治療上有効な量は、疾患若しくは症状を治癒させるのに必要ではないが、疾患若しくは症状の開始を遅延させる、妨害するか、若しくは防止するか、又は疾患若しくは症状の症候が改善するか、又は疾患若しくは症状の期間が変化するか、又は例えば、個体における重篤度が低いか、又は回復が加速されるような、疾患若しくは症状のための治療を提供するであろう。
【０２０６】
この使用にとって有効な量は、疾患若しくは症状の重篤度及び被験体の体重及び全身状態に依存し得る。イデュルスルファーゼは、0.5mg/kgの毎週の静脈内投与が推奨される。本発明の化合物は、例えば同等の投与量（すなわち、イデュルスルファーゼに対する融合タンパク質の追加の分子量を考慮して）及び頻度で投与しうる。化合物は、イズロン酸（iduronase）等量で、例えば、0.01、0.05、0.1、0.5、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0又は5mg/kgを、毎週、週に2回、一日おき、毎日又は1日2回で投与することができる。哺乳動物（例えば、ヒト）に適用される本発明の方法において用いられる本発明の組成物の治療上有効な量を、当業者であれば、哺乳動物の年齢、体重、及び症状における個々の差異を考慮して決定することができる。本発明の特定の化合物はBBBを通過しリソソームに侵入する高い能力を示すため、本発明の化合物の用量は、コンジュゲート化されていない薬剤の治療効果のために必要な相当する用量よりも低いものであってよい（例えば、約90％、75％、50％、40％、30％、20％、15％、12％、10％、8％、7％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、又は0.1％に等しい又はそれ未満）。治療される被験体（例えば、ヒトなどの哺乳動物）において望ましい結果（例えば、GAG蓄積の低減）をもたらす量である有効量の本発明の薬剤を、該被験体に投与する。当業者であれば、治療上有効な量を経験的に決定することもできる。
【０２０７】
有効量を含む本発明の組成物の単回又は複数回投与を、治療する医師により選択される用量レベル及びパターンで実行することができる。用量及び投与スケジュールを、被験体における疾患又は症状の重篤度に基づいて決定及び調整し、臨床医により一般的に実施されるか、又は本明細書に記載の方法に従う治療過程を通してモニターすることができる。
【０２０８】
本発明の化合物を、従来の治療方法若しくは療法と共に用いるか、又は従来の治療方法若しくは療法とは別々に用いることができる。
【０２０９】
本発明の化合物を他の薬剤との組合せ療法において投与する場合、それらを個体に対して連続的に、又は同時に投与することができる。あるいは、本発明に係る医薬組成物は、本明細書に記載のような製薬上許容される賦形剤、及び当技術分野で公知の別の治療薬若しくは予防剤と共に、本発明の化合物の組合せを含んでもよい。
【実施例】
【０２１０】
以下の実施例は、本発明を例示する目的であり、本発明を限定するものではない。
[実施例1]
IDS-Angiopep-2融合タンパク質の設計
一連のIDS-Angiopep-2構築物を設計した。IDS cDNAはOrigeneより入手した（Cat. No. RC219187）。3つの基本構成物を用いた:N末端融合物（An2-IDS及びAn2-IDS-His）、C末端融合物（IDS-An2及びIDS-An2-His）、並びにN及びC末端融合物（An2-IDS-An2及びAn2-IDS-An2-His）、いずれも8xHisタグ有り及び無し（図1）。Angiopep-2無しの対照も作製した（IDS及びIDS-His）。
【０２１１】
[実施例2]
CHO-S細胞における組換えhIDSタンパク質の発現及び活性
次に、これら構築物を、懸濁液中で培養したCHO-S細胞内で発現させた。直鎖25kDaポリエチレンイミン（PEI、Polyscience）をトランスフェクション試薬として用いて、一過性トランスフェクションによりFreeStyle CHO-S細胞（Invitrogen）内でIDS構築物を発現させた。一例において、DNA（1mg）を70mlのFreeStyle CHO発現培地（Invitrogen）と混合し、室温で15分間インキュベートした。別にPEI（2mg）を70mlの培地中で15分間インキュベートし、その後DNA及びPEI溶液を混合し、さらに15分間インキュベートした。DNA/PEI複合体混合物を、CHO-S細胞1×109個を含有する360mlの培地に添加した。適度の撹拌を伴う37℃、8％CO2での4時間のインキュベーション後、500mlの温かい培地を添加した。CHO-S細胞を回収前に、同じ条件で5日間さらにインキュベートした。
【０２１２】
細胞がIDS又はIDS融合タンパク質を発現し分泌しているかどうかを判定するため、抗IDS抗体を用いたウエスタンブロッティングを培養培地上で実施した。図2からわかるように、IDS-His、An2-IDS-His及びIDS-An2-Hisの発現レベルは同様であった。このように、細胞はこれらタンパク質を発現させることができた。
【０２１３】
また、培地中のIDS活性を特性決定した。このアッセイは、2ステップ酵素的アッセイを用いて実施した（図3）。このアッセイは、水中の4-メチルウンベリフェリル-α-L-イズロニド-2-スルフェートをIDSで4時間処理し、4-メチルウンベリフェリル-α-L-イズロニド及びスルフェートを生成することを伴う。第2ステップでは、これらの産物を過剰量のα-L-イズロニダーゼ（IDUA）で24時間処理し、α-L-イズロン酸及び4-メチルウンベリフェロンを生成した。4-メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより、活性を判定した（365nm励起;450nm発光）。
【０２１４】
特定の一例において、このアッセイは以下のとおり実施された。CHO-Sトランスフェクト細胞からの培地10μlを、酢酸バッファー、pH5.0中の20μlの1.25mM 4-メチルウンベリフェリル-α-L-イズロニド-2-スルフェート（Moscerdam Substratesより入手したIDS基質）と混合し、4時間、37℃でインキュベートした。次に、20μlの0.2M Na2HPO4/0.1Mクエン酸バッファー、pH4.5及びウシ精巣から精製されたリソソーム酵素（LEBT）10μlを添加することにより、アッセイの第2ステップを開始した。37℃で24時間後、0.025％ Triton X-100を含有する200μlの0.5M NaHCO3/Na2CO3バッファー、pH10.7で反応を停止した。4-メチルウンベリフェロンの蛍光を測定することにより、活性を判定した（365nm励起;450nm発光）。
【０２１５】
懸濁液中で培養したCHO-S細胞のIDS活性の測定値を図4に示し、3つのタンパク質（IDS-His、An2-IDS-His、及びIDS-AN2-His）すべてがIDS活性を有することが示された。
【０２１６】
[実施例3]
発現の特性決定及び最適化
さらに発現を特性決定するため、図5A及び図5Bに示すように、懸濁液中で培養したCHO-S細胞におけるIDS発現及び活性の時間経過評価をIDS-His及びIDS-An2-His融合タンパク質について測定した。これらのデータから、最大IDS発現及び活性は、トランスフェクションの5日後に観察された。これらの実験において、CHO-S細胞によるIDS-An2-Hisの再捕捉は観察されなかった。
【０２１７】
さらにトランスフェクション条件を最適化するため、2つの異なる数の細胞（細胞1.25×107個又は細胞2.5×107個）を用いてトランスフェクションを実施した。DNAとポリエチレンイミン（PEI）との3つの異なる比を用いた（1:1、1:2、1:3、及び1:4）。
【０２１８】
これらの実験から、IDS活性（図5A）及び発現解析（図5B）に示されるように、1:2のDNA:PEI比を用いて最善の結果が得られた。
【０２１９】
[実施例4]
MPS-II線維芽細胞におけるIDS活性
発現タンパク質が細胞中のグリコサミノグリカン（GAG）蓄積を減少させることができるかどうかを判定するため、MPS-II患者から採取された線維芽細胞を用いた。実験の第1セットにおいて、様々なIDS及びIDS融合タンパク質がトランスフェクトされた上述のCHO-S細胞からの細胞培養培地を、線維芽細胞と共にインキュベートした。35S-GAGの存在に基づきGAG蓄積を測定した。図6Aに示されるように、融合タンパク質を用いたGAGの減少は、IDS自体を用いた場合と同様であった。
【０２２０】
これらのアッセイを以下のとおり実施した。MPS II（Coriell institute、GM00298）、又は健常ヒト線維芽細胞（GM05659）を、10％ウシ胎児血清（FBS）を有するDMEM中に細胞250,000個/ウェルで6ウェル皿にプレートし、37℃、5％CO2下で培養した。4日後、細胞をPBSで1回、低スルフェートF-12培地（Invitrogen、catalog # 11765-054）で1回洗浄した。10％透析FBS（Sigma、catalog # F0392）及び10μCi 35S-硫酸ナトリウムを含有する1mlの低スルフェートF-12培地を、組換えIDSタンパク質の不在又は存在下で細胞に添加した。線維芽細胞を37℃、5％CO2下でインキュベートした。48時間後、培地を除去し、細胞をPBSで5回洗浄した。細胞を0.4ml/ウェルの1N NaOH中に溶解し、60℃で60分間加熱し、タンパク質を可溶化した。マイクロBCA（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイ(Smith, P.K. et al., 1986, Anal. Biochem., 150(1): 76-85)のため、アリコートを取り出した。放射活性を液体シンチレーションカウンタで計数した。データをタンパク質1μg当たりの35S CPMとして表す。
【０２２１】
なお一層有望な結果が精製IDS-An2-hisで得られ、それはGAG蓄積を正常ヒト線維芽細胞において測定された正常な対照値まで減少させることが可能だった（図6B）。これらの結果は、本発明の精製融合タンパク質が活性であることを示す。要約すれば、MPS-II線維芽細胞でのこれらデータは、融合タンパク質が活性であり、リソソームに到達して、そこでグリコサミノグリカンを切断できることを示す。
【０２２２】
最後に、ウエスタンブロットは、正常及びMPS-II線維芽細胞において、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（LRP-1）が同レベルで発現していることを示す（データは示さず）。
【０２２３】
[実施例5]
クリックケミストリーリンカー
一例において、ターゲティング部分をクリックケミストリーリンカーを介してリソソーム酵素に連結する。このケミストリーの一例を下に示す。
【０２２４】
【化３０】
2015536658.tif 000037
【０２２５】
このアプローチは、反応がアジド部分とアルキン部分との間でのみ生じるので、非常に選択的である点で有利である。この反応はまた、水溶液中で生じ、生体適合性であり、生細胞中で実施できる。加えて、反応は急速で定量的であり、希釈液中でのナノモル単位のコンジュゲートの調製を可能にする。最後に、この反応はpH非感受性であるので、pH4〜11のどのpHでも実施できる。本発明で使用する具体的なクリックケミストリーリンカーは、実施例8及び9で論じる。
【０２２６】
[実施例6]
SATA化学結合
別の一例において、ターゲティング部分をSATA化学リンカーを介してリソソーム酵素に連結する。かかるコンジュゲートを生成するための典型的スキームを下に示す。
【０２２７】
【化３１】
2015536658.tif 000038
【０２２８】
[実施例7]
他の化学的コンジュゲーション方法
別の一例において、化学的コンジュゲーションは、ヒドラジドリンカーを介して達成される。かかるコンジュゲートの生成のための典型的スキームは以下のとおりである。
【０２２９】
【化３２】
2015536658.tif 000039
【０２３０】
別の一例において、化学的コンジュゲーションは、糖部分（例えばグリコシル化部位）を介して過ヨウ素酸で酸化された酵素をヒドラジド誘導体と共に用いて達成される。保護されたプロピオニルヒドラジドを用いるこのアプローチの一例を下に示す。
【０２３１】
【化３３】
2015536658.tif 000040
【０２３２】
このアプローチの別の一例を下に示す。
【０２３３】
【化３４】
2015536658.tif 000041
【０２３４】
[実施例8]
クリックケミストリーによるIDSのAn2とのコンジュゲーション方法
イズロン酸-2-スルファターゼのアミノ酸配列における可能なコンジュゲーション部位はリジン及びN末端残基を含む。
2015536658.tif 000042
【０２３５】
化合物の構造
Angiopep2配列
2015536658.tif 000043
【０２３６】
アジド-An2（N末端）4
N末端アジド基を有するアジドブチリル-An2（アジド-An2）の構造を下に示す。この化合物は標準的な固相合成法により作製した。
【０２３７】
【化３５】
2015536658.tif 000044
【０２３８】
An2-アジド（C末端）8
C末端アジド基を有するAn2-[アジドノルロイシン]（AN2-アジド）の構造を下に示す。この化合物は標準的な固相合成法により作製した。
【０２３９】
【化３６】
2015536658.tif 000045
【０２４０】
スキーム構造:
IDS-BCN-ブチリル-An2（70-56-1B及び70-56-2B）の構造を下に示す。
【０２４１】
【化３７】
2015536658.tif 000046
【０２４２】
式中、R1は
【０２４３】
【化３８】
2015536658.tif 000047
【０２４４】
であり、該IDSに連結されたNH基はIDS中の一級アミノ基の反応により誘導されるものである。
【０２４５】
An2-[アジドノルロイシン]-MFCO-IDS（70-66-1B）の構造を下に示す。
【０２４６】
【化３９】
2015536658.tif 000048
【０２４７】
式中、R2は
【０２４８】
【化４０】
2015536658.tif 000049
【０２４９】
であり、該IDSに連結されたNH基はIDS中の一級アミノ基の反応により誘導されるものである。
【０２５０】
An2-[アジドノルロイシン]-BCN-IDS（68-32-2）の構造を下に示す。
【０２５１】
【化４１】
2015536658.tif 000050
【０２５２】
式中、R1は
【０２５３】
【化４２】
2015536658.tif 000051
【０２５４】
であり、該IDSに連結されたNH基はIDS中の一級アミノ基の反応により誘導されるものである。
70-56-1B及び70-56-2Bの合成スキーム
【０２５５】
【化４３】
2015536658.tif 000052
【０２５６】
式中、R1は
【０２５７】
【化４４】
2015536658.tif 000053
【０２５８】
である。
【０２５９】
BCN:ビシクロ[6.1.0]ノニン
70-56-1Aの合成
pH約7.6のリン酸バッファー20mM中の（7.24mg、95nmole）のIDS（1）に、380nmole（4当量）のBCN-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（2）（以下のとおり調製されたストック溶液から:1000μlの無水DMSO中に5.82mgを溶解）を、室温で5時間、時折手で振盪しながら添加した。修飾IDS 3a、70-56-1Aを、HiPrep 26/10脱塩カラムを用いて、5mL/分で、リン酸バッファー20mM pH7.6でゲル濾過により過剰量の試薬から精製した。収集された画分を、Amicon ultra遠心式フィルタ（リミット10kDa、3000rpm）により3.8mLまで濃縮した（6.5mg、収率90％）。修飾IDS 70-56-1A（3a）を回収し、アジド-An2（N末端）（4）との次のコンジュゲーションステップに用いた。
【０２６０】
ステップ:2-修飾IDSのアジドAn2（N末端）とのコンジュゲーション
（70-56-1B）の合成
修飾IDS誘導体（3a）（6.5mg、85.2nmole）に、8当量のアジド-An2（N末端）（4）を添加した。溶液を手で振盪し、アルミホイルで包み、室温で一晩放置した。次に、pH7の20mM TRISを結合バッファーとして用い、一方でpH7.0の20mM TRIS及び500mM NaClを溶出バッファーとして用いて、コンジュゲート（5）をQセファロース1mLカラムにより精製した。コンジュゲートを単離し、Amicon ultra遠心式フィルタ（10kDaカットオフ、3000rpm）で5回、15mLで洗浄することにより、IDSバッファー（1×:137mM NaCl、17mM NaH2PO4、3mM Na2HPO4、pH約6）と交換し、2.5mLまで濃縮し、70-56-1Bを得た（6mg、収率83％）。
【０２６１】
70-56-2Aの合成
pH約7.6のリン酸バッファー20mM中の7.24mg（95nmole）のIDS（1）に、570nmole（6当量）のBCN-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル（2）を、室温で5時間、時折手で振盪しながら添加した。活性化されたIDS 70-56-2B（3b）を、HiPrep 26/10脱塩カラムを用いて、5mL/分で、リン酸バッファー20mM pH7.6でゲル濾過により過剰量の試薬から精製した。収集された画分を、Amicon ultra遠心式フィルタ（10kDa、3000rpm）により3.5mLまで濃縮した（6.5mg、収率90％）。修飾IDS 3b、70-66-2Aを回収し、それをアジド-An2（N末端）（4）との次のコンジュゲーションステップに用いた。
【０２６２】
（70-56-2B）の合成
修飾IDS 3b、70-56-2A（6.5mg、85.2nmole）に、12当量のアジド-An2（N末端）（4）を添加した。溶液を手で振盪し、アルミホイルで包み、室温で一晩放置した。pH7の20mM TRISバッファーを結合バッファーとして用い、pH7.0の20mM TRIS及び500mM NaClを溶出バッファーとして用いて、コンジュゲート（5）をQセファロース1mLカラムにより精製した。コンジュゲートを単離し、Amicon ultra遠心式フィルタ（10kDaリミット、3000rpm）で5回、15mLで洗浄することにより、IDSバッファー（1×:137mM NaCl、17mM NaH2PO4、3mM Na2HPO4、pH約6）と交換し、3mLまで濃縮し、70-56-2Bを得た（6mg、83％）。
【０２６３】
70-56-2Bの大規模合成
pH7.6のリン酸バッファー20mM中のIDS(152mg、1992nmole)に、11952nmole(6当量)のBCN-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(無水DMSO中の20mmolar)を、室温で5時間、時折手で振盪しながら添加した。修飾IDS 70-56-2Bを、脱塩カラムSephadex G25を用いて、15mL/分で、pH7のリン酸バッファー20mMでゲル濾過により過剰量の試薬から精製した。収集された画分(65mL)を、Centricon Plus-70(10kDa、3100rpm)遠心分離フィルタにより36mLまで濃縮した(145mg、収率95%)。修飾IDSを、アジドAn2(N末端)との次のコンジュゲーションステップのために回収した。修飾IDS(130mg、1704nmole)に、12当量のアジドAn2(62mg)を添加した。溶液を手で振盪し、アルミホイルで包み、室温で一晩放置した。コンジュゲートを、結合バッファーについてはpH7の20mM TRISバッファー及び溶出バッファーについてはpH7.0の500mM NaClを含む20mM TRISを用いて、Qセファロース20mLカラム上で精製した。コンジュゲート(90mL)を単離し、Centricon Plus-70(10kDa、3100rpm)を用いて30mLに濃縮し、洗浄(4x35mL IDSバッファー)することによりIDSバッファー(1X: 137mM NaCl、17mM NaH2PO4、3mM Na2HPO4、pH6)と交換した。次いで、材料をCentricon Plus-70(10kDa、3100rpm)カラムで33mLに濃縮し、滅菌濾過して、70-56-2B(114mg、88%)を得た。
【０２６４】
70-66-1Bの合成スキーム
下に示す合成スキームは、MFCOリンカーを含有するリンカーのIDSへの結合及びAn2-アジド(C末端)(8)のアジド基を介したAn2-[アジド-ノルロイシン]（An2-アジド）(C末端))のMFCO含有リンカーへの結合を示す。
【０２６５】
70-66-1Bの合成スキーム
【０２６６】
【化４５】
2015536658.tif 000054
【０２６７】
(式中、R2は、
【０２６８】
【化４６】
2015536658.tif 000055
【０２６９】
である)。
【０２７０】
MFCO: モノフルオロシクロオクチン
70-66-1Aの合成
pH約7.6のリン酸バッファー20mM中の(10.6mg、139nmole)のIDS(1)に、1112nmole(8当量)のMFCO-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(6)(以下のとおり調製されたストック溶液から:1000μlの無水DMSO中に7.6mgを溶解)を添加し、時折手で振盪しながら室温で5時間放置した。修飾IDS 70-66-1A(7)を、HiPrep 26/10脱塩カラムを用いて、5mL/分で、pH7.6のリン酸バッファー20mMでゲル濾過により過剰量の試薬から精製した。収集された画分を、Amicon ultra遠心分離フィルタ(10kDaリミット、3000rpm)により3mLまで濃縮した(9.4mg、収率89％)。修飾IDS(7)をAn2-アジド(C末端)(8)との次のコンジュゲーションステップに用いた。
【０２７１】
ステップ:2-修飾IDSのAn2-アジド(C末端)(An2-[アジド-ノルロイシン])とのコンジュゲーション
修飾IDS誘導体(7)(6.1mg、80nmole)に、16当量のAn2-アジド(C末端)(8)を添加した。溶液を手で振盪し、アルミホイルで包み、室温で一晩放置した。pH7の20mM TRISを結合バッファーとして用い、一方でpH7.0の20mM TRIS及び500mM NaClを溶出バッファーとして用いて、コンジュゲート(9)をQセファロース1mLカラムにより精製した。コンジュゲートを単離し、Amicon ultra遠心分離フィルタ(10KmW、3000rpm)で5回、15mLで洗浄することにより、IDSバッファー(1×:137mM NaCl、17mM NaH2PO4、3mM Na2HPO4、pH約6)と交換し、2.5mLまで濃縮し、70-66-1Bを得た(6.1mg、100％)。
【０２７２】
70-66-1Bの大規模合成
pH7.6のリン酸バッファー20mM中のIDS(152mg、1992nmole)に、15936nmole(8当量)のMFCO-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(無水DMSO中の20mM)を室温で5時間、時折手で振盪しながら添加した。修飾IDSを、脱塩カラムSephadex G25を用いて、15mL/分で、pH7のリン酸バッファー20mMでゲル濾過により過剰量の試薬から精製した。収集された画分(65mL)を、Centricon Plus-70(10kDa、3100rpm)遠心分離フィルタにより36mLまで濃縮した(157mg、収率約100%)。修飾IDSを、An2アジド(C末端)との次のコンジュゲーションステップのために回収した。
【０２７３】
修飾IDS(130mg、1704nmole)に、16当量のAn2-アジド(C末端)の溶液(84mg、脱イオン水中の10mg/mL)を添加した。溶液を手で振盪し、アルミホイルで包み、室温で一晩放置した。コンジュゲートを、結合バッファーについてはpH7の20mM TRISバッファー及び溶出バッファーについてはpH7.0の500mM NaClを含む20mM TRISを用いて、Qセファロース20mLカラム上で精製した。コンジュゲート(90mL)を単離し、Centricon Plus-70(10kDa、3100rpm)を用いて30mLに濃縮し、洗浄(4x35mL IDSバッファー)することによりIDSバッファー(1X: 137mM NaCl、17mM NaH2PO4、3mM Na2HPO4、pH6)と交換した。次いで、材料をCentricon Plus-70(10kDa、3100rpm)カラムで33mLに濃縮し、滅菌濾過して、70-66-1B(104mg、80%収率)を得た。
68-32-2の合成スキーム
【０２７４】
【化４７】
2015536658.tif 000056
【０２７５】
(式中、R1は、
【０２７６】
【化４８】
2015536658.tif 000057
である)。
【０２７７】
BCN: ビシクロ[6.1.0]ノニン
68-31-2の合成
pH約7.6のリン酸バッファー20mM中の(14.5mg、190nmole)のIDS(1)に、1520nmole(8当量)のBCN-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(2)(以下のとおり調製されたストック溶液から:1000μlの無水DMSOに5.82mgを溶解)を添加し、時折手で振盪しながら室温で5時間貯蔵した。修飾IDS(10)を、HiPrep 26/10脱塩カラムを用いて、5mL/分で、pH7のリン酸バッファー20mMでゲル濾過により過剰量の試薬から精製した。収集された画分を、Amicon ultra遠心分離フィルタ(リミット10kDa、3000rpm)により4mLまで濃縮した(14.5mg、収率100％)。修飾IDSを回収し、An2-アジド(C末端)との次のコンジュゲーションステップに用いた。
【０２７８】
ステップ:2-修飾IDSのAn2−アジド(C末端)(An2-[アジド-ノルロイシン])とのコンジュゲーション
68-32-2の合成
修飾IDS誘導体(10)(11mg、144.2nmole)に、16当量のAn2-アジド(C末端)を添加した。溶液を手で振盪し、アルミホイルで包み、室温で一晩放置した。pH7の20mM TRISを結合バッファーとして用い、一方でpH7.0の20mM TRIS及び500mM NaClを溶出バッファーとして用いて、コンジュゲート(11)をQセファロース1mLカラムにより精製した。コンジュゲートを単離し、Amicon ultra遠心分離フィルタ(10KmW、3000rpm)で5回、15mLで洗浄することにより、IDSバッファー(1×:137mM NaCl、17mM NaH2PO4、3mM Na2HPO4、pH約6)と交換し、2.5mLまで濃縮し、68-32-2を得た(10mg、91％)。
【０２７９】
68-32-2の大規模合成
pH7.6のリン酸バッファー20mM中のIDS(152mg、1992nmole)に、15936nmole(8当量)のBCN-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(以下のとおり調製されたストック溶液から: 1000μlの無水DMSOに5.82mgを溶解)を室温で5時間、時折手で振盪しながら添加した。修飾IDSを、脱塩カラムSephadex G25を用いて、15mL/分で、pH約7のリン酸バッファー20mMでゲル濾過により過剰量の試薬から精製した。収集された画分65mLを、Centricon Plus-70(10kDa、3100rpm)遠心分離フィルタにより36mLまで濃縮した(145mg、収率約95%)。修飾IDSを、An2アジド(C末端)との次のコンジュゲーションステップのために回収した。
【０２８０】
修飾IDS(130mg、1704nmole)に、16当量のアジドAn2(C末端)(84mg)の溶液(脱イオン水中の10mg/mL)を添加した。溶液を手で振盪し、アルミホイルで包み、室温で一晩放置した。コンジュゲートを、結合バッファーについてはpH7の20mM TRISバッファー及び溶出バッファーについてはpH7.0の500mM NaClを含む20mM TRISを用いて、Qセファロース20mLカラム上で精製した。コンジュゲート(90mL)を単離し、Centricon Plus-70(10kDa、3100rpm)を用いて30mLに濃縮し、洗浄(4x35mL IDSバッファー)することによりIDSバッファー(1X: 137mM NaCl、17mM NaH2PO4、3mM Na2HPO4、pH6)と交換した。次いで、材料をCentricon Plus-70(10kDa、3100rpm)カラムで33mLに濃縮し、滅菌濾過して、68-32-2(104mg、80%収率)を得た。
【０２８１】
[実施例9]
切断可能リンカーを用いたIDS-Angiopep-2コンジュゲートの合成
An2を、下に示す2つのスキームにより、切断可能リンカーを含むジスルフィドを介してIDSにコンジュゲートする。第1のスキームにおいて、IDSのリジン側鎖をSPDPリンカーと反応させ、修飾IDSを生成する。修飾IDSをAn2-Cys-SHと反応させ、An2-CysのC末端システインのS部分を介してAn2と結合させ、IDS-An2コンジュゲートを生成する。
【０２８２】
第2のスキームにおいて、IDSをSATAリンカーと反応させ、続いてヒドロキシルアミンと反応させ、修飾IDSを生成する。An2のN末端をSPDPと反応させ、修飾An2を生成する。修飾IDSを修飾An2と反応させ、An2をAn2のN末端アミノ基を介してIDSと結合させ、IDS-An2コンジュゲートを生成する。
【０２８３】
【化４９】
2015536658.tif 000058
【０２８４】
【化５０】
2015536658.tif 000059
【０２８５】
[実施例10]
化合物のスクリーニング及び特性決定
組換えイズロン酸-2-スルファターゼ(IDS)(JR-032)を、リジン結合を介してAn2にコンジュゲートした。印を付けた潜在的な結合部位を有するIDSアミノ酸配列を、上の実施例8において提示した。これらのコンジュゲートは、IDSに対するAn2:リンカーの様々な比を代表する。このコンジュゲーション戦略で試験されたリンカーは、MFCO(モノフルオロシクロオクチン)、BCN(ビシクロノニン)、SATA(S-アセチルチオアセテート)、DBCO(ジベンジルシクロオクチン)、及びマレイミドを含むクリックケミストリーリンカーであった。いずれの場合も、反応に添加されたAn2:リンカー材料の比は2:1であり、An2はIDSに対し4倍、6倍、又は8倍のいずれかの過剰である。An2を、Q-セファロースカラムクロマトグラフィーにより反応産物から除去し、MALDI-TOF解析を用いて、それぞれのIDSに組み込まれたAn2の平均数を判定した。SP-HPLC解析を用いて、コンジュゲートされていないIDSが産物中に存在するかどうかを判定した。SEC解析を用いて、コンジュゲーション後のタンパク質の質を検査した。この方法を用いて、第1シリーズの9つのコンジュゲートに、凝集体形成の証拠があることが見出され、コンジュゲーション反応を最適化及び反復して、この問題を除去した。加えて、他のリンカーを用いて、5つの新規コンジュゲートを作製した。
【０２８６】
以下の表3に示されるように、これらのコンジュゲートを評価し、以下の点について判定した:
1. An2組み込み（1〜5の範囲のAn2/IDS）
2. サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)による凝集の程度
3. 副集団(SP)-解析によるメジャーピーク。
【０２８７】
さらなる解析のために選択されたリジンコンジュゲートを、以下の表3に提示する。複数の種がコンジュゲーション反応産物中に存在してもよいため、組込まれたAn2の数は平均であることに注意すべきである。MALDI TOFによるJR-032の質量は、76,320Daである(11回判定)。これらコンジュゲートについてのウエスタンブロットを図8に提示する。
【０２８８】
U87細胞中でのAlexa488-IDS及びAlexa488-An2-IDS(70-56-2B)の取込み
U87細胞を、12穴プレートに播種し、通常の細胞培養条件で48時間増殖させた。集密なU87細胞を、細胞培養条件で1時間又は16時間、完全細胞培養培地(フェノールレッドを含まず、抗生物質を含む)中で増加する濃度のAlexa488標識産物と共にインキュベートすることにより、細胞取込み実験を実施した。次いで、細胞を1回洗浄し、トリプシン処理し、氷上で再度大規模に洗浄した。細胞中での蛍光化合物の取込みを、フローサイトメトリーにより評価した。標識された化合物の非存在下で測定された基底細胞蛍光を差し引いた後、試料の相対蛍光単位(RFU)として結果を表した。
【０２８９】
【表３】
2015536658.tif 000060
【０２９０】
2015536658.tif 000061
【０２９１】
組み込まれるAn2の数をIDS当たり1つに限定（して標準化）する試みの中でシステインを用いた戦略も用いたが、20当量までのAn2を含む条件範囲を用いた場合、An2とのIDSコンジュゲーションは50％以下しか得られなかった。さらに、コンジュゲーション反応産物は、酵素活性の50％の減少を示し、コンジュゲートされた物質が不活性であることを示唆する。したがって、リジンを用いたアプローチが好ましい。
【０２９２】
結果
図9A、9B、9C及び9Dは、それぞれ、70-56-1B、70-56-2B、68-32-2、及び70-66-1BのMALDI-TOF解析を示す。図10A及び10Bは、68-32-2、70-56-1B、70-56-2B、及び70-66-1BのSEC及びSP分析を示す。これらのコンジュゲートの構造及び合成プロトコルの概要は、上記に提供されている。68-32-2、70-66-1B、70-56-2B及び70-56-1Bに組込まれたAn2の平均数は、それぞれ、2.3、4.9、2.4及び1.2である。これら解析において、コンジュゲートされていないJR-032は検出されなかった。An2-IDSの2つの集団を代表する2つのピークを、それぞれのコンジュゲートについて見て取ることができ、1つは4〜5分で溶出し、第2のものは10分で溶出している。異なるAn2-IDSコンジュゲートについて、類似した間隔を置いたピークの精製が示されている。
【０２９３】
コンジュゲーション産物をAlexa 488色素で標識してU87細胞内での輸送研究において用いて、その局在をlysotracker色素の局在と比較した。顕微鏡検査実験の図解を図11に記載し、Alexa 488色素で標識され、その局在をlysotracker色素と比較して示す、68-32-2、70-56-1B、70-56-2B、及び70-66-1Bコンジュゲートの共焦点顕微鏡検査の結果を図12〜16に示す。コンジュゲートのlysotracker色素との共局在は、酸性リソソームにおけるそのコンジュゲートの存在を示す。図17は、1時間又は16時間(図17)のインキュベーション後に、コンジュゲートされたJR-032及びネイティブJR-032の両方の進入が観察されたことを示すデータの定量化を示す。取込みEC50は、両方の酵素について約10nMであり、より高い最大取込み量は70-56-2Bについて示された。An2-IDSのU-87細胞中での取込みを支持するさらなるデータを、図18及び19に示す。
【０２９４】
[実施例11]
修飾リジンの同定
An2がコンジュゲートされたIDS中のリジンを決定するために、JR-032、70-56-2B、70-66-1B、及び68-32-2B並びにその中間体を、トリプシン消化にかけた。続いて、各タンパク質のタンパク質分解断片をLCMSMSにより解析した。この解析から、JR-032上の8つのリジンが、表4に示されるようなAn2-IDSコンジュゲートの合成中に改変が生じる位置として同定された。
【０２９５】
【表４】
2015536658.tif 000062
【０２９６】
[実施例12]
コンジュゲートのIDS酵素特異的活性
プロトコル：
1) JR-032及びコンジュゲート中のタンパク質の濃度をマイクロBCAにより決定する。
【０２９７】
2) 試験溶液の調製：
JR-032及びコンジュゲートをTriton-X100を含有する希釈バッファー中で1/200に希釈する。
【０２９８】
3) 1mLの4-MUストック溶液((4-メチルウンベリフェロン；0.01mol/L)を、11.5mLのTriton-X100含有バッファー中で希釈することにより標準溶液を調製する(最終濃度800μmol/L)。
【０２９９】
4) 500μLの標準溶液800μmol/Lを、500μLのTriton X100含有バッファー中で希釈して、400μmol/Lの溶液とすることにより、標準溶液の段階希釈液を調製する。このプロセスを繰り返して、以下の希釈液を得る:800、400、200、100、50、25、12.5及び6.25μmol/L。
【０３００】
5) 10μLずつ、ブランク溶液(Triton-X100を含有する希釈バッファー)をマイクロプレートの2つのウェル(n=2)に、標準溶液(6.25μmol/L〜800μmol/L)をマイクロプレートの2つのウェル(n=2)に、試験溶液をマイクロプレートの4つのウェルそれぞれ(n=4)に、各々分配する。
【０３０１】
6) それぞれのウェルに、100μLの基質溶液(4-メチルウンベリフェリル硫酸カリウム塩；0.1%(w/v)Triton X-100及び0.05%(w/v)BSAを含有する5mM酢酸バッファー(pH4.5)中の4-MUS)を添加し、穏やかに混合する。
【０３０２】
7) プレートを覆い、37℃に調整されたインキュベータに置く。
【０３０３】
8) 正確に60分後に、それぞれのウェルに190μLの停止溶液(0.33Mグリシン及び0.21M炭酸ナトリウムpH10.7)を添加し、混合して反応を停止させる。
【０３０４】
9) プレートを蛍光プレートリーダー内にセットし、355nmの励起波長及び460nmの検出波長で蛍光強度を測定する。
【０３０５】
10) 試験間の比較が必要な場合には、参照材料について同じ測定を実施する。
計算方法:
11) 試験ウェル中の4-MUの濃度、Cu(μmol/L)を、以下の式を用いて決定する。
【０３０６】
【数１】
2015536658.tif 000063
【０３０７】
Cu：試験溶液中の濃度(μmol/L)
Cs：標準溶液中の濃度(μmol/L)
Au：試験溶液の蛍光強度
As：標準溶液中の蛍光強度
12) 試験溶液の比活性:以下の式を用いて、試験溶液の比活性、B（mU/mg）を決定する。
【０３０８】
【数２】
2015536658.tif 000064
【０３０９】
C：脱塩試験物質の希釈係数。
【０３１０】
B：比活性(mU/mg)
P：脱塩試験物質中のタンパク質の濃度(mg/mL)。
【０３１１】
結果
リジンコンジュゲートを、対照としてJR-032を用いるin vitro酵素アッセイにかけた。全てのコンジュゲートは、酵素活性を保持する(図20Aを参照されたい)。いくつかの場合には、測定活性はネイティブIDSのそれを超える。これは、タンパク質定量アッセイにおける干渉により生じ得るのであり、より低く算出されるタンパク質濃度及びより高い活性/タンパク質をもたらすか、又は酵素の改変がその活性を正に調節することを示し得る。図20Bは、JR032のin vitroでの酵素活性のさらなる比較(Tween-80を除去するためにQ-セファロースカラム上に通過させる)並びに70-56-2B、70-66-1B及び68-32-2の大規模合成の結果を示す。
【０３１２】
[実施例13]
グリコサミノグリカン(GAG)蓄積アッセイ
プロトコル：
材料：
・II型MPS Hunter線維芽細胞(Coriell institute、GM00298)
・健常ヒト線維芽細胞(Coriell institute、GM05659)
・ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)、ウシ胎児血清(FBS)
・低スルフェートHam's F-12培地(Invitrogen、catalog # 11765-054)
・0.15M NaCl、10000Da MWCOに対し透析されたFBS(Sigma、catalog # F0392)
・35S-硫酸ナトリウム(Perkin-Elmer、catalog # NEX041H002MC)。
方法:
1. 10％ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM中に細胞250,000個/ウェルで6ウェル皿中にMPS II(GM00298)又は健常ヒト線維芽細胞(GM05659)を播種する。
【０３１３】
- 4日間培養する。
【０３１４】
2. - 培地を廃棄し、温かく無菌のPBSで細胞を洗浄する。
【０３１５】
- 10％透析FBS及び10μCi 35S-硫酸ナトリウムを含む1mL/ウェルの低スルフェートF-12培地を添加する。
【０３１６】
- JR-032又はコンジュゲートを添加する。37℃、5％CO2で48時間インキュベートする。
【０３１７】
3. - 培地を廃棄し、冷PBSで細胞を洗浄する(1mL、5回洗浄)。
【０３１８】
- 0.4mL/ウェルの1N NaOH中で細胞を溶解する。
【０３１９】
- 60℃で60分間加熱し、タンパク質を可溶化する。
【０３２０】
- μBCAタンパク質アッセイのため、アリコートを取り出す。
【０３２１】
4. 放射活性を液体シンチレーションカウンタで計数する。
【０３２２】
5. マイクロBCAタンパク質アッセイ。
【０３２３】
データをタンパク質1μg当たりの35S CPMとして表す。
【０３２４】
結果
機能的エンドポイント(functional endpoint)を有する酵素活性を確認するため、コンジュゲートを、MPSII患者由来線維芽細胞におけるGAGレベルを減少させる効率についてアッセイした。4ng/ml(50pM)の濃度で、GAGレベルは、非疾患線維芽細胞において観察されるレベルであって、JR-032について観察されるレベルに類似するレベルまで減少する(図21及び図22を参照されたい)。
【０３２５】
[実施例14]
in situ脳灌流
プロトコル：
Q-セファロースカラムを通過させたJR-032及びコンジュゲートを、Pierce(Rockford、IL)からのヨードビーズキット及びD-Salt Dextran脱塩カラムを用いる標準的手順により放射標識した。2ヨードビーズを、タンパク質のヨード化のために用いた。簡潔に述べると、ビーズを、Whatmanフィルタ上で3mlのPBSで2回洗浄し、60μlのPBS中に再懸濁した。Amersham-Pharmacia Biotech(Baie d'Urfe, Que)からのNa125I(1mCi)を、室温で5minにわたってビーズ懸濁液に添加した。0.1Mリン酸バッファー溶液、pH6.5中に希釈した2mgのタンパク質を添加することにより、JR-032又はコンジュゲートのヨード化を開始させた。室温で10minインキュベートした後、ヨードビーズを除去し、上清を、Pierce(Rockfork、IL)からの5mlの架橋デキストランを予め充填した脱塩カラム上に印加した。125I-タンパク質を10mlのPBSで溶出した。0.5mlの画分を収集し、5μlの各画分中の放射活性をガンマカウンタ(Perkin-Elmer、2470自動ガンマカウンタ)を用いて測定した。125I-タンパク質に対応する画分をプールし、Ringer/Hepes、pH7.4に対して透析した(カットオフ10kDa)。遊離ヨウ素をゲル濾過カラム上で除去し、続いて十分な透析を行った。放射標識後、SEC解析は、90%を超える放射活性が酵素画分に対応する主ピークと関連することを示す。放射性標識されたタンパク質を、Bradfordアッセイ及び標準としてJR-032を用いて分量した。
【０３２６】
Dagenaisら、2000に記載のプロトコルから、実験室でin situマウス脳灌流法を確立した。簡潔に述べると、鎮静させたマウスに手術を実施し、ケタミン/キシラジン(140/8mg/kg)を腹腔内(i.p.)注射した。右総頚動脈を露出させ、分岐のレベルで結紮した。次に、26ゲージ針にマウントされた生理食塩水/ヘパリン(25U/ml)溶液を充填したポリエチレンチューブ(0.30mm内径×0.70mm外径)を用いて、総頚動脈に吻方にカテーテル挿入した。
【０３２７】
手術前、KREBS-重炭酸バッファー-9mMグルコースからなる灌流バッファーを調製し、37℃、pH7.4でインキュベートし、95％O2: 5％CO2で安定化させた。灌流バッファーに添加された放射性標識化合物を含むシリンジを、注入ポンプ(HarvardポンプPHD2000;Harvard apparatus)に載置し、カテーテルに接続した。灌流直前に心臓を切断し、脳を2分間、2.5ml/分の流速で灌流した。JR-032及びコンジュゲートの灌流はすべて、5nMの濃度で実施した。灌流後、脳をトレーサーを含まない溶液で短時間灌流し、血管を30秒間洗い流した。灌流の最後に、マウスをすぐ断頭して犠牲にし、氷上で右半球を単離し、毛細血管除去(capillary depletion)にかける前にRinger/Hepesバッファー中でホモジナイズした。
【０３２８】
毛細血管除去
毛細血管除去法は、トレーサーの毛細血管への結合を除去することにより、脳実質への灌流分子の蓄積の測定を可能にする。毛細血管除去プロトコルは、Trigueroら、1990に記載の方法を適合化させた。デキストランの溶液(35％)を脳ホモジネートに添加して、17.5％の最終濃度を得た。手で十分混合した後、混合物を遠心分離した(10分間、10000rpm)。結果として得られたペレットは主に毛細血管を含有し、上清は脳実質に対応する。
【０３２９】
トレーサーシグナルの判定
ホモジネート、上清、ペレット及び灌流液のアリコートを採取して、放射性標識分子におけるその含有量を測定した。[125I]-試料を、Wizard 1470自動ガンマカウンター(Perkin-Elmer Inc、Woodbridge、ON)で計数した。放射性標識沈殿タンパク質画分を得るため、すべてのアリコートをトリクロロ酢酸(TCA)で沈殿させた。結果を、異なる脳区画について、容積分布(ml/100g/2分)で表す。
【０３３０】
結果
脳透過性に関して、コンジュゲーションが利点を有するかどうかを判定するため、コンジュゲートを放射性ヨウ素標識し、マウスでのin situ脳灌流アッセイにおいて試験した。この実験では、酵素（5nM）を頚動脈を介して送達し、それによって脳に選択的に送達される量を最大化した。2分間の曝露に続いて、脳を生理食塩水で灌流して、循環する酵素を除去した。脳の除去の際、毛細血管除去プロトコルを用いて、毛細血管関連画分と実質画分とに分離した。放射活性を計数し、被験物質の分布容積を定量した。すべての実験においてJR-032を対照として用い、その結果をプールして単一の対照値を生成した。図23及び図24はそれぞれ、単一時点(2分)におけるJR-032及びコンジュゲートの脳での分布を示す。イヌリンに対するJR-032の脳での分布の比較を図25に記載する。図26は、ヨード化されたJR032(Tween-80を除去するためにQ-セファロースカラム上に通過させた)のマウスにおいて行われたさらに2分間のin vivoでの脳透過性試験並びに全脳、毛細血管及び脳実質における70-56-2B、70-66-1B及び68-32-2の大規模合成の結果を提供する。BBBの内部にあるニューロン及びグリア細胞を含む脳実質は、酵素の治療効力のための標的化領域である。70-56-2B、70-66-1B及び68-32-2については、全区画における曝露は、ネイティブ酵素のそれよりも高い。
【０３３１】
[実施例15]
野生型マウスにおけるPK/組織分布
プロトコル：
12週齢のC57Bl6(Jackson Laboratories)マウスに、1mg/kg又は5mg/kgのいずれかの125I酵素を単回iv尾静脈投与により投与した。組織及び血漿を、表5(P:血漿、T:組織)におけるスケジュールに従って収集した。血液を、EDTA被覆マイクロチューブ(マイクロキュベットキャピラリーDi-Kalium EDTA)中に収集した。5000rpmで10分間の遠心分離(Beckman Coulter Microfuge 22R Centrifuge)後、血漿試料を得た。組織収集のために犠牲にするために、氷冷40ml生理食塩水で左心室によりマウスを灌流した(5ml/分、8分)。収集された組織は、脳、肝臓、心臓、肺、皮膚、筋肉、脾臓、腎臓、骨及び軟骨であった。組織を収集し、予め計量したチューブ(Sarstedt 12 x 75mm丸底)中で計量した(Balance Denver Instrument S-403)。血漿(10μL)及び組織中の放射活性レベルを、Wizard 1470自動ガンマカウンタ(Perkin-Elmer Inc, Woodbridge, ON)上でのガンマ計測により計数した。
【０３３２】
【表５】
2015536658.tif 000065
【０３３３】
データの数学的解析を、Excelスプレッドシートを用いて実施した。生データをcpm/mg組織として収集し、ng/gに変換した。血漿試料について、放射活性計数を血漿μg/mlに変換した。薬物動態解析を、WinNonlin Professional version 5.2(Pharsight Corporation, Mountain View, CA)を用いて実施した。
【０３３４】
データを、平均±S.E.M.として表す。全ての統計解析を、GraphPad Prism version 5.0(GraphPad Software Inc., San Diego, CA)を用いて実施した。
【０３３５】
結果
PK解析のために、放射活性計測により血漿中の酵素の量を決定した。血漿濃度対時間曲線を図27に示し、解析されたパラメータに関する値を表6に示す。全ての酵素について、Tmaxは15分で観察される。コンジュゲートについて予測されるように、血漿AUC、及びCmaxはJR-032についてより低いが、クリアランス及び分布容積はより高く、コンジュゲートが血漿から組織により迅速に分配される可能性と一致する。AUC%、又は外挿に基づくAUC∞のパーセントは、全ての酵素について低く、95%を超える全体的血漿曝露がAUC0-48により表されることを示唆している。
【０３３６】
【表６】
2015536658.tif 000066
【０３３７】
1時間、8時間及び48時間での組織中のIDSと比較したコンジュゲートの濃度を図28に示し、脳における全酵素濃度の比較を図29に示す。70-56-2B(図28A)について、濃度は試験した全ての時点で全ての組織についてネイティブIDSのものと類似するか、又はそれより低い。70-66-1B(図28B)について、濃度は、心臓においてはIDSの濃度と類似し、脳、肺、筋肉及び皮膚においてはそれより高く、肝臓、腎臓、脾臓及び骨においてはそれより低い。68-32-2(図28C)については、濃度は、脳及び肺においてはIDSよりも高く、心臓、脾臓、筋肉及び皮膚においては類似し、肝臓、骨及び腎臓においてはわずかに低い。図29に見ることができるように、脳濃度の順位は、68-32-2(最も高い)、次いで、70-66-1B及び70-56-2Bである。この順位は、図26に示されるマウス脳透過性試験において観察されるものと一致し、in situ脳灌流技術が脳曝露を高度に予測することを示唆している。JR-032及びコンジュゲートに関するAUC値、並びに比率(コンジュゲート：JR-032)を、表7に見出すことができる。
【０３３８】
【表７】
2015536658.tif 000067
【０３３９】
3つのコンジュゲートに関する血漿AUC値は、JR-032のものよりもわずかに低く、血漿から組織への分布はLRP-1受容体媒介性トランスサイトーシスにより加速されると考えられることを考慮すれば、予想される結果である。
【０３４０】
1つのコンジュゲート70-56-2Bは、試験した他のコンジュゲートと比較してはるかにより高い分布容積を示した；22対12〜15ml。この結果は、コンジュゲーションが酵素の薬物動態に対する効果を有することを示唆する。しかしながら、本発明者らの試験において検査した9つの組織は70-56-2Bに対する高い曝露を受けたため、この値の原因となる組織区分は未知である。
【０３４１】
その他のコンジュゲート、70-66-1B及び68-32-2は、ネイティブJR-032について得られたレベルよりも単回iv投与後により高い脳レベルを示すことが示された。より特には、70-66-1Bは、より早い時点でのネイティブJR-032よりも脳におけるより高いレベルの曝露を達成した。最も高い脳曝露は、68-32-2について観察され、そのAUC0-∞はネイティブJR-032のそれの2.5倍であった。より高い脳レベルの達成は、この場合、血漿安定性を増強し、それによって、脳に供給される血液が薬物を含有する時間量を増大させることによって明らかに達成されなかったため、血漿レベルがネイティブ酵素と比較して増加するという事実は注目に値する。
【０３４２】
[実施例16]
雄の野生型及び雄の半接合体イズロン酸-2-スルファターゼノックアウトマウスにおける組織分布
プロトコル
追加の組織分布試験を、表8にまとめたように行った。それぞれの段階で、マウスは、尾静脈へのボーラス注射により1mg/kgの標的用量レベルでリン酸緩衝生理食塩水中の[125I]JR032、[125I]70-66-1B又は[125I]68-32-2溶液のいずれかの単回静脈内投与を受けた。それぞれの動物により受容された放射活性用量を、投与された用量製剤の重量及びその放射活性濃度から算出した。
【０３４３】
【表８】
2015536658.tif 000068
【０３４４】
定量的組織分布(段階A、C及びE)
個々のマウスを、放血(イソフルラン/酸素麻酔下での心穿刺)させ、表に列挙された時間に殺傷(頸椎脱臼)した。犠牲後、脳、心臓、肝臓、肺、腎臓(皮質)、筋肉(脚外転筋)、皮膚、骨(骨髄を含む大腿骨)及び脾臓を含むそれぞれの残骸から、いくつかの組織/臓器を取り出すか、又は試料化(必要に応じて)した。全放射活性濃度の測定のために、血漿のアリコート(約0.05g)も取った。それぞれの試料の重量及び放射活性濃度を測定した。
【０３４５】
4分に予め設定された計測様式でCOBRA IIガンマシンチレーションカウンタ(Model 5003)を用いて、放射活性濃度を測定した。60日の半減期並びに[125I]JR032については2013年4月3日、[125I]70-66-1Bについては2013年4月11日及び[125I]68-32-2については2013年4月15日の参照日を用いるガンマカウンタコンピュータソフトウェアにより、全計数を逆算した。試験試料のバッチ毎にブランク「バックグラウンド」崩壊速度を測定し、各試料から崩壊速度を減算した。調査下の試料におけるバックグラウンド濃度の放射活性の2倍未満の量の放射活性を、正確な定量化の限界以下(BLQ)であると考えた。
【０３４６】
結果
投与後1時間及び8時間での脳、心臓、肝臓、肺、腎臓(皮質)、筋肉(脚外転筋)、皮膚、骨(骨髄を含む大腿骨)及び脾臓におけるJR-032と比較したコンジュゲートの濃度を、図30に示す。1時間での70-66-1Bについては、濃度は、心臓、肝臓、肺、脾臓及び骨においてIDSより低く、脳、筋肉及び皮膚においてはIDSと類似し、腎臓皮質においてIDSよりわずかに高かった。JR-032及びコンジュゲートの濃度は、8時間でそれぞれの組織においてより低かった(8時間での肝臓におけるJR-032を除く)。しかしながら、JR-032に対するコンジュゲートの比較レベルは類似していた(しかし、70-66-1Bは8時間での腎臓皮質におけるIDSよりも低かった)。
【０３４７】
1時間での血漿におけるコンジュゲートの濃度は、JR-032のそれよりも低かったが、これは、血漿から組織への分布がLRP-1受容体媒介性トランスサイトーシスにより加速されると考えられることを考慮すれば、予想される結果である。8時間で、血漿中でのJR-032及びコンジュゲートの濃度は類似していた。
【０３４８】
全身オートラジオグラフィー(段階B、D及びF)
半接合体IDSノックアウトマウス(n=4匹の動物/段階)への[125I]JR032(段階B)、[125I]70-66-1B(段階D)又は[125I]68-32-2(段階F)の単回静脈内用量の投与後、個々のマウスをイソフルランを用いて麻酔し、表に列挙された時点で右目の眼窩静脈叢から全血試料を収集した。
【０３４９】
各血液試料(約0.2mL)を、ヘパリン抗凝固剤を含有するチューブに移し、最小限の遅延で遠心分離(約4℃で10分間、約2000×「g」)し、分離された血漿をプレーンチューブに移した。血液細胞を廃棄した。
【０３５０】
依然として麻酔下にしながら、マウスをボードにピンで刺し、約-80℃でヘキサン/固体CO2の浴中で凍結することによって殺傷した。ヒゲ、脚及び尾を除去した後、それぞれの凍結された残骸を約-80℃で2%(w/v)水性カルボキシメチルセルロースのブロック中にセットした。
【０３５１】
7つの異なる濃度の放射活性を含有する強化ヒト血液の試料([125I]JR032(段階B)、[125I]70-66-1B(段階D)及び[125I]68-32-2(段階F)の放射標識溶液を、健康なヒトボランティアから得られた全血に添加して、0.50、1.0、2.5、5、100、1000及び2000nCi/mLの名目濃度を生成することにより得られる)を、補正線を構築するために用いられるブロック中にドリルで開けられた穴に入れた。
【０３５２】
ブロックを、約-20℃に維持された低温保持装置中のミクロトームのステージに載置した。次いで、矢状断面(名目上30μm)を、残骸を通して6つのレベルで得た：
レベルA：腎臓
レベルB：眼窩内涙腺
レベルC：ハーダー腺
レベルD：副腎
レベルE：半脳及び甲状腺
レベルF：脳及び脊髄。
【０３５３】
切片化テープ上に載置した切片を、Heto Power LL3000凍結乾燥機を用いて-55℃の平均温度で凍結乾燥機中で凍結乾燥した。各レベルからの1つの切片を、銅鉛線曝露ボックス中のイメージングプレート(Raytek Scientific Ltd, Sheffield UK)に7日間曝露した。イメージング位置を、FLA5000ラジオルミノグラフィーシステム(Raytek Scientific Ltd, Sheffield, UK)を用いて走査した。電子イメージを、検証されたイメージ解析パッケージ(Seescan Densitometryソフトウェア、バージョン1.3)を用いて解析した。
【０３５４】
定量化された切片と同一である、各レベルでの1つの複製凍結乾燥切片を、アセテートシート上に載置し、イメージを評価する時の視覚的参考目的で用いた。
【０３５５】
放射活性の濃度を、脳、肝臓及び甲状腺を含むいくつかの組織において定量した。これらの組織について、1つのオートラジオグラム内の各組織の最大領域を、測定のために定義した。この手順における定量化の上限及び下限を、表9に与える。
【０３５６】
【表９】
2015536658.tif 000069
【０３５７】
結果
図31は、血漿、脳、肝臓及び甲状腺における0.5時間、1時間、4時間及び24時間でのJR-032、70-66-1B及び68-32-2の濃度を示す。脳においては、両コンジュゲートの濃度は、0.5時間でJR-032よりも高かった。JR-032及び両コンジュゲートの濃度は、より後の時点ではより低かった。さらに、両コンジュゲートの濃度は、1時間及び24時間ではJR-032よりも低く、4時間では類似していた。JR-032及びコンジュゲートのレベルは、脳におけるよりも肝臓及び甲状腺においてはるかにより高く、JR-032に対するコンジュゲートの比較レベルは脳について観察されたパターンとは有意に異なっていた。
【０３５８】
表10は、15%水性TCAを用いて沈降させた血漿試料中の放射活性のパーセンテージを示す。これは、JCR-032又はコンジュゲートなどのタンパク質と会合した放射活性ヨウ素同位体のパーセンテージを示す。
【０３５９】
【表１０】
2015536658.tif 000070
【０３６０】
[実施例17]
JR-032及びコンジュゲートのプロセッシング
イズロン酸-2-スルファターゼ(90kDa)は、線維芽細胞中で、様々な中間体を通して主要な55kDaの中間体に、次いで、45kDaの成熟形態にプロセッシングされる(Froissartら、Biochem J.309:425-430, 1995)。コンジュゲートが、コンジュゲートされていない酵素と同様の様式でプロセッシングされたかどうかを判定するために、ANG3402及びANG3403の試料を解析し、ウェスタンブロットによりJR-032の試料と比較した。
【０３６１】
結果
図32A及び図32Bに示されるように、ANG3402及びANG3403は、コンジュゲートされていない酵素と同様にプロセッシングされる。この結果は、MPS-II線維芽細胞中でプロセッシングされたANG3402及びANG3403及びJR-032の試料を比較することにより確認された(図33)。JR-032又はコンジュゲートの見かけのプロセッシングは、図34に示されるように血漿中で起こらなかった。
【０３６２】
[実施例18]
半接合体イズロン酸-2-スルファターゼノックアウトマウスにおける脳、心臓及び肝臓中でのGAG蓄積に対するコンジュゲートの効果
プロトコル
21〜23週齢の雄の半接合体イズロン酸-2-スルファターゼ遺伝子ノックアウトマウス(Oriental BioService Inc.; Minamiyamashiro Laboratoryにより供給された)に、表11に従って4週間にわたって週1回、尾静脈への注射により投与した。雄の野生型動物(23週齢)を、対照として試験群1において用いた。
【０３６３】
【表１１】
2015536658.tif 000071
【０３６４】
JR-032、68-32-2又は70-66-1Bを、ビヒクル(0.22μM滅菌注射筒を用いて濾過された8g/Lの塩化ナトリウム、2.65g/Lのリン酸二水素ナトリウム、1.07gのリン酸水素ナトリウム水和物(5.86〜6.14の範囲のpH))中で投与した。試験群3においては、ビヒクルのみを投与した。
【０３６５】
4週間の投与の完了の1週間後に、生存する動物を、20%イソフルラン麻酔下で腹部大動脈から出血させることにより安楽死させ、脳(大脳及び小脳)、心臓及び肝臓を取り出し、液体窒素を用いて凍結した。凍結された組織を凍結乾燥し、小片に切断し、計量した。溶液の全添加量が組織乾燥重量100mgあたり1mlとなるように、50mg/mLアクチナーゼEを含有する0.5mol/L tris HClバッファー溶液(pH7.5)を添加した。混合物を、乾燥浴インキュベータを用いて100℃で10分間加熱した。次いで、組織乾燥重量とアクチナーゼEの比が10mg〜1mgとなるように、50mg/mLアクチナーゼEを含有するさらなる0.5mol/L tris HClバッファー溶液(pH7.5)を添加し、混合物を乾燥加熱滅菌装置を用いて60℃で約16時間インキュベートした。次いで、混合物を乾燥浴インキュベータを用いて100℃で10分間加熱した後、24℃で約20400gで10分間遠心分離した。上清を除去し、12時間を超えて凍結させた。次いで、室温で上清を解凍し、24℃で約20400gで10分間、再度遠心分離した。上清を除去し、凍結させた。
【０３６６】
Wieslab(登録商標)sGAG定量キット(EURO-DIAGNOSTICA)を用いて、各組織からの50μlの試料、50μlのブランク試料(注射用水)及び50μlの較正試料(640μg/ml、320μg/ml、160μg/ml、80μg/ml、40μg/ml及び20μg／mlの濃度の、注射用水中のコンドロイチン硫酸Bナトリウム塩溶液)中で2回、GAG濃度を測定した。
【０３６７】
簡潔に述べると、50μlの8Mグアニジン-HClを各試料に添加し、混合物を室温で15分間反応させた。次いで、50μlのSAT溶液(0.3%H2SO4及び0.75%Triton X-100)を添加し、混合物を室温で15分間反応させた。750μlのAlcian Blue希釈標準溶液(9:5:1の比の注射用水、SAT溶液及びAlcian Blueストック溶液(0.1%H2SO4及び0.4MグアニジンHCl)を混合することにより調製される)を各試料に添加し、混合物を室温で15分間反応させた。次いで、試料を24℃で15分間、12600gで遠心分離し、上清を廃棄した。500μlのDMSO溶液(40%ジメチルスルホキシド及び0.05M MgCl2)をチューブに添加し、チューブの内容物を室温で15分間ミキサーで撹拌した後、24℃で15分間、12600gで遠心分離した。上清を廃棄し、500μlのGu-Prop(4Mグアニジン-HCl、33% 1-プロパノール及び0.25%Triton X-100)を各試料に添加した。チューブを室温で15分間ミキサーで撹拌し、沈降物を完全に溶解した。200μlの各試料を、96穴マイクロプレート中のウェルに分注した。マイクロプレートリーダーを用いて、600nmの波長で吸光度値を得た。GAG濃度を、解析ソフトウェア(KC4 v3.4 DS Pharma Biomedical Co., Ltd.)を用いる線形方法により算出した。GAG濃度の2回の測定の平均値(μg/ml)を算出した。
【０３６８】
較正試料のGAG濃度の精度を算出した。精度及び相関係数が評価基準内になかった場合、組織試料中のGAG濃度を算出しなかった(精度に関する評価基準：変動係数は15%以内(20μg/mlの試料については20%以内)である)。相関係数に関する評価基準：0.997以上(小数点4位で四捨五入)。
【０３６９】
組織試料中で測定されたGAG濃度を、以下の式：
【０３７０】
【数３】
2015536658.tif 000072
【０３７１】
(式中、
[GAG]d = 乾燥組織中のGAG濃度(μg/mL)
[GAG]s = 試料中のGAG濃度(μg/mL)
A = 添加量(ml)
W = 乾燥組織重量(mg)
である)
により各組織の乾燥重量中での濃度に変換した。
【０３７２】
結果
肝臓(図35A)及び心臓(図35B)において、GAG濃度は、ビヒクルのみを投与された半接合体ノックアウトマウスと比較して、JR-032又はコンジュゲートを投与された半接合体ノックアウトマウスにおいて有意に低かった。ビヒクル又はJR-032若しくはコンジュゲートを投与された半接合体マウスにおける脳組織中ではGAG濃度の有意差は観察されなかった(図35C)。
【０３７３】
[実施例19]
半接合体イズロン酸-2-スルファターゼノックアウトマウスの脳におけるGAG蓄積に対するコンジュゲートの効果
プロトコル
18週齢(受領時)の雄の半接合体イズロン酸-2-スルファターゼ遺伝子ノックアウトマウス(Oriental BioService Inc.; Minamiyamashiro Laboratory)に、表12に従って8週間にわたって週に2回、尾静脈への注射により5mL/kg体重の容量で投与した。雄の野生型動物(18週齢)を、対照として試験群1において用いた。
【０３７４】
【表１２】
2015536658.tif 000073
【０３７５】
JR-032、68-32-2又は70-66-1Bを、ビヒクル(20mMリン酸ナトリウム、137mM NaCl、pH6)中で投与した。試験群2においては、ビヒクルのみを投与した。
【０３７６】
8週間の投与の完了の1週間後、右心房を20%イソフルラン麻酔下で切開し、約30mLの生理食塩水を注射筒と針を用いて左心室から灌流した。灌流後、脳(大脳及び小脳)を取り出した。脳を右脳と左脳とに分割した。右脳を計量及び凍結し、左脳を10%中性緩衝化ホルマリン中に含浸させた。
【０３７７】
固定された左脳を矢状に整え、パラフィン中に包埋させた。パラフィン包埋された組織標本を、ミクロトームを用いて切片化して、約0.96+/-0.24mmの側面(切片の厚さ：4μm)上で5つの切片を得た。2つの切片を、H&E及びLAMP-1を用いる染色のために用いた。
【０３７８】
凍結組織を凍結乾燥(FZ-Compact, Asahi Life Science Co, Ltd.)し、小片に切断し、計量した。溶液の全添加量が組織乾燥重量100mgあたり1mlとなるように、50mg/mLアクチナーゼEを含有する0.5mol/Lのtris HClバッファー溶液(pH7.5)を添加した。混合物を、乾燥浴インキュベータを用いて100℃で10分間加熱した。次いで、組織の乾燥重量とアクチナーゼEとの比率が50mg〜1mgとなるように、50mg/mLアクチナーゼEを含有するさらなる0.5mol/Lのtris HClバッファー溶液(pH7.5)を添加し、混合物を乾燥加熱滅菌装置を用いて60℃で約16時間インキュベートした。次いで、混合物を乾燥浴インキュベータを用いて100℃で10分間加熱した後、24℃で10分間、約20400gで遠心分離した。上清を除去し、12時間を超えて凍結した。次いで、上清を室温で解凍し、24℃で10分間、約20400gで再度遠心分離した。上清を除去し、凍結した。
【０３７９】
Wieslab(登録商標)sGAG定量キット(EURO-DIAGNOSTICA)を用いて、脳からの50μlの試料、50μlのブランク試料(注射用水)及び50μlの較正試料(640μg/ml、320μg/ml、160μg/ml、80μg/ml、40μg/ml及び20μg／mlの濃度の、注射用水中のコンドロイチン硫酸Bナトリウム塩溶液)中で2回、GAG濃度を測定した。
【０３８０】
簡潔に述べると、50μlの8Mグアニジン-HClを各試料に添加し、混合物を室温で15分間反応させた。次いで、50μlのSAT溶液(0.3%H2SO4及び0.75%Triton X-100)を添加し、混合物を室温で15分間反応させた。750μlのAlcian Blue希釈標準溶液(9:5:1の比の注射用水、SAT溶液及びAlcian Blueストック溶液(0.1%H2SO4及び0.4MグアニジンHCl)を混合することにより調製される)を各試料に添加し、混合物を室温で15分間反応させた。次いで、試料を24℃で15分間、12600gで遠心分離し、上清を廃棄した。500μlのDMSO溶液(40%ジメチルスルホキシド及び0.05M MgCl2)をチューブに添加し、チューブの内容物を室温で15分間ミキサーで撹拌した後、24℃で15分間、12600gで遠心分離した。上清を廃棄し、500μlのGu-Prop(4Mグアニジン-HCl、33% 1-プロパノール及び0.25%Triton X-100)を各試料に添加した。チューブを室温で15分間ミキサーで撹拌し、沈降物を完全に溶解した。200μlの各試料を、96穴マイクロプレート中のウェルに分注した。マイクロプレートリーダーを用いて、600nmの波長で吸光度値を得た。GAG濃度を、解析ソフトウェア(KC4 v3.4 DS Pharma Biomedical Co., Ltd.)を用いる線形方法により算出した。GAG濃度の2回の測定の平均値(μg/ml)を算出した。
【０３８１】
較正試料のGAG濃度の精度を算出した。精度及び相関係数が評価基準内になかった場合、組織試料中のGAG濃度を算出しなかった(精度に関する評価基準：変動係数は15%以内(20μg/mlの試料については20%以内)である)。相関係数に関する評価基準：0.997以上(小数点4位で四捨五入)。
【０３８２】
脳試料中で測定されたGAG濃度を、以下の式：
【０３８３】
【数４】
2015536658.tif 000074
【０３８４】
(式中、
[GAG]d = 乾燥組織中のGAG濃度(μg/mL)
[GAG]s = 試料中のGAG濃度(μg/mL)
A = 添加量(ml)
W = 乾燥組織重量(mg)
である)
により脳の乾燥重量中での濃度に変換した。
【０３８５】
結果
図36は、各コンジュゲートに関する各用量でのGAG減少を示すグラフである(JR-32について達成された減少のパーセンテージとして表す)。実施例17に記載の試験において同じコンジュゲートにより達成されたGAG減少を、比較のためにこのグラフ中に含有させる。
【０３８６】
他の実施形態
本明細書で言及したすべての特許、特許出願、及び刊行物は、2012年11月30日出願の米国仮出願番号第61/732,145号及び2013年6月6日出願の米国仮出願番号第61/831,919号を含め、それぞれの独立した特許、特許出願、又は刊行物を参照により組み込むと具体的且つ個別に示した場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【図１】
2015536658.tif 000092
【図２】
2015536658.tif 000093
【図３】
2015536658.tif 000094
【図４】
2015536658.tif 000095
【図５】
2015536658.tif 000096
【図６】
2015536658.tif 000097
【図７】
2015536658.tif 000098
【図８】
2015536658.tif 000099
【図９Ａ】
2015536658.tif 000100
【図９Ｂ】
2015536658.tif 000101
【図９Ｃ】
2015536658.tif 000102
【図１０Ａ】
2015536658.tif 000103
【図１０Ｂ】
2015536658.tif 000104
【図１１】
2015536658.tif 000105
【図１２】
2015536658.tif 000106
【図１３】
2015536658.tif 000107
【図１４】
2015536658.tif 000108
【図１５】
2015536658.tif 000109
【図１６】
2015536658.tif 000110
【図１７】
2015536658.tif 000111
【図１８】
2015536658.tif 000112
【図１９】
2015536658.tif 000113
【図２０Ａ】
2015536658.tif 000114
【図２０Ｂ】
2015536658.tif 000115
【図２１】
2015536658.tif 000116
【図２２】
2015536658.tif 000117
【図２３】
2015536658.tif 000118
【図２４Ａ】
2015536658.tif 000119
【図２４Ｂ】
2015536658.tif 000120
【図２４Ｃ】
2015536658.tif 000121
【図２４Ｄ】
2015536658.tif 000122
【図２５】
2015536658.tif 000123
【図２６】
2015536658.tif 000124
【図２７−１】
2015536658.tif 000125
【図２７−２】
2015536658.tif 000126
【図２８Ａ】
2015536658.tif 000127
【図２８Ｂ】
2015536658.tif 000128
【図２８Ｃ】
2015536658.tif 000129
【図２９】
2015536658.tif 000130
【図３０】
2015536658.tif 000131
【図３１】
2015536658.tif 000132
【図３２Ａ】
2015536658.tif 000133
【図３２Ｂ】
2015536658.tif 000134
【図３３】
2015536658.tif 000135
【図３４】
2015536658.tif 000136
【図３５Ａ】
2015536658.tif 000137
【図３５Ｂ】
2015536658.tif 000138
【図３５Ｃ】
2015536658.tif 000139
【図３６】
2015536658.tif 000140
【配列表】
2015536658000001.app
【国際調査報告】
2015536658.tif 000141
2015536658.tif 000142
2015536658.tif 000143
2015536658.tif 000144
2015536658.tif 000145
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