(57)【要約】本発明は、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療のための方法および組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＯＰＤでの老化および炎症を予防または治療を必要とする被験者においてＣＯＰＤにおける老化および炎症を予防または治療するための方法であって、該被験者に、ＰＧＥ２レセプターアンタゴニスト、ＰＧＥ２レセプター発現阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ＣＯＸ−２発現阻害剤、プロスタグランジンＥ２シンターゼ阻害剤またはプロスタグランジンＥ２シンターゼ発現阻害剤からなる群より選択される化合物を投与するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記ＰＧＥ２レセプターアンタゴニストは、ＥＰ２アンタゴニストまたはＥＰ４アンタゴニストから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＧＥ２レセプターアンタゴニストは、ＡＨ−６８０９またはＧＷ６２７３６８Ｘから選択され、前記ＣＯＸ−２阻害剤は、インドメタシンまたはセレコキシブから選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ＣＯＰＤでの老化および炎症の予防または治療を必要とする被験者におけるＣＯＰＤにおける老化および炎症の予防または治療のための薬物として使用するための候補化合物をスクリーニングする方法であって：
−  ＰＧＥ２、ＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２、プロスタグランジンＥ２シンターゼを提供するステップ、ＰＧＥ２レセプターを発現している細胞、組織試料または生物を提供するステップと、
−  小有機分子、プロスタグランジンアナログ、抗体、ペプチドまたはポリペプチドなどの候補化合物を提供するステップと、
−  ＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２またはプロスタグランジンＥ２シンターゼの活性を測定するステップと、
−  ＰＧＥ２レセプターを遮断する、ＰＧＥ２レセプターの発現を阻害する、ＣＯＸ−２の活性を阻害する、ＣＯＸ−２の発現を阻害する、プロスタグランジンＥ２シンターゼの活性を阻害する、または、プロスタグランジンＥ２シンターゼの発現を阻害する候補化合物をポジティブ選択するステップと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、慢性閉塞性肺疾患の予防または治療方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
現在アメリカ合衆国およびヨーロッパにおける第４位の死因である慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）は、２０２０年までに第３位の死因になるであろう（Mannino and Buist. Lancet 2007; 370: 765-773）。喫煙が最も重大な原因であり、疾患経過の初期における禁煙は肺機能が失われる速度を下げることができる（Wagena et al. Respir Med 2004; 98: 805-815）。禁煙にもかかわらず持続する肺の異常炎症応答（Yoshida and Tuder. Physiol Rev 2007; 87: 1047-1082）がＣＯＰＤの特徴である。この炎症は、ＣＯＰＤの病理発生および進行に大きな役割を果たすと考えられている（Yoshida and Tuder. Physiol Rev 2007; 87: 1047-1082）。しかし、その特徴は十分には定義されていない。
【０００３】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を予防または治療するために適切な新薬を開発する必要がある。このように、ＣＯＰＤにおける新しい治療ターゲットの特徴づけが極めて望ましい可能性があることが示唆されている。
【０００４】
細胞老化は、組織再生を制限して加齢過程に関与する不可逆的な成長停止状態である（Campisi. Cell 2005; 120: 513-522）。老化は、連続的な細胞複製の間のテロメア短縮に繋がる、または、過酸化水素もしくはタバコ煙などのストレッサーによってトリガーされる場合がある（Campisi. Cell 2005; 120: 513-522）（それぞれ複製老化および早期細胞老化（accelerated senescence））。両方の種類の老化は、ＡＴＭ／ＡＴＲ−ｐ５３経路およびｐ１６−網膜芽腫タンパク質（ｐＲｂ）経路の一方または両方を経由して誘導されうる（Kim and Sharpless. Cell 2006; 127: 265-275）。重要なことに、老化細胞は、遺伝子発現に多数の変化を示し、細胞環境に著しく影響しうる多くの炎症性メディエーターの分泌を含む複合表現型（老化関連分泌表現型、ＳＡＳＰ）を獲得する（Coppe et al. Annu Rev Pathol 2010; 5: 99-118）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
肺線維芽細胞の老化は、重症ＣＯＰＤの患者で記載されており（Muller et al. Respir Res 2006; 7: 32）、この過程はＣＯＰＤの病理発生に関与すると提唱されている。しかし、ＣＯＰＤにおける線維芽細胞老化のメカニズム（Nyunoya et al. Am J Respir Crit Care Med 2009; 179: 279-287）およびＣＯＰＤと炎症との関係に関して入手可能なデータは不足している。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の概要：
本発明は、ＣＯＰＤの予防または治療を必要とする被験者におけるＣＯＰＤの予防または治療に使用するための、ＰＧＥ２レセプターアンタゴニスト、ＰＧＥ２レセプター発現阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ＣＯＸ−２発現阻害剤、プロスタグランジンＥ２シンターゼ阻害剤またはプロスタグランジンＥ２シンターゼ発現阻害剤からなる群より選択される化合物に関する。
【０００７】
発明の詳細な説明：
ＣＯＰＤに果たすＰＧＥ２の役割は、本発明者らによってＣＯＰＤ線維芽細胞、ＰＧＥ２、ならびにＰＧＥ２レセプターであるＥＰ２およびＥＰ４のアンタゴニストを使用して研究された。本発明者らは、ＣＯＰＤ線維芽細胞が、非喫煙者対照よりも高いレベルのＰＧＥ２、ＰＧＥ２合成酵素ｍＰＧＥ２およびＰＧＥ２レセプターＥＰ４、ならびに喫煙者対照および非喫煙者対照の両方よりも高いレベルのＰＧＥ２レセプターＥＰ２を示すことを見いだした。本発明者らは、また、ＰＧＥ２が線維芽細胞に早期細胞老化および関連炎症を誘導すること、ならびにＰＧＥ２の炎症効果が老化誘導に二次的なこと、ならびにこれらの効果が非喫煙者対照線維芽細胞および喫煙者対照線維芽細胞よりもＣＯＰＤ線維芽細胞において重要であることを実証した。本発明者らは、また、ＰＧＥ２がマウス肺に老化および関連炎症を誘導することを実証した。このように、ＰＧＥ２は、ＣＯＰＤにおける老化および炎症の新しいメディエーターである。したがって、ＰＧＥ２の合成またはＰＧＥ２レセプターの遮断は、ＣＯＰＤにおける老化および炎症を克服するための新しい薬理学的アプローチとなる。
【０００８】
治療方法および使用
したがって、本発明は、ＣＯＰＤの予防または治療を必要とする被験者におけるＣＯＰＤの予防または治療に使用するための、ＰＧＥ２レセプターアンタゴニスト、ＰＧＥ２レセプター発現阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ＣＯＸ−２発現阻害剤、プロスタグランジンＥ２シンターゼ阻害剤またはプロスタグランジンＥ２シンターゼ発現阻害剤からなる群より選択される化合物に関する。
【０００９】
本明細書に使用される用語「被験者」は、哺乳類を意味する。本発明の好ましい一態様では、本発明による被験者は、ＣＯＰＤに苦しむまたは苦しむリスクのある任意の被験者（好ましくはヒト）を指す。
【００１０】
本発明の方法は、慢性気管支炎（気道閉塞、気腫を伴う、喘息性（閉塞性）、気腫性、）；慢性閉塞性（喘息、気管支炎、気管気管支炎）；急性下気道感染を伴う慢性閉塞性肺疾患；急性増悪を伴う慢性閉塞性肺疾患；慢性閉塞性肺疾患（慢性気管支炎：喘息性（閉塞性）ＮＯＳ、気腫性ＮＯＳ、閉塞性ＮＯＳ）；慢性閉塞性肺疾患（慢性閉塞性：気道疾患ＮＯＳ、肺疾患ＮＯＳ）の群より選択される、世界保健機関のＣＯＰＤ分類（the World Health Organisation Classification of COPD）で改訂されたような任意の種類のＣＯＰＤについて実施できる。
【００１１】
特定の一態様では、本発明による化合物は、ＣＯＰＤでの老化および炎症の予防または治療を必要とする被験者におけるＣＯＰＤでの老化および炎症の予防または治療に使用することができる。
【００１２】
本明細書に使用される用語「ＰＧＥ２」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、プロスタグランジンＥ２を指す。
【００１３】
用語「ＰＧＥ−２レセプター」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＰＧＥ−２レセプターＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３およびＥＰ４を指す（Narumiya et al. (1999), Physiol. Rev. 79(4): 1193-226）。
【００１４】
用語「ＣＯＸ−２」および「ＰＴＧＳ２」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ＰＧＥ−２前駆体であるＰＧＨ２の合成を担うシクロオキシゲナーゼ−２を指す（Iyer et al. (2009), Expert Opin. Ther. Targets 13(7): 849-865）。
【００１５】
用語「ＰＧＥＳ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、プロスタグランジンＥ２シンターゼを表す。用語「ＰＧＥＳ」は、ミクロソームプロスタグランジンＥ２シンターゼ（ｍＰＧＥＳ−１およびｍＰＧＥＳ−２）および細胞質プロスタグランジンＥ２シンターゼ（ｃＰＧＥＳ）などの、ＰＧＥ２合成を担う酵素を指す。
【００１６】
遺伝子または核酸の発現の文脈で使用されるときの用語「発現」は、遺伝子内に含まれる情報の遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接転写産物（例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡもしくは任意の他の種類のＲＮＡ）か、ｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質かの場合がある。遺伝子産物には、また、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化およびエディティングのようなプロセスによって修飾されたメッセンジャーＲＮＡと、例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって改変されたタンパク質（例えばＰＧＥ−２レセプターまたはＣＯＸ−２）とが含まれる。
【００１７】
「発現阻害剤」は、遺伝子の発現を阻害するための生物学的効果を有する天然または合成化合物を指す。
【００１８】
用語「ＰＧＥ２レセプターアンタゴニスト」は、ＰＧＥ２レセプターを選択的に遮断または不活性化する化合物を表す。本明細書に使用される用語「選択的に遮断または不活性化する」は、他のサブタイプまたはアイソフォームのＰＧレセプターファミリーとの相互作用よりもそれぞれ大きな親和性および効力で優先的にＰＧＥ２レセプターと結合し、ＰＧＥ２レセプターを遮断または不活性化する化合物を表す。ＰＧＥ２レセプターを好むが、部分または完全アンタゴニストとして他のＰＧレセプターサブタイプも遮断または不活性化しうる化合物が考えられている。「ＰＧＥ２レセプターアンタゴニスト」は、ＰＧＥ２と高い親和性および特異性で結合する能力を有する化合物またはＰＧＥ２と競合する化合物などの、ＰＧＥ２レセプターへのＰＧＥ２の結合を阻害する化合物にもありうる。典型的には、ＰＧＥ２レセプターアンタゴニストは、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アプタマーまたは抗体である。
【００１９】
本発明の一態様では、ＰＧＥ２レセプターアンタゴニストは、ＥＰ１アンタゴニスト、ＥＰ２アンタゴニスト、ＥＰ３アンタゴニストまたはＥＰ４アンタゴニストより選択される。
【００２０】
本発明の一態様では、ＰＧＥ２レセプターアンタゴニストには、ＥＰ１アンタゴニスト：ＯＮＯ−８７１１、ＳＣ−１９２２０、ＡＨ−６８０９、ＳＣ−５１３２２、ＺＤ−４９５３、ＺＤ−６４１６、ＺＤ−６８４０、国際公開公報第０３／０８４９１７号に記載のＳＣ−５１０８９；ＥＰ２アンタゴニスト：ＡＨ６８０９、ＰＦ−０４４１８９４８および米国特許第１１，８９６，９２２号、同第１１，８９６，９２３号、同第１２，１４２，０５８号、同第１２，１７１，３６５号に記載の化合物；ＥＰ３アンタゴニスト：ＤＧ−０４１（２，３−ジクロロチオフェン−５−スルホン酸、３−［１−（２，４−ジクロロベンジル）−５−フルオロ−３−メチル−１Ｈ−インドール−７−イル］アクリロイルアミド）（Heptinstall et al. (2008), Platelets, 19(8): 605-613）；ならびにＥＰ４アンタゴニスト：ＧＷ６２７３６８Ｘ、ＡＨ２３８４８Ｂ、Ｌ−１６１９８２、ＡＨ２２９２１Ｘ、ＥＰ４ＲＡ、ω−置換プロスタグランジンＥ誘導体、５−チア−プロスタグランジンＥ誘導体、ＯＮＯ−ＡＥ３−２０８（４−｛４−シアノ−２−［２−（４−フルオロナフタレン−１−イル）プロピオニルアミノ］フェニル｝酪酸）、米国特許第１０，５４５，４７８号、同第１２，７５２，１７９号、国際特許公報である国際公開公報第００／１５６０８号、国際公開公報第０１／４２２８１号、国際公開公報第００／１８７４４号、国際公開公報第００／０３９８０号、国際公開公報第０１／１０４２６号、国際公開公報第００／２１５３２号、国際公開公報第００／１８４０５号、国際公開公報第０１／７２３０２号に記載のペプチドおよび化合物（Fukuda et al. (2007), Acta Obstet. Gynecol. Scand. 86(11): 1297-302）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
本発明の一態様では、ＰＧＥ２レセプターアンタゴニストは、ＰＧＥ２結合タンパク質（米国特許第１２，４９９，６４６号）、プロスタグランジンアナログ、または、米国特許第３，７４９，７７６号、同第４，００４，０２７号、同第５，４４９，６７３号、同第５，３９３，７４７号に記載の化合物より選択することができる。
【００２２】
本発明のＰＧＥ２レセプターアンタゴニストは、ＰＧＥ２またはＰＧＥ２レセプターに対する抗体または抗体フラグメントからなる場合がある。
【００２３】
ＰＧＥ２に対する抗体の例は、１９Ｃ９、４Ｆ１０、１５Ｆ１０、Ｋ１Ｂ、Ｋ７Ｈ、Ｋ３Ａ、Ｌ１１、Ｌ２１、２Ｂ５−７．０、２Ｂ５−８．０もしくは２Ｂ５−９．０、または、これらの変異体を含むが、これらに限定されない。一態様では、変異体は、米国特許第１２，４９９，６４６号記載のＨｕ２Ｂ５．Ｐ１またはＨｕ２Ｂ５．Ｐ２などのヒト化変異体である。
【００２４】
用語「ＣＯＸ−２阻害剤」は、ＣＯＸ−２の効果を阻止することができる任意の化合物を指す。本発明のＣＯＸ−２阻害剤は、ＣＯＸ−２の活性を阻害または低減する化合物である。
【００２５】
一態様では、本発明のＣＯＸ−２阻害剤は、ＣＯＸ−２活性の阻害剤である。該ＣＯＸ−２活性の阻害剤は、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アプタマーまたは抗体（好ましくは内部抗体（intra-antibody））からなる群より選択することができる。
【００２６】
ＣＯＸ−２活性の阻害剤は、Chung et al. (2005), Expert Opin. Ther. Patents 15(1):9-32によって例示されるように、当技術分野において周知である。
【００２７】
本発明の一態様では、ＣＯＸ−２活性の阻害剤は、ニメスリド、４−ヒドロキシニメスリド、フロスリド、メロキシカム、Ｌ４７５ Ｌ３３７、Ｖｉｏｘｘ、ＳＣ５８１２５、セレコキシブ、ＮＳ３９８、ＤｕＰ６９７、インドメタシン、バルデコキシブ、メロキシカム、ロフェコキシブ、エトリコキシブ、スリンダク、ルミラコキシブ、Ｅ−５２２、ＮＳ−３９８ならびに米国特許第１０，５４５，４７８号および国際公開公報第０４／７２０３７号、国際公開公報第０４／７２０５７号に開示された化合物からなる群より選択される。
【００２８】
用語「プロスタグランジンＥ２シンターゼ阻害剤」は、プロスタグランジンＥ２シンターゼの効果を阻止することができる任意の化合物を指す。本発明のプロスタグランジンＥ２シンターゼ阻害剤は、プロスタグランジンＥ２シンターゼの活性を阻害または低減する化合物である。
【００２９】
一態様では、本発明のプロスタグランジンＥ２シンターゼ阻害剤は、プロスタグランジンＥ２シンターゼ活性の阻害剤である。該プロスタグランジンＥ２シンターゼ活性の阻害剤は、小有機分子、ペプチド、ポリペプチド、アプタマーまたは抗体（好ましくは内部抗体）からなる群より選択することができる。
【００３０】
プロスタグランジンＥ２シンターゼ活性の阻害剤は、Iyer et al. (2009), Expert Opin. Ther. Targets 13(7):849-865によって例示されるように、当技術分野において周知である。
【００３１】
本発明の一態様では、プロスタグランジンＥ２シンターゼ活性の阻害剤は、脂肪酸およびプロスタグランジンアナログ、１５−デオキシ−ＰＧＪ２、ＬＴＣ４、Ｕ−５１６０５、ＮＳ−３９８、スリンダク、ＭＫ−８８６、ＭＦ−６３、チエノピロール、ベンゾキサゾール、ナフタレンジスルホンアミド、３−ベンズアミドカルバゾールと、Iyer et al. (2009), Expert Opin. Ther. Targets 13(7): 849-865に開示された化合物とからなる群より選択される。
【００３２】
別の態様では、本発明のＰＧＥ２レセプターアンタゴニスト、ＣＯＸ−２阻害剤またはＰＧＥ２シンターゼ阻害剤は、アプタマーである。アプタマーは、分子認識に関して抗体の代替物に相当する分子の１つのクラスである。アプタマーは、実質的に任意のクラスのターゲット分子を高い親和性および特異性で認識する能力を有するオリゴヌクレオチド配列である。そのようなリガンドは、Tuerk C.およびGold L.（1990）に記載のランダム配列ライブラリーの試験管内進化法（ＳＥＬＥＸ）を経て単離することができる。ランダム配列ライブラリーは、ＤＮＡのコンビナトリアル化学合成によって入手可能である。このライブラリーでは、各メンバーは、最終的に化学修飾されたユニーク配列の直鎖オリゴマーである。このクラスの分子の予想される修飾、使用および利点は、Jayasena S.D.（1999）に総説されている。ペプチドアプタマーは、大腸菌チオレドキシンＡなどのプラットフォームタンパク質によってディスプレイされるコンフォメーション的に束縛されている抗体可変領域から成り、ツーハイブリッド法によってコンビナトリアルライブラリーより選択される（Colas et al., 1996）。次に、上記のように本発明の化合物に対するアプタマーを産生した後に、当業者は、ＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２またはＰＧＥ２シンターゼを阻害するアプタマーを容易に選択することができる。
【００３３】
一態様では、本発明の化合物は、ＰＧＥ２レセプターの発現阻害剤、ＣＯＸ−２の発現阻害剤またはプロスタグランジンＥ２シンターゼの発現阻害剤である。
【００３４】
本発明に使用するためのＰＧＥ２レセプターの発現阻害剤、ＣＯＸ−２の発現阻害剤またはプロスタグランジンＥ２シンターゼの発現阻害剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物に基づく場合がある。アンチセンスＲＮＡ分子と、アンチセンスＤＮＡ分子を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドとは、ＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２またはプロスタグランジンＥ２シンターゼのｍＲＮＡに結合することでタンパク質の翻訳を阻止することによってｍＲＮＡの翻訳を直接遮断するように作用するか、または、ｍＲＮＡの分解を増大させることで細胞中のＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２もしくはプロスタグランジンＥ２シンターゼのタンパク質レベル、したがって、活性を減少させるように作用する。例えば、ＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２またはプロスタグランジンＥ２シンターゼをコードするｍＲＮＡ転写体配列のユニーク領域に相補的な、少なくとも塩基約１５個のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、従来のホスホジエステル技法によって合成し、例えば静脈内注射または注入によって投与することができる。配列が公知の遺伝子の遺伝子発現を特異的に軽減するためにアンチセンス技法を用いるための方法は、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号；同第６，５６６，１３１号；同第６，３６５，３５４号；同第６，４１０，３２３号；同第６，１０７，０９１号；同第６，０４６，３２１号；および同第５，９８１，７３２号を参照されたい）。
【００３５】
低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）も、本発明に使用するためのＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２またはプロスタグランジンＥ２シンターゼの発現阻害剤として機能しうる。ＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２またはプロスタグランジンＥ２シンターゼの遺伝子発現は、被験者または細胞を、低分子２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と、または、低分子２本鎖ＲＮＡの産生を引き起こすベクターもしくは構築物と接触させることにより、ＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２またはプロスタグランジンＥ２シンターゼの発現が特異的に阻害される（すなわちＲＮＡ干渉またはＲＮＡｉ）ことによって低減することができる。配列が公知の遺伝子に適切なｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡコードベクターを選択するための方法は、当技術分野において周知である（例えば、Tuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002); McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第６，５７３，０９９号および同第６，５０６，５５９号；ならびに国際特許公報である国際公開公報第０１／３６６４６号、国際公開公報第９９／３２６１９号および国際公開公報第０１／６８８３６号を参照されたい）。
【００３６】
リボザイムも、本発明に使用するためのＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２またはプロスタグランジンＥ２シンターゼの発現阻害剤として機能しうる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機作は、相補的ターゲットＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションに続く、ヌクレオチド鎖内切断を含む。その結果、ＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２またはプロスタグランジンＥ２シンターゼのｍＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖内切断を特異的および効率的に触媒する改変ヘアピンモチーフ型リボザイム分子または改変ハンマーヘッドモチーフ型リボザイム分子が、本発明の範囲内で有用である。任意の潜在的ＲＮＡターゲット内の特異的リボザイム切断部位は、最初に、典型的には以下の配列、すなわち、ＧＵＡ、ＧＵＵおよびＧＵＣを含むリボザイム切断部位についてターゲット分子をスキャンすることによって同定される。同定された後に、切断部位を含むターゲット遺伝子領域に対応するリボヌクレオチド約１５ないし２０個の間の低分子ＲＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド配列を不適切にするおそれのある二次構造などの予測される構造特徴について評価することができる。候補ターゲットの妥当性は、候補ターゲットが相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを達成しやすいことを、例えばリボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて検査することによっても評価することができる。
【００３７】
ＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２またはプロスタグランジンＥ２シンターゼの発現阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの両方は、公知の方法によって調製することができる。これらには、例えば、固相ホスホルアマダイト（phosphoramadite）化学合成などの化学合成のための技法が含まれる。または、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のin vitroまたはin vivo転写によって産生することができる。そのようなＤＮＡ配列は、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み込んでいる多種多様なベクターに組み込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドへの多様な改変は、細胞内安定性および半減期を増大させる一手段として導入することができる。可能な改変は、分子の５’および／もしくは３’末端にリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列を付加すること、または、オリゴヌクレオチド主鎖内にホスホジエステラーゼ結合よりもホスホロチオエートもしくは２’−Ｏ−メチルを使用することを含むが、これらに限定されない。
【００３８】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡおよびリボザイムは、単独で、または、ベクターに関連してin vivo送達することができる。「ベクター」は、その最も広い意味で細胞への、好ましくはＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２またはプロスタグランジンＥ２シンターゼを発現している細胞への、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡまたはリボザイム核酸の転移を促進することができる任意の媒介物である。好ましくは、ベクターは、ベクターの不在下で生じる分解の程度よりも低い分解で、細胞に核酸を輸送する。一般に、本発明に有用なベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡまたはリボザイム核酸配列の挿入または組み込みによって操作されている、ウイルスまたは細菌起原の他の媒介物を含むが、これらに限定されない。ウイルスベクターは、好ましい種類のベクターであり、以下のウイルス：モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳ガンウイルスおよびラウス肉腫ウイルスなどのレトロウイルス；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタイン−バーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；およびレトロウイルスなどのＲＮＡウイルスからの核酸配列を含むが、これらに限定されない。名前が挙がっていないが当技術分野において公知の他のベクターを容易に採用することができる。
【００３９】
好ましいウイルスベクターは、可欠遺伝子が、関心がもたれる遺伝子により置換されている非細胞変性真核ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスには、レトロウイルス（例えばレンチウイルス）が含まれ、レトロウイルスの生活環は、ＤＮＡへのゲノムウイルスＲＮＡの逆転写に続く、ホスト細胞ＤＮＡへのプロウイルス組み込みを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子療法の試験が認可されている。複製欠損のレトロウイルス（すなわち所望のタンパク質の合成を指令することができるが、感染性粒子を製造することができない）が最も有用である。そのような遺伝的に変更されたレトロウイルス発現ベクターは、遺伝子のin vivo高効率トランスダクションのために一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準プロトコール（プラスミドへの外因性遺伝物質の組み込み、プラスミドを用いたパッケージング細胞系のトランスフェクション、パッケージング細胞系によるリコンビナントレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の収集およびウイルス粒子を用いたターゲット細胞の感染のステップを含む）が、KRIEGLER（A Laboratory Manual," W.H. Freeman C.O., New York, 1990）およびMURRY（"Methods in Molecular Biology," vol.7, Humana Press, Inc., Cliffton, N.J., 1991）に提供されている。
【００４０】
ある種の用途に好ましいウイルスは、遺伝子療法におけるヒトへの使用がすでに認可されている２本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損であるように操作することができ、多種多様な細胞型および種に感染することができる。アデノ随伴ウイルスは、さらに、熱および脂質溶媒安定性；造血細胞を含む多様な系列の細胞での高いトランスダクション頻度；および重感染阻害を欠如することで多系列のトランスダクションが可能などの利点を有する。報告によると、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的にヒト細胞ＤＮＡに組み込むことができ、それによって挿入突然変異誘発の確率およびレトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子発現の変動性が最小限になる。加えて、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、組織培養において選択圧の不在下で１００回よりも多い継代の間追跡されており、アデノ随伴ウイルスのゲノム組み込みが比較的安定な事象であることが暗に示された。アデノ随伴ウイルスは、染色体外で機能する場合もある。
【００４１】
他のベクターには、プラスミドベクターが含まれる。プラスミドベクターは、当技術分野において広く記載されており、当業者に周知である。例えばSANBROOK et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989を参照されたい。最近数年の間に、プラスミドベクターは、抗原コード遺伝子を細胞にin vivo送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。プラスミドベクターは、多くのウイルスベクターと同じような安全上の懸念を有さないことから、ＤＮＡワクチンのために特に有利である。しかしながら、これらのプラスミドは、ホスト細胞と適合性のプロモーターを有するので、プラスミド内に作動するようにコードされる遺伝子からペプチドを発現することができる。いくつかの一般に使用されるプラスミドには、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０およびｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが含まれる。他のプラスミドは、当業者に周知である。追加的に、制限酵素および連結反応を使用してプラスミドを特別設計し、ＤＮＡの特定フラグメントを除去および付加してもよい。プラスミドは、多様な非経口、粘膜および局所経路によって送達することができる。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下、または、他の経路によって注射することができる。それは、また、鼻腔内スプレーまたは点鼻、直腸坐剤によっておよび経口的に投与することができる。それは、また、遺伝子銃を使用して表皮または粘膜表面に投与することができる。プラスミドは、水溶液の状態で投与されるか、金粒子上に乾燥させて投与されるか、リポソーム、デンドリマー、コクリエート（cochleate）およびマイクロカプセル化を含むが、これらに限定されない、別のＤＮＡ送達系と関連させて投与されるかの場合がある。
【００４２】
特定の一態様では、本発明の化合物は、ＣＯＰＤの予防または治療を必要とする被験者におけるその予防または治療と同時に使用するか、連続して使用するかの場合がある。
【００４３】
別の特定の態様では、本発明の化合物は、ＣＯＰＤにおける老化および炎症の予防または治療を必要とする被験者におけるＣＯＰＤでの老化および炎症の予防または治療と同時にまたは連続して使用することができる。
【００４４】
一態様では、本発明は、ＣＯＰＤの予防または治療を必要とする被験者においてＣＯＰＤを予防または治療するための方法であって、該被験者に、ＰＧＥ２レセプターアンタゴニスト、ＰＧＥ２レセプター発現阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤、ＣＯＸ−２発現阻害剤、プロスタグランジンＥ２シンターゼ阻害剤またはプロスタグランジンＥ２シンターゼ発現阻害剤からなる群より選択される化合物を投与するステップを含む方法に関する。
【００４５】
特定の一態様では、本発明による方法は、ＣＯＰＤにおける老化および炎症の予防または治療を必要とする被験者におけるＣＯＰＤでの老化および炎症の予防または治療に使用することができる。
【００４６】
医薬組成物
本発明の化合物は、医薬組成物中で使用または調製することができる。
【００４７】
一態様では、本発明は、ＣＯＰＤの予防または治療を必要とする被験者におけるＣＯＰＤの予防または治療に使用するための、本発明の化合物および薬学的に許容されうる担体を含む医薬組成物に関する。
【００４８】
典型的には、本発明の化合物は、薬学的に許容されうる賦形剤と、場合により、生分解性ポリマーなどの徐放マトリックスと組み合わせて治療用組成物を形成させることができる。
【００４９】
「薬学的に」または「薬学的に許容されうる」とは、必要に応じて哺乳類、特にヒトに投与された場合に、有害反応、アレルギー反応または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。薬学的に許容されうる担体または賦形剤は、無毒な固体、半固体または液体の増量剤、希釈剤、カプセル化物質または任意の種類の製剤化助剤を指す。
【００５０】
経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所または直腸投与用の本発明の医薬組成物において、活性主薬を単独で、または、別の活性主薬と組み合わせて、単位投与形態で、従来の薬学的支持体との混合物として、動物およびヒトに投与することができる。適切な単位投与形態は、錠剤、ゲルカプセル剤、散剤、顆粒剤および経口懸濁剤または液剤のような経口経路形態、舌下および頬側投与形態、エアロゾル、植込剤、皮下、経真皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、真皮下、経真皮、髄腔内および鼻腔内投与形態ならびに直腸投与形態を含む。
【００５１】
好ましくは、医薬組成物は、注射可能な製剤に対して薬学的に許容されうるビヒクルを含有する。これらのビヒクルは、特に等張無菌塩類溶液（リン酸一ナトリウムまたはリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムおよびこれらに類するものか、これらの塩の混合物）、または、場合に応じて無菌の水もしくは生理食塩水を添加したときに注射液の構成が可能になる乾燥組成物、特に凍結乾燥組成物の場合がある。
【００５２】
注射用途に適切な薬学的形態には、無菌水溶液または分散物；ゴマ油、ラッカセイ油または水性プロピレングリコールを含む製剤；および無菌注射液または分散物の即時調製用の無菌粉末が含まれる。その形態は、全ての場合で無菌でなければならず、容易なシリンジ通過性が存在する程度に流動性でなければならない。剤形は、製造および保存の条件で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。
【００５３】
本発明の化合物を遊離塩基か薬理学的に許容されうる塩かとして含む溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。分散物は、また、グリセロール、液体ポリエチレングリコールと、その混合物と、油とに入れて調製することができる。通常の保存および使用条件で、これらの調製物は、微生物の成長を阻止するために保存料を含有する。
【００５４】
本発明の化合物は、中性または塩形態で組成物に入れて製剤化することができる。薬学的に許容されうる塩には、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）が含まれ、酸付加塩は、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸か、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸かとともに製剤化される。遊離カルボキシル基で製剤化された塩は、また、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または、水酸化鉄（ＩＩＩ）のような無機塩基と、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基とに由来する場合がある。
【００５５】
担体は、また、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど）を含有する溶媒または分散媒、その適切な混合物および植物油でありうる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合は必要とされる粒子径の維持によっておよび界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の阻止は、様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合で、等張化剤、例えば糖類または塩化ナトリウムを含ませることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
【００５６】
無菌注射液は、必要量の活性化合物を、必要に応じて上に列挙した他の成分のいくつかとともに適切な溶媒中に混合し、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散物は、塩基性分散媒および上に列挙した成分からの必要な他の成分を含有する無菌ビヒクル中に様々な無菌活性成分を混合することによって調製される。無菌注射液の調製用の無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分と任意の追加的な所望の成分との粉末を、予め濾過滅菌されたその溶液から回収する真空乾燥法および凍結乾燥法である。
【００５７】
製剤化されると、溶液は、投薬製剤と適合性の方法および治療的に有効な量で投与される。製剤は、上記注射液の種類などの多様な投薬剤形で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなども採用することができる。
【００５８】
水溶液状態での非経口投与のために、例えば溶液を必要により適切に緩衝化し、液体希釈剤を最初に十分な塩類溶液またはグルコースで等張にすべきである。これらの特定の水溶液は、特に静脈内、筋肉内、皮下および腹腔内投与に適する。これに関して、採用できる無菌水性媒は、本開示に照らして当業者に公知である。処置される被験者の状態に応じて、投薬量にいくらかの変動が必然的に起こる。いずれにせよ、投与担当者が、個別の被験者に適切な用量を決定する。
【００５９】
静脈内または筋肉内注射などの非経口投与用に製剤化された本発明の化合物に加えて、他の薬学的に許容されうる形態には、例えば錠剤または経口投与用の他の固形剤；リポソーム製剤；持続放出カプセル；および現在使用されている任意の他の形態が含まれる。
【００６０】
スクリーニング方法
さらなる一局面では、本発明は、ＣＯＰＤの予防または治療を必要とする被験者におけるＣＯＰＤの予防または治療のための薬物として使用するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、ｉ）候補化合物を提供するステップと、ｉｉ）ＰＧＥ２レセプターを遮断する、ＰＧＥ２レセプターの発現を阻害する、ＣＯＸ−２の活性を阻害する、ＣＯＸ−２の発現を阻害する、プロスタグランジンＥ２シンターゼの活性を阻害する、または、プロスタグランジンＥ２シンターゼの発現を阻害する候補化合物を選択するステップとを含む方法に関する。
【００６１】
さらなる一局面では、本発明は、ＣＯＰＤの予防または治療を必要とする被験者におけるその予防または治療のための薬物として使用するための候補化合物をスクリーニングする方法であって、
−  ＰＧＥ２、ＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２、プロスタグランジンＥ２シンターゼを提供し、ＰＧＥ２レセプターを発現している細胞、組織試料または生物を提供するステップと、
−  小有機分子、プロスタグランジンアナログ、抗体、ペプチドまたはポリペプチドなどの候補化合物を提供するステップと、
−  ＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２またはプロスタグランジンＥ２シンターゼの活性を測定するステップと、
−  ＰＧＥ２レセプターを遮断する、ＰＧＥ２レセプターの発現を阻害する、ＣＯＸ−２の活性を阻害する、ＣＯＸ−２の発現を阻害する、プロスタグランジンＥ２シンターゼの活性を阻害する、または、プロスタグランジンＥ２シンターゼの発現を阻害する候補化合物をポジティブ選択するステップと
を含む方法に関する。
【００６２】
ＰＧＥ２レセプター、ＣＯＸ−２またはプロスタグランジンＥ２シンターゼの活性を測定するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、ＰＧＥ２レセプターの活性を測定することは、ＣＨＯ細胞系に安定的にクローニングおよびトランスフェクションされたＰＧＥ２レセプターに関するＫｉを決定すること、または、候補化合物の存在化または不在下でＰＧＥ２レセプター（ｃＡＭＰ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＰＰＡＲγ）の１種または複数のセカンドメッセンジャーを測定することを伴う。
【００６３】
候補化合物がＰＧＥ２レセプターアンタゴニストであるかどうかをスクリーニングおよび決定するための検査およびアッセイは、当技術分野において周知である（米国特許第５，３９３，７４７号；同第４，００４，０２７号）。in vitroおよびin vivoアッセイは、候補化合物がＰＧＥ２レセプター活性を低減する効力および選択性を評価するために使用することができる。
【００６４】
候補化合物の活性と、該候補化合物がＰＧＥ２レセプターと結合する能力と、前記候補化合物がＰＧＥ２レセプターの活性を阻害する能力とは、ＰＧＥ２レセプターを発現している単離された線維芽細胞と、ヒトＰＧＥ２レセプターによって安定的にクローニングおよびトランスフェクションされたＣＨＯ細胞系とを使用して検査することができる。
【００６５】
ＰＧＥ２レセプター以外の別のレセプターを発現している細胞および線維芽細胞は、候補化合物の選択性を評価するために使用することができる。
【００６６】
本発明を以下の図面および実施例によりさらに例示する。しかし、これらの実施例および図面が本発明の範囲を限定するものとして、決して解釈してはならない。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１Ａ】線維芽細胞における老化マーカーの発現を示す図である。（Ａ）慢性閉塞性肺疾患患者（ＣＯＰＤ、ｎ＝２５）ならびに非喫煙者対照および喫煙者対照（それぞれＮＳ−Ｃ、ｎ＝１０；Ｓ−Ｃ、ｎ＝２５）から得られた肺線維芽細胞の複製老化。増殖速度は、集団倍加レベル（population doubling level）（ＰＤＬ）の総計によって評価した。＊ｐ＜０．０５［ＣＯＰＤ ｖｓ対照］。図全体でデータは平均±ＳＥＭとして表示する。
【図１Ｂ】線維芽細胞における老化マーカーの発現を示す図である。（Ｂ）老化関連（ＳＡ）β−Ｇａｌ−陽性細胞のパーセンテージ。＊ｐ＜０．０５［ＣＯＰＤ ｖｓ対照］。図全体でデータは平均±ＳＥＭとして表示する。
【図１Ｃ】線維芽細胞における老化マーカーの発現を示す図である。（Ｃ）テロメア長。Ｔ／Ｓ比は、単一遺伝子のコピー数（３６Ｂ４遺伝子）に対するテロメア反復コピー数の比である。＊ｐ＜０．０５［継代３回目ｖｓ継代７回目］。図全体でデータは平均±ＳＥＭとして表示する。
【図１Ｄ】線維芽細胞における老化マーカーの発現を示す図である。（Ｄ）リアルタイムｑＰＣＲによるｐ１６遺伝子の量的転写発現。＊＊ｐ＜０．０１［ＣＯＰＤ ｖｓ ＮＳ−Ｃ］；†ｐ＜０．０５［ＣＯＰＤ ｖｓ Ｓ−Ｃ］；§ｐ＜０．０５および§§§ｐ＜０．００１［継代３回目ｖｓ継代７回目］。図全体でデータは平均±ＳＥＭとして表示する。
【図２Ａ】非老化期および老化期のＣＯＰＤ線維芽細胞におけるＰＧＥ２／ＥＰ２／ＥＰ４経路のアップレギュレーションを示す図である。略語は図１に記載の略語と同じである。（Ａ）ＮＳ−Ｃ、Ｓ−ＣおよびＣＯＰＤについてそれぞれｎ＝６、１４および１６の培地中のＰＧＥ２レベル。＊＊＊ｐ＜０．００１［継代７回目ｖｓ継代３回目］；††ｐ＜０．０１［Ｓ−ＣおよびＣＯＰＤ ｖｓ ＮＳ−Ｃ］。図全体でデータは平均±ＳＥＭとして表示する。
【図２Ｂ】非老化期および老化期のＣＯＰＤ線維芽細胞におけるＰＧＥ２／ＥＰ２／ＥＰ４経路のアップレギュレーションを示す図である。略語は図１に記載の略語と同じである。リアルタイムｑＰＣＲによるＣＯＸ２遺伝子（Ｂ）の量的転写発現。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１［Ｓ−ＣまたはＣＯＰＤ ｖｓ ＮＳ−Ｃ］；†ｐ＜０．０５［Ｓ−ＣおよびＣＯＰＤ ｖｓ ＮＳ−Ｃ］；§ｐ＜０．０５［ＣＯＰＤ ｖｓ対照］；||ｐ＜０．０５［継代３回目ｖｓ継代７回目］。図全体でデータは平均±ＳＥＭとして表示する。
【図２Ｃ】非老化期および老化期のＣＯＰＤ線維芽細胞におけるＰＧＥ２／ＥＰ２／ＥＰ４経路のアップレギュレーションを示す図である。略語は図１に記載の略語と同じである。リアルタイムｑＰＣＲによるｍＰＧＥ２遺伝子（Ｃ）の量的転写発現。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１［Ｓ−ＣまたはＣＯＰＤ ｖｓ ＮＳ−Ｃ］；†ｐ＜０．０５［Ｓ−ＣおよびＣＯＰＤ ｖｓ ＮＳ−Ｃ］；§ｐ＜０．０５［ＣＯＰＤ ｖｓ対照］；||ｐ＜０．０５［継代３回目ｖｓ継代７回目］。図全体でデータは平均±ＳＥＭとして表示する。
【図２Ｄ】非老化期および老化期のＣＯＰＤ線維芽細胞におけるＰＧＥ２／ＥＰ２／ＥＰ４経路のアップレギュレーションを示す図である。略語は図１に記載の略語と同じである。リアルタイムｑＰＣＲによるＥＰ２、ＥＰ４遺伝子（Ｄ）の量的転写発現。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１［Ｓ−ＣまたはＣＯＰＤ ｖｓ ＮＳ−Ｃ］；†ｐ＜０．０５［Ｓ−ＣおよびＣＯＰＤ ｖｓ ＮＳ−Ｃ］；§ｐ＜０．０５［ＣＯＰＤ ｖｓ対照］；||ｐ＜０．０５［継代３回目ｖｓ継代７回目］。図全体でデータは平均±ＳＥＭとして表示する。
【図３Ａ】ＰＧＥ２が非老化線維芽細胞の老化を用量依存的に誘導することを示す図である。略語は図１に記載の略語と同じである。（Ａ）ＳＡ  β−ｇａｌ陽性細胞のパーセンテージ。ＮＳ−Ｃ、Ｓ−ＣおよびＣＯＰＤ線維芽細胞（それぞれｎ＝５、６および６）を異なる濃度のＰＧＥ２に曝露し、２４時間曝露後に染色した。＊ｐ＜０．０５［ＰＧＥ２ｖｓビヒクル（ＤＭＳＯ）］。§ｐ＜０．０５［ＣＯＰＤ ｖｓ対照］。図全体でデータは平均±ＳＥＭとして表示する。
【図３Ｂ】ＰＧＥ２が非老化線維芽細胞の老化を用量依存的に誘導することを示す図である。略語は図１に記載の略語と同じである。（Ｂ）ＰＧＥ２レセプターのアンタゴニスト［ＥＰ２（ＡＨ６８０９（１０μM）、ＥＰ４（ＧＷ６２７３６８Ｘ（１０μM）］またはＰＦＴ−αで前処理し、１０ng・ml-1のＰＧＥ２に曝露した後にＳＡ  β−ｇａｌ活性について染色された細胞の棒グラフ。ｎ＝６。＊ｐ＜０．０５［ＰＧＥ２ｖｓ ＤＭＳＯ］；†ｐ＜０．０５［ＰＧＥ２ ｖｓ ＰＧＥ２＋ＰＦＴ−αまたはＰＧＥ２＋アンタゴニスト］；‡＜０．０５［両方のアンタゴニストｖｓ一方のアンタゴニスト］。図全体でデータは平均±ＳＥＭとして表示する。
【図３Ｃ】ＰＧＥ２が非老化線維芽細胞の老化を用量依存的に誘導することを示す図である。略語は図１に記載の略語と同じである。（Ｃ）（Ｄ）欄記載の処理と同じ処理後にｐ２１について染色された細胞の棒グラフ。＊＊ｐ＜０．０１［ＰＧＥ２ｖｓ ＤＭＳＯ］；||ｐ＜０．０５［Ｓ−Ｃ ｖｓ ＮＳ−Ｃ］；§ｐ＜０．０５［ＣＯＰＤ ｖｓ 対照］；†ｐ＜０．０５［ＰＧＥ２ ｖｓ ＰＧＥ２＋ＰＦＴ−αまたはＰＧＥ２＋アンタゴニスト］；‡ｐ＜０．０５［両方のアンタゴニストｖｓ一方のアンタゴニスト］。図全体でデータは平均±ＳＥＭとして表示する。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
実施例：ＣＯＸ２／ＰＧＥ２経路は、慢性閉塞性肺疾患線維芽細胞の老化を維持する
方法
in vitro実験
患者および細胞：初代肺線維芽細胞は、ＣＯＰＤを有する患者２５人およびＣＯＰＤの臨床的、形態的または機能的徴候を有さない被験者３５人（対照）からの肺腫瘍切除について得られた肺標本から、移植片技法（Normand J and Karasek MA. In Vitro Cell Dev Biol Anim 1995;31: 447-455）によって単離された（表１）。対照を非喫煙者群および喫煙者群に分けた（それぞれＮＳ−Ｃ、ｎ＝１０およびＳ−Ｃ、ｎ＝２５）。喫煙状態（現在喫煙者または１年よりも長い禁煙によって定義される元喫煙者（Lapperre TS et al., Respir Res 2007;8:85; Savale L et al. Am J Respir Crit Care Med 2009）を、種々の結果の解析で考慮した（表２）。ＣＯＰＤの重症度の分類は、２００３年慢性閉塞性肺疾患のためのグローバルイニシアティブ（ＧＯＬＤ）基準に基づいた（Rabe KF et al., Am J Respir Crit Care Med 2007;176:532-555）。全ての患者からインフォームドコンセントを得た。本試験は、「Comite de Protection des Personnes Ile de France IX」によって承認された。
【００６９】
【表１】
2015522528.tif 000002
【００７０】
略語：ＣＯＰＤ  慢性閉塞性肺疾患；ＶＣ  肺活量；ＦＥＶ１  一秒量；ＧＯＬＤ  慢性閉塞性肺疾患のためのグローバルイニシアティブ。気腫スコアは０〜１００％のスケールで評価した。
データは、平均±ＳＥＭとして表した気腫スコアを除き、中央値に第１および第３四分位数（カッコ内）を付記したものとして表現する。††ｐ＜０．０１、†††ｐ＜０．００１［ＣＯＰＤ患者ｖｓ対照（ＮＳ−ＣおよびＳ−Ｃ）］；＊＊＊ｐ＜０．００１［ＣＯＰＤ患者ｖｓ非喫煙者］；‡‡ｐ＜０．０１［ＣＯＰＤ患者ｖｓ喫煙者］。
【００７１】
【表２】
2015522528.tif 000003
2015522528.tif 000004
2015522528.tif 000005
略語：ＣＯＰＤ  慢性閉塞性肺疾患；ＶＣ  肺活量；ＦＥＶ１  一秒量。年齢、喫煙歴、禁煙期間およびＦＥＶ１／ＶＣは、中央値に第１および第３四分位数（カッコ内）を付記したものとして表現し、その他のデータは平均±ＳＥＭとして表現する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１［ＣＯＰＤ患者ｖｓ対照（ＮＳ−Ｃ、Ｓ−Ｃ、ＥｘＳ−Ｃ）］；§ｐ＜０．０５、§§ｐ＜０．０１［継代７回目（Ｐ７）ｖｓ継代３回目（Ｐ３）］；†ｐ＜０．０５［ＣＯＰＤ患者またはＳ−Ｃ ｖｓ ＮＳ−Ｃ］；‡ｐ＜０．０５［Ｓ−ＣＯＰＤ ｖｓ ＥｘＳ−ＣＯＰＤ］。
【００７２】
細胞の処理：線維芽細胞を、ＰＧＥ２（０．５ないし５０ng ml-1）または２４時間インキュベーションされた線維芽細胞から収集した馴化培地（ＣＭ）のいずれかに曝露した。異なる実験で細胞を、ＣＯＸの阻害剤、プロスタグランジンレセプターＥＰ２およびＥＰ４のアゴニストまたはアンタゴニスト、抗酸化剤Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、または、ｐ５３転写作用阻害剤ピフィスリン−αで処理した。
【００７３】
線維芽細胞の老化の特徴づけ：老化は、累積集団倍加レベル（ＰＤＬ）（Holz O et al., Eur Respir J 2004;24:575-579）、テロメア長（Savale L et al., Am J Respir Crit Care Med 2009）、β−ガラクトシダーゼ活性関連老化（ＳＡ  β−ｇａｌ）（Dimri GP. Cancer Cell 2005;7:505-512）、ならびにウエスタンブロット、免疫蛍光およびＲＴ−ｑＰＣＲ分析によるホスホ（セリン１５）−ｐ５３、ｐ１６、ｐ２１およびカスパーゼ３の発現を測定することによって特徴づけた。Luminex法（Millipore, Molscheim, France）を用いて馴化培地中の２９種の可溶性因子のレベルを定量した。
【００７４】
ＰＧＥ２経路の分析：プロスタグランジンＥ２モノクローナルＥＩＡキット（Bertin Pharma, Montigny le Bretonneux, France）を使用することによってＰＧＥ２を定量した。ＰＧＥ２合成に関与するＰＧＥ２レセプターおよび酵素はＲＴ−ｑＰＣＲによって定量した。活性酸素種の細胞産生は、ＤＣＦＨ−ＤＡアッセイ（Carter W et al., J Leukoc Biol 1994;55:253-258）によって定量した。
【００７５】
動物実験
Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドの雄性８週齢マウスおよびｐ５３−／−動物（Tyler Jacks, MIT, Cambridgeにより恵与）にＰＧＥ２（１ng・ml-1）またはビヒクル（ＤＭＳＯ、１／１００００）のいずれかを気管内に滴下注入した。滴下体積は５０μlであった。滴下注入の２４および４８時間後にマウスを屠殺し、老化マーカーおよびサイトカインの肺ｍＲＮＡ発現の分析を行った。動物の公正な取り扱いに関するＩＮＳＥＲＭガイドラインを遵守して研究を行った。
【００７６】
統計解析
GraphPad Prism 4.0（La Jolla, CA, USA）でデータを解析した。群間比較は、クラスカル−ワリス  ノンパラメトリック分散分析検定で行い、有意差が検出された場合は続いてマン−ホイットニーＵ検定とともに２×２比較を行った。スピアマンの順位相関係数を用いて相関を解析した。ｐ＜０．０５を統計的に有意と見なした。
【００７７】
結果
患者の臨床的および人口統計学的特徴
被験者の臨床的および人口統計学的特徴を表１および２に示す。３つの群は年齢が類似していた。喫煙者およびＣＯＰＤ患者は、類似の喫煙歴を有した。ＣＯＰＤを有する被験者は、ＧＯＬＤステージＩおよびＩＩによって示されるような軽症〜中等症の疾患（それぞれ被験者９および１６人）および最大１００に対して気腫スコア４２．６±６．５を示した（Bankier AA et al., Radiology 1999;211 :851-858）。
【００７８】
ＣＯＰＤ患者からの線維芽細胞は、対照よりも高い複製老化を示した
前記３群の患者の線維芽細胞は、ガン関連線維芽細胞のマーカーを発現しなかった。ＣＯＰＤ患者からの線維芽細胞は、非老化継代で対照と差がなかったが、継代５〜７回目に対照よりもよりも低いＰＤＬ（図１Ａ）、ＳＡ  β−ｇａｌ染色の増大（図１Ｂ）、ｐ１６のｍＲＮＡおよびタンパク質発現の増大（in vitroと、肺スライドでのin situとの両方、図１Ｄ）、ＨＯ−１のｍＲＮＡ発現およびＲＯＳ産生を示した。加えて、ＣＯＰＤ線維芽細胞は、継代３回目に比べて継代７回目にｐ５３およびｐ２１のタンパク質およびｍＲＮＡの発現増大ならびにテロメア長の減少を示し（図１Ｃ）、これらの後２者の結果は、Ｓ−Ｃでも観察された。ＣＯＰＤ患者における累積ＰＤＬは、ＦＥＶ１／ＶＣおよびＦＥＶ１と正の相関を示した（それぞれｒ＝０．４２、ｐ＜０．０５およびｒ＝０．４０、ｐ＜０．０５）。ＳＡ  β−ｇａｌ染色に関するＣＯＰＤと対照との間の差は、継代５回目に起こった（図１Ｂ）が、一方でｐ１６および累積ＰＤＬに関する差は、継代７回目に起こったことに留意しなければならない（図１ＡおよびＤ）。そのような解離は、以前に報告され（Zdanov S et al., Exp Cell Res 2007; 313: 3046-3056; Noureddine H et al. Circ Res; 109: 543-553）、異なる老化マーカーを強調している異なるメカニズムに関係しうる（Kurz DJ et al. J Cell Sci 2000; 113 (Pt 20): 3613-3622）。
【００７９】
これらの結果を考えて、それぞれ非老化継代、中間継代および老化継代と見なされる継代３、５および７回目にさらなる研究を行った。線維芽細胞のセクレトームの分析から、老化ＣＯＰＤ線維芽細胞が対照よりも多量のＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＲＯ、ＣＸ３ＣＬ１（フラクタルカイン）、ＴＮＦ−α、ＩＧＦＢＰ−７、ＦＧＦ−２およびＣＣＬ５（Ｒａｎｔｅｓ）を分泌したことが示された。
【００８０】
禁煙は、継代３回目および７回目の両方で２群の老化および炎症性セクレトームに影響しなかった。例外的に、ＣＯＰＤ線維芽細胞では継代７回目の累積ＰＤＬは、現在喫煙者のＳ−Ｃ線維芽細胞よりも元喫煙者の方が有意に高かった（表２、ｐ＜０．０５）。
【００８１】
これらの結果は、軽症〜中等症のＣＯＰＤ患者からの線維芽細胞が、対照よりも際立ったＳＡＳＰ関連老化表現型を表すことを示している。
【００８２】
ＣＯＰＤ線維芽細胞におけるＰＧＥ２経路のアップレギュレーション
次に、本発明者らは、ＣＯＰＤ線維芽細胞および対照線維芽細胞におけるＰＧＥ２経路を分析した。分泌されたＰＧＥ２のレベルおよびＰＧＥ２合成における最終酵素の誘導性アイソフォームであるｍＰＧＥＳ−１のｍＲＮＡ発現は、継代３回目でＮＳ−Ｃ群よりもＳ−Ｃ群およびＣＯＰＤ群の方が有意に高くなった（図２ＡおよびＣ）。継代７回目では、各群におけるＰＧＥ２レベルが継代３回目よりも有意に高く、対照群よりもＣＯＰＤ群のＰＧＥ２レベルの方が有意に高くなった（図２Ａ）。加えて、継代７回目でＣＯＸ２のｍＲＮＡレベルは対照よりもＣＯＰＤの方が有意に高くなった（図２Ｂ）。おそらくこの差は、継代３回目で高い値であったこと（対照と統計的な差はないが）および継代３回目に対する増加倍率が対照と同様であったことに起因する。
【００８３】
ＰＧＥ２は、ＥＰ１〜４と呼ばれる特異的レセプターを介して作用する（Woodward DF et al., Pharmacol Rev 2011;63:471-538）。継代３回目に、ＥＰ２およびＥＰ４のｍＲＮＡ発現は、対照群よりもＣＯＰＤ線維芽細胞の方が有意に高くなったものの（図２Ｄ）、ＥＰ１およびＥＰ３について差は観察されなかった（オンライン追補データの図Ｅ７）。継代７回目に４種のＰＧＥ２レセプターの発現に有意差は観察されなかった（図２Ｄ）。
【００８４】
全体的に見て、これらの結果は、対照線維芽細胞に比べてＣＯＰＤ線維芽細胞ではＰＧＥ２／ＥＰ２−ＥＰ４経路がアップレギュレーションされていることを示している。
【００８５】
ＰＧＥ２への単回曝露は、肺線維芽細胞の早期細胞老化および関連炎症を誘導する
本発明者らは、次に、老化線維芽細胞のセクレトームから見いだされた濃度に近い濃度のＰＧＥ２への単回曝露が非老化線維芽細胞の老化を誘導することができるかどうかおよび対照細胞よりもＣＯＰＤ線維芽細胞の方がこの作用に感受性が高いかどうかを問題にした。
【００８６】
非老化線維芽細胞をＰＧＥ２とともに２４時間インキュベーションすると、ＳＡ  β−ｇａｌ、ｐ２１およびｐ１６タンパク質を発現している細胞の百分率の用量応答性増加（図３Ａ）と、それに加えて細胞培養上清中のＩＬ−６、ＣＸ３ＣＬ１、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ２、ＭＭＰ−２およびＴＩＭＰ−２のレベル増加とが誘導された。これらの誘導は、対照線維芽細胞よりもＣＯＰＤ線維芽細胞の方が有意に高かった。切断型カスパーゼ−３の不在およびホスファチジルセリン残基の不検出が３群の患者の線維芽細胞から観察された。
【００８７】
それぞれＡＨ６８０９およびＧＷ６２７３６８Ｘを用いたＥＰ２レセプターまたはＥＰ４レセプターの遮断は、ＣＯＰＤ線維芽細胞においてＰＧＥ２が誘導するＳＡ  β−ｇａｌおよびｐ２１の発現を有意に減少させ、両方のアンタゴニストを同時に使用した場合、小規模であるが有意に高い効果があった（図３ＢおよびＣ）。両方の対照線維芽細胞では、両方のアンタゴニストを同時に適用した場合にのみ、ＰＧＥ２が誘導するＳＡ−βｇａｌおよびｐ２１の発現が減少した（図３ＢおよびＣ）。したがって、両方のアンタゴニストは、ＰＧＥ２によって誘導されるＩＬ−６、ＣＸ３ＣＬ１、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ２およびＴＩＭＰ２の増加を抑制するために必要であった。他のＥＰ２レセプターアンタゴニストおよびＥＰ４レセプターアンタゴニスト（それぞれＰＦ−０４４１８９４８およびＬ−１６１９８２）を用いたときも、ＣＯＰＤ線維芽細胞および対照線維芽細胞においてＰＧＥ２が誘導するＳＡ  β−ｇａｌおよびｐ２１の発現に類似の効果が観察された。最後に、それぞれＥＰ２アゴニストおよびＥＰ４アゴニストであるＯＮＯ−ＡＥ１−２５９−０１およびＣＡＹ１０５９８は、ＣＯＰＤ線維芽細胞および対照線維芽細胞におけるＳＡ  β−ｇａｌおよびｐ２１の発現に対するＰＧＥ２の効果を模倣し、両方のアゴニストを同時に使用すると、小規模であるが有意に高い効果が生じた。したがってこれらのアゴニストは、ＰＧＥ２誘導老化へのこれらのレセプターの関与を確認するものである。
【００８８】
最後に、ｐ２１はｐ５３の主要な下流エフェクターであるので（Zhang H. J Cell Physiol 2007;210:567-574）、本発明者らは、ＰＧＥ２が誘導するＳＡ−βｇａｌ、ｐ２１の発現および炎症性サイトカインの分泌にｐ５３が果たす役割を検討した。ｐ５３核移行阻害剤であるピフィスリン−α（Komarov PG et al., Science 1999;285: 1733-1737）は、対照線維芽細胞およびＣＯＰＤ線維芽細胞の両方においてＳＡ  β−ｇａｌ、ｐ２１の発現（図３ＢおよびＣ）ならびにＰＧＥ２によって誘導されるＩＬ６、ＣＸ３ＣＬ１、ＭＭＰ−２およびＴＩＭＰ−２のレベル増加を完全に阻止したが、ｐ１６の増加を改変しなかった。
【００８９】
さらに、ＰＧＥ２が誘導する老化および炎症にｐ５３が果たす役割を、野生型マウスおよびｐ５３−／−マウスで確認した。ＰＧＥ２の単回器官内滴下注入は、それぞれ２４時間および４８時間でｐ５３およびｐ２１の肺発現と、in vitroで誘導される同じ炎症性メディエーター（ＩＬ−６、ＣＸ３ＣＬ１、ＦＧＦ２、ＶＥＧＦ、ＭＭＰ２）の発現とを誘導したが、ｐ１６の発現は無変化であった。加えて、ＰＧＥ２は、４８時間でＣＯＸ２のｍＲＮＡレベルを増大させた。ＰＧＥ２によるｐ２１および炎症性メディエーターの誘導は、ｐ５３−／−マウスでは観察されず、これらの現象にｐ５３が果たす役割を裏付けている。
【００９０】
ＲＯＳは老化の誘導に関与するので（Campisi J. Cell 2005;120:513-522）、本発明者らは、ＰＧＥ２の効果に対するＲＯＳの関与について検討した。ＣＯＰＤ患者由来線維芽細胞をＰＧＥ２とともにインキュベーションした場合にのみ、細胞内ＲＯＳ濃度およびオキシダント感受性タンパク質ＨＯ−１の発現が用量依存的に増加した。ＰＧＥ２に曝露されたＣＯＰＤ細胞ではＤＮＡ損傷活性化転写因子ＡＴＭの活性化は観察されなかった。ＥＰ２／ＥＰ４レセプターの両方のアンタゴニスト、チオールアンチオキシダントであるＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）、ＣＯＸ１およびＣＯＸ２阻害剤であるインドメタシン、または、ＣＯＸ２阻害剤セレコキシブを用いた線維芽細胞の２４時間の前処理により、ＰＧＥ２によって誘導されるＲＯＳ、ならびにＳＡ  β−ｇａｌおよびｐ２１の発現の増加が有意に低減した。さらに、外因性ＰＧＥ２は、内因性ＰＧＥ２の合成を誘導し、それはセレコキシブ処理によって打ち消された。
【００９１】
まとめると、これらの結果は、ＰＧＥ２への単回曝露が老化とＥＰ２／ＥＰ４、ＣＯＸ２依存性ＲＯＳおよびｐ５３カスケードを介した関連炎症とを誘導すること、および、ＣＯＰＤ線維芽細胞が対照細胞よりもこれらの効果に対して有意に感受性が高いことを示している。
【００９２】
ＰＧＥ２は、老化ＣＯＰＤ線維芽細胞由来セクレトームのパラクリン老化効果の原因である
本発明者らは、次に、ＰＧＥ２が老化ＣＯＰＤ線維芽細胞由来セクレトームのパラクリン老化促進効果に関与したかどうかを分析した。ＮＳ−ＣおよびＳ−Ｃ線維芽細胞はＥＰレセプターの発現に関して同様に挙動するので、本発明者らは、これらの実験に対照としてＳ−Ｃ線維芽細胞だけを使用した。
【００９３】
Ｓ−ＣおよびＣＯＰＤ患者由来の非老化線維芽細胞（以下にターゲット線維芽細胞と呼ぶ）を、非老化継代および老化継代で得られたそれぞれの群の細胞由来の馴化培地（ＣＭ）とともに２４時間インキュベーションした。非老化継代で得られたＣＭとともにターゲット線維芽細胞をインキュベーションすることにより、ＣＯＰＤの場合にのみＳＡ−βｇａｌ陽性細胞のパーセンテージ増加が実証された。老化継代で得られたＳ−Ｃ  ＣＭおよびＣＯＰＤ  ＣＭの両方が、ターゲット細胞におけるＳＡ−βｇａｌ、ホスホ（セリン１５）−ｐ５３、ｐ２１およびｐ１６のタンパク質発現と、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１およびＦＧＦ−２のｍＲＮＡ発現の百分率とを増加させた。しかし、ＭＣＰ−１を除き、これらの増加は、Ｓ−Ｃ  ＣＭよりもＣＯＰＤ  ＣＭとともにインキュベーションした後の方が有意に大きかった。老化ＣＭは、切断型カスパーゼ−３の発現を誘導しなかった。
【００９４】
線維芽細胞をＣＯＸ阻害剤インドメタシンまたはセレコキシブで処理すると、ＣＭ中のＰＧＥ２のレベルが６０％減少した。ターゲット細胞をこれらの培地とともにインキュベーションすると、ＳＡ  β−ｇａｌ陽性細胞およびｐ２１のタンパク質発現のパーセンテージが平行して有意に減少した。
【００９５】
ピフィスリン−αまたはＥＰ２／ＥＰ４アンタゴニスト両方とともにターゲット線維芽細胞を前処理することで、Ｓ−Ｃ老化ＣＭおよびＣＯＰＤ老化ＣＭによるＳＡ  β−ｇａｌ陽性細胞の増加と、ｐ２１タンパク質の誘導とが抑制された。ピフィスリン−αは、ＣＭによって誘導されるＩＬ−６、ＩＬ−８およびＭＣＰ−１のｍＲＮＡ発現増加を抑制した一方、ＦＧＦ−２の増加は改変されなかった。
【００９６】
全体的に見て、これらの結果は、ＰＧＥ２がパラクリン的に作用して、ＥＰ２／ＥＰ４−ｐ５３カスケードを介してＣＯＰＤ線維芽細胞に炎症とともに老化を誘導することを示している。
【００９７】
ＰＧＥ２は、肺線維芽細胞の複製老化および関連炎症を亢進する
ＰＧＥ２への単回曝露がヒト線維芽細胞およびマウスに老化を誘導したことを実証した後に、本発明者らは、複製老化に及ぼすＰＧＥ２への反復曝露の効果を分析した。これらの実験は、Ｓ−Ｃ線維芽細胞だけで行った。それは、ＮＳ−Ｃ線維芽細胞およびＳ−Ｃ線維芽細胞の両方が、老化およびＰＧＥ２への応答に関して同様に挙動したからである。
【００９８】
継代３回目から９回目まで培養する間に１ng・ml-1のＰＧＥ２にＳ−Ｃ線維芽細胞およびＣＯＰＤ線維芽細胞を反復曝露すると、老化関連累積ＰＤＬがさらに減少し、ＳＡ−βｇａｌ、ｐ２１、ｐ１６、ＣＯＸ２およびＨＯ−１の発現誘導ならびにＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＲＯ、ＶＥＧＦおよびＣＸ３ＣＬのレベルが高まったが、一方でＭＣＰ３の発現は改変されなかった。これらの現象は、Ｓ−Ｃ線維芽細胞よりもＣＯＰＤ線維芽細胞の方が際立っていた。ＰＧＥ２は、ＣＯＰＤ線維芽細胞でのテロメア長の短縮を改変しなかったが、リン酸化ＡＴＭの発現を高め、これは、ＰＧＥ２への反復曝露後にＤＮＡ損傷が発生したことを示唆する。
【００９９】
最後に、本発明者らは、内因性ＰＧＥ２が複製老化に関与するかどうかを検討した。本発明者らは、最初に、連続継代の間にＣＯＰＤ線維芽細胞およびＳ−Ｃ線維芽細胞をインドメタシンおよびセレコキシブとともにインキュベーションした。各阻害剤は、ＣＯＰＤ細胞におけるＳＡ−βｇａｌ、ｐ２１、ｐ１６および累積ＰＤＬの増加を阻止し、一方でそれらの阻害剤は、Ｓ−Ｃ細胞におけるそれらのレベルを改変しなかった。ＣＯＰＤ患者における継代５回目および７回目の培養上清では、この効果にＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＲＯ、ＣＸ３ＣＬ１およびＣＣＬ７レベルの平行した減少が続いた。この効果は、Ｓ−Ｃ患者では観察されなかった。
【０１００】
考察
本発明者らの知るかぎりでは、本研究は、ＣＯＰＤにおける老化肺線維芽細胞によって合成されたＰＧＥ２が、老化を誘導、強化および拡大し、ＥＰ２レセプターおよびＥＰ４レセプター、ＣＯＸ２依存性ＲＯＳシグナル伝達およびｐ５３シグナル伝達経路を介して炎症を起こすオートクリンおよびパラクリン効果を発揮することができることを初めて示すものである。ＣＯＰＤ線維芽細胞の方が、喫煙者対照細胞および非喫煙者対照細胞よりもこの現象に対して感受性が高かった。
【０１０１】
ＥＰ２のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現は、ＣＯＰＤ非老化線維芽細胞でアップレギュレーションされた。これは、特に明白であって、両方の対照群とは異なっていた。これは、おそらくＰＧＥ２に対するＣＯＰＤ細胞の特別な感受性を説明している。この増加は、肺ガンに関係するおそれがあった。というのは、線維芽細胞が腫瘍病理学のために切除された肺の非腫瘍領域から試料採取されたからである（Kreutzer M et al., Oncol Rep 2007; 18: 497-501）。しかし本発明者らは、本発明者らの細胞がガン関連線維芽細胞のどのマーカーもディスプレイしなかったことを慎重に立証した。ＣＯＰＤ線維芽細胞におけるＥＰ２の過剰発現は、ＤＮＡの低メチル化に関係する可能性があった。それは、ＤＮＡメチル化が、ＥＰ２発現の負のモデュレーションを行い（Huang SK et al., Am J Pathol 2010; 177: 2245-2255）、加齢およびタバコへの曝露が全体的なＤＮＡ低メチル化に関連しているからであった（Smith IM et al., Int J Cancer 2007; 121: 1724-1728; Bollati V et al., Mech Ageing Dev 2009; 130: 234-239）。このエピジェネティック仮説に合致して、複製老化ＣＯＰＤ細胞におけるＣＯＸ２の発現増加は、平行したｍｉＲ１４６ａの発現減少に関係する可能性があった。実際、ＣＯＸ２の発現を負コントロールするこのｍｉＲの発現（Sato T et al., Am J Respir Crit Care Med 2010; 182: 1020-1029）は、複製老化とともに減少する（Vasa-Nicotera M et al., Atherosclerosis 2011; 217: 326-330）。または、ＰＧＥ２とＣＯＸ２の間の正のフィードバックループで、老化ＣＯＰＤ線維芽細胞におけるＣＯＸ２増加を説明することができた。それは、本発明者らの結果および他の研究から、ＰＧＥ２がＣＯＸ２の発現を誘導しうることが示されたからである（Diaz-Munoz MD et al., Biochem J 2012; 443: 451-461）。
【０１０２】
いくつかの線維芽細胞パラメーターが本質的に喫煙と関係し、Ｓ−Ｃ線維芽細胞で観察された（例えば継代３回目でのＰＧＥ２およびＥＰ４の発現増加）ものの、継代３回目での高いＥＰ２発現ならびに継代７回目での大部分の老化マーカーおよび炎症性メディエーター（ＰＧＥ２、ＩＬ−８、ＧＲＯ、ＣＸ３ＣＬ１、ＦＧＦ２、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ）の増加は、ＣＯＰＤ線維芽細胞だけに観察されるか、または、両方の対照群に比べてＣＯＰＤ線維芽細胞の方が有意に大きくなった。この増加は、継代７回目での累積ＰＤＬを除き、禁煙した後も不可逆的であった。これらのデータおよび対照喫煙者が（彼らの現在の喫煙状況が何であろうと）ＣＯＰＤ患者と同じ喫煙歴を有したという事実を考慮すると、肺線維芽細胞老化がＣＯＰＤに特異的であるという見込みは非常に高い。本発明者らは、禁煙後のＣＯＰＤ線維芽細胞において累積ＰＤＬだけが可逆的であったことに関する説明をつかんでいない。しかし、ＣＯＰＤ線維芽細胞における大部分の老化マーカーおよびＳＡＳＰマーカーの可逆性の不在は、老化と炎症との間の自己永続化過程に一致し（Acosta JC et al., Cell 2008;133: 1006-1018）、そのことで禁煙後のＣＯＰＤにおける炎症持続を説明することができよう（Rutgers SR et al., Chest 2000;117:262S）。
【０１０３】
本質的にＥＰ２またはＥＰ４のいずれかを伴うＰＧＥ２の効果は、内因性および／または外因性ＰＧＥ２が、肺線維芽細胞を含む異なる細胞型の増殖を低減したことを示す以前の研究に合致する（Togo et al. Am J Respir Crit Care Med 2008;178:248-260; Sato et al. Am J Respir Crit Care Med 2010;182: 1020-1029; Walker NM et al., Am J Respir Crit Care Med 2012;185:77-84）。本発明者らは、異なる化学的性質の数種のＣＯＸ阻害剤ならびにＥＰ２／ＥＰ４レセプターのアゴニストおよびアンタゴニストを使用したので、自らの結果に自信をもっている。最近の論文から、外因性ＰＧＥ２がヒト真皮線維芽細胞の複製老化をいっそう激化させたことが示された（Yang HH et al., Biogerontology 2011;12: 239-252）。しかし、その研究でＰＧＥ２の効果は、本研究のほぼ１５００倍の濃度である５μMから観察された。これは、おそらく病態生理学的効果よりも薬理効果を反映している。さらに、その研究でＳＡＳＰの分析は行われなかった。in vitroデータとin vivoデータを比較することは困難であるが、本研究におけるＣＯＰＤ線維芽細胞のセクレトームにおけるＰＧＥ２濃度は、ＣＯＰＤ患者の誘導喀痰から見いだされた濃度と同じ範囲内である（Chen Y et al., Respirology 2008; 13: 1014-1021）。この濃度のＰＧＥ２は、非老化ＣＯＰＤ線維芽細胞による炎症性メディエーターの分泌を、ＣＯＰＤ線維芽細胞のＳＡＳＰから見いだされたレベルに近いレベルで誘導し、本発明者らの結果の病態生理学的重要性を強調している。その上、内因性ＰＧＥ２は、ＣＯＰＤ線維芽細胞のＳＡＳＰのオートクリンおよびパラクリン老化効果に直接関与した。しかし、老化ＣＯＰＤ線維芽細胞からのＳＡＳＰが、老化を誘導および増幅することができるＩＬ−６およびＩＬ−８などのサイトカインを含有したので（Acosta JC et al., Cell 2008; 133: 1006-1018; Kojima H et al., Cell Cycle 2012; 11: 730-739）、ＣＯＸ２阻害による老化の抑止が、ＰＧＥ２ではなくこれらの因子の不在に関係したと主張することができる。本発明者らは、この可能性を完全には排除することができないものの、少なくともＩＬ−８に関してはありそうにないと考えている。というのは、ＣＯＰＤ線維芽細胞からＣＸＣＲ２ ｍＲＮＡの発現が検出されなかったからである。最後に、文献のデータから、２型肺細胞およびマクロファージが老化ＣＯＰＤ線維芽細胞によって産生された範囲内の量のＰＧＥ２を産生しうることが示されているので（Cao H et al., Anal Biochem 2008; 372: 41-51; Mundandhara SD et al., Toxicol in vitro 2006; 20: 614-624; Mao JT et al., Clin Cancer Res 2003; 9: 5835-5841）、これらの隣接細胞によって合成されたＰＧＥ２が線維芽細胞に対してパラクリン老化促進的な役割を果たすことを排除することはできない。
【０１０４】
ＰＧＥ２への単回曝露によって誘導される老化にｐ５３が果たす役割は、早期細胞老化の仲介にこのタンパク質が果たす、十分に確立した役割に一致し、その一方でｐ１６は、細胞成長を完全に停止させ、細胞を複製老化に駆動するために必要である（Zhang H. J Cell Physiol 2007; 210: 567-574）。それに合うように、ＰＧＥ２への単回曝露によってｐ１６も増加したが、細胞およびマウスの両方においてｐ５３を阻害したときにｐ１６は改変されなかった。これは、ｐ１６がＰＧＥ２への単回曝露によって誘導される老化に関与しないことを示唆している。ｐ５３は、ＣＯＸ２依存性ＲＯＳ産生の増加によって活性化されたが、これは、リン脂質を切断し、プロスタグランジンの産生のための前駆体として利用可能なアラキドン酸をもたらす細胞外ホスホリパーゼであるｓＰＬＡ２が、ＣＯＸ２誘導を介してマウス大動脈中にＲＯＳを誘導することを示している以前の結果に沿ったものである（van der Giet M et al., J Mol Med (Berl) 2010; 88: 75-83）。老化マーカーに対する効果とは対照的に、ＰＧＥ２に単回曝露後のｐ５３が果たす炎症促進的な役割は予想外であった。それは、このタンパク質が、ＳＡＳＰの負のレギュレーターであると繰り返し報告されているからである（Coppe JP et al., Annu Rev Pathol 2010; 5: 99-118）。ただ１つの研究が反対の結果を実証しており、ベンゾ［ａ］ピレンジオールエポキシド（ＢＰＤＥ）へのＷＩ３８ヒト肺線維芽細胞の曝露が、ｐ５３およびＪＮＫ経路を経由したＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１β分泌に繋がることを示した（Dreij K et al., Carcinogenesis 2010; 31: 1149-1157）。興味深いことに、ＢＰＤＥはＣＯＸ２も誘導したので、ＣＯＸ２を介したｐ５３活性化が炎症促進効果に繋がるという特別な効果を示している。関与するメカニズムが何であれ、本発明者らの結果は、ＰＧＥ２の炎症促進効果についての新しいメカニズムを実証するものである。このメカニズムは、線維芽細胞をはるかに超えたものである。というのは、その効果が野生型マウスおよびｐ５３−／−マウスの全肺からも実証されたからである。
【０１０５】
ＰＧＥ２へのＣＯＰＤ線維芽細胞の反復曝露は、単回曝露後に観察されたＣＯＸ２／ＲＯＳ経路の活性化を再現および増強した。実際に、ＰＧＥ２に反復曝露された線維芽細胞は、継代５回目および７回目にＨＯ−１の発現増加だけでなくＡＴＭの活性化も示した。これは、この場合、ＲＯＳのレベルがＤＮＡ損傷を誘導するために十分であったことを示していた（Banin S et al., Science 1998; 281: 1674-1677）。この現象で、ＰＧＥ２の単回適用によって誘導されなかったＩＬ−８およびＧＲＯなどのいくつかの炎症性メディエーターの誘導を説明することができよう（Rodier F et al., Nat Cell Biol 2009; 11: 973-979）。加えてＰＧＥ２は、テロメア長をさらに減少させずにｐ２１およびｐ１６の発現誘導を高めた。したがって、これは、ＣＯＰＤ細胞に自然に発生する複製老化のパターンが強化したことを示している。そのような結果は、複製老化の間に適用された他の酸化刺激で以前に実証されたように、複製老化の自然過程に重なったＰＧＥ２誘導酸化的シグナル伝達と一致する（Frippiat C et al., Exp Gerontol 2000; 35: 733-745; de Magalhaes JP et al., FEBS Lett 2002; 523: 157-162）。これらの結果に沿って、ＣＯＸ２阻害剤を用いた継代３回目から７回目までのＣＯＰＤ線維芽細胞の慢性処理は、ＳＡ−βｇａｌ、ｐ１６、ｐ２１およびＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＲＯ、ＣＸ３ＣＬ１、ＭＣＰ３およびＭＭＰ２を対照喫煙者に近いレベルに有意に減少させた。対照的に、これらの阻害剤は、対照喫煙者の線維芽細胞の老化およびＳＡＳＰを改変しなかったので、ＰＧＥ２／ＣＯＸ２経路の老化促進効果に対するＣＯＰＤ線維芽細胞の特別な感受性を強調している。
【０１０６】
これらの結果を考慮して、ＰＧＥ２経路の阻害は、ＣＯＰＤにおける老化および炎症を低減するためのオリジナルのアプローチとなりうる。ＣＯＸ２阻害剤の長期使用は、特にＣＯＰＤ患者における心血管イベントのリスク増加に繋がるので（Solomon DH et al., Arthritis Rheum 2008; 59: 1097-1104）、ＥＰ２／ＥＰ４レセプターまたはｍＰＧＥＳ−１などのＰＧＥ２経路の他の要素の選択的阻害が、代替的なオリジナルのアプローチを構成するはずである。
【０１０７】
参考文献：
本出願にわたり、様々な参考文献が、本発明が属する技術の現状を説明している。これらの参考文献の開示内容は、ここで引用により本件開示内容に取り込まれる。
【０１０８】
【表３】
2015522528.tif 000006
2015522528.tif 000007
2015522528.tif 000008
2015522528.tif 000009
【図１Ａ】
2015522528.tif 000010
【図１Ｂ】
2015522528.tif 000011
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【国際調査報告】
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