(57)【要約】  生物学的標的材料を含む、または生物学的標的物を含むと疑われるサンプルから当該生物学的標的物を選択的に分離する方法は、（i）その表面にウレイド部分を含む固体を提供する工程、（ii）当該サンプルを当該固体と接触させる工程、それによって当該サンプル中の生物学的標的物の実質的なフラクションが当該ウレイド部分に対して結合する、および（iii）当該サンプルから当該固体を分離する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的標的材料を含む、または生物学的標的物を含むと疑われるサンプルから当該生物学的標的物を選択的に分離する方法であって、
（i）その表面にウレイド部分を含む固体を提供する工程；
（ii）当該サンプルを当該固体と接触させる工程、それによって当該サンプル中の当該生物学的標的物の実質的なフラクションは当該ウレイド部分に結合する；および
（iii）当該サンプルから当該固体を分離する工程；
を含む方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、当該生物学的標的物は、（１）約１０ｎｍ〜約２００ｎｍ、（２）約２００ｎｍ〜約１ミクロン、（３）約１ミクロン〜約２０ミクロン、および（４）約２０ミクロン以上、からなる群より選択される範囲のサイズを有する方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、当該生物学的標的物は、（１）約１００キロダルトン〜約５００キロダルトン、（２）約５００キロダルトン〜約１メガダルトン、（３）約１メガダルトン〜約１０メガダルトン、および（４）約１０メガダルトン以上、からなる群より選択される範囲の分子量を有する大型の生物学的標的物である方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、当該生物学的標的物が細胞である方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、当該細胞は、（ｉ）哺乳類細胞、（ｉｉ）昆虫細胞、（ｉｉｉ）酵母細胞、（ｉｖ）細菌細胞、および（ｖ）他の生体細胞からなる群より選択される１種類を含む方法。
【請求項６】
請求項１〜５に記載の方法であって、当該生物学的標的物は、細胞サブストラクチャーを含む方法。
【請求項７】
請求項６に記載の方法であって、当該細胞サブストラクチャーは、（ｉ）オルガネラ、（ｉｉ）封入体、（ｉｉｉ）エンドトキシン、または（ｉｖ）他の細胞サブストラクチャーからなる群より選択される１種類を含む方法。
【請求項８】
請求項７に記載の方法であって、当該細胞サブストラクチャーは、（ｉ）エキソソーム、（ｉｉ）リボソーム、（ｉｉｉ）ミトコンドリア、（ｉｖ）葉緑体、または（ｖ）他の細胞サブストラクチャーからなる群より選択されるオルガネラを含む方法。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の方法であって、当該生物学的標的物の少なくとも５０％が当該ウレイド部分に結合する方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、当該生物学的標的物の少なくとも７５％が当該ウレイド部分に結合する方法。
【請求項１１】
請求項９に記載の方法であって、当該生物学的標的物の少なくとも９０％が当該ウレイド部分に結合する方法。
【請求項１２】
請求項９に記載の方法であって、当該生物学的標的物の少なくとも９５％が当該ウレイド部分に結合する方法。
【請求項１３】
請求項９に記載の方法であって、当該生物学的標的物の少なくとも９９％が当該ウレイド部分に結合する方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３に記載の方法であって、実質的には当該生物学的標的物の全てが当該ウレイド部分に結合する方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４に記載の方法であって、当該ウレイド部分がアラントイン上にある方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５に記載の方法であって、当該ウレイド部分が結晶であり、当該固体が粉末状である方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、当該アラントインが水性液体中にあり、過飽和濃度で存在していることにより固体である方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法であって、当該アラントインが水性液体中にあり、当該アラントインが、（ｉ）０．５６％を超える、（ｉｉ）０．５６〜２０％、（ｉｉｉ）５〜１０％、（ｉｖ）１〜２％、（ｖ）２〜５％、（ｖｉ）２０〜５０％の群からの１つからなる濃度で存在する方法。
【請求項１９】
請求項１に記載の方法であって、当該固体と関連している当該生物学的標的物が、濾過または沈殿により当該サンプルから分離される方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、当該生物学的標的物が、クリーンバッファ中にそれを再懸濁すること、沈殿または濾過により当該固体からその後に回収することにより洗浄される方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、当該ウレイドは、過飽和のアラントインであり、当該クリーンバッファは、飽和でまたはほぼ飽和でアラントインを含む方法。
【請求項２２】
請求項２０および２１に記載の方法であって、当該洗浄工程は、１回以上繰り返されてよい方法。
【請求項２３】
請求項１９〜２２に記載の方法であって、当該ウレイド部分は、アラントインに具体化され、当該生物学的標的物は、当該アラントインの少なくとも一部分を可溶化することによって当該アラントインの少なくとも一部分から分離される方法。
【請求項２４】
請求項２３に記載の方法であって、当該生物学的標的物が、ダイアフィルトレーションによってその後に濃縮される方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、当該生物学的標的物の再可溶化が、ダイアフィルトレーションと同時である方法。
【請求項２６】
請求項２４および２５に記載の方法であって、当該生物学的標的物は、その後、更なる分別法により精製される方法。
【請求項２７】
請求項１に記載の方法であって、当該サンプルが液体または気体である方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７に記載の方法であって、当該サンプルが、細胞または溶解細胞を含む細胞培養収穫物である方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の方法であって、当該細胞が予め取り出されている方法。
【請求項３０】
請求項２７に記載の方法であって、当該サンプルが、部分的に精製される方法。
【請求項３１】
請求項２７に記載の方法であって、当該サンプルが高度に精製される方法。
【請求項３２】
請求項１および２７に記載の方法であって、当該サンプルが水性である方法。
【請求項３３】
請求項１および２７に記載の方法であって、当該サンプルが水である方法。
【請求項３４】
請求項１および２７に記載の方法であって、当該サンプルが空気である方法。
【請求項３５】
請求項１に記載の方法であって、当該生物学的標的物が、精製されるべき所望の生物学的標的物である方法。
【請求項３６】
請求項１に記載の方法であって、当該生物学的標的物が、取り出されるべき不要の生物学的標的物である方法。
【請求項３７】
請求項１に記載の方法であって、当該生物学的標的物が、１種よりも多くの取り出されるべき生物学的標的物を含み得る方法。
【請求項３８】
請求項３６および３７に記載の方法であって、当該サンプルが、０．００１〜０．１％の範囲の凝集濃度で同じ正味荷電を伴う１以上の種類の溶解性有機多価イオンで処理される方法。
【請求項３９】
請求項３８に記載の方法であって、当該溶解性有機多価イオンが、０．００１〜０．１％の範囲の濃度で、エタクリジン、クロルヘキシジンまたはオクタン酸の群からの１種類以上を含む方法。
【請求項４０】
請求項３６および３７に記載の方法であって、所望のタンパク質が、固定化された有機多価イオンに実質的に結合していない条件下で、固体表面に固定化された同じまたは異なる正味荷電の１種類以上の有機多価イオンによって当該サンプルが処理される方法。
【請求項４１】
請求項３６および３７に記載の方法であって、当該サンプルが、溶解性および固定化された有機多価イオンの両方により処理され、少なくとも１種類の固定化された有機多価イオンが、当該溶解性有機多価イオンとは反対の正味荷電を有する方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法であって、当該固定化された有機多価イオンは、反対の正味荷電の種を含む方法。
【請求項４３】
請求項３９〜４２に記載の方法であって、少なくとも１種類の有機多価陽イオンが、金属親和性官能性を含む方法。
【請求項４４】
請求項３９〜４３に記載の方法であって、溶解性有機多価イオンでの処理が、最初にあるか、または溶解性および固定化有機多価イオンへの暴露が本質的に同時にある方法。
【請求項４５】
請求項１〜４４に記載の方法であって、当該方法においては、（ｉ）７、（ｉｉ）６．５〜７．５、（ｉｉｉ）６〜８、（ｉｖ）５〜９、（ｖ）４〜１０、（ｖｉ）４未満、および（ｖｉｉ）中間のｐＨ値、からなる群より選択されたｐＨ値で行われる方法。
【請求項４６】
請求項１〜４５に記載の方法であって、当該方法においては、（ｉ）１２〜１５ｍＳ／ｃｍ、（ｉｉ）５〜２０ｍＳ／ｃｍ、（ｉｉｉ）１〜３０ｍＳ／ｃｍ、（ｉｖ）１〜５０ｍＳ／ｃｍ、（ｖ）１〜１００ｍＳｃｍ、（ｖｉ）１ｍＳ／ｃｍ未満、（ｖｉｉ）１００ｍＳ／ｃｍを越えて、および（ｖｉｉｉ）中間の伝導率値、からなる群より選択された伝導率で行われる方法。
【請求項４７】
請求項１〜４６に記載の方法であって、当該ウレイドに結合されるべき当該生物学的標的物が、（ｉ）１分、（ｉｉ）５分、（ｉｉｉ）１０分、（ｉｖ）１５分、（ｖ）３０分、（ｖｉ）６０分、（ｖｉｉ）６０分を越えて、または（ｖｉｉｉ）中間の時間、からなる群から選択される期間に亘り、当該ウレイドと一緒にインキュベートされる方法。
【請求項４８】
請求項１に記載の方法であって、当該ウレイドに結合されるべき当該生物学的標的物が、ウイルスを不活性化するための処理に供される当該ウイルスである方法。
【請求項４９】
請求項４８に記載の方法であって、当該ウイルス不活性化処理が、（ｉ）３〜５のｐＨに対する暴露、（ｉｉ）９〜１１のｐＨに対する暴露、（ｉｉｉ）エタクリジンに対する暴露、（ｉｖ）クロルヘキシジンに対する暴露、（ｖ）塩化ベンザルコニウムに対する暴露、（ｖｉ）界面活性剤に対する暴露、（ｖｉｉ）トリ（ｎ−ブチル）フォスフェートに対する暴露、（ｖｉｉｉ）メチレンブルーに対する暴露、（ｉｘ）ポリエチレンイミンに対する暴露、（ｘ）尿素に対する暴露、（ｘｉ）グアニジンに対する暴露、（ｘｉｉ）カプリル酸に対する暴露、（ｘｉｉｉ）塩化ナトリウムに対する暴露、または（ｘｉｖ）アルギニンに対する暴露からなる群からの１種類である方法。
【請求項５０】
請求項１〜４９に記載の何れかの方法の都合のよい実施のためのキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の概要】
【０００１】
関連出願の記載
本出願は、２０１２年５月３１日に提出された米国仮出願第６１／６５３，７２９およびまた２０１２年５月３１日に提出された６１／６５３，７４０の優先権を主張するものであり、それらの内容は、引用によってそれらの全体に亘ってここに組み込まれる。
【０００２】
分野
ここに開示される実施形態は、独立してまたは集合において存在する生物学的標的物を選択的に結び付けるためウレイドを有する固体表面を使用する方法に関する。前記生物学的標的物は、サイズが変化に富んでいてもよく、特定の実施形態においては、それらのサイズは約２０ミクロン以上〜何百万ダルトンものサイズを含んでもよい。前記生物学的標的物は、とりわけ細胞、細胞サブストラクチャー（substructures of cells）、ウイルスおよび／または凝集物を含み、そこにおいて当該方法の目的は、局所環境（local environment）からそれらを取り出すこと、潜在的には、その後の使用のためにそれらを精製することである。ここに開示される方法は更に、どちらか一方の大きい生物学的標的物をより高程度に精製すること、または大きな生物学的標的物が取り出されたものから、サンプルを構成する所望の別成分の更なる精製を達成するために他の分別工程と更に一体化されていてもよい。
【０００３】
背景
沈殿法は、関係している機能的機序に基づいて、２つのグループ：沈殿と共沈とに分類できる。古典的な沈殿法は通常、大量の添加物を使用し、それは沈殿させるべき種を不溶性の状態にするように溶媒の特性を変える。添加物はそれ自身、溶解性を維持することができ、上清が沈殿物から分離されるときに大部分が取り除かれる。沈殿物はその後、沈殿を媒介するために使用された作用物質を含まない液体に再懸濁される。微量の作用物質は容易に除去でき、それは、それらが沈殿している生成物との強固な結び付きを形成しないからである。例は、塩、例えば、とりわけ、硫酸アンモニウム、クエン酸ナトリウム、リン酸カリウム；有機ポリマー、例えば、とりわけ、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、デキストラン、ポリビニルピロリドン；および有機溶媒、とりわけ、アセトン、クロロホルムおよびアルコールなどとの沈殿を含む。
【０００４】
共沈法は典型的に、沈殿させるべき種に結合することと、自然発生的にそれが沈殿する点にまでその溶解度を下げることとにより機能する。当該技術は、調査または商業的に関心のあるタンパク質またはウイルスを選択的に沈殿するために使用され得る。同様に、当該技術は、１つ以上の混入物質種を興味のあるタンパク質またはＤＮＡプラスミドを含む調製物から選択的に沈殿するために使用できる。タンパク質およびＤＮＡプラスミド調製物から除去するために重要な混入物質は、特にウイルスおよびエンドトキシンを含む。共沈は、それが通常少量の沈殿剤を使用するという意味では、一般的に古典的な沈殿以上に有利ではあるが、沈殿した生成物の回収が、沈殿剤を含まないその再懸濁を用いるということばかりではなく、興味のある生成物に対して微量で結合したままで残留する沈殿剤を移動させる更なる処理工程の必要性を強要し得るという意味では不利である。これは通常、生成物と共沈物との間の相互作用を乱す薬剤を導入することにより行われる。共沈剤の例は、とりわけ、アニオン性ポリマー、カチオン性ポリマーおよび脂肪酸を含む。残留沈殿剤を移動させるために使用される物質はとりわけ、高濃度の中性塩、例えば、塩化ナトリウム、カオトロープおよび有機溶媒を含む。
【０００５】
典型的な沈殿法および共沈法は双方ともにウイルスの精製において使用されてきた。多くの種類の化学的表面は、ウイルスを接着する能力を有する。あるものは、例えば、イオン交換体および疎水性相互作用クロマトグラフィ媒体など、正および負電荷または疎水性を介するウイルスとの相互作用を媒介するために化学修飾された表面を含む。これらの材料は、種々のウイルス種を接着することおよびかなり低価格であることという望ましい特徴を有するが、また多数のタンパク質を接着することおよび広範に及ぶプロセス開発を必要とすることという望ましくない特徴も有している。或いは、バイオ親和性リガンドとして抗体を表面に固定化することは、他のタンパク質に対立するものとして、ウイルスに特異的である可能性があり、限られたプロセス開発のみが求められるのみならず、単一のウイルス種のみを一般的に接着する固定化された抗体を備える表面も必要とされ、且つそれらは比較的かなりな費用になる。
【０００６】
ウレイドは、ヒトのスキンケアのための製品において広く使用される非炎症性または抗炎症性の薬剤として活性を示す。１つの一般的な例はアラントインであり、これは、水溶液中で難溶性であり、約３６ｍＭの濃度で飽和する。この濃度を越えた量は、結晶として存在する。幾つかのウレイドは、シリカ粒子状に共有結合で固定化されている。シリカ上の１−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］尿素の固定化が明示されており（Bicker et al. J. Chromatogr. A, 1218 882-895 2011）、構成体は、様々な小分子化合物の親水性相互作用クロマトグラフィのために使用される。二座のアルコキシシランは、また親水性相互作用クロマトグラフィのためにもシリカ上に尿素フラグメントを組み入れて固定化されており（Kotoni et al J. Chromatogr. A, 1232 196-211 2012）、糖類の分析のために有用であることが見いだされた。抗体を含有する細胞培養物上清からの凝集物の浄化のために多価陽イオンとの併用でのアラントインの使用が記載されている（J. Chromatogr. A, 1291 33-40 2013）。
【０００７】
発明の概要
ここに開示された実施形態は、サンプルから生物学的標的物を選択的に分離する方法であって、当該方法は、(i)その表面で１以上のウレイド分子部分を有する固体を提供する工程と；(ii)当該サンプルを前記固体と接触させる工程と、それにより当該サンプル中の生物学的標的物の本質的なフラクションを当該固体の表面上のウレイドに結合する；および(iii)当該サンプルから前記固体を分離する工程とを含む。幾つかの実施形態において、当該生物学的標的物は、「大型（large）」と看做される。生物学的標的物に関してここで使用されるとき、用語「大型」は、個々の生物学的標的物または約２０ミクロン〜何百万ダルトンまでもの凝集サイズを有する生物学的標的物の集合物を含むと理解されるであろう。典型的な生物学的標的物は、細胞および細胞サブストラクチャー、例えば、オルガネラ、封入体、エンドトキシン、凝集物およびウイルスなどを含む。それらの表面に１つ以上のウレイドを有する固体は、特に、ウレイド結晶または表面に固定化されたウレイドを含む。ある実施形態において、ウレイドは、特にアラントインを含む。
【０００８】
ある実施形態において、サンプルは局所環境であり、当該方法は、その環境から生物学的標的物を選択的に取り出すための手段を提供する。幾つかのそのような実施形態において、サンプルは空気であり、その表面に１つ以上のウレイドを有する固体材料と接触される。１つの特定の実施形態では、空中浮遊生物学的標的物は、ウイルスまたは他の病原体であり、ウレイドはアラントインである。
【０００９】
ある実施形態では、サンプルは液体であり、その表面に１つ以上のウレイドを有する固体材料と接触される。１つのそのような実施形態では、サンプルは水であり、生物学的標的物は、病原微生物またはその派生サブストラクチャー、例えば、エンドトキシンなどを含み、ウレイドは、過飽和濃度でのアラントインである。もう１つのそのような実施形態では、サンプルは、所望のタンパク質を含むタンパク質調製物、例えば、組み換えタンパク質などを含むタンパク質調製物であり、ウレイドは過飽和濃度でのアラントインである。特定のそのような実施形態では、タンパク質調製物は、その液体から取り出されるべき、細胞、細胞片（cell debris）、微生物およびエンドトキシンを含むそのサブストラクチャーを含んでもよい。特定のそような実施形態では、有機多価イオンが、ウレイドと併用され、不要な材料の除去を向上してもよい。特定のそのような実施形態では、ウレイドおよび／または有機多価イオンで処理されたサンプルは、有機多価イオンを含む他の固体と併用して、不要な材料の除去率を更に向上してもよい。
【００１０】
特定の実施形態では、生物学的標的物は、固体を溶解することにより、またはウレイドと標的物との相互作用を乱すことにより、その１つの表面で１つ以上のウレイドを有する固体から回収されてもよい。１つのそのような実施形態では、ウレイドはアラントインである。１つのそのような実施形態では、当該方法は、固体からウイルスを回収することの更なる工程を提供するものであり、ここにおいて、サンプルは、精製されるべき所望のウイルスを含む。もう１つのそのような実施形態では、当該方法は、固体から細胞オルガネラを回収する更なる工程を提供するものであり、ここにおいて、サンプルは、精製されるべき所望のオルガネラを含む。
【００１１】
[図面の簡単な説明］
図１は、ここで開示される方法に従う高分子量の凝集の減少およびホスト細胞タンパク質混入物質の減少を示す経時的プロットを示す。
【００１２】
図２Ａおよび２Ｂは、ここに開示される方法に従うＩｇＭ−８４抗体の処理前および後のサイズ排除クロマトグラフィプロファイルを示す。
【００１３】
図３は、ここに開示される方法に従う抗ＨＥＲ２モノクローナルＩｇＧ抗体の処理前および後のサイズ排除クロマトグラフィプロファイルを示す。
【００１４】
［詳細な説明］
その表面に１つ以上のウレイドを有する固体が、大型の生物学的標的物を含む生物学的標的物に対する十分に強い親和性を媒介するということ、それらが結合している固体をただ取り出すことだけでサンプルから、それらが選択的に抽出されるということが、驚くべきことに発見された。抽出された生物学的標的物は、その後、破棄されてもよく、回収されてもよい。大型の生物学的標的物は、個々の標的物または２０ミクロンから何百万ダルトン（Ｄ）までもの凝集サイズを有する標的物の集合物を含む、特に、細胞および細胞サブストラクチャー、例えば、オルガネラ、マイクローブおよびマイクローブのサブストラクチャー、例えば、エンドトキシンおよび凝集物などを含むと理解される。特にタンパク質を含む小型の生物学的標的物は、固体表面上のウレイドに対して低い親和性を示す可能性があり、これが、ウレイドに結合した大型標的物からそれらを分離することを容易にする。
【００１５】
幾つかの実施形態では、生物学的標的物は、（１）約１０ｎｍ〜約２００ｎｍ、（２）約２００ｎｍ〜約１ミクロン、（３）約１ミクロン〜約２０ミクロン、および（４）約２０ミクロン以上からなる群から選択される範囲のサイズを有する。当業者は、生物学的標的物の実サイズが、標的物自身の本質的な機能となることを理解できる。小型の生物学的標的物が精製されるべき場合には、ここで開示される方法は、他の精製技術と組み合わされて、所望する程度の精製が提供されてもよい。
【００１６】
何れの特定の理論により縛られることなく、実験データは、アラントインの親和性が、特に、水素結合などのファンデルワールス（van der Walls）相互作用により媒介されることを示す。そのような結合は、ｐＨ、伝導率および有機修飾剤の存在により、大部分の共有結合よりも大きい範囲まで、しかしながら非共有相互作用、例えば、静電気性または疎水性相互作用などよりも小さい範囲までの影響を受ける。これは多くの場合において、特定の生物学的標的物に対するウレイドの親和性が、なぜｐＨおよび塩濃度の変化、または静電気性若しくは疎水性相互作用に著しく影響する有機修飾剤の存在によって殆ど影響されないのかを説明し得る。しかしながら、特定の生物学的標的物に対するウレイドの明白な親和性は、ｐＨまたは塩濃度または有機修飾剤の存在に応じて、標的物に本欄備わっている溶解度の変化の影響を受け得る。
【００１７】
結合が固体のウレイド表面で生じることを考えれば、ウレイド表面の全表面積が大きくなればなる程、その能力は大きくなることは明らかである。そのため、小型の粒子は一般に、大型の粒子と同様の集団よりも高い能力を示し、小型の結晶は一般に大型の結晶と同様の集団よりも高い能力を示し、概して、入手可能な最小サイズの粒子または結晶を使用することが有利になる。
【００１８】
ある実施形態では、本発明は、実質的にタンパク質を結合せず、ウイルスおよび／またはエンドトキシンを結合するために、過飽和または固定化されたウレイドを使用する方法を提供する。用語「過飽和」は、粒子、粉末または結晶材料が、その材料の最大量が溶解しているときに、固体塊が依然として存在するような濃度で存在する状態をいう。
【００１９】
ある実施形態では、本発明は、タンパク質を取り出すことを介してウイルスを精製する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、ウイルスおよびエンドトキシンを取り出すと同時にタンパク質を精製する方法を提供する。更に他の実施形態では、本発明は、例えば、気体または液体からウイルスを濾過することとの関連などにおいて、サンプルまたは局所環境からウイルスを取り出すことおよび任意に不活性化することに関連して、ウイルスを結合するための、または浄化用若しくは保護用の適用のための方法を提供する。
【００２０】
ある実施形態において、本発明は、タンパク質および他の小分子混入物質を取り出すことを介して細胞オルガネラを精製する方法を提供する。例えば、オルガネラが存在する調製物の体積の１〜２０％の量で、過飽和している量の固体表面上のウレイド、例えば、アラントインなどと、オルカネラの部分を共沈殿物する。実質的にはアラントインに対して結合していないタンパク質および小分子混入物質は、固体材料がアラントインの過飽和溶液を含むバッファで洗浄されるときに除去される。オルガネラは、その後、アラントインを含まないバッファの添加を介して、アラントインを可溶化することにより回収される。精製されたオルガネラは、限外濾過により濃縮されてもよい。生物学的に活性なオルガネラの回収が、生物学的活性を保存するための溶解性成分を含むバッファ、または少なくとも生物学的活性を減弱し得る条件および化合物を含むことを回避するバッファに頼ってもよいことは、当業者には明白であろう。
【００２１】
ある実施形態では、本発明は、混入しているタンパク質および他の小分子を取り出すことを介して封入体を精製する方法を提供する。
【００２２】
ある実施形態では、本発明は、そこにおいてウイルスが不溶性のウレイドにより共沈するウレイド共沈剤の使用、所望のウイルスの結合を伴う固体材料を分離すること、および次にウレイドからウイルスを解離させる競合剤を導入することによって固体からウイルスを回収することを介するウイルス精製方法を提供する。このアプローチは、アラントインおよび尿酸を含む低溶解性ウレイドの使用から恩恵を受けることができる。ある実施形態では、それが再懸濁されたウイルス中の残留ウレイドの量を制限することから、低溶解性ウレイドの使用が有利である。
【００２３】
ある実施形態において、本発明は、ウイルスを不溶性ウレイドと共沈するウレイド共沈剤の使用、所望のウイルスの結合を伴う固体材料の分離、例えば、水または適切な非ウレイド含有バッファの添加によって、ウレイドを溶解することによる固体からのウイルスの回収を介するウイルスの精製方法を提供する。ウイルス共沈および回収の有効性は、環境のｐＨおよび塩濃度、並びに使用されるウレイドの相対量に影響され得る。多価イオンとの共沈と正反対に、塩濃度の増加は、ウレイドの共沈の有効性を増大する。更に多価イオン、特により一般に使用される多価陽イオンとの共沈とは反対に、陰イオン交換体との強い結合を示すウイルスを共沈することと同等に、ウレイド沈殿は、酸性ｐＨでより効果的であり得る。
【００２４】
ウイルス回収を対象にするある実施形態では、何れかのアプローチにより回収されたウイルス中の残留ウレイドは、様々な方法、例えば、限外濾過によってウイルス濃縮と同時に容易に取り出される。或いはまたは加えて、特に、仮に高程度の精製が所望されるときには、ウレイドは大部分のクロマトグラフィ法に不活性であるために、それらはほとんど何れのクロマトグラフィ法により取り出せる。ウレイドはほとんど非イオン性であるため、サンプルはイオン交換体に適用でき、その結果、ウイルスが結合され、続いてウレイドを含まない塩含有バッファで溶出される間に、残留ウレイドは、結合されず、流失する。または、サンプルは、サイズ排除クロマトグラフィカラムに適用でき、そこにおいてウイルスは、その大きなサイズのために容易に溶出され、その小さいサイズを理由に非常に遅くに溶出するウレイドから良好に分離される。または、塩がサンプルに対して添加されて、ウイルスを疎水性相互作用クロマトグラフィカラムに対して結合させてもよく、その間にウレイドは貫流し、従って除去される。当業者は、他のカラムクロマトグラフィ法または沈殿法が、ウイルスの純度を増大すると共に、残留ウレイドを除去するために使用できることを認めるだろう。これは、ウレイド共沈は、もし所望されるのであれば、他のウイルス精製法と組み合わされて、特定の適用のための必要性を満たすために要求されるレベルの純度を達成することが可能であるということを浮き彫りにする。溶解性ウレイドは或いは、溶解性ウレイドを通過させるが、興味のある生物学的標的物は保持するポアサイズを有するメンブランを使用する膜濾過処理によって取り出されてもよい。このアプローチは、生物学的法的を濃縮するという更なる利点を有する。
【００２５】
タンパク質またはプラスミド精製を対象とするある実施形態では、ウイルスおよびエンドトキシンが不溶性ウレイドに結合するので、本発明は、過飽和されたウレイドと共にウイルスおよびエンドトキシンを共沈する方法を提供する。溶解性タンパク質またはＤＮＡプラスミドは、次に濾過または遠心分離により不溶性沈殿物を取り出することによって上清中に回収できる。不溶性の共沈物は、任意に滅菌および破棄されてもよい。ＤＮＡは通常ウレイド、例えば、アラントインに対しては低親和性を有するように見える一方で、混入物質と強く結びついているＤＮＡは、混入物質とウレイドとの相互作用によって取り出される可能性があることから、このアプローチには多少の注意を要する。混入物質関連ＤＮＡは、例えば、ヒストン、ヌクレオソーム、他のタンパク質または他の異種集合物と結びついたＤＮＡを含む。
【００２６】
ある実施形態では、本発明は、ウイルスを含有するサンプルまたはウイルスを含有することが疑われるサンプルからウイルスを選択的に分離する方法であって、（i）その表面にウレイド部分を有する固体を提供する工程；（ii）サンプルを固体と接触させる工程、それによってサンプル中の実質的なウイルスのフラクションを固体の表面上のウレイドに対して結合する；および（iii）サンプルの液体フラクションから固体を分離する工程を含む；方法を提供する。
【００２７】
ある実施形態では、サンプル中の少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、９５％または実質的に全てのウイルスが固体の表面上のウレイドに対して結合する。
【００２８】
ある実施形態では、方法は、所望のウイルスを精製するための方法であり、およびサンプルは所望のウイルスを含む。
【００２９】
ある実施形態では、ウレイドは過飽和のウレイド、例えば、アラントインまたは尿酸を含む。あるそのような実施形態では、ウレイドは、０．５６％、１％、２％、５％、１０％、２０％以上を越える濃度でのアラントインである。
【００３０】
ある実施形態では、サンプルの液体フラクションは、固体の沈殿または濾過により取り出される。ある実施形態では、液体フラクションから分離された固体は、アラントンで飽和またはほとんど飽和された再懸濁バッファにより洗浄され、沈殿物の隙間に残された流体中の混入物質が希釈され、固体が、その後、液体フラクションから分離される。ある実施形態では、液体フラクションから分離された固体は、ウレイドを可溶化するために十分な量の再懸濁バッファに接触される。バッファは様々なｐＨまたは塩濃度であってよく、そこにおいて、そのような条件は一般的に、ウイルスの安定性を支持するように、およびウレイドの溶解性に実質的には影響を及ぼさないように選択されるだろう。
【００３１】
ある実施形態では、サンプルは所望の生物学的産物を含み、ウイルスは混合物質であり、当該方法は、生物学的産物を精製する方法である。そのようなある実施形態では、所望の生物学的産物は、タンパク質、ＤＮＡプラスミドまたは抗体である。ある実施形態では、固体は、そのような固体材料の表面に複数個のウレイド分子を有する固体材料である。ある実施形態では、固体ウレイドは、過飽和のウレイド、例えば、アラントインまたは尿酸などの不溶性部分である。そのようなある実施形態では、ウレイドは、０．５６％、１％、２％、５％、１０％または２０％以上を越える濃度でのアラントインである。他のある実施形態では、ウレイドは、０．００２５％、０．０１％、０．１％、１％、２％、５％、１０％以上を越える濃度での尿酸である。ある実施形態では、ウレイドは、飽和の約２倍を超える、または約１％を超える、または約２％を超える、または約３％を超える、または約５％を超える、または約１０％を超える濃度である。
【００３２】
ある実施形態では、サンプルは、細胞、細胞サブストラクチャー、細胞フラグメント、凝集物およびエンドトキシンからなる群より選択される更なる混入物質を含み、更なる混入物質の量は、固体との共沈により低減される。
【００３３】
ある実施形態では、液体フラクションから固体を分離する工程に先立って、少なくとも約１５分間に亘って、サンプルを固体と接触する。他のある実施形態では、サンプルは、１５分未満の間に亘り、または約１５〜３０分間、または３０分を越えて、または約６０分、または約６０分を越えて、固体とインキュベートされる。一般的な事柄として、大型の生物学的標的物のアラントインとの結合は、本質的に瞬時に起こるように見え、取り除く工程よりも短い時間に達成完了が行われる。そうは言うものの良識的な実験室業務は、インキュベーション時間を体系的に評価し、たとえ特定の適用のために実質的に影響を有していないことが分かっても、矛盾のない処理時間を特定の適用のために特定し、それに従うべきであることを勧める。
【００３４】
ある実施形態では、固体がサンプルに接触する間に、サンプルは約４．０未満、または約４．０を超えて約７．０未満、または約７．０を超えて約９．０未満のｐＨ値を有する。ある実施形態では、固体は、約１ｍＳ／ｃｍ未満、または約１ｍＳ／ｃｍを越えて約１０ｍＳ／ｃｍ未満、または約１０ｍＳ／ｃｍを越えて約２５ｍＳ／ｃｍ未満、または約２５ｍＳ／ｃｍを越えて約４０ｍＳ／ｃｍ未満、または約４０ｍＳ／ｃｍを越えて約１００ｍＳ／ｃｍ未満、または約１００ｍＳ／ｃｍを越える伝導率で適用されてもよい。
【００３５】
ある実施形態では、生物学的標的物を有する液体は、沈殿または濾過により不溶性材料から分離されてもよい。
【００３６】
ある実施形態では、本発明は、例えば、空気または液体からのウイルスの濾過に関連して、局所環境からウイルスを回収するためにウイルス結合能を有する化学的に修飾された表面を使用する方法を提供する。
【００３７】
ウイルスが取り出され得る局所環境は、気体、液体および固体表面を含む。そのような環境は、そのような局所環境からのウイルスの取り出しまたは「濾過」のために、本発明の材料に対して供給されてもよく、接触させてもよく、または流過させてもよい。
【００３８】
ウレイドは、少なくとも１つのウレイド残基を具体化する有機分子の類を代表する。
【００３９】
例は、これらに限定するものではないが、尿素、ヒダントイン、アラントイン、尿酸、イミダゾリジニル尿素（1,1'-メチレンビス（3-[1-(ヒドロキシメチル)-2,5-ジオキソイミダゾリジン-4-イル]尿素）、ジアゾリジニル尿素（1,3-ビス(ヒドロキシメチル)-1-(1,3,4-トリス(ヒドロキシメチル)-2,5-ジオキソイミダゾリジン-4-イル)尿素）プリン、並びに誘導体およびこれらの構造を含む化合物構造体を含む。本発明の便利な実施のために十分な低溶解性を有するウレイドは、特に、アラントインおよび尿酸を含む。高溶解性のウレイドは、幾つかの場合においては、固体表面上のウレイドと大型標的生物学的存在物との相互作用が弱いかもしれない。
【００４０】
そのようなある実施形態では、固体の表面は、更に複数の第２の化学官能性を有し、そこにおいて、第２の化学感応性は、陽性部分、疎水性部分および金属キレート部分からなる群より選択される。
【００４１】
１以上の先行する実施形態において、サンプルが、１以上の種類の溶解性有機多価イオンとウレイドとの組み合わせによる続く精製工程のために調節されてもよい。
【００４２】
１以上の先行する実施形態において、溶解性多価イオンが陽性物質であってもよい。１つのそのような実施形態では、溶解性陽性多価イオンは、(i)エタクリジン、(ii)クロルヘキシジン、(iii)メチレンブルー、(iv)塩化ベンザルコニウム、(v)ポリエチレンイミンまたは(vi)他の陽性多価有機イオンからなる群からの１つ以上を含んでもよい。１つのそのような実施形態では、陽性有機多価イオンの濃度は、０．００１〜０．１％の範囲であってもよい。
【００４３】
１つ以上の先行する実施形態において、溶解性有機多価イオンが陰性物質であってもよい。１つのそのような実施形態では、溶解性多価イオンは、０．０１〜５．０％の濃度範囲で；カプリン酸、カプリル酸またはオクタン酸からなる群からの１つ以上を含んでもよい。
【００４４】
１つ以上の先行する実施形態において、ウレイドおよび１つ以上の種類の溶解性有機多価イオンを含むサンプルは、更に、(i)サンプルから固体を取り出すこと；(ii)陰性表面を有する第１の固体基体である第１の成分を提供すること；(iii)陽性表面を有する第２の固体基体である第２の成分を提供すること；(iv)タンパク質調製物を第１および第２の成分と接触させること、ここにおいて、第１および第２の成分は、サンプルが両方の成分と実質的に接触し得るように構成されており、ここにおいて、操作条件は、所望のタンパク質の第１または第２の成分に対する結合を実質的に妨げる；および(v)所望の生物学的標的物を第１および第２の成分から分離すること；によって調節されてよい。１つのそのような実施形態において、サンプル条件は、溶解性または固定化されたイオンに対する問題の生物学的標的物の実質的な結合を妨げる。１つのそのような実施形態では、多価イオンに対する問題の生物学的標的物の結合を実質的に阻害することは、塩濃度の調整、またはｐＨの調整、または多価イオンに対する生物学的標的物の実質的な結合を効果的に阻害するための有機修飾剤の添加からなる。
【００４５】
１つ以上の先行する実施形態において、ウレイドおよび１つ以上の種類の溶解性有機多価イオンを含むサンプルは、更に、(i)サンプルから固体を取り出すこと；(ii)金属を結合する能力のある少なくとも１つの表面結合リガンドを含む少なくとも１つの固体表面とサンプルを接触させること、ここにおいて、金属を結合する能力のある表面結合リガンドは、当初は実質的には金属を有しておらず、ここにおいて操作条件は、少なくとも１つの固体表面に対する所望のタンパク質の結合を実質的に阻害するように選択される；および(iii)少なくとも１つの表面結合リガンドからサンプルを分離すること、ここにおいて、１つを超える表面結合結合リガンドが存在している場合には、それぞれ表面結合リガンドは独立して同じ電荷または電荷中性の何れかである；により調節されてもよい。１つのそのような実施形態において、サンプル条件は、溶解性または固定化されたイオンに対する問題の生物学的標的物の実質的な結合を阻害する。１つのそのような実施形態において、多価イオンに対する問題の生物学的標的物の結合を実質的に阻害することは、塩濃度の調整、またはｐＨの調整、または多価イオンに対する生物学的標的物の実質的な結合を効果的に阻害するための有機修飾剤の添加からなる。
【００４６】
１つ以上の先行する実施形態において、タンパク質調製物の調節は、前述の調節処理またはその一部分の何れかの組み合わせを含む。
【００４７】
１つ以上の先行する実施形態において、サンプルの調製は、１つ以上の溶解性多価有機イオンに対して所望のタンパク質が実質的に結合せず、且つそれにより実質的に沈殿しない条件下で、同じ正味荷電型を有し、約０．００１重量／体積％〜約０．１重量／体積％の範囲の凝集濃度で、１つ以上の溶解性有機多価イオンを含むタンパク質調製物を処理することを含む。
【００４８】
１つ以上の先行する実施形態において、サンプルの調製は、固定化された有機多価イオンに対して所望のタンパク質が実質的に結合しない条件下で、同じまたは異なる正味荷電の１つ以上の固定化された有機多価イオンでサンプルを処理することを含む。
【００４９】
１つ以上の先行する実施形態において、少なくとも１種類の溶解性または固定化された有機多価陽イオンは、金属親和性官能性を含む。
【００５０】
１つ以上の先行する実施形態において、１つ以上の溶解性有機多価イオンに対する所望のタンパク質の結合および沈殿は、伝導率の増大、ｐＨの変更、阻害性有機添加剤の添加またはそれらの組み合わせにより阻害される。
【００５１】
定義
本発明をより容易に理解できるように、用語が明確にされる。付加的な定義は、詳細な説明を通して説明される。
【００５２】
「エンドトキシン」とは、グラム陰性菌の外膜内に存在する有毒な耐熱性のリポ多糖物質をいい、これは、溶菌すると当該細胞から放出される。一般的にエンドトキシンは、それらのリン酸塩とカルボキシル基の高含有量に起因して酸性であり、リピドＡ領域の脂肪酸含有量に起因して高疎水性である。個々のエンドトキシン分子の分子量は、僅か１０，０００Ｄ以下であり得るが、それらは一般的に強い洗浄剤の存在と金属イオンの不在においてこの形態で存在する。生体液中では、それらは、１０，０００，０００Ｄを越えるまでの分子量を有する様々な物理学的構造で、典型的に大型の凝集物として存在する。幾つかのそのような凝集物は、１０００ｎｍ（１ミクロン）以上の物理的サイズを有することが知られ、それらはミセル、リボンおよび金属イオンとの錯体集合物およびそれらのサイズ拡大に寄与する他のサンプル成分との複合集合物として構成され得る。
【００５３】
「ポリヌクレオチド」とは、鎖中で共有結合した複数のヌクレオチドモノマーから構成されているバイオポリマーをいう。ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）は、ポリヌクレオチドの例である。「ＤＮＡプラスミド」とは、染色体ＤＮＡとは独立して細胞内で複製する能力を有するＤＮＡの閉環二本鎖ユニットをいう。
【００５４】
「タンパク質」とは、何れかの群の複合有機高分子をいい、それは、炭素、水素、酸素、窒素および通常、硫黄を含み、大抵、ペプチド結合により連結されたアミノ酸の１つ以上の鎖から構成されている。タンパク質は、天然または組み換え起源であってもよい。タンパク質は、例えば、グリコシル化、ペグ化、または他の化学部分との複合などを介して、非アミン酸部分で修飾されていてもよい。タンパク質の例は、これらに限定するものではないが、抗体、凝固因子、酵素およびペプチドホルモンを含む。
【００５５】
「過飽和のウレイド」とは、特に調製物に広がる条件下で、その最大溶解度を超えるウレイドの量を含む懸濁液をいう。ある実施形態では、本発明は、ウレイドのあるフラクションがサンプル中で溶解されていない形態で存在するようなサンプルについての条件下において、そのようなサンプル中にそのようなウレイドの溶解度を超えた量で存在しているウレイドを伴うサンプルを提供する。
【００５６】
「ウレイド」とは、天然または合成起源の環状または非環状分子をいい、それは１つ以上のウレイド部分またはその誘導体を含む。ある実施形態では、本発明は、ウレイド、例えば、尿素、尿酸、ヒダントイン、アラントイン（CAS番号97-59-6；アルクロキサ(alcloxa)、アルジオキサ、ヘモケイン(hemocane)、ウレイドヒダントイン、5-ウレイドヒダントイン、グリオキシルウレイド、グリオキシル酸ジウレイド、2,5-ジオキソ-4-イミダゾリジニル尿素）、イミダゾリジニル尿素（1,1'-メチレンビス(3-[1-(ヒドロキシメチル)-2,5-ジオキソイミダゾリジン-4-イル]尿素）、ジアゾリジニル尿素（1,3-ビス(ヒドロキシメチル)-1-(1,3,4-トリス(ヒドロキシメチル)-2,5-ジオキソイミダゾリジン-4-イル)尿素）、プリンおよびその誘導体などを提供する。ある実施形態では、本発明は、Ｒ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ２またはＲＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ’またはＲ’Ｒ’’ＮＨ−ＣＯ−ＮＲ’’’Ｒ’’’’の有機分子を提供し、ここで、関連する「Ｒ基」はＨまたは何れかの有機性基であってもよい。
【００５７】
「ウイルス」または「ビリオン」とは、超微細（直径でおおよそ２０〜３００ｎｍ）の、代謝的に不活性な、感染物質をいい、それは生存しているホスト、主に細菌、植物および動物の細胞内で複製し、ＲＮＡまたはＤＮＡコア、タンパク質被膜、およびより複雑な種類では周囲被膜から構成されている。例は、これらに限定するものではないが、ｄｓＤＮＡウイルス、ｓｓＤＮＡウイルス、ｄｓＲＮＡウイルス、（＋）ｓｓＲＮＡウイルス、（−）ｓｓＲＮＡウイルス、ｓｓＲＮＡ  ＲＴウイルスおよびｄｓＤＮＡ−ＲＴウイルス；アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、ノロウイルス、ピコルナウイルス、トガウイルス、オルトミクソウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、ヘパダンウイルス(hepadanvirus)、パピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、デング熱ウイルス、日本脳炎ウイルス、西ナイルウイルスおよびバクテリオファージを含む。用語ウイルスは、ベクターとして遺伝子治療のための使用、ワクチンとしての使用、および抗生物質のための代替物(replacement)としての使用のためのウイルス粒子を含むと理解される。またそれは、所謂、偽ウイルス含むと理解され、それは、それらの感染を引き起こす能力が取り除かれると同時に、感染防御免疫を作り出すそれらの能力を保存するように組み換え技術により修飾されているウイルス粒子として記載され得るものである。
【００５８】
「有機多価イオン」とは、少なくとも１つの荷電および少なくとも１つの更なる化学官能性を具現し、それ故にそれを多価にする天然または合成起源の有機分子、イオンまたは塩をいう。ある実施形態では、有機多価イオン、少なくとも１つの更なる化学官能性は、有機多価イオンが２つ以上の同様または異なる電荷を有するような付加的な荷電である。有機多価イオンは、正味の正電荷、正味の負電荷または正味の中性電荷を有してもよい。有機多価イオンが、正味陽性であるとき、それは、陰イオン、例えば、塩化物、臭化物、硫酸塩、有機酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩および当該方法に不適合ではない他の陰イオンと共に提供されてもよい。ある実施形態では、ある有機多価イオンの正電荷は、アミン、イミンまたは他の窒素基により提供される。有機多価イオンは、更に、混合された化学的特性であってもよく、疎水性残基、他の官能基を含んでもよく、および／またはそれは、他の種類の化学的相互作用に関与する能力、例えば、水素結合、疎水性相互作用、π−π結合、金属配位およびインターカレーションなどに関与する能力を有してもよい。陽性に荷電した有機多価イオンの例は、ある実施形態において、これらに限定するものではないが、ジアミノ酸、ジ、トリまたはより大きいホモまたはヘテロペプチド、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン；ポリエチレンイミン；ポリアリルアミン；ポリジメスリン、ポリメチルアクリルアミドプロピルトリメチルアンモニア；ポリジアリルジメチルアンモニア；ポリビニルベンジルトリメチルアンモニア；ポリビニルグアニジン；ポリ（Ｎ−エチル−４−ビニルピリジン；ＤＥＡＥ−デキストラン；ＤＥＡＥ−セルロース；エタクリジン）（CAS番号442-16-0；7-エトキシアクリジン-3,9-ジアミン）；トリス（２−アミノエチル）アミン；グアニジン；クロルヘキシジン；アレキシジン(alexidine)；シトリシダル(citricidal)、プロタミン；スペルミン；スペルミジン；サルミン(salmine)；キトサン；および前述のものの変異体および誘導体；を含む。例えば、エタクリジンの変異体および誘導体は、９−アミノアクリジン（アミナクリン）、３，６アクリジンジアミン（プロフラビン）、アクリゾルシン、アクリザン（フェナクリダン）、アクリジンオレンジ、キナクリン、アクリシド(acricide)、アクリドン、アクリジン−９−カルボン酸、アクラニル（１−［（６−クロロ−２−メトキシ−９−アクリジニル）アミノ］−３−（ジエチルアミノ）−２−プロパノール二塩酸塩）、フェノサフラニン(phenosafranin)、フェノキサジン(phenoxazine)、フェノチアジン、アクリフラビン（３，６−ジアミノ−１０−メチルアクリジニウム、塩化物および３，６−アクリジンイジアミン）、およびその塩（例えば、塩化物、臭化物、硫酸塩、乳酸塩、グルコン酸塩）を含むと理解される。有機多価イオンが、正味の陰性であるとき、それは陽イオン、例えば、ナトリウム若しくはカリウムなど、または当該方法に不適合ではない他の何れかの陽イオンと共に提供されてもよい。ある実施形態において、有機多価イオンのある負電荷は、カルボキシル、ホスホ若しくはスルホ部分により提供される。有機多価イオンは、更に混合された化学的特性であってもよく、疎水性���基または他の官能基を含んでもよく、および／またはそれは、他の種類の化学的相互作用に関連する能力、例えば、水素結合、疎水性相互作用、π−π結合、金属配位およびインターカレーションなどに関与する能力を有してもよい。ある実施形態における陰性に荷電した有機多価イオンの例は、これらに限定するものではないが、脂肪酸、例えば、カプリン酸、カプリル酸またはオクタン酸、陰イオン性ポリマー、およびその塩（例えば、塩化物、臭化物、硫酸塩、乳酸塩およびグルコン酸塩）を含む。
【００５９】
ある実施形態では、本発明は、過飽和ウレイドに対するウイルス粒子の化学親和性によりウレイド共沈を生じる方法を提供する。小型の混入物質、例えば、タンパク質、ヌクレオチド、塩、糖などおよび他の小分子サンプル成分は、共沈せず、従って液体中に溶解したままである。もし所望するならば、次に、ウイルス産物は、過飽和のウレイドを採用化するために十分な量の水または適切なウレイド非含有バッファを添加し、過飽和のウレイドを再溶解することによって回収され、その間にウイルスもまた、ウレイドが溶解するときの溶解度を自然発生的に取り戻し得る。或いは、固体は廃棄されてもよく、減少したウイルス量を伴う液体を残してもよい。
【００６０】
過飽和のウレイドとウイルスとの共沈を頼りにする本発明のある実施形態では、低程度から中程度までの溶解度を具現するウレイド種が使用されてもよい。高溶解性のウレイドは、過剰な高い総量のウレイドの使用を不都合な程に必要としてもよいが、一方で、ほぼ不溶性のウレイドは、ウイルスが結合している過飽和のウレイドを可溶化するために過剰な体積の水を必要とする。アラントインは、適切な溶解度特性を有するウレイドの例である。それは約３６ｍＭの濃度、これは０．５６％の重量対体積（ｗ／ｖ）比に相当する濃度で飽和する。一般的な事柄として、有効性は、より高いウレイド比、例えば、１〜５％、または１０％まで、またはそれ以上で増大する。
【００６１】
尿素およびヒダントインは、不都合に高い溶解度を有するウレイドの例である。ヒダントインはアラントインのおよそ１０倍以上の溶解性であり、尿素は、１００倍以上の溶解性である。尿酸は、過剰に低い溶解度を有するウレイドの例であり、約０．００２５重量／体積％で飽和し、これはたった１グラムを可溶化するためにほぼ４０Ｌの水を必要とすることを意味する。
【００６２】
固体から所望の大型の生物学的標的物を回収することを目的とするある実施形態では、特定の適用のための最良の結果を提供するために特別に設計された方法の開発は、ウレイドの選択から始まる。ある実施形態では、水再可溶化方式が開発および操作するためには最も簡単であろうし、一般に、最良の回収率を提供する。アラントインは、この方式によく適している。５〜１０％の量が、出発点として好都合なところである。他のウレイドが評価されてもよいが、今までの実験データは、アラントインが一貫して最も効果的な候補であることを示している。
【００６３】
ある実施形態では、ウイルスとウレイドとの共沈は、環境のｐＨおよび塩濃度により影響を受け得る。１つの実施形態では、処理は、ｐＨ３〜９の範囲のｐＨ値、および１未満〜５０ｍＳを越えるまでの伝導率を生じる。実験データは、ウイルスに対するアラントインの親和性に関してではなく、ｐＨおよび伝導率に関する変動が、ウイルスの本来備わっている溶解度の変動に主に由来することを示す。明示されたｐＨおよび伝導率仕様と共に、それは、ウイルスを十分に沈殿するために必要とされるウレイドの量を決定するためのある実施形態において都合がよいかもしれない。これは、ウレイドの異なる増加量での実験によって容易に決定される。可能ではあるが、１０％を超えて使用することはめったに必要ではないだろう。
【００６４】
仮に水性再可溶化方式が、ウレイドからのウイルスの分離のために選択される場合、ある実施形態においては、最も効果的なウイルス沈殿を支持する再懸濁バッファのためのｐＨおよび伝導率を決定することが有利である。これは、ｐＨおよび伝導率値の範囲に亘って行われる簡単な実験により行われる。実験の仕事量は、実験の設計（ＥｏＤ）のための統計的手法により低減できる。少なくとも５〜８のｐＨ範囲および１５ｍＳ／ｃｍ〜少なくとも５０ｍＳ／ｃｍまでの伝導率値を評価する。これらの伝導率は、生理的な伝導率の範囲に対応し、塩化ナトリウムの約半分のモル濃度に対応する。より低い伝導率値が評価され得るが、ウイルスサンプルを犠牲にする希釈またはバッファの余分な運搬上の負荷を強いるかもしれない。一般的な事柄として、特別な注意が、回収されるウイルスの感染性に対して払われるべきである。伝染性のウイルスの回収が当該方法の特定の目的である場合、アラントインを溶解するためのバッファ条件は、特に感染力を保持することに有利に働くように選択されるべきである。そのような条件は、本発明とは無関係によく知られており、全体として本発明の有効性を減じることなく適用されてよい。
【００６５】
ウイルス精製を対象とするある実施形態では、これはアラントインを単に溶解するアプローチと比較すると処理されるべき液体体積を低減するであろうことから、固体ウレイドからの化学溶解によってウイルスを回収することが好ましい。そのようなアプローチは、しかしながら低い回収率に終わる可能性があり、回収されたウイルスの感染性が減弱する高いリスクを与える可能性がある。ウレイドの強い極性特性とそれらの大きな水素結合潜在性とを考えると、高溶解性ウレイドは検討するのに妥当な候補であり、それらは尿素または特にアラントインに対するより大きな構造的類似性を有するウレイド、例えば、イミダゾリジニル尿素などを含む。感染性が精製されるウイルスの必要な特性ではない限りにおいて、その喪失は関心事ではないかもしれない。何れにせよ、解離剤の適切な濃度を決定するために実験が必要とされるだろう。
【００６６】
アラントインの溶解と解離剤の使用との両方を含む回収戦略を追求することも可能であることは、当業者には明らかであろう。
【００６７】
タンパク質精製および／またはウイルスの除去を対象とするある実施形態では、特定の適用のための方法を特別に設計するために都合のよい開始点は、サンプルに対して５％の選択されたウレイドを添加し、１５分間以上に亘りインキュベートし、沈殿物を取り出し、次に問題のタンパク質またはプラスミドの回収率について、並びにウイルスおよび／またはエンドトキシン含有量について、上清を評価するだけである。方法条件は、更に、ウレイドの量、ｐＨおよび伝導率を変化させ得るその後の一連の実験によって評価されてもよい。実験の総数は、実験の設計のための統計的手法を適用することにより低減することが可能である。実験データは、結合反応速度が非常に早く長いインキュベーションを不要にすることを示す。１５分よりも長いインキュベーションによる結果は、ウイルスまたはエンドトキシンの取り出しにおいて有意な改善を示さない。それにも拘らず、このパラメータは、適切な結合間隔が特定の適用のために文章化されることを保証するために容易に評価できる。ウイルス除去およびまた低いｐＨでのウイルスの不活性化の両方の有効性を高めることを目的とするこれらの実施形態において、適切な条件の評価は、標的物の同定および予め評価された低いｐＨ条件で適用されるウレイド量に都合よく集中され得る。
【００６８】
タンパク質またはプラスミドの精製およびウイルス除去を対象とするある実施形態では、本発明は、残存ウレイドが、ほとんどのクロマトグラフィ表面に対して不活性であるようであり、そのために、クロマトグラフィ支持体に対して問題のタンパク質またはプラスミドが結合することにより簡単に取り出され、ウレイドが貫流することを可能にするという利点を提供する。特定のタンパク質またはプラスミドに適切な方法を選択することは、当業者の範囲内である。ＩｇＧの精製に関する１つの一般的な例は、本発明に適用すること、プロテインＡのカラムからのＩｇＧの溶出に続き、低いｐＨによるウイルス不活性化のために適切な条件下でアラントインを添加すること、インキュベートすること、不溶性アラントインを取り出すこと、次にサンプル条件を調整すること、サンプルを陽イオン交換カラムクロマトグラフィに対して添加すること、それによりＩｇＧを結合させることができる。平衡バッファで洗浄して微量のアラントインを除去し、次にＩｇＧを従来通りに溶出する。ＤＮＡプラスミドの精製に関するもう１つの一般的な例は、陰イオン交換またはヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィに対してプラスミドを結合することであろう。過剰のウレイドを洗い流し、次にＮａＣｌまたはリン酸塩によってそれぞれ溶出し、ウレイドを含まないプラスミドを得る。
【００６９】
タンパク質またはプラスミド精製を対象とするある実施形態では、当該方法は、低いｐＨでのウイルスの不活性と併せて適用され、何れかの方法単独よりも効果的なウイルスの低減が達成できる。ウレイド共沈は、所望の他のタンパク質またはプラスミド精製方法と組み合わされて、特定の適用のための必要性を満たすために必要とされるレベルの精製が達成されてもよい。溶解したアラントインおよび尿酸は、実質的にほとんどのクロマトグラフィ表面に対して不活性であり、このことは、それらが、問題のタンパク質がクロマトグラフィ支持体に対して結合することにより簡単に取り除かれ、ウレイドがカラムを貫流することを可能にすることを意味する。実験データは、９９％を超える溶解性残留ウレイドが第１のクロマトグラフィ工程、例えば、陽イオン交換クロマトグラフィ工程または親和性クロマトグラフィ工程などにおいて減少すること、およびウレイド含有量が、第２のカラムクロマトグラフィ工程、例えば、陰イオン交換体またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ工程などの後に、検出能のレベルよりも下まで減少することを示す。
【００７０】
ある実施形態では、過飽和のウレイドに捕捉されたウイルス産物は、同じように処理されてもよく、または沈殿に基づく方法の分野においては珍しい機序により処理されてもよい。例えば、ウイルスは、過飽和のアラントインに対して結合し、タンパク質混入物質は上清と共に取り出され、その後、ウイルスは、水の添加だけによるアラントインの溶解と、それによるウイルス放出によって回収される。今溶解性のアラントインは、その後限外濾過のみ、または他の手段により取り出され得る。
【００７１】
本発明のある実施形態は、沈殿法が、沈殿剤の過飽和レベルに基づき、そのような沈殿剤の溶解性レベルには基づかないことの利点を提供する。例えば、溶解性アラントインはウイルスの溶解性に実際的な影響を持たないのに対して、過飽和のアラントインはウイルスを共沈殿する。従って、水を単に添加することによる、ウイルスを結合している予め過飽和のアラントインのそれに続く可溶化が、新たに再溶解されたアラントインからウイルスを放出する。実験データは、ウイルスには結合するが、タンパク質には結合しないアラントインを含むウレイドの能力は、その選択性にサイズ構成を反映することを示す。これは、ウレイド修飾した表面が、他のクラスの微生物を除去すること、少なくともそれらのクラスの幾つかを潜在的に不活性化することの並行する能力を提供することを順を追って示す。そのような類は、細菌、マイコプラズマおよび原生動物を含んでもよい。
【００７２】
ある実施形態では、大型の生物学的標的物、例えば、ウイルスなど対して選択的に結合する過飽和のアラントインの明白な能力は、ウイルスの生物学的機能を考慮した懸濁液を強化するために使用でき、例えば、そこにおいて、目的は、その通常のホストを感染させるその能力を喪失させるように、ウイルスを不活性化することであってもよい。そのような適用は、アラントインが含まれる低いｐＨでの処理よるウイルスの不活性化、または有機多価陽イオン、例えば、エタクリジン、エチレンブルー、塩化ベンザルコニウム、クロルヘキシジンなどまたは有機多価陰イオン、例えば、カプリル酸などによる、または非イオン性有機溶媒、例えば、非イオン性界面活性剤との潜在的に併用されてもよいトリ（ｎ−ブチル）ホスフェートなどによる、またはトリ（ｎ−ブチル）ホスフェートとは無関係に界面活性剤による、または前述のものの組み合わせなどでの処理によるウイルスの不活性化を含む。水結合により結合するアラントインの明確な能力は、それがこれらの不活性化処理に干渉せず、且つこれらの不活性処理によりそれ自身が干渉されないことを意味する。特定の不活性化方法に加えて、および特定の不活性化方法とは無関係に、ウイルスに結合する過飽和のアラントインの能力、およびそれによるサンプルからのそれを物理的に除去する能力は、問題のサンプルからの感染性ウイルスの総合的な減少させることに直接に関与することが理解される。
【００７３】
ある実施形態では、表面に結合されている不溶性ウレイドは、エンドトキシンを結合できるが、不思議なことにＤＮＡを結合する能力はほとんどないことを示す。これは、そのような実施形態の潜在的な有用性をエンドトキシンおよび／またはウイルスの両方をタンパク質調製物および／またはＤＮＡプラスミドを含む調製物から取り出すことにまで拡大する。ＤＮＡが、他のサンプル成分との安定複合体中に存在する他の実施形態では、アラントインは、ＤＮＡが関連している複合体を取り出すことにより、ＤＮＡを取り出す効果を有する。
【００７４】
幾つかの実施形態では、ここで開示された何れかの方法を都合よく実施するためのキットが提供される。そのようなキットは、当該方法を実施するための試薬および１組の一般的な使用説明書を含んでもよい。キットに加えて、当業者は、ここで開示された方法は、様々な適用、例えば、抗ウイルスおよび／または抗微生物呼吸フィルタ、マスク、水の緊急解毒のためのシステムなどにおいて使用するために構成されてもよいことを認識できるであろう。
【００７５】
前述の全般的な説明および以下の詳細な説明は、両者ともに例示と説明のためのものであり、権利請求される通り、本発明を制限するものではないことが理解されるべきである
［例］
以下の例は、方法を説明しており、それによって本発明の態様が実施され得る、または本発明のある実施形態の実施に適した材料が調製され得る。
【００７６】
例１．アラントインとの共沈によるウイルス、バクテリオファージＭ１３の精製。７％の重量対体積比でアラントインを添加することによって、ファージ細胞培養物上清を共沈させた。ｐＨは約７．０であった。伝導率は２０ｍＳであった。ウイルスは、５０ｍＭのヘペス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０にアラントインを溶解させることにより回収した。ファージ回収率は約７０％であった。９９％を超えるタンパク質および小分子混入物質は上清と共に除去された。
【００７７】
例２．バクテリオファージＭ１３の共沈。ｐＨ値が５．０、６．０、および８．０％アラントインで例１を繰り返した。両方の例の範囲に亘る共沈効率は、上清からの除去により判断されたとき、ｐＨと逆相関した。
【００７８】
例３．バクテリオファージＭ１３の共沈。伝導率値が４０、６０、８０、および１００ｍＳ／ｃｍに対応するＮａＣｌ濃度で例１を繰り返した。これらの塩濃度は、約４００、６００、８００、および１０００ｍＭのＮａＣｌに対応した。沈殿効率は、サンプルからのウイルスの回収率により判断したとき、伝導率と直接に相関した。最適な共沈は、４００ｍＭＮａＣｌで生じた。これは、ウレイド表面上の粒子の高いパッキング密度を支持する結果を伴って、ウイルス粒子間の静電気性の相互反発の抑制を反映していると解釈された。
【００７９】
例４．バクテリオファージＭ１３の共沈。３％、５％および１０％アラントインで例１を繰り返した。共沈効率は、上清からの除去率により判断したときに、アラントイン濃度と直接に相関した。回収率は、約３１％〜５７％まで〜９１％までにそれぞれ増加した。
【００８０】
例５．バクテリオファージＭ１３の共沈。ファージ細胞培養物上清を７％のアラントインを用いて４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で沈殿させた。タンパク質の大部分および小分子混入物質は、上清と共に除去された。回収率は、９０％を超えていると推定された。ウイルスは５０ｍＭのヘペス、ｐＨ７．０中にアラントインを溶解させることにより回収し、その後限外濾過により濃縮した。組み合わされたプロセスからの純度は、分析用陰イオン交換クロマトグラフィにより９０％を超えていることが推定された；回収率約８０％。
【００８１】
例６．弱毒化デング熱ウイルスの共沈。弱毒化デング熱ウイルスを６００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０で７％のアラントインと合わせた。上清を取り出した。ウイルスは、５０ｍＭのヘペス、ｐＨ７．０にアラントインを溶解することにより回収した。回収率は、免疫学的検定により７０〜８０％であることが推定された。ホストタンパク質混入物質は９９．３％まで減少された。
【００８２】
例７．１０％の量にアラントインを添加することにより、１ｍＬ当たり１０１０粒子のマウスの微小ウイルスを含むウイルス培養物を生理的条件下で共沈した。上清の感染力試験は、９９．９％のウイルスの除去率を実証した。
【００８３】
例８．１０％の量にアラントインを添加することにより、１ｍＬ当たり１０１０粒子のマウス白血病ウイルスを含むウイルス培養物を生理的条件下で共沈した。上清の感染力試験は、９９．９％のウイルスの除去率を実証した。
【００８４】
例９．アラントインとの共沈によるタンパク質調製物からのウイルスの除去。ファージＭ１３細胞培養物上清を、重量対体積比が５％でアラントインを添加することにより共沈した。ｐＨは約７．０であった。伝導率は約１５ｍＳであった。約６０％のウイルスが沈殿物中に除去された。大部分のタンパク質は上清中に残った。
【００８５】
例１０．タンパク質溶液からのエンドトキシンの低減。約５０ＥＵ／ｍＬのエンドトキシンで汚染された、５０ｍＭホスフェート、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２中のオボアルブミンノのサンプルを３％アラントインで飽和させ、１５分間インキュベートし、それに続いて、沈殿物を膜濾過により取り出した。上清のエンドトキシン含有量は、９５％を超えるまで、１ｍＬ当たり２ＥＵ未満までに減少された。実験を１０％アラントインで繰り返した。エンドトキシンは９９．５％を超えるまで、１ＥＵ／ｍＬ未満までに減少された。
【００８６】
例１１．固体表面上のウレイドを使用するＩｇＧ−エンドトキシン混合物からの抗体の回収とエンドトキシンの低減。５ｍＭヘペス、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０中の１ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧに対して、エンドトキシンを２２，０００ＥＵ／ｍＬまでに添加した。この混合物のアリコートに対して２％（Ｗ／Ｖ）アラントインを添加し、室温で１５分間に亘り混合した。懸濁液を遠心分離により清澄化した。タンパク質およびエンドトキシン濃度を測定し、抗体回収率およびエンドトキシン除去率を計算した。２％アラントインはエンドトキシンを２倍減少させた。抗体回収率は、アラントインの量により影響を受けなかった。後続する一連の実験においては、アラントインの量を徐々に１０％まで増やした。抗体回収率は、１０％アラントインで約９３％までに徐々に減少し、しかし一方、エンドトキシン除去効率は、約９９％まで増大した。これらの実験は、アラントインの過剰量の使用が幾つかのタンパク質の損失を招き得ることを説明する。そのような場合では、当業者は、エンドトキシン除去率とタンパク質回収率とを対比しての最も生産性の高いバランスに関して情報を得た上での決断を行い、それに応じて固相ウレイドの利用可能性を調整し得る。約１２ｋＤａ〜１ＭＤａの範囲のサイズを有するタンパク質を用いた追加実験は、明確な傾向を示し、それによってタンパク質の損失は、タンパク質のサイズと共に増加した。
【００８７】
例１２．アラントインと尿酸とのエンドトキシンを取り出すための基質としての比較。５ｍＭヘペス、１００ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．０中で６．７ｍｇ／ｍＬのヒトＩｇＧ溶液に対して最終濃度１３，０００ＥＵ／ｍＬでエンドトキシンを添加した。１、２および４％（ｗ／ｖ）のアラントインまたは尿酸の何れかをこの混合液のアリコートに対して添加して、室温で１５分間混合させた。コントロールとして、等量のジャガイモデンプンを分離系に対して添加した。最終的に、反応混合物を遠心分離により清澄化した。タンパク質およびエンドトキシン濃度を測定し、抗体回収率およびエンドトキシン除去率を計算した。デンプンの添加に伴うエンドトキシンの減少はなかった。尿酸は全ての濃度で４倍の減少を生じた。アラントインは、（低いものから高いものへと）実験に亘って５〜１０倍のエンドトキシンを減少した。抗体回収率は、完全に９０％を超えていた。尿酸の能力不足に加えて、尿酸の量に応じて結果が変化しなかったという事実は、不可解であり、アラントインが、そもそもより好ましいウレイドであることを浮き彫りにする。
【００８８】
例１３．アラントインの添加による哺乳類細胞の収集物の促進された清澄化。アラントインは、通常のスペクトルの混入物質に混じってＩｇＭモノクローナル抗体を含む細胞含有細胞培養物収集物の５Ｌに対して１％の最終濃度まで添加した。容器を穏やかに回転させて、成分を混合した。アラントインと未知の細胞培養物成分との間の相互作用は、この量のアラントインを完全に可溶化したので、更なる１％を添加し、総添加量を２％（ｗ／ｖ）に持って行った。容器を再び回転させて成分を混合した。アラントインの添加前には粒子材料が非常にゆっくりと沈むのが観察されていたのに対して、１％アラントインの存在においては僅かに速いだけだが、２％アラントインによっては沈降速度は明らかに加速され、光学的に真透明な（sparkling optically clear）細胞培養物上清を残した。１％と２％アラントインとの差異は、１％アラントインは、サンプル中の幾らかの可溶化物質が存在する理由で、サンプルによってほとんど完全に可溶化されたことを示すものと解釈される。上清は、その後、静かに移された。この気付かずに細胞懸濁された沈殿物の部分は、その後、遠心分離され、残りの固体を沈殿させた。そのウイルスおよびエンドトキシンの除去能力を超えて、これは、細胞収集物清澄化の質を改善する本発明の能力を浮き彫りにする。また、それは少なくとも２％のアラントイン濃度で最初の試用を実施することの実用性も浮き彫りにする。水中での公知のその溶解度が有用な予備的な指針を提供する可能性はあるのではあるが、アラントインの過飽和濃度が最終的に実験的に決定されるという効果と共に、それは更に、アラントインの溶解性がサンプルの成分により影響を受け得るという重要点を浮き彫りにする。
【００８９】
例１４．アラントインの添加による大腸菌溶解物の清澄化。５０ｍＭヘペス、ｐＨ７．０を超えた２５０ｍＬ中の２０グラムの大腸菌ペーストを１６，０００×ｇでマイクロフリューダイザー（microfluidizer）でホモジナイズした。次にホモジネートを１時間に亘り１５，０００×ｇで遠心分離し、最も大きい粒子種を取り出した。これは、黄褐色の不透明な上清を生じた。５％ｗ／ｖの最終濃度まで乾燥アラントインを直接に上清に添加した。混合物を約１分間に亘り回転させ、落ち着かせた。初めのホモジネート中に存在した９０％を超えるタンパク質生成物を含む光学的に真透明な上清を残して、不溶性材料は２〜３分以内で落ち着いた。上清は、０．２２ミクロンのメンブランフィルタを容易に通過し、アラントイン処理前には、上清は、事実上、接触したフィルタを詰まらせた。この例は、処理されたサンプルの濾過性を劇的に改善するアラントインの能力を浮き彫りにする。
【００９０】
例１５．アラントイン親和性段階での有機添加剤の影響。モノクローナルＩｇＧを含む細胞含有哺乳類細胞培養物収集物を０．０１％エタクリジンとの併用での１％アラントインによるアラントイン親和性により処理した。これらの条件は所謂生理的条件に相当する約７．２のｐＨで約１３．５ｍＳの伝導率で、等量の金属親和性リガンドＴＲＥＮ（BioWorks TREN hi-sub）と疎水性リガンド（Macroprep T-butyl）とを含むカラムクロマトグラフィ媒体を充填されたカラムにサンプルを通過させた。前段階に続いて抗体回収率は９９％であった。ＤＮＡは、３．５ｌｏｇ減少し、ウイルスは４〜５ｌｏｇ減少した。加えて、処理されたサンプルは、真透明（sparking clear）であり、濁度は約２．０ＮＴＵであり、粒子の殆ど全てが取り出されたことを示した。
【００９１】
例１６．形態または例１５は、一連の実験の手順に亘り、２％、４％および８％を含むアラントインの量の増加を除いて追随された。抗体回収率は、略直線的な様式でアラントインの量に反比例して減少した。それに対して、１％での回収率（例１５）は９９％であり、８％での回収率は約８７％であった。
【００９２】
例１７．例１５および１６において記載された通りに処理が行われたＩｇＧをサイズ排除クロマトグラフィにより分析した。結果は、アラントインの増加に伴う凝集体積の略直線的な減少を示したが、凝集体積の減少は、例１６において言及された抗体の損失よりも大きかった。例１５に続く凝集体積が約５％であった場合には、それは、８％のアラントインでは約１．３％まで減少した。アラントインを含まない膜清澄化された細胞収集物の凝集体積は約１９％であった。また、アラントインの増加量は、選択的に高分子量の凝集を減少したことも観察された。この例は、過飽和のアラントインが選択的に高分子量の生物学的標的物を結合するという本発明の機能的特徴を浮き彫りにする。また、特定の生物学的標的物を処理するために使用されたアラントインの実際の量は、凝集除去率または抗体回収率を助けるために調整され得るという重要な開発展望を浮き彫りにした。
【００９３】
例１８．アラントインおよびエタクリジンは、５％血清添加モノクローナルＩｇＭ上清に対して、それぞれ最終濃度１％（過飽和）および０．０２％まで添加された。上清は、遠心分離により清澄化され、次に細孔性およびマクロ多孔性陽性および陰性媒体、更に細孔性親油性粒子の等容積での組み合わせ：ＱＡＥセファデックスＡ−２５，ＳＰセファデックスＣ−２５，Ｎｕｖｉａ  Ｑ，Ｎｕｖｉａ  ＳおよびセファデックスＬＨ−２０：を含む充填カラムクロマトグラフィベッドを通過させた（充填ベッド１ｍＬ当たり２０ｍＬ上清）。ＩｇＭを次に陽イオン交換体で捕捉した。ＩｇＭ回収率は、２段階処理を終えて８０％であり、純度は、分析ＳＥＣにより９０％を超え、明らかな凝集は見られなかった。
【００９４】
例１９．１リットルのモノクローナルＩｇＧ含有細胞培養物上清を１％のアラントインおよび０．０２％のエタクリジンで１５分間処理した。黄色沈殿物が膜濾過により取り出され、光学的に真透明な山吹色の濾液をキレックス１００（Chelex 100）とマクロプレップハイＱ（Macroprep High Q）の均等混合物が充填された１０ｍＬのカラムに加えた。処理された材料を次に、２０ｍｇ／ｍＬの装填量までプロテインＡカラムに加え、１０カラム体積に亘って洗浄し、ＩｇＧを溶出した。溶出されたＩｇＧ抗体を未処理細胞培養物上清を負荷されたプロテインＡから溶出された抗体と比べると、大凡８０倍低いホスト細胞タンパク質混入物質、１０ｐｐｍ対８００ｐｐｍを含んでいた。これらの結果は、下流の精製法により効果的に除去されない混入物を除去する本発明の能力を特に浮き彫りにする。並行する実験を設け、処理サンプルと未処理サンプルとを負荷されたプロテインＡカラムの動的結合能力を測定した。処理サンプルを負荷されたカラムにおける動的能力は、未処理サンプルを負荷されたカラムよりも約２０％高かった；３５ｍｇ／ｍＬ対２８ｍｇ／ｍＬ。これらの結果は、下流の精製法の機能を直接に妨げる混合物質を除去する本発明の能力を特に浮き彫りにする。
【００９５】
例２０．負荷電金属キレートスチレンジビニルベンゼン粒子（キレックス１００、Chelex 100）、正荷電ポリメタクリレート多孔質粒子マクロプレップハイＱ（Macroprep High-Q）および負荷電ポリメタクリレート粒子（MacroPrep High-S）の均等混合物を、予めＮａＣｌで最終伝導率２０ｍＳ／ｃｍ、１％アラントインおよび０．０２５％エタクリジンまで処理したＩｇＭ−５２９のサンプルと混合した。粒子のサンプルに対する体積比は１：２０であった。サンプルは、１０分、２０分、４０分および６０分で採取し、粒子を精密濾過により取り出した。図１は、全ての時点での高分子量凝集の劇的な低下を示すが、時間と共に全ての凝集が徐々に大きく減少し、同時に実質的にホスト細胞タンパク質混入物質の明らかな減少も生じた。続く分析は、凝集とホストタンパク質との両方の減少が、サンプルからのクロマチン残遺物の全てを含めた減少を反映したことを示した。エタクリジンもまた、全ての時点でサンプルから除去された。
【００９６】
例２１．図２Ａおよび２Ｂは、２００ｍＭＮａＣｌ、１％アラントインおよび０．０２５％エタクリジンで処理され、次に例７の通りの同じ媒体混合物で、しかしながら、混合媒体が粒子を保持するために十分に細かいメッシュの織りポリマーリテーナの間に挟まれたデバイスを通過させることにより処理されたＩｇＭ−８４の処理前および処理後のサイズ排除クロマトグラフィプロファイルを示す。ＨＭＷ凝集は、小型凝集の大部分と一緒に完全に除かれた。以下の表１は、ＤＮＡおおびヒストンは、ＩｇＧフラクションを含み、全タンパク質含有フラクションに亘る全ての凝集フラクションに亘って初期に分布していたことを示す。
【表１】
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【００９７】
表１はまた、ＤＮＡのサイズ分布を示し、これは、幾つかの凝集母集団は、ＤＮＡおよびヒストンに加えて、多様な数のヌクレオソームを含むヌクレオソームアレイを含むという予期しなかった発見に繋がった。この処理からのＩｇＭの回収率は９８％であった。
【００９８】
例２２．図３は、抗ＨＥＲ２モノクローナルＩｇＧ抗体の例１９と同じ手順前および後のサイズ排除クロマトグラフィプロファイルを示す。結果は、同じやり方で同じであるが、抗体の濃度が約１０倍高いので、恐らく少なくとも一部分においては程度が改善される。
【００９９】
例２３．１Ｌの細胞培養物収集物を１％アラントインおよび０．０２５％エタクリジンの添加により処理し、撹拌しながら１５分間インキュベートし、その後、細胞および他の粒子を遠心分離により取り出した。イミノ二酢酸で置換されたスチレン−ジビニルベンゼン粒子、ＴＲＥＮで置換されたアガロース粒子およびブチル残基で置換されたアクリレート粒子を均等な割合で含むアセンブリに、５０ｍＬの複合体積、２．６×１０ｃｍの寸法、２５ｍＬ／ｍｉｎの流量で上清を通過させた。１２％を超える初期の凝集含有量は、０．１％未満まで減少した。過剰のエタクリジンを除去した。ホストタンパク質混入物質は、６０％を低下させた。ＤＮＡは、ｑＰＣＲにより測定したとき、６ｌｏｇ減少した。抗体回収率は９９％であった。
【０１００】
例２４．１Ｌの細胞培養物収集物を１％アラントインおよび０．０２５％エタクリジンの添加により処理し、撹拌しながら１５分間インキュベートし、その後、細胞および他の粒子を遠心分離により取り出した。イミノ二酢酸で置換されたスチレン−ジビニルベンゼン粒子、アミノ基で置換されたスチレン−ジビニルベンゼン粒子、およびブチル残基で置換されたアクリレート粒子を均等な割合で含むアセンブリに、５０ｍＬの複合体積、２．６×１０ｃｍの寸法、２５ｍＬ／ｍｉｎの流量で上清を通過させた。１２％を超える初期の凝集含有量は、０．１％未満まで減少した。抗体回収率は９５％であった。結果は、他の点では例２０と同一であった。
【０１０１】
例２５．サーモン精子から精製されたＤＮＡの１ｍｇ／ｍＬ調製物を５％アラントインで処理した。９５％を超えるＤＮＡが、上清中に依然として溶解していた。これは、ＤＮＡ調製物、例えば、プラスミド調製物からのウイルスまたはエンドトキシン混入物を分離することの実用性を浮き彫りにするものであり、それは、陽性の表面、例えば、陰イオン交換体などに対して全ての三重結合が強力に結合しているために、別のやり方では極めて難しい。これらの結果は予測外のものであるが、それは多くの以前の例が、ＤＮＡレベルは抗体含有タンパク質調製物において９８〜９９％以上減少されたことを示したからである。明らかな相違は、ＤＮＡに対してはほんとんど親和性のないまたは固有に親和性を有せず、しかしながら特にＤＮＡ濃縮タンパク質を含む他の分子との関連するＤＮＡ、または特にヌクレオソームおよびそれらの原核生物類似体を含む染色体構造を有するＤＮＡの他の化合物結合物に対しては、非常に高い親和性を有するアラントインによって解決されるように見える。これは更に、ポリヌクレオチドの精製に対する適用が、恐らく特に、高塩濃度および／または有機モジュレータの存在下で行われ、それが混入物質とのポリヌクレオチド複合体の非特異的な形成を妨げることから恩恵受けるであろうという点を浮き彫りにする。
【０１０２】
例２６．低ｐＨでのウイルス不活性化の促進。１ｍＬ当たり約１０１０粒子のマウス白血病ウイルスを含む細胞培養物上清を１０のアリコートに分けた。半分のアリコートは、ウイルスを非活性化するためにｐＨを４まで低下させることにより処理した。もう一方の半分は、同様のｐＨの低下と、それに加えて１０％アラントインの添加により処理した。１、５、１０、１５および６０分での処理に相当するアリコートは、ウイルス感染性を評価された。１分では、アラントインなしの不活性化が１．２ｌｏｇであるのに対して、アラントインありで２．４ｌｏｇであった。５分では、アラントインなしの不活性化が３．２ｌｏｇであるのに対して、アラントインありで４．５ｌｏｇであった。１０分では、アラントインなしの不活性化が４．３ｌｏｇであるのに対して、アラントインありで５．４ｌｏｇであった。１５分では、アラントインなしの不活性化が５．１ｌｏｇであるのに対して、アラントインありで５．６ｌｏｇであった。６０分では、アラントインなしの不活性化が５．４ｌｏｇであるのに対して、アラントインありで５．６ｌｏｇであった。感染性試験の感度が約５．５ｌｏｇであることから、不活性化を促進することに加えて、アラントインの包含は、恐らく全ての時点で不活性化のレベルを増大し得る。他のウイルス不活性化法とのアラントインの併用は恐らく同様の強化効果を有し得ることが、当業者には明らかであろう。
【０１０３】
例２７．過飽和アラントインと有機多価陰イオンとの併用によるモノクローナルＩｇＧ含有細胞培養物上清の強化清澄化。細胞含有収集物を遠心分離と０．２２ミクロンのメンブランを通す膜濾過により清澄化し、次に上清のｐＨを６．０まで下げた。様々なサブサンプルは、０．０１％、０．０５％および０．１％の量でオクタン酸で処理された。沈殿した材料が遠心分離により取り出された後でさえも、全てのサンプルは、処理の後に不透明であり、これは粒子の残留性または再形成を示した。同じ一連の実験を２％アラントインの存在において繰り返した。抗体回収率および混入物質の減少率は、基本的に同等であったが、処理された材料は、処理後に真透明であった。
【０１０４】
例２８．ＤＮＡプラスミドの精製中のエンドトキシンの取り出し。ＤＮＡプラスミドを含みフィルター処理された大腸菌溶解物中に粉末のアラントインを最終濃度１０％で添加した。混合物を１５分間撹拌し、次に固体アラントインを精密濾過により取り出した。９６．７％のエンドトキシンをアラントインで取り出した。８０％のＤＮＡプラスミドを濾液中に回収した。この例は、エンドトキシンに対するアラントインの比較的高親和性と、ＤＮＡに対する低親和性とを示し、アラントインが、ＤＮＡプラスミド調製物、例えば、遺伝子治療ベクターとしてＤＮＡプラスミドを含有するものなどから、エンドトキシンを除去するために重要手段であることを明らかにする。以前の例において得られた結果から、哺乳類細胞において産生されたプラスミドの場合においては、アラントイン処理はウイルス回収の付加的な利益を提供できることが当業者には明らかであろう。
【０１０５】
当業者により、実験、例えば、上記の例において記載されたものからの結果を、彼らの特定の要求に応じるために求められる何れのボリュームにまでどのように拡大するかは理解されるであろう。
【０１０６】
本発明は、他の精製方法と組み合わされて、より高いレベルの精製を達成してもよい。これらに限定するものではないが、例は、親和性クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、陽イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、固定化金属親和性クロマトグラフィ、および付加的な混合モードクロマトグラフィ法などを含む。特定の抗体、タンパク質、ウイルス、ファージ、プラスミドまたは所望通りの他の生物学的産物の所望の精製を達成するために、多様な方法のために適切な条件を明らかにすること、およびここにおける本発明とそれらとを一体化することは、当業者の範囲内にある。加えて、本発明の方法は、生物学的産物の精製、診断用および／または治療用医療機器、およびウイルス感染からの個人または公衆保護のための機器と関連する使用のために開発されてもよく、またはそれらの使用に適していてもよい。
【０１０７】
それぞれ個々の刊行物または特許または特許出願が、明確且つ個別に、全ての目的のためにその全体に亘り言及することにより組み込まれることが示されたように、ここで引用された全ての参考資料は、引用によって同じ範囲にまで、全ての目的のためにそれらの全体に亘って組み込まれる。
【０１０８】
引用により組み込まれる刊行物および特許または特許出願が、本明細書中に含まれる開示と矛盾する範囲において、本明細書は、何れかのそのような矛盾する材料を越えて、取って代わるおよび／または優先するよう意図されている。
【０１０９】
明細書および特許請求の範囲において使用されている、成分、クロマトグラフィ条件およびその他の全ての量を表す数字は、全ての場合において「約」の語によって修飾されているとして理解されるべきである。従って、反対のことを指示しない限り、明細書および添付の特許請求の範囲に示された数値パラメータは、本発明により得ようとする所望のパフォーマンスに応じて変化し得る近似値である。
【０１１０】
当業者には明白であるように、本発明の多くの変更および変型がその精神と範囲から逸脱することなく行うことが可能である。ここに記載される特定の実施形態は、ほんの一例として提示されるものであり、何であれ、限定されるべきことを意図するものではない。明細書および例は、以下の特許請求の範囲によって示されている本発明の真の範囲および精神と共に、単に例示として見なされるべきことを意図する。
【国際調査報告】
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