(57)【要約】  本発明は、非構造タンパク質ｎｓｐ２のＰＬＰ２ドメインにおける突然変異により低下したＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を有する複製可能アルテリウイルス、医薬としてのその使用、ワクチンとしての及び予防におけるその使用、そのようなアルテリウイルスを含むワクチン、ならびにアルテリウイルスＰＬＰ２−ユビキチン複合体に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複製可能アルテリウイルスと医薬上許容される担体とを含む生弱毒化ワクチンであって、該ウイルスが、非構造タンパク質ｎｓｐ２のＰＬＰ２ドメインにおける突然変異により低下したＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を有することを特徴とする、生弱毒化ワクチン。
【請求項２】
該ウイルスが、図３に示されているＥＡＶ番号付けによるコンセンサス位置領域２９６−２９７、３０３−３０６、３０９−３１９、３２６−３３０および３４３−３５５からなる群から選択される少なくとも２つの異なるコンセンサス位置領域に突然変異を有することを特徴とする、請求項１記載の生弱毒化ワクチン。
【請求項３】
該ウイルスが、コンセンサス位置領域の前記群の少なくとも３つの異なるコンセンサス位置領域に突然変異を有する、請求項２記載の生弱毒化ワクチン。
【請求項４】
該ウイルスが、図３に示されているＥＡＶ番号付けによるコンセンサス位置Ｔ３１２、Ｉ３１３およびＩ３５３の１以上に突然変異を有し、医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする、請求項１記載の生弱毒化ワクチン。
【請求項５】
該アルテリウイルスが、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）ならびにブタ呼吸器および生殖器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）からなるウイルスの群から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の生ワクチン。
【請求項６】
ＰＬＰ２ドメインにおける前記突然変異が、図３に示されているＥＡＶ番号付けによるコンセンサス位置領域２９６−２９７、３０３−３０６、３１０−３１８、３２７−３２９または３４３−３５４に位置することを特徴とする、請求項２または３記載の生ワクチン。
【請求項７】
ＰＬＰ２ドメインにおける前記突然変異が、図３に示されているＥＡＶ番号付けによるコンセンサス位置領域２９６−２９７、３０３−３０６、３１１−３１７、３２８、３４３−３４６、３４７−３４８または３５０−３５３に位置することを特徴とする、請求項６記載の生ワクチン。
【請求項８】
ＰＬＰ２ドメインにおける前記突然変異がコンセンサス位置Ｔ３１２、Ｉ３１３またはＩ３５３に存在することを特徴とする、請求項７記載の生ワクチン。
【請求項９】
該アルテリウイルスがＥＡＶであり、ＰＬＰ２ドメインにおける前記突然変異がＴ３１２Ａ、Ｉ３１３Ｖ、Ｉ３５３Ａ、Ｉ３５３Ｒ、Ｉ３５３Ｓ、Ｉ３５３ＴまたはＩ３５３Ｗから選択されることを特徴とする、請求項８記載の生ワクチン。
【請求項１０】
該ウイルスが少なくとも２つの突然変異を含み、それらのそれぞれが、ＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性の低下に寄与することを特徴とする、請求項４記載の生ワクチン。
【請求項１１】
該ワクチンが、ワクチン接種される動物に対して病原性であるウイルスまたは微生物の追加的な免疫原、該免疫原に対する抗体、あるいは該ウイルスまたは微生物の免疫原をコードする遺伝情報を含むことを特徴とする、前記請求項のいずれか１項記載の生ワクチン。
【請求項１２】
ワクチン接種される動物に対して病原性であるウイルスまたは微生物が、ブラキスピラ・ヒオジセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、アフリカブタコレラウイルス、ニパウイルス、ブタサーコウイルス、ブタトルクテノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エリシペロ・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびアクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１記載の生ワクチン。
【請求項１３】
ワクチン接種される動物に対して病原性であるウイルスまたは微生物が、ウマインフルエンザウイルス、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ウマヘルペスウイルス１およびウマヘルペスウイルス４からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１１記載の生ワクチン。
【請求項１４】
非構造タンパク質ｎｓｐ２のＰＬＰ２ドメインにおける突然変異により低下したＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を有する複製可能アルテリウイルスの製造方法であって、該突然変異が、該突然変異を組換え的に導入することにより作製されることを特徴とする製造方法。
【請求項１５】
該ウイルスが、図３に示されているＥＡＶ番号付けによるコンセンサス位置領域２９６−２９７、３０３−３０６、３０９−３１９、３２６−３３０および３４３−３５５からなる群から選択される２つの異なるコンセンサス位置領域に突然変異を有することを特徴とする、請求項１４記載の製造方法。
【請求項１６】
該ウイルスが、図３に示されているＥＡＶ番号付けによるコンセンサス位置Ｔ３１２、Ｉ３１３およびＩ３５３の１以上に突然変異を有することを特徴とする、請求項１４記載の製造方法。
【請求項１７】
請求項１４〜１６のいずれか１項記載の製造方法により入手可能な複製可能アルテリウイルス。
【請求項１８】
非構造タンパク質ｎｓｐ２のＰＬＰ２ドメインにおける突然変異により低下したＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を有することを特徴とする複製可能アルテリウイルス。
【請求項１９】
アルテリウイルスのｎｓｐ２の少なくともＰＬＰ２ドメインとユビキチンとを含むＰＬＰ２−ユビキチン複合体であって、該ＰＬＰ２ドメインが該ユビキチンに共有結合している該ＰＬＰ２−ユビキチン複合体、またはアルテリウイルスのｎｓｐ２の少なくともＰＬＰ２ドメインとＩＳＧ１５とを含むＰＬＰ２−ＩＳＧ１５複合体であって、該ＰＬＰ２ドメインが該ＩＳＧ１５に共有結合している該ＰＬＰ２−ＩＳＧ１５複合体。
【請求項２０】
該アルテリウイルスが、ＥＡＶおよびＰＲＲＳＶからなるウイルスの群から選択されることを特徴とする、請求項１９記載のＰＬＰ２−ユビキチン複合体またはＰＬＰ２−ＩＳＧ１５複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複製可能（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）アルテリウイルス、医薬としてのその使用、ワクチンとしての及び予防におけるその使用、そのようなアルテリウイルスを含むワクチン、ならびにアルテリウイルスＰＬＰ２−ユビキチン複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルテリウイルス科はニドウイルス目に属し、それらのうちの４種、すなわち、ウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ）、ブタ呼吸器および生殖器症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）、乳酸脱水素酵素上昇ウイルス（ＬＤＶ）ならびにサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ）が公知である。ＬＤＶおよびＳＨＦＶは、それぞれマウスおよびサルに感染するため、僅かな経済的影響を及ぼすに過ぎない。これに対して、ＥＡＶおよび特にＰＲＲＳＶは社会に相当な経済的負担を課す。
【０００３】
ウマ動脈炎ウイルスはウマにおいて感染症を引き起こし、したがって、ウマの畜産業において、繰返し生じる問題を引き起こす。したがって、それはウマの畜産業者に重大な経済的負担を課す。ウマ動脈炎ウイルスは、いわゆる「キャリア種ウマ（ｃａｒｒｉｅｒ  ｓｔａｌｌｉｏｎ）」において持続感染を確立し、ついで該種ウマは該ウイルスを雌ウマに伝染させて、胎仔の流産を潜在的に引き起こす。ウマの畜産業者は、特に種ウマにおいては、ＥＡＶの存在を注意深く監視する。生弱毒化ウイルスに基づく又はＥＡＶ構造サブユニットの発現に基づく、該ウイルスに対する幾つかのワクチンが開発されている。しかし、米国ニューメキシコ州（２００６年）およびフランス（２００７年）における最近の大流行は獣医およびウマの所有者においてＥＡＶに対する関心を増大させている。診断手段およびワクチンは利用可能であるが、現在利用可能なワクチンは改良されるべきである（後記を参照されたい）。
【０００４】
ＰＲＲＳＶは経済学的に最も重要なアルテリウイルスであり、世界中のブタ畜産業に悪影響を及ぼしている。このウイルスの感染は、低成長、飼料効率の低減、食欲不振、および離乳ないし仕上げ（ｆｉｎｉｓｈｉｎｇ）ブタにおける発熱、妊娠雌ブタにおける流産、若いブタにおける呼吸障害を引き起こす。米国だけでも、ＰＲＲＳＶ感染に関連した年間損失は２００５年には約５億６０００万ドル、そして２０１１年には６億６４００万ドルであると見積もられた。ＰＲＲＳＶ感染は養豚業において第１位の健康問題とされており、例えばクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ブタインフルエンザ、ストレプトコッカス属種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ロタウイルスまたはブタサーコウイルスにより引き起こされる他の疾患と比較して最大の生産量低下をもたらす。２００６年の東南アジアにおけるＰＲＲＳＶの強毒性株の出現、およびアジアの養豚業が世界最大であることを考慮すると、世界のこの地域における損失は、米国に関して報告されているものより相当に高いと確実に言うことができる。ＰＲＲＳＶは依然として養豚業に対する重大な脅威である。なぜなら、ＰＲＲＳＶに対する生弱毒化ワクチンおよび不活化ワクチンの両方が利用可能であるにもかかわらず、関連疾患の防除が困難であることが判明しているからである。
【０００５】
生弱毒化ワクチンは通常、ブタにおける疾患をもやは誘発しない弱毒化ウイルスを産生する、細胞培養内の株の連続継代により産生されるウイルスを含む。これらのワクチンは一般に、何らかのレベルの長期的防御を誘導する。しかし、単一のＰＲＲＳＶワクチン株から誘導された場合、それらは異種ＰＲＲＳＶ感染を完全には防御しない可能性がある（ＰＲＲＳＶ分離物は非常に多種多様であり、欧州および北米遺伝子型に分類されうる）。また、生弱毒化ワクチンでのワクチン接種は野生型ウイルスの再感染を完全には予防しない可能性があり、ワクチン接種動物群を介したワクチンウイルスの伝染が幾つかの場合に観察された。また、ワクチン株のビルレンス（毒性）への復帰突然変異も観察された（Ｓｔｏｒｇａａｒｄ，Ｔ．ら，（１９９９），Ｂｏｔｎｅｒ，Ａ．ら，（１９９７），Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｈ．Ｓ．ら，（２００１））。更に、現在、商業的に入手可能なマーカーワクチンは存在しないため、ワクチン接種動物と自然感染動物とを識別することは不可能である。不活化ウイルスワクチンも利用可能であり、それらは複製ウイルスを含まないため、本質的に遥かに安全である。しかし、マイナス面としては、ウイルス複製の欠如は恐らく、これらのワクチンが一般にそれほど有効ではない主要理由であろう。
【０００６】
有効なアルテリウイルスワクチンの開発における追加的な悪化要因は一般に、アルテリウイルスが宿主の自然免疫応答を回避すると考えられていることにある。一般に、アルテリウイルスの強力な免疫調節能は（生弱毒化）ワクチンによる効率的な免疫応答の誘導を妨げると考えられている。したがって、誘導されうる免疫のレベルはチャレンジウイルスに対する防御に最適でない可能性がある。
【０００７】
したがって、古典的な不活化課題を軽減し又は更には解決するための代替的アプローチが必要とされている。
【０００８】
アルテリウイルス科は、約１３〜１６ｋｂの範囲のゲノムサイズを有するプラス−センス（＋）一本鎖ＲＮＡウイルスからなる。感染に際して、該ＲＮＡは２つのレプリカーゼ前駆体ポリタンパク質（ｐｐ１ａおよびｐｐ１ａｂ）に翻訳される。アルテリウイルスの機能性非構造タンパク質（ｎｓｐｓ）は内在的にコードされたプロテアーゼによる、これらのポリタンパク質の切断から誘導される。該ポリタンパク質からの遊離に際して、これらの非構造タンパク質は一緒になって、ウイルスゲノムの複製と構造タンパク質をコードするサブゲノムメッセンジャーＲＮＡの合成とをもたらす複製および転写複合体を形成する。原型アルテリウイルスＥＡＶのｐｐ１ａおよびｐｐ１ａｂポリタンパク質は、非構造タンパク質１（ｎｓｐ１）、ｎｓｐ２およびｎｓｐ４に存在する３個の内在性プロテアーゼにより、少なくとも１３個の非構造タンパク質へと切断される。アルテリウイルスｎｓｐ２はそのＮ末端領域内にパパイン様プロテアーゼ（ＰＬＰ）ドメインを含有する。ＰＬＰ２は、このプロテアーゼの一般名のとおり、ｎｓｐ２とｎｓｐ３との間の結合の切断をもたらし、その触媒活性は、恐らくこの理由により、ウイルス複製に不可欠である（より古い文献は、しばしば、このプロテアーゼをＣＰ（システインプロテアーゼ）またはｎｓｐ２  ＣＰと呼んでいる）。
【０００９】
ポリタンパク質プロセシングにおけるその役割に加えて、ｎｓｐ２は、前記のとおりの宿主自然免疫応答の回避における役割をも果たしていることが、より最近になって判明した。感染に際して、ウイルス核酸の存在は自然免疫シグナリングカスケードの活性化を誘発して、ＮＫκＢおよびＩｒｆ３／Ｉｒｆ７のような転写因子の活性化をもたらし、最終的に、ベータインファーフェロン（ＩＦＮ−β）および他の炎症性サイトカインをコードする遺伝子の転写を引き起こす。タンパク質リン酸化のほかに、これらのシグナリング経路はタンパク質のユビキチン化を介して正および負の両方で広範に調節される（Ｊｉａｎｇ，Ｘ．（２０１２））。ｎｓｐ２の可能な免疫回避活性に対する関心が高まったのは、このタンパク質のＰＬＰ２ドメインが、脱ユビキチン化酵素（ＤＵＢ）の卵巣腫瘍ドメイン含有（ＯＴＵ）クラスに属するタンパク質に対して非常に低い類似性を示すことが、比較配列分析により示されたときであった（Ｍａｋａｒｏｖａ（２０００））。それ以来、アルテリウイルスＰＬＰ２は真のＤＵＢ活性を実際に有すること、およびこの活性は、ユビキチン（更にＵｂとも称される）を自然免疫シグナリング因子から除去して抗ウイルス状態の誘導を抑制または低減するために恐らく用いられることが確認されている（Ｆｒｉａｓ−Ｓｔａｈｅｌｉ，Ｎ．（２００７），Ｓｕｎ，Ｚ．（２０１０），ｖａｎ  Ｋａｓｔｅｒｅｎ，Ｐ．Ｂ．（２０１２））。抗ウイルスＰＬＰ２は、そのＤＵＢ活性に加えて、ユビキチン様抗ウイルスタンパク質インターフェロン刺激性遺伝子１５（ＩＳＧ１５）を細胞標的タンパク質から除去することも示されている（Ｆｒｉａｓ−Ｓｔａｈｅｌｉ，Ｎ．（２００７），Ｓｕｎ，Ｚ．（２０１２），Ａｒｇｕｅｌｌｏ，Ｍ．Ｄ．（２００７））。この活性は脱ＩＳＧ化（ｄｅＩＳＧｙｌａｔｉｎｇ）活性と称される。ユビキチンとＩＳＧ１５との密接な関連性ゆえに、ＰＬＰ２ドメインのこの役割は一般にＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性と称される。
【００１０】
ポリタンパク質プロセシング機能とＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性との間には非常に密接な関連性が明らかに存在する。なぜなら、どちらの活性もＰＬＰ２における同一触媒コアアミノ酸残基に基づくものだからである。更に、アルテリウイルスレプリカーゼポリタンパク質内のｎｓｐ２／ｎｓｐ３切断部位を定める配列（ｘｘＧＧ）は、ユビキチンおよびユビキチン様分子ＩＳＧ１５において見出されるカノニカル（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｃ末端モチーフ（ＬＲＧＧ）に対する類似性を示し、切断は第２グリシン残基の直後で生じる。その結果、この密接な関連性は、独立してこれらの基質特異性を研究することを、不可能ではないとしても非常に困難にする。
【００１１】
ＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を特異的に低減または排除する一方で同時にｎｓｐ２／ｎｓｐ３結合部におけるポリタンパク質プロセシング機能（それが無ければ該ウイルスは生存できない）を完全なままに維持する、ＰＬＰ２ドメインまたはその近傍における修飾を行うための幾つかの予備的な試みが記載されている。
【００１２】
Ｓｕｎら（２０１０）は、ＰＲＲＳＶのＰＬＰ２ドメインのＮ末端境界における幾つかのアミノ酸位置で突然変異を行うための試みを記載している。彼らは、突然変異を導入するために、ＰＬＰ２ドメインの或る部分を、この領域内のＢ細胞エピトープ（ＥＳ２）の存在に基づいて選択した。予想されたとおり、ｎｓｐ２／ｎｓｐ３結合部におけるポリタンパク質プロセシング活性におけるこの領域の重要性を考慮すると、生じたＰＬＰ２突然変異の大部分は該ウイルスに対して致死性であった。３つの突然変異、すなわち、Ｄ４５８Ａ、Ｓ４６２ＡおよびＤ４６５Ａ（番号はＳｕｎら，２０１０に基づいている）における突然変異のみが、ウイルス生存性の完全な喪失を引き起こすことなく「許容」された。しかし、これらの突然変異体はＮＦκＢ活性化の抑制における低減をほとんど又は全く示さなかった。これらの位置に施された突然変異は、該ウイルスに対して致死性であるか、または脱ユビキチン化を介してＮＦκＢ活性化を抑制するその能力において野生型ウイルスとほとんど異ならない生存可能ウイルスを与えるかのいずれかであると結論づけられうるに過ぎないであろう。この研究は、密接に関連した、ポリタンパク質プロセシングにおけるＰＬＰ２機能とＤＵＢ／脱ＩＳＧ化とを分離することが困難であることを示している。
【００１３】
Ｓｕｎらは後に、ＰＬＰ２ポリタンパク質プロセシング機能を保持させつつＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を遮断する可能性を研究するための新たな試みにおいて、突然変異の導入のためにもう１つの領域を選択した（Ｓｕｎ  ２０１２）。Ｓｕｎ（２０１２）に、ＰＲＲＳＶのＰＬＰ２ドメインのＮ末端境界における欠失の新たな組合せが記載されている。ＯＲＦ１ａコード化タンパク質のアミノ酸４０２−４２０の領域にわたる欠失のみが、ＩＳＧ１５アンタゴニスト機能の部分的低下を示すウイルスを与えることが判明し、非常に低い力価でではあるが尚も複製可能であったが、これは、４６２位に追加的な下流点突然変異が存在する場合に限られた。したがって、このウイルスは、記載されている理由により、生ワクチンウイルスのための基礎としては適していない。
【００１４】
特許出願ＷＯ２０１２／０６３２１２は、ＰＲＲＳＶにおける免疫回避能の低下に恐らくつながりうる修飾を施すための試みを記載している。この特許出願においては、全てＰＬＰ２ドメインの外部の、ウイルスゲノム全体にわたって分散した位置に、全て該ウイルスのインターフェロン誘導／抑制表現型を直接的にもたらすと考えられている３２個のアミノ酸変化を含む突然変異ウイルスが記載されている。したがって、野生型ウイルスを、低下したインターフェロン抑制活性を有する複製可能ウイルスへと変換するためには、これらの変化の全てが導入される必要がある。どのアミノ酸変化がこの抑制効果を実際にもたらすのかは全く示されていないため、該ウイルスの安全性に関する予想は不可能であり、単点突然変異が、このウイルスを不良ワクチン候補にする毒性の復帰を招くであろう。更に、どのアミノ酸が弱毒化表現型をもたらすのかに関する知識の欠如は、他の株から新規ワクチン候補を構築することを困難にする。ウイルス内に３２個のアミノ酸変化を導入するための骨の折れる仕事はさておき、別のウイルスの異なる配列状況におけるこれらの３２個のアミノ酸突然変異がウイルス弱毒化およびＩＦＮ抑制の低減に対して同じ効果をもたらす可能性は低いであろう。
【００１５】
特許出願ＷＯ２００９／００８９２４は、ＯＴＵ含有ウイルスタンパク質の脱ＩＳＧ化活性を抑制することによりウイルス感染を予防する方法を記載している。該出願は、主として、医薬化合物によりＯＴＵ含有ウイルスタンパク質の脱ＩＳＧ化活性を標的化することを目的としている。しかし、この出願は、ＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を特異的に除去する一方で同時にポリタンパク質プロセシング機能を完全なままに維持する、アルテリウイルスにおける修飾を開示も更には示唆もしていない。
【００１６】
したがって、基本的には、ＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性の有意な低減を引き起こす公知突然変異はウイルス複製における許容し得ない低減またはほとんどの場合にはウイルス複製の完全な阻止を不可避的に引き起こすようである。許容されうる結果がこれまでに得られていないことは、ＰＬＰ２のＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性とポリタンパク質プロセシング機能との間の密接な関連を解除することが全く不可能である可能性があることを強く示唆している。
【００１７】
本発明の目的の一つは、一方では複製可能であり、それでも他方ではＰＬＰ２のＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性の低下を示すアルテリウイルス科のウイルスを提供することである。
【発明の概要】
【００１８】
ポリタンパク質プロセシング機能およびＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性のためのＰＬＰ２活性部位は同じであるが、一方においてはＵｂおよびＩＳＧ１５に対する、そして他方においてはｎｓｐ２／ｎｓｐ３切断部位に対する基質結合は異なることが、驚くべきことに、本発明において判明した。一方においてはＵｂのベータｇｒａｓｐ（グラスプ）フォールドまたはＩＳＧ１５のＣ末端ベータｇｒａｓｐフォールドに結合するＰＬＰ２ドメインの部分、そして他方においては、ＵｂまたはＩＳＧ１５のＣ末端尾部の非構造化領域に類似したｘｘＧＧモチーフを含有するポリタンパク質の非構造化領域への結合に関与する領域の特定が、ｎｓｐ２のＰＬＰ２ドメイン、より詳細にはユビキチンに結合したｎｓｐ２のＰＬＰ２ドメインの３Ｄ構造の解明および分析により、初めて本発明において行うことができた。
【００１９】
本発明以前には、ＰＬＰ２ドメインの３Ｄ構造を決定することは、とりわけ、Ｘ線結晶解析に適したタンパク質結晶を成長させることが困難であったため、可能でなかった。
【００２０】
解決すべき第１の課題は、ＰＬＰ２ドメインの結晶解析を可能にする十分な量のｎｓｐ２断片の製造に関連したものである。Ｎｓｐ２は発現系において十分には発現されず、融合タンパク質として発現された場合には、ＰＬＰ２が不溶性になってタンパク質結晶解析に不適になることなしに融合相手から取り出されることは困難である。驚くべきことに、発現プラスミドｐＡＳＫ３（Ｇｏｈａｒａ  Ｄら，（１９９９））からのＮ末端ユビキチンに対してインフレームであるＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメイン（この場合、必要条件というわけではないが、該ポリタンパク質の残基２６１−３９２）の発現が、１）タンパク質がウイルスポリタンパク質に由来する場合と同様の天然Ｎ末端を有する、そして２）結晶化の目的に十分な量で製造されうるタンパク質を得るために十分であることが、本発明において判明した。プラスミドｐＡＳＫ３は通常、ＤＵＢユビキチンプロテアーゼ１（Ｕｂｐ１）も発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞におけるタンパク質の発現のために使用され、その結果として、Ｎ末端ユビキチンタグは発現後に直ちに切断除去される。しかし、今回の状況においては、ＰＬＰ２自体がＤＵＢとして作用するため、ＤＵＢ  Ｕｂｐ１を同時に発現させることなく、プラスミドｐＡＳＫ３を使用して、Ｎ末端ユビキチンタグに対してインフレームであるポリタンパク質残基２６１−３９２（すなわち、ＥＡＶ  ｎｓｐ２のＰＬＰ２ドメイン）を発現させることで十分であった。更に、ＰＬＰ２はその認識部位ＬｘＧＧの直後を切断するため、タンパク質がウイルスレプリカーゼポリタンパク質切断に由来する場合と同様に、ＰＬＰ２断片がその天然Ｎ末端を伴って産生された。発現プラスミドｐＡＳＫ３の使用とＥＡＶ  ｎｓｐ２のＰＬＰ２ドメインとのこの特別な組合せは、タンパク質Ｘ線結晶解析によるＰＬＰ２ドメインの三次元構造の決定を可能にするのに十分な量で産生される、天然Ｎ末端を実際に有するタンパク質断片を与えた。
【００２１】
ＰＬＰ２ドメインの３Ｄ構造を決定する方法において直面した第２の課題は、精製されたＰＬＰ２ドメインを結晶化できないことであった。この次の段階における課題を克服するために、メカニズムに基づく自殺インヒビターＵｂ（１−７５）−３−ブロモプロピルアミン（Ｕｂ−３Ｂｒ）を、Ｊａｍｅｓら（２０１１）により記載されているとおりにＭｅｓｓｉｃｋら（２００８）およびＢｏｒｏｄｏｖｓｋｙら（２００２）に従い製造した。ついでＵｂ−Ｂｒ３を精製ＰＬＰ２に、それらのタンパク質をそれぞれ３：２のモル比で３７℃で１時間混合することにより共有結合させた。得られたＰＬＰ２−ユビキチン複合体をゲル濾過、アニオン交換（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ）クロマトグラフィーにより精製し、ついで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に交換した後、１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、４℃で保存した。ＰＬＰ２ドメインの触媒求核基（Ｃｙｓ２７０）とユビキチンのＣ末端との間の共有結合により安定化されたこのＰＬＰ２−ユビキチン複合体の形成は、結晶化するのに十分な程度に安定な、そしてＸ線結晶解析により該複合体の３Ｄ構造が決定されることを可能にするのに十分な程度に安定な複合体を与えた。該ＰＬＰ−Ｕｂ複合体をハンギングドロップ蒸気拡散により結晶化した。実施例は結晶化法に関する更に詳細な情報を記載している。
【００２２】
前記のとおり、ＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメイン（ＥＡＶ  ｐｐ１ａの残基２６１−３９２；１３．６ｋＤａ）の結晶構造は、メカニズムに基づくインヒビターＵｂ−Ｂｒ３との共有結合複合体として決定された。複数のシステイン残基の保存性と、プロテアーゼ機能性のためのそれらの実証された重要性は、ＰＬＰ２が亜鉛に結合しうることを示唆しているため（Ｓｎｉｊｄｅｒら，１９９５）、亜鉛吸収端にわたって集められたＸ線回折データを使用する多波長異常分散（ＭＡＤ）フェージング実験により該複合体の結晶構造を決定した。得られた電子密度地図は、完全なユビキチン分子に結合したＰＬＰ２の残基２６１−３８７を示し、該複合体のモデルが構築され１．４５オングストロームの分解能まで精密化（Ｒｗｏｒｋ＝０．１６，Ｒｆｒｅｅ＝０．１８）されることを可能にした（図１Ａ）。
【００２３】
ＰＬＰ２は、結合Ｕｂ分子（Ｕｂ二量体における「遠位」Ｕｂ）のＣ末端を溶媒露出活性部位に向ける浅いＵｂ結合部位を有する小さな２ドメインフォールドをとる（図１Ａ）。ＰＬＰ２のドメインＩ（残基２６７−３０７および３６５−３７８）は、２本鎖逆平行シート（β２↑β６↓）に対して詰め込まれた３ヘリックスバンドル（α１、α２、α４）からなる。ドメインＩＩは、ドメインＩのヘリックスα１およびα２に対して一緒に詰め込まれたαヘリックス（α３）および４本鎖βシート（β１↑β５↓β４↑β３↑）を中心とする。ドメインＩＩはＵｂ結合部位の大部分を構成し、これは、四面体形状で亜鉛イオンを配位させる４個のシステイン残基（Ｃｙｓ３１９、３４９、３５４、３５６）により安定化される（図１Ｂ）。それらの配置は、Ｃ末端型ジンクネックレスモチーフに類似したＣ４ジンクフィンガーを形成する（Ａｎｄｒｅｉｎｉら，２０１１）（図１Ｂ）。Ｃ１位（Ｃｙｓ３１９）とＣ２位（Ｃｙｓ３４９）との間の大きな挿入がジンクフィンガーの安定化効果をドメインＩＩの大部分にわたって広げるようである。第５のシステイン（Ｃｙｓ３４４）は該亜鉛イオンの近くに位置するが、それに配位せず、このことは、記載されている他のジンクネックレスモチーフ（Ａｎｄｒｅｉｎｉら，２０１１）に合致しており、また、Ｃｙｓ３４４からアラニンへの突然変異がＰＬＰ２ドメインの触媒活性に影響を及ぼさないことを示している過去の知見（Ｓｎｉｊｄｅｒら，１９９５）に合致している。該システインのうちの３個（Ｃｙｓ３１９、３４９および３５４）はアルテリウイルスにおいて完全に保存されており、これらの残基およびＣｙｓ３５６の突然変異分析は、それらの存在が触媒活性に不可欠であることを示した（Ｓｎｉｊｄｅｒら，１９９５）。しかし、活性部位からのその距離（〜２５オングストローム）（図１Ａ）を考慮すると、ジンクフィンガーは、触媒への関与ではなく、構造的役割を果たしているようである。亜鉛の非存在下（Ｍ９培地）で増殖した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるＰＬＰ２ドメインの発現は不溶性タンパク質を与える。このことは、ジンクフィンガーが構造的なものであり、該プロテアーゼの適切なフォールディングに要求される可能性が高いという見解を支持している。
【００２４】
ＰＬＰ２活性部位は、Ｈｉｓ３３２のイミダゾール環に水素結合している付随的アスパラギン（Ａｓｎ２６３）と共に、触媒システイン求核基（Ｃｙｓ２７０）およびヒスチジン（Ｈｉｓ３３２）残基を含有する（図１Ｃ）。Ｃｙｓ２７０の側鎖は３−プロピルアミン（３ＣＮ）修飾を介してＵｂのＣ末端に共有結合しており、触媒反応のアシル−酵素中間段階を模倣しており、Ｃｙｓ２７０が触媒求核基に相当することを証明している（図１Ａ、Ｃ）。
【００２５】
アルテリウイルスＰＬＰ２は典型的なＯＴＵ−ドメイン構造からは逸脱している。ＯＴＵスーパーファミリーのメンバーはアルテリウイルスＰＬＰ２の構造的類縁体として分類されており、このことは、このスーパーファミリーのメンバーとしてのその分類を支持している。しかし、アルテリウイルスＰＬＰ２とＯＴＵ−ドメインプロテアーゼとの間の配列類似性は非常に低く（Ｍａｋａｒｏｖａら，２０００）、実際、ＥＡＶ  ＰＬＰ２構造は、典型的なＯＴＵ−フォールドからは相当に逸脱したトポロジー的特徴を示している。公知ＯＴＵ−ドメイン構造のドメインＩは、２つの内部ヘリックスに対して垂直に詰め込まれた溶媒露出アルファヘリックスのペアを含有する（図１Ｄ、Ｇ、Ｈ）。該内部ヘリックスはＰＬＰ２において保存されているが（α１およびα２）、該溶媒露出ヘリックスは、前記の３ヘリックスバンドルを形成するようにヘリックスα１およびα２に平行に詰め込まれた単一ヘリックス（α４）により置換される（図１Ａ、Ｆ）。このトポロジーはパパインのＬドメインに微妙に類似しており（Ｋａｍｐｈｕｉｓら，１９８４）、ＰＬＰ２のドメインＩのサイズを顕著に減少させ、Ｕｂと複合体を形成することが確認されている他のＯＴＵ−ドメインＤＵＢと比較した場合のＵｂ結合へのその寄与を顕著に低減する（Ａｋｕｔｓｕら，２０１１；Ｃａｐｏｄａｇｌｉら，２０１１；Ｈｕａｎｇら，２０１２；Ｊａｍｅｓら，２０１１；Ｍｅｓｓｉｃｋら，２００８）。
【００２６】
公知ＯＴＵ−ドメイン構造からのより顕著な逸脱はＰＬＰ２のドメインＩＩにおけるジンクフィンガーの存在（図１Ａ、Ｂ）および触媒活性のためのその決定的な重要性である（Ｓｎｉｊｄｅｒら，１９９５）。ジンクフィンガーを含有するＵｂ結合ドメインは幾つかのＯＴＵ−ドメインＤＵＢ内に存在するが、いずれも遠位Ｕｂ結合部位の部分をＯＴＵ−ドメインフォールド内に含まない。その代わりに、それらは、柔軟なリンカーを介してＯＴＵ−ドメインに連結された補助ドメインとして存在し（Ｋｏｍａｎｄｅｒら，２００９）、Ａ２０の場合には、それらは追加的なポリユビキチン結合特異性を付与するようであり、おそらく、特異的シグナリング複合体に該タンパク質を標的化するであろう（Ｂｏｓａｎａｃら，２０１０）。ＰＬＰ２の場合、ジンクフィンガーモチーフはＯＴＵ−フォールドの必須部分であり、後記のとおり、プロテアーゼ表面上の遠位Ｕｂ分子の結合および配置において中心的役割を果たしている（図１）。現在、ＯＴＵ−ドメインＤＵＢは、それらの構造的特徴に基づいて、３つのサブクラス（オツバイン（Ｏｔｕｂａｉｎ）、Ａ２０様ＯＴＵおよびＯＴＵ）に分類されている（Ｋｏｍａｎｄｅｒら，２００９）。
【００２７】
ＥＡＶ  ＰＬＰ２の驚くべき特有の特徴を考慮すると、本発明者らは今や、アルテリウイルスＰＬＰ２酵素は亜鉛依存性ＯＴＵの新規サブクラスを代表するものであると考えている。アルテリウイルスＰＬＰ２およびＣＣＨＦＶ  ＯＴＵは真核生物ＯＴＵ−ドメインＤＵＢと比較して特有である。なぜなら、それらはＵｂに加えて細胞標的からＩＳＧ１５を除去するからである。ＣＣＨＦＶ  ＯＴＵに関して観察されるＩＳＧ１５タグ付き基質に対する交差反応性は、主として、Ｕｂ結合部位がＵｂおよびＩＳＧ１５のＣ末端Ｕｂ様ドメインの両方を収容しうるようにＵｂ結合部位を修飾する、Ｕｂ結合部位上の特有のβヘアピンから生じる（Ａｋｕｔｓｕら，２０１１；Ｊａｍｅｓら，２０１１）。アルテリウイルスＰＬＰ２はＩＳＧタグ付き基質に対する交差反応性を示すが、驚くべきことに、βヘアピン構造はＰＬＰ２内に全く存在せず、ジンクフィンガーモチーフのヘリックスα３により置換されていることが今や判明した。興味深いことに、ＣＣＨＦＶ  ＯＴＵ上のβヘアピンの役割に合致して、ヘリックスα３の残基は、Ｕｂ結合性タンパク質により一般に標的化される部位である疎水性「Ｉｌｅ４４パッチ」に結合し（Ｄｉｋｉｃら，２００９）、ＣＣＨＦＶ  ＯＴＵで観察されるものと同等の様態でＰＬＰ２ドメインへのＵｂの結合を補助する（図１Ｅ）。この結合様式は、Ｕｂ上には存在しないＩＳＧ１５上の追加的な嵩高い残基をＣＣＨＦＶ  ＯＴＵが収容することを可能にするが、この特徴は、ＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメイン内にも存在すると思われる。
【００２８】
前記のとおり、アルテリウイルスＰＬＰ２は、ＵｂおよびＩＳＧ１５を標的化するそのイソペプチダーゼ活性に加えて、レプリカーゼポリタンパク質の成熟過程の一部としてウイルスポリタンパク質内の特異的ペプチド結合を切断する。ＰＬＰ２活性部位からのヘリックスα３の距離を考慮することにより（図１Ａ）、今や始めて、ウイルスポリペプチド内の直鎖状ｎｓｐ２／ｎｓｐ３結合部に結合しそれを切断するＰＬＰ２酵素の能力に影響を及ぼすことなくＰＬＰ２のＤＵＢおよび脱ＩＳＧ化活性を選択的に損なうような突然変異を、Ｕｂ結合部位であるこの領域内へ導入し得ることを確認できた。ＥＡＶの推定ｎｓｐ２／ｎｓｐ３切断部位（８２８−ＲＬＩＧＧ↓−８３２）はＩＳＧ１５およびＵｂのＣ末端尾部（ＲＬＲＧＧ↓）に非常に類似しているが、該切断部位の上流のｎｓｐ２配列はＵｂ様フォールドを有していないらしいという観察により、この知見は更に裏付けられた。このことは、ＰＬＰ２  Ｕｂ結合部位の大部分は、該酵素がｎｓｐ２／ｎｓｐ３結合部を認識しこれを切断するのに要求されないことを示している。
【００２９】
アルテリウイルスのＰＬＰ２ドメインの３Ｄ構造が今や解明され、それだけでなく１．４５オングストロームの分解能で解明されることが、本発明の利点の１つである。したがって、ＰＬＰ２デユビキチナーゼおよびポリタンパク質切断活性の構造誘導性脱共役（デカップリング）を行うことが今や初めて可能となり、本発明のアルテリウイルス、すなわち、尚も複製可能であるがＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性の低下を示すアルテリウイルスを得るために任意のアルテリウイルスにおけるＰＬＰ２ドメインのどの領域が修飾可能または修飾不可能であるかを理論的に判断することが今や初めて可能となった。
【００３０】
単なる一例に過ぎないが、ＰＬＰ２、ユビキチンおよびＰＬＰ２−ユビキチン結合表面の３Ｄ構造を、アルテリウイルスＥＡＶに関して、より詳細には株ブシルス（Ｂｕｃｙｒｕｓ）（ＧｅｎｅＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ ００２２５３２）に関して、図２に示す。しかし、ここでは以下の点が強調される。ＰＬＰ２−ユビキチン複合体の結晶構造を得るために本発明で提供される発現方法および結晶化方法の新たに開発された組合せは任意のアルテリウイルスのＰＬＰ２ドメインに一般に適用可能である。また、この点に関して、ユビキチン結合表面を定めるのは主としてＰＬＰ２ドメインの３Ｄ構造であり、そのドメインの単なるアミノ酸配列ではないことを認識することが重要である。これは、図３に示されている多配列アライメントから直接的に理解される。この構造的に機能的なアライメントはＥＡＶブシルス株および３つの代表的だが異なるＰＲＲＳＶ株［ＧＭ２（中国野外株）、レリスタット（Ｌｅｌｙｓｔａｄ）（原型欧州株）およびＶＲ−２３３２（原型北米株）］のＰＬＰ２配列を含む。個々のアミノ酸の性質、および、該アライメントの幾つかの位置に存在するギャップを与える種々の株におけるアミノ酸の数の相違の両方に関して、それらの種々のアルテリウイルス配列の間には相当な数の相違が存在することがすぐに理解されうる。それにもかかわらず、ＥＡＶブシルス株のＰＬＰ２ドメインのユビキチン結合表面の３Ｄ構造とＰＲＲＳＶ株ＧＭ２、レリスタットおよびＶＲ−２３３２に関する比較分子モデリングにより予想される３Ｄ構造は著しく類似している。これを図４に示す。図４においては、ＥＡＶ株ブシルス、ＰＲＲＳＶ株レシスタットおよびＰＲＲＳＶ株ＶＲ−２３３２のＰＬＰ２−ユビキチンの構造モデルが示されている。この場合もまた、アミノ酸配列および数の相違にもかかわらず、ＥＡＶおよびそれらの２つのＰＲＲＳＶ株のＰＬＰ２ドメインのユビキチン結合表面は著しく類似していることが直ちに理解されうる。そして実際に、これは予想と一致している。すなわち、全てのアルテリウイルスＰＬＰ２ドメインは同一触媒コアを用いており、このプロテアーゼの非常に複雑な基質特異性ゆえに、該３Ｄ構造はアルテリウイルス科の種々のメンバー間で十分に保存されている必要がある。
【００３１】
したがって、本発明の第１の実施形態は、非構造タンパク質ｎｓｐ２のＰＬＰ２ドメイン内の突然変異により低下したＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を有することを特徴とする複製可能アルテリウイルスに関する。
【００３２】
非構造タンパク質ｎｓｐ２のＰＬＰ２ドメインは非常に短いドメインであり、例えばＥＡＶ株ブシルスのＰＬＰ２ドメインは僅か１２７アミノ酸（配列番号９）からなり、ＰＲＲＳＶ株レリスタットのＰＬＰ２ドメインは僅か１３６アミノ酸（配列番号１０）からなる。例えばＰＲＲＳＶ株ＶＲ−２３３２のＰＬＰ２ドメインは１３９アミノ酸（配列番号１１）からなる。図３はＥＡＶ株ブシルス、ＰＲＲＳＶ株レリスタット、ＰＲＲＳＶ株ＶＲ−２３３２およびＰＲＲＳＶ株ＧＭ２のＰＬＰ２ドメインの配列アライメントを示す（後記を参照されたい）。図４は、ＥＡＶ  ＰＬＰ２に対するそれぞれの配列のアライメントに基づくＶＲ−２３３２およびレリスタットの分子モデルを示す。ＥＡＶ  ＰＬＰ２に対して整列（アライメント）させることにより、、ＶＲ−２３３２またはＬＶの配列がＥＡＶ  ＰＬＰ２結晶構造の３Ｄバックボーン構造上に置換されることを可能にする。言い換えると、ＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメインのアミノ酸側鎖は、該多配列アライメントにより定められたＶＲ−２３３２またはＬＶのものにより置換される。そこから、欠落ループがアブイニシオ（ａｂ  ｉｎｉｔｉｏ）でモデル化され、適当なエネルギー最小化標的関数を使用して全体的な３Ｄモデルが最適化される。
【００３３】
図３に示されているＥＡＶのＰＬＰ２ドメインのアミノ酸配列の番号付け（ナンバリング）は、枠で囲まれた種々の領域を示すために用いられる。したがって、この番号付けはＰＬＰ２ドメインの「コンセンサスナンバリング」と称される。
【００３４】
本明細書において定義される複製可能アルテリウイルスは、尚も複製可能な、すなわち、感染性後代ウイルスを産生する能力を有するウイルスである。感染性後代ウイルスは複製可能な感染性後代ウイルスまたは複製欠損型感染性後代ウイルスでありうる。本発明の複製可能ウイルスは生弱毒化アルテリウイルスワクチンのための基礎として非常に適している。しかし、ワクチンにおける使用のための十分な量のウイルスを産生させるためには、後代ウイルスの量が十分に高くなければならない。したがって、本発明の目的においては、複製可能ウイルスは、本発明の突然変異を含有しない同一ウイルスにより同一細胞系において産生される後代ウイルスの量と比べて３１０  ｌｏｇより大きくは下回らない量の後代ウイルスを感受性細胞系において産生するウイルスである。単なる一例に過ぎないが、或る量のＰＲＲＳＶ株が１．０００．０００個の感染性後代ウイルス粒子を或る細胞培養系において産生する場合、本発明の突然変異を含有する同一株は、複製可能ウイルスとして適格であるためには、１０００個またはそれより多くの感染性粒子を産生する必要がある。好ましくは、後代ウイルスの量は、本発明の突然変異を含有しないウイルスが同一細胞系において産生する後代ウイルスの量と比べて２１０  ｌｏｇより大きくは下回らない。より好ましくは、後代ウイルスの量は、その量と比べて１１０  ｌｏｇより大きくは下回らない。
【００３５】
本発明の目的においては、ＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性の低下を示す本発明のアルテリウイルスは、野生型ウイルスにより示されるインターフェロンベータｍＲＮＡ誘導の量の少なくとも２倍であるレベルまでのインターフェロンベータｍＲＮＡ誘導における増加を該ウイルスが示すように、ＰＬＰ２ドメイン内に突然変異を有するウイルスである。実施例においては、インターフェロンベータｍＲＮＡ誘導のレベルを決定するために用いられうるリアルタイム定量ＰＣＲ反応が説明されている。その実施例においては、ＥＡＶ野生型ウイルスおよび本発明の突然変異体のインターフェロンベータｍＲＮＡ誘導のレベルが試験され、比較されている。
【００３６】
ＲＴ−ＰＣＲにおけるＥＡＶ  ＩＦＮベータｍＲＮＡの試験のための必要なプライマーを表２に示す。Ａｒｔｕｒｓｓｏｎ  Ｋら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｒｅｓ．１２（３）：１５３−１６０（１９９２）においては、本発明のＰＲＲＳウイルス突然変異体のＩＦＮベータｍＲＮＡ誘導のレベルを決定するために用いられうるリアルタイムＰＣＲ反応のための比較しうるプライマーを当業者が設計することを可能にするブタＩＦＮベータの配列が記載されている。
【００３７】
図９Ａにおいては、例えばＥＡＶ突然変異体Ｉ３５３Ｒは、Ｉ３５３Ｒ突然変異を含まない野生型ウイルスと比較して約４倍のＩＦＮベータｍＲＮＡを産生することが示されている。図９Ａにおける三重突然変異体は更に、該野生型ウイルスと比較して約８倍のＩＦＮベータｍＲＮＡを産生する。
【００３８】
図６Ｂから理解されうるとおり、Ｔ３１２Ａのような突然変異体は、野生型ウイルスのものより有意に密なアルファＦＬＡＧレーン（残存ユビキチンコンジュゲートの量に相当する）を与えるＤＵＢ−活性のレベルを既に示している。図９Ａに示されている対応突然変異ウイルスが野生型ウイルスと比較して４倍のＩＦＮベータを示した隣接Ｉ３５３Ｒレーンは、Ｔ３１２Ａレーンの場合の約２倍高いアルファＦＬＡＧレーンの密度を示している。この理由により、本発明者らは、ＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性の低下を示すウイルスであるためには、野生型ウイルスにより示されるインターフェロンベータｍＲＮＡ誘導の量の少なくとも２倍、好ましくは４倍、より好ましくは８倍のレベルまでのインターフェロンベータｍＲＮＡ誘導における増加を該ウイルスが示すようにＰＬＰ２ドメイン内に突然変異を有するウイルスを考えている。
【００３９】
本発明の目的においては、突然変異は、例えば、後記のとおりの置換、挿入または欠失でありうる。
【００４０】
図３においては、アルテリウイルスの４個の異なる例（ＥＡＶ株ブシルスならびにＰＲＲＳＶ株ＧＭ２、レリスタットおよびＶＲ−２３３２）のＰＬＰ２ドメインの概観が示されている。該配列のアライメントがなされており、関連領域が枠により示されている。この図は、図２および４と密接に関連づけて理解されるべきである。図２はＥＡＶのＰＬＰ２ドメインの３Ｄ構造、およびユビキチンがこの構造に結合する様態を示す。図４は、比較のためにＥＡＶ株ブシルスのＰＬＰ２ドメインの結晶構造と共に並べられた、ＰＲＲＳＶ株レリスタットおよびＶＲ−２３３２のＰＬＰ２ドメインの予測３Ｄ構造ならびにユビキチンがこの構造に結合する様態を示す。点線の枠で示された図３における残基は、ユビキチンのＲＬＲＧＧモチーフと活性部位の近傍で相互作用する残基を表す。これらの残基の突然変異は、ＰＬＰ２ドメインのポリタンパク質プロセシング活性に影響を及ぼす可能性が高く、したがって、好ましくは、回避されるべきである。実線の枠で示されている残基は、活性部位の近傍ではなく、ユビキチンのベータｇｒａｓｐフォールド（すなわち、ユビキチンの主要体）に直接結合する残基を表す。亜鉛結合部位およびこの部位を直に包囲する残基は、おそらくはＩＳＧ１５のＣ末端ドメインの類似領域およびユビキチンのベータｇｒａｓｐフォールドに結合するＰＬＰ２ドメインのユビキチン相互作用表面の大部分を形成している。
【００４１】
前記のとおり（そして図３におけるアライメントから理解されうるとおり）、どのアミノ酸残基がユビキチン相互作用表面を形成するのかを決定するのは該３Ｄ構造である。これは図４Ｃからも理解される。図４Ｃにおいては、ＰＲＲＳＶ株レリスタットに関しては、とりわけＴｈｒ４７８、Ｖｌａ４７９およびＶａｌ５２０がユビキチンに結合すると予想され、一方、ＰＲＲＳＶ株ＶＲ−２３３２に関しては、この役割はＡｌａ４８６、Ｌｅｕ４８７およびＣｙｓ５２８により果たされ、ＥＡＶ株ブシルスに関しては、この役割はＴｈｒ３１２、Ｉｌｅ３１３およびＩｌｅ３５３により果たされることが示されている。
【００４２】
本発明の第１の実施形態の好ましい形態においては、ｎｓｐ２のＰＬＰ２ドメインにおける突然変異により低下したＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を有する複製可能アルテリウイルスは、ＥＡＶおよびＰＲＲＳＶからなるウイルスの群から選択される。
【００４３】
図３は、主要ＥＡＶおよびＰＲＲＳＶ株を代表する４個のアルテリウイルス配列のユビキチン相互作用表面アライメントを定める構造的に整列（アライメント）された配列を表す。図４において並べて示されている結晶構造（ＥＡＶ）またはモデル（ＰＲＲＳＶ）によれば、全ての場合にユビキチンと相互作用するＰＬＰ２アミノ酸配列のそれぞれの領域を枠が示しているという点で、該アライメントは実際に構造的なものである。
【００４４】
図３および４Ｃからは、１つのアルテリウイルスにおけるどのアミノ酸がもう１つのアルテリウイルスのものに対応するのかが理解されうる（例えば、ユビキチンとの相互作用表面におけるそれらの位置に関して、ＥＡＶにおけるＩ３１３＝ＬＶにおけるＶ４７９、およびＶＲ２３３２におけるＬ４８７）。
【００４５】
非構造タンパク質ｎｓｐ２のＰＬＰ２ドメインにおける突然変異により低下したＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を有する複製可能アルテリウイルスを得るためには、図３を考慮して、好ましくは、構造的に整列されたＰＬＰ２配列における実線の枠で囲まれた領域内および／または該領域の近傍において突然変異を行うであろう。図３におけるアミノ酸の番号付けは、ここではアルテリウイルスの４つの例（ＥＡＶ株ブシルスならびにＰＲＲＳＶレリスタット、ＶＲ−２３３２およびＧＭ２）に関して示されている。他のアルテリウイルスＰＬＰ２配列は、図３に既に示されている配列と同等に構造的に整列されうることが明らかである。前記のとおり、参照が容易となるように、図３に示されているＥＡＶのＰＬＰ２ドメインのアミノ酸配列の番号付けが、枠で囲まれた種々の領域に言及するために用いられる。
【００４６】
したがって、この実施形態のより好ましい形態は、ＰＬＰ２ドメインにおける突然変異が、図３に示されているＥＡＶ番号付けによるコンセンサス位置２９６−２９７位および／または３０９−３１９位および／または３２６−３３０位および／または３４５−３５５位のいずれかに位置することを特徴とする、本発明の複製可能アルテリウイルスに関する。この図においては、ＰＲＲＳＶレリスタットに関する位置はそれぞれ４６３−４６４、４７５−４８５、４９２−４９６および５１２−５２２である。ＰＲＲＳＶ  ＶＲ−２３３２およびＰＲＲＳＶ  ＧＭ２に関しては、該位置は４７１−４７２、４８３−４９３、５００−５０４および５２０−５３０である。
【００４７】
この実施形態のより一層好ましい形態は、ＰＬＰ２ドメインにおける突然変異が、図３に示されているＥＡＶ番号付けによるコンセンサス位置２９６−２９７位および／または３１０−３１８位および／または３２７−３２９位および／または３４６−３５４位のいずれかに位置することを特徴とする、本発明の複製可能アルテリウイルスに関する。単なる一例に過ぎないが、例えばＰＲＲＳＶレリスタットに関するこれらの位置は４６３−４６４、４７６−４８４、４９３−４９５および５１３−５２１である。
【００４８】
この実施形態の更により一層好ましい形態は、ＰＬＰ２ドメインにおける突然変異が、図３に示されているＥＡＶ番号付けによるコンセンサス位置２９６−２９７位および／または３１１−３１７位および／または３２８位および／または３４７−３４８位および／または３５１−３５３位のいずれかに位置することを特徴とする、本発明の複製可能アルテリウイルスに関する。
【００４９】
本発明者らは、一例として、部位特異的突然変異誘発により、例えば、ＥＡＶ  ＰＬＰ２ユビキチン相互作用表面のＴｈｒ３１２、Ｉｌｅ３１３およびＩｌｅ３５３位が該酵素のＤＵＢ活性に、そしてＩＦＮ応答を抑制するＥＡＶウイルスの能力に重要であることを実証した。ＰＲＲＳＶ株レリスタットにおける類似位置（Ｔｈｒ４７８、Ｖａｌ４７９およびＶａｌ５２０）ならびにＶＲ２３３２における類似位置（Ａｌａ４８６、Ｌｅｕ４８７およびＣｙｓ５２８）ならびにＤＵＢおよび脱ＩＳＧ化活性に重要であると特定された該領域内の隣接アミノ酸も、ＰＲＲＳＶにおける同一効果を達成するために突然変異されうる。ＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメインのＩｌｅ３１３位（レリスタットＰＬＰ２のＶａｌ４７９、ＶＲ２３３２  ＰＬＰ２のＬｅｕ４８７）およびＩｌｅ３５３位（レリスタットＰＬＰ２のＶａｌ５２０、ＶＲ２３３２  ＰＬＰ２のＣｙｓ５２８）がユビキチン相互作用表面の溶媒露出表面上に存在することを考慮すると、レリスタットまたはＶＲ２３３２  ＰＬＰ２ドメイン上のこれらの位置は、ＤＵＢおよび脱ＩＳＧ化活性を選択的に損なうために種々のアミノ酸へと突然変異されうるであろう。そのようなアミノ酸には、例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ（それに関して、ＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメイン内の３５３位においてそれが許容されうることを、本発明者らは既に実証している）が含まれる。ＥＡＶ  ＰＬＰ２のＴｈｒ３１２（レリスタットＰＬＰ２のＴｈｒ４７８、ＶＲ２３３２  ＰＬＰ２のＡｌａ４８６）の側鎖は堅固なループ内に詰め込まれており、したがって、この位置における突然変異はより保存的であることを要する。なぜなら、それらは該ループをミスフォールドしうるからである。この位置における可能な突然変異には、例えば、Ｇｌｙ（ＥＡＶ、レリスタットおよびＶＲ２３３２に関して）、ＡｌａまたはＳｅｒ（ＥＡＶおよびレリスタット）が含まれる。
【００５０】
この実施形態のより好ましい形態は、ＰＬＰ２ドメインにおける突然変異がコンセンサス位置Ｔ３１２、Ｉ３１３またはＩ３５３位に存在することを特徴とする、本発明の複製可能アルテリウイルスに関する。
【００５１】
この最も好ましい形態の特定の形態は、該アルテリウイルスがＥＡＶであり、ＰＬＰ２ドメインにおける突然変異がＴ３１２Ａ、Ｉ３１３Ｖ、Ｉ３５３Ａ、Ｉ３５３Ｒ、Ｉ３５３Ｓ、Ｉ３５３ＴまたはＩ３５３Ｗであることを特徴とする、本発明の複製可能アルテリウイルスに関する。
【００５２】
ユビキチンに直接結合するＰＬＰ２ドメインのユビキチン相互作用表面の残基（図３において実線の枠で囲まれているもの）に加えて、ユビキチン相互作用表面を構造的に支持し、この表面の形状をそれがユビキチン（およびＩＳＧ１５）の構造に相補的となるように定めることを補助する幾つかの残基が存在する。ＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメインの３Ｄ結晶構造ならびにＰＲＲＳＶ株レリスタットおよびＶＲ−２３３２からのＰＬＰ２ドメインの比較分子モデルに基づけば、ＥＡＶ  ＰＬＰ２の残基３０３−３０６（レリスタットＰＬＰ２の４７０−４７３およびＶＲ−２３３２  ＰＬＰ２の４７８−４８１）は、ヘリックス２をＰＬＰ２酵素のユビキチン相互作用表面の下に配置する際に重要な役割を果たす。この領域内の残基の突然変異は、ヘリックス２の適切な配置に影響を及ぼして、ユビキチン相互作用表面の歪み、そしてそれによるＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性の低下をもたらすために用いられうるであろう。これらの残基がＰＬＰ２活性部位から遠いことを考慮すると、それらの突然変異は、ウイルスポリタンパク質プロセシングに対する最小の影響を伴ってＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を低下させるために用いられうるであろう。
【００５３】
したがって、この実施形態のもう１つのより好ましい形態は、ＰＬＰ２ドメインにおける突然変異が、図３に示されているＥＡＶ番号付けによるコンセンサス位置３０３−３０６位のいずれかに位置することを特徴とする、本発明の複製可能アルテリウイルスに関する。この図においては、ＰＲＲＳＶレリスタットに関する該位置は４７０−４７３である。ＰＲＲＳＶ  ＶＲ−２３３２に関しては、該位置は４７８−４８１である。
【００５４】
同様に、ＥＡＶ  ＰＬＰ２の残基３４３−３４６（レリスタットＰＬＰ２の５１０−５１３およびＶＲ−２３３２  ＰＬＰ２の５１８−５２１）は、Ｕｂとの幾つかの中心的結合相互作用を生成する構造であるジンクフィンガーモチーフのヘリックス３を配置することを補助する。この領域内の残基の突然変異は、ウイルスポリタンパク質プロセシングに影響を及ぼすことなくＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を選択的に低下させるために、該ジンクフィンガーモチーフおよび周囲のユビキチン相互作用表面の位置を損なうように施されうるであろう。
【００５５】
したがって、再び、この実施形態のもう１つのより好ましい形態は、ＰＬＰ２ドメインにおける突然変異が、図３に示されているＥＡＶ番号付けによるコンセンサス位置３４３−３４６位に位置することを特徴とする、本発明の複製可能アルテリウイルスに関する。この図においては、ＰＲＲＳＶレリスタットに関する該位置は５１０−５１３である。ＰＲＲＳＶ  ＶＲ−２３３２に関しては、該位置は５１８−５２１である。
【００５６】
更に、ＥＡＶ  ＰＬＰ２残基Ｐｈｅ３５０（レリスタットＰＬＰ２のＶａｌ５１７およびＶＲ−２３３２  ＰＬＰ２のＶａｌ５２５）はジンクフィンガーのヘリックス３上に位置し、ａヘリックス２に対してヘリックス３を詰め込むことに関与する。ユビキチンへの結合におけるヘリックス３の重要性を考慮すると、ＥＡＶ  ＰＬＰ２残基Ｐｈｅ３５０（レリスタットＰＬＰ２のＶａｌ５１７およびＶＲ−２３３２  ＰＬＰ２のＶａｌ５２５）の突然変異は、ヘリックス３を置換してＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を選択的に低下させるために用いられうるであろう。
【００５７】
したがって、この実施形態の更にもう１つのより好ましい形態は、ＰＬＰ２ドメインにおける突然変異が、図３に示されているＥＡＶ番号付けによるコンセンサス位置３５０位に位置することを特徴とする、本発明の複製可能アルテリウイルスに関する。この図においては、ＰＲＲＳＶレリスタットに関する該位置は５１７である。ＰＲＲＳＶ  ＶＲ−２３３２に関しては、該位置は５２５である。
【００５８】
ＤＵＢおよび脱ＩＳＧ化活性に重要だとみなされる、ＰＬＰ２酵素の領域内に導入されうる残基の突然変異のタイプは、突然変異されるべき残基の局所環境に左右され、過度な負担を伴うことなく当業者により決定されうる。例えば、該残基がユビキチン相互作用表面の表面上に存在し、ユビキチンの疎水性領域に対して詰め込まれる疎水性側鎖（例えば、ロイシン）を有する場合、許容されうる突然変異には以下のものが含まれうるであろう：１）側鎖の完全な除去（すなわち、グリシンでの置換）、２）疎水性相互作用を静電的に破壊するための極性側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒなど）での置換、３）相互作用を立体的に破壊するための大きな嵩高い残基（例えば、Ｔｒｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）での置換。注：ＡｒｇおよびＬｙｓは共に極性かつ嵩高であり、これは相乗効果をもたらして、この位置における相互作用の相当な破壊を招くであろう。ＤＵＢおよび脱ＩＳＧ化活性の最高の低下をもたらすために、ユビキチン相互作用表面にわたるそのような突然変異の組合せが用いられうるであろう。
【００５９】
標的化残基が、埋もれた疎水性残基である場合には、置換はより保存的であることが必要とされる。すなわち、該置換は、好ましくは、ＤＵＢおよび脱ＩＳＧ化活性を低下させるためにユビキチン相互作用表面を歪めるために形状を改変しつつ全体的に適切なタンパク質フォールディングを維持する他の疎水性残基であるべきである。
【００６０】
標的化残基が、タンパク質安定性に要求される重要な静電的相互作用を形成する場合、この相互作用を保持させる置換のみがこの位置に導入されうる。
【００６１】
前記突然変異誘発指針の例は、ＥＡＶ  ＰＬＰ２酵素において施された置換に関して認められうる（表１）。例えば、Ｔｈｒ３１２の側鎖は堅固なループ内に詰め込まれており、この場合、３１２位の追加的な嵩高さは該ループの形状を歪める可能性が高く、恐らくタンパク質ミスフォールディングを引き起こす。実際、Ｔ３１２Ａは許容されたが、Ｔ３１２ＬおよびＴ３１２Ｖは該ウイルスに対して致死的であった。Ｔ３１２Ｌはより嵩高い側鎖を導入し、これは恐らくループ構造を破壊し、したがって該ウイルスに致死的であり、一方、Ｔ３１２Ｖは、同様にウイルスの生存性に必要であるらしい極性ヒドロキシル基を除去する。これとは対照的に、Ｉｌｅ３５３の側鎖はユビキチン相互作用表面上に完全に露出する。言い換えると、この残基の側鎖はＰＬＰ２構造のいずれの部分に対しても詰め込まれず、またはＰＬＰ２構造のいずれの部分をも支持せず、したがって、この位置において調べられた全ての側鎖置換が許容された（Ｔ３５３Ａｌａ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ）。
【００６２】
更に、ＥＡＶ  ＰＬＰ２結晶構造は、Ｓｕｎら（２０１０）によりＰＬＰ２ドメインに施された置換の結果を説明するために今や使用されうる。例えば、Ｃｙｓ４２９ＡｌａおよびＨｉｓ４９８Ａｌａ置換は生存不能ウイルスを与えた。なぜなら、これらの残基は活性部位の触媒残基を含むからである。しかし、Ａｓｐ４５８Ａｌａは、生存可能ウイルスを産生するが、ＮＦ−ＫＢ活性化に全く影響を及ぼさなかった。なぜなら、ＥＡＶ  ＰＬＰ２構造によれば、この位置の主鎖カルボニル基のみがユビキチンと相互作用するからである。したがって、恐らくプロリンを除いて、この位置の側鎖置換はＰＬＰ２の触媒機能に影響を及ぼさないであろう。しかし、Ｓｅｒ４６２Ａｌａも、Ｕｂ依存的ＮＦκＢ活性化を抑制する若干低下した能力（２倍）を有する生存可能ウイルスを与えた。ＥＡＶ  ＰＬＰ２構造に基づけば、この位置の極性残基、例えばＳｅｒ（ＳＤ−０１８０  ＰＬＰ２）またはＡｓｐ（ＥＡＶ  ＰＬＰ２）はユビキチンのＡｒｇ７４の水素結合距離内に存在し、これはＰＬＰ２活性部位に非常に近い。ＤＵＢ活性を抑制する、この部位における突然変異は、Ａｓｐ４５８Ａｌａ突然変異体と比較された場合のＳｅｒ４６２Ａｌａのウイルス力価の低下により示されるとおり、ポリタンパク質プロセシングをも抑制しうるであろう。Ｓｕｎらにより施された第３の生存可能突然変異（Ａｓｐ４６５Ａｌａ）は、該残基がユビキチンと直接的に相互作用することを可能にしない位置におけるヘリックス２内に存在する。この残基は、ＰＬＰ２ドメインの３ヘリックスバンドル内に相互作用を詰め込むのに重要であるようであり、したがって、この突然変異はＮＦκＢ活性化に影響を及ぼさなかったものの、それはウイルス力価に最大の負の影響を及ぼした。これは恐らく、該ヘリックスバンドルの破壊がＰＬＰ２ドメインの全体的な安定性に悪影響を及ぼすからであろう。
【００６３】
側鎖置換（部位特異的突然変異誘発により施される点突然変異）に加えて、ユビキチン相互作用表面を含むＰＬＰ２ドメインの領域内の残基の欠失および／または挿入が、ＰＬＰ２ドメインのＤＵＢおよび脱ＩＳＧ化活性を特異的に破壊するために用いられうるであろう。例えば、ＰＲＲＳＶ株レリスタットの配列４７９−４８４（ＶＲ−２３３２の４８７−４９２、ＥＡＶの３１３−３１８）内の追加的残基の挿入はユビキチン相互作用表面における酵素表面上に追加的な嵩高さを導入し、それにより、ユビキチンおよびＩＳＧ１５結合を破壊するが、活性部位領域には影響を及ぼさず、したがってＰＬＰ２ドメインによるポリタンパク質プロセシングに影響を及ぼさないであろう。ユビキチン相互作用表面を歪めるために残基を挿入または欠失するこの方法は、突然変異に適していると前記で示されているＰＬＰ２ドメイン内の任意の部位において用いられうるであろう。好ましくは、残基を挿入または欠失する方法は、図３に示されているＥＡＶ番号付けによるコンセンサス位置２９６−２９７位および／または３０３−３０６位および／または３０９−３１９位および／または３２６−３３０位および／または３４３−３５５位のいずれかにおけるＰＬＰ２ドメインに適用される。より好ましくは、この方法は、図３において実線の枠で囲まれたＰＬＰ２ドメインの領域に適用される。
【００６４】
自然ランダム突然変異は自然界で生じることが一般に公知であり、これは、本発明のウイルスを得るために故意に施された突然変異が更なる自然突然変異を受けうることを意味する。最悪の場合には、この突然変異は、本発明のウイルスから、ＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性の低下をもはや示さないウイルスへの復帰を招く。ＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性の低下を招く突然変異が施されうる幾つかの位置が今や特定されていることは本発明の利点の１つである。これは、特定されている領域において、１つの突然変異だけでなく、２以上の突然変異を施すことが今や可能であることを意味する。そのような突然変異体は復帰の傾向が遥かに低い。なぜなら、復帰突然変異が生じる既に低い可能性がより一層低減されているからである。
【００６５】
したがって、本発明の最も好ましい複製可能アルテリウイルスは少なくとも２つの突然変異を含み、それらのそれぞれはＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性の低下に寄与する。一緒になって単一アミノ酸における突然変異を招くヌクレオチドレベルでの２つの連続的な突然変異は、この点において、少なくとも２つの突然変異を含む本発明の複製可能アルテリウイルスの定義に含まれるとみなされることが強調される。そのような突然変異の一例は前記のＥＡＶ  Ｉ３５３Ｒ突然変異体である。
【００６６】
本発明のウイルスを与える突然変異を施すための３Ｄ構造の情報の利用方法の単なる一例に過ぎないが、ＩＳＧ１５に結合したＰＬＰ２ドメインの比較分子モデル（図５Ｃ、Ｄ）および結晶構造（図５Ａ、Ｂ）に基づいて、以下のことが理解されうる。Ｉｌｅ３５３は亜鉛配位部位のＣ４（Ｃｙｓ３５４）の隣のヘリックスα３のＣ末端に位置する。それはＵｂのＩｌｅ４４パッチ内に直接的に突出しており、この場所において、それはＵｂのＩｌｅ４４、Ｖａｌ７０およびＬｅｕ８０との広範なファンデルワールス相互作用を引き起こす。Ｔｈｒ３１２およびＩｌｅ３１３は、活性部位に、より接近して位置し、この場所において、それらはＵｂの残基Ｌｅｕ８、Ｌｅｕ７１およびＬｅｕ７３との追加的な疎水性相互作用を引き起こす。Ｔｈｒ３１２はＩＳＧ１５のＡｓｎ８９との決定的に重要な水素結合相互作用を引き起こす（図Ｄ）。
【００６７】
この情報に基づいて、ＰＬＰ２ドメインのＵｂ結合部位内の３つの鍵位置（Ｉｌｅ３５３、Ｔｈｒ３１２およびＩｌｅ３１３）において、種々の単一、二重および三重突然変異が今や施された。
【００６８】
施された種々の突然変異の概観を表１に示す。
【表１】
2015532269.tif 000003
【００６９】
これらの突然変異を含有する組換えウイルスでの感染実験に進む前に、本発明者らは、ＰＬＰ２突然変異体の、より速いスクリーニングを可能にする、２つの利用し易いインビトロ試験を用いた。これらの２つの試験は後記に記載されており、詳細は実施例に記載されており、結果は表１に示されている。
【００７０】
第１試験は、突然変異ウイルスの複製能を試験するために、リバースジェネティクスを用いてＰＬＰ２ドメイン内に突然変異を含有する組換え突然変異ウイルスを作成し、ついでそのウイルスを細胞培養系に加える必要は必ずしもないことに基づく。これらのＰＬＰ２実験の場合の複製能は、基本的には、ｎｓｐ２／ｎｓｐ３切断を突然変異体ＰＬＰ２ドメインが行う能力に基づくものであり、これはインビトロ系で容易に試験されうる。本発明者らはＰＬＰ２ドメインの異所性発現およびインビトロアッセイを用いて、ＥＡＶレプリカーゼポリタンパク質プロセシングおよびＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性に対する前記位置における種々の突然変異の効果の特徴を明らかにした。この目的のために、Ｎ末端ＨＡタグを含有する自己切断性ｎｓｐ２−３ポリタンパク質をコードする哺乳類発現ベクター内に突然変異を導入した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における野生型ｎｓｐ２−３の発現に際して、ＰＬＰ２はｎｓｐ２／ｎｓｐ３結合の切断をもたらした（図６Ａ）。予想どおり、ＰＬＰ２活性部位突然変異体（Ｃ２７０Ａ／Ｈ３３２Ａ）はｎｓｐ２／ｎｓｐ３部位のいずれのプロセシングをも示さず、ｎｓｐ２−３前駆体のみを与えた（図６Ａ）。Ｕｂ結合部位がＴｈｒ３１２またはＩｌｅ３５３の置換により標的化された７個の単一部位突然変異体は野生型レベルのｎｓｐ２／ｎｓｐ３切断を示した。このことは、ポリタンパク質プロセシングがこれらの突然変異により顕著には影響されないことを示唆している（図６Ａ）。また、Ｔｈｒ３１２、Ｉｌｅ３１３およびＩｌｅ３５３位における突然変異の組合せを試験したところ、実質的に類似した結果が得られた（図６Ａ）。より長い曝露時間は野生型ＰＬＰ２の場合でさえも幾らかのｎｓｐ２−３前駆体タンパク質を示したが、この量は、２つ又は３つの突然変異が組合された場合に、ほんの僅か増加しただけであった（図７Ｂ、８）。
【００７１】
第２試験は、ＰＬＰ２ドメイン内に突然変異を有する複製可能組換えアルテリウイルスを製造することは、そのような突然変異ＰＬＰ２のＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性の低下を試験するのに必ずしも必要でないことに基づく。ＰＬＰ２  ＤＵＢ活性に対する突然変異の効果は、ＦＬＡＧタグ付きＵｂを発現するプラスミドと組合された野生型または突然変異ＰＬＰ２を含有するｎｓｐ２−３をコードするプラスミドで哺乳類細胞をトランスフェクトすることにより試験されうる。ＦＬＡＧ−Ｕｂの異所性発現は広範囲の細胞標的のＦＬＡＧタグ付きユビキチン化を引き起こし、これは、抗ＦＬＡＧ抗体を使用するウエスタンブロット分析により可視化されうる。予想どおり、野生型ＰＬＰ２の発現はＵｂ−コンジュゲートの蓄積を大きく低減したが、該活性部位突然変異体の発現は無視しうる効果しか示さなかった（図６Ｂ）。ＤＵＢ活性の最も顕著な低減を示すＰＬＰ２突然変異体の選択物を図６Ｂに示す。これらのＵｂ結合部位突然変異体は種々の度合のＤＵＢ活性を示し、表現型は野生型と活性部位突然変異体との間の範囲のものであった（図６Ｂ）。類似実験を用いて、ＰＬＰ２の脱ＩＳＧ化活性に対するこれらの突然変異体の効果を評価した。このアッセイのために、ＩＳＧ１５およびＥ１（ＵｂＥ１Ｌ）およびＥ２（ＵｂｃＭ８）酵素（そのコンジュゲート化に必須のもの）をコードするプラスミドの組合せで哺乳類細胞をコトランスフェクトして、抗ＩＳＧ１５抗体を使用してウエスタンブロット上で可視化されうる細胞タンパク質の集団のＩＳＧ化を生成させた（図８）。再び、野生型ＰＬＰ２の発現はＩＳＧ化タンパク質の蓄積を大きく低減したが（図８）、該活性部位突然変異体の発現はそうではなかった（図８）。ＰＬＰ２ドメインの脱ＩＳＧ化活性に対する突然変異の効果はＤＵＢ活性に対するそれらの効果より控えめであることに注目すべきである（図８）。
【００７２】
Ｕｂ、ＩＳＧ１５およびＲＬＲＧＧ−ペプチド基質（ＰＬＰ２の活性部位に進入するＵｂまたはＩＳＧ１５のＣ末端尾部に相当するもの）に対する活性に対するＰＬＰ２における突然変異の効果をより詳細に分析するために、インビトロアッセイが行われる。このアッセイのために、本発明者らは突変異体Ｉ３５３ＲおよびＴ３１２Ａ／Ｉ３１３Ｖ／Ｉ３５３Ｒに焦点を合わせた。なぜなら、これらは、細胞培養に基づくアッセイにおいてＤＵＢ活性に対する顕著な効果を示し、該活性部位突然変異体に類似したＩＦＮ−βプロモーター活性の抑制のレベルを示し（後記）、ＢＨＫ−２１細胞内への該突然変異ウイルスの添加に際して有効な力価を示した（後記）からである。
【００７３】
ペプチダーゼ酵素の速度論はミカエリス−メンテン（ＭＭ）式：
【数１】
2015532269.tif 000004
【００７４】
に従う。式中、［Ｐ］は産物の濃度であり、ｔは時間であり、［Ｓ］は基質の濃度であり、［Ｅ］は酵素の全濃度であり、ｋｃａｔおよびＫｍはミカエリスパラメータである。酵素活性に対するアミノ酸点突然変異の効果は、それらが酵素の特異性にどのような影響を及ぼすか（比ｋｃａｔ／Ｋｍにより示される）により最も良く示される。通常、ｋｃａｔおよびＫｍパラメータは本格的なミカエリス−メンテン分析から別々に得られる。しかし、比ｋｃａｔ／Ｋｍは、低い基質濃度におけるＭＭ式の積分：
【数２】
2015532269.tif 000005
【００７５】
からも、独立して且つ正確に得られうる。前記式は、蛍光標識基質ユビキチン−アミノメチルクマリン（Ｕｂ−ＡＭＣ）、ＩＳＧ１５−アミノメチルクマリン（ＩＳＧ１５−ＡＭＣ）またはこれらの基質のＣ末端ペプチドモチーフＲＬＲＧＧ−ＡＭＣ（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）を使用してインビトロのＰＬＰ２活性を定量するために用いられうる。ＰＬＰ２はＡＭＣをこれらの基質から除去する。遊離したＡＭＣは、それがＵｂ、ＩＳＧ１５またはＲＬＲＧＧペプチドに結合している場合より遥かに高い蛍光量子収率を示し、したがって、それは、ＰＬＰ２活性に比例した蛍光シグナルを与える。Ｕｂ−ＡＭＣまたはＩＳＧ１５−ＡＭＣ（これらはユビキチン相互作用表面を要する）に対するＰＬＰ２突然変異体の活性をＲＬＲＧＧ−ＡＭＣ（これは活性部位領域のみに結合する）に対するそれらの活性と比較することにより、ＤＵＢまたは脱ＩＳＧ化活性の選択的低下を示すＰＬＰ２突然変異体が特定されうる。
【００７６】
Ｕｂ−ＡＭＣおよびＩＳＧ１５−ＡＭＣは比較的低い水溶性を示すため、完全なＭＭ分析は困難である。あるいは、式１は、溶解度の問題を解決するための、そして迅速かつ信頼しうる様態でｋｃａｔ／Ｋｍを決定するための有用な方法を提供する。産物の蛍光はその濃度に比例するため、経時的な産物蛍光の放出は、低い基質濃度における式−１の以下の変形：
【数３】
2015532269.tif 000006
【００７７】
に従い進行する。式中、Ｆは、測定された蛍光であり、Ａ∞は一定パラメータである。したがって、Ｋｍより有意に低い濃度でＡＭＣ標識基質を含有する溶液にＰＬＰ２が加えられた後で放出された蛍光の時間−プロファイルが、ｋｃａｔ／Ｋｍを決定するために用いられうる。
【００７８】
実施例は、非構造タンパク質ｎｓｐ２のＰＬＰ２ドメインにおける突然変異により低下したＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を有する複製可能アルテリウイルスの十分な例を示している。
【００７９】
ｎｓｐ２のＰＬＰ２ドメインにおける突然変異により低下したＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を有する追加的なアルテリウイルスを製造することを望む当業者は、ＰＬＰ２突然変異体の迅速なスクリーニングのために、前記のとおりに、そして実施例に詳細に記載されているとおりに、ｎｓｐ２／ｎｓｐ３プロテアーゼ活性およびＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性を測定するために前記のインビトロ試験を用いることが可能である。
【００８０】
前記のとおり、ユビキチンに結合したＰＬＰ２ドメインの結晶構造は、そのような結晶が今や初めて安定な形態で調製可能となったことにより、決定可能であろう。そのような結晶の形成は、ＰＬＰ２−ユビキチン複合体を形成させるためにＰＬＰ２ドメインへのユビキチンの共有結合を可能にする条件下、ＰＬＰ２ドメインを含む精製ｎｓｐ２断片とユビキチンを混合することにより可能であった。ＰＬＰ２ドメインはドメイン自体（例えば、ＥＡＶ  ｎｓｐの２２６１−３９２位のアミノ酸）であることが可能であり、あるいはそれはＰＬＰ２ドメインと、ｎｓｐ２タンパク質の他の部分とを含みうる。
【００８１】
ＰＬＰ２−ＩＳＧ１５複合体を形成させるためにＰＬＰ２ドメインへのＩＳＧ１５の共有結合を可能にする条件下、ＰＬＰ２ドメインを含む精製ｎｓｐ２断片とＩＳＧ１５を混合することにより、そのような結晶の形成のために同じアプローチが適用される。
【００８２】
したがって、本発明のもう１つの実施形態は、アルテリウイルスのｎｓｐ２の少なくともＰＬＰ２ドメインとユビキチンとを含むＰＬＰ２−ユビキチン複合体であって、該ＰＬＰ２ドメインが該ユビキチンに共有結合しているＰＬＰ２−ユビキチン複合体、またはアルテリウイルスのｎｓｐ２の少なくともＰＬＰ２ドメインとＩＳＧ１５とを含むＰＬＰ２−ＩＳＧ１５複合体であって、該ＰＬＰ２ドメインが該ＩＳＧ１５に共有結合しているＰＬＰ２−ＩＳＧ１５複合体に関する。この実施形態の好ましい形態においては、該アルテリウイルスは、ＥＡＶおよびＰＲＲＳＶからなるウイルスの群から選択される。
【００８３】
本発明の更にもう１つの実施形態は、アルテリウイルス感染に対する哺乳動物の防御のための生弱毒化ワクチンに関するものであり、そのようなワクチンは、本発明の複製可能アルテリウイルスと医薬上許容される担体とを含むことを特徴とする。
【００８４】
本発明の生弱毒化ワクチンを製造するための出発物質として、野生型または生弱毒化ウイルス株が使用されうる。例えば種々の細胞系にわたる連続継代によるウイルスの弱毒化のための方法が当技術分野において詳細に記載されている。それらは当業者によく知られている。
【００８５】
しかし、弱毒化ウイルス株から出発することを望む、本発明のＰＲＲＳＶまたはＥＡＶに対するワクチンを要する当業者の場合、原則として、新規生弱毒化アルテリウイルスを開発する必要はない。生弱毒化ＰＲＲＳＶおよびＥＡＶは文献に記載されており、それらは商業的に入手可能である。したがって、そのようなウイルスは、本発明の生弱毒化ワクチンを開発することを望む当業者にとって非常に好適な出発物質となりうる。
【００８６】
商業的に入手可能な生修飾ＰＲＲＳＶ−ワクチン、それらの特性およびそれらの製造業者の概要は、とりわけ、Ｍｕｒｔａｕｇｈ，Ｍ．Ｐ．およびＧｅｎｚｏｗ，Ｍ．（Ｖａｃｃｉｎｅ  ２９：８１９２−８２０４（２０１１））に記載されている。
【００８７】
生修飾ＥＡＶ−ワクチンの概要は、とりわけ、ＭｃＣｏｌｌｕｍ，Ｗ．Ｈ．（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４７：１９３１−１９３４（１９８６））およびＳｕｍｍｅｒｓ−ｌａｗｙｅｒ，Ｋ．Ａ．ら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｑｕｉｎｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  ３１：１２９−１３８（２０１１））に記載されている。生弱毒化ＥＡＶウイルスは、とりわけ、米国において認可されている。
【００８８】
通常、本発明のワクチンは非経口経路により投与される。好ましくは、該ワクチンは筋肉内に投与される。ワクチンにおける本発明のウイルスの適当な量は、使用されるウイルスの弱毒化のレベルに応じて、１０２〜１０８  ＴＣＩＤ５０の範囲となろう。ＥＡＶおよびＰＲＲＳＶワクチン接種に関する前記で引用されている文献および当技術分野における知見は、必要なウイルスの量を決定するための十分な指針を当業者に示す。ワクチン株が、弱毒化欠失を含む既存の商業的に入手可能なウイルス株である場合、製造業者の説明が、使用されるウイルスの量に関する良好な指針を示すであろう。大雑把に言うと、生弱毒化ウイルスの場合、１０４〜１０６  ＴＣＩＤ５０の量が非常に好適なウイルス量とみなされるであろう。
【００８９】
アルテリウイルスにより引き起こされる疾患のほかに、ウマおよびブタは、しばしば、種々の他のウイルス疾患、寄生生物疾患および細菌疾患に罹患する。この理由により、それらは、しばしば、そのような疾患に対してワクチン接種される。したがって、動物愛護、使いやすさおよび経費節約の観点から、幾つかのワクチンを組合せ、そのような組合せワクチンを１回の単一投与において投与することには、もっともな理由がある。
【００９０】
したがって、この実施形態の好ましい形態は、ワクチン接種される動物に対して病原性であるウイルスまたは微生物の追加的な免疫原、該免疫原に対する抗体、あるいは該ウイルスまたは微生物の免疫原をコードする遺伝情報を含むことを特徴とする、本発明のワクチンに関する。
【００９１】
ブタに対して病原性であるウイルス／微生物の最も頻繁に見られる例としては、ブラキスピラ・ヒオジセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、アフリカブタコレラウイルス、ニパウイルス、ブタサーコウイルス、ブタトルクテノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エリシペロ・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびアクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が挙げられる。したがって、この実施形態のより好ましい形態は、ブタに対して病原性であるウイルスまたは微生物が、ブラキスピラ・ヒオジセンテリエ（Ｂｒａｃｈｙｓｐｉｒａ  ｈｙｏｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、アフリカブタコレラウイルス、ニパウイルス、ブタサーコウイルス、ブタトルクテノウイルス、仮性狂犬病ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタ流行性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、口蹄疫ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エリシペロ・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、ヘモフィルス・パラスイス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）およびアクチノバチルス・プルロニューモニエ（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からなる群から選択されることを特徴とする、本発明のワクチンに関する。
【００９２】
ウマに対して病原性であるウイルス／微生物の最も頻繁に見られる例としては、ウマインフルエンザウイルス、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ウマヘルペスウイルス１およびウマヘルペスウイルス４が挙げられる。したがって、この実施形態の同等に好ましい形態は、ウマに対して病原性であるウイルスまたは微生物が、ウマインフルエンザウイルス、クロストリジウム・テタニ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ウマヘルペスウイルス１およびウマヘルペスウイルス４からなる群から選択されることを特徴とする、本発明のワクチンに関する。
【００９３】
医薬上許容される担体は安定剤、希釈剤およびバッファーであることが可能であり、あるいは安定剤、希釈剤およびバッファーを含みうる。適当な安定剤としては、例えばＳＰＧＡ、炭水化物（例えば、乾燥乳、血清アルブミンまたはカゼイン）またはそれらの分解産物が挙げられる。適当なバッファーとしては、例えばリン酸アルカリ金属が挙げられる。希釈剤には、水、水性バッファー（例えば、緩衝食塩水）、アルコールおよびポリオール（例えば、グリセロール）が含まれる。
【００９４】
ワクチン全般、特に、生弱毒化ウイルスを含むワクチンは低温で保存される必要があり、あるいはそれらは凍結乾燥形態でなければならない。凍結乾燥ワクチンは適度な冷却条件下または更には室温で維持されうる。しばしば、該ワクチンは、例えば、分解しやすいタンパク質が分解するのを防ぐために、該ワクチンの貯蔵寿命を延長させるために、または凍結乾燥効率を改善するために、安定剤と混合される。有用な安定剤としては、とりわけ、ＳＰＧＡ、炭水化物、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デンプン、スクロース、デキストランまたはグルコース、タンパク質、例えばアルブミンまたはカゼインあるいはそれらの分解産物、およびバッファー、例えばリン酸アルカリ金属が挙げられる。したがって、好ましくは、本発明のワクチンは凍結乾燥形態である。また、該ワクチンは、生理的に許容される希釈剤に懸濁されうる。そのようなバッファーは、例えば無菌水、バッファーなどでありうる。言うまでもなく、ウイルスを乳化または安定化するための化合物および希釈剤も本発明において具体化されている。
【００９５】
本発明の更にもう１つの実施形態は、医薬としての使用のための、本発明の複製可能アルテリウイルスに関する。
【００９６】
本発明の更にもう１つの実施形態は、ワクチンにおける使用のための、本発明の複製可能アルテリウイルスに関する。
【００９７】
そして本発明の更にもう１つの実施形態は、哺乳動物におけるアルテリウイルス感染の予防における使用のための、本発明の複製可能アルテリウイルスに関する。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ＥＡＶ  ＰＬＰ２−Ｕｂ複合体の構造ならびに酵母ＯＴＵ１およびＣＣＨＦＶ  ＯＴＵとの重ね合せ。Ａ）Ｕｂ（オレンジ色）に結合したＥＡＶ  ＰＬＰ２（紫色）の構造。Ｂ）Ｃ４ジンクフィンガーモチーフの電子密度。青色の密度は、１．０σで輪郭形成された最尤加重２Ｆｏ−Ｆｃ地図である。亜鉛原子（灰色）の周囲の緑色の密度は、５．０σで輪郭形成されたＦｏ−Ｆｃ省略（ｏｍｉｔ）地図である。Ｃ）ＥＡＶ  ＰＬＰ２活性部位の触媒三残基。青色の密度は、１．０σで輪郭形成された最尤加重２Ｆｏ−Ｆｃ地図である。システイン求核基（Ｃｙｓ２７０）は、ＵｂのＧｌｙ７６に取って代わった３ＮＣリンカーを介してＵｂに共有結合している。Ａｓｎ２６３はＨｉｓ３３２のイミダゾール環に向いており、２つの交互立体配座で存在する。Ｄ）ＥＡＶ  ＰＬＰ２（紫色）、ＣＣＨＦＶ  ＯＴＵ（緑色）および酵母ＯＴＵ１（赤色）の重ね合せ。ＰＬＰ２は２つの中心ヘリックスおよび四本鎖ベータシートの保存コアをＣＣＨＦＶ  ＯＴＵおよび酵母ＯＴＵ１と共有している。Ｅ）Ｕｂと複合体形成したＣＣＨＦＶ  ＯＴＵおよびＥＡＶ  ＰＬＰ２の重ね合せ。両方の酵素は類似の配向でＵｂをつかんでおり、ここで、ＥＡＶ  ＰＬＰ２のＣ４ジンクフィンガーモチーフがＣＣＨＦＶ  ＯＴＵのβヘアピンに取って代わっている。ＥＡＶ  ＰＬＰ２、ＣＣＨＦＶ  ＯＴＵおよび酵母ＯＴＵ１のトポロジー概要図が、それぞれ、パネルＦ、ＧおよびＨに示されている。これらの酵素の間で保存された領域が線（点線の枠）で囲まれている。ＥＡＶ  ＰＬＰ２内の亜鉛原子に配位している４個のシステイン残基が黄色の円として示されている。構造イメージは、ＰｙＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ，２００２）を使用して作製した。
【図２】ＥＡＶ  ＰＬＰ２構造（ＰＩＳＡ分析に基づくもの）。灰色領域は、ＤＵＢおよびＩＳＧ化活性を選択的に破壊するように標的化されるべきＰＬＰ２酵素上のユビキチン相互作用表面（６１７平方オングストローム）を示す。酵素活性部位内の触媒求核基システイン２７０（Ｃ２７０）はユビキチンのＣ末端に共有結合しており、触媒反応のアシル−酵素中間段階に類似している。
【図３】ＥＡＶおよびＰＲＲＳ配列の多配列アライメント。この図は、アルテリウイルスＰＬＰ２ドメインの構造的に機能的なアライメントを表す。コンセンサス位置を示すためにＥＡＶ番号付けが用いられている（例えば、ＰＲＲＳＶレリスタットにおける「Ｔ４７８位」は「コンセンサス位置Ｔ３１２位」と同じである）。
【図４】Ｕｂに結合したアルテリウイルスＰＬＰ２ドメインの結晶構造に基づくＰＲＲＳＶ  ＰＬＰ２ドメインの構造モデル。Ａ）ＰＲＲＳＶ株レリスタットからのユビキチンに結合したＰＬＰ２ドメインの分子モデル。Ｂ）ＰＲＲＳＶ株ＶＲ−２３３２からのユビキチンに結合したＰＬＰ２ドメインの分子モデル。Ｃ）ＥＡＶ株ブシルスからのユビキチンに結合したＰＬＰ２ドメインの分子モデル。Ｄ）ＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメインの残基Ｔｈｒ３１２、Ｉｌｅ３１３、Ｉｌｅ３５３の代わりに存在するＰＲＲＳＶ  ＰＬＰ２残基を示す表。Ｅ）ＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメインの残基Ｔｈｒ３１２、Ｉｌｅ３１３、Ｉｌｅ３５３の代わりに存在する２つの他の株のＰＲＲＳＶ  ＰＬＰ２残基を示す表。
【図５】ＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメインのＵｂ結合部位およびＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメインに結合したＩＳＧ１５の比較モデル。Ａ）Ｕｂ（薄灰色）に結合したＥＡＶ  ＰＬＰ２（濃灰色）であり、６１２平方オングストロームのＵｂ結合部位が表面として示されている。ＤＵＢおよび脱ＩＳＧ化活性を破壊するための突然変異分析のために標的化される残基が矢印により示されている。Ｂ）ＥＡＶ  ＰＬＰ２−Ｕｂ結合境界の拡大図。ＥＡＶ  ＰＬＰ２残基Ｉｌｅ３５３はＵｂのＩｌｅ４４、Ｌｅｕ８およびＶａｌ７０とファンデルワールス相互作用を形成し、一方、残基Ｔｈｒ３１２およびＩｌｅ３１３は、ＰＬＰ２の活性部位により近いＵｂ上の疎水性パッチ（残基Ｌｅｕ８、Ｖａｌ７０、Ｌｅｕ７１およびＩｌｅ７３により形成される）と相互作用する。Ｃ）ＩＳＧ１５に結合したＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメインの比較分子モデル。該モデルは、（ＰＤＢ  １Ｚ２Ｍからの）ＩＳＧ１５のＣ末端Ｕｂ様ドメインをＥＡＶ  ＰＬＰ２−Ｕｂ複合体のＵｂ分子上に重ね合せることにより構築された。該モデルから、ＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメインは、ＩＳＧ１５上に存在する（Ｕｂ内には存在しない）追加的な嵩高物を収容しうるように、ＩＳＧ１５に結合することが予想される。
【図６】ＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメインのポリタンパク質プロセシングおよびＤＵＢ活性の脱共役。Ａ）野生型または突然変異ＰＬＰ２を含有するｎｓｐ２−３をコードするプラスミドでＨＥＫ２９３Ｔをトランスフェクトした。３７℃で１６時間の後、細胞を細胞溶解させ、結果をウエスタンブロットにより分析した。野生型ＰＬＰ２によるｎｓｐ２／３結合のタンパク質分解プロセシングはｎｓｐ２−３前駆体からのＨＡタグ付きｎｓｐ２の遊離をもたらした。触媒的に不活性である突然変異体Ｃ２７０Ａ／Ｈ３３２Ａ（ｖａｎ  Ｋａｓｔｅｒｅｎら，２０１２）の場合を除き、全ての突然変異体がｎｓｐ２／３切断部位の効率的プロセシングを示した。Ｂ）野生型または突然変異ＰＬＰ２およびＦＬＡＧ−Ｕｂを含有するｎｓｐ２−３をコードするプラスミドの組合せでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。ＦＬＡＧ−Ｕｂの発現は広範囲の細胞タンパク質のＦＬＡＧタグ付きユビキチン化をもたらし、これは、抗ＦＬＡＧ抗体を使用してウエスタンブロット上で可視化されうる。野生型ＰＬＰ２の発現はユビキチン化を大きく低下させたが、Ｃ２７０Ａ／Ｈ３３２Ａ突然変異体の発現はそうではなかった。Ｕｂ結合部位突然変異体は種々の度合のＤＵＢ活性を示し、表現型は野生型と活性部位突然変異体との間の範囲のものであった。
【図７】ＰＬＰ２  Ｕｂ結合部位突然変異はＩＦＮ−βプロモーター活性化の抑制を低減する。Ａ）ＩＦＮβプロモーター活性の抑制に対する種々のＰＬＰ２  Ｕｂ結合部位突然変異の効果を評価するための、ルシフェラーゼに基づくレポーターアッセイ。ＩＦＮβプロモーターの制御下のホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、ＲＩＧ−Ｉ（２ＣＡＲＤ）および野生型または突然変異ＰＬＰ２を含有するｎｓｐ２−３をコードするプラスミドの組合せでＨＥＫ２９３Ｔ細胞を四重にトランスフェクトした。野生型ＰＬＰ２はＩＦＮβプロモーターの活性を強力に抑制したが、該活性部位突然変異体は僅かな抑制活性を示したに過ぎなかった。Ｕｂ結合部位突然変異体は種々の度合の抑制を示した。データを３つの独立した実験において得、独立両側スチューデントｔ検定を用いて分析した。エラーバーは標準偏差を表し、ｐ値は野生型に対するものである。Ｂ）Ａに記載されている３つの実験のそれぞれにおける残りのウェルから得られたライセートを１：１：１の比で混合し、ｎｓｐ２−３の発現のためにウエスタンブロットにより分析した。
【図８】野生型または突然変異ＰＬＰ２を含有するｎｓｐ２−３、ＩＳＧ１５ならびにＥ１（ＵｂＥ１Ｌ）およびＥ２（ＵｂｃＭ８）酵素をコードするプラスミドの組合せでＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトした。ＩＳＧ１５ならびにそのＥ１およびＥ２酵素の発現は細胞タンパク質の集団のＩＳＧ化をもたらし、これは、抗ＩＳＧ１５抗体を使用してウエスタンブロット上で可視化されうる。野生型ＰＬＰ２の発現はＩＳＧ化を低減したが、該活性部位突然変異体の発現はそうではなかった。Ｕｂ結合部位突然変異は脱ＩＳＧ化活性に軽度の効果を及ぼしたに過ぎなかった。
【図９】定量的リアルタイムＰＣＲ。この図は、ウイルス増殖（図９ＢにおけるＥＡＶゲノムの定量）に対する及びＤＵＢ／脱ＩＳＧ化（図９Ａにおける感染の結果としてのＩＦＮベータｍＲＮＡ誘導の定量によりアッセイされ、それはＤＵＢ−ＩＳＧ化活性に直接的に相関（反比例）する）に対するＰＬＰ２ドメインにおける幾つかの突然変異の効果を示す。
【図１０】ＥＡＶ−ｗｔ、ＥＡＶ突然変異株ＥＡＶ−ＰＬＰ２でワクチン接種された動物および非ワクチン接種動物の、チャレンジの前および後の平均体温。
【図１１】ＥＡＶ−ｗｔ、ＥＡＶ突然変異株ＥＡＶ−ＰＬＰ２でワクチン接種された動物および非ワクチン接種動物の、チャレンジの前および後の平均ＥＡＶウイルス中和抗体価。
【００９９】
実施例
実施例１
プラスミド、細胞および抗体
ＥＡＶ  ＰＬＰ２の細菌発現のために、ＥＡＶ  ｐｐ１ａの残基２６１−３９２とインフレームＣ末端ＨＩＳ６精製タグとをコードするｃＤＮＡ断片をｐＡＳＫ３ベクター（Ｇｏｈａｒａら，１９９９）内のＵｂ融合相手の下流に挿入して、プラスミドｐＡＳＫ３−ｅＰＬＰ２を得た。ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内のＮ末端ＨＡタグに対してインフレームであるＥＡＶ  ｐｐ１ａの残基２６１−１０６４をクローニングすることにより、ＥＡＶ  ｎｓｐ２−３ポリタンパク質をコードする哺乳類発現構築物を作製した。全ての突然変異体を、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用する部位特異的突然変異誘発により操作した。プライマー配列は請求に応じて入手可能である。全ての構築物は配列分析により検証された。以下の哺乳類発現プラスミドは他の箇所に記載されている：ｐＬｕｃ−ＩＦＮ−β（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄら，２００３）、ｐＲＬ−ＴＫ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＥＢＧ−ＲＩＧ−Ｉ（２ＣＡＲＤ）（Ｇａｃｋら，２００７）、ｐｃＤＮＡ−ｅＧＦＰ（ｖａｎ  Ｋａｓｔｅｒｅｎら，２０１２）、ｐＣＭＶ−ＦＬＡＧ−Ｕｂ（Ｇａｃｋら，２００９）、ｐＣＡＧＧＳ−ＨＡ−ｍＵｂＥ１Ｌ、ｐＣＭＶ２−ＦＬＡＧ−ＵｂｃＭ８およびｐＣＡＧＧＳ−Ｖ５−ｈＩＳＧ１５（Ｖｅｒｓｔｅｅｇら，２０１０）。
【０１００】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％  ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補足されたダルベッコ変法イーグル培地（Ｌｏｎｚａ）内で培養した。ＢＨＫ−２１細胞は、５％  ＦＢＳ、１０％  トリプトースリン酸ブロスおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）で補足されたグラスゴー最少必須培地（Ｌｏｎｚａ）内で培養した。初代ウマ肺線維芽細胞（ＥＬＦ）は、１０％  ＦＢＳで補足された最少必須培地（Ｌｏｎｚａ）内で培養し、コラーゲン被覆プラスチック上で増殖させた。全ての培地は１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有していた。
【０１０１】
以下の商業的に入手可能な抗体を使用した：αＨＡ（ａｂ８１８１；Ａｂｃａｍ）、α−ＦＬＡＧ（Ｆ３１６５；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、α−ＧＳＴ（ｓｃ４５９；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、α−β−アクチン（Ａ５３１６；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ロバ−α−マウス−Ｃｙ３（７１５−１６５−１５１；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）およびヤギ−α−ウサギ−ＡＬ４８８（Ａ−１１００８；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。以下の抗体は他の箇所に記載されている：α−ｈＩＳＧ１５（クローン２．１）（Ｍａｌａｋｈｏｖら，２００３）およびα−ＥＡＶ  Ｎタンパク質（クローン３Ｅ２）（ＭａｃＬａｃｈｌａｎら，１９９８）。ＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメインおよびＧＦＰを認識するウサギ抗血清を、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）から精製された組換えタンパク質を使用して産生させた。
【０１０２】
Ｕｂに結合したＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメインの精製および結晶化
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（ＤＥ３）細胞をｐＡＳＫ３−ｅＰＬＰ２で形質転換し、３７℃でＬＢ培地内で０．７の光学密度（ＯＤ６００）まで培養した。ついで該培養を２００ｎｇ／ｍｌの無水テトラサイクリンで補足し、振とうしながら２８℃で３時間インキュベートして、Ｕｂ−ＰＬＰ２−ＨＩＳ６融合タンパク質の発現を誘導した。該細胞をペレット化し、氷冷細胞溶解バッファー（２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ  ７、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％  グリセロール、５ｍＭ  イミダゾール  ｐＨ７．４、０．５ｍＭ  ＴＣＥＰ）に再懸濁させ、フレンチプレスセル（ＡＭＥＣＯ）を使用して細胞溶解させた。ライセートを遠心分離により清澄化し、細胞溶解バッファーで予め平衡化されたＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）上にローディングした。１５ｍＭ  イミダゾールで補足された細胞溶解バッファーで洗浄した後、組換えＰＬＰ２を、１５０ｍＭ  イミダゾールで補足された平衡化バッファーを使用して該カラムから溶出し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５ｍＭ  ＤＴＴ内に交換した後、４℃で保存した。ＰＬＰ２ドメインの内因性ＤＵＢ活性は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内の発現中に該融合タンパク質からのＮ末端Ｕｂタグの効率的除去をもたらした。したがって、アフィニティクロマトグラフィーは、Ｃ末端ＨＩＳ６精製タグのみを含有する高度に純粋なＰＬＰ２を与えた。
【０１０３】
メカニズムに基づく自殺インヒビターＵｂ（１−７５）−３−ブロモプロピルアミン（Ｕｂ−３Ｂｒ）を、Ｊａｍｅｓら（Ｊａｍｅｓら，２０１１）により記載されているとおりにＭｅｓｓｉｃｋら（Ｍｅｓｓｉｃｋら，２００８）およびＢｏｒｏｄｏｖｓｋｙら（Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙら，２００２）に従い製造した。Ｕｂ−Ｂｒ３を精製ＰＬＰ２に、それらのタンパク質をそれぞれ３：２のモル比で３７℃で１時間にわたって穏やかに混合することにより共有結合させた。得られたＰＬＰ２−Ｕｂ複合体をゲル濾過（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５）およびそれに続くアニオン交換（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ）クロマトグラフィーにより精製し、ついで２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ  ８．０）、５０ｍＭ  ＮａＣｌ中に交換した後、１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、４℃で保存した。
【０１０４】
該ＰＬＰ−Ｕｂ複合体を、１００ｍＭ  ＭＥＳ（ｐＨ６．２）、１８％  ＰＥＧ  ２０，０００からなる母液中、１０ｍｇ／ｍｌで、ハンギングドロップ蒸気拡散により結晶化した。結晶を急速冷却し、２０％  グリセロールで補足された母液内でそれをスイープした後、液体窒素中に保存した。
【０１０５】
Ｘ線データ収集および結晶構造決定
多波長異常分散（ＭＡＤ）実験に関するＸ線回折データをＣａｎａｄｉａｎ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ビーム線０８ＩＤ−１）において収集した。Ｎ２（ｇ）流中で１００Ｋで保持されたＰＬＰ２−Ｕｂ複合体の単結晶からの亜鉛の吸収端にわたる３つの異なる波長においてデータを収集した。ＭＯＳＦＬＭおよびＳＣＡＬＡ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ４，１９９４）を使用して該データを処理し、フェニックス・オートソール（ｐｈｅｎｉｘ．ａｕｔｏｓｏｌ）（Ａｄａｍｓら，２０１０）を使用して構造因子位相を決定した。ＳＯＬＶＥにより得られた初位相を、ＰＨＥＮＩＸパッケージ内のＲＥＳＯＬＶＥを使用する密度修飾により改善した。自由Ｒ因子（Ｂｒｕｎｇｅｒ，１９９２）を使用する交差検定のための反射のランダムサブセットを確保した後、モデルを、フェニックス・オートビルド（ｐｈｅｎｉｘ．ａｕｔｏｂｕｉｌｄ）（Ａｄａｍｓら，２０１０）を使用して構築し、手動で完成させ、ＣＯＯＴ（ＥｍｓｌｅｙおよびＣｏｗｔａｎ，２００４）およびフェニックス・レファイン（ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅ）（Ａｄａｍｓら，２０１０）を使用して精密化した。
【０１０６】
ＰＲＲＳＶ株レリスタットおよびＶＲ２３３２からのＰＬＰ２ドメインの比較分子モデリング
ＰＲＲＳＶ株レリスタット、ＶＲ２３３２およびＧＭ２の完全長ｎｓｐ２配列ならびにＥＡＶブシルスからの結晶化ＰＬＰ２ドメイン（ｎｓｐ２残基２６１−３８７）の配列の多配列アライメントに基づいて、プログラムＭＯＤＥＬＬＥＲ  ９．１０（Ｅｓｗａｒ，Ｎ．ら，２００６）を使用して、ＰＲＲＳＶ株レリスタットおよびＶＲ２３３２からのＰＬＰ２ドメインの比較分子モデルを構築した（図３）。Ｇｅｎｅｉｏｕｓ  Ｐｒｏ  ５．１．７ソフトウェアパッケージ内のＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズムを使用して、多アライメントを得た。レリスタット（４２０−５５５）およびＶＲ２３３２（４２８−５６６）に関するモデル化残基は、ＥＡＶブシルスＰＬＰ２ドメインの結晶構造に対して整列されたものであった。レリスタットおよびＶＲ２３３２  ＰＬＰ２ドメインに特有の（すなわち、ＥＡＶ  ＰＬ２結晶構造には存在しない）ループ構造を、ＭＯＤＥＬＬＥＲ  ９．１０と共に「ループモデル」サブルーチンを使用して最適化した。プログラムＰｙＭＯＬ（ＤｅＬａｎｏ  ＷＬ  （２００２）Ｔｈｅ  ＰｙＭＯＬ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ．）を使用して、これらのＰＬＰ２ドメインのモデルを、ユビキチンに結合したＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメインの結晶学的複合体のＰＬＰ２ドメイン上に重ねることにより、ユビキチンに結合したレリスタットおよびＶＲ２３３２  ＰＬＰ２ドメインのモデルを作製した。該アライメントは、ＥＡＶ  ＰＬＰ２結晶構造に結合した場合に観察されるのと同じ結合配向およびＣ末端尾部コンホメーションでＰＲＲＳＶモデルがユビキチンを容易に収容しうることを示した。ユビキチンのＣ末端ＲＬＲＧＧに結合する酵素活性部位につながる緊固な溝内を含め、ユビキチンとＰＲＲＳＶモデルとの間の重大な構造的衝突は観察されなかった。同じ重ね合せを用いて、レリスタットおよびＶＲ２３３２  ＰＬＰ２モデルに亜鉛原子を加えたところ、これらのモデル内のシステイン残基は、重ね合された亜鉛原子の周囲に密集することが示され、ＥＡＶ  ＰＬＰ２結晶構造に関して観察されるものに類似して、これらのＰＲＲＳＶ  ＰＬＰ２ドメインのこの領域内にジンクフィンガーモチーフが存在するという強力な証拠が得られた。他のＰＲＲＳＶ株からのＰＬＰ２ドメインの対応比較分子モデルを作製した。このために、以下の弱毒化ＰＲＲＳＶワクチン株を使用した：従来のＵＳＤＡにより承認されたＰＲＲＳＶワクチンＰｒｉｍｅＰａｃ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ，Ｓｕｍｍｉｔ  ＮＪにより販売されている；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＤＱ７７９７９１．１を参照されたい）中に存在する株、およびＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ製品Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（登録商標）ＰＲＲＳ（「ＤＶ株」として一般に公知である）中に存在する株。これは、これらの株のＰＬＰ２ドメインがその他の２つのＰＲＲＳＶ株のものに類似しており、実際に、ＥＡＶユビキチン結合部位に関してユビキチンに結合すると予想される同じ残基を有することを示した（図４Ｄ／４Ｅを参照されたい）。
【０１０７】
細胞培養に基づくアッセイ
種々のＰＬＰ２突然変異体によるｎｓｐ２／ｎｓｐ３切断を評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を８０％のコンフルエンスまで１０ｃｍ２のウェル内で増殖させ、ＣａＰＯ４を使用して、野生型または突然変異ＰＬＰ２を含有するｎｓｐ２−３をコードする４μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。３７℃で１６時間の後、細胞を２×Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（２×ＬＳＢ；２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２％  ＳＤＳ、２０％  グリセロール、０．０１％  ブロモフェノールブルー、２ｍＭ  ＤＴＴ，ｐＨ６．８）中で細胞溶解させた。サンプルをＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上にローディングし、半乾燥転移膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、それをＨｙｂｏｎｄ−Ｐポリビニリデンジフルオリド膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にブロットした。適当な抗体の存在下のインキュベーションの後、Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ検出試薬（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、タンパク質バンドを可視化した。
【０１０８】
種々のＰＬＰ２突然変異体のＤＵＢ活性を評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を８０％のコンフルエンスまで４ｃｍ２のウェル内で増殖させ、ＣａＰＯ４を使用して、ＦＬＡＧ−Ｕｂ（０．２５μｇ）、ＧＦＰ（０．２５μｇ）、および野生型または突然変異ＰＬＰ２を含有するｎｓｐ２−３（１．５μｇ）をコードするプラスミドの組合せでトランスフェクトした。３７℃で１６時間の後、細胞を２×ＬＳＢ中で細胞溶解させ、前記のとおりにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１０９】
種々の突然変異体の脱ＩＳＧ化活性を評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を８０％のコンフルエンスまで４ｃｍ２のウェル内で増殖させ、ＣａＰＯ４を使用して、ｈＩＳＧ１５（０．７５μｇ）、ＨＡ−ｍＵｂＥ１Ｌ（０．２５μｇ）、ＦＬＡＧ−ＵｂｃＭ８（０．２５μｇ）、ＧＦＰ（０．２５μｇ）、および野生型または突然変異ＰＬＰ２を含有するｎｓｐ２−３（０．５μｇ）をコードするプラスミドの組合せでトランスフェクトした。３７℃で４８時間の後、細胞を２×ＬＳＢ中で細胞溶解させ、前記のとおりにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１１０】
ルシフェラーゼに基づくＩＦＮ−βプロモーター活性アッセイ
８０％のコンフルエンスまで２ｃｍ２のウェル内で増殖させたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＩＦＮβプロモーターの制御下のホタルルシフェラーゼ（５０ｎｇ）、ウミシイタケルシフェラーゼ（５ｎｇ）、ＲＩＧ−Ｉ（２ＣＡＲＤ）（２５ｎｇ）、および野生型または突然変異ＰＬＰ２を含有するｎｓｐ２−３（５００ｎｇ）をコードするプラスミドの組合せで四重にトランスフェクトした。トランスフェクションに使用したＤＮＡの全量を適量の空ベクターの添加により１μｇ／ウェルに調節した。３７℃で１２時間の後、４個中３個のウェルを１００μｌの受動細胞溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）中で細胞溶解させ、Ｍｉｔｈｒａｓ  ＬＢ  ９４０多重モードリーダー（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で二重ルシフェラーゼレポーターアッセイ系（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ルシフェラーゼ活性に関してサンプルをアッセイした。３つの独立した実験のそれぞれからの残りのウェルを２×ＬＳＢ中で細胞溶解させ、１：１：１の比で混合し、前記のとおりにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０１１１】
独立両側スチューデントｔ検定を用いて、３つの独立した実験から得られた結果の統計的有意性を決定した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意とみなした。
【０１１２】
インビトロＰＬＰ２ドメイン活性アッセイ
野生型ＥＡＶ  ＰＬＰ２ドメインおよびユビキチン相互作用表面上に単点突然変異（Ｉｌｅ３５３Ａｒｇ）を含有する変異体によるＵｂ−ＡＭＣおよびＲＬＲＧＧ−ＡＭＣの切断に関するｋｃａｔ／Ｋｍの実験的に決定された値の例を表Ｘに示す。定常状態蛍光スペクトルをＦｌｕｏｒｏｌｏｇ−３  Ｈｏｒｉｂａ  Ｊｏｂｉｎ  Ｙｖｏｎ分光蛍光光度計（Ｅｄｉｓｏｎ，ＮＪ）で測定した。サンプルを１０×３ｍｍ２使い捨てキュベット内で保持した。データをＳｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ（Ｐｏｉｎｔ  Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）ソフトウェアで分析した。Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の１５０ｍＭのイオン強度（ＮａＣｌ）のバッファー（ｐＨ８）において５０ｍＭ  トリス中で室温で測定を行った。基質濃度をＲＬＲＧＧ−ＡＭＣおよびＵｂ−ＡＭＣ基質に関してそれぞれ５０μＭおよび２００ｎＭに維持し、一方、ＲＬＲＧＧ−ＡＭＣ基質に関しては１．７〜２．６μＭおよびＵｂ−ＡＭＣ基質に関しては１１６〜１７４ｎＭの最終濃度の酵素濃度を用いた。該サンプルを３６０ｎｍの光で励起させ、時間依存的発光を４６０ｎｍで集めた。
【０１１３】
励起および発光スリットを３ｎｍの帯域通過に設定した。該野生型および突然変異体に関して測定されたｋｃａｔ／Ｋｍの値を表３に示す。
【０１１４】
この表から直ちに理解されうるとおり、野生型ウイルスおよび突然変異体Ｉ３５３ＲのＲＬＲＧＧ−ＡＭＣに関するｋｃａｔ／Ｋｍ値は同程度であり、一方、突然変異体Ｉ３５３ＲのＵｂ−ＡＭＣに関するｋｃａｔ／Ｋｍ値は野生型ウイルスのものより２０倍低い。
【表２】
2015532269.tif 000007
【０１１５】
リバースジェネティックス
ＥＡＶ  ＰＬＰ２コード配列における突然変異を、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用する部位特異的突然変異誘発により、適当なシャトルベクターにおいて操作し、ついで、追加的（翻訳的にサイレント）なＡｆｌＩＩおよびＢｓｐＥＩ制限部位を含有するＥＡＶ完全長ｃＤＮＡクローンｐＥＡＮ５５１の誘導体であるｐＥＡＮ５５１／ＡＢに移した（Ｐｏｓｔｈｕｍａら，２００８）。ｐＥＡＮ５５１／ＡＢから誘導されたウイルスを全ての実験における野生型対照として使用した。全ての構築物を配列分析により検証した。
【０１１６】
ＸｈｏＩ線状化野生型または突然変異ＥＡＶ完全長ｃＤＮＡクローンからのインビトロＲＮＡ転写を、ｍＭＥＳＳＡＧＥ  ｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して行った。Ａｍａｘａ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＴおよびＡｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（Ｌｏｎｚａ）のプロメガ（ｐｒｏｇｒａｍ）Ｔ−０２０を該製造業者の説明に従い使用して、５μｇのインビトロ合成ＥＡＶ  ＲＮＡを５．０∧１０６  ＢＨＫ−２１細胞内にエレクトロポレーションした。細胞を適当な培地内に再懸濁させ、７５ｃｍ２  フラスコ内に播き、３９．５℃でインキュベートした。トランスフェクションの２４時間後にウイルス含有上清を集め、既に記載されているとおりに（Ｎｅｄｉａｌｋｏｖａら，２０１０）、ウマ肺線維芽細胞上のプラークアッセイにより力価を決定した。
【０１１７】
正しい突然変異の存在を検証するために、ＲＮＡを、ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してウイルス含有上清から単離し、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ逆転写酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）およびランダム六量体プライマーを使用してＤＮＡに変換した。ついで、該突然変異をコードするＰＬＰ２ドメインの領域を、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を使用してＰＣＲ増幅し、配列決定した。
【０１１８】
定量的リアルタイムＰＣＲ
コンフルエントなウマ肺線維芽細胞に野生型または突然変異ＥＡＶを０．２５のｍ．ｏ．ｉ．で感染させ、該細胞を３７℃でインキュベートした。２０および２４時間ｐ．ｉ．の時点で、ＴｒｉＰｕｒｅ単離試薬（Ｒｏｃｈｅ）中に細胞ライセートを集めた。クロロホルムの添加の後、水相をＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）のバッファーＲＡ１と１：１の比で混合し、該製造業者の説明に従いＲＮＡを単離した。ついで、単離されたＲＮＡを、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ逆転写酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）およびオリゴ（ｄＴ）２０プライマーを使用するｃＤＮＡ合成のための鋳型として使用した。最後に、ｉＴａｑ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ＲＯＸ（ＢｉｏＲａｄ）を使用するＣＦＸ３８４  ＴｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出系（ＢｉｏＲａｄ）における定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により、サンプルをアッセイした。Ｐｒｉｍｅｒ３（ＲｏｚｅｎおよびＳｋａｌｅｔｓｋｙ，１９９８）を使用して、ウマＧＡＰＤＨ、アクチン−β、ＩＦＮ−βおよびＥＡＶゲノムを標的化するプライマーを設計した。配列を表２に示す。リアルタイムＰＣＲプログラムの後、融解曲線分析を行って、該反応の特異性を検証した。結果を、標準的な曲線法を用いて定量し、ＧＡＰＤＨおよびアクチンβの相対量の幾何平均に対して標準化した。
【表３】
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【０１１９】
図９は該ｑＰＣＲの結果を示す。図９Ｂにおいては、野生型ウイルス、単一突然変異体（Ｉ３５３Ｒ）および三重突然変異体（Ｔ３１２Ａ／Ｉ３１３Ｖ／Ｉ３５３Ｒ）に感染した初代ウマ肺細胞において産生されたウイルスｍＲＮＡの量は実質的に等しいと理解されうる。これは、これらの突然変異ウイルスにおいては、野生型ウイルスのものと比較して複製レベルが実質的に不変であることを示しており、このことは、該突然変異体がポリタンパク質プロセシングを行いうることを示している。図９Ａにおいては、ＩＦＮベータｍＲＮＡの誘導が該突然変異体においては該野生型ウイルスの場合より有意に高いことが理解されうる。該三重突然変異は、ＩＦＮベータの誘導に対して、該単一突然変異体より一層低い抑制効果を及ぼすことも理解されうる。実際に、該突然変異体はＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性における非常に有意な低下を示すことが、この図から明らかであり、それは、該野生型ウイルスがそのＤＵＢ／脱ＩＳＧ化活性により示すＩＦＮベータ誘導に対する抑制効果の有意な低減に直接的に関連している。これは、本発明の突然変異ウイルスが該野生型形態より良好な細胞性免疫応答を誘発し、したがって、改善されたワクチンを実際に提供することを示している。
【０１２０】
実施例２：インビボ実験
実験計画
２０頭のＳＰＦシェトランドウマ（雌ウマ）をこの研究に使用した。それらは３つの群に割り当てられた［群１には９頭の雌ウマ（ｎ＝９）、群２には９頭の雌ウマ（ｎ＝９）、および群３には２頭の雌ウマ（ｎ＝２）］。群１の動物には細胞培養順応野生型ＥＡＶワクチン（ＥＡＶ−ｗｔ；株ブシルス由来のクローン）を与えた。群２の動物には突然変異ＥＡＶワクチン（ＥＡＶ−ＰＬＰ２；図９に記載されている三重突然変異体）を与えた。どちらの群に関しても、それぞれのウイルスの１×１０７  ＰＦＵを含有する１ｍｌの用量を使用し、該懸濁液を頸部筋の筋肉内（ＩＭ）に投与した。群３の動物はワクチン接種されず、チャレンジのための非ワクチン接種対照として使用された。
【０１２１】
ワクチン接種の約５週間後、全ての雌ウマにビルレント（毒性）ＥＡＶ株（ＥＡＶケンタッキー８４株；ＫＹ８４と一般に称される）を感染させた。２×１０４  ＰＦＵ／ｍｌを含有する５ｍｌのウイルス懸濁液を、シリンジに取り付けられたノズルを使用して投与することにより、ウイルスを鼻腔内（ＩＮ）に適用した。注射（すなわち、ワクチン接種およびチャレンジ）後、感染後０〜１４日にわたって毎日ならびに感染後の第２１日および第２８日に、直腸温度を測定した。チャレンジ後、感染後０〜１４日にわって毎日、全ての雌ウマを臨床徴候に関して観察した。
【０１２２】
第０日、ワクチン接種およびチャレンジ前ならびに該感染のそれぞれの２、４、６、８、１０、１２、１４、２１および２８日後、該雌ウマの血液サンプルを採取した。血液サンプルをＥＡＶおよびＥＡＶ特異的抗体の存在に関して試験した。
【０１２３】
ウイルス中和試験
抗凝固剤を使用することなく、チューブ内に集められた血液サンプルから血清を調製した。室温で少なくとも４時間にわたる該血液の凝固の後、７００×ｇ、４℃で１５分間の遠心分離により血清を集めた。使用まで、該血清を−２０℃で保存した。該試験血清の中和抗体価を９６ウェルプレートにおいて二重に決定した。簡潔に説明すると、該サンプルの２倍系列希釈物（二重）をマイクロタイタープレートにおいて調製し、一定量の生ＥＡＶウイルスと混合した。１時間のインキュベーション時間の後、Ｖｅｒｏ（ベロ）細胞を加えた。該プレートを、ＣＯ２の存在下、３７℃で４日間インキュベートし、ついで単層を細胞変性効果（ＣＰＥ）に関して検査した。各ウェルを陰性（ＣＰＥ無し）または陽性（ＣＰＥ）と評価した。ＥＡＶ中和抗体価を、ＣＰＥが観察されなかった最高血清希釈度の逆数として計算し、ｌｏｇ２として表した。
【０１２４】
全血からの全ＲＮＡの単離およびＥＡＶ  ＲＮＡの定量
Ｔｅｍｐｕｓ（商標）血液ＲＮＡチューブで集められた全血からのＲＮＡを、「ＭａｇＭＡＸ（商標）ｆｏｒ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｔｕｂｅｓ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」を製造業者の説明（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従い使用して単離した。ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｈ  Ｍｉｎｕｓ  ＲＴ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）およびオリゴ（ｄＴ）２０プライマーを使用して、全血からのＲＮＡ（８００ｎｇ）を逆転写した。ついで、ｉＴａｑ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｗｉｔｈ  ＲＯＸ（ＢｉｏＲａｄ）を使用するＣＦＸ３８４  ＴｏｕｃｈリアルタイムＰＣＲ検出系（ＢｉｏＲａｄ）における定量的リアルタイムにより、サンプルをアッセイした。プライマーセットは、一般的なソフトウェアプログラムＰｒｉｍｅｒ（プライマー）３を使用して設計した。
【０１２５】
結果
該試験は妥当なものであった。なぜなら、該非ワクチン接種対照雌ウマはチャレンジまではＥＡＶ陰性のままであったからである。また、該非ワクチン接種動物は株ＫＹ８４でのチャレンジによる明らかなウイルス血症および臨床徴候を現した。群１および２のワクチン接種動物は顕著な臨床徴候をほとんど示さなかった。これらの結果に基づけば、該突然変異株は、公知ブシルスワクチン株と少なくとも同じレベルで、ビルレントチャレンジに対して有効に防御可能であったと結論づけられうる。これは、後記のとおりの体温分析およびウイルス中和試験により確認された。
【０１２６】
体温
測定された体温の個々のデータに基づいて、各群のウマに関して平均値を計算した。これらの値を図１０に示す。ワクチン接種の１〜６日後、該ワクチン接種群（ＥＡＶ−ｗｔおよびＥＡＶ−ＰＬＰ２ワクチン）の両方において、明らかな（そして同程度の）体温上昇が観察された。チャレンジ後、該対照群は第３日〜第１０日に体温のピークを示し、一方、該ワクチン接種群の体温は増加せず、正常範囲内に維持された。
【０１２７】
ウイルス中和試験
個々のデータに基づいて、平均値を計算した。ＶＮ力価のグラフ表示の概要を図１１に示す。実験の開始時に、全てのウマはＥＡＶに対する中和抗体に関して陰性であった。ワクチン接種後、ＥＡＶ特異的ＶＮ抗体価は検出可能であり、群１（ＥＡＶ−ｗｔ）および群２（ＥＡＶ−ＰＬＰ２）の両方に関して±７．５  ｌｏｇ２のプラトーに達した。チャレンジ後、特異的ＶＮ抗体価が該対照群に関して検出可能であり、該チャレンジ感染は両方のワクチン接種群の動物のＶＮ力価を増加させなかった。
【０１２８】
ＥＡＶ特異的ｑＰＣＲによる血液中に存在するＥＡＶの検出
全血サンプルから抽出された全ＲＮＡのリアルタイムｑＲＴ−ＰＣＲ分析によりＥＡＶの量を決定した。群１および２の両方におけるウイルスＲＮＡ力価はワクチン接種の約４日後にほぼ同じレベルのそれらの最高値に到達し、その後、それらは徐々に減少した。ＥＡＶ−ＰＬＰ２突然変異体に導入された突然変異はインビボにおいて或る僅かな更なる低減を引き起こしたようであった。なぜなら、観察されたＥＡＶ−ＰＬＰ２力価は、親株ＥＡＶ−ｗｔが到達した力価と比較して、ほとんどの試験時点において若干低かったからである。しかし、この考えられうる若干の低減にもかかわらず、インビトロ実験において見られたもの（実施例１）に合致して、該ＥＡＶ−ＰＬＰ２突然変異体はインビボで相当良好に増殖すると結論づけられうる。
【０１２９】
チャレンジ感染後、両方の非ワクチン接種動物（群３）はそれらの血液において高いウイルスＲＮＡ力価を示した。このことは、該チャレンジ感染が成功したことを示している。ＥＡＶ−ｗｔでワクチン接種された９頭中４頭の動物において（群１）、該チャレンジ株のウイルスＲＮＡはチャレンジ後の４、６および／または８日の時点でそれらの血液において検出可能であり、一方、群２の動物のいずれにおいても、これらの時点でチャレンジ株ＲＮＡは検出できなかった。このことは、該突然変異株が、野生型株と比較して改善された免疫応答を誘導することを明らかに示している。
【０１３０】
参考文献
【表４】
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2015532269.tif 000010
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2015532269.tif 000015
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2015532269.tif 000020
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2015532269.tif 000022
【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2015532269.tif 000027
【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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