(57)【要約】  インビボ試験を含み、局所的な皮膚治療における皮脂抑制活性能を決定するために物質を分類する方法であって、前記インビボ試験は以下の工程を含む：ＡｈＲ受容体のリガンドの中から物質を選択すること；ＣＹＰ１Ａ１遺伝子を発現している哺乳動物を選択すること；皮脂腺を含む前記哺乳動物の皮膚の一部分を、局所経路を介して、用量／反応／反応時間プロトコルに従って前記物質を含む組成物で処理すること；前記哺乳動物の皮膚の当該一部分の皮脂腺におけるＣＹＰ１Ａ１の発現を免疫組織化学的染色により試験すること；前記皮脂腺のいくつかの異なる種類の細胞における免疫組織化学的染色の発現のシーケンスの関数に従って前記物質を選択すること。活性物質として５，６ベンゾフラボンを含むことを特徴とする、皮脂産生を減少させるために局所的に使用するための医薬組成物。【選択図】図１
2015523553.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビボ試験を含むことを特徴とする、局所的な皮膚治療における皮脂抑制活性能を決定するために物質を分類する方法であって、前記インビボ試験は以下の工程を含む：
−ＡｈＲ受容体のリガンドの中から物質を選択すること；
−ＣＹＰ１Ａ１遺伝子を発現している哺乳動物を選択すること；
−皮脂腺を含む前記哺乳動物の皮膚の一部分を、局所経路を介して、用量／反応／反応時間プロトコルに従って前記物質を含む組成物で処理すること；
−前記哺乳動物の皮膚の前記一部分の皮脂腺におけるＣＹＰ１Ａ１の発現を免疫組織化学的染色により試験すること；
−前記皮脂腺のいくつかの異なる種類の細胞における免疫組織化学的染色の発現のシーケンスの関数に従って前記物質を選択すること。
【請求項２】
前記インビボ試験が、所定の時間内に複数の細胞種において染色を示すときに前記物質が選択されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記物質が少なくとも１つのインビトロ試験に基づいてアゴニスト性を有するＡｈＲ受容体のリガンドの中から選択されることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記インビトロ試験が、ＣＡＬＵＸ、ＥＲＯＤ試験およびそれらの組み合わせの中から選択されることを特徴する請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物は、当該皮脂腺が：
−前駆細胞
−未分化細胞
−分化細胞
−成熟細胞
の活性化のシーケンスを再現することを可能にするように選択されたマウス系統であることを特徴とする先行する請求項のうちの１つに記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物が、Ｃ５７／Ｂ６マウス系統であることを特徴とする先行する請求項の１つに記載の方法。
【請求項７】
前記マウスの耳が、局所的経路により処理され、次にサンプリングされ、およびＣＹＰ１Ａ１発現が抗体を使用する免疫組織化学的試験によって試験されることを特徴とする請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
皮脂腺におけるＣＹＰ１Ａ１の発現の当該試験が：
−峡部領域の試験、特に前駆細胞の試験；
−当該腺の周辺領域の試験、特に未分化細胞の試験；
−当該腺の中間領域の試験、特に分化細胞の試験；
−当該腺の中心領域の試験、特に成熟細胞の試験；
を含むことを特徴とする、先行する請求項のうちの１つに記載の方法。
【請求項９】
ＣＹＰ１Ａ１の当該発現が、１週間の処理の後に２種類以上の細胞において標識されるときに、前記物質が選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＹＰ１Ａ１の当該発現が、１週間の処理の後に４種類以上の細胞において標識されるときに、前記物質が選択されることを特徴とする請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ヒトの皮膚疾患、特にニキビ、脂漏性皮膚炎および酒さを治療および／または予防するための組成物であって、前記組成物は、前記組成物の皮膚への局所適用によって高脂漏を治療および／または予防するように構成され、前記組成物は：
−ＡｈＲ受容体を活性化する能力；
−ＡｈＲによって制御される遺伝子を調節する能力；
−人体における２時間〜９６時間の間の短い半減期；
−認められた高脂漏の基準において測定可能な陽性作用；
を有するＡｈＲアゴニストリガンドからなる群より選択された活性化物質を含み、
および
前記活性化物質は請求項１〜１０のいずれか１項において記載されるインビボ試験によって肯定的に選択される組成物。
【請求項１２】
活性物質として５，６ベンゾフラボン（５，６ＢＺＦ）を含むことを特徴とする、皮脂産生を減少させることを目的として局所的に使用するための医薬組成物。
【請求項１３】
ヒトの皮膚疾患、特にニキビ、脂漏性皮膚炎および酒さを治療および／または予防するための医薬組成物であって、前記組成物は、前記組成物の皮膚への局所適用によって高脂漏を治療および／または予防するように構成され、前記組成物は、活性物質として５，６ベンゾフラボン（５，６ＢＺＦ）を含む医薬組成物。
【請求項１４】
５，６ベンゾフラボン（５，６ＢＺＦ）の濃度が、前記組成物の０．００５重量％〜１重量％、特に０．１重量％〜１重量％であることを特徴とする請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
局所的に使用するための皮脂抑制組成物における活性物質としての５，６ベンゾフラボン（５，６ＢＺＦ）。
【請求項１６】
局所的に使用するための皮脂抑制組成物における活性物質としてのルテカルピン。
【請求項１７】
ヒトの皮膚疾患、例えば、ニキビ、脂漏性皮膚炎および酒さなどを治療および／または予防するための処理方法であって、組成物の皮膚への局所適用によって高脂漏を治療および／または予防するように構成された組成物を提供することと、
前記組成物は：
−ＡｈＲ受容体を活性化する能力；
−ＡｈＲによって制御される遺伝子を調節する能力；
−人体における２時間〜９６時間の間の短い半減期；
−認められた高脂漏の基準において測定可能な陽性作用；
を有するＡｈＲアゴニストリガンドからなる群より選択された活性化物質を含み、
前記活性物質は請求項１〜１０の何れか１項に記載において記載されたいずれか１つのインビボ試験によって肯定的に選択された物質であり、
当該ヒトに対して前記組成物を局所的に投与することとを含む、方法。
【請求項１８】
皮膚に局所適用するように構成された組成物を提供することと、ここで、前記組成物は活性物質として５，６ベンゾフラボン（５，６ＢＺＦ）を含み、前記組成物をヒトに局所的に投与することとを含む、ヒトおける高脂漏を治療および／または予防する方法。
【請求項１９】
５，６ベンゾフラボン（５，６ＢＺＦ）の当該濃度が、前記組成物の０．００５重量％〜１重量％、特に０．１重量％〜１重量％である請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、局所的皮膚治療における皮脂抑制活性能（sebosuppressive activity）を決定するために物質を分類する方法に関する。また本発明はこのような選別により識別可能な物質に関する。
【０００２】
本発明は、特に、高脂漏（hyperseborrhea）およびそれによって、関連する皮膚疾患、例えば、ニキビ、脂漏性皮膚炎および酒さなどの治療および／または予防を目的とする局所使用のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
多く物質が、リガンドとして、上皮および間葉皮膚細胞によって顕著に発現されるＡｈＲ受容体（アリール炭化水素受容体）と相互作用することができる。文献ＷＯ２００４／０４１７５８、ＷＯ２００７／０６０２５６およびＷＯ２００７／１２８７２５は、そのようなリガンドのアンタゴニスト性またはアゴニスト性を決定するためのインビトロ試験を記載し、皮膚科的治療におけるアンタゴニストリガンドの使用を提案する。現在の当該技術分野において最も頻繁に使用されるこの種のインビトロ試験はＣＡＬＵＸまたはＥＲＯＤ試験である。文献ＷＯ２００９／０９３２０７もまたこのようなインビトロ試験を開示する。
【０００４】
２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ダイオキシン(ＴＣＤＤ)が原型であるアゴニストリガンドとしてＡｈＲ受容体と相互作用する化合物は、ほとんどが様々な種類の組織病変を誘発するゼノトキシック（xenotoxic）な化合物である。この理由により、皮膚機能を調節する活性剤としてのそのようなアゴニスト化合物の治療的および／または予防的使用が、現在の当該技術分野では排除されていると思われる。
【０００５】
それとは逆に、出願人は、参照によりその内容をここに引用する、文献ＷＯ２００９／０９３２０７では、ＡｈＲ受容体のあるアゴニストリガンドの皮膚への適用が、いくつかの皮膚機能、例えば、皮脂腺機能、抗感染防御、創傷治癒、皮膚粗鬆症（dermatoporosis）およびエストロゲン枯渇に関わる皮膚萎縮などを有利に調節できることを示している。その文献において、出願人は、この特性をこれらの皮膚機能の機能不良を治療するために使用でき、またそれらが、ダイオキシンなどのゼノトキシックなリガンドによる過剰なＡｈＲ活性化の１つの主要な合併症、すなわち増殖性嚢胞性病変（proliferative cystic lesions）を引き起こさないようにこれらの物質がどのように選択されるべきかを示した。これらの嚢胞性病変は、正式には「塩素挫瘡」と呼ばれ、これ以後ＭＡＤＩＳＨと呼ぶ（J.H.Saurat et al The cutaneous lesions of dioxin exposure: Lessons from 15 the poisoning of V. Yushchenko, Toxicological Sciences 2012; 125; 310-SI 7）。治療用ＡｈＲリガンドの適用がＭＡＤＩＳＨの原因となることを防ぐために、アゴニストは、それらが迅速に代謝されるように、体内で複数時間／複数日の半減期を有するように選択しなければならず、これは、ヒトの皮膚におけるその半減期が複数年において測定され得る原型アゴニスト、ダイオキシンとは異なる。
【０００６】
文献ＷＯ２００９／０９３２０７によると、リガンドは好ましくは４つの基準を満たすように選択される：
１．ＡｈＲ受容体を活性化する能力。
【０００７】
２．ＡｈＲによって制御される特異的遺伝子を調節する能力。
【０００８】
３．人体において、好ましくは２時間〜９６時間、より具体的には６〜２４時間の短い半減期。
【０００９】
４．認められたこれらの皮膚機能の機能不良の基準において測定可能な陽性作用。
【００１０】
アゴニストの特徴を有するリガンドは数多く存在する。文献ＷＯ２００９／０９３２０７はそのようなアゴニストリガンドを数種列挙している。それらのいくつかは、ＮＡｈＲＡｓ（ナチュラルＡｈＲアゴニスト）と呼ばれる、所謂≪ナチュラルリガンド≫ＡｈＲクラスに属する。
【００１１】
ヒトにおいて治療に有効な皮脂抑制作用を有すると思われるこれらのリガンドから最善の候補を実際にどのように同定するのかもまた知られていない。現在のアプローチは、適切な動物種における皮脂腺の分化領域の萎縮誘導試験を伴う。これらの試験は、複雑な解釈を必要とし、慎重に取り扱われるべきであり、それらは複数週に亘る検討の下で長期に亘るリガンドの適用を必要とするかもしれない。
【００１２】
そのため、本発明の目的は、高精度、迅速であり、且つ分類結果と選択された物質のヒト皮膚における皮脂抑制特性との間で高相関性を示す、上述において明示されたような分類方法を提供することである。
【発明の概要】
【００１３】
発明の主題
この目的のために、本発明はインビボ試験を含む、局所的皮膚治療における皮脂抑制活性能を決定するために物質を分類する方法であって、前記インビボ試験が以下のステップを含む方法を提供する：
−ＡｈＲ受容体のリガンドの中から物質を選択すること；
−皮膚内でＣＹＰ１Ａ１遺伝子が誘導される哺乳動物を選択すること；
−皮脂腺に関して選択された前記哺乳動物の皮膚の一部分を、局所的経路を介して、用量／反応／反応時間プロトコルに従って前記物質を含む組成物で処理すること；
−前記哺乳動物の皮膚の前記一部分の皮脂腺におけるＣＹＰ１Ａ１の発現を免疫組織染色により試験すること；
−前記皮脂腺のいくつかの異なる種類（区画）の細胞における免疫組織化学的標識の発現のシーケンス（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）に関して前記物質を選択すること。
【００１４】
分析に適している皮脂腺を含んでいることが知られており、またＣＹＰ１Ａ１遺伝子が最も誘導されやすい耳の皮膚を特に選択することが可能である。
【００１５】
前記物質は、前記インビボ試験が所定の時間内に複数の細胞種が染色を示すときに選択される。
【００１６】
試験されるべき前記物質は、好ましくは少なくとも１つのインビトロ試験に基づいてアゴニスト性を有するＡｈＲ受容体のリガンドの中から選択される。
【００１７】
ＮＡｈＲＡの中からの最も好ましい性質の候補の選択は、それゆえインビトロ試験に基づいて、例えばＣＡＬＵＸおよびＥＲＯＤ試験を使用して、十分なＡｈＲアゴニスト作用の証明およびでの短いインビボ半減期の証明を初めに必要とする。
【００１８】
本発明の方法の１つの実施形態によれば、前記哺乳動物はマウスである。Ｃ５７／Ｂ６マウス系統を選択することが可能である。
【００１９】
この実施形態によれば、さらに詳細には前記マウスの耳が局所的経路を介して処理され、次にサンプリングされ、ＣＹＰ１Ａ１の発現が、抗体を使用する免疫化学的分析により試験される；特に、それらに限定されるものではないが、使用される抗体は、ウサギ抗ラットＣＹＰ１Ａ１ポリクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＡＢ１２４７）であってもよい。
【００２０】
この実施形態において、皮脂腺におけるＣＹＰ１Ａ１の発現の試験は：
−峡部（isthmus region）の試験、特に前駆細胞の試験；
−当該腺の周辺領域の試験、特に未分化細胞の試験；
−前記腺の中間領域の試験、特に分化細胞の試験；
−前記腺の中心領域の試験、特に成熟細胞の試験；
を含み得る。
【００２１】
これらの４つの細胞種を試験した後に、１週間の処理の後に少なくとも２つの細胞種においてＣＹＰ１Ａ１の発現が標識されたときに、前記物質は選択されることができる。
【００２２】
これらの４つの細胞種を試験した後に、好ましくは、１週間の処理の後に４つの細胞種においてＣＹＰ１Ａ１の発現が標識されたときに、前記物質が選択される。
【００２３】
そのため、本発明の更なる側面によると、本発明の目的は、ヒトの皮膚疾患、特にニキビ、脂漏性皮膚炎および酒さの治療および／または予防のための組成物であって、前記組成物は、皮膚への前記組成物の局所的な適用によって高脂漏を治療および／または予防するように構成されており、前記物質は
−ＡｈＲ受容体を活性化する能力；
−ＡｈＲにより制御されている遺伝子を調節する能力；
−人体における２時間〜９６時間の短い半減期；
−認められた高脂漏の基準において測定可能な陽性作用；
を有するＡｈＲアゴニストリガンドからなる群から選択される活性物質を含み、
および
前記活性物質は、先に定義されたインビボ試験によって肯定的に選択される。
【００２４】
本発明は、局所的使用のための皮脂抑制組成物の中の好ましい活性物質として、特に、ベータ−ナフトフラボンとも呼ばれる５，６ベンゾフラボン（５，６ＢＺＦ）を提案する。
【００２５】
本発明はまた、局所的使用のための皮脂抑制組成物の中の活性物質として、ルテカルピンも提案する。
【００２６】
またさらなる側面よると、本発明の目的は、ヒトの皮膚疾患、例えば、ニキビ、脂漏性皮膚炎および酒さなどを治療および／または予防するための処理方法であって、皮膚への局所的適用により高脂漏を治療および／または予防するように構成されている組成物を提供することと、
前記組成物は：
−ＡｈＲ受容体を活性化する能力；
−ＡｈＲにより制御された遺伝子を調節する能力；
−人体における２時間〜９６時間の短い半減期；
−認められた高脂漏の基準において測定可能な陽性作用；
を有するＡｈＲアゴニストリガンドからなる群から選択された活性物質を含み、
ここにおいて、前記活性物質は先に定義されたインビボ試験によって肯定的に選択され、
当該ヒトに前記組成物を局所的に投与することとを含む、方法である。
【００２７】
本発明の特定の目的は、従って、ヒトにおいて高脂漏に誘導された皮膚状態を治療および／または予防するための方法であって、皮膚への局所的適用のために構成された組成物を提供することと、
前記組成物は活性物質として５，６ベンゾフラボン（５，６ＢＺＦ）を含み、
前記ヒトに前記組成物を局所的に投与することとを含む、方法である。
【００２８】
添付の図面についての言及とともに述べられた本発明の特定の実施形態の以下の詳細な説明を通して、当業者であれば治療用の局所的な皮脂抑制活性を有するＡｈＲ受容体のリガンドを同定するための新規な方法をどのように決定することができるかを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａ部分を含み、これらは、ＣＹＰ１Ａ１遺伝子を発現することができる４種類の細胞、すなわち：−前駆細胞（１）；−未分化細胞（２）；−分化細胞（３）；−成熟細胞（４）；の皮脂腺内部での位置の概略図である。
【図２】図２は、１Ｂ、２Ｂ、３Ｂ、４Ｂ部分を含み、これらは、図１Ａ、２Ａ、３Ａ、４Ａに対応する顕微鏡写真観察である；１Ｃは１Ｂ、すなわち前駆細胞の異なる視野角および拡大図を示す。
【図３】図３は、ＡｈＲ受容体のいくつかのリガンドの局所的な適用後の図１および図２の脂腺細胞のすべての分集団（sub-population）における時間の関数としてＣＹＰ１Ａ１活性の発現を示す。
【図４】図４は、インビトロ試験、本発明に従うインビボ試験および図３のリガンドのヒトにおける皮脂抑制活性の臨床試験の相関関係を示す表である。
【図５】図５は、インビトロ試験、本発明によるインビボ試験および３つのフラボンのヒトにおける皮脂抑制活性の臨床試験の相関関係を示す表である。
【図６】図６は、３つのフラボンによる皮脂産生酵素（sebogenic enzymes）の遺伝子の転写の阻害の比較表である。
【図７】図７は、３つの異なる濃度で５，６ＢＺＦで処理した後に真皮において皮脂腺が占める相対的な表面の比較表である。
【図８】図８は、図７と同じ濃度で５，６ＢＺＦで処理した後の皮脂腺における分化指数の比較表である。
【図９】図９は、図７と同じ濃度で５，６ＢＺＦで処理した後の分化および成熟脂腺細胞の数の比較表である。
【図１０】図１０は、図７と同じ濃度で５，６ＢＺＦで処理した後の活性な皮脂腺の数の比較表である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
分類方法の実施形態の説明
本発明に従うヒトにおける皮脂抑制治療を目的とするＡｈＲのリガンド分子を分類するための方法は、ＷＯ２００９／０９３２０７に列挙されたいくつかのＡｈＲリガンドの局所的および全身的な投与の際の偶然の予想外の観察結果に基づく。
【００３１】
当業者が、本発明の最も驚くべき性質をよく理解できるように、技術水準の以下の要素が、核受容体、例えばＡｈＲ、またはさらなる例として、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）などのリガンドの適用により誘発される皮膚における生物学的現象の分布に関して想起されるに違いない。
【００３２】
技術水準によれば、リガンドの局所的または全身的な投与により誘発される生物学的活性は：
−受容体を発現する全ての体の部位において；および
−当該リガンドは量的に十分な態様で、また非代謝活性型で、これらの部位において拡散され；
均一であるべきである。
【００３３】
この場合、皮膚へのＡｈＲリガンドの適用は、はじめに表皮の表層で均一にこの受容体の経路を活性化し、その後、リガンドの侵入勾配により、表皮のより深い層、次に恐らく真皮および付属物、毛髪および皮脂腺へと徐々に拡散する。そのことは事実上公知であり、これは、出願人によって、ＡｈＲ受容体が皮膚のこれらの区画（compartments）の全てにおいて均一に発現されていることが証明されている。
【００３４】
さらに、最も驚くべきことに、出願人は、ＡｈＲリガンドの皮膚への適用が、前駆細胞から始まる皮脂腺における限局的な態様で、すなわち毛包脂腺の峡部領域内に位置する脂腺幹細胞、続いて未分化脂腺細胞、分化脂腺細胞、そして最後に成熟細胞のシーケンスに、この受容体の経路を活性化することを発見した。これらの結果を図１および２に示す。
【００３５】
さらに驚くべきことに、強い皮脂抑制活性を持つリガンドは、ＡｈＲ受容体のインビトロ活性化試験時に最も強い活性を示す必要はなく、図４の表および図３に示されるように初期段階で迅速且つ完全に自然の位置でのこのシーケンスの活性化に従うものである。
【００３６】
これらの観察結果は、Rowe MJら(J. Invest. Derm. 2008:128; 1866-68)のものとは異なるために実に驚くべきものである。これらの著者らは、（ＣＹＰ１Ａ１−ＧＦＰプロモーター）トランスジェニックマウスにおいて、全身的経路を介して投与されたＡｈＲリガンドによって誘導された生物学的活性は皮脂腺に局在することができたが、次の場合には均一になる：
−第１に、出願人の観察では、投与経路が経皮であり、上記で説明された経皮拡散のために優先的な分布が完全に予測できない。Rowe MJらにより行われた研究においては、３−メチルコラントレンであるリガンドは血液経路を介した皮膚へ接近を必要とする全身的な経路を介して投与され、このことは皮脂腺における脂溶性リガンドの分布は驚くべきものではないことを意味する。
【００３７】
−第２に、また特に、本発明の基礎にある活性化シーケンス：前駆＞未分化＞分化＞成熟細胞：は、皮脂腺の領域における生物学的活性の拡散を明示しているRowe MJら(J. Invest. Derm. 2008:128;1866-68)によっては観察されていなかった。Roweらによって示されたこの側面は、本発明の皮脂抑制リガンドを分類するための方法という課題を決定することも、または示唆することもいずれもできるものではないであろう。
【００３８】
皮脂腺におけるＡｈＲ受容体活性の連続する限局的な領域の証明
ここで説明される実施形態は、この分野で広く使用される例えばＣＡＬＵＸやＥＲＯＤなどの方法を使用して受容体のインビトロでのそれらの活性化特性について既に特徴づけられたＡｈＲ受容体のリガンドを用いた、用量／反応／反応時間プロトコルに従う局所的経路を介した、Ｃ５７／Ｂ６マウスの耳の処理を伴う（表１を参照されたい）。
【００３９】
前記耳はサンプリングされ、ＣＹＰ１Ａ１発現は、特異的な抗体を使用する免疫組織化学的分析により試験される。図１は、観察された異なる種類の標識を示す。免疫組織化学の陽性、すなわち図２において茶色に染色されている細胞は、その領域がＣＹＰ１Ａ１タンパク質を発現していることを示す。
【００４０】
１．基礎的状態では、前記タンパク質は検出できない。
【００４１】
２．ＡｈＲリガンドが使用された全ての場合において、ＣＹＰ１Ａ１免疫組織化学の陽性をもたらし、染色されるのと同時にＡｈＲ受容体の活性化により誘導されたＣＹＰ１Ａ１タンパク質の増加を示す最初の領域は、皮脂腺の《前駆》細胞が位置する峡部の領域である（図１Ａおよび２Ｂ）：第１段階。これは多能性増殖性細胞に相当し、それゆえ一般的に《脂腺幹細胞》に相当する。峡部領域の特有のトポロジーに加えて、これらの細胞は峡部多能性増殖細胞のマーカーであるケラチン１５およびＬ−ＲＩＧ１の発現により特徴づけられる。ＣＹＰ１Ａ１およびＬ−ＲＩＧ１ダブル染色の使用により、局所由来のＡｈＲリガンドによって活性化された細胞が、事実上この峡部領域でのこの個体群に対応すると断定できると考えられた。
【００４２】
３．次の段階は、未分化細胞への染色の拡大であり、これは脂質を含有せず、また一般的に皮脂腺の周辺に位置する(図２Ａおよび２Ｂ)：第２段階。
【００４３】
４．次の段階は、分化細胞への染色の拡大であり、これは脂質を含有し、また一般的に皮脂腺の中間部に位置する（図３Ａおよび３Ｂ）：第３段階。
【００４４】
５．次の段階は、成熟細胞への染色の拡大であり、これは脂質を含有し、また一般的に皮脂腺の中央部に位置する（図４Ａおよび４Ｂ）：第４段階。
【００４５】
連続的な活性化段階とリガンドの皮脂抑制特性との間の対応
図４の表は、局所的な活性化発現の段階および皮脂阻害指数、並びにヒト皮膚における作用の間の対応を示す。皮脂阻害指数は、皮脂腺の全細胞数に対する成熟および分化細胞の数を数えることにより計算される。成熟および分化細胞の減少は、皮脂産生の阻害を表す。ヒト皮膚への作用は、《カジュアルレベル（casual level）》として知られているもの(J. Cosmet Dermatol. 2007 June;6(2):113-8)を使用する皮脂計量試験（sebumetric examination）により決定される。
【００４６】
図３および図４の表１において、使用される略語は以下の意味を持つ：
ＮＳＡ１：ルテカルピン
ＮＳＡ２：ベータナフトフラボン
ＮＳＡ３：ＴＣＤＤ
ＮＳＡ４：ＦＩＣＺ
ＮＳＡ５：ヒスピジン
ＮＳＡ６：ベータカルボリン
ＮＳＡ７：エソメプラゾール。
【００４７】
図３および図４（表１）間の比較は、１週間未満の期間内で４つの細胞分集団においてＡｈＲ経路を活性化する２つのリガンド、すなわち５，６ベンゾフラボンまたは５，６ＢＺＦとも呼ばれるベータタフトフラボン、およびＴＣＤＤが、ヒトにおいて最も強い皮脂抑制活性を示すものであることを示す。２つの細胞分集団内のＡｈＲ経路を活性化するルテカルピンは、５，６ＢＺＦの活性よりも弱いが有用な皮脂抑制活性を潜在的に持っている。一方、他のリガンドは、１つの細胞分集団のＡｈＲ経路を活性化するのみであり、仮にこの活性が高いレベルに達したとしてもヒトでは弱い皮脂抑制活性を発揮するだけである。
【００４８】
５，６ＢＺＦおよび構造類似体の皮脂抑制特性の説明
５，６ＢＺＦの皮脂抑制活性を、同じ条件の下で、すなわち上述した通りのインビトロ試験、本発明に従うインビボ試験およびヒトにおける臨床試験において７，８ＢＺＦ（７，８ベンゾフラボン）およびフラボンと比較した。結果を図５に示す。７，８ＢＺＦまたはフラボンではなく、５，６ベンゾフラボンは、最も活性なＡｈＲアゴニスト（ＴＣＤＤ）と同じように皮脂腺におけるそのアゴニスト活性を分布するが、一方、フラボンおよび７，８ベンゾフラボンはこのような作用を有さないことがわかる。いかなる理論によって拘束されることを望むものではないが、組織分布のこの能力は、ＡｈＲ受容体への当該分子の親和性に完全には関連していないようであり、これはＦＩＣＺなどのより強い親和性を持つ分子は、５，６ＢＺＦように皮脂腺には分布しないからである。以下に説明するその他の特性と組み合わせて、皮脂腺を標的にするこの特性は、望まれる治療効果を説明することができる。
【００４９】
図６は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの耳が、５週間に亘り０．５％で３種類の上記の異なるフラボンで処理された時の実験結果を示す。参考の活性物質は１０００倍低い濃度のＴＣＤＤであった。
【００５０】
ＲＮＡの抽出の後、ＲＴｑＰＣＲ反応を皮脂性脂質の産生における３つの主要な酵素について行った。その結果を賦形剤で処理されたコントロールマウスと比較した：図６は、３種のフラボンの中でもっぱら５，６ベンゾフラボンが３つの酵素をコードするｍＲＮＡの発現を大きく阻害を誘導するのに対して、７，８ベンゾフラボンはむしろ僅かな刺激作用しか持たず、フラボンは顕著な作用を有してはいないことを示す。７，８ベンゾフラボンではなく、５，６ベンゾフラボンは、マウスにおけるＡＷＡＴ１、ＥＬＯＶＬ３およびＦＡＤＳ２などの皮脂を特徴づける脂質の産生において重要な酵素の遺伝子の発現を強く阻害し、このことはその皮脂抑制作用の部分的に説明する。これらの標的は、先行技術において開示されてはいない。
【００５１】
分子構造におけるこれらの差異は、第１に受容体活性化特性に関する、第２に可溶特性に関する変化を引き起こす。これらの後者の特性は前述のように皮脂腺を標的とするための決定因子となり得る。
【００５２】
５，６ＢＺＦの用量と皮脂抑制作用との間の関係
皮脂産生の顕著な抑制を得るための５，６ベンゾフラボンの用量は、特に良好な耐性を確保し、また上述のようなＭＡＤＩＳＨ型の嚢胞の発現を阻止するために定められるべきであり、それは用量依存性であってもよく、それら自身部分的にこの状況の範囲内で用量に依存する薬物動態に関連していてもよい。
【００５３】
この必須段階は、いくつかの局面において達成された。
【００５４】
１．マウスにおける用量効果
予備研究は、０．０５％よりも高い濃度の良好な耐性と、上述の連続的なインビボ活性化試験における活性とを示した。これらの用量効果試験のために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、耳に３〜５週間に亘り、週に５日、３つの濃度、すなわち０．１、０．５および１％のＢＺＦで処理された。
【００５５】
ａ.皮脂抑制効果は３週間目に分析されたが、その発現は、１週間後に始まる。図７〜１０は、非常に顕著な効果を示しており、そこにおいてＴＣＤＤなどの有害物質以外の物質では、皮脂腺が占める相対表面およびそれらの活性に関して、並びに未分化、分化および成熟脂腺細胞の割合に関して双方ともにこのモデルにおいて誘発できるものは少ない。特に、腺の分化した区分における減少が観察されたが、これは、脂腺細胞の分化が細胞質の脂質過負荷によって規定されることから、皮脂性脂質生成酵素の遺伝子の抑制効果によく一致している。
【００５６】
ｂ.ＭＡＤＩＳＨ型嚢胞の産生がないときには、耐性は、５週間の処理の後に評価された。これらの高濃度では嚢胞性病変は観察されなかった。これらのマウスにおけるＨＰＬＣによる５，６ＢＺＦの血液分析は、いずれも観測可能な濃度（検出感度５ｎＭ）を検出せず、これは、体内で短命のアゴニストの使用に関するＷＯ２００９／０９３２０７の教示を裏付ける。
【００５７】
２．ヒトにおける耐性および効果
ａ．５，６ＢＺＦの安定的な０．５％処方を明示した。
【００５８】
ｉ．処方：１００ｍＬのエタノール／ＰＥＧ４００（１：１）中で０．５ｇの５，６ＢＺＦ。
【００５９】
溶媒：エタノール  ＥＭＳＵＲＥ（登録商標）メルク社カタログ１．００９８３番、バッチＫ４２７５４１８３。
【００６０】
ポリエチレン４００、フルカ社カタログ８１１７０番、バッチ２６０１５４  ２８６またはＰＥＧ４００、アルドリッチ社カタログ２０２３９８番。
【００６１】
ii．安定性：調製後の６か月で観察された分解産物なし。
【００６２】
ｂ．ヒトにおける使用：当該処方は、強度の脂漏を患い、且つイソトレチノインでの経口治療には適さない１１人の患者、６人がニキビ、４人が酒さ、１人が脂漏性皮膚炎を伴う患者の顔面に対して１日１回適用された。
【００６３】
i．副作用は認められず、特に小嚢胞の発現を示唆する臨床的兆候は認められなかった。これは、動物で得られた所見の確認をヒトに与えるものである。ＡｈＲ受容体の活性化のこの分野において種の感応性は非常に重要な意味をもつ；仮に試験のために選択されたマウス系統がＴＣＤＤおよび５，６ＢＺＦの局所的作用に対して最も感受性があったとしても。そのためヒトにおけるこの耐性は最も重要なオリジナルデータに値する。それは体内で寿命が短いアゴニストの使用に関するＷＯ２００９／０９３２０７における教示の正確さを裏付け、且つその明確な適用の例証を与える。
【００６４】
ii．脂漏は、適用の２〜３か月後の効果の明確な出現を伴って、著しく減少した。ニキビ、酒さおよび脂漏性皮膚炎の症状は、有意に改善または取り除かれた。予め０．４〜０．５ｍｇ／ｂｗ／ｄａｙの中間用量のイソトレチノインを経口投与を受けた患者は、彼らがそれゆえに刺激や不快症状を抑えて処方された局所的な５，６ＢＺＦで同様の効果を得たと判断された。
【００６５】
iii．処置後の６人において産生された皮脂の総量を測定するためのＳｅｂｕｔａｐｅ（登録商標）（ＣＵＤｅｒｍ）パッチテストの使用は、正常な脂漏の範囲に相当するカジュアルレベルを示した。
【００６６】
本発明の局所的医薬組成物は、前記組成物の０．００５重量％〜１重量％、特に０．１重量％〜１重量％の濃度の５，６ベンゾフラボン（５，６BZF）を有し得る。
【００６７】
結論：関連する皮脂腺の生理病理学的における新規な情報に加えて、本発明は、治療上の使用のための候補皮脂抑制分子の迅速な分類を可能にする。
【００６８】
当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく、Ｃ５７ＢＬ／６マウス系統以外の他の実験用哺乳動物において、記載されている活性化シーケンスの再現を提供するという条件において、本発明の方法を実施することができることを容易に理解するだろう。
【００６９】
受容体の活性化力を示すインビトロデータとインビボ効果との間の相違は、恐らく各分子に特有の組織内の動態要素を反映している。そのため本発明の方法主題は、皮膚組織内の脂腺細胞を特異的に標的とする調査を可能にすることを初めて記述する。
【００７０】
臨床レベルで顕著な皮脂抑制効果の誘導が可能なリガンドは、処理の第１週目ほどの初期に第２段階を超える。最大の活性は処理の第１週目ほどの初期に第４段階に達する。
【００７１】
上述の試験の間、本発明によるインビボ試験の後に選択された５，６ベンゾフラボンはヒトにおける局所的適用として皮脂抑制治療での使用可能性を確認する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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