(57)【要約】  本発明は、電荷の斥力相互作用を使用することによりホモダイマータンパク質混合物を調製するための方法に関する。本方法は、異なるタンパク質又は抗体が類似の電荷間の斥力相互作用によりヘテロダイマーを形成しにくく、一方で同じタンパク質又は抗体が反対電荷間の引力相互作用によりホモダイマーを形成しやすいように、残基の一部を反対荷電残基と置換する工程を含む。本発明の方法により得られるホモダイマータンパク質混合物は、同じ標的の異なるエピトープに同時に作用して、異なるソースからの抗原に結合することにより、複数の抗原の効果を同時に阻害する可能性があることから、腫瘍及び他の疾患の免疫学的診断及び治療に対する新規アプローチが提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
単一の組換え細胞クローンを使用することにより２種以上のタンパク質（例えば抗体）を含有する混合物を得るための方法であって、ここでタンパク質はモノマー鎖間の重合により形成されるダイマーの形態であり、２種以上のタンパク質は同じドメインを含有しており、前記方法は、異なるタンパク質からのモノマー鎖が類似の電荷間の斥力相互作用によりヘテロダイマーを形成しにくく、一方で同じタンパク質からのモノマー鎖が反対電荷間の引力相互作用によりホモダイマーを形成しやすいように、１種又は複数のタンパク質の同じドメインにおける２つのモノマー鎖のアミノ酸残基の一部を反対荷電残基と置換する工程を含む、上記方法。
【請求項２】
２種以上のタンパク質（例えば抗体）を含有する混合物であって、ここでタンパク質はモノマー鎖間の重合により形成されるダイマーの形態であり、２種以上のタンパク質は同じドメインを含有しており、異なるタンパク質からのモノマー鎖が類似の電荷間の斥力相互作用によりヘテロダイマーを形成しにくく、一方で同じタンパク質からのモノマー鎖が反対電荷間の引力相互作用によりホモダイマーを形成しやすいように、１種又は複数のタンパク質の同じドメインにおける２つのモノマー鎖の残基の一部が反対荷電残基と置換されている、上記混合物。
【請求項３】
最大で１種のタンパク質の残基が置換されていない、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載の混合物。
【請求項４】
同じドメインが、抗体のＣＨ３ドメイン又は抗体のＦｃ領域を指す、請求項１に記載の方法又は請求項２に記載の混合物。
【請求項５】
抗体が、哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラットに由来する、請求項４に記載の方法又は混合物。
【請求項６】
抗体が、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３）、ＩｇＡ（例えばＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＥ、ＩｇＤ及びＩｇＭ（例えばＩｇＭ１、ＩｇＭ２）からなる群から選択される、請求項４に記載の方法又は混合物。
【請求項７】
同じドメインにおける残基の一部を反対荷電残基と置換する工程が、
（１）タンパク質の２つのモノマー鎖の同じドメイン間の界面残基を得る工程、
（２）工程（１）で得られた界面残基から対になる正電荷及び負電荷を有する対になる残基を選択する工程、並びに
（３）工程（２）で得られた対になる正電荷及び負電荷を有する対になる残基から、残基の１つ又は複数の対（例えば２つの対、３つの対又は４つの対）を選択し、選択された対の残基を反対荷電残基と置換する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
残基の一部が、タンパク質の２つのモノマー鎖の同じドメイン間の界面残基であり、好ましくは、界面残基が、対になる正電荷及び負電荷を有する荷電残基であり、より好ましくは、対になる残基の１つ又は複数の対（例えば２つの対、３つの対又は４つの対）が、反対荷電残基と置換されている、請求項２に記載の混合物。
【請求項９】
荷電残基が、リシン（ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）からなる群から選択される、請求項７に記載の方法又は請求項８に記載の混合物。
【請求項１０】
同じドメインが、抗体のＦｃ領域又はＣＨ３ドメインを指し、対になる正電荷及び負電荷を有する対になる荷電残基が、以下のａ）〜ｈ）
ａ）第１鎖の３５６位のＧｌｕ（Ｅ）及び第２鎖の４３９位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｂ）第１鎖の３５７位のＧｌｕ（Ｅ）及び第２鎖の３７０位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｃ）第１鎖の３７０位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の３５７位のＧｌｕ（Ｅ）、
ｄ）第１鎖の３９２位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の３９９位のＡｓｐ（Ｄ）、
ｅ）第１鎖の３９９位のＡｓｐ（Ｄ）及び第２鎖の３９２位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｆ）第１鎖の３９９位のＡｓｐ（Ｄ）及び第２鎖の４０９位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｇ）第１鎖の４０９位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の３９９位のＡｓｐ（Ｄ）、並びに
ｈ）第１鎖の４３９位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の３５６位のＧｌｕ（Ｅ）
に示す対になる残基からなる群から選択され、
上の８つの残基対の位置が、抗体のＫＡＢＡＴシステムのＥＵナンバリングインデックスにより決定される、請求項７に記載の方法又は請求項８に記載の混合物。
【請求項１１】
同じドメインにおける２つのモノマー鎖の残基を反対荷電残基と置換する工程が、１つのタンパク質について、３９２位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、４０９位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、３９９位のＡｓｐをＬｙｓに置換することを意味する、請求項１０に記載の方法又は混合物。
【請求項１２】
同じドメインにおける残基の一部を反対荷電残基と置換するプロセスが、残基の置換から得られるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を得る工程、及びヌクレオチド配列を組換え宿主細胞で発現させ、残基の置換から得られるタンパク質を得る工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１、３から７まで及び９から１２までのいずれか一項に記載の方法により得られるタンパク質混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ホモダイマータンパク質の混合物を調製するための方法、特に、電荷の斥力相互作用を使用することによりホモダイマータンパク質の混合物を調製するための方法に関する。本発明は更に、この方法により得られるホモダイマータンパク質混合物、及びホモダイマータンパク質混合物を調製するための方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体薬は、この１５年間で大きな進歩を遂げ、製薬業界の推進力となった。１９９６年以来、合計約３０のモノクローナル抗体薬が承認され、９つの薬剤の年間売上は１０億ＵＳドル超に上った。２０１０年、モノクローナル抗体薬全体の売上は、３００億ＵＳドル超であり、年成長率は１０％超であった。モノクローナル抗体は、その標的に対する高い特異性により、単一の標的のみを阻害する。しかしながら、腫瘍、自己免疫疾患、及び他の疾患について代償的な作用を回避するため、複数の標的／シグナル経路を阻害することが必要な場合がある。ウイルス感染については、ウイルスの高い変異率により、一般に、漏れを防止するために複数の抗原部位を阻害することが必要である。複数の代替的解決策がある。１つは、ポリクローナル抗体を使用するか、又は、抗体のＦｃフラグメントを改変することによりヘテロダイマー、例えば二重特異性抗体を得るというものである。別の解決策は、治療のための抗体混合物を使用するというものであり、抗体混合物は、同じ標的の異なるエピトープ、又は異なる標的に対する、２つ以上の抗体を含む。
【０００３】
ＵＳ７２６２０２８は、１つの軽鎖及び異なる重鎖の発現による、２価抗体又は単一の宿主細胞クローンからの２価抗体の混合物を作製するための方法を開示しており、さらに様々な用途における有用性についてスクリーニングされ得る抗体の組合せを作製するための方法も提供する。
【０００４】
ＷＯ／２０１０／０８４１９７には、単一の宿主細胞クローンからの２つ以上の異なる抗体を含む混合物を作製するための方法が記載されている。一実施形態において、異なる１価抗体の混合物が作製されている。別の一実施形態において、１価抗体と２価抗体との混合物が作製されている。この方法において、ホモダイマーは、ＩｇＧ４の２つのＦａｂアームの自然交換現象により安定化され、現象を引き起こすヒンジ領域及びＣＨ３ドメインのいくつかの残基が変更されている。しかしながら、この特許文献は、ヘテロダイマーの存在の問題が完全に解決されるかどうかに言及していない。
【０００５】
ＵＳ５７８９２０８及びＵＳ６３３５１６３には、ポリクローナル抗体のライブラリーを発現させるための方法が記載されており、ポリクローナルＦａｂフラグメントのライブラリーは、ファージ提示ベクター上で発現され、次に抗原の反応性についてスクリーニングされた。重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子の選択された組合せが、対に結合された形で定常領域遺伝子を含む真核細胞発現ベクター内へ導入され、完全ポリクローナル抗体のサブライブラリーが得られる。サブライブラリーを骨髄腫細胞内にトランスフェクトさせた後、安定なクローンは抗体を生成すると考えられ、これらを混合してモノクローナル抗体の混合物を得ることができる。この方法を使用することにより、混合されたトランスフェクト細胞群を培養することによって１つの組換え生産プロセスでポリクローナル抗体を直接得ることが理論上可能であるとはいえ、混合された細胞群の安定性、したがって生成されたポリクローナル抗体の一貫性の観点から、潜在的問題が存在し得る。薬学的に許容される大規模（工業）生産方法において、群全体で異なる細胞を制御することは困難な課題である。例えば、細胞の増殖速度及び抗体の生産速度等の特性は、ポリクローナル抗体の混合物中の抗体の比が一定に保たれ得るよう、非クローン性群中のすべての単一のクローンについて安定に保たれるべきである。したがって、混合抗体の生産は、当技術分野において実現されているかもしれないが、経済的及び実際的に大規模製造に適した好適な解決策は依然として存在しない。
【０００６】
最近、Ｍｅｒｃｋ社とデンマークのＳｙｍｐｈｏｇｅｎ  Ａ／Ｓ社は、Ｓｙｍ００４について、世界的な専用実施契約を締結した。Ｓｙｍ００４は、現在開発中の新規抗体混合物であり、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とする。
【０００７】
Ｓｙｍ００４は２つの抗体からなり、リガンド結合、受容体活性化及び下流シグナリングを遮断可能であり、ＥＧＦＲ内在化及び分解を誘導することにより、癌細胞表面からのＥＧＦＲ受容体の除去を誘発するとも考えられている。Ｓｙｍ００４は現在、以前に標準的化学療法及び市販の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体での治療を受けたことがある、早期野生型ＫＲＡＳ転移大腸癌（ｍＣＲＣ）に罹患した患者の治療のためのフェーズＩ／ＩＩの治験において評価されている。加えて、抗ＥＧＦＲベースの治療に失敗した、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）に罹患した患者のフェーズＩＩの治験が現在進行中である。
【０００８】
Ｓｙｍｐｈｏｇｅｎ  Ａ／Ｓ社の抗体混合物技術は、以下の工程、すなわち、まず、抗体スクリーニングプラットフォームにより同じ標的に対する複数の抗体を得る工程、次に、それぞれの抗体の分子構築を実施する工程、振とうフラスコ内で細胞を培養する工程、及び細胞を混合する工程、及び漸次増幅培養により細胞混合物を培養する工程、次に最適化された精製を実施し、最終産物を得る工程を含む。しかしながら、この方法は依然として、不安定な細胞増殖速度及び抗体生産速度に起因する問題を伴う。なぜなら、組換え宿主細胞が、様々なホモダイマーの混合物を作製するための方法において使用されるからである。この方法では単一の細胞で単一の抗体を発現させるので、この方法にはヘテロダイマーの問題を伴わない。
【０００９】
すべての手段において、２種以上のタンパク質又は抗体を単一の組換え細胞クローンで作製することができれば、タンパク質又は抗体混合物を作製するのにより理想的であると考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
大規模な実験に基づき、本発明者らは、２種以上のタンパク質又は抗体を単一の組換え細胞クローンから同時に調製するための方法を開発した。本発明は、具体的には、以下の態様を含む。すなわち、
本発明の第１の態様は、単一の組換え細胞クローンを使用することにより２種以上のタンパク質を含有する混合物を得るための方法であって、ここでタンパク質はモノマー鎖間の重合により形成されるダイマーの形態であり、２種以上のタンパク質は同じドメインを含有しており、前記方法は、異なるタンパク質からのモノマー鎖が類似の電荷間の斥力相互作用によりヘテロダイマーを形成しにくく、一方で同じタンパク質からのモノマー鎖が反対電荷間の引力相互作用によりホモダイマーを形成しやすいように、１種又は複数のタンパク質の同じドメインにおける２つのモノマー鎖の残基の一部を反対荷電アミノ酸（単数又は複数）と置換する工程を含む、上記方法に関する。
【００１１】
本発明の一実施形態において、タンパク質は、抗体又は抗体の一部を含む融合タンパク質である。
【００１２】
本発明の第１の態様のうちいずれか一つの実施形態による方法において、最大で１種のタンパク質の残基が置換されていない。本発明の一実施形態において、一方のタンパク質の残基は置換されていないが、他方のタンパク質の残基は置換されている。本発明の別の一実施形態において、２種のタンパク質の残基は両方とも置換されている。
【００１３】
複数（２種以上）のタンパク質の残基が置換される場合、異なるタンパク質間で置換された残基の位置のうち少なくとも１種が異なっており、好ましくは、異なるタンパク質間で置換された残基のすべての位置が異なっている。
【００１４】
本発明の第１の態様のうちいずれか一つの実施形態による方法において、同じドメインは、抗体のＣＨ３ドメインを指す。
【００１５】
本発明の第１の態様のうちいずれか一つの実施形態による方法において、同じドメインは、抗体のＦｃ領域を指す。
【００１６】
本発明の第１の態様のうちいずれか一つの実施形態による方法において、抗体は哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラットに由来する。
【００１７】
本発明の第１の態様のうちいずれか一つの実施形態による方法において、抗体は、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３）、ＩｇＡ（例えばＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＥ、ＩｇＤ及びＩｇＭ（例えばＩｇＭ１、ＩｇＭ２）からなる群から選択される。
【００１８】
本発明の第１の態様のうちいずれか一つの実施形態による方法において、同じドメインにおける残基の一部を反対荷電残基と置換する工程は、
（１）タンパク質の２つのモノマー鎖の同じドメイン間の界面残基を得る工程、
（２）工程（１）で得られた界面残基から、対になる正電荷及び負電荷を有する対になる残基を選択する工程、並びに
（３）工程（２）で得られた対になる正電荷及び負電荷を有する対になる残基から、残基の１つ又は複数の対（例えば２つの対、３つの対又は４つの対）を選択し、選択された対の残基を反対荷電残基と置換する工程
を含む。
【００１９】
本発明の一実施形態において、荷電アミノ酸は、リシン（ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）からなる群から選択される。
【００２０】
本発明の一実施形態において、同じドメインは、抗体のＦｃ領域又はＣＨ３ドメインを指し、対になる正電荷及び負電荷を有する対になる荷電残基は、以下のａ）〜ｈ）
ａ）第１鎖の３５６位のＧｌｕ（Ｅ）及び第２鎖の４３９位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｂ）第１鎖の３５７位のＧｌｕ（Ｅ）及び第２鎖の３７０位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｃ）第１鎖の３７０位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の３５７位のＧｌｕ（Ｅ）、
ｄ）第１鎖の３９２位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の３９９位のＡｓｐ（Ｄ）、
ｅ）第１鎖の３９９位のＡｓｐ（Ｄ）及び第２鎖の３９２位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｆ）第１鎖の３９９位のＡｓｐ（Ｄ）及び第２鎖の４０９位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｇ）第１鎖の４０９位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の３９９位のＡｓｐ（Ｄ）、並びに
ｈ）第１鎖の４３９位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の３５６位のＧｌｕ（Ｅ）
に示す対になる残基からなる群から選択され、
上の８つの残基対の位置は、抗体のＫＡＢＡＴシステムのＥＵナンバリングインデックスにより決定される。
【００２１】
本発明の一実施形態において、１種又は複数のタンパク質の同じドメインにおける２つのモノマー鎖の残基の一部を反対荷電残基と置換する工程は、以下の状況の１つ又は任意の組合せを指す。すなわち、
（１）１種のタンパク質について、３９２位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、４０９位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、及び３９９位のＡｓｐをＬｙｓと置換すること、
（２）１種のタンパク質について、３５６位のＧｌｕをＬｙｓと置換すること、及び４３９位のＬｙｓをＧｌｕと置換すること、
（３）１種のタンパク質について、３５７位のＧｌｕをＬｙｓと置換すること、及び３７０位のＬｙｓをＧｌｕと置換すること、
（４）１種のタンパク質について、３５７位のＧｌｕをＬｙｓと置換すること、３７０位のＬｙｓをＧｌｕと置換すること、３９２位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、４０９位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、及び３９９位のＡｓｐをＬｙｓと置換すること、
（５）１種のタンパク質について、３９２位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、及び３９９位のＡｓｐをＬｙｓと置換すること、
（６）１種のタンパク質について、３９９位のＡｓｐをＬｙｓと置換すること、及び４０９位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、
（７）１種のタンパク質について、３９２位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、４０９位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、及び３９９位のＡｓｐをＬｙｓと置換すること、同時に、もう１種のタンパク質について、３５７位のＧｌｕをＬｙｓと置換すること、及び３７０位のＬｙｓをＧｌｕと置換すること、並びに
（８）１種のタンパク質について、３９２位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、４０９位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、及び３９９位のＡｓｐをＬｙｓと置換すること、同時に、もう１種のタンパク質について、３５６位のＧｌｕをＬｙｓと置換すること、及び４３９位のＬｙｓをＧｌｕと置換すること。
【００２２】
本発明の一実施形態において、配列番号２に示す配列における対になる正電荷及び負電荷を有する対になる荷電残基は、以下のａ１）〜ｈ１）に示す８つの残基対である。
ａ１）第１鎖の１６１位のＧｌｕ（Ｅ）及び第２鎖の２４４位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｂ１）第１鎖の１６２位のＧｌｕ（Ｅ）及び第２鎖の１７５位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｃ１）第１鎖の１７５位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の１６３位のＧｌｕ（Ｅ）、
ｄ１）第１鎖の１９７位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の２０４位のＡｓｐ（Ｄ）、
ｅ１）第１鎖の２０４位のＡｓｐ（Ｄ）及び第２鎖の１９７位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｆ１）第１鎖の２０４位のＡｓｐ（Ｄ）及び第２鎖の２１４位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｇ１）第１鎖の２１４位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の２０４位のＡｓｐ（Ｄ）、
ｈ１）第１鎖の２４４位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の１６１位のＧｌｕ（Ｅ）。
【００２３】
本発明の一実施形態において、配列番号４に示す配列における対になる正電荷及び負電荷を有する対になる荷電残基は、以下のａ２）〜ｈ２）に示す８つの残基対である。
ａ２）第１鎖の３９９位のＧｌｕ（Ｅ）及び第２鎖の４８２位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｂ２）第１鎖の４００位のＧｌｕ（Ｅ）及び第２鎖の４１３位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｃ２）第１鎖の４１３位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の４００位のＧｌｕ（Ｅ）、
ｄ２）第１鎖の４３５位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の４４２位のＡｓｐ（Ｄ）、
ｅ２）第１鎖の４４２位のＡｓｐ（Ｄ）及び第２鎖の４３５位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｆ２）第１鎖の４４２位のＡｓｐ（Ｄ）及び第２鎖の４５２位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｇ２）第１鎖の４５２位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の４４２位のＡｓｐ（Ｄ）、
ｈ２）第１鎖の４８２位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の３９９位のＧｌｕ（Ｅ）。
【００２４】
本発明の第１の態様のうちいずれか一つの実施形態による方法において、同じドメインにおける残基の一部を反対荷電残基と置換するプロセスは、残基の置換から得られるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を得る工程、及びヌクレオチド配列を組換え宿主細胞で発現させ、残基の置換から得られるタンパク質を得る工程を含む。
【００２５】
本発明において、タンパク質混合物は、異なるタンパク質を発現ベクター内に別々にクローニングし、異なる発現ベクターを宿主細胞に同時トランスフェクトし、組換え宿主細胞を培養してタンパク質を発現させることにより、又は、異なるタンパク質を１つの発現ベクター内に作動可能に連結及びクローニングし、更に発現ベクターを培養のための宿主細胞内に導入することにより得られる。
【００２６】
本発明において、置換から得られるアミノ酸配列に基づくコード化ヌクレオチド配列を得るためのプロセスは、当技術分野においてよく知られている。
【００２７】
本発明の第２の態様は、２種以上のタンパク質を含有する混合物であって、ここでタンパク質はモノマー鎖間の重合により形成されるダイマーの形態であり、２種以上のタンパク質は同じドメインを含有しており、異なるタンパク質からのモノマー鎖が類似の電荷間の斥力相互作用によりヘテロダイマーを形成しにくく、一方で同じタンパク質からのモノマー鎖が反対電荷間の引力相互作用によりホモダイマーを形成しやすいように、１種又は複数のタンパク質の同じドメインにおける２つのモノマー鎖の残基の一部が反対荷電アミノ酸（単数又は複数）と置換されている、上記混合物に関する。
【００２８】
本発明の一実施形態において、タンパク質は、抗体又は抗体の一部を含む融合タンパク質である。
【００２９】
本発明の第２の態様のうちいずれか一つの実施形態による混合物において、最大で１種のタンパク質又は抗体の残基が置換されていない。本発明の一実施形態において、一方のタンパク質の残基は置換されていないが、他方のタンパク質の残基は置換されている。本発明の別の一実施形態において、２種のタンパク質の残基は両方とも置換されている。
【００３０】
複数（２種以上）のタンパク質の残基が置換される場合、異なるタンパク質間で置換された残基の位置のうち少なくとも１種が異なっており、好ましくは、異なるタンパク質間で置換された残基のすべての位置が異なっている。
【００３１】
本発明の第２の態様のうちいずれか一つの実施形態による混合物において、同じドメインは、抗体のＣＨ３ドメインを指す。
【００３２】
本発明の第２の態様のうちいずれか一つの実施形態による混合物において、同じドメインは、抗体のＦｃ領域を指す。
【００３３】
本発明の第２の態様のうちいずれか一つの実施形態による混合物において、抗体は哺乳動物、例えばヒト、マウス又はラットに由来する。
【００３４】
本発明の第２の態様のうちいずれか一つの実施形態による混合物において、抗体は、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３）、ＩｇＡ（例えばＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＥ、ＩｇＤ及びＩｇＭ（例えばＩｇＭ１、ＩｇＭ２）からなる群から選択される。
【００３５】
本発明の第２の態様のうちいずれか一つの実施形態による混合物において、残基の一部は、タンパク質の２つのモノマー鎖の同じドメイン間の界面残基であり、好ましくは、界面残基は、対になる正電荷及び負電荷を有する荷電残基であり、より好ましくは、対になる残基の１つ又は複数の対（例えば２つの対、３つの対又は４つの対）は、反対荷電残基と置換されている。
【００３６】
本発明の一実施形態において、荷電アミノ酸は、リシン（ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ）からなる群から選択される。
【００３７】
本発明の一実施形態において、同じドメインは、抗体のＦｃ領域又はＣＨ３ドメインを指し、対になる正電荷及び負電荷を有する対になる荷電残基は、以下のａ）〜ｈ）
ａ）第１鎖の３５６位のＧｌｕ（Ｅ）及び第２鎖の４３９位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｂ）第１鎖の３５７位のＧｌｕ（Ｅ）及び第２鎖の３７０位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｃ）第１鎖の３７０位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の３５７位のＧｌｕ（Ｅ）、
ｄ）第１鎖の３９２位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の３９９位のＡｓｐ（Ｄ）、
ｅ）第１鎖の３９９位のＡｓｐ（Ｄ）及び第２鎖の３９２位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｆ）第１鎖の３９９位のＡｓｐ（Ｄ）及び第２鎖の４０９位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｇ）第１鎖の４０９位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の３９９位のＡｓｐ（Ｄ）、並びに
ｈ）第１鎖の４３９位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の３５６位のＧｌｕ（Ｅ）
に示す対になる残基からなる群から選択され、
上の８つの残基対の位置は、抗体のＫＡＢＡＴシステムのＥＵナンバリングインデックスにより決定される。
【００３８】
本発明の一実施形態において、１種又は複数のタンパク質の同じドメインにおける２つのモノマー鎖の残基の一部を反対荷電残基と置換する工程は、以下の状況の１つ又は任意の組合せを指す。すなわち、
（１）１種のタンパク質について、３９２位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、４０９位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、及び３９９位のＡｓｐをＬｙｓと置換すること、
（２）１種のタンパク質について、３５６位のＧｌｕをＬｙｓと置換すること、及び４３９位のＬｙｓをＧｌｕと置換すること、
（３）１種のタンパク質について、３５７位のＧｌｕをＬｙｓと置換すること、及び３７０位のＬｙｓをＧｌｕと置換すること、
（４）１種のタンパク質について、３５７位のＧｌｕをＬｙｓと置換すること、３７０位のＬｙｓをＧｌｕと置換すること、３９２位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、４０９位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、及び３９９位のＡｓｐをＬｙｓと置換すること、
（５）１種のタンパク質について、３９２位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、及び３９９位のＡｓｐをＬｙｓと置換すること、
（６）１種のタンパク質について、３９９位のＡｓｐをＬｙｓと置換すること、及び４０９位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、
（７）１種のタンパク質について、３９２位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、４０９位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、及び３９９位のＡｓｐをＬｙｓと置換すること、同時に、もう１種のタンパク質について、３５７位のＧｌｕをＬｙｓと置換すること、及び３７０位のＬｙｓをＧｌｕと置換すること、並びに
（８）１種のタンパク質について、３９２位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、４０９位のＬｙｓをＡｓｐと置換すること、及び３９９位のＡｓｐをＬｙｓと置換すること、同時に、もう１種のタンパク質について、３５６位のＧｌｕをＬｙｓと置換すること、及び４３９位のＬｙｓをＧｌｕと置換すること。
【００３９】
本発明の一実施形態において、配列番号２に示す配列における対になる正電荷及び負電荷を有する対になる荷電残基は、以下のａ１）〜ｈ１）に示す８つの残基対である。
ａ１）第１鎖の１６１位のＧｌｕ（Ｅ）及び第２鎖の２４４位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｂ１）第１鎖の１６２位のＧｌｕ（Ｅ）及び第２鎖の１７５位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｃ１）第１鎖の１７５位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の１６３位のＧｌｕ（Ｅ）、
ｄ１）第１鎖の１９７位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の２０４位のＡｓｐ（Ｄ）、
ｅ１）第１鎖の２０４位のＡｓｐ（Ｄ）及び第２鎖の１９７位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｆ１）第１鎖の２０４位のＡｓｐ（Ｄ）及び第２鎖の２１４位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｇ１）第１鎖の２１４位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の２０４位のＡｓｐ（Ｄ）、
ｈ１）第１鎖の２４４位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の１６１位のＧｌｕ（Ｅ）。
【００４０】
本発明の一実施形態において、配列番号４に示す配列における対になる正電荷及び負電荷を有する対になる荷電残基は、以下のａ２）〜ｈ２）に示す８つの残基対である。
ａ２）第１鎖の３９９位のＧｌｕ（Ｅ）及び第２鎖の４８２位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｂ２）第１鎖の４００位のＧｌｕ（Ｅ）及び第２鎖の４１３位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｃ２）第１鎖の４１３位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の４００位のＧｌｕ（Ｅ）、
ｄ２）第１鎖の４３５位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の４４２位のＡｓｐ（Ｄ）、
ｅ２）第１鎖の４４２位のＡｓｐ（Ｄ）及び第２鎖の４３５位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｆ２）第１鎖の４４２位のＡｓｐ（Ｄ）及び第２鎖の４５２位のＬｙｓ（Ｋ）、
ｇ２）第１鎖の４５２位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の４４２位のＡｓｐ（Ｄ）、
ｈ２）第１鎖の４８２位のＬｙｓ（Ｋ）及び第２鎖の３９９位のＧｌｕ（Ｅ）。
【００４１】
本発明の第３の態様は、本発明の第１の態様のうちいずれか一つの実施形態の方法により得られるタンパク質混合物に関する。
【００４２】
ＣＨ３ドメインを含有するポリペプチドが残基間の相互作用により相互作用界面を形成してダイマーを形成することから、本発明の一実施形態において、ホモダイマー混合物を得るための方法が記載され、ヘテロダイマーにおける２つのＣＨ３ドメイン間の引力相互作用を、ＣＨ３ドメインの相互作用界面上の残基を改変することにより電荷の斥力作用を介して減少させ、ホモダイマーの混合物をもたらすことができる。一般的に、関連残基を荷電残基として改変することにより、ヘテロダイマーのＣＨ３−ＣＨ３界面上に電荷の斥力作用を形成できる。いくつかの場合において、界面上で正電荷を有する所定のアミノ酸（リシン、アルギニン、ヒスチジン）を負電荷を有するもの（アスパラギン酸、グルタミン酸）に変異させると斥力作用が形成される可能性があり、逆もまた同様である。
【００４３】
本発明の一実施形態において、ＣＨ３−ＣＨ３界面上で残基が相互作用する際に、対になっている荷電残基間の相互作用を決定し、任意の１つ又は複数の残基を選択し、ホモダイマー及びヘテロダイマーの形成に対する選択された残基の効果を分析し、次に、選択された残基を荷電残基に変異させ、変異後にホモダイマー及びヘテロダイマーの形成に対する変異残基の効果を調査し、次に、変異前後の効果を比較するが、ここで適切な変異は、ホモダイマーの形成を強化し、ヘテロダイマーの形成を減弱化する効果をもたらすと予想される。最後に、ホモダイマーの形成を強化してヘテロダイマーの形成を減弱化する効果が最大化されるような、残基の適切な変異を選択する。
【００４４】
特定の一実施形態において、上に記載の方法は、以下のとおり定義される。すなわち、ホモダイマータンパク質のＣＨ３ドメインにおける対になる荷電残基を反対荷電残基に変異させると、対になる反対荷電残基の引力相互作用によりもたらされる相互作用により、２つのモノマー鎖のＦｃ間にホモダイマーが形成され得るが、一方で、１つの鎖上の対になるアミノ酸の電荷の電気特性の交換によりもたらされる類似の電荷の斥力相互作用により、ヘテロダイマーは形成され得ないことから、ホモダイマーのみを含むＦｃ抗体又はＦｃ融合タンパク質混合物が得られる。
【００４５】
本発明において、ポリペプチドとも呼ばれるタンパク質は、１０より多くの残基、好ましくは５０より多くの残基、より好ましくは１００より多くの残基を含有する。本発明の一実施形態において、タンパク質は、抗体であるか、又は抗体の一部を含む。本発明の特定の実施形態において、タンパク質は、ＩｇＧ１のＦｃフラグメントである。本発明の別の一実施形態において、タンパク質は、単鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）とＩｇＧ１のＦｃフラグメントとの融合タンパク質である。
【００４６】
本発明において、宿主細胞は、タンパク質又は抗体を発現させるのに好適な細胞、例えば原核細胞又は真核細胞である。原核細胞の一例は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）であり、真核細胞の例は、酵母細胞又は哺乳動物細胞であり、哺乳動物細胞の例は、ヒト上皮細胞（例えば２９３Ｈ）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又は骨髄腫細胞である。
【００４７】
本発明において、異なるタンパク質は同じドメインを含有する。本発明の一実施形態において、同じドメインは、抗体のＣＨ３ドメイン又は抗体のＦｃ領域を指す。
【００４８】
本発明において、単一ポリペプチドとも呼ばれるモノマー鎖は、ダイマータンパク質を形成する１つのモノマー又は１つのサブユニットを指す。本発明の一実施形態において、ダイマーを形成する２つのモノマー鎖は対称的であり、すなわち、２つのモノマー鎖の配列は同じである。
【００４９】
本発明において、残基の置換は、ダイマータンパク質を形成する２つのモノマー鎖の対応する位置の残基の置換を指す。
【００５０】
本発明において、ダイマーは、タンパク質又は核酸の形成中に、２つのサブユニット又は２つのモノマーにより形成される組合せを指し、サブユニット又はモノマーは、共有結合又は非共有結合により結合され得るのであり、ホモダイマーは、ダイマーを形成する２つのサブユニットの配列が同じことを意味し、ヘテロダイマーは、ダイマーの２つのサブユニットが異なることを意味する。
【００５１】
本発明において、ドメインは、生体高分子において、特にタンパク質において、特定の構造及び独立した機能を有する領域を指す。本発明の一実施形態において、ドメインは、抗体のＣＨ３ドメイン及び抗体のＦｃ領域を指す。
【００５２】
本発明において、界面残基は、ドメイン間の接触界面を形成する残基を指す。界面残基は、２つ以上の残基からなる。
【００５３】
本発明において、１種のタンパク質又は同じタンパク質は、１つのヌクレオチド配列から発現されるタンパク質、すなわちホモダイマーとして形成されるタンパク質を指す。
【００５４】
本発明の方法を使用して得られるタンパク質又は抗体混合物は、２種以上のタンパク質又は抗体ホモダイマーの混合物、好ましくは２種のタンパク質又は抗体ホモダイマーの混合物であり得る。
【００５５】
本発明の一実施形態において、ＣＨ３を含有するドメインは、ＣＨ３ドメインのみ、又はＣＨ３ドメインを含有するヒト免疫グロブリンＦｃ領域であり得る。一般に、ヒト免疫グロブリンＦｃ領域のＣＨ３ドメインのポリペプチドは、野生型ヒト免疫グロブリンＦｃ領域に由来する。野生型ヒト免疫グロブリンＦｃは、ヒト個体群内に生じるアミノ酸配列を指す。もちろん、Ｆｃ配列は個体間で若干異なり得る。本発明におけるヒト免疫グロブリンＦｃはまた、野生型ヒト免疫グロブリンＦｃ配列と比較して複数の残基が変化した断片も含有し、例えば、糖鎖付加部位で変異したいくつかの残基又は他の変異を含む、Ｆｃ領域におけるいくつかの残基の変化を有する断片を含有する。ＣＨ３ドメインの配列は、例えば、配列番号２の１４８位〜２５２位に示す配列であり得る。Ｆｃ領域の配列は、例えば、配列番号２の２６位〜２５２位に示す配列であり得る。
【００５６】
本発明において、「ヒト免疫グロブリンＦｃ」という用語は、ヒト免疫グロブリン結晶化可能フラグメントを指し、ヒト免疫グロブリン鎖定常領域、特に免疫グロブリン重鎖定常領域のＣ末端部である。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖のＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４の２つ以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域との組合せを含んでいてもよい。本明細書において、ＩｇＧのＦｃ領域は、下部ヒンジ領域−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインに相当する（ＩｇＧについて、ＣＨ２及びＣＨ３は、Ｃγ２及びＣγ３ドメインとも呼ばれる）。ヒトＩｇＧ１のバックグラウンドでは、ＫａｂａｔシステムにおけるＥＵインデックスによれば、下部ヒンジ領域は、２２６位〜２３６位を指し、ＣＨ２ドメインは２３７位〜３４０位を指し、ＣＨ３ドメインは３４１位〜４４７位を指す。重鎖定常領域のアミノ酸配列により、免疫グロブリンは異なるタイプへと分けることができる。主に５つのタイプの免疫グロブリンが存在する。すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭであり、免疫グロブリンのいくつかは、更にサブタイプ（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−４、ＩｇＡ−１及びＩｇＡ−２に分けることができる。他のＩｇＧサブタイプの類似のドメインは、ＩｇＧサブタイプの重鎖又は重鎖フラグメントを、ヒトＩｇＧ１の重鎖又は重鎖フラグメントのアミノ酸配列と比較することにより決定できる。特定の免疫グロブリンタイプ及びサブタイプからの特定の免疫グロブリンＦｃ領域を選択することは、当業者の能力の範囲内である。免疫グロブリンモノマーの残基相互作用界面は、ヒトとマウスとの間で高度に保存されているので、電荷の斥力相互作用を使用することによりホモダイマータンパク質又は抗体混合物を調製する方法はまた、ヒト及びマウス両方のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭにも好適である。関連する方法はまた、ＣＨ３ドメインの非荷電残基を荷電残基に変異させるのにも好適である。
【００５７】
本発明において、Ｆｃ領域の残基は、免疫グロブリン重鎖のためのＥＵインデックスによりナンバリングされる（Ｋａｂａｔら、免疫学的に関心を引くタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年）、参照のためここに引用する）。ＫａｂａｔシステムのＥＵインデックスは、ヒトＩｇＧ１抗体のためのＥＵ残基ナンバリングを指す。抗体Ｆｃ領域のアミノ酸配列の位置は、Ｋａｂａｔらにおいて言及されているＥＵインデックスで示される。
【００５８】
本発明において、ホモダイマータンパク質混合物を作製するための抗体プロトタイプは、抗体、免疫グロブリン、Ｆｃ融合ポリペプチド、Ｆｃコンジュゲート（図２参照）であり得るが、このリストに限定することは意図されていない。
【００５９】
本発明において、ホモダイマータンパク質は、Ｆｃ領域を含有するポリペプチドのホモダイマータンパク質であってもよく、これは抗体、Ｆｃ融合タンパク質、Ｆｃコンジュゲート、Ｆｃ由来ポリペプチド、単離Ｆｃ及びそれらの断片を含むが、これに限られるものではない。したがって、ホモダイマータンパク質は、天然ポリペプチド、天然ポリペプチドの変異型、天然ポリペプチドの改変形態、合成ポリペプチド又は非タンパク質断片を含有するポリペプチドであってもよい。天然ポリペプチドの改変形態は、天然遺伝子によりコードされないポリペプチドである。例えば、改変ポリペプチドは、キメラ抗体又はヒト化抗体であり得る。
【００６０】
本発明において、ホモダイマー混合物は、標準的実験手法で組換え細胞から精製されてもよい。例えば、ホモダイマータンパク質がＦｃ領域を含むとき、タンパク質はプロテインＡを使用して精製されてもよい。精製方法は、クロマトグラフィー法、例えばサイズ排除、イオン交換、親和性クロマトグラフィー及び限外濾過を含むが、これに限定されるものではない。本発明のホモダイマー混合物の分離及び精製方法はまた、上の方法の任意の適切な組合せを含む。
【００６１】
本発明は更に、ホモダイマータンパク質又は抗体を構成するための改変モノマー鎖又は改変単一ポリペプチドに関する。
【００６２】
本発明は更に、改変ホモダイマータンパク質又は抗体（又はモノマー鎖又は単一ポリペプチド）をコードする核酸配列に関する。
【００６３】
本発明は更に、改変ホモダイマータンパク質又は抗体（又はモノマー鎖又は単一ポリペプチド）を含む医薬組成物に関する。
【発明の効果】
【００６４】
異なるタンパク質の同じドメイン（例えば抗体のＦｃ）間の相互作用により、ホモダイマー及びヘテロダイマーの形成は動的で複雑なプロセスであり、これは、ホモダイマーの界面残基の相互作用による安定なホモダイマーの形成、及びヘテロダイマーの界面残基の相互作用による安定なヘテロダイマーの形成、並びに、ホモダイマーの存在によるヘテロダイマーの含有量の動的変化、及びヘテロダイマーの存在によるホモダイマーの含有量の動的変化を伴う。本発明は、単一の組換え細胞クローンで２種以上のタンパク質又は抗体の混合物を調製するための方法を提供し、この方法は、タンパク質又は抗体のホモダイマーの含有量を増加させることができ、他の望ましくない産物、例えばヘテロダイマーの含有量を減少させることができる。実験結果は、本発明により得られるタンパク質又は抗体混合物が、純粋な成分及び所望の安定性を有することを示す。本発明により調製されるタンパク質又は抗体混合物は、同じ標的の異なるエピトープに同時に作用するか、又は異なる抗原の機能を同時に阻害する可能性があることから、腫瘍及び他の疾患の治療のための新規方法及び常法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】組換えベクターｐｃＭＶβ−ＳＰ−Ｆｃの構造の概略図である。
【図２】組換えベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｚｅｏ−ＳｃＦｖ−Ｆｃの構造の概略図である。
【図３】ヒト（ａ）及びマウス（ｂ）ＩｇＧサブタイプ配列のアラインメントの図である。図において、重鎖のＣＨ３のアラインメントが実施され、星印（＊）で示される残基は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃの結晶構造によるＣＨ３−ＣＨ３相互作用領域の残基であり、四角囲みで示される残基は、ホモダイマー混合物を形成しやすいアミノ酸変異を表す。ＩｇＧの荷電残基のほとんどが、高度に保存されていることに留意すべきである。（ｃ）は、他の抗体サブタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｄＤ及びＩｇＭ）のＣＨ３配列の比較を表す。（ｂ）及び（ｃ）における星印（＊）は、ヒトＩｇＧ１によるＣＨ３−ＣＨ３相互作用領域における残基を表す。
【図４】野生型における電荷の相互作用及び変異体における電荷の相互作用の概略図であり、後者はヘテロダイマーの形成を阻害し、ホモダイマーの形成を増進する。（ａ）野生型の場合には、電荷の相互作用がヘテロダイマー及びホモダイマーの両方の形成を促進する。（ｂ）１つの鎖のＦｃ領域のＣＨ３ドメインにおける二重変異（Ｄ３９９Ｋ及びＫ４０９Ｄ）の場合には、電荷の斥力相互作用により、ヘテロダイマーは形成され得ないことから、電荷の引力相互作用によりホモダイマー混合物が容易に形成され得る。
【図５】ホモダイマー（ＳｃＦｖ−Ｆｃ／ＳｃＦｖ−Ｆｃ及びＦｃ／Ｆｃ）及びヘテロダイマー（ＳｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ）の電気泳動解析の結果を示す図であり、レーンＭは、分子量マーカー（上の３つの断片は、上から下に１０４ＫＤ、７８ＫＤ及び５０ＫＤを表す）を示し、レーン１〜９はそれぞれ、表５における変異組合せ０〜８である。
【図６】３１日間の加速安定性試験におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の結果を示す図であり、Ｃｏｎｔｒｏｌは野生型、ｓｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ−ｍｉｘ１は変異組合せ１、ｓｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ−ｍｉｘ１３は変異組合せ４、ｓｃＦｖ−Ｆｃｍｉｘ１／Ｆｃ−ｍｉｘ２は変異組合せ６である。
【図７】３１日間の加速安定性試験におけるＣＥ−ＳＤＳ解析の結果を示す図であり、Ｃｏｎｔｒｏｌは野生型、Ｍｉｘ１は変異組合せ１、Ｍｉｘ２は変異組合せ６である。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
本発明の実施形態を、実施例を参照することにより詳細に例示するが、当業者は、以下の実施例は単に本発明を例示するのみであり、本発明を限定するものとみなされるべきでないことを理解すると考えられる。具体的な条件が与えられていない実施例は、従来の条件又は製造者により提示された条件により実施される。製造業者が与えられていない試薬又は機器は、すべて従来の市販製品である。
【００６７】
特に指定しない限り、以下の実施例において使用される実験方法は、従来の方法である。
【００６８】
特に指定しない限り、以下の実施例において使用される材料、試薬等は、市販されている。
【実施例】
【００６９】
（例１：抗体ＦｃフラグメントのＣＨ３ドメインにおける変異残基の選択）
１．配列及び構造の取得
Ｆｃ領域を含有する４８のヒトＩｇＧ１抗体の結晶構造を、タンパク質データベース（ＰＤＢ、ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）から取得し、これら４８の抗体のＦｃフラグメントは、構造類似性検索アルゴリズム上で１ＤＮ２（ＰＤＢ番号）に由来していた（参照文献：Ｙｕｚｈｅｎ  Ｙｅ及びＡｄａｍ  Ｇｏｄｚｉｋ．ＦＡＴＣＡＴ：柔軟な構造比較及び構造類似性検索のためのウェブサーバ（ＦＡＴＣＡＴ：  ａ  ｗｅｂ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｓｅａｒｃｈｉｎｇ）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００４年、３２（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ）：Ｗ５８２〜５８５頁．）。
【００７０】
２．界面残基の決定
界面アミノ酸予測ソフトウェアＣＭＡ（ＵＲＬ：ｈｔｔｐ：／／ｌｉｇｉｎ．ｗｅｉｚｍａｎｎ．ａｃ．ｉｌ／ｃｍａ／）を、残基相互作用の距離に基づき、抗体（ＰＤＢ番号：１ＤＮ２）におけるＣＨ３−ＣＨ３間の接触残基をスクリーニング及び認識するために使用した。アミノ酸残基の接触規則に従い、界面残基は、限界よりも短い距離（側鎖の重原子から他の鎖の残基の任意の重原子まで）を有するものを指す。この実施例において、距離限界は、４．５Å又は５．５Åのいずれかに設定された（Ｂ．Ｅｒｍａｎ、Ｉ．Ｂａｈａｒ及びＲ．Ｌ．Ｊｅｒｎｉｇａｎ．複数の相互作用部位を有する剛体の平衡状態  タンパク質らせんへの応用（Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  ｒｉｇｉｄ  ｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｈｅｌｉｃｅｓ．）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９９７年、１０７：２０４６〜２０５９頁を参照のこと）。ヒト及びマウスＩｇＧサブタイプの残基の接触界面の保存は、図３の配列の多重アラインメントにより決定できた。表１は、残基の接触規則（すなわち、残基間の距離が４．５Åよりも短い）でのスクリーニングにより同定される抗体１ＤＮ２の３４の界面残基を示し、Ａ鎖及びＢ鎖はそれぞれ、抗体１ＤＮ２の第１鎖及び第２鎖を表した。以下の残基の位置は、抗体ＦｃのためのＫＡＢＡＴナンバリングシステムのＥＵインデックスにより指定された。
【表１】
2015522295.tif 000002
【００７１】
３．対になる荷電残基の調査
表１に挙げたＣＨ３−ＣＨ３界面残基に基づき、対になる荷電残基を、残基の電荷に従い選択し、結果を表２に示し、８対の荷電残基が存在した。
【表２】
2015522295.tif 000003
【００７２】
４．荷電残基の変異
表２の結果によれば、抗体１ＤＮ２の２つのＦｃ鎖は、２つの対称的な鎖である。したがって、任意の鎖の対になる残基について、１つの鎖の所定の位置の残基を反対電荷を有する残基に変異させると、抗体の２つの鎖の同じ位置の残基は両方とも変異し、例えば、対になる残基Ｇｌｕ３５６Ａ−Ｌｙｓ４３９Ｂについては、変異の２つのタイプは次のとおりである。すなわち、
１）Ｇｌｕ３５６ＡがＬｙｓ３５６Ａ若しくはＡｒｇ３５６Ａに変異するか、及び／又はＬｙｓ４３９ＡがＧｌｕ４３９Ａ若しくはＡｓｐ４３９Ａに変異する、
２）Ｇｌｕ３５６ＢがＬｙｓ３５６Ｂ若しくはＡｒｇ３５６Ｂに変異するか、及び／又はＬｙｓ４３９ＢがＧｌｕ４３９Ｂ若しくはＡｓｐ４３９Ｂに変異する。
【００７３】
この場合、反対電荷は、正荷電残基（リシン（Ｌｙｓ、Ｋ）又はアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）又はヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ））が負荷電残基（アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）又はグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ））に変異するか、又は負荷電残基（アスパラギン酸又はグルタミン酸）が正荷電残基（リシン又はアルギニン）に変異することを意味する。具体的な変異位置は、表３及び表４に示されるとおりである。
【表３】
2015522295.tif 000004
【表４】
2015522295.tif 000005
【００７４】
加えて、より複雑な場合には、操作はまた、上記方法又は上述の対になる残基の変異の組合せに基づいていてもよい。本発明の解決法に従って（Ｆｃ混合物を調製するために）Ｆｃを改変して抗体混合物を調製するための方法は、上述の単鎖の対になる残基の二重変異又は変異の任意の組合せに限定されなかった。
【００７５】
（例２：抗体ＦｃフラグメントのＣＨ３ドメインにおける残基を改変することによるホモダイマータンパク質混合物の調製）
１．ヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメントを発現させるための組換えベクターｐｃＭＶβ−ＳＰ−Ｆｃの構築
遺伝子データベースにおけるヒトＩｇＧ１のＦｃフラグメント（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）の遺伝子配列により、２つの末端に認識配列としてＨｉｎｄ  ＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ並びに保護塩基をそれぞれ含有する配列番号１に示されるヒトＦｃ遺伝子（７８０ｂｐの長さ、ＳＰ−Ｆｃと命名）を人工合成により得た。Ｆｃ遺伝子をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩで二重消化し、得られた断片を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩで二重消化した哺乳動物細胞のための発現ベクターｐｃＭＶβ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のベクター主鎖に結合して、組換えベクターｐｃＭＶβ−ＳＰ−Ｆｃ（その構造の概略図は図１に示すとおりである）を得た。組換えベクターｐｃＭＶβ−Ｆｃが、ｐｃＭＶβのＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位との間に配列番号１の１６位から７７１位のヌクレオチド配列に示されるＤＮＡ断片が挿入されたベクターであることが、配列決定で判明した。
【００７６】
配列番号１の１６位から７７１位のヌクレオチド配列によりコードされるＦｃタンパク質のアミノ酸配列は、以下のとおりである（配列番号２に示す）。
ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧＧＳＧＧＧＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＮＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２）。
【００７７】
２．ＳｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質を発現させるための組換えベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｚｅｏ−ＳｃＦｖ−Ｆｃの構築
両端に認識配列としてＨｉｎｄ  ＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ並びに保護塩基をそれぞれ含有する配列番号３に示すＳｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子合成により得た。ＳｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質をコードするＯＲＦをＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩで二重消化し、得られた断片を、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄ  ＩＩＩで二重消化した哺乳動物細胞のための発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｚｅｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の主鎖に結合して、組換えベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｚｅｏ−ＳｃＦｖ−Ｆｃ（その構造の概略図は図２に示すとおりである）を得た。組換えベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｚｅｏ−ＳｃＦｖ−Ｆｃが、ｐｃＤＮＡ３．１−ｚｅｏのＥｃｏＲＩ部位とＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位との間に配列番号３の１６位から１４８８位のヌクレオチド配列に示されるＤＮＡ断片が挿入されたベクターであることが、配列決定で判明した。
【００７８】
配列番号３の１６位から１４８８位のヌクレオチド配列によりコードされるＳｃＦｖ−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列は、以下のとおりである（配列番号４に示す）。
ＭＧＷＳＬＩＬＬＦＬＶＡＶＡＴＲＶＬＳＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＩＡＳＧＦＴＦＳＳＹＰＭＴＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＳＩＳＹＤＧＳＹＫＹＫＡＤＳＭＫＧＲＬＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＥＭＮＳＬＴＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＡＦＦＮＡＹＤＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＥＩＶＭＴＱＳＰＡＴＬＳＶＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＲＳＮＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＡＡＳＴＲＡＴＧＩＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＴＬＴＩＳＳＬＱＳＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＮＥＷＦＲＴＳＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＮＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号４）。
【００７９】
配列番号２及び配列番号４の下線部のアミノ酸配列は同じである。
【００８０】
３．変異誘発のためのアミノ酸位置を選択することによる改変組換えベクターの調製
例１の表３及び表４の変異させられる残基に従い、ｓｃＦＶ−Ｆｃ及びＦｃをコードするヌクレオチド配列（配列番号１及び配列番号３）の変異及び組合せ変異のため、オーバーラップＰＣＲ法を使用した。表５の変異組合せ１〜８に示すとおり、改変後、８つの組換えベクターｐｃＤＮＡ３．１−ｚｅｏ−ＳｃＦｖ−Ｆｃ及びｐｃＭＶβ−ＳＰ−Ｆｃを得た。
【表５】
2015522295.tif 000006
【００８１】
４．トランスフェクト細胞及び抗体混合物の検出
工程３における８つの変異組合せを有する発現ベクターを、ＰＥＩで懸濁適応２９３Ｈ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）内に別々にトランスフェクトさせ、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｚｅｏ−ＳｃＦｖ−ＦｃのｐｃＭＶβ−ＳＰ−Ｆｃに対する同時トランスフェクション比は１：１であり、３〜４日後、細胞培養上清を回収した。プロテインＡアガロース樹脂で免疫沈降を実施し、ホモダイマータンパク質又は抗体（ＳｃＦｖ−Ｆｃ／ＳｃＦｖ−Ｆｃ及びＦｃ／Ｆｃ）及びヘテロダイマータンパク質又は抗体（ＳｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ）の含有量を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した。Ｇｅｌ−Ｐｒｏプロフェッショナル画像解析ソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社）を、ホモダイマータンパク質又は抗体（ＳｃＦｖ−Ｆｃ／ＳｃＦｖ−Ｆｃ及びＦｃ／Ｆｃ）及びヘテロダイマータンパク質又は抗体（ＳｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ）の割合を解析するために使用した。結果は、図５及び表６に示すとおりであった。表５における関連する変異組合せをＳｃＦｖ−Ｆｃに導入したとき、ホモダイマーＳｃＦｖ−Ｆｃ／ＳｃＦｖ−Ｆｃ及びＦｃ／Ｆｃの割合が大きく増加し、一方でヘテロダイマー（ＳｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ）は大きく減少した。３つの変異Ｋ３９２Ｄ／Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ（変異組合せ２）又は変異組合せ４、５若しくは６がＦｃに導入されたときは、発現タンパク質は主にＳｃＦｖ−Ｆｃ／ＳｃＦｖ−Ｆｃ及びＦｃ／Ｆｃホモダイマーの形態で存在し（＞９６％）、電荷の斥力相互作用が、ホモダイマーの形成を増進させ、ヘテロダイマーの形成を阻害するために重要であることを示唆する。ＳｃＦｖ−Ｆｃ上の追加の変異（Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０Ｅ又はＥ３５６Ｋ／Ｋ４３９Ｅ）が、ホモダイマーの含有量を有意には増加させなかったが、ヘテロダイマーの含有量を一定の範囲で増加させたことに留意すべきである。加えて、Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０Ｅ／Ｋ３９２Ｄ／Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ（変異組合せ４）がＦｃに導入されたときには、Ｆｃモノマーが現れる（約６％）ので、安定性を更に調査すべきである。
【００８２】
タンパク質又は抗体混合物の組成の解析のために使用される方法は、以下のとおりである。すなわち、融合タンパク質ＳｃＦｖ−ＦｃはＦｃより大きな分子量を有し、したがって、ＳｃＦｖ−Ｆｃ及びＦｃの組合せでは、ホモダイマー（ＳｃＦｖ−Ｆｃ／ＳｃＦｖ−Ｆｃ及びＦｃ／Ｆｃ）及びヘテロダイマー（ＳｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて異なる位置のバンドを示すと考えられる。ホモダイマー及びヘテロダイマーの割合を検出できる。ＳｃＦｖ−Ｆｃ及びＦｃの発現ベクターを同時トランスフェクトさせ、ホモダイマー（ＳｃＦｖ−Ｆｃ／ＳｃＦｖ−Ｆｃ及びＦｃ／Ｆｃ）及びヘテロダイマー（ＳｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ）を同時に視覚化できる。
【表６】
2015522295.tif 000007
【００８３】
プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｚｅｏ−ＳｃＦｖ−ＦｃのｐｃＭＶβ−ＳＰ−Ｆｃに対する同時トランスフェクション比が、ホモダイマーのヘテロダイマーに対する比に与える影響を調査するために、変異組合せ１を有するプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ｚｅｏ−ＳｃＦｖ−Ｆｃ及びｐｃＭＶβ−ＳＰ−Ｆｃを、ＰＥＩで懸濁培養中の２９３Ｈ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）内に、４：１、１：１及び１：４の比で同時トランスフェクトさせ、３〜４日の培養後、細胞培養上清を回収した。プロテインＡアガロース樹脂で免疫沈降を実施し、ホモダイマータンパク質又は抗体（ＳｃＦｖ−Ｆｃ／ＳｃＦｖ−Ｆｃ及びＦｃ／Ｆｃ）及びヘテロダイマータンパク質又は抗体（ＳｃＦｖ−Ｆｃ／Ｆｃ）の含有量を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した。結果を表７に示す。ＳｃＦｖ−ＦｃのＦｃに対する同時トランスフェクション比を変化させることにより、異なるホモダイマーの割合が変化するが、ヘテロダイマーの割合が常に５％未満であることが結果から分かり、変異組合せ１がヘテロダイマーを安定的に排除できることを示唆する。
【表７】
2015522295.tif 000008
【００８４】
本発明によれば、異なるＦｃ鎖を含む２つのプラスミドの同時トランスフェクション比を変化させることにより、異なるホモダイマーの比を一定程度まで調整できるが、ホモダイマー全体の割合は、ヘテロダイマーの割合と同様、有意に変化させることはできず、プラスミドの同時トランスフェクション比が変化してもホモダイマー全体の割合は安定に保たれることを示す。
【００８５】
５．抗体混合物の加速安定性研究
工程４におけるＳＤＳ−ＰＡＧＥでの様々な変異組合せの結果に基づき、本発明者らは、変異組合せ１、４、６及び０（野生型、ｓｃＦｖ−Ｆｃ野生型のみがトランスフェクトされる）の抗体混合物を選択し、３１日間にわたり、４５℃未満で加速安定性研究を実施し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を、０、４、８、１６、２１及び３１日目に実施した。同様に、本発明者らは、変異組合せ１（ミックス１）、組合せ６（ミックス２）及び組合せ０（野生型、対照）の抗体混合物を選択し、ＣＥ−ＳＤＳ（キャピラリー電気泳動）解析を０、８、２１及び３１日目に実施した。
【００８６】
３１日間の加速安定性ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、変異組合せ１及び６が、野生型（ｓｃＦＶ／ｓｃＦＶホモダイマー、対照）抗体混合物と同様、非常に高い安定性を示したことを示した。１６日目から、ＳｃＦｖ−Ｆｃ／ＳｃＦｖ−Ｆｃホモダイマーが部分的に劣化した一方で、Ｆｃ／Ｆｃホモダイマーは、３１日目まで優れた安定性を示した。ＳｃＦＶの不安定性を考慮すると、変異組合せ１及び６の抗体混合物は、野生型Ｆｃと比較して安定性に差がなかったと考えられる。変異組合せ４により作製された抗体混合物に、比較的顕著な劣化が見られ、沈殿が観察されたことに留意すべきである。単一のＦｃ鎖上の５つの変異（すなわち、Ｆｃダイマー上の１０の変異）で、構造が影響を受け、不安定性を引き起こしたと推測される。関連する結果は、図６に示すとおりである。
【００８７】
従来のＳＤＳ−ＰＡＧＥと対照的に、ＣＥ−ＳＤＳは、試料のローディング量が少ない、精確な分子量マーカーを得ることが可能である、紫外線等でのインライン検出、及び定量分析等の利点を有する。したがって、この方法を、ホモダイマー混合物の劣化をより精確に測定するために使用できる。変異組合せ１及び６が、野生型（対照）抗体混合物と同様の良好な安定性を示すことが、図７及び表６から分かった。ＳｃＦｖ−Ｆｃ／ＳｃＦｖ−Ｆｃホモダイマー試料の比較的明らかな劣化ピークが１６日目から現れる。関連する結果は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析の加速安定性結果と一致している。
【表８】
2015522295.tif 000009
【００８８】
本発明を実施するための具体的なモデルを詳細に説明したが、当業者は、これらの詳細は、当技術分野におけるあらゆる教示に従い修正及び変更が可能であり、これら変更が本発明の保護範囲内であることを理解すると考えられる。本発明の全範囲は、添付の請求項及びそれらのあらゆる均等物により定められる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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