(57)【要約】本発明は、人乳製品に渦流を与えて人乳製品を紫外線に曝露させて、人乳製品中の生物学的汚染物質を不活化するための方法及び装置に関する。曝露により、人乳製品中の汚染物質の量が減少され又は不活化され、人乳製品中に存在する生理活性成分の活性は実質的に減少しない。汚染物質は、大腸菌、ブドウ球菌属、ストレプトコッカス属、バシラス属、エンテロコッカス属及びエンテロバクター属を含む群から選択されるか、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、又はヒトＴリンパ球向性ウイルスであってよい。生理活性成分は、炭水化物、脂質、蛋白質、脂肪酸、酵素、抗体、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗菌化合物、又は代謝産物でもよい。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
人乳製品中の生物学的汚染物質の量を減少させる又は不活化する方法であって、該方法は、２００ｎｍ〜２８０ｎｍの波長を有する紫外線（ＵＶ）光に前記人乳を曝露させる、及び、前記汚染物質の前記ＵＶ光への曝露を促進するために前記乳製品に渦流を与える、ことを含み、
前記曝露が、前記乳製品中の前記汚染物質の量を減少させ又は不活化し、前記乳製品中に存在する生理活性成分の活性を実質的に減少させない方法。
【請求項２】
前記渦流が渦によって前記人乳に与えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＵＶ光が２５０ｎｍ〜２７０ｎｍ、好ましくは２５４ｎｍの波長を有する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記渦流が撹拌手段を使用して与えられる、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記渦流が、前記生理活性成分の活性を実質的に減少させずに、前記生物学的汚染物質を前記ＵＶ光に曝露させるのに十分な速度で与えられる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的汚染物質の量が、少なくとも１−Ｌｏｇ１０オーダーで、好ましくは５−Ｌｏｇ１０オーダーで、減少される又は不活化される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記人乳に加えられる紫外線量が１００〜１００００Ｊ／ｌの範囲である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記汚染物質が、大腸菌（E.  coli）、ブドウ球菌属（Staphylococcus  spp.）、ストレプトコッカス属（Streptococcus  spp.）、バシラス属（Bacillus  spp.）、エンテロコッカス属（Enterococcus  spp.）及びエンテロバクター属（Enterobacter  spp.）を含む群から選択されるか、サイトメガロウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、又はヒトＴリンパ球向性ウイルスである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記生理活性成分が、炭水化物、脂質、蛋白質、脂肪酸、酵素、抗体、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗菌化合物、又は代謝産物である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生理活性成分が、胆汁酸塩刺激リパーゼ、アルカリホスファターゼ、ラクトペルオキシダーゼ、ラクトフェリン、リゾチーム及び分泌型ＩｇＡを含む群から選択される蛋白質、ミエロペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシド・ジスムターゼ、又はラクトフェリンであり、好ましくは胆汁酸塩刺激リパーゼ、アルカリホスファターゼ、ラクトフェリン、リゾチーム、分泌型ＩｇＡ、より好ましくは胆汁酸塩刺激リパーゼ、アルカリホスファターゼ、ラクトフェリンである、請求項９の記載の方法。
【請求項１１】
前記人乳製品の静菌性、又は、生理活性成分若しくは抗酸化活性の濃度が、実質的に減少しない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記人乳製品が人乳である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
人乳製品中の生物学的汚染物質の量を減少させる又は不活化する装置において、
ある体積の人乳製品を収容するための容器であって、ＵＶ光源が前記人乳製品をＵＶ光に曝露させるように連結される容器と、
前記汚染物質の前記ＵＶ光源への曝露を促進するために、前記容器内に保持された前記人乳製品に渦流を与える手段と、を備えた装置。
【請求項１４】
前記渦流を与える手段が撹拌手段である、請求項１３に記載の装置。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項の方法によって調製される人乳製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人乳製品（human  milk  product）中の生物学的汚染物質を不活化するための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
殺菌（pasteurization）とは、食品、一般的に液体中に含まれる微生物を死滅又は不活化させて、食品中の微生物の成長による食品の腐敗を防止する処理のことを指す。殺菌は、食品中の生存微生物数を減少させるために、特定の時間、特定の温度へ食品を加熱することにより起こる。このプロセスを熱殺菌と呼ぶ。
【０００３】
牛乳の熱殺菌は１００年以上前から使用されてきた。熱殺菌の２つの一般的な方法では、ミルクを高温に短時間曝し、その後急激に冷却する。第一の熱殺菌の方法は、高温短時間殺菌法（ＨＴＳＴ）と呼ばれ、ミルクを約７２℃の温度に１５〜２０秒間さらす。第二の熱殺菌の方法は、低温長時間殺菌法（ＬＴＬＴ）又は「ホルダー」殺菌と呼ばれ、ミルクを６２．５℃に加熱して３０分間保つ。これらが唯一広く認められている技術である。
【０００４】
現在、熱殺菌は人乳に用いられているただ１つの殺菌法であり、母乳バンク用に現在採用されており、そこでは乳が供与され、スクリーニングされ、自身の母親から乳が得られない乳幼児に提供される。人乳が無菌であることは非常にまれである。現在、さまざまな母乳バンクで収集された母乳の約１５％は、黄色ブドウ球菌（S.  aureus）、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、腸球菌（Enterococci）などの細菌を含んでいるため、廃棄しなければならない。約６％は、細菌の総数が１００，０００コロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）を超えるため、廃棄しなければならない。さらに、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）及びその他のウイルスは人乳によって伝染され、感染して疾患を引き起こすおそれがある。また、疾患の伝染は、熱殺菌に耐える耐熱性芽胞を介して媒介されることもある。
【０００５】
人乳は、ＨＴＳＴ法又はＬＴＬＴ法で殺菌することができる。ホルダー殺菌は、人乳中の大腸菌（Escherichia  coli）、表皮ブドウ球菌（Staphylococcus  epidermidis）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter  cloacae）、セレウス菌（Bacillus  cereus）及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus  aureus）を含むさまざまな菌種を５−ｌｏｇ１０減少させることが可能である（Czank  C,  et  al,  Pediatric  Research  2009;66:374-379）。従って、熱殺菌によって人乳を介した病気の伝染のリスクが最小限に抑えられる。
【０００６】
しかし、人乳中に存在する重要な非耐熱性の生理活性成分は、熱殺菌を施すと変化したり、人乳から喪失されることがある。従って、重要な生理活性成分を変化又は不活化することなく生物学的汚染物質を十分不活化する、人乳を殺菌するための改善された方法を提供する必要がある。
【０００７】
紫外線（ＵＶ）処理は、飲料水、ビール、ワイン、果汁、及びカット果物や全果の殺菌と除菌に採用されており、また、空気浄化や生鮮食品の包装にも採用されてきた。物質の紫外線への曝露、又はＵＶ処理は、非加熱殺菌法に分類される。これは「ＵＶ殺菌」又は「低温殺菌」と当業者に呼ばれている。
【０００８】
紫外線は、可視光よりも短く、Ｘ線よりも長い波長を有する電磁波と定義される。液体を殺菌するために効果的なＵＶ処理には、十分な被ばく量、即ち、生物学的汚染物質の紫外線への十分な曝露が必要である。紫外線が液体を透過する度合は、その液体の溶解性、密度、濁度によって異なる。
【０００９】
これまでの研究では、ＵＶ処理は、不透明な液体の微生物負荷を低減するために使用され得ることが実証されている。しかし、２５４ｎｍの波長で、飲料水とビールの吸収係数はそれぞれ０．１ｃｍ−１と２０ｃｍ−１であるのに対して、ミルクの吸収係数は３００ｃｍ−１と高いので、紫外線で処理するのが困難である。
【００１０】
実際に、大量の液体を処理する場合や、処理をする液体が濁っていて光の透過が制限される場合に、十分なＵＶ曝露が達成されることを確実にするために、様々なフロースルー反応器が開発されてきた。このようなフロースルー反応器は、薄層又は膜に液体を広げるよう設計され、或いは、乱流を液体に与えて、液体がＵＶ光源の周りを流れるようにし、それにより、不透明液と光子源との界面で生物学的汚染物質を光子に曝露させる。このような装置は特許文献１〜５に記載されている。
【００１１】
しかし、牛乳や果汁を殺菌するための現行の方法や装置と関連して多数の不利な点が存在し、人乳の殺菌へのそれらの応用を実行不可能とする。
【００１２】
第一に、現在の方法は、大量の乳の処理を対象とし、大量の乳を源からＵＶ反応器へポンプで送り、その後、複数の反応器を再循環又は通過させる必要がある。人乳は少量でしか収集することができず、このような少量では、これらの大規模反応器の中で失われてしまう。
【００１３】
第二に、反応器にミルクを送り出す必要性に関連するその他の問題として以下が挙げられる：装置の一定部分にミルクが停滞し、生物学的汚染物質の堆積と成長を許してしまう；反応器の表面上に乳固形分が沈殿し、ＵＶ透過の障害と装置の洗浄困難を引き起こす；ミルクに乱流が加えられた結果、乳脂肪球の合一からバターが形成されるなどの望ましくない特性がミルクに与えられる。
【００１４】
これらの装置は維持が困難なことがある。少量の人乳製品を殺菌する方法と、そのための装置があれば望ましく、母乳バンク、病院及びその他の臨床の場で、母乳を授乳する母親が便利に使用することができる。搾乳した母乳を便利に殺菌することができるような方法と装置があれば、安心だろう。
【００１５】
人乳を殺菌する現在の方法が直面している別の問題は、人乳中に存在する様々な重要な生理活性成分の活性の低下及び／又は喪失である。ホルダー殺菌等の人乳を殺菌するための現行の方法は、人乳中の重要な生理活性成分の有効レベルを維持することを考慮せずに、人乳の細菌負荷を低減することを目的としている。人乳の殺菌は、乳業界によって開発された技術に基づいている。乳業界の目的は、牛乳の酵素活性を低減して、それ自体の寿命を長くすることである。人乳においては、人乳の全恩恵を乳幼児に伝達するために酵素活性が必要である。
【００１６】
人乳は、大腸菌、黄色ブドウ球菌及びカンジダ・エスピー（Candida  sp.）の増殖を抑制することが分かっている。人乳のこの静菌性は、ラクトフェリン、リゾチームおよび分泌型ＩｇＡを含む免疫蛋白質に主に起因すると考えられている。ラクトフェリンは、大腸菌などの鉄依存性の病原菌に必要な遊離鉄の有効性を低下させ、それによって、それらの増殖を抑制する鉄結合蛋白質であり、また、細菌細胞表面のリポ多糖体のリピド−Ａ部に結合することにより細菌細胞膜を破壊する。リゾチームは、Ｎ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミン酸との特異的結合の加水分解を触媒することにより、黄色ブドウ球菌などのほとんどのグラム陽性細菌の細胞壁を溶解させる。リゾチームは単独では静菌性であるが、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）研究では、ラクトフェリンの存在下では殺菌性でもあり、ある程度のグラム陰性細菌を殺菌することができることが分かった。分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）は抗体であり、母親と乳幼児が曝される病原菌に反応して特異的に分泌されるので、乳幼児の免疫防御システムを強化する。ｓＩｇＡは、蛋白質分解酵素に対する抵抗性のために、他の免疫グロブリンよりも腸管内で生き残ることができる。ｓＩｇＡは人乳中での抗菌活性については知られていないが、ラクトフェリンやリゾチームの抗菌活性を高め、消化時乳幼児の免疫防御において重要な役割を果たす。このような生理活性成分の活性および保持は、熱殺菌を使用すると悪影響を受ける可能性がある。
【００１７】
従って、現在採用されている方法が直面している問題を克服する、生理活性成分を維持しながら人乳製品を殺菌する改善された方法を提供する必要がある。
【００１８】
文献、行為、資料、装置、論文等の議論は、本発明の背景を提供するためだけに本明細書に含まれる。これらの事項の一部又は全てが、先行技術基準の一部を形成したか、或いは、本出願の各請求項の優先日より前に存在していたために本発明の関連分野では共通の技術常識であったかは、示唆も提示もされない。
【００１９】
「含む」又は「備える」（“comprise”、“comprises”、“comprised”又は“comprising”）という用語は、本明細書（請求項を含む）で使用される場合、記載された特徴、整数、工程、又は構成要素の存在を明記していると解釈されるべきであり、１以上のその他の特徴、整数、工程、構成要素、又はそれらの群の存在を排除すると解釈されるべきではない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許５，６７５，１５３
【特許文献２】米国特許５，５６７，６１６
【特許文献３】米国特許６，５４０，９６７
【特許文献４】米国特許６，５７６，２０１
【特許文献５】ＷＯ０１／３７６７５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
人乳の殺菌は、人乳からその受容者への病気の伝染のリスクを低減するために必要である。また、人乳中に存在する重要な生理活性成分の活性を保護または保持しながら、人乳中の生物学的汚染物質を十分不活化する能力が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
従って、本発明の一態様では、人乳製品中に存在する生物学的汚染物質の量を減少させる又は不活化する方法であって、この方法は、人乳製品を紫外線光（ＵＶ）に曝露させる、及び、乳製品中の汚染物質のＵＶ光への曝露を促進するために乳製品に渦流を与えることを含み、汚染物質のＵＶ光への曝露が、乳製品中の汚染物質の量を減少させ又は不活化し、乳製品中に存在する生理活性成分の活性を実質的に減少させない、方法を提供する。
【００２３】
本発明のさらなる態様によると、人乳製品中の生物学的汚染物質の量を減少させる又は不活化する装置であって、ある体積の人乳製品を収容するための容器であり、人乳製品がＵＶ光に曝露されるようにＵＶ光源が連結される容器と、汚染物質のＵＶ光源への曝露を促進するために、この容器内に保持された人乳製品に渦流を与える手段と、を備える装置を提供する。
【００２４】
本発明のさらなる態様によると、紫外線光（ＵＶ）に乳製品を曝露させる、及び、乳製品中の汚染物質のＵＶ光への曝露を促進するために人乳製品に渦流に与える、ことを含む方法であって、汚染物質のＵＶ光への曝露が、乳製品中の汚染物質の量を減少させ又は不活化し、乳製品中に存在する生理活性成分の活性を実質的に減少させない、方法によって調製される人乳製品を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、本発明の一態様による装置の一実施形態を示す。
【図２】図２は、人乳サンプル中の全固形分と相関するデシマル減少量を示す。
【図３】図３は、長時間紫外線照射した後の人乳サンプル中のアルカリホスファターゼの保持率を示す。
【図４】図４は、未処理の人乳サンプル（白色）と、４８６３Ｊ／ｌの紫外線量のＵＶ−Ｃで処理したサンプル（灰色）の脂肪酸プロフィールの濃度を示す。
【図５】図５は、紫外線に曝した乳と培地に存在するＣＭＶの不活性化を示す。結果をＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表す。
【図６】図６は、未処理、ＵＶ−Ｃ照射した、及びホルダー殺菌した人乳、及びニュートリエントブロス（ＮＢ）の細菌の増殖を示す。
【図７】図７は、ＵＶ−Ｃ照射した人乳中の全固形分濃度とリゾチーム保持率の関係を示す。
【図８】図８は、未処理、ＵＶ−Ｃ照射した、及びホルダー殺菌した人乳の免疫蛋白質濃度を示す。
【図９】図９は、１時間あたりの細菌増殖速度と、分泌型ＩｇＡ、ラクトフェリン、リゾチームの濃度の関係を示す。
【図１０】図１０は、人乳中の免疫蛋白質の濃度の関係を示す。
【図１１】図１１は、本発明の一実施形態による装置の構造配置の概略図である。
【図１２】図１２は、本発明の別の一実施形態による装置の構造配置の概略図である。
【図１３】図１３は、ＵＶ−Ｃの配置（層処理）を示す。
【図１４】図１４は、ＵＶ−Ｃ照射前及びＵＶ−Ｃ照射後の人乳の蛍光測定値を示す。
【図１５】図１５は、さらに何も添加しない、さらにカタラーゼ又はＨ２Ｏ２を添加した、未処理、ＵＶ−Ｃ照射した、及びホルダー殺菌した人乳の蛍光測定値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の態様及び利点のさらなる理解のために、以下の詳細な説明は、添付の図と併せて参照されるべきである。
【００２７】
人乳は、調合乳では乳幼児に与えることができない栄養成分と生理活性成分を含んでいる。従って、母親が自分の母乳を利用できない場合、特に早期産児にとって、ドナーの人乳は最も良い代替物とみなされる（Wight,  NE.  Donor  human  milk  for  preterm  infants.  J  Perinatol  2001;21:249-254）。ドナーのミルクは、正期産児や免疫不全の大人にも役立てられることが実証されている。ドナーの母親から早期産児へ病気が伝染するリスクを最小限にするために、ドナーの人乳は殺菌される。人乳を熱殺菌する現行の方法では、人乳中に存在するさまざまな重要な生理活性成分を減少及び／又は活性喪失させてしまう。このような減少及び／又は喪失の結果、ミルクの品質を低下させる可能性がある。研究により、未殺菌の人乳を飲んだ乳幼児と比較して、熱殺菌された人乳を飲んだ乳幼児の脂肪吸収と成長速度が低下していることが実証されている。
【００２８】
人乳中の重要な生理活性物質と全体的な組成を損なうことなく人乳を殺菌する能力は、乳幼児の新生児医療や母乳バンク等の分野では非常に重要な能力である。
【００２９】
ここで使用する用語「人乳製品」は、人乳、又は、人乳由来若しくは人乳を含む製品を指す。これは、全乳、物質が添加された乳、又は、分離、抽出濃縮、遠心分離、又はウルトラ濾過若しくはナノ濾過などの濾過を含む処理技術や分離技術によって得られる一部の人乳のことを指すこともある。このような乳製品には、搾りたての乳、又は、室温、冷蔵又は冷凍（例えば、０℃以下、−２０℃以下、又は−８０℃以下）で貯蔵されていた乳、初乳、強化された母乳、低脂肪乳製品、砂糖／ラクトースを含まない乳製品、カゼイン、クリーム、ホエイ又は乳固形分が含まれてよい。
【００３０】
以下の説明では人乳の使用を例示するが、これに限定されない。しかし、上述のような人乳製品も同様に本発明の方法に適用できる。
【００３１】
本発明の方法によれば、人乳中の生物学的汚染物質の不活化により、人乳中に存在する重要な生理活性物質の生物活性の保持が可能になり、また、人乳の全体的な組成を維持することも可能になる。このように、この方法は、ホルダー殺菌を使用して得られた製品よりも優れた品質の人乳製品を提供することを可能にする。
【００３２】
ここで使用する用語「生物学的汚染物質」は、ウイルス、細菌、原虫、酵母菌、胞子、カビや藻類などの微生物のことを示すが、これらに限定されない。かかる生物学的汚染物質として、限定はされないが、Ｂ−型（レトロウイルス様粒子）、コクサッキーウイルスＢ３、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エボラウイルス、エコーウイルス１８、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）１型（及び２型）、ヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）、ヒトパピローマウイルス１６、ロタウイルス、風疹ウイルス、シンノンブル（名なし）ハンタウイルスＲＮＡ、輸血伝達ウイルス（ＴＴＶ）、水痘・帯状疱疹ウイルス、ウエストナイルウイルスから選択されるウイルス（ウイルス核酸を含む）；限定はされないが、ブドウ球菌属（Staphylococcus  spp.）、ストレプトコッカス属（Streptoccoccus  spp.）、バシラス属（Bascillus  spp.）、カンピロバクター属（Campylobacter  spp.）、エンテロコッカス属（Enterococcus  spp.）及びエンテロバクター属（Enterobacter  spp.）、大腸菌、セレウス菌、ライム病ボレリア（Borrelia  burgdorferi）、マルタ熱菌（Brucella  melitensis）、類鼻疽菌（Burkholderia  pseudomallei）、カンジダアルビカンス（Candida  albicans）、シトロバクター・フロインディ（Citrobacter  freundii）、コクシエラ・バーネッティ（Coxiella  burnetti）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterbacter  aerogenes）、エンテロバクター・クロアカ（E.cloaca）、肺炎桿菌（Klebsiella  pneumonia）、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus  gasseri）、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus  faecium）、レプトスピラ・オーストラリス（Leptospira  australis）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria  monocytogenes）、パラ結核菌（Mycobacterium  paratuberculosis）、ヒト型結核菌（Mycobacterium  tuberculosis）、緑膿菌（Pseudomonas  Aeruginosa）、サルモネラ・コトブス（Salmonella  Kottbus）、サルモネラ・パナマ（Salmonella  panama）、サルモネラ・ゼンフテンベルク（Salmonella  senftenberg）、ネズミチフス菌（Salmonella  typhimurium）、霊菌（Serratia  marcescens）、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌及びストレプトコッカス・アガラクティエ（Streptococcus  agalactiae）を含む細菌及び真菌；限定はされないが、アメリカ鉤虫（Necator  americanus）、回旋糸状虫（Onchocerca  volvulus）、マンソン住血吸虫（Schistosoma  mansoni）、ストロンギロイデス・フレボルニ（Strongyloides  fulleborni）、トキソプラスマ原虫（Toxoplasma  gondii）、旋毛虫（Trichinella  spiralis）及びクルーズ・トリパノソーマ（Trypanosoma  cruzi）を含む寄生虫、が挙げられる。
【００３３】
人乳中の生物学的汚染物質の検出は、当業者に公知の標準的方法を使用して行うことができる。これらの方法には、培養ベースアッセイ法や核酸ベース検出法が含まれるが、これらに限定されない。例えば、血液寒天培地、マッコンキー寒天培地などの適切な培地を用いて、４８時間などの適切な時間、３７℃で、人乳製品のサンプルを培養することにより、細菌汚染物質の存在を得ることができる。細菌汚染物質はグラム染色でさらに特定できる。或いは、ＰＣＲ検出法等の核酸ベース検出法を利用してもよい。同様に、培養又は核酸ベース法はウイルス又は寄生虫汚染物質の検出にも採用できる。乳のサンプル中の汚染物質の陽性検出は、採用した検出方法によって異なる。サンプルの汚染は、そのサンプル中に汚染物質が存在することを検出したことを意味する。
【００３４】
人乳の細菌汚染は、非殺菌の搾乳器や容器を使用することにより起こり得る。乳バンク等、いくつかの状況においては、殺菌前の、細菌培養により検出された細菌汚染全体の上限は１００，０００ＣＦＵ／ｍｌである。さらに、オーストラリアでは、殺菌前サンプルに、熱安定エンテロトキシン（例えば、黄色ブドウ球菌、腸内細菌科、腸球菌など）を作り出す病原性細菌は存在してはならない。人乳を汚染することが分かっている最も一般的な細菌として、大腸菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、セレウス菌及びエンテロバクター・クロアカエが挙げられる。人乳を汚染することが分かっている最も一般的なウイルスとしてはＣＭＶ、ＨＩＶ、ＨＴＬＶが挙げられる。
【００３５】
好ましい実施形態では、本発明は人乳中に存在する生物学的汚染物質の量を減少させる又は不活化する方法を提供し、汚染物質は大腸菌、ブドウ球菌属、ストレプトコッカス属、バシラス属、エンテロコッカス属及びエンテロバクター属から選択される。
【００３６】
さらに好ましい実施形態では、本発明は人乳中に存在する生物学的汚染物質の量を減少させる又は不活化する方法を提供し、汚染物質はＣＭＶ、ＨＩＶ及びＨＴＬＶから選択される。
【００３７】
いかなる理論にも拘束されるものではないが、生物学的汚染物質を十分な量のＵＶ光に曝すことにより、核酸のらせん構造に切断や二量体などの損傷が導入される。このような損傷は、汚染物質の遺伝物質を複製する能力を損ない、又は抑止し、汚染物質の死滅又は破壊につながる。
【００３８】
ここで使用する用語「不活化する」（及びその形態）とは、汚染物質の実際の破壊、撲滅、又は、複製する能力又は生きている受容者に悪影響を与える能力を実質的に抑止する、汚染物質への直接的又は間接的効果を意味する。
【００３９】
別の実施形態によると、本発明の方法は、人乳中に存在する生物学的汚染物質の量を減少させる。ここで使用する用語「減少させる」（及びその変形）とは、生物学的汚染物質に適用される場合、生物学的汚染物質の量の低下、又はアクティブな及び／又は複製する能力及び／又は人に感染させる能力がある汚染物質の数の低減を指す。
【００４０】
人乳中の生物学的汚染物質の不活化又は生物学的汚染物質の量の減少は、当業者に公知の検出方法を使用して測定することができる。生物学的汚染物質の不活化は、生物学的汚染物質の生物活性のアッセイを使用して判定することもできる。不活化又は減少は、紫外線への曝露前と曝露後のサンプルの分析から作成されたデータの比較によって確認できる。紫外線への曝露前と曝露後の細胞に感染するウイルスの能力の判定は、汚染物質の生物活性のアッセイの一例である。このようなアッセイでは、紫外線に曝露させた後の細胞に感染するウイルスの能力の低下が、不活化を示すことになる。このような生物学的汚染物質の不活化は、サンプルから検出された汚染物質の総量が減少していないにもかかわらず起こることがある。例えば、サンプル中のウイルスのＤＮＡ又はＲＮＡの量は、ウイルスに感染した細胞の数が減少しているにもかかわらず、紫外線曝露の後でも変化しないことがある。
【００４１】
ここで使用するデシマル減少量（decimal  reduction  dose）という用語は、生き残っている汚染物質の集団が１ログサイクル減少するのに必要な紫外線量、即ち、汚染物質の集団の９０％を破壊又は不活化するのに必要な量を指す。好ましい実施形態では、本発明の方法は、汚染物質レベルを少なくとも１Ｌｏｇ１０単位減少させる。さらに好ましい実施形態では、本発明の方法は、汚染物質を少なくとも２、３、４又は５Ｌｏｇ１０単位減少させる。さらにより好ましい実施形態では、本発明の方法は、汚染物質を少なくとも５Ｌｏｇ１０単位減少させる。
【００４２】
好ましくは、本発明の方法は、人乳製品中の汚染物質レベルを、その乳製品が安全に使用できるように不活化する又は減少させる。好ましくは、汚染物質レベルは、２００００ＣＦＵ／ｍｌのレベルまで不活化又は減少される。より好ましくは、汚染物質は、１００００、９０００、８０００、７０００、６０００、５０００、４０００、３０００、２０００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５ＣＦＵ／ｍｌを含む群から選択されるレベルよりも低いレベルに減少される。
【００４３】
好ましい実施形態では、生物学的汚染物質を不活化するために使用される紫外線の種類はＵＶ−Ｃである。ＵＶ−Ｃは２００から２８０ｎｍの範囲の波長を有する紫外線と定義される。従って、さらに好ましい実施形態では、本方法は、２５５ｎｍ、２６０ｎｍ、２６５ｎｍの波長を含む２５０ｎｍ〜２７０ｎｍの範囲のＵＶ−Ｃに人乳を曝すことを含む。よりさらに好ましい実施形態では、本方法は約２５４ｎｍの波長のＵＶ−Ｃに人乳を曝すことを含む。
【００４４】
ＵＶ−Ｃの侵入深さは、液体の溶解性、密度及び濁度に依存する。不透明又は混濁した液体の紫外線処理は、紫外線の吸光又は反射という結果になることがある。飲料水、ビールの吸光係数はそれぞれ０．１ｃｍ−１と２０ｃｍ−１であり、このような液体の吸光係数と比べて、乳は２５４ｎｍの波長で３００ｃｍ−１の高い吸光係数を有する（Shama  G.Ultraviolet  light.  In:Encyclopaedia  of  food  microbiology.  Academic  Press(Elsevier)1999）。従って、乳のＵＶ−Ｃでの処理は、その吸光係数が高いので困難である。
【００４５】
ここで示すように、デシマル減少量と人乳の全固形分との間には強い正の相関関係があり、Ｒ２＝０．８２（Ｐ＜０．０１）である。従って、本発明の一態様において、本方法は、ある体積の人乳中の全固形分の測定と、人乳中に存在する生物学的汚染物質を不活化するために必要なＵＶ、好ましくはＵＶ−Ｃの量の調節を含む。
【００４６】
紫外線曝露量又は紫外線照射量は、本発明の方法を実行する際に使用した紫外線源の出力と曝露時間によって計算される。従って、紫外線照射量は、与えられた紫外線源の出力、使用する紫外線源の数、又は曝露時間によって変えてもよい。紫外線照射量はさまざまな方法で表され、一般には、処理される表面積当たりの到達エネルギーの量と定義される（例えば、ミリジュール・パー・平方センチメートル、ｍＪ／ｃｍ２）。ここに記載の紫外線曝露量又は紫外線照射量は、ジュール・パー・リットル（Ｊ／ｌ）として表される。好ましい実施形態では、本発明の方法は、１００〜１０，０００Ｊ／ｌの範囲の量のＵＶ光に人乳を曝すことを含む。より好ましくは、人乳製品は、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、５０００、５１００、５２００、５３００、５４００、５５００、５６００、５７００、５８００、５９００、６０００、６１００、６２００、６３００、６４００、６５００、６６００、６７００、６８００、６９００、７０００、７１００、７２００、７３００、７４００、７５００、７６００、７７００、７８００、７９００、８０００、８１００、８２００、８３００、８４００、８５００、８６００、８７００、８８００、８９００、９０００、９１００、９２００、９３００、９４００、９５００、９６００、９７００、９８００、９９００及び１０，０００Ｊ／ｌを含む群から選択される量でＵＶ光源にさらされる。最も好ましくは、紫外線量は５００Ｊ／ｌ以上である。
【００４７】
本発明によれば、乳中に存在する生理活性成分の活性は、紫外線曝露後に実質的に減少しない。ここで使用する用語「生理活性成分」とは、生物学的効果を有する物質を指す。例として、限定はされないが、炭水化物、脂質、ペプチド、脂肪酸、酵素、抗体、成長因子、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、抗菌性化合物、代謝産物、ビタミン、及び、幹細胞や白血球などの免疫細胞を含むがこれらに限定されない細胞が挙げられる。
【００４８】
生理活性成分は、ペプチド、蛋白質、酵素、抗体、成長因子、ホルモン及びステロイドであることが好ましい。
【００４９】
ここで使用する用語「実質的に減少」とは、人乳製品の生理活性成分の活性若しくは濃度、又は静菌性の、５０％を超える減少のことを言う。即ち、本発明によると、紫外線曝露によって生物学的汚染物質を不活化させた後、人乳製品に存在する生理活性成分の活性若しくは濃度、又は人乳製品の静菌性は、紫外線曝露の前の人乳製品の生理活性成分の活性若しくは濃度、又は静菌性の５０％以上である。好ましい実施形態では、人乳製品の生理活性成分の活性若しくは濃度、又は静菌性の減少は４０％以下、３０％以下、又は２０％以下である。さらに好ましい実施形態では、人乳製品の生理活性成分の活性若しくは濃度、又は静菌性は１０％を超えて減少しない。
【００５０】
ここで使用される用語「静菌性」とは、細菌の成長、分裂、増殖又は複製の停止、停滞又は抑制のことを言う。
【００５１】
熱殺菌方法では、免疫蛋白質の保持率が実質的に減少し、ホルダー殺菌の使用により胆汁酸塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）の活性が完全に喪失されることがある。ＢＳＳＬは、トリアシルグリセロールをモノアシルグリセリドと遊離脂肪酸に分解するので、乳幼児の脂肪の消化を助ける。ＢＳＳＬは非常に熱に不安定な酵素であり、曝露時間によって、４５℃で不活化が始まることがある。早期産児は内因性リパーゼ活性が低いため、人乳からＢＳＳＬを供給することは早期産児にとって特に重要である。研究によれば、熱殺菌した人乳を与えた早期産児は、未殺菌の乳を与えた早期産児に比べて、脂肪吸収と成長速度が低いことが分かっている。これらのより低い成長速度は、熱殺菌処理によるＢＳＳＬの不活化に原因があると考えられる。
【００５２】
ホルダー殺菌で完全に失われる別の酵素は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）である。乳のアルカリホスファターゼは、乳中の対象とする微生物を破壊するのに必要な殺菌条件をわずかに上回る条件で不活化することから、ＡＬＰは乳の不十分な殺菌を検知するバイオマーカーとして乳業界で使用されている。
【００５３】
従って、好ましい実施形態では、乳中に存在する生理活性蛋白質の活性は実質的に減少しない。さらに好ましい実施形態では、蛋白質は酵素である。さらにより好ましい実施形態では、生理活性蛋白質は、胆汁酸塩刺激リパーゼ、アルカリホスファターゼ、ラクトフェリン、リゾチーム、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシド・ジスムターゼ、又はラクトフェリンを含む群から選択される。
【００５４】
さらにより好ましい実施形態では、生理活性蛋白質は抗体、成長因子、サイトカイン、又はケモカインである。
【００５５】
熱殺菌の方法では、人乳の静菌性はホルダー殺菌を使用することにより完全に失われることがある。
【００５６】
従って、好ましい実施形態では、人乳製品の静菌性が実質的に減少しない。
【００５７】
別の好ましい実施形態では、乳中に存在する生理活性蛋白質の濃度が実質的に減少しない。さらに好ましい実施形態では、乳中に存在する酵素の濃度が実質的に減少しない。
【００５８】
さらにより好ましい実施形態では、胆汁酸塩刺激リパーゼ、アルカリホスファターゼ、分泌型ＩｇＡ（ｓＩｇＡ）、ラクトフェリン、及びリゾチームを含む群から選択される生理活性蛋白質の濃度が実質的に減少しない。さらにより好ましい実施形態では、胆汁酸塩刺激リパーゼ、アルカリホスファターゼ及び／又はラクトフェリンの濃度が実質的に減少しない。
【００５９】
さらに別の好ましい実施形態では、限定されないが、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシド・ジスムターゼ、ラクトフェリン、ビタミンＣ、及びビタミンＥを含む群などの抗酸化成分の活性が実質的に減少しない。従って、さらに別の好ましい実施形態では、乳の抗酸化活性が実質的に減少しない。
【００６０】
述べてきたように、乳などの混濁液が含まれる場合では、紫外線の吸光度又は反射が増加するために、紫外線への曝露の有効性は低下する。さまざまなフロースルー型ＵＶ反応器が設計されており、パイプや導管に液体を流し、その液体を紫外線にさらす。このような反応器は大量の液体の処理用に設計されている。
【００６１】
層流を使用してフロースルー反応器で不透明の液体を処理することは、反応器を通る流れの中央にある層が紫外線に曝されないために問題がある。
【００６２】
個人の人乳は少量でしか収集できない。例えば、個人が任意の時に搾り出した母乳の体積は個人間のばらつきが大きい。研究によれば、搾り出せる母乳の平均重量は、約３０グラムから約１５０グラム（即ち、約３０〜１５０ｍｌ）に及ぶことがある。従って、このような少量は大規模反応器やフロースルー反応器では失われてしまうだろう。また、上記で明らかにしたように、乳をフロースルー反応器にポンプ送りする必要がある場合、その他の問題が生じる。さらにまた、強い乱流を乳に加えると、乳脂肪球の合一からバターが形成されるなどの望ましくない特性がミルクに与えられることがある。
【００６３】
本発明によると、渦流のような流れを乳に与えると、乳中の汚染物質を紫外線に曝露させ易くする。ここで使用する「渦流」とは、液体が仮想軸の周りを回転運動又はスピン運動して、層状に流れる液体の流れのことである。軸は真っ直ぐでも曲がっていてもよい。層間で流れに分裂又は混合、及び乱流が発生することがあり、これは容器内で液体の流れのさまざまなポイントで発生するが、液体のほとんどは渦形状に流れる。
【００６４】
本発明の方法によると、人乳を収容するための容器の中に人乳を保持し、渦流を乳に与える。速度を十分減少させた渦流を乳に与えることにより、乳の粘度を維持しながら、汚染物質の紫外線への曝露を促進する。即ち、十分減速した渦流を乳に与えることにより、乳に適用した結果生じる乳脂肪球の合一からバターが形成されるなどの乳の粘度に望ましくない変化を防止することができる。ここで使用する速度とは、回転速度、又は回転強度のことを言う。従って、十分減少した速度を有する渦流は、乳に望ましくない変化を与えないように低減した回転速度又は回転強度を有する渦流である。流れもまた十分速度を落とすようにしなければならないが、流れは連続しているので、乳は移動し続けて、望ましくない物理的ダメージを乳に与えることなく、確実に乳中の汚染物質の紫外線への曝露を促進する。
【００６５】
流れには分裂又は混合、及び乱流が起こる場合があり、これらは容器内の液体の流れのさまざまなポイントで発生するが、液体のほとんどは渦形状で流れる。発生し得る崩壊又は混合及び乱流は、乳中の汚染物質の紫外線への曝露を促進する。
【００６６】
渦流は、当業者に公知の任意の手段で乳に与えることができる。これにより、乳を穏やかな形で流すことが可能となり、乳表面のバターオイル層の形成や、バターの形成などの乳に望ましくない物理的ダメージを与えることなく、乳中の汚染物質の紫外線への曝露を促進する。好ましい実施形態では、渦流は、磁気バー及び磁気バーを回転させる装置を使用して作り出される渦によって与えられる。さらにより好ましい実施形態では、磁気バーを回転させる装置はマグネチックスターラーである。
【００６７】
実際には、この例に限定されないが、磁気バーは、乳を収容する容器内に置かれる。乳中の低速の渦、従って渦流は、磁気バーをマグネチックスターラーで回転させることにより得られる。磁気バーの大きさは、処理される乳の体積又は容器の大きさに応じて変えることができる。例えば、乳を収容するために大きな容器を使用する場合、大きな磁気バーを採用することができる。或いは、少量の乳を処理する予定の場合、小さな磁気バーを使用することができる。同様に、磁気バーが回転する速度もまた変えることができる。例えば、大量の乳の場合、又は乳を収容する容器が小さい場合、渦流を維持し、乳製品中の生物学的汚染物質の紫外線への曝露を促進する速度へ、磁気バーの回転速度をそれぞれ上げたり、下げたりすることができる。
【００６８】
従って、ＵＶ−Ｃ光子への最適な微生物曝露のために十分な速さの流れを作り出し、人乳にダメージを与えるリスクを最小にするように、バランスを取ることができる。これは、回転速度及び／又は撹拌方法を調節することによって達成できる。さらに、撹拌手段の大きさと形状を、せん断力を低減するように調節することができる。回転する容器を使用することも可能である。
【００６９】
ここに例示するように、十分速度を減少した渦流を、５００ｒｐｍ又はそれに等しい速度で回転させる８ｘ４０ｍｍの磁気バーを使用して、４００ｍｌの液体を収容するための容器に入れた３８０ｍｌの人乳に加えてもよい。
【００７０】
図１を参照すると、そこに例示した装置の好ましい実施形態は、ＵＶ光源（３）を導入した、ある体積の乳製品（２）を収容する容器（１）を備える。ＵＶ光源を乳製品へ導入することにより、乳製品中に存在する汚染物質のＵＶ光への曝露を可能にし、十分な量が曝露されると、汚染物質は順に不活化される。汚染物質の紫外線への曝露を促進するために、乳に渦流を与える。この好ましい実施形態では、渦流は磁気バー（４）を使用して作り出され、渦を作り出し、維持するのに十分な速度で磁気バー（４）を回転させる。磁気バーはマグネチックスターラー（５）を使用することで回転させる。マグネチックスターラーは、低速の渦流が乳に与えられ、維持されるように、磁気バーの回転速度を指定して制御できる。
【００７１】
図１１は、本発明の一実施形態による装置の構造配置を概略的に示している。この装置の配置は、ベース（６）を有するスタンド（８）を含み、そのベース（６）内に（磁気バー（４）を駆動するための）マグネチックスターラー（５）が組み込まれている。ベース（６）は、好ましくは、容器（１）がその上に置かれるときに容器（１）を適切に位置決めして保持するように構成される。容器（１）は開口部（１２）を有するカバー（１０）を含み、カバー（１０）は、容器内の乳製品の流出と汚染が最小限になるように容器（１）に相対的に取付け可能である。スタンド（８）は頭上構造（１８）を含み、この頭上構造（１８）は電気ソケット（２０）を含み、その中にランプであるＵＶ光源（３）が差し込まれる。容器（１）がベース（６）上に位置するとき、頭上構造（１８）は容器（１）の上に延び、その結果、カバー（１０）の開口部（１２）を貫通するＵＶランプ（３）が適切な深さで容器（１）内に支持され、位置決めされる。スターラー（５）を駆動するための電気接続とＵＶランプ（３）用のソケット（２０）は、電気ケーブル（１４）とプラグ（１６）を介して通常の／家庭用のＧＰＯに接続される。この装置の分離した部品、即ち、スタンド（８）（マグネチックスターラー（５）を有するベース（６）、頭上構造（１８）、ソケット（２０）、及び電気ケーブルとプラグ（１４／１６）を含む）、ＵＶランプ（３）、容器（１）とカバー（１０）、及び磁気バー（４）は、装置の取扱説明書とともに、個別に、又は、１つのユニット／単一のパッケージとして一緒に、包装され、販売されることが予想される。
【００７２】
好ましい実施形態では、装置は容器を備え、その容器に、ある体積の人乳を直接搾り出せ、収集され、又は貯蔵できる。個人によって任意の時に搾り出される母乳の体積は個人間で大きなばらつきがある。研究によれば、搾り出される母乳の平均重量は、約３０グラムから約１５０グラム（即ち、約３０〜１５０ｍｌ）に及ぶことがある。好ましい実施形態では、容器は、約３０ｍｌ〜約１００００ｍｌの範囲の体積の人乳ための容器である。好ましい実施形態では、容器は、５０ｍｌ、１００ｍｌ、２００ｍｌ、３００ｍｌ、４００ｍｌ、５００ｍｌ、６００ｍｌ、７００ｍｌ、８００ｍｌ、９００ｍｌ、１０００ｍｌ、１１００ｍｌ、１２００ｍｌ、１３００ｍｌ、１４００ｍｌ、１５００ｍｌ、１６００ｍｌ、１７００ｍｌ、１８００ｍｌ、１９００ｍｌ、２０００ｍｌ、２５００ｍｌ、３０００ｍｌ、３５００ｍｌ、４０００ｍｌ、４５００ｍｌ、５０００ｍｌ、５５００ｍｌ、６０００ｍｌ、６５００ｍｌ、６５００ｍｌ、７００ｍｌ、７５００ｍｌ、８０００ｍｌ、８５００ｍｌ、９０００ｍｌ、９５００ｍｌ及び１００００ｍｌから選択される体積の人乳製品のための容器である。
【００７３】
容器は開閉でき、ガラス、ステンレス鋼、又はポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）及びポリプロピレン（ＰＰ）を含む群から選択されるプラスチックを含む食品用材料を含む、任意の適切な材料から構成され得る。
【００７４】
好ましい実施形態では、装置は容器と係合するよう構成されたカバーをさらに備える。或いは、容器はカバーを受けるように構成される。蓋などのカバーは、容器からの漏れ又は流出を防ぐことができる。カバーはまた、容器内に保持された乳製品をＵＶ光に曝露させる間、又は曝露後、例えば乳製品の貯蔵時に、容器に汚染物質が入ることを防止する役目も果たせる。さらに好ましい実施形態では、カバーはＵＶ光源及び／又は前記容器内で乳に渦流を与える手段を受け入れるよう構成される。
【００７５】
例えば、カバーは、ＵＶ光源及び／又は前記容器内で乳に渦流を与える手段を、開閉できる開口などによって受け入れるよう構成されてもよい。
【００７６】
ＵＶ光源は１以上のＵＶランプを備えてもよい。ＵＶランプは特定の形状又は大きさのものであってもよい。好ましい実施形態では、ＵＶ光源は、好ましくは２５０ｎｍ〜２７０ｎｍの範囲で、最も好ましくは２５４ｎｍでＵＶ−Ｃを発光する。ＵＶ光源は、容器の内側又は外側になるように配置されてもよく、容器内の人乳製品をＵＶ光、好ましくはＵＶ−Ｃに曝露させるのに十分な任意の特定の方法で配向されていてもよい。ＵＶ光源が容器の外側に位置する場合、１以上のＵＶランプを容器の周囲のさまざまなポイントに位置させてもよい。好ましい実施形態では、ＵＶ光源は容器内に導入されて、容器内の人乳製品と接している。ＵＶ光源が容器の外側に配置される一定の実施形態では、容器は、容器の表面を通してＵＶ光を十分透過させることが可能な材料から形成され、容器によるＵＶ光の吸収が最少の材料から形成されることが好ましい。
【００７７】
図１２は、本発明の一実施形態による装置の構造配置を概略的に示しており、ＵＶ光源は容器の外側に位置している。この装置の配置は、ベース（６）を有するスタンド（８）を含み、そのベース（６）内に（磁気バー（４）を駆動するための）マグネチックスターラー（５）が組み込まれている。ベース（６）は、好ましくは、容器（１）がその上に置かれるときに容器（１）を適切に位置決めして保持するように構成される。容器（１）はカバー（１０）を含み、カバー（１０）は、容器内の乳製品の流出と汚染が最小限になるように容器（１）に相対的に取付け可能である。スタンド（８）は電気ソケット（２０）を含み、その中にランプであるＵＶ光源（３）が差し込まれる。容器（１）がベース（６）上に位置するとき、スタンド（８）は容器（１）に隣り合って延び、その結果、ＵＶランプ（３）が容器（１）に適切に近接して支持され、位置決めされる。スターラー（５）を駆動するための電気接続とＵＶランプ（３）用のソケット（２０）は、電気ケーブル（１４）とプラグ（１６）を介して、通常の／家庭用のＧＰＯに接続される。この装置の分離した部品、即ち、スタンド（８）（マグネチックスターラー（５）を有するベース（６）、ソケット（２０）、電気ケーブルとプラグ（１４／１６）を含む）、ＵＶランプ（３）、容器（１）とカバー（１０）、及び磁気バー（４）は、装置の取扱説明書とともに、個別に、又は、１つのユニット／単一のパッケージとして一緒に、包装され、販売されることが予想される。
【００７８】
乳に渦巻状の流れを与える手段は、オーバーヘッドスターラーやマグネチックスターラーなどの撹拌装置を含んでもよい。オーバーヘッドスターラーは、一端にブレードが配置されたシャフトを備え、このブレードを液体内に導入して、渦流を作り出すように乳の中で回転させる。或いは、磁気撹拌装置を使用してもよい。或いは、乳を収容する容器を、渦流を与えるように動かし、又は回転させてもよい。好ましい実施形態では、乳に渦流を与えるように構成された手段は、マグネットとマグネチックスターラーである。作動中、マグネチックスターラーはマグネットに磁力を印加し、乳製品に渦を発生させるようにマグネットを回転させ、それにより乳に渦流を与える。或いは、乳に渦を、従って渦流を作り出すように、容器をＵＶ源に対して動かしてもよい。
【００７９】
マグネットは任意の適切な形状又は大きさのものでよい。好ましくは、マグネットは磁気撹拌バーである。磁気バーの大きさは、処理される乳の体積、又は容器の大きさに応じて変えることができる。例えば、乳を収容するために大きな容器を使用する場合は大きな磁気バーを採用することができる。或いは、少量の乳を処理する予定の場合は小さな磁気バーを使用することができる。好ましい実施形態では、容器は４００ｍｌの人乳製品を収容するよう構成され、磁気バーは８ｘ４０ｍｍである。８ｘ４０ｍｍの磁気バーを５００ｒｐｍで回転させると、４００ｍｌを収容するよう構成された容器で３８０ｍｌの人乳に実質的に渦流を与えるように、渦を作り出すことができる。
【００８０】
さらなる実施形態によると、ＵＶ光源を、渦を乳に加える手段として操作することができる。例えば、ＵＶランプを容器内に保持された乳に導入して、乳の中に渦を、従って渦流を作り出すようにＵＶランプを動かしてもよい。例えば、ＵＶランプを容器内に保持されたある体積の乳に挿入して、撹拌するように回転させて、渦を、従って渦流を作り出してもよい。
【００８１】
別の態様によると、本発明は、本明細書に記載の方法によって調製された人乳製品を提供する。乳製品中に存在する生物学的汚染物質を不活化及び／又は減少させた、本発明の方法によって調製された人乳製品は、未殺菌の人乳製品と比較して、より長時間保管することができる。また、本発明による乳製品は、熱的方法を使用して殺菌された人乳製品と比較して優れた生物活性を有する。
【００８２】
本発明を以下の実施例を参照して、より詳細に説明するが、これらに限定されない。
【実施例】
【００８３】
実施例−１  乳の紫外線曝露
１０個の人乳の冷凍サンプルが、過剰母乳が出る母親から供与された。乳は実験前に−２０℃の冷凍庫で保管された。人乳サンプル中の全固形分を、中赤外分析装置（HMA-Human  Milk  Analyser,  Miris  AB,  Uppsala,  Sweden）を使用して測定した。その後、サンプルを遠心分離し（Allegra  X-12R,  Beckman  Coulter  Inc.,  Brea,  CA,  USA）、除去又は同一の人乳サンプルのクリームを添加して全固形分含有量を調節した。サンプルの最終の全固形分含有量は、１０個のサンプルで１０７〜１４６ｇ／ｌの範囲であった。概要を表１に示す。
【００８４】
【表１】
2015536681.tif 000003
【００８５】
各人乳サンプル（３８０ｍｌ；ｎ＝１０）を４００ｍｌＰＹＲＥＸ(登録商標)ガラスビーカーＮｏ．１００３に移した。部分的に覆った（弧長２１１ｍｍのうち５７ｍｍを開放）ＵＶ−Ｃ殺菌ランプ（２５３．７ｎｍで９５％のＵＶ出力）（GPH287T5L,  Infralight  Pty  Ltd,  Helensburgh,  NSW,  Australia)をガラスビーカーの中に入れた（図１）。
【００８６】
５７ｍｍを開放したランプのＵＶ出力は１．１Ｗであった。ＵＶ−Ｃ処理の間、ＵＶ−Ｃ殺菌ランプ（２５３．７ｎｍで９５％のＵＶ出力）（GPH287T5L,  Infralight  Pty  Ltd,  Helensburgh,  NSW,  Australia）を容器内に斜めに入れた（図１）。ＵＶ−Ｃ処理の間、８ｘ４０ｍｍマグネチックスターラーバー（C-MAG  HS7,  IKA,  Staufen,  Germany）で、回転速度５００ｒｐｍで乳を撹拌し、低速の渦を作り出した。人乳をＵＶ−Ｃに曝し、１ｍｌのサンプルを異なる時点で取り、別の分析のために管に分けた。酵素及び脂肪酸の分析（以下に記載）のための一定分量を、アッセイを行うまで−８０℃で冷凍保存した。細菌の分析を直ちに行った。
【００８７】
実施例２−細菌の分析
表皮ブドウ球菌（ATCC  12228）、エンテロバクター・クロアカエ（ATCC  27508）、セレウス菌（ATCC  10702）（American  Type  Culture  Collection  Inc,  Manassas,  VA,  USA）及び大腸菌Ｋ１２（ATCC  1498,  Southern  Biological,  Nunawading,  Vic,  Australia）を、ニュートリエントブロス（Nutrient  Broth  No.2,  Oxoid  Australia  Pty  Ltd,  Adelaide,  SA,  Australia）中で３３℃で一晩培養した。黄色ブドウ球菌（ATCC  6538）（American  Type  Culture  Collection  Inc,  Manassas,  VA,  USA）をトリプチックソイブロス（BBL  Trypticase  Soy  Broth,  Becton  Dickinson  &  Co,  Franklin  Lakes,  NJ,  USA）中で３３℃で一晩培養した。その後、予め描かれた標準曲線を用いて、吸光度法を使用して細菌を数えた。培地を希釈して、全固形分を調節した人乳サンプルに植菌して、母乳バンクの最大許容濃度１０５ＣＦＵ／ｍｌ（ミリットル当たりコロニー形成単位）にした。
【００８８】
実施例１と同様にして、ＵＶ光で照射したときの、大腸菌、表皮ブドウ球菌、エンテロバクター・クロアカエ、セレウス菌、及び黄色ブドウ球菌の指数関数的減少を観察した。細菌の５つの異なる種では、デシマル減少量はそれぞれ５９４±２６５、５６９±２０９、５６５±１７８、６４０＋１８９及び６３５±２６８Ｊ／ｌであり、大きな違いはなかった。
【００８９】
デシマル減少量と人乳中で測定された全固形分には、高い正の相関関係（Ｐ＜０．０１）が見られた。サンプルの全固形分の濃度は、１０７．０、１１０．５、１２０．０、１２１．０、１２５．０、１２６．０、１３１．５、１３３．０、１３９．５、１４６ｇ／ｌ、相関するデシマル減少量はそれぞれ、２８９±１７、３９６±５２、４７０±５１、４５４±３６、３８０±３９、４３７±７２、７７４±９８、８０５＋７４、７２１±６４、９４５±１６４Ｊ／ｌであった（図２）。
【００９０】
実施例３−胆汁酸塩刺激リパーゼ活性
人乳中の胆汁酸塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）活性を、リパーゼアッセイキット（QuantiChrom  Lipase  Assay  Kit,  BioAssay  Systems,  Hayward,  CA,  USA）を使用して判定した。実施例１と同様の冷凍（−８０°Ｃ）人乳サンプル（ｎ＝１０）を解凍して３７℃にし、ＤＤＩ（１／１００、ｖ／ｖ）で希釈し、キットの説明書に従い、アッセイを二重に（in  duplicate）行った。吸光度を分光光度計（PowerWave,  Biotek,  Winooski,  VT,  USA）で測定し、キットの説明書の式に基づき、ミリリットル当たりＢＳＳＬ活性（Ｕ／ｍｌ）に変換した。キットの直線検出範囲は、９６ウェルプレートアッセイで４０〜１６００Ｕ／ｍｌリパーゼ活性である。ユニットの定義：アッセイ条件下（ｐＨ８．５）で１分間に１．０μΜの基質の切断を触媒する酵素を１ユニットとする。グループ内の変動係数（ＣＶ）は７％未満であった。
【００９１】
未処理の人乳サンプルのＢＳＳＬ活性は１１６．５±３６．６Ｕ／ｍｌであった。実施例１と同様に１３８９、２０８４、２７７９、３４７４、４８６３Ｊ／ｌのＵＶ−Ｃ量で処理した後、ＢＳＳＬ活性は、それぞれ１１３．１±３４．０、１１２．７±３３．３、１１４．３±３４．６、１１３．６±３３．７、１１５．３±３４．４Ｕ／ｍｌ（ｎ＝１０）であり、大きく減少しなかった。
【００９２】
実施例４−アルカリホスファターゼアッセイ
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）はｐ−ニトロフェニルリン酸を加水分解させ、黄色の合成物を形成し、４０５ｎｍで測定されたその強度は、サンプル中のＡＬＰの濃度と正比例する。ＡＬＰ活性を、Walter  and  Schuett（２３）に基づいて酵素アッセイを用いて分析した。実施例１と同様の冷凍（−８０℃）人乳サンプルを解凍して３７℃にし、ＤＤＩ（１／４、ｖ／ｖ）で希釈して、サンプルを５μｌずつ、９６ウェルプレートに入れた１３５μｌの基質（１Ｍ  ジエタノールアミン、０．５ｍＭ  ＭｇＣＩ２、ｐＨ１０．３）に添加した。その後、１０μｌの発色試薬（１０ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルリン酸）をウェルに添加して、プレートを３７℃で３０分間培養した。吸光度を４０５ｎｍで分光光度計（PowerWave,  Biotek,  Winooski,  VT,  USA）を使用して測定し、標準曲線を用いて１ミリリットル当たりのアルカリホスファターゼ活性（Ｕ／ｍｌ）に変換した。ユニット定義：アッセイ条件下で１分間に１．０ｍＭのｐ−ニトロフェニルリン酸を加水分解する酵素を１ユニットとする。リカバリアッセイは９４±９％、イントラ−アッセイ変動は６％未満であった。
【００９３】
未処理の人乳サンプルのＡＬＰ活性は０．２００±０．０５０Ｕ／ｍｌであった。実施例１と同様に２０８４，３４７４、４８６３Ｊ／ｌのＵＶ−Ｃ量で処理した後、ＡＬＰ活性はそれぞれ０．１９９±０．０５６，０．１９９±０．０４７、０．２０４±０．０５７Ｕ／ｍｌ（ｎ＝１０）であり、大きく減少しなかった。
【００９４】
過剰曝露の実験において、微生物負荷を５−ｌｏｇ１０減少させるのに必要とされるよりもかなり長く人乳を処理した場合、１０，４００、６２，５２６及び２３９，６８４Ｊ／ｌのＵＶ−Ｃ量で、ＡＬＰ活性保持率は、それぞれ７９．８±７．１％、５３．４±２０．２％、４０．６±１５．０％の著しい減少が見られた（ｎ＝３）（図３）。
【００９５】
実施例５−脂肪酸の分析
脂肪酸（ＦＡ）を、Mitoulas  et  al.（２４）に基づいて抽出及びエステル交換方法を用いて分析した。抗酸化剤としてブチル化ヒドロキシアニソールを使用し、クロロホルム／メタノール（２／１、ｖ／ｖ）を用いてＦＡを抽出した。１％Ｈ２ＳＯ４メタノール溶液を使用した酸トランスメチル化により、乳脂質抽出物からＦＡメチルエステルを調製した。その後、内径０．３２ｍｍ、コーティング０．２５μｍのＢＰＸ−７０（SGE  Pty  Ltd.,  Ringwood,  VIC,  Australia）の５０ｍキャピラリーカラムを使用して、ガス・クロマトグラフィー（GC-2010、Shimadzu  Co.,  Kyoto,  Japan）により脂肪酸メチルエステルを分離、定量した。その後、各サンプル（３μｌ）を、オートインジェクタ（AOC-20i，Shimadzu  Co.,  Kyoto,  Japan）を使用して、分割比２０：１でカラムに注入した。インジェクタ温度を２５０℃に、検出器（フレームイオン化）温度を３００℃に設定した。初期オーブン温度は１３０℃であった。この温度は、５分以内で１５５℃に上昇し、その後１分以内で徐々に１６５℃に、その後５分以内で２３０℃に、そして最終的に１０分以内で２５０℃に上昇して５分間維持されるよう最初にプログラムされた。ヘリウムを速度４ｍｌ／分でキャリアガスとして使用した。認証脂質基準（Sigma-Aldrich  Co.,  St  Louis,  MO,  USA）に対する保持時間に基づいて、脂肪酸を同定した。個々のＦＡピークをＦＡピーク下の総面積として定量化した。５つの別々の抽出に対してＦＡピーク下の面積の変動係数は、４．２％未満であった。
【００９６】
ＦＡ濃度は個々の未処理サンプル間では大きなばらつきがあったが、実施例１と同様のＵＶ−Ｃ処理の間、著しい変化はなかった。実施例１と同様の１０個の人乳サンプルを分析し、９個のサンプルで検出されたＦＡ１７：０、２０：５ｎ３、２０：０、２２：１ｎ９と、８個のサンプルで検出されたＦＡ１８：２ｔｔを除いて、全ての脂肪酸（ＦＡ）を１０個全てのサンプルに検出した。ＦＡ８：０は最小の濃度、ｃ−１８：１ｎ９は最大の濃度を有し、未処理のメジアン面積はそれぞれ１１，２７０（範囲４２３３〜２４，５１３）、６，８１９，３５３（１，１５７，３９８〜１１，６１３，６１４）であった。４８６３Ｊ／ｌのＵＶ−Ｃで処理されたこれら２つのＦＡのメジアン面積はそれぞれ１３，３０４（３６１２〜３０，１３２）、７，２８５，７９５（１，０６７，５４７〜１３，４５９，４３９）であった（図４）。
【００９７】
このように、ＵＶ−Ｃ照射により、求められる増殖性細菌汚染の低減が促進され、ＦＡを変化させないでＢＳＳＬやＡＬＰなどの熱に弱い酵素の活性が保護されるので、ドナーの人乳の品質が向上する。
【００９８】
実施例６−紫外線曝露によるウイルスの不活化
マウス又は人のＣＭＶを細胞培地又は殺菌した母乳に植菌し、容器に注入して０．５ｍｍの層を設けた。その後、サンプルをＵＶ光源に１０、２０、３０又は６０秒間、ＵＶ光源から１、２、３、４ｃｍの距離で曝した。ＵＶ光源の距離の違いにより、サンプルに異なる量の紫外線を届けることが容易になる。続いて、プラークアッセイ又は組織培養感染値量（ＴＣＩＤ）５０アッセイを用いて、サンプル中に存在するウイルスの不活化を評価した。
【００９９】
プラークアッセイについて、マウスのＣＭＶ（ＭＣＭＶ）ウイルスストック又はＭＣＭＶを加えた母乳を連続希釈法を使用して、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦｓ）を植菌した。３７℃、５％ＣＯ２で１時間培養した後、植種液を吸引して取り出し、全てのウェルを洗浄した。洗浄液を吸引して、０．５％メチルセルロース／ＭＥＭ＋２％ＮＣＳを細胞の上に重ねた。プレートを４〜５日間３７℃、５％ＣＯ２で培養し、ウェル毎に１ｍＬのメチレンブループラークアッセイ染色剤で染色した。室温で２〜３日後、染色剤を洗い落とし、プラークのカウントの前にプレートを空気乾燥した。ウイルスの力価を以下の式により計算した：プラーク形成ユニット（ｐｆｕ）／ｍＬ＝ウェル毎のプラークの数×希釈ファクタ×５。このアッセイの結果を以下の表２に表す。
【０１００】
【表２】
2015536681.tif 000004
【０１０１】
これらのデータは、人乳中に存在するウイルスを不活化するＵＶ光の曝露の能力を実証している。
【０１０２】
ＴＣＩＤ５０アッセイについて、ヒトＣＭＶ（ＨＣＭＶ）を加えた培地又は母乳を準備した。異なる距離で紫外線に曝した又は未処理のいずれかの、培地又は乳の２つの複製を順次希釈して、培養したヒト包皮線維芽細胞（ＨＦＦｓ）を添加して、３週間培養した。その後、処理済又は未処理のサンプル中に存在するウイルスの細胞変性効果を毎日評価した。結果をReed  and  Muench（Reed  LJ,  Muench  HA.  The  American  Journal  of  Hygiene.  1938;27:493-497）のプロトコールに基づき、Brett  D.  Lindenbach（Yale  University）が作成したカルキュレータを使用して分析した。値はＴＣＩＤ５０／ｍｌとして与えられる。
【０１０３】
この研究の結果は、ウイルスを含む人乳のＵＶ光の曝露により、ウイルスの不活化が可能であり、それにより、ウイルスの、細胞に感染する能力を低下させることを実証している。実際に、１、２及び３ｃｍの距離で曝露させた乳サンプルのＴＣＩＤ５０／ｍＬ値は検出基準を下回っていた（図５）。
【０１０４】
本実施例の実験計画は、人乳を容器に収容して渦流を与えた条件では行われていないが、アッセイの結果から当業者は、このような条件下で、同等かそれ以上のレベルのウイルスの不活化が起こるであろうということを予測できる。データの裏づけのない実施例（prophetic  example）に従って、人乳の複製サンプルに規定量のウイルスを加える。その後、この乳サンプルを実施例１に記載のようにＵＶ光に曝す。その後、異なるＵＶ曝露量で紫外線に曝された乳のウイルスの不活化度を、ウイルスを加えて紫外線に曝さなかったサンプルと比較して、プラーク形成アッセイ又はＴＣＩＤ５０アッセイを使用して評価することができる。実施例６で得られたデータに基づき、当業者は、ＵＶ曝露の増加がウイルスの不活化の向上と相関することを予測するだろう。
【０１０５】
実施例７−ＵＶ処理した乳とホルダー殺菌された乳の静菌性
ホルダー殺菌：
母親から供与された（実施例１）１０個の人乳冷凍サンプルそれぞれの一部（１．６ｍｌ；ｎ＝１０）を、２ｍｌポリプロピレンマイクロチューブに移した。その後、サンプルを予熱した水槽（ＣＣ−１，Huber  GmbH.  Offenburg,  Germany）内に置き、３０分間で６２．５℃にし、その直後に氷槽で冷却した。実験室分析を行うまで、サンプルを−８０℃で冷凍保存した。
【０１０６】
静菌性分析：
大腸菌Ｋ１２（ATCC1498,  Southern  Biological,  Nunawading,  Vic,  Australia）と黄色ブドウ球菌（ATCC6538,  American  Type  Culture  Collection  Inc,  Manassas,  VA,  USA）をニュートリエントブロス（Nutrient  Broth  No.2,  Oxoid  Australia  Pty  Ltd,  Adelaide,  SA,  Australia）で３７℃で一晩培養した。予め描かれた標準曲線を用いて吸光度法を使用して数えた後、培地を希釈して、未処理のサンプル、ＵＶ−Ｃ照射したサンプル及びホルダー殺菌したサンプルに植種して、大腸菌及び黄色ぶどう球菌の細菌負荷を２０００ＣＦＵ／ｍｌ（ミリットル当たりコロニー形成単位）にした。植菌直後と３７℃で２時間培養した後に、全てのサンプルを、複数、エオシンメチレンブルー寒天培地とマンニット食塩寒天培地（Oxoid  Australia  Pty  Ltd,  Adelaide,  SA,  Australia/Plain  agar,  Southern  Biological,  Nunawading,  Vic,  Australia）の上に蒔いた。その後、プレートを３７℃で一晩培養して、コロニーの数を数えて、ミリットル当たりコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍｌ）に基づいて細菌数を判定した。
【０１０７】
３７℃で２時間の培養時間が終わったところで、大腸菌と黄色ぶどう球菌の成長速度に差はなかった（ｐ＝０．６９）。従って、２つの種を残りの統計的分析用に１つのグループにした。
【０１０８】
未処理の人乳の細菌成長速度は毎時２．７±１．１倍であった。
ＵＶ−Ｃ照射した人乳（４６８３Ｊ／ｌ）の細菌成長速度は毎時３．１±０．９倍であった。この成長速度は未処理の人乳と大きく違わなかった（ｐ＝０．７５）。
【０１０９】
ホルダー殺菌した人乳の細菌成長速度は毎時５．１±１．４倍であった。ホルダー殺菌した人乳の細菌成長速度は、未処理の人乳とＵＶ−Ｃ照射した人乳のどちらと比べても著しく高かった（ｐ＜０．００１）。
【０１１０】
ニュートリエントブロスの細菌成長速度は毎時５．９±１．５倍であり、ホルダー殺菌した人乳と大きく違わなかった（ｐ＝０．１３）が、未処理の人乳とＵＶ−Ｃ照射した人乳のどちらと比べても著しく高かった（ｐ＜０．００１）（図６）。
【０１１１】
実施例８−ＵＶ処理及びホルダー殺菌後の人乳の免疫蛋白質濃度
１０個の人乳のサンプルに、実施例１及び７にそれぞれ記載したように、ＵＶ処理又はホルダー殺菌を行った。
【０１１２】
人乳サンプル中の分泌型ＩｇＡとラクトフェリンの含有量を、前に記載したスタンダードサンドイッチＥＬＩＳＡ法を使用して定量化した（Czank  C,  et  al  Pediatr  Res  2009;66:374-379）。全ての抗体とスタンダードはMP  Biomedicals  Australasia（New  South  Wales,  Australia）から購入した。分泌型ＩｇＡのリカバリアッセイは８５±４％（ｎ＝６）であり、ラクトフェリンのリカバリアッセイは８２±９％（ｎ＝６）であった。人乳サンプルのリゾチーム含有量は、ヒトリゾチーム酵素免疫抗体法（ＥＩＡ）キット（Biomedical  Technologies,  Inc.,  MA）を使用してメーカーの説明書に従って定量化した。
【０１１３】
これらのアッセイの結果を以下で表３に表す。
【０１１４】
【表３】
2015536681.tif 000005
【０１１５】
３４７４Ｊ／ｌのＵＶ−Ｃ照射量で照射したサンプルの分泌型ＩｇＡの濃度（ｐ＝０．０３６）とリゾチーム（ｐ＝０．０３２）の濃度は、未処理のサンプルと比べて著しく低かった。４６８３Ｊ／ｌで処理すると、どちらの蛋白質も有意性がｐ＜０．００１に増加した。使用した量では、ラクトフェリン（ｐ＝０．２８）の濃度は大きく減少しなかった。
【０１１６】
全固形分の濃度が高くなると、リゾチーム保持率が多くなることが分かった（ｐ＜０．００１）（図７）。人乳中の全固形分が１ｇ／ｌ増えるごとに、リゾチームの保持率は０．５５％パーセンテージポイント増加した。ＵＶ−Ｃ照射後の、全固形分濃度と分泌型ＩｇＡ（ｐ＝０．４５）又はラクトフェリン（ｐ＝０．２３）保持率の間には有意な相関は見られなかった。
【０１１７】
ホルダー殺菌後、分泌型ＩｇＡ、ラクトフェリン及びリゾチームの著しい減少が観察された（ｐ＜０．００１）（表２）（図８）。ホルダー殺菌の際の、全固形分の濃度と免疫蛋白質保持率の間に相関は見られなかった（ｐ＝０．７６）。
【０１１８】
実施例９−人乳の免疫蛋白質濃度と静菌性
さまざまな処理（未処理、ＵＶ−Ｃ照射、ホルダー殺菌）が与え得る影響を考慮しても、分泌型ＩｇＡ（ｐ＜０．００１）、ラクトフェリン（ｐ＜０．００１）及びリゾチーム（ｐ＜０．０１９）の濃度が個別に高くなれば、また、これら３つの合計（ｐ＜０．００１）の濃度が高くなっても、１時間あたりの細菌成長速度は低下した（図９）。人乳のサンプルは、分泌型ＩｇＡとラクトフェリン（ｐ＜０．００１）の濃度の間に高い相関を示したが、分泌型ＩｇＡとリゾチーム（ｐ＝０．３５）及びラクトフェリンとリゾチーム（ｐ＝０．２５）の間に有意な相関は見られなかった（図１０）。
【０１１９】
実施例１０−ＵＶ−Ｃ処理とホルダー殺菌後の抗酸化活性
搾り出した人乳を、搾乳中及び貯蔵中に酸素、光、電離放射線、及び温度変化に曝す。殺菌等の環境ストレスは人乳中の活性酸素種（ＲＯＳ）の生成の原因となり得る。温度上昇により細胞ＲＯＳの生成が高くなり、細胞の抗酸化能力を超え、次いで、その結果、ＲＯＳ濃度が増加し得る。
【０１２０】
人乳は、ラクトペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、カタラーゼ、スーパーオキシド・ジスムターゼ、ラクトフェリン、ビタミンＣ及びビタミンＥ等の抗酸化成分を含む。この実施例では、人乳の過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）状況と、ホルダー殺菌又はＵＶ−Ｃ照射がＨ２Ｏ２レベルを変えるかどうか、従って、人乳中の抗酸化成分の活性を調査する。
【０１２１】
実験の前に人乳のサンプルが供与され、−２０℃の冷凍庫に保管された。サンプルを紫外線又はホルダー殺菌で処理した。
【０１２２】
（ａ）紫外線処理
図１３の配置のように、各人乳サンプルの一部（１５０μｌ）を、ＵＶ−Ｃランプ（４Ｗ  波長２５４ｎｍ、４０ｍＷ／ｃｍ２＠１メーター、GPH287T5L、Infralight  Technology,  Helensburgh,  NSW,  Australia）の下に８ｍｍの距離で０．４ｍｍ層に置き、３分間照射した。これらの条件下で、人乳中のサイトメガロウイルスを減少するのに１０秒の処理時間が必要である（Marchant,  2011）。
【０１２３】
（ｂ）ホルダー殺菌
各人乳サンプルの一部（１．６ｍｌ）を２ｍｌポリプロピレンマイクロチューブに移した。サンプルを予熱した水槽（CC-1,  Huber  GmbH.  Offenburg,  Germany）内に置き、６２．５℃にして、３０分間維持し、その後すぐに氷槽で４℃に冷却し、分析又はさらなる処理のいずれかを施した。
【０１２４】
（ｃ）カタラーゼとＨ２Ｏ２処理
未処理、ＵＶ−Ｃ照射した、及びホルダー殺菌した人乳サンプルのそれぞれ一定分量を１０Ｕ／ｍｌのカタラーゼ（Sigma-Aldrich  Co.,  St  Louis,  MO,  USA）で処理し、室温で１５分間培養した。未処理、ＵＶ−Ｃ照射した、及びホルダー殺菌した人乳サンプルのそれぞれの別の一部を、１０μΜのＨ２Ｏ２で処理し、室温で１５分間培養した。
【０１２５】
（ｄ）過酸化水素の測定
アンプレックスレッドアッセイ（Amplex  red  assay）（Life  Technologies,  Carlsbad,  CA,  USA）を使用して過酸化水素活性を検出し、５４４ｎｍで励起を、５９０ｎｍで発光と１０のフラッシュを示した。
【０１２６】
ＵＶ−Ｃ処理の前に（図１４、時間＝−１分）、人乳は８０３±１３４の蛍光測定値を有していた。ＵＶ−Ｃ照射（０分）の直後に、蛍光測定値は１１，５１９±８２５０に著しく高くなった。ＵＶ−Ｃ処理の３分後、蛍光測定値は１，２３８±９０５であり、６分後は６２８±１８７であり、これは４５分まで一定であった（図１４）。
【０１２７】
未処理の人乳（ＵＨＭ）の蛍光測定値は、ＵＨＭ、１０Ｕ／ｍｌのカタラーゼを含むＵＨＭ、１０μΜのＨ２Ｏ２を含むＵＨＭで、それぞれ９３７±１１２、９５８±１１７、９３５±１２９であった（ｎ＝６）。ＵＶ−Ｃ照射した人乳（ＵＶＨＭ）の蛍光測定値は、ＵＶＨＭ、１０Ｕ／ｍｌのカタラーゼを含むＵＶＨＭ、１０μΜのＨ２Ｏ２を含むＵＶＨＭで、それぞれ１，０１４±１１２、１，０２５±１３７、１，１４３±１０９であった（ｎ＝６）。ホルダー殺菌した人乳（ＨＰＨＭ）の蛍光測定値は、ＨＰＨＭ、１０Ｕ／ｍｌのカタラーゼを含むＨＰＨＭ、及び１０μΜのＨ２Ｏ２を含むＨＰＨＭで、それぞれ１，１５５±１０４９、３６３±１２５、４，３８１±２６５７であった（ｎ＝６）（図１５）。
【０１２８】
結論として、未処理の人乳とＵＶ−Ｃ照射した人乳はＨ２Ｏ２のベースラインを有し、調節作用を有し、これによりベースラインを一定に保つ。ＵＶ−Ｃ照射は人乳中にＨ２Ｏ２を作り出すが、処理後３分以内に減少し、処理前のレベルに戻る。ホルダー殺菌した人乳はその調節作用を喪失して、Ｈ２Ｏ２レベルが環境ストレスによって変わり得る。この発見は、ＵＶ−Ｃ照射は、人乳中の抗酸化成分に対して重大なダメージの原因とはならないことを示唆している。
【０１２９】
本発明の前述の説明は、そのベストモードであると現在考えられていることを当業者が製造、使用することを可能にするが、当業者は、本明細書中の具体的な実施形態、方法、及び実施例の変形、組み合わせ、及び等価物が存在することを理解し、評価するべきである。従って、本発明は上述の実施形態、方法及び実施例に限定されるべきではなく、本明細書に広く記載される本発明の範囲及び趣旨に入る全ての実施形態と方法によって限定されるべきである。
【図１】
2015536681.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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