(57)【要約】本発明は、微生物学の分野、詳細には、第１酵素活性ドメインの源と第２酵素活性ドメインの源との組み合わせ、及び前記組み合わせを含む組成物に関する。本発明は、医薬品として用いるための前記組み合わせを含む組成物、抗微生物剤としての前記組成物の使用、並びに食品若しくは飼料製品中で、食物若しくは飼料加工設備で、及び／又は食物若しくは飼料加工設備中で、食物若しくは飼料容器で、及び／又は食物若しくは飼料容器中での微生物混入を制御するための方法にさらに関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１酵素活性ドメインの源と第２酵素活性ドメインの源との組み合わせであって、前記第１及び第２酵素活性ドメインがそれぞれ、別個の標的結合特異性を示し、別個の第１及び第２ポリペプチドに含まれる、組み合わせ。
【請求項２】
前記異なる標的結合が、細菌細胞のペプチドグリカン層中の必須結合であり、好ましくは、前記細菌細胞が、スタフィロコッカスである、請求項１に記載の組み合わせ。
【請求項３】
前記第１及び／又は前記第２酵素活性ドメインが、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼドメイン、エンドペプチダーゼドメイン、アミダーゼドメイン及びグリコシルヒドロラーゼからなる群から選択されるドメインである、請求項２に記載の組み合わせ。
【請求項４】
前記第１及び第２ポリペプチドが、異なる多数性の前記第１及び／又は第２酵素活性ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項５】
前記別個の第１及び第２ポリペプチドがそれぞれ、細胞壁結合ドメインをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項６】
前記第１酵素活性ドメインが、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼドメインであり、前記第２酵素活性ドメインが、エンドペプチダーゼドメインであり、
前記組み合わせが、別個の第３ポリペプチドに含まれる第３酵素活性ドメインの源をさらに含み、
前記第３酵素活性ドメインが、アミダーゼドメインであり、
前記別個の第３ポリペプチドが、細胞壁結合ドメインをさらに含み、
前記別個の第１、第２及び第３ポリペプチドのそれぞれが、多数性の前記第１、第２及び第３酵素活性ドメインを含む、
請求項５に記載の組み合わせ。
【請求項７】
前記第１ポリペプチドが、配列番号５８と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号７０と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、前記第３ポリペプチドが、配列番号５２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項６に記載の組み合わせ。
【請求項８】
第１酵素活性ドメインの前記源が、ポリペプチドを含み、及び／又は第２酵素活性ドメインの前記源が、ポリペプチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項９】
第１酵素活性ドメインの前記源が、前記第１酵素活性ドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、及び／又第２酵素活性ドメインの前記源が、前記第２酵素活性ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項１０】
前記第１酵素活性ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドが、発現コンストラクト中に存在し、及び／又は前記第２酵素活性ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドが、発現コンストラクト中に存在し、好ましくは、前記発現コンストラクトが、発現系に存在する、請求項９に記載の組み合わせ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組み合わせを含む組成物。
【請求項１２】
薬学的に許容される担体並びに／又はバクテリオファージ、静菌剤、殺菌剤、抗生物質、界面活性剤及び／若しくは酵素からなる群から選択される追加の活性成分をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
医薬品として用いるための、好ましくは、対象におけるスタフィロコッカスに関連する状態の処置、防止又は遅延のための医薬品として用いるための、請求項１１又は１２に記載の組成物。
【請求項１４】
抗微生物剤、好ましくは食物保存剤又は消毒剤としての、請求項１１又は１２に記載の組成物の使用。
【請求項１５】
食品若しくは飼料製品中で、食物若しくは飼料加工設備又は医療設備で、及び／又は食物若しくは飼料加工設備又は医療設備中で、食物若しくは飼料容器で、及び／又は食物若しくは飼料容器中での微生物混入を制御するための方法であって、請求項１１又は１２に記載の組成物を、食品若しくは飼料製品、食物若しくは飼料加工設備又は医療設備、及び／又は食物若しくは飼料容器と接触させるステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物学の分野、詳細には、第１酵素活性ドメインの源と第２酵素活性ドメインの源との組み合わせ、ポリペプチド、ポリヌクレオチド並びに前記組み合わせ、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを含む組成物に関する。本発明は、医薬品として用いるための前記組み合わせ、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを含む組成物、抗微生物剤としての前記組成物、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドの使用、並びに食品若しくは飼料製品中で、食物若しくは飼料加工設備で及び／又は食物若しくは飼料加工設備中で、食物若しくは飼料容器で及び／又は食物若しくは飼料容器中での微生物混入を制御するための方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、深刻な感染性疾患及び食中毒を頻繁に引き起こす主要なヒト病原体である。新たな抗生物質耐性株の出現のために、スタフィロコッカス・アウレウスの処置はより困難になっている。スタフィロコッカス・アウレウスに感染するファージからのエンドライシンは、ある                                                                                                          程度これらの病原体を制御できることが示されており、スタフィロコッカス・アウレウスの特異的検出のために用いることができる。ほとんどの場合では、スタフィロコッカス種を標的にするエンドライシンを用いることにおける主な障害は、酵素活性が低いこと、大量生産が困難なこと、及び／又はタンパク質安定性である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、例えば抗微生物活性及び／又は安定性についての特徴が改善された新しい抗微生物剤に対する必要性がまだ存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
第１の態様では、本発明は、第１酵素活性ドメインの源と第２酵素活性ドメインの源との組み合わせであって、前記第１及び第２酵素活性ドメインが、別個の標的結合特異性を示し、別個の第１及び第２ポリペプチドに含まれ、すなわち前記第１酵素活性ドメインが、第１ポリペプチドに含まれ、前記第２酵素ドメインが、第２ポリペプチドに含まれ、前記第１及び第２ポリペプチドがそれぞれ、別個のアミノ酸配列を有する組み合わせを提供する。さらに、本発明は、第１酵素活性ドメインの源と、第２酵素活性ドメインの源と、第３酵素活性ドメインの源との組み合わせであって、前記第１、第２及び第３酵素活性ドメインが、別個の標的結合特異性を示し、別個の第１、第２及び第３ポリペプチドに含まれ、すなわち前記第１酵素活性ドメインが、第１ポリペプチドに含まれ、前記第２酵素ドメインが、第２ポリペプチドに含まれ、前記第３酵素ドメインが、第３ポリペプチドに含まれ、前記第１、第２及び第３ポリペプチドがそれぞれ、別個のアミノ酸配列を有する組み合わせを提供する。さらに、本発明は、第１酵素活性ドメインの源と、第２酵素活性ドメインの源と、第３酵素活性ドメインの源と、さらなる酵素活性ドメインの源との組み合わせであって、前記第１、第２、第３及びさらなる酵素活性ドメインが、別個の標的結合特異性を示し、別個の第１、第２、第３及びさらなるポリペプチドに含まれ、すなわち、前記第１酵素活性ドメインが、第１ポリペプチドに含まれ、前記第２酵素ドメインが、第２ポリペプチドに含まれ、前記第３酵素ドメインが、第３ポリペプチドに含まれ、前記さらなる酵素活性ドメインが、さらなるポリペプチドに含まれ、前記第１、第２、第３及びさらなるポリペプチドがそれぞれ、別個のアミノ酸配列を有する組み合わせを提供する。さらなる酵素活性ドメインは、本明細書において、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０以上の酵素活性ドメイン、好ましくは第４酵素活性ドメインを意味する。さらなるポリペプチドは、本明細書において、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０以上のポリペプチド、好ましくは第４ポリペプチドを意味する。
【０００５】
ペプチドグリカンヒドロラーゼ活性を示す最も自然なスタフィロコッカスバクテリオファージエンドライシンは、Ｃ末端の細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）と、中央のＮ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼドメインと、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ（ＣＨＡＰ）相同性を有するＮ末端のアラニル−グリシルエンドペプチダーゼドメイン、又はＰｌｙ２６３８の場合、ペプチダーゼ＿Ｍ２３相同性を有するＮ末端のグリシル−グリシンエンドペプチダーゼドメインとからなる（後者の３つのドメインは、それぞれ別個の標的結合特異性でペプチドグリカンヒドロラーゼ活性を示し、本明細書において全般的に酵素活性ドメインと命名する）。本発明において、本発明による第１酵素ドメインは、特定の標的結合を加水分解する触媒活性を有し、該標的結合は、本発明による第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインにより加水分解される標的結合とは異なる。さらに、本発明において、本発明による第２酵素ドメインは、特定の標的結合を加水分解する触媒活性を有し、該標的結合は、本発明による第１並びに場合によって第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインにより加水分解される標的結合とは異なる。
【０００６】
本発明者らは、別個の標的結合特異性を有する２以上の酵素活性ドメインを同時に用いることにより相乗効果が得られることを、驚くべきことに見出した。驚くべきことに、異なる特異性を有する酵素活性ドメインが、自然のスタフィロコッカスエンドライシン中でのように同じ分子上にある場合だけでなく、異なる特異性を有する酵素活性ドメインが、別個のポリペプチド上に別々に存在する場合であっても、相乗効果が得られる。
【０００７】
別々で個別のポリペプチド上に別個の酵素活性ドメインがあることの利点は、得られるポリペプチドがより小さく、より容易に生成できることである。さらに、これらのより小さいポリペプチドは、特定の環境においてよりよい分散特性を有し、分解に対して耐性がより高く、より高い熱安定性を特徴とすることができる。別の利点は、別々で別個のポリペプチド分子上にある独立して別個の酵素活性ドメインは、特定の細菌標的細胞を加水分解するために最も適する比率で様々な組成物として混合及びプールできることである。本発明による組み合わせに対して、ファージ溶解素、バクテリオシン、自己溶菌酵素又は任意のその他の細胞壁溶解酵素を含む、多くの異なる起源からの実質的に全ての標的結合特異性を有する実質的に全ての機能的酵素活性ドメインを用いることにより、補充及び／又は補足できる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ（ＣＨＡＰ）ドメイン、エンドペプチダーゼドメイン（ペプチダーゼ＿Ｍ２３）、アミダーゼドメイン（Ａｍｉ２６３８）、ムラミダーゼドメイン及びグルコサミニダーゼドメインの標的結合部位。
【図２】部分精製タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ。１：ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号４６）、２：ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＮＭ３（配列番号４８）、３：ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号４４）、４：ＨＸａＣＨＡＰＴｗ＿ＣＷＴ−ＮＭ３（配列番号４２）、５：ＨＸａＣＨＡＰＴｗ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号４０）、６：ＨＸａＣＨＡＰＴｗ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号３８）、７：ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＮＭ３（配列番号３６）、８：ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号３４）、９：ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号３２）、１０：ＨＸａＡｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＮＭ３（配列番号３０）、１１：ＨＸａＡｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号２８）、１２：ＨＸａＡｍｉ２６３８＿ＣＢＤ２６３８（配列番号２６）。
【図３】部分精製タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ。１：ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号３２）、２：ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号３４）、３：ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＮＭ３（配列番号３６）、４：ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号５６）、５：ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５８）、６：ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＮＭ３（配列番号６０）。
【図４】部分精製タンパク質のＳＤＳ  ＰＡＧＥ。１：ＨＸａＡｍｉ２３６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＢＤ２６３８（配列番号５０）、２：ＨＸａＡｍｉ２３６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５２）、３：ＨＸａＡｍｉ２３６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＮＭ３（配列番号５４）、４：ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号６８）、５：ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号７０）。
【図５】Ｓ．アウレウスＢＢ２７０細胞に対する５０ｎＭ及び２００ｎＭタンパク質アッセイ濃度でのＣＨＡＰＫ含有溶解素の影響。試験したコンストラクト：ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５８）及びＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号５６）
【図６】Ｓ．アウレウスＢＢ２７０細胞に対する５０ｎＭ及び２００ｎＭタンパク質アッセイ濃度でのＭ２３−ＬＳＴ含有溶解素の影響。試験したコンストラクト：ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号７０）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号６８）及びＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号４６）
【図７】Ｓ．アウレウスＢＢ２７０細胞に対する５０ｎＭ及び２００ｎＭタンパク質アッセイ濃度でのＡｍｉ２６３８含有溶解素の影響。試験したコンストラクト：ＨＸａＡｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５２）、ＨＸａＡｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＢＤ２６３８（配列番号５０）、ＨＸａＡｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号２８）、ＨＸａＡｍｉ２６３８＿ＣＢＤ２６３８（配列番号２６）
【図８】等しいＣＢＤを有する５０ｎＭタンパク質混合物（１６．６７ｎＭの各タンパク質）の比較。試験したコンストラクト：ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５８）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号７０）、ＨＸａＡｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５２）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号５６）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号６８）、ＨＸａＡｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＢＤ２６３８（配列番号５０）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号３２）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号４４）及びＨＸａＡｍｉ２６３８＿ＣＢＤ２６３８（配列番号２６）。
【図９】等しいＣＢＤを有する２００ｎＭタンパク質混合物（６６．６７ｎＭの各タンパク質）の比較。試験したコンストラクト：ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５８）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号７０）、ＨＸａＡｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５２）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号５６）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号６８）、ＨＸａＡｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＢＤ２６３８（配列番号５０）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号３２）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号４４）及びＨＸａＡｍｉ２６３８＿ＣＢＤ２６３８（配列番号２６）。
【図１０】（１６．６７ｎＭ及び６６．６７ｎＭの各タンパク質）でのＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５８）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号７０）及びＨＸａＡｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５２）のタンパク質混合物と、５０ｎＭ及び２００ｎＭの参照タンパク質Ｍ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号７０）との比較。
【図１１】Ｓ．アウレウスＢＢ２７０細胞に対する３０ｎＭタンパク質アッセイ濃度でのＣＨＡＰＫ、Ｍ２３及びＡｍｉ含有溶解素の影響。試験したコンストラクト：ＨＸａＡｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号２８）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号３４）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号４６）、ＨＸａＡｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５２）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５８）及びＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号７０）。
【図１２】３０ｎＭタンパク質混合物（１５ｎＭの各タンパク質）の影響。試験したコンストラクト：ＨＸａＡｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号２８）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号３４）、ＨＸａＡｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５２）及びＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５８）。
【図１３】３０ｎＭタンパク質混合物（１５ｎＭの各タンパク質）の影響。試験したコンストラクト：ＨＸａＡｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号２８）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号４６）、ＨＸａＡｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５２）及びＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号７０）。
【図１４】３０ｎＭタンパク質混合物（１５ｎＭの各タンパク質）の影響。試験したコンストラクト：ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号３４）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号４６）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５８）及びＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号７０）。
【図１５】３０ｎＭタンパク質混合物（１０ｎＭの各タンパク質）の影響。試験したコンストラクト：ＨＸａＡｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号２８）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号３４）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号４６）、ＨＸａＡｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５２）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５８）及びＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号７０）。
【図１６】Ｓ．アウレウスＢＢ２７０細胞に対する５０ｎＭタンパク質アッセイ濃度でのＣＨＡＰＫ、Ｍ２３及びＡｍｉ含有溶解素の影響。試験したコンストラクト：ＨＸａＡｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号２８）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号３４）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号４６）、ＨＸａＡｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５２）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５８）及びＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号７０）。
【図１７】５０ｎＭタンパク質混合物（２５ｎＭの各タンパク質）の影響。試験したコンストラクト：ＨＸａＡｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号２８）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号３４）、ＨＸａＡｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５２）及びＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５８）。
【図１８】５０ｎＭタンパク質混合物（２５ｎＭの各タンパク質）の影響。試験したコンストラクト：ＨＸａＡｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号２８）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号４６）、ＨＸａＡｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５２）及びＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号７０）。
【図１９】５０ｎＭタンパク質混合物（２５ｎＭの各タンパク質）の影響。試験したコンストラクト：ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号３４）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号４６）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５８）及びＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号７０）。
【図２０】５０ｎＭタンパク質混合物（１６．６７ｎＭの各タンパク質）の影響。試験したコンストラクト：ＨＸａＡｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号２８）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号３４）、ＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号４６）、ＨＸａＡｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５２）、ＨＸａＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５８）及びＨＸａＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号７０）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の関係において、「組み合わせ」とは、第１酵素活性ドメインの源及び第２酵素活性ドメインの源が意図され、包含することを意味する。さらに、本発明の関係において、「組み合わせ」とは、第１酵素活性ドメインの源と、第２酵素活性ドメインの源と、場合によって第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインの源とを企図し、包含することを意味する。それぞれの源は、一緒であるか、又は一緒に存在するか、又は一緒に組み合わされるか、又は単一組成物を形成する他の源と物理的に接触することがある。それぞれの源は、代わりに、別個の組成物に含まれることがある。しかし、本発明は、本明細書で定義する本発明の効果を得るために、第１及び第２の酵素活性ドメインの源がともに必要であるか、又は用いられるという見識をもたらす。それぞれの源が同じ単一組成物中に存在しない場合、それぞれの源及び／又は本発明による組み合わせの源を含むそれぞれの別個の組成物は、逐次的又は同時に用いることができる。
【００１０】
「第１酵素活性ドメインの源」、「第２酵素活性ドメインの源」、「第３酵素活性ドメインの源」及び「さらなる酵素活性ドメインの源」は、タンパク質に基づく源、すなわちポリペプチド、タンパク質、タンパク質の消化物及び／又はタンパク質若しくは消化物の断片、又はタンパク質に基づかない源、すなわちタンパク質又は派生するペプチド若しくはタンパク質断片をコードする核酸を含むことが好ましい。以下において、我々は、本発明に包含される好ましい第１酵素活性ドメインの源、第２酵素活性ドメインの源、第３酵素活性ドメインの源及びさらなる酵素活性ドメインの源を定義した。本発明は、第１酵素活性ドメインの源と、第２酵素活性ドメインの源と、場合によって第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインの源との組み合わせに関するので、本明細書で定義する第１酵素活性ドメインの源のそれぞれは、本明細書で定義する第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインの源のそれぞれと組み合わせることができる。本発明は、タンパク質に基づく第１酵素活性ドメインの源と、タンパク質に基づかない第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインの源との組み合わせ、並びにその逆を用いることも包含する。
【００１１】
「酵素活性ドメイン」は、本明細書で定義する場合、溶解活性を有し、好ましくはペプチドグリカンヒドロラーゼ活性を示すドメインである。本発明による別個の第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドに含まれる本発明による第１、第２、第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインの溶解活性は、当業者に公知の方法により評価できる。ある実施形態では、溶解活性は、基質細胞懸濁物の濁度の下落を測定することにより分光光学的に評価される。濁度は、５９５ｎｍの波長にて光学密度を測定することにより評価され、培養物は、５９５ｎｍの波長にて少なくとも０．３ＯＤの光学密度を示す場合に濁っていると典型的に評価される。溶解活性は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）懸濁物の濁度の下落を分光光学的に測定することにより評価されることが好ましく、ここで、ＯＤ５９５を分光光学的に測定（リブラ（Ｌｉｂｒａ）Ｓ２２、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）することにより濁度が定量される。２００ｎＭの本明細書で同定する第１、第２及び／又は第３ポリペプチドを、分光光学的に評価（リブラＳ２２、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ）して初期ＯＤ５９５が１±０．０５であるＳ．アウレウス懸濁物と一緒にＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４、１２０ｍＭ塩化ナトリウム中、３７℃にて３０分間インキュベートすることがより好ましい。濁度の下落は、３０分間のインキュベーション前のＯＤ５９５から３０分間のインキュベーション後のＯＤ５９５を減じることにより算出する。本発明の関係において、第１、第２及び／又は第３ポリペプチドは、このアッセイを用いて、少なくとも１０、２０、３０、４０、５０又は６０％の濁度の下落が検出されるならば、溶解活性を有するという。少なくとも７０％の濁度の下落が検出されることが好ましい。本発明は、配列番号１によりコードされるＳ．アウレウスバクテリオファージΦ２６３８ａエンドライシン（配列番号２で同定されるＰｌｙ２６３８エンドライシン）の溶解活性の少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０又は２００％以上の溶解活性を示す第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドに関することが好ましい。
【００１２】
「別個の標的結合特異性を示し」とは、本明細書において、本発明による第１、第２、第３又はさらなる酵素活性ドメインのいずれかによる、前記第１、第２、第３又はさらなる酵素活性ドメインのいずれか他のものが酵素活性を示す標的結合とは別個の標的結合に対して示される酵素活性を意味する。
【００１３】
「別個のポリペプチドに含まれ」とは、本明細書において、前記第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインのいずれかが、前記第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインのいずれか他のものが含まれるポリペプチドとは別個のポリペプチドに含まれることを意味する。
【００１４】
本発明によるポリペプチドは、単離ポリペプチドであることが好ましい。本発明による核酸は、単離核酸であることが好ましい。本発明による核酸コンストラクトは、単離核酸コンストラクトであることが好ましい。
【００１５】
ある好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドは、精製を容易にするためのタグをコードする配列を含む。前記タグは、それらに限定されないが、ＦＬＡＧタグ、ポリ（Ｈｉｓ）タグ、ＨＡタグ及びＭｙｃタグからなる群から選択されることが好ましい。前記タグは、６×Ｈｉｓタグであることがより好ましい。前記タグは、配列番号７４と同一であり、配列番号７３によりコードされるＮ末端６×Ｈｉｓタグ（本明細書においてＨＸａと示す）であることがさらにより好ましい。
【００１６】
本発明による別個の標的結合は、細菌細胞のペプチドグリカン層中の必須結合であることが好ましく、前記細菌細胞は、スタフィロコッカスであることが好ましい。グラム陽性細菌細胞のペプチドグリカン層中の必須結合とは、本明細書において、前記細菌細胞の形及び浸透圧ショックに対して耐える堅固な構造をもたらすために前記ペプチドグリカンにおいて必須である前記ペプチドグリカン内の連結と定義される。グラム陽性細菌細胞のペプチドグリカン層中の前記必須結合は、基幹ペプチドのＤ−アラニンと架橋ペプチドのグリシンとの間の結合（本明細書において、Ｎ末端アラニンとグリシンとの間の結合とも定義される）、ペンタグリシン架橋中の結合（本明細書において、ペンタグリシンブリッジグリシル−グリシル結合とも定義される、Ｎ−アセチルムラモイルとＬ−アラニンとの間の結合、又はＮ−アセチルムラミンとＮ−アセチルグルコサミンとの間若しくはＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミンとの間の結合（図１）であることが好ましい。グラム陽性細菌細胞のペプチドグリカン層中のその他の好ましい必須結合は、ガンマ−グルタミル基幹ペプチド中の結合、基幹ペプチド中のＬ−アラニル−イソ−Ｄ−グルタミン酸の間の結合、及び基幹ペプチド中のイソ−Ｄ−グルタミン酸−Ｌ−リジンの間の結合である。
【００１７】
本発明による第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインは、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ（ＣＨＡＰ）ドメイン、エンドペプチダーゼドメイン及びアミダーゼドメインからなる群から選択されるドメインであることが好ましい。さらに、前記第１、第２、第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインは、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼ（ＣＨＡＰ）ドメイン、エンドペプチダーゼドメイン、アミダーゼドメイン及びグリコシルヒドロラーゼドメインからなる群から選択されるドメインであることが好ましい。前記グリコシルヒドロラーゼドメインは、ムラミダーゼドメイン又はグルコサミニダーゼドメインであり得る。
【００１８】
前記ＣＨＡＰドメインは、ペプチドグリカン層内のＮ末端アラニルとグリシルとの間の結合を切断することが好ましい。前記ＣＨＡＰドメインは、ペプチドグリカン層内のＮ末端アラニルとグリシルとの間の結合を特異的に切断することがより好ましい。前記エンドペプチダーゼドメインは、ペプチドグリカン層内のペンタグリシンブリッジグリシル−グリシル結合を切断することが好ましい。前記エンドペプチダーゼドメインは、ペプチドグリカン層内のペンタグリシンブリッジグリシル−グリシル結合を特異的に切断することがより好ましい。前記アミダーゼドメインは、ペプチドグリカン層内の中央のＮ−アセチルムラモイルとＬ−アラニンとの間の結合を切断することが好ましい。前記アミダーゼドメインは、ペプチドグリカン層内の中央のＮ−アセチルムラモイルとＬ−アラニンとの間の結合を特異的に切断することがより好ましい。前記ムラミダーゼドメインは、ペプチドグリカン層内のＮ−アセチルムラミンとＮ−アセチルグルコサミンとの間の結合を切断することが好ましい。前記ムラミダーゼドメインは、ペプチドグリカン層内のＮ−アセチルムラミンとＮ−アセチルグルコサミンとの間の結合を特異的に切断することがより好ましい。前記グルコサミニダーゼドメインは、ペプチドグリカン層内のＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミンとの間の結合を切断することが好ましい。前記グルコサミニダーゼドメインは、ペプチドグリカン層内のＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセチルムラミンとの間の結合を特異的に切断することがより好ましい。前記ペプチドグリカン層は、グラム陽性細菌細胞のものであることが好ましく、スタフィロコッカスのものであることが好ましく、スタフィロコッカス・アウレウスのものであることが最も好ましい。本明細書で定義する酵素活性ドメインによる結合の切断は、そのような結合が、本明細書において上で定義する任意のその他の結合の前記酵素活性ドメインでの加水分解と比較して、前記酵素活性ドメインを用いて少なくとも２、１０、５０又は１００倍効果的に加水分解されるならば、特異的であることが好ましい。
【００１９】
本発明に包含されるＣＨＡＰドメインは、スタフィロコッカスファージＫ及び／又はスタフィロコッカスファージＴｗｏｒｔを起源とすることが好ましい。本発明に包含されるＣＨＡＰドメインは、配列番号１０又は１２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有するドメインであることが好ましい。本発明に包含されるエンドペプチダーゼドメインは、Ｓ．アウレウスバクテリオファージΦ２６３８ａ及び／又はＳ．シミュランス（Ｓ．ｓｉｍｕｌａｎｓ）を起源とすることが好ましい。本発明に包含されるエンドペプチダーゼドメインは、配列番号１４又は１６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有することが好ましい。本発明に包含されるアミダーゼドメインは、Ｓ．アウレウスバクテリオファージΦ２６３８ａを起源とすることが好ましい。本発明のアミダーゼドメインは、配列番号１８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有することが好ましい。
【００２０】
本発明による第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドは、異なる多数性（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ）の本発明による第１、第２、第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインを含むことが好ましい。「多数性」とは、本明細書において、コピー数と定義される。「異なる多数性」とは、本明細書において、本発明の特定の酵素活性ドメインの多数性又はコピー数と定義され、すなわち、本発明の特異的なポリペプチド、すなわち本明細書で同定する第１、第２、第３又はさらなるポリペプチド内に含まれる、本明細書で同定する第１、第２、第３又はさらなる酵素活性ドメインが、本発明の組み合わせの別のポリペプチド内の同じ酵素活性ドメインの多数性又はコピー数とは異なると定義される。例えば、本発明の組み合わせは、特定のコピー数の第１酵素活性ドメインを含む第１ポリペプチドと、異なるコピー数の前記第１酵素活性ドメインを含む第２ポリペプチドとを含む。さらに、本発明の例示した前記組み合わせの前記第１ポリペプチドは、特定のコピー数の第２酵素活性ドメイン（これは、前記組み合わせの前記第２ポリペプチドに含まれる前記第２酵素活性ドメインのコピー数とは異なる）をさらに含んでもよい。さらに、本発明の例示した前記組み合わせのいずれのさらなるポリペプチドも、あるコピー数のさらなる酵素活性ドメイン（これは、前記組み合わせの前記第１及び第２ポリペプチドに含まれる前記さらなる酵素活性ドメインのコピー数とは異なる）を含んでもよい。単一で別個の酵素活性ドメインをそれぞれが含む別個のポリペプチドの組み合わせは、それぞれ別々のポリペプチドの溶解活性と比較して相乗的な溶解活性を示したが、本発明者らは、驚くべきことに、多数性の酵素活性ドメインを含むポリペプチドが、単一の酵素活性ドメインを含むポリペプチドと比較して、優れた溶解活性を示すことを見出した。
【００２１】
さらに、別個のポリペプチド上の別個の酵素ドメインの組み合わせ（前記別個のポリペプチドの少なくとも１つは、多数性の酵素活性ドメインを含む）は、前記別個のポリペプチドが全て単一で別個の酵素活性ドメインを含む組み合わせよりも優れていることが見出された。さらに、本発明による第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドがそれぞれ多数性の本発明による第１、第２、第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインを含む本発明による組み合わせは、前記第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドがそれぞれ単一コピーの前記第１、第２、第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインを含む本発明による組み合わせよりも優れていることが見出され、前記多数性は、本明細書で定義するように、２、すなわち二重性であることが好ましい。ある好ましい実施形態では、本発明による第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドがそれぞれ多数性の本発明による第１、第２、第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインを含む本発明による組み合わせの相乗効果は、前記第１、第２、第３及びさらなるポリペプチドがそれぞれ単一コピーの前記第１、第２、第３及びさらなる酵素活性ドメインを含む本発明による組み合わせよりも優れていることが見出され、前記多数性は、本明細書で以下に定義するように、２、すなわち二重性であることが好ましい。
【００２２】
本発明による第１及び／又は第２ポリペプチドは、異なる多数性の本発明による第１及び／又は第２酵素活性ドメインを含むことが好ましい。前記第１及び第２ドメインの多数性とは、本明細書で以前に定義したように、以下に示すような前記第１及び第２ドメインのコピー数（好ましくはｋ、ｌ、ｎ及びｐにより示される）と定義される：
ｋは、前記第１ポリペプチド上の前記第１酵素活性ドメインのコピー数を示し、
ｌは、前記第１ポリペプチド上の前記第２酵素活性ドメインのコピー数を示し、
ｎは、前記第２ポリペプチド上の前記第１酵素活性ドメインのコピー数を示し、
ｐは、前記第２ポリペプチド上の前記第２酵素活性ドメインのコピー数を示し、
ｋ及びｐは、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３又は好ましくは１〜２の独立した整数であり、ｌ及びｎは、０〜１０、０〜９、０〜８、０〜７、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３又は好ましくは０〜２の独立した整数であり、ｋは、ｎとは異なる整数であり、及び／又はｌは、ｐとは異なる整数であり、最も好ましくは、ｋ及びｐは、２であり、ｌ及びｎは、０である。
【００２３】
本発明の第１、第２及び第３ポリペプチドは、異なる多数性の本発明による第１、第２及び第３酵素活性ドメインを含むことが好ましい。
【００２４】
前記第１、第２及び第３ドメインの多数性は、本明細書で以前に定義したように、以下に示すような前記第１、第２及び第３ドメインのコピー数（好ましくは、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔにより示される）と定義される：
ｋは、前記第１ポリペプチド上の前記第１酵素活性ドメインのコピー数を示し、
ｌは、前記第１ポリペプチド上の前記第２酵素活性ドメインのコピー数を示し、
ｍは、前記第１ポリペプチド上の前記第３酵素活性ドメインのコピー数を示し、
ｎは、前記第２ポリペプチド上の前記第１酵素活性ドメインのコピー数を示し、
ｐは、前記第２ポリペプチド上の前記第２酵素活性ドメインのコピー数を示し、
ｑは、前記第２ポリペプチド上の前記第３酵素活性ドメインのコピー数を示し、
ｒは、前記第３ポリペプチド上の前記第１酵素活性ドメインのコピー数を示し、
ｓは、前記第３ポリペプチド上の前記第２酵素活性ドメインのコピー数を示し、
ｔは、前記第３ポリペプチド上の前記第３酵素活性ドメインのコピー数を示し、
ｋ、ｐ及びｔは、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３又は好ましくは１〜２の独立した整数であり、ｌ、ｍ、ｎ、ｑ、ｒ及びｓは、０〜１０、０〜９、０〜８、０〜７、０〜６、０〜５、０〜４、０〜３又は好ましくは０〜２の独立した整数であり、ｋは、ｎ及び／若しくはｒとは異なる整数であり、並びに／又はｌは、ｐ及び／若しくはｓとは異なる整数であり、並びに／又はｔは、ｍ若しくはｑとは異なる整数であり、最も好ましくは、ｋ、ｐ及びｔは、２であり、ｌ、ｍ、ｎ、ｑ、ｒ及びｓは、０である。
【００２５】
本発明の第１、第２、第３及びさらなるポリペプチドは、異なる多数性の本発明による第１、第２、第３及びさらなる酵素活性ドメインを含むことが好ましい。前記第１、第２及び第３酵素活性ドメインの観点における前記さらなる酵素活性ドメインの多数性は、第１、第２及び第３酵素活性ドメインについて本明細書において上で定義したものと同様の様式で、本明細書において解釈される。
【００２６】
本発明による第１、第２、第３又はさらなるポリペプチドは、少なくとも１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０若しくは３３０アミノ酸の長さ、及び／又は多くとも８５０、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０若しくは３７０アミノ酸の長さを有することが好ましい。本発明による第１、第２又は第３ポリペプチドは、１４０〜８５０、１４０〜８００、１４０〜７５０、１４０〜７００、１４０〜６５０、１４０〜６００、１４０〜５５０、１４０〜５００、１４０〜４９０、１４０〜４８０、１４０〜４７０、１４０〜４６０、１４０〜４５０、１４０〜４４０、１４０〜４３０、１４０〜４２０、１４０〜４１０、１４０〜４００、１４０〜３９０、１４０〜３８０、１４０〜３７０、１５０〜８５０、１６０〜８５０、１７０〜８５０、１８０〜８５０、１９０〜８５０、２００〜８５０、２１０〜８５０、２２０〜８５０、２３０〜８５０、２４０〜８５０、２５０〜８５０、２６０〜８５０、２７０〜８５０、２８０〜８５０、２９０〜８５０、３００〜８５０、３１０〜８５０、３２０〜８５０又は３３０〜８５０アミノ酸の長さを有することがより好ましい。
【００２７】
本発明による第１及び第２ポリペプチドは、それぞれ、少なくとも１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０若しくは３３０アミノ酸の長さ、及び／又は多くとも８００、８５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０若しくは３７０アミノ酸の長さを有することが好ましい。本発明による第１及び第２ポリペプチドは、それぞれ、１４０〜８５０、１４０〜８００、１４０〜７５０、１４０〜７００、１４０〜６５０、１４０〜６００、１４０〜５５０、１４０〜５００、１４０〜４９０、１４０〜４８０、１４０〜４７０、１４０〜４６０、１４０〜４５０、１４０〜４４０、１４０〜４３０、１４０〜４２０、１４０〜４１０、１４０〜４００、１４０〜３９０、１４０〜３８０、１４０〜３７０、１５０〜８５０、１６０〜８５０、１７０〜８５０、１８０〜８５０、１９０〜８５０、２００〜８５０、２１０〜８５０、２２０〜８５０、２３０〜８５０、２４０〜８５０、２５０〜８５０、２６０〜８５０、２７０〜８５０、２８０〜８５０、２９０〜８５０、３００〜８５０、３１０〜８５０、３２０〜８５０又は３３０〜８５０アミノ酸の長さを有することがより好ましい。
【００２８】
本発明による第１、第２及び第３ポリペプチドは、それぞれ、少なくとも１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０若しくは３３０アミノ酸の長さ、及び／又は多くとも８００、８５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０若しくは３７０アミノ酸の長さを有することが好ましい。本発明による第１、第２及び第３ポリペプチドは、それぞれ、１４０〜８５０、１４０〜８００、１４０〜７５０、１４０〜７００、１４０〜６５０、１４０〜６００、１４０〜５５０、１４０〜５００、１４０〜４９０、１４０〜４８０、１４０〜４７０、１４０〜４６０、１４０〜４５０、１４０〜４４０、１４０〜４３０、１４０〜４２０、１４０〜４１０、１４０〜４００、１４０〜３９０、１４０〜３８０、１４０〜３７０、１５０〜８５０、１６０〜８５０、１７０〜８５０、１８０〜８５０、１９０〜８５０、２００〜８５０、２１０〜８５０、２２０〜８５０、２３０〜８５０、２４０〜８５０、２５０〜８５０、２６０〜８５０、２７０〜８５０、２８０〜８５０、２９０〜８５０、３００〜８５０、３１０〜８５０、３２０〜８５０又は３３０〜８５０アミノ酸の長さを有することがより好ましい。
【００２９】
本発明による第１、第２、第３及びさらなるポリペプチドは、それぞれ、少なくとも１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０若しくは３３０アミノ酸の長さ、及び／又は多くとも８００、８５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４９０、４８０、４７０、４６０、４５０、４４０、４３０、４２０、４１０、４００、３９０、３８０若しくは３７０アミノ酸の長さを有することが好ましい。本発明による第１、第２、第３及びさらなるポリペプチドは、それぞれ、１４０〜８５０、１４０〜８００、１４０〜７５０、１４０〜７００、１４０〜６５０、１４０〜６００、１４０〜５５０、１４０〜５００、１４０〜４９０、１４０〜４８０、１４０〜４７０、１４０〜４６０、１４０〜４５０、１４０〜４４０、１４０〜４３０、１４０〜４２０、１４０〜４１０、１４０〜４００、１４０〜３９０、１４０〜３８０、１４０〜３７０、１５０〜８５０、１６０〜８５０、１７０〜８５０、１８０〜８５０、１９０〜８５０、２００〜８５０、２１０〜８５０、２２０〜８５０、２３０〜８５０、２４０〜８５０、２５０〜８５０、２６０〜８５０、２７０〜８５０、２８０〜８５０、２９０〜８５０、３００〜８５０、３１０〜８５０、３２０〜８５０又は３３０〜８５０アミノ酸の長さを有することがより好ましい。
【００３０】
ある実施形態は、本発明による第１及び第２酵素活性ドメインの源の組み合わせであって、前記第１及び第２酵素活性ドメインが、別個の本発明の第１及び第２ポリペプチドに含まれ、前記第１ポリペプチドが、前記第２酵素活性ドメインを含まず、前記第２ポリペプチドが、前記第１酵素活性ドメインを含まない組み合わせを提供する。さらに、ｌ及びｎが０である本発明による組み合わせが提供される。
【００３１】
別の実施形態は、本発明による第１、第２及び第３酵素活性ドメインの源の組み合わせであって、前記第１、第２及び第３酵素活性ドメインが、別個の第１、第２及び第３ポリペプチドに含まれ、前記第１ポリペプチドが、前記第２及び第３酵素活性ドメインを含まず、前記第２ポリペプチドが、前記第１及び第３酵素活性ドメインを含まず、前記第３ポリペプチドが、前記第１及び第２酵素活性ドメインを含まない組み合わせを提供する。さらに、ｌ、ｍ、ｎ、ｑ、ｒ及びｓが０である本発明による組み合わせが提供される。本発明は、ｌ、ｍ、ｎ、ｑ、ｒ及びｓが０であり、ｋ、ｐ及びｔが２である本発明による組み合わせを提供することがさらにより好ましい。
【００３２】
別の実施形態は、本発明による第１、第２、第３及びさらなる酵素活性ドメインの源の組み合わせであって、前記第１、第２、第３及びさらなる酵素活性ドメインが、別個の第１、第２、第３及びさらなるポリペプチドにそれぞれ含まれ、
好ましくは、前記第１ポリペプチドが、前記第２、第３及びさらなる酵素活性ドメインを含まず、
好ましくは、前記第２ポリペプチドが、前記第１、第３及びさらなる酵素活性ドメインを含まず、
好ましくは、前記第３ポリペプチドが、前記第１、第２及びさらなる酵素活性ドメインを含まず、
好ましくは、前記さらなるポリペプチドが、前記第１、第２及び第３酵素活性ドメインを含まない、
組み合わせを提供する。
【００３３】
前記第１、第２、第３及びさらなる酵素活性ドメインは、前記第１、第２、第３及びさらなるポリペプチド内でそれぞれ二重に含まれ、すなわち、本明細書で同定される多数性が２であることが好ましい。本発明による第１、第２及び／又は第３ポリペプチドが、本発明による第１、第２及び／又は第３酵素活性ドメインを含まなくないが、前記第１、第２及び／又は第３ポリペプチドが、前記第１、第２及び／又は第３酵素活性ドメインの多数性において異なる本発明による組み合わせも包含される。さらに、ｋ、ｌ、ｍ、ｎ  ｐ、ｑ、ｒ、ｓ又はｔの少なくとも１つが２であり、他のｋ、ｌ、ｍ、ｎ  ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及び／又はｔのいずれかが１又は０である本発明による組み合わせが包含される。
【００３４】
本発明によるポリペプチドが、細胞壁結合ドメインをさらに含む本発明による組み合わせが好ましい。さらに、本明細書で定義するように少なくとも１つの酵素活性ドメインをそれぞれが含む本発明による第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドは、細胞壁結合ドメインをさらに含む。本発明の細胞壁結合ドメインは、前記別個のポリペプチドを細胞の細菌壁に向かわせる要素、好ましくは前記別個のポリペプチド内のポリペプチドと定義される。本発明の細胞壁結合ドメインは、前記別個のポリペプチドをグラム陽性細菌細胞のペプチドグリカン細胞壁、好ましくはスタフィロコッカス細菌細胞のペプチドグリカン細胞壁に向かわせる要素、好ましくは前記別個のポリペプチド内のポリペプチドであることが好ましい。
【００３５】
ドメインとスタフィロコッカス属のペプチドグリカン細胞壁との結合は、当業者に公知のアッセイを用いて評価できる。ある好ましい実施形態では、免疫組織化学技術及び／又は標識コンストラクトをもたらす遺伝子融合技術を、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質と、スタフィロコッカス属のペプチドグリカン細胞壁との特異的結合を評価するために用いる。上記の免疫組織化学又は融合技術において用いるシグナルの定量方法は、当業者に公知である。
【００３６】
一実施形態では、スタフィロコッカスペプチドグリカン細胞壁結合は、対象の細胞壁ドメインを含む蛍光融合コンストラクトを用いて定量される。このような細胞壁結合アッセイは、Ｌｏｅｓｓｎｅｒら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２００２、４４（２）：３３５〜３４９頁）に詳細に記載されている。このアッセイでは、前記蛍光融合コンストラクト又は陰性対照、好ましくは緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む溶液を、スタフィロコッカス細胞、好ましくはＳ．アウレウス細胞、より好ましくはＳ．アウレウスＢＢ２５５に、記載された時間与え、その後、細胞を、結合した蛍光融合コンストラクトと一緒に遠心分離により沈降させる。蛍光融合コンストラクトに曝露したスタフィロコッカス細胞の蛍光シグナルから、陰性対照、好ましくはＧＦＰに曝露したスタフィロコッカスの細胞の蛍光シグナルを減じたものが、本開示において意味する細胞結合の尺度である。本発明の関係において、ドメインは、このアッセイを用いて、本明細書で定義するような陰性対照を超える沈降細胞の蛍光シグナルの増加が検出される場合、スタフィロコッカス属のペプチドグリカン細胞壁と結合するといわれることが好ましい。本発明は、配列番号１によりコードされるＳ．アウレウスバクテリオファージΦ２６３８ａエンドライシン（配列番号２により定義されるＰｌｙ２６３８エンドライシン）のペプチドグリカン細胞壁結合の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０又は１００、１５０又は２００％の本明細書で定義する結合を示す細胞壁結合ドメインに関することが好ましい。
【００３７】
本発明に包含される細胞壁結合ドメインは、当業者に知られる任意の細胞壁結合ドメインであってもよい。本発明の好ましい細胞壁結合ドメインは、配列番号４により本明細書で定義され、配列番号３によりコードされるＳ．シミュランスリゾスタフィンの細胞壁結合ドメインと少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する細胞壁結合ドメインである。自然のスタフィロコッカスバクテリオファージエンドライシンから単離される細胞壁結合ドメインも好ましい。本発明の細胞壁結合ドメインは、配列番号６により本明細書で定義され、配列番号５によりコードされるＳ．アウレウスバクテリオファージΦ２６３８ａエンドライシンの細胞壁結合ドメインと少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有することが好ましい。自然のスタフィロコッカス・アウレウスファージｐｈｉＮＭ３エンドライシンから単離される細胞壁結合ドメインも好ましい。本発明の細胞壁結合ドメインは、配列番号８により本明細書で定義され、配列番号７によりコードされるＳ．アウレウスファージｐｈｉＮＭ３エンドライシンの細胞壁結合ドメインと少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有することが好ましい。
【００３８】
本発明による細胞壁結合ドメインは、前記別個の第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドに関して酵素活性ドメインのＣ末端側にあることが好ましい。本発明による別個の第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなるポリペプチドが、それらの特定の酵素活性ドメインだけでなく、それらの特定の細胞壁結合ドメインにおいても異なる本発明による組み合わせがさらに包含されることが理解される。本発明による別個の第１、第２及び場合によって第３ポリペプチドが、本発明による細胞壁結合ドメインを含まない本発明による組み合わせさえ、本発明の範囲内である。さらに、本発明による第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなるポリペプチドの１つ又は２つが細胞壁結合ドメインを含まない本発明による組み合わせは、本発明の範囲内である。
【００３９】
本発明による第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドが、配列番号２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０又は７２からなる群から選択されるポリペプチドと少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有するポリペプチドである本発明による組み合わせが好ましい。
【００４０】
ある好ましい実施形態では、本発明は、第１酵素活性ドメイン及び第２酵素活性ドメインの源の組み合わせであって、前記第１及び第２酵素活性ドメインが、別個の第１及び第２ポリペプチドに含まれ、前記第１酵素活性ドメインが、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼドメインであり、前記第２酵素活性ドメインが、エンドペプチダーゼドメインであるか、又は前記第１酵素活性ドメインが、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼドメインであり、前記第２酵素活性ドメインが、アミダーゼドメインであるか、又は前記第１酵素活性ドメインが、エンドペプチダーゼドメインであり、前記第２酵素活性ドメインが、アミダーゼドメインであり、前記別個の第１及び第２がそれぞれ、細胞壁結合ドメインをさらに含み、前記別個の第１及び第２ポリペプチドがそれぞれ、多数性の前記第１又は第２酵素活性ドメインを含み、好ましくは前記多数性が２、すなわち二重性である組み合わせを提供する。さらに、ある好ましい実施形態では、本発明は、第１及び第２酵素活性ドメインの源の組み合わせであって、前記第１及び第２酵素活性ドメインが、別個の第１及び第２ポリペプチドに含まれ、前記第１酵素ドメインが、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼドメインであり、前記第２酵素活性ドメインが、エンドペプチダーゼドメインであるか、又は前記第１酵素活性ドメインが、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼドメインであり、前記第２酵素活性ドメインが、アミダーゼドメインであるか、又は前記第１酵素活性ドメインが、エンドペプチダーゼドメインであり、前記第２酵素活性ドメインが、アミダーゼドメインであり、前記第１及び第２ポリペプチドがそれぞれ、細胞壁結合ドメインをさらに含む組み合わせを提供する。
【００４１】
ある好ましい実施形態では、本発明は、第１酵素活性ドメイン及び第２酵素活性ドメインの源の組み合わせであって、前記第１及び第２酵素活性ドメインが、別個の第１及び第２ポリペプチドに含まれ、前記第１酵素活性ドメインが、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼドメインであり、前記第２酵素活性ドメインが、エンドペプチダーゼドメインであり、前記組み合わせが、別個の第３ポリペプチドに含まれる第３酵素活性ドメインの源をさらに含み、前記第３酵素活性ドメインが、アミダーゼドメインであり、前記別個の第１、第２及び第３ポリペプチドがそれぞれ、細胞壁結合ドメインをさらに含み、前記別個の第１、第２及び第３ポリペプチドのそれぞれが、多数性の前記第１、第２又は第３酵素活性ドメインを含み、好ましくは前記多数性が２、すなわち二重性である組み合わせを提供する。さらに、ある好ましい実施形態では、本発明は、第１、第２及び第３酵素活性ドメインの源の組み合わせであって、前記第１、第２及び第３酵素活性ドメインが、別個の第１、第２及び第３ポリペプチドに含まれ、前記第１酵素ドメインが、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼドメインであり、前記第２酵素活性ドメインが、エンドペプチダーゼドメインであり、前記第３酵素活性ドメインが、アミダーゼドメインであり、前記第１、第２及び第３ポリペプチドがそれぞれ、細胞壁結合ドメインをさらに含む組み合わせを提供する。
【００４２】
本発明による第１酵素活性ドメインが、配列番号１０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２酵素活性ドメインが、配列番号１６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００４３】
本発明による第１酵素活性ドメインが、配列番号１０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２酵素活性ドメインが、配列番号１８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００４４】
本発明による第１酵素活性ドメインが、配列番号１６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２酵素活性ドメインが、配列番号１８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００４５】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号３４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号４６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００４６】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号３４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号２８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００４７】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号４６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号２８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００４８】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号７０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００４９】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号５２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００５０】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号７０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号５２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせがより好ましい。
【００５１】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号４６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００５２】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号２８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００５３】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号７０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号３４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００５４】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号７０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号２８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせがより好ましい。
【００５５】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号３４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００５６】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号４６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００５７】
本発明による第１酵素活性ドメインが、配列番号１０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２酵素活性ドメインが、配列番号１６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３酵素活性ドメインが、配列番号１８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００５８】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号３４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号４６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号２８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００５９】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号３２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号４４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号２６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００６０】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号３４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号４６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号２６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００６１】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号３６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号４８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号３０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００６２】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号３２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号４６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号２６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００６３】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号３４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号４４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号２６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００６４】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号３２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号４４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号２８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００６５】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号３２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号４６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号２８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００６６】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号３４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号４４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号２８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００６７】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号７０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号５２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせが好ましい。
【００６８】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号７０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号５０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせも好ましい。
【００６９】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号６８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号５０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせがさらに好ましい。
【００７０】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号６０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号７２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号５４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせも好ましい。
【００７１】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号７０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号５０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせも好ましい。
【００７２】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号６８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号５０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせも好ましい。
【００７３】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号６８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号５２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせも好ましい。
【００７４】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号６５と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号７０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号５２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせも好ましい。
【００７５】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号６８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号５２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせも好ましい。
【００７６】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号７０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号２８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせも好ましい。
【００７７】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号３４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号７０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号５２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせも好ましい。
【００７８】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号４６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号５２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせも好ましい。
【００７９】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号３４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号４６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号５２と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせも好ましい。
【００８０】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号５８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号４６と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号２８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせも好ましい。
【００８１】
本発明による第１ポリペプチドが、配列番号３４と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第２ポリペプチドが、配列番号７０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有し、本発明による第３ポリペプチドが、配列番号２８と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有する本発明による組み合わせも好ましい。本発明による組み合わせは、様々な比率での第１酵素活性ドメインの源と、第２酵素活性ドメインの源と、場合によって第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインの源との混合物を包含することが理解される。本発明による組み合わせは、本発明による第１酵素活性ドメインの源と第２酵素活性ドメインの源とを含み、前記第１及び第２酵素活性ドメインが、等モル量で存在することが好ましい。本発明による第１酵素活性ドメインの源と、第２酵素活性ドメインの源と、第３酵素活性ドメインの源とを含む本発明による組み合わせであって、前記第１、第２及び第３酵素活性ドメインが、等モル量で存在する組み合わせも好ましい。本発明による第１酵素活性ドメインの源と、第２酵素活性ドメインの源と、第３酵素活性ドメインの源と、さらなる酵素活性ドメインの源とを含む本発明による組み合わせであって、前記第１、第２、第３及びさらなる酵素活性ドメインが、等モル量で存在する組み合わせも好ましい。
【００８２】
第２の態様では、本発明は、第１の態様による組み合わせであって、本発明の第１の態様による第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインの源が、ポリペプチドを含む組み合わせを提供する。前記ポリペプチドは、タンパク質、タンパク質の消化物及び／又はタンパク質若しくは消化物の断片であってもよく、精製された形であってもよいか、又は好ましくは生物起源の粗製組成物、例えば細菌可溶化液、酵母可溶化液、真菌可溶化液、音波破砕物又は固定物に含まれてもよい。代わりに、前記ポリペプチドは、化学合成ポリペプチド又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された組換えポリペプチドであってもよい。
【００８３】
本発明による前記第１酵素活性ドメインの源は、本発明の第１の態様による第１ポリペプチドを含み、本発明による第２酵素活性ドメインは、本発明の第１の態様による第２ポリペプチドを含み、場合によって、本発明による第３酵素活性ドメインは、本発明の第１の態様による第３ポリペプチドを含み、場合によって、本発明によるさらなる酵素活性ドメインは、本発明の第１の態様によるさらなるポリペプチドを含むことが好ましい。前記第１酵素活性ドメインの前記源は、本発明の第１の態様による第１ポリペプチドからなり、前記第２酵素活性ドメインは、本発明の第１の態様による第２ポリペプチドからなり、前記第３酵素活性ドメインは、本発明の第１の態様による第３ポリペプチドからなり、前記さらなる酵素活性ドメインは、本発明のさらなる態様による第３ポリペプチドからなることがより好ましい。
【００８４】
ある実施形態は、本発明による組み合わせであって、本発明の第１、第２並びに／又は場合によって第３及び／若しくはさらなるポリペプチドが、第１、第２並びに／又は第３及び／若しくはさらなるバリアントポリペプチドである組み合わせを包含する。バリアントポリペプチドは、ポリペプチドの天然に存在しない形であってもよい。ポリペプチドバリアントは、その自然の源から単離されたポリペプチドから、いくらか工学的に異なっていることがある。バリアントは、本明細書で定義され、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１又は７３により示されるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からの部位特異的突然変異誘発により作製できる。本発明によるポリペプチドバリアントは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２又は７４のいずれかと少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有することが好ましい。本発明による組み合わせでは、ポリペプチドバリアントは、コードされるポリペプチドの生物学的機能を変更しない変異を含有することが好ましい。
【００８５】
本発明によるポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１又は７３のいずれかと少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有することができるか、又は代わりに、これらの示した配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズできる。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、当該技術において理解されているものであり、例えば、６×ＳＳＣ（１０００ｍｌあたり２０×ＳＳＣ：１７５．３ｇ  ＮａＣ１、１０７．１ｇクエン酸ナトリウム．５Ｈ  ２０、ｐＨ７．０）、０．１％ＳＤＳ、０．０５％ピロリン酸ナトリウム、５＊デンハルト溶液及び２０μｇ／ｍ１変性ニシン精子ＤＮＡ中、５６℃にて１８〜２４時間のハイブリダイゼーションと、その後の５６℃にて５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で３０分間の２回の洗浄と、５６℃にて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＳＣ中で３０分間の２回の洗浄である。
【００８６】
好ましい実施形態によると、ポリペプチドバリアントは、本明細書において以前に同定したアッセイにより測定して、配列番号２の溶解及び／又は細胞壁結合活性と比較して同じ又はそれより増進された溶解又は細胞壁結合活性を示す。
【００８７】
本発明による組み合わせは、様々な比率での本発明による第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなるポリペプチドの混合物を包含することが理解される。本発明による組み合わせは、本発明による第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなるポリペプチドを含み、第１及び第２酵素活性ドメインが、等モル量で存在することが好ましい。本発明による第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなるポリペプチドの等モル量を含む本発明による組み合わせであって、第１、第２並びに第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインが、等モル量で存在する組み合わせも好ましい。
【００８８】
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様による組み合わせであって、本発明の第１の態様による第１酵素活性ドメインの源が、前記第１酵素活性ドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、本発明の第１の態様による第２酵素活性ドメインの源が、前記第２酵素活性ドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、場合によって、本発明の第１の態様による第３酵素活性ドメインの源が、前記第３酵素活性ドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、場合によって、本発明の第１の態様によるさらなる酵素活性ドメインの源が、前記さらなる酵素活性ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む組み合わせを提供する。前記ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子であってもよい。
【００８９】
本発明は、本発明による組み合わせであって、第１ポリヌクレオチドが、本発明による第１酵素活性ドメインをコードし、第２ポリヌクレオチドが、本発明による第２酵素活性ドメインをコードする組み合わせを提供することが好ましい。本発明による組み合わせでは、本発明による第１及び／又は第２ポリヌクレオチドは、本明細書で定義する細胞壁結合ドメインをさらにコードすることが好ましい。本発明は、本発明による組み合わせであって、第１ポリヌクレオチドが、本発明による第１酵素活性ドメインをコードし、第２ポリヌクレオチドが、本発明による第２酵素活性ドメインをコードし、第３ポリヌクレオチドが、本発明による第３酵素活性ドメインをコードし、さらなるポリヌクレオチドが、本発明によるさらなる酵素活性ドメインをコードする組み合わせを提供することが好ましい。本発明による組み合わせでは、本発明による第１、第２、第３及び／又はさらなるポリヌクレオチドは、本明細書で定義する細胞壁結合ドメインをさらにコードすることが好ましい。
【００９０】
本発明は、本発明による組み合わせであって、本発明の第１、第２並びに／又は場合によって第３及び／若しくはさらなるポリペプチドが、自然に存在するか又は改造されたポリヌクレオチドコンストラクトによりコードされるキメラ第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドである組み合わせをさらに提供する。改造コンストラクトは、本明細書において、異種ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと定義される。本明細書で用いる場合、用語「異種配列」又は「異種ポリヌクレオチド」は、天然で前記第１ヌクレオチド配列の隣接配列として作動可能に連結していないものである。本明細書で用いる場合、用語「異種」は、組換えを意味することがある。組換えとは、自然で一般的に見出されるものとは別個の遺伝子物体のことをいう。ヌクレオチド配列又は核酸分子に対して用いる場合、組換えとは、前記ヌクレオチド配列又は核酸分子が、クローニング、制限及び／又はライゲーションステップ並びに自然で見出される配列又は分子とは別個のコンストラクトの生成をもたらすその他の手順の様々な組み合わせの生成物であることを意味する。本発明による組み合わせでは、前記キメラポリペプチドは、本明細書において以前に定義した第１、第２又は第３ポリペプチドを少なくとも含み、本明細書において以前に定義した少なくとも１つの細胞結合ドメインをさらに含むことが好ましい。
【００９１】
代替の実施形態は、本発明の組み合わせであって、キメラポリペプチドが、Ｃ末端で疎水性ペンタペプチド（前記疎水性ペンタペプチドは、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏであることが好ましい）と共有的に連結された本明細書で定義するエンドライシンを含み、結果として、Ｉｂｒａｈｉｍら、１９９４（ＪＢＣ  １９９４第２６９巻、５０５３〜５０６３頁）により報告されるように、特にグラム陰性細菌に対するエンドライシンの殺菌作用の増加がもたらされる組み合わせを提供する。
【００９２】
本発明による組み合わせでは、本発明による第１、第２、第３及び／又はさらなるポリヌクレオチドは、少なくとも４２０、４５０、４８０、５１０、５４０、５７０、６００、６３０、６６０、６９０、７２０、７５０、７８０、８１０、８４０、８７０、９００、９３０、９６０若しくは９９０ヌクレオチドの長さ、及び／又は多くとも２５５０、２４００、２２５０、２１００、１９５０、１８００、１６５０、１５００、１４７０、１４４０、１４１０、１３８０、１３５０、１３２０、１２９０、１２６０、１２３０、１２００、１０７０、１０４０若しくは１１００ヌクレオチドの長さを有することが好ましい。本発明による第１、第２、第３及び／又はさらなるポリヌクレオチドは、４２０〜２５５０、４２０〜２４００、４２０〜２２５０、４２０〜２１００、４２０〜１９５０、４２０〜１８００、４２０〜１６５０、４２０〜１５００、４２０〜１４７０、４２０〜１４４０、４２０〜１４１０、４２０〜１３８０、４２０〜１３５０、４２０〜１３２０、４２０〜１２９０、４２０〜１２６０、４２０〜１２３０、４２０〜１２００、４２０〜１０７０、４２０〜１０４０又は４２０〜１１００、４５０〜２５５０、４８０〜２５５０、５１０〜２５５０、５４０〜２５５０、５７０〜２５５０、６００〜２５５０、６３０〜２５５０、６６０〜２５５０、６９０〜２５５０、７２０〜２５５０、７５０〜２５５０、７８０〜２５５０、８１０〜２５５０、８４０〜２５５０、８７０〜２５５０、９００〜２５５０、９３０〜２５５０、９６０〜２５５０又は９９０〜２５５０ヌクレオチドの長さを有することがより好ましい。
【００９３】
本発明による第１及び第２ポリヌクレオチドは、それぞれ、少なくとも４２０、４５０、４８０、５１０、５４０、５７０、６００、６３０、６６０、６９０、７２０、７５０、７８０、８１０、８４０、８７０、９００、９３０、９６０若しくは９９０ヌクレオチドの長さ、及び／又は多くとも２５５０、２４００、２２５０、２１００、１９５０、１８００、１６５０、１５００、１４７０、１４４０、１４１０、１３８０、１３５０、１３２０、１２９０、１２６０、１２３０、１２００、１０７０、１０４０若しくは１１００ヌクレオチドの長さを有することが好ましい。本発明による第１及び第２ポリヌクレオチドは、それぞれ、４２０〜２５５０、４２０〜２４００、４２０〜２２５０、４２０〜２１００、４２０〜１９５０、４２０〜１８００、４２０〜１６５０、４２０〜１５００、４２０〜１４７０、４２０〜１４４０、４２０〜１４１０、４２０〜１３８０、４２０〜１３５０、４２０〜１３２０、４２０〜１２９０、４２０〜１２６０、４２０〜１２３０、４２０〜１２００、４２０〜１０７０、４２０〜１０４０又は４２０〜１１００、４５０〜２５５０、４８０〜２５５０、５１０〜２５５０、５４０〜２５５０、５７０〜２５５０、６００〜２５５０、６３０〜２５５０、６６０〜２５５０、６９０〜２５５０、７２０〜２５５０、７５０〜２５５０、７８０〜２５５０、８１０〜２５５０、８４０〜２５５０、８７０〜２５５０、９００〜２５５０、９３０〜２５５０、９６０〜２５５０又は９９０〜２５５０ヌクレオチドの長さを有することがより好ましい。
【００９４】
本発明による第１、第２及び第３ポリヌクレオチドは、それぞれ、少なくとも４２０、４５０、４８０、５１０、５４０、５７０、６００、６３０、６６０、６９０、７２０、７５０、７８０、８１０、８４０、８７０、９００、９３０、９６０若しくは９９０ヌクレオチドの長さ、及び／又は多くとも２５５０、２４００、２２５０、２１００、１９５０、１８００、１６５０、１５００、１４７０、１４４０、１４１０、１３８０、１３５０、１３２０、１２９０、１２６０、１２３０、１２００、１０７０、１０４０若しくは１１００ヌクレオチドの長さを有することが好ましい。本発明による第１、第２及び第３ポリヌクレオチドは、それぞれ、４２０〜２５５０、４２０〜２４００、４２０〜２２５０、４２０〜２１００、４２０〜１９５０、４２０〜１８００、４２０〜１６５０、４２０〜１５００、４２０〜１４７０、４２０〜１４４０、４２０〜１４１０、４２０〜１３８０、４２０〜１３５０、４２０〜１３２０、４２０〜１２９０、４２０〜１２６０、４２０〜１２３０、４２０〜１２００、４２０〜１０７０、４２０〜１０４０又は４２０〜１１００、４５０〜２５５０、４８０〜２５５０、５１０〜２５５０、５４０〜２５５０、５７０〜２５５０、６００〜２５５０、６３０〜２５５０、６６０〜２５５０、６９０〜２５５０、７２０〜２５５０、７５０〜２５５０、７８０〜２５５０、８１０〜２５５０、８４０〜２５５０、８７０〜２５５０、９００〜２５５０、９３０〜２５５０、９６０〜２５５０又は９９０〜２５５０ヌクレオチドの長さを有することがより好ましい。
【００９５】
本発明による第１、第２、第３及びさらなるポリヌクレオチドは、それぞれ、少なくとも４２０、４５０、４８０、５１０、５４０、５７０、６００、６３０、６６０、６９０、７２０、７５０、７８０、８１０、８４０、８７０、９００、９３０、９６０若しくは９９０ヌクレオチドの長さ、及び／又は多くとも２５５０、２４００、２２５０、２１００、１９５０、１８００、１６５０、１５００、１４７０、１４４０、１４１０、１３８０、１３５０、１３２０、１２９０、１２６０、１２３０、１２００、１０７０、１０４０若しくは１１００ヌクレオチドの長さを有することが好ましい。本発明による第１、第２、第３及びさらなるポリヌクレオチドは、それぞれ、４２０〜２５５０、４２０〜２４００、４２０〜２２５０、４２０〜２１００、４２０〜１９５０、４２０〜１８００、４２０〜１６５０、４２０〜１５００、４２０〜１４７０、４２０〜１４４０、４２０〜１４１０、４２０〜１３８０、４２０〜１３５０、４２０〜１３２０、４２０〜１２９０、４２０〜１２６０、４２０〜１２３０、４２０〜１２００、４２０〜１０７０、４２０〜１０４０又は４２０〜１１００、４５０〜２５５０、４８０〜２５５０、５１０〜２５５０、５４０〜２５５０、５７０〜２５５０、６００〜２５５０、６３０〜２５５０、６６０〜２５５０、６９０〜２５５０、７２０〜２５５０、７５０〜２５５０、７８０〜２５５０、８１０〜２５５０、８４０〜２５５０、８７０〜２５５０、９００〜２５５０、９３０〜２５５０、９６０〜２５５０又は９９０〜２５５０ヌクレオチドの長さを有することがより好ましい。
【００９６】
第４の態様では、本発明は、本明細書において上で定義するポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドを提供する。前記ポリペプチドは、本発明の第２の態様で定義する第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドのいずれかであることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、前記第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドのいずれかをコードすることが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、本発明の第３の態様で定義する第１、第２、第３及び／又はさらなるポリヌクレオチドのいずれかであることが好ましい。前記ポリペプチドは、酵素活性ドメインと、細胞壁結合ドメインと、場合によって、本明細書で定義する精製を容易にするためのタグとを含み及び／又はそれらからなることが好ましく、前記酵素活性ドメインは、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼドメイン、エンドペプチダーゼドメイン又はアミダーゼドメインであることが好ましく、前記ポリペプチドは、多数性の前記酵素活性ドメインを含むことが好ましく、前記多数性は、２、すなわち二重性であることが好ましい。前記ポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０又は７２のいずれかと少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有することが好ましい。前記ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９若しくは７１のいずれかと少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００％の同一性を有するか、又は代わりに、これらの示した配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズできることが好ましい。前記ポリペプチドは、重複アミダーゼドメインと、細胞壁結合ドメインと、場合によって、本明細書で定義する精製を容易にするためのタグとを含み及び／又はそれらからなることがより好ましく、前記アミダーゼドメインは、Ｓ．アウレウスバクテリオファージΦ２６３８ａエンドライシンのものであり、前記細胞壁結合ドメインは、Ｓ．シミュランスリゾスタフィンのものであることが好ましい。前記ポリペプチドは、重複エンドペプチダーゼドメインと、細胞壁結合ドメインと、場合によって、本明細書で定義する精製を容易にするためのタグとを含み及び／又はそれらからなることがより好ましく、前記エンドペプチダーゼドメインは、Ｓ．シミュランスリゾスタフィンのペプチダーゼ＿Ｍ２３ドメインであり、前記細胞壁結合ドメインは、Ｓ．シミュランスリゾスタフィンのものであることが好ましい。
【００９７】
前記ポリペプチドは、配列番号２８、３４、４６、５２、５８又は７０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有することが好ましく、前記ポリペプチドは、配列番号２８、４６、５２又は７０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有することがより好ましく、前記ポリペプチドは、配列番号４６又は７０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有することがさらにより好ましく、前記ポリペプチドは、配列番号７０と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は１００％の同一性を有することが最も好ましい。前記ポリヌクレオチドは、記載する好ましいポリペプチドのいずれかをコードすることが好ましい。
【００９８】
前記ポリヌクレオチドは、配列番号２７、３３、４５、５１、５７若しくは６９と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００％の同一性を有するか、又は代わりに、これらの示した配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズできることが好ましい。前記ポリペプチドは、配列番号２７、４５、５１若しくは６９と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００％の同一性を有するか、又は代わりに、これらの示した配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズできることが好ましい。前記ポリペプチドは、配列番号４５若しくは６９と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００％の同一性を有するか、又は代わりに、これらの示した配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズできることがさらにより好ましい。前記ポリペプチドは、配列番号６９と少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９若しくは１００％の同一性を有するか、又は代わりに、これらの示した配列とストリンジェント条件下でハイブリダイズできることが最も好ましい。
【００９９】
別の実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号７０でなく、及び／又は前記ポリヌクレオチドは、配列番号６９でない。
【０１００】
第５の態様では、本発明は、本発明の第３の態様及び／又は第４の態様によるポリヌクレオチドが、発現コンストラクト中に存在する、本発明の第３の態様による組み合わせ及び／又は第４の態様のポリヌクレオチドに関する。さらに、前記第１、第２並びに／又は第３及び／若しくはさらなるポリヌクレオチドは、発現コンストラクト中に存在できる。前記発現コンストラクトは、小胞若しくはリポソームに含まれることが好ましい「裸の」ＤＮＡ若しくはＲＮＡであってもよいか、又は発現ベクターに含まれてもよい。前記発現コンストラクトは、発現ベクターであることが好ましく、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はウイルスは、本明細書において以前に定義した第１、第２又は第３ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することにより形質転換されることがより好ましく、ここで、前記ポリヌクレオチドは、細胞、対象又は無細胞系においてコードされるポリペプチドの生成又は発現を駆動する１又は複数の制御に作動可能に連結されている。形質転換される宿主生物によるこのような形質転換ベクターは、当業者に公知であり、文献に広く記載されている。発現コンストラクトは、例えば、それらに限定されないが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、改変ワクシニアナカラ（Ｎａｋａｒａ）ウイルス若しくは鶏痘ウイルス又は選択した対象においてポリペプチドを発現させるために用いることができる任意のその他のウイルスベクターのようなＤＮＡ又はＲＮＡウイルスのいずれであってもよい。ＤＮＡベクターは、エピソーム複製ベクターのような非組み込み型であってもよいか、又は無作為組み込み若しくは相同組換えにより宿主ゲノムに組み込まれるベクターであってもよい。発現ベクターは、組換え発現ベクターと考えられるものであってもよい。
【０１０１】
本発明において、本発明による第１、第２、第３及び／又は第４ポリヌクレオチドは、別個の発現コンストラクトに存在できるか、又は単一の発現コンストラクトに組み合わさって存在してもよい。さらに、本発明の組み合わせでは、前記第１ポリヌクレオチドは、第１発現コンストラクトに存在でき、第２ポリヌクレオチドは、第２発現コンストラクトに存在できる。さらに、本発明の組み合わせでは、前記第１ポリヌクレオチドは、第１発現コンストラクトに存在でき、第２ポリヌクレオチドは、第２発現コンストラクトに存在でき、第３ポリヌクレオチドは、第３発現コンストラクトに存在でき、さらなるポリヌクレオチドは、さらなる発現コンストラクトに存在できる。第１、第２、第３及び／又はさらなるポリヌクレオチドが単一発現コンストラクトに含まれることも本発明に包含される。本発明の２つのポリペプチドが単一発現コンストラクトに存在し、それらのうちの１つが別個の発現コンストラクトに存在する組み合わせも可能である。
【０１０２】
第６の態様では、本発明の第５の態様による発現コンストラクトが発現系に存在する、本発明の第３の態様による組み合わせ及び／又は第４の態様のポリヌクレオチドが提供される。本発明において、前記発現系は、本発明のポリペプチドの発現に適切な細胞、好ましくは微生物、原核生物又は真核生物細胞であってもよい。ある好ましい実施形態では、前記細胞は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。さらにより好ましい実施形態では、前記細胞は、Ｅ．コリＸＬ１ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’である。
【０１０３】
第７の態様では、本発明による少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入することによる宿主生物又は細胞の形質転換プロセスが提供され、形質転換は、専門の文献、特に本出願で引用する参考文献に広く記載されている任意の適切な既知の手段、より具体的には本発明によるベクターにより行うことができる。本発明において、本明細書で定義する前記第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドは、単一の形質転換された宿主生物若しくは細胞に存在できるか、又は別個の形質転換された宿主生物若しくは細胞に存在できる。細胞は、本発明のポリペプチドの発現に適切ないずれの微生物、原核生物又は真核生物細胞であってもよい。ある好ましい実施形態では、前記細胞は、Ｅ．コリである。さらにより好ましい実施形態では、前記細胞は、Ｅ．コリＸＬ１ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’である。本明細書で定義する第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドを生成し、場合によって精製し、場合によって凍結乾燥するための好ましい方法は、以下のステップを含む：
ｉ）本明細書で定義する発現コンストラクトを含む細胞において前記第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドを生成するステップと、
ｉｉ）場合によって、前記第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドを精製するステップと、
ｉｉｉ）場合によって、前記精製された第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドを凍結乾燥するステップ。
【０１０４】
ある好ましい実施形態では、Ｅ．コリをステップｉ）において用いて、組換え技術を用いて前記第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドを生成する。Ｅ．コリＸＬ１ｂｌｕｅＭＲＦをステップｉ）において用いて、組換え技術を用いて前記第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドを生成することがより好ましい。ステップｉｉ）において、重力流と組み合わせて５ｍＬ低密度ニッケルキレートアガロースビーズ（ＡＢＴ  ｂｅａｄｓ）を充填したＩＭＡＣ及びエコノ−パック（Ｅｃｏｎｏ−Ｐａｃ）クロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて、前記第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドを精製することが好ましい。溶出された第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドは、２、４及び１２時間、３×１ｌの凍結乾燥緩衝液（前記緩衝液は、５０ｍＭリン酸塩、５００ｍＭショ糖、２００ｍＭマンニトール、０．００５％ポリソルベート２０、ｐＨ７．４を含むことが好ましい）に対して透析できる。
【０１０５】
本明細書で定義する第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドを生成し、場合によって精製及び凍結乾燥するための前記方法は、上記の方法により得ることができる前記第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドを処理する方法をさらに含むことがさらにより好ましい。前記処理は、未処理の第１、第２、第３及び／又はさらなるポリペプチドと比較して溶解活性を増加させるために二価金属イオンを置換するステップを含み、前記方法は、以下のステップを含むことが好ましい：
ｉｖ）前記ポリペプチドを、キレート化合物を含む緩衝液に対して透析するステップと；
ｖ）前記ポリペプチドを、二価金属イオン含有緩衝液（前記二価金属イオンは、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋及びＺｎ２＋からなる群から選択されることが好ましい）に対して透析するステップ。
【０１０６】
「キレート化合物」は、本明細書において、金属イオンと結合する化合物と定義される。公知のキレート化合物は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及びエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）である。ＥＤＴＡを本明細書に記載する方法のステップｖ）において用いることが好ましい。前記方法のステップｖ）の二価金属イオンは、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｃｕ２＋からなる群から選択されることが好ましく、前記二価金属イオンは、Ｍｎ２＋及びＣｏ２＋からなる群から選択されることがより好ましく、前記二価金属イオンは、Ｍｎ２＋であることがさらにより好ましい。
【０１０７】
本発明の第８の態様では、本発明の第１の態様による組み合わせが、少なくとも２つの別個の組成物に存在する。さらに、本発明は、本発明の組み合わせであって、第１組成物が、本発明による第１酵素活性ドメインの源を含み、第２組成物が、本発明による第２酵素活性ドメインの源を含み、前記第１及び第２酵素活性ドメインが、第１の態様による別個の第１及び第２ポリペプチドに含まれる組み合わせを提供し、前記第１組成物は、前記第２酵素ドメインの源を含まず、前記第２組成物は、前記第１酵素活性ドメインの源を含まないことが好ましい。さらに、本発明は、本発明による組み合わせであって、第１組成物が、本発明による第１酵素活性ドメインの源を含み、第２組成物が、本発明による第２酵素活性ドメインの源を含み、第３組成物が、本発明による第３酵素活性ドメインの源を含み、さらなる組成物が、本発明によるさらなる酵素活性ドメインの源を含み、前記第１、第２、第３及びさらなる酵素活性ドメインが、本発明の第１の態様による別個の第１、第２、第３及びさらなるポリペプチドに含まれる組み合わせを提供し、前記第１組成物は、前記第２、第３及びさらなる酵素ドメインの前記源を含まず、前記第２組成物は、前記第１、第３及びさらなる酵素活性ドメインの前記源を含まず、前記第３組成物は、前記第１、第２及びさらなる酵素活性ドメインの前記源を含まず、前記さらなる組成物は、前記第１、第２及び第３酵素活性ドメインの前記源を含まないことが好ましい。
【０１０８】
さらに、本発明は、本発明による組み合わせであって、第１組成物が、本発明による第１ポリペプチドの源を含み、第２組成物が、本発明による第２ポリペプチドの源を含み、場合によって、第３及び／又はさらなる組成物が、本発明による第３及び／又はそれぞれのさらなるポリペプチドの源を含む組み合わせを提供する。前記第１組成物は、第２ポリペプチドの前記源を含まず、第３ポリペプチドの前記源を含まず、それぞれのさらなるポリペプチドの前記源を含まないことが好ましい。前記第２組成物は、第１ポリペプチドの前記源を含まず、第３ポリペプチドの前記源を含まず、それぞれのさらなるポリペプチドの前記源を含まないことが好ましい。前記第３組成物は、第１ポリペプチドの前記源を含まず、第２ポリペプチドの前記源を含まず、それぞれのさらなるポリペプチドの前記源を含まないことが好ましい。前記さらなる組成物は、第１ポリペプチドの前記源を含まず、第２ポリペプチドの前記源を含まず、第３ポリペプチドの前記源を含まないことが好ましい。
【０１０９】
第９の態様では、本発明は、本発明の第４の態様の第１、第２、第３及び／若しくはさらなるポリペプチド並びに／又はヌクレオチドのいずれかを含む組成物を提供する。本発明は、本発明の第２の態様で定義する第１、第２、第３及び／若しくはさらなるポリペプチド並びに／又は本発明の第３の態様で定義するヌクレオチドのいずれかを含む組成物を提供する。
【０１１０】
第１０の態様では、本発明は、本発明の第１の態様による組み合わせを含む組成物を提供する。さらに、本発明は、本発明による第１酵素活性ドメインの源と、本発明による第２酵素活性ドメインの源とを含む単一組成物であって、前記第１及び第２酵素活性ドメインが、別個の第１及び第２ポリペプチドに含まれる単一組成物を提供する。さらに、本発明は、本発明による第１酵素活性ドメインの源と、本発明による第２酵素活性ドメインの源とを含む本発明による組成物であって、前記第１酵素活性ドメインが、本発明の第１の態様による第１ポリペプチドに含まれ、前記第２酵素活性ドメインが、本発明の第１の態様による第２ポリペプチドに含まれ、前記第１ポリペプチドが、前記第２酵素活性ドメインを含まず、前記第２ポリペプチドが、前記第１酵素活性ドメインを含まない組成物を提供する。
【０１１１】
さらに、本発明は、本発明による第１酵素活性ドメインの源と、本発明による第２酵素活性ドメインの源と、本発明による第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインの源とを含む単一組成物であって、前記第１、第２並びに第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインが、本発明の第１の態様による別個の第１、第２並びに第３及び／又はさらなるポリペプチドに含まれる単一組成物を提供する。さらに、本発明は、本発明による第１酵素活性ドメインの源と、本発明による第２酵素活性ドメインの源と、本発明による第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインの源とを含む組成物であって、前記第１酵素活性ドメインが、本発明の第１の態様による第１ポリペプチドに含まれ、前記第２酵素活性ドメインが、本発明の第１の態様による第２ポリペプチドに含まれ、前記第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインが、本発明の第１の態様による第３及び／又はさらなるポリペプチドに含まれ、前記第１ポリペプチドが、前記第２酵素活性ドメイン並びに第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインを含まず、前記第２ポリペプチドが、前記第１並びに第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインを含まず、前記第３及び／又はさらなるポリペプチドが、前記第１及び第２酵素活性ドメインを含まない組成物を提供する。
【０１１２】
本発明の第８の態様による第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる組成物、並びに／又は本発明の第９及び／若しくは第１０の態様による単一組成物は、液体、固体又は半液体又は半固体の形であってもよい。本発明の第８の態様による第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる組成物、並びに／又は本発明の第９及び／若しくは第１０の態様による単一組成物は、抗微生物剤であることが好ましく、好ましくは食物保存剤又は消毒剤である。前記抗微生物剤は、細菌、好ましくはスタフィロコッカス属の細菌、より好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス種の細菌を殺すためであることが好ましい。本発明の第８の態様による第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる組成物、並びに／又は本発明の第９及び／若しくは第１０の態様による単一組成物は、薬学的に許容される担体並びに／又はバクテリオファージ、静菌剤、殺菌剤、抗生物質、界面活性剤及び／若しくは酵素からなる群から選択される追加の活性成分をさらに含むことが好ましい。本発明の抗生物質は、抗生物質及び化学療法剤を含み、それらに限定されないが、バンコマイシン、ナイシン、ダノフロキサシン及びネオマイシンを含む当該技術において既知の任意の抗生物質であることができる。本発明の組成物において有用な酵素は、それらに限定されないが、バイオフィルム（例えば食物加工設備で見出されるバイオフィルム）の破壊を助ける酵素、例えばそれらに限定されないが、多糖解重合酵素及びプロテアーゼを含む。本発明の組成物において有用な界面活性剤は、本発明の組み合わせを含む本発明の活性成分が様々な表面に適切に分配されるように表面を湿らせる助けとなり、スタフィロコッカスが本発明の活性成分に近づくことができるように汚物を可溶化及び除去する助けとなる。適切な界面活性剤は、それらに限定されないが、ポリソルベート（ツイーン）８０、２０及び８１並びにドバノール（Ｄｏｂａｎｏｌ）（Ｓｈｅｌｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．ＲＴＭ）を含む。
【０１１３】
本発明の抗微生物消毒剤組成物は、それらに限定されないが安息香酸及びＰＢＴのような当該技術において既知の表面消毒剤、好ましくは本発明の第１の態様の組み合わせ、好ましくは発現系、さらにより好ましくは本発明の（組換え）バクテリオファージと適合性の消毒剤をさらに含むことができる。
【０１１４】
本発明の第８の態様の第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる組成物、並びに／又は本発明の第９及び／若しくは第１０の態様の単一組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。このような組成物は、薬剤又は医薬品として用いるためであることが好ましい。
【０１１５】
第１１の態様では、本発明は、医薬品として用いるための本発明の第８の態様による第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる組成物の組み合わせ、並びに／又は本発明の第９及び／若しくは第１０の態様による単一組成物を提供する。前記医薬品は、感染性疾患のような、対象におけるスタフィロコッカスに関連する状態の防止又は遅延のためであることが好ましい。本発明は、スタフィロコッカスに関連する状態の処置のための医薬又は医薬組成物に関することがより好ましい。本発明は、細菌、好ましくはスタフィロコッカス属の細菌、より好ましくはＳ．アウレウス種の細菌により引き起こされる感染性疾患の処置のための医薬又は医薬組成物に関することが好ましい。前記感染性疾患は、皮膚感染、乳腺炎、肺炎、髄膜炎、心内膜炎、毒素ショック症候群（ＴＳＳ）、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ）、菌血症又は骨髄炎であることが好ましい。前記皮膚感染は、面皰、膿痂疹、おでき、せつ、蜂巣炎、毛包炎、よう、鱗状皮膚症候群（ｓｃａｌｅｄ  ｓｋｉｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）及び膿瘍の群から選択されることが好ましい。
【０１１６】
本発明の第８の態様による前記第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる組成物の組み合わせ、並びに／又は本発明の第９及び／若しくは第１０の態様による単一組成物は、患者又は前記患者の細胞又は細胞株又は無細胞ｉｎ  ｖｉｔｒｏ系に存在するスタフィロコッカス属の量を低減させる場合に、活性、機能的若しくは治療活性がある、又は感染性疾患を処置、防止及び／若しくは遅延させることができると言われることが好ましく、スタフィロコッカス属の初期量の９９％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％以下がまだ検出可能であることを意味することが好ましい。スタフィロコッカス属が検出可能でないことがより好ましい。この段落では、「スタフィロコッカス属の量」との表現は、生存ブドウ球菌を意味することが好ましい。全ての属のブドウ球菌は、スタフィロコッカス特異的抗体を用いる免疫組織化学技術、スタフィロコアグラーゼ又は「遊離型コアグラーゼ」を検出する試験管コアグラーゼ法、クランピング因子（スライドグラスコアグラーゼ試験）及び／又はプロテインＡ（市販のラテックス試験）のような表面タンパク質の検出のような当業者に知られる標準的な技術を用いて検出できる。生存ブドウ球菌は、微生物学的細菌培養技術及び／又は細菌ｍＲＮＡをアッセイするためのリアルタイム定量逆転写ポリメラーゼ連鎖反応のような当業者に知られる標準的な技術を用いて検出できる。
【０１１７】
本発明による低減は、個体又は患者の組織又は細胞において、本発明の前記組成物又はポリペプチドを用いる処置の前の前記個体又は患者に存在する量と比較することにより評価することが好ましい。代わりに、処置が局所的である場合、前記組成物又はポリペプチドを用いてまだ処置されていない前記個体又は患者の組織又は細胞と比較することができる。
【０１１８】
個体における微生物に関連する状態の処置、防止又は遅延のための方法であって、前記個体に、本発明の第８の態様による第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる組成物の組み合わせを投与するステップを含む方法は、本発明に包含される。さらに、本発明は、医薬品、好ましくは微生物に関連する状態の処置、防止又は遅延のための医薬品の製造のための、本発明の第８の態様による組み合わせの使用であって、前記第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインが、別個の第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなるポリペプチドに含まれ、前記第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなるポリペプチドが、別々の組成物に含まれる、使用を提供する。
【０１１９】
本発明の第８の態様による第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる組成物の組み合わせ、並びに／又は本発明の第９及び／若しくは第１０の態様による単一組成物は、Ｓ．アウレウスに感染したヒトを含む動物を処置するために用いることができる。それらに限定されないが、経口、エアロゾル、又は肺、経鼻スプレー、静脈内、筋内、腹腔内、くも膜下腔内、膣、直腸、局部、腰椎穿刺、くも膜下腔内への送達のためのその他のデバイス並びに脳及び／又は髄膜への直接施用を含む任意の適切な投与経路を用いて、組成物の前記組み合わせ又は前記単一組成物を投与できる。本発明の組成物の組み合わせ又は単一組成物は、患者又は前記患者の細胞、組織若しくは器官に、少なくとも１週間、１カ月、６カ月、１年以上投与してもよい。ある実施形態では、本発明の第７の態様による組成物の前記組み合わせは、別々に投与される。代替の実施形態では、前記組み合わせは、別々に貯蔵され、投与の直前に混和される。前記組み合わせは、等モル量の前記第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなるポリペプチドを含むように混和されることが好ましい。前記組み合わせは、等モル量の前記第１、第２並びに場合によって第３及び／又はさらなる酵素活性ドメインを含むように混和されることがさらにより好ましい。
【０１２０】
第１２の態様では、本発明は、第８の態様による組成物の組み合わせ又は本発明の第９及び／若しくは第１０の態様による単一組成物の、抗微生物剤、好ましくは食物保存剤又は消毒剤としての使用を提供する。抗微生物剤は、細菌を制御するためであり、前記細菌は、スタフィロコッカスであることが好ましく、前記細菌は、スタフィロコッカス・アウレウスであることがより好ましい。抗微生物剤は、細菌を殺すためであることが好ましく、前記細菌は、スタフィロコッカスであることが好ましく、前記細菌は、スタフィロコッカス・アウレウスであることがより好ましい。消毒剤は、無生物物体に対して特異的に用いるための抗微生物剤である。
【０１２１】
第１３の態様では、本発明は、食品若しくは飼料製品中で、食物若しくは飼料加工設備又は医療設備で、及び／又は食物若しくは飼料加工設備又は医療設備中で、食物若しくは飼料容器で及び／又は食物若しくは飼料容器中での微生物混入を制御するための方法であって、本発明の第８の態様による組成物の組み合わせ又は本発明の第９及び／若しくは第１０の態様による組成物を、食品若しくは飼料製品、食物若しくは飼料加工設備又は医療設備、及び／又は食物若しくは飼料容器と接触させるステップを含む方法を提供する。
【０１２２】
本発明による方法は、スタフィロコッカス属の細菌、より好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス種の細菌を制御するためであることが好ましい。制御の前記方法は、食品（それらに限定されないが乳業を含む）、並びに加工設備のような食品を加工する食物加工工場、及び食品業の施設における他の場所、例えば食物貯蔵容器での、スタフィロコッカス細菌の計数の低減及び／又は根本的にそれらの成長の防止を含むことが好ましい。さらに、制御の前記方法は、医療設備における、スタフィロコッカス細菌の計数の低減及び／又は根本的にそれらの成長の防止を含む。制御の前記方法は、胃カメラ、腹腔鏡、胸腔鏡及び関節鏡のようなファイバースコープのような医療設備、並びに長い管路若しくは中空部分を有し、人体に導入することにより反復して用いられる傾向にあるカテーテル及びチューブのような医療備品を洗浄及び滅菌するためであることが好ましい。
【０１２３】
本発明の方法は、それらに限定されないが、本発明の第８の態様の組成物の前記組み合わせ又は第９及び／若しくは第１０の態様の組成物の混和、噴霧又は直接施用を含むいくつかの手段による、本発明の第８の態様による組成物の組み合わせ並びに／又は本発明の第９及び／若しくは第１０の態様による組成物の、食品への又は食品中への、及び／又は食物加工工場内の様々な物理的場所への又は食物加工設備への若しくは食物加工設備中への施用を包含する。
【０１２４】
さらなる実施形態では、本発明の前記第１の態様の源の組み合わせは、前記源から単離でき、ここで、前記源は、発現系であり、例えば組換え細胞又は組換えバクテリオファージを、前記ポリペプチドを単離することなく直接施用又は投与できる。例えば、本発明の第１及び第２並びに場合によって第３及び／又はさらなるポリペプチドを生成する細胞は、対象（ヒト又は動物）に投与又は表面に施用でき、ここで、本発明の前記第１及び第２並びに場合によって前記第３及び／又はさらなるポリペプチドは、食物中、表面上又は対象の腸に分泌される。本発明の組み合わせは、次いで、この環境に存在する細菌細胞、好ましくはスタフィロコッカス属の細菌、より好ましくはスタフィロコッカス・アウレウス種の細菌と結合して場合によってこれを溶解できる。本明細書で定義する施用は、存在し得るスタフィロコッカス細菌の数を著しく低減する。
【０１２５】
場合によって、本発明の方法は、超音波洗浄、照射若しくは加熱滅菌、エタノール、アンモニア、ヨウ素及び／若しくはアルデヒド消毒剤のような消毒剤溶液への設備の浸漬、又はホルマリンガス若しくはエチレンオキシドガスのような閉鎖雰囲気中にデバイスを保持することによるガス滅菌の使用によるような、当該技術において既知の任意の滅菌法又は消毒剤と組み合わせることができる。
定義
【０１２６】
アミノ酸又は核酸配列の関係における「配列の同一性」又は「同一性」は、本明細書において、配列を比較することにより決定される、２つ以上のアミノ酸（ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２つ以上の核酸（ヌクレオチド、ポリヌクレオチド）配列間の関係と定義される。当該技術において、「同一性」は、場合によってこのような一連の配列間の一致により決定されるアミノ酸又はヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。本発明において、特定の配列との配列同一性は、前記特定のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列の全長にわたる配列同一性を意味することが好ましい。本明細書で示す配列情報は、誤って同定された塩基を含むことを必要とするように狭く解釈されるべきでない。当業者は、このような誤って同定された塩基を同定でき、このような誤りをどのようにして修正するかを知っている。
【０１２７】
２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、アミノ酸配列及び第２ペプチド又はポリペプチドの配列へのあるペプチド又はポリペプチドの保存アミノ酸置換を比較することにより決定される。ある好ましい実施形態では、同一性又は類似性は、本明細書で同定する配列番号全体にわたって算出される。「同一性」及び「類似性」は、それらに限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ、第Ｉ部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；並びにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１；並びにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．及びＬｉｐｍａｎ，Ｄ．、ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．、４８：１０７３頁（１９８８）に記載されるものを含む、既知の方法により容易に算出できる。
【０１２８】
同一性を決定するための好ましい方法を設計して、試験する配列間の最大の一致をもたらす。同一性及び類似性を決定するための方法は、公共で利用可能なコンピュータプログラムに体系化される。２つの配列間の同一性及び類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法は、例えばＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７頁（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０）を含む。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩ及びその他の供給源から公共で利用可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０）。公知のスミスウォーターマンアルゴリズムを用いて同一性を決定してもよい。
【０１２９】
ポリペプチド配列比較のための好ましいパラメータは、以下のものを含む：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３頁（１９７０）；比較行列：Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｔｉｋｏｆｆ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８９：１０９１５〜１０９１９頁（１９９２）からのＢＬＯＳＳＵＭ６２；ギャップペナルティ：１２；並びにギャップ長さペナルティ：４。これらのパラメータと一緒に用いるのが有用なプログラムは、「Ｏｇａｐ」プログラム（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐから）のように公共で利用可能である。上記のパラメータは、アミノ酸比較についてのデフォルトパラメータ（エンドギャップについてペナルティなし）である。
【０１３０】
核酸比較についての好ましいパラメータは、以下のものを含む：アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３頁（１９７０）；比較行列：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長さペナルティ：３。Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓに所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐからＧａｐプログラムとして利用可能。上に示すものは、核酸比較のためのデフォルトパラメータである。
【０１３１】
場合によって、アミノ酸類似性の程度を決定する場合に、当業者は、当業者に明確なように、いわゆる「保存」アミノ酸置換も考慮に入れてもよい。保存アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基を交換可能であることをいう。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシ側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン及びヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書で開示するアミノ酸配列の置換バリアントは、開示する配列中の少なくとも１残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入されているものである。アミノ酸変化は保存的であることが好ましい。自然に存在するアミノ酸のそれぞれについての好ましい保存置換は、以下のとおりである：Ａｌａからｓｅｒ、Ａｒｇからｌｙｓ、Ａｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ、Ａｓｐからｇｌｕ、Ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ、Ｇｌｎからａｓｎ、Ｇｌｕからａｓｐ、Ｇｌｙからｐｒｏ、Ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ、Ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ、Ｌｅｕからｉｌｅ又はｖａｌ、Ｌｙｓからａｒｇ、ｇｌｎからｇｌｕ、Ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ、Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ、Ｓｅｒからｔｈｒ、Ｔｈｒからｓｅｒ、Ｔｒｐからｔｙｒ、Ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ、及びＶａｌからｉｌｅ又はｌｅｕ。
【０１３２】
ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列により表される。ポリペプチドは、アミノ酸配列により表される。核酸コンストラクトは、自然に存在する遺伝子から単離されるか又は自然に存在しない様式で組み合わせ若しくは並列されるポリヌクレオチドのセグメントを含有するように改変されたポリヌクレオチドと定義される。場合によって、核酸コンストラクト中に存在するポリヌクレオチドは、細胞又は対象における前記ペプチド又はポリペプチドの生成又は発現を駆動する１又は複数の制御配列と作動可能に連結される。
【０１３３】
本明細書で用いる場合、用語「異種配列」又は「異種核酸」は、天然で前記第１ヌクレオチド配列の隣接配列として作動可能に連結していないものである。本明細書で用いる場合、用語「異種」は、「組換え」を意味することがある。「組換え」とは、自然で一般的に見出されるものとは別個の遺伝子物体のことをいう。ヌクレオチド配列又は核酸分子に対して用いる場合、組換えとは、前記ヌクレオチド配列又は核酸分子が、クローニング、制限及び／又はライゲーションステップ並びに自然で見出される配列又は分子とは別個のコンストラクトの生成をもたらすその他の手順の様々な組み合わせの生成物であることを意味する。
【０１３４】
「作動可能に連結され」とは、本明細書において、制御配列が細胞及び／又は対象において本発明のペプチド又はポリペプチドの生成／発現を駆動するように本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関して適切な位置に制御配列が配置された構成と定義される。
【０１３５】
「作動可能に連結され」とは、キメラポリペプチドが細胞及び／又は対象においてコードされるように機能的ドメインをコードする別の配列に関して適切な位置に配列が配置された構成を定義するために用いることもできる。
【０１３６】
発現とは、それらに限定されないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含む、ペプチド又はポリペプチドの生成に関与する任意のステップを含むと理解される。
【０１３７】
場合によって、核酸コンストラクト中に存在するヌクレオチド配列により表されるプロモーターは、本明細書で同定するペプチド又はポリペプチドをコードする別のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０１３８】
用語「形質転換」は、新しいＤＮＡ（すなわち細胞にとって外因性のＤＮＡ）の組み込みの後に細胞において誘導される永続的又は一過的な遺伝的変化のことをいう。細胞が細菌細胞である場合、本発明で意図するように、この用語は、選択可能な抗生物質耐性を保有する染色体外の自己複製ベクターのことを通常いう。
【０１３９】
発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供することができ、細胞及び／又は対象における本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる任意のベクターであることができる。本明細書で用いる場合、用語「プロモーター」は、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に関して上流にある、１又は複数の遺伝子又は核酸の転写を制御するように機能する核酸断片のことをいう。これは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開示部位及び任意のその他のＤＮＡ配列（それらに限定されないが、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位並びにプロモーターからの転写の量を直接又は間接的に調節するように作用することが当業者に知られている任意のその他のヌクレオチドの配列を含む）の存在により同定される結合部位に関する。本発明の関係において、プロモーターは、転写開始部位（ＴＳＳ）のヌクレオチド−１にて終了することが好ましい。
【０１４０】
「ポリペプチド」は、本明細書で用いる場合、任意のペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、遺伝子生成物、発現生成物又はタンパク質のことをいう。ポリペプチドは、連続アミノ酸で構成される。用語「ポリペプチド」は、自然に存在するか又は合成された分子を包含する。
【０１４１】
用語「制御配列」は、本明細書において、ポリペプチドの発現にとって必要又は有利である全ての構成要素を含むと定義される。それぞれの制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然又は外来であってもよい。このような制御配列は、それらに限定されないが、リーダー、最適翻訳開始配列（Ｋｏｚａｋ、１９９１、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７〜１９８７０に記載されるような）、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プレプロペプチド配列、プロモーター、シグナル配列及び転写ターミネーターを含む。最小限で、制御配列は、プロモーターと転写及び翻訳停止シグナルを含む。
【０１４２】
制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを促進する特定の制限部位を導入する目的のために、リンカーを備えていてもよい。
【０１４３】
制御配列は、核酸配列に発現のために宿主細胞により認識される核酸配列である適当なプロモーター配列であってもよい。プロモーター配列は、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異、短縮及びハイブリッドプロモーターを含む細胞の転写活性を示す任意の核酸配列であってもよく、細胞にとって同種又は異種のいずれかである細胞外又は細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【０１４４】
制御配列は、転写を終結するために宿主細胞により認識される配列である適切な転写ターミネーター配列であってもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。細胞において機能的な任意のターミネーターを本発明において用いることができる。
【０１４５】
制御配列は、宿主細胞による翻訳のために重要なｍＲＮＡの非翻訳領域である適切なリーダー配列であってもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。細胞において機能的な任意のリーダー配列を本発明において用いることができる。
【０１４６】
制御配列は、核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写されると、ｍＲＮＡに転写されるポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞により認識される配列であるポリアデニル化配列であってもよい。細胞において機能的な任意のポリアデニル化配列を本発明において用いることができる。
【０１４７】
本文書及び特許請求の範囲では、動詞「含む」及びその関連は、その非限定的な意味において用いて、この用語に続く項目が含まれるが、具体的に言及していない項目が除外されないことを意味する。さらに、動詞「からなる」は、本明細書で定義する核酸コンストラクト若しくはベクター若しくは細胞の、生成物若しくは組成物又は核酸分子若しくはペプチド若しくはポリペプチドが、具体的に記載するもの以外の追加の構成要素（複数可）（前記追加の構成要素（複数可）は、本発明の独特の特徴を変更しない）を含み得ることを意味する「から本質的になる」で置き換えることができる。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」によりある要素に言及することは、１つ及び１つだけの要素が存在することを文脈が明確に必要としない限り、１つより多い要素が存在する可能性を排除しない。不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、よって、「少なくとも１つ」を通常意味する。
【０１４８】
本明細書で引用する全ての特許及び参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれている。
【０１４９】
以下の実施例は、説明の目的のためだけに示され、いずれの方式でも本発明の範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１５０】
実施例１
材料及び方法
【０１５１】
細菌、ファージ及びプラスミド
本研究で用いるクローニング及びタンパク質生成のための細菌株、ファージ及びプラスミドを、表１に列挙する。Ｅ．コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．）及びＥ．コリＳｕｒｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、Ｎ末端６×Ｈｉｓタグ付加組換え融合タンパク質のクローニング及び過剰発現のために用いた。反復配列を含有するコンストラクトを、Ｅ．コリＳｕｒｅ株においてプロセシングした。Ｅ．コリを、クローニングのために１００μｇ／ｍｌのアンピシリン及び３０μｇ／ｍｌのテトラマイシンを補ったルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中で３７℃にて、タンパク質発現中のプラスミド選択のために１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを補って３０℃にて培養した。溶解アッセイにおいて基質として用いたスタフィロコッカス・アウレウス、ＢＢ２７０  ＮＣＴＣ８３２５ｍｅｃは、半分濃縮したブレインハートインフュージョン培地（ＢＨＩ、Ｂｉｏｌｉｆｅ、Ｍｉｌａｎｏ、Ｉｔａｌｙ）中で３７℃にて成長させた。２リットル培養物からの対数期細胞を採集し、ＰＢＳＴ（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１２０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）で洗浄し、１００倍に濃縮し、その分割量を−８０℃にて貯蔵した。
【０１５２】
ＤＮＡ技術及びクローニング手順
融合タンパク質のクローニング及び構築は、標準的な技術を用いて行った（Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２００２、４４：３３５〜３４９頁；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。酵素は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｔｃｈ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．）、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｃａｎａｄａ、Ｒｏｃｈｅ  Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）及びＱｉａｇｅｎから購入した。ファージΦ２６３８ａ、Φ１８７、ΦＫ及びΦＴｗｏｒｔからのエンドライシン及び分離した酵素活性ドメイン（ＥＡＤ）コード領域を、精製ファージＤＮＡ又はファージ可溶化液からインフレームで増幅した。プラスミドＤＮＡは、高適合度ＰＣＲ酵素ミックス（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いるリゾスタフィンのＥＡＤコード遺伝子断片の増幅のための鋳型となった。ｐＱＥ−３０タンパク質発現プラスミド（Ｑｉａｇｅｎ）及びその誘導体への挿入断片ライゲーションのための制限部位は、プライマーにより導入した。本研究で構築又は使用したプラスミドを、表１に列挙する。タンパク質発現プラスミドで、エレクトロコンピテントＥ．コリＸＬ１ＢｌｕｅＭＲＦ’を形質転換し、反復配列を含有するプラスミドでエレクトロコンピテントＥ．コリＳｕｒｅを形質転換した。ＤＮＡ濃度は、分光光度計（ナノドロップ（ＮａｎｏＤｒｏｐ）ＮＤ−１０００分光光度計、Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．）を用いて決定した。配列完全制覇を、ヌクレオチド配列決定（ＧＡＴＣ、Ｋｏｎｓｔａｎｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）により確認した。
【０１５３】
単一Ｎ末端酵素活性ドメイン（ＥＡＤ）及びＣ末端細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）又は細胞壁標的化ドメイン（ＣＷＴ）をそれぞれ有するコンストラクトを、スプライシングオーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＳＯＥ）を用いてそれぞれのコード領域のインフレーム融合体を創出することにより構築した。これらの断片を、ｐＱＥ−３０ＸａベクターＤＮＡのＳａｃＩ−ＳａｌＩ制限部位に挿入した。これらのベクターに基づいて、反復重複ＥＡＤを有するコンストラクトを、それぞれのＥＡＤコード配列をＳｔｕＩ−ＳａｃＩ部位に導入することにより得た。完全な構築の原理について、表１を参照されたい。
【０１５４】
組換え融合タンパク質の発現及び精製
Ｎ末端６×Ｈｉｓタグ付加タンパク質のタンパク質過剰発現及び固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）精製は、他者により以前に記載されたものにわずかな改変を加えて行った（Ｌｏｅｓｓｎｅｒら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９６、６２：３０５７〜３０６０頁；Ｓｃｈｍｅｌｃｈｅｒら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ２０１０、７６：５７４５〜５７５６頁；Ｅｉｃｈｅｎｓｅｈｅｒら、未発表）。簡単に述べると、異種タンパク質発現を、ＬＢ培地中で３０℃にて成長させた対数期のＥ．コリ培養物に０．２〜０．５ｍＭのＩＰＴＧを加えることにより誘導した。細胞を同じ温度でさらにインキュベートした後に、遠心分離により採集した。Ｅ．コリを、固定化緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾール、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）中で、１２００ｐｓｉで操作するフレンチプレッシャーセルプレス（French Pressure Cell Press）（１２００ｐｓｉ、ＳＬＭ  Ａｍｉｎｃｏ、Ｕｒｂａｎａ、ＩＬ、Ｕ．Ｓ．）を２回通すことにより溶解した。不溶性細胞破片は、遠心分離及びフィルタ滅菌（０．２μｍ  ＰＥＳメンブレン、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により除去した後に、低密度Ｎｉ−ＮＴＡスーパーフロー樹脂（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ  ＡＧ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を充填したマイクロバイオスピン（ＭｉｃｒｏＢｉｏｓｐｉｎ）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．）カラム中での重力流ＩＭＡＣ精製を行った。カラム洗浄の後に、６×Ｈｉｓタグ付加タンパク質を、溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１２５ｍＭイミダゾール、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ  ７．４）を用いて溶出し、透析緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４）に対して透析した。ＣＨＡＰ相同ドメイン含有タンパク質を、ＣＨＡＰ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、１０％グリセロール、ｐＨ７．４）を用いるエコノパック（ＥｃｏｎｏＰａｋ）１０ＤＧカラム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて緩衝液交換に供した。タンパク質純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより見積もり、濃度は、分光光学的（ナノドロップＮＤ−１０００分光光度計）又は製造者の使用説明に従ってＰｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．）を用いて決定した。タンパク質は、５０％グリセロール中、−２０℃にて貯蔵した。
【０１５５】
溶解速度論の光度測定による決定
溶解活性は、Ｗａｌｌａｃ  ＶＩＣＴＯＲ３  ＴＭ１４２００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．）多重標識計測デバイスを用いる濁度低減アッセイにおいて測定した。凍結ストックからの基質細胞を緩衝液で洗浄し、マクロキュベット（Macro Cuvettes）（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ、Ｋｒｅｍｓｍｕｎｓｔｅｒ、Ａｕｓｔｒｉａ）及び分光光度計（ＢｉｏＣｈｒｏｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いて、１＋／−０．０５の５９５ｎｍでの光学密度（ＯＤ５９５ｎｍ）に調節した。スタフィロコッカス溶解酵素を緩衝液で等モル量に希釈し、所望により、その後プールして、酵素混合物を得た。１０μｌのタンパク質溶液を、クリスタルグレードマルチウェルポリスチレン組織培養試験プレート（ＳＰＬ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｏｎｃｈｅｏｎ−Ｓｉ、Ｋｏｒｅａ）に分配し、マルチチャネルピペットを用いて１９０μｌの基質細胞懸濁物と混合した。経時的な濁度の低減を、ＯＤ５９５ｎｍにて、読み取りの間にプレートを激しく振とうしながらモニタリングした。所定の条件下での自己溶解活性をモニタリングするための対照として、１０μｌ緩衝液又は水を用いた。アッセイは、１点につき３つの検体を用いて行った。相対活性値の計算は、他の箇所に記載するようにして行った（Ｋｏｒｎｄｏｒｆｅｒら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００６、３６４：６７８〜６８９頁；Ｓｃｈｍｅｌｃｈｅｒら、Ｍｉｃｒｏｂ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１、４（５）：６５１〜６６２頁）。シグモイド溶解及び対照曲線を、共通の開始値１に正規化した。
【０１５６】
結果
サイトゾルで発現されたスタフィロコッカス溶解性タンパク質の下流プロセシングは、タンパク質構造及び起源に依存する純度で可溶性タンパク質をもたらした。コンストラクトの大多数は、＞９０％までのＳＤＳ−ＰＡＧＥにより見積もられる純度を有した（図２〜４）。
【０１５７】
我々は、濁度低減アッセイ（溶解アッセイ）における部分的に精製されたタンパク質の選択について試験した。個別の溶解素及びそれらの組み合わせを、ｐＨ７．４のＰＢＳＴ緩衝液中で、異なるタンパク質濃度にて凍結ストックからのＳ．アウレウスＢＢ２７０細胞に対して試験した。ＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号４７によりコードされる配列番号５８）及びＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＢＤ２６３８（配列番号５５によりコードされる配列番号５６）タンパク質は、およそ１の５９５ｎｍでの光学密度（ＯＤ５９５ｎｍ）に設定した細胞懸濁物に対して、５０ｎＭアッセイ濃度にて実質的に不活性であったが、２００ｎＭのアッセイ濃度にて著しい活性を示した（図５）。
【０１５８】
同一のアッセイ背景にてＭ２３−ＬＳＴ（配列番号１５によりコードされる配列番号１６）含有タンパク質を用いて、２００ｎＭアッセイ濃度にてＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号６９によりコードされる配列番号７０）を用いて最良の結果が達成された。ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号３にコードされる配列番号４）は、ＣＢＤ２６３８（配列番号５によりコードされる配列番号６）よりも優れるように見受けられる。さらに、反復二重性Ｍ２３−ＬＳＴバリアント（それぞれ配列番号６７及び６９によりコードされる配列番号６８及び７０）は、単一Ｍ２３−ＬＳＴ（それぞれ配列番号４３及び４５によりコードされる配列番号４４及び４６）よりも優れることがわかった。この効果は、５０ｎＭタンパク質濃度にてより明白であった。完全な結果については、図６を参照されたい。
【０１５９】
Ａｍｉ２６３８（配列番号１７によりコードされる配列番号１８）を用いて構築した全ての溶解素は、ＣＨＡＰＫ（配列番号９によりコードされる配列番号１０）及びＭ２３−ＬＳＴ（配列番号１５によりコードされる配列番号１６）タンパク質と比較して著しく活性が低かった。ここで、ＣＢＤ２６３８（配列番号５によりコードされる配列番号６）は、ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号３によりコードされる配列番号４）よりも優れていた。触媒ドメインの重複は、ＣＢＤ２６３８（配列番号５によりコードされる配列番号６）と組み合わせた場合にほとんど影響がなかったが、ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号３によりコードされる配列番号４）と組み合わせた場合に、重複は、溶解速度論に対して正の影響を与えた（図７）。
【０１６０】
我々は、ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号３によりコードされる配列番号４）又はＣＢＤ２６３８（配列番号５によりコードされる配列番号６）を用いて構築したタンパク質の混合物の活性も比較した。低いタンパク質濃度（それぞれ１６．６７ｎＭ、又はそれぞれ５０ｎＭの全タンパク質濃度）にて、ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５８、７０及び５２）タンパク質は、ＣＢＤ２６３８（配列番号５６、６８及び５０）タンパク質の混合物よりも著しく活性であったことがわかった。さらに、ＥＡＤの重複は、ＣＢＤ２６３８コンストラクト混合物（配列番号３２、４４及び２６と比較して配列番号５６、６８及び５０）における溶解速度論に対してほとんど影響しなかった（図８）。タンパク質のアッセイ濃度を２００ｎＭ（それぞれ６６．６７ｎＭ）まで増加すると、ＣＷＴ−ＬＳＴ及びＣＢＤ２６３８コンストラクトと反復二重ＥＡＤとで実質的に等しい活性が得られた。ＣＢＤ２６３８コンストラクトの溶解曲線（図９）は、ＣＷＴ−ＬＳＴコンストラクトの曲線の「上」を走るように見られるが、我々は、溶解速度論が等しいと見積もった。なぜなら、単純に、アッセイを９６ウェルプレートで行い、ＯＤ５９５ｎｍ測定をリジン添加後の同時点にて開始しなかったからである。曲線の最初の測定は、溶解が既に開始した段階であったので、１の初期ＯＤ５９５ｎｍへの曲線の正規化は、曲線をより高い値にシフトさせた。５０ｎＭタンパク質濃度とは異なって、ＣＢＤ２６３８コンストラクトと単一ＥＡＤだけとの混合物は、反復二重ＥＡＤ−ＣＢＤ２６３８コンストラクトと等しく活性であることが見出されなかったが、より遅い溶解速度論を示した。
【０１６１】
最後に、我々は、Ａｍｉ２６３８＿Ａｍｉ２６３８＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５１によりコードされる配列番号５２）、ＣＨＡＰＫ＿ＣＨＡＰＫ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号５７によりコードされる配列番号５８）及びＭ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号６９によりコードされる配列番号７０）からなる最も効果的な混合物を、最も効果的な参照タンパク質Ｍ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号６９によりコードされる配列番号７０）と比較した。試験した両方の濃度（５０ｎＭ及び２００ｎＭの全タンパク質濃度）にて、混合物は、Ｍ２３−ＬＳＴ＿Ｍ２３−ＬＳＴ＿ＣＷＴ−ＬＳＴ（配列番号６９によりコードされる配列番号７０）よりもわずかに優れることが見出された（図１０）。
【０１６２】
実施例２
材料及び方法
実施例１に従って生成した単一及び組み合わせ／混合物のタンパク質コンストラクトの溶解速度論を、実施例１の材料及び方法の項に記載した濁度低減アッセイを用いて試験した。
【０１６３】
結果
タンパク質及び混合物の溶解曲線を、図１１〜２０に示す。これらの治癒から、各タンパク質又は混合物の最大測定活性を、ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェアで５パラメータシグモイド適合モデルを用いて算出した。傾斜の一次導関数は、光学密度（ＯＤ５９５ｎｍ）の最大限の下落であり、最大測定活性と定義する。表３は、各タンパク質又は混合物の最大測定活性をまとめた表である。
【０１６４】
【表１】
2015522533.tif 000002
2015522533.tif 000003
2015522533.tif 000004
【０１６５】
【表２】
2015522533.tif 000005
2015522533.tif 000006
【０１６６】
【表３】
2015522533.tif 000007
2015522533.tif 000008
2015522533.tif 000009
【図１】
2015522533.tif 000010
【図２】
2015522533.tif 000011
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2015522533.tif 000021
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
2015522533000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年1月14日(2015.1.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１酵素活性ドメインの源と第２酵素活性ドメインの源との組み合わせであって、前記第１及び第２酵素活性ドメインがそれぞれ、別個の標的結合特異性を示し、別個の第１及び第２ポリペプチドに含まれ、前記第１及び第２ポリペプチドが、異なる多数性の前記第１及び／又は第２酵素活性ドメインを含む、組み合わせを含む組成物。
【請求項２】
前記異なる標的結合が、細菌細胞のペプチドグリカン層中の必須結合であり、前記細菌細胞が、スタフィロコッカスである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記第１及び／又は前記第２酵素活性ドメインが、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼドメイン、エンドペプチダーゼドメイン、アミダーゼドメイン及びグリコシルヒドロラーゼからなる群から選択されるドメインである、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記別個の第１及び第２ポリペプチドがそれぞれ、細胞壁結合ドメインをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記第１酵素活性ドメインが、システイン、ヒスチジン依存性アミドヒドロラーゼ／ペプチダーゼドメインであり、前記第２酵素活性ドメインが、エンドペプチダーゼドメインであり、
前記組み合わせが、別個の第３ポリペプチドに含まれる第３酵素活性ドメインの源をさらに含み、
前記第３酵素活性ドメインが、アミダーゼドメインであり、
前記別個の第３ポリペプチドが、細胞壁結合ドメインをさらに含み、
前記別個の第１、第２及び第３ポリペプチドのそれぞれが、多数性の前記第１、第２及び第３酵素活性ドメインを含む、
請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記第１ポリペプチドが、配列番号５８と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、前記第２ポリペプチドが、配列番号７０と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、前記第３ポリペプチドが、配列番号５２と少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
第１酵素活性ドメインの前記源が、ポリペプチドを含み、及び／又は第２酵素活性ドメインの前記源が、ポリペプチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
第１酵素活性ドメインの前記源が、前記第１酵素活性ドメインをコードするポリヌクレオチドを含み、及び／又第２酵素活性ドメインの前記源が、前記第２酵素活性ドメインをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記第１酵素活性ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドが、発現コンストラクト中に存在し、及び／又は前記第２酵素活性ドメインをコードする前記ポリヌクレオチドが、発現コンストラクト中に存在し、好ましくは、前記発現コンストラクトが、発現系に存在する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
薬学的に許容される担体並びに／又はバクテリオファージ、静菌剤、殺菌剤、抗生物質、界面活性剤及び／若しくは酵素からなる群から選択される追加の活性成分をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
医薬品として用いるための、好ましくは、対象におけるスタフィロコッカスに関連する状態の処置、防止又は遅延のための医薬品として用いるための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
抗微生物剤、好ましくは食物保存剤又は消毒剤としての、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１３】
食品若しくは飼料製品中で、食物若しくは飼料加工設備又は医療設備で、及び／又は食物若しくは飼料加工設備又は医療設備中で、食物若しくは飼料容器で、及び／又は食物若しくは飼料容器中での微生物混入を制御するための方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物を、食品若しくは飼料製品、食物若しくは飼料加工設備又は医療設備、及び／又は食物若しくは飼料容器と接触させるステップを含む方法。
【国際調査報告】
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