(57)【要約】  親イオンが分析される第１のモードと、親イオンがフラグメント化され、それらのフラグメントイオンが質量分析される第２のモードとを交互に行うことを含む質量分析方法が開示される。第１のモードでは、分析の前に、親イオンが電荷低減され、得られる親イオンスペクトルデータが単純化される。第２のモードでは、親イオンはフラグメント化の前に電荷低減されず、それにより、親イオンがフラグメント化し易いままで残る。その後、親イオンは、得られた質量スペクトルデータを使って、それらのフラグメントイオンと関連付けられる。【選択図】図１Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析方法であって、
（ｉ）複数の親イオンを用意するステップ、
（ｉｉ）前記親イオンを電荷低減条件に供して親イオンの荷電状態を低減し、得られた電荷低減親イオンを質量分析して第１の質量スペクトルデータを取得するステップ、
（ｉｉｉ）イオンを前記電荷低減条件にさらすことにより最初に前記親イオンの荷電状態を低減しないで、親イオンをフラグメント化してフラグメントイオンを生成し、前記フラグメントイオンを質量分析して第２の質量スペクトルデータを取得するステップ、
（ｉｖ）前記親イオンが、繰り返して交互に前記電荷低減条件および前記フラグメント化に供され、それにより、ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）とを交互に繰り返すステップ、
を含む方法。
【請求項２】
前記電荷低減条件が前記フラグメント化を起こす条件とは異なり、それにより、前記電荷低減条件が、前記親イオンのフラグメント化を実質的に全く起こさない請求項１に記載の方法。
【請求項３】
次記のステップ
請求項１に記載のステップ（ｉｉ）を行うステップ、
請求項１に記載のステップ（ｉｉｉ）を行うステップ、および
イオンを前記電荷低減条件にさらすことにより最初に親イオンの荷電状態を低減した親イオンをフラグメント化してフラグメントイオンを生成し、これらのフラグメントイオンを質量分析して第３の質量スペクトルデータを取得するステップ、
を任意の並び順で含むステップを繰り返し行うことを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
最初に親イオンの荷電状態を低減することなく、前記親イオンをフラグメント化するステップが、所与の親イオンから第１のフラグメント化プロセスにより親イオンをフラグメント化して、第１のセットのフラグメントイオンを生成するステップを含み、また、前記所与の親イオンから第２の異なるフラグメント化プロセスにより親イオンをフラグメント化して、第２の異なるセットのフラグメントイオンを生成するステップを含み、および／または、
最初に親イオンの荷電状態を低減した前記親イオンをフラグメント化するステップが、親イオンを第１のフラグメント化プロセスによりフラグメント化して、所与の親イオンから第１のセットのフラグメントイオンを生成するステップを含み、また、第２の異なるフラグメント化プロセスにより親イオンをフラグメント化して、前記所与の親イオンから第２の異なるセットのフラグメントイオンを生成するステップを含む、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のフラグメント化プロセスが、電子移動解離（「ＥＴＤ」）または電子捕獲解離（「ＥＣＤ」）であり、前記第２のフラグメント化プロセスが、衝突誘起解離（「ＣＩＤ」）である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載のステップ（ｉｉ）が、荷電状態が高められた前記親イオンの荷電状態を低減し、その後、得られたイオンを質量分析して、前記第１の質量スペクトルデータを取得するステップを含み、さらに、
請求項１に記載のステップ（ｉｉｉ）が、最初にこれらのイオンの荷電状態を低減しないで荷電状態が高められた前記親イオンをフラグメント化し、その後、得られたフラグメントイオンを質量分析して、前記第２の質量スペクトルデータを取得することを含む、
親イオンの荷電状態を高めることをさらに含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の質量スペクトルデータで検出された親イオンと、前記第２の質量スペクトルデータで検出されたフラグメントイオンとを関連付けるステップを含む請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
請求項１に記載のステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間で交互に繰り返して行われて、前記第１の質量スペクトルデータの取得と、第２の質量スペクトルデータの取得とが交互に行われ、いずれかの所与のセットの第１の質量スペクトルデータ中の親イオンが、前記所与のセットの第１の質量スペクトルデータが取得される直前または直後に取得される第２の質量スペクトルデータセット中のフラグメントイオンに関連付けられる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
親イオンの前記複数のイオン中のそれぞれの化学種が、前記ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の両方に供されるような速度で請求項１のステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）とを交互に行う請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複数の親イオンを用意するステップが、相互に空間的に離れ、それにより、請求項１に記載のステップ（ｉｉ）で、それらのイオンが異なる時間に質量分析器に導入され、異なる時間に質量分析される異なる親イオンを用意するステップを含む請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記親イオンが、試料をクロマトグラフィーに供し、溶出試料をイオン化することにより生成され、さらに、前記第１の質量スペクトルデータで観察されたイオンのクロマトグラフ溶出時間プロファイルと、第２の質量スペクトルデータで観察されたイオンのクロマトグラフ溶出時間プロファイルとの照合により、前記第１の質量スペクトルデータで検出された親イオンが、前記第２の質量スペクトルデータで検出されたフラグメントイオンと関連付けられる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
異なる親イオンが、それらのイオン移動度に従ってイオン移動度分光計中で分離され、それにより、それらが、請求項１に記載のステップ（ｉｉ）で、異なる時間に質量分析器に導入され、異なる時間に質量分析され、さらに、前記第１の質量スペクトルデータで観察されたイオンのイオン移動度ドリフト時間プロファイルを、第２の質量スペクトルデータで観察されたイオンのイオン移動度ドリフト時間プロファイルと照合することにより、前記第１の質量スペクトルデータで検出された前記イオンが、第２の質量スペクトルデータで検出されたフラグメントイオンに関連付けられる請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記親イオンの荷電状態を低減するステップが、大気圧で行われる請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記親イオンをフラグメント化するステップが、大気圧で行われる請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
質量分析計であって、
イオンの荷電状態を低減するように配置され、適合された装置、
質量分析器、
フラグメント化装置、ならびに
制御手段であって、
前記親イオンを電荷低減条件に供することによりイオンの荷電状態を低減するように配置され、適合された前記装置中で親イオンの荷電状態を低減し、
前記質量分析器中で前記得られた電荷低減親イオンを質量分析して第１の質量スペクトルデータを取得し、
電荷低減条件にさらすことにより最初に親イオンの荷電状態を低減しないで、前記フラグメント化装置中で前記親イオンをフラグメント化してフラグメントイオンを生成し、
前記フラグメントイオンを前記質量分析器中で質量分析し、第２の質量スペクトルデータを取得し、および
前記親イオンの電荷を減らすステップと、前記親イオンフラグメント化するステップを交互に繰り返し行う、
ように配置され、適合された制御手段、
を含む質量分析計。
【請求項１６】
前記質量分析計が、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法を行うように配置され、適合された請求項１５に記載の質量分析計。
【請求項１７】
質量分析方法であって、
親イオンの複数の化学種を生成するステップ、
前記親イオンの電荷を低減するステップ、
電荷低減親イオンの１種または複数種の化学種の強度プロファイルを時間の関数として変動させ、それにより、親イオンの異なる化学種に、時間の関数として異なる強度プロファイルを持たせるステップ、
前記親イオンを前記電荷低減ステップに供しないで、親イオンをフラグメント化し、フラグメントイオンを形成するステップ、
フラグメントイオンを質量分析するステップ、および
前記フラグメントイオンの強度プロファイルおよび前記電荷低減親イオンの強度プロファイルに基づいて、前記フラグメントイオンと、対応する電荷低減親イオンを相互に関連付けるステップ、
を含む方法。
【請求項１８】
電荷低減親イオンの１種または複数種の化学種のプロファイルを取得するために、電荷低減親イオンを質量分析するステップを含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
電荷低減と親イオンの質量分析ステップと、最初にそれらの荷電状態を低減することなく親イオンをフラグメント化し、フラグメントイオンを質量分析するステップとを交互に繰り返し行う請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
電荷低減親イオンの１種または複数種の化学種の前記強度プロファイルを時間の関数として変動させるステップが、分析物試料をクロマトグラフィーに供するステップを含み、前記親およびフラグメントイオンのクロマトグラフ溶出時間プロファイルを照合することにより、親イオンがフラグメントイオンと相互に関連付けられる請求項１７、１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
電荷低減親イオンの１種または複数種の化学種の前記強度プロファイルを時間の関数として変動させるステップが、前記親イオンをイオン移動度分光計中で分離させるステップを含み、前記親およびフラグメントイオンのイオン移動度ドリフト時間プロファイルを照合することにより、前記親イオンがフラグメントイオンと相互に関連付けられる請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法
【請求項２２】
質量分析計であって、
親イオンの複数の化学種を生成するイオン源、
前記親イオンの電荷を低減する手段、
電荷低減親イオンの１種または複数種の化学種の前記強度プロファイルを時間の関数として変動させ、それにより、親イオンの異なる化学種に時間の関数として異なる強度プロファイルを持たせる手段、
前記親イオンを前記電荷低減ステップに供しないで、親イオンをフラグメント化して、フラグメントイオンを形成する手段、
フラグメントイオンを質量分析する手段、および
前記フラグメントイオンの前記強度プロファイルおよび前記電荷低減親イオンの前記強度プロファイルに基づいて、前記フラグメントイオンと、対応する電荷低減親イオンとを相互に関連付ける手段、
を含む質量分析計。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、質量分析法および質量分析計に関し、質量分析計は、親イオン分析モードとフラグメントイオンの生成および分析モードとを交互に実行する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年５月１８日出願の英国特許出願第１２０８７４１．７号、２０１２年１０月１６日出願の英国特許出願第１２１８５１９．５号、２０１２年５月２２日出願の米国特許仮出願第６１／６５０，０５１号、および２０１２年１０月１８日出願の米国特許仮出願第６１／７１５，５４８号の優先権および利益を主張する。これらの出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
第１のモードで、親イオンが質量分析され、さらに、第２のモードで、親イオンがフラグメント化されて得られたフラグメントイオンが質量分析されるＭＳｅ質量スペクトル技術を実行できることが知られている。しかし、このような技術で取得したスペクトルデータは、通常、複雑であるため、親イオンデータ中の親イオンを、フラグメントイオンデータ中の対応するフラグメントイオンに関連付けることが困難な場合がある。
【０００４】
改善された質量分析法および改善された質量分析計を提供することが望まれている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の第１の態様では、
（ｉ）複数の親イオンを提供するステップ、
（ｉｉ）親イオンを電荷減少条件に供することにより、親イオンの荷電状態を低減し、得られた電荷低減親イオンを質量分析して第１の質量スペクトルデータを得るステップ、
（ｉｉｉ）イオンを前記電荷減少条件に供することにより最初に親イオンの荷電状態を低減することなく、親イオンをフラグメント化してフラグメントイオンを生成し、フラグメントイオンを質量分析して第２の質量スペクトルデータを得るステップ、
を含み、
（ｉｖ）親イオンが、交互に繰り返して前記電荷減少条件および前記フラグメント化に供し、それにより、ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間でこの方法を交互に繰り返し実行する質量分析法が提供される。
【０００６】
本発明は、親イオン質量スペクトルデータおよび対応するフラグメントイオン質量スペクトルデータを得て、より効率的な方式で関連付けることを可能とする。特に、従来技術では、異なる荷電状態を有する異なる化学種の親イオンの質量電荷比が部分的に重なることがあり、そのために、質量スペクトルデータが互いに干渉する場合がある。本発明では、親イオンの電荷が質量分析の前に減らされるため、親イオンが異なる化学種の質量電荷比が良好に分離されるようになり、従って、質量分析されて、より容易に同定できる。他方、本発明は、親イオンがフラグメント化されるモードでは親イオンの電荷低減を行わない。これにより、親イオンが比較的に高い荷電状態を維持するために、親イオンのフラグメント化がより容易に誘導可能となる。従って、本発明は、２種の操作モードの間で切り替えることにより、親イオンとそのフラグメントイオンとの関連付けをより単純に、かつ効率的に行えるようにする。
【０００７】
電荷低減条件が親イオンのフラグメント化を実質的に全く生じないように、電荷低減条件は、フラグメント化条件とは異なるのが好ましい。
【０００８】
フラグメントイオンは、質量分析される前に電荷低減に供されないのが好ましい。
【０００９】
２種の操作モードは、別個のモードである。従って、電荷低減ステップからの親イオンは、フラグメント化ステップで生成されるフラグメントイオンが質量分析される時間とは別の、異なる時間の間、質量分析されるのが好ましい。
【００１０】
この方法では、所与の親イオンの化学種がステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の両方に供されて、親イオンの質量スペクトルデータ、およびそれぞれの親イオンの化学種に対応するフラグメントイオンの質量スペクトルデータを得られるような速度で、ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）が交互に実行されるのが好ましい。
【００１１】
方法は、ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間で、少なくともｘ回、交互に自動的、かつ連続定期に行われるのが好ましく、ここで、ｘは、５回超、１０回超、１５回超、２０回超、３０回超、４０回超、５０回超、７５回超、１００回超、１５０回超、または２００回超である。
【００１２】
方法は、ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間で、少なくとも、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、または９秒に１回、交互に自動的、かつ連続定期に行われるのが好ましい。
【００１３】
本発明により取得された質量スペクトルデータを使って、親イオンとそのフラグメントイオンを関連付け、親イオンが由来する分析物を同定するのが好ましい。従って、方法は、好ましくは、第１の質量スペクトルデータ中の親イオンと、第２の質量スペクトルデータ中のフラグメントイオンを関連付けることを含む。
【００１４】
フラグメント化プロセスは、電子移動解離（「ＥＴＤ」）、電子捕獲解離「ＥＣＤ」）または衝突誘起解離（「ＣＩＤ」）であってよい。あるいは、他のフラグメント化プロセスを使ってもよい。
【００１５】
方法は、次のステップを含む繰り返しを行うことを含むのが好ましい（ステップは、各繰り返し内のどの並び順で行ってもよい）：
上述のステップ（ｉｉ）を行うステップ、
上述のステップ（ｉｉｉ）を行うステップ、および
親イオンをフラグメント化し、イオンを前記電荷低減条件に供することにより最初に親イオンの荷電状態を低減したフラグメントイオンを生成後、これらのフラグメントイオンを質量分析して第３の質量スペクトルデータを得るステップ。上記最後のステップからの質量スペクトルデータは、ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）からのスペクトルデータを関連付けるのと同じ方式で、親イオンデータに関連付けることができる。
【００１６】
繰り返しは、自動的に制御され、連続的にｙ回繰り返されるのが好ましく、ここで、ｙは、５回超、１０回超、１５回超、２０回超、３０回超、４０回超、５０回超、７５回超、１００回超、１５０回超、または２００回超である。
【００１７】
各繰り返しは、少なくとも、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、または９秒に１回行うことができる。
【００１８】
最初にイオンの荷電状態を低減したイオンのフラグメント化ステップは、荷電状態が低減されていない同じイオンに対するフラグメント化とはかなり異なる質量スペクトルデータを生成する。例えば、第１と第２の質量スペクトルデータとの間、および第１と第３の質量スペクトルデータとの間で比較を行い、どのフラグメントイオンが第２または第３のスペクトルデータで生成されたかを判定することができる。従って、この方法は、電荷低減イオンのみがフラグメント化された場合に対し、追加された質量スペクトルデータを明らかにする。
【００１９】
最初に親イオンの荷電状態を低減していない親イオンのフラグメント化ステップは、第１のフラグメント化プロセスにより親イオンをフラグメント化して、所与の親イオンから第１のセットのフラグメントイオンを生成するステップを含んでもよく、また、第２の異なるフラグメント化プロセスにより親イオンをフラグメント化して、所与の親イオンから第２の異なるセットのフラグメントイオンを生成するステップを含んでもよい。代わりに、または、追加して、最初に親イオンの荷電状態を低減した親イオンのフラグメント化ステップが、第１のフラグメント化プロセスにより親イオンをフラグメント化して、所与の親イオンから第１のセットのフラグメントイオンを生成するステップを含んでもよく、また、第２の異なるフラグメント化プロセスにより親イオンをフラグメント化して、所与の親イオンから異なるセットのフラグメントイオンを生成するステップを含んでもよい。
【００２０】
２種のフラグメント化プロセスは、第１の時間に第１のセットのフラグメントイオンに対し質量スペクトルデータが得られ、異なる時間に第２のセットのフラグメントイオンに対し質量スペクトルデータが得られるように、異なる回数行われるのが好ましい。２種のフラグメント化技術から得た質量スペクトルデータの間で比較して、および／または、それぞれのフラグメント化技術からのフラグメントイオンスペクトルデータを親イオンスペクトルデータと比較して、どのフラグメント化技術によりどのフラグメントイオンが生成されるかを判断できる。従って、この方法では、１種のフラグメント化技術のみが使われる場合に対し、追加された質量スペクトルデータが明らかになる。
【００２１】
第１のフラグメント化プロセスは、ＥＴＤ、ＥＣＤまたはＣＩＤであってもよく、また、第２のフラグメント化プロセスは、別のＥＴＤ、ＥＣＤまたはＣＩＤであってもよい。第１のフラグメント化プロセスがＥＴＤまたはＥＣＤで、第２のフラグメント化プロセスがＣＩＤであるのが好ましい。
【００２２】
方法は、親イオンの荷電状態を高めることをさらに含んでもよく、この場合、上述のステップ（ｉｉ）は、これらの親イオンの荷電状態を低減した後、得られたイオンを質量分析し、前記第１の質量スペクトルデータを得るステップを含み、上述のステップ（ｉｉｉ）は、最初にこれらのイオンの荷電状態を低減することなく、高められた荷電状態の親イオンをフラグメント化した後、得られたフラグメントイオンを質量分析して前記第２の質量スペクトルデータを得るステップを含む。
【００２３】
本発明は、前記第１の質量スペクトルデータで検出された親イオンを、前記第２の質量スペクトルデータで検出されたフラグメントイオンと関連付けするステップを含むのが好ましい。方法は、上記ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）とを交互に繰り返し実行して、第１の質量スペクトルデータの取得と第２の質量スペクトルデータの取得とを交互に行うのが好ましい。いずれかの所与のセットの第１の質量スペクトルデータ中の親イオンは、前記所与のセットの第１の質量スペクトルデータが取得された直前にまたは直後に得られる第２の質量スペクトルデータセット中のフラグメントイオンと関連付けるのが好ましい。
【００２４】
方法は、好ましくは、前記複数のイオン中のそれぞれの親イオンの化学種が前記ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の両方に供されるような速度で、上記ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）とを交互に行うのが好ましい。
【００２５】
複数の親イオンを与えるステップは、異なる回に質量分析器に導入されて、上述のステップ（ｉｉ）の異なる回に質量分析されるように空間的に相互から離れている異なる親イオンを与えるステップを含むのが好ましい。好ましくは、親イオンは、異なる親イオンに由来するフラグメントイオンが異なる回に上記ステップ（ｉｉｉ）で質量分析されるように分離された後でフラグメント化に供されるのが好ましい。
【００２６】
親イオンは、クロマトグラフィーに供してもよく、さらに、前記第１の質量スペクトルデータで検出された親イオンと、前記第２の質量スペクトルデータで検出されたフラグメントイオンとを関連付けるステップが、第１の質量スペクトルデータで観察されたイオンのクロマトグラフの溶出時間プロファイルと、第２の質量スペクトルデータで観察されたクロマトグラフ溶出時間プロファイルとを照合するステップを含んでもよい。
【００２７】
親イオンは、試料をクロマトグラフィーに供し、溶出試料をイオン化することにより生成されてもよい。クロマトグラフィーは、液体クロマトグラフィーであるのが好ましい。前記第１の質量スペクトルデータで検出された親イオンと、前記第２の質量スペクトルデータで検出されたフラグメントイオンとを関連付けるステップは、第１の質量スペクトルデータで観察されたイオンのクロマトグラフ溶出時間プロファイルと、第２の質量スペクトルデータで観察されたイオンのクロマトグラフ溶出時間プロファイルを照合するステップを含んでもよい。
【００２８】
代わりに、または追加で、異なる親イオンが、異なる回に質量分析器に導入され、上記ステップ（ｉｉ）の異なる回に質量分析されるように、イオン移動度に従ってイオン移動度分光計中で分離されてもよい。第１の質量スペクトルデータで検出された親イオンと、第２の質量スペクトルデータで検出されたフラグメントイオンとを関連付けるステップが、第１の質量スペクトルデータで観察されたイオンのイオン移動度ドリフト時間プロファイルと、第２の質量スペクトルデータで観察されたイオンのイオン移動度ドリフト時間プロファイルを照合するステップを含んでもよい。
【００２９】
方法は、実質的に同じ時間に取得された（すなわち、順次取得されたスペクトルデータセット中の）第１と第２の質量スペクトルデータを比較し、第２の質量スペクトルデータに比べて第１の質量スペクトルデータ中でより高い強度を有するイオンを親イオンとして識別するステップを含んでもよい。代わりに、または追加して、方法は、実質的に同じ時間に取得された第１と第２の質量スペクトルデータを比較し、第１の質量スペクトルデータに比べて第２の質量スペクトルデータ中で高い強度のイオンをフラグメントイオンとして識別するステップを含んでもよい。
【００３０】
本発明では、親イオンは、エレクトロスプレーイオン化（「ＥＳＩ」）イオン源により生成してもよい。
【００３１】
親イオンは、これらのイオンを試薬陰イオンまたは中性超塩基分子と相互作用させることにより荷電状態を低減させることができる。陰イオンは、ガスをＵＶ光などのコロナ放電または電磁波に供することにより生成できる。試薬イオンは、親イオンと共に存在する単電荷バックグラウンドイオンを中和できる。
【００３２】
親イオンの荷電状態は、プロトン移動反応（「ＰＴＲ」）により低減できる。
【００３３】
荷電状態は、大気圧で低減できる。追加で、または代わりに、親イオンをフラグメント化するステップは、大気圧下で行ってもよい。
【００３４】
また、本発明は、分析物、好ましくは、生体分子を同定する方法も提供し、この方法は、分析物をイオン化して親イオンを形成し、上述の方法を行うことを含む。
【００３５】
また、本発明は、質量分析計を提供し、質量分析計は、
イオンの荷電状態を低減するように配置され、適合された装置、
質量分析器、
フラグメント化装置、および
制御手段であって、
親イオンを電荷低減条件に供することによりイオンの荷電状態を低減するように配置され、適合された装置で親イオンの荷電状態を低減し、
得られた電荷低減親イオンを質量分析器で質量分析して第１の質量スペクトルデータを得て、
フラグメント化装置中で親イオンをフラグメント化して、電荷低減条件に供することにより最初に親イオンの荷電状態を低減していないフラグメントイオンを生成し、
質量分析器でフラグメントイオンを質量分析して第２の質量スペクトルデータを得て、さらに
親イオン電荷を低減するステップと親イオンのフラグメント化ステップを交互に繰り返しを行う、ように配置され、適合された制御手段、
を含む。
【００３６】
質量分析計は、本明細書記載の方法の組み合わせのいずれか１種を行うように配置され、適合されてもよい。
【００３７】
第２の態様では、本発明は、質量分析方法を提供し、方法は、
複数の親イオンの化学種を生成するステップ、
親イオンの電荷を低減するステップ、
１種または複数種の化学種の電荷低減親イオンの強度プロファイルを、時間の関数として変動させて、それにより、異なる化学種の親イオンが、時間の関数として異なる強度プロファイルを有することを可能とするステップ、
親イオンを電荷低減ステップに供することなく、親イオンをフラグメント化して、フラグメントイオンを形成するステップ、
フラグメントイオンを質量分析するステップ、および
前記フラグメントイオンの強度プロファイルおよび前記電荷低減親イオンの強度プロファイルに基づいて、フラグメントイオンと、対応する電荷低減親イオンとを相互に関連付けるステップ、
を含む。
【００３８】
方法は、電荷低減親イオンの１種または複数種の化学種の前記プロファイルを得るために電荷低減親イオンを質量分析するステップを含むのが好ましい。
【００３９】
本発明の第２の態様による方法では、本発明の第１の態様に関連して記載された特徴のいずれかを含むことができる。例えば、電荷低減条件は、親イオンのフラグメント化が実質的全く生じないように前記フラグメント化を可能とするのが好ましい条件である電荷低減条件とは異なる。
【００４０】
最初に親イオンの荷電状態を低減していない親イオンをフラグメント化するステップは、第１のフラグメント化プロセスにより親イオンをフラグメント化して、所与の親イオンから第１のセットのフラグメントイオンを生成するステップを含んでもよく、また、第２の異なるフラグメント化プロセスにより親イオンをフラグメント化し、前記所与の親イオンから第２の異なるセットのフラグメントイオンを生成するステップを含んでもよい。第１のフラグメント化プロセスは、好ましくは、電子移動解離（「ＥＴＤ」）または電子捕獲解離（「ＥＣＤ」）であり、第２のフラグメント化プロセスは、衝突誘起解離（「ＣＩＤ」）であってもよい。
【００４１】
方法は、親イオンの電荷を低減する前に、親イオンの荷電状態を高めるステップをさらに含んでもよい。方法は、荷電状態を高めた親イオンを、最初にこれらのイオンの荷電状態を低減しないでフラグメント化するステップを含んでもよい。
【００４２】
方法は、電荷低減ステップと、親イオンを質量分析するステップとを交互に繰り返し行い、第１の電荷低減親イオンを含まない親イオンをフラグメント化し、フラグメントイオンを質量分析するのが好ましい。
【００４３】
方法は、親イオンのそれぞれの化学種が両方のモードに供されるような速度で、２種のモードの間で交互に行うのが好ましい。
【００４４】
電荷低減親イオンの１種または複数種の化学種の強度プロファイルを時間の関数として変動させるステップが、分析物試料をクロマトグラフィーにかけるステップを含むのが好ましく、この場合、親およびフラグメントイオンのクロマトグラフ溶出時間プロファイルを照合することにより、親イオンは、フラグメントイオンと相互に関連付けられる。
【００４５】
追加して、または代わりに、電荷低減親イオンの１種または複数種の化学種の強度プロファイルを時間の関数として変動させるステップは、親イオンをイオン移動度分光計中で分離させるステップを含んでもよく、この場合、親およびフラグメントイオンのイオン移動度ドリフト時間プロファイルを照合することにより、親イオンは、フラグメントイオンと相互に関連付けられる。
【００４６】
親イオンの荷電状態を低減させるステップは、大気圧で行われるのが好ましい。
【００４７】
親イオンをフラグメント化するステップは、大気圧で行われるのが好ましい。
【００４８】
また、本発明は、質量分析計を提供し、質量分析計は、
親イオンの複数の化学種を生成するイオン源、
親イオンの電荷を低減する手段、
親イオンの異なる化学種が時間の関数として異なる強度プロファイルを有することを可能とするように、電荷低減親イオンの１種または複数種の化学種の強度プロファイルを時間の関数として変動させる手段、
親イオンを電荷低減ステップに供することなく、親イオンをフラグメント化し、フラグメントイオンを形成する手段、
フラグメントイオンを質量分析する手段、および
前記フラグメントイオンの強度プロファイルおよび前記電荷低減親イオンの強度プロファイルに基づいて、フラグメントイオンと、対応する電荷低減親イオンとを相互に関連付ける手段、
を含む。
【００４９】
質量分析計は、本明細書記載のいずれかの方法を行うように配置され、適合されるのが好ましい。
【００５０】
質量分析計は、次記の内のいずれかの１つまたは複数を含んでもよい：
（ａ）（ｉ）エレクトロスプレーイオン化（「ＥＳＩ」）イオン源、（ｉｉ）大気圧光イオン化（「ＡＰＰＩ」）イオン源、（ｉｉｉ）大気圧化学イオン化（「ＡＰＣＩ」）イオン源、（ｉｖ）マトリックス支援レーザー脱離イオン化（「ＭＡＬＤＩ」）イオン源、（ｖ）レーザー脱離イオン化（「ＬＤＩ」）イオン源、（ｖｉ）大気圧イオン化（「ＡＰＩ」）イオン源、（ｖｉｉ）ポーラスシリコンを用いたレーザー脱離イオン化（「ＤＩＯＳ」）イオン源、（ｖｉｉｉ）電子衝撃イオン化（「ＥＩ」）イオン源、（ｉｘ）化学イオン化（「ＣＩ」）イオン源、（ｘ）電界イオン化（「ＦＩ」）イオン源、（ｘｉ）電界脱離イオン化（「ＦＤ」）イオン源、（ｘｉｉ）誘導結合プラズマ（「ＩＣＰ」）イオン源、（ｘｉｉｉ）高速原子衝撃（「ＦＡＢ」）イオン源、（ｘｉｖ）液体二次イオン質量分析（「ＬＳＩＭＳ」）イオン源、（ｘｖ）脱離エレクトロスプレーイオン化（「ＤＥＳＩ」）イオン源、（ｘｖｉ）ニッケル−６３放射性イオン源、（ｘｖｉｉ）大気圧マトリックス支援レーザー脱離イオン化イオン源、（ｘｖｉｉｉ）熱スプレーイオン源、（ｘｉｘ）大気サンプリンググロー放電イオン化（「ＡＳＧＤＩ」）イオン源、（ｘｘ）グロー放電（「ＧＤ」）イオン源、（ｘｘｉ）インパクターイオン源、（ｘｘｉｉ）リアルタイム直接分析（ＤＡＲＴ」）イオン源、（ｘｘｉｉｉ）レーザースプレイイオン化（「ＬＳＩ」）イオン源、（ｘｘｉｖ）ソニックスプレーイオン化（「ＳＳＩ」）イオン源、（ｘｘｖ）マトリックス支援インレットイオン化（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｉｎｌｅｔ  Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ）（「ＭＡＩＩ」）イオン源、および（ｘｘｖｉ）溶媒支援インレットイオン化（Ｓｏｌｖｅｎｔ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｉｎｌｅｔ  Ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ）（「ＳＡＩＩ」）イオン源、からなる群より選択されるイオン源、および／または
（ｂ）１つまたは複数の連続またはパルス状イオン源、および／または
（ｃ）１つまたは複数のイオンガイド、および／または
（ｄ）１つまたは複数のイオン移動度分離装置、および／または１つまたは複数の電界非対称イオン移動度分光装置、および／または
（ｅ）１つまたは複数のイオントラップまたは１つまたは複数のイオントラッピング領域、および／または
（ｆ）（ｉ）衝突誘導解離（「ＣＩＤ」）フラグメント化装置、（ｉｉ）表面誘起解離（「ＳＩＤ」）フラグメント化装置、（ｉｉｉ）電子移動解離（「ＥＴＤ」）フラグメント化装置、（ｉｖ）電子捕獲解離（「ＥＣＤ」）フラグメント化装置、（ｖ）電子衝突または衝撃解離フラグメント化装置、（ｖｉ）光誘起解離（「ＰＩＤ」）フラグメント化装置、（ｖｉｉ）レーザー誘起解離フラグメント化装置、（ｖｉｉｉ）赤外線照射誘発解離装置、（ｉｘ）紫外線照射誘発解離装置、（ｘ）ノズル−スキマーインターフェースフラグメント化装置、（ｘｉ）インソースフラグメント化装置、（ｘｉｉ）インソース衝突誘起解離フラグメント化装置、（ｘｉｉｉ）熱または温度源フラグメント化装置、（ｘｉｖ）電場誘起フラグメント化装置、（ｘｖ）磁場誘起されたフラグメント化装置、（ｘｖｉ）酵素消化または酵素分解フラグメント化装置、（ｘｖｉｉ）イオン−イオン反応フラグメント化装置、（ｘｖｉｉｉ）イオン−分子反応フラグメント化装置、（ｘｉｘ）イオン−原子反応フラグメント化装置、（ｘｘ）イオン−準安定性イオン反応フラグメント化装置、（ｘｘｉ）イオン−準安定性分子反応フラグメント化装置、（ｘｘｉｉ）イオン−準安定性原子反応フラグメント化装置、（ｘｘｉｉｉ）イオンを反応させて付加または生成イオンを形成させるためのイオン−イオン反応装置、（ｘｘｉｖ）イオンを反応させて付加または生成イオンを形成させるためのイオン−分子反応装置、（ｘｘｖ）イオンを反応させて付加または生成イオンを形成させるためのイオン−原子反応装置、（ｘｘｖｉ）イオンを反応させて付加または生成イオンを形成させるためのイオン−準安定性イオン反応装置、（ｘｘｖｉｉ）イオンを反応させて付加または生成イオンを形成させるためのイオン−準安定性分子反応装置、（ｘｘｖｉｉｉ）イオンを反応させて付加または生成イオンを形成させるためのイオン−準安定性原子反応装置、および（ｘｘｉｘ）電子イオン化解離（「ＥＩＤ」）フラグメント化装置、からなる群より選択される１つまたは複数の衝突、フラグメント化または反応セル、および／または
（ｇ）（ｉ）四重極質量分析器、（ｉｉ）２次元又はリニア四重極質量分析器、（ｉｉｉ）ポール（Ｐａｕｌ）トラップ型又は３次元四重極質量分析器、（ｉｖ）ペニング（Ｐｅｎｎｉｎｇ）トラップ型質量分析器、（ｖ）イオントラップ型質量分析器、（ｖｉ）磁場セクター型質量分析器、（ｖｉｉ）イオンサイクロトロン共鳴（Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：「ＩＣＲ」）質量分析器、（ｖｉｉｉ）フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（Ｆｏｕｒｉｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ：「ＦＴＩＣＲ」）質量分析器、（ｉｘ）静電またはオービトラップ型質量分析器、（ｘ）フーリエ変換静電またはオービトラップ型質量分析器、（ｘｉ）フーリエ変換質量分析器、（ｘｉｉ）飛行時間型質量分析器、（ｘｉｉｉ）直交加速飛行時間型質量分析器、および（ｘｉｖ）線形加速飛行時間型質量分析器、からなる群より選択される質量分析器、および／または
（ｈ）１つまたは複数のエネルギー分析器または静電エネルギー分析器、および／または
（ｉ）１つまたは複数のイオン検出器、および／または
（ｊ）（ｉ）ａ四重極マスフィルタ、（ｉｉ）２次元又はリニア四重極イオントラップ、（ｉｉｉ）ポール（Ｐａｕｌ）または３次元四重極イオントラップ、（ｉｖ）ペニング（Ｐｅｎｎｉｎｇ）イオントラップ、（ｖ）イオントラップ、（ｖｉ）磁気セクター型マスフィルタ、（ｖｉｉ）飛行時間型マスフィルタ、および（ｖｉｉｉ）ウィーン（Ｗｉｅｎ）フィルタ、からなる群より選択される１つまたは複数のマスフィルタ、および／または
（ｋ）イオンをパルス状にする装置またはイオンゲート、および／または
（ｌ）実質的に連続的なイオンビームをパルス状イオンビームに変換する装置。
【００５１】
質量分析計は、
（ｉ）Ｃトラップならびに外側のバレル様電極および内側の同軸スピンドル様電極を備えたオービトラップ（ＲＴＭ）質量分析器であって、第１のモードで、イオンは、Ｃ型トラップに送られ、次に、オービトラップ型（ＲＴＭ）質量分析器に注入され、第２のモードで、イオンは、Ｃトラップに、次に、衝突セル又は電子移動解離（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）装置に送られて、少なくとも一部のイオンがフラグメントイオンにフラグメント化され、フラグメントイオンは、Ｃ型トラップに送られた後で、オービトラップ型（ＲＴＭ）質量分析器に注入されるオービトラップ質量分析器、および／または、
（ｉｉ）使用時にイオンを透過させる開口部を各々有する複数の電極を備える積層リング型イオンガイドであって、電極間の間隔がイオン通路の長さ方向に沿って増大し、イオンガイドの上流部分に配置される電極の開口部が第１の直径を有する一方で、イオンガイドの下流部分に配置される電極の開口部が第１の直径よりも小さい第２の直径を有し、使用時に、連続する電極に、逆相のＡＣ又はＲＦ電圧を印加するイオンガイド、のいずれかをさらに含んでもよい。
【００５２】
一実施形態では、質量分析計は、ＡＣまたはＲＦ電圧を電極に供給するように配置され、適合された装置をさらに含む。ＡＣまたはＲＦ電圧は、下記からなる群より選択される振幅を有するのが好ましい：（ｉ）５０Ｖ未満のピークツーピーク、（ｉｉ）５０〜１００Ｖのピークツーピーク、（ｉｉｉ）１００〜１５０Ｖのピークツーピーク、（ｉｖ）１５０〜２００Ｖのピークツーピーク、（ｖ）２００〜２５０Ｖのピークツーピーク、（ｖｉ）２５０〜３００Ｖのピークツーピーク、（ｖｉｉ）３００−３５０Ｖのピークツーピーク、（ｖｉｉｉ）３５０〜４００Ｖのピークツーピーク、（ｉｘ）４００〜４５０Ｖのピークツーピーク、（ｘ）４５０〜５００Ｖのピークツーピーク、および（ｘｉ）５００Ｖ超のピークツーピーク。
【００５３】
ＡＣまたはＲＦ電圧は、下記からなる群より選択される周波数であるのが好ましい：（ｉ）未満１００ｋＨｚ、（ｉｉ）１００〜２００ｋＨｚ、（ｉｉｉ）２００〜３００ｋＨｚ、（ｉｖ）３００〜４００ｋＨｚ、（ｖ）４００〜５００ｋＨｚ、（ｖｉ）０．５〜１．０ＭＨｚ、（ｖｉｉ）１．０〜１．５ＭＨｚ、（ｖｉｉｉ）１．５〜２．０ＭＨｚ、（ｉｘ）２．０〜２．５ＭＨｚ、（ｘ）２．５〜３．０ＭＨｚ、（ｘｉ）３．０〜３．５ＭＨｚ、（ｘｉｉ）３．５〜４．０ＭＨｚ、（ｘｉｉｉ）４．０〜４．５ＭＨｚ、（ｘｉｖ）４．５〜５．０ＭＨｚ、（ｘｖ）５．０〜５．５ＭＨｚ、（ｘｖｉ）５．５〜６．０ＭＨｚ、（ｘｖｉｉ）６．０〜６．５ＭＨｚ、（ｘｖｉｉｉ）６．５〜７．０ＭＨｚ、（ｘｉｘ）７．０〜７．５ＭＨｚ、（ｘｘ）７．５〜８．０ＭＨｚ、（ｘｘｉ）８．０〜８．５ＭＨｚ、（ｘｘｉｉ）８．５〜９．０ＭＨｚ、（ｘｘｉｉｉ）９．０〜９．５ＭＨｚ、（ｘｘｉｖ）９．５〜１０．０ＭＨｚ、および（ｘｘｖ）１０．０ＭＨｚ超。
【００５４】
好ましい方法では、分析物イオンは、エレクトロスプレーイオン源などの大気圧イオン源により生成される。親分析物イオンの電荷低減は、例えば、ＰＴＲ反応により大気圧で行うことができる。これは、試薬陰イオンを生成し、試薬イオンを親イオンと相互作用させることにより行うことができる。試薬イオンは、揮発性分子をＵＶ光源に暴露することにより生成できる。試薬陰イオンは、大気圧でイオンの電荷低減が生じるように、多重電荷または多重プロトン化親イオンから水素イオンを受け取るか、または除去できる。一実施形態では、電荷低減プロセスは、ＵＶ光源をオン、オフすることにより間欠的に断続して、それにより、試薬陰イオンの生成を間欠的に停止させてもよい。
【００５５】
電荷移動または電荷低減を行う代替法は、例えば、米国特許公開第２０１１／０１１４８３５号（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ）で開示のような超塩基化合物を使用することである。電荷低減の別の方法は、Ｂ．Ｌ．Ｆｒｅｙ、Ｙ．Ｌｉｎ、Ｍ．Ｓ．ＷｅｓｔｐｈａｌｌおよびＬ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈの「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  Ｇａｓ−Ｐｈａｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｃｈａｒｇｅ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｏｆ  Ｉｎｔａｃｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００５、１６（１１）、ｐ．１８７６−１８８７、に記載されているが、ここでは、大気圧コロナ放電を使ってプロトン移動反応用の試薬陰イオンを生成している。
【００５６】
本発明は、標的の、または非標的の親イオンのフラグメント化の前に、イオン電荷の量を低減する。好ましい実施形態は、複雑な混合物（例えば、タンパク質消化物）の分析中に特に好都合であり、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）および／またはイオン移動度分光計（ＩＭＳ）分離技術と組み合わせて使用できる。
【００５７】
ＭＳｅは、十分に確立した質量分析方法である。ＭＳｅおよびＨＤＭＳｅ（すなわち、イオン移動度支援ＭＳｅ）手法では、親イオンスペクトルが低フラグメント化モードで取得され、フラグメントイオンスペクトルが高フラグメント化モードで取得される。その後、親イオンは、同時に起こるそれらの液体クロマトグラフィー時間溶出プロファイルに基づいて、および／または、ＨＤＭＳｅの場合には、同時に起こるそれらのイオン移動度時間溶出プロファイルに基づいて、フラグメントイオンに関係付けられる。しかし、タンパク質消化物の分析では、親イオンスペクトルは、質量スペクトルの比較的狭い質量電荷比領域中で重なり合う多重電荷親イオンが原因で複雑になる場合がある。これは、例えば、エレクトロスプレーイオン化の場合に、特に問題となる。理由は、この形式のイオン化は、通常、二価および三価の親イオンを生成するためである。この複雑さは、親イオン質量スペクトル中の質量干渉につながり、スペクトルピークの誤帰属になる、または帰属できない場合がある。
【００５８】
本発明の好ましい方法による電荷低減は、ＭＳｅプロテオミクス実験にとって、親イオンスペクトルの複雑さを減らすという観点でいくつかの有益な効果がある。第１に、イオンの電荷が低減されるに伴い、部分的に重なる高電荷親イオンのスペクトルピークがより大きい質量電荷比側にシフトされる。従って、電荷低減が起こると、部分的に重なりあうスペクトルピークが質量電荷比のより大きな範囲にわたり分離される。これは、親イオンスペクトルを単純化し、非分離または部分的にのみ分離された異なるペプチド由来の親イオンの発生を減らす。さらに、電荷低減技術は、また、単電荷バックグラウンドイオンを中和し、そのために、これらのバックグラウンドイオンを親イオン質量スペクトルデータから効率的に除去する。これは、質量スペクトル内の信号雑音比をさらに改善する。複雑な実験であっても、上記の両方の効果により、より確実なペプチドの帰属に繋げることができる。
【００５９】
好ましい実施形態では、ＭＳｅ実験の高フラグメント化モードの間、電荷低減プロセスは停止され、親イオンがフラグメント化中に、そのより高い荷電状態で維持されることを可能とする。その後、高電荷親イオンは、例えば、ＥＴＤフラグメント化によりフラグメント化できる。親イオンを比較的高電荷で維持することを可能とすることにより、特に、ＥＴＤフラグメント化に対して、フラグメント化プロセスの効率が改善される傾向がある。
【００６０】
さらに、電荷低減に供された親イオンに対して、ＣＩＤフラグメント化などのフラグメント化技術を実行できる。一般に、電荷低減種のフラグメント化により得られたフラグメントイオンは、電荷低減の方法に関わらず、非電荷低減親イオンのフラグメント化により生成されたイオンとは異なるであろう。従って、電荷低減親イオンのフラグメント化により、非電荷低減親イオンのフラグメント化からは得ることができない追加の情報が得られる。
【００６１】
従って、本発明の好ましい実施形態の方法は、親イオン同定の複雑さを減らすことにより、既存の方法に対し改善を示す。また、好ましい方法は、既知の方法に比べて、相補的フラグメントイオン情報の生成を可能とし、それにより、分析の情報量を増やす。
【００６２】
また、上述の利点は、多重反応モニタリング（「ＭＲＭ」）などの計画されたＭＳ−ＭＳ実験に適用可能であり、この場合、親とフラグメントイオンの両方が、取得の前に既知である。単電荷ノイズおよび干渉の可能性の両方が、電荷低減により少なくなるので、好都合にも、検出限界を高めることができる。
【００６３】
以降で、付随する図を参照しながら種々の本発明の実施形態が例示のみの目的で説明される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１Ａ】１つの操作モードでは、電荷低減親イオンに対して質量スペクトルデータが取得され、別の操作モードでは、電荷低減親イオンのフラグメントに対し質量スペクトルデータが取得される本発明の一実施形態を示す図である。
【図１Ｂ】１つの操作モードでは、電荷低減親イオンに対して質量スペクトルデータが取得され、別の操作モードでは、ＣＩＤフラグメント化に供された非電荷低減親イオンのフラグメントに対して質量スペクトルデータが取得される本発明の一実施形態を示す図である。
【図１Ｃ】１つの操作モードでは、電荷低減親イオンに対して質量スペクトルデータが取得され、別の操作モードでは、ＥＴＤフラグメント化に供された非電荷低減親イオンのフラグメントに対して質量スペクトルデータが取得される本発明の一実施形態を示す図である。
【図２】親イオンの荷電状態が高められ、その後、１つの操作モードでは、イオンがＥＴＤフラグメント化に供されて、質量分析され、別の操作モードでは、親イオンの荷電状態が低減され、親イオンが質量分析される、あまり好ましくない本発明の実施形態を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
好ましい方法では、例えば、液体クロマトグラフィー装置から溶出することにより、またはイオン移動度分光計を通過させることにより異なる親イオンが分離される。親イオンは、親イオンが質量分析器の方に移動するときに、フラグメント化領域を通過する。ＭＳｅ質量スペクトル技術が行われ、フラグメント化領域が低フラグメント化モードと高フラグメント化モードとの間で繰り返し入れ替わる。親イオン質量スペクトルが、低フラグメント化モードで取得され、フラグメントイオン質量スペクトルが高フラグメント化モードで取得される。その後、親イオンは、例えば、同時に起こるそれらの液体クロマトグラフィー時間溶出プロファイル、および／または、イオン移動度時間溶出プロファイルに基づいて、それらの対応するフラグメントイオンと関連付けられる。図１Ａ〜Ｃは、本発明の好ましい実施形態によるＭＳｅの方法の３種のスキームを示す。
【００６６】
図１Ａに示す実施形態では、第１の操作モードで、親イオンが電荷低減され、その後、質量分析されて、第１の質量スペクトルデータが取得される。親イオンを分析することが目的なので、ＣＩＤフラグメント化は、この操作モードでは行われない。第２の操作モードでは、電荷低減親イオンがＣＩＤフラグメント化に供され、フラグメントイオンが質量分析されて、第２のスペクトルデータが取得される。方法は、２種のモードの間で交互に繰り返し行われる。
【００６７】
図１Ｂに示す実施形態では、第１の操作モードで、親イオンが電荷低減され、その後、質量分析されて、第１の質量スペクトルデータが取得される。親イオンの分析が目的なので、この操作モードでは、ＣＩＤフラグメント化は行われない。第２の操作モードでは、親イオンは、電荷低減されないが、ＣＩＤフラグメント化に供される。フラグメントイオンが、質量分析されて第２のスペクトルデータが取得される。方法は、２種のモードの間で交互に繰り返し行われる。
【００６８】
図１Ｃに示す実施形態では、第１の操作モードで、親イオンが電荷低減され、その後、質量分析されて、第１の質量スペクトルデータが取得される。親イオンの分析が目的なので、この操作モードでは、フラグメント化は行われない。第２の操作モードでは、親イオンは電荷低減されないが、ＥＴＤフラグメント化に供される。フラグメントイオンが、質量分析されて、第２のスペクトルデータが取得される。方法は、２種のモードの間で交互に繰り返し行われる。
【００６９】
上述のように、ＭＳｅ実験では、低フラグメント化モードおよび高フラグメント化モードが行われ、親およびフラグメントイオンスペクトルが取得される。本発明の一実施形態では、３種以上の操作モードを利用して、単一の試料注入からより多くの情報を取り出すことができる。例えば、一実施形態では、次の手順の任意の組み合わせを行うことができる：（ｉ）親イオンが、電荷低減に供されず、かつフラグメント化に供されないで質量分析される、（ｉｉ）親イオンが電荷低減に供され、その後、例えば、ＣＩＤまたはＥＴＤによりフラグメント化され、フラグメントイオン質量分析される、（ｉｉｉ）親イオンが、電荷低減に供され、その後、フラグメント化されないで質量分析される、および（ｉｖ）親イオンが電荷低減に供されないで、続けて、例えば、ＣＩＤまたはＥＴＤによりフラグメント化に供され、フラグメントイオンが質量分析される。方法は、これらのモードの内の２種、３種、または４種を繰り返して行うことができる。方法は、このような繰り返しを反復して行うことができる。好ましい実施形態における繰り返しは、上記操作モードの３種以上を含み、従って、従来の方法に比べて、より多くの情報を試料から取り出すことができる。
【００７０】
方法は、好ましくは、それぞれの親イオンに対する各モードからデータを取得するのに十分速い速度で異なる操作モードの間を切り替えるのが好ましい。好ましい方法は、それぞれのタイプの親イオンに対して各操作モードからデータが得られるように、異なる操作モードの間で連続的に繰り返される。
【００７１】
また、あまり好ましくない実施形態も意図され、この場合、フラグメント化の前に、親イオンの荷電状態を高めること、すなわち、過電荷化できる。過電荷化を含むＭＳｅ実験の一例が、以降で図２に関連して記載される。親イオンは、最初に、過電荷にされ、それにより、それらのイオンは比較的高い荷電状態にある。第１の操作モードでは、これらの親イオンは、次に、電荷低減に供されて、それらの荷電状態を下げ、その後、質量分析されて親イオンスペクトルが取得される。上述のように、親イオンスペクトルは、親イオンの電荷を低減することにより単純化される。第２の操作モードでは、親イオンのフラグメント化が目的である。このモードでは、電荷低減プロセスは、停止され、その後、親イオンは、最初に電荷低減されることなく、ＥＴＤによりフラグメント化される。親イオンのより高い荷電状態は、より効率的なまたはより情報価値のあるフラグメントイオンに形成につながることがあるので、過電荷化は、ＥＴＤなどのフラグメント化プロセスには好都合である。方法は、２種のモードの間で交互に繰り返し行われる。過電荷化および間欠的電荷低減の組み合わせは、親イオンおよびフラグメントイオンの両方の分析プロセスの最適化を可能とすることは理解されよう。その後、親イオンおよびそれらのフラグメントイオンは、例えば、ＬＣ溶出時間またはＩＭＳドリフト時間を照合することにより、関連付けできる。
【００７２】
過電荷化は、エレクトロスプレーイオン化の前に、例えば、ｍ−ニトロベンジルアルコール（ＭＮＢＡ）などの試薬を分析物溶液に加えることにより得ることができる。これにより、他の方法で生成されたものより増加した荷電状態の親イオンが生成される。
【００７３】
好ましい実施形態に関連して本発明が記載されてきたが、当業者なら、付随する請求項で定められる本発明の範囲を逸脱することなく、形態と詳細における種々の変更を行えることを理解するであろう。
【００７４】
例えば、過電荷化は、中性の分子から親イオンの形成のために使用可能であることが意図されている。この場合、代わりの電荷低減と組み合わされた過電荷化は、その後のフラグメント化による情報を含めて、または含めないでも特有の情報を提供できる。
【００７５】
さらなる実施形態では、電荷低減は、大気圧下で、または大気圧以下の圧力下の衝突ガスセル内、例えば、ＲＦガスセル内で行うことができることが意図されている。
【００７６】
本発明の実施形態に従って、ＣＩＤ、光フラグメント化、ＥＣＤまたはＥＴＤなどの種々のフラグメント化法を使うことができることは理解されよう。
【００７７】
また、電荷低減親イオンおよび非電荷低減親イオンの間で切り替えながら、フラグメント化を全く起こさないで質量分析を行うことができることも意図されている。この場合、親イオンのみが同定されてペプチドマップが生成される。異なるペプチドは、質量干渉のある領域が異なるために、電荷低減および非電荷低減データ中で同定できる。想定されるペプチドの合計は、どちらかの個別実験の場合に比べて大きくなるであろう。この場合には、保持時間の照合により、異なる荷電状態の同じ親イオンが同定できる。
【図２】
2015523552.tif 000003
【図１Ａ】
2015523552.tif 000004
【図１Ｂ】
2015523552.tif 000005
【図１Ｃ】
2015523552.tif 000006
【手続補正書】
【提出日】平成27年1月20日(2015.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析方法であって、
（ｉ）複数の親イオンを用意するステップ、
（ｉｉ）前記親イオンを電荷低減条件に供して親イオンの荷電状態を低減し、得られた電荷低減親イオンを質量分析して第１の質量スペクトルデータを取得するステップ、
（ｉｉｉ）イオンを前記電荷低減条件にさらすことにより最初に前記親イオンの荷電状態を低減しないで、親イオンをフラグメント化してフラグメントイオンを生成し、前記フラグメントイオンを質量分析して第２の質量スペクトルデータを取得するステップ、
（ｉｖ）前記親イオンが、交互に繰り返して前記電荷低減条件および前記フラグメント化にさらされ、それにより、ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）とを交互に繰り返すステップ、
を含み、
前記第１の質量スペクトルデータで検出された親イオンと、前記第２の質量スペクトルデータで検出されたフラグメントイオンとを関連付けることを含む、
方法。
【請求項２】
前記電荷低減条件が前記フラグメント化を起こす前記条件とは異なり、それにより、前記電荷低減条件が、前記親イオンのフラグメント化を実質的に全く起こさない請求項１に記載の方法。
【請求項３】
次記のステップ
請求項１に記載のステップ（ｉｉ）を行うステップ、
請求項１に記載のステップ（ｉｉｉ）を行うステップ、および
親イオンをフラグメント化して、イオンを前記電荷低減条件に供することにより最初に親イオンの荷電状態を低減したフラグメントイオンを生成し、これらのフラグメントイオンを質量分析して第３の質量スペクトルデータを取得するステップ、
を任意の順で含む繰り返しを行うことを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
最初に親イオンの荷電状態を低減することなく、前記親イオンをフラグメント化するステップが、所与の親イオンから第１のフラグメント化プロセスにより親イオンをフラグメント化して、第１のセットのフラグメントイオンを生成するステップを含み、また、前記所与の親イオンから第２の異なるフラグメント化プロセスにより親イオンをフラグメント化して、第２の異なるセットのフラグメントイオンを生成するステップを含み、および／または、
最初に親イオンの荷電状態を低減した前記親イオンをフラグメント化するステップが、親イオンを第１のフラグメント化プロセスによりフラグメント化して、所与の親イオンから第１のセットのフラグメントイオンを生成するステップを含み、また、第２の異なるフラグメント化プロセスにより親イオンをフラグメント化して、前記所与の親イオンから第２の異なるセットのフラグメントイオンを生成するステップを含む、
請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１のフラグメント化プロセスが、電子移動解離（「ＥＴＤ」）または電子捕獲解離（「ＥＣＤ」）であり、前記第２のフラグメント化プロセスが、衝突誘起解離（「ＣＩＤ」）である請求項４に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載のステップ（ｉｉ）が、荷電状態が高められた前記親イオンの荷電状態を低減し、その後、得られたイオンを質量分析して、前記第１の質量スペクトルデータを取得するステップを含み、さらに、
請求項１に記載のステップ（ｉｉｉ）が、最初にこれらのイオンの荷電状態を低減しないで荷電状態が高められた前記親イオンをフラグメント化し、その後、得られたフラグメントイオンを質量分析して、前記第２の質量スペクトルデータを取得することを含む、
親イオンの荷電状態を高めることをさらに含む請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載のステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間で交互に繰り返して行われて、前記第１の質量スペクトルデータの取得と、第２の質量スペクトルデータの取得とが交互に行われ、いずれかの所与のセットの第１の質量スペクトルデータ中の親イオンが、前記所与のセットの第１の質量スペクトルデータが取得される直前または直後に取得される第２の質量スペクトルデータセット中のフラグメントイオンに関連付けられる請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
親イオンの前記複数のイオン中のそれぞれの化学種が、前記ステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の両方に供されるような速度で請求項１のステップ（ｉｉ）と（ｉｉｉ）とを交互に行う請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記複数の親イオンを用意するステップが、相互に空間的に離れ、それにより、請求項１に記載のステップ（ｉｉ）で、それらのイオンが異なる時間に質量分析器に導入され、異なる時間に質量分析される異なる親イオンを用意するステップを含む請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記親イオンが、試料をクロマトグラフィーに供し、溶出試料をイオン化することにより生成され、さらに、前記第１の質量スペクトルデータで観察されたイオンのクロマトグラフ溶出時間プロファイルと、第２の質量スペクトルデータで観察されたイオンのクロマトグラフ溶出時間プロファイルとの照合により、前記第１の質量スペクトルデータで検出された親イオンが、前記第２の質量スペクトルデータで検出されたフラグメントイオンと関連付けられる請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
異なる親イオンが、それらのイオン移動度に従ってイオン移動度分光計中で分離され、それにより、それらが、請求項１に記載のステップ（ｉｉ）で、異なる時間に質量分析器に導入され、異なる時間に質量分析され、さらに、前記第１の質量スペクトルデータで観察されたイオンのイオン移動度ドリフト時間プロファイルを、第２の質量スペクトルデータで観察されたイオンのイオン移動度ドリフト時間プロファイルと照合することにより、前記第１の質量スペクトルデータで検出された前記イオンが、第２の質量スペクトルデータで検出されたフラグメントイオンに関連付けられる請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記親イオンの荷電状態を低減するステップが、大気圧で行われる請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記親イオンをフラグメント化するステップが、大気圧で行われる請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
質量分析計であって、
イオンの荷電状態を低減するように配置され、適合された装置、
質量分析器、
フラグメント化装置、ならびに
制御手段であって、
前記親イオンを電荷低減条件に供することによりイオンの荷電状態を低減するように配置され、適合された前記装置中で親イオンの荷電状態を低減し、
前記質量分析器中で前記得られた電荷低減親イオンを質量分析して第１の質量スペクトルデータを取得し、
電荷低減条件にさらすことにより最初に親イオンの荷電状態を低減しないで、前記フラグメント化装置中で前記親イオンをフラグメント化してフラグメントイオンを生成し、
前記フラグメントイオンを前記質量分析器中で質量分析し、第２の質量スペクトルデータを取得し、
前記親イオンの電荷を減らすステップと、前記親イオンフラグメント化するステップを交互に繰り返し行い、および
前記第１の質量スペクトルデータで検出された親イオンと、前記第２の質量スペクトルデータで検出されたフラグメントイオンとを関連付ける、
ように配置され、適合された制御手段、
を含む質量分析計。
【請求項１５】
前記質量分析計が、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法を行うように配置され、適合された請求項１４に記載の質量分析計。
【請求項１６】
質量分析方法であって、
親イオンの複数の化学種を生成するステップ、
前記親イオンの電荷を低減するステップ、
電荷低減親イオンの１つまたは複数の化学種の強度プロファイルを時間の関数として変動させ、それにより、親イオンの異なる化学種に、時間の関数として異なる強度プロファイルを持たせるステップ、
前記電荷低減ステップに前記親イオンを供しないで、親イオンをフラグメント化し、フラグメントイオンを形成するステップ、
フラグメントイオンを質量分析するステップ、および
前記フラグメントイオンの強度プロファイルおよび前記電荷低減親イオンの強度プロファイルに基づいて、前記フラグメントイオンと、対応する電荷低減親イオンを相互に関連付けるステップ、
を含む方法。
【請求項１７】
電荷低減親イオンの１つまたは複数の化学種のプロファイルを取得するために、電荷低減親イオンを質量分析するステップを含む請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
電荷低減と親イオンの質量分析ステップと、最初にそれらの荷電状態を低減することなく親イオンをフラグメント化し、フラグメントイオンを質量分析するステップとを交互に繰り返し行う請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
電荷低減親イオンの１つまたは複数の化学種の前記強度プロファイルを時間の関数として変動させるステップが、分析物試料をクロマトグラフィーに供するステップ含み、前記親およびフラグメントイオンのクロマトグラフ溶出時間プロファイルを照合することにより、親イオンがフラグメントイオンと相互に関連付けられる請求項１６、１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
電荷低減親イオンの１つまたは複数の化学種の前記強度プロファイルを時間の関数として変動させるステップが、前記親イオンをイオン移動度分光計中で分離させルステップを含み、前記親およびフラグメントイオンのイオン移動度ドリフト時間プロファイルを照合することにより、前記親イオンがフラグメントイオンと相互に関連付けられる請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の方法
【請求項２１】
質量分析計であって、
親イオンの複数の化学種を生成するイオン源、
前記親イオンの電荷を低減する手段、
電荷低減親イオンの１つまたは複数の化学種の前記強度プロファイルを時間の関数として変動させ、それにより、親イオンの異なる化学種に時間の関数として異なる強度プロファイルを持たせる手段、
前記親イオンを前記電荷低減ステップに供しないで、親イオンをフラグメント化して、フラグメントイオンを形成する手段、
フラグメントイオンを質量分析する手段、および
前記フラグメントイオンの前記強度プロファイルおよび前記電荷低減親イオンの前記強度プロファイルに基づいて、前記フラグメントイオンと、対応する電荷低減親イオンとを相互に関連付ける手段、
を含む質量分析計。
【国際調査報告】
2015523552.tif 000007
2015523552.tif 000008