(57)【要約】  本発明は、抗体コンジュゲートの調製のための方法であって、単一の重鎖間ジスルフィド結合を有する改変された抗体と、該ジスルフィド結合由来の2つのシステイン残基の間に架橋を形成するコンジュゲート試薬を反応させる工程を含む、方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体コンジュゲートの調製のための方法であって、単一の重鎖間ジスルフィド結合を有する改変された抗体と、該ジスルフィド結合由来の2つのシステイン残基の間に架橋を形成するコンジュゲート試薬を反応させる工程を含む、方法。
【請求項２】
前記抗体が、IgG1又はIgG4分子である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、組換え発現又は化学合成によって調製される、請求項1又は請求項2に記載の方法。
【請求項４】
a)親抗体をコードする核酸配列を変異させる工程であって、前記変異が、1つ若しくは複数の重鎖間システイン残基の欠失、又は、前記システイン残基の、システイン以外のアミノ酸との置換をもたらす、前記工程と;
b)前記核酸を発現系中で発現させる工程と;
c)前記改変された抗体を単離する工程と
を含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記親抗体のコード配列中にヌクレオチド変化を取り込むために、部位特異的変異誘発が実施される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記単一の重鎖間ジスルフィド結合が、前記抗体のEU-インデックス・ナンバリング・システムによる226位又は229位にある、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体が、EU-インデックス・ナンバリング・システムによる226位にシステイン及び229位にシステイン以外のアミノ酸を有するか、又はEU-インデックス・ナンバリング・システムによる226位にシステイン以外のアミノ酸及び229位にシステインを有する、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記システイン以外のアミノ酸が、チオール部分、例えば、セリン、スレオニン、バリン、アラニン、グリシン、ロイシン又はイソロイシン、他の極性アミノ酸、他の天然アミノ酸、又は非天然アミノ酸を含まない、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、EU-インデックス・ナンバリング・システムによる226位にシステイン及び229位にセリンを有するか、又はEU-インデックス・ナンバリング・システムによる226位にセリン及び229位にシステインを有する、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、IgG1分子であって、EU-インデックス・ナンバリング・システムによる226位〜229位にCys-Pro-Pro-Ser若しくはSer-Pro-Pro-Cysの配列を含むか;又はIgG4分子であって、EU-インデックス・ナンバリング・システムによる226位〜229位にCys-Pro-Ser-Ser若しくはSer-Pro-Ser-Cysの配列を含む、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記単一の重鎖間ジスルフィド結合が、抗体のヒンジ領域中で、親抗体中のジスルフィド結合とは異なる位置にある、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試薬が、診断薬、治療薬若しくは標識剤、又は診断薬、治療薬若しくは標識剤を結合することができる結合剤を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試薬がポリマーを含む、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試薬が、官能基:
【化１】
2015521615.tif 000022
[式中、Wは、電子吸引基を表し;Aは、C1-5アルキレン又はアルケニレン鎖を表し;Bは、結合又はC1-4アルキレン鎖若しくはアルケニレン鎖を表し;各Lは、独立して脱離基を表す]
を含有する、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試薬が、式II、III又はIV:
【化２】
2015521615.tif 000023
[式中、
X及びX'のうちの一方は、ポリマーを、他方は、水素原子を表し、
Qは、連結基を表し、
Wは、電子吸引基を表すか;又はX'がポリマーを表す場合、X-Q-Wは一緒になって電子吸引基を表すことができ;
Aは、C1-5アルキレン又はアルケニレン鎖を表し;
Bは、結合又はC1-4アルキレン若しくはアルケニレン鎖を表し;
各Lは、独立して脱離基を表す];
【化３】
2015521615.tif 000024
[式中、X、X'、Q、W、A及びLは、一般式IIについて示した意味を有し、さらに、Xがポリマーを表す場合、X'及び電子吸引基Wは、その間にある原子と一緒になって環を形成することができ、mは、1から4までの整数を表す];又は、
X-Q-W-CR1R1'-CR2.L.L'      (IV)
[式中、
X、Q及びWは、一般式IIについて示した意味を有し、かつ
R1は、水素原子若しくはC1-4アルキル基を表し、R1'は、水素原子を表し、L及びL'は、それぞれ独立して脱離基をあらわすか;又は
R1は、水素原子若しくはC1-4アルキル基を表し、Lは、脱離基を表し、R1'及びL'は、一緒になって結合を表すか;又は
R1及びLは、一緒になって結合を表し、R1'及びL'は、一緒になって結合を表し;かつ
R2は、水素原子若しくはC1-4アルキル基を表す]
を有する、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
結果として生じたコンジュゲート中の電子吸引基Wを還元するさらなる工程を含む、請求項14又は請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記重鎖間ジスルフィド結合由来の前記2つのシステイン残基間に架橋を形成する1分子のコンジュゲート試薬に加えて、追加の2分子のコンジュゲート試薬が、前記抗体の軽鎖のCLドメインと重鎖のCH1ドメインの間に位置する鎖間ジスルフィド結合に由来するシステイン残基間に架橋を形成する、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
コンジュゲート試薬が、抗体中のジスルフィド架橋由来の2つの硫黄原子を介して前記抗体に結合している抗体コンジュゲートであって、前記ジスルフィド架橋が、前記抗体中に存在する唯一の重鎖間ジスルフィド結合であることを特徴とする、抗体コンジュゲート。
【請求項１９】
前記抗体の軽鎖のCLドメインと重鎖のCH1ドメインの間に位置する鎖間ジスルフィド結合に由来する硫黄原子を介して結合した、2つのコンジュゲート試薬をさらに含む、請求項18に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項２０】
請求項1から17のいずれか一項に規定の方法により調製されうる、請求項18又は請求項19に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項２１】
治療に使用するための、請求項18から20のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項２２】
癌の治療に使用するための、請求項18から20のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲート。
【請求項２３】
癌の治療用の医薬品を製造するための、請求項18から20のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲートの使用。
【請求項２４】
請求項18から20のいずれか一項に記載の抗体コンジュゲートを患者に投与する工程を含む、癌の治療方法。
【請求項２５】
請求項18から20のいずれか一項に記載のコンジュゲートを、医薬として許容されるキャリアーとともに;場合により、追加の治療薬とともに含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体コンジュゲートを調製するための新規方法及び新規抗体コンジュゲートに関する。
【背景技術】
【０００２】
標的細胞表面及び分子上の特定の抗原に対する抗体の特異性は、様々な診断薬及び治療薬のキャリアーとしてのそれらの広範な用途をもたらす。例えば、フルオロフォア、放射性同位体及び酵素などの標識及びレポーター基にコンジュゲートされた抗体は、標識化及び画像化適用における用途を見出す一方、細胞毒性薬及び化学療法薬へのコンジュゲーションは、特別な細胞タイプ又は成長因子などの特定の組織又は構造へのそのような薬剤の送達を可能として、正常な健康組織への影響を最小化し、化学療法による治療に伴う副作用を顕著に低減する。抗体-薬物コンジュゲートは、いくつかの疾病分野、特に癌における広範な潜在的治療用途を有する。
【０００３】
所望の部分を抗体にコンジュゲートする従来の方法は、一般に、抗体に沿った部位(例えば、リジン側鎖アミンを介して)における非特異的コンジュゲーションを含み、コンジュゲーション産物及びしばしばコンジュゲートされていないタンパク質の不均一な分布をもたらして、特徴づけ及び精製が困難で高価な複合体混合物を生じさせる。そのような混合物中の各コンジュゲーション産物は、異なる薬物動態、分布、毒性及び有効性プロフィールを有する可能性があり、非特異的コンジュゲーションは抗体機能の障害を引き起こすことも多い。
【０００４】
抗体へのコンジュゲーションは、鎖間のジスルフィド結合を還元し、続いて、付加される部位と各遊離システイン残基とのアルキル化によって活性化されたシステインスルフィドリル基を介して実行されることもできる。4つの鎖間ジスルフィド結合を有するIgG1モノクローナル抗体においては、この部位特異的コンジュゲーションは、8個以下の活性部分が付加されたコンジュゲートをもたらす。しかしながら、そのようなコンジュゲーション方法は、なお、様々な化学量論(抗体あたり、0、2、4、6又は8個の部分)を有し、可能性のある8個のコンジュゲーション部位にわたって結合部分が分布しているコンジュゲートの不均一混合物を生じさせる。さらに、これらの様々なシステイン残基へのコンジュゲーションの間、元のジスルフィド結合は常に再架橋可能なわけではなく、構造変化及び抗体機能の障害をもたらす可能性がある。
【０００５】
最適化された有効性のためには、抗体あたりのコンジュゲートされた部分の数が同じであり、かつ、各部分が各抗体中の同じアミノ酸残基に特異的にコンジュゲートされるという用量どうしの一貫性を確実にするのは重要である。したがって、抗体コンジュゲートの均一性を改善するための数多くの方法が開発された。
【０００６】
WO2006/065533は、抗体-薬物コンジュゲートの治療指数が、抗体の薬物負荷の化学量論を8個の薬物分子/抗体未満に低減することによって改善されうることを認識し、化学量論的薬物付加のための所定の部位を有する改変された抗体を開示する。鎖間ジスルフィド結合の形成に関与する親抗体の8個の各システイン残基は、別のアミノ酸残基で計画的に置換されて、残った6、4又は2個のアクセス可能なシステイン残基を有する変異型抗体を生成する。4個の残ったシステイン残基を有する変異型抗体は、次いで所定の化学量論(4個の薬物/抗体)及び薬物付加部位を呈するコンジュゲートを生成し、これは、従来法から得られた、より不均質な「部分的に負荷された」4個の薬物/抗体コンジュゲートと同様の抗原結合親和性及び細胞毒性を呈した。
【０００７】
WO2006/065533の抗体は、収率の改善された均一なコンジュゲートを生成するが、ネイティブの鎖間ジスルフィド結合の除去は、抗体の四次構造を破壊し、それによって、抗体エフェクター機能の変化を含むインビボでの抗体の挙動をかく乱しうると考えられる(Junutula JRら、Nat Biotechnol.、2008年8月;26(8):925〜32頁)。
【０００８】
WO2008/141044は、抗体の1つ又は複数のアミノ酸がシステインアミノ酸で置換されている変異型抗体を対象とする。改変されたシステインアミノ酸残基は、遊離アミノ酸であり、鎖内又は鎖間のジスルフィド結合の一部ではなく、ネイティブのジスルフィド結合を破壊することなく、薬物を所定の化学量論比でコンジュゲートさせる。しかしながら、遊離システイン残基を改変によって抗体分子中に導入すると、抗体の折りたたみ及び組み立ての間に分子内の既存のシステイン残基と再編成及びスクランブリング反応が引き起こされ、又は別の抗体分子中の遊離システイン残基との反応を介して二量体化がもたらされ、抗体機能の障害若しくは凝集が起こるリスクが依然としてある。
【０００９】
WO2005/007197は、タンパク質中のジスルフィド結合由来の両硫黄原子とコンジュゲートして新規チオエーテルコンジュゲートを与える能力を有する新規コンジュゲート試薬を用いた、タンパク質へのポリマーのコンジュゲーションのための方法を記載する。この方法においては、ジスルフィド結合が、還元されて2つの遊離システイン残基を生成し、次いで、ポリマーが共有結合した架橋試薬を用いて、タンパク質の三次構造を破壊又は生理活性を失わせることなく、再び形成される。しかしながら、この方法は、抗体のコンジュゲーションの効率が他のタンパク質に関するよりも低い可能性があり、それは、抗体分子のヒンジ領域中の隣接するジスルフィド結合の相対的な近さが、ジスルフィド結合の何らかのスクランブリングをもたらしうるからである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】WO2006/065533
【特許文献２】WO2008/141044
【特許文献３】WO2005/007197
【特許文献４】WO2004/113394
【特許文献５】WO99/45964
【特許文献６】WO2010/100430
【特許文献７】WO2005/081711
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Junutula JRら、Nat Biotechnol.、2008年8月;26(8):925〜32頁
【非特許文献２】Edelman GMら、Proc Natl Acad Sci USA.、1969年5月; 63(1):78〜85頁
【非特許文献３】Kabatら、1991年、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda
【非特許文献４】Al-Lazikaniら、(1997) JMB 273、927〜948頁
【非特許文献５】Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Publish.、Cold Spring Harbor, New York (2001)
【非特許文献６】Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、第4版、John Wiley and Sons、New York (1999)
【非特許文献７】Coら、J. Immunol、152:2968〜76頁、1994年
【非特許文献８】Better及びHorwitz、Methods Enzymol.、178:476〜96頁、1989年
【非特許文献９】Pluckthun及びSkerra、Methods Enzymol、178:497〜515頁、1989年
【非特許文献１０】Lanioyi、Methods Enzymol、121:652〜63頁、1986年
【非特許文献１１】Rousseauxら、Methods Enzymol.、121:663〜9頁、1986年
【非特許文献１２】Bird及びWalker、Trends Biotechnol、9:132〜7頁、1991年
【非特許文献１３】Solid-Phase Peptide Synthesis、WH Freeman Co, San Francisco Calif.中のStewartら、1969年
【非特許文献１４】Merrifield、1963年、J. Am Chem. Soc.、85, 2149
【非特許文献１５】Matteucciら、J. Am. Chem. Soc. 103:3185〜3191頁、1981年
【非特許文献１６】Morimotoら、(1992)Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107〜117頁
【非特許文献１７】Brennanら、(1985) Science, 229:81頁
【非特許文献１８】Smithら、J. Am. Chem. Soc.、2010年、132, 1960〜1965頁
【非特許文献１９】Schumakerら、Bioconj. Chem.、2011年、22, 132〜136頁
【非特許文献２０】Bioconj. Chem 1990(1)、36〜50頁
【非特許文献２１】Bioconj. Chem 1990(1)、51〜59頁
【非特許文献２２】J. Am. Chem. Soc. 110、5211〜5212頁
【非特許文献２３】Hamblett KJら、Clin Cancer Res.、2004年10月15日; 10(20):7063〜70頁
【非特許文献２４】Nature Protocols、2006年、1(54)、2241〜2252頁
【非特許文献２５】Carter P.ら、Proc. Natl Acad. Sci. USA、89、4285〜4289頁、(1992)
【非特許文献２６】Hoら、Gene,、77 (1989) 51〜59頁
【非特許文献２７】Expression Systems (Dyson及びDurocher編)Scion Publishing Ltd.、Oxfordshire、UK、2007年中、「Transient Expression in HEK293-EBNA1 Cells,」Chapter 12
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
発明者らは今回、抗体コンジュゲートの調製中における、ジスルフィド結合のスクランブリングの問題を低減し、抗体コンジュゲーションの均一性を改善する、この方法の変法を発見した。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
したがって、本発明は、抗体コンジュゲートの調製のための方法であって、単一の重鎖間ジスルフィド結合を有する改変された抗体(engineered antibody)と、該ジスルフィド結合由来の2つのシステイン残基の間に架橋を形成するコンジュゲート試薬を反応させる工程を含む、方法を提供する。
【００１４】
天然のIgG分子においては、抗体分子の重鎖は、抗体のヒンジ領域中のシステイン残基間の複数の鎖間ジスルフィド結合(重鎖間ジスルフィド結合)によって連結される。本明細書中で使用されるとおり、「重鎖間システイン残基」は、重鎖間ジスルフィド結合の形成に関与することのできる抗体重鎖のシステイン残基をさす。
【００１５】
4つのIgGサブクラスは、ヒンジ領域中の重鎖間ジスルフィド結合の数の点で異なり:ヒトIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4アイソタイプは、2、4、11及び2個の重鎖間ジスルフィド結合をそれぞれ有する。IgG1及びIgG4においては、重鎖はEU-インデックス・ナンバリング・システム(EU-index numbering system)(Edelman GMら、Proc Natl Acad Sci USA.、1969年5月; 63(1):78〜85頁)による226及び229に相当する位置の重鎖間システイン残基間の、抗体のヒンジ領域におけるジスルフィド結合によって連結される。本発明において使用される抗体は、抗体のヒンジ領域中に単一の重鎖間ジスルフィド結合を有する(すなわち、一般に221位及び236位の間)。
【００１６】
本明細書及び請求の範囲全体をとおして、抗体配列中の残基は慣用的にEU-インデックス・ナンバリング・システムにより番号付けされる。EU-インデックス・ナンバリング・システムによる226位及び229位は、Kabatナンバリング・システム(Kabat numbering system)(Kabatら、1991年、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda)又はChothiaナンバリング・システム(Chothia numbering system)(Al-Lazikaniら、(1997) JMB 273、927〜948頁)を用いた239位及び242位に相当する。EUインデックスによる残基の指定は、アミノ酸配列中のアミノ酸残基の直線的ナンバリングと必ずしも直接的に対応するわけではない。実際の直鎖状アミノ酸配列は、厳密なEUインデックス・ナンバリングよりも少ないか又は追加のアミノ酸を含むかも知れない。残基の正確なEUインデックス・ナンバリングは、「標準的な」EUインデックス又はKabatでナンバリング付した配列(EU-index or Kabat numbered sequence)と、抗体の配列中の相同な残基を整列化することによって、例えば、抗体のヒンジ領域の残基の整列化によって所与の抗体について決定されうる。
【００１７】
単一の重鎖間ジスルフィド結合は、親抗体のジスルフィド結合の位置に、又はヒンジ領域中にあるという条件で異なる位置にあることができ、すなわち、抗体は親抗体のネイティブのヒンジジスルフィド結合のうちの1つ以外はすべて欠くように改変されるか、又は親抗体のヒンジジスルフィド結合のすべてを除去し、改変される新しいジスルフィド結合が新しい位置にあるように改変されうる。
【００１８】
一実施態様において、本発明の方法は、組換え発現又は化学合成によって単一の重鎖間ジスルフィド結合を有する改変された抗体を調製する工程を含む。例えば、結果として得られる改変された抗体が、その間で重鎖間ジスルフィド結合が形成される各重鎖中に単一の重鎖間システイン残基を有するように、システイン以外のアミノ酸によるシステイン残基の置換によって、親抗体配列中の1つ又は複数の重鎖間システイン残基を除去しうる。或いは、ネイティブの親抗体配列中の1つ又は複数の重鎖間システイン残基が欠失させてもよく、別のアミノ酸で置換されなくてもよい。これらの方法は、親抗体中のジスルフィド結合と同じ位置に単一のジスルフィド結合を有する改変された抗体を生じる。親抗体中のジスルフィド結合とは異なる位置に単一の重鎖間ジスルフィド結合を導入することが望ましい場合には、親抗体配列中の重鎖間システイン残基を置換又は欠失させ、新しいシステイン残基を改変によって抗体のヒンジ領域内の異なる位置に導入する。
【００１９】
好ましくは、単一の重鎖間ジスルフィド結合を有する改変された抗体を調製する工程は、
a)親抗体をコードする核酸配列を変異させる工程であって、前記変異が、1つ若しくは複数の重鎖間システイン残基の欠失、又は、前記システイン残基の、システイン以外のアミノ酸との置換をもたらす、前記工程と;
b)上記核酸を発現系中で発現させる工程と;
c)上記改変された抗体を単離する工程と
を含む。
【００２０】
核酸配列中へ変異を導入するための方法は、当技術分野で周知である。そのような方法は、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく変異誘発、部位特異的変異誘発、合成DNAオリゴマーによるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を用いた遺伝子合成、及び核酸合成とその後の重鎖の他の部分及び/又は軽鎖を規定通りに含む発現ベクターへの合成DNAの連結を含む(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning、A Laboratory Manual、第3版、Cold Spring Harbor Publish.、Cold Spring Harbor, New York (2001);及びAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、第4版、John Wiley and Sons、New York (1999)を参照のこと)。例えば、部位特異的変異誘発は、1つ又は複数の重鎖間システイン残基をシステイン以外のアミノ酸で置換するために使用されうる。手短に言えば、対象抗体のコード配列中にヌクレオチド変化を取り込むために、PCRプライマーオリゴヌクレオチドが設計されうる。例えば、セリン置換変異は、システインをコードするコドンTGT又はTGCを、セリンをコードするTCT、TCC、TCA、TCG、AGT又はAGCコドンに変更するようにプライマーを設計することによって構築されうる。
【００２１】
抗体をコードする核酸を発現させ、該抗体を宿主細胞系から単離するための詳細な方法も周知である(例えば、Coら、J. Immunol、152:2968〜76頁、1994年;Better及びHorwitz, Methods Enzymol., 178:476-96, 1989;Pluckthun及びSkerra、Methods Enzymol、178:497〜515頁、1989年;Lanioyi、Methods Enzymol、121:652〜63頁、1986年;Rousseauxら、Methods Enzymol.、121:663〜9頁、1986年;Bird及びWalker、Trends Biotechnol、9:132〜7頁、1991年を参照のこと)。好適な発現系は、抗体のコード配列を含む組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌(例えば、E.コリ(E. coli));抗体のコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母(例えば、サッカロミセス(Saccharomyces);ピキア(Pichia))などの微生物;抗体のコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系;抗体のコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)に感染した、若しくは抗体のコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター(例えば、Tiプラスミド)で形質転換された植物細胞系;又は哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター(例えば、メタロチオネインプロモーター)若しくは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター(例えば、アデノウイルス後期プロモーター;ワクシニアウイルス7.5Kプロモーター)を含む組換え発現構築物を有する哺乳動物細胞系(例えば、COS、CHO、BHK、HEK293、NSO、及び3T3細胞)を含む。
【００２２】
単一の重鎖間ジスルフィド結合を有する抗体は、合成タンパク質化学の知られた方法を用いる化学合成によって調製されうることも考慮される。例えば、適切なアミノ酸配列又はその部分は、固相技術(例えば、Solid-Phase Peptide Synthesis、WH Freeman Co, San Francisco Calif.中のStewartら、1969年;Merrifield、1963年、J. Am Chem. Soc.、85, 2149;Matteucciら、J. Am. Chem. Soc. 103:3185〜3191頁、1981年)を用いる直接ペプチド合成、又は例えばApplied Biosystems社(California, USA)製のSynthesiserを用いる自動合成などの、当技術分野で周知のペプチド合成法を用いて調製されうる。抗体の様々な部分も別々に合成可能であり、例えば、抗体フラグメントは完全な抗体のタンパク質消化を介して得られるか(Morimotoら、(1992)Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107〜117頁;及びBrennanら、(1985) Science, 229:81頁)、組換え宿主細胞から直接産生されるか、又は抗体ファージライブラリーから単離されて、化学的結合法を用いて結合されて所望の抗体分子を生成することができる。
【００２３】
好ましくは、上記単一の重鎖間ジスルフィド結合は、EUインデックス・ナンバリング・システムによる抗体の226位又は229位にある(Kabatナンバリング・システムを用いた239位又は242位)。
【００２４】
好ましくは、抗体は、EUインデックス・ナンバリング・システムによる226位又は229位にシステイン以外のアミノ酸を有する。例えば226位又は229位におけるネイティブのシステイン残基は、システイン以外のアミノ酸に置換されてよい。226位又は229位におけるネイティブのシステイン残基を置換するアミノ酸は、チオール部分を含んではならず、セリン、スレオニン、バリン、アラニン、グリシン、ロイシン又はイソロイシン、他の極性アミノ酸、他の天然アミノ酸、又は非天然アミノ酸であってよい。好ましくは、226位又は229位におけるシステイン残基はセリンで置換される。
【００２５】
一実施態様において、抗体は、226位にシステイン及び229位にシステイン以外のアミノ酸、例えば、セリンを有する。別の実施態様において、抗体は、226位にシステイン以外のアミノ酸、例えば、セリン及び229位にシステインを有する。
【００２６】
例えば、抗体は、IgG1分子であり、EUインデックス・ナンバリング・システムによる226位〜229位にCys-Pro-Pro-Ser又はSer-Pro-Pro-Cysの配列を含むことができ;すなわち、226及び229の間の配列は野生型である。或いは、抗体は、IgG4分子であり、EUインデックス・ナンバリング・システムによる226位〜229位にCys-Pro-Ser-Ser又はSer-Pro-Ser-Cysの配列を含むことができ;すなわち、226及び229の間の配列は野生型である。
【００２７】
或いは、残基226及び229の間の配列は、野生型からの変異を含有しうる。例えば、IgG4においては、Cys-Pro-Pro-Ser及びSer-Pro-Pro-Cysであることができる。より一般的には、IgG1又はIgG4中の配列は、Cys-(Xaa)-(Xaa)-Ser又はSer-(Xaa)-(Xaa)-Cysであることができ、各Xaaは独立してチオール部分を欠く任意のアミノ酸である。例えば、各Xaaは独立して、セリン、スレオニン、バリン、アラニン、グリシン、ロイシン又はイソロイシン、他の極性アミノ酸、他の天然アミノ酸、又は非天然アミノ酸から選ばれるアミノ酸であることができる。例えば、各Xaaは、セリン、スレオニン及びバリンから選ばれてよく、例えば、セリンであることができる。
【００２８】
更なる選択肢においては、残基226及び229の間に2つ超のアミノ酸残基が存在しうる。例えば、配列は、Cys-(Xaa)n-Ser又はSer-(Xaa)n-Cysであり、nは、3、4又は5であり、各Xaaは独立して、チオール部分を欠く任意のアミノ酸であることができる。具体的には、Cys-Pro-(Xaa)m-Pro-Ser、Ser-Pro-(Xaa)m-Pro-Cys、Cys-Pro-Pro-(Xaa)m-Ser、Ser-Pro-Pro-(Xaa)m-Cys、Cys-(Xaa)m-Pro-Pro-Ser及びSer-(Xaa)m-Pro-Pro-Cysであり、mは1、2又は3であり、各Xaaは独立して、チオール部分を欠く任意のアミノ酸であることができる。例えば、各Xaaは独立して、セリン、スレオニン、バリン、アラニン、グリシン、ロイシン又はイソロイシン、他の極性アミノ酸、他の天然アミノ酸、又は非天然アミノ酸から選ばれるアミノ酸であることができる。例えば、各Xaaは、セリン、スレオニン及びバリンから選ばれてよく、例えば、セリンであることができる。
【００２９】
本明細書全体を通して、用語「抗体」は、イムノグロブリン分子の可変領域内の少なくとも1つの抗原認識部位によってタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭化水素、ポリヌクレオチド、脂質又はそれらの組合せなどの標的抗原を認識し、特異的に結合するイムノグロブリン分子を意味すると理解されなければならない。用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、及び抗体が所望の生理活性を示す限り、抗原認識部位を含む任意の他の改変されたイムノグロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれるそれらの重鎖定常領域のアイデンティティーに基づいて、イムノグロブリンの5つの主要クラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM,又はそのサブクラス(アイソタイプ)(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)のいずれかであることができる。イムノグロブリンの異なるクラスは、異なる周知のサブユニット構造及び三次元構成を有する。IgG1又はIgG4の使用が特に好ましい。
【００３０】
本明細書及び請求の範囲全体を通して、文脈上他に要求されない限り、用語「抗体」は、完全長抗体及び完全長抗体の抗原結合領域及び単一の重鎖間ジスルフィド結合を含む抗体フラグメントを包含する。抗体フラグメントは、例えば、F(ab')2、又は抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体、例えば、scFv-Fc、scFv-Fc-scFv、(Fab'ScFv)2、sc二重特異性抗体-Fc、sc二重特異性抗体-CH3、scFv-CH3、scFv-CH2-CH3融合タンパク質などのようなscFvフラグメント若しくは二重特異性抗体及びFcフラグメント若しくはCHドメインの異なる順列から成るミニボディであることができる。抗体フラグメントは、酵素的切断、合成又は上記の組換え技術によって生成されてよい。
【００３１】
好ましくは、抗体コンジュゲートは、診断及び治療目的のための臨床医薬品において使用される。例えば、コンジュゲート試薬は、診断薬若しくは治療薬又は診断薬若しくは治療薬を結合することのできる結合剤を含みうる。そのようなコンジュゲートは、例えば癌の治療のための治療法において、又はインビトロ若しくはインビボの診断適用のために使用される。抗体コンジュゲートは、非臨床適用においても使用されうる。例えば、コンジュゲート試薬は、特定の抗原の存在を検出するためのイムノアッセイにおける使用又は蛍光活性化セルソーター(FACS)分析のような用途のために、標識剤又は標識剤を結合することのできる結合剤を含むことができる。
【００３２】
当技術分野で知られている多種多様な診断薬、治療薬及び標識剤が、抗体分子にコンジュゲートされた。例えば、コンジュゲート剤は、診断薬、細胞毒性薬などの薬物分子、毒素、放射性核種、蛍光剤(例えば、5-ジメチルアミノナフタレン-1-(N-(2-アミノメチ))スルホンアミド-ダンシルエチレンジアミン、Oregon Green(登録商標)488カダベリン(カタログ番号O-10465、Molecular Probes社)、ダンシルカダベリン、N-(2-アミノエチル)-4-アミノ-3,6-ジスルホ-1,8-ナフタルイミド、二カリウム塩(ルシファーイエローエチレンジアミン)、若しくはローダミンBエチレンジアミン(カタログ番号L-2424、Molecular Probes社)などのアミノ誘導体化蛍光プローブ、若しくはBODIPY(登録商標)FL L-シスチン(カタログ番号B-20340、Molecular Probes社)などのチオール誘導体化蛍光プローブ);又は結合剤、例えば、キレート剤を含むことができ、これは、上記のもののうちの1つなどの任意の他の所望の部分を結合する(例えばキレート)ために使用されうる。
【００３３】
コンジュゲート試薬は、(本明細書中で便宜上、「ポリマー」とあわせて呼ばれる)オリゴマー又はポリマーも含む。水溶性の合成ポリマー、特にポリアルキレングリコールが、抗体を含むタンパク質のような治療的活性を有する分子をコンジュゲートするために広く使用される。これらの治療用コンジュゲートは、循環時間を延長し、クリアランス速度を低下させ、全身毒性を減少させ、そしていくつかの場合には、増大した臨床有効性を示すことによって薬物動態を好ましく変化させることが示された。ポリエチレングリコール、PEGを共有結合によってタンパク質にコンジュゲートする過程は、一般に「ペグ化」として知られる。
【００３４】
ポリマーは、例えば、ポリアルキレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリロイルモルホリンなどのポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキサゾリン、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド又はポリカルボキシメタクリルアミドなどのポリメタクリルアミド、又はHPMAコポリマーであることができる。さらに、ポリマーは、酵素分解又は加水分解を受けやすいポリマーであることができる。そのようなポリマー類は、例えば、ポリエステル類、ポリアセタール類、ポリ(オルトエステル類)、ポリカーボネート類、ポリ(イミノカーボネート類)、及びポリ(アミノ酸類)のようなポリアミド類を含む。ポリマーは、ホモポリマー、ランダムコポリマー又はブロックコポリマーのような構造的に定義されたコポリマーであることができ、例えば、それは、2種以上のアルキレンオキシドから、又はポリ(アルキレンオキシド)とポリエステル、ポリアセタール、ポリ(オルトエステル)、若しくはポリ(アミノ酸)のいずれかから生じるブロックコポリマーであることができる。使用されることのできる多機能性ポリマー類は、ジビニルエーテル-無水マレイン酸及びスチレン-無水マレイン酸のコポリマー類を含む。
【００３５】
キチン、デキストラン、デキストリン、キトサン、デンプン、セルロース、グリコーゲン、ポリ(シアル酸)、ヒアルロン酸及びその誘導体のような多糖類などの天然のポリマー類も使用可能である。タンパク質はポリマーとして使用可能である。これは、抗体若しくは抗体フラグメントへの、第2のタンパク質、例えば、酵素若しくは他の活性タンパク質、又は足場タンパク質、例えば、ビオチン化分子に結合可能なアビジンのコンジュゲーションを可能とする。また、グリコシルトランスフェラーゼのためのO-グリカンアクセプター部位などの触媒配列を含むペプチドが使用される場合、それは、その後の酵素反応のための基質又は標的の取り込みを可能とする。ポリグルタミン酸のようなポリマー類も使用可能であり、糖類又はアミノ酸のような天然のモノマー類及びエチレンオキシド又はメタクリル酸のような合成モノマー類から生じるハイブリッドポリマー類も同様である。
【００３６】
ポリマーが、ポリアルキレングリコールである場合、これは、C2及び/又はC3単位を含有するもの、特にポリエチレングリコールであることが好ましい。ポリマー、特にポリアルキレングリコールは、単一の直鎖を含有することができ、又は小さな又は大きな多くの鎖から成る分岐した形態を有することができる。いわゆるプルロニック類(Pluronics)は、PEGブロックコポリマーの重要なクラスである。これらは、エチレンオキシド及びプロピレンオキシドブロックから生じる。置換された、又はキャッピングされたポリアルキレングリコール、例えば、メトキシポリエチレングリコールが使用可能である。
【００３７】
ポリマーは、例えば、参照することによりその内容が本明細書中に組み込まれるWO2004/113394に記載の方法によって製造されるくし形ポリマーであることができる。例えば、該ポリマーは、一般式:
A-(D) d-(E) e-(F) f
[式中、
Aは、存在しても存在しなくてもよく、タンパク質又はポリペプチドに結合することのできる部分であり;
Dは、存在する場合、Eにおいて定義されるものでない、1つ又は複数のオレフィン性不飽和モノマーの追加の重合化によって得ることができ;
Eは、直鎖、分岐鎖又は星形の置換された又は非置換の複数のモノマーの追加の重合化によって得ることができ、オレフィン性不飽和部分を有し;
Fは、存在する場合、Eにおいて定義されるものでない、1つ又は複数のオレフィン性不飽和モノマーの追加の重合化によって得ることができ;
d及びfは、0から500までの間の整数であり;
eは、0から1000までの整数であり;
Aが存在する場合、D、E及びFのうちの少なくとも1つが存在する]
を有するくし形ポリマーであることができる。
【００３８】
ポリマーは、場合により任意の所望の方法で誘導体化又は官能化されてよい。好ましい一実施態様において、ポリマーは、診断薬、治療薬若しくは標識剤、例えば、上記のものの1つ、又は診断薬、治療薬又は標識剤を結合することのできる結合剤を担持する。反応性基が、ペンダントリンカーによってポリマー末端若しくは末端基に、又はポリマー鎖に沿って連結可能であり;そのような場合、ポリマーは、例えば、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、又は無水マレイン酸コポリマーである。1つ超の生物学的分子を含有する多量体コンジュゲートは、相乗的及び相加的利益をもたらすことができる。所望により、ポリマーは、慣用方法を用いて固体支持体にカップリングされてよい。
【００３９】
当然、ポリマーの最適な分子量は意図された用途に依存する。長鎖ポリマー類が使用可能であり、例えば、数平均分子量は、500g/モルから約75,000g/モルまでの範囲にあることができる。しかしながら、例えば、わずか2反復単位の、例えば、2から20までの反復単位の非常に小さいオリゴマーがいくつかの用途に有用である。例えば、悪性腫瘍、感染症又は自己免疫疾患によって、或いは外傷によって引き起こされた炎症の治療における用途のために、抗体コンジュゲートは循環を出て、組織に浸透することを意図される場合、30,000g/モル以下の範囲内の低分子量ポリマーを使用することが有利でありうる。抗体コンジュゲートが循環中に留まることを意図される用途のためには、例えば、20,000〜75,000g/モルの範囲内の高分子量ポリマーを使用することが有利でありうる。
【００４０】
使用されるポリマーは、コンジュゲートがその意図された用途のための溶媒に可溶性であるように選ばれなくてはならない。生物学的用途、特に、哺乳動物への臨床における治療的投与のための診断適用及び治療適用のためには、コンジュゲートは水性媒体に可溶性である。
【００４１】
好ましくは、ポリマーは合成ポリマーであり、水溶性ポリマーであることが好ましい。水溶性ポリエチレングリコールの使用は、多くの用途のために特に好ましい。
【００４２】
ジスルフィド結合の還元により生成された両チオール基を介して抗体と反応することのできる任意の好適なコンジュゲート試薬が使用可能である。
【００４３】
試薬の1つの群は、Smithら、J. Am. Chem. Soc.、2010年、132, 1960〜1965頁及びSchumakerら、Bioconj. Chem.、2011年、22, 132〜136頁に記載のビス-ハロ-又はビス-チオ-マレイミド類及びその誘導体である。これらの試薬は、官能基:
【００４４】
【化１】
2015521615.tif 000002
【００４５】
[式中、各Lは、脱離基、例えば、以下に示すものの1つである]
を含有する。好ましい脱離基は、ハロゲン原子、例えば、塩素、臭素又はヨウ素原子、-S.CH2CH2OH基及び-S-フェニル基を含む。マレイミド環の窒素原子は、診断薬、治療薬若しくは標識剤、又は診断薬、治療薬若しくは標識剤のための結合剤、例えば、以下に示す式D-Q-のうちの1つを担持することができる。
【００４６】
本発明の好ましい実施態様において、上記試薬は、官能基:
【００４７】
【化２】
2015521615.tif 000003
【００４８】
[式中、Wは、電子吸引基、例えば、ケト基、エステル基-O-CO-、スルホン基-SO2-、又はシアノ基を表し;Aは、C1-5アルキレン又はアルケニレン鎖を表し;Bは、結合又はC1-4アルキレン若しくはアルケニレン鎖を表し;各Lは、独立して脱離基を表す]
を含有する。このタイプの試薬は、Bioconj. Chem 1990(1)、36〜50頁、Bioconj. Chem 1990(1)、51〜59頁及びJ. Am. Chem. Soc. 110、5211〜5212頁に記載されている。W、A、B及びLについての好ましい意味が以下に与えられる。
【００４９】
そのような試薬は、診断薬、治療薬若しくは標識剤、又は診断薬、治療薬若しくは標識剤のための結合剤を担持することができる。この場合、試薬は、式(Ia)、又はWがシアノ基を表す場合には式(Ib):
【００５０】
【化３】
2015521615.tif 000004
【００５１】
[式中、Qは、連結基を表し、Dは、診断薬、治療薬若しくは標識剤、又は診断薬、治療薬若しくは標識剤のための結合剤を表す]
を有することができる。式II、III及びIVのための好ましいQ基を、以下に示す。
【００５２】
このタイプの特別に好ましい官能基は、式:
【００５３】
【化４】
2015521615.tif 000005
【００５４】
を有する。
【００５５】
例えば、該基は、式:
【００５６】
【化５】
2015521615.tif 000006
【００５７】
を有することができる。
【００５８】
そのような試薬が、診断薬、治療薬若しくは標識剤、又は診断薬、治療薬若しくは標識剤のための結合剤を担持することができる場合、それは、式:
【００５９】
【化６】
2015521615.tif 000007
【００６０】
[式中、Q及びDは、上記の意味を有する]
を有する。式II、III及びIVのための好ましいQ基を、以下に示す。
【００６１】
このタイプの特別に好ましい試薬は、式:
【００６２】
【化７】
2015521615.tif 000008
【００６３】
[式中、Arは、場合により置換されたフェニル基、例えば、式II、III及びIVの化合物のために以下に列挙されたもののうちの1つを表す]
を有する。例えば、該試薬又は該試薬の前駆体は、式:
【００６４】
【化８】
2015521615.tif 000009
【００６５】
を有することができる。
【００６６】
上記の試薬は、診断薬、治療薬若しくは標識剤、又は診断薬、治療薬若しくは標識剤のための結合剤を担持するために官能化されうる。例えば、式(Ig)中に示されるNH2基又は上記式(Ih)中のカルボン酸基は、診断薬、治療薬若しくは標識剤、又は診断薬、治療薬若しくは標識剤のための結合剤を付加して、その中のNH2基又はカルボン酸基がD-Q-基により置換されるか;又は上記式(If)、(Ig)又は(Ih)中のフェニル基が好適な反応性基を担持しうる式(Ig)又は(Ih)の化合物を与えるために、任意の好適な基と反応するために使用されうる。
【００６７】
コンジュゲート試薬がポリマーを含む場合、該試薬は、参照することによりその内容が本明細書中に組み込まれるWO99/45964、WO2005/007197又はWO2010/100430に記載された試薬のうちの1つであることができる。好ましくは、ポリマー含有試薬は、上記の官能基Iを含有し、以下の式II、III又はIV:
【００６８】
【化９】
2015521615.tif 000010
【００６９】
[式中、
X及びX'のうちの一方は、ポリマーを、他方は、水素原子を表し;
Qは、連結基を表し;
Wは、電子吸引基、例えば、ケト基、エステル基-O-CO-若しくはスルホン基-SO2-を表すか;又はX'がポリマーを表す場合、X-Q-Wは一緒になって電子吸引基を表すことができ;
Aは、C1-5アルキレン又はアルケニレン鎖を表し;
Bは、結合又はC1-4アルキレン若しくはアルケニレン鎖を表し;
各Lは、独立して脱離基を表す];
【００７０】
【化１０】
2015521615.tif 000011
【００７１】
[式中、X、X'、Q、W、A及びLは、一般式IIについて与えられた意味を有し、さらに、Xがポリマーを表す場合、X'及び電子吸引基Wは、その間にある原子と一緒になって環を形成することができ、mは、1から4までの整数を表す];又は、
【００７２】
X-Q-W-CR1R1'-CR2.L.L'      (IV)
【００７３】
[式中、
X、Q及びWは、一般式IIについて与えられた意味を有し、かつ
R1は、水素原子若しくはC1-4アルキル基のいずれかを表し、R1'は、水素原子を表し、L及びL'は、それぞれ独立して脱離基をあらわすか;又は
R1は、水素原子若しくはC1-4アルキル基を表し、Lは、脱離基を表し、R1'及びL'は、一緒になって結合を表すか;又は
R1及びLは、一緒になって結合を表し、R1'及びL'は、一緒になって結合を表し;かつ
R2は、水素原子若しくはC1-4アルキル基を表す]
を有する。
【００７４】
連結基Qは、例えば、直接的な結合、アルキレン基(好ましくは、C1-10アルキレン基)又は場合により置換されたアリール若しくはヘテロアリール基であってよく、そのいずれも、1つ又は複数の酸素原子、硫黄原子、-NR基(式中、Rは水素原子又はアルキル(好ましくは、C1-6アルキル)、アリール(好ましくは、フェニル)、又はアルキル-アリール(好ましくは、C1-6アルキル-フェニル)基を表す)、ケト基、-O-CO-基、-CO-O-基、-O-CO-O、-O-CO-NR-、-NR-CO-O-、-CO-NR-及び/又は-NR.CO-基を末端基とするか又はそれらによって中断されてよい。そのようなアリール及びヘテロアリール基Qは、本発明の好ましい一実施態様を形成する。好適なアリール基は、フェニル及びナフチル基を含む一方、好適なヘテロアリール基は、ピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン及びプリンを含む。
【００７５】
特に好適な連結基Qは、ポリマーXに隣接して-NR.CO-基を末端基をするヘテロアリール又は、特にアリール基、特にフェニル基である。ポリマーへの連結は、加水分解を受けやすい結合、又は受けにくい結合によることができる。Wは、例えば、ケト基CO、エステル基-O-CO-又はスルホン基-SO2-を表しうるか;又はX-Q-W-が一緒になって電子吸引基を表す場合、この基は例えば、シアノ基であることができる。好ましくは、Xは、ポリマーを表し、X'-Q-は、水素原子を表す。
【００７６】
場合により置換されたアリール又はヘテロアリール基上に存在しうる置換基は、例えば、アルキル(好ましくは、場合によりOH又はCO2Hにより置換されたC1-4アルキル、特にメチル)、-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、NHCO2R、-NR.CO2R、-NO、-NHOH、-NR.OH、-C=N-NHCOR、-C=N-NR.COR、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R、ハロゲン、例えば、フッ素若しくは塩素、-C≡CR、-C=CR2、及び-C=CHRから選ばれる、1つ又は複数の同じ又は異なる置換基を含み、各Rは、独立して、水素原子又はアルキル(好ましくは、C1-6アルキル)、アリール(好ましくは、フェニル)、又はアルキル-アリール(好ましくはC1-6アルキル-フェニル)基を表す。電子吸引性置換基の存在が特に好ましい。好ましい置換基は、例えば、CN、NO2、-OR、-OCOR、-SR、-NHCOR、-NR.COR、-NHOH及び-NR.CORを含む。
【００７７】
脱離基Lは、例えば、-SR、-SO2R、-OSO2R、-N+R3、-N+HR2、-N+H2R、ハロゲン又は-Oφを表すことができ、Rは上で与えられた意味を有し、φは、少なくとも1つの電子吸引性置換基、例えば、-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR'CO2R、-NO、-NHOH、-NR'OH、-C=N-NHCOR、-C=N-NR'COR、-N+R3、-N+HR2、-N+H2R、ハロゲン、特に塩素又は特にフッ素、-C≡CR、-C=CR2及び-C=CHRを含有する、置換されたアリール、特にフェニル基を表し、各Rは、独立して、上で与えられた意味のうちの1つを有する。
【００７８】
特に好ましいポリマーコンジュゲート試薬は、式:
【００７９】
【化１１】
2015521615.tif 000012
【００８０】
[式中、PEGは、場合により、診断薬、治療薬若しくは標識剤、例えば、上記のもののうちの1つ、又は診断薬、治療薬若しくは標識剤を結合することのできる結合剤を有することができる]
を有する。
【００８１】
上記試薬のうちの1つを用いるコンジュゲーション方法の即時生成物は、電子吸引基Wを含有するコンジュゲートである。しかしながら、本発明の方法は、好適な条件下で可逆的である。これは、例えば、抗体の即時放出が必要ないくつかの用途のためには望ましい可能性があるが、他の用途については、抗体の即時放出は望ましくない可能性がある。したがって、電子吸引部分Wの還元によってタンパク質の放出を防止する部分を与えることによってコンジュゲートを安定化することは望ましいかも知れない。よって、上記方法は、コンジュゲート中の電子吸引基Wを還元するさらなる任意の工程を含むことができる。還元剤としてのホウ化水素、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素カリウム、又はトリアセトキシホウ化水素の使用が特に好ましい。使用されうる他の還元剤は、例えば、塩化スズ(II)、アルミニウムアルコキシド及び水素化リチウムアルミニウムのようなアルコキシドを含む。
【００８２】
したがって、例えば、ケト基を含有するW部分は、CH(OH)基を含有する部分まで還元可能であり;エーテル基CH.ORはヒドロキシ基とエーテル化剤との反応によって得ることが可能であり;エステル基CH.O.C(O)Rは、ヒドロキシ基とアシル化剤との反応によって得ることが可能であり、アミン基CH.NH2、CH.NHR若しくはCH.NR2は、還元的アミノ化によってケトンから調製可能であり;又はアミドCH.NHC(O)R若しくはCH.N(C(O)R)2は、アミンのアシル化によって形成されうる。スルホンは、スルホキシド、スルフィド又はチオールエーテルまで還元可能である。シアノ基は、アミン基まで還元可能である。
【００８３】
上記コンジュゲート試薬を使用することの重要な特徴は、α-メチレン脱離基及び二重結合が、マイケル活性化部分(Michael activation moiety)として働く電子吸引性官能基と交差コンジュゲートすることである。脱離基が直接置換ではなく交差機能性試薬中での脱離を受けやすく、電子吸引基がマイケル反応のための好適な活性化部分である場合、継続的なマイケル及び逆マイケル反応によって、連続的な分子内ビスアルキル化(bis-alkylation)が起こることができる。脱離部分は、最初のアルキル化が起こるまで露出されない隠れた共役二重結合を遮蔽するために働き、連続した相互作用性のマイケル及び逆マイケル反応の結果としてビスアルキル化が起こる。電子吸引基及び脱離基は、場合により、連続したマイケル反応及び逆マイケル反応によってビスアルキル化が起こることができるように、最適に選択される。二重結合に共役した又は脱離基及び電子吸引基の間の追加の複数の結合を有する交差機能性アルキル化剤を調製することも可能である。
【００８４】
一般に、抗体とコンジュゲート試薬の反応は、抗体中のヒンジジスルフィド結合を還元すること及び続いて還元産物とコンジュゲート試薬とを反応させることを含む。好適な反応条件は、上記の参考文献中に与えられる。該過程は、例えば、すべての反応物質が可溶性である溶媒又は溶媒混合物中で実施可能である。抗体は、水性反応媒体中でコンジュゲート試薬と直接反応することが可能でありうる。この反応媒体は、求核試薬のpH要求性に依存して緩衝化されることもできる。反応のための最適pHは、一般に、少なくとも4.5、典型的には約5.0から約8.5までの間、好ましくは約5.0から7.5までである。最適の反応条件は、もちろん、使用される特定の反応物質に依存する。
【００８５】
3〜37℃の間の反応温度が一般に好適である。(THF、酢酸エチル、アセトンなどの)有機媒体中で行われる反応は、典型的に周囲温度以下の温度で行われる。
【００８６】
化学量論的当量又は過剰量の試薬を用いて、抗体は所望の試薬と効果的にコンジュゲート可能である。試薬は、例えば、抗体の鎖間ジスルフィド結合の数に対する試薬の化学量論比で使用されうる。例えば、試薬は、抗体の鎖間ジスルフィド結合あたり、0.25から4等量まで、例えば、0.5から2等量までの間、又は0.5から1.5等量までの間の量で使用されうる。試薬は、例えば、抗体の鎖間ジスルフィド結合あたり約1等量の量で使用されうる。過剰の試薬と生成物は、日常的な精製の間に、例えば、イオン交換クロマトグラフィー若しくはサイズ排除クロマトグラフィーなどの標準的なクロマトグラフィー法、透析によって、又はポリヒスチジンタグが存在する場合には、ニッケル若しくは亜鉛などに基づく金属アフィニティークロマトグラフィーを用いる分離によって容易に分離されうる。
【００８７】
上記の式II、III及びIVのコンジュゲート試薬がポリマーを含有する一方、当業者は、上記の議論が、官能基Iを含有する試薬を用いる本発明の方法に従う、抗体への任意の診断薬、治療薬又は標識剤のコンジュゲーションに同様に適用可能であることを認識するだろう。
【００８８】
本発明の方法は、抗体が1つ、2つ又は3つのコンジュゲート試薬と効果的にコンジュゲートされること、すなわち、抗体のヒンジ領域中の単一の重鎖間ジスルフィド結合にわたって、かつ抗体軽鎖のCLドメインと重鎖のCH1ドメイン間に位置する鎖間ジスルフィド結合にわたってコンジュゲートされることを可能とする。本発明による好ましいコンジュゲートは、抗体あたり3個のコンジュゲートされた分子を含む。特に好ましいコンジュゲートは、抗体あたり3個のコンジュゲートされた薬物又は診断用分子を含む。薬物/診断薬は、薬物/診断薬をすでに担持しているコンジュゲート試薬を使用することによって、抗体に直接コンジュゲートされうるか、又は薬物/診断薬は、例えば、薬物/診断薬のための結合基を含有するコンジュゲート試薬の使用により、抗体とコンジュゲート試薬のコンジュゲーション後に付加されうる。
【００８９】
本発明の方法は、こうして改善された均一性を有する抗体コンジュゲートが生成されることを可能とする。特に、抗体の鎖間ジスルフィド結合にわたって結合するコンジュゲート試薬の使用は、改善された負荷化学量論を有し、抗体のネイティブの鎖間ジスルフィド結合を破壊することなく特定の付加部位がその中に存在する抗体コンジュゲートを提供する。コンジュゲート試薬によるネイティブのジスルフィド結合の架橋は、こうして抗体コンジュゲートの安定性を改善し、抗体の結合及び機能を保持する。例えば、226位又は229位のいずれかにおける単一の重鎖間ジスルフィド結合を有する抗体の使用は、ジスルフィド結合のスクランブリングも低減する。ジスルフィドのスクランブリング、すなわち、システイン対のジスルフィド結合への間違った組み立ては、抗体の抗原結合能力に影響を及ぼし、活性低下をもたらすことが知られている。本発明の使用によるスクランブリングの最小化は、コンジュゲートされた抗体の均一性を改善する。
【００９０】
改善された均一性を有する抗体-薬物コンジュゲートは、治療における利益、例えば、より高い治療インデックスを提供し、薬物の有効性を改善し、毒性を低減する。均一な抗体コンジュゲートは、診断及び画像化適用においてより正確かつ一貫性のある測定も提供する。
【００９１】
本発明の方法は、抗体の四次構造を破壊することなく、抗体コンジュゲートがより低レベルの薬物負荷、すなわち、より低い薬物対抗体比(DAR)により生産されることも可能とする。抗体-薬物コンジュゲートのインビトロでの効力は、薬物負荷に直接依存することが示されているが(Hamblett KJら、Clin Cancer Res.、2004年10月15日; 10(20):7063〜70頁)、1分子あたり4個の薬物の抗体-薬物コンジュゲート(DAR4)のインビボでの抗腫瘍活性は、コンジュゲートがmAbあたり半分量の薬物を含有するとしても、等しいmAb用量における1分子あたり8個の薬物のコンジュゲート(DAR8)に匹敵する。薬物負荷は、血漿クリアランスにも影響し、DAR8コンジュゲートは、DAR4コンジュゲートの3倍速く排出され、DAR2コンジュゲートの5倍速い。抗体-薬物コンジュゲートの治療能力を最大化するためには、高い治療インデックスが必要とされ、したがって、有効性の低下を伴わない治療インデックスの増大が、改善された治療法に導くはずである(Hamblett KJら、2004)。
【００９２】
本発明の方法により調製された抗体コンジュゲートは新規であり、したがって、本発明は、これらのコンジュゲート自体、並びに本発明の方法により調製された抗体コンジュゲートを提供する。本発明はさらに、そのような抗体コンジュゲートを医薬として許容されるキャリアーとともに、場合により追加の治療薬とともに含む医薬組成物;特に、コンジュゲート剤が、癌の治療用の医薬品として細胞毒性薬を含む場合、医薬品としての使用のためのそのようなコンジュゲート;及び医薬としての有効量のそのようなコンジュゲート又は医薬組成物を患者に投与する工程を含む、患者の治療方法を提供する。
【００９３】
ここで、本発明を、例として図面を参照して説明する:
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ポリマーコンジュゲート試薬及びi)親抗体(「親mAb」)、ii)単一のヒンジジスルフィド結合を229位に有する改変された抗体(「IgGC226S」)及びiii)単一のヒンジジスルフィド結合を226位に有する改変された抗体(「IgGC229S」)を用いて、40℃において実施されたコンジュゲーション反応に関する、薬物-抗体比(DAR)分布のグラフである。
【図２】ポリマーコンジュゲート試薬及びi)親抗体(「親mAb」)、ii)単一のヒンジジスルフィド結合を229位に有する改変された抗体(「IgGC226S」)及びiii)単一のヒンジジスルフィド結合を226位に有する改変された抗体(「IgGC229S」)を用いて、22℃において実施されたコンジュゲーション反応に関する、薬物-抗体比(DAR)分布のグラフである。
【図３】ポリマーコンジュゲート試薬によるコンジュゲーション前及び後の親抗体及び変異型抗体IgGC226SのSDS-PAGE分析を示す図である。
【実施例１】
【００９５】
変異型抗体-薬物コンジュゲートの調製
本発明の方法が、抗体コンジュゲートを高レベルの均一性かつ低い平均DARで生成するのを可能とすることを実証するために、それぞれが単一の重鎖間ジスルフィド結合を有する、2つの改変された変異型抗体を、親抗体配列のPCRに基づく部位特異的変異誘発によって作製した。次いで、これらの変異型抗体及び親抗体を、ジスルフィド結合由来の2つのシステイン残基の間に架橋を形成するコンジュゲート試薬(ビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAE)と反応させた。
【００９６】
末端ビス-スルホン官能基を有する、24反復単位のPEGを持つバリン-シトロリン-パラアミノベンジル-モノメチルオーリスタチンE(val-cit-PAB-MMAE)試薬1の合成
【００９７】
【化１２】
2015521615.tif 000013
【００９８】
工程1:4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]ベンゾイックアシッド-N-ヒドロキシスクシニミジルエステル(ビス-スルホン)のH2N-dPEG(24)-CO-OtBuへのコンジュゲーション
【００９９】
【化１３】
2015521615.tif 000014
【０１００】
H2N-dPEG(24)-CO-OtBu(1.057g、Iris Biotech社)のトルエン溶液(3ml)を乾燥するまで蒸発させ、残渣をジクロロメタン(25ml)に再溶解した。撹拌下、4-[2,2-ビス[(p-トリルスルホニル)-メチル]アセチル]ベンゾイックアシッド-N-ヒドロキシスクシニミジルエステル(1.0g;Nature Protocols、2006年、1(54)、2241〜2252頁)を添加し、得られた溶液を、アルゴン雰囲気下、室温で72時間、さらに撹拌した。揮発性物質を真空中で除去し、固体残渣を温アセトン(30mL)に溶解し、非吸着性の脱脂綿を通してろ過した。濾液を-80℃まで冷却して固体を沈殿させ、これを-9℃において30分間、4000rpmの遠心分離により単離した。上清を除去し、沈殿/単離過程をさらに2回繰り返した。最後に、上清を除去し、得られた固体を真空中で乾燥させてビス-スルホンを無色の非晶質固体として得た(976mg、68%)。
【０１０１】
【数１】
2015521615.tif 000015
【０１０２】
工程2.tert-ブチル保護基の除去:
【０１０３】
【化１４】
2015521615.tif 000016
【０１０４】
撹拌した工程1の生成物(976mg)のジクロロメタン(4mL)溶液に、トリフルオロ酢酸(4mL)を添加し、得られた溶液をさらに2時間撹拌した。次いで、揮発性物質を真空中で除去し、残渣を温アセトン(30mL)に溶解した。工程1に記載の通りに、沈殿によってアセトンから生成物を単離して、白色粉末(816mg、85%)として生成物2を与えた。
【０１０５】
【数２】
2015521615.tif 000017
【０１０６】
工程3:酸を末端基とするペグ化ビス-スルホン2へのH2N-val-cit-PAB-MMAEのコンジュゲーション
【０１０７】
N-メチルモルホリン(7.5mg)を、撹拌したジクロロメタン-ジメチルホルムアミド(85:15v/v、6mL)中のビス-スルホン-PEG-COOH(45mg)及びHATU(13mg)の溶液に添加した。室温で30分間撹拌後、H2N-val-cit-PAB-MMAE(38mg、Concortis、WO2005/081711の通りに調製した)を添加し、混合物を室温でさらに24時間撹拌した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、1M  HCl、10%w/vのNaHCO3水溶液、塩水で洗浄し、次いで、MgSO4で乾燥させた。ジクロロメタン-メタノール(90:10v/v)で溶出するカラムクロマトグラフィーによって粗材料をさらに精製し、真空下で溶媒を除去し、ビス-スルホン-PEG(24)-MMAE生成物1を、無色透明の固体(31mg、41%)として単離した。m/zM+Na  2758.5;
【０１０８】
【数３】
2015521615.tif 000018
【０１０９】
の特徴的シグナル:
【０１１０】
親抗体及び変異型抗体(IgGC226S及びIgGC229S)の調製
ヒトIgG1(κ)フレームワークに基づいて作製した変異型ヒト化抗Her2レセプターモノクローナル抗体(トラスツズマブ)をコードする親抗体DNA配列の構築は、先にCarter P.ら、Proc. Natl Acad. Sci. USA、89、4285〜4289頁、(1992)に記載されており、ここで、抗体は、humAb4D5-8と呼ばれる。本実験の目的のために、重鎖アミノ酸配列の359位及び361位のアミノ酸を、それぞれ、Asp及びLeuで置換した(E359D及びM361L)。本実験において使用する親抗体の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列も、それぞれ、本明細書中の配列番号1及び2に示す。親抗体のヒンジ領域中のシステインのうちの2つ(ヒンジ領域配列:PKSCDKTHTCPPCP)は、抗体の2つの重鎖間の鎖間ジスルフィド結合を形成する。これらのシステイン残基は、EUインデックス・ナンバリング・システムによるIgG1の226位及び229位に相当し、配列番号2の残基229及び232に相当する。
【０１１１】
2つの改変された変異型抗体(IgGC226S及びIgGC229S)を、親抗体重鎖配列のPCRに基づく部位特異的変異誘発により作製して、ヒンジ領域中の重鎖間システイン残基の1つをアミノ酸Serで置換した。ヒンジ領域配列中に改変を生じさせるために、使用したPCR方法は、Hoら、Gene,、77 (1989) 51〜59頁に記載のプライマーオーバーラップエクステンションであった。対象抗体のコード配列中にヌクレオチド変化を取り込むために、PCRプライマーオリゴヌクレオチドを設計した。Cys226Ser変異体において、コドンの変化は、TGC(Cys)からAGC(Ser)であった。Cys229Ser変異体において、コドンの変化は、TGC(Cys)からAGT(Ser)であった。新しい配列を、重鎖の他の部分を含む重鎖発現ベクターにクローニングして戻した。インサートの完全長配列決定によって、(変異誘発後の)最終的な構築物を確認した。
【０１１２】
Expression Systems(Dyson及びDurocher編)Scion Publishing Ltd.、Oxfordshire、UK、2007年中、「Transient Expression in HEK293-EBNA1 Cells,」Chapter 12からのプロトコールに基づいて、新たに作製した重鎖構築物を、ポリエチレンイミン(PEI)を用いて対応する軽鎖構築物とともにHEK293細胞中に同時にトランスフェクトし、6日間の一過性培養において発現させ、プロテインA及びサイズ排除クロマトグラフィーの組合せによって精製した。
【０１１３】
親抗体及び変異型抗体へのビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAEのコンジュゲーション
変異型抗体と、鎖間ジスルフィド結合あたり1、1.5又は2等量のポリマーコンジュゲート試薬ビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAEとのコンジュゲーションを、抗体の還元後に実施した。還元反応は、22℃又は40℃のいずれかにおいて10mM  DTTを用い、4.7mg/mLの抗体濃度において1時間実施した。過剰の還元体を除去するために、各変異型抗体についてバッファー交換を行った。ポリマーコンジュゲート試薬は、コンジュゲーションの直前に、pH8において50%アセトニトリル水溶液中で調製した。コンジュゲーションの間の抗体濃度は3mg/mLであり、40℃又は22℃において反応を一夜(16時間)実施した。コンジュゲーション反応のための反応条件を以下のTable 1(表1)に要約する:
【０１１４】
【表１】
2015521615.tif 000019
【０１１５】
「IgGC226S」変異体は、226位にCysからSerへの置換を有し、したがって、229位に単一の重鎖間ジスルフィド結合を有する。「IgGC229S」変異体は、229位にCysからSerへの置換を有し、したがって、226位に単一の重鎖間ジスルフィド結合を有する。
【０１１６】
バッファー交換後、疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)によって各反応を分析して、先に記載された通りに、280nmにおけるピークの面積%を用いて薬物負荷の化学量論を決定した。生成した抗体-薬物コンジュゲートの平均薬物対抗体比(DAR)及び薬物コンジュゲート種分布(DAR1〜3)をTable2(表2)に示す。
【０１１７】
【表２】
2015521615.tif 000020
【０１１８】
Table 2(表2)中のデータが示すとおり、本発明の方法は、高レベルの均一性かつ低い平均DARで、効果的に抗体をコンジュゲートすることを可能とする。平均DARの低い抗体-薬物コンジュゲートは、より高い平均DARを有するコンジュゲートよりも低いクリアランス速度、高い治療インデックス及び低い毒性を含む多くの有益な性質を有する。
【実施例２】
【０１１９】
DAR分布の解析
実施例1においては、40℃(反応1及び7)及び22℃(反応4及び10)のどちらにおいても、鎖間ジスルフィド結合あたり1等量のポリマーコンジュゲート試薬を用いた場合、単一のヒンジジスルフィド変異体に関して最も低い平均DARを得た。これらの結果を親抗体を用いて得られるものと比較するために、実施例1において述べた条件を用い、ジスルフィド結合あたり1等量のポリマーコンジュゲート試薬を用いて、親抗体をコンジュゲーションさせた。
【０１２０】
親抗体、IgGC226S及びIgGC229Sに関する平均DARをTable 3(表3)に示す。
【０１２１】
【表３】
2015521615.tif 000021
【０１２２】
Table 3(表3)中のデータが示すとおり、40℃又は22℃のいずれにおいても、親抗体に関する平均DARは、単一ヒンジジスルフィド変異体IgGC226S及びIgGC229Sよりも顕著に高かった。
【０１２３】
コンジュゲーション反応により生成した抗体-薬物コンジュゲート種の分布曲線もDAR分布を決定するために解析した。図1(40℃におけるコンジュゲーション)及び図2(22℃におけるコンジュゲーション)から、より低い平均DARに加えて、本発明の方法が、親抗体を用いて生成したものよりも不均一性が低く、収率が改善された抗体-薬物コンジュゲート(IgGC226S及びIgGC229S)を得たことがわかる。改善された均一性を有する抗体-薬物コンジュゲートは、化学量論が可変の混合物よりも精製の必要性が低く、高い薬物負荷のないことによる低い毒性、及び/又は改善された薬物動態、並びにそれによって改善された有効性を示す。
【実施例３】
【０１２４】
親抗体及び変異型抗体IgGC226Sへのビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAEのコンジュゲーション:IgGC226Sによる鎖間架橋のより高い保持
親抗体及び単一のヒンジジスルフィド変異体IgGC226Sと、鎖間ジスルフィド結合あたり1モル等量のコンジュゲート試薬ビス-スルホン-PEG(24)-val-cit-PAB-MMAEのコンジュゲーションを、抗体の還元後に実施した(TCEP、鎖間ジスルフィドあたり1モル等量、15分、40℃)。コンジュゲート試薬は、コンジュゲーションの直前に、(反応溶液中、5%(v/v)DMSOとするための)DMSO中で調製した。コンジュゲーションの間の抗体濃度は、4mg/mLであった。40℃において反応を一夜(16時間)実施し、その後、反応混合物を、10mM  DHAで1時間、室温で処理し、次いで、SDS-PAGEで分析した。該SDS-PAGEゲルをInstantBlue(商標)で染色し、各レーン内に存在する種それぞれの%を決定するために、IMAGEQUANT(商標)LAS 4010装置(GE Healthcare社)を用いて画像化した。SDS-PAGEの結果を図3に示す。図3においては、Mで標識したレーンは、Novexタンパク質スタンダード(Invitroge社)を示す。レーン1及び2は、それぞれ、コンジュゲーション反応の前後のIgGC226Sの移動プロフィールを示す。レーン3及び4は、親抗体についての同じ反応を示す。例えば、ジスルフィド結合のスクランブリングによって抗体の重鎖間ジスルフィドがコンジュゲーション後に共有結合により架橋していない場合、SDS-PAGEによって重鎖-軽鎖二量体(H+L)の80kDaマーカーのすぐ下にバンドが見える。対照的に、重鎖間ジスルフィドがコンジュゲーション後に架橋している場合、抗体重鎖-軽鎖四量体(2H＋2L)の160kDaマーカーのすぐ上にバンドが見える。レーン2と4を比較すると、単一の重鎖間ジスルフィドを持つIgGC226Sにコンジュゲートすることが、2つの重鎖間ジスルフィド(それぞれ、抗体重鎖-軽鎖四量体の80%対67%)及びより小規模な重鎖-軽鎖二量体形成(それぞれ、17%対31%)を伴う、親抗体に比べてより大規模な2つの重鎖間の架橋をもたらすことがわかる。こうして、本発明の方法は、重鎖間ジスルフィド結合の有効な架橋によって、抗体コンジュゲートの安定性を改善する。
【図１】
2015521615.tif 000025
【図２】
2015521615.tif 000026
【図３】
2015521615.tif 000027
【配列表】
2015521615000001.app
【国際調査報告】
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2015521615.tif 000029
2015521615.tif 000030
2015521615.tif 000031