(57)【要約】  微生物バイオフィルムの溶解のための組成物及び方法が提供され、この方法は、マイクロバイオフィルムをバイオフィルム阻害物質としてのクルクミン誘導体の有効用量に接触させることを含む。一部の実施形態では、クルクミン誘導体は、ジメトキシクルクミンである。一部の実施形態では、バイオフィルムは、例えば、尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む。バイオフィルムは、インビトロ又はインビボで存在することができる。バイオフィルム阻害物質は、単独で、又は殺菌剤と併用して投与されてもよい。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物バイオフィルムの維持又は形成を阻害する方法であって、
前記バイオフィルムの形成又は維持に関与する微生物を、クルクミン誘導体の有効用量に接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記クルクミン誘導体が、ジメトキシクルクミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記有効用量が、約０．０１μＭ〜約１０ｍＭの濃度を前記バイオフィルム部位に提供する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオフィルムがインビトロで存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記バイオフィルムがインビボで存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオフィルムが大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオフィルムが尿路病原性又は腸管出血性微生物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオフィルムが尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
有効一日用量が約０．５ｍｇ〜約５００ｇの範囲である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオフィルム形成又は維持に関与する微生物を、前記クルクミン誘導体と併用して、殺菌剤の有効用量に接触させることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記クルクミン誘導体が細胞外でバイオフィルムを阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記バイオフィルムがヒトの個体内に存在する、請求項５に記載の方法。
【請求項１３】
前記個体が、バイオフィルム形成微生物に関連する尿路感染症に罹患している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記尿路感染症が留置カテーテル関連尿道感染症である、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）によって認定された規約第ＯＤ００７４８８号の下、米国政府の支援を受けて行われたものである。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
現代は、薬剤開発環境における抗生物質耐性の増加及び徐々に減少している驚くほどわずかな数の候補抗生物質のために、感染性疾患が世界的な規模で再流行した時代として記憶されるようになる可能性がある。抗生物質という現在の兵器は、細胞の死滅の唯一の主題、すなわち、細菌の生存能力に不可欠なプロセスを標的とする薬剤に基づく種類から構成される。菌毒性の標的化とは、宿主中の病原体を武装解除させ、利用可能な治療法の数を増加させ、現行の抗生物質の有効性を保護するために使用できる新しい抗菌剤の開発への代替的かつ魅力的な手法である。この手法の全体的な方針は、本来は細胞生存能力に必要ではないが、感染を促進し、病原性カスケード内の常在性に不可欠である特異的機構を阻害することである。
【０００３】
バイオフィルムは、多糖類マトリックス内に埋め込まれ、固体状の生物学的又は非生物的な表面に接着する微生物（細菌、真菌、及び／又は原生動物、及び関連するバクテリオファージならびに他のウイルス）の蓄積物である。バイオフィルムは、医学的に重要であり、体内の院内微生物感染の８０％超を占める。例としては、口腔軟組織及び歯及び歯科インプラント；中耳；胃腸管；泌尿生殖器官；気道／肺組織；目；人工尿管；腹膜及び腹膜透析カテーテル、血液透析用の留置カテーテル及び化学療法剤の常習的投与用の留置カテーテル（Ｈｉｃｋｍａｎカテーテル）；ペースメーカー、人工心臓弁、心室補助装置、および合成血管移植片及びステントなどの心臓インプラント；人工器官、内固定器、経皮的縫合糸；並びに気管内及びベンチレータチューブの感染が挙げられる。微生物は、抗菌剤に対しより一層耐性がつき、宿主免疫系に適切な応答させることが特に困難となる傾向にある。
【０００４】
バイオフィルムは、抗菌剤で処置することが非常に困難である。抗菌剤は、容易に不活性化されるか、又はバイオフィルムを浸透できない場合がある。加えて、バイオフィルム内の微生物は、これらの同一の細菌が浮遊条件下で増殖する場合に抗菌化合物に感受性であるにもかかわらず、これら抗菌化合物に対する高い（最大１０００倍高い）耐性を有する。
【０００５】
バイオフィルムは、ヒトの疾患の伝染及び常在化に重要な役割を果たし、嚢胞性線維症肺炎、感染性心内膜炎、尿路感染症（ＵＴＩ）、歯周炎、中耳の慢性感染症、並びに静脈内カテーテル及び人工関節などの医療装置の感染などの重篤かつ常在性の感染性疾患の病毒性特徴として明らかになった。現在使用可能な抗生物質は、しばしばバイオフィルム関連細菌を根絶できず、耐性病原菌の進化および、最後の手段である抗生物質の消耗を誘導する多重的で強力な抗菌治療計画を必要とする。結果として、バイオフィルム関連感染は、院内の重大な疾病及び死亡の原因である。
【０００６】
ＵＴＩは、膀胱の感染（膀胱炎）及び腎臓の感染（腎盂腎炎）を含み、最も一般的な細菌感染症の１つである。米国では、年間１３００万人に近い女性がＵＴＩに罹患し、全女性の半分以上が一生の間にＵＴＩを経験する。非合併性ＵＴＩの治療を受ける女性は、一次感染から１年以内に再発性感染を発症する可能性が２５〜５０％あり、その大部分は初期感染と同一の細菌株によって引き起こされる。更に、院内感染に起因する年間４０億ドルの費用の約４分の１が、ＵＴＩの結果であり、そのほとんどが留置カテーテル関連ＵＴＩである。残念なことに、慢性及び再発性ＵＴＩを有する患者に対して限定された治療選択肢が使用可能である。このような患者は、概して、長期の抗生物質投与が続けられ、これは共生宿主微生物叢を完全に分裂するためのものであるが、尿管内の薬剤耐性生物の進化を伴う場合がある。加えて、抗生物質療法が無効である場合、ＵＴＩは全身感染及び敗血症に強い因果関係を有する。
【０００７】
尿路病原性大腸菌（Ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（ＵＰＥＣ）は、市中感染のＵＴＩの８０〜８５％を占める、最も一般的な病原体である。ＵＰＥＣは、マウス膀胱炎モデル及びヒトＵＴＩで検討されるいくつかの別々の段階に関与する協調され調節された遺伝的かつ分子的病原性カスケードに関わる。ＵＰＥＣは、主として遠位泌尿生殖器官から出現し、尿道を上昇し、膀胱に入ると考えられる。ＵＰＥＣは、膀胱内腔に沿って並ぶ表在性アンブレラ細胞に結合して、これに侵入し、そこでＵＰＥＣは急速に複製し、バイオフィルムに似た細胞内細菌共同体（ＩＢＣ）を形成する。ＩＢＣ内では、細菌は、これらが抗生物質に対して耐性である安住の地を見つけ、先天性の宿主応答による排泄の効力が失われる。急性感染が消散した後であっても、標準的な抗生物質治療を問わず、細菌は数日間から数週間にわたって膀胱内に生存することができ、再発性尿管感染症の感染源になり得る。留置カテーテル関連ＵＴＩの発生機序においては、ＵＰＥＣは、尿管カテーテル上に頑強なバイオフィルムを形成し、感染性カスケード並びに菌血症を含むより重篤な後遺症を開始するための先駆病原体として作用することが可能である。細胞内の適所であろうと又はカテーテル表面上であろうと、ＵＰＥＣバイオフィルム形成を標的化することは、抗毒性治療法の開発のための成熟した候補として浮かび上がってきた。
【０００８】
レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス  Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、カンピロバクター菌種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．）、病原性大腸菌Ｏ１５７（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  Ｃｈｏｌｅｒａｅ）、及びヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）などのいくつかの明白な細菌病原体が、バイオフィルムに関連し、場合によってはバイオフィルム内で増殖することが示されている。これらの生物は全て、表面及び現存するバイオフィルムに付着する能力を有するが、全てではないにしてもそのほとんどが、バイオフィルム内で広範な増殖ができないと思われる。これは、これらの選好性増殖要求によるもの、又はこれらの固有の生物との競合の不能性によるものであり得る。バイオフィルム内の病原体生物の生存及び増殖はまた、固有の生物との関連及び代謝相互作用によって増強され得る。
【０００９】
バイオフィルム内に存在する細菌は、身体の免疫学的かつ非特異的な防御機構の双方に対して耐性がある。固体表面との接触が、細菌酵素のパネルの発現を惹起し、この細菌酵素は、コロニー形成及び保護を促進する粘着性の多糖類の形成を触媒する。バイオフィルムの構造は、免疫応答が、バイオフィルムの外表面上で見られるこれらの抗原にしか向けられないようになっており、抗体及び他の血清タンパク質又は唾液タンパク質は、多くの場合、バイオフィルムに深く入り込むことができない。加えて、食細胞は、固体表面に付着している複雑な多糖類マトリックス内で増殖している細菌を効果的に貪食することができない。このことが、食細胞に大量の炎症誘発性酵素及びサイトカインを放出させ、近くの組織の炎症及び破壊を引き起こす。
【００１０】
微生物感染のためのバイオフィルムの重要性を考慮して、バイオフィルム溶解を理解及び操作する方法が非常に高い関心を集めており、本明細書で提起される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｒａｖｉｄｒａｎら著（２０１０）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ７９（１１）：１６５８−１６６６．Ｏｒｌａｎｄｏら著（２０１２）、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（３）：ｅ３１８６９。Ｍｏｓｈｅ著、ＳＣＩＥＮＣＥ  ＡＮＤ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ  ＡＧＡＩＮＳＴ  ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ  ＰＡＴＨＯＧＥＮＳ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ（８９−９３頁）、ＤＯＩ番号：１０．１１４２／９７８９８１４３５４８６８＿００１７
【非特許文献２】Ｂａｒｎｈａｒｔ及びＣｈａｐｍａｎ著（２００６）、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、６０：１３１−１４７；Ｒｏｍｅｒｏら著（２０１０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０７：２２３０−２２３４；Ｎｅｎｎｉｎｇｅｒら著（２００９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０６：９００−９０５；Ｃｅｇｅｌｓｋｉら著（２００８）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、６：１７−２７；Ｃｅｇｅｌｓｋｉら著（２００９）、Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．、５：９１３−９１９
【発明の概要】
【００１２】
微生物バイオフィルムの溶解のための組成物及び方法が提供される。アミロイド形成を妨害する化学的又は生物学的手段は、バイオフィルム溶解を誘起し、抗生物質の新しい種類のための標的を提供する。本発明の一実施形態では、バイオフィルム阻害物質は、限定するものではないがジメトキシクルクミンを含むクルクミン誘導体である。
【００１３】
一部の実施形態では、微生物バイオフィルムを溶解する方法が提供され、この方法は、ミクロバイオフィルムをバイオフィルム阻害物質としてのクルクミン誘導体の有効用量に接触させる工程を含む。一部の実施形態では、クルクミン誘導体は、ジメトキシクルクミンである。一部の実施形態では、バイオフィルムは、例えば、尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含む。他の実施形態では、微生物膜は、例えば、尿路病原性及び腸管出血性微生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種等を含む。一部の実施形態では、バイオフィルムは、グラム陽性生物、例えば、黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）等を含む。バイオフィルムは、インビトロ又はインビボで存在することができる。バイオフィルム阻害物質は、単独で投与されてもよく、又は殺菌剤、例えば抗生物質等と併用して投与されてもよい。バイオフィルムのインビトロ溶解は、病院内で用途を見出すことができ、他の殺菌剤と併用されてもよい。クルクミン誘導体は、細胞外でｃｕｒｌｉ線毛に結合し、バイオフィルムを細胞外で阻害することができ、したがって、細菌細胞に入らなくてもよく、小分子排出系などの耐性機構を受けることはない。
【００１４】
一部の実施形態では、活性作用物質としての本発明のバイオフィルム阻害物質と、医薬的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が提供される。本製剤は、例えば、単位用量製剤として、微生物バイオフィルムの溶解に有効である用量で提供することができる。本製剤は、微生物感染、特にバイオフィルムを形成する、又はバイオフィルムに由来する細菌感染症を罹患する患者に投与され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａ：クルクミンの存在下、寒天上で正常なｃｕｒｌｉ線毛形成条件の下で増殖する細菌は、タンパク質フィブロネクチンへの接着の低減を示した。図１Ｂ：クルクミンは、ｃｕｒｌｉ線毛タンパク質の形成に影響しなかった。
【図２】図２Ａ：クルクミンは、寒天上、空気−液体境界面において、及びプラスチックに付着したバイオフィルム形成をブロックする。コンゴレッドは、ｃｕｒｌｉ線毛及びセルロースに関連するｒｅｄ−ｒｏｕｇｈ−ｄｒｙ表現型（ｒｄａｒ株）を染色し、良好に可視化するために頻繁に使用され、ＵＴＩ８９によるバイオフィルム形成をブロックしない（上部）。ＹＥＳＣＡ栄養寒天培地に添加されたクルクミンは、ＵＴＩ８９バイオフィルム形成に関連する特徴的なコロニー形態を阻害する（底部）。図２Ｂ：クルクミンは、空気−液体境界面において、ＵＴＩ８９バイオフィルム形成をブロックするが、コンゴレッドはブロックしない。図２Ｃ：クルクミンはまた、９６−ウェルクリスタルバイオレットアッセイにおいて、ＵＴＩ８９がＰＶＣプラスチックに関連するバイオフィルムを形成する能力をブロックする。
【図３】図３Ａ：ＤＭＣは、寒天上のバイオフィルム形成をブロックする上でクルクミンよりも強力であり、寒天中で５日後までもその効力を維持する。図３Ｂ：ＤＭＣは、クルクミン媒介阻害のために必要とされる濃度（２５μＭ）よりも低い濃度（１０μＭ）でプラスチックに付着したバイオフィルム形成を抑制することにおいて有効である。
【図４】クルクミン及びジメチルクルクミンは、１ｍＬのテフロンビーカーを使用してテフロンに付着した大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のバイオフィルム形成を低減する。化合物の有無で、ＹＥＳＣＡ栄養ブロス中、２６℃で４８時間にわたる細菌のインキュベーション後に、浮遊性の緩く結合した細菌をビーカーから洗い出し、接着細菌をクリオスタルバイオレットで染色し、エタノール中に溶解させて、分光光度計で定量化した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
実施形態の詳細な説明
バイオフィルム溶解作用物質の抗菌剤として用途のために本方法が提供される。かかるバイオフィルム阻害物質は、バイオフィルム形成を含む感染に罹患している又は素因を呈する患者に、微生物病原体の患者集団を低減するのに十分な用量及び期間にわたって、単独で、又は他の活性作用物質と併用して投与できる。かかるバイオフィルム阻害物質はまた、特に医療用表面を含む表面にインビトロ表面で接触させて使用することも可能である。対象の特定の治療としては、限定するものではないが、バイオフィルム形成に特に感受性を示す、移植可能な医療装置を有する患者の治療、並びに尿路病原性及び腸管出血性微生物、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種等による感染症の治療が挙げられる。
【００１７】
バイオフィルムは、表面に密接に結合した微生物細胞の集団であり、多糖類、ＤＮＡ、及びタンパク質を含む物質のマトリックス内に封入されている。バイオフィルムが発生した環境に応じて、鉱物結晶、腐食粒子、粘土又はシルト粒子、もしくは血液成分などの非細胞物質がバイオフィルムマトリックス中で見出され得る。バイオフィルム関連生物はまた、転写される遺伝子に関して、それらの浮遊性（自由に懸濁した）対応物質とは異なる。バイオフィルムは、生組織、留置医療装置、工業用水又は飲料水システムの配管、または天然の水生系を含む多種多様な表面上で形成され得る。
【００１８】
表面と水性媒体との間の固体−液体境界面は、微生物の付着及び増殖に理想的な環境を提供する。固体表面は、付着プロセスにおいて重要であるいくつかの特性を有し得る。微生物コロニー形成の範囲は、表面粗さが増加するにつれて増加すると思われる。これは、剪断力が低下し、粗表面上では表面積がより大きくなるためである。表面の物理化学的特性もまた、付着の速度及び範囲に強い影響を及ぼし得る。微生物は、ガラス又は金属などの親水性材料よりもテフロン及び他のプラスチックなどの疎水性の非極性表面に迅速に付着する。
【００１９】
ｐＨ、栄養レベル、イオン強度、及び温度などの水性媒体の他の特性は、基層への微生物付着の速度において役割を果たし得る。いくつかの研究において、異なる水性系における細菌の付着及びバイオフィルム形成に及ぼす季節的影響が示されてきた。この影響は、水温に起因するか、又は他の測定されない季節的に影響されるパラメータに起因し得る。
【００２０】
細胞表面の疎水性、線毛及び鞭毛の存在、並びにＥＰＳの産生は、全てが微生物細胞の付着の速度及び範囲に影響を及ぼす。疎水性相互作用は、関与する一方の表面又は双方の表面（すなわち、微生物細胞表面及び基層表面）の非極性性質の増加と共に増加する傾向にあるため、細胞表面の疎水性は、接着において重要である。大部分の細菌は、負に帯電しているが、それでも疎水性表面成分を含有する。線毛、すなわち、ウイルス又は細菌の核酸の転移に関与するもの以外の非鞭毛付属物は、細胞表面の疎水性に寄与する。検討された大部分の線毛は、高比率の疎水性アミノ酸残基を含有する。線毛は、恐らく、細胞と基層との間に存在する初期の静電的反発バリアを克服することによって、細胞表面疎水性及び付着において役割を果たす。多数の水生細菌は線毛を有し、線毛が動物細胞への細菌の付着に関与することも示されている。
【００２１】
他の細胞表面特性もまた、付着を容易にし得る。いくつかの研究では、吸着された細胞のタンパク質分解酵素による処理が、付着細菌の著しい開放を引き起こし、付着におけるタンパク質の役割に対して証拠を提供していることが示されている。リポ多糖（ＬＰＳ）のＯ抗原成分もまた、グラム陰性細菌に親水性特性を付与することが示されている。
【００２２】
本発明の方法の対象となる作用物質は、クルクミン誘導体である。本明細書で使用する場合、クルクミン誘導体という用語は、以下に示すクルクミン構造の修飾型である作用物質を指し、特にジメトキシクルクミン（ＤＭＣ）を指し、ＤＭＣの構造も以下に示されている。
【００２３】
クルクミンの多くの誘導体が当該技術分野において既知であり、本発明の方法における用途のため選択されてもよい。例えば、本明細書に記載され、実施例で例示されているスクリーニングアッセイは、既知のクルクミン誘導体からの選択において用途を見出すことができ、既知のクルクミン誘導体としては、限定するものではないが、ジメトキシクルクミン、デメトキシクルクミン、ビスデメトキシクルクミン、ビス−デヒドロキシ−クルクミン；ＢＤＭＣ３３  ［２，６−ビス（２，５−ジメトキシベンジリデン）シクロヘキサノン］；（１Ｅ，４Ｅ）−１−（チオ−フェン−２−イル）−５−（２，６，６−トリメチル−シクロ−ヘキサ−１−エン−１−イル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オン；（１Ｅ，４Ｅ）−１−（２−ニトロ−フェン−イル）−５−（２，６，６−トリメチル−シクロ−ヘキサ−１−エン−１−イル）ペンタ−１，４−ジエン−３−オン；（３Ｅ、５Ｅ）−３，５−ビス（２−クロロ−ベンジリデン）−１−プロピル−ピペリジン−４−オン；（１Ｅ，４Ｅ）−１，５−ビス［２−（トリフルオロ−メチル）フェン−イル］ペンタ−１，４−ジエン−３−オン；ビス−デヒドロキシクルクミン・カルボン酸；クルクミノイドビ−及びトリ−カルボニルメタン、例えば、ビス−デメトキシクルクミンのＮ−フェニルアミノカルボニル誘導体（ＣＭＣ２．２４）（Ｚｈａｎｇら著（２０１２）、Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１９（２５）：４３４８−５８）；テトラヒドロクルクミン及びそのキノリン誘導体（Ｍａｎｊｕｎａｔｈａら著（２０１３）、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ  １３６（２）：６５０−６５８）；酸化メトキシポリエチレン結合パルミテート修飾型クルクミン（Ａｍｏｒｎｗａｃｈｉｒａｂｏｄｅｅら著（２０１２）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、１０１（１０）：３７７９−８６）；クルクミン−グリコシド（Ｇａｄａｄら著（２０１２）、Ｃｕｒｒ．Ｐａｒｍ．Ｄｅｓ．、１８（１）：７６−８４）；（ｐ−シメン）Ｒｕ（クルクミナト）クロロ；２，６−ビス（２，５−ジメトキシベンジリデン）−シクロヘキサノン（ＢＤＭＣ３３）；３，５−ビス（２−フルオロベンジリジン）−４−ピペリドン等が挙げられる。
【化１】
2015523997.tif 000002
【００２４】
ＤＭＣの有効用量は、少なくとも約０．０１μＭ、少なくとも約０．１μＭ、少なくとも約１μＭ、少なくとも約５μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約５０μＭ、少なくとも約１００μＭ、少なくとも約５００μＭ、少なくとも約１ｍＭ、少なくとも約５ｍＭ、少なくとも約１０ｍＭの濃度をバイオフィルムの部位において達成する用量であってよい。
【００２５】
一部の実施形態では、有効な一日用量は、約０．５ｍｇ〜約５００ｇの範囲、例えば、少なくとも約０．５ｍｇ、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約５０ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、少なくとも約５００ｍｇ、少なくとも約１ｇ、少なくとも約５ｇ、少なくとも約１０ｇ、少なくとも約５０ｇ、少なくとも約１００ｇであり、かつ約５００ｇ以下であり得る。
【００２６】
一部の実施形態では、有効な一日用量は、任意の増分において単位投与製剤で提供される。非限定的な例として、５ｇの投与（例えば、１．６ｇのカプセルを１つ、８００ｍｇのカプセルを２つ等）は、３．２ｇの一日用量を送達させるために一日２回、又は４．８ｇの一日用量を送達させるために一日３回行うことができる。別の非限定的な例として、８００ｍｇのカプセルの使用は、（０．８ｇ）を複数回行うことで（例えば、２．４ｇ、３．２ｇ、４ｇ、４．８ｇ、５．６ｇ、６．４ｇ等）、任意の用量（例えば、一日用量）を容易にする。
【００２７】
治療計画は、毎日の投与（例えば、毎日、１回、２回、３回等）、一日おきの投与（例えば、一日おきに１回、２回、３回等）、週に２回の投与、毎週投与、二週間毎に１回の投与、一ヶ月に１回の投与等を行うことができる。別の例では、治療は、連続注入として受けることができる。単位用量は、通常、複数回にわたり投与される。間隔はまた、臨床症状をモニタリングすることによって指示される通りに、不規則であり得る。あるいは、単位用量を、徐放性製剤として投与でき、この場合、頻繁に投与する必要がなくなる。投与量及び頻度は、患者に応じて異なってもよい。当業者であれば、かかるガイドラインは、局所的投与（例えば、鼻腔内、吸入、経直腸等）のために、又は全身投与（例えば、経口、浣腸を介するなどの経直腸、ｉ．ｍ．（筋肉内）、ｉ．ｐ．（腹腔内）、ｉ．ｖ．（静脈内）、ｓ．ｃ．（皮下）、経尿道的等）のために調整されることを理解されるであろう。
【００２８】
クルクミン誘導体は、治療的用途、例えば、ヒトの治療に好適な医薬組成物中で提供できる。一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、本発明の１つ以上の治療学的実体又はその医薬的に許容できる塩、エステルもしくは溶媒和物を含む。いくつかの他の実施形態では、クルクミン誘導体の使用は、別の治療用薬剤、例えば、殺菌性薬剤又は静菌性薬剤と併用する使用を含む。治療用製剤は、凍結乾燥製剤又は水性溶液の形態で、クルクミン誘導体を任意の生理学的に許容できる担体、賦形剤又は安定化剤と混合することによって、保存用に調製できる（レミントンの薬剤科学第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．編集（１９８０））。クルクミン誘導体組成物は、適切な医療行為にかなう様式で製剤化され、分量され、投与されるであろう。投与されるクルクミン誘導体の「有効量」は、上記で引用したものなどを考慮することによって（例えば、疾患の重篤度等）管理され、有効量は、標的としたバイオオフィルムを抑制及び／又は低減するために必要な最小量である。
【００２９】
活性作用物質は、治療用の投与に、種々の製剤に組み込まれることができる。例えば、活性作用物質は、適切な、医薬的に許容できる担体又は希釈剤と組み合わせることによって、医薬組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル、粉剤、顆粒剤、軟膏剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤及びエアロゾル剤などの固体、半固体、液体又は気体の形態の調製物に製剤化されてもよい。例示的な実施形態では、活性作用物質は、ゲルとして、溶液として、又は膣内投与に好適な他の形態で製剤化される。更なる例示的な実施形態では、活性作用物質は、ゲルとして、溶液として、又は直腸（直腸内）投与に好適な他の形態で製剤化される。
【００３０】
スクリーニングアッセイ：  候補作用物質、例えば、クルクミン誘導体は、アミロイド形成及びバイオフィルム形成を妨害するためのそれらの能力についてスクリーニングされ得る。阻害物質のバイオフィルムの溶解における用途が見出される。結合の親和性又は特異性を判定するためのアッセイは当該技術分野において既知であり、例えば、競合アッセイ又は非競合アッセイが挙げられる。対象となるアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリー、９６−ウェルベースのバイオフィルムスクリーン等が挙げられる。１つのかかる例では、テスター細菌のバイオフィルムは、９６−ウェルプレート内で増殖され、ここでは、テスター細菌はプラスチック表面上にバイオフィルムを形成する。次いで、試験化合物を加え、ウェルからのバイオマスの損失が定量化される。
【００３１】
一般的に、種々の濃度への分差応答を得るために、異なる作用物質濃度で並行して複数のアッセイを行う。典型的には、これら濃度の１つは、陰性対照（すなわち、ゼロ濃度又は検出のレベル未満）として作用する。作用物質の不在下（対照）及び存在下の結果が比較される。
【００３２】
好都合なことに、これらアッセイでは、分子の１つ以上は、標識に結合され、この標識は検出可能な信号を直接的又は間接的に提供できる。種々の標識としては、放射性同位元素、蛍光体、化学発光体、酵素、特異的結合分子、粒子（例えば磁気粒子等）が挙げられる。特異的結合分子は、例えば、ビオチンとストレプトアビジン、ジゴキシンとアンチジゴキシン等の対を含む。特異的結合メンバーについては、通常は相補的メンバーが、既知の手順に従って、検出を提供する分子で標識付けされる。
【００３３】
インビトロ結合アッセイは、例えば、マイクロタイタープレート、ミクロビーズ、ディップスティック、樹脂粒子等といった多種多様な材料及び形状で行うことができる。基材は、バックグラウンドを最小にし、信号対ノイズ比を最大にするよう選択される。結合は、当該技術分野において既知の種々の方法によって定量化され得る。結合を平衡に到達させるのに十分なインキュベーション時間の後に、不溶性の支持体を洗浄し、残存する標識を定量化する。結合を妨害する作用物質は、検出される標識を低減するであろう。
【００３４】
候補活性物質として、クルクミンの既知の合成された類似体が挙げられ、これらは、例えば、Ｏｒｌａｎｄｏら著（２０１２）、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、７（３）：ｅ３１８６９；Ｈａｕｋｖｉｋら著（２０１１）、Ｐａｒｍａｚｉｅ．、６６（１）：６９−７４；及びＲａｖｉｎｄｒａｎら著（２０１０）、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、７９（１１）：１６５８−６６に記載されているものが挙げられ、各々が特に参照として本明細書に組み込まれる。天然又は合成的に産生されたライブラリー及び化合物は、従来の化学的、物理的及び生化学的手段を通して容易に修飾される。構造的類似体を作製するために、既知の薬理学的作用物質を、化学的修飾、例えば、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド付加、ハロゲン化に直接またはランダムに供することができる。
【００３５】
種々の他の試薬が、スクリーニングアッセイに含まれてもよい。これらとしては、塩類、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、洗浄剤等のような試薬が挙げられ、これらは、最適なタンパク質−ＤＮＡ結合を容易にするためにかつ／又は非特異的な又はバックグラウンド相互作用を低減するために使用されてもよい。また例えば、プロテアーゼ阻害物質、ヌクレアーゼ阻害物質、抗菌剤等のアッセイの効率を別の方法で改善する試薬が使用されてもよい。
【００３６】
対象の機能的アッセイは、微生物バイオフィルムの機能的溶解、例えば、実施例に記載されているものの評価を含む。
【００３７】
使用方法
バイオフィルム阻害物質の製剤は、微生物感染症を罹患する又はその素因がある宿主に投与される。特定の微生物に応じて、局所投与、局在化投与、または全身性投与であってもよく、好ましい投与は局在化投与である。一般的に、バイオフィルム阻害物質の用量は、バイオフィルム中の微生物集団を少なくとも約５０％、通常は少なくとも１ｌｏｇ減少させるに十分であり、これは２ｌｏｇ以上の遊離でもよい。本発明の化合物は、副作用を最小にすると同時に、微生物集団を低減する投与量で投与される。本組成物は、インビボでの使用のために、臨床医のガイダンスの下で取得されかつ使用されることが企図される。
【００３８】
バイオフィルム阻害物質はまた、微生物バイオフィルムを溶解するために、インビトロの製剤に有用である。例えば、バイオフィルム阻害物質は、診療器具、例えば、ベンチレーション、水処理等に添加されてもよい。
【００３９】
バイオフィルム阻害物質に対する特定の微生物の感受性は、実験のセクションで詳説されるようなインビトロ試験で判定されてもよい。概して、タンパク質を作用させるのに十分な時間であり、通常は約１時間および１日の間、異なる濃度での阻害剤とバイオフィルム中の微生物の培養物を混合する。次いで、付着した微生物を計測し、溶解レベルを決定する。
【００４０】
ほぼあらゆる微生物は、バイオフィルムに参画できる。対象の微生物としては、限定するものではないが、フザリウム属細菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）；シトロバクター属細菌（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）；エンテロバクター属細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）；エシェリキア属細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；クレビシエラ属細菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐ．）；モルガネラ属細菌（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｓｐ．）；プロテウス属細菌（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐ．）；プロビデンシア属細菌（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｐ．）；サルモネラ属細菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、例えば腸チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；セラチア属細菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐ．）；シゲラ属細菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．）、シュードモナス属細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、例えば、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）；エルシニア属細菌（Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐ．）、例えば、ペスト菌（Ｙ．ｐｅｓｔｉｓ）、偽結核エルシニア菌（Ｙ．ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、腸炎エルシニア（Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）；フランシセラ属細菌（Ｆｒａｎｃｉｓｃｅｌｌａ  ｓｐ．）；パスツレラ属細菌（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｓｐ．）；ビブリオ属細菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．）、例えば、コレラ菌（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）、腸炎ビブリオ菌（Ｖ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）；カンピロバクター属細菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）；ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐ．）、例えば、インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、デュクレー桿菌（Ｈ．ｄｕｃｒｅｙｉ）；ボルデテラ属細菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｓｐ．）、例えば、百日咳菌（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、気管支敗血症菌（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、パラ百日咳菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）；ブルセラ属細菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐ．）；ナイセリア属菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐ．）、例えば、淋菌（Ｎ．ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）等が挙げられる。他の対象の細菌としては、レジオネラ属細菌（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）、例えば、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）；リステリア属細菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐ．）、例えば、リステリア菌（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）；マイコプラズマ属細菌（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓｐ．）、例えば、マイコプラズマ・ホミニス（Ｍ．ｈｏｍｉｎｉｓ）、肺炎マイコプラズマ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）；マイコバクテリウム属細菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）、例えば、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）；トレポネーマ属細菌（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｓｐ．）、例えば、梅毒トレポネーマ（Ｔ．ｐａｌｌｉｄｕｍ）；ボレリア属細菌（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｓｐ．）、例えば、ライム病ボレリア（Ｂ．ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）；レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｅ  ｓｐ．）；リケッチア属細菌（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ  ｓｐ．）、例えば、斑点熱リケッチア（Ｒ．ｒｉｃｋｅｔｔｓｉｉ）、発疹熱リケッチア（Ｒ．ｔｙｐｈｉ）；クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｓｐ．）、例えば、トラコーマ病原体（Ｃ．ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、クラミジア肺炎病原体（Ｃ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、モラクセラ・カタラーリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、オウム病クラミジア（Ｃ．ｐｓｉｔｔａｃｉ）；ヘリコバクター属細菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、例えば、ヘリコバクター・ピロリ菌（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）；ブドウ球菌属細菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）；シゲラ属細菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐ．）；連鎖球菌属細菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ  ｓｐ．）等が挙げられる。
【００４１】
慢性感染症は、医療従事者にとって大きな課題となっており、従来の抗生物質療法が、大抵の場合、これら感染症を根絶するために十分ではないために、大きな経済的な関連性がある。常在化の１つの主な理由は、細菌が有害な環境因子から保護するバイオフィルム内で増殖する能力であると見られる。緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、重要な日和見病原体及び院内感染の原因病原体であるばかりでなく、細菌の常在性に寄与する様々な細菌機構の研究のためのモデル生物と考えることができる。
【００４２】
歯垢は、歯に付着する物質であり、細菌細胞（主として、ミュータンス連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）及びストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ））、唾液ポリマー、及び細菌の細胞外産物からなる。歯垢は、歯の表面上のバイオフィルムである。この微生物の蓄積物は、歯及び歯肉組織を高濃度の細菌代謝産物に露出させ、これが歯科疾患を引き起こす。
【００４３】
レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）細菌は、それらが消毒薬に対して保護されるバイオフィルム内の特定の条件下で増殖することが知られている。
【００４４】
淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）は、排他的なヒト病原体である。最近の研究では、淋菌が、異なる細菌表面リガンド及び宿主受容体が関与する、ヒトの尿道及び子宮頚部上皮細胞に侵入するための２つの別個のメカニズムを利用することが例証されている。加えて、淋菌はガラス表面上及びヒト細胞を覆うバイオフィルムを形成できることが例証されている。
【００４５】
投与のための種々の方法が使用されてもよい。本製剤は、経口で投与されてもよく、または、血管内、皮下、腹膜注射されてもよく、エアロゾルによって注入されてもよく、眼科的に、膀胱内に、局所的に、等の手法で注入されてもよい。例えば、吸入による投与の方法は、当該技術分野において良く知られている。治療用製剤の投与量は、投与される特定のバイオフィルム阻害物質、疾患の性質、投与の頻度、投与の方法、宿主からの作用物質の排泄等に応じて幅広く変化する。初期用量は大きく、その後少量の維持用量が継続されてもよい。有効な投与量レベルを維持するために、用量は、毎週もしくは隔週に１回程度に低頻度で投与されても、または少量の用量に分割され、毎日、半週毎等に１回又は数回投与されてもよい。経口投与は、血管内投与される場合よりも高い用量を必要とすることが多い。
【００４６】
製剤
クルクミン誘導体は、治療用投与のために種々の製剤に組み込むことができる。より具体的には、本発明の化合物は、適切な医薬的に許容できる担体又は希釈剤との組み合わせによって医薬組成物に製剤化することができ、錠剤、カプセル剤、粉剤、顆粒剤、軟膏剤、クリーム剤、発泡剤、液剤、坐剤、注射剤、吸入剤、ゲル剤、ミクロスフィア、ローション剤、及びエアロゾル剤などの固体、半固体、液体又は気体の形態で、調製物に製剤化されてもよい。したがって、本化合物の投与は、経口、口腔内、経直腸、非経口、腹腔内、皮内、経皮、気管内、経尿道等の投与を含む種々の方法で達成できる。本バイオフィルム阻害物質は、投与後に全身的に存在してもよく、またはインプラントもしくは移植の部位で活性用量を保持するよう作用する他の製剤の使用によって、局在化されてもよい。
【００４７】
本発明の化合物は、単独で、もしくは相互に組み合わせて投与でき、または他の既知の化合物（例えば、抗生物質等）と併用して使用できる。医薬投与形態において、本発明の化合物は、その医薬的に許容できる塩の形態で投与されてもよい。以下の方法及び賦形剤は、例示にすぎず、多少なりとも限定するものではない。
【００４８】
経口調製物については、錠剤、粉剤、顆粒剤又はカプセル剤を生成するために、本化合物は単独で、または適切な添加剤、例えば、乳糖、マンニトール、コーンスターチもしくはポテトスターチなどの従来の添加剤；結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、コーンスターチもしくはゼラチンなどの結合剤；コーンスターチ、ポテトスターチもしくはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤；タルク又はステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；所望の場合、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、防腐剤及び風味剤と併用して使用できる。
【００４９】
本発明の化合物を、所望の場合、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤及び防腐剤などの従来の添加剤を用いて植物性又は他の類似の油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステル又はプロピレングリコールなどの水性又は非水性溶媒中で溶解し、懸濁させ又は乳化することによって、注射用調製物に製剤化することができる。
【００５０】
本発明の化合物は、吸入を介して投与されるエアロゾル製剤で利用できる。本発明の化合物は、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素等の加圧された許容できる噴霧剤中に製剤化することができる。
【００５１】
本発明の化合物は、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤及び防腐剤などの従来の添加剤と共に製剤化することによって、例えば、火傷からの感染を予防するために、ローション剤として使用することができる。
【００５２】
更に、本発明の化合物は、乳化基剤又は水溶性基剤などの種々の基剤と混合することによって、坐剤に形成できる。本発明の化合物は、坐剤を介して経直腸投与することができる。坐剤は、ココアバター、カルボワックス及びポリエチレングリコールなどのビヒクルを含むことができ、これらは体温で融解し、室温では固化状態を維持する。
【００５３】
シロップ剤、エレキシル剤、及び懸濁剤などの経口又は経直腸投与のための単位用量形態は、各投薬量単位、例えば、茶さじ量、食さじ量、錠剤又は坐剤が、本発明の１つ以上の化合物を含有する組成物の所定量を含むように提供され得る。同様に、注射又は静脈内投与用の単位用量形態は、無菌水、正常生理食塩水又は別の医薬的に許容できる担体中の溶液として、組成物中に本発明の化合物を含んでもよい。
【００５４】
徐放性製剤用のインプラントは、当該技術分野において良く知られている。インプラントは、生体分解性又は非生体分解性ポリマーと共に、ミクロスフィア、スラブ等として製剤化される。例えば、乳酸及び／又はグリコール酸のポリマーは、宿主に十分に許容される浸食可能なポリマーを形成する。バイオフィルム阻害物質を含有するインプラントは、感染の部位近くに配置されることで、活性作用物質の局所濃度が、身体の他の部位に比べて向上する。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「単位用量形態」とは、ヒトおよび動物の治療対象のための単位用量として適した単位を物理的に分離した単位を指し、各々の単位は、医薬的に許容できる希釈剤、担体又はビヒクルと共に所望の効果を生じるのに十分な量で計算された本発明の化合物の所定量を含有するものである。本発明の単位用量形態に対する仕様は、使用される特定の化合物及び達成される効果、並びに宿主におけるこの化合物に関連する薬物動態に依存する。
【００５６】
ビヒクル、補助剤、担体又は希釈剤などの医薬的に許容できる賦形剤は、一般に容易に入手可能なものである。更に、医薬的に許容できる補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、浸透圧調整剤、安定化剤、湿潤剤等も、一般に容易に入手可能なものである。
【００５７】
全身投与のための典型的な投与量は、１回の投与毎に治療対象の体重のｋｇ当たり０．１μｇ〜１００ミリグラムの範囲である。典型的投与量は、１日に２回〜６回服用される１つの錠剤であっても、又は１日１回服用される１つの徐放性カプセル又は錠剤であってもよく、この徐放性カプセル又は錠剤は、比例的に高い活性成分含量を含む。徐放効果は、異なるｐＨ値で溶解するカプセル材料によって、浸透圧によりゆっくりと放出するカプセルによって、又は制御放出の任意の他の既知の手段によって得られてもよい。
【００５８】
用量レベルは、特定の化合物、症状の重篤度及び副作用に対する治療対象の感受性に応じて変動することができることを当業者であれば容易に理解できるであろう。特定の化合物の一部は、その他のものよりも強力である。所定の化合物の好ましい投与量は、種々の手段によって、当業者により容易に決定される。好ましい手段は、所定の化合物の生理学的効力を測定するものである。
【００５９】
本方法での使用のために、バイオフィルム阻害物質は、他の医薬的に活性な作用物質、特に他の抗菌剤と共に製剤化されてもよい。対象の他の作用物質としては、当該技術分野で既知の多種多様な抗生物質が挙げられる。抗生物質の種類としては、ペニシリン類、例えばペニシリンＧ、ペニシリンＶ、メチシリン、オキサシリン、カルベニシリン、ナフシリン、アンピシリン等；β−ラクタマーゼ阻害物質、セファロスポリン、例えばセファクロール、セファゾリン、セフロキシム、モキサラクタム等と組み合わせたペニシリン類；カルバペネム；モノバクタム；アミノグリコシド類；テトラサイクリン類；マクロライド類；リンコマイシン類；ポリミキシン類；スルホンアミド類；キノロン類；クロラムフェニコール；メトロニダゾール；スペクチノマイシン；トリメトプリム；バンコマイシン等が挙げられる。
【００６０】
ポリエン類、例えば、アンフォテリシンＢ、ナイスタチン；５−フルコシン；及びアゾール類、例えばミコナゾール、ケトコナゾール、イトラコナゾール及びフルコナゾールなどの抗真菌剤も有用である。抗結核剤としては、イソニアジド、エタンブトール、ストレプトマイシン及びリファンピンが挙げられる。
【００６１】
以下の実施例は、本発明の製造及び使用法の完全な開示及び説明を当業者に提供するために提示されており、本発明とみなされるものの範囲を限定することを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度、濃度等）に関して正確性を保つために努力がなされているが、一定の実験誤差及び偏差が許容されるべきである。特段の記載のない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧又は大気圧に近い圧力である。
【実施例】
【００６２】
本明細書で引用されている全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各々の個々の刊行物、特許、又は特許出願が、参照により援用されるよう具体的かつ個別に指示されているように、参照により本明細書に援用される。
【００６３】
本発明の実施のために好ましい態様を含むよう本発明者によって見出され又は提案された特定の実施形態に関して本発明を記載した。本開示を考慮すれば、本発明の意図された範囲から逸脱することなく、多数の修正及び変更が、例示した特定の実施形態においてなされ得ることが、当業者には理解されるであろう。更に、生物学的な機能的同等性という観点のために、種類又は量において生物学的作用に影響を及ぼすことなく、方法、構造、及び化合物に変更を行うことができる。全てのかかる修正は、添付の特許請求項の範囲内に含まれることが意図される。
【００６４】
実施例１
クルクミン及びジメチル化クルクミンは、アミロイド媒介接着及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によって形成されたアミロイド組込みバイオフィルムを阻害する
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、細菌細胞表面において、ｃｕｒｌｉ線毛と呼ばれる機能性アミロイド線維の組立てを統括する。ｃｕｒｌｉ線毛は１９８９年に接着性線毛として発見され、２００２年にアミロイドとしてｃｕｒｌｉ線毛の特定が行われたが、本発明者らは、現在、機能性アミロイドは、例えば、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）菌種、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）種などの微生物中蔓延するものと理解している。正確な時間及び場所における重合を指図するために、並びに毒性を防止するために、微生物における機能性アミロイドの組立ては調節されている。このようにして、機能性アミロイドの形成は、好ましくないタンパク質のミスアセンブリ事象並びにアルツハイマー病などのヒト疾患に関連するアミロイド形成タンパク質オリゴマー及びアミロイド線維の組立てと並行して行われる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｃｕｒｌｉ線毛アセンブリは、多岐にわたり転写されたｃｓｇＢＡ及びｃｓｇＤＥＦＧオペロン（ｃｓｇ、ｃｕｒｌｉ線毛特異的遺伝子）によってコード化されたいくつかのタンパク質の発現及び適切な相互作用を必要とする。βシート構造リッチなアミロイド線維への主要ｃｕｒｌｉ線毛サブユニットＣｓｇＡのインビボ重合は、少量のサブユニットＣｓｇＢの核形成活性に依存する。ＣｓｇＥ、ＣｓｇＦ、及びＣｓｇＧは、ＣｓｇＡ及びＣｓｇＢの細胞表面への安定化及び輸送に必要とされるアセンブリ因子である。
【００６５】
ｃｕｒｌｉ線毛は、微生物アミロイドの中で最も十分に研究されたものであり、ステンレススチールなどの無生物表面、植物の葉を含む生物表面への接着を媒介する能力により、環境常在性及び伝染に役割を果たすと考えられている。無生物及び生物基材の双方への接着は、病原性大腸菌Ｏ１５７（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７）などの病原体株による食物媒介性感染症の大流行の原因となる可能性がある。また、ｃｕｒｌｉ線毛は、細胞集合を促進し、共同体挙動及びバイオフィルムアセンブリを促進するための接着性の足場として作用する。バイオフィルムは、宿主及び環境内の常在性に寄与する複雑な細胞外マトリックスを特徴とする多細胞共同体である。バイオフィルム細菌は、抗生物質及び洗浄剤に対して低減した感受性を呈する。胃腸管にコロニー形成する共生菌株並びに病原体として現れる菌株（例えば、尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＵＰＥＣ））は、これらがＧＩ管から出て尿路に入る場合、一般に、インビトロでｃｕｒｌｉ線毛を形成する。
【００６６】
長期の抗生物質療法を必要とし、しばしば、抗生物質耐性及び敗血症を含むことがある致命的な後遺症に関連する急性感染症並びに慢性及び再発性感染症の形態でのＵＰＥＣによる尿路感染症（ＵＴＩ）の有意な有病率のために、ＵＰＥＣは、研究室及び病院内で大きな注目を集めている。ＵＰＥＣは、１型及びＰ型線毛（それぞれ膀胱及び腎臓の感染症に関連する善意の（ｂｏｎａｆｉｄｅ）毒性因子である）を組み立てるために、注目に値する、十分に研究された遺伝的及び分子的カスケードに関わる。更に、臨床分離株は、それら及びそれらの宿主との相互作用を識別する無数の分子的特徴のために、インビトロ及びインビボにおいてその表現型が著しく異なる。注目すべきことに、ｃｕｒｌｉ線毛の形成は、尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株で最も顕著である。ｃｕｒｌｉ線毛及びセルロースの共生産は、寒天上で、空気−液体境界面において、及びＰＶＣプラスチックに付着した細菌バイオフィルムの生成を可能にする。最近のインビボでの研究は、ｃｕｒｌｉ線毛が、マウスＵＴＩモデル中の膀胱及び腎臓内の細菌力価で反映されるようなＵＰＥＣに対する適合有利性を提供すること、並びにｃｕｒｌｉ線毛及びセルロースが、免疫応答を調節することの証拠を提供している。またｃｕｒｌｉ線毛は、電子顕微鏡によって、更に抗体反応性によって、ヒト患者の尿試料でも特定されており、このことは、ｃｕｒｌｉ線毛は、ヒトで発現されることを示唆している。
【００６７】
バイオフィルムは大部分の感染性疾患に関与し、細菌性アミロイドが尿路病原性及び腸管出血性生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及びサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）種の環境常在性及び病原性に寄与するという証拠が蓄積しているので、ｃｕｒｌｉ線毛アセンブリ及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）バイオフィルム形成を阻害することが望ましい。また、アミロイド線維は、最近、グラム陽性生物の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）により形成されたバイオフィルム内でも同定されている。微生物性アミロイド形成及びバイオフィルム形成をブロックするという目標に向けて、ｃｕｒｌｉ線毛の形成を妨害し、したがって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のｃｕｒｌｉ線毛を組み込むバイオフィルムを妨害する小分子阻害物質が発見されている。抗菌性ペプチドＬＬ−３７もまた、ｃｕｒｌｉ線毛の形成を阻害する。その他の分子は、土壌中に生息する生物である枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）によって形成されたアミロイドを組み込んだバイオフィルムを抑制しかつ破壊し、枯草菌では、アミロイド線維は、ＴａｓＡタンパク質を含む。
【００６８】
本明細書に記載したことは、クルクミン及びその類似体、特にジメチル化クルクミン（ＤＭＣ）の作用であり、これらは、尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）によるｃｕｒｌｉ線毛媒介接着をブロックし、ｃｕｒｌｉ線毛が組み込まれたバイオフィルム形成を阻害する。クルクミンは、ウェスタンブロット分析によって評価されるように、ｃｕｒｌｉ線毛タンパク質の産生に影響を及ぼすことはない。したがって、クルクミンは、ｃｕｒｌｉ線毛に翻訳後に影響を及ぼし、ｃｕｒｌｉ線毛依存的バイオフィルム形成を阻害する。更に、ＤＭＣは、クルクミンと比べて優れたバイオフィルム阻害特性を呈することを、本発明者らは示す。
【００６９】
結果
クルクミンは、フィブロネクチンへのｃｕｒｌｉ線毛媒介接着をブロックするが、ｃｕｒｌｉ線毛タンパク質の発現に影響を及ぼさない。フィブロネクチンでコーティングされたプレートへの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＭＣ４１００の接着を、クルクミンがブロックするかどうかを判定するために、本発明者らは、一般的に使用されているフィブロネクチン結合アッセイを使用した。ＭＣ４１００は、ｃｕｒｌｉ線毛生合成が最初に記述された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株である。これは、ｃｕｒｌｉ線毛を発現するが、セルロース（主な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）バイオフィルム決定因子）も１型線毛も産生しない、従来使用されてきた研究室Ｋ１２菌株であり、ガラス上、プラスチック上、又は空気−液体境界面で明らかなバイオフィルムを形成しない。一方ＵＴＩ８９は、プロトタイプのバイオフィルム有能菌株であり、ｃｕｒｌｉ線毛及びセルロースを発現する場合、寒天上、プラスチック上、及び空気−液体境界面でバイオフィルムを形成する。ｃｕｒｌｉ線毛は、フィブロネクチンへの結合を媒介するために十分であるために、ＭＣ４１００の使用により、化合物又は外部刺激がｃｕｒｌｉ線毛依存的接着に影響を及ぼすかどうかを判定することを容易に可能にする。クルクミンの存在下では、用量依存的方法において、寒天上で正常なｃｕｒｌｉ線毛形成条件下で増殖する細菌は、タンパク質フィブロネクチンへの接着の低減を示した（図１Ａ）。図１Ｂに示すように、クルクミンは、ｃｕｒｌｉ線毛タンパク質の産生に影響しなかった。これらの結果は、クルクミンがｃｕｒｌｉ線毛に結合し、フィブロネクチンへのｃｕｒｌｉ線毛媒介接着を低減させることを示唆している。
【００７０】
クルクミンは、寒天上、空気−液体境界面において、及びプラスチックに付着したバイオフィルム形成をブロックする。クルクミンの存在下では、寒天プレート上で増殖させたＵＴＩ８９は、特徴的な粗い皺のよった表現型を喪失し、ＭＣ４１００（非バイオフィルム形成菌）に類似した滑らかな皺のない形態を示した（図２Ａ）。ウェスタンブロット分析は、図１のＭＣ４１００について示されたように、ｃｕｒｌｉ線毛形成が、影響されないことを確認した。クルクミンは、菌膜形成を完全に抑制することができ（図２Ｂ）、プラスチック結合バイオフィルム形成は、試験されたクルクミンの最低濃度、１０μＭで抑制された。
【００７１】
ジメチルクルクミン、クルクミン類似体は、寒天上、空気−液体境界面において、及びプラスチックに付着したバイオフィルム形成をブロックする。クルクミンで実施されたものと同一のバイオフィルムアッセイを、市販されているクルクミン類似体、ＤＭＣで実施した。クルクミン及びＤＭＣを比較する結果は、ＤＭＣが寒天上のバイオフィルムを阻害することにおいてより強力であり、５日間の細菌増殖を過ぎてもその影響を示したが、一方クルクミンの存在下のバイオフィルム阻害は、５日後からは減少したことを明らかにした（図３Ａ）。このことは、ＤＭＣが増強した安定性を示し、したがって、５日後にもその効力を維持することを示唆している。ＤＭＣはまた、空気−液体境界面でのバイオフィルム形成をブロックする上でもより強力であり、１０μＭの低い濃度でもバイオフィルムの形成を抑制したが、一方、ＵＴＩ８９について空気−液体境界面におけるバイオフィルムの形成の完全な阻害には、クルクミンでは２５μＭを必要とした。同様に、ＤＭＣは、ＰＶＣに付着したＵＴＩ８９バイオフィルムを、１０μＭでブロックしたのに対し、プラスチック結合バイオフィルム形成を阻害するためには２５μＭのクルクミンが必要であった。
【００７２】
テフロンは、カテーテルの作製を含む種々の工業的及び生物医学的用途における材料としてしばしば使用される。テフロンは、その全般的抗接着特性のために、頻繁に使用される。しかしながら、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、テフロンに接着することができ、テフロン表面上にバイオフィルムを形成できる。したがって、本発明者らは、小型の１ｍＬのテフロンビーカーを使用して、テフロンに付着するバイオフィルムの形成を抑制するためのクルクミン及びＤＭＣの能力を検討した。図４に示すように、クルクミン及びＤＭＣの両方が、テフロンに付着するバイオフィルム形成を有意に抑制する上で有効であった。
【００７３】
バイオフィルム形成を抑制する上でのクルクミンの作用態様。まとめると、このデータは、（ＭｃＣｒａｔｅ、Ｚｈｏｕ、及びＣｅｇｅｌｓｋｉ著、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２００３、４９：４１９３−４１９５で示されたような）ｃｕｒｌｉ線毛に結合し、ｃｕｒｌｉ線毛と細胞外マトリックスの他の成分、特に多糖類成分との間の相互作用を抑制するクルクミンと一致する。したがって、クルクミンの活性は、細菌が主要なバイオフィルム成分を分泌することを可能にするが、それでもバイオフィルム形成が抑制されることを明らかにした。
【００７４】
考察
クルクミンは、オリゴマー型及び原線維型のアミロイドタンパク質、アミロイドβに結合することが示されている（Ｙａｎｇら著、「Ｃｕｒｃｕｍｉｎ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｙｌｏｉｄ  β  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｆｉｂｒｉｌｓ，Ｂｉｎｄｓ  Ｐｌａｑｕｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｄｕｃｅｓ  Ａｍｙｌｏｉｄ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ」、ＴＨＥ  ＪＯＵＲＮＡＬ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ．第２８０巻、第７番、２月１８日発行５８９２−５９０１頁、２００５）。アミロイドβに関して、クルクミンは、インビトロでアミロイド原線維形成を抑制することが示され（Ｏｎｏら著、「Ｃｕｒｃｕｍｉｎ  ｈａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｔｉ−ａｍｙｌｏｄｏｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  β−ａｍｙｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｉｌｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．第７５巻、第６版７４２−７５０頁、２００４）、これはバイオフィルムのクルクミン媒介阻害とは異なり、ここではｃｕｒｌｉ線維はなお形成されているが、クルクミンはバイオフィルム形成を媒介するための能力をブロックする。
【００７５】
尿路病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＵＰＥＣ）による接着及びバイオフィルム形成並びに細菌性アミロイド線維又はアミロイド媒介接着又はアミロイド組込みバイオフィルム形成に及ぼすクルクミンの影響は新規である。更に、ＤＭＣはクルクミンよりも有効であり、クルクミンよりも優れた投与特性及び生物利用特性をＤＭＣに付与する増強された安定性を示し得る。これら化合物は、ＵＰＥＣの細胞生存能力に及ぼす影響は有さず、したがって、古典的な抗生物質が行うような細胞生存能力を標的とすることなく、接着及びバイオフィルム形成をブロックする抗毒性戦略として使用することができる。これは、典型的には従来の抗生物質が原因とされる微生物のバランスに対する圧倒的な変化を防止し、抗生物質耐性の蔓延の低減に関連し得る魅力的な手法である。
【００７６】
特定の例では、本発明の方法は、膀胱及び腎臓の感染症並びにカテーテル関連尿路感染症を含む尿路感染症を予防しかつ治療する用途を見出す。本発明の方法は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７）及びサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌種などのｃｕｒｌｉ線毛形成生物に起因する食品処理プラントの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）汚染を防止する上で有用でもある。更に、本発明の方法は、他のアミロイド産生生物によるアミロイド媒介接着及びアミロイド組込みバイオフィルム形成をブロックする上での用途を見出す。クルクミン化合物は、細胞外でｃｕｒｌｉ線毛に結合し、バイオフィルムを細胞外で阻害し、したがって、細菌細胞に入る必要はなく、小分子排出系などの耐性機構を受けることはない。
【００７７】
材料及び方法
増殖条件。  ＵＴＩ８９、ＵＴＩ８９ΔｃｓｇＡ、ＭＣ４１００、及びＭＣ４１００Δｃｓｇは、指示された追加の化合物で補足されたＹＥＳＣＡ（０．５ｇ／Ｌの酵母抽出物；１０ｇ／Ｌのカザミノ酸）寒天培地上で増殖させた。
【００７８】
ウェスタンブロット分析。  細胞関連ｃｕｒｌｉ線毛タンパク質、ＣｓｇＡ及びＣｓｇＧを、記載の（４１）通りにイムノブロットアッセイによって試験した。簡潔に述べると、等しい細胞数を有する全細胞試料を、１．０のＯＤ６００を有する、１ｍＬの細胞培養物の細胞ペレットとして調製した。各ペレットを、１００μＬのヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）で処理して、ｃｕｒｌｉ線毛サブユニットを解離させた（４１）。真空遠心分離によりＨＦＩＰを除去し、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥ負荷緩衝液中に再懸濁させた。１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、タンパク質ゲル電気泳動を行い、０．２ｍｍのニトロセルロース転移膜（Ｗｈａｔｍａｎ）にブロットした。ＣｓｇＡ又はＣｓｇＧに対するポリクローナルウサギ抗血清を一次抗体として使用し、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ウサギ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を二次抗体として使用した（５５）。
【００７９】
バイオフィルムアッセイ。  コロニーバイオフィルム形成を、細菌の一晩の培養物１０μｌを、ＹＥＳＣＡ寒天プレートにスポットすることによって開始させた（Ｋｏｌｏｄｋｉｎ−Ｇａｌら著（２０１０）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２８：６２７−６２９）。２６℃における指示された培養時間後に、コロニーの形態を観察した。プラスチック（ポリ塩化ビニル、ＰＶＣ）に付着したＹＥＳＣＡブロス中のバイオフィルムを、Ｏ’Ｔｏｏｌｅら著（１９９８）、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８：４４９−４６１により記載されたＫｏｌｔｅｒクリスタルバイオレットアッセイを使用して判定した。簡潔に述べると、細菌細胞を９６−ウェルＰＶＣプレートで増殖させて、非付着細胞を洗い流し、ＰＶＣウェル関連の残存細胞を、０．１％のクリスタルバイオレットで染色した。バイオフィルム形成の範囲を、９５％のエタノール中でＰＶＣ関連バイオマスを溶解した後に、ＯＤ５９５にてのクリスタルバイオレットの吸光度を測定することによって定量化した。化合物が存在しない場合、パーセント単位のバイオフィルムは、バイオフィルム形成に対する、種々の濃度のＤＭＳＯ及びエタノールの存在下でのバイオフィルム形成における増加を示す。３通りの実験のそれぞれの平均を使用し、エラーバーは標準偏差を表す。１２−ウェルプレート内で２６℃にてインキュベートした４ｍＬのＹＥＳＣＡ中のＹＥＳＣＡブロスで、一晩細菌培養物の４μＬを接種することで菌膜形成を開始させた。７２時間の増殖後に、菌膜形成を肉眼で観察し、ピペット先端部による摂動（ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）によって評価した。
【図１】
2015523997.tif 000003
【図２】
2015523997.tif 000004
【図３】
2015523997.tif 000005
【図４】
2015523997.tif 000006
【国際調査報告】
2015523997.tif 000007
2015523997.tif 000008
2015523997.tif 000009