(57)【要約】  本発明は、新規な有効成分を取得することと、いずれもヤシ科由来のアクロコミア・クリスパ及び／又はアクロコミア・アクレアタの未熟な又は熟した果実から上記有効成分を取得する方法とに関する。酸化ストレス及び炎症を予防及び／又は治療する治療用化粧料製剤又は医薬組成物において、栄養補助剤として上記有効成分を使用することができる。上記成分は、炭素数６〜２８の脂肪酸（遊離及び／又はアシルグリセロール若しくはエチルエステルとして）の混合物、主に炭素数８、１０、１２、１４、１６及び１８の直鎖飽和脂肪酸と、炭素数１６及び１８の不飽和脂肪酸とを含む。また、上記成分は、ステロールと高分子量の脂肪族アルコールとを含有し得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヤシ科のアクロコミア・クリスパ種及び／又はアクロコミア・アクレアタ種の両方の果実から得られる有効成分であって、炭素数６〜２８の脂肪酸（遊離又はアシルグリセロール若しくはエチルエステルとして）の混合物を含有し、また、ステロール及び高分子量脂肪族アルコールを含有することができ、以下の酸：カプリル酸（Ｃ８：０）、カプリン酸（Ｃ１０：０）、ラウリン酸（Ｃ１２：０）、ミリスチン酸（Ｃ１４：０）、パルミチン酸（Ｃ１６：０）、パルミトレイン酸（Ｃ１６：１）、ステアリン酸（Ｃ１８：０）、オレイン酸（Ｃ１８：１）、リノール酸（Ｃ１８：２）及びリノレン酸（Ｃ１８：３）を、以下の割合で主に含む、有効成分。
【表１】
2015521606.tif 000016
＊オレイン酸Ｃ１８：１（６０％〜７０％）；リノール酸Ｃ１８：２（２５％〜４０％）及びリノレン酸Ｃ１８：３（１０％未満）の混合物を含むオレイン酸として定義される。
【請求項２】
前記果実に含有されるアシルグリセロールの部分的又は全体的な加水分解（酵素的な、塩基性又は酸）により取得されることを特徴とし、該加水分解を植物性原料又はかかる植物性原料から得られる脂質抽出物に対して行うことができる、請求項１に記載の有効成分。
【請求項３】
リパーゼ、アルカリ（ナトリウム又はカリウム）水酸化物、アルカリ土類（マグネシウム又はカルシウム）水酸化物、水酸化アンモニウム又は有機性水酸化物、及び塩酸、クエン酸又は硫酸を使用して取得されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の有効成分。
【請求項４】
以下の工程、果実（粒子サイズ３ｍｍ未満）の乾燥、粉砕及び篩分け工程と、ＣＯ２の超臨界液を用いる抽出による、又は炭化水素、アルコール、酢酸エチル、アセトン若しくはそれらの混合物等の有機溶媒を使用する撹拌反応装置若しくはソックスレー装置における固液抽出による、脂質物質の更なる分離工程と、濾過及び溶媒蒸発工程とを、有効成分の取得プロセスに含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の有効成分。
【請求項５】
ペンタン、ヘキサン、ヘプタン、及びオクタンの群からの炭化水素の選択、並びにメタノール、エタノール、プロパノール及び２−プロパノールの群からのアルコールの選択を特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の有効成分。
【請求項６】
急性及び慢性の炎症、酸化ストレスの増加及び骨関節炎の治療及び／又は予防を特徴とする、請求項１に記載の有効成分を含む薬剤。
【請求項７】
良性前立腺肥大症及び前立腺炎の治療及び／又は予防を特徴とする、請求項１に記載の有効成分を含む薬剤。
【請求項８】
急性及び慢性の炎症、酸化ストレスの増加及び骨関節炎の治療及び／又は予防への使用を特徴とする、請求項６に記載の薬剤を含む組成物。
【請求項９】
良性前立腺肥大症及び前立腺炎の治療及び／又は予防への使用を特徴とする、請求項７に記載の薬剤を含む組成物。
【請求項１０】
５０ｍｇ〜１００ｍｇの用量で前記有効成分を含有する、請求項８又は９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
固形経口形態（硬カプセル剤、ソフトゲルカプセル剤、錠剤）、半固形（坐剤、クリーム、軟膏）、又は液体（乳剤、懸濁剤、チンキ剤、ローション又はシャンプー）として製剤化されることを特徴とする、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
請求項１に記載の有効成分を５０ｍｇ〜１０００ｍｇの用量で含有することを特徴とする、栄養補助剤。
【請求項１３】
機能性食品、栄養補助食品、低カロリー食品、食品添加物、飲料及び化粧料の形態での使用を特徴とする、請求項１２に記載の栄養補助剤。
【請求項１４】
炎症及び酸化ストレスの予防における使用を特徴とする、請求項１２又は１３に記載の栄養補助剤。
【請求項１５】
請求項１に記載される有効成分を０．１％〜９０％の濃度で含有することを特徴とする、美容−治療作用を有する製剤。
【請求項１６】
クリーム、石鹸、ローション、シャンプー、入浴ジェル、毛髪ジェル、軟膏、ボディオイル、唇保護剤及び日焼け止めを含むスキンケア製品としての投与を特徴とする、請求項１５に記載の美容−治療作用を有する製剤。
【請求項１７】
炎症及び酸化ストレスを予防するのに使用されることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の美容−治療作用を有する製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、加齢プロセス及びとりわけ良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、前立腺炎、骨関節炎のような多くの病状を伴う炎症プロセス及び酸化ストレスを予防する及び／又は治療する栄養補助剤、医薬製品又は化粧料製品として使用することができる新たな有効成分の取得に関し、またヤシ科のアクロコミア・クリスパ（Acrocomiacrispa）種及びアクロコミア・アクレアタ（Acrocomia aculeata）種の両方の未熟な又は熟した果実からかかる有効成分を取得するプロセスに関する。この有効成分は、炭素数６〜２８の直鎖脂肪酸の混合物、主に飽和：Ｃ８：０、Ｃ１０：０、Ｃ１２：０、Ｃ１４：０、Ｃ１６：０及びＣ１８：０と不飽和：Ｃ１６：１、Ｃ１８：１、Ｃ１８：２及びＣ１８：３とを含み、またステロールと高分子量脂肪族アルコールとを含有し得る。
【０００２】
この有効成分の取得プロセスは、果実を乾燥及び粉砕することにより開始し、脂肪酸の更なる回収を伴う植物性原料又はその脂質画分の部分的又は全体的な加水分解（酵素的な、塩基性又は酸）を含んでもよく、上記脂質画分の選択的抽出は、有機溶媒により又は超臨界液による抽出により行われ得る。加水分解を伴う及び伴わない、いずれの手法も同様の薬理学的効果及び生理学的効果を有する有効成分を得ることを可能とする。
【０００３】
本発明は、言及される有効成分は、それ自体が、又はＢＰＨ、前立腺炎及び骨関節炎を含む炎症及び酸化ストレスを予防及び／又は治療するための栄養製剤、化粧料製剤及び／又は医薬製剤の一部として５０ｍｇ〜１０００ｍｇの用量で使用され得ることから、食品産業及び医薬産業と関連付けられる。
【背景技術】
【０００４】
炎症、すなわち感染、刺激又は外因性物質に対する組織の血管及び細胞の反応は、生体の最も重要な防御機構の一つであるが、この反応が過剰に高まると悪影響を与えるか、又は致命的な場合さえある。炎症は、とりわけ骨関節炎、ＢＰＨ、前立腺炎、炎症性腸疾患及びがんのような慢性疾患の発症に重要な病因因子である。慢性炎症性疾患の発症頻度は、年齢及び平均余命の両方と共に増加する。
【０００５】
炎症の間、活性な細胞は、細胞内シグナル又は細胞外シグナルとして作用する脂質メディエーターの生成に細胞膜の脂質を使用することができる。食品から得られるか又はリノール酸の転化により得られる炭素数２０の多価不飽和脂肪酸（５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）であるアラキドン酸（ＡＡ）が、物理的、化学的及び生物学的刺激によるホスホリパーゼ（phospholipase）Ａ２酵素の活性化によって膜リン脂質から放出される（非特許文献１）。エイコサノイドと名付けられたＡＡ由来代謝産物は、プロスタグランジン及びトロンボキサンの生成をもたらすシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）（ＣＯＸ−１及びＣＯＸ−２）酵素と、ロイコトリエン及びリポキシンを生成する、サイトゾル酵素５−ＬＯＸ、１５−ＬＯＸ及び１２−ＬＯＸのファミリーであるリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）酵素とによって合成される（非特許文献２、非特許文献３）。エイコサノイドは炎症の種々の段階に関与する可能性があり、そのため、エイコサノイドは炎症性滲出液中に存在し、それらの合成は炎症部位で増加される。
【０００６】
炎症は、強度及び反応期間に応じて急性又は慢性に分類される。短期を特徴とする急性炎症は、主に３つの機構、すなわち血管拡張、毛細血管透過性の増加、及び血液から炎症部位への白血球の遊走（主に好中球）を含むが、他の事象、例えば貪食、再生及び細胞修復もまた含まれる（非特許文献４）。急性炎症の特徴的な兆候（signs）は、発赤、腫脹、熱、疼痛、及び機能障害である（非特許文献５、非特許文献６）。
【０００７】
一方、慢性炎症は数週間又は数か月に亘って続く場合があり、損傷部位へのリンパ球及びマクロファージの浸潤を主な特徴とするが、好酸球、肥満細胞及び好中球もまた関与する。血管の増殖及び組織線維化の存在及び壊死もまた、この段階の特徴である。 
【０００８】
多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の酵素性脂質過酸化（ＬＰ）は、細胞代謝経路に関与する酵素によって制御される様式で脂質ラジカル種を産生することから、炎症と酸化ストレスとは密接に関係している。Ｏ２と脂質ヒドロペルオキシド及びエンドペルオキシド（endoperoxides）を産生する一部のＰＵＦＡとの間の反応を触媒することから、ＬＯＸ及びＣＯＸの酵素作用はいずれもこの種のＬＰに関与する。具体的には、ＬＯＸ酵素は、ヒドロキシル化生成物（ＨＥＴＥ）に変換され得るＡＡ生成脂質ヒドロペルオキシド（ＨＰＥＴＥ）に対して触媒的に作用する。
【０００９】
一方、そのようにして生成される有機ヒドロペルオキシド（hydroperoxides）は、遷移金属（銅及び第一鉄イオン）の前に破壊され得る安定な構造であり、気体の炭化水素（hydrocarbures）（エタン及びペンタン）のような二次過酸化生成物と、後に細胞構造を損なう可能性があるアルデヒド（マロンジアルデヒド及び４−ヒドロキシノネナール）との複合混合物を生成する（非特許文献７）。
【００１０】
その点について、炎症プロセスを改善するため、様々な合成及び天然の抗炎症剤が開発されてきた。広く処方される薬効分類の非ステロイド系（ＮＳＡＩＤ）及びステロイド系（ＳＡＩＤ）の抗炎症薬のいずれもが、急性及び慢性の炎症、並びに関連する疼痛を治療するのに非常に有効な抗炎症剤としてよく知られている。それにもかかわらず、これらの薬剤は、多様な有害事象（ＡＥ）を生じ、とりわけ胃腸、腎臓及び心臓血管のＡＥは、特定の抗炎症薬に伴って最も一般的に起こるものである（非特許文献８）。
【００１１】
ＮＳＡＩＤの抗炎症機構は、ＣＯＸ酵素経路の阻害に依存し、ＮＳＡＩＤは非選択的又は非特異的（１つ及び２つのＣＯＸアイソフォームを阻害する）及び選択的ＣＯＸ−２阻害剤として分類される（非特許文献９）。非選択的ＮＳＡＩＤ（とりわけ、アセチルサリチル酸、インドメタシン、ナプロキセン、イブプロフェン、ジクロフェナク）は、疼痛、並びに急性及び慢性の炎症性疾患の進行を効果的に改善するが、それらの主な制限は、長期投与された場合又は高齢患者に投与された場合に重度となり得る胃腸ＡＥの発生である。高血圧及び腎毒性もまた、別のＮＳＡＩＤ関連ＡＥを構成する（非特許文献１０、非特許文献１１）
【００１２】
より最近の世代の薬剤である特異的ＣＯＸ−２阻害剤（セレコキシブ、エトリコキシブ）は、ＣＯＸ−２アイソフォームに対して高い選択性を呈し、より良好な胃忍容性を支持する（非特許文献１２）。しかしながら、特異的ＣＯＸ−２阻害剤の使用は、ロフェコキシブ及びバルデコキシブの市場からの撤退をもたらした重度の心臓血管ＡＥと関連していた（非特許文献１３）。
【００１３】
ＳＡＩＤ（とりわけ、プレドニゾン、プレドニゾロン、デキサメタゾン）は、高血糖、クッシング症候群、高血圧、顔面潮紅、めまい等のいくつかのＡＥ、並びに胃腸及び骨（骨折を引き起こす骨粗鬆症及び骨壊死）のＡＥを生じる（非特許文献１４、非特許文献１５）。
【００１４】
最後に、二重抗炎症薬（dual anti-inflammatory drugs）（５−ＬＯＸ及びＣＯＸの阻害剤）は、非特異的ＮＳＡＩＤの特徴的な胃毒性を呈することなく、慢性炎症プロセスの進行を低減する（非特許文献１６、非特許文献１７）。
【００１５】
良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）は、その発症が前立腺の炎症性細胞浸潤と関係することから、その病因に慢性炎症を含む疾患であり、つまり抗炎症性物質がこの疾患の治療に有用な可能性がある（非特許文献１８、非特許文献１９）。ＢＰＨは、がん及び前立腺炎と共に、前立腺に影響を及ぼし、主に５０歳より高齢の男性において成人男性集団の生活の質を低下する、最も関連する病状である（非特許文献２０、非特許文献２１）。ＢＰＨは、前立腺（膀胱頸部及び尿道の最初の部分を取り囲む腺）の非悪性の制御されていない成長であり、大きくなると尿道閉塞を引き起こす。その結果、ＢＰＨ患者の多くは、尿閉、尿量減少、尿勢低下、排尿潜時の延長、過敏、溢流性尿失禁及び夜間頻尿等の下部尿路症状（ＬＵＴＳ）を患う（非特許文献２２、非特許文献１８、非特許文献１９）。
【００１６】
ＢＰＨの病因は多因子性であり完全には理解されていないが、ホルモン因子と非ホルモン因子との両方が関与することが十分裏付けられている。主なホルモン因子は、前立腺５α−レダクターゼによって触媒されるジヒドロテストステロンにおけるテストステロン転化の増加であり、これは細胞増殖及び前立腺成長（ＢＰＨの静的要素）を引き起こし、一方、主な非ホルモン因子はアドレナリン受容体（α１−ＡＤＲ）により媒介される前立腺及び膀胱平滑筋の両方の緊張増加である（ＢＰＨの動的要素）（非特許文献２２、非特許文献１９）。ホルモン要素が過形成及び前立腺肥大の発症に極めて重要な役割を果たす一方、泌尿生殖器平滑筋緊張の増加はＬＵＴＳ発生の主要因子である（非特許文献１８）。
【００１７】
ＢＰＨの治療は、上記疾患の重症度に応じて経過観察から手術までを含むが、薬物治療がより一般的に使用され、主に、５α−レダクターゼ阻害剤（フィナステリド、デュタステリド）及びα１−ＡＤＲ（アルフゾシン、ドキサゾシン、プラゾシン（prazosin）、テラゾシン（terazosin）、タムスロシン）の使用である（非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５）。
【００１８】
それにもかかわらず、前者（フィナステリド、デュタステリド）を用いる治療がＢＰＨ進行を予防し、前立腺の容積増加をやや減少するが、常に症状緩和をもたらすわけではなく、性欲の減少、インポテンス及び射精障害等のＡＥを生じる場合がある（非特許文献２６、非特許文献２７、非特許文献１８、非特許文献２４）。一方、α１−ＡＤＲ遮断剤（アルフゾシン、ドキサゾシン、プラゾシン、テラゾシン、タムスロシン）は、前立腺の大きさを変えることなくα１−ＡＤＲによる症状を緩和することが多く、起立性低血圧、疲労感、目まい、射精機能障害及び虹彩筋変性等のＡＥを生じる場合がある（非特許文献２８、非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１）。
【００１９】
加えて、ＢＰＨの病因及び進行における慢性炎症の関連性を示す証拠がますます増えつつあることから、慢性炎症及び酸化ストレスは、ＢＰＨの発病と密接に関連しており、この病状を管理するために抗炎症性物質の使用が追加された。一方、いくつかの証拠が、前立腺組織における酸化ストレスとＢＰＨ発症との因果関係を示唆し、前立腺肥大（ＰＨ）の軽減と抗酸化効果との両方をもたらすことができるそのような物質が、肥大化した前立腺に対して更なる利益もたらす可能性がある（非特許文献３２、非特許文献３３、非特許文献３４、非特許文献３５、非特許文献３６）。
【００２０】
セレノア・レペンス（Serenoa repens）果実、ククルビタ・ペポ（Cucurbita pepo）種子、プルヌス・アフリカナ（Prunus africana）のやに及びウルティカ・ディオイカ（Urtica dioica）の根に由来する抽出物を用いる植物療法（非特許文献３７、非特許文献３８、非特許文献３９）は、低プロファイルのＡＥを伴うＢＰＨ／ＬＵＴＳ実体を治療する薬物治療に含まれる。それらの中で、遊離脂肪酸及びエステル型脂肪酸、ステロール、並びに脂肪族アルコールの混合物であるセレノア・レペンス果実の脂質抽出物（ＬＥＳＲ）が最も広く使用される。
【００２１】
ＬＥＳＲの作用機序は多因子性であり、とりわけ５α−レダクターゼの阻害（非特許文献４０、非特許文献４１）、α１−ＡＤＲ拮抗作用（非特許文献４２、非特許文献４３、非特許文献４１）、ＣＯＸ及び５−ＬＯＸの阻害によって媒介されるその抗炎症効果（非特許文献４４、非特許文献４５、非特許文献４６、非特許文献３９）、並びにその抗酸化剤効果（非特許文献４７、非特許文献４８、非特許文献４９）等の上述の幾つかの因子を含む。ＬＥＳＲに関する前臨床毒性データは十分ではないが、良好な忍容性及び低いＡＥ頻度を示す（非特許文献５０）。
【００２２】
Ｄ−００４は、ロイストネア・レジア（Roystonea regia）果実から最近開発されたＢＰＨの治療に潜在的な価値を有する別の脂質抽出物である。ＰＨの実験モデルに対するその効果を支持する作用機序は多因子的であり、前立腺５α−レダクターゼの競合阻害及び前立腺組織のα１−ＡＤＲ媒介収縮応答の非競合的拮抗作用を含む。さらに、Ｄ−００４は多面的（pleiotropic）抗炎症効果（ＣＯＸ及び５−ＬＯＸの両方の阻害につながる）及び抗酸化剤効果（正常及び肥大した前立腺組織の両方に対する）をもたらし、Ｄ−００４の有効性に寄与する可能性がある（非特許文献５１、非特許文献５２）。
【００２３】
最も一般的な変性性関節炎である骨関節炎（ＯＡ）は、炎症プロセスに関与する別の病状であり、軟骨基質（プロテグリカン、コラーゲン及び水からなる）の合成と分解との不均衡、軟骨破壊、軟骨下骨の障害、及び更なる炎症反応を特徴とし、軟骨は再生するのみならず、消滅する場合もある（非特許文献５３）。
【００２４】
過去には、ＯＡに関する学術調査は、軟骨変性が最も関連する根本的な病的変化とされていたため軟骨変性に注目していたが、現在では、軟骨をこえて、ＯＡが軟骨下骨、靭帯、関節包、滑膜、関節周囲の筋肉、半月板及び神経終末等の全ての関節構成要素に関与することが受け入れられている（非特許文献５４、非特許文献５５）。ＯＡにおける軟骨下骨の応答は、二次炎症性の可能性がある小結節として、又は周辺構造を刺激し得る骨増殖として突出する辺縁骨棘の発症を引き起こす新たな骨の生成を含む（非特許文献５６、非特許文献５３）。
【００２５】
ＯＡを治療するのに使用される主な薬剤は、ＮＳＡＩＤ及びＳＡＩＤ等の疼痛を緩和し、機能不全を改善するものであり、ＯＡの治療により使用されるものであるが、それらは、軟骨の損傷を予防しないことから上記疾患の経過を変更しない（非特許文献５７）。また、膝のＯＡを伴う高齢女性において治療していない高齢女性と比べ、アレンドロネート及びエストロゲンが軟骨下骨の病変を著しく低減することを示し、これはＯＡが全ての関節構成要素（軟骨及び骨）に関与することを支持することから、骨吸収抑制薬（Antiresorptivedrugs）もＯＡを管理するため使用されてきた（非特許文献５８）。
【００２６】
酸化ストレスの増加、活性酸素種（ＲＯＳ）及びフリーラジカル（ＦＲ）の細胞代謝による産生と、かかる産生及び／又は効果に対抗する抗酸化系の能力との間の不均衡は、ＬＰの増加、並びにビタミンＣ及びスーパーオキシドジスムターゼ活性（ＳＯＤ）等の内因性（endogen）抗酸化防御の減少を含む、ＯＡ発症機序に対する寄与因子として理解される（非特許文献５９、非特許文献６０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Aster, 2009
【非特許文献２】Diaz, 2001
【非特許文献３】Gajraj, 2003
【非特許文献４】Gallin et al. 1992
【非特許文献５】Parakramaand Clive, 2005
【非特許文献６】Porth,2007
【非特許文献７】Halliwell,1995
【非特許文献８】Salles, 2007
【非特許文献９】Sciulli et al. 2005
【非特許文献１０】Garcia and Hernandez-Diaz, 2004
【非特許文献１１】Lanas and Fernandez, 2006
【非特許文献１２】Silverstein et al. 2000
【非特許文献１３】Blandizzi et al. 2008
【非特許文献１４】Mazziotti et al. 2006
【非特許文献１５】Kerachian et al. 2009
【非特許文献１６】Whitehouse and Butters, 2003
【非特許文献１７】Whitehouse, 2004
【非特許文献１８】Roehrborn, 2008
【非特許文献１９】Zhu and McGinley, 2009
【非特許文献２０】Fernandez and Pereira, 2008
【非特許文献２１】Alcaraz et al., 2008
【非特許文献２２】Nix and Carson, 2007
【非特許文献２３】Doggrell, 2004
【非特許文献２４】Roehrborn et al., 2008
【非特許文献２５】Schwinn andRoehrborn, 2008
【非特許文献２６】Sandhu and Te, 2004
【非特許文献２７】Gonzalez and Vegas, 2007
【非特許文献２８】Lepor, 2006
【非特許文献２９】Van Dijk et al., 2006
【非特許文献３０】Bar-Yosef et al., 2008
【非特許文献３１】Prata et al., 2009
【非特許文献３２】Aydin etal., 2006
【非特許文献３３】Aryal etal., 2007
【非特許文献３４】Siddiquiet al., 2006
【非特許文献３５】Belostottskaiaet al., 2006
【非特許文献３６】Prasadet al., 2006
【非特許文献３７】Wiltet al., 2000
【非特許文献３８】Koch,2001
【非特許文献３９】Curtis, 2008
【非特許文献４０】Raynaud et al., 2000
【非特許文献４１】Abe et al., 2009
【非特許文献４２】Gerber et al., 2001
【非特許文献４３】Debruyne et al., 2002
【非特許文献４４】Mogulet al., 2000
【非特許文献４５】Potenziani, 2003
【非特許文献４６】Raman et al., 2007
【非特許文献４７】Henry, 2000
【非特許文献４８】Perona, 2005
【非特許文献４９】Chapkin et al., 2007
【非特許文献５０】Rockville, 2005
【非特許文献５１】Menendez,2006
【非特許文献５２】Perez,2008
【非特許文献５３】Little, 2008
【非特許文献５４】Lotz, 2010
【非特許文献５５】Heinegard, 2011
【非特許文献５６】Buckland-Wright, 2004
【非特許文献５７】McMahon, 2008
【非特許文献５８】Carbone, 2004
【非特許文献５９】Manesh, 2005
【非特許文献６０】Chandran, 2009
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
それにもかかわらず、抗酸化効果と炎症プロセスを予防及び治療する効果とを有するアクロコミア・クリスパ（Ａ．クリスパ（A, crispa））種及び／又はアクロコミア・アクレアタ（Ａ．アクレアタ（A. aculeata）種の果実からの有効成分の取得は、これまで参照されたものを含めて、以前に報告されておらず、また、この種の物質を取得する単純かつ経済的な方法も報告されていない。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
本発明において請求項に係る有効成分は、合成薬のＡＥを示すことなく、上述の天然起源の抽出物に対する有効性及び効力を上回る。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明の目的である上記有効成分を取得する手法は、いずれもヤシ科のＡ．クリスパ種及び／又はＡ．アクレアタ種の未熟な又は熟した果実を用い、これらの果実を周囲環境又はオーブンでよく乾燥し、粒子サイズ３ｍｍ未満が得られるまでハンマー、ブレード又はラミネーターディスクミルで挽く。脂質有効成分は、かかる乾燥砕製物から得られ、主に脂肪酸で構成されるが、低い割合でステロール及び脂肪族アルコールも含有し得る。この有効成分の取得は、脂肪酸の更なる回収を伴う酵素的、塩基性若しくは酸による加水分解（全体的又は部分的）を含んでもよく、又は有機溶媒（炭化水素、アルコール、酢酸エチル、アセトン又はそれらの混合物）による選択的抽出若しくは超臨界液による抽出を含んでもよい。加水分解プロセスを、植物性砕製物又はそれから得られた脂質有効成分に直接適用することができる。
【００３１】
アシルグリセロール又はエチルエステルとして最も多く脂肪酸を含む有効成分を取得するため、植物の乾燥砕製物を、有機溶媒を用いる選択的抽出に供し、その後、更なる濾過及び低圧での加熱による溶媒の除去又は超臨界条件での抽出に供する。抽出プロセスは振蕩反応装置又はソックスレー装置等の従来の固液抽出装置において為され、脂肪酸（アシルグリセロール、エチルエステルとして、またより少ない割合で遊離して存在する）が、炭素数１〜３のアルコール（メタノール、エタノール、２−プロパノール）、炭素数５〜８の炭化水素（ペンタン、イソペンタン、ヘキサン、ヘプタン及びオクタン）、酢酸エチル、アセトン、又はそれらの混合物等の適当な溶媒中の選択的抽出により植物原料中に存在する他の成分から分離され得るが、ＣＯ２を用いた超臨界抽出によっても為され得る。エタノール抽出は、果実中に極めてわずかな割合で存在するエチルエステルの取得を支持するが、酸性媒質中の方が好ましい。
【００３２】
遊離形態の脂肪酸を含む有効成分を得るため、酵素的（リパーゼによる）、塩基性（アルカリ、アルカリ土類（alkaline-earthen）、有機水酸化物、又は水酸化アンモニウムによる）でもよく、又は酸（塩酸、クエン酸、又は硫酸による）でもよい加水分解プロセスが必要とされる。植物の砕製物に対して、又はそれから得られる油性抽出物に対し全体的でもよく又は部分的でもよい加水分解が行われてもよく、遊離脂肪酸はその後回収される。塩基性加水分解が使用される場合、希釈された酸媒質（塩酸、クエン酸、又は硫酸を使用することによる）中での適切な撹拌は脂肪酸の遊離を可能とし、上部の油相を形成することによって脂肪酸が水相から分離され、順に処理水で洗浄され、低圧にて熱乾燥される。
【００３３】
本方法により、植物の乾燥砕製物からの１０％〜４０％の収率が達成され、遊離脂肪酸又はエステル型脂肪酸（アシルグリセロール又はエチルエステル等）、主に炭素数８、１０、１２、１４、１６及び１８の飽和脂肪酸、及び炭素数１６及び１８の不飽和脂肪酸で主に構成されるが、ステロール及び脂肪族アルコールも含有し得る、この有効成分の取得を確実なものとする。上記混合物中の脂肪酸の割合（遊離又はエステル型）は表１に示される。
【００３４】
表１．有効成分中の脂肪酸の含有量
【表１】
2015521606.tif 000002
＊オレイン酸Ｃ１８：１（６０％〜７０％）；リノール酸Ｃ１８：２（２５％〜４０％）及びリノレン酸Ｃ１８：３（１０％未満）の混合物を含むオレイン酸として求められ、報告される。
【００３５】
全ての評価が、この物質すなわち有効成分が、ＢＰＨ、前立腺炎及び骨関節炎を含む炎症プロセス及び酸化ストレスの予防及び／又は治療のための現在知られている植物起源の他の有効成分よりも効果的且つ強力であることを支持する。この有効成分は、齧歯類研究で毒性がないことを示し、ヒトにおいて良好な忍容性を示し、その潜在用途に対する利点を表している。
【実施例】
【００３６】
本発明の目的は、本発明の範囲を限定しない実施例を使用して以下に詳述される。
【００３７】
実施例１
Ａ．クリスパの新鮮な果実（５ｋｇ）を採取し、７日間に亘って６０℃の制御温度のオーブンに置き、１５００μｍ〜２０００μｍの粒子サイズを得るまでブレードミルで更に製粉した。その後、この粉末１０００ｇを取って振蕩反応装置に置き、１６時間に亘って一定の振蕩を使用して５５℃にてヘキサン１０Ｌにより抽出し、この工程を３回繰り返した。その後、生成物を濾過し、真空補助蒸発装置において５０℃にて蒸発乾固させた。得られた物質は１２０ｇの重さであり、ガスクロマトグラフィーを使用して決定された表２に示される組成を有していた。同じ手法をＡ．アクレアタ果実に適用し、１５０ｇの有効成分を得た。
【００３８】
表２．有効成分中の脂肪酸の組成（％）
【表２】
2015521606.tif 000003
＊オレイン酸Ｃ１８：１；リノール酸Ｃ１８：２及びリノレン酸Ｃ１８：３の混合物を含むオレイン酸として求められ、報告される。
【００３９】
実施例２
Ａ．アクレアタの新鮮な果実（１０ｋｇ）を採取し、１５日間に亘って周囲条件で乾燥し、その後、ハンマーグライディングミルを使用して１５００μｍ未満の粒子サイズまで挽いた。この粉末１０００ｇを取り、アルカリ加水分解に供した。３０％ＨＣｌにより脂肪酸が遊離され、有機相を抽出して水で５回洗浄し、濾過し、真空補助蒸発装置において８０℃にて蒸発乾固させた。得られた物質を計量（２００ｇ）し、その後、ガスクロマトグラフィーにより解析し、表３に示される組成を得た。同じ手法をＡ．クリスパ果実に適用し、２３０ｇの有効成分を得た。
【００４０】
表３．有効成分中の脂肪酸の組成（％）
【表３】
2015521606.tif 000004
＊オレイン酸Ｃ１８：１；リノール酸Ｃ１８：２及びリノレン酸Ｃ１８：３の混合物を含むオレイン酸として求められ、報告される。 
【００４１】
実施例３
Ａ．クリスパ（５ｋｇ）及びＡ．アクレアタ（５ｋｇ）の新鮮な果実を採取し、７日間に亘って制御温度（４５℃）のオーブンで乾燥し、その後、１５００μｍ〜１８００μｍの粒子サイズに達するまでグライディングミルで砕いた。この粉末１０００ｇを取って、１６時間に亘り３５℃、２５０バールでＣＯ２１０Ｌを用いて連続的超臨界液抽出に供した。その後、生成物を酵素的加水分解に供し、計量（１５０ｇ）し、ガスクロマトグラフィーによって解析を行った。表４に要約される組成を示す。
【００４２】
表４．有効成分中の脂肪酸の組成（％）
【表４】
2015521606.tif 000005
＊オレイン酸Ｃ１８：１；リノール酸Ｃ１８：２及びリノレン酸Ｃ１８：３の混合物を含むオレイン酸として求められ、報告される。 
【００４３】
実施例４
Ａ．クリスパの新鮮な果実（１０ｋｇ）を採取し、２０日間に亘って周囲条件で乾燥し、１０００μｍ未満の粒子サイズまでラミネーターディスクミルで製粉した。この粉末１０００ｇを取り、ソックスレー装置に置いて、３６時間に亘ってエタノール１０Ｌで抽出し、その後、濾過し、真空補助蒸発装置を使用して８０℃にて蒸発乾固させた。溶媒除去後、６０℃にて水酸化アンモニウム溶液による部分加水分解を行った。その後、脂肪酸を、１０％Ｈ２ＳＯ４を用いて遊離させ、この抽出物を水で洗浄し、真空下で乾燥し、計量（３００ｇ）し、ガスクロマトグラフィーにより解析した。その組成を表５に示す。同じ手法をＡ．アクレアタ果実に適用した場合、２８０ｇの有効成分を得た。
【００４４】
表５．有効成分中の脂肪酸の組成（％）
【表５】
2015521606.tif 000006
＊オレイン酸Ｃ１８：１；リノール酸Ｃ１８：２及びリノレン酸Ｃ１８：３の混合物を含むオレイン酸として求められ、報告される。 
【００４５】
実施例５
Ａ．クリスパの新鮮な果実（１０ｋｇ）を採取し、２０日間に亘って周囲条件で乾燥し、１０００μｍ未満の粒子サイズまでラミネーターディスクミルで製粉した。１０００ｇを取り、３６時間に亘って６５℃にて撹拌反応装置においてエタノール１０Ｌを用いて抽出し、濾過し、減圧下で８０℃にて蒸発乾固させ、その後、溶媒除去の後ＨＣｌを用いて加水分解した。得られた抽出物を水で洗浄し、真空下で乾燥し、計量（２５０ｇ）し、ガスクロマトグラフィーにより解析した。その組成を表６に示す。同じ手法をＡ．アクレアタ果実に適用した場合、２２０ｇの有効成分を得た。
【００４６】
表６．有効成分中の脂肪酸の組成（％）
【表６】
2015521606.tif 000007
＊オレイン酸Ｃ１８：１；リノール酸Ｃ１８：２及びリノレン酸Ｃ１８：３の混合物を含むオレイン酸として求められ、報告される。
【００４７】
実施例６
実施例１で言及される有効成分の効果を、慢性炎症モデル（コットン肉芽腫）において評価するため、雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２５０ｇ〜２７０ｇ）を７日間実験室条件に適応させた。適応期間を終えると、ラットを異なる群に無作為化し、チオペンタールナトリウム（３０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔し、ラットの背部を７０％アルコール溶液で消毒し、背外側中央領域においてブラントニッパー（blunt nippers）により切開を行って皮下トンネルを作製し、そこに５０ｍｇの滅菌コットンペレットを埋め込んだ。傷を縫い、その後、局所的に消毒剤溶液を塗布した。最後の投与から１８時間後、エーテル雰囲気でラットを屠殺し、肉芽腫を注意深く切り取って摘除し、一定重量を達成するまで２４時間に亘って６０℃で乾燥した。乾燥肉芽腫の重量及び埋め込んだコットンペレットの重量（５０ｍｇ）の差によって、乾燥肉芽腫重量を算出した。陽性対照群の肉芽腫重量を１００％として阻害度（％）を推定した。
【００４８】
Ａ．クリスパ及びＡ．アクレアタの果実の抽出物を、Ｔｗｅｅｎ２０／水ビヒクル中に懸濁した。ラットを、７群（１群当たりラット１０匹）、すなわち、１つのビヒクル対照群、Ａ．クリスパ抽出物で処理される３群、及びＡ．アクレアタ抽出物で処理される３群（いずれの場合もそれぞれ２５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ及び５００ｍｇ／ｋｇ）に無作為に分配した。コットンペレットを埋め込んだ後、次の６日間に亘って胃挿管（gastric gavage）により投与を行い（５ｍＬ／ｋｇ）、その後、肉芽腫の乾燥重量を定量した。マンホイットニーＵ検定により対照群と処理群との比較を行った。
【００４９】
動物の背外側中央領域におけるコットンペレットの皮下への埋め込みは、肉芽腫形成を誘導した（表７）。全ての処理は、対照群と比較して肉芽腫の乾燥重量を有意に減少した。Ａ．クリスパ及びＡ．アクレアタの果実抽出物の効果は、５００ｍｇ／ｋｇの用量で、それぞれ５６．４％阻害及び５５．４％阻害まで用量と共に増加した。
【００５０】
本研究の結果は、ラットのコットンペレット肉芽腫モデルにおけるＡ．クリスパ及びＡ．アクレアタの果実抽出物の有効性を示し、肉芽腫重量の有意な減少が観察され、これは果実抽出物の抗炎症性の治療薬の可能性を示す。
【００５１】
表７．ラットのコットンペレット肉芽腫モデルにおけるＡ．クリスパ抽出物及びＡ．アクレアタ抽出物の効果。
【表７】
2015521606.tif 000008
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１対照との比較（マンホイットニーＵ検定）
【００５２】
実施例７
実施例２で言及された有効成分の効果を急性炎症モデル（カラギーナン誘導性胸膜炎）において評価した。雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（１９０ｇ〜２９０ｇ）を７日間実験室条件に適応させ、その後、異なる群に無作為に分配した。
【００５３】
カラギーナン誘導性胸膜炎は、処理剤の経口投与後１時間で引き起こした。簡潔には、ラットをエーテル雰囲気で麻酔した。３００μＬの生理食塩水溶液中１％（ｗ/ｖ）カラギーナン懸濁液の胸腔内投与により、ラットにおいて胸膜炎を誘導した。特別に適合された針をラット胸腔の右側に導入してカラギーナン懸濁液を注入し、陰性対照には等容量の滅菌生理食塩水を注入した。５時間後、エーテル麻酔下でラットを屠殺し、それらの胸腔を開いて胸膜滲出液を収集し、１ｍＬの３．１５％クエン酸ナトリウム中でホモジナイズして、目盛り付プラスチック管で滲出液の容量（ＥＶ）として計測した。血液で汚染された滲出液を廃棄した。
【００５４】
Ａ．クリスパ及びＡ．アクレアタの果実抽出物をＴｗｅｅｎ２０／水溶液に懸濁し、胃挿管により単回用量（５ｍｇ／ｋｇ）として投与した。ラットを８群（１群当たりラット１０匹）、すなわち、胸腔に生理食塩水溶液を注入される１つの陰性対照群と、カラギーナンを注入される７群、すなわち、ビヒクルで処理される１つの陽性対照群、それぞれＡ．クリスパ抽出物で処理される３群（２５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ及び５００ｍｇ／ｋｇ）及びＡ．アクレアタ抽出物で処理される３群（２５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ及び５００ｍｇ／ｋｇ）とに無作為に分配した。マンホイットニーＵ検定により対照群と処理群との比較を行った。
【００５５】
カラギーナンの注入は、陰性対照群と比較して陽性対照群の滲出液におけるＥＶ及びＭＰＯ活性の有意な増加をもたらした（表８）。
【００５６】
両方の物質の単回経口用量の投与（２５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ）は、本発明の目的である、有意かつ用量依存的なＥＶの減少に効果的であり、アッセイされた最も大きい用量（５００ｍｇ／ｋｇ）でＭＰＯの酵素活性を阻害し、対照群に対して５０％を超える阻害パーセントを達成した。
【００５７】
上記結果は、ＥＶ及びＭＰＯ活性の有意かつ用量依存的な減少によりラットのカラギーナン誘導性胸膜炎におけるＡ．クリスパ及びＡ．アクレアタの果実抽出物の有効性を示し、これは果実抽出物の抗炎症性効果の可能性を示す。
【００５８】
表８．カラギーナン誘導性胸膜炎を伴うラットの胸膜滲出液におけるＥＶ及びＭＰＯに対するＡ．クリスパ抽出物及びＡ．アクレアタ抽出物による経口処理の効果
【表８】
2015521606.tif 000009
値は平均±ＳＭＥ（平均標準誤差）で表される；
ＥＶ：浸出液の容量；ＭＰＯ：ミエロペルオキシダーゼ（正：myeloperoxidase）；Ｉ（％）：阻害割合；Ｃ：カラギーナン。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。陽性対照群との比較（マンホイットニーＵ検定）
【００５９】
実施例８
急性炎症モデル（マウスの耳においてキシレンによって誘導される浮腫）におけるＳ．レペンス（S. repens）（ＬＥＳＲ）及びＲ．レジア（R. regia）（Ｄ−００４）の果実の脂質抽出物との実施例３で言及される有効成分の効果の比較研究。
【００６０】
この研究を行うため、雄性の幼若マウスＯＦ１（２０ｇ〜３０ｇ）を７日間実験室条件に適応させた。適応期間の後、マウスを６群、すなわち、１つの陰性対照群（ビヒクル）、１つの陽性対照群（ビヒクル＋キシレン塗布）、並びにキシレンと共に適用される、４００ｍｇ／ｋｇの用量のＡ．クリスパ、Ａ．アクレアタ、ＬＥＳＲ及びＤ−００４の抽出物で処理される４群に無作為に分配した。浮腫誘導の１時間前に全ての処理剤を投与した。
【００６１】
マウス右耳背面における３０μＬのキシレンの局所塗布によって浮腫の誘導を行った。２時間後、浮腫を定量するためマウスをエーテル雰囲気で麻酔し、頸椎脱臼により屠殺した。両耳を切断し、化学天秤（Mettler Toledo）で計量した。浮腫の形成を、右耳（浮腫を伴う）と左耳（浮腫を伴わない）との重量（ｍｇ）の差によって算出した（ΔＯ）。マンホイットニーＵ検定によって対照群と処理群との比較を行った。
【００６２】
キシレンの局所塗布は、両方の耳の重量差を有意に増加し、陰性対照群と比較した浮腫の形成を示した（表９）。全ての処理は、浮腫の増加を有意に阻害した。Ａ．クリスパ及びＡ．アクレアタの抽出物（それぞれ、５４．５％及び５２．９％の減少）は、ＬＥＳＲ（２６．７％の減少）及びＤ−００４（３４％の減少）よりもより効果的であった。
【００６３】
これらの結果は、マウスの耳におけるキシレンの局所塗布により誘導される浮腫に対するＡ．クリスパ及びＡ．アクレアタの果実抽出物（４００ｍｇ／ｋｇ）を用いた経口処理の有効性が、同様の用量のＬＥＳＲ及びＤ−００４より優れていたことを示す。
【００６４】
表９．マウスの耳においてキシレンにより誘導される浮腫に対するアクロコミア・クリスパ抽出物、アクロコミア・アクレアタ抽出物、ＬＥＳＲ及びＤ００４の効果
【表９】
2015521606.tif 000010
値は平均±ＳＭＥ（平均標準誤差）で表される；
Ｉ（％）：阻害割合
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１陽性対照との比較、
＋ｐ＜０．０５アクロコミア・クリスパとの比較；
†ｐ＜０．０５アクロコミア・アクレアタとの比較（マンホイットニーＵ検定）
【００６５】
実施例９
実施例４で言及される有効成分の抗酸化剤活性を評価するため、雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（体重２００ｇ〜２５０ｇ）を７日間実験室条件に適応させた。適応期間後、動物を異なる群に無作為に分配し、エーテル雰囲気で麻酔し、腹部大動脈により出血させた。
【００６６】
ＥＤＴＡ（１０％）を用いて血液を収集した（最終濃度：１ｍｇ／ｍｌの血液）。１０分間３０００ｒｐｍの遠心分離により血漿を得て、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）及びスルフヒドリル（sulfhydryl）基（ＳＨＧ）の濃度を決定するのに使用した（それぞれＬＰ及びタンパク質酸化のマーカー）。
【００６７】
Ａ．クリスパ及びＡ．アクレアタの果実抽出物をＴｗｅｅｎ−２０／水の溶液に懸濁した。ラットを、９群（１群当たりラット１０匹）、すなわち、ビヒクルにより処理される１つの対照、Ａ．クリスパの抽出物により処理される４群、及びＡ．アクレアタの抽出物により処理される４群（５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇ）に無作為に分配した。３０日間に亘り胃挿管で処理剤を投与した。その後、ＭＤＡ及びＳＨＧの血漿濃度を生化学的に決定した。マンホイットニーＵ検定を使用して対照群と処理群との比較を行った。
【００６８】
表１０に見られるように、処理はいずれも有意かつ顕著にＭＤＡ及びＳＨＧの血漿値を減少した。Ａ．クリスパによる処理は、６３．４％（ＭＤＡ）及び５９．４％（ＳＨＧ）の減少を達成した。本研究の結果は、ＭＤＡ及びＳＨＧの血漿レベルを減少するＡ．クリスパ及びＡ．アクレアタの果実抽出物の有効性を示し、これはこれらの抽出物の抗酸化剤効果を示している。
【００６９】
表１０．ラットにおけるＭＤＡ及びＳＨＧの血漿値に対するＡ．クリスパ及びＡ．アクレアタの抽出物による経口処理の効果
【表１０】
2015521606.tif 000011
値は平均±ＳＭＥ（平均標準誤差）で表される；
Ｉ（％）：阻害割合
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１対照群との比較（マンホイットニーＵ検定）
【００７０】
実施例１０
実施例５に言及される有効成分のラットにおける前立腺肥大に対する潜在効果を評価するため、有効成分をビヒクルＴｗｅｅｎ２０／水に懸濁した。７日間実験室条件に適応させた雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（３００ｇ〜３６０ｇ）を８つの実験群、すなわち、１つの陰性対照群（ビヒクル）と、テストステロン注射（４ｍｇ／ｋｇ）によって誘導される前立腺肥大を伴う７群、すなわち、ビヒクルのみを受ける１つの陽性対照、並びにＡ．クリスパ抽出物及びＡ．アクレアタ抽出物（５０ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇ）により処理される６群とに無作為に分配した。プロピオン酸テストステロンを植物油に溶解し、１４日間に亘り毎日皮下注射した。
【００７１】
１４日間に亘り１日１回、胃挿管（５ｍｌ／ｋｇ）による経口処理剤を投与した。ラットをエーテル雰囲気下で屠殺し、出血させて腹側正中線で切開により開腹し、前立腺及び膀胱を切り取り、摘除して計量した。マンホイットニーＵ検定を使用して対照群と処理群との比較を行った。
【００７２】
テストステロン注射は、陰性対照群と比較して前立腺重量及び前立腺重量／体重比の有意な増加をもたらした（表１１）。１４日間のＡ．クリスパ及びＡ．アクレアタの果実抽出物のラットへの経口投与は、テストステロン注射によって誘導された前立腺サイズの増加を有意に減少した（アッセイした最も大きい用量の約４４％）。
【００７３】
これらの結果は、齧歯類においてテストステロンによって誘導される前立腺サイズの増加を有意かつ顕著に減少するＡ．クリスパ及びＡ．アクレアタの果実抽出物の有効性を示し、これは前立腺肥大に対するこれらの抽出物の効果の可能性を示している。
【００７４】
表１１．ラットにおけるテストステロン誘導性前立腺肥大に対するＡ．クリスパ抽出物及びＡ．アクレアタ抽出物の効果
【表１１】
2015521606.tif 000012
値は平均±ＳＭＥ（平均標準誤差）で表される；
Ｔ：テストステロン；ＢＷ：体重（ｇ）；ＰＷ：前立腺重量（ｍｇ）；
Ｉ（％）：阻害割合
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１陽性対照との比較（マンホイットニーＵ検定）
【００７５】
実施例１１
骨関節炎モデルにおける実施例１で言及される有効成分の効果を、ラットでモノヨードアセテート（ＭＩＡ）によって誘導された関節炎モデルにおいて評価した。７日間実験室条件に適応させた雄性Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（１５０ｇ〜１７５ｇ）を、８つの実験群、すなわち、１つの陰性対照（ビヒクル）と、ＭＩＡ誘導性骨関節炎を伴う７群、すなわち、ビヒクルのみを受ける１つの陽性対照、並びにＡ．クリスパ及びＡ．アクレアタの果実抽出物（１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ及び４００ｍｇ／ｋｇ）によって処理される６群とに無作為に分配した。
【００７６】
左膝の滑液腔におけるＭＩＡ（５０μｌ）の単回注射により、関節の損傷を誘導した。等容量の生理食塩水を右膝に注射した。損傷誘導後すぐに胃挿管（５ｍＬ／ｋｇ）により処理剤を投与した。その後、ラットを麻酔下で屠殺した。
【００７７】
左膝の関節を取り出し、組織学的研究を行う目的で２４時間に亘りホルモル中に保存した。その後、４週間、４℃にてＥＤＴＡ二ナトリウム０．５Ｍ（ｐＨ７．４）中で試料を脱灰した。脱灰の完了時に、関節を半分に２つにするために縦面で切片を作製し、更に軟骨を解析するためパラフィン包埋し、切断し、ヘマトキシリン、エオシン、及びトルイジンブルーで染色した。以下の通り修正したＭａｎｋｉｎスコアを使用して深度及び拡大に従って軟骨の損傷を評価した。
深度（０〜５）：０−正常、１−最小、表層帯のみに影響する、２−中間帯上部への軽度侵入、３−中間帯における中等度の侵入、４−深帯への顕著な侵入であるが、分割線又は非石灰化軟骨と石灰化軟骨との間の界面（タイドマーク）までは及んでいない、及び５−非石灰化軟骨と石灰化軟骨との間に存在する分割線までの全ての厚みにおける重度の分解。
基質着色の減少（０〜４）：０−正常／軽度の着色減少、１−放射層における着色の減少、２−領域間基質における着色の減少、３−細胞外基質のみに存在する着色、及び４−着色なし。
軟骨の変化（０〜６）：０−正常、１−放射層における亀裂を含む不規則な表面、２−パンヌス、３−軟骨表層の欠如、４−軽度の崩壊（細胞列の欠如、一部のわずかな表層集塊）、５−石灰化軟骨層における亀裂、及び６−崩壊（無秩序な構造、集塊及び破骨細胞活性）。
炎症の拡大（０〜４）：０−正常（浸潤なし）、１−最小の炎症性浸潤、２−軽度の浸潤、３−中等度の浸潤、及び４−顕著な浸潤。
細胞異常（０〜３）：０−正常、１−小さい表層集塊を含む細胞過形成、２−集塊、及び３−低細胞性。
脛骨への損傷の拡大（０〜３）：０−正常、１−最小、中等度、及び３−重度
皮質骨及び海綿骨の喪失（０〜４）：０−正常、１−少数の部位における皮質骨の最小の喪失、２−皮質骨又は海綿骨の軽度の喪失、３−多くの部位における骨の中等度の喪失、及び４−皮質骨の炎症プロセスであるパンヌスによる全ての厚みにおける断片化及び浸透を伴う多くの部位における骨の顕著な喪失。
破骨細胞の存在（０〜４）：０−正常（実質的に破骨細胞なし）、１−少数の破骨細胞（冒された骨表面の大半で５％）、２−いくつかの破骨細胞（冒された骨表面の大半で５％〜２５％）、３−多くの破骨細胞（冒された骨表面の大半（majority）で２６％〜５０％）、及び４−大量の破骨細胞（冒された骨表面の５０％超）。
【００７８】
調査した組織学パラメーターのスコアの中央値（median）を算出した。組織学的スコアは、評価した全ての組織学的変数の平均値として算出された。マンホイットニーＵ検定により対照群と処理群との比較を行った。
【００７９】
陰性対照群の動物はいずれも、調査した変数に応じた損傷の痕跡を示さず、陽性対照群の動物は全て、調査した変数に応じた損傷の痕跡を示した（表１２、表１３及び表１４）。Ａ．クリスパ及びＡ．アクレアタの果実抽出物の投与は、膝関節においてＭＩＡによって誘導される組織学的スコアの増加を有意に減少した（アッセイした最も大きい用量の５０％）。
【００８０】
これらの結果は、ＭＩＡの単回注射により誘導されたラット左膝の滑液腔における損傷を有意かつ顕著に軽減するＡ．クリスパ及びＡ．アクレアタの果実抽出物の有効性を示し、これは骨関節炎に対する治療効果の可能性を示す。
【００８１】
表１２．組織学的スコアの合計に対するＡ．クリスパ抽出物及びＡ．アクレアタ抽出物の効果
【表１２】
2015521606.tif 000013
陽性対照及び抽出物を用いた処理群の全ては、ＭＩＡ注射を受けた。
値は平均±ＳＭＥ（平均標準誤差）で表される；
Ｉ（％）：阻害割合
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１陽性対照との比較（マンホイットニーＵ検定）
【００８２】
表１３．軟骨の損傷に対するＡ．クリスパ抽出物及びＡ．アクレアタ抽出物の効果
【表１３】
2015521606.tif 000014
陽性対照及び抽出物を用いた処理群の全ては、ＭＩＡ注射を受けた。
値は平均±ＳＭＥ（平均標準誤差）で表される；
Ｉ（％）：阻害割合
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１陽性対照との比較（マンホイットニーＵ検定）
【００８３】
表１４．軟骨損傷に対するＡ．クリスパ抽出物及びＡ．アクレアタ抽出物の効果
【表１４】
2015521606.tif 000015
陽性対照及び抽出物を用いた処理群の全ては、ＭＩＡ注射を受けた。
値は平均±ＳＭＥ（平均標準誤差）で表される；
Ｉ（％）：阻害割合
＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１陽性対照との比較（マンホイットニーＵ検定）
【００８４】
実施例１２
実施例１で言及される有効成分を使用して、以下のように幾つかの製剤が開発された：コーンスターチ、ラクトース、タルク、ゼラチン、クロスカルメロースナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、カルボキシメチルセルロースを含有する錠剤等の５０ｍｇ〜１０００ｍｇの用量の固体経口剤形；又は硬カプセル剤及びソフトゲルカプセル剤；０．１％〜９０％の濃度の実施例１に言及される有効成分と、賦形剤としての固形ワセリン、セチルアルコール、ポリソルベート、プロピレングリコール、グリセリン、ステアリルアルコール、ラウリル硫酸ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、第一リン酸ナトリウム、精製水、エデト酸二ナトリウム、カルボポール、ジメチコン、ミツロウ、及びトリエタノールアミンとを含有するクリーム；０．１％〜９０％の濃度の実施例１に言及される有効成分と、賦形剤としてのポリソルベート、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロース、グリセリン、ラウリル硫酸ナトリウム、メチルパラベン、プロピルパラベン、第一リン酸ナトリウム、精製水及びトリエタノールアミンとを含有するローション及びシャンプー。
【国際調査報告】
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