(57)【要約】  本発明は、経時的な及び／又はストレスに曝露される間の、インビトロ、エクスビボ、及びインビボでの生物学的細胞機能及び活性の維持及び／又は改善のため、並びに不適切な細胞機能又は細胞死の予防のために、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンを使用する方法に関する。メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンは、インビトロ、インビボ、エクスビボ、又は移植に関わらず細胞生存を促進するために、及び細胞保護剤として、細胞生存性を増加させるため、及び始原細胞又は幹細胞の成熟細胞への変換を改善するために、使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
経時的に及び／又はストレスに曝露される間に細胞の生物学的機能及び活性を維持又は改善するための、純粋な又は生成物若しくは組成物中に製剤化された、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの使用であって、細胞には、動物、ヒト、植物、並びに細菌、酵母、及び真菌等の微生物からの細胞が含まれる、使用。
【請求項２】
細胞生存性を増加させるための、細胞生存及び細胞保護剤としての、純粋な又は生成物若しくは組成物中に製剤化された、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの使用であって、細胞には、動物、ヒト、植物、並びに細菌、酵母、及び真菌等の微生物からの細胞が含まれる、使用。
【請求項３】
インビトロ、インビボ、エクスビボ、又は移植に関わらず始原細胞又は幹細胞の成熟細胞への変換を改善するための、純粋な又は生成物若しくは組成物中に製剤化された、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの使用。
【請求項４】
細胞が、グルコース又は他のモノサッカライド及びジサッカライドによって直接又は間接的に引き起こされるストレス条件に曝露される、請求項１〜３に記載の使用。
【請求項５】
細胞が、脈管系の内側に沿って並ぶ始原細胞及び成熟細胞である、請求項１〜４に記載の使用。
【請求項６】
細胞が、ランゲルハンス島に位置する始原細胞及び成熟β細胞である、請求項１〜４に記載の使用。
【請求項７】
細胞が、頭蓋の内側、又は中枢脊柱管（central spinal canal）内、リンパ組織内、血管内、脳神経内、髄膜内、頭蓋骨、脳下垂体、若しくは松果腺内の全ての細胞を含むが、これらに限定されない始原細胞及び成熟脳細胞である、請求項１〜４に記載の使用。
【請求項８】
細胞が、ニューロン及びグリア細胞である、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
細胞が、星状細胞、乏突起膠細胞、及び上衣細胞である、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
細胞が、微生物腸管細胞（microbial intestinal cells）、並びに細胞結腸、直腸内、又は虫垂内の細胞を含むが、これらに限定されない始原細胞及び成熟宿主腸管細胞である、請求項１〜４に記載の使用。
【請求項１１】
細胞が、始原細胞及び成熟前立腺細胞である、請求項１〜４に記載の使用。
【請求項１２】
細胞が、導管（ducti）及び小葉からの上皮細胞、並びに脂肪細胞を含むが、これらに限定されない始原細胞及び成熟乳房細胞である、請求項１〜４に記載の使用。
【請求項１３】
細胞が、発酵乳又は乳由来物、ヨーグルト、チーズ、パン、ペストリー、ソース、ペースト、ワイン、ビール、ザウアークラウト、キムチ、テンペ、餡等を含むが、これらに限定されない食料製品の生産過程の発酵工程において使用される微生物である、請求項１〜４に記載の使用。
【請求項１４】
細胞が、食物、食物成分及び添加剤、栄養補助食品、医薬品、又はパーソナルケア製品として使用される物質の製造のための生産菌株として使用される微生物である、請求項１〜４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経時的な及び／又はストレスに曝露される間の、インビトロ、エクスビボ、及びインビボでの生物学的細胞機能及び活性の維持及び／又は改善のため、並びに不適切な細胞機能又は細胞死の予防のために、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルコース若しくは他の糖類又はそれらの存在によって形成若しくは上昇させられたストレスを引き起こし得る物質への曝露を含むが、これらに限定されないような事象から引き起こされるストレスに曝露される細胞は、インビトロ、エクスビボ、及びインビボでそれらの正常な活性及び機能を維持せず、死滅することさえある。高い細胞死は、細胞、例えば、動物、ヒト、植物、細菌、酵母、及び真菌からの商業的に重要な細胞等が高細胞密度かつ高グルコース又は糖培地条件に曝露されるとき、インビトロ及びエクスビボで問題となる。高い細胞死はまた、臓器内の細胞が高グルコース又は糖及びグルコース又は糖の存在によって形成又は上昇させられた他のストレッサーに曝露されるとき、インビボでも問題となる。インビボ細胞死又は不適切な細胞機能は、特に、例えば、糖尿病前症、糖尿病（Ｉ型及びＩＩ型）、代謝症候群を含む、病前状態又は病状、アルツハイマー病、前立腺癌、乳癌、アテローム動脈硬化症、結腸癌、並びに一般の心血管疾患等の慢性炎症性疾患において生じる。故に、インビトロ、エクスビボ、及びインビボでかかる不適切な細胞機能及び細胞死を予防及び／又は軽減する薬剤又は治療法を見出す必要性が継続的に存在する。
【０００３】
上述の疾患のうち、糖尿病は、その高まる有病率から特に関心の的となる。糖尿病は、過度の排尿によって特徴付けられる疾患に対する一般用語である。最も研究される糖尿病の型は、真性糖尿病（ＤＭ）であり、それは、高血糖（血中グルコース＞８ｍＭ）及び糖尿（尿中のグルコースの存在）によって特徴付けられ、インスリンの不十分な生成又は使用からもたらされる、炭水化物代謝の慢性障害である。ＤＭは、次の２つの症候群に従って分類される：Ｉ型、又はインスリン依存性ＤＭ（ＩＤＤＭ）、及びＩＩ型、又はインスリン非依存性ＤＭ（ＮＩＤＤＭ）。Ｉ型において、患者は、インスリンをほとんど又は全く分泌しない。ＩＩ型において、インスリンは生成されるが、患者は、彼／彼女自身でインスリンを検出又は処理することができないため、高血糖を調節するために外因性インスリン又は血糖降下薬が必要とされる。ＩＩ型ＤＭは、Ｉ型よりもはるかにより頻繁に生じる。
【０００４】
加えて、幾つかの重要な及び綿密に行われた疫学研究は、高血糖と心血管疾患の増加した危険性との間の関係を強調している。これらの心血管疾患には、眼（網膜）、腎臓、及び末梢神経における微小血管性病態が含まれる。結果として、ＤＭは、失明、腎疾患、及び多様な衰弱性神経障害の主要な原因となる。ＤＭはまた、心臓、脳、及び四肢に供給を行う動脈におけるアテローム動脈硬化性病変の形成と関連付けられる。結果として、ＤＭを有する患者は、心筋梗塞、脳卒中、及び切断のはるかにより高い危険性を有する。総合すれば、慢性高血糖のこれらの結果は、糖尿病合併症と称され、それが今度は、細胞に対して高レベルのストレスをもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
経時的な、並びに／又は網膜、腎臓、及び末梢神経における微小血管性病態を含む、糖尿病における慢性高血糖と関連付けられる種々の状態及び疾患に関連する細胞ストレス等の、ストレスに曝露される間の、細胞の生物学的機能及び活性を維持及び／又は改善するための方法の開発に対する必要性が依然として存在する。更に、細胞内でのその高い利用可能性の能力を考慮すると、細胞が化合物メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン及びその製剤によって保護され得る、新規の生物学的便益及び関連する機構を発見する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、経時的に及び／又はストレスに曝露される間に細胞の生物学的機能及び活性を維持及び／又は改善するために、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン、及びこの化合物を含む製剤を使用する新規の方法に関する。本開示はまた、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの化合物及びその製剤を使用して、アルツハイマー病、前立腺癌、乳癌、アテローム動脈硬化症、結腸癌、糖尿病、及び心血管疾患等の慢性炎症性又は加齢関連疾患を予防又は治療する新規の方法にも関する。
【０００７】
経時的に及び／又はストレスに曝露される間に細胞の生物学的機能及び活性を維持又は改善するための、純粋な若しくは実質的に純粋な形態の、又は生成物若しくは組成物中に製剤化された、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの使用が、本明細書に開示され、細胞には、動物、ヒト、及び植物、並びに細菌、酵母、及び真菌からの細胞が含まれる。また、細胞生存性を増加させるための、細胞生存及び細胞保護剤としての、純粋な若しくは実質的に純粋な形態の、又は生成物若しくは組成物中に製剤化された、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの使用が、本明細書に開示され、細胞には、動物、ヒト、植物、並びに細菌、酵母、及び真菌等の微生物（mircoorganisms）からの細胞が含まれる。また、インビトロ、インビボ、エクスビボ、又は移植に関わらず、始原細胞又は幹細胞の成熟細胞への変換を改善するための、純粋な若しくは実質的に純粋な形態の、又は生成物若しくは組成物中に製剤化された、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの使用が、本明細書に開示される。
【０００８】
上述のメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの使用が、本明細書に開示され、細胞は、グルコース又は他のモノサッカライド及びジサッカライドによって直接又は間接的に引き起こされるストレス条件に曝露される。ある特定の実施形態において、細胞は、脈管系の内側に沿って並ぶ始原細胞及び成熟細胞であり得る。本明細書に開示されるある特定の実施形態において、細胞は、ランゲルハンス島に位置する始原細胞及び成熟β細胞であり得る。
【０００９】
ある特定の実施形態において、細胞は、頭蓋の内側又は中枢脊柱管（central spinal canal）内、リンパ組織内、血管内、脳神経内、脳の外被（髄膜）、頭蓋骨内、脳下垂体、及び／又は松果腺内の全ての細胞を含むが、これらに限定されない、始原細胞及び成熟脳細胞であり得、脳自体の内側で、細胞は、ニューロン及び／又はグリア細胞（星状細胞、乏突起膠細胞、及び上衣細胞を含む）であり得る。
【００１０】
ある特定の実施形態において、細胞は、微生物腸管細胞、並びに結腸、直腸内、又は虫垂内の細胞を含むが、これらに限定されない始原細胞及び成熟宿主腸管細胞であり得る。ある特定の実施形態において、細胞は、始原細胞（progentor）及び成熟前立腺細胞、又は導管及び小葉からの上皮細胞、並びに脂肪細胞を含むが、これらに限定されない、始原細胞及び成熟乳房細胞であり得る。ある特定の他の実施形態において、細胞は、発酵乳又は乳由来物、ヨーグルト、チーズ、パン、ペストリー、ソース、ペースト、ワイン、ビール、ザウアークラウト、キムチ、テンペ、餡等を含むが、これらに限定されない食料製品の生産過程の発酵工程において使用される微生物であり得る。ある特定の実施形態において、細胞は、食物、食物成分及び添加剤、栄養補助食品、医薬品、及び／又はパーソナルケア製品として使用される物質の製造のための生産菌株として使用される微生物であり得る。
【００１１】
次のことを含むが、これらに限定されない、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの化合物、及びメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンを含む製剤を使用することの多くの便益及び適応が存在する：（１）細胞が経時的に及び／又はストレス条件下で生存する及び機能を維持する、並びに細胞の加齢過程を低減する及び／又は遅延させる一助となること、（２）糖尿病前症、糖尿病（Ｉ型及びＩＩ型）、代謝症候群、アルツハイマー病、前立腺癌、乳癌、アテローム動脈硬化症、結腸癌、糖尿病、及び一般の心血管疾患等の慢性炎症性疾患を含むが、これらに限定されない、疾患の危険性を低減すること、（３）Ｉ型若しくはＩＩ型糖尿病等のグルコース代謝機能障害を有する大集団、又は代謝症候群を有する個人を治療するために重要であり得る、β細胞機能及びインスリン耐性を改善すること、（４）幅広い経済的及び生物医学的重要性を有する、細胞移植及び始原（幹）細胞生存率を改善すること、（５）発酵過程において使用される微生物（生菌培養物、乳製品において使用される培養物、醸造及びベーキングにおいて使用される酵母、タンパク質等の臨床的に重要な生成物を生成する細胞、食物、食物成分、医薬品、パーソナルケア製品等として使用される物質を生成するために使用される微生物等）の細胞生存率を向上させること及びその活性を促進すること、（６）微生物が、例えば、濃縮、乾燥、凍結等の貯蔵過程中に、及び貯蔵時に、生存する並びに機能及び活性を維持する一助となること、並びに（７）食品産業、特に成分中の生菌生存及び機能性が関与する産業、並びに食品企業及び臨床医において、バイオプロセッサーにとって高い経済的重要性を持つ商業的に重要な細胞の生成収率の少量の増加を誘導すること。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＨＧ（３０ｍＭ）との２４時間にわたるＨＵＶＥＣインキュベーション後の死細胞の量の有意な増加を例示するグラフである。図１において、ｎは、４に等しく、＃は、ブランクと比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）ということであり、＊は、高グルコース曝露と比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）ということである。
【図２】Ｓｉｎ−１との２４時間にわたるＨＵＶＥＣインキュベーション後の死細胞の量の有意な増加を例示するグラフである。図２において、ｎは、３に等しく、＃は、ブランクと比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）ということである。
【図３】ＣＭＬとの２４時間にわたるＨＵＶＥＣインキュベーション後の死細胞の量の有意な増加を例示するグラフである。図３において、ｎは、３に等しく、＃は、ブランクと比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）ということであり、＊は、Ｎε−（カルボキシメチル）リジン曝露と比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）ということである。
【図４Ａ】ＨＵＶＥＣ死細胞の割合を減少させる、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの効果を例示する一連のグラフを提供する（このうちｙ軸が死細胞の割合を表す）。
【図４Ｂ】ＨＵＶＥＣ死細胞の割合を減少させる、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの効果を例示する一連のグラフを提供する（このうちｙ軸が死細胞の割合を表す）。
【図４Ｃ】ＨＵＶＥＣ死細胞の割合を減少させる、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの効果を例示する一連のグラフを提供する（このうちｙ軸が死細胞の割合を表す）。
【図５】糖類の異なる濃度での細胞死を例示するグラフである（このうちｙ軸がＵ／Ｌ単位での乳糖脱水素酵素の漏出を表す）。
【図６】ＨＩＴ−Ｔ１５細胞の生存性（機能及び活性）に対する、漸増レベルのグルコースとのインキュベーションの効果を例示するグラフである。
【図７Ａ】１０、３０、及び４５ｍＭのグルコースと共に２４時間インキュベートされた１．１Ｅ７細胞の生存性に対する効果を示すグラフである。
【図７Ｂ】１０、３０、及び４５ｍＭのグルコースと共に４８時間インキュベートされた１．１Ｅ７細胞の生存性に対する効果を示すグラフである。
【図７Ｃ】１０、３０、及び４５ｍＭのグルコースと共に６日間インキュベートされた１．１Ｅ７細胞の生存性に対する効果を示すグラフである。図７Ｃにおいて、＊は、１０ｍＭ（正常グルコース）と比較してｐ＜０．０５ということであり、＊＊は、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンなしと比較してｐ＜０．０５ということである。
【図７Ｄ】１０、３０、及び４５ｍＭのグルコースと共に７日間インキュベートされた１．１Ｅ７細胞の生存性に対する効果を示すグラフである。図７Ｄにおいて、＊は、１０ｍＭ（正常グルコース）と比較してｐ＜０．０５ということであり、＊＊は、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンなしと比較してｐ＜０．０５ということである。
【図８Ａ】１０、３０、及び４５ｍＭのグルコースと共に２４時間インキュベートされた１．１Ｅ７細胞の７Ｂ２の遺伝子発現に対する効果を示すグラフである。図８Ａにおいて、＊は、１０ｍＭ（正常グルコース）と比較してｐ＜０．０５ということであり、＊＊は、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンなしと比較してｐ＜０．０５ということである。
【図８Ｂ】１０、３０、及び４５ｍＭのグルコースと共に７日間インキュベートされた１．１Ｅ７細胞の７Ｂ２の遺伝子発現に対する効果を示すグラフである。図８Ｂにおいて、＊は、１０ｍＭ（正常グルコース）と比較してｐ＜０．０５ということである。
【図８Ｃ】１０、３０、及び４５ｎＭグルコースと共に２４時間インキュベートされた１．１Ｅ７細胞のＰＣ１／３の遺伝子発現に対する効果を示すグラフである。図８Ｃにおいて、＊＊は、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンなしと比較してｐ＜０．０５ということである。
【図８Ｄ】１０、３０、及び４５ｎＭグルコースと共に７日間インキュベートされた１．１Ｅ７細胞のＰＣ１／３の遺伝子発現に対する効果を示すグラフである。図８Ｄにおいて、＊は、１０ｍＭ（正常グルコース）と比較してｐ＜０．０５ということである。
【図８Ｅ】１０、３０、及び４５ｎＭグルコースと共に２４時間インキュベートされた１．１Ｅ７細胞のＰＣ２の遺伝子発現に対する効果を示すグラフである。図８Ｅにおいて、＊＊は、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンなしと比較してｐ＜０．０５ということである。
【図８Ｆ】１０、３０、及び４５ｎＭグルコースと共に７日間インキュベートされた１．１Ｅ７細胞のＰＣ２の遺伝子発現に対する効果を示すグラフである。図８Ｆにおいて、＊は、１０ｍＭ（正常グルコース）と比較してｐ＜０．０５ということである。
【図９】メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン摂取前及び後の血中グルコースレベルを示すグラフである（ｎ＝２４）。
【図１０】メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン摂取前及び後の血中インスリンレベルを示すグラフである（ｎ＝２４）。
【図１１】メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン摂取前及び後の血中Ｃ−ペプチドレベルを示すグラフである（ｎ＝２４）。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本開示は、例示的な実施形態において、インビボ、エクスビボ、若しくはインビトロでの経時的な及び／又は細胞がストレス条件に曝露されるときの、生物学的細胞機能及び活性の維持又は改善のために、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン、及びメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンを含む製剤を使用する方法に関する。
【００１４】
メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン（「ＥＲＴ」）は、適度な甘味（スクロースの約６０〜７０％と同程度の甘味）及びスクロースと同様の外観を有する、粉末状又は顆粒状で利用可能な、白色、含水、非吸湿性の、結晶性物質として調製されてきた。その小さい分子径が、ＥＲＴの固有の特徴の多くに関与する。その小さい分子径に起因して、摂取されたＥＲＴの約９０％は、小腸内で吸収される。それは、よく吸収される一方で、それは、代謝されない。腎臓は、ＥＲＴを血流から除去し、それは、尿中で変化しないまま排泄される。吸収されない少量の残ったＥＲＴは、大腸へと通過し、便中で変化しないまま排泄される。ＥＲＴは、結腸内で代謝されないか又は発酵するため、それはノンカロリーで、忍容性が非常に良好である。ＥＲＴは、身体へのエネルギーに全く寄与しない。ＥＲＴは、代謝されないことから、それはいかなる糖血症作用又はインスリン血症作用も有しない。このことから、それは、食事後血糖レベルを低減することを望む人々にとって特に有用である。
【００１５】
ＥＲＴは、多種多様な果物、野菜、及び発酵食物において天然に生じる。それはまた、ヒトの体内及び動物内にも存在する。ＥＲＴは、自然発酵過程によって生成される。ＥＲＴは、ミュータンス連鎖球菌等の、う歯を引き起こす口腔細菌によって基質として使用され得ないか、又は不十分にしか使用されないため、虫歯を促進しない。ＥＲＴは、歯垢を低減して、それによってう歯を発達する危険性を低減し得る。
【００１６】
ＥＲＴは、食品として（その純粋な形態で）及び成分又は添加剤として、多くの食物及び飲料において、医薬品において、並びにパーソナルケア製品において使用される。
【００１７】
卓上甘味料の用途において、ＥＲＴは、「そのままで」（市場で販売されるその純粋な形態で）、任意の他の成分を添加することなく、又は最大９９．９％レベルで、強力な甘味料のためのノンカロリー、非う蝕性、非糖血症担体として、使用される。これらの用途において、ＥＲＴの感覚プロファイル調整特性は、甘味相乗作用、改善された口当たり、及び異臭のマスキングをもたらす大きな重要性を持つ。加えて、スクロースと同様のＥＲＴの結晶性構造及び密度、並びにその非吸湿性の特性に起因して、それは、担体として優れた流動性及び安定性を提示する。
【００１８】
強力な甘味料と組み合わせてＥＲＴが示す定量的及び定性的相乗作用はまた、低カロリー及びダイエット飲料においても非常に有用である。ＥＲＴは、しばしば、飲み物において風味向上剤として使用されて、通常の砂糖のそれに近い甘味プロファイルを達成する。良質なノンカロリー及び非う蝕性チューインガムもまた、ＥＲＴを使用して製剤化され得る。チョコレート組成物におけるＥＲＴの使用は、高温でのドライコンチング過程を可能にする。ＥＲＴの良好な熱安定性及び低吸湿量に起因して、伝統的に使用される温度よりも高い温度で作業することさえも可能である。これは、向上した風味発生をもたらす。例えば、従来通りに加糖されたファッジと同等の食感及び貯蔵寿命特性を有する無糖のファッジを、ＥＲＴを使用して生産することができる。
【００１９】
最先端のキャンディー革新は、ＥＲＴの融解並びに結晶化ピークを拡大し、融解結晶化ピークを、鋳型への堆積を可能にして結晶の形成を調節するのに十分に低いレベルまで推移させる、技術を伴う。結果として生じる硬いキャンディーは、スムーズな外観、食感、及び所望の硬さを有する。この新規の技術は、本質的にカロリーがなく、歯に安全であり、新規の食感及び味覚を有する、堆積されたキャンディーの製造を可能にする。
【００２０】
ＥＲＴを使用して、伝統的な糖含有製品と同様の特性を有する、無糖、低カロリー、非う蝕性のフォンダン、ロゼンジ、錠剤、及び多くの他の種類のキャンディーを得ることが可能である。ベーカリー製品の用途において、ＥＲＴは一般に、スクロースと比較して、幾らか異なる融解挙動、より密な生地、より軟らかい最終製品、及びより低い色素形成を提供する。
【００２１】
医薬及びパーソナルケアの用途において、ＥＲＴは、例えば、その技術的機能性、歯科衛生便益から、並びにその代謝特徴及び高い不活性度から、使用される。
【００２２】
本開示は、ＥＲＴの新たな及び以前に知られていなかった便益、つまり、経時的に及び／又はストレスに曝露される間に細胞の生物学的機能及び活性を維持及び／又は改善するその能力を提供する。
【００２３】
以前の研究は、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンのインビトロでの使用が、ヒドロキシルラジカルを消去する（ＨＯ・ラジカルを消去する）ことにおいて有効であったが、いかなるスーパーオキシド又は過酸化亜硝酸消去活性も有しないことを示してきた。更に、ラジカル誘導性溶血のインビトロモデルにおいて、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンは、特にＡＢＴＳ誘導性溶血における、酸化損傷の発生を遅延させることが可能であった。
【００２４】
高血圧の予防又は治療のためのメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの関連化合物の使用に関わる追加の研究及び結果が、国際公開第ＷＯ  ２０１１／０１４４４８  Ａ１号に記載され、それは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００２５】
新たな研究が本明細書に開示され、それは生物学的細胞機能を保護、維持、及び改善するために、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの化合物及びメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンを含む製剤を使用する新規の方法を例証する。ＨＵＶＥＣ細胞においてメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンを使用することの効果を、標的化アプローチ及びトランスクリプトミクスアプローチを使用して、細胞を正常な及び高グルコース条件に曝露することにより、更に研究した。これらの研究は、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンが高グルコース誘導性細胞死を低減することを例証する。下に詳細に説明される、種々の経路における遺伝子転写に対する変化は、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの化合物及びメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンを含む製剤の、単独での又は併用療法における使用が、どのように細胞損傷及び／又は細胞死に関する糖尿病合併症を低減し得るかを含めて、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンがどのように有益な効果を発揮するかを明確にし得る。
【００２６】
定義
本明細書で使用される「疾患」、「状態」等の用語は、一連の特徴的な症状（sysmptoms）及び徴候によって現され、その病因学、病理学、及び予後が知られていることも知られていないこともある、動物又はヒトの任意の部分、臓器、若しくは系、又はそれらの組み合わせの正常な構造又は機能の任意の逸脱又は断絶を意味することが意図される。本明細書で使用される「動物」という用語は、ヒト、及び、例えば、ウマ、ブタ、ウシ、ネズミ、イヌ、又はネコ種のメンバーを含むが、これらに限定されない哺乳動物を含む。
【００２７】
本明細書で使用される「高血糖」という用語は、過剰量のグルコースが血清中に存在する状態を指す。生理的血中グルコースレベルは、典型的に約５〜７ｍｍｏｌ／Ｌである。１０ｍｍｏｌ／Ｌ（又は慢性的に７ｍｍｏｌ／Ｌを上回る）以上の血糖レベルが典型的に高血糖と見なされる。
【００２８】
本明細書で使用される「予防」という用語は、（ｉ）疾患の素因があり得るが、それを有すると未だに診断されていない動物又はヒトの疾患の発症を回避する、任意の活動、並びに（ｉｉ）早期検出を目指し、それによって、疾患の進行及び症状の出現を予防するための介入の機会を増加させる、任意の活動を含む。更に、本明細書で使用される「治療」という用語は、任意の程度で、（ｉ）疾患を阻害することによって疾患に対して保護する、すなわち、疾患発症を停止させる、任意の活動、及び（ｉｉ）疾患を緩和する、すなわち、疾患の退行又は消失を引き起こす、任意の活動を指す。
【００２９】
細胞について本明細書で使用される「生物学的機能」という用語は、調節された様式での持続及び／又は複製に寄与する能力を指す。特に、それは、生き続けるのに重要である、並びに／又は細胞が所望の機能及び機械的特性の一部である組織を提供するのに重要である、並びに／又は細胞外で使用されるのに重要である、分子の適時の及び適正な生成を含み得、またそれは、安定した比較的一定の特性の状態を維持するようにその内環境を制御するための細胞系の特性を含み得る。
【００３０】
メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの使用は、ストレスに曝露される細胞に対して、インビトロ、エクスビボ、及びインビボで、生物学的細胞機能及び活性を維持又は改善し、不適切な細胞機能又は細胞死を予防することができる。更に、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの使用は、細胞生存率を促進し、細胞生存性を増加させ得る細胞保護剤として作用することができる。メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの使用はまた、インビトロ、インビボ、エクスビボ、又は移植のいずれでも、始原細胞又は幹細胞の成熟細胞への変換を改善することができる。影響を受けた細胞には、動物、ヒト、植物、並びに細菌、酵母、及び真菌を含む微生物が含まれる。
【００３１】
メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン化合物は、少なくともある特定の非限定的な例示的な実施形態において、純粋な、又は実質的に純粋な形態で使用され得、例にすぎないが、９９％超のメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン及び１％以下の水、９９．５％のメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン及び０．５％以下の水、若しくは９９．９％のメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン及び０．１％以下の水を含んでもよく、又は生成物若しくは組成物中に製剤化されてもよい。メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンを含む組成物は、例えば、比較的大量に使用又は消費されるときには２０％未満のメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン、より大量に使用又は消費されるときには２０％〜５０％のメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン、及び比較的少量で使用又は消費されるときには５０％超のメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンを含んでもよい。
【００３２】
メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン化合物又はその製剤の純粋な、又は実質的に純粋な形態は、当業者に既知の種々の経路によって投与されてもよい。投与経路は、特に限定されず、調製物の形態、並びに、例えば、年齢、性別、及び疾患又は状態の程度等の、予防又は治療対象となる動物又はヒトの状態によって、決定される。例えば、純粋な若しくは実質的に純粋なメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン化合物、又はメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンを含む組成物若しくは製剤は、経口に、非経口に、皮下に、静脈内に、筋肉内に、吸入スプレーによって、局所に、直腸に、鼻腔に、頬側に、膣内に、又は経皮的に、投与することができる。種々の実施形態において、純粋なメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン、又はメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンを含む製剤若しくは組成物はまた、食料製品、飲料製品、又は他の経口に使用される生成物中に容易に組み込まれてもよい。
【００３３】
メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンは、例えば、患者に投与されるときに所望の治療効果を誘導することが可能な化学生成物又は組成物を含み、またメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン、及び任意に他の活性成分を、改善された移入、送達、忍容性等を提供するために医薬製剤に通常組み込まれる生理的に許容される担体、希釈剤、及び他の薬剤等の１つ以上の周知の物質と混合することによって製剤化される、ヒト又は動物消費用の医薬製品又は組成物として製剤化されてもよい。加えて、酸化防止剤、分散剤、乳化剤、香味剤、甘味剤、着色剤、及び防腐剤等の化合物もまた、任意に（optinally）生成物又は組成物に含まれてもよい。
【００３４】
本発明の医薬製品又は組成物の好適な形態には、例えば、粉末、錠剤、丸薬、カプセル、カシェット、坐剤、及び顆粒等の固体形態、並びに溶液、シロップ、懸濁液、及び乳剤等の液体形態が含まれる。医薬製品又は組成物の適切な形態は、主に、投与経路、所望の放出プロファイル、及び活性物質と医薬賦形剤との不適合性等の他の要因によって導かれる。医薬製剤の当業者は、既知の材料及びプロセスパラメーターを参照して、形態及び調製方法を通例の様式で選定することが可能である。経口投与の場合、例えば、錠剤は、ＥＲＴ、乳糖、及びトウモロコシデンプン等であるが、これらに限定されない担体、並びに／又はステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤を含有してもよい。更に、カプセルは、ＥＲＴ、乳糖、及び乾燥トウモロコシデンプンを含むが、これらに限定されない希釈剤を含有してもよい。その上、水溶液又は懸濁液は、乳化剤及び懸濁化剤を含有してもよい。
【００３５】
以前の研究では、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンをそれだけで（すなわち、非糖尿病条件下で）組み込むことが、細胞に対して最少の効果を有することを見出している。生存性、酸化損傷、スーパーオキシドジスムターゼ活性、及び重要な細胞機能パラメーター（一酸化窒素生成、接着分子生成）及びトランスクリプトームは、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンとのインキュベーション後に変化を示さなかった。しかしながら、細胞が、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンとのプレインキュベーションに次いで高グルコースに曝露されたとき、驚くべきことに、高グルコースストレス条件によって引き起こされる幾つかの有害な効果が逆行させられた。
【００３６】
更に、非糖尿病対象において、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンは細胞に影響を及ぼさず、それは望ましい特性であるが、細胞が糖尿病ストレス下にある糖尿病対象においては、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンは驚くべきことに、多様な損傷及び機能不全パラメーターをより安全でより許容できる程度まで推移させ得ることが見出された。メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンは、高血糖の間に細胞に対して確定的な保護効果を有するものとして示されてきており、それは糖尿病合併症を発症する危険性を低減することにおいて他の安全な薬剤を補助し得る。したがって、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンは、糖尿病を有する急速に増加する人口にとって、彼らが糖尿病合併症を発症する危険性を低減することにおいて、大きな重要性を持つ。
【００３７】
次の実施例は、生物学的細胞機能及び活性、又は細胞が老化するときの若しくは細胞がストレス条件に曝露されるときの細胞の、維持及び改善における、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの使用を例示するために提供される。上述の説明及び次の実施例の両方は、例示的及び説明的なものにすぎず、本開示を制限するものとして解釈されるべきでなく、本発明の範囲が特許請求の範囲によって定義されることを理解されたい。その上、本明細書における様々な実施形態の種々の特長及び／又は特徴は、互いと組み合わされてもよいことが理解されるべきである。したがって、例示となる実施形態に対して多数の修正が行われてもよいこと、並びに本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の構成が考案されてもよいことを理解されたい。本開示の考慮及び本明細書に開示される種々の例示的な実施形態の実践から、他の実施形態が当業者に明らかとなろう。
【００３８】
そうでないとする明示的な記載のない限り、本明細書で使用される「ｔｈｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味し、「１つのみ」に限定されるべきでないこともまた理解されたい。
【００３９】
別途記載のない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される全ての数字は、全ての事例において、そのように述べられるか否かに関わらず、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されたい。本明細書及び特許請求の範囲において使用される正確な数値は、本発明の追加の実施形態を形成し、提供される例示的な範囲及び値内で開示される任意の２つの端点に狭められ得る、任意の範囲を含むことが意図されることもまた理解されるべきである。本明細書に開示される数値の正確さを確実にするための努力がなされた。任意の測定された数値は、しかしながら、本質的に、そのそれぞれの測定技法において見出される標準偏差からもたらされる、ある特定の誤差を含有し得る。
【実施例】
【００４０】
次の実施例１について、評価されたパラメーターには、（ｉ）生存性及び外観によって評価した一般毒性（標的化）と、（ｉｉ）脂質過酸化反応、カルボニル化タンパク質形成、及び酸化ヌクレオチド形成によって評価した酸化損傷（標的化）と、（ｉｉｉ）一酸化窒素生成、炎症促進性及び抗炎症性遺伝子の発現（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））、並びに接着分子生成によって評価した細胞機能（標的化）と、（ｉｖ）エイコサノイドミクス（eicosanoidomics）と、（ｖ）トランスクリプトミクスとが含まれた。
次の略号が実施例において使用される：
【００４１】
【表Ａ】
2015522250.tif 000002
【００４２】
実施例１−ＨＵＶＥＣ細胞
ＨＵＶＥＣ細胞株（ＣＲＬ−１７３０）は、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡのアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から得た。ＨＵＶＥＣを、１０％の熱失活されていないウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＡＴＣＣ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．０５ｍｇ／ｍｌのＨＵＶＥＣ成長補助剤（ＥＣＧＳ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、及び０．１ｍｇ／ｍｌのヘパリン（Ｌｅｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を含む、Ｆ１２Ｋ培地（ＡＴＣＣから）中で培養した。調製された細胞をコラーゲンコーティングＴ７５フラスコ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）中、５％  ＣＯ２雰囲気下で３７℃で維持した。
【００４３】
調製された細胞を種々のストレッサーに供した。ストレッサーは、この実施例の目的のために、グルコースによって直接、又はストレスを引き起こす他の物質の形成若しくは上昇を通じて間接的に引き起こされる、ストレスの条件を含む。糖尿病ストレッサーは、高グルコース（ＨＧ；３０ｍＭ、２４時間）、ＴＮＦα：炎症促進剤、Ｎεカルボキシメチルリジン：最終糖化（ＡＧＥ）産物、及びＳＩＮ−１：過酸化亜硝酸ジェネレータを含む。調製された細胞をまた、対照として正常グルコース（ＮＧ；７ｍＭ、２４時間）に曝露した。
【００４４】
調製された細胞を６ウェルプレート及びＴ７５フラスコ中に播種し、８０％培養密度になるまで成長させた。培地を除去し、細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄した。補助剤を含まない新たな培地を添加し、５０ｍＭのメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン（ＥＲＴ）若しくは（２Ｒ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ）−ヘキサン−１，２，３，４，５，６−ヘキソール（ＭＡＮ）溶液又はビヒクル溶液の１／１０体積を、細胞に添加した（５ｍＭの最終濃度）。ビヒクル溶液は、試験化合物のための溶媒であり、この場合には補助剤を含まない培地である。約１時間のインキュベーション後、２３０ｍＭのグルコース溶液（最終濃度３０ｍＭ）又は上述のビヒクル溶液の１／１０体積を、高グルコース（ＨＧ）条件下で細胞に添加した。上述の細胞をまた、７ｍＭの正常グルコース（ＮＧ）溶液と共に、又は場合によっては、１５ｍＭの中間グルコース（ＩＧ）溶液と共に、２４時間インキュベートした。例えば、図６を参照されたい。その後、細胞を２４時間インキュベートした。同じプロトコルを、Ｎε−（カルボキシメチル）リジン（ＣＭＬ、最終濃度１マイクロモーラー）及び１，３−モルホリノシドノンイミン（ＳＩＮ−１、最終濃度０．５ｍＭ）とのインキュベーションのために使用した。腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα、最終濃度０．１ｎｇ／ｍｌ）を３時間インキュベートした。
【００４５】
細胞生存性：細胞内生存性アッセイにおいて、新鮮な未処理ＨＵＶＥＣ細胞を６ウェルプレート中で、８０％培養密度になるまで成長させた。その後、インキュベーション培地を除去し、細胞をＨＢＳＳで洗浄し、トリプシンにより採取した。培地及びＨＢＳＳ洗浄液を含む、全ての細胞材料を収集し、５００×ｇで５分間遠心分離した。上清を除去し、細胞を１００マイクロリットルのＨＢＳＳ中に再懸濁させた。細胞懸濁液を０．４％トリパンブルー色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）中で１：１希釈し、Ｂｕｒｋｅｒ計数板に負荷した。生存（白色）及び死（青色）細胞の数を２５個の四角内で計数し、計数を各試料につき更に２回反復し、１試料当たり総計３回の計数を行った。平均数に２０，０００を乗じた（それは１ｍＬ当たりの細胞の量を表す）。次いで、死細胞の割合を、式：（青色の細胞／（青色の細胞＋白色の細胞））×１００を用いて算出した。
【００４６】
結果及びデータを収集した。５ｍＭのＥＲＴ又は５ｍＭのＭＡＮとのプレインキュベーション、続いて２４時間のＮＧ濃度は、増加した細胞死をもたらさなかった（ＮＧ対ＮＧＥＲＴ、ＮＧ対ＮＧＭＡＮ）。５ｍＭは、最終濃度を示し、すなわち、５０ｍＭの１：１０である。ＨＵＶＥＣをＨＧ単独と共に２４時間インキュベートしたとき、死細胞の量は、ＮＧ条件と比べてほぼ４倍増加した（ＮＧ対ＨＧ）。５ｍＭのＥＲＴとのプレインキュベーションは、ＨＧ条件において死細胞の数の増加を完全に予防したが（ＨＧ対ＨＧＥＲＴ）、ＭＡＮは、それを予防しなかった（ＮＧ対ＮＧＭＡＮ）。
【００４７】
図１は、ＨＧ（３０ｍＭ）との２４時間にわたるＨＵＶＥＣインキュベーションが、どのように死細胞の量の有意な増加をもたらしたかを例示する。ＥＲＴとの共インキュベーション（＝Ｅ）は、この数を有意に減少させた一方で、ＭＡＮとの共インキュベーション（＝Ｍ）は、死細胞の量を減少させる有意な効果を有しなかった。図１において、記号解説には次のものが含まれる：（ｎ＝４）＃ブランクと比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）；＊＝高グルコース曝露と比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン。
【００４８】
図２は、ＳＩＮ−１との２４時間にわたるＨＵＶＥＣインキュベーションが、死細胞の量の有意な増加をもたらしたことを例示する。ＥＲＴとの共インキュベーション（＝Ｅ）は、この数を減少させた一方で、ＭＡＮとの共インキュベーション（＝Ｍ）は、この効果を有しなかった。図２についての記号解説には次のものが含まれる：（ｎ＝３）＃＝ブランクと比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）。
【００４９】
図３は、ＣＭＬとの２４時間にわたるＨＵＶＥＣインキュベーションが、死細胞の量の有意な増加をもたらしたことを例示する。ＥＲＴとの共インキュベーション（＝Ｅ）は、この数を減少させた一方で、ＭＡＮとの共インキュベーション（＝Ｍ）は、この効果を有しなかった。図３についての記号解説には次のものが含まれる：（ｎ＝３）＃＝ブランクと比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）、＊は、Ｎε−（カルボキシメチル）リジン曝露と比較して有意に異なる（ｐ＜０．０５）ということである。
【００５０】
酸化損傷：高血糖は、酸化ストレス、すなわち、活性酸素種の形成と存在する抗酸化物質との間の平衡異常と強く関連付けられる。過剰の活性酸素種は、必要不可欠な細胞標的、すわなち、膜脂質、タンパク質、及び（デオキシ）リボ核酸と反応する。高グルコースによって引き起こされる酸化脂質及びタンパク質の形成に対するメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンとのプレインキュベーションの効果を調査して、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンが保護を提供し得るかどうかを決定した。結果的に、標的化アッセイのうちの１つは、ＨＧ対ＨＧＥＲＴ条件の比較を研究することを含み、ここで酸化損傷を評価すると、カルボニル化タンパク質が、ＨＧによる６．５５ｎＭ／ｍｇタンパク質から、ＨＧＥＲＴによる３．７７へと減少した（ｐ＝０．０８９）ことが示された。カルボニル化タンパク質は、酸化ストレス中に形成される、タンパク質と活性酸素種（ＲＯＳ）との間の反応の最終産物である。カルボニル化タンパク質は、ＨＧによる６．５５ｎＭ／ｍｇタンパク質から、ＨＧＥＲＴによる３．７７へと減少した（ｐ＝０．０８９）。カルボニル化タンパク質及びＥＲＴは両方とも親水性分子であり、カルボニル化タンパク質はサイトゾル中に存在するため、この減少は、ＥＲＴが細胞内、サイトゾル、グルコース誘導性酸素ラジカルに対して作用を発揮するという証拠を提供した。関連分子ＭＡＮは、高グルコース条件下でカルボニル化タンパク質を低減しなかったが、それは、ＭＡＮが十分なレベルでサイトゾルに到達しなかったことを示唆する可能性が高い。
【００５１】
ＨＵＶＥＣ細胞の、５ｍＭのＥＲＴ及び３０ｍＭのグルコースへの曝露（ＨＧＥＲＴ）、又はＨＧ単独への曝露のいずれも、脂質過酸化反応の最終産物である、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）に影響を及ぼさなかった（ｐ＜０．１）。ＥＲＴは、しかしながら、２４時間以内のインキュベーションで高血糖条件に曝露された赤血球のラジカル誘導性溶血を阻害することが可能であった（膜保護効果）。故に、ＨＵＶＥＣにおいて、ＨＧＥＲＴの下で、カルボニル化タンパク質が減少したことにより、ＥＲＴが、細胞内、サイトゾル、グルコース誘導性酸素ラジカルに対する作用を発揮し得ることが示される。
【００５２】
高血糖の間に生成が増加する可能性が高い、活性酸素種のうちの１つは、スーパーオキシドラジカル（Ｏ２・−）であり、それは潜在的にミトコンドリア呼吸鎖の過剰活性化に起因する。スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）は、スーパーオキシドラジカルの量を、それらを過酸化水素及び酸素に変化させることによって効果的に低減する酵素のファミリーを構成する。ＳＯＤは、細胞質において（銅、亜鉛ＳＯＤ又はＳＯＤ１）、及び単数ミトコンドリアにおいて（マンガンＳＯＤ又はＳＯＤ２）生じる。第３の形態（ＳＯＤ３又はＥＣ−ＳＯＤ）は、細胞外で見出される。メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンが細胞機能を改善及び／又は維持する、潜在的な保護機構には、これらのＳＯＤの発現又は活性を増加させることが含まれる。結果的に、ＳＯＤ２（それは誘導性ＳＯＤである）、ＳＯＤ１、及び総ＳＯＤ活性の発現タンパク質及び活性レベルを研究した。
【００５３】
ＥＲＴがインビトロでスーパーオキシドラジカルを直接消去しないことが以前に発見された。したがって、ＳＯＤパラメーターを使用して、ＥＲＴが、スーパーオキシドラジカルを過酸化水素及び二原子酸素に分解して、ＮＯ生体利用能（biovailability）を増加させ、血管弛緩を増加させる酵素である、総ＳＯＤ並びにＳＯＤ１（細胞質Ｃｕ−Ｚｎ  ＳＯＤ）及びＳＯＤ２［ミトコンドリア又はマンガン（Ｍｎ）ＳＯＤ］の活性、発現、及びタンパク質レベルに影響を及ぼすかどうかを研究した。還元遷移金属イオン（例えば、Ｆｅ２＋）と組み合わせて増加した過酸化水素は、ＥＲＴ消去のために、ヒドロキシルラジカルを増加させることが可能であった。総ＳＯＤ活性（Ｕ／ｍｇタンパク質）、ＳＯＤ１活性、ＳＯＤ２活性、ＳＯＤ２発現（ＲＴ−ＰＣＲによる）、及びＳＯＤ２タンパク質（ウエスタンプロットによる）は、ＨＧＥＲＴ対ＨＧによって影響を受けなかった（ｐ＜０．１）。
【００５４】
メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンは、高血糖条件中に、総スーパーオキシドジスムターゼ活性を増加させるようであったが、正常血糖条件中にはそれを増加させなかった。曝露及びＳＯＤ活性決定を５倍で行ったが、この効果は、高グルコース及びＥＲＴとの二重インキュベーション中の高い変動に主に起因して、有意でなかった。故に、ＥＲＴが、ＳＯＤ２の転写又はタンパク質レベルに影響を及ぼさなかったことが見出された。
【００５５】
過酸化亜硝酸発生化合物である、３−モルホリノシドノンイミン−１（ＳＩＮ−１；ＳＩＮ）の添加は、ＮＧ条件下で死細胞の数を増加させたが（ＮＧ対ＮＧＳＩＮ）、ＨＧ条件下では増加させなかった（ＨＧ対ＨＧＳＩＮ）。ＥＲＴと共にプレインキュベートされた細胞において、ＮＧ（ＮＧＳＩＮ対ＮＧＳＩＮＥＲＴ）条件及びＨＧ（ＨＧＳＩＮ対ＨＧＳＩＮＥＲＴ）条件中のＳＩＮ−１とのインキュベーションは、死細胞の量を減少させた。ＭＡＮとのプレインキュベーションは、この保護特性を呈しなかった（ＮＧＳＩＮ対ＮＧＳＩＮＥＲＴ、ＨＧＳＩＮ対ＨＧＳＩＮＥＲＴ）。
【００５６】
ＮＧとの共インキュベーション中の最終糖化産物ＣＭＬの添加は、細胞の量を若干増加させ（ＮＧ対ＮＧＣＭＬ）、それはＨＧを用いては観察されなかった（ＨＧ対ＨＧＣＭＬ）。死細胞の数は、ＥＲＴ又はＭＡＮと組み合わせたとき、ＮＧ又はＨＧ＋ＣＭＬとのインキュベーションと比較して異ならなかった（ＮＧＣＭＬ対ＮＧＣＭＬＥＲＴ、ＨＧＣＭＬ対ＨＧＣＭＬＥＲＴ、ＮＧＣＭＬ対ＮＧＣＭＬＭＡＮ、ＨＧＣＭＬ対ＨＧＣＭＬＭＡＮ）。
【００５７】
次の表１は、種々の処理及び調製物の下での異なる細胞の組み合わせの間の比較を要約する。
【００５８】
【表１】
2015522250.tif 000003
Ｔ検定、対応なし、両側、等分散
太字の値は、＜０．１のｐ値を示す
【００５９】
エイコサノイド：標的化アッセイにおいて評価される別のパラメーターには、ＨＧ対ＨＧＥＲＴ条件の比較における２３個のエイコサノイドの研究が含まれた。血小板、及びまた、内皮細胞によって生成される、血小板血管収縮化合物ＴＸＢ２は、ＨＧＥＲＴ条件下で、０．７６（ＨＧで）から１．２０へと増加することが見出された。
【００６０】
内皮細胞の酸化ストレス及び高グルコースインキュベーションは、１２−ＨＥＴＥを増加させることが示されてきており、上昇した血中グルコースを有する糖尿病ブタは、増加した１２−ＨＥＴＥを有する。インビトロで、１２（Ｓ）−ＨＥＴＥで処理されたヒト膵島細胞において、減少したインスリン分泌、増加した細胞死、及び増加したリン酸化ｐ３８−ＭＡＰＫ（ｐｐ３８）タンパク質活性が存在した。炎症性サイトカインの添加は、ｐｐ３８を増加させた。単球において、高グルコースは、１２−ＨＥＴＥ及び単球によるインテグリンの産生を介した内皮細胞への単球接着を増加させた。内皮細胞内で、１２−ＨＥＴＥは、ＰＫＣ依存性様態で内皮細胞インテグリン産生を誘導した。１２−ＨＥＴＥへの内皮細胞の曝露は、血管拡張性分子プロスタサイクリンを産生する細胞の能力を低減することも見出された。ＨＵＶＥＣ細胞内で、高グルコースインキュベーションが炎症性サイトカイン及び酸化ストレスを誘導し、それが１２−ＨＥＴＥを伴うシグナル伝達カスケードを通じて細胞死を誘因し、接着に影響を及ぼしたということが妥当である。ＥＲＴは、これらの効果を部分的に逆行させて、細胞生存を増加させ、１２−ＨＥＴＥレベルを減少させた。故に、ペレットにおける１２−ＨＥＴＥの減少（ＨＧＥＲＴ対ＨＧ）が、ＨＧ又は酸化ストレスに曝露された内皮細胞内の１２−ＨＥＴＥの既知の特性に基づいて、ＥＲＴの生存、保護、及び抗炎症性特性に対する機構的根拠を提供することが見出された。
【００６１】
８−ＨＥＴＥは、培養内皮細胞内で産生されることが知られている。８（Ｓ）−ＨＥＴＥは、ＰＰＡＲａ及びｇの天然の作動物質であるため、この減少は、生物学的に重要であり得る。８（Ｓ）−ＨＥＴＥはまた、ラット角膜上皮細胞内のＦ−アクチン組織化及び上皮創傷閉鎖を増加させ、可能性としては、内皮細胞内の細胞骨格効果を有し得る。最後に、８−ＨＥＴＥレベルは、ドキシサイクリン誘導性酸化ストレスに曝露されたケラチノサイト細胞株において増加することが報告され、これは、減少したＤＮＡ合成に起因して細胞成長の阻害をもたらした。細胞成長の減少は、ｐ３８マイトジェン活性化タンパク質キナーゼによって媒介されたが、ＥＲＫ  １／２又はＪＮＫ／ＳＡＰキナーゼによっては媒介されなかった。８−ＨＥＴＥに曝露されたＨＵＶＥＣ細胞内のシグナル伝達カスケードは、直接調査され得る。
【００６２】
上清を研究するとき、Ｃｙｐ  ２Ｃ及び２Ｊを介してアラキドン酸から生成して、エポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）を形成し、次いで、ｓＥＨを介してＤｉＨＥＴｒＥに変換した、１４，１５−ジヒドロキシ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ−エイコサトリエン酸塩（１４，１５−ＤｉＨＥＴｒＥ）は、０．００８５から０．００４０ｎＭへと減少した（ｐ＜０．０５）。１４，１５−ＤｉＨＥＴｒＥのこの減少は、ｓＥＨの高グルコース抑制と一致しており、血管拡張を生み出すであろう増加したＥＥＴをもたらすはずである。しかしながら、ＥＥＴは、増加することが観察されなかった。
【００６３】
図４Ａ〜４Ｃは、ＨＵＶＥＣ死細胞の割合を減少させる、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの効果を例示する一連のグラフを提供する。図４Ａにおいて、ＨＧＥＲＴは、最左のバー（ＨＧ）、ｐ＜０．０５、Ｔ検定、ｎ＝３（ＥＲＴ無添加）と異なる。図４Ｂにおいて、ＮＧＳＩＮＥＲＴは、最左のバー（ＮＧＳＩＮ）、ｐ＜０．０５、Ｔ検定、ｎ＝３（ＥＲＴ無添加）と異なる。図４Ｃにおいて、ＨＧＳＩＮＥＲＴは、最左のバー（ＨＧＳＩＮ）、ｐ＜０．０５、Ｔ検定、ｎ＝３（ＥＲＴ無添加）と異なる。図４Ａ〜４Ｃにおいて、ＨＧは、２４時間にわたる３０ｍＭのグルコースを示す。ＮＧは、２４時間にわたる７ｍＭのグルコースを示す。ＥＲＴは、ＥＲＴがストレッサーの１時間前に５ｍＭで添加されたことを示し、ＭＡＮは、ＭＡＮがストレッサーの１時間前に５ｍＭで添加されたことを示す。ＳＩＮは、２４時間の３−モルホリノシドノンイミン過酸化亜硝酸ジェネレータを示す。
【００６４】
実施例２
マウス腸（腸内分泌）ＳＴＣ−１細胞を３７℃で２時間、１％、２％、５％、及び１０％（ｗ／ｖ）（最終濃度）のフルクトース、グルコース、スクロース、ＥＲＴ、又は６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトースと共に２系列でインキュベートした。適切なブランク、陽性対照、及び標準物もまた含めた。
【００６５】
細胞からの乳糖脱水素酵素（ＬＤＨ）漏出を、細胞毒性細胞死に対するマーカーとして上清中で分析した。１００％細胞死は、約１２００Ｕ／Ｌに対応した。２４ウェルプレート（培地の除去後）中のタンパク質濃度を決定し、それを使用して効果を正規化した。
【００６６】
図５に示されるように、有意なストレスを誘導するのに十分に高い濃度で（１０％）、細胞死は、ＥＲＴを用いるよりも、フルクトース、グルコース、スクロース、及び６−Ｏ−α−Ｄ−グルコピラノシル−Ｄ−フルクトースを用いたときにより高かった。データは、これらの腸細胞が、試験されたグルコース及び他の糖類よりも高い濃度のＥＲＴに耐え得ること、及びＥＲＴを用いたときに細胞活性及び機能が正常なままであったことを示した。
【００６７】
実施例３−トランスクリプトミクス
トランスクリプトミクス：メソ−１，２，３，４，−テトラヒドロキシブタンとのプレインキュベーションを用いた又は用いない、ＣＲＬ  １７３０  ＨＵＶＥＣのトランスクリプトミクスに対する高グルコースの効果を、正常／疾患状態の遺伝子発現プロファイル、並びにこれらの状態に対する薬物、栄養補助食品、及び食物構成成分の効果の包括的分析のための有力なツールである、ＤＮＡマイクロアレイ技術を使用して調査した。
【００６８】
結果的に、評価された最後のパラメーターには、転写変化の数、標準的な経路、上位及び下位カテゴリー及びネットワークが含まれた。マイクロアレイトランスクリプトミクスを、様々なグルコース濃度に曝露されたＨＵＶＥＣ細胞上で、次の例示的な方法を使用して行った。ＲＮＡ単離の調製において、総ＲＮＡをＱｉａｚｏｌで単離し、ジエチルピロカーボネート（diethylprocarbonate）（ＤＥＰＣ）処理された、ＲＮａｓｅ除去水を使用して、ＲＮＡｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎによる）で精製した。得られたＲＮＡの純度を分光光度的に試験し（Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して）、２６０／２８０が＞１．７であった場合、好適であると決定した。得られたＲＮＡの完全性を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）によるラボ・オン・チップ技術によって試験した。ＲＮＡは、無損傷の測定基準である、特有の１８Ｓ及び２８ＳリボソームＲＮＡバンドを有した。
【００６９】
総ＲＮＡの試料（１０μｇ）を、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプロトコルを介して逆転写した。標識されたｃＲＮＡを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒト転写物Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０チップ（Ｐ／Ｎ  ５２００１９、ロット番号４０９６３０３）とハイブリッド形成した。自動洗浄及び染色後、発現の絶対値を走査アレイから、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘソフトウェアを使用して算出した。
【００７０】
次いで、チップハイブリッド形成及び走査の品質を、Ｓｉｍｐｌｅａｆｆｙパッケージ（ＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒ）内の品質管理（ＱＣ）機能を使用して評価した。評価されたＱＣ測定基準には、平均バックグラウンド、スケール係数、存在すると見なされる転写物の数、β−アクチン及びＧＡＰＤＨについての３’対５’比、並びにスパイクイン対照転写物についての値が含まれた。ＱＣ指示計は、青色で表示され、ＲＮＡ品質に何ら問題がないことを示している。ＲＮＡ品質の別の測定として、マイクロアレイ実験において使用された１２個の試料からのＲＮＡ分解プロットは、異なるプローブについての５’及び３’末端において同様の強度を示し、予想通り、このうちより感受性の高い５’末端における強度がより低かった。
【００７１】
データの正規化後、線形ＡＮＯＶＡモデルを適用し、ここで転写物発現は、グルコース＋処理＋グルコース：治療＋日にほぼ等しい。次いで、ｐ値を、次の比較について算出した：ＨＧＥＲＴ対ＨＧ（ＨＧＥＲＴ／ＨＧ）、ＮＧＥＲＴ対ＮＧ（ＮＧＥＲＴ／ＮＧ）、及びＨＧ対ＮＧ（ＨＧ／ＮＧ）。処理は、転写物発現に対して有意な効果を有した。
【００７２】
結果及びデータを収集した。ＮＧ対ＨＧを比較した際、ＮＧ条件下で、ＥＲＴは、異なる及びより少数の転写物及び経路に影響を及ぼしたことが見出された。ＨＧ／ＮＧ対ＨＧＥＲＴ／ＨＧを比較すると、驚くべきことに、ＥＲＴが、ＨＧ条件下で、細胞死等の主要な経路において、その不在下で観察されたトランスクリプトミクス変化の多くを逆行させることが見出された。細胞骨格（cytosketal）及び接着点トランスクリプトミクスを研究したとき、この変化が、ＨＧＥＲＴ対ＨＧに曝露された細胞の順応性の生存及び保護特性を反映している可能性が高いことが見出された。ポリイノシチド代謝の研究において、ＨＧＥＲＴをＨＧと比較したとき、多種多様なトランスクリプトミクス変化が、ＰＩ３Ｋカスケード及びイノシチド誘導性の順応性細胞骨格変化の生存及び保護特性に関連することが見出された。
【００７３】
細胞生存率及び保護又は細胞成長と関連付けられる転写物を伴う研究は、多種多様なシグナル伝達経路を介して、ＨＧ条件下で、ＥＲＴが、細胞生存率及び保護並びに細胞死転写物（cell death transcripts）の両方を促進することを示した。ＥＲＴは、ＨＧ条件下で細胞死を減少させたことから、トランスクリプトミクスでは検出されない、翻訳後事象が、ＥＲＴの保護特性に関与すると結論付けられた。
【００７４】
ＨＧ条件下で行われた抗炎症に関与する研究は、ＥＲＴが、炎症促進性及び抗炎症性の両方の役割を有して、サイトカイン関連転写物を変更することを示した。
【００７５】
トランスクリプトミクス証拠は、多くの転写物が、形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）シグナル伝達経路に起因して、ＨＧＥＲＴ対ＥＲＴに反応して変更されることを示唆した。
【００７６】
ＨＧ条件下で、ＥＲＴがクエン酸回路及び電子伝達複合体を通じて流量を減少させ、それにより活性酸素種（ＲＯＳ）をもたらすミトコンドリア電子漏出が減少し得ることが見出された。しかしながら、抗酸化物質又はＲＯＳ消去の伝統的なマーカーは、トランスクリプトミクスで検出されなかった。
【００７７】
プリン及びピリミジン代謝に関わる試験は、ＥＲＴがＲＮＡポリメラーゼを介して、プリン及びピリミジン代謝を変更して、可能性としてはＤＮＡを修復し、転写を減速する効果を媒介するという、考慮すべきトランスクリプトミクス証拠を提供した。プレｍＲＮＡプロセシングに関与する転写物に対する多くの変化もまた、ＥＲＴが転写に影響を及ぼし、それが細胞生存率及び保護特性に関連し得ることを示した。ＨＧ条件下で、研究は、ＥＲＴが、タンパク質分解に関連する、ＥＲストレス及び折り畳み不全タンパク質応答（ＵＰＲ）（例えば、ＳＵＭＯ化及び脱ユビキチン化を介した）経路の調節を介して、細胞生存率及び保護特性を発揮することを示した。故に、全体として、研究は、ＥＲＴが典型的な抗酸化物質ではないという証拠を提供した。それは確かに、ＨＧ条件及び酸化体ストレス条件下で（後者は標的化細胞死アッセイに基づく）、強力な細胞生存率及び保護特性を発揮する。
【００７８】
次の表２Ａ〜２Ｆは、多様な疾患について、ＨＧ対ＮＧ及びＨＧＥＲＴ対ＨＧによって、差次的に発現された遺伝子（ｐ＜０．０５で）の数を示し、どの遺伝子が高グルコースストレス条件下で上方制御又は下方制御されたか、及びどの代謝経路がこれらの遺伝子と関連付けられるかに関するデータ点を含む。次の表２Ａ〜２Ｆは、ＥＲＴが、同じストレス条件下でどのようにかかる遺伝子の上方制御又は下方制御を逆行させ、それによって細胞活性及び機能性のストレス関連変化を逆行させ、それによって不適切な細胞機能又は細胞死の危険性を低減し、正常な細胞機能及び活性を維持する一助となることが可能であったかを更に例証する。表２Ａ〜２Ｆにおいて、Ψ記号は、ＨＧＥＲＴ／ＨＧ又はＨＧ／ＮＧ条件下での遺伝子の上方制御を示し、Ω記号は、遺伝子の下方制御を示す。印のない細胞は、それらの条件下で遺伝子の制御に変化がないことを示す。
【００７９】
【表２Ａ】
2015522250.tif 000004
【００８０】
【表２Ａ−２】
2015522250.tif 000005
【００８１】
【表２Ｂ−１】
2015522250.tif 000006
【００８２】
【表２Ｂ−２】
2015522250.tif 000007
【００８３】
【表２Ｂ−３】
2015522250.tif 000008
【００８４】
【表２Ｂ−４】
2015522250.tif 000009
【００８５】
【表２Ｂ−５】
2015522250.tif 000010
【００８６】
【表２Ｃ−１】
2015522250.tif 000011
【００８７】
【表２Ｃ−２】
2015522250.tif 000012
【００８８】
【表２Ｃ−３】
2015522250.tif 000013
【００８９】
【表２Ｄ−１】
2015522250.tif 000014
【００９０】
【表２Ｄ−２】
2015522250.tif 000015
【００９１】
【表２Ｄ−３】
2015522250.tif 000016
【００９２】
【表２Ｅ−１】
2015522250.tif 000017
【００９３】
【表２Ｅ−２】
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【００９４】
【表２Ｅ−３】
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【００９５】
【表２Ｆ−１】
2015522250.tif 000020
【００９６】
【表２Ｆ−２】
2015522250.tif 000021
【００９７】
実施例４
ゲオトリクム・カンジダムは、カマンベール、サンネクテール、トム・ドゥ・サヴォワのようなソフトチーズ等の乳製品、並びにヨーグルト及び凝固乳のような他の発酵乳製品を含むが、これらに限定されない、多くの食物の醗酵生産における培養物として幅広く使用される真菌又はかびである。
【００９８】
ゲオトリクム・カンジダム細胞（ＧＣＣ）での種培養を、ＧＣＣを、１０％グルコース及び他の栄養素を含有する培地中で成長させることによって生成した。ＧＣＣの数が更に増加しなくなった発酵過程の終わりに、ＧＣＣ培養物が保存されるように発酵ブロスを凍結乾燥させた。ＧＣＣの機能及び活性は、保存過程中に低減された。ＧＣＣ機能及び活性に及ぼすＥＲＴの影響を、凍結乾燥前にＥＲＴをＧＣＣ発酵ブロスに添加し、凍結乾燥したＥＲＴの添加を伴う及び伴わないＧＣＣの機能及び活性を比較することによって、研究した。機能及び活性は、１リットルの発酵ブロス当たり、標準化された量の活性及び機能を有する、どれほど多くの用量のＧＣＣ培養物を得ることができるかを測定することによって表した。
【００９９】
【表３】
2015522250.tif 000022
【０１００】
表３は、２％及び３％  ＥＲＴの発酵ブロスへの添加が、ＧＣＣ活性及び機能をそれぞれ２０％及び２６％改善したことを例示するデータを提供する。５％  ＥＲＴの添加は、活性及び機能が８％増加したのみであったことから、一見したところ高すぎるようであった。
【０１０１】
実施例５
β細胞（細胞株：ＨＩＴ−Ｔ１５）を、供給元ＡＴＣＣから得た。細胞を２４ウェルプレート中に播種した（３００．０００細胞／ウェル）。一晩の付着後、培地を除去し、細胞をＨＢＳＳで洗浄した。新たな培地を添加し、５０ｍＭのＥＲＴ又はビヒクル（培地）の１／１０体積を、細胞に添加した。１時間のインキュベーション後、グルコース溶液をウェル中６、１５、又は３０ｍＭの最終濃度に添加した。その後、細胞を２４時間インキュベートした。インキュベーション後、培地及びＨＢＳＳを含む全ての細胞材料を収集し、遠心分離した（５分間、５００×ｇ）。上清を除去し、細胞を５００μＬのＨＢＳＳ中に再懸濁させた。細胞懸濁液を０．４％トリパンブルー色素中で１：１希釈し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓチャンバに負荷した。細胞を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ細胞計数器を使用して計数し、それにより細胞の生存性（機能及び活性）を算出した。
【０１０２】
図６は、漸増レベルのグルコースとのインキュベーションがどのようにＨＩＴ−Ｔ１５細胞の生存性（機能及び活性）の用量依存性減少をもたらしたかを例示する。５ｍＭのＥＲＴの存在下での同じインキュベーションは、この減少を有意に減弱し、細胞機能及び活性の改善をもたらした。３０ｍＭのグルコースとの２４時間のインキュベーションによって引き起こされる最も高いストレス下で、最も高い改善が達成された。同様のストレス条件は、急性として、健康な人々に現れ得、急性から慢性として、糖尿病を患う人々を含むが、これらに限定されない、グルコース代謝機能障害を有する人々に現れ得る。
【０１０３】
実施例６
ヒトβ細胞内のグルコース誘導性の生存性及びインスリン産生関連遺伝子の変化に対するメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの効果を研究した。β細胞は、インスリンを分泌する、膵臓のランゲルハンス島における細胞である。ヒトβ細胞は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｌｓｔｅｒによって開発された、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）にて市販されている１．１Ｅ７細胞株を用いて、インビトロで培養し、成長させることができる。
【０１０４】
細胞培養物：ヒト１．１Ｅ７β細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭのＬ−グルタミン及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ  １６４０培地中で培養した。細胞を３７℃で、５％  ＣＯ２雰囲気下で維持した。
【０１０５】
生存性：細胞を２４ウェルプレート中に播種した。一晩の付着後、培地を除去し、細胞をＨＢＳＳで洗浄した。新たな培地を添加し、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン（最終濃度：５ｍＭ）又はビヒクル溶液（培地）を、細胞に添加した。１時間のインキュベーション後、ビヒクル又はグルコース溶液をウェル中１０、３０、又は４５ｍＭの最終濃度に添加した。その後、細胞を２４時間、４８時間、６日間、及び７日間インキュベートした。インキュベーション後、培地及びＨＢＳＳを含む全ての細胞材料を収集し、遠心分離した（５分間、５００×ｇ）。上清を除去し、細胞を１００μＬのＨＢＳＳ中に再懸濁させた。細胞懸濁液を０．４％トリパンブルー色素中で１：１希釈し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓチャンバに負荷した。細胞を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（登録商標）自動細胞計数器（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＢＶ，Ｂｌｅｉｓｗｉｊｋ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して計数した。
【０１０６】
遺伝子発現分析：ＲＮＡを、製造元のプロトコルに従ってＱｉａｚｏｌ懸濁化細胞から単離し、分光光度的に定量した。逆転写反応を、５００ｎｇのＲＮＡを使用して、それを、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キットを使用してｃＤＮＡへと転写させることにより、行った。次に、リアルタイムＰＣＲをＢｉｏＲａｄ  ＭｙｉＱ  ｉＣｙｃｌｅｒ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｏｌｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ検出系により、Ｓｅｎｓｉｍｉｘ（商標）＋ＳＹＢＲ及びフルオレセイン、５μＬ希釈（１０倍）ｃＤＮＡ、及び０．３μＭのプライマーを使用して、２５μＬの総体積で行った。ＰＣＲを次のように行った：９５℃で１０分間の変性、続いて９５℃で１５秒間及び６０℃で４５秒間を４０周期。ＰＣＲ後、融解曲線（６０〜９５℃）を生成物識別及び純度のために生成した。アクチンを内部対照として含めた。プライマー配列が表４に示される。データを、ＭｙＩＱソフトウェアシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＢＶ，Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して分析し、相対的な遺伝子発現（倍率変化）として、２ΔΔＣｔ法を使用して表した。
【０１０７】
下の表４は、遺伝子発現分析のために使用したインスリン産生関連遺伝子についてのプライマー配列を示す。ＰＣ１／３及びＰＣ２は、プロタンパク質又はプロホルモン変換酵素である。それらは、分泌経路を通じて通行しているタンパク質の不活性な前駆体を（例えば、プレプロインスリン及びプロインスリン）を、それらの成熟型（例えばインスリン）へと変換する。７Ｂ２は、活性プロホルモン変換酵素２（ＰＣ２）の産生に必要とされる小さい神経内分泌タンパク質である。
【０１０８】
【表４】
2015522250.tif 000023
【０１０９】
図７Ａ〜７Ｄは、１．１Ｅ７細胞の生存性に対する、１０、３０、及び４５ｍＭのグルコースとの、２４時間（図８Ａ）、４８時間（図８Ｂ）、６日間（図８Ｃ）、又は７日間（図８Ｄ）にわたるインキュベーションの効果を示すグラフである。データは、４つの独立した実験の平均±標準誤差として表される。＊＝１０ｍＭ（正常グルコース）と比較してｐ＜０．０５、＊＊＝ＥＲＴなし（ＥＲＴ＝メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン）と比較してｐ＜０．０５。
【０１１０】
グルコースとの２４時間及び４８時間のインキュベーション後、細胞生存性に対する影響は何ら観察されず、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの存在は、この維持された生存性に対していかなる影響も有しなかった。グルコースとのインキュベーションは、６日及び７日後に１．１Ｅ７細胞の生存性の用量依存性減少をもたらした。５ｍＭのメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの存在は、このβ細胞生存性の減少を完全に予防した。高血糖の間にβ細胞の生存性を維持及び／又は改善する能力はしたがって、真性糖尿病の治療において関連性があり、有益である。
【０１１１】
図８Ａ〜８Ｆは、１０、３０、及び４５ｍＭのグルコースと共に２４時間（図８Ａ、８Ｃ、及び８Ｅ）又は７日間（図８Ｂ、８Ｄ、及び８Ｆ）インキュベートされた１．１Ｅ７細胞の７Ｂ２（図８Ａ及び８Ｂ）、ＰＣ１／３（図８Ｃ及び８Ｄ）、及びＰＣ２（図８Ｅ及び８Ｆ）の遺伝子発現に対する効果を示すグラフである。データは、３つの独立した実験の平均±標準誤差として表される。＊＝１０ｍＭ（正常グルコース）と比較してｐ＜０．０５、＊＊＝ＥＲＴなしと比較してｐ＜０．０５。
【０１１２】
メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンは、（プレ）プロインスリンのインスリンへの変換に関与する遺伝子の発現を改善した（図８Ａ〜Ｆを参照されたい）。これらの効果は、高濃度のグルコースへのより長い曝露後に特に顕著である。プロタンパク質変換酵素１（ＰＣ１）は、インスリンの生合成の第１の工程に主に関与する酵素である。ＰＣ１の作用に次いで、塩基性残基をプロセシング中間体から除去し、インスリンの生理活性型を生成するためにカルボキシペプチダーゼが必要とされる。別のプロホルモン変換酵素である、プロタンパク質変換酵素２（ＰＣ２）は、インスリン生合成の第１の工程においてより副次的な役割を果たすが、グルカゴン生合成の第１の工程においてはより大きい役割を果たす。ＰＣ２は、７Ｂ２と名付けられる神経内分泌タンパク質に結合し、このタンパク質が存在しない場合、プロＰＣ２は、酵素的に活性となることができない。７Ｂ２はまた、７Ｂ２がより小さい不活性型へと切断されるまでＰＣ２活性を阻害する。故に、７Ｂ２は、ＰＣ２の活性化因子及び阻害因子の両方である。メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンが、漸増するグルコース濃度及びより長い曝露の下で、培養β細胞内のこれらの遺伝子の発現を増加させ得るという観察は、漸増するストレス条件への曝露の間にヒト膵臓β細胞の機能を維持及び改善するその能力を例証する。
【０１１３】
実施例７
２型真性糖尿病患者へのメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの投与は、グルコース及びインスリン代謝を改善及び回復させたことにより、糖尿病ストレス条件の曝露の間のインビボでのヒトβ細胞機能の維持及び改善を例証している。
【０１１４】
ヒト研究を、２型真性糖尿病を有する患者において行った。空腹時血糖＞１２５ｍｇ／ｄｌによって定義される２型真性糖尿病を有する、又はインスリンを例外として２型真性糖尿病に対する継続的治療を受けている、さもなければ健康な患者である、患者を登録した。
【０１１５】
患者に、１２ｇのメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンを含有するドライミックス小袋を８ｆｌ  ｏｚの水のボトルに添加し、激しく振盪して、レモン風味の飲料としてまとめて即座に消費するように指示した。
【０１１６】
参加者は、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン（１２ｇのメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンを毎日３回）を２８日間消費し、このうち最後の消費が試験訪問の前日の夕方であった。試験訪問の朝、空腹時採血を行い、その後メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンのレモン風味の飲料（１２ｇのメソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン）を１枚のバターなしトーストと一緒に消費した。２時間後、採血を再び行った。血中グルコース、インスリン、及びＣ−ペプチドレベルを両時点（すなわち、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン摂取の前及びその２時間後）で測定した。
【０１１７】
各可変要素を正規性について検定した後、対応のあるｔ検定を行って、統計的有意性を決定した。非正規分布を有する可変要素については、ウィルコクソンの符号順位検定を使用した。全ての分析を、ＳＰＳＳ（ＩＢＭ、バージョン１９）を使用して行った。服薬遵守を、研究参加者によって返却された空の小袋の計数に基づいて決定した。２４人の対象を登録し、研究から辞退した者はいなかった。平均服薬遵守は、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの小袋の計数に基づいて９０％であった。下の表５は、ベースラインでの対象の臨床特徴を示す。
【０１１８】
【表５】
2015522250.tif 000024
【０１１９】
メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタンの消費は、血液Ｃ−ペプチドレベルの増加をもたらし（Ｐ＝０．０５）、それには血中グルコースレベルの境界域で有意な減少（Ｐ＝０．０６）及びインスリンレベルの有意でない増加（Ｐ＝０．２２）を伴った。図９、１０、及び１１は、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン摂取前及び後のグルコース、インスリン及び、Ｃ−ペプチドの変化を例示する。
【０１２０】
メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン消費は、２型真性糖尿病患者において、血中グルコース、インスリン、及びＣ−ペプチドレベルを含む、幾つかのグルコース代謝の測定値に対して好ましい効果をもたらした。この研究は、メソ−１，２，３，４−テトラヒドロキシブタン投与が、２型真性糖尿病を有する患者において、グルコース代謝を改善及び回復させたことを例証する。
【図１】
2015522250.tif 000025
【図２】
2015522250.tif 000026
【図３】
2015522250.tif 000027
【図４Ａ】
2015522250.tif 000028
【図４Ｂ】
2015522250.tif 000029
【図４Ｃ】
2015522250.tif 000030
【図５】
2015522250.tif 000031
【図６】
2015522250.tif 000032
【図７Ａ】
2015522250.tif 000033
【図７Ｂ】
2015522250.tif 000034
【図７Ｃ】
2015522250.tif 000035
【図７Ｄ】
2015522250.tif 000036
【図８Ａ】
2015522250.tif 000037
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
2015522250.tif 000041
【図８Ｆ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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