(57)【要約】一例は、細胞を流体試料から分離するための装置を含み、該装置は、中央に位置している上部入口と、該入口よりも下側にかつ該入口の側方に配置されたそれぞれの側方出口と、該上部入口よりも下側で、2つまたはそれ以上の該出口の側方に配置された下部出口とを画定するプレナムを備え、該プレナムは、該入口を通じて流体および細胞懸濁液を受け取るように、かつ該下部出口と2つまたはそれ以上の該側方出口の間で延びているそれぞれの側壁に接して該下部出口に該流体および該細胞懸濁液を方向付けるように構成され、かつ、該2つまたはそれ以上の側方出口のそれぞれと該下部出口の間の距離は、細胞が力を受けて該下部出口を通って出ることを促進すべく選択される。該入口と該側方出口の間の横方向/垂直方向の距離は流体側方移動を提供することができ、それにより、重力が細胞を出口の方へ付勢するための時間が与えられる。2015514425.tif 000009
2015514425.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中央に位置している上部入口と、
該入口の側方に配置された少なくとも2つの側方出口と、
該上部入口よりも下側で、2つまたはそれ以上の該出口の側方に配置された、下部出口と
を画定するプレナムを備える、力の影響を受けて細胞を流体試料から分離するための装置であって
該プレナムが、該入口を通じて流体を受け取るように、かつ該下部出口と2つまたはそれ以上の該側方出口の間で延びている少なくとも2つの側壁に接して該下部出口にその流体を方向付けるように構成され、かつ
該2つもしくはそれ以上の側方出口のそれぞれと該下部出口の間の距離、および/または該入口から該少なくとも2つの側方出口のうちの一つもしくは複数までの距離が、細胞が該力を受けて該下部出口を通って出ることを促進すべく選択される、装置。
【請求項２】
前記壁が、前記力に対してある角度を成して配置されている、請求項1に記載の装置。
【請求項３】
前記壁が、前記力に対して60°の角度を成して配置されている、請求項2に記載の装置。
【請求項４】
前記力が重力を含む、請求項1に記載の装置。
【請求項５】
前記入口が試料収集チャネルに対して開口し、該試料収集チャネルが、y方向に対して水平に直交するz方向よりもy方向に沿って幅広く、かつ、前記力が、y方向およびz方向の両方に対して直交するx軸線に沿って方向付けられている、請求項1に記載の装置。
【請求項６】
前記入口よりも下側で、z方向に沿って該入口の側方に、前記少なくとも2つの側方出口が配置されている、請求項5に記載の装置。
【請求項７】
前記プレナムが、x-z平面に沿って切断された断面において第1の円錐台形状を有する、請求項5に記載の装置。
【請求項８】
前記プレナムが、x-y平面に沿った第2の円錐台形状を有し、該第2の円錐台形状が、第1の円錐台形状の第1の中心頂点からz方向の周りに180°位相をずらされた第2の中心頂点を有する、請求項7に記載の装置。
【請求項９】
前記プレナムが、x-y平面に沿った第2の円錐台形状を有し、該第2の円錐台形状が、前記第1の円錐台形状の第1の中心頂点からz方向の周りに0°位相をずらされた第2の中心頂点を有する、請求項7に記載の装置。
【請求項１０】
前記少なくとも2つの側方出口の第1の出口が、x-y平面の一方側に配置されており、かつ、該少なくとも2つの側方出口の第2の出口が、x-y平面の反対側に配置されている、請求項5に記載の装置。
【請求項１１】
前記少なくとも2つの側方出口のそれぞれが、細長く、y方向に沿って広がっている、請求項5に記載の装置。
【請求項１２】
前記下部出口が、細長く、y方向に沿って広がっている、請求項5に記載の装置。
【請求項１３】
前記少なくとも2つの側方出口のそれぞれおよび前記下部出口が、実質的に同じ面積である、請求項5に記載の装置。
【請求項１４】
前記プレナムを画定する上壁がy-z平面に沿って広がっており、入口開口部が該上壁を貫通して配置されており、かつ、前記少なくとも2つの側方出口のそれぞれの上側面が該上壁に隣接して配置されている、請求項5に記載の装置。
【請求項１５】
前記プレナムが、前記上壁と前記少なくとも2つの側壁とによって画定される、請求項14に記載の装置。
【請求項１６】
中央に位置している上部入口と、
該上部入口の一側面側に配置された第1の側方出口と、
該上部入口の反対側面側に配置された第2の側方出口と、
該上部入口、該第1の側方出口、および該第2の側方出口よりも下側に配置された、下部出口と
を画定するプレナムを備える、力の影響を受けて細胞を流体から分離するための装置であって、
該プレナムが、該入口を通じて該流体を受け取るように、かつ2つまたはそれ以上の該側方出口のそれぞれと該下部出口の間で延びているそれぞれの側壁に沿って該下部出口にその流体を方向付けるように構成され、かつ
該第1の側方出口と該上部入口の間の距離が、細胞が該力を受けて該下部出口を通って出ることを促進すべく選択され、かつ、該第2の側方出口と該上部入口の間の距離が、細胞が該力を受けて該下部出口を通って出ることを促進すべく選択される、装置。
【請求項１７】
各前記側壁のそれぞれの長さが、細胞が前記力を受けて前記下部出口を通って出ることを促進すべく選択される、請求項16に記載の装置。
【請求項１８】
前記それぞれの側壁が、前記力に対してある角度を成して配置されている、請求項16に記載の装置。
【請求項１９】
前記側壁が、前記力に対して60°の角度を成して配置されている、請求項18に記載の装置。
【請求項２０】
前記入口が試料収集チャネルに対して開口し、該試料収集チャネルが、z方向に対して水平に直交するy方向よりもz方向に沿って幅広く、かつ前記力が、z方向およびy方向の両方に対して直交するx方向に方向付けられている、請求項16から19のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２１】
前記入口よりも下側で、y方向に沿って該入口の側方に、それぞれの前記側方出口が配置されている、請求項20に記載の装置。
【請求項２２】
x-y平面に沿って切断された断面上の、z方向に沿って突出した第1の円錐台形状を、前記プレナムが有する、請求項20または請求項21に記載の装置。
【請求項２３】
y方向に沿って突出した、x-z平面に沿った第2の円錐台形状を、前記プレナムが有する、請求項22に記載の装置。
【請求項２４】
それぞれの前記側方出口の第1の出口が、x-z平面の一方側に配置されており、かつ、該それぞれの側方出口の第2の出口が、x-z平面の反対側に配置されている、請求項20から23のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２５】
各前記側方出口のそれぞれが、細長く、z方向に沿って広がっている、請求項20から24のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２６】
前記下部出口が、細長く、z方向に沿って広がっている、請求項20から25のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２７】
各前記側方出口のそれぞれおよび前記下部出口が、実質的に同じ面積である、請求項20から26のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２８】
前記プレナムを画定する上壁がy-z平面に沿って広がっており、入口開口部が該上壁を貫通して配置されており、かつ、各前記側方出口のそれぞれの上側面が該上壁に隣接して配置されている、請求項20から27のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２９】
前記プレナムが、前記上壁と前記それぞれの側壁とによって画定される、請求項28に記載の装置。
【請求項３０】
以下の段階を含む、力の影響を受けて細胞を流体試料から分離する方法：
プレナムの中央に位置している上部入口を通じて該流体を受け取る段階、
該上部入口よりも下側に配置された下部出口に該流体を方向付ける段階であって、該流体が、該下部出口と2つまたはそれ以上の側方出口の間で該入口の側部および該下部出口まで延びており該下部出口よりも上側に位置しているそれぞれの側壁に接して、方向付けられている、段階、ならびに
該流体の無細胞部分が該下部出口よりも上側の該2つまたはそれ以上の側方出口を通って出る間に該流体中の細胞が該力を受けて該下部出口を通って出ることを促進されるように、該2つまたはそれ以上の側方出口のそれぞれと該下部出口の間の距離を移動させるために該流体を押し進める段階。
【請求項３１】
細胞が前記力を受けて前記下部出口を通って出ることを促進すべく、前記入口からそれぞれの前記側方出口のうちの一つまたは複数までの距離を選択する段階を含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
押し進める段階が、前記プレナムと重力とを一直線に合わせることを含む、請求項30または請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
押し進める段階が、遠心分離機上に前記プレナムを位置合わせして、前記流体を前記上部入口から前記下部出口まで径方向外側に押し進めることを含む、請求項30から32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記流体を方向付ける段階が、2つの洗浄ストリーム間に層流状態で挟まれる細胞含有中央ストリームを前記上部入口から前記下部出口に方向付けることを含む、請求項30から33のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
凍結保護剤を前記流体から洗浄する段階を含む、請求項24に記載の方法。
【請求項３６】
入口ポート、第1の出口ポート、および第2の出口ポートを有し、該入口ポートと該第1の出口ポートの間で流体の流れを調節するようにかつ該入口ポートと該第2の出口ポートの間で流体の流れを調節するように構成され、該入口ポートと該第1の出口ポートの間の軸線と一直線に合わせられた力に流体が供される場合に該入口ポートにおける該流体の第1の成分が該第1の出力ポートに方向付けられるようなかつ該流体の第2の成分が該第2の出力ポートに方向付けられるような壁形態を有する、流体プレナムチャンバ
を備える、システム。
【請求項３７】
前記第2の出口ポートが、前記入口ポートの両側に配置された一対の出口ポートのうちの一方である、請求項36に記載のシステム。
【請求項３８】
細胞を含んだ流体を前記入口ポートに圧送するためかつ一対の洗浄液ストリームを該入口ポートに圧送するためのシリンジポンプを備え、該一対の洗浄液ストリームが、それらの間に該細胞を含んだ流体を挟んでいる、請求項37に記載のシステム。
【請求項３９】
前記シリンジポンプが、前記洗浄液ストリームを前記第2の出口ポートから圧送するように構成される、請求項38に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本特許出願は、参照によりその全体が本願に組み入れられる2012年4月17日に出願された"INLET AND OUTLET GEOMETRIES FOR A VERTICAL THREE-STREAM MICROFLUIDIC DEVICE"と題されるAllison Hubel等の米国仮特許出願第61/625,498号（代理人整理番号600.865PRV）の優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
細胞は、特定の利益を得るために化学物質または他の物質を用いて処理され得る。例えば、細胞は、調査用途および治療用途のために定期的に凍結保存される。しかしながら、凍結および解凍のストレスから細胞を保護するために使用される一般的な凍結保護剤（CPA）であるジメチルスルホキシド（DMSO）は有毒となり得るものであり、そのため、DMSOなどの物質は、細胞が特定のプロセスで使用される前に除去されるべきである。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本発明者らは、とりわけ、解決されるべき問題が流体試料から物質を除去することを含み得ることを認識した。本主題は、例えば3つのストリームが長方形のチャネルを通って例えば垂直に、例えば平行に流れるマイクロ流体デバイスを提供することによってこの問題に対する解決策を提供するのに役立ち得る。2つの洗浄液ストリームが、DMSOを含んだ細胞ストリームなどのストリームの両側で流れることができ、それにより、DMSOなどの物質が洗浄液中へ拡散して除去され得る。洗浄された試料を収集することができる。
【０００４】
本発明者らは、特に、解決されるべき問題が、流れている試料から物質が除去される間に高い割合の細胞を回収することを含み得ることを認識した。本主題は、例えば約0.5〜約4.0ml/分（Pe＝1263-10,100）の流量で細胞ストリームからDMSOの抽出を行うことによってこの問題に対する解決策を提供するのに役立ち得る。より高い細胞ストリーム流量およびより低い細胞ストリーム流量はいずれも、チャネルおよびプレナムのスケーリングによって達成することができる。物質が回収される細胞は、容量で0.5％〜20％細胞の範囲の懸濁液などの懸濁液中にリンパ芽球（例えばジャーカット細胞）を含むことができる。細胞回収率は95％よりも高くなり得る。DMSO除去などの物質除去は、デバイスの長さに沿って行うことができる。態様は、確立された細胞洗浄技術よりも約25％良好となり得る高い細胞回収率を提供する。態様は、高い流量を提供することができ、それにより、臨床的に関連する細胞群の処理を可能にする。
【０００５】
特定の態様は、高価なあるいは重い機器を伴うことなく処理を行い、それにより、幅広い範囲の使用分野を可能にする。態様は、特に、細胞治療および再生医療のための細胞の処理、細胞バンキング、ならびに生物検体の処理のために使用され得る。
【０００６】
本概要は、本特許出願の主題の概要を提供することを目的としている。これは、本発明の排他的なあるいは包括的な説明を提供することを目的としていない。詳細な説明は、本特許出願に関するさらなる情報を提供することを目的としている。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図1Aは、一態様に係るチャネル内の流れ形態の概略図を示す。図1Bは、図1Aにおける部分1Bの拡大図である。
【図２】デバイス、シリンジポンプ、接続部、観察機器、および試料収集ポイントを備える設備の一例の概略図を示す。
【図３】図3Aは、一態様に係る細胞が存在しないデバイスにおけるDMSO除去を表すプロットを示す。図3Bは、一態様に係る、3ストリーム垂直デバイスにおけるDMSO除去と2ストリーム水平デバイスにおけるDMSO除去との比較を表すプロットを示す。
【図４】図4Aは、一態様に係る入口付近のデバイス内の細胞の画像を示す。図4Bは、一態様に係る出口付近のデバイス内の細胞の画像を示す。
【図５】図5Aは、一態様に係る、fq＝0.019の流量での約0.5％の細胞体積分率（"CVF"）におけるデバイスからの細胞回収率のプロットを含む。図5Bは、一態様に係る、fq＝0.033の流量での約0.5％のCVFにおけるデバイスからの細胞回収率のプロットを含む。
【図６】一態様に係る、細胞ストリーム出口および洗浄液ストリーム出口 対CVFからの細胞回収率のプロットを含む。
【図７】一態様に係る細胞分離器の斜視図である。
【図８】図8Aは、一態様に係る細胞分離器の正面図である。図8Bは、一態様に係る細胞分離器の側断面図である。
【図９】一態様に係るプレナムおよびチャネルの概略的な図を示す。
【図１０】一態様に係る図9のプレナムの寸法を示す。
【図１１】一態様に係るデバイスを動作させる方法を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
詳細な説明
凍結保存は、細胞治療/細胞再生医療、バイオバンキング、および組み換えタンパク質の生成を含む多種多様な分野のための実現技術である。凍結保存される細胞は、凍結融解プロセスのストレスから細胞を保護するために、凍結保護剤（"CPA"）の導入を必要とし得る。ある凍結保護剤、すなわち、ジメチルスルホキシド（"DMSO"）は、溶液の導入または除去が細胞の融解をもたらすことができるような濃度で使用され得る。
【０００９】
DMSOは、細胞に対して毒性を有し得、かつ、細胞に基づく治療を受ける患者に注入される場合にマイナスの副作用を引き起こし得る。DMSOは、洗浄溶液を用いて浮遊物の遠心分離および置換を繰り返すことによって細胞試料から除去され得る。しかしながら、試料は、遠心分離および浸透力に起因して、27〜30％の細胞損失を被る可能性がある。自動細胞洗浄機は、必要労力を減らすことができるが、依然として同様の細胞損失をもたらす可能性がある。
【００１０】
マイクロ流体デバイスは細胞群を操作できる。これらのデバイスは、数ある利点の中でも特に、細胞計数、異種細胞群の蓄積、および試薬への曝露制御を行うことができる。例は、数ある手法の中でも特に、サイズに基づいて、蛍光標識化、および電磁（EM）場、磁力、音場を用いた偏向に基づいて、ならびに重力による分画細胞沈殿に基づいて細胞を分離することができる。マイクロ流体デバイスは、用量依存的な細胞配列を行うため、および細胞キャリア媒体を交換するために使用され得る。細胞および細胞を取り囲む化学環境を操作できる能力は、マイクロ流体デバイスを凍結保存用途に役立つようにすることができる。
【００１１】
マイクロ流体デバイスにおけるCPAの抽出は、濃度の漸進的変化をもたらすことができる拡散によって左右され得る。この効果は、幾つかの従来の遠心分離に基づく洗浄技術によってもたらされる段階的変化と比べて、細胞に対する浸透ストレスを減少させることができる。細胞運動は、流れの層流性に起因して穏やかになり得る。幾つかの最近の例は、標準的なプロトコールと比べて細胞生存率を高めることができるが流量が20μl/分に制限され得る、細胞試料からのCPAの除去およびCPAの導入のためのマイクロ流体デバイスを使用する。幾つかの最近のマイクロ流体デバイスは、非常に低い細胞濃度でのみ細胞懸濁液を扱うことができる。
【００１２】
実際には、多くの凍結保存用途は2〜20％の細胞体積分率（"CVF"）を使用し、また、約1〜2ml/分の流量を達成するデバイスが望ましい。最近の例は、これらの条件下でDMSOの95％除去を達成できる多段マイクロ流体デバイスを含む。デバイスの各段は、水平に方向付けられた長方形断面のチャネルから成る。2つのストリームがチャネルを通って平行に接触状態で流れることができる。すなわち、細胞を含んだ試料ストリームおよびDMSOを含んだ試料ストリームが下部に沿って流れることができる一方で、リン酸緩衝生理食塩水（"PBS"）洗浄溶液が上部に沿って流れることができる。DMSOは試料ストリームから洗浄液ストリームに拡散し、かつ、2つのストリームは出口で分離されることができ、それにより、DMSOが試料から除去される。しかしながら、デバイスからの細胞回収率は、特定の流量範囲条件下でのみ高いため、DMSO除去における動作ウインドウが制限される。チャネル下部付近の細胞の位置は、放物線状の流れプロファイルに起因してこれらの細胞を大きな剪断勾配にも晒し、それにより、細胞損失が増大する。また、デバイスはかなりの起動時間を有し、この場合、細胞がチャネル下部付近で低速流れ中に沈降するため、細胞回収率が低くなり得る。
【００１３】
これらの懸案事項を扱うためかつ他の利点を提供するために、本主題の態様は、DMSO除去を向上させつつ前述した細胞回収率問題を軽減する改良されたシステムおよび方法を提供する。特定の態様は、デバイスを通って平行に下方へ流れる3つのストリームを使用する。洗浄液ストリームは、試料ストリーム（例えば、細胞およびDMSO）のうちの一つまたは複数の側に位置し得る。洗浄液ストリームは、中央の試料ストリームの両側に位置し得る。CPAの拡散に基づく抽出は、チャネル内に確立されたマイクロ流体環境（例えば、短い交差流距離および層流）によってもたらされ得る。最近の設計と比べて、態様は、ストリーム間の界面積を増大させることができかつ拡散距離を短くすることができ、それにより、試料ストリームからのDMSO除去に必要な下流距離を減らすことができる。特定の態様における細胞運動は、細胞に対するストレスを減らすことができるマイクロ流体デバイス内の中央に、例えば剪断が最も低い領域に細胞を含むストリームを配置することによって、制御され得る。この配向は、重力などの外力を利用して、デバイスからの細胞回収率を向上させることができる。
【００１４】
図1Aおよび図1Bには、3ストリーム垂直マイクロチャネルの概略図が示される。概略図はマイクロチャネル102内の流れ形態を示す。CPAを含んだ細胞懸濁液を含むことができる、細胞ストリーム104は、チャネルの中央を通って垂直下方へ流れることができる107。CPAが無い洗浄液ストリーム、例えば106aおよび/または106bは、細胞ストリームの一方側または両側で平行に下方へと流れることができる103。CPAは、細胞ストリーム104から一つまたは複数の隣接する洗浄液ストリーム106a、106bに拡散できる105。長さLは、所望量の拡散をもたらすように選択され得る。図1Bの部分図は、細胞内空間110から細胞外空間108に細胞膜112を横切るCPAの輸送109を図示している。
【００１５】
マイクロチャネル102は、500μm深さ（y方向）、25mm幅（z方向）、および80mm長さ（x方向）となり得る長方形断面のチャネル114を含むことができ、このチャネルを通って3つのストリームが流れることができる。中央ストリーム104は、細胞を含んでもあるいは含まなくてもよいDMSO溶液を含むことができ、一方、2つの側方のストリーム160a、106bは洗浄溶液を含むことができる。3つの全てのストリームは、チャネル内で互いに平行に接触してx方向（例えば垂直下方）に流れることができる。
【００１６】
チャネル内の流れは、小さい交差流寸法と低いレイノルズ数（約2〜約12のRe）とに起因して層流となり得る。細胞を含んだストリームから洗浄液ストリームへのCPAの輸送は、幾つかのケースにおいてのみ、高濃度細胞を含んだストリームから低濃度洗浄液ストリームへの濃度勾配によりもたらされる交差流拡散（y方向）に起因し得る。細胞は、典型的なCPA分子と比べたそれらの長い特徴的な拡散時間とチャネル中央の低い剪断勾配とに起因して中央ストリーム内に集約されたままとなり得る。
【００１７】
マイクロチャネル102の幾何学的形態の設計およびマイクロチャネル102を備えるデバイスのための動作条件の選択は、デバイス挙動の理論モデルに基づくことができる。マイクロ流体チャネル内のCPAの拡散挙動は、以下の4つの仮定のうちの一つまたは複数を伴って、対流拡散式の変形を使用して予測することができる。4つの仮定は以下の通りである。（1）チャネル内の流れは、層流、定常状態、および二次元となり得る。チャネルの入口長さは、無視できるほど短いと見なすことができる。したがって、チャネル内の速度は、x方向においてであり得、かつ、yのみの関数となり得る。（2）細胞は、細胞ストリーム流体の全体にわたって均一に分布されることができ、中立的に浮遊性があることができ、かつ局所流体速度をもって移動できる。（3）細胞内空間から細胞外空間へのCPAの拡散は、細胞が小さくて分散し得る際に局所流体のための均一な"ソース"項としてモデリングされ得る。（4）スケーリング解析に基づいて、拡散は、交差流（y）方向でのCPA輸送の基本モードとなることができ、また、対流は、下流（x）方向で優位を占めることができる。拡散は、x方向およびz方向で無視することができ、また、y方向またはz方向では対流が殆ど存在し得ないかあるいは全く存在し得ない。これらの仮定の一部または全部は、以下の対流-拡散式をもたらすことができる。
2015514425.tif 000003
式中、vxはx方向における局所流体速度であり、DはCPAの拡散率であり、dはチャネル深さ（y方向）であり、Uはチャネル内の平均流速度であり、ctは局所細胞外CPA濃度であり、Bは、CPAに対する細胞膜のモデリング透過性（膜透過性を膜厚で割ったもの）であり、Viは細胞内容積であり、Vtは局所体積（細胞内および細胞外）であり、ciおよびceは、細胞内空間および細胞外空間のそれぞれにおける局所CPA濃度を示す。第1項は、チャネル内のCPA下流側の対流を参照する。第2項は、交差流拡散挙動を参照する。第3項は、局所流体内のCPAのソースとしての役目を果たし、細胞膜を横切る細胞外空間へのCPAの輸送を参照する。
【００１８】
式1から、以下の3つの無次元パラメータは明らかになる。
2015514425.tif 000004
Peは、ペクレ数であり、CPAの拡散輸送に対する対流輸送の相対的重要性を参照する。B＊は、CPAが細胞内空間から輸送される速度と下流側対流とを比較する。Vi/Vtは、細胞によって占められる局所体積の部分を表し、したがって、どのくらいの量のCPAが洗浄液ストリームに拡散する前に細胞外空間へ輸送されるべきかを表す。洗浄液ストリーム中に細胞が殆ど存在しないかあるいは全く存在しないと仮定されるため、Viは洗浄液ストリーム中でゼロに等しくてもあるいはゼロに近くてもよく、かつ式1の第3項の影響は減少されてもあるいは低下されてもよい。
【００１９】
対象となるさらなるパラメータは、深さ分率
2015514425.tif 000005
または、細胞ストリームにより占められ得るチャネル深さの部分となり得る。これは、チャネル内の放物線状の速度プロファイルによって体積流量分率に関連付けられ得る。流量分率は式（5）によって規定される。式中、qcは細胞ストリーム104の体積流量を表し、qtはマイクロチャネル102を通った総体積流量（例えば、細胞ストリーム104と洗浄液ストリーム106a,106bとの組み合わせ）であり、また、qwは洗浄液ストリームの体積流量の合計を表すことができ、この場合、106aが0.5qw表し、また、106bが0.5qwを表す。流量分率は、CPAを含んだ（細胞）ストリームおよびCPAが無い（洗浄液）ストリームの相対的な量、並びに、CPA分子が細胞ストリームから出るために拡散しなければならない平均距離を変えることにより、チャネル内の拡散挙動に影響を及ぼすことができる。
【００２０】
（6）によって規定されるレイノルズ数は、チャネル内の流れ安定性のその表示のために重要となり得る。式中、ρは流体密度であり、μは流体の粘度である。
2015514425.tif 000006
【００２１】
式1は、フォワードマーチング有限差分計算を使用して数値的に解くことができる。解領域は、細胞ストリーム全体をCPAの入口濃度および細胞体積分率に設定することによって初期化することができる。両方の洗浄液ストリームをゼロCPA濃度に設定することができる。ノーフラックス・ノースリップ（no-flux and no-slip）境界条件をチャネル壁に適用することができる。先進の放物線状速度プロファイルを領域全体にわたって適用することができる。結果として得られる計算モデルは、MATLABを使用して解くことができる。
【００２２】
図2は、デバイス210、シリンジポンプ204、接続部、観察機器、および収集ポイントを備える設備200の概略図を提供する。図に示すように、マイクロチャネル230（例えば、図1の102）をデバイス210間に配置することができる。2つのデバイス210が図示されるが、考えられる例は、入口208のみのデバイス210と、出口212のみのデバイス210とを含む。
【００２３】
幾つかの態様によれば、細胞懸濁液（例えば、溶液中のDMSOを伴う細胞）を含む細胞入口シリンジ202がシリンジポンプ204によって駆動され得る。洗浄溶液（例えばPBS）を含む一つまたは複数の洗浄液入口シリンジ206が、同じシリンジポンプ204または他のポンプによって駆動され得、かつ、3/16"内径（"ID"）シリコンチューブなどのチューブを介してデバイス入口208に接続され得る。3つのストリームは、デバイス出口212で分離される前に、デバイス210を通って平行接触して流され得る。デバイス210を通った流れは、シリンジポンプ204により印加される任意の圧力に加えて、重力などの外力によって影響され得る。洗浄液ストリーム流量は、同じシリンジポンプ204または他のポンプによって引き込まれ得る一組の洗浄液出口シリンジ214によって制御することができる。流れは、様々なタイプのポンプ（例えば、蠕動シリンジ）および/または重力によって押し流すことができる。
【００２４】
細胞出口224および洗浄液出口218は、試料を収集するために使用できる取り外し可能なチューブの一つまたは複数のセグメントを備えることができる。細胞出口224は入口208に先行することができ、かつ、洗浄液出口218を出口212に結合させることができる。細胞出口224は、細胞入口シリンジ202によりもたらされる細胞ストリーム215からの細胞を含むことができ、かつ、大気に対して開放することができる。細胞出口224からの細胞は、例えばバイアル瓶内に収集することができる。また、マイクロチャネル230内の細胞運動を観察するために顕微鏡226およびカメラ220を据え付けることができる。
【００２５】
3つのストリームによる体積流量は、Harvard Apparatus社のモデル22ポンプなどのシリンジポンプ204を介して制御され得る。細胞を含んだストリームにおける流量は、ピストン222が所望の流量（例えば、±0.1ml/分の許容範囲内）でシリンジを駆動させるように、ポンプコントローラを介して設定され得る。同じピストンを使用して2つの洗浄液ストリーム入口シリンジを駆動させることができる。ピストン222は3つの全ての入力を同じ速度で移動させることができるため、洗浄液ストリームと比べた細胞ストリームの相対的な体積流量は、シリンジの相対断面積によって決定され得る。洗浄液入口シリンジ206のそれぞれは、ピストン222の逆側に装着される同様のサイズのあるいは同一に寸法付けられた洗浄液出口シリンジ214と対にすることができ、その場合、これらの洗浄液出口シリンジ214が、デバイス入口208のデバイスに入る量と等しい量の洗浄液を出口212から引き込むようにする。
【００２６】
研究において使用される初期濃度は容量で10％DMSOとなり得るものであり、かつ、幾つかの凍結保存プロトコールで使用される濃度は、例えば造血幹細胞生成物における濃度となり得る。細胞出口ストリーム内および洗浄液出口ストリーム内のDMSO濃度は、本明細書中に記載される方法を使用する分光光度法によって決定することができる。例えば、濃度は、209nmの波長の光の試料の吸光度に相関され得、かつ、Molecular Device社により製造されるSpectraMax（商標）Plus 384分光光度計を使用して測定され得る。試料吸光度を既知の濃度に関連付けるために、C＊＝1.0〜0.0001（10％〜0.001％DMSO）から正規化された濃度の範囲にわたってストック溶液（容量で10％DMSO）の試料を連続的に希釈することによって較正曲線を作成することができる。較正測定は、正確を期して3つ組で行うことができる。吸光度と濃度の間の関係を非線形にすることができる。しかしながら、この関係は、約0.6〜1.2光学密度（OD）の範囲の吸収性においては線形として近似されてもよい。この領域は、高い感度を有することができる（例えば、小さい濃度変化に関して大きなOD変化を実証する）。
【００２７】
試料は、DMSO濃度の測定のために、細胞ストリーム出口および両方の洗浄液出口ストリームから取得することができる。細胞を使用する態様では、試料を遠心分離して細胞を分光側光前に除去することができる。較正曲線と同様に、試料を連続的に例えば3倍に希釈することができる。較正曲線の線形領域内に入る吸収性測定を選択することができ、また、線形領域のための適合式と試料の既知の数の希釈とを使用して、試料の実際の濃度を計算することができる。
【００２８】
デバイス内の細胞挙動は、モデル細胞としてジャーカット細胞などの不死化リンパ芽球細胞株を使用して探ることができる。デバイス性能は、以下のように規定される細胞回収率を追跡することによって定量化できる。
2015514425.tif 000007
式中、生存率は試料中の生細胞対全細胞の部分となり得るものであり、かつ、細胞体積分率（"CVF"）は、細胞によって占められる試料体積の分率、または、幾つの細胞を試料中に配置できるのかについての指標を表す。この指標は、デバイス内で損傷された細胞によりもたらされる細胞損失、および、洗浄液ストリームで失われたかあるいはデバイス内に保持される細胞のうちの一方または両方を定量化できる。細胞体積分率は、血球計算板、例えばHausser Scientificにより製造される血球計算板を使用して決定することができる。試料サイズ、例えば200細胞の最小値を有する試料サイズを、それぞれの細胞ストリーム試料ごとに数えることができる。生存率は、幾つかの態様ではプロピジウムヨウ化物とアクリジンオレンジとの混合物を含むことができる膜完全性色素（membrane integrity dye）を使用して決定することができる。
【００２９】
図2に示されるように、試料は、デバイスに対する細胞出口224の直前で、細胞出口224で、および洗浄液出口218で収集することができる。試料は、細胞出口224から取得でき、かつ、基準として使用できる。細胞出口224での回収率は、デバイス210の一方または両方の指標を提供することができる。洗浄液出口218から取得された試料は、細胞が洗浄液ストリームで失われたかあるいは細胞がデバイス自体内に残存するかどうかを判定するために使用することができる。また、細胞が周囲の流体よりも僅かに密度が高いため、細胞が経時的に沈降し得る。このため、デバイスを出入りする細胞の均一な分布を確実なものにすべく、細胞懸濁液調製の10分以内で試料をデバイスから取得できる。細胞入口216と細胞出口224とを（fqに応じて）約1mL未満の流体分だけ離間させることができ、それにより、細胞濃度の時間に依存する不一致を減らすかあるいは最小限に抑えることができるはずである。
【００３０】
様々な試料位置で細胞回収率を追跡することに加え、顕微鏡226に取り付けられるカメラ220を使用することによってデバイス内の細胞運動を定性的に観察できる。顕微鏡226は、2つの垂直な角度から（例えば、y方向およびz方向に沿って）、デバイスの動作セグメントのほぼ全体を観察するために使用できる。画像データを記憶してコンピュータ217により処理できる。
【００３１】
細胞を含まないストリームからDMSOを除去できるデバイスの能力を実証するためにプロセスを行うことができる。DMSO（"細胞"）ストリーム流量は、3つの流量分率fq＝0,15、0.19、0.33において0.45ml/分から4.0ml/分まで変化され得る。本主題の一例との比較のために、2ストリームの水平に方向付けられたデバイスを使用して単一の流量分率に関して同様の組のプロセスを行うこともできる。これらの態様および他の態様は、デバイス出口でDMSO濃度を決定できる。
【００３２】
図3Aおよび図3Bは、C＊＝Cc/Coとして規定される正規化されたDMSO濃度と無次元パラメータ（1/Pe）＊（L/d）の間の関係を示す。式中、Ccは"細胞"ストリームの濃度であり、Coは当初の試料濃度である。図3Aは、細胞が存在しない場合のデバイスのDMSO除去を示すC＊対（1/Pe）＊（L/d）のプロットを示す。3つのシリーズのそれぞれは、異なる流量分率（fq）における態様を表す。曲線は、DMSO抽出のための数値モデル予測を示すプロットでもある。各ポイントは、少なくとも3つの別個の実験の平均を表し、また、エラーバーは1標準偏差を示す。図3Bは、fq＝0.33に関して3ストリーム垂直デバイスにおけるDMSO除去と2ストリーム水平デバイスにおけるDMSO除去とを比較するC＊対（1/Pe）＊（L/d）のプロットを示す。この場合もまた線はモデル化された手法を表し、かつ各ポイントは、少なくとも3つの別個の実験の平均を示す。
【００３３】
様々なアスペクト比のデバイスの抽出挙動は、（1/Pe）＊（L/d）に対してプロットされると、単一の曲線へと化すことができ、これは、デバイスの大規模な用途において有用となり得る。また、各データポイントは、3つの別個の実験の最小値の平均を表し、この場合、エラーバーは1標準偏差を示す。プロットされた線は、特定の実験的に決定された値との比較のための、数値モデルによって予測される出口濃度を示す。
【００３４】
表1は、幾つかの態様に関するDMSO除去特性に対する細胞群密度の影響を示す。表は、fq＝0.33における細胞ストリーム出口のDMSO濃度に対するCVFの影響を示す。結果は、細胞を伴うDMSOの除去を表す。プロセスは、CVF＝0.5％および15％に関して、および無細胞態様に関して行うことができる。結果は、細胞ストリーム出口における正規化されたDMSO濃度を平均±1標準偏差として示す。3つまたはそれ以上の繰り返しを無細胞およびCVF＝0.5％に関してそれぞれの条件で行うことができ、かつ単一の試行をそれぞれの条件でCVF＝15％に関して行うことができるが、本主題は、これらの数の繰り返しに限定されない。
【００３５】
DMSOは、細胞膜を貫通し、したがって、最初に細胞を離れることができ、その後、洗浄液ストリーム中に拡散することができる。
【００３６】
【表１】
2015514425.tif 000008
【００３７】
態様は、0.5％および15％のCVFに関して造血幹細胞のためのモデルとしてジャーカット細胞を用いて行うことができる。細胞は10％vol/volDMSO溶液中に懸濁され得る。本明細書中に開示される他の実験と同様に、洗浄液ストリームはPBSを含むことができる。プロセスは、Qc＝0.5〜3.5ml/分からの細胞ストリーム流量およびfq＝0.33に関して行うことができる。表1中、C＊（実験）は、細胞ストリーム出口の正規化されたDMSO濃度を平均±1標準偏差として示す。C＊（モデル）は、例えば比較のための、数値モデルにより予測され得るDMSO濃度である。
【００３８】
細胞運動の画像は、10×倍率および明視野照明を使用する顕微鏡から取得できる。図4Aおよび図4Bは、デバイス内の細胞の明視野顕微鏡画像（10×倍率）を示す。図4Aにおいて、画像402は、チャネル入口付近の正面図（図1で定められるx-z平面）を示し、また、画像404は、2つの洗浄液ストリーム間を流れる細胞ストリームを示す入口付近の断面図（図1に定められるy-x平面）を示す。スケールバーは115μmを示す。図4Bにおいて、画像406は出口付近の正面図を示し、画像408は出口付近の断面図を示す。プロセスは、CVF＝0.5％に関して、0.5〜1.5ml/分（Pe＝1263〜3788）の細胞ストリーム流量およびfq＝0.33を使用して行うことができる。画像は、細胞ストリームの全体にわたる細胞分布の均一性を評価するために正面図（すなわち、y方向）を横切る幾つかの位置で取得され得る。
【００３９】
デバイスからの細胞回収率は、デバイス性能の重要な指標となり得る。回収率は、幅広い範囲の流れ状態下で評価され得る。図5Aおよび図5Bは、fq＝0.19およびfq＝0.33のそれぞれにおける細胞回収率対流量を示す。図は、10％DMSO＋PBS溶液におけるCVF＝0.5％（vol/vol）に関するデバイスからの細胞回収率を示す。細胞ストリーム流量は0.5ml/分と3.5ml/分の間で変化され得る。回収率は、試料中で数えられる細胞の数および細胞生存率に相当する。除去された洗浄溶液で失われた細胞を考慮するために、試料は、細胞ストリーム出口および洗浄液ストリーム出口の両方で取得されて、デバイス入口からの試料と比較され得る。各データポイントは、少なくとも3つの別個の実験の平均を表し、この場合、エラーバーは1標準偏差を示している。
【００４０】
図6は、デバイスからの細胞回収率に対する細胞体積分率の影響を示す。プロセスをCVF＝0.5、1.5、6、および15％に関して行うことができる。図は、細胞ストリーム出口および洗浄液ストリーム出口からの細胞回収率対CVFを示す。プロセスは、Qc＝2.5ml/分およびfq＝0.33を使用して行うことができる。CVF＝0.5％、1.5％、および6％に関して、プロセスを3つ組で行うことができ、この場合、エラーバーは1標準偏差を示す。CVF＝15％における結果は単一の実験に相当する。
【００４１】
2.5ml/分（Pe＝6313）の細胞ストリーム流量およびfq＝0.33の流量分率が、図6における態様の一部または全てにおいて一定に保たれ得る。回収率は、細胞ストリーム出口および洗浄液ストリーム出口の両方で測定され得る。CVF＝0.5％、1.5％、および6％に関して、データポイントは、3つの別個の試行の平均を表し、この場合、エラーバーは1標準偏差を示す。単一の試行をCVF＝15％に関して行うことができる。
【００４２】
図3Aおよび図3Bに戻ると、プロットは、（1/Pe）＊（L/d）の増大に伴って減少する出口のDMSO濃度を示す。より高い流速（（1/Pe）＊（L/d）のより低い値）では、DMSOが出口で再び分離される前に試料ストリームから洗浄液ストリームへ拡散するための時間が殆どない可能性があり、そのため、より高い流量ではDMSOを殆ど除去できない。また、fqのそれぞれの値に関して、（1/Pe）＊（L/d）の値を増大させるために"除去限界"に近づくことができることに気付くことができる。より低い流速では、濃度勾配が減少するかあるいは無視できるようになるまでDMSOが洗浄液ストリーム中へ拡散し続けることができる。また、図3Aおよび図3Bにおいては、（1/Pe）＊（L/d）の所定の値に関して、DMSO除去がfqの減少に伴って増大し得ることに気付くこともできる。これは、洗浄液ストリームおよび試料ストリームの相対量に関連付けられ得る。より低いfqにおいては、試料ストリームから拡散するDMSOを受け入れるために、DMSOが無い洗浄溶液が比例的に多い量で存在し得る。流量分率は深さ率δ/dに影響を及ぼすこともできる。fqのより大きな値は、試料ストリームがチャネル内でより大きな幅δを占め、そのため、DMSO分子が拡散して洗浄液ストリームに移動する平均距離がより大きくなり得ることを表し得る。除去限界の存在は、デバイス設計の実用的限界と相俟って、細胞試料からのDMSOの95％除去などの所望の除去率を達成する多段デバイスから利益を得ることができる。マイクロ流体デバイスの複数の段は、直列に連結されて、試料を一方の段から隣の段に通過させることができる。幾つかの態様は、それぞれの段に新鮮な洗浄溶液を導入することを含む。また、図3Aは、数値モデルがデバイス内のDMSO除去を予測するための実験結果に一致し得ることも示す。この挙動は、2ストリームデバイスにおけるDMSO拡散に定性的に類似し得る。
【００４３】
図3Bは、垂直3ストリームデバイスにおけるDMSO除去と、2ストリーム水平デバイスにおける除去挙動との比較を示す。3ストリーム配置は、例えばストリーム間の界面積を2倍にすることよって、細胞ストリームから洗浄液ストリームへの拡散を増大させる。また、DMSO分子が細胞ストリームを離れるように拡散する平均距離を減少させることができる。3ストリームの幾何学的形態に関して、正規化された濃度は、（1/Pe）＊（L/d）＝0.02においてC＊＝0.50に達することができ、かつ（1/Pe）＊（L/d）＝0.10付近でC＊＝0.33の除去限界に近づくことができる。同様の条件下での2ストリームデバイスに関しては、（1/Pe）＊（L/d）＝0.08および0.40のそれぞれにおいて、C＊＝0.50および除去限界に近づくことができ、これは、3ストリームデバイスに関するそれの約4倍である。項（1/Pe）＊（L/d）は長さおよび速度の両方を包含するため、これは、3ストリームデバイスが2ストリームデバイスと同じ量のDMSOを除去できるがそれをデバイス長さの1/4または4倍の流速のいずれかにおいて行うことができることを示すのに相当し得る。これは、より小さいデバイスサイズ、より速い処理速度、または、これらの2つのファクタの組み合わせのいずれかを可能にし得る。
【００４４】
一般に、細胞を伴うDMSO除去は、細胞を伴わないDMSO除去と同様の傾向を辿り、その場合、C＊が（1/Pe）＊（L/d）の増大に伴って漸近的に減少する。細胞の存在は、試料内に存在する細胞の量に比例してDMSO除去を減少させ得る。これは、DMSOが細胞ストリームから拡散する前に最初に細胞を離れることができるからである。モデルによれば、CVF＝0.5％に関して、細胞の存在は、約0.01のデバイス出口のC＊の増大を引き起こす。CVF＝15％に関しては、影響がより顕著になり得るものであり、それにより、0.06だけC＊が増大する。幾つかの流量においては、態様がモデルと一致する。しかしながら、検査された最も低い流量Qc＝0.5ml/分（Pe＝1263）に関してずれに気付くことができる。非常に低い流量において、C＊は、モデル予測よりも0.10超高くなり得る。幾つかの例において、これは、細胞ストリームと洗浄液ストリームの間の密度差の結果である。細胞およびDMSOはいずれもPBSよりも密度が高く、それにより、中央ストリームがデバイス内で沈降し、放物線から逸脱する速度プロファイルをもたらす場合がある。非放物線状の速度プロファイルは、特定の実験条件における有効Peが推定されたものよりも高くなり得ること、したがって、デバイス出口のDMSOの濃度が予期されたものよりも高くなり得ることを示唆する。しかしながら、より高い流量（Qc＝1.5ml/分またはそれ以上）では、影響があまり顕著にならない。全体の流速が増大するにつれて、滞留時間が減少し、それにより、浮力が作用する時間が少なくなり得る。また、全体の流速が増大するにつれて、細胞により獲得される沈降速度を比較的小さくすることができる。
【００４５】
マイクロ流体デバイスに存在する層流は、細胞の有利な動きをもたらすことができる。図4Aおよび図4Bに示されるように、画像402および406は、細胞がx-z平面にわたって均一に分布されることを裏付ける。また、両方の画像404、408では、剪断力が減少されたかあるいは最小である中央の細胞ストリームに細胞が大きく制約され、かつ、細胞が洗浄液ストリームに移動しないのが分かる。スケールバーは115μmを示し、fq＝0.33において細胞ストリームにより占められる幅が放物線状の速度プロファイルをとる。デバイス入口（例えば404）において、細胞は、115μmよりもかなり狭い約60μm幅の帯状態でデバイスの中央に非常に集約される。画像408はデバイス出口を示す。この場合もまた細胞が主に中央にとどまるが、それらの細胞を入口におけるよりも散乱させることができ、かつ、細胞のほんの一部が予測された115μm細胞ストリームの外側で流れるのに気付くことができる。中央ストリームのより狭い領域における細胞の分布は、速度プロファイルが3つの全てのストリームにわたって放物線状でない場合があるという前述した仮説と一致し得る。あるいは、細胞が局所流体よりも速く移動している場合、滑り速度は、細胞をチャネル壁からはねつけて細胞を中央に向かって移動させる流体力学的な力をもたらし得る。
【００４６】
画像シーケンスは、細胞がデバイスを通過する際に細胞を追跡して細胞の速度を概算するために使用することもできる。速度概算値の精度はカメラフレームレートによって制限され得るが、デバイス中央を通って移動する10個の細胞の観察は、約3.6mm/sの平均速度を示すことができる。これは、放物線状のプロファイルおよび細胞の中立的浮力をとる予測された3.1mm/s最大流速よりも速くなり得、かつ、細胞がそれらを含むストリームよりも高密度であり、したがって縦長のチャネル内で細胞が沈降することを表し得る。チャネル側部付近の細胞は、壁付近の境界層の存在に起因して、約3.0mm/sで僅かにさらにゆっくりと移動するように観察され得る。
【００４７】
デバイスからの細胞回収率は、デバイス性能の指標となり得る。マイクロ流体デバイスは、従来の方法と比べた細胞へのストレスの減少に起因して、細胞処理のための展望を示してきた。2ストリームデバイスを用いる最近の手法は、デバイスからの細胞回収率が特定の条件下で高くなり得ることを示してきた。しかしながら、回収率は流量への依存性を有し得るため、場合により、デバイスにとって有効な流れ状態が制限される。マイクロ流体デバイスを用いて得られる流量に対する同様の制約は共通の欠点である。本主題の利点のうちの一つは、デバイスの臨床適用性を向上させるために、幅広い範囲の流れ状態にわたって、特により高い流量にわたって、より高い回収率を態様が達成できるという点である。図5の結果は、幅広い範囲の流量にわたる2つの異なる流量分率およびCVF＝0.5％に関する実験を示す。図に示すように、回収率は高くなり得る（全ての流れ状態において95％よりも高い）。同時に、洗浄液ストリーム試料において見出される損失は、全てのケースにおいて6％未満となり得る。これは、デバイスからの細胞回収率を流量に影響されにくくすることができ、かつ、検査される状態にわたって拡散または細胞処理のために使用できる流れ状態を細胞回収率が制限しないことを示す。
【００４８】
態様は、一連の細胞濃度を扱うことができるデバイスの能力に対する制限を実証するために様々な細胞体積分率を使用する。幾つかのマイクロ流体デバイスは、凍結保存のために使用される2％〜20％のサイトクリット(cytocrit)と比べるとまばらにしか存在しない細胞懸濁液を扱う。図6は、0.5％〜15％のCVFに関する回収率結果を示す。全ての状態にわたって洗浄液ストリームへの損失を低くすることができ（＜10％）、一方、回収率を95％よりも高くすることができる。ある場合には、（細胞ストリーム出口および洗浄液ストリーム出口の両方から）回収される全ての細胞が100％を超える可能性があり、これは、血球計を使用する細胞計数と関連付けられる不正確さに起因し得る。
【００４９】
幅広い範囲の流れ状態における高い回収率は、最近のデバイスに優る、特に遠心分離細胞洗浄方法に優る際立った向上を提供することができる。特に、高CVF試料を扱うことができる能力は、最近のマイクロ流体デバイスの間では稀である。したがって、本明細書中に開示される主題は、臨床的に関連する細胞群の処理を容易にするのに役立ち得る。
【００５０】
マイクロ流体チャネルは、凍結保存された細胞懸濁液からのDMSOの除去にとって有効な選択肢であることが分かってきた。様々な態様において、デバイス設計を2ストリーム水平構成から3ストリーム垂直デバイスに変更すると、DMSOの抽出および試料からの細胞の回収率の両方に関してデバイス性能が大きく向上する。DMSO除去率を4倍に向上させることができ、それにより、さらにコンパクトなデバイスまたは高速処理流量のいずれかが可能となる。単一デバイスは潜在的にDMSOの望ましい95％除去を達成できるが、幾つかのチャネルを直列に使用する態様は、処理時間を短くでき、かつ、必要とされる洗浄溶液の量を減らすことができる。細胞回収率は、特定の流量および細胞体積分率において95％よりも高くなり得る。これは、遠心分離洗浄を約25％超える向上となり得る。特定の態様は、大部分のマイクロ流体デバイスでは稀な3ml/分を超える流量、柔軟性、および速度で、まばらな細胞（CVF＝0.5％）試料および高密度細胞（CVF＝15％）試料の両方を扱うことができ、それにより、臨床的に関連する細胞群を処理するための遠心分離技術に代わる実行可能な手段を提供するデバイスを提供する。
【００５１】
図7は、一態様に係る細胞分離のためのマイクロ流体デバイス700の一部の斜視図を示す。図示のデバイスおよびそれらのそれぞれの幾何学的形態は、流体を細胞ストリームから除去するために前述したデバイスの入口（例えば、図2における入口208）で使用することができ、かつ/または、細胞ストリームを洗浄液ストリームから分離するためにデバイスの出口（図2における出口212）で使用することができる。デバイス700はマイクロチャネル716を備えることができる。図1はマイクロチャネル102の一例を表し、この場合、図1に示される断面がマイクロチャネル前壁719と平行である。一例において、プレナム702は、重力と一直線になってx方向に垂直で下方に向けられた頂点を有するデルタ形状の断面（x-y平面に沿う）を有するが、本主題はそのように限定されない。プレナム702へはマイクロチャネル704が通じており、プレナム702からは細胞収集チャネル706が通じている。洗浄流体除去チャネル708がプレナム702の両側でそのプレナムから横方向に（例えば、y軸線に沿って）延びている。チャネルはそれぞれの出口で終端する。洗浄液チャネル出口712は典型的である。
【００５２】
図は、特徴702〜708の一部を画定する挿入体710を示す。挿入体710は、チャネル706、708のための境界（z軸線に沿う）を画定できる。チャネル706、708は、プレナム702から離れるように延びるそれらの長さに沿って断面積がほぼ一定のままとなり得る。言い換えると、例えば中央プレナム702の後の出口のチャネルは、チャネルの残りの部分に沿って実質的に一定のままである流れに垂直な（例えば、細胞試料収集チャネル706においてはy-z平面内の）断面積を有することができる。この場合、チャネルの形状は、プレナム出口からの距離が増大するにつれて（細胞試料収集チャネル706においては軸線xに対応する方向で）変化する。一例において、チャネル形状は、（x値の減少に対応する方向の）上部では高アスペクト比の長方形形状であり、洗浄液チャネル出口712の下部では円形形状であり、この場合、これらの端部間の断面積は比較的一定である。円形形状は、出口においてチューブとの接続を容易にし得る。断面積は中央プレナム702内で変化可能であり、それにより、x方向で面積が減少する。中央プレナム内では、流体の速度を落として、重力が細胞を細胞収集チャネル706の出口に向かって引き下げるための時間が与えられることが望ましい。これを容易にするために、デバイス700の幾何学的形態は、チャネル（706および/または708）とプレナム702が合流するプレナム702の出口で受けられる圧力および流体速度を制御するように選択することができる。
【００５３】
幾つかの態様において、デバイス700は、重力が流体をマイクロチャネル704から細胞収集チャネル706に（軸線xにより示される方向に）方向付けることができるように垂直に装着される。一例において、プレナム702を通った流れは層流となり得る。細胞は、プレナム702内の流体よりも重く、したがって、流入する細胞は細胞収集チャネル706に方向付けられており、かつ、洗浄流体は洗浄流体除去チャネル708に方向付けられている。
【００５４】
厚さ（例えば、細胞試料収集チャネル706への出口開口部においてはz方向の厚さ）は500マイクロメートルとなり得る。プレナム702のx軸線に沿った深さ、すなわち、マイクロチャネル704から細胞収集チャネル706までの距離は、y軸線に沿った厚さに実質的に等しくなり得る。幾つかの例では、これが約25ミリメートルである。深さと厚さの間のそのような割合は、各出口への質量流量を一定として維持できる。平均的な哺乳類細胞は約20マイクロメートルになり得るものであり、したがって、マイクロチャネル704への入口は、細胞直径よりも大きい程度の大きさの幅をy方向で有し得る。
【００５５】
特定の例において、プレナム702は、x-y断面に沿って、中心頂点714を有する第1の円錐台形状を有する。他の想定し得る形状は、半球断面などの丸みを帯びた底部と、球の1/4が細胞収集チャネル706への出口から第1の洗浄流体チャネルへの出口および第2の洗浄流体チャネルへの出口まで延びている、u形状とを含む。プレナム702は、x-z平面に沿った第2の円錐台形状を有することができ、第2の円錐台形状の第2の中心頂点717は、第1の円錐台形状の第1の中心頂点714からx方向の周りに90°ずれた軸線に沿って配置されることができる。
【００５６】
一例において、プレナムへの入口と過剰流体または洗浄流体の除去のための出口の間の距離（例えば、図9におけるD91）は、細胞の沈降速度に基づいて選択され得る。この距離は、細胞が洗浄流体チャネルへの出口までストリームラインに追従せずに沈降するように十分に離れるべく定められ得る。寸法は、細胞沈降速度に基づいて選択され得る。細胞慣性は、それぞれの各細胞を、プレナム702への入口を通り過ぎて、かつ洗浄液チャネル708にまで及ぶ流れを通り過ぎて運ぶ傾向がある。横方向距離718（例えば、図9に示されるような寸法D91を有する）は、細胞が洗浄液チャネル708を避けることを促進すべく選択され得る。幾つかの例において、洗浄液チャネル708への出口をマイクロチャネル704からプレナム702への入口よりも上側に持ち上げるかあるいは配置すると、細胞が洗浄液ストリーム708に移動するのを妨げるのに役立つこともできる。各側壁720のそれぞれの長さ（図9に示されるような寸法L9を有する）は、細胞が重力などの力などにより下部出口を通って出ることを促進すべく選択することもできる。
【００５７】
図8Aは、一態様に係る細胞分離器800の正面図である。図8Bは、一態様に係る細胞分離器の側断面図である。デルタ形状のプレナム802を見ることができ、このデルタ形状のプレナムに向かってチャネルが延びている。プレナム802へはマイクロチャネル804が通じており、かつ、プレナム802からは細胞収集チャネル806が通じている。洗浄流体除去チャネル808がプレナム802の両側でプレナム802から延びている。説明図は、重力などの力とのアライメントを示す。なお、重力は、地球の重力場により引き起こされる力であってもよいか、あるいは、遠心力、集音力、静電気力または磁力などの他の力であってもよい。
【００５８】
説明図は、典型的な寸法をさらに示す。本主題の範囲から逸脱することなく、他の寸法も想定し得る。幾つかの態様が洗浄流体チャネルへの第2の出口を含まないことに留意すべきである。線8A--8Aに沿って画定された平面は、y方向およびz方向の流体の流れに対してシールされる表面を備えることができる。そのような形態は、2つのストリームを含む入口からの試料収集に適合する。例えば、2つのストリームが使用されるように、デバイスを線8A-8Aに沿って半分にして、切断部に沿ってデバイスをシールすることができる。この場合、一方のストリームは細胞試料入力を含み、他方のストリームは洗浄流体入力を含む。
【００５９】
図9は、一つの例に係るプレナム902およびチャネルの概略的な図を示す。図10は、図9のプレナムの典型的な寸法を示す。プレナム902の幾何学的形態は、細胞の損失を最小に抑えながら洗浄流体を除去して廃棄できるようにしつつ、細胞が試料収集ポイント903に到達しかつさらに一時的に収集されることを促進すべく形成される。これは、プレナム902の作用に影響を及ぼす一つまたは複数の動作モードに起因する。
【００６０】
第1の動作モードは90°角部901と関連付けられ、この角部901の近傍で3つの流体ストリームが拡散セグメント916（例えば、図7におけるマイクロチャネル704）からプレナム902に入る。十分に高い流速（例えば、10またはそれを上回るストークス数の流速）において、流入する細胞の慣性は、これらの細胞を、洗浄液除去ポイント904に向かって最終的に洗浄流体除去914に至る洗浄流体に追従させずに、角部901を通過させて、試料収集ポイント903に向かって細胞収集912に移動する流体ストリームライン中に運び入れることができる。本主題は90°角部に限定されず、他の角部を使用できる。また、プレナム902の一般的な形状が、デルタ形状に限定されず、圧力差および流速の制御をもたらしかつ細胞慣性を利用して細胞を細胞収集チャネルに送る他の形状を成すことができることに留意すべきである。
【００６１】
第2の動作モードは、細胞を試料収集ポイント903に方向付けるために重力などの力924を使用できる。試料中の細胞は、周囲の流体よりも密度が僅かに高く、したがって、下方へ沈降する傾向がある。プレナムの断面積は、プレナムが取り付けられるマイクロチャネルよりも大きくなり得る。したがって、プレナム902内で流速をかなり減少させることができる。901と904の間には、重力に細胞を試料収集ポイント903に向かって引き下げるための時間を与えるべく選択され得る水平距離D91が存在することができ、この寸法の増大は、細胞のさらなる下方への動きをもたらす。
【００６２】
この動作モードに代えてあるいは加えて、904と912の間で延びている、側壁908および/または側壁910など側壁の距離L9は、重力に細胞を試料収集ポイント903に向かって引き下げるための時間を与えるべく選択される寸法を有することができ、この寸法の増大は、細胞のさらなる下方への動きをもたらす。そのような時間中、細胞は試料収集チャネル内に沈降できる。角度A91は、重力に細胞を試料収集ポイント903に向かって引き下げるための時間を与えるべく選択される大きさを有することができ、この大きさの増大は、細胞のさらなる下方への動きをもたらす。試料収集ポイント903と拡散セグメント916の間の圧力差を含むことができるが、必ずしも含める必要はない。
【００６３】
本明細書中で論じられる態様はさらなる利点を提供する。マイクロ流体デバイスを垂直方向で使用することに対する難題のうちの一つは、デバイスが完全に垂直でなければそれを望み通りに実行できないということである。本明細書中で論じられる入口および出口の形態は、僅かな位置ずれを補償する。最近のマイクロ流体デバイスよりもかなり高い流量では、独特の幾何学的形態が有効である。さらに、デバイスからの細胞の回収率は、細胞バンキングで使用される細胞試料などの高密度細胞試料においてさえも高い。
【００６４】
図11は、力の影響を受けて細胞を流体から分離する方法のフローチャートを示す。1102において、方法は、プレナムの中央に位置している上部入口を通じて流体を受け取る段階を含む。1104において、方法は、上部入口の下側に配置された下部出口に流体を方向付ける段階を含み、流体は、下部出口と2つまたはそれ以上の側方出口の間で該入口の側部および下部出口まで延びており下部出口よりも上側に位置しているそれぞれの側壁（例えば、図9における908、910）に接して、方向付けられている。1106において、方法は、流体の無細胞部分が、下部出口よりも上側の2つまたはそれ以上の側方出口を通って出る間に流体中の細胞が力を受けて下部出口を通って出るべく引き込まれるかあるいは下部出口を通って出ることを促進されるように、2つまたはそれ以上の側方出口のそれぞれと下部出口の間の距離を移動させるために流体を押し進める段階を含む。
【００６５】
方法は、細胞が力を受けて下部出口を通って出るように引き込まれるべくまたは下部出口を通って出ることを促進すべく、入口からそれぞれの側方出口のうちの一つもしくは複数までの距離を選択する段階を含むことができる。方法によれば、押し進める段階は、プレナムと重力とを一直線に合わせることを含む。方法によれば、押し進める段階は、遠心分離機上にプレナムを位置合わせして、流体を上部入口から下部出口まで径方向外側に押し進めることを含む。方法によれば、流体を方向付ける段階は、2つの洗浄ストリーム間に層流状態で挟まれる細胞含有中央ストリームを上部入口から下部出口に方向付けることを含む。方法は、凍結保護剤を流体から洗浄する段階を含む。
【００６６】
様々な注釈および例
例1は、力の影響を受けて細胞を流体から分離するための装置を含むことができる。この例は、中央に位置している上部入口を画定するプレナムを含むことができる。この例は、上部入口の両側に配置されたそれぞれの側方出口を含むことができる。この例は、上部入口よりも下側に配置された下部出口を含むことができ、この場合、2つまたはそれ以上の側方出口が、上部入口の両側に配置されている。この例において、プレナムは、入口を通じて流体を受け取るように、かつ、下部出口と2つまたはそれ以上の側方出口の間で延びているそれぞれの側壁に接して下部出口にその流体を方向付けるように構成される。この例において、2つもしくはそれ以上の側方出口のそれぞれと下部出口の間の距離、および/または該入口から少なくとも2つの側方出口のうちの一つもしくは複数までの距離は、細胞が力を受けて下部出口を通って出ることを促進すべく選択される。
【００６７】
例2は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、それぞれの側壁が、力に対してある角度を成して配置されている。
【００６８】
例3は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、側壁が、力に対して60°の角度を成して配置されている。
【００６９】
例4は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、入口が試料収集チャネルに対して開口し、該試料収集チャネルは、それがz方向に対して水平に直交するy方向よりもz方向に沿って幅広く、かつ、力は、z方向およびy方向の両方に対して直交するx方向に方向付けられている。
【００７０】
例5は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、それぞれの側方出口は、入口よりも下側で、y方向に沿って入口の側方に、配置されている。
【００７１】
例6は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、プレナムは、x-y平面に沿って切断された断面上の、z方向に沿って突出した第1の円錐台形状を有する。
【００７２】
例7は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、プレナムは、y方向に沿って突出した、x-z平面に沿った第2の円錐台形状を有する。
【００７３】
例8は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、それぞれの側方出口の第1の出口が、x-z平面の一方側に配置されており、かつ、それぞれの側方出口の第2の出口が、x-z平面の反対側に配置されている。
【００７４】
例9は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、各側方出口のそれぞれは、細長く、z方向に沿って広がっている。
【００７５】
例10は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、下部出口は、細長く、z方向に沿って広がっている。
【００７６】
例11は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、各側方出口のそれぞれおよび下部出口が、実質的に同じ面積である。
【００７７】
例12は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、プレナムを画定する上壁が、y-z平面に沿って広がっている。この例は、上壁を貫通して配置された入口開口部を含むことができ、かつ、各側方出口のそれぞれの上側面が、上壁に隣接して配置されている。
【００７８】
例13は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、プレナムは、上壁とそれぞれの側壁とによって画定される。
【００７９】
例14は、力の影響を受けて細胞を流体試料から分離する方法を含むことができる。この例は、プレナムの中央に位置している上部入口を通じて流体を受け取ることを含むことができる。この例は、上部入口よりも下側に配置された下部出口に流体を方向付けることを含むことができ、流体は、下部出口と2つまたはそれ以上の側方出口の間で該入口の側部および下部出口まで延びており、下部出口よりも上側に位置している、それぞれの側壁に接して、方向付けられている。この例は、流体の無細胞部分が下部出口よりも上側の2つまたはそれ以上の側方出口を通って出る間に流体中の細胞が力を受けて下部出口を通って出ることを促進されるように、2つまたはそれ以上の側方出口のそれぞれと下部出口の間の距離を移動させるために流体を押し進めることを含むことができる。
【００８０】
例15は、前記例のいずれかを含むことができ、細胞が力を受けて下部出口を通って出ることを促進すべく、入口からそれぞれの側方出口のうちの一つまたは複数までの距離を選択することを含む。
【００８１】
例16は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、押し進めることは、プレナムと重力とを一直線に合わせることを含む。
【００８２】
例17は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、押し進めることは、遠心分離機上にプレナムを位置合わせして、流体を上部入口から下部出口まで径方向外側に押し進めることを含む。
【００８３】
例18は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、流体を方向付けることは、2つの洗浄ストリーム間に層流状態で挟まれる細胞含有中央ストリームを上部入口から下部出口に方向付けることを含む。
【００８４】
例19は、前記例のいずれかを含むことができ、凍結保護剤を流体から洗浄することを含む。
【００８５】
例20は、入口ポート、第1の出口ポート、および第2の出口ポートを有する流体プレナムチャンバを備えるシステムを含むことができ、チャンバは、入口ポートと第1の出口ポートの間で流体の流れを調節するようにかつ入口ポートと第2の出口ポートの間で流体の流れを調節するように構成され、チャンバは、入口ポートと第1の出口ポートの間の軸線と一直線に合わせられた力に流体が供される場合に入口ポートにおける流体の第1の成分が第1の出力ポートに方向付けられるようなかつ流体の第2の成分が第2の出力ポートに方向付けられるような壁形態を有する。
【００８６】
例21は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、第2の出口ポートは、入口ポートの両側に配置された一対の出口ポートのうちの一方である。
【００８７】
例22は、前記例のいずれかを含むことができ、細胞を含んだ流体および一対の洗浄液ストリームを入口ポートに圧送するためのシリンジポンプを備え、一対の洗浄液ストリームが、それらの間に細胞を含んだ流体を挟んでいる。
【００８８】
例23は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、シリンジポンプは、洗浄液ストリームを第2の出口ポートから圧送するためである。
【００８９】
例24は、前記例のいずれかを含むことができ、この場合、第1の出口ポートのサイズは、細胞を含んだ流体の細胞を一時的に収集するように寸法付けられ、それにより、一対の出口ポートを通った洗浄液ストリームの洗浄を促進するように圧力差を形成する。
【００９０】
これらの非限定的な例のそれぞれは、自立できるか、または、他の例のうちの一つまたは複数との様々な置換もしくは組み合わせを成して組み合わせることができる。
【００９１】
前述した詳細な説明は、詳細な説明の一部を形成する添付図面への参照を含む。図面は、例示として、本発明を実施できる特定の態様を示す。また、これらの態様も本明細書中で"例"として見なされる。そのような例は、示されたあるいは説明された要素に加えて要素を含むことができる。しかしながら、本発明者らは、示されたあるいは説明された要素のみが提供される例も考える。また、本発明者らは、特定の例（または、その一つまたは複数の局面）に関してあるいは本明細書中に示されたまたは説明された他の例（または、その一つもしくは複数の局面）に関して、示されたまたは説明された要素（または、その一つもしくは複数の局面）の任意の組み合わせまたは置換を使用する例も考える。
【００９２】
本文書と参照することによりそのように組み入れられる任意の文書の間で使用に矛盾がある場合には、この文書の使用が支配する。
【００９３】
本文書中、"一つ（a）"または"一つ（an）"という用語は、一つあるいは複数を含むべく、特許文書において一般的であるように使用され、任意の他の事例または"少なくとも一つ"あるいは"一つまたは複数"の使用とは無関係である。この文書において、"または"という用語は、別段に示唆されなければ、非排他的と見なすように、あるいは、"AまたはB"が"AであるがBではない"、"BであるがAではない"、および"AおよびB"を含むように使用される。本文書において、"含む(including)"および"この場合（in which）"という用語は、"備える(comprising)"および"この場合（wherein）"というそれぞれの用語のプレイン・イングリッシュ等価物として使用される。また、以下の特許請求項において、"含む"および"備える"という用語は非制約的である。すなわち、一つの特許請求項においてそのような用語の後に挙げられた要素に加えてさらに要素を含むシステム、デバイス、物品、組成体、形成体、または、プロセスは、依然としてその特許請求項の範囲内に入ると見なされる。また、以下の特許請求項において、"第1の"、"第2の"、および"第3の"等という用語は、標示としてのみ使用され、数値要件をそれらの対象物に課すことを目的としていない。
【００９４】
上記の説明は、例示的であり制限的であることを意図されている。例えば、前述の例（または、その一つもしくは複数の局面）は互いに組み合わせて使用されてもよい。他の態様は、例えば上記の説明を検討する際に当業者によって使用され得る。要約書は、読者が技術的開示の本質を素早く確認できるように37 C.F.R.§1.72(b)に準拠すべく提供される。要約書は、それが特許請求項の範囲または意味を解釈するかまたは限定するために使用されないという理解の下で提出される。また、前述した詳細な説明では、開示を合理化すべく様々な特徴が一緒にまとめられてもよい。これは、特許請求項に記載されない開示された特徴が任意の特許請求項に不可欠であることを意図しているとして解釈されるべきではない。むしろ、発明主題は、特定の開示された態様の全てに満たない特徴に内在し得る。したがって、以下の特許請求項は、それぞれの特許請求項が別個の態様として自立した状態で、例としてあるいは態様として詳細な説明に組み入れられ、また、そのような態様を様々な組み合わせあるいは置換を成して互いに組み合わせることができると考えられる。本発明の範囲は、添付の特許請求項の権利が与えられる等価物の全範囲と共に、そのような特許請求項を基準にして決定されるべきである。
【図１】
2015514425.tif 000010
【図２】
2015514425.tif 000011
【図３】
2015514425.tif 000012
【図４】
2015514425.tif 000013
【図５】
2015514425.tif 000014
【図６】
2015514425.tif 000015
【図７】
2015514425.tif 000016
【図８】
2015514425.tif 000017
【図９】
2015514425.tif 000018
【図１０】
2015514425.tif 000019
【図１１】
2015514425.tif 000020
【国際調査報告】
2015514425.tif 000021
2015514425.tif 000022