(57)【要約】本発明は、Ｍ４Ｎ（テトラ−Ｏ−メチルノルジヒドログアイアレチン酸）を含めたＮＤＧＡの誘導体、およびソラフェニブを含む医薬組成物、ならびに、例えば被験体における、肝臓がん、結腸がん、乳がん、脳がんおよび卵巣がんなどの新生物疾患の阻害および処置におけるこれらの使用を提供する。Ｍ４Ｎを含めたＮＤＧＡの誘導体、ソラフェニブ、およびさらなる治療剤を含む組成物も提供する。
2015505567.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効量の式Ｉ：
【化１】
2015505567.tif 000008
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖の低級アルキルもしくはアルコキシ、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、窒素含有５員もしくは６員の複素環式環またはサッカライド残基を表し、前記アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、窒素含有５員もしくは６員の複素環式環またはサッカライド残基は、任意に、酸素原子および１〜１０個の炭素原子のリンカーによってフェニル環に結合している）のノルジヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）またはその誘導体、
ならびに有効量のソラフェニブを含む医薬組成物。
【請求項２】
テトラ−ｏ−メチルノルジヒドログアイアレチン酸（Ｍ４Ｎ）またはマルトース−Ｍ３Ｎを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
薬剤に使用するのに、最も好ましくは被験体における新生物疾患に関する疾患または障害を処置するための薬剤として使用するのに有効な量での、請求項１または２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項４】
前記被験体が、ヒト、ネコ、イヌまたはマウスである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記新生物疾患が、腫瘍ならびに／またはその微小転移およびマクロ転移である、請求項３または４に記載の使用。
【請求項６】
前記腫瘍が、固形腫瘍、血液腫瘍であり、または、前記腫瘍ならびに／またはその微小転移およびマクロ転移が、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、結腸がん、肝がん、膠芽細胞腫、卵巣がん、白血病、ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項３から５のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
薬剤に使用するのに、最も好ましくは被験体における腫瘍ならびに／またはその微小転移およびマクロ転移の増殖を予防または阻害するための薬剤として使用するのに有効な量での、請求項１または２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項８】
前記ＮＤＧＡの誘導体が、テトラ−Ｏ−メチルノルジヒドログアイアレチン酸（Ｍ４Ｎ）またはマルトース−Ｍ３Ｎである、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記被験体が、ヒト、ネコ、イヌまたはマウスである、請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
前記新生物疾患が、腫瘍である、請求項７から９のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
前記腫瘍が、固形腫瘍、血液腫瘍であり、または、前記腫瘍が、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、結腸がん、肝がん、膠芽細胞腫、卵巣がん、白血病、ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項７から１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記医薬組成物が、さらなる治療剤を含む、請求項７から１１のいずれかに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１２年２月３日に出願された米国特許仮出願第６１／５９４，７４３号、および２０１２年３月２３日に出願された同第６１／６１４，８２５号の利益を主張するものであり、参照により、本明細書に全文を記載しているのと同様に全ての目的のために本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発がんは、種々の遺伝的要因および後成的要因によって影響を受ける多段階事象であり、種々の組織から生ずる非調節の細胞増殖の発生という特徴を示す。抗がんのリサーチの全般的な目標は、腫瘍増殖の削減に非常に有効であり、宿主に対して非毒性であり、且つ大部分の患者にとって手頃である臨床処置を開発することにある。分裂細胞、特に、非調節な方法で分裂する細胞に特有の標的を阻害する薬物は、化学療法剤としての理想的なパラダイムであり、非調節な方法で分裂する細胞に対する特異性が大きいほど、付随する副作用の危険性は低くなる。
【０００３】
本発明者らおよび同僚らは、ＥＭ１４２１およびテラメプロコールとしても公知であり、ノルジヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）の半化学的に合成された誘導体であるテトラ−Ｏ−メチルノルジヒドログアイアレチン酸（Ｍ４Ｎ）が、培養細胞、マウスモデル、およびヌードマウスにおけるヒト異種移植片において、抗ウイルスおよび抗がん活性を有することを以前報告した。転写阻害剤として、Ｍ４Ｎは、細胞周期のＧ２期において、Ｓｐ１−制御されたｃｄｋ発現を抑制し、細胞周期の停止をもたらす。
【０００４】
ソラフェニブは、細胞分裂および増殖を調節するＲＡＦ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル伝達経路の決定的な構成要素である酵素ＲＡＦキナーゼを阻害する。さらに、ソラフェニブは、ＶＥＧＦＲ−２／ＰＤＧＦＲ−βシグナル伝達カスケードにおけるチロシンキナーゼの阻害を介して腫瘍の血管形成をブロックする。ソラフェニブは、現在、肝細胞がん（ＨＣＣ）および腎細胞がん（ＲＣＣ）の処置のために承認されており、非反応性の甲状腺がんおよび膠芽細胞腫における使用のために調査中である。Ｍ４Ｎ（テトラ−Ｏ−メチルノルジヒドログアイアレチン酸）は、ヒト前立腺がん細胞における急速な死の誘発においてキナーゼ阻害剤ＵＣＮ−０１、ロットレリンおよびＬＹ２９４００２と相乗的に作用することが示された、本発明者らの実験室において開発されたＳｐ１転写阻害剤である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、新生物疾患の処置のための新規で且つ相乗作用的な治療に対する必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態によると、本発明は、有効量の式Ｉ：
【化１】
2015505567.tif 000003
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖の低級アルキルもしくはアルコキシ、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、窒素含有５員もしくは６員の複素環式環またはサッカライド残基を表し、前記アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、窒素含有５員もしくは６員の複素環式環またはサッカライド残基は、任意に、酸素原子および１〜１０個の炭素原子のリンカーによってフェニル環に結合している）のノルジヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）またはその誘導体、ならびに有効量のソラフェニブを含む医薬組成物を提供する。
【０００７】
別の実施形態によると、本発明は、有効量のテトラ−ｏ−メチルノルジヒドログアイアレチン酸（Ｍ４Ｎ）またはマルトース−Ｍ３Ｎ、および有効量のソラフェニブを含む医薬組成物を提供する。
【０００８】
一実施形態によると、本発明は、有効量の式（ＩＩ）：
【化２】
2015505567.tif 000004
またはその塩、溶媒和物、もしくは立体異性体、および有効量のソラフェニブを含む医薬組成物を提供する。
【０００９】
さらなる実施形態によると、本発明は、薬剤に使用するのに、最も好ましくは被験体における新生物疾患に関する疾患または障害を処置するための薬剤として使用するのに有効な量での、上記の医薬組成物の使用を提供する。
【００１０】
また別の実施形態によると、本発明は、薬剤に使用するのに、最も好ましくは被験体における新生物疾患に関する疾患または障害を処置するための薬剤として使用するのに有効な量での、上記の医薬組成物、および少なくとも１種のさらなる治療剤の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図１は、２４時間の処置後のＨｅｐＧ２細胞における、単独でのおよび組み合わせたＭ４Ｎおよびソラフェニブの細胞毒性についての用量反応曲線を示す。ｘ軸は薬物の用量（μＭ）を表し、ｙ軸は未処置の対照に対する生存細胞の百分率を表す。
【図２】図２は、異なる効果レベル（Ｆａ）での、ＨｅｐＧ２細胞におけるＭ４Ｎとソラフェニブとの組み合わせのアイソボログラム分析を示す。斜辺、左下、および右上に位置する組み合わせデータポイントは、それぞれ、相加効果、相乗作用、および拮抗作用を表す。
【図３】図３は、ＨｅｐＧ２細胞におけるＭ４Ｎとソラフェニブとの組み合わせのＣＩプロット分析を示す。ＣＩ＝１、＜１、および＞１は、それぞれ、相加効果、相乗作用、および拮抗作用を示す。
【図４】図４は、２４時間の処置後のＨｅｐＧ２細胞における、単独でのおよび６０μＭのＭ４Ｎと組み合わせたソラフェニブの細胞毒性についての用量反応曲線を示す。ｘ軸はソラフェニブの用量（μＭ）を表し、ｙ軸は、未処置の対照に対する生存細胞の百分率を表す。
【図５】ヌードマウスにおけるＨｅｐＧ２ヒト肝細胞がん異種移植片の増殖に対するＭ４Ｎおよびソラフェニブによる併用処置の効果である。
【図６】処置群によって評価した、ＨｅｐＧ２腫瘍担持マウスの累積生存率である。
【図７】ＨｅｐＧ２腫瘍担持ヌードマウスにおける、腫瘍サイズに対するＭ４Ｎおよびソラフェニブでの併用処置の効果の写真記録である。
【図８】ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、ホルムアルデヒドで固定した薄切片による、ヒト肝細胞がん異種移植片腫瘍に対するＭ４Ｎおよびソラフェニブでの併用処置の効果の組織分析である。
【図９】ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、ホルムアルデヒドで固定した薄切片による、肺へのヒト肝細胞がん異種移植転移に対するＭ４Ｎおよびソラフェニブでの併用処置の効果の組織分析である。
【図１０】ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、ホルムアルデヒドで固定した薄切片による、ヒト肝細胞がん異種移植片腫瘍を担持したヌードマウスにおける肝臓細胞毒性に対するＭ４Ｎおよびソラフェニブでの併用処置の効果の組織分析である。
【図１１】４８時間の処置後のＡｓＰｃ−０１ヒト膵臓がん細胞における単独でのおよびソラフェニブと組み合わせたＭ４Ｎの用量効果関係である。ａＤｍ、半有効用量（細胞増殖を５０％阻害するマイクロモル／リットルでの濃度）。ｍ、用量効果曲線の形状（ｍ＝１、双曲線；ｍ＞１、Ｓ字状；ｍ＜１、反対のＳ字状）。Ｒ、半有効プロットの直線相関係数。ｂＣＩ、組み合わせインデックス（ＣＩ＜１、相乗作用；ＣＩ＝１、相加効果；ＣＩ＞１、拮抗作用）：相互に非排他的な薬物について、ＣＩ＝（Ｄ１／Ｄｘ１）＋（Ｄ２／Ｄｘ２）＋（Ｄ１Ｄ２）／（Ｄｘ１Ｄｘ２）。Ｄｘ１およびＤｘ２は、所与の系にｘ％（ｘ＝５０、７５、９０、９５）だけ影響を与えるのに必要とされる薬物１（Ｍ４Ｎ）および薬物２（ソラフェニブ）の用量である。ｃＤＲＩ、用量低減インデックス（薬物を単一の薬剤としておよび組み合わせて使用したときの、所与の程度の阻害に達するのに必要とされる用量を比較することによって測定される）
【図１２】２４時間の処置後のＭＤＡ−ＭＢ４６８ヒト乳がん細胞における単独でのおよびソラフェニブと組み合わせたＭ４Ｎの用量効果関係である。ａＤｍ、半有効用量（細胞増殖を５０％阻害するマイクロモル／リットルでの濃度）。ｍ、用量効果曲線の形状（ｍ＝１、双曲線；ｍ＞１；Ｓ字状；ｍ＜１、反対のＳ字状）。Ｒ、半有効プロットの直線相関係数。ｂＣＩ、組み合わせインデックス（ＣＩ＜１、相乗作用；ＣＩ＝１、相加効果；ＣＩ＞１、拮抗作用）：相互に非排他的な薬物について、ＣＩ＝（Ｄ１／Ｄｘ１）＋（Ｄ２／Ｄｘ２）＋（Ｄ１Ｄ２）／（Ｄｘ１Ｄｘ２）。Ｄｘ１およびＤｘ２は、所与の系にｘ％（ｘ＝５０、７５、９０、９５）だけ影響を与えるのに必要とされる薬物１（Ｍ４Ｎ）および薬物２（ソラフェニブ）の用量である。ｃＤＲＩ、用量低減インデックス（薬物を単一の薬剤としておよび組み合わせて使用したときの、所与の程度の阻害に達するのに必要とされる用量を比較することによって測定される）。
【図１３】ヌードマウスにおけるＡｓＰｃ−１ヒト膵臓がん異種移植片の増殖に対するＭ４Ｎおよびソラフェニブでの併用処置の効果である。
【図１４】ヌードマウスにおけるＭＤＡ−ＭＢ４６８ヒト乳がん異種移植片の増殖に対するＭ４Ｎおよびソラフェニブでの併用処置の効果である。
【図１５】処置群によって評価した、ＡｓＰｃ−１腫瘍担持マウスの累積生存率である。
【図１６】処置群によって評価した、ＭＤＡ−ＭＢ４６８腫瘍担持マウスの累積生存率である。
【図１７】１％ＤＭＳＯビヒクル（Ｄ）、８０μＭのＭ４Ｎ（Ｍ）、４０μＭのソラフェニブ（Ｓ）、または８０μＭのＭ４Ｎおよび４０μＭのソラフェニブの組み合わせ（Ｍ／Ｓ）によるＡｓＰｃ−１ヒト膵臓がん細胞の処置後の、カスパーゼ活性化の免疫ブロット分析である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一実施形態によると、本発明は、有効量の式Ｉ：
【化３】
2015505567.tif 000005
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、ヒドロキシ、直鎖もしくは分岐鎖の低級アルキルもしくはアルコキシ、アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、窒素含有５員もしくは６員の複素環式環またはサッカライド残基を表し、前記アミノ酸残基、置換アミノ酸残基、窒素含有５員もしくは６員の複素環式環またはサッカライド残基は、任意に、酸素原子および１〜１０個の炭素原子のリンカーによってフェニル環に結合している）のノルジヒドログアイアレチン酸（ＮＤＧＡ）またはその誘導体、ならびに有効量のソラフェニブを含む医薬組成物を提供する。
【００１３】
別の実施形態において、本発明は、化合物、上記の化合物のいずれかの塩、溶媒和物、または立体異性体、少なくとも１種のさらなる治療剤、および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
ソラフェニブの化学構造は、
【化４】
2015505567.tif 000006
である。
【００１５】
開示された化合物の互変異性体の形態、ジアステレオ異性体を含む異性体の形態、およびその薬学的に許容される塩も、本発明の化合物に含まれる。「薬学的に許容される塩」の用語は、アルカリ金属塩を形成するために、および遊離酸または遊離塩基の付加塩を形成するために一般に使用される塩を包含する。薬学的に許容される酸付加塩を形成するのに用いることができる酸の例としては、塩酸、硫酸およびリン酸などの無機酸、ならびにマレイン酸、コハク酸およびクエン酸などの有機酸が挙げられる。他の薬学的に許容される塩としては、ナトリウム、カリウム、カルシウムおよびマグネシウム等のアルカリ金属もしくはアルカリ土類金属を有する塩、またはジシクロヘキシルアミン等の有機塩基を有する塩を含む。好適な本発明の化合物の薬学的に許容される塩としては、例えば、本発明による化合物の溶液と、塩酸、硫酸、メタンスルホン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酢酸、安息香酸、シュウ酸、クエン酸、酒石酸、炭酸またはリン酸等の薬学的に許容される酸の溶液とを混合することによって例えば形成することができる酸付加塩が挙げられる。これらの塩の全ては、例えば、適当な酸または塩基と本発明の対応する化合物とを反応させることによって、通常の手段によって調製することができる。
【００１６】
また、遊離カルボキシル基から形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄等の無機塩基、および、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来することができる。
【００１７】
薬に使用するため、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容される塩であるべきである。しかしながら、他の塩も、本発明による化合物またはそれらの薬学的に許容される塩の調製において有用であることがある。
【００１８】
さらに、本発明の実施形態は、本発明の化合物の水和物を含む。「水和物」の用語は、これらに限定されないが、半水和物、一水和物、二水和物、三水和物などを含む。本発明の化合物の水和物は、当該化合物と水とを、一般に好まれる水和物を得るのに適切な条件下で接触させることによって調製することができる。
【００１９】
本明細書に記載の医薬組成物に関して、担体は通常に使用されるもののいずれかでよく、溶解度や活性化合物との反応性の欠如等の物理化学的な考慮によって、ならびに投与経路によってのみ限定される。本明細書に記載されている担体、例えば、ビヒクル、アジュバント、添加剤、および賦形剤は、当業者にとって既知であり、一般の人々がすぐに入手できる。担体は、活性剤に対して化学的に不活性であるもの、および、使用の条件下で有害な副作用または毒性をほとんどまたは全く有さないものが好ましい。担体の例としては、固体状態の担体またはラテックスビーズ等の固体組成物が挙げられる。
【００２０】
固体の担体または賦形剤としては、これらに限定されないが、ガム、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、アルファ化デンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロース、デキストロース）、セルロース系材料（例えば、微結晶性セルロース）、アクリレート（例えば、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはこれらの混合物が挙げられる。
【００２１】
担体の選択は、部分的に、特定の医薬組成物によって、およびかかる組成物を投与するのに使用される特定の方法によって決定される。したがって、本発明の医薬組成物の種々の適切な製剤が存在する。
【００２２】
一実施形態によると、本発明は、薬剤に使用するのに、最も好ましくは被験体における新生物疾患に関する疾患または障害を処置するための薬剤として使用するのに有効な量での、本明細書に開示の医薬組成物の使用を提供する。好ましい実施形態において、新生物疾患は、固形腫瘍、血液腫瘍に関し、または、腫瘍ならびに／またはその微小転移およびマクロ転移は、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、結腸がん、肝がん、膠芽細胞腫、卵巣がん、白血病、ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫からなる群から選択される。
【００２３】
「治療剤」の用語は、被験体の体の構造もしくは機能に影響を与えることができる任意の薬剤であり、あるいは被験体が患っている疾患または状態の処置またはモジュレーションのために有用な薬剤であることを当業者は理解する。治療剤の例としては、疾患の徴候の処置のための、当技術分野において公知の任意の薬物を挙げることができる。
【００２４】
本明細書において、活性剤および生物学的活性剤は、所望の薬理学的および／または生理学的な効果であって、予防的または治療的であり得る効果を誘発する化学的化合物または生物学的化合物を指すのに互換的に使用される。これらの用語はまた、これらに限定されないが、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、類似体などを含む、薬学的に許容される、本明細書において具体的に言及する活性剤の薬理学的に活性な誘導体を包含する。「活性剤」、「薬理学的活性剤」および「薬物」という用語が使用されるとき、本発明は、活性剤それ自体、および薬学的に許容される、薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝物、類似体などを含むことを理解すべきである。
【００２５】
さらなる実施形態において、本発明の組成物および方法は、上述の状態または疾患を処置することができると知られている１種以上のさらなる治療活性剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の組成物は、１種以上の公知の治療活性剤と組み合わせて使用して、腫瘍またはがんなどの増殖性疾患を処置することができる。本発明の組成物および方法と共に医薬組成物中に容易に合わせることができる他の治療活性剤の非限定的例としては、酵素的核酸分子、アロステリック核酸分子、アンチセンス、デコイ、またはアプタマー核酸分子、モノクローナル抗体などの抗体、小分子、ならびに金属、塩およびイオンを含む他の有機および／または無機の化合物が挙げられる。
【００２６】
本発明の組成物の用量はまた、特定の組成物の投与に伴い得る任意の不利な副作用の存在、性質および程度によって決定される。典型的には、主治医は、種々の要因、例えば、年齢、体重、身体全体の健康、食事、性別、投与される化合物、投与経路、および処置される状態の重症度を考慮して、それぞれの個々の被験体を処置する医薬組成物の投与量を決定する。例として、本発明を限定することを意図せず、本発明の医薬組成物の用量は、約０．００１〜約１０００ｍｇ／処置される被験体の体重ｋｇ、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ、および約０．５ｍｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ体重とすることができる。
【００２７】
本発明の組成物の用量はまた、特定の組成物の投与に伴い得る任意の不利な副作用の存在、性質および程度によって決定される。典型的には、主治医は、種々の要因、例えば、年齢、体重、身体全体の健康、食事、性別、投与される化合物、投与経路、および処置される状態の重症度を考慮して、それぞれの個々の被験体を処置する医薬組成物の投与量を決定する。
【００２８】
本明細書において使用する場合、「有効量」または「十分な量」という用語は、疾患の重症度および／もしくは期間を低減させ、１つ以上のその症状を緩和し、疾患の進展を予防し、または疾患の後退をもたらすのに十分な、あるいは疾患または１つ以上のその症状の発生、再発、発症、もしくは進行の予防をもたらし、または新生物疾患もしくは腫瘍等の疾患を処置するのに有用な別の治療（例えば、別の治療剤）の予防的効果および／または治療効果を増強または改善するのに十分な、治療（例えば、予防剤または治療剤）の量を指す同等の語句である。
【００２９】
本発明による医薬組成物は、状態の診断、予後判定、予防または処置に有用である。したがって、本発明による組成物は、薬物として、または例えば、合理的なドラッグデザインによる、既存の化合物の構造的改変のための情報として有用である。本発明の化合物および方法は、種々の状態に対して効果を有する化合物をスクリーニングするのに有用である。
【００３０】
治療上の使用のために、本明細書に開示の方法を使用して同定される組成物または薬剤は、例えば、生理食塩水などの薬学的に許容される緩衝液中に製剤されて、全身的に投与することができる。好ましい投与経路としては、例えば、患者において薬物の連続的な持続したレベルを実現する、皮下、静脈内、腹腔内、筋内、または皮内の注射が挙げられる。ヒト患者または他の動物の処置は、一般に、生理学的に許容される担体中で治療的に有効量の本発明の治療薬を使用して行われる。適切な担体およびこれらの製剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載されている。
【００３１】
投与する治療剤の量は、投与の様式、被験体／患者の年齢および体重によって、ならびに被験体の症状および状態と共に変化する。化合物は、最少の対応副作用を伴って医学的目標を最良に達成する投与量で投与される。
【００３２】
その生物活性のあるフラグメント、バリアント、または類似体を含め、本発明の医薬組成物は、頭蓋内、脳内、脳室内、くも膜下腔内、脊髄内、経口、局所的、直腸、経皮的、皮下、静脈内、筋内、鼻腔内などを含む任意の適切な経路によって投与することができる。一実施形態において、組成物は、脳脊髄液、血液、または滑液等の、保持生理液に添加される。本発明の組成物は、疾患または傷害の部位における直接の注射または注入に適し得る。
【００３３】
上で述べたように、本発明の組成物は、剤形、製剤において、または通常の非毒性の薬学的に許容される担体およびアジュバントを含有する適切な送達デバイスもしくは埋め込み物を介して、注射、注入または埋め込み（皮下、静脈内、筋内、腹腔内など）によって非経口的に投与することができる。このような組成物の製剤および調製物は、医薬製剤の当業者には周知である。製剤は、本明細書において引用したＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙにおいて見出すことができる。
【００３４】
例えば、本発明による医薬組成物は、無菌の注射に適した形態であってもよい。このような組成物を調製するために、組成物を、非経口的に許容される液体ビヒクルに溶解または懸濁させる。使用することができる許容されるビヒクルおよび溶媒の中には、水；適当な量の塩酸、水酸化ナトリウムまたは適切な緩衝剤を添加することによって適切なｐＨに調整した水；１，３−ブタンジオール、リンゲル液、および等張食塩液およびデキストロース溶液がある。水性製剤はまた、１種以上の保存剤（例えば、メチル、エチルまたはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート）を含有してもよい。
【００３５】
適切な剤形は、これらに限定されないが、経口、直腸、舌下、粘膜、経鼻、眼、皮下、筋内、静脈内、経皮的、脊髄、くも膜下腔内、関節内、動脈内、くも膜下、気管支、リンパ管、および子宮内投与のために製剤することができ、活性成分の全身的送達のための他の剤形であってもよい。好ましい実施形態において、剤形は、注射または静脈内投与に適している。
【００３６】
このような医薬剤形を調製するために、１つ以上の上記の化合物は、通常の医薬配合技術によって医薬担体と密接に混合される。担体は、投与のために望ましい調製物の形態によって多種多様の形態を取ることができる。
【００３７】
非経口製剤のために、担体は、通常、滅菌水を含むが、他の成分、例えば、溶解度を補助する成分、または保存のための成分を含んでもよい。また、注射可能な溶液を調製してもよく、この場合は、適当な安定化剤を用いてもよい。
【００３８】
経口剤形の組成物の調製においては、通常の医薬媒体のいずれかを採用することができる。このように、例えば懸濁剤、エリキシル剤および液剤などの液体経口調製物において、適切な担体および添加物としては、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤などが挙げられる。例えば、散剤、カプセル剤および錠剤などの固体経口調製物において、適切な担体および添加物としては、デンプン、糖、賦形剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などが挙げられる。投与における容易さから、錠剤およびカプセル剤は、最も有利な経口投与単位形態になっている。必要に応じ、錠剤を、標準的な技術によって、糖コーティングまたは腸溶コーティングしてもよい。
【００３９】
非経口使用のための組成物は、単位剤形（例えば、単回用量アンプル）で、またはいくつかの用量を含有するバイアルで提供することができ、ここでは適切な保存剤を添加してもよい。かかる組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、注入デバイス、もしくは埋め込みのための送達デバイスの形態であってもよく、または使用前に水もしくは別の適切なビヒクルと再構成される乾燥粉末として提示してもよい。かかる組成物は、適切な非経口的に許容される担体および／または添加剤を含んでもよい。
【００４０】
１つのアプローチにおいては、本発明の治療薬を、埋め込み物、例えば、浸透圧ポンプ内で、または適当に形質転換された細胞を含む移植片中で提供する。導入の方法はまた、再充填可能なまたは生分解性のデバイスによって実現し得る。タンパク性生物医薬品を含めて様々な徐放性ポリマーデバイスが、薬物の調節された送達のために開発および試験されてきた。生分解性および非分解性ポリマーの両方を含む種々の生体適合性ポリマー（ヒドロゲルを含む）を使用して、特定の標的部位における生物活性因子の持続放出のための埋め込み物を形成することができる。
【００４１】
一般に、本発明の薬剤の投与される量（投与量）は、当技術分野において公知の情報およびプロトコルによって経験的に決定される。
【００４２】
本発明の組成物は、活性化合物の様々な薬学的に許容される塩、エーテル誘導体、エステル誘導体、酸誘導体、および水溶解度を変化させる誘導体を含むことができる。本発明は、本発明の化合物の全ての個々のエナンチオマー、ジアステレオマー、ラセミ化合物、および他の異性体を含むことができる。本発明はまた、この化合物の全ての多形および溶媒和物、例えば、水和物、および有機溶媒と共に形成されるものを含む。このような異性体、多形、および溶媒和物は、当技術分野において公知の方法によって、例えば、本明細書で提供する開示に基づいた、位置特異的および／またはエナンチオ選択的合成および分解によって、調製することができる。
【００４３】
化合物の適切な塩としては、これらに限定されないが、酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、硝酸、リン酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、炭酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サリチル酸、ｐ−アミノサリチル酸、２−フェノキシ安息香酸、および２−アセトキシ安息香酸と共に作製したもの；サッカリンと共に作製した塩；アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩およびカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えば、カルシウム塩およびマグネシウム塩；ならびに有機または無機リガンドと共に形成された塩、例えば、第四級アンモニウム塩が挙げられる。
【００４４】
さらなる適切な塩としては、これらに限定されないが、本発明の化合物の、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、炭酸水素塩、硫酸水素塩、酒石酸水素塩、ホウ酸塩、ブロミド、カルシウムエデト酸塩、カンシル酸塩、炭酸塩、クロリド、クラブラン酸塩、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシル酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレゾルシネート、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨージド、イソチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチルブロミド、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、Ｎ−メチルグルカミンアンモニウム塩、オレイン酸塩、パモ酸塩（エンボン酸塩）、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、硫酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、トリエチオジドおよび吉草酸塩が挙げられる。
【００４５】
本発明の化合物のプロドラッグおよび活性代謝物もまた、本発明の範囲内である。
【００４６】
プロドラッグは、代謝的転換によって薬理学的活性剤に変換される、薬理学的に不活性な化合物である。プロドラッグは、インビボで、天然に存在する酵素によって作用し、薬理学的活性剤の遊離をもたらす。適切なプロドラッグ誘導体の選択および調製についての通常の手順は、例えば、「Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ」、Ｈ．Ｂｕｎｄｇａａｒｄ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、１９８５に記載されている。
【００４７】
活性代謝物は、被験体への別の化合物の投与後のその化合物の代謝からもたらされる化合物である。代謝物は、当技術分野において周知の技術によって同定することができる。
【００４８】
本発明の一実施形態において、本明細書において開示した処置の方法はまた、例えば、乳がん、前立腺がん、膵臓がん、結腸がん、肝がん、膠芽細胞腫、卵巣がん、白血病、ホジキンリンパ腫および多発性骨髄腫を含む多くの哺乳動物の腫瘍に対して有用であると考えられる。
【００４９】
本明細書において使用する「腫瘍」の用語は、悪性であっても悪性でなくてもよい新生物増殖を意味することが当業者には理解されよう。さらに、本明細書において提供される組成物および方法は、腫瘍の処置においてだけではなく、これらの微小転移およびこれらのマクロ転移においても有用である。典型的には、微小転移は、転移（体内の最初の位置から他の部位へのがんの拡散）の形態であり、新たに形成された腫瘍は、組織学的検査によってのみ同定される。微小転移は、身体検査によっても、イメージング技術によっても検出されない。対照的に、マクロ転移は通常、大きな二次腫瘍である。
【００５０】
一実施形態によれば、本発明は、腫瘍、ならびにこれらの微小転移およびこれらのマクロ転移の予防および／または処置のための組成物および方法を提供する。
【実施例】
【００５１】
細胞毒性アッセイ。ＨｅｐＧ２ヒトＨＣＣ細胞を、２４ウェルプレートのウェル毎に５×１０４個の細胞の密度で播種し、２４時間後、増殖培地に、Ｍ４Ｎ、ソラフェニブ、またはこの２種の薬物の組み合わせを補充した。Ｍ４Ｎは、０〜８０μＭの間の濃度で使用した。Ｍ４Ｎおよびソラフェニブの組み合わせについては、２：１（Ｍ４Ｎ：ソラフェニブ）の一定のモル比を使用した。薬物添加の２４時間後に、細胞毒性を、Ｐｏｗｅｒ  Ｗａｖｅ２００マイクロプレートリーダーで測定する５４０でのＭＴＴアッセイによってアセスメントした。細胞毒性を、一定の濃度のＭ４Ｎ（６０μＭ）を含む、および含まない、増加する濃度のソラフェニブ（０〜１６０μＭ）で処置した細胞についても測定した。
【００５２】
薬物相互作用の評価。半有効原理に基づいたＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの組み合わせインデックス（ＣＩ）アイソボログラム法を使用して、合わせた薬物効果についての相乗作用または拮抗作用を計算した。段階希釈した濃度での、単独でのおよび組み合わせた２種の薬物についての用量効果曲線を、半有効等式およびプロット、ならびにＣＩ等式およびプロットを使用してプロットした。異なる効果および用量レベルでのＣＩ値、ならびにアイソボログラムを、コンピュータソフトウェアＣｏｍｐｕＳｙｎを使用して自動的に作製した。この方法によって、相加効果、相乗作用的効果、または拮抗作用的効果を、それぞれ、１、＜１、および＞１のＣＩ値によって示す。それぞれの単一の薬物および組み合わせた薬物について、所与の効果レベルに達するのに必要とされる用量の比の比較を使用して、用量低減を決定した。
【００５３】
動物。Ｔ細胞欠損ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス、５〜６週齢の雄および雌をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから購入した。ヌードマウスは無菌室に収容し、マウスが関与する全ての実験は、ジョンズホプキンス大学、動物実験委員会のガイドラインに従って行った。
【００５４】
腫瘍モデル。Ｔ細胞欠損ヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスの側腹部に、ＨＢＳＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（５０：５０、ｖ／ｖ）に懸濁させた培養したヒト腫瘍細胞をｓ．ｃ．で埋め込んだ。腫瘍が４〜８ｍｍの平均直径を示したとき、マウスを、Ｍ４Ｎ、ソラフェニブまたはこの２種の薬物の組み合わせを投与された処置群、およびビヒクルのみを投与された対照群に割り当てた。Ｍ４Ｎ処置群および対照群が、概ね等しい分布の腫瘍サイズと共に開始することを確実にするために、マウスを、３つのカテゴリー：小さな腫瘍（長さ＜４ｍｍ）、中間の腫瘍（４〜８ｍｍ）、および大きな腫瘍（＞８ｍｍ）を担持するものの１つに分類した。対照群とＭ４Ｎ処置群の両方は、３つのカテゴリーのそれぞれからの概ね等しい数のマウスを受け入れた。
【００５５】
腫瘍を外植されたヌードマウスへのＭ４Ｎの投与。ｉ．ｖ．および経口投与のために、Ｍ４Ｎおよびソラフェニブを、シクロデキストリンをベースとするＣＰＥ溶媒系（Ｅｒｉｍｏｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）に溶解した。マウスは、図６、１５および１６において概要を述べる投薬スケジュールによって、毎日１回のｉ．ｖ．尾静脈注射を受け、動物飼養ニードルによる経口胃管栄養法によって強制的に給餌された。
【００５６】
抗腫瘍効果の評価。７日毎に１度、腫瘍の２つの垂直の寸法を測定し、腫瘍体積を式：Ｖ＝（ａ２×ｂ）／２によって計算した。式中、ａは、腫瘍の幅（より小さな直径）であり、ｂは、長さ（より大きな直径）である。それぞれの腫瘍の相対的腫瘍体積（ＲＴＶ）は、所与の時間における体積と処置の開始時における体積との比として定義した（５）。平均ＲＴＶおよびＳＥを、各処置群について計算した。実験の終了時に、腫瘍を切除し、ホルムアルデヒド中に固定した。次いで組織試料を切除し、ヘマトキシリンおよびエオシンによる組織学的染色のためにマウントした。
【００５７】
ウェスタン免疫ブロット分析。処置細胞および対照細胞をＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充したＲＩＰＡ緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）、０．１％ＳＤＳ、１％ＮＰ４０、および０．５％デオキシコレート）中で懸濁させた。氷上での２０分のインキュベーション後、懸濁液を遠心分離し、可溶化したタンパク質を清浄にした。ブラッドフォードタンパク質アッセイを行い、同等の量のタンパク質を含有する試料を、標準的ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜に移した。膜を脱脂乳でブロックし、一次抗体と共に４℃にて一晩、次いで西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした二次抗体と共に室温にて１時間インキュベートした。シグナルは、ウェスタンブロット化学発光検出試薬によって検出した。
【００５８】
実施例１
Ｍ４Ｎおよびソラフェニブの複合効果の評価。Ｍ４Ｎおよびソラフェニブは、組み合わせて、ＨＣＣヒトがん細胞系ＨｅｐＧ２の増殖を用量依存的に阻害した（図１）。薬物の組み合わせの細胞毒性活性は、いずれかの薬物単独の活性と比較したとき、劇的に増強された。
【００５９】
アイソボログラム法およびＣＩ法の２つの方法を使用して、ソラフェニブの間に相乗作用があるかを決定した。アイソボログラムは、増殖の９０％（Ｆａ＝０．９）、７５％（Ｆａ＝０．７５）、および５０％（Ｆａ＝０．５）を阻害するのに必要とされるＭ４Ｎおよびソラフェニブの用量のために構築した。ＨｅｐＧ２細胞におけるＭ４Ｎおよびソラフェニブの薬物の組み合わせについての実験データポイントは、これらの値のそれぞれについての予想される相加効果ライン未満の薬物濃度であったが、これはＭ４Ｎとソラフェニブとの間に相乗作用が存在することを示す（図２）。
【００６０】
ＣｈｏｕおよびＴａｌａｌａｙの半有効分析を使用して、Ｍ４Ｎおよびソラフェニブの薬物の組み合わせについての組み合わせインデックス（ＣＩ）を計算した。組み合わせは、ＥＤ５０にて強力に相乗作用的（ＣＩ＜０．３）、ＥＤ７５およびＥＤ９０にて相乗作用的（ＣＩ＜０．７）、ならびにＥＤ９５にて中程度に相乗作用的（ＣＩ＜０．８５）であった（表１および図３）。
【００６１】
【表１】
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【００６２】
実施例２
用量低減インデックス（ＤＲＩ）は、相乗作用的組み合わせにおける各薬物について可能となる用量低減が何分の１になるかを決定する。用量低減は、所望の有効性を維持する一方で、毒性の低減をもたらすため、これは重要である。これらの相乗作用の結果として、ＤＲＩは、薬物のそれぞれについてかなりの用量の低減を示した。ＤＲＩは、Ｍ４Ｎの併行投与によって、ＨｅｐＧ２細胞の５０％、７５％、９０％、および９５％の増殖を阻害するのに必要とされるソラフェニブの濃度（ＥＤ５０、ＥＤ７５、ＥＤ９０、ＥＤ９５）を、それぞれ、１７，５８３．１分の１、９２，８１５．６分の１、４８，９９４５．０分の１、および１５１，９０４１分の１に減少させることができることを示した（表１）。
【００６３】
用量反応曲線を、単独でのまたは６０μＭのＭ４Ｎと組み合わせた、増加する濃度のソラフェニブで処置した細胞についても作製した。これらの結果（図４）は、２４時間の処置後のＨｅｐＧ２細胞に対するソラフェニブのＩＣ５０は、概ね３０μＭであることを示した。データはまた、２０μＭの濃度でのソラフェニブの細胞毒性効果は約２０％のみであった一方、６０μＭのＭ４Ｎと合わせたとき、ほとんど９０％有効であったことを示した（図４）。
【００６４】
実施例３
ヌードマウスにおけるヒト肝細胞がんの腫瘍外植に対する併用処置の効果：ヒト肝細胞がんの異種移植腫瘍を、Ｍ４Ｎおよびソラフェニブの薬物の組み合わせの有効性の前臨床試験のために、ヌードマウスにおいて確立した。ソラフェニブと合わせた様々なレジメンのＭ４Ｎで処置した３群のマウスを、各薬物単独で、またはＣＰＥビヒクルのみで処置したマウスと比較した。処置の５週間後、試験した２つのパラメーターである腫瘍増殖および生存について、対照および単一の薬物群と比較したとき、Ｍ４Ｎおよびソラフェニブの組み合わせは、非常により有効であったことを結果は示した（図５、６）。ｉ．ｖ．、経口、またはこの２つの組み合わせのいずれであろうと、投与経路にかかわらず、処置の４週間後、他の群と比較して、腫瘍増殖は併用処置群において抑止され（図５）、マウスの生存は劇的に増加した（図６）。毎週２回のｉ．ｖ．投与および毎日の経口投薬からなるさらに３週間の維持療法の後、Ｍ４Ｎおよびソラフェニブの組み合わせで処置されたマウスの１００％が生存した一方で、単一処置または対照群マウスは生存し続けなかったことを結果はさらに示した（図６）。マウスの死亡は、対照群および単一薬物処置群における大きな腫瘍の存在を示す写真によって示されるように、腫瘍量の増加によるものであった（図７）。
【００６５】
実施例４
マウスの死後の組織バイオプシーの組織分析を使用して、腫瘍外植に対する薬物の組み合わせの細胞毒性効果、肺における転移巣が存在することまたは存在しないこと、およびもしあれば、肝臓の細胞診断に対する効果を評価した。処置群のそれぞれからの腫瘍組織の検査は、併用処置群において腫瘍細胞の大規模な減少を明らかにし、これはエオシン染色結合組織の微小線維によって置き換えられた（図８、下のパネル）。単一の薬物で処置されたマウスからの腫瘍組織においては目に見える軽度の腫瘍細胞死のみ（図８、中央のパネル）、および対照マウスからの腫瘍組織においては腫瘍細胞のロバストな集団が存在した。各群におけるマウスからの肺を、腫瘍転移の存在について肉眼的に検査した。転移は対照群および単一薬物処置群において存在したが、薬物の組み合わせで処置されるマウスの群において存在しなかった。これらの結果は、肺組織バイオプシーの組織学的検査によって確認され（図９）、薬物の組み合わせのマウスの肺は、細胞学的に正常および微小転移が存在しないことが観察された。最後に、組み合わせ薬物処置の有害効果は、マウスにおいて観察されなかった。これらの薬物レジメンの安全性のさらなる証拠は、肝毒性の証拠を示さなかった、処置されたマウスからの死後の肝臓バイオプシーの組織学的検査によって確立された（図１０）。
【００６６】
実施例５
他のヒトがんに対する併用処置の有効性。異なる組織からのがんおよびそれどころか同じ組織からのがんでさえ、異なる分子の遺伝的原因を有することが多いが、これらは全て、野放しの増殖調節および過度な刺激を与えられた生存促進性経路という同じ一般的特徴を共有する。さらなる細胞培養および動物試験を行い、これらのそれぞれの増殖停止特性とアポトーシス誘発特性との間の相乗作用によって、異なる組織源からのより広い範囲の腫瘍を処置することにおいて、Ｓｐ１依存性転写の包括的阻害剤であるＭ４Ｎ、およびマルチキナーゼ阻害剤であるソラフェニブが、有効であるかを決定した。薬物の組み合わせは、下記のがん細胞系：ＡｓＰｃ−１（膵臓）、ＭＤＡ−ＭＢ４６８（乳房）、ＨＣＴ−１１６（結腸）、ＦａＤｕ（咽頭）、ＯＳＣ−１９（甲状腺）、ＬＮ２２９（脳の神経膠腫）、ＳＫＯＶ３（卵巣）、７８６−０（腎臓）およびＳＷ−７８０（膀胱）からの細胞を相乗作用的に死滅させることにおいて有効であった。組み合わせインデックス（ＣＩ）および用量低減インデックス（ＤＲＩ）データを、細胞系の２つである膵臓がんＡｓＰｃ−１および乳がんＭＤＡ−ＭＢ４６８（図１１、１２）について示し、これらの２つの細胞系を、外植された腫瘍担持ヌードマウスにおけるさらなる前臨床試験のために選択した。
【００６７】
実施例６
ヒトＨｅｐＧ２肝細胞がんの細胞について示されたように、さらなる細胞系の両方は、静脈内または経口的に投与したＭ４Ｎおよびソラフェニブの薬物の組み合わせによる処置に対して感受性であると判明した。腫瘍増殖（図１３、１４）は、抑止された（ＭＤＡ−ＭＢ４６８）か、または逆行（ＡｓＰｃ−１）し、マウスの生存率（図１５、１６）は、１００％ではないが、処置によって増加した。薬物の組み合わせが、いくつかの異なるがんにおいて有効であり、他のより標的化された療法より包括的に作用し得ることをこれらのデータは示す。薬物のこの組み合わせの作用の正確な機序は完全には解明されてこなかったが、これらの動物試験において示された毒性の欠如は、これらの薬剤が、がん特異的に異常に変更される経路に対して活性であることを示唆する。
【００６８】
実施例７
作用機序。過剰発現された生存促進性経路を標的とすることは、有効な抗がん戦略であることが判明している。キナーゼ阻害剤をしばしば使用して、これらの経路に関与するタンパク質キナーゼカスケードを乱す。Ｍ４Ｎは、Ｓｐ１依存性転写を阻害し、それによってサバイビン発現の阻害によって、増殖停止、場合によっては、アポトーシスをもたらすことが示されてきた。Ｍ４Ｎがソラフェニブのアポトーシス誘発効果を促進するように作用するかを決定するために、単独でのまたは組み合わせたＭ４Ｎおよびソラフェニブで処置した培養した膵臓がん細胞からのタンパク質を、カスパーゼ活性化について免疫ブロットによって分析した。結果（図１７）は、ソラフェニブ処置単独が、プロカスパーゼ９、４および７のレベルの低下をもたらしたことを示し、これはプロカスパーゼ分解によるカスパーゼ活性化を示唆する。Ｍ４Ｎは、単独で使用したとき、カスパーゼ活性化に対してほとんど効果を有さなかったが、ソラフェニブと一緒に投与したとき、２種の薬物はプロカスパーゼ分解を非常に増強した。カスパーゼ７分解についてのより特定の証拠は、カスパーゼ７分解産物を検出する抗体を使用して観察した（図１７、パネル４）が、これは併用処置後にのみ増加した。１８時間の処置後、薬物も、これらの組み合わせも、カスパーゼ３活性化に対して効果を有さなかった。
【００６９】
本明細書において引用した公開資料、特許出願、および特許を含めた全ての参照文献は、あたかもそれぞれの参照文献が参照により個々におよび特に組み込まれていることが示され、かつ本明細書においてその全体が記載されているのと同一程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
【００７０】
本発明を記載することとの関連で（特に、下記の特許請求の範囲との関連で）、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」という用語、ならびに同様の参照対象の使用は、本明細書において他に示さない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方をカバーすると解釈される。「含む」、「有する」、「含める」および「含有する」という用語は、他に断らない限り、拡張可能な用語として解釈される（すなわち、「これらに限定されないが、以下を含む」を意味する）。本明細書において値の範囲の列挙は、本明細書において他に示さない限り、範囲内に入るそれぞれの別々の値を個々に指す省略表現法としての役割を果たすことが単に意図され、それぞれの別々の値は、あたかもこれが本明細書において個々に列挙されているのと同様に、明細書中に組み込まれている。本明細書に記載されている全ての方法は、本明細書において他に示さない限り、または他に文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書において提供するありとあらゆる例、または例示的な言語（例えば、「例えば」）の使用は、本発明をより良好に解明することを単に意図し、他に特許請求しない限り、本発明の範囲に対する限定を提起しない。明細書における言語は、任意の特許請求していない要素を本発明の実施に必要不可欠であるとして示していると解釈すべきではない。
【００７１】
本発明の好ましい実施形態は、本発明を実施するための本発明者らに知られている最良の態様を含めて本明細書に記載されている。これらの好ましい実施形態のバリエーションは、上記の記載を読むことによって、当業者には明らかとなり得る。本発明者らは、当業者がこのようなバリエーションを必要に応じて用いることを予想し、本発明者らは、本発明が本明細書に特に記載されているのとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、準拠法によって可能とされるような本明細書に添付の特許請求の範囲において列挙される主題の全ての修正および同等物を含む。さらに、その全ての可能性のあるバリエーションにおける上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書において他に示さない限り、または他に文脈によって明らかに矛盾しない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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