(57)【要約】本発明はチロシンキナーゼレシピエント（RET）、膜貫通型チロシンキナーゼレシピエント、造血幹細胞（HSC）用アゴニスト分子の増幅プロトコル、及び、HSC移植医療の使用に関する。RETシグナル分子は、HSCsによって発現され、Ret剥離がHSC数の減少を導く。RETシグナルは、キューを生き抜く分類が曖昧なBcl2及びBcl2l1と、p38/MAPキナーゼの下流と、CREB活性とを、HSCsに提供する。従って、RET下流標的、Bcl2又はBcl2l1の強制発現は、生体内でRetヌル前駆体の活性を回復するには不十分である。著しく、RETの活性は、HSC生存又は維持と、生体内移植効率とを向上させ、HSC増殖及び移植プロトコルにおいてRETアゴニストの使用に新規な着想を開示する。従って、本開示は、HSC増幅プロトコル及び移植医療に使用される、RETアゴニスト分子を備えるキットを示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
幹細胞維持の調節剤としてチロシンキナーゼレシピエントアゴニスト分子の使用。
【請求項２】
請求項１記載のチロシンキナーゼレシピエントアゴニスト分子の使用であって、
前記チロシンキナーゼレシピエントアゴニストは、グリア細胞株由来神経栄養因子、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、又は、それらの混合物からなる一群から選択されることを特徴とする、チロシンキナーゼレシピエントアゴニスト分子の使用。
【請求項３】
請求項１又は２記載のチロシンキナーゼレシピエントアゴニスト分子の使用であって、
前記幹細胞は造血幹細胞であることを特徴とする、チロシンキナーゼレシピエントアゴニスト分子の使用。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項記載のチロシンキナーゼレシピエントアゴニスト分子の使用であって、
前記造血幹細胞は幹細胞性を維持することを特徴とする、チロシンキナーゼレシピエントアゴニスト分子の使用。
【請求項５】
造血幹細胞移植治療によって改善可能又は予防可能な病気の治療に対する、チロシンキナーゼレシピエントアゴニスト分子の使用。
【請求項６】
造血幹細胞の細胞培養培地と、少なくとも１つのチロシンキナーゼレシピエントアゴニストとを備える、造血幹細胞の維持、増幅、又は、移植のためのキット。
【請求項７】
請求項６記載のキットであって、
前記チロシンキナーゼレシピエントアゴニストは、グリア細胞株由来神経栄養因子、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、又は、それらの混合物からなる一群から選択されることを特徴とする、キット。
【請求項８】
請求項６又は７記載のキットの使用であって、
造血幹細胞の維持のためのプロトコルに適用されることを特徴とする、キットの使用。
【請求項９】
請求項６又は７記載のキットの使用であって、
造血幹細胞の増幅のためのプロトコルに適用されることを特徴とする、キットの使用。
【請求項１０】
請求項６又は７記載のキットの使用であって、
造血幹細胞の移植のためのプロトコルに適用されることを特徴とする、キットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、造血幹細胞増殖プロトコル（haematopoietic stem cell expansion protocols）及び移植療法におけるRETアゴニスト分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
特定種類の白血病及び多発性骨髄腫のような多くの血液細胞悪性腫瘍に対して、造血幹細胞（haematopoietic stem cell （HSC））は重要な治療方法の選択肢である。さらに、これらの細胞は、HIV及び多発性硬化症を含む他の病気の緊急に必要とされる治療の研究開発において広く使用されている。しかしながら、HSCの使用は、これらの細胞の限定された増殖によってかなり制限される。現在の細胞培養技術は、幹細胞の不充分な品質及び数量をもたらしている。
【０００３】
多くの研究が、細胞培養培地のサイトカインカクテルで実験することによってHSC増殖を起こそうと行われている。これらの増殖因子の組合せはHSCの数を増加することができるけれども、これは細胞成熟を犠牲にして起きる。最終培養中の多くの細胞は、その幹細胞の特性を失い、換言すれば、それらの「幹細胞性（stemness）」を失い、そして、治療及び研究開発に使用されている。このことが治療成果を妨害し、研究開発活動も必要以上に高価で非効率にしている。
【０００４】
疑問の余地なく、HSC増殖を改良することは、膨大な社会的な利益を有する。HSC移植は、より安価になり、そして、より多くの患者に使用され得る。”the Agency for Health Care Research and Quality”の最近の報告によれば、HSC移植は最近１０年間入院費の合計において最も急激な増加を生じているので、コスト低減は特に興味深い。非常に有望な新規なHSC源である臍帯血（umbilical cord blood（UCB））由来のHSCの増殖技術の使用は特に興味深い。残念なことに、UCB移植に関する９０％の患者は未だ、典型的なUCBユニットに使用できる限定された数の幹細胞のために適応されていない。
【０００５】
これらの細胞増殖の本開示は、未だ満たされていない医学的ニーズに対する解決策を提供することができた。さらに、HSCの改良された可用性は、幹細胞生物学の研究、及び、HIV及び多発性硬化症等の病気に対する新規な治療方法の開発を推進する。
【０００６】
社会的な利益以外に、かなりのビジネスチャンスもある。ＵＳを拠点とする幹細胞研究は、２００５年の支出額で、１０％（８２百万ＵＳドル）が培地等の消耗品に割り当てられた８２０百万ＵＳドルを占めた。幹細胞研究に対する出費は、２０１５年迄に、約２０％（約４００百万ＵＳドル）が消耗品に割り当てられた２０億ＵＳドルに到達すると予測されている［Bioinformatics, 2009］。多国籍製薬会社は次第に、この新興成長市場の重要なチャンスの存在を意味する幹細胞の開発を取り組んでいる［Datamonitor, 2011］。
【０００７】
本発明は、造血中、RETの役割を開示し、神経栄養因子（neurotrophic factors）がHSC生存、機能、及び増殖に非常に有益な効果を有する発見を導く。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、幹細胞の維持、増殖又は移植の重要な因子として、チロシンキナーゼレシピエント（tyrosine kinase receptor（RET））のアゴニスト分子の使用に関する。
【０００９】
本発明の好ましい実施形態は、グリア細胞株由来神経栄養因子、ニュールツリン（neurturin）、アルテミン（artemin）、パーセフィン（persephin）又はそれらの混合物からなる一群から選択されたＲＥＴアゴニスト分子の使用である。
【００１０】
本発明の他の好ましい実施形態において、幹細胞は、幹細胞性を維持する造血幹細胞である。
【００１１】
本発明の好ましい実施形態は、造血幹細胞の移植治療によって、改良又は妨害可能な状態の治療に対するRETアゴニスト分子の使用である。
【００１２】
また、本発明の目的は、グリア細胞株由来神経栄養因子、ニュールツリン（neurturin）、アルテミン（artemin）、パーセフィン（persephin）又はそれらの混合物からなる一群から選択された少なくとも１つのRETアゴニストを有する、造血幹細胞の細胞培養培地を備える、造血幹細胞の維持、増殖又は移植のためのキットを提供することである。
【００１３】
また、本発明の目的は、造血幹細胞の維持、増殖又は移植のプロトコルにおいて上記キットの使用を提供することである。
【００１４】
造血幹細胞移植は現在、白血病等の様々な造血器悪性腫瘍を処置するために使用される。しかしながら、移植は未だ、少数のHSC及び不十分な生着により限定されたままである。HSC機能を改良する新規な標的の同定（Identification）は、輸血剤及び癌治療において重要な目標である。本開示において、そのようなタイプの分子が同定される。RETを介してシグナルを送る神経増殖因子は、HSC機能を制御し、及びHSC生存を促進する。従って、神経増殖因子を用いたHSC治療は、正常な血液生成に有意な副作用を有することなく、HSC移植及び増殖プロトコルにおいて非常に成功している。
【００１５】
本明細書は、HSC工業的増殖プロトコル及びHSC移植治療に、RETアゴニストの使用に新規な着想を開示する。驚くほどに、最新の考え方と対照的に、造血幹細胞及び神経幹細胞が類似のシグナルを介してこれらの細胞への適応度を維持することも開示される。さらに具体的に言うと、神経栄養因子レシピエントRETはHSC生存及び機能に重要であり、RETシグナル分子はHSCによって発現され、網状赤血球剥離（Ret ablation）はHSC数を減少させることを導く。正常な分化能に関わらず、RETヌル前駆細胞（null progenitors）は、生体内ストレス応答及び再構成可能性の損失を示し、急激に消耗する。著しく、RETのシグナルは、HSCに、critical Bcl2 and Bcl2l1 surviving cues、p38/MAPキナーゼ、及びCREB活性化を提供する。従って、RET下流標的、Bcl2又はBcl2l1の強制発現は、生体内で網状赤血球ヌル前駆体（Ret null progenitor）の活性を復元するのに十分である。
【００１６】
意外なことに、RETの活性化は、改良されたHSC生存、及び、生体内移植効率をもたらし、HSC増殖及び移植プロトコルにRETアゴニストの使用に新規な領域を開く。
【００１７】
最終的に、本実施形態は、RETがHSCの機能の重要な細胞自律的な調節遺伝子であることを示し、HSC微環境の新規なコンポーネントとして神経栄養因子を明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１Ａ】網状赤血球剥離がHSCを減少させる原因となることを示す図。図１ａはFL E14.5 MP及びLSKが定量的なRT-PCRによって分析された図である。図１ｂはHSCs及びMPPsが定量的なRT-PCRによって分析された図である。図１ｃは、FL E14.5 TER119negCD45negCD31pos内皮細胞（endothelial cells (EC)）、TER119negCD45negCD31negcKitposICAM-1neg肝細胞前駆細胞（hepatocyte progenitor cells (HP)）、及びTER119negCD45negCD31negcKitnegICAM-1pos（間葉細胞（mesenchymal cells (MC)）が定量的なRT-PCRによって分析された図である。図１ｄは、E14.5 Ret-/-及びWT同腹子のフローサイトメトリー分析がLSKs（上図）及びMPs（下図）を制御する図である。図１ｅは、LSKsの数及び総FL細胞の数（WT n=18; Ret-/-n=17）を示す図である。図１ｆは、8日目のCFUコロニー数（WT n=3; Ret-/- n=3）を示す図である。両側t検定のp値が示されている。エラー・バーは標準誤差を示している。
【図１Ｂ】網状赤血球剥離がHSCを減少させる原因となることを示す図。図１ｇは、E14.5 LSK細胞のBrdU及びKi-67を示す図である。図１ｈは、Ki-67neg LSKs（G0 細胞）の割合（WT n=12; Ret-/- n=14）を示す図である。図１ｉは、E14.5 HSCsの数（WT n=20; Ret-/-n=18）を示す図である。図１ｊは、5-FU処置後のVaviCre.Retnull/flの生存及び同腹子コントロール（WT n=5; Ret-/-n=6）を示す図である。両側t検定のp値が示されている。エラー・バーは標準誤差を示している。
【図２Ａ】Ret-/-LSKsが生体内再構成可能性を有することを示す図。図２ａは、１２日目のCFU-s（WT n=10; Ret-/-n=10）を示す図である。図２ｂは、投与後２０時間後のBM及び脾臓中のLinnegcKitposCMTMRpos細胞の割合（WT n=3; Ret-/- n=3）を示す図である。図２ｃは、移植での生存（WT n=5; Ret-/-n=6）を示す図である。対数順位検定のp値が示されている。図２ｄは、一次及び二次（red）移植のスキームを示す図である。両側t検定のp値が示されている。エラー・バーは標準誤差を示している。
【図２Ｂ】Ret-/-LSKsが生体内再構成可能性を有することを示す図。図２ｅは、移植後のMac1pos細胞の割合（WT n=8; Ret-/- n=8）を示す図である。図２ｆは、移植後16週目の血液細胞系譜を示す図である。図２ｇは、移植後16週目のBM Linneg及びLSK細胞、及びBM LSK 細胞の割合（WT n=4; Ret-/- n=4）を示す図である。図２ｈは、二次移植後のMac1pos細胞の割合（WT n=4; Ret-/- n=4）を示す図である。図２ｉは、二次移植後16週目の血液細胞系譜を示す図である。図２ｊは、16週目のBM Linneg及びLSK細胞、及びBM LSK 細胞の割合（WT n=4; Ret-/- n=4）を示す図である。両側t検定のp値が示されている。エラー・バーは標準誤差を示している。
【図３Ａ】RETがBcl2/Bcl2l1、下流のp38/MAP、及びCREB活性化を誘導することを示す図。図３ａ及び図３ｂは、FL E14.5 Ret-/-及びWT LSKs及びHSCsの定量的RT-PCR（n=3）を示す図である。図３ｃは、培養されたE14.5 LSK細胞中のアネキシンVpos細胞（WT n=7; Ret-/- n=4）を示す図である。図３ｄは、回復したLSKs、及び、4日間、GFLsで処置されたHSCsの数（n=12）を示す図である。図３ｅは、培養したLSK細胞中のアネキシンVpos細胞（Alone n=9; GFLs n=9）を示す図である。両側t検定のp値が示されている。エラー・バーは標準誤差を示している。ライトグレーはアイソタイプコントロールである。
【図３Ｂ】RETがBcl2/Bcl2l1、下流のp38/MAP、及びCREB活性化を誘導することを示す図。図３ｆは、E14.5 Ret-/-及びWT同腹子コントロールLSKsのフローサイトメトリー（WT n>8; Ret-/-n>7）を示す図である。図３ｇは、１時間、GFLsの欠乏下又は存在下でのLSK細胞のフローサイトメトリー分析（n>6）を示す図である。図３ｈは、GFL処置でのBcl2及びBcl2l1発現を示す図である。両側t検定のp値が示されている。エラー・バーは標準誤差を示している。ライトグレーはアイソタイプコントロールである。
【図３Ｃ】RETがBcl2/Bcl2l1、下流のp38/MAP、及びCREB活性化を誘導することを示す図。図３ｉは、GFLsで培養されたLSKs（黒線）又はGFLs、そして、阻害剤SB 202190 (SB); PD98,059 (PD); Akt1/2, Akt Inhibitor VIII (AktVIII)（solid grey社製)のフローサイトメトリー分析（n>5）を示す図である。図３ｊは、GFL処置でのBcl2及びBcl2l1発現とそれぞれの阻害剤を示す図である。図３ｋは、GFL処置での、未処理のLSKsに関連するBcl2及びBcl2l1発現、又は、GFL+CBP-CREB相互作用インヒビター（CREBinh）を示す図である。両側t検定のp値が示されている。エラー・バーは標準誤差を示している。ライトグレーはアイソタイプコントロールである。
【図４Ａ】RETシグナルのトリガーが移植活性を改善することを示す図。図４ａは、定量的なRT-PCRを示す図である。pMig.GFP-IRES-Ret9と空ベクトルとの間の増加倍数の比率（n=3）を示す図である。図４ｂは、形質導入細胞の移植４週目のRet-/-血液細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。図４ｃは、pMig.GFP-IRES-Empty (Empty), pMig.GFP-IRES-Ret9 (Ret9), pMig.GFP-IRES-Bcl2l1 (Bcl2l1) 又は、pMig.GFP-IRES-Bcl2 (Bcl2)で形質導入されたRet-/-前駆体で移植後４週目の血液中のCD45.2posGFPposの割合（Empty n=13; Ret9 n=5; Bcl2l1 n=8; Bcl2 n=7）を示す図である。図４ｄは、図４ｂに示された形質導入したBM LSK細胞の数（Ret-/- Empty n=13; Ret9 n=4; Bcl2l1 n=6; Bcl2 n=5）を示す図である。両側t検定のp値が示されている。
【図４Ｂ】RETシグナルのトリガーが移植活性を改善することを示す図。図４ｅは、移植後８週目の血液細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。図４ｆは、血液由来のMac1pos細胞におけるCD45.2posドナー細胞の割合（Alone n=5; GFLs n=5）を示す図である。図４ｇは、移植後１２週目のBM CD45.2posドナーLSK及びHSC細胞の割合（Alone n=5; GFLs n=5）を示す図である。両側t検定のp値が示されている。
【図５】造血前駆細胞におけるRet発現を示す図。図５ａは、フローサイトメトリーによってE14.5 FL由来のLinnegSca1negcKitpos骨髄前駆細胞(MP)及びLinnegSca1poscKitpos(LSK)細胞の精製ストラテジーを示す図である（上図はLinneg細胞で前選別してゲートされ（pre sortgated）、下左図は選別後のLinnegSca1negcKitpos骨髄前駆体の純度、下右図は選別後のLinnegSca1poscKitpos細胞の純度を示す）。図５ｂは、FL E14.5 MP及びLSKが定量化RT-PCRで分析された図を示す。図５ｃは、E14.5 FL及び成熟BM由来のLSK細胞が定量化RT-PCRで分析された図を示す。図５ｄは、E14.5 FL及び成熟BM LSK細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。図５ｅは、ヒト臍帯血（hCB）由来のCD34posCD38neg細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。ライトグレーはアイソタイプコントロールである。
【図６】Retリガンドが胎児及び成熟造血幹細胞環境で発現させられたことを示す図。図６ａ及び図６ｂは、E14.5 FL TER119negCD45negCD31pos内皮細胞(EC)、TER119negCD45negCD31negcKitposICAM-1neghepatocyte肝細胞の前駆体細胞（hepatocyte progenitor cells）(HP)及びTER119negCD45negCD31negcKitnegICAM-1pos間葉細胞(MC)が、定量化RT-PCRで分析された図を示す。図６ｃ及び図６ｄは、BM TER119negCD45negCD31posSca1pos内皮細胞(Endo)、TER119negCD45negCD31negSca1negCD51pos骨芽細胞(Osteo)、TER119negCD45negCD31negSca1posCD51pos間葉幹細胞(MSC)及び、残余のTER119negCD45negCD31negSca1negCD51neg(CD51neg)細胞が、定量化RT-PCRで分析された図を示す。結果は３つの独立した実験の代表例である。
【図７】長期再構成LSK細胞数がRet欠損によって影響を受けていることを示す図。図７ａは、E14.5ST-LSK (LSKCD38neg)及びLT-LSK (LSKCD38pos)細胞の数（WT n=12; Ret-/-n=11）を示す図である。図７ｂは、DNA含量(7AAD)に応じた、LSK細胞inG0+G1, S 又はG2+M細胞周期の割合（WT n=7; Ret-/-n=6）を示す図である。両側t検定のp値が示されている。エラー・バーは標準誤差を示している。
【図８】Ret条件付きノックアウトマウスの生成及びBM造血幹細胞の分析を示す図。図８ａは、（Ａ）loxPが導入されたネオマイシン・カセット（floxed Neomycin cassette）がマウスRet遺伝子座のエクソン１の上流、〜4.5kbに投与され、第３loxP(LoxP3)がエクソン１の下流に投与され、〜5kb下流でPGK-TK-pAカセットが陰性選択を補助するために投与され、標的イベントが5’外部プローブを用いてゲノムDNAのHind III消化のサザン解析によって同定し、（Ｂ）loxPが導入された対立遺伝子がPCRによって同定され、プライマーP1/P2がネオマイシン・カセット(PGK-Neo-PA)の切除後に残ったloxPを同定するために使用され、一方loxP3がプライマーP3/P4を使用して同定され、プライマーシーケンスがメソッド・セクションにあり、（ｃ）ヌル対立遺伝子に対して選別するために、プライマーP1及びP4が使用されることを示す図である。図８ｂは、HindIII消化及び5’外部プローブを使用したサザンブロットを示す図である。図８ｃは、遺伝子型判定がcRet131WT/null x cRet131fl/fl増殖から得られた一緒に生まれたマウスからもたらされ、loxP 部位のPCRsにおいて、上部バンドがloxP部位を有するシーケンスに、下部バンドがWTシーケンスに対応することを示す図である。図８ｄは、BM HSCsの数（Vav1iCre RetWT/fl(RetWT/fl) n=5; Vav1iCre Retnull/fl(Retnull/fl) n=4）を示す図である。図８ｅは、HSCs中のKi-67（Vav1iCre RetWT/fl=68.85 ± 1.43; Vav1iCre Retnull/fl=60.09 ± 1.59 (平均値±標準誤差)）を示す図である。両側t検定のp値が示されている。エラー・バーは標準誤差を示している。
【図９】Ret欠損LSKsが異なる移植比率で適応性を低下し、Ret発現がLSK移植後増加することを示す図。図９ａは、競合移植アッセイが、異なる比率のE14.5 Ret-/- CD45.2及びWT CD45.1/CD45.2からのLinnegcKitposを用いて実施され、二次移植後のMac1pos細胞の割合を示す図である。左図は同時注入した1.5x105WT CD45.1/CD45.2及び0.5x105Ret-/-CD45.2 (3:1)、中央図は同時注入した1x105WT CD45.1/CD45.2及び1x105 Ret-/- CD45.2 (1:1)、右図は同時注入した0.5x105 WTCD45.1/CD45.2及び1.5x105Ret-/- CD45.2 (1:3)で、3:1 n=4; 1:1 n=3; 1:3 n=4である。図９ｂは、８週目の1：3レシピエントからの血液細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。図９ｃは、E14.5 FL LSK細胞が致死的被照射レシピエントに移植された図である。移植されたLSK細胞は移植後7日目及び15日目に精製され、定量的RT-PCRで分析された。両側t検定のp値が示されている。
【図１０】RETシグナルが生存増加及びCREBリン酸化反応をもたらすことを示す図。図１０ａは、FL E14.5 Ret-/-及びWT HSCsの定量的RT-PCR（n=3）を示す図である。図１０ｂは、培養後のアネキシンVpos LSK細胞の割合（WT n=7, Ret-/-n=4）を示す図である。図１０ｃは、培養後のアネキシンVposLSK細胞の割合（Alone n=7, GFLs n=4）を示す図である。図１０ｄは、E14.5 Ret-/-又はWT同腹子コントロールLSK細胞のフローサイトメトリー（WT n=6; Ret-/- n=6）を示す図である。図１０ｅは、一時間、GDNF, NRTN又はARTNの欠乏又は存在下でのLSK細胞のフローサイトメトリー（n = 6）を示す図である。両側t検定のp値が示されている。ライトグレーはアイソタイプコントロールである。
【図１１Ａ】RetMEN2B LSK分化及び移植可能性の分析を示す図。図１１ａは、図４ｂ〜図４ｄに対する、Ret欠損前駆体の競合移植レスキューのスキームを示す図である。図１１ｂは、LSK及び総FL細胞の数（WT n=10; RetMEN2B n=15）を示す図である。図１１ｃは、８日目のCFUコロニー数（WT n=3; RetMEN2B n=3）を示す図である。図１１ｄは、８日目のCFU-s（WT n=5; RetMEN2Bn=4）を示す図である。図１１ｅは、RetMEN2B CD45.2及びWT CD45.1/2を用いた競合移植アッセイを示す図である。二次移植後のMac1pos細胞の割合を示す。n=4。両側t検定のp値が示されている。エラー・バーは標準誤差を示している。
【図１１Ｂ】RetMEN2B LSK分化及び移植可能性の分析を示す図。図１１ｆは、二次移植後８週目のRetMEN2B CD45.2及びWTCD45.1/2ソース由来の血液細胞系譜を示す図である。図１１ｇは、図４ｅ〜図４ｇに対する、GFLs処理を用いた競合移植のスキームを示す図である。両側t検定のp値が示されている。エラー・バーは標準誤差を示している。
【図１２】Gfra欠損胎児（embryos）が通常LSK細胞数を有することを示す図。図１２ａは、E14.5Gfra1-/-及びWT同腹子コントロールLSKs（上図）及びMPs（下図）のフローサイトメトリーを示す図である。図１２ｂは、LSK及び総FL細胞の数（WT n=9;Gfra1-/-n=10）を示す図である。図１２ｃは、E14.5Gfra2-/-及びWT同腹子コントロールLSKs（上図）及びMPs（下図）のフローサイトメトリーを示す図である。図１２ｄは、LSK及び総FL細胞の数（WT n=12; Gfra2-/-n=11）を示す図である。図１２ｅは、E14.5Gfra3-/-及びWT同腹子コントロールLSKs（上図）及びMPs（下図）のフローサイトメトリーを示す図である。図１２ｆは、LSK及び総FL細胞の数（WT n=11;Gfra3-/-n=20）を示す図である。両側t検定のp値が示されている。エラー・バーは標準誤差を示している。
【図１３】神経細胞増殖因子が生理学的要求に対するHSC応答を調節することを示す図。神経栄養因子GDNF, NRTN及びARTNは、HSC微小環境の細胞によって産生され、RET/GFRαへトロダイマーに結合させることによって直接作用する。ハイライトした領域は、RET刺激がp38/MAPキナーゼをもたらし、CREB活性がBcl2及びBcl2l1発現を引き起こす。そして、RETシグナルはHSCsにクリティカル生存シグナルを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
造血は、主に胎仔肝臓（Foetal Liver (FL)）で、胚期の間に開始し、骨髄（Bone Marrow (BM)）で成人期を通じて維持される。HSCはほとんど成人期で休眠しているけれども、HSCは生理学的要求に応じて増殖性になる。興味深いことに、自律神経が最近、HSCのニッチに活発に参加するということが示され、神経栄養因子がHSC機能を調整するという仮説を提起された。神経増殖因子ファミリーは、RETチロシンキナーゼレシピエントを介してシグナルを送り、そして、自律神経系、腎臓、及び成熟リンパ球様細胞で作用する、グリア細胞株由来神経栄養因子（glial cell-line derived neurotrophic factor (GDNF)）リガンド（GFLs）を含む。
【００２０】
HSC生物学におけるGFLsの役割を決定するために、胎齢14.5日目（E14.5）のFL LinnegSca1poscKitpos（LSK）細胞中の標準レシピエントRETの発現は最初に決定され、個体群はHSC中で高濃度に濃縮された。骨髄性前駆細胞（myeloid progenitors (LinnegSca1negcKitpos) (MP)）と比較すると、LSKsは高レベルの網状赤血球、及びその補助レシピエントGfra1，Gfra2，Gfra3を発現した。この結果はまた、BM LSKs及びヒトのCD34posCD38neg臍帯血前駆体で確認された（図１ａ，図５）。著しく、網状赤血球発現は、LinnegSca1poscKitposCD150posCD48neg造血幹細胞（HSC）に限定された一方、多能性前駆体（LinnegSca1poscKitposCD150negCD48pos(MPPs)）は不十分に遺伝子を発現した（図１ｂ）。興味深いことに、Kitリガンド及びトロンボポエチン等の、HSCに主要因子を生成するFL間葉細胞及びBM骨芽細胞は、さらにHSCsでRETシグナルの未発現併発を意味する、神経栄養のRETリガンドGDNF、ニュールツリン（NRTN）、及びアルテミン（ARTN）を同時発現した（図１ｃ，図６）。
【００２１】
この仮説を精査するために、Ret9のヌル突然変異体を有するマウスが分析された。E14.5 Ret欠損前駆体は、WT同腹子コントロールと同じ比率で生成された（図１ｄ）。しかしながら、LSKの数及び胎仔肝臓細胞の総数はRet-/-胎仔でかなり減少した（図１ｅ）。減少した細胞数に関わらず、Ret-/-LSKの分化能はコロニー形成単位（colony-forming units（CFU））の正常数によって明らかにされるようにインタクト（intact）であった（図１ｆ）。さらに、CD38発現による短期LSK（short-term LSK（ST-LSK））及び長期LSK（long-term LSK（LT-LSK））へのLSK細胞の精査は、Ret欠損LT-LSKsの選択的還元を示した（図７ａ）。この以上LSK集団の遺伝的構造は、Ret-/-LSKの異常細胞周期持続状態と関連付けられた。そして、同じG1/S/G2+M画分に関わらず（図７ｂ）、代謝率はBrdU取り込みによって決定され（図１ｇ）、静止Ki-67neg G0phase LSKsは常に、Ret-/- animals動物において減少した（図１ｇ〜図１ｈ）。従って、Ret欠損はHSC数の減少をもたらす（図１ｉ）。
【００２２】
RETはまた成熟HSCに影響を及ぼすか否か試験するために、発明者等はVav1-iCreマウスに育てられたRetfl/flマウスを生成した（図８）。著しく、成熟HSCにおける低レベルなRet発現に関わらず、Ret条件付き剥離は減少した静止HSC数に導いた（図５，図８）。これらのデータは、RETが生理的欲求に対するHSC応答を調整し得るということを示した。同意のもとで、5-フルオロウラシル（5-fluorouracil（5-FU））を有する連続処理は、VavCrepos/Retwt/fl同腹子コントロールと比較すると、VavCrepos/Retnull/flマウスが5-FU処置で一瞬に死滅したことを示した。これらを基に、これらの結果は、RETが静止HSCの正常なプールの維持と造血ストレス応答に対して要求されることを示している。
【００２３】
過去、静止HSCの減少は、細胞１個当たりの造血活性不全に関連付けられた。従って、Ret-/-前駆体は、致死照射宿主への移植で減少したCFU-s潜在性を示した（図２ａ）。Retが長期HSC移植に要求されるか否かを評価するために、発明者等は生体内再増殖アッセイを実施した。著しく、同じBM及び脾臓コロニー形成能であるにも関わらず（図２ｂ）、Ret欠損前駆体は致死照射宿主をレスキューせず、１００％の宿主致死をもたらした（図２ｃ）。再構成潜在性の損失はRetヌル前駆体の運命を評価できないので、発明者等は競合移植アッセイを実施した。そして、胎児Ret-/-前駆体は、対症的な造血を提供し、宿主生存を保証する同数のWT同腹子前駆体と共に移植された（図２ｄ）。受容マウスの分析は、Ret欠損前駆体がすべての血液細胞系譜にわたり移植適応性を失っていることを示し、また、異なるドナー細胞比で移植されると、発見が確認された（図９）。これらのデータは、HSCのRETの役割を示している。従って、移植後４ヶ月のBM分析はRet欠損LSKの１分当たりの頻度で示した（図２ｇ）。連続して、発明者等は、一次レシピエントから分離された同じ数のWT及びRet-/- BM細胞を非常に感度の高い第２次競合移植アッセイを実施した（図２ｄ）。発明者等は、血液中のRet-/-細胞の１分当たりの頻度を観察し（図２ｈ〜図２ｉ）、欠陥が既にBM LSK内にあることが証明された（図２ｊ）。要するに、これらの発見は、RETが胎児LSK機能、成熟LSK機能、及び移植活性に非常に要求され、また、発見はLSK移植のRet上方調節によってサポートされている（図９ｃ）。
【００２４】
RETヌルHSCの著しい欠損は、分子レベルで研究された推定的変化を導く。上記報告は、長期HSC活性と関連した遺伝子特性を同定した。著しく、ほとんどのこれら遺伝子は有意義に修飾されない一方、Bcl2及びBcl2l1はRet欠損LSKs及びHSCsで大きく減少した（図３ａ〜図３ｂ，図１０ａ）。Bcl2及びBcl2l1の抗アポトーシス遺伝子の著しい減少は、RETがクリティカル生存シグナルをHSCsに提供し得るということを示唆している。従って、RetヌルLSKsは非常にアポトーシスの影響を受けやすく、そして、GFLsは効果的に、培養状態においてLSK及びHSC生存を増加させる（図３ｃ〜３ｅ，図１０ｂ〜図１０ｃ）。
【００２５】
神経細胞におけるRET活性は、ERK1/2、PI3K/Akt及びp38/MAPキナーゼ活性の原因となることが示され（参考文献６）、一方、転写因子CREBのリン酸化反応はBcl2遺伝子ファミリー発現を誘導し得る（参考文献１８，１９）。Ret-/- LSKsのp38/MAPキナーゼ及びCREBの分析は、これらの分子が常に低リン酸化状態であることを示し、一方、ERK1/2及びPI3K/Akt活性は、activationこれらのWTカウンターパートと比較すると、表面上変動がみられない（図３ｆ，図１０ｄ）。従って、RET活性を引き起こしたGFLは、急激なp38/MAPキナーゼ及びCREBリン酸化反応を導き、そして、一方で、ERK1/2、PI3K/Aktリン酸化反応は安定である一方、LSKsによってBcl2/Bcl2l1発現を増加させた（図３ｇ〜図３ｈ，図１０ｅ）。重要なことには、GFL活性のp38/MAPキナーゼの抑制は、低下したCREBリン酸化反応及びBcl2/Bcl2l1活性を引き起こし、一方で、ERK1/2及びPI3K/Aktの抑制はこれらの分子に有意な影響を与えなかった（図３ｉ〜図３ｊ）。最終的に、GFL活性でのCREBの抑制は、減少したBcl2/Bcl2l1レベルをもたらした（図３ｋ）。完全に、これらのデータは、RET欠損前駆体が減少したBcl2及びBcl2l1、下流の低下したp38/MAPキナーゼ、及びCREB活性を発現した。
【００２６】
Ret欠損HSCsの異常分子署名は、微小なレベルのBcl2及びBcl2l1が観察したLSK不適合性の原因になるということを示している。レトロウィルスの形質導入を用いることによって、発明者等はBcl2及びBcl2l1の発現レベルがWT Retで形質導入したRet-/-で瞬時に回復し、一方、他の署名遺伝子はRET機能のこの即時レスキューによって変動を生じないということを見出した（図４ａ）。そして、Ret-/-前駆体の適応性がRetの強制発現によって回復され得るか否かを試験するために、競合的／放射線防護の少量なCD45.1 BMとともに、pMig.Ret9.IRES.GFP又はpMig.Empty.IRES.GFPレトロウィルスで形質導入したRet欠損前駆体と競合移植アッセイを実施した（図１１ａ）。RET発現の回復は十分に、Ret-/-前駆体移植をレスキューした（図４ｂ〜図４ｄ）。著しく、RET下流標的、Bcl2又はBcl2l1、の強制発現はRetヌルLSKsの生着を回復するのに十分であった（図４ｂ〜図４ｄ）。
【００２７】
結局、これらのデータは、RETシグナルが血液細胞移植に使用され得るということを意味している。この仮説を直接試験するために、初めに発明者等はRetMEN2Bマウスを使用し、リガンドに依存したRET活性を改良した（参考文献２０）。これらの動物の初期造血前駆体は、著しく増加したCFU-s活性及び再構成潜在性を阻害した。しかしながら、RetMEN2Bと野生型マウスとの間の下流の造血前駆体と、胎児LSK数とを比較すると、違いは観察されなかった（図１１ｂ〜図１１ｆ）。このように、RETシグナルの正変調は、定常状態の造血を損なうことなく、明らかに移植に有利であった。さらに、RETシグナル軸がHSCを促進するという証拠が、生体内適合性がGFL前処理前駆体の移植によって提供された。E14.5 LSKsは、GFLs又は培地のみで処理され、競合者CD45.1 BMとともに移植された（図１１ｇ）。未処理の前駆体がこのような条件下で不十分に移植されている間、前駆体で処理されたGFLは著しく移植適合性及びHSC生着を増加した（図４ｅ〜図４ｇ）。
【００２８】
結果は、RETシグナルがBCL2ファミリーのメンバーを介してクリティカル生存シグナルを提供することによって、胎児及び成熟HSC活性を調節する重要で新規な経路であることを明らかにしている。感知可能なHSC生存欠損はBcl2欠損マウスで報告されていないけれども、造血ストレス条件はそのような欠損を明らかにし得る（参考文献２１）。また、Bcl2及びBcl2l1は、HSCsの不必要な役割を有し得、Bcl2l1又Bcl2が独立にRet欠損HSC機能をレスキューするのに十分であるということを示すデータによって概念はサポートされている（図４ｂ〜図４ｄ）。
【００２９】
造血前駆体は多数のRET補助レシピエントを発現し、そして、それぞれのレガンドに積極的に応答する（図１ａ，図３ｇ〜図３ｈ，図１０）。神経細胞とは逆に、RET補助レシピエントシグナルの遺伝子欠損（knockouts）の分析は正常なLSKの数を示すので、HSCsは汎用的で冗長な方法でGFLsを使用してもよい（図１２）。この考えに従って、リンパ系組織イニシエータ細胞は全てのRETレガンドに冗長に応答し得る。明細書に開示したデータは、神経栄養因子キューの欠損が減少したHSC生存を導き、静止LT-HSCsの可能な要件が生体内のHSC移植の顕著な欠損をもたらすということを示している。従って、RETの活性は、増加したBcl2/Bcl2l1発現、改善したHSC生存、及び生体内移植効率をもたらす。そして、RETコントロールHSCは生理的増殖要求に応答する（図１３）。これらの結果及びヒトCD34posCD38neg臍帯血前駆体のRET発現は、ヒト造血幹細胞発現及び移植治療におけるGFLsの使用を試験する新たな展開を開く。
【００３０】
最終的に、本実施形態は、造血の神経調節をサポートする。上述の技術は、神経細胞がHSC機能を間接的に調節することができることを示した。しかしながら、これにより、HSCsが神経栄養因子の直接標的であることを示し、造血・神経幹細胞が同じ生存シグナルを要求することを示している。HSCsはまた、神経栄養因子を介して自動神経機能を制御することができるか否かは、消費が分かりにくい態様のままである。しかしながら、HSC環境の神経栄養因子の存在は、さらに造血及び神経機能調節に関する研究に道を開いている。
【００３１】
［方法］
［マウス］C57BL/6J (CD45.2及びCD45.1)、Rag1-/- (CD45.2及びCD45.1)（参考文献２９）、Vav1-iCre（参考文献１１）、Gfra1-/-（参考文献２２）、Gfra2-/-（参考文献２４）、Gfra3-/-（参考文献２３）、RetMEN2B20 and Ret-/-（参考文献９）は、C57BL/6Jの遺伝的背景であった。全てのマウス系統は、IMM飼育施設で飼育及び維持された。動物処置は、国及び機構のガイドラインにより実施された。
【００３２】
［Ret条件付きノックアウトマウスの生成］
条件付きRetノックアウト対立遺伝子を持つマウスを生成するために、発明者等は初めに、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（PGK）プロモータ及びポリＡテール（pA）の制御下で、loxPが導入された2.1kbネオマイシン耐性（Neor）カセットの導入を含む標的構築物を操作した。このカセットは（PGK-NEOr-pA）は、約13kbの5’末端マウスRetゲノム遺伝子座の隣接エクソン1を保有しているpBluescript KS（pBS KS）ベクターのXhoI部位で約4.5kb上流に導入された。第２修飾は、マウスRet遺伝子座のエクソン１と２との間のイントロンのHind III部位で、エクソン１のloxP 〜2.5kb下流の挿入を含んでいた。最終的に、PGKプロモータ（PGK-TK-pA）の制御下で、ウイルスチミジンキナーゼカセット（〜3kb）は挿入されたLoxP部位の〜5kb下流のHind III部位で挿入された。相同遺伝子組換えを得るために、このような標的構築物は、Xho Iによって直線化され、そして、マウス胎児線維芽細胞（mouse embryonic fibroblast（MEF））支持細胞層で成長した129SvJ-由来 R1 ES細胞へのエレクトロポレーションの前に、Qiaquick gel extraction kit（Qiagen社製）を用いてゲル溶出及び抽出によって精製した。３００μg/mlジェネテシン（G418，Invitrogen社製）及び2μMガンシクロビル（Sigma社）による２重選択に続いて、陽性クローンがサザンブロット法によって同定された。ゲノムDNAは、Hind III制限酵素及び500bpの5’外部プローブで消化された。Hind III消化により、WT及び変異対立遺伝子はそれぞれ、16.5kbと6kbのバンドサイズを示した。陽性動物はその後、PGK-NEOr-pAカセットを除去するために、Vav1-iCreを発現する遺伝子導入マウスと交配された。このような遺伝子組換えは、loxPが導入されたRetマウスの生成をもたらし、２つの残存LoxP部位がRet遺伝子座の第１エクソン又は第１エクソンの完全除去に隣接することが見出された。これらのマウスはさらに、Ret floxed （Retfl）そしてRetヌル（Retnull）として指定されている。マウスはさらに、PCRによって選別された。プライマー配列は次の通りであった：P1: AAG CTC CCT CCT ACC GTG CT; P2: TGG GAT GAA CTC TGC CCA TT; P3: TGC TGC TCC ATA CAG ACA CA; P4: TAC ATG CTG TCT GCT CTC AG。
【００３３】
［コロニー形成単位アッセイ］5x103 E14.5 LinnegcKitpos細胞がMACS（MiltenyiBiotec社製）でWTから精製され、Ret-/-又はRetMEN2BがM3434（Stem Cell Technologies社製）中で培養され、フローサイトメトリー分析及び顕微鏡解析によって8〜10日間記録された。3x104 E14.5 LinnegcKitpos細胞がMACS（MiltenyiBiotec社製）でWTから精製され、Ret-/-又はRetMEN2Bが致死的被照射マウス（9Gy）に投与され、そして、CFUsがフローサイトメトリー分析及び顕微鏡解析によって8〜10日間記録された。ホーミングアッセイは、CMTMRでラベルされたE14.5 LinnegcKitpos細胞を使用して行われ、致死的被照射マウスに投与された。フローサイトメトリー分析は注射20h後、実施された。
【００３４】
［移植実験］胎仔肝臓を用いる再構成実験のために、1x105E14.5 LinnegcKitpos細胞がMACSでWTから精製され、Ret-/-又はRetMEN2Bが致死的被照射Rag1-/- CD45.1マウスに単独又は（１：１比率で）直接競合して投与された。３：１比率に対して、1.5x105 WT CD45.1/CD45.2細胞は0.5x105 Ret-/-CD45.2細胞と同時注入し；１：３比率に対して、0.5x105 WT CD45.1/CD45.2細胞は1.5x105Ret-/- CD45.2細胞と同時注入した。補助的再構成実験として、2.5x105の各遺伝子型の骨髄細胞が一次レシピエントから選別されたFACSであり、致死的被照射Rag1-/- CD45.1マウスに直接競合して投与された。
【００３５】
［生体内移植のレスキュー］E14.5 LinnegcKitpos WT又はRet-/-細胞は、Ret9、Bcl2又はBcl2l1を含むpMig.IRES-GFPレトロウイルス・ベクターで一晩形質導入され、GFPpos細胞がFACS選別され、致死的被照射マウスに投与された。6〜8週間後形質導入BM LinnegCD45.2posGFPposは、フローサイトメトリーによって精製され、105細胞が致死的被照射レシピエントに放射線防護線量の105CD45.1 BM細胞と同時注入した。
【００３６】
［フローサイトメトリー］胎仔肝臓は顕微解剖され、70μmの細胞株に均質化された。骨髄細胞は、骨をフラッシングする又は粉砕することによって採取された。細胞懸濁液は、eBioscience社製の、anti-CD117 (cKit) (2B8)、anti-Ly-6A/E (Sca-1) (D7)、anti-CD16/32 (FcRγII/III) (93)、anti-CD3 (eBio500A2)、anti-CD150 (mShad150)、anti-CD48 (HM48-1)、anti-CD19 (eBio1D3)、anti-CD11b (M1/70)、anti-Ly-6G (Gr-1) (RB6-8C5)、anti-Ly79 (TER119)、anti-NK1.1 (PK136)、anti-CD11c (N418)、anti-CD45.1 (A20)、anti-CD45.2 (104)、anti-CD54 (ICAM-1) (YN1/1.7.4)、anti-CD34 (RAM34)、anti-CD51 (RMV-7)、及び、anti-CD41 (eBioMWReg30)；BioLegend社の、anti-CD38 (90)、anti-CD3 (145-2C11)、anti-CD34 (HM34)、及び、anti-CD31 (390)；Abcam社製のanti-Ly6C (HK1.4)；BD Pharmingen社製のAnnexin Vで染色した。分化系列カクテル（Lineage cocktail）は、胎仔肝臓用のanti-CD3, anti-CD19, anti-Ly-6G, anti-Ly6C, anti-Ly79, anti-NK1.1, anti-CD11cと、成熟骨髄細胞用のanti-CD11bとを含む。ヒト臍帯血は、Histopaque（Sigma社製）で分離した後、CD34 MicroBead Kit（Miltenyi Biotec社製）を用いてCD34pos細胞を濃縮し、anti-human CD34 (AC136) (Miltenyi Biotec社製)及びanti-human CD38 (HIT2) (eBioscience社製)で染色した。サンプルはFACSAria I又はFACSAria IIIで選別され、FACSCanto又はLSRFortessa (BD社製)で分析された。フローサイトメトリーデータはFlowJo 8.8.7 software (Tree Star社製)で分析された。
【００３７】
［細胞周期分析及び細胞内染色］細胞内染色（Intracellular stainings）は、BD Pharmingen社製の、BrdU Flow Kit and anti-BrdU (3D4)、7AAD、anti-Ki-67 (B56)、anti-S6 (pS235/pS236) (N7-548)、及び、anti-Akt (pT308) (JI-223.371)；R&D Systems社製のanti-human RET (132507)；Echelon Biosciences社製のanti-PIP3 (Z-P345)；Cell Signaling Technology社製のanti-CREB (pS133) (87G3)、anti-p38 (pT180/Y182) (28B10)、anti-Akt (pS473) (D9E)、及び、anti-ERK1/2 (pT202/pY204) (D13.14.4E)を使用して行われた。
【００３８】
［造血前駆体の生体内培養］106 E14.5 WT LinnegcKitpos細胞がDMEMで培養され、2時間飢餓状態にされた。GFL刺激でCREBリン酸化反応を試験するために、LinnegcKitpos細胞が500ng/mlの各GFL及びコレセプターで1時間刺激した。LSK細胞はフローサイトメトリーで精製され、Bcl2及びBcl2l1の発現レベルを決定するためにGFL/GFRαの組合せで一晩刺激した。阻害実験のために、CREBリン酸化反応を試験するために、又は、GFLsで一晩刺激中に、Bcl2及びBcl2l1の発現レベルを決定するために、Sigma-Aldrich社製のSB 202190及びPD98,059、又は、Calbiochem社製のAkt1/2、Akt Inhibitor VIII及びCBP-CREB Interaction Inhibitorを用いて、細胞がGFL刺激の前に2時間培養された。LinnegcKitpos細胞は120時間 GFL/GFRαで刺激され、2.5x105 CD45.2posLinnegcKitpos細胞は連続してフローサイトメトリーで分析され、致死的被照射宿主に放射線防護線量の2.5x105 CD45.1 BM細胞を移植した。アネキシンVを検出するために、ウェル（well）ごとの4x104E14.5 WT又はRet-/- Linnegckitpos細胞がDMEM中で一晩、単独で又はGFL/GFRαを用いて培養された。フローサイトメトリーで分析されると、造血前駆体はさらにLSK抗体カクテルで染色された。
【００３９】
［リアルタイムPCR分析］RNAは、RNeasy Mini Kit又はRNeasy Micro Kit (Qiagen社製)を用いて、細胞懸濁液から抽出された。Ret、Gfra1、Gfra2及びGfra3のリアルタイムPCRは、上述したように行われた（参考文献５，３０）。Hprt1は、ハウスキーピング遺伝子として使用された。TaqMan assays（Applied Biosystems社製）のために、RNAはHigh Capacity RNA-to-cDNA Kit（Applied Biosystems社製）を用いてレトロトランスクリプション（retro-transcribed：逆転写）を行い、続いてTaqMan PreAmp Master Mix（Applied Biosystems社製）を用いて前置増幅（pre-amplification）を行った。TaqMan Gene Expression Master Mix（Applied Biosystems社製）は、リアルタイムPCRで使用された。Applied Biosystems社から購入したTaqMan Gene Expression Assaysは、以下の通りである。
Gapdh Mm99999915_g1; Hprt1 Mm00446968_m1; Gusb Mm00446953_m1; Mpl Mm00440310_m1; Mcl1Mm00725832_s1; Meis1 Mm00487664_m1; Angpt1 Mm00456503_m1; Eya1 Mm00438796_m1; Eya2 Mm00802562_m1; Egr1Mm00656724_m1; Tek Mm00443243_m1; Slamf1 Mm00443316_m1; Lef1 Mm00550265_m1; Thy1 Mm00493681_m1; Mllt3Mm00466169_m1; Hoxa5 Mm00439362_m1; Hoxa9 Mm00439364_m1; Hoxc4 Mm00442838_m1; Pbx3 Mm00479413_m1; Ndn Mm02524479_s1; Evi1Mm00514814_m1; Mll1 Mm01179213_g1; Hlf Mm00723157_m1; Cxcr4 Mm01292123_m1; Smo Mm01162710_m1; Igf2r Mm00439576_m1; Cdkn1a Mm00432448_m1; Notch1 Mm00435249_m1; Kitl Mm00442972_m1; Thpo Mm00437040_m1; Bcl2l1Mm00437783_m1; Bcl2 Mm00477631_m1; persephin(PSPN) Mm00436009_g1; ARTNMm00507845_m1; NRTN Mm03024002_m1; GDNF Mm00599849_m1; Ret Mm00436304_m1。
HSCシグネチュー遺伝子アレイのために、遺伝子発現レベルはGapdh、Hprt1、及びGusbに正規化された。HSC刺激後のBcl2/Bcl2l1、及び、生体内伝達後のRet発現レベルのために、遺伝子発現レベルはGapdh及びHprt1に正規化された。
【００４０】
［統計］統計分析は、Microsoft Excel（登録商標）を用いて行われた。分散はF検定を用いて分析された。スチューデントt検定が等分散性を有する母集団で行われ、Welchの補正を有するスチューデントt検定が異なる分散を有するサンプルに適用された。カプラン・マイヤー生存曲線が対数順位検定を用いて分析された。
【００４１】
［結果］
RETアゴニストは、補助タンパク質（補助レシピエント）を用いてRETレシピエントに結合するタンパク質（リガンド）を自然に生じる。ヒト及びマウスにおいて、GDNF、NRTN、ARTN及びPSPNという４種類のRETのリガンドが存在し、それらの各々が特定の補助レシピエント（それぞれ順に、GFRα1、GFRα2、GFRα3及びGFRα4）を有する。RETアゴニストはRETレシピエントに結合し、そして、レシピエントは活性になり、細胞にシグナルを提供する。
【００４２】
以下の結果は、HSC発現及び移植でRETシグナル機能を示している。この点は、マウスの血液システムの開発におけるRETレシピエントの役割、特に造血幹細胞、培養アッセイ及び生体内モデルを用いる造血幹細胞（HSCs）の機能への影響ということである。
−KIT及びFLT3等の現在の発現プロトコルに使用される他の分子経路に反して、RETは生体内（図１ｄ）又は体外（図１ｆ）での分化に影響を与えないが、HSC数を調節する（図１ｅ、図１ｉ）。
−RETは、生存促進性の遺伝子、Bcl2及びBcl2l1の約４分の１のRET欠損細胞発現として、HSC生存に重要であり（図３ｂ）、培養液中で正常細胞の２倍死滅する（図３ｃ；図１０ｂ）。重要なことには、RETレガンドで培養された正常細胞が通常の培地を用いたよりも約３倍良好に生存する（図３ｄ〜図３ｅ；図１０ｃ）。
−RETシグナルは、胎児RET欠損細胞が事実上、移植能力を有さないので、HSC移植効率を決定する（図２ｃ）。著しく、正常細胞と競合して移植されると、発明者等は移植効率を定量化し得る。発明者等はRET欠損HSCsが血液中で１０分の１の細胞と、骨髄中でHSCsを生成する（図２ｅ〜図２ｇ）。著しく、ＲＥＴ欠損期限由来の成熟骨髄細胞は二次移植で正常細胞の約５０分の１の移植能力を有する（図２ｈ〜図２ｊ）。
−RETシグナルは培養中にHSC発現を制御する。RETレガンドの存在により、HSC発現は通常培地のみを用いた場合よりも３倍大きい（図３ｄ）。重要なことには、RET処置済増幅HSCsはまた、通常の培地でのHSCs増幅を比較すると、移植効率を約３００倍に増加させる（図４ｅ〜図４ｇ）。RETアゴニストを含む増幅及び移植プロトコルはともに、通常の培地と比較して、約１０００倍まで移植効率を増加する。
【００４３】
本実施形態は、生物医学研究と臨床診療に使用されるために、造血幹細胞の増幅及び移植プロトコルに利用され得る。
【００４４】
RETアゴニストを用いる通常の培養条件の補充は、発現プロトコルで回復された細胞の数を増加させるために使用され得る。移植でのHSCsの使用はかなり、これらの細胞の制限された増幅によってかなり制約される。現在の細胞培養技術は、特に臍帯血がソースとして使用される場合、不十分な幹細胞量をもたらす。現在の通常の培地と比較すると、造血前駆体を緩やかに増幅させるだけでなく、分化も引き起こし、RETアゴニストを使用する発明者等の処方は回復した細胞の数を２倍にする。さらに、RETアゴニスト処置は細胞の分化を変化させず、増幅培養から回復した真性HSCsを３倍にできる（図３ｄ）。最も重要なこととして、通常条件のHSCs増幅と比較して、RETリガンドによる増幅HSCsが約３００倍移植効率を増加させる。従って、RETアゴニストを含む、組み合わせた増幅及び移植プロトコルは通常のプロトコルと比較して約１０００倍まで移植効率を増加させる。
【００４５】
従って、RETの活性は、マウスにおける、向上したHSC生存／増幅と、生体内移植効率とをもたらす。現在の最新の増幅方法と比較すると、これらの実験は、神経栄養因子を有するHSC増幅が、幹細胞性を維持する真実のHSCsを２０倍増加させるということを示している。
【００４６】
要するに、発明者等の技術は、臨床用及び研究開発用の用途に対するHSCsの適用性を有意に向上させ得る。
【００４７】
［参考文献］
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【図１Ａ】
2015522273.tif 000002
【図１Ｂ】
2015522273.tif 000003
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年2月14日(2014.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血幹細胞の増幅プロトコル及び移植治療において、幹細胞の維持、増幅、又は移植の調節剤として使用するためのチロシンキナーゼレシピエントアゴニスト分子。
【請求項２】
請求項１記載のチロシンキナーゼレシピエントアゴニスト分子であって、
前記チロシンキナーゼレシピエントアゴニストは、グリア細胞株由来神経栄養因子、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、又は、それらの混合物からなる一群から選択されることを特徴とする、チロシンキナーゼレシピエントアゴニスト分子。
【請求項３】
請求項１又は２記載のチロシンキナーゼレシピエントアゴニスト分子であって、
前記造血幹細胞は幹細胞性を維持することを特徴とする、チロシンキナーゼレシピエントアゴニスト分子。
【請求項４】
造血幹細胞移植治療によって改善可能又は予防可能な病気の治療に使用するための、チロシンキナーゼレシピエントアゴニスト分子。
【請求項５】
造血幹細胞の細胞培養培地と、少なくとも１つのチロシンキナーゼレシピエントアゴニストとを備える、造血幹細胞の維持、増幅、又は、移植のためのキットであって、
前記チロシンキナーゼレシピエントアゴニストは、グリア細胞株由来神経栄養因子、ニュールツリン、アルテミン、パーセフィン、又は、それらの混合物からなる一群から選択されることを特徴とするキット。
【請求項６】
請求項５記載のキットであって、
造血幹細胞の維持のためのプロトコルに使用されるキット。
【請求項７】
請求項５記載のキットであって、
造血幹細胞の増幅のためのプロトコルに使用されるキット。
【請求項８】
請求項５記載のキットであって、
造血幹細胞の移植のためのプロトコルに使用されるキット。
【国際調査報告】
2015522273.tif 000021
2015522273.tif 000022