(57)【要約】本発明は、単一細胞と所定数、通常は１つの均質配列タグを含む反応器を形成することによって集団の個々の細胞に対して測定を行う方法を提供する。一態様では、本発明は、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）反応を行って、同定する核酸配列、例えば、均質配列タグに由来する配列タグのコピーを目的の他の細胞核酸に結合して融合産物を形成することによってこのような集団の個々の細胞に対してマルチパラメータ測定を行う方法を提供する。次いで、集団の細胞についてのマルチパラメータデータを作成するためにこのようなＰＣＡ反応の融合産物をシークエンシングして表にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
集団の単一細胞の複数の標的核酸を分析する方法であって、
複数の反応器を提供するステップであって、各反応器が前記集団の１つの単一細胞と１つの単一均質配列タグを増幅混合物中に含み、前記増幅混合物が、前記複数の標的核酸の各々を増幅するための一対のプライマーを含む、ステップ；
前記均質配列タグから増幅可能な配列タグを提供するステップ；
前記標的核酸および前記増幅可能な配列タグを増幅して、配列タグを含むアンプリコンを作製するステップ；および
前記反応器からの前記アンプリコンをシークエンシングして、前記アンプリコンに取り込まれた配列タグによって前記集団からの各細胞の標的核酸を同定するステップを含む、方法。
【請求項２】
前記増幅するステップが、ポリメラーゼ連鎖反応によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記増幅可能な配列タグを提供するステップが、前記均質配列タグから前記増幅可能な配列タグを遊離させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記増幅可能な配列タグを遊離させるステップが、熱安定性制限エンドヌクレアーゼによって前記均質配列タグから前記増幅可能な配列タグを切断することによって行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記増幅可能な配列タグのそれぞれが、配列タグ付きプライマーである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記増幅可能な配列タグのそれぞれが、プライマー結合部位に挟まれた配列タグであり、前記増幅混合物が、前記増幅可能な配列タグをＰＣＲで増幅することができる一対のプライマーをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記増幅可能な配列タグを提供するステップが、前記増幅可能な配列タグをＥＸＰＡＲによって作製するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記均質配列タグが、複数の配列タグ付きプライマーを含むローリングサークルアンプリコンである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記均質配列タグが、複数の配列タグ付きプライマーが取り付けられたビーズである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記反応器が、エマルションのミセルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ミセルが、マイクロ流体デバイスで形成される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ミセルが、変動係数が３０％以下の体積分布を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記単一細胞の前記集団が、同じサンプルに由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記増幅するステップの前に、前記単一細胞を前記反応器のそれぞれで溶解するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記均質配列タグが、ランダムゲノムセグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記均質配列タグが、ランダムトランスクリプトームセグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
集団の各細胞の複数の標的核酸を分析する方法であって：
複数の反応器を提供するステップであって、各反応器が１つの単一細胞と１つの単一の均質配列タグをポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）反応混合物中に含み、前記均質配列タグが、少なくとも１つの配列タグ付きプライマーを含み、前記ＰＣＡ反応混合物が、一対の外側プライマー、および前記複数の標的核酸に特異的な一対以上の連結プライマーを含み、前記外側プライマーおよび前記連結プライマーの少なくとも一方が、前記均質配列タグの配列タグ付きプライマーである、ステップ；
前記均質配列タグが前記配列タグ付きプライマーを遊離または形成し、かつ前記標的核酸と前記配列タグ付きプライマーとの融合産物が前記反応器で形成されるように、ＰＣＡ反応を前記反応器で行うステップ；および
前記反応器からの前記融合産物をシークエンシングして、前記集団の各細胞の標的核酸を同定するステップを含む、方法。
【請求項１８】
前記複数の反応器が、油中水型エマルションの水性ミセルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記油中水型エマルションが、マイクロ流体デバイスによって形成される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記標的核酸が、トランスクリプトームの転写物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記均質配列タグが、複数の配列タグ付きプライマーが取り付けられたビーズである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
前記増幅するステップの前に、前記単一細胞を前記反応器のそれぞれで溶解するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
集団の単一細胞の複数の標的核酸を分析する方法であって：
複数の反応器を提供するステップであって、各反応器が前記集団の１つの細胞、第１の均質配列タグ、および第２の均質配列タグを増幅混合物中に含み、前記増幅混合物が、前記複数の標的核酸の各々を増幅するための一対のプライマーを含む、ステップ；
前記標的核酸の鎖の５’末端にフラップ構造が形成されるように、ヘルパーオリゴヌクレオチドの存在下で、前記均質配列タグから増幅可能な配列タグを提供するステップ；
前記フラップ構造をフラップエンドヌクレアーゼで切断して、前記標的核酸の鎖に、増幅可能な配列タグにライゲーション可能な５’末端を提供するステップ；
前記増幅可能な配列タグを、前記標的核酸の鎖のライゲーション可能な５’末端にライゲーションするステップ；
前記各核酸の鎖および前記増幅可能な配列タグを増幅して、配列タグを含むアンプリコンを作製するステップ；および
前記反応器からの前記アンプリコンをシークエンシングして、前記アンプリコンに取り込まれた配列タグによって前記集団からの各細胞の標的核酸を同定するステップを含む、方法。
【請求項２４】
前記複数の反応器が、油中水型エマルションの水性ミセルである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記油中水型エマルションが、マイクロ流体デバイスによって形成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的核酸が、トランスクリプトームの転写物である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記均質配列タグが、複数の配列タグ付きプライマーが取り付けられたビーズである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記増幅するステップの前に、前記単一細胞を前記反応器のそれぞれで溶解するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列タグを用いる単一細胞分析に関する。
【背景技術】
【０００２】
サイトメトリーは、様々な医療および研究の分野で不可欠な重要な役割を果たす。画像ベースのフローサイトメトリーは、細胞の計数ならびに細胞の物理特性および分子特性の測定のためにこれらの分野で広く使用されている（例えば、非特許文献１）。特に、フローサイトメトリーは、集団およびその亜集団についての統計的に信頼できる情報の取得を可能にする、集団の多数の個々の細胞についての多数のパラメータを迅速に測定するための強力な技術である。この技術は、様々な疾患、特に血液関連疾患、例えば、造血性癌およびＨＩＶなどの検出および管理で以前から重要である（例えば、非特許文献２、非特許文献３）。この有用性に反して、フローサイトメトリーには、希少な細胞の検出における限定された感度、（例えば、非特許文献４）；同時に実際に測定できる細胞パラメータ数の制限；および高価な器具類を含め、多くの欠点がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００３】
【非特許文献１】シャピロ（Ｓｈａｐｉｒｏ）著、プラクティカル・フローサイトメトリー（Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）、第４版（ワイリー−リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）、２００３年）
【非特許文献２】ヴォイチェフ（Ｗｏｉｊｃｉｅｃｈ）著、フローサイトメトリー・イン・ネオプラスティック・ヘマトロジー（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ）、第２版（インフォーマ・ヘルスケア（Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、２０１０年）
【非特許文献３】ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら著、クリニカル・ケミストリー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２０００年、第４６巻、第８（Ｂ）号、ｐ．１２２１〜１２２９
【非特許文献４】カンパーナ（Ｃａｍｐａｎａ）ら著、ヘマトロジー／オンコロジー・クリニックス・オブ・ノースアメリカ（Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．）、２００９年、第２３巻、第５号、ｐ．１０８３〜１０９８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
上記を考慮して、現在のサイトメトリー法の欠点を解消した、多数の個々の細胞に対してマルチパラメータの測定を行うための利用可能な代替の方法およびシステムが存在すると、様々な医療および研究の分野にとって有利であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、集団の個々の細胞の標的核酸のマルチパラメータ測定を、このような核酸とユニークな配列タグとの１つ以上の融合産物を各細胞に対して形成することによって行う方法に関する。本発明の態様は、一部が以下および本明細書全体に亘って要約されている多数の実施および適用例に例示されている。
【０００６】
一態様では、本発明は、集団の単一細胞の複数の標的核酸を分析する方法を含み、この方法は：（ａ）複数の反応器を提供するステップであって、各反応器が集団の１つの単一細胞と１つの単一均質配列タグを増幅混合物中に含み、この増幅混合物が、複数の標的核酸の各々を増幅するための一対のプライマーを含む、ステップ；（ｂ）均質配列タグから
増幅可能な配列タグを形成するステップ；（ｃ）標的核酸および増幅可能な配列タグを増幅して、配列タグを含むアンプリコンを作製するステップ；および（ｄ）反応器からのアンプリコンをシークエンシングして、このアンプリコンに取り込まれた配列タグによって集団からの各細胞の標的核酸を同定するステップを含む。一部の実施形態では、この方法は、増幅するステップの前に、単一細胞を反応器で溶解するステップをさらに含む。さらなる実施形態では、反応器は、マイクロ流体デバイスによって形成される油中水型ミセルである。なおさらなる実施形態では、本発明のミセルは、均一なサイズ分布を有し；例えば、一部の実施形態では、ミセルは、変動係数が３０％以下の体積分布を有する。
【０００７】
本発明のこれらの上記特徴付けられた態様、および他の態様は、一部が図面に示され添付の特許請求の範囲で特徴付けられる多数の例示的な実施および適用例に例示される。しかしながら、上記の概要は、本発明の各例示された実施形態または全ての実施を説明することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】本発明の方法の一実施形態のステップを例示する図。
【図１Ｂ】本発明の一実施形態からの単一細胞の分析から得たデータを例示する図。
【図１Ｃ】均質配列タグの様々な実施形態を例示する図。
【図１Ｄ】均質配列タグの様々な実施形態を例示する図。
【図１Ｅ】均質配列タグの様々な実施形態を例示する図。
【図１Ｆ】均質配列タグの様々な実施形態を例示する図。
【図１Ｇ】ビーズ形態の均質配列タグから配列タグ付きプライマーを遊離させる酵素的方法を例示する図。
【図１Ｈ】リガーゼおよびフラップエンドヌクレアーゼを用いて配列タグ付きプライマー結合部位に標的核酸を取り付ける方法を例示する図。
【図１Ｉ】図１Ｈに例示されている反応の構成要素を例示する図。
【図１Ｊ】ユニークな配列タグが標的ポリヌクレオチドの各末端に取り付けられる一実施形態を例示する図。
【図１Ｋ】細胞と均質配列タグの両方を含むミセルを濃縮するためのマイクロ流体デバイスを図式的に例示する図。
【図２Ａ】内側プライマーの対が相補的な尾部を有する、標的配列を連結するためのＰＣＡスキームを例示する図。
【図２Ｂ】内側プライマーの対が相補的な尾部を有する、標的配列を連結するためのＰＣＡスキームを例示する図。
【図２Ｃ】内側プライマーの対が相補的な尾部を有する、標的配列を連結するためのＰＣＡスキームを例示する図。
【図３Ａ】内側プライマーの各対の一方のプライマーのみが標的配列の末端に相補的な尾部を有する、標的配列を連結するためのＰＣＡスキームを例示する図。
【図３Ｂ】内側プライマーの各対の一方のプライマーのみが標的配列の末端に相補的な尾部を有する、標的配列を連結するためのＰＣＡスキームを例示する図。
【図３Ｃ】内側プライマーの各対の一方のプライマーのみが標的配列の末端に相補的な尾部を有する、標的配列を連結するためのＰＣＡスキームを例示する図。
【図４Ａ】内側プライマーの対が相補的な尾部を有し、外側プライマーが、ＰＣＲによって構築される産物の連続増幅のための尾部を有する、標的配列を連結するためのＰＣＡスキームを例示する図。
【図４Ｂ】内側プライマーの対が相補的な尾部を有し、外側プライマーが、ＰＣＲによって構築される産物の連続増幅のための尾部を有する、標的配列を連結するためのＰＣＡスキームを例示する図。
【図４Ｃ】内側プライマーの対が相補的な尾部を有し、外側プライマーが、ＰＣＲによって構築される産物の連続増幅のための尾部を有する、標的配列を連結するためのＰＣＡスキームを例示する図。
【図５Ａ】標的配列のマルチプレックス方式での対構築を例示する図。
【図５Ｂ】標的配列のマルチプレックス方式での対構築を例示する図。
【図５Ｃ】標的配列のマルチプレックス方式での対構築を例示する図。
【図５Ｄ】標的配列のマルチプレックス方式での対構築を例示する図。
【図５Ｅ】標的配列のマルチプレックス方式での対構築を例示する図。
【図５Ｆ】標的配列のマルチプレックス方式での対構築を例示する図。
【図６Ａ】３つの配列を互いに連結するためにＰＣＡを用いる方法を例示する図。
【図６Ｂ】３つの配列を互いに連結するためにＰＣＡを用いる方法を例示する図。
【図６Ｃ】３つの配列を互いに連結するためにＰＣＡを用いる方法を例示する図。
【図６Ｄ】３つの配列を互いに連結するためにＰＣＡを用いる方法を例示する図。
【図６Ｅ】３つの配列を互いに連結するためにＰＣＡを用いる方法を例示する図。
【図７】細胞のゲノムＤＮＡのランダムセグメントから均質配列タグを作製する一実施形態を例示する図。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
本発明の実施は、特段の記載がない限り、当業者の技術の範囲内である有機化学、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、および生化学の従来の技術および記述を利用することができる。このような従来の技術としては、限定されるものではないが、血液細胞のサンプリングおよび分析、ならびに核酸のシークエンシングおよび分析などが挙げられる。適切な技術の特定の例示では、以下の例を参照しなければならないことがある。しかしながら、他の同等の従来の手順も、もちろん使用することができる。このような従来の技術および記述は、標準的な実習マニュアル、例えば、ゲノム解析（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）：実習マニュアルシリーズ（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ
Ｓｅｒｉｅｓ）（第Ｉ巻〜第ＩＶ巻）；ＰＣＲプライマー（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ）：実習マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）；および分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実習マニュアル（Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）（全て、コールド・スプリング・ハーバ研究所の出版局（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）から）：およびオーズベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）編、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ジョン・ワイリー＆サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ）、電子版および印刷版）などで確認することができる。
【００１０】
本発明は、集団の個々の細胞または粒子の複数の核酸を分析する方法を提供する。一態様では、個々の細胞または粒子の核酸に対して反応を行って、ユニークな配列タグを目的の１つ以上の細胞核酸に結合し、次いで、配列タグと標的核酸とのコンジュゲート（本明細書では「融合産物」と呼ばれる）を、高スループットの核酸シークエンシングによって分析する。即ち、核酸が分析される各細胞または粒子は、ユニークな配列タグを受け取り、この配列タグにより、核酸を同定することができるとともに、他の細胞からの核酸と区別することができる。このような結合の産物、即ち、上述のコンジュゲートは、本明細書では「融合産物」と呼ばれる。融合産物が形成されたら、集団の各細胞または粒子についてのデータ、特にマルチパラメータデータを作成するために融合産物をシークエンシングして表にする。このようなデータは、遺伝子発現データ、１つ以上の所定のゲノム配列（例えば、癌遺伝子）の存在もしくは非存在についてのデータ、遺伝子コピー数のデータ、またはこれらの組み合わせを含み得る。一部の実施形態では、このようなデータは、特に、遺伝子発現データ、例えば、細胞の細胞質から抽出されたメッセンジャーＲＮＡに由来する遺伝子発現データを含む。分析される細胞としては、血球、組織から分離された細胞、単細胞生物、または循環腫瘍細胞などを挙げることができる。分析される粒子としては、細胞小器官、エキソソーム、小胞、または微小胞などを挙げることができる。一実施形
態では、分析されるべき細胞および／または粒子は、同じサンプルまたは同じ生物学的起源、例えば、（例として）患者の組織サンプルに由来する。他の実施形態では、分析されるべき細胞および／または粒子は、サンプルの混合物としても良いし、または複数の生物学的起源としても良い。一部の実施形態では、本発明の方法によって分析される細胞は、細胞壁が存在しない。他の実施形態では、本発明の方法によって分析される細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。
【００１１】
一部の実施形態では、単一の配列タグが、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）反応によって複数の標的核酸に取り付けられる。他の実施形態では、１つの配列タグが、各標的核酸に取り付けられる。図１Ａは、本発明の一実施形態の概要を示している。細胞（１００）が、ＰＣＡ反応混合物中で複数の均質配列タグ（１０２）と混合され、次いで、ＰＣＡ反応混合物が、小さな反応単位（ボリューム）に分割され、これは、多くのそうした単位の各々が１つの細胞と１つの均質配列タグとを含むように分割される。このような分割は、以下により詳細に説明される様々な方法で行うことができる。一部の実施形態では、分割は、例えば（１１０）などのミセルが単一細胞反応器として機能する油中水型エマルション（１２６）を形成することによって達成される。例えばミセル（１０８）および（１１０）などのミセルの部分は、１つの細胞と１つの均質配列タグを含む。このようなミセルでは、標的核酸は、均質配列タグによってユニークに標識される。以下により詳細に論じられるように、均質配列タグは、様々な形態を有することができる。図１Ａの実施形態では、均質配列タグ（１０２）は、配列タグ付きプライマーのコピーを含むローリングサークル増幅反応の産物、即ち、ＲＣＡアンプリコンである。拡大部（１０５）は、１つの標準ＲＣＡアンプリコンにおける配列タグを二進数として表している。一実施形態では、このような配列タグ付きプライマーは、線状オリゴヌクレオチドであり、それぞれの線状オリゴヌクレオチドは、その５’末端のプライマー結合部位、３’末端の標的特異的配列、およびこれらの間に挟まれた配列タグを含む（例えば、図１Ｃに一実施形態として例示されている）。このようなＰＣＡ試薬は、ＰＣＡ反応における内側プライマーまたは外側プライマーとすることができる。別の実施形態では、プライマーとするのではなく、均質配列タグ（１０２）の配列タグを含む要素を、ＰＣＡ反応における標的核酸として取り扱うことができる。即ち、セグメント（１５４）は、遺伝子座特異的ではなく、共通プライマーまたは連結プライマーに特異的にして、ＰＣＡ反応で細胞標的核酸と共に増幅されるようにすることができ、これにより、少なくとも１つの配列タグを含む融合産物が得られる。
【００１２】
各細胞は、目的の様々な核酸（１０４）、即ち、標的核酸を有し、かつ／または発現し、この標的核酸は、文字「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、および「ｗ」で表され、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、または発現遺伝子などであり得る。ＲＮＡ標的核酸は、典型的には、例えば、テコット（Ｔｅｃｏｔｔ）らによる米国特許第５，１６８，０３８号明細書に開示されているように、従来の試薬および技術を用いる逆転写反応によってＤＮＡに転換される。本発明によると、細胞（１００）が、単一細胞反応器に入れられ（１０６）、この細胞反応器が、この例では油中水型エマルション（１２６）のミセルとして例示されているが、様々な単一細胞反応器を使用することができ、このような単一細胞反応器には、限定されるものではないが、以下により詳細に説明される、ナノリットル量のウェルのアレイを備えたプレート、およびマイクロ流体デバイスなどが含まれる。一態様では、単一細胞エマルション（１２６）は、マイクロ流体エマルション形成装置、例えば、ゼン（Ｚｅｎｇ）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．）、２０１０年、第８２巻、ｐ．３１８３〜３１９０などに開示されているようなマイクロ流体エマルション形成装置を用いて形成される。
【００１３】
単一細胞反応器（例えば、エマルションのミセル（１２６））は、例えば、核酸ポリメラーゼ、外側プライマーおよび連結プライマー（以下により詳細に説明される）、ヌクレ
オシド三リン酸、および緩衝液などを含み得るＰＣＡ反応混合物を含む。一部の実施形態では、ＰＣＡ反応混合物は、１種以上の細胞溶解試薬を含むこともでき、このような試薬は、標的核酸へのアクセスをより容易にすることができる。細胞および均質配列タグを含む各反応器、例えば、（１１０）では、ＰＣＡ反応（１１２）は、一対以上の配列を含み得る融合産物（１１４）を生成し、各対の一方の要素は、配列タグであり、他方の要素は、目的の核酸、例えば、発現遺伝子または癌遺伝子などである。他の実施形態では、融合産物は、トリプレットまたはそれ以上に連結された配列を含み得る。一部の実施形態では、単一種の融合産物を各細胞（または反応器毎）で形成することができる、または複数の異なる種の融合産物を各細胞（または各反応器毎）で形成することができる。このような複数は、２〜１０００、２〜２００、２〜１００、または２〜２０の範囲とすることができる。一実施形態では、このような複数は、２〜１０の範囲とすることができる。一部の実施形態では、少なくとも１つの配列タグが、このような複数のものに含まれることを理解されたい。
【００１４】
ＰＣＡ反応（１１２）の完了後、エマルション（１２６）が破壊され、融合産物（１１４）が単離される（１１６）。融合産物（１１４）は、配列タグ（１０３）と標的核酸（１２８）とのコンジュゲート（１１８）として図１に示されている。限定されるものではないが、カラムクロマトグラフィー、エタノール沈殿、ビオチン化プライマー使用後の親和性精製、またはゲル電気泳動法などを含む、様々な従来の方法を使用して融合産物（１１４）を単離することができる。ＰＣＡ反応（１１２）の一部として、または単離（１１６）後に、例えば、照射を利用するシークエンシング用のＰ５およびＰ７プライマーを用いるシークエンシング（１２０）のために、必要に応じて追加の配列を融合産物（１１４）に追加することができる。シークエンシングは、従来の高スループット器具（１２２）、例えば、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘ（イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）、サンディエゴ）などを用いて行うことができる。器具（１２２）からのデータを、様々な方法で分析して表示することができる（１２４）。一実施形態では、標的核酸が、選択された遺伝子発現産物、例えば、ｍＲＮＡである場合、プロット（１３０）によって例示されているように、フローサイトメトリーデータと同様の方式で、集団全体または亜集団について選択された遺伝子の細胞毎の発現レベルを表示するプロットを作成することができる。各細胞は、ユニークな配列タグに関連付けられており、こうしたユニークな配列タグは、細胞存在量に比例して細胞内で発現される遺伝子に対してＰＣＡ反応によって連結されている。従って、特定のクローン型配列に連結された発現遺伝子配列の数を計数することにより、特定の配列タグに関連付けられた細胞におけるこのような遺伝子の発現の指標が得られる。図１Ｂのプロット（１３０）に例示されているように、細胞の３つの亜集団が、遺伝子ｗおよび遺伝子ａの発現レベルに基づいた別個のクラスター（１３２、１３４、および１３６）の存在によって示されている。一部の実施形態では、遺伝子発現レベルが監視されるときは常に、少なくとも１つの遺伝子が、他の遺伝子の発現測定値を正規化するための内部標準として選択される。
【００１５】
分割された細胞サンプルのための均質配列タグ
均質配列タグは、複数の同一の配列タグを含む試薬であるか、または既定の反応条件下で複数の同一の配列タグを作製できる試薬である。均質配列タグは、限定されるものではないが、（ｉ）同じ配列タグの反復コピーを含むローリングサークル増幅（ＲＣＡ：ｒｏｌｌｉｎｇ  ｃｉｒｃｌｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）アンプリコン、（ｉｉ）ビーズ固定配列タグ、および（ｉｉｉ）自己複製配列タグなどを含む様々な形態を有することができる。均質配列タグの共通の特性は、このようなタグが、同じ配列タグの複数のコピーを遊離または作製できる１つの分子または粒子実体を含んでいることである。均質配列タグは、１つの細胞と１つのユニークな試薬（例えば、ＰＣＲまたはＰＣＡ反応用の配列タグ付きプライマー）を含む反応器を作製する際に有用である。この条件は、反応混合物中の細胞と均質配列タグの濃度を適切に調整して、この反応混合物を、分割された単位（
ボリューム）の部分がそれぞれ１つの細胞と１つの均質配列タグを含むように複数の小さな単位（ボリューム）に分割することによって達成することができる。一部の実施形態では、これは、以下により詳細に説明されるように、油中水型エマルション中で水性ミセルを形成することによって達成される。一部の実施形態では、複数の均質配列タグの形態を一緒に利用することができる。
【００１６】
図１Ｃおよび図１Ｄは、ＲＣＡアンプリコンに基づいた２つの例示的な均質配列タグを示している。両方の例では、均質配列タグによって遊離される末端試薬は、ＰＣＡ反応で使用される配列タグ付きプライマーである。図１Ｃでは、ＲＣＡアンプリコン（１４６）は、従来の技術、例えば、ファイアー（Ｆｉｒｅ）らによる米国特許第５，６４８，２４５号明細書（参照により本明細書に組み入れられる）を用いて作製され、かつ配列タグ付きプライマー（１４８）ならびに逆相補的ステムセグメント（１５１）および（１５３）を有する反復単位（１４９）を含むように設計されている。一部の実施形態では、配列タグ付きプライマー（１４８）は、３つのセグメント：（ｉ）連結配列（５’セグメントがＰＣＡにおける内側プライマーである場合の標的ポリヌクレオチドを連結するための以下に記載されるような）または共通プライマー配列（例えば、５’セグメントがＰＣＡにおける外側プライマーである場合）を含む５’セグメント（１５０）、（ｉｉ）配列タグ（１５２）、および（ｉｉｉ）ポリメラーゼ伸長が起こり得るように標的ポリヌクレオチドにアニーリングするための遺伝子座特異的セグメントまたはプライマーを含む。ＲＣＡアンプリコン（１４６）の作製後、ステムセグメント（１５１）および（１５３）が、ＲＣＡアンプリコン（１４６）を切断してループ（１５７）の配列タグ付きプライマーを遊離させるための制限エンドヌクレアーゼ認識部位を含む二本鎖ステム（１５５）を形成するように、条件が調整される。ＲＣＡアンプリコンと制限エンドヌクレアーゼとが結合しても消化が始まらないように、試薬が低温、例えば、室温で結合することができ、かつ温度を酵素の最適切断温度に上昇させることによって切断を開始できるように、制限エンドヌクレアーゼを、熱安定性制限エンドヌクレアーゼまたはニッカーゼから選択することができる。例示的な熱安定性制限エンドヌクレアーゼとしては、Ｂｓｐ  ＱＩ（ニュー・イングランド・バイオラボ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）より入手可能）が挙げられる。切断（１５８）後、配列タグ付きプライマー（１６０）が遊離する。
【００１７】
図１Ｄでは、ＲＣＡアンプリコン（１６１）が、従来の技術を用いて作製される。セグメント（１６１）および（１６３）が、これらの間に配列タグ付きプライマー（１６５）を挟んでいる。セグメント（１６１）および（１６３）に相補的な領域を含むオリゴヌクレオチド（１６２）が追加されると、制限エンドヌクレアーゼ部位を含む二重鎖（１６７）が形成される。制限エンドヌクレアーゼおよび部位の位置は、切断（１６８）時に配列タグ付きプライマー（１７０）が遊離するように選択される。上記のように、ＲＣＡアンプリコンおよび酵素を、（例えば、エマルションの形成中に）消化が起きない低温で結合させ、次いで、温度を上昇させて（例えば、エマルションのミセル内で）配列タグ付きプライマーの消化および遊離を開始できるように、熱安定性制限エンドヌクレアーゼおよび／またはニッカーゼを使用することができる。
【００１８】
図１Ｅでは、均質配列タグは、ポリメラーゼ伸長反応とニッカーゼ反応（等温性指数関数的増幅反応またはＥＸＰＡＲ）とが組み合わせられた反応で配列タグ付きプライマーを形成する核酸構造を構成する。ＥＸＰＡＲは、参照により本明細書に組み入れられるヴァン・ネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）らによる米国特許第７，１１２，４２３号明細書に開示されている。ＥＸＰＡＲ核酸構造（１７１）は、二本鎖ＤＮＡ部分（１７７）（オリゴヌクレオチド（１７５）をセグメント（１７４）にアニーリングさせることによって形成される）および（１７５）の３’末端からのポリメラーゼ伸長の鋳型として機能する一本鎖部分（１７２）を含む。二本鎖部分（１７７）内に、セグメント（１７２）と（１７４）との間の境界でポリメラーゼ伸長に切れ目を入れるように配置されたニッカーゼ部位が存在
する。従って、適切な緩衝液（１７８）中でｄＮＴＰと共にポリメラーゼおよびニッカーゼ活性が存在すると、配列タグ付きプライマー（１８０）が連続的に作製される。
【００１９】
均質配列タグは、図１Ｆおよび図１Ｇに例示されているように、ビーズをベースとすることもできる。この実施形態では、同一の配列タグ付きプライマーは、単一細胞反応器が形成された後に化学的または酵素的に遊離され得るように、ビーズ上で合成される。一態様では、配列タグ付きプライマーは、従来の化学、例えば、ホスホラミダイト化学を用いて化学的にビーズ上で合成される。配列タグの同一（例えばクローン）の集団を有するビーズは、配列タグ付きプライマーの配列タグ部分の従来のスプリットおよびミックス合成によって形成される。例えば、ヤン（Ｙａｎｇ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００２年、第３０巻、第２３号、ｐ．ｅｌ３２。図１Ｆは、化学的に合成された均質配列タグの一実施形態を例示している。この図では、見やすくするために１本の鎖しか固体支持体（１０００）に取り付けられていないが、完全に取り付けられたビーズであると理解されたい。固体支持体（１０００）のサイズおよび組成ならびにリンカー（１００２）の選択は、適用例に一部依存する設計上の選択である。この実施形態では、配列タグ付きプライマー（１０１１）は、固体支持体（１０００）の基端側の３’末端（１００１）から始まる次の要素を含む：制限エンドヌクレアーゼ部位の一本鎖を含むセグメント（１００４）；標的核酸に特異的なプライマーを含むセグメント（１００６）；配列タグ（１００８）；およびタグ付き標的ポリヌクレオチドを増幅するための共通プライマーのプライマー結合部位を含むセグメント（１０１０）。図１Ｇに示されているように、一実施形態では、セグメント（１００４）に相補的なオリゴヌクレオチド（１０１６）は、二重鎖（１０１８）の形成を可能にする条件下で、反応器に入れる前に反応混合物中で固体支持体（１０００）に結合される（１０１２）。二重鎖（１０１８）は、温度上昇時に活性化される制限エンドヌクレアーゼの制限部位を含む。当業者には、二重鎖（１０１８）の配列の組成および長さが、配列タグ付きプライマー（１０１１）を固体支持体（１０００）から切断するために使用される熱安定性制限エンドヌクレアーゼの作用する温度に依存することは明らかであろう。制限酵素を活性化させるための温度が上昇すると（１０１４）、二重鎖（１０１８）を有する取り付けられた配列タグ付きプライマー（１０１１）が、固体支持体（１０００）から切断され、これにより、機能性配列タグ付きプライマー（１０１１）が遊離する。制限エンドヌクレアーゼの切断特性によっては、配列タグ付きプライマー（１０１１）の３’末端を、標的ポリヌクレオチドに相補的であるように選択することができる（例えば、ＩＩｓ型酵素ＢｓｐＱＩがこのような選択を可能にする）。他の制限酵素では、配列タグ付きプライマーの３’末端を、標的核酸に特異的なアダプタープライマーの５’尾部に特異的とすることができる。
【００２０】
ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）反応の形式
ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｙｃｌｉｎｇ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）反応（連結ＰＣＲと呼ばれることもある）では、断片アニーリングおよびポリメラーゼ伸長の１回以上のサイクルにおいて、複数の核酸断片を互いに融合して１つの融合産物を形成することが可能である。例えば、ション（Ｘｉｏｎｇ）ら著、ＦＥＢＳマイクロバイオロジー・リビュー（ＦＥＢＳ  Ｍｉｃｒｏ  ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．）、２００８年、第３２巻、ｐ．５２２〜５４０。ＰＣＡ反応には多数の形式がある。目的の一形式では、ＰＣＡは、共通の反応単位（ボリューム）で行われる複数のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）を含み、各構成要素ＰＣＲは、少なくとも１つの連結プライマーを含み、この連結プライマーにより、得られるアンプリコンの鎖が、反応中に別のアンプリコンの鎖にアニーリングし、伸長されて融合産物または融合産物の前駆体を形成することができる。様々な形式（および様々な代替の名称）のＰＣＡは、断片構築および遺伝子合成のための周知の方法であり、このうちのいくつかの形式は、以下に説明され、それぞれ参照により本明細書に組み入れ
られる次の参照文献に記載されている：ヨン（Ｙｏｎ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９８９年、第１７巻、ｐ．４８９５；ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）らによる米国特許第５，９２８，９０５号明細書；チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）、１９９４年、第１１６巻、ｐ．８７９９〜８８００；ステマー（Ｓｔｅｍｍｅｒ）ら著、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９９５年、第１６４巻、ｐ．４９〜５３；フーバー（Ｈｏｏｖｅｒ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００２年、第３０巻、第１０号、ｐ．ｅ４３；ション（Ｘｉｏｎｇ）ら著、バイオテクノロジー・アドナンシス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ）、２００８年、第２６巻、ｐ．１２１〜１３４；およびション（Ｘｉｏｎｇ）ら著、ＦＥＢＳマイクロバイオロジー・リビュー（ＦＥＢＳ  Ｍｉｃｒｏ  ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．）、２００８年、第３２巻、ｐ．５２２〜５４０など。
【００２１】
特定のＰＣＡ反応条件は、特定の実施形態によって様々であり得、かつ当業者にとってのルーチンの設計上の選択を含み得る。例示的なＰＣＡ反応条件は、次の条件を含み得る：１０μＬの１０×緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００ｍＭのＫＣ１、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、および０．０１％のゼラチン）と混合された３９．４μＬの蒸留水、各ｄＮＴＰの２μＬの１０ｍＭの溶液、０．５μＬのＴａｑポリメラーゼ（５単位／μＬ）、１μＬの各外側プライマー（１００μＭのストック液から）、および１０μＬの各内側プライマー（０．１μＭのストック液から）。典型的には、ＰＣＡ反応では、外側プライマーの濃度は、最初の形成後にも融合産物の増幅が続くように、内側プライマーの濃度よりも高い。例えば、２つの標的核酸を融合するための一実施形態では、外側プライマーの濃度は、内側プライマーの濃度の約１０〜１００倍とすることができ、例えば、外側プライマーを１μＭ、内側プライマーを０．０１μＭとすることができる。そうでない場合は、ＰＣＡ反応は、ＰＣＲの構成要素を含み得る。
【００２２】
本発明に有用な一部のＰＣＡの形式が、図２Ａ〜図２Ｃ、図３Ａ〜図３Ｃ、図４Ａ〜図４Ｃ、図５Ａ〜図５Ｄ、および図６Ａ〜図６Ｅに示されている。図２Ａ〜図２Ｃは、２つの別個の断片Ａ’（２０８）およびＢ’（２１０）を接合して１つの融合産物（２２２）にする例示的なＰＣＡスキーム（「スキーム１」）を例示している。断片Ａ’（２０８）は、プライマー（２００）および（２０２）を用いて増幅され、断片Ｂ’（２１０）は、同じＰＣＲ混合物中でプライマー（２０６）および（２０４）を用いて増幅される。プライマー（２００）および（２０６）は、ＰＣＡ反応の「外側」プライマーであり、プライマー（２０２）および（２０４）は、ＰＣＡ反応の「内側」プライマーである。内側プライマー（２０２）および（２０４）はそれぞれ、Ａ’またはＢ’に相補的でない尾部（それぞれ２０３および２０５）（または、Ａ’およびＢ’が長い配列に組み込まれたセグメントであるの場合には、隣接する配列）を有する。尾部（２０３）および（２０５）は、互いに相補的である。一般に、このような内側プライマー尾部は、（他ではなく）その対応する内側プライマーに対する選択的ハイブリダイゼーションのために選択されるが；そうではない場合は、このような尾部は、長さおよび配列が大きく異なり得る。一態様では、このような尾部は、８〜３０ヌクレオチドの範囲の長さ；または１４〜２４ヌクレオチドの範囲の長さを有する。ＰＣＲが進行すると（２１２）、尾部（２０３）および（２０５）をそれぞれ領域（２１４）および（２１６）に取り込んだ産物断片Ａ（２１５）およびＢ（２１７）が形成される。ＰＣＲ中に、産物断片Ａ（２１５）およびＢ（２１７）が変性し、Ａの「上」鎖（２１５ａ）の一部が、Ｂの下鎖（２１７ｂ）にアニーリングし、３’末端が伸長されて（２１９）、融合産物Ａ−Ｂ（２２２）を形成する（２２０）。融合産物Ａ−Ｂ（２２２）は、過剰な外側プライマー（２００）および（２０６）によってさらに増幅することができる。一部の実施形態では、尾部（２０３）および（２０５）から形成された融合産物（２２２）の領域は、後の分析、例えば、高スループットシークエ
ンシングに使用される１つ以上のプライマー結合部位を含み得る。
【００２３】
スキーム１の変形が、スキーム１（ａ）として図３Ａ〜図３Ｃに例示されている。上記のように、断片Ａ（３００）は、プライマー（３０４）および（３０６）を用いて増幅され、断片Ｂ’（３０２）は、共通の反応混合物中で行われるＰＣＲでプライマー（３０８）および（３１２）を用いて増幅される。外側プライマー（３０４）および（３１２）は、上記のように利用され、内側プライマー（３０８）は尾部（３１０）を有するが；尾部（３１０）は、プライマー（３０６）に対応する尾部に相補的である代わりに、断片Ａの末端のセグメント（即ち、プライマー（３０６）が相補的である同じセグメント）に相補的である。ＰＣＲは、断片ＡおよびＢを作製し（３１５）、Ｂは、プライマー（３０８）の尾部（３１０）によって形成されたセグメント（３１６）が追加されたＢ’（３０２）と同一である。上記のように、温度サイクルが進むと（特に、内側プライマーが使い尽くされると）、断片Ａの上部断片が、断片Ｂの下部断片にアニーリングし（３１８）、伸長されて融合産物Ａ−Ｂ（３２０）を形成し、この融合産物Ａ−Ｂを、プライマー（３０４）および（３１２）を用いてさらに増幅することができる。
【００２４】
本発明に使用できるＰＣＡの別の実施形態（「スキーム２」）が図４Ａ〜図４Ｃに例示されている。この実施形態は、図２Ａ〜図２Ｃの実施形態に類似しているが、外側プライマー（４０４）および（４１４）がそれぞれ、尾部（４０８）および（４１８）を有し、これにより、所定のプライマーでの融合産物のさらなる増幅が可能である点が異なる。以下により詳細に説明されるように、この実施形態は、マルチプレックス増幅に適している。断片Ａ’（４００）は、尾部（４０８）および尾部（４１０）をそれぞれ有するプライマー（４０４）およびプライマー（４０６）を用いて増幅されて断片Ａを形成する。また、断片Ｂ’（４０２）は、尾部（４１６）および尾部（４１８）をそれぞれ有するプライマー（４１２）およびプライマー（４１４）を用いて増幅されて断片Ｂを形成する（４２０）。内側プライマー（４０６および４１２）の尾部（４１０および４１６）は、互いに相補的（４１５）であるように選択される。断片ＡおよびＢの末端は、尾部（４０８、４１０、４１６、および４１８）のそれぞれによって形成されたセグメント（４２２、４２４、４２６、および４２８）によって増補されている。前述の実施形態と同様に、断片Ａの上鎖が、断片Ｂの下鎖にアニーリングし（４３０）、伸長されて（４３２）融合産物Ａ−Ｂ（４３６）を形成し（４３４）、この融合産物Ａ−Ｂ（４３６）を、プライマー（４０４および４１４）と同じであるが尾部を有していないプライマー（４３８および４４０）を用いてさらに増幅することができる（４３７）。
【００２５】
上述のように、図４Ａ〜図４Ｃの実施形態は、図５Ａ〜図５Ｄに例示されているマルチプレックスＰＣＡ反応で使用することができる。これらの断片Ａ’（５０１）、Ｂ’（５０２）、Ｃ’（５０３）、およびＤ’（５０４）が、断片Ａ’用のプライマーセット（５０６および５０８）、断片Ｂ’用のプライマーセット（５１４および５１６）、断片Ｃ’用のプライマーセット（５２２および５２４）、および断片Ｄ’用のプライマーセット（５３０および５３２）を用いて共通の反応混合物中で、ＰＣＲで増幅される。全てのプライマーは尾部を有する：外側プライマー（５０６、５１６、５２２、および５３２）はそれぞれ、断片の増幅および続く融合産物の増幅の両方を可能にする尾部（５１２、５２０、５２６、および５３６）をそれぞれ有する。尾部（５１２）および（５２０）の配列はそれぞれ、尾部（５２６）および（５３６）の配列と同じでも良いし、異なっていても良い。一実施形態では、尾部（５１２、５２０、５２６、および５３６）の配列は同じである。内側プライマーの尾部（５１８および５１０）は、互いに相補的であり（５１１）；同様に、内側プライマーの尾部（５２８および５３４）も、互いに相補的である（５１３）。上記ＰＣＲは、断片Ａ（５４１）、Ｂ（５４２）、Ｃ（５４３）、およびＤ（５４４）を形成し、これらの断片は、さらに互いにアニーリングして（５４６）、複合体（５４８および５５０）を形成し、これらの複合体がそれぞれ伸長されて融合産物Ａ−Ｂ（５５
２）およびＣ−Ｄ（５５４）を形成する。
【００２６】
図５Ｅおよび図５Ｆは、上記の実施形態の一般化を例示しており、ここでは、複数の異なる標的核酸（５６０）Ａ１’、Ａ２’、．．．ＡＫ’が、同一の標的核酸Ｘ’（５６２）に連結されて複数の融合産物Ｘ−Ａ１、Ｘ−Ａ２、．．．Ｘ−ＡＫ（５６６）を形成している（５６４）。この実施形態は、標的核酸Ｘが、リンパ球の組換え配列のセグメントである場合に特に興味深く、この標的核酸Ｘを、この標的核酸Ｘが由来するリンパ球のタグとして使用することができる。一態様では、Ｘは、クローン型、例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞のいずれかのＶ（Ｄ）Ｊ領域のセグメントである。一実施形態では、複数の標的核酸Ａ１、Ａ２、．．．ＡＫが、その起源の細胞のクローン型に融合される。別の実施形態では、このような複数は２〜１０００であり；別の実施形態では、このような複数は２〜１００であり；別の実施形態では、このような複数は２〜１０である。これらの実施形態のＰＣＡ反応では、内側プライマー（５６８）の濃度は、Ａｉアンプリコンの多数の鎖とアニーリングする十分な量のＸアンプリコンが存在するように、様々なＡｉ核酸の内側プライマーの濃度よりも高くすることができる。融合産物（５６６）は、反応混合物から抽出されて（例えば、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）などが販売する従来の二本鎖ＤＮＡ精製技術によって）シークエンシングされる。外側プライマーの配列は、シークエンシングシステム、例えば、ゲノムアナライザー（Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）（イルミナ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）、カリフォルニア州サンディエゴ）のさらなる操作なしでも、クラスターの形成に直接使用できるように選択することができる。一態様では、Ｘは、（リンパ球の）クローン型であっても良いし、または配列タグを含んでも良く、Ａ１、Ａ２、．．．ＡＫは、目的の特定の遺伝子または転写物とすることができる。融合産物のシークエンシングの後、細胞毎の遺伝子発現レベルを表にし、かつ／または図１Ｂに示されているようにプロットすることができる。
【００２７】
複数の２者融合産物を同時に形成するという並列方向（パラレルセンス）のマルチプレックスＰＣＡ反応に加えて、図６Ａ〜図６Ｅに例示されているように、ＰＣＡ反応は、マルチサブユニット融合産物を構築する直列方向（シリアルセンス）のマルチプレックスであり得る。図６Ａに示されているように、断片Ａ’（６０１）、Ｂ’（６０２）、およびＣ’（６０３）が、Ａ’用のプライマーセット（６０６および６０８）、Ｂ’用のプライマーセット（６１０および６１２）、およびＣ’用のプライマーセット（６１４および６１６）を用いて共通のＰＣＲ混合物中で増幅される。全てのプライマーは尾部を有する：（ｉ）外側プライマー（６０６および６１６）の尾部（６２０および６３０）は、外側断片Ａ’およびＣ’の増幅用、および図６Ｅに示されている３者融合産物Ａ−Ｂ−Ｃ（６６２）のさらなる増幅用に選択され；（ｉｉ）内側プライマー（６０８および６１０）の尾部（６２２および６２４）は互いに相補的であり；かつ（ｉｉｉ）内側プライマー（６１４および６１２）の尾部（６２８および６２６）は互いに相補的である。ＰＣＲは、断片Ａ（６４１）、Ｂ（６４２）、およびＣ（６４３）を形成し（６３２）、これらの断片は、この反応でセグメントＬＳ１およびＬＳ２をそれぞれ含む複合体（６４６および６４８）を形成し（６４４）、これらの複合体は、伸長されて融合産物Ａ−Ｂ（６５２）およびＢ−Ｃ（６５４）を形成する（６５０）。これらの融合産物は、変性され、共通のＢ断片（６５６）によって互いに交差アニーリングして（６５８）複合体を形成し、この複合体が伸長されて（６６０）、融合産物Ａ−Ｂ−Ｃ（６６２）を形成する。
【００２８】
フラップエンドヌクレアーゼ反応を用いる融合産物の形成
一部の実施形態では、配列タグおよび標的核酸を含む融合産物を、図１Ｉに例示されているフラップエンドヌクレアーゼ反応を用いて形成することができる。反応器が１つの細胞と１つの均質配列タグを用いて形成されたら、分子（１１０２）が各反応器で形成されるように条件が調整される（例えば、昇温してタグ遊離エンドヌクレアーゼを活性化させる）。各分子（１１０２）は、プライマー結合部位（１１０１）、配列タグ（１１０３）
（反応器に対してユニーク）、およびセグメント（１１０５）を含む。セグメント（１１０５）は、オリゴヌクレオチド（１１０４）にアニーリングすることができ、これらオリゴヌクレオチドの各々は、標的ポリヌクレオチド（例えば（１１０７））に特異的な部分（１１０９）を含む。オリゴヌクレオチド（１１０４）は、本明細書では「ヘルパーオリゴヌクレオチド」と呼ばれる。均質配列タグからの分子（１１０２）の遊離により、分子（１１０２）、オリゴヌクレオチド（１１０４）、および標的核酸（１１０７）を含むフラップ構造（１１１１）が形成される。条件は、フラップエンドヌクレアーゼの存在下で、フラップ構造（１１１１）が切断されて、標的核酸（１１０７）の５’部分（１１１３）が遊離し、フラップ構造（１１１１）の分子（１１０２）の３’末端にライゲーションすることができる（１１１４）末端が残るように選択される。ライゲーション（１１１４）時に、融合産物（１１１５）が形成され、この融合産物を、プライマー結合部位（１１０１）に特異的なプライマー（１１０６）および標的核酸の選択された部位に特異的なプライマー（１１０８）の存在下でＰＣＲを行うことによって増幅することができる（１１１６）。
【００２９】
図１Ｉは、図１Ｈに例示されている実施形態の試薬を示している。反応の一部として形成される全てのミセルに共通の試薬には、（ｉ）配列タグを含む分子（１１２２）（図１Ｈでは１１０２とも呼ばれる）のプライマー結合部位（１１０１）に特異的なプライマー（１１１７）、（ｉｉ）均質配列タグから遊離し、かつ反応器に対してユニークな配列タグ（１１０３）を含む分子（１１２２）、（ｉｉｉ）それぞれの異なる標的核酸のフラップ構造（１１１１）を形成するために標的核酸に特異的な５’部分（１１０９）および分子（１１２２）の部分（１１０５）に特異的な３’部分をそれぞれ含むオリゴヌクレオチド（１１１８）（図１Ｉのｏ１、ｏ２、．．．ｏＫであり、図１Ｈではまとめて１１０４、またはヘルパーオリゴヌクレオチドとも呼ばれる）、および（ｉｖ）標的核酸特異的プライマー（１１１９）（図１Ｉのｐ１、ｐ２、．．．ｐＫであり、図１Ｈではまとめて（１１０８）とも呼ばれる）が含まれる。
【００３０】
上記の反応を行うためのフラップエンドヌクレアーゼは、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる次の参照文献に開示されている：米国特許第６，２５５，０８１号明細書；マツイ（Ｍａｔｓｕｉ）ら著、ザ・ジャーナル・オブ・バイロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９９９年、第２７４巻、第２６号、ｐ．１８２９７〜１８３０９；オリバー（Ｏｌｉｖｉｅｒ）著、ミューテーション・リサーチ（Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００５年、第５７３巻、ｐ．１０３〜１１０；フォース（Ｆｏｒｓ）ら著、ファーマコゲノミクス（Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）、１９９９年、第９巻、第１号、ｐ．３７〜４７など。
【００３１】
一態様では、上記の実施形態は、次のステップを用いて行うことができる：（ａ）複数の反応器を提供するステップであって、各反応器が増幅混合物中に集団の１つの単一細胞、第１の均質配列タグ、および第２の均質配列タグを含み、この増幅混合物が、複数の各標的核酸を増幅するための一対のプライマーを含む、ステップ；（ｂ）フラップ構造が標的核酸の鎖の５’末端を形成するように、ヘルパーオリゴヌクレオチドの存在下で均質配列タグから増幅可能な配列タグを形成するステップであって、各フラップ構造のヘルパーオリゴヌクレオチドが、標的核酸の鎖に相補的な５’部分および増幅可能な配列タグまたはその産物に相補的な３’部分を含む、ステップ；（ｃ）フラップ構造をフラップエンドヌクレアーゼを用いて切断して、増幅可能な配列タグにライゲーション可能な５’末端を標的核酸の鎖に形成するステップ；（ｄ）増幅可能な配列タグを、各フラップ構造の標的核酸の鎖のライゲーション可能な５’末端にライゲーションするステップ；（ｅ）各標的核酸の鎖および増幅可能な配列タグを増幅して、配列タグを含むアンプリコンを作製するステップ；および（ｆ）反応器からのアンプリコンをシークエンシングして、このアンプリコンに組み込まれた配列タグによって集団から各細胞の標的核酸を同定するステップ。
【００３２】
均質配列タグとしてのランダムゲノムセグメント
一部の実施形態では、均質配列タグは、同定されるべき細胞のゲノムＤＮＡのランダムセグメント、および同定されるべき細胞のトランスクリプトームのランダムセグメントを含む。一部の実施形態では、「トランスクリプトーム」とは、細胞に存在する転写物の全セットのことであり；一部の実施形態では、「トランスクリプトーム」とは、細胞の細胞質に存在する転写物の全セットのことである。一部の実施形態では、ＲＮＡトランスクリプトームは、逆転写酵素によってトランスクリプトームを逆転写するステップによってＤＮＡに変換される。さらなる実施形態では、このようなランダムセグメントは、中断パリンドローム認識配列を有する制限エンドヌクレアーゼのサブセットによる細胞ＤＮＡの消化によって形成される。このサブセットの酵素は、本明細書では「部位切除」制限エンドヌクレアーゼと呼ばれ、これらは、次の特性によって特徴付けられる：（ｉ）中断パリンドローム認識配列、（ｉｉ）一方がこの認識配列の上流であり、他方がこの認識配列の下流である２つの切除部位、および（ｉｉｉ）認識部位を含む規定長さの切除配列の形成。例示的な部位切除制限エンドヌクレアーゼは次の通りである。
【００３３】
【表１】
2015523087.tif 000002
【００３４】
平衡（７００）が分子の環状状態（７０２）と線状状態（７１４）との間に存在するように、認識部位（７０６）を認識する制限エンドヌクレアーゼ活性およびリガーゼ活性とともに環状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）（７０２）が提供される（図７）。従って、環状ｄｓＤＮＡ（７０２）が１つのコピーで形成される場合は常に、環状ｄｓＤＮＡ（７０２）は、環状の形態（７０２）または線状の形態（７１４）のいずれかで存在する。エンドヌクレアーゼ活性（７１０）は、環状ｄｓＤＮＡ（７０２）を切断して線状ｄｓＤＮＡ分子（７１４）を形成し、ライゲーション活性（７１２）は、末端（７１３）と（７１５）との間のリン酸ジエステル結合の再形成を触媒する。本発明のこの実施形態によると、反応混合物中の環状ｄｓＤＮＡ（７０２）は、反応器（例えば、エマルション中のミセル）の一部の各反応器が１つの環状ｄｓＤＮＡ（７０２）のみを含むような濃度で反応器に供給される。環状ｄｓＤＮＡ（７０２）は、プライマー結合部位（７０４）および（７０５）、ならびに任意選択の第２の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（７０６）を含み、この第２の制限エンドヌクレアーゼ認識部位は、例えば、後の増幅用の構築物（７１８）を線状化するための熱安定性エンドヌクレアーゼが認識することができる。同じ反応器で、細胞ＤＮＡ（７２５）が、部位切除制限エンドヌクレアーゼ（７２６）で消化されて、可変長の鎖（不図示）および切除産物（７２７）が形成される。インキュベーション後、環状ｄｓＤＮＡ（７０２）からのＤＮＡおよび配列タグとして機能するランダム断片（７２８）を含む環状ＤＮＡ産物（７１８）が形成される。制限部位（７０８）による環状ｄｓＤＮＡの消化（７３０）後、得られる線状構築物は、例えば、プライマー結合部位（７０４）および（７０５）に特異的な共通プライマー（７３２）および（７３４）を用いて、上記のようにＰＣＡ反応によって目的の標的ポリヌクレオチドにコンジュゲートすることが
できる。
【００３５】
反応器毎に複数の配列タグ
一部の実施形態では、２つ以上の配列タグを、１つの細胞を含む反応器で使用することができる。例えば、一部の実施形態では、それぞれが第１の均質配列タグおよび第２の均質配列タグを含む反応器またはミセルを選択することができる。第１の均質配列タグは、二本鎖標的核酸の一方の鎖に取り付けられる配列タグを遊離させ、第２の均質配列タグは、二本鎖標的核酸の他方の鎖に取り付けられる配列タグを遊離させる。このような実施形態は、上記のようにＰＣＲまたはフラップエンドヌクレアーゼ反応に基づくことができる。例えば、図１Ｊは、フラップエンドヌクレアーゼ反応を利用する２つの配列タグの実施形態を例示している。第１の均質配列タグおよび１つの細胞を有するミセルの部分（例えば、１２３１）、第２の均質配列タグおよび１つの細胞を有するミセルの部分（例えば、１２３３）、ならびに第１および第２の均質配列タグおよび１つの細胞を有するミセルの部分（例えば、１２３５）を含むエマルション（１２３０）が形成される。第１および第２の均質配列タグを含むミセル（１２３５）の１つの標的核酸（１２１８）のフラップエンドヌクレアーゼ反応（１２３２）が以下に例示される。条件は、標的核酸（１２１８）が、鎖Ｓｉ（１２２０）とその相補体Ｓｉ’（１２２１）に変性し、次いで、両鎖が、それらの対応する反応要素に結合して、第１のフラップ構造（１２２４）および第２のフラップ構造（１２２６）を形成するように選択される。フラップエンドヌクレアーゼおよびリガーゼの存在下で、ユニークな配列タグ（１２２５）が、鎖Ｓｉ（１２２０）に取り付けられ、異なるユニークな配列タグ（１２２７）が、その相補体Ｓｉ’（１２２１）に取り付けられる。得られる融合産物は、ＰＣＲでさらに増幅することができる（１２４０）。
【００３６】
単一細胞分析
上述のように、本発明の一態様では、集団からの細胞は、１つの細胞をそれぞれ含む反応器に入れられる。これは、当技術分野で公知の様々なラージスケール単一細胞反応器プラットフォームによって達成することができる。例えば、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる、クラーク（Ｃｌａｒｋｅ）らによる米国特許出願公開第２０１０／０２５５４７１号明細書；マチス（Ｍａｔｈｉｅｓ）らによる米国特許出願公開第２０１０／０２８５９７５号明細書；エド（Ｅｄｄ）らによる米国特許出願公開第２０１０／００２１９８４号明細書；コルストン（Ｃｏｌｓｔｏｎ）らによる米国特許出願公開第２０１０／０１７３３９４号明細書；ラブ（Ｌｏｖｅ）らによる国際公開第２００９／１４５９２５号パンフレット；ムラグチ（Ｍｕｒａｇｕｃｈｉ）らによる米国特許出願公開第２００９／０１８１８５９号明細書；ノバク（Ｎｏｖａｋ）ら著、アンゲヴァンテ・ケミー・インターナショナル・エディション（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．）、２０１１年、第５０巻、ｐ．３９０〜３９５；およびチェン（Ｃｈｅｎ）ら著、バイオメド・マイクロデバイセズ（Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｄｅｖｉｃｅｓ）、２００９年、第１１巻、ｐ．１２２３〜１２３１など。一態様では、細胞は、例えばＰＣＡ反応などの反応が行われるマイクロアレイのウェルに入れられ；別の態様では、細胞は、油中水型エマルションのミセルに入れられ、ミセルが反応器として機能する。例えば、マチス（Ｍａｔｈｉｅｓ）ら（前掲）またはエド（Ｅｄｄ）ら（前掲）の、マイクロ流体デバイスによって形成されるミセル反応器は、バルク乳化プロセスでのミセルよりも細胞に対するせん断および応力が低い均一なサイズのミセルを形成できるため特に興味深い。ミセル中で増幅反応、例えば、ＰＣＲを行うことを含む、乳化の組成物および技術は、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる次の参照文献に見られる：ベッカー（Ｂｅｃｈｅｒ）著、「エマルション：理論と実践（Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、２００１年）；グリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）およびタウフィック（Ｔａｗｆｉｋ）による米国特許第６，４８９，１０３号明細書；タウフィック（Ｔａｗｆ
ｉｋ）およびグリフィス（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ）著、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９９８年、第１６巻、ｐ．６５２〜６５６；ナカノ（Ｎａｋａｎｏ）ら著、ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、２００３年、第１０２巻、ｐ．１１７〜１２４；ドレスマン（Ｄｒｅｓｓｍａｎ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、２００３年、第１００巻、ｐ．８８１７〜８８２２；ドレスマン（Ｄｒｅｓｓｍａｎ）らによる米国特許第８，０４８，６２７号明細書；ベルカ（Ｂｅｒｋａ）らによる米国特許第７，８４２，４５７号明細書および同第８，０１２，６９０号明細書；ディール（Ｄｉｅｈｌ）ら著、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２００６年、第３巻、ｐ．５５１〜５５９；ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ら著、ネイチャー・メソッズ（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）、２００６年、第３巻、ｐ．５４５〜５５０；ゼン（Ｚｅｎｇ）ら著、アナリティカル・ケミストリー（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２０１０年、第８２巻、第８号、ｐ．３１８３〜３１９０；およびミセルラＤＮＡエマルション＆精製キット説明書（Ｍｉｃｅｌｌｕｌａ  ＤＮＡ
Ｅｍｕｌｓｉｏｎ＆Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）（ＥＵＲｘ、グダニスク、ポーランド、２０１１年）など。一実施形態では、均質配列タグ（例えば、ビーズ）と反応混合物との混合物を、生体適合性油（例えば、軽油、シグマ（Ｓｉｇｍａ））の回転混合物に滴下して乳化させることができる。別の実施形態では、均質配列タグおよび反応混合物を、生体適合性油の交差流に滴下する。使用される油に、１種以上の生体適合性乳化安定剤を追加することができる。これらの乳化安定剤としては、Ａｔｌｏｘ４９１２、Ｓｐａｎ８０、および他の認知されている市販の適切な安定剤を挙げることができる。一部の実施形態では、エマルションは、例えば、少なくとも９４℃、少なくとも９５℃、または少なくとも９６℃の熱サイクルを可能にする熱安定性である。好ましくは、形成される小滴は、約５ミクロン（μｍ）〜約５００ミクロン、より好ましくは約１０ミクロン〜約３５０ミクロン、さらに好ましくは約５０ミクロン〜２５０ミクロン、最も好ましくは約１００ミクロン〜約２００ミクロンの範囲である。有利なことに、交差流流体混合により、小滴形成および小滴サイズの均一化の制御が可能である。
【００３７】
一部の実施形態では、反応器内で利用可能な試薬が、同様に増幅された標的核酸および配列タグをもたらすように、均一な体積分布を有するミセルが形成される。即ち、大きく変動する反応器の体積、例えば、ミセルの体積により、増幅の失敗および／または非常に様々な程度の増幅となり得る。このような失敗および変動は、集団の個々の細胞における標的核酸、例えば、遺伝子発現の差異の定量比較の困難さを妨げ、または増大させるであろう。一態様では、変動係数（ＣＶ）が３０％以下の体積分布を有するミセルが形成される。一部の実施形態では、ミセルは、ＣＶが２０％以下の体積分布を有する。
【００３８】
サンプルの細胞および均質配列タグは、反応器に入れる前に反応混合物中に懸濁させることができる。一態様では、反応混合物は、ＰＣＡ反応混合物であり、かつ少なくとも一対の内側（または連結）プライマーおよび少なくとも一対の外側プライマーを含むＰＣＲ反応混合物と実質的に同じである。反応混合物は、限定されるものではないが、配列タグ付きプライマーを均質配列タグから遊離させる熱安定性制限エンドヌクレアーゼ；１つ以上のプロティナーゼ阻害剤；および単離細胞の標的核酸の遊離を容易にする溶解剤、例えば、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）ら著、インターフェイス（Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ）、２００８年、第５巻、ｐ．Ｓ１３１〜Ｓ１３８などを含む１つ以上の任意選択の成分を含み得る。一部の実施形態では、細胞を溶解するステップは、増幅反応を行う前の一定期間に、非イオン性洗剤、例えば、０．１％のＴｗｅｅｎ  Ｘ−１００の存在下で細胞を９５℃以上に加熱することによって達成することができる。一実施形態では、このような昇温期間は、１０〜２０分とすることができる。あるいは、細胞を溶解するステップは、非イオン性洗剤、例えば、０．１％のＴｗｅｅｎ  Ｘ−１００の存在下での、例えば、９６℃で１５分間、続いて１０℃で１０分間の１回以上の加熱と冷却のサイクルによって達成することが
できる。
【００３９】
一部の実施形態では、ミセル反応器は、図１Ｋに例示されているようなマイクロ流体デバイスで形成されて分類され、このマイクロ流体デバイスの特徴は、参照により本明細書に組み入れられるチェン（Ｃｈｅｎ）ら著（前掲）に開示されている。細胞（１３０２）および均質配列タグ（１３０４）を含む水性反応混合物（１３０６）が、選択された運転条件下で１つの細胞と１つの均質配列タグを含むミセルの形成を確実にする濃度でタンク（１３００）に供給される。反応混合物（１３０６）が、通路（１３０５）を通って合流部（１３０７）に流れ、そこで反応混合物が、通路（１３０８）および（１３０９）からの油の流れに合流する。この３つの流れの流量および圧力は、水性ミセルが合流部（１３０７）で形成され、そして通路（１３０８）および（１３０９）からの組み合わされた油の流れによって運ばれ、通路（１３１１）を通って最終的に検査領域（１３１２）を通過し、そこで各ミセルの１つ以上の所定の特性の存在、非存在、またはレベルが決定されるように調整される。所定の特性は、ミセル中の細胞または粒子の存在または非存在、およびミセル中の１つ以上の均質配列タグの存在または非存在を含み得る。一部の実施形態では、このような特性の検出は、均質配列タグおよび／または細胞に特異的に結合する独特な蛍光プローブを用いて行うことができる。例えば、第１の発光特性を有する１つ以上の蛍光標識抗体が、細胞を標識することができ、第２の発光特性を有する１つ以上の蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブが、均質配列タグを標識することができる。検査領域（１３１２）に関連した検出器は、任意選択でエフェクター領域（１３１３）に関連し、ミセルがエフェクター領域（１３１３）に達すると、検査領域（１３１２）で検出される信号に基づいてミセルに力が加えられる。ミセルを異なる通路を通る代替の流れに誘導する力は、音響または光などとすることができる。一実施形態では、チェン（Ｃｈｅｎ）ら（前掲）の教示に従って音響力（１３１４）を加えて、１つの細胞と１つの均質配列タグの両方を含むミセル（１３２０）を通路３（１３４２）に誘導し、１つ以上の細胞のみを含むミセル（１３１６）を通路１（１３４４）に誘導し、残りのミセル（１３１８）を通路２（１３４６）に誘導する。
【００４０】
多数の他のマイクロ流体デバイス構成を利用して、１つの細胞と所定数の均質配列タグ、例えば、１つの均質配列タグ、２つの均質配列タグを含むミセルを形成する、または選択的にミセルを合体させることによって、または電気穿孔法などによってミセルに試薬を選択的に追加することができるのは明らかである。例えば、ザゴニ（Ｚａｇｏｎｉ）ら著、第２章、メソッズ・オブ・セル・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２０１１年、第１０２巻、ｐ．２５〜４８；ブロウゼス（Ｂｒｏｕｚｅｓ）著、第１０章、メソッズ・オブ・セル・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２０１１年、第１０２巻、ｐ．１０５〜１３９；ヴィークルンド（Ｗｉｋｌｕｎｄ）ら著、第１４章、メソッズ・オブ・セル・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２０１１年、第１０２巻、ｐ．１７７〜１９６；およびル・ガック（Ｌｅ  Ｇａｃ）ら著、第７章、メソッズ・オブ・セル・バイオロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、２０１２年、第８５３巻、ｐ．６５〜８２など。
【００４１】
核酸シークエンシング技術
核酸シークエンシングの任意の高スループット技術を、本発明の方法に使用することができる。ＤＮＡシークエンシング技術としては、標識ターミネータまたはプライマーを用いたジデオキシシークエンシング反応（サンガー法）およびスラブまたは毛細管でのゲル分離、可逆的に終端された標識ヌクレオチドを用いた合成によるシークエンシング、パイロシークエンシング、４５４シークエンシング、後にライゲーションされる標識クローンのライブラリに対する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを用いた合成によるシークエンシング、重合ステップ中の標識ヌクレオチドの取り込みのリアルタイム監視、ポロ
ニー（ｐｏｌｏｎｙ）シークエンシング、およびＳＯＬｉＤシークエンシングなどが挙げられる。従って、これらのシークエンシングアプローチを使用して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ：Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）および／またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ：Ｂ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）に基づいて目的の標的核酸とクローン型の融合産物をシークエンシングすることができる。本発明の一態様では、シークエンシングの高スループット法が利用され、この方法は、個々の分子を固体表面上で空間的に分離して、これらの分子を並行にシークエンシングするステップを含む。このような固体表面としては、無孔表面（例えば、Ｓｏｌｅｘａシークエンシング、例えば、ベントレイ（Ｂｅｎｔｌｅｙ）著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００８年、第４５６巻、ｐ．５３〜５９またはＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓシークエンシング、例えば、ドルマナック（Ｄｒｍａｎａｃ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０１０年、第３２７巻、ｐ．７８〜８１）、ビーズ結合鋳型もしくは粒子結合鋳型を含み得るウェルのアレイ（例えば、４５４を用いる、例えば、マーグリース（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００５年、第４３７巻、ｐ．３７６〜３８０またはＩｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシークエンシング、米国特許出願公開第２０１０／０１３７１４３号明細書または同第２０１０／０３０４９８２号明細書）、微細加工膜（例えば、ＳＭＲＴシークエンシングと同様、例えば、エイド（Ｅｉｄ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００９年、第３２３巻、ｐ．１３３〜１３８）、またはビーズアレイ（ＳＯＬｉＤシークエンシングまたはポロニー（ｐｏｌｏｎｙ）シークエンシングと同様、例えば、キム（Ｋｉｍ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２００７年、第３１６巻、ｐ．１４８１〜１４１４）を挙げることができる。別の態様では、このような方法は、単離された分子を、これらの分子が固体表面上で空間的に単離される前または後で増幅するステップを含む。前増幅は、エマルジョンをベースとした増幅、例えば、エマルジョンＰＣＲ、またはローリングサークル増幅を含み得る。特に興味深いのはＳｏｌｅｘａベースのシークエンシングであり、このシークエンシングでは、個々の鋳型分子が、固体表面上で空間的に分離された後に、これらの分子が、ブリッジＰＣＲによって並行に増幅されて、別個のクローン集団またはクラスターが形成され、次いで、ベントレイ（Ｂｅｎｔｌｅｙ）（前掲）および製造者の取扱説明書（例えば、ＴｒｕＳｅｑ（商標）サンプル精製キットおよびデータシート、イルミナ社（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．）、サンディエゴ、カリフォルニア州、２０１０年）；並びに、参照により本明細書に組み入れられる次の参照文献：米国特許第６，０９０，５９２号明細書；同第６，３００，０７０号明細書；同第７，１１５，４００号明細書；および欧州特許第０９７２０８１Ｂ１号明細書に記載されているように、シークエンシングされる。一実施形態では、個々の分子が、固定表面に配置されて増幅され、少なくとも１０５クラスター／ｃｍ２の密度；または少なくとも５×１０５／ｃｍ２の密度；または少なくとも１０６クラ��ター／ｃｍ２の密度でクラスターが形成される。一実施形態では、比較的エラー率の高いシークエンシング化学が利用される。このような実施形態では、このような化学によって生成される平均品質スコアは、配列リードの長さの単調に減少する関数である。一実施形態では、このような減少は、配列リードの０．５％が、位置１〜７５に少なくとも１つのエラーを有すること；配列リードの１％が、位置７６〜１００に少なくとも１つのエラーを有すること；配列リードの２％が、位置１０１〜１２５に少なくとも１つのエラーを有することに一致する。
【００４２】
一部の実施形態では、マルチプレックスＰＣＲを使用して、核酸の混合物、特に、組換え免疫分子、例えば、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体、またはこれらの一部を含む混合物のメンバーが増幅される。このような免疫分子のマルチプレックスＰＣＲを行うための手引きは、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる次の参照文献に見られる：モーレイ（Ｍｏｒｌｅｙ）による米国特許第５，２９６，３５１号明細書；ゴルスキー（Ｇｏｒｓｋｉ）による米国特許第５，８３７，４４７号明細書；ダウ（Ｄａｕ）による米国特許第６，０８７，０９６号明細書；ヴァン・ドンゲン（Ｖｏｎ  Ｄｏｎｇｅｎ）らによる米国特許出願公開第２００６／０２３４２３４号明細書；欧州特許第１５４４３０８Ｂ１号明
細書；ファハム（Ｆａｈａｍ）らによる米国特許出願公開第２０１０／１５１４７１号明細書；ハン（Ｈａｎ）による米国特許出願公開第２０１０／００２１８９６号明細書；およびロビンス（Ｒｏｂｉｎｓ）らによる米国特許出願公開第２０１０／０３３０５７号明細書など。このような増幅技術は、本発明の外側プライマーおよび連結プライマーを提供するために当業者によって容易に変更される。
【００４３】
本発明は、いくつかの特定の実施形態の例を参照して説明されたが、当業者であれば、本発明の概念および範囲から逸脱することなく本発明の様々な変更が可能であることを理解されよう。本発明は、上記説明されたものに加えて、様々なセンサの実施および他の主題に適用可能である。
【００４４】
定義
本明細書に特段の記載がない限り、本明細書で使用される核酸化学、生化学、遺伝学、および分子生物学の用語および記号は、その分野の標準的な論文または教科書の意味である。例えば、コーンバーグ（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ）およびベイカー（Ｂａｋｅｒ）著、ＤＮＡ複製（ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）、第２版（Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ）、ニューヨーク、１９９２年）；レインガー（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）著、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第２版（ワース・パブリシャー（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ニューヨーク、１９７５年）；ストラカン（Ｓｔｒａｃｈａｎ）およびリード（Ｒｅａｄ）著、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第２版（ワイリー−リス（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ）、ニューヨーク、１９９９年）；アバス（Ａｂｂａｓ）ら著、セルラー・アンド・モレキュラー・イムノロジー（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第６版（サウンダーズ（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）、２００７年）。
【００４５】
「アンプリコン」とは、ポリヌクレオチド増幅反応の産物；即ち、一本鎖または二本鎖であり得、かつ１つ以上の開始配列から複製されるポリヌクレオチドのクローン集団のことである。１つ以上の開始配列は、同じ配列の１つ以上のコピーでも良いし、または異なる配列の混合物でも良い。一部の実施形態では、アンプリコンは、１つの開始配列の増幅によって形成される。アンプリコンは、１つ以上の開始核酸または標的核酸の複製を含む産物が作製される様々な増幅反応によって作製することができる。一態様では、アンプリコンを作製する増幅反応は、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである反応物の塩基対が、反応産物の生成に必要な鋳型ポリヌクレオチドに相補体を有するという点で「鋳型主導性」である。一態様では、鋳型主導性反応は、核酸ポリメラーゼを用いるプライマーの伸長、または核酸リガーゼを用いるオリゴヌクレオチドのライゲーションである。このような反応としては、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）、線状ポリメラーゼ反応、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ：ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｂａｓｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、およびローリングサークル増幅などが挙げられ、これらは、参照により本明細書に組み入れられる次の参照文献に開示されている：マリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らによる米国特許第４，６８３，１９５号明細書；同第４，９６５，１８８号明細書；同第４，６８３，２０２号明細書；同第４，８００，１５９号明細書（ＰＣＲ）；ゲルファント（Ｇｅｌｆａｎｄ）らによる米国特許第５，２１０，０１５号明細書（「ｔａｑｍａｎ」プローブを用いるリアルタイムＰＣＲ）；ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）らによる米国特許第６，１７４，６７０号明細書；カシャン（Ｋａｃｉａｎ）らによる米国特許第５，３９９，４９１号明細書（「ＮＡＳＢＡ」）；リザルディ（Ｌｉｚａｒｄｉ）による米国特許第５，８５４，０３３号明細書；およびアオノ（Ａｏｎｏ）らによる特開平４−２６２７９９号公報（ローリングサークル増幅）など。一態様では、本発明のアンプリコンは、ＰＣＲによって作製される。増幅反応は、反応産物の増幅反応の進行と
しての測定を可能にする検出化学が利用可能である場合は「リアルタイム」増幅とすることができる。例えば、以下に記載される「リアルタイムＰＣＲ」、またはレオン（Ｌｅｏｎｅ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９８年、第２６巻、ｐ．２１５０〜２１５５などの参照文献に記載される「リアルタイムＮＡＳＢＡ」。本明細書で使用される「増幅する」という語は、増幅反応を行うことを意味する。「反応混合物」または「増幅混合物」とは、限定されるものではないが、反応中にｐＨを選択されたレベルに維持する緩衝剤、塩、補助因子、およびスカベンジャなどを含み得る、反応を行うために必要な全ての反応物を含む溶液のことである。
【００４６】
「キット」とは、本発明の方法を行うために材料または試薬を送達するための任意の送達システムのことである。本発明の方法との関連では、このような送達システムは、反応試薬（例えば、適切な容器に入れられたプライマー、酵素、内部標準など）および／または支援材料（例えば、緩衝剤、アッセイなどを行うための取扱説明書）の保存、ある位置から別の位置への移送または送達を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連する反応試薬および／または支援材料を含む１つ以上の容器（例えば、箱）を含む。このような内容物は、目的のレシピエントに一緒にまたは別個に送達することができる。例えば、第１の容器は、アッセイに使用される酵素を含み得、第２の容器はプライマーを含む。
【００４７】
「ライゲーション」とは、鋳型駆動反応における２つ以上の核酸、例えば、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドの末端間に共有結合または連結を形成することである。結合または連結の性質は、様々であり得、ライゲーションは、酵素的または化学的に行うことができる。本明細書で使用されるライゲーションは、通常は酵素的に行われて、１つのオリゴヌクレオチドの末端ヌクレオチドの５’炭素と別のオリゴヌクレオチドの３’炭素との間にホスホジエステル結合を形成する。様々な鋳型駆動ライゲーション反応が、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる次の参照文献に記載されている：ホワイトリー（Ｗｈｉｔｅｌｙ）らによる米国特許第４．８８３，７５０号明細書；レットシンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）らによる米国特許第５，４７６，９３０号明細書；ファン（Ｆｕｎｇ）らによる米国特許第５，５９３，８２６号明細書；クール（Ｋｏｏｌ）による米国特許第５，４２６，１８０号明細書；ランデグレン（Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ）らによる米国特許第５，８７１，９２１号明細書；スー（Ｘｕ）およびクール（Ｋｏｏｌ）著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９９９年、第２７巻、ｐ．８７５〜８８１；ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）ら著、メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１９７９年、第６８巻、ｐ．５０〜７１；エングラー（Ｅｎｇｌｅｒ）ら著、ザ・エンザイムズ（Ｔｈｅ  Ｅｎｚｙｍｅｓ．）、１９８２年、第１５巻、ｐ．３〜２９；およびナムサラエフ（Ｎａｍｓａｒａｅｖ）による米国特許出願公開第２００４／０１１０２１３号明細書。
【００４８】
「マイクロ流体デバイス」とは、１つ以上のチャンバ、ポート、および通路の統合システムのことであり、これらのチャンバ、ポート、および通路は、相互に連結されて流体連通し、単独で、または器械もしくは器具と協働して分析反応またはプロセスを行うように設計されており、このような器械もしくは器具は、支持機能、例えば、サンプルの導入、流体および／または試薬の駆動手段、温度制御、検出システム、データ収集、および／または統合システムなどを実現する。マイクロ流体デバイスは、弁、ポンプ、および内壁の特殊な機能性コーティングをさらに備えることができ、この機能性コーティングは、例えば、サンプルの成分または反応物質の吸着を防止して、電気浸透などによる試薬の移動を容易にする。このようなデバイスは、通常は、固体基板に形成される、または固体基板として形成され、この固体基板は、ガラス、プラスチック、または他の固形ポリマー材料と
することができ、典型的には、特に光学的または電気化学的方法によるサンプルおよび試薬の移動の検出および監視を容易にするために平面の形態を有する。マイクロ流体デバイスの特徴は、通常は数百平方マイクロメートル未満の断面寸法を有し、通路が、典型的には、毛細管寸法、例えば、約５００μｍ〜約０．１μｍの最大断面寸法を有することである。マイクロ流体デバイスは、典型的には、１μＬ〜数ｎＬ、例えば、１０〜１００ｎＬの範囲の容積容量を有する。マイクロ流体デバイスの製造および運転は、当技術分野で周知であり、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる次の参照文献によって例示されている：ラムゼイ（Ｒａｍｓｅｙ）による米国特許第６，００１，２２９号明細書；同第５，８５８，１９５号明細書；同第６，０１０，６０７号明細書；および同第６，０３３，５４６号明細書；ソーン（Ｓｏａｎｅ）らによる米国特許第５，１２６，０２２号明細書および同第６，０５４，０３４号明細書；ネルソン（Ｎｅｌｓｏｎ）らによる米国特許第６，６１３，５２５号明細書；マハル（Ｍａｈｅｒ）らによる米国特許第６，３９９，９５２号明細書；リッコ（Ｒｉｃｃｏ）らによる国際公開第０２／２４３２２号パンフレット；ビョルンソン（Ｂｊｏｒｎｓｏｎ）らによる国際公開第９９／１９７１７号パンフレット；ワイルディング（Ｗｉｌｄｉｎｇ）らによる米国特許第５，５８７，１２８号明細書；同第５，４９８，３９２号明細書；シーア（Ｓｉａ）ら著、エレクトロフォレーシス（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、２００３年、第２４巻、ｐ．３５６３〜３５７６；ウンガー（Ｕｎｇｅｒ）ら著、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２０００年、第２８８巻、ｐ．１１３〜１１６；エンゼルバーガー（Ｅｎｚｅｌｂｅｒｇｅｒ）らによる米国特許第６，９６０，４３７号明細書。
【００４９】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」とは、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による特定のＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅反応のことである。言い換えれば、ＰＣＲは、プライマー結合部位に隣接した標的核酸の複数のコピーまたは複製を作製する反応であり、このような反応は、次のステップの１回以上の反復を含む：（ｉ）標的核酸を変性させるステップ、（ｉｉ）プライマーをプライマー結合部位にアニーリングするステップ、および（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸の存在下でプライマーを核酸ポリメラーゼによって伸長させるステップ。通常は、この反応は、サーマル・サイクラー装置で各ステップに最適な異なる温度で繰り返される。各ステップでの特定の温度、期間、ステップ間の変化の割合は、例えば、参照文献：イニス（Ｉｎｎｉｓ）ら編、ＰＣＲプロトコル（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、１９９０年）：マクファーソン（ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ）ら編、ＰＣＲ：実践的なアプローチ（ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）およびＰＣＲ２：実践的なアプローチ（ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）（ＩＲＬプレス（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ）、オックスフォード、それぞれ１９９１年および１９９５年）によって例示されている、当業者に周知の多数の因子によって決まる。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用する従来のＰＣＲでは、二本鎖標的核酸を、９０℃を超える温度で変性させ、プライマーを５０〜７５℃の温度でアニーリングし、そしてプライマーを７２〜７８℃の温度で伸長させることができる。ＰＣＲの典型的な増幅混合物は、０．１〜０．５μＭの濃度の少なくとも１つの順方向プライマーおよび逆方向プライマー；１００〜３００μＭの濃度のｄＮＴＰ；ＤＮＡポリメラーゼと塩（例えば、１０〜５０ｍＭのＫＣｌまたはＮａＣｌ、および１〜６ｍＭのＭｇＣｌ２）；および緩衝剤（例えば、１０〜５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３〜８．８）を含む。反応量は、数百ナノリットル、例えば、２００ｎＬ〜数百μＬ、例えば、２００μＬの範囲である。「ＰＣＲ」という語は、限定されるものではないが、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、およびマルチプレックスＰＣＲなどを含む反応の派生形を包含する。利用される特定の形式のＰＣＲは、本出願との関連から当業者には認識されよう。「逆転写ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」とは、標的ＲＮＡを相補的な一本鎖ＤＮＡに変換する逆転写反応が先に起こり、次いで、この一本鎖ＤＮＡが増幅されるＰＣＲのことである。例えば、参照により本明細書に組み入れられるテコット（Ｔｅｃｏｔｔ）らによる米国特許
第５，１６８，０３８号明細書。「リアルタイムＰＣＲ」とは、反応産物、即ち、アンプリコンの量が、反応が進行するときに監視されるＰＣＲのことである。様々な形式のリアルタイムＰＣＲが存在し、これらのリアルタイムＰＣＲは主に、反応産物の監視に使用される検出化学が異なる。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、ゲルファント（Ｇｅｌｆａｎｄ）らによる米国特許第５，２１０，０１５号明細書（「ｔａｑｍａｎ」）；ウィットワー（Ｗｉｔｔｗｅｒ）らによる米国特許第６，１７４，６７０号明細書および同第６，５６９，６２７号明細書（挿入染料（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ  ｄｙｅｓ））；チャギ（Ｔｙａｇｉ）らによる米国特許第５，９２５，５１７号明細書（分子ビーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅａｃｏｎｓ））。リアルタイムＰＣＲの検出化学は、同様に参照により本明細書に組み入れられるマッカイ（Ｍａｃｋａｙ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、２００２年、第３０巻、ｐ．１２９２〜１３０５に概説されている。「ネステッドＰＣＲ」とは、２段階ＰＣＲのことであり、第１のＰＣＲのアンプリコンが、新たなセットのプライマーを用いる第２のＰＣＲのサンプルとなり、このプライマーの少なくとも１つが、第１のアンプリコンの内部の位置に結合する。ネステッド増幅反応に関連して本明細書で使用される「一次プライマー」とは、第１のアンプリコンを作製するために使用されるプライマーのことであり、「二次プライマー」とは、第２のアンプリコンまたはネステッドアンプリコンを作製するために使用される１つ以上のプライマーのことである。「マルチプレックスＰＣＲ」とは、複数の標的配列（または１つの標的配列と１つ以上の基準配列）が、同じ反応混合物内で同時に増幅されるＰＣＲのことである。例えば、バーナード（Ｂｅｒｎａｒｄ）ら著、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１９９９年、第２７３巻、ｐ．２２１〜２２８（２色リアルタイムＰＣＲ（ｔｗｏ−ｃｏｌｏｒ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ））。通常は、プライマーの異なるセットが、増幅される各配列に利用される。典型的には、マルチプレックスＰＣＲの標的配列の数は、２〜５０、２〜４０、または２〜３０の範囲である。「定量ＰＣＲ」とは、サンプルまたは標本中の１つ以上の特定の標的配列の存在量を測定するように設計されたＰＣＲのことである。定量ＰＣＲは、このような標的配列の絶対定量および相対定量の両方を含む。定量測定は、標的配列と別個にまたは一緒にアッセイされ得る１つ以上の基準配列または内部標準を用いて行われる。基準配列は、サンプルまたは標本に対して内因性または外因性であり得、後者の場合は、１つ以上の競合鋳型を含み得る。典型的な内因性基準配列は、次の遺伝子の転写物のセグメントを含む：β−アクチン、ＧＡＰＤＨ、β２−ミクログロブリン、およびリボソームＲＮＡなど。定量ＰＣＲの技術は、当業者に周知であり、参照により本明細書に組み入れられる次の参照文献に例示されている：フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）ら著、バイオテクニークス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１９９９年、第２６巻、ｐ．１１２〜��２６；ベッカー−アンドレ（Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９８９年、第１７巻、ｐ．９４３７〜９４４７；ジマーマン（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ）ら著、バイオテクニークス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、１９９６年、第２１巻、ｐ．２６８〜２７９；ディビアッコ（Ｄｉｖｉａｃｃｏ）ら著、ジーン（Ｇｅｎｅ）、１９９２年、第１２２巻、ｐ．３０１３〜３０２０；ベッカー−アンドレ（Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ）ら著、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、１９８９年、第１７巻、ｐ．９４３７〜９４４６など。
【００５０】
「プライマー」とは、ポリヌクレオチド鋳型と二重鎖を形成するときに、核酸合成の開始点として機能し、その３’末端から鋳型に沿って伸長して伸長した二重鎖を形成することができる天然または合成のオリゴヌクレオチドのことである。プライマーの伸長は、通常は、核酸ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼで行われる。伸長プロセス中に付加されるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。通常は、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは、通常は、１４〜４０ヌクレオチドの範囲、または１８〜３６ヌクレオチドの範囲の長さ
を有する。プライマーは、様々な核酸増幅反応、例えば、１種類のプライマーを用いる線状増幅反応、または２種類以上のプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応に利用される。特定の適用例に対してプライマーの長さおよび配列を選択する案内は、参照により本明細書に組み入れられる次の参照文献から分かるように当業者には周知である：ディーフェンバッハ（Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ）編、ＰＣＲプライマー：実習マニュアル（ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版（コールド・スプリング・ハーバ・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、２００３年）。
【００５１】
「配列リード」とは、シークエンシング技術によって生成される一連のデータまたはデータのストリームから決定されるヌクレオチド配列のことであり、この決定は、例えば、技術に関連したベースコーリングソフトウェア、例えば、ＤＮＡシークエンシングプラットフォームの供給業者からのベースコーリングソフトウェアによって行われる。配列リードは、通常は、配列の各ヌクレオチドの品質スコアを含む。典型的には、配列リードは、プライマーを、例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼを用いて鋳型核酸に沿って伸長させることによって作製される。データは、このような伸長に関連したシグナル、例えば、光シグナル、化学シグナル（例えば、ｐＨの変化）、または電気シグナルを記録することによって生成される。このような初期データが、配列リードに変換される。
【００５２】
「配列タグ」（もしくは「タグ」）または「バーコード」とは、ポリヌクレオチドまたは鋳型分子に付着されたオリゴヌクレオチドのことであり、１回の反応または一連の反応でポリヌクレオチドまたは鋳型を識別し、かつ／または追跡するために使用される。配列タグは、ポリヌクレオチドまたは鋳型の３’末端もしくは５’末端に付着させることができる、または配列タグは、このようなポリヌクレオチドまたは鋳型の内部に挿入して線状コンジュゲートを形成することができ、この線状コンジュゲートは、本明細書では、「タグ付きポリヌクレオチド」、「タグ付き鋳型」、「タグ−ポリヌクレオチドコンジュゲート」、または「タグ−分子コンジュゲート」などと呼ばれることもある。配列タグは、サイズおよび組成が非常に多様であり得；参照により本明細書に組み入れられる次の参照文献が、特定の実施形態に適切な配列タグのセットを選択するための案内を示す：ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）による米国特許第５，６３５，４００号明細書；ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）およびマチェビッツ（Ｍａｃｅｖｉｃｚ）による米国特許第７，５３７，８９７号明細書；ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、２０００年、第９７巻、ｐ．１６６５〜１６７０；チャーチ（Ｃｈｕｒｃｈ）らによる欧州特許公開第０３０３４５９号明細書；シューメーカ（Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ）ら著、ネイチャー・ジェネティクス（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、１９９６年、第１４巻、ｐ．４５０〜４５６；モーリス（Ｍｏｒｒｉｓ）らによる欧州特許出願公開第０７９９８９７Ａ１号明細書；ワレス（Ｗａｌｌａｃｅ）による米国特許第５，９８１，１７９号明細書など。配列タグの長さおよび組成は、非常に多様であり得、特定の長さおよび／または組成の選択は、限定されるものではないが、例えば、ハイブリダイゼーション反応または酵素反応、例えば、シークエンシングによってタグがどのように使用されて読出しが生成されるか；例えば、蛍光染料などで配列タグが標識されているか否か；ポリヌクレオチドのセットなどを一義的に識別するために必要な区別可能なオリゴヌクレオチドタグの数、および、例えば、クロスハイブリダイゼーションまたはシークエンシングエラーによる誤認が存在しない、確実な識別を保障するためにタグのセットがどの程度異なっていなければならないかを含め、いくつかの因子によって決まる。一態様では、配列タグはそれぞれ、２〜３６ヌクレオチド、４〜３０ヌクレオチド、８〜２０ヌクレオチド、または６〜１０ヌクレオチドの範囲内の長さを有し得る。一態様では、配列タグのセットが使用され、各配列タグのセットは、同じセットの他のどのタグのヌクレオチド配列とも少なくとも２つの塩基が異なるユニークなヌクレオチド配列を有し；別の態様では、配列タグのセットが使用され、各配列タグのセットは、同じセット
の他のどのタグとも少なくとも３つの塩基が異なる。
【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
2015523087.tif 000021
【図６Ｅ】
2015523087.tif 000022
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2015523087.tif 000024
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図３Ａ】
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【図４Ａ】
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【図５Ａ】
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【図６Ａ】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2015523087.tif 000035