(57)【要約】  本発明は、患者の血液サンプルからのクローン型プロファイルの処置後分析により、免疫移植患者におけるマントル細胞リンパ腫残存病変をモニターする方法に関連する。一部の実施形態では、本発明の方法は、（ａ）ワクチン刺激された自家Ｔ細胞により前記患者を免疫移植することにより、患者を処置する工程；（ｂ）前記患者から、Ｂ細胞および／または無細胞核酸を含む末梢血サンプルを取得する工程；（ｃ）前記サンプルのＢ細胞由来の核酸および／または前記サンプル中の無細胞核酸の分子を増幅する工程であって、前記核酸分子が、免疫グロブリン遺伝子由来の組換えＤＮＡ配列を含む工程；（ｄ）クローン型プロファイルを形成するために、増幅された前記核酸分子を配列決定する工程；ならびに、（ｅ）前記クローン型プロファイルから、その系統学的クローン型を含む、前記マントル細胞リンパ腫に関連する１つ以上の患者特異的クローン型の有無および／またはレベルを決定する工程を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
マントル細胞リンパ腫に関連する１つ以上の患者特異的クローン型により、患者におけるマントル細胞リンパ腫残存病変をモニターする方法であって、
（ａ）ワクチン刺激された自家Ｔ細胞により免疫移植することにより、患者を処置する工程；
（ｂ）前記患者から、Ｂ細胞および／または無細胞核酸を含む末梢血サンプルを取得する工程；
（ｃ）前記サンプルのＢ細胞および／または前記サンプル中の無細胞核酸から、核酸分子を増幅する工程であって、前記核酸分子が、免疫グロブリン遺伝子由来の組換えＤＮＡ配列を含む工程；
（ｄ）クローン型プロファイルを形成するために、増幅された前記核酸分子を配列決定する工程；ならびに、
（ｅ）前記クローン型プロファイルから、その系統学的クローン型を含む、前記マントル細胞リンパ腫に関連する１つ以上の患者特異的クローン型の有無および／またはレベルを決定する工程
を含む、方法。
【請求項２】
さらに、前記工程（ｂ）から（ｅ）を繰り返して、前記患者におけるマントル細胞リンパ腫残存病変をモニターする工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クローン型プロファイルがそれぞれ、９９パーセントの確率で、０．０１パーセント以上の頻度で存在する全てのクローン型を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記クローン型プロファイルがそれぞれ、少なくとも１０４個のクローン型を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記マントル細胞リンパ腫に関連する１つ以上の患者特異的クローン型が、前記患者の骨髄サンプルまたはリンパ節サンプルから決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
マントル細胞リンパ腫に関連する１つ以上の患者特異的クローン型により、患者におけるマントル細胞リンパ腫をモニターする方法であって、
（ａ）ワクチン刺激された自家Ｔ細胞により免疫移植することにより、患者を処置する工程；
（ｂ）前記患者から、Ｂ細胞、形質細胞、ならびに／または、Ｂ細胞および／もしくは形質細胞由来の無細胞核酸を含む末梢血サンプルを取得する工程；
（ｃ）前記末梢血サンプルから核酸サンプルを抽出する工程；
（ｄ）核酸サンプル由来の核酸分子をポリメラーゼ連鎖反応において増幅する工程であって、前記核酸分子が、ＩｇＨのＶＤＪ再配列を含む工程；
（ｅ）クローン型プロファイルを形成するために、増幅された前記核酸分子を配列決定する工程；ならびに、
（ｆ）前記クローン型プロファイルから、前記マントル細胞リンパ腫に関連する１つ以上の患者特異的クローン型それぞれのレベルを決定する工程
を含み、このようなレベルが、このような１つ以上の患者特異的クローン型それぞれの系統学的クローン型を含む、方法。
【請求項７】
前記配列決定工程が、各クローン型の配列を決定するために、２０から４００個のヌクレオチドの範囲の配列リードを生成する工程を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記決定工程が、寛解の低下した可能性と、前記マントル細胞リンパ腫に関連する１つ以上の患者特異的クローン型の前記レベルとを関連付ける工程を含む、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１２年１０月２２日に出願された、米国仮特許出願第６１／７１６，９９５号の利益を主張する。前記出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）は、乏しい長期予後を有する。自家移植は、生存を延長するが、新たな、機構的に異なる治療が、再発をもたらす、残った骨髄破壊耐性腫瘍細胞を標的とする必要がある。低度のリンパ腫用のＣｐＧ系ワクチンの臨床試験は、抗腫瘍Ｔ細胞の誘導および臨床応答を示してきた、例えば、Ｂｒｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２８（２８）：４３２４−４３３２（２０１０）。例えば、「免疫移植（ｉｍｍｕｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）」または「免疫移植（ｉｍｍｕｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ）」と呼ばれる有望な処置アプローチは、下記工程：１）ＣｐＧ系ワクチン接種、２）ワクチン刺激されたＴ細胞の収集、３）幹細胞救助による骨髄破壊、および、４）Ｔ細胞再注入を含む、例えば、Ｂｒｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，１１３（１）：８５−９４（２００９）。免疫移植は、抗腫瘍Ｔ細胞の割合を一桁増幅させ、容積の大きい、全身性リンパ腫の負荷さえも治癒可能である。免疫移植患者を疾患のない状態に維持することは、微小残存病変（ＭＲＤ）の発生を、高感度でモニターする能力により決まる。
【０００２】
免疫分子、例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞の受容体またはその成分をコードする核酸プロファイルは、生物の健康または疾患の状態における豊富な情報を含んでいる。したがって、診断または予後の指標としての、このようなプロファイルの使用は、広い各種の症状を提案する、例えば、ＦａｈａｍおよびＷｉｌｌｉｓ、米国特許出願公開第２０１０／０１５１４７１号および同第２０１１／０２０７１３４号明細書；Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１８１７−１８２４（２００９）；Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，１（１２）：１２ｒａ２３（２００９）；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（Ｍａｒｃｈ  ８，２０１１）。このような配列系プロファイルは、免疫レパートリまたはその成分のクローン型を測定するための他のアプローチより、非常に高い感度が可能である、例えば、ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１７：２２５７−２３１７（２００３）；Ｏｔｔｅｎｓｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，９１：４２９２−４２９９（１９９８）。
【０００３】
より高感度で都合の良いアッセイが、配列系免疫レパートリ分析を使用して、微小残存病変を正確にモニターおよび検出するのに利用可能であるのが、ＭＣＬ患者に有益であろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１０／０１５１４７１号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１１／０２０７１３４号明細書
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｂｒｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２８（２８）：４３２４−４３３２（２０１０）
【非特許文献２】Ｂｒｏｄｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，１１３（１）：８５−９４（２００９）
【非特許文献３】Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９：１８１７−１８２４（２００９）
【非特許文献４】Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，１（１２）：１２ｒａ２３（２００９）
【非特許文献５】Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ（Ｍａｒｃｈ  ８，２０１１）
【非特許文献６】ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１７：２２５７−２３１７（２００３）
【非特許文献７】Ｏｔｔｅｎｓｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，９１：４２９２−４２９９（１９９８）
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、末梢血サンプルの配列系免疫レパートリ分析を使用して、微小残存病変について、ＭＣＬ患者をモニターするための方法に関連する。本発明は、数多くの実施および適用において例示され、それらの一部は、以下および本明細書全体を通してまとめられる。
【０００７】
一態様では、本発明は、マントル細胞リンパ腫に関連する１つ以上の患者特異的クローン型により、患者におけるマントル細胞リンパ腫残存病変をモニターする方法に関連する。前記方法は、下記工程：（ａ）ワクチン刺激された自家Ｔ細胞により患者を免疫移植することにより、患者を処置する工程；（ｂ）前記患者から、Ｂ細胞および／またはＢ細胞由来の無細胞核酸を含む末梢血サンプルを取得する工程；（ｃ）前記サンプルのＢ細胞由来の核酸および／または前記サンプル中のＢ細胞由来の無細胞核酸の分子を増幅する工程であって、前記核酸分子が、免疫グロブリン遺伝子由来の組換えＤＮＡ配列を含む工程；（ｄ）クローン型プロファイルを形成するために、増幅された前記核酸分子を配列決定する工程；ならびに、（ｅ）前記クローン型プロファイルから、予め記録されていないその系統学的クローン型を含む、前記マントル細胞リンパ腫に関連する１つ以上の患者特異的クローン型の有無および／またはレベルを決定する工程を含む。
【０００８】
本発明のこれらの上記特徴付けられた態様および他の態様は、数多くの例証された実施および適用において例示される。それらの一部は、図に示され、下記の特許請求の範囲のセクションにおいて特徴付けられる。ただし、上記概要は、本発明の、各例証された実施形態または全ての実施を記載することを意図しない。
【０００９】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲において、詳細に説明される。本発明の特徴および利点のより良好な理解は、実例となる実施形態を説明する下記発明を実施するための形態を参照することにより得られる。本発明の原理は、添付の図面を利用する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】免疫グロブリン遺伝子を増幅および配列決定するための、２段階のＰＣＲスキームを示す。
【図１Ｂ】免疫グロブリン遺伝子を増幅および配列決定するための、２段階のＰＣＲスキームを示す。
【図１Ｃ】免疫グロブリン遺伝子を増幅および配列決定するための、２段階のＰＣＲスキームを示す。
【図２Ａ】図１ＣのＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を決定する工程の一実施形態の詳細を図示する。
【図２Ｂ】図１ＣのＰＣＲ産物のヌクレオチド配列を決定する工程の別の実施形態の詳細を図示する。
【図３Ａ】１つの反応において、ＩｇＨ鎖から３つの配列決定テンプレートを生成するためのＰＣＲスキームを図示する。
【図３Ｂ】３つの別々の反応において、ＩｇＨ鎖から３つの配列決定テンプレートを生成するためのＰＣＲスキームを図示する。その後、得られたアンプリコンは、Ｐ５およびＰ７プライマー結合部位を付加するために、二次ＰＣＲに組み合わせられる。
【図３Ｃ】３つの別々の反応において、ＩｇＨ鎖から３つの配列決定テンプレートを生成するためのＰＣＲスキームを図示する。その後、得られたアンプリコンは、Ｐ５およびＰ７プライマー結合部位を付加するために、二次ＰＣＲに組み合わせられる。
【図３Ｄ】ＩｇＨ鎖について生成される配列リードの位置を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明の実施には、特に断らない限り、分子生物学（例えば、組換え技術）、バイオインフォマティックス、細胞生物学および生化学の従来技術および説明が使用されてもよい。前記従来技術および説明は、当業者の範囲内である。このような従来技術としては、制限されず、血球のサンプリングおよび分析、核酸の配列決定および分析等があげられる。適切な技術の具体的な説明は、以下の本明細書における例示に参照され得る。ただし、他の同等の従来法も、当然使用され得る。このような従来技術および説明は、標準的な研究室マニュアル、例えば、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ）；ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（全てＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから）；等に見出され得る。
【００１２】
ほとんどのリンパ系新生物、例えば、マントル細胞リンパ腫では、疾患細胞は、疾患状態に関連するクローン型を表す。すなわち、クローン型プロファイル内の前記疾患細胞により産生されるクローン型のレベルは、前記疾患状態に単調に関連する。リンパ系新生物について、関連するクローン型のレベルは、典型的には、前記疾患の程度または負の予後に直接関連する。一部の例では、この相関関係は、クローン型プロファイルのクローン性測定を使用する数として表される場合がある。すなわち、クローン性測定は、複雑なデータセット（前記クローン型プロファイル）を、１つの数に変換する。その値は、クローン型プロファイルが１つまたは少しのクローン型によりどのように支配されるのかの測定である。典型的には、クローン型プロファイルのクローン性が高いほど、疾患状態が悪い。マントル細胞リンパ腫の関連するクローン型は、各種の技術により決定され得る。１つのアプローチでは、１つ以上の関連するクローン型は、例えば、骨髄、リンパ節組織等のサンプルからの、クローン型プロファイルにおける優勢な１つ以上のクローン型として、診断において特定される。部分的に、本発明は、マントル細胞リンパ腫の疾患状態が、末梢血サンプル由来のクローン型プロファイルにおける疾患関連クローン型のレベルを決定することにより、決定および／またはモニターされ得る、認識および評価である。具体的には、マントル細胞リンパ腫患者の末梢血中での（インタクトな細胞または無細胞核酸、例えば、無細胞ＤＮＡのいずれかからの）関連するクローン型の存在は、関連するクローン型が検出されない場合より、疾患進行について悪い予後を示す。
【００１３】
更なる実施形態では、本発明の方法は、下記工程：（ａ）前記患者から、末梢血サンプルを取得する工程であって、前記サンプルが、Ｂ細胞および／または無細胞核酸を含む工程；（ｂ）前記末梢血サンプルから核酸サンプルを抽出する工程；（ｃ）核酸サンプル由来の核酸分子をポリメラーゼ連鎖反応において増幅する工程であって、前記核酸分子が、ＩｇＨのＶＤＪ領域またはその一部をコードする工程；（ｃ）クローン型プロファイルを形成するために、増幅された前記核酸分子を配列決定する工程；ならびに、（ｄ）前記クローン型プロファイルから、ＤＬＢＣＬに関連する１つ以上の患者特異的クローン型それぞれのレベルを決定する工程を含む。この場合、このようなレベルは、このような１つ以上の患者特異的クローン型それぞれの系統学的クローン型を含む。
【００１４】
一部の実施形態では、前記配列決定工程は、各クローン型の配列を決定するために、２０から４００個のヌクレオチドの範囲の配列リードを生成する工程を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、本発明の方法は、さらに、測定される前記１つ以上の患者特異的クローン型またはその系統学的クローン型のレベルに基づいて、骨髄を移植することにより患者を処置する工程を含む。一部のこれらの実施形態では、前記移植工程は、前記１つ以上の患者特異的クローン型およびその系統学的クローン型のレベルが、診断サンプル中の前記１つ以上の患者特異的クローン型の５０パーセントのレベルを超える場合には必ず実行される。
【００１６】
一部の実施形態では、前記末梢血サンプルからのクローン型プロファイルはそれぞれ、９９パーセントの確率で、０．１パーセント以上の頻度；または、９９パーセントの確率で、０．０１パーセント以上の頻度；または、９９パーセントの確率で、０．００１パーセント以上の頻度；または、９９パーセントの確率で、０．０００１パーセント以上の頻度で存在する全てのクローン型を含む。
【００１７】
一部の実施形態では、前記増幅工程は、少なくとも１０５個のＢ細胞；または、少なくとも１０６個のＢ細胞；または、少なくとも１０７個のＢ細胞；または、少なくとも１０８個のＢ細胞を含む末梢血サンプルから、核酸分子を増幅する工程を含む。
【００１８】
サンプル
本発明の方法についてのクローン型プロファイルは、患者のサンプルから生成される。前記サンプルは、診断サンプルの場合、腫瘍または末梢血由来でもよく、残存病変をモニターするためのサンプルの場合、末梢血由来である。ＤＬＢＣＬに関連する１つ以上のクローン型は、診断サンプルから決定される。通常、前記ＤＬＢＣＬに関連する１つ以上のクローン型は、最も高頻度でクローン型プロファイルに存在するものである。一部の場合には、１つの関連するクローン型が存在する場合があり、他の場合には、ＤＬＢＣＬに関連する複数のクローン型が存在する場合がある。腫瘍サンプルは、ＤＬＢＣＬにより影響を受けた任意の組織から採取されてもよく、前記組織としては、リンパ節またはリンパ系の外側、消化管、精巣、甲状腺、皮膚、乳、骨または脳があげられる。上記されたように、残存病変をモニターするためのクローン型プロファイルは、末梢血から抽出された核酸サンプルから生成される。前記サンプルの核酸は、末梢血の細胞含有画分から、または、末梢血の無細胞画分、例えば、血漿もしくは血清からのＢ細胞由来であり得る。一実施形態では、サンプルは、少なくとも１，０００個のＢ細胞を含むが、より典型的には、サンプルは、少なくとも１０，０００個のＢ細胞；およびより典型的には、少なくとも１００，０００個のＢ細胞を含む。別の態様では、サンプルは、１０００から１，０００，０００個のＢ細胞の範囲におけるいくつかのＢ細胞を含む。前記細胞の十分なサンプリングは、「クローン型」および「レパートリ」の定義において以下にさらに記載されるように、レパートリデータを解釈する重要な様態である。サンプル中の細胞数は、測定感度の限界を設定する。例えば、１，０００個のＢ細胞を含むサンプルでは、多くの配列決定リードがどのようにして取得されるのかに関わらず、このような細胞のＤＮＡが配列決定により分析される場合、最も低頻度の検出可能なクローン型は、１／１０００または０．００１である。
【００１９】
本発明で使用するためのサンプルは、ＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、メッセンジャＲＮＡ）を含み得る。前記核酸は、例えば、循環系から抽出された、無細胞ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る、Ｖｌａｓｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，１０：１４２−１６５（２０１０）；Ｓｗａｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，５８１：７９５−７９９（２００７）。提供された発明の方法では、分析され得る対象由来のＲＮＡまたはＤＮＡの量は、例えば、一部の適用（例えば、他の細胞選択評価基準、例えば、形態学的評価基準による較正試験）における１個の細胞の少なさ、および、１０００万個以上の細胞の多さを含む。前記細胞は、６ｐｇ〜６０ｕｇの範囲のＤＮＡ量に、および、１ｐｇ〜１０ｕｇの範囲のＲＮＡ量を翻訳する。一部の実施形態では、核酸サンプルは、６ｐｇ〜６０ｕｇのＤＮＡサンプルである。他の実施形態では、核酸サンプルは、１００μＬから１０ｍＬの末梢血からのＤＮＡサンプルである。他の実施形態では、核酸サンプルは、１００μＬから１０ｍＬの末梢血からの無細胞画分からのＤＮＡサンプルである。
【００２０】
一部の実施形態では、区別できるクローン型を有する実質的に全てのＢ細胞がそこに表されるように、リンパ球または無細胞核酸のサンプルは、十分多量であることにより、クローン型の「レパートリ」を形成する。一実施形態では、全ての区別できるクローン型の実質的な提示を達成するために、０．００１パーセント以上の頻度で存在する全てのクローン型集合を９９パーセントの確率で含むサンプルが取得される。別の実施形態では、０．０００１パーセント以上の頻度で存在する全てのクローン型集合を９９パーセントの確率で含むサンプルが取得される。また別の実施形態では、０．００００１パーセント以上の頻度で存在する全てのクローン型集合を９９パーセントの確率で含むサンプルが取得される。一実施形態では、Ｂ細胞のサンプルは、少なくとも５０万個の細胞を含む。別の実施形態では、このようなサンプルは、少なくとも１００万個の細胞を含む。
【００２１】
核酸サンプルは、従来技術、例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０）等を使用して、末梢血から取得されてもよい。例えば、白血球は、従来技術、例えば、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐキット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、血液サンプルから分離され得る。血液サンプルは、１００μＬから１０ｍＬの容量の範囲であり得る。一態様では、血液サンプル量は、１００μＬから２ｍＬの範囲である。ついで、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡは、このような血液サンプルから、本発明の方法において使用するための従来技術、例えば、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して抽出され得る。白血球、例えば、リンパ球の部分集合が、従来技術、例えば、蛍光活性化セルソータ（ＦＡＣＳ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）、磁気活性化セルソータ（ＭＡＣＳ）（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）等を使用して、さらに単離されてもよい。例えば、メモリＢ細胞は、表面マーカーＣＤ１９およびＣＤ２７により単離されてもよい。
【００２２】
無細胞ＤＮＡも、末梢血サンプルから、従来技術、例えば、Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第６，２５８，５４０号明細書；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４４４：２０３−２０８（２００８）等を使用して抽出され得る。前記文献は、参照により本明細書に組み込まれる。非限定的な例として、末梢血は、ＥＤＴＡチューブに収集され得る。その後、それは、血漿、白血球および赤血球の成分に、遠心分離により分画され得る。無細胞血漿画分（例えば、０．５から２．０ｍＬ）からのＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）等のキットを使用して、製造メーカーのプロトコルに従って抽出され得る。
【００２３】
組換えの特定が、個々の適応型免疫細胞それぞれのＤＮＡおよびその関連するＲＮＡ転写物に存在するため、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかが、提供された発明の方法において配列決定され得る。免疫グロブリン分子またはその一部をコードするＢ細胞由来の組換え配列は、クローン型と呼ばれる。前記ＤＮＡまたはＲＮＡは、抗体をコードする免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子由来の配列に対応し得る。
【００２４】
本発明の方法において分析されるＤＮＡおよびＲＮＡは、重鎖免疫グロブリン（ＩｇＨ）をコードする配列に対応する。各鎖は、定常（Ｃ）領域および可変領域から構成される。前記重鎖について、前記可変領域は、可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）および結合（Ｊ）のセグメントから構成される。これらのセグメントの各型をコードする複数の区別できる配列は、ゲノムに存在する。特定のＶＤＪ組換えイベントは、Ｂ細胞の発展中に生じ、特定の重鎖を生成する細胞をマークする。体細胞性変異は、多くの場合、前記組換え部位の付近で生じ、複数のヌクレオチドの付加または欠失を生じさせ、Ｂ細胞により生成された重鎖の多様性をさらに向上させる。ついで、Ｂ細胞により生成された抗体の可能性のある多様性は、種々の重鎖と軽鎖との生成物である。前記重鎖と軽鎖との可変領域は、抗原認識（または結合）領域または部位を形成するのに寄与する。この多様性に、特定の応答が一部のエピトープに対して開始された後に生じ得る、体細胞性の超変異のプロセスが加えられる。
【００２５】
本発明に基づいて、プライマーが、Ｂリンパ球から抽出された組換え核酸のアンプリコンを生成するのに選択され得る。このような配列は、本明細書において、「体細胞性に再配列された領域」または「体細胞性に組み換えられた領域」または「組換え配列」と呼ばれる場合がある。体細胞性に再配列された領域は、発展中または完全に発展したリンパ球由来の核酸を含んでもよい。この場合、発展中のリンパ球は、免疫遺伝子の再配列が完全なＶ（Ｄ）Ｊ領域を有する分子を形成するのが完了していない細胞である。例示となる不完全な体細胞性に再配列された領域としては、不完全なＩｇＨ分子（例えば、Ｄ−Ｊ領域のみを含む分子）があげられる。
【００２６】
向上した感度のための顆粒球の枯渇
一部の実施形態では、末梢血におけるＤＬＢＣＬ細胞検出の感度は、核酸抽出前にサンプルから非リンパ球を除去することにより向上する場合がある。末梢血のかなりの非リンパ球成分は、顆粒球からなる。前記顆粒球は、好中球、好塩基球および好酸球を含む。一実施形態では、末梢血サンプルから顆粒球を除去する工程は、サンプルを含む反応混合物において、下記：（ｉ）赤血球の溶解；（ｉｉ）顆粒球の親和性捕捉；および、（ｉｉｉ）前記反応混合物からの前記捕捉された顆粒球の除去のように行われ得る。一部の実施形態では、親和性捕捉の工程は、固体支持体、例えば、磁性ビーズ、ＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）に結合された顆粒球特異的抗体により行われ得る。他の実施形態では、顆粒球またはその成分のサブタイプは、リセットおよび／または密度勾配遠心、例えば、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ（登録商標）キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ，Ｃａｎａｄａ）：ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＣＰＴ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）により除去され得る。本発明に基づいて、顆粒球は、好中球、好塩基球もしくは好酸球の全て、または、好中球、好塩基球および好酸球のいずれか１つのみを個々に除去することにより除去されてもよい。顆粒球特異的抗体は、市販されており、例えば、顆粒球特異的抗体をビオチン化し、サンプルとインキュベートした後、ストレプトアビジン化磁性ビーズを介してコンジュゲートを捕捉する従来の方法を使用して、固体支持体に直接的または間接的に、都合良く結合され得る。
【００２７】
核酸集合の増幅
以下に記載されるように、核酸のターゲット集合のアンプリコンは、各種の増幅技術により生成され得る。本発明の一態様では、多重ＰＣＲが、核酸混合物、特に、組換え免疫分子、例えば、Ｔ細胞受容体、Ｂ細胞受容体またはそれらの一部を含む混合物のメンバーを増幅するのに使用される。このような免疫分子の多重ＰＣＲを行うためのガイダンスは、参照により組み込まれる下記参考文献：Ｆａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ、米国特許出願公開第２０１１／０２０７１３４号明細書；Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ、米国特許出願公開第２００８／０１６６７１８号明細書；等に見出される。より完全に以下に記載されるように、一態様では、個々の核酸分子を空間的に分離する工程は、それぞれ、ターゲット配列に対して、テイル非相補を有するフォワードおよびリバースプライマーを使用して、予め選択された体細胞性に再配列された領域またはその一部（すなわち、ターゲット配列）の一次多重増幅を行い、メンバー配列が更なる操作を可能にする各端部における共通配列を有する、第１のアンプリコンを産生することにより達成される。例えば、このような共通端部は、複数のそれらに代えて、１つのフォワードプライマーおよび１つのリバースプライマーのみを使用する連続性増幅用、または、固体表面上の個々の分子のブリッジ増幅用等のプライマー結合部位を含んでもよい。このような共通端部は、上記された単独の増幅において付加されてもよいし、または、それらは、長いプライマー（例えば、５０〜７０塩基以上）の混合物を製造すること、および、同混合物における品質コントロールを訓練することに関連する困難性を避けるために、２工程法において付加されてもよい。（以下により完全に記載される）このような２工程法では、一次増幅は、プライマーテイルが第１のアンプリコンの配列の端部におけるフォワードおよびリバースプライマー結合部位のみを提供する長さに制限されること以外、上記された通りに行われる。ついで、二次増幅は、第２のアンプリコンの端部に対して更なる配列を付加する、これらのプライマー結合部位に特異的な二次増幅プライマーを使用して行われる。前記二次増幅プライマーは、ターゲット配列に対するテイル非相補を有する。前記ターゲット配列は、前記第２のアンプリコンの端部を形成し、前記第２のアンプリコンのクローン型を配列決定するのに関連して使用され得る。一実施形態では、このような付加された配列は、固体表面上でブリッジＰＣＲを行って、例えば、Ｓｏｌｅｘａ系シークエンシングが使用される場合、空間的に単離された個々の分子のクローン集合を生成するための、配列リードおよびプライマー結合部位を生成するためのプライマー結合部位を含んでもよい。この後者のアプローチでは、前記第２のアンプリコンからの配列サンプルは、前記サンプルの配列にアニーリング可能な相補のオリゴヌクレオチドと結合している固体表面上に配置される。その後、プライマー伸長、変性、アニーリングのサイクルが、テンプレートのクローン集合が形成されるまで実行される。好ましくは、前記サンプルのサイズは、（ｉ）それが、元のサンプル中のクローン型の効果的な提示を含む、および、（ｉｉ）前記固体表面上のクローン集合の密度がクローン型の明確���配列決定を可能にする範囲にあるように選択される。
【００２８】
増幅される領域は、完全なクローン配列または前記クローン配列の部分集合、例えば、免疫グロブリン遺伝子のＶ−Ｄジャンクション、Ｄ−Ｊジャンクション、免疫グロブリンの完全な可変領域、抗原認識領域またはＣＤＲ、例えば、相補性決定領域３（ＣＤＲ３）を含み得る。
【００２９】
ゲノムからのＤＮＡ増幅（またはＲＮＡを逆転写することによるｃＤＮＡの形成における核酸増幅）後に、個々の核酸分子は、単離されることができ、再度増幅されてもよく、ついで、個々に配列決定されてもよい。例示となる増幅プロトコルは、ｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１７：２２５７−２３１７（２００３）またはｖａｎ  Ｄｏｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ、米国特許出願公開第２００６／０２３４２３４号明細書において見出され得る。これらの文献は、参照により組み込まれる。簡潔に、例示となるプロトコルは、以下の通りである。反応バッファー：ＡＢＩバッファーＩＩまたはＡＢＩ  Ｇｏｌｄバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；５０μＬの最終反応容量；１００ｎｇのサンプルＤＮＡ；１０ｐｍｏｌの各プライマー（以下に記載されたバランス増幅に対する調節の対象）；最終濃度２００μＭでのｄＮＴＰ；最終濃度１．５ｍＭでのＭｇＣｌ２（ターゲット配列およびポリメラーゼに応じた最適化の対象）；Ｔａｑポリメラーゼ（１〜２Ｕ／チューブ）；サイクル条件：９５℃で７分の前活性化；６０℃でのアニーリング；サイクル時間：３０秒の変性；３０秒のアニーリング；３０秒の伸長。本発明の方法における増幅に使用され得るポリメラーゼは市販されており、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅポリメラーゼまたはＰｆｕがあげられる。使用するポリメラーゼの選択は、忠実度または効率が好ましいかどうかに基づくことができる。
【００３０】
プールからの核酸を単離するための方法は、ＤＮＡベクター内に核酸をサブクローニングし、細菌を形質転換し（細菌クローニング）、固体基材（例えば、ガラススライド）上で二次元において分子を空間分離し、ミセル内の溶液中で三次元において分子を空間的に分離する（例えば、固体表面、例えば、ビーズ上に分子を固定するか、または、固定しない、オイルエマルジョンを使用して達成され得る）、または、マイクロ反応チャンバ、例えば、マイクロ流動チップまたはナノ流動チップを使用することを含む。希釈は、平均において、１つの分子が、所定の容量、空間領域、ビーズまたは反応チャンバ中に存在するのを確保するのに使用され得る。個々の核酸分子を単離するこのような方法についてのガイダンスは、下記参考文献：Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１ｓ）；Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９：１７２８−１７３２（例えば、ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌ）（２００５）；米国特許第６，３００，０７０号明細書；Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４５６：５３−５９（例えば、ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌ）（２００８）；米国特許第７，３２３，３０５号明細書；Ｍａｔｓｕｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，２０：１４８２−１４９０（２００５）：米国特許第６，７５３，１４７号明細書；等に見出される。
【００３１】
リアルタイムＰＣＲ、ピコグリーン染色、ナノ流動電気泳動（例えば、ＬａｂＣｈｉｐ）またはＵＶ吸光測定が、増幅可能な材料の機能性量を判定する最初の工程に使用され得る。
【００３２】
一態様では、多重増幅は、開始集合における配列の相対量が、増幅された集合またはアンプリコンにおけるそれらと実質的に同じであるように行われる。すなわち、多重増幅は、サンプル集合のメンバー配列の中から、最少増幅偏りにより行われる。一実施形態では、このような相対量は、アンプリコンにおける各相対量が前記開始サンプルにおけるその値の５倍以内である場合に、実質的に同じである。別の実施形態では、このような相対量は、アンプリコンにおける各相対量が前記開始サンプルにおけるその値の２倍以内である場合に、実質的に同じである。以下により完全に記載されるように、ＰＣＲにおける増幅偏りは、ＰＣＲプライマーのセットが、任意のサンプルの偏りのない増幅を提供する所定のレパートリを選択し得るように、従来技術を使用して検出および収集され得る。
【００３３】
一実施形態では、増幅偏りは、（上記された）２段階増幅を行うことにより避けることができる。この場合、少数の増幅サイクルが、ターゲット配列を含むテイル非相補を有するプライマーを使用する、第１または一次段階において実行される。前記テイルは、前記一次アンプリコンの配列の端部に付加されるプライマー結合部位を含む。したがって、このような部位は、１つのフォワードプライマーおよび１つのリバースプライマーのみを使用する第２段階の増幅において使用され、これにより、増幅偏りの主要な要因を除去する。一部の実施形態では、前記一次ＰＣＲは、種々のプライマーによる差異のある増幅を最少化するために、少数の十分なサイクル（例えば、５〜１０回）を有するであろう。二次増幅は、一対のプライマーにより行われるため、差異のある増幅の問題は最小である。前記一次ＰＣＲの１パーセントが、前記二次ＰＣＲに直接使用される。前記２つの増幅間に使用される３５サイクル（１００倍希釈工程を含まない約２８サイクルに相当）は、サイクルの内訳が、１サイクルの一次および３４サイクルの二次または２５サイクルの一次および１０サイクルの二次であったにも関わらず、強固な増幅を示すのに十分であった。前記一次ＰＣＲにおいて、１サイクルのみを理想的に行うことで、増幅偏りを低下させ得る場合でさえ、他の考慮が存在する。この一態様は、表現である。これは、開始入力量が最終的に取得されるリード数に対して過剰でない場合に、役割を果たす。例えば、１，０００，０００個のリードが取得される場合、１，０００，０００個の入力分子で開始し、ついで、前記二次増幅に、１００，０００個の分子からの表現のみを取得することは、元のサンプル中の異なる種類の相対的存在度を推定する正確性を低下させるであろう。前記２工程間での１００倍希釈は、前記一次ＰＣＲ増幅が明らかに１００個の分子より多く生成される限り、前記表現が低下することを意味する。これは、最少８サイクル（２５６倍）、より適切には、１０サイクル（約１，０００倍）が使用され得ることを示す。それに対する代替手段は、１％より多くの前記一次ＰＣＲを、前記二次に使用することであるが、前記一次ＰＣＲに使用されたプライマーが高濃度であるため、大きな希釈因子が、これらのプライマーが増幅を妨害せず、配列間の増幅偏りを悪化させないことを確保するのに使用され得る。別の代替手段は、それのより小さい希釈を可能にするために、前記一次ＰＣＲからのプライマーを除去するための精製または酵素工程を追加することである。この例では、前記一次ＰＣＲは、１０サイクルであり、前記二次は、２５サイクルであった。
【００３４】
簡潔に、ＩｇＨコード核酸（ＲＮＡ）を増幅するための（上記引用された）ＦａｈａｍおよびＷｉｌｌｉｓのスキームは、図１Ａ〜１Ｃに図示される。核酸（１２００）は、サンプル中のリンパ球から抽出され、Ｃ領域（１２０３）に特異的なプライマー（１２０２）、および、免疫グロブリンまたはＴＣＲ遺伝子の種々のＶ領域（１２０６）に特異的なプライマー（１２１２）によるＰＣＲにおいて組み合わせられる。プライマー（１２１２）はそれぞれ、第２段階の増幅用のプライマー結合部位を提供する同一のテイル（１２１４）を有する。上記されたように、プライマー（１２０２）は、Ｃ領域（１２０３）とＪ領域（１２１０）との間のジャンクション（１２０４）に隣接して位置する。ＰＣＲにおいて、Ｃコード領域（１２０３）の一部、Ｊコード領域（１２１０）、Ｄコード領域（１２０８）およびＶコード領域（１２０６）の一部を含むアンプリコン（１２１６）が生成される。アンプリコン（１２１６）は、さらに、プライマーＰ５（１２２２）およびプライマーＰ７（１２２０）を使用する第２段階において増幅される。それらはそれぞれ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＤＮＡシークエンサーにおいて使用するために設計されたテイル（１２２４および１２２１／１２２３それぞれ）を有する。プライマーＰ７（１２２０）のテイル（１２２１／１２２３）は、配列決定プロセスにおいて、別々のサンプルを標識するためのタグ（１２２１）を包含してもよい。第２段階の増幅は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＤＮＡシークエンサーにおいて使用され得るアンプリコン（１２３０）を生成する。
【００３５】
配列リードの生成
核酸を配列決定するための任意の高スループット技術が、本発明の方法において使用され得る。好ましくは、このような技術は、少なくとも１０００個のクローン型が決定され得る、好ましくは、少なくとも１０，０００から１，０００，０００個のクローン型が決定され得る、配列データ量を、対費用効果の高い方法で、生成する能力を有する。ＤＮＡ配列決定技術としては、標識されたターミネータまたはプライマーおよび平板またはキャピラリにおけるゲル分離を使用する古典的なジデオキシ配列決定反応（Ｓａｎｇｅｒ法）、可逆的に末端化された標識ヌクレオチドを使用する合成による配列決定、パイロシークエンシング、４５４シークエンシング、標識オリゴヌクレオチドプローブのライブラリに対する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、ライゲーション、重合工程中の標識ヌクレオチドの包含のリアルタイムモニタリングに続く標識クローンのライブラリに対する対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを使用する合成による配列決定、ポロニーシークエンシングならびにＳｏＬｉＤシークエンシングがあげられる。分離された分子の配列決定は、ごく最近、ポリメラーゼまたはリガーゼを使用する連続的または単独での伸長反応により、ならびに、プローブのライブラリとの単独または連続的な差異のあるハイブリダイゼーションにより説明されてきた。これらの反応は、多くのクローン配列において平行して、例えば、１億個を超える配列の現在商業的用途において平行して行われてきた。本発明の一態様では、固体表面上で個々の分子を空間的に単離する工程を含む配列決定の高スループット法が使用される。この場合、それらは、平行して配列決定される。このような固体表面は、非多孔性表面（例えば、Ｓｏｌｅｘａシークエンシング、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４５６：５３−５９（２００８）、または、完全なゲノム配列決定、例えば、Ｄｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２７：７８−８１（２０１０））、ビーズ−もしくは粒子−結合テンプレートを含み得るウェルのアレイ（例えば、４５４による、例えば、Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，４３７：３７６−３８０（２００５）、または、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシークエンシング、米国特許出願公開第２０１０／０１３７１４３号もしくは同第２０１０／０３０４９８２号明細書）、微細加工膜（例えば、ＳＭＲＴシークエンシングによる、例えば、Ｅｉｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２３：１３３−１３８（２００９））、または、ビーズアレイ（例えば、ＳＯＬｉＤシークエンシングもしくはポロニーシークエンシングによる、例えば、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１６：１４８１−１４１４（２００７））を含んでもよい。別の態様では、このような方法は、単離された分子を、それらが固体表面上で空間的に単離される前または後のいずれかで増幅する工程を含む。先の増幅は、エマルジョン系増幅、例えば、エマルジョンＰＣＲまたは回転サイクル増幅を含んでもよい。具体的な対象は、Ｓｏｌｅｘａ系シークエンシングである。この場合、個々のテンプレート分子は、固体表面上で空間的に単離される。その後、それらは、分離したクローン集合��たはクラスターを形成するために、ブリッジＰＣＲにより平行して増幅され、ついで、（上記引用された）Ｂｅｎｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌおよび製造メーカーの説明書（例えば、ＴｒｕＳｅｑ（商標）サンプル調製キットおよびデータシート、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、２０１０）；ならびに、さらに下記参考文献：米国特許第６，０９０，５９２号；同第６，３００，０７０号；同第７，１１５，４００号明細書；および、欧州特許第０９７２０８１号明細書に記載されたように配列決定される。これらの文献は、参照により組み込まれる。一実施形態では、固体表面上に配置され、増幅される個々の分子は、１ｃｍ２あたりに少なくとも１０５のクラスター密度で；または、１ｃｍ２あたりに少なくとも５×１０５のクラスター密度で；または、１ｃｍ２あたりに少なくとも１０６のクラスター密度でクラスターを形成する。一実施形態では、比較的高いエラー率を有する配列決定化学が使用される。このような実施形態では、このような化学により生成される平均品質スコアは、配列リード長の機能を単調に減退させている。一実施形態では、０．５パーセントの配列リードに対応するこのような減退は、１〜７５位において、少なくとも１つのエラーを有し；１パーセントの配列リードは、７６〜１００位において、少なくとも１つのエラーを有し；２パーセントの配列リードは、１０１〜１２５位において、少なくとも１つのエラーを有する。
【００３６】
一態様では、個体の配列系クローン型プロファイルは、下記工程：（ａ）個体のＢ細胞から、核酸サンプルを取得する工程；（ｂ）このような核酸サンプル由来の個々の分子を空間的に単離する工程であって、前記個々の分子は、前記サンプル中の核酸から生成された少なくとも１つのテンプレートを含み、前記テンプレートが、体細胞性に再配列された領域もしくはその一部を含み、個々の各分子が、少なくとも１つの配列リードを産生可能である工程；（ｃ）前記空間的に単離された個々の分子を配列決定する工程；ならびに、（ｄ）クローン型プロファイルを生成するために、前記核酸サンプルから前記核酸分子の種々の配列の存在度を決定する工程を使用して取得される。一実施形態では、前記体細胞性に再配列された領域はそれぞれ、Ｖ領域およびＪ領域を含む。別の実施形態では、前記配列決定工程は、少なくとも１つのフォワード配列リードおよび少なくとも１つのリバース配列リードを産生するために、空間的に単離された個々の分子それぞれを、双方向性に配列決定する工程を含む。後者の実施形態に対して、さらに、前記少なくとも１つのフォワード配列リードおよび前記少なくとも１つのリバース配列リードは、オーバーラップ領域を有する。したがって、このようなオーバーラップ領域の塩基は、このような配列リード間の逆相補関係により決定される。さらに別の実施形態では、前記体細胞性に再配列された領域はそれぞれ、Ｖ領域およびＪ領域を含み、前記配列決定工程は、Ｊ領域における位置から開始し、その関連するＶ領域の方向に伸長する、１つ以上のそのフォワード配列リードおよび少なくとも１つのリバース配列リードから、個々の核酸分子それぞれの配列を決定する工程をさらに含む。別の実施形態では、個々の分子は、完全なＩｇＨ分子、不完全なＩｇＨ分子からなる群から選択される核酸を含む。別の実施形態では、前記配列決定工程は、単調に低下する品質スコアを有する配列リードを生成する工程を含む。後者の実施形態に対して、さらに、単調に低下する品質スコアは、前記配列リードが、下記より良くないエラー率を有するようになっている。０．２パーセントの配列リードは、１から５０の塩基位置において、少なくとも１つのエラーを含む。０．２から１．０パーセントの配列リードは、５１〜７５位において、少なくとも１つのエラーを含む。０．５から１．５パーセントの配列リードは、７６〜１００位において、少なくとも１つのエラーを含む。別の実施形態では、上記方法は、下記工程：（ａ）前記個体のＴ細胞および／またはＢ細胞から、核酸サンプルを取得する工程；（ｂ）このような核酸サンプル由来の個々の分子を空間的に単離する工程であって、前記個々の分子が、前記サンプル中の核酸からそれぞれ生成された入れ子状態のセットのテンプレートを含み、それぞれが、体細胞性に再配列された領域またはその一部を含み、各入れ子状態のセットが、複数の配列リードを産生可能であり、それぞれが、同じ方向に伸長し、それぞれが、前記入れ子状態のセットが生成された前記核酸上における異なる位置から開始する工程；（ｃ）前記空間的に単離された個々の分子を配列決定する工程；ならびに、（ｄ）クローン型プロファイルを生成するために、前記核酸サンプルから、前記核酸分子の種々の配列の存在度を決定する工程を含む。一実施形態では、前記配列決定工程は、前記入れ子状態のセットのそれぞれについて、複数の配列リードを産生する工程を含む。別の実施形態では、前記体細胞性に再配列された領域はそれぞれ、Ｖ領域およびＪ領域を含み、前記複数の配列リードはそれぞれ、前記Ｖ領域における異なる位置から開始し、その関連するＪ領域の方向に伸長する。
【００３７】
一態様では、個体由来の各サンプルについて、本発明の方法に使用される配列決定技術は、ランあたりに少なくとも１０００個のクローン型の配列を生成する。別の態様では、このような技術は、ランあたりに少なくとも１０，０００個のクローン型の配列を生成する。別の態様では、このような技術は、ランあたりに少なくとも１００，０００個のクローン型の配列を生成する。別の態様では、このような技術は、ランあたりに少なくとも５００，０００個のクローン型の配列を生成する。別の態様では、このような技術は、ランあたりに少なくとも１，０００，０００個のクローン型の配列を生成する。さらに別の態様では、このような技術は、個体サンプルあたりの、ランあたりに１００，０００から１，０００，０００個の間のクローン型の配列を生成する。一部の実施形態では、前述のクローン型数はそれぞれ、２から１００個の配列リードから決定される。他の実施形態では、前述のクローン型数はそれぞれ、２から１０個の配列リードから決定される。さらに他の実施形態では、前述のクローン型数はそれぞれ、少なくとも１０個の配列リードから決定される。
【００３８】
提供された発明の方法に使用される配列決定技術は、リードあたりに、約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約６０ｂｐ、約７０ｂｐ、約８０ｂｐ、約９０ｂｐ、約１００ｂｐ、約１１０、約１２０ｂｐ、リードあたりに、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約４５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約５５０ｂｐまたは約６００ｂｐを生成し得る。
【００３９】
配列データからのクローン型の生成
配列リードデータからのクローン型の構築は、（上記引用された）ＦａｈａｍおよびＷｉｌｌｉｓに開示されている。同文献は、参照により本明細書に組み込まれる。簡潔に、種々の方法が、種々の予測されるリード長およびデータ品質を有するように、配列リードデータからのクローン型の構築は、部分的に、このようなデータを生成するのに使用される配列決定法により決まる。１つのアプローチでは、Ｓｏｌｅｘａシークエンサーが、分析用の配列リードデータを生成するのに使用される。一実施形態では、少なくとも１００万個のテンプレート分子を産生するために、少なくとも０．５−１．０×１０６個のリンパ球を提供するサンプルが取得される。その後、任意の増幅により、対応する１００万個以上のテンプレート分子のクローン集合（またはクラスター）が産生されてもよい。ほとんどの高スループットの配列決定アプローチ、例えば、Ｓｏｌｅｘａアプローチについて、クラスターレベルでのこのようなオーバーサンプリングは、配列決定の精度を向上させるために、各テンプレート配列が、大きい度合いの重複性により決定されるために望ましくある。Ｓｏｌｅｘａ系の実行について、好ましくは、それぞれ独立したテンプレートの配列は、１０回以上決定される。種々の予測されたリード長およびデータ品質を有する他の配列決定アプローチについて、種々のレベルの重複性が、配列決定の比較可能な精度に使用されてもよい。当業者は、上記パラメータ、例えば、サンプルサイズ、重複性等が、具体的な適用に関連する設計選択であることを理解する。
【００４０】
一態様では、（図２Ａに図示された）ＩｇＨ鎖のクローン型は、そのＣ領域において開始し、その関連するＶ領域の方向に伸長する、少なくとも１つの配列リード（本明細書において、「Ｃリード」（２３０４）とも呼ばれる）、および、そのＶ領域において開始し、その関連するＪ領域の方向に伸長する少なくとも１つの配列リード（本明細書において、「Ｖリード」（２３０６）と呼ばれる）により決定される。このようなリードは、オーバーラップ領域（２３０８）を有してもよいし、または、有しなくてもよい。このようなオーバーラップは、図２Ａに示されたように、ＮＤＮ領域（２３１５）を包含してもよいし、または、包含しなくてもよい。オーバーラップ領域（２３０８）は、完全に前記Ｊ領域にあってもよいし、完全に前記ＮＤＮ領域にあってもよいし、完全に前記Ｖ領域にあってもよく、または、それは、（図２Ａに図示されたように）Ｊ領域−ＮＤＮ領域の境界もしくはＶ領域−ＮＤＮ領域の境界またはこのような境界の両方を包含してもよい。典型的には、このような配列リードは、合成反応による配列決定におけるポリメラーゼにより、配列決定プライマー、例えば、図２Ａにおける（２３０２）および（２３１０）を伸長することにより生成される、例えば、Ｍｅｔｚｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：３１−４６（２０１０）；Ｆｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２７：１０１３−１０２３（２００９）。プライマー（２３０２）および（２３１０）についての結合部位は、それらが、最初のアライメントおよび配列リードの分析用の開始点またはアンカー点を提供し得るように予め決定される。一実施形態では、Ｃリードは、それが、ＩｇＨ鎖のＤおよび／またはＮＤＮ領域を包含し、例えば、図２Ａおよび２Ｂに図示されたように、隣接するＶ領域の一部を含むように配置される。一態様では、前記Ｖ領域における前記Ｖリードおよび前記Ｃリードのオーバーラップは、前記リードを互いに整列させるのに使用される。他の実施形態では、配列リードのこのようなアライメントは不要である。したがって、Ｖリードは、クローン型の特定のＶ領域を特定するのに十分長いのみでもよい。この後者の態様は、図２Ｂに図示される。配列リード（２３３０）は、別の配列リードとの重複を伴って、または、同重複を伴わずに、Ｖ領域を特定するのに使用される。別の配列リード（２３３２）は、ＮＤＮ領域を通過し、その配列を決定するのに使用される。前記Ｖ領域内に伸長する配列リード（２３３２）の一部（２３３４）は、配列リード（２３３２）の配列情報を、クローン型を決定する配列リード（２３３０）のそれと関連付けるのに使用される。一部の配列決定法、例えば、ｂａｓｅ−ｂｙ−ｂａｓｅアプローチ、例えば、Ｓｏｌｅｘａシークエンシング法について、配列決定ラン時間および試薬コストは、分析における配列決定サイクルの数を最少化することにより低減される。図２Ａに図示されたように、アンプリコン（２３００）は、種々の生物学的サンプル、例えば、種々の患者から取得するクローン型間を区別するためのサンプルタグ（２３１２）により産生されてもよい。サンプルタグ（２３１２）は、プライ��ー結合領域（２３１６）に対してプライマーをアニーリングし、それを伸長して（２３１４）、サンプルタグ（２３１２）がデコードされる、タグ（２３１２）を横切る配列リードを産生することにより特定されてもよい。
【００４１】
本発明の一態様では、クローン型の配列は、例えば、選択された鎖のＶ（Ｄ）Ｊ領域に沿った、１つ以上の配列リードからの情報を組み合わせることにより決定されてもよい。別の態様では、クローン型の配列は、複数の配列リードからの情報を組み合わせることにより決定される。このような複数の配列リードは、センス鎖（すなわち、「フォワード」配列リード）に沿った１つ以上の配列リード、および、その相補鎖（すなわち、「リバース」配列リード）に沿った１つ以上の配列リードを含んでもよい。複数の配列リードが、同じ鎖に沿って生成される場合、まず、別々のテンプレートが、前記配列リードの種々の位置について選択されたプライマーにより、サンプル分子を増幅することにより生成される。この概念は、図３Ａに図示される。この場合、プライマー（３４０４、３４０６および３４０８）は、アンプリコン（３４１０、３４１２および３４１４それぞれ）を、１つの反応において生成するのに使用される。このような増幅は、同じ反応において、または、別々の反応において行われてもよい。一態様では、ＰＣＲが使用される場合は必ず、別々の増幅反応が、別々のテンプレートを生成するのに使用され、次に、同じ鎖に沿って複数の配列リードを生成するのに、組み合わせられ、使用される。この後者のアプローチは、複数のテンプレートの同等の増幅（本明細書において、「平衡した増幅」または「偏りのない増幅」と呼ばれる場合もある）を確保するために、プライマー濃度（および／または他の反応パラメータ）を釣り合わせる必要を避けるのに好ましい。別々の反応におけるテンプレートの生成は、図３Ｂ〜３Ｃに図示される。そこでは、ＩｇＨ（３４００）を含むサンプルは、３つの部分（３４７０、３４７２および３４７４）に分割される。それらは、Ｊ領域プライマー（３４０１）ならびにＶ領域プライマー（３４０４、３４０６および３４０８それぞれ）を使用する別々のＰＣＲに添加されて、アンプリコン（３４２０、３４２２および３４２４それぞれ）を産生する。ついで、後者のアンプリコンは、ブリッジＰＣＲ用のテンプレート（３４８２）を調製するために、Ｐ５およびＰ７プライマーを使用する二次ＰＣＲ（３４８０）において、組み合わせられ（３４７８）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＧＡシークエンサー等の機器において配列決定される。
【００４２】
本発明の配列リードは、使用される配列決定技術により部分的に決まる、広い各種の長さを有してもよい。例えば、一部の技術について、複数のトレードオフが、その実行、例えば、（ｉ）テンプレートあたりの配列リードの数および長さ、ならびに、（ｉｉ）配列決定操作のコストおよび持続時間において生じる場合がある。一実施形態では、配列リードは、２０から３４００ヌクレオチドの範囲である。別の実施形態では、配列リードは、３０から２００ヌクレオチドの範囲である。さらに別の実施形態では、配列リードは、３０から１２０ヌクレオチドの範囲である。一実施形態では、１から４個の配列リードが、各クローン型の配列を決定するために生成される。別の実施形態では、２から４個の配列リードが、各クローン型の配列を決定するために生成される。別の実施形態では、２から３個の配列リードが、各クローン型の配列を決定するために生成される。前述の実施形態では、与えられた前記数は、種々の個体からのサンプルを特定するのに使用される配列リードを除いている。以下に記載される実施形態に使用される種々の配列リード長は、前記リードにより捕捉されるのが求められる情報にも基づいて変動してもよい。例えば、配列リードの開始位置および長さは、ＮＤＮ領域の長さおよびそのヌクレオチド配列を提供するように設計されてもよい。このため、ＮＤＮ領域全体にまたがる配列リードが選択される。他の態様では、Ｄおよび／またはＮＤＮ領域を（別々でなく）組み合わせにおいて包含する１つ以上の配列リードが十分である。
【００４３】
本発明の別の態様では、クローン型の配列は、部分的に、配列リードを１つ以上のＶ領域参照配列および１つ以上のＪ領域参照配列に対して整列させ、部分的に、例えば、非常に可変性のＮＤＮ領域において、参照配列に対してアライメントさせずに塩基決定により決定される。各種のアライメントアルゴリズムが、前記配列リードおよび参照配列に適用され得る。例えば、アライメント法を選択するためのガイダンスは、Ｂａｔｚｏｇｌｏｕ，Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，６：６−２２（２００５）において入手できる。同文献は、参照により組み込まれる。一態様では、（上記されたように）ＶリードおよびＣリードが、ＶおよびＪ領域参照配列に対して整列される場合には必ず、例えば、一般的に、（上記引用された）ＧｕｓｆｉｅｌｄおよびＣｏｒｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｔｈｅ  ＭＩＴ  Ｐｒｅｓｓ，２００９）に記載された、ツリー検索アルゴリズムが使用される。
【００４４】
配列リードからのＩｇＨクローン型の構築は、少なくとも２つの要因：ｉ）アライメントをより困難にする体細胞性変異の存在、および、ｉｉ）ＮＤＮ領域が、Ｃリードに対してＶセグメントの一部をマップするのが多くの場合不可能であるほど大きいことにより特徴付けられる。本発明の一態様では、この問題は、Ｖリードを生成するための複数のプライマーセットを使用することにより克服される。前記Ｖリードは、好ましくは、プライマー結合部位が、オーバーラップせず、空間が開いており、ＮＤＮ領域に、例えば、一実施形態では、Ｖ−ＮＤＮジャンクションから５〜５０塩基、または、別の実施形態では、Ｖ−ＮＤＮジャンクションから１０〜５０塩基で隣接する、少なくとも１つのプライマー結合部位を含むように、Ｖ領域に沿った種々の位置に位置する。複数のプライマーセットの重複性は、１つまたは２つのプライマーの失敗が体細胞性変異により影響を受ける結合部位を有することによるため、クローン型の検出を失敗するリスクを最少化する。さらに、ＮＤＮ領域に隣接する少なくとも１つのプライマー結合部位の存在は、ＶリードがＣリードとオーバーラップするために、効果的に、Ｃリード長を伸長するであろうことの可能性をより高める。これは、全てのサイズのＮＤＮ領域にまたがり、ＮＤＮ領域の両サイドにおけるＶおよびＪ領域全体も実質的にマップし得る、連続的な配列の生成を可能にする。このようなスキームを行うための実施形態は、図３Ａおよび３Ｄに図示される。図３Ａにおいて、ＩｇＨ鎖（３４００）を含むサンプルは、Ｊ領域プライマー（３４０１）および複数（３つが示される）のセットのＶ領域（３４０２）プライマー（３４０４、３４０６、３４０８）の１つのセットにより鎖を増幅することにより、各鎖についての複数のアンプリコンを生成することにより配列決定されて、同じＮＤＮ領域を含み、Ｖ領域（３４０２）の成功した、より長い部分（３４１１、３４１３、３４１５）を包含する種々の長さを有する、複数の入れ子状態のアンプリコン（例えば、３４１０、３４１２、３４１４）を産生する。入れ子状態のセットのメンバーは、その各ＮＤＮ、Ｊおよび／またはＣ領域の同一性（または実質的な同一性）に注目することにより配列決定した後に互いにグループ化されてもよい。これにより、限定されたリード長および／または配列品質による配列決定プラットホームについての他の方法の場合においてより、長いＶ（Ｄ）Ｊセグメントの再構築が可能となる。一実施形態では、前記複数のプライマーセットは、２から５個の範囲の数でもよい。別の実施形態では、前記複数は、２〜３個である。さらに別の実施形態では、前記複数は、３個である。複数における前記プライマーの濃度および位置は、広く変動し得る。前記Ｖ領域プライマーの濃度は、同じでもよいし、または、同じでなくてもよい。一実施形態では、ＮＤＮ領域に最も近いプライマーは、例えば、ＮＤＮ領域を含むアンプリコンが、得られたアンプリコンを代表することを保証するために、前記複数の他のプライマーより高い濃度を有する。複数の３つのプライマーが使用される具体的な実施形態では、６０：２０：２０の濃度比が使用される。ＮＤＮ領域（３４４４）に隣接する１つ以上のプライマー（例えば、図３Ｄにおける３４３５および３４３７）は、Ｊ領域プライマー（３４３２）により生成される配列リード（３４４２）とオーバーラップする、１つ以上の配列リード（例えば、３４３４および３４３６）を生成するのに使用されてもよい。これにより、オーバーラップ領域（３４４０）における塩基コールの品質が改善される。前記複数のプライマーからの配列リードは、隣接する下流のプライマー結合部位および／または隣接する下流の配列リードとオーバーラップしてもよいし、または、オーバーラップしなくてもよい。一実施形態では、ＮＤＮ領域に近位の配列リード（例えば、３４３６および３４３８）は、クローン型に関連する特定のＶ領域を特定するのに使用されてもよい。このような複数のプライマーは、１つのプライマー結合部位が免疫グロブリン発展中に超変異される場合に、不完全または失敗した増幅の確率を低減する。それは、Ｖ領域の超変異により導入された多様性がクローン型配列において捕捉されるであろう確率も向上させる。二次ＰＣＲは、例えば、図示されたＰ５（３４０１）およびＰ７（３４０４、３４０６、３４０８）プライマーにより増幅することにより配列決定するための入れ子状態のアンプリコンを調製して、アンプリコン（３４２０、３４２２および３４２４）を産生するのに行われてもよい。前記アンプリコンは、固体表面上に１つの分子として分布され得る。この場合、それらは、さらに、ブリッジＰＣＲ等の技術により増幅される。
【００４５】
体細胞性の超変異
一実施形態では、体細胞性の超変異を受けているＩｇＨ系クローン型は、下記のように決定される。体細胞性変異は、（関連するセグメント、通常、Ｖ、ＪまたはＣの）参照配列の対応する塩基とは異なり、統計学的に有意な数のリードに存在する、配列決定された塩基として規定される。一実施形態では、Ｃリードは、Ｊセグメントおよび同様にＶセグメントについてのＶリードに対する体細胞性変異を見出すのに使用されてもよい。ＪまたはＶセグメントに直接マップされるか、または、ＮＤＮ境界までクローン型拡張の中であるかのいずれかである、ＣおよびＶリードの部分のみが使用される。この方法では、ＮＤＮ領域は避けられ、（真に異なる組換えＮＤＮ領域である変異ヌクレオチドとして誤って分類するのを避けるために）クローン型決定に先に使用された、同じ「配列情報」は、変異発見に使用されない。各セグメント型について、マップされたセグメント（主要な対立遺伝子）は、スキャフォールドとして使用され、リードマッピング段階中にこの対立遺伝子にマップされた全てのリードが考慮される。少なくとも１つのリードがマップされている参照配列の各位置が、体細胞性変異について分析される。一実施形態では、有効な変異としての非参照塩基を受容するための評価基準は、下記：１）所定の変異塩基を有する少なくともＮ個のリード、２）少なくとも所定の分数Ｎ／Ｍのリード（ここで、Ｍは、この塩基位置でマップされたリードの総数である）ならびに、３）二項分布、前記変異塩基でのＮ個のリードの平均Ｑスコアおよび非変異塩基を有するリード数（Ｍ−Ｎ）に基づく統計学的カットを含む。好ましくは、上記パラメータは、クローン型あたりの変異の誤った発見率が、１０００に１未満、より好ましくは、１００００に１未満であるように選択される。
【００４６】
ＰＣＲエラーは、ＰＣＲの初期サイクルにおいて変異したいくつかの塩基に集中すると予測される。配列決定エラーは、前記エラーが、おそらく一部の組織的偏りを有することである場合、全くランダムに、多くの塩基に分布されると予測される。いくつかの塩基が、５％というより高い率（平均の５倍）で、配列決定エラーを有するであろうことが仮定される。これらの仮定をすれば、配列決定エラーは、エラーの最も有力なタイプとなる。非常に関連するクローン型の発生からＰＣＲエラーを区別することは、分析において役割を果たすであろう。２つ以上の非常に関連するクローン型が存在することを決定するための生物学的有意性を仮定すれば、このようなコールを作製する保存的アプローチが使用される。２つ以上のクローン型が存在する、（９９．９％という）高い信頼性を有するのを確保するように、より少ないクローン型の十分な検出が考慮される。１００コピー／１，０００，０００で存在するクローン型の例としては、独立したクローン型と指定されるより少ない変異体は、１４回以上検出される。同様に１，０００コピー／１，０００，０００で存在するクローン型について、独立したクローン型と指定される前記より少ない変異体は、７４回以上検出され得る。このアルゴリズムは、各配列決定された塩基について得られる塩基品質スコアを使用することにより向上され得る。品質スコアとエラー率との間の関係が上記のように検証され、ついで、全ての塩基についての保存的な５％エラー率を使用するのに代える場合、前記品質スコアは、独立したクローン型をコールするのに存在する必要があるリード数を決定するのに使用され得る。前記全てのリードにおける特定塩基の品質スコア中央値が使用されることができ、または、より厳密に、エラーである確率は、各リードにおける特定塩基の品質スコアを与えるように処理され得る。ついで、前記確率は、その塩基についての配列決定エラー数をおそらく推定するために、（独立性を仮定して）組み合わせられ得る。結果として、種々の品質スコアを有する種々の塩基についての配列決定エラー仮定を否定する種々の閾値が存在する。例えば、クローン型が１，０００コピー／１，０００，０００で存在することについて、エラーの確率が０．０１および０．０５それぞれであったとし、２２および７４回検出される場合、前記より少ない変異体は、独立していると指定される。
【００４７】
配列決定エラーの存在において、真の各クローン型は、その配列に対して変化するエラー数を有するリードの「雲」により取り囲まれている。前記配列決定エラーの「雲」は、距離が配列空間におけるクローン型から増加すると、密度が少なくなる。各種のアルゴリズムが、配列リードをクローン型に変換するのに利用可能である。一態様では、配列リードの合体（すなわち、１つ以上の配列決定エラーを有することが決定された候補クローン型を組み合わせること）は、少なくとも３つの要因：前記クローン型それぞれについて得られた配列数が比較されること；塩基数が異なること；および、一致しない位置での配列決定品質スコアにより決まる。予測されたエラー率およびエラーの二項分布に基づく確度が構築され、評価されてもよい。例えば、低い配列決定品質の領域におけるそれらの間に１つの差異を有する、一方が１５０個のリードを有し、他方が２個のリードを有する、２つのクローン型は、それらがおそらく配列決定エラーにより生成される場合、おそらく合体されるであろう。一方、それらの間に２つの差異を有する、一方が１００個のリードを有し、他方が５０個のリードを有する、２つのクローン型は、それらが配列決定エラーにより生成されそうもないと考えられる場合、合体されない。本発明の一実施形態では、以下に記載されるアルゴリズムが、配列リードからクローン型を決定するのに使用されてもよい。本発明の一態様では、まず、配列リードは、候補クローン型に変換される。このような変換は、使用される配列決定プラットホームにより決まる。高いＱスコアの長い配列リードを生成するプラットホームについて、前記配列リードまたはその一部が、候補クローン型として、直接取得されてもよい。より低いＱスコアのより短い配列リードを生成するプラットホームについて、一部のアライメントおよびアッセンブリの工程は、関連する配列リードのセットを、候補クローン型に変換するのに必要とされる場合がある。例えば、Ｓｏｌｅｘａ系プラットホームについて、一部の実施形態では、候補クローン型は、上記されたように、例えば、１０以上の複数のクラスターからの、対のリードの収集から生成される。
【００４８】
各候補クローン型を取り囲む配列リードの雲は、前記二項分布および一塩基エラーの確率についての単純なモデルを使用してモデル化され得る。この後者のエラーモデルは、ＶおよびＪセグメントをマッピングすることから、または、クローン型発見アルゴリズム自体から、自己矛盾のないことおよび収束により推測され得る。モデルは、Ｘが配列空間のこの領域における真のクローン型のみであるヌル・モデル下において、完全なリードカウントＣ１を有する真のクローン型配列Ｘの一部である、（配列Ｘに対する）リードカウントＣ２およびＥエラーを有する、所定の「雲」配列Ｙの確率について構築される。決定は、パラメータＣ１、Ｃ２およびＥに基づいて、配列Ｙをクローン型Ｘに合体させるかどうかによりなされる。任意の所定のＣ１およびＥについて、最大値Ｃ２は、前記配列Ｙを合体させる決定をするために予め算出される。Ｃ２についての前記最大値は、Ｙがクローン型Ｘの一部である帰無仮説下において、Ｙを合体させるのに失敗する確率が、配列Ｘの周囲において、エラーＥを有する全ての可能性のある配列Ｙを統合した後に、一部の値Ｐ未満であるように選択される。値Ｐは、アルゴリズムの挙動をコントロールし、多少寛容に合体させる。
【００４９】
そのリードカウントがクローン型Ｘへの合体のための閾値Ｃ２を上回るために、配列Ｙがクローン型Ｘに合体させられない場合、例えば、それは、別々のクローン型をシード処理するための候補になる。このような原理を実行するアルゴリズムは、（Ｘとは独立していると見なされている）この配列Ｙに「より近い」任意の他の配列Ｙ２、Ｙ３等が、Ｘに集められないことを確認する。この「近さ」の概念は、ＹおよびＸに対するエラーカウントならびにＸおよびＹの絶対リードカウントの両方を含む。すなわち、それは、クローン型Ｘ周囲のエラー配列の雲についての上記モデルと同じ方法においてモデル化される。この方法では、「雲」配列は、それらが、２つ以上のクローン型の偶然「近く」にある場合、その正確なクローン型に適切に帰属し得る。
【００５０】
一実施形態では、アルゴリズムは、最も高いリードカウントを有する配列Ｘにより開始することにより、トップダウン法において進行する。この配列は、第１のクローン型をシードする。隣接した配列は、そのカウントが予め算出された閾値（上記参照）を下回る場合、このクローン型に合体されるか、または、それらが、前記閾値を上回る、もしくは、合体されなかった別の配列に「より近い」場合、そのままにされるかのいずれかである。最大エラーカウント内で全ての隣接する配列を検索した後、リードをクローン型Ｘに合体させるプロセスが完了する。そのリードおよびそれに合体させられた全てのリードが説明され、他のクローン型を作製するのに利用可能なリードのリストから除外される。ついで、次の配列が、最も高いリードカウントにより移動させられる。隣接するリードは、上記のように、このクローン型に合体させられる。このプロセスは、所定の閾値を上回るリードカウントを有する配列がもはや存在しなくなるまで、例えば、２つ以上のカウントを有する全ての配列がクローン型用のシードとして使用されるまで続けられる。
【００５１】
上記されたように、上記アルゴリズムの別の実施形態では、更なる試験が、候補配列Ｙを既存のクローン型Ｘに合体させるかどうかを決定するために追加されてもよい。前記クローン型Ｘは、関連する配列リードの品質スコアを考慮する。（配列Ｙを有する全てのリードにわたって平均化された）（１または複数の）平均品質スコアは、（１または複数の）配列Ｙについて決定される。配列ＹとＸとは異なる。前記平均スコアが所定の値を上回る場合、その差異は、合体されるべきでない真に異なるクローン型を示す可能性が高い。前記平均スコアがこのような所定の値を下回る場合、配列Ｙは、配列決定エラーにより生じるため、Ｘに合体されるべきである可能性が高い。
【００５２】
関連するクローン型のクラン
リンパ球は、関連するクローン型を頻繁に産生する。すなわち、配列が類似するクローン型を産生する複数のリンパ球が、存在または発展してもよい。これは、各種のメカニズム、例えば、ＩｇＨ分子の場合における超変異による場合がある。別の例として、ガン、例えば、リンパ系新生物において、１つのリンパ球前駆体は、わずかに異なるＴＣＲまたはＢＣＲをそれぞれ所有および／または発現している、多くの関連するリンパ球子孫をもたらすため、（１または複数の）ガン関連体細胞性変異、例えば、塩基置換、異常な再配列等による異なるクローン型をもたらす場合がある。このような関連するクローン型のセットは、本明細書では、「クラン」と呼ばれる。一部の場合には、クランのクローン型は、別のクランメンバーの変異から生じる場合がある。このような「子孫」クローン型は、系統学的クローン型と呼ばれる場合がある。クラン内のクローン型は、親クローン型に対する、または、互いに対する１つ以上の関連性の測定により特定され得る。一実施形態では、クローン型は、以下により完全に記載されるように、パーセント相同性により同じクラン内でグループ化されてもよい。別の実施形態では、クローン型は、Ｖ領域、Ｊ領域および／またはＮＤＮ領域の共通利用により、クランに帰属してもよい。例えば、クランは、共通のＪおよびＮＤ領域を有するが、異なるＶ領域を有するクローン型により規定されてもよいし、または、それは、（同一の塩基置換変異を含む）同じＶおよびＪ領域を有するが、異なるＮＤＮ領域を有するクローン型により規定されてもよいし、または、それは、クランメンバーを生成するために、１〜１０個の塩基もしくは１〜５個の塩基または１〜３個の塩基の１つ以上の挿入および／または欠失を受けているクローン型により規定されてもよい。別の実施形態では、クランのメンバーは、下記のように決定される。
【００５３】
クローン型は、それらが、下記評価基準：ｉ）それらが、クローン型配列における同じ相対位置において生じるマッピングにより、同じＶおよびＪ参照セグメントにマップされる、および、ｉｉ）そのＮＤＮ領域が実質的に同一である、を満たす場合、同じクランに帰属する。クランのメンバーシップに関連する「実質的」は、体細胞性変異がこの領域で生じている場合があるため、ＮＤＮ領域におけるいくつかの小さな差異が許容されることを意味する。好ましくは、一実施形態では、ＮＤＮ領域における変異を誤ってコールするのを避けるために、塩基置換がガン関連変異として受け入れられるかどうかは、前記クランのＮＤＮ領域のサイズにより直接的に決まる。例えば、ガン関連変異として、（１または複数の）クランＮＤＮ配列からの１塩基差を有し、（１または複数の）クランＮＤＮ配列の長さが、ｍ個以上のヌクレオチド、例えば、９個以上のヌクレオチドである場合、方法は、クランメンバーとしてクローン型を受け入れてもよいし、または、他の方法では、それは、受け入れない。または、それが、ガン関連変異として、（１または複数の）クランＮＤＮ配列からの２つの塩基差を有し、（１または複数の）クランＮＤＮ配列の長さが、ｎ個以上のヌクレオチド、例えば、２０個以上のヌクレオチドである場合、別の方法では、受け入れられない。別の実施形態では、クランのメンバーは、下記評価基準：（ａ）Ｖリードが同じＶ領域に対してマップする、（ｂ）Ｃリードが同じＪ領域にマップする、（ｃ）（上記されたように）ＮＤＮ領域が実質的に同一である、および、（ｄ）Ｖ−ＮＤＮの境界とＪ−ＮＤＮの境界との間のＮＤＮ領域の位置が同じ（または、同等、Ｄに対する下流塩基付加数およびＤに対する上流塩基付加数が同じである）、を使用して決定される。１つのサンプルのクローン型は、クラン内にグループ化されてもよい。種々のタイミングで取得される連続的なサンプルからのクランは、互いに比較されてもよい。特に、本発明の一態様では、疾患、例えば、リンパ系新生物に関連するクローン型を含むクランは、各サンプルのクローン型から特定され、病状、例えば、継続的な寛解、初期の再発、更なるクローン性進化の証拠等を決定するために、直前のサンプルのそれと比較される。本明細書で使用する時、クランに関連する「サイズ」は、前記クラン中のクローン型数を意味する。
【００５４】
上記されたように、一態様では、本発明の方法は、個々のクローン型よりむしろ、クローン型のクランのレベルをモニターする。これは、クローン性進化の現象のためである、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０５：１３０８１−１３０８６（２００８）；Ｇｅｒｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１０３：１１３９−１１４３（２０１０）。診断サンプル中に存在するクローンの配列は、後のサンプル中のもの、例えば、疾患の再発に基づいて採取されたものと、正確に同じままでなくてもよい。したがって、一方が、診断サンプルの配列を一致させる正確なクローン型配列に基づく場合、再発の検出に失敗するおそれがある。このような進化したクローンは、配列決定により直ちに検出および特定される。例えば、多くの前記進化したクローンが、Ｖ領域の置換（ＶＨ置換と呼ばれる）により現れる。これらの種類の進化したクローンは、リアルタイムＰＣＲ技術により見逃される。プライマーが、誤ったＶセグメントをターゲットにするためである。ただし、Ｄ−Ｊジャンクションが前記進化したクローン中にそのままとどまるとすれば、それは、個々の空間的に単離された分子の配列決定を使用して、この発明において、検出および特定され得る。さらに、診断サンプルにおいてかなりの頻度でのこれらの関連するクローン型の存在は、前記クローン型の関連性における確率を向上させる。同様に、免疫受容体配列における体細胞性の超変異の発展は、リアルタイムＰＣＲプローブ検出により妨害される場合があるが、（上記開示された）配列決定のリードアウトに適用される適切なアルゴリズムは、それでも進化しているクローン型として、クローン型を認識し得る。例えば、ＶまたはＪセグメントにおける体細胞性の超変異が認識され得る。これは、最も近い生殖細胞系統のＶおよびＪ配列に、前記クローン型をマップすることにより行われる。前記生殖細胞系統の配列からの差異は、体細胞性の超変異に起因し得る。したがって、ＶまたはＪセグメントにおける体細胞性の超変異により進化するクローン型は、直ちに検出および特定され得る。ＮＤＮ領域における体細胞性の超変異は、予測され得る。残りのＤセグメントが認識およびマップされるのに十分長い場合、それにおける任意の体細胞性変異は、直ちに認識され得る。Ｎ＋Ｐ塩基における（または、マップできないＤセグメントにおける）体細胞性の超変異は、これらの配列が、ガンのクローン型の子孫でない場合がある、新たに組み換えられた細胞において修飾され得る場合、確かに認識され得ない。ただし、アルゴリズムは、体細胞性変異による高い確率を有する塩基の変化を特定するために直ちに構築される。例えば、同じＶおよびＪセグメントならびに元の（１または複数の）クローンからＮＤＮ領域における一塩基の差異を有するクローン型は、体細胞性組換えの結果である高い確率を有する。この確率は、ＶおよびＪセグメントにおける他の体細胞性の超変異が存在する場合、向上し得る。これは、体細胞性の超変異の対象であったものとして、この特定のクローン型を特定するためである。したがって、元のクローン型からの体細胞性の超変異の結果であるクローン型の���率は、複数のパラメータ：ＮＤＮ領域における差異数、ＮＤＮ領域の長さならびにＶおよび／またはＪセグメントにおける他の体細胞性の超変異の存在を使用して、コンピュータ処理され得る。
【００５５】
クローン性進化データは、有益であり得る。例えば、主なクローンが、進化したクローン（予め存在しなかったため、予め記録されていないもの）である場合、例えば、これは、腫瘍が可能性のある選択優位性を有する新たな遺伝的変化を取得していることの指標である。このことは、免疫細胞受容体における特定の変化が選択優位性の原因であるとは言わないまでも、それらは、それについてのマーカーを表す場合がある。クローン型が進化している腫瘍は、潜在的に、差異のある予後に関連し得る。本発明の一態様では、疾患、例えば、リンパ系新生物、例えば、白血病の患者特異的バイオマーカーとして使用される１つ以上のクローン型は、モニターされる１つ以上のクローン型の体細胞性変異である、予め記録されていないクローン型を含む。別の態様では、任意の予め記録されたクローン型が、患者特異的バイオマーカーとして機能する既存のクローン型またはクローン型の群に対して、少なくとも９０パーセントの相同性である場合は必ず、例えば、このような相同なクローン型は、進行するのがモニターされるクローン型の群と共に、または、同群に含まれる。すなわち、１つ以上の患者特異的クローン型が、リンパ系新生物において特定され、前記疾患を（例えば、ほとんど観血的に取得されなかった血液サンプルにおける測定をさせることにより）周期的にモニターするのに使用される場合、および、１つのこのような測定中に、新たな（予め記録されていない）クローン型が、本セットのクローン型の体細胞性変異であることが検出される場合、例えば、それは、その後の測定についてモニターされる患者特異的クローン型のセットに追加される。一実施形態では、このような予め記録されていないクローン型は、本セットのメンバーと少なくとも９０パーセントの相同性である場合、例えば、それは、前記患者において行われる次の試験のためのクローン型バイオマーカーの患者特異的セットに追加される。すなわち、このような予め記録されていないクローン型は、それが、（クローン型データの上記分析に基づいて）導かれる、本セットのクローン型のクランのメンバーに含まれる。別の実施形態では、このような包含は、前記予め記録されていないクローン型が、本セットのメンバーと少なくとも９５パーセントの相同性である場合に行われる。別の実施形態では、このような包含は、前記予め記録されていないクローン型が、本セットのメンバーと少なくとも９８パーセントの相同性である場合に行われる。
【００５６】
細胞が、ＮＤＮ領域を置き換えるプロセスにより進化するが、その蓄積された変異を伴ってＶおよびＪセグメントが保存される可能性もある。このような細胞は、共通するＶおよびＪセグメントの特定により、予め記録されていないガンのクローン型として特定され得る。ただし、それらは、独立して導かれた小さなこれらの変異の機会を提供するために、十分な数の変異を含む。更なる制約は、ＮＤＮ領域が、前記予め配列決定されたクローンに対して、類似するサイズのものであることである場合がある。
【００５７】
［実施例］
新たに診断されたＭＣＬ患者についての免疫移植の１／２相研究を、免疫移植が抗腫瘍Ｔ細胞を増幅させるであろう仮説を試験するために開始した。抗腫瘍Ｔ細胞を、自家腫瘍を末梢血のＴ細胞と共培養し、ＩＦＮｇ、ＴＮＦ、ＩＬ２、ＣＤ１３７、パーフォリンおよびグランザイムのその産生を、多重表面および細胞内フローサイトメトリにより測定することにより評価する。二次終了点は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドＰＣＲ（ＡＳＯ  ＰＣＲ）および免疫受容体レパートリ分析を使用する、分子残存病変（ＭＲＤ）の測定である。前記ＰＣＲは、免疫グロブリンをコードする核酸の偏りのない増幅および配列決定用のコンセンサスプライマーを使用する。本研究は、標準的な移植の最近の臨床試験、例えば、Ｐｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，１１５（１６）：３２１５−３２２３（２０１０）；Ｇｅｉｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，１１２（７）：２６８７−２６９３（２００８）と比較して、持続性の分子寛解率における５０％の改善を検出するのが促進される。２５名の登録患者の内の１３名は、免疫移植プロトコルを完了した。８３％の患者は、免疫移植後に抗腫瘍Ｔ細胞の増幅を示した。本発明者らは、これらの患者の中でも、異なるパターンの抗腫瘍Ｔ細胞を観察してきた。いくつかは、ＣＤ８  Ｔ細胞応答、ＣＤ４  Ｔ細胞応答またはその２つの組み合わせを有した。ワクチン接種に特異的なＴＣＲβクローン型を、ＴＣＲβレパートリ分析により特定した。血液サンプルにおける配列系ＢＣＲ分析を使用するＭＲＤ試験は、３名の患者において、移植後直ちに陽性であった。その内の２名は、最終的に再発し、息を引き取った。これらの場合には、再発を、本発明の方法により、ＰＥＴまたはＭＲＩ画像化技術それぞれによる検出の１４か月および４．５か月前に検出した。４．５か月で再発した患者では、標準的な方法を使用する骨髄の評価は、陰性であった。前記再発は、ＣＮＳに制限されると考えられた。７７％の患者（１０／１３名）は、移植後最初の１年全体を通してＭＲＤ陰性であった。分子再発は、１年後に１５％の患者（２／１３名）に見られ、これらの患者は、臨床的再発をたどった。前臨床的に、抗腫瘍Ｔ細胞の増幅は、骨髄破壊抵抗性疾患の治癒にも関連する。本発明者らの予備的な患者データにおける前記抗腫瘍Ｔ細胞増幅の反復は、免疫移植が、臨床成果を改善する場合があることを示唆する。本発明の方法による免疫レパートリの配列決定は、ＡＳＯ  ＰＣＲのアッセイ個別化を迂回するＭＲＤの効果的な測定を提供し、従来のＰＥＴおよびＭＲＩより感度が高いことを示した。
【００５８】
本発明は、複数の具体的な例示となる実施形態を参照して記載されてきたが、当業者は、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、多くの変更がそれになされてもよいことを認識するであろう。本発明は、上記されたものに加えて、各種のセンサの実施および他の主題に適用可能である。
【００５９】
定義
本明細書において、他の方法で特に規定されない限り、本明細書で使用される核酸化学、生化学、遺伝学および分子生物学の用語および記号は、その分野における標準的な専門書およびテキスト、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７５）；Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）；Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｕｎｄｅｒｓ，２００７）のものに従う。
【００６０】
「整列」は、参照配列または参照配列の一部が、いくつかの配列距離測定に基づいて最も近いことを決定するために、テスト配列、例えば、配列リードを、１つ以上の参照配列に対して比較する方法を意味する。ヌクレオチド配列を整列させる例示となる方法は、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムである。距離測定は、Ｈａｍｍｉｎｇ距離、Ｌｅｖｅｎｓｈｔｅｉｎ距離等を含んでもよい。距離測定は、比較される配列のヌクレオチドの品質値に関連する成分を含んでもよい。
【００６１】
「アンプリコン」は、ポリヌクレオチド増幅反応の生成物、すなわち、ポリヌクレオチドのクローン集合を意味する。前記ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖でもよく、１つ以上の開始配列から複製される。前記１つ以上の開始配列は、同じ配列の１つ以上のコピーでもよいし、または、それらは、種々の配列の混合物でもよい。好ましくは、アンプリコンは、１つの開始配列の増幅により形成される。アンプリコンは、生成物が前記１つ以上の開始またはターゲットの核酸の複製物を含む、各種の増幅反応により産生され得る。一態様では、アンプリコンを産生する増幅反応は、反応物質の塩基対合において「テンプレート駆動」される。ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドのいずれかは、反応生成物の形成に必要とされる、テンプレートポリヌクレオチドに補完性を有する。一態様では、テンプレート駆動反応は、核酸ポリメラーゼによるプライマー伸長または核酸リガーゼによるオリゴヌクレオチドのライゲーションである。このような反応としては、制限されず、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、直線ポリメラーゼ反応、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、回転サイクル増幅等があげられ、参照により本明細書に組み込まれる下記参考文献：Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第４，６８３，１９５号；同第４，９６５，１８８号；同第４，６８３，２０２号；同第４，８００，１５９号明細書（ＰＣＲ）；Ｇｅｌｆａｎｄ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第５，２１０，０１５号明細書（「ｔａｑｍａｎ」プローブによるリアルタイムＰＣＲ）；Ｗｉｔｔｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第６，１７４，６７０号明細書；Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ，米国特許第５，３９９，４９１号明細書（「ＮＡＳＢＡ」）；Ｌｉｚａｒｄｉ、米国特許第５，８５４，０３３号明細書；Ａｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ、特開平４−２６２７９９号公報（回転サイクル増幅）；等に開示される。一態様では、本発明のアンプリコンは、ＰＣＲにより産生される。反応生成物が増幅反応の進行時に測定されるのが可能である検出化学が利用可能な場合には、増幅反応は、「リアルタイム」増幅、例えば、以下に記載される「リアルタイムＰＣＲ」またはＬｅｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６：２１５０−２１５５（１９９８）等の参考文献に記載された「リアルタイム−ＮＡＳＢＡ」でもよい。本明細書で使用する時、「増幅」の用語は、増幅反応を行うことを意味する。「反応混合物」は、反応を行うのに必要な全ての反応物質を含む溶液を意味する。前記反応は、制限されず、反応中に選択したレベルにおいてｐＨを維持するための緩衝剤、塩、補因子、スカベンジャ等を含んでもよい。
【００６２】
本明細書で使用する時、「クローン性」は、レパートリのクローン型の中でのクローン型の存在度の分布が、１つまたは少しのクローン型に傾いている度合いの測定を意味する。大まかに、クローン性は、クローン型の多様性の逆測定である。多くの測定または統計が、本発明に基づくクローン性測定に使用され得る種−存在度の関係を記載する生態学から利用可能である、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １７  ＆  １８，ｉｎ  Ｐｉｅｌｏｕ，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ  Ｅｃｏｌｏｇｙ，（Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９６９）。一態様では、本発明に使用されるクローン性測定は、クローン型プロファイルの関数（すなわち、検出される区別できるクローン型の数およびその存在度）である。したがって、クローン型プロファイルが測定された後に、クローン性は、１つの数を与えるために、それからコンピュータ処理されてもよい。１つのクローン性測定は、Ｓｉｍｐｓｏｎ’ｓ測定である。前記測定は、単純に、２つのランダムに取り出されたクローン型が同じであろう確立である。他のクローン性測定としては、（上記引用された）Ｐｉｅｌｏｕに開示された、情報系測定およびＭｃＩｎｔｏｓｈ’ｓ多様性インデックスがあげられる。
【００６３】
「クローン型」は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）もしくはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）またはそれらの一部をコードするＴ細胞またはＢ細胞の組換えヌクレオチド配列を意味する。一態様では、個体のリンパ球集合の区別できる全てのクローン型の収集は、このような集合のレパートリである、例えば、Ａｒｓｔｉｌａ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：９５８−９６１（１９９９）；Ｙａｓｓａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，６１：４９３−５０２（２００９）；Ｋｅｄｚｉｅｒｓｋａ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４５（３）：６０７−６１８（２００８）；等。本明細書で使用する時、「クローン型プロファイル」または「レパートリプロファイル」は、実質的に全てのレパートリのクローン型およびその相対存在度を含む、Ｔ細胞および／またはＢ細胞のサンプル（例えば、このような細胞を含む末梢血サンプル）におけるクローン型の集計である。「クローン型プロファイル」、「レパートリプロファイル」および「レパートリ」は、本明細書において互換的に使用される（すなわち、前記「レパートリ」の用語は、以下により完全に記載されるように、リンパ球サンプルから測定されたレパートリを意味する）。本発明の一態様では、クローン型は、免疫グロブリンの重鎖（ＩｇＨ）またはＴＣＲのβ鎖の一部を含む。本発明の他の態様では、クローン型は、他の組換え分子、例えば、免疫グロブリンの軽鎖もしくはＴＣＲα鎖またはそれらの一部に基づいてもよい。
【００６４】
「合体」は、このような差異が、実験的または測定のエラーによるものであり、真の生物学的差異によらないことを決定することにより同じである場合に、配列差を有する２つの候補クローン型を処理することを意味する。一態様では、より高い頻度の候補クローン型の配列が、より低い頻度の候補クローン型のそれに対して比較される。所定の評価基準が満たされる場合、例えば、前記より低い頻度の候補クローン型の数は、より高い頻度の候補クローン型のそれに追加され、その後、前記より低い頻度の候補クローン型は無視される。すなわち、前記より低い頻度の候補クローン型に関連するリードカウントは、前記より高い頻度の候補クローン型のものに追加される。
【００６５】
「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、分子が、抗原の構造を捕捉することにより、前記分子の特異性を決定し、特定の抗原と接触する、免疫グロブリン（すなわち、抗原）またはＴ細胞受容体の領域を意味する。Ｔ細胞受容体および免疫グロブリンはそれぞれ、３つのＣＤＲを有する。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２は、可変（Ｖ）ドメインに見出される。ＣＤＲ３は、Ｖドメインの一部、全ての多様性（Ｄ）（重鎖のみ）およびジョイント（Ｊ）ならびに定常（Ｃ）ドメインの一部を含む。
【００６６】
「リンパ系新生物」は、悪性または非悪性であり得る、リンパ球の異常な増殖を意味する。リンパ球ガンは、悪性のリンパ系新生物である。リンパ系新生物は、リンパ増殖性障害、例えば、制限されず、濾胞性リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、Ｔ細胞リンパ腫等の結果であるか、または、同障害に関連する、例えば、Ｊａｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｌｏｏｄ，１１２：４３８４−４３９９（２００８）；Ｓｗｅｒｄｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ，ＷＨＯ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｕｒｓ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  Ｔｉｓｓｕｅｓ（ｅ．４ｔｈ）（ＩＡＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，２００８）。
【００６７】
「微小残存病変」は、処置後に残存するガン細胞を意味する。前記用語は、最も多くの場合、リンパ腫および白血病の処置に関連して使用される。
【００６８】
参照配列と別の配列（「比較配列」）との比較に関連して使用される「パーセント相同性」、「パーセント同一性」等の用語は、前記２つの配列間の最適なアライメントにおいて、前記比較配列が、示された割合に相当するいくつかのサブユニット位置において、前記参照配列に対して同一であることを意味する。前記サブユニットは、ポリヌクレオチド比較についてのヌクレオチド、または、ポリペプチド比較についてのアミノ酸である。本明細書で使用する時、比較される配列の「最適なアライメント」は、サブユニット間のマッチを最大化し、アライメントの構築に使用されるギャップ数を最少化するものである。パーセント同一性は、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３（１９７０）（「ＧＡＰ」ｐｒｏｇｒａｍ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）等に記載された、市販のアルゴリズムの実行により決定されてもよい。アライメントを構築し、パーセント同一性または類似性の他の測定を算出するための当該分野における他のソフトウェアパッケージとしては、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，２：４８２−４８９（１９８１）（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）のアルゴリズムに基づく、「ＢｅｓｔＦｉｔ」プログラムがあげられる。すなわち、例えば、参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５パーセントの同一性のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列における５パーセントまでのヌクレオチドが、欠失してもよいし、もしくは、別のヌクレオチドにより置換されていてもよいし、または、前記参照配列中のヌクレオチドの総数の５パーセントまでのいくつかのヌクレオチドが、前記参照配列内に挿入されてもよい。
【００６９】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による、特定のＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅のための反応を意味する。すなわち、ＰＣＲは、プライマー結合部位に隣接するターゲット核酸の複数のコピーまたは複製を作製するための反応である。このような反応は、下記工程：（ｉ）前記ターゲット核酸を変性する工程、（ｉｉ）プライマーを前記プライマー結合部位にアニーリングする工程、および（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸の存在下において、前記プライマーを核酸ポリメラーゼにより伸長する工程の１回以上の反復を含む。通常、前記反応は、サーマルサイクラー装置において、各工程用に最適化された種々の温度によりサイクルされる。具体的な温度、各工程の継続時間および工程間の変化速度は、例えば、参考文献：ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ａｎｄ  ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（それぞれ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１  ａｎｄ  １９９５）により例示された、当業者に周知の多くの要因により決まる。例えば、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用する従来のＰＣＲにおいて、二本鎖ターゲット核酸は、＞９０℃の温度で変性されてもよく、プライマーは、５０〜７５℃の範囲の温度でアニーリングされてもよく、プライマーは、７２〜７８℃の範囲の温度で伸長されてもよい。前記「ＰＣＲ」の用語は、反応の派生型、例えば、制限されず、ＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、定量ＰＣＲ、多重化ＰＣＲ等を包含する。反応容量は、数百ナノリットル、例えば、２００ｎＬから、数百μＬ、例えば、２００μＬの範囲である。「逆転写ＰＣＲ」または「ＲＴ−ＰＣＲ」は、ターゲットＲＮＡを相補の一本鎖ＤＮＡに変換する逆転写反応により進行され、ついで、前記一本鎖ＤＮＡが増幅される、ＰＣＲを意味する、例えば、Ｔｅｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第５，１６８，０３８号明細書。同特許は、参照により本明細書に組み込まれる。「リアルタイムＰＣＲ」は、反応生成物、すなわち、アンプリコンの量が、反応の進行時にモニターされるＰＣＲを意味する。反応生成物をモニターするのに使用される検出化学が主に異なる多くの形式のリアルタイムＰＣＲが存在する、例えば、Ｇｅｌｆａｎｄ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第５，２１０，０１５号明細書（「ｔａｑｍａｎ」）；Ｗｉｔｔｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第６，１７４，６７０号および同第６，５６９，６２７号明細書（インターカレート染料）；Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ、米国特許第５，９２５，５１７号明細書（分子ビーコン）；これらの特許は、参照により本明細書に組み込まれる。リアルタイムＰＣＲについての検出化学は、Ｍａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３０：１２９２−１３０５（２００２）においてレビューされている。同文献も、参照により本明細書に組み込まれる。「ネステッドＰＣＲ」は、２段階のＰＣＲを意味し、第１のＰＣＲのアンプリコンが、新たなセットのプライマーを使用する第２のＰＣＲ用のサンプルになる。その少なくとも１つは、前記第１のアンプリコンの内側位置に結合する。本明細書で使用する時、ネステッド増幅反応に関連する「最初のプライマー」は、第１のアンプリコンを生成するのに使用されるプライマーを意味し、「二次プライマー」は、第２またはネステッドのアンプリコンを生成するのに使用される１つ以上のプライマーを意味する。「多重化ＰＣＲ」は、複数のターゲット配列（または１つのターゲット配列および１つ以上の参照配列）が、同じ反応混合物中で同時に行われるＰＣＲを意味する、例えば、Ｂｅｒｎａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７３：２２１−２２８（１９９９）（２色リアルタイムＰＣＲ）。通常、区別できるセットのプライマーが、各配列を増幅させるのに使用される。典型的には、多重化ＰＣＲにおけるターゲット配列の数は、２から５０または２から４０または２から３０の範囲である。「定量ＰＣＲ」は、サンプルまたは標本中の１つ以上の特定のターゲット配列の存在度を測定するように設計されたＰＣＲを意味する。定量ＰＣＲは、このようなターゲット配列の絶対定量および相対定量の両方を含む。定量測定は、ターゲット配列とは別個に、または、同ターゲット配列と共にアッセイされ得る、１つ以上の参照配列または内部標準を使用してなされる。前記参照配列は、サンプルまたは標本に対して、内因性でもよいし、または、外因性でもよい。後者の場合、１つ以上の競合テンプレートを含んでもよい。典型的な外因性参照配列としては、下記遺伝子：β−アクチン、ＧＡＰＤＨ、β２−ミクログロブリン、リボソームＲＮＡ等の転写物のセグメントがあげられる。定量ＰＣＲの技術は、参照により組み込まれる下記参考文献：Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２６：１１２−１２６（１９９９）；Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：９４３７−９４４７（１９８９）；Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２１：２６８−２７９（１９９６）；Ｄｉｖｉａｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ，１２２：３０１３−３０２０（１９９２）；Ｂｅｃｋｅｒ−Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１７：９４３７−９４４６（１９８９）；等において例示されたように、当業者に周知である。
【００７０】
「プライマー」は、ポリヌクレオチドテンプレートと二重鎖を形成可能であり、核酸合成の開始点として作用可能であり、伸長した二重鎖が形成されるように、前記テンプレートに沿ってその３’端から伸長され得る、天然または合成いずれかのオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーの伸長は、通常、核酸ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼにより行われる。前記伸長プロセスに添加されるヌクレオチドの配列は、前記テンプレートポリヌクレオチドの配列により決定される。通常、プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長される。通常、プライマーは、１４から４０個のヌクレオチドの範囲、または、１８から３６個のヌクレオチドの範囲の長さを有する。プライマーは、各種の核酸増幅反応、例えば、１つのプライマーを使用する直線増幅反応または２つ以上のプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応に使用される。具体的な適用についてのプライマーの長さおよび配列を選択するためのガイダンスは、参照により組み込まれる下記参考文献：Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ，ｅｄｉｔｏｒ，ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００３）により実証されているように、当業者に周知である。
【００７１】
「品質スコア」は、特定の配列位置における塩基割り当てが正しい確率の測定を意味する。各種の方法が、特定の環境についての品質スコアを測定するため、例えば、種々の配列決定化学、検出システム、塩基コールアルゴリズム等の結果としてコールされる塩基のために、当業者に周知である。一般的には、品質スコア値は、単調に、正確な塩基コールの確率に関連する。例えば、１０の品質スコアまたはＱは、塩基が正しくコールされる９０パーセントの機会が存在することを意味してもよく、２０のＱは、塩基が正しくコールされる９９パーセントの機会が存在することを意味してもよい、等である。いくつかの配列決定プラットホーム、特に、合成化学による配列決定を使用するものについて、平均品質スコアは、配列リードの開始時での品質スコアが、配列リードの最後でのものより高いように、配列リード長の関数として低下する。このような低下は、例えば、不完全な伸長、伸長の進行、テンプレートの損失、ポリメラーゼの損失、キャップ形成の失敗、脱保護の失敗等の現象による。
【００７２】
本明細書で使用する時、「レパートリ」または「免疫レパートリ」は、個体のリンパ球集合におけるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）またはそのフラグメントそれぞれをコードする、区別できる組換えヌクレオチド配列のセットを意味する。この場合、前記セットのヌクレオチド配列は、前記集合の実質的に全てのリンパ球についての、区別できるリンパ球またはそのクローン部分集合と１対１の対応を有する。一態様では、レパートリが決定されるリンパ球の集合が、１つ以上の組織サンプル、例えば、１つ以上の血液サンプルから採取される。レパートリのメンバーヌクレオチド配列は、本明細書において、「クローン型」と呼ばれる。一態様では、レパートリのクローン型は、その正常または（例えば、ガンに関連する）異常の前駆体分子を含むＢＣＲ、例えば、制限されず、下記：免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）またはその部分集合（例えば、ＩｇＨ可変領域、ＣＤＲ３領域等）、不完全なＩｇＨ分子、免疫グロブリン軽鎖またはその部分集合（例えば、可変領域、ＣＤＲ領域等）、ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３、ＢＣＲまたはこのようなＣＤＲの組み合わせ）、ＢＣＲのＶ（Ｄ）Ｊ領域、ＩｇＨ可変領域の超変異領域等の発展中に体細胞性組換えを受けている、Ｂ細胞集合に共通する核酸の任意のセグメントを含む。一態様では、レパートリのクローン型を規定する核酸セグメントは、その多様性（すなわち、前記セットにおける区別できる核酸配列の数）が、個体における実質的に全てのＢ細胞またはそのクローンがこのようなレパートリの固有の核酸配列を有するように十分大きくなるように選択される。すなわち、本発明に基づいて、実務家は、クローン型である、Ｂ細胞集合の完全な多様性を反映していないＢＣＲをコードする組み換えられた核酸の特定のセグメントまたは領域を規定するために選択してもよい。ただし好ましくは、クローン型は、それらが、それらが派生されるＢ細胞集合の多様性を反映するように規定される。すなわち、好ましくは、サンプルの各種のクローンは、異なるクローン型を有する（当然、一部の用途では、例えば、白血病またはリンパ腫の患者からのサンプルの場合に、プロファイル内の１つ以上の特定のクローン型の複数のコピーが存在するであろう）。本発明の他の態様では、レパートリに対応するリンパ球集合は、循環性Ｂ細胞または細胞表面マーカーにより規定される他の部分集合等であり得る。このような部分集合は、特定の組織、例えば、骨髄またはリンパ節等からサンプルを取得することにより、または、サンプル（例えば、末梢血）から、１つ以上の細胞表面マーカー、サイズ、形態等に基づいて細胞をソートもしくは濃縮することにより、取得され得る。さらに他の態様では、レパートリに対応するリンパ球集合は、疾患組織、例えば、腫瘍組織、感染組織等由来でもよい。一実施形態では、ヒトのＩｇＨ鎖またはそのフラグメントを含むレパートリは、０．１×１０６から１．８×１０６の範囲、または、０．５×１０６から１．５×１０６の範囲、または、０．８×１０６から１．２×１０６の範囲のいくつかの、区別できるヌクレオチド配列を含む。具体的な実施形態では、本発明のレパートリは、ＩｇＨ鎖のＶ（Ｄ）Ｊ領域の実質的に全てのセグメントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。一態様では、本明細書で使用する時、「実質的に全て」は、０．００１パーセント以上の相対存在度を有する全てのセグメントを意味する。または、別の様態では、本明細書で使用する時、「実質的に全て」は、０．０００１パーセント以上の相対存在度を有する全てのセグメントを意味する。別の具体的な実施形態では、本発明のレパートリは、ＴＣＲβ鎖のＶ（Ｄ）Ｊ領域の実質的に全てのセグメントをコードするヌクレオチド配列のセットを含む。別の実施形態では、本発明のレパートリは、２５〜２００個のヌクレオチドの範囲の長さを有し、ＩｇＨ鎖のＶ、ＤおよびＪ領域のセグメントを含む、ヌクレオチド配列のセットを含む。別の実施形態では、本発明のレパートリは、区別できるＩｇＨ鎖を発現するリンパ球の数に実質的に相当する、いくつかの区別できるヌクレオチド配列を含む。さらに別の実施形態では、「実質的に相当する」は、９９パーセントの確率について、ヌクレオチド配列のレパートリが、０．００１パーセント以上の頻度で、個体群の全てのリンパ球により保持または発現されるＩｇＨまたはその一部をコードするヌクレオチド配列を含むであろうことを意味する。さらに別の実施形態では、「実質的に相当する」は、９９パーセントの確率について、ヌクレオチド配列のレパートリが、０．０００１パーセント以上の頻度で存在する、全てのリンパ球により保持または発現されるＩｇＨまたはその一部をコードするヌクレオチド配列を含むであろうことを意味する。前述の２つの文章に記載されたクローン型のセットは、本明細書において、ＩｇＨ配列の「完全なレパートリ」を提示すると呼ばれる場合がある。上記されたように、クローン型プロファイル（またはレパートリプロファイル）を測定または生成する場合、リンパ球の十分大きなサンプルが、このようなプロファイルが、特定の用途のためのレパートリの合理的に正確な提示を提供するように取得される。一態様では、特に１〜１０ｍＬの末梢血サンプルから取得される場合、１０５から１０７個のリンパ球を含むサンプルが使用される。
【００７３】
「配列リード」は、配列決定技術により生成された配列またはデータ流から決定されるヌクレオチドの配列を意味する。その決定は、例えば、ＤＮＡ配列決定プラットホームの商業的供給者からの塩基コールソフトウェアの技術に関連する、塩基コールソフトウェアによりなされる。配列リードは、通常、配列における各ヌクレオチドについての品質スコアを含む。典型的には、配列リードは、テンプレート核酸に沿って、例えば、ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡリガーゼにより、プライマーを伸長させることによりなされる。データは、このような伸長に関連するシグナル、例えば、光学的、化学的（例えば、ｐＨ変化）または電気的シグナルを記録することにより生成される。このような初期データは、配列リードに変換される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【国際調査報告】
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