(57)【要約】  本発明は、一般的に骨代用材料の分野、特に生物活性化される骨代用材料に関する。より詳細には、本発明は、骨代用材料のオッセオインテグレーションを改良又は促進するのに使用するためのクエン酸塩、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含む特定の薬剤、前記特定の薬剤の被覆を与えられた骨代用材料、及び骨代用材料、並びにクエン酸塩、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含む骨代用材料を取り付ける方法に使用するためのキットに関する。【選択図】  図１ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨代用材料のオッセオインテグレーションを改良又は促進するのに使用するための薬剤であって、クエン酸三ナトリウム、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含むことを特徴とする薬剤。
【請求項２】
骨代用材料がリン酸三カルシウムを含有することを特徴とする請求項１に記載の薬剤。
【請求項３】
薬剤が水に溶解されて水溶液を形成することを特徴とする請求項１又は２に記載の薬剤。
【請求項４】
水溶液が以下のものを含むことを特徴とする請求項３に記載の薬剤：
−  １．３２〜１０５．２０ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム、
−  ０．１６〜１３．０８ｇ／ｌのクエン酸、
−  ０．１１〜８．８８ｇ／ｌのリン酸一ナトリウム、
−  １．６０〜１２７．６０ｇ／ｌのデキストロース、及び
−  ０．０１〜１．１０ｇ／ｌのアデニン。
【請求項５】
骨代用材料上に被覆を生成するための薬剤の使用であって、薬剤がクエン酸三ナトリウム、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含むことを特徴とする使用。
【請求項６】
骨代用材料がリン酸三カルシウムを含有することを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
薬剤が水に溶解されて水溶液を形成することを特徴とする請求項５又は６に記載の使用。
【請求項８】
水溶液が以下のものを含むことを特徴とする請求項７に記載の使用：
−  １．３２〜１０５．２０ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム、
−  ０．１６〜１３．０８ｇ／ｌのクエン酸、
−  ０．１１〜８．８８ｇ／ｌのリン酸一ナトリウム、
−  １．６０〜１２７．６０ｇ／ｌのデキストロース、及び
−  ０．０１〜１．１０ｇ／ｌのアデニン。
【請求項９】
少なくとも一種の被覆を与えられた骨代用材料であって、被覆が、クエン酸三ナトリウム、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含む水溶液中に骨代用材料を浸漬することによって得られることを特徴とする骨代用材料。
【請求項１０】
骨代用材料がリン酸三カルシウムを含有することを特徴とする請求項９に記載の骨代用材料。
【請求項１１】
水溶液が以下のものを含むことを特徴とする請求項９又は１０に記載の骨代用材料：
−  １．３２〜１０５．２０ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム、
−  ０．１６〜１３．０８ｇ／ｌのクエン酸、
−  ０．１１〜８．８８ｇ／ｌのリン酸一ナトリウム、
−  １．６０〜１２７．６０ｇ／ｌのデキストロース、及び
−  ０．０１〜１．１０ｇ／ｌのアデニン。
【請求項１２】
骨代用材料の表面が親水性であることを特徴とする請求項９〜１１のいずれかに記載の骨代用材料。
【請求項１３】
骨代用材料を取り付ける方法に使用するためのキットであって、骨代用材料、クエン酸三ナトリウム、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含むことを特徴とするキット。
【請求項１４】
クエン酸三ナトリウム、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンが水溶液中に存在することを特徴とする請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に骨代用材料の分野、特に生物活性化される骨代用材料に関する。より詳細には、本発明は、骨代用材料のオッセオインテグレーションを改良又は促進するのに使用するためのクエン酸塩、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含む特定の薬剤、前記特定の薬剤の被覆を与えられた骨代用材料、及び骨代用材料、並びにクエン酸塩、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含む骨代用材料を取り付ける方法に使用するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨代用材料は、自家海綿骨を補足又は代用するために使用される。海綿骨の移植と比較して、骨代用物は、それらが十分に利用可能でありかつ保管可能であるという利点を持つ。骨代用材料は、足場構造を与えることによって欠陥部位を機械的に強化し、かつ骨治癒を支持するための充填材料として役立つ。
【０００３】
骨代用材料は、それらの生物学的機構によって分類されることができる：骨伝導、骨誘導及び骨形成。
【０００４】
骨伝導は、骨代用材料が自分の骨によって永続される新しい骨成長のための足場として役立つときに起こる。欠陥部位の境界からの骨芽細胞は、新しい骨が生成される骨格として骨代用材料を利用する。最低限でも、骨代用材料は骨伝導であるべきである。一般的な骨伝導材料は、リン酸カルシウム（例えばヒドロキシアパタイト及びリン酸三カルシウム）のセラミック、バイオポリマー、バイオガラス及びリン酸カルシウムのような合成材料、並びにウシ亜科のような同種及び異種材料を含む。
【０００５】
骨誘導は、骨幹細胞を刺激して骨芽細胞に分化し、次いで新しい骨形成を始めることを伴なう。最も広く研究されているタイプの骨誘導細胞メディエーターは、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）である。骨伝導及び骨誘導である骨代用材料は、現在存在している骨芽細胞のための足場として役立つだけでなく、新しい骨芽細胞の形成を誘発するだろう。さらに、ＢＭＰの骨誘導材料は、脱塩された骨マトリックス及び粉砕された骨の自己骨移植片を含む。
【０００６】
骨形成は、骨代用材料から生じる生きた骨芽細胞が他の二つの機構を介して生成された骨成長とともに新しい骨成長に寄与するときに起こる。骨形成を示す材料は、自己骨及び組織工学材料を伴なう。
【０００７】
骨代用材料は、通常、多孔質構造を持ち、かつ顆粒、ブロック、及びパテ状の形態で利用可能であり、柔らかくて曲がりやすいか又は硬くて形を維持する。全ての骨代用材料は、フィブリンネットワークが治癒時に形成されることができるように血液浸透を要求する。吸収性骨代用材料は、骨が形成されている間に同時に分解又は吸収するべきである。非吸収性骨代用材料は、オッセオインテグレートされるべきである。オッセオインテグレーションの前提条件は、結合組織の介入なしで生きている骨と骨代用材料の間の直接的な構造及び機能上の結合である。
【０００８】
骨代用材料の湿潤性がオッセオインテグレーションに高い影響を持つことが示唆されている。例えば、ポリカプロラクトンベースのポリウレタンウレアのような疎水性骨代用材料は血液に露出されると、それは多孔質構造内でのフィブリンの浸透を全く示さない。他方、親水性骨代用材料は、材料の周囲で血小板活性化の促進を誘発するかもしれないが、凝固した血液が、代用材料の周囲に被膜を形成して完全な血液浸透を阻止するかもしれない。それゆえ、良好な湿潤性は重要な因子であるが、良好なオッセオインテグレーションに対して追加のまだ知られていない特性が他にも存在する。
【０００９】
上記に照らして、本発明によって解決されるべき課題は、骨代用材料のオッセオインテグレーションを改良する能力を有する薬剤の提供、並びに優れたオッセオインテグレーション特性を有する骨代用材料の提供である。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者は、骨代用材料の表面上のクエン酸塩、リン酸塩、デキストロース、及びアデニンの存在がその表面上の血液タンパク質の被覆、血小板活性化、及びかかる表面への強いフィブリン線維の結合を誘導することを驚くべきことに見出した。これらの効果（即ち、改良された血液タンパク質の被覆、改良された血小板活性化、及び強いフィブリン線維の結合は骨代用材料の優れたオッセオインテグレーションのための基本的条件である。
【００１１】
上記の知見に照らして、第一態様では、本発明は、骨代用材料のオッセオインテグレーションを改良又は促進するのに使用するための薬剤であって、クエン酸三ナトリウム、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含むことを特徴とする薬剤に関する。
【００１２】
第二態様では、本発明は、骨代用材料上に被覆を生成するための薬剤の使用であって、薬剤がクエン酸三ナトリウム、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含むことを特徴とする使用に関する。
【００１３】
第三態様では、本発明は、少なくとも一種の被覆を与えられた骨代用材料であって、被覆が、クエン酸三ナトリウム、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含む水溶液中に骨代用材料を浸漬することによって得られることを特徴とする骨代用材料に関する。
【００１４】
第四態様では、本発明は、骨代用材料を取り付ける方法に使用するためのキットであって、骨代用材料、クエン酸三ナトリウム、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含むことを特徴とするキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１ａ】図１ａは、非凝固血に露出後のＡｒｔｅｌｏｎ（登録商標）膜のＳＥＭ写真（倍率＝１０００倍）を示し、Ａｒｔｅｌｏｎ（登録商標）膜は、本願に記載のような被覆を与えられていない。
【００１６】
【図１ｂ】図１ｂは、非凝固血に露出後の本発明によるＡｒｔｅｌｏｎ（登録商標）膜のＳＥＭ写真（倍率＝１０００倍）を示す。
【００１７】
【図２ａ】図２ａは、非凝固血に露出後のＣｅｒａｓｏｒｂ  Ｇｅｌａｔｉｎｅタイプの骨代用材料のＳＥＭ写真（倍率＝１４０００倍）を示し、骨代用膜は、本願に記載のような被覆を与えられていない。
【００１８】
【図２ｂ】図２ｂは、非凝固血に露出後の本発明によるＣｅｒａｓｏｒｂ  Ｇｅｌａｔｉｎｅタイプの骨代用材料のＳＥＭ写真（倍率＝１４０００倍）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
第一態様によれば、本発明は、骨代用材料のオッセオインテグレーションを改良又は促進するのに使用するための薬剤であって、クエン酸三ナトリウム、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含むことを特徴とする薬剤を提供する。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態によれば、薬剤は、水に溶解されて水溶液を形成する。骨代用材料のオッセオインテグレーションを改良又は促進するのに使用するためのこの水溶液は以下のものを含むことが特に好ましい：
−  １．３２〜１０５．２０ｇ／ｌ、好ましくは２．６３〜２６．３ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム、
−  ０．１６〜１３．０８ｇ／ｌ、好ましくは０．３３〜３．２７ｇ／ｌのクエン酸、
−  ０．１１〜８．８８ｇ／ｌ、好ましくは０．２２〜２．２２ｇ／ｌのリン酸一ナトリウム、
−  １．６０〜１２７．６０ｇ／ｌ、好ましくは３．１９〜３１．９０ｇ／ｌのデキストロース、及び
−  ０．０１〜１．１  ｇ／ｌ、好ましくは０．０３〜０．２８ｇ／ｌのアデニン。
【００２１】
上で規定されたようなかかる水溶液（以下において「被覆溶液」とも言及される）は、２６．３ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム、３．２７ｇ／ｌのクエン酸、２．２２ｇ／ｌのリン酸一ナトリウム、３１．９ｇ／ｌのデキストロース、及び０．２７５ｇ／ｌのアデニンを含有する水溶液がＦＤＡ及びヨーロッパ当局によって既に承認されている溶液であるので好ましい。かかる溶液、いわゆるＣＰＤＡ−１溶液は、血球活性の実質的な損失なしで３５日間の保管を可能にするための血液バッグのための凝固防止保存剤及び補助剤として確立されている。
【００２２】
特に好ましい実施形態によれば、本発明による使用のための溶液は、上述のＣＰＤＡ−１溶液の５〜４０容量％溶液である。最も好ましい実施形態によれば、上述のＣＰＤＡ−１溶液の１０〜２０容量％溶液が使用される。
【００２３】
換言すれば、本発明の特に好ましい実施形態によれば、２．６３〜５．２６ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム、０．３２７〜０．６５４ｇ／ｌのクエン酸、０．２２２〜０．４４４ｇ／ｌのリン酸一ナトリウム、３．１９〜６．３８ｇ／ｌのデキストロース、及び０．０２７５〜０．０５５ｇ／ｌのアデニンからなり、残りが水である水溶液が使用される。
【００２４】
本発明による「骨代用材料」は、改良されたオッセオインテグレーションからもたらされる業界で公知のいかなる骨代用材料であることもできる。本発明に従って使用される骨代用材料は、吸収性又は非吸収性であってもよい。さらに、本発明に従って使用される骨代用材料は、骨伝導特性、又は骨伝導プラス骨誘導特性のいずれかを持っていてもよい。本発明に使用される典型的な骨代用材料は、合成、人工、天然の骨代用材料を含む。例示として、セラミックベースの骨代用材料、例えばセラミックベースのリン酸三カルシウム、リン酸カルシウムセメント、ウシ由来のヒドロキシアパタイト、及び例えばポリカプロラクトン及び／又はポリウレタンから作られたポリマーベースの材料を挙げることができる。本発明の好ましい実施形態によれば、骨代用材料はリン酸三カルシウムを含有する。さらにより好ましい実施形態によれば、骨代用材料はβ−リン酸三カルシウム、又はβ−リン酸三カルシウムとブタゼラチンの混合物である。
【００２５】
骨代用材料は、骨代用材料の骨誘導及び／又は骨形成特性を改良又は促進する手段をさらに与えられることも可能である。また、成長因子、好ましくは形質転換成長因子β、例えば骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２，−４，−７）を与えられているか、又は多血小板血漿（ＰＲＰ）を組み合わせた表面を有する歯支持要素を使用することも可能である。成長因子はさらに、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、分化因子５（ＧＤＦ−５）からなる群から選択されたいずれか一つを含んでもよい。
【００２６】
オッセオインテグレーションは、生きている骨と骨代用材料の表面の間の直接的な構造及び機能上の結合である。骨代用材料の表面の強い血液タンパク質被覆及び強いフィブリンネットワーク一体化は、マトリックスの細胞のインターロゲーション、動員、増殖、分化及び成熟のカスケードに影響するだろう。予備マトリックスを形成するフィブリン線維は、柔らかい組織及び硬い組織を形成する細胞が骨代用材料の表面に沿って動く「ハイウェイ」である。活性化血小板から放出されたタンパク質及び成長因子は、細胞の連絡を支持しかつ組織化する。血小板放出因子はまた、内皮細胞の移動、増殖、及び分化を誘導及び拡大し、それによって血管形成を開始する。血管の浸潤及び成長は、高度に活性化した再生細胞によって要求される、十分な栄養及び酸素供給のための前提条件である。骨代用材料の表面上の傷を治す過程を最適化することによって、密着−骨形成が早期に起こり、最終的にオッセオインテグレーションが加速されるだろう。
【００２７】
本発明の第二態様によれば、上で規定された薬剤は、上で規定したような骨代用材料上に被覆を生成するために使用される。上で説明したように、本発明の好ましい実施形態によれば、薬剤は、水に溶解されて水溶液を形成する。好ましくは、骨代用材料の表面上に被覆を生成するための水溶液は、上で規定した通りである。
【００２８】
上で規定した薬剤で骨代用材料を被覆する方法は特に限定されず、いかなる既知の方法も採用可能である。
【００２９】
上で規定したような水溶液の形で薬剤を使用する場合には、骨代用材料は水溶液、即ち上で規定された水溶液に、室温（２５℃）で例えば１０分間浸漬されてもよい。多孔質骨代用材料の場合には、被覆溶液が細孔中に浸透することを確実にするために低真空（例えば６００ｍｂａｒ）を例えば約１０分間適用することが推奨される。続いて、骨代用材料は、溶液から除去され、例えば３７℃で３０分間空気乾燥される。しかし、被覆材料の乾燥は不可欠なことではない。代替的に、移植のために、乾燥なしで、被覆された骨代用材料をそのまま直接使用することも可能である。
【００３０】
上で例示された方法は、もし望むなら好適に変更することができる。例えば、最初に骨代用材料に真空を適用し、それによって表面上に吸着された水を除去することが可能である。かかる前処理は、多孔質骨代用材料の場合に好ましい。なぜなら、多孔質骨代用材料の場合、被覆手順を実施する前に細孔内の吸着された水を除去することが有益であるからである。その後、そのように処理された材料は、例えば骨代用材料を被覆溶液に浸漬することによって被覆溶液で被覆される。
【００３１】
特に細孔中への被覆溶液の浸透が問題でない非多孔質骨代用材料の場合には、骨代用材料が硬い組織又は柔らかい組織に挿入される直前に、患者の傷、即ち欠陥部位に直接被覆溶液を注ぐことが可能である。それによって、被覆溶液による骨代用材料の被覆を得ることが可能である。
【００３２】
また、単一成分溶液を使用して骨代用材料の表面の被覆を少しずつ適用することも可能である。例えば、最初にクエン酸三ナトリウムを含有する溶液に、その後クエン酸を含有する溶液に骨代用材料を浸漬した後、リン酸一ナトリウムを含有する溶液に骨代用材料を浸漬し、この後、デキストロースを含有する溶液にそのように処理された材料を浸漬し、最後にアデニンを含有する溶液に材料を浸漬することが可能である。単一成分溶液は、いかなる順序でも骨代用材料の表面に適用されることができる。代替的に、被覆工程の前に上述の薬剤のうちの二つ、三つ又は四つの溶液を調製することも可能である。
【００３３】
薬剤が水に溶解されない場合には、骨代用材料に被覆を適用するための代替方法として、化学蒸着及び乾燥した結晶性薬剤への露出を挙げることができる。
【００３４】
第三態様によれば、本発明は、少なくとも一種の被覆を与えられた骨代用材料であって、前記被覆が、クエン酸三ナトリウム、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含む水溶液中に骨代用材料を浸漬することによって得られることを特徴とする骨代用材料を提供する。水溶液は、上で特定されたものと同じである。
【００３５】
被覆の厚さは、特に限定されず、数ミクロメートルから数ミリメートルであることができる。被覆の厚さは、被覆溶液の濃度及び被覆条件に依存する。一般的に、高濃度被覆溶液は骨代用材料上の被覆の厚さを増加すると言われている。代替的に、もし骨代用材料上の被覆の量を増加することが意図されるなら、被覆工程を望む限り多く繰り返すことが可能である。
【００３６】
さらに、上で規定した薬剤、特にクエン酸三ナトリウム、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含む、上で規定された被覆溶液で被覆された骨代用材料の表面は、超親水性であることが好ましい。被覆された骨代用材料の湿潤性は、液滴法に従って接触角を測定することによって決定されてもよい。本発明による被覆された骨代用材料は、ｔ＝０秒の時間（表面と水滴の最初の接触の時間）で、３０°以下、特に約２０°の接触角を示す。しかしながら、水滴は、数秒以内、例えば５０ミリ秒以下、特に約５〜１０ミリ秒で表面上に完全に広がる。かかる湿潤挙動は、親水性表面に対しては一般的である。
【００３７】
第四態様では、本発明は、骨代用材料を取り付ける方法に使用するためのキットであって、骨代用材料、クエン酸三ナトリウム、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含むことを特徴とするキットに関する。
【００３８】
第四態様によるキットは、乾燥粉末の形で包装された乾燥薬剤としてクエン酸三ナトリウム、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含有することが可能である。かかる乾燥粉末は、別個に又は乾燥薬剤の二つ以上又は全ての混合物として包装されることができる。骨代用材料の被覆前に、これらの乾燥粉末は、上で規定された被覆溶液を調製するために適切な量の水に溶解されることができる。
【００３９】
本発明の第四態様のさらに好ましい実施形態によれば、キットは、クエン酸三ナトリウム、クエン酸、リン酸一ナトリウム、デキストロース、及びアデニンを含む水溶液を含有する。キットは、上記の好ましい実施形態による水溶液を含有することが好ましい。例えば、本発明のキットに含有される水溶液は、２．６３〜５．２６ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム、０．３２７〜０．６５４ｇ／ｌのクエン酸、０．２２２〜０．４４４ｇ／ｌのリン酸一ナトリウム、３．１９〜６．３８ｇ／ｌのデキストロース、及び０．０２７５〜０．０５５ｇ／ｌのアデニンからなり、残りが水である。
【実施例】
【００４０】
実施例１
膜タイプの骨代用材料Ａｒｔｅｌｏｎ（登録商標）が使用された。Ａｒｔｅｌｏｎ（登録商標）は生物分解性ポリウレタンウレアである。この材料は、以下の組成を有する被覆水溶液で被覆された：
−  ２．６３ｇ／ｌのクエン酸三ナトリウム、
−  ０．３２７ｇ／ｌのクエン酸、
−  ０．２２２ｇ／ｌのリン酸一ナトリウム、
−  ３．１９ｇ／ｌのデキストロース、及び
−  ０．０２７５ｇ／ｌのアデニン。
【００４１】
骨代用材料は被覆溶液に１０分間浸漬された。次いで、６００ｍｂａｒの低真空が適用された。１０分後、骨代用材料は被覆溶液から除去され、３７℃で２０分間乾燥された。
【００４２】
骨代用材料の表面と直接接触している血液の凝固を決定するために、被覆された材料が新鮮な（即ち、凝固していない）ヒトの血液に露出された。凝固特性は、オッセオインテグレーションを可能にするための有益な条件の指標として役立つ。それゆえ、被覆された材料は、エッペンドルフ瓶に置かれ、血液が添加された。１０分後、材料は、除去され、ホルムアルデヒド溶液に固定された。そのように固定された材料は４℃で一晩保管された。
【００４３】
比較の理由のため、上記の被覆を与えられていない、膜タイプの同じ骨代用材料Ａｒｔｅｌｏｎ（登録商標）を上記と同じ方法で血液で処理した。
【００４４】
図１ａは、非凝固血液に露出後の骨代用材料のＳＥＭ写真（倍率＝１０００倍）を示し、骨代用材料は本発明による被覆を与えられていない。
【００４５】
図１ｂは、非凝固血液に露出後の本発明による骨代用材料のＳＥＭ写真（倍率＝１０００倍）を示す。
【００４６】
血液タンパク質の被覆、血小板活性化、及びフィブリン線維の結合が未処理骨代用材料と比較して本発明による骨代用材料の表面上で大きく改良されることが図１ａと図１ｂの比較から明らかである。
【００４７】
実施例２
Ｃｅｒａｓｏｒｂ  Ｇｅｌａｔｉｎｅタイプの骨代用材料が実施例１に記載されているのと同じ方法で被覆された。
【００４８】
被覆された骨代用材料が実施例１に記載されているのと同じ方法で処理された。
【００４９】
さらに、比較の理由のため、被覆されていない骨代用材料が同じ方法で血液で処理された。
【００５０】
血液で処理された骨代用材料の表面が図２ａ及び２ｂに示される。血液タンパク質の被覆、血小板活性化、及びフィブリン線維の結合が未処理骨代用材料と比較して本発明による骨代用材料の表面上で大きく改良されることが図２ａと図２ｂの比較から明らかである。
【図１ａ】
2015522361.tif 000003
【図１ｂ】
2015522361.tif 000004
【図２ａ】
2015522361.tif 000005
【図２ｂ】
2015522361.tif 000006
【国際調査報告】
2015522361.tif 000007
2015522361.tif 000008