(57)【要約】  腫瘍のクローン性、全メジャークローンの数および比率ならびにそれらを識別する変異を決定するための枠組みを提供するゲノム解析のシステムおよび方法が提示される。企図されたシステムおよび方法は、腫瘍細胞の集団内での出現タイミングを決定するために親対立遺伝子へ突然変異を位相化することをさらに可能にし、および腫瘍生検標本内に存在した正常組織をコンタミネーションしている量の正確な推定値をさらに提供する。
2015531240.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍のクローン性を前記腫瘍から得られた配列データを使用して生体外で決定する方法であって、
前記配列データから前記配列データ内の一つの対立遺伝子についてのコピー数および対立遺伝子画分を決定する工程、
前記決定されたコピー数および前記決定された対立遺伝子画分に基づいて前記対立遺伝子についての対立遺伝子状態を計算する工程、および
前記対立遺伝子状態を使用して別個の細胞クローンの存在および分布を同定し、それによってクローン性を決定する工程を含む方法。
【請求項２】
前記コピー数および前記対立遺伝子画分を決定する工程は、配列ストリングの増分同期化により局所アラインメントを生成する配列解析プログラムによって実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対立遺伝子状態は、正常コピー数、単一コピー増幅、単一コピー／ヘミ接合体欠失、ヘテロ接合体の喪失の後に続く残留対立遺伝子の一つ以上の増幅および両方の対立遺伝子の増幅からなる群から選択される状態であると同定される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記対立遺伝子状態を計算する工程は、正常コンタミネーションについての補正を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記対立遺伝子状態を計算する工程は、腫瘍および正常についての多数および少数対立遺伝子状態を使用する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記対立遺伝子状態を計算する工程は、一つの対立遺伝子について混合画分Ｍｂの同定を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍は、前記対立遺伝子についてのＭｂが０または１である場合は単クローン性である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記腫瘍は、前記対立遺伝子についてのＭｂが０より大きく１より小さい場合は多クローン性である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記対立遺伝子状態を計算する工程は、配列包括度レベルについての補正を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
一つの対立遺伝子状態の目印を決定する工程をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍内の多数のクローンのうちの少なくとも一つおよび前記腫瘍内のクローンの比率を決定するために前記対立遺伝子目印を使用する工程をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
突然変異を多数対立遺伝子もしくは少数対立遺伝子に結び付ける工程、および前記突然変異対立遺伝子画分を使用して対立遺伝子状態における変化と比較して前記突然変異のタイミングを決定する工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
一つの対立遺伝子状態図内に前記対立遺伝子状態をプロットする工程をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
一つの二対立遺伝子状態図内に前記対立遺伝子状態をプロットする工程をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
腫瘍内の対立遺伝子状態を生体外で可視化する方法であって、
複数の配列データから前記配列データ内の一つの対立遺伝子についてのコピー数および対立遺伝子画分を決定する工程、
前記決定されたコピー数および前記決定された対立遺伝子画分に基づいて前記対立遺伝子についての対立遺伝子状態を計算する工程、および
前記コピー数対前記対立遺伝子画分をプロットする対立遺伝子状態図内に前記対立遺伝子の前記対立遺伝子状態をマッピングする工程を含む方法。
【請求項１６】
前記対立遺伝子状態図は、前記コピー数対多数対立遺伝子画分をプロットする、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対立遺伝子状態図は、前記対立遺伝子状態図内の各頂点が一つの腫瘍対立遺伝子状態に対応するように提示される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対立遺伝子状態図を正常コンタミネーションについて調整する工程をさらに含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記対立遺伝子状態図は、多クローン性腫瘍内の一つの対立遺伝子の喪失もしくは獲得を伴う１サブセットのクローンが頂点間に描かれた縁部に沿ってマッピングするように提示される、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対立遺伝子状態図は、多クローン性腫瘍内の一つの対立遺伝子の喪失もしくは獲得以外の変化を伴うクローンが頂点間に描かれた縁部間でマッピングするように提示される、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記対立遺伝子状態図は、二対立遺伝子状態図である、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
ゲノム配列データを解析する方法であって、
ＢＡＭサーバが複数のゲノム配列解読を受信する工程であって、前記複数のゲノム配列解読は、患者の腫瘍試料のゲノムおよび正常試料のゲノムから得られる工程、
前記ＢＡＭサーバによって、複数のディファレンシャル配列オブジェクトを生成するために前記複数のゲノム配列解読を処理する工程であって、前記ディファレンシャル配列オブジェクトは前記腫瘍ゲノム内の一つの対立遺伝子についてのコピー数および対立遺伝子画分を含む工程、
前記ＢＡＭサーバに結合された解析エンジンによって、前記対立遺伝子についての一つの対立遺伝子状態を決定するために、前記対立遺伝子についての前記コピー数および前記対立遺伝子画分を処理する工程を含む方法。
【請求項２３】
前記ＢＡＭサーバがディファレンシャル配列データベースに前記ディファレンシャル配列オブジェクトを提供するように、および前記ディファレンシャル配列データベースが前記解析エンジンに前記ディファレンシャル配列オブジェクトを提供するように、前記ＢＡＭサーバおよび前記解析エンジンに結合された前記ディファレンシャル配列データベースをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
対立遺伝子状態図内に前記対立遺伝子についての前記対立遺伝子状態をプロットする前記解析エンジンによってグラフ出力を生成する工程をさらに含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
腫瘍由来のゲノム情報を生体外で特性評価する方法であって、
前記腫瘍ゲノム内の一つの対立遺伝子についての対立遺伝子状態を決定する工程、
前記決定された対立遺伝子状態を使用して別個の細胞クローンの存在および分布を同定し、それによって前記腫瘍を単クローン性腫瘍である、または少なくとも二つの別個の腫瘍クローンを含むと同定する工程を含む方法。
【請求項２６】
前記決定された対立遺伝子状態を使用して前記少なくとも二つの別個の腫瘍クローンを非関連性であると同定する工程をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記決定された対立遺伝子状態を使用して前記少なくとも二つの別個の腫瘍クローンについてクローン歴を同定する工程をさらに含む、請求項２５または２６に記載の方法。
【請求項２８】
腫瘤内の腫瘍クローンを生体外で特性評価する方法であって、
前記腫瘤からゲノム配列情報を得る工程、
前記ゲノム配列情報を使用して腫瘍の前記ゲノム配列情報内で一つの対立遺伝子についての対立遺伝子状態を決定する工程、
対立遺伝子状態図内の前記対立遺伝子についての前記対立遺伝子状態の場所を決定する工程、および
前記場所を使用してそれにより前記クローンを単クローン性または多クローン性であると同定する工程を含む方法。
【請求項２９】
前記ゲノム配列情報は、ＢＡＭサーバから得られる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記対立遺伝子状態の場所を決定する工程は、図形表示内で実施される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記クローンは、前記対立遺伝子状態の場所が前記対立遺伝子状態図の一つの頂点上にある場合は単クローン性である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍を治療するための治療情報を提供する方法であって、
前記腫瘍における対立遺伝子の対立遺伝子状態情報を究明する工程、ここで、前記対立遺伝子情報は、前記対立遺伝子のコピー数および対立遺伝子画分を含み、および
薬物を用いた治療への腫瘍の感受性、および薬物耐性のリスク増大または転移可能性の少なくとも一つの指標である、腫瘍内の（ａ）クローンもしくは（ｂ）クローンの進化パターンの存在もしくは発生を同定するため前記対立遺伝子情報を使用する工程を含む方法。
【請求項３３】
前記存在もしくは出現を同定する工程は、前治療データもしくは先験的な公知データに基づく、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１２年１０月９日に出願された同時係属の米国仮特許出願第６１／７１１４６７号明細書に対する優先権を主張するものである。
本発明の分野は、ゲノムデータのコンピュータ解析であり、特に混合細胞集団のクローン性状態の同定に関する。
【背景技術】
【０００２】
全ゲノムデータの利用可能性が増加して全ゲノム配列決定の速度がますます高まるにつれて、現在では、臨床医もしくは科学者により効果的な治療または薬物開発を可能にする情報を提供するために、有意義な解析を必要とする極めて大量のデータを利用することができる。
【０００３】
例えば、多発性腫瘍および対応する正常全ゲノム配列は、現在は「癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ）」のようなプロジェクトから入手できるが、関連情報の抽出は困難である。これはさらに、統計学的関連データを得るには高いゲノム配列決定包括度（例えば、３０倍を超える）が必要であることによって複雑になる。圧縮された形態でさえ、そのようなゲノム情報は頻回に数百ギガバイトに達する可能性があり、多数のそのような大きなデータセットを比較する有意義な解析は多くの場合に極めて時間がかかり管理するのが困難であるが、第２試料と比較して任意の所定試料内で発生した多数のゲノム変化を発見することが絶対的に不可欠である。より近年には、国際公開第２０１３／０７４０５８号に記載されているように、大量の出力ファイルを回避するフォーマットでの迅速な情報生成を可能にするシステムおよび方法が開発されてきた。本明細書で特定したこの特許公開および全ての他の刊行物は、各個別の公開もしくは特許出願が特別および個別的に参照により組み込まれると指示されたのと同程度まで参照により組み込まれる。組み込まれた参考文献における用語の定義もしくは使用が本明細書に提供したその用語の定義と矛盾する、もしくは反対である場合は、本明細書に提供したその用語の定義が適用され、参考文献内のその用語の定義は適用されない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】国際公開第２０１３／０７４０５８号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
’０４８特許出願のシステムは、他の公知のシステムに比して有意な改善を提供するが、それでも様々な困難が存在する。例えば、大多数の乳癌は臨床的およびゲノム的に異種であり、幾つかの病理的および分子的に別個のサブタイプから構成され、これらはゲノム解析を複雑にすることが多い。さらに、現在公知の方法は、可能性のある腫瘍細胞進化および結果として生じる組織内の腫瘍細胞に共通するクローン性に関する洞察を獲得するためのそのようなゲノム多様性のデコンボリューションを許容しない。
【０００６】
そこで、当分野では極めて多数のゲノム解析の方法が公知であるが、それらの全部またはほぼ全部は幾つかの不利点を有している。最も需要なことは、現在までに公知の方法は、分子レベルでの腫瘍進行を同定することができず、それを用いてクローン性および潜在的治療有効性に関する洞察を提供することもできない。他の観点から見ると、今までに公知の方法は、多数の不均質細胞を含有する細胞内の細胞集団のクローン性およびクローン関係の同定を許容しない。結果として、現在もなおゲノム解析のための改良されたシステムおよび方法、特に詳細にはクローン性、クローン画分、分子的腫瘍進行および／またはそのような情報に基づく治療選択肢に関する情報を提供するシステムおよび方法を提供する必要がある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ゲノム解析のための様々なシステム、装置および方法に関し、そして、特に試料から得られたゲノムデータに基づいて、細胞の一つ以上のクローン集団を含有する試料内の別個の細胞クローンの存在および分布を同定するため遺伝子解析に関する。特に好ましい態様では、解析は、腫瘍さもなければ異常細胞集団由来のゲノムＤＮＡに基づいており、腫瘍もしくは細胞集団内の複数のクローンの決定を可能にするだけではなく、可能性のあるクローン進化および／またはクローン関係の同定もまた可能にする。
【０００８】
本発明の主題の一つの態様では、腫瘍から入手した配列データから腫瘍のクローン性を生体外で（ex-vivo）決定する方法は、配列データ内の一つの対立遺伝子についてのコピー数および対立遺伝子画分を配列データから決定する工程、および決定されたコピー数および決定された対立遺伝子画分に基づいてその対立遺伝子についての対立遺伝子状態を計算するまた別の工程を含んでいる。次に対立遺伝子状態を使用して、腫瘍のクローン性が決定される。本発明の主題には限定されないが、一般には、対立遺伝子状態は、対立遺伝子状態図（単一または二対立遺伝子状態図であってよい）内にプロットまたは表示されるのが好ましい。
【０００９】
本発明の主題の少なくとも一部の実施形態では、コピー数および対立遺伝子画分の決定は、配列ストリングのインクリメンタルシンクロナイゼーションにより局所アラインメントを生成する配列解析プログラム（例えば、ＢＡＭＢＡＭ）によって実施される。数ある状態の中でも、企図された対立遺伝子状態には、正常コピー数、単一コピー増幅、単一コピー／ヘミ接合体欠失、ヘテロ接合体のコピーニュートラル喪失および両対立遺伝子の増幅が含まれる。
【００１０】
本発明の主題のさらに別の企図された実施形態では、対立遺伝子状態の計算は、正常コンタミネーションについての補正を含み、腫瘍および正常についての多数および少数対立遺伝子状態を使用し、および／または一つの対立遺伝子についての混合画分Ｍｂ（単クローン性腫瘍に対しては０または１のいずれかであり、腫瘍が多クローン性である場合は０より大きく１より小さい）の同定を含んでいる。さらに、対立遺伝子状態の計算は、特に腫瘍についての包括度レベルが、同一患者の対応する非腫瘍（例えば、健常）試料についての包括度レベルより高い場合には、配列包括度レベルについての補正もまた含むことができる。
【００１１】
所望の場合、企図された方法は、好ましくは腫瘍内の多数の別個の（関連もしくは非関連）クローンの数および／または腫瘍内のクローンの比率を決定するために使用される、対立遺伝子状態の目印（landmark）を決定する工程をさらに含むことになる。加えて、もしくは代替的に、突然変異を多数対立遺伝子もしくは少数対立遺伝子に結び付けられること、および突然変異対立遺伝子画分を使用すると対立遺伝子状態における変化に比較して突然変異のタイミングを決定できることもまた企図されている。
【００１２】
本発明の主題のまた別の態様では、腫瘍内の対立遺伝子を生体外で（ex-vivo）可視化する方法は、配列データ内で一つの対立遺伝子についてのコピー数および対立遺伝子画分を決定する工程、およびその対立遺伝子についての対立遺伝子状態を決定されたコピー数および決定された対立遺伝子画分に基づいて計算するまた別の工程を含んでいる。さらに別の工程では、対立遺伝子の対立遺伝子状態は、コピー数対対立遺伝子画分（典型的には多数対立遺伝子画分）をプロットする対立遺伝子状態図内でマッピングされる。
【００１３】
最も典型的には、対立遺伝子状態図は、対立遺伝子状態図内の各頂点が一つの腫瘍対立遺伝子状態に対応し、多クローン性腫瘍内の一つの対立遺伝子の喪失もしくは獲得が頂点間に引かれた縁部に沿って位置する、および／または多クローン性腫瘍内の一つの対立遺伝子の喪失もしくは獲得以外の変化を備えるクローンが頂点間に引かれた縁部間に位置するように表示される。さらにまた、対立遺伝子状態図が正常コンタミネーションについて調整されることも企図されている。当然ながら、対立遺伝子状態図は二対立遺伝子状態図の場合があることを理解されたい。
【００１４】
このため、および異なる観点から見ると、本発明者らはさらに、ＢＡＭサーバが複数のゲノム配列解読を受信するゲノム配列データの解析方法であって、その複数のゲノム配列解読は、患者の腫瘍試料のゲノムおよび正常試料のゲノムから得られる方法も企図している。ＢＡＭサーバは次に、ゲノム配列解読を処理して、腫瘍ゲノム内の一つの対立遺伝子についてのコピー数および対立遺伝子画分を含む複数のディファレンシャル配列オブジェクトを生成する。解析エンジン（ＢＡＭサーバに結合されている）は次に、対立遺伝子についてのコピー数および対立遺伝子画分を処理し、そこでその対立遺伝子についての一つの対立遺伝子状態を決定する。
【００１５】
そのような方法の典型的な実施形態では、ディファレンシャル配列データベースは、ＢＡＭサーバがディファレンシャル配列データベースにディファレンシャル配列オブジェクトを提供するように、およびディファレンシャル配列データベースが解析エンジンにディファレンシャル配列オブジェクトを提供するように、ＢＡＭサーバおよび解析エンジンに結合されている。さらに、対立遺伝子状態図内でその対立遺伝子についての対立遺伝子状態をプロットする解析エンジンによって、図形出力が生成されることが企図されている。
【００１６】
本発明の主題のまた別に企図された態様では、腫瘍からのゲノム情報を生体外で（ex-vivo）特性評価する方法は、腫瘍ゲノム内の一つの対立遺伝子についての対立遺伝子状態を決定する工程、および決定された対立遺伝子状態を使用してその腫瘍を単クローン性腫瘍である、または少なくとも二つの別個の腫瘍クローンを含んでいると同定する工程を含んでいる。
【００１７】
そのような方法では、決定された対立遺伝子状態を使用して腫瘍クローンの関係を（例えば、別個で非関連性である、または関連性であると）同定することもさらに企図されている。クローンが関連性である場合、決定された対立遺伝子状態を使用して別個の腫瘍クローンについてのクローン歴を同定することが企図されている。
【００１８】
そこで、本発明者らは、腫瘤内で腫瘍クローンを生体外で（ex-vivo）特性評価する方法であって、一つの工程では腫瘤からのゲノム配列情報が（例えば、ＢＡＭサーバから）得られる方法もまた企図している。また別の工程では、ゲノム情報は、腫瘍ゲノム配列情報内で一つの対立遺伝子についての対立遺伝子状態を決定するために使用される。さらに別の工程では、対立遺伝子状態図内の対立遺伝子についての対立遺伝子状態の場所が（例えば、図形表示またはコンピュータ内で、または数値的に）決定され、その場所を使用してクローンは単クローン性または多クローン性であると同定される。例えば、クローンが、対立遺伝子状態の場所が対立遺伝子状態図の一つの頂点上にある場合は単クローン性である。
【００１９】
本発明の主題のさらにまた別の態様では、本発明者らは、腫瘍を治療するための治療情報を提供する方法を企図している。そのような方法では、腫瘍についての対立遺伝子状態情報が解明され、薬物治療への腫瘍の感受性、および薬物耐性もしくは転移能のリスク増大の少なくとも一つの指標である、（ａ）クローンもしくは（ｂ）クローンの進化パターンの存在もしくは出現が解明される。最も典型的には、存在もしくは出現を同定する工程は、前治療データもしくは先験的公知データに基づいている。
【００２０】
本発明の主題の様々な目的、特徴、態様および利点は、その中で同様の数字が同様の成分を表す添付の図面とともに、好ましい実施形態についての下記の説明からより明白になるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】生殖細胞系から始まって、初期腫瘍細胞、腫瘍生検によって試料採取されるメジャーおよびマイナークローンの集団への腫瘍の進化の典型的な例示を示す図である。
【図２】ゼロ正常コンタミネーション（α＝０）を備える単クローン性腫瘍試料についての模擬データの典型的な対立遺伝子状態図（ＡＳＤ）を示す図である。異なるコピー数変化を示す染色体領域が異なる陰影でプロットされている。この模擬腫瘍ゲノムは６つの対立遺伝子状態、正常、単一コピー増幅、ヘミ接合体欠失、ホモ接合体欠失、コピーニュートラルＬＯＨおよび多重コピーの二対立遺伝子増幅を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、典型的には様々なレベルの正常コンタミネーション物質を備える、図２の模擬単クローン性腫瘍ゲノムについての一セットの対立遺伝子状態図を示している。図３Ａは、０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｂは１０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｃは５０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｄは９０％の正常コンタミネーション物質を示し、これらは相違が正常コンタミネーション物質レベルの関数としての分解能であることを示している。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、典型的には様々なレベルの正常コンタミネーション物質を備える、図２の模擬単クローン性腫瘍ゲノムについての一セットの対立遺伝子状態図を示している。図３Ａは、０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｂは１０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｃは５０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｄは９０％の正常コンタミネーション物質を示し、これらは相違が正常コンタミネーション物質レベルの関数としての分解能であることを示している。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、典型的には様々なレベルの正常コンタミネーション物質を備える、図２の模擬単クローン性腫瘍ゲノムについての一セットの対立遺伝子状態図を示している。図３Ａは、０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｂは１０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｃは５０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｄは９０％の正常コンタミネーション物質を示し、これらは相違が正常コンタミネーション物質レベルの関数としての分解能であることを示している。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、典型的には様々なレベルの正常コンタミネーション物質を備える、図２の模擬単クローン性腫瘍ゲノムについての一セットの対立遺伝子状態図を示している。図３Ａは、０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｂは１０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｃは５０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｄは９０％の正常コンタミネーション物質を示し、これらは相違が正常コンタミネーション物質レベルの関数としての分解能であることを示している。
【図４】対立遺伝子状態間のいくつかの可能性のある二方向性および一方向性トランジションを示している図２の対立遺伝子状態図であって、一方向性トランジションは親染色体の不可逆的喪失を含むトランジションである対立遺伝子状態図を示す図である。
【図５】前の図に図示した対立遺伝子状態から単一コピーの喪失もしくは獲得だけが異なる新規対立遺伝子状態へトランジションする腫瘍ゲノムについての対立遺伝子状態図を示す図である。ここで、トランジション期対立遺伝子状態は、腫瘍が二つの異なるクローン／サブクローンの混合を含む場合に作り出される。クローンＡは、最初の対立遺伝子状態、（２，１）、（５，２）および（１，０）によって規定されている。クローンＢは、増幅および欠失を通してこれらの状態を変化させて対立遺伝子状態、（２，２）、（４，２）および（２，０）を生成する。パーセンテージは、腫瘍集団中に存在するクローンＢのパーセンテージを表すが、このとき、０％はクローンＡの単クローン性集団を説明し、１００％はクローンＢの単クローン性集団である。
【図６】図２の対立遺伝子状態図の典型的な例示を示す図であり、腫瘍が二つ以上の非関連または遠縁のクローンからなる場合に発生する可能性がある、対立遺伝子状態が「スキップされた」場合に生成されるトランジション期対立遺伝子状態を示している。その場合には、多数および少数対立遺伝子の両方において二つのメジャークローンの対立遺伝子状態が異なる場合は、トランジション期状態は、対立遺伝子状態を接続する縁部上では見いだされない。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、二つのＧＢＭ腫瘍、ＧＢＭ−０６−０１４５（図７Ａ）およびＧＢＭ−０６−０１８５（図７Ｂ）についての対立遺伝子状態図の典型的な例示を示す図である。近似パラメータは、正常コンタミネーションが各々２１．５％および１４．６％であることを見いだした。図７Ａは、クローン対立遺伝子状態しか示しておらず、トランジション期対立遺伝子状態の証拠を示していないので、これはＧＢＭ−０６−０１４５が単クローン性腫瘍であることを示しているが、図７Ｂはクローン性状態および多重トランジション期対立遺伝子状態の両方を示している。トランジション期対立遺伝子状態（（＊）を用いて表示）は三種類の混合のパーセンテージを特徴とするので、この多クローン性腫瘍は少なくとも三つのサブクローンからなるはずである。図７Ｂでプロットされた黒色Ｘは、ＧＢＭ−０６−０１８５のクローン混合を決定するために使用するのに適切である「目印」対立遺伝子状態を表す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、二つのＧＢＭ腫瘍、ＧＢＭ−０６−０１４５（図７Ａ）およびＧＢＭ−０６−０１８５（図７Ｂ）についての対立遺伝子状態図の典型的な例示を示す図である。近似パラメータは、正常コンタミネーションが各々２１．５％および１４．６％であることを見いだした。図７Ａは、クローン対立遺伝子状態しか示しておらず、トランジション期対立遺伝子状態の証拠を示していないので、これはＧＢＭ−０６−０１４５が単クローン性腫瘍であることを示しているが、図７Ｂはクローン性状態および多重トランジション期対立遺伝子状態の両方を示している。トランジション期対立遺伝子状態（（＊）を用いて表示）は三種類の混合のパーセンテージを特徴とするので、この多クローン性腫瘍は少なくとも三つのサブクローンからなるはずである。図７Ｂでプロットされた黒色Ｘは、ＧＢＭ−０６−０１８５のクローン混合を決定するために使用するのに適切である「目印」対立遺伝子状態を表す。
【図８】ＧＢＭ−０６−０１４５についての単クローン性の核型を描出する典型的なプロットである。プロットの最上部に表示した「相対包括度」および「対立遺伝子画分」は、どちらもＢａｍＢａｍによって観察された結果の出力ならびに単一クローンおよび正常コンタミネーションの混合をモデリングすることによって生成された計算した包括度および対立遺伝子画分の両方を示している。実数データ対モデリングデータの比較は、極めて強い一致を示している。クローンの核型は、腫瘍ゲノムについての多数および少数対立遺伝子状態を示しており、これは全ｃｈｒ７およびｃｈｒ１９のうちの１コピーの増幅、ｃｈｒ１０の１コピーの完全喪失およびｃｈｒ９ｐのアームレベル喪失を示している。
【図９】ＧＢＭ−０６−０１８５についての多クローン性の核型を描出する典型的なプロットを示す図である。計４個の別個のクローンがこの腫瘍内で同定され、クローンＤが腫瘍試料の４２．７％を含む、この集団の優性クローンであると決定された。全クローンは、共通してｃｈｒ７、ｃｈｒ１９およびｃｈｒ２０の単一コピー増幅、ｃｈｒ１０およびｃｈｒ２２の単一コピー喪失ならびにｃｈｒ９ｐの喪失を有している。クローンＢ、ＣおよびＤは全部がｃｈｒ６の欠失を有するが、クローンＢの欠失は限局性であり、クローンＣおよびＤはｃｈｒ６ｑのアームレベル喪失を示している。クローンＤは、さらにｃｈｒ９の完全コピーの増幅によって識別される。
【図１０】ＧＢＭ−０６−０１５２についての多クローン性の核型を描出する典型的なプロットを示す図である。三つのクローンが推定２４．１％の正常コンタミネーションを有するこの腫瘍試料中で同定された。全クローンはｃｈｒ１、ｃｈｒ１９およびｃｈｒ２０の増幅、ｃｈｒ１０およびｃｈｒ２２の欠失、ならびに先行する章で記載した二つのＤＭを作成したクロモトリプシス（染色体破砕）様事象に関連するｃｈｒ１２の限局性喪失を共有している。クローンＢおよびＣは、ｃｈｒ７の増幅およびｃｈｒ１ならびにｃｈｒ２、ｃｈｒ３、ｃｈｒ４、ｃｈｒ８、ｃｈｒ１３およびｃｈｒ１７の非増幅コピーの欠失を示している。クローンＣは、ｃｈｒ８の残りのコピーをさらに増幅させる。
【図１１】ＧＢＭ−０６−１０８６についての多クローン性の核型を描出している典型的なプロットを示す図である。四つのクローンが、推定７．５％の正常コンタミネーションを有するこの腫瘍試料中で同定された。全クローンは、ｃｈｒ２１の増幅およびｃｈｒ９およびｃｈｒ１１ｐの欠失を共有する。クローンＣおよびＤは、ｃｈｒ１、ｃｈｒ３、ｃｈｒ４、ｃｈｒ５、ｃｈｒ６、ｃｈｒ８、ｃｈｒ１０、ｃｈｒ１３、ｃｈｒ１４、ｃｈｒ１５、ｃｈｒ１７、ｃｈｒ１８およびｃｈｒ２０を欠失して有意な染色体喪失を示す。腫瘍試料の４１．６％を構成する優性クローンＤは、さらにｃｈｒ１８の単独残留コピーを欠失し、ｃｈｒ１９を増幅する。黒色矢印は、クローンＡおよびＢ中のＣＤＫ２ＮＡの位置を示しており、クローンＢ内のＣＤＫＮ２Ａの限局性喪失の出現が強調されている。
【図１１】ＧＢＭ−０６−１０８６についての多クローン性の核型を描出している典型的なプロットを示す図である。四つのクローンが、推定７．５％の正常コンタミネーションを有するこの腫瘍試料中で同定された。全クローンは、ｃｈｒ２１の増幅およびｃｈｒ９およびｃｈｒ１１ｐの欠失を共有する。クローンＣおよびＤは、ｃｈｒ１、ｃｈｒ３、ｃｈｒ４、ｃｈｒ５、ｃｈｒ６、ｃｈｒ８、ｃｈｒ１０、ｃｈｒ１３、ｃｈｒ１４、ｃｈｒ１５、ｃｈｒ１７、ｃｈｒ１８およびｃｈｒ２０を欠失して有意な染色体喪失を示す。腫瘍試料の４１．６％を構成する優性クローンＤは、さらにｃｈｒ１８の単独残留コピーを欠失し、ｃｈｒ１９を増幅する。黒色矢印は、クローンＡおよびＢ中のＣＤＫ２ＮＡの位置を示しており、クローンＢ内のＣＤＫＮ２Ａの限局性喪失の出現が強調されている。
【図１２】二重ＡＳＤ上で位相化された突然変異の典型的な例示を示す図である。単一コピー獲得対立遺伝子状態における一領域、「正常」対立遺伝子状態内の一領域、ＣＮ−ＬＯＨを示す一領域およびＬＯＨを示す一領域からなる、腫瘍ゲノム上の代表的領域が示されている。二つの多数位相化（赤色の星）および一つの少数位相化（青色の星）された三つの突然変異は、増幅領域内で見いだされる。一つは多数位相化およびもう一つは少数位相化された二つの突然変異は、「正常」対立遺伝子状態上で見いだされる。ＬＯＨを示す両方の領域は、各々が単独残留対立遺伝子に位相化された一つの突然変異を有するので、そこで多数位相化されている。二重ＡＳＤの下方は、各突然変異の補正対立遺伝子画分ＭＡＦｃを用いて、ｘ軸に沿った場所を決定するために、これらの突然変異の各々が見いだされた場所を示している。単一コピー獲得対立遺伝子状態における二つの多数位相化された突然変異の異なる配置であって、両方の多数対立遺伝子上に存在する突然変異対立遺伝子（すなわち、増幅前に突然変異した）だけが単一コピー獲得多数対立遺伝子状態の近くで見いだされる異なる配置に注目されたい。他方は、単一コピー獲得少数対立遺伝子状態の近くで見いだされ、突然変異が多数対立遺伝子の唯一のコピー上に存在することを正確に同定している。最後に、青色の少数位相化された突然変異全部が二重ＡＳＤの左半分に向かって見いだされることに注目されたい。
【図１３】腫瘍ＧＢＭ−０６−０１４５についての二重ＡＳＤ上の位相化された突然変異の例示を示す図である。これらのプロット上では、七つの領域が取り囲まれている。（ａ）増幅対立遺伝子状態への多数位相化はそれでもまだＭＡＦｃを提示するが、これは突然変異が二つのコピー中の一つの上だけであることを示唆している、（ｂ）ＭＡＦｃを伴う増幅対立遺伝子状態への多数位相化であって、これは突然変異が両方の増幅コピー上に存在することを示唆している、（ｃ）ＬＯＨ対立遺伝子状態と一致する対立遺伝子画分を伴う多数位相化、（ｄ）単一コピーと一致するＭＡＦｃを伴う多数増幅対立遺伝子状態における少数位相化、（ｅ）増幅対立遺伝子状態と一致するＭＡＦｃを伴う非位相化突然変異および（ｆ）ＬＯＨ対立遺伝子状態と一致するＭＡＦｃを伴う非位相化突然変異。
【図１４】腫瘍ＬＵＳＣ−３４−２５９６についての二重ＡＳＤ上の位相化された突然変異の例示を示す図である。二つの取り囲まれた領域（ａ）および（ｂ）は、均衡した増幅対立遺伝子状態（２，２）内の各々多数および少数対立遺伝子へ位相化された多数の突然変異を示している。ＮＤＲＧ１内の一つの多数位相化された突然変異は、対応するＭＡＦｃを伴うトランジション期対立遺伝子状態内で見いだされる。ＢＲＡＦおよびＤＮＭＴ３Ａにおける二つのミスセンス突然変異、ならびにＴＰ５３における一つのナンセンス突然変異の場所は、ＢＲＡＦを高増幅対立遺伝子状態に、ＤＮＭＴ３Ａを「正常」対立遺伝子状態に、そしてＴＰ５３をＣＮ−ＬＯＨ状態に配置している非位相化プロット内に示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明者らは、対立遺伝子状態モデル（例えば、対立遺伝子状態図として表示された）を使用すると遺伝的に異質の試料のクローン性を容易に解明できること、およびこのようにして得られたクローン性情報は解析、予後診断および診断使用を含む様々な目的のために使用できることを見いだした。
【００２３】
例えば、本明細書で企図した方法およびシステムは、全ゲノム配列データを用いて腫瘍の集団をコンピュータで解析する、および所望であれば、対立遺伝子状態図を用いて腫瘍試料のクローン性を視覚的に評価する能力を提供する。異なる観点から見ると、腫瘍のクローン混合は、現在では腫瘍集団を腫瘍細胞集団のメジャークローンへ分解することによって、ならびコピー数および対立遺伝子画分を明らかにするために正常コンタミネーションを推定すること（これは、国際公開第２０１３／０７４０５８号に記載されたように、好ましくはＢａｍＢａｍを用いて実施される）によって決定できる。さらにまた、全メジャークローンの全ゲノム核型の決定および位相化のために企図されたシステムおよび方法は、順にクローン特異的コピー数変化の出現のタイミングを決定するために多クローン性腫瘍ゲノムの系統樹について推測することを許容する。最後に、位相化および突然変異対立遺伝子画分を用いることによって、突然変異の出現は、それらがコピー数変化を包含することに関するタイミングを決定することができる。
【００２４】
このため、本発明の主題の一つの態様では、クローン性およびタイミングの情報が、腫瘍タイプの反映である、または腫瘍の存在もしくは進行への個体もしくは組織の応答である可能性がある、個々の腫瘍の動的性質をより明確に理解することに役立つことを理解すべきである。注目すべきことに、これらの情報は全部が単一腫瘍生検標本から見いだすことができ、企図されたシステムおよび方法を特に生体外診断アプローチにおいて有用にさせる。
【００２５】
本発明の主題のまた別の態様では、本明細書で企図された系統発生学に基づく突然変異モデルを使用すると、関連試料（例えば、原発腫瘍およびその転移）の突然変異を解析することができ、そこで癌が拡散するに従った突然変異歴を再構成できる。全部が単一腫瘍生検の全ゲノム配列データ由来である、腫瘍のクローン性を決定し、増殖腫瘤を含むメジャークローンの全部を同定する能力は、極めて様々な潜在的な臨床用途を開く。例えば、新規に診断された患者の腫瘍が生検されるシナリオでは、メジャークローンの全部がクローン性解析により同定される。臨床医は次に、初期腫瘤を治療すれば派生クローンも標的にできると見込んで、このクローン性解析を使用して最終的には系統樹、前駆腫瘍細胞までのクローンに特異的な変化にしたがって患者の治療をテーラーメードすることができよう。他方、患者が手術または化学療法の開始前に長期間にわたり安全に監視できる進行の遅い腫瘍であると診断されたシナリオでは、一連の生検組織標本のクローン性解析を実施することができ、腫瘍のクローン組成を時系列で追跡することによって、臨床医は最も急速に進行するクローンを同定することができる。現在は優性クローンではないが優性クローンになることが決まっているクローンを標的とする治療を設計することによって、その癌をより効果的に治療できる可能性がある。
【００２６】
クローン性解析は、さらに癌の転移性拡散をより明確に理解することに有用であると分かることも企図されている。そのようなシナリオでは、原発腫瘍および一連の転移についてのクローン性解析を使用して、拡散性腫瘍中に存在するメジャークローン全部が決定される。原発腫瘍および各転移のクローン組成を調査することによって、各クローンがどのように拡散するのかを決定し、転移能の増大を示す一つ以上の特定クローンが存在するかどうかを見いだすことができる。転移クローンに固有の特性を決定することによって、本発明者らは別の患者の原発腫瘍のマイナークローンにおけるこれらの特性の出現の同定において、切迫転移の可能性を決定するための「初期警告」信号を開発できることを企図している。
【００２７】
クローン性解析のためのデータ収集の方法に関して、コピー数および対立遺伝子画分を同定するためのゲノム解析は、第一および第二組織試料（例えば、健常および疾患組織）から各々のより大きな遺伝配列ストリングの複数の相当に小さなゲノム配列サブストリング（例えば、配列決定ランからのショート解読）が得られるシステムおよび方法を用いて決定されるのが好ましい。遺伝配列ストリングは、次に少なくとも一つの対応するサブストリングの一つ以上の公知の位置を用いて増分同期化され、そこで局所アラインメントが生成される。このように生成された局所アラインメントは次に、有意な（典型的には参照ゲノム配列と比較して）ディファレンシャル情報を含有する局所アラインメント内の第一および第二配列ストリング間の局所ディファレンシャルストリングを生成するために（典型的には参照ゲノム配列を用いて）解析される。次にゲノムの一部分もしくは全体についてさえのディファレンシャル遺伝配列オブジェクトが、局所ディファレンシャルストリング、および最も典型的には複数のディファレンシャル局所ストリングを用いて作成される。局所アラインメントおよびディファレンシャル情報を生成するための増分同期化は、全ゲノムの処理速度ならびに対立遺伝子特異的情報（例えば、コピー数、対立遺伝子画分など）を生成する能力の有意な増加を含む、様々な技術的利点を提供することに注目されたい。
【００２８】
そのようなシステムおよび方法では、また別の非常に大きな中間ファイル（または出力ファイルさえ）を生成するために二つの非常に大きなファイルを処理する代わりに、複数の有意にもっと小さい部分内でゲノムレベル解析を達成でき、そのもっと小さな部分は、一つ以上のサブストリングのゲノム内の公知の位置を用いて参照ゲノムへアラインメントされる。また別の観点から見ると、アラインメントは、サブストリングおよび参照ゲノム配列の公知の位置を用いて配列ストリングの増分同期化によって実施することができ、参照ゲノムに比較して関連変化しか含んでいない出力ファイルを生成できる。そこで、処理速度が有意に改良され、有意義な出力を生成するために必要とされるデータ量が劇的に減少する。さらにまた、そのようなシステムおよび方法が、特に、ハプロタイピング／体細胞および生殖細胞変異コーリング、ならびに対立遺伝子特異的コピー数の決定を可能にすることに留意されたい。さらに、本明細書に提示したシステムおよび方法は、ＳＡＭ／ＢＡＭフォーマットの配列情報とともに使用するために適合する。
【００２９】
例えば、複数の配列決定フラグメント（例えば、ドナーの腫瘍試料および同一ドナーの対応する非腫瘍試料由来のショート解読）は、試料由来の配列決定フラグメントを組織化するために使用される同一参照ゲノムにアラインメントされる。そこで、そのような方法は、同一患者および参照ゲノム由来の二つの配列決定フラグメントデータセット（一つは腫瘍から、もう一つは対応する正常「生殖細胞」組織から）を使用し、同一ゲノム位置に重複している両方のデータセット内の全配列が（参照ゲノムおよびサブストリング内のアノテーションに基づいて）同時に処理されるようにデータセットを読み取る。これは、このようなデータを処理するために最も効率的な方法であるが、他方各データセットが単独で処理され、結果は後になってのみマージされる逐次方法で遂行するのは困難もしくは不可能であろう複雑な解析もまた可能にする。特に適切なシステムは、本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２０１３／０７４０５８号に記載されている。
【００３０】
基本的考察
第一次近似では、腫瘍増殖は癌細胞の集団である。この集団は、全腫瘍細胞が実質的に同一の遺伝的特徴を共有していて均質である。そのような腫瘍は、全腫瘍細胞は腫瘍細胞がそれから増殖する前駆腫瘍細胞と比較して、実質的に同一の遺伝変異（例えば、コピー数異常、構造変異、突然変異）を特徴とするので、単クローン性であると言われる。この前駆腫瘍細胞は、腫瘍を開始した最初の癌細胞の場合がある、または腫瘍集団の完全除去に役立つ有益な突然変異を獲得した後に生じた腫瘍細胞の場合がある。
【００３１】
他方、多クローン性腫瘍増殖は、腫瘍細胞の少なくとも二つの遺伝的に別個のクローナル集団から構成される腫瘍のようにみなされる。多クローン性腫瘍では、各クローン集団は各前駆クローンから発生したが、各前駆クローンは一部の観察可能な変化によって相互に異なる。そこで、複数のクローン集団は、相互に有意に異なる場合がある、または（よくあるケースのように）腫瘍細胞の全部もしくは大きなサブセット内で見いだされる一セットの変異を共有しているクローン集団が関連付けられる。例えば、多クローン性腫瘍は、メジャークローンがコンピュータにより検出可能なクローン（典型的には腫瘍集団の１０％を表す）を表す複数のメジャークローンを含む場合があるが、他方、同一の多クローン性腫瘍は何らかの所定の方法によって検出不能な極めて多数のマイナークローンをさらに含む場合がある。
【００３２】
さらに、個々の突然変異は、クローン性もしくはサブクローン性のどちらかに分類できることに留意されたい。その状況において、特定腫瘍の優性クローンが見いだされる場合、クローン変異は、優性クローンの任意もしくは全部の全腫瘍細胞が共有するクローン変異である。異なる観点から見ると、クローン変異は、細胞の全集団もしくは多クローン性サブ集団において完全浸透度を達成した。サブクローン変異は、クローン集団に属する細胞の小集団内にのみ存在する変異である。
【００３３】
腫瘍およびその進化の上記のモデルについての例は、初期生殖細胞系細胞が重要な腫瘍抑制遺伝子（Ｍ１）におけるナンセンス突然変異を獲得し、腫瘍の初期増殖を支持する癌遺伝子（Ａ１）を増幅させた図１に提供した。この腫瘍の成長における初期には、また別の腫瘍抑制遺伝子（Ｄ１）が欠失しており、このことが腫瘍細胞がより急速に一様に増殖することを誘発し、この欠失を備える細胞が全腫瘍集団で急速に圧倒することを可能にした。欠失Ｄ１の獲得後すぐに、細胞はさらに一セットの中立突然変異（Ｍ２、Ｍ３）、増幅（Ａ２、Ａ３）、欠失（Ｄ２、Ｄ３）もまた獲得する。これらの変異はこの腫瘍細胞変異のクローン性増殖中の初期に発生したが、選択的利点を全く提供しないので、腫瘍細胞の集団は二つの「メジャークローンに」分割され、腫瘍細胞の２５％は中立変異（Ｍ２、Ｍ３、Ａ２、Ａ３、Ｄ２およびＤ３）を有するが、腫瘍細胞の７５％は有していない。この腫瘍の成長中のより後期には、追加の突然変異（Ｍ４、Ｍ５）が二つのメジャークローンの一つで現れるが、患者の死亡および／または組織生検の前に集団全体へ広がる機会はない。
【００３４】
図１の実施例では、腫瘍集団は多クローン性であり、その二つのメジャークローンは、クローン（１）が変異Ｍ１、Ａ１およびＤ１を有し、クローン（２）がクローン（１）の変異を共有することに加えて、変異Ｍ２、Ｍ３、Ａ２、Ａ３、Ｄ２およびＤ３を有するように規定されている。このクローン混合は、７５％のクローン（１）および２５％のクローン（２）であると決定されている。突然変異Ｍ１、Ｍ２およびＭ３は、それら全部が各クローン内で完全浸透度を達成したので全部が「クローン性」であると分類され、他方Ｍ４およびＭ５は「サブクローン」突然変異と分類されることになる。さらに、図１から明らかなように、生検標本は、典型的には腫瘍不均質組織に加えて正常組織を含むであろう。
【００３５】
データの抽出および合成
下記は、単一腫瘍生検標本の全ゲノム配列データから腫瘍のクローン進化を再構築するためのデータを抽出および合成するための様々なシステムおよび方法を提示している。これらのシステムおよび方法は、腫瘍のクローン性、腫瘍内の全メジャークローンの数および比率ならびにメジャークローンを識別する有力な変異を決定する強力な枠組みを提供する。さらに、突然変異を親対立遺伝子へ位相化し、それにより集団内での出現のタイミングを測るシステムおよび方法が提示される。さらに、企図されたシステムおよび方法は、腫瘍生検標本内に存在した正常組織を汚染している量の正確な推定値を提供するであろう。
【００３６】
コピー数の変化、対立遺伝子画分および対立遺伝子状態図
一つの集団のメジャークローンを見つけ出して説明するために、相対コピー数および対立遺伝子画分推定値が利用される。そのようなデータは、国際公開第２０１３／０７４０５８号に記載されたアルゴリズムおよび方法を用いて得ることができる。両方のクローン性を決定して正常コンタミネーションを推定するための方法の基礎となるのは、下記でより詳細に説明する「対立遺伝子状態図」（ＡＳＤ）である。ＡＳＤは、対立遺伝子特異的コピー数変異のクローン位置の位置を、相対コピー数およびコピー数変化の対立遺伝子画分の両方を用いて説明するが、そこでＡＳＤが全ての対立遺伝子状態についてコピー数と対立遺伝子画分との関係を示すことを特に理解されたい。ＡＳＤ内のクローン対立遺伝子状態の位置は、以下の方程式Ｉ[数１]およびＩＩ[数２]によって決定される。
【００３７】
【数１】
2015531240.tif 000003
【００３８】
【数２】
2015531240.tif 000004
【００３９】
式中、ＣＮは対応の正常に比較した相対腫瘍コピー数であり、ＡＦは腫瘍内の対立遺伝子画分であり、αは腫瘍試料内の正常コンタミネーションの画分であり、ならびにｔｍａｊ、ｔｍｉｎ、ｎｍａｊおよびｎｍｉｎは、それぞれ腫瘍および正常各々における多数および少数対立遺伝子状態である。個々のゲノムは、それらが所定の染色体セグメントの０、１または２個以上のコピーを有するように別個の対立遺伝子状態だけを有することができるので、ｔｍａｊおよびｔｍｉｎについて可能性のある数値は、正の整数ｔｉ  εのセット（０，１，２，．．．ｎ）に制約される。さらに、正常についての多数および少数対立遺伝子状態は、１に設定されているが（ｎｉ＝１）、これは正常ヒトゲノム内の常染色体全部について当てはまる。性染色体ＸおよびＹは、ＡＳＤでは無視される。上記の式は必ず二つの対立遺伝子を必要とするので、ＡＳＤのためには対応の正常ゲノム内のヘテロ接合体部位しか考察されないことに留意されたい。
【００４０】
下記の図では、特に有意な対立遺伝子状態は、正常コピー数、単一コピー増幅、単一コピー／ヘミ接合体欠失、ホモ接合体欠失、ヘテロ接合体のコピーニュートラル喪失（ＣＮ−ＬＯＨ）および両方の親対立遺伝子の増幅である。例えば、図２は、正常コンタミネーションを伴わない上記の対立遺伝子状態についての典型的なコピー数および対立遺伝子画分データを示しており、ＡＳＤを点の各クラスタの対立遺伝子状態を決定するためにどのように使用できるかを示している。ここで、ＡＳＤのグリッド内の各頂点はその腫瘍対立遺伝子状態（ｔｍａｊ、ｔｍｉｎ）により標識され、この位置は上記の方程式によって決定される。図３は、対立遺伝子状態の場所が正常コンタミネーションαの量を増加させることによってどのような影響を受けるのかを示している。図３Ａは正常コンタミネーションを有しておらず（α＝０）、図３Ｂ〜Ｄは増加した正常コンタミネーションを有する（３Ｂ：α＝０．１；３Ｃ：α＝０．５；３Ｄ：α＝０．９）。容易に明らかなように、正常コンタミネーションが増加するにつれて対立遺伝子状態の位置はより近接して集合し、異なる対立遺伝子状態を解明する能力を低下させる。特に、ＡＳＤを生成するためにコピー数対対立遺伝子画分をプロットすることは、腫瘍のクローン性状態を観察および同定する能力ならびに腫瘍のクローン性状態における（一方向性および二方向性）変化を観察および同定する能力を含む様々な技術的利点が提供されることに留意されたい。
【００４１】
図３の例は、単クローン性腫瘍の静止スナップショットを示していることに留意されたい。しかし、腫瘍ゲノムは、小および大染色体セグメントの獲得および喪失を伴って、極めて動的な可能性があることは周知である。図４は、前の図において記載した対立遺伝子状態間で可能性のあるトランジションの一部を典型的に例示している。一部のトランジションは、それらが染色体セグメントの不可逆性喪失を含むので、「一方向性」であることを理解されたい。例えば、正常対立遺伝子状態（１，１）とヘミ接合体欠失状態（１，０）の間のトランジションは、欠失対立遺伝子は決して復元できないので、「一方向性」である。しかしこのケースで保持された対立遺伝子は増幅させることができ、コピーニュートラルＬＯＨ（ＣＮ−ＬＯＨ）状態へのトランジションおよび超越（２＋，０）を可能にする。他の対立遺伝子状態間のトランジションに必要な欠失は、各対立遺伝子の少なくとも一つのコピー残留物がゲノム内に残留するので、「一方向性」とは見なされないことに留意されたい。
【００４２】
上記に基づいて、対立遺伝子状態は、現在では相当に単純な方法で同定できることを認識されたい。例えば、図５は、先行図に提示した対立遺伝子状態から単一コピーの喪失もしくは獲得しか異ならない新規の対立遺伝子状態への腫瘍ゲノムトランジションについてのＡＳＤを示す図である。そのようなトランジション中、腫瘍細胞の集団は、最初の対立遺伝子状態を備える腫瘍細胞と新規な対立遺伝子状態を備える腫瘍細胞を有する腫瘍細胞との混合になるであろう。図５に提示した例については、この「トランジション性」腫瘍は二つのメジャークローンＡおよびＢ間で分割された集団であると見ることができ、クローンＡは最初の対立遺伝子状態であると規定され、クローンＢは新規な対立遺伝子状態であると規定される。この図の上に示した混合画分Ｍｂは、腫瘍集団がＭｂ＝０の場合はクローンＡだけからなり、Ｍｂ＝１の場合は集団がクローンＢだけからなるように、集団内のクローンＢの画分を表している。両方のクローンｔｉ，ａおよびｔｉ，ｂについての対立遺伝子状態が依然として一セットの正の整数に制約されることに注目することが重要である。
【００４３】
図５から、混合画分Ｍｂが、腫瘍が細胞の不均質集団であるようにＭｂ＝０．２５、０．５、０．７５である場合、対立遺伝子状態は、ＡＳＤの頂点上には存在せず、むしろ二つの頂点を接続する縁部上に存在する。そのような状態にある腫瘍集団は、多クローン性と分類される。例えば、図４における点のクラスタを取り上げよう。ゲノムのこの領域では、クローンＡはヘミ接合体欠失もしくは（１，０）の対立遺伝子状態を有するが、他方クローンＢは増幅したクローンＡの残留対立遺伝子を有しており、この領域内の対立遺伝子状態をコピーニュートラル（ＬＯＨ）もしくは（２，０）に変化させる。Ｍｂ＝０の場合、赤色点の対立遺伝子状態は、ＡＳＤ頂点上でクラスタ化されていることが見いだされており、これはヘミ接合体欠失対立遺伝子状態を表している。Ｍが増加するにつれて（すなわち、集団内のクローンＢの量が増加するに伴って）、点のクラスタは縁部に沿ってＣＮ−ＬＯＨ状態に向かって進行する。集団内に等量のクローンＡおよびＢが存在するＭｂ＝０．５では、点のクラスタはＬＯＨおよびＣＮ−ＬＯＨ対立遺伝子状態間の縁部の正確に中央にあることが見いだされている。
【００４４】
腫瘍集団が、非派生クローン、またはそれらの対立遺伝子状態が単一コピーの獲得もしくは喪失は異ならないように相互に遠縁で関連しているクローンを含む場合は、対立遺伝子状態の混合の位置は、図６に示したように、ＡＳＤの縁部に沿っては存在しない。下記でより詳細に考察するように、そのような異常対立遺伝子状態は、さらに多クローン性腫瘍内に二つより多いメジャークローンが存在する場合にも発生する可能性がある。そこで、ＡＳＤは、一見したところ、腫瘍試料内の一つ以上のメジャークローンの存在を示す可能性があり、メジャークローンの対立遺伝子状態を決定するのに役立ち、そして腫瘍集団内の各メジャークローンの比率の視覚的推定値を提供して、ＡＳＤを腫瘍試料のクローン性を決定するための強力な診断ツールとすることを認識されたい。さらに、対立遺伝子状態図を生成するためにコピー数対対立遺伝子画分をプロットすると、非単クローン性関連性／派生もしくは非関連性／非派生腫瘍内の混合画分を決定できることを理解されたい。
【００４５】
ＡＳＤへの配列データのフィッティング
上記の方程式ＩおよびＩＩに表示したＡＳＤの背後にある数学的構築物は、正常（１，１）対立遺伝子状態についての相対コピー数が１．０であり、多数対立遺伝子画分が０．５である理想的ケースをモデリングしている。しかし、実環境データに関する配列解析によって生成された結果は、この理想化されたケースに正確には適合しないことが多い。相対コピー数を推測するために、配列解析（例えば、国際公開第２０１３／０７４０５８号に記載されている）は、腫瘍と正常との間の相対包括度を計算する。腫瘍および正常試料が同一包括度レベルで配列決定されると、相対包括度は相対コピー数の正確な尺度である。しかしこれは、腫瘍試料内での突然変異、特にサブクローン性突然変異の検出を改良することを試みて、腫瘍試料がその対応した正常よりはるかに高い包括度で配列決定される場合には当てはまらなくなる。
【００４６】
例えば、および正常コンタミネーションがないと仮定して、腫瘍が対応の正常の包括度の二倍で配列決定されると、次に「正常」対立遺伝子状態を備える領域は、通常有するように腫瘍内の解読数の二倍の解読数を有するであろう。そこで、この領域は２．０の相対包括度および１．０の相対コピー数を有するので、このように決定された相対包括度はＡＳＤに適合しない。残念なことに、所定の配列データセットの正確な包括度レベルは不明であるが、それは配列決定サービスが所望の包括度レベルしかターゲットとしないことが多く、それを達成する保証を何も有していないからである。腫瘍および対応の正常のデータセット内で全包括度レベルの推定値として見いだされた解読の生の数値データを使用すると、不均衡を補正するのに役立つことができるが、腫瘍試料の倍数性によって複雑化する。四倍体腫瘍（倍数性＝４．０）およびその対応の正常（倍数性＝２．０）を同一の物理的包括度で配列決定すると、腫瘍は対応の正常の二倍の生の解読数を有することになる。そこで、局所相対包括度推定値をスケーリングするためにそれらの生の解読数の比を使用すると、この四倍体腫瘍は正常コピー数を有するように見えるであろう。
【００４７】
配列解析（例えば、国際公開第２０１３／０７４０５８号に記載されている）が生み出す対立遺伝子画分における推定値の誤差は、例えば「正常」対立遺伝子状態のような対立遺伝子均衡の領域内で多数対立遺伝子がどのように選択されるかに関する限界によって誘発される。理想的には、そのような領域についての対立遺伝子画分は約０．５でなければならないが、これは両方の対立遺伝子が同等の解読深さを有する場合にしか発生しない。より頻回には、ヘテロ接合体対立遺伝子がゲノムＤＮＡのプールから試料採取される方法の確率的性質に起因して、二つの対立遺伝子の一方は、おそらく他方よりわずかに大きな解読深さを有し、推定される多数対立遺伝子画分のわずかな増加を誘発することになる。
【００４８】
例えば、正常コンタミネーションがないと想定すると、３０倍の包括度を備える全ゲノムは、理想的にはヘテロ接合体「正常」対立遺伝子状態で１５の両方の対立遺伝子を生成することになる。しかし一つの対立遺伝子の解読深さが、対立遺伝子Ａが１６の解読サポートを有するようにちょうど単一解読だけシフトさせられると、配列解析（例えば、国際公開第２０１３／０７４０５８号に記載されている）は、多数対立遺伝子画分が実際対立遺伝子画分とは０．０３の偏差となる１６／３０＝０．５３であると推定するであろう。通常は多数の位置にわたって平均化するとそのような誤差の影響を減らすことができ、これらの均衡した対立遺伝子状態についての多数対立遺伝子画分における誤差は、多数対立遺伝子画分がその定義によって０．５未満には決して低下することはあり得ないために、平均することはできない。残念なことに、サンプリング誤差は、増幅および欠失対立遺伝子状態には余り明確な作用を有していない。これらのケースでは、多数対立遺伝子は容易に同定可能であり、サンプリング誤差は多数の位置にわたり平均することができる。
【００４９】
配列解析結果（例えば、国際公開第２０１３／０７４０５８号に記載されている）を理想化ＡＳＤに適合させるためには、上記の誤差はデータからモデリングして修正することができる。このモデルは四つのパラメータ、正常コンタミネーションα、対立遺伝子画分デルタＡＦｄ、包括度デルタＣＯＶｄおよび包括度スケーリング因子ＣＯＶｓを有する。αパラメータは、図３Ａ〜Ｄに示したＡＳＤのグリッドレイアウトにしか影響を及ぼさない。後者三つのパラメータは、配列解析結果を変換する。パラメータＣＯＶｄおよびＣＯＶｓは、下記の方程式〔数３〕にしたがって「正常」対立遺伝子状態からのコピー数データのｙ軸シフトおよびコピー数データのスケールに影響を及ぼす。 
【００５０】
【数３】
2015531240.tif 000005
【００５１】
式中、ＣＮは、配列解析によって生成された相対コピー数推定値であり、ＣＮｃｏｒｒは、ＡＳＤに対して比較するために使用される補正コピー数である。最後のパラメータＡＦｄは、対立遺伝子均衡状態の対立遺伝子画分推定値に最も強力な影響を及ぼす。このパラメータは、この影響を下記の方程式〔数４〕に及ぼす。 
【００５２】
【数４】
2015531240.tif 000006
【００５３】
式中、ｘは、それらが均衡対立遺伝子状態から逸れるにつれて対立遺伝子画分推定値が補正される程度を急速に低下させるために大きな整数（例えば、ｘ＝２０）に設定されている。欠失状態での対立遺伝子画分推定値は、それらが正常コンタミネーションを推定するための決定因子であるので、目に見えるほど変化させるべきではないことに留意されたい。
【００５４】
これら四つのパラメータについての最適値は、正常コンタミネーションパラメータαによって定義されたＡＳＤへのＣＮｃｏｒｒおよびＡＦｃｏｒｒである補正コピー数および対立遺伝子画分推定値のＲＭＳＤを最適化する、グラジエント再急降下検索を使用して見いだされる。この検索は、各パラメータについての一セットの初期値および各パラメータについての一セットの増分ＣＯＶｉｄ、ＣＯＶｉｓ、ＡＦｉｄおよびαｉを用いて開始される。各パラメータｐおよびパラメータ増分ｐｉに対して、ＡＳＤからのＲＭＳＤは、ｐ、ｐ＋ｐｉおよびｐ−ｐｉについて計算される。全四つのパラメータの間でＲＭＳＤにおける最大低下をもたらすパラメータ値は、そのパラメータについての最新の現在値として選択され、サイクルが繰り返される。現行パラメータの増分に伴ってＲＭＳＤにおける減少が起こる可能性がなければ、増分は半分に分割され、検索が再開される。三ラウンドの分割が発生したら、検索は終了され、最良適合パラメータが報告される。グラジエント下降が局所最小値になって動かなくなる可能性が頻回にあるので、グラジエント検索は、一貫した適合パラメータのセットが見いだされるまで多数の異なる初期パラメータを用いて実施される。このため、上述した配列解読（例えば、腫瘍解読対正常解読）の実際包括度を考慮に入れることによって、腫瘍と正常との間の包括度が同一ではない（または不明でさえある）場合でさえ対立遺伝子状態を同定することを可能にすることに留意されたい。
【００５５】
腫瘍試料のクローン混合物のモデリング
次にＡＳＤを使用すると、腫瘍集団内の別個のクローンの数およびそれらの比率Ｌｉ＝（ＣＮｃｏｒｒ，ｉ、ＡＦｃｏｒｒ，ｉ）を規定するのに役立つ一セットの対立遺伝子状態「目印」を決定することができる。この解析で使用された目印は、それらが全腫瘍集団の有意な画分内でコピー数変化を受けていた腫瘍の大きな部分を示しているので、ＡＳＤ上の点の大クラスタによって規定される。ＧＢＭ−０６−０１８５を解析するために使用された目印の対立遺伝子状態については図７Ｂを参照されたい。ＡＳＤ上の各目印について、その観察されたコピー数および対立遺伝子画分を生じさせるであろう全ての妥当と思われるクローン混合物が考察され、次に全てのＡＳＤ目印をほとんど考慮に入れずに済むように最適クローン混合が選択される。
【００５６】
図５において観察されたように、単クローン性腫瘍集団については、目印は全部がＡＳＤ頂点上に存在すると予期される。しかしクローンＢがクローンＡの対立遺伝子状態の全部を引き継いでいて、クローンＡとは別個の追加の対立遺伝子状態を有する二つのメジャークローンを含む多クローン性腫瘍内では、目印はＡＳＤの頂点および縁部の両方の上で見いだされると予期される。頂点上に存在する目印は、クローンＡおよびＢ両方に共有される対立遺伝子状態を表す目印であり、他方ＡＳＤ縁部上の目印は異なる対立遺伝子状態の混合を表す。この接続する縁部に沿った位置は、混合中のクローンＡおよびＢの比率を決定する。多数の目印が縁部上では見いだされるが頂点上では見いだされない場合、それらの各縁部に沿った様々な位置はクローンの数を決定することになる。
【００５７】
例えば、全部の目印が二つの対立遺伝子状態間の中間で見いだされる場合、この例は集団内において同等比率にある二つのメジャークローンによって最も単純に説明される。しかし一つの目印が中間マークにあり、もう一つが一つの対立遺伝子状態に向かう途中の２５％で見いだされる場合は、集団内に三つ以上のクローンが存在するはずである。これについての一つの単純な説明は、三つのクローン、Ａ、ＢおよびＣが存在することであるが、このときＡは腫瘍集団の５０％までを占め、クローンＢおよびＣは各々２５％を占める。クローンＢおよびＣがクローンＡからの単一コ−ピー対立遺伝子状態変化を示すと想定すると、この中間目印を説明できる。２５％の目印は、次にその染色体セグメント内で、クローンＢ（もしくはＣ）がクローンＡおよびＣ（もしくはＢ）において見いだされない単一コピー対立遺伝子状態変化を経験したと説明される。そこで、当面の問題は、ｎ個の観察された目印を説明するメジャークローンの最小数を決定することであり、これは下記式〔数５〕で表すことができる。
【００５８】
【数５】
2015531240.tif 000007
【００５９】
式中、Ｌｏｂｓｉ＝（ＣＮｏｂｓｉ，ＡＦｏｂｓｉ）である。そこで、各々がｋ積分の多数および少数対立遺伝子状態Ｃｉ＝［（ｔ０ｍａｊ，ｉ，ｔ０ｍｉｎ，ｉ），（ｔ１ｍａｊ，ｉ，ｔ１ｍｉｎ，ｉ），．．．，（ｔｋｍａｊ，ｉ，ｔｋｍｉｎ．ｉ）］および下記方程式〔数６〕であるような混合比率を備えるｍ個のクローンの混合を想定できる。
【００６０】
【数６】
2015531240.tif 000008
【００６１】
各目印Ｌｍｉｘｉの相対コピー数および対立遺伝子画分は、クローン混合全体にわたりｉで指標が付けられた対立遺伝子状態の線形組み合わせである。 
【００６２】
【数７】
2015531240.tif 000009
【００６３】
【数８】
2015531240.tif 000010
【００６４】
式中、全クローンについての正常対立遺伝子状態は、ｎｋｍａｊ，ｉ＝ｎｋｍｉｎ，ｊ＝１であると想定されている。最適ソリューションは、メジャークローンの最も単純な混合を含む観察された目印を最も緊密に近似するソリューション、または下記式〔数９〕の目的関数を最適化するソリューションである。
【００６５】
【数９】
2015531240.tif 000011
【００６６】
ここでは、観察されたデータからのＲＭＳＤに、強度パラメータｘによって制御される集団内のクローン数についてのペナルティを加えたものである。
【００６７】
本方法は、最良適合パラメータを見つけた後に実施される。混合内の全てのクローンが示すはずの全ての「共有された」目印の対立遺伝子状態を同定することから始まる。腫瘍が段階的に進化すると想定するなら、これらの共有された対立遺伝子状態は腫瘍の進化樹の「根元」を表している。ＡＳＤ縁部に目印が存在しなければ、この手法は完了し、腫瘍集団は単クローン性と分類される。
【００６８】
目印が二つの境界対立遺伝子状態間でＡＳＤを接続する縁部に沿って存在する場合は、追加のクローンが必要である。この手法は、その混合物に、共有された対立遺伝子状態の全部を引き継ぎ、縁部が結合した目印を説明するために必要な対立遺伝子状態および混合比率を獲得する一つの追加の「娘」クローンを付け加える。同一混合比率を用いて二つ以上の縁部結合目印を説明できれば、それらの新規な対立遺伝子状態が新規なクローンに追加される。この方法は、全部の非頂点目印がクローン混合によって説明されるまで繰り返されるが、このとき各追加の「娘」クローンは説明されていない目印の一方の側と隣接する混合中のいずれかの現在のクローンから引き出すことができる。全目印を合理的に説明できたら、そのクローンの対立遺伝子状態および混合比率が報告される。
【００６９】
上記の方程式から、ＡＳＤ上の各目印の位置を独自に決定する対立遺伝子状態の組合わせはさらに、その目印に対応するゲノム内の全位置についての位相化セット対立遺伝子状態も決定することができることに留意すべきである。これは混合比が各クローンについて固有である場合にのみ機能できる、すなわちメジャークローンは腫瘍集団を不均質に分割するはずである。そのようなケースでは、これは全ゲノム、クローン特異的核型を腫瘍集団内の各クローンについて推測することを可能にする。結果として、対立遺伝子目印を使用することは、腫瘍集団内の別個のクローンの数およびそれらの比率を規定することが現在は可能である点で、技術的利点を提供することになる。
【００７０】
突然変異をクローン特異的対立遺伝子状態へ結び付ける
腫瘍の進化についてのいっそう深い理解を達成するためには、コピー数変化の排他的解析に制約する必要はない。上記で考察した枠組みに体細胞突然変異を統合することによって、現在では突然変異が腫瘍の成長中のいつ発生したかを決定することが可能である。これを行うために、一つ以上の突然変異は、ＡＳＤ上の染色体領域を包含することに関して多数もしくは少数対立遺伝子に直接的に結び付けられる。次に、突然変異の対立遺伝子画分は、対立遺伝子状態における変化の前に、対立遺伝子状態変化の直後、またはずっと後に、突然変異が発生したかどうかを決定するために使用される。そのような解析は、二種の異なる方法で実施できる。
【００７１】
直接位相化によって、配列解析によって見いだされたあらゆる突然変異に対して、全ての隣接する生殖細胞系ヘテロ接合体変異は、突然変異対立遺伝子を特異的生殖細胞系対立遺伝子へ物理的に接続する、または「位相化する」ペア解読を同定するために同定できる。「隣接する」は、この状況では、二つのペア解読を分離するであろう予測距離のはるかに外側にあるので、ペア解読ライブラリのわずか二倍の挿入サイズ、典型的にはこれらの全ゲノムライブラリについての１，０００ｂｐによって分離されていると規定されている。
【００７２】
突然変異および生殖細胞系変異の両方の位置に重複する全解読ペアが収集され、突然変異がどちらかの生殖細胞系変異対立遺伝子に位相化される回数が記録される。突然変異が同一生殖細胞系変異対立遺伝子に一度より多く結び付いていることが見いだされ、その生殖細胞系変異の他の対立遺伝子に位相化が見いだされない場合は、その生殖細胞系変異対立遺伝子に直接位相化されると見なされる。位相化は、突然変異および生殖細胞系変異が１解読長未満により分離される場合は単一解読内で行うことができる、または解読ペアの片方を越えて発生できる。突然変異はさらに、複数の生殖細胞系変異の位置に位相化することもできる。
【００７３】
生殖細胞系変異へ直接的に位相化できるあらゆる突然変異について、生殖細胞系変異の対立遺伝子画分は、突然変異が多数もしくは少数対立遺伝子に位相化されるかどうかを決定するために使用される。生殖細胞系変異対立遺伝子画分が０．５以上であると決定されると、次に突然変異は「多数位相化」されたと考えられ、さもなければ少数対立遺伝子に位相化された、または「少数位相化」されたとみなされる。二つの対立遺伝子状態が、例えば正常（１，１）もしくは二対立遺伝子の均衡増幅（２，２）のように同等であるケースでは、「多数」もしくは「少数」対立遺伝子への突然変異の指定は、いずれの対立遺伝子が配列データ内でわずかにより深く試料採取されたかどうかに左右される。そこで、そのようなケースで突然変異を「多数位相化」または「少数位相化」と分類することは有意義ではない。
【００７４】
増幅対立遺伝子画分によって、直接位相化を行うことができない場合は、突然変異がどの対立遺伝子に結び付いているかを決定する能力が重大に限定される。しかし突然変異が増幅染色体セグメント内で見いだされた場合は、突然変異の対立遺伝子画分を使用するとその突然変異がどの対立遺伝子に結び付けられるのかを決定することができる。突然変異の対立遺伝子画分が多数対立遺伝子画分とほぼ同等である場合は、これはその突然変異が増幅前に増幅対立遺伝子内に存在した場合にしか起こりえなかった。突然変異がその代わりに非増幅対立遺伝子上に存在した場合は、突然変異の対立遺伝子画分は、必ずはるかに低くなる。
【００７５】
しかし低突然変異対立遺伝子画分は、必ずしもそれらが「多数位相化」ではないことを示していないが、それは突然変異が増幅後に発生する可能性があるからである。例えば、一つの領域が単一コピー対立遺伝子状態（２，１）により増幅した場合は、増幅後突然変異は、多くても、多数対立遺伝子の一つのコピー上に存在する可能性があり、このとき最高対立遺伝子画分は、２／２＋１＝０．６７の増幅前突然変異の予測対立遺伝子画分と比較して１／２＋１＝０．３３となる。
【００７６】
そこで、突然変異が増幅前に発生する場合は、非位相化突然変異の増幅セグメントへの結び付きに限定される。それにもかかわらず、これは、それらが腫瘍増殖を駆動する可能性が高いので、発癌性突然変異が腫瘍の成長における早期に発生することが予測されるために依然として有用な可能性がある。これらの発癌性突然変異の多数のコピーが腫瘍細胞に対して選択的に有益である場合は、ユーザがこの方法を使用するのを可能にするために突然変異コピー数および対立遺伝子画分における不可欠な増加を予測するであろう。
【００７７】
対立遺伝子画分を比較して突然変異のタイミングを推測する
多数もしくは少数対立遺伝子に突然変異を指定した後に、次にその突然変異の対立遺伝子画分を、生殖細胞系変異の対立遺伝子を包含する染色体セグメントの多数もしくは少数対立遺伝子画分の対立遺伝子画分と比較することができる。一般には、生殖細胞系変異の対立遺伝子の代わりに染色体セグメントの対立遺伝子画分を使用するのが好ましいが、それは染色体セグメントの対立遺伝子画分の推定値は、セグメント内の全生殖細胞ヘテロ接合体の位置にわたって平均化するためにより正確だからである。突然変異の対立遺伝子画分をヘテロ接合体の位置の多数もしくは少数対立遺伝子画分と正確に比較するためには、一部の「正常な」コンタミネーションを突然変異対立遺伝子に付け加えなければならない。多数対立遺伝子画分ＡＦは、その分子および分母の両方における正常コンタミネーションを特徴とすることに留意されたい。これは、これらの方程式において考察された位置が正常ではヘテロ接合体であり、そこで両方の対立遺伝子から正常コンタミネーションを獲得すると予測されるという事実のためである。しかし体細胞突然変異については、突然変異が正常では存在しないので突然変異対立遺伝子の正常コンタミネーションは存在しない。 
【００７８】
【数１０】
2015531240.tif 000012
【００７９】
式中、ＭＡＦは突然変異の対立遺伝子画分であり、ｍは突然変異している腫瘍対立遺伝子ｔｍａｊのコピーの画分であり、そしてｔｍａｊ、ｔｍｉｎ、ｎｍａｊおよびｎｍｉｎは同一ホモ接合体対立遺伝子を表す。ＭＡＦをヘテロ接合体位置で推測された対立遺伝子画分へ適正に比較するためには、以下の補正〔数１１〕が使用される。 
【００８０】
【数１１】
2015531240.tif 000013
【００８１】
式中、ＭＡＦｃは、補正突然変異対立遺伝子画分である。ｍは上記の方程式において０以下であるいずれかの画分であると認められるが、特別な意味を有するいくつかのｍの数値がある。ｍ＝１である場合は、ｔｍａｊ対立遺伝子の全部が突然変異していたが、ｔｍａｊが増幅対立遺伝子を表すケースでは、ｍ＝１である場合は、突然変異は増幅前に発生していたに違いない。ｍ＝１ｔｍａｊ（ここで、ｔｍａｊは増幅対立遺伝子のコピー数を表す）である場合は、突然変異は増幅対立遺伝子の単一コピー上に存在するが、腫瘍細胞の多数においてはこの状態で見いだされるので、突然変異が増幅の直後に発生したはずであることが分かる。しかしｍ＜＜１／ｔｍａｊである場合は、その極めて低い対立遺伝子画分が腫瘍細胞の小画分内でのみ見いだされたことを示しているので、突然変異は増幅後に、おそらく腫瘍増殖中の極めて後期に発生したに違いない。
【００８２】
突然変異が少数対立遺伝子ｔｍｉｎに位相化されると、少数対立遺伝子の全コピーが変換されたことを示しているので、最高突然変異画分がｍ＝ｔｍｉｎ／ｔｍａｊであることが分かると予測される。そこで少数対立遺伝子状態が単一コピー内に存在し、その全コピーが突然変異していた場合は（ｍ＝１ｔｍａｊ）、単一コピーに存在する「多数位相化」突然変異に対して正確に同一の突然変異画分が計算されるであろう。そこで、直接位相化を用いた場合にのみ、初期「少数位相化」突然変異と増幅後に発生する突然変異を識別することができる。
【実施例】
【００８３】
ＧＢＭ（多形性膠芽腫）、１２の全ゲノムＧＢＭ試料を上記の方法によって処理し、各腫瘍生検標本中に存在する正常コンタミネーションレベルおよびクローン性を決定した。前のセクションで考察した他の５つのゲノムＧＢＭ試料についてＢａｍＢａｍによって生成した相対包括度および対立遺伝子画分は、これらの方法によって解析するには過剰な変動性を有していた。クローン性解析の結果は、表１に要約した。
【００８４】
【表１】
2015531240.tif 000014
【００８５】
驚くべきことに、３つのＧＢＭ腫瘍試料だけが単クローン性であることが見いだされたが、他方、他の９つの試料は少なくとも二つのメジャークローンを含んでいた。７つのＧＢＭ腫瘍についてクローンの正確な混合が決定され、他方、残り５つの腫瘍が視覚的に検査されてそれらのクローン性が決定された。
【００８６】
２つの腫瘍ＧＢＭ−０６−０１４５およびＧＢＭ−０６−０１８５の結果は、図７Ａおよび７Ｂに示した。これら２つの試料の相対包括度および対立遺伝子画分データは、上述した最良適合パラメータを使用して変換されたが、これは各々２１．５％および１４．６％の推定正常コンタミネーションレベルを備えてＡＳＤの緊密な適合を証明している。頂点上または縁部上のいずれであってもデータクラスタの場所を検査することによって、これらの腫瘍のクローン性を視覚的に決定することができる。ＧＢＭ−０６−０１４５の全部（図７Ａ）のデータはＡＳＤ頂点の周囲に集まっているので、おそらくこの腫瘍は単クローン性である。他方、ＧＢＭ−０６−０１８５（図７Ｂ）は、ＡＳＤ縁部に沿ったいくつかの大きなクラスタがこの腫瘍内の少なくとも二つのメジャークローンの存在を示すので、明白に多クローン性である。実際に、縁部結合クラスタはそれらの縁部に沿った様々な位置で見いだされるので（例えば、一部のクラスタは中間マークにあり、他方他のクラスタは単一コピー欠失状態に向かう途中の各々０．７５および０．８０にある）、これは少なくとも３つのメジャークローンの混合からのみ発生できる。
【００８７】
これらの試料中のクローンの数を正確に決定するために、本発明者らは、上述した方法を使用してクローンの数およびそれらの対立遺伝子状態を決定した。各予測クローン混合物について、本発明者らは、派生したクローン混合物を前提に、ゲノム内のあらゆる位置についての相対コピー数および対立遺伝子画分をコンピュータにより決定し、それを配列解析によって生成された結果と比較した。これは、クローン混合が観察されたデータをどのように良好にモデリングするかを決定するための測定基準を提供する。
【００８８】
図８に示したように、本発明者らは、予測されたＧＢＭ−０６−０１４５についての単一クローンを見出した。コンピュータを使用して引き出した相対コピー数および対立遺伝子の各データは、観察されたデータへの極めて良好な適合を証明している。全４つのメジャークローンは、そのクローン対立遺伝子状態が図９に提示されているＧＢＭ−０６−０１８５について見出された。本明細書に提示した４つのクローンから注目すべき２つの重要なことがある。第一に、上述したように、各クローンの混合比は他の全てと異なるという事実は、全ゲノムにわたって対立遺伝子状態をクローン特異的核型に位相化するために役立つ。第二に、全クローンはクローンＡから派生したと思われる。各派生クローンはクローンＡにおいて見いだされる事象の全部を共有しており、これはクローンＡがクローンＢ、ＣおよびＤの前駆クローンであることを示唆している。しかし、この一セットのクローンが直線的に、段階的進行によって進化したのかどうか、またはクローンＢとクローンＣおよびＤとが異なる系統を表すのかどうかは不明である。これら後者３つのクローンはｃｈｒ６ｑの欠失という点で異なり、クローンＢは一セットの限局性欠失を特徴とするが、クローンＣおよびＤはｃｈｒ６ｑの全部を欠失していた。これらは相互に排他的事象ではないので、クローンＣはＢから派生していて、ｃｈｒ６ｑの限局性喪失を引き継ぎ、続いて残りのｃｈｒ６ｑを欠失していることが考えられる。しかし、クローンＢおよびＣがクローンＡから直接派生し、独立してｃｈｒ６ｑの部分を欠失していることを排除しない。この系統樹の最後のクローンである、混合比によると腫瘍集団内の優性クローンになるのがクローンＤであることは興味深く、これはこのクローンに固有の事象（例えば、ｃｈｒ９の増幅）がこのクローンに増殖の優越を提供した可能性があることを示唆している。
【００８９】
ＧＢＭ−０６−０１５２についてのクローン核型は図１０に示した。この腫瘍は、ＧＢＭ腫瘍のおよそ４０％の特徴であるｃｈｒ７の増幅がクローンＢまでは発生しないので興味深い。この試料は、一つはＭＤＭ２およびＣＤＫ４を備え、もう一つはＥＧＦＲを含有する、これらは、クロモトリプシス様事象から生まれた、二つの二重微小染色体を有すると独立解析でも証明されたことに留意されたい。極度に増幅したゲノム領域をこれらのクローン核型においてモデリングするのは困難であるが、クローンＡ内のｃｈｒ１２上でのこれらの事象に関連する欠失の証拠は明らかであり、これらの二重微小染色体が腫瘍成長の早期に発生したことを示唆している。ＥＧＦＲの早期限局性増幅がｃｈｒ７増幅の後期の出現に役割を果たした可能性があることは考えられる。
【００９０】
試料ＧＢＭ−０６−１０８６についての核型によって提示されたクローン進化は、本明細書に記載する価値のある数少ない興味深い態様である。図１１に示したその核型において気付くべき第１の些細なことは、ＣＤＫＮ２Ａの限局性喪失の発生がクローンＢまでは発生しない点であり、これはクローンＡ内で最初に観察されるｃｈｒ９の完全喪失後に発生したことを示唆している。これは、ＣＤＫＮ２Ａの限局性喪失がｃｈｒ９のアームレベルまたは全染色体喪失後に発生する可能性が高いという仮説を支持する強力な証拠である。第二の興味深い態様は、クローンＣおよびＤが１３個の異なる完全染色体の喪失を有する点である。クローンＤは、さらにｃｈｒ１８の最終コピーを喪失し、ならびにｃｈｒ１９を増幅することによって一歩前進する。これは両方のクローンＣおよびＤの倍数性を他の二つのクローンと共有したほぼ正常な倍数性（倍数性＝１．９５）から１．３１へ減少させる。それらのゲノム含量のほぼ３０％を喪失している細胞がどのようにして生存できるのかだけではなく、クローンＤの４１．８％という混合比を前提にすると、腫瘍細胞の集団内では明らかに力強く成長することは注目に値する。
【００９１】
肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）、ＴＣＧＡによって配列決定した９例の肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ）についての全ゲノムデータをこれらの方法によって解析してクローン性を推測した。２例の腫瘍の対立遺伝子状態図は図７Ｃおよび７Ｄに示した。これらの２例の試料内での明白な極めて多数のトランジション期対立遺伝子状態からは、これらのＬＵＳＣ腫瘍が上述したＧＢＭ腫瘍に比較してはるかに高度なクローン性を示すように思われる。
【００９２】
図７Ｄに示した腫瘍試料ＬＵＳＣ−６６−２７５６は、ＡＳＤ頂点（全メジャークローンに共通する状態）およびＡＳＤ縁部（１サブセットのメジャークローンだけに共有する状態）での極めて多数の高増幅状態を示す。極めて様々な混合比は、ＡＳＤ縁部に沿った、およびＡＳＤ縁部間におけるほぼ連続する一セットの点クラスタの様々な位置から明白であり、これはこの試料が高度に多クローン性であることを示唆している。この試料のまた別の興味深い特徴は、そのゲノムのいずれも単一コピー喪失対立遺伝子状態において見出されない（１，０）ことである。これは、腫瘍ゲノムが一時的に四倍体（Ｎ＝４）であったゲノム倍加事象によって発生した可能性があり、そこで一連の染色体欠失は、単一コピー獲得、「正常」またはＣＮ−ＬＯＨいずれかの対立遺伝子状態を導いた。ゲノム倍加事象は、重症卵巣癌において発生することが多いと考えられており、これはそれらのゲノムの大きな部分がＣＮ−ＬＯＨ対立遺伝子状態でどのように観察されるのかを説明する。
【００９３】
対立遺伝子状態への位相化された突然変異、対立遺伝子上への位相化された突然変異を可視化するために、本発明者らは、わずかに修正した対立遺伝子状態図である二対立遺伝子状態図（二重ＡＳＤ）を使用した。上記の方程式から、少数対立遺伝子画分が多数対立遺伝子の補完物であるので（ＡＦｍｉｎ＝１．０−ＡＦｍａｊ）、少数対立遺伝子状態の場所を表示するためにＡＳＤの鏡像を配置することによって二重ＡＳＤを構築できることに留意されたい。多数対立遺伝子、少数対立遺伝子に対応する、またはどちらにも対応しない生殖細胞系変異に位相化された突然変異は、二重ＡＳＤ上にプロットする。突然変異がどちらの対立遺伝子状態（多数もしくは少数）に最も近いのかを決定することによって、および（もしあれば）それらの位相化状態を使用することによって、突然変異のタイミングを推測することができる。
【００９４】
典型的な二重ＡＳＤを図１２に示したが、この図は、二つの異なる対立遺伝子状態にある多数もしくは少数対立遺伝子のどちらかに属する生殖細胞系変異へ位相化されている一連の突然変異を提示している。各突然変異の対立遺伝子画分は、上述したように補正され、二重ＡＳＤ上に配置される。それらの位相および突然変異対立遺伝子画分に基づくと、二重ＡＳＤは、その突然変異が何個の多数（もしくは少数）対立遺伝子のコピー数上に存在するのかを同定するために役立つ。図１２に提示した増幅のケースでは、両方の対立遺伝子上に存在する突然変異対たった一つの増幅コピー上の突然変異が容易に識別され、突然変異が増幅の前もしくは後に発生したかどうかの視覚的決定を可能にする。同様に、少数対立遺伝子に位相化された突然変異については、それらの位相化指定が有意義ではない「正常」対立遺伝子状態以外の全部についてＭＡＦｃ≦０．５を有するように見えるであろう。
【００９５】
腫瘍ＧＢＭ−０６−０１４５についての二重ＡＳＤは図１３に示した。これらの図上の６つの領域は、実数データ上のこれらの図を解釈するのに役立つように強調表示した。領域（ａ）および（ｂ）は、隣接生殖細胞系変異によって多数対立遺伝子に直接的に位相化された突然変異を示しているが、（ｂ）の２つの突然変異だけが増幅した突然変異に対応するＭＡＦｃを有することが見いだされた。大多数の多数位相化された突然変異は、単一コピー数での突然変異に対応する領域（ａ）内で見いだされるが、これはこれらの突然変異が増幅後に発生したことを明らかにしている。ＤＯＣＫ８内の非位相化ミスセンス突然変異は単一コピー喪失対立遺伝子状態において見いだされるが、これは、この腫瘍内に残留するＤＯＣＫ８のコピーだけが突然変異状態にあることを意味している。ホモ接合体欠失を通してのＤＯＣＫ８の不活性化は肺癌の進行に結び付けられてきたので、このＧＢＭ腫瘍における野生型ＤＯＣＫ８の欠如がその腫瘍形成において役割を果たした可能性がある。図１３は、これらの平均包括度全ゲノムからＭＡＦｃの推定値における高度の変動もまた示している。
【００９６】
図１４に示した腫瘍ＬＵＳＣ−３４−２５９６についての二重ＡＳＤに関して最も印象的なことは、全ての予測対立遺伝子状態にわたって位相化された、もしくは位相化されていない極めて多数の突然変異である。前のＧＢＭ腫瘍と比較して、ＬＵＳＣ−３４−２５９６の突然変異率の方が有意に高いことは明白である。これは、肺腫瘍が試験された癌の間で最高突然変異率の一部を示すので、ＴＣＧＡによってはるかに遠いと予測される。
【００９７】
本発明者らは、図１４において目印とした（ａ）および（ｂ）である予測ＭＡＦｃ?０．５で均衡増幅対立遺伝子状態（２，２）にある極めて多数の多数および少数位相化された突然変異両方を観察した。本発明者らはさらに、単一コピー数での突然変異に対応するこれらの領域の左側で突然変異のクラスタもまた観察した。肺扁平細胞癌においてアップレギュレートされると近年見いだされた遺伝子であるＮＤＲＧ１における多数位相化ミスセンス突然変異の場所は、ゲノム領域内の「正常」と単一コピー喪失対立遺伝子状態との間で見いだされる。そのＭＡＦｃがゲノム領域の対立遺伝子画分とほぼ同等であり、これは突然変異が両クローン（つまり、「正常」対立遺伝子状態を備えるクローンおよび単一コピー喪失対立遺伝子状態を備えるクローン）上に存在することを示唆している。これは、突然変異が早期に、新規の欠失を特徴とする第二クローンの出現の前に発生した、およびこの欠失がＮＤＲＧ１の野生型バージョンを含有したという証拠である。
【００９８】
３つの非位相化突然変異ＢＲＡＦ、ＤＮＭＴ３ＡおよびＴＰ５３の場所もまた図１４で強調表示した。ＴＰ５３におけるナンセンス突然変異は、ＣＮＬＯＨ状態において見出され、ＣＮ−ＬＯＨ対立遺伝子画分に正確に対応する突然変異対立遺伝子画分を有するが、これはこの腫瘍がＴＰ５３の１コピーを欠失しており、突然変異により残留コピーをノックアウトし、次に突然変異対立遺伝子を増幅させた。ＢＲＡＦを包含する領域は高度に増幅しており、ＢＲＡＦのＭＡＦｃから、突然変異がその増幅において事前もしくは早期に発生したことは明白である。ＢＲＡＦ突然変異は黒色腫において頻回に発生するが、近年は非小細胞性肺癌において低いパーセンテージで見いだされている。半数より多いコピーが突然変異しているので、ＢＲＡＦが高度に起こりえない事象である多数のコピー上で独立して同一に突然変異しない限り、突然変異は増幅プロセスの終了後には発生できなかった。その喪失が肺癌および他の腫瘍タイプに関係する遺伝子であるＤＮＭＴ３Ａは、「正常」対立遺伝子状態において見いだされ、予測ＭＡＦｃ≒０．５を有する。これらのケースの全部において、これらの遺伝子への突然変異は、それらが腫瘍のメジャークローンの全部（または、ＢＲＡＦのケースでは少なくとも多数）において存在しているので、腫瘍形成中の早期に発生していたに違いない。これらが複数の腫瘍タイプに関係する公知の遺伝子であるという事実と結び付けると、これらの突然変異の一つ以上がこの特定腫瘍の駆動因子である可能性を高める。
【００９９】
表２は、下記で１２個のＧＢＭおよび８個のＬＵＳＣ腫瘍についての位相化可能な突然変異を要約している。さらに、ＧＢＭ腫瘍に比較してＬＵＳＣ腫瘍における突然変異の総合率が高いことに留意すべきである。さらに、ＧＢＭ腫瘍の増幅領域内では有意により多くの突然変異が単一コピーで見いだされ、他方ＬＵＳＣ腫瘍では増幅対立遺伝子状態全体に一様に分布した突然変異を見いだせることは明白である。
【０１００】
【表２】
2015531240.tif 000015
【０１０１】
突然変異率がこれらの腫瘍の成長を通して一定のままであると仮定すると、増幅はＧＢＭ腫瘍の進行において早期だが大多数の突然変異が発生する前に発生した。この同一の論法を用いると、突然変異およびコピー数変化はＬＵＳＣ腫瘍成長の頻回な発生であり、極めて多数の突然変異は増幅事象の前後に発生する。
【０１０２】
突然変異パターンにおける差を説明するまた別の可能性は、突然変異率が成長中に一定で留まっていなかったことである。これらのＧＢＭ腫瘍における一般的事象である増殖因子ＥＧＦＲの増幅が細胞の増殖率を増加させ、引き続いて細胞がゲノム複製中に作られた誤りを補正する能力を減少させ、それにより細胞分裂一回当たりの突然変異率を増加させると想定されたい。これは、増幅対立遺伝子状態内の単一コピー内に存在する突然変異の濃縮を説明できよう。しかし、ＥＧＦＲ増幅前後に発生した生成数を知らずに突然変異率が増加したかどうかを決定することはできない。それにもかかわらず、本明細書に提示したＡＳＤおよび二重ＡＳＤ法を使用すると、前例のない方法で有意および臨床的に重要な情報を配列解析出力から引き出すことができる。
【０１０３】
本明細書に記載の本発明の概念から逸脱せずに本明細書に記載した以外のより多数の変更が可能であることは当業者には明白なはずである。このため本発明の主題は、添付の特許請求の範囲に記載の精神を除いて制限されるべきではない。さらに、特許明細書および特許請求の範囲の記載の両方を解釈する際に、全ての用語はこの状況に一致する極めて広い考えられる方法で解釈すべきである。特に、用語「含む」および「含んでいる」は、本明細書で言及した要素、成分もしくは工程が明示的には言及されない他の要素、成分または工程とともに存在してよい、もしくは利用できる、または結合できることを示す非排他的方法で要素、成分または工程を意味すると解釈すべきである。本明細書がＡ、Ｂ、Ｃ．．．．およびＮからなる群から選択される何かの少なくとも一つについて言及する場合は、本文は、Ａ＋Ｎ、またはＢ＋Ｎなどではないその群からの唯一の要素を要求していると解釈すべきである。
【図１】
2015531240.tif 000016
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2015531240.tif 000024
【図７Ａ】
2015531240.tif 000025
【図７Ｂ】
2015531240.tif 000026
【図７Ｃ】
2015531240.tif 000027
【図７Ｄ】
2015531240.tif 000028
【図８】
2015531240.tif 000029
【図９】
2015531240.tif 000030
【図１０】
2015531240.tif 000031
【図１１】
2015531240.tif 000032
【図１２】
2015531240.tif 000033
【図１３】
2015531240.tif 000034
【図１４】
2015531240.tif 000035
【手続補正書】
【提出日】平成27年7月31日(2015.7.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
【図１】生殖細胞系から始まって、初期腫瘍細胞、腫瘍生検によって試料採取されるメジャーおよびマイナークローンの集団への腫瘍の進化の典型的な例示を示す図である。
【図２】ゼロ正常コンタミネーション（α＝０）を備える単クローン性腫瘍試料についての模擬データの典型的な対立遺伝子状態図（ＡＳＤ）を示す図である。異なるコピー数変化を示す染色体領域が異なる陰影でプロットされている。この模擬腫瘍ゲノムは６つの対立遺伝子状態、正常、単一コピー増幅、ヘミ接合体欠失、ホモ接合体欠失、コピーニュートラルＬＯＨおよび多重コピーの二対立遺伝子増幅を示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｄは、典型的には様々なレベルの正常コンタミネーション物質を備える、図２の模擬単クローン性腫瘍ゲノムについての一セットの対立遺伝子状態図を示している。図３Ａは、０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｂは１０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｃは５０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｄは９０％の正常コンタミネーション物質を示し、これらは相違が正常コンタミネーション物質レベルの関数としての分解能であることを示している。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｄは、典型的には様々なレベルの正常コンタミネーション物質を備える、図２の模擬単クローン性腫瘍ゲノムについての一セットの対立遺伝子状態図を示している。図３Ａは、０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｂは１０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｃは５０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｄは９０％の正常コンタミネーション物質を示し、これらは相違が正常コンタミネーション物質レベルの関数としての分解能であることを示している。
【図３Ｃ】図３Ａ〜３Ｄは、典型的には様々なレベルの正常コンタミネーション物質を備える、図２の模擬単クローン性腫瘍ゲノムについての一セットの対立遺伝子状態図を示している。図３Ａは、０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｂは１０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｃは５０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｄは９０％の正常コンタミネーション物質を示し、これらは相違が正常コンタミネーション物質レベルの関数としての分解能であることを示している。
【図３Ｄ】図３Ａ〜３Ｄは、典型的には様々なレベルの正常コンタミネーション物質を備える、図２の模擬単クローン性腫瘍ゲノムについての一セットの対立遺伝子状態図を示している。図３Ａは、０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｂは１０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｃは５０％の正常コンタミネーション物質を示し、図３Ｄは９０％の正常コンタミネーション物質を示し、これらは相違が正常コンタミネーション物質レベルの関数としての分解能であることを示している。
【図４】対立遺伝子状態間のいくつかの可能性のある二方向性および一方向性トランジションを示している図２の対立遺伝子状態図であって、一方向性トランジションは親染色体の不可逆的喪失を含むトランジションである対立遺伝子状態図を示す図である。
【図５】前の図に図示した対立遺伝子状態から単一コピーの喪失もしくは獲得だけが異なる新規対立遺伝子状態へトランジションする腫瘍ゲノムについての対立遺伝子状態図を示す図である。ここで、トランジション期対立遺伝子状態は、腫瘍が二つの異なるクローン／サブクローンの混合を含む場合に作り出される。クローンＡは、最初の対立遺伝子状態、（２，１）、（５，２）および（１，０）によって規定されている。クローンＢは、増幅および欠失を通してこれらの状態を変化させて対立遺伝子状態、（２，２）、（４，２）および（２，０）を生成する。パーセンテージは、腫瘍集団中に存在するクローンＢのパーセンテージを表すが、このとき、０％はクローンＡの単クローン性集団を説明し、１００％はクローンＢの単クローン性集団である。
【図６】図２の対立遺伝子状態図の典型的な例示を示す図であり、腫瘍が二つ以上の非関連または遠縁のクローンからなる場合に発生する可能性がある、対立遺伝子状態が「スキップされた」場合に生成されるトランジション期対立遺伝子状態を示している。その場合には、多数および少数対立遺伝子の両方において二つのメジャークローンの対立遺伝子状態が異なる場合は、トランジション期状態は、対立遺伝子状態を接続する縁部上では見いだされない。
【図７Ａ】図７Ａおよび７Ｂは、二つのＧＢＭ腫瘍、ＧＢＭ−０６−０１４５（図７Ａ）およびＧＢＭ−０６−０１８５（図７Ｂ）についての対立遺伝子状態図の典型的な例示を示す図である。近似パラメータは、正常コンタミネーションが各々２１．５％および１４．６％であることを見いだした。図７Ａは、クローン対立遺伝子状態しか示しておらず、トランジション期対立遺伝子状態の証拠を示していないので、これはＧＢＭ−０６−０１４５が単クローン性腫瘍であることを示しているが、図７Ｂはクローン性状態および多重トランジション期対立遺伝子状態の両方を示している。トランジション期対立遺伝子状態（（＊）を用いて表示）は三種類の混合のパーセンテージを特徴とするので、この多クローン性腫瘍は少なくとも三つのサブクローンからなるはずである。図７Ｂでプロットされた黒色Ｘは、ＧＢＭ−０６−０１８５のクローン混合を決定するために使用するのに適切である「目印」対立遺伝子状態を表す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび７Ｂは、二つのＧＢＭ腫瘍、ＧＢＭ−０６−０１４５（図７Ａ）およびＧＢＭ−０６−０１８５（図７Ｂ）についての対立遺伝子状態図の典型的な例示を示す図である。近似パラメータは、正常コンタミネーションが各々２１．５％および１４．６％であることを見いだした。図７Ａは、クローン対立遺伝子状態しか示しておらず、トランジション期対立遺伝子状態の証拠を示していないので、これはＧＢＭ−０６−０１４５が単クローン性腫瘍であることを示しているが、図７Ｂはクローン性状態および多重トランジション期対立遺伝子状態の両方を示している。トランジション期対立遺伝子状態（（＊）を用いて表示）は三種類の混合のパーセンテージを特徴とするので、この多クローン性腫瘍は少なくとも三つのサブクローンからなるはずである。図７Ｂでプロットされた黒色Ｘは、ＧＢＭ−０６−０１８５のクローン混合を決定するために使用するのに適切である「目印」対立遺伝子状態を表す。
【図７Ｃ】図７Ｃおよび７Ｄは、二つのＬＵＳＣ腫瘍、ＬＵＳＣ−３４−２５９６（図７Ｃ）およびＬＵＳＣ−６６−２７５６（図７Ｄ）についての対立遺伝子状態図の典型的な例示を示す図である。これらの２例の試料内での明白な極めて多数のトランジション期対立遺伝子状態からは、これらのＬＵＳＣ腫瘍が図７Ａ及び図７ＢのＧＢＭ腫瘍に比較してはるかに高度なクローン性を示すように思われる。
【図７Ｄ】図７Ｃおよび７Ｄは、二つのＬＵＳＣ腫瘍、ＬＵＳＣ−３４−２５９６（図７Ｃ）およびＬＵＳＣ−６６−２７５６（図７Ｄ）についての対立遺伝子状態図の典型的な例示を示す図である。これらの２例の試料内での明白な極めて多数のトランジション期対立遺伝子状態からは、これらのＬＵＳＣ腫瘍が図７Ａ及び図７ＢのＧＢＭ腫瘍に比較してはるかに高度なクローン性を示すように思われる。
【図８】ＧＢＭ−０６−０１４５についての単クローン性の核型を描出する典型的なプロットである。プロットの最上部に表示した「相対包括度」および「対立遺伝子画分」は、どちらもＢａｍＢａｍによって観察された結果の出力ならびに単一クローンおよび正常コンタミネーションの混合をモデリングすることによって生成された計算した包括度および対立遺伝子画分の両方を示している。実数データ対モデリングデータの比較は、極めて強い一致を示している。クローンの核型は、腫瘍ゲノムについての多数および少数対立遺伝子状態を示しており、これは全ｃｈｒ７およびｃｈｒ１９のうちの１コピーの増幅、ｃｈｒ１０の１コピーの完全喪失およびｃｈｒ９ｐのアームレベル喪失を示している。
【図９】ＧＢＭ−０６−０１８５についての多クローン性の核型を描出する典型的なプロットを示す図である。計４個の別個のクローンがこの腫瘍内で同定され、クローンＤが腫瘍試料の４２．７％を含む、この集団の優性クローンであると決定された。全クローンは、共通してｃｈｒ７、ｃｈｒ１９およびｃｈｒ２０の単一コピー増幅、ｃｈｒ１０およびｃｈｒ２２の単一コピー喪失ならびにｃｈｒ９ｐの喪失を有している。クローンＢ、ＣおよびＤは全部がｃｈｒ６の欠失を有するが、クローンＢの欠失は限局性であり、クローンＣおよびＤはｃｈｒ６ｑのアームレベル喪失を示している。クローンＤは、さらにｃｈｒ９の完全コピーの増幅によって識別される。
【図１０】ＧＢＭ−０６−０１５２についての多クローン性の核型を描出する典型的なプロットを示す図である。三つのクローンが推定２４．１％の正常コンタミネーションを有するこの腫瘍試料中で同定された。全クローンはｃｈｒ１、ｃｈｒ１９およびｃｈｒ２０の増幅、ｃｈｒ１０およびｃｈｒ２２の欠失、ならびに先行する章で記載した二つのＤＭを作成したクロモトリプシス（染色体破砕）様事象に関連するｃｈｒ１２の限局性喪失を共有している。クローンＢおよびＣは、ｃｈｒ７の増幅およびｃｈｒ１ならびにｃｈｒ２、ｃｈｒ３、ｃｈｒ４、ｃｈｒ８、ｃｈｒ１３およびｃｈｒ１７の非増幅コピーの欠失を示している。クローンＣは、ｃｈｒ８の残りのコピーをさらに増幅させる。
【図１１】ＧＢＭ−０６−１０８６についての多クローン性の核型を描出している典型的なプロットを示す図である。四つのクローンが、推定７．５％の正常コンタミネーションを有するこの腫瘍試料中で同定された。全クローンは、ｃｈｒ２１の増幅およびｃｈｒ９およびｃｈｒ１１ｐの欠失を共有する。クローンＣおよびＤは、ｃｈｒ１、ｃｈｒ３、ｃｈｒ４、ｃｈｒ５、ｃｈｒ６、ｃｈｒ８、ｃｈｒ１０、ｃｈｒ１３、ｃｈｒ１４、ｃｈｒ１５、ｃｈｒ１７、ｃｈｒ１８およびｃｈｒ２０を欠失して有意な染色体喪失を示す。腫瘍試料の４１．６％を構成する優性クローンＤは、さらにｃｈｒ１８の単独残留コピーを欠失し、ｃｈｒ１９を増幅する。黒色矢印は、クローンＡおよびＢ中のＣＤＫ２ＮＡの位置を示しており、クローンＢ内のＣＤＫＮ２Ａの限局性喪失の出現が強調されている。
【図１２】二重ＡＳＤ上で位相化された突然変異の典型的な例示を示す図である。単一コピー獲得対立遺伝子状態における一領域、「正常」対立遺伝子状態内の一領域、ＣＮ−ＬＯＨを示す一領域およびＬＯＨを示す一領域からなる、腫瘍ゲノム上の代表的領域が示されている。二つの多数位相化（白色の星）および一つの少数位相化（黒色の星）された三つの突然変異は、増幅領域内で見いだされる。一つは多数位相化およびもう一つは少数位相化された二つの突然変異は、「正常」対立遺伝子状態上で見いだされる。ＬＯＨを示す両方の領域は、各々が単独残留対立遺伝子に位相化された一つの突然変異を有するので、そこで多数位相化されている。二重ＡＳＤの下方は、各突然変異の補正対立遺伝子画分ＭＡＦｃを用いて、ｘ軸に沿った場所を決定するために、これらの突然変異の各々が見いだされた場所を示している。単一コピー獲得対立遺伝子状態における二つの多数位相化された突然変異の異なる配置であって、両方の多数対立遺伝子上に存在する突然変異対立遺伝子（すなわち、増幅前に突然変異した）だけが単一コピー獲得多数対立遺伝子状態の近くで見いだされる異なる配置に注目されたい。他方は、単一コピー獲得少数対立遺伝子状態の近くで見いだされ、突然変異が多数対立遺伝子の唯一のコピー上に存在することを正確に同定している。最後に、黒色の少数位相化された突然変異全部が二重ＡＳＤの左半分に向かって見いだされることに注目されたい。
【図１３】腫瘍ＧＢＭ−０６−０１４５についての二重ＡＳＤ上の位相化された突然変異の例示を示す図である。これらのプロット上では、七つの領域が取り囲まれている。（ａ）増幅対立遺伝子状態への多数位相化はそれでもまだＭＡＦｃを提示するが、これは突然変異が二つのコピー中の一つの上だけであることを示唆している、（ｂ）ＭＡＦｃを伴う増幅対立遺伝子状態への多数位相化であって、これは突然変異が両方の増幅コピー上に存在することを示唆している、（ｃ）ＬＯＨ対立遺伝子状態と一致する対立遺伝子画分を伴う多数位相化、（ｄ）単一コピーと一致するＭＡＦｃを伴う多数増幅対立遺伝子状態における少数位相化、（ｅ）増幅対立遺伝子状態と一致するＭＡＦｃを伴う非位相化突然変異および（ｆ）ＬＯＨ対立遺伝子状態と一致するＭＡＦｃを伴う非位相化突然変異。
【図１４】腫瘍ＬＵＳＣ−３４−２５９６についての二重ＡＳＤ上の位相化された突然変異の例示を示す図である。二つの取り囲まれた領域（ａ）および（ｂ）は、均衡した増幅対立遺伝子状態（２，２）内の各々多数および少数対立遺伝子へ位相化された多数の突然変異を示している。ＮＤＲＧ１内の一つの多数位相化された突然変異は、対応するＭＡＦｃを伴うトランジション期対立遺伝子状態内で見いだされる。ＢＲＡＦおよびＤＮＭＴ３Ａにおける二つのミスセンス突然変異、ならびにＴＰ５３における一つのナンセンス突然変異の場所は、ＢＲＡＦを高増幅対立遺伝子状態に、ＤＮＭＴ３Ａを「正常」対立遺伝子状態に、そしてＴＰ５３をＣＮ−ＬＯＨ状態に配置している非位相化プロット内に示されている。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2015531240.tif 000036
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2015531240.tif 000037
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ａ】
2015531240.tif 000038
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ｂ】
2015531240.tif 000039
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ｃ】
2015531240.tif 000040
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３Ｄ】
2015531240.tif 000041
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2015531240.tif 000042
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2015531240.tif 000043
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2015531240.tif 000044
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７Ａ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７Ａ】
2015531240.tif 000045
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７Ｂ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７Ｂ】
2015531240.tif 000046
【手続補正１３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７Ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７Ｃ】
2015531240.tif 000047
【手続補正１４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７Ｄ】
2015531240.tif 000048
【手続補正１５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１２】
2015531240.tif 000049
【手続補正１６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３】
2015531240.tif 000050
【手続補正１７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１４】
2015531240.tif 000051
【国際調査報告】
2015531240.tif 000052
2015531240.tif 000053
2015531240.tif 000054
2015531240.tif 000055