(57)【要約】  本発明は、試料の希釈を必要とせず、かつアッセイを繰り返す必要なく、広範囲の濃度の分析物を１つのアッセイで定量化するための方法に関する。本発明の重要な特徴は、プローブに試料を結合させること、結合反応、および検出を含む事象のサイクルを２つ有することにある。結合および検出の第１のサイクル後、プローブを同じ試料容器に浸漬して、第１のサイクルにおける条件よりも結合に有利な条件で試料容器中のさらなる分析物と結合させる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体試料中の広い濃度範囲の分析物を検出する方法であって、
（ａ）先端表面の直径が５ｍｍ以下のプローブ先端に第１の抗体が固定化されているプローブを得るステップと、
（ｂ）分析物を有する試料溶液を含有する試料容器中に前記プローブ先端を１０秒〜２分間浸漬し、前記試料容器中で前記試料溶液を横方向に０〜５００ｒｐｍで流動させて、前記分析物を前記プローブ先端上の前記第１の抗体と結合させるステップと、
（ｃ）結合対の第１の要素と共役した第２の抗体の試薬を含む試薬溶液を含む試薬容器中に前記プローブ先端を浸漬して、前記試薬を前記分析物と結合させるステップと、
（ｄ）第１の洗浄溶液を含む第１の洗浄容器中に前記プローブ先端を浸漬して、前記プローブ先端を洗浄するステップと、
（ｅ）１以上の発光標識と共役した前記結合対の第２の要素を含む増幅溶液を含む増幅容器中に前記プローブ先端を浸漬して、前記分析物、前記第１の抗体、前記第２の抗体、ならびに前記プローブ先端上の前記結合対の前記第１および前記第２の要素の免疫複合体を形成するステップと、
（ｆ）第２の洗浄溶液を含有する第２の洗浄容器中に前記プローブ先端を浸漬して、前記プローブ先端を洗浄するステップと、
（ｇ）前記プローブ先端上に形成された前記免疫複合体の発光シグナルを測定することによって第１の結果を得るステップと、
（ｈ）前記プローブ先端を同じ試料容器中に１〜３０分間浸漬し、前記試料容器中で前記試料溶液を横方向に２００〜１２００ｒｐｍで流動させて、前記試料中のさらなる分析物を前記プローブ先端上の前記第１の抗体と結合させるステップと、
（ｉ）ステップ（ｃ）〜（ｆ）を１〜１０回繰り返すステップと、
（ｊ）前記プローブ先端上に形成された前記最終免疫複合体の前記発光シグナルを測定することによって第２の結果を得るステップと、
（ｋ）前記２つの結果を組み合わせ、広範囲の前記分析物濃度を分析するステップと
をこの順序で含み、
前記第１の抗体および前記第２の抗体が前記分析物に対する抗体である、方法。
【請求項２】
前記増幅溶液が、前記結合対の第２の要素の少なくとも５つの分子および少なくとも２５の発光標識と共役したポリマーを含み、ポリマーが少なくとも１００万ダルトンの分子量を有し、前記発光標識が２，０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記先端表面が約２ｍｍ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記結合対が、ハプテンとその抗体、リガンドとその受容体、核酸の相補鎖、またはレクチンと炭水化物である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記結合対が、ビオチンおよびストレプトアビジン、ビオチンおよびアビジン、ビオチンおよびストレプトアビジン、ビオチンおよびニュートラアビジン、フルオレセインおよび抗フルオレセイン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、またはＤＮＰ−抗ＤＮＰである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記結合対の前記第１の要素がビオチンであり、前記結合対の前記第２の要素がストレプトアビジンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリマーが、多糖、ポリヌクレオチド、デンドリマー、ポリオール、またはポリエチレングリコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリマーが分枝多糖である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ステップ（ｉ）がステップ（ｃ）〜（ｆ）を１〜３回繰り返す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記発光標識が、シアニン、クマリン、キサンテンおよびその誘導体からなる群から選択される蛍光染料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記発光標識がルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジンまたはルミノールの化学発光標識である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
液体試料中で広い濃度範囲の分析物を検出する方法であって、
（ｉ）先端表面の直径が５ｍｍ以下のプローブ先端に第１の抗体が固定化されているプローブを得るステップと、
（ｉｉ）前記プローブ先端を、分析物を有する試料溶液を含む試料容器中に１０秒〜２分間浸漬し、前記試料溶液を試料容器中横方向に０〜５００ｒｐｍで流動させて、前記分析物を前記プローブ先端上の前記第１の抗体に結合させるステップと、
（ｉｉｉ）前記プローブ先端を、蛍光標識と共役した第２の抗体を含む試薬溶液を含む試薬容器中に浸漬して、前記分析物、前記第１の抗体、および前記第２の抗体の免疫複合体を形成するステップと、
（ｉｖ）前記プローブ先端を、洗浄溶液を含有する洗浄容器中に浸漬して、前記プローブ先端を洗浄するステップと、
（ｖ）前記プローブ先端上で形成された前記第１免疫複合体の発光シグナルを測定することによって第１の結果を得るステップと、
（ｖｉ）前記プローブ先端を同じ試料容器中に１〜３０分間浸漬し、前記試料溶液を横方向に試料容器中２００〜１２００ｒｐｍで流動させて、試料中のさらなる分析物を前記プローブ先端上の前記第１の抗体と結合させるステップと、
（ｖｉｉ）ステップ（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を繰り返すステップと、
（ｖｉｉｉ）前記プローブ先端上で形成された前記最終免疫複合体の前記発光シグナルを測定することによって第２の結果を得るステップと、
（ｉｘ）２つの結果を組み合わせ、広範囲の分析物濃度を分析するステップと
をこの順序で含み、
前記第１の抗体および前記第２の抗体が前記分析物に対する抗体である、方法。
【請求項１３】
前記試薬溶液が、少なくとも５つの第２の抗体分子と、少なくとも２５の発光標識と共役したポリマーとを含み、前記ポリマーが少なくとも１００万ダルトンの分子量を有し、前記発光標識が２，０００ダルトン未満の分子量を有する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記先端表面が約２ｍｍ以下である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリマーが、多糖、ポリヌクレオチド、デンドリマー、ポリオール、またはポリエチレングリコールである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリマーが分枝多糖である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記発光標識が、シアニン、クマリン、キサンテンおよびその誘導体からなる群から選択される蛍光染料である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記発光標識が、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジンまたはルミノールの化学発光標識である、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
臨床診断法では多くの場合、免疫アッセイによって定量化される特定の試料は、ハイレンジ外の値を生じる、すなわち、分析物濃度が、アッセイにより正確かつ再現性のある結果が得られるレベルよりも高くなることがある。そのような分析物試料がハイレンジ外となる患者は、高い罹患率および死亡率を有することが多く、医療を必要とするので、このような試料を定量化する必要がある。これらの臨床的状況における診断のみならず、治療をモニターするためにも、免疫アッセイは有用なツールである。
【背景技術】
【０００２】
ハイレンジ外の試料による標準的な実験室手法では、分析物濃度が定量化範囲内に収まるように検査技師が試料をさらに希釈し、続いて繰り返し第２のアッセイを行う。再アッセイの結果が出るのに長時間を要し、このことは、救急処置もしくは緊急治療室では致命的である可能性があり、研究室にさらなる試薬コストをさらに課す点で、このプロトコルは問題となる。一部の一般的に用いられる側方流動免疫アッセイ装置は、試料を希釈するための手段を有さず、このため、使用者は、試料希釈プロトコルを可能にする別の器具でその後のアッセイを実施しなければならなくなる。
【０００３】
固相免疫アッセイは、分析物濃度が固定化抗体の結合能力を超える可能性があるので、ハイレンジ試料では限界がある。一部の臨床アッセイは、低分析物レベルの超高感度検出と多量の分析物の定量化との組み合わせをさらに必要とし、それゆえに広い定量化範囲が望ましい。Ｂ型ナトリウム利尿ペプチドであるＮＴｐｒｏＢＮＰ、およびプロカルシトニンがその例である。
【０００４】
低レベルの検出と高レベルの検出との広い定量化範囲を有する固相免疫アッセイの開発は、相反する技術目標である。例えば、高い分析物レベルを有する固定化抗体結合能力を超えないために、試料は高度に希釈（１／１０〜１／１００）されるか、または固相で短いインキュベーション時間を有する。高感度アッセイは多くの場合、検出可能な量の微量分析物の結合を実施するために、最低試料希釈（未希釈、１／２〜１／３）および固相で比較的長いインキュベーション時間を必要とする。最終結果は多くの場合、準最適臨床成績を有する分析物範囲の下限または上限のいずれかを有する適切な定量範囲に満たない。
【０００５】
アリールスルホネートシアニン蛍光染料は、Ｍｕｊｕｍｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４：１０５−１１１；Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１１：４１８−４３０；および米国特許第５，２６８，４８６号に記載されている。Ｃｙ５は、参考文献のそれぞれで記載され、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．，（ペンシルベニア州ピッツバーグ）から商品名ＦＬＵＯＲＯＬＩＮＫ（商標）Ｃｖ５（商標）として市販されている。アリールスルホネートシアニン蛍光染料は、高い吸光係数（典型的には１３０，０００Ｌ／モル〜２５０，０００Ｌ／モル）、良好な量子収率、ほとんどの生体物質およびプラスチックの自己蛍光波長の外側の範囲（５００ｎｍ〜７５０ｎｍ）内の蛍光発光スペクトル、良好な溶解度、および低い非特異的結合特性を有する。
【０００６】
これらの優れた特性にも関わらず、アリールスルホネートシアニン蛍光染料にはある制限がある。詳細には、これらの染料は比較的狭いストークシフトを有し、その結果、染料の励起スペクトルと発光スペクトルとの間でかなりのオーバーラップを生じる。励起および発光スペクトルのオーバーラップは、染料分子が互いに近くに位置する場合に励起されると蛍光の自己消光を引き起こし得る。そのような自己消光は、免疫アッセイで使用するために１つの抗体分子と共役することができるアリールスルホネート染料分子の数を制限する。アリールスルホネートシアニン蛍光染料の一例であるＣｙ５の場合、ストークシフトは１７ｎｍ（６５０ｎｍの励起波長と６６７ｎｍの発光波長との差）である。最適蛍光収率は、２〜４個のＣｙ５分子が１つの抗体分子と共役する場合に得られる。蛍光シグナル出力は、４個より多い染料分子が１つの抗体分子と共役する場合に激減する。４を超える染料分子を個々の抗体分子と共役させることができないため、Ｃｙ５で標識された抗体および他の結合物質を用いる免疫アッセイの感度が著しく制限される。
【０００７】
米国特許出願公開第２０１１／０３１２１０５号は、検出システムおよび蛍光免疫アッセイを開示しており、この刊行物は、その全体が参照により本明細書中で援用される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献２】米国特許第５，２６８，４８６号
【特許文献１】米国特許公開第２０１１／０３１２１０５号
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｍｕｊｕｍｄａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４：１０５−１１１；Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，１１：４１８−４３０
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
試料の希釈を必要とせず、かつ新しい試薬を用いてアッセイを繰り返す必要なく、広範囲の濃度の分析物を定量化するための方法が必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】プローブの検出面から蛍光シグナルを検出するための光検出システムを表す。
【図２】プローブ先端上の化学発光シグナルを検出するための電気化学発光検出システムを表す。
【図３】抗原分析物を検出するための本発明の第１の実施形態の免疫アッセイフォーマットを表す。Ａｂ：抗体、Ａｇ：抗原、Ｓａ：ストレプトアビジン、Ｂ：ビオチン、Ｆ：蛍光標識。
【図４】本発明の第１の実施形態の広範囲プロトコルを表す。
【図５】抗原分析物を検出するための本発明の第２の実施形態の免疫アッセイフォーマットを表す。Ａｂ：抗体、Ａｇ：抗原、Ｆ：蛍光標識。
【図６】本発明の実施形態の第２の実施形態の広範囲プロトコルを示す。
【図７】架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００−ＳＰＤＰの調製のフローチャートを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
定義
特許請求の範囲および明細書で用いられる用語は、以下に定義するものを除いて、当業者によって理解される、当該用語の通常の意味に従って解釈されるべきである。
【００１３】
「約」は、本明細書中で用いられる場合、記載される値の±１０％以内を指す。
【００１４】
「分析物結合分子」は、本明細書中で用いられる場合、分析物分子との特定の結合反応に関与することができる任意の分子を指す。
【００１５】
形状の「アスペクト比」は、その短い方の寸法に対する長い方の寸法の比を指す。
【００１６】
「結合分子」は、対象の別の分子と結合することができる分子を指す。
【００１７】
「結合対」は、本明細書中で用いられる場合、互いに引かれ合い、互いに特異的に結合する２つの分子を指す。結合対の例としては、限定するものではないが、抗原およびその抗原に対する抗体、リガンドおよびその受容体、核酸の相補鎖、ビオチンおよびアビジン、ビオチンおよびストレプトアビジン、ビオチンおよびニュートラアビジン（アビジンの脱グリコシル化形）、レクチンおよび炭水化物が挙げられる。好ましい結合対は、ビオチンおよびストレプトアビジン、ビオチンおよびアビジン、ビオチンおよびニュートラアビジン、フルオレセインおよび抗フルオレセイン、ジゴキシゲニン／抗ジゴキシゲニン、ＤＮＰ（ジニトロフェノール）／抗ＤＮＰである。
【００１８】
「分枝ポリマー」は、本明細書中で用いられる場合、２次元もしくは３次元構造を有する非線形ポリマーを指し、これは天然分枝ポリマー、または合成架橋ポリマーのいずれかであり得る。
【００１９】
「化学発光」は、本明細書中で用いられる場合、化学反応の結果として、限定された発光を伴うエネルギー放出を指す。例えば、ルミノールが過酸化水素と好適な触媒の存在下で反応する場合、それは励起状態で３−アミノフタレートを産生し、これはより低いエネルギーレベルへ崩壊する場合に発光する。
【００２０】
「デンドリマー」は、本明細書中で用いられる場合、反復する有機、分枝分子を指す。デンドリマーは典型的にはコアの周りに対称的であり、多くの場合、球状３次元形態をとる。
【００２１】
「電気化学発光」（ＥＣＬ）は、本明細書中で用いられる場合、溶液中での電気化学反応の間に生じるルミネッセンスを指す。ＥＣＬでは、電気化学的に生じた中間体は、高度の発エルゴン反応を受けて、電子的に励起された状態を生じ、次いで発光する。ＥＣＬ励起は、電気生成種（ｅｌｅｃｔｒｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｓｐｅｃｉｅｓ）のエネルギー的電子移動（レドックス）反応に起因する。ＥＣＬは通常、発光種の溶液を含有する電気化学電池の電極に電位（数ボルト）を適用する間に観察される。
【００２２】
「固定化」は、本明細書中で用いられる場合、試薬が固体表面に固定されることを指す。試薬が固体表面に固定化される場合、それは表面に非共有結合されるか、または共有結合されるかのいずれかである。
【００２３】
「モノリス担体」は、本明細書中で用いられる場合、一片の固体材料を指す。
【００２４】
「プローブ」は、本明細書中で用いられる場合、検知面において分析物結合分子の薄膜層でコーティングされた基体を指す。プローブは先端部と基端部とを有する。基端部（本願においてはプローブ先端も指す）は分析物結合分子の薄層でコーティングされた検出面を有する。
【００２５】
「広範囲の濃度」は、本明細書中で用いられる場合、少なくとも５００倍、１０００倍、２０００倍、または５０００倍を超える濃度範囲を指す。
【００２６】
本発明は、試料の希釈を必要とせず、かつアッセイを繰り返す必要なく、広範囲の濃度の分析物を１つのアッセイで定量化するための方法に関する。本発明の特徴は、それぞれが試料をプローブに結合させること、結合反応、および検出を含む事象のサイクルを２つ有する。一般的に、第１のサイクルのアッセイ条件は、関連する臨床範囲の濃度上限の試料に対して最適化され、第２のサイクルのアッセイ条件は、関連する臨床範囲の濃度の下限に対して最適化される。結合および検出の第１のサイクル後に、プローブを同じ試料容器中に浸漬して、試料容器中のさらなる分析物を、第１のサイクルにおける結合条件よりも有利な結合条件（たとえば、さらに長い反応時間および／または撹拌）でプローブと結合させる。分析物濃度を両サイクルで検出し、合わせた結果から、試料の希釈を必要とせず、かつアッセイを繰り返す必要なく、単一アッセイにおいて広範囲濃度を有する分析物を定量化することができる。本発明の別の利点は、広範囲プロトコルが両サイクルで同じ試料および試薬を使用し、第２のサイクルのためにさらなる試料または試薬を必要としないことである。
【００２７】
第１の実施形態
第１の実施形態において、本発明の方法は、（ａ）直径が５ｍｍ以下のプローブ先端に第１の抗体が固定化されているプローブを得るステップと、（ｂ）プローブ先端を、分析物を有する試料溶液を含む試料容器中に１０秒〜２分間浸漬し、試料溶液を試料容器中で横方向に０〜５００ｒｐｍ、好ましくは０〜２００ｒｐｍで流動させて、分析物をプローブ先端上の第１の抗体に結合させるステップと、（ｃ）結合対の第１の要素と共役した第２の抗体の試薬を含む試薬溶液を含む試薬容器中にプローブ先端を浸漬して、試薬を分析物に結合させるステップと、（ｄ）洗浄溶液を含む第１の洗浄容器中にプローブ先端を浸漬して、プローブ先端を洗浄するステップと、（ｅ）１以上の発光標識と共役した結合対の第２の要素を含む増幅溶液を含む増幅容器中にプローブ先端を浸漬して、分析物、第１の抗体、第２の抗体、ならびにプローブ先端上の結合対の第１および第２の要素の免疫複合体を形成するステップと、（ｆ）洗浄溶液を含む第２の洗浄容器中にプローブ先端を浸漬して、プローブ先端を洗浄するステップと、（ｇ）プローブ先端上で形成された免疫複合体の発光シグナルを測定することによって第１の結果を得るステップと、（ｈ）プローブ先端を同じ試料容器中に１〜３０分間浸漬し、試料容器中で０〜１２００ｒｐｍ、好ましくは２００〜１２００ｒｐｍまたは２００〜１０００ｒｐｍで横方向に試料溶液を流動させて、試料中のさらなる分析物をプローブ先端上の第１の抗体に結合させるステップと、（ｉ）ステップ（ｃ）〜（ｆ）を１〜１０回繰り返すステップと、（ｊ）プローブ先端上に形成された最終免疫複合体の発光シグナルを測定することによって第２の結果を得るステップと、（ｋ）２つの結果を組み合わせ、広範囲の分析物濃度を分析するステップとをこの順序で含み、第１の抗体および第２の抗体は分析物に対する抗体である。
【００２８】
ステップ（ａ）において、プローブは、例えば少なくとも５：１、好ましくは１０：１の長さ：幅のアスペクト比を有するロッド、円筒形、円形、正方形、三角形などの任意の形状であり得る。ロッド形状が好ましい。プローブは免疫アッセイの間に試料溶液および１以上のアッセイ溶液中に浸漬されるので、溶液中にプローブ先端を浸漬することができるように少なくとも５：１のアスペクト比を有する細長いプローブを有することが望ましい。蛍光アッセイのために、プローブはモノリス担体であり得る。
【００２９】
プローブは、分析物を結合するための小さな先端を有する。先端は、直径５ｍｍ以下、好ましくは２ｍｍ以下または１ｍｍ以下、例えば０．５〜２ｍｍでさらに小さな表面積を有する。プローブ先端の小さな表面はいくつかの利点を提供する。第１に、小さな表面は非特異的結合が少なく、したがってバックグラウンドシグナルが低い。第２に、プローブ先端上の試薬または試料キャリーオーバーは、先端の表面積が小さいために非常に小さい。この特徴によってプローブ先端を洗浄しやすくなり、洗浄溶液の方が大きな容積を有するので、洗浄溶液中に生じる汚染がごくわずかとなる。さらに、小さな表面積のプローブ先端は、結合能力が低い。その結果、プローブ先端を試薬溶液中に浸漬する場合、試薬の結合はあまり試薬を消費せず、試薬濃度は事実上変化しない。洗浄溶液の汚染がわずかであり、試薬の消費が少ないことにより、試薬溶液、増幅溶液、および洗浄溶液を多数回、例えば、１〜１０回または３〜５回再使用することが可能になる。
【００３０】
プローブの検出面を、試料中の分析物と結合する第１の抗体でコーティングする。試薬を固相（プローブ先端の検出面）に固定する方法は、免疫化学で一般的であり、固相と試薬との間の共有結合、疎水結合または静電結合の形成を含む。第１の抗体を検出面上に直接固定化することができる。別法として、第１の抗体を結合対によって検出面上に間接的に固定化することができる。例えば、抗フルオレセインを、固体表面に吸着させることによるか、または固体表面上にコーティングされたアミノプロピルシランに共有結合させることによるかのいずれかでまず固定することができる。次いで、フルオレセインで標識された第１の抗体をフルオレセインと抗フルオレセインとの結合（結合対）によって固体表面に結合させることができる。
【００３１】
ステップ（ｂ）において、プローブ先端を試料容器中に１０秒〜２分、好ましくは３０秒〜１分間浸漬して、分析物をプローブ先端上の第１の抗体と結合させる。
【００３２】
ステップ（ｂ）後、プローブを場合によって１〜５回、好ましくは１〜３回、洗浄溶液を含む洗浄容器中で洗浄する。キャリーオーバーされる溶液の量は結合表面積が狭いため最小であるので、この追加の洗浄ステップは不要であってもよい。洗浄溶液は典型的には、緩衝液およびＴｗｅｅｎ  ２０などの界面活性剤を含有する。
【００３３】
ステップ（ｃ）において、プローブ先端を試薬容器中に２０秒〜１０分間、好ましくは２０秒〜２分間浸漬して、試薬をプローブ先端上の分析物と結合させる。試薬溶液は、結合対の第１の要素と共役した第２の抗体の試薬を含む。
【００３４】
結合対は、典型的には、ハプテンおよびその抗体、リガンドおよびその受容体、核酸の相補鎖、またはレクチンおよび炭水化物である。例えば、結合対は、ビオチンおよびストレプトアビジン、ビオチンおよびアビジン、ビオチンおよびニュートラアビジン、フルオレセインおよび抗フルオレセイン、ジゴキシゲニンおよび抗ジゴキシゲニン、ならびにＤＮＰ（ジニトロフェノール）および抗ＤＮＰである。好ましくは、結合対の第１の要素はビオチンであり、結合対の第２の要素はストレプトアビジンである。
【００３５】
ステップ（ｄ）において、プローブを１〜５回、好ましくは１〜３回、洗浄溶液を含む第１の洗浄容器中で洗浄する。洗浄溶液は、典型的には緩衝液とＴｗｅｅｎ  ２０などの界面活性剤とを含む。
【００３６】
ステップ（ｅ）において、プローブを、増幅溶液を含む増幅容器中に２０秒〜５分間、好ましくは２０秒〜２分間浸漬して、分析物、第１の抗体、第２の抗体、ならびにプローブ先端上の結合対の第１および第２の要素の免疫複合体を形成する。増幅溶液は、１以上の発光標識と共役した結合対の第２の要素を含む。
【００３７】
アッセイの感度を改善するために、増幅溶液は、結合対の第２の要素の少なくとも５つの分子および少なくとも２５の発光標識と共役したポリマーを含み得る。ポリマーは、好ましくは分枝および／または架橋している。ポリマーは少なくとも５００，０００、好ましくは１００万ダルトンの分子量を有する。ポリマーは、多糖（たとえば、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）（スクロースおよびエピクロロヒドリンのコポリマー）またはデキストラン）、ポリヌクレオチド、デンドリマー、ポリオール、もしくはポリエチレングリコールであり得る。ポリマーは好ましくは分枝または架橋していて、２次元または３次元構造を有する。ポリマーは、好ましくは５〜５０または５〜１００の結合分子および２５〜１００または２５〜５００の発光性分子を含む。
【００３８】
本発明に有用な発光標識は、５，０００未満、好ましくは２，０００未満、例えば５００〜２０００または１００〜２０００ダルトンの分子量を有する。１つの実施形態において、発光標識は、シアニン、クマリン、キサンテンおよびその誘導体からなる群から選択される蛍光染料である。例えば、蛍光染料は、Ｃｙ５（分子量ＭＷ７９２）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ＤｙＬｉｇｈｔ  ３５０（ＭＷ８７４）、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４０５（ＭＷ７９３）、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８（ＭＷ７１０１１）、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５５０（ＭＷ９８２）、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５９４（ＭＷ１０７８）、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６３３（ＭＷ１０６６）、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６５０（ＭＷ１００８）、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０（ＭＷ９５０）、ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５５（ＭＷ１０９２）、ＤｙＬｉｇｈｔ  ８００（ＭＷ１０５０）、Ｏｙｓｔｅｒ蛍光染料、ＩＲＤｙｅ、またはランタノイド（Ｅｕ、Ｔｈ、Ｓｍ、もしくはＤｙ）などの希土類金属とキレート化した複数の環を含む有機化合物である。
【００３９】
別の実施形態において、発光標識は、ルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジン（ＭＷ１０５７）、ルミノール（ＭＷ１７７）、アクリジニウムエステル（９［［４−［３−［（２，５−ジオキソ−１−ピロリジニル）オキシ］−３−オキソプロピル］フェノキシ］カルボニル］−１０−メチル−アクリジニウムトリフルオロメタンスルホネート、ＭＷ６３２）、ヘミン（ＭＷ６５２）からなる群から選択される化学発光マーカーである。
【００４０】
結合分子がポリペプチドまたはタンパク質である場合、発光標識は、化学文献および特許文献に記載されるような通常の共役化学反応を使用して、ジスルフィド、ヒドロキシフェニル、アミノ、カルボキシル、インドール、または他の官能基などの様々な部分によってそれと結合することができる。
【００４１】
ポリヌクレオチドに対する結合分子の共有結合は、アルデヒド、ケトン、イソチオシアネート、イミデート、イノシン、アシル、およびアルキルなどの様々な部分により、通常の共役化学を使用して実施することができ、一方、ビオチンを用いた誘導体化は多くの文献で教示されている。（Ｌｅａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４０４５−４０４９；国際公開第８６／０２９２９号；ＥＰ０６３  ８７９；Ｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６６３３−６６３７；ならびにＥＰ２００９  ９９６）。
【００４２】
ステップ（ｂ）、（ｃ）、および（ｅ）のそれぞれにおいて、反応は容器中で溶液を撹拌または混合することによって加速することができる。例えば、プローブ先端を横切る溶液の側方流動（環状流動（ｏｒｂｉｔａｌ  ｆｌｏｗ））は、１〜５００ｒｐｍ、好ましくは１〜２００ｒｐｍで誘発することができ、これによって固相に固定化されたその結合パートナーによる標的分子の捕捉が加速される。例えば、反応容器をオービタルシェーカーに取り付けることができ、このオービタルシェーカーを少なくとも５０ｒｐｍ、好ましくは少なくとも２００ｒｐｍの速度で回転させる。場合によって、プローブ先端を０．０１〜１０ｍｍ／秒の速度で環状流動の面に対して垂直に上下させて、プローブ先端の上下で溶液のさらなる撹拌を誘導することができる。
【００４３】
ステップ（ｆ）において、プローブを１〜５回、好ましくは１〜３回、第２の洗浄溶液を含む第２の洗浄容器中で洗浄する。洗浄溶液は典型的には緩衝液とＴｗｅｅｎ  ２０などの界面活性剤とを含有する。第１の洗浄容器と第２の洗浄容器とは、同じ容器でも、異なる容器であってもよい。第１の洗浄溶液と第２の洗浄溶液とは、同じ溶液でも、異なる溶液であってもよい。
【００４４】
ステップ（ｇ）において、免疫複合体は、プローブ上の発光シグナルを読み取ることによって検出される。蛍光標識について、プローブを透明な底のウェル中に入れ、参照により本明細書中で援用される、米国特許出願公開第２０１１／０３１２１０５号に記載されているような検出器（図１）によって読み取る。
【００４５】
化学発光標識について、プローブを、共反応物質（ｃｏ−ｒｅａｃｔａｎｔ）を有する測定溶液を含む透明な底のウェル中に入れる。例えば、化学発光標識がルテニウム（ＩＩ）トリス−ビピリジンである場合、共反応物質はトリプロピルアミンである。化学発光標識がルミノールである場合、共反応物質は過酸化水素および水中水酸化物塩である。放出された光は、光電子増倍管（ＰＭＴ）によって測定される。
【００４６】
電気化学発光（ＥＣＬ）について、ＥＣＬ分析器の機構および主成分は、参照により本明細書中で援用される、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．  ３７：１５３４−１５３９（１９９１））によって記載されている。共反応物質を有する測定溶液を含む透明な測定のウェル中にプローブを入れた後、作用電極および対電極に電圧を加え、放出された光をＰＭＴによって測定する。
【００４７】
好ましい実施形態において、抗体でコーティングされたプローブはＥＣＬ分析器の作用電極としての役割を果たす（図２）。Ｒｕ（ＩＩ）／トリプロピルアミンレドックス反応は、電極表面で起こるか、または電極表面に非常に近接して起こる必要があるので、これによって、効率的な発光の利点が得られる。
【００４８】
ステップ（ｈ）は、第２の事象のサイクルを開始する。ステップ（ｈ）はプローブ先端を同じ試料容器に１〜３０分ものさらに長時間、好ましくは２〜３０分、または３〜３０分再度浸漬し、場合によって撹拌して、プローブ先端上の第１の抗体へのさらなる分析物の結合を増大させる。
【００４９】
ステップ（ｉ）は、ステップ（ｃ）〜（ｆ）を１〜１０回、好ましくは１〜５回、１〜３回、または２〜３回繰り返すことによる循環増幅である。増幅溶液が結合対の第２の要素の少なくとも５つの分子および少なくとも２５の発光標識と共役したポリマーを含む場合、ステップ（ｃ）〜（ｆ）を２〜１０回繰り返して、アッセイシグナルおよび感度を増大させることができる。各サイクルは、プローブを同じ試薬容器、同じ第１の洗浄容器、同じ増幅容器、同じ第２の洗浄容器に戻すことから構成される。増幅溶液が高分子量ポリマーを含まない場合、ステップ（ｃ）〜（ｆ）は典型的には１回だけ繰り返される。
【００５０】
ステップ（ｊ）は、プローブ先端上の発光シグナルを測定し、２つの検出結果を組み合わせて広範囲の分析物濃度を分析することによって形成された最終免疫複合体を検出し、次いで２つの検出結果を組み合わせて、広範囲の分析物濃度を分析する。
【００５１】
図３は、抗原分析物を検出するための本発明の第１の実施形態の免疫アッセイのフォーマットを示す。
【００５２】
図４は、本発明の第１の実施形態の広範囲プロトコルにおけるプローブ移動を示す。図４では、広範囲プロトコルは、同じ試料および試薬を用いる２つのアッセイシーケンスから構成される。第１のシーケンスは、抗体（Ａｂ）でコーティングされたプローブを抗原（Ａｇ）試料容器中に浸漬し、続いてビオチニル化抗体（Ｂ−ＡＢ）試薬容器中に浸漬し、次いで蛍光標識（ＣｙＳ−ＳＡ）と結合したストレプトアビジンを含む容器中に浸漬することを伴う。シグナルは標識されたストレプトアビジン結合後にプローブの先端部で読み取られる。第２のシーケンスに関して、プローブを次いで同じ試料容器に戻し、ここで結合条件を変えて、さらに強い結合およびさらに高い感度を達成する。典型的には、インキュベーション時間の増加および／またはプローブの環状流動速度の増加は、試料結合の感度を改善する。プローブを次いで同じビオチニル化抗体試薬容器に移し、次いで標識されたストレプトアビジン試薬容器に移し、続いて２回目の測定を行う。
【００５３】
第２の実施形態
第２の実施形態において、本発明の方法は、（ｉ）直径が５ｍｍ以下のプローブ先端に第１の抗体が固定化されているプローブを得るステップと、（ｉｉ）プローブ先端を、分析物を有する試料溶液を含む試料容器中に１０秒〜２分間浸漬し、試料溶液を試料容器中に横方向に０〜５００ｒｐｍで流動させて、分析物をプローブ先端上の第１の抗体と結合させるステップと、（ｉｉｉ）蛍光標識に共役した第２の抗体を含む試薬溶液を含む試薬容器中にプローブ先端を浸漬して、分析物、第１の抗体、および第２の抗体の免疫複合体を形成するステップと、（ｉｖ）洗浄溶液を含む洗浄容器中にプローブ先端を浸漬して、プローブ先端を洗浄するステップと、（ｖ）プローブ先端上に形成された第１免疫複合体の発光シグナルを測定することによって第１の結果を得るステップと、（ｖｉ）プローブ先端を同じ試料容器中に１〜３０分間浸漬し、試料溶液を試料容器中横方向に０〜１２００ｒｐｍ、好ましくは２００〜１２００ｒｐｍまたは２００〜１０００ｒｐｍで流動させて、試料中のさらなる分析物をプローブ先端上の第１の抗体と結合させるステップと、（ｖｉｉ）ステップ（ｉｉｉ）および（ｉｖ）を繰り返すステップと、（ｖｉｉｉ）プローブ先端上に形成された最終免疫複合体の発光シグナルを測定することによって第２の結果を得るステップと、（ｉｘ）２つの結果を組み合わせ、広範の分析物濃度を分析するステップとをこの順序で含み、第１の抗体および第２の抗体は分析物に対する抗体である。
【００５４】
第２の実施形態のステップ（ｉ）および（ｉｉ）は第１の実施形態のステップ（ａ）および（ｂ）に類似している。
【００５５】
ステップ（ｉｉｉ）において、プローブ先端を試薬容器中に２０秒〜１０分間、好ましくは２０秒〜２分間浸漬して、試薬をプローブ先端上の分析物と結合させる。試薬溶液は、蛍光標識と共役した第２の抗体の試薬を含む。１つの実施形態において、試薬溶液は、第２の抗体の少なくとも５つの分子および少なくとも２５の発光標識と共役したポリマーを含み、この場合、ポリマーは少なくとも１００万ダルトンの分子量を有し、発光標識は２，０００ダルトン未満の分子量を有する。好適なポリマーは、第１の実施形態で記載されているものと類似している。
【００５６】
ステップ（ｉｖ）、（ｖ）、（ｖｉ）、（ｖｉｉｉ）および（ｉｘ）は、それぞれ、第１の実施形態のステップ（ｄ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｊ）、および（ｋ）と類似している。
【００５７】
図５は、抗原分析物を検出するための本発明の第２の実施形態の免疫アッセイフォーマットを示す。
【００５８】
図６は、本発明の第２の実施形態の広範囲プロトコルにおけるプローブ移動を示す。図６において、広範囲プロトコルは、同じ試料および試薬を使用する２つのアッセイシーケンスから構成される。第１のシーケンスは、抗体（Ａｂ）でコーティングされたプローブを抗原（Ａｇ）試料容器中に浸漬し、続いて蛍光標識と共役した抗体（Ａｂ−Ｃｙ５）を含む試薬容器中に浸漬することを含む。シグナルを、標識抗体結合後にプローブの先端部で読み取る。第２のシーケンスに関して、プローブを次いで同じ試料容器に戻し、この場合、結合条件を変更して、さらに大きな結合およびさらに高い感度を達成する。典型的には、インキュベーション時間の増加および／またはプローブの環状流動速度の増加によって、試料結合の感度が改善される。プローブを次いで同じ試薬容器に移し、続いて第２の測定を実施する。
【００５９】
一般的に、第１のシーケンスのアッセイ条件は、関連する臨床範囲の濃度上限の試料について最適化され、低濃度試料は検出されない。第２のシーケンスのアッセイ条件は、低濃度臨床試料について最適化され、高濃度試料はプローブの結合能力を飽和状態にする。周期増幅は、いずれかのシーケンスで用いることができるが、第１のシーケンスでは高感度は要求されないのでほとんど使用されない。
【００６０】
小表面積プローブを使用する広範囲プロトコルは、同じ試料および試薬を使用して免疫アッセイの分析範囲を拡大する２つのアッセイシーケンスを特徴とする。本発明は、抗原を迅速に捕捉できる比較的高い表面積を有するので、固相として通常用いられる、マイクロウェル、磁性粒子、またはビーズなどの他の異種免疫アッセイフォーマットよりも優れた予想外の利点を有する。それらのプロトコルは、試料および試薬を添加し、インキュベーション期間後に、それらを固相から取り出すことを含む。各試薬を固相に添加する間に、洗浄シーケンスを実施する。洗浄シーケンスも、洗浄試薬を添加し、次いで固相から取り出すことから構成される。それによって、アッセイ実施の複雑さが増し、試料および試薬の再使用を可能にするために追加のピペッティングシステムを有する。第２に、他のプロトコルにおける固相の高表面積は、試薬を消耗させるか、または洗浄サイクルにおけるキャリーオーバーの原因となる可能性があり、これはアッセイ性能を低減する可能性がある。
【００６１】
本発明を以下の実施例でさらに説明し、この実施例は、本発明の範囲をその中で記載される特定の手順に限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００６２】
実施例１：第１の抗体が固定化されたプローブの調製
塩基性ナトリウム利尿ペプチド（Ｂａｓｉｃ  ｎｕｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ：ＢＮＰ）は、心筋細胞の過度の伸張に応答して心臓の心室によって分泌される３２のアミノ酸ポリペプチドである。脳ナトリウム利尿ペプチド（ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ）のＮ末端プロホルモンは７６アミノ酸Ｎ末端フラグメントである。血液中のＢＮＰおよびＮＴ−ｐｒｏＢＮＰレベルはどちらも、急性うっ血性心不全のスクリーニング、診断に有用であり、心不全における予後の確立に有用であり得る。
【００６３】
プロカルシトニン（ＰＣＴ）は、ホルモンカルシトニンのペプチド前駆体であり、後者はカルシウムホメオスタシスに関与する。それは１１６のアミノ酸で構成され、甲状腺の傍濾胞細胞ならびに肺および腸の神経内分泌細胞によって産生される。
【００６４】
直径１ｍｍ、長さ２ｃｍの石英プローブを、製造業者のプロトコルに従って化学蒸着プロセス（Ｙｉｅｌｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  １２２４Ｐ）を使用してアミノプロピルシランでコーティングした。プローブ先端を次いでネズミモノクローナル抗フルオレセイン（ＢｉｏｓＰａｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．）、１０μｇ／ｍｌのｐＨ７．４のＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）中溶液中に浸漬した。抗体をプローブに２０分間吸着させた後、プローブ先端をＰＢＳ中で洗浄した。
【００６５】
ＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよびＰＣＴの捕捉抗体（ＨｙＴｅｓｔ，  Ｆｉｎｌａｎｄ）を標準的方法によってフルオレセインで標識した。典型的には、抗体あたり約４のフルオレセイン置換があった。抗フルオレセインでコーティングされたプローブをフルオレセイン標識捕捉抗体溶液（５μｇ／ｍｌ）中に５分間浸漬し、続いてＰＢＳ中で洗浄した。
【００６６】
実施例２：ビオチニル化抗体の調製
抗ＢＮＰ、抗ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰおよび抗ＰＣＴ抗体を標準的方法によってビオチンで標識した。例えば、ビオチニル化−ＮＨＳを約１５：１のモル比でＰＢＳ（ｐＨ７）中で１時間抗体と室温で反応させた。ビオチニル化抗体をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムによって精製した。典型的には、抗体あたり約３〜６のビオチンが存在していた。
【００６７】
実施例３：架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００−ＳＰＤＰの調製
架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００−ＳＰＤＰ（スクシンイミジル６−［３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド］ヘキサノエート、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、参照により本明細書中で援用される米国特許出願公開第２０１１／０３１２１０５号の実施例１に従って調製した。図７はその調製のフローチャートを示す。
【００６８】
実施例４：Ｃｙ５−ストレプトアビジンの調製
ＤＭＦ中５ｍｇ／ｍｌの３２μＬのＣｙ５−ＮＨＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を、１ｍｌのストレプトアビジン（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｌａｂｓ）と２．４ｍｇ／ｍｌの０．１Ｍの炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ９．５で４０分間３０℃で反応させた。混合物をＰＤ１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけて、非結合Ｃｙ５を除去した。スペクトル分析によってストレプトアビジン１分子あたり２．８のＣｙ５が結合することが示された。
【００６９】
実施例４ａ：Ｃｙ５−抗体の調製
ストレプトアビジンを抗体と置換することにより、実施例４に従ってＣｙ５−抗体を調製する。
【００７０】
実施例５：Ｃｙ５−ストレプトアビジン架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）の調製
５．８μΤのＳＭＣＣ（スクシンイミジル４−［Ｎ−マレミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）をＤＭＦ中１０ｍｇ／ｍｌで、１ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中２ｍｇのＣｙ５−ストレプトアビジン（実施例４）と１時間室温で反応させた。混合物をＰＤ１０カラムにかけることによって非結合ＳＭＣＣを除去した。
【００７１】
架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００−ＳＰＤＰ上のチオールを、３０μＬのＤＴＴを３８ｍｇ／ｍｌで１ｍｌのＰＢＳ中の１ｍｇの架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００−ＳＰＤＰに添加し、１時間室温で反応させることによって保護し、続いてＰＤ１０カラムによって架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）を精製した。
【００７２】
Ｃｙ５−ストレプトアビジン−ＳＭＣＣを架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）４００−ＳＨと混合し、一晩室温で反応させた。１０μＬのＮＥＭ（Ａｌｄｒｉｃｈ）を次いで１２．５ｍｇ／ｍｌで添加し、半時間室温で反応させた。複合体を次いでＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ４Ｂ  ＣＬカラム上で精製した。複合体はＦｉｃｏｌｌ（登録商標）（２００万ダルトン）あたり約２０〜３０のストレプトアビジンを有し、ストレプトアビジンあたり２〜３のＣｙ５を有すると推定された。
【００７３】
実施例５ａ：Ｃｙ５−ストレプトアビジン−架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）の調製
ストレプトアビジンを抗体と置換することにより、実施例５に従ってＣｙ５−抗体−架橋ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）を調製する。
【００７４】
実施例６：ＢＮＰの広範囲プロトコル
広範アッセイの第１のシーケンスのために、ＢＮＰ校正器（Ｈｙｔｅｓｔ）を正常なプールされたヒト血漿中にスパイクし、次いで５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０（アッセイ緩衝液）を含むＰＢＳ中で１〜３倍に希釈した。プローブ先端をＢＮＰ試料ウェル中に浸漬し、試料ウェルを５０ｒｐｍで環状運動（直径１ｍｍのストローク）させつつ室温で１分間インキュベートした。プローブを静置した。プローブをＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０中で１０秒間３回洗浄した。洗浄シーケンス後、ビオチニル化抗ＢＮＰをアッセイ緩衝液中１０ｕｇ／ｍｌで含有する試薬溶液中にプローブを浸漬し、続いて５００ｒｐｍで０．５分インキュベートし、次いで３回洗浄シーケンスを実施した。プローブを次いで増幅溶液Ｃｙ５−ストレプトアビジン−Ｃｘ  ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）に移した。５００ｒｐｍで０．５分インキュベーション後、プローブを洗浄シーケンスによって採取した。プローブの先端部での蛍光を次いで測定し、結果を表１中１ｓｔ  Ｒｅａｄの下欄に示す。
【００７５】
第２のシーケンスは、プローブを同じ試料ウェルに戻すことから構成され、周期増幅手順でアッセイを実施した。プローブを試料中で５分間、７５０ｒｐｍでインキュベートし、続いて洗浄シーケンスを実施した。３サイクルを次いで実施し、この場合、各サイクルについて、プローブを同じビオチニル化抗ＢＮＰ溶液中に２分間５００ｒｐｍで浸漬し、続いて洗浄シーケンスを実施し、同じＣｙ５−ストレプトアビジン−Ｃｘ  ＦｉＣＯＬＬ（登録商標）溶液中に１分間５００ｒｐｍで浸漬し、続いて洗浄シーケンスを実施した。第１のサイクル（Ａｍｐｌ）および第３サイクル（Ａｍｐ３）後、プローブ先端上の蛍光を測定した。データを表１に示す。各データポイントは重複試験の平均である。「Ｓａｔ」は飽和シグナルを指す。
【００７６】
【表１】
2015514992.tif 000003
【００７７】
表１の結果は、第１のシーケンスの定量化範囲（１ｓｔ  Ｒｅａｄ）が約１〜５０ｎｇ／ｍｌであり、１増幅サイクル（Ａｍｐ  １）の第２のシーケンスについては０．３〜２５ｎｇ／ｍｌであり、３増幅サイクル（Ａｍｐ  ３）の第２のシーケンスについては０．０１２〜３ｎｇ／ｍｌであることを示す。第１のシーケンスと第２のシーケンスとの結果を組み合わせることによって、１つのシーケンスによるよりもはるかに広い全範囲（０．０１〜５０ｎｇ／ｍＬ、５０００倍）が得られる。
【００７８】
実施例７：ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰの広範囲プロトコル
ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ校正器をフィンランドのハイテスト（Ｈｙｔｅｓｔ）から入手した。２増幅サイクル（Ａｍｐ  ２）を第２のシーケンスで実施した以外は、実施例５と同様にアッセイを実施した。
【００７９】
データを表２に示す。
【００８０】
【表２】
2015514992.tif 000004
【００８１】
表２の結果は、第１のシーケンスの定量化範囲（１ｓｔ  Ｒｅａｄ）が約０．５６〜１３５ｎｇ／ｍｌであり、２増幅サイクル（Ａｍｐ  ２）での第２のシーケンスについては０．０６〜５．０４ｎｇ／ｍｌである。第１のシーケンスと第２のシーケンスとの結果を組み合わせることによって、１つのシーケンスによるよりもはるかに広い全範囲（０．０６〜１３５ｎｇ／ｍＬ、２２５０倍）が得られることを示す。
【００８２】
工業規格と比較して、Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ＮＴｐｒｏＢＮＰアッセイ範囲は０．０６〜３５ｎｇ／ｍＬ（５８３倍）である。Ｒｏｃｈｅの定量化範囲は本発明のものよりも約４倍低い。
【００８３】
実施例８：ＰＣＴ用の広範囲プロトコル
ＰＣＴ校正器をフィンランドのハイテスト（Ｈｙｔｅｓｔ）から入手した。２増幅サイクル（Ａｍｐ  ２）を第２のシーケンスで実施した以外は、実施例５と同様にしてアッセイを実施した。
【００８４】
データを表３に示す。
【００８５】
【表３】
2015514992.tif 000005
【００８６】
表３の結果は、第１のシーケンスの定量化範囲（１ｓｔ  Ｒｅａｄ）は約４．９〜４００ｎｇ／ｍｌであり、２増幅サイクル（Ａｍｐ  ２）の第２のシーケンスについては０．０６〜１４．８ｎｇ／ｍｌであることを示す。第１のシーケンスと第２のシーケンスとの結果を組み合わせることによって、１つのシーケンスによるよりもはるかに高い全範囲（０．０６〜４００ｎｇ／ｍＬ、６６６７倍）が得られる。
【００８７】
工業規格と比較して、Ｒｏｃｈｅ  Ｃｏｂａｓ  ＰＣＴアッセイ範囲は０．０６〜１００ｎｇ／ｍＬ（１６６７倍）である。Ｒｏｃｈｅの定量化範囲は本発明のものよりも約４倍低い。
【００８８】
本発明、ならびにそれを作製および使用する方法およびプロセスを、本発明の関連する分野の当業者がこれを作製し、使用することが可能になるように、完全、明確、簡潔かつ正確な文言で記載したる。上記の内容は、本発明の好ましい実施形態を記載すること、ならびに特許請求の範囲に記載される本発明の範囲から逸脱することなく変更することができることと理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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