(57)【要約】  本発明は抗原特異的形質芽細胞の濃縮のための方法に関する。該方法は、複数の抗原を認識する希少抗体を含む抗体の同定に有用である。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原に特異性を有する形質芽細胞を濃縮した形質芽細胞の集団を得る方法であって、ドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ることと、該ＰＢＭＣを、ＰＢＭＣ／抗原プレミックスを得るために抗原又はその断片もしくは一部分と接触させることと、該ＰＢＭＣを免疫不全動物の脾臓に移植することと、及び該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することとを含み、その結果抗原に特異性を有する形質芽細胞を濃縮した形質芽細胞の集団を得る、方法。
【請求項２】
ＰＢＭＣの免疫不全動物の脾臓への移植前に、ＰＢＭＣを洗浄して過剰又は非結合抗原をＰＢＭＣ／抗原プレミックスから除去することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ドナーが、抗原又はその一部の断片に予め曝されているドナーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
形質芽細胞の単一細胞選別を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
形質芽細胞の抗原特異的単一細胞選別を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングすることを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗原特異的形質芽細胞を濃縮するための方法であって、ドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ることと、該ＰＢＭＣを、ＰＢＭＣ／抗原プレミックスを得るために少なくとも一種の抗原と接触させることと、該ＰＢＭＣを免疫不全動物の脾臓に移植することと、及び該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することとを含み、その結果抗原特異的形質芽細胞を濃縮する、方法。
【請求項８】
ＰＢＭＣの免疫不全動物の脾臓への移植前に、ＰＢＭＣを洗浄して過剰又は非結合抗原をＰＢＭＣ／抗原プレミックスから除去することを更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ドナーが、抗原又はその一部の断片に予め曝されているドナーである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
形質芽細胞の単一細胞選別を更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
形質芽細胞の抗原特異的単一細胞選別を更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングすることを更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＢＭＣを、複数の異なる抗原と接触させることを更に含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
抗原に特異性を有する抗体を産生することができる形質芽細胞を同定する方法であって、ドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ることと、該ＰＢＭＣを、ＰＢＭＣ／抗原プレミックスを得るために少なくとも一種の抗原と接触させることと、該ＰＢＭＣを免疫不全動物の脾臓に移植することと、該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することと、及び単離された形質芽細胞から抗原特異的細胞を選別することとを含み、その結果抗原特異性を有する抗体を産生できる形質芽細胞を同定する、方法。
【請求項１５】
ＰＢＭＣの免疫不全者の脾臓への移植前に、ＰＢＭＣを洗浄して過剰又は非結合抗原をＰＢＭＣ／抗原プレミックスから除去することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングすることを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
複数の抗原に特異性を有する抗体を産生することができる形質芽細胞を同定する方法であって、ドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ることと、該ＰＢＭＣを、ＰＢＭＣ／抗原プレミックスを得るために複数の異なる抗原と接触させることと、該ＰＢＭＣを免疫不全動物の脾臓に移植することと、該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することと、及び単離された形質芽細胞から抗原特異的細胞を選別することとを含み、その結果抗原特異性を有する抗体を産生できる形質芽細胞を同定する、方法。
【請求項１８】
ＰＢＭＣの免疫不全者の脾臓への移植前に、ＰＢＭＣを洗浄して過剰又は非結合抗原をＰＢＭＣ／抗原プレミックスから除去することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングすることを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１２年１１月１３日に出願された米国仮出願第６１／７２５７６４号の利益を主張し、その全内容は本明細書に参照により援用される。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、その全内容は本明細書に参照により援用される。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１３年１０月２２日に作成され、Ｐ５５００Ｒ１−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、大きさは１５，４５３バイトである。
【０００３】
発明の分野
本発明は抗原特異的形質芽細胞の濃縮のための方法に関する。該方法は、複数の抗原を認識する希少抗体を含む抗体の同定に有用である。
【背景技術】
【０００４】
ヒト免疫グロブリン遺伝子のクローニングを可能にする技術の進歩は、治療可能性を有する希少で機能的なヒトモノクローナル抗体の発見に有効であることが証明されている。しかし、そのような希少なヒト抗体を発見するために使用される方法の多くは、わずかな数の潜在的候補抗体を同定するために、インビトロ培養や、数十万ものヒト形質細胞の選別又はヒト形質細胞からの大ファージディスプレイライブラリー作成などを伴い、しばしば困難である。
【０００５】
希少で機能的なヒトモノクローナル抗体の同定効率を高めるための種々の方法が開発されてきた。無感作ヒト脾細胞のインビトロプライミングと抗原を組み合わせ、続いてこのプライミングした脾細胞を免疫不全マウスに腹腔内又は静脈内移植し、次に追加の抗原でドナーマウスにインビボ追加免疫することによる抗原特異的なＩｇＧ応答が、Ｂｒａｍｓ等から報告されている。（Brams et al., (1998) J Immunology 160:2051-2058；国際出願公開第１９９６／４０２５２号参照。）抗原特異的応答性を高めるための、インビトロ脾臓細胞培養、並びにインビトロ及びインビボ両方での抗原攻撃の必要条件が記述された。その他、ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）を抗原と一緒に直接免疫不全マウスの脾臓に移植した後の抗原選択的ヒトＢ細胞の増殖が報告されている。（Depraetere et al., (2001) J Immunology 166:2929-2936；国際出願公開第１９９９／６０８４６号参照。）
【０００６】
これらの抗体同定技術の進歩にもかかわらず、複数の抗原を認識するモノクローナル抗体を含む希少モノクローナル抗体の同定に有用な、抗原特異的形質芽細胞を濃縮するための方法に対する必要性が存在している。本発明者らは、抗原特異的形質芽細胞の同定に有効な、インビボ形質芽細胞濃縮技術を開発した。ここに記載されるのは、抗原誘導性のインビボ形質芽細胞濃縮技術であり、これらは、抗原特異的細胞の選別と併せて用いられる場合、形質細胞を増殖させたり又はファージディスプレイライブラリーを作成する必要なく、希少で機能的なモノクローナル抗体の同定を効率的且つ高頻度で行うことを可能にする。本発明により提供される方法は、特に、希少抗体の同定に有用である。また、本発明により提供される方法は、特に、複数の抗原に特異性を有する抗体（例えば、モノクローナル抗体）の同定に有用である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、一つには、抗原特異的形質芽細胞を濃縮する方法を提供する。
【０００８】
いくつかの態様において、本発明は、抗原特異的形質芽細胞を濃縮するための方法であって、ドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ることと、該ＰＢＭＣを少なくとも一種の抗原と接触させることと、該ＰＢＭＣを免疫不全動物の脾臓に移植することと、及び該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することとを含み、その結果抗原特異的形質芽細胞を濃縮する、方法を提供する。いくつかの実施態様において、ＰＢＭＣを抗原と接触させた後、且つそれを免疫不全動物の脾臓に移植する前に、過剰又は非結合抗原を除去するため、ＰＢＭＣを洗浄して過剰又は非結合抗原を除去する追加の工程が行われる。いくつかの実施態様において、形質芽細胞から抗原特異的単一細胞を選別する追加の工程が行われる。他の実施態様において、単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングする追加の工程が行われる。
【０００９】
いくつかの態様において、本発明は、抗原特異的形質芽細胞を濃縮するための方法であって、ドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ることと、該ＰＢＭＣを少なくとも一種の抗原と接触させることと、ＰＢＭＣを洗浄して過剰又は非結合抗原を除去することと、該ＰＢＭＣを免疫不全動物の脾臓に移植することと、及び該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することとを含み、その結果抗原特異的形質芽細胞を濃縮する、方法を提供する。いくつかの実施態様において、形質芽細胞から抗原特異的単一細胞を選別する追加の工程が行われる。他の実施態様において、単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングする追加の工程が行われる。
【００１０】
いくつかの態様において、ＰＢＭＣは、予め抗原に曝されたドナーから得られる。したがって、いくつかの態様において、本発明は抗原特異的形質芽細胞を濃縮するための方法であって、予め抗原に曝されたドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ることと、該ＰＢＭＣを抗原又はその断片もしくは一部分と接触させることと、該ＰＢＭＣを免疫不全動物の脾臓に移植することと、及び該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することとを含み、その結果抗原特異的形質芽細胞を濃縮する、方法を提供する。いくつかの実施態様において、ＰＢＭＣを抗原と接触させた後、且つそれを免疫不全動物の脾臓に移植する前に、ＰＢＭＣを洗浄して過剰又は非結合抗原を除去する追加の工程が行われる。いくつかの実施態様において、形質芽細胞から抗原特異的単一細胞を選別する追加の工程が行われる。他の実施態様において、単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングする追加の工程が行われる。
【００１１】
いくつかの態様において、本発明は、抗原を同定又は単離するための方法であって、ドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ることと、該ＰＢＭＣを少なくとも一種の抗原と接触させることと、該ＰＢＭＣを免疫不全動物の脾臓に移植することと、該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することと、及び単離された抗原特異的形質芽細胞を選別することとを含み、その結果抗体を同定又は単離する、方法を提供する。いくつかの実施態様において、ＰＢＭＣを抗原と接触させた後、且つそれを免疫不全動物の脾臓に移植する前に、ＰＢＭＣを洗浄して過剰又は非結合抗原を除去する追加の工程が行われる。いくつかの実施態様において、単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングする追加の工程が行われる。
【００１２】
本方法のいくつかの態様において、ＰＢＭＣを抗原と接触させる工程で使用される抗原は、ドナーが予め曝された抗原と同一抗原（又はその断片もしくは一部分）である。他の実施態様において、ＰＢＭＣを抗原と接触させる工程で使用される抗原は、ドナーが予め曝された抗原とは異なる抗原（該抗原は、例えば、ドナーが予め曝された抗原の変異体、サブタイプ、アイソタイプ、又はホモログ）である。
【００１３】
いくつかの態様において、本発明は、抗原特異性を有する形質芽細胞が濃縮された形質芽細胞の集団を得るための方法であって、ドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ることと、該ＰＢＭＣを抗原又はその断片もしくは一部分と接触させることと、該ＰＢＭＣを免疫不全動物の脾臓に移植することと、及び該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することとを含み、その結果抗原特異性を有する形質芽細胞が濃縮された形質芽細胞の集団を得る、方法を提供する。いくつかの実施態様において、ＰＢＭＣを抗原と接触させた後、且つそれを免疫不全動物の脾臓に移植する前に、ＰＢＭＣを洗浄して過剰又は非結合抗原を除去する追加の工程が行われる。いくつかの実施態様において、濃縮された形質芽細胞の集団は、少なくとも一種の、抗原に対して特異性を有する抗原特異的形質芽細胞を含有する。いくつかの実施態様において、濃縮された形質芽細胞の集団は、少なくとも一種の、抗原に特異的な抗体を産生する、抗原に対して特異性を有する形質芽細胞を含有する。いくつかの実施態様において、形質芽細胞から抗原特異的単一細胞を選別する追加の工程が行われる。他の実施態様において、単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングする追加の工程が行われる。
【００１４】
他の態様において、本発明は、抗原特異性を有する形質芽細胞が濃縮された形質芽細胞の集団を得るための方法であって、予め抗原に曝されたドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ることと、該ＰＢＭＣを抗原又はその断片もしくは一部分と接触させることと、該ＰＢＭＣを免疫不全動物の脾臓に移植することと、及び該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することとを含み、その結果抗原特異性を有する形質芽細胞が濃縮された形質芽細胞の集団を得る、方法を提供する。いくつかの実施態様において、ＰＢＭＣを抗原と接触させた後、且つそれを免疫不全動物の脾臓に移植する前に、ＰＢＭＣを洗浄して過剰又は非結合抗原を除去する追加の工程が行われる。いくつかの実施態様において、濃縮された形質芽細胞の集団は、少なくとも一種の、抗原に対して特異性を有する抗原特異的形質芽細胞を含有する。いくつかの実施態様において、濃縮された形質芽細胞の集団は、少なくとも一種の、抗原に特異的な抗体を産生する、抗原に対して特異性を有する形質芽細胞を含有する。いくつかの実施態様において、形質芽細胞から抗原特異的単一細胞を選別する追加の工程が行われる。他の実施態様において、単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングする追加の工程が行われる。
【００１５】
他の態様において、本発明は、複数の抗原に特異性を有する抗体を産生することができる形質芽細胞を同定する方法であって、ドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得ることと、該ＰＢＭＣを、ＰＢＭＣ／抗原プレミックスを得るために複数の異なる抗原と接触させてＰＢＭＣ／抗原プレミックスを得ることと、該ＰＢＭＣを免疫不全動物の脾臓に移植することと、該免疫不全動物の脾臓から形質芽細胞を単離することと、及び単離された形質芽細胞から抗原特異的細胞を選別することとを含み、その結果抗原特異性を有する抗体を産生できる形質芽細胞を同定する、方法を提供する。いくつかの実施態様において、該方法は、ＰＢＭＣを免疫不全動物の脾臓に移植する前にＰＢＭＣを洗浄して、ＰＢＭＣ／抗原プレミックスから過剰又は非結合抗原を除去することを更に含む。他の実施態様において、該方法は、単離された形質芽細胞から免疫グロブリンをクローニングすることを更に含む。
【００１６】
いくつかの態様において、ＰＢＭＣは、哺乳動物から得られる。いくつかの実施態様において、ＰＢＭＣは、マウス、ラット、ウサギ又はヤギから得られる。他の実施態様において、ＰＢＭＣは、ヒトから得られる。他の態様において、ＰＢＭＣは、非哺乳類動物から得られる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】インビボＳＣＩＤマウスにおける形質芽細胞の分化を示すデータを表す。移植前（０日目と表示）のヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、又は４、７、及び８日目に（ヒトＰＢＭＣの脾臓内注射後）ＳＣＩＤマウスから得られた脾細胞は、Ｂ系細胞と識別するために抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３８で染色された。上方の円、下方の円、及び矩形はそれぞれ、形質芽細胞、活性化された胚中心様細胞、無感作Ｂ細胞を表す。数字は、各サブセットの頻度をパーセントで示している。
【図２Ａ】破傷風ワクチン接種後７日目のヒトドナーＰＢＭＣ（破傷風トキソイド反応性）の典型的断面を示す。
【図２Ｂ】破傷風ワクチン接種されたドナー由来のヒトＰＢＭＣ移植後８日目にＳＣＩＤマウスから得られた脾臓細胞（破傷風トキソイド反応性）の典型的断面を示す。数字は、各サブセットの頻度をパーセントで示している。
【図２Ｃ】各刺激条件下での個々のＳＣＩＤマウスから得られた、各脾臓あたりの破傷風トキソイド反応性細胞の数を示す。１００μｇの破傷風トキソイドを含有するインビボ追加免疫がＳＣＩＤマウスへ腹腔内注射された。ヒトＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ、５０ｇ）並びにＩＬ−２、ＩＬ−６及びＩＬ−２１（各５０ｎｇ）の混合物を含有するサイトカインカクテルが、ＳＣＩＤマウスへ腹腔内（ｉｐ）注射された。
【図３Ａ−３Ｂ】抗ヘマグルチニン陽性形質芽細胞（Ｈ３ヘマグルチニン及びＨ１ヘマグルチニン）のＦＡＣＳ分析のデータで、上枠は、ＳＣＩＤマウス濃縮より前、ワクチン接種後７日目のもの（図３Ａ）、及び、下枠は、ＳＣＩＤマウス濃縮の後、移植後８日目のもの（図３Ｂ）で、抗原プレミックスあり、なしをそれぞれ示す。
【図４】ＰＢＭＣ／抗原プレミックスなし（円）及びＰＢＭＣ／抗原プレミックスあり（四角）の各ＳＣＩＤ／ベージュマウスからＰＢＭＣの脾臓内移植後８日目に得られた脾細胞の分析データを、ヘマグルチニン（Ｈ１）＋／ＣＤ３８ｈｉｇｈ形質芽細胞のパーセントで示す。四角は、Ｈ１＋形質芽細胞を発現したマウスを示す。
【図５】本発明の方法を用いて得られた抗ヘマグルチニン抗体でインフルエンザＡ型のグループ１及びグループ２の種々のウイルス株をインビトロ中和した際のデータを示す。
【図６Ａ−６Ｂ】モノクローナル抗体３９．２９でインフルエンザＡ型のグループ１（図６Ａ）及びグループ２（図６Ｂ）の種々のウイルス株をインビトロ中和した際のデータを示す。
【図７Ａ−７Ｂ】モノクローナル抗体８１．３９でインフルエンザＡ型のグループ１（図７Ａ）及びグループ２（図７Ｂ）の種々のウイルス株をインビトロ中和した際のデータを示す。
【図８Ａ−８Ｄ】インフルエンザＡ型の種々のウイルス株（Ａ／プエルトリコ／８／１９３４（ＰＲ８）、図８Ａ；Ａ／ポート・チャーマーズ／１／１９７３（ＰＣ７３）、図８Ｂ；Ａ／香港／１／１９６８（ＨＫ６８）、図８Ｃ；及びＡ／愛知／２／１９６８（愛知６８）、図８Ｄ）に感染し、様々な量のモノクローナル抗体３９．２９を投与されたマウスの生存率を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、特に、形質芽細胞の抗原特異的な濃縮のための方法を提供する。本方法は、抗原特異的形質芽細胞の迅速な同定及び希少なモノクローナル抗体の効率的な同定のために提供される。
【００１９】
定義
用語「形質芽細胞」は、形質細胞の前駆体である細胞を指す。
【００２０】
用語「脾細胞」は、脾臓内に位置するか、又は膵臓組織から得られる、様々な血液細胞型の何れか一つを指す。
【００２１】
形質芽細胞の「濃縮（「ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ」又は「ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」）」なる用語は、所望の細胞、典型的には、混合した細胞集団に含まれる抗原特異的な細胞の頻度を高めることを指す。したがって、細胞集団（例えば、抗原特異的形質芽細胞）の濃縮は、濃縮工程の結果として、より高い頻度の抗原特異的細胞を有する細胞集団（例えば、抗原特異的形質芽細胞）を包含する。
【００２２】
「末梢血単核細胞」（ＰＢＭＣ）は、リンパ球（Ｔ細胞及びＢ細胞）、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、形質細胞並びに形質芽細胞を含む、球状の核を有する血液細胞を指す。本明細書で用いられる場合、用語「末梢血単核細胞」は、用語「末梢血リンパ球」（ＰＢＬ）と互換的に使用され、それはリンパ球（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞）を含む。
【００２３】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原を結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線形抗体；単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体を含む。
【００２４】
用語「キメラ」抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部分が特定の起源又は種から由来し、一方重鎖及び／又は軽鎖の残りは異なる起源又は種から由来する抗体を指す。
【００２５】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラスがあり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、また、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２に、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩＧＡ１、及びＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００２６】
薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」とは、所望の治療的又予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。
【００２７】
用語「完全長抗体」、「インタクトな抗体」及び「全抗体」は、本明細書中で互換的に使用され、天然型抗体構造と実質的に類似の構造を有するか、又は本明細書で定義されるＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００２８】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が本明細書において含まれる。
【００２９】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生されるか、又はヒト抗体のレパートリーや他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト起源に由来する抗体のそれに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【００３０】
「ヒト化」抗体は、非ヒト超可変領域（ＨＶＲ）由来のアミノ酸残基及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある実施態様において、ヒト化抗体は、少なくとも一つ、典型的には二つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）のすべて又は実質的にすべてが、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてが、ヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、場合によって、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化型」、例えば、非ヒト抗体は、ヒト化を遂げている抗体を指す。
【００３１】
「個体」又は「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、並びにげっ歯類（例えば、マウス及びラット）を含む。ある実施態様において、個体又は被検体はヒトである。
【００３２】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上又は９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007）を参照のこと。
【００３３】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を意味し、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、通常少量存在し得る、例えば、自然発生的な変異を含む、又はモノクローナル抗体製剤の製造時に発生するような、起こり得る変異体抗体を除いて同一であり、且つ／又は同じエピトープに結合する。異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を通常含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。したがって、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含む様々な技術によって作成され、モノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【００３４】
「ネイキッド抗体」とは、異種の部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射性標識にコンジュゲートしていない抗体を指す。ネイキッド抗体は薬学的製剤中に存在してもよい。
【００３５】
「天然型抗体」は、天然に生じる、様々な構造をとる免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然型ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している二つの同一の軽鎖と二つの同一の重鎖から成る約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各重鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、三つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）が続く。同様に、各軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端に、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる、二つのタイプの何れかに割り当てることができる。
【００３６】
用語「添付文書」は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに使用され、このような治療製品の使用に関する指示、使用法、用量、投与、併用療法、禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【００３７】
用語「薬学的製剤」は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被検体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない調製物を指す。
【００３８】
「薬学的に許容される担体」は、被検体に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【００３９】
本明細書で用いられる場合、「治療」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」などその文法上の変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の過程においての何れかで実行され得る。治療の望ましい効果は、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な任意の病理学的帰結の縮小、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善を含む。いくつかの実施態様において、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００４０】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが結合されている別の核酸を運搬することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それらが動作可能なように結合されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【００４１】
一般的方法
本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者にとって既知であり、利用可能である細胞生物学、細胞培養、（組換え技術を含む）分子生物学、微生物学、生化学、及び免疫学の従来技術を用いる。そのような技術は、例えば、Molecular Cloning: A laboratory Manual, 第3版 (Sambrook et al., 2001) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (P. Herdewijn, 編, 2004); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, 編, 1987); Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., 編, 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., 編, 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., 編, 1991); 及びShort Protocols in Molecular Biology (Wiley及びSons, 1999)などの文献に記載されている。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号に記載されている。（また、大腸菌における抗体断片の発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, 248 巻 (B.K.C. Lo, 編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), 245-254頁も参照)
【００４２】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【００４３】
ここに提供されるのは、希少なモノクローナル抗体の同定に有用な方法である。特に、本発明は、抗原特異的形質芽細胞の効率的且つ効果的な同定のための形質芽細胞のインビボ濃縮方法を提供し、その抗原特異的形質芽細胞から、抗体及び該抗体をコードする核酸が単離され得る。形質芽細胞の抗原特異的インビボ濃縮を用いた、希少な抗体（ここで抗体は、希少で機能的なモノクローナル抗体である）の同定及び単離の方法を提供することが、本発明の一態様である。複数の抗原を認識する（例えば、それらに結合する）抗体（例えば、同一抗原の変異体、アイソタイプ、サブタイプかホモログ、もしくは異なる種の同一抗原を認識、又はそれらに結合する）の同定及び単離のための方法を提供することが、本発明の別の態様である。本発明の方法は、ドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得る（例えば、単離する）ことと、該ＰＢＭＣを抗原（本明細書中ではＰＢＭＣ／抗原プレミックスと呼ばれる）と接触させることと、該ＰＢＭＣを（注射、移植、又は他の方法により）免疫不全動物の脾臓内に移植し、注入されたＰＢＭＣが該免疫不全動物の脾臓内に残留するようにすることと、及び該脾臓から抗原特異的形質芽細胞を単離することとを含む。脾臓から形質芽細胞を単離するための方法は当業者にとって周知であり、利用可能な方法である。
【００４４】
いくつかの実施態様において、ＰＢＭＣと抗原の接触はインビトロで実施される。いくつかの実施態様において、ＰＢＭＣ／抗原プレミックス後、且つ該ＰＢＭＣの免疫不全動物の脾臓への移植前に、非結合抗原はＰＢＭＣから洗い流されていない。他の実施態様において、ＰＢＭＣを洗浄して非結合抗原を除去する追加の工程が、ＰＢＭＣ／抗原プレミックス後、且つ該ＰＢＭＣの免疫不全動物の脾臓への移植前に実施される。いくつかの実施態様において、抗原特異的形質芽細胞の脾臓からの単離後、抗原特異的な単一細胞を選別する追加の工程が実施される。他の実施態様において、抗原特異的形質芽細胞の脾臓からの単離後、又は単一細胞の選別後、単離された細胞から免疫グロブリンをクローニングする追加の工程が実施される。
【００４５】
形質芽細胞のインビボ濃縮方法の最適化が、破傷風トキソイド抗原を使用して実施された。これらの試験において、本発明者らは、本明細書に記載の方法を使用して、破傷風トキソイド特異的形質芽細胞の数が増加したことを示した。（実施例１及び２を参照）これらの方法は、インフルエンザＡ型ウイルスのヘマグルチニンに対して特異的な希少形質芽細胞の濃縮及び同定に更に適用された。本発明の形質芽細胞の濃縮方法の使用は、グループ１とグループ２双方のヘマグルチニンに結合するのに効果的なヒトモノクローナル抗体、及び／又はグループ１とグループ２双方のインフルエンザＡ型ウイルス分離株を中和するのに効果的なヒトモノクローナル抗体を含む種々のインフルエンザＡウイルス分離株を結合及び中和するのに効果的なヒトモノクローナル抗体の同定につながる。（実施例３−７を参照）
【００４６】
本方法は、効率的且つ改良された抗原特異的形質芽細胞の濃縮、抗原特異的応答の増加、高親和性及び高機能を有する抗体の同定、並びに複数の抗原を認識する抗体の同定を含むがこれらに限定されない、従来のモノクローナル抗体を同定するための方法に勝る利点を提供する。
【００４７】
本発明の方法は、希少で機能的なモノクローナル抗体同定の効率を高めることにより、従来の方法に勝る更なる利点を提供する。例えば、本方法は、免疫不全動物の脾臓へのＰＢＭＣ移植の時点で、又はその後で、免疫不全動物（例えば、マウス）の目的の抗原（単数又は複数）を用いたインビボ免疫化をせず、効率的である。加えて、本方法は、免疫不全動物の脾臓へのＰＢＭＣ移植の時点で、又はその後で、免疫不全動物に目的の抗原（単数又は複数）を用いた追加免疫をせず、効率的である。更に、本発明の方法は、抗原特異的形質芽細胞を濃縮するために免疫不全動物の脾臓にＰＢＭＣを移植する前に、前記動物を抗ＩＬ−２−Ｒｂ抗体を用いて前処理するなど、免疫不全動物のナチュラルキラー（ＮＫ）  細胞を除去又は殺傷することを伴わない。
【００４８】
（インフルエンザウイルス感染の治療又は予防に使用するための）抗ヘマグルチニン抗体の同定の文脈で、過去の報告には、グループ１とグループ２すべてのインフルエンザＡ型ウイルス分離株に結合又はそれらを中和することが可能なただ一つの抗体を発見するために、約１０４０００個のインビトロ培養ヒト形質芽細胞からヘマグルチニン結合抗体を直接クローニングすることが記載されている。（Corti et al., (2011) Science 333:850-856を参照。）しかし、本明細書に記載される形質芽細胞濃縮方法は、たった８４０個のクローニングされたヒトモノクローナル抗体を選別することで、種々のヘマグルチニンのサブタイプを認識した２０個の抗ヘマグルチニン抗体の同定につながり、これら２０個のうち、４つの抗ヘマグルチニン抗体がグループ１とグループ２の種々のインフルエンザＡ型ウイルス分離株を中和するのに効果があった。
【００４９】
本発明の抗原特異的形質芽細胞濃縮方法は、形質芽細胞及びそれらに対応する、任意の所望の抗原（限定されないが、例えば、破傷風トキソイド、風疹、麻疹、おたふくかぜ、水痘帯状疱疹、トキソプラズマ症、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、パピローマウイルス、酵母、寄生虫（例えば、マラリア）、細菌、ＣＭＶ、ラウス肉腫ウイルス等含む）に対する抗体の同定に有用である。
【００５０】
本方法に使用するためのＰＢＭＣは、抗原特異的な抗体が所望される任意の動物（ドナー）から得ることができる。このような動物は、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ヒト等を含む。いくつかの実施態様において、ＰＢＭＣは例えばヒトなど、哺乳動物から得られる。他の実施態様では、ＰＢＭＣは、抗原に対する免疫応答を誘発（ｉｌｌｉｃｉｔ）するのに十分である少なくとも一種の抗原、感染因子（例えば、細菌もしくはウイルス剤）、又はその一部で予め免疫化されたか、それらに曝されたヒトから得られる。あるいは、ＰＢＭＣは非ヒト動物、特に非ヒト哺乳動物から得られる。したがって、いくつかの実施態様において、ＰＢＭＣは、少なくとも一種の抗原、感染因子、又はその一部で予め免疫化された非ヒト動物から得られる。抗原は、自己又は非自己抗原の何れであってもよい。特定の実施態様において、抗原は、造血組織及びリンパ単球組織（ｌｙｍｐｈｏｍｏｎｃｙｔｉｃ  ｔｉｓｓｕｅ）における抗原特異的形質芽細胞、形質細胞又はＢ細胞の存在につながる、ドナーの免疫応答を誘発することができる。
【００５１】
本方法は、マウス又は他の動物種を含む任意の免疫不全動物に適用され得る。免疫不全動物は、一般的に、異種移植又は同種移植された血中白血球／リンパ球（例えば、ＰＢＭＣ、ＰＢＬ）もしくは脾細胞に対する有効な免疫応答を引き起こす能力が限られているか、或いは欠いている。ある態様において、免疫不全動物は、移植された細胞を拒絶する機能的なＴ細胞又はＢ細胞を持っていない。本方法で使用される免疫不全動物の例は、例えば、ＳＣＩＤ／ベージュマウス、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウス、ヌードマウスなどを含む。
【００５２】
いくつかの態様において、ＰＢＭＣ／抗原プレミックスに使用される抗原は、精製されているか、又は実質的に精製されている抗原である。前記抗原は、組換え技術により産生された抗原（例えば、組換抗原）又は天然の抗原であってもよい。前記抗原は、完全長タンパク質又はポリペプチドであり得るか、或いは例えばタンパク質分解断片のような、タンパク質又はポリペプチドの一部もしくは断片を含む。前記抗原は、人工的な方法で製造された合成タンパク質又はポリペプチドであってもよい。加えて、ＰＢＭＣ／抗原プレミックスに使用される抗原は、一種以上の抗原（例えば、複数の抗原の混合物）を含むことができる。該抗原は、例えば、様々なインフルエンザＡ型ウイルス分離株由来の複数のヘマグルチニンサブタイプのような、複数の抗原の混合物（例えば、ヘマグルチニンサブタイプのグループ１とグループ２）であってもよい。
【００５３】
本方法によるＰＢＭＣ／抗原プレミックス用に使用される抗原の量は様々である。本発明は、ＰＢＭＣ／抗原プレミックス中、Ｂ細胞１００万個あたり抗原約０．１から２μｇが、抗原特異的形質芽細胞の効果的かつ十分な濃縮をもたらしたことを示す例示的なデータを提供する。しかし、本方法は、ＰＢＭＣ／抗原プレミックス中で使用される抗原の量に限られるものではない。一般に、ＰＢＭＣ／抗原プレミックス用に使用される抗原の量は、Ｂ細胞１００万個あたり約０．００１μｇ、０．００５μｇ、０．０１μｇ、０．０５μｇ、０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、０．７５μｇ、１．０μｇ、２μｇ、５μｇ、又は１０μｇ；或いはＢ細胞１００万個あたり約０．００１μｇから１０μｇの範囲である。抗原特異的な形質芽細胞の濃縮のためのＰＢＭＣ／抗原プレミックス用に使用される抗原の量を（常套的実験によって）決定することは、十分に当業者の技術の範囲内である。
【００５４】
本方法によるＰＢＭＣ／抗原プレミックスのための時間は様々である。本発明は、３０分のＰＢＭＣ／抗原プレミックスが、抗原特異的形質芽細胞の効果的かつ十分な濃縮をもたらしたことを示す例示的なデータを提供する。一般に、ＰＢＭＣ／抗原プレミックスのための時間の長さは、約１０分から約１８０分、例えば、約１０分、約１５分、約２０分、約３０分、約４５分、約６０分、約７５分、約９０分、約１２０分、約１５０分、又は約１８０分である。抗原特異的な形質芽細胞の濃縮のためのＰＢＭＣ／抗原プレミックスのための時間の長さを（常套的実験によって）決定することは、十分に当業者の技術の範囲内である。
【００５５】
本方法に従ってＰＢＭＣ／抗原プレミックスが生じる温度は様々である。本発明は、３７℃で（３０分間）ＰＢＭＣ／抗原プレミックスを行うことが抗原特異的形質芽細胞の効果的かつ十分な濃縮をもたらしたことを例として示している。ＰＢＭＣ／抗原プレミックスを行う温度を（常套的実験によって）決定することは、十分に当業者の技術の範囲内である。一般に、温度が低いほどＰＢＭＣ／抗原プレミックスに要する時間が長くなる。例えば、ＰＢＭＣ／抗原プレミックスを３７℃ではなく３０℃で行うと、ＰＢＭＣ／抗原プレミックスに要する時間が３０分以上、例えば、約４５分、約６０分、約９０分などと、長くなる。
【００５６】
いくつかの態様において、ＰＢＭＣ／抗原プレミックスは、完全フロイントアジュバント、ミョウバン、サポニン等のアジュバントの存在又は非存在下で実施され得る。他の知られているアジュバントも、このＰＢＭＣ／抗原プレミックスで用いられ得る。
【００５７】
ＰＢＭＣ／抗原プレミックス工程では、抗原と混合又は接触する細胞の数はいくつでもよい。本方法は、ＰＢＭＣ／抗原プレミックス中で抗原と接触する細胞の数に限られるものではない。抗原特異的な形質芽細胞の濃縮のためのＰＢＭＣ／抗原プレミックス用に使用される細胞の数を（常套的実験によって）決定することは、十分に当業者の技術の範囲内である。
【００５８】
本方法による免疫不全動物の脾臓に移植される細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の数は様々である。本発明は、免疫不全マウスの脾臓に移植された５０ｘ１０６個のＰＢＭＣが、希少抗原に特異的な形質芽細胞同定の成功をもたらしたことを示す例示的なデータを提供する。しかし、本方法は、免疫不全動物の脾臓に移植される細胞の数に限られるものではない。免疫不全動物の脾臓に移植する細胞の数を（常套的実験によって）決定することは、十分に当業者の技術の範囲内である。細胞の数は、一般に、約１ｘ１０５個、約１ｘ１０６個、  約５ｘ１０６個、約１ｘ１０７、約５ｘ１０７個、約１ｘ１０８個、約５ｘ１０８個、約１ｘ１０９個、約５ｘ１０９個、又は約１ｘ１０１０個である。
【００５９】
脾臓内に移植後、移植されたＰＢＭＣを脾臓内に留めておく単離までの時間を様々に割り当てることができる。本発明は、移植されたＰＢＭＣを７日間又は８日間免疫不全動物の脾臓内に留めておくことが、破傷風トキソイド及びヘマグルチニンに対する抗原特異的な形質芽細胞の効果的かつ十分な濃縮をもたらしたことを示す例示的なデータを提供する。移植されたＰＢＭＣを脾臓内に留めておく単離までの時間の長さは、一般に、約４日から約１４日、約７日から約１０日、約７日、又は約８日である。ただし、脾臓内注射後、移植されたＰＢＭＣは、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、又は１４日間以上脾臓内に留まることができる。１４日を超えると、移植されたＰＢＭＣは、マウスのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞に対して攻撃を開始すると予想される。脾臓内移植する細胞の数が少ないほど、移植されたＰＢＭＣは、単離前に脾臓内により長時間留まることが可能になる。ＰＢＭＣが抗原特異的な形質芽細胞の濃縮のための単離の前に脾臓に留まる時間の長さを（常套的実験によって）決定することは、十分に当業者の技術の範囲内である。
【００６０】
いくつかの実施態様において、ＰＢＭＣは一個体のドナーから得られる。他の実施態様において、ＰＢＭＣは複数個体のドナーから得られる。複数個体のドナーから得られるＰＢＭＣは、ＰＢＭＣ／抗原プレミックスの前に、又はＰＢＭＣ／抗原プレミックス後の脾臓内注射の前にプールされるか、或いは混ぜ合わされる。
【００６１】
本方法は、ドナーから得られる抗原特異的な形質芽細胞の濃縮のためのＰＢＭＣ又はＰＢＬの使用に限られるものではない。例えば、脾臓細胞、骨髄細胞、扁桃細胞、リンパ腺から得られる細胞、幹細胞等、形質芽細胞及びＢ細胞の他のドナー細胞源が、本方法に関して使用され得る。例えば、ある態様において脾細胞（すなわち、脾臓細胞）は、本発明による抗原特異的な形質芽細胞の濃縮に使用するためにドナーから得ることができる。脾細胞は、本明細書に記載の方法に従って混合され、インキュベートされ、又は抗原（抗原プレミックス）と接触した一種以上の抗原を用いて免疫化されたマウスから単離され、次に免疫不全動物の脾臓に注射される。抗原プレミックスの前に、脾細胞は、例えばフィコロール分離法等の当業者に周知の方法を用いて、単核細胞（例えば、形質芽細胞、Ｂ細胞等）に濃縮され得る。
【００６２】
本発明は、複数の抗原、又は同一抗原の様々な変異体、分離株、サブタイプもしくはホモログに特異性を有する（例えば、それらを認識又は結合できる）希少形質芽細胞（及び希少Ｂ細胞）（並びにそれらに対するモノクローナル抗体）を同定する効率的か且つ効果的な方法を提供する。一態様において、本発明は、複数の抗原、又は同一抗原の様々な変異体、分離株、サブタイプもしくはホモログを認識できる、或いはそれらに結合できる抗体を産生する、抗原特異的な形質芽細胞を同定するための方法を提供する。本発明は、例えば、インフルエンザＡ型ウイルスのヘマグルチニンサブタイプのグループ１及びグループ２をそれぞれ認識するモノクローナル抗体を含む、ヘマグルチニンに向けられた希少なヒトモノクローナル抗体を同定するための本方法の使用を例として示す。
【００６３】
したがって、本方法は、例えば、同一抗原又は複数の種に由来する相同抗原、同一抗原又は異なる種に由来する相同抗原、同一抗原又は複数の種に共通する相同抗原を認識又は結合するか、或いはそれらに対して特異性を有する抗体（例えば、同一抗原又はヒト及びマウス由来の相同抗原を認識又は結合するか、或いはそれらに対して特異性を有する抗体）のように、同一抗原（例えば、タンパク質、ポリペプチド等）の、一又は複数の様々な変異体、ホモログ、サブタイプもしくはアイソタイプを認識又は結合するか、或いはそれらに対する特異性を有する（例えばモノクローナル抗体、特にヒトモノクローナル抗体のような）抗体を同定するのに有用である。このような抗体は、同一の抗原又は異なる種、サブタイプ、分離株（例えば、ウイルス分離株）、菌株等に由来する相同抗原を認識及び／又はそれらに結合する自身の能力のために、特に有用であるいくつかの実施態様において、本方法は、交差反応性抗体（例えば、非ヒト動物抗原及びヒト抗原を結合又は認識することができる抗体）を同定するために有用である。
【００６４】
本方法によって得られる抗体は、様々な研究、医療、治療（例えば、受動免疫療法）及び診断用途において有用である。
【００６５】
組換え方法及び組成物
本発明の方法を用いて同定される抗体は、例えば米国特許第４８１６５６７号に記載されているような組換え方法及び組成物を用いて製造することができる。例えば、本発明に従って同定された抗体をコードする、単離された核酸分子が単離され得る。このような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び／又は抗体のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードし得る。更なる実施態様において、そのような核酸を含む一又は複数のベクター（例えば、発現ベクター）が提供される。更なる実施態様において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施態様において、宿主細胞は以下を含む（例えば、以下で形質転換されている）：（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一ベクター、及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二ベクター。一実施態様において、宿主細胞は、真核生物細胞、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
【００６６】
抗体の組換え生産のために、抗体（例えば本明細書に記載の方法を使用して同定される抗体）をコードする核酸が単離され、宿主細胞内での更なるクローニング及び／又は発現のために一又は複数のベクターに挿入される。このような核酸は、容易に単離され得、一般的な手順を用いて例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）配列決定され得る。
【００６７】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現に適した宿主細胞は、本明細書に記載の原核生物細胞又は真核細胞を含む。例えば、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要ない場合には、抗体は、細菌内で製造され得る。細菌における抗体断片及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５６４８２３７号、第５７８９１９９号及び第５８４０５２３号を参照。（また、大腸菌における抗体断片発現を説明している、Charlton, Methods in Molecular Biology, 248 巻 (B.K.C. Lo, 編, Humana Press, Totowa, NJ, 2003), 245-254頁も参照）発現の後、抗体は可溶性画分において細菌の細胞ペーストから単離され得、更に精製され得る。
【００６８】
原核生物に加えて、部分的又は完全なヒトのグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、「ヒト化」されたグリコシル化経路を有する真菌及び酵母の株を含む、糸状菌又は酵母のような真核微生物も、抗体をコードするベクターのための適切なクローニング宿主又は発現宿主である。Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 及び Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)参照。
【００６９】
グリコシル化抗体の発現に適した宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）にも由来する。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が含まれる。今まで多数のバキュロウイルス株が同定されているが、これらは特にヨトウガ細胞のトランスフェクションのために、昆虫細胞と併せて使用され得る。
【００７０】
植物細胞培養物を宿主として利用することもできる。例えば、米国特許第５９５９１７７号、第６０４０４９８号、第６４２０５４８号、第７１２５９７８号及び第６４１７４２９号（遺伝子組み換え植物における抗体産生に関するＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載）を参照。
【００７１】
脊椎動物細胞もまた宿主として用いることができる。例えば、懸濁液中で増殖するように適合した哺乳動物細胞株は有用であり得る。他の有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胎児腎臓株（例えば、Graham et al., J. Gen Virol. 36: 59 (1977)に記載の２９３又は２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)に記載のＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞（例えば、Mather et al., Annals N. Y Acad. Sci. 383: 44-68 (1982)に記載）；ＭＲＣ  ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な補注動物宿主細胞株は、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞(Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))；並びにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０等のミエローマ細胞株を含む。抗体産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki 及びWu, Methods in Molecular Biology, 248巻 (B.K.C. Lo, 編., Humana Press, Totowa, NJ), 255-268頁 (2003)を参照。
【実施例】
【００７２】
以下は本発明の方法および組成物の例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得る。
【００７３】
実施例１．形質芽細胞の濃縮及び増殖
以下の実験は、ＳＣＩＤ／ベージュマウスへのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の脾臓内移植後のＰＢＭＣの増殖及び分化の影響を評価するために実施された。
【００７４】
正常なヒトドナーのロイコパック（ｌｅｕｋｏｐａｃ）をＢｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｃｉｆｉｃ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から得た。標準的方法を用い、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をロイコパックから単離した。６−８週齢の雌ＳＣＩＤ／ベージュマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）より購入し、全米実験動物協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の動物ケアガイドライン（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）に従い、ジェネンテック社にて収容、飼養した。実験研究はすべて、ジェネンテック実験動物研究施設内の動物管理使用委員会（ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の承認の下、ＡＡＡＬＡＣｉ（国際実験動物ケア評価認証協会）認定施設内で、実験動物のケアと使用に関する指針及び関連法令、規則に従って実施された。健康なヒトドナー由来のロイコパック又は血液は、書面によるインフォームド・コンセントが提出され、欧米の治験審査委員会（ｔｈｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）の倫理的承認を得た後、採取された。
【００７５】
６−８週齢の雌ＳＣＩＤ／ベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に、セシウム１３７線源を使用し、吸収線量３５０ラドで半致死的に照射した。照射後７日間、飲料水にポリミキシンＢ（１１０ｍｇ／Ｌ）及びネオマイシン（１．１ｇ／Ｌ）を添加した。照射の４時間後、各マウスの左わき腹を剪毛し、Ｂｅｔａｄｉｎｅ（登録商標）（Ｐｕｒｄｕｅ  Ｐｈａｒｍａ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ）及び７０％アルコールで前処理した。無菌の外科的手順を用い、麻酔下の外科手技が実施された。各マウスの肋骨境界腺の真下の皮膚が１センチ切開され、続いて腹壁と腹膜の切開が行われた。各マウスの膵臓が注意深く露出され、ＰＢＳ３０μＬに再懸濁された５０×１０６ヒトＰＢＭＣが注射された。切り込みは、５−ＯＶｉｃｒｙｌ（登録商標）縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ，  Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）を使用して筋層で、外科用ステープラーを使用して皮膚で閉じられた。マウスは移植後８日目に屠殺され、脾臓が収集された。
【００７６】
脾臓細胞の単一細胞懸濁液が、Ｂ系統細胞を区別するための抗ヒトｍＡｂ（ＣＤ３８  ＰＥＣｙ７，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ；及びＣＤ１９）のカクテルで染色された。
【００７７】
図１はインビボＳＣＩＤマウスにおける形質芽細胞分化の結果を示す。移植前（０日目と表示されている）のＰＢＭＣ、又はＳＣＩＤマウスから（ヒトＰＢＭＣの脾臓内注射後）４、７及び８日目に得られた脾細胞が染色され、Ｂ系統細胞を区別するための抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３８を用いて選別された。上方の円、下方の円、及び矩形はそれぞれ、形質芽細胞、活性化された胚中心様細胞、無感作Ｂ細胞を示す。数字は、各サブセットの頻度をパーセントで示している。図１に示すように、ヒト形質芽細胞は、五千万個のヒトＰＢＭＣ移植後８日目に脾臓細胞集団の総数の約４０％にまで増殖した。
【００７８】
実施例２．破傷風毒素特異的なヒト形質芽細胞の濃縮
採血７日前にＤＴ（ジフテリアトキソイド及び破傷風トキソイド）ワクチンを受けた正常なヒトドナー由来のロイコパックを、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｃｉｆｉｃ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から得た。標準的方法を用い、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をロイコパックから単離した。６−８週齢の雌ＳＣＩＤ／ベージュマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）より購入し、全米実験動物協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の動物愛護ガイドライン（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）に従い、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社にて飼養、保管した。実験研究はすべて、ジェネンテック実験動物研究の施設内動物管理使用委員会（ｔｈｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｌａｂ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）の承認の下、ＡＡＡＬＡＣｉ（国際実験動物ケア評価認証協会）認定施設内で、実験動物のケアと使用に関する指針及び関連法令、規則に従って実施された。健康なドナー由来のロイコパック又は血液は、書面によるインフォームド・コンセントが提出され、欧米の治験審査委員会（ｔｈｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）の倫理的承認を得た後、採取された。
【００７９】
抗原誘導性のインビボ形質芽細胞濃縮及び増殖は、ＰＢＭＣの脾臓内移植を用いて以下の通り実施された。上記の通り得られた、単離されたＰＢＭＣは、破傷風トキソイド（ＴＴ）（Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）で各百万個のＢ細胞に対して０．１-２μｇで再懸濁され、３７℃で３０分間インキュベートされた（ＰＢＭＣ／抗原プレミックス）。ＰＢＭＣ／抗原プレミックスに続き、ＰＢＭＣを優しく洗浄し、脾臓内注射に先立って過剰又は非結合抗原を除去した。この一連の実験において、ＰＢＭＣの一部は、破傷風毒素特異的な形質芽細胞の濃縮の程度に対する抗原プレミックスの効果を比較するため、脾臓内注射前に抗原プレミックスに全く曝されることがなかった。
【００８０】
６−８週齢の雌ＳＣＩＤ／ベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に、セシウム１３７線源を使用し、吸収線量３５０ラドで半致死的に照射した。照射後７日間、飲料水にポリミキシンＢ（１１０ｍｇ／Ｌ）及びネオマイシン（１．１ｇ／Ｌ）が添加された。照射の４時間後、各マウスの左わき腹を剪毛し、Ｂｅｔａｄｉｎｅ（登録商標）（Ｐｕｒｄｕｅ  Ｐｈａｒｍａ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ）及び７０％アルコールで前処理した。無菌の外科的手順を用い、麻酔下の外科手技が実施された。各マウスの肋骨境界腺の真下の皮膚が１センチ切開され、続いて腹壁と腹膜の切開が行われた。各マウスの膵臓が注意深く露出され、ＰＢＳ３０μＬに再懸濁された５０×１０６ヒトＰＢＭＣが注射された。切り込みは、５−ＯＶｉｃｒｙｌ（登録商標）縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）を使用して筋層で、外科用ステープラーを使用して皮膚で閉じられた。抗原特異的な細胞の選別実験のために、移植後８日目にマウスを屠殺し、その膵臓を収集した。
【００８１】
脾臓細胞の単一細胞懸濁液は、ヒトＩｇＧ＋形質芽細胞をＣＤ３８ｈｉｇｈＩｇＧ＋発現として明らかにする抗ヒトｍＡｂ（ＣＤ３８  ＰＥＣｙ７，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ；及びＩｇＧ  Ｄｙｌｉｇｈｔ，Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ））のカクテルで染色された。破傷風トキソイド反応性形質芽細胞は、ｒＴＴｃ．ＰＥ（破傷風毒素断片Ｃ、Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｐｂｅｌｌ，ＣＡ）、及び形質細胞内にある膜貫通タンパク質である、ヒトｐ６３を認識するマウスモノクローナル抗体ＶＳ３８ｃ−ＦＩＴＣ（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）で染色することによって同定された。
【００８２】
次いで試料を、ヨウ化プロピジウムの存在下で死細胞を排除してＡｒｉａ高速セルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で解析し、抗破傷風毒素特異的形質芽細胞を、単一細胞方式で選別して５％低ＩｇＧウシ胎児血清で補充した５０μｌのＲＰＭＩ細胞培地を含む９６ウェル組織培養ブレートに入れた。（Ｇｉｂｃｏ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）。五百万個の生細胞のすべての解析プロファイルが記録された。プロファイルは、Ｆｌｏｗｊｏ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．４．１１ソフトウェアで解析された。
【００８３】
ＳＣＩＤ／ベージュレシピエントの脾臓内移植の際、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）が急速に増殖し、Ｂ細胞活性化を行い、ヒト形質芽細胞に分化した。具体的には、ＴＴ抗原プレミックスに曝されなかったヒト形質芽細胞は、五千万個のヒトＰＢＭＣ移植後８日目に脾臓細胞集団の総数の約４０％にまで増殖した。
【００８４】
この工程が抗原特異的形質芽細胞を濃縮するために改善され得るかを決定するためには、脾臓内注射（ＰＢＭＣ／抗原プレミックス）に先立って抗原結合を介してＢ細胞レセプター複合体に生存シグナルを送るために、破傷風ワクチンを接種したヒトドナー由来のＰＢＭＣを破傷風トキソイドと共にインキュベートした。この技術は、移植前に抗原と共にインキュベートされなかった細胞に比べて、破傷風トキソイドに結合するモノクローナル抗体を産生する形質芽細胞の濃縮が２０倍になった。
【００８５】
図２Ａは、ワクチン接種後７日目のヒトドナー抗ＴＴ＋ＰＢＭＣの典型的なプロファイルを示す。図２Ｂは、脾臓内移植後８日目のＳＣＩＤマウスの脾臓から採取された抗ＴＴ＋細胞の典型的プロファイルを示す。図２Ｃは、表示されている各刺激条件下での個々のマウスの脾臓あたりの抗ＴＴ＋細胞の定量を示す。ヒトＢＡＦＦ（５０μｇ）と、ＩＬ−２、ＩＬ−６及びＩＬ−２１（各５０ｎｇ）の混合物を含有するサイトカインカクテルをｈＳＣＩＤマウスに腹腔内注射した。
【００８６】
図２に示すように、試験された全条件のうち、本明細書に記載の方法を用いたＰＢＭＣ／抗原プレミックスにおいて、最多の抗ＴＴ＋形質芽細胞数が観察された。これらの結果は、破傷風トキソイドワクチン接種ドナー由来のＰＢＭＣを使用したインビトロＰＢＭＣ／抗原プレミックスが、ＳＣＩＤ／ベージュレシピエントにおいて破傷風毒素抗原特異的形質芽細胞の濃縮をもたらしたことを示す。
【００８７】
実施例３．インフルエンザＡウイルスヘマグルチニン特異的ヒト形質芽細胞の濃縮
採血の７日前に季節性インフルエンザワクチンＦｌｕｖｉｒｉｎ（登録商標）（ノバルティス  ロット＃１１１７９６Ｐ１）を接収した正常ヒトドナー由来のロイコパックをＢｌｏｏｄ  Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｃｉｆｉｃ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）より得た。標準的方法を用い、末梢単核細胞（ＰＢＭＣ）をロイコパックから単離した。６−８週齢の雌ＳＣＩＤ／ベージュマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）より購入し、全米実験動物協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）の動物愛護ガイドライン（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）に従い、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社にて飼養、保管した。実験研究はすべて、ジェネンテック実験動物研究の施設内動物管理使用委員会の承認の下、ＡＡＡＬＡＣｉ（国際実験動物ケア評価認証協会）認定施設内で、実験動物のケアと使用に関する指針及び関連法令、規則に従って実施された。健康なヒトドナー由来のロイコパック又は血液は、書面によるインフォームド・コンセントが提出され、欧米の治験審査委員会（ｔｈｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）の倫理的承認を得た後、採取された。
【００８８】
抗原誘導性のインビボ形質芽細胞濃縮及び増殖は、ＰＢＭＣの脾臓内移植を用いて以下の通り実施された。単離されたＰＢＭＣをヘマグルチニン抗原（Ｂ細胞１００万個毎に０．１−２μｇ）で再懸濁させ、３７℃で３０分間インキュベートした  （ＰＢＭＣ／抗原プレミックス）。このインキュベーションに続き、ＰＢＭＣを洗浄して非結合抗原を除去した。交差反応性ヘマグルチニン抗体を産生した形質芽細胞を濃縮するために、ＰＢＭＣ／抗原プレミックス及び単一細胞選別用に使用されるヘマグルチニン抗原変異体が、インフルエンザワクチンＦｌｕｖｉｒｉｎ（登録商標）中に含有されるヘマグルチニン抗原変異体とは異なるように、特に選択された。したがって、本試験で使用されるヘマグルチニン抗原は、インフルエンザＡウイルス分離株  Ａ／ＮＷＳ／１９３３のヘマグルチニンＨ１（インフルエンザＡウイルスグループ１のヘマグルチニン）、インフルエンザＡウイルス分離株  Ａ／香港／８／１９６８のヘマグルチニンＨ３（インフルエンザＡウイルスグループ２のヘマグルチニン）、及びインフルエンザＡウイルス分離株  Ａ／オランダ／２１９／２００３のヘマグルチニンＨ７（インフルエンザＡウイルスグループ２のヘマグルチニン）を含む。これらのヘマグルチニン抗原は、標準的な分子生物学の手法を用いてジェネンテックにて作製された。
【００８９】
６−８週齢の雌ＳＣＩＤ／ベージュマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ，ＣＡ）に、セシウム１３７線源を使用し、吸収線量３５０ラドで半致死的に照射した。照射後７日間、飲料水にポリミキシンＢ（１１０ｍｇ／Ｌ）及びネオマイシン（１．１ｇ／Ｌ）が添加された。照射の４時間後、各マウスの左わき腹を剪毛し、Ｂｅｔａｄｉｎｅ（登録商標）（Ｐｕｒｄｕｅ  Ｐｈａｒｍａ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ）及び７０％アルコールで前処理した。無菌の外科的手順を用い、麻酔下の外科手技が実施された。各マウスの肋骨境界腺の真下の皮膚が１センチ切開され、続いて腹壁と腹膜の切開が行われた。各マウスの膵臓が注意深く露出され、ＰＢＳ３０μＬに再懸濁された５０×１０６ヒトＰＢＭＣが注射された。切り込みは、５−ＯＶｉｃｒｙｌ（登録商標）縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ，Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ，ＮＪ）を使用して筋層で、外科用ステープラーを使用して皮膚で閉じられた。抗原特異的な細胞の選別実験のために、移植後８日目にマウスを屠殺し、その膵臓を収集した。
【００９０】
マウスから得た脾臓細胞の単一細胞懸濁液は、ヒトＩｇＧ＋形質芽細胞をＣＤ３８ｈｉｇｈＩｇＧ＋発現として明らかにする抗ヒトモノクローナル抗体ＣＤ３８  ＰＥＣｙ７（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）及びＩｇＧ  Ｄｙｌｉｇｈｔ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）のカクテルで染色された。単離された脾臓細胞の懸濁液中のヘマグルチニン交差反応性形質芽細胞を同定するために、該脾臓細胞は、インフルエンザウイルスＡ分離株  Ａ／ＮＷＳ／１９３３のヘマグルチニンＨ１、及びインフルエンザウイルスＡ分離株  Ａ／香港／８／１９６８のヘマグルチニンＨ３で染色された。尚、これらの分離株はＬｉｇｈｔｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（登録商標）標識キット（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）を使用して、予めＦＩＴＣ又はＰＥとそれぞれコンジュゲートされていた。
【００９１】
図３Ａは、ワクチン接種後７日目、ＳＣＩＤ／ベージュマウス濃縮前（すなわち、ＰＢＭＣ／抗原プレミックス前）のＰＢＭＣの抗ヘマグルチニン陽性（Ｈ３及びＨ１）形質芽細胞の典型的なＦＡＣＳ解析を示す。図３Ｂは、プレミックスなし（上枠）、及び抗原プレミックス（下枠）と比較した、移植後８日目、ＳＣＩＤ／ベージュマウス濃縮後のヘマグルチニン陽性（Ｈ３及びＨ１）形質芽細胞の典型的なＦＡＣＳデータ解析を示す。図３Ａ及び３Ｂが示すように、脾臓内移植前ＰＢＭＣ／抗原プレミックスは、Ｈ３＋／Ｈ１＋抗ヘマグルチニン反応性形質芽細胞を高頻度にもたらした。
【００９２】
以下の表１は、本明細書に記載のＳＣＩＤ濃縮前後での、抗Ｈ１＋／抗Ｈ３＋形質芽細胞の頻度を比較したものである。表１に示されるように、抗Ｈ１＋／抗Ｈ３＋形質芽細胞の頻度は、ＳＣＩＤ／ベージュマウス濃縮なしで観察されるものと比較して、本発明のＳＣＩＤ／ベージュマウス濃縮方法使用時に大きく上昇した。
【００９３】
2015536145.tif 000003
【００９４】
次いで試料を、ヨウ化プロピジウムの存在下で死細胞を排除してＡｒｉａ高速セルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で解析し、抗ヘマグルチニン特異的形質芽細胞を、単一細胞方式で選別して５％低ＩｇＧウシ胎児血清で補充した５０μｌのＲＰＭＩ細胞培地を含む９６ウェル組織培養プレートに入れた（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）。五百万個の生細胞のすべての解析プロフィールが記録された。プロファイルは、Ｆｌｏｗｊｏ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．４．１１ソフトウェアで解析された。
【００９５】
図４は、プレミックスなし（円）と抗原プレミックスあり（四角）とを比較した、確率応答を示す各ＳＣＩＤ／ベージュマウスからの、移植後８日目の脾細胞の解析を示す。データは、抗Ｈ１＋／ＣＤ３８ｈｉｇｈ形質芽細胞をパーセントで示している。矩形は、抗Ｈ１＋形質芽細胞を示したマウスを表す。
【００９６】
これらの結果は、インフルエンザＡウイルスのグループ１（例えば、Ｈ１）及びグループ２（例えば、Ｈ３、Ｈ７）ヘマグルチニン抗原を脾臓内移植前にＰＢＭＣと共にインキュベートした場合、ヘマグルチニン交差反応性がある広範な形質芽細胞が検出されたことを示す。これらの結果は、インフルエンザワクチン接種ドナーのヘマグルチニン抗原刺激ＰＢＭＣのインビトロ刺激が、ＳＣＩＤ／ベージュマウスレシピエントにおける形質芽細胞のヘマグルチニン抗原特異的濃縮を促進したことを更に示す。
【００９７】
実施例４．単一形質芽細胞からのＩｇＧクローニング
ヘマグルチニンＨ１及びＨ３交差反応性ヒト形質芽細胞（上に記載）は単一細胞選別され、約９５０個の形質芽細胞となった。単一形質芽細胞を、５％低ＩｇＧウシ胎児血清含有ＲＰＭＩを５０μｌ含むＵ字底型９６ウェルマイクロウェルプレートに直接入れた。該プレートを６００ｘｇで５分間遠心分離し（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）、培地を吸引により注意深く除去した。細胞を再懸濁させ、同じ手順に従い、ＰＢＳ  ９０μｌ中で二回洗浄した。
【００９８】
可変重鎖及び可変軽鎖をコードするｃＤＮＡ生成のため、各細胞を、ＲＮａｓｅｏｕｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）２ユニット、４ｄＮＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）０．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  １．５ｍＭ、ＫＣｌ  ３７．５ｍＭ、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）  １０ｍＭ、ノニデットＰ４０（ＵＳ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｍａｒｂｌｅｈｅａｄ，ＭＡ）  ０．２５％、ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）  ０．１ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ８．３トリス  ２５ｍＭ、０．２５ｐｍｏｌのＩｇＧ１−４の定常領域、カッパ鎖定常領域及びラムダ鎖定常領域に特異的なオリゴヌクレオチド（下記）、並びにＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）４０ユニットを含有する６μｌの逆転写酵素（ＲＴ）反応混合液に再懸濁させた。
【００９９】
ＩｇＧ１−４定常：GAAGTAGTCCTTGACCAGGCAG（配列番号１）
カッパ定常：CTCAGCGTCAGGGTGYTGCTGAG（配列番号２）
ラムダ定常：GGGTKTGGTSGTCTCCAC（配列番号３）
【０１００】
反応物を３０分おきに３回、それぞれ４５℃、５０℃、５５℃でインキュベートした。インキュベーションに続いて、反応混合物をＴＥ緩衝液（１０ｍｍ  トリス  ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）で１５μｌに希釈した。２μｌの上記希釈ＲＴカクテルとＡｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  ２  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を製造業者の示す手順に従って使用して最初のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施し、ＩｇＧ重鎖、カッパ鎖及びラムダ鎖を増幅させた。ＰＣＲ増幅は、以下に示す可変重鎖及び可変軽鎖の生殖細胞系配列並びに定常領域配列に基づく縮重オリゴヌクレオチドを使用して実施された。
ＩＧＶＨ１ａＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣ（配列番号４）
ＩＧＶＨ１ｂＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣ（配列番号５）
ＩＧＶＨ２ＣＡＧＧＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣ（配列番号６）
ＩＧＶＨ３ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧ（配列番号７）
ＩＧＶＨ４ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＣＧＧＧＣＣＣ（配列番号８）
ＩＧＶＨ５ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧ（配列番号９）
ＩＧＶＨ６ＣＡＧＧＴＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＡＧＧＴＣＣ（配列番号１０）
ＩＧＶＨ７ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＡＴＣＴＧＧ（配列番号１１）
ＩＧＫＶ１ＧＨＣＡＴＣＣＲＧＷＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号１２）
ＩＧＫＶ２ＧＡＴＲＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＹＣＡＧＷＣＴＣ（配列番号１３）
ＩＧＫＶ３ＧＡＡＡＴＷＧＴＲＷＴＧＡＣＲＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号１４）
ＩＧＫＶ４ＧＡＣＡＴＣＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ（配列番号１５）
ＩＧＫＶ５ＧＡＡＡＣＧＡＣＡＣＴＣＡＣＧＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号１６）
ＩＧＫＶ６ＧＡＷＲＴＴＧＴＧＭＴＧＡＣＷＣＡＧＴＣＴＣ（配列番号１７）
ＩＧＬＶ１ＣＡＧＴＣＴＧＴＧＹＴＧＡＣＫＣＡＧＣＣＲＣＣＣＴＣ（配列番号１８）
ＩＧＬＶ２ＣＡＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＴ（配列番号１９）
ＩＧＬＶ３ＴＣＣＴＡＴＧＡＧＣＴＧＡＣＷＣＡＧＳＨＶＣＣＣＫＣ（配列番号２０）
ＩＧＬＶ４ＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＲＴＣＶＣＣＣＴＣ（配列番号２１）
ＩＧＬＶ５ＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＡＣＴＴＣ（配列番号２２）
ＩＧＬＶ６ＡＡＴＴＴＴＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣ（配列番号２３）
ＩＧＬＶ７ＣＡＧＧＣＴＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＡＧＧＡＧＣＣＣ（配列番号２４）
ＩＧＬＶ８ＣＡＧＡＣＴＧＴＧＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣ（配列番号２５）
ＩＧＬＶ９ＣＡＧＣＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号２６）
ＨＣ３０１．５定常ＧＣＡＧＣＣＣＡＧＧＧＣＳＧＣＴＧＴＧＣ（配列番号２７）
カッパ１０２定常ＧＣＡＣＡＣＡＡＣＡＧＡＧＧＣＡＧＴＴＣＣＡＧ（配列番号２８）
ラムダ２０２定常ＣＴＴＧＲＡＧＣＴＣＣＴＣＡＧＡＧＧＡＧ（配列番号２９）
【０１０１】
重鎖及び軽鎖ＰＣＲ増幅反応はそれぞれ次の二つの反応に分かれる：重鎖ファミリー  ＶＨ．１、２、３（プライマー  ＩＧＶＨ１ａ、ＩＧＶＨ１ｂ、ＩＧＶＨ２、ＩＧＶＨ３）とＶＨ．４、５、６、７（プライマー  ＩＧＶＨ４、ＩＧＶＨ５、ＩＧＶＨ６及びＩＧＶＨ７）；カッパ鎖ファミリー  ＶＫ．１、２、３（プライマー  ＩＧＫＶ１、ＩＧＫＶ２及びＩＧＫＶ３）とＶＫ．４、５、６（プライマー  ＩＧＶＫ４、ＩＧＶＫ５及びＩＧＶＫ６）；並びにラムダ鎖ファミリー  ＶＬ．１、２、３、４、５（ＩＧＬＶ１、ＩＧＬＶ２、ＩＧＬＶ３、ＩＧＬＶ４及びＩＧＬＶ５）とＶＬ．６、７、８、９（プライマー  ＩＧＬＶ６、ＩＧＬＶ７、ＩＧＬＶ８及びＩＧＬＶ９）。温度循環のためにタッチダウンＰＣＲ増幅手順が用いられた。
【０１０２】
この反応に続いて、ＰＣＲ増幅産物を、エキソヌクレアーゼ１（Ｅｘｏ）及びエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）で処理し、過剰なヌクレオチドやプライマーを各ＰＣＲ増幅反応から除去した（Ｕ．Ｓ．  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，  Ｍａｒｂｌｅｈｅａｄ，ＭＡ）。最初のＰＣＲ増幅産物を、重鎖及び軽鎖両方の可変配列を決定するために、サンガー配列決定を用いて直接配列決定した。入れ子形式の第２次ＰＣＲ増幅は、哺乳動物のシグナルと定常領域クローニング配列を以下のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて挿入するために、生殖細胞系列が一致した重鎖可変及び軽鎖可変オリゴヌクレオチドを用いて実施された。
【０１０３】
sVH1a:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGG(配列番号30)
sVH2:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGATCACCT(配列番号31)
sVH3vv:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAG(配列番号32)
sVH3gl:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAGG(配列番号33)
sVH4:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTGCAGCTGCAGG(配列番号34)
sVH5:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAGGTGCA(配列番号35)
sVH6:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTACAGC(配列番号36)
sVH7:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGTGCA(配列番号37)
sVK1:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTG(配列番号38)
sVK2:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGATATTGTGATGACTCAGTCTCACTCTCCCTGC  (配列番号39)
sVK3:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTG(配列番号40)
sVK4:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGACATCGTGATGACCCAGTCTCCAGACTCCCTGGCTGTG(配列番号41)
sVK5:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAACGACACTCACGCAGTCTCCAGC(配列番号42)
sVK6:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGACTTTCG(配列番号3)
sVL1:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGTCTGTGYTGACKCAGCCRCCCTC(配列番号44)
sVL2:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGTCTGCCCTGACTCAGCCT(配列番号45)
sVL3:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCATCCTATGAGCTGACWCAGSHVCCCKC(配列番号46)
sVL4:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGCCTGTGCTGACTCARTCVCCCTC(配列番号47)
sVL5:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGCCTGTGCTGACTCAGCCAACTTC(配列番号48)
sVL6:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCAAATTTTATGCTGACTCAGCCCCAC(配列番号49)
sVL7:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGGCTGTGGTGACTCAGGAGCCC(配列番号50)
sVL8:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGACTGTGGTGACCCAGGAGCC(配列番号51)
wVL9:
CCACCATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACTGGAGTACATTCACAGCCTGTGCTGACTCAGCCACC(配列番号52)
重鎖定常:GCCAGGGGGAAGACCGATG(配列番号53)
カッハ゜定常:CTGGGATAGAAGTTATTCAGCAGGCACACAACAGAAGCAGTTCCAGATTTCAACTGCTC(配列番号54)
ラムタ゛定常:CTTGRAGCTCCTCAGAGGAG(配列番号29)
【０１０４】
ＰＣＲ増幅反応は、製造者の推奨に従い、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｗｉｔｈ  ＧＣ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を使用して設定した。ＰＣＲ増幅反応に続き、増幅産物を上記のＥｘｏ／ＳＡＰで処理した。ＰＣＲ増幅産物をコードする重鎖可変及び軽鎖可変を、制限エンドヌクレアーゼ除去手順を使用して哺乳動物発現ベクターに挿入した。キュンケル突然変異誘発法を用いて、ＰＣＲ増幅産物２０μｌをＩｇＧ１、カッパ鎖及びラムダ鎖の一本鎖ＤＮＡヒト鋳型にアニールした。(Kunkel (1985) PNAS 82:488-492参照。）正しく挿入された構築物がＤＮＡ配列決定により確認された。重鎖及び軽鎖をコードする核酸を含有するプラスミドを、一過性発現のためのＦｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を用いて２９３Ｔヒト胎児性腎臓細胞にコトランスフェクトし、発現及び結合について以下の実施例５に記載の通り解析した。
【０１０５】
実施例５．ヘマグルチニンＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイ
本発明の方法を用いて得られた各モノクローナル抗ヘマグルチニン抗体が種々のヘマグルチニンサブタイプに結合する能力を、ＥＬＩＳＡによって次の通り調べた。種々のヘマグルチニン発現プラスミドが、上記２９３Ｔ細胞にトランスフェクトされた。これらには、Ｈ１Ｎ１／サウスカロライナ／１９１８インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニンＨ１、Ｈ３Ｎ２／パース／２００９インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニンＨ３、Ｈ５Ｎ１／ベトナム／２００４インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニンＨ５、及びＨ７Ｎ７／オランダ／２００３インフルエンザＡウイルスのヘマグルチニンＨ７が含まれた。２日後、細胞を５０ｍＭのトリス（ｐＨ８）、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００プラスプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）に溶解した。核を遠心分離により取り除き、得られた溶解物を−８０℃で保存した。
【０１０６】
ＥＬＩＳＡスクリーニング用に、ＰＢＳ中のガランサス・ニバリスのレクチン（Ｓｉｇｍａ）５μｇ／ｍｌで３８４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ）をコーティングした。このプレートを洗浄し、次いで種々の発現ヘマグルチニンを含有する細胞溶解物の希釈液でコーティングした。このプレートを洗浄し、抗ヘマグルチニン抗体の種々の希釈液で、次にヤギ抗ヒトＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ）でインキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）基質検出のための処理をした。
【０１０７】
約９５０個の形質芽細胞が上記実施例２に記載の単一細胞選別から得られた。このうち、８４０個のモノクローナル抗体が２９３Ｔ細胞において一時的に発現され、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５及びＨ７ヘマグルチニンサブタイプへの結合についてＥＬＩＳＡによりスクリーニングされ、結果としてインフルエンザＡウイルスグループ１又は２のヘマグルチニンに結合した８２個のモノクローナル抗体、並びにインフルエンザＡウイルスグループ１及び２のヘマグルチニンに結合した２０個のモノクローナル抗体が得られた。
【０１０８】
実施例６．インビトロインフルエンザＡウイルスの中和
本発明の方法を用いて同定された抗ヘマグルチニン抗体の、広範なヘマグルチニンサブタイプへの結合、並びにインフルエンザＡグループ１及びグループ２ウイルス分離株パネルのインビトロ中和を引き起こす能力を下記の通り調べた。
【０１０９】
ＭＤＣＫ細胞は、９６-ウェル黒透明底イメージングプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ３９０４）中、均一の２５％コンフルエントな単層として、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地中で増殖した。各インフルエンザＡウイルスのサブタイプ／菌株をインフルエンザ培地（ＤＭＥＭ＋０．２％ＢＳＡ、２μｇ／ｍｌ  ＴＰＣＫで処理したトリプシン）中で感染多重度（ＭＯＩ）１に希釈し、各抗体の濃度を変えて（０．０２ｎＭから１６００ｎＭの範囲）３７℃で１時間インキュベートした。各抗体／インフルエンザウイルス混合物を、５％ＣＯ２インキュベーター内３７℃で１６時間、冷１００％エタノールでの細胞固定の前にＭＤＣＫ細胞に感染させた。次いで固定した細胞をＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，カタログ＃Ｈ３５７０）で染色し、細胞核を視覚化し、総細胞数を決定した。細胞を、インフルエンザＡウイルス核タンパク質に特異的な、広範囲反応性のモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  カタログ＃ＭＡＢ８２５８）でも染色し、感染細胞数を決定した。
【０１１０】
細胞はＩｍａｇｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｍｉｃｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して撮像され、データ画像はＭｅｔａＸｐｒｅｓｓ  ３．１ソフトウェアを使用して解析された。感染細胞の割合を決定し、Ｘ軸上のｌｏｇ１０の抗体濃度に対してＹ軸上にプロットした。すべての中和アッセイを３重測定で完了した。データは、非線形回帰用量応答曲線を用いて適合させ、９５％信頼区間（９５％ＣＩ）でのＩＣ５０値がｎＭ単位で図５に示されている。
各インフルエンザＡウイルス菌株のヘマグルチニン（ＨＡ）サブタイプが図５に示されている。
【０１１１】
インフルエンザＡグループ１及びグループ２ウイルス株の広範なパネルに対して、様々な濃度の本明細書に記載のモノクローナル抗体を用いて、インビトロ中和用量応答曲線を作成した。図６Ａ及び６Ｂは、インフルエンザＡグループ１及びグループ２ウイルス株のパネルに対するｍＡｂ  ３９．２９の中和曲線をそれぞれ示す。図６Ａ及び６Ｂが示すように、ｍＡｂ  ３９．２９は、試験されたすべてのインフルエンザＡウイルス株のインビトロ中和に有効であった。加えて、図７Ａ及び７Ｂは、インフルエンザＡグループ１及びグループ２ウイルス株のパネルに対するｍＡｂ８１．３９の中和曲線をそれぞれ示す。図７Ａ及び７Ｂが示すように、ｍＡｂ８１．３９は、試験されたすべてのインフルエンザＡウイルス株のインビトロ中和に有効であった。
【０１１２】
これらの結果から、本発明の方法を用いて同定された抗ヘマグルチニン抗体が種々のインフルエンザＡウイルス株に対して中和活性を示したことがわかる。とりわけ、二つの抗ヘマグルチニン抗体（ｍＡｂ  ３９．２９及びｍＡｂ  ８１．３９）が、インフルエンザＡウイルス株のグループ１（Ａ／ＣＡ／７／２００９、Ａ／ブリズベン／５９／２００７、Ａ／ソロモン／３／２００６、Ａ／ニューカレドニア（Ｎｅｗ  Ｃａｌｄｏｎｉａ）（Ｃａｌｅｄｏｎｉａ？）／２０／１９９９、Ａ／プエルトリコ／８／１９３４、Ａ／日本／３０５／１９５７）及びグループ２（Ａ／ビクトリア／３６１／２０１１、Ａ／パース／１６／２００９、Ａ／ブリズベン／１０／２００７、Ａ／ウィスコンシン／６７／２００５、Ａ／ビクトリア  ３／１９７５、Ａ／ポート・チャーマーズ／１／１９７３、Ａ／香港／８／１９６８、Ａ／愛知／２／１９６８）両方の中和を含む全インフルエンザＡウイルス株の中和に有効であった。
【０１１３】
まとめると、これらの結果は、本発明の抗原特異的な形質芽細胞濃縮技術の使用が、複数の抗原に特異性を有する（つまり、種々のヘマグルチニンのサブタイプに特異性を有する）モノクローナル抗体の同定をもたらしたことを示した。加えて、これらの結果は、本明細書に記載の形質芽細胞濃縮技術により、インフルエンザＡウイルス株のグループ１とグループ２両方の中和が可能なモノクローナル抗体を、わずか９５０個の分離された形質芽細胞から同定することが可能になったことを示した。
【０１１４】
実施例７．マウスにおけるｍＡｂ  ３９．２９のインビボ有効性
本発明の方法を使用して得られた抗ヘマグルチニン抗体の特性を更に明らかにした。ｍＡｂ  ３９．２９（ｍＡｂ  ３９．２９  ＮＣ  ｖ１）の、マウスにおけるインフルエンザＡウイルス感染に対するインビボ有効性試験が以下の通り実施された。ＤＢＡ／２Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を、インフルエンザ培地（ＤＭＥＭ、０．２％  ＢＳＡ、２μｇ／ｍＬ  ＴＰＣＫで処理したトリプシン）中、最小ＬＤ１００量に希釈した種々のインフルエンザＡウイルス株５０μに経鼻感染させた。マウス当たり４０ＰＦＵで使用したＨ１Ｎ１  Ａ／プエルトリコ／８／１９３４（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ；ＩＣ５０  ２．０ｎＭ）；マウス当たり３ＰＦＵで使用したＨ３Ｎ２  Ａ／香港／１／１９６８（ＶｉｒａＰｕｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ＩＣ５０  ４５．１ｎＭ）；マウス当たり１．５ｘ１０４ＰＦＵで使用したＨ３Ｎ２  Ａ／ポート・チャーマーズ／１／１９７３  （ＶｉｒａＰｕｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ＩＣ５０  ２．２ｎＭ）；及びマウス当たり２ｘ１０２ＰＦＵで使用したＨ３Ｎ２  Ａ／愛知／２／１９６８（ＶｉｒａＰｕｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；ＩＣ５０  ３５ｎＭ）を含む、様々なインビトロＩＣ５０値を示す４つの異なるインフルエンザＡウイルス株が、この一連の実験で使用された。ｍＡｂ  ３９．２９の静脈内投与に先立って、インフルエンザウイルス感染を７２時間進行させた。
【０１１５】
インフルエンザウイルス感染後７２時間後、２００μｌ  ＰＢＳ中９００μｇ／マウス（約４５ｍｇ／ｋｇ）、３００μｇ／マウス（約１５ｍｇ／ｋｇ）、及び１００μｇ／マウス（約５ｍｇ／ｋｇ）の種々の用量でｍＡｂ  ３９．２９をマウスへ静脈投与した。コントロール処置した動物には、ｍＡｂ  ｇＤ５２３７（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の糖タンパク質Ｄに特異的なモノクローナル抗体）を、ｍＡｂ  ３９．２９の試験した最高用量と同等の用量（すなわち、約４５ｍｇ／ｋｇ）で投与した。感染後２１日目まで、マウスの体調と生存を毎日モニターし、体重も毎日測定した。４つすべてのインフルエンザＡウイルス株感染における、ｍＡｂ  ３９．２９全用量対コントロールは、ログランク検定でＰ＜０．０１であった。
【０１１６】
図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ及び８Ｄは、インフルエンザＡウイルスＡ／プエルトリコ／８／１９３４、Ａ／ポート・チャーマーズ／１／１９７３、Ａ／香港／１／１９６８及びＡ／愛知／２／１９６８にそれぞれ感染してから７２時間後に種々の量のｍＡｂ  ３９．２９を投与されたマウスの生存率（経時、日単位）を示す。図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ及び８Ｄが示すように、コントロール抗体を投与された感染マウスにおいて、１４日目までに１００％の死亡率が観察された。しかし、本発明のモノクローナル抗体を投与された感染マウスでは、生存率が増加した。特に、インフルエンザウイルスＡ／ポート・チャーマーズ／１／１９７３又はインフルエンザウイルスＡ／愛知／２／１９６８に感染したマウスにおける試験された３９．２９の全用量で、１００％の生存率が観察された。（図８Ｂ及び８Ｄ参照。）
【０１１７】
これらの結果は、本発明の方法に従って得られたモノクローナル抗体は、種々のインフルエンザＡウイルスのサブタイプの感染を治療するのに有効であることを示した。
【０１１８】
前述の発明は、明確性と理解の目的のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明されてきたが、これらの説明や例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての特許及び科学文献の開示は、その内容全体が出典明示により援用される。
【図１】
2015536145.tif 000004
【図２Ａ】
2015536145.tif 000005
【図２Ｂ】
2015536145.tif 000006
【図２Ｃ】
2015536145.tif 000007
【図３Ａ】
2015536145.tif 000008
【図３Ｂ】
2015536145.tif 000009
【図４】
2015536145.tif 000010
【図５】
2015536145.tif 000011
【図６Ａ】
2015536145.tif 000012
【図６Ｂ】
2015536145.tif 000013
【図７Ａ】
2015536145.tif 000014
【図７Ｂ】
2015536145.tif 000015
【図８】
2015536145.tif 000016
【配列表】
2015536145000001.app
【国際調査報告】
2015536145.tif 000017
2015536145.tif 000018
2015536145.tif 000019
2015536145.tif 000020
2015536145.tif 000021
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