(57)【要約】本発明は、所望のポリヌクレオチドを植物ゲノムに安定に組み込むための方法に関連し、その方法は、標的配列を認識するように設計されたＴＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第一のベクターによって植物材料を形質転換する工程；（ｉ）プロモーターに作動可能に連結されていないマーカー遺伝子（「プロモーターフリーマーカーカセット」）であって、標的配列と相同な配列を含むマーカー遺伝子；および（ｉｉ）所望のポリヌクレオチドを含む第二のベクターで植物材料を形質転換する工程；ならびに所望のポリヌクレオチドが安定に組み込まれた、形質転換された植物材料を同定する工程を含む。
2015534834.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望のポリヌクレオチドを植物ゲノム中に安定に組み込む方法であって、以下：
（Ａ）標的配列を認識するように設計されたＴＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第一のベクターにより植物材料を形質転換する工程；
（Ｂ）第二のベクターにより該植物材料を形質転換する工程であって、該第二のベクターは、（ｉ）プロモーターに作動可能に連結されていないマーカー遺伝子（「プロモーターフリーマーカーカセット」）であって、該標的配列と相同な配列を含むマーカー遺伝子；および（ｉｉ）所望のポリヌクレオチドを含む、工程；ならびに
（Ｃ）該所望のポリヌクレオチドが安定に組み込まれた、形質転換された植物材料を同定する工程、
を含む、方法。
【請求項２】
前記形質転換された植物材料は、形質転換された前記植物中の前記マーカー遺伝子の存在または不存在を反映する条件に曝露される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マーカー遺伝子は除草剤抵抗性遺伝子であり、そして、前記形質転換された植物材料は除草剤に曝露される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記除草剤耐性遺伝子はＡＬＳ遺伝子である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記プロモーターフリーマーカーカセットは前記植物ゲノム中に安定に組み込まれる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
植物中への外因性ＤＮＡの標的型挿入の方法であって、以下の工程：
（ｉ）（Ａ）プロモーターレスカセットを含む第一のバイナリーベクターであって、該プロモーターレスカセットは（ｂ）Ｕｂｉ７イントロン５’−非翻訳領域の部分配列に連結された（ａ）右側境界配列；（ｃ）変異型アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子と融合されたＵｂｉ７単量体コード配列；（ｄ）所望のヌクレオチド配列；および（ｅ）ターミネーター配列を含み、該所望のヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結されていない、第一のバイナリーベクター；および
（Ｂ）（ａ）右側境界；（ｂ）フォワード発現カセットおよびリバース発現カセットであって、各々が強力で構成的なプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された改変ＴＡＬエフェクターを含む、フォワード発現カセットおよびリバース発現カセット；および（ｃ）イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）をコードする配列を含む第二のバイナリーベクターであって、該改変ＴＡＬエフェクターはポテトのユビキチン−７（Ｕｂｉ７）遺伝子のイントロン内の該所望のヌクレオチド配列に結合するように設計される、第二のバイナリーベクターによって、単離された植物細胞を形質転換する工程；ならびに
（ｉｉ）該単離された植物細胞を、該所望のヌクレオチド配列を発現する植物の成長を促進するような条件下で培養する工程を含み、
ここで、ベクター骨格のＤＮＡは該植物ゲノム中に恒久的に挿入されない、方法。
【請求項７】
前記改変ＴＡＬエフェクターは（ａ）Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼ触媒ドメインを含む短縮Ｃ−末端活性化ドメイン；（ｂ）前記Ｕｂｉ７の５’−非翻訳イントロン配列と対応する１６．５回の反復可変二残基を含むコドン最適化された標的配列結合ドメイン；および（ｃ）ＳＶ４０核局在化配列を含むＮ−末端領域を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記所望のポリヌクレオチド配列は、アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）、ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）、および液胞インベルターゼ（Ｉｎｖ）遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を標的とするサイレンシングカセットである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記第一のバイナリーベクターは、ネイティブのプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された疫病抵抗性遺伝子Ｖｎｔ１をさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
形質転換された植物であって、そのゲノム中に、外因性ターミネーター配列に作動可能に連結された所望の外因性ヌクレオチド配列に作動可能に連結された内因性Ｕｂｉ７プロモーターを含む、形質転換された植物。
【請求項１１】
アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）、ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）、および液胞インベルターゼ（Ｉｎｖ）遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の発現がダウンレギュレートされる、請求項１０に記載の形質転換された植物。
【請求項１２】
前記植物は疫病抵抗性遺伝子Ｖｎｔ１をさらに発現する、請求項１１に記載の形質転換された植物。
【請求項１３】
前記植物は塊茎を有する植物である、請求項１２に記載の形質転換された植物。
【請求項１４】
前記塊茎を有する植物はポテト植物である、請求項１３に記載の形質転換された植物。
【請求項１５】
前記植物は、疫病抵抗性、黒斑傷耐性、低温誘導性甘味化の低減および塊茎中のアスパラギンレベルの低減の１つ以上により特徴づけられる表現型を有する、請求項１４に記載の形質転換された植物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の形質転換された植物の熱加工製品。
【請求項１７】
前記製品はフレンチフレイ、チップ、クリスプ、ポテト、乾燥ポテトまたは焼きポテトである、請求項１６に記載の熱加工製品。
【請求項１８】
前記熱加工製品は、同種の形質転換されていない植物の熱加工製品よりも低いレベルのアクリルアミドを有する、請求項１７に記載の熱加工製品。
【請求項１９】
所望の配列に結合するように設計された改変ＴＡＬエフェクターであって、（ａ）触媒ドメインを含む短縮Ｃ−末端活性化ドメイン；（ｂ）コドン最適化された標的配列結合ドメイン；および（ｃ）核局在化配列を含むＮ−末端領域を含む、改変ＴＡＬエフェクター。
【請求項２０】
前記改変ＴＡＬエフェクターはポテトのユビキチン−７（Ｕｂｉ７）遺伝子のイントロン内の前記所望の配列に結合するように設計される、請求項１９に記載の改変ＴＡＬエフェクター。
【請求項２１】
（ａ）前記Ｃ−末端活性化ドメイン中の前記触媒ドメインは、Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼを含み；（ｂ）前記標的配列結合ドメインは、Ｕｂｉ７の５’−非翻訳イントロン配列と対応する１６．５回の反復可変二残基を含み；そして（ｃ）前記Ｎ−末端領域中の前記核局在化配列はＳＶ４０核局在化配列である、請求項２０に記載の改変ＴＡＬエフェクター。
【請求項２２】
（ａ）右側境界；（ｂ）フォワード発現カセットおよびリバース発現カセットであって、各々が強力で構成的なプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された請求項１６に記載の改変ＴＡＬエフェクターを含む、フォワード発現カセットおよびリバース発現カセット；ならびに（ｃ）イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）をコードする配列を含むバイナリーベクター。
【請求項２３】
プロモーターレスカセットを含むＤＮＡコンストラクトであって、該プロモーターレスカセットは、（ｂ）Ｕｂｉ７の５’−非翻訳イントロン部分配列に連結された（ａ）右側境界配列；（ｃ）変異型アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子と融合されたＵｂｉ７単量体コード配列；（ｄ）所望のヌクレオチド配列；（ｅ）ターミネーター配列；および（ｆ）左側境界を含み、該所望のヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結されていない、ＤＮＡコンストラクト。
【請求項２４】
前記所望のヌクレオチド配列は、アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）、ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）、および液胞インベルターゼ（Ｉｎｖ）遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を標的とするサイレンシングカセットである、請求項２３に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項２５】
前記ＤＮＡコンストラクトは、ネイティブのプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された疫病抵抗性遺伝子Ｖｎｔ１をさらに含む、請求項２４に記載のＤＮＡコンストラクト。
【請求項２６】
植物への外因性のＤＮＡの標的型挿入のためのキットであって、以下：
（Ａ）プロモーターレスカセットを含む第一のバイナリーベクターであって、該プロモーターレスカセットは、（ｂ）Ｕｂｉ７イントロン５’−非翻訳領域の部分配列に連結された（ａ）右側境界配列；（ｃ）変異型アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子と融合されたＵｂｉ７単量体コード配列；（ｄ）所望のヌクレオチド配列；および（ｅ）ターミネーター配列を含み、該所望のヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結されていない、第一のバイナリーベクター；ならびに
（Ｂ）（ａ）右側境界；（ｂ）フォワード発現カセットおよびリバース発現カセットであって、各々が強力で構成的なプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された改変ＴＡＬエフェクターを含む、フォワード発現カセットおよびリバース発現カセット；および（ｃ）イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）をコードする配列を含む第二のバイナリーベクターであって、該改変ＴＡＬエフェクターは、ポテトのユビキチン−７（Ｕｂｉ７）遺伝子のイントロン内の該所望のヌクレオチド配列に結合するように設計される、第二のバイナリーベクター
を含む、キット。
【請求項２７】
前記改変ＴＡＬエフェクターは、（ａ）Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼ触媒ドメインを含む短縮Ｃ−末端活性化ドメイン；（ｂ）Ｕｂｉ７の５’−非翻訳イントロン配列と対応する１６．５回の反復可変二残基を含むコドン最適化された標的配列結合ドメイン；および（ｃ）ＳＶ４０核局在化配列を含むＮ−末端領域を含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記所望のヌクレオチド配列は、アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）、ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）、および液胞インベルターゼ（Ｉｎｖ）遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を標的とするサイレンシングカセットである、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記第一のバイナリーベクターは、ネイティブのプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された疫病抵抗性遺伝子Ｖｎｔ１をさらに含む、請求項２８に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１３年３月１５日に出願された米国仮特許出願第６１／７９０４３４号、および２０１２年１１月２０日に出願された米国仮特許出願第６１／７２８４６６号の優先権を主張し、両出願はその全体が本明細書において参考として援用される。
【０００２】
本発明の分野
本発明は植物バイオテクノロジーの分野に関連し、そして所望の形質を有する植物および植物産物の生産のための標的型（ｔａｒｇｅｔｅｄ）トランスファーＤＮＡ挿入の方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
植物は、ＤＮＡセグメントをそのゲノム中に挿入することによって改変することができる。加えられるＤＮＡは、タンパク質をコードするＲＮＡ、または特定のネイティブＲＮＡの分解を引き起こすＲＮＡのいずれかを産生するように再編成された遺伝エレメントを含有する。先行技術は、非標的型（ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｅｄ）（予測できない、およびランダムな）挿入をもたらす様々な最適ではない方法を教示する。
【０００４】
当該分野では、所望の形質を有する遺伝子操作された植物および植物産物の効率的および再現可能な生産についての必要性が存在する。トランスジェニック形質の使用に伴う課題は錯綜しており、これは特に重要な質的問題が従来の育種によっては効果的に対処されていないためである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の１つの局面は、所望のポリヌクレオチドを植物ゲノム中に安定に組み込むための方法であって、該方法は以下を包含する：
（Ａ）標的配列を認識するように設計されたＴＡＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第一のベクターによって植物材料を形質転換する工程；
（Ｂ）（ｉ）プロモーターに作動可能に連結されていないマーカー遺伝子（「プロモーターフリーマーカーカセット」）であって、標的配列と相同な配列を含むマーカー遺伝子；および（ｉｉ）所望のポリヌクレオチドを含む第二のベクターによって植物材料を形質転換する工程；ならびに
（Ｃ）所望のポリヌクレオチドが安定に組み込まれた、形質転換された植物材料を同定する工程。
【０００６】
１つの実施態様では、形質転換された植物材料は、形質転換された植物中のマーカー遺伝子の存在または不存在を反映するような条件に曝露される。他の実施態様では、マーカー遺伝子は除草剤耐性遺伝子であり、そして形質転換された植物材料は除草剤に曝露される。１つの実施態様では、除草剤耐性遺伝子はＡＬＳ遺伝子である。他の実施態様では、プロモーターフリーマーカーカセットは安定に植物ゲノム中に組み込まれる。
【０００７】
他の実施態様では、本発明は植物への外因性ＤＮＡの標的挿入のための方法を提供し、該方法は以下の工程を包含する、
（ｉ）（Ａ）プロモーターレスカセットを含む第一のバイナリーベクターであって、該プロモーターレスカセットは（ｂ）Ｕｂｉ７イントロン５’−非翻訳領域の部分配列に連結された（ａ）右側境界配列；（ｃ）変異型アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子と融合されたＵｂｉ７単量体コード配列；（ｄ）所望のヌクレオチド配列；および（ｅ）ターミネーター配列を含み、該所望のヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結されていない、第一のバイナリーベクター；ならびに（ａ）右側境界；（ｂ）強力で構成的なプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された改変ＴＡＬエフェクターをそれぞれ含むフォワード発現カセットおよびリバース発現カセット；および（ｃ）サイトカイニン産生に関係する酵素（例えば、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ））をコードする配列を含む第二のバイナリーベクターであって、該改変ＴＡＬエフェクターはポテト（ｐｏｔａｔｏ）のユビキチン−７（Ｕｂｉ７）遺伝子のイントロン内の所望のヌクレオチド配列に結合するように設計される、（Ｂ）第二のバイナリーベクターによって、単離された植物細胞を形質転換する工程；ならびに
（ｉｉ）該単離された植物細胞を、該所望のヌクレオチド配列を発現する植物の成長を促進するような条件下で培養する工程；
ここで、ベクター骨格のＤＮＡは植物ゲノム中に恒久的に挿入されるものではない、工程。
【０００８】
本発明の好ましい局面では、改変ＴＡＬエフェクターは、（ａ）Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼ触媒ドメインを含む短縮Ｃ−末端活性化ドメイン；（ｂ）Ｕｂｉ７の５’−非翻訳イントロン配列と対応する１６．５回の反復可変二残基を含むコドン最適化された標的配列結合ドメイン；および（ｃ）ＳＶ４０核局在化配列を含むＮ−末端領域を含む。
【０００９】
本発明のさらなる好ましい局面では、所望のヌクレオチド配列は、アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）、ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）、および液胞インベルターゼ（Ｉｎｖ）遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を標的とするサイレンシングカセットである。本発明のさらになお好ましい局面では、第一のバイナリーベクターはさらに、ネイティブのプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された疫病（ｌａｔｅ  ｂｌｉｇｈｔ）抵抗性遺伝子Ｖｎｔ１を含む。
【００１０】
異なる実施態様では、本発明は、外因性ターミネーター配列に作動可能に連結された所望の外因性ヌクレオチド配列に作動可能に連結された内因性Ｕｂｉ７プロモーターをそのゲノム中に含む形質転換された植物を提供する。本発明の１つの局面では、形質転換された植物中のアスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）、ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）、および液胞インベルターゼ（Ｉｎｖ）遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の発現は、ダウンレギュレートされる。本発明の好ましい局面では、植物はさらに疫病抵抗性遺伝子Ｖｎｔ１を発現する。
【００１１】
１つの実施態様では、形質転換される植物は塊茎を有する植物である。好ましい実施態様では、塊茎を有する植物はポテト植物である。好ましくは、形質転換された植物は、疫病抵抗性、黒斑傷耐性、低温誘導性甘味化の低減および塊茎中のアスパラギンレベルの低減の１つ以上によって特徴づけられる表現型を有する。
【００１２】
また他の実施態様では、本発明は、本発明の形質転換された植物の熱加工製品を提供する。好ましくは、熱加工製品はフレンチフライ、チップ、クリスプ、ポテト、乾燥ポテトまたは焼きポテトである。本発明の好ましい局面では、熱加工製品は、同種の形質転換されていない植物の熱加工製品よりも低いレベルのアクリルアミドを有する。
【００１３】
異なる実施態様では、本発明は、（ａ）触媒ドメインを含む短縮Ｃ−末端活性化ドメイン；（ｂ）コドン最適化された標的配列結合ドメイン；および（ｃ）核局在化配列を含むＮ−末端領域を含む、所望の配列に結合するように設計された改変ＴＡＬエフェクターを提供する。本発明の好ましい局面では、改変ＴＡＬエフェクターは、ポテトのユビキチン−７（Ｕｂｉ７）遺伝子のイントロン中の所望の配列に結合するように設計される。したがって、改変ＴＡＬエフェクターは、（ａ）Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼを含むＣ−末端活性化ドメイン中の触媒ドメイン；（ｂ）Ｕｂｉ７の５’−非翻訳イントロン配列と対応する１６．５回の反復可変二残基を含む標的配列結合ドメイン；および（ｃ）Ｎ−末端領域中のＳＶ４０核局在化配列を含む。
【００１４】
また他の実施態様では、本発明は、（ａ）右側境界；（ｂ）フォワード発現カセットおよびリバース発現カセットであって、各々が強力で構成的なプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された請求項１６に記載の改変ＴＡＬエフェクターを含む、フォワード発現カセットおよびリバース発現カセット；および（ｃ）サイトカイニン産生に関係する酵素（例えば、イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ））をコードする配列を含むバイナリーベクターを提供する。
【００１５】
また他の実施態様では、本発明は、プロモーターレスカセットを含むＤＮＡコンストラクトであって、該プロモーターレスカセットは（ｂ）Ｕｂｉ７の５’−非翻訳イントロン部分配列に連結された（ａ）右側境界配列；（ｃ）変異型アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子と融合されたＵｂｉ７単量体コード配列；（ｄ）所望のヌクレオチド配列；（ｅ）ターミネーター配列；および（ｆ）左側境界を含み、該所望のヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結されていない、ＤＮＡコンストラクトを提供する。本発明の好ましい局面では、ＤＮＡコンストラクト中の所望のヌクレオチド配列は、アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）、ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）、および液胞インベルターゼ（Ｉｎｖ）遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を標的とするサイレンシングカセットである。さらになお好ましい局面では、ＤＮＡコンストラクトはさらに、ネイティブのプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された疫病抵抗性遺伝子Ｖｎｔ１を含む。
【００１６】
異なる実施態様では、本発明は植物への外因性ＤＮＡの標的型挿入のためのキットを提供し、該キットは以下を包含する：プロモーターレスカセットを含む第一のバイナリーベクターであって、該プロモーターレスカセットは（ｂ）Ｕｂｉ７イントロン５’−非翻訳領域の部分配列に連結された（ａ）右側境界配列；（ｃ）変異型アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子と融合されたＵｂｉ７単量体コード配列；（ｄ）所望のヌクレオチド配列；および（ｅ）ターミネーター配列を含み、該所望のヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結されていない、（Ａ）第一のバイナリーベクター；ならびに（ａ）右側境界；（ｂ）フォワード発現カセットおよびリバース発現カセットであって、各々が強力で構成的なプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された改変ＴＡＬエフェクターを含む、フォワード発現カセットおよびリバース発現カセット；および（ｃ）イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）をコードする配列を含む（Ｂ）第二のバイナリーベクター。本発明の好ましい局面では、改変ＴＡＬエフェクターは、ポテトのユビキチン−７（Ｕｂｉ７）遺伝子のイントロン中の所望のヌクレオチド配列に結合するように設計され、そして（ａ）Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼ触媒ドメインを含む短縮Ｃ−末端活性化ドメイン；（ｂ）Ｕｂｉ７の５’−非翻訳イントロン配列と対応する１６．５回の反復可変二残基を含むコドン最適化された標的配列結合ドメイン；および（ｃ）ＳＶ４０核局在化配列を含むＮ−末端領域を含む。本発明の他の好ましい局面では、所望のヌクレオチド配列は、アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）、ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）、および液胞インベルターゼ（Ｉｎｖ）遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を標的とするサイレンシングカセットである。本発明のさらになお好ましい局面では、第一のバイナリーベクターはさらに、ネイティブのプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された疫病抵抗性遺伝子Ｖｎｔ１を含む。
【００１７】
上記の概略の説明および下記の詳細な説明は、代表的および説明的であり、特許請求される本発明のさらなる説明を提供することを意図するものである。他の目的、利点および新規な特徴は、下記の本発明の詳細な説明から当業者には一見して明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
図面の簡単な説明
本出願はカラーで制作された少なくとも１つの図面を含む。
【００１９】
【図１】図１は、プラスミドｐＳＩＭ２１６８のトランスファーＤＮＡの構成を図解している。下部のパネルに示された配列は、２５ｂｐのハイライトされていない右側境界から始まる。薄いグレーにハイライトされた配列はＵｂｉ７イントロンの部分であり、濃いグレーにハイライトされた配列はＵｂｉ７単量体であり、そして残りのハイライトされていない配列はポテトＡＬＳ遺伝子コーディングの部分である。ｐＳＩＭ２１６８のＵｂｉ７Ｉｎセグメントは、ＴＡＬによって選択的に切断される内因性イントロン配列と相同な相同性アームを含む。
【００２０】
【図２】図２は、ベクターｐＳＩＭ２１７０中のフォワード（Ｅ３）およびリバース（Ｅ４）のＴＡＬエフェクターカセットを図解している。
【００２１】
【図３】図３は、実施例９で説明される右側境界試験カセットを示している。
【００２２】
【図４】図４は、Ｕｂｉ７：：ＡＬＳカセットを運搬するプラスミドｐＳＩＭ２１６２のＤＮＡ構成を図解している。
【００２３】
【図５】図５は、フォワード（５Ａ）およびリバース（５Ｂ）のエフェクタータンパク質の構成を示している。
【００２４】
【図６】図６は、ＧＵＳレポーター遺伝子の開始コドンからすぐ下流に位置するフォワードおよびリバースの認識部位を含む標的配列を運搬するプラスミドｐＳＩＭ２１６の構成を図解している。
【００２５】
【図７】図７は、アグロバクテリウム侵入（ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に続くＮｉｃｏｔｈｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉のＧＵＳ染色を示している。左のパネル：標的ベクターｐＳＩＭ２１６７のみでの侵入。右のパネル；標的ベクターｐＳＩＭ２１６７およびＴＡＬエフェクターベクターｐＳＩＭ２１７０での侵入。
【００２６】
【図８】図８は、ＴＡＬエフェクターベクターｐＳＩＭ２１７０と共侵入させた後の、ＰＣＲ増幅されたプラスミドｐＳＩＭ２１６７の標的領域の配列を示している。エフェクター認識部位はグレーにハイライトされている。標的配列の改変は、小さな欠失（多数形態）および置換（濃いグレーにハイライトされる）である。
【００２７】
【図９Ａ】図９は、標的型挿入特異的ＰＣＲからのフラグメントの配列を示す。最初のハイライトされていない配列および最初の薄いグレーにハイライトされた配列は、ポテトゲノムの配列である。ハイライトされていない配列：Ｕｎｉ７−ｌｉｋｅプロモーターの部分；薄いグレーにハイライトされた配列：Ｕｎｉ７−ｌｉｋｅイントロン。残りの配列はｐＳＩＭ２１６８ベクターからのものである。濃いグレーの配列：Ｕｂｉ７イントロンの部分；ハイライトされていない配列：Ｕｂｉ７単量体；薄いグレーにハイライトされた配列：ＡＬＳコード配列の部分。
【００２８】
【図９Ｂ】図９は、標的型挿入特異的ＰＣＲからのフラグメントの配列を示す。最初のハイライトされていない配列および最初の薄いグレーにハイライトされた配列は、ポテトゲノムの配列である。ハイライトされていない配列：Ｕｎｉ７−ｌｉｋｅプロモーターの部分；薄いグレーにハイライトされた配列：Ｕｎｉ７−ｌｉｋｅイントロン。残りの配列はｐＳＩＭ２１６８ベクターからのものである。濃いグレーの配列：Ｕｂｉ７イントロンの部分；ハイライトされていない配列：Ｕｂｉ７単量体；薄いグレーにハイライトされた配列：ＡＬＳコード配列の部分。
【００２９】
【図１０】図１０は、チメンチンおよび０．０ｍｇ／ｌイマザモックス（左のパネル）もしくは２．０ｍｇ／ｌイマザモックス（右のパネル）を含有するホルモンフリーの培地内で育てられる節間移植片を示している。節間移植片がイマザモックスを含有する培地中で育てられた場合、完全に発達した正常なシュートは見られなかった。
【００３０】
【図１１】図１１は、病害の症状を発症させるためにＰ．  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ疫病系統ＵＳ８ＢＦ６によって攻撃感染された、感染の７日後のＲａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔコントロール（ＲＲ−Ｃ）系統、ならびに標的型挿入のためのｐＳＩＭ２１７０およびｐＳＩＭ２１６８プラスミドによって共形質転換された除草剤耐性Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ系統を示している。
【００３１】
【図１２】図１２は、標的型挿入のためのｐＳＩＭ２１７０およびｐＳＩＭ２１６８プラスミドによって共形質転換され、選択された除草剤耐性Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ系統についてのサザンブロットのゲルを描写している。左のパネル：インベルターゼプローブ；右のパネル：Ｖｎｔ１プロモータープローブ。Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔコントロール（ＲＲ）系統と比較して、形質転換系統でそれぞれ増えているバンドは、系統ＲＲ−３６（３６）およびＲＲ−３９（３９）についてのシングルコピーのトランスジーンを示している。形質転換系統ＲＲ−２６およびＲＲ−３２は示されていない。
【００３２】
【図１３】図１３は、ポテト塊茎におけるアスパラギンの一様なサイレンシングを示している。Ｓｎｏｗｄｅｎ系統２、１５、５５および８３は、ｐＳＩＭ２１６８およびｐＳＩＭ２１７０によって形質転換された。
【００３３】
【図１４】図１４は、ポテト塊茎におけるポリフェノールオキシダーゼの一様なサイレンシングを示している。Ｓｎｏｗｄｅｎ系統２、１５、５５および８３は、ｐＳＩＭ２１６８およびｐＳＩＭ２１７０によって形質転換された。
【００３４】
【図１５】図１５は、ポテト塊茎におけるアスパラギンの一様なサイレンシングを示している。Ｒａｎｇｅｒ系統２６、３２、３８および３９は、ｐＳＩＭ２１６８およびｐＳＩＭ２１７０によって形質転換された。
【００３５】
【図１６】図１６は、ポテト塊茎におけるポリフェノールオキシダーゼの一様なサイレンシングを示している。Ｒａｎｇｅｒ系統２６、３２、３８および３９は、ｐＳＩＭ２１６８およびｐＳＩＭ２１７０によって形質転換された。
【００３６】
【図１７】図１７は、形質転換ポテト系統の収量を示している。
【００３７】
【図１８】図１８は、ｐＳＩＭ４１８７中のＦＭＶ−ＣＡＳ９−ＯＣＳおよび３５ｓ−ｇＲＮＡ−Ｎｏｓカセットを示している。ｇＲＮＡの配列が示され、そして２０ｂｐの標的特異的配列がハイライトされている。
【００３８】
【図１９】図１９は、アグロバクテリウム侵入の後のＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉のＧＵＳ染色を示している。ｐＳＩＭ２１６７：標的−ＧＵＳベクター；ｐＳＩＭ４１８７：Ｃａｓ９およびｇＲＮＡベクター。
【００３９】
【図２０】図２０は、ｐＳＩＭ４１８７と共侵入させた後の、ＰＣＲ増幅されたプラスミドｐＳＩＭ２１６７の標的領域の配列を示している。ｇＲＮＡ中の標的特異的配列は濃い緑でハイライトされている。標的配列の改変は、小さな欠失および置換である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
本発明の１つの局面は、所望のゲノム標的座に結合し、そしてその結果所望のゲノム標的座を切断するように設計され、それによりその特定の標的座での所望のポリヌクレオチドの挿入を促進する転写活性化因子様エフェクタータンパク質の一過的な発現である。したがって、本発明は、標的座を認識および切断する適切なＴＡＬ二量体を形成するペプチドまたはタンパク質をコードする発現カセットを含有するベクター、ならびに１つ以上の所望の発現カセットを含む第二のベクターによる植物材料の形質転換を包含する。そのような所望の発現カセットは、特定のタンパク質または遺伝子サイレンシング転写産物をコードし得る。１つの実施態様では、第二のベクターは、（ｉ）マーカー遺伝子もしくは所望の表現型をコードする遺伝子、およびプロモーターに作動可能に連結された場合にマーカー遺伝子の適切な発現を促進する適切な他の制御エレメント；ならびに（ｉｉ）内因性標的座の目的部位と相同なヌクレオチド領域を含む、本明細書では「プロモーターフリー」カセットと呼ばれるカセットを含み得る。上記相同なヌクレオチド領域は、例えば、１００％、または少なくとも９９％、または少なくとも９８％、または少なくとも９７％、または少なくとも９６％、または少なくとも９５％、または少なくとも９４％、または少なくとも９３％、または少なくとも９２％、または少なくとも９１％、または少なくとも９０％、または少なくとも８９％、または少なくとも８８％、または少なくとも８７％、または少なくとも８６％、または少なくとも８５％、または少なくとも８４％、または少なくとも８３％、または少なくとも８２％、または少なくとも８１％、または少なくとも８０％、または少なくとも７９％、または少なくとも７８％、または少なくとも７７％、または少なくとも７６％、または少なくとも７５％、または少なくとも７４％、または少なくとも７３％、または少なくとも７２％、または少なくとも７１％、または少なくとも７０％、または少なくとも６９％、または少なくとも６８％、または少なくとも６７％、または少なくとも６６％、または少なくとも６５％、または少なくとも６４％、または少なくとも６３％、または少なくとも６２％、または少なくとも６１％、または少なくとも６０％、または少なくとも５９％、または少なくとも５８％、または少なくとも５７％、または少なくとも５６％、または少なくとも５５％、または少なくとも５４％、または少なくとも５３％、または少なくとも５２％、または少なくとも５１％、または少なくとも５０％のヌクレオチド配列同一性を、内因性標的座の対応する配列と共有する、１０〜２０、２０〜５０、または２０〜１００ヌクレオチドを含むことができる。
【００４１】
したがって、１つの実施態様では、第二のベクターは少なくとも（ｉ）所望のポリヌクレオチド（例えば、タンパク質または非翻訳ＲＮＡ転写産物をコードするポリヌクレオチドであり、該ＲＮＡ転写産物は、ダウンレギュレートされる標的遺伝子のセンス、アンチセンス、および／または逆方向反復の配列を含み得る）をコードする発現カセット、および（ｉｉ）制御エレメント（例えば、ターミネーターまたは３−非翻訳領域）に作動可能に連結されたマーカー遺伝子を含むプロモーターフリーマーカーカセットを、相同性標的部位領域と共に含む。
【００４２】
第二のベクターのプロモーターフリーマーカーカセットおよび発現カセットは、理想的には一緒に移動し、それによりＴＡＬ−媒介活性（他のＴＡＬをコードするベクターによりもたらされる）の結果として両者は標的座に組み込まれることとなる。理想的には、プロモーターフリーマーカーカセットおよび発現カセットは、内因性のプロモーターまたは制御エレメントが第二のベクター中のプロモーターフリーマーカーカセットのマーカー遺伝子を発現させるように、１つ以上の機能的な内因性プロモーターまたは内因性制御エレメントの近傍（例えば、場合によって下流または上流）の、標的座の所望の部位に適切に組み込まれる。したがって、遺伝子発現を開始させる内因性遺伝子プロモーターまたは制御エレメント（例えば、エンハンサーエレメント）の下流または上流の当該標的配列を認識するためのＴＡＬ配列の適切な設計は、発現カセットおよびプロモーターフリーマーカーカセットが、特に選択されたゲノム上の位置に異なる形質転換事象間で何度も組み込まれることを保証するのを補助するのに重要である。
【００４３】
したがって、本発明は、所望のポリヌクレオチド（例えば、本明細書で開示されるカセットの１つおよび他で説明されるカセット）の部位特異的挿入を可能にし、それにより、異なる形質転換事象間での特定の標的遺伝子の発現またはダウンレギュレーションのレベルの一貫性が保証される。例えば、所望のポリヌクレオチドの部位特異的挿入は、標的遺伝子を新規に発現または過剰発現させるように機能することができる。いくつかの実施態様では、標的遺伝子の新規発現または過剰発現のレベルは異なる形質転換事象にわたって、２００％を超えない、または１００％を超えない、または５０％を超えない、または３０％を超えない範囲で変動し得る。あるいは、所望のポリヌクレオチドの部位特異的挿入は、標的遺伝子をダウンレギュレートするようなＲＮＡ転写産物を産生するように機能することができる。いくつかの実施態様では、標的遺伝子のダウンレギュレーションのレベルは異なる形質転換事象にわたって、２００％を超えない、または１００％を超えない、または５０％を超えない、または３０％を超えない範囲で変動し得る。
【００４４】
プロモーターフリーマーカーカセットが適切に組み込まれた場合に、マーカー遺伝子は内因性制御エレメントによって発現させられ、そしてマーカーのタイプに応じて（ａ）成功した形質転換体を効果的に同定し、（ｂ）一緒に結合された発現カセットの所望の標的座での挿入の成功の予備的な指示を与えることから、マーカー遺伝子は重要である。したがって、マーカー遺伝子が除草剤耐性遺伝子である場合に、形質転換された植物細胞は関連する除草剤上で培養され得、そして生存する細胞は、機能的な内因性プロモーターの近傍の所望の標的座において除草剤耐性遺伝子によって形質転換された細胞を反映する。
【００４５】
したがって、異なる形質転換事象間で同一の遺伝子座に発現カセットを常に挿入する能力は、非常に望ましく、有利で対費用効果が高い。なぜなら、これはそれが無ければ異なるゲノム環境においてランダムに起こったであろう組み込み事象を同定するために必要となるスクリーニングの規模を縮小するからである。例えば、実施例１４を参照。ランダムな組み込み座におけるこれらの差異は、しばしば局所的なゲノム環境を有害に破壊し、不可欠な遺伝子をノックアウトし、または所望の発現カセットを、組み込みＤＮＡを発現させることができない座に配置し得る。
【００４６】
したがって、第二のベクターのプロモーターフリーマーカーカセット中に存在する相同性標的部位領域は、第一のベクターのＴＡＬタンパク質二量体も認識、結合、および切断するように設計される内因性標的部位配列と、整合するように特異的に設計される。第二のベクターは、挿入されるポリヌクレオチド配列の上流または下流の１つの相同性標的部位領域、または挿入されるポリヌクレオチド配列に隣接する２つの相同性標的部位領域を含み得る。したがって、プロモーターフリーマーカーカセットおよびＴＡＬ発現カセットの双方は、内因性遺伝子標的座に特有の配列を含み、それによりプロモーターフリーマーカーカセットおよびその一緒に結合された所望の発現カセットはＴＡＬによって切断された正確な標的座の部位に挿入される。
【００４７】
本発明は、遺伝子座への、または内因性プロモーターもしくは制御エレメント近傍へのプロモーターフリーマーカーカセットおよび発現カセットの挿入に限定されない。むしろ、本発明は、先の形質転換事象に由来するポリヌクレオチド配列を認識するＴＡＬ配列、および相同性領域の設計に基づいてモジュラー的にカセットを積み重ねる本発明の方法の使用を包含する。つまり、１つの実施態様では、植物は、ＴＡＬの使用を伴いまたは伴わずに植物ゲノム中の特定のまたはランダムな部位で遺伝子Ｘを発現させる発現カセットＡで既に安定に形質転換されていてもよい。ＴＡＬによって媒介される本発明の組み込みの方法は、発現カセットＡ中の遺伝子Ｘのおそらく下流の配列を認識するＴＡＬ配列の設計を可能にし、それによりＴＡＬ二量体は効果的に当該遺伝子Ｘ部位で植物ゲノムを切断する。プロモーターフリーマーカーカセット−または任意の発現カセット−は、当該遺伝子Ｘ部位と相同な領域を含み、次にそのカセットは遺伝子Ｘのすぐ下流に導入することが可能である。言及されたように、必ずしも全ての場合に本発明はプロモーターフリーマーカーシステムを利用するべきというわけではなく、それは着目した遺伝子が予め形質転換された遺伝子Ｘの下流に組み込まれた植物が、それ自体における、またはそれ自体の検出可能な、および所望の形質を産生する場合であり得るためである。さらに、追加の発現カセットは、それ自体のプロモーターを含み得、または着目した遺伝子が発現カセットＡのプロモーターまたは制御エレメントによって発現させられるようにプロモーターフリーであり得る。
【００４８】
したがって、１つの実施態様では、本発明は、成功した適切な形質転換体を同定するためのプロモーターフリーマーカー設計を用いて標的座に所望の発現カセットを新規に挿入することを包含する。他の実施態様では、本発明は、先の組み込み事象の下流または上流に、プロモーターフリーマーカーカセットを含むまたは含まない可能性のある１つ以上の追加の発現カセットの後の挿入を包含する。したがって、後者のアプローチにおいて、異なる発現カセットを効果的に一緒に連結することによって、これが異なる形質転換によってなされるとしても本明細書で記載されるＴＡＬ媒介部位特異的挿入技術を用いて、本発明は遺伝子を植物ゲノム中の正確な定義された位置に積み重ねる能力を可能にする。
【００４９】
１つの実施態様では、植物ゲノムに安定に組み込まれることとなるＤＮＡのみが、所望の発現カセットおよびプロモーターフリーマーカーカセット（用いられる場合）に属するようにＴＡＬタンパク質の発現は単に一過的であるのが望ましい。
【００５０】
したがって、本発明の１つの局面は、（１）植物のゲノム中で所望の標的座配列を同定する工程；（２）その標的座配列を特異的に認識する、対応するＴＡＬ配列を設計する工程；および、必要に応じて（３）例えば、対応するＴＡＬ二量体が、形成された際に、適切に切断をするかを試験するために、設計されたＴＡＬ配列を侵入アッセイにおいてアッセイする工程を包含する。機能するＴＡＬは、次に一過性発現形質転換ベクター（例えば、図２に示される）にサブクローニングされ得る。それらの工程は本明細書で詳細に説明される。例えば、実施例１０および１１を参照。
【００５１】
次に、第二のベクターは１つ以上の所望の発現カセットをプロモーターフリーマーカーカセットと共に含むように設計され得、その後にＴＡＬベクターおよび第二のベクターの双方はアグロバクテリウムの１つまたは２つの系統に形質転換される。
【００５２】
次に、植物材料（例えば、移植片、カルス、細胞、葉、または茎）は、これらのアグロバクテリウムを用いて形質転換することができる。１つの実施態様では、形質転換された植物材料は、いかなる選択成分も含有しない培地上でカルスへと育てられ得る。つまり、例示を簡単にするために、第二のベクターが、プロモーターに作動可能に連結されていない除草剤耐性マーカー遺伝子を含む場合、形質転換された植物材料はまず一定の時間、除草剤を含有しない培地上で培養される。その期間の後、植物材料は除草剤を含有するカルス誘導培地上に配置され得る。生存する材料は、次にまた同一の除草剤を含有するシュート誘導培地上に、シュートが発達し一定の時間生存するまで配置され得る。したがって、除草剤培地上で育ったシュートは、安定に組み込まれた除草剤耐性遺伝子を、実際の所望の発現カセットと共にゲノム中に含む可能性が高い。これらの除草剤耐性のシュートまたはこれらのシュートから育った葉が、マーカーを、および所望の発現カセットも、正確な、そして期待されたゲノム上の標的位置に含んでいるか決定するために、次にＰＣＲおよび他の分子分析に供され得る。この方法は本明細書で詳細に説明される、例えば実施例４を参照。本明細書で考察されるように、プロモーターフリー構成中のマーカー遺伝子としてＡＬＳ遺伝子が用いられた場合、形質転換されたシュート／葉の分析されたうちの８０％が、所望のゲノム座に安定に組み込まれた所望のインサートを含んでいた。
【００５３】
１つの実施態様では、第二のベクターは、ｐＳＩＭ２１６８（図１）に示されるように、疫病についての遺伝子発現カセット、ならびにＰＰＯ、ＡＳＮ１、およびインベルターゼをサイレンシングするための遺伝子サイレンシングカセットを、プロモーターフリーＡＬＳ除草剤マーカー遺伝子に加えて含む。この場合において、ＡＬＳ遺伝子はプロモーターに作動可能に連結されていないが、ターミネーターに作動可能に連結され、そして上流に、内因性植物Ｕｂｉ７遺伝子イントロンおよびＵｂｉ７エキソン＃１の部分の領域と相同な配列を含む。図２は、Ｕｂｉ７遺伝子イントロン中で天然に存在する配列を認識するようにも設計されたＥ４ＲｅｐおよびＥ３反復ＴＡＬ配列を発現する対応するベクター（ｐＳＩＭ２１７０）を描写している。ｐＳＩＭ２１６８およびｐＳＩＭ２１７０の双方は、ポテト茎移植片に形質転換され、上記で説明された、そして本明細書で提供される実施例中の方法論の詳細において説明されるような方法に供される。ＴＡＬ媒介の組み込みを用いて、ｐＳＩＭ２１６８のカセットを内因性Ｕｂｉ７遺伝子イントロン中の正確な所望の標的位置に安定に組み込むことにおいて、本発明のアプローチが成功していたことは、結果によって示される。
【００５４】
本発明の方法は、トランスファーＤＮＡまたはアグロバクテリウムを用いたそのようなベクターの導入に限定されない。例えば、いかなるアグロバクテリウムまたはＴ−ＤＮＡの構成要素も伴わずに、パーティクルボンバードメントを用いることが可能である。１つの実施態様では、例えば、パーティクルボンバードメント粒子を、所望の発現カセットおよびプロモーターフリーマーカーカセットをコードするＤＮＡで被覆することが可能であり、そしてまた同一の粒子をＴＡＬタンパク質またはＴＡＬタンパク質二量体で被覆することも可能である。したがって、この態様では粒子はコードＤＮＡおよびＴＡＬタンパク質の双方を含み得、あるいはいくつかの粒子はコードＤＮＡまたはＴＡＬタンパク質のいずれかで被覆され得る。いかなる事象においても、植物材料はそのような被覆された粒子で衝撃され得、そして粒子が植物細胞に入った場合、ＴＡＬタンパク質は意図したように機能して、所望の部位のゲノム配列を切断し、そして共送達されたＤＮＡを組み込む。例えば、Ｍａｒｔｉｎ−Ｏｒｔｉｇｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．  Ｆｕｎｃｔ．  Ｍａｔｅｒ．  ２２，３５７６−３５８２  （２０１２）を参照、該文献は、タンパク質およびＤＮＡを植物に共送達するためのパーティクルボンバードメントの使用法の例として、本明細書において参考として援用される。
【００５５】
本明細書で使用される「所望のポリヌクレオチド」は、ユーザーが植物ゲノム中に組み込むことを所望する発現カセットまたは遺伝子サイレンシングカセット中の任意のポリヌクレオチドまたはＤＮＡ配列のシリーズ（ｓｅｒｉｅｓ）である。したがって、「所望のポリヌクレオチド」は本明細書中の「カセット」「発現カセット」または「サイレンシングカセット」と交換可能に使用され得る。任意の発現カセット中の所望のポリヌクレオチドは、任意の種類または強度のプロモーターと作動可能に連結され得、したがって、その発現は必ずしも内因性の植物ゲノム上のプロモーターの発現に依存性ではない。
【００５６】
本発明のＴＡＬ媒介組み込み技術に従って植物ゲノムを安定に形質転換するのが望ましいが、本発明の方法の他の実施態様は、所望のポリヌクレオチドを核酸の任意の形態またはサンプル中に組み込むことを包含する。
【００５７】
ＴＡＬｓ
転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターは、特定の所望の標的部位（例えば、植物ゲノム中）へのＤＮＡの部位特異的な組み込みを促進するモジュラーＤＮＡ結合ドメインを含む植物病原性細菌のタンパク質である。これらのドメインは、ＤＮＡ中の連続するヌクレオチドを個別に特定するタンデムかつ多型性のアミノ酸反復を含み、標的型部位特異的組み込みアプローチを方向づけるのに有用である。
【００５８】
中央反復ドメインは、典型的には長さ３４残基の１．５回と３３．５回との間の反復を含み得る。反復配列の例：
ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳＨＤＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ
【００５９】
１２番目および１３番目の位置の残基は超可変性であり得、「繰り返し可変二残基」またはＲＶＤとして知られる。配列の繰り返し中のこれらの２つの残基の同一性と、ＴＡＬエフェクターの標的部位中の配列ＤＮＡ塩基との間には関係がある。ＲＶＤ配列と標的ＤＮＡ塩基との間のコードは、以下のように表現され得る：
ＮＩ＝Ａ
ＨＤ＝Ｃ
ＮＧ＝Ｔ
ＮＮ＝Ｒ（ＧまたはＡ）、および
ＮＳ＝Ｎ（Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）。
【００６０】
ＲＶＤのＮＫはＧを標的とすることができるが、Ｇを標的とするためにもっぱらＮＮの代わりにＮＫを用いるＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、より活性が低くあり得る。
【００６１】
ＴＡＬエフェクターの標的部位には、最初の反復によって標的とされる５’−塩基に隣接するＴが含まれ得、これはおそらく、このＴヌクレオチドと中央反復ドメインのＮ末端領域中の保存されたトリプトファンとの間の接触による。
【００６２】
下記の文献もまた参照、それらの文献は全てそれらの全体が本明細書において参考として援用される：Ｂｏｃｈ  Ｊ，Ｂｏｎａｓ  Ｕ  （Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２０１０）．”ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓＡｖｒＢｓ３  Ｆａｍｉｌｙ−Ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ４８：４１９−３６；Ｖｏｙｔａｓ  ＤＦ，Ｊｏｕｎｇ  ＪＫ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００９）．”Ｐｌａｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ．  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍａｄｅ  ｅａｓｙ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６（５９５９）：１４９１−２．Ｂｉｂｃｏｄｅ  ２００９；Ｍｏｓｃｏｕ  ＭＪ，Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ＡＪ（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００９）．”Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｃｉｐｈｅｒ  ｇｏｖｅｒｎｓ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６（５９５９）：１５０１；Ｂｏｃｈ  Ｊ，Ｓｃｈｏｌｚｅ  Ｈ，Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２００９）．”Ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＴＡＬ−ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６（５９５９）：１５０９−１２；Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒ，Ｒ．；Ｒｏｍｅｒ，Ｐ．；Ｂｏｃｈ，Ｊ．；Ｌａｈａｙｅ，Ｔ．（２０１０）．”Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｌｏｃｉ  ｕｓｉｎｇ  ｄｅ  ｎｏｖｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  （ＴＡＬＥ）−ｔｙｐｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ”．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０７（５０）：２１６１７−２１６２２；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．；Ｔａｎ，Ｓ．；Ｑｉａｏ，Ｇ．；Ｂａｒｌｏｗ，Ｋ．Ａ．；Ｗａｎｇ，Ｊ．；Ｘｉａ，Ｄ．Ｆ．；Ｍｅｎｇ，Ｘ．；Ｐａｓｃｈｏｎ，Ｄ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）．”Ａ  ＴＡＬＥ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｆｗｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ”．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９（２）：１４；Ｈｕａｎｇ，Ｐ．；Ｘｉａｏ，Ａ．；Ｚｈｏｕ，Ｍ．；Ｚｈｕ，Ｚ．；Ｌｉｎ，Ｓ．；Ｚｈａｎｇ，Ｂ．（２０１１）．”Ｈｅｒｉｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｕｓｉｎｇ  ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ  ＴＡＬＥＮｓ”．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９（８）：６９９；ａｎｄ  Ｍａｋ，Ａ．Ｎ．−Ｓ．；Ｂｒａｄｌｅｙ，Ｐ．；Ｃｅｒｎａｄａｓ，Ｒ．Ａ．；Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ａ．Ｊ．；Ｓｔｏｄｄａｒｄ，Ｂ．Ｌ．（２０１２）．”Ｔｈｅ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ＰｔｈＸｏ１  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  Ｉｔｓ  ＤＮＡ  Ｔａｒｇｅｔ”．Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２１６２１１。
【００６３】
マーカー
本明細書で開示されるようにプロモーターフリーマーカー遺伝子カセット中で使用され得るマーカー遺伝子のカテゴリーの例は、除草剤耐性、農薬耐性害虫抵抗性、ストレスに対する耐性、果実または種子の風味または安定性の増強、または有用な非植物性タンパク質を合成する能力（例えば、医療的に有益なタンパク質）、もしくは植物タンパク質の濃度の変化を生成する能力、ならびに植物への関連する影響（例えば、植物二次代謝産物を含む植物代謝産物の生産を触媒する植物タンパク質のレベルの変化）を含むが、それらに限定されない。
【００６４】
本発明は、所望のヌクレオチド配列の植物への標的型挿入のための方法およびキットを提供し、それはプロモーターレスの所望のヌクレオチド配列をユビキチン−７（Ｕｂｉ７）遺伝子のイントロン配列中に挿入することにより、それによって植物中の外因性ヌクレオチド配列の発現は、内因性Ｕｂｉ７プロモーターによって駆動される。特に、発明者は、Ｕｂｉ７遺伝子のイントロン配列中の所望のヌクレオチド配列と結合するように特異的に設計された転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼの一過的な発現のためのバイナリーベクターを、これらのベクターが標的型プロモーターレスヌクレオチド配列を運搬するバイナリーベクターと一緒に植物細胞内に導入されたとき、所望のヌクレオチド配列は適切な方向および間隔でＵｂｉ７遺伝子のイントロン配列に挿入され、そしてそれらの発現は内因性Ｕｂｉ７プロモーターによって駆動されるように、作製することができた。そのように得られた形質転換移植片から再生される形質転換された植物は、標的とされる配列のみを有する。
【００６５】
本発明は、本発明の方法によって形質転換された植物、ならびに一過的および恒久的な形質転換のためのバイナリーベクターをさらに提供する。
【００６６】
本発明の技術戦略は、望ましい形質を有する遺伝子操作植物および植物産物を標的型形質転換によって効率的に生産することについての必要性に対処し、それにより、植物作物、特に塊茎を有する植物（例えば、ポテト植物）の栄養価および農業的特性が改善され得る。望ましい形質には、衝撃誘導性の黒斑傷に対する高耐性、アクリルアミド前駆アスパラギンの形成の減少、還元糖の蓄積の減少およびアクリルアミドを含む毒性メイラード産物の蓄積の減少が含まれるが、それらに限定されない。したがって、本発明は、酵素（例えば、黒斑傷の要因であるポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）、およびアスパラギン、つまりアクリルアミドの形成における前駆体の蓄積の要因であるアスパラギンシンターゼ−１（Ａｓｎ−１））の発現を低下させることにより、そして疫病抵抗性遺伝子Ｖｎｔ１の発現を増加させることにより、植物ゲノムへのこれらの望ましい形質の標的型挿入を可能にする。
【００６７】
本発明は、当業者にとって周知である用語または句を使用する。異なって定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的な用語は、本発明が属する分野の通常の能力の当業者に共通に理解されるのと同一の意味を有する。一般的に本明細書で使用される用語法ならびに本明細書で説明される細胞培養、分子遺伝学、および核酸化学および核酸ハイブリダイゼーションにおける実験室的手順は当該分野で周知なものであり、広く使用される。標準技術は、組み換え核酸方法、ポリヌクレオチド合成、微生物培養、細胞培養、組織培養、形質転換、形質移入、形質導入、分析化学、有機合成化学、化学合成、化学分析、ならびに薬学製剤および薬学送達のために使用される。一般的に、酵素的反応ならびに精製および／または単離の工程は製造者の仕様書に従って行われる。技術および手順は、一般的に従来の方法論に従って行われる（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌ編  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）。
【００６８】
アグロバクテリウムまたは細菌性形質転換：当該分野で周知であるように、植物細胞の形質転換のために用いられるアグロバクテリウムは、通常Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓまたはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓの、無害化および感染強化された派生体である。植物、移植片、細胞、またはプロトプラストへの感染に際し、ＴＡＬエフェクターカセットを含むバイナリーベクターおよび目的の遺伝子を含むバイナリーベクターを含む１つのアグロバクテリウム系統、あるいはＴＡＬエフェクターカセットを含むバイナリーベクターを含む１つの系統および目的の遺伝子を含むバイナリーベクターを含む他の系統からなる２つの異なるアグロバクテリウム系統が、所望のＤＮＡセグメントをプラスミドベクターから植物細胞核へと転移させる。ベクターは典型的にはＴ−ＤＮＡの境界の間に位置する所望のポリヌクレオチドを含む。しかしながら、植物細胞を形質転換することのできる任意の細菌を使用することができる（例えば、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ、Ｐｈｙｌｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｙｒｓｉｎａｃｅａｒｕｍ、ＳｉｎｏＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｍｅｌｉｌｏｔｉ、およびＭｅｓｏＲｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｌｏｔｉ）。本発明は、細菌性形質転換システムの使用に限定されない。植物細胞形質転換を達成するのに適切な細胞機構およびタンパク質をどのような形であれ含む任意の有機体。
【００６９】
被子植物：子房に包まれた種子を有する維管束植物。被子植物は果実をつける花を産生する種子植物である。被子植物は双子葉植物および単子葉植物に分けられる。
【００７０】
抗生物質耐性：細胞の、抗生物質の存在下で生存する能力。本明細書で使用される抗生物質耐性は、宿主細胞中の抗生物質耐性遺伝子の発現によってもたらされる。細胞は、任意の抗生物質に対する耐性を有し得る。一般的に使用される抗生物質の例にはカナマイシンおよびハイグロマイシンが含まれる。
【００７１】
双子葉植物（双子葉類）：顕花植物であって、その胚芽は２枚の種子半片または子葉、分岐状葉脈、および４つまたは５つの倍数の花の部分を有する。双子葉類の例には、ポテト、テンサイ、ブロッコリー、キャッサバ、サツマイモ、コショウ、ポインセチア、マメ、アルファルファ、ダイズ、およびアボカドが含まれるが、それらに限定されない。
【００７２】
内因性：形質転換される植物または植物種のゲノムから単離された、あるいは形質転換される植物種と性的に適合性または種間繁殖可能な植物または生物種から単離された、核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ分子は該植物種に「ネイティブ」、すなわち生来のものである。
【００７３】
発現カセット：ポリヌクレオチドであって、（ａ）第一のプロモーター、（ｂ）（ｉ）遺伝子もしくは遺伝子フラグメントの少なくとも１コピー、または（ｉｉ）遺伝子のプロモーターのフラグメントの少なくとも１コピーを含む配列、および（ｃ）ターミネーターもしくは第一のプロモーターと反対の方向に位置付けられた第二のプロモーターのいずれか、を含み得る。
【００７４】
外来：核酸について「外来」は、その核酸が、非植物の有機体に由来する、または形質転換される植物と同一の種でない植物に由来する、あるいは形質転換される植物と種間繁殖可能ではない植物に由来しない、標的植物の生物種に属さないことを意味する。本発明によれば、外来ＤＮＡまたはＲＮＡは、真菌、細菌、ウイルス、哺乳動物、魚類または鳥類の遺伝的構成において天然に存在するが、形質転換される植物においては天然に存在しない核酸を表す。したがって、外来核酸は、例えば、形質転換される植物によっては天然に産生されないポリペプチドをコードする核酸である。外来核酸は必ずしもタンパク質産物をコードしなくともよい。
【００７５】
遺伝子：遺伝子は、産物、ポリペプチド鎖またはコード配列および非コード配列の双方が含まれるＲＮＡ分子の合成に必要とされる情報を全て含んでいるＤＮＡ分子のセグメントである。遺伝子は、複数の配列であって、それぞれが独立に発現され得、そして同様の機能的活性を示す少しずつ異なるタンパク質をコードし得る複数の配列もまた表す。例えば、アスパラギンシンターゼ１および２の遺伝子は、一緒に１つの遺伝子として呼ばれ得る。
【００７６】
遺伝エレメント：「遺伝エレメント」は任意の分離した（ｄｉｓｃｒｅｅｔ）ヌクレオチド配列（例えば、限定されないが、プロモーター、遺伝子、ターミネーター、イントロン、エンハンサー、スペーサー、５’−非翻訳領域、３’−非翻訳領域、またはリコンビナーゼ認識部位）である。
【００７７】
遺伝的改変：分子生物学および細胞生物学の方法を適用することによる特定の有機体のゲノムへのＤＮＡの安定な導入。
【００７８】
裸子植物：本明細書で使用される裸子植物は、子房のない種子をつける種子植物をいう。裸子植物の例には、針葉樹、ソテツ、イチョウ（ｇｉｎｋｇｏｓ）、およびエフェドラが含まれる。
【００７９】
導入：本明細書で使用される導入は、感染、形質移入、形質転換または形質導入を含む方法によって、細胞に核酸配列を挿入することをいう。
【００８０】
単子葉植物（単子葉類）：１枚の子葉（ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ）または子葉（ｓｅｅｄ  ｌｅａｆ）を有する胚芽、平行葉脈、および３の倍数の花の部分を有する顕花植物。単子葉類の例には、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、コメ、カラスムギ、コムギ、オオムギ、およびソルガムが含まれるが、それらに限定されない。
【００８１】
ネイティブ：形質転換される植物または植物種のゲノムから単離された、あるいは形質転換される植物種と性的に適合性または種間繁殖可能な植物または生物種から単離された、核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ分子は該植物種に「ネイティブ」、すなわち生来のものである。
【００８２】
ネイティブＤＮＡ：形質転換される植物または植物種のゲノムから単離された、あるいは形質転換される植物種と性的に適合性または種間繁殖可能な植物または生物種から単離された、任意の核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ分子は該植物種に「ネイティブ」、すなわち生来のものである。換言すると、ネイティブな遺伝エレメントは、旧来の植物育種を通じて植物の改善のために植物育種者が利用できる全ての遺伝的材料を表す。本発明によれば、ネイティブな核酸の任意のバリアントもまた「ネイティブ」であると考えられる。例えば、ネイティブＤＮＡは、そのような点変異が天然で起こるため、点変異を含み得る。制限酵素部位は植物ゲノム中に遍在しているため、制限酵素部位を使用することにより異なる２つのネイティブＤＮＡを連結することもまた可能である。
【００８３】
ネイティブ核酸コンストラクト：少なくとも１つのネイティブＤＮＡを含むポリヌクレオチド。
【００８４】
作動可能に連結：組み合わせることによって植物細胞内で適切に機能するような様態で２つ以上の分子を組み合わせること。例えば、プロモーターが構造遺伝子の転写を制御している場合、プロモーターは構造遺伝子に作動可能に連結されている。
【００８５】
過剰発現：ある遺伝子の対照植物における発現よりも高いレベルの発現。
【００８６】
Ｐ−ＤＮＡ：本発明の植物由来トランスファーＤＮＡ（「Ｐ−ＤＮＡ」）境界配列は、いかなる公知の細菌由来Ｔ−ＤＮＡ境界配列ともヌクレオチド配列において同一ではないが、本質的に同様の目的のために機能する。つまり、Ｐ−ＤＮＡは、１つのポリヌクレオチドを他のポリヌクレオチドに転移させる、および組み込むために使用され得る。Ｐ−ＤＮＡは、従来のＴ−ＤＮＡに代わり、腫瘍誘導プラスミド（例えば、アグロバクテリウムのＴｉ−プラスミド）中に挿入することができ、そして従来の形質転換プラスミドとちょうど同じように細菌系統中で維持することができる。Ｐ−ＤＮＡは、細菌媒介性の植物形質転換による植物ゲノム中への組み込みを予定される所望のポリヌクレオチドを含むように操作され得る。Ｐ−ＤＮＡは少なくとも１つの境界配列を含む。Ｒｏｍｍｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３９：１３３８−１３４９を参照、該文献は本明細書において参考として援用される。本発明の特定の実施態様では、Ｔ−ＤＮＡはＰ−ＤＮＡに置き換えられる。
【００８７】
表現型：表現型は植物の識別可能な特徴または特性であり、１つ以上の「所望のポリヌクレオチド」および／またはスクリーニング可能／選抜可能なマーカーを、形質転換された植物の少なくとも１つ以上の植物細胞のゲノムに組み込むことにより、本発明に従って変更され得る。「所望のポリヌクレオチド」および／またはマーカーは、形質転換された植物細胞または植物全体の、遺伝的、分子的、生化学的、生理的、形態学的、または農業的ないくつかの特性またはプロパティーのうちの任意の１つを改変することにより、形質転換された植物の表現型における変化を付与し得る。
【００８８】
植物組織：「植物」は、特徴的に胚を生産し、葉緑体を含み、セルロース細胞壁を有する植物界の様々な光合成性、真核、多細胞の有機体の任意のものである。植物の部分、すなわち「植物組織」は、トランスジェニック植物を生産するための本発明の方法に従って処置され得る。多数の適切な植物組織が、本発明に従って形質転換させることができ、そして、体細胞胚、花粉、葉、茎、カルス、走出枝、微小塊茎、およびシュートを含むが、それらに限定されない。したがって、本発明は被子植物および裸子植物（例えば、コムギ、トウモロコシ、コメ、オオムギ、カラスムギ、テンサイ、ポテト、トマト、アルファルファ、キャッサバ、サツマイモ、およびダイズ）の形質転換を想定する。本発明によれば「植物組織」は植物細胞もまた包含する。植物細胞には、懸濁培養、カルス、胚、分裂領域、カルス組織、葉、根、シュート、配偶体、胞子体、花粉、種子および小胞子が含まれる。植物組織は、様々な成熟段階であり得、そして、液体もしくは固体培養で、または鉢、温室もしくは畑内の土もしくは適切な培地で育てられ得る。植物組織はまた、そのような植物の任意のクローン、種子、後代、有性的に生成されたかもしくは無性的に生成されたかにかかわらない栄養繁殖体、およびこれらの任意の子孫、（例えば、切穂または種子）もまたいう。特に着目されるのが、ポテト、トウモロコシ、およびコムギである。
【００８９】
植物形質転換および細胞培養：植物細胞が遺伝的に改変され、そして維持、さらなる成長、および／またはさらなる発達のための適切な植物培養培地に移されるプロセスを広くいう。そのような方法は当業者にとって周知である。
【００９０】
加工：（１）例えば、コムギ、コーン（ｃｏｒｎ）、コーヒー植物、もしくはココア木の種子、（２）例えば、ポテトの塊茎、または（３）例えば、サツマイモおよびヤムの根から食品を生産する、少なくとも１２０℃の温度に加熱することを含むプロセス。加工された食品の例には、パン、朝食シリアル、パイ、ケーキ、トースト、ビスケット、クッキー、ピザ、プレッツェル、トルティーヤ、フレンチフライ、オーブンベークトフライ（ｏｖｅｎ−ｂａｋｅｄ  ｆｒｉｅｓ）、ポテトチップス、ハッシュブラウン、ローストコーヒー、およびココアが含まれる。
【００９１】
後代：本発明の「後代」（例えば、トランスジェニック植物の後代）は、植物もしくはトランスジェニック植物から生まれる、植物もしくはトランスジェニック植物によって生み出される、または植物もしくはトランスジェニック植物に由来する後代である。したがって、「後代」の植物、すなわち、「Ｆ１」世代植物は、本発明の方法によって生産されたトランスジェニック植物の子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）または子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）である。トランスジェニック植物の後代は、その細胞ゲノムの少なくとも１つ、いくつか、または全てに、本明細書で説明される方法によって親のトランスジェニック植物の細胞に組み込まれた所望のポリヌクレオチドを含み得る。したがって、所望のポリヌクレオチドは、後代の植物に「伝達」される、または「遺伝」する。そのように後代の植物に遺伝した所望のポリヌクレオチドは、同様に親から後代の植物に遺伝したＴ−ＤＮＡまたはＰ−ＤＮＡコンストラクト中に存在し得る。本明細書で使用される「後代」はまた、植物の群の子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ）または子孫（ｄｅｓｃｅｎｄａｎｔ）であるとも考えられ得る。
【００９２】
プロモーター：プロモーターは、核酸、好ましくはＲＮＡポリメラーゼおよび／または他の転写調節エレメントと結合するＤＮＡを意味することを意図している。プロモーターは、それが関係する遺伝子が転写されることを可能にする核酸配列である。調節領域は、転写の開始に影響する、および／または転写の開始を促進する核酸配列をいう。プロモーターは、一般的に、調節領域（例えば、エンハンサーまたはインデューサーエレメント）を含むと考えられる。
【００９３】
真核性のプロモーターは一般的には、それらがもっとも密接に関連する遺伝子の上流に存在する。プロモーターは、それらの転写開始部位から数キロ塩基離れた位置に調節エレメントを有し得るが、転写複合体による特定の３次構造の形成がＤＮＡを折りたたみ得、それによりそれらの調節エレメントは実際の転写部位に近づけられ得る。多数の真核性のプロモーターは、典型的にはＴＡＴＡＡＡというヌクレオチド配列で示される、「ＴＡＴＡボックス」配列を含む。このエレメントはＴＡＴＡ結合タンパク質と結合し、それによりＲＮＡポリメラーゼ転写複合体の形成が促進される。ＴＡＴＡボックスは典型的には転写開始部位の５０塩基以内に存在する。
【００９４】
真核性のプロモーターは、転写複合体の形成に関係する転写因子と結合する特定の調節配列の存在によっても特徴づけられる。一例は、配列ＣＡＣＧＴＧによって示されるＥ−ボックスであり、塩基性−ヘリックス−ループ−ヘリックスファミリーの転写因子と結合する。ＧＣヌクレオチドの含量が高い領域もまた存在する。
【００９５】
ポリヌクレオチドは、プロモーターに対して２つの異なった方向で連結され得る。１つの方向（例えば、「センス」）では、結果的なＲＮＡ転写産物の少なくとも５’−部分が、少なくとも１つの標的転写産物の少なくとも部分と配列同一性を共有する。「アンチセンス」と呼ばれる他の方向では、予期される転写産物の少なくとも５’−部分が、少なくとも１つの標的転写産物の逆向き相補鎖の少なくとも部分と同一または相同である。
【００９６】
植物プロモーターは、植物細胞内で転写を開始することができるプロモーターであり、その起源が植物細胞であってもなくてもよい。代表的な植物プロモーターには、植物、植物ウイルス、および細菌（例えば、植物細胞中で発現させられる遺伝子を含むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＲｈｉｚｏｂｉｕｍ）から得られたプロモーターが含まれるが、それに限定されない。発生上の制御を受けるプロモーターの例には、特定の組織（例えば、木部、葉、根、または種子）において優先的に転写を開始させるプロモーターが含まれる。そのようなプロモーターは、組織好適プロモーターと呼ばれる。特定の組織においてのみ転写を開始させるプロモーターは、組織特異的プロモーターと呼ばれる。細胞タイプ特異的プロモーターは、一つ以上の器官の特定の細胞タイプ（例えば、根または葉の脈管細胞）において主に発現を駆動する。誘導性または抑制可能プロモーターは、環境の制御を受けるプロモーターである。誘導性プロモーターによる転写に影響し得る環境条件の例には、嫌気的条件または光の存在が含まれる。組織特異的、組織好適、細胞タイプ特異的、および誘導性プロモーターは、非構成的プロモーターのクラスを構成する。構成的プロモーターは、ほとんどの環境条件下、およびほとんどの植物の部分において活性であるプロモーターである。
【００９７】
ポリヌクレオチドはヌクレオチド配列であって、遺伝子コード配列またはそのフラグメント、（少なくとも１５の連続するヌクレオチド、好ましくは少なくとも３０の連続するヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも５０の連続するヌクレオチドを含む）、プロモーター、イントロン、エンハンサー領域、ポリＡ化部位、転写開始部位、５’または３’非翻訳領域、レポーター遺伝子、選抜可能なマーカー等を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。ポリヌクレオチドは、改変された塩基または改変された骨格を含み得る。ポリヌクレオチドは、ゲノム、ＲＮＡ転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）または加工されたヌクレオチド配列（例えば、ｃＤＮＡ）であり得る。ポリヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスのいずれかの方向の配列を含み得る。
【００９８】
単離されたポリヌクレオチドは、その天然の状態にはないポリヌクレオチド配列であり、例えば、そのポリヌクレオチドは天然には見られないヌクレオチド配列から構成される、あるいはそのポリヌクレオチドは、典型的にはそのポリヌクレオチドと近接しているヌクレオチド配列から分離されている、または典型的にはそのポリヌクレオチドと近接していないヌクレオチド配列と隣接している。
【００９９】
種子：「種子」は、植物の胚を含む熟した胚珠、ならびに塊茎または胞子としての植物の増殖する部分とみなされ得る。種子は、アグロバクテリウム媒介形質転換に先立ち、暗所で、例えば、発芽を促進させるために、インキュベーションされ得る。種子はまた、インキュベーションに先立ち、例えば、漂白剤で短時間処理することによって、滅菌もされ得る。次に、結果的な実生は、アグロバクテリウムの所望の系統に曝露され得る。
【０１００】
選抜可能／スクリーニング可能なマーカー：植物または植物組織において発現された場合、それらの植物または植物組織を、その遺伝子を発現しない他の植物または植物組織から区別することを可能にする遺伝子。スクリーニング手順は、スクリーニング可能なマーカー遺伝子にコードされたタンパク質の発現についてのアッセイを必要とし得る。選抜可能なマーカーの例には、除草剤抵抗性遺伝子（例えば、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ））、カナマイシンおよびジェネテシン抵抗性をコードするネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ（ＮｐｔＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシンに対する抵抗性をコードするハイグロマイシンホスフォトランスフェラーゼ（ＨｐｔＩＩ）遺伝子、または当該分野で公知の他の類似の遺伝子が含まれる。
【０１０１】
官能特性：専門的に訓練された審査員団は、食品製品を、官能特性（例えば、外観、風味、香り、テクスチャ）について評価することができる。したがって、本発明は、本発明に従ってその塊茎の生産収量を操作するために改変された植物から得られた植物産物の官能特性を向上させることを意図している。
【０１０２】
配列同一性：本明細書で使用される「配列同一性」または「同一性」は、２つの核酸またはポリペプチド配列についての文脈では、特定された領域にわたって最大に一致するように整列された際に、２つの配列中で同一である残基を指示する内容を含む。したがって、本明細書で使用される相同な領域または相同な配列は、標的となるゲノム座とある程度の配列同一性を共有する配列について説明する。タンパク質に関して配列同一性の割合が用いられる場合、同一でない残基位置では、アミノ酸残基が、類似の化学的プロパティー（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換され、それゆえ分子の機能的プロパティーを変化させないような保存的アミノ酸置換によって異なっている場合が多々あることが知られている。配列が非保存的置換で異なっている場合、配列同一性の割合は、置換の保存的性質について修正するために上方に調整され得る。そのような保存的置換によって異なっている配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この調整を行う手段は、当業者に周知である。一般的には、保存的置換を完全ではなく部分的なミスマッチとしてスコア付けをし、それによって配列同一性の割合を増加させることが含まれる。したがって、例えば、同一のアミノ酸は１のスコアを与えられ、そして非保存的置換は０のスコアを与えられる場合に、保存的置換は０から１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコア付けは、例えば、ＭｅｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃ．  Ｂｉｏｌ．  Ｓｃｉ．，４：  １１  １７  （１９８８））に従って、例えば、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，  ＵＳＡ）において実行されるように、計算される。
【０１０３】
本明細書で使用される配列同一性の割合は、比較窓にわたって最適に整列された２つの配列の比較によって決定される値を意味し、ここで、比較窓中のポリヌクレオチド配列の割合は、２つの配列の最適な整列のためにリファレンス配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセント割合は、一致する位置の数を得るために両方の配列に存在する一致する核酸塩基またはアミノ酸残基の存在する位置の数を決定する工程、比較の窓内の位置の総数で一致した位置の数を割る工程および配列同一性のパーセント割合を得るために結果に１００を掛ける工程によって計算される。
【０１０４】
「配列同一性」は、当該分野で認識される意味を有し、公知の技術を用いて計算することができる。ＣＯＭＰＵＴＡＴＩＯＮＡＬ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｌｅｓｋ，ｅｄ．（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８），ＢＩＯＣＯＭＰＵＴＩＮＧ：ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＣＳ  ＡＮＤ  ＧＥＮＯＭＥ  ＰＲＯＪＥＣＴＳ，Ｓｍｉｔｈ，ｅｄ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３），ＣＯＭＰＵＴＥＲ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＯＦ  ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＤＡＴＡ，ＰＡＲＴ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ＆Ｇｒｉｆｆｉｎ，ｅｄｓ．，（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４），ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８７），ＳＥＱＵＥＮＣＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＰＲＩＭＥＲ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ＆Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，ｅｄｓ．（Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９１），およびＣａｒｉｌｌｏ＆Ｌｉｐｔｏｎ，ＳＩＡＭ  Ｊ．  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．  ４８：１０７３  （１９８８）を参照。２つの配列の間の同一性または類似性を決定するために広く用いられる方法には、ＧＵＩＤＥ  ＴＯ  ＨＵＧＥ  ＣＯＭＰＵＴＥＲＳ，Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９４）およびＣａｒｉｌｌｏ＆Ｌｉｐｔｏｎ（同上）で開示される方法が含まれるが、それらに限定されない。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータプログラムにコード化（ｃｏｄｉｆｙ）される。２つの配列の間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム方法には、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７  （１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３  （１９９０））、およびＦＡＳＴＤＢ（Ｂｒｕｔｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．  Ａｐｐ．  Ｂｉｏｓｃｉ．  ６：２３７  （１９９０））が含まれるが、それらに限定されない。
【０１０５】
サイレンシング：遺伝子または遺伝子フラグメントのいずれかのプロモーターからターミネーターまでの一方向性および非摂動的な転写は、標的遺伝子の転写後サイレンシングを引き起こし得る。植物における転写後遺伝子サイレンシングのための初期の発現カセットは、転写開始および終結のための調節配列の間に、アンチセンス方向（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第６６１７４９６号；Ｓｈｅｗｍａｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５１０７０６５号）またはセンス方向（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｋｒｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：２９１−２９９，  １９９０）のいずれかに位置付けられた単一の遺伝子フラグメントを含んだ。シロイヌナズナでは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる結果的な転写産物の認識が、二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡの産生をもたらす。ダイサー様（Ｄｃｌ）タンパク質（例えば、Ｄｃｌ４）によるこのｄｓＲＮＡの切断が、２１−ヌクレオチド（ｎｔ）小分子干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡｓ）を生み出す。これらのｓｉＲＮＡｓはアルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーのメンバーを含むタンパク質と複合体化し、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣｓ）を産生する。次にＲＩＳＣｓはヌクレオチド内部切断のために相同なＲＮＡを標的とする。
【０１０６】
さらに効果的なサイレンシングコンストラクトには、センスおよびアンチセンス双方の構成要素が含まれ、ヘアピン構造に折り返されたＲＮＡ分子を産生する（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９５：１３９５９−１３９６４，１９９８）。逆向き反復トランスジーンの発現によって生まれる高いｄｓＲＮＡレベルは、複数のＤｃｌｓの活性を促進するとの仮説が立てられていた。シロイヌナズナにおける組み換えＤｃｌノックアウトの分析によりこの考えは支持され、そしてまたＲＮＡ切断に関わるタンパク質の１つとしてＤｃｌ４が同定された。
【０１０７】
従来のセンス、アンチセンス、および二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡに基づく遺伝子サイレンシングコンストラクトの１つの構成要素は、転写ターミネーターである。国際公開第２００６／０３６７３９号（その全体が本明細書において参考として援用される）において、遺伝子フラグメントが２つの対向する機能的に活性なプロモーターの間に位置している際に、この調節エレメントが使われなくなることが示される。結果的な収束転写が、一方向性の「プロモーターからターミネーター」の転写と少なくとも同等に効果的な遺伝子サイレンシングを引き起こす。短い可変サイズおよび非ポリＡ化のＲＮＡに加えて、ターミネーターフリーカセットは、隣接するプロモーターにまで到達する稀な長い転写産物を産生した。遺伝子フラグメントをプロモーター由来の配列で置き換えることで、遺伝子サイレンシングの程度はさらに向上した。
【０１０８】
ＴＡＬエフェクター（ＴＡＬＥ）は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌によって分泌されるタンパク質であり、高度に可変的な１２番目および１３番目のアミノ酸を除いて高度に保存された３３〜３４アミノ酸の反復配列を含むＤＮＡ結合ドメインの存在によって特徴づけられ、その高度に可変的なアミノ酸は特定のヌクレオチドの認識に強い相互関係を示す。これらのタンパク質は、宿主植物のプロモーター配列に結合し、そして植物遺伝子の発現を活性化することができる。本発明は、望ましい遺伝子の植物への標的型挿入のためにＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの切断ドメインと融合された操作されたＴＡＬエフェクターを使用する。
【０１０９】
組織：食品を生産するために用いられる植物の任意の部分。組織は、ポテトの塊茎、サツマイモの根、またはトウモロコシ植物の種子であり得る。
【０１１０】
転写ターミネーター：本発明の発現ＤＮＡコンストラクトは、一般的には転写開始調節領域から反対側の端に転写終結領域を有する。転写終結領域は、発現を亢進させるｍＲＮＡの安定性について、および／または遺伝子転写産物に付加されるポリＡテールの付加について選択され得る。新生ポリペプチドの翻訳は、任意の３つ組終結コドンがリボソームのＡ部位に入った場合に、終結する。翻訳終結コドンは、ＵＡＡ、ＵＡＧ、およびＵＧＡである。本発明では、転写ターミネーターは、遺伝子、または、さらに好ましくは、遺伝子ではなく遺伝子間のＤＮＡに対応する配列のいずれかに由来する。例えば、ポテトユビキチン遺伝子のターミネーター配列が用いられ得る。
【０１１１】
トランスファーＤＮＡ（Ｔ−ＤＮＡ）：トランスファーＤＮＡは、Ｔ−ＤＮＡまたはＰ−ＤＮＡをそれぞれ作製するためのＴ−ＤＮＡ境界またはＰ−ＤＮＡ境界のいずれかによって縁取られるＤＮＡセグメントである。Ｔ−ＤＮＡはその境界中に含まれるヌクレオチド配列を他のゲノムに組み込むことができるエレメントとして周知の遺伝エレメントである。この点から、Ｔ−ＤＮＡは一般的に２つの「境界」配列に隣接する。本発明の所望のポリヌクレオチドおよび選抜可能なマーカーは、Ｔ−ＤＮＡの左側境界様配列と右側境界様配列との間に位置し得る。Ｔ−ＤＮＡ中に含まれる所望のポリヌクレオチドおよび選抜可能なマーカーは、プロモーターおよびターミネーター調節エレメントのようなその発現、すなわち、所望のポリヌクレオチドまたは選抜可能なマーカーにコードされたＤＮＡ配列の転写および／または翻訳を促進するような、植物特異的（すなわち、ネイティブ）、または外来の様々な異なる核酸に作動可能に連結され得る。
【０１１２】
植物細胞の形質転換：植物細胞のゲノム中に核酸を安定に挿入するプロセス。形質転換は、当該分野で周知の様々な方法を用いて自然条件下または人工条件下で起こり得る。形質転換は、原核性または真核性の宿主細胞に核酸配列を挿入する任意の公知の方法に依存し得、アグロバクテリウム媒介形質転換プロトコル（例えば、「改良形質転換」または「精密育種」）、ウイルス感染、ウィスカー（ｗｈｉｓｋｅｒｓ）、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ポリエチレングリコール処理、熱ショック、リポフェクションおよびパーティクルボンバードメントを含み得る。
【０１１３】
トランスジェニック植物：本発明のトランスジェニック植物は、外因性の核酸が安定に組み込まれた少なくとも１つの細胞ゲノムを含む植物である。本発明によれば、トランスジェニック植物は、１つのみの遺伝的に改変された細胞および細胞ゲノムを含む植物であるか、または、いくつかの遺伝的に改変された細胞を含む植物であるか、または、その全ての細胞が遺伝的に改変された植物である。本発明のトランスジェニック植物は、所望のポリヌクレオチド、すなわち、外因性の核酸の、植物の特定の部分においてのみの発現を含む植物であり得る。したがって、トランスジェニック植物は、その構造の特定の部分に遺伝的に改変された細胞のみを含み得る。
【０１１４】
バリアント（ｖａｒｉａｎｔ）：本明細書で使用される「バリアント」は、特定の遺伝子またはタンパク質の、スタンダード、または与えられたヌクレオチドまたはアミノ酸配列から逸れたヌクレオチドまたはアミノ酸配列を意味すると理解される。「アイソフォーム」「アイソタイプ」および「アナログ」の用語もまた、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「バリアント」形態をいう。１つ以上のアミノ酸の付加、欠損または置換により変更されたアミノ酸配列、あるいはヌクレオチド配列の変化は、「バリアント」配列と考えられ得る。バリアントには、「保存的」変化があり得、ここで、置換されるアミノ酸は類似の構造的または化学的なプロパティーを有する（例えば、ロイシンとイソロイシンとの置き換え）。バリアントには、「非保存的」変化があり得る（例えば、グリシンとトリプトファンとの置き換え）。アナログのマイナーバリアントはまた、アミノ酸の欠失または挿入、あるいはその両方も含み得る。どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失され得るかの決定の指針は、当該分野で周知であるコンピュータプログラム（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  （ＩｎｆｏｒＭａｘ，  ＭＤ）ソフトウェア）を用いて見つけられ得る。「バリアント」はまた、「シャッフルドジーン」（例えば、Ｍａｘｙｇｅｎに譲渡された特許において説明されるバリアント）もいう。
【０１１５】
本発明では標的型トランスファーＤＮＡ挿入技術を例示するために主にＴＡＬを用いているが、メガヌクレアーゼ（Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１（１１）：２９５２−２９６２  （２００３））、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（Ｐｏｒｔｅｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００（５６２０）：７６３  （２００３）；Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３（６０５１）：１８４３−６  （２０１１））、およびＣＲＩＳＰＥＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７（６０９６）：８１６−２１  （２０１２）；Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８（９）：７２５−６  （２０１３））を含む、他のエンドヌクレアーゼに基づくゲノム編集酵素もまた使用され得ることが理解される。その点に関して、実施例１５で、本明細書で説明される標的型トランスファーＤＮＡ挿入技術のためのＣａｓ９の使用の成功が例示されている。
【０１１６】
本発明は、本明細書で説明される特定の方法論、プロトコル、ベクター、および試薬等は変化し得るので、それらに限定されないことが理解される。本明細書で使用される用語法は、特定の実施態様を説明する目的で用いられるのみであり、そして本発明の範囲を限定することを意図するものではないこともまた理解される。本明細書および添付される特許請求の範囲で用いられる、単数形「ａ」「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が異なる意味を明らかに要求していない限り、複数形の意味内容を含むことに注意されるべきである。したがって、例えば、「遺伝子（ａ  ｇｅｎｅ）」についての言及は、１つ以上の遺伝子への言及であり、そして当業者に公知であるその等価物等を含む。実際に、当業者は本明細書で説明される方法を、任意のネイティブな遺伝子（現在知られている、または今後知られる）を植物宿主システム中で発現させるために使用することができる。
【０１１７】
以下の例は、本発明の特定の、そして好ましい実施態様の代表として述べられる。これらの例は、どのような形であれ本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の意図および範囲の中にあるままに、多数のバリエーションまたは改変が行われ得ることが理解されるべきである。
【０１１８】
追加の実施態様
実施態様１−所望のポリヌクレオチドを植物ゲノム中に安定に組み込む方法であって、以下：
（Ａ）標的配列を認識するように設計されたＴＡＬタンパク質またはＣＲＩＳＰＲタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む第一のベクターにより植物材料を形質転換する工程；
（Ｂ）第二のベクターにより該植物材料を形質転換する工程であって、該第二のベクターは、（ｉ）プロモーターに作動可能に連結されていないマーカー遺伝子（「プロモーターフリーマーカーカセット」）であって、該標的配列と相同な配列を含むマーカー遺伝子；および（ｉｉ）所望のポリヌクレオチドを含む、工程；ならびに
（Ｃ）該所望のポリヌクレオチドが安定に組み込まれた、形質転換された植物材料を同定する工程、
を含む、方法。
【０１１９】
実施態様２−前記形質転換された植物材料は、形質転換された前記植物中の前記マーカー遺伝子の存在または不存在を反映する条件に曝露される、実施態様１に記載の方法。
【０１２０】
実施態様３−前記マーカー遺伝子は除草剤抵抗性遺伝子であり、そして、前記形質転換された植物材料は除草剤に曝露される、実施態様１〜２のいずれかに記載の方法。
【０１２１】
実施態様４−前記除草剤耐性遺伝子はＡＬＳ遺伝子である、実施態様１〜３のいずれかに記載の方法。
【０１２２】
実施態様５−前記プロモーターフリーマーカーカセットは前記植物ゲノム中に安定に組み込まれる、実施態様１〜４のいずれかに記載の方法。
【０１２３】
実施態様６−植物中への外因性ＤＮＡの標的型挿入の方法であって、以下の工程：
（ｉ）（Ａ）プロモーターレスカセットを含む第一のバイナリーベクターであって、該プロモーターレスカセットは（ｂ）Ｕｂｉ７イントロン５’−非翻訳領域の部分配列に連結された（ａ）右側境界配列；（ｃ）変異型アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子と融合されたＵｂｉ７単量体コード配列；（ｄ）所望のヌクレオチド配列；および（ｅ）ターミネーター配列を含み、該所望のヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結されていない、第一のバイナリーベクター；および
（Ｂ）（ａ）右側境界；（ｂ）フォワード発現カセットおよびリバース発現カセットであって、各々が強力で構成的なプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された改変ＴＡＬエフェクターまたはＣａｓ９を含む、フォワード発現カセットおよびリバース発現カセット；および（ｃ）イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）をコードする配列を含む第二のバイナリーベクターであって、該改変ＴＡＬエフェクターまたはＣａｓ９はポテトのユビキチン−７（Ｕｂｉ７）遺伝子のイントロン内の該所望のヌクレオチド配列に結合するように設計される、第二のバイナリーベクターによって、単離された植物細胞を形質転換する工程；ならびに
（ｉｉ）該単離された植物細胞を、該所望のヌクレオチド配列を発現する植物の成長を促進するような条件下で培養する工程を含み、
ここで、ベクター骨格のＤＮＡは該植物ゲノム中に恒久的に挿入されない、方法。
【０１２４】
実施態様７−前記改変ＴＡＬエフェクターは（ａ）Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼ触媒ドメインを含む短縮Ｃ−末端活性化ドメイン；（ｂ）前記Ｕｂｉ７の５’−非翻訳イントロン配列と対応する１６．５回の反復可変二残基を含むコドン最適化された標的配列結合ドメイン；および（ｃ）ＳＶ４０核局在化配列を含むＮ−末端領域を含む、実施態様６に記載の方法。
【０１２５】
実施態様８−前記所望のポリヌクレオチド配列は、アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）、ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）、および液胞インベルターゼ（Ｉｎｖ）遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を標的とするサイレンシングカセットである、実施態様６〜７のいずれかに記載の方法。
【０１２６】
実施態様９−前記第一のバイナリーベクターは、ネイティブのプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された疫病抵抗性遺伝子Ｖｎｔ１をさらに含む、実施態様６〜８のいずれかに記載の方法。
【０１２７】
実施態様１０−形質転換された植物であって、そのゲノム中に、外因性ターミネーター配列に作動可能に連結された所望の外因性ヌクレオチド配列に作動可能に連結された内因性Ｕｂｉ７プロモーターを含む、形質転換された植物。
【０１２８】
実施態様１１−アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）、ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）、および液胞インベルターゼ（Ｉｎｖ）遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子の発現がダウンレギュレートされる、実施態様１０に記載の形質転換された植物。
【０１２９】
実施態様１２−前記植物は疫病抵抗性遺伝子Ｖｎｔ１をさらに発現する、実施態様１０〜１１のいずれかに記載の形質転換された植物。
【０１３０】
実施態様１３−前記植物は塊茎を有する植物である、実施態様１０〜１２のいずれかに記載の形質転換された植物。
【０１３１】
実施態様１４−前記塊茎を有する植物はポテト植物である、実施態様１０〜１３のいずれかに記載の形質転換された植物。
【０１３２】
実施態様１５−前記植物は、疫病抵抗性、黒斑傷耐性、低温誘導性甘味化の低減および塊茎中のアスパラギンレベルの低減の１つ以上により特徴づけられる表現型を有する、実施態様１０〜１４のいずれかに記載の形質転換された植物。
【０１３３】
実施態様１６−実施態様１０〜１５のいずれかに記載の形質転換された植物の熱加工製品。
【０１３４】
実施態様１７−前記製品はフレンチフレイ、チップ、クリスプ、ポテト、乾燥ポテトまたは焼きポテトである、実施態様１６に記載の熱加工製品。
【０１３５】
実施態様１８−前記熱加工製品は、同種の形質転換されていない植物の熱加工製品よりも低いレベルのアクリルアミドを有する、実施態様１６または１７に記載の熱加工製品。
【０１３６】
実施態様１９−所望の配列に結合するように設計された改変ＴＡＬエフェクターであって、（ａ）触媒ドメインを含む短縮Ｃ−末端活性化ドメイン；（ｂ）コドン最適化され、５’−非翻訳イントロン配列に結合するように設計された標的配列結合ドメイン；および（ｃ）核局在化配列を含むＮ−末端領域を含む、改変ＴＡＬエフェクター。
【０１３７】
実施態様２０−前記改変ＴＡＬエフェクターはポテトのユビキチン−７（Ｕｂｉ７）遺伝子のイントロン内の前記所望の配列に結合するように設計される、実施態様１９に記載の改変ＴＡＬエフェクター。
【０１３８】
実施態様２１−（ａ）前記Ｃ−末端活性化ドメイン中の前記触媒ドメインは、Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼを含み；（ｂ）前記標的配列結合ドメインは、Ｕｂｉ７の５’−非翻訳イントロン配列と対応する１６．５回の反復可変二残基を含み；そして（ｃ）前記Ｎ−末端領域中の前記核局在化配列はＳＶ４０核局在化配列である、実施態様１９または２０に記載の改変ＴＡＬエフェクター。
【０１３９】
実施態様２２−（ａ）右側境界；（ｂ）フォワード発現カセットおよびリバース発現カセットであって、各々が強力で構成的なプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された実施態様１９〜２１のいずれかに記載の改変ＴＡＬエフェクターをコードする、フォワード発現カセットおよびリバース発現カセット；ならびに（ｃ）イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）をコードする配列を含むバイナリーベクター。
【０１４０】
実施態様２３−プロモーターレスカセットを含むＤＮＡコンストラクトであって、該プロモーターレスカセットは、（ｂ）Ｕｂｉ７の５’−非翻訳イントロン部分配列に連結された（ａ）右側境界配列；（ｃ）変異型アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子と融合されたＵｂｉ７単量体コード配列；（ｄ）所望のヌクレオチド配列；（ｅ）ターミネーター配列；および（ｆ）左側境界を含み、該所望のヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結されていない、ＤＮＡコンストラクト。
【０１４１】
実施態様２４−前記所望のヌクレオチド配列は、アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）、ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）、および液胞インベルターゼ（Ｉｎｖ）遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を標的とするサイレンシングカセットである、実施態様２３に記載のＤＮＡコンストラクト。
【０１４２】
実施態様２５−前記ＤＮＡコンストラクトは、ネイティブのプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された疫病抵抗性遺伝子Ｖｎｔ１をさらに含む、実施態様２３または２４に記載のＤＮＡコンストラクト。
【０１４３】
実施態様２６−植物への外因性のＤＮＡの標的型挿入のためのキットであって、以下：
（Ａ）プロモーターレスカセットを含む第一のバイナリーベクターであって、該プロモーターレスカセットは、（ｂ）Ｕｂｉ７イントロン５’−非翻訳領域の部分配列に連結された（ａ）右側境界配列；（ｃ）変異型アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子と融合されたＵｂｉ７単量体コード配列；（ｄ）所望のヌクレオチド配列；および（ｅ）ターミネーター配列を含み、該所望のヌクレオチド配列はプロモーターに作動可能に連結されていない、第一のバイナリーベクター；および
（Ｂ）（ａ）右側境界；（ｂ）フォワード発現カセットおよびリバース発現カセットであって、各々が強力で構成的なプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された改変ＴＡＬエフェクターまたはＣａｓ９を含む、フォワード発現カセットおよびリバース発現カセット；および（ｃ）イソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）をコードする配列を含む第二のバイナリーベクターであって、該改変ＴＡＬエフェクターまたはＣａｓ９は、ポテトのユビキチン−７（Ｕｂｉ７）遺伝子のイントロン内の該所望のヌクレオチド配列に結合するように設計される、第二のバイナリーベクター
を含む、キット。
【０１４４】
実施態様２７−前記改変ＴＡＬエフェクターは、（ａ）Ｆｏｋ１エンドヌクレアーゼ触媒ドメインを含む短縮Ｃ−末端活性化ドメイン；（ｂ）Ｕｂｉ７の５’−非翻訳イントロン配列と対応する１６．５回の反復可変二残基を含むコドン最適化された標的配列結合ドメイン；および（ｃ）ＳＶ４０核局在化配列を含むＮ−末端領域を含む、実施態様２６に記載のキット。
【０１４５】
実施態様２８−前記所望のヌクレオチド配列は、アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）、ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）、および液胞インベルターゼ（Ｉｎｖ）遺伝子からなる群より選択される１つ以上の遺伝子を標的とするサイレンシングカセットである、実施態様２６または２７に記載のキット。
【０１４６】
実施態様２９−前記第一のバイナリーベクターは、ネイティブのプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された疫病抵抗性遺伝子Ｖｎｔ１をさらに含む、実施態様２６〜２８のいずれかに記載のキット。
【０１４７】
実施態様３０−植物ゲノムへのトランスファーＤＮＡの標的型挿入の方法であって、１つ以上のベクターにより植物材料を形質転換する工程を含み、該１つ以上のベクターは以下：
該植物ゲノムの標的とされる遺伝子座の５’非翻訳イントロン配列内に、二本鎖ＤＮＡ断裂を選択的に導入するエンドヌクレアーゼに基づく酵素をコードする第一の遺伝カセット、および
（ａ）プロモーターを含まず、（ｂ）所望の遺伝子配列を含み、そして（ｃ）該エンドヌクレアーゼに基づく酵素により導入される該二本鎖ＤＮＡ断裂の相同組み換えに基づく修復を媒介する相同な配列を含む、第二の遺伝カセット、を含み、
ここで、該形質転換された植物は該所望の遺伝子配列を含み、該所望の遺伝子配列は、該標的とされた遺伝子座に選択的に挿入され、５’非翻訳イントロン配列と関係するプロモーターに作動可能に連結される、方法。
【０１４８】
実施態様３１−前記エンドヌクレアーゼに基づく酵素はＴＡＬエフェクターである、実施態様３０に記載の方法。
【０１４９】
実施態様３２−前記エンドヌクレアーゼに基づく酵素はＣａｓ９である、実施態様３０に記載の方法。
【０１５０】
実施態様３３−前記標的とされる遺伝子座はポテトのユビキチン−７（Ｕｂｉ７）遺伝子である、実施態様３０〜３２のいずれかに記載の方法。
【０１５１】
実施態様３４−標的とされた遺伝子座に挿入された前記所望の遺伝子配列の発現によって付与される表現型に基づいて前記形質転換された植物を選抜する工程をさらに含む、実施態様３０〜３３のいずれかに記載の方法。
【０１５２】
実施態様３５−５’から（ｆｏｒｍ）３’に、外因性ターミネーターに作動可能に連結された外因性遺伝子配列に作動可能に連結された内因性プロモーターを含む改変された植物ゲノムを含む、実施態様３０〜３４のいずれかに記載の方法によって得られた形質転換された植物。
【０１５３】
実施態様３６−プロモーターレス遺伝カセットに連結された右側境界配列を含むトランスファーＤＮＡをコードする、実施態様３０〜３４のいずれかに記載の方法に適切なベクターであって、該プロモーターレス遺伝カセットは、前記標的とされた遺伝子座に挿入され、そして前記５’非翻訳イントロン配列に関係するプロモーターに作動可能に連結された場合に、タンパク質またはＲＮＡ転写産物を発現させる、ベクター。
【実施例】
【０１５４】
実施例
実施例１：標的型挿入の方法
好ましい遺伝子挿入の標的部位は、ポテトのユビキチン−７（Ｕｂｉ７）遺伝子の非翻訳５’−リーダー領域に位置するイントロンの内部である。ポテトは４倍体であり、この遺伝子を４コピー含んでいる；これらのコピーは同一またはほぼ同一である。Ｕｂｉ７遺伝子は、ほぼ構成的に高いレベルで発現しており、転写活性を促進する領域内にそれらが存在していることが示唆される。したがって、トランスファーＤＮＡ内に位置する配列は、効果的に発現させられることが期待される。さらに、Ｕｂｉ７遺伝子の１つへの挿入による不活性化は、ポテトが該遺伝子の機能的に活性な３コピーを依然として含むため、いかなる質的問題も、農業的問題ももたらさないことが期待される。
【０１５５】
ＤＮＡセグメントを、以下の工程に従って、ユビキチン−７遺伝子のイントロン配列内に挿入した：
（１）ＴＡＬエフェクターを、（ａ）分枝部位（コンセンサス＝ＣＵ（Ａ／Ｇ）Ａ（Ｃ／Ｕ））、ピリミジンリッチ（＝ＡＴリッチ）配列、およびイントロン／エキソンジャンクション（コンセンサス＝ＣＡＧＧ）を含む領域から約２５−ｂｐより上流側、ならびに（ｂ）エキソン／イントロンジャンクション（コンセンサス＝ＡＧＧＴ）のスプライスドナー部位から約５０−ｂｐより下流側の、イントロン中の配列に結合するように設計した。
（２）植物細胞でのＴＡＬエフェクターの一過的な発現のためにバイナリーバクターを作製した。このベクターは（ａ）１つの右側境界（ただし左側境界は含まない）；（ｂ）強力な構成的プロモーターに作動可能に連結された２つのＴＡＬエフェクター遺伝子；および（ｃ）サイトカイニン産生に関わるイソペンテニルトランスフェラーゼ（ｉｐｔ）遺伝子の発現カセットを含む。安定な形質転換は、ベクター全体の組み込みをもたらし、そして次に、サイトカイニンを過剰発現して根を産生できない発育阻止シュートの生産をもたらすため、安定な形質転換を選抜することができる。
（３）第二のバイナリーベクターを、以下の境界に縁取られたポテト由来の遺伝エレメントを含むトランスファーＤＮＡを用いて、安定な形質転換のために作製した。：（ａ）右側境界；（ｂ）標的とされるＴＡＬ結合部位の間の配列から始まる、Ｕｂｉ７プロモーターのイントロンの部分；（ｃ）Ｕｂｉ７単量体コード配列；（ｄ）スルホニルウレア、イミダゾリノン、トリアゾロピリミジン、ピリミジニルオキシ安息香酸、およびスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノンを含む群から選択される少なくとも１つのＡＬＳ阻害剤に対して非感受性である改変アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子；（ｅ）ユビキチン−３遺伝子のターミネーター；（ｆ）アスパラギンシンターゼ１（Ａｓｎ１）、ポリフェノールオキシダーゼ（Ｐｐｏ）、および液胞インベルターゼ（Ｉｎｖ）遺伝子を標的とするサイレンシングカセット；（ｇ）ネイティブプロモーターおよびターミネーター配列に作動可能に連結された疫病抵抗性遺伝子Ｖｎｔ１；ならびに（ｈ）左側境界。ベクター骨格は、Ｅ．  ｃｏｌｉおよびＡ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓにおける維持および選抜に必要とされる配列のほかに、ｉｐｔ遺伝子の発現カセットを含む。
（４）前記２つのバイナリーベクターを、Ａ．  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＡＧＬ−１系統に別々に導入した。
（５）ポテト茎移植片を、工程（４）の２つの系統に共感染させ、そして次に２日間共培養した。
（６）移植片を、アグロバクテリウムを死滅させる選抜薬品を含有する培地に移動させた。
（７）形質転換の２週間後、前記移植片をＡＬＳ阻害剤をまた含有する培地に再び移動させた。
（８）続く３か月のうちに移植片から生じた除草剤耐性シュートを、根−誘導培地に移動させ、そしてＵｂｉ７プロモーターおよび改変ＡＬＳ遺伝子との間のジャンクションの存在についてＰＣＲによって分析した。再生された植物のうちの少なくとも８０％がそのようなジャンクションを含んでいた。
（９）ＰＣＲ陽性植物を再生させ、増殖させ、ならびに疫病抵抗性、塊茎のアスパラギンレベルの低減、黒斑傷耐性、および低温誘導性甘味化の低減について評価した。
【０１５６】
以下の例は、本方法の局面を説明する。
【０１５７】
実施例２：イマザモックス殺草曲線アッセイ（ｅｓｓａｙ）
形質転換されていないポテト細胞を死滅させるために必要なイマザモックスの濃度を決定するために、Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ節間茎移植片を、バイナリーベクターｐＳＩＭ１３３１で形質転換した。このベクターは、（ａ）境界の間に挿入された選抜可能マーカー遺伝子ｎｐｔＩＩの発現カセットおよび（ｂ）ｉｐｔ遺伝子の発現カセットを骨格に含む。形質転換を媒介するために用いた系統はアグロバクテリウム系統ＬＢＡ４４０４であり、０．２のＯＤ６００まで増大させた。１０分間の接種期間に続いて、移植片を共培養培地に移動させ、そしてフィルターされた光の下で２４℃のＰｅｒｃｉｖａｌグロースチャンバ内に４８時間配置した。節間移植片を、抗生物質チメンチンは含むがイマザモックスを欠くホルモンフリー培地（ＨＦＭ）に移動させた。ペトリ皿を、２４℃および１６時間光周期のＰｅｒｃｉｖａｌグロースチャンバ中に配置した。
【０１５８】
２週間後、節間移植片を、チメンチンならびに５種類の処理濃度（０、０．５、１．０、１．５および２．０ｍｇ／ｌ）の植物選抜除草剤イマザモックスを含むＨＦＭに移動させた。それぞれの処置は３回の反復からなり、それぞれの反復はペトリ皿あたり〜２０の節間移植片を含む。ペトリ皿を、２４℃および１６時間光周期のＰｅｒｃｉｖａｌグロースチャンバ内に配置した。節間移植片を、２週間ごとにそれぞれの処理濃度のイマザモックスを含む新鮮なＨＦＭに継代培養し、シュートの任意の再生を促進、そして任意のアグロバクテリウムの過成長を低減させた。
【０１５９】
全てのイマザモックス処理濃度において、少数の節間移植片がいくつかのＩｐｔ成長点（ｍｅｒｉｓｔａｍａｔｉｃ）カルス成長および初期シュート形成を示したことが、結果により示された。しかしながら、完全に発達した正常なシュートは、どのイマザモックス処理濃度においても生じなかった。これらの結果に基づき、２．０ｍｇ／ｌ  イマザモックスがインビトロの選抜に最適な濃度であると決定した。最適な濃度は、細胞の成長をある程度まで許容し、しかし完全に発達したシュートの再生は許容しない選抜薬品の濃度として定義する。
【０１６０】
共培養培地は、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）および６．０ｇ／ｌ  寒天（Ｓ２０４００；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）を有する０．４４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含み、そして、５．７のｐＨを有していた。
【０１６１】
ホルモンフリー培地（ＨＦＭ）は、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）、３００ｍｇ／ｌ  チメンチンおよび２．０ｇ／ｌ  Ｇｅｌｚａｎ（Ｇ０２４；Ｃａｉｓｓｏｎ）を有する４．４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含み、そして、５．７のｐＨを有していた。
【０１６２】
実施例３：形質転換および茎移植片からのポテト植物の再生
単一系統アプローチ
（１）Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１５ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）および２．０ｇ／ｌ  Ｇｅｌｚａｎ（Ｇ０２４；Ｃａｉｓｓｏｎ）を有するｐＨ５．７の２．２２ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含むストック培地上で生育する３〜４週齢インビトロＲａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔポテト植物を用いた。
【０１６３】
（２）葉および節切片を除去し、そして、節間茎の部分を単離した。節間茎の部分を３〜５ｍｍの移植片切片に切断し、そして、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、および３０ｇ／ｌスクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）を有するｐＨ５．７の４．４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含む１５ｍｌのＭＳ液体培地中に配置した。
【０１６４】
（３）バイナリーベクターＴＡＬエフェクターカセットおよびバイナリーベクター目的遺伝子カセットを含むシングルコロニーに由来するアグロバクテリウム（ＬＢＡ４４０４）を、振盪インキュベーター中の２８℃のルリア培地で一晩育てた。翌日、細菌溶液をペレット化し、そしてＭＳ液体培地中で０．２のＯＤ６００に再懸濁した。
【０１６５】
（４）茎移植片を、室温で１０分間細菌溶液中でインキュベートし、そして、細菌の余剰を除去するために滅菌したろ紙上で吸い取って乾燥させた。
【０１６６】
（５）接種した茎移植片を、Ｐｅｒｃｉｖａｌグロースチャンバ中で４８時間フィルターされた光の下で共培養培地上に選抜無しで配置した。共培養培地は、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）および６．０ｇ／ｌ  寒天（Ｓ２０４００；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）を有するｐＨ５．７の０．４４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含んでいた。
【０１６７】
（６）前記茎移植片を、抗生物質（チメンチン）を含むが植物選抜は含まないカルス誘導ホルモン培地（ＣＩＨＭ）またはホルモンフリー培地（ＨＦＭ）のいずれかに移動させた。ペトリ皿を、２４℃および１６時間光周期のＰｅｒｃｉｖａｌグロースチャンバ内に配置した。ＣＩＨＭは、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）、２．５ｍｇ／ｌ  ゼアチンリボシド、０．１ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、３００ｍｇ／ｌ  チメンチンおよび６．０ｇ／ｌ  寒天（Ｓ２０４００；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）を有するｐＨ５．７の４．４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含んでいた。ＨＦＭは、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）、３００ｍｇ／ｌ  チメンチンおよび２．０ｇ／ｌ  Ｇｅｌｚａｎ（Ｇ０２４；Ｃａｉｓｓｏｎ）を有するｐＨ５．７の４．４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含んでいた。
【０１６８】
（７）２週間後、前記茎移植片を、抗生物質（チメンチン）および植物選抜を含むカルス誘導ホルモン培地（ＣＩＨＭ）またはホルモンフリー培地に移動させた。ペトリ皿を、２４℃および１６時間光周期のＰｅｒｃｉｖａｌグロースチャンバ内に配置した。ＣＩＨＭは、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）、２．５ｍｇ／ｌ  ゼアチンリボシド、０．１ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、３００ｍｇ／ｌ  チメンチン、２．０ｍｇ／ｌ  イマザモックスおよび６．０ｇ／ｌ  寒天（Ｓ２０４００；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）を有するｐＨ５．７の４．４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含んでいた。ＨＦＭは、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）、３００ｍｇ／ｌ  チメンチン、２．０ｍｇ／ｌ  イマザモックスおよび２．０ｇ／ｌ  Ｇｅｌｚａｎ（Ｇ０２４；Ｃａｉｓｓｏｎ）を有するｐＨ５．７の４．４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含んでいた。
【０１６９】
（８）形質転換の４週間後、前記茎移植片を、抗生物質（チメンチン）および植物選抜を含むシュート誘導ホルモン培地（ＳＩＨＭ）またはホルモンフリー培地に移動させた。ペトリ皿を、２４℃および１６時間光周期のＰｅｒｃｉｖａｌグロースチャンバ内に配置した。茎移植片を、シュートの完全な再生を促進するために、２〜４週間ごとに新鮮なＳＩＨＭまたはＨＦＭに継代培養した。ＳＩＨＭは、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）、２．５ｍｇ／ｌ  ゼアチンリボシド、０．３ｍｇ／ｌ  ＧＡ３、３００ｍｇ／ｌ  チメンチン、２．０ｍｇ／ｌ  イマザモックスおよび６．０ｇ／ｌ  寒天（Ｓ２０４００；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）を有するｐＨ５．７の４．４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含んでいた。ＨＦＭは、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）、３００ｍｇ／ｌ  チメンチン、２．０ｍｇ／ｌ  イマザモックスおよび２．０ｇ／ｌ  Ｇｅｌｚａｎ（Ｇ０２４；Ｃａｉｓｓｏｎ）を有するｐＨ５．７の４．４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含んでいた。
【０１７０】
（９）完全に発達したシュートを、その後の試験および分析のために増殖させた。
【０１７１】
実施例４：形質転換および茎移植片からのポテト植物の再生
二系統アプローチ
（１）Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１５ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）および２．０ｇ／ｌ  Ｇｅｌｚａｎ（Ｇ０２４；Ｃａｉｓｓｏｎ）を有するｐＨ５．７の２．２２ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含むストック培地上で生育する３〜４週齢インビトロＲａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔポテト植物を用いた。
【０１７２】
（２）葉および節切片を除去し、そして、節間茎の部分を単離した。節間茎の部分を３〜５ｍｍの移植片切片に切断し、そして、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、および３０ｇ／ｌスクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）を有するｐＨ５．７の４．４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含む１５ｍｌのＭＳ液体培地中に配置した。
【０１７３】
（３）ＴＡＬエフェクターカセットを含むバイナリーベクターを含むシングルコロニー、および目的遺伝子カセットを含むバイナリーベクターを含む他のシングルコロニーに、それぞれ由来する２つの別のアグロバクテリウム系統（ＬＢＡ４４０４）を、振盪インキュベーター中の２８℃のルリア培地で一晩育てた。翌日、それぞれ別の細菌溶液をペレット化し、そしてＭＳ液体培地中で０．２のＯＤ６００に再懸濁した。
【０１７４】
（４）茎移植片を、それぞれの細菌溶液の同体積からなる１つに組み合わせた細菌溶液中で、室温で１０分間インキュベート（共形質転換）し、そして、細菌の余剰を除去するために滅菌したろ紙上で吸い取って乾燥させた。
【０１７５】
（５）接種した茎移植片を、Ｐｅｒｃｉｖａｌグロースチャンバ中で４８時間フィルターされた光の下で共培養培地上に選抜無しで配置した。共培養培地は、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）および６．０ｇ／ｌ  寒天（Ｓ２０４００；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）を有するｐＨ５．７の０．４４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含んでいた。
【０１７６】
（６）前記茎移植片を、抗生物質（チメンチン）を含むが植物選抜は含まないカルス誘導ホルモン培地（ＣＩＨＭ）またはホルモンフリー培地（ＨＦＭ）のいずれかに移動させた。ペトリ皿を、２４℃および１６時間光周期のＰｅｒｃｉｖａｌグロースチャンバ内に配置した。ＣＩＨＭは、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）、２．５ｍｇ／ｌ  ゼアチンリボシド、０．１ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、３００ｍｇ／ｌ  チメンチンおよび６．０ｇ／ｌ  寒天（Ｓ２０４００；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）を有するｐＨ５．７の４．４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含んでいた。ＨＦＭは、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）、３００ｍｇ／ｌ  チメンチンおよび２．０ｇ／ｌ  Ｇｅｌｚａｎ（Ｇ０２４；Ｃａｉｓｓｏｎ）を有するｐＨ５．７の４．４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含んでいた。
【０１７７】
（７）２週間後、前記茎移植片を、抗生物質（チメンチン）および植物選抜を含むカルス誘導ホルモン培地（ＣＩＨＭ）またはホルモンフリー培地に移動させた。ペトリ皿を、２４℃および１６時間光周期のＰｅｒｃｉｖａｌグロースチャンバ内に配置した。ＣＩＨＭは、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）、２．５ｍｇ／ｌ  ゼアチンリボシド、０．１ｍｇ／ｌ  ＮＡＡ、３００ｍｇ／ｌ  チメンチン、２．０ｍｇ／ｌ  イマザモックスおよび６．０ｇ／ｌ  寒天（Ｓ２０４００；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）を有するｐＨ５．７の４．４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含んでいた。ＨＦＭは、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）、３００ｍｇ／ｌ  チメンチン、２．０ｍｇ／ｌ  イマザモックスおよび２．０ｇ／ｌ  Ｇｅｌｚａｎ（Ｇ０２４；Ｃａｉｓｓｏｎ）を有するｐＨ５．７の４．４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含んでいた。
【０１７８】
（８）形質転換の４週間後、前記茎移植片を、抗生物質（チメンチン）および植物選抜を含むシュート誘導ホルモン培地（ＳＩＨＭ）またはホルモンフリー培地に移動させた。ペトリ皿を、２４℃および１６時間光周期のＰｅｒｃｉｖａｌグロースチャンバ内に配置した。茎移植片を、シュートの完全な再生を促進するために、２〜４週間ごとに新鮮なＳＩＨＭまたはＨＦＭに継代培養した。ＳＩＨＭは、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）、２．５ｍｇ／ｌ  ゼアチンリボシド、０．３ｍｇ／ｌ  ＧＡ３、３００ｍｇ／ｌ  チメンチン、２．０ｍｇ／ｌ  イマザモックスおよび６．０ｇ／ｌ  寒天（Ｓ２０４００；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）を有するｐＨ５．７の４．４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含んでいた。ＨＦＭは、Ｇａｍｂｏｒｇビタミン（Ｍ４０４；ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、３０ｇ／ｌ  スクロース（Ｓ２４０６０；Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．）、３００ｍｇ／ｌ  チメンチン、２．０ｍｇ／ｌ  イマザモックスおよび２．０ｇ／ｌ  Ｇｅｌｚａｎ（Ｇ０２４；Ｃａｉｓｓｏｎ）を有するｐＨ５．７の４．４４ｇ／ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ改良基礎培地を含んでいた。
【０１７９】
（９）完全に発達したシュートを、その後の試験および分析のために増殖させた。
【０１８０】
実施例５：Ｒａｎｇｅｒ、ＢｕｒｂａｎｋおよびＡｔｌａｎｔｉｃ栽培品種ポテトにおける標的部位配列
標的領域（Ｕｂｉ７プロモーターイントロンの５’領域）が異なるポテト栽培品種にわたり保存されているかを判定するため、ＨＤ１７５Ｆ１およびＨＤ１７５Ｒ１（配列番号１および配列番号２）のプライマー対を設計し、そしてＲａｎｇｅｒ、ＢｕｒｂａｎｋおよびＡｔｌａｎｔｉｃ品種ポテト由来の標的領域を増幅するために用いた。増幅したフラグメントをｐＧＥＭＴ−ｅａｓｙベクター中にクローニングし、そして配列決定した。配列決定結果において、前記標的領域は試験された全ての品種について同一であることが示された。前記ｕｂｉ７プロモーターイントロン配列は、配列番号３に表される。
【０１８１】
実施例６：ＴＡＬエフェクターの設計
選択した領域を標的とするように、１組のＴＡＬエフェクターを設計した。フォワードおよびリバースのＴＡＬＥ認識部位は、それぞれ配列番号４および配列番号５として挙げられる。ＴＡＬＥスキャフォールドは、アブラナ科の病原体Ｘ．  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ  ｐｖ．  Ａｒｍｏｒａｃｉａｅ系統５において同定されたＡｖｒＢｓ３ファミリーのメンバーであるＨａｘ３であった。このスキャフォールドにおいて行った改変は、以下を含んだ：（ａ）オリジナルのＨａｘ３のＣ−末端活性化ドメインを短縮した；（ｂ）ＳＶ４０ウイルス由来の核局在化配列を、短縮されたＨａｘ３タンパク質のＮ末端に付加した；（ｃ）オリジナルのＨａｘ３のＤＮＡ配列においてコドン最適化を行った；（ｄ）オリジナルの１１．５回の反復可変二残基（ＲＶＤ）を、標的部位に対応する１６．５回ＲＶＤに置き換えた；（ｅ）Ｆｏｋ１ヌクレアーゼの触媒ドメインを、改変Ｈａｘ３スキャフォールドのＣ−末端に付加した。
【０１８２】
エフェクタータンパク質の構成は図５に示される。最終的なフォワードおよびリバースのＴＡＬＥｓのＤＮＡおよびタンパク質配列は、配列番号６、７、８および９として挙げられる。
【０１８３】
実施例７：ＤＮＡ転移のためのベクター
トランスファーＤＮＡは、ポテト由来の遺伝エレメントからなり、そして、Ｔ−ＤＮＡ様の境界によって縁取られた。トランスファーＤＮＡは左側境界から右側境界までに３つのカセットを含んだ：（ａ）疫病抵抗性カセット；（ｂ）以下の３つの遺伝子を標的とする塊茎特異的サイレンシングカセット：アスパラギン形成に関わるＡＳＮ１遺伝子；スクロースの加水分解に関連する酸性インベルターゼ（ＩＮＶ）遺伝子；および衝撃傷上でポリフェノールを酸化する酵素をコードするポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）遺伝子；ならびに（ｃ）過剰発現された際にＡＬＳ阻害除草剤への抵抗性を付与するとの仮説が立てられていた、プロモーターレスの変異型ポテトアセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）遺伝子（Ｗ５６３ＬおよびＳ６４２Ｉの置換を伴う）。
【０１８４】
トランスファーＤＮＡがポテトの４つのＵｂｉ７遺伝子の１つのリーダー内に位置するイントロン領域に挿入され、それにより、関連するＵｂｉ７プロモーターがＡＬＳ遺伝子の発現を駆動し、そしてＡＬＳ阻害型除草剤に対する抵抗性を付与するように、トランスファーＤＮＡを設計した。
【０１８５】
Ｕｂｉ７単量体はタンパク質安定化に重要な役割を果たしているため、イントロンの部分を前置したコード配列を、ＡＬＳ遺伝子とインフレームに融合した。トランスファーＤＮＡのバイナリーベクターへの挿入により、プラスミドｐＳＩＭ２１６８を作製した。トランスファーＤＮＡの構成は図１に例示されている。野生型および変異型のＡＬＳ遺伝子のＤＮＡおよびタンパク質配列は、配列番号１０、１１、１２および１３に表される。ｐＳＩＭ２１６８中のトランスファーＤＮＡ配列の全体は配列番号１４に表される。
【０１８６】
実施例８：ＴＡＬエフェクターのためのベクター
フォワードまたはリバースのそれぞれのＴＡＬエフェクターは、構成的（３５ｓまたはＦＭＶ）プロモーターによって駆動され、そしてターミネーター（ＮｏｓまたはＯｃｓ）がその後に続き、２つの別の植物発現カセットを形成した。前記２つのカセットをバイナリーベクターにクローニングし、図２に示されるようにｐＳＩＭ２１７０を形成した。このバイナリーベクターは、１つの境界のみを有し、そしてｉｐｔ遺伝子発現カセットを含み、それにより、エフェクター遺伝子の安定な組み込みに対して選抜することが可能となった。
【０１８７】
実施例９：Ｕｂｉ７イントロン５’領域の上流の右側境界がＤＮＡ転移を支援する
主な切断部位としての境界の有効性は、部分的には隣接するＤＮＡ配列に依存性であるため、Ｕｂｉ７イントロン５’領域の上流の右側境界を、ＤＮＡ転移を支援する能力について試験した。この目的のために、Ｕｂｉ７単量体の上流の右側境界／イントロン配列および改変ＡＬＳ遺伝子を含むＤＮＡフラグメントをバイナリーベクターｐＳＩＭ１２３−ＦにクローニングしｐＳＩＭ２１６４を形成した。ベクターｐＳＩＭ１２３−Ｆは選抜可能マーカー遺伝子ｎｐｔＩＩの発現カセットを含んでいたが、このカセットを植物細胞に転移させるのに必要な境界を欠いていた（図３参照）。しかしそれでも、ｐＳＩＭ２１６４を運搬するアグロバクテリウム系統による移植片の感染は、ポジティブコントロール（Ｔ−ＤＮＡ境界中に位置するｎｐｔＩＩ遺伝子を運搬する系統による感染）と移植片あたり同数のカナマイシン抵抗性シュートを生成させた。
【０１８８】
ポテトへのイマザモックス抵抗性の付与における変異型ＡＬＳ遺伝子の効率性を試験するため、Ｕｂｉ７：：ＡＬＳカセット（ｐＳＩＭ２１６２、図４参照）を有するベクターを作製した。このベクターによる形質転換によって、除草剤抵抗性植物が得られ、それらがＵｂｉ７：：ＡＬＳカセットを含むことをＰＣＲによって確認した。
【０１８９】
実施例１０：Ｎ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａにおける一過的形質転換のためのベクター設計
特異的に設計されたＴＡＬＥｓの効率性をインビボで試験するために、標的配列（Ｕｂｉ７イントロンの部分）を有するベクターを設計した。このベクター、ｐＳＩＭ２１６７を、エフェクターを運搬するベクターと共にＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａに共形質転換した。図６に示されるように、標的配列は、ＧＵＳレポーター遺伝子の開始コドンのすぐ下流に位置するフォワードおよびリバースの認識部位を含んでいた。２つの認識配列の間に存在し、そしてＧＵＳコード配列とインフレームにある終止コドンは、ＧＵＳコード配列を不活性にした。ＴＡＬＥｓが設計された認識部位に結合し、そして介在する配列を切断した場合、それに続く修復が時にはリーディングフレームを変更せずに終止コドンを取り除き、それによりＧＵＳの機能が回復されることが期待された。そのような事象は、侵入の約４日後のＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉の組織化学的染色によって可視化することができた。
【０１９０】
標的配列領域はまた、ＴＡＬＥ媒介の変異を同定するために、ＰＣＲ増幅および配列決定することもできる。しかしながら、形質転換の効率が低い可能性があるため、標的配列のダイレクトＰＣＲおよびクローニングは、改変されていない標的配列をもたらし得る。したがって、単離されたＤＮＡを、２つのＴＡＬＥ認識部位の間に位置するＡＧＧＴ制限酵素部位を切断するＡｌｕＩ酵素によって最初に消化した。増幅の後、ＰＣＲ産物を再びＡｌｕＩによって消化し、下流のクローニングおよび配列決定分析のためにさらに変異型標的配列を濃縮した。ＦＭＶ−標的−ＧＵＳ−Ｎｏｓカセットの全体の配列は、配列番号１５に表される。標的配列を増幅するために用いたＰＣＲプライマーは、配列番号１６および配列番号１７に表される。
【０１９１】
実施例１１：アグロバクテリウム形質転換およびＮ．  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ侵入
設計したベクターをアグロバクテリウムＡＧＬ１系統に形質転換し、そしてベクター安定性について試験した。侵入の４から６日後に、被侵入組織由来の葉ディスクをＧＵＳ染色アッセイおよびＤＮＡ単離のために回収した。単離したＤＮＡをＡｌｕＩ酵素によって消化し、そして標的領域増幅ならびにさらにクローニングおよび配列決定のためのテンプレートとして用いた。図７に示されるように、ＧＵＳ染色は共侵入された組織（右のパネル）においては観察されたが、標的ベクター単独で侵入された組織（左のパネル）においては観察されなかった。さらに図８に示される配列決定分析においても、標的配列がＴＡＬＥによって改変されていることが確認された。
【０１９２】
実施例１２：安定な形質転換体の遺伝子型判定
ＨＤ２０８Ｆ１およびＲ１のプライマー対を、除草剤抵抗性形質転換体の遺伝子型判定のために設計した。フォワードプライマーはＵｂｉ７遺伝子のプロモーター領域に位置し、そして、リバースプライマーはＡＬＳコード領域に位置する。トランスファーＤＮＡが設計された位置に挿入された場合にのみ、このプライマー対はフラグメントを増幅するため、このプライマー対は標的型挿入特異的なプライマーである。ｐＳＩＭ２１７０およびｐＳＩＭ２１６８の共形質転換由来の独立した除草剤抵抗性系統のＰＣＲ分析により、フラグメントの増幅を行った。これらのフラグメントをクローニングし、そして配列決定した。図９に示されるように、ＴＡＬＥ１という１つの系統では、フラグメントは、Ｕｂｉ７イントロンの部分、Ｕｂｉ７単量体およびＡＬＳコード領域の部分を含む、ポテトゲノム配列と隣接するトランスファーＤＮＡカセットの部分を含んでいた。配列ブラストにより、隣接するポテトゲノムは７番染色体上に位置するＵｂｉ７様遺伝子のプロモーター領域であることが示され、７番染色体はまた、非常に類似する設計されたＴＡＬＥの認識部位を含む。ＴＡＬＥ２およびＴＡＬＥ３という他の２つの系統では、トランスファーＤＮＡカセットは、トランスファーＤＮＡカセットのイントロン部分が大幅に欠失していることを除いては、ＴＡＬＥ１と同一のゲノム座に挿入された。ＴＡＬＥ２およびＴＡＬＥ３の系統は、ＴＡＬＥ２において９ｂｐの欠失がＵｂｉ７単量体中に存在したことを除いては、非常に類似していた。
【０１９３】
実施例１３：標的型挿入についての安定な形質転換系統の特性評価
上述のデータおよび結果において、意図したＤＮＡセグメントの標的型挿入が成功していることが示された。ｐＳＩＭ２１７０およびｐＳＩＭ２１６８の共形質転換に由来する除草剤抵抗性Ｒａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ（ＲＲ）系統を増殖させ、そして後の試験／分析のために土に移動させた。特に、酵素ポリフェノールオキシダーゼの活性を測定することならびにサイレンシングカセットおよびＶｎｔ１カセットの双方のコピー数についてのサザン分析を行うことによって、疫病病害の感染攻撃に対する抵抗性について形質転換系統を試験した。病害アッセイのために、土中で３週間の小植物体に、病害の症状を発症させるためにＰ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓ  ＵＳ８  ＢＦ６疫病系統を接種した。サザンブロット分析のために、葉組織から単離した３μｇのＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化し、０．７％アガロースゲル上に流し、正に帯電したナイロンメンブレンに移し、そしてサイレンシングカセット中のインベルターゼフラグメントのＤｉｇ標識プローブまたはＶｎｔ１発現カセット中のＶｎｔ１プロモーターのＤｉｇ標識プローブとハイブリダイズさせた。４つの系統を同定し、下記表１に概要を示した。これらの系統は疫病抵抗性（図１１参照）であり、そして両方のカセットのシングルコピーを有していた（図１２参照）。ＲＲ−３６およびＲＲ−３９系統において、ＲＲコントロール系統と比較して増加しているそれぞれのバンドはシングルコピーのトランスジーンの存在を示していた。（系統ＲＲ−２６およびＲＲ−３２についてのデータは示されていない）。
【表１】
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【０１９４】
実施例１４：標的型挿入についての形質転換系統のフィールド実験評価
ｐＳＩＭ２１７０およびｐＳＩＭ２１６８で共形質転換したＲａｎｇｅｒ  Ｒｕｓｓｅｔ（ＲＲ）およびＳｎｏｗｄｅｎ（ＳＮ）の小植物体を、反復のあるフィールド実験において植えた。植物系統を、形質有効性および収量について評価した。Ｓｎｏｗｄｅｎ系統２、１５、５５および８３（図１３参照）ならびにＲａｎｇｅｒ系統２６、３２、３８および３９（図１５参照）は、ポテト塊茎におけるアスパラギンのサイレンシングについて非常に一様であった。加えて、同一のＳＮ系統（図１４参照）およびＲＲ系統（図１６参照）はまた、非常に一様なポリフェノールオキシダーゼ（ＰＰＯ）のサイレンシングを有していた。これらの結果は、標的部位がサイレンシングカセットの一様かつ高い発現を可能にすることを示している。上記のＳＮおよびＲＲ系統からの収量（図１７参照）は、野生型（ＷＴ）および空ベクターのコントロール（２１６２、２３７０）と比較した場合、有意には異ならなかった。この結果は、標的型挿入部位が、収量見込みに対して悪影響を有しないことを示している。
【０１９５】
実施例１５：ＣＡＳ９媒介標的型トランスファーＤＮＡ挿入
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の他に、標的ＤＮＡ配列中にＤＳＢを導入することができるような、ゲノム編集酵素に基づく他のエンドヌクレアーゼ（例えば、メガヌクレアーゼ（Ｅｐｉｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（Ｐｏｒｔｅｕｓ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，２００３）、（Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ  ａｎｄ  Ｖｏｙｔａｓ，２０１１）、およびＣＲＩＳＰＥＲ関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼ（Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ，  Ｃ．＆Ｃａｔｈｏｍｅｎ  ２０１３）が存在する。一旦ＤＳＢが生成されると、植物のＤＮＡ修復機構は、不正確でありための変異を生成して遺伝子のノックアウトが実現される非相同末端連結（ＮＨＥＪ）経路によって、あるいは遺伝子のターゲッティング（遺伝子の置き換えまたは挿入）を実現する相同組み換え（ＨＲ）経路のいずれかによって断裂を修復する（Ｓｙｍｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｇａｕｔｉｅｒ  ２０１１）。したがって、本発明者らのＴＡＬＥＮに基づくＤＮＡ組み込みにおいて用いられたのと類似の戦略が、他のヌクレアーゼに基づくゲノム編集ツールにおいて転用可能である。一例として、操作されたＣＡＳ９エンドヌクレアーゼが、本発明者らのＵｂｉ７イントロンＤＮＡ標的を改変することができることを、本明細書において示す。
【０１９６】
Ｃａｓ９ゲノム編集技術は、２０ｂｐの標的特異的配列および小分子ＲＮＡスキャフォールドを含む小分子キメラＲＮＡを用いて、標的を切断するＣａｓ９ヌクレアーゼをガイドする。コンストラクトｐＳＩＭ４１８７を、２つの発現カセットを含むように設計した（図１８）。第一のカセットは、ＣＡＳ９ヌクレアーゼ発現カセットである。植物コドン最適化されたＣａｓ９は、構成的ＦＭＶプロモーターによって駆動され、そしてＳＶ４０ウイルスの核局在化配列を、タンパク質のＮ末端に付加した。操作されたＣａｓ９のＤＮＡおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１８および配列番号１９に挙げられる。第二のカセットは、構成的３５Ｓプロモーターの制御下で植物細胞内で転写された際にガイドＲＮＡを産生する。ガイドＲＮＡの配列は、配列番号２０に挙げられる。設計されたベクターｐＳＩＭ４１８７を、アグロバクテリウムＡＧＬ１系統に形質転換し、そしてベクター安定性についてチェックした。次に、ｐＳＩＭ４１８７を含むアグロバクテリウムを用いて、上記の例で説明されたＵｂｉ７イントロン標的を含むコンストラクトであるプラスミドｐＳＩＭ２１６７を含むアグロバクテリウムと共に、Ｎ．  Ｂｅｎｔｈａｍｉｎａに共侵入させた。侵入の２から４日後に、被侵入組織由来の葉ディスクを、ＧＵＳ染色アッセイおよびＤＮＡ単離のために回収した。単離したＤＮＡをＡｌｕＩ酵素によって消化し、そして標的領域増幅ならびにさらにクローニングおよび配列決定のためのテンプレートとして用いた。図１９に示されるように、ＧＵＳ染色は共侵入された組織（右のパネル）においては観察されたが、標的ベクター単独で侵入された組織（左のパネル）においては観察されなかった。さらに図２０に示される配列決定分析においても、標的配列がＣａｓ９によって改変されていることが確認された。この改変は、設計されたＴＡＬＥＮによって誘導されるものと非常に類似している。
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図１】
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【図１０】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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