(57)【要約】酵素により生成する一群の求電子性脂肪酸誘導体(electrophilic fatty acid derivative)（ＥＦＡＤ）、または酵素により生成するそれらの代謝産物。ＥＦＡＤおよびそれらの代謝産物は、ヒトの健康に有益な作用をもつ。本発明者らによれば、本発明のケト脂肪酸、または酵素により生成するそれらの代謝産物は、インビボで適応性シグナル伝達分子を生成することにより、炎症を阻害することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記のものを含む医薬配合物：
（ａ）式（Ｉ）または式（ＩＩ）による脂肪酸：
【化１】
2015508065.tif 000014
［式中：
Ｘは、−ＣＨ２−、−ＯＨ、−Ｓ、−ＯＲｔおよび−ＮＲｐＲｑからなる群から選択され；
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−、Ｏ、−Ｓ−、および−ＮＲｐＲｑからなる群から選択され；
Ｗは、−ＯＨ、−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｒｐ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲｐ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＣＮ、ＳＲｕ、ＳＲｐ、−ＳＯ３、−ＳＯ２Ｒｐ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ３＋、−ＮＨ２Ｒｐ＋、−ＮＲｐＲｑＲｔ、ＮＯ２、＝Ｏ、＝ＮＲｐ、＝ＣＦ２、および−ＣＨＦからなる群から選択され；
Ｖは、Ｗが−ＯＨ、−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｒｐ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲｐ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＳＯ３、−ＳＯ２Ｒｐ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ３＋、−ＮＨ２Ｒｐ＋、−ＮＲｐＲｑＲｔおよびＮＯ２からなる群から選択される場合は−ＣＨ−であり、Ｖは、Ｗが＝Ｏ、＝ＮＲｐ、＝ＣＦ２、および＝ＣＨＦからなる群から選択される場合は−Ｃ−であり；
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈおよびｉは、独立して０〜１５（０および１５を含む）の整数であり、その際、ｄが０でない場合はｃは０であり；ｃが０でない場合はｄは０であり；かつ
和（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ）および（ａ＋ｂ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ）は、独立して式２ｎまたは２ｎ＋ｌに従う整数に等しく、その際、ｎは３〜１５（３および１５を含む）の整数であり；
−Ｒｐ、−Ｒｑおよび−Ｒｔは、独立してＨ、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ１−Ｃ８）ヒドロキシアルキルおよび（Ｃ１−Ｃ８）ハロアルキルからなる群から選択され；
−Ｒｕは
【化２】
2015508065.tif 000015
であり；
−Ｒａ、−Ｒａ’、−Ｒｂ、−Ｒｂ’、−Ｒｃ、−Ｒｃ’、−Ｒｄ、および−Ｒｄ’は、独立して−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｒｐ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲｐ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＮ、−ＳＯ３、−ＳＯ２Ｒｐ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ３＋、−ＮＨ２Ｒｐ＋、−ＮＲｐＲｑＲｔおよびＮＯ２からなる群から選択され；
−Ｒａと−Ｒａ’は、同時に非水素基を表わすことはなく；
−Ｒｂと−Ｒｂ’は、同時に非水素基を表わすことはなく；
−Ｒｃと−Ｒｃ’は、同時に非水素基を表わすことはなく；
【化３】
2015508065.tif 000016
は任意に二重結合を示すことができ；
【化４】
2015508065.tif 000017
は任意に存在することができ、存在する場合は
【化５】
2015508065.tif 000018
はＸおよびＹならびにそれらが結合している炭素原子と一緒に５〜６員ヘテロサイクリル環またはヘテロアリール環を表わし；
その際、式（Ｉ）または式（ＩＩ）は下記のものではない：
１３−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１４，１６，１９−ペンタン酸、
１７−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１５，１９−ペンタン酸、
１３−ＯＨ（７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１４，１６，１９−ペンタン酸、
１７−ＯＨ（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１５，１９−ペンタン酸、
１３−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１４，１６，１９−ヘキサン酸、
１７−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１５，１９−ヘキサン酸、
１３−ＯＨ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１４，１６，１９−ヘキサン酸、または
１７−ＯＨ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１５，１９−ヘキサン酸；
これらにおいて、ＡはＥまたはＺのいずれかの立体配置を示す］；
ならびに
（ｂ）医薬的に許容できるキャリヤー。
【請求項２】
ＹがＯであり、Ｘが−ＯＨであり、
【化６】
2015508065.tif 000019
が二重結合を示す、請求項１に記載の配合物。
【請求項３】
ＹがＯであり、Ｘが−ＯＲｔであり、
【化７】
2015508065.tif 000020
が二重結合を示す、請求項１に記載の配合物。
【請求項４】
下記のものを含む医薬配合物：
（ｉ）下記のものからなる群から選択される脂肪酸：
１３−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１４，１６，１９−ペンタン酸、
１７−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１５，１９−ペンタン酸、
１３−ＯＨ（７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１４，１６，１９−ペンタン酸、
１７−ＯＨ（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１５，１９−ペンタン酸、
１３−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１４，１６，１９−ヘキサン酸、
１７−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１５，１９−ヘキサン酸、
１３−ＯＨ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１４，１６，１９−ヘキサン酸、または
１７−ＯＨ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１５，１９−ヘキサン酸；
これらにおいて、ＡはＥまたはＺのいずれかの立体配置を示す；
ならびに
（ｉｉ）医薬的に許容できるキャリヤー。
【請求項５】
脂肪酸が、１３−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１４，１６，１９−ペンタン酸、１７−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１５，１９−ペンタン酸、１３−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１４，１６，１９−ヘキサン酸、１７−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１５，１９−ヘキサン酸からなる群から選択される、請求項４に記載の配合物。
【請求項６】
炎症状態に罹患している対象を処置するための方法であって、その対象に療法有効量の式（Ｉ）または式（ＩＩ）による脂肪酸を投与することを含む方法：
【化８】
2015508065.tif 000021
［式中：
Ｘは、−ＣＨ２−、−ＯＨ、−Ｓ、−ＯＲｔおよび−ＮＲｐＲｑからなる群から選択され；
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−、Ｏ、−Ｓ−、および−ＮＲｐＲｑからなる群から選択され；
Ｗは、−ＯＨ、−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｒｐ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲｐ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＣＮ、ＳＲｕ、ＳＲｐ、−ＳＯ３、−ＳＯ２Ｒｐ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ３＋、−ＮＨ２Ｒｐ＋、−ＮＲｐＲｑＲｔ、ＮＯ２、＝Ｏ、＝ＮＲｐ、＝ＣＦ２、および−ＣＨＦからなる群から選択され；
Ｖは、Ｗが−ＯＨ、−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｒｐ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲｐ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＳＯ３、−ＳＯ２Ｒｐ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ３＋、−ＮＨ２Ｒｐ＋、−ＮＲｐＲｑＲｔおよびＮＯ２からなる群から選択される場合は−ＣＨ−であり、Ｖは、Ｗが＝Ｏ、＝ＮＲｐ、＝ＣＦ２、および＝ＣＨＦからなる群から選択される場合は−Ｃ−であり；
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈおよびｉは、独立して０〜１５（０および１５を含む）の整数であり、その際、ｄが０でない場合はｃは０であり；ｃが０でない場合はｄは０であり；かつ
和（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ）および（ａ＋ｂ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ）は、独立して式２ｎまたは２ｎ＋ｌに従う整数に等しく、その際、ｎは３〜１５（３および１５を含む）の整数であり；
−Ｒｐ、−Ｒｑおよび−Ｒｔは、独立してＨ、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ１−Ｃ８）ヒドロキシアルキルおよび（Ｃ１−Ｃ８）ハロアルキルからなる群から選択され；
−Ｒｕは
【化９】
2015508065.tif 000022
であり；
−Ｒａ、−Ｒａ’、−Ｒｂ、−Ｒｂ’、−Ｒｃ、−Ｒｃ’、−Ｒｄ、および−Ｒｄ’は、独立して−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｒｐ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲｐ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＮ、−ＳＯ３、−ＳＯ２Ｒｐ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ３＋、−ＮＨ２Ｒｐ＋、−ＮＲｐＲｑＲｔおよびＮＯ２からなる群から選択され；
−Ｒａと−Ｒａ’は、同時に非水素基を表わすことはなく；
−Ｒｂと−Ｒｂ’は、同時に非水素基を表わすことはなく；
−Ｒｃと−Ｒｃ’は、同時に非水素基を表わすことはなく；
【化１０】
2015508065.tif 000023
は任意に二重結合を示すことができ；
【化１１】
2015508065.tif 000024
は任意に存在することができ、存在する場合は
【化１２】
2015508065.tif 000025
はＸおよびＹならびにそれらが結合している炭素原子と一緒に５〜６員ヘテロサイクリル環またはヘテロアリール環を表わす］；
その際、式（Ｉ）および式（ＩＩ）は下記のものではない：
１３−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１４，１６，１９−ペンタン酸、
１７−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１５，１９−ペンタン酸、
１３−ＯＨ（７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１４，１６，１９−ペンタン酸、
１７−ＯＨ（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１５，１９−ペンタン酸、
１３−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１４，１６，１９−ヘキサン酸、
１７−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１５，１９−ヘキサン酸、
１３−ＯＨ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１４，１６，１９−ヘキサン酸、または
１７−ＯＨ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１５，１９−ヘキサン酸；
これらにおいて、ＡはＥまたはＺのいずれかの立体配置を示す。
【請求項７】
炎症状態を処置するための方法であって、対象に下記のものからなる群から選択される脂肪酸を含む医薬配合物を投与する方法：１３−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１４，１６，１９−ペンタン酸、１７−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１５，１９−ペンタン酸、１３−ＯＨ（７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１４，１６，１９−ペンタン酸、１７−ＯＨ（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１５，１９−ペンタン酸、１３−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１４，１６，１９−ヘキサン酸、１７−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１５，１９−ヘキサン酸、１３−ＯＨ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１４，１６，１９−ヘキサン酸、または１７−ＯＨ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１５，１９−ヘキサン酸；これらにおいて、ＡはＥまたはＺのいずれかの立体配置を示す。
【請求項８】
炎症状態が、移植のための臓器保存、骨関節炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アテローム硬化症、高血圧症、同種異系移植片拒絶、骨盤内炎症性疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、肺のアレルギー性炎症、カヘキシー、発作、うっ血性心不全、肺線維症、肝炎、グリア芽細胞腫、ギラン-バレー症候群、全身性紅斑性狼瘡、ウイルス性心筋炎、移植後臓器保護、急性膵臓炎、過敏性腸疾患、全身性炎症、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、動脈狭窄、臓器移植拒絶および熱傷、慢性肺傷害および呼吸窮迫、インスリン依存型糖尿病、非インスリン依存型糖尿病、高血圧症、肥満症、関節炎、神経変性障害、狼瘡、ライム病、痛風、敗血症、高体温、潰瘍、腸炎、骨粗鬆症、ウイルス性または細菌性の感染症、サイトメガロウイルス、歯周疾患、腎炎、サルコイドーシス、肺疾患、肺炎症、肺の線維症、喘息、後天性呼吸窮迫症候群、喫煙誘発性肺疾患、肉芽腫形成、肝臓の線維症、移植片対宿主疾患、手術後炎症；血管形成術、ステント設置またはバイパス移植、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）の後の冠動脈および末梢血管の再狭窄；急性および慢性白血病、Ｂリンパ球性白血病、新生物性疾患、動脈硬化症、アテローム硬化症、心筋炎症、乾癬、免疫不全、播種性血管内血液凝固、全身性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳脊髄炎、浮腫、炎症性腸疾患、高ＩｇＥ症候群、癌の転移または増殖、養子免疫療法、再潅流症候群、放射線熱傷、円形脱毛症、虚血、心筋梗塞、動脈狭窄、リウマチ性関節炎、冠動脈再狭窄、神経認知衰退ならびにインスリン抵抗性からなる群から選択される、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）による脂肪酸の代謝産物を検出するための、下記の段階を含む方法：
（ａ）生物試料に少なくとも１種類の式（Ｉ）または式（ＩＩ）による脂肪酸を接触させる：
【化１３】
2015508065.tif 000026
［式中：
Ｘは、−ＣＨ２−、−ＯＨ、−Ｓ、−ＯＲｔおよび−ＮＲｐＲｑからなる群から選択され；
Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−、Ｏ、−Ｓ−、および−ＮＲｐＲｑからなる群から選択され；
Ｗは、−ＯＨ、−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｒｐ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲｐ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＣＮ、ＳＲｕ、ＳＲｐ、−ＳＯ３、−ＳＯ２Ｒｐ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ３＋、−ＮＨ２Ｒｐ＋、−ＮＲｐＲｑＲｔ、ＮＯ２、＝Ｏ、＝ＮＲｐ、＝ＣＦ２、および−ＣＨＦからなる群から選択され；
Ｖは、Ｗが−ＯＨ、−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｒｐ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲｐ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＣＮ、−ＳＯ３、−ＳＯ２Ｒｐ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ３＋、−ＮＨ２Ｒｐ＋、−ＮＲｐＲｑＲｔおよびＮＯ２からなる群から選択される場合は−ＣＨ−であり、Ｖは、Ｗが＝Ｏ、＝ＮＲｐ、＝ＣＦ２、および＝ＣＨＦからなる群から選択される場合は−Ｃ−であり；
ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈおよびｉは、独立して０〜１５（０および１５を含む）の整数であり、その際、ｄが０でない場合はｃは０であり；ｃが０でない場合はｄは０であり；かつ
和（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ）および（ａ＋ｂ＋ｄ＋ｅ＋ｆ＋ｇ＋ｈ＋ｉ）は、独立して式２ｎまたは２ｎ＋ｌに従う整数に等しく、その際、ｎは３〜１５（３および１５を含む）の整数であり；
−Ｒｐ、−Ｒｑおよび−Ｒｔは、独立してＨ、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ１−Ｃ８）ヒドロキシアルキルおよび（Ｃ１−Ｃ８）ハロアルキルからなる群から選択され；
−Ｒｕは
【化１４】
2015508065.tif 000027
であり；
−Ｒａ、−Ｒａ’、−Ｒｂ、−Ｒｂ’、−Ｒｃ、−Ｒｃ’、−Ｒｄ、および−Ｒｄ’は、独立して−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｒｐ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲｐ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＮ、−ＳＯ３、−ＳＯ２Ｒｐ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ３＋、−ＮＨ２Ｒｐ＋、−ＮＲｐＲｑＲｔおよびＮＯ２からなる群から選択され；
−Ｒａと−Ｒａ’は、同時に非水素基を表わすことはなく；
−Ｒｂと−Ｒｂ’は、同時に非水素基を表わすことはなく；
−Ｒｃと−Ｒｃ’は、同時に非水素基を表わすことはなく；
【化１５】
2015508065.tif 000028
は任意に二重結合を示すことができ；
【化１６】
2015508065.tif 000029
は任意に存在することができ、存在する場合は
【化１７】
2015508065.tif 000030
はＸおよびＹならびにそれらが結合している炭素原子と一緒に５〜６員ヘテロサイクリル環またはヘテロアリール環を表わす］；
（ｂ）任意に、生物試料から細胞溶解物を調製してもよい；
（ｃ）（ａ）からの生物試料または（ｂ）において得た細胞溶解物と、０−メルカプトエタノールとを、１種類以上の共有結合β−メルカプトエタノール−脂肪酸付加物を含有する混合物を形成させるのに十分な時間接触させる；そして
（ｄ）（ｃ）からの混合物を質量分析により分析して、１種類以上の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の脂肪酸の代謝産物を同定する。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本出願は、U.S. Provisional Application No. 61/594,911, 2012年2月3日出願に基づく優先権を主張し、それを全体として本明細書に援用する。本出願は、United States Provisional Application No. 61/213,946, 2009年7月31日出願、およびPCT出願No. PCT/US2010/002141, 2010年8月2日出願を相互参照し、両者の内容全体を本明細書に援用する。
【０００２】
政府の権利
[0002]  本発明は、米国政府の支援で、国立予防衛生研究所が支給する助成金番号ROl HL58115およびROl HL64937のもとに行なうことができた。米国政府は本発明に一定の権利をもつことができる。
【背景技術】
【０００３】
[0003]  ３種類の既知のＣＯＸアイソエンザイム（ＣＯＸ−Ｉ、ＣＯＸ−２およびＣＯＸＳ）のうち、ＣＯＸ−２により産生されるプロスタグランジン類は疼痛および炎症に関連する。したがって、ＣＯＸ−２を阻害できる薬剤が疼痛治療および炎症軽減のための療法薬として用いられている。
【０００４】
[0004]  選択的ＣＯＸ−２阻害剤が現在知られているが、これらの化合物は随伴する毒性副作用を示す。したがって、慢性疼痛および炎症の治療における療法薬としてのそれらの使用は限られている。
【発明の概要】
【０００５】
[0005]  本発明は、その観点の１つにおいて、（Ａ）式（Ｉ）または式（ＩＩ）によるケト脂肪酸、および（Ｂ）医薬的に許容できるキャリヤーを含む、配合物を提供する。
【０００６】
【化１】
2015508065.tif 000002
【０００７】
[0006]  本発明は、その観点の１つにおいて、（Ａ）式（Ｉ）または式（ＩＩ）によるケト脂肪酸、および（Ｂ）医薬的に許容できるキャリヤーを含む、配合物を提供する。
[0007]  式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＯＨ、−Ｓ、−ＯＲｔおよび−ＮＲｐＲｑからなる群から選択され；Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−、Ｏ、−Ｓ−、および−ＮＲｐＲｑからなる群から選択され；Ｗは、−ＯＨ、−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｒｐ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲｐ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＣＮ、ＳＲｕ、ＳＲｐ、−ＳＯ３、−ＳＯ２Ｒｐ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ３＋、−ＮＨ２Ｒｐ＋、−ＮＲｐＲｑＲｔ、ＮＯ２、＝Ｏ、＝ＮＲｐ、＝ＣＦ２、および−ＣＨＦからなる群から選択され；Ｖは、−ＣＨ−であり、Ｖは、Ｗが＝Ｏ、＝ＮＲｐ、＝ＣＦ２、および＝ＣＨＦからなる群から選択される場合は−Ｃ−である。
【０００８】
[0008]  インデックスａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆは、独立して０〜１５（０および１５を含む）の整数である。１態様において、ｄが０でない場合はｃは０である。あるいは、ｃが０でない場合はｄは０である；したがって、和（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｅ＋ｆ）および（ａ＋ｂ＋ｄ＋ｅ＋ｆ）は、独立して式２ｎまたは２ｎ＋ｌに従う整数に等しく、その際、ｎは３〜１５（３および１５を含む）の整数である。
【０００９】
[0010]  置換基−Ｒｐ、−Ｒｑおよび−Ｒｔは、独立してＨ、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ１−Ｃ８）ヒドロキシアルキルおよび（Ｃ１−Ｃ８）ハロアルキルからなる群から選択される。置換基−Ｒｕは
【００１０】
【化２】
2015508065.tif 000003
【００１１】
である。
[0009]  式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、任意の二重結合は
【００１２】
【化３】
2015508065.tif 000004
【００１３】
により示され、一方、
【００１４】
【化４】
2015508065.tif 000005
【００１５】
が存在する場合、それはＸおよびＹならびにそれらが結合している炭素原子と一緒に５〜６員ヘテロサイクリル環またはヘテロアリール環を表わす。化合物１３−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１４，１６，１９−ペンタン酸、１７−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１５，１９−ペンタン酸、１３−ＯＨ（７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１４，１６，１９−ペンタン酸、１７−ＯＨ（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１５，１９−ペンタン酸、１３−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１４，１６，１９−ヘキサン酸、１７−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１５，１９−ヘキサン酸、１３−ＯＨ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１４，１６，１９−ヘキサン酸、または１７−ＯＨ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１５，１９−ヘキサン酸（これらにおいて、ＡはＥまたはＺのいずれかの立体配置を示す）は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）に含まれない。置換基−Ｒａ、−Ｒａ’、−Ｒｂ、−Ｒｂ’、−Ｒｃ、および−Ｒｃ’は、独立して−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｒｐ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲｐ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＮ、−ＳＯ３、−ＳＯ２Ｒｐ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ３＋、−ＮＨ２Ｒｐ＋、−ＮＲｐＲｑＲｔおよびＮＯ２からなる群から選択される。さらに、−Ｒａと−Ｒａ’は、同時に非水素基（水素ではない基）を表わすことはなく；−Ｒｂと−Ｒｂ’は、同時に非水素基を表わすことはなく；−Ｒｃと−Ｒｃ’は、同時に非水素基を表わすことはなく；−Ｒｄと−Ｒｄ’は、同時に非水素基を表わすことはない。
【００１６】
[0010]  他の態様において、医薬配合物は下記のリスト：１３−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１４，１６，１９−ペンタン酸、１７−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１５，１９−ペンタン酸、１３−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１４，１６，１９−ヘキサン酸、１７−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１５，１９−ヘキサン酸からなる群から選択される脂肪酸（これらにおいて、ＡはＥまたはＺのいずれかの立体配置を示す）、および医薬的に許容できるキャリヤーを含む。
【００１７】
[0011]  本発明はまた、炎症状態に罹患している対象を処置するための方法であって、その対象に療法有効量の式（Ｉ）または式（ＩＩ）による脂肪酸を投与することを含む方法を提供する。他の観点において、本発明は、１３−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１４，１６，１９−ペンタン酸、１７−オキソ−（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１５，１９−ペンタン酸、１３−ＯＨ（７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１４，１６，１９−ペンタン酸、１７−ＯＨ（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１５，１９−ペンタン酸、１３−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１４，１６，１９−ヘキサン酸、１７−オキソ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１５，１９−ヘキサン酸、１３−ＯＨ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１４Ａ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１４，１６，１９−ヘキサン酸、または１７−ＯＨ−（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１５Ａ，１９Ｚ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１５，１９−ヘキサン酸（これらにおいて、ＡはＥまたはＺのいずれかの立体配置を示す）からなる群から選択される脂肪酸を含む医薬配合物を投与することにより炎症状態に罹患している対象を処置するための方法を提供する。
【００１８】
[0012]  本発明の配合物を用いて処置される炎症状態は、下記のものである：移植のための臓器保存、骨関節炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、アテローム硬化症、高血圧症、同種異系移植片拒絶、骨盤内炎症性疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病、肺のアレルギー性炎症、カヘキシー、発作、うっ血性心不全、肺線維症、肝炎、グリア芽細胞腫、ギラン-バレー症候群、全身性紅斑性狼瘡、ウイルス性心筋炎、移植後臓器保護、急性膵臓炎、過敏性腸疾患、全身性炎症、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、動脈狭窄、臓器移植拒絶および熱傷、ならびに慢性状態、たとえば慢性肺傷害および呼吸窮迫、インスリン依存型糖尿病、非インスリン依存型糖尿病、高血圧症、肥満症、関節炎、神経変性障害、狼瘡、ライム病、痛風、敗血症、高体温、潰瘍、腸炎、骨粗鬆症、ウイルス性または細菌性の感染症、サイトメガロウイルス、歯周疾患、腎炎、サルコイドーシス、肺疾患、肺炎症、肺の線維症、喘息、後天性呼吸窮迫症候群、喫煙誘発性肺疾患、肉芽腫形成、肝臓の線維症、移植片対宿主疾患、手術後炎症；血管形成術、ステント設置またはバイパス移植、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）の後の冠動脈および末梢血管の再狭窄；急性および慢性白血病、Ｂリンパ球性白血病、新生物性疾患、動脈硬化症、アテローム硬化症、心筋炎症、乾癬、免疫不全、播種性血管内血液凝固、全身性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳脊髄炎、浮腫、炎症性腸疾患、高ＩｇＥ症候群、癌の転移または増殖、養子免疫療法、再潅流症候群、放射線熱傷、円形脱毛症、虚血、心筋梗塞、動脈狭窄、リウマチ性関節炎、冠動脈再狭窄、神経認知衰退ならびにインスリン抵抗性。
【００１９】
[0013]  他の態様において、本発明は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）による脂肪酸の代謝産物を検出するための方法を提供する。１種類以上の脂肪酸代謝産物の検出は、生物試料と少なくとも１種類の式（Ｉ）または式（ＩＩ）による脂肪酸を接触させることにより達成される。
【００２０】
【化５】
2015508065.tif 000006
【００２１】
[0014]  式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、Ｘは、−ＣＨ２−、−ＯＨ、−Ｓ、−ＯＲｔおよび−ＮＲｐＲｑからなる群から選択され；Ｙは、−Ｃ（Ｏ）−、Ｏ、−Ｓ−、および−ＮＲｐＲｑからなる群から選択され；Ｗは、−ＯＨ、−Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｒｐ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲｐ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＣＮ、ＳＲｕ、ＳＲｐ、−ＳＯ３、−ＳＯ２Ｒｐ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ３＋、−ＮＨ２Ｒｐ＋、−ＮＲｐＲｑＲｔ、ＮＯ２、＝Ｏ、＝ＮＲｐ、＝ＣＦ２、および−ＣＨＦからなる群から選択され；Ｖは、−ＣＨ−であり、Ｖは、Ｗが＝Ｏ、＝ＮＲｐ、＝ＣＦ２、および＝ＣＨＦからなる群から選択される場合は−Ｃ−である。
【００２２】
[0015]  インデックスａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆは、独立して０〜１５（０および１５を含む）の整数である。１態様において、ｄが０でない場合はｃは０である。あるいは、ｃが０でない場合はｄは０である；したがって、和（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｅ＋ｆ）および（ａ＋ｂ＋ｄ＋ｅ＋ｆ）は、独立して式２ｎまたは２ｎ＋ｌに従う整数に等しく、その際、ｎは３〜１５（３および１５を含む）の整数である。
【００２３】
[0016]  置換基−Ｒｐ、−Ｒｑおよび−Ｒｔは、独立してＨ、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ１−Ｃ８）ヒドロキシアルキルおよび（Ｃ１−Ｃ８）ハロアルキルからなる群から選択される。置換基−Ｒｕは
【００２４】
【化６】
2015508065.tif 000007
【００２５】
である。
[0017]  式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、任意の二重結合は
【００２６】
【化７】
2015508065.tif 000008
【００２７】
により示され、一方、
【００２８】
【化８】
2015508065.tif 000009
【００２９】
が存在する場合、それはＸおよびＹならびにそれらが結合している炭素原子と一緒に５〜６員ヘテロサイクリル環またはヘテロアリール環を表わす。置換基−Ｒａ、−Ｒａ’、−Ｒｂ、−Ｒｂ’、−Ｒｃ、および−Ｒｃ’は、独立して−Ｈ、−ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）、−Ｃ（Ｏ）Ｒｐ、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲｐ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｆ、−ＣＦ３、−ＣＨＦ２、−ＣＨ２Ｆ、−ＣＮ、−ＳＯ３、−ＳＯ２Ｒｐ、−ＳＯ３Ｈ、−ＮＨ３＋、−ＮＨ２Ｒｐ＋、−ＮＲｐＲｑＲｔおよびＮＯ２からなる群から選択される。さらに、−Ｒａと−Ｒａ’は、同時に非水素基を表わすことはなく；−Ｒｂと−Ｒｂ’は、同時に非水素基を表わすことはなく；−Ｒｃと−Ｒｃ’は、同時に非水素基を表わすことはなく；−Ｒｄと−Ｒｄ’は、同時に非水素基を表わすことはない。
【００３０】
[0018]  本発明方法によれば、生物試料の性質に応じて任意に細胞溶解物を調製することができる。生物試料または細胞溶解物を、次いでβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）と共に、１種類以上の共有結合ＢＭＥ−脂肪酸付加物を含有する混合物を形成させるのに十分な時間インキュベートする。１種類以上の脂肪酸代謝産物の同定は、ＢＭＥを含有する細胞抽出物に質量分析を施すことにより実施される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】[0019]  図１は、ＢＭＥ−ケト脂肪酸付加物のフラグメンテーションに際して検出されたイオンの代表的な質量スペクトルである。
【図２】[0020]  図２は、ＢＭＥ−ケト脂肪酸付加物のフラグメンテーションにより得られた代表的なイオンピークの質量を示す。
【図３】[0021]  図３は、ＣＯＸ−２の阻害試験からの結果を示す。これらの結果は、求電子性脂肪酸の形成がＣＯＸ−２のレベルに依存することを指摘する。
【図４】[0022]  図４は、細胞における脂肪酸補充試験の結果をグラフで示したものである。２２：５  ω−３ケト脂肪酸の生成は１８：５  ω−３脂肪酸を出発物質として使う一連の伸長および不飽和化の段階を伴なうことが見出された。
【図５】[0023]  図５は、マクロファージ活性化に際してのＥＦＡＤ生成を示す。ＲＡＷ２６４．７細胞をＰＭＡ（３．２４μＭ）、ＬＰＳ（０．５μｇ／ｍｌ）、およびＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）で活性化し、活性化後２０時間目にハーベストした。（ａ）７８のニュートラルロス(neutral loss)（ＢＭＥの喪失）を追跡するＭＲＭスキャンを用いて、活性化（ａ，上のクロマトグラム）および非活性化（ａ，下のクロマトグラム）ＲＡＷ２６４．７細胞の細胞抽出物中の求電子性脂肪酸とＢＭＢとの付加物を検出した。（ｂ）ＴＨＰ−Ｉ細胞をＰＭＡ（８６ｎＭ）で１６時間分化させ、Ｋｄｏ２（０．５μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）で活性化し、活性化後８時間目にＥＦＡＤレベルを検出した。（ｃ）ＲＡＷ２６４．７細胞を指示した化合物で活性化し、活性化後２０時間目にＥＦＡＤレベルを定量した。化合物濃度は下記のとおりである：ＬＰＳ（０．５μｇ／ｍｌ）、Ｋｄｏ２（０．５μｇ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）、ＰＭＡ（３．２４μＭ）、およびｆＭＬＰ（１μＭ）。データを平均±Ｓ．Ｄ．として表わす（０＝４）；ここで、＊＝“ＰＭＡ＋ＩＦＮγ＋ＬＰＳ”から有意差（ｐ＜０．０１）、＃＝ＬＰＳと“Ｋｄｏ２＋ＩＦＮγ”の間で有意差（ｐ０．０１）（一元ＡＮＯＶＡ、ポストホックＴｕｋｅｙ検定）。（ｄ）ＲＡＷ２６４．７細胞をＫｄｏ２（０．５μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）で活性化し、活性化後、指示した時点でＥＦＡＤレベルを定量した。ＥＦＡＤ−２レベルを他のＥＦＡＤの一般的代表例としてレポートする。
【図６】[0024]  図６は、ＥＦＡＤ−２がＤＰＡのａ，β−不飽和オキソ誘導体であることを示す。（ａ）７８ａｍｕの主要なニュートラルロス（ＢＭＥの喪失に相当する）を示す特徴的な求電子付加物フラグメンテーションパターンを、ＥＦＡＤ−２の増強型生成物イオン分析により表わす。（ｂ）ＲＡＷ２６４．７細胞を、３２μＭの指示した脂肪酸を補充したＤＭＥＭおよび１０％  ＦＢＳ中で３日間増殖させた。３日目に細胞をＫｄｏ２（０．５μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）で活性化し、活性化後２０時間目にＥＦＡＤ−２レベルを定量した。（ｃ）オキソ基からアルコール基へのＮａＢＨ４還元の図。（ｄ）ＥＦＡＤ−２について精製したＲＡＷ２６４．７細胞溶解物における、３４３．２／２９９．２のｍ／ｚ転移（オキソ−ＤＰＡのＣＯ２喪失）をモニターするＭＲＭスキャン：ＮａＢＨ４で処理しなかったものまたは処理したもの（上および下パネル）；ＥＦＡＤ−２について精製し、ＮａＢＨ４で処理したＲＡＷ２６４．７細胞溶解物における、［３４５．２／３２７．２のｍ／ｚ転移（ヒドロキシ−ＤＰＡ／Ｈ２Ｏのニュートラルロス）をモニターするＭＲＭスキャン。（ｅ）活性化ＲＡＷ２６４．７細胞から精製した、ＮａＢＨ４で還元したＥＦＡＤ−２のＭＳ／ＭＳフラグメンテーション。
【図７】[0025]  図７は、ＥＦＡＤ−２形成がＣＯＸ−２活性に依存することを示す。ＲＡＷ２６４．７細胞を、Ｋｄｏ２（０．５μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）で、指示した阻害剤の存在下に活性化し、活性化後２０時間目にＥＦＡＤ−２レベルを定量した。（ａ）阻害剤濃度は下記のとおりであった：ゲニステイン(genistein)（２５μＭ）、ＭＡＦＰ（２５μＭ）、ＭＫ８８６（５００ｎＭ）、ＥＴＹＡ（２５μＭ）およびＯＫＡ（５０ｎＭ）。（ｂ）ＣＯＸ阻害剤濃度は下記のとおりであった：ＡＳＡ（２００μＭ）、インドメタシン(indomethacin )（２５μＭ）、イブプロフェン(ibuprofen)（１００μＭ）、ジクロフェナク(diclofenac)（１μＭ）およびＮＳ−３９８（４μＭ）。データを平均±Ｓ．Ｄ．として表わす（ｎ＝４）；ここで、＊＝“Ｋｄｏ２＋ＩＦＮγ”から有意差（ｐ＜０．０１）（一元ＡＮＯＶＡ、ポストホックＴｕｋｅｙ検定）。（ｃ）ＥＦＡＤ−２のヒドロキシ前駆体を、精製ヒツジＣＯＸ−２＋ＤＰＡ、±ＡＳＡを用いて合成し、指示した時点で定量した（ＭＲＭ  ３４５／３２７）。（ｄ，ｅ）ＣＯＸ−２およびＣＯＸ−２＋ＡＳＡにより形成された２つの異性体のクロマトグラフィープロフィール（左パネル）およびスペクトル（右パネル）。（ｆ）ＲＡＷ２６４．７細胞をＫｄｏ２（０．５μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）±ＡＳＡで活性化し、オキソＤＰＡの生成を分析し、１７−オキソＤＰＡ標準品と比較した。ＥＦＡＤ−２の溶出プロフィールをＭＲＭスキャンにより４２１．２／３４３．２のｍ／ｚ転移に従ってモニターした（ＥＦＡＤ−２のＢＭＥ付加物のＢＭＥ喪失）。（ｇ〜ｉ）ＲＡＷ２６４．７細胞をＫｄｏ２（０．５μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）で活性化し、あるいはビヒクル対照で処理し、活性化後２０時間目に細胞溶解物を採集した。ＯＨ−ＤＰＡ（μＭ）、ＤＰＡ（μＭ）、またはビヒクルを細胞溶解物に添加し、オキソ−ＤＰＡまたはＯＨ−ＤＰＡの生成を経時的にモニターした。中実および中空の記号は、それぞれ活性化細胞および非活性化細胞からの溶解物の使用を示す。
【図８】[0026]  図８は、活性化された初代ネズミマクロファージにおけるＥＦＡＤの形成を表わす。骨髄由来マクロファージをＫｄｏ２（０．５μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）で活性化し、活性化後１０時間目にＥＦＡＤを検出した。
【図９】[0027]  図９は、細胞におけるタンパク質とのＥＦＡＤ付加物の形成を示す。（ａ）ＲＡＷ２６４．７細胞をＫｄｏ２（０．５μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）で活性化し、活性化後２０時間目にハーベストした。細胞溶解物を次いで２グループに分割した（内部標準を添加した）：５００ｍＭ  ＢＭＥによる処理に続いてアセトニトリルによるタンパク質沈殿（“総量”）、およびアセトニトリルによるタンパク質沈殿に続いて５００ｍＭ  ＢＭＥによる処理（“遊離＋小分子付加物”）。ＥＦＡＤ−２レベルをＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより定量した。（ｂ）活性化ＲＡＷ２６４．７細胞溶解物におけるＥＦＡＤ−２とＢＭＥの反応のタイムコース。
【図１０】[0028]  図１０は、ＲＡＷ２６４．７細胞の活性化後の細胞内および細胞外ＧＳ−オキソ−ＤＰＡ付加物の検出を示す。（ａ）ＧＳ−１３−オキソＤＰＡの化学構造およびフラグメンテーションパターン。（ｂ）１３−および１７−オキソＤＰＡのクロマトグラフィープロフィールおよび質量スペクトル；合成標準品（上パネル）、細胞培地（中パネル）および細胞ペレット（下パネル）から得たもの。内部標準ＧＳ−５−オキソＥＴＥ−ｄ７を用いて信号レベルを補正することにより、回収効率による差を考慮に入れた。それぞれ細胞培地および細胞ペレットから得た試料中の最良の信号対ノイズ比を与えるものとしてフラグメント３４５．３および５２３．３を選択し、モニターした。フラグメント６３４．４は親イオン６５２．４からのＨ２Ｏの喪失から得られた；ｍ／ｚ  ５２３．３およびｍ／ｚ  ４２０．３はペプチドフラグメンテーションに典型的なフラグメントｙ２およびｃｌに対応し、一方、３４５．３および３０８．２は脂質およびグルタチオン分子から得られ、ｍ／ｚ  ５０５．３およびｍ／ｚ  ３２７．２はそれぞれ５２３．３および３４５．３からのＨ２Ｏの喪失から得られた。Ｋ／ＩはＫｄｏ２およびＩＦＮγで処理した細胞；Ｋ／Ｉ＋ＡＳＡはＫｄｏ２、ＩＦＮγおよびＡＳＡで処理した細胞；ＮＴは処理しなかった細胞。
【図１１】[0029]  図１１は、１７−オキソＤＨＡおよび１７−オキソＤＰＡによる抗酸化および炎症応答の調節を示す。ＲＡＷ２６４．７細胞を漸増濃度の１７−オキソＤＨＡおよび１７−オキソＤＰＡで処理した。（ａ）細胞を処理後１時間目にハーベストし、核抽出物中のＮｒｆ２レベルを定量した。（ｂ）細胞を処理後１８時間目にハーベストし、ＨＯ−ＩおよびＮｑｏ１（上バンド）のレベルをウェスタンブロットにより測定した。（ｃ，ｄ）ＲＡＷ２６４．７細胞を漸増濃度の１７−オキソＤＨＡおよび１７−オキソＤＰＡで６時間処理し、Ｋｄｏ２＋ＩＦＮγを添加した。試料を１２時間目に採集した。細胞培地中のＩＬ−６、ＭＣＰ−ＩおよびＩＬ−１０レベルをＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により測定し、総タンパク質含量により正規化した（ｃ）；細胞培地中のナイトライトレベルを測定して総タンパク質含量により正規化し、総細胞溶解物中のｉＮＯＳおよびＣｏｘ−２レベルを測定した（ｄ）；（ｅ）ＰＰＡＲγ  ベータ−ラクタマーゼ−レポーターアッセイを、ロシグリタゾン(Rosiglitazone)、１７−オキソＤＰＡ、１７−オキソＤＨＡ、１５ｄ−ＰＧＪ２、１７−ヒドロキシＤＨＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡについて、０．５〜１０，０００ｎＭの範囲の濃度で実施した。
【図１２】[0030]  図１２は、ＴＨＰ−Ｉ細胞が産生したＥＦＡＤであって、ＲＡＷ２６４．７細胞が産生したものと同時溶出するものを示す。ＴＨＰ−Ｉ細胞をＰＭＡ（８６ｎＭ）で１６時間分化させ、Ｋｄｏ２リピドＡ（０．５μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）で活性化した。活性化後８時間目にＥＦＡＤレベルを検出した。７８のニュートラルロスを追跡するＭＲＭスキャンを用いてＥＦＡＤ−ＢＭＥ付加物を検出した。
【図１３】[0031]  図１３は、α，β−不飽和ケト誘導体のＢＭＥ付加物が、ＭＳ／Ｍ．Ｓ．による定量のために最も信頼性のある濃度曲線を与えることを示す。（ａ）化合物９−オキソＯＤＥ、１２−オキソＥＴＥ、１５−オキソＥＤＥおよび９−オキソＯＴｒＥを、内部標準としての５−オキソＥＴＥ−ｄ７の存在下でＢＭＥと２時間反応させ、濃度曲線を作成した。（ｂ〜ｃ）９−オキソＯＤＥ、１２−オキソＥＴＥ、１５−オキソＥＤＥおよび９−オキソＯＴｒＥの系列希釈液を、内部標準（５−オキソＥＴＢ−ｄ７）の存在下で定量した；ＭＲＭによりＣＯ２のニュートラルロスに従って（ｂ）、またはＳＩＭにより親質量に従って（ｃ）。これらの化合物に対応するすべてのピーク面積を内部標準に対して正規化し、それらの濃度に対してプロットした。
【図１４】[0032]  図１４は、ＥＦＡＤ生成がＲＡＷ２６４．７細胞活性化に依存することを示す。ＲＡＷ２４．７細胞を指示した化合物で活性化し、活性化後２０時間目にＥＦＡＤレベルを定量した。化合物濃度は下記のとおりである：ＬＰＳ（０．５μｇ／ｍｌ）、Ｋｄｏ２リピドＡ（０．５μｇ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）、ＰＭＡ（３．２４μＭ）、およびｆＭＬＰ（１μＭ）。データを平均±Ｓ．Ｄ．として表わす（ｎ＝４）；ここで、＊＝“ＰＭＡ＋ＩＦＮγ＋ＬＰＳ”から有意差（ｐ＜０．０１）、＃＝ＬＰＳと“Ｋｄｏ２＋ＩＦＮγ”の間で有意差（ｐ＜０．０１）（一元ＡＮＯＶＡ、ポストホックＴｕｋｅｙ検定）。
【図１５】[0033]  図１５は、ＥＦＡＤ生成が時間依存性であることを示す。ＲＡ  ２６４．７細胞をＫｄｏ２リピドＡ（０．５μｇ／ｍｌ）、ＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）で活性化し、活性化後の指示した時点でＥＦＡＤレベルを定量した。
【図１６】[0034]  図１６は、ＥＦＡＤ−Ｉおよび−３がｎ−３シリーズの脂肪酸から誘導されることを示す。ＲＡＷ２６４．７細胞を、３２μＭの指示した脂肪酸を補充したＤＭＥＭおよび１０％  ＦＢＳ中で３日間増殖させた。３日目に細胞をＫｄｏ２リピドＡ（０．５μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）で活性化し、活性化後２０時間目にＥＦＡＤ−Ｉおよび−３レベルを定量した。
【図１７】[0035]  図１７は、ＥＦＡＤ形成がＰＬＡ２およびＣＯＸ−２の活性に依存することを示す。ＲＡＷ２６４．７細胞をＫｄｏ２リピドＡ（０．５μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）で、指示した阻害剤の存在下に活性化し、活性化後２０時間目にＥＦＡＤ−２レベルを定量した。阻害剤濃度は下記のとおりであった：ゲニステイン（２５μＭ）、ＭＡＦＰ（２５μＭ）、ＭＫ８８６（５００ｎＭ）、ＥＴＹＡ（２５μＭ）およびＯＫＡ（５０ｎＭ）。データを平均±Ｓ．Ｄ．として表わす（ｎ＝４）；ここで、＊＝“Ｋｄｏ２＋ＩＦＮγ”から有意差（ｐ＜０．０１）（一元ＡＮＯＶＡ、ポストホックＴｕｋｅｙ検定）。
【図１８】[0036]  図１８は、ＥＦＡＤ形成がＣＯ−２活性に依存することを示す。ＲＡＷ２６４．７細胞をＫｄｏ２リピドＡ（０．５μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）で、指示した阻害剤の存在下に活性化し、活性化後２０時間目にＥＦＡＤ−２レベルを定量した。ＣＯＸ阻害剤濃度は下記のとおりであった：ＡＳＡ（２００μＭ）、インドメタシン（２５μＭ）、イブプロフェン、ジクロフェナク（１μＭ）およびＮＳ−３９８（４μＭ）。データを平均±Ｓ．Ｄ．として表わす（ｎ＝４）；ここで、＊＝“Ｋｄｏ２＋ＩＦＮ−γ”から有意差（ｐ＜０．０１）（一元ＡＮＯＶＡ、ポストホックＴｕｋｅｙ検定）。
【図１９】[0037]  図１９は、アスピリン−アセチル化ＣＯＸ−２がインビボおよびインビトロの両方で、１３−ＨＤＨＡではなく１７−ＨＤＨＡを生成することを示す。１０μＭ  ＤＨＡ±ＡＳＡの存在下でＣＯＸ−２により合成されたＨＤＨＡのクロマトグラフィープロフィール（ａ）および質量スペクトル（ｂ）。活性化ＲＡＷ２６４．７細胞（Ｋ／Ｉ）±ＡＳＡの細胞溶解物からのＨＤＨＡのクロマトグラフィープロフィールを、１３−ＨＤＨＡおよび１７−ＨＤＨＡ合成標準品とも比較した；（ｃ）活性化ＲＡＷ２６４．７細胞（Ｋ／Ｉ）±ＡＳＡが産生したオキソＤＡＨのクロマトグラフィープロフィールを１３−オキソＤＨＡおよび１７−オキソＤＨＡ合成標準品と比較したもの。拡大したクロマトグラムを挿入図中にレポートする。
【図２０】[0038]  図２０は、ＥＦＡＤがＢＭＥに対して他の（＾−不飽和ケト脂肪酸と比較して類似の活性をもつことを示す。各種のＢＭＥ（５０ｍＭ）とα，β−不飽和ケト脂肪酸（２．９μＭ）の擬似一次反応速度を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ８４５３ダイオードアレイを用いて分光光度法により測定した。吸光度の変化（低下）を３０９ｎｍ（１５ｄ−ＰＧＪ２）、２８９ｎｍ（１７−オキソ−ＤＨＡおよび１７−オキソ−ＤＰＡ）および２８７ｎｍ（１５−オキソＥＴＥ）で追跡した（左パネル）。リン酸緩衝液ｐＨ７．４中、３７°で反応を実施し、右パネルに示すように４５０のスペクトルを記録した（１スペクトル／秒で）。ＵＶ−Ｖｉｓ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて吸光度の低下を一次曲線に調整した。
【図２１Ａ】[0039]  図２１は、ＧＡＰＤＨとＥＦＡＤ−２のインビトロ反応の質量分析を示す。処理したウサギＧＡＰＤＨにおいて４つの残基がＥｆＡＤ−２に対するターゲットとして検出および確認された。ペプチドはＣｙｓ２４４（ａ）、Ｈｉｓｌ６３（ｂ）、Ｃｙｓｌ４９（ｃ）およびＨｉｓ３２８（ｄ）においてアルキル化された。上パネルはＥＦＡＤ−２修飾されたペプチドを示し、下パネルは対応する天然ペプチドからのスペクトルを示す。
【図２１Ｂ】同上。
【図２１Ｃ】同上。
【図２１Ｄ】同上。
【図２２】[0040]  図２２は、ＥＦＡＤを漸増濃度のグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の不存在下でまたは存在下でインキュベートすると添加した酵素の量に依存した付加速度が得られたことを示し、これによりＥＦＡＤがＧＳＴに対する基質であることが確認された。
【図２３】[0041]  図２３は、活性化ＲＡＷ２６４．７細胞のペレットおよび培地中にＧＳ−オキソＤＨＡ付加物が検出されることを示す。合成標準品（上パネル）、細胞培地（中パネル）および細胞ペレット（下パネル）から得られた１３−および１７−オキソＤＨＡのクロマトグラフィープロフィールおよび質量スペクトルを示す。内部標準ＧＳ−５−オキソＥＴＥ−ｄ７を用いて信号レベルを補正することにより、回収効率による差を考慮に入れた。それぞれ細胞培地および細胞ペレットから得た試料中の最良の信号対ノイズ比を与えるものとしてフラグメント３４３．３および５２１．３を選択し、モニターした。フラグメント５２１．３および４１８．２はフラグメントｙ２およびｃｌに対応し、一方、３４３．３および３０８．２は脂質およびグルタチオン分子から得られた。フラグメント５０３．３は５２３．３からの水の喪失から得られた。
【図２４】[0042]  図２４は、１７−オキソＤＨＡおよび７−オキソＤＰＡが骨髄由来マクロファージにおける炎症応答を調節することを示す。細胞を漸増濃度の１７−オキソＤＨＡおよび１７オキソ−ＤＰＡで６時間処理し、Ｋｄｏ２リピドＡ（０．５μｇ／ｍｌ）およびＩＦＮγを添加した。（２）ナイトライトレベルを細胞培地において測定し、総タンパク質含量に対して正規化した：ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２レベルを総細胞溶解物において測定した。（ｂ）ＩＬ−６、ＭＣＰ−Ｉ、およびＩＬ−１０レベルを細胞培地において測定し、総タンパク質含量に対して正規化した。
【図２５】[0043]  図２５は、本明細書に記載する反応を示す。ＤＨＡおよびＤＰＡは、ＣＯＸ−２およびデヒドロゲナーゼの作用により、１３−ＥＦＯＸ−Ｄ６（ａ）および１３−ＥＦＯＸ−Ｄ５（ｂ）に変換される。ＡＳＡの存在下では、１７−ＯＨおよび１７−オキソ異性体が好都合である。１３−および１７−ＥＦＯＸ−Ｄ５および−Ｄ６（６、７、１６、および８）はグルタチオンと反応してＧＳ−付加物（１５、９、１７、および１０）になる。これらの反応はインビトロとＲＡＷ２６４．７細胞の両方で起きる。質量分析のために、ＥＦＯＸを過剰のＢＭＥと反応させてＢＭＥ−ＥＦＯＸ付加物（１４、４、１８、および３）を得た。
【図２６】[0044]  図２６は、マクロファージ活性化に際してＥＦＯＸが産生されることを示す。（ａ）７８のニュートラルロスを追跡するＭＲＭスキャンにより、ＢＭＥで処理した活性化（上）および非活性化（下）ＲＡＷ２６４．７細胞からの細胞抽出物中に、ＢＭＥと付加したＥＦＯＸが明らかになった。（ｂ）ＰＭＡで分化させたＴＨＰ−１細胞における、活性化後８時間目のＥＦＯＸレベル。（ｃ）下記濃度の指示した化合物で活性化したＲＡＷ２６４．７細胞におけるＥＦＯＸ−Ｄ５レベル：ＬＰＳ（０．５μｇ  ｍｌ−１）、Ｋｄｏ２（０．５μｇ  ｍｌ−１）、ＩＦＮγ（２００Ｕ  ｍｌ−１）、ＰＭＡ（３．２４μＭ）、ｆＭＬＰ（１μＭ）。データを平均±ｓ．ｄ．として表わす（ｎ＝４）；＊は‘ＰＭＡ＋ＩＦＮγ＋ＬＰＳ’から有意差（Ｐ＜０．０１）、“は‘ＬＰＳ’と‘Ｋｄｏ２＋ＩＦＮγ’の間で有意差（ｐ＜０．０１）（一元ＡＮＯＶＡ、ポストホックＴｕｋｅｙ検定）。（ｄ）活性化後、指示した時点でのＲＡＷ２６４．７細胞におけるＥＦＯＸ−Ｄ５レベル。ＮＤ：検出できなかった。
【図２７】[0045]  図２７は、ＤＰＡのα，β−不飽和オキソ誘導体（２）であるＥＦＯＸ−Ｄ５の特性を示す。（ａ）ＢＭＥ−ＥＦＯＸ−Ｄ５のＥＰＩ分析から得られた特徴的なＢＭＥ−ＥＦＯＸフラグメンテーションパターン。（ｂ）指示した脂肪酸を補充した培地で３日間増殖させた活性化ＲＡＷ２６４．７細胞におけるＥＦＯＸ−Ｄ５レベル。ＮＤ：検出できなかった。（ｃ）精製したＲＡＷ２６４．７細胞溶解物においてＥＦＯＸ−Ｄ５±ＮａＢＨ４につき下記のｍ／ｚ転移をモニターしたＭＲＭスキャン：４２１．２／３４３．２（ＢＭＥ−１３−ＥＦＯＸ−Ｄ５（１４）／ＢＭＥの喪失）、３４３．２／２９９．２（１３−ＥＦＯＸ−Ｄ５／ＣＯ２の喪失；上および中パネル）および３４５．２／３２７．２（ＯＨ−ＤＰＡ／Ｈ２Ｏの喪失；下パネル）。（ｄ）活性化ＲＡＷ２６４．７細胞から精製し、ＮａＢＨ４で還元したＥＦＯＸ−Ｄ５のＭＳ／ＭＳフラグメンテーション。
【図２８】[0046]  図２８は、ＥＦＯＸ−Ｄ５形成がＣＯＸ−２活性に依存することを示す。（ａ，ｂ）活性化し、下記の濃度の指示した阻害剤で処理したＲＡＷ２６４．７細胞におけるＥＦＯＸ−Ｄ５レベル：ゲニステイン（２５μＭ）、ＭＡＦＰ（２５μＭ）、ＭＫ８８６（５００ｎＭ）、ＥＴＹＡ（２５μＭ）、ＯＫＡ（５０ｎＭ）、ＡＳＡ（２００μＭ）、インドメタシン（２５μＭ）、イブプロフェン（１００μＭ）、ジクロフェナク（１μＭ）およびＮＳ−３９８（４μＭ）。ＮＤ：検出できなかった。データを平均±ｓ．ｄ．として表わす（ｎ＝４）；＊‘Ｋｄｏ２＋ＩＦＮγ’から有意差（Ｐ＜０．０１）（一元ＡＮＯＶＡ、ポストホックＴｕｋｅｙ検定）。（ｃ）ＣＯＸ−２  ｓｉＲＮＡをトランスフェクションし、活性化したＲＡＷ２６４．７細胞における、ＣＯＸ−２発現およびＥＦＯＸ−Ｄ５形成（Ｎ／Ａ／，非活性化細胞；Ｋ／Ｉ，活性化細胞，ＮＴＧ，非ターゲティングｓｉＲＮＡ対照）。データを平均±ｓ．ｄ．として表わす（ｎ＝５）；＊は‘ＮＴＧ  ｓｉＲＮＡ’から有意差（Ｐ＜０．０１）（一元ＡＮＯＶＡ、ポストホックＴｕｋｅｙ検定）。（ｄ，ｅ）ＤＰＡ±ＡＳＡの存在下でＣＯＸ−２のインビトロ酵素反応により形成された２つのＯＨ−ＤＰＡ異性体のクロマトグラフィープロフィール（ｄ）およびスペクトル（ｅ）。
【図２９】[0047]  図２９は、ＲＡＷ２６４．７の活性化後にＥＦＯＸがタンパク質およびＧＳＨと付加物を形成することを示す。（ａ）活性化ＲＡＷ２６４．７細胞からの溶解物を２グループに分割した：ＢＭＥによる処理に続いてアセトニトリルによるタンパク質沈殿（“総量”）、およびタンパク質沈殿に続いてＢＭＥ処理（遊離＋小分子付加物）。（ｂ）インビトロで酵素合成したＦＳ−１３−ＥＦＯＸ−Ｄ５（１５）の化学構造およびフラグメンテーションパターン。（ｃ）インビトロ酵素合成（上パネル）および細胞ペレット（下パネル）から得られた１３−ＥＦＯＸ−Ｄ５（６）のＧＳＨ付加物のクロマトグラフィープロフィールおよび陽イオン質量スペクトル。Ｎ／Ａ，非活性化細胞試料。
【図３０】[0048]  図３０は、１７−ＥＦＯＸ−Ｄ６（８）および１７−ＥＦＯＸ−Ｄ５（７）が抗酸化および炎症応答を調節することを示す。（ａ，ｂ）１７−ＥＦＯＸ−Ｄ６（８）および１７−ＥＦＯＸ−Ｄ５（７）で処理したＲＡＷ２６４．７細胞を、１時間目に核内Ｎｒｆ２測定のために（ａ）、そして１８時間目にＨＯ−１、ＧＣＬＭおよびＮＱＯ−１測定のために（ｂ）、ハーベストした。（ｃ，ｄ）１７−ＥＦＯＸ−Ｄ６および１７−ＥＦＯＸ−Ｄ５で６時間、前処理したＲＡＷ２６４．７細胞を、活性化後１２時間目にハーベストし、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ＩＬ−１０のレベル、およびナイトライトのレベルを細胞培地において測定し、タンパク質に対して正規化した；（ｄ）ｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２のレベルを細胞溶解物において検出した。数値を平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表わす（ｎ＝６）；＊は‘Ｋ／Ｉ’から有意差（Ｐ＜０．０１）（一元ＡＮＯＶＡ、ポストホックＴｕｋｅｙ検定）。（ｅ）ロシグリタゾン（Ｒｏｓｉ）、１７−ＥＦＯＸ−Ｄ６、１７−ＥＦＯＸ−Ｄ５、１５ｄ−ＰＧＪ２、１７−ＯＨ−ＤＨＡ、ＤＰＡおよびＤＨＡについてのＰＰＡＲγ  β−ラクタマーゼ−レポーターアッセイ。
【図３１】[0049]  図３１は、ＥＦＯＸが抗炎症シグナル伝達メディエーターであることを示す。炎症促進刺激されると、マクロファージは活性化状態になる。オメガ−３脂肪酸が細胞膜から放出され、ＣＯＸ−２によりＯＨ−誘導体に変換され、これが次いで代謝されてＥＦＯＸになる。ＥＦＯＸは炎症促進応答を阻害し、Ｎｒｆ２依存性の遺伝子発現およびＰＰＡＲγ活性化を誘導し、タンパク質およびグルタチオンに付加する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
[0050]  用語“アルキル”は、本明細書中で炭素原子１〜２４個の分枝または非分枝−飽和炭化水素基、たとえばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどを表わすために用いられる。“低級アルキル”基は、１個から６個までの炭素原子を含むアルキル基である。
【００３３】
[0051]  “アルケニル基”は、２〜２４個の炭素原子、および少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を含む構造式をもつ、分枝または非分枝−炭化水素基である。
[0052]  本明細書中で用いる“アルキニル基”という句は、炭素原子２〜２４個をもち、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を含む、分枝または非分枝−炭化水素基を表わす。
【００３４】
[0053]  本明細書中で用いる“アリール”は、単環式または多環式の芳香族基、好ましくは単環式または二環式の芳香族基、たとえばフェニルまたはナフチルを表わす。別途指示しない限り、アリール基は置換されていなくてもよく、あるいは独立してたとえばハロ、アルキル、アルケニル、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、ＯＨ、アルコキシ、アミノ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２アルキル、アリール、およびヘテロアリールから選択される１個以上、特に１〜４個の置換基で置換されていてもよい。代表的なアリール基にはフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、クロロフェニル、メチルフェニル、メトキシフェニル、トリフルオロメチルフェニル、ニトロフェニル、および２，４−メトキシクロロフェニルが含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
[0054]  用語“ハロゲン”および“ハロ”は、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒまたは−Ｉを表わす。
[0055]  用語“ヘテロ原子”は、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、および硫黄（Ｓ）を含むものとする。
【００３６】
[0056]  用語“ヒドロキシアルキル”は、指示した数の炭素原子をもつアルキル基において、アルキル基の１個以上の水素原子が−ＯＨで置き換えられたものを表わす。ヒドロキシアルキル基の例には、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｈ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、およびその分枝形が含まれるが、これらに限定されない。
【００３７】
[0057]  用語“ハロアルコイル”は、−（Ｃ１−Ｃ８）アルキル基において、Ｃ１−Ｃ８アルキル基中の１個以上の水素原子が、同一でも異なってもよいハロゲン原子で置き換えられたものを表わす。ハロアルキル基の例には、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピリル、ペンタクロロエチル、およびｌ，ｌ，ｌ−トリフルオロ−２−ブロモ−２−クロロエチルが含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
[0058]  用語“アミンまたはアミノ”は、−ＮＲｐＲｑ基を表わし、その際、ＲｐおよびＲｑはそれぞれ独立して水素、（Ｃ１−Ｃ８）アルキル、（Ｃ１−Ｃ８）ハロアルキル、および（Ｃ１−Ｃ６）ヒドロキシアルキル基を表わす。
【００３９】
[0059]  用語“オキソ”は、飽和または不飽和（Ｃ３−Ｃ８）環式または（Ｃ１−Ｃ８）非環式部分に結合した＝Ｏ原子を表わす。＝Ｏ原子は、環式または非環式部分の一部である炭素、硫黄および窒素原子に結合することができる。
【００４０】
[0060]  用語“ヘテロサイクル（複素環）”は、単環系、二環系、三環系、または多環系を表わし、それらは不飽和または芳香族であり、独立して窒素、酸素および硫黄から選択される１個から４個までのヘテロ原子を含み、その際、窒素および硫黄ヘテロ原子は任意に酸化されていてもよく、窒素ヘテロ原子は任意に第四級化していてもよく、二環系および三環系を含む。ヘテロサイクルはヘテロ原子または炭素原子のいずれかを介して結合することができる。ヘテロサイクルには、前記に定義したヘテロアリールが含まれる。ヘテロサイクルの代表例にはベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイミダゾリル、イソインドリル、インダゾリル、ベンゾジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、プリニル、インドリル、イソキノリニル、キノリニルおよびキナゾリニルが含まれるが、これらに限定されない。ヘテロサイクル基は置換されていなくてもよく、あるいは任意に１個以上の置換基で置換されていてもよい。
【００４１】
[0061]  用語“ヘテロシクロアルキル”は、１または２つの飽和環または不飽和環を含み、かつ環中に少なくとも１個の窒素、酸素または硫黄原子を含む、単環系または二環系を意味する。用語“シクロアルキル”は、１または２つの飽和または不飽和環を含む単環系または二環系を表わす。
【００４２】
[0062]  用語“ハロアルキル”は、Ｃ１−Ｃ８アルキル基において、ＣｐＣ６アルキル基中の１個以上の水素原子が−ハロゲン原子で置き換えられたものを表わし、それらは同一でも異なってもよい。ハロアルキル基の例には、トリフルオロメチル、２，２，２−トリフルオロエチル、４−クロロブチル、３−ブロモプロピル、ペンタクロロエチル、およびｌ，ｌ，ｌ−トリフルオロ−２−ブロモ−２−クロロエチルが含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
[0063]  用語“ヘテロアリール”は、本明細書中で、１または２つの芳香環を含み、かつ芳香環中に少なくとも１個の窒素、酸素または硫黄原子を含む、単環系または二環系を表わすために用いられる。別途指示しない限り、ヘテロアリール基は置換されていなくてもよく、あるいは独立してたとえばハロ、アルキル、アルケニル、ＯＣＦ３、ＮＯ２、ＣＮ、ＮＣ、ＯＨ、アルコキシ、アミノ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２アルキル、アリール、およびヘテロアリールから選択される１個以上、好ましくは１〜４個の置換基で置換されていてもよい。ヘテロアリール基の例には、チエニル、フリル、ピリジル、オキサゾリル、キノリル、チオフェニル、イソキノリル、インドリル、トリアジニル、トリアゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、イミダゾリル、ベンゾチアゾリル、ピラジニル、ピリミジニル、チアゾリル、およびチアジアゾリルが含まれるが、これらに限定されない。
【００４４】
[0064]  それぞれ、ｎ−３、ｎ−６、またはｎ−９多価不飽和脂肪酸(poly unsaturated fatty acid)（ＰＵＦＡ）；ｎ−３、ｎ−６、またはｎ−９求電子性脂肪酸誘導体(electrophilic fatty acid derivative)（ＥＦＡＤ）；あるいはそれらのいずれかの代謝産物という用語は、それぞれω−３、ω−６、もしくはω−９多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、またはそれぞれω−３、ω−６、もしくはω−９求電子性脂肪酸誘導体（ＥＦＡＤ）、あるいはそれの代謝産物という用語と互換性もって用いられる。オメガ−３、オメガ−６、もしくはオメガ−９多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、またはオメガ−３、オメガ−６、もしくはオメガ−９求電子性脂肪酸誘導体（ＥＦＡＤ）、あるいはそれの代謝産物という用語も同じものを表わす。
【００４５】
[0065]  これに関して、“代謝産物”というカテゴリーには、ケト脂肪酸のレジオ異性体、立体異性体、および構造アナログが含まれる。したがって、本発明の代謝産物には、異なる炭素長のテイルをもつ脂肪酸、および二重結合の位置異性体が含まれる。代謝産物のクラスには、ＰＵＦＡのケトおよびヒドロキシ誘導体の位置異性体も含まれる。さらに、二重結合はシス（Ｚ）二重結合またはトランス（Ｅ）二重結合であってもよい。さらに、本発明によれば、より詳細に後記に述べるように、代謝産物カテゴリーはケト脂肪酸の小分子アナログを包含することができる。
【００４６】
[0066]  用語“誘導体”は、類似化合物から誘導される化合物、または他の化合物から１個以上の原子を他の原子もしくは一群の原子で置き換えれば生成すると考えることができる化合物を表わす。本発明による脂肪酸代謝産物の誘導体には、限定ではなく、脂肪酸テイル中の１個以上の炭素原子が酸素、硫黄またはアミノ基で置換されたすべての化合物が含まれる。たとえば、脂肪酸は１以上のポリエチレングリコール単位もしくは１以上の１，２−ジアミノエタン単位またはその組合わせを含むことができる。
【００４７】
[0067]  用語“生物試料”は、組織、細胞、細胞抽出物、ホモジナイズした組織の抽出物、生理的に許容できる適切なキャリヤー中における１種類以上の酵素の混合物、たとえば限定ではなくヒドロキシデヒドロゲナーゼおよびシクロオキシゲナーゼを含有する混合物を表わす。
【００４８】
[0068]  本発明の化合物は、立体配置異性体、幾何異性体、立体配座異性体を含む多様な異性体形態で存在することもでき、また多様な互変異性形態、特に水素原子の結合点が異なる形態で存在することもできる。用語“異性体”は化合物の互変異性形態を含めて本発明化合物のすべての異性体形態を包含するものとする。
【００４９】
[0069]  本明細書に記載する特定の化合物は、不斉中心をもち、そのため異なる鏡像異性体およびジアステレオマーの形態で存在するという可能性がある。本発明の化合物は、光学異性体またはジアステレオマーの形態であってもよい。したがって、本発明は、本明細書に記載するようにそれらの光学異性体、ジアステレオ異性体、およびその混合物（ラセミ混合物を含む）の形態の本発明化合物、ならびにそれらの使用を包含する。本発明化合物の光学異性体は、既知の手法、たとえば不斉合成、キラルクロマトグラフィー、擬似移動床法により、または光学活性分割剤を用いる化学的な立体異性体分離により、得ることができる。
【００５０】
[0070]  別途指示しない限り、“立体異性体”は、ある化合物の１つの立体異性体であってその化合物の他の立体異性体を実質的に含まないものを意味する。したがって、１つのキラル中心をもつ立体的に純粋な化合物は、その化合物の反対の鏡像異性体を実質的に含まないであろう。２つのキラル中心をもつ立体的に純粋な化合物は、その化合物の他のジアステレオマーを実質的に含まないであろう。一般的な立体的に純粋な化合物は、約８０重量％を超えるその化合物の１つの立体異性体および約２０重量％未満のその化合物の他の立体異性体、たとえば約９０重量％以上のその化合物の１つの立体異性体および約１０重量％未満のその化合物の他の立体異性体、または約９５重量％以上のその化合物の１つの立体異性体および約５重量％未満のその化合物の他の立体異性体、または約９７重量％以上のその化合物の１つの立体異性体および約３重量％未満のその化合物の他の立体異性体を含むであろう。
【００５１】
[0071]  描かれた構造とその構造に与えられた名称との間に不一致があれば、描かれた構造が支配する。さらに、ある構造またはある構造の一部の立体化学性がたとえば太線または点線で指示されていない場合、その構造またはその構造の一部はそれのすべての立体異性体を包含すると解釈すべきである。
【００５２】
[0072]  用語“プロドラッグ”は、ある化合物の誘導体であって、生物学的条件下においてインビトロまたはインビボで加水分解、酸化、または他の形で反応して、活性化合物、特に本発明の化合物を供給できる化合物を意味する。プロドラッグの例には、本発明化合物の生物加水分解性(biohydrolyzable)基を含む誘導体および代謝産物、たとえば生物加水分解性アミド、生物加水分解性エステル、生物加水分解性カルバメート、生物加水分解性カーボネート、生物加水分解性ウレイド、および生物加水分解性ホスフェートアナログ（たとえば、モノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェート）が含まれるが、これらに限定されない。たとえば、カルボキシル官能基をもつ化合物のプロドラッグは、そのカルボン酸の低級アルキルエステルである。それらのカルボキシレートエステルは、その分子上に存在するいずれかのカルボン酸部分をエステル化することによって簡便に形成される。プロドラッグは、一般に、周知の方法、たとえばBURGER'S MEDICINAL CHEMISTRY AND DRUG DISCOVERY 6th ed. (Wiley, 2001)およびDESIGN AND APPLICATION OF PRODRUGS (Harwood Academic Publishers Gmbh, 1985)により記載された方法を用いて製造できる。
【００５３】
[0073]  用語“処置(treat, treating, treatment)””は、ある疾患またはある疾患に関連する症状の改善または根絶を表わす。特定の態様において、そのような用語は、そのような疾患を伴なう患者に１種類以上の予防薬または治療薬を投与することによりその疾患の拡散または増悪を最小限に抑えることを表わす。
【００５４】
[0074]  用語“有効量”は、ある疾患の治療または予防において治療上または予防上の有益性をもたらすのに十分な、あるいはある疾患に関連する症状を遅延させまたは最小限に抑えるのに十分な、本発明化合物または他の有効成分の量を表わす。さらに、本発明の化合物に関して“療法有効量”は、ある疾患の治療または予防において療法上の有益性をもたらす、療法薬単独の量または他の療法薬と組合わせた量を意味する。本発明の化合物に関して用いる場合、この用語は、療法全般を改善し、疾患の症状または原因を軽減または回避し、あるいは他の療法薬の療法有効性を増強し、またはそれと相乗作用する量を包含することができる。
【００５５】
[0075]  “患者”または“対象”は、本明細書全体において互換性をもって用いられ、動物（たとえば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウズラ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギまたはモルモット）、１態様においては哺乳動物、たとえば非霊長類および霊長類（たとえば、サルおよびヒト）、他の態様においてはヒトを含む。１態様において、患者はヒトである。特定の態様において、患者はヒトの乳児、小児、若者または成人である。
【００５６】
求電子性脂肪酸誘導体
[0076]  多価不飽和脂肪酸は、ヒトにおいて健康上有益な多数の効果を発揮する。主要な（ｎ−３  ＰＵＦＡ）は、エイコサペンタン酸（ＥＰＡ；（５Ｚ，８Ｚ，１ｌＺ，１４Ｚ，１７Ｚ）−エイコサ−５，８，１１，１４，１７−ペンタン酸）およびドコサヘキサン酸（ＤＨＡ；（４Ｅ，７Ｅ，１０Ｚ，１３Ｅ，１６Ｅ，１９Ｅ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサン酸）である。ＥＰＡおよびＤＨＡは両方とも、アラキドン酸から誘導されるプロスタノイド合成およびそれに続くｎ−３プロスタノイド生成の競合阻害により、抗炎症効果を発揮する。本発明に関して、求電子性脂肪酸誘導体（ＥＦＡＤ）はｎ−３  ＰＵＦＡの酸化的代謝産物である。本発明によるＥＦＡＤの代表例は、アルファ，ベータ−不飽和ケト脂肪酸またはそれの代謝産物である。ケト脂肪酸は、炭素−炭素二重結合に隣接する炭素原子上にケトン基がある脂質である。ケト脂肪酸およびそれらの生物代謝産物は、生物学的環境に存在する求核体との付加物形成反応を行なうことにより生物学的効果を発揮する。
【００５７】
ケト脂肪酸およびそれらの代謝産物の同定
[0077]  本発明者らは、活性化マクロファージにおいてＣＯＸ−２依存性機序により生成する６種類の求電子性脂肪酸誘導体（ＥＦＡＤ）を見出した。ところが、細胞のアセチルサリチル酸（ＡＳＡ）処理はＥＦＡＤの形成速度および細胞内濃度を増大させた。これら６種類のＥＦＡＤは、ＲＡＷ２６４．７では６５ｎＭから３５０ｎＭまでの範囲の濃度でみられ、ＬＰＳおよびＩＦＮγで活性化したＴＨＰ−Ｉ細胞および初代ネズミマクロファージによっても産生された。
【００５８】
[0078]  ＥＦＡＤ  １〜３は、それぞれｎ−３脂肪酸であるＤＨＡ、（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１６，１９−ペンタエン酸（ＤＰＡ）、およびドコサテトラエン酸（ＤＴＡ）のα，β−不飽和オキソ誘導体として広く特性解明された。特定の１３−オキソおよび１７−オキソ位置異性体がＥＦＡＤ  １および２について同定され、インビトロ合成された。ＥＦＡＤは、それらの生物学的作用を調べた際に、活性化ＲＡＷ２６４．７細胞においてタンパク質および小分子細胞性スルフヒドリル類、たとえばＧＳＨと付加物を形成することが見出された。ＥＦＡＤ−ＩおよびＥＦＡＤ−２の１７−オキソ標準品（１７−オキソＤＨＡおよび１７−オキソＤＰＡ）は、活性化マクロファージにおいて観察された細胞内濃度に匹敵する濃度で、活性化マクロファージにおいてＰＰＡＲγおよびＫｅａｐ−１／Ｎｒｆ２経路を活性化し、ｉＮＯＳおよびサイトカインの発現を阻害することができた。
【００５９】
[0079]  １態様において、本発明は酵素により生成する一群の求電子性脂肪酸誘導体（ＥＦＡＤ）、または酵素により生成するそれらの代謝産物を記載する。ＥＦＡＤおよびそれらの代謝産物はヒトの健康に有益な効果をもつ。本発明者らによれば、本発明のケト脂肪酸、または酵素により生成するそれらの代謝産物は、インビボで適応性シグナル伝達分子を生成することにより、炎症を阻害することができる。炎症状態に対する応答の性質は個々のケト脂肪酸の細胞レベルに依存するので、生物試料中のこれらの作用物質を同定できる分析法の開発が重要である。本発明は生物試料を分析するための質量分析法を提供する。すなわち、本発明は、ケト脂肪酸およびそれらの代謝産物を同定するために、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）駆動による求電子化合物のアルキル化を逆相高速液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）２２方法と連携させて用いる。
【００６０】
[0080]  したがって、関心のある生物試料をβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）と共に、求核体として作用するβ−メルカプトエタノールと求電子体である式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩの脂肪酸をミカエル付加反応させるのに十分な時間インキュベートすると、１種類以上の共有結合β−メルカプトエタノール−求電子性脂肪酸付加物を含有する混合物が形成される。試料中のケト脂肪酸のアイデンティティーを、試料のクロマトグラム中に得られる質量ピークから演繹する。この方法を炎症のインビトロモデルに適用することにより、伝統的なスクリーニング法では見落とされていた可能性のある未知の種またはほとんど特性解明されていない種がより顕著に同定されるであろうと仮定した。ＢＭＥとのアルキル化反応は、付加したＲＥＳについてのＭＳ／ＭＳ条件を標準化して、それぞれがそれら自身の特定のＭＳ／ＭＳ特徴をもつ広範なＲＥＳに類似のイオン化およびフラグメンテーション特性を与える。したがって、可逆性ＲＥＳ種（遊離したもの、またはタンパク質もしくは小分子チオールに付加したもの）、ＭＳ／ＭＳに際してほとんどフラグメンテーションしなかった種、検出限界以下であった種、および現在の知識に基づいてその形成を予測できなかった種を、この方法により同定できるであろう。
【００６１】
[0081]  図１に示すように、本発明方法による細胞溶解物の分析により、７８ダルトンの質量差を示す２つのピークが得られた；これは付加物からのＢＭＥ基の喪失に起因する（−７８ａｍｕ；［Ｍ−ＢＭＥ］”）。そのようなフラグメンテーションの正味の結果として第２ピークが生じ、それの質量は細胞溶解物中に存在するケト脂肪酸の質量に対応するであろう。このケト脂肪酸のアイデンティティーを確認する追加証拠は、Ｍ−ＢＭＥピークをフラグメンテーションし、得られたフラグメントイオンを続いて分析することにより得られる。本発明方法の利点は、それが生物試料中のケト脂肪酸の検出のための感度および精度を高める良好な離脱基（すなわち、ＢＭＥ）を提供することである。
【００６２】
[0082]  この方法を用いて、ＲＡＷ２６４．７細胞をＰＭＡ、ＬＰＳおよびＩＦＮγにより活性化した際に形成された６種類のこれまで特性解明されていなかった主なＲＥＳ種（図５ａ）が同定された。ＭＳ／ＭＳ実験により、これら６種類のＥＦＡＤそれぞれからのＢＭＥのニュートラルロスが確認された（データを示していない）。これらと同じ求電子種が、ＰＭＡ、Ｋｄｏ２およびＩＦＮγにより活性化されたＴＨＰ−Ｉ細胞、すなわちヒト単球／マクロファージ細胞系において検出された（図５ｂおよび１２）。それらの相対存在量はこれら２細胞系間で異なっていたが、ＭＳ／ＭＳスペクトルは同じ特徴的な喪失および類似の強度比を示した（データを示していない）。
【００６３】
[0083]  ＢＭＥ法、選択イオンモニタリング(selected ion monitoring)（ＳＩＭ）、およびＣＯ２の喪失を追跡する多重イオンモニタリング(multiple ion monitoring)（ＭＲＭ）モードを用いてα，β−不飽和部分を含む種々の求電子性脂肪酸の質量分析応答を比較することにより、求電子性脂質の検出および定量に関するＢＭＥ法の堅実性をさらに試験した（図１３）。種々の脂肪酸につき試験した各濃度で得られた全プロセスに関する標準偏差は、ＢＭＥ分析については４０％〜５０％、ＭＲＭ分析については６０〜８３％、ＳＩＭ分析については１５〜３５％の範囲であった。さらに、本発明者らはＢＭＥベースの質量分析法は他の質量分析ベースの方法より優れていることを見出した；前者は一貫して強い信号強度、低いバックグラウンドレベルおよび直線性を与えたからである。ＳＩＭおよびＭＲＭ分析が高いバックグラウンドレベルのためきわめて劣る結果を与えた生物試料について、ＢＭＥ法を選択した。ＥＦＡＤ形成は、マクロファージ活性化後の時間に依存する。
【００６４】
[0084]  種々の炎症状態下でのＥＦＡＤの形成を、多様な刺激で細胞を処理することにより確認した。したがって、マクロファージを種々の組合わせのＬＰＳ、ＩＦＮγ、ＰＭＡ、ｆＭＬＰ、およびＫｄｏ２−リピドＡ（Ｋｄｏ２）で活性化した（図１ｃ、および補助的な図３）。ＥＦＡＤ形成に対する潜在的なＬＰＳ製剤夾雑物の関与を避けるために、Ｋｄｏ２、すなわち合成エンドトキシンを用いた。Ｋｄｏ２−リピドＡおよびＩＦＮγの組合わせはＬＰＳとほぼ同等な挙動を示したので、それを以後のすべての実験に用いた。これによりさらに、ＬＰＳ自体の成分または夾雑物はＥＦＡＤの前駆体として作用しないことが確認された。さらに、タイムコース分析により、ＥＦＡＤ形成は活性化後４〜６時間目に開始し、約１０時間目にピークに達することが示された（図１ｄ、および補助的な図４）。他のＥＦＡＤの時間依存的形成のプロフィールは、ＥＦＡＤ−２のものと類似し（データを示していない）、種々の種について得られた細胞内濃度の範囲は６５から３５０ｎＭに及んでいた（表１）。
【００６５】
【表１】
2015508065.tif 000010
【００６６】
ＥＦＡＤはｎ−３脂肪酸のａ，β−不飽和オキソ誘導体である
[0085]  同定を伴なったＥＦＡＤ中のα，β−不飽和ケトン基の存在の確認は、質量−飛行時間(time of flight)（ＴＯＦ）データ（１０ｐｐｍ以下の精度のもの）、溶出プロフィールの分析に基づき、かつＥＦＡＤのフラグメンテーションに際してのＣＯ２喪失の観察に基づく。こうして、ＤＰＡのＥＦＡＤ（ＥＦＡＤ−２）は、合計５つの二重結合をもつ２２炭素脂肪酸テイルのモノ酸素化誘導体と同定された。ＢＭＥ付加したＥＦＡＤ−２のＭＳ／ＭＳスペクトル（ｍ／ｚ  ４２１  ［Ｍ−Ｈ］”）は、特徴的なフラグメントイオンをｍ／ｚ  ４０３（［Ｍ−Ｈ−Ｈ２Ｏ］）、３７７（［Ｍ−Ｈ−ＣＯ２］）、３４３（［Ｍ−Ｈ−ＢＭＥ］）、３２５（［Ｍ−Ｈ−ＢＭＥ−Ｈ２Ｏ］）、および２９９（［Ｍ−Ｈ−ＢＭＥ−ＣＯ２］）に示した（図６ａ）；これは、先に報告されたＢＭＥ付加物のフラグメンテーションパターン２２と一致した。
【００６７】
[0086]  同様に、ＤＨＡのＥＦＡＤ（ＥＦＡＤ−Ｉ）およびＤＴＡのＥＦＡＤ（ＥＦＡＤ−３）は、それぞれ合計６および４つの二重結合をもつ２２炭素脂肪酸のモノ酸素化誘導体と同定された。前駆体をインビボで解明するために、脂肪酸補充試験を実施した。ＥＦＡＤ−２の形成は、１８：３  ｎ−３（α−リノレン酸）および２０：５  ｎ−３（ＥＰＡ）を補充した活性化ＲＡＷ２６４．７細胞では有意に増大し、一方、関連のｎ−６種を供給した場合はわずかに低下した（図６ｂ）。これらの結果は、ＥＦＡＤ−２がもっぱらｎ−３  ＰＵＦＡから誘導されたことを指摘した。さらに、図４に示すように、ＥＦＡＤ−２形成はＣＯＸ−２依存性である。２２：６  ｎ−３（ＤＨＡ）の補充はＥＦＡＤ−２レベルを上昇させなかった。これは、哺乳動物細胞は短鎖ＰＵＦＡを脱飽和および伸長することができるけれどもそれらは一般にＤＨＡのようなＰＵＦＡを再飽和しないという事実と一致した。
【００６８】
[0087]  活性化ＲＡＷ２６４．７におけるＥＦＡＤ−Ｉの形成は、２２：６  ｎ−３の補充によってのみ増大した（図１６ａ）。ＥＦＡＤ−３はｎ−３およびｎ−６両方の脂肪酸の補充によって増加し、これはそれの前駆体がｎ−３またはｎ−６  ＤＴＡのいずれかの可能性があることを指摘する（図１６ｂ）。全体として、この試験は、ＥＦＡＤ−Ｉ、ＥＦＡＤ−２、およびある割合のＥＦＡＤ−３がｎ−３脂肪酸ＤＨＡ、ＤＰＡおよびＤＴＡの誘導体であり、一方、ＥＦＡＤ−４〜−６はｎ−３およびｎ−９脂肪酸から合成されたことを示した。（表１）。
【００６９】
[0088]  ＥＦＡＤの求電子性官能基はα，β−不飽和カルボニルであり、脂肪酸テイル中の他の求電子性基（たとえば、エポキシ基）の存在は除外されるというさらなる確証が、Ｌｕｃｈｅ反応を実施することにより得られた（図６ｃ）。この反応は、ＮａＢＨ４（ＣｅＣ１３の存在下で）を用いて、レジオ選択性を失うことなくカルボニル基（ただし、エポキシ基またはカルボン酸基ではない）を選択的に還元してアリルアルコールにする２３。ＩＦＮγおよびＬＰＳにより活性化されたＲＡＷ２６４．７細胞溶解物からの脂質抽出物をＨＰＬＣにより分画した。ＥＦＡＤ−２を含有する画分を精製し、ＮａＢＨ４で還元すると、ＥＦＡＤ−２に対応する信号が有意に低下し、それまで存在しなかったピークが転移３４５／３２７に現われた（ＥＦＡＤ−２の還元生成物，図６ｄ）。一般にＭＳ／ＭＳに際してヒドロキシ基によってフラグメンテーション増強が誘発されるため、Ｌｕｃｈｅ反応の生成物によりカルボニル基の位置についての関連情報が得られた。したがって、一般的に観察されるイオンフラグメント（ｍ／ｚ  ３２７（［Ｍ−Ｈ］−Ｈ２Ｏ）および２８３（［Ｍ−Ｈ］−Ｈ２Ｏ−ＣＯ２）のほかに、ＮａＢＨ４で還元したＥＦＡＤ−２富化画分に１３−ヒドロキシ−ＤＰＡ（１３−ＯＨ−ＤＰＡ）について下記の診断イオンが観察された：ｍ／ｚ  ２２３、２０５（２２３−Ｈ２Ｏ）および１９５（図６ｅ）。これらの所見により、ＥＦＡＤ−２は１３−オキソＤＰＡに対応すること、およびＥＦＡＤ−３はＤＴＡのオキソ誘導体であることが最終的に明らかになった（表１）。
【００７０】
[0089]  ＢＭＥ法は、求電子性ケト脂肪酸の生物学的に重要な代謝産物を同定するために有用である。たとえば、本発明者らはＢＭＥ法を用いて、有効な抗炎症性求電子シグナル伝達分子であるＣ１０〜Ｃ１８代謝産物を探り当てた。これらの小型低分子量代謝産物は改善された安定性および生物学的利用能をもち、それによりこれらの化合物およびこれらの脂肪酸代謝産物の誘導体は慢性疼痛および炎症を処置するための候補療法薬となる。
【００７１】
ケト酸およびそれらの代謝産物
[0090]  主要なｎ−３多価不飽和脂肪酸（ｎ−３  ＰＵＦＡ）であるエイコサペンタン酸（ＥＰＡ；（５Ｚ，８Ｚ，１ｌＺ，１４Ｚ，１７Ｚ）−エイコサ−５，８，ｌ１，１４，１７−ペンタン酸）およびドコサヘキサン酸（ＤＨＡ；（４Ｅ，７Ｅ，１０Ｚ，１３Ｅ，１６Ｅ，１９Ｅ）−ドコサ−４，７，１０，１３，１６，１９−ヘキサン酸）は、ヒトにおいて健康上有益な多数の効果と関連づけられてきた。特に、脳および網膜の組織は健康な個体ではＤＨＡに富み、ＤＨＡはこれらの組織の正常な発達および機能のために必要である１，２。さらに、食事におけるＤＨＡの摂取は下記に関与することが示唆されている：神経認知衰退の軽減３、糖尿病におけるインスリン抵抗性の改善４、心筋梗塞などの心血管リスクの発生率の低下５、および炎症の軽減６。ＥＰＡおよびＤＨＡは両方とも、アラキドン酸から誘導されるプロスタノイド合成およびそれに続くｎ−３プロスタノイド生成を競合阻害することにより抗炎症効果を発揮し、血管拡張を誘導し、血小板凝集を阻害し７、その機序が依然として推測のままである一連の抗炎症事象を促進する能力をもつ。
【００７２】
[0091]  幾つかの台頭しつつあるクラスの抗炎症性脂質メディエーターが最近報告された。これらの脂質誘導体は、構造的には炎症促進性プロスタノイドに関係があるが、下記により炎症の消散を促進する：ＮＦ−κＢ活性化の抑制、サイトカイン発現の調節、Ｇタンパク質共役型受容体の活性化８、および細胞保護応答の促進９。これらには、酵素合成されたレゾルビン(resolvin)（Ｒｖ）類、ニューロプロテクチン(neuroprotectin)類、マレシン(maresin)類、およびリポキシン(lipoxin)（ＬＸ）類が含まれる。シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）およびリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）類を含めたオキシゲナーゼ類は、これらの生合成プロセスに関与し、炎症事象の発生および繊細に統合されたそれらの消散の両方における鍵酵素として台頭している１０。
【００７３】
[0092]  そのような脂質誘導体の第２グループには、ニトロ脂肪酸（ＮＯ２−ＦＡ）、１５−デオキシ−△（１２，１４）−プロスタグランジンＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）、およびニューロプロスタン(neuroprostan)類が含まれ、これらは反応性求電子種(reactive electrophilic species)（ＲＥＳ）であり、大部分が非酵素的酸化事象に際して形成される。本発明に関して、求電子性脂肪酸誘導体（ＥＦＡＤ）はｎ−３  ＰＵＦＡの酸化的代謝産物である。ＥＦＡＤの代表例はケト脂肪酸である。ケト脂肪酸は、二重結合の炭素原子に隣接してケトン基がある脂質である。ケト脂肪酸およびそれらの生物学的代謝産物は、反応性求電子種（ＲＥＳ）であり、主に求電子反応によりそれらの生物学的効果を発揮する１１，１２。
【００７４】
[0093]  ＲＥＳは電子吸引性官能基をもつことを特徴とする分子であり、その基がアルファ−炭素を貧電子状態にし、電子に富むドナー分子（求核体）に対して反応性にする。電子吸引基の強さが求電子体の反応性を決定するであろう。本発明のケト脂肪酸またはそれらの代謝産物中に存在する電子吸引基の代表例はアルファ−ベータ不飽和カルボニル基であり、それは生物学的求核体とのミカエル付加反応を行なうことができる。ＲＥＳのより詳細な特性分析を後記に示す。
【００７５】
[0094]  したがって、それぞれマウス細胞（ＲＡＷ２６４．７）およびヒト細胞（ＴＨＰ−Ｉ）において炎症が開始すると、ケト脂肪酸の細胞内レベルが上昇する。特に、活性化マクロファージにおいて６種類の求電子性脂肪酸誘導体（ＥＦＡＤ）が本発明者らにより同定された。活性化マクロファージにおけるこれらのＥＦＡＤは、質量分析により、それぞれｎ−３脂肪酸であるＤＨＡ、（７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）−ドコサ−７，１０，１３，１６，１９−ペンタン酸（ＤＰＡ）、およびドコサテトラン酸(docosatetranoic acid)（ＤＴＡ）のα，β−不飽和オキソ誘導体であると特徴づけられた。詳細には、ＤＨＡおよびＤＰＡ  ＥＦＡＤについて１３−オキソおよび１７−オキソ位置異性体が同定された。
【００７６】
ＥＦＡＤの生物学的産生
１．ＣＯＸ−２の役割
[0095]  いずれか特定の理論により拘束されたくはないが、本発明者らはＥＦＡＤは活性化細胞においてＣＯＸ−２依存性の機序で産生されると考える。たとえば、ＥＦＡＤをＰＵＦＡのα，β−不飽和オキソ−誘導体として同定する過程で、それらの合成に関与する経路を決定するために一連の実験を実施した。Ｋｄｏ２およびＩＦＮγで活性化し、多様な阻害剤で処理したＲＡＷ２６４．７細胞において、ＥＦＡＤレベルを定量した（図７ａ、図１７、および表１）。
【００７７】
[0096]  ゲニステインおよびメチルアラキドニルフルオロホスホネート（ＭＡＦＰ）の両方がＥＦＡＤ産生を５０％以上阻害した。ゲニステインは、ＬＰＳおよびＩＦＮγシグナル伝達を阻害するための全般的チロシンキナーゼ阻害剤として選択された。ＭＡＦＰ、すなわちカルシウム依存性および細胞質ゾル性の両方のホスホリパーゼＡ２（ｃＰＬＡ２およびｉＰＬＡ２）に対する選択的な不可逆的阻害剤は、ＲＡＷ２６４．７を活性化した際にＥＦＡＤ前駆体が細胞質膜から放出されるかどうかを判定するために用いられた。５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯＸ）がＥＦＡＤ形成に関与するかどうかを判定するために、ＭＫ８８６を用いてＦＬＡＰ依存性の５−ＬＯＸ活性化を阻止した。ＭＫ８８６はＥＦＡＤに対して有意の作用をもたなかった。
【００７８】
[0097]  エイコサテトライン酸(eicosatetraynoic acid)（ＥＴＹＡ）、すなわちＣＯＸおよびＬＯＸ酵素の非特異的的阻害剤はＥＦＡＤ形成を強く阻害することが認められ、一方、全般的なホスファターゼ阻害剤であるオカダ酸(okadaic acid)（ＯＫＡ）はＥＦＡＤ形成のわずかな増大をもたらし、これはおそらくＬＰＳおよびＩＦＮγシグナル伝達の増強によるものであろう。ＥＦＡＤ形成に対するＥＴＹＡの阻害作用が特異的にＣＯＸの阻害によるものかどうかを判定するために、Ｋｄｏ２およびＩＦＮγで活性化したＲＡＷ２６４．７細胞におけるＥＦＡＤレベルを定量し、それらのＩＣ５０値の少なくとも５倍の濃度のＣＯＸ阻害剤で処理した２４（図７ｃおよび１８、ならびに表１）。
【００７９】
[0098]  インドメタシンおよびジクロフェナクは完全にＥＦＡＤ形成を阻害することが見出され、一方、イブプロフェンはＥＦＡＤ形成を有意に８０％以上阻害することが見出され、ただし、ＥＦＡＤ−Ｉには有意の阻害が示されなかった。さらに、選択的ＣＯＸ−２阻害剤ＮＳ−３９８、すなわちニメスリド(Nimesulide)の近縁構造関係物質も、ＥＦＡＤ形成を消滅させた。すなわち、炎症を軽減するために用いられるＣＯＸ−２特異的な一般の非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）も細胞性ケト脂肪酸の生成レベルを低下させる。図３を参照。
【００８０】
[0099]  最後に、アセチルサリチル酸（ＡＳＡ）は、すべてのＥＦＡＤについて約２．５倍、有意にＥＦＡＤ形成を増大させ、唯一の例外はＥＦＡＤ−４およびＥＦＡＤ−６であった。これは、ＣＯＸ−２  Ｓｅｒ５３０のＡＳＡアセチル化が長鎖ＰＵＦＡのモノ酸素化誘導体の形成に好都合であることを示す先のレポート２５と一致した。すべてのＥＦＡＤについての阻害剤試験で得た結果のまとめを表１に報告する。
【００８１】
[00100]  ＣＯＸ−２阻害試験の結果は、ＥＦＡＤにおけるＣＯＸ−２の関与を示唆し、酵素によるＥＦＡＤ合成のインビトロモデルを開発する動機となった。精製したヒツジＣＯＸ−２を用いてＥＦＡＤ−２前駆体（ＯＨ−ＤＰＡ）を産生させ（図７ｃ〜ｅ）、一方、ＥＦＡＤ−Ｉ前駆体であるヒドロキシ−ＤＨＡ（ＯＨ−ＤＨＡ）はＤＨＡからＣＯＸ−２により産生された（図１９ａおよび１９ｂ）。興味深いことに、ＡＳＡはＯＨ−ＤＰＡ形成の速度および程度を増大させ（図７ｃ）、生成したヒドロキシ−異性体の集団を１３−から１７−へシフトさせた（図７ｄ〜ｆならびに図１９ａおよび１９ｂ）。
【００８２】
[00101]  質量分析を用いる酵素反応混合物の分析は、特徴的なフラグメンテーションパターンを示した。ＣＯＸ誘導による１３−ＯＨ−ＤＰＡのフラグメンテーションパターンについては、特徴的なｍ／ｚ  １９５および２２３イオンが観察され、それらのイオンは、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ４）を用いる還元反応を施したＲＡＷ２６４．７細胞抽出物について観察されたヒドロキシル基誘導によるフラグメンテーションに対応する（図６ｅおよび７ｄ）。これと対照的に、ＣＯＸ−２反応混合物をＡＳＡで処理すると、Ｃ−１７位のヒドロキシル基に対応する特徴的なイオンが検出された（図７ｅ）。活性化されたＡＳＡ処理ＲＡＷ２６４．７細胞においては、ＥＦＡＤ−２について図７ｇに、またＥＦＡＤ−Ｉについて図１９ｃに示すように、このシフトにより１７−オキソ異性体が生成した。
【００８３】
２．ヒドロキシデヒドロゲナーゼの役割
[00102]  ＰＵＦＡからそれらに対応するオキソ誘導体への変換には、ＣＯＸ−２のほかにヒドロキシデヒドロゲナーゼの存在が必要である。たとえば、活性化または非活性化ＲＡＷ２６４．７細胞からの溶解物を、ＥＦＡＤ−２前駆体ＤＰＡおよびＯＨ−ＤＰＡと共にインキュベートした。活性化および非活性化細胞の溶解物をＯＨ−ＤＰＡと共にＮＡＤ＋の存在下でインキュベートした場合、時間依存性でＥＦＡＤ−２が生成した（図７ｇ）。これと対照的に、ＤＰＡと共にインキュベートした場合、活性化細胞からの溶解物のみが時間依存性のＯＨ−ＤＰＡおよびＥＦＡＤ−２生成を示した（図７ｇ〜ｉ）。
【００８４】
[00103]  これらの結果は、活性化細胞のみがＤＰＡをそれのオキソ誘導体（オキソ−ＤＰＡ）に代謝変換できることを示し、これは、ＰＵＦＡからそれらに対応するヒドロキシ誘導体への変換におけるＣＯＸ−２の役割を確証する；ヒドロキシ誘導体は構成性発現すると思われるヒドロキシ−デヒドロゲナーゼによって対応するオキソ誘導体に酵素変換される。したがって、本発明によれば、ケト脂肪酸のインビボレベルとＣＯＸ−２のインビボレベルとの間に直線関係がある。後記に実験のセクションでさらに説明するように、本発明者らは他の細胞系、たとえば霊長類細胞系におけるＥＦＡＤ形成も測定した。
【００８５】
ＥＦＡＤは細胞保護経路および抗炎症経路を活性化する
[00104]  前記のように、本発明の化合物は生体チオールと反応して可逆性共有結合付加物を形成できる。たとえば、ＥＦＡＤなどの細胞内ＲＥＳは、Ｎｒｆ２インヒビターＫｅａｐ１のチオール依存性修飾によりＮｒｆ２依存性抗酸化応答経路の活性化を促進する。これが転写因子Ｎｒｆ２の核内トランスロケーションおよびそれのターゲット遺伝子の発現を誘発する２８。たとえば、１７−オキソＤＨＡおよび１７−オキソＤＰＡは、用量依存性のＮｒｆ２核内蓄積ならびに細胞保護酵素ヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ−１）およびＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノリンオキシドレダクターゼ１（Ｎｑｏ１）の発現を促進した（図１１ａおよび１１ｂ）。
【００８６】
[00105]  １７−オキソＤＨＡおよび１７−オキソＤＰＡがＫｄｏ２およびＩＦＮγにより発生する炎症応答の調節において役割を果たすかどうかを調べるために、本発明者らは、漸増濃度の１７−オキソＤＨＡおよび１７−オキソＤＰＡに曝露された細胞におけるサイトカイン類ＩＬ−６、ＭＣＰ−ＩおよびＩＬ−１０の変化を調べた。
【００８７】
[00106]  ＭＣＰ−ＩおよびＩＬ−１０両方の細胞内レベルが、ＥＦＡＤ処理後に用量依存性で抑制された。たとえば、ＭＣＰ−Ｉレベルの−８０％の低下が最大濃度のＥＦＡＤで観察され、一方、約５０％の低下がＩＬ−６において観察された（図１１ｃ）。同様な結果が骨髄由来マクロファージ（bone marrow-derived macrophage)（ＢＭＤＭ）において観察された（図２３ａ）。図１１ｄに示すように、ＥＦＡＤ−Ｉおよび−２は、ＲＡＷ２６４．７およびＢＭＤＭの両方において、誘導性一酸化窒素シンターゼ(inducible nitric oxide synthase)（ｉＮＯＳ）の誘導およびそれに続く細胞培地中のナイトライト蓄積を強くかつ用量依存性で抑制した（図２３ｂ）。
【００８８】
[00107]  特に、それぞれ２５および２０μＭの濃度の１７−オキソＤＰＡおよび１７−オキソＤＨＡで−７０％のナイトライト産生低下が観察された。興味深いことに、この試験ではＣｏｘ−２誘導はＥＦＡＤにより影響されなかった。ｉＮＯＳおよび分析した炎症性サイトカインの発現は、ＮＦ−κＢおよびＳｔａｔ−１の活性に依存する。求電子性脂質は、ＮＦκＢサブユニットｐ６５のＤＮＡ結合ドメインへの、およびインヒビターＩκＢαへの直接付加により、または間接的機序を介して、これらの転写因子の活性化を抑制する可能性があると報告されている。しかし、ＥＦＡＤはｐ６５の核内トランスロケーションおよびＤＮＡ結合またはＳｔａｔ１リン酸化を有意に阻害することはない。
【００８９】
[00108]  オキソ脂肪酸、たとえば１５ｄ−ＰＧＪ２３０、５−オキソＥＰＡ、６−オキソＯＴＥ、および合成４−オキソＤＨＡ３１がペルオキシソーム増殖剤活性化受容体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ)（ＰＰＡＲγ）を共有結合して活性化するという所見により本発明者らは刺激されて、１７−オキソＤＰＡおよび１７−オキソＤＨＡがＰＰＡＲγを活性化する能力を試験した。したがって、有効な合成ＰＰＡＲγアゴニストであるロジグリタゾンを陽性対照としてアッセイに用いて、ＰＰＡＲγベータ−ラクタマーゼ−レポーターアッセイを実施した。
【００９０】
[00109]  両方のＥＦＡｄ（１７−オキソＤＰＡおよび１７−オキソＤＨＡ）が、天然リガンド１５ｄ−ＰＧＪ２（約２５ｎＭ）と比較してわずかに高いＥＣ５０Ｓ（約４０ｎＭ）で、かつ１７−ＯＨ−ＤＰＡ（＞１０μＭ）およびそれらに対応する天然脂肪酸（ＤＨＡおよびＤＰＡ）より低い規模のＥＣ５０Ｓで、ＰＰＡＲγを活性化した（図１１ｅ）。
【００９１】
[00110]  本発明のＥＦＡＤおよびそれらの代謝産物は、それらと生体チオールとの反応性のため、ＣＯＸ−２遺伝子の転写因子の結合ポケットに存在するシステインと反応し、それによりその転写因子を不活性化すると考えられる。その結果、細胞内ＣＯＸ−２レベルが低下することにより炎症が阻害される。
【００９２】
[00111]  本発明はまた、ケト脂肪酸またはそれらの代謝産物の特定のミメティックを提供し、それらの合成を以下に記載する。
ケト脂肪酸のミメティックの合成
[00112]  多くの生物活性分子中にみられるアルファ，ベータ−不飽和ケトン単位は、医薬化学における重要なシントン(synthon)である。  −不飽和ケトン単位を伴なう生物活性分子について幾つかの合成が報告されている。参照：Synder, B. et al., Org Lett., (2001), 3(4), 569-572、およびBamford, S. et al., OrgLett, (2000), 2(8), 1157-1160。
【００９３】
[00113]  この背景とは異なり、本発明者らは式（Ｉ）または式（ＩＩ）による脂肪酸が炎症応答の有効なメディエーターであることを見出した。
【００９４】
【化９】
2015508065.tif 000011
【００９５】
[00114]  特に、アルファ，ベータ−不飽和ケト脂肪酸は強い抗炎症作用を示す。いずれか特定の理論を是認するわけではないが、本発明者らは、ある態様において、不飽和脂質のケト基およびカルボキシレート基がエフェクタータンパク質の結合ポケットを裏打ちする残基との静電相互作用および水素結合相互作用に寄与すると考える。
【００９６】
[00115]  したがって、本発明は、上記の静電相互作用および水素結合相互作用を保持するケト脂肪酸ミメティックを提供する。本発明のある態様において、式（Ｉ）または式（ＩＩ）に従うミメティックは、α,β-不飽和アルキルケトンにコンジュゲートしたヘテロサイクリックジオンのアナログである。本発明のミメティックのジオン官能基は、エフェクタータンパク質の結合ポケット内で脂質のカルボキシレートヘッド基が占めるものと同じ領域を占めると考えられる。したがって、このジオン官能基は、生体ケト脂肪酸のカルボキシレート基の様式でそのタンパク質と相互作用するであろう。さらに、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物は、ミメティックのテイル領域のケト基の位置を維持することにより、それらのターゲットに緊密に結合すると考えられる。
【００９７】
[00116]  式（Ｉ）または式（ＩＩ）に示す化合物の合成は、スキーム１に記載するように、適宜置換されたニトリルをホスホン酸ジエチルと反応させ、続いてそのエナミンホスホネートをアルデヒド類と塩基触媒反応させることにより達成できる。
【００９８】
スキーム１：
【００９９】
【化１０】
2015508065.tif 000012
【０１００】
[00117]  この方法は多能であり、種々のヘテロサイクリックジオンを適宜官能化されたアルファ，ベータ−不飽和アルキルケトンにコンジュゲートさせることができる。したがって、スキーム１中のＸは硫黄、酸素、または置換されていないかもしくは適宜置換された窒素原子であってもよい。
【０１０１】
[00118]  スキーム１に示した方法により、ケト基に対してアルファの炭素上に置換基をもつミメティックを合成することもできる。したがって、スキーム１中のＲｌは、下記のものからなる群から選択される：水素、（Ｃｌ−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、（Ｃｌ−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃｌ−Ｃ４）アルコキシ（Ｃｌ−Ｃ４）アルキル、（Ｃｌ−Ｃ８）フルオロアルキル、（Ｃｌ−Ｃ８）ヒドロキシアルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ４−Ｃ８）ビシクロアルキル、（Ｃ３−Ｃ８）ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アリール、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル（Ｃｌ−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）ヘテロシクロアルキル（Ｃｌ−Ｃ６）アルキル、ヘテロアリール（Ｃｌ−Ｃ６）アルキルおよびアリール（Ｃｌ−Ｃ６）アルキル。
【０１０２】
[00119]  さらなる態様において、本発明のミメティックはトリアゾール誘導体である。幾つかの試験により、トリアゾール単位はカルボキシレート基のミミックであることが示されている。したがって、カルボキシレート部分の代わりにトリアゾール単位を取り込んだ推定ミメティックは、抗炎症活性に関与することが示唆されている生理学的ターゲットに、ケト脂肪酸と類似の様式で結合すると考えられる。したがって、これらの化合物は炎症を処置するための候補療法薬である。式（Ｉ）または式（ＩＩ）のトリアゾール化合物は、“クリック(click)”化学を用いて容易に合成できる。たとえば、アルファ，ベータ−不飽和アルキルケトンのアジドと適宜置換されたアルキンを触媒の存在下で反応させると、トリアゾールミメティックが得られる。スキーム２は、本発明のトリアゾールミメティックをもたらす多様な合成工程を示す。
【０１０３】
スキーム２
【０１０４】
【化１１】
2015508065.tif 000013
【０１０５】
[00120]  したがって、スキーム２中のＲ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれ独立して下記のものからなる群から選択される：水素、（Ｃｌ−Ｃ８）アルキル、（Ｃ２−Ｃ８）アルケニル、（Ｃ２−Ｃ８）アルキニル、（Ｃｌ−Ｃ４）アルコキシ、（Ｃｌ−Ｃ４）アルコキシ（Ｃｌ−Ｃ４）アルキル、（Ｃｌ−Ｃ８）フルオロアルキル、（Ｃｌ−Ｃ８）ヒドロキシアルキル、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル、（Ｃ４−Ｃ８）ビシクロアルキル、（Ｃ３−Ｃ８）ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、アリール、（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキル（Ｃｌ−Ｃ６）アルキル、（Ｃ３−Ｃ８）ヘテロシクロアルキル（Ｃｌ−Ｃ６）アルキル、ヘテロアリール（Ｃｌ−Ｃ６）アルキルおよびアリール（Ｃｌ−Ｃ６）アルキル。
【０１０６】
ケト脂肪酸、代謝産物およびミメティックの配合物
[00121]  本発明は、それの観点のひとつによれば、式Ｉ〜ＩＩＩに適合するケト脂肪酸、それの代謝産物またはミメティック、およびそれらの医薬的に許容できる塩、溶媒和物または水和物、ならびに医薬的に許容できるキャリヤーの配合物を提供する。本発明の化合物のほかに１種類以上の療法薬を含む配合物も考慮される。本発明の配合物に添加される療法薬の限定ではない例には、化学療法薬、抗体、抗ウイルス薬、ステロイド系および非ステロイド系抗炎症薬、一般的な免疫療法薬、サイトカイン、ケモカイン、および／または成長因子が含まれる。さらなる観点において、本発明の組成物は一緒に配合された２種類以上の前記式Ｉ〜ＩＩＩの化合物を含有する。
【０１０７】
[00122]  本発明の配合物には、１種類より多い生理的に許容できるキャリヤー、たとえば２種類以上のキャリヤーの混合物を使用できる。さらに、本発明の配合物は、増粘剤、希釈剤、溶剤、緩衝剤、保存剤、界面活性剤、賦形剤などを含有することができる。
【０１０８】
[00123]  本発明の化合物は、医薬的に許容できるカチオンを含有することができ、それには金属イオンおよび有機イオンが含まれる。より好ましい金属イオンには、適宜なアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、および生理的に許容できる他の金属イオンが含まれるが、これらに限定されない。代表的なイオンには、通常の原子価のアルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛が含まれる。好ましい有機イオンには、プロトン化した第三級アミンおよび第四級アンモニウムカチオンが含まれ、その一部にはトリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）およびプロカインが含まれる。代表的な医薬的に許容できる酸には、限定ではなく、塩酸、ヨウ化水素酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、ギ酸、酒石酸、マレイン酸、リンゴ酸、クエン酸、イソクエン酸、コハク酸、乳酸、グルコン酸、グルクロン酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸、フマル酸、プロピオン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸などが含まれる。
【０１０９】
[00124]  本発明の独創的な異性体および互変異性体の形態の化合物、およびこれらの化合物の医薬的に許容できる塩類も本発明に包含される。代表的な医薬的に許容できる塩類は、下記のものから調製される：ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、ステアリン酸、サリチル酸、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トルエンスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、アルゲン酸、ベータ−ヒドロキシ酪酸、ガラクタル酸、およびガラクツロン酸。
【０１１０】
[00125]  本発明の独創的な化合物に関連して用いられる適切な医薬的に許容できる塩基付加塩には、金属イオン塩および有機イオン塩が含まれる。代表的な金属イオン塩には適切なアルカリ金属（Ｉａ族）塩、アルカリ土類金属（Ｉａ族）塩、および生理的に許容できる他の金属イオンが含まれるが、これらに限定されない。そのような塩類は、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛のイオンから調製できる。好ましい有機塩は、第三級アミンおよび第四級アンモニウム塩から製造でき、その一部にはトリメチルアミン、ジエチルアミン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（Ｎ−メチルグルカミン）およびプロカインが含まれる。上記の塩類はすべて当業者が対応する本発明化合物から常法により調製できる。
【０１１１】
[00126]  本発明の化合物およびキャリヤーを含有する医薬配合物は多様な形態であってよく、それには有効量の本発明化合物を含む固体、溶液、粉末、乳液、懸濁液、半固体、および乾燥粉末が含まれるが、これらに限定されない。有効成分をそのような配合物中に、医薬的に許容できる希釈剤、増量剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、界面活性剤、疎水性ビヒクル、水溶性ビヒクル、乳化剤、緩衝剤、保湿剤、湿潤剤、可溶化剤、抗酸化剤、保存剤などと共に含有できることも当技術分野で知られている。投与のための手段および方法は当技術分野で知られており、当業者はガイダンスのための多様な薬理学参考文献を参照できる。たとえば、Modern Pharmaceutics, Banker & Rhodes, Marcel Deldcer, Inc. (1979);およびGoodman & Gilman's, The Pharmaceutical Basis of Therapeutics, 6th Edition, MacMillan Publishing Co., New York (1980)；これら両者を全体として本明細書に援用する。
【０１１２】
[00127]  本発明の化合物は、注射により、たとえばボーラス注射または連続注入により、非経口または静脈内投与するために配合することができる。注射用配合物は、単位剤形でたとえばアンプルに入れて、または保存剤を添加して多数回用容器に入れて、提供できる。それらの組成物は、油性または水性のビヒクル中の懸濁液剤、液剤また乳剤などの形をとることができ、配合用剤、たとえば懸濁化剤、安定剤および／または分散剤を含有することができる。
【０１１３】
[00128]  注射用製剤、たとえば無菌の注射用水性または油性懸濁液剤は、既知の技術に従って適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて配合することができる。無菌の注射用製剤は、非経口用として許容できる無毒性の希釈剤または溶剤中の無菌の注射用液剤または懸濁液剤、たとえば１，３−ブタンジオール中の液剤であってもよい。使用してもよい許容できるビヒクルおよび溶剤には、水、リンガー液、および等張塩化ナトリウム溶液が含まれる。さらに、無菌の固定油が溶剤または懸濁媒体として一般に用いられる。この目的には、合成モノ−またはジグリセリドを含めたいかなる銘柄の固定油も使用できる。さらに、脂肪酸系の希釈剤、たとえばオレイン酸を注射剤の調製に使用できる。本発明の態様に使用できる他の脂肪酸系希釈剤には、たとえば下記のうち１種類以上が含まれる：ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、ステアリルフマル酸ナトリウム、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、ベヘン酸グリセリル、鉱油、植物油、パラフィン、ロイシン、シリカ、ケイ酸、タルク、プロピレングリコール脂肪酸エステル、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、ポリオキシエチレン−グリセロール脂肪エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリエトキシル化ステロール、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリエトキシル化植物油など。ある態様において、脂肪酸系希釈剤は脂肪酸の混合物であってもよい。ある態様において、脂肪酸は脂肪酸エステル、脂肪酸の糖エステル、脂肪酸のグリセリド、またはエトキシル化脂肪酸エステルであってもよく、他の態様において、脂肪酸系希釈剤は脂肪アルコール、たとえばステアリルアルコール、ラウリルアルコール、パルミチルアルコール、パルミトイル酸、セチルアルコール、カプリルアルコール、カプリリルアルコール、オレイルアルコール、リノレニルアルコール、アラキドニックアルコール、ベヘニルアルコール、イソベヘニルアルコール、セラキルアルコール(selachyl alcohol)、キミルアルコール(chimyl alcohol)、およびリノレイルアルコールなど、ならびにその混合物であってもよい。
【０１１４】
[00129]  他の態様において、本発明の配合物は経口投与用の固体剤形であり、これにはカプセル剤、錠剤、丸剤、散剤および顆粒剤が含まれる。そのような態様において、有効化合物を１種類以上の不活性希釈剤、たとえばショ糖、乳糖またはデンプンと混和することができる。そのような剤形は、常法どおり、不活性希釈剤以外の追加物質、たとえば滑沢剤、たとえばステアリン酸マグネシウムを含むこともできる。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、それらの剤形は緩衝剤を含むこともでき、さらに腸溶コーティングを備えた状態で製造することができる。
【０１１５】
[00130]  固体剤形は、本発明化合物をたとえば前記の１種類以上の脂肪酸系希釈剤と混和し、この液状混合物に増粘剤を添加してゼラチン状にすることにより調製された、液状またはゼラチン状配合物であってもよい。このゼラチン状物質を次いで単位剤形に封入してカプセル剤を形成することができる。他の代表的態様において、前記に従って調製した本発明化合物の油性調製物を凍結乾燥して固体にし、それを１種類以上の医薬的に許容できる賦形剤、キャリヤーまたは希釈剤と混和して錠剤を形成することができ、さらに他の態様において、本発明化合物の油性調製物を結晶化して固体にし、それを１種類以上の医薬的に許容できる賦形剤、キャリヤーまたは希釈剤と混和して錠剤を形成することができる。
【０１１６】
[00131]  本発明化合物の経口投与に有用な可能性があるさらなる態様には、液体剤形が含まれる。そのような態様において、液体剤形には、当技術分野で慣用される水などの不活性希釈剤を含有する医薬的に許容できる乳剤、液剤、懸濁液剤、シロップ剤、およびエリキシル剤を含めることができる。そのような組成物は、佐剤、たとえば湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、ならびに甘味剤、着香剤および香料を含むこともできる。
【０１１７】
[00132]  さらに他の態様において、本発明の独創的な化合物をデポー製剤として配合することができる。そのような長時間作用型配合物を埋込みにより（たとえば、皮下または筋肉内に）、または筋肉内注射により、投与することができる。デポー注射剤は約１〜約６か月またはより長い間隔で投与できる。したがって、たとえば化合物を適切なポリマー材料もしくは疎水性材料と共に（たとえば、許容できる油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂と共に、あるいは難溶性誘導体として、たとえば難溶性塩として配合することができる。
【０１１８】
[00133]  注射用配合物に適した他の希釈剤には以下に記載するものが含まれるが、それらに限定されない。
[00134]  植物油：本明細書中で用いる用語“植物油”は、植物油のエトキシル化により形成された化合物、または化合物の混合物を表わし、それらにおいては少なくとも１つのポリエチレングリコール鎖が植物油に共有結合している。ある態様において、脂肪酸は約１２個の炭素〜約１８個の炭素をもつ。ある態様において、エトキシル化の量は約２から約２００まで、約５から約１００まで、約１０から約８０まで、約２０から約６０まで、約１２から約１８までの範囲のエチレングリコール反復単位であってもよい。植物油は水素化されていてもよく、あるいは水素化されていなくてもよい。適切な植物油にはヒマシ油、水素化ヒマシ油、ゴマ油、トウモロコシ油、ラッカセイ油、オリーブ油、ヒマワリ油、サフラワー油、ダイズ油、安息香酸ベンジル、ゴマ油、綿実油、およびパーム油が含まれるが、これらに限定されない。他の適切な植物油には市販の合成油、たとえば下記のものが含まれるが、それらに限定されない：Ｍｉｇｌｙｏｌ．ＴＭ．８１０および８１２（入手先：Ｄｙｎａｍｉｔ  Ｎｏｂｅｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，スウェーデン）、Ｎｅｏｂｅｅ．ＴＭ．Ｍ５（入手先：Ｄｒｅｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．）、Ａｌｏｆｉｎｅ．ＴＭ．（入手先：Ｊａｒｃｈｅｍ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）、Ｌｕｂｒｉｔａｂ．ＴＭ．シリーズ（入手先：ＪＲＳ  Ｐｈａｒｍａ）、Ｓｔｅｒｏｔｅｘ．ＴＭ．（入手先：Ａｂｉｔｅｃ  Ｃｏｒｐ．）、Ｓｏｆｔｉｓａｎ．ＴＭ．１５４（入手先：Ｓａｓｏｌ）、Ｃｒｏｄｕｒｅｔ．ＴＭ．（入手先：Ｃｒｏｄａ）、Ｆａｎｃｏｌ．ＴＭ．（入手先：ｔｈｅ  Ｆａｎｎｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．）、Ｃｕｔｉｎａ．ＴＭ．ＨＲ（入手先：Ｃｏｇｎｉｓ）、Ｓｉｍｕｌｓｏｌ．ＴＭ．（入手先：ＣＪ  Ｐｅｔｒｏｗ）、ＥｍＣｏｎ．ＴＭ．ＣＯ（入手先：Ａｍｉｓｏｌ  Ｃｏ．）、Ｌｉｐｖｏｌ．ＴＭ．ＣＯ、ＳＥＳ、およびＨＳ−Ｋ（入手先：Ｌｉｐｏ）、ならびにＳｔｅｒｏｔｅｘ．ＴＭ．ＨＭ（入手先：Ａｂｉｔｅｃ  Ｃｏｒｐ．）。ゴマ油、ヒマシ油、トウモロコシ油、および綿実油を含めた他の適切な植物油には、R. C. Rowe and P. J. Shesky、Handbook of Pharmaceutical Excipients、(2006)、5th ed.に挙げられたものが含まれる；これを全体として本明細書に援用する。適切なポリエトキシル化植物油には、Ｃｒｅｍａｐｈｏｒ．ＴＭ．ＥＬまたはＲＨシリーズ（入手先：ＢＡＳＦ）、Ｅｍｕｌｐｈｏｒ．ＴＭ．ＥＬ−７１９（入手先：Ｓｔｅｐａｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、およびＥｍｕｌｐｈｏｒ．ＴＭ．ＥＬ−６２０Ｐ（入手先：ＧＡＦ）が含まれるが、それらに限定されない。
【０１１９】
[00135]  鉱油：本明細書中で用いる用語“鉱油”は、未精製および精製（軽）両方の鉱油を表わす。適切な鉱油には、たとえばＡｖａｔｅｃｈ．ＴＭ．グレード（入手先：Ａｖａｔａｒ  Ｃｏｒｐ．）、Ｄｒａｋｅｏｌ．ＴＭ．グレード（入手先：Ｐｅｎｒｅｃｏ）、Ｓｉｒｉｕｓ．ＴＭ．グレード（入手先：Ｓｈｅｌｌ）、およびＣｉｔａｔｉｏｎ．ＴＭ．グレード（入手先：Ａｖａｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２０】
[00136]  ヒマシ油：本明細書中で用いる用語“ヒマシ油”は、ヒマシ油のエトキシル化により形成される化合物であって、ポリエチレングリコールの少なくとも１つの鎖がヒマシ油に共有結合したものを表わす。ヒマシ油は水素化されていてもよく、水素化されていなくてもよい。ポリエトキシル化ヒマシ油の同義語にはポリオキシル(polyoxyl)ヒマシ油、水素化ポリオキシルヒマシ油、マクロゴールグリセロリリシノレアス(mcrogolglyceroli ricinoleas)、マクロゴールグリセロリヒドロキシステアラス(macrogolglyceroli hysroxystearas)、ポリオキシル３５ヒマシ油、およびポリオキシル４０水素化ヒマシ油が含まれるが、これらに限定されない。適切なポリエトキシル化ヒマシ油には下記のものが含まれるが、それらに限定されない：Ｎｉｋｋｏｌ．ＴＭ．ＨＣＯシリーズ（入手先：Ｎｉｋｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）、たとえばＮｉｋｋｏｌ  ＨＣＯ−３０、ＨＣ−４０、ＨＣ−５０、およびＨＣ−６０（ポリエチレングリコール−３０  水素化ヒマシ油、ポリエチレングリコール−４０  水素化ヒマシ油、ポリエチレングリコール−５０  水素化ヒマシ油、およびポリエチレングリコール−６０  水素化ヒマシ油）、Ｅｍｕｌｐｈｏｒ．ＴＭ．ＥＬ−７１９（ヒマシ油４０モル−エトキシレート、入手先：Ｓｔｅｐａｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒｅ．ＴＭ．シリーズ（入手先：ＢＡＳＦ）：これにはＣｒｅｍｏｐｈｏｒｅ  ＲＨ４０、ＲＨ６０、およびＥＬ３５（それぞれ、ポリエチレングリコール−４０  水素化ヒマシ油、ポリエチレングリコール−６０  水素化ヒマシ油、およびポリエチレングリコール−３５  水素化ヒマシ油）が含まれる；ならびにＥｍｕｌｇｉｎ．ＲＴＭ．ＲＯおよびＨＲＥシリーズ（入手先：Ｃｏｇｎｉｓ  ＰｈａｒｍａＬｉｎｅ）。他の適切なポリオキシエチレンヒマシ油誘導体には、R. C. Rowe and P. J. Shesky, Handbook of Pharmaceutical Excipients, (2006), 5th ed.に挙げられたものが含まれる；これを全体として本明細書に援用する。
【０１２１】
[00137]  ステロール：本明細書中で用いる用語“ステロール”は、ステロール分子のエトキシル化により誘導された化合物、または化合物の混合物を表わす。適切なポリエトキシル化ステロールには下記のものが含まれるが、それらに限定されない：ＰＥＧ−２４コレステロールエーテル、Ｓｏｌｕｌａｍｍ  Ｃ−２４（入手先：Ａｍｅｒｃｈｏｌ）；ＰＥＧ−３０コレスタノール、Ｎｉｋｋｏｌ．ＴＭ．ＤＨＣ（入手先：Ｎｉｋｋｏ）；フィトステロール、ＧＥＮＥＲＯＬ．ＴＭ．シリーズ（入手先：Ｈｅｎｋｅｌ）；ＰＥＧ−２５フィトステロール、Ｎｉｋｋｏｌ．ＴＭ．ＢＰＳＨ−２５（入手先：Ｎｉｋｋｏ）；ＰＥＧ−５ダイズステロール、Ｎｉｋｋｏｌ．ＴＭ．ＢＰＳ−５（入手先：Ｎｉｋｋｏ）；ＰＥＧ−１０ダイズステロール、Ｎｉｋｋｏｌ．ＴＭ．ＢＰＳ−１０（入手先：Ｎｉｋｋｏ）；ＰＥＧ−２０ダイズステロール、Ｎｉｋｋｏｌ．ＴＭ．ＢＰＳ−２０（入手先：Ｎｉｋｋｏ）；およびＰＥＧ−３０ダイズステロール、Ｎｉｋｋｏｌ．ＴＭ．ＢＰＳ−３０（入手先：Ｎｉｋｋｏ）。本明細書中で用いる用語“ＰＥＧ”は、ポリエチレングリコールを表わす。
【０１２２】
[00138]  ポリエチレングリコール：本明細書中で用いる用語“ポリエチレングリコール”または“ＰＥＧ”は、式−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−のエチレングリコールモノマー単位を含むポリマーを表わす。適切なポリエチレングリコールはポリマー分子の各末端に遊離ヒドロキシル基をもつことができ、あるいは１個以上のヒドロキシル基が低級アルキル基、たとえばメチル基でエーテル化されていてもよい。同様に適切なものは、エステル化可能なカルボキシ基をもつポリエチレングリコール誘導体である。本発明に有用なポリエチレングリコールは、いかなる鎖長または分子量のポリマーであってもよく、分枝を含むこともできる。ある態様において、ポリエチレングリコールの平均分子量は約２００から約９０００までである。ある態様において、ポリエチレングリコールの平均分子量は約２００から約５０００までである。ある態様において、ポリエチレングリコールの平均分子量は約２００から約９００までである。ある態様において、ポリエチレングリコールの平均分子量は約４００である。適切なポリエチレングリコールには、たとえばポリエチレングリコール−２００、ポリエチレングリコール−３００、ポリエチレングリコール−４００、ポリエチレングリコール−６００、およびポリエチレングリコール−９００が含まれるが、これらに限定されない。名称中のダッシュに続く数字はそのポリマーの平均分子量を表わす。ある態様において、ポリエチレングリコールはポリエチレングリコール−４００である。適切なポリエチレングリコールには、Ｃａｒｂｏｗａｘ．ＴＭ．およびＣａｒｂｏｗａｘ．ＴＭ．Ｓｅｎｔｒｙシリーズ（入手先：Ｄｏｗ）、Ｌｉｐｏｘｏｌ．ＴＭ．シリーズ（入手先：Ｂｒｅｎｎｔａｇ）、Ｌｕｔｒｏｌ．ＴＭ．シリーズ（入手先：ＢＡＳＦ）、およびＰｌｕｒｉｏｌ．ＴＭ．シリーズ（入手先：ＢＡＳＦ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２３】
[00139]  プロピレングリコール脂肪酸エステル：本明細書中で用いる用語“プロピレングリコール脂肪酸エステル”は、プロピレングリコールもしくはポリプロピレングリコールと脂肪酸との間で形成されるモノエーテルもしくはジエステル、またはその混合物を表わす。プロピレングリコール脂肪アルコールエーテルを誘導するために有用な脂肪酸には、本明細書中で定義するものが含まれるが、これらに限定されない。ある態様において、モノエステルまたはジエステルはプロピレングリコールから誘導される。ある態様において、モノエステルまたはジエステルは約１〜約２００のオキシプロピレン単位をもつ。ある態様において、分子のポリプロピレングリコール部分は約２〜約１００のオキシプロピレン単位をもつ。ある態様において、モノエステルまたはジエステルは約４〜約５０のオキシプロピレン単位をもつ。ある態様において、モノエステルまたはジエステルは約４〜約３０のオキシプロピレン単位をもつ。適切なプロピレングリコール脂肪酸エステルには下記のものが含まれるが、これらに限定されない；プロピレングリコールラウレート：Ｌａｕｒｏｇｌｙｃｏｌ．ＴＭ．ＦＣＣおよび９０（入手先：Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ）；プロピレングリコールカプリレート：Ｃａｐｒｙｏｌ．ＴＭ．ＰＧＭＣおよび９０（入手先：Ｇａｔｅｆｏｓｓｅ）；ならびにプロピレングリコールジカプリロカプレート：Ｌａｂｒａｆａｃ．ＴＭ．ＰＧ（入手先：Ｇａｔｅｆｏｓｓｅ）。
【０１２４】
[00140]  ステアロイルマクロゴールグリセリド：ステアロイルマクロゴールグリセリドは、主にステアリン酸から（または、主にステアリン酸から誘導された化合物から）合成されたポリグリコール化グリセリドを表わす；ただし、他の脂肪酸または他の脂肪酸から誘導された化合物もこの合成に使用できる。適切なステアロイルマクロゴールグリセリドにはＧｅｌｕｃｉｒｅ．ＲＴＭ．５０／１３（入手先：Ｇａｔｔｅｆｏｓｓｅ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２５】
[00141]  ある態様において、希釈剤成分は下記のうち１種類以上を含む：マンニトール、乳糖、ショ糖、マルトデキテトリン、ソルビトール、キシリトール、粉末セルロース、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、メチルヒドロキシエチルセルロース、デンプン、グリコール酸デンプンナトリウム、α化デンプン、リン酸カルシウム、炭酸金属塩、金属酸化物、またはアルミノケイ酸金属塩。
【０１２６】
[00142]  固体および／または液体剤形に使用するための代表的な賦形剤またはキャリヤーには、ソルビトール、たとえばＰｈａｒｍＳｏｒｂｉｄｅｘ  Ｅ４２０（入手先：Ｃａｒｇｉｌｌ）、Ｌｉｐｏｎｉｃ  ７０−ＮＣおよび７６−ＮＣ（入手先：Ｌｉｐｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、Ｎｅｏｓｏｒｂ（入手先：Ｒｏｑｕｅｔｔｅ）、Ｐａｒｔｅｃｈ  ＳＩ（入手先：Ｍｅｒｃｋ）、ならびにＳｏｒｂｏｇｅｍ（入手先：ＳＰＩ  Ｐｏｌｙｏｌｓ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１２７】
[00143]  デンプン、グリコール酸デンプンナトリウム、およびα化デンプンには、R. C. Rowe and P. J. Shesky, Handbook of Pharmaceutical Excipients, (2006), 5th ed.に記載されるものが含まれるが、これらに限定されない；これを全体として本明細書に援用する。
【０１２８】
[00144]  崩壊剤：崩壊剤には下記のうち１種類以上を含めることができる：クロスカルメロースナトリウム、カルメロースカルシウム、クロスポビドン、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カリウム、アルギン酸カルシウム、イオン交換樹脂、食用酸と炭酸アルカリ成分をベースとする発泡系、クレー、タルク、デンプン、α化デンプン、グリコール酸デンプンナトリウム、セルロースフロー(cellulose floe)、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ケイ酸カルシウム、炭酸金属塩、炭酸水素ナトリウム、クエン酸カルシウム、またはリン酸カルシウム。
【０１２９】
[00145]  本発明のさらに他の態様には、そのような組合わせが本明細書に記載する方法の目的とする効果の達成に望ましいかまたは有利であると思われる場合に、本発明化合物を他の有効成分、たとえば佐剤、プロテアーゼ阻害剤、または他の適合性薬物もしくは化合物と組み合わせて投与することが含まれる。
【０１３０】
投与経路
[00146]  本発明の独創的な化合物は、それらが有効であるいずれか一般的な様式でいずれかの経路により投与できる。投与は全身的または局所的であってもよい。たとえば、投与は非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、経口、口腔、もしくは眼内経路、または膣内、吸入によるもの、デポー注射によるもの、もしくは埋込み剤によるものであってもよいが、これらに限定されない。特定の態様において、投与は非経口または静脈内であってもよく、それらはすべて、持続的な全身取込み、組織半減期および細胞内送達に好都合な安定化用添加剤の存在下または非存在下で行なわれる。したがって、本発明化合物の投与方式（単独で、または他の医薬と組み合わせて）は注射可能なものであってもよい（皮下または筋肉内に注射する短時間作用型、デポー、埋込み、およびペレットの形態を含む）。ある態様において、本発明化合物を含有する注射用配合物を、傷害または炎症の部位、たとえば関節鏡検査、血管形成術、ステント設置、バイパス外科処置などによる外科切開部位または炎症部位に埋め込むことができる。
【０１３１】
[00147]  他の特定の態様において、本発明の化合物を炎症領域に直接適用する軟膏剤またはローション剤として局所適用することができる。たとえば、ある態様において、本発明の独創的な化合物を含有するローション剤または軟膏剤を調製し、熱傷、放射線熱傷、皮膚障害部位、浮腫、関節炎の関節などに適用することができる。
【０１３２】
[00148]  本発明の多様な態様はまた、本発明化合物を投与する方法に関する。具体的な投与方式は変更でき、その適応症に依存する可能性がある。具体的な投与経路および投与計画の選択は、最適臨床応答を得るために、臨床医が臨床医に既知の方法により調整または用量設定することができる。化合物の投与量は、療法上有効な量である。投与量は処置される対象の特性、たとえば処置される個々の動物、年齢、体重、健康状態、並存する処置があればそのタイプ、および処置の頻度に依存し、当業者が（たとえば、臨床医が）容易に決定できる。たとえばGoodman & Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition (1996), Appendix II, pp. 1707-1711、またはGoodman & Goldman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Tenth Edition (2001), Appendix II, pp. 475-493からのガイダンスに従って投与量を決定できることは当業者には認識されるであろう；これら両者を全体として本明細書に援用する。
【０１３３】
[00149]  多様な態様において、各投与サイクル中に送達される本発明化合物の有効量は約１０ｍｇ／ｍ２／日から約１０００ｍｇ／ｍ２／日までの範囲であってもよい。ある態様において、有効量は約２０ｍｇ／ｍ２／日〜約７００ｍｇ／ｍ２／日であってもよく、他の態様において、有効量は約３０ｍｇ／ｍ２／日〜約６００ｍｇ／ｍ２／日であってもよい。特定の態様において、有効量は約５０ｍｇ／ｍ２／日、約４００ｍｇ／ｍ２／日、約５００ｍｇ／ｍ２／日、または約６００ｍｇ／ｍ２／日であってもよい。さらに他の態様において、本発明化合物の有効量は処置の進行に伴なって変更できる。たとえば、投与サイクル全体を通して処置が進行するのに伴なって投与計画を増強または低減することができ、あるいは投与全体を通して日用量を増加または減少させることができる。さらに他の態様において、１０００ｍｇ／ｍ２／日より多量を投与することができる；高用量の本発明化合物ですら一般的に患者に耐容され、望ましくない生理的作用を生じる可能性がないからである。
【０１３４】
[00150]  本発明化合物を配合するために用いる医薬用キャリヤーは、投与経路に依存するであろう。投与は局所（眼、膣、直腸、または鼻腔内を含む）、経口、吸入によるもの、または非経口、たとえば静脈内点滴によるもの、皮下、腹腔内または筋肉内注射であってもよい。
【０１３５】
[00151]  したがって、本発明の化合物を静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮、気管内、体外、または局所（たとえば、局所鼻内投与または吸入による投与）に投与することができる。これに関して、“局所鼻腔内投与”という句は、組成物を一方または両方の鼻孔から鼻内および鼻腔路内へ送達することを伴ない、噴霧メカニズムもしくは点滴メカニズムによる、または核酸もしくはベクターのエアゾール化による送達を含むことができる。後者は多数の対象を同時に処置する場合に有効となる可能性がある。吸入剤による組成物の投与は、鼻または口を通して、スプレーまたは点滴メカニズムにより行なうことができる。送達は、挿管により呼吸器系（たとえば、肺）のいずれかの領域へ向けることもできる。
【０１３６】
[00152]  非経口投与のための本発明のケト脂肪酸ミメティックの配合物は、ニトロ脂肪酸ミメティックを安定化する賦形剤およびキャリヤーを含有するであろう。そのようなキャリヤーの具体例は、非水性溶剤、たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、および注射用有機エステル、たとえばオレイン酸エチルである。さらに、非経口投与用の配合物には、液剤、懸濁液剤、または注射の前に液体に溶解もしくは懸濁するのに適した固体剤形、または乳剤が含まれる。
【０１３７】
[00153]  前記ミメティックの静脈内配合物は、配合物の浸透圧を維持するための作用剤を含有する。そのような作用剤の例には、塩化ナトリウム溶液、リンガーデキストロース、デキストロース、乳酸加リンガー液、液体および栄養素の補充液などが含まれる。静脈内配合物には、微生物感染または炎症を予防するための１種類以上の追加成分、および麻酔薬も含有される。
【０１３８】
[00154]  本発明はまた、本発明のミメティックの医薬的に許容できる塩類の配合物を提供する。そのような塩類の具体例は、ミメティックと無機塩基、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、または水酸化カリウムとの反応により形成されるものである。本発明のミメティックと有機塩基、たとえばモノ−、ジ−、トリアルキルおよびアリールアミンならびに置換エタノールアミンとの塩類も考慮される。
【０１３９】
[00155]  さらに他の観点において、本発明のミメティックはプロドラッグとして配合することができる。生理的ｐＨで、ケト脂肪酸のミメティックは一般に荷電分子であり、それは最適ではない生物学的利用能および細胞輸送動態をもつ可能性がある。したがって、これらの問題に対処するために、本発明の化合物を医薬的に許容できるエステル、たとえばメチルエステルまたはエチルエステルとして提供できる。非特異的的な細胞内エステラーゼがインビボでエステルを活性形態に変換するので、エステルはプロドラッグとして作用する。
【０１４０】
処置方法
[00156]  本発明による化合物は、多数の急性および慢性両方の炎症状態および代謝状態を治療、改善および／または予防するために個体に投与することができる。特に、式Ｉ〜ＩＩＩによる化合物およびそれらの代謝産物は、下記を含めた急性状態：全身性炎症、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、動脈狭窄、臓器移植拒絶および熱傷、ならびに慢性状態、たとえば慢性肺傷害および呼吸窮迫、糖尿病、高血圧症、肥満症、関節炎、神経変性障害、ならびに各種の皮膚障害を処置するために使用できる。しかし、他の態様において、本発明化合物は下記を含めた症状をもついずれかの状態を処置するために使用できる：慢性または急性の炎症、たとえば関節炎、狼瘡、ライム病、痛風、敗血症、高体温、潰瘍、腸炎、骨粗鬆症、ウイルス性または細菌性の感染症、サイトメガロウイルス、歯周疾患、腎炎、サルコイドーシス、肺疾患、肺炎症、肺の線維症、喘息、後天性呼吸窮迫症候群、喫煙誘発性肺疾患、肉芽腫形成、肝臓の線維症、移植片対宿主疾患、手術後炎症；血管形成術、ステント設置またはバイパス移植、冠動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）の後の冠動脈および末梢血管の再狭窄；急性および慢性白血病、Ｂリンパ球性白血病、新生物性疾患、動脈硬化症、アテローム硬化症、心筋炎症、乾癬、免疫不全、播種性血管内血液凝固、全身性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、脳脊髄炎、浮腫、炎症性腸疾患、高ＩｇＥ症候群、癌の転移または増殖、養子免疫療法、再潅流症候群、放射線熱傷、円形脱毛症など。
【０１４１】
[00157]  本発明化合物は、投与すると、炎症を仲介する多数の細胞性受容体および／またはタンパク質の活性を阻害または刺激することによりそれらと相互作用し、それにより炎症を阻害または軽減することができる。理論により拘束されたくはないが、本発明者らは本発明化合物がたとえば神経伝達、遺伝子発現、血管機能および炎症応答を含めた重要なシグナル伝達活性を調節できると考える。これらの活性を促進することができる本発明化合物の化学的特性には、電子吸引性ビニル基に隣接するβ−炭素の強い可逆的な求電子性、Ｎｅｆ様の酸塩基反応を行なってＮＯを放出する能力、疎水性および親水性の両コンパートメントに分布する能力、ならびにＧタンパク質共役型受容体および核内受容体に対する強い親和性が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４２】
[00158]  たとえば、１態様において、本発明化合物を投与して、多数のＧタンパク質共役型受容体および核内受容体、たとえば（ただし、それらに限定されない）ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（ＰＰＡＲ）（ＰＰＡＲアルファ、ＰＰＡＲガンマ、およびＰＰＡＲデルタを含む）を介して細胞のシグナル伝達を仲介することができる。ＰＰＡＲは、単球／マクロファージ、好中球、内皮細胞、脂肪細胞、上皮細胞、肝細胞、メサンギウム細胞、血管平滑筋細胞、神経細胞を含めて生物全体に発現している核内受容体であり、“活性化”されると多数のターゲット遺伝子の転写を誘導する。ＰＰＡＲの活性化は、たとえば下記を含めた組織ホメオスタシスの調節において多様な役割を果たすことが示されている：インスリン感受性の増大、慢性炎症プロセスの抑制、遊離脂肪酸の循環レベルの低減、内皮機能不全の補正、脂肪条痕形成の低減、斑形成の遅延、血管壁肥厚の制限、ならびに斑の安定化および退縮の増進。本明細書に示す独創的な化合物は、ＰＰＡＲ活性化に関連するこれらの各機能を遂行できる。
【０１４３】
[00159]  さらに、本発明化合物は、正常な細胞プロセスを有意に変化させることなくこれらの機能を遂行できる。たとえば、１態様において、本発明化合物を投与して血圧を正常レベルに低下させることにより高血圧症を処置することができ、たとえ本発明化合物が過剰投与されたとしても個体の血圧を正常レベル以下にまで低下させることはない。したがって、理論により拘束されたくはないが、本発明の化合物は、伝統的な医療による過剰投与または過剰処置に伴なう負の作用なしに、個体の処置を提供できる。
【実施例】
【０１４４】
実験方法
材料
[00160]  ジクロフェナク、メチルアラキドニルフルオロホスホネート、ＭＫ８８６、（±）−イブプロフェン、インドメタシン、ＮＳ−３９８、１５ｄ−ＰＧＪ２、４−ヒドロキシ−２−ノネナール、９−オキソＯＤＥ、５−オキソＥＴＥｄ７、１２−オキソＥＴＥ、１５−オキソＥＤＥ、９−オキソＯＴｒＥ、１７−オキソＤＰＡ、および１７−オキソＤＨＡは、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ミシガン州アンアーバー）から購入された。ヒツジ胎盤ＣＯＸ−２（Ｃａｙｍａｎ  ６０１２０）もＣａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓから購入された。ＤＰＡおよびＤＨＡはＮｕＣｈｅｃｋ  Ｐｒｅｐ（ミネソタ州エリシアン）からのものであった。Ｋｄｏ２リピドＡはＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ（アラバマ州アラバスター）からのものであった。ＨＰＬＣ溶媒はＨｏｎｅｙｗｅｌｌ  Ｂｕｒｄｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊａｃｋｓｏｎ（ＵＳＡ）からのものであった。グルタチオンおよびグルタチオンＳ−トランスフェラーゼはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入された。
【０１４５】
細胞の培養および処理
[00161]  ネズミ単球／マクロファージ細胞（ＲＡＷ２６４．７）およびヒト単球細胞（ＴＨＰ−１）をＡＴＣＣ（ＵＳＡ）から入手し、３７℃、５％  ＣＯ２で、ＤＭＥＭ＋１０％  ＦＢＳ（ＲＡＷ２６４．７）およびＲＰＭＩ＋１０％  ＦＢＳ（ＴＨＰ−Ｉ）中において、ＡＴＣＣガイドラインに従って維持した。ＡＴＣＣからＬ細胞（ＣＣＬ−Ｉ）を入手し、３７℃、５％  ＣＯ２で、１０％  ＦＢＳ、グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ペニシリン、ストレプトマイオシンおよび非必須アミノ酸を補充したＤＭＥＭにおいて維持した。
【０１４６】
[00162]  活性化実験のために、ＲＡＷ２６４．７細胞を播種し、一夜インキュベートし、約８０％集密状態において、指示した化合物で処理した４７。非活性化対照はビヒクルのみで処理された。活性化に際して、細胞を活性化用培地（ＳＭＥＭ）中に維持した；Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（Ｃｅｌｌｇｒｏ，１７−３０５）＋２％  ＦＢＳに、Ｌ−グルタミン（５８４ｍｇ／Ｌ）、ピルビン酸ナトリウム（１１０ｍｇ／Ｌ）およびＨｅｐｅｓ（３．５７ｇ／Ｌ，ｐＨ７．４）を補充したもの。阻害試験のために、活性化の時点で阻害剤を培地に添加し、ＭＴＴアッセイを用いて細胞生存性を確認した。細胞を活性化後２０時間目に（別途指示しない限り）、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）中にハーベストし、液体Ｎ２中で瞬間凍結した。ＴＨＰ−Ｉ細胞をＰＭＡ（８６ｎＭ）で１６時間分化させ、ＩＦＮγ（２００Ｕ／ｍｌ）およびＫｄｏ２リピドＡ（０．５μｇ／ｍｌ）でＲＰＭＩ＋２％  ＦＢＳ中において活性化し、分化後４０時間目にハーベストした。ＥＦＡＤ単独での処理のために、１７−オキソＤＨＡおよび１７−オキソＤＰＡを細胞培地に指示した濃度で指示した期間添加した。炎症刺激と連携したＥＦＡＤ処理のために、１７−オキソＤＨＡおよび１７−オキソＤＰＡの添加に続いてＫｄｏ２およびＩＦＮγを６時間目に添加した。
【０１４７】
ＢＭＥと求電子体のアルキル転位反応
[00163]  融解した時点で細胞溶解物をＢＭＥ（５００ｍＭ＋内部標準５−オキソＥＴＥｄ７（１．２５ｎｇ／ｍｌ））に曝露し、３７℃で１時間、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）中で、先の記載に従ってインキュベートした２２。タンパク質を冷アセトニトリルで沈殿させ、上清をＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳで分析した。
【０１４８】
ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ
[00164]  逆相ＨＰＬＣにより２０×２ｍｍ  Ｃ１８  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ＭＳカラム（３μｍ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いて試料を分離した。Ａ（水／０．１％ギ酸）およびＢ（アセトニトリル／０．１％ギ酸）からなる勾配溶媒系を７５０μｌ／分で下記の条件下で用いた：３５％  Ｂに０．５分保持、次いで３５−９０％  Ｂに４分で、９０−１００％  Ｂに０．１分で、１．４分保持、そして１００−３５％  Ｂに０．１分で、１．９分保持。異性体の分割を達成するために、１５０×２ｍｍ  Ｃ１８  Ｌｕｎａカラム（３μｍ，Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を用いてクロマトグラフィー操作を実施した。２５０μｌ／分の流速を下記の条件下で用いた：３５％  Ｂに３分保持、次いで３５−９０％  Ｂに２３分、次いで９０−１００％  Ｂに０．１分で、５．９分保持、そして１００−３５％  Ｂに０．１分で、７．９分保持。ＢＭＥ付加物の分析および定量を、ハイブリッドトリプル四重極リニアイオントラップ質量分析計(hybrid triple quadrupole-linear ion trap mass spectrometer)（４０００  Ｑトラップ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  Ｓｃｉｅｘ）を用いて、ニュートラルロス（ＮＬ）スキャンモード、多重反応モニタリング(multiple reaction monitoring)（ＭＲＭ）スキャンモード、および増強型プロダクトイオン分析(enhanced product ion analysis)（ＥＰＩ）モードで実施した。下記の設定を用いた：遊離脂肪酸およびＢＭＥ付加物について、それぞれデクラスタリング電位−９０および−５０Ｖ、ならびに衝突エネルギー−３０および−１７Ｖ。ゼログレード空気をガス源として用い、Ｎ２を衝突チャンバー内に用いた。得られる場合には外部合成標準を用い、被検体と５−オキソＥＴＥｄ７内部標準の間のピーク面積比を比較することにより、ＥＦＡＤを定量した。データを取得し、Ａｎａｌｙｓｔ  １．４．２ソフトウェア（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，マサチュセッツ州ファーミンガム）を用いて分析した。
【０１４９】
ＣＯＸ−２反応
[00165]  ヒツジ胎盤ＣＯＸ−２（２０Ｕ／ｍｌ）をＴｒｉｓ／ヘム／フェノール（ＴＨＰ）緩衝液±２ｍＭ  ＡＳＡ中、３７℃でプレインキュベートした。各反応の前に新たに調製したＴＨＰ緩衝液は、Ｔｒｉｓ＊Ｃｌ（１００ｍＭ，ｐＨ８．１）、ヘマチン（１μＭ）、およびフェノール（１μＭ）からなっていた。指示した脂肪酸を１０μＭの濃度で添加することにより反応を開始した。指示した時点で氷冷アセトニトリル（９×反応体積）を添加することにより反応を停止し、ＣＯＸ−２タンパク質を遠心により分離した。生成物の形成をＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードでＣＯ２の喪失を追跡してモニターした（それぞれ、ＯＨ−ＤＰＡおよびＯＨ−ＤＨＡにつきｍ／ｚ  ３４５／３０１およびｍ／ｚ  ３４３／２９９）。
【０１５０】
初代マクロファージの調製
[00166]  骨髄由来マクロファージをＣ５７ＢＬ／６マウスから、Daviesが開発したプロトコルに従って単離した。参照：Davies, J. Q. & Gordon, S. Isolation and culture of murine macrophages. Methods Mol Biol 290, 91-103 (2005)。
【０１５１】
ウェスタンブロット
[00167]  試料のタンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により測定した。下記の一次抗体を用いた：Ｎｒｆ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−７２２）、ＨＯ−Ｉ（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ，ＳＰＡ−８９６）、Ｎｑｏ１（Ａｂｅａｍ，ａｂ３４１７３）、Ｃｏｘ−２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ｓｃ−１７４５）、ｉＮＯＳ（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂ，６１０３３２）、Ｌａｍｉｎ  Ｂｌ（Ａｂｅａｍ，ａｂｌ６０４８）。アクチン（Ｓｉｇｍａ  Ａ２０６６により検出）を装填対照として用いた。二次抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入された。
【０１５２】
ナイトレート／ナイトライト測定
[00168]  細胞培地中の総ナイトレートおよびナイトライト濃度を、ナイトレート／ナイトライト比色アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を用いるＧｒｉｅｓｓ反応により測定した。
【０１５３】
グルタチオン付加物の測定
[00169]  細胞ペレットおよび培地中のＧＳ−付加物を、ｎａｎｏ−ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した；ｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ  ＵｌｔｒａＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＬＣをＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  ＬＴＱと連携させて使用。ＧＳ−５−オキソＥＴＥ−ｄ７を内部標準として添加した。Ｗａｔｅｒｓ  ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  １３０  Ｃ１８  ＮａｎｏＥａｓｅカラム（３．５μｍ，１００μｍ×１００ｍｍ）を用いた。Ａ（Ｈ２ＣＶＯ．１％ギ酸）およびＢ（アセトニトリル／０．１％ギ酸）からなる２成分流動系を０．５μｌ／分で用いて下記の条件下でクロマトグラフィーを実施した：１．５％  Ｂに３分保持、次いで１．５−３０％  Ｂに１０分で、次いで３０−７０％  Ｂに２７分で。下記の親イオンを、それぞれＧＳ−５−オキソＥＴＥ−ｄ７、ＧＳ−オキソＤＨＡおよびＧＳ−オキソＤＰＡの同定のためにモニターした：６３３．３、６５０．３および６５２．３。
【０１５４】
統計
[00170]  データを平均±ＳＤとして表わし、一元分散分析、多重対比較のためのポストホックＴｕｋｅｙ検定により評価した。別途指示しない限り、有意性をｐ＜０．０１と決定した。
【０１５５】
反応性求電子種（ＲＥＳ）
[00171]  ＲＥＳは電子吸引性官能基をもつことを特徴とする分子であり、その基がアルファ−炭素を貧電子状態にし、電子に富むドナー分子（求核体）に対して反応性にする。電子吸引基の強さが求電子体の反応性を決定するであろう。これらの電子吸引基の２つの主な例は、α，β−不飽和カルボニルおよびニトロアルケンであり、それらにおいてβ−炭素（それが少なくとも１個の水素原子に結合していれば）が求核攻撃の部位である。これらのような求電子体の共鳴構造により、それらは多くの求核体とミカエル付加により共有結合反応することができる。興味深いことに、求電子性化合物の反応性はそれぞれの求電子体の生物学的結果と直接関係すると思われ１３、不可逆的付加物が毒性を運搬する１４。さらに、ＲＥＳはまた、ＧＳＨ／ＧＳＳＧ酸化還元対を変化させることにより細胞の酸化還元電位を調節し、これは基礎となっているシグナル伝達にさらに影響を及ぼす可能性がある。ＲＥＳは、タンパク質を共有結合修飾することにより、細胞のシグナル伝達事象を開始し、酵素活性および細胞内局在性を調節する可能性がある１５。ＲＥＳの生成およびレベルは、健全な細胞においては、細胞生存遺伝子の発現を誘導し、ある場合にはストレス期間に生き残るように細胞をプライミングする、低レベルのこれらの種で厳密に制御されている。これと対照的に、病的条件下ではＲＥＳはしばしば過剰に産生され、シグナル伝達事象および防御経路に打ち勝って細胞損傷を促進する１６。最近、有意の炎症成分を提示する種々の疾患、たとえば神経変性、癌、およびの他の病態の予防または治療にＲＥＳを用いることに向かう動きがある。たとえば、求電子性の神経突起伸長促進性プロスタグランジン化合物は、脳虚血／再潅流に際して保護作用を示す；これはニューロンにおけるそれらの蓄積、およびそれに続くＫｅａｐ１／Ｎｒｆ２経路の活性化に起因する１７。他のＲＥＳ（たとえば、アビシン類１８およびビス（２−ヒドロキシベンジリデンアセトン１９、イソチオシアネート類２０）は有望な予防化学療法薬であり、これはそれらが前癌細胞および腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する能力によるものである。さらに、求電子体１５ｄ−ＰＧＪ２は急性肺傷害の動物モデルにおいて保護的役割を示す２１。
【０１５６】
[00172]  ＥＦＡＤは、マウス骨髄から分離した初代マクロファージにより産生される。ＲＡＷ２６４．７細胞（およびおそらく他のマクロファージ細胞系）は変化したＡＡ代謝をもつので２６、ＥＦＡＤの形成が初代細胞系においても起きることを証明するのが重要であった。したがって、Ｃ５７ＢＬ／６ネズミ初代造血幹細胞をマクロファージに分化させ、Ｋｄｏ２およびＩＦＮγで活性化し、ＥＦＡＤの形成を分析した。ＲＡＷ２６４．７細胞により産生されたものおよび入手できる標準品と同時溶出する６種類中５種類のＥＦＡＤ種（ＥＦＡＤ−Ｉ、２、−３、−５および−６）を観察した。ＲＡＷ２６４．７細胞において観察されたものと同様に、活性化された骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）細胞をＡＳＡで処理すると、ＥＦＡＤ形成の程度が約２〜３倍増大し、ＥＦＡＤ−Ｉおよび−２の場合は異性体組成が１３−オキソ種から１７−オキソ種へシフトした（図８）。
【０１５７】
タンパク質およびグルタチオン（ＧＳＨ）へのＥＦＡＤ付加物の動態および同定
[00173]  生物求電子体、たとえばＥＦＡＤは、タンパク質のスルフヒドリル基および細胞性還元体ＧＳＨと反応する15’27”29。ＥＦＡＤによるタンパク質および小分子スルフヒドリルへの付加物形成の発生および程度を証明するために、種々の方法を用いた。活性化細胞におけるスルフヒドリル付加物の出現を証明するために、総ＥＦＡＤ含量を定量し、遊離ＥＦＡＤのプール（グルタチオンなどの小分子に付加したＥＦＡＤを含む）と比較した。これら２グループの差から、タンパク質に付加したＥＦＡＤのパーセント（−５１％）が得られた（図９ａ）。遊離形態と付加物形態のＥＦＡＤの細胞内分布を確認するために、遊離および付加したＥＦＡｄをＢＭＥと反応させた。遊離ＥＦＡＤとＢＭＥ、および付加したＥＦＡＤとＢＭＥの反応速度の差を利用して、遊離形態と付加物形態のＥＦＡＤの細胞内分布を確認した。
【０１５８】
[00174]  一般に、ＢＭＥと遊離求電子体との反応速度は速やかであり、試験した種々のα，β−不飽和オキソ−脂肪酸（１５ｄ−ＰＧＪ２、ＥＦＡＤ−Ｉ、ＥＦＡＤ−２）について約３×１０３〜５×ｌ０”３  ｓｅｃ”ｌの範囲の計算した擬似一次反応速度定数をもつ（図２０）。これと対照的に、付加した求電子体との反応速度は、Ｃｙｓ−ＥＦＡＤおよびＨｉｓ−ＥＦＡＤ付加物につき、速度定数（ｋｏｆｆ）に応じて、より遅い。これらの反応の時間依存性を利用して、細胞溶解物中に存在する付加した集団をさらに確認した（図９ｂ）。
【０１５９】
[00175]  遊離ＥＦＡＤについての速やかな反応速度、および付加したタンパク質からのＥＦＡＤ排除についてのより遅い反応速度が観察された。約５０％のＥＦＡＤがＢＭＥと最初の５分以内に反応し、これはタンパク質付加したＥＦＡＤが総ＥＦＡＤのうち４５分後にＢＭＥと反応した残り−５０％に関与することを示唆する（図９ｂ）。
【０１６０】
[00176]  タンパク質中の求核性残基へのＥＦＡＤの結合をより詳細に試験するために、ＧＡＰＤＨがＥＦＡＤによりアルキル化されるかどうかを試験した。この酵素は求電子体に対する十分に特性解明されたターゲットであり、ニトロシル化、酸化または求核付加によって容易に不活性化される。予想どおり、ＥＦＡＤ−２合成標準品（１７−オキソ−イソ形）はそれの求電子性に基づいて、ＧＡＰＤＨのＣｙｓ２４４、Ｃｙｓｌ４９、Ｈｉｓ１６３およびＨｉｓ３２８残基とインビトロで容易に付加物を形成した（図２１）。
【０１６１】
[00177]  細胞性還元剤グルタチオンは、システインのスルフヒドリル基を介して、生物求電子体、たとえばＥＦＡｄと容易に反応して、対応するグルタチオン−ＥＦＡＤ（ＧＳ−ＥＦＡＤ）付加物を生成する。本発明者らは、ＥＦＡＤがグルタチオン  Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の基質であるかどうか、また細胞においてマクロファージ活性化に際しＧＳ−ＥＦＡＤ付加物が実際に形成されるかどうかを調べた。
【０１６２】
[00178]  ＥＦＡＤをＧＳＴなしで、または漸増濃度のＧＳＴと共にインキュベートすると、添加した酵素の量に依存した付加速度が得られ、これによりＥＦＡＤがＧＳＴの基質であることが確認された（図２２）。
【０１６３】
[00179]  図１０ａ、１０ｂおよび２２は、活性化ＲＡＷ２６４．７細胞の溶解物、細胞培地からのグルタチオン付加物の質量スペクトル分析の結果を示し、これらの質量スペクトルを、合成製造したＧＳ−オキソＤＨＡおよびＧＳ−オキソＤＰＡ標準品の反応混合物から得られた質量スペクトルと比較している。ＥＦＡＤ−Ｉおよび−２のＧＳＨ付加物について観察されたフラグメンテーションパターンおよび保持時間は、合成標準品を用いて得られたものと一致した。さらに、ＡＳＡの添加はＧＳ−付加物の形成を増大させ、これはＥＦＡＤ合成の同時増大と一致した。ＧＳ−付加物は細胞外培地中にも見出され、唯一の例外はＡＳＡで処理した試料についてのものであり、細胞外培地におけるＧＳ−付加物の検出は予想外に低下した。
【０１６４】
考察
[00180]  広範な脂質シグナル伝達メディエーターに関する現在の知識にもかかわらず、Harkewiczらが提示した疑問は依然として残されている：“見落とされている生物学的に重要なエイコサノイド［または他の脂肪酸由来の代謝産物］があるか？”。本発明者らはここで、負に荷電した脂質代謝産物についての探索を、可逆性求電子活性および結果的にシグナル伝達能をもつものに集中することにより、この疑問に答える。この研究に用いた方法により、活性化マクロファージにより産生された６種類の新規ＥＦＡＤおよびオキソＥＴＥ（データを示していない）を検出した。本発明者らが知る限り、これらの種のうち５つは、これまで哺乳動物細胞が形成する炎症関連メディエーターまたは代謝産物としては記載されていない（ＥＦＡＤ−５はオキソＥＴｒＥに対応する可能性がある）。興味深いことに、１５ｄ−ＰＧＪ２はこの試験では観察されなかった；１５ｄ−ＰＧＪ２のレベルは検出するには低すぎた可能性があり、これはしばしば１５ｄ−ＰＧＪ２に起因するとされている作用に本明細書で報告する新規種が関与している可能性も示唆する。
【０１６５】
[00181]  脂質メディエーターの探査を考慮に入れて、さらなるステップ、Lipid Metabolites and Pathway Strategyコンソーシアム(Lipid MAPS; http://www.lipidmaps.org)が、メタボロームの脂質セクションおよび“脂質代謝産物のグローバル変化”（すなわち、リピドミクス）に注目した情報を２００５年以来公開されている。現在までに用いられた方法によって新規な脂質代謝産物が同定され、これらの代謝産物のシグナル伝達特性に関する価値あるデータが得られたが、それらにはそれらがもつ制限があり、ユニークな意味または一般的でない意味のシグナル伝達をもつ脂質を見落とす可能性がある。他の研究は、もっぱらＲＥＳに注目した方法を用いている；ＭＳ／ＭＳを用いてＲＥＳ−ＧＳＨ付加物を検出および試験することにより、種々のＲＥＳが残したインビボシグネチャーを認識し、ＭＳを用いて目的とするＲＥＳに関する構造情報を得ることができる３。しかし、この方法の使用にも限界がある。たとえば、脂質二重層中に生成したＲＥＳはＧＳＨと相互作用する機会がない可能性があるが、それでもなお、膜会合したタンパク質を修飾する可能性がある。この概念は既にタバコ葉において過敏性応答により産生された酵素生成によるＲＥＳを特性解明するために採用されている。
【０１６６】
[00182]  本発明者らは、ＲＥＳ−ＧＳＨ付加物のみを分析するための別法を開発した；この方法では、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）に対する求電子体のアルキル化反応を利用して、細胞性スルフヒドリル（または他の求核体）に可逆的に付加できる求電子体を同定する。一般的に、酸化型ＰＵＦＡ種は、基質、機序／酵素を仮定し、続いて合成化合物と比較して標識化基質の生成物を同定するか、あるいは仮定した生成物を同定することにより見出された。この方法の成功例は、多様なＰＧ種の広範な知識、ならびにイソプロスタン類、ニューロプロスタン類、リポキシン類、およびレゾルビン類の発見である。それに反して、この研究で報告された酸化型脂質種は、最初にもっぱらそれらの化学的特性に基づいて見出された：可逆的な求電子活性をもつ負に荷電した疎水性の小分子。本発明において用いたＢＭＥ法は、ＲＥＳに対するＭＳ／ＭＳ感度を増大させ、ＭＳ／ＭＳに際しての多様なＲＥＳの挙動を標準化した。たとえば、オキソ脂肪酸誘導体は対応するヒドロキシ誘導体と同様にはフラグメント化せず、構造同定をより困難にする。したがって、本明細書に記載した種がこれまで報告されていなかった理由のひとつは、脂質代謝産物同定の一般的方法によれば大部分は予想した種または最も多量に存在する種が得られるからであるという可能性がある；より低い濃度で生成およびシグナル伝達すると思われる予想外の脂質種は、この方法ではより顕著な種のバックグラウンドへ追放されたであろう。本発明において、本発明者らは、これまで特性解明されていなかった求電子性脂肪酸であって、主にｎ−３  ＰＵＦＡの酸素化により誘導されたものを報告する。特に、ＥＦＡＤ−Ｉ〜−３はオキソＤＨＡ、オキソＤＰＡおよびオキソＤＴＡに対応していた（異なる異性体はＡＳＡの存在に応じて形成される）。ＥＦＡＤ−４〜−６は、ｎ−６およびｎ−９  ＰＵＦＡから誘導された。しかし、低レベルでありかつ数種類の異性体が存在するため、これら後者の種の詳細な構造特性解明はできなかった。
【０１６７】
[00183]  したがって、誘導性酵素ＣＯＸ−２がＥＦＡＤ生合成のために必要であったが、本発明者らは他の機序がそれらの形成に関与しているという可能性を排除できない。事実、ＤＨＡからＯＨ−ＤＨＡへの自動酸化および結果的に形成される１０種類の位置異性体が既に１９８０年代に報告された。ＬＯＸ｛すなわち、５−ＬＯＸ、および若干の場合に１２−ＬＯＸおよび１５−ＬＯＸ）もＰＵＦＡの酸化を開始できる。最後に、シトクロムｐ４５０（ＣＹＰ）モノオキシゲナーゼがＮＡＤＰＨ依存性のＰＵＦＡ酸化を触媒すると報告されており、またＣＹＰ４Ｆ８は主にｎ−３位においてＡＡおよびＤＰＡ（２２：５ｎ−６）のヒドロキシル化を触媒することが示されている。ＰＵＦＡのヒドロキシ誘導体の形成は既に記載されていたが、対応するオキソ種へのさらなる酸化はヒドロキシ−ＥＴＡについて観察されていたにすぎない。さらに、（６Ｅ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ）−５−オキソイコサ−６，８，ｌｌ，１４−テトラン酸（５−オキソＥＴＥ）およびＫＯＤＥについての知識にもかかわらず、類似の２２−炭素種に関する研究はない。生物活性脂質上のヒドロキシル基の酸化は一般に代謝不活性化の１段階とみられているが、本発明者らはそのような反応はそうではなく新たな有益な生物活性をもたらす可能性があると提唱する。本明細書中で本発明者らは、ｎ−３  ＰＵＦＡのヒドロキシ誘導体がＬＯＸによりさらに酸化されてＲｖおよびニューロプロテクチン類になる可能性がある分岐点を報告する。本発明者らは、モノヒドロキシ−ＰＵＦＡ誘導体が同様に対応するカルボニル種に変換されて生理活性求電子性脂質を生成することを示す。
【０１６８】
[00184]  ＥＦＡＤ形成の第２酸化段階に関与する可能性がある幾つかのデヒドロゲナーゼ酵素が既に記載されている。たとえば、酵素１５−ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼはこの反応の候補である；それは１５−オキソＥＴＥの形成ならびにレゾルビンＤ１およびＥ１の位置−１７における酸化を触媒することが報告されているからである（Mol Pharmacol. 2009 Jun 17. [プリントに先立つEpub])。同様に、ＬＴＢ４  １２−ヒドロキシデヒドロゲナーゼ／プロスタグランジンレダクターゼ（ＬＴＢ４  １２−ＨＤ／ＰＧＲ）は、ヒドロキシ−エイコサノイドから対応するα，β−不飽和オキソ誘導体へのＮＡＤＰ＋依存性還元を触媒する。５−オキソＥＴＥ形成の場合、５−リポキシゲナーゼ生成物である５−ヒドロキシエイコサテトラン酸が５−ヒドロキシエイコサノイドデヒドロゲナーゼ（５−ＨＥＤＨ）によってさらに酸化されて５−オキソＥＴＥになる。ＨＥＤＨは５−ＨＥＴＥから５−オキソＥＴＥへの反応を前進方向および逆方向の両方において触媒することができるので、５−オキソＥＴＥの形成は高いＮＡＤＰ＋：ＮＡＤＰＨ比（酸化的ストレス下の細胞を表わす状態）が好都合である。ＨＥＤＨ活性は骨髄細胞に存在するけれどもそれはＰＭＡを用いてマクロファージに分化させた後に最も著しく誘導されることに注目すると興味深い。
【０１６９】
[00185]  タンパク質への、またＧＳＨへの、ＥＦＡＤ付加は、それらがタンパク質機能の潜在的モジュレーターとして、また求電子シグナル伝達物質として果たす役割を証明した。タンパク質へのＲＥＳ付加、たとえばＮＯ２−ＦＡによるＧＡＰＤＨの共有結合修飾は、タンパク質の活性または細胞内ロケーションを変化させる可能性がある。ＮＦκＢのｐ６５サブユニットへのＮＯ２ＦＡおよび１５ｄ−ＰＧＪ２の付加により例示されるように、ＲＥＳは転写調節物質に共有結合し、こうしてＤＮＡ結合を阻止することにより、遺伝子発現を調節する可能性もある。他の例では、ＲＥＳは転写因子に関連するタンパク質と共有結合付加物を形成する（たとえば、Ｎｒｆ２インヒビターＫｅａｐ１への１５ｄ−ＰＧＪ２付加）。さらに、ＲＥＳはＧＳＨとの共有結合付加物を形成することによりシグナル伝達に関与する。活性化ＲＡＷ２６４．７細胞溶解物から回収されたＥＦＡＤのうち約５０％がタンパク質に付加していた（図９ａ）が、この数値はＧＳＨのような小分子に結合していたＥＦＡＤを含まなかった。細胞内および細胞外（分泌されたもの）両方のＧＳ−ＥＦＡＤ−２（およびＧＳ−ＥＦＡＤ−Ｉ）付加物がＲＰ−ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより同定された。興味深いことに、ＲＡＷ２６４．７細胞について、ＧＳ−１３−オキソＤＰＡおよびＧＳ−１７−オキソＤＰＡ付加物が両方とも細胞内に検出されたが、細胞外にはＧＳ−１３−オキソＤＰＡ付加物のみが検出された。この所見は幾つかの可能性によるものであろう；ＡＳＡによるＲＡＷ２６４．７細胞の処理は分泌経路に影響を及ぼす可能性がある、ＧＳ−１７−オキソＤＰＡはＧＳ−１３−オキソＤＰＡほど効率的には分泌されない可能性がある、あるいはＧＳ−１７−オキソＤＰＡはいったん分泌されるとＧＳ−１３−オキソＤＰＡより速やかにさらに代謝される可能性がある。
【０１７０】
[00186]  ＧＳＨおよびＧＡＰＤＨ−付加物形成のほかに、ＥＦＡＤによる幾つかのシグナル伝達経路の調節により、内因性産生される抗炎症シグナル伝達メディエーターとしてのそれらの役割が確認された。１７−オキソＤＨＡおよび１７−オキソＤＰＡは、それらの求電子性に従って、Ｎｒｆ２の核内蓄積ならびに２つの主要Ｎｒｆ２ターゲット遺伝子ＨＯ−ＩおよびＮｑｏ−１の発現を促進することより、抗酸化応答を誘導した。１７−オキソ−標準品はＰＰＡＲγのアゴニストとしても作用し、これはＥＦＡＤがＰＰＡＲγの活性化によって何らかの抗炎症作用を発揮する可能性があることを示唆する。これは、低濃度の合成リガンドであるロシグリタゾンによるＰＰＡＲγの活性化が初代マウスマクロファージにおいて少数のＩＦＮγおよびＬＰＳ−依存性遺伝子の発現を阻害するという先の所見と一致した。さらに、１７−オキソＤＰＡおよび１７−オキソＤＨＡは、ＲＡＷ２６４．７においてＩＦＮγおよびＬＰＳ−誘導によるサイトカイン産生を用量依存性で阻害した。ＥＦＡＤの抗炎症シグナル伝達特性に関するさらなる証拠は、ＩＦＮγおよびＫｄｏ２でマクロファージを活性化した後に１７−オキソＤＰＡおよび１７−オキソＤＨＡがｉＮＯＳの発現および活性を用量依存性で阻害したことであった。意外にも、ＥＦＡＤ−Ｉおよび−２はＲＡＷ２６４．７においてＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性、ｐ６５の核内トランスロケーション、またはＳＴＡＴ−Ｉリン酸化に影響を及ぼさなかった（データを示していない）；これは、サイトカインおよびｉＮＯＳ発現の阻害はこれらのシグナル伝達経路と無関係であることを示唆した。興味深いことに、Ｋｄｏ２およびＩＦＮγに応答したＣＯＸ−２誘導はＥＦＡＤ処理により影響を受けなかった。これらの知見は全体として、ＥＦＡＤはそれらの抗炎症作用をＮＦ−κＢおよびＳＴＡＴ−Ｉ以外の経路で発揮する可能性があることを示唆する。ＰＰＡＲγの活性化は可能性のひとつであると思われる；その理由は特に、ＰＰＡＲγの活性化はｉＮＯＳおよびＣＯＸ−２の発現に異なる影響を及ぼし、ＮＦ−κＢ活性化に影響を及ぼすことなく、本発明者らが観察したものと類似のサイトカイン発現パターンを生じる可能性があることである。シグナル伝達メディエーターとしてのＥＦＡＤの役割を支持するさらなる証拠は、１７−オキソＤＰＡおよび１７−オキソＤＨＡがＧＡＰＤＨ中のＣｙｓおよびＨｉｓ残基を共有結合して、ＮＯ２−ＦＡについて先に観察されたものと類似のパターンを生じるという所見であった。最後に、予備データは、ＥＦＡＤ−Ｉおよび２が、おそらく転写因子Ｈｓｆ１およびそれに続くターゲット遺伝子（たとえば、Ｈｓｐ７０およびＨｓｐ４０）の転写を誘導することによる熱ショック応答の活性化を介して、細胞保護作用を促進する可能性があることを示す。これは、それによりＥＦＡＤがそれらの有益な作用を発揮することができるさらなる機序を表わすであろう。全体として、求電子体により調節される認識されているシグナル伝達経路を試験したが、ＥＦＡＤはそれぞれそれら自身の独自のシグナル伝達プロフィールおよび受容体をもつ可能性がある。これらのプロフィールを解明するためにさらなる研究が現在行なわれている。
【０１７１】
[00187]  ＥＦＡＤの生物学的特性を全体的に考慮すると、本発明の知見の有効性を完全に認識できる：それらは、オメガ−３  脂肪酸から誘導され、ＣＯＸ−２の作用により産生される、有益な生物活性脂質であり、それの形成はアスピリンによって増大する。このシナリオにおいて、炎症の消散におけるＣＯＸ−２およびオメガ−３  脂肪酸のまだ完全には解明されていない有益な役割、および心血管ホメオスタシスにおけるそれらの重要な役割は、ＣＯＸ−２誘導によるＥＦＡＤがこれらの作用の仲介に寄与している可能性があることを示唆する。さらに、ＥＦＡＤ生合成がＡＳＡ依存性で増大することは、本発明者らが細胞モデルにおいて観察したＥＦＡＤの保護作用および抗炎症作用が、ヒトの健康におけるオメガ−３  脂肪酸、ＣＯＸ−２およびＡＳＡの何らかの有益な作用の伝達に関与している可能性があることを示唆するこの仮説をさらに強化する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【国際調査報告】
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