(57)【要約】クロッカスサティヴァス（C. sativus）の代謝産物を生成する方法は、（ｉ）細胞懸濁培養物中で１つ以上のサフラン代謝産物を生成するＣ．サティヴァス細胞株を選択すること、及び（ｉｉ）選択された細胞株を懸濁細胞培養物中で生長させ、サフラン代謝産物を生成すること、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロッカスサティヴァス（C. sativus）の代謝産物を生成する方法であって、
カロテノイド、アポカロテノイド、テルペン、テルペノイド、これらのグリコシド、及びこれらの組み合わせから選択される、１つまたは複数のサフラン代謝産物を生成するＣ．サティヴァスの細胞株を選択する工程と、
前記選択された細胞株を懸濁細胞培養物中で生長させ、前記サフラン代謝産物を生成する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
生成された前記サフラン代謝産物が、乾燥重量基準で前記懸濁細胞培養物の細胞の少なくとも０．７重量％である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生成された前記サフラン代謝産物が、乾燥重量基準で前記懸濁細胞培養物の細胞の少なくとも２．０重量％である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
生成された前記サフラン代謝産物が、乾燥重量基準で前記懸濁細胞培養物の細胞の少なくとも１０．０重量％である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
乾燥重量基準で前記懸濁培養物の細胞の少なくとも１％が、クロセチン、クロシン、ピクロクロシン、及び／又はサフラナール、並びにこれらの組み合わせから選択されるサフラン代謝産物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記選択された細胞株を生長させる工程が、前記細胞懸濁培養物をＵＶ光に曝露することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記懸濁細胞培養物が多段階培養で生長し、初期段階（単数又は複数）が、所望の速度の細胞生長を生成する培地を含み、後期段階（単数又は複数）が、カロテノイド及び／又はアポカロテノイド、テルペン及び／又はテルペノイド、並びにこれらのグリコシドの生成を増加させる培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞懸濁培養物が、バイオリアクタ内で生長する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオリアクタが、少なくとも１リットルの容積を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオリアクタが、５〜５００グラムの生細胞重量／リットル（「ｇＦＣＷ／Ｌ」）の範囲の密度を有する接種材料で接種される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記生長速度が、３０日未満で最大密度に達する、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
複数のＣ．サティヴァス細胞株を培養する工程と、
前記細胞株のそれぞれで生成される前記サフラン代謝産物の濃度を測定する工程であって、前記選択された細胞株が、少なくとも部分的に、前記サフラン代謝産物の濃度に基づいて選択される、測定する工程と、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞株の選択基準が、
目視観測と、
蛍光定量解析（fluorimetric analysis）と、
ペーパークロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、並びに／又はタンデムクロマトグラフィー技術（ＨＰＬＣ−ＭＳｎ、ＵＰＬＣ−ＭＳｎ、ＵＰＬＣ−ＮＭＲ、及び／若しくはＵＰＬＣ−ＭＳ−ＮＭＲを含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない、クロマトグラフィー技術と、
直接的又は間接的に前記細胞株の生長をモニターすることと、
炭素源の代謝又は異化をモニターすることと、
酸素及び二酸化炭素の利用又は生成をモニターすることと、及び／又は
前記培養培地のｐＨをモニターすることと、によって得られた結果を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞株が、選択されなかった細胞株と比較して、黄色、金色、橙色、又は赤色を有する前記選択された細胞株に部分的に基づいて選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択された細胞株における前記サフラン代謝産物の濃度が、乾燥重量基準で前記懸濁細胞培養物の細胞の少なくとも０．７重量％である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記選択された細胞株における前記サフラン代謝産物の濃度が、乾燥重量基準で前記懸濁細胞培養物の細胞の少なくとも２．０重量％である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
所望の代謝産物生成を有するＣ．サティヴァスの単離された細胞株であって、前記細胞株が、
複数のＣ．サティヴァス細胞株を培養する工程と、
細胞懸濁培養物中で生長するときの、各細胞株で生成されたクロセチン、クロシン、ピクロクロシン、及び／又はサフラナールの濃度を測定する工程と、
前記複数の細胞株から、乾燥重量に基づいて、細胞懸濁培養物中に少なくとも０．７％のクロセチン、クロシン、ピクロクロシン、及び／又はサフラナールを有する細胞株を選択する工程と、を含む方法により生成される、単離された細胞株。
【請求項１８】
前記濃度を測定する工程が、少なくとも部分的に、
目視観測と
蛍光定量解析と、
ペーパークロマトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、並びに／又はタンデムクロマトグラフィー技術（ＨＰＬＣ−ＭＳｎ、ＵＰＬＣ−ＭＳｎ、ＵＰＬＣ−ＮＭＲ、及び／若しくはＵＰＬＣ−ＭＳ−ＮＭＲを含むが、これらに限定されない）を含むが、これらに限定されない、クロマトグラフィー技術と、
直接的又は間接的に前記細胞株の生長をモニターすることと、
炭素源の代謝又は異化をモニターすることと、
酸素及び二酸化炭素の利用又は生成をモニターすることと、及び／又は
前記培養培地のｐＨをモニターすることと、により行われる、請求項１７に記載の単離された細胞株。
【請求項１９】
前記複数の細胞株を培養する工程が、一段階又は多段階培養のための１つまたは複数の培地処方の特定と、
単離されたＣ．サティヴァス培養物中での１つまたは複数の選択されたカロテノイド及び／又はアポカロテノイド、テルペン、及び／又はテルペノイド、並びにこれらのグリコシドの生成のための条件の特定であって、前記条件が、
温度（すなわち、最低、最高、日内周期）、
光条件（すなわち、波長、強度、日内周期、持続時間）、並びに
撹拌又は通気の速度及び方法、
培養器形状と、を含む、特定と、
天然植物と比較して、単離されたＣ．サティヴァス培養物中でのカロテノイド及び／又はアポカロテノイド、テルペン及び／又はテルペノイド、並びにこれらのグリコシドの増加した生成をもたらす化合物又は化合物の混合物の特定と、を含む、請求項１７に記載の単離された細胞株。
【請求項２０】
前記細胞株が、乾燥重量に基づいて、細胞懸濁培養物中で少なくとも２．０％のクロセチン、クロシン、ピクロクロシン、及び／又はサフラナールを生成するように選択される、請求項１７に記載の単離された細胞株。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
サフランは、一般に、サフランクロッカス（saffron crocus）として知られる、クロッカスサティヴァス（Crocus sativus）の花に由来する香辛料である。各サフランクロッカスは、２０〜３０ｃｍ（８〜１２インチ）まで生長し、最大４輪の花を有し、各々は、心皮の遠位末端に３つの鮮やかな深紅色の柱頭を有する（Ｒａｓｈｅｄ−Ｍｏｈａｓｓｅｌ  ２００６）。サフランは秋に３０〜４０日間開花し、各植物は最大１５日間開花する（Ｄｅｏ  ２００３）。柱頭は手で回収され、乾燥され、調味料及び着色剤として様々な料理で使用される。１ｋｇの乾燥サフランを生成するために、約１５０，０００〜２００，０００の花及び４００時間を超える手作業が必要である（Ｄｅｏ  ２００３）。各花の柱頭は手で回収する必要があり、１つの花につき数個の柱頭しかないので、サフランは、世界で最も高価な香辛料である。２０１１年８月に、ＳａｆｆｒｏｎＥｘｐｏｒｔｅｒ．ｃｏｍは、等級により、イランのサフランに１キログラム当たり１４００〜１８５０ＵＳドルの値を付けた。
【０００２】
世界全体の乾燥サフラン生産量の推定は、年間生産量の推定の情報源により非常に変動し、Ｏｂｅｒｄｉｅｃｋ（１９９１）により言及される、年間約５０，０００ｋｇ（年間５０トン）〜Ａｈｍａｄら（２０１１）により言及される、年間２０５，０００ｋｇ（年間２０５トン）である。ＵＮ  ＣｏｍＴｒａｄｅの統計によると、２０１１年のサフランの全輸出額は総計でほぼ３億７３００万ＵＳドルであった。１キログラム当たり１５００ＵＳドルで、約２５０，０００ｋｇ（２５０トン）の２０１１年の世界全体のサフラン生産量に相当するであろう。
【０００３】
クロッカスサティヴァスＬ．（Crocus sativus L.）は小さな地中植物であり、世界中で栽培され、料理、染色、医薬品、化粧品、及びいくつかの他の目的に使用される香辛料サフランの源として知られる。サフラン（クロッカスサティヴァスＬ．）は３倍体（２ｎ＝３ｘ＝２４）不稔植物であり、約６０属及び１，５００種を含むアヤメ科の構成員である（Ｃａｉｏｌａ及びＣａｎｉｎｉ  ２０１０）。この科の植物は、根茎、球茎、又は鱗茎などの地下貯蔵器官を有する草本である。クロッカス属は、全世界で約８５種あるが、約３０種のみが栽培されている（Ｒａｓｈｅｅｄ−Ｈｏｈａｓｓｅｌ  ２００６）。
【０００４】
サフランの球茎は、種被に覆われ、節からなり、内部はデンプン含有柔細胞から構成される。球茎は、一季のみ生存し、分裂により繁殖して「子球」を生じ、これはやがては新しい植物を生じる。各球茎は、５〜１１枚の葉を生成する。初冬〜初春の数ヶ月間の葉の光合成活性は、新芽の基部で置換球茎の形成に寄与する。秋には、各球茎は１〜４輪の濃いスミレ色〜紫色の芳香性の花を生じ、これらは濃い色の葉脈及びより濃いスミレ色の花喉を有する。花柱は、３つの濃い赤色のこん棒状の枝に分かれ、各枝は２５〜３２ｍｍの長さである。花柱のほとんどは、葯、及び花被の長さの少なくとも半分を超える。花柱は、花の花喉の葯の基部よりずっと下の点で生じる（Ｒａｓｈｅｅｄ−Ｈｏｈａｓｓｅｌ  ２００６）。Ｃ．サティヴァスの花の３つに枝分かれした花柱は、サフラン植物の経済学的に最も重要な部分である。
【０００５】
サフランは、１５０超の揮発性及び不揮発性化合物を含有すると考えられるが、それらの構成要素の約３分の１しか単離及び特徴付けされていない（Ａｂｄｕｌｌａｅｖ  ２００２）。薬理学的に活性かつ重要であると見なされる化合物は、揮発性薬剤（例えば、サフラナール）、苦み成分（例えば、ピクロクロシン）、並びに染料材料（例えば、クロセチン及びそのグリコシド、クロシン）である（Ａｂｄｕｌｌａｅｖ  ２００２）。
【０００６】
サフランはカロテノイドの珍しいクラス、水溶性Ｃ２０アポカロテノイド、クロセチン（８，８’−ジアポ−８，８’−カロテン二酸）、並びにそのエステル誘導体及びグリコシドを生成し、それらは集合的にクロシン類と称される（Ｐｆａｎｄｅｒ及びＳｃｈｕｒｔｅｎｂｕｒｇｅｒ  １９８２）。クロシン類は、その特有の色の原因であるので、サフラン柱頭の最も特徴的な成分である。これらのクロシン類のうちの最も重要かつ豊富なものは、α−クロシン、トランス−クロセチンジ−（β−Ｄ−ゲンチオビオシル）エステルである。クロシンは食物に豊かな黄金色の色相を与え、また布地の染料としても使用される。サフラン中に存在する他の化合物は、リコピン、α−及びβ−カロテン、並びにゼアキサンチンなどの脂溶性カロテノイドを含む。
【０００７】
サフランの苦味及び芳香は主に、ゼアキサンチンの酸化の結果である化学物質ピクロクロシン（Ｒａｉｎａら、１９９６）、及び加熱又はβ−グルコシダーゼ作用を通したピクロクロシンの脱グリコシルにより生成されるサフラナール（Ｈｉｍｅｎｏ及びＳａｎｏ  １９８７）から生じる。ＩＳＯ  ３６３２−２：２０１０（Ｓｐｉｃｅｓ−−Ｓａｆｆｒｏｎ（Ｃｒｏｃｕｓ  ｓａｔｉｖｕｓ  Ｌ．）−−Ｐａｒｔ  ２：Ｔｅｓｔ  ｍｅｔｈｏｄｓ）により規定されるサフランの品質は、苦さ（ピクロクロシン２５７ｎｍで）、香り（サフラナール３３０ｎｍで）、及び着色強度（クロシン４４０ｎｍで）を測定することにより分光光度的に判定される。
【０００８】
また、サフラン及びサフラン抽出物は、様々な状態を治療するための従来の医薬品で使用されてきた（最近の概要についてはＷａｎｉら（２０１１）を参照のこと）。例えば、サフランは、神経鎮静、うつ病及びヒステリー、抑うつ、腹痛、喘息、咳及び気管支痙攣を治療するために、去痰剤として、月経障害（無月経、月経困難症、白色帯下）、消化不良性障害での胃腸管鎮静のため、駆風剤として、熱、肝損傷、貧血、リウマチ、神経痛、歯痛、敗血症性炎症のため、様々な形態の癌、例えば、腹部腫瘍、膀胱、耳、腎臓、肝臓、頸部、脾臓、胃、胸、口、及び子宮の癌の補佐的な治療として、刺激薬及び催淫薬として、循環の刺激のために、並びに早漏の予防のために使用されている（Ｗａｎｉら、２０１１）。
【０００９】
抗腫瘍効果、細胞保護効果、細胞増殖抑制剤の毒性の減少、学習能力及び記憶の改善、抗抑うつ効果、抗パーキンソン効果、抗酸化効果、抗炎症効果、血中脂質低下効果、創傷治癒の促進効果、聞こえ及び循環に対する効果、鎮痙効果、免疫系に対する効果、血液凝固に対する効果、並びに抗アレルギー効果を含む、サフラン抽出物のいくつかの効果が、薬理学的試験モデルで最近検査された（Ｗａｎｉら、２０１１）。加えて、クロシン類は、強力な抗酸化特性及びフリーラジカル消去能力を有することが現在知られ、それらは、癌治療及び予防で有用であり得る（Ｏｃｈｉａｉら、２００４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
サフランの化学成分（例えば、テルペノイド、カロテノイド、アポカロテノイド、モノテルペン、テルペノイドなど）の商業的利用は、その高い価格及び比較的制限された利用可能性のために限定されてきた。植物細胞培養は、この植物が開花する毎年秋の限定された時間内の、畑で生長した植物からの手作業による柱頭の収穫に対して、サフラン代謝産物の魅力的な代替源を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本開示の上記及び他の利点及び特徴を更に明らかにするために、本開示の主題のより具体的な説明を、付属の図面中に例示される本開示の特定の実施形態を参照することにより表す。これらの図面は本開示の例示の実施形態を描写するのみであり、それゆえ、本開示の範囲の限定と見なされるべきでないことを理解すべきである。本開示の主題は、付属の図面の使用を通して、追加の特異性及び詳細を伴って記載及び説明される。
【図１】ξ−カロテンからクロセチン、ピクロクロシン、及びサフラナールへのアポカロテノイド経路の簡略化描写を示す。
【図２】サフラン抽出物の全ＵＶ吸収クロマトグラム、及び同じ注入からの全質量クロマトグラムを示し、ここで、全イオンクロマトグラムでの多くのピークはこの抽出物中の代謝産物の複合混合物を示す。
【図３】４４３ｎｍで測定された、サフラン抽出物及びサフラン標準中のクロシンの、ＵＶクロマトグラムの比較であり、クロシンピークは１６．４分で容易に特定可能である。
【図４】３１２ｎｍで測定された、サフラン抽出物中のサフロナール及びサフロナール標準の、ＵＶクロマトグラムの比較であり、サフラナールピークは２９．２分で特定可能である。
【図５】メタノールサフラン抽出物の単回注入からの、様々なＵＶ波長でモニターされた３つのクロマトグラムのプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
サフラン（Ｃ．サティヴァス）は３倍体雑種であり、それゆえ、不稔であるため、繁殖は、前季の親球茎から発達した球茎の分離及び定植に依存する完全な増殖型である。サフランについての最近の科学的研究のほとんどは、古典的育種に代わる方法の開発に関連しており（最近の概要については、Ａｈｍａｄら（２０１１）及びＡｓｃｕｏｇｈら（２００９）を参照のこと）、インビトロミクロ増殖（Ｄｈａｒ及びＳａｐｒｕ  １９９３、Ｄｉｎｇら１９７９、Ｇｅｏｒｇｅら１９９２、Ｈｏｍｅｓら１９８７、Ｉｌａｈｉら１９８７、Ｓａｎｏら１９８７、Ｓｈｅｉｂａｎｉら２００７、Ｗａｎｉ及びＭｏｈｉｄｄｉｎら２００９）、並びにインビトロでサフランを生成する手段としての柱頭及び柱頭様構造の器官形成での試み（Ｆａｋｈｒａｉ及びＥｖａｎｓ  １９９０、Ｈａｎ及びＺｈａｎｇ  １９８７、Ｈｉｍｅｎｏ及びＳａｎｏ  １９８７、Ｌｕｓｋｏｔｏｖら１９９９、Ｍｉｒら２０１０、Ｓａｒｍａら１９９０）を含む。脱分化Ｃ．サティヴァス細胞の植物細胞培養はＣ．サティヴァス植物から重要な化合物を生成するための代替法である。
【００１３】
比較的高い量でクロシン誘導体を生成するために、クロッカスサティヴァス細胞の持続可能なインビトロ培養システムを開発する必要がある。インビトロでのＣ．サティヴァスからの天然物生成についていくつかの研究がなされているが、それらの研究は固体培地上のカルス培養での研究に限定されている（Ｃｈｅｎら２００３）。本明細書で開示される本発明の実施形態は、液体懸濁培養を利用し、それは、商業的に実現可能な量のこれらの天然物を生成するために十分な規模拡張を可能にする。
【００１４】
本開示は、液体培地中の懸濁細胞培養物として生長するよう構成されたクロッカスサティヴァス細胞に関連する。細胞は、１つ以上のＣ．サティヴァス植物部、例えば、花部（例えば、花弁、子房、葯、及び柱頭）、茎、葉、球茎、又は根に由来する。細胞を選択された期間内（例えば、５、１０、若しくは１５日超、及び／又は３０、２５、若しくは２０日未満、並びに／又は上記の日数の範囲内）に高密度まで生長するように適合させる。
【００１５】
加えて、細胞が、テルペノイド、ポリフェノール、グリコシド、及びアルカロイドを含むが、これれに限定されない、１つ以上の選択された二次代謝化合物を高濃度で生成することを可能にする、特定の細胞培養条件（例えば、生長培地、光条件、生成培地、他の化合物の添加を伴って）下で、細胞を生長させてもよい。具体的には、細胞が高濃度の選択されたカロテノイド及び／又はアポカロテノイド、テルペン及び／又はテルペノイド、並びにこれらのグリコシドを生成することを可能にする特定の細胞培養条件下で、細胞を生長させる。
【００１６】
本明細書で使用されるとき、「二次代謝産物」という用語は、全生活環を経るために植物にとって必要ではない、生物により生成される有機化合物である。一次代謝産物とは異なり、二次代謝産物の欠乏は即死をもたらさないが、むしろ植物の生存可能性、繁殖性、若しくは美観の長期欠陥をもたらし、又はおそらく全く顕著な変化をもたらさない（Ｆｒａｅｎｋｅｌ  １９５９）。二次代謝産物はしばしば、食害に対する植物防御、及び他の種間防御で重要な役割を果たす。ヒトは植物の二次代謝産物を医薬品、香未付、及び娯楽的薬物として使用する傾向がある。
【００１７】
本開示の主題である二次代謝産物のクラスを生じる、クロッカスサティヴァスのいくつかの関連した生合成経路がある。これらはイソプレンに由来する化合物を含み、テルペン、カロテノイド、及びアポカロテノイド生合成経路を含む。
【００１８】
テルペノイド（ときにはイソプレノイドとも称される）は、数千の様式で組み立てられ、修飾される、５炭素イソプレン単位に由来する、大きく、かつ多種多様な化合物クラスである（Ｇｅｒｓｈｅｎｚｏｎ及びＤｕｄａｒｅｖａ  ２００７）。多くは、官能基のみでなく、基本炭素骨格も互いに異なる多環状構造である。これらの化合物は、全てのクラスの生体で見ることができ、天然物の最も大きな群である。植物テルペノイドは、芳香品質のために広く使用され、サフランも例外ではない。植物テルペノイドは、従来のハーブ療法で役割を果たし、抗菌機能、抗悪性腫瘍機能、及び他の薬学的機能について調査されているところである（Ｇｅｒｓｈｅｎｚｏｎ及びＤｕｄａｒｅｖａ  ２００７）。
【００１９】
カロテノイドは、植物の葉緑体及び有色体、並びにいくつかの他の光合成生物で天然に生じる、テトラテルペノイド有機色素である。６００超の既知のカロテノイドがあり、それらは、２つのクラス、（酸素を含有する）キサントフィル、及び（純粋に炭化水素であり、酸素を含有しない）カロテンに分けられる。カロテノイドは、集光性色素であり、青色光を特に強く吸収する（４５０〜４８０ｎｍ）。それらは、植物及び藻類で２つの鍵となる役割を果たす。それらは、光合成での使用のために光エネルギーを吸収し、かつそれらは光酸化からの損傷から葉緑素を保護する（Ｄｅｍｍｉｇ−Ａｄａｍｓ及びＡｄａｍｓ  １９９６）。
【００２０】
アポカロテノイドは、生物で広く生じる有機化合物である。アポカロテノイドは、カロテノイドオキシゲナーゼにより触媒される酸化的切断によりカロテノイドに由来する。例としては、サフランの主要な着色化合物の１つであるクロセチン、ビタミンＡレチノイドレチナール、レチノイン酸、及びレチノール、並びに植物ホルモンアブシジン酸が挙げられる。
【００２１】
現在、経済的に、料理上、及び薬学的に価値があると見なされるサフランの主な化合物は、クロセチン、クロシン類（すなわち、クロシン、クロシンの様々なエナンチオマーなど）、ピクロクロシン、及びサフラナールを含むが、これらに限定されない。サフランの色は、主に分解されたカロテノイド（クロシン及びクロセチン）のためであるが、風味はカロテノイド酸化生成物（主にサフラナール及び苦いグルコシドピクロクロシン）から生じる。着色化合物及び揮発性香味付化合物の生合成は、ゼアキサンチンの生体酸化切断に由来することが、Ｐｆａｎｄｅｒ  ＆  Ｓｃｈｕｒｔｅｎｂｅｒｇｅｒ（１９８２）により提唱された。提唱された生合成経路を、図１に示す（Ｇｏｍｅｚ−Ｇｏｍｅｚら２０１０から）。
【００２２】
一実施形態では、本開示は、クロッカスサティヴァス細胞に由来する細胞株、及びこれらの細胞株を作成する方法に関連する。細胞は、懸濁された細胞培養物中で生育することができ、選択されたカロテノイド及び／又はアポカロテノイド、テルペン及び／又はテルペノイド、並びにこれらのグリコシドなどのサフラン代謝産物を高濃度で生成する。例えば、培養物は、クロセチン、クロシン及び他のクロシン類、モノテルペンアルデヒドピクロクロシン、又はサフラナールの代謝産物の混合物のうちの１つ以上を高濃度で生成するように選択されてもよい。
【００２３】
別の実施形態では、本開示は、Ｃ．サティヴァス細胞培養物が高濃度の１つ以上のカロテノイド及び／又はアポカロテノイド、テルペン及び／又はテルペノイド、並びにこれらのグリコシドを生成することを可能にする、特定の細胞培養条件（例えば、生長及び／又は生成培地処方、環境条件、代謝産物形成を刺激する化合物の添加）を特定することに関連する。例えば、細胞培養条件は、単離された細胞が、クロセチン、クロシン及び他のクロシン類、モノテルペンアルデヒドピクロクロシン、又はサフラナールからなる代謝産物の混合物のうちの１つ以上を高濃度で生成することを可能にするように選択されてもよい。細胞懸濁培養物は、細胞懸濁培養物中で少なくとも０．７重量％のサフラン代謝産物（すなわち、クロセチン、クロシン及び他のクロシン類、モノテルペンアルデヒドピクロクロシン、又はサフラナール）を生成する細胞から生長させてもよい（乾燥重量に基づいて）。他の実施形態では、上記サフラン代謝産物の割合は、少なくとも０．７％、１．０％、２．０％、５．０％、１０％、２０％、及び／若しくは９５％、８０％、５０％、３０％、２０％未満、又は上記割合の範囲内であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞株は、特定のサフラン代謝産物の生成に基づいて選択されてもよい。例えば、細胞株は、非限定的に、上記濃度及び／又は範囲のクロセチン及びクロシンの組み合わせなどの、上記サフラン代謝産物のある特定の組み合わせを生成する能力について選択することができる。
【００２４】
クロセチン、クロシン及び他のクロシン類、モノテルペンアルデヒドピクロクロシン、又はサフラナールからなる代謝産物の混合物のうちの１つ以上を高濃度で生成することができる、選り抜きのＣ．サティヴァス細胞株は、目視検査、蛍光定量法、培養培地の光学特性の測定、生長速度及び炭素源消費速度のモニタリング、並びに細胞、培地、及び細胞及び培地抽出物からの混合代謝産物のクロマトグラフィー分離検出の任意の方法などの、１つ以上の方法により特定され得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、消耗した培養培地の光学特性の測定は、生長及び生産性を判定するために使用される。例えば、液体の溶質濃度の屈折測定である、Ｂｒｉｘの周期的測定は、培養物の炭水化物消費速度の関数として、どのくらい速く培養物が生長しているかを判定するために使用される。このように、生長培地中の物質又は培地に分泌され得る物質は、光学密度（「ＯＤ」）によりモニターすることができ、細胞の生長速度を計測する。例えば、生長培地の多くの通常の構成要素（例えば、ビタミン）は、特徴的なスペクトル及び吸収を有し、それらの消費速度は、培養物の生長速度を推定するために使用することができる。サフランの多くの代謝産物もまた、特徴的なスペクトルを有し、速く生長する培養物では検出可能な量で培地に排出され得る。一実施例では、消耗された培地を、クロシン類又はサフランの他の所望の代謝産物の存在について調べることができる。速く生長していること及び高生産であることが光学密度（ＯＤ）により特定される細胞株は、これらの細胞の全ての構成要素を特定するためにＨＰＬＣ又はＬＣ−ＭＳによってより厳密に解析することができる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、複数の細胞株を生長させ又は栽培し、所望の代謝産物又は所望の濃度のある特定の代謝産物を生成する個々の細胞株を解析し、互いに比較してよい。これらの複数の様々な細胞株の構成要素を解析することは、所望の代謝産物を所望の濃度で生成する、及び／又は所望の生長速度などの特に所望される特徴を有する、ある特定の細胞株の選択を可能にする。
【００２７】
更に別の実施形態では、本開示は初代及び多段階培養両方の生長及び生成のための培地組成の特定を説明する。「多段階培養」という用語は、バイオマスが増加される初期段階（単数又は複数）、及び所望の代謝産物の生成が開始又は向上される後期段階（単数又は複数）を含む、培養方法を説明する。様々な段階は、初期段階から後期段階への培地の変化により、及び／又は所望の代謝産物の生成を刺激するであろう化合物若しくは化合物の混合物の添加により定義され得る。
【００２８】
更に別の実施形態では、本開示は、クロセチン、ピクロクロシン、サフラナール、若しくは他のクロシン類の生成、又はクロシンのピクロクロシンへの変換のための、光条件（波長、強度、持続時間、及び／又は周期）の特定（identification）を説明する。光合成生物の生長、具体的には二酸化炭素及び水を炭水化物に変換する能力は光により影響される。培養で生長する植物については、細胞の栄養素必要量は生長培地により提供されるため、このパラメータは、通常関連する懸念事項ではない。それにもかかわらず、光条件は、鍵となる発達段階、細胞生長、及び代謝産物生成に影響し得る。例えば、クロシン生成は、ＵＶ光への曝露により刺激され得る。一実施形態では、細胞懸濁培地をＵＶ光に曝露し、所望の代謝産物の生成を刺激する。ＵＶ光の波長は、２５０〜４００ｎｍの範囲であってもよい。光の強度は、０（暗）又は５００、１０００、若しくは５０００ルックス超、及び２０，０００、１０，０００、若しくは５，０００ルックス未満、又はこれらの範囲内であってもよい。ＵＶ光の持続時間は、連続的又は断続的であってもよい。
【００２９】
所望の濃度のサフラン代謝産物を生成するための他の生長条件は、少なくとも１５、２０、若しくは２２℃、及び／又は３０、２５、若しくは２３℃未満、又は上記温度の範囲内の温度を含む。細胞懸濁培養物は、暗条件又は様々な光条件下で生長させてもよい。細胞懸濁培養物の照明は、白色光（例えば、３８０〜７００ｎｍの波長）、及び少なくとも５００、１０００、５，０００、１０，０００、若しくは２０，０００ルックス、及び／又は１００，０００、５０，０００、若しくは２５，０００ルックス未満、又は上記ルックスの範囲内であるように選択してもよい。照明は、連続的又は周期的であってもよい。光周期は、少なくとも６、８、１０、若しくは１２時間、及び／又は２４、２０、若しくは１６時間未満、又はこれらの範囲内の持続時間を有することができる。明暗の光周期は、対称（例えば、１２時間暗／１２時間明）、又は非対称（例えば、８時間暗／１６時間明、若しくは１６時間暗、８時間明）であってよい。
【００３０】
細胞懸濁培養物は、撹拌せずに、あるいは少なくとも５０、１００、若しくは２００ｒｐｍ、及び／又は５００、３００、若しくは２００ｒｐｍ未満、又はこれらの範囲内の速度を用いて撹拌して、生長させてもよい。また、細胞懸濁培養物は、通気されてもよい。通気は、周囲空気、又は純酸素と混合した空気で行うことができる。通気速度は、少なくとも１０、２５、若しくは５０、若しくは１００Ｌ／時間、及び／又は５００、１００、若しくは５０Ｌ／時間未満、又はこれらの範囲内であってもよい。
【００３１】
更に別の実施形態では、本開示は、細胞懸濁物中でクロセチン、ピクロクロシン、サフラナール、若しくは他のクロシン類の生成、又はクロシンのピクロクロシンへの変換を刺激する化合物又は化合物の混合物の特定を説明する。このような化合物の例としては、ジャスモン酸及びサリチル酸並びにこれらのエステル、重金属、トリアゾール、キチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
細胞懸濁培養物中で細胞を生長させることは、従来の天然植物生産又は更には固体培地上での生成と比較して、代謝産物がより高濃度で生成されることを可能にする。これらのより高い濃度は、懸濁培養物中で細胞に対する最小限の有害な影響を伴う、特定の二次代謝産物の生成を促進する生長条件を選択することにより達成することができる。細胞懸濁培養物の好適な生長条件は、天然植物の最適生長条件とは実質的に異なることが分かっており、このため、天然植物の生長条件から観察されるであろう結果と同じ有害な結果を伴わない、所望の代謝産物の生成を刺激する生長条件の選択を可能にする。場合によっては、懸濁培地での植物の栽培と、土壌での植物の生長との相違のために、細胞懸濁培養物に適用される条件は、天然植物への適用に実用的でない。又は代替的に、細胞懸濁培養物中での処理の濃度又は強度は、天然植物に適用されたとき所望の応答を呼び起こすために必要な濃度より低い場合がある。
【００３３】
また、本発明は、細胞懸濁培養物を用いたサフラン代謝産物の大量合成にも関連する。この実施形態では、所望の速度又は濃度で１つ以上のサフラン代謝産物を生成するように選択される細胞株が、選択される（例えば、天然植物での代謝産物生成と比較してより高い速度又は濃度）。この細胞株をその後、所望の速度又は濃度でその代謝産物を生成するために好適な条件下で懸濁細胞培養物中で栽培する。バイオリアクタは、少なくとも１、１０、１００、５００、又は１０００リットルの容積を有し得る。大量合成は、接種材料の生成、及びこの接種材料のバイオリアクタへの添加を含み得る。いくつかの実施形態では、接種材料は少なくとも５、１０、２５、若しくは５０グラムの生細胞（ｆｒｅｓｈ  ｃｅｌｌ）重量／リットル（「ｇＦＣＷ／Ｌ」）、並びに／又は５００、２５０、１５０、及び／若しくは１００ｇＦＣＷ／Ｌ未満を有し、あるいは上記濃度のいずれかの範囲内の濃度を有してもよい。
【００３４】
懸濁細胞（接種材料又は生成培養物）を培養するために使用される器は、１：１〜５：１の垂直：水平形状の構成の、ガラスフラスコ、ウェーブ袋、泡タイプバイオリアクタ、撹拌タイプバイオリアクタなどであってもよい。
【００３５】
また更に別の実施形態では、本開示は、抽出効率又はクロシンとピクロクロシンとの間の選択性を改善するための抽出法を説明する。
【００３６】
本開示の主題は、以下の実施例の使用を通して、追加の特異性及び詳細を伴って記載及び説明される。
【００３７】
［実施例］
実施例１．球茎の表面滅菌
クロッカスサティヴァスの球茎を洗剤を用いて、又は用いずに水道水で洗浄し、蒸留水又は脱イオン水で洗浄し、５０〜９５％エタノール中に１〜６０秒間浸し、界面活性剤を伴って又は伴わずに０．１〜３％次亜塩素酸ナトリウム溶液中で１〜６０分間表面滅菌し、その後、滅菌蒸留水又は脱イオン水ですすいだ。
【００３８】
頂端部の芽をこの球茎から切除し、解体した。花部を除去し、花弁、子房、葯、及び柱頭に分けた。これらの柱頭をその後、色素沈着が発達する点のすぐ下で切断することにより、２つの部に分けた。子房と色素沈着部との間の非色素沈着部もまた維持した。外植片を０．５〜１ｃｍの片に解体した。
【００３９】
球茎を水平に３〜４切片に切り、そのそれぞれを腋芽を伴って及び伴わずに更に区分に切り分けた。伸長した球茎を解体して、花原基及び栄養原基を露出させ、それぞれは約０．５〜１ｃｍの長さであった。
【００４０】
実施例２．クロッカスサティヴァスのカルス誘導
解体した外植片を、１〜１０％炭水化物総濃度でショ糖、ブドウ糖、麦芽糖、乳糖、及び／又は果糖などの炭水化物源を含有する、カスタム又は確立された培地処方（medium formulation）、例えば、ＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ  １９６２）、ＬＳ培地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ及びＳｋｏｏｇ  １９６５）、Ｂ５培地（Ｇａｍｂｏｒｇら１９６８）、ホワイト培地（Ｗｈｉｔｅ  １９４３）、又はＮ６培地（Ｎｉｔｓｃｈ及びＮｉｔｓｃｈ  １９６９）に接種した。更に、これらの培地は、０〜２０ｍｇ／Ｌで変動する濃度の植物生長調節剤を含有した。オーキシンは、４−クロロフェノキシ酢酸、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２，４，５−トリクロロ酢酸、ナフタレン酢酸、インドール酢酸、インドール酪酸、トリヨード安息香酸、β−ナフトキシ酢酸（ＮＯＡ）、フェニル酢酸、及びピクロラムを含み得る。サイトカイニンは、アデニン及びその塩、カイネチン、ゼアチン及びそのリボシドの異性体、ベンジルアミノプリン、２−イソペンテニルアデニン、１，３−ジフェニル尿素（ＤＰＵ）、Ｎ−（２−クロロ−４−ピリジル）−Ｎ−フェニル尿素（４−ＣＰＰＵ）、並びにチジアズロン［１−フェニル−３−（１，２，３−チアジアゾール−５−イル）尿素］を含み得る。他の植物生長調節剤は、ジカンバ、アブシジン酸、ジベレリン酸及びその異性体のうちの１つ以上、パクロブトラゾール、アンシミドール、ジャスモン酸及びそのエステル、フロログルシノール、クロロコリンクロリド、Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン（グリホサート）、並びにコハク酸２，２−ジメチルヒドラジドを含み得る。バナナ粉末、酵母抽出物、ココナッツジュース、タンパク質加水分解物、アミノ酸、ビタミン、及び活性炭を含むが、これらに限定されない、追加の成分を、生長及び生産性を向上させるために培地に添加してよい。全ての培地を、５．２５〜６のｐＨに調節し、１．２ｋｇ／ｃｍ２の滅菌を保証するのに十分な時間、オートクレーブした後、０．１〜１．５％寒天又は他の好適なゲル化材料により凝固させた。培養物を、暗条件で、連続光で、又は様々な明暗条件の任意の組み合わせで、１５〜３０℃でインキュベートした。１〜８週間後、外植片から生じるカルスを観察することができた。
【００４１】
必ずしもそうとは限らないが、典型的な例である、最適培地は、０．８％寒天で凝固したＢ５ＮＢであるが（Ｋｅｔｃｈｕｍ及びＧｉｂｓｏｎ  １９９５）、他の培地も有効な結果を提供した。
【００４２】
Ｃ．サティヴァス組織に由来するカルスを、既定の培地上で１〜８週毎に継代培養した。細胞株を、黄色〜暗い金色〜赤色で、もろく、かつ速く生長したカルスから、更なる増殖及び維持のために選択した。
【００４３】
実施例３．クロッカスサティヴァスの選り抜きのカルス系のスクリーニング
カロテノイドは、クロッカスサティヴァスの特有の色の原因である、この植物の非常に特徴的、かつ重要な成分である。この特徴を、固体プレート上での選り抜きのカルス系の選択のために使用した。カロテノイド及びアポカロテノイド生成のために適切なカルス系を選択するために、カルスを第１に、カルスのもろさ、生長、及び色に従って、目視でスクリーニングした。ゼアキサンチン及びβ−カロテンなどのカロテノイドは黄色〜橙色を有し、クロシンなどのアポカロテノイドは特有の橙色〜赤色を有し、それらはカルスで容易に区別できた。赤色、黄色、及び金色のカルスは、高濃度のクロシン及びその生合成前駆体を含有するため、これらを選択した。しかしながら、いくつかの有色カルスは茶色になる傾向を有し、茶色化は無色素カルスに広がることが分かった。また、非茶色化カルスの慎重な選択は選択基準でもあった。
【００４４】
目視で選択したカルスプレートをスミレ色〜青色光励起下での蛍光観測によりスクリーニングした。４３５〜４４０ｎｍの励起で、クロシンは特有の山吹色〜緑色の蛍光を示す。ｐＨ  １０の溶液中でのクロシンの分光学研究は、４１０〜４３０ｎｍでの最大吸収、及び４３６ｎｍの励起下での５４３ｎｍの強い発光ピークを示した。固体プレート上でｐＨ  ４〜６では、蛍光はｐＨ  １０のときほど強くなかったが、蛍光を用いたスクリーニング方法は高濃度のクロシンを生成するカルスを選択するために有効であった。蛍光により選択されたカルスからのサンプルを、標的のクロシン類及び他の代謝産物の存在を確認するために、ＬＣ−ＭＳにより解析した。
【００４５】
実施例４．ＨＰＬＣ、並びにＰＤＡ及びＥＳＩ−ＭＳ検出によるサフラン解析
ＨＰＬＣ−ＰＤＡ−ＭＳ法を、サフランの主要な代謝産物を分離及び検出するために開発した。この方法はサフラン植物の抽出物、及び培養サフラン植物細胞に適用可能である。好適な方法の例は、サフラン抽出物の成分を分離するために、逆相Ｃ−１８カラム及び水−アセトニトリル移動相勾配を用いることである。ＰＤＡ分光計及びＥＳＩタンデム質量分析器を、この抽出物の成分がカラムから溶離するとき、それらを検出及び特徴付けするために使用した。
【００４６】
この方法は、広範囲の代謝産物（図２）を検出するために十分に一般的であるが、３つの価値の高いサフラン化合物、クロシン、ピクロクロシン、及びサフラナールの検出及び定量に特に注意して焦点を合わせた。これらの化合物をそれらのＵＶスペクトル及び質量スペクトルにより、及び信頼できる標準との比較により特定した（図３〜４）。これらの標準から構築された較正曲線を、定量に使用した。質量ペクトルを１４０〜１２００ａｍｕの負イオンモードで取得し、また、ＵＶクロマトグラムをピクロクロシン（２５７ｎｍ）、サフラナール（３３０ｎｍ）、及びクロシン（４４０ｎｍ）の最大吸収に対応する３つの異なる波長でモニターした（図５）。
【００４７】
実施例５．クロッカス細胞培養物中の全クロシン類の高処理分光光度定量
以下は、クロッカスカルス又は懸濁細胞中の全クロシン類含有量の判定のための、抽出及び分光光度分析の高処理方法を説明する。信頼できるクロシン標準（Ｓｉｇｍａ）を、７０％メタノール中で２．５、５、１０、５０、１００、及び２００μｇ／ｍＬで調製した。抽出物を、２ｍＬの７０％メタノールを、２ｍＬエッペンドルフ管中の１００ｍｇの生細胞に添加すること（１：２０抽出率）により作成した。これらの混合物を均質化するために、タングステンビーズを各管に添加し、これらの管に蓋をし、２４個の溝のサンプルラックに入れ、Ｍｉｘｅｒ  Ｍｉｌｌ  ３００（Ｒｅｔｓｃｈ）上で１８Ｈｚで４分間振盪させた。最大４８個のサンプルを、この方法で同時に処理することができる。抽出物を４０００ｒｐｍで４分間遠心分離し、その後、各管からの２００μＬの透明な上清をＵＶプレート上の各ウェルに移した。２００μＬの各標準希釈物を、同じプレート中の別個のウェルに添加した。この抽出物及び標準の吸収を、４４０ｎｍで測定した。この抽出物中の全クロシン類含有量を、クロシン標準から作成した標準曲線に対して判定した。
【００４８】
実施例６．クロッカスサティヴァスに由来するカルスからの懸濁物作製
もろい、金色の細胞株を懸濁物の開始のために選択した。細胞懸濁物を、Ｃ．サティヴァスカルス（実施例２及び３のように調製した）を滅菌エルレンマイヤーフラスコ中の液体培地に導入することにより作製した。この実施例で使用した培地は、実施例２で速いカルス生長及び高い代謝産物生成の最も優れた組み合わせを提供したことが分かった培地である。この種類の培地の例は、Ｂ５ＮＢである（Ｋｅｔｃｈｕｍ及びＧｉｂｓｏｎ  １９９５）。フラスコを滅菌シリコーン（泡）キャップで覆い、ジャイロロータリ振盪器内で５０〜１５０毎分回転数（ｒｐｍ）で撹拌した。懸濁物を１５〜３０℃で暗条件で維持した。細胞培養物を確立するために、消耗した培地を除去し、新しい培地を添加した。細胞の生長を、培地の°Ｂｒｉｘのデルタを測定することにより、炭水化物消費速度により測定した。°Ｂｒｉｘが培地の初期値の半分と等しい、又はそれ以下であった場合、新しい培地を細胞に添加した。°Ｂｒｉｘが半分超であった場合、新しい培地を２週間後にのみ添加した。
【００４９】
実施例７．細胞生長の最適化
この実施例は懸濁物の細胞生長を増加させるために使用される方法を説明する。体積測定による標的化合物の生産性は細胞生長速度、及び細胞生長が停止する最終バイオマスの関数として増加する。最適接種材料サイズを判定するために、クロッカスサティヴァス細胞の懸濁培養物を５〜１００グラム生細胞重量／リットル（「ｇＦＣＷ／Ｌ」）の接種材料サイズで開始し、様々な培地条件で１４日間生長させた。生長調節剤、基本培地塩、炭水化物源、及び有機／無機源を最終バイオマスを最大化するために培養期間中試験した。
【００５０】
生重量の接種の例として、２５ｇＦＣＷ／Ｌの細胞密度で開始した培養物は、７日以内に最大密度に達しなかった。５０ｇＦＣＷ／Ｌの細胞密度で開始した最終バイオマスは、１４日以内にバイオマスが５倍（ｇＦＣＷ／Ｌ）超に増加し、いくつかの培養物は１４日目までに２７０〜３００ｇＦＣＷ／Ｌまで生長した。細胞選択は、１４日以内又はそれより短い期間内に２５０ｇＦＣＷ／Ｌ超に達した培養物をもたらした（速く生長する細胞培養物）。２００ｇＦＣＷ／Ｌに達するのに１４日超かかった培養物は、廃棄した。
【００５１】
５０ｇＦＣＷ／Ｌ接種材料について、５．６２日の倍加時間は１４日目までに２８０ｇＦＣＷ／Ｌの計算上の最終バイオマス蓄積をもたらす。比較として、８．０３日の倍加時間を有する１００ｇＦＣＷ／Ｌ接種材料サイズは１４日目までに３３５ｇＦＣＷ／Ｌに達する。しかしながら、細胞の色は、より低い接種材料密度での培養物より暗い茶色であった。１４日目の光学密度（ＯＤ）を十分に生長したフラスコの選択に使用した。手持ち式携帯用ＯＤスキャナを、非侵襲的間接法としてバイオマスを測定するために使用した。消耗した培地又は培養物のＯＤ値とＦＣＷとの間の較正曲線を先に構築し、１４日目のＯＤ値はｇＦＣＷ／Ｌの単位で最終バイオマスを示した。
【００５２】
実施例８．クロシン高生成Ｃ．サティヴァス懸濁培養物の細胞選択
炭水化物消費は培養物生長及び代謝産物生成の指標である。懸濁培養物の屈折率を全培養周期をとおしてモニターする。１４日目までに炭水化物を完全に使い尽くさなかった培養物は、好ましくないと見なされ、廃棄した。
【００５３】
クロシン生成を３つの方法、分光光度法、ＬＣ−ＭＳ分析、及びＣＩＥＬＡＢ色測定により測定した。細胞が静止した後、静止細胞のＣＩＥＬＡＢ  ＣＩＥ  １９７６（Ｌ＊、ａ＊、ｂ＊）色空間データ値を手持ち式携帯用分光光度計により測定した。これは、静止した細胞のクロシン色の「Ｌａｂ」値を与えた。「Ｌａｂ」値により選択した高クロシン生成フラスコのうちの上位１０〜１５％のみを、ＬＣ−ＭＳ分析のためにサンプリングした。細胞選択プロセスでは、各継代培養でのクロシンの高生成レベルにより定量されるように、平均細胞内クロシン含有量より高い量を生成したフラスコが選択され、これはクロセチン、クロシン、ピクロクロシン、及びサフラナール生成レベルの更なる改善を可能にした。
【００５４】
実施例９．多段階培養によるＣ．サティヴァス懸濁物からのクロシン生成の最適化
細胞生長及びクロシン生成を多段階培養プロセスを用いることにより分離した。第１段階では、バイオマス生成を最大化させた。第２段階では、所望の二次代謝産物（例えば、クロセチン、クロシン、ピクロクロシン、及びサフラナール）の生成を最大化させた。多段階培養法は、生長周期の終わりに生長培地を生成培地で置換することにより、バイオマス及びクロシン生成を最大化させる、最も優れた方法であることが分かった。大量バイオリアクタプロセスでの培地の完全排水及び置換の困難のために、生成培地処方は、生長培地と同じ塩及びビタミンの基本処方を有したが、様々な種類又は濃度の炭水化物、植物生長調節剤、代謝誘発剤、追加の塩若しくはビタミン、又はサフラン代謝産物の生成を向上させる他の成分などの追加の変更を含有した。
【００５５】
また、クロセチン、クロシン、ピクロクロシン、及びサフラナール生成の要光量も研究した。これらのＰＹ（生成収率、ｍｇ生成物／ｇＤＣＷ細胞）値を、様々な光強度、波長、及び曝露時間を比較することにより統計的実験設計（ＤＯＥ）により試験し、最も優れた条件を第２の培養段階で使用した。
【００５６】
実施例１０．アポカロテノイド及びテルペンの過剰生成のための誘発剤の開発
いくつかの化合物及び化合物の混合物を、クロセチン、クロシン、ピクロクロシン、及びサフラナール生成の生成について試験した。これらの種類の化合物の典型的な例としては、ジャスモン酸及びサリチル酸並びにこれらのエステル、重金属、トリアゾール、キチンなどが挙げられるが、これらに限定されない。様々な濃度及び組み合わせのこれらの化合物を、１４日目に最適化生成培地に添加した。実験は、完全乱塊法を用いて行った。ＦＣＷを２１日目に判定した。その後、細胞を、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）の判定のために一定重量になるまで凍結乾燥した。乾燥サンプルを更なるＬＣ−ＭＳ分析に使用し、乾燥細胞中のクロセチン、クロシン、ピクロクロシン、サフラナール含有量を判定した。
【００５７】
実施例１１．Ｃ．サティヴァス懸濁培養物からのアポカロテノイド及びテルペンの抽出
この実施例は、実施例１〜８で開発されたＣ．サティヴァス培養物の懸濁細胞からアポカロテノイド及びテルペンを抽出するために開発された方法を説明する。培地を伴わないＣ．サティヴァス生細胞、又は乾燥し、かつ粉砕されたＣ．サティヴァス細胞をエタノール：水（５０：５０、ｖ／ｖ）中に再懸濁し、暗条件で室温で１〜３時間撹拌した。この懸濁物を３０００〜５０００×ｇで２０分間遠心分離して、細胞残留物を分離し、上清を回収した。抽出効率を改善するために、同じプロセスを上記細胞残留物で繰り返した。固体相を廃棄し、上清を解析又は更なる精製プロセスのために使用した。
【００５８】
ＬＣ−ＭＳ分析のために、解析の前に、上清を６０００×ｇ（ＲＣＦ  ５９９６）で４分間遠心分離し、０．４５μｍ膜フィルタで濾過し、同じ水性抽出溶媒を用いることにより１０倍希釈した。残りの抽出物を、更なる解析のために−２０度の冷凍庫で保存した。
【００５９】
実施例１２．Ｃ．サティヴァス懸濁培養物の増量
植物細胞培養物の使用での共通の問題は標的生成物の一貫した生成を得ることである（Ｋｉｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２０（６）１６６６、２００４）。それゆえ、大量植物細胞培養の成功の鍵は安定した生産性を維持することである。Ｃ．サティヴァス細胞培養物の懸濁物を１２５ｍＬフラスコから２５０ｍＬ、そして５００ｍＬフラスコまで増量するプロセスは、Ｂ５ＮＢなどの実施例５で最適であると判定された培地中で行って成功した（Ｋｅｔｃｈｕｍ及びＧｉｂｓｏｎ  １９９５）。振盪器のスピードを、１２５ｍＬフラスコのときと同じような生長及び生成数を与えるように、５００ｍＬフラスコについて最適化した。−５０〜１５０ＲＰＭの様々な振盪器スピードを試験し、それらのＤＯ（溶存酸素）濃度を１２５ｍＬフラスコ中での生長と比較した。撹拌スピード及び作業体積は、１２５ｍＬフラスコ及び５００ｍＬフラスコの両方で同様のＤＯ濃度を提供するように調節した。最終バイオマスは３５０〜４００ｇＦＣＷ／Ｌであり、これは全ての処理について５０ｇＦＣＷ／Ｌの開始バイオマスの約７倍超であった。また、生成収率（ＰＹ）及びバイオマスに対する撹拌スピード及び培養体積の効果も研究した。バイオマス、培地中の糖濃度、伝導率、及び代謝産物生産性を培養周期中、規則的な間隔で測定した。
【００６０】
より大きな容器（例えば、２．８Ｌフェルンバッハフラスコ）中で生長させるために培養物を増量するための実験を行い、撹拌スピード（ｒｐｍ）、振盪器行程サイズ、及び作業体積をＤＯ濃度傾向、最終バイオマス、並びにクロセチン、クロシン、ピクロクロシン、及びサフラナールのＰＹに基づいて最適化した。これは、より小さな１２５ｍＬ及び５００ｍＬフラスコのときと同様の生長及び生成をもたらすことに成功した。
【００６１】
本発明は、本発明の趣旨又は本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で実施することができる。説明された実施形態は全ての点で単に例示であると考えられるべきであり、制限であるとして見なされるべきでない。本発明の範囲は、それゆえ、上記の説明ではなく、付属の特許請求の範囲によって示される。特許請求の範囲の均等物の意味及び範囲内に入る全ての変更は特許請求の範囲に包含されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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