(57)【要約】  本開示は、生物学的に活性なポリペプチド、特にエクセンジン−４などの代謝性ペプチドの経口投与のためのポリ（オクチルシアノアクリレート）を含むナノ粒子に関する。そのようなナノ粒子を製造する方法、そのようなナノ粒子を含む医薬組成物、及びそのようなナノ粒子を使用して肥満症などの代謝性障害を治療する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（オクチルシアノアクリレート）を含み、生物学的に活性なポリペプチドを含む、ナノ粒子。
【請求項２】
経口投与される、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
生物学的に活性なポリペプチドが７０個以下のアミノ酸残基を含む、請求項１又は２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
生物学的に活性なポリペプチドが代謝性ペプチドを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
代謝性ペプチドが、インスリン分泌性ペプチド又はインクレチンである、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項６】
代謝性ペプチドが、ＧＬＰ−１アゴニストペプチド、ＰＹＹ、ＮＭＵ、及びＣＣＫからなる群から選択される、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項７】
代謝性ペプチドがエクセンジン−４である、請求項４〜６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
ナノ粒子が３００ｎｍ以下の流体力学的直径を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
数で少なくとも９０％のナノ粒子が、１０ｎｍから２００ｎｍの内に動的光散乱法により測定された流体力学的直径を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子を含むナノ粒子の集団。
【請求項１０】
ａ）オクチルシアノアクリレートを有機溶媒に溶解してモノマー溶液を形成する工程、
ｂ）工程（ａ）からのモノマー溶液を酸性水溶液に加えて、水性相中に有機液滴のエマルションを形成する工程、及び同時に又は連続して
ｃ）生物学的に活性なポリペプチドの水溶液を、工程（ｂ）からのエマルションに加えて、モノマーを重合させる工程、
ｄ）有機相を蒸発させて、それによりポリペプチドを含有するポリ（オクチルアクリレート）ナノ粒子の水性懸濁液を得る工程
を含むナノ粒子を製造する方法。
【請求項１１】
有機溶媒が、酢酸エチル、ジクロロメタン、及びクロロホルムからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）の水溶液が界面活性剤を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）の水溶液が安定剤を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
界面活性剤が、ポロキソマー、ポリソルベート界面活性剤、マクロゴールエーテル界面活性剤、ポリビニルアルコール、及びポリビニルピロリドンからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
安定剤が、デキストラン、キトサン、フコイダン、ペクチン、グリコーゲン、アミラーゼ、及びアミロペクチンからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
エマルションを中和する工程が工程（ｃ）と（ｄ）の間に含まれる、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
エマルションが水酸化ナトリウムを使用して中和される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポリペプチドのモノマーに対する比が１〜１０％ｗ／ｗである、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノ粒子、又は請求項１１〜１８のいずれか一項の方法により製造されたナノ粒子を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
オリゴフルクトースをさらに含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子、請求項９に記載のナノ粒子の集団、又は請求項１９若しくは２０に記載の医薬組成物の、以下の代謝性障害、即ち上昇したグルコースレベルと関連する障害、糖尿病（１型又は２型又は先天性）、代謝症候群、高血糖、耐糖能異常、β細胞欠損及び過食に特徴づけられる若しくは関連する肥満症などの疾患の任意の１つ若しくは複数を治療するための使用であって、生物学的に活性なポリペプチドが代謝性ペプチドである、使用。
【請求項２２】
肥満症を治療するための、請求項２１に記載のナノ粒子、ナノ粒子の集団、又は医薬組成物の使用であって、代謝性ペプチドがエクセンジン−４である、使用。
【請求項２３】
以下の代謝性障害、即ち、上昇したグルコースレベルと関連する障害、糖尿病（１型又は２型又は先天性）、代謝症候群、高血糖、耐糖能異常、β細胞欠損及び過食に特徴づけられる又は関連する肥満症などの疾患の任意の１つ又は複数を有する被験体を、請求項９に記載のナノ粒子の集団又は請求項１９若しくは２０に記載の医薬組成物の治療的有効量を被験体に投与することにより治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
背景技術
生物薬剤、特にタンパク質及びペプチド薬剤の圧倒的大多数は、非経口的経路、例えば、静脈内又は皮下注射により投与される。これらの投与経路は、不便で且つ苦痛であることが多くなりがちで、それが、特に１日に複数の注射が必要な場合に、患者の投薬遵守を減少させる。それらは経費も高くなり得る（例えば、静脈内点滴による投与では、医療センターへの通院が必要になる）。
【０００２】
生物薬剤の経口投与は、これらの欠点の多くを克服するであろうが、それ自身の課題も有する。そのような分子は、通常経口的に生体利用可能ではなく、それは、タンパク質及びペプチドは、プロテアーゼに富む胃及び腸の環境でタンパク質分解を受けやすいからである。他の障害として、胃腸（ＧＩ）管で遭遇する酸性条件における分子の安定性、及び全身を曝す必要があるタンパク質又はペプチド治療の場合における、薬剤がＧＩ管に入る時とその標的に達する時との時間的遅れ、腸粘膜などの生物膜を越える薬剤の透過率が挙げられる(Goldberg and Gomez-Orellana,Nat Rev Drug Discov(2003) 2(4):289〜295)。これらの理由で、経口的に送達される生物薬剤は、異例の１１個のアミノ酸の環状ペプチドであるシクロスポリンを例外として、現在のところ上市されていない。シクロスポリンは、それが、水不溶性、環状ペプチド、非リボソームペプチドであり、単一のＤ−アミノ酸を含有すること（天然には滅多に見られない）において代表的ペプチドではない。
【０００３】
活性なタンパク質又はペプチドを保護してその腸壁を通る吸収を可能にするためには、代謝過程を迂回して、完全且つ機能的生物薬剤を維持する精巧な薬剤送達方法が必要である(Hamman J.H.,EnslinG.M.,Kotz A.F.(2005), Oral Delivery of Peptide Drugs,Biodrugs 165-177)。
【０００４】
ミクロスフィア、リポソーム、及び種々のナノ粒子などの粒子状担体が、生物薬剤の経口送達のために探索されている。しかしながら、そのような技法は、それらのサイズ、胃／ＧＩ管内における不安定性及び低い薬剤搭載が原因で経口送達のために適することができない。
【０００５】
肥満症などの代謝性疾患及び障害が増加している。肥満症は、先進国の人口に影響するだけでなく、低所得及び中所得国においてもますます広まりつつある新しく出現したグローバルな問題である。肥満症及び肥満症関連疾患の治療及び食事栄養素の提供のためのグローバルな出費は、絶えず増加している(World Health Organisation(2011),Obesity and overweight,Factsheet no.311(updated March 2011)、James P.T.,Leach R.,Kalamara E.,Shayeghi M.(2001),Worldwide Obesity Epidemic,Obesity Research 9(4):228S-233S)。肥満症の治療の選択肢は限られており、主として外科的介入に限定され、したがって、実現性のある薬剤に基づく治療選択肢を見極める明らかな臨床的必要性がある。天然ＧＬＰ−１を超える効力を有する非ヒトインクレチン模倣体であるエクセンジン−４が、２型糖尿病の治療のために、現在認可されており（BYETTA（商標）、BYDUREON（商標））、肥満症の治療のためにも多数の臨床試験において検討されている。しかしながら、エクセンジン−４などの開発されていることが知られている殆ど全ての後期ステージの代謝性ペプチドは、注射が必要である。
【発明の概要】
【０００６】
ポリ（オクチルシアノアクリレート）（他の言い方ではＰＯＣＡとして知られる）を含む、生物学的に活性なポリペプチドを含むナノ粒子が、特に経口投与のために提供される。
【０００７】
数で少なくとも９０％のナノ粒子が動的光散乱法により測定して１０ｎｍから２００ｎｍの中に流体力学的直径を有する本開示のナノ粒子を含むナノ粒子の集団も提供される。
【０００８】
本開示は、以下の工程を含む、ナノ粒子を製造する方法をさらに提供する。
ａ）オクチルシアノアクリレート（ＯＣＡ）を有機溶媒に溶解してモノマー溶液を形成させる工程、
ｂ）工程（ａ）からのモノマー溶液を酸性水溶液に加えて、水性相中に有機液滴のエマルションを形成させる工程、及び同時に又は連続して
ｃ）生物学的に活性なポリペプチドの水溶液を、工程（ｂ）からのエマルションに加えてモノマーの重合を起こさせる工程、及び
ｄ）有機相を蒸発させて、それによりポリペプチドを含有するポリ（オクチルアクリレート）（ＰＯＣＡ）ナノ粒子の水性懸濁液を得る工程。
【０００９】
本開示のナノ粒子を含む医薬組成物も提供される。
【００１０】
以下の代謝性疾患のいずれか１つ又は複数を治療するための代謝性ペプチドを含む本開示のナノ粒子の使用がさらに提供される。即ち、上昇したグルコースレベルと関連する障害、糖尿病（１型又は２型又は先天性(gestational)）、代謝症候群（メタボリックシンドローム）、高血糖、耐糖能異常(impaired glucose tolerance)、β細胞欠損、及び過食に特徴づけられる又は関連する肥満症などの疾患。
【００１１】
以下の代謝性疾患、即ち、上昇したグルコースレベル、糖尿病（１型又は２型又は先天性）、代謝症候群、高血糖、耐糖能異常、β細胞欠損、及び過食に特徴づけられる又は関連する肥満症などの疾患と関連する障害の１つ又は複数を有する被験体を、本開示によるナノ粒子の治療的有効量を投与することにより治療する方法も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１は、胃液シミュレート中の種々の時点におけるエクセンジン−４ ＰＯＣＡナノ粒子及び遊離エクセンジン−４の安定性を示す棒グラフである。
【図２】図２は、腸液シミュレート中の種々の時点におけるエクセンジン−４ ＰＯＣＡナノ粒子及び遊離エクセンジン−４の安定性を示す棒グラフである。
【図３】図３は、遊離エクセンジン−４、エクセンジン−４ ＰＯＣＡナノ粒子、又は対照の生理食塩水のいずれかを投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスの静脈内の種々の時点（投薬前並びに０．５、１、２、３、４及び８時間後）における血中グルコースレベルの変化（パーセンテージ）を示す図である。
【図４】図４は、給餌され、経口的にエクセンジン−４ ＰＯＣＡナノ粒子若しくは遊離エクセンジン−４のいずれかを投与された、又は皮下に遊離エクセンジン−４を投与されたＣ５７／ＢＬ６マウスにおける、投薬後１２、２４及び３６時間後の時点で、対照の水と比較した食物摂取の減少率（％）を示す図である。
【図５】図５は、用量範囲の研究に関し、給餌され、経口的に２０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ若しくは２．５ｍｇ／ｋｇのいずれかのエクセンジン−４ ＰＯＣＡナノ粒子又は２０ｍｇ／ｋｇの遊離エクセンジン−４を投与されたＣ５７／ＢＬ６マウスにおける、投薬後１２、２４及び３６時間の時点で、対照の水と比較した食物摂取の減少率（％）を示す図である。
【図６】図６は、用量範囲の研究に関し、給餌され、経口的に２０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ若しくは２．５ｍｇ／ｋｇのいずれかのエクセンジン−４ ＰＯＣＡナノ粒子又は２０ｍｇ／ｋｇの遊離エクセンジン−４を投与されたＣ５７／ＢＬ６マウスにおける、投薬後１２、２４及び３６時間の時点で対照の水と比較した体重の減少率（％）を示す図である。
【発明の具体的説明】
【００１３】
生物薬剤を経口投与する効率的且つ効果的な手段に対する強い需要がある。特に、望ましい放出速度及び全身的な生体利用可能性を達成するが、その一方でタンパク質／ペプチドの安定性及び活性を維持する、生物薬剤を経口投与する手段を見出すことが望ましい。
【００１４】
本開示は、これらの問題に対する解決策を提供する。本開示は、生物学的に活性なポリペプチド、特に、エクセンジン−４などの代謝性ペプチドの経口投与のためにポリ（オクチルシアノアクリレート）を含むナノ粒子を提供する。本発明者らは、本開示のナノ粒子を使用してエクセンジン−４ペプチドを経口投与して、代謝性ペプチドを搭載（付加）した本開示のナノ粒子の治療の可能性を示す低下した血中グルコースレベル、減少した食物摂取及び体重減少を含む有意の生物学的効果を達成した。したがって、本開示のナノ粒子は、経口経路により投与された生物学的に活性なポリペプチドの全身的送達を達成することができる。本開示のナノ粒子は、生物学的に活性なポリペプチドを胃腸（ＧＩ）管の領域へ局所送達することも達成することができる。
【００１５】
一つの実施形態において、ナノ粒子は、３００ｎｍ以下の流体力学的直径を有する。他の実施形態において、数で少なくとも９０％のナノ粒子が動的光散乱法により測定して１０ｎｍから２００ｎｍの中に流体力学的直径を有するナノ粒子の集団が提供される。
【００１６】
本開示のナノ粒子調合薬は、オリゴフルクトース（ＯＦＳ）もさらに含むことができる。
【００１７】
本開示は、そのようなナノ粒子、そのようなナノ粒子を含む医薬組成物を製造する方法、及びそのようなナノ粒子を使用して肥満症などの代謝性障害を治療する方法も包含する。
【００１８】
本開示は、
ａ）オクチルシアノアクリレート（ＯＣＡ）を有機溶媒に溶解してモノマー溶液を形成させる工程、
ｂ）工程（ａ）からのモノマー溶液を酸性水溶液に加えて、水性相中に有機液滴のエマルションを形成させる工程、及び同時に又は連続して
ｃ）生物学的に活性なポリペプチドの水溶液を、工程（ｂ）からのエマルションに加えてモノマーの重合を起こさせる工程、及び
ｄ）有機相を蒸発させて、それによりポリペプチドを含有するポリ（オクチルアクリレート）（ＰＯＣＡ）ナノ粒子の水性懸濁液を得る工程
を含むナノ粒子を製造する方法を提供する。
【００１９】
一つの実施形態において、有機溶媒は、酢酸エチル、ジクロロメタン、及びクロロホルムからなる群から選択される。他の水と非混合性の溶媒も使用することができる。
【００２０】
一つの実施形態において、工程（ｂ）で使用される酸性水溶液を生成させるために使用される酸は、塩酸、硫酸、硝酸及びクエン酸からなる群から選択される。特定の実施形態において、使用される酸は塩酸である。
【００２１】
一つの実施形態において、工程（ｂ）で使用される水溶液のｐＨは、１〜３．５、又は２〜３．５の範囲内にある。一つの実施形態において、使用されるｐＨは約２である。
【００２２】
一つの実施形態において、工程（ｂ）の水溶液は、界面活性剤及び／又は安定剤を含む。界面活性剤は、ポロキソマー、ポリソルベート（例えばＴＷＥＥＮ（商標））界面活性剤、マクロゴールエーテル（例えばＢＲＤ（商標））界面活性剤、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）からなる群から選択されるいずれか１つであってよい。安定剤は、デキストラン、キトサン、フコイダン、ペクチン、グリコーゲン、アミラーゼ、及びアミロペクチンからなる群から選択されるいずれか１つであってよい。
【００２３】
一つの実施形態において、エマルションを中和する工程は、工程（ｃ）と（ｄ）の間に含まれる。エマルションは、水酸化ナトリウムを使用して中和することができる。
【００２４】
ポリペプチドのモノマーに対する比は、０．１から２５％ｗ／ｗの範囲内であってよい。一つの実施形態において、ポリペプチドのモノマーに対する比は１〜１０％ｗ／ｗである。
【００２５】
有機相を蒸発させることは、受動的であっても能動的であってもよい。例えば、能動的な蒸発は、熱の使用によってもよい。
【００２６】
あるいは、Liquidia Tecnologies PRINT（商標）技法などの知られた技法（ＵＳ７９７６７５９及びＷＯ２００７０２４３２３に記載された）を、本開示のナノ粒子を調合するために使用してもよい。
【００２７】
本開示の医薬組成物は、さらにオリゴフルクトース（ＯＦＳ）を含んでもよい。
【００２８】
本明細書において使用する「ナノ粒子」は、例えば、１〜１０００ｎｍなどのサブミクロンのサイズの粒子である。２００ｎｍ未満の直径を有するナノ粒子は、全身的露出のための経口投与に特に適当である。一つの実施形態において、全身的露出のための経口投与用のナノ粒子は、直径が５〜１００ｎｍである。
【００２９】
本明細書において使用する「全身的露出」は、生物学的に活性な作用剤、例えばペプチド又はタンパク質の、ＧＩ管上皮及び／又はパイエル板を通る吸収による全身系（例えば、血流）への送達を意味することを意図される。
【００３０】
ポリアルキルシアノアクリレート（ＰＡＣＡ）ナノ粒子は、生体適合性、生分解性であり、胃液シミュレート及び腸液シミュレート内で安定である。ＰＡＣＡナノ粒子は、異なる長さのアルキル鎖及び異なる粒子サイズ、並びに異なる条件及び調製方法を使用して、カプセル化された分子の放出プロファイルを変調するために使用することもできる。本発明者らは、生物学的に活性なポリペプチドを搭載したポリ（オクチルシアノアクリレート）（ＰＯＣＡ）ナノ粒子が、経口投与された場合に、ポリペプチド安定性及び活性を維持しながら、望ましい全身的薬理学的応答を提供することを示した。
【００３１】
本明細書において使用する「経口投与」は、本開示のナノ粒子及び組成物の口による投与を指す。本開示のナノ粒子及び組成物は、典型的には嚥下されて胃腸（ＧＩ）管を通って移動し、そこでそれらは腸粘膜を越えて吸収されて循環中に入り全身的に作用する。吸収は、口内（頬側口腔）及び胃で始まり得るが、通常小腸で起こる。
【００３２】
「胃腸（ＧＩ）管」は、上部ＧＩ管、即ち、口腔、咽頭、食道及び胃、及び下部ＧＩ管、即ち、小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸（盲腸、上行結腸、横向結腸、下行結腸及びＳ字結腸を含む大腸）、直腸及び肛門、並びに胆嚢、肝臓及び膵を含む。本開示のナノ粒子は、ＧＩ管の上記の区域の１つ又は複数のいずれを標的としてもよい。
【００３３】
本明細書において使用する「生物学的活性剤」という用語は、分子が、所望の標的に到達したときに、少なくともある程度の生物学的に活性であることができなければならないことを示すために使用される用語である。重複を避けるために、本明細書を通じて使用される用語「生物学的活性剤」及び用語「生物学的に活性な分子」は、同じ意味を有することを意図されて互換的に使用される。生物学的活性剤は、タンパク質、ペプチド、及びオリゴヌクレオチドを含む。「オリゴヌクレオチド」は、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡアゴニスト及びアンタゴニスト、並びにＲＮＡ及びＤＮＡアプタマーを含む。特定の実施形態において、本開示の生物学的に活性な作用剤は、「生物学的に活性なタンパク質」及び「生物学的に活性なペプチド」の両方を包含する「生物学的に活性なポリペプチド」である。一つの実施形態において、生物学的に活性なポリペプチドは、サイズが、２０ｋＤａ以下、特に１８ｋＤａ以下、１５ｋＤａ以下、１２ｋＤａ以下、又は１０ｋＤａ以下のポリペプチドである。一つの実施形態において、生物学的に活性なポリペプチドは、７０以下のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態において、生物学的に活性なポリペプチドは、代謝性ペプチドを含むか又はそれから構成される。
【００３４】
その最も広い意味における「ポリペプチド」は、ペプチド結合により接合して一緒になったアミノ酸のポリマーである。ポリペプチドは、タンパク質及びペプチドの両方を含む。
【００３５】
本明細書を通して使用される用語「タンパク質」は、少なくとも１１ｋＤａ、又は少なくとも１２ｋＤａ、又は少なくとも５０ｋＤａ、又は少なくとも１００ｋＤａ、又は少なくとも１５０ｋＤａ又は少なくとも２００ｋＤａの分子量を有するポリペプチドを含む。カプセル化のためのタンパク質は、少なくとも７０アミノ酸の長さ又は少なくとも１００アミノ酸の長さ又は少なくとも１５０アミノ酸の長さ又は少なくとも２００アミノ酸の長さなどの相当の長さであってもよい。
【００３６】
本明細書を通して使用される「ペプチド」という用語は、２個以上のアミノ酸残基を含む分子を指し、約１０ｋＤａ以下、又は約８ｋＤａ以下、又は約５ｋＤａ以下、又は約２ｋＤａ以下又は約１ｋＤａ以下又は１ｋＤａ未満の分子量を有するアミノ酸の比較的短い配列（タンパク質と比較して）を含む。一つの実施形態において、カプセル化のためのペプチドは、長さが７０アミノ酸以下又は６０アミノ酸以下、又は５０アミノ酸以下、又は４０アミノ酸以下、又は３０アミノ酸以下、又は２０アミノ酸以下又は１０アミノ酸未満である。
【００３７】
本明細書において使用される「代謝性ペプチド」は、任意の内分泌腺／神経内分泌器官から分泌される任意のエネルギー調節ホルモンである。代謝性ペプチドとして、インスリン分泌性ペプチド、インクレチン及び種々の腸ペプチドが挙げられる。例えば、代謝性ペプチドとして、ＧＬＰ−１及びエクセンジン分子を含むＧＬＰ−１アゴニスト分子、アジポネクチン、アデノモジュリン、アドロピン、アペリン、アミリン、ボンベシン、カルシトニン及びカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）、コカイン及びアンフェタミンで調節された転写物（ＣＡＲＴ）、コレシストキニン（ＣＣＫ）、デス−アシル−グレリン、エンテロスタチン、エンドテリン、ガラニン様ペプチド（ＧＡＬＰ）、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）、グリセンチン、グルカゴン、グルコース依存性インスリン分泌性ペプチド（ＧＩＰ）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、インスリン、インターメジン、レプチン、モチリン、メラノコルチンアゴニストペプチド（ΜΤＩＩ）、ニューロメジンＢ、ニューロテンシン、ニューロメジンＵ（ＮＭＵ）、オベスタチン、オレキシンＡ、オレキシンＢ、オキシントモジュリン（ＯＸＭ）、オキシトシン、下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ポリペプチド（ＰＡＣＡＰ−３８）、膵ポリペプチド（ＰＰ）、ＰＹＹ（ＰＹＹ１〜３６、ＰＹＹ３〜３６又はＰＹＹ１３〜３６）、ペプチドＷ、セクレチン、ストレスコピン、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）、ウロコルチン、血管作動性腸ペプチド（ＶＩＰ）及びキセニンが挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、代謝性ペプチドは、インスリン分泌性ペプチド(insulinotropic peptide)又はインクレチンである。一つの実施形態において、代謝性ペプチドは、ＧＬＰ−１アゴニスト、ＰＹＹ、ＮＭＵ、又はＣＣＫである。特定の実施形態において、代謝性ペプチドはエクセンジン−４である。
【００３８】
本明細書において使用する「インスリン分泌性の作用剤(insulinotropic agent)」という用語は、インスリンというホルモンの合成若しくは発現、又は活性を刺激するか若しくは刺激を惹起することができる化合物を意味する。インスリン分泌性の作用剤の知られた例として、グルコース、ＧＩＰ、ＧＬＰ−１、エクセンジン分子、及びＯＸＭが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
本明細書において使用する「インクレチン」という用語は、グルコースレベルが正常であるときに又は特にそれらが上昇したときに放出されるインスリンの量における増加を引き起こすタイプの胃腸ホルモンを意味する。それらの例として、ＧＬＰ−１、ＧＩＰ、ＯＸＭ、ＰＹＹ（例えばＰＹＹ３〜３６）、ＶＩＰ、及びＰＰが挙げられる。
【００４０】
本明細書において使用する「ＧＬＰ−１アゴニスト分子」は、ＧＬＰ−１受容体に拮抗することができる任意の分子を意味する。これらの分子として、ＧＬＰ−１、エクセンジン−３、エクセンジン−４、オキシントモジュリン、並びにそれらの断片及び／又は変種及び／又は複合体、例えば生物学的に活性なＧＬΜＬ（７〜３７）を含む、少なくとも１種のＧＬＰ−１活性を有する任意のポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、ＧＬＰ−１アゴニスト分子は、ＧＬＰ−１（７〜３７）である。一つの実施形態において、ＧＬＰ−１アゴニスト分子はＧＬＰ−１（７〜３７）Ａ８Ｇである。一つの実施形態において、ＧＬＰ−１アゴニスト分子は、ＧＬΜＬ（３〜３６）である。一つの実施形態において、ＧＬＰ−１アゴニスト分子はＧＬΜＬ（７〜３６）である。一つの実施形態において、ＧＬＰ−１アゴニスト分子は、Ｓｙｎｃｒｉａ（商標）（アルビグルチド）である。他の実施形態において、ＧＬＰ−１アゴニスト分子はＶｉｃｔｏｚａ（商標）（リラグルチド）である。
【００４１】
ＷＯ０５／０２７９７８には、作用の長引かせたプロファイルを有するＧＬＰ−１誘導体が開示されている。ＷＯ０２／４６２２７には、ＧＬＰ−１と融合したポリペプチド（例えばアルブミン）又はアナログを含む異種融合タンパク質が開示されており、そのようなＧＬＰ−１アナログは、本開示において使用することができる。ＷＯ０５／００３２９６、ＷＯ０３／０６００７１、ＷＯ０３／０５９９３４には、アミノ融合タンパク質が開示され、そこで、ＧＬＰ−１が、ホルモンの半減期を増大させることを試みるために、アルブミンと融合された。
【００４２】
国際特許出願ＷＯ９１／１１４５７(Buckley et al.)には、活性ＧＬＰ−１ペプチド７〜３４、７〜３５、７〜３６、及び７〜３７のアナログが開示されており、それらも、本開示によるＧＬＰ−１アゴニスト分子のように有用であり得る。
【００４３】
本明細書において使用する「エクセンジン分子」は、エクセンジン−３、エクセンジン−４及びエクセンジン関連分子の両方を含む。
【００４４】
本明細書において使用する「エクセンジン−４」という用語は、エクセンジン−４（１〜３９）、エクセンジン−４アナログ、エクセンジン−４ペプチドのフラグメント、エクセンジン−４誘導体又はエクセンジン−４アナログの誘導体を意味する。エクセンジン−４（１〜３９）の配列は、ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＬＳＫＱＭＥＥＥＡＶＲＬＦＩＥＷＬＫＮＧＧＰＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号：ｌ）である。
【００４５】
本開示にために有用なエクセンジン−アナログは、ＰＣＴ特許公報ＷＯ９９／２５７２８(Beeley et al.)、ＷＯ９９／２５７２７(Beeley et al.)、ＷＯ９８／０５３５１(Beeley et al.)、ＷＯ９９／４０７８８(Beeley et al.)、ＷＯ９９／０７４０４(Beeley et al)、及びＷＯ９９／４３７０８(Knudsen et al)に記載されている。一つの実施形態において、代謝性ペプチドは、エクセンジン−４、例えばＢＹＥＴＴＡ（商標）（エキセナチド）である。
【００４６】
本開示のために有用なさらなるエクセンジンアナログは、ＰＣＴ特許出願ＷＯ９９／２５７２８(Beeley et al.)、ＷＯ９９／２５７２７(Beeley et al.)、ＷＯ９８／０５３５１(Young et al.)、ＷＯ９９／４０７８８(Young et al.)、ＷＯ９９／０７４０４(Beeley et al)、及びＷＯ９９／４３７０８(Knudsen et al)に記載されている。
【００４７】
本明細書において使用する「生物学的活性剤を搭載したナノ粒子」という語句は、生物学的活性剤、例えばエクセンジン−４などの代謝性ペプチドが、ナノ粒子の表面、ナノ粒子内部のいずれか、又はナノ粒子の表面及び内部の両方に存在するナノ粒子を指す。例えば、生物学的活性剤は、重合プロセス中にナノ粒子中に組み込むことができ、例えば、生物学的活性剤を、重合媒体に溶解するか、又は重合が完結したら生物学的活性剤をナノ粒子上及びその中に収着させることによる。
【００４８】
本開示の生物学的活性剤は、安定性例えばプロテアーゼ抵抗性タンパク質を改良するために操作することができる。
【００４９】
本開示の生物学的活性剤は、半減期を増大させるために、他の作用剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合体化することもできる。
【００５０】
ある種のアミノ酸置換が「保存的」であるとみなされることは、当技術分野においてよく認識されている。アミノ酸は、側鎖の共通の性質に基づいて群に分けられ、抗原結合タンパク質の結合親和性の全て又は実質的に全てを維持する群内の置換は、保存的置換とみなされる。下記表１を参照されたい。
【表１】
2015523332.tif 000002
【００５１】
本明細書において使用する用語の「光散乱技法」は、溶液中の小さい粒子のサイズ分布プロファイルを決定するために使用される手段であり、光散乱技法の１例はナノ粒子を測定するために使用することができる動的光散乱であり、光散乱の他の例は、ミクロスフィアを測定するために使用することができる静的光散乱又は小角光散乱である。
【００５２】
本明細書において使用する用語の「動的光散乱」（ＤＬＳ）は、粒子分散液により散乱された光を利用して粒子サイズについての情報を引き出す方法である。動的光散乱は、液体懸濁液における場合、粒子のブラウン運動粒子サイズに依存すること及び粒子のブラウン運動は粒子試料から散乱された光の強度における揺らぎを生じさせるという事実に依存する。粒子直径は、これらの揺らぎを相関関数により解析することにより導かれる。次に、ストークス−アインシュタインの方程式を適用して、粒子の平均流体力学的直径を出す。多次指数関数的分析により、サイズ分布を出して、試料内の異なる種の存在についての洞察を提供することができる。ＤＬＳは、ナノ粒子の分析のために一般的に受け入れられている。
【００５３】
ナノ粒子中にカプセル化された生物学的活性剤及び／又は本開示の組成物は、少なくともある程度の生物学的活性の、例えば、ナノ粒子から例えば全身的循環中へのその放出に基づく５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を保持する。例えば、作用剤が代謝性ペプチドである場合、組成物中における作用剤の部分は、それらの標的の受容体／エフェクター分子に結合する少なくともある程度の能力を保持して、ナノ粒子から放出されたら生物学的応答を引き出す。特異的標的の受容体／エフェクターへの結合が測定される場合、そのような結合は、ＥＬＩＳＡ及びＢＩＡＣＯＲＥ（商標）を含むが、これらに限定されない適当な生物学的結合アッセイで測定することができる。一つの実施形態において、作用剤は、生物学的結合アッセイにより測定した場合、ナノ粒子からの放出に基づいて、標的へのその親和性の少なくとも５０％、又は標的へのその親和性の少なくとも７０％又は少なくとも９０％（例えば、平衡解離定数ＫＤにより測定される）を保持する。組成物は、それが投与された被験体における治療効果を引き出すことができるであろう。本開示の組成物の生物学的活性は、カプセル化された生物学的に活性な分子の活性を測定する任意の適当なアッセイにより測定することができる。例えば、生物学的に活性な分子がエクセンジン−４などの代謝性ペプチドである場合、血中グルコースレベル、食物摂取及び／又は体重における減少を測定する方法は、例えば実施例３〜５に記載したように、使用することができる。
【００５４】
本開示の方法で使用するのに適当な有機溶媒の例として、水と混合しないエステル、例えば、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ｎ−プロピル、酢酸イソブチル、酢酸ｎ−ブチル、酪酸イソブチルイソ、酢酸２−エチルヘキシル、エチレングリコールジアセテートなど、水と混合しないケトン、例えば、メチルエチルケトン、メチルイソブチルケトン、メチルイソアミルケトン、メチルｎ−アミルケトン、ジイソブチルケトンなど、水と混合しないアルデヒド、例えば、アセトアルデヒド、ｎ−ブチルアルデヒド、クロトンアルデヒド、２−エチルヘキサアルデヒド、イソブチルアルデヒド及びプロピオンアルデヒドなど、水と混合しないエーテルエステル、例えば、エチル３−エトキシプロピオネートなど、水と混合しない芳香族炭化水素、例えば、トルエン、キシレン及びベンゼンなど、水と混合しないハロ炭化水素、例えば、１，１，１−トリクロロエタンなど、水と混合しないグリコールエーテルエステル、例えば、プロピレングリコールモノメチルエーテルアセテート、エチレングリコールモノエチルエーテルアセテート、エチレングリコールモノブチルエーテルアセテート、ジエチレングリコールモノブチルエーテルアセテートなど、水と混合しないフタレート可塑剤、例えばジブチルフタレート、ジエチルフタレート、ジメチルフタレート、ジオクチルフタレート、ジオクチルテレフタレート、ブチルオクチルフタレート、ブチルベンジルフタレート、アルキルベンジルフタレートなど、水と混合しない可塑剤、例えば、ジオクチルアジペート、トリエチレングリコールジ−２−エチルヘキサノエート、トリオクチルトリメリテート、グリセリルトリアセテート、グリセリル／トリプロピオニン、２，２，４−トリメチル−ｌ，３−ペンタンジオールジイソブチレート、塩化メチレン、酢酸エチル又はジメチルスルホキシド、四塩化炭素、クロロホルム、シクロヘキサン、１，２−ジクロロエタン、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、ジメチルホルムアミド、ヘプタン、ヘキサン及び他の炭化水素、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル、ペンタン、トルエン、２，２，４−トリメチルペンタン、１−オクタノール及びその異性体又はベンジルアルコールなどが挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、有機溶媒は、酢酸エチル、ジクロロメタン、及びクロロホルムからなる群から選択される。一つの実施形態において、有機溶媒は酢酸エチルである。一つの実施形態において、有機溶媒は、水と混合しない溶媒である。
【００５５】
本開示に適当な界面活性剤の例として、コール酸ナトリウム、ポロキソマー１８８（プルロニックＦ６８（商標）、又はＦ１２７）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリソルベート８０、デキストランポロキソマー、ポロキサミン、多官能性アルコールのカルボン酸エステル、アルコキシル化されたエーテル、アルコキシル化されたエステル、アルコキシル化されたモノ、ジ及びトリグリセリド、アルコキシル化されたフェノール及びジフェノール、エトキシル化されたエーテル、エトキシル化されたエステル、エトキシル化されたトリグリセリド、ＧｅｎａｐｏｌＲ（商標）及びＢａｕｋｉＲ（商標）シリーズの物質、脂肪酸の金属塩、カルボン酸の金属塩、アルコールサルフェートの金属塩、及び脂肪族アルコールサルフェートの金属塩及びスルホスクシネートの金属塩及び前記物質の２種以上の混合物が挙げられるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、界面活性剤は、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）Ｆ６８などのポロキソマー、ポリソルベート（例えばＴＷＥＥＮ（商標））界面活性剤、マクロゴールエーテル（例えばＢＲＩＪ（商標））界面活性剤、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、及びポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）からなる群から選択される。
【００５６】
本開示における適当な安定剤の例として、デキストラン、キトサン、フコイダン、ペクチン、グリコーゲン、アミラーゼ、アミロペクチンなどの多糖類が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
イヌリンは、非消化性の発酵可能な、端部αｌ−２連結Ｄ−グルコースとβ２Ｏ１結合により接続されたｄ−フルクトース分子の鎖からなる可溶性多糖繊維である。イヌリン鎖長さは、高度に可変性であり、１０から６０個のフルクトース分子（１０から６０の重合度、即ちＤＰ）の範囲にあることができる。イヌリンは、エルサレムアーティチョーク、チコリ、タマネギ、ニンニク、及びアスパラガスを含む広い範囲の植物で見出される。オリゴフルクトース（ＯＦＳ）は、さらに分解されて中鎖及び短鎖の分子の混合物を生成したイヌリンである。幾つかの例において、より小さい蔗糖分子から酵素的に合成されて短鎖又は中鎖を形成した分子も、ＯＦＳと称される。フルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）は、さらに短いフルクトース鎖分子を一般的に指す用語であるが、それは、ＯＦＳと互換的に使用されることもある。
【００５８】
本明細書に記載した生物学的に活性なポリペプチド又はペプチドを搭載したナノ粒子の精製された製剤は、本明細書に記載したヒトの疾患、障害及び状態の治療で使用するために、医薬組成物に組み込むことができる。疾患、障害及び状態という用語は、互換的に使用される。
【００５９】
薬学的製剤は、本明細書に記載したナノ粒子を、薬学的に許容される担体との組合せで含むことができる。ナノ粒子は、単独で、又は医薬組成物の一部として投与することができる。オリゴフルクトース（ＯＦＳ）は、医薬組成物中に含ませることができる。
【００６０】
典型的には、そのような組成物は、許容される薬務により知られて必要とされる薬学的に許容される担体を含む。例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16th edition (1980) Mack Publishing Co.を参照されたい。そのような担体の例として、生理食塩水又はデキストロ−ス溶液（場合により適当な緩衝剤でｐＨを５から８の範囲内に緩衝した）などの滅菌された担体が挙げられる。
【００６１】
一つの実施形態において、本開示の医薬組成物は、経口投与されるものである。液体（溶液剤、懸濁液剤（水性又は油性）、及びエマルション剤）、半固体（ペースト）、フィルム及び固体（錠剤、ロゼンジ、カプセル剤、散剤、結晶及び顆粒剤）を含む種々の剤形が考えられる。１側面において、組成物は、肥満症治療のための体重減少飲料として市販されている飲料として投与することができる。
【００６２】
経口投与のための分散液剤は、シロップ剤、エマルション剤及び懸濁液剤であってもよい。シロップ剤は、担体として、例えば、ショ糖又はグリセリン及び／若しくはマンニトール及び／若しくはソルビトールを添加したショ糖を含むことができる。
【００６３】
懸濁液剤及びエマルション剤は、担体として、例えば、天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、又はポリビニルアルコールを含むことができる。筋肉注射のための懸濁液剤又は溶液剤は、活性な化合物と一緒に、薬学的に許容される担体、例えば滅菌水、オリーブ油、エチルオレエートを含むことができる。
【００６４】
本開示は、本開示によるナノ粒子を含む組成物、特に医薬組成物を提供する。一つの実施形態において、数で少なくとも約９０％のナノ粒子が、動的光散乱技法を使用して測定したときに、約ｌｎｍから約４００ｎｍ、又は約１ｎｍから約３００ｎｍ、又は約１ｎｍから約２８０ｎｍ、又は約ｌｎｍから約２５０ｎｍ、又は約ｌｎｍから約２００ｎｍ、又は約１ｎｍから約１５０ｎｍ、又は約１０ｎｍから約３００ｎｍ、又は約１０ｎｍから約２５０ｎｍ、又は約１００ｎｍから約３００ｎｍ、又は約４０ｎｍから約１５０ｎｍ、又は約１００ｎｍから約３００ｎｍ、又は約１００ｎｍから約２００ｎｍ、又は約１００ｎｍから約１５０ｎｍの範囲の流体力学的直径を有する。特定の実施形態において、数で少なくとも約９０％のナノ粒子のが、約１０ｎｍから約３００ｎｍの範囲内に流体力学的直径を有する。特定の実施形態において、数で少なくとも約９０％のナノ粒子が、約１０ｎｍから約２００ｎｍの範囲内に流体力学的直径を有する。特定の実施形態において、数で少なくとも約９０％のナノ粒子が、約１０ｎｍから約１５０ｎｍの範囲に流体力学的直径を有する。
【００６５】
生物学的に活性なポリペプチドを投与するために効果的な用量及び治療計画は、一般的に経験により決定され、患者の年齢、体重及び健康状態及び治療されるべき疾患又は障害などの要因に依存し得る。そのような要因は主治医の裁量内である。
【００６６】
代謝性ペプチド（例えばＧＬＰ−１、エクセンジン−４、又はＰＹＹ）の用量の範囲は、０．１ｍｇ〜１００ｍｇであってよい。
【００６７】
本開示の医薬組成物は、本明細書に記載した生物学的に活性なポリペプチドを搭載したナノ粒子の部分と他の薬剤と、場合により使用説明書と共にキット構成することができる。便宜上、キットは、試薬を所定量で使用説明書と共に含むことができる。
【００６８】
本開示のナノ粒子及び関連する医薬組成物は、中に搭載した生物学的に活性なポリペプチドによって広範囲の疾患及び状態を治療するために使用することができる。特に、代謝性ペプチドは、代謝性障害、例えば、上昇したグルコースレベルと関連する障害、糖尿病（１型又は２型又は先天性）、代謝症候群、高血糖、耐糖能異常、β細胞欠損及び肥満症などの過食により特徴づけられる又はそれに関連する疾患を治療するために使用することができる。特定の実施形態において、エクセンジン−４を搭載したナノ粒子が肥満症を治療するために使用される。
【００６９】
２種以上の代謝性ペプチドの組合せは、本開示の治療計画で投与することができる。一つの実施形態において、第１の代謝性ペプチドを含むナノ粒子の集団を、第２の代謝性ペプチドを含むナノ粒子の集団との組合せで投与することができる。例えば、肥満症を治療するために、例えばエクセンジン−４を含むナノ粒子の集団を、ＰＹＹを含むナノ粒子の集団との組合せで投与することができる。さらなる組合せは、ＮＭＵとエクセンジン−４、並びにＣＣＫとエクセンジン−４を含む。
【００７０】
本開示は、中に搭載された生物学的に活性なポリペプチドの治療的有効量を含む本開示のナノ粒子又は本開示の医薬組成物を、それらを必要とする患者に投与する工程を含む、上記の疾患を治療する方法を提供する。
【００７１】
本開示は、本明細書でリストに挙げた疾患及び障害の治療のための医薬の製造における、本明細書に記載した本開示のナノ粒子又は本明細書に記載した本開示の医薬組成物の使用も提供する。
【００７２】
「個人」、「被験体」及び「患者」という用語は、本明細書において互換的に使用される。被験体は、典型的にはヒトである。被験体は、マウス、ラット又は霊長類（例えば、マーモセット又はサル）などの哺乳動物であってもよい。被験体は、非ヒト動物であってもよい。
【００７３】
処置は、治療的、予防的(prophylactic)又は防止的(preventative)であってもよい。被験体は、それらを必要とする者である。治療を必要とするこれらの者は、将来疾患を発生するかもしれない人々に加えて、特定の医学的疾患をすでに患っている個人を含んでもよい。
【００７４】
本明細書中で、明確な及び簡潔な明細書が書かれることを可能にするように、実施形態を参照して、本開示を記載した。実施形態は、色々に組み合わせるか又は本開示から逸脱することなく別々にすることができることが意図されており、それは認識されるべきである。
【実施例】
【００７５】
実施例１：エクセンジン−４を搭載したＰＯＣＡナノ粒子の調製
ナノ粒子調製プロセスの概要：
ａ）オクチルシアノアクリレート（ＯＣＡ）を有機溶媒に溶解してモノマー溶液を形成する工程、
ｂ）モノマー溶液を、界面活性剤及び安定剤を含有する酸性水溶液に磁性攪拌下で加えて、水性相で有機液滴のエマルションを形成する工程、
ｃ）ペプチドの水溶液をエマルションに加える工程、
ｄ）重合反応の完了時にエマルションを中和する工程、
ｅ）有機相を蒸発させて、それによりペプチドを含有するポリ（オクチルシアノアクリレート）（ＰＯＣＡ）ナノ粒子の水性懸濁液を得る工程。
【００７６】
詳細な方法
ポリ（オクチルシアノアクリレート）ナノ粒子に対するエクセンジン−４の搭載。
エクセンジン−４を含有するポリ（オクチルシアノアクリレート）ナノ粒子を以下のように調製した。
有機相及び水性相の調製：
水性相：ｐＨ２．０、０．５％ｗ／ｖデキストラン、１．０％ｗ／ｖΜＬＵＲＯＮＩＣ（商標）Ｆ６８水溶液は、
８．５ｍＬのＨ２Ｏ（２Ｍ  ＨＣｌでｐＨ２．０に調節した）
１ｍＬのΜＬＵＲＯＮＩＣ（商標）Ｆ６８（１０％貯蔵溶液）
L. Mesenteroidesからの５００μｌのデキストラン（水中１０％ｗ／ｖの貯蔵溶液）
を混合することにより調製した。
溶液を２０ｍＬのガラスのシンチレーションバイアルに室温で加えて、磁性攪拌棒（１２ｍｍ×８ｍｍ、八角形）を使用して８００ｒｐｍで攪拌した。
有機相：１００ｍｇ／ｍＬ酢酸エチル中オクチルシアノアクリレート：
１００μｌのオクチルシアノアクリレート
１ｍＬの酢酸エチル
を混合することにより調製した。
【００７７】
モノマーは、他の有機溶媒（例えば、ジクロロメタン、アセトン及びテトラヒドロフラン）に溶解することもできるが、酢酸エチルが、最少の及び最も再現性のある粒子サイズを生じ、３等級溶媒としてジクロロメタンより毒性が低いことが見いだされた。
【００７８】
エマルションの形成：
ＧＩＬＳＯＮ（商標）ピペットを使用して、１ｍＬの有機相を１０ｍＬの水性相の液体の表面下にゆっくり加えた。
ペプチド溶液：水中１０ｍｇ／ｍＬのエクセンジン−４：
１ｍｇのエクセンジン−４ペプチド
１００μｌ  Ｈ２Ｏ
を混合することにより調製した
【００７９】
オクチルシアノアクリレート溶液の添加後６０分に、ＧＩＬＳＯＮ（商標）ピペットを使用して、１００μｌをエマルションに速やかに加えた。
【００８０】
ペプチドを反応液にモノマーの６０分後に加えた結果、所望の放出特性を有するナノ粒子が生じた。本発明者らは、ペプチドを反応液に任意の時点で６０分まで加えて首尾よくナノ粒子を調製したが、６０分を超える時点は調べなかった。
【００８１】
１００ｍｇのモノマー当たり１ｍｇのエクセンジン−４を加えた（即ちモノマーに対して１％ｗ／ｗのペプチド）。ペプチドを１０％ｗ／ｗまで搭載したポリ（オクチルシアノアクリレート）ナノ粒子が首尾よく調製された。
【００８２】
溶液は、カバーなしで６時間反応するに任せた。
【００８３】
溶液の中和：
ポリ（オクチルシアノアクリレート）ナノ粒子形成するオクチルシアノアクリレートの重合の６時間後、懸濁液をｐＨ６に水酸化ナトリウム（０．１Ｍ）を使用して中和した。
【００８４】
通風室中で有機相を終夜５００ｒｐｍで一定の攪拌をしながら蒸発させた。
【００８５】
ナノ粒子の精製：
ナノ粒子懸濁液を、真空濾過（焼結フィルタ−Ｎｏ３）を使用して濾過して、如何なる大きいポリマー凝集塊も除去した。濾液を回収してＶＩＶＡＳＰＩＮ（商標）２０濃縮機を使用して遠心分離により洗浄した（３００Ｋ  ＭＷＣＯ、４０００ｇで１２０分）。
【００８６】
上記の手順を使用して調製したナノ粒子を、動的光散乱を使用してキャラクタライズし、粒子サイズを測定して、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで搭載されたペプチドの量を定量した。ＰＯＣＡナノ粒子の流体力学的半径は、１００から１５０ｎｍの範囲にあり、平均は１２６ｎｍであった。ナノ粒子の多分散値は、０．０１６から０．２０８の範囲であった。これは試料における粒子サイズの範囲の広さの尺度である。
【００８７】
粒子中に搭載されたエクセンジン−４の量は、６３から１００μｇ／ｍＬの範囲であった（１００μｇ／ｍＬのペプチド投入から）。ＳＤＳ  ＰＡＧＥアッセイで使用される定量方法は約１０％までで可変であり、それ故、得られた幾つかの結果は１００μｇ／ｍＬを超えた。用量計算の目的のために、これらのバッチは１００μｇ／ｍＬのエクセンジン−４を含有すると仮定した。
【００８８】
ナノ粒子のキャラクタリゼーション：
ＤＬＳ
ナノ粒子のサイズは、Brookhaven Instruments corporationの粒子サイズ分析装置（ＢＩＣ９０ｐｌｕｓ）を使用する動的光散乱（ＤＬＳ）を使用して、メーカーにより提供された標準的手順に従って測定した。ナノ粒子懸濁液を濾過水で１０×に希釈し、標準サイズパラメータを使用してサイズを求めた（温度２５℃、レーザビーム角度９０°、レーザ波長６５８ｎｍ）。各１分間のサイズ測定実験を１０回実施することにより粒子を分析した。
【００８９】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥ
ナノ粒子中に搭載されたペプチドの量は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を使用して定量した。簡単に述べると、ナノ粒子懸濁液を、３７℃で１時間、０．１Ｍ水酸化ナトリウムと共にインキュベートし、ポリマーを解離してペプチドを放出させた。次に、試料溶液を、装填緩衝液と共に８０℃に５分間加熱した。準備した標準及び分子量マーカーと共に、試料をＮＵＰＡＧＥ（商標）ＮＯＶＥＸ（商標）４〜１２％ビストリスゲルに載せた。ゲルのリグを１×ＭＥＳ操作緩衝液中で２５分間２００Ｖ（４００ｍＡ）に調節して、タンパク質のバンドをインスタントブルーで１時間染色して可視化した。生じたバンドのデンシトメトリーを、Ｏｄｙｓｓｅｙ  ＬＩ−ＣＯＲ（商標）ゲル撮像系を使用して実施し、既知のペプチド標準を使用して試料中のペプチドを定量した。
【００９０】
実施例２：ＰＯＣＡナノ粒子の安定性
実施例１の方法により製造したＰＯＣＡナノ粒子が、カプセル化されたペプチドを胃腸管中における分解から保護する能力を、ＴＮＯ−ＴＩＭ（商標）腸モデル系に基づいて、以下のように調合された胃液シミュレート及び腸液シミュレート中でナノ粒子をインキュベートすることにより示した。
【００９１】
胃液シミュレート（ＳＧＦ）：
胃塩溶液（１０×濃縮）は、３１ｇ（＋／−０．５ｇ）の塩化ナトリウム、１１ｇ（＋／−０．２ｇ）塩化カリウム、１．５ｇ（＋／−０．０３ｇ）無水塩化カルシウムを使用して調製し、純水で合計１０２０ｇ（＋／−１０ｇ）にして、溶解した塩を確認した。
【００９２】
次に、胃塩溶液は、５１ｇ（＋／−０．５ｇ）の胃塩溶液（１０×濃縮）及び３．５８ｇ（＋／−０．０５ｇ）の１Ｍ重炭酸ナトリウムを使用して調製し、純水で５００ｍｌ（＋／−０．５ｇ）にした。
【００９３】
胃酵素溶液は、１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ５．０に酸性化した１５０ｇの胃塩溶液を使用して新たに調製した。次に、１１２５単位のリパーゼ及び１８０００単位のペプシンを、胃塩溶液に穏やかに攪拌して溶解し、溶液を氷上で貯蔵した。
【００９４】
次に、ＳＧＦは、１００ｇの胃塩溶液を１７０ｇの水道水及び３０ｇの０．１Ｍクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７）と混合することにより調製し、溶液を１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ２に酸性化した。次に、５ｇ（＋／−０．２ｇ）の胃酵素溶液を、５ｇ（＋／−０．２ｇ）の水と混合して上記混合物に加え、ｐＨを再確認した。次に、溶液を調製後直ちに使用した。
【００９５】
腸液シミュレート（ＳＩＦ）：
胆汁酸溶液は、連続して攪拌しながら、２．０ｇ（＋／−０．０２ｇ）の胆汁酸粉末を、２５０ｇ（＋／−５ｇ）の純水中に、透明な溶液が得られるまで穏やかに加えることにより調製した。
【００９６】
パンクレアチン溶液は、２．１ｇ（＋／−０．２ｇ）のパンクレアチン粉末を、１５０ｇ（＋／−３ｇ）の純水に加えることにより調製した。攪拌機を使用し、泡立ちを最少にするように注意した。均一な混合物が得られたら、溶液を３５００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、次に上清を氷上で貯蔵した。
【００９７】
小腸電解質溶液（ＳＩＥＳ）（濃縮、２５％）を、２５０ｇ（＋／−５ｇ）の塩化ナトリウム、３０ｇ（＋／−０．５ｇ）の塩化カリウム、及び１５ｇ（＋／−０．３ｇ）の無水塩化カルシウムに純水を加えて、合計を２１７４ｇにすることにより製造した。塩が溶解したら、１Ｍ水酸化ナトリウムでｐＨをｐＨ７．０（＋／−０．５）に調節した。
【００９８】
次に、４３．５（＋／−１ｇ）のＳＩＥＳ濃縮液を使用して純水に加え、合計重量を１０００ｇにしてＳＩＥＳ希釈液を調製した。
【００９９】
トリプシン溶液は、２００ｍｇ（＋／−５ｍｇ）のトリプシンを１００ｇ（＋／−２ｇ）のＳＩＥＳ希釈液に溶解することにより調製した。次に、この溶液を１．５ｍｌエッペンドルフピペット中に取って（チューブ当たり１ｍｌ）、−２０℃で凍結した。
【０１００】
次に、ＳＩＦを、２５ｇ（＋／−０．３ｇ）の胆汁酸溶液、１２．５ｇ（＋／−０．３ｇ）パンクレアチン溶液及び１２．５ｇ（＋／−０．５ｇ）のＳＩＥＳ希釈液を混合することにより調製した（比２：１：１胆汁酸／パンクレアチン／ＳＩＥＳ希釈液）。次に、溶液の即時使用の前に１ｍｌのトリプシン溶液を加えた。
【０１０１】
１５０μｇ／ｍＬのエクセンジン−４を含有する濃縮されたナノ粒子の一部を、３７℃で、胃液シミュレート又は腸液シミュレートのいずれかの中でインキュベートして、遊離ペプチドの試料と比較した。試料を種々の時点で取り出して、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを使用してペプチドを定量した。図１及び２に示すように、残存するペプチドの量をペプチドの初期量と比較した。胃液シミュレートでは（図１）、３時間後に３７％のペプチドが変化しないまま残存した。腸液シミュレートでは（図２）、２４時間後に７６％のペプチドが変化しないまま残存した。
【０１０２】
データは、２００ｎｍ未満のポリ（オクチルシアノアクリレート）ナノ粒子は、再現性よく調製することができることを示す。このサイズの粒子は、ＧＩ管を通って全身の循環中に吸収される可能性を有し、それ故これらの粒子は、ペプチドの経口送達のために使用され得る。
【０１０３】
粒子は、一貫して少なくとも６３μｇ／ｍＬのエクセンジン−４を搭載することができて、安定性の検討により、ポリマーナノ粒子は、胃液及び腸液中における酵素的分解からペプチドを保護して経口送達を可能にすることが示された。
【０１０４】
実施例３：エクセンジン−４を搭載したＰＯＣＡナノ粒子のインビボ分析（ｉ．ｖ．投与）：血中グルコースレベルの減少
【０１０５】
エクセンジン−４の血中グルコースを変調する性質を利用することにより、インビボの検討を実施して、実施例１の方法により製造されたＰＯＣＡナノ粒子からの、血流に入ったときの機能的エクセンジン−４の放出を示した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、単回のｉ．ｖ．用量のエクセンジン−４を搭載したＰＯＣＡナノ粒子（２μｇペプチド／１００μｌに相当）、カプセル化されていない（遊離）エクセンジン−４ペプチド（１μｇ／１００μｌに相当）又は対照として生理食塩水を与えた。血中グルコースレベルをモニターするために、２〜３μｌの血液試料を、各動物の末梢尾静脈から投薬前に並びに投薬後０．５、１、２、３、４及び８時間に再び採取した。各試料を、手持ち式グルコースモニター（ＢＡＹＥＲ  ＡＳＣＥＮＳＩＡ  ＢＲＥＥＺＥ２（商標））を使用して分析した。値はグルコースレベルにおけるベースラインからの変化をパーセンテージで表し、結果を図３に示す。
【０１０６】
血中グルコースレベルにおけるベースラインからの有意の減少が、エクセンジン−４のカプセル化された形態及びカプセル化されない形態を与えられた動物の両方で観察された（投薬後２時間までに約３０％の変化）。血中グルコースレベルにおけるこの減少は、ナノ粒子で治療された群では投薬後８時間まで保たれたが、カプセル化されないペプチドを与えられた群では、この時点までにグルコースレベルがベースラインに戻った。これは、ナノ粒子により送達されるペプチドからの効果の方が長く持続することを示唆し、徐放を示す。
【０１０７】
実施例４：エクセンジン−４を搭載したＰＯＣＡナノ粒子のインビボ分析（経口投与）：給餌されたマウスモデルにおける食物摂取の減少
食欲抑制に基づく食物摂取における減少を示すために、食物摂取阻害のマウスモデルで、給餌された動物と絶食させた動物の両方における検討を企てた。そのような検討において、実施例１の方法により製造されたエクセンジン−４を搭載したＰＯＣＡナノ粒子の経口投与（経管栄養）に続いて直ちに、動物に食物を提供した。ここで示されたデータは、給餌されたマウスモデルにのみ関するもので、絶食させた動物を使用する検討において為された観察を表すものではない。
【０１０８】
単独で収容された８〜１０週齢の雄Ｃ５７／ＢＬ６マウスの体重を測定して等級付けした。動物は、全郡にわたって体重の均一な分布が得られるように治療群に割り振った。明暗サイクル開始直前に、動物に、以下の処置、即ち、水（ｐ．ｏ．）、カプセル化されていない（遊離）エクセンジン−４（２０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．）、ＰＯＣＡナノ粒子（２０ｍｇ／ｋｇ  ｐ．ｏ．）中のエクセンジン−４又はカプセル化されていないエクセンジン−４（０．３ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ）の単回用量を与えた。処置直前に、全ての食物を取り除いて、測定された標準量の食事（約１００ｇ）で置き換えた。１２時間の暗サイクル後に、残存した食事の重量を記録して動物に返した。このプロセスを投薬後２４時間及び３６時間後に繰り返した。結果を図４に示し、水対照群と比較した食物摂取における減少をパーセンテージで表した。
【０１０９】
結果は、このカプセル化された形態で経口経路によりペプチドを送達する利点を明確に示す。等用量のカプセル化されていないペプチドと比較して、考慮された全ての時点で有意の食物摂取における減少があった（ｐ＝＜０．００１）。食物摂取阻害のこのレベルは、皮下投与されたペプチドに対して重要とは思われないが、モニターされた３６時間の期間にわたる応答のプロファイルは、ナノ粒子からのペプチドの徐放性放出を示唆する。
【０１１０】
実施例５：エクセンジン−４を搭載したＰＯＣＡナノ粒子のインビボ分析（経口投与）：給餌されたマウスモデルにおける食物摂取の減少及び体重−用量範囲の検討
実施例４に記載した給餌されたマウスモデルを使用した。しかしながら、この検討においては、動物に、ＰＯＣＡナノ粒子中のエクセンジン−４の２０、１０、５、２．５ｍｇ／ｋｇの単回経口用量（経管栄養）又は２０ｍｇ／ｋｇのカプセル化されていない（遊離）エクセンジン−４の単回経口用量（経管栄養）を与えた。動物の体重も投薬の２４時間後及び３６時間後に記録した。食物摂取の結果は図５に示し、体重の結果は図６に示す。
【０１１１】
上の実施例４及び再び実施例５で示したように、ＰＯＣＡナノ粒子中へのエクセンジン−４のカプセル化は、経口経路により与えられた場合に、カプセル化されていない材料よりも明かに優る保護を提供する。ここで（図５）、２０ｍｇ／ｋｇという高い用量を与えられた場合の方が、再び明かに有意に食物摂取は減少する（０〜１２時間でｐ＝＜０．００１及び１２〜２４時間及び２４〜３６時間でｐ＝＜０．０００１）。
【０１１２】
図６における結果も、エクセンジン−４を搭載したＰＯＣＡナノ粒子の単回の投薬後の体重減少は、２０ｍｇ／ｋｇを与えられたとき、投薬の２４時間後に非常に大きく、平均の体重減少は５．５％（ｐ＝＜０．０００１）、及び投薬の３６時間後で、平均体重減少は４％（ｐ＝＜０．００１）であったことを示す。有意の体重減少は、ペプチドをＰＯＣＡナノ粒子１０ｍｇ／ｋｇで投薬されたときにも２４時間後に観察された（３％、ｐ＝＜０．０１）。
【０１１３】
実施例１〜５のまとめ
ここで報告したインビボの検討は、血流に入ったときの、ＰＯＣＡナノ粒子からの機能的ペプチド、この場合はエクセンジン−４の放出を示した。さらに、これらのナノ粒子の経口投与は、給餌された及び絶食させた食物摂取阻害のマウスの両モデルにおける食物消費及び体重において、遊離エクセンジン−４と比較して有意の減少を示した。したがって、これらの例は、療法におけるペプチドを搭載したＰＯＣＡナノ粒子の経口投与による使用、特にエクセンジン−４を搭載したＰＯＣＡナノ粒子の肥満症などの代謝性障害の治療のための使用をサポートする。
【０１１４】
配列の索引
配列番号      名称
１            エクセンジン−４（１〜３９）
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年2月3日(2015.2.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリ（オクチルシアノアクリレート）を含み、生物学的に活性なポリペプチドを含む、ナノ粒子。
【請求項２】
経口投与される、請求項１に記載のナノ粒子。
【請求項３】
生物学的に活性なポリペプチドが７０個以下のアミノ酸残基を含む、請求項１又は２に記載のナノ粒子。
【請求項４】
生物学的に活性なポリペプチドが代謝性ペプチドを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項５】
代謝性ペプチドが、インスリン分泌性ペプチド又はインクレチンである、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項６】
代謝性ペプチドが、ＧＬＰ−１アゴニストペプチド、ＰＹＹ、ＮＭＵ、及びＣＣＫからなる群から選択される、請求項４に記載のナノ粒子。
【請求項７】
代謝性ペプチドがエクセンジン−４である、請求項４〜６のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項８】
ナノ粒子が３００ｎｍ以下の流体力学的直径を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のナノ粒子。
【請求項９】
数で少なくとも９０％のナノ粒子が、１０ｎｍから２００ｎｍの内に動的光散乱法により測定された流体力学的直径を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のナノ粒子を含むナノ粒子の集団。
【請求項１０】
ａ）オクチルシアノアクリレートを有機溶媒に溶解してモノマー溶液を形成する工程、
ｂ）工程（ａ）からのモノマー溶液を酸性水溶液に加えて、水性相中に有機液滴のエマルションを形成する工程、及び同時に又は連続して
ｃ）生物学的に活性なポリペプチドの水溶液を、工程（ｂ）からのエマルションに加えて、モノマーを重合させる工程、
ｄ）有機相を蒸発させて、それによりポリペプチドを含有するポリ（オクチルアクリレート）ナノ粒子の水性懸濁液を得る工程
を含むナノ粒子を製造する方法。
【請求項１１】
有機溶媒が、酢酸エチル、ジクロロメタン、及びクロロホルムからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
工程（ｂ）の水溶液が界面活性剤を含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｂ）の水溶液が安定剤を含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
界面活性剤が、ポロキソマー、ポリソルベート界面活性剤、マクロゴールエーテル界面活性剤、ポリビニルアルコール、及びポリビニルピロリドンからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
安定剤が、デキストラン、キトサン、フコイダン、ペクチン、グリコーゲン、アミラーゼ、及びアミロペクチンからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
エマルションを中和する工程が工程（ｃ）と（ｄ）の間に含まれる、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
エマルションが水酸化ナトリウムを使用して中和される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポリペプチドのモノマーに対する比が１〜１０％ｗ／ｗである、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載のナノ粒子、又は請求項１１〜１８のいずれか一項の方法により製造されたナノ粒子を含む、医薬組成物。
【請求項２０】
オリゴフルクトースをさらに含む、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
以下の代謝性障害、即ち上昇したグルコースレベルと関連する障害、糖尿病（１型又は２型又は先天性）、代謝症候群、高血糖、耐糖能異常、β細胞欠損及び過食に特徴づけられる若しくは関連する肥満症などの疾患の任意の１つ若しくは複数を治療するための、生物学的に活性なポリペプチドが代謝性ペプチドである、請求項１９または２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
肥満症を治療するための、代謝性ペプチドがエクセンジン−４である、請求項２１に記載の医薬組成物。
【国際調査報告】
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