(57)【要約】  本発明は、動物又は人間でロタウイルスに対する免疫応答を誘引するロタウイルス抗原性ポリペプチド又は抗原、前記ロタウイルスポリペプチドを含む組成物、ロタウイルスに対してワクチン免疫する方法、並びにそのような方法及び組成物で使用されるキットを提供する。本発明はさらに、ワクチンの抗原性ポリペプチドを製造するための新規な発現ベクターを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む免疫学的組成物：
（a）ロタウイルスポリペプチド又はそのフラグメントから選択される1つ以上のポリペプチド；及び
（b）医薬的に又は獣医的に許容できるビヒクル、希釈剤又は賦形剤。
【請求項２】
さらにアジュバントを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
アジュバントが水中油である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
アジュバントが、TRIGEN若しくはULTRAGEN若しくはPRIMAVANT、TS6又はLR4である、請求項２又は３に記載の組成物。
【請求項５】
ポリペプチドが、配列番号：17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69又は71に示す配列と少なくとも80％の配列同一性を有する、請求項１から３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
さらにロタウイルス以外の病源体に付随する少なくとも1つの追加抗原を含む、請求項１−３又は５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
少なくとも1つの追加抗原が、M. hyo、PCV2、PRRSV、SIV、又はブタに感染して病気若しくは病気に対する感受性を引き起こすことができる他の病源体に対する免疫応答をブタで誘引できる、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
以下の工程を含む、請求項１−３、５又は７のいずれか１項に記載の自原性組成物を製造する方法：
（a）ロタウイルスの1つ以上の型に感染していることが判明しているか又は疑われる動物から生物学的サンプルを入手する工程；
（b）感染状況が不明である場合に、該動物がロタウイルスに感染しているか否かを決定する工程；
（c）ロタウイルスの1つ以上の型に感染した動物からRNAを採集する工程；
（d）少なくとも1つのグループCロタウイルス遺伝子に相補的なプライマーを用いて逆転写酵素PCRを実施する工程；
（e）工程（d）のPCR生成物を適切な発現ベクターに挿入する工程；
（f）工程（e）で作製されたベクターを適切な宿主発現系に配置する工程；
（g）ロタウイルスポリペプチドを採集する工程；
（h）任意の追加ワクチン成分を添加し、それによってワクチン組成物を製造する工程。
【請求項９】
追加成分が、アジュバント、担体、希釈剤及びロタウイルス以外の病源体に付随する抗原から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
追加成分がTRIGEN又はULTRAGENである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
追加成分が、M. hyo、PCV2、PRRSV、SIV、又はブタに感染して病気若しくは病気に対する感受性を引き起こすことができる他の病源体に対する免疫応答をブタで誘引できる1つの抗原又は複数の抗原である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１から７のいずれか１項に記載の組成物又はベクターの少なくとも1回の投与を含む、動物をワクチン免疫する方法。
【請求項１３】
動物がブタである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ブタが、分娩前約3週から約6週の成熟雌ブタである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
得られた仔ブタが、非ワクチン免疫成熟雌ブタから得られた仔ブタと比較して有病率及び／又は死亡率の低下を示す、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願USSN61/598,624（2012年2月14日出願、前記は参照によりその全体が本明細書に含まれる）の優先権を主張する。
本発明は、概してサブユニットワクチンに関し、特に標的動物集団に感染したウイルスが発現するペプチドと遺伝的及び抗原的にほぼ同一であるように操作されたロタウイルスペプチドを含むサブユニットワクチンに関する。抗原性ペプチド又はサブユニットタンパク質を発現するプラスミドは、毒素/解毒物質選別系の手段によって細菌細胞集団で維持される。該細菌細胞は、非形質転換細胞を生存不能にする毒素タンパク質を生成し、該毒素タンパク質は、前記ペプチドを保持するプラスミドによってコードされる解毒タンパク質によって中和される。
【背景技術】
【０００２】
ロタウイルスは、幼児及び低年齢小児の重篤な下痢のもっとも一般的な原因であり（Dennehy PH, 2000）、しばしば胃インフル（stomach flu）（ただしインフルエンザとは無関係である）と称される感染を引き起こすいくつかのウイルスの1つである。ロタウイルスはレオウイルス科の二本鎖RNAウイルスの1つの属である。このウイルスには5つの種がありA、B、C、D及びEと称される（ICTV Virus Taxonomy: 2009 Release）。テーブル1は公知のロタウイルスタンパク質の要旨を提供する。ロタウイルスA（もっとも一般的である）は、ヒトで90％を超える感染を引き起こす。前記ウイルスは糞便経口ルートで伝染し、小腸に一列に並ぶ細胞に感染して損傷を与え、胃腸炎を引き起こす。人間の健康に対するその大きな影響に加えて、ロタウイルスはまた動物に感染し、家畜の病源体である（Dubovi EJ, 2010）。
例えば最近の研究によれば、ロタウイルスは、下痢を発しているブタの糞便又は腸内容物で一般的（65％）に見出された。大半の動物にただ1つのグループ（A、B、C）が感染するが、2つ以上のロタウイルスグループによる同時感染も生じる（Yoon, KJ, Epidemiology of rotaviruses, ISUVDL submissions, 2010-2011, Iowa State）。1/3近くの動物が少なくともグループCロタウイルスに感染した。これまで、ブタのロタウイルス予防はむしろ奇妙な慣行（例えば感染子ブタの組織を健康なブタの餌とする）を含んでいた。グループCロタウイルスはin vitroで増殖できないので（したがって通常の不活化/弱毒全ウイルスワクチンの製造を妨げる）、前記慣行が必要とされた。したがって、より安全でより有効な防御手段の明白で火急の要望が存在する。
【０００３】
テーブル１
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【０００４】
代替アプローチは、免疫原性ロタウイルスサブユニット蛋白質又は抗原を含むワクチンを製造することであろう。本開示を出願する時点で、発明者らは、ロタウイルス（特にグループC系統）に対してブタを免疫するために、ロタウイルスサブユニットワクチンを製造する方法（自原性であれ非自原性であれ）を記載した文献が存在しないことを認識している。以下の特許及び特許出願は、特にサブユニット系ワクチンに重点を置く従来技術のロタウイルス関連ワクチンの要旨である。
US7790178（Intervet）は三価ワクチンを記載し、前記は不活化イヌロタウイルスを含む。
US7311918及びUS6589529（Children’s Hospital Ohio）は、ヒトのワクチン免疫を意図する、VP6タンパク質フラグメントを含む組換えロタウイルス融合タンパク質を記載する。マウスのデータは、該ワクチンはVP6融合タンパク質に向けられた免疫応答を生じることを示した。
US6867353（Exploregen）は、全般的に、形質転換トマトを用いた、ヒトロタウイルス構造タンパク質をコードするcDNAフラグメントの発現を記載している。
US6716431（Wyeth, 現在はPfizer）はNSP4のまた別の形態（すなわちアミノ酸変異を生じたSNP）を記載している（前記別の形態はなお抗原性を維持するが、細胞傷害性の低下を示す）。
US6673355及びUS6210682（Baylor College of Medicine）は、ロタウイルス性疾患の予防及び／又は治療としてNSP4及びそのフラグメント（NSP4 114-135、NSP4 120-147、NSP4 112-174又はNSP4 112-150）の使用に関する。内毒素アジュバントを含む組成物もまた記載されている。US5891676及びUS5827696（Baylor）はそれぞれロタウイルスVP2及びVP7のバキュロウイルスによる発現を記載している。
US6187319（University of Mass.）は、概して、ワクチン免疫される動物以外の種に感染する第二のロタウイルスの単離VP6ポリペプチドを投与することによって第一のロタウイルスに対して動物で免疫応答を生じる方法に関する。
US5298244（University of Saskatchewan）は、VP4、VP6及びVP7を有する組立てウイルス粒子について記載する。
US20110171316（US Health and Human Service）は、組換えヒトロタウイルスグループCウイルス様粒子について記載する。
US20100047763（Goes et al.）は、診断キットで使用する、ロタウイルスタンパク質をコードするプラスミドDNAを開示する。
US5186933（Baylor College of Medicine）は、バキュロウイルス系を用いる、ロタウイルス遺伝子（特にVP3及びVP7）の発現を開示する。
上記のこれらの開示まで、大腸菌（E. coli）でロタウイルスC型抗原を発現させることによって調製された有効なブタロタウイルスサブユニットワクチンが存在しないことを発明者らは認識している。さらにまた、安全で有効なブタのワクチンを製造する方法もこれまで開示されていず、したがって、そのようなワクチンを提供することが本開示の目的である。
【０００５】
参考文献
Dennehy PH (2000). "Transmission of rotavirus and other enteric pathogens in the home". Pediatr. Infect. Dis. J. 19 (10 Suppl): S103-5. doi:10.1097/00006454-200010001-00003. PMID 11052397. 
Bernstein DI (March 2009). "Rotavirus overview". The Pediatric Infectious Disease Journal 28 (3 Suppl): S50-3.
Grimwood K, Lambert SB (February 2009). "Rotavirus vaccines: opportunities and challenges". Human Vaccines 5 (2): 57-69. PMID 18838873.
Bishop R (October 2009). "Discovery of rotavirus: Implications for child health". Journal of Gastroenterology and Hepatology 24 Suppl 3: S81-5. 
Rheingans RD, Heylen J, Giaquinto C (2006). "Economics of rotavirus gastroenteritis and vaccination in Europe: what makes sense?". Pediatr. Infect. Dis. J. 25 (1 Suppl): S48-55.
Simpson E, Wittet S, Bonilla J, Gamazina K, Cooley L, Winkler JL (2007). "Use of formative research in developing a knowledge translation approach to rotavirus vaccine introduction in developing countries". BMC Public Health 7: 281.
Edward J Dubovi; Nigel James MacLachlan (2010). Fenner's Veterinary Virology, Fourth Edition. Boston: Academic Press. p. 288. ISBN 0-12-375158-6.
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、ロタウイルスによる感染の治療及び予防のためにサブユニットワクチン及び方法を提供することである。
本発明はさらに、例えば免疫との関係で用いることができる、問題の異種タンパク質又は遺伝子の製造のための新規なベクター及びその使用に関する。具体的な実施態様では、該異種タンパク質はロタウイルスタンパク質である。より具体的な実施態様では、該タンパク質は、NSP4、VP4又はVP6から選択されるブタロタウイルスタンパク質である。別の実施態様では、ロタウイルスタンパク質はNSP4-VP4-VP6三重融合タンパク質である。
本発明の別の目的は工業的規模で用いることができ、高発現収量をもたらすという利点を有し（これは抗生物質の使用を全く欠くという事例である）、したがって小規模体積でも大規模体積でも利用することができる（例えば1−10,000リットル培養）、新規なベクターを提供することである。
【０００７】
本発明は、したがって抗生物質耐性遺伝子を一切欠く自己複製性ベクターを提供する。前記ベクターは以下を含む：（a）第一のプロモーターに機能的に連結されたccdAタンパク質をコードする配列；及び（b）第二のプロモーターに機能的に連結された異種配列。ある具体的な実施態様にしたがえば、第一のプロモーターは構成的プロモーターである。別の実施態様にしたがえば、第二のプロモーターは誘導性プロモーターであり、特に第二のプロモーターはT7プロモーターである。別の実施では、前記プロモーターはT5プロモーターである。
ある具体的な実施態様にしたがえば、異種配列はワクチン抗原をコードする。
別の特徴にしたがえば、本発明は、上記に規定のベクターを含む、ccdBタンパク質を発現する原核細胞に関する。
ある具体的な特徴にしたがえば、前記原核細胞は大腸菌である。
別の特徴にしたがえば、本発明は、以下の工程を含む、異種タンパク質を製造する方法に関する：
（a）適切な培地に、ccdBタンパク質を発現しさらに上記に規定のベクターを含む原核細胞を接種する工程；
（b）抗生物質の非存在下でそのように形質転換された細胞をファーメンター培養する工程；及び
（c）工程（b）の間に生成された異種タンパク質を上清から又は細胞ペレットから回収する工程。
ある具体的な実施態様にしたがえば、本発明は組換えロタウイルスペプチドを製造する方法に関する。
【０００８】
別の特徴にしたがえば、本発明は、以下の工程を含む、上記に規定の自己複製性ベクターを製造する方法に関する：
（a）適切な培地に、ccdBタンパク質を発現しさらに上記に規定のベクターを含む原核細胞を接種する工程；
（b）抗生物質の非存在下でそのように形質転換された細胞をファーメンター培養する工程；及び
（c）工程（b）で生成されたベクターを回収する工程。
別の特徴にしたがえば、本発明は、以下の工程を含む、上記に規定の自己複製性ベクターを構築する方法に関する：
（a）機能的な抗生物質耐性遺伝子及びccdA遺伝子を含む自己複製性ベクターから開始して；
（b）インバースPCRを実施して非抗生物質耐性遺伝子プラスミド配列を増幅する工程；
（c）該PCR生成物をリン酸化し、連結して（a）に記載のベクターの抗生物質耐性遺伝子の無いベクター型を製造する工程；
（d）ccdBタンパク質を発現する原核細胞を形質転換する工程；及び
（e）自己複製ベクターを含む原核細胞を回収する工程。
別の特徴にしたがえば、生産動物集団（ブタを含む）から生物学的サンプルが採取される。それらサンプルからRNAを採集し、ロタウイルス遺伝子特異的プライマーを用いて逆転写を実施する。続いてPCR生成物を上記に規定の自己複製性プラスミドでクローニングし、群れ特異的及び／又は地域特異的ロタウイルス遺伝子を含む新規なプラスミドでccdB発現原核細胞を形質転換する。ロタウイルスペプチドを該細胞から採集し、本発明の自原性ワクチン及び／又はコマーシャルワクチンに処方する。
【０００９】
具体的な実施態様では、該自原性ロタウイルスサブユニットワクチンはアジュバントを含む。該アジュバントは、油、エマルジョン、金属塩（例えばAl(OH)3）又は前記の組合せであり得る。ある実施態様では、アジュバントは、TRIGEN(商標)若しくはULTRAGEN(商標)若しくはPrimaVant(商標)（TRIGEN＋Quil A）、TS6（US 7,371,395（Merial）に記載されている）、LR4（US 7,691,368（Merial）に記載）、又はUS 2011-0129494 A1（Merial）に記載されている任意の処方物である。
ある実施態様では、ワクチンは、ロタウイルスVP4、VP6及びNSP4並びに腐敗防止量のホルムアルデヒド及び／又は抗菌剤を含むことができる。
本発明はさらに、ロタウイルスに対する免疫学的（又は免疫原性）応答又は防御性応答を誘発する方法、及びロタウイルス又はロタウイルスによって引き起こされる症状を予防若しくは治療する方法を提供し、前記方法は該サブユニット又は該サブユニットを含む組成物を投与する工程を含む。
本発明はまた、プラスミドの発現生成物、並びに前記発現生成物又はその発現から生じる抗体、そのような生成物及び抗体の使用、例えば診断的応用における使用に関する。
少なくとも1つのロタウイルスポリペプチド若しくはフラグメント又はその変種を含むキット、及び使用の指示もまた提供される。
これら及び他の実施態様は以下の詳細な説明に開示されるか又はそれらから明らかであり、かつそれらに含まれている。
当業者への本発明の完全かつその実行を可能にする開示（その最良の態様を含む）は、本明細書の残りの部分でより詳細に説明され、前記部分は以下の添付図面の言及を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】pStaby1.2の制限エンドヌクレアーゼマップ（供給業者が提供）を提供する；
【図２】pStaby1.2からアンピシリン耐性遺伝子の除去を模式的に示す；
【図３】pNPL1へのGST遺伝子の挿入によるpNPL2の形成を模式的に示す；
【図４】pNPL2のフランキング領域及びロタウイルス遺伝子挿入部位を示すマップである；
【図５】ドナーDNA回収技術の模式図である；
【図６】臨床サンプルから自原性ワクチン候補のロタウイルス遺伝子を単離するプロセスを模式的に示す；
【図７】ドナーDNA pNPL2を挿入してpNPL2-Rotaを得るために用いられる手順を示す模式図である；
【図８】ロタウイルスVP4、VP6及びNSP4タンパク質の発現及びサイズを確認するPAGEゲルである；
【図９Ａ】NSP4単離体のヌクレオチド及びペプチド配列アラインメントを示す（パーセント同一性の表を含む）；
【図９Ｂ】VP4単離体のヌクレオチド及びペプチド配列アラインメントを示す（パーセント同一性の表を含む）；
【図９Ｃ】VP6単離体のヌクレオチド及びペプチド配列アラインメントを示す（パーセント同一性の表を含む）；
【図１０】ワクチン有効性実験の総合的な血清反応結果を示すグラフである；
【図１１】ELISAにより測定したVP4、VP6及びNSP4特異的血清反応を示すグラフである；
【図１２】ロタC NSP4-VP4-VP6三重融合タンパク質の発現を確認するPAGEゲルである。Lはラダー、1は誘導前（OD=0.6）、2は非誘導培養（OD=1.5）、3は誘導培養（OD=1.5）；
【図１３】融合タンパク質の発現を確認するウェスタンブロット（左）及びPAGEゲル（右）である。Lはラダー、1はBSA 1.5μg、2は融合タンパク質の1：20稀釈、3は融合タンパク質の1：40希釈、4はGST 0.5μg。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明は、動物において免疫学的応答を誘引するロタウイルスサブユニット、特にブタで応答を誘引、誘導又は刺激するロタウイルスサブユニットを包含する（本明細書ではロタウイルスサブユニットは、例えばロタウイルスポリペプチド、タンパク質、抗原、エピトープ又は免疫原と定義される）。問題の具体的なロタウイルスサブユニットはVP4、VP6及びNSP4、特にグループCロタウイルス感染ブタに由来する核酸配列によってコードされるものである。これらの抗原のいずれかの前駆体を本発明の実施に用いることができることは理解されよう。
ある実施態様では、本発明は、感染ブタ由来のロタウイルス配列を増幅し、周知の分子技術を用いて前記増幅配列を発現ベクターに配置する方法を提供する。具体的な実施態様では、増幅は、ロタウイルス遺伝子の高度に保存された領域に相補的なプライマーを用いるPCRによって達成され、したがって、極めて多様なロタウイルス株由来の遺伝子を同じプライマーを用いて増幅できる。ある実施態様では、プライマーは、VP4、VP6及び／又はNSP4をコードするロタウイルス核酸配列と相補的であり、配列番号：8−13に示す配列を有する。
【００１２】
別の特徴では、本発明は発現ベクターを作製する方法を提供し、前記ベクターは、解毒物質遺伝子を含み、これを原核細胞宿主で発現する。この解毒物質遺伝子はタンパク質毒素を発現する細菌細胞に生存能力を付与する。ある実施態様では、該解毒物質はccdAであり、該毒素はccdBである。
別の特徴では、この新規なロタウイルス配列は、サブユニットワクチンの処方で用いるために、ロタウイルスサブユニットを生成できるように該発現ベクターに配置される。
ある実施態様では、サブユニットワクチンはさらにアジュバントを含む。具体的な実施態様では、アジュバントは水中油アジュバントである。いくつかの実施態様では、アジュバントはTRIGEN、 ULTRAGEN、PrimaVant、TS6、LR4又はその組合せである。ある実施態様では、ワクチンはさらにアジュバント量のアルミニウム塩を含む。他のアジュバント化合物（サポニン及び水酸化アルミニウムが含まれるが、ただし前記に限定されない）もまた該サブユニットワクチンに添加できる。これらの追加的アジュバント化合物は、ワクチンの保存安定性、有効性、又はその両方を改善できる。
別の特徴では、本発明は、仔ブタにロタウイルスに対する防御免疫を提供する方法を提供し、前記方法は本発明のサブユニットワクチンを成熟雌ブタ及び若雌ブタ（分娩前）に投与する工程を含む。
【００１３】
表1：ベクターの構築及び遺伝子のクローニングで用いられるプライマー一覧
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【００１４】
本発明の抗原性ポリペプチド又はタンパク質はロタウイルスを防御することができる。すなわち、それらは、動物で免疫応答を刺激することができる。“抗原”又は“免疫原”とは、宿主動物で特異的な免疫応答を誘導する物質を意味する。該抗原は、全生物（死滅、弱毒又は生）；生物のサブユニット又は部分；免疫原性特性を有する挿入物を含む組換えベクター；宿主動物への提示に際して免疫応答を誘導できるDNA片又はフラグメント；ポリペプチド、エピトープ、ハプテン、又は前記の任意の組合せを含むことができる。或いはまた、該免疫原又は抗原は毒素又は抗毒素を含むことができる。
“タンパク質”、“ペプチド”、“ポリペプチド”及び“ポリペプチドフラグメント”は本明細書では互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸残基ポリマーを指す。該ポリマーは直鎖状でも分枝状でもよく、改変アミノ酸又はアミノ酸アナローグを含むことができ、さらにアミノ酸以外の化学的部分によって中断されてあってもよい。該用語はまた、天然に又は介入により改変されてあるアミノ酸ポリマーを含むことができ、前記介入は例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは改変、例えば標識又は生物活性成分との結合である。
【００１５】
本明細書で用いられる“免疫原性又は抗原性ポリペプチド”という用語は、宿主に投与されると、当該タンパク質に対抗する液性及び／又は細胞性タイプの免疫応答を惹起することができるという意味で免疫学的に活性なポリペプチドを含む。好ましくは、該タンパク質フラグメントとは、それが完全なタンパク質と実質的に同じ免疫学的活性を有するものである。したがって、本発明のタンパク質フラグメントは、少なくとも1つのエピトープ又は抗原決定基を含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成る。本明細書で用いられる“免疫原性”タンパク質又はポリペプチドには、該タンパク質の完全長配列、そのアナローグ又はその免疫学的フラグメントが含まれる。“免疫原性フラグメント”とはあるタンパク質のフラグメントであって、前記は1つ以上のエピトープを含み、したがって上記に記載の免疫学的応答を生じさせるフラグメントを意味する。そのようなフラグメントは、当業界で周知の多数のエピトープマッピング技術によって同定できる。例えば以下を参照されたい：Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66（Glenn E. Morris, Ed., 1996）。例えば、線状エピトープは、例えば固相上で多数のペプチド（該タンパク質分子の部分に対応する）を同時に合成し、当該ペプチドが該固相になお結合している間に抗体と該ペプチドを反応させることによって決定することができる。そのような技術は当業界で公知であり、例えば以下に記載されている：米国特許第4,708,871号；Geysen et al., 1984；Geysen et al., 1986。同様に立体的エピトープは、アミノ酸の立体配座を例えばX線結晶学及び二次元核磁気共鳴によって決定することによって容易に同定される。例えば上掲書（Epitope Mapping Protocols）を参照されたい。T.パルバ（T. parva）のタンパク質に特に応用可能な方法は、PCT/US2004/022605に完全に記載されている（前記文献は参照によりその全体が本明細書に含まれる）。
【００１６】
本明細書で考察するように、本発明は、抗原性ポリペプチドの活性なフラグメント及びその変種を包含する。したがって、“免疫原性又は抗原性ポリペプチド”にはさらに、当該ポリペプチドが機能して本明細書に規定の免疫学的応答を生じる限り、当該配列に対する欠失、付加及び置換が想定される。“保存的変種”は、あるアミノ酸残基の別の生物学的に類似する残基による入れ替え、又はコードアミノ酸残基が変化しないか若しくは別の生物学的に類似の残基であるような当該核酸配列内のヌクレオチドの入れ替えを指す。これに関しては、特に好ましい置換は一般的には性質が保存的である、すなわち、あるファミリーのアミノ酸内で生じる置換であろう。例えば、アミノ酸は一般的には以下の4つのファミリーに分割される：（1）酸性：アスパラギン酸及びグルタミン酸；（2）塩基性：リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；及び（4）非荷電極性：グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンは時には芳香族アミノ酸として分類される。保存的変異の例には以下が含まれる：ある疎水性残基（例えばイソロイシン、バリン、ロイシン又はメチオニン）による別の疎水性残基の置換、又はある極性残基による別の極性残基の置換（例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換、又はグルタミンによるアスパラギンの置換など）；又は、生物学的活性に大きな影響をもたない、あるアミノ酸の構造的に関連するアミノ酸による入れ替え。参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、該タンパク質の免疫原性に実質的に影響を及ぼさない小さなアミノ酸置換を有するタンパク質は、したがって参照ポリペプチドの定義内に入る。これらの改変によって生じるポリペプチドはいずれもここに含められる。“保存的変異”という用語はまた、未置換親アミノ酸の代わりの置換アミノ酸の使用を含むが、ただし該置換ポリペプチドに対して生じた抗体がまた該未置換ポリペプチドと免疫反応することを条件とする。
【００１７】
“エピトープ”という用語は、特異的B細胞及び／又はT細胞が応答する、抗原又はハプテン上の部位を指す。前記用語はまた、“抗原決定基”又は“抗原性決定部位”と互換的に用いられる。同じエピトープを認識する抗体は、ある抗体が別の抗体の標的抗原への結合を阻止する能力を示す簡単な免疫アッセイで同定できる。
ある組成物又はワクチンとの“免疫学的応答”は、問題の組成物又はワクチンに対する宿主の細胞性及び／又は抗体媒介免疫応答の発生である。通常は、“免疫学的応答”には以下の１つ以上の作用が含まれる（ただしこれらに限定されない）：問題の組成物又はワクチンに含まれる1つの抗原又は複数の抗原に特異的に向けられる、抗体、B細胞、ヘルパーT細胞及び／又は細胞傷害性T細胞の産生。好ましくは、宿主は治療的又は防御的な免疫学的応答を示し、したがって、新規な感染に対する耐性が強化されるか、及び／又は疾患の臨床的重篤性が軽減されるであろう。そのような防御は、感染宿主によって通常示される症候群及び／又は臨床的徴候の軽減又は欠如、より短い回復期間、及び／又は感染宿主のウイルス力価の低下によって提示されるであろう。
【００１８】
“動物”とは哺乳動物、鳥類などを意図する。本明細書で用いられる動物又は宿主には哺乳動物及び人間が含まれる。動物は、ウマ科の動物（例えばウマ）、イヌ科の動物（例えばイヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル）、ネコ科の動物（例えばライオン、トラ、家ネコ、野生ネコ、他の大型のネコ、及びネコ科動物（チーター、オオヤマネコを含む））、ヒツジ科の動物（例えばヒツジ）、ウシ科の動物（例えばウシ）、ブタ科の動物（例えばブタ）、トリ（例えばニワトリ、アヒル、カモ、シチメンチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミュ及びヒクイドリ）、霊長類（例えばキツネザル、メガネザル、サル、テナガザル、ヒヒ）、フェレット、アザラシ及び魚類から成る群から選択できる。“動物”という用語はまた、全発育段階（新生児期、胚性期及び胎生期を含む）の個々の動物を含む。
特段の説明がなければ、本明細書で用いられる全ての技術用語及び学術用語は、本開示が属する業界の業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。単数形の用語、“a”、“an”及び“the”は、文脈が明瞭にそうでないことを示さないかぎり複数の同一語を含む。同様に“or”という単語は、文脈が明らかにそうでないことを示さないかぎり“and”を含む。
本開示及び特に特許請求の範囲及び／又はパラグラフでは、例えば“comprises”、“comprised”、“comprising”（含む）などの用語は、米国特許法で前記に帰せられる意味を有することができる。例えば、それらは“includes”、“included”、“including”（含む）などの意味を有することができ、さらに例えば“consisting essentially of”及び“consists essentially of”(本質的に〜から成る)という用語は、米国特許法でそれらに割り当てられた意味を有する。例えば、それら用語は明確に列挙されなかった成分を許容するが、従来技術で見出される成分又は発明の基本的又は新規な特徴に影響を与える成分は排除する。
【００１９】
組成物
本発明はロタウイルスワクチン又は組成物に関し、前記ロタウイルスワクチン又は組成物は、ロタウイルスポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原、及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを含むことができる。該ロタウイルスポリペプチド、タンパク質、抗原、エピトープ又は免疫原は、任意のロタウイルスポリペプチド、タンパク質、抗原、エピトープ又は免疫原、例えば動物で応答を引き起こし、誘発し又は刺激するタンパク質、ペプチド又はそのフラグメントであり得るが、ただしこれらに限定されない。
本発明はロタウイルスワクチン又は組成物に関し、前記ロタウイルスワクチン又は組成物は、ロタウイルスVP1、VP2、VP3、VP4、NSP1、VP6、NSP3、NSP2、VP7、NSP4、NSP5又はNSP6ポリペプチド、及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを含むことができる。ある実施態様では、発現ベクターはさらに、VP4、VP6又はNSP4ポリペプチド又は前記の組合せをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。ある具体的な実施態様では、該ポリヌクレオチドは、配列番号：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72に示す配列又はその組合せを含む。
別の実施態様では、該医薬的又は獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルは油中水エマルジョンであり得る。さらにまた別の実施態様では、該油中水エマルジョンは水/油/水（W/O/W）三重エマルジョンであり得る。
【００２０】
ある実施態様では、該ロタウイルスポリペプチド、抗原又はそのフラグメント若しくは変種は、ロタウイルスポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種を含む。この実施態様のある特徴では、該ロタウイルスポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種は、ロタウイルス遺伝子によって生成される組換えポリペプチドである。この実施態様の別の特徴では、該ロタウイルス遺伝子は、配列番号：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72に示す配列と少なくとも70％の同一性を有する、又はそれらの組合せである。この実施態様の別の特徴では、該ロタウイルスポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種は、配列番号：17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69又は71に示す配列と少なくとも80％の同一性を有し、ここで、該ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種は同じ機能的役割を有する（すなわち、該ポリペプチドは、グループCロタウイルスの異なる株に属するVP4、VP6又はNSP4ポリペプチドである）。
【００２１】
合成抗原、例えばポリエピトープ、フランキングエピトープ及び他の組換え体又は合成誘導抗原もまた本定義に含まれる。例えば以下を参照されたい：Bergmann et al., 1993；Bergmann et al., 1996；Suhrbier, 1997；Gardner et al., 1998。本発明の目的のための免疫原性フラグメントは、通常は該分子の約3アミノ酸、少なくとも約5アミノ酸、少なくとも約10−15アミノ酸、又は約15−25アミノ酸、又はそれより大きいアミノ酸を含むであろう。該フラグメントの長さに決定的な上限は存在せず、該タンパク質のほぼ完全長又は該タンパク質の少なくとも1つのエピトープを含む融合タンパク質すら含むことができよう。
したがって、エピトープを発現するポリヌクレオチドの最小構造は、ロタウイルスポリペプチドのエピトープ又は抗原決定基をコードするヌクレオチドを含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成るものである。ロタウイルスポリペプチドのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、該ポリペプチドをコードする配列の連続する又は隣接する、最小限15ヌクレオチド、約30−45ヌクレオチド、約45−75又は少なくとも57，87又は150を含むか、又は本質的に前記から成るか、又は前記から成る。エピトープ決定手順、例えばオーバーラップペプチドライブラリーの作製（Hemmer et al., 1998）、ペプスキャン（Geysen et al., 1984；Geysen et al., 1985；Van der Zee R. et al., 1989；Geysen, 1990；Multipin.RTM. Peptide Synthesis Kits de Chiron）及びアルゴリズム（De Groot et al., 1999；PCT/US2004/022605）を本発明の実施で用いることができる。
【００２２】
“核酸”及び“ポリヌクレオチド”という用語はRNA又はDNAを指し、直鎖状若しくは分枝状であるか、単鎖若しくは二本鎖であるか、又はそのハイブリッドである。前記用語はまたRNA/DNAハイブリッドを包含する。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子フラグメント、エクソン、イントロン、mRNA、tRNA、rRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ及びプライマー。ポリヌクレオチドは改変ヌクレオチド（例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナローグ）、ウラシル、他の糖及び連結基（例えばフルオロリボース及びチオレート）、並びにヌクレオチド分枝を含むことができる。ヌクレオチドの配列はポリマー形成後に、標識成分により（例えば複合物形成によって）さらに改変され得る。この定義に含まれる他の改変タイプは、キャップ、1つ以上の天然に存在するヌクレオチドのアナローグによる置換、及びポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド又は固相と結合させる手段の導入である。ポリヌクレオチドは化学合成によって入手するか、又は微生物から誘導することができる。
“遺伝子”という用語は、生物学的機能と密接に関係するポリヌクレオチドの任意のセグメントを指すために広く用いられる。したがって、遺伝子は、ゲノム配列におけるイントロン及びエクソン、又はcDNAにおける単なるコード配列、及び／又はそれらの発現に必要な調節配列を含む。例えば、遺伝子はまた、mRNA又は機能的RNAを発現するか、又は特異的タンパク質をコードする核酸フラグメントを指し、遺伝子には調節配列が含まれる。
【００２３】
本発明はさらに、ロタウイルス抗原、エピトープ又は免疫原をコードするポリヌクレオチドに対する相補鎖を含む。該相補鎖はポリマーで任意の長さを有することができ、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及びアナローグを任意の組み合わせで含むことができる。
“単離された”生物学的成分（例えば核酸又はタンパク質又は細胞内小器官）は、当該成分が天然に存在する当該生物の細胞内の他の生物学的成分（例えば他の染色体及び染色体外DNA及びRNA、タンパク質並びに細胞内小器官）から実質的に分離されてあるか、又は精製されてある成分を指す。“単離”された核酸及びタンパク質には標準的な精製方法によって精製された核酸及びタンパク質が含まれる。前記用語はまた、組み換え技術の他に化学合成によって調製された核酸及びタンパク質を包含する。
本明細書で用いられる“精製された”という用語は完璧な純度を必要とせず、前記は相対的用語である。したがって、例えば部分的に精製されたポリペプチド調製物は、当該ポリペプチドがその天然の環境にあるよりも当該ポリペプチドがより濃縮されている調製物である。それは、当該ポリペプチドが細胞成分から分離されているということである。“実質的に精製される”とは、細胞成分又は細胞物質の少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、又は少なくとも98％又は前記以上が除去されてあることが意図される。同様に、ポリペプチドも部分的に精製され得る。“部分的に精製される”とは、細胞成分又は細胞物質の60％未満が除去されることが意図される。同じことがポリヌクレオチドに適用される。本明細書に開示のポリペプチドは当業界で公知の任意の手段によって精製できる。
【００２４】
さらにまた、ロタウイルスのホモローグが本発明の範囲内に入ることが意図される。本明細書で用いられるように、“ホモローグ”という用語には、オルトローグ、アナローグ及びパラローグが含まれる。“アナローグ”という用語は、同じ又は類似の機能を有するが無関係の生物で別個に進化してきた2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。“オルトローグ”という用語は、異なる種に由来する2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを指すが、ただしそれらは共通の先祖遺伝子から種形成によって進化してきた。通常は、オルトローグは同じ又は類似の機能を有するポリペプチドをコードする。“パラローグ”という用語は、ゲノム内の複製によって関係を有する2つのポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。パラローグは、通常は異なる機能を有するが、これらに機能は関連する。例えば、野生型ロタウイルスポリペプチドのアナローグ、オルトローグ及びパラローグは、翻訳後修飾によって、アミノ酸の配列相違によって、又はその両方によって野生型ロタウイルスポリペプチドと相違し得る。特に、本発明のホモローグは、概して野生型ロタウイルスポリペプチドの全部又は部分と少なくとも85−90％、90−95％又は95％、96％、97％、98％、99％の配列同一性を示し、さらに類似の機能を示すであろう。
【００２５】
別の特徴では、本発明は、配列番号：17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69又は71に示す配列を有するポリペプチドと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。さらにまた別の特徴では、本発明は、上記同定のロタウイルス（配列番号：17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69又は71）のフラグメント及び変種を提供する（前記を当業者は分子生物学的技術を用いて容易に調製できる）。
変種及びホモローグポリペプチドは、配列番号：17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69又は71に示すアミノ酸配列と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％又は99％同一性のアミノ酸配列を有する。
変種には対立遺伝子変種が含まれる。“対立遺伝子変種”という用語は、タンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらし、かつ天然の集団（例えばウイルスの種又は系統）内に存在する多形性を含むポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。そのような天然の対立遺伝子変種は、ポリヌクレオチド又はポリペプチドに典型的には1−5％の多様性をもたらすことができる。対立遺伝子変種は、多数の異なる種で問題の核酸配列を配列決定することによって同定できる（前記は、それらの種で同じ遺伝子の遺伝子座を同定するハイブリダイゼーションプローブを用いることによって容易に実施することができる）。そのような核酸変異体及びその結果のアミノ酸多形性、又は天然の対立遺伝子変異の結果であり問題の遺伝子の機能的活性を変化させない変異体のいずれか及びいずれも、本発明の範囲内に入ることが意図される。
【００２６】
本明細書で用いられるように、“誘導体”又は“変種”という用語はポリペプチド又はポリペプチドをコードする核酸を指し、前記は、（1）野生型ポリペプチドと比較したとき対応するポリペプチドが実質的に等価の機能を有するか、又は（2）当該ポリペプチドに対して作製した抗体が該野生型ポリペプチドと免疫反応するように、1つ以上の保存的アミノ酸変異又は他のマイナーな改変を有する。これらの変種又は誘導体には、ロタウイルスポリペプチドの一次アミノ酸配列のマイナーな改変を有するポリペプチドが含まれる（前記マイナーな改変は、未改変の対応ポリペプチドと比較したとき実質的に等価の活性を有するペプチドを生じ得る）。“変種”という用語はさらに、当該配列への欠失、付加及び置換を意図するが、ただし前記ポリペプチドが機能して本明細書に規定の免疫学的応答を生じることを条件とする。
“保存的変種”という用語は、あるアミノ酸残基の別の生物学的に類似する残基による入れ替え、又はコードアミノ酸残基が変化しないか若しくは別の生物学的に類似する残基であるような核酸配列内のヌクレオチドの入れ替えを指す。これに関しては、特に好ましい置換は一般的には上記に記載のように性質が保存的であろう。
【００２７】
ロタウイルスポリペプチドの免疫原性フラグメントは、配列番号：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72に示す配列を有するロタウイルスポリペプチド又はその変種若しくは機能的フラグメントの少なくとも8、10、13、14、15又は20の連続するアミノ酸、少なくとも21アミノ酸、少なくとも23アミノ酸、少なくとも25アミノ酸、又は少なくとも30アミノ酸を含む。
別の特徴では、本発明は、ロタウイルスポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば配列番号：配列番号：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72に示す配列を有するロタウイルスポリペプチド又はその変種若しくは機能的フラグメントをコードするポリヌクレオチドを提供する。さらにまた別の特徴では、本発明は、配列番号：16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72に示す配列を有するロタウイルスポリペプチド、又は保存的変種、対立遺伝子変種、ホモローグ若しくは免疫原性フラグメント（これらポリペプチドの1つの少なくとも8又は少なくとも10の連続するアミノ酸を含む）、若しくはこれらポリペプチドの組合せと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２８】
別の特徴では、本発明は、配列番号：17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69又は71に示すヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、又はその変種若しくは機能的フラグメントを提供する。さらに別の特徴では、本発明は、配列番号：17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69又は71に示す配列を有するポリヌクレオチドの1つ又はその変種と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、96％、97％、98％又は99％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを提供する。
本開示のポリヌクレオチドは、遺伝暗号の結果、例えばある特定の宿主のための最適化コドン使用としての縮退である配列を含む。本明細書で用いられるように、“最適化”は、与えられた種におけるその発現を高めるように遺伝的に操作されたポリペプチドを指す。ロタウイルスポリペプチドをコードする最適化ポリヌクレオチドを提供するために、ロタウイルス遺伝子のDNA配列は以下のように改変できる：（1）特定の宿主発現系（例えば細菌宿主細胞）で高度に発現される遺伝子によって優先されるコドンを含む；（2）前記宿主細胞で実質的に見出されるヌクレオチド塩基組成のA＋T又はG+C含量を含む；（3）前記宿主細胞の開始配列を形成する；又は（4）RNAの脱安定化、分解及び停止を引き起こすか、又は二次構造ヘアピンを形成する配列を排除する。前記宿主細胞発現系でのロタウイルスタンパク質の発現増加は、原核細胞のコドン使用の分布頻度を利用することによって達成できる。
【００２９】
2つのアミノ酸配列間の配列同一性は、NCBI（National Center for Biotechnology Information）ペアワイズブラスト及びblosum6マトリックスで標準的パラメーターを用いて決定できる（例えばNCBI（“National Center for Biotechnology Information”(NCBI, Bethesda, Md., USA)サーバー及びAltschuらの著書（したがってこの著書はBLAST又は BLASTX及びBLOSUM62マトリックスの“blasts”という用語による使用について記述する）で利用できるBLAST又はBLASTXアルゴリズムを参照されたい）。
配列に関する“同一性”は、同一のヌクレオチド又はアミノ酸を有する位置の数を2つの配列の短い方のヌクレオチド又はアミノ酸の数で割ったものを指し、ここで前記2つの配列のアラインメントは、ウィルバーとリップマンのアルゴリズム（Wilbur and Lipman）にしたがい、例えばウィンドウサイズ20ヌクレオチド、ワード長4ヌクレオチド及びギャップペナルティー4並びにコンピューター支援分析を用いて決定できる。アラインメントを含む配列データの解釈は、市場で利用可能なプログラム（例えばIntelligeneticsTM Suite, Intelligenetics Inc. CA）を便利に用いて実施できる。RNA配列が、DNA配列と類似する、又はある程度の配列同一性若しくは相同性を有するというとき、DNA配列中のチミジン（T）はRNA配列中のウラシル（U）と等しいとみなされる。したがって、RNA配列は本発明の範囲内にあり、DNA配列中のチミジン（T）をRNA配列中のウラシル（U）と等しいと考えることによってDNA配列から誘導することができる。
【００３０】
2つのアミノ酸配列の配列同一性又は配列類似性、又は2つのヌクレオチド配列間の配列同一性はベクターNTIソフトウェアパッケージ（Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA）を用いて決定できる。
以下の著書は配列の相対的同一性又は相同性を比較するアルゴリズムを提供し、さらに上記に加えて又は上記の代替として、これら文献の教示を用いパーセント相同性又は同一性を決定できる：Needleman SB and Wunsch CD；Smith TF and Waterman MS；Smith TF, Waterman MS and Sadler JR；Feng DF and Dolittle RF；Higgins DG and Sharp PM；Thompson JD, Higgins DG and Gibson TJ；及びDevereux J, Haeberlie P and Smithies O。さらに、煩雑な実験を行うことなく、パーセント相同性を決定するために当業者は多くの他のプログラム又は参考文献を利用することができる。
ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの増加が周知である、種々の“ストリンジェンシー”条件の条件下でハイブリダイゼーション反応を実施できる。例えば以下を参照されたい：“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”（第二版）(Sambrook et al., 1989)。
【００３１】
本発明はさらに、ベクター分子又は発現ベクターに含まれ、プロモーター成分及び場合によってエンハンサーに作動できるように連結されたロタウイルスポリヌクレオチドを包含する。
“ベクター”は、標的細胞にin vitro又はin vivoでデリバーされるべき異種ポリヌクレオチドを含む、組換えDNA又はRNAプラスミド又はウイルスを指す。該異種ポリヌクレオチドは、本発明の目的又は治療のために問題の配列を含むことができ、場合によって発現カセットの形態であり得る。本明細書で用いられるように、ベクターは最終標的細胞又は対象動物で複製できないことが要求される。前記用語はクローニングベクター及びウイルスベクターを含む。
“組換え体”という用語は半合成又は合成起源のポリヌクレオチドを意味し、それらは天然には存在しないか、又は天然には見出されないアレンジメントで別のポリヌクレオチドと連結される。
“異種”は、比較されている存在物の残りの部分と遺伝的に別個の存在物に由来することを意味する。例えば、あるポリヌクレオチドは、異なる供給源に由来するプラスミド又はベクター中に遺伝子操作技術によって配置することができ、前記ポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである。その本来のコード配列から取り出され、本来の配列以外のコード配列に作動的に連結されたプロモーターは異種プロモーターである。
【００３２】
本発明のポリヌクレオチドは、追加の配列、例えば同じ転写ユニット内の追加のコード配列、制御エレメント、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、5’UTR、3’UTR、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位、同じ又は異なるプロモーター制御下の追加の転写ユニット、クローニング、発現、相同組換え及び宿主細胞の形質転換を可能にする配列、並びに本発明の実施態様を提供するために所望され得る任意の構築物を含むことができる。
ロタウイルスポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原の発現のためのエレメントが有利には本発明のベクターに存在する。最小限の態様として、前記は開始コドン（ATG）、停止コドン及びプロモーター、並びに場合によってある種のベクター（例えばプラスミド）及びある種のウイルスベクター（例えばポックスウイルス以外のウイルスベクター）のためのポリアデニル化配列を含む。該ポリヌクレオチドがポリペプチドフラグメント（例えばロタウイルスポリペプチド）をコードするとき、有利には該ベクターでは、ATGはリーディングフレームの5’に配置され、停止コドンは3’に配置される。発現制御のための他のエレメント、例えばエンハンサー配列、安定化配列（例えばイントロン）及び該タンパク質の分泌を許容するシグナル配列も存在し得る。
【００３３】
本発明はまたベクター（例えば発現ベクター）を含む調製物、例えば治療用組成物に関する。該調製物は、1つ以上のベクター、例えば発現ベクター、例えばin vivo発現ベクターを含み、該ベクターは、1つ以上のロタウイルスポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原を含み、それらを発現する。ある実施態様では、該ベクターは、ロタウイルス抗原、エピトープ又は免疫原をコードし及び／又は発現するポリヌクレオチドを、医薬的又は獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクル中に含むポリヌクレオチドを含み、これを発現する。したがって、本発明の実施態様にしたがえば、該調製物中の他のベクターは、適切な環境下でロタウイルスポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原の1つ以上の他のタンパク質（例えばヘマグルチニン、キャプシド、ニュートラミニダーゼ、核タンパク質、非構造タンパク質、エンテロトキシン）又はそのフラグメントをコードし、発現するポリヌクレオチドを含むか、本質的に前記から成るか、又は前記から成る。
【００３４】
別の実施態様にしたがえば、該調製物中の該1つのベクター又は複数のベクターは、ロタウイルスポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原の1つ以上のタンパク質又はフラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むか、又は本質的に前記から成るか、又は前記から成る。別の実施態様では、該調製物は1つ、2つ又は3つ以上のベクターを含み、該ベクターは、ロタウイルスポリペプチド、抗原、融合タンパク質又はそのエピトープをコードし発現する（有利にはin vivoで）ポリヌクレオチドを含む。本発明はまた、種々のロタウイルスポリペプチド、抗原、エピトープ、融合タンパク質又は免疫原、例えば異なる種（例えばヒト、ブタ、乳牛又はウシ、イヌ、ネコ及びトリであるがただしこれらに限定されない）のロタウイルスポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原をコードし発現するポリヌクレオチドを含むベクターの混合物を目的とする。
本発明のさらに別の実施態様にしたがえば、該発現ベクターは、プラスミドベクター、特にin vivo発現ベクターである。ある具体的な非限定的な例では、pVR1020又は1012プラスミド（VICAL Inc.；Luke et al., 1997；Hartikka et al., 1996、例えば米国特許第5,846,946号及び6,451,769号を参照されたい）をポリヌクレオチド配列の挿入のためのベクターとして利用することができる。pVR1020プラスミドはpVR1012に由来し、ヒトtPAシグナル配列を含む。ある実施態様では、ヒトtPAシグナルは、Genbankのアミノ酸M(1)からアミノ酸S(23)（アクセッション番号HUMTPA14）を含む。別の具体的な非限定的な例では、ポリヌクレオチド配列挿入のためのベクターとして利用されるプラスミドは、Genbankuのアミノ酸M(24)からアミノ酸A(48)（アクセッション番号U28070）のウマIGF1のシグナルペプチド配列を含む。本発明の実施に参考とするか又は利用できるDNAプラスミドの追加の情報は、例えば米国特許第6,852,705号、6,818,628号、6,586,412号、6,576,243号、6,558,674号、6,464,984号、6,451,770号、6,376,473号及び6,221,362号で見出される。
【００３５】
プラスミドという用語は、本発明のポリヌクレオチド及び所望の宿主又は標的の細胞（1つ又は複数の細胞）におけるそのin vivo発現に必要なエレメントを含む任意のDNA転写ユニットを包含する。さらにこれに関して、スーパーコイル又は非スーパーコイル環状プラスミドは、線形プラスミドと同様に本発明の範囲内に含まれるものであることに留意されたい。
各プラスミドは、ロタウイルスポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原（場合によって異種ペプチド配列と融合される）に加えて、変種、アナローグ又はフラグメントを含むか、収納するか又は本質的に前記から成り、前記は、プロモーターに作動できるように連結されるか、又はプロモーターの制御下にあるか、又はプロモーターに依存する。一般的には、真核細胞で機能する強力なプロモーターを利用することが有利である。強力なプロモーターは、ヒト又はネズミ起源の（場合によっては別の起源（例えばラット又はモルモット）を有する）極初期サイトメガロウイルスプロモーター（CMV-IE）であり得る。
より一般的な関係では、プロモーターはウイルス起源又は細胞起源を有する。本発明の実施で有用に利用できる、CMV-IE以外の強力なウイルスプロモーターは、SV40ウイルスの初期/後期プロモーター又はラウス肉腫ウイルスのLTRプロモーターである。本発明の実施で有用に利用できる強力な細胞性プロモーターは、細胞骨格の遺伝子のプロモーター、例えばデスミンプロモーター（Kwissa et al., 2000）又はアクチンプロモーター（Miyazaki et al., 1989）である。
プラスミド及びポックスウイルス以外のウイルスベクターのためのポリアデニル化シグナル（ポリA）に関しては、ウシ成長ホルモン（bGH）遺伝子のポリ(A)シグナル（米国特許第5,122,458号を参照されたい）、又はウサギβ-グロビン遺伝子のポリ(A)シグナル、又はSV40ウイルスのポリ(A)シグナルが有用であり得る。
“宿主細胞”は、遺伝的に改変されてあるか、又は外因性ポリヌクレオチド（例えば組換えプラスミド又はベクター）の投与によって遺伝的に改変させることができる原核又は真核細胞を指す。遺伝的に改変された細胞というとき、該用語は、最初に改変された細胞及びその子孫の両方を指す。
【００３６】
使用方法及び製造物品
本発明は以下の態様の方法を含む。ある実施態様では、動物をワクチン免疫する方法が開示され、前記方法はベクターを含む組成物を動物に投与する工程を含む。前記ベクターは、ロタウイルスポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変種及び医薬的若しくは獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルを含む。この実施態様のある特徴では、動物はブタである。
本発明のある実施態様では、プライム-ブースト投薬スケジュールを利用することができる。前記投薬スケジュールは、少なくとも1回の基本投与及び少なくとも1回のブースター投与で構成され、少なくとも1つの共通のポリペプチド、抗原、エピトープ又は免疫原が用いられる。典型的には、基本投与で用いられる免疫学的組成物又はワクチンは、ブースターとして用いられるものとは性質が異なる。しかしながら、基本投与及びブースター投与と同じ組成物を用いることができることは理解されよう。この投与プロトコルは“プライム-ブースト”と呼ばれる。
プライム-ブースト投薬スケジュールは、少なくとも1つの共通ポリペプチド及び／又はその変種又はフラグメントを用いる、少なくとも1回のプライム投与及び少なくとも1回のブースト投与を含む。プライム投与で用いられるワクチンは、後のブースターワクチンとして用いられるものと性質が異なってもよい。プライム投与は1回以上の投与を含むことができる。同様に、ブースト投与は1回以上の投与を含むことができる。
【００３７】
哺乳動物である標的種のための組成物の1用量体積（例えばブタ又はブタ科動物用組成物（ウイルスベクター系、例えば非ポックスウイルスベクター系組成物）の1用量体積）は、一般的には約0.1から約2.0mL、約0.1から約1.0mL、約0.5mLから約1.0mLである。
ワクチンの有効性は、動物（例えばブタ）をロタウイルスのビルレント株でチャレンジすることによって最後の免疫接種から約2から4週間後に試験できる。同種株及び異種株の両方をチャレンジに用いて該ワクチンの有効性を試験する。動物は、IM若しくはSC注射、スプレー、鼻内、眼内、気管内及び／又は経口的にチャレンジできる。チャレンジウイルスは、投与ルートに対応する体積でqPCRによって決定したとき、約105-8EID50、TCID50又は103-8ゲノム等価量であり得る。例えば、投与がスプレーによる場合、ウイルス分散物は噴霧化されて約1から100μmの水滴を生じ、投与が鼻内、気管内又は経口である場合、チャレンジウイルス体積は、それぞれ約0.5mL、1−2mL及び5−10mLである。チャレンジ後、臨床徴候（例えば脱水、下痢、のり状から水様便、死亡、及び／又は体重低下、発育不全、ウイルス放出）について動物を14日間毎日観察できる。さらにまた、動物グループを安楽死させ、腸症状、絨毛萎縮の病理学的所見について評価できる。ウイルス単離若しくは定量又は検出のために、チャレンジ後に直腸又は糞便スワブを全動物から収集できる。腸組織又は糞便中のウイルス抗原の有無は、定量的リアルタイム逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（qRT-PCR）によって判定できる。チャレンジ前後に血液サンプルを収集し、ロタウイルス特異的抗体の存在について分析できる。
プライム-ブーストプロトコルで用いられる本発明の組換え抗原ポリペプチドを含む組成物は、医薬的若しくは獣医的に許容できるビヒクル、希釈剤又は賦形剤中に含まれる。本発明のプロトコルは、ロタウイルスから動物を防御し及び／又は疾患の進行を感染動物で防ぐ。
多様な投与は好ましくは1から6週間離して実施される。好ましい時間的間隔は3から5週間、場合によって4週間である。ある実施態様にしたがえば、1年ごとのブースターもまた想定される。最初の投与時に動物（例えばブタ）は少なくとも8週齢である。
本明細書の開示は例示として提供され、本発明は前記に限定されないことは当業者には理解されよう。本明細書の開示及び当業界の情報から、当業者は、投与回数、投与ルート、及び各注入プロトコルに使用される用量を煩雑な実験を行うことなく決定できる。
【００３８】
本発明は、本発明にしたがって製造した十分な量の治療用組成物の動物への少なくとも1回の投与を意図する。例えば、十分な量は約10μgから約300μgのタンパク質であり得る。ある実施態様では、3つの異なるグループCのロタウイルスタンパク質のそれぞれ約100μgが十分な量の治療用組成物に存在する。動物は雄、雌、妊娠雌及び新生仔であり得る。本投与は、多様なルート（筋肉内（IM）、皮内（ID）、腹腔内（IP）若しくは皮下（SC）注射又は鼻内若しくは経口投与を含むがただしこれらに限定されない）を介することができる。本発明の治療用組成物はまた無針装置（例えば以下による：パルスニードルフリー（Pulse Needle Free, Pulse Needlefree, Lenexa, KS, USA）、ピッグジェット（Pigjet）、デルモジェット（Dermojet）、バイオジェクター（Biojector）（Merial, GA, USA）、アビジェット（Avijet）、ベトジェット（Vetjet）又はビタジェット装置（Vitajet apparatus）（Bioject, Oregon, USA））によって投与できる。プラスミド組成物を投与する別のアプローチはエレクトロポレーションの使用である（例えば以下を参照されたい：Tollefsen et al., 2002；Tollefsen et al., 2003；Babiuk et al., 2002；PCT出願WO99/01158）。別の実施態様では、治療用組成物は遺伝子銃又は金粒子ボンバードメントによって動物にデリバーされる。有利な実施態様では、動物はブタ、イヌ、フェレット又はアザラシである。
【００３９】
本発明の別の実施態様は、動物でロタウイルスに対する免疫学的又は防御応答を誘引又は誘導する方法を実施するためのキットであり、前記キットは、ロタウイルスサブユニット免疫学的組成物又はワクチン、及び動物で免疫応答を誘引するために有効量でデリバリーする方法を実施するための指示を含む。
本発明の別の実施態様は、動物でロタウイルスに対する免疫学的又は防御応答を誘発する方法を実施するためのキットであり、前記キットは、本発明のロタウイルスポリペプチド又は抗原を含む組成物又はワクチン、及び動物で免疫応答を誘引するために有効量でデリバリーする方法を実施するための指示を含む。
本発明のさらにまた別の特徴は、上記に記載の本発明のプライム-ブーストワクチン免疫用キットに関する。該キットは、少なくとも2つのバイアルを含むことができる。第一のバイアルは本発明のプライムワクチン免疫用ワクチン又は組成物を含み、第二のバイアルは本発明のブーストワクチン免疫用ワクチン又は組成物を含む。該キットは、有利には追加プライムワクチン免疫用又は追加ブーストワクチン免疫用の追加第一及び第二バイアルを含むことができる。
【００４０】
医薬的に又は獣医的に許容できる担体又はビヒクル又は賦形剤は当業者には周知である。例えば、医薬的に又は獣医的に許容できる担体又はビヒクル又は賦形剤は、0.9％NaCl（例えば食塩水）溶液又はリン酸緩衝液であり得る。本発明の方法に用いることができる他の医薬的に又は獣医的に許容できる担体又はビヒクル又は賦形剤にはポリ-(L-グルタメート)又はポリビニルピロリドンが含まれるが、ただし前記に限定されない。医薬的に又は獣医的に許容できる担体又はビヒクル又は賦形剤は、ベクター（又は本発明のベクターからin vitroで発現されたタンパク質）の投与を容易にする任意の化合物又は化合物の組合せであり得る。有利には、前記担体、ビヒクル又は賦形剤は、トランスフェクションを容易にするか、及び／又はベクター（又はタンパク質）の保存を改善することができる。用量及び用量体積は一般的記述としてここで考察されるが、煩雑な実験を実施することなく当業界の情報と併せて本開示から当業者によって決定され得る。
【００４１】
プラスミドのために極めて適切な（ただし唯一無比に適切というわけではない）第四アンモニウム塩を含む陽イオン脂質は、有利には下記式を有するものである：
【００４２】
2015508776.tif 000005
【００４３】
式中、R1は、12から18の炭素原子を有する飽和又は不飽和直鎖脂肪族基であり、R2は、2又は3炭素原子を含む別の脂肪族基であり、さらにXはアミン又はヒドロキシル基である（例えばDMRIE）。別の実施態様では、陽イオン脂質は中性脂質、例えばDOPEと会合し得る。
これら陽イオン脂質の中で、DMRIE（N-(2-ヒドロキシエチル)-N,N-ジメチル-2,3-ビス(テトラデシルオキシ)-1-プロパンアンモニウム；WO96/34109）が好ましく、前記は有利には中性脂質、有利にはDOPE（ジオレオイル-ホスファチジル-エタノールアミン；Behr, 1994）と会合してDMRIE-DOPEを形成する。
DOPEが存在するとき、DMRIE：DOPE分子比は有利には約95：約5から約5：約95、より有利には約1：約1、例えば1：1である。
【００４４】
別の実施態様では、医薬的に又は獣医的に許容できる担体、賦形剤又はビヒクルは油中水エマルジョンであり得る。適切な油中水エマルジョンの例には、油をベースにした油中水ワクチンエマルジョン（ただし前記に限定されない）が含まれ、前記は、安定かつ4℃で液体であり、以下を含む：6から50v/v％（好ましくは12から25v/v％）の抗原含有水相、50から94v/v％の油相（その全部又は一部分が非代謝性油（例えば鉱物油（例えばパラフィン油））及び／又は代謝性油（例えば植物油又は脂肪酸、ポリオール又はアルコールエステル）である）、0.2から20p/v％、好ましくは３から８p/v％の界面活性剤。後者の界面活性剤は、その全部又は部分がポリグリセロールエステル（好ましくはポリグリセロール(ポリ)リシノレート）又はポリオキシエチレンリシン油又は他の水素添加ポリオキシエチレンリシン油のいずれかであるか、又は前記の混合物である。油中水エマルジョンで用いることができる界面活性剤の例には、エトキシル化ソルビタンエステル（例えばポリオキシエチレン（20）ソルビタンモノオレエート（TWEEN80(商標)、アプリケム社（AppliChem, Inc., Cheshire, CT）から入手できる）及びソルビタンエステル(例えばソルビタンモノオレエート（SPAN80(商標)、シグマアルドリッチ(Sigma Aldrich, St. Louis, MO)から入手できる)が含まれる。前記の他に油中水エマルジョンに関しては、US6,919,084を参照されたい。いくつかの実施態様では、抗原含有水相は、1つ以上の緩衝剤を含む食塩水溶液を含む。適切な緩衝溶液の例はリン酸緩衝食塩水である。有利な実施態様では、油中水エマルジョンは水/油/水（W/O/W)三重エマルジョンであり得る（US6,358,500)。他の適切なエマルジョンの例はUS7,371,395に記載されている。
【００４５】
本発明の免疫学的組成物及びワクチンは、1つ以上のアジュバントを含むか、本質的に前記から成り得る。本発明の実施で使用される適切なアジュバントは、(1)アクリル又はメタクリル酸のポリマー、マレイン酸無水物及びアルケニル誘導体ポリマー、(2)免疫刺激配列（ISS）、例えば1つ以上の非メチル化CpGユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman et al., 1996；WO98/16247）、(3)水中油エマルジョン、例えばSPTエマルジョン（以下の文献の147ページに記載：“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach”M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995）及びエマルジョンMF59（同書の183ページに記載)、(4)第四アンモニウム塩を含む陽イオン脂質、例えばDDA、(5)サイトカイン、(6)水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム、(7)サポニン、又は(8)本出願に参考文献により引用され及び取り入れられた任意の文書類で考察される他のアジュバント、又は（9）前記の組合せ又は混合物である。
水中油エマルジョン（3）（前記はウイルスベクターに特に適切である）は以下を基剤にすることができる：軽流動パラフィン油（欧州薬局方タイプ）、イソプレノイド油、例えばスクアラン、スクアレン、アルケンのオリゴマー化から生じた油、例えばイソブテン又はデセン、直鎖アルキル基を有する酸又はアルコールのエステル、例えば植物油、エチルオレエート、プロピレングリコール、ジ(カプリレート/カプレート)、グリセロールトリ(カプリレート/カプレート)及びプロピレングリコールジオレエート、又は分枝脂肪アルコール又は酸のエステル、特にステアリン酸エステル。
【００４６】
油は、エマルジョンを形成させるために乳化剤と組み合わせて用いられる。乳化剤は非イオン性界面活性剤であり、例えば一方でソルビタン、マンニド（例えば無水マンニトールオレエート）、グリセロール、ポリグリセロール又はプロピレングリコールのエステル、及び他方でオレイン酸、イソステアリン酸又はヒドロキシステアリン酸のエステルであり、前記エステルは場合によってエトキシル化されるか、又はポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンコポリマーブロック（例えばプルロニック、例えばL121）である。
タイプ（1）のアジュバントの中で、架橋されたアクリル又はメタクリル酸のポリマー（特に糖又は多価アルコールのポリアルケニルエーテルによって架橋されたもの）が好ましい。これらの化合物はカルボマーの名称で知られている（Pharmeuropa, vol. 8, no. 2, June 1996）。当業者はまたUS2,909,462を参照できる。前記文献は、少なくとも3つのヒドロキシル基（好ましくは8つを超えないヒドロキシル基で、少なくとも3つのヒドロキシル基の水素原子が、少なくとも2つの炭素原子を有する不飽和、脂肪族基によって置き換えられてある）を有するポリヒドロキシル化合物によって架橋されたアクリルポリマーを提供する。好ましい基は2から4炭素原子を含むもの、例えばビニル、アリル及び他のエチレン系不飽和基である。該不飽和基はまた他の置換基、例えばメチルを含むことができる。カルボポール（Carbopol, BF Goodrich, Ohio, USA）の名称で販売される製品が特に適切である。それらは、アリルサッカロース又はアリルペンタエリトリトールによって架橋される。それらの中で、Carbopol 974P、934P及び971Pが挙げられる。
【００４７】
無水マレイン酸-アルケニル誘導体コポリマーに関しては、EMA（Monsanto）が好ましい。前記は、直鎖又は架橋エチレン-無水マレイン酸コポリマーであり、それらは、例えばジビニルエーテルによって架橋される。以下の文献もまた参照されたい：J. Fields et al., 1960。
構造に関しては、アクリル又はメタクリル酸ポリマー及びEMAは、好ましくは以下の式を有する基本単位によって形成される：
【００４８】
2015508776.tif 000006
【００４９】
式中、R1及びR2（これらは同じでも異なっていてもよい）はH又はCH3を表し、ｘは0又は 1で、好ましくはｘは1であり、ｙは1又は2であってｘ＋ｙは2である。
EMAについては、ｘは0でｙは2であり、カルボマーについては、ｘ＝ｙ＝1である。
これらのポリマーは、水又は生理学的塩溶液（20g/L NaCl）に可溶性であり、pHは7.3から7.4に例えばソーダー（NaOH）で調整されて、発現ベクターを取り入れることができるアジュバント溶液が生成される。最終的な免疫学的組成物又はワクチン組成物のポリマー濃度は、約0.01から約1.5％w/v、約0.05から約1％w/v、及び約0.1から約0.4％w/vの範囲であり得る。
1つのサイトカイン又は複数のサイトカイン（5）は免疫学的組成物又はワクチン組成物中でタンパク質の形態を有するか、又は宿主中で1つの免疫原又は複数の免疫原又は前記のエピトープと同時発現され得る。1つのサイトカイン又は複数のサイトカインの同時発現が好ましいが、前記は、1つの免疫原又は複数の免疫原又は前記のエピトープを発現するベクターと同じベクターによって、又は別個のベクターによって発現される。
【００５０】
本発明はそのような組成物の調製を包含し、前記は、例えば活性成分を有利にはアジュバント、担体、サイトカイン及び／又は希釈剤と一緒に混合することによって実施される。
本発明で用いることができるサイトカインには、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンα（IFNγ）、インターフェロンβ（IFNβ）、インターフェロンγ（IFNγ）、インターロイキン-1α（IL-1α）、インターロイキン-1β（IL-1β）、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン-10（IL-10）、インターロイキン-11（IL-11）、インターロイキン-12（IL-12）、腫瘍壊死因子α（TNFα）、腫瘍壊死因子β（TNFβ）、形質転換成長因子β（TGFβ）が含まれるが、ただしこれらに限定されない。サイトカインは、本発明の免疫学的組成物又はワクチン組成物と一緒に同時投与されるか、及び／又は連続的に投与され得る。したがって、例えば、本発明のワクチンはまた、適切なサイトカイン（例えばワクチン接種されるべき又は免疫学的応答が誘引されるべき宿主と適合するサイトカイン（例えばイヌに投与される調製物のためにはイヌサイトカイン））をin vivoで発現する外因性核酸分子を含むことができる。
本発明をこれから以下の非限定的な実施例の手段によってさらに詳しく説明する。
【００５１】
実施例
要旨：ウイルスワクチンは、典型的には感染動物の臨床サンプルから単離した全ウイルスを用い、卵胚又はin vivo細胞培養でのウイルス順化及び増殖によって製造される。グループCブタロタウイルスは、これらの通常的なウイルス学的技術では回収が困難であることは周知であり、さらにロタウイルスは、卵胚又は細胞培養増殖に順化させる間に抗原のゆがみを生じる傾向があり、その結果、単離したまるごとのウイルスによるワクチン製造は最適に達しないと考えられる。したがって、発現ベクター（pNPL2、配列番号：15）は、ブタロタウイルスグループC VP4、VP6及び／又はNSP4組換えタンパク質を含むワクチンの製造を可能にするように構築された。群れの獣医師から付託された臨床材料からPCRによってロタウイルスの遺伝的材料をレスキューした。VP4（18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38又は40）、VP6（42、44、46、48又は50）又はNSP4（52、54、56、58、60、62、64、66、68、70又は72）ポリヌクレオチドをコードする遺伝子をpNPL2に加え（本明細書に記載し図7に示したプロセスによる）、pNPL2-RotaCベクターを得た（前記ベクターの各々はNSP4、VP4又はVP6のいずれかの部分をコードしさらに細菌宿主細胞で前記を発現することができる）。これらのベクターを続いてSE1大腸菌（E. coli）で増殖させた。前記細胞はccdBタンパク質毒素を構成的に発現し、前記毒素はベクターの非存在下では該細胞を殺滅する。細胞を増殖させ、不活化し、続いて組換え発現ロタウイルスタンパク質を採集し、非生存性サブユニットタンパク質自原性ワクチンとして使用するためにアジュバントとともに処方した。本発明のワクチン組成物はロタウイルスに対しブタにおける防御免疫を誘引した。
【実施例１】
【００５２】
ロタウイルスサブユニットワクチンの自原性又は商業的製造用ベクターの構築
pNPL1及び2発現ベクターの構築：デルフィジネティクス（Delphi Genetics）のpStaby1.2ベクター（配列番号：1）から、アンピシリン耐性遺伝子置の欠失及びGST（グルタチオンS-トランスフェラーゼ）遺伝子の挿入によって発現ベクターpNPL2（配列番号：15）を構築し、製造時の下流タンパク質のプロセッシングを促進した（pStaby1.2ユーザーマニュアル（2011年刊行））。このベクターは、公知の哺乳動物ビルレンス特徴物を含まず発現もせず、さらにまた全ての抗生物質耐性遺伝子がその構築中に前記から除去された。pNPL2をSE1大腸菌で増殖させ、それらは共同してB株大腸菌宿主/ベクター生成系である（pStabyユーザーマニュアル）。
pStaby1.2制限マップは図1に提示され、前記に示すように、組換えタンパク質をコードする遺伝子の発現を駆動するためにT7プロモーターを含む。前記プラスミドはまたccdA遺伝子（不安定な解毒剤タンパク質をコードする）を含む。前記不安定解毒剤タンパク質は、腸内細菌科細胞に対して有毒である安定なアンチジャイレースタンパク質（ccdB）の発現を阻害する。ccdBタンパク質はccdB遺伝子によってコードされ、前記遺伝子は宿主のSE1大腸菌宿主細胞の染色体に存在する（ccdB遺伝子はpStaby1.2プラスミドには存在しない）。形質転換後に、プラスミド中のccdA遺伝子の存在は、形質転換達成細胞の生存を担保し、一方、非プラスミド保持SE1細胞は解毒剤の非存在下で毒素を産生し、したがって生存できない。
pStaby1.2ベクターのアンピシリン耐性遺伝子は、ロタウイルスサブユニットワクチン製造で所望されないと考えられるので、したがってインバースPCR技術を用いて除去した（図2）。全ての開示方法で用いられたプライマーリストは表1に示される。最終的PCR生成物をリン酸化し、自己連結してpNPL1（配列番号：14）を得た。続いてGSTをpNPL1に添加して任意の発現タンパク質のサイズを増し、下流のプロセッシング/インライン分析を改善した。GSTをプライマー#650（配列番号：2）及び#651（配列番号：3）を用いてpGEX4T.1（GE Life Science）から増幅し、続いてアンプリコン（配列番号：16）を消化し、NdeI-BamHI線状化pNPL1でクローニングしてpNPL2を得た（図2−4）。BamHI及びHindIIIでpNPL2を消化し、アガロースゲルで見ることができる2つのバンドを得た（5682bp及び25bp）。
【００５３】
pNPL3の構築：プライマーKSN772（配列番号：77）及びKSN773（配列番号：78）並びに鋳型としてpNPL1を用いてPCRを実施した。PCR生成物をリン酸化し、自己連結してpNPL3を形成した（前記は今やhexa-HISタグを含んでいた）。配列番号：79−89に示すプライマーを用いて生成されたPCR生成物を使用し、インヒュージョン反応によってNSP4、VP4、VP6又はVP7遺伝子をBamHI及びBamHIII消化pNPL3ベクターでクローニングできる。pNPL3はGST遺伝子をコードする配列を欠くという点を除いて、pNPL3はpNPL2と類似する。代わりにpNPL3はHisタグをコードする配列を有し、N-末端Hisタグ付加融合ペプチドを可能にする。
【実施例２】
【００５４】
自原性ロタウイルスサブユニットワクチンの製造
感染ブタから収集した臨床サンプルからロタウイルスRNAを直接単離し精製し、VP4（配列番号：10、11に示すプライマー）、VP6（配列番号：12、13に示すプライマー）及びNSP4（配列番号：8、9に示すプライマー）をコードする遺伝子に特異的なプライマーを用いて逆転写PCR（RTPCR）に付した。各プライマー対は、標的遺伝子の各末端の高度に保存された領域と結合するように設計され（図5）、多くの異なるウイルス単離体のグループCロタウイルス遺伝子の増幅を可能にする。該遺伝子が配列番号：8、9、10、11、12及び13に示すロタウイルスC遺伝子特異的プライマーを用いて増幅できない場合、代替プライマーを設計し、前記を当業界で周知の技術を用いて当業者が使用した。例えば、重要なプライマー位置（例えば3’末端ヌクレオチド）を変動させて保存配列から逸脱した鋳型を適合させることができるように、縮退プライマーを利用することができる。配列番号：73、74、75及び76に示す配列を有するプライマーを用いて、VP4配列を増幅し、pNPL1及び／又はpNPL2でクローニングすることができる。配列番号：73及び74を用いて、VP4配列を増幅しTOPOベクターでクローニングすることができる。続いて、その後のサブユニットワクチン製造のために配列番号：75及び76を用いてVP4配列をpNPL2ベクターに挿入することができる。
各プライマーの5’末端は、後のインヒュージョン反応の間にpNPL2への挿入を可能とするため15ヌクレオチド配列を含む。発現系で用いられるべきドナーDNA作製のための野外起源ロタウイルス遺伝子の単離及び増幅は図4、5及び6に示されている。ccdA（ベクターコード）遺伝子及びccdB（細胞ゲノムコード）遺伝子の両方が形質転換SE1細胞内に存在することによって、ロタウイルス遺伝子を発現する、生存能力を有する安定な培養物が生じる。非形質転換又はプラスミドが脱落した細胞はいずれも生存できない。遺伝子挿入は特徴付け及び配列決定によって立証し、タンパク質発現はSDS-PAGEによって立証し（図8）、前記SDS-PAGEは36kDa（NSP4）、52kDa（VP4）及び68kDa（VP6）の凡その分子量を示した。このアプローチは、保存領域でクローニングプライマーと十分な相同性を有するいずれのロタウイルス野外株に対しても応用可能であると考えられる。
大規模製造のために、単一コロニー又は多数の均一形コロニーを10mL−200,000mLのLB培養液に移した。600nmで測定して光学密度が0.4−1.0に達したとき、IPTG（イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシド；Sigma Aldrich Catalog No. I5502又は等価物）を1mMの最終濃度で添加した。この培養をさらに2−6時間インキュベートした。培養は発酵装置で以下のように増殖させることができる：
a．培養温度を36±3℃で維持する。
b．ろ過圧縮気流を0.1−300L/分で維持する。
c．培養pHを7.4±0.3で維持する。
d．600nmで測定して光学密度が0.4−1.0に達したとき、IPTGを最終濃度1mMで添加する。培養をさらに2−6時間インキュベートする。
【００５５】
採集技術：消耗培養液をろか又は遠心分離によって大腸菌細胞から分離し、0.1−0.45ミクロンフィルターを用いてろ過によって濃縮した。続いて濃縮細胞をB-PER試薬（Thermo Scientific, Catalog No. 78248又は等価物）を用いて溶解し、続いてこの溶液を0.5−2時間攪拌するか又は激しくかき混ぜる。前記溶解細胞を5000−10000gで15−30分遠心分離するか、0.1−0.45ミクロンフィルターを用いてろ過することによって濃縮し、上清/浸透液を廃棄した。ペレット/濃縮物を0.1−0.5時間攪拌するか又は激しくかき混ぜることによって、洗浄緩衝液A（20mM トリス-HCL、2 mM EDTA及び0.1％ トリトンX-100、pHを7.5-8.5に調整）に再懸濁し、生じた懸濁物を5000−10000gで15−30分遠心分離するか、又は0.1−0.45ミクロンフィルターを用いてろ過することによって濃縮した。ペレット/濃縮物を0.1−0.5時間攪拌するか又は激しくかき混ぜることによって、洗浄緩衝液B（20mM トリス-HCL及び2 mM EDTA、pHを7.5-8.5に調整）に再懸濁し、この懸濁物を5000−10000gで15−30分遠心分離するか、又は0.1−0.4ミクロンフィルターを用いてろ過することによって濃縮した。8M尿素（Sigma-Aldrich, Catalog No. U6504又は等価物）に懸濁し、さらに0.5−2時間攪拌するか又は激しくかき混ぜた後、この最終懸濁物を無菌的PBSで稀釈した。
ワクチン処方物：採集後、ロタウイルスサブユニットをTRIGEN（油中水）及び保存料（30μg/mL未満の濃度のゲンタミシン及び2.50μg/mL未満の濃度のアンホテリシンB又は30μg/mL未満の濃度のポリミキシンB）とともに処方した。前記混合物にa）水酸化アルミニウムゲル（ALHYDROGEL(商標)“85”（以下の業者が製造；Brenntag Biosector（Cat. No. EMS 2485-2）又はREHYDRAGEL HPA, Reheis（Cat. No. 203130070600）、REHYDRAGEL LV, Reheis（Cat. No. 203120070602））又は等価物）を加え、最終生成物に約0.1から約0.5％のAl2O3を提供した。或いは、Quil Aアジュバントが、不活化液の0.5から2.5％の割合で処方物中に水中油アジュバントとともに存在する。
【実施例３】
【００５６】
自原性ロタウイルスサブユニットワクチンによる成熟雌ブタの免疫
概要：ロタウイルスCに慢性的に感染し、同様な経産の48匹の実験用成熟雌ブタをワクチン有効性実験に用いた。26匹の動物はプラセボワクチン接種コントロールであり、一方、22匹の動物にロタウイルスサブユニットワクチン（VP4、VP6、NSP4及びエマルジョン/追加アジュバントを含む）を投与した。前記ワクチンは、ワクチン1用量当たり約100マイクログラムのそれぞれのタンパク質（合計300マイクログラムのタンパク質）及び10％のTrigenが存在するように処方される。ワクチンは分娩前6及び3週に筋肉内に投与された。成熟雌ブタの血清をワクチン接種前及び分娩前に収集し、続いて仔ブタの血清を分娩後7日に収集した。
結果：ワクチン接種ブタから生まれた仔ブタ（死亡率14％）と比較して、非ワクチン接種成熟雌ブタから生まれた仔ブタの死亡率は21％であった（すなわち33％減少）。有病率もまたワクチン接種成熟雌ブタから生まれたブタで有意に低下した。ワクチン接種ブタ由来の仔ブタはまた、コントロール仔ブタよりも有意（p＜0.05）に高い抗体力価を有した（図9）。
【実施例４】
【００５７】
哺乳ブタの下痢発生率の低下及び行動改善における新規なロタウイルスCワクチンの有効性
要旨：3600頭の交配-隔離群の成熟雌ブタを選択して、新規なロタウイルスワクチンの有効性を評価した。前記の群れはLine 02雄ブタと交配したPIC L03雌から成っていた。この農場で与えた飼料はいずれも栄養基準（NRC, 1998）に合致するか又は前記を超えるように処方される。出産経歴内で交配日を基準に、成熟雌ブタ及び若雌ブタを2つの処置（コントロール（CON）又はロタC RSワクチン（VACC））の一方にランダムに割り振った。VACCグループに割り振った動物に2mLのワクチンを分娩前3週；3及び5週；又は3、5及び8週に投与した。これらの動物の全ての同腹仔を誕生から24時間以内に処置にしたがって混合飼育した。誕生の日から5日目まで下痢採点を実施した。以下のような採点が与えられた：0（下痢無し）、1（少数が下痢）、2（新生仔の50％が下痢）、又は3（50％を超える新生仔が下痢）。下痢に関連する死亡率のために最初の同腹仔から取り除いたブタを記録した。3週と3、5及び8週ワクチン接種プログラムを用いたとき、下痢採点又は下痢関連死亡に相違はなかった。しかしながら、下痢採点は、CONとVACC（3及び5週）処置との間で減少した（0.56対0.41、P＜0.05）。さらにまた、下痢を示す同腹仔の％は、CONに対してVACC処置（3及び5週）で1日目から5日目まで減少した。結論すれば、成熟雌ブタを1回又は3回ワクチン接種したときは、この新規なロタウイルスCワクチンは、哺乳ブタの下痢率の傾向又は死亡率を変化させなかった。しかしながら、分娩前3及び5週に投与したとき、前記新規なワクチンの使用は下痢発生を減少させるようであった。
処置：出産経歴内で交配日を基準に、成熟雌ブタ及び若ブタを4つの処置（コントロール（CON）又はニューポートワクチン処置1−3（VACC））にランダムに割り振った。処方は、以下の各ポリペプチド100マイクログラムであった：VP4（配列番号：42）、VP6（配列番号：52）及びNSP4（配列番号：18）、前記ポリペプチドはロタウイルス単離株1に由来した。これらのタンパク質サブユニットを2ccの1用量のために処方した10％のTRIGEN（概ね、1.6％のポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート、10％水酸化アルミニウムゲル、38％水性物/食塩水、45％精製鉱物油及び5％ソルビタンモノオレエートから構成される）と混合した。VACC処置グループ1に割り当てられた動物は2mLのワクチンを分娩前3週に筋肉内に投与され、VACC処置グループ2に割り当てられた動物は2mLのワクチンを分娩前5週に続いて分娩前3週に再度筋肉内に投与され、VACC処置グループ3に割り当てられた動物は2mLのワクチンを分娩前7週、分娩前5週及び続いて分娩前3週に再度筋肉内に投与された。これらの動物の全ての同腹仔を誕生から24時間以内に処置にしたがって混合飼育した。
データ収集：下痢採点は誕生の日から5日目まで毎日実施した。個々に収集した全データでは最初の処置割り振りを隠した。下痢に関連する死亡のために最初の同腹仔から取り除かれたブタを除去の日に記録し、当該データセットの死亡率/有病率としてまとめた。
データ分析：GLMの手順を用いて死亡率/有病率及び下痢採点を分析した。ルーム及び経産もまた本モデルに含めた。
【００５８】
結果：仔ブタの死亡率及び有病率は、対応するコントロールグループと比較して分娩前に2用量のワクチンを投与されたグループで減少したが、ただし有意ではなかった。しかしながら、1用量又は3用量のワクチンを投与されたグループでは相違はなかった。下痢採点は、2用量ワクチン接種処置について分娩後1日目でのみ有意に相違した。いずれの他の時点でも又は1用量若しくは3用量プログラムのどちらに関しても、下痢採点でそれ以外の相違は認められなかった。この実験で興味深いことには、本ワクチンは2用量ワクチン接種プログラムを用いたとき減少を示したが。1倍又は3倍用量プログラムでは減少を示さなかった。
【００５９】
表2：2用量ワクチン接種で測定した性能データ
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表3：2用量ワクチン接種における分娩日後の平均下痢採点
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表4：3用量ワクチン接種における分娩日後の平均下痢採点
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【実施例５】
【００６０】
三重融合ロタウイルスCワクチン
概要：上記で述べたように、ロタCサブユニットワクチンの製造は、3つの異なる遺伝子（NSP4、VP4及びVP6）を3つの異なるベクターでクローニングし、3つの異なる大腸菌培養で増殖させることによって達成された。このプロセスを簡単にするために、3つの遺伝子全部を1つのプラスミドベクターに直列かつインフレームで配置し、したがって大腸菌の単一バッチを用いてワクチン製造することを可能にした。この構築物は、ロタC（単離株12-1260-5）遺伝子をpNPL2（N-末端にインフレームでGSTタグを有する）でクローニングすることによって作製された。前記3遺伝子融合物（GSTタグは含まない）は配列番号：94に示す配列を有する。コードされるポリプロテインは、配列番号：95に示す配列を有する。
材料及び方法： QiagenウイルスRNA抽出キットを製造業者のプロトコルにしたがって臨床サンプルからRNAを抽出する。RNAの濃度及び純度は、ナノドロップ（Nanodrop）を用いて260及び280での吸収を測定することによって立証した。260/280比が少なくとも1.7であり、RNAの濃度が少なくとも50ng/μLならば、当該RNAは適性であった。ロタウイルス遺伝子を増幅し（プライマーは表5に示す）、Qiagen PCR精製キットを用いてPCR生成物を精製した。生成物のサイズはDNAゲルで泳動させることによって確認し（NSP4−300bp、VP4−750bp、VP6−1200bp）、濃度はナノドロップで概算する。
【００６１】
表5：ロタC三重融合物プライマー
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PCRクローニング生成物のpNPL2へのクローニング：3つの生成物の全部を同時に発現ベクターでクローニングした。反応物を以下のように設定し、さらに50℃で15分インキュベートし、続いて4℃で維持した。約5μLの反応生成物を用いてCYS21大腸菌コンピテント細胞（Cat # GE-STCB-22）を製造業者（Delphi Genetics）の推奨にしたがって形質転換する。該プラスミドを含む組換え大腸菌をLB培地で増殖させ、表5に列挙したプライマーをT7プロモーター及びT7ターミネータープライマー（スタンダードフリープライマー）とともに用いてプラスミドDNAの配列を決定する。配列アラインメントを実施して、大きなオープンリーディングフレームを作製し、その正確性を立証した。該ORFはGSTタグとともにインフレームで3つの遺伝子全部を含んでいた（GST-NSP4-VP4-VP6；約2.9kb）。
【００６２】
表6：三重融合連結反応混合物
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NSP4-VP4-VP6ポリプロテイン発現の分析：IPTGを標準的プロトコルにしたがって添加することによって、タンパク質発現を誘導した。この培養液をPAGEゲルで解析して融合タンパク質の発現を立証した（図12）。融合タンパク質は当該溶液の尿素可溶性分画に存在したが、B-per溶液分画には存在しなかった（PAGE、データは示されていない）。尿素可溶性融合タンパク質を水で1：20及び1：40に稀釈してPAGEで泳動し、続いてウェスタンブロットを実施した。GSTに対するモノクローナル抗体（Genscript Cat A00866）をプローブとして最終濃度0.1μg/mLで標準的プロトコルにしたがって用いて、このブロットを精査した（図13）。
【００６３】
本発明の好ましい実施態様をこれまで述べてきたが、上記文書に規定する本発明は、上記に示す特定の説明に限定されないことは理解されよう。なぜならば、それらの多くの改変は本発明の意図及び範囲から外れることなく可能だからである。
【図１】
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【図８】
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【図９Ａ−１】
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【図９Ａ−２】
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【図９Ａ−３】
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【図９Ｂ−１】
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【図９Ｂ−２】
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【図９Ｂ−３】
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【図９Ｃ−１】
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【図９Ｃ−２】
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【図９Ｃ−３】
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【図９Ｃ−４】
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【図９Ｃ−５】
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【図９Ｃ−６】
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【図９Ｃ−７】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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