(57)【要約】本発明は、オリゴヌクレオチドに対する化学修飾モチーフに関する。化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの本発明のオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は増大し得る。化学修飾されたオリゴヌクレオチドは、効力、送達の効率、標的特異性、毒性、および／または安定性の１つまたは複数において利点をもたらす。化学修飾されたオリゴヌクレオチドはロックド核酸（ＬＮＡ）の特定の化学修飾モチーフまたはパターンを有する。オリゴヌクレオチド（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）は、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡなどのＲＮＡを標的とし得る。本明細書では、化学修飾されたオリゴヌクレオチドを含む組成物、および化学修飾されたオリゴヌクレオチドを、心血管障害を含めた種々の障害に対する治療薬として使用する方法も提供される。
2015521626.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｍｉＲＮＡのシード領域と相補的な配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該配列が、少なくとも５つのロックド核酸（ＬＮＡ）を含み、該オリゴヌクレオチドが、少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドを含み、同じ配列およびＬＮＡ組成、ならびに異なるＬＮＡモチーフを含む第２のオリゴヌクレオチドと比較してｉｎ  ｖｉｖｏ有効性が増大している、オリゴヌクレオチド。
【請求項２】
５’末端にＬＮＡを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
３’末端にＬＮＡを含む、請求項１または２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
３つ以下の連続したＬＮＡを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
少なくとも１６ヌクレオチドの長さである、請求項１から４のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
１６ヌクレオチドの配列を含むオリゴヌクレオチドであって、該配列が、少なくとも５つのロックド核酸（ＬＮＡ）、５’末端にあるＬＮＡ、３’末端にあるＬＮＡ、および３つ以下の連続したＬＮＡを含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記配列の５’末端から３’末端までの、１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１５位、および１６位がＬＮＡである、請求項６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記非ロックドヌクレオチドの少なくとも１つが２’デオキシである、請求項１から７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記非ロックドヌクレオチドの全てが２’デオキシである、請求項１から８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドが２’Ｏ−アルキルまたは２’ハロである、請求項１から８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
少なくとも１つのＬＮＡが２’−４’メチレン架橋を有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’および３’キャップ構造を有する、請求項１から１１のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
完全にホスホロチオエート結合している、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
１つ〜３つのリン酸結合を有する、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
ペンダント親油基または親水基をさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
約１８〜５０ヌクレオチドの長さである、請求項１から１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
ｍｉＲＮＡ阻害剤である、請求項１から１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
前記配列がｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列と実質的に相補的である、請求項１から１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
ｍｉＲＮＡと完全に相補的である、請求項１から１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２１】
前記ｍｉＲＮＡが心臓組織において発現される、請求項１から５および請求項１８から２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２２】
前記ｍｉＲＮＡが心臓組織において選択的に発現される、請求項１から５および請求項１８から２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２３】
前記ｍｉＲＮＡが表１または表２から選択される、請求項１から５および請求項１８から２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２４】
前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ２０８ａ、ｍｉＲ２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９ではない、請求項２３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２５】
前記ｍｉＲＮＡがｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、ｌｅｔ７ファミリーのメンバー、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９９ａ−ｂ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１０ａ−ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４６ａ−ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ファミリーのメンバー、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−１−１、ｍｉＲ−１−２、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−２９、またはｍｉＲ−３３である、請求項１から５および請求項１８から２０のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
前記配列がｍＲＮＡのヌクレオチド配列と実質的に相補的である、請求項６から１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
前記配列がｍＲＮＡのヌクレオチド配列と完全に相補的である、請求項６から１７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
同じ配列およびＬＮＡ組成、ならびに異なるＬＮＡモチーフを含む第２のオリゴヌクレオチドと比較してｉｎ  ｖｉｖｏ有効性が増大している、請求項６から２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
有効量の請求項１から２８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項３０】
前記薬学的に許容される担体が、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、ミクロスフェア、ビーズ、水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含む、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
前記薬学的に許容される担体または希釈剤が、生理食塩水から本質的になる、請求項２９に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
細胞におけるｍｉＲＮＡの活性を低下させまたは阻害する方法であって、該細胞を請求項１から２５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、方法。
【請求項３３】
細胞におけるｍＲＮＡの発現を低下させる方法であって、該細胞を請求項６から１７、２６および２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む、方法。
【請求項３４】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が心臓細胞である、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞がｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにある、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３７】
対象におけるｍＲＮＡの発現に付随するまたはそれに媒介される状態を予防または処置する方法であって、該対象に請求項６から１７、２６および２７のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３８】
対象におけるｍｉＲＮＡの活性に付随するまたはそれに媒介される状態を予防または処置する方法であって、該対象に請求項１から２５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む、方法。
【請求項３９】
前記状態が心臓の状態または血管の状態である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記心臓の状態が病的心肥大、心筋梗塞、心筋虚血、または心不全である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記医薬組成物を、非経口投与することによって、または心臓組織に直接注射することによって投与する、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記非経口投与が静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、または筋肉内投与である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記組成物を、経口投与、経皮投与、持続放出投与、制御放出投与、遅延放出投与、坐薬投与、カテーテル投与、または舌下投与によって投与する、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象がヒトである、請求項３８から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記オリゴヌクレオチドを２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で送達する、請求項３８から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記オリゴヌクレオチドを生理食塩水中で製剤化し、皮下投与する、請求項３８から４５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願発明は、２０１２年６月２１日に出願された米国特許仮出願第６１／６６２，７４６号および２０１３年３月１５日に出願された米国特許仮出願第６１／８０１，５３３号の利益を請求し、その両方は、その全体が参照によって本開示に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出されたテキストファイルについての記載
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読フォーマットのコピー（ファイル名：ＭＩＲＧ＿０３６＿０２ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日２０１３年６月２１日、ファイルサイズ８５キロバイト）。
【０００３】
本発明は、ｍＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）阻害剤を含めたアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの、オリゴヌクレオチドに対する化学修飾モチーフに関する。化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドなどの本発明のオリゴヌクレオチド、例えば、ｍｉＲＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、対象に投与した際の効力、送達の効率、標的特異性、安定性、および／または毒性において利点を有し得る。
【背景技術】
【０００４】
オリゴヌクレオチドを身体に送達すること、例えばアンチセンスに基づく治療法などには、いくつかの難題が生じる。標的に対する結合親和性および特異性、細胞内取り込みの効率、ならびにヌクレアーゼ抵抗性は全て、オリゴヌクレオチドに基づく治療薬の送達および活性に関する因子である。例えば、オリゴヌクレオチドをインタクトな細胞に導入すると、オリゴヌクレオチドはヌクレアーゼによる攻撃を受け、分解され、これにより活性が失われる。したがって、有用なオリゴヌクレオチドは、細胞膜を透過することができるだけでなく、細胞外および細胞内のヌクレアーゼに対する良好な抵抗性を有するべきである。
ポリヌクレオチド類似体は、それらの分解を回避するための試みの中で、例えば２’置換によって調製されてきた（Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７巻（１９８９年）、３３７３〜３３８６頁）。しかし、そのような修飾により、多くの場合、ポリヌクレオチドの意図された生物学的作用についてのその効力が影響を受ける。そのような効力の低下は、修飾されたポリヌクレオチドが標的ＲＮＡと安定な二重鎖を形成することができないこと、および／または細胞機構との相互作用が失われることに起因し得る。他の修飾として、ＲＮＡ結合親和性を改善する潜在性を有するロックド核酸の使用が挙げられるが（ＶｅｅｄｕおよびＷｅｎｇｅｌ、ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６巻：３号、３２１〜３２３頁（２００９年））、これはｉｎ  ｖｉｖｏ有効性が低い可能性がある。アンチセンス治療薬として使用されるオリゴヌクレオチドは、その標的の機能が効率的に損なわれるように（例えば、ｍＲＮＡ標的の翻訳の阻害、またはｍｉＲＮＡ標的の活性の阻害など）、その標的に対して高親和性を有するべきである。しかし、オリゴヌクレオチドを修飾することにより、その親和性および結合特異性、ならびに、その標的の機能を損なう能力が低下し得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７巻（１９８９年）、３３７３〜３３８６頁
【非特許文献２】ＶｅｅｄｕおよびＷｅｎｇｅｌ、ＲＮＡ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６巻：３号、３２１〜３２３頁（２００９年）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、オリゴヌクレオチドを治療薬として送達することに関して記載されている方法が多様にあるにもかかわらず、安定かつ有効なオリゴヌクレオチドに基づく阻害剤に対する改善された化学修飾が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、一部において、オリゴヌクレオチドの特定の化学修飾パターンまたはモチーフにより、対象に投与した際の効力、送達の効率、標的特異性、安定性を増大させ、そして／または毒性プロファイルを改善することができるという発見に基づく。本発明者らは、オリゴヌクレオチドの送達、安定性、効力、特異性、および／または毒性プロファイルを改善する潜在性を有する特定のオリゴヌクレオチド化学修飾パターンまたはモチーフを発見した。例えば、ｍｉＲＮＡ阻害剤に対するオリゴヌクレオチド化学修飾パターンまたはモチーフにより、ｍｉＲＮＡ阻害剤の送達、安定性、効力、特異性、および／または毒性プロファイルを改善し、したがって、治療の状況下でｍｉＲＮＡ機能を有効に標的とすることができる。
【０００８】
本発明は、例えばｉｎ  ｖｉｖｏ有効性の増大など、性質が改善された、ｍｉＲＮＡの発現（例えば、存在量）を阻害することができる化学修飾パターンまたはモチーフを有するオリゴヌクレオチドを提供する。この化学修飾パターンまたはモチーフは、他の治療上の標的、例えば、ｍＲＮＡなどを標的とするための他のオリゴヌクレオチドに適用することができる。したがって、本発明は、心血管疾患、肥満、糖尿病、および他の代謝障害を含めた種々の疾患を処置するための新規の治療薬を提供する。
【０００９】
特定の化学修飾パターンまたはモチーフを有するオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、ヌクレオチド配列は同じであるが化学修飾パターンまたはモチーフが異なるオリゴヌクレオチドと比較して増大し得る。例えば、特定のロックド核酸（ＬＮＡ）パターンを有するオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、ヌクレオチド配列は同じであるがＬＮＡパターンが異なるオリゴヌクレオチドと比較して増大し得る。
【００１０】
一実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡのシード領域（ｓｅｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ）と相補的であり、少なくとも５つのＬＮＡを含む配列を含む。オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡのシード領域と相補的な少なくとも５つのＬＮＡおよび少なくとも１つの非ロックドヌクレオチド（ｎｏｎ−ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含んでもよい。一部の実施形態では、非ロックドヌクレオチドはシード領域と相補的な領域内にある。オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、同じ配列およびＬＮＡ組成、ならびに異なるＬＮＡモチーフを含む第２のオリゴヌクレオチドと比較して増大し得る。オリゴヌクレオチドは、５’末端、３’末端、または５’末端と３’末端の両方にＬＮＡを含んでもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、３つ以下の連続したＬＮＡを含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、３つ以下の連続したＬＮＡを含む。オリゴヌクレオチドは少なくとも１６ヌクレオチドの長さであってもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、８〜２０ヌクレオチドの長さ、１８〜５０ヌクレオチドの長さ、１０〜１８ヌクレオチドの長さ、または１１〜１６ヌクレオチドの長さであってもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは約８ヌクレオチド、約９ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１３ヌクレオチド、約１４ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１６ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、または約１８ヌクレオチドの長さである。
【００１１】
別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５つのＬＮＡ、５’末端にあるＬＮＡ、３’末端にあるＬＮＡ、および３つ以下の連続したＬＮＡを含む、１６ヌクレオチドの配列を含む。オリゴヌクレオチドは、５’末端から３’末端までの、配列の１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１５位、および１６位にＬＮＡを含んでよい。
【００１２】
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の非ロックドヌクレオチドを含んでよい。一部の実施形態では、非ロックドヌクレオチドの少なくとも１つは２’デオキシ、２’Ｏ−アルキルまたは２’ハロである。別の実施形態では、非ロックドヌクレオチドは全て２’デオキシ、２’Ｏ−アルキル、２’ハロ、またはそれらの任意の組合せである。
【００１３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、２’−４’メチレン架橋を有する少なくとも１つのＬＮＡを含む。オリゴヌクレオチドは、５’キャップ構造、３’キャップ構造、または５’および３’キャップ構造を有してよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含む、または完全にホスホロチオエート結合している。オリゴヌクレオチド１つ〜３つのリン酸結合を有してよい。オリゴヌクレオチドは、ペンダント親油基または親水基をさらに含んでよい。
【００１４】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡの阻害剤、例えば、その発現または活性の阻害剤などである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡ阻害剤である。例えば、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列またはその断片と実質的にまたは完全に相補的な配列を含んでよい。ｍｉＲＮＡは、あらゆる組織において発現されてもよく、ある組織において選択的に発現されてもよい。一実施形態では、組織は心臓組織である。例えば、ｍｉＲＮＡは心臓組織において選択的に発現される。
【００１５】
オリゴヌクレオチドは任意のｍｉＲＮＡの阻害剤であってよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９ではない任意のｍｉＲＮＡの阻害剤であってよい。そのような阻害剤は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２／０８３００５号に記載されている。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表１または表２から選択されるｍｉＲの阻害剤である。さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、ｌｅｔ７ファミリーのメンバー、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９９ａ−ｂ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１０ａ−ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４６ａ−ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ファミリーのメンバー、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−１−１、ｍｉＲ−１−２、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−２９、またはｍｉＲ−３３の阻害剤である。
【００１６】
さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドはｍＲＮＡの阻害剤であってよい。例えば、配列はｍＲＮＡのヌクレオチド配列またはその断片と実質的にまたは完全に相補的であってよい。
【００１７】
有効量の本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物も本明細書に提供される。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、ミクロスフェア、ビーズ、水中油エマルション、ミセル、混合ミセル、またはリポソームを含んでよい。別の実施形態では、薬学的に許容される担体または希釈剤は、生理食塩水から本質的になる。
【００１８】
本発明は、本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを産生する方法およびそれを使用する方法も提供する。細胞におけるｍｉＲＮＡの活性を低下させまたは阻害する方法であって、細胞を本明細書に記載のオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法も提供される。本明細書には、細胞におけるｍＲＮＡの発現を低下させる方法であって、細胞を本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドと接触させることを含む方法も開示されている。細胞は心臓細胞などの任意の細胞型であってよい。細胞はｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにあってよい。一実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。
【００１９】
対象におけるＲＮＡの発現に付随するまたはそれに媒介される状態を予防または処置する方法も提供される。当該方法は、対象に、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含んでよい。一実施形態では、対象におけるｍｉＲＮＡの活性に付随するまたはそれに媒介される状態を予防または処置する方法は、対象に、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む。別の実施形態では、対象におけるｍＲＮＡの活性に付随するまたはそれに媒介される状態を予防または治療する方法は、対象に、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物を投与することを含む。状態は、病的心肥大、心筋梗塞、心筋虚血、虚血再灌流傷害、心筋症、または心不全などの心臓の状態であってよい。医薬組成物は、非経口投与によって、例えば、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、または筋肉内投与によって投与することができる。一部の実施形態では、投与は、心臓組織に直接注射することによるものである。さらに一部の実施形態では、組成物を、経口投与、経皮投与、持続放出投与、制御放出投与、遅延放出投与、坐薬投与、カテーテル投与、または舌下投与によって投与する。さらに、対象はヒトであってよい。一部の実施形態では、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドを約１０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの用量で送達する。一部の実施形態では、本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドを約１００ｍｇ／ｋｇ以下、約５０ｍｇ／ｋｇ以下、約２５ｍｇ／ｋｇ以下、または約１０ｍｇ／ｋｇ以下の用量で送達する。一実施形態では、オリゴヌクレオチドを生理食塩水中で製剤化し、皮下投与する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１−１】（Ａ）ｍｉＲ−２０８ａ（配列番号７６〜９１）を標的とするように設計された１６種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置を示す。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物によるＭｉＲ−２０８ａの阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により、左心室における有意な阻害が示された。＃生理食塩水に対してｐ＜０．０５。＊対照オリゴ、Ｍ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｃ）抗ｍｉＲ−２０８ａで処置したラットの心臓組織のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＤｙｎｌｔ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。＃生理食塩水に対してｐ＜０．０５。＊対照オリゴ、Ｍ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｄ）毒性パラメータの血清レベル。注射の４日後に全群から血漿を採取した。抗ｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドまたは対照オリゴヌクレオチドのいずれによっても、ＡＬＴおよびＡＳＴ測定値によって評価される肝毒性、またはＢＵＮ測定値によって評価される腎毒性のレベルの生理食塩水対照と比較した上昇は示されなかった。（Ｅ）２５ｍｇ／ｋｇを単回皮下投与した４日後の心臓、肝臓、および腎臓からの抗ｍｉＲの定量化。心臓への分布は肝臓および腎臓よりもはるかに低い。有効な化合物ほどより強く心臓に分布するわけではない。
【図１−２】（Ａ）ｍｉＲ−２０８ａ（配列番号７６〜９１）を標的とするように設計された１６種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置を示す。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物によるＭｉＲ−２０８ａの阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により、左心室における有意な阻害が示された。＃生理食塩水に対してｐ＜０．０５。＊対照オリゴ、Ｍ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｃ）抗ｍｉＲ−２０８ａで処置したラットの心臓組織のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＤｙｎｌｔ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。＃生理食塩水に対してｐ＜０．０５。＊対照オリゴ、Ｍ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｄ）毒性パラメータの血清レベル。注射の４日後に全群から血漿を採取した。抗ｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドまたは対照オリゴヌクレオチドのいずれによっても、ＡＬＴおよびＡＳＴ測定値によって評価される肝毒性、またはＢＵＮ測定値によって評価される腎毒性のレベルの生理食塩水対照と比較した上昇は示されなかった。（Ｅ）２５ｍｇ／ｋｇを単回皮下投与した４日後の心臓、肝臓、および腎臓からの抗ｍｉＲの定量化。心臓への分布は肝臓および腎臓よりもはるかに低い。有効な化合物ほどより強く心臓に分布するわけではない。
【図１−３】（Ａ）ｍｉＲ−２０８ａ（配列番号７６〜９１）を標的とするように設計された１６種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置を示す。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物によるＭｉＲ−２０８ａの阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により、左心室における有意な阻害が示された。＃生理食塩水に対してｐ＜０．０５。＊対照オリゴ、Ｍ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｃ）抗ｍｉＲ−２０８ａで処置したラットの心臓組織のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＤｙｎｌｔ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。＃生理食塩水に対してｐ＜０．０５。＊対照オリゴ、Ｍ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｄ）毒性パラメータの血清レベル。注射の４日後に全群から血漿を採取した。抗ｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドまたは対照オリゴヌクレオチドのいずれによっても、ＡＬＴおよびＡＳＴ測定値によって評価される肝毒性、またはＢＵＮ測定値によって評価される腎毒性のレベルの生理食塩水対照と比較した上昇は示されなかった。（Ｅ）２５ｍｇ／ｋｇを単回皮下投与した４日後の心臓、肝臓、および腎臓からの抗ｍｉＲの定量化。心臓への分布は肝臓および腎臓よりもはるかに低い。有効な化合物ほどより強く心臓に分布するわけではない。
【図１−４】（Ａ）ｍｉＲ−２０８ａ（配列番号７６〜９１）を標的とするように設計された１６種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置を示す。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物によるＭｉＲ−２０８ａの阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により、左心室における有意な阻害が示された。＃生理食塩水に対してｐ＜０．０５。＊対照オリゴ、Ｍ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｃ）抗ｍｉＲ−２０８ａで処置したラットの心臓組織のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＤｙｎｌｔ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。＃生理食塩水に対してｐ＜０．０５。＊対照オリゴ、Ｍ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｄ）毒性パラメータの血清レベル。注射の４日後に全群から血漿を採取した。抗ｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドまたは対照オリゴヌクレオチドのいずれによっても、ＡＬＴおよびＡＳＴ測定値によって評価される肝毒性、またはＢＵＮ測定値によって評価される腎毒性のレベルの生理食塩水対照と比較した上昇は示されなかった。（Ｅ）２５ｍｇ／ｋｇを単回皮下投与した４日後の心臓、肝臓、および腎臓からの抗ｍｉＲの定量化。心臓への分布は肝臓および腎臓よりもはるかに低い。有効な化合物ほどより強く心臓に分布するわけではない。
【図１−５】（Ａ）ｍｉＲ−２０８ａ（配列番号７６〜９１）を標的とするように設計された１６種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置を示す。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物によるＭｉＲ−２０８ａの阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により、左心室における有意な阻害が示された。＃生理食塩水に対してｐ＜０．０５。＊対照オリゴ、Ｍ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｃ）抗ｍｉＲ−２０８ａで処置したラットの心臓組織のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＤｙｎｌｔ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。＃生理食塩水に対してｐ＜０．０５。＊対照オリゴ、Ｍ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｄ）毒性パラメータの血清レベル。注射の４日後に全群から血漿を採取した。抗ｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドまたは対照オリゴヌクレオチドのいずれによっても、ＡＬＴおよびＡＳＴ測定値によって評価される肝毒性、またはＢＵＮ測定値によって評価される腎毒性のレベルの生理食塩水対照と比較した上昇は示されなかった。（Ｅ）２５ｍｇ／ｋｇを単回皮下投与した４日後の心臓、肝臓、および腎臓からの抗ｍｉＲの定量化。心臓への分布は肝臓および腎臓よりもはるかに低い。有効な化合物ほどより強く心臓に分布するわけではない。
【図１−６】（Ａ）ｍｉＲ−２０８ａ（配列番号７６〜９１）を標的とするように設計された１６種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置を示す。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）抗ｍｉＲ−２０８ａ化合物によるＭｉＲ−２０８ａの阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により、左心室における有意な阻害が示された。＃生理食塩水に対してｐ＜０．０５。＊対照オリゴ、Ｍ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｃ）抗ｍｉＲ−２０８ａで処置したラットの心臓組織のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＤｙｎｌｔ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。＃生理食塩水に対してｐ＜０．０５。＊対照オリゴ、Ｍ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｄ）毒性パラメータの血清レベル。注射の４日後に全群から血漿を採取した。抗ｍｉＲ−２０８ａオリゴヌクレオチドまたは対照オリゴヌクレオチドのいずれによっても、ＡＬＴおよびＡＳＴ測定値によって評価される肝毒性、またはＢＵＮ測定値によって評価される腎毒性のレベルの生理食塩水対照と比較した上昇は示されなかった。（Ｅ）２５ｍｇ／ｋｇを単回皮下投与した４日後の心臓、肝臓、および腎臓からの抗ｍｉＲの定量化。心臓への分布は肝臓および腎臓よりもはるかに低い。有効な化合物ほどより強く心臓に分布するわけではない。
【００２１】
【図２−１】（Ａ）ｍｉＲ−２０８ｂ（配列番号９２〜１００）を標的とするように設計された９種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）抗ｍｉＲ−２０８ｂ化合物によるＭｉＲ−２０８ｂの阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により、左心室における有意なｍｉＲ−２０８ｂの阻害が示された。（Ｃ）抗ｍｉＲ−２０８ｂで処置したラットの心臓組織のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＤｙｎｌｔ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。＊生理食塩水に対してｐ＜０．０５
【図２−２】（Ａ）ｍｉＲ−２０８ｂ（配列番号９２〜１００）を標的とするように設計された９種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）抗ｍｉＲ−２０８ｂ化合物によるＭｉＲ−２０８ｂの阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により、左心室における有意なｍｉＲ−２０８ｂの阻害が示された。（Ｃ）抗ｍｉＲ−２０８ｂで処置したラットの心臓組織のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＤｙｎｌｔ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。＊生理食塩水に対してｐ＜０．０５
【００２２】
【図３−１】サイレンシング（Ａ）ｍｉＲ−３７８（配列番号１０１〜１０７）を標的とするように設計された７種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）抗ｍｉＲ−３７８化合物によるＭｉＲ−３７８の阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により、左心室における有意なｍｉＲ−３７８の阻害が示された。（Ｃ）抗ｍｉＲ−３７８で処置したラットの心臓組織のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＧｆｐｔ２を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。＃生理食塩水に対してｐ＜０．０５
【図３−２】サイレンシング（Ａ）ｍｉＲ−３７８（配列番号１０１〜１０７）を標的とするように設計された７種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）抗ｍｉＲ−３７８化合物によるＭｉＲ−３７８の阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により、左心室における有意なｍｉＲ−３７８の阻害が示された。（Ｃ）抗ｍｉＲ−３７８で処置したラットの心臓組織のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＧｆｐｔ２を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。＃生理食塩水に対してｐ＜０．０５
【００２３】
【図４−１】（Ａ）ｍｉＲ−２９（配列番号１０８〜１１４）を標的とするように設計された７種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）心臓（上のパネル）、肝臓（中央のパネル）、および腎臓（下のパネル）における抗ｍｉＲ−２９化合物によるＭｉＲ−２９ファミリーの阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により、心臓、肝臓、および腎臓における有意なｍｉＲ−２９ファミリーの阻害が示された。（Ｃ）抗ｍｉＲ−２９で処置したラットの心臓（上のパネル）、肝臓（中央のパネル）、および腎臓（下のパネル）のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＤｎｍｔ３ｂおよびＭｃｌ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。＊生理食塩水に対してｐ＜０．０５；＃対照オリゴヌクレオチドＭ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｄ）２５ｍｇ／ｋｇを単回皮下投薬した４日後の心臓および肝臓からの抗ｍｉＲ化合物の定量化。心臓への分布は肝臓よりもはるかに低い。有効性が高い化合物が、有効性が低い化合物と比較してより強く心臓に分布するわけではない。
【図４−２】（Ａ）ｍｉＲ−２９（配列番号１０８〜１１４）を標的とするように設計された７種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）心臓（上のパネル）、肝臓（中央のパネル）、および腎臓（下のパネル）における抗ｍｉＲ−２９化合物によるＭｉＲ−２９ファミリーの阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により、心臓、肝臓、および腎臓における有意なｍｉＲ−２９ファミリーの阻害が示された。（Ｃ）抗ｍｉＲ−２９で処置したラットの心臓（上のパネル）、肝臓（中央のパネル）、および腎臓（下のパネル）のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＤｎｍｔ３ｂおよびＭｃｌ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。＊生理食塩水に対してｐ＜０．０５；＃対照オリゴヌクレオチドＭ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｄ）２５ｍｇ／ｋｇを単回皮下投薬した４日後の心臓および肝臓からの抗ｍｉＲ化合物の定量化。心臓への分布は肝臓よりもはるかに低い。有効性が高い化合物が、有効性が低い化合物と比較してより強く心臓に分布するわけではない。
【図４−３】（Ａ）ｍｉＲ−２９（配列番号１０８〜１１４）を標的とするように設計された７種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）心臓（上のパネル）、肝臓（中央のパネル）、および腎臓（下のパネル）における抗ｍｉＲ−２９化合物によるＭｉＲ−２９ファミリーの阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により、心臓、肝臓、および腎臓における有意なｍｉＲ−２９ファミリーの阻害が示された。（Ｃ）抗ｍｉＲ−２９で処置したラットの心臓（上のパネル）、肝臓（中央のパネル）、および腎臓（下のパネル）のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＤｎｍｔ３ｂおよびＭｃｌ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。＊生理食塩水に対してｐ＜０．０５；＃対照オリゴヌクレオチドＭ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｄ）２５ｍｇ／ｋｇを単回皮下投薬した４日後の心臓および肝臓からの抗ｍｉＲ化合物の定量化。心臓への分布は肝臓よりもはるかに低い。有効性が高い化合物が、有効性が低い化合物と比較してより強く心臓に分布するわけではない。
【図４−４】（Ａ）ｍｉＲ−２９（配列番号１０８〜１１４）を標的とするように設計された７種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）心臓（上のパネル）、肝臓（中央のパネル）、および腎臓（下のパネル）における抗ｍｉＲ−２９化合物によるＭｉＲ−２９ファミリーの阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により、心臓、肝臓、および腎臓における有意なｍｉＲ−２９ファミリーの阻害が示された。（Ｃ）抗ｍｉＲ−２９で処置したラットの心臓（上のパネル）、肝臓（中央のパネル）、および腎臓（下のパネル）のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＤｎｍｔ３ｂおよびＭｃｌ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。＊生理食塩水に対してｐ＜０．０５；＃対照オリゴヌクレオチドＭ−１０５９１に対してｐ＜０．０５。（Ｄ）２５ｍｇ／ｋｇを単回皮下投薬した４日後の心臓および肝臓からの抗ｍｉＲ化合物の定量化。心臓への分布は肝臓よりもはるかに低い。有効性が高い化合物が、有効性が低い化合物と比較してより強く心臓に分布するわけではない。
【００２４】
【図５−１】（Ａ）ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号１１５〜１１９）を標的とするように設計された５種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）心臓、肺、肝臓（Ｌｉ）、および腎臓（Ｋ）における抗ｍｉＲ−１９９化合物によるＭｉＲ−１９９ａの阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により心臓、肺、肝臓、および腎臓における有意なｍｉＲ−１９９ａの阻害が示された。（Ｃ）抗ｍｉＲ−１９９で処置したラットの心臓、肺、肝臓（Ｌｉ）、および腎臓（Ｋ）のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＤｄｒ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。Ｍ−１０５１８により多数の組織にわたって標的抑制解除が一貫して示されると思われた。＊生理食塩水に対してｐ＜０．０５。
【図５−２】（Ａ）ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号１１５〜１１９）を標的とするように設計された５種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）心臓、肺、肝臓（Ｌｉ）、および腎臓（Ｋ）における抗ｍｉＲ−１９９化合物によるＭｉＲ−１９９ａの阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により心臓、肺、肝臓、および腎臓における有意なｍｉＲ−１９９ａの阻害が示された。（Ｃ）抗ｍｉＲ−１９９で処置したラットの心臓、肺、肝臓（Ｌｉ）、および腎臓（Ｋ）のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＤｄｒ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。Ｍ−１０５１８により多数の組織にわたって標的抑制解除が一貫して示されると思われた。＊生理食塩水に対してｐ＜０．０５。
【図５−３】（Ａ）ｍｉＲ−１９９ａ（配列番号１１５〜１１９）を標的とするように設計された５種の抗ｍｉＲについてのＬＮＡ塩基およびＤＮＡ塩基の位置。ＬＮＡ塩基が大文字で表されている。ＤＮＡ塩基が小文字で表されている。（Ｂ）心臓、肺、肝臓（Ｌｉ）、および腎臓（Ｋ）における抗ｍｉＲ−１９９化合物によるＭｉＲ−１９９ａの阻害。全ての抗ｍｉＲ化合物により心臓、肺、肝臓、および腎臓における有意なｍｉＲ−１９９ａの阻害が示された。（Ｃ）抗ｍｉＲ−１９９で処置したラットの心臓、肺、肝臓（Ｌｉ）、および腎臓（Ｋ）のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＤｄｒ１を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。Ｍ−１０５１８により多数の組織にわたって標的抑制解除が一貫して示されると思われた。＊生理食塩水に対してｐ＜０．０５。
【００２５】
【図６】抗ｍｉＲ−９２ａで処置したラットの心臓組織から単離した内皮細胞のリアルタイムＰＣＲにより、有効性および標的抑制解除に関する一次読み取りとしてＭａｐ２Ｋ４を使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて異なる標的抑制解除が示された。＊生理食塩水に対してｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、一部において、オリゴヌクレオチドの特定の化学修飾パターンまたはモチーフにより、対象に投与した際の効力、送達の効率、標的特異性、安定性、および／または毒性を改善することができるという発見に基づく。特定の化学修飾パターンまたはモチーフを有するオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、ヌクレオチド配列は同じであるが化学修飾パターンまたはモチーフが異なるオリゴヌクレオチドと比較して増大し得る。例えば、特定のＬＮＡ／ＤＮＡパターンを有するオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、ヌクレオチド配列は同じであるがＬＮＡ／ＤＮＡパターンが異なるオリゴヌクレオチドと比較して増大し得る。
【００２７】
本発明は、一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡなどのＲＮＡ種の発現または存在量を特定の様式で阻害することができるオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、さらに、オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物、および種々の心血管系の状態など、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡなどのＲＮＡに関連または関係する状態または障害を有する患者を処置する方法を提供する。種々の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、効力、送達の効率、標的特異性、毒性、および／または安定性のうちの１つまたは複数において利点をもたらす。
【００２８】
一態様では、本発明は、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなどのＲＮＡの発現または存在量を低下させることができるオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、ヌクレオチド配列は同じであるが化学修飾モチーフまたはパターンが異なる別のオリゴヌクレオチドと比較して増大し得る。例えば、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは各々、ｍｉＲＮＡを標的とする同じヌクレオチド配列を有する。第１のオリゴヌクレオチドは第２のオリゴヌクレオチドとは異なる化学修飾モチーフまたはパターンを有する。第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドはどちらも、ｍｉＲＮＡの発現または存在量を低下させることができる。しかし、第１の化学修飾モチーフを有する第１のオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、ｍｉＲＮＡの標的のうちの１つまたは複数の抑制解除の量によって測定しすると、異なる化学修飾モチーフを有する第２のオリゴヌクレオチドと比較して高い。
【００２９】
ｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ種の発現または存在量を低下させることにおけるオリゴヌクレオチドの活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで決定することができる。例えば、ｍｉＲＮＡ活性の阻害をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定する場合、本明細書に記載されているものなどの二重ルシフェラーゼアッセイを使用して活性を決定することができる。オリゴヌクレオチドは、二重ルシフェラーゼ活性によって決定して、約５０ｎＭ以下、または他の実施形態では、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、もしくは１０ｎＭ以下の濃度で、そのような活性を有意に阻害する。例えば、オリゴヌクレオチドは、二重ルシフェラーゼアッセイにおいて決定して、ｍｉＲＮＡ活性の阻害に関して、約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、または約２０ｎＭ以下のＩＣ５０を有し得る。二重ルシフェラーゼアッセイでは、市販されている製品であるＰｓｉＣＨＥＣＫ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって例示される通り、検出可能なタンパク質（例えば、ウミシイタケルシフェラーゼ）の遺伝子の３’ＵＴＲにｍｉＲ認識部位を配置させることを含む。構築物を標的ｍｉＲＮＡと同時発現させ、したがって、阻害剤活性をシグナルの変化によって決定することができる。検出可能なタンパク質（例えば、ホタルルシフェラーゼ）をコードする第２の遺伝子を同じプラスミド上に含め、シグナルの比を抗ｍｉＲ活性の指標として決定することができる。
【００３０】
その代わりに、またはそれに加えて、ｍｉＲＮＡなどのＲＮＡ種の発現または存在量を低下させることにおけるオリゴヌクレオチドの活性は、本明細書に記載されているものなどの適切なマウスモデルまたはラットモデルにおいて決定することができ、その場合、オリゴヌクレオチドの用量、例えば約５０ｍｇ／ｋｇ以下、約２５ｍｇ／ｋｇ以下、約１０ｍｇ／ｋｇ以下または約５ｍｇ／ｋｇ以下の用量におけるｍｉＲＮＡの阻害（例えば、少なくとも５０％の阻害）を観察する。一部の実施形態では、その記載が本明細書によって参照により組み込まれるＷＯ２００８／０１６９２４に記載されているものなどの動物モデルにおいてオリゴヌクレオチドの活性を決定する。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えば、約５０ｍｇ／ｋｇ以下または約２５ｍｇ／ｋｇ以下など、例えば約１０ｍｇ／ｋｇ以下、約５ｍｇ／ｋｇ以下などの用量で、少なくとも５０％の標的ｍｉＲＮＡの阻害を示し得る。そのような実施形態では、オリゴヌクレオチドをマウスの静脈内または皮下に投薬することができ、そしてオリゴヌクレオチドは生理食塩水中で製剤化されていてよい。
【００３１】
オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性は、本明細書に記載されているものなどの適切なマウスモデルまたはラットモデルにおいて、ｍｉＲＮＡの標的のうちの１つまたは複数の抑制解除のレベルまたは量を評価することによって決定することができる。オリゴヌクレオチドは、約５０ｍｇ／ｋｇ以下、約２５ｍｇ／ｋｇ以下、約１０ｍｇ／ｋｇ以下または約５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で少なくとも５０％の標的抑制解除を示し得る。そのような実施形態では、オリゴヌクレオチドをマウスの静脈内または皮下に投薬することができ、そしてオリゴヌクレオチドは生理食塩水中で製剤化されていてよい。
【００３２】
これらまたは他の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは投与後に安定であり得、投与後少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも５週間、または少なくとも６週間、またはそれ以上にわたって循環および／または標的臓器において検出可能であり得る。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドにより、より頻度の低い投与、より低い用量、および／または治療効果のより長い持続時間をもたらすことができる。
【００３３】
オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなどのＲＮＡのヌクレオチド配列と実質的に相補的であってよい。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９ではない。オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡ、例えば、少なくとも５つのＬＮＡ、少なくとも７つのＬＮＡまたは少なくとも９つのＬＮＡを含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＬＮＡと非ロックドヌクレオチドとの混合物を含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５つまたは少なくとも７つまたは少なくとも９つのロックドヌクレオチドと、少なくとも１つの非ロックドヌクレオチドとを含有してよい。
【００３４】
一般に、オリゴヌクレオチドの長さならびにロックドヌクレオチドの数および位置は、各々本明細書に記載の通り、ｉｎ  ｖｉｔｒｏルシフェラーゼアッセイにおいて約５０ｎＭ以下のオリゴヌクレオチド濃度で、または適切なマウスモデルまたはラットモデルにおいて約５０ｍｇ／ｋｇ以下、または約２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で、オリゴヌクレオチドによりＲＮＡの発現または存在量、例えば、ｍＲＮＡの発現またはｍｉＲＮＡの発現などが低下するようなものである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡ阻害剤であり、したがって、オリゴヌクレオチドの長さならびにロックドヌクレオチドの数および位置は、本明細書に記載されているものなどの適切なマウスモデルまたはラットモデルにおいて、オリゴヌクレオチドにより、約５０ｍｇ／ｋｇ以下、または約２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で、標的抑制解除によって決定されるｍｉＲＮＡ活性が低下するようなものである。
【００３５】
本発明のオリゴヌクレオチドは、少なくとも５つのＬＮＡ、配列の５’末端にあるＬＮＡ、配列の３’末端にあるＬＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含むヌクレオチドの配列を含んでよい。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５つのＬＮＡ、配列の５’末端にあるＬＮＡ、配列の３’末端にあるＬＮＡ、またはそれらの任意の組合せを含むヌクレオチドの配列を含み、ヌクレオチドの３つ以下は連続したＬＮＡである。例えば、オリゴヌクレオチドは、３つ以下の連続したＬＮＡを含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも５つのＬＮＡ、５’末端にあるＬＮＡ、３’末端にあるＬＮＡ、および３つ以下の連続したＬＮＡを有する配列を含んでよい。オリゴヌクレオチドは、少なくとも５つのＬＮＡ、５’末端にあるＬＮＡ、３’末端にあるＬＮＡ、および３つ以下の連続したＬＮＡを有する配列を含んでよく、配列は少なくとも１６ヌクレオチドの長さである。配列は、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡなどのＲＮＡと実質的にまたは完全に相補的であってよく、実質的に相補的な配列は、その標的配列に対して１〜４つのミスマッチ（例えば、１つまたは２つのミスマッチ）を有してよい。一実施形態では、標的配列はｍｉＲＮＡであり、したがって、オリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡ阻害剤または抗ｍｉＲである。ｍｉＲＮＡは例えば、これだけに限定されないが、表１または表２に列挙されているものなどの任意のｍｉＲＮＡであってよい。例示的なｍｉＲＮＡの治療上の有用性は、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれる、以下の表２に列挙されているＵＳ特許参考文献およびＰＣＴ特許参考文献に開示されている。ｍｉＲＮＡの成熟形態およびプロセシング前の形態は、表２に列挙されている特許参考文献に開示されており、そのような記載も本明細書によって参照により組み込まれる。
【表１−１】
2015521626.tif 000003
【表１−２】
2015521626.tif 000004
【表１−３】
2015521626.tif 000005
【表２−１】
2015521626.tif 000006
【表２−２】
2015521626.tif 000007
【００３６】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、これだけに限定されないが、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、ｌｅｔ７ファミリーのメンバー、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９９ａ−ｂ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１０ａ−ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４６ａ−ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ファミリーのメンバー、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−１−１、ｍｉＲ−１−２、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−２９、またはｍｉＲ−３３からなる群から選択されるｍｉＲＮＡと実質的にまたは完全に相補的である配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ２０８ａ、ｍｉＲ２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１２／０８３００５号に記載されているものなどではない。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、腎臓組織、肝臓組織、または心臓組織などの特定の組織において発現される。さらに別の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、腎臓組織、肝臓組織、または心臓組織などの組織において選択的に発現される。
【００３７】
さらに別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡのシード領域と相補的であり、少なくとも５つのＬＮＡを含む配列を含んでよい。「ｍｉＲＮＡのシード領域」とは、ｍｉＲＮＡの５’末端にある塩基２〜９にわたる部分である。ｍｉＲＮＡは、例えば、これだけに限定されないが、表１または表２に列挙されているものなどの任意のｍｉＲＮＡであってよい。ｍｉＲＮＡは、これだけに限定されないが、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、ｌｅｔ７ファミリーのメンバー、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９９ａ−ｂ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１０ａ−ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４６ａ−ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ファミリーのメンバー、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−１−１、ｍｉＲ−１−２、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−２９、またはｍｉＲ−３３であってよい。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ２０８ａ、ｍｉＲ２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９ではない。配列は、ｍｉＲＮＡと実質的にまたは完全に相補的であってよい。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、腎臓組織、肝臓組織、または心臓組織などの特定の組織において発現される。さらに別の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、腎臓組織、肝臓組織、または心臓組織などの組織において選択的に発現される。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、これだけに限定されないが、心筋細胞、筋細胞、線維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、および単球を含めた特定の細胞型において選択的に発現される。
【００３８】
ｍｉＲＮＡのシード領域と相補的であり、少なくとも５つのＬＮＡを含む配列を含むオリゴヌクレオチドは、５’末端にあるＬＮＡまたは３’末端にあるＬＮＡ、または５’末端と３’末端の両方にあるＬＮＡを含んでよい。一実施形態では、少なくとも５つのＬＮＡ、５’末端にあるＬＮＡおよび／または３’末端にあるＬＮＡを含むオリゴヌクレオチドは、３つ以下の連続したＬＮＡも有する。一部の実施形態では、配列は少なくとも１６ヌクレオチドの長さである。ｍｉＲＮＡのシード領域と相補的な配列は実質的に相補的であっても完全に相補的であってもよい。
【００３９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のロックド核酸（ＬＮＡ）残基、または「ロックドヌクレオチド」を含有する。ＬＮＡは、例えば、全てが本明細書によってその全体が参照により組み込まれる米国特許第６，２６８，４９０号；同第６，３１６，１９８号；同第６，４０３，５６６号；同第６，７７０，７４８号；同第６，９９８，４８４号；同第６，６７０，４６１号；および同第７，０３４，１３３号に記載されている。ＬＮＡは、「ロックド」コンフォメーションをもたらすリボース糖部分の２’炭素と４’炭素との間の追加的な架橋、および／または二環構造を含有する修飾されたヌクレオチドまたはリボヌクレオチドである。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、下の構造Ａによって示される構造を有するＬＮＡを１つまたは複数含有する。その代わりにまたはそれに加えて、オリゴヌクレオチドは、下の構造Ｂによって示される構造を有するＬＮＡを１つまたは複数含有してよい。その代わりにまたはそれに加えて、オリゴヌクレオチドは、下の構造Ｃによって示される構造を有するＬＮＡを１つまたは複数含有する。
【化１】
2015521626.tif 000008
【００４０】
本発明のオリゴヌクレオチドに組み入れることができる他の適切なロックドヌクレオチドとしては、どちらも本明細書によってその全体が参照により組み込まれる米国特許第６，４０３，５６６号および同第６，８３３，３６１号に記載されているものが挙げられる。
【００４１】
例示的な実施形態では、ロックドヌクレオチドは、例えば構造Ａに示されている２’−４’メチレン架橋を有する。他の実施形態では、架橋は、メチレン基またはエチレン基を含み、これは置換されていてもよく、そして２’位にエーテル結合を有しても有さなくてもよい。
【００４２】
オリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡに対するアンチセンス配列を含んでもよく、それから本質的になってもよく、それからなってもよい。一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡを対象とするアンチセンス配列を含む。例えば、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡ配列に対して、生理的条件下で内在性ｍｉＲＮＡとハイブリダイズするのに十分に相補的であるアンチセンス配列を含む。そのような実施形態では、オリゴヌクレオチドは、成熟ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも部分的に相補的な配列、例えば、これだけに限定されないが、表１、表２のｍｉＲＮＡ、または以下のｍｉＲＮＡのいずれか１つなどの成熟ｍｉＲＮＡ配列と少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％相補的である配列を含んでよい：ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、ｌｅｔ７ファミリーのメンバー、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９９ａ−ｂ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１０ａ−ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４６ａ−ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ファミリーのメンバー、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−１−１、ｍｉＲ−１−２、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−２９、またはｍｉＲ−３３。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ２０８ａ、ｍｉＲ２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９ではない。一実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、これだけに限定されないが、ｍｉＲ−１５ａ、ｍｉＲ−１５ｂ、ｍｉＲ−１６−１、ｍｉＲ−１６−２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２５、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−４９７、ｍｉＲ−１９５、ｍｉＲ−４２４、ｌｅｔ７ファミリーのメンバー、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１９９ａ−ｂ、ｍｉＲ−２１４、ｍｉＲ−１０ａ−ｂ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２５ｂ、ｍｉＲ−１４６ａ−ｂ、ｍｉＲ−２２１、ｍｉＲ−２２２、ｍｉＲ−３０ファミリーのメンバー、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−４８６、ｍｉＲ−９２ａ、ｍｉＲ−３２０、ｍｉＲ−１−１、ｍｉＲ−１−２、ｍｉＲ−４５１、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−３７８＊、ｍｉＲ−９２、ｍｉＲ−３４ａ、ｍｉＲ−３４ｂ、ｍｉＲ−３４ｃ、ｍｉＲ−２９、またはｍｉＲ−３３からなる群から選択されるｍｉＲＮＡなどの成熟ｍｉＲＮＡ配列と１００％相補的である配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ２０８ａ、ｍｉＲ２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９ではない。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９ではない。
【００４３】
オリゴヌクレオチドは、一般に、成熟ｍｉＲＮＡを標的とするように設計されたヌクレオチド配列を有する。これらまたは他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、同様にまたはその代わりに、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡまたはｐｒｉ−ｍｉＲＮＡの形態を標的とするように設計されてもよい。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドを、十分に相補的な（成熟）ｍｉＲＮＡ配列と比較して１〜５つ（例えば、１つ、２つ、３つ、または４つ）のミスマッチを含有する配列を有するように設計することができる。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９ではない。ある特定の実施形態では、そのようなアンチセンス配列は、例えば、ｓｈＲＮＡまたはステム部分およびループ部分を含有する他のＲＮＡ構造に組み入れることができる。
【００４４】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列と完全に相補的である（すなわち十分に相補的である）ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９ではない。特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡのヌクレオチド配列と完全に相補的な配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。この場合、「から本質的になる」とは、５’末端と３’末端のいずれかまたはその両方への任意選択のヌクレオチドの付加（例えば、１つまたは２つ）を、追加的なヌクレオチド（複数可）が、二重ルシフェラーゼアッセイまたはマウスモデルにおけるオリゴヌクレオチドによる標的ｍｉＲＮＡ活性の阻害に実質的に影響を及ぼさない（ＩＣ５０の増加が２０％以下であることによって定義される）限りは含む。
【００４５】
オリゴヌクレオチドは、約８〜約２０ヌクレオチドの長さ、約１８〜約５０ヌクレオチドの長さ、約１０〜約１８ヌクレオチドの長さ、または約１１〜約１６ヌクレオチドの長さであってよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、約８ヌクレオチド、約９ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド、約１２ヌクレオチド、約１３ヌクレオチド、約１４ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約１６ヌクレオチド、約１７ヌクレオチド、または約１８ヌクレオチドの長さである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは少なくとも１６ヌクレオチドの長さである。
【００４６】
オリゴヌクレオチドは、一般には少なくとも約５つ、少なくとも約７つ、または少なくとも約９つのＬＮＡを含有するが、種々の実施形態では、完全にＬＮＡで構成されるのではない。一般に、ＬＮＡの数および位置は、オリゴヌクレオチドによりｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの活性が低下するようなものである。一実施形態では、ＬＮＡの数および位置は、オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性がＬＮＡの数および／または位置が異なるオリゴヌクレオチドと比較して増大するようなものである。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、４つより多くまたは３つより多く連続したＬＮＡを有するひと続きのヌクレオチドを含有しない。例えば、オリゴヌクレオチドは、３つ以下の連続したＬＮＡを含む。これらまたは他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲＮＡシード領域と実質的にまたは完全に相補的であり、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのロックドヌクレオチドを含む領域または配列を含んでよい。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡはｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９ではない。
【００４７】
種々の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも９つのロックドヌクレオチドを含有する。例えば、オリゴヌクレオチドは、９つのロックドヌクレオチドおよび７つの非ロックドヌクレオチドを含有してよい。ＬＮＡのパターンは、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端までの、少なくとも１位、６位、１０位、１３位、および１５位がＬＮＡになるようなものであってよい。一部の実施形態では、ＬＮＡのパターンは、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端までの、少なくとも１位、６位、１０位、１１位、１３位、および１６位がＬＮＡになるようなものであってよい。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端までの、１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１５位、および１６位がＬＮＡであり、残りの位置が非ロックドヌクレオチドである。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端までの、１位、４位、５位、７位、９位、１０位、１２位、１４位、および１６位がＬＮＡであり、残りの位置が非ロックドヌクレオチドである。例えば、一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１６ヌクレオチドを含んでよく、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端までの、１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１５位、および１６位がＬＮＡであり、残りの位置が非ロックドヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡ阻害剤である。
【００４８】
例えば、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１６ヌクレオチドを含んでよく、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端までの、１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１５位、および１６位がＬＮＡであり、残りの位置が非ロックドヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であり、ｍｉＲＮＡは、一部の実施形態では、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９でなくてもよい。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１６ヌクレオチドを含んでよく、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端までの、１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１４位、および１６位がＬＮＡであり、残りの位置が非ロックドヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡと少なくとも部分的に相補的であり、ｍｉＲＮＡは、一部の実施形態では、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９でなくてもよい。さらに別の例では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１６ヌクレオチドを含んでよく、オリゴヌクレオチドの５’末端から３’末端までの、１位、５位、６位、８位、１０位、１１位、１３位、１５位、および１６位がＬＮＡであり、残りの位置が非ロックドヌクレオチドである、オリゴヌクレオチドはｍｉＲＮＡのシード領域と少なくとも部分的に相補的であり、ｍｉＲＮＡは、一部の実施形態では、ｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、またはｍｉＲ−４９９でなくてもよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、表３、表５、表６、表７、表８、または表９から選択される。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、Ｍ−１０１０１、Ｍ−１０７０７、Ｍ−１１１９２、Ｍ−１１１８５、Ｍ−１０５１８、またはＭ−１１１２７から選択される化合物である。
【００４９】
非ロックドヌクレオチドについては、ヌクレオチドは、２’ヒドロキシルに関して２’修飾を含有してよい。例えば、２’修飾は２’デオキシであってよい。２’修飾されたヌクレオチドをアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み入れることにより、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼに対する抵抗性とそれらの相補的なＲＮＡとの熱安定性の両方が増大し得る。２’位における種々の修飾は、独立に、ＲＮＡ標的または細胞機構との分子相互作用を損なうことなくヌクレアーゼ感受性の増大をもたらす修飾から選択することができる。そのような修飾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの効力の増大に基づいて選択することができる。ｍｉＲＮＡの阻害に関する効力の増大（例えば、ＩＣ５０）を決定するための例示的な方法は、二重ルシフェラーゼアッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるｍｉＲＮＡの発現または標的抑制解除を含め、本明細書に記載されている。
【００５０】
一部の実施形態では、２’修飾は、独立に、Ｏ−アルキル（置換されていてもよい）、ハロ、およびデオキシ（Ｈ）から選択することができる。ある特定の実施形態では、非ロックドヌクレオチドの実質的に全てまたは全てのヌクレオチドの２’位を、例えば、独立に、Ｏ−アルキル（例えば、Ｏ−メチル）、ハロ（例えば、フルオロ）、デオキシ（Ｈ）、およびアミノから選択される通り修飾することができる。例えば、２’修飾は、各々独立に、Ｏ−メチルおよびフルオロから選択することができる。例示的な実施形態では、プリンヌクレオチドは各々２’ＯＭｅを有し、ピリミジンヌクレオチドは各々２’−Ｆを有する。ある特定の実施形態では、１つ〜約５つの２’位、または約１つ〜約３つの２’位が修飾されていないままである（例えば、２’ヒドロキシルのように）。
【００５１】
本発明による２’修飾は、小さな炭化水素置換基も含む。炭化水素置換基としては、アルキル、アルケニル、アルキニル、およびアルコキシアルキルが挙げられ、アルキル（アルコキシのアルキル部分を含む）、アルケニルおよびアルキニルは置換されていても置換されていなくてもよい。アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、Ｃ１〜Ｃ１０のアルキル、アルケニルまたはアルキニル、例えば、Ｃ１、Ｃ２、またはＣ３などであってよい。炭化水素置換基は、１つまたは２つまたは３つの非炭素原子を含んでよく、これは、独立に、Ｎ、Ｏ、および／またはＳから選択することができる。２’修飾は、アルキル、アルケニル、およびアルキニルをＯ−アルキル、Ｏ−アルケニル、およびＯ−アルキニルとしてさらに含んでよい。
【００５２】
本発明による２’修飾の例としては、２’−Ｏ−アルキル（Ｃ１〜３アルキル、例えば、２’ＯＭｅまたは２’ＯＥｔなど）置換、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−Ｏ−ＭＯＥ）置換、２’−Ｏ−アミノプロピル（２’−Ｏ−ＡＰ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＯＥ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノプロピル（２’−Ｏ−ＤＭＡＰ）置換、２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’−Ｏ−ＤＭＡＥＯＥ）置換、または２’−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミド（２’−Ｏ−ＮＭＡ）置換が挙げられる。
【００５３】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−ハロ修飾（例えば、２’ヒドロキシルの代わりに）、例えば、２’−フルオロ、２’−クロロ、２’−ブロモ、および２’−ヨードなどを含有する。一部の実施形態では、２’ハロ修飾はフルオロである。オリゴヌクレオチドは、１つ〜約５つの２’−ハロ修飾（例えば、フルオロ）、または１つ〜約３つの２’−ハロ修飾（例えば、フルオロ）を含有してよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、全ての２’−フルオロヌクレオチドを非ロックド位に含有する、または全ての非ロックドピリミジンヌクレオチド上に２’−フルオロを含有する。ある特定の実施形態では、２’−フルオロ基は、独立に、ジメチル化されている、トリメチル化されている、またはメチル化されていない。
【００５４】
オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数の２’−デオキシ修飾（例えば、２’ヒドロキシルについてのＨ）を有してよく、一部の実施形態では、２〜約１０の２’−デオキシ修飾を非ロックド位に含有する、または、全ての非ロックド位に２’デオキシを含有する。
【００５５】
例示的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、２’ＯＭｅに修飾された２’位を非ロックド位に含有する。あるいは、非ロックドプリンヌクレオチドは２’位で２’ＯＭｅに修飾されており、非ロックドピリミジンヌクレオチドは２’位で２’−フルオロに修飾されている。
【００５６】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの末端修飾または「キャップ」をさらに含む。キャップは、５’および／または３’キャップ構造であってよい。「キャップ」または「末端キャップ」という用語は、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端における化学修飾（末端リボヌクレオチドに関して）を含み、そして５’末端上の最後の２つのヌクレオチドと３’末端上の最後の２つのヌクレオチドの間の連結における修飾を含む。本明細書に記載のキャップ構造により、ＲＮＡ標的または細胞機構との分子相互作用を損なうことなくオリゴヌクレオチドのエキソヌクレアーゼに対する抵抗性を増大させることができる。そのような修飾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのそれらの効力の増大に基づいて選択することができる。キャップは５’末端に存在してもよく（５’キャップ）、３’末端に存在してもよく（３’キャップ）、両末端上に存在してもよい。ある特定の実施形態では、５’キャップおよび／または３’キャップは、独立に、ホスホロチオエートモノホスフェート、脱塩基残基（部分）、ホスホロチオエート結合、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、反転ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）または反転脱塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ａｂａｓｉｃ）部分（２’−３’または３’−３’）、ホスホロジチオエートモノホスフェート、およびメチルホスホネート部分から選択される。ホスホロチオエート結合またはホスホロジチオエート結合（複数可）は、キャップ構造の一部である場合、一般に、５’末端上の２つの末端ヌクレオチドと３’末端上の２つの末端ヌクレオチドの間に配置される。
【００５７】
ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの末端ホスホロチオエートモノホスフェートを有する。ホスホロチオエートモノホスフェートは、エキソヌクレアーゼの作用を阻害することによってより高い効力を支持し得る。ホスホロチオエートモノホスフェートは、オリゴヌクレオチドの５’末端および／または３’末端にあってよい。ホスホロチオエートモノホスフェートは以下の構造によって定義され、式中、Ｂは塩基であり、Ｒは上記の２’修飾である：
【化２】
2015521626.tif 000009
【００５８】
キャップ構造によりロックドヌクレオチドの化学的性質を支持することができる場合、キャップ構造に本明細書に記載のＬＮＡを組み入れることができる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ホスホロチオエート結合は、例えば、５’末端および３’末端上の最後の２つのヌクレオチド間に存在してもよく（例えば、キャップ構造の一部として）、リン酸ジエステル結合と交互に存在してもよい。これらのまたは他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端と３’末端のいずれかまたはその両方に少なくとも１つの末端脱塩基残基を含有してよい。脱塩基部分は、アデノシン、グアニン、シトシン、ウラシルまたはチミンなどの一般に認識されているプリンヌクレオチド塩基またはピリミジンヌクレオチド塩基を含有しない。したがって、そのような脱塩基部分はヌクレオチド塩基を欠く、または１’位にヌクレオチド塩基ではない他の化学基を有する。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、例えば、逆脱塩基（ｒｅｖｅｒｓｅ  ａｂａｓｉｃ）ホスホルアミダイトが５’アミダイト（３’アミダイトの代わりに）を介してカップリングし、それにより５’−５’リン酸結合が生じた、逆脱塩基ヌクレオチドであってよい。ポリヌクレオチドの５’末端および３’末端の逆脱塩基ヌクレオシドの構造が下に示されている。
【化３】
2015521626.tif 000010
【化４】
2015521626.tif 000011
【００６０】
オリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のホスホロチオエート結合を含有してよい。ホスホロチオエート結合は、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼによる切断に対してより抵抗性にするために使用されてきた。例えば、ポリヌクレオチドは部分的にホスホロチオエート結合していてよく、例えば、ホスホロチオエート結合とリン酸ジエステル結合が交互になっていてよい。しかし、ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは完全にホスホロチオエート結合している。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは１つ〜５つまたは１つ〜３つのリン酸結合を有する。
【００６１】
一部の実施形態では、ヌクレオチドは、本明細書によって参照により組み込まれるＷＯ２０１２／０６１８１０に記載されている１つまたは複数のカルボキシアミド修飾塩基を、そこに複素環置換基と共に開示されている例示的なピリミジンカルボキシアミド修飾の全てに関しても含めて有する。
【００６２】
修飾されたポリヌクレオチドを含めたオリゴヌクレオチドの固相合成による合成は周知であり、Ｎｅｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．  Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  ＭＨ、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ＳＬ、Ｅｆｃａｖｉｔｃｈ  ＪＷ、Ｆｉｓｈｅｒ  ＥＦ、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ  ＭＤ、Ｓｔａｂｉｎｓｋｙ  Ｙ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．  Ｓｅｒ．  １９８０年；（７巻）：２１５〜２３頁に概説されている。
【００６３】
オリゴヌクレオチドは種々の高分子集合体または組成物に組み入れることができる。そのような送達用の複合体としては、患者に送達するために製剤化された種々のリポソーム、ナノ粒子、およびミセルを挙げることができる。複合体は、細胞膜透過を開始させるための１つまたは複数の融合性分子または親油性分子を含んでよい。そのような分子は、例えば、本明細書によってそれらの全体が参照により組み込まれる米国特許第７，４０４，９６９号および米国特許第７，２０２，２２７号に記載されている。あるいは、オリゴヌクレオチドは、細胞への送達を補助するためのペンダント親油基、例えば、脂肪酸、およびその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／１２９６７２に記載されているものなどをさらに含んでよい。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを特定の組織に標的化するためのペンダント親水基をさらに含んでよい。例えば、一実施形態では、オリゴヌクレオチドをマンノース−６−リン酸などの糖部分またはＮ−アセチルグルコサミンなどのアミノ糖とコンジュゲートすることができる。
【００６４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、種々の医薬組成物として製剤化することができる。医薬組成物は、意図された適用のために適した形態に調製する。一般に、これは、発熱物質ならびにヒトまたは動物に対して有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴う。例示的な送達／製剤系としては、コロイド分散系、高分子複合体、ナノカプセル、ナノ粒子、ミクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルション、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを含めた脂質ベースの系が挙げられる。本発明の核酸を心臓組織および骨格筋組織に送達するために適した市販の脂肪エマルション（ｆａｔ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）としては、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩ、Ｌｉｐｏｓｙｎ（登録商標）ＩＩＩ、Ｎｕｔｒｉｌｉｐｉｄ、および他の類似した脂質エマルション（ｌｉｐｉｄ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ）が挙げられる。ｉｎ  ｖｉｖｏ送達ビヒクルとして使用するために好ましいコロイド系はリポソーム（すなわち、人工膜小胞）である。そのような系の調製および使用は当該技術分野において周知である。例示的な製剤は、全てが本明細書によってその全体が参照により組み込まれる、米国特許第５，９８１，５０５号；同第６，２１７，９００号；同第６，３８３，５１２号；同第５，７８３，５６５号；同第７，２０２，２２７号；同第６，３７９，９６５号；同第６，１２７，１７０号；同第５，８３７，５３３号；同第６，７４７，０１４号；およびＷＯ０３／０９３４４９にも開示されている。
【００６５】
組成物または製剤には、本明細書に記載されている少なくとも１種を含めた複数の治療用オリゴヌクレオチドを使用することができる。例えば、組成物または製剤には本明細書に記載されているｍｉＲＮＡ阻害剤の少なくとも２種、３種、４種、または５種を使用することができる。別の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、他の治療様式と組み合わせて使用することができる。組合せはまた、細胞を１つより多くの別個の組成物または製剤と同時に接触させることによって実現することもできる。あるいは、組合せを連続して投与することができる。
【００６６】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドを従来の皮下投与または静脈内投与用に、例えば、滅菌水および通常の生理食塩水を含めた適切な水性希釈剤を用いて製剤化することによって製剤化する。
【００６７】
医薬組成物および製剤には、送達ビヒクルを安定にするために適切な塩および緩衝液を使用することができ、それにより、標的細胞による取り込みが可能になる。本発明の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散させた阻害剤オリゴヌクレオチド（例えば、リポソーム、ナノ粒子、または他の複合体）を含む送達ビヒクルを有効量で含む。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という句は、動物またはヒトに投与した際に有害な反応、アレルギー性反応、または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、ヒトに投与するために適した医薬品などの医薬品の製剤化において使用するために許容される１種または複数種の溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などを含み得る。薬学的に活性な物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は当該技術分野において周知である。補足的な活性成分も組成物に組み入れることができる。
【００６８】
本発明による医薬組成物の投与または送達は、標的組織がその経路によって利用可能である限りはいかなる経路によるものであってもよい。例えば、投与は局所的なものであってもよく、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、動脈内注射、冠内注射、くも膜下腔内注射、または静脈内注射によるものであってもよく、標的組織（例えば、心臓組織）への直接注射によるものであってもよい。本明細書に開示されているオリゴヌクレオチドの安定性および／または効力により、皮下、皮内、静脈内、および筋肉内を含めた簡便な投与経路が可能になる。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物は、カテーテルシステムまたは治療剤を心臓に送達するために冠循環を隔離するシステムによって投与することもできる。治療剤を心臓および冠血管系に送達するための種々のカテーテルシステムが当該技術分野で公知である。本発明において使用するために適したカテーテルに基づく送達方法または冠血管の隔離方法のいくつかの非限定的な例は、全て本明細書によってその全体が参照により組み込まれる米国特許第６，４１６，５１０号；同第６，７１６，１９６号；および同第６，９５３，４６６号；ＰＣＴ公開第ＷＯ２００５／０８２４４０号および同第ＷＯ２００６／０８９３４０号；および米国特許公開第２００７／０２０３４４５号、同第２００６／０１４８７４２号、および同第２００７／００６０９０７号に開示されている。
【００６９】
組成物または製剤はまた、非経口的にまたは腹腔内に投与することもできる。例示として、遊離塩基または薬理学的に許容される塩としてコンジュゲートの溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性物質と適切に混合されている水中で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、ならびにそれらの混合物中、および油中で分散液を調製することもできる。保管および使用の通常の条件下で、これらの調製物は、一般に、微生物の成長を予防するために防腐剤を含有する。
【００７０】
注射用の使用またはカテーテルによる送達のために適した医薬形態としては、例えば、滅菌水溶液または分散液、および滅菌注射用溶液または分散液を即時調製するための滅菌粉末が挙げられる。一般に、これらの調製物は、滅菌されており、容易に注射可能な程度に流動性である。調製物は製造および保管の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の混入作用から保護されるべきである。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、および植物油を含有してよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤を使用することによって、分散液の場合では必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性物質を使用することによって維持することができる。微生物の作用の予防は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらすことができる。多くの場合、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらすことができる。
【００７１】
滅菌注射用溶液は、所望の通り、適量のコンジュゲートを任意の他の成分（例えば、上に列挙されているもの）と一緒に溶媒中に組み入れることによって調製することができる。一般に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基本的な分散媒および所望の他の成分、例えば、上に列挙されているものを含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合では、好ましい調製方法として、活性成分（複数可）と任意の追加的な所望の成分の粉末を予め滅菌濾過したその溶液から得る真空乾燥技法および凍結乾燥技法が挙げられる。
【００７２】
製剤化されたら、溶液は、投薬製剤と適合する様式で、かつ治療的に有効な量で投与されることが好ましい。製剤は、注射用溶液、薬物放出カプセル剤などの種々の剤形で容易に投与することができる。水溶液中で非経口投与するためには、例えば、一般に、溶液を適切に緩衝し、液体希釈剤を、まず、例えば、十分な生理食塩水またはグルコースを用いて等張性にする。そのような水溶液は、例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与のために使用することができる。滅菌水性媒体を当業者に公知の通り、特に本開示に照らして使用することが好ましい。例示として、単一用量を等張性ＮａＣｌ溶液１ｍｌに溶解させ、皮下注入用液１０００ｍｌに添加するか、または提案される注入部位に注射することができる（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」１５版、１０３５〜１０３８頁および１５７０〜１５８０頁を参照されたい）。治療されている対象の状態に応じて投与量のいくらかの変動が必ず生じる。投与を担当する人は、いかなる場合においても、個々の対象に適した用量を決定する。さらに、ヒトに投与するためには、調製物は、必要に応じてＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｓｔａｎｄａｒｄｓによる滅菌、発熱性、一般的な安全性および純度の基準に適合するべきである。
【００７３】
本発明は、オリゴヌクレオチドを細胞に送達する（例えば、本明細書に記載の組成物または製剤の一部として）ための方法、および対象における状態の進行を処置する、好転させる、または予防するための方法を提供する。本明細書で使用される場合、「対象」または「患者」という用語は、これだけに限定することなく、ヒトおよび他の霊長類（例えば、チンパンジーおよび他の類人猿およびサル種）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ）、家畜哺乳動物（例えば、イヌおよびネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、およびモルモットなどのげっ歯類）、ならびに鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウおよび他のキジ類の鳥、アヒル、ガチョウなどの家禽、野鳥および猟鳥）を含めた任意の脊椎動物を指す。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。他の実施形態では、対象はヒトである。
【００７４】
オリゴヌクレオチドまたは医薬組成物をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで標的細胞（例えば、哺乳動物細胞）と接触させることができる。細胞は、腎臓細胞、肝臓細胞、血管細胞、または心臓細胞であってよい。
【００７５】
当該方法は、一般には、オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを含む組成物を対象または細胞に投与することを含む。本明細書に記載のオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの阻害剤であってよい。一部の実施形態では、ｍｉＲＮＡ阻害剤は、ｍｉＲ−２０８ａ阻害剤、ｍｉＲ−２０８ｂ阻害剤、またはｍｉＲ−４９９阻害剤ではない。したがって、患者は、ｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡの発現または調節不全に付随する、それによって媒介される、またはそれによって生じる状態を有してよい。そのような状態としては、これだけに限定されないが、心肥大、心筋梗塞、心不全（例えば、うっ血性心不全）、心筋虚血、虚血再灌流傷害、血管損傷、冠動脈疾患、末梢動脈疾患、不安定プラーク、再狭窄、または病的心臓線維症などの心血管の状態が挙げられる。他の状態として、代謝の状態、腎臓の状態（例えば、腎臓虚血）、肝臓の状態、または肺の状態を挙げることができる。したがって、本発明は、そのような状態を処置するため、およびそのような治療用の医薬を調製するための、本発明の修飾されたオリゴヌクレオチドおよび組成物の使用を提供する。
【００７６】
ある特定の実施形態では、対象（例えば、ヒト患者）は、例えば、これだけに限定されないが、長期にわたる制御されていない高血圧症、矯正されていない弁膜疾患、慢性狭心症、最近の心筋梗塞、うっ血性心不全、心疾患に対する先天性の素因および病的肥大などの状態に対する１つまたは複数の危険因子を有する。その代わりにまたはそれに加えて、患者は、例えば心肥大に対する遺伝的素因を有すると診断されていてもよく、例えば心肥大の家族歴を有してもよい。
【００７７】
この態様では、本発明は、心不全または心肥大の患者における運動耐容能の改善、入院の減少、よりよい生活の質、罹患率の低下、および／または死亡率の低下を提供し得る。
【００７８】
ある特定の実施形態では、心臓組織などの目的の組織における、または血清において決定されるｍｉＲＮＡの活性が低下するまたは阻害される。
【００７９】
種々の実施形態では、医薬組成物を、非経口投与によって、または心臓組織に直接注射することによって投与する。非経口投与は静脈内投与、皮下投与、または筋肉内投与であってよい。一部の実施形態では、組成物を、経口投与、経皮投与、持続放出投与、制御放出投与、遅延放出投与、坐薬投与、カテーテル投与、または舌下投与によって投与する。ある特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドを約２５ｍｇ／ｋｇ以下の用量、または約１０ｍｇ／ｋｇ以下の用量、または約５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与する。これらの実施形態では、オリゴヌクレオチドまたは組成物は、筋肉内注射もしくは皮下注射によって、または静脈内に投与することができる。
【００８０】
一部の実施形態では、当該方法は、処置後にｍｉＲＮＡ阻害剤を除去するまたは取り除くことをさらに含む。例えば、阻害剤の機能を減弱または停止させるために、阻害剤と相補的なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド（例えば、ｍｉＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチド）を治療後に投与することができる。
【００８１】
本発明を、限定するものと解釈されるべきではない以下のさらなる実施例によってさらに例示する。当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでも本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似した結果が得られることを理解するべきである。
【００８２】
本明細書において言及されている刊行物ならびに特許および特許出願は全て、個々の刊行物、特許または特許出願それぞれが、具体的にかつ個別に参照により組み込まれることが示されたものと同じく参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００８３】
（実施例１）
抗ｍｉＲ−２０８ａのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
ＬＮＡ塩基の位置が、長さおよびＬＮＡの割合が同一であるマイクロＲＮＡ阻害剤（抗ｍｉＲ）のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性に影響を及ぼすかどうかを決定するために、ＬＮＡ修飾パターンが異なるいくつかの抗ｍｉＲを設計し、ｉｎ  ｖｉｖｏでｍｉＲＮＡ機能を阻害することにおける有効性について試験した。
【００８４】
以下の表３に示されている通り、種々のＴｍ測定値を有する、ｍｉＲ−２０８ａに対する抗ｍｉＲを１６種（図１Ａ）設計した。
【表３−１】
2015521626.tif 000012
【表３−２】
2015521626.tif 000013
【表４】
2015521626.tif 000014
【００８５】
これらの抗ｍｉＲを、２５ｍｇ／ｋｇの用量で６〜８週齢のスプラーグドーリーラットの背側に皮下注射した（群当たりｎ＝４）。注射体積は１．０ｍＬであった。ＬＮＡおよびＤＮＡの割合が同様（９／７）の対照オリゴヌクレオチドも化学的対照として使用した。この分子番号はＭ−１０５９１であり、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに特定のｍｉＲＮＡを標的とするように設計したものである。単回投与した４日後に、これらのラットを屠殺し、肝毒性および腎毒性のパラメータのために血漿を採取した。さらに、ｍｉＲＮＡの阻害、標的抑制解除、および抗ｍｉＲ分布の定量化を含めた分子分析のために心臓、肝臓、および腎臓を採取した。ＲＮＡを心臓組織から単離し、リアルタイムＰＣＲを実施した。ｍｉＲ−２０８ａに対して設計した全ての抗ｍｉＲによりｍｉＲ−２０８ａの有意な阻害が示され、これにより、全ての抗ｍｉＲが心臓組織に送達されたことが示唆される（図１Ｂ）。ｍｉＲ−２０８ａの阻害がｉｎ  ｖｉｖｏ有効性と相関するかどうかを決定するために、ｍｉＲ−２０８ａの標的の抑制解除について、ｍｉＲ−２０８ａの標的であるＤｙｎｌｔ１についてリアルタイムＰＣＲを実施することによって評価した。驚いたことに、試験した１６種の抗ｍｉＲのうち４種のみでＤｙｎｌｔ１の有意な抑制解除が示された（図１Ｃ）。
【００８６】
これらの抗ｍｉＲのいずれかを用いた処置により肝毒性パラメータおよび／または腎毒性パラメータが上昇したかどうかを決定するために、ＡＬＴ、ＡＳＴ、およびＢＵＮについてのＥＬＩＳＡを実施して、肝機能および腎機能を評価した。抗ｍｉＲ処置群のいずれにおいても、肝毒性パラメータまたは腎毒性パラメータのいずれについてもいかなる上昇も示されなかった（図１Ｄ）。
【００８７】
化合物間の有効性の差異が、有効な分子の心臓へのよりよい分布に起因するかどうかを決定するために、有効性が示された２種の抗ｍｉＲ（Ｍ−１０１０１およびＭ−１０６８３）および有効性が示されなかった２種の抗ｍｉＲ（Ｍ−１０６７３およびＭ−１０６８１）について、心臓、肝臓、および腎臓への抗ｍｉＲの分布を評価した。ＥＬＩＳＡに基づく分布の分析では、有効でない化合物と比較して有効な化合物の心臓でのよりよい存在は示されなかった。実際、有効でない化合物は全ての組織へのよりよい分布を示すと思われた。（図１Ｅ）。
【００８８】
これらのデータにより、抗ｍｉＲ内のＬＮＡおよびＤＮＡの配置が異なることにより、心臓に関して抗ｍｉＲの有効性が有意に異なることが示唆され、Ｍ−１０１０１配列のＬＮＡ／ＤＮＡ「モチーフ」が心臓に関する有効性について最良の化合物であると思われる。
【００８９】
（実施例２）
抗ｍｉＲ−２０８ｂのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
Ｍ−１０１０１の有効なＬＮＡ／ＤＮＡモチーフが、追加的なｍｉＲＮＡに対しても有効を保持するかどうかを試験するために、ｍｉＲ−２０８ｂ、ｍｉＲ−２９、ｍｉＲ−３７８、ｍｉＲ−１９９ａ、およびｍｉＲ−９２ａを含めた他のｍｉＲＮＡについてのこれらのサブセットを試験した。実験計画は全て、実施例１に記載の通りｍｉＲ−２０８ａについて実施したものと同じであった。
【００９０】
以下の表５に示されている通り（表示法についての説明は表４に記載されている）、ＬＮＡおよびＤＮＡの配置がｍｉＲ−２０８ａスクリーンについて見いだされるものと同様である、ｍｉＲ−２０８ｂに対する抗ｍｉＲを９種（図２Ａ）合成し、種々のＴｍ測定値を設計した：
【表５−１】
2015521626.tif 000015
【表５−２】
2015521626.tif 000016
【００９１】
これらの抗ｍｉＲを、２５ｍｇ／ｋｇの用量で６〜８週齢のスプラーグドーリーラットの背側に皮下注射した（群当たりｎ＝４）。注射体積は１．０ｍＬであった。ＬＮＡおよびＤＮＡの割合が同様（９／７）の対照オリゴヌクレオチドも化学的対照として使用した。この分子番号はＭ−１０５９１であり、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに特定のｍｉＲＮＡを標的とするように設計したものである。単回投与した４日後に、これらのラットを屠殺し、ｍｉＲＮＡの阻害および標的抑制解除を含めた分子分析のために心臓を採取した。ＲＮＡを心臓組織から単離し、リアルタイムＰＣＲを実施した。ｍｉＲ−２０８ｂに対して設計した全ての抗ｍｉＲによりｍｉＲ−２０８ｂの有意な阻害が示され、これにより、全ての抗ｍｉＲが心臓組織に送達されたことが示唆される（図２Ｂ）。ｍｉＲ−２０８ｂの阻害がｉｎ  ｖｉｖｏ有効性と相関するかどうかを決定するために、ｍｉＲ−２０８ｂの標的であるＤｙｎｌｔ１の抑制解除について、リアルタイムＰＣＲを実施することによって評価した。驚いたことに、ｍｉＲ−２０８ａに対して最も良い有効性を示したものと同じＬＮＡ／ＤＮＡモチーフである（図１Ｃ）Ｍ−１０７０７のみでＤｙｎｌｔ１の有意な抑制解除が示された（図２Ｃ）。
【００９２】
これらのデータにより、Ｍ−１０１０１およびＭ−１０７０７のＬＮＡ／ＤＮＡモチーフ（同じである）により、ｉｎ  ｖｉｖｏでの心臓に関する有効性が付与されることが示唆される。
【００９３】
（実施例３）
抗ｍｉＲ−３７８のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
モチーフＭ−１０１０１がｍｉＲ−２０８ファミリーを超えて拡張するかどうかを決定するために、以下の表６に示されている通り（表示法についての説明は表４に記載されている）、種々のＴｍ測定値を有し、ＬＮＡおよびＤＮＡの配置がｍｉＲ−２０８ａスクリーンについて見いだされるものと同様である、ｍｉＲ−３７８に対する抗ｍｉＲを７種（図３Ａ）設計し、合成した。
【表６】
2015521626.tif 000017
【００９４】
これらの抗ｍｉＲを、２５ｍｇ／ｋｇの用量で６〜８週齢のスプラーグドーリーラットの背側に皮下注射した（群当たりｎ＝４）。注射体積は１．０ｍＬであった。ＬＮＡおよびＤＮＡの割合が同様（９／７）の対照オリゴヌクレオチドも化学的対照として使用した。この分子番号はＭ−１０５９１であり、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに特定のｍｉＲＮＡを標的とするように設計したものである。単回投与した４日後に、これらのラットを屠殺し、ｍｉＲＮＡの阻害および標的抑制解除を含めた分子分析のために心臓を採取した。ＲＮＡを心臓組織から単離し、リアルタイムＰＣＲを実施した。ｍｉＲ−３７８に対して設計した全ての抗ｍｉＲによりｍｉＲ−３７８の有意な阻害が示され、これにより、全ての抗ｍｉＲが心臓組織に送達されたことが示唆される（図３Ｂ）。ｍｉＲ−３７８の阻害がｉｎ  ｖｉｖｏ有効性と相関するかどうかを決定するために、本発明者らは、ｍｉＲ−３７８の標的であるＧｆｐｔ２の抑制解除について、リアルタイムＰＣＲを実施することによって評価した。驚いたことに、心臓においてｍｉＲ−２０８ａおよびｍｉＲ−２０８ｂに対して最も良い有効性を示した（図１Ｃおよび図２Ｃ）ものと同じＬＮＡ／ＤＮＡモチーフであるＭ−１１１９２のみでＧｆｐｔ２の有意な抑制解除が示された（図３Ｃ）。
【００９５】
これらのデータにより、Ｍ−１０１０１、Ｍ−１０７０７、およびＭ−１１１９２のＬＮＡ／ＤＮＡモチーフ（同じである）により、ｉｎ  ｖｉｖｏでの心臓に関する有効性が付与されることが強く示唆される。
【００９６】
（実施例４）
抗ｍｉＲ−２９のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
ＬＮＡおよびＤＮＡの配置がｍｉＲ−２０８ａスクリーンについて見いだされるものと同様である、ｍｉＲ−２９ｂに対する抗ｍｉＲを７種（図４Ａ）合成して、このモチーフによりさらなるｍｉＲＮＡファミリーにおける有効性が付与されるかどうかを決定した。対応する予測Ｔｍ値を有するこれらの抗ｍｉＲの配列および修飾パターンが以下の表７に示されている（表示法についての説明は表４に記載されている）。
【表７】
2015521626.tif 000018
【００９７】
これらの抗ｍｉＲを、２５ｍｇ／ｋｇの用量で６〜８週齢のスプラーグドーリーラットの背側に皮下注射した（群当たりｎ＝４）。注射体積は１．０ｍＬであった。ＬＮＡおよびＤＮＡの割合が同様（９／７）の対照オリゴヌクレオチドも化学的対照として使用した。この分子番号はＭ−１０５９１であり、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに特定のｍｉＲＮＡを標的とするように設計したものである。単回投与した４日後に、これらのラットを屠殺し、ｍｉＲＮＡの阻害、標的抑制解除、および抗ｍｉＲ分布の定量化を含めた分子分析のために心臓、肝臓、および腎臓を採取した。ＲＮＡを心臓組織、肝臓組織、および腎臓組織から単離し、リアルタイムＰＣＲを実施した。ｍｉＲ−２９に対して設計した全ての抗ｍｉＲにより、全ての組織においてｍｉＲ−２９ファミリーメンバーの有意な阻害が示され、これにより、全ての抗ｍｉＲがこれらの３つの組織に送達されたことが示唆される（図４Ｂ）。
【００９８】
ｍｉＲ−２９ファミリーの阻害がｉｎ  ｖｉｖｏ有効性と相関するかどうかを決定するために、ｍｉＲ−２９の標的であるＭｃｌ１およびＤｎｍｔ３ｂの抑制解除について、リアルタイムＰＣＲを実施することによって評価した。驚いたことに、心臓においてｍｉＲ−２０８ａ、ｍｉＲ−２０８ｂ、およびｍｉＲ−３７８に対して最も良い有効性を示したものと同じＬＮＡ／ＤＮＡモチーフである（図１Ｃ、２Ｃ、および３Ｃ）Ｍ−１１１８５のみで心臓におけるＭｃｌ１の有意な抑制解除が示され、Ｄｎｍｔ３ｂの抑制解除の傾向が見られた（図４Ｃ）。驚いたことに、全ての抗ｍｉＲ−２９化合物により肝臓におけるＭｃｌ１の抑制解除が示されると思われ、これにより、このモチーフは心臓に関する有効性を付与し、他方で他の化合物は他の組織において活性であるという概念が助長される。
【００９９】
化合物間の有効性の差異が、有効な分子の心臓へのよりよい分布に起因するかどうかを決定するために、本発明者らは、全ての抗ｍｉＲ−２９化合物について、心臓および肝臓への抗ｍｉＲの分布を定量化した。ＥＬＩＳＡに基づく分布の分析では、最も有効な化合物（Ｍ−１１１８５）について有効性がより低い化合物と比較して心臓でのよりよい存在は示されなかった。化合物間で有効性が同様であった肝臓の組織については、分布も同様であった（図４Ｄ）。
【０１００】
（実施例５）
抗ｍｉＲ−１９９のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
ＬＮＡおよびＤＮＡの配置がｍｉＲ−２０８ａスクリーンについて見いだされるものと同様であるｍｉＲ−１９９ａに対する抗ｍｉＲを５種（図５Ａ）合成して、このモチーフによりさらなるｍｉＲＮＡファミリーにおける有効性が付与されるかどうかを決定した。対応する予測Ｔｍ値を有するこれらの抗ｍｉＲの配列および修飾パターンが以下の表８に示されている（表示法についての説明は表４に記載されている）。Ｍ−１０５１８化合物は、Ｍ−１０１０１（抗ｍｉＲ−２０８ａ）、Ｍ−１０７０７（抗ｍｉＲ−２０８ｂ）、Ｍ−１１１９２（抗ｍｉＲ−３７８）、およびＭ−１１１８５（抗ｍｉＲ−２９）と同じＬＮＡおよびＤＮＡの配置を含有する。
【表８】
2015521626.tif 000019
【０１０１】
これらの抗ｍｉＲを、２５ｍｇ／ｋｇの用量で６〜８週齢のスプラーグドーリーラットの背側に皮下注射した（群当たりｎ＝４）。注射体積は１．０ｍＬであった。ＬＮＡおよびＤＮＡの割合（９／７）が同様の対照オリゴも化学的対照として使用した。この分子番号はＭ−１０５９１であり、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓに特定のｍｉＲＮＡを標的とするように設計したものである。単回投与した４日後に、これらのラットを屠殺し、肝毒性および腎毒性のパラメータのために血漿を採取した。さらに、ｍｉＲＮＡの阻害および標的抑制解除を含めた分子分析のために心臓、肺、肝臓、および腎臓を採取した。ＲＮＡを心臓組織、肺組織、肝臓組織、および腎臓組織から単離し、リアルタイムＰＣＲを実施した。ｍｉＲ−１９９ａに対して設計した全ての抗ｍｉＲにより、全ての組織においてｍｉＲ−１９９ａの有意な阻害が示され、これにより、全ての抗ｍｉＲがこれらの４つの組織に送達されたことが示唆される（図５Ｂ）。
【０１０２】
ｍｉＲ−１９９ａの阻害がｉｎ  ｖｉｖｏ有効性と相関するかどうかを決定するために、ｍｉＲ−１９９の標的であるＤｄｒ１の抑制解除について、本発明者らは、リアルタイムＰＣＲを実施することによって評価した。驚いたことに、Ｍ−１１３９０を除くｍｉＲ−１９９ａを標的とする全ての抗ｍｉＲにより心臓におけるＤｄｒ１標的抑制解除が示されるように思われた（図５Ｃ）。他の組織については、異なる化合物により種々の程度の標的調節が示されたが、Ｍ−１０５１８（Ｍ−１０１０１モチーフである）では、一貫して、全ての組織について標的抑制解除が示されるように思われ、これにより、このモチーフにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで心臓組織および多組織に関する有効性が付与されることが示唆される。
【０１０３】
（実施例６）
抗ｍｉＲ−９２ａのｉｎ  ｖｉｖｏ有効性
ＬＮＡおよびＤＮＡの配置がｍｉＲ−２０８ａスクリーンについて見いだされるものと同様であるｍｉＲ−９２ａに対する抗ｍｉＲを３種合成して、このモチーフによりさらなるｍｉＲＮＡファミリーにおける有効性が付与されるかどうかを決定した。対応する予測Ｔｍ値を有するこれらの抗ｍｉＲの配列および修飾パターンが以下の表９に示されている（表示法についての説明は表４に記載されている）。Ｍ−１１１２７化合物は、Ｍ−１０１０１（抗ｍｉＲ−２０８ａ）、Ｍ−１０７０７（抗ｍｉＲ−２０８ｂ）、Ｍ−１１１９２（抗ｍｉＲ−３７８）、Ｍ−１１１８５（抗ｍｉＲ−２９）、およびＭ−１０５１８（抗ｍｉＲ−１９９ａ）と同じＬＮＡおよびＤＮＡの配置を含有する。
【表９】
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【０１０４】
これらの抗ｍｉＲを、２５ｍｇ／ｋｇの用量で６〜８週齢のスプラーグドーリーラットの背側に皮下注射した（群当たりｎ＝４）。注射体積は１．０ｍＬであった。単回投与した２日後に、これらのラットを屠殺し、ｍｉＲＮＡの阻害および標的抑制解除を含めた分子分析のために心臓から内皮細胞を採取した。ＲＮＡを内皮細胞から単離し、リアルタイムＰＣＲを実施してｍｉＲ−９２ａの標的であるＭａｐ２Ｋ４の抑制解除を評価した。抗ｍｉＲ  Ｍ−１１１２７（Ｍ−１０１０１モチーフである）ならびに抗ｍｉＲ  Ｍ−１１１３０を投与することにより、内皮細胞におけるＭａｐ２Ｋ４の発現が有意に増加し（図６）、これにより、これらの２つの阻害剤がｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を有することが実証された。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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