(57)【要約】【解決手段】  本発明は、改良された性能特性を備えるイソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドに関する方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、組換え宿主細胞においてイソプレン生産を増加させる、マメ科植物イソプレン合成酵素を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも４０％の配列同一性を含み、前記ポリペプチドは、配列番号１に対応する１つ以上のアミノ酸残基に対応する１つ以上のアミノ酸残基を有し、前記１つ以上のアミノ酸残基は、Ｆ２８７、Ｇ３９７、Ｎ４３８、Ｅ４５１、及びＹ５１４からなる群から選択され、前記単離ポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（P. montana）のものではない、単離ポリペプチド。
【請求項２】
前記単離ポリペプチドが、ラッカセイ種（Arachis sp.）、ムクナ種（Mucana sp.）、キマメ種（Cajanus sp.）、ダイズ種（Glycine sp.）、ミヤコグサ種（Lotus sp.）、及びウマゴヤシ種（Medicago sp.）からなる群から選択されるイソプレン合成酵素である、請求項１に記載の単離ポリペプチド。
【請求項３】
前記単離ポリペプチドが、ラッカセイ（A. hypogaea）、ハッショウマメ（M. pruriens）、キマメ（C. cajans）、ダイズ（G. max）、ツルマメ（G. soja）、ミヤコグサ（L. japonicus）、及びタルウマゴヤシ（M. truncatula）からなる群から選択されるイソプレン合成酵素である、請求項２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項４】
前記単離ポリペプチドが、ラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素である、請求項２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項５】
前記単離ポリペプチドが、ハッショウマメ（M. pruriens）イソプレン合成酵素である、請求項２に記載の単離ポリペプチド。
【請求項６】
前記単離ポリペプチドが、ポプラ（poplar）イソプレン合成酵素と比較して基質阻害が低減されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項７】
前記単離ポリペプチドが、ポプラ（poplar）イソプレン合成酵素と比較して向上されているイソプレン合成酵素活性を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項８】
向上されているイソプレン合成酵素活性が、ポプラ（poplar）イソプレン合成酵素を含む宿主細胞と比較してメバロン酸の存在下での増殖性が改良されていることを示す前記イソプレン合成酵素を含む宿主細胞により表される、請求項７に記載の単離ポリペプチド。
【請求項９】
前記単離ポリペプチドが、ラッカセイ（A. hypogaea）（配列番号３）、ダイズ１（G. max 1）（配列番号５）、ダイズ２（G. max 2）（配列番号７）、ハッショウマメ（M. pruriens）（配列番号９）、及びキマメ（C. cajans）（配列番号１１）からなる群から選択されるイソプレン合成酵素である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１０】
前記単離ポリペプチドが、配列番号３のアミノ酸配列を含むラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素である、請求項９に記載の単離ポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号３のアミノ酸配列を含むマメ科植物イソプレン合成酵素に対し少なくとも７０％の配列同一性を含む、イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチド。
【請求項１２】
前記イソプレン合成酵素が、少なくとも約１．３のＫｃａｔ値を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のイソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチド。
【請求項１３】
前記イソプレン合成酵素が、少なくとも約２．５のＫｍ値を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のイソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチド。
【請求項１４】
前記イソプレン合成酵素が、少なくとも約１３．０のＫｉ値を有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のイソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチド。
【請求項１５】
イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むポプラ（poplar）イソプレン合成酵素に対し少なくとも４０％配列同一性を含み、及び前記ポリペプチドが、少なくとも約１．３のＫｃａｔ値を有する、単離ポリペプチド。
【請求項１６】
イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、前記配列番号１のアミノ酸配列を含むポプラ（poplar）イソプレン合成酵素に対し少なくとも４０％配列同一性を含み、前記ポリペプチドが少なくとも約２．５のＫｍ値を有する、単離ポリペプチド。
【請求項１７】
イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列を含むポプラ（poplar）イソプレン合成酵素に対し少なくとも４０％配列同一性を含み、及び前記ポリペプチドが少なくとも約１３．０のＫｉ値を有する、単離ポリペプチド。
【請求項１８】
操作可能なようにプロモータと組み合わせられた請求項１〜１７のいずれか一項に記載のイソプレン合成酵素をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
【請求項１９】
前記ポリヌクレオチド配列が、プラスミド内に含有される、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２０】
前記ポリヌクレオチド配列が、前記宿主細胞の染色体に組み込まれる、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２１】
前記宿主細胞が、グラム陽性菌細胞、グラム陰性菌細胞、糸状菌細胞、及び酵母細胞からなる群から選択される、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２２】
前記宿主が、エシェリキア種（Escherichia sp.）（大腸菌（E. coli））、パントエア種（Panteoa sp.）（パントエア・シトレア（P. citrea））、バチルス種（Bacillus sp.）（バチルス・スブチリス（B. subtilis））、ヤロウイア種（Yarrowia sp.）（ヤロワイア・リポリィティカ（Y. lipolytica））、トリコデルマ（trichoderma）（トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei））及びサッカロミセス（Saccharomyces）（サッカロミセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae））からなる群から選択される、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞が、グルコース、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、酵母エキス、バイオマス、糖蜜、スクロース、及び油からなる群から選択される炭素源を含有する培地で培養される、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記宿主細胞が、１種以上のメバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチドをコードする１つ以上の異種又は天然の核酸を更に含む、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記宿主細胞が、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）及びエンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）由来のＭＶＡ経路のポリペプチドからなる群から選択されるメバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチドをコードする異種核酸を更に含む、請求項２４に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
ＩＤＩポリペプチドをコードする異種又は天然の核酸をコードする１つ以上の核酸を更に含む、請求項２４に記載の宿主。
【請求項２７】
前記宿主細胞が、所望により前記天然のＤＸＰ経路と組み合わせて、ＩＤＩポリペプチドをコードする異種又は天然の核酸並びに／あるいはＤＸＳポリペプチドをコードする異種又は天然の核酸を更に含む、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記宿主細胞が、ＩＤＩポリペプチド及び前記ＤＸＳポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を更に含む、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
前記宿主細胞が、前記イソプレン合成酵素、前記ＩＤＩポリペプチド、及び前記ＤＸＳポリペプチドをコードする１種のベクターを含む、請求項２７に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
前記宿主細胞が、ＭＶＡ経路のポリペプチド及び／又はＤＸＳポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を更に含む、請求項１８に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
前記宿主細胞が、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、前記ＤＸＰ経路に関係するその他の１種以上のポリペプチド、又はＭＶＡ経路のポリペプチド、をコードする１つ以上の核酸を更に含む、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項３２】
ＤＸＳを更に含む、請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項３３】
（ａ）イソプレン生産に好適な培養条件下で、請求項１８〜３２のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養する工程、並びに
（ｂ）前記イソプレンを生産させる工程、を含む、イソプレン生産方法。
【請求項３４】
（ｃ）前記イソプレンを回収する工程、を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
（ｄ）前記イソプレンを重合させる工程、を更に含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
イソプレン合成酵素活性を検出する方法であって、（ａ）前記発現ベクターを含む宿主細胞を、マメ科植物イソプレン合成酵素を生産させるのに好適な条件下で培養する工程、（ｂ）リゾチームを含む溶解緩衝液で前記宿主細胞を溶解させて、細胞可溶化液を生成する工程、並びに（ｃ）ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）から生成されるイソプレンを測定することにより、前記細胞可溶化液に含まれるイソプレン合成酵素活性を検出する工程、を含む、方法。
【請求項３７】
前記宿主細胞が、グラム陽性菌細胞、グラム陰性菌細胞、糸状菌細胞、及び酵母細胞からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記宿主細胞が、エシェリキア種（Escherichia sp.）（大腸菌（E. coli））、パントエア種（Panteoa sp.）（パントエア・シトレア（P. citrea））、バチルス種（Bacillus sp.）（バチルス・スブチリス（B. subtilis））、ヤロウイア種（Yarrowia sp.）（ヤロワイア・リポリィティカ（Y. lipolytica））、トリコデルマ（trichoderma）（トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei））及びサッカロミセス（Saccharomyces）（サッカロミセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae））からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記宿主細胞が、グルコース、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、酵母エキス、バイオマス、糖蜜、スクロース、及び油からなる群から選択される炭素源を含有する培地で培養される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
ハイスループットスクリーニングにおいて、複数のサンプル中のイソプレンを検出する方法であって、
（ａ）ｉ）それぞれがイソプレン合成酵素を含む複数のサンプル、ｉｉ）複数のウェルを含むガラスプレート、及びｉｉｉ）ガラスプレート用シールを準備する工程、
（ｂ）前記ガラスプレートの前記複数のウェル中に前記複数のサンプルを配置する工程、
（ｃ）前記シールにより前記ガラスプレートを密閉して、前記複数のウェルのそれぞれの中の前記サンプルと関連するヘッドスペースを有する密閉されたガラスプレートを作り出す工程、
（ｄ）前記イソプレン合成酵素が活性である条件下で前記ガラスプレートをインキュベートする工程、並びに
（ｅ）前記ヘッドスペース中のイソプレンを検出する工程、を含む、方法。
【請求項４１】
前記イソプレンが、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）により検出される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記複数のサンプルが、操作可能なようにプロモータと組み合わせられたイソプレン合成酵素変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記複数のサンプルが、前記宿主細胞の可溶化液、リゾチーム、及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記ガラスプレートが、ディープウェルガラスブロックである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記複数のウェルが、少なくとも２４ウェルから構成される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記複数のウェルのそれぞれが、２ｍＬ以下の容量を含む、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許仮出願番号第６１／６４１，８６１号（２０１２年５月２日出願）、並びに米国特許出願第１３／８０２，３６０号（２０１３年３月１３日）に対する優先権を主張し、これらの開示は、参照によりその全容が本明細書に援用される。
【０００２】
（参考文献による組み込み）
ＡＳＣＩＩテキストファイル（ＳＴ．２５テキストフォーマット）上の次の提出書類の内容は、参照によりその全体が本案件に援用される：コンピュータ読み取り可能な形態（ＣＲＦ）の配列リスト（ファイル名「６４３８４２００４６４０＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」；データ記録日：２０１３年４月２６日；及びＡＳＣＩＩテキストファイルのファイルサイズ１８５，９７２バイト）
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、改良されたイソプレン生産のためのイソプレン合成酵素を含む方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、宿主細胞においてイソプレン生産を増加させる、マメ科植物イソプレン合成酵素を提供する。
【背景技術】
【０００４】
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、水不溶性でかつアルコール溶解性の揮発性炭化水素である。採算の合う量のイソプレンは、石油分解生成物中のＣ５留分から直接得ることができ、あるいはＣ５イソアルカン又はイソアルケンを脱水することにより得ることができる（Ｗｅｉｓｓｅｒｍｅｌ  ａｎｄ  Ａｒｐｅ，工業有機化学（Industrial Organic Chemistry），第４版，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ｐｐ．１１７〜１２２，２００３）。Ｃ５骨格は、より小さなサブユニットから合成することもできる。しかしながら、再生不能資源に依存せずとも採算の合うイソプレン生産方法が所望されている。
【０００５】
ポリイソプレン及び多様なコポリマー（イソブチレン、ブタジエン、スチレン、又は他のモノマー）の製造にイソプレンモノマーを使用する。採算の合うレベルのイソプレンを生産し得る株（原核生物又は真核生物の株）を樹立するには、ＤＸＰ又はＭＶＡ経路の一部又は全体、あるいはＭＶＡ及びＤＸＰ経路の両方を最適化する必要がある。この経路において鍵となる酵素はイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）であり、この酵素は前駆体であるＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する。これまでに同定されているイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）としては、ポプラ（poplar）、ヨーロッパナラ（English oak）及びクズ（kudzu vine）などの植物由来のものが挙げられる。同定されている植物ＩｓｐＳ酵素のうちいくつかは、大腸菌で発現させることによりある程度特性評価されており、これらの酵素のいくつかの動態パラメーターは、精製タンパク質をもとにインビトロで決定されている。しかしながら、天然のＩｓｐＳ酵素及び更には一部の組換え酵素の動態パラメーター（Ｋｍ、Ｋｉ、及びＫｃａｔを含む）は、宿主生物におけるイソプレンの商業生産には不十分である。加えて、発現レベルが不十分であることに起因して、一部のＩｓｐＳ酵素の商業利用は制限され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、解決すべき課題のうち１つとしては、商業利用用に、より多量のイソプレンを生物学的に生産することができるよう改良された特性を有するイソプレン合成酵素を提供することが挙げられる。本明細書に記載されるような課題を解決するにあたり、改良された特性を有するイソプレン合成酵素を宿主（例えば、宿主微生物）で発現させることができる。特に、本発明は、宿主細胞におけるイソプレン生産の向上のため改良された特徴を示すマメ科植物イソプレン合成酵素を提供する。
【０００７】
本明細書において引用するすべての特許、特許出願、刊行物、文書、ヌクレオチド及びタンパク質配列のデータベースのアクセッション番号、それらが示す配列、並びに論文は、いずれも参照によりそれらの全容を本明細書に援用するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書で提供される発明は、とりわけ、イソプレン生産に関し改良された特性を備え、イソプレン合成酵素活性を有する、ポリペプチド組成物、並びにイソプレン生産のためこのようなポリペプチドを特定、生産及び使用する方法を開示する。いくつかの態様では、本発明は、宿主細胞におけるイソプレン生産を向上させるためのマメ科植物イソプレン合成酵素を提供する。
【０００９】
適宜に、いくつかの態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有する、マメ科植物由来の単離ポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、配列番号１に対し少なくとも４０％の配列同一性を有し、前記ポリペプチドは、配列番号１に対応する１つ以上のアミノ酸残基に対応する１つ以上のアミノ酸残基を有し、前記１つ以上のアミノ酸残基は、Ｆ２８７、Ｇ３９７、Ｎ４３８、Ｅ４５１、及びＹ５１４からなる群から選択される。他の態様では、単離ポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（P. montana）由来のものではない。いくつかの態様では、単離ポリペプチドは、ラッカセイ種（Arachis sp.）、ムクナ種（Mucana sp.）、キマメ種（Cajanus sp.）、ダイズ種（Glycine sp.）、ミヤコグサ種（Lotus sp.）、及びウマゴヤシ種（Medicago sp.）からなる群から選択されるイソプレン合成酵素である。更なる態様では、単離ポリペプチドは、ラッカセイ（A. hypogaea）、ハッショウマメ（M. pruriens）、キマメ（C. cajans）、ダイズ（G. max）、ツルマメ（G. soja）、ミヤコグサ（Lotus japonicus）及びタルウマゴヤシ（M. truncatula）からなる群から選択されるイソプレン合成酵素である。尚更なる態様では、すなわち請求項２に記載の単離ポリペプチドでは、単離ポリペプチドはラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素である。更に別の態様では、単離ポリペプチドはハッショウマメ（M. pruriens）イソプレン合成酵素である。いくつかの態様では、本発明は、ポプラ（poplar）イソプレン合成酵素と比較した場合に、少なくとも１つの特性が改良されているマメ科植物イソプレン合成酵素を提供する。いくつかの態様では、改良されている少なくとも１つの特性は、限定するものではないが、比生産性、収率、細胞性能指数及びタンパク質発現からなる群から選択される。いくつかの態様では、改良されている少なくとも１つの特性は、限定するものではないが、比活性、Ｋｃａｔ、Ｋｉ、及びＫｍからなる群から選択される。本明細書における任意の態様では、単離ポリペプチドは、ポプラ（poplar）イソプレン合成酵素と比較して基質阻害が低減されている。本明細書における任意の態様では、単離ポリペプチドは、ポプラ（poplar）イソプレン合成酵素と比較して向上されているイソプレン合成酵素活性を有する。いくつかの態様では、向上されているイソプレン合成酵素活性は、イソプレン合成酵素を含む宿主細胞の、メバロン酸の存在下での増殖性が、ポプラ（poplar）イソプレン合成酵素を含む宿主細胞と比較して改良されていることを示すことにより表される。本明細書における任意の態様では、単離ポリペプチドは、ラッカセイ（A. hypogaea）（配列番号３）、ダイズ１（G. max 1）（配列番号５）、ダイズ２（G. max 2）（配列番号７）、ハッショウマメ（M. pruriens）（配列番号９）、並びにキマメ（C. cajans）（配列番号１１）からなる群から選択されるイソプレン合成酵素である。更なる態様では、単離ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含むラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素である。
【００１０】
加えて、いくつかの態様では、本発明は、配列番号３に対し少なくとも７０％の配列同一性を含み、イソプレン合成酵素活性を有する、マメ科植物由来の単離ポリペプチドを提供する。本明細書における任意の態様、すなわちイソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドでは、少なくとも約１．３のＫｃａｔ値を有する前記イソプレン合成酵素が提供される。本明細書における任意の態様、すなわちイソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドでは、少なくとも約２．５のＫｍ値を有する前記イソプレン合成酵素が提供される。本明細書における任意の態様、すなわちイソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドでは、少なくとも約１３．０のＫｉＤＭＡＰＰ値を有する前記イソプレン合成酵素が提供される。
【００１１】
加えて、いくつかの態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有する、マメ科植物由来の単離ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、配列番号１に対し少なくとも４０％の配列同一性を含み、かつ前記ポリペプチドは、少なくとも約１．３のＫｃａｔ値を有する。他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有する、マメ科植物由来の単離ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、配列番号１に対し少なくとも４０％の配列同一性を含み、かつ前記ポリペプチドは、少なくとも約２．５のＫｍ値を有する。更に他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有する、マメ科植物由来の単離ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、配列番号１に対し少なくとも４０％の配列同一性を含み、かつ前記ポリペプチドは、少なくとも約１３．０のＫｉＤＭＡＰＰ値を有する。本明細書における任意の態様では、操作可能なようにプロモータと組み合わせられたイソプレン合成酵素をコードする異種ポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞が提供される。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド配列は、プラスミド内に含有される。他の態様では、ポリヌクレオチド配列は、宿主細胞の染色体に組み込まれる。更に他の態様では、宿主は、グラム陽性菌細胞、グラム陰性菌細胞、糸状菌細胞、及び酵母細胞からなる群から選択される。他の態様では、宿主は、エシェリキア種（Escherichia sp.）（大腸菌（E. coli））、パントエア種（Panteoa sp.）（パントエア・シトレア（P. citrea））、バチルス（Bacillus sp.）（バチルス・スブチリス（B. subtilis））、ヤロウイア（Yarrowia sp.）（ヤロワイア・リポリィティカ（Y. lipolytica））、トリコデルマ（trichoderma）（トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei））及びサッカロミセス（Saccharomyces）（サッカロミセス・セレヴィシエ）からなる群から選択される。いくつかの態様では、宿主細胞は、グルコース、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、酵母エキス、バイオマス、糖蜜、スクロース、及び油脂からなる群から選択される炭素源を含有する培地で培養される。本明細書における任意の態様では、宿主細胞は、メバロン酸（ＭＶＡ）経路のポリペプチドを１種以上コードする１つ以上の異種又は天然の核酸を更に含む。いくつかの態様では、宿主細胞は、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）、及びエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）由来のＭＶＡ経路のポリペプチドからなる群から選択される、メバロン酸（ＭＶＡ）経路のポリペプチドをコードする異種核酸を更に含む。一部の他の態様では、ＩＤＩポリペプチドをコードする異種又は天然の核酸をコードする１つ以上の核酸を更に含む宿主細胞が提供される。いくつかの態様では、宿主細胞は、ＩＤＩポリペプチドをコードする異種又は天然の核酸並びに／あるいはＤＸＳポリペプチドをコードする異種又は天然の核酸を、所望により天然のＤＸＰ経路と組み合わせて更に含む。いくつかの態様では、宿主細胞は、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を更に含む。一部の更なる態様では、宿主細胞は、イソプレン合成酵素、ＩＤＩポリペプチ���、及びＤＸＳポリペプチドをコードする１種のベクターを含む。更に他の態様では、宿主細胞は、ＭＶＡ経路のポリペプチド及び／又はＤＸＳポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を更に含む。更なる態様では、宿主細胞は、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＤＸＰ経路に関係するその他の１つ以上のポリペプチド、又はＭＶＡ経路のポリペプチド、をコードする１つ以上の核酸を更に含む。一部の更なる態様では、更にＤＸＳを含む宿主細胞が提供される。
【００１２】
更に、いくつかの態様では、本発明は、イソプレン生産方法であって、（ａ）イソプレン生産に好適な培養条件下で、本明細書における任意の態様の宿主細胞を培養する工程、並びに（ｂ）イソプレンを生産する工程、を含む、方法を提供する。一部の更なる態様では、（ｃ）イソプレンを回収する工程、を更に含む方法が提供される。尚更なるいくつかの態様では、（ｄ）イソプレンを重合させる工程、を更に含む方法が提供される。
【００１３】
更に、いくつかの態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を検出する方法を更に提供し、方法は：（ａ）発現ベクターを含む宿主細胞を、マメ科植物イソプレン合成酵素を生産させるのに好適な条件下で培養する工程、（ｂ）リゾチームを含む溶解緩衝液で宿主細胞を溶解させて、細胞可溶化液を生成する工程、並びに（ｃ）ジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）から生成されるイソプレンを測定することにより、細胞可溶化液に含まれるイソプレン合成酵素活性を検出する工程、を含む。いくつかの態様では、宿主細胞は、グラム陽性菌細胞、グラム陰性菌細胞、糸状菌細胞、及び酵母細胞からなる群から選択される。一部の更なる態様では、エシェリキア種（Escherichia sp.）（大腸菌（E. coli））、パントエア種（Panteoa sp.）パントエア・シトレア（P. citrea）、バチルス（Bacillus sp.）（バチルス・スブチリス（B. subtilis））、ヤロウイア（Yarrowia sp.）（ヤロワイア・リポリィティカ（Y. lipolytica））、トリコデルマ（trichoderma）（トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei））、及びサッカロミセス（Saccharomyces）（サッカロミセス・セレヴィシエ）からなる群から選択される宿主細胞が提供される。他の態様では、宿主細胞はグルコース、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、酵母エキス、バイオマス、糖蜜、スクロース、及び油脂からなる群から選択される炭素源を含有する培地で培養される。
【００１４】
いくつかの態様では、本発明は、ハイスループットスクリーニングで複数のサンプル中のイソプレンを検出する方法を提供し、方法は、（ａ）ｉ）それぞれがイソプレン合成酵素を含む複数のサンプル、ｉｉ）複数個のウェルを含むガラスプレート、及びｉｉｉ）ガラスプレート用シール、を提供する工程と、（ｂ）ガラスプレートの複数個のウェル中に複数のサンプルを配置する工程と、（ｃ）ガラスプレートをシール材によりシールすることで、複数個のウェルのそれぞれの中にサンプルに関連するヘッドスペースを有するシールされたガラスプレートを準備する工程と、（ｄ）イソプレン合成酵素が活性である条件下でガラスプレートをインキュベートする工程と、（ｅ）ヘッドスペース中のイソプレンを検出する工程と、を含む。一態様では、イソプレンは、ガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）により検出される。更なる態様では、複数のサンプルが、操作可能なようにプロモータと組み合わせられたイソプレン合成酵素変異体をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む宿主細胞を含む、方法が提供される。他の更なる態様では、複数のサンプルが、宿主細胞可溶化液、リゾチーム、及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）を含む方法が提供される。尚更なる他の態様では、ガラスプレートがディープウェルガラスブロックである方法が提供される。尚更なる他の態様では、複数個のウェルが、少なくとも２４ウェルから構成されるものである、方法が提供される。一部の更なる態様では、複数個のウェルのそれぞれが２ｍＬ以下の容量を含むものである、方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素（「ピーナッツ」とも表記）及びＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素のアミノ酸配列のアラインメントである。これらの配列は残基３から開始するものとして示される（配列番号５６、５７）。
【図２Ａ】ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素を参照配列として用いる、推定上のイソプレン合成酵素のアミノ酸配列のアラインメントである。配列アラインメントの最下部に共通配列を示す（それぞれ配列番号１８、２０、２２、２４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、２６、１、２８）。
【図２Ｂ】ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素を参照配列として用いる、推定上のイソプレン合成酵素のアミノ酸配列のアラインメントである。配列アラインメントの最下部に共通配列を示す（それぞれ配列番号１８、２０、２２、２４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、２６、１、２８）。
【図２Ｃ】ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素を参照配列として用いる、推定上のイソプレン合成酵素のアミノ酸配列のアラインメントである。配列アラインメントの最下部に共通配列を示す（それぞれ配列番号１８、２０、２２、２４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、２６、１、２８）。
【図２Ｄ】ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素を参照配列として用いる、推定上のイソプレン合成酵素のアミノ酸配列のアラインメントである。配列アラインメントの最下部に共通配列を示す（それぞれ配列番号１８、２０、２２、２４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、２６、１、２８）。
【図２Ｅ】ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素を参照配列として用いる、推定上のイソプレン合成酵素のアミノ酸配列のアラインメントである。配列アラインメントの最下部に共通配列を示す（それぞれ配列番号１８、２０、２２、２４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、２６、１、２８）。
【図２Ｆ】ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素を参照配列として用いる、推定上のイソプレン合成酵素のアミノ酸配列のアラインメントである。配列アラインメントの最下部に共通配列を示す（それぞれ配列番号１８、２０、２２、２４、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、２６、１、２８）。
【図３Ａ】ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素及びプエラリア・モンタナ（P. montana）イソプレン合成酵素を参照配列として用いる、推定上のイソプレン合成酵素のアミノ酸配列のアラインメントである（それぞれ、配列番号１、１５、３、５８、７、５、５９、１３）。
【図３Ｂ】ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素及びプエラリア・モンタナ（P. montana）イソプレン合成酵素を参照配列として用いる、推定上のイソプレン合成酵素のアミノ酸配列のアラインメントである（それぞれ、配列番号１、１５、３、５８、７、５、５９、１３）。
【図３Ｃ】ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素及びプエラリア・モンタナ（P. montana）イソプレン合成酵素を参照配列として用いる、推定上のイソプレン合成酵素のアミノ酸配列のアラインメントである（それぞれ、配列番号１、１５、３、５８、７、５、５９、１３）。
【図４】クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、推定イソプレン合成酵素の溶解度を既知のイソプレン合成酵素と比較して示す。Ａ）可溶性画分（レーン１）及び不溶性画分（レーン２）中のＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素のタンパク質量を示す。Ｂ）は、総可溶化液（レーン２）、可溶性画分（レーン３）、及び不溶性ペレット画分（レーン４）中のラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素のタンパク質量、総可溶化液（レーン５）、可溶性画分（レーン６）、及び不溶性ペレット画分（レーン７）中のダイズ１（G. max 1）イソプレン合成酵素のタンパク質量、並びに総可溶化液（レーン８）、可溶性画分（レーン９）、及び不溶性ペレット画分（レーン１０）中のダイズ２（G. max 2）イソプレン合成酵素のタンパク質量を示す。レーン１は分子量マーカーを含有する。矢印は、イソプレン合成酵素の分子量に一致するバンドを示す。
【図５】クマシー染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルであり、推定イソプレン合成酵素の溶解度を既知のイソプレン合成酵素と比較して示す。可溶性画分の３通りの希釈液を、左から右に向かってタンパク質濃度が減少するようレーンに装填した。可溶性ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体３イソプレン合成酵素（レーン２、３、及び４）、ハッショウマメ（M. pruriens）（レーン５、６、及び７）、及びキマメ（C. cajans）（レーン８、９、及び１０）のタンパク質量を示す。レーン１は分子量マーカーを含有する。矢印は、イソプレン合成酵素の分子量に一致するバンドを示す。
【図６】インビトロイソプレン生産アッセイにおける、推定イソプレン合成酵素のイソプレン合成酵素活性を実証するグラフを示す。ラッカセイ（A. hypogaea）又はフユナラ（Q. petraea）から単離されるポリペプチドを発現する細胞から回収した可溶化液から調製した上清を、高濃度ＤＭＡＰＰとともにインキュベートし、そのままのイソプレン生産をＧＣ−ＦＩＤ（ガスクロマトグラフ−水素炎イオン化検出器）により測定した。
【図７】インビトロイソプレン生産アッセイにおける、推定イソプレン合成酵素のイソプレン合成酵素活性を実証するグラフを示す。ハッショウマメ（M. pruriens）から単離されるポリペプチド又はウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体３から単離されるイソプレン合成酵素を発現する細胞から回収した可溶化液から調製した上清を、高濃度ＤＭＡＰＰとともにインキュベートし、そのままのイソプレン生産をＧＣ−ＦＩＤ（ガスクロマトグラフ−水素炎イオン化検出器）により測定した。
【図８】インビトロイソプレン生産アッセイから測定されるものとして、推定イソプレン合成酵素の比生産性を実証するグラフである。ラッカセイ（A. hypogaea）、ダイズ１（G. max 1）、ダイズ２（G. max 2）、ハッショウマメ（M. pruriens）、又はキマメ（C. cajans）から単離されるポリペプチドを発現する細胞から回収した可溶化液から調製した上清を、高濃度ＤＭＡＰＰとともにインキュベートし、イソプレン生産をＧＣ−ＦＩＤにより測定した。イソプレン合成酵素の比生産性を、イソプレンｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤの単位で算出した。ウラジロハコヤナギ（P. alba）野生型由来のポプラ（poplar）イソプレン合成酵素を陽性対照として使用した。
【図９】インビトロイソプレン生産アッセイにおける、マメ科植物ラッカセイ（A. hypogaea）から単離されたポリペプチドのイソプレン合成酵素比活性を示すグラフである。ウラジロハコヤナギ（P. alba）由来のイソプレン合成酵素と比較して、ラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素は、高濃度ＤＭＡＰＰ下での基質阻害の低減を示した。イソプレン合成酵素活性は、ｓ−１の単位で記録される。
【図１０】１０ｍＭ又は１００ｍＭマグネシウム（Ｍｇ）の存在下でのインビトロイソプレン生産アッセイにおける、マメ科植物ラッカセイ（A. hypogaea）から単離されたポリペプチドのイソプレン合成酵素比活性を示すグラフである。ラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素は、高濃度ＤＭＡＰＰの存在下でも、１００ｍＭ濃度のＭｇ２＋が提供されたときに基質阻害の低減を示した。低濃度のＭｇ２＋下では、ラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素は、低濃度ＤＭＡＰＰ下での基質阻害に感受性を示した。イソプレン合成酵素活性は、ｓ−１の単位で記録される。
【図１１】図インビトロイソプレン生産アッセイにおける、マメ科植物ラッカセイ（A. hypogaea）から単離されたポリペプチドのイソプレン合成酵素比活性を示すグラフである。ウラジロハコヤナギ（P. alba）野生型由来のイソプレン合成酵素と比較して、ラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素は、高濃度ＤＭＡＰＰ下での基質阻害の低減を示した。ラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素は、親ウラジロハコヤナギ（P. alba）配列と比較してイソプレン合成酵素比活性が向上していることが予め判明しているイソプレン合成酵素変異体、ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体１並びにウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体２と比較して、高濃度ＤＭＡＰＰ下での基質阻害をより低減させることも示した。イソプレン合成酵素活性は、ｓ−１の単位で記録される。
【図１２】ｐＣＬ２０１のプラスミドマップを示す。
【図１３】アッセイ株の増殖性と、ＤＭＡＰＰ濃度との間の関係性を示すグラフである。ラッカセイ（A. hypogaea）（ＤＷ６６８）を発現する細菌株を、ＩＰＴＧによる発現誘導後、０、１５、３０、４５、６０、又は７５ｍＭメバロン酸（ＭＶＡ）の存在下で１時間増殖させ、アッセイの開始時及び１時間毎に５時間後まで、６００ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を評価することにより増殖性を測定した。ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体１、ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体２、又はウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体３由来のイソプレン合成酵素を発現する細菌株を陽性対照として使用した。
【図１４】アッセイ株において、イソプレン生産と、ＤＭＡＰＰ濃度との間の関係性を示すグラフである。ラッカセイ（A. hypogaea）（ＤＷ６６８）を発現する細菌株を、ＩＰＴＧによる発現誘導後、０、１５、３０、４５、６０、又は７５ｍＭメバロン酸（ＭＶＡ）の存在下で１時間増殖させ、アッセイの開始時及び１時間毎に５時間後まで、ＧＣ−ＦＩＤによりイソプレン生産を測定した。イソプレン合成酵素の比生産性を、イソプレンｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤの単位で算出した。ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体１、ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体２、又はウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体３由来のイソプレン合成酵素を発現する細菌株を陽性対照として使用した。
【図１５】ｐＥＷＬ１０３６のプラスミドマップを示す。
【図１６】マメ科植物イソプレン合成酵素を、上流ＭＶＡ経路のポリペプチド（エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis））又は上流ＭＶＡ経路のポリペプチド（エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）及びエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum））と共発現する細菌株の増殖を示すグラフである。増殖は、ＩＰＴＧによる発現誘導後、ラッカセイ（A. hypogaea）を、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）上流ＭＶＡ経路ポリペプチド（ＥＷＬ１０４３及びＥＷＬ１０４７）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）上流ＭＶＡ経路のポリペプチド（ＥＷＬ１０４９）、又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）上流ＭＶＡ経路のポリペプチド（ＥＷＬ１０５２）と共発現する細菌株において測定した。増殖アッセイの開始時、及び１時間毎に５時間後までの増殖を、６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ）により評価した。異なる上流ＭＶＡ経路を有するウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体１由来のイソプレン合成酵素を発現する細菌株を、対照として使用した。
【図１７】マメ科植物イソプレン合成酵素を、上流ＭＶＡ経路のポリペプチド（エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis））又は上流ＭＶＡ経路のポリペプチド（エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）及びエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum））と共発現する細菌株のイソプレン生産を示すグラフである。イソプレン生産は、ＩＰＴＧによる発現誘導後、ラッカセイ（A. hypogaea）を、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）上流ＭＶＡ経路ポリペプチド（ＥＷＬ１０４３及びＥＷＬ１０４７）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）上流ＭＶＡ経路のポリペプチド（ＥＷＬ１０４９）、又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）上流ＭＶＡ経路のポリペプチド（ＥＷＬ１０５２）と共発現する細菌株において測定した。イソプレンは、アッセイの開始時、及び１時間毎に５時間後までＧＣ−ＦＩＤにより測定した。イソプレン合成酵素の比生産性を、イソプレンｍｇ／Ｌ／ｈｒ／ＯＤの単位で算出した。異なる上流ＭＶＡ経路を有するウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体１由来のイソプレン合成酵素を発現する細菌株を、対照として使用した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、特性の改良された少なくとも１つのマメ科植物イソプレン合成酵素酵素を含む方法及び組成物を提供する。マメ科植物イソプレン合成酵素は、配列番号１に対し少なくとも４０％の配列同一性を含み、マメ科植物イソプレン合成酵素は、配列番号１に対応する１つ以上のアミノ酸残基に対応する１つ以上のアミノ酸残基を有する。いくつかの態様では、１つ以上のアミノ酸残基は、Ｆ２８７、Ｇ３９７、Ｎ４３８、Ｅ４５１、及びＹ５１４であり得る。いくつかの実施態様では、マメ科植物イソプレン合成酵素はプエラリア・モンタナ（P. montana）のものではない。本発明は、ポプラ（poplar）イソプレン合成酵素と比較して少なくとも１つの特性が改良されているマメ科植物イソプレン合成酵素を提供する。いくつかの好ましい実施形態では、改良されている少なくとも１つの特性は、限定するものではないが、比生産性、収率、細胞性能指数、及びタンパク質発現からなる群から選択される。いくつかの特に好ましい実施形態では、改良されている少なくとも１つの特性は、限定するものではないが、比活性、Ｋｃａｔ、Ｋｉ、及びＫｍからなる群から選択される。特に、本発明は、宿主細胞においてイソプレン生産を増加させる、マメ科植物イソプレン合成酵素を提供する。生物生産により製造される本発明のイソプレンは、ゴム、ポリマー、及びエラストマーを製造する際の使用が見出される。
【００１７】
更に、本開示で提供される表題は本発明の様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、総じて本明細書において参照として用いられ得るものである。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく定義される。それでもなお、本発明に対する理解を容易にさせる目的で、数多くの用語を以下に定義する。
【００１８】
Ｉ．一般的技術
本発明の実施においては、別途記載のない限り、当業者の技能の範囲内に含まれる従来の分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の技術を用いる。これらの手法は、次の文献：「分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Cloning: A Laboratory Manual）」第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９）；「オリゴヌクレオチド合成法（Oligonucleotide Synthesis）」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；「動物細胞培養法（Animal Cell Culture）」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．、１９８７）；「酵素学的実験法（Methods in Enzymology）」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「分子生物学標準プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．、１９８７、定期的に改定）；「ＰＣＲ：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR: The Polymerase Chain Reaction）」（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、「微生物学及び分子生物学辞典（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology）」、第２版、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４）、Ｂａｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、「工業微生物学及びバイオテクノロジーマニュアル（Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology）」、第３版（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ：ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，２０１０）、並びに「有機化学反応、機序及び構造第４版（Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed.）」，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）中に十分に説明されており、これらの文献は、本出願で使用される数多くの用語の一般的な指針を当業者に提供する。
【００１９】
ＩＩ．用語の定義
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。本明細書において述べられるものと同様又は同等のあらゆる方法及び材料を本発明の実施において使用することができるが、好ましい方法及び材料については本明細書に述べる。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく説明される。
【００２０】
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」には、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、及び融合ポリペプチドが含まれる。
【００２１】
本明細書で使用するとき、「単離ポリペプチド」は、２、５、１０、２０、又は５０個以上の異なるポリペプチドのライブラリなどといった、ポリペプチドのライブラリの一部を意味するものではなく、天然に生じる少なくとも１つの成分から分離されたポリペプチドを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組み換え核酸を発現させることで単離ポリペプチドを得ることができる。
【００２２】
「異種ポリペプチド」は、宿主細胞と異なる生物、種、又は株由来の核酸配列によりコードされるポリペプチドを意味する。いくつかの態様では、異種ポリペプチドは、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型ポリペプチドと同一ではない。異種タンパク質の例としては、イソプレン合成酵素などの酵素が挙げられる。いくつかの実施態様では、タンパク質をコードする遺伝子が天然に生じる遺伝子であるのに対し、他の実施形態では、変異の生じている及び／又は合成遺伝子が使用される。
【００２３】
「内在性ポリペプチド」は、宿主細胞においてそのアミノ酸配列が天然に見られるポリペプチドである。いくつかの実施態様では、内在性ポリペプチドは、宿主細胞において天然に見られる野生型ポリペプチドと同一である。
【００２４】
本明細書で使用するとき、「核酸」は、共有結合により単鎖又は二本鎖のいずれかの形態で連結している、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを指す。本明細書で定義される通りの核酸には、単一ヌクレオチド変異などの変異が生じ得ることは理解されるであろう。
【００２５】
「組換え核酸」とは、対象とする核酸が由来する生物において自然に存在するゲノムにおいて、対象とする核酸に隣接する１つ以上の核酸（例えば遺伝子）を含まない、対象とする核酸のことを意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクターに組み込まれた、プラスミド又はウィルスに自己複製的に組み込まれた、原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、又は他の配列とは独立して別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、又はＰＣＲにより生産された若しくは制限エンドヌクレアーゼによる消化により生産されたｃＤＮＡ断片）として存在する、組み換えＤＮＡが包含される組み換え核酸は、当該技術分野において既知である分子生物学的手法により得ることができ、あるいは、組み換え核酸の一部又は全長を化学合成することもできる。
【００２６】
「異種核酸」は、宿主細胞と異なる生物、種又は株由来の核酸配列を意味する。いくつかの態様では、異種核酸は、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型核酸と同一ではない。いくつかの態様では、異種核酸は、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型核酸と同一ではない。
【００２７】
「内在性の核酸」は、宿主細胞においてその核酸配列が天然に見られる核酸である。いくつかの実施態様では、内在性の核酸は、宿主細胞において天然に見られる野生型核酸と同一である。いくつかの実施態様では、内在性の核酸の１つ以上のコピーを宿主細胞に組み込む。
【００２８】
本発明の核酸又はタンパク質は、単離又は精製形態であってよい。本明細書で使用するとき、核酸又はタンパク質に対して「単離」とは、これらが、限定するものではないが、細胞又は細胞培養物などの他の成分から分離されていることを意味する。均一な状態が好ましいものの、乾燥形態又は水溶液形態のいずれかであってもよい。純度及び均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて判定される。調製液中に存在する主要なタンパク質又は核酸が実質的に精製される。用語「精製」は、核酸又はタンパク質が、電気泳動ゲル中で基本的に１本のバンドとして検出されることを意味する。具体的には、「精製された」は、単離した際に、単離物が、単離物の少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９８重量％、又はより好ましくは少なくとも９９重量％の核酸又はタンパク質を含有することを意味する。精製ポリペプチドは、例えば、研究室での合成、クロマトグラフィー、分取用電気泳動、ゲル電気泳動、遠心分離、沈殿、親和的精製などの数多くの手法により得ることができる（概して、Ｒ  Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２），Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２、「タンパク質精製の手引（Guide to Protein Purification）」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい）。
【００２９】
本明細書において使用するとき、「発現調節配列」とは、対象とする核酸の転写を指示する核酸配列のことを意味する。発現制御配列は、常時発現型若しくは誘導型のプロモータ、又はエンハンサなどのプロモータであり得る。発現制御配列は「ネイティブ」な配列又は異種性の配列であり得る。ネイティブな発現制御配列は、遺伝子を発現させる生物、種又は株と同様の生物、種又は株に由来する配列である。異種性の発現制御配列は、遺伝子を発現させる生物、種又は株とは異なる生物、種又は株に由来する配列である。「誘導型プロモータ」は、環境下、又は発育制限下で活性であるプロモータである。
【００３０】
「調節可能に連結された」は、核酸発現制御配列（プロモータなど）及び第２の核酸配列間の機能的連結を意味し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指示する。
【００３１】
用語「イソプレン」は、２−メチル−１，３−ブタジエン（ＣＡＳ＃  ７８−７９−５）を指す。３，３−ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からピロリン酸を除去することで、揮発性のＣ５炭化水素を、直接的に及び最終的に生成することができる。ＩＰＰ分子をＤＭＡＰＰ分子に結合又は重合させることは包含しない場合がある。用語「イソプレン」は、概して、本明細書に別途記載のない限り、生産方法を限定されることを意図しない。
【００３２】
本明細書で使用するとき、用語「イソプレン合成酵素」、「イソプレン合成酵素変異体」及び「ＩｓｐＳ」は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からピロリン酸を除去してイソプレンを生成する反応を触媒する酵素を指す。「イソプレン合成酵素」は、野生型配列であっても、あるいはイソプレン合成酵素変異体配列であってもよい。
【００３３】
本明細書で使用するとき、用語、「自然発生」は、自然に見られる（例えば、組み換え法又は化学的方法により操作されていない）任意のもの（例えば、タンパク質、アミノ酸又は核酸配列）を指す。本明細書で使用するとき、用語「非天然に生じる」は、天然には見られない任意の対象（例えば、組み換えにより生成されたタンパク質又は化学合成されたタンパク質、アミノ酸、又は研究施設で作成された核酸配列）を指す。
【００３４】
対象とするアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基が、参照アミノ酸配列のアミノ酸残基と「対応する」又は「対応している」又は「対応した」とは、対象とする配列に含まれるアミノ酸残基が、参照アミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置と相同である位置又は等しい位置に配置されていることを示す。当業者は、ポリペプチド中の特定のアミノ酸残基の位置が、相同な参照配列の位置に対応するかどうかを判定することができる。例えば、イソプレン合成酵素ポリペプチドの配列を、既知の手法（例えば、基本的な局所的アラインメント／検索ツールであるＢＬＡＳＴ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、又は構造に基づき配列をアラインメントするプログラムであるＳＴＲＡＰなど）により参照配列（例えば、配列番号１）とアラインメントさせることもできる。加えて、ホモログポリペプチド残基の三次元構造を求める際に参照配列の結晶構造座標を補助として使用することもできる（例えば、国際出願第ＵＳ２０１０／０３２１３４号を参照されたい）。他の態様では、立体構造レベルでの相同性を決定することで等価な残基を同定することもできる。このような手法を用いる場合、イソプレン合成酵素ポリペプチド又はイソプレン合成酵素変異体のアミノ酸残基は、対応する参照配列のアミノ酸残基の位置番号に従い、番号付けすることもできる。例えば、アミノ酸残基の位置を決定し、対象とするイソプレン合成酵素の各アミノ酸残基に付番する際に、配列番号１のアミノ酸配列を使用することもできる。
【００３５】
本明細書で使用するとき、「相同性」は、配列類似性又は同一性を指し、同一性が好ましい。相同性は、当該技術分野において既知の標準法を使用して求めることができる（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４（１９８８）；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージに含まれるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡなどのソフトウェアプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５（１９８４）を参照されたい）。有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、ペアワイズアラインメントのプログレッシブ法を用いて、一群の関連する配列から複数の配列のアラインメントを行う。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを行うのに使用されるクラスタリング関係を示す系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブアラインメント法を単純化させて用いる（Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０（１９８７）を参照されたい）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより記載されるものと類似のものである（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３（１９８９）を参照されたい）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターとしては、３．００のデフォルトギャップウェイト（default gap weight）、０．１０のデフォルトギャップレングスウェイト（default gap length weight）及びウェイテッドエンドギャップ（weighted end gaps）が挙げられる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．により報告されているＢＬＡＳＴアルゴリズムもその他の有用なアルゴリズムの例である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０（１９９０）；並びにＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３〜５７８７（１９９３）を参照されたい）。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０〜４８０（１９９６）を参照されたい）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、複数の検索パラメーターを使用し、これらのうちのほとんどはデフォルト値に設定される。調製可能なパラメーターは以下の値に設定される：ｏｖｅｒｌａｐ  ｓｐａｎ＝１、ｏｖｅｒｌａｐ  ｆｒａｃｔｉｏｎ＝０．１２５、ｗｏｒｄ  ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメーターは動的な値であり、特定の配列の構成及び、所望の配列を検索する特定のデータベースの構成に依存してプログラム自体により確立される。しかしながら、これらの値は、感度を上昇させるように調整することができる。
【００３６】
参照配列と対象とする試験配列との配列同一率は、当業者により容易に判定することができる。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列により共有される同一率は、配列をアライメントし、当該技術分野において既知の方法により同一性を判定することによって分子間での配列情報を直接比較することにより、判定される。配列類似性を判定するのに好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０（１９９０）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）より公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントを行ったときに一致するか又はある程度ポジティブであると評価された（positive-valued）閾値スコアＴを満たすかのいずれかである問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を同定する。これらの最初にヒットした隣接ワードは、これらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための開始点として働く。ワードのヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り比較されている２つの配列の各々に沿って両方向に拡張される。ワードのヒットの拡張は、次の場合に止まる：累積アラインメントスコアが最大達成値から量Ｘだけ減少する、累積スコアがゼロ以下になる、又は、いずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、感度及びアラインメントの速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、ワード長（Ｗ）：１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９９２）を参照されたい）アラインメント（Ｂ）：５０、期待値（Ｅ）：１０、Ｍ’５、Ｎ’−４をデフォルトとして使用し、両鎖を比較する。
【００３７】
次に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、上記Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌを参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一つの尺度は、最小和確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然により生じ得る確率の指標を提供する。例えば、試験核酸をイソプレン合成酵素の核酸と比較した際の最小和確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は本発明のイソプレン合成酵素の核酸と類似していると考えられる。イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする試験核酸は、最小和確率の比較結果が約０．５未満、及びより好ましくは約０．２未満である場合に、イソプレン合成酵素に関係している特定の核酸と類似していると考えられる。
【００３８】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列についての文脈において、「同一率（percent identical or percent identity）」は、２つ以上の配列を最も一致するように比較及びアライメントし、配列比較アルゴリズムを用いて又は目視確認により判定したときに、２つ以上の配列が、同一であるか、あるいは核酸残基又はアミノ酸残基と、表記される割合で同一であることを指すものである。参照アミノ酸配列に対する、対象とするアミノ酸配列の、「配列相同性」又は「相同（％）」又は「配列相同性（％）」又は「アミノ酸配列相同性（％）」は、対象とするアミノ酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたって参照アミノ酸配列に対して表記される割合（すなわち、アミノ酸とアミノ酸を並べたときの一致度）だけ相同であることを意味する。したがって、２つのアミノ酸配列に対するアミノ酸配列同一率８０％又は同一率８０％は、最適にアライメントした２つのアミノ酸配列中のアミノ酸残基のうち８０％が同一であることを意味する。
【００３９】
参照核酸配列に対する、対象とする核酸配列の、「配列相同性」又は「相同性（％）」又は「配列相同性（％）」は、対象とする核酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたって参照配列に対して表記される割合（すなわち、ヌクレオチドとヌクレオチドを並べたときの一致度）だけ相同であることを意味する。したがって、２つの核酸配列に対するヌクレオチド配列同一率８０％又は同一率８０％は、最適にアライメントした２つの核酸配列中のヌクレオチド残基のうち８０％が同一であることを意味する。
【００４０】
一態様では、参照配列に対する対象とする配列の「配列相同性」又は「配列相同性（％）」、又は「相同性（％）」は、２つの配列を最適にアライメントし、比較長さにわたって、２つの最適にアライメントした配列を比較することで、算出することができる。最適なアライメントにおいて両方の配列の残基が一致している位置の数は、一致する位置の数を求めて一致する位置の数を比較長さ（別途記載のない限り、参照配列の長さである）のうちの位置の合計数で除することで決定される。得られる数に１００を乗じることで、参照配列に対する対象とする配列の配列同一性を算出する。
【００４１】
「最適アラインメント」又は「最適アラインメントを行った」は、最高同一率スコアを与える２つ（以上）の配列のアラインメントを指す。例えば、２つのポリペプチド配列の最適アラインメントは、各配列中の同一のアミノ酸残基の最大数が共にアラインメントされているように手作業で配列のアラインメントを行うことにより、あるいは、本明細書に記載の又は当該技術分野において既知の、ソフトウェアプログラム又は手順を用いることにより、達成することができる。２つの核酸配列の最適アラインメントは、各配列中の同一のヌクレオチド残基の最大数が共にアラインメントされているように手作業で配列のアラインメントを行うことにより、あるいは、本明細書に記載の又は当該技術分野において既知の、ソフトウェアプログラム又は手順を用いることにより、達成することができる。
【００４２】
既定のアミノ酸置換マトリックス、ギャップ存在ペナルティ（ギャップオープンペナルティとも呼ばれる）及びギャップ伸張ペナルティなどの既定パラメーターを用い、２つの配列（例えば、ポリペプチド配列）がこのペアの配列について類似性スコアが最も高くなるようアラインメントされた場合、「最適アラインメントが行われた」とみなされ得る。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（上記Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆを参照されたい）は、多くの場合、ポリペプチド配列アラインメントアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）においてデフォルトのスコアリング置換マトリックスとして使用される。ギャップ存在ペナルティはアラインメントされた配列の１つにアミノ酸ギャップが１つ導入された際に課せられ、ギャップ伸張ペナルティはギャップ中の各残基位置に対して課される。用いられる代表的なアラインメントは以下のものである：ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス、ギャップ存在ペナルティ＝１１、及びギャップ伸張ペナルティ＝１。アラインメントスコアは、アラインメントが開始及び終了する各配列のアミノ酸位置により（例えば、アラインメントウィンドウ）、並びに、場合によっては可能な限り最高の類似性スコアを達成するように一方若しくは両方の配列の中に１つ若しくは複数のギャップを挿入することにより、決定される。
【００４３】
２つ以上の配列間の最適アラインメントは、目視確認により手作業で、あるいは、コンピュータ（例えば、アミノ酸配列に対するＢＬＡＳＴＰプログラム及び核酸配列に対するＢＬＡＳＴＮプログラム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２（１９９７）を参照されたい。米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトも参照されたい。）又はＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムが挙げられるがこれらに限定されない）を使用することにより、判定することができる。
【００４４】
２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」は、以下の配列比較又は解析アルゴリズムのうちの１つを用いて評価する際に、最も一致するようにアライメントしたときに、２つの配列中の残基が同じのものであることを指す。
【００４５】
対象とするポリペプチドが、参照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む場合、対象とするポリペプチドは参照ポリペプチドに対して「実質的に同一」であるということができる。２つのこのようなポリペプチド間の同一性（％）は、最適にアラインメントされた２つのポリペプチド配列を目視確認することにより、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム又はアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ，ＡＬＩＧＮ，ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することで、手作業で判定することができる。２つのポリペプチドが実質的に同一である一つの指標は、第一のポリペプチドが第二のポリペプチドと免疫学的に交差反応することである。典型的には、保存アミノ酸置換によって異なるポリペプチドは免疫学的に交差反応する。したがって、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドが１つの保存的アミノ酸置換又は１つ以上の保存的アミノ酸置換のみで異なる場合、第二ポリペプチドに対して実質的に同一である。
【００４６】
対象とする核酸が、参照核酸のヌクレオチド配列に対して少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む場合、対象とする核酸は参照核酸に対して「実質的に同一である」ということができる。２つのこのような核酸間の同一性（％）は、最適にアラインメントされた２つの核酸配列を目視確認することにより、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム又はアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することで、手作業で判定することができる。厳密な条件下（例えば、中程度に厳密〜非常に厳密という範囲）で、２つの核酸分子が互いにハイブリッド形成することは、核酸配列が実質的に同一であることの１つの指標になる。
【００４７】
本明細書で使用するとき、用語「質量収率」は、組み換え（例えば、細菌）細胞により生産される生産物の質量を、組み換え細胞により消費されたグルコースの質量より除算し、１００を乗じたものを指し、あるいは割合として表される。
【００４８】
「比生産性」は、組み換え（細菌）細胞により生産される生産物の質量を、生産物の生産にかかった時間、細胞密度及び培養体積により除したものを意味する。
【００４９】
「力価」は、組み換え（例えば、細菌）細胞により生産される生産物の質量を、培養体積により除したものを意味する。
【００５０】
本明細書で使用するとき、用語「細胞生産性指数（cell productivity index）（ＣＰＩ）」は、組み換え（例えば、細菌）細胞により生産される生産物の質量を、培養により生産された組み換え細胞の質量により除したものを指す。
【００５１】
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈に明示されない限り、対象物が複数ある場合をも包含する。
【００５２】
別途記載のない限り、それぞれ、核酸は左から右に５’→３’の向きで記述され、アミノ酸は左から右にアミノ末端→カルボキシ末端の向きで記述される。
【００５３】
本開示において、実施形態に包含される（及び説明する）「約（about）」を付した値又はパラメーターについては、「約」を付したその値又はパラメーター自体を目的とする。
【００５４】
本開示に記載される本発明のすべての態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む（comprising）」、態様及び実施形態「からなる（consisting）」、及び態様及び実施形態「から本質的になる（consisting essentially of）」を含むことが理解される。記載の要素から「本質的になる」方法又は組成物には、特定の工程又は材料のみが含まれ、かつこれらの工程又は材料は、方法及び組成物の基本特性及び新規特性に実質的に影響しないことは理解されるであろう。
【００５５】
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。
【００５６】
本発明は記載される特定の方法論、プロトコル、及び試薬に制限されるものではなく、これらは当業者により使用される文脈に応じて変化させ得ることが理解されるであろう。
【００５７】
本明細書を通じて与えられるあらゆる最大数の限定は、あらゆるより小さい数値の限定を、あたかもそのようなより小さい数値の限定が明確に書かれているかのように包含するものと理解されることが意図される。本明細書の全体を通じて与えられるすべての最小の数値的限定には、これよりも大きいすべての数値的限定が、あたかもこうしたより大きい数値的限定が本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。本明細書の全体を通じて与えられるすべての数値的範囲には、これよりも狭い数値的範囲が、あたかもこうしたより狭い数値的範囲がすべて本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。
【００５８】
ＩＩＩ．イソプレン合成酵素配列
ポリペプチドは、参照配列に対する配列アラインメントにより、並びにその他の特性（例えば、イソプレン合成酵素活性）により、イソプレン合成酵素であるとして同定することができる。いくつかの実施態様では、参照配列は、植物イソプレン合成酵素配列である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号１のアミノ酸配列を含む、ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号２の配列を含む核酸配列によりコードされるＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）合成酵素である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むプエラリア・モンタナ（P. montana）（クズ（kudzu））イソプレン合成酵素である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号１６の配列を含む核酸配列によりコードされるプエラリア・モンタナ（P. montana）（クズ（kudzu））合成酵素である。本発明の任意の態様では、参照配列に対する配列アラインメントは、成熟ポリペプチド配列との配列アラインメントをもとにしたものであってよく、前記成熟ポリペプチドは、未成熟なシグナル配列のプロセシングを受け、完了したものとして定義される。本発明の任意の態様では、参照配列に対する配列アラインメントは、参照配列のＣ末端領域との配列アラインメントをもとにしたものであってよく、Ｃ末端領域は、触媒活性部位を含有する。本発明の態様では、参照配列に対するポリペプチド配列の配列アラインメントにより、共通配列の確認がなされ、前記共通配列により、ポリペプチドがイソプレン合成酵素活性を有することが決定される。一実施形態では、共通配列は、図２Ａ〜Ｆに示されるものである。いくつかの実施態様では、参照配列は植物イソプレン合成酵素配列である。いくつかの実施態様では、参照配列は配列番号１のアミノ酸配列を含むＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むプエラリア・モンタナ（P. montana）（クズ（kudzu））イソプレン合成酵素である。本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドの同定には、限定するものではないが、ポプラ（poplar）イソプレン合成酵素の１つ以上の共通アミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を１つ以上有するポリペプチドが含まれる。いくつかの実施態様では、ポプラ（poplar）イソプレン合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様では、ポプラ（poplar）イソプレン合成酵素残基の１つ以上の共通部は、Ｆ２８７、Ｇ３９７、Ｎ４３８、Ｅ４５１、及びＹ５１４からなる群から選択される。本発明のいくつかの態様では、共通配列は、すべての候補イソプレン合成酵素配列及び対象とする配列が比較される原型となるアミノ酸配列を指す。本発明の他の態様では、共通配列は、対象とするＤＮＡ配列中に最も豊富に存在する記載のヌクレオチド配列を指す。遺伝子の各位置に関し、共通配列は、多重配列アラインメントにおいてその位置に最も豊富なアミノ酸を与える。本発明のいくつかの態様では、多重配列アラインメントは、アルゴリズム（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ）を使用してアラインメントされる参照配列の複数の相同性���列を指す。いくつかの実施態様では、参照配列は、植物イソプレン合成酵素配列である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）合成酵素である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号２の配列を含む核酸配列によりコードされるＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）合成酵素である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むプエラリア・モンタナ（P. montana）（クズ（kudzu））である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号１６の配列を含む核酸配列によりコードされるプエラリア・モンタナ（P. montana）（クズ（kudzu））合成酵素である。
【００５９】
本発明のいくつかの態様では、イソプレン合成酵素を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドは、配列番号１に対し少なくとも４０％の配列同一性を含み、マメ科植物イソプレン合成酵素は、配列番号１に対応する１つ以上のアミノ酸残基に対応する１つ以上のアミノ酸残基を有し、１つ以上のアミノ酸残基は、Ｆ２８７、Ｇ３９７、Ｎ４３８、Ｅ４５１、及びＹ５１４からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、マメ科植物イソプレン合成酵素はプエラリア・モンタナ（P. montana）由来のものではない。
【００６０】
本発明の任意の態様では、イソプレン活性を有するポリペプチドは、イソプレン合成酵素ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、マメ（Leguminosae）科、ブナ（Fagaceae）科、ミカン（Rutaceae）科、クスノキ（Lauraceae）科、ブドウ（Vitaceae）科、又はフトモモ（Myrtaceae）科由来のものである。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、ピーナッツ（peanut）（ラッカセイ（Arachis hypogaea）など）、八升豆（ハッショウマメ（Mucuna pruriens）など）、キマメ（（Cajanus cajans）など）、大豆（ダイズ（Glycine max）など）、野生のマメ科植物（ミヤコグサ（Lotus japonicus）など）、又はクローバー様植物（タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）など）を含むがこれらに限定されないマメ科植物に由来する、天然に生じるポリペプチド又は核酸である。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、限定するものではないが、レモン（シトラス・レモン（Citrus limon））を含む柑橘類由来の、天然に生じるポリペプチド又は核酸である。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、シナモマム・テヌイパイル（Cinnamomum tenuipile）由来の、天然に生じるポリペプチド又は核酸である。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、限定するものではないが、ワイン用ブドウ（ビティス・ヴィニフェラ（Vitis vinifera））を含むブドウ由来の、天然に生じるポリペプチド又は核酸である。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、フユナラ（Querus petraea）又はケルクス・アイレックス（Querus ilex）などのオーク由来の、天然に生じるポリペプチド又は核酸である。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、ユーカリ・グロブルス（Eucalyptus globulus）又はティーツリー（Melaleuca alternifolia）由来の、天然に生じるポリペプチド又は核酸である。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、プエラリア・モンタナ（P. montana）に由来するものではない。本発明のイソプレン合成酵素としては、ＪＧＩ寄託番号Ｇｌｙｍａ０９ｇ２１９００．１、Ｇｌｙｍａ２０ｇ１８２８０．１、Ｇｌｙｍａ０６ｇ４５７８０．１、及びＧｌｙｍａ１２ｇ１０９９０．１として識別されるものが挙げられるがこれに限定されない。本発明のイソプレン合成酵素には、ダイズ（G. max）ゲノム配列にコードされており、ＦＧＥＮＥＳＨにより予測されるポリペプチド、例えば、Ｇｌｙｍａ２０ｇ１８２８０＿１＿ＦＧとして特定されるポリペプチドにより特定されるものが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含むラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドは、配列番号４の配列を含む核酸配列によりコードされるラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。
【００６１】
本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）シンターゼと少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、配列番号２の配列を含む核酸配列によりコードされるＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）シンターゼと少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むプエラリア・モンタナ（P. montana）（クズ（kudzu））と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。他の実施形態では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、配列番号１６の配列を含む核酸配列によりコードされるプエラリア・モンタナ（P. montana）（クズ（kudzu））シンターゼと少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。
【００６２】
イソプレン合成酵素変異体は、本発明のイソプレン合成酵素より生成することもでき、イソプレン合成酵素は、野生型及び非野生型イソプレン合成酵素を含む、本明細書に記載される通りのイソプレン合成酵素であり得る。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素は、マメ科植物イソプレン合成酵素である。代表的なイソプレン合成酵素の核酸としては、イソプレン合成酵素ポリペプチドの活性を少なくとも１種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。代表的なイソプレン合成酵素ポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載される任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載される任意の生物資源から誘導されるポリペプチド及び核酸の変異体が挙げられる。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素変異体は、配列番号１に対応する１つ以上のアミノ酸残基に対応する１つ以上のアミノ酸残基に１つ以上のアミノ酸置換を有し、前記配列番号１に対応する１つ以上のアミノ酸残基は、Ｔ４８１、Ｋ４６３、Ｋ３９３、Ｌ３７６、Ｋ１６１、Ｓ２８８、Ｔ２４０、Ｅ４７２、Ｇ３８９、及びＲ２４２からなる群から選択される。いくつかの実施態様では、アミノ酸置換はＳ２８８Ｃである。
【００６３】
本発明のイソプレン合成酵素変異体を生成するのに好適な様々な方法が当該技術分野において既知であり、限定するものではないが、例えば、部位飽和変異導入、系統的変異導入、変異挿入、ランダム変異、部位特異的変異導入、及び定向進化、並びに様々な他の組み換え手法が挙げられる。
【００６４】
ＩＶ．イソプレン合成酵素の特性
本明細書に記載の本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドは、参照配列よりも改良されている少なくとも１つの特性を有する。いくつかの実施態様では、参照配列は、植物イソプレン合成酵素配列である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）シンターゼである。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号２の配列を含む核酸配列によりコードされるＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）シンターゼである。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むプエラリア・モンタナ（P. montana）（クズ（kudzu））である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号１６の配列を含む核酸配列によりコードされるプエラリア・モンタナ（P. montana）（kudzu）シンターゼである。いくつかの好ましい実施形態では、改良されている少なくとも１つの特性は、限定するものではないが、比生産性、収率、細胞性能指数、及びタンパク質発現からなる群から選択される。いくつかの特に好ましい実施形態では、改良されている少なくとも１つの特性は、限定するものではないが、比活性、Ｋｃａｔ、Ｋｉ、及びＫｍからなる群から選択される。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、少なくとも約１．３のＫｃａｔ値を有する。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、少なくとも約２．５のＫｍ値を有する。いくつかの実施態様では、ポリペプチドは、少なくとも約１３．０のＫｉＤＭＡＰＰ値を有する。
【００６５】
対象とする特性としては、限定するものではないが、細胞内活性の増加、比生産性の増加、収率の増加、及び細胞性能指数の増加が挙げられる。いくつかの実施態様では、比生産性は、少なくとも約２、３、４、５、６  ７、８、９、１０倍以上に増加する。一実施形態では、比生産性は約２０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ／ｈｒである。他の実施形態では、収率は、少なくとも約２、３、４、５倍以上に増加する。他の実施形態では、細胞性能指数は、少なくとも約２、３、４、５倍以上に増加する。他の実施形態では、細胞内活性は少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上に増加する。
【００６６】
理論に束縛されるものではないが、これらの特性は、以降の本発明のＩｓｐＳの特性のいずれか１つにより又はこれらを組み合わせることにより達成され得る：細胞生存率の上昇、ｋｃａｔの上昇、Ｋｍの低下、Ｋｍの上昇、Ｋｉの上昇、比生産性の上昇、比活性の上昇、溶解性の上昇、不溶性の低下、リボソーム結合の改良、翻訳開始率の上昇、翻訳伸長率の上昇、転写開始率の上昇、転写伸長率の上昇、ＤＮＡの二次構造の減少、ＲＮＡの二次構造の減少、ＤＮＡの二次構造の増加、ＲＮＡの二次構造の増加、折り畳み速度の増加、細胞内シャペロンとの親和性の向上、安定性の向上、タンパク質の代謝回転の減少、タンパク質発現量の増加、細胞内プロテアーゼへの暴露の減少、細胞内プロテアーゼに対する親和性の低下、周辺質への局在の減少、細胞質への局在の増加、封入体形成の減少、膜への局在の減少、より望ましいコドンによる発現の上昇、ＤＮＡ安定度の増加、ＲＮＡ安定度の増加、及びＲＮＡ分解の減少。ＩｓｐＳをコードする又は発現する核酸配列（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の特性に、あるいはＩｓｐＳ酵素自体のもつ生化学的特性に好ましく作用する任意の変異により、細胞内部の活性をより増加させることができる。対象とする他の特性としては、至適ｐＨ、温度安定性（例えば、Ｔｍ値）、並びに基質阻害又は生成物阻害などを引き起こす可能性のあるインヒビターに対する感受性が挙げられる。酸化安定性及びタンパク質分解安定性も対象とする。更に、金属イオンの作用及び金属イオンのイオン強度による活性化又は阻害も対象とする。
【００６７】
本発明のイソプレン合成酵素をコードする核酸を含む宿主細胞の増殖指数又は性能指数を使用して、特定のイソプレン合成酵素が対象とする特性を有するか否かを示すこともできる。増殖指数及び性能指数は、当業者に既知の手法、及び／又は本開示に教示される通りの手法に従い測定することもできる。増殖及び性能指数は、特定のイソプレン合成酵素を参照配列と比較することにより求めることができる。いくつかの実施態様では、参照配列は、植物イソプレン合成酵素配列である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）合成酵素である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号２の配列を含む核酸配列によりコードされるＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）合成酵素である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むプエラリア・モンタナ（P. montana）（クズ（kudzu））である。いくつかの実施態様では、参照配列は、配列番号１６の配列を含む核酸配列によりコードされるプエラリア・モンタナ（P. montana）（kudzu）合成酵素である。各種実施態様では、イソプレン合成酵素の増殖指数は、参照配列と比較た場合に少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３である。各種実施態様では、イソプレン合成酵素の性能指数は、参照配列と比較した場合に少なくとも約０．７、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２である。
【００６８】
対象とする特性を測定する手法は当業者に既知である。いくつかの手法を実施例において更に記載する。イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドは、所望の結果又は改良される特性をもとに評価することができる。例えば、イソプレン合成酵素は、精製又は一部精製したイソプレン合成酵素により、インビトロで、あるいは、大腸菌（E. coli）などの宿主生物に関する文脈においてインビボで、ＤＭＡＰＰのイソプレンへの変換率について試験することができる。場合により、大腸菌は、ＤＸＰ経路、ＭＶＡ経路、又はこれらの両方を発現し得る。改良された活性は、他のイソプレン合成酵素；例えば、ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素、ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体イソプレン合成酵素、又は他の参照ポリペプチドとの比較において評価される。多様な宿主においてイソプレンを生産させることを目的とした本発明において、１種以上の試験条件下で、例えば、様々な程度の安定性、溶解度、活性、及び／又は発現レベルを示す酵素を使用することが見出されるものと企図される。ハイスループットな手法を用いると、効率的な方法でこれらの特性を評価することができる。
【００６９】
細胞内ＤＭＡＰＰ濃度の増加と、ウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）を発現させることで軽減され得る大腸菌の増殖阻害との間には、強い相関がある。理論に束縛されるものではないが、ＩｓｐＳ活性が増強されると、ＤＭＡＰＰは、より迅速にイソプレンへと変換されるようになり、その結果増殖性が更に良好になるはずである。これらの条件下で、対象とするポリペプチドを発現する大腸菌（E. coli）の増殖率を監視することにより、本発明者らは、細胞内でＤＭＡＰＰをイソプレンへと変換する能力が増強されている、ＩｓｐＳ酵素を特定した。いくつかの実施態様では、ＩｓｐＳはマメ科植物ＩｓｐＳである。いくつかの実施態様では、ＩｓｐＳはラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳである。他の実施形態では、ＩｓｐＳはハッショウマメ（M. pruriens）ＩｓｐＳである。
【００７０】
本発明は、イソプレン合成酵素活性に関しポリペプチドを選別するための方法も想到し、方法は、（ａ）宿主細胞を、約１０μＭ〜約７０μＭ  ＩＰＴＧ、及び約５ｍＭ〜約２０ｍＭメバロン酸（ＭＶＡ）を含む培地と接触させる工程、ここで、宿主細胞は、操作可能なようにプロモータと組み合わせられた対象とするポリペプチドをコードする核酸を含む、並びに（ｂ）宿主細胞の増殖率を測定する工程、を含む。イソプレン合成酵素による増殖率は、参照イソプレン合成酵素（例えば、ウラジロハコヤナギ（P. alba）野生型イソプレン合成酵素、ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素、ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体、又はプエラリア・モンタナ（P. montana））と比較することができる。この方法を使用して、対象とする特定の特性、例えば、本明細書に記載の１つ以上の特性に関し、イソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドを選別することもできる。いくつかの実施態様では、増殖率の増加により、イソプレン合成酵素がＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する能力が宿主細胞合成酵素の能力よりも向上していることが意味される。例えば、増殖速度は、当該技術分野で既知の手法により、あるいは以降の実施例において例示される通りに解析することができる。いくつかの実施態様では、手法は、イソプレン合成酵素の増殖指数を決定する工程を更に含む。いくつかの実施態様では、手法は、イソプレン合成酵素の性能指数を決定する工程を更に含む。対数増殖期における細胞の増殖率及び／又は細胞の最終密度は、改良された特性を有するイソプレン合成酵素を選別する際の因子として検討され得る。
【００７１】
いくつかの実施態様では、ＩＰＴＧは、約１０μＭ〜約６０μＭの濃度で培地中に存在する。いくつかの実施態様では、ＩＰＴＧは、約２０μＭ〜約６０μＭの濃度で培地中に存在する。いくつかの実施態様では、ＩＰＴＧは、約４０μＭ〜約６０μＭの濃度で培地中に存在する。いくつかの実施態様では、ＩＰＴＧは、約５０μＭの濃度で培地中に存在する。いくつかの実施態様では、ＭＶＡは、約５ｍＭ〜約７５ｍＭの濃度で培地中に存在する。いくつかの実施態様では、ＭＶＡは、約１０ｍＭ〜約６０ｍＭの濃度で培地中に存在する。いくつかの実施態様では、ＭＶＡは、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭの濃度で培地中に存在する。いくつかの実施態様では、ＭＶＡは、約５ｍＭ〜約３０ｍＭの濃度で培地中に存在する。いくつかの実施態様では、ＭＶＡは、約５ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度で培地中に存在する。いくつかの実施態様では、ＭＶＡは、約１５ｍＭの濃度で培地中に存在する。
【００７２】
Ｖ．イソプレン生産のためのマメ科植物イソプレン合成酵素
本発明は、イソプレンの生産量を増加させるための組成物及び方法を特徴とする。特に、これらの組成物及び方法は、イソプレンの生成速度を増加させ、かつ生成されるイソプレンの総量を増加させる。天然ゴムを用いる代わりに、本開示に記載のイソプレン生産に関する生合成工程を用いることは望ましい。以降に更に説明される通り、細胞により生産されるイソプレンの量は、本発明のイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）をコードする異種核酸を細胞に導入することにより大幅に増加させることができる。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素はマメ科植物イソプレン合成酵素である。
【００７３】
Ａ．イソプレン生産のための組換え細胞
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、多様な用途で使用される重要な有機化合物である。例えば、イソプレンは、合成ゴムの製造時など、数多くの化学組成物及びポリマーの合成時に、中間体又は出発物質として使用される。イソプレンはまた、多くの植物及び動物により天然に合成される重要な生体物質でもある。
【００７４】
イソプレンは、イソプレン合成酵素の触媒作用によりＤＭＡＰＰから製造される。したがって、理論に束縛されるものではないが、更に多量のイソプレン生産をもたらす上記の任意の組成物及び方法により、組換え細胞において、別の下流ＭＶＡ経路を介しメバロン酸からのイソペンテニルピロリン酸の細胞生産量が増加されるものと考えられる。グルコースからのイソペンテニルピロリン酸生産のモル収率を増加させ、適切な酵素活性濃度で、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ、イソペンテニルキナーゼ、及びイソプレン生産に適切な他の酵素と組み合わせるとき、グルコースから生産されるイソプレンのモル収率の増大につながる。
【００７５】
いくつかの態様では、イソプレン生産に使用される任意の細胞は、イソプレンの細胞生産を増加させる１種以上のポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸を発現することができる。他の態様では、細胞は、イソプレン生産に関与する代謝経路（ＭＶＡ経路など）を通し、イソプレン生産を増強する又は炭素利用能を増加させる、特異的なゲノム変異も保有し得る。
【００７６】
本明細書に記載されるとき、本発明は、イソプレンを生産することのできる組換え細胞を提供し、細胞は、ＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸、並びにイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、細胞を好適な培地で培養することによりイソプレン生産が提供される。更なる実施形態では、組換え細胞は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を更に含む。特定の実施形態では、本発明はイソプレンを生産することのできる組換え細胞を提供し、細胞は、ＭＶＡ経路の１種以上のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸、及びイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、細胞は、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸及び／又はイソペンテニルキナーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸を含まないイソプレン生産細胞と比較して多量にイソプレンを生産する。更なる実施形態では、組換え細胞は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を更に含む。
【００７７】
イソプレン生産は、１つ以上の酵素経路を更に操作された、本明細書に記載の任意の組換え宿主細胞を使用することによりなすこともでき、この場合、酵素活性は、メバロン酸生産に取り込まれる炭素を増加させるよう調節される。本明細書に記載の、メバロン酸生産に取り込まれる炭素量が増加するよう操作された各種酵素経路を有する組換え細胞を、イソプレン生産に使用することができる。一実施形態では、組換え細胞は、ホスホケトラーゼをコードする核酸を更に含む。別の実施形態では、組換え細胞には、次の、リボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡ及び／又はｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−リン酸３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）からなる群から選択される遺伝子のうちの１つ以上の活性を増加させるよう、遺伝子操作を施すことができる。別の実施形態では、これらの組換え細胞には、次の、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、及び／又はＨＰｒ（ｐｔｓＨ）といった遺伝子のうち、１種以上の遺伝子の活性を減少させるよう更に遺伝子操作を施すことができる。
【００７８】
１．イソプレン合成酵素の核酸及びポリぺプチド
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に記載の組換え細胞は、イソプレン合成酵素ポリペプチド又はイソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を発現する。本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に記載される細胞（本明細書に記載される通りに改変された宿主細胞を含む）は、イソプレン合成酵素ポリペプチド又はイソプレン合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を更に含む。核酸及び／又はポリペプチドは、内在性又は異種性のいずれであっても良い。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする内在性核酸は、常時発現型プロモータに調節可能なように連結される。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする内在性核酸は、誘導型プロモータに調節可能なように連結される。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする内在性核酸は、高発現型プロモータに調節可能なように連結される。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする内在性の核酸を１つ以上（例えば、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする内在性の核酸の２、３、又は４つ以上のコピー）使用する。
【００７９】
いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは異種ポリペプチドである。いくつかの態様では、細胞は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする異種核酸のコピーを１つ以上含む。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする異種核酸は、常時発現型プロモータに調節可能なように連結される。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする異種核酸は、誘導型プロモータに調節可能なように連結される。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする異種核酸は、高発現型プロモータに調節可能なように連結される。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする異種核酸は、低発現型プロモータに調節可能なように連結される。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、プエラリア（Pueraria）又はハコヤナギ属（Populus）、あるいはウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種由来のポリペプチド又はこれらの変異体である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、クズ（Pueraria montana又はPueraria lobata）、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、及びコットンウッド（Populus trichocarpa）由来のポリペプチド又はこれらの変異体である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドはユーカリプタス（Eucalyptus）に由来するものである。
【００８０】
イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする核酸は、更にベクターに組み込むこともできる。
【００８１】
特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比べ、内在性イソプレン合成酵素経路のポリペプチドが過剰発現するよう設計する。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする内在性核酸は、低発現型プロモータに調節可能なように連結される。
【００８２】
いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、マメ科、ブナ科、ミカン科、クスノキ科、ブドウ科、又はフトモモ科由来のポリペプチドである。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドはマメ科植物由来である。いくつかの実施態様では、マメ科植物イソプレン合成酵素は、ラッカセイ（Arachis hypogaea）（配列番号３）、ダイズ１（G. max 1）（配列番号５）、ダイズ２（G. max 2）（配列番号７）、ハッショウマメ（M. pruriens）（配列番号９）、キマメ（C. cajans）（配列番号１１）、ミヤコグサ（Lotus japonicas）（配列番号３３）、又はタルウマゴヤシ（Medicago truncatula）（配列番号３５）である。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは柑橘類に由来し、限定するものではないが、シトラス・レモン（Citrus limon）に由来する（配列番号１７）。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、シナモマム・テヌイパイル（Cinnamomum tenuipile）である（配列番号２３）。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ブドウであり、限定するものではないが、ビティス・ヴィニフェラ（Vitis vinifera）（配列番号２１）が挙げられる。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、フユナラ（Querus petraea）（配列番号１３）又はケルクス・アイレックス（Querus ilex）（配列番号１９）などのオーク由来である。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ユーカリ・グロブルス（Eucalyptus globulus）（配列番号２５）又はティーツリー（Melaleuca alternifolia）（配列番号２７）由来である。本発明のイソプレン合成酵素としては、ＪＧＩ寄託番号Ｇｌｙｍａ０９ｇ２１９００．１、Ｇｌｙｍａ２０ｇ１８２８０．１、Ｇｌｙｍａ０６ｇ４５７８０．１、及びＧｌｙｍａ１２ｇ１０９９０．１として識別されるものが挙げられるがこれに限定されない。本発明のイソプレン合成酵素には、ダイズ（G. max）ゲノム配列にコードされており、ＦＧＥＮＥＳＨにより予測されるポリペプチド、例えば、Ｇｌｙｍａ２０ｇ１８２８０＿１＿ＦＧとして特定されるポリペプチドにより特定されるものが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８３】
本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸配列を含むラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列を含むダイズ１（G. max）１イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含むダイズ２（G.e max 2）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９配列同一性を有する。本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含むハッショウマメ（M. pruriens）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドは、配列番号１１のアミノ酸配列を含むキマメ（C. cajans）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドは、配列番号３３のアミノ酸配列を含むミヤコグサ（Lotus japonicas）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドは、配列番号３５のアミノ酸配列を含むタルウマゴヤシ（Medicago truncatula）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９���％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。
【００８４】
いくつかの態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有する単離ポリペプチドを提供し、単離ポリペプチドはマメ科植物のものではない。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素活性を有する柑橘類由来の単離ポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を含むシトラス・レモン（Citrus limon）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素活性を有するシナモマム（Cinnamomum）由来の単離ポリペプチドは、配列番号２３のアミノ酸配列を含む（シナモマム・テヌイパイル（Cinnamomum tenuipile）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素活性を有するブドウ由来の単離ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含むビティス・ヴィニフェラ（Vitis vinifera）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素活性を有するオーク単離ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含むフユナラ（Querus petraea）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素活性を有するオーク由来の単離ポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むケルクス・アイレックス（Querus ilex）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素活性を有するユーカリプタス（Eucalyptus）由来の単離ポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を含むユーカリ・グロブルス（Eucalyptus globulus）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、マヌカ（manuka）イソプレン合成酵素活性を有する単離ポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列を含むティーツリー（Melaleuca alternifolia）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。
【００８５】
イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする核酸は、ベクター（複数種のベクターを含む）上に存在するものであってもよい。
【００８６】
代表的なイソプレン合成酵素の核酸としては、イソプレン合成酵素ポリペプチドの活性を少なくとも１種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する。代表的なイソプレン合成酵素ポリペプチドとしては、イソプレン合成酵素ポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、並びに融合ポリペプチドが挙げられる。イソプレン合成酵素ポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。加えて、イソプレン合成酵素変異体は、酵素活性が改良されているなどして、活性が改良されていてよい。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素変異体は、安定性（例えば、熱安定性）が改良されている、及び／又は溶解性が改良されているなどして、その他の特性が改良されている。
【００８７】
インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボで、ポリペプチドがＤＭＡＰＰをイソプレンへと変換する能力を測定して、ポリペプチドがイソプレン合成酵素ポリペプチド活性を有するか否かを判定する際には、標準法を使用できる。細胞抽出物中のイソプレン合成酵素ポリペプチド活性は、例えば、Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０〜１３０１６，（１９９５）に記載のとおりに測定することができる。代表的なアッセイでは、ＤＭＡＰＰ（Ｓｉｇｍａ）は窒素流下で蒸発させ、乾燥させ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ  ８．２）を用い１００ｍＭの濃度に再水和し、−２０℃で保存する。アッセイを実施するために、金属製スクリューキャップと、テフロンコーティングのなされたシリコン製隔壁（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを取り付けた２０ｍＬのヘッドスペースバイアル内で、５μＬの１Ｍ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ（２５０μｇ／ｍＬ）ＤＭＡＰＰ、６５μＬの植物抽出緩衝液（ＰＥＢ）（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、及び２ｍＭ  ＤＴＴ）に、２５μＬの細胞抽出物を加え、振とうさせながら３７℃で１５分間培養した。２００μＬの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡを加えて反応をクエンチさせ、ＧＣ／ＭＳにより定量することができる。
【００８８】
いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、植物のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はそれらの変異体である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、プエラリア（Pueraria）に由来するイソプレン合成酵素又はそれらの変異体である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ハコヤナギ属（Populus）由来のイソプレン合成酵素又はそれらの変異体である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ポプラ（poplar）のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はそれらの変異体である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドはクズ（kudzu）のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はそれらの変異体である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ヤナギ（willow）イソプレン合成酵素ポリペプチド又はそれらの変異体である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ユーカリプタス（Eucalyptus）イソプレン合成酵素ポリペプチド又はこれらの変異体である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、クズ（Pueraria）又はハコヤナギ（Populus）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘヤマナラシ（Populus tremula）などの交雑種、又はこれらの変異体由来のポリペプチドである。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ハリエンジュ（Robinia）、ヤナギ（Salix）、又はコバノブラシノキ（Melaleuca）あるいはこれらの変異体に由来する。
【００８９】
いくつかの実施態様では、植物イソプレン合成酵素は、マメ科、ヤナギ科（Salicaceae）、又はブナ科に由来する。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、タイワンクズ（Pueraria montana）（クズ（kudzu））（Ｓｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １３７：７００〜７１２，（２００５））、クズ（Pueraria lobata）、ポプラ（poplar）（ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、セイヨウハコヤナギ（Populus nigra）、コットンウッド（Populus trichocarpa）、又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘトレムラ（tremula）（ＣＡＣ３５６９６）など（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ  ２１３：４８３〜４８７，（２００１））、ヤマナラシ（aspen）（アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）など）（Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＢＣ  ２７０（２２）：１３０１０〜１３１６，（１９９５））、ヨーロッパナラ（English oak）（ヨーロッパナラ（Quercus robur））（Ｚｉｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第９８／０２５５０号）、又はそれらの変異体由来のポリペプチド又は核酸である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、プエラリア・モンタナ（Pueraria montana）、プエラリア・ロバタ（Pueraria lobata）、ポプラ・トレムロイド（Populus tremuloides）、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）、ポプラ・ニグラ（Populus nigra）又はポプラ・トリコカルパ（Populus trichocarpa）由来のイソプレン合成酵素、又はこれらの変異体である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）由来のイソプレン合成酵素であるか、又はこれらの変異体である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素は、バルサムポプラ（Populus balsamifera）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０３７）、アメリカクロヤマナラシ（Populus deltoides）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０３９）、フレモントコットンウッド（Populus fremontii）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０４０）、オオバギンドロ（Populus granididenta）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０３８）、ヤナギ属（Salix）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０４３）、ニセアカシア（Robinia pseudoacacia）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０４１）、フジ属（Wisteria）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＪＮ１７３０４２）、ユーカリ・グロブルス（Eucalyptus globulus）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢ２６６３９０）又はティーツリー（Melaleuca alterniflora）（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＹ２７９３７９）又はこれらの変異体である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）又はこれらの変異体由来のイソプレン合成酵素）をコードする核酸は、コドンを最適化されている。
【００９０】
いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、マメ科植物イソプレン合成酵素ポリペプチド又はこれらの変異体である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、落花生又はこれらの変異体由来のイソプレン合成酵素である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ムクナ（Mucuna）又はこれらの変異体由来のイソプレン合成酵素である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、キマメ（Cajanus）又はこれらの変異体由来のイソプレン合成酵素である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ダイズ（Glycine）又はこれらの変異体由来のイソプレン合成酵素である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ミヤコグサ（Lotus）又はこれらの変異体由来のイソプレン合成酵素である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ウマゴヤシ（Medicago）又はこれらの変異体由来のイソプレン合成酵素である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ポプラ（poplar）のイソプレン合成酵素ポリペプチド又はそれらの変異体である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドはクズのイソプレン合成酵素ポリペプチド又はそれらの変異体である。
【００９１】
本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、マメ科、ブナ科、ミカン科、クスノキ科、ブドウ科、又はフトモモ科由来の核酸によりコードされる。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、マメ科植物由来の核酸によりコードされる。いくつかの実施態様では、マメ科植物イソプレン合成酵素をコードする核酸は、ラッカセイ（Arachis hypogaea）（配列番号４）、ダイズ１（G. max 1）（配列番号６）、ダイズ２（G. max 2）（配列番号８）、ハッショウマメ（M. pruriens）（配列番号１０）、キマメ（C. cajans）（配列番号１２）、野生のマメ科植物（ミヤコグサ（Lotus japonicus）など）、又はクローバー様の植物（タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）など）に由来する。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は限定するものではないが、レモン（シトラス・レモン（Citrus limon））を含む柑橘類由来の核酸によりコードされる。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、シナモマム・テヌイパイル（Cinnamomum tenuipile）由来の核酸によりコードされる。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、限定するものではないが、ワイン用ブドウ（ビティス・ヴィニフェラ（Vitis vinifera）など）を含む、ブドウ由来の核酸によりコードされる。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、フユナラ（Querus petraea）（配列番号１４）又はケルクス・アイレックス（Querus ilex）などのオーク由来の核酸によりコードされる。いくつかの実施態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ユーカリ・グロブルス（Eucalyptus globulus）又はティーツリー（Melaleuca alternifolia）由来の核酸によりコードされる。本発明のイソプレン合成酵素としては、ＪＧＩ寄託番号Ｇｌｙｍａ０９ｇ２１９００．１、Ｇｌｙｍａ２０ｇ１８２８０．１、Ｇｌｙｍａ０６ｇ４５７８０．１、及びＧｌｙｍａ１２ｇ１０９９０．１として識別されるものが挙げられるがこれに限定されない。本発明のイソプレン合成酵素には、ダイズ（G. max）ゲノム配列にコードされており、ＦＧＥＮＥＳＨにより予測されるポリペプチド、例えば、Ｇｌｙｍａ２０ｇ１８２８０＿１＿ＦＧとして特定されるポリペプチドにより特定されるものが挙げられるがこれらに限定されない。
【００９２】
本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドは、配列番号４の配列を含む核酸配列によりコードされるラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドは、配列番号６の配列を含む核酸配列によりコードされるダイズ１（G. max 1）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドは、配列番号８の配列を含む核酸配列によりコードされるダイズ２（G. max 2）イソプレン合成酵素とと少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドは、配列番号１０の配列を含む核酸配列によりコードされるハッショウマメ（M. pruriens）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素活性を有するマメ科植物由来の単離ポリペプチドは、配列番号１２の配列を含む核酸配列によりコードされるキマメ（C. cajans）イソプレン合成酵素と少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有する。
【００９３】
いくつかの態様では、イソプレン合成酵素核酸又はポリペプチドは、天然に生じるポリペプチド又は核酸である（例えば、ハコヤナギ属から天然に生じるポリペプチド又は核酸）。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸ではない。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体である（例えば、ハコヤナギ属の野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体）。
【００９４】
いくつかの態様では、イソプレン合成酵素核酸又はポリペプチドは、天然に生じるポリペプチド又は核酸である（例えば、ラッカセイ（Arachis）由来の天然に生じるポリペプチド又は核酸）。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸ではない。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素核酸又はポリペプチドは、野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体である（例えば、ラッカセイ（Arachis）由来の野生型又は天然に生じるポリペプチド又は核酸の変異体）。
【００９５】
いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、マメ科植物イソプレン合成酵素である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、野生型又は天然型マメ科植物イソプレン合成酵素である。いくつかの態様では、マメ科植物イソプレン合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素などの参照イソプレン合成酵素と比較して、改良された触媒活性など、改良された活性を有する。活性（例えば、触媒活性）の向上は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のうちのいずれかの程度であり得る。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の向上は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、又は１００倍のいずれかである。いくつかの態様では、触媒活性などの活性の向上は、約１０％〜約１００倍である（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、又は約５倍〜約２０倍）。いくつかの態様では、マメ科植物イソプレン合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素などの参照イソプレン合成酵素と比較して改良された溶解度を有する。溶解度における上昇は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９５％のうちの任意であり得る。可溶性の向上は、少なくとも約１倍、２倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、７５倍、又は１００倍のうちのいずれかの程度であり得る。いくつかの態様では、溶解性の向上は、約１０％〜約１００倍のうちのいずれかの程度であり得る（例えば、約２０％〜約１００倍、約５０％〜約５０倍、約１倍〜約２５倍、約２倍〜約２０倍、又は約５倍〜約２０倍）。
【００９６】
いくつかの態様では、ｋｃａｔは少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、又は３．０である。他の態様では、ｋｃａｔは少なくとも約３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６．４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８．５．９又は６．０である。
【００９７】
いくつかの態様では、Ｋｍは少なくとも約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１６、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、又は２５である。
【００９８】
いくつかの態様では、ＫｉＤＭＡＰＰ値少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、又は６０である。
【００９９】
いくつかの態様では、マメ科植物イソプレン合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素に対し少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％を有する。マメ科植物イソプレン合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素と配列相同性を共有することができる。いくつかの態様では、マメ科植物イソプレン合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素と、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％のうちの任意のアミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの態様では、マメ科植物イソプレン合成酵素は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素と、約７０％〜約９９．９％、約７５％〜約９９％、約８０％〜約９８％、約８５％〜約９７％、又は約９０％〜約９５％のうちの任意のアミノ酸配列同一性を有し得る。
【０１００】
いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは変異体である。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチドは、野生型又は天然型イソプレン合成酵素の変異体である。いくつかの態様では、変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素と比較して触媒活性が改良されているなど、活性が改良されている。
【０１０１】
本発明の任意の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、野生型又は天然型イソプレン合成酵素中に変異を含む。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素変異体は、少なくとも１箇所のアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸挿入、及び／又は少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素変異体は、少なくとも１箇所のアミノ酸置換を有する。いくつかの態様では、変異体と、野生型又は天然型イソプレン合成酵素との間で異なっているアミノ酸残基の数は、１以上であってよく、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、又は５０以上のアミノ酸残基が異なっていてよい。天然型イソプレン合成酵素には、植物、例えば、ピーナッツ（ラッカセイ（Arachis hypogaea）など）、八升豆（ハッショウマメ（Mucuna pruriens）など）、キマメ（キマメ（Cajanus cajans））、大豆（ダイズ（G. max）など）、野生のマメ科植物（ミヤコグサ（Lotus japonicus）など）、クローバー様の植物（タルウマゴヤシ（Medicago truncatula）など）、柑橘類（シトラス・レモン（Citrus limon）など）、シナモマム・テヌイパイル（Cinnamomum tenuipile）、ワイン用ブドウ（ビティス・ヴィニフェラ（Vitis vinifera）など）、オーク（フユナラ（Querus petraea）又はケルクス・アイレックス（Querus ilex）など）、ユーカリ・グロブルス（Eucalyptus globulus）又はティーツリー（Melaleuca alternifolia）由来の任意のイソプレン合成酵素が含有され得る。いくつかの態様では、変異体は、ラッカセイ（Arachis hypogaea）由来のイソプレン合成酵素の変異体である。いくつかの態様では、ラッカセイ（Arachis hypogaea）由来のイソプレン合成酵素変異体は、少なくとも１箇所のアミノ酸置換、少なくとも１つのアミノ酸挿入、及び／又は少なくとも１つのアミノ酸欠失を有する。いくつかの態様では、変異体は、トランケート型ラッカセイ（Arachis hypogaea）イソプレン合成酵素である。いくつかの態様では、変異体（例えば、ラッカセイ（Arachis hypogaea）由来のイソプレン合成酵素の変異体）をコードする核酸は、コドンを最適化させたものである（例えば、異種イソプレン合成酵素を発現させる宿主細胞に基づきコドンを最適化している）。いくつかの態様では、変異体は、ハッショウマメ（Mucuna pruriens）由来のイソプレン合成酵素の変異体である。いくつかの態様では、ハッショウマメ（Mucuna pruriens）由来のイソプレン合成酵素の変異体は、少なくとも一箇所にアミノ酸置換、少なくとも１箇所にアミノ酸挿入、及び／又は少なくとも１箇所にアミノ酸欠失を有する。いくつかの態様では、変異体は、トランケート型のハッショウマメ（Mucuna pruriens）イソプレン合成酵素である。いくつかの態様では、変異体（例えば、ハッショウマメ（Mucuna pruriens）由来のイソプレン合成酵素の変異体）をコードする核酸は、コドンを最適化させたものである（例えば、異種イソプレン合成酵素を発現させる宿主細胞に基づきコドンを最適化している）。
【０１０２】
本開示のイソプレン合成酵素ポリペプチドは、国際公開第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／１２４１４６号、米国特許出願第２０１０／００８６９７８号に記載のいずれかのイソプレン合成酵素又はイソプレン合成酵素変異体であってよい。これらの文献に記載される、イソプレン合成酵素及びイソプレン合成酵素変異体に関係するすべての内容は、参照により本開示に明示的に組み込む。
【０１０３】
本開示のプロモータのうちのいずれか（例えば、本開示に記載され、本開示の実施例において識別される、誘導型プロモータ及び常時発現型プロモータなどのプロモータ）を使用して、本開示のいずれかのイソプレン合成酵素の発現を駆動させることができる。
【０１０４】
好適なイソプレン合成酵素としては、ＪＧＩ寄託番号Ｇｌｙｍａ０９ｇ２１９００．１、Ｇｌｙｍａ２０ｇ１８２８０．１、Ｇｌｙｍａ０６ｇ４５７８０．１、及びＧｌｙｍａ１２ｇ１０９９０．１により識別されるものが挙げられるがこれに限定されない。本発明のイソプレン合成酵素には、ダイズ（G. max）ゲノム配列にコードされており、ＦＧＥＮＥＳＨにより予測されるポリペプチド、例えば、Ｇｌｙｍａ２０ｇ１８２８０＿１＿ＦＧとして特定されるポリペプチドにより特定されるものが挙げられるがこれらに限定されない。本明細書に記載のイソプレン合成酵素をコードする微生物を作製する方法を含む組成物又は方法のいずれかにおいて使用することのできるイソプレン合成酵素のタイプは、国際出願第２００９／０７６６７６号、国際出願第２０１０／００３００７号、国際出願第２００９／１３２２２０号、国際出願第２０１０／０３１０６２号、国際出願第２０１０／０３１０６８号、国際出願第２０１０／０３１０７６号、国際出願第２０１０／０１３０７７号、国際出願第２０１０／０３１０７９号、国際出願第２０１０／１４８１５０号、国際出願第２０１０／１２４１４６号、国際出願第２０１０／０７８４５７、及び国際出願第２０１０／１４８２５６号、米国特許出願第１３／２８３５６４号、並びにＳｈａｒｋｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｔｐｓ−Ｂテルペンシンターゼファミリーのアクリル系テルペンシンターゼの単系統群を形成するイソプレン合成酵素遺伝子（Isoprene Synthase Genes Form A Monophyletic Clade Of Acyclic Terpene Synthases In The Tps-B Terpene Synthase Family）」，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ（２０１２）（オンラインでもＤＯＩ：１０．１１１１／ｅｖｏ．１２０１３に利用可能）にも記載されており、これらの文献の内容は、イソプレン合成酵素及びイソプレン合成酵素変異体に関し、参照によりその全体が本明細書に明示的に援用される。
【０１０５】
２．ＭＶＡ経路の核酸及びポリぺプチド
完全なＭＶＡ経路は、上流経路及び下流経路の２群に分けることができる。ＭＶＡ経路の上流部位では、細胞代謝中に産出されたアセチルＣｏ−Ａは、（ａ）（ｉ）チオラーゼ活性又は（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素活性、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、及び（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素酵素活性のいずれかを有するポリペプチド部位によりメバロン酸へと変換される。最初に、チオラーゼ又はアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡを利用する）の作用によりアセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する。次に、アセトアセチル−ＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素の酵素作用により、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）へと変換される。このＣｏ−Ａ誘導体をＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素により還元してメバロン酸を生成する。この反応は、メバロン酸経路によるイソプレノイド生産の律速段階となる。下流ＭＶＡ経路では、メバロン酸塩は、次にメバロン酸キナーゼの作用により５−ホスホメバロン酸へと変換され、これは続いてホスホメバロン酸キナーゼの酵素活性により５−ジホスホメバロン酸へと転換される。最後に、酵素のメバロン酸−５−ピロリン酸塩デカルボキシラーゼの活性により、５−ジホスホメバロン酸からＩＰＰが形成される。メバロン酸依存性生合成経路は、イソプレノイド前駆体分子のジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）及びイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の生産に特に重要である。
【０１０６】
ＭＶＡ経路のポリペプチド例としては、限定するものではないが、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド（例えば、ｍｖａＳによりコードされる酵素）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド（例えば、ｍｖａＲによりコードされる酵素又はチオラーゼは欠損しているものの還元酵素活性は保持するよう改変を受けたｍｖａＥによりコードされる酵素）、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＰＭＤＣ）ポリペプチド、イソペンテニルリン酸キナーゼ（ＩＰＫ）ポリペプチド、ＩＰＰイソメラーゼポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＭＶＡ経路ポリペプチドに関係する２つ又はそれ以上の活性を有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）、が挙げられる。特に、ＭＶＡ経路ポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。ＭＶＡ経路の代表的な核酸としては、ＭＶＡ経路に含まれるポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路に含まれる代表的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。更に、イソプレンの生産を増大させるような、ＭＶＡ経路のポリペプチド変異体も、良好に使用することができる。
【０１０７】
使用され得るＭＶＡ経路ポリペプチドの非限定例は、国際出願公開第２００９／０７６６７６号；同第２０１０／００３００７号及び同第２０１０／１４８１５０号に記載のものである。
【０１０８】
ａ．上流ＭＶＡ経路のポリペプチドをコードする核酸
ＭＶＡ経路の上流は、細胞内代謝により生産されるアセチルＣｏ−Ａを、（ａ）（ｉ）チオラーゼ活性又は（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素活性、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、及び（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素活性のいずれかの活性をもつポリペプチドの作用によりメバロン酸に変換する際の開始基質として利用する。最初に、チオラーゼ又はアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ（アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡを利用する）の作用によりアセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する。次に、アセトアセチル−ＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素の酵素作用により、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）へと変換される。このＣｏ−Ａ誘導体をＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素により還元してメバロン酸を生成する。この反応は、メバロン酸経路によるイソプレノイド生産の律速段階となる。
【０１０９】
ＭＶＡ経路上流に関係するポリペプチドの非限定例としては、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチドが挙げられる。ＭＶＡ経路上流のポリペプチドには、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが含まれる。ＭＶＡ経路上流に関係する代表的な核酸としては、ＭＶＡ経路上流に関係するポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路に含まれる代表的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。したがって、本開示では、ＭＶＡ経路上流関連性ポリペプチドをコードする任意の遺伝子は、本発明において使用できることを企図する。
【０１１０】
特定の実施形態では、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来の様々なｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を、単独で、あるいはＭＶＡ経路上流関連性タンパク質をコードする１つ以上の他のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子と組み合わせて選択することが、本発明の範囲内のものとして企図される。他の実施形態では、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素の遺伝子は、（ｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ合成酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素）ポリペプチド及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチドをコードする１つ以上の他の遺伝子との組み合わせで本発明の範囲内のものとして企図される。したがって、特定の態様では、本明細書において企図される遺伝子の任意の組み合わせを、本開示に記載される任意の手法により、組み換え細胞で発現させることができる。
【０１１１】
本明細書に使用することのできる上流ＭＶＡ経路ポリペプチドの更なる非限定例は、国際出願公開第２００９／０７６６７６号；同第２０１０／００３００７号及び同第２０１０／１４８１５０号に記載される。
【０１１２】
（ｉ）アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ核酸及びポリペプチド
アセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子（ｎｐｈＴ７としても知られる）は、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有し、かつ２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性は最小限である（例えば、非活性である）酵素をコードする遺伝子である。例えば、Ｏｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｖｏｌ  １０７，Ｎｏ．２５，ｐｐ．１１２６５〜１１２７０（２０１０）を参照されたい。この文献中のｎｐｈＴ７に関する教示は、本開示に明確に援用される。日本国特許公開第２００８〜６１５０６（Ａ）号及び米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４９号には、放線菌のストレプトマイセス属ＣＬ１９０株のアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子が記載されている。アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素も、アセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素として参照され得る。使用することのできる代表的なアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素（又はアセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素）としては、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＢ５４０１３１．１が挙げられる。
【０１１３】
一実施形態では、本発明のアセトアセチルＣｏＡシンターゼは、不可逆反応を介し、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡから、アセトアセチルＣｏＡを合成する。アセトアセチルＣｏＡシンターゼを使用してアセチルＣｏＡを生成することで、この作用は不可逆的なものであり、かつアセトアセチルＣｏＡチオラーゼ酵素の２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する作用は可逆的なものであるという、更なる利点が提供される。これらを踏まえると、アセトアセチルＣｏＡシンターゼを使用して、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成することで、チオラーゼを使用して同様の最終産物を生産した場合と比較して、イソプレンの生産量において有意な向上が得られる。
【０１１４】
これに加え、アセトアセチルＣｏＡシンターゼを使用してイソプレンを生成した場合には、アセトアセチルＣｏＡシンターゼが、マロニルＣｏＡの脱炭酸によりマロニルＣｏＡをアセチルＣｏＡへと変換し得るという更なる利点も提供する。したがって、開始基質の貯蔵量は、アセチルＣｏＡの開始量により制限されない。アセトアセチルＣｏＡシンターゼによるアセトアセチルＣｏＡの合成は、開始基質がマロニルＣｏＡのみである場合にのみ引き続き生じ得る。一実施形態では、開始時のマロニルＣｏＡのプール量は、よりマロニルＣｏＡを有する宿主株を使用することにより増加する。このようなプール量の増加は、天然に生じ得るものであり又は分子操作により設計され得るものである。例えば、Ｆｏｗｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７５，Ｎｏ．１８，ｐｐ．５８３１〜５８３９（２００９）を参照されたい。
【０１１５】
本開示に記載の任意の態様又は実施例では、マロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを合成する能力を有する酵素を使用できる。このような酵素の非限定例を本明細書に記載する。本開示に記載の特定の実施形態では、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する能力を有する放線菌のストレプトマイセス属から誘導されるアセトアセチルＣｏＡシンターゼ遺伝子を使用できる。このようなアセトアセチルＣｏＡシンターゼの遺伝子の例としては、配列番号１５のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。このような、配列番号１５のアミノ酸配列を有するタンパク質は、マロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有し、２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性は有さないアセトアセチルＣｏＡシンターゼに相当する。
【０１１６】
アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ配列
2015521036.tif 000003
ポリペプチドのアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ活性は、以降のとおりに評価することができる。具体的には、評価されることになるポリペプチドをコードする遺伝子は、遺伝子を細胞中で発現させ、続いてクロマトグラフィーなどの手法によりタンパク質を精製することができるような様式で、まずは宿主細胞に導入される。得られた評価すべきタンパク質を含有させた緩衝液に、基質としてマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡを加え、続いて例えば、所望の温度（例えば、１０℃〜６０℃）でインキュベートする。反応の完了後、基質の減少量及び／又は生成物量（アセトアセチルＣｏＡ）を測定する。したがって、試験したタンパク質がマロニルＣｏＡ及びアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する機能を有するか評価すること、並びに合成度を評価することができる。このような場合では、このタンパク質が、２分子のアセチルＣｏＡからアセトアセチルＣｏＡを合成する活性を有しているか否かは、得られた評価すべきタンパク質を含有させた緩衝液に、アセチルＣｏＡのみを基質として加え、基質の減少量及び／又は同様の方法において生産された生産物量を測定することにより、試験することができる。
【０１１７】
（ｉｉ）ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードする遺伝子
特定の実施形態では、リステリア・グレイ（L.grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カセリフラブス（E. casseliflavus）及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来の様々なｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を、単独で、あるいはＭＶＡ経路上流関連性タンパク質をコードする１つ以上の他のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子と組み合わせて選択することが、本発明の範囲内のものとして企図される。いくつかの実施態様では、ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性の両方を保有するポリペプチドをコードする（Ｈｅｄｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２  Ａｐｒｉｌ；１８４（８）：２１１６〜２１２２）。リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カセリフラブス（E. casseliflavus）、及びエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）では、ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性のいずれをも保有しているポリペプチドをコードする。実際に、ｍｖａＥ遺伝子産物は、真性細菌で見られる、ＩＰＰ生合成に関係する最初の二機能性酵素となるものであり、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の第一例は、天然において他のタンパク質と融合していた（Ｈｅｄｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２  Ａｐｒｉｌ；１８４（８）：２１１６〜２１２２）。それに対しｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を有するポリペプチドをコードし得る。
【０１１８】
適宜に、組換え細胞（例えば、大腸菌（E. coli））は、リステリア・グレイ（L. grayi）、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）及び／又はエンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）由来の１種以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を発現して、イソプレンを生産するよう遺伝子操作することができる。１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子をマルチコピープラスミドで発現させることもできる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を宿主細胞の染色体に組み込むことができる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子のいずれもの異種発現に際し、遺伝子発現は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータのいずれかにより駆動できる。プロモータは、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
【０１１９】
ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼ活性及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を両方保有しているポリペプチドをコードする。ｍｖａＥ遺伝子によりコードされているポリペプチドのチオラーゼ活性は、アセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換するのに対し、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素ポリペプチドの酵素活性は、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する。ｍｖａＥポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにｍｖａＥポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【０１２０】
変異型ｍｖａＥポリペプチドとしては、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けており、かつｍｖａＥポリペプチド活性（すなわち、アセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力並びに３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する能力）を保持しているものが挙げられる。アミノ酸置換は、保存的なものであっても非保存的なものであってもよく、アミノ酸残基の置換は遺伝子暗号によりコードされていてもコードされていなくてもよい。標準的な２０個のアミノ酸「記号（alphabet）」を、側鎖の類似性に基づき化学的なファミリーに分けた。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を持つアミノ酸が挙げられる。「保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。「非保存的アミノ酸置換」では、アミノ酸残基は、化学的に異なる側鎖を有するアミノ酸残基で置換される（すなわち、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸により置換される）。
【０１２１】
ｍｖａＥポリペプチド中にアミノ酸置換を導入することで、分子の官能性を改良することができる。例えば、ｍｖａＥポリペプチドの、基質に対する結合親和性を増加させるアミノ酸置換、あるいはアセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する能力及び／又は３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する能力を改良するアミノ酸置換を、ｍｖａＥポリペプチドに導入することができる。いくつかの態様では、ｍｖａＥポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的なアミノ酸置換を含有する。
【０１２２】
一態様では、イソプレン生産には、分解していない又は分解しにくいｍｖａＥタンパク質を使用することができる。使用することのできる、分解されていない又は分解しにくいｍｖａＥ遺伝子産物の例としては、限定するものではないが、エンテロコッカス・フェシウム（E. faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）、エンテロコッカス・カセリフラブス（E. casseliflavus）、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）及びリステリア・グレイ（L. grayi）に由来するものが挙げられる。当業者は、大腸菌（E. coli）ＢＬ２１（ＤＥ３）においてｍｖａＥタンパク質を発現させ、任意の標準的な分子生物学手法により断片が存在していないか調べることができる。例えば、Ｈｉｓ−ｔａｇを利用して精製した後、すなわちメバロン酸又はイソプレンを生産する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１において発現させた後、本明細書に記載の検出法を使用して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをＳａｆｅｓｔａｉｎで染色することにより、断片が存在していないことを確認することができる。
【０１２３】
Ｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２，Ａｐｒｉｌ；１８４（８）：２１１６〜２１２２）に記載のものなどの標準法を使用して、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性並びにＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性を測定することにより、ポリペプチドがｍｖａＥ活性を有しているか評価することができる。代表的なアッセイでは、アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ活性は、アセトアセチルＣｏＡの形成又はリオリシスに伴う吸光度の変化を分光光度計により３０２ｎｍにて監視することで測定できる。アセトアセチルＣｏＡ合成を判定するための各反応に関する標準的なアッセイ条件は、１ｍＭのアセチルＣｏＡ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのトリス（ｐＨ  １０．５）というものであり、反応は酵素の添加により開始される。アッセイは最終用量２００μＬで実施できる。アッセイに関し、１酵素単位（ｅｕ）は、１分間で１μｍｏｌのアセトアセチルＣｏＡを合成又はチオリシスすることを意味する。他の代表的なアッセイでは、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素活性は、分光光度計により、３４０ｎｍでのＮＡＤＰ（Ｈ）の出現又は消失をもとに監視することもできる。ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロン酸への還元的脱アシル化について測定した各反応の標準的なアッセイ条件は、０．４ｍＭのＮＡＤＰＨ、１．０ｍＭの（Ｒ，Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡ、１００ｍＭのＫＣｌ及び１００ｍＭのＫｘＰＯ４（ｐＨ  ６．５）というものである。アッセイは最終用量２００μＬで実施する。反応は酵素の添加により開始される。アッセイに関し、１ｅｕは、１分間で１μｍｏｌのＮＡＤＰ（Ｈ）が代謝回転されることを意味する。これは、０．５μｍｏｌのＨＭＧ−ＣｏＡ又はメバロン酸が代謝回転することに相当する。
【０１２４】
ｍｖａＥ核酸の例としては、ｍｖａＥポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードする核酸が挙げられる。ｍｖａＥポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。代表的なｍｖａＥ核酸としては、例えば、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、及び／又はエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）から単離されたｍｖａＥ核酸が挙げられる。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１のｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号４７に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）のｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号４８に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２のｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号４９に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）のｍｖａＥ遺伝子によりコードされるｍｖａＥ核酸は、配列番号５０に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）のｍｖａＥ遺伝子によりコードされているｍｖａＥ核酸は、これまでにメバロン酸を生産するための大腸菌（E. coli）において開示されているｍｖａＥ遺伝子に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る（米国特許第２００５／０２８７６５５  Ａ１号；Ｔａｂａｔａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．−Ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６：１４８７〜１４９１，２００４を参照されたい）。
【０１２５】
リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＥの配列
2015521036.tif 000004
【０１２６】
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＥの配列
2015521036.tif 000005
【０１２７】
エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２  ｍｖａＥの配列
2015521036.tif 000006
【０１２８】
エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＥの配列
2015521036.tif 000007
【０１２９】
ｍｖａＥ核酸は、組み換え細胞において、マルチコピープラスミド上で発現させることができる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、ｍｖａＥ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込むこともできる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、ｍｖａＥ核酸の異種発現に際し、核酸の発現は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータのいずれかにより駆動できる。プロモータは、ｍｖａＥ核酸の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
【０１３０】
ｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ活性を保有するポリペプチドをコードする。このポリペプチドは、アセトアセチルＣｏＡを、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を変換させることができる。ｍｖａＳポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びにｍｖａＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有する、本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【０１３１】
変異型ｍｖａＳポリペプチドとしては、１つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸置換を受けており、かつｍｖａＳポリペプチド活性（すなわち、アセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡをメバロン酸に変換する能力）を保持しているものが挙げられる。ｍｖａＳポリペプチド中にアミノ酸置換を導入することで、分子の官能性を改良することができる。例えば、ｍｖａＳポリペプチドの、基質に対する結合親和性を増加させるアミノ酸置換、あるいはアセトアセチルＣｏＡを３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡに変換する能力を改良するアミノ酸置換を、ｍｖａＳポリペプチドに導入することができる。いくつかの態様では、ｍｖａＳポリペプチド変異体は、１つ以上の保存的なアミノ酸置換を含有する。
【０１３２】
Ｑｕａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，１９８９，２６２：１５９〜１６４）に記載のものなどの標準法を使用して、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの活性を測定することにより、ポリペプチドがｍｖａＳ活性を有するか評価することもできる。代表的なアッセイでは、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの活性は、３０３ｎｍでの吸光度の変化を監視し、エノール形態のアセトアセチルＣｏＡの消失を分光光度をもとに評価することで、検定できる。３０℃下で、５０ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２及び０．２ｍＭのジチオスレイトールを含有する標準的な１ｍＬのアッセイ系に、５μＬのアセチルリン酸、１０，Ｍ−アセトアセチル−ＣｏＡ及び５ｕＬの抽出試料を加え、続いてアセチルＣｏＡ（１００ｕＭ）及び１０ユニットのＰＴＡを同時に加えることができる。次に、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼの活性を、アセチルＣｏＡ添加前及び添加後の速度（rate）の差として測定する。使用した条件下（ｐＨ  ８．０、１０ｍＭ−ＭｇＣｌ２）での、アセトアセチルＣｏＡの吸光係数は、１２．２×１０３Ｍ−１  ｃｍ−１である。定義によると、１ユニットの酵素活性により、１分あたり１μｍｏｌのアセトアセチルＣｏＡが変換されることになる。
【０１３３】
あるいは、組換え細胞におけるメバロン酸の生産量は、限定するものではないが、ガスクロマトグラフィー（米国特許出願公開番号第２００５／０２８７６５５（Ａ１）号を参照されたい）又はＨＰＬＣ（米国特許出願第公開２０１１／０１５９５５７（Ａ１）号を参照されたい）で測定することができる。代表的なアッセイの際には、１種以上の抗生物質を添加したＬＢブロスを含有させた振とうチューブに培養物を接種し、３４℃にて、２５０ｒｐｍで１４時間インキュベートする。次に、１％グルコース、０．１％酵母エキス及び２００μＭのＩＰＴＧを添加したＴＭ３培地を入れたウェルプレート中で、最終的なＯＤが０．２になるよう培養物を希釈する。次に、プレートを、Ｂｒｅａｔｈ  Ｅａｓｉｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でシールし、振とう／恒温器で、３４℃にて、６００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。次に各培養物１ｍＬを３，０００×ｇで５分遠心分離する。次に、上清に２０％硫酸を添加し、氷上で５分インキュベートする。次に、混合物を３０００×ｇで５分遠心分離し、ＨＰＬＣ解析のため上清を回収する。メバロン酸（Ｓｉｇｍａ）の標準曲線と比較して、試料中のメバロン酸濃度を測定する。更に、当該技術分野において既知の任意の手法によりグルコースオキシダーゼアッセイを実施し、グルコース濃度を測定する。ＨＰＬＣを使用し、各試料により得られた屈折率を、濃度既知の各種メバロン酸溶液のＨＰＬＣをもとに作成した検量線に対し比較して、メバロン酸濃度を定量することができる。
【０１３４】
ｍｖａＳ核酸の例としては、ｍｖａＳポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードする核酸が挙げられる。ｍｖａＳポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。代表的なｍｖａＳ核酸としては、例えば、リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）、及び／又はエンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）から単離されたｍｖａＳ核酸が挙げられる。リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１のｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号５１に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）のｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号５２に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２のｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号５３に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）のｍｖａＳ遺伝子によりコードされるｍｖａＳ核酸は、配列番号５４に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％又は８５％の配列同一性を有し得る。エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）ｍｖａＳ遺伝子によりコードされているｍｖａＳ核酸は、これまでにメバロン酸を生産するための大腸菌（E. coli）において開示されているｍｖａＥ遺伝子に対し、少なくとも約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９５％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、又は８５％の配列同一性を有し得る（米国特許第２００５／０２８７６５５  Ａ１号；Ｔａｂａｔａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．−Ｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ２６：１４８７〜１４９１，２００４を参照されたい）。
【０１３５】
リステリア・グレイ（Listeria grayi）ＤＳＭ  ２０６０１  ｍｖａＳの配列
2015521036.tif 000008
【０１３６】
エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）ｍｖａＳの配列
2015521036.tif 000009
【０１３７】
エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）ＥＧ２  ｍｖａＳの配列
2015521036.tif 000010
【０１３８】
エンテロコッカス・カセリフラブス（Enterococcus casseliflavus）ｍｖａＳの配列
2015521036.tif 000011
【０１３９】
ｍｖａＳ核酸は、組み換え細胞において多コピープラスミド上で発現させることができる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、ｍｖａＳ核酸は、宿主細胞の染色体に組み込むこともできる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、ｍｖａＳ核酸の異種発現に際し、核酸の発現は、誘導型プロモータ又は常時発現型プロモータのいずれかにより駆動できる。プロモータは、ｍｖａＳ核酸の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
【０１４０】
本開示に記載される通りの組み換え細胞の組成は、同様に本発明の範囲内で企図される。組み換え細胞には、同様に後代細胞も包含されることは理解される。
【０１４１】
ｂ．ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする核酸
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載の組成物又は方法の任意のものに記載の細胞は、メバロン酸（ＭＶＡ）経路下流のポリペプチドをコードする核酸を１つ以上更に含む。いくつかの態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする内在性核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結される。いくつかの態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。いくつかの態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比較して、内在性ＭＶＡ経路下流のポリペプチドが過剰発現するよう設計する。いくつかの態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。
【０１４２】
メバロン酸生合成経路の下流は、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）及びジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）を含む。いくつかの態様では、ＭＶＡ経路の下流は、イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）を更に含む。本明細書に提供される細胞は、イソプレン合成酵素、ＭＶＡ経路上流の１種以上のポリペプチド及び／又はＭＶＡ経路下流の１種以上のポリペプチドをコードする核酸を含み得る。ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、（ａ）メバロン酸を５−ホスホメバロン酸ヘとリン酸化する酵素、（ｂ）５−ホスホメバロン酸を５−ジホスホメバロン酸へと変換する酵素、（ｃ）５−ジホスホメバロン酸をイソペンテニルピロリン酸へと変換する酵素、のうちの任意の酵素であり得る。より具体的には、メバロン酸を５−ホスホメバロン酸へとリン酸化する酵素は、Ｍ．マゼイ（M. mazei）メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス（Lactobacillus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、メタノコックシド（Methanoccoides）メバロン酸キナーゼポリペプチド、メタノコックシド・バートニイ（Methanoccoides burtonii）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトミセス（Streptomyces）メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトミセス（Streptomyces）ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群に由来するものであり得る。他の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸へとリン酸化する酵素はＭ．マゼイ（M. mazei）・メバロン酸キナーゼである。
【０１４３】
いくつかの態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは異種ポリペプチドである。いくつかの態様では、細胞は、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする異種核酸のコピーを１つ以上含む。いくつかの態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする異種核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結される。いくつかの態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする異種核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。いくつかの態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする異種核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。いくつかの態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする異種核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。いくつかの態様では、異種ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のポリペプチドである。
【０１４４】
ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする核酸は、細胞のゲノムに組み込むことができ、あるいは細胞で安定的に発現させることができる。ＭＶＡ経路下流のポリペプチドをコードする核酸は更に、ベクター上に存在させてもよい。
【０１４５】
ＭＶＡ経路下流のポリペプチドの例としては、次の（ｉ）メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）；（ｉｉ）ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）；（ｉｉｉ）ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）；及び（ｉｖ）イソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）も挙げられる。詳細には、下流のＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ（Methanosarcina）属由来のものであってよく、更に詳細には、下流のＭＶＫポリペプチドは、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のものであってよい。他の態様では、下流ＭＶＫポリペプチドは、メタノコックシド（Methanococcoides）属、及びより詳細には、メタノコックシド・バートニイ（M. Burtonii）由来のものであってよい。ＭＶＡ経路下流のポリぺプチドのその他の例は、米国特許出願公開第２０１０／００８６９７８号に見出すことができ、この内容は、ＭＶＫ経路下流のポリペプチド及びＭＶＫ経路下流のポリペプチド変異体に関し参照によりその全文が明示的に本明細書に援用される。
【０１４６】
本明細書に記載の細胞のうち任意のものは、ＩＤＩ核酸（例えば、ＩＤＩをコードする内在性又は異種核酸）を含み得る。イソペンテニルジホスフェートイソメラーゼポリペプチド（イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ又はＩＤＩ）は、イソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する（例えば、ＩＰＰをＤＭＡＰＰへと変換し及び／又はＤＭＡＰＰをＩＰＰヘと変換する）。例示的なＩＤＩポリペプチドとしては、ＩＤＩポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＩＰＰ及びＤＭＡＰＰを相互変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＩＤＩポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＩＤＩ核酸の例としては、ＩＤＩポリペプチド活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードする核酸が挙げられる。ＩＤＩポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。
【０１４７】
特に、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドとしては、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。ＭＶＡ経路下流の核酸の例としては、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路下流のポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。更に、イソプレンの生産量を増加させるような、ＭＶＡ経路下流のポリペプチド変異体も、良好に使用することができる。
【０１４８】
いくつかの態様では、ＭＶＡ経路下流のポリペプチドは、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）、エンテロコッカス・フェカリス（Enterococcus faecalis）又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）由来のポリペプチドである。いくつかの態様では、前記ＭＶＫは、ラクトバチルス（Lactobacillus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ（Lactobacillus sakei）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレヴィシエ（Saccharomyces cerevisiae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス（Streptococcus）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ（Streptococcus pneumoniae）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセス（Streptomyces mevalonate）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトマイセスＣＬ１９０（Streptomyces CL190）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、Ｍ．バートニイ（M. burtonii）・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）・メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択される。本開示のプロモータのうちのいずれか（例えば、本開示に記載され、本開示の実施例において識別される、誘導型プロモータ及び常時発現型プロモータなどのプロモータ）を使用して、本開示のいずれかのＭＶＡポリペプチドの発現を駆動させることができる。
【０１４９】
３．ＤＸＰ経路核酸及びポリペプチド
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に記載の組換え細胞（本明細書に記載される通りに改変された宿主細胞を含む）は、ＤＸＳポリペプチド及び／又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸を更に含む。いくつかの態様では、細胞は、ＤＸＳポリペプチド及び／又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする内在性の核酸の染色体コピーを更に含む。いくつかの態様では、大腸菌（E. coli）細胞は、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド並びに／又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を更に含む。いくつかの態様では、１種の核酸は、イソプレン合成酵素ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチド、並びに／又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、１種のプラスミドは、イソプレン合成酵素ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド並びに／又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする。いくつかの態様では、複数のプラスミド（multiple plasmids）は、イソプレン合成酵素、ＩＤＩポリペプチド及びＤＸＳポリペプチド又は他のＤＸＰ経路ポリペプチドをコードする。
【０１５０】
例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸ヘと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＤＸＳポリペプチド及び核酸の例並びにＤＸＳ活性の測定法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に、より詳細に記載される。
【０１５１】
ＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドの例としては、限定するものではないが、次の任意のポリペプチド：ＤＸＳポリペプチド、ＤＸＲポリペプチド、ＭＣＴポリペプチド、ＣＭＫポリペプチド、ＭＣＳポリペプチド、ＨＤＳポリペプチド、ＨＤＲポリペプチド、及びＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を１つ、又は２つ以上有するＤＸＰ経路ポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）、が挙げられる。特に、ＤＸＰ経路ポリペプチドとしては、ＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが挙げられる。例示的なＤＸＰ経路に関する核酸としては、ＤＸＰ経路のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。ＤＸＰ経路に含まれる代表的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。ＤＸＰ経路のポリペプチド及び核酸の例としては、並びにＤＸＰ経路のポリペプチド活性を測定する方法については、国際公開第２０１０／１４８１５０号に、より詳細に記載されている。
【０１５２】
例示的なＤＸＳポリペプチドとしては、ＤＸＳポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、及び融合ポリペプチドが挙げられる。標準法（本明細書に記載されるものなど）を用い、ポリペプチドが、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸ヘと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。ＤＸＳポリペプチド及び核酸の例並びにＤＸＳ活性の測定法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に、より詳細に記載される。
【０１５３】
特に、ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド３−リン酸を１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１５４】
ＤＸＲポリペプチドは、１−デオキシ−ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＤＸＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＤＸＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１５５】
ＭＣＴポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール４−リン酸（ＭＥＰ）を４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＴポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１５６】
ＣＭＫポリペプチドは、４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥ）を２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＣＤＰ−ＭＥを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＣＭＫポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１５７】
ＭＣＳポリペプチドは、２−ホスホ−４−（シチジン５’−ジホスホ）−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール（ＣＤＰ−ＭＥＰ）を２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェート（ＭＥ−ＣＰＰ又はｃＭＥＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＣＤＰ−ＭＥＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＭＣＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１５８】
ＨＤＳポリペプチドは、２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロジホスフェートを（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェート（ＨＭＢＰＰ又はＨＤＭＡＰＰ）ヘと変換する。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＭＥ−ＣＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＳポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１５９】
ＨＤＲポリペプチドは、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチルブタ−２−エン−１−イルジホスフェートをイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリルジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）ヘと変換する。一実施形態では、ＨＤＲポリペプチドのコードには、ｉｓｐＨ遺伝子を使用することができる。ＩｓｐＨは、１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−ジホスフェート還元酵素、４Ｆｅ−４Ｓタンパク質、ＥＣＫ００３０、ＪＷ００２７、ｌｙｔＢ、ｙａａＥ、及びｂ００２９としても知られている。標準法を用い、インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボでポリペプチドがＨＭＢＰＰを変換する能力を測定することで、ポリペプチドがＨＤＲポリペプチド活性を有するか否かを判定することができる。
【０１６０】
４．ＭＶＡ経路、イソプレン合成酵素、ＩＤＩ及びＤＸＰ経路のポリペプチドに関する生物資源
イソプレン合成酵素、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路及び／又は下流ＭＶＡ経路の核酸は、イソプレン合成酵素、ＩＤＩ、ＤＸＰ経路及び／又はＭＶＡ経路の核酸を天然に含有する任意の生物から得ることができる。イソプレンは、バクテリア、酵母、植物及び動物などの様々な生物により天然に生成される。一部の生物は、イソプレンの生産に関係するＭＶＡ経路を含有する。イソプレン合成酵素の核酸は、例えば、イソプレン合成酵素を含有する任意の生物から得ることができる。したがってＭＶＡ経路の核酸は、例えば、ＭＶＡ経路を含有する任意の生物から得ることができる。ＩＤＩ及びＤＸＰ経路の核酸は、例えば、ＩＤＩ及びＤＸＰ経路を含有する任意の生物から得ることができる。
【０１６１】
イソプレン合成酵素、ＤＸＰ経路、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路の核酸の核酸配列は、細菌、真菌、植物、藻類、又はシアノバクテリアから単離することができる。例示的な生物資源としては、例えば、酵母、例えばサッカロミセス（Saccharomyces）種（例えば、サッカロミセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）、バクテリア、例えば、エシェリキア（Escherichia）種（例えば、エシェリキア・コリ）、又はメタノサルシナ（Methanosarcina）種（例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei））、植物、例えば葛又はポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）又はウラジロハコヤナギｘトレムラＣＡＣ３５６９６（Populus alba x tremula CAC35696））又はヤマナラシ（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））が挙げられる。使用することのできるイソプレン合成酵素、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドの資源例は、国際出願公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０１３０７７号、同第２０１０／０３１０７９号、同第２０１０／１４８１５０号、同第２０１０／０７８４５７号、及び同第２０１０／１４８２５６号にも記載される。
【０１６２】
いくつかの態様では、生物資源は酵母であり、例えば、酵母菌属、シゾサッカロミセス属、ピキア（Pichia sp.）又はカンジダ（Candida sp.）である。
【０１６３】
いくつかの態様では、宿主細胞は、バチルス・リケノフォルミス（B. lichenoformis）又はバチルス・サブチリス（B. subtilis）などのバチルス株、シュードアルテロモナス・シトレア（P. citrea）などのパントエア（Pantoea）株、シュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）などのシュードモナス属（Pseudomonas）株、ストレプトマイセス・リビダンス（S. lividans）又はストレプトマイセス・ルビギノーサス（S. rubiginosus）などのストレプトマイセス（Streptomyces）株、大腸菌（E. coli）などのエシェリキア（Escherichia）株、エンテロバクター株（Enterobacter）、ストレプトコッカス（Streptococcus）株、又はメタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei）などの古細菌株である。
【０１６４】
本明細書で使用するとき、「バチルス（Bacillus）属」としては、当業者に既知の「バチルス（Bacillus）」属のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、バチルス・サブチリス（B. subtilis）、バチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシイ（B. clausii）、バチルス・ハロデュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サークランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、及びバチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）が挙げられる。バチルス（Bacillus）属は分類上の再編成を受け続けるものと認識される。したがって、この属は、再分類された種を包含することを意図し、例えば、限定するものではないが、現在は「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス」と命名されたバチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）のような生物を包含する。酸素存在下での耐性内生胞子の生成はバチルス属の決定的特徴と考えられるが、この特徴は最近命名されたアリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、アムピバチルス（Amphibacillus）、アネウリニバチルス（Aneurinibacillus）、アノキシバチルス（Anoxybacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、フィロバチルス（Filobacillus）、グラシリバチルス（Gracilibacillus）、ハロバチルス（Halobacillus）、パエニバチルス（Paenibacillus）、サリバチルス（Salibacillus）、サーモバチルス（Thermobacillus）、ウレイバチルス（Ureibacillus）、及びバルジバチルス（Virgibacillus）にも当てはまる。
【０１６５】
いくつかの態様では、生物資源はグラム陽性細菌である。非限定的な例としては、ストレプトマイセス（treptomyces）株（例えば、ストレプトマイセス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトマイセス・コエリカラー（S. coelicolor）、又はストレプトマイセス・グリセウス（S. griseus））及びバチルス株が挙げられる。いくつかの態様では、生物資源は、大腸菌（E. coli）又はシュードモナス属（Pseudomonas sp.）などのグラム陰性細菌である。いくつかの態様では、生物資源はＬ．アシドフィルス（L. acidophilus）である。
【０１６６】
いくつかの態様では、微生物源は植物であり、例えば、マメ科（Fabaceae）、例えばマメ亜科（Faboideae）などの植物である。いくつかの態様では、生物資源はクズ、ポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘトレムラ（tremula）ＣＡＣ３５６９６など）、アスペン（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））、又はヨーロッパナラ（Quercus robur）である。
【０１６７】
いくつかの態様では、微生物源は、藻類、例えば緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ミドリムシ目、クロミスタ、又は渦鞭毛藻類である。
【０１６８】
いくつかの態様では、生物資源は、形態に基づき次の群：クロオコッカス（Chroococcales）、プレウロカプサ（Pleurocapsales）、ユレモ（Oscillatoriales）、ネンジュモ（Nostocales）、又はスティゴネマ（Stigonematales）のいずれかに分類される、ラン藻である。
【０１６９】
５．ホスホケトラーゼ核酸及びポリペプチド
本発明のいくつかの態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に記載の組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチド又はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を更に含む。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結される。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性の核酸を１つ以上（例えば、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性の核酸の２、３、又は４つ以上のコピー）を使用する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比べ、内在性のホスホケトラーゼポリペプチドが過剰発現するよう遺伝子操作される。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。
【０１７０】
ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換、並びに／又はフルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼポリペプチドは、セドヘプツロース−７−リン酸の生成物（例えば、リボース−５−リン酸）及びアセチルリン酸への変換を触媒する。したがって、理論に束縛されるものではないが、本明細書に記載のホスホケトラーゼの発現の結果として、炭素源から生成されるアセチルリン酸の量は増加し得る。このアセチルリン酸をアセチルＣｏＡへと変換させ、更にこれを利用して、ＭＶＡ経路に関係する酵素活性により、メバロン酸及び／又はイソプレンを生成させることができる。したがって、炭素源から生成されるこれらの化合物の量は増加し得る。特定の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、キシルロース５−リン酸のグリセルアルデヒド３−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。他の実施形態では、ホスホケトラーゼ酵素は、フルクトース６−リン酸のエリトロース４−リン酸及びアセチルリン酸への変換を触媒する。したがって、理論に束縛されるものではないが、本明細書で説明されるとおりホスホケトラーゼを発現させることにより、炭水化物資源から生成されるアセチルリン酸量を増加させることができる。このアセチルリン酸をアセチルＣｏＡへと変換させ、更にこれを利用して、ＭＶＡ経路に関係する酵素活性により、イソプレンを生成させることができる。したがって、炭水化物基質より生成されるこれらの化合物量を増加させることができる。あるいは、細胞内濃度の上昇という形式で生成性の向上が反映されずとも、アセチル−Ｐ及びＡｃＣｏＡの生成量を増加させることができる。特定の実施形態では、細胞内アセチル−Ｐ又はアセチルＣｏＡ濃度は、ホスホケトラーゼによる反応が生じた場合でさえ変化せず一定であり、又は減少する場合すらある。
【０１７１】
適宜に、特定の実施形態では、本明細書に記載の任意の方法に記載の組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチド又はホスホケトラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を更に含む。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドは内在性ポリペプチドである。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、調節可能なように常時発現型プロモータに連結される。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、調節可能なように誘導型プロモータに連結される。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、調節可能なように高発現型プロモータに連結される。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性の核酸を１つ以上（例えば、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性の核酸の２、３、又は４つ以上のコピー）を使用する。特定の態様では、細胞は、野生型細胞と比べ、内在性のホスホケトラーゼポリペプチドが過剰発現するよう遺伝子操作される。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする内在性核酸は、調節可能なように低発現型プロモータに連結される。
【０１７２】
ホスホケトラーゼの核酸の例としては、ホスホケトラーゼポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又はポリペプチド融合物をコードする核酸が挙げられる。ホスホケトラーゼのポリペプチド及び核酸の例としては、本明細書に記載の任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載の任意の生物資源から誘導されるポリペプチド変異体及び核酸変異体が挙げられる。いくつかの態様では、ホスホケトラーゼをコードする核酸は、クロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ラクトバチルス・プランタラム（Lactobacillus plantarum）、ラクトバチルス・パラプランタルム（Lactobacillus paraplantarum）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Bifidobacterium animalis）、ビフィドバクテリウム・ブレビ（Bifidobacterium breve）、エンテロコッカス・ガリナラム（Enterococcus gallinarum）、ガードネレラ・バギナリス（Gardnerella vaginalis）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ムチラギニバクター・パルディス（Mucilaginibacter paludis）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）、ノストック・パンクチホルム（Nostoc punctiforme）ＰＣＣ  ７３１０２、パントエア（Pantoea）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ロードシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、ストレプトマイセス・アベルミティリス（Streptomyces avermitilis）、ノカルディオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、及び／又はサーモビフィダ・フスカ（Thermobifida fusca）由来である。本明細書において使用することのできるホスホケトラーゼ酵素の更なる例は、米国特許第７，７８５，８５８号及び国際出願公開第２０１１／１５９８５３号に開示されており、これらの特許文献は参照により本明細書に援用される。
【０１７３】
標準法を使用し、ペプチドがＤ−フルクトース６−リン酸又はＤ−キシルロース５−リン酸をアセチル−Ｐへと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがホスホケトラーゼペプチド活性を有するかを判断できる。次に、アセチル−Ｐはフェリルアセチルヒドロキサム酸（ferryl acetyl hydroxamate）へと変換され得る。この変換は、分光測定により検出可能である（Ｍｅｉｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３：２９２９〜２９３６，２００１）。本発明での使用には、本明細書に記載されるとおりホスホケトラーゼペプチド活性を有するとして判定された任意のポリペプチドが好適である。
【０１７４】
他の態様では、ホスホケトラーゼの核酸の例としては、限定するものではないが、ラクトバチルス・ロイテリ（Lactobacillus reuteri）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、フェリモナス・バレアリカ（Ferrimonas balearica）、ペドバクター・サルタンス（Pedobactor saltans）、ストレプトマイセス・グリセウス（Streptomyces griseus）、及び／又はノカルディオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）から単離したホスホケトラーゼが挙げられる。本明細書において使用することのできるホスホケトラーゼ酵素のその他の例は、参照により本明細書に援用される米国特許第７，７８５，８５８号に記載されている。
【０１７５】
本明細書に記載の任意の一実施形態では、組換え細胞は、次のリボース−５−リン酸イソメラーゼ（ｒｐｉＡ及び／又はｒｐｉＢ）、Ｄ−リブロース−５−ホスフェート３−エピメラーゼ（ｒｐｅ）、トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ及び／又はｔｋｔＢ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、ホスフェートアセチルトランスフェラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）からなる群から選択される遺伝子のうちの１種以上の活性を増加させるよう更に遺伝子操作を施すことができる。別の実施形態では、組換え細胞は、次の、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホフルクトキナーゼ−１（ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ）、フルクトースビスリン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、ＥＩ（ｐｔｓＩ）、ＥＩＩＣＢＧｌｃ（ｐｔｓＧ）、ＥＩＩＡＧｌｃ（ｃｒｒ）、及び／又はＨＰｒ（ｐｔｓＨ）といった遺伝子のうち、１つ以上の遺伝子の活性を減少させるよう更に遺伝子操作を施すことができる。
【０１７６】
グリセルアルデヒド３−リン酸を包含する経路
グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）は、解糖に重要な酵素であり、グリセルアルデヒド３−ホスフェートの１，３−ビホスホ−Ｄ−グリセリン酸への変換を触媒する（Ｂｒａｎｌａｎｔ  Ｇ．ａｎｄ  Ｂｒａｎｌａｎｔ  Ｃ．１９８５．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５０：６１〜６６）。
【０１７７】
特定の態様では、本明細書で開示されるモノリン酸デカルボキシラーゼ及び／又はイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする核酸を１種以上発現した組換え細胞は、ホスホケトラーゼポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を更に含む。ホスホケトラーゼ酵素を炭素に直接作用させるために、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの発現を調節（例えば、酵素活性を低下させるなど）して、より多量の炭素をフルクトース６−リン酸及びキシルロース５−リン酸へと変換させ、以降に続くイソプレンの生産量を増加させることもできる。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。場合によっては、酵素活性の低下は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％低下する。いくつかの態様では、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼは、内在性グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を減少させることにより調節される。このような調節は、内在性グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子プロモータを常時低発現型合成プロモータにより置き換えることで実施できる。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を欠失させることもできる。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子は、同様の反応を触媒するもののＮＡＤＰＨよりはＮＡＤＨを生産するバチルス（Bacillus）の酵素と置き換えることもできる。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を減少させることで、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼの発現を減少させていない細胞と比較して、より多量にメバロン酸依存性生合成経路に炭素を取り込ませることができる。本発明の任意の態様では、本明細書において、本明細書で開示される通りのモノリン酸デカルボキシラーゼ及び／又はイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする発現した１つ以上の核酸を含み、更にグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）の活性を低下させるよう遺伝子操作された組み換え細胞が提供される。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼイソ酵素の活性を調節（例えば、減少）させることも本明細書において企図される。本発明の任意の態様では、本明細書において、本明細書で開示される通りのモノリン酸デカルボキシラーゼ及び／又はイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする異種発現した１つ以上の核酸を含み、更にグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ｇａｐＡ及び／又はｇａｐＢ）イソ酵素の活性を低下させるよう遺伝子操作された組み換え細胞が提供される。
【０１７８】
ａ．エントナー・ドゥドロフ経路に関与する経路
エントナー・ドゥドロフ（ＥＤ）経路は、エムデン・マイヤーホフ・パルナス（ＥＭＰ−解糖）経路とは異なる経路である。大腸菌（E. coli）などの一部の生物がＥＤ経路及びＥＭＰ経路の両方を内包するのに対し、その他の生物はいずれか１つの経路のみを有する。バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）は、ＥＭＰ経路のみを有するのに対し、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）はＥＤ経路のみを有する（Ｐｅｅｋｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｗａｙ．１９９８．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８０：３４９５〜３５０２；Ｓｔｕｌｋｅ  ａｎｄ  Ｈｉｌｌｅｎ．２０００．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５４，８４９〜８８０；Ｄａｗｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９６６．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．９８：７９５〜８０３）。フルクトース二リン酸アルドラーゼ（ｆｂａ、ｆｂａＡ、ｆｂａＢ、及び／又はｆｂａＣ）はエントナー・ドゥドロフ経路と相互作用し、フルクトース１，６〜２リン酸のジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）及びグリセルアルデヒド３−リン酸（ＧＡＰ）への変換を可逆的に触媒する（Ｂａｌｄｗｉｎ  Ｓ．Ａ．，ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．（１９７８）１６９（３）：６３３〜４１）。
【０１７９】
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）は、６−ホスホ−Ｄ−グルコネートから一分子のＨ２Ｏを除去して２−デヒドロ−３−デオキシ−Ｄ−グルコネート６−リン酸を生成するのに対し、２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）はアルドールの開裂を触媒する（Ｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１７４：４６３８〜４６４６）。２つの遺伝子はオペロンの関係である。
【０１８０】
ホスホケトラーゼ経路に指向する代謝経路をＥＤ経路に迂回させることもできる。ＥＤ経路に取り込まれる代謝産物が損失することを回避するため、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子（例えば、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子）及び／又は２−ケト−３−デオキシグルコナーゼ６−リン酸アルドラーゼ遺伝子（例えば、内在性２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子）活性を減弱させる。１つの手法としては、ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）及び／又は２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）を欠失させることで減弱を行うことができる。この欠失は、クロラムフェニコール又はカナマイシンカセットにより片方又はいずれもの遺伝子を置き換え、その後カセットを除去することで導入される。これらの酵素活性を存在させずとも、ホスホケトラーゼ酵素によってより多くの炭素を取り込むことができ、ひいてはイソプレンの収率を増加させることができる。
【０１８１】
ホスホグルコン酸デヒドラターゼ（ｅｄｄ）及び／又は２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ（ｅｄａ）の活性は、酵素に関係する他の分子操作により減少させることもできる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。
【０１８２】
一部の場合では、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子及び／又は内在性２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子の活性を減弱させることにより、内在性ホスホグルコン酸デヒドラターゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ２−ケト−３−デオキシグルコネート６−リン酸アルドラーゼ遺伝子の発現を減弱させていない細胞と比較して、多量の炭素がメバロン酸依存性生合成経路に取り込まれることになる。
【０１８３】
ｂ．ペントースリン酸経路の酸化経路に関与する経路
大腸菌（E. coli）は、ペントースリン酸経路を使用してヘキソース及びペントースを分解し、各種代謝経路に関係する中間体を細胞に提供する。この経路は、ＮＡＤＰＨの主要な生成経路でもある。ペントースリン酸経路は、酸化経路（グルコース６−リン酸１−デヒドロゲナーゼ（ｚｗｆ）、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｐｇｌ）又は６−ホスホグルコネートデヒドロゲナーゼ（ｇｎｄ）などの酵素による）及び非酸化経路（トランスケトラーゼ（ｔｋｔＡ）、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＡ又はｔａｌＢ）、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼなどの酵素による）から構成される（Ｓｐｒｅｎｇｅｒ．１９９５．Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１６４：３２４〜３３０）。
【０１８４】
ホスホケトラーゼ酵素に炭素を直接作用させる目的で、ペントースリン酸経路の非酸化的経路（トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ、及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼ）の発現を調節して（例えば、酵素活性を上昇させる）、より多くの炭素をフルクトース６−ホスフェート及びキシルロース５−ホスフェートとして取り込ませて、最終的なイソプレンの生産を増加させることができる。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼ活性を増加させることで、活性を操作しなかった場合と比較して比活性又は総活性を任意の量で増加させることができる。一部の例では、酵素活性は少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％上昇する。いくつかの態様では、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性は、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性を増強させることにより調節される。このような上昇は、内在性トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼ遺伝子のプロモータを常時高発現型の合成プロモータにより置き換えることで得られる。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼをコードする遺伝子を、プラスミド上の適切なプロモータの後にクローン化させてもよい。トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの活性を増加させることにより、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼの発現を増加させていない細胞と比較して多量の炭素をメバロン酸依存型の生合成経路に取り込ませることができる。
【０１８５】
ｃ．ホスホフルクトキナーゼに関与する経路
ホスホフルクトキナーゼは、解糖系でフルクトース６−リン酸のリン酸化を触媒する重要な酵素である。大腸菌（E. coli）はｐｆｋＡ及びｐｆｋＢによりコードされる２種のイソ酵素を有する。細胞におけるホスホフルクトキナーゼ活性の大部分はｐｆｋＡによるものである（Ｋｏｔｌａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．１９７５，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，３８１：２５７〜２６８）。
【０１８６】
ホスホケトラーゼ酵素を炭素に直接作用させるために、ホスホフルクトキナーゼの発現を調節（例えば、酵素活性を低下させるなど）して、より多量の炭素をフルクトース６−リン酸及びキシルロース５−リン酸へと変換させ、最終的なイソプレンの生産量を増加させることもできる。ホスホフルクトキナーゼ活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。場合によっては、酵素活性の低減は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の低減である。いくつかの態様では、内在性ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させることにより、ホスホフルクトキナーゼの活性を調節する。このような調節は、内在性ホスホフルクトキナーゼ遺伝子プロモータを常時低発現型合成プロモータと置き換えることにより行うことができる。ホスホフルクトキナーゼをコードする遺伝子を欠失させてもよい。ホスホフルクトキナーゼの活性を低下させることで、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みを、ホスホフルクトキナーゼの発現を低下させていない細胞と比較して増加させることができる。
【０１８７】
６．その他の宿主細胞変異
本発明は、ＭＶＡ経路に取り込まれる炭素量を増大させる追加の宿主細胞変異も企図する。炭素取り込み量を増加させることにより、イソプレン生産量を増加させることができる。本明細書に記載される通りのアセトアセチル−ＣｏＡシンターゼを含む組換え細胞には、メバロン酸生産に取り込まれる炭素が増加するよう遺伝子操作を施すこともでき、ここで、（ａ）クエン酸シンターゼ、（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ；（ｃ）酢酸キナーゼ；（ｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ；（ｅ）ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素、及び；（ｆ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ；（ｇ）６−ホスホグルコノラクトナーゼ；（ｈ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ；（ｉ）マグネシウム欠乏時のＲｓｓＢ活性阻害タンパク質；（ｊ）多剤排出ポンプａｃｒＡＢ−ＴｏｌＣのａｃｒＡ成分；並びに（ｋ）フマル酸還元及び硝酸還元ｓＲＮＡ（ＦＮＲ）、からなる群の１種以上の酵素の活性が調節される。
【０１８８】
ａ．クエン酸合成酵素による経路
クエン酸シンターゼは、オキサロ酢酸とアセチルＣｏＡを縮合させることによるクエン酸（トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクルの代謝生成物）の生成を触媒する（Ｎｅｒ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９８３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２，：５２４３〜５２４９；Ｂｈａｙａｎａ，Ｖ．ａｎｄ  Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ，Ｈ．１９８４．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２３：２９００〜２９０５）。大腸菌（E. coli）では、ｇｌｔＡによりコードされたこの酵素は、二量体サブユニットからなる三量体様の挙動を示す。六量体の形成により、酵素はＮＡＤＨによりアロステリックに制御されるようになる。この酵素は、これまでに広く研究されている（Ｗｉｅｇａｎｄ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｓ．１９８６．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．１５：９７〜１１７；Ｄｕｃｋｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９８７．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｓｙｍｐ．５４：８３〜９２；Ｓｔｏｃｋｅｌｌ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３５４３５〜４３；Ｍａｕｒｕｓ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．２００３．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４２：５５５５〜５５６５）。ＮＡＤＨによるアロステリック阻害を回避するにあたって、これまでに、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）ＮＡＤＨ非感受性クエン酸合成酵素による置き換え、又はこの酵素の添加が検討されている（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：１０７１〜１０８１；Ｓａｎｃｈｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２００５．Ｍｅｔ．Ｅｎｇ．７：２２９〜２３９）。
【０１８９】
クエン酸合成酵素による触媒反応は、メバロン酸経路の第一工程を触媒し、同様にアセチルＣｏＡを基質として使用するチオラーゼと直接的に競合する（Ｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８４：２１１６〜２１２２）。したがって、当業者は、クエン酸合成酵素の発現を調節して（例えば、酵素活性を減少させて）、より多量の炭素がメバロン酸経路に取り込まれるようにすることで、イソプレンの最終的な生産量を増加させることができる。クエン酸合成酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。いくつかの態様では、クエン酸シンターゼに関係する内在性遺伝子の活性を減少させることにより、クエン酸シンターゼの活性を調節する。この調節は、ＮＡＤＨ非感受性クエン酸合成酵素をコードする導入遺伝子により、あるいはバチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）から誘導したＮＡＤＨ非感受性クエン酸合成酵素をコードする導入遺伝子により、内在性クエン酸合成酵素遺伝子の染色体を置換することで実施できる。クエン酸シンターゼの活性は、内在性クエン酸シンターゼ遺伝子のプロモータを、常時低発現型の合成プロモータと置き換えることによっても調節（例えば、低下させる）できる。クエン酸合成酵素の活性を低下させることで、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みを、クエン酸合成酵素の発現を低下させていない微生物と比較して増加させることができる。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるモノリン酸デカルボキシラーゼ及び／又はイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする発現される核酸を１つ以上含み、かつクエン酸合成酵素（ｇｌｔＡ）の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。クエン酸シンターゼイソ酵素の活性の調節（例えば、低下）も本明細書において企図される。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるモノリン酸デカルボキシラーゼ及び／又はイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１種以上の発現される核酸を含み、かつクエン酸合成酵素イソ酵素の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。
【０１９０】
ｂ．ホスホトランスアセチラーゼ及び／又は酢酸キナーゼの関与する経路
ホスホトランスアセチラーゼ（（大腸菌（E. coli）において（ｉ）ｐｔａ（Ｓｈｉｍｉｚｕ  ｅｔ  ａｌ．１９６９．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １９１：５５０〜５５８）又は（ｉｉ）ｅｕｔＤ（Ｂｏｌｏｇｎａ  ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｊ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．４８：６２９〜６３６）によりコードされている）は、アセチル−ＣｏＡ及びアセチルリン酸（アセチル−Ｐ）の可逆的な変換を触媒するのに対し、酢酸キナーゼ（大腸菌（E. coli）においてａｃｋＡによりコードされる）（Ｋａｋｕｄａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．１９９４．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：９１６〜９２２）はアセチル−Ｐを使用して酢酸を生成する。これらの遺伝子は、大腸菌においてオペロンとして転写され得る。これらの遺伝子は共に、ＡＴＰの放出により酢酸の異化を触媒する。したがって、当業者は、ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子（例えば、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子）及び／又は酢酸キナーゼ遺伝子（例えば、内在性酢酸キナーゼ遺伝子）の活性を減弱させて、利用可能なアセチルＣｏ−Ａを増加させることができる。特定の実施形態では、増強は、染色体中の遺伝子上流に上方調節されたプロモータを配置するか、又はプラスミドにおいて適切なプロモータの下流に遺伝子のコピーを配置するかによりなすことができる。酢酸に変換されるアセチルＣｏＡの量を減少させる目的で、酢酸キナーゼ遺伝子（例えば、内在性酢酸キナーゼ遺伝子）の活性を減少又は減弱させることができる。減弱させる手法の一つとしては、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）及び／又は酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の欠失が挙げられる。この欠失は、クロラムフェニコールカセットにより片方又はいずれもの遺伝子を置き換え、その後カセットを除去することで導入される。酢酸は多様な理由により大腸菌（E. coli）により生成される（Ｗｏｌｆｅ，Ａ．２００５．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６９：１２〜５０）。理論に束縛されるものではないが、ａｃｋＡ−ｐｔａはアセチル−ＣｏＡを使用することから、これらの遺伝子を欠失させることで、炭素は酢酸に転用されず、イソプレンの収率が増加する。理論に束縛されるものではないが、ａｃｋＡを欠失させることにより、炭素の酢酸の生産への転用が減少し（ａｃｋＡはアセチル−ＣｏＡを利用するため）、イソプレンの収率が増加することになる。
【０１９１】
いくつかの態様では、組み換え微生物は、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、酢酸の生成量が減少している。酢酸生成量の減少は、当業者に既知の所定のアッセイ法により測定できる。酢酸の生成量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％減少する。
【０１９２】
ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ）及び／又は酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の活性は、酵素に関係する他の分子的操作によっても低下させることができる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。
【０１９３】
ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）の活性は、酵素に関係する他の分子的操作により増加させることができる。酵素活性を増加させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で増加させることができる。一部の例では、酵素活性の増加は、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％だけ増加させることができる。一実施形態では、ｐｔａの活性は、染色体上のプロモータ及び／又はｒｂｓを変更することにより増加させることができ、又はプラスミドに発現させることにより増加させることができる。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるモノリン酸デカルボキシラーゼ及び／又はイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする異種発現される核酸を１つ以上含み、かつホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）の活性が増加するよう更に遺伝子操作されている。ホスホトランスアセチラーゼイソ酵素の活性を調節（例えば、増加）することも、本明細書において企図される。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるモノリン酸デカルボキシラーゼ及び／又はイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする１種以上の発現される核酸を含み、かつホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａ及び／又はｅｕｔＤ）の活性が増加するよう更に遺伝子操作されている。
【０１９４】
酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の活性は、酵素に関係する他の分子的操作によっても低下させることができる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるホスホケトラーゼポリペプチドをコードする異種発現される核酸を１つ以上含み、かつ酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。酢酸キナーゼイソ酵素の活性の調節（例えば、低下）も本明細書において企図される。本明細書において提供される、本発明の任意の態様では、組換え細胞は、本明細書で開示されるモノリン酸デカルボキシラーゼ及び／又はイソペンテニルキナーゼポリペプチドをコードする発現される核酸を１つ以上含み、かつ酢酸キナーゼイソ酵素の活性が減少するよう更に遺伝子操作されている。
【０１９５】
一部の場合では、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性ホスホトランスアセチラーゼ遺伝子及び／又は内在性酢酸キナーゼ遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。
【０１９６】
ｃ．乳酸デヒドロゲナーゼを含む経路
大腸菌（E. coli）では、Ｄ−乳酸は、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡによりコード）により、ピルビン酸から生成される（Ｂｕｎｃｈ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９９７．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４３：１８７〜１９５）。乳酸の生成はＮＡＤＨの酸化によりなされるため、乳酸は、酸素制限下で、かつ還元当量のすべてを収容できない場合に生成されることになる。したがって、乳酸の生成は、炭素消費の原因となり得る。そのため、当業者は、酵素の活性を低下させるなどにより、乳酸脱水素酵素の活性を調節して、イソプレン生産時の炭素の取り込みを改良することができる。
【０１９７】
したがって、一態様では、乳酸脱水素酵素の活性は、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。このような減弱は、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の欠失により実施できる。当業者に知られている、乳酸脱水素酵素遺伝子の活性を減弱させる他の手法も使用できる。乳酸脱水素酵素の関与する経路を操作することで、組み換え微生物の生成する乳酸量は、内在性乳酸脱水素酵素遺伝子の発現を減弱させていない微生物と比較して、減少することになる。乳酸の生成量の減少は、当業者に知られている所定のアッセイ法により測定できる。乳酸の生成量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％減少する。
【０１９８】
乳酸脱水素酵素の活性は、酵素に関係するその他の分子操作により低下させることもできる。酵素活性を低下させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で低下させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％低下させる。
【０１９９】
したがって、一部の場合では、内在性乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の活性を減弱させることで、内在性乳酸デヒドロゲナーゼの遺伝子発現を減弱させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素の取り込みが増加する。
【０２００】
ｄ．リンゴ酸酵素の関与する経路
リンゴ酸酵素（大腸菌（E. coli）ではｓｆｃＡ及びｍａｅＢ）は、次式に従いリンゴ酸のピルビン酸への変換を触媒する（ＮＡＤ＋又はＮＡＤＰ＋を用いる）アナプレロティックな酵素である：
【０２０１】
【数１】
2015521036.tif 000012
したがって、この酵素の２種の基質は（Ｓ）−リンゴ酸及びＮＡＤ（Ｐ）＋であり、これらにより３種の生成物、すなわち、ピルビン酸、ＣＯ２、及びＮＡＤＰＨが生成される。
【０２０２】
ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素（ｍａｅＢ）（Ｉｗｉｋｕｒａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９７９．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８５：１３５５〜１３６５）を発現させ、１）ＴＣＡサイクルの炭素を、それ自体がメバロン酸経路の直接的な前駆体であるアセチル−ＣｏＡの直接的な前駆体であるピルビン酸に戻し、２）ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼによる反応に使用され得る過剰なＮＡＤＰＨを生産することにより（Ｏｈ，ＭＫ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１３１７５〜１３１８３；Ｂｏｌｏｇｎａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５９３７〜５９４６）、イソプレン収率の増加を助けることができる。
【０２０３】
そのため、リンゴ酸酵素の活性及び／又は発現を増加させるなどして調節することにより、下流でのイソプレン生産に関係する開始基質（ピルビン酸又はアセチル−ＣｏＡ）がより多く得られる。ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子は、内在性遺伝子であってよい。非限定的な手法の１つとしては、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素の内在性遺伝子プロモータを、常時発現型の合成発現プロモータにより置き換えるというものが挙げられる。酵素活性を増加させる手法のその他の非限定例としては、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素ポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸を用いるものが挙げられる。当業者は、容易に利用可能な分子生物学的手技を用い、発酵又は培養する際に、ｍａｅＢ  ＲＮＡの発現をモニターすることができる。
【０２０４】
したがって、いくつかの実施態様では、組み換え微生物は、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、ピルビン酸の生産量が増加する。いくつかの態様では、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の活性を増加させることで、ＮＡＤＰ依存性のリンゴ酸酵素遺伝子の発現を増加させていない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素原子の取り込みが増加する。
【０２０５】
ピルビン酸生成量の増加は、当業者に既知の所定のアッセイ法により測定できる。ピルビン酸量は、分子的な操作を行なっていない場合と比較して、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％増加する。
【０２０６】
リンゴ酸酵素の活性は、酵素に関係するその他の分子操作により増加させることもできる。酵素活性を増加させることで、比活性又は総活性を、活性を操作しなかった場合と比較して任意の量で増加させることができる。一部の例では、酵素活性を、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％増加させる。
【０２０７】
ｅ．ピルビン酸脱水素酵素複合体の関与する経路
ピルビン酸のアセチル−ＣｏＡへの脱炭酸を触媒するピルビン酸脱水素酵素複合体は、遺伝子ａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及びｌｐｄＡによりコードされるタンパク質から構成される。これらの遺伝子の転写は、複数の制御因子により制御される。したがって、当業者は、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性を調節して、アセチル−ＣｏＡを増加することができる。調節により、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性及び／又は発現（例えば、常時発現）を増加させることができる。このような調節は、異なる手法により、例えば、ＰＬ．６（aattcatataaaaaacatacagataaccatctgcggtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccactggcggtgatactgagcacatcagcaggacgcactgaccaccatgaaggtg（配列番号３０）ラムダプロモータ、ＧｅｎＢａｎｋ  ＮＣ＿００１４１６）などの強力な常時発現型プロモータをオペロンの前に配置する）ことにより、あるいは常時発現型合成プロモータを１種以上用いることにより行うことができる。
【０２０８】
したがって、一態様では、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性は、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼから構成されるピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体に関係する、１種以上の遺伝子の活性を増加させることで調節される。これらの遺伝子のうちの任意の１つ、２つ、又は３つを操作して、ピルビン酸デヒドロゲナーゼの活性を増加させることができることは理解される。他の態様では、以降に更に説明するように、ピルビン酸脱水素酵素複合体の活性は、内在性ピルビン酸脱水素酵素複合体のリプレッサー遺伝子の活性を減弱させることで調節できる。内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のリプレッサーの活性は、内在性ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体リプレッサー遺伝子を欠失させることにより減弱させることができる。
【０２０９】
一部の場合では、ピルビン酸脱水素酵素複合体に関係する遺伝子の１つ以上は内在性遺伝子である。ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体の活性を増加させるその他の方法としては、微生物に、（ａ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（Ｅ１）、（ｂ）ジヒドロリポイルトランスアセチラーゼ、及び（ｃ）ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼからなる群に由来するポリペプチドを１つ以上コードしている異種核酸を１つ以上導入することによるものが挙げられる。
【０２１０】
これらの方法のうち任意のものを用いることで、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ活性の調節されていない微生物と比較して、組み換え微生物によるアセチルＣｏ−Ａの生産量を増加させることができる。ピルビン酸脱水素酵素の活性を調節することで、ピルビン酸脱水素酵素の発現を調節していない微生物と比較して、メバロン酸依存性の生合成経路への炭素原子の取り込みを増加させることができる。
【０２１１】
ｆ．変異の組み合わせ
本開示の酵素及び／又は酵素経路の何れかに関し、本開示の酵素及び／又は酵素経路の任意の組み合わせ（これらのうち２、３、４、５、又は６の組み合わせ）を調節する分子的操作は、明確に企図されることは理解される。組み合わせて詳細説明することを容易にする目的で、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）はＡと表記し、ホスホトランスアセチラーゼ（ｐｔａＢ）はＢと表記し、酢酸キナーゼ（ａｃｋＡ）はＣと表記し、乳酸デヒドロゲナーゼ（ｌｄｈＡ）はＤと表記し、リンゴ酸酵素（ｓｆｃＡ又はｍａｅＢ）はＥと表記し、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（ａｃｅＥ、ａｃｅＦ及び／又はｌｐｄＡ）はＦと表記し、６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ｙｂｈＥ）はＧと表記し、及びホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ｐｐｌ）はＨと表記する。上記の通り、ピルビン酸脱炭酸酵素複合体のａｃｅＥ、ａｃｅＦ、及び／又はｌｐｄＡ酵素を単独で使用して、又は３つの酵素のうち２つを、又は３つ酵素のうち３つを使用して、ピルビン酸脱炭酸酵素の活性を増加させることができる。
【０２１２】
適宜、酵素Ａ〜Ｈのうちの任意の２つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせは：ＡＢ、ＡＣ、ＡＤ、ＡＥ、ＡＦ、ＡＧ、ＡＨ、ＢＣ、ＢＤ、ＢＥ、ＢＦ、ＢＧ、ＢＨ、ＣＤ、ＣＥ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＨ、ＤＥ、ＤＦ、ＤＧ、ＤＨ、ＥＦ、ＥＧ、ＥＨ及びＧＨである。酵素Ａ〜Ｈのうちの任意の３つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせは：ＡＢＣ、ＡＢＤ、ＡＢＥ、ＡＢＦ、ＡＢＧ、ＡＢＨ、ＢＣＤ、ＢＣＥ、ＢＣＦ、ＢＣＧ、ＢＣＨ、ＣＤＥ、ＣＤＦ、ＣＤＧ、ＣＤＨ、ＤＥＦ、ＤＥＨ、ＡＣＤ、ＡＣＥ、ＡＣＦ、ＡＣＧ、ＡＣＨ、ＡＤＥ、ＡＤＦ、ＡＤＧ、ＡＤＨ、ＡＥＦ、ＡＥＧ、ＡＥＨ、ＢＤＥ、ＢＤＦ、ＢＤＧ、ＢＤＨ、ＢＥＦ、ＢＥＧ、ＢＥＨ、ＣＥＦ、ＣＥＧ、ＣＥＨ、ＣＦＧ、ＣＦＨ及びＣＧＨである。酵素Ａ〜Ｈのうちの任意の４つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせは：ＡＢＣＤ、ＡＢＣＥ、ＡＢＣＦ、ＡＢＣＧ、ＡＢＣＨ、ＡＢＤＥ、ＡＢＤＦ、ＡＢＤＧ、ＡＢＤＨ、ＡＢＥＦ、ＡＢＥＧ、ＡＢＥＨ、ＢＣＤＥ、ＢＣＤＦ、ＢＣＤＧ、ＢＣＤＨ、ＣＤＥＦ、ＣＤＥＧ、ＣＤＥＨ、ＡＣＤＥ、ＡＣＤＦ、ＡＣＤＧ、ＡＣＤＨ、ＡＣＥＦ、ＡＣＥＧ、ＡＣＥＨ、ＢＣＥＦ、ＢＤＥＦ、ＢＧＥＦ、ＢＨＥＦ、ＡＤＥＦである。酵素Ａ〜Ｈのうちの任意の５つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせは：ＡＢＣＤＥ、ＡＢＣＤＦ、ＡＢＣＤＧ、ＡＢＣＤＨ、ＡＢＤＥＦ、ＡＢＤＥＧ、ＡＢＤＥＨ、ＢＣＤＥＦ、ＢＣＤＥＧ、ＢＣＤＥＨ、ＡＣＤＥＦ、ＡＣＤＥＧ、ＡＣＥＤＨ、ＡＢＣＥＦ、ＡＢＣＥＧ及びＡＢＣＥＨである。酵素Ａ〜Ｈのうちの任意の６つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせは：ＡＢＣＤＥＦ、ＡＢＣＤＥＧ、ＡＢＣＤＥＨ、ＢＣＤＥＦＧ、ＢＣＤＥＦＨ及びＣＤＥＦＧＨである。酵素Ａ〜Ｈのうちの任意の７つの組み合わせに関し、使用することのできる非限定的な組み合わせは：ＡＢＣＤＥＦＧ、ＡＢＣＤＥＦＨ、ＢＣＤＥＦＧＨである。他の態様では、全８つの酵素（ＡＢＣＤＥＦＧＨ）を組み合わせて使用できる。
【０２１３】
適宜に、本明細書に記載される通りの組換え微生物は、トリカルボン酸（ＴＣＡ）サイクル活性の条件下で増殖しない微生物と比較して増加しているメバロン酸生産を達成することができ、ここで（ａ）クエン酸シンターゼ（ｂ）ホスホトランスアセチラーゼ、（ｃ）酢酸キナーゼ、（ｄ）乳酸デヒドロゲナーゼ、（ｅ）ＮＡＤＰ依存性リンゴ酸酵素、並びに（ｆ）ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、（ｇ）６−ホスホグルコノラクトナーゼ、（ｈ）ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、（ｉ）マグネシウム欠乏時のＲｓｓＢ活性阻害タンパク質、（ｊ）多剤排出ポンプａｃｒＡＢ−ＴｏｌＣのａｃｒＡ成分、並びに（ｋ）フマル酸還元及び硝酸還元ｓＲＮＡ（ＦＮＲ）からなる群由来の１種以上の酵素の活性を調節することにより、組み換え微生物において、代謝される炭素が直接メバロン酸に取り込まれる。
【０２１４】
７．イソプレン生産の増加に関係するその他の制御分子及び因子
他の分子的操作を使用して、イソプレン生産に指向する炭素取り込みを増加させることができる。このような方法のうちの１つは、メバロン酸経路に合流する経路に対する負の制御効果を減少させ、低下させるか、又は除去するものである。例えば、一部の場合では、遺伝子ａｃｅＥＦ−ｌｐｄＡはオペロンであり、ｐｄｈＲの上流に遺伝子を４つ有する。ｐｄｈＲは、このオペロンの転写に対する負の制御因子である。ｐｄｈＲは、ピルビン酸の非存在下で標的プロモータに結合し、転写を抑制する。この制御因子は同様の手法でｎｄｈ及びｃｙｏＡＢＣＤも制御する（Ｏｇａｓａｗａｒａ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．２００７．Ｊ．Ｂａｃｔ．１８９：５５３４〜５５４１）。一態様では、ｐｄｈＲ制御因子の欠失によりピルビン酸の供給が改良され、したがって別の下流ＭＶＡ経路によるイソプレン生産が改良され得る（例えば、ＭＶＫ、ＰＭｅｖＤＣ、ＩＰＫ、及び／又はＩＤＩ）。
【０２１５】
他の実施形態では、上記で得られる任意の株を更に遺伝子操作して、エントナー・ドゥドロフ経路の活性を調節することもできる。ホスホグルコン酸デヒドラターゼ又はアルドラーゼをコードする遺伝子を減弱又は欠失させることができる。他の実施形態では、上記で得られる任意の株は、酢酸キナーゼ又はクエン酸シンターゼの活性を減少又は除去するよう遺伝子操作することもできる。他の実施形態では、得られる株のうち任意の株は、ホスホフルクトキナーゼの活性を減少又は除去するよう遺伝子操作することもできる。他の実施形態では、上記で得られる任意の株は、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性を調節するよう遺伝子操作することもできる。グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの活性は、活性を減少させることにより調節することができる。他の実施形態では、ペントースリン酸経路の非酸化経路の、例えば、トランスケトラーゼ、トランスアルドラーゼ、リブロース−５−リン酸−エピメラーゼ及び（又は）リボース−５−リン酸エピメラーゼなどの酵素を過剰発現させることができる。
【０２１６】
他の態様では、セドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ／フルクトース−１，６−ビスホスフェートアルドラーゼ及びセドヘプツロース−１，７−ビスホスファターゼ／フルクトース−１，６−ビスホスフェートホスファターゼをコードする異種核酸を導入することにより、細胞内アセチル−リン酸濃度を増加させるよう宿主細胞を更に遺伝子操作することができる。特定の実施形態では、これらの分子操作を有する宿主細胞には、トランスアルドラーゼ（ｔａｌＢ）及びホスホフルクトキナーゼ（ｐｆｋＡ及び／又はｐｆｋＢ）遺伝子の減弱又は欠失を組み合わせることにより、エリトロース４−リン酸、ジヒドロキシアセトンリン酸、及びグリセルアルデヒド３−リン酸を、セドヘプツロース７−リン酸及びフルクトース１−リン酸へと迅速に変換させることができる。
【０２１７】
他の態様では、イソプレンの生産を改良させるために、ＰＧＬを欠損している微生物（各種大腸菌株など）に６−ホスホグルコノラクトナーゼ（ＰＧＬ）を導入し、使用することができる。ＰＧＬは、染色体への組み込み、又はプラスミドなどの染色体外のビヒクルを用い、導入することができる。更に他の態様では、ＰＧＬを発現している細胞（例えば、各種大腸菌（E. coli）株などの微生物）のゲノムから、ＰＧＬを欠失させて、メバロン酸及び／又はイソプレンの生産量を増加させることもできる。他の態様では、ＰＧＬのポリペプチドをコードする異種核酸は、内因的にＰＧＬを発現していない細胞で発現させることができる。いくつかの態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、イソプレンの収率が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、イソプレンの瞬間的な収率が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、細胞生産性指数が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、容積生産量が高くなる。他の態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、包括的に約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％ほど（これらの割合の間の任意の値も含む）、最大比生産量が高くなる。いくつかの態様では、ＰＧＬを欠失させることで、ＰＧＬを発現している微生物と比較して、より長い期間、最大比生産量が維持されることになる。
【０２１８】
８．ベクター
本明細書に記載の任意の組成物及び方法には好適なベクターを使用することができる。例えば、好適なベクターを使用して、細胞において、イソプレン合成酵素、アセトアセチルｃｏ−Ａシンターゼ、ＭＶＡ経路酵素、ＤＸＰ経路酵素、ホスホケトラーゼ、及び／又はポリプレニルピロリン酸シンターゼをコードする遺伝子の１つ以上のコピーの発現を最適化することができる。いくつかの態様では、ベクターには選択マーカーを含有させる。選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されるものではないが、抗生物質耐性核酸（例えば、カナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ヒグロマイシン、フェロマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン又はクロラムフェニコール）、及び／又は宿主細胞に栄養的な利点などの代謝的な利点を与える核酸が挙げられる。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素、アセトアセチルｃｏ−Ａシンターゼ、ＭＶＡ経路酵素、ＤＸＰ経路酵素、ホスホケトラーゼ、及び／又はポリプレニルピロリン酸シンターゼ核酸のうちの１つ以上のコピーが、選択マーカーは伴わずに宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【０２１９】
本開示の実施例において特徴づけられ又は使用される任意の１つのベクターを使用することができる。
【０２２０】
９．例示的な宿主細胞
当業者であれば、具体的な宿主株における遺伝子発現を最適化する特定の配列を含有するよう、発現ベクターが設計されることを認識するであろう。このような最適化配列としては、限定するものではないが、複製起点、プロモータ、及びエンハンサが挙げられる。本明細書で参照するベクター及び配列は例示目的で記載され、本発明の範囲を狭めることを意味するものではない。
【０２２１】
イソプレン生産を増加させるために本明細書に記載される任意の遺伝子を調節するために、遺伝子を異種発現させるのに使用することのできる任意の微生物又はこれらの子孫を使用することができる（例えば、クエン酸シンターゼ、ホスホトランスアセチラーゼ、酢酸キナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸酵素、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、６−ホスホグルコノラクトナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及び／又はＦＮＲ）。同様に、細胞において、イソプレン合成酵素、アセトアセチルｃｏ−Ａシンターゼ、ＭＶＡ経路酵素、ＤＸＰ経路酵素、ホスホケトラーゼ、及び／又はポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸を発現させるために、遺伝子を異種発現させるのに使用することのできる任意の微生物又はこれらの子孫を使用することができる。いくつかの態様では、イソプレン合成酵素をコードする１種以上の遺伝子を異種発現させるために任意の微生物又はこれらの子孫を使用することができる（限定するものではないが、ラッカセイ（A. hypogaea）、ハッショウマメ（M. pruriens）、キマメ（C. cajans）、ダイズ（G. max）、ツルマメ（G. soja）、ミヤコグサ（L. japonicus）、タルウマゴヤシ（M. truncatula）、シトラス・レモン（C. limon）、シナモマム・テヌイパイル（C. tenuipile）、ビティス・ヴィニフェラ（Vitis vinifera）、フユナラ（フユナラ（Q. petraea））、ケルクス・アイレックス（Q. ilex）、ユーカリノキ（E. globulus）、及び／又はティーツリー（M. alternifolia）由来のイソプレン合成酵素遺伝子など）。上記の核酸又はポリペプチドのいずれかを発現させるために、グラム陽性又はグラム陰性細菌を含む微生物細胞を使用することができる。いくつかの実施態様では、宿主細胞は、グラム陽性細菌である。非限定例としては、ストレプトミセス（Streptomyces）（例えば、ストレプトミセス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（S. coelicolor）、ストレプト・ルビギノーサス（S. rubiginosus）、又はストレプトマイセス・グリセウス（S. griseus））、ストレプトコッカス（Streptococcus）、バチルス（Bacillus）（例えば、バチルス・リケノフォルミス（B. lichenformis）又はバチルス・スブチリス（B. subtilis））、リステリア（Listeria）（例えば、リステリア・モノサイトジェネス（L. monocytogenes））、コリネバクテリア（Corynebacteria）、又はラクトバチルス（Lactobacillus）（例えば、ラクトバチルス（L. spp））の株が挙げられる。いくつかの実施態様では、微生物源はグラム陰性細菌である。非限定例としては、エシェリキア（Escherichia）（例えば、大腸菌（E. coli））、シュードモナス（Pseudomonas）（例えば、シュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes））、パントエア（Pantoea）（例えば、パントエア・シトレア（P. citrea））、エンテロバクター（Enterobacter）、又はヘリコバクター（Helicobacter）（ヘリコバクター・ピロリ（H. pylori））株が挙げられる。具体的には、イソプレン合成酵素、アセトアセチルｃｏ−Ａシンターゼ、ＭＶＡ経路酵素、ＤＸＰ経路酵素、ホスホケトラーゼ、及び／又はポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸の１種以上のコピーは、パントエア・シトレア（P. citrea）、バチルス・スブチリス（B. subtilis）、バチル���・リケニフォルミス（B. licheniformis）、バチルス・レンタス（B. lentus）、バチルス・ブレビス（B. brevis）、バチルス・ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、バチルス・アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス（B. amyloliquefaciens）、バチルス・クラウシィ（B. clausii）、バチルス・ハロドュランス（B. halodurans）、バチルス・メガテリウム（B. megaterium）、バチルス・コアギュランス（B. coagulans）、バチルス・サーキュランス（B. circulans）、バチルス・ロータス（B. lautus）、バチルス・チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、ストレプトマイセス・アルバス（S. albus）、ストレプトミセス・リビダンス（S. lividans）、ストレプトマイセス・セリカラー（S. coelicolor）、ストレプトマイセス・グリセウス（S. griseus）、シュードモナス種（Pseudomonas sp.）、及びシュードモナス・アルカリゲネス（P. alcaligenes）細胞のうちのいずれかにおいて発現させることができる。いくつかの態様では、宿主細胞は、ラクトバチルス・ラクチス（Lactobacillus lactis）又はラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）などのラクトバチルス菌種（Lactobacilis spp.）であり得る。
【０２２２】
例示的な宿主細胞としては、例えば、サッカロミセス（Saccharomyces）種（例えば、サッカロミセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae））などの酵母、エシェリキア（Escherichia）種（例えば、大腸菌（E. coli））などの細菌、メタノサルシナ（Methanosarcina）種（例えば、メタノサルシナ・マゼイ（Methanosarcina mazei））などの古細菌、クズ（kudzu）又はポプラ（poplar）（例えば、ウラジロハコヤナギ（Populus alba）又はウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘトレムラ（tremula）ＣＡＣ３５６９６）又はヤマナラシ（aspen）（例えば、アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））などの植物が挙げられる。
【０２２３】
本発明の組成物及び方法には、数多くの種類の嫌気生細胞を宿主細胞として使用することができる。本発明の一態様では、本明細書に記載の任意の組成物又は方法に関し記載される細胞は、絶対嫌気性細胞及びその子孫細胞である。絶対嫌気性菌は、典型的には、条件下に酸素が存在する場合には良好に増殖しない。絶対嫌気性菌が低濃度の酸素に対しある程度の耐性を示す場合には、少量の酸素が存在してもよいことは理解されるであろう。一態様では、イソプレンを生産するよう遺伝子操作した偏性嫌気性菌を、本明細書に記載のいずれかの方法及び／又は組成物のための宿主細胞として提供し、実質的に無酸素条件下で増殖させることができ、存在する酸素量は、嫌気性菌の増殖、維持、及び／又は発酵に有害な量ではない。
【０２２４】
本発明の他の態様では、本明細書に記載の組成物又は方法のいずれかにおいて記載され及び／又は使用される宿主細胞は、通性嫌気性細胞及びその子孫細胞である。酸素が存在する場合、通性嫌気性菌は、好気呼吸により（例えば、ＴＣＡサイクルを利用するなどして）細胞ＡＴＰを生成し得る。しかしながら、通性嫌気性菌も、酸素の非存在下で増殖させることができる。絶対嫌気性菌とは対照的に、通性嫌気性菌はより多量の酸素の存在下で死滅し、又は増殖性が乏しくなる。したがって、一態様では、通性嫌気性菌は、本明細書で提供される組成物及び／又は方法のいずれかにおいて、宿主細胞として使用でき、イソプレンを生産するよう遺伝子操作を行うことができる。通性嫌気性の宿主細胞は、実質的に無酸素（存在する酸素量が、増殖、嫌気性菌の維持、及び／又は発酵に有害なものではないことを意味する）条件下で増殖させることができ、あるいは酸素がより多量に存在している場合にも増殖することができる。
【０２２５】
宿主細胞は、糸状真菌細胞及びその子孫細胞であってもよい。（例えば、Ｂｅｒｋａ  ＆  Ｂａｒｎｅｔｔ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ，（１９８９），７（２）：１２７〜１５４を参照されたい）。いくつかの態様では、糸状菌細胞はトリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・ビリデ（T. viride）、トリコデルマ・コニンギ（T. koningii）、Ｔ．ハルジアナム（T. harzianum）、ペニシリウム種（Penicillium sp.）、ヒュミコラ・インソレンス（Humicola insolens）、ヒュミコラ・ラヌギノーサ（H. lanuginose）、ヒュミコラ・グリセア（H. grisea）、クリソスポリウム種（Chrysosporium sp.）、クリソスポリウム・ラックノウエンス（C. lucknowense）、グリオクラジウム種（Gliocladium sp.）、アスペルギルス（Aspergillus sp.）、例えば、アスペルギルス・オリザエ（A. oryzae）、アスペルギルス・ニガー（A. niger）、ショウユコウジカビ（A sojae）、アスペルギルス・ジャポニクス（A. japonicus）、アスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）、又はアワモリコウジカビ（A. awamori）、フザリウム種（Fusarium sp.）、例えば、フザリウム・ロゼウム（F. roseum）、フザリウム・グラミナム（F. graminum）、フザリウム・セレアリス（F. cerealis）、フザリウム・オキシスポラム（F. oxysporuim）、又はフザリウム・ベネナタム（F. venenatum）、ニューロスポラ種（Neurospora sp.）、例えば、ニューロスポラ・クラッサ（N. crassa）、ヒポクレア種（Hypocrea sp.）、ムコール種（Mucor sp.）、例えば、ムコール・ミエヘイ（M. miehei）、リソプス種（Rhizopus sp.）又はエメリセラ種（Emericella sp）のいずれか由来のものであってよい。いくつかの態様では、真菌は、アスペルギルス・ニデュランス（A. nidulans）、アワモリコウジカビ（A. awamori）、アスペルギルス・オリザエ（A. oryzae）、アスペルギルス・アクレタス（A.aculeatus）、アスペルギルス・ニガー（A. niger）、アスペルギルス・ジャポニクス（A. japonicus）、トリコデルマ・リーゼイ（T. reesei）、トリコデルマ・ビリデ（T. viride）、フザリウム・オキシスポラム（F. oxysporum）、又はフザリウム・ソラニ（F. solani）である。特定の実施形態では、本明細書で使用するためのプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。
【０２２６】
宿主細胞は、酵母菌属、シゾサッカロミセス（Schizosaccharomyces sp.）、ピキア（Pichia sp.）、又はカンジダ（Candida sp.）などの酵母であってもよい。いくつかの態様では、酵母菌属は、出芽酵母である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ，（１９９２），８（６）：４２３〜４８８を参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で使用するプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許第７，６５９，０９７号、及び米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。
【０２２７】
宿主細胞は、マメ（Fabaceae）亜科などのマメ科由来の植物など、植物種であってもよい。いくつかの態様では、宿主細胞は、クズ（kudzu）、ポプラ（poplar）（ウラジロハコヤナギ（Populus alba）ｘトレムラ（tremula）ＣＡＣ３５６９６などの）、ヤマナラシ（aspen）（アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides）など）、又はヨーロッパナラ（Quercus robur）である。
【０２２８】
宿主細胞は、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類などの藻類であってもよい。（例えば、Ｓａｕｎｄｅｒｓ及びＷａｒｍｂｒｏｄｔ、「藻類及び酵母などの菌類における遺伝子発現（Gene Expression in Algae and Fungi, Including Yeast）」（１９９３年），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｌｉｂｒａｒｙ，Ｂｅｌｔｓｖｉｌｌｅ，ＭＤを参照されたい）。特定の実施形態では、本明細書で使用するためのプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１１／００４５５６３号に記載のものが包含される。いくつかの態様では、宿主細胞は、形態学に基づき次の群：クロオコッカス目（Chroococcales）、プレウロカプサ目（Pleurocapsales）、ユレモ目（Oscillatoriales）、ネンジュモ目（Nostocales）、又はスティゴネマ目（Stigonematales）（例えば、Ｌｉｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，（２０１０）１２（１）：７０〜７９を参照されたい）のいずれかに分類されるシアノバクテリアなどの、シアノバクテリアである。特定の実施形態では、本明細書で使用するプラスミド又はプラスミド配列には、米国特許出願公開第２０１０／０２９７７４９号、同第２００９／０２８２５４５号、及び国際公開第２０１１／０３４８６３号に記載のものが包含される。
【０２２９】
大腸菌（E. coli）宿主細胞は、本明細書に記載の組成物及び方法において、１種以上のイソプレン合成酵素、アセトアセチルｃｏ−Ａシンターゼ、ＭＶＡ経路酵素、ＤＸＰ経路酵素、ホスホケトラーゼ、及び／又はポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドを発現させるために使用することができる。一態様では、宿主細胞は、イソプレンを生産することができ、イソプレン合成酵素、アセトアセチルｃｏ−Ａシンターゼ、ＭＶＡ経路酵素、ＤＸＰ経路酵素、ホスホケトラーゼ、及び／又はポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つ以上の核酸を発現する大腸菌（Escherichia coli、E. coli）株又はこれらの子孫の組み換え細胞である。大腸菌（E. coli）宿主細胞は、イソプレン合成酵素、アセトアセチルｃｏ−Ａシンターゼ、ＭＶＡ経路酵素、ＤＸＰ経路酵素、ホスホケトラーゼ、及び／又はポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つ以上の核酸の異種発現を欠く同種の細胞を上回る量、ピーク力価、及び細胞生産性でイソプレンを生産することができる。加えて、大腸菌（E. coli）において異種発現される、イソプレン合成酵素、アセトアセチルｃｏ−Ａシンターゼ、ＭＶＡ経路酵素、ＤＸＰ経路酵素、ホスホケトラーゼ、及び／又はポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする１つ以上の核酸は染色体コピーであってよい（例えば、大腸菌（E. coli）染色体に組み込まれる）。他の態様では、大腸菌（E. coli）細胞は培養物である。
【０２３０】
他の態様では、宿主細胞は、限定するものではないが、ピキア種（Pichia spp.）、カンジダ種（Candida spp.）、ハンゼヌラ種（Hansenula spp.）、クリベロミセス種（Kluyveromyces spp.）、クリベロミセス種（Kluyveromyces spp.）、又はシゾサッカロミセス種（Schizosaccharomyces spp.）などの、サッカロミセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）以外の酵母種であり得る。更に他の態様では、宿主細胞は、アルスロバクター種（Arthrobacter spp.）、ザイモモナス種（Zymomonas spp.）、ブレビバクテリウム種（Brevibacterium spp.）、クロストリジウム種（Clostridium spp.）、アエルコッカス種（Aerococcus spp.）、バチルス種（Bacillus spp.）、アクチノバチルス種（Actinobacillus spp.）（限定するものではないが、アクチノバチルス・スクシノゲネス（A. succinogens）など）、カルボバクテリウム（種Carbobacterium spp.）、コリネバクテリウム種（Corynebacterium spp.）、エンテロコッカス種（Enterococcus spp.）、エリジペロスリックス種（Erysipelothrix spp.）、ゲメラ種（Gemella spp.）、ゲオバチルス種（Geobacillus spp.）、グロビカテラ種（Globicatella spp.）、ラクトバチルス種（Lactobacillus spp.）（限定するものではないが、ラクトバチルス・ラクチス（L. lactis）及びラクトバチルス・ラムノサス（L. rhammosus）など）、ラクトコッカス種（Lactococcus spp.）、ロイコノストック種（Leuconostoc spp.）、ペディオコッカス種（Pediococcus spp.）、ストレプトコッカス種（Streptococcus spp.）、テトラゲノコッカス種（Tetragenococcus spp.）、アクチノバチルス種（Actinobacillus spp.）、又はバゴコッカス種（Vagococcus spp.）が挙げられるがこれらに限定されない細菌種であり得る。他の態様では、発酵微生物にはリゾプス（Rhizopus spp.）が挙げられるが、これらに限定されない真菌であり得る。
【０２３１】
他の態様では、宿主細胞は、アエルコッカス（Aerococcus）、バチルス（Bacillus）、カルノバクテリウム（Carbobacterium）、エンテロコッカス（Enterococcus spp.）、エリジペロスリックス（Erysipelothrix）、ゲメラ（Gemella）、グロビカテラ（Globicatella）、ラクトバチルス（Lactobacillus）、ラクトコッカス（Lactococcus）、ロイコノストック（Leuconostoc）、ペディオコッカス（Pediococcus）、ストレプトコッカス（Streptococcus）、テトラゲノコッカス（Tetragenococcus）、及びバゴコッカス（Vagococcus spp.）属のものなどの乳酸菌であり得る。例えば、置き換えることのできるラクトバチルス（Lactobacillus）属の他の細菌としては、ラクトバチルス・ヘルベティカス（L. heiveticus）、ラクトバチルス・デルブリュッキ（L. delbrueckii）、ラクトバチルス・カゼイ（L. casei）、ラクトバチルス・アシドフィラス（L, acidophilus）、ラクトバチルス・アミロボラス（L. amylovorus）、ラクトバチルス・ライヒマニ（L. leichmanii）又はラクトバチルス・ブルガリクス（L. bulgaricus）、ラクトバチルス・アミロボラス（L. amylovorus）、及びラクトバチルス・ペントーサス（L. pentosus）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０２３２】
使用することのできる他の代表的な宿主細胞は、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０３１０７７号、及び国同第２０１０／０３１０７９号に記載されている。
【０２３３】
Ｂ．イソプレンの生産方法
本明細書では、本明細書に記載される通りの任意のイソプレンを使用して、本明細書に開示されるものなどの条件下で、本明細書に記載のいずれかの組換え細胞を培養することによる、イソプレンの生産方法が提供される。一態様では、イソプレンは、培養培地中で、（ａ）イソプレン合成酵素ポリペプチド、ここで、イソプレン合成酵素ポリペプチドは異種核酸によりコードされる、並びに（ｂ）１種以上のメバロン酸（ＭＶＡ）経路ポリペプチド、をコードする１つ以上の核酸を発現する組換え細胞により生産され得る。一態様では、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、下流ＭＶＡ経路のポリペプチド、及びイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸を使用することができる。別の態様では、チオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、下流ＭＶＡ経路のポリペプチド、並びにイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸を含む組み換え細胞を培養することによりイソプレンを生産することができる。更に別の態様では、上流ＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチド、下流ＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチド、及び／又はＤＸＰ経路の１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸を使用することができる。いくつかの態様では、本明細書に記載の組換え細胞は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸及びＭＶＡ経路のポリペプチドを１種以上含まない細胞と比較して、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９５％、又は１００％（これらの割合間における任意の値を包含する）向上されたイソプレン生産を示す。イソプレンは、本開示の任意の方法に従い、本明細書に記載の任意の細胞から生産することができる。本明細書に記載される通りの任意のイソプレン合成酵素を使用してイソプレンを生産させる目的で、任意の細胞を使用することができる。
【０２３４】
細胞には、上記の下流ＭＶＡ経路ポリペプチド（例えば、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ及び／又はＩＤＩ）、上記の上流ＭＶＡ経路ポリペプチドのいずれか（例えば、チオラーゼ、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、及び／又はＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）及び／又は上記のイソプレン合成酵素ポリペプチドのいずれか（例えば、ラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素）をコードする１つ以上の核酸分子を更に発現させることができる。いくつかの態様では、組換え（例えば、細菌）細胞は、本明細書に記載の任意の細胞であってよい。本明細書に記載の任意のイソプレン合成酵素又はこれらの変異体、本明細書に記載の任意の細菌株、本明細書に記載の任意のプロモータ、及び／又は本明細書に記載の任意のベクターを使用して、イソプレンを生産させることもできる。いくつかの態様では、イソプレンの生産方法は更に、イソプレンを回収する工程を含む。
【０２３５】
いくつかの態様では、生産されるイソプレン量は、各生産時点で測定されたものである。いくつかの態様では、細胞に関し生産量は、本開示の任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。いくつかの態様では、生産されたイソプレンの総量は累積値として測定される。いくつかの態様では、細胞の累積生産量は、本明細書で開示される任意のおよそのイソプレン量を指していうものである。
【０２３６】
いくつかの態様では、本明細書に記載の、任意の細胞（例えば、培養物中の細胞）は、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００又は５，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｎｍｏｌ）／細胞湿潤重量（ｇ）／ｈｒ（ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）値でイソプレンを生産する。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒであり、例えば、約２〜約１００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１５０〜約５００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、又は約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。いくつかの態様では、イソプレンの量は約２０〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約２，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約２００〜約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約３００〜約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、又は約４００〜約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。
【０２３７】
いくつかの態様では、細胞は、培養時に、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００又は１００，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｎｍｏｌ）／細胞湿潤重量（ｇ）／時間（ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）値でイソプレンを生産する。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈであり、例えば、約２〜約１００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約５００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１，０００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ又は約２，０００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約２００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約３００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ又は約４００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。
【０２３８】
いくつかの態様では、細胞は、培養時に、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００以上のうちのいずれかのイソプレン（ｍｇ）／ブロス（Ｌ）（ｍｇ／Ｌブロス、ブロス体積には、細胞及び細胞培地の体積を含む）値の累積力価（総量）でイソプレンを生産する。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロスであり、例えば、約２〜約１００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌブロス、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、又は約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロスなどである。いくつかの態様では、イソプレンの量は、約２０〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約１００〜約５，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約２，０００ｍｇ／Ｌブロス、約２００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、約３００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロス、又は約４００〜約１，０００ｍｇ／Ｌブロスである。
【０２３９】
いくつかの態様では、培養において細胞により生産されるイソプレン（本明細書に記載のいずれかの組換え細胞など）は、少なくとも約１、２、５、１０、１５、２０、又は２５体積％の発酵時排出気体を含む。いくつかの態様では、イソプレンは、排出気体の体積の約１〜約２５％を構成し、例えば、約５〜約１５％、約１５〜約２５％、約１０〜約２０％又は約１〜約１０％を構成する。
【０２４０】
いくつかの実施態様では、イソプレン生産条件下で細胞を培養培地で培養する。いくつかの実施態様では、培養時に細胞が生産するイソプレン量は、１時間につき、細胞の湿潤重量１ｇ当たり、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、又は５，０００ナノモル（ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）以上である。いくつかの実施態様では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、例えば、約２〜約１００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１５０〜約５００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、又は約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ単位のイソプレンの量は、米国特許第５，８４９，９７０号に開示の通りに測定できる。例えば、ヘッドスペース２ｍＬに含まれるイソプレン（例えば、密封したバイアル瓶で、３２℃、２００ｒｐｍで振盪させながら約３時間培養した２ｍＬ培養物などの培養物から、ヘッドスペースに放出されたイソプレン）は、ｎ−オクタン／ｐｏｒａｓｉｌ  Ｃカラム（Ａｌｌｔｅｃｈ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ））を取り付け、ＲＧＤ２酸化水銀還元ガス検出器（Ｔｒａｃｅ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡ））に連結させた等温操作系（８５℃）などの、一般的なガスクロマトグラフィー系を用い測定する（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ａｔｍｏｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．２７Ａ：２６８９〜２６９２，１９９３；Ｓｉｌｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７：１５８８〜１５９１，１９９１を参照されたい）。標準イソプレン濃度をもとにした検量線により、ガスクロマトグラフィーの面積単位をイソプレン量（ｎｍｏｌ）に変換する。いくつかの実施態様では、細胞の湿潤重量（ｇ）当たりの値は、細胞培養物サンプルのＡ６００値を得、次に、Ａ６００値が既知である細胞培養物の湿潤重量に関する検量線をもとにＡ６００値を細胞重量（ｇ）に変換することで算出する。いくつかの実施態様では、細胞重量（ｇ）は、ブロス１Ｌ（細胞培地及び細胞を含む）のＡ６００値が１である場合、湿潤細胞が１ｇ含まれているものと仮定し、概算する。この値を、培養物をインキュベートした時間数（例えば３時間）で除算する。
【０２４１】
いくつかの実施態様では、培養時に細胞が生産するイソプレン量は、１時間につき、細胞の湿潤重量１ｇ当たり、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、又は１００，０００ｎｇ（ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ）以上である。いくつかの実施態様では、イソプレン量は、約２〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、例えば、約２〜約１００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約５００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１，０００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、又は約２，０００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。イソプレン量（ｉｎｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ）は、上記のイソプレン生産量（ｎｍｏｌ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）に６８．１を乗じることで算出できる（以下の式５に記載の通り）。
【０２４２】
いくつかの実施態様では、細胞は、培養時に累積力価（総量）約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００ｍｇ／Ｌ（ブロス１Ｌ当たりの生産量（ｍｇ）。ここで、ブロス体積には、細胞体積及び細胞培地の体積を含む）以上のイソプレンを生産する。いくつかの実施態様では、イソプレン量は約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約２〜約１００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌ、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌ、又は約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌである。振盪フラスコ又は同様の培養装置のヘッドスペースにおけるイソプレンの比生産量（ｍｇ／Ｌ）は、ＯＤ６００が約１．０の細胞培養物から試料を１ｍＬ採取し、２０ｍＬバイアル瓶に移し入れ、３０分インキュベートした後に、ヘッドスペース中のイソプレン量を測定することで、測定できる。ＯＤ６００が１．０でない場合、測定値は、ＯＤ６００により除算して、ＯＤ６００が１．０になるよう標準化できる。ヘッドスペースに含まれるイソプレン量（ｍｇ／Ｌ）に係数３８を乗じ、培養培地のＯＤ６００値をもとにした、１時間当たりのイソプレン生産量（ｍｇ／Ｌ（ブロス）／ｈｒ／ＯＤ６００）に変換することもできる。単位「ｍｇ／Ｌ（ブロス）／ｈｒ／ＯＤ６００」の値に、時間数とＯＤ６００値を乗じ、イソプレンｍｇ／Ｌ（ブロス）単位での累積力価を得ることもできる。
【０２４３】
発酵槽の瞬間イソプレン生産速度（ｍｇ／Ｌ（ブロス）／ｈｒ）は、発酵槽で放出された気体試料を採取し、イソプレン量（気体１Ｌ当たりのイソプレン重量（ｍｇ）などの単位）を解析し、この値に、ブロス１Ｌにつき放出される気体速度（例えば、１時間当たりに６０Ｌの気体が放出されることを意味する１ｖｖｍ（気体体積／ブロス体積／分））を乗じることで測定することができる。したがって、気体の放出濃度が１ｍｇ／Ｌである場合、空気流１ｖｖｍ下での瞬間生産速度は６０ｍｇ／Ｌ（ブロス）／ｈｒに相当する。必要に応じて、単位ｍｇ／Ｌ（ブロス）／ｈｒの値をＯＤ６００により除算することで、ｍｇ／Ｌ（ブロス）／ｈｒ／ＯＤ単位で比速度を得ることもできる。イソプレンの平均放出濃度に、発酵時の発酵ブロス１Ｌ当たりの放出気体総量（off-gas sparged）を乗じることで、イソプレン／Ｌ（気体）の平均値を総生産物の生産性（発酵ブロス１Ｌ当たりのイソプレン重量、ｍｇ／（ブロス）Ｌ）に変換することもできる。したがって、イソプレンの平均放出濃度が０．５ｍｇ／（ブロス）Ｌ／ｈｒである場合、１ｖｖｍ下１０時間経過時の総生成物濃度は３００ｍｇ／（ブロス）Ｌに相当する。
【０２４４】
いくつかの実施態様では、細胞は、培養時に、細胞培養培地に含まれる炭素の約０．００１５、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、又は１．６％以上をイソプレンに変換する。いくつかの実施態様では、炭素のイソプレンへの変換率は約０．００２〜約１．６％であり、例えば、約０．００２〜約０．００５％、約０．００５〜約０．０１％、約０．０１〜約０．０５％、約０．０５〜約０．１５％、０．１５〜約０．２％、約０．２〜約０．３％、約０．３〜約０．５％、約０．５〜約０．８％、約０．８〜約１．０％、又は約１．０〜約１．６％である。炭素のイソプレンへの変換率（「炭素収率（％）」とも呼ばれる）は、生産されたイソプレンに含まれる炭素原子のモル数を、炭素源（バッチ中の並びに供給したグルコース及び酵母エキスに含まれる炭素モル濃度）に含まれる炭素原子のモル数により除算することで測定できる。この数に１００％を乗じ、百分率を生成する（式１に示す通り）。
式１
炭素収率（％）＝（生産されたイソプレンに含まれる炭素のモル数）／（炭素源に含まれる炭素のモル数）＊１００
【０２４５】
この計算式では、酵母エキスには５０重量％の炭素が含有されるものと仮定することができる。
式２
炭素収率（％）＝（３９．１ｇイソプレン＊１／６８．１ｍｏｌ／ｇ＊５Ｃ／ｍｏｌ）／［（１８１２２１ｇグルコース＊１／１８０ｍｏｌ／ｇ＊６Ｃ／ｍｏｌ）＋（１７７８０ｇ酵母エキス＊０．５＊１／１２ｍｏｌ／ｇ）］＊１００＝０．０４２％
【０２４６】
当業者であれば、イソプレン生産速度又は生産されたイソプレン量は、容易に任意の単位に変換できる。単位を相互変換するための、代表的な等式を以下に掲載する。
【０２４７】
イソプレン生産速度単位（総生産量及び比生産量）
式３
１ｇイソプレン／Ｌブロス／ｈｒ＝１４．７ｍｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／ｈｒ（合計容積流量）
式４
１ｎｍｏｌイソプレン／ｇｗｃｍ／ｈｒ＝１ｎｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／ｈｒ／ＯＤ６００（この変換式では、ＯＤ６００の値が１のブロス１Ｌには、１ｇの湿潤細胞が含まれているものと仮定する）。
式５
１ｎｍｏｌイソプレン／ｇｗｃｍ／ｈｒ＝６８．１ｎｇイソプレン／ｇｗｃｍ／ｈｒ（イソプレンの分子量）
式６
１ｎｍｏｌイソプレン／Ｌガス中Ｏ２／ｈｒ＝９０ｎｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／ｈｒ（培養ブロス１Ｌ当たりのＯ２流速９０Ｌ／ｈｒ）
式７
１μｇイソプレン／Ｌ放出ガス中イソプレン＝６０μｇイソプレン／Ｌブロス／ｈｒ（流速６０Ｌガス／Ｌブロス）（１ｖｖｍ）
【０２４８】
力価単位（合計単位及び比単位）
式８
１ｎｍｏｌイソプレン／１ｍｇ細胞タンパク質＝１５０ｎｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／ＯＤ６００（この変換式では、ＯＤ６００値が１のブロス１Ｌに含まれる合計細胞タンパク質量は約１５０ｍｇであると仮定する）（比生産性）
式９
１ｇイソプレン／Ｌブロス＝１４．７ｍｍｏｌイソプレン／Ｌブロス（合計力価）
【０２４９】
必要に応じて、細胞の湿潤重量単位を細胞の乾燥重量単位へと変換する際に、式１０を使用することができる。
式１０
細胞乾燥重量＝（細胞湿潤重量）／３．３
【０２５０】
本発明に包含される一部の実施例では、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする異種核酸を含む細胞は、本質的に同一の条件下で、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードする核酸を含まない対応する細胞を増殖させた場合のイソプレン生産量の、少なくとも約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、又は４００倍以上の量のイソプレンを生産する。
【０２５１】
本発明に包含される一部の実施例では、イソプレン合成酵素のポリペプチドと、ＤＸＳ、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドのうちの１種以上とをコードする異種核酸を含む細胞は、本質的に同一の条件下で、異種核酸を含まない対応する細胞を増殖させた場合のイソプレン生産量の、少なくとも約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、又は４００倍以上の量のイソプレンを生産する。
【０２５２】
１．形質転換法
ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチド、イソプレン合成酵素ポリペプチド、ＭＶＡ経路ポリペプチド、ＤＸＰ経路ポリペプチド、ホスホケトラーゼポリペプチド、及び／又はポリプレニルピロリン酸シンターゼポリペプチドをコードする核酸の１つ以上のコピーをコードする核酸を、好適な技術を使用して微生物に入れることができる。加えて、これらの核酸又はこれらを含むベクターは、宿主細胞内にＤＮＡコンストラクト又はベクターを導入するための、形質転換、電気穿孔法、核マイクロインジェクション、形質導入、遺伝子導入（例えばリポフェクション法による若しくはＤＥＡＥ−デキストラン法による遺伝子導入、又は組換えファージウイルスを使用したトランスフェクション）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法とインキュベーションの併用、ＤＮＡコーティングした微粒子を用いる高速微粒子銃、及びプロトプラスト融合などの、標準的な技術を使用して、宿主細胞（例えば本明細書において述べられるような植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は細菌細胞）に入れることができる。一般的な形質転換法は、当該技術分野で既知である（例えば、分子生物学領域の現行のプロトコル（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｃｈａｐｔｅｒ  ９，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，「分子クローニング（Molecular Cloning）」：「実験室マニュアル（A Laboratory Manual）第２版」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，１９８９；及びＣａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．１６：５３〜５６，１９８９を参照されたい）。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込むことができ、又は染色体外の複製配列として維持することができる。形質転換体は、当該技術分野において既知の任意の方法により選別することができる。形質転換体の選別に好適な方法は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、及び米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６に記載される。
【０２５３】
２．例示的な細胞培養培地
本明細書で使用するとき、用語「最少培地（minimal medium又はminimal media））」は、概して細胞増殖に必要とされる最低限の栄養素を含有している増殖培地を指すが、常にアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０種以上のアミノ酸）が存在していないわけではない。最少培地は、（１）微生物を増殖させるための炭素源；（２）微生物種及び増殖条件によって異なる様々な塩；並びに（３）水；を含有する。炭素源は、グルコースなどの単糖から、本明細書で以下により詳細に記載されるような、他のバイオマスのより複雑な加水分解物、例えば、酵母エキスなどといった多様なものであり得る。塩は、概してマグネシウム、窒素、リン及びイオウなどの必須元素を提供し、細胞がタンパク質及び核酸を合成できるようにする。また、最少培地には、特定のプラスミド及び同様物を維持すべく選別するために、抗菌剤などの選択剤を添加することもできる。例えば、微生物が、例えばアンピシリン又はテトラサイクリンなどの特定の抗菌剤に耐性である場合、耐性を欠く細胞の増殖を阻害する目的で培地に抗菌剤を添加することができる。培地には、所望される生理学的又は生化学的特性について選別するのに必要とされる、例えば特定のアミノ酸などといった他の化合物を添加することができる。
【０２５４】
宿主細胞を培養するにあたり、任意の最少培地処方を使用することができる。例示的な最少培地処方としては、例えば、Ｍ９最少培地及びＴＭ３最少培地が挙げられる。Ｍ９最少培地は、１Ｌにつき（１）２００ｍＬの滅菌Ｍ９塩類（１Ｌ当たり６４ｇのＮａ２ＨＰＯ４−７Ｈ２Ｏ、１５ｇのＫＨ２ＰＯ４、２．５ｇのＮａＣｌ及び５．０ｇのＮＨ４Ｃｌ）；（２）２ｍＬの１ＭのＭｇＳＯ４（滅菌）；（３）２０ｍＬの２０％（ｗ／ｖ）グルコース（又は他の炭素源）；及び（４）１００μＬの１ＭのＣａＣｌ２（滅菌）を含有する。ＴＭ３最少培地は、１Ｌ中に（１）Ｋ２ＨＰＯ４（１３．６ｇ）；（２）ＫＨ２ＰＯ４（１３．６ｇ）；（３）ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）；（４）クエン酸一水和物（２ｇ）；（５）クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）；（６）（ＮＨ４）２ＳＯ４（３．２ｇ）；（７）酵母エキス（０．２ｇ）；及び（８）１０００×微量元素溶液（１ｍＬ）を含有する。ｐＨは約６．８に調整し、溶液は濾過滅菌する。１０００×微量元素は、１Ｌ中に（１）クエン酸一水和物（４０ｇ）；（２）ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）；（３）ＮａＣｌ（１０ｇ）；（４）ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）；（４）ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）；（５）ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）；（６）ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）；（７）Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）；及び（８）ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）を含有する。ｐＨは約３．０に調節する。
【０２５５】
その他の最小培地の例は、（１）リン酸カリウムＫ２ＨＰＯ４、（２）硫酸マグネシウムＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ、（３）クエン酸一水和物Ｃ６Ｈ８Ｏ７＊Ｈ２Ｏ、（４）クエン酸鉄アンモニウムＮＨ４ＦｅＣ６Ｈ５Ｏ７、（５）酵母エキス（ｂｉｏｓｐｒｉｎｇｅｒ）、（６）１０００×改変微量金属溶液、（７）硫酸５０％（ｗ／ｖ）、（８）ｆｏａｍｂｌａｓｔ  ８８２（Ｅｍｅｒａｌｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ）及び（９）微量塩溶液を３．３６ｍＬ含有する。すべての成分を同時に加え、脱イオン水に溶解させた後、加熱滅菌した。続いて室温に冷却し、水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調節し、用量に調整する。滅菌後にビタミン溶液及びスペクチノマイシンを加え、ｐＨを調整する。
【０２５６】
宿主細胞を培養するにあたり任意の炭素源を使用することができる。用語「炭素源」は、宿主細胞又は微生物により代謝させることのできる、１つ以上の炭素を含有している化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するにあたり使用される細胞培地には、宿主細胞の生存能を維持させる又は宿主細胞を増殖させるのに好適な任意の炭素源を包含させることができる。いくつかの態様では、炭素源は炭水化物（例えば、単糖、二糖、オリゴ糖、又は多糖など）、又は転化糖（例えば、酵素により処理したスクロースシロップ）である。
【０２５７】
いくつかの態様では、炭素源としては、酵母エキス又は酵母エキスの１つ以上の成分が挙げられる。いくつかの態様では、酵母エキスの濃度は、酵母エキスの０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）、又は０．０１％（重量／体積）である。いくつかの態様では、炭素源には、酵母エキス（又は酵母エキスの１つ以上の成分）及び他の炭素源、例えばグルコースの両方を含む。
【０２５８】
単糖の例としては、グルコース及びフルクトースが挙げられ、オリゴ糖の一例としては、ラクトース及びスクロースが挙げられ、並びに多糖の例としては、デンプン及びセルロースが挙げられる。例示的な炭水化物としては、Ｃ６糖（例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、又はグルコース）及びＣ５糖（例えば、キシロース又はアラビノース）が挙げられる。
【０２５９】
いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞は、エネルギー及び／又は炭素源として合成ガスを使用することができる。いくつかの実施態様では、合成ガスは、少なくとも一酸化炭素及び水素を含有する。いくつかの実施態様では、合成ガスは、二酸化炭素、水、又は窒素のうちの１つ以上を更に含有する。いくつかの実施態様では、合成ガス中の一酸化炭素に対する水素のｍｏｌ比は、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、３．０、４．０、５．０、又は１０．０である。いくつかの実施態様では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０体積％の一酸化炭素を含む。いくつかの実施態様では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０体積％の水素を含む。いくつかの実施態様では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０体積％の二酸化炭素を含む。いくつかの実施態様では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０体積％の水を含む。いくつかの実施態様では、合成ガスは、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、又は９０体積％の窒素を含む。
【０２６０】
合成ガスは、天然又は合成資源に由来するものであり得る。合成ガスの由来する資源を「フィードストック」として参照する。いくつかの実施態様では、合成ガスは、バイオマス（例えば、木材、スイッチグラス、農業廃棄物、都市ごみ）又は炭水化物（例えば、糖類）に由来する。他の実施形態では、合成ガスは、石炭、石油、油母、タールサンド、オイルシェール、又は天然ガスに由来する。他の実施形態では、合成ガスは、ゴムタイヤなどのゴムに由来する。
【０２６１】
メタン改質、石炭液化、混焼、発酵反応、酵素反応、及びバイオマスのガス化などの多様な加工法により、フィードストックから合成ガスを得ることができる。バイオマスのガス化は、反応器中で、化学量論量未満の酸素の存在下、約７００℃を超える温度にて、バイオマスを部分的に酸価することにより実施される。空気、高純度酸素、又は蒸気の形態で酸素をバイオリアクタに導入する。ガス化は、主に、１）最初に加熱して、バイオマスに含有されている何らかの水分を乾燥させる工程、２）酸化剤の非存在下で、バイオマスを３００〜５００℃に加熱して、ガス、タール、油及び炭化固体残渣を生成する、熱分解工程、並びに３）炭化固体、タール、及びガスをガス化して、合成ガスの主成分を生成する工程、の３工程で生じ得る。混焼は、石炭／バイオマス混合物をガス化することにより実施される。合成ガス成分の同一性及びｍｏｌ比など、合成ガスの組成は、合成ガスの由来するフィードストック、並びにフィードストックを合成ガスに変換する方法に応じ変化し得る。
【０２６２】
合成ガスは不純物を含有してもよく、不純物の性質及び量は、生産に使用されたフィードストック及び加工法の両方によって異なる。発酵は、ある種の不純物に対し許容性を示し得るものの、発酵装置及び関連する設備を損傷させる恐れのあるタール及び微粒子などは、合成ガス材料から除去する必要がある。イソプレン産物に混入し得る、揮発性有機化合物、酸性気体、メタン、ベンゼン、トルエン、エチルベンゼン、キシレン、Ｈ２Ｓ、ＣＯＳ、ＣＳ２、ＨＣｌ、Ｏ３、有機硫黄化合物、アンモニア、酸化窒素、窒素含有有機化合物、及び重金属蒸気などの化合物を除去することも好ましい。合成ガスからの不純物の除去は、ガス洗浄、固相吸着剤による処置、及びガス透過性膜を用いる精製などの数種類の手法のいずれかにより実施することができる。
【０２６３】
３．例示的な細胞培養条件
本発明の組み換え細胞を維持し及び増殖させるのに好適な材料及び方法は、以下、例えば、実施例の節に記載される。微生物又は細胞培養物の維持及び増殖に好適な他の材料及び方法は当該技術分野において周知である。例示的な手法としては、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（同第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号、Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，編の一般細菌学に関係する手法についてのマニュアル）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）又はＢｒｏｃｋ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：テキスト「工業微生物学（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第２版（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）が挙げられる。いくつかの態様では、細胞は、宿主細胞に挿入する核酸にコードされた、ＭＶＡ経路、イソプレン合成酵素、ＤＸＰ経路（例えば、ＤＸＳ）、ＩＤＩ、ＭＶＡ経路、のポリペプチドのうちの、１種以上を発現させる条件下で、培地中で培養される。
【０２６４】
細胞を培養するにあたり、標準的な細胞培養条件を使用することができる（例えば、国際公開第２００４／０３３６４６号及び該当特許中に引用される参考文献を参照されたい）。いくつかの態様では、細胞は適切な温度、気体混合物、及びｐＨ（例えば、約２０℃〜約３７℃、約６％〜約８４％のＣＯ２、及び約５〜約９のｐＨ）で増殖し、維持される。いくつかの態様では、細胞は適切な細胞培地中で３５℃で増殖する。いくつかの態様では、発酵の際のｐＨ範囲は約ｐＨ  ５．０〜約ｐＨ  ９．０（例えば、約ｐＨ  ６．０〜約ｐＨ  ８．０、又は約６．５〜約７．０）である。細胞は、宿主細胞に必要とされる条件に基づき、好気性、無酸素性、又は嫌気性条件下で生育させることができる。加えて、細胞を培養するにあたり、より特異的な細胞培養条件を使用することができる。例えばいくつかの実施態様では、高発現型プロモータの調節下の低〜中間コピー数のプラスミドにおいてｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードする１つ以上の異種核酸を発現するバクテリア細胞（例えば、大腸菌（E. coli）細胞など）を３４℃で培養する。
【０２６５】
使用することのできる標準的な培養条件、並びに回分式、流加式、又は連続式発酵などの発酵様式は、国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／３３５，０７１号（米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号）、国際公開第２０１０／００３００７号、米国特許出願公開第２０１０／００４８９６４号、国際公開第２００９／１３２２２０号、米国特許出願公開第２０１０／０００３７１６号に記載されている。回分式発酵及び流加式発酵は一般的かつ当該技術分野では周知のものであり、その例は、Ｂｒｏｃｋ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．に見ることができる。
【０２６６】
いくつかの態様では、細胞はグルコース制限条件下で培養される。「グルコース制限条件」は、添加されるグルコースの量が、細胞により消費されるグルコース量の約１０５％以下（例えば、約１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、又は１０％）であることを意味する。特定の態様では、培養培地に添加されるグルコース量は、特定の期間中に細胞により消費されるグルコース量とほぼ同様である。いくつかの態様では、細胞の増殖速度は、細胞培地中のグルコースの量により維持することのできる速度で細胞が増殖するよう、添加するグルコース量を制限することで制御される。いくつかの態様では、グルコースは細胞培養時に蓄積しない。様々な態様で、細胞はグルコース制限条件下で、約１、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、又は７０時間以上培養される。様々な態様で、細胞は、細胞を培養する合計時間の長さの約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５又は１００％以上の時間にわたって、グルコース制限条件下で培養される。任意の特定の理論に束縛されることを意図するものではないが、グルコース制限条件は、細胞をより都合よく制御し得るものであると考えられる。
【０２６７】
いくつかの態様では、細菌細胞は回分式培養で増殖させる。細菌細胞は、流加式培養又は連続式培養により生育させることもできる。加えて、細菌細胞は、限定するものではないが、上記のいずれかの最少培地などの最少培地で培養することができる。最少培地には、更に１．０％（ｗ／ｖ）グルコース又は任意の他の６単糖以下の糖などを添加してもよい。具体的には、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）、又は０．１％（重量／体積）のグルコースが添加される。加えて、最少培地には０．１％（ｗ／ｖ）以下の酵母エキスを添加してもよい。具体的には、最少培地には０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスを添加してもよい。あるいは、最少培地には１％（重量／体積）、０．９％（重量／体積）、０．８％（重量／体積）、０．７％（重量／体積）、０．６％（重量／体積）、０．５％（重量／体積）、０．４％（重量／体積）、０．３％（重量／体積）、０．２％（重量／体積）又は０．１％（重量／体積）のグルコース及び０．１％（重量／体積）、０．０９％（重量／体積）、０．０８％（重量／体積）、０．０７％（重量／体積）、０．０６％（重量／体積）、０．０５％（重量／体積）、０．０４％（重量／体積）、０．０３％（重量／体積）、０．０２％（重量／体積）又は０．０１％（重量／体積）の酵母エキスを添加してもよい。
【０２６８】
４．例示的な精製方法
いくつかの実施態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に、イソプレンを回収する工程を包含する。例えば、本発明の組成物及び方法により生産されるイソプレンは、ガス・ストリッピング、高機能分離膜による分離（membrane enhanced separation）、分画、吸着／脱着、浸透気化法、固相からのイソプレンの熱又は真空脱着、あるいは固相に対し固定化させた又は吸着させたイソプレンの溶媒による抽出（例えば、米国特許第４，７０３，００７号及び同第４，５７０，０２９号を参照されたい。これらの特許文献のそれぞれは参照により本開示に援用し、特にイソプレンの回収及び精製法に関し援用する。）などの標準法により回収することができる。一態様では、イソプレン吸着ストリッピングにより回収できる（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１７８２６１号を参照されたい）。特定の態様では、イソプレンの回収には、アルコール（エタノール、メタノール、プロパノール、又はこれらの組み合わせなど）による抽出蒸留が使用される。いくつかの実施態様では、イソプレンの回収には、液体イソプレン（イソプレンの未希釈溶液又はイソプレンの溶媒希釈液など）の単離を包含する。ガス・ストリッピングには、連続的な様式で、発酵による放出気流からイソプレン蒸気を除去することを包含する。このような除去は、限定するものではないが、固相への吸着、液相への分配、又は直接濃縮（濃縮コイルへの暴露、又は加圧による凝縮など）などの、いくつかの異なる手法により実施できる。いくつかの実施形態では、蒸気の露点を上回る温度での希釈イソプレン蒸気ストリームの膜濃縮により、液体イソプレンの凝縮がもたらされる。いくつかの実施態様では、回収は、米国特許出願公開番号第２０１１／０１７８２６１号に記載のとおりに実施される。いくつかの態様では、イソプレンを加圧濃縮する。
【０２６９】
イソプレンの回収には、一工程又は複数工程を包含し得る。いくつかの実施態様では、発酵により生じた気体からのイソプレン蒸気の回収、及びイソプレンの液相への転換は同時に行う。例えば、放出される気体流から、イソプレンを直接液体へと凝縮させることができる。いくつかの実施態様では、発酵により生じた気体からのイソプレン蒸気の回収、及びイソプレンの液相への転換は連続的に行う。例えば、イソプレンを、固相に吸着させ、次に溶媒を用い固相から抽出することができる。一態様では、イソプレンは、米国特許出願第１２／９６９，４４０号（米国特許出願公開第２０１１／０１７８２６１号）に記載の通りに吸着ストリッピングを用い回収する。
【０２７０】
いくつかの実施態様では、本開示の任意の方法は、イソプレンの精製を更に包含する。例えば、本発明の組成物及び方法を用い生成したイソプレンを、標準法により精製することができる。精製とは、イソプレンを生成した際に存在している１種以上の成分から、イソプレンを分離する手法を指す。いくつかの実施態様では、イソプレンは実質的に純粋な液体として得られる。精製法の例としては（ｉ）抽出溶媒からの蒸留、及び（ｉｉ）クロマトグラフィーが挙げられる。本明細書で使用するとき、「精製イソプレン」は、イソプレンを生成した際に存在している１種以上の成分から分離したイソプレンを意味する。例えば、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号、ＰＣＴ出願国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／４９６，５７３号を参照されたい。いくつかの実施態様では、イソプレンはイソプレンの生産時に存在する他の成分を少なくとも約２０重量％含んでいない。各種実施形態では、イソプレンの純度は、少なくとも又は約２５重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、重量％又は９９重量％である。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ分析、又はＧＣ−ＭＳ分析等の任意の適切な方法で分析することができる。いくつかの態様では、イソプレン除去の際の１回以上の回収工程後に残存している気体相の少なくとも一部は、気体層をイソプレン生産用の細胞培養系（発酵槽など）に導入することでリサイクルされる。
【０２７１】
いくつかの態様では、本開示の任意の方法は、本明細書で開示される任意の組換え細胞により生産されたイソプレンを回収する工程を更に含有する。いくつかの態様では、イソプレンは吸着ストリッピングにより回収される（例えば、米国特許出願公開第２０１１／０１７８２６１（Ａ１）号を参照されたい）。
【０２７２】
いくつかの態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に異種核酸を回収する工程を包含する。いくつかの態様では、本明細書に記載の任意の方法は更に異種ポリペプチドを回収する工程を包含する。
【０２７３】
好適な精製方法は、米国特許出願公開第２０１０／０１９６９７７（Ａ１）号により詳細に記載されている。
【０２７４】
本明細書の上記のすべての刊行物及び特許は、参照により本開示に援用される。本発明の範囲及び精神から逸脱せずとも、本発明に記載の方法及び系の様々な修正及び改変が、当業者には明白であろう。これまでに、本発明を、特定の実施形態に関連付けて記載したが、本発明は、特定の実施形態に不当に制限されるよう請求されるものではないことは理解されるべきである。本明細書に記載の各種実施形態に関する１つの、幾つかの、又は全ての特性は、本発明の他の実施形態と組み合わせることができることも理解されるであろう。本発明のこれらの態様及び他の態様は、当業者にとっては自明のものであろう。
【０２７５】
本明細書を通じ、各種特許、特許出願及び他の種類の刊行物（例えば、学術論文）を参照する。本明細書に引用する、本開示に関係する全ての特許、特許出願及び刊行物は、すべての目的に関し、参照によりその全文が本明細書に援用される。
【０２７６】
本発明は、実例として提供され、本発明の範囲を制限することを意図するものではない以降の実施例を参照することにより更に完全に理解され得る。本開示中のすべての引用は、参照により本明細書に明示的に援用される。
【実施例】
【０２７７】
以降の実施例は例示目的で提供され、更に特定の好ましい実施形態及び本発明の態様を示すものであり、発明の範囲を制限するよう解釈されるものではない。
【実施例１】
【０２７８】
実施例１：イソプレン合成酵素候補の特定
ウラジロハコヤナギ（P. alba）及びプエラリア・モンタナ（P. montana）から単離されたイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）をコードするアミノ酸配列を、所有権及び公共の配列データベースに対し解析し、イソプレン合成酵素活性を有し得るポリペプチドを特定した。イソプレン合成酵素活性を保有し得るポリペプチド候補を特定するための選別基準としては、１）ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）イソプレン合成酵素アミノ酸残基Ｆ２８７、Ｇ３９７、Ｎ４３８、Ｅ４５１、Ｙ５１４に対応する１つ以上の不変のアミノ酸残基の有無；２）未熟なシグナル配列のプロセシングが完了したポリペプチドとして定義される成熟配列との配列アラインメント；並びに３）ＩｓｐＳの触媒活性部位を含有しているＣ末端領域に基づく配列アラインメント、が挙げられる。配列アラインメントにより、ラッカセイ（A. hypogaea）（ピーナッツ）、ダイズ１（G. max 1）（大豆）、ダイズ２（G. max 2）（大豆）、フユナラ（フユナラ（Q. petraea））（オーク）、ケルクス・アイレックス（Q. ilex）、ハッショウマメ（M. pruriens）（八升豆）、及びキマメ（C. cajans）（キマメ）（図１、２Ａ〜Ｆ及び３Ａ−Ｃ）を含む数種類のイソプレン合成酵素が特定された。
【実施例２】
【０２７９】
実施例２：インビトロでのイソプレン生産により測定されるイソプレン合成酵素活性を評価することによるイソプレン合成酵素候補の解析
インビトロでＤＭＡＰＰをイソプレンへと変換する能力について、イソプレン合成酵素候補を解析した。
【０２８０】
材料及び方法
ＩｓｐＳ酵素のコドン最適化及び株構築
ラッカセイ（A. hypogaea）、キマメ（C. cajans）、ダイズ（G. max）、ハッショウマメ（M. pruriens）、及びフユナラ（Q. petraea）由来の推定ＩｓｐＳ酵素をコードするＤＮＡ配列をコドン最適化し、合成し、ＤＮＡ２．０によりウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ  ＭＥＡ酵素と同一の向きでｐＣＬ２０１発現ベクターにクローニングした（図１２）。精製したプラスミドにより、製造元の推奨するプロトコルに従って発現宿主ＢＬ２１  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させ、更なる試験のため推定ＩｓｐＳ酵素の発現カセットを保有する耐性コロニーを選別した。株の詳細な説明は表１を参照されたい。
【０２８１】
【表１】
2015521036.tif 000013
【０２８２】
イソプレン合成酵素比生産性の決定
材料
Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．６）、ＭｇＣｌ２、４−（２−アミノエチル）ベンゼンスルホン酸フルオリド塩酸塩（ＡＥＢＳＦ）、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ＤＭＡＰＰトリアンモニウム塩（Ｃａｙｍａｎ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、９６ウェルＺｉｎｓｓｅｒガラスブロック、Ｓｅａｌ  ＆  Ｓａｍｐｌｅ  Ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｆｏｉｌ  ｌｉｄｓ（製品番号５３８６１９）（Ｂｅｃｋｍａｎ  ｃｏｕｌｔｅｒ）、ポリプロピレン製高容量Ｎｕｎｃマイクロウェル９６ウェルプレート（製品番号２４４９９４６）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（ＶＷＲ）。
【０２８３】
タンパク質発現及び溶解度特性の測定
ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＭＥＡイソプレン合成酵素、ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体３イソプレン合成酵素、ラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素、ダイズ１（G. max 1）（Ｇ，ｍａｘ  ２１９００又はＧｌｙｍａ０９ｇ２１９００．１）イソプレン合成酵素、ダイズ（G. max）２（Ｇ，ｍａｘ  １８２８０又はＧｌｙｍａ２０ｇ１８２８０＿１＿ＦＧ）イソプレン合成酵素、ハッショウマメ（M. pruriens）イソプレン合成酵素、又はキマメ（C. cajans）イソプレン合成酵素を発現する大腸菌（E. coli）形質転換体をＬＢ培地で増殖させ、ＯＤ６００が約０．５になった時点で２００μＭ  ＩＰＴＧを導入し、５時間発現誘導した。細胞を回収する前に、最終的なＯＤ６００値を記録した。細胞ペレットを遠心分離により回収し、−８０℃で保存した。３ｍＬ溶解緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．６）、１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＤＮＡａｓｅ、０．５ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を各凍結ペレットに加え、このペレットを再懸濁し、続いて氷上で３０分間インキュベートした。次に、可溶化液が透明になり始めるまで、フレンチプレス（５．５２ＭＰａ（８００ｐｓｉ）／Ｌｏｗ設定に設定した小型フレンチプレスセル）のセルに２〜３回通過させて、細胞懸濁液を完全に可溶化させた。次に混合物を４℃下、１４０００ｒｐｍにて２５分間遠心分離した。酵素活性アッセイにおいて使用するため、上清を回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色により、タンパク質の可溶性について、総可溶化液、可溶性画分、及びペレット由来のサンプルを解析した。
【０２８４】
イソプレン合成酵素酵素活性アッセイ
イソプレン合成酵素を含有している２５μＬの大腸菌（E. coli）上清を、アルミホイル製の蓋により密封したＺｉｎｓｓｅｒ  ９６ウェルガラスブロック内にて、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌを含有している１００μＬ反応液中で、０．２５、０．５、１、３、５、７、１０、１５、２０、及び２５ｍＭ  ＤＭＡＰＰとともに３４℃にて３０分インキュベートした。次にガラスブロックを８０℃の水浴に移し２分間置いた。次に、ＧＣ−ＦＩＤ（以降を参照のこと）によりガラスブロックを解析して、反応時に生成されたイソプレン濃度を求めた。
【０２８５】
ＧＣ−ＦＩＤ解析
装置及び材料
ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、７８９０（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）７８９０（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＨＰ−５ｍｓカラム、５％−フェニル−メチルポリシロキサン、１５ｍ×０．２５ｍｍ×０．２５μｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＣＴＣオートサンプラー（Ｌｅａｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．２％  ｖ／ｖイソプレン、窒素バランス（Ａｉｒ  Ｌｉｑｕｉｄｅ）、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｄ．０３．００．６１１）をインストールしたＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ。
【０２８６】
手順
次のパラメーターを用いＧＣ−ＦＩＤを使用して、９６ウェルガラスブロックを解析した。
【０２８７】
【表２】
2015521036.tif 000014
【０２８８】
実施時間：２８分間
【０２８９】
【表３】
2015521036.tif 000015
【０２９０】
計算
ピーク面積を、窒素校正標準において０．２％（ｖ／ｖ）イソプレンから算出された反応係数により除算し、ピーク面積をイソプレン濃度に変換した。イソプレン合成酵素の比生産性をｍｇ（イソプレン）／Ｌ／ｈｒ／ＯＤ単位で算出した。
【０２９１】
イソプレン合成酵素比活性の決定
６×Ｈｉｓタグ付加したイソプレン合成酵素の発現
Ｎ−末端６×Ｈｉｓタグ付加ウラジロハコヤナギ（P. alba）野生型イソプレン合成酵素、ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体１イソプレン合成酵素、ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体２イソプレン合成酵素、及びラッカセイ（A. hypogaea）イソプレン合成酵素を発現させ、精製した。増殖法は、ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞で発現させたヒスチジンタグ付加酵素に好適なものである。各１Ｌの予定していた増殖用に、１０ｍＬの一晩培養物を調製した。２５ｍＬフラスコを用い、１０ｍＬ  ＬＢ培地に適切な抗生物質（５０ｍｇ／ｍＬカナマイシン、２５ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコール）を加え、新しい細胞プレートから１コロニーを接種し、あるいは凍結させたグリセロールストックを直接摂取した。約２２０ｒｐｍで振盪させながら、培養物を３０℃で一晩増殖させた。一日培養物は、各培養時に適切な抗生物質を添加した１Ｌ  ＬＢ培地で調製した。各１Ｌの一日培養物に１０ｍＬの一晩培養物を接種し、ＯＤ６００が約０．４〜０．６に到達するまで、約２２０ｒｐｍで振盪しながら３０〜３７℃で増殖させた。次に、４００μＭのＩＰＴＧにより１日培養物に発現誘導を行い、２２０ｒｐｍで振盪しながら３０℃にて５〜６時間増殖させた。次に、４℃にて１０，０００×ｇで１０分間遠心沈降し、細胞を回収した。回収後、細胞は次工程に直接用いるか、あるいは使用までの間−８０℃で保存した。
【０２９２】
６×Ｈｉｓタグ付加したイソプレン合成酵素の精製
ヒスチジンタグ付加した酵素をＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞から精製するにあたって、細胞を新鮮な溶解緩衝液（溶解緩衝液（ｐＨ  ８．０）：Ｎｉ洗浄緩衝液＋０．５ｍＭ  ＰＭＳＴ、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、０．２ｍｇ／ｍＬ  ＤＮａｓｅＩ、Ｎｉ洗浄緩衝液：５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）に穏やかに再懸濁した。細胞ペレットに対し、培養培地１Ｌにつき約４０〜５０ｍＬ溶解緩衝液を使用した。次に細胞を氷上で約３０分インキュベートした。次に、可溶化液が透明になり始めるまで、フレンチプレスのセルを２〜３回通過させて（８．２７ＭＰａ／Ｈｉｇｈ（１２００ｐｓｉ／Ｈｉｇｈ）に設定して大型フレンチプレスセルを使用）、細胞懸濁液を完全に可溶化させた。活性解析及びゲル解析（約１００μＬ）のため可溶化液を保存した。次に、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ９０ＳＥ超遠心機により、４℃にて３０，０００×ｇで３０分遠心分離し、可溶化液を清澄化させた。上清を回収し、維持した。「清澄化させた可溶化液」試料を、活性解析及びゲル解析のため保存した（約１００μＬ）。
【０２９３】
清澄化させた可溶化液を、０〜１００％  Ｎｉ緩衝液Ｂを用い、ＨｉｓＴｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。カラムに可溶化液を充填した後、このカラムをＮｉ洗浄緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ、３００ｍｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ  ８．０））により洗浄した。次に、０〜１００％  Ｎｉ溶出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール（ｐＨ  ８．０））を用い、カラムからＨｉｓタグ付加イソプレン合成酵素を溶出させ、Ｈｉｓタグ付加イソプレン合成酵素を含有している画分を回収した。次にカラムをＮｉ脱着緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ７．４））で洗浄した。次に、製造元の指示に従い、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜１２％ゲルＮＵＰＡＧＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により解析した。所望の画分をスピンフィルタ（Ｖｉｖａｓｐｉｎ−２０、Ｓａｒｔｏｒｉｓ）で濃縮し、次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５樹脂を装填したＨｉ  Ｐｒｅｐ  ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ  ｈｅａｔｈｃａｒｅ）で脱塩した。Ｇ−２５緩衝液は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び１ｍＭ  ＤＴＴからなり、ｐＨ  ７．４であった。次に画分を解析し、濃縮した。次に試料を−８０℃で保存した。
【０２９４】
ＴＥＶ切断によるヒスチジンタグの除去
Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．のＴｕｒｂｏＴＥＶプロテアーゼにより消化を実施した。１０μｇの精製タンパク質当たり１ユニットのＴｕｒｂｏＴＥＶを使用した。消化は４℃で一晩行った。試料をＮｉ緩衝液で平衡化させた他のＮｉカラムに素通りさせ、未切断の酵素、タグ、ＴｕｒｂｏＴＥＶプロテアーゼ（同様にタグ付加されている）、及び不純物を除去した。Ｎｉカラムを素通りさせ、洗浄液をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮＵＰＡＧＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い解析し、及びＤＭＡＰＰ活性を解析した。純粋な酵素を含有しているサンプルをプールし、５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ  ７．４）緩衝液中に脱塩し、Ａ２８０での吸光度を使用してタンパク質濃度を決定し、次に精製タンパク質を分割し、−８０℃で保存した。
【０２９５】
イソプレン合成酵素の酵素活性アッセイ
上記の通り、イソプレン合成酵素の酵素アッセイを実施した。
【０２９６】
イソプレン合成酵素の動態パラメーターの計算
イソプレン合成酵素活性は、ｓ−１の単位で記録される。ＤＭＡＰＰアッセイにおいてイソプレン濃度を決定し、換算係数１．４７Ｅ−０４を乗じ、μＭ／Ｌ／秒の単位を得る。次に、各基質濃度にて、各変異体についてイソプレン合成酵素の活性を計算する。
【０２９７】
【数２】
2015521036.tif 000016
【０２９８】
Ｋａｌｅｉｄａｇｒａｐｈ  ４．０（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、基質阻害を考慮に入れ、イソプレン合成酵素の動態アッセイ由来のデータを、アンリ・ミカエリス・メンテン式の改変式に従って代入し、解析した各イソプレン合成酵素に関してＫＭ、ｋｃａｔ及びｋｉＤＭＡＰＰ値を求めた。
【０２９９】
【数３】
2015521036.tif 000017
【０３００】
結果
記載のＩｓｐＳを発現する細胞から調製した可溶化液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、ラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳ（図４Ｂ；レーン３及び４）及びダイズ１（G. max 1）ＩｓｐＳ（図４Ｂ；レーン６及び７）が可溶性であり、ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＭＥＡ  ＩｓｐＳ（図４Ａ；レーン２）に匹敵するレベルで発現していたことを実証した。対照的に、ダイズ２（G. max 2）ＩｓｐＳ（図４Ｂ；レーン９及び１０）は、ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＭＥＡ  ＩｓｐＳと比較してほとんど不溶性であった。ハッショウマメ（M. pruriens）ＩｓｐＳ（図５；レーン５、６及び７）又はキマメ（C. cajans）ＩｓｐＳ（図５；レーン８、９及び１０）を発現する細胞の可溶性画分から調製した３つの希釈物の解析により、これらが可溶性であり、かつウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体３  ＩｓｐＳ（図５；レーン２、３及び４）に匹敵するレベルで発現していたことを実証した。
【０３０１】
記載のＩｓｐＳを含有する細胞可溶化液にもたらされるＤＭＡＰＰからのイソプレン生産を測定した。高濃度ＤＭＡＰＰの存在下で、ラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳを含有する可溶化液によりイソプレンを生産するラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳ又はフユナラ（フユナラ（Q. petraea））ＩｓｐＳを発現する細胞由来の可溶化液は、フユナラ（フユナラ（Q. petraea））ＩｓｐＳ（図６）を発現する細胞由来の可溶化液と比較して、優位に高いイソプレン生産を示す。陽性対照のウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体３  ＩｓｐＳを含有する細胞可溶化液によるイソプレン産生との比較により示される通り、高濃度ＤＭＡＰＰが存在する場合、ハッショウマメ（M. pruriens）ＩｓｐＳを含有する細胞可溶化液から、イソプレンが生産された（図７）。これらの結果から、ポリペプチド候補、ラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳ、フユナラ（フユナラ（Q. petraea））ＩｓｐＳ、及びハッショウマメ（M. pruriens）ＩｓｐＳがイソプレン合成酵素活性を有することが示される。
【０３０２】
ＩｓｐＳ候補のラッカセイ（A. hypogaea）（ピーナッツ（peanut））、ダイズ１（G. max 1）（ダイズ（soybean））、ダイズ２（G. max 2）（ダイズ（soybean））、ハッショウマメ（M. pruriens）（八升豆）、又はキマメ（C. cajans）（キマメ（pigeon pea））を発現する細胞から調製した可溶化液におけるＩｓｐＳ比生産性の解析により、ラッカセイ（A. hypogaea）及びハッショウマメ（M. pruriens）の有する比生産性が、その他のＩｓｐＳ候補及びウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳよりも高かったことが実証された（図８及び表２）。ダイズ１（G. max 1）ＩｓｐＳ、ダイズ２（G. max 2）ＩｓｐＳ、及びキマメ（C. cajans）ＩｓｐＳを含有する細胞可溶化液は、ＤＭＡＰＰの存在下ではイソプレンを生産しなかった。
【０３０３】
【表４】
2015521036.tif 000018
【０３０４】
ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳを発現する細胞から調製した可溶化液に、基質に対し標準化させた場合のイソプレン生産解析を行うことにより、約６ｍＭ  ＤＭＡＰＰ濃度下で酵素が基質阻害を示したことが実証された（図９）。対照的に、ラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳは、アッセイした高濃度ＤＭＡＰＰでは基質阻害を示さなかった（図９）。ラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳによる基質阻害の欠如は、酵素活性に関しＩｓｐＳにより必要とされる補助因子であるマグネシウム（Ｍｇ２＋）の存在に依存した。ラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳが１０ｍＭ  Ｍｇ２＋で提供された場合、約１０ｍＭ  ＤＭＡＰＰの濃度で基質阻害が観察された（図１０）。しかしながら、１００ｍＭ  Ｍｇ２＋が提供された場合、アッセイした高濃度ＤＭＡＰＰ下では基質阻害は観察されなかった（図１０）。
【０３０５】
精製タンパク質を用い、インビトロでラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳの動態パラメーターを求め、ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ（野生型）、ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体１  ＩｓｐＳ、及びウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体２  ＩｓｐＳと比較した。基質に対し正規化したとき、イソプレン生産の解析により、約１０ｍＭ  ＤＭＡＰＰの存在下でウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳが基質阻害を示すことが実証された（図１１及び表３）。ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体１  ＩｓｐＳ及びウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体２  ＩｓｐＳは、いずれも濃度約１５ｍＭのＤＭＡＰＰで基質阻害を示した（図１１及び表３）。比較すると、ラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳは、それぞれ２．１７、１．６８、及び１．６２のＫｉＤＭＡＰＰ値を有する（表４）ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ（野生型）、ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体１  ＩｓｐＳ又はウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体２  ＩｓｐＳと比較して、３０．６の高いＫｉＤＭＡＰＰ値により濃度約２５ｍＭのＤＭＡＰＰ下で基質阻害を示す（図１１及び表３）。加えて、ラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳは、ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳ（野生型）、ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体１  ＩｓｐＳ、又はウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体２  ＩｓｐＳのＫｍ値よりも優位に高い１８．３のＫｍ値を有しており、かつラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳでは１．８１のＫｃａｔ値が測定された（表４）。
【０３０６】
【表５】
2015521036.tif 000019
【０３０７】
【表６】
2015521036.tif 000020
【実施例３】
【０３０８】
実施例３：ＤＭＡＰＰ毒性を軽減させることによるイソプレン合成酵素候補の解析
細胞内ＤＭＡＰＰ濃度の増加と、ウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳを発現させることで軽減され得る大腸菌（E. coli）の増殖阻害との間には、強い相関がある。理論に束縛されるものではないが、ＩｓｐＳ活性が増強されると、ＤＭＡＰＰは、より迅速にイソプレンへと変換されるようになり、その結果増殖性が更に良好になるはずである。ＩｓｐＳ候補を発現する大腸菌（E. coli）の増殖速度を監視して、細胞内でＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する能力を示す候補を特定した。
【０３０９】
材料及び方法
プラスミドｐＥＷＬ１０３６の構築
大腸菌（E. coli）での発現に関しラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳ遺伝子を最適化し、ＤＮＡ２．０により合成した。生産宿主において使用するための発現コンストラクトを作製するため、プライマーＥＬ１３０４及びＥＬ１３０５に関する製造元のプロトコルにしたがって、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）のＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼを用い、ＤＮＡ２．０発現ベクターからラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳを増幅させた（表５）。プライマーＥＬ１３０６及びＥＬ１３０７によりｐＤＷ３４主鎖を増幅した（表５）。Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＧＥＮＥＡＲＴ  Ｓｅａｍｌｅｓｓ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙキットを使用し、２つのＰＣＲ産物を精製し（Ｑｉａｇｅｎ）、及び組み替えてインビトロで環状産物を形成した。標準的な分子生物学的プロトコルにしたがって、電気穿孔法により生成物をＣＭＰ４５１株に導入した。非選択的ＬＢ培地に細胞を回収し、ＬＡ＋５０μｇ／μＬ  カルベニシリン＋５ｍＭメバロン酸プレートに接種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、ＰＣＲにより形質転換体を選別して、プライマーＥＬ１００５及びＥＬ１３１０によりラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳ−ｍＭＶＫ断片の有無について確認した（表５）。適切な大きさのＰＣＲ産物を含有する形質転換体を、ＬＢ＋５０μｇ／μＬカルベニシリン中で一晩増殖させ、選別のためプラスミドを精製した（Ｑｉａｇｅｎ）。プライマーＥＬ１００４、ＥＬ１００５、ＥＬ１００６、ＥＬ１２３８、ＥＬ１３０８、ＥＬ１３０９、ＥＬ１３１０を用いる配列決定（Ｑｕｉｎｔａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりプラスミドを確認した（表５）。１種のプラスミド、ｐＥＷＬ１０３６を更なる試験のため選別した（図１５及び表６）。
【０３１０】
【表７】
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【０３１１】
【表８】
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【０３１２】
ＥＷＬ１０４３、ＥＷＬ１０４７、ＥＷＬ１０４９、及びＥＷＬ１０５２株の構築
ＥＷＬ１０４３株を構築するため、標準的な分子生物学的プロトコルに従う電気穿孔法により、親株ＣＭＰ１１３３をプラスミドｐＥＷＬ１０３６及びＭＣＭ８２により同時形質転換した。非選択的液体ＬＢに細胞を回収し、振盪しながら３０℃で２時間インキュベートし、ＬＡ＋５０μｇ／μＬカルベニシリン＋５０μｇ／μＬスペクチノマイシンプレートで選別し、３７℃で一晩インキュベートした。カルベニシリン及びスペクチノマイシンに耐性である個々のコロニーをＥＷＬ１０４３株と命名し、更なる試験に使用した（表７）。
【０３１３】
ＥＷＬ１０４７株を構築するため、標準的な分子生物学的プロトコルに従う電気穿孔法により、親株ＣＭＰ１１３３をプラスミドＥＷＬ１０３６及びｐＣＨＬ２７６により同時形質転換した。非選択的液体ＬＢに細胞を回収し、振盪しながら３０℃で２時間インキュベートし、ＬＡ＋５０μｇ／μＬカルベニシリン＋５０μｇ／μＬスペクチノマイシンプレートで選別し、３７℃で一晩インキュベートした。カルベニシリン及びスペクチノマイシンに耐性である個々のコロニーをＥＷＬ１０４７株と命名し、更なる試験に使用した（表７）。
【０３１４】
ＥＷＬ１０４９株を構築するため、標準的な分子生物学的プロトコルに従う電気穿孔法により、親株ＣＭＰ１１３３をプラスミドｐＥＷＬ１０３６及びｐＣＨＬ２７７により同時形質転換した。非選択的液体ＬＢに細胞を回収し、振盪しながら３０℃で２時間インキュベートし、ＬＡ＋５０μｇ／μＬカルベニシリン＋５０μｇ／μＬスペクチノマイシンプレートで選別し、３７℃で一晩インキュベートした。カルベニシリン及びスペクチノマイシンに耐性である個々のコロニーをＥＷＬ１０４９株と命名し、更なる試験に使用した（表７）。
【０３１５】
ＥＷＬ１０５２株を構築すため、標準的な分子生物学的プロトコルに従う電気穿孔法により、親株ＣＭＰ１１３３をプラスミドｐＥＷＬ１０３６及びＭＣＭ１２２５により同時形質転換した。非選択的液体ＬＢに細胞を回収し、振盪しながら３０℃で２時間インキュベートし、ＬＡ＋５０μｇ／μＬカルベニシリン＋５０μｇ／μＬスペクチノマイシンプレートで選別し、３７℃で一晩インキュベートした。カルベニシリン及びスペクチノマイシンに耐性である個々のコロニーをＥＷＬ１０５２株と命名し、更なる試験に使用した（表７）。
【０３１６】
【表９】
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【０３１７】
イソプレン生産株の増殖及び比生産性アッセイ
イソプレン生産株の増殖及びイソプレン生産性アッセイは、次のとおりに実施した：３０ｍＬガラス製試験管において、適切な抗生物質を加えたＬＢ培地で、培養物のグリセロールストックから一晩培養物を調製し、３４℃で増殖させた。翌日、適切な抗生物質を加えたＴＭ３培地により、ＯＤ６００が０．２になるよう培養物を希釈し、Ｂｒｅａｔｈｅ  Ｅａｓｉｅｒメンブレン（Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により密封した４８ウェルブロック（ＶＷＲ）に分注し３４℃下、Ｓｈｅｌ  Ｌａｂ振盪インキュベータ内で６００ｒｐｍで増殖させた。ＯＤ６００が０．４〜０．８に達したときに、適量のＩＰＴＧにより培養物に発現誘導を行った。続いて、発現誘導の１時間後、選別した培養物にメバロン酸を加えた。次に、４〜５時間にわたって、１時間毎にＯＤ及びイソプレンを測定した。標準的な分子生物学的手順に従って、プレートリーダー（ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により、９６ウェルポリスチレンプレート（ＶＷＲ）内のＯＤ６００を測定した。標準的な手順にしたがって、イソプレン測定を実施した。簡潔に述べると、４８ウェルブロックから１００μＬ細菌培養物を取り出し、解析用の９６ウェルガラスブロック（Ｚｉｎｓｓｅｒ）に再分注した。ホイルメンブレンでガラスブロックを密封し、３４℃下、４５０ｒｐｍで３０分間、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）でインキュベートし、培養物を８０℃の水浴で２分間熱殺菌した。ＧＣ−ＭＳによる標準的なイソプレン測定の前に、ガラスブロックを冷却した。生産されたイソプレン重量（ｇ）を、体積、細胞密度、及び時間により分割することにより比生産性を計算した。
【０３１８】
結果
ラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳを発現する細胞（ＥＷＬ１０４３株）において、高濃度のＭＶＡ存在下での細胞増殖及びイソプレン生産を経時的に測定した。ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体１  ＩｓｐＳ発現細胞では、増殖は、試験したいずれのＭＶＡ濃度でも阻害された（図１３；１枚目のパネル）。ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体２  ＩｓｐＳ発現細胞では、増殖は、ＭＶＡが約１５ｍＭを超える濃度で供給された場合に阻害された（図１３；２枚目のパネル）。ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体３  ＩｓｐＳ発現細胞では、増殖は、ＭＶＡが少なくとも約３０ｍＭの濃度で供給された場合に一部阻害され、約４５〜７５ｍＭの濃度では完全に阻害された（図１３；３枚目のパネル）。ラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳ発現細胞では、増殖は、約６０〜７５ｍＭのＭＶＡ濃度では一部阻害されたものの、約１５〜４５ｍＭのＭＶＡ濃度では優位な増殖が見られた（図１３；４枚目のパネル）。細胞増殖のレベルは、ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体１  ＩｓｐＳ、ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体２  ＩｓｐＳ、及びウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体３  ＩｓｐＳと匹敵する有意なレベルのイソプレンを生産するラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳ発現細胞による、イソプレンの比生産性レベルと一致した（図１４）。
【０３１９】
細胞増殖及びイソプレン生産を、ラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳ又はウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体１  ＩｓｐＳを、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）上流ＭＶＡ経路（ＥＷＬ１０４３及びＥＷＬ１０４７）、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）上流ＭＶＡ経路（ＥＷＬ１０４９）又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）上流ＭＶＡ経路（ＥＷＬ１０５２）と共発現する細胞において経時的に測定した。ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体１  ＩｓｐＳ発現細胞では、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）上流ＭＶＡ経路を共発現させた場合に、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）上流ＭＶＡ経路を共発現した場合と比較して増殖は減少した（図１６；左側のパネル）。ラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳ発現細胞では、エンテロコッカス・カッセリフラバス（E. casseliflavus）又はエンテロコッカス・ガリナラム（E. gallinarum）上流ＭＶＡ経路を共発現させることにより、エンテロコッカス・フェカリス（E. faecalis）上流ＭＶＡ経路を共発現する細胞と匹敵する増殖が得られた（図１６；右側パネル）。細胞増殖のレベルは、ウラジロハコヤナギ（P. alba）変異体１  ＩｓｐＳと匹敵する有意なレベルのイソプレンを生産するラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳ発現細胞による、イソプレンの比生産性レベルと一致した（図１７）。
【実施例４】
【０３２０】
実施例４：１５Ｌスケールで流加式培養させた、マメ科植物イソプレン合成酵素を発現する大腸菌（E. coli）による、イソプレン生産
材料及び方法
培地組成（発酵培地１Ｌあたり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、５０％硫酸（１．６ｍＬ）、１０００Ｘ改変微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を共に加え、脱イオン水に溶解させる。この溶液を加熱滅菌する（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量にメスアップした。滅菌及びｐＨ調整後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
【０３２１】
１０００Ｘ改変微量金属溶液（１Ｌあたり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌する。
【０３２２】
ビタミン溶液（１Ｌあたり）：
チアミン塩酸塩（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、Ｄ−パントテン酸（４．８ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を１つずつ脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次に溶液を用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用いろ過滅菌する。
【０３２３】
供給溶液（１ｋｇあたり）：
グルコース（０．５７ｋｇ）、脱イオン水（０．３８ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、及び１００％  Ｆｏａｍｂｌａｓｔ（１０ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。溶液を２５℃に冷却した後、マクロ塩溶液（３．４ｍＬ）、１０００×改変微量金属溶液（０．８ｍＬ）、及びビタミン溶液（６．７ｍＬ）を加えた。
【０３２４】
マクロ塩溶液（１Ｌあたり）：
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、用量に調整し、０．２２μｍのフィルタを用い、ろ過滅菌する。
【０３２５】
ＭＶＡ経路上流（ｐＣＬＵｐｐｅｒ−ＭＣＭ８２）、ＭＶＡ経路下流（ＰＬ．２−ｍＫＫＤｙＩ）及びラッカセイ（A. hypogaea）（ｐＥＴ２４ａ  ＰＴ７−Ａ）由来のイソプレン合成酵素を過剰発現する大腸菌（E. coli）ＢＬ２１細胞を用い、１５Ｌのバイオリアクタで発酵を実施する。
【０３２６】
本実験は、所望の発酵ｐＨ  ７．０及び温度３４℃でのグルコースからのイソプレン生成をモニターするために実施する。大腸菌（E.coli）株を凍結したバイアルを解凍し、トリプトン酵母エキス培地及び適切な抗生物質を入れたフラスコに接種する。５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度が１．０になるまで接種材料を生育させた後、培養物のうち５００ｍＬを１５Ｌのバイオリアクタに接種し、初期槽容量を５Ｌに調整する。
【０３２７】
最高供給速度が６ｇ／分に達するまで、指数関数的な速度で供給溶液を添加する。この時間後、６ｇ／分以下の速度にて、代謝に必要とされる量のグルコースを供給する。５２時間の発酵期間にバイオリアクタに供給したグルコースの総量は６．８ｋｇである。誘導は、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し実施する。細胞のＯＤ５５０が６に達した時に、濃度が１００ｕＭになるようにして反応槽にＩＰＴＧを添加し１回目の誘導を行い、細胞のＯＤ５５０が１００に達した時に、濃度が１００ｕＭになるようにして反応槽にＩＰＴＧを添加し２回目の誘導を行う。
【０３２８】
生物反応器から放出された気体に含まれるイソプレン濃度を、ｉＳＣＡＮ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｓｕｎｄｓｔｒａｎｄ）質量分析計を用い測定する。
【０３２９】
配列
ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳのアミノ酸配列
2015521036.tif 000024
【０３３０】
ＭＥＡウラジロハコヤナギ（P. alba）ＩｓｐＳの核酸配列
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【０３３１】
ラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳのアミノ酸配列
2015521036.tif 000026
【０３３２】
ラッカセイ（A. hypogaea）ＩｓｐＳの核酸配列
2015521036.tif 000027
【０３３３】
ダイズ１（G. max 1）ＩｓｐＳのアミノ酸配列
2015521036.tif 000028
【０３３４】
ダイズ１（G. max 1）ＩｓｐＳの核酸配列
2015521036.tif 000029
【０３３５】
ダイズ２（G. max2）ＩｓｐＳのアミノ酸配列
2015521036.tif 000030
【０３３６】
ダイズ２（G. max 2）ＩｓｐＳの核酸配列
2015521036.tif 000031
【０３３７】
ハッショウマメ（M. pruriens）ＩｓｐＳのアミノ酸配列
2015521036.tif 000032
【０３３８】
ハッショウマメ（M. pruriens）ＩｓｐＳの核酸配列
2015521036.tif 000033
【０３３９】
キマメ（C. cajans）ＩｓｐＳのアミノ酸配列
2015521036.tif 000034
【０３４０】
キマメ（C. cajans）ＩｓｐＳの核酸配列
2015521036.tif 000035
【０３４１】
フユナラ（Q. petraea）ＩｓｐＳのアミノ酸配列
2015521036.tif 000036
【０３４２】
フユナラ（Q. petraea）ＩｓｐＳの核酸配列
2015521036.tif 000037
【０３４３】
プエラリア・モンタナ（P. montana）ＩｓｐＳのアミノ酸配列
2015521036.tif 000038
【０３４４】
プエラリア・モンタナ（P. montana）ＩｓｐＳの核酸配列
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【０３４５】
ｐＣＬ２０１の核酸配列
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ｐＥＷＬ１０３６の核酸配列
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【図１】
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【図２Ａ】
2015521036.tif 000047
【図２Ｂ】
2015521036.tif 000048
【図２Ｃ】
2015521036.tif 000049
【図２Ｄ】
2015521036.tif 000050
【図２Ｅ】
2015521036.tif 000051
【図２Ｆ】
2015521036.tif 000052
【図３Ａ】
2015521036.tif 000053
【図３Ｂ】
2015521036.tif 000054
【図３Ｃ】
2015521036.tif 000055
【図４】
2015521036.tif 000056
【図５】
2015521036.tif 000057
【図６】
2015521036.tif 000058
【図７】
2015521036.tif 000059
【図８】
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【図９】
2015521036.tif 000061
【図１０】
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【図１１】
2015521036.tif 000063
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2015521036.tif 000068
【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015521036.tif 000071
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