(57)【要約】  本明細書は、T細胞エピトープを含みB細胞立体構造エピトープを有さない少なくとも2つのペプチドに結合している多糖を含む非直鎖状糖コンジュゲートであって、ペプチドの1つが内部の糖に結合しており、それによりコンジュゲートが分枝状(すなわち、非直鎖状)構造を有する、前記非直鎖状糖コンジュゲートを対象とする。本明細書はまた、これらのコンジュゲートを製造する方法、ワクチンとしての使用のために組成物中のこれらのコンジュゲートを製剤化する方法、及び莢膜糖に対する免疫応答を誘導するために組成物を使用する方法を提供する。本明細書はまた、ポリオウイルス由来PV1エピトープを含む新規ポリエピトープ担体ペプチドを提供する。新規ポリエピトープ担体ペプチドは、直鎖状糖コンジュゲート及び非直鎖状糖コンジュゲートの両方において使用できる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖及びオリゴ糖から選択される糖を含む非直鎖状糖コンジュゲートを含む組成物であって、前記糖が少なくとも2つの担体ペプチドに結合しており、前記少なくとも2つの担体ペプチドが、少なくとも1つのT細胞エピトープを含み、B細胞立体構造エピトープを有さず、前記少なくとも2つのペプチドの少なくとも1つが前記糖に内部で結合している、前記組成物。
【請求項２】
前記少なくとも2つのペプチドが、直鎖状B細胞エピトープを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記少なくとも2つのペプチドが、直鎖状B細胞エピトープを含まない、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記少なくとも2つのペプチドの少なくとも1つが、PV1 T細胞エピトープを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも2つのペプチドが、同じアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも2つのペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも2つのペプチドが、糖に直接結合している、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記少なくとも2つのペプチドが、リンカーを介して糖に結合している、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも2つのペプチドについての前記リンカーが、同じである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも2つのペプチドについての前記リンカーが、異なっている、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
前記リンカーが直鎖状である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記リンカーが、N-κ-マレイミドウンデカン酸ヒドラジド-TFA(KMUH)又はN-β-マレイミドプロピオン酸ヒドラジド-TFA(BMPH)である、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記糖が担体タンパク質に結合していない、請求項1〜12のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記糖が、糖5個〜35個あたり少なくとも1つのペプチドに、糖5個〜25個あたり少なくとも1つのペプチドに、糖5個〜20個あたり少なくとも1つのペプチドに又は糖7個〜15個あたり少なくとも1つのペプチドに結合している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記糖が、少なくとも3個のペプチド、少なくとも4個のペプチド、少なくとも5個のペプチド、少なくとも6個のペプチド、少なくとも7個のペプチド、少なくとも8個のペプチド、少なくとも9個のペプチド又は少なくとも10個のペプチドに結合している、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記糖が莢膜糖である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記莢膜糖が、髄膜炎菌(N. meningitidis)、肺炎球菌(S. pneumoniae)、化膿性連鎖球菌(S. pyogenes)、S.アガラクチア(S. agalactiae)、インフルエンザ菌(H. influenzae)、緑膿菌(P. aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、フェカリス菌(E. faecalis)、フェシウム菌(E. faecium)、Y.エンテロコリチカ(Y. enterocolitica)、コレラ菌(V. cholerae)又はチフス菌(S. typhi)由来である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記糖がグルカンである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記グルカンが、C.アルビカンス(C. albicans)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)、トリコフィトン・ベルコースム(Trichophyton verrucosum)、ブラストミセス・デルマチチジス(Blastomyces dermatitidis)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)又はフィチウム・インシジオスム(Pythiumn insidiosum)由来である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記糖が、少なくとも10個の糖、少なくとも15個の糖、少なくとも20個の糖、少なくとも25個の糖、少なくとも30個の糖、少なくとも35個の糖又は少なくとも40個の糖を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
アジュバントをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
以下から選択される追加的成分をさらに含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の組成物: 髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)抗原、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)抗原、カタル球菌(Moraxella catarrhalis)抗原、百日咳菌(Bordetella pertussis)抗原、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)抗原、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermis)抗原、破傷風菌(Clostridium tetani)抗原、ジフテリア菌(Cornynebacterium diphtheriae)抗原、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)B型(Hib)抗原、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)抗原、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)抗原、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)抗原、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)抗原、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)抗原、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)抗原、軟性下疳菌(Haemophilus ducreyi)抗原、フェカリス菌(Enterococcus faecalis)抗原、フェシウム菌(Enterococcus faecium)抗原、ピロリ菌(Helicobacter pylori)抗原、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)抗原、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)抗原、大腸菌(E. coli)抗原、炭疽菌(Bacillus anthracis)抗原、ペスト菌(Yersinia pestis)抗原、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原、リケッチア(Rickettsia)抗原、リステリア菌(Listeria monocytogenes)抗原、クラミジア肺炎(Chlamydia pneumoniae)抗原、コレラ菌(Vibrio cholerae)抗原、チフス菌(Salmonella typhi)抗原、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)抗原、ジンジバリス菌(Porphyromonas gingivalis)抗原、シゲラ(Shigella)抗原及びクレブシエラ(Klebsiella)抗原。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物の被験体への投与を含む、免疫応答を誘導する方法。
【請求項２５】
前記被験体がヒトである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫応答が多糖を認識する、請求項２４又は２５に記載の方法。
【請求項２７】
多糖に対する前記免疫応答が、担体タンパク質又は他のT細胞エピトープに結合していない多糖によって誘導される免疫応答よりもさらにT細胞依存性である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
哺乳動物被験体における糖に対する免疫応答の増強を誘導するための、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項２９】
多糖及びオリゴ糖から選択される糖を含む糖コンジュゲートを含む組成物であって、前記糖が、少なくとも2つのT細胞エピトープを含みB細胞立体構造エピトープを有さないペプチドに結合しており、前記T細胞エピトープの少なくとも1つがPV1エピトープである、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2012年10月2日に出願された米国仮特許出願第61/709,093号の利益を主張する。前述の出願の内容全体は、すべての目的について参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、T細胞エピトープを含み、B細胞立体構造エピトープを有さない、少なくとも2つの担体ペプチドに結合している多糖又はオリゴ糖を含む非直鎖状糖コンジュゲートであって、該担体ペプチドの1つが内部の糖に結合している、前記非直鎖状糖コンジュゲートを使用する免疫処置に関する。特に関心があるのは、細菌性及び真菌性感染及び疾患に対するワクチンとしてのそのような組成物の使用である。本発明はまた、少なくとも2つのPV1 T細胞エピトープを含み、B細胞立体構造エピトープを有さない、少なくとも1つの担体ペプチドに結合している多糖又はオリゴ糖を含む直鎖状糖コンジュゲートを使用する免疫処置に関する。
【背景技術】
【０００３】
担体タンパク質は、多糖免疫原への免疫応答を改善するために使用される。そのような担体タンパク質は、幼児における免疫応答の誘導において特に有利であり得、したがって、多数の小児用ワクチンに見られる。推奨される小児用免疫処置スケジュールは、誕生時のB型肝炎ワクチン、6週で開始するジフテリア/破傷風/百日咳(DTaP)、ロタウイルス、インフルエンザ菌(H. influenzae)b型(Hib)コンジュゲート、不活化ポリオウイルス及び肺炎球菌コンジュゲートのすべて、6ヶ月で開始する不活化インフルエンザワクチン、12ヶ月で開始する麻疹/流行性耳下腺炎/風疹(MMR)、水痘及びA型肝炎、並びに2歳以後の髄膜炎菌コンジュゲートを含むかなりの数のワクチンを含む。この一覧の内、次のものは多糖コンジュゲートである: Hibコンジュゲート(例えば、VaxemHib-ジフテリアCRM197コンジュゲート)、肺炎球菌コンジュゲート(例えば、Prevnar-ジフテリアCRM197コンジュゲート)、及び髄膜炎菌コンジュゲート(例えば、Menveo-ジフテリアCRM197コンジュゲート)。
【０００４】
現在の小児用免疫処置スケジュールに新規ワクチンを追加すると、対処すべき2つの潜在的課題に直面する可能性がある。第一に、担体誘導エピトープ抑制(又は「担体抑制」として一般に知られている)の問題、特に担体プライミングから生じる抑制は対処されなければならない。「担体抑制」は、担体タンパク質を用いた動物の予備免疫処置が、その担体上に提示される新規抗原性エピトープに対する後の免疫応答の誘発を妨げる現象である(Herzenberg et al. (1980) Nature 285: 664〜667)。
【０００５】
Schutze et al. (1985) J Immunol 135:2319〜2322に報告されたとおり、いくつかのワクチン抗原が、同じタンパク質成分(コンジュゲートにおいて免疫原として及び/又は担体タンパク質として使用される)を含有する場合、これらの抗原間に干渉が生じる可能性がある。Schutze et al.は、破傷風トキソイド(Tt)担体にコンジュゲートされた抗原に対する免疫応答が、Ttに対する既存の免疫によって抑制されたことを観察した。
【０００６】
Dagan et al.は、Hibコンジュゲートについての担体が、DTPワクチン由来の破傷風抗原と同じであった場合に、DTPワクチンとHibコンジュゲートワクチンとの組合せが悪影響を受けたことを観察した((1998) Infect Immun 66:2093〜2098)。Dagan et al.は、複数のコンジュゲートを含むワクチンを導入する場合は、共通のタンパク質担体による干渉から生じるこの「担体抑制」現象を考慮するべきであると結論付けた。
【０００７】
Schutze et al.及びDagan et al.とは対照的に、Barington et al.は、破傷風トキソイドを用いたプライミングは、続いて投与されたHib-Ttコンジュゲートに対する免疫応答に悪影響を有さないが、母胎免疫の抗Tt抗体を有する患者においては抑制が見られたことを報告した((1994) Infect Immun 62:9〜14)。しかしDi John et al.は、破傷風ワクチン接種から生じる抗Tt抗体を既に有する患者において、Ttベースのペプチドコンジュゲートに対する「エピトープ抑制」作用を観察した((1989) Lancet 2(8677):1415〜8)。
【０００８】
Granoff et al.は、担体としてCRM197(ジフテリア毒素の解毒変異体)を有するコンジュゲートが、ワクチンの一部として(例えば、DTP又はDTワクチンの一部として)以前にジフテリア毒素を受けたことがない小児において無効でありうることを示唆した((1993) Vaccine Suppl 1: S46〜51)。この研究は、D-T免疫処置による担体プライミング効果が、Hibコンジュゲートを用いた次の免疫処置に持続することが見られたGranoff et al. (1994) JAMA 272:1116〜1121においてさらに進展された。
【０００９】
Barington et al. (1993) Infect Immun 61:432〜438において、筆者らは、ジフテリア又は破傷風トキソイド担体タンパク質を用いた予備免疫処置が、これらの担体にコンジュゲートされたHib莢膜糖を用いた次の免疫処置後の抗Hib抗体レベルにおける増大を、IgG1及びIgG2が等しく影響を受けて低減させることを見出した。コンジュゲートの担体部分への応答も同様に抑制された。さらに、1つのコンジュゲートを用いた予備免疫処置が、4週間後に投与された第二のコンジュゲートの担体及び糖部分両方に対する免疫応答に影響することが見られたことから、より一般的な非エピトープ特異的抑制が見られた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Herzenberg et al. (1980) Nature 285: 664〜667
【非特許文献２】Schutze et al. (1985) J Immunol 135:2319〜2322
【非特許文献３】Dagan et al. (1998) Infect Immun 66:2093〜2098
【非特許文献４】Barington et al. (1994) Infect Immun 62:9〜14
【非特許文献５】Di John et al. (1989) Lancet 2(8677):1415〜8
【非特許文献６】Granoff et al. (1993) Vaccine Suppl 1: S46〜51
【非特許文献７】Granoff et al. (1994) JAMA 272:1116〜1121
【非特許文献８】Barington et al. (1993) Infect Immun 61:432〜438
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、「担体抑制」の影響に関する混乱を考慮すると、コンジュゲーションに利用可能である追加的担体タンパク質を有することは、そのような有害な相互作用を低減するために有益である。理想的には、担体タンパク質は、それ自体への抗体応答を誘導することなく、コンジュゲートしたB細胞エピトープ(例えば、多糖)に強いヘルパー効果を誘導するべきである。担体タンパク質に対する代替として、大部分の主要組織適合性複合体クラスII分子の関連において免疫原性であるユニバーサルペプチドエピトープの使用は、この目的に向けての1つの手法である[例えば、Alexander et al. (2000) J Immunol 164:1625〜1633を参照されたい]。そのようなペプチドエピトープは、TT及び他のタンパク質内で同定されている。しかし、単一のエピトープを使用することは、強いT細胞依存性免疫応答を誘導するために典型的には不十分であった。これに対処するために、複数のT細胞エピトープを含むがB細胞立体構造エピトープを欠いているポリエピトープ担体ペプチドが、個々の糖及び異なる病原体由来の糖の組合せの両方のための担体として特に有用であることが実証された。さらに、免疫原性応答は、病原性エピトープの数に比例して増大することが予測されている一方で、これらのポリエピトープ担体ペプチドに対して、それらがいくつかの公知の病原性エピトープを含んでいても、低い免疫原性応答が見られるだけであることが発見されている[例えば、米国特許出願公開第2008/0260773号を参照されたい]。
【００１２】
第二に、既に過密な免疫処置スケジュールを考慮すると、免疫処置スケジュールへの新たなワクチンの追加は、有害な相互作用の可能性のためだけでなく、単に必要とされる別個の注射の数のためにも、ますます困難になっている。したがって、DtaP又はMMRワクチンなどのように1回の注射にワクチンを組合せられるようにすることは有利である。多糖免疫原への免疫応答を、それ自体への免疫応答を誘導することなく増強できる追加的担体ペプチドを有することは有益である。なぜならば、既存のワクチンを伴う新規糖ベースワクチンの単一の注射可能な組成物への追加を簡易にしうるからである。
【００１３】
多糖免疫原へのコンジュゲーションのためのさらなる及び/又はより良い担体ペプチド、並びに多糖の長さに沿ってペプチドエピトープを分布させるためのコンジュゲーションのより良い様式を提供することが、本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一実施形態では、本開示は、少なくとも2つの担体ペプチドに結合している、多糖及びオリゴ糖から選択される糖を含む非直鎖状糖コンジュゲートを含む組成物であって、前記少なくとも2つの担体ペプチドのそれぞれが、少なくとも1つのT細胞エピトープを有するが、B細胞立体構造エピトープを有さず、前記少なくとも2つのペプチドの少なくとも1つが内部で前記糖に結合している、前記組成物を提供する。特定の例では、少なくとも2つのペプチドは、直鎖状B細胞エピトープを含む。別の例では、少なくとも2つのペプチドは、直鎖状B細胞エピトープを含まない。先の例のいずれかと組み合わされてよいいくつかの例では、少なくとも2つのペプチドの少なくとも1つは、PV1 T細胞エピトープを有する。PV1 T細胞エピトープを有する特定の例では、アミノ酸配列は、場合により1個、2個、3個、4個又は5個の単一アミノ酸変更を有する、配列番号9を含む。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、少なくとも2つのペプチドは、同じアミノ酸配列又は異なるアミノ酸配列を有する。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、少なくとも2つのペプチドは糖に直接結合しているか、又は少なくとも2つのペプチドはリンカーを介して糖に結合している。リンカーを伴う前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、少なくとも2つのペプチドのためのリンカーは同じであるか、又は異なっている。リンカーを伴う前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、リンカーは、直鎖状(例えば、炭素原子1個〜10個(例えば、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)を有する直鎖アルキル)である。リンカーを伴う前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、リンカーは、N-κ-マレイミドウンデカン酸ヒドラジド-TFA(KMUH)又はN-β-マレイミドプロピオン酸ヒドラジド-TFA(BMPH)である。前述の例と組み合わされてよい特定の例では、糖は、担体タンパク質に結合していない。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、糖は、糖5個〜35個あたり少なくとも1つのペプチド、糖5個〜25個あたり少なくとも1つのペプチド、糖5個〜20個あたり少なくとも1つのペプチド又は糖7個〜15個あたり少なくとも1つのペプチドに結合している。前述の例と組み合わされてよい特定の例では、糖は、少なくとも3個のペプチド、少なくとも4個のペプチド、少なくとも5個のペプチド、少なくとも6個のペプチド、少なくとも7個のペプチド、少なくとも8個のペプチド、少なくとも9個のペプチド又は少なくとも10個のペプチドに結合している。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、糖は、髄膜炎菌(N. meningitidis)、肺炎球菌(S. pneumoniae)、化膿性連鎖球菌(S. pyogenes)、S.アガラクチア(S. agalactiae)、インフルエンザ菌、緑膿菌(P. aeruginosa)、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、フェカリス菌(E. faecalis)、フェシウム菌(E. faecium)、Y.エンテロコリチカ(Y. enterocolitica)、コレラ菌(V. cholerae)又はチフス菌(S. typhi)など由来の莢膜糖である。前述の例と組み合わされてよい他の例では、糖は、C.アルビカンス(C. albicans)、コクシジオイデス・イミチス(Coccidioides immitis)、トリコフィトン・ベルコースム(Trichophyton verrucosum)、ブラストミセス・デルマチチジス(Blastomyces dermatitidis)、クリプトコッカス・ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、ヒストプラズマ・カプスラーツム(Histoplasma capsulatum)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス(Paracoccidioides brasiliensis)又はフィチウム・インシジオスム(Pythiumn insidiosum)など由来のグルカンである。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、糖は、少なくとも10個の糖、少なくとも15個の糖、少なくとも20個の糖、少なくとも25個の糖、少なくとも30個の糖、少なくとも35個の糖、少なくとも40個の糖、少なくとも50個の糖、少なくとも75個の糖又は少なくとも100個の糖を含む。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、組成物は、薬学的に許容される担体も含む。前述の例と組み合わされてよい特定の例では、組成物は、アジュバントも含む。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、組成物はまた、以下から選択される追加的成分を含む: 髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)抗原、肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)抗原、化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)抗原、カタル球菌(Moraxella catarrhalis)抗原、百日咳菌(Bordetella pertussis)抗原、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)抗原、表皮ブドウ球菌(Staphylococcus epidermis)抗原、破傷風菌(Clostridium tetani)抗原、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)抗原、インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)B型(Hib)抗原、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)抗原、レジオネラ・ニューモフィラ(Legionella pneumophila)抗原、ストレプトコッカス・アガラクチア(Streptococcus agalactiae)抗原、淋菌(Neisseria gonorrhoeae)抗原、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis)抗原、梅毒トレポネーマ(Treponema pallidum)抗原、軟性下疳菌(Haemophilus ducreyi)抗原、フェカリス菌(Enterococcus faecalis)抗原、フェシウム菌(Enterococcus faecium)抗原、ピロリ菌(Helicobacter pylori)抗原、スタフィロコッカス・サプロフィチカス(Staphylococcus saprophyticus)抗原、エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)抗原、大腸菌(E. coli)抗原、炭疽菌(Bacillus anthracis)抗原、ペスト菌(Yersinia pestis)抗原、結核菌(Mycobacterium tuberculosis)抗原、リケッチア抗原、リステリア菌(Listeria monocytogenes)抗原、クラミジア肺炎(Chlamydia pneumoniae)抗原、コレラ菌(Vibrio cholerae)抗原、チフス菌(Salmonella typhi)抗原、ボレリア・ブルグドルフェリ(Borrelia burgdorferi)抗原、ジンジバリス菌(Porphyromonas gingivalis)抗原、シゲラ(Shigella)抗原及びクレブシエラ(Klebsiella)抗原。
【００１５】
本開示の別の態様は、前述の態様の任意の種々の例の組成物の被験体への投与を含む、免疫応答を誘導する方法を含む。特定の例では、被験体はヒトである。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、免疫応答は糖を認識する。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、糖に対する免疫応答は、担体タンパク質又は他のT細胞エピトープに結合していない糖によって誘導される免疫応答よりもさらにT細胞依存性である。
【００１６】
本開示の別の態様は、哺乳動物被験体において糖に対する増強された免疫応答を誘導するための、前述の態様の任意の種々の例の組成物の使用を含む。特定の例では、哺乳動物被験体はヒトである。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、増強された免疫応答は糖を認識する。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、糖に対する増強された免疫応答は、担体タンパク質又は他のT細胞エピトープに結合していない糖によって誘導される免疫応答よりもさらにT細胞依存性である。
【００１７】
本開示のさらに別の態様は、多糖及びオリゴ糖から選択される糖を含む糖コンジュゲートを含む組成物であって、前記糖は、少なくとも2つのT細胞エピトープを含みB細胞立体構造エピトープを有さないペプチドに結合しており、T細胞エピトープの少なくとも1つがPV1エピトープである、前記組成物を含む。特定の例では、ペプチドは、直鎖状B細胞エピトープを含む。別の例では、ペプチドは、直鎖状B細胞エピトープを含まない。先の例のいずれかと組合されてよいいくつかの例では、PV1エピトープのアミノ酸配列は、場合により1個、2個、3個、4個又は5個の単一アミノ酸変更を有する、配列番号9を含む。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、ペプチドは糖に直接結合しているか、又はペプチドはリンカーを介して糖に結合している。リンカーを伴う前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、リンカーは、同じであるか、又は異なっている。リンカーを伴う前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、リンカーは、直鎖状(例えば、炭素原子1個〜10個(例えば、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)を有する直鎖アルキル)である。リンカーを伴う前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、リンカーは、N-κ-マレイミドウンデカン酸ヒドラジド-TFA(KMUH)又はN-β-マレイミドプロピオン酸ヒドラジド-TFA(BMPH)である。前述の例と組み合わされてよい特定の例では、糖は、担体タンパク質に結合していない。前述の例と組み合わされてよい特定の例では、ペプチドは、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個又は少なくとも10個のT細胞エピトープを有する。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、糖は、髄膜炎菌、肺炎球菌、化膿性連鎖球菌、S.アガラクチア、インフルエンザ菌、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、フェカリス菌、フェシウム菌、Y.エンテロコリチカ、コレラ菌又はチフス菌由来などの莢膜糖である。前述の例と組み合わされてよい別の例では、糖は、C.アルビカンス、コクシジオイデス・イミチス、トリコフィトン・ベルコースム、ブラストミセス・デルマチチジス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、出芽酵母、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス又はフィチウム・インシジオスム由来などのグルカンである。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、糖は、少なくとも10個の糖、少なくとも15個の糖、少なくとも20個の糖、少なくとも25個の糖、少なくとも30個の糖、少なくとも35個の糖又は少なくとも40個の糖を含む。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、組成物は、薬学的に許容される担体も含む。前述の例と組み合わされてよい特定の例では、組成物は、アジュバントも含む。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、組成物はまた、以下から選択される追加的成分を含む: 髄膜炎菌抗原、肺炎球菌抗原、化膿性連鎖球菌抗原、カタル球菌抗原、百日咳菌抗原、黄色ブドウ球菌抗原、表皮ブドウ球菌抗原、破傷風菌抗原、ジフテリア菌抗原、インフルエンザ菌B型(Hib)抗原、緑膿菌抗原、レジオネラ・ニューモフィラ抗原、ストレプトコッカス・アガラクチア抗原、淋菌抗原、クラミジア・トラコマチス抗原、梅毒トレポネーマ抗原、軟性��疳菌抗原、フェカリス菌抗原、フェシウム菌抗原、ピロリ菌抗原、スタフィロコッカス・サプロフィチカス抗原、エルシニア・エンテロコリチカ抗原、大腸菌抗原、炭疽菌抗原、ペスト菌抗原、結核菌抗原、リケッチア抗原、リステリア菌抗原、クラミジア肺炎抗原、コレラ菌抗原、チフス菌抗原、ボレリア・ブルグドルフェリ抗原、ジンジバリス菌抗原、シゲラ抗原及びクレブシエラ抗原。
【００１８】
本開示の別の態様は、直前の態様の任意の種々の例の組成物の被験体への投与を含む、免疫応答を誘導する方法を含む。特定の例では、被験体はヒトである。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、免疫応答は糖を認識する。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、糖に対する免疫応答は、担体タンパク質又は他のT細胞エピトープに結合していない糖によって誘導される免疫応答よりもさらにT細胞依存性である。
【００１９】
本開示の別の態様は、哺乳動物被験体において糖に対する増強された免疫応答を誘導するための、前述の態様の任意の種々の例の組成物の使用を含む。特定の例では、哺乳動物被験体はヒトである。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、増強された免疫応答は糖を認識する。前述の例と組み合わされてよいいくつかの例では、糖に対する増強された免疫応答は、担体タンパク質又は他のT細胞エピトープに結合していない糖によって誘導される免疫応答よりもさらにT細胞依存性である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】糖コンジュゲートワクチンについて提案された作用機構を示す図である。
【図２】糖コンジュゲートワクチンについて新たに提案された作用機構を示す図である。
【図３】下に記載の実施例において用いられたコンジュゲートのため及び直鎖状コンジュゲートのための好ましい結合点を示す図である。
【図４】2種類の糖ペプチド: オリゴMenCコンジュゲートのための直鎖状コンジュゲート構造及びポリMenC conjのための非直鎖状コンジュゲート構造を示す図である。
【図５】直鎖状オリゴMenC-ペプチドコンジュゲートを調製するための化学的スキームを示す図である。(a)1の5mg/mlでの10％ DMSO 90％ MeOH溶液中、最終濃度50mM酢酸アンモニウム、最終濃度10mMシアノ水素化ホウ素ナトリウム、50℃、24〜72時間。(b)アミノ基について10当量のスルホ-EMCSリンカー、5当量のEt3N、DMSO:H2O(9:1)。(c)1×PBS中、3当量のペプチド、ペプチドについて3mg/ml。
【図６】マレイミド基導入後のオリゴMenCの1H NMRスペクトルを示す図である。
【図７】ペプチド単独(レーン2)と比較した、糖ペプチドオリゴMenC-ペプチド(レーン3)のSDS-PAGE 4〜12％ Bis-Tris(ランニングバッファーとしてMES)を示す図である。実施例に記載のすべてのコンジュゲートは、類似のSDS-PAGEプロファイルを有した。
【図８】ペプチドMet6(青線)及びオリゴMenC(赤線)と比較した、オリゴMenC-Met6 conj(ピンク線)のRP-HPLC溶出プロファイルを示す図である(Jupiter C18カラム、0.1％TFAを含むH2O-ACNの勾配、95％ H2O及び5％ACNから45％ ACNまで、流速0.1ml/分)。実施例に記載のすべてのコンジュゲートは、類似のプロファイルを示した。
【図９】ポリMenC-ペプチドコンジュゲートを調製するために使用された化学的プロセスを示す図である。(a)MES緩衝液pH4.56中、20％EDAC、20％KMUH、糖について2mg/ml、(b)1×PBS pH7中、導入されるリンカーのモルに関して3当量のペプチド、ペプチドについて3mg/ml。
【図１０】KMUHでの誘導体化後の多糖の代表的な1H NMRスペクトルを示す図であり、糖鎖1モルあたり約35molのマレイミド基の組み込みを示している。
【図１１】ペプチド単独(レーン2)と比較した、ポリMenC-ペプチドコンジュゲート(レーン3)の代表的なSDS-PAGE 4〜12％ Bis-Tris(ランニングバッファーとしてMESを用いた)を示す図である。すべてのコンジュゲートは類似の傾向を示した。
【図１２】ペプチドMet6単独(青線)及びポリMenC単独(黒線)と比較した、ポリMenC-Met6コンジュゲート(ピンク線)のRP-HPLCプロファイルの代表的なセットを示す図である。Jupiter C18カラム、0.1％TFAを含むH2O-ACNの勾配、95％ H2O及び5％ACNから45％ ACNまで、流速0.1ml/分。すべてのコンジュゲートは類似のプロファイルを示した。
【図１３】ポリMenC-Met6 conj(赤線)と比較した、オリゴMenC-Met6 conj(ピンク線)のRP-HPLCプロファイルを示す図であり、C18カラムとの異なる相互作用を示している。Jupiter C18カラム、0.1％TFAを含むH2O-ACNの勾配、95％ H2O及び5％ ACNから45％ ACNまで、流速0.1ml/分。すべてのコンジュゲートは類似のプロファイルを示した。
【図１４】ELISAアッセイ(ペプチドでコーティングしたプレート)によって決定され、GMT(95％信頼区間での幾何平均)として、カットオフOD 0.2で報告された、Met6及びFbaペプチドに対するポリMenCコンジュゲートによって誘導されたIgG力価を示す図である。
【図１５】ELISAアッセイ(糖ペプチドでコーティングしたプレート)によって決定され、GMT(95％信頼区間での幾何平均)としてカットオフOD 0.2で報告された、各糖コンジュゲートに対するポリMenCコンジュゲートによって誘導されたIgG力価を示す図である。
【図１６】KMUHリンカーでの誘導体化後の多糖の代表的な1H NMRスペクトルを示す図であり、糖約16molあたり1molのリンカーの導入を示している。
【図１７】ペプチド単独(レーン2)と比較した、ポリMenC-ペプチドコンジュゲート(レーン3)の代表的なSDS-PAGE 4〜12％ Bis-Tris(ランニングバッファーとしてMESを用いた)を示す図である。すべてのコンジュゲートは類似の傾向を示した。
【図１８】ポリMenC-ペプチドコンジュゲートを調製するために使用されたプロセスを示す図である。(a)MES緩衝液pH4.56中、20％EDAC、2.3当量KMUHリンカー、糖について2mg/ml、(b)1×PBS pH7中、導入されるリンカーのモルに関して3当量のペプチド、ペプチドについて3mg/ml。
【図１９】遊離ペプチド(青線)及び多糖単独(黒線)と比較した、ポリMenc-PV1 N末端コンジュゲート(ピンク線)のHPLCプロファイルを示す図である。HPLC-SEC、Superdexペプチドカラム、20mM NaPi、250mM NaCl pH7、0.05ml/分、定組成(isocratic)条件。すべてのコンジュゲートは類似のプロファイルを示した。
【図２０】BMPHリンカーでの誘導体化後の多糖の代表的な1H NMRスペクトルを示す図であり、糖約17molあたり1molのリンカーの導入を示している。
【図２１】ペプチド単独(レーン2)と比較した、ポリMenC-ペプチドコンジュゲート(レーン3)の代表的なSDS-PAGE 4〜12％ Bis-Tris(ランニングバッファーとしてMESを用いた)を示す図である。すべてのコンジュゲートは類似の傾向を示した。
【図２２】ポリMenC-ペプチドコンジュゲートを調製するために使用されたプロセスを示す図である。(a)MES緩衝液pH4.56中、20％EDAC、2.3当量BMPHリンカー、糖について2mg/ml、(b)PBS pH7中、導入されるリンカーのモルに関して3当量のペプチド、ペプチドについて3mg/ml。
【図２３】ペプチド混合物(レーン2)と比較した、ポリMenC-MIXペプチドコンジュゲート(レーン3)の代表的なSDS-PAGE 4〜12％ B-T(ランニングバッファーMESを用いた)を示す図である。
【図２４】ポリMenC-MIXペプチドコンジュゲートを調製するために使用されたプロセスを示す図である。(a)MES緩衝液pH4.56中、20％EDAC、2.3当量BMPHリンカー、糖について2mg/ml、(b)各ペプチドの1当量の混合物(リンカーのモルに関して全量で3当量)、PBS pH7。
【図２５】Fbaペプチドの1H NMRスペクトルを示す図である。
【図２６】Met6ペプチドの1H NMRスペクトルを示す図である。
【図２７】Hpw1ペプチドの1H NMRスペクトルを示す図である。
【図２８】Fba、Hpw1及びMet6に比1:1:2で結合したコンジュゲートの1H NMRを示す図である。
【図２９】第二のセットの免疫原性アッセイにおいて比較したさまざまなコンジュゲートを示す図である。
【図３０】ELISAアッセイによって決定され、GMT(95％信頼区間での幾何平均)としてカットオフOD1で報告された、CPS髄膜炎菌血清群Cに対するポリMenCコンジュゲートによって誘導されたIgG力価を示す図である。
【図３１】ELISAアッセイによって決定され、GMT(95％信頼区間での幾何平均)としてカットオフOD1で報告された、ポスト2(青)及びポスト3(赤)で髄膜炎菌多糖血清群Cに対するポリMenC-PV1 C及びN末端コンジュゲートによって誘導されたIgG力価を示す図である。
【図３２】ELISAアッセイによって決定され、GMT(95％信頼区間での幾何平均)としてカットオフOD1で報告された、IgG力価(緑)と比較した、髄膜炎菌多糖血清群Cに対するポリMenC-PV1 C及びN末端コンジュゲートによって誘導されたIgM力価(赤)を示す図である。
【図３３】ELISAアッセイによって決定され、GMT(95％信頼区間での幾何平均)としてカットオフOD1で報告された、それぞれのペプチドに対するポリMenC-PV1 C及びN末端コンジュゲートによって誘導されたIgG力価を示す図である。
【図３４】髄膜炎菌多糖血清群C、W-135及びYの反復単位の化学的構造を示す図である。
【図３５】ポリMenW及びポリMenYを有するOvaペプチドのコンジュゲートを調製するために使用された化学プロセスを示す図である。(a)糖について10mg/mlを得るために、10mM NaPi pH7中、0.1M NaIO4、30％シアル酸モル、2時間、室温、暗所、(b)50mM NaPi 200mM NaCl pH7中、NaBH3CN(2当量)、Ovaペプチド(1.5当量)、5日間、37℃。
【図３６】シアル酸(30％)の酸化後の髄膜炎菌多糖血清群W-135の1H NMRスペクトルを示す図である。
【図３７】シアル酸(30％)の酸化後の髄膜炎菌多糖血清群Yの1H NMRスペクトルを示す図である。
【図３８】Ovaペプチド(レーン2)と比較した、コンジュゲート12(レーン3)及び13(レーン4)の代表的なSDS-PAGE 4〜12％ Bis-Tris(ランニングバッファーとしてMES)を示す図である。
【図３９】ポリMenC-Ovaペプチドコンジュゲートを調製するために使用された化学プロセスを示す図である。(a)MES緩衝液pH4.56中、20％EDAC、2.3当量KMUHリンカー又はBMPHリンカー、糖について2mg/ml、(b)1×PBS pH7中、導入されるリンカーのモルに関して3当量のOvaペプチドGGC、ペプチドについて3mg/ml。
【図４０】コンジュゲート14及び15のSDS-PAGE 4〜12％ Bis-Tris(ランニングバッファーとしてMES)を示す図である。
【図４１】ポリMenC-Ovaペプチドコンジュゲートを調製するために使用された化学プロセスを示す図である。(a)30mM MES pH6中、1当量EDAC、1当量スルホNHS、1当量Ovaペプチド、ペプチドについて3mg/ml。
【図４２】コンジュゲートポリMenC-Ovap 16のSDS-PAGE 4〜12％ Bis-Tris(ランニングバッファーとしてMES)を示す図である。
【図４３】ELISAアッセイによって決定され、GMT(95％信頼区間での幾何平均)としてカットオフOD1で報告された、髄膜炎菌多糖血清群Cに対するポリMenC-Ovaペプチドコンジュゲートによって誘導されたIgG力価を示す図である。
【図４４】ELISAアッセイによって決定され、GMT(95％信頼区間での幾何平均)としてカットオフOD1で報告された、ポスト2(青)及びポスト3(ピンク)で髄膜炎菌多糖血清群Cに対するポリMenC-Ovaペプチドコンジュゲートによって誘導されたIgG力価を示す図である。
【図４５】ELISAアッセイによって決定され、GMT(95％信頼区間での幾何平均)としてカットオフOD1で報告された、髄膜炎菌多糖血清群W及びYそれぞれに対するポリMenW-Ovaペプチド及びポリMenY-Ovaペプチドポリコンジュゲートによって誘導されたIgG力価を示す図である。
【図４６】ELISAアッセイによって決定され、GMT(95％信頼区間での幾何平均)としてカットオフOD1で報告された、Ovaペプチドに対するポリMenC- W- Y-Ovaペプチドコンジュゲートによって誘導されたIgG力価を示す図である。
【図４７】ELISAアッセイによって決定され、GMT(95％信頼区間での幾何平均)としてカットオフOD1で報告された、さまざまなIgGサブタイプについての髄膜炎菌多糖血清群Cに対するポリMenC-PV1 C及びN末端コンジュゲートによって誘導された力価を示す図である。
【図４８】ELISAアッセイによって決定され、阻害百分率として報告された、血清群C由来天然髄膜炎菌多糖と、(A)ポリMenCコンジュゲート(オレンジ線)、(B)N末端リンカーを有するPV1エピトープ単独(青)、及び(C)ラミナリン糖陰性対照(緑)との間の競合的ELISAを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
純粋な多糖及びオリゴ糖は、しばしば不十分な免疫原であり、したがって担体ペプチドへのコンジュゲートをしばしば必要とする。多糖が十分な免疫原性を有する場合であっても、担体タンパク質へのコンジュゲーションは免疫原性を増強でき、送達される必要がある多糖が少なくなる。さらに、幼児における防御効果のために、担体ペプチドへのコンジュゲーションがしばしば必要である。糖質抗原の免疫原性を増強するための担体タンパク質へのコンジュゲーションの使用は、周知であり(例えば、Lindberg (1999) Vaccine 17 Suppl 2:S28〜36、Buttery & Moxon (2000) J R Coll Physicians Lond 34: 163〜8、Ahmad & Chapnick (1999) Infect Dis Clin North Am 13: 113〜33, vii、Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47:563〜567、EP-B-0477508、米国特許第5,306,492号、WO98/42721、Dick et al. in Conjugate Vaccines (eds. Cruse et al.) Karger, Basel, 1989, Vol. 10, 48〜1 14、Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego CA (1996)などを参照されたい); 特に小児用ワクチンで使用される(Ramsay et al. (2001) Lancet 357(9251):195〜6)。
【００２２】
担体タンパク質に対する代替として、大部分の主要組織適合性複合体クラスII分子の関連において免疫原性であるユニバーサルペプチドエピトープの使用が開発されている[例えば、Alexander et al. (2000) J Immunol 164:1625〜1633を参照されたい]。そのようなペプチドエピトープは、TT及び他のタンパク質において同定されている。しかし、単一のエピトープを使用することは、強いT細胞依存性免疫応答を誘導するためには典型的には不十分であった。これに対処するために、複数のT細胞エピトープを含むが、B細胞立体構造エピトープを欠いている、ポリエピトープ担体ペプチドが、個々の糖及び異なる病原体由来の糖の組合せの両方のための担体として特に有用であることが実証された。さらに、免疫原性応答は病原性エピトープの数に比例して増大することが予測されている一方で、これらのポリエピトープ担体ペプチドが、いくつかの公知の病原性エピトープを含んでいても、せいぜい、それら自体に対して低い免疫原性応答を誘導しただけであることが発見されている[例えば、米国特許出願公開第2008/0260773号を参照されたい]。したがって、直鎖状配置にある複数のT細胞エピトープを含んでも、ポリエピトープ担体ペプチドは、それら自体に対する免疫応答を誘導することなく、それらがコンジュゲートしている糖に対する免疫応答だけを誘導する。
【００２３】
本発明者らは、少なくとも1つのエピトープが内部の糖に結合して非直鎖状コンジュゲートを形成するように、糖抗原が、糖にコンジュゲートした少なくとも2つのペプチドエピトープを有する場合に、単一のペプチドエピトープが糖、抗原に対する強いT細胞依存性免疫応答を誘導することにおいて有効でありうることを驚くべきことに見出した。
【００２４】
したがって、本発明の態様は、それぞれが少なくとも1つのT細胞エピトープを含む、少なくとも2つの担体ペプチドにコンジュゲートした多糖又はオリゴ糖、及び場合によりアジュバント(下に定義のとおり)を含む糖コンジュゲートを提供する。
【００２５】
したがって、本発明の追加的態様は、その1つがPV1エピトープである、少なくとも2つのT細胞エピトープを含む少なくとも1つの担体ペプチドにコンジュゲートした多糖又はオリゴ糖、及び場合によりアジュバント(下に定義のとおり)を含む糖コンジュゲートを提供する。
【００２６】
担体ペプチドは、直接又はリンカーを介して糖に共有結合でコンジュゲートしてよい。任意の好適なコンジュゲーション反応は、必要に応じて任意の好適なリンカーと共に使用できる。
【００２７】
担体ペプチドへの糖の結合は、好ましくは-SH基を通じて、好ましくはN-若しくはC末端で又はN-若しくはC末端の近くで、例えばシステイン残基(複数可)の側鎖(複数可)を通じてである。結合は、代替的に-NH2基を通じて、例えば担体ペプチド中のリジン残基(複数可)又はアルギニン残基(複数可)の側鎖(複数可)を通じてであってよい。多糖が遊離アルデヒド基を有する場合、この基は、担体ペプチド中のアミンと反応し、還元アミノ化によってコンジュゲートを形成することができる。代替的に、多糖は、リンカー分子を介して担体タンパク質に結合してもよい。
【００２８】
糖は、典型的にはコンジュゲーションの前に活性化又は官能基化される。活性化は、例えばCDAP(1-シアノ-4-ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート)などのシアニル化試薬を含みうる。他の好適な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン(norborane)、p-ニトロ安息香酸、N-ヒドロキシスクシンイミド、S-NHS、EDC、TSTUを使用する(例えばWO98/42721の序論を参照されたい)。
【００２９】
担体ペプチドへの直接結合は、例えば米国特許第4,761,283号及び米国特許第4,356,170号に記載されるように、糖の酸化に続く担体ペプチドとの還元アミノ化を含みうる。
【００３０】
リンカー基を介した結合は、任意の公知の手順、例えば米国特許第4,882,317号及び米国特許第4,695,624号に記載の手順を使用して作られてよい。典型的にはリンカーは、糖のアノマー炭素を介して結合される。結合の好ましい種類はアジピン酸リンカーであり、これは、遊離-NH2基(例えば、アミノ化によって多糖に導入される)をアジピン酸とカップリングし(例えば、ジイミド活性化を使用して)、次いで得られた糖-アジピン酸中間体にタンパク質をカップリングすることによって形成されうる(例えば、EP-B-0477508, Mol. Immunol, (1985) 22, 907〜919及びEP-A-0208375を参照されたい)。結合の同様の好ましい種類はグルタル酸リンカーであり、これは、遊離-NH基を同じ方法でグルタル酸とカップリングすることによって形成されうる。アジピン酸及びグルタル酸リンカーは、直接、すなわち遊離基、例えば遊離-NH基の多糖への先行する導入を伴わない、多糖へのカップリングに続く、得られた糖-アジピン酸/グルタル酸中間体へのタンパク質のカップリングによっても形成されうる。結合の別の好ましい種類はカルボニルリンカーであり、これは、修飾された多糖の遊離ヒドロキシル基のCDIとの反応(Bethell G.S. et al. (1979) J Biol Chem 254, 2572〜4及びHearn M.T.W. (1981) J. Chromatogr 218, 509〜18)に続く、カルバミン酸結合を形成するためのタンパク質との反応によって形成されうる。他のリンカーは、β-プロピオンアミド(WO00/10599)、ニトロフェニル-エチルアミン(Gever et al. (1979) Med Microbiol Immunol 165, 171〜288)、ハロアシルハロゲン化物(米国特許第4,057,685号)、グリコシド結合(米国特許第4,673,574号、同第4,761,283号及び同第4,808,700号)、6-アミノカプロン酸(米国特許第4,459,286号)、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオン酸(SPDP)(米国特許第5,204,098号)、アジピン酸ジヒドラジド(ADH)(米国特許第4,965,338号)、C4〜C12成分(米国特許第4,663,160号)などを含む。カルボジイミド縮合も使用できる(WO2007/000343)。
【００３１】
二官能性リンカーは、糖中のアミン基(例えばアミノ化によって多糖に導入される)にカップリングするための第一の基、及び担体にカップリングするための(典型的には担体中のアミンにカップリングするための)第二の基を提供するために使用しうる。代替的に、第一の基は、直接、すなわち基、例えばアミン基の多糖への先行する導入を伴わずに多糖にカップリングできる。
【００３２】
したがって、いくつかの実施形態では、二官能性リンカー中の第一の基は、多糖上のアミン基(-NH2)と反応できる。この反応は、典型的には、アミンの水素の求電子置換を含む。他の実施形態では、二官能性リンカー中の第一の基は、多糖と直接反応できる。両方のセットの実施形態では、二官能性リンカー中の第二の基は、典型的には担体ペプチド上のアミン基と反応できる。この反応は、アミンの求電子置換を再び典型的には含む。
【００３３】
多糖及び担体タンパク質の両方との反応がアミンを含む場合、二官能性リンカーを使用することは好ましい。例えば、式X-L-Xのホモ二官能性リンカーは: 2つのX基が互いに同じであり、アミンと反応できる場合、及びLがリンカー中の結合部分である場合に使用しうる。同様に、式X-L-Xのヘテロ二官能性リンカーは: 2つのX基が異なり、アミンと反応できる場合、及びLがリンカー中の結合部分である場合に使用しうる。好ましいX基はN-オキシスクシンイミドである。Lは、好ましくは式L'-L2-L'を有し、式中、L'はカルボニルである。好ましいL2基は炭素原子1個〜10個(例えば、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)を有する直鎖アルキル、例えば-(CH2)4-又は-(CH2)3-である。
【００３４】
先行する段落において記載の二官能性リンカーにおける使用のための他のX基は、ノルボラン、p-ニトロ安息香酸及びスルホ-N-ヒドロキシスクシンイミドなど、HO-L-OHと組み合わされた場合にエステルを形成するものである。
【００３５】
本発明での使用のためのさらなる二官能性リンカーは、アクリロイルハロゲン化物(例えば塩化物)及びハロアシルハロゲン化物を含む。
【００３６】
リンカーは、多糖へのカップリングの際に多糖にモル過剰量で一般に添加される。
【００３７】
コンジュゲーション後、遊離の及びコンジュゲートした糖は分離されうる。多数の好適な方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿、疎水性クロマトグラフィー、接線限外ろ過(tangential ultrafiltration)、ダイアフィルトレーションなどがある(Lei et al. (2000) Dev Biol (Basel) 103:259〜264及びWO00/38711も参照されたい)。接線流限外ろ過は好ましい。
【００３８】
コンジュゲート中の糖部分は、下に定義(糖免疫原についての節を参照されたい)のとおり高分子量、低分子量又は中間の分子量の多糖であってよい。オリゴ糖は、典型的にはコンジュゲーションの前にサイズ分類される。
【００３９】
担体ペプチド-糖コンジュゲートは、好ましくは、水及び/又は生理的緩衝液に可溶性である。
【００４０】
いくつかの糖について、免疫原性は、多糖と担体タンパク質との間にスペーサーがある場合に改善しうる。この関連で「スペーサー」は、単一の共有結合よりも長い部分である。このスペーサーは、上に記載のとおりリンカー(例えば、KMUHリンカー)であってよい。代替的に、それは多糖とリンカーとの間に共有結合している部分であってよい。典型的にはその部分は、リンカー又は担体へのカップリングの前に多糖に共有結合される。例えば、スペーサーは、部分Yであってよく、ここでYは炭素原子1個〜15個(例えば、C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15)、典型的には炭素原子6個〜12個(例えば、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12)を有する直鎖アルキルを含む。本発明者らは、炭素原子10個を有する直鎖アルキル(すなわち、-(CH2)10)が特に好適であり、より短い鎖(例えば、-(CH2)2)よりも大きな免疫原性を提供しうることを見出した。典型的には、Yは、多糖のアノマー炭素に、通常-O-結合を介して結合される。しかし、Yは、多糖の他の部分に及び/又は他の結合を介して結合してもよい。Yの他方の末端は、任意の好適な結合によってリンカーに結合される。典型的には、Yは、上に記載のとおり二官能性リンカーへの結合を促進するためにアミン基で終わる。したがって、これらの実施形態では、Yは、-NH-結合によってリンカーに結合される。したがって、下記の構造を有するコンジュゲートは、本発明における使用のために具体的に想定され: ここで、n+2は2〜60の範囲にあり、例えば10〜50の間又は2〜40の間である。好ましくは、n+2は、25〜30又は11〜19、例えば13〜17の範囲にある。本発明者らは、n+2=15が好適であることを見出した。Yは上に記載のとおりである。
【００４１】
一態様では、本発明は、担体ペプチド(複数可)にコンジュゲートした糖を作製する方法であって、コンジュゲーションのステップが、>10mMリン酸塩を含むリン酸緩衝液中で実行される、前記方法、及び本方法によって得られるコンジュゲートを提供する。本発明者らは、リン酸ナトリウムが緩衝液のためのリン酸塩の好適な形態であることを見出した。緩衝液のpHは、7.0〜7.5の間、特に7.2に調整されてよい。コンジュゲーションのステップは、典型的には20〜200mMの間、例えば50〜150mMのリン酸塩を含むリン酸緩衝液中で実行される。特に、本発明者らは、90〜110mM、例えば約100mMリン酸塩を含むリン酸緩衝液が好適であることを見出した。コンジュゲーションのステップは、通常、室温で実行される。同様に、コンジュゲーションのステップは、通常、室内圧で実行される。典型的には、糖は、上に記載のとおりコンジュゲーションのステップの前にリンカーに結合される。特に、糖は、上に記載のとおり1つ以上の二官能性リンカーに結合されてよい。リンカー(複数可)の遊離末端は、担体ペプチド(複数可)へのコンジュゲーションを促進する基を含んでもよい。例えば、本発明者らは、リンカーの遊離末端がエステル基、例えばN-ヒドロキシスクシンイミドエステル基を含んでよいことを見出した。
【００４２】
本明細書に開示の糖コンジュゲートは、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。
【００４３】
本明細書に開示の糖コンジュゲートは、アジュバントをさらに含むことができる。アジュバントは、下に記載のアジュバントの1種以上を含むことができる。
【００４４】
糖コンジュゲートはまた、哺乳動物(又は鳥類)に本発明の組成物を投与することを含む、哺乳動物(又は鳥類)において免疫応答を生じさせる方法において使用しうる。
【００４５】
糖免疫原
哺乳動物又は鳥類において免疫応答を誘導できる任意の多糖又はオリゴ糖は、本明細書に記載のとおり非直鎖状糖コンジュゲート及び直鎖状糖コンジュゲート(すなわち、糖免疫原)において使用しうる。好ましくは、糖は、目的の病原体に対する免疫応答を誘導できる。糖は分枝状又は直鎖状であってよい。
【００４６】
低分子量の糖、特に100kDa未満(例えば、80、70、60、50、40、30、25、20又は15kDa未満)の分子量を有するものは使用しうる。例えば、60個以下(例えば、59個、58個、57個、56個、55個、54個、53個、52個、51個、50個、49個、48個、47個、46個、45個、44個、43個、42個、41個、40個、39個、38個、37個、36個、35個、34個、33個、32個、31個、30個、29個、28個、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個又は4個)の単糖単位を含有するオリゴ糖を使用することも可能である。この範囲内で、10個〜50個の間又は20個〜40個の間の単糖単位を有するオリゴ糖は好ましい。
【００４７】
高分子量の多糖又は天然多糖をも、特に50kDaを超える(例えば、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、270、300、350又は400kDaを超える)分子量を有するものは使用しうる。例えば、20個以上(例えば、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、32個、34個、36個、38個、40個、42個、44個、46個、48個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個又は100個)の単糖単位を含有する糖を使用することも可能である。この範囲内で、50個を超える又はさらに100個をも超える単糖単位を有する糖は好ましい。
【００４８】
例示的糖免疫原を下に詳述する。
【００４９】
好ましくは、本発明の組成物中のコンジュゲート中の糖免疫原は、細菌性糖、特に細菌性莢膜糖である。
【００５０】
本発明の組成物中に含まれうる細菌性莢膜糖の例は、髄膜炎菌(血清群A、B、C、W135及び/又はY)、肺炎球菌(血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及び33F、特に4、6B、9V、14、18C、19F及び/又は23F)、ストレプトコッカス・アガラクチア(1a型、1b型、II型、III型、IV型、V型、VI型、VII型及び/又はVIII型、例えば参考文献20〜23に開示の糖抗原)、インフルエンザ菌(分類可能株: a、b、c、d、e及び/又はf)、緑膿菌(例えば、PA01、O5血清型から単離されたLPS)、黄色ブドウ球菌(例えば、血清型5及び8由来)、フェカリス菌又はフェシウム菌(三糖反復)、エルシニア・エンテロコリチカ、コレラ菌、チフス菌、クレブシエラ属種など由来の莢膜糖を含む。本発明の組成物中に含まれうる他の糖は、グルカン(例えば、真菌のグルカン、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)におけるものなど)及び真菌莢膜糖、例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンスの莢膜由来を含む。
【００５１】
髄膜炎菌: 特定の実施形態では、コンジュゲート組成物は、髄膜炎菌の血清群A、C、W135及びYの少なくとも2つ由来の莢膜糖を含んでよい。他の実施形態では、そのような組成物は、次の1つ以上由来の抗原をさらに含む: (a)髄膜炎菌、(b)インフルエンザ菌B型、黄色ブドウ球菌、連鎖球菌A及びB群、病原性大腸菌及び/又は(c)肺炎球菌。
【００５２】
天然髄膜炎菌血清群A(MenA)莢膜は、C3位及びC4位に部分的O-アセチル化を有する(a1→6)-結合N-アセチル-D-マンノサミン-1-ホスフェートのホモポリマーである。髄膜炎菌血清群B(MenB)莢膜は、(a2→8)-結合シアル酸のホモポリマーである。髄膜炎菌血清群C(MenC)莢膜糖は、7位及び/又は8位に可変O-アセチル化を有する(a2→9)結合シアル酸のホモポリマーである。髄膜炎菌血清群W135糖は、シアル酸-ガラクトース二糖単位[→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Gal-α-(1→)を有するポリマーである。それは、シアル酸の7位及び9位に可変O-アセチル化を有する。髄膜炎菌血清群Y糖は、二糖反復単位がガラクトースの代わりにグルコースを含むことを除いて、血清群W135糖に類似している[→4)-D-Neup5Ac(7/9OAc)-α-(2→6)-D-Glc-α-(1→)。それはまた、シアル酸の7位及び9位に可変O-アセチル化を有する。
【００５３】
特定の実施形態では、コンジュゲート組成物は、髄膜炎菌の血清群C、W135及びY由来の莢膜糖を含む。特定の実施形態では、コンジュゲート組成物は、髄膜炎菌の血清群A、C、W135及びY由来の莢膜糖を含む。特定の実施形態では、コンジュゲート組成物は、インフルエンザ菌B型並びに髄膜炎菌の血清群C、W135及びY由来の莢膜糖を含む。特定の実施形態では、コンジュゲート組成物は、インフルエンザ菌B型並びに髄膜炎菌の血清群A、C、W135及びY由来の莢膜糖を含む。特定の実施形態では、コンジュゲート組成物は、肺炎球菌並びに髄膜炎菌の血清群C、W135及びY由来の莢膜糖を含む。特定の実施形態では、コンジュゲート組成物は、肺炎球菌並びに髄膜炎菌の血清群A、C、W135及びY由来の莢膜糖を含む。特定の実施形態では、コンジュゲート組成物は、インフルエンザ菌B型、肺炎球菌並びに髄膜炎菌の血清群C、W135及びY由来の莢膜糖を含む。特定の実施形態では、コンジュゲート組成物は、インフルエンザ菌B型、肺炎球菌並びに髄膜炎菌の血清群A、C、W135及びY由来の莢膜糖を含む。
【００５４】
肺炎球菌: 肺炎球菌糖コンジュゲートは、糖(多糖又はオリゴ糖を含む)及び場合により肺炎球菌由来の1つ以上のタンパク質を含んでよい。糖抗原は、血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、1OA、HA、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F及び33Fから選択しうる。任意選択のタンパク質抗原は、WO98/18931、WO98/18930、米国特許第6,699,703号、米国特許第6,800,744号、WO97/43303及びWO97/37026において同定されたタンパク質から選択しうる。肺炎球菌タンパク質は、ポリヒスチジントライアドファミリー(PhtX)、コリン結合タンパク質ファミリー(CbpX)、CbpX切断型、LytXファミリー、LytX切断型、CbpX切断型-LytX切断型キメラタンパク質、ニューモリシン(Ply)、PspA、PsaA、Spl28、SpIOl、Spl30、Spl25又はSpl33から選択しうる。
【００５５】
黄色ブドウ球菌: 黄色ブドウ球菌糖コンジュゲートは、黄色ブドウ球菌5型、8型及び336型莢膜糖並びにそれらの断片、並びに場合により表面タンパク質由来タンパク質抗原、インベイシン(ロイコシジン、キナーゼ、ヒアルロニダーゼ)、食作用貪食を阻害する表面因子(莢膜、プロテインA)、カロテノイド、カタラーゼ産生、プロテインA、コアグラーゼ、凝固因子及び/又は真核細胞膜を溶解する膜障害毒素(場合により解毒される)(溶血素、ロイコトキシン、ロイコシジン)を含んでよい。黄色ブドウ球菌莢膜糖の断片を生成する例示的脱重合法は、そのような脱重合技術の教示に関して参照により本明細書に組み込まれる2009年9月30日に出願された米国シリアルナンバー61/247,518、表題「Conjugation of Staphylococcus Aureus Type 5 and Type 8 Capsular Polysaccharides」、5頁6行目〜6頁23行目に見出すことができる。
【００５６】
インフルエンザ菌B型(Hib): Hib糖コンジュゲートはHib糖抗原を含んでよい。
【００５７】
ストレプトコッカス・アガラクチア(B群連鎖球菌): B群連鎖球菌糖コンジュゲートは、WO04/041157において同定された血清型Ia、Ib、Ia/c、II、III、IV、V、VI、VII及びVIII由来の糖抗原並びに場合によりWO02/34771、WO03/093306、WO04/041157又はWO05/002619において同定されたものを非限定的に含む、1つ以上のタンパク質抗原(例えば、タンパク質GBS80、GBS104、GBS276及びGBS322を含む)を含んでよい。
【００５８】
コレラ菌: コレラ菌糖コンジュゲートは、LPS、特にコレラ菌II、O1 Inaba O-特異的多糖のリポ多糖を含んでよい。
【００５９】
チフス菌(腸チフス熱): 糖コンジュゲートはViなどの莢膜多糖を含んでよい。
【００６０】
グルカン糖: コンジュゲートのための糖は、グルカンを含む。グルカンは、他の病原体の中でも、真菌の細胞壁において見出されるグルコース含有多糖である。β-グルカンはグルコースサブユニット間に1つ以上のα結合を含む一方で、β-グルカンはグルコースサブユニット間に1つ以上のβ結合を含む。本発明において使用されるグルカンはβ結合を含み、β結合だけを含有してもよい(すなわち、α結合を含まない)。
【００６１】
グルカンは、1つ以上のβ-1,3-結合及び/又は1つ以上のβ-1,6-結合を含んでもよい。それはまた、1つ以上のβ-1,2-結合及び/又はβ-1,4-結合を含んでもよいが、通常は、そのβ結合は、β-1,3-結合及び/又はβ-1,6-結合だけである。
【００６２】
グルカンは、分枝状又は直鎖状であってよい。
【００６３】
全長天然β-グルカンは、不溶性であり、メガダルトン範囲の分子量を有する。本発明の免疫原性組成物において可溶性グルカンを使用することは好ましい。可溶化は、長い不溶性グルカンを断片化することによって達成してよい。これは、加水分解、又はより便利にはグルカナーゼによる(例えば、β-1,3-グルカナーゼ又はβ-1,6-グルカナーゼによる)消化によって達成してよい。代替的に、短いグルカンは単糖構成要素を連結することによって合成的に調製できる。
【００６４】
低分子量グルカン、特に100kDa未満(例えば、80、70、60、50、40、30、25、20又は15kDa未満)の分子量を有するものは、使用してよい。例えば、60個以下(例えば、59個、58個、57個、56個、55個、54個、53個、52個、51個、50個、49個、48個、47個、46個、45個、44個、43個、42個、41個、40個、39個、38個、37個、36個、35個、34個、33個、32個、31個、30個、29個、28個、27個、26個、25個、24個、23個、22個、21個、20個、19個、18個、17個、16個、15個、14個、13個、12個、11個、10個、9個、8個、7個、6個、5個又は4個)のグルコース単糖単位を含有するオリゴ糖を使用することも可能である。この範囲内で、10個〜50個の間又は20個〜40個の間の単糖単位を有するオリゴ糖は好ましい。
【００６５】
高分子量又はさらにグルカン、特に50kDaを超える(例えば、60、70、80、90、100、125、150、175、200、225、250、270、300、350又は400kDaを超える)分子量を有するものも使用してよい。例えば、20個以上(例えば、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、32個、34個、36個、38個、40個、42個、44個、46個、48個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個又は100個)の単糖単位を含有する糖を使用することも可能である。この範囲内で、50個を超える又は100個を超える単糖単位を有する糖は好ましい。
【００６６】
グルカンは、真菌グルカンであってよい。「真菌グルカン」は、一般に真菌から得られるが、ある特定のグルカン構造が真菌及び非真菌(例えば、細菌、下等植物又は藻類において)の両方において見出される場合、非真菌生物は代替的供給源として使用してよい。したがって、グルカンは、C.アルビカンスなどのカンジダの細胞壁由来、又はコクシジオイデス・イミチス、トリコフィトン・ベルコースム、ブラストミセス・デルマチチジス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、出芽酵母、パラコクシジオイデス・ブラジリエンシス若しくはフィチウム・インシジオスム由来であってよい。真菌β-グルカンの例示的供給源は、WO2009/077854において見出しうる。
【００６７】
いくつかの実施形態では、グルカンは、例えばラミナリンにおいて見られるように、いくつかのβ-1,6分枝を有するβ-1,3グルカンである。ラミナリンは、褐藻類及び海藻において見られる。ラミナリンのβ(1-3):β(1-6)比は、異なる供給源の間で変動し、例えば比は、アラメ(Eisenia bicyclis)ラミナリンでは3:2と小さいが、ラミナリア・ジギタータ(Laminaria digititata)ラミナリンでは7:1と大きい(Pang et al. (2005) Biosci Biotechnol Biochem 69:553〜8)。したがって本発明で使用されるグルカンは、1.5:1と7.5:1の間(例えば、約2:1、3:1、4:1、5:1、6:1又は7:1)のβ(1-3):β(1-6)比を有してよい。場合により、グルカンは、末端マンニトールサブユニット、例えば1,1-α-結合マンニトール残基を有してよい(Read et al. (1996) Carbohydr Res. 281:187〜201)。グルカンはまた、マンノースサブユニットを含んでもよい。
【００６８】
他の実施形態では、グルカンは、カードランにおいて見られるように、β-1,3結合だけを有するか、又は主にβ-1,3結合を有する。本発明者らは、これらのグルカンが、他の結合を含むグルカン、特にβ-1,3結合と高い割合のβ-1,6結合を含むグルカンよりもさらに免疫原性でありうることを見出した。したがって、グルカンは、β-1,3-結合グルコース残基だけ(例えば、1,3結合だけを含む直鎖状β-D-グルコピラノース)からなってよい。しかし場合により、グルカンは、β-1,3-結合グルコース残基ではない単糖残基を含んでよく、例えばβ-1,6-結合グルコース残基を含んでよい。β-1,3-結合グルコース残基の、これらの他の残基との比は、少なくとも8:1(例えば>9:1、>10:1、>11:1、>12:1、>13:1、>14:1、>15:1、>16:1、>17:1、>18:1、>19:1、>20:1、>25:1、>30:1、>35:1、>40:1、>45:1、>50:1、>75:1、>100:1など)であるべきであり、及び/又はβ-1,3結合だけによって他の残基に結合した少なくとも5個(例えば、>5個、>6個、>7個、>8個、>9個、>10個、>11個、>12個、>13個、>14個、>15個、>16個、>17個、>18個、>19個、>20個、>30個、>40個、>50個、>60個など)の隣接非末端残基の1個以上(例えば、>1個、>2個、>3個、>4個、>5個、>6個、>7個、>8個、>9個、>10個、>11個、>12個など)の連続(sequence)が存在する。「非末端」によって、残基がグルカンの遊離末端に存在しないことが意味される。いくつかの実施形態では、隣接非末端残基は、担体分子、リンカー又は下に記載の他のスペーサーにコンジュゲートした、いかなる残基も含まなくてよい。β-1,3結合だけによって他の残基に結合した5個の隣接非末端残基の存在が、例えばC.アルビカンスに対して、防御抗体応答を提供しうることが見出された。
【００６９】
さらなる実施形態では、組成物は、2つの異なるグルカン、例えば1.5:1と7.5:1の間のβ(1-3):β(1-6)比を有する第一のグルカン、及びβ-1,3結合だけを有するか、若しくは主にβ-1,3結合を有する第二のグルカンを含んでよい。例えば、組成物は、ラミナリングルカン及びカードラングルカンの両方を含んでよい。
【００７０】
β-グルカンを調製するための例示的方法は、WO2009/077854において見出すことができる。
【００７１】
ラミナリン及びカードランは、天然では高分子量ポリマー、例えば少なくとも100kDaの分子量を有するものとして典型的には見出される。それらは水性媒体にはしばしば不溶性である。したがってそれらは、天然形態では免疫処置に十分には適さない。より親水性のペプチドとの非直鎖状ポリコンジュゲーションは、高分子量ポリマーをコンジュゲートとして免疫処置のために好適にさせ、この溶解度の課題を克服することができる。特に、次の構造(A)又は(B)を有するグルカンは本発明における使用のために具体的に想定される:
【化１】
2015532276.tif 000003
[式中、n+2は、2〜60の範囲にあり、例えば10〜50の間又は2〜40の間である]。好ましくは、n+2は、25〜30又は11〜19、例えば13〜17の範囲にある。本発明者らは、n+2=15が好適であることを見出した。
【化２】
2015532276.tif 000004
[式中、nは、0〜9の範囲にあり、例えば1〜7の間又は2〜6の間である]。好ましくは、nは、3〜4又は1〜3の範囲にある。本発明者らは、n=2が好適であることを見出した。
【００７２】
グルカン(上に定義のとおり)は、好ましくは単一分子種である。本実施形態では、すべてのグルカン分子は配列の観点からは同一である。したがって、すべてのグルカン分子は、分子量などを含むそれらの構造的特性の観点からは同一である。典型的には、グルカンのこの形態は、例えば上に記載の方法を使用して化学合成によって得られる。例えばJamois et al. (2005) Glycobiology 15(4):393〜407は、単一のβ-1,3結合種の合成を記載している。代替的に他の実施形態では、グルカンは、天然グルカン、例えば上に記載のとおりL.ジギタータ(L. digitata)、アグロバクテリウム又はユーグレナ由来のグルカンから、グルカンを、必要とされる単一分子種が得られるまで精製して、得てもよい。このように精製された天然グルカンは、商業的に入手できる。単一分子種であるグルカンは、グルカン試料の多分散性(Mw/Mn)を測定することによって同定しうる。このパラメーターは、例えばBardotti et al. (2008) Vaccine 26:2284〜96に記載のとおりSEC-MALLSによって簡便に測定できる。本発明の本実施形態における使用のために好適なグルカンは、約1、例えば1.01又はそれ未満の多分散性を有する。
【００７３】
カードランなどの天然グルカンの溶解度は、イオン基を導入すること(例えば、硫酸化によって、特にカードラン中のO-6で)によって増大させることができる。そのような修飾は、本発明で使用されうるが、それらがグルカンの抗原性を変化させうることから理想的には回避される。
【００７４】
グルカンが天然供給源から単離される場合、それらは混入物と一緒に単離されうる。例えば、本発明者らは、紫外可視(UV/VIS)分光測定によって同定できるフロロタンニンがグルカンに混入しうることを見出した。この問題は、グルカンが褐藻類又は海藻から単離される場合には特によく起こる。例えばラミナリア・ジギタータから抽出された商業的に入手可能なラミナリンのUVスペクトルは、フロロタンニン混入の存在から生じる吸収ピークを含む。同様にアーティー・ラミナリアリス(Artie laminarialis)、サッコルヒザ・デルマトデア(Saccorhiza dermatodea)及びアラリア・エスクレンタ(Alaria esculenta)から抽出されたグルカンは、フロロタンニン混入から生じる吸収ピークを含むUVスペクトルを有する。
【００７５】
グルカン試料中のフロロタンニンの存在は、グルカンの生物学的特性に影響を与えうる。したがって、試料からフロロタンニンを除去することが、特にグルカンが本発明の多数の態様の医療用途のためである場合に望ましい。β-グルカンからフロロタンニンを除去する例示的方法は、WO2009/077854において見出すことができる。
【００７６】
担体ペプチド
上に考察したとおり多糖は、典型的には弱いT非依存性抗原である。この免疫原性は、免疫応答をよりT細胞依存性応答にシフトさせるタンパク質担体へのコンジュゲーションによって、量的及び質的に増大させることができる。図1に示すとおり、現在のモデルは、コンジュゲートが抗原提示細胞内部で処理され、主要組織適合性複合体(MHC)クラスIIタンパク質によって提示されるペプチド又は糖ペプチドに壊され; 次いで、担体特異的T細胞とのさらなる相互作用が、多糖特異的B細胞分化を誘導し、抗体産生及びメモリーへの刺激をもたらす、というものである。結果として、コンジュゲートワクチンは、免疫学的メモリー及びワクチンのさらなる投与による応答のブースティングをもたらす、T細胞依存性(TD)応答を既に幼少期に誘導する[Costantino, P. et al. Expert Opin. Drug Discov. 2011, 6(10), 1045〜1066]。
【００７７】
代替担体の探索では、他の研究者らは、担体タンパク質を、選択されたCD4+T細胞エピトープを含有する合成ペプチドに置き換えている[Falugi, F. et al. Eur. J. Immunol, 2001, 31, 3816〜3824]。文献ではいつくかの論文が、担体タンパク質全体がT細胞エピトープペプチドで置換されており従来の糖コンジュゲートワクチンに対して匹敵する又はより高い免疫応答を誘導する糖ペプチドの調製を報告した。インフルエンザ菌B型(Hib)に対するワクチンの開発に関して、莢膜多糖の合成断片、ポリ-3-β-D-リボース-(1,1)-D-リビトール-5-ホスフェート(sPRP)は、Hib外膜タンパク質P1、P2及びP6由来の合成ペプチドにコンジュゲートされている。これらの合成糖ペプチドは、免疫原性で、抗PRP抗体応答を誘発し、さらに防御レベルの抗PRP抗体を誘導した[Kandil, A.A. et al. Glycoconjugate Journal, 1997, 14, 13〜17]。
【００７８】
肺炎球菌17F型に対するワクチンに関して、担体タンパク質を置き換えるために、いくつかのペプチドが、それらの実証された又は予測されたTh細胞刺激特性に基づいて選択された: HSP、マイコバクテリアhsp65由来ドミナントThエピトープ; HAG、インフルエンザウイルスヘマグルチニン由来; ニューモリシン(又はそのトキソイド)。糖抗原として、肺炎球菌多糖17F型(PS)が選択され、得られた糖ペプチドは、マウスにおいて抗PS IgM及びIgG応答を一貫して誘発している[De Velasco, E.A. et al. Infection and Immunity, 1995, 63, 961〜968]。
【００７９】
図2に示すとおり、Avcil et al.は、糖コンジュゲートのタンパク質及び糖質部分の両方のプロセシングがグリカンp-ペプチドを生成した、糖コンジュゲートワクチンについての新規ワーキングモデルを提案した。グリカンp-ペプチドのペプチド部分のMHCII結合は、MHCIIによる、より親水性の糖質の、CD4+T細胞のαβ受容体(αβTCR)への提示を可能にした。CD4+ヘルパーT細胞のαβ受容体は、MHCIIの関連において提示されたグリカンpエピトープを認識し、及びそれに応答した。糖質-MHCIIによるT細胞の活性化は、共刺激と共に、IL-4及びIL-2などのサイトカインのT細胞産生をもたらし、次いで、メモリーB細胞になる同族B細胞の成熟を誘導し、下の図において報告するとおり、結果として糖質特異的IgG抗体の産生を生じた。要約として、このワーキングモデルに従って、原型的GBS III型-TTコンジュゲートにおいてそれらが結合しているペプチドに関係なく、純粋な糖質エピトープのT細胞クローン認識によって実証されたとおり、T細胞は、多糖及び恐らく他の構造を、それらがペプチドアンカーに共有結合で結合している場合、認識できる。したがって、本明細書に開示のコンジュゲートにおける使用のためのT細胞エピトープの選択において当業者を導くために利用可能なかなりの量の文献が存在する。
【００８０】
担体ペプチドは、1個以上のT細胞エピトープ(例えば、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、22個、24個、26個、28個、30個、32個、34個、36個、38個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個又はそれ以上)を含んでよい。コンジュゲートについて、担体ペプチドは、好ましくは、6個以下のT細胞エピトープ、5個以下のT細胞エピトープ、4個以下のT細胞エピトープ、3個以下のT細胞エピトープ、6個以下のT細胞エピトープ、又は1個だけのT細胞エピトープを有する。ポリエピトープ担体ペプチドについて、担体ペプチドは、好ましくは、6個以上のT細胞エピトープ又は10個以上のT細胞エピトープを含み、ここで少なくとも1つのエピトープはPV1エピトープである。より好ましくは、ポリエピトープ担体ペプチドは、19個以上のT細胞エピトープを含み、ここで少なくとも1つのエピトープはPV1エピトープである。担体ペプチドは、好ましくは、少なくとも1個のPV1 T細胞エピトープ、少なくとも2個のPV1 T細胞エピトープ、少なくとも3個のPV1 T細胞エピトープ、少なくとも4個のPV1 T細胞エピトープ、少なくとも5個のPV1 T細胞エピトープ、少なくとも1個のPV1 T細胞エピトープを含むか、又はすべてのT細胞エピトープはPV1 T細胞エピトープであってよい。各担体ペプチドは、ある特定のエピトープのコピーを1つだけ有してよく、又はある特定のエピトープのコピーを2個以上有してもよい。エピトープはCD4+ T細胞エピトープである。好ましくは、ポリエピトープ担体ペプチドは少なくとも1つの細菌性エピトープを、PV1ウイルスエピトープに加えて含む。好ましくはエピトープは、ヒト集団が自然感染又はワクチン接種によってのいずれかで頻繁に曝露される抗原に由来し、例えば、エピトープは、A型肝炎ウイルス、B型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、ポリオウイルス、マイコバクテリウム・ボビス(Mycobacterium bovis)及びらい菌(M. leprae)由来熱ショックタンパク質並びに/又は連鎖球菌株などに由来してよい。好ましくはエピトープは、破傷風毒素(TT)、熱帯熱マラリア原虫(Plasmodium falciparum)CSP(PfC)、B型肝炎ウイルス核カプシド(HBVnc)、インフルエンザヘマグルチニン(HA)、HBV表面抗原(HBsAg)及びインフルエンザマトリクス(MT)から選択される。担体ペプチドにおいて使用されるエピトープは、好ましくは、次の表1から選択される。最も好ましくはエピトープは、PV1エピトープである。
【００８１】
【表１】
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【００８２】
いずれのエピトープ配列も、配列番号1〜18と比較して、別々の位置にあっても又は連続的であってもよい、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個若しくは10個(又はそれを超える)単一アミノ酸変更(欠失、挿入、置換)を有してよい。
【００８３】
T細胞エピトープは周知であり、典型的には病原体由来の特徴付けられた抗原性ペプチド断片であり、それは、主要組織適合性複合体(MHC)分子によって提示された場合に、抗原提示細胞の表面への輸送後にT細胞受容体と相互作用する。実験的に決定された親和性データは、ペプチド配列に基づいて非結合体から結合体を識別できる、種々のMHC結合予測アルゴリズムを開発するために使用されている[Davies, m.N.; Flower, D.R. Harnessing bioinformatics to discover new vaccines Drug Discovery Today, 2007, 12 ( 9/10) , 389〜395]。これらのアルゴリズムは、本明細書に開示のコンジュゲートにおける使用のための追加的T細胞エピトープを選択するために使用できる。
【００８４】
複数のエピトープが担体ペプチドに存在する場合、エピトープは、好ましくはスペーサーによって連結されている。好ましくはスペーサーは、エピトープではない短い(例えば、1個、2個、3個、4個又は5個の)アミノ酸配列である、。好ましいスペーサーは、1つ以上のグリシン残基、例えば-KG-を含む。好ましくは、より長い担体ペプチドは、6個の-Hisテール、担体ペプチドをスクリーニング若しくは精製するために有用な免疫親和性タグ(例えば、配列「MDYKDDDD」[配列番号18]は使用してよい)、及び/又はプロテアーゼ切断配列を含む、N-若しくはC末端領域を含む。好ましくは、タンパク質分解性配列は、第Xa因子認識部位である。
【００８５】
好ましくは担体ペプチドは、抑制性T細胞エピトープを含まない。
【００８６】
T細胞エピトープに加えて、担体ペプチドは、他のペプチド又はタンパク質断片、例えばインターロイキン-2(IL-2)又は顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)などの免疫調節性サイトカイン由来のエピトープを含んでよい。
【００８７】
本発明と共に使用される担体ペプチドは、種々の手段(例えば、組換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成など)によって調製できる。化学的に合成されたペプチドは、特に担体ペプチドが1つ又は数個のエピトープだけを有する場合、好ましい。
【００８８】
本発明と共に使用される担体ペプチドは、好ましくは、精製された又は実質的に精製された形態、すなわち、実質的に他のペプチドを含まない形態で提供され、一般に少なくとも約50％純粋(重量で)であり、通常少なくとも約90％純粋であり、すなわち、組成物の約50％未満、より好ましくは約10％未満(例えば、5％)が他の発現ペプチドで構成される。誤解をさけるために、糖にコンジュゲートされる精製された又は実質的な担体ペプチドがワクチンの成分として使用される場合、担体ペプチドは、他のタンパク質抗原及び細胞成分(例えば、他の多糖、外膜小胞など)の存在にかかわらず、依然として「精製」又は「実質的に精製」されている。
【００８９】
用語「ペプチド」は、任意の長さのアミノ酸ポリマーを指す。ポリマーは、直鎖状又は分枝状であってよく、それは、修飾アミノ酸を含んでよいし、非アミノ酸によって隔てられてもよい。その用語はまた、天然に修飾されているか、又は介在、例えばジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化又は、標識化成分とのコンジュゲーションなどの任意の他の操作若しくは修飾によって修飾されているアミノ酸ポリマーを包含する。同様に含まれるのは、例えば、アミノ酸の1つ以上の類似体(例えば、非天然アミノ酸などを含む)並びに当技術分野において公知の他の修飾を含有するペプチドである。ペプチドは単鎖又は会合した鎖として存在してよい。
【００９０】
コンジュゲートによって被験体において生じた免疫応答と、糖によって生じた免疫応答との比較は、当業者に利用可能な任意の手段を使用して実行しうる。下の実施例において使用される1つの簡単な方法は、マウスなどのモデル被験体の免疫処置、及び続く目的の病原体の致死性用量によるチャレンジを含む。髄膜炎菌コンジュゲートなどの多くの組成物について、マウスの免疫処置、及びその後の、マウス血清が殺菌性抗体を含むことの実証は、組成物が防御免疫応答を誘導できることを実証するために典型的には十分である。適正な比較のために、当業者は、アルミニウムアジュバントなどの同じアジュバントを当然ながら選択する。
【００９１】
本発明は、化学的手段によってペプチドの少なくとも部分を合成するステップを含む、本発明の担体ペプチドを産生する方法を提供する。
【００９２】
本発明はまた、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を、ペプチド発現を誘導する条件下で培養するステップを含む、本発明のペプチドを産生する方法を提供する。ペプチドは、次に、例えば培養上清から精製されてよい。
【００９３】
本発明の担体ペプチドの発現は同種の宿主において実行しうるが、本発明は、発現のために異種性宿主を通常使用する。異種性宿主は、原核性(例えば、細菌)又は真核性であってよい。好適な宿主は、これだけに限らないが、枯草菌(Bacillus subtilis)、コレラ菌、チフス菌、マウスチフス菌、ナイセリア・ラクタミカ(Neisseria lactamica)、ナイセリア・シネレア(Neisseria cinerea)、マイコバクテリア(例えば結核菌(M. tuberculosis))、酵母などを含む。
【００９４】
免疫原性組成物及び医薬
本発明の糖コンジュゲートは、免疫原性組成物における活性成分(免疫原)として有用であり、そのような組成物はワクチンとして有用でありうる。本発明によるワクチンは、予防的(すなわち感染を予防する)又は治療的(すなわち感染を治療する)のいずれであってもよいが、典型的には予防的である。
【００９５】
免疫原性組成物は、薬学的に許容される。通常それらは、抗原に加えて成分を含み、例えば典型的には1つ以上の医薬用担体(複数可)、賦形剤(複数可)及び/又はアジュバント(複数可)を含む。担体及び賦形剤の徹底的な議論は参考文献96において得られる。ワクチンアジュバントの徹底的な議論は参考文献1及び2において得られる。
【００９６】
組成物は、一般に水性形態で哺乳動物に投与される。しかし投与の前に、組成物は非水性形態であってもよい。例えばいくつかのワクチンは、水性形態で製造され、次いで充填され、流通され、同様に水性形態で投与されるが、他のワクチンは、製造の際に凍結乾燥され、使用時に水性形態に再構成される。したがって本発明の組成物は、凍結乾燥製剤などに乾燥されてよい。
【００９７】
組成物は、チオマーサル又は2-フェノキシエタノールなどの保存剤を含んでよい。しかしワクチンが実質的に水銀材料を含まない(すなわち、5μg/ml未満)、例えばチオマーサルを含まないことは好ましい。水銀を含有しないワクチンはより好ましい。保存剤不含有ワクチンは特に好ましい。
【００９８】
熱安定性を改善するために、組成物は温度保護剤を含んでもよい。
【００９９】
張度を調節するために、ナトリウム塩などの生理的塩を含むことは好ましい。塩化ナトリウム(NaCl)は好ましく、1〜20mg/mlの間、例えば約10±2mg/ml NaClで存在してよい。存在してよい他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、無水リン酸二ナトリウム(disodium phosphate dehydrate)、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどを含む。
【０１００】
組成物は、一般に200mOsm/kg〜400mOsm/kgの間、好ましくは240〜360mOsm/kgの間のオスモル濃度を有し、より好ましくは290〜310mOsm/kgの範囲内にある。
【０１０１】
組成物は、1種以上の緩衝液を含んでよい。典型的な緩衝液は、リン酸緩衝液、Tris緩衝液、ホウ酸緩衝液、コハク酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液(特に水酸化アルミニウムアジュバントと共に)又はクエン酸緩衝液を含む。緩衝液は、典型的には5〜20mMの範囲で含まれる。
【０１０２】
組成物のpHは、一般に5.0〜8.1の間、より典型的には6.0〜8.0、例えば6.5〜7.5の間又は7.0〜7.8の間である。
【０１０３】
組成物は、好ましくは滅菌性である。組成物は、好ましくは非発熱性であり、例えば1用量あたり<1 EU(エンドトキシン単位、標準測定)、好ましくは1用量あたり<0.1 EUを含有する。組成物は、好ましくはグルテン不含有である。
【０１０４】
組成物は、単回免疫処置のための材料を含んでよく、又は複数回免疫処置のための材料を含んでもよい(すなわち「複数回投与」キット)。複数回投与構成では保存剤の包含は好ましい。複数回投与組成物での保存剤含有の代替として(又は付加的に)、組成物は材料を取り出すための無菌性アダプターを備えた容器に含有されてよい。
【０１０５】
ヒトワクチンは、約0.5mlの投与用量で典型的には投与されるが、半分の投与量(すなわち約0.25ml)で小児に投与されてよい。
【０１０６】
本発明の免疫原性組成物はまた、1種以上の免疫調節性薬剤を含んでもよい。好ましくは1種以上の免疫調節性薬剤は、1種以上のアジュバントを含む。アジュバントは、下にさらに考察するTH1アジュバント及び/又はTH2アジュバントを含みうる。
【０１０７】
本発明の組成物において使用しうるアジュバントは、これだけに限らないが次を含む:
【０１０８】
A.  無機物含有組成物
本発明におけるアジュバントとしての使用のために好適な無機物含有組成物は、アルミニウム塩及びカルシウム塩(又はその混合物)などの無機塩を含む。カルシウム塩は、リン酸カルシウム(例えば、参考文献3に開示の「CAP」粒子)を含む。アルミニウム塩は、塩が任意の好適な形態(例えば、ゲル、結晶、アモルファスなど)をとって、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などを含む。これらの塩への吸着は好ましい。無機物含有組成物は、金属塩の粒子として製剤化されてもよい(4)。
【０１０９】
水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントは使用してよい。これらの名称は慣用的であるが、便宜上使用されているだけであり、どちらも存在する実際の化学化合物の正確な記述ではない(例えば、参考文献1の9章を参照されたい)。本発明は、アジュバントとして一般に使用されている任意の「水酸化物」及び「リン酸塩」アジュバントを使用できる。「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩であり、通常少なくとも部分的に結晶である。「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはヒドロキシリン酸アルミニウムであり、しばしば少量の硫酸塩も含有する(すなわち、ヒドロキシリン酸硫酸アルミニウム(aluminum hydroxyphosphate sulfate))。それらは、沈殿によって得てよく、沈殿の際の反応条件及び濃度は塩中のヒドロキシルについてのリン酸の置換の程度に影響する。
【０１１０】
線維状形態(例えば、透過型電子顕微鏡において見られる)は水酸化アルミニウムアジュバントについて典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのpIは典型的には約11であり、すなわちアジュバント自体が生理的pHで正の表面電荷を有する。pH 7.4でAl+++ 1mgあたりタンパク質1.8〜2.6mgの間の吸着能力が水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【０１１１】
一般にリン酸アルミニウムアジュバントは、0.3〜1.2の間、好ましくは0.8〜1.2の間、及びより好ましくは0.95±0.1のPO4/Alモル比を有する。一般にリン酸アルミニウムは、特にヒドロキシリン酸塩についてはアモルファスである。典型的なアジュバントは、0.84〜0.92の間のPO4/Alモル比を有するアモルファスヒドロキシリン酸アルミニウムであり、0.6mg Al3+/mlで含まれる。リン酸アルミニウムは、一般に微粒子(例えば、透過型電子顕微鏡において見られる板状形態)である。粒子の典型的直径は、任意の抗原吸着後に0.5〜20μm(例えば、約5〜10μm)の範囲である。pH7.4でAl+++ 1mgあたりタンパク質0.7〜1.5mgの間の吸着能力がリン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。
【０１１２】
リン酸アルミニウムのゼロ電荷点(PZC)はリン酸のヒドロキシルについての置換の程度に逆相関し、この置換の程度は沈殿によって塩を調製するために使用した反応条件及び反応物の濃度に依存して変動しうる。PZCはまた、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させることによって(リン酸が多い=より酸性のPZC)又はヒスチジン緩衝液などの緩衝液を添加することによって(PZCをより塩基性にする)変更される。本発明により使用されるリン酸アルミニウムは、一般に4.0〜7.0の間、より好ましくは5.0〜6.5の間、例えば約5.7のPZCを有する。
【０１１３】
本発明の組成物を調製するために使用されるアルミニウム塩の懸濁液は、緩衝液(例えば、リン酸又はヒスチジン又はTris緩衝液)を含有してよいが、これは必ずしも必要ではない。懸濁液は、好ましくは滅菌性及び発熱物質不含有である。懸濁液は、例えば濃度1.0〜20mMの間、好ましくは5〜15mMの間、より好ましくは約10mMで存在する、遊離水性リン酸イオンを含んでよい。懸濁液は、塩化ナトリウムを含んでもよい。
【０１１４】
本発明は、水酸化アルミニウム及びリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用できる。この場合、リン酸アルミニウムは水酸化物より多く存在してよく、例えば少なくとも2:1、例えば≧5:1、≧6:1、≧7:1、≧8:1、≧9:1などの重量比であってよい。
【０１１５】
患者への投与のための組成物中のAl+++の濃度は、好ましくは10mg/ml未満、例えば≦5mg/ml、≦4mg/ml、≦3mg/ml、≦2mg/ml、≦1mg/mlなどである。好ましい範囲は、0.3〜1mg/mlの間である。最大0.85mg/用量は好ましい。
【０１１６】
B.  油エマルジョン
本発明におけるアジュバントとしての使用のために好適な油エマルジョン組成物は、MF59(商標)などのスクアレン-水エマルジョンを含む(参考文献1の10章、参考文献5も参照されたい)(5％スクアレン、0.5％ TWEEN 80(商標)及び0.5％ SPAN 85(商標)、マイクロフルイダイザーを使用してサブミクロン粒子に製剤化された)。フロイント完全アジュバント(CFA)及びフロイント不完全アジュバント(IFA)も使用しうる。
【０１１７】
種々の水中油型エマルジョンアジュバントが公知であり、それらは典型的には、少なくとも1種の油及び少なくとも1種のサーファクタントを含み、油(複数可)及びサーファクタント(複数可)は生分解性(代謝可能)及び生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、一般に直径5μm未満であり、理想的にはサブミクロン直径を有し、これらの小さなサイズは安定なエマルジョンを提供するためにマイクロフルイダイザーで達成される。220nm未満のサイズを有する液滴は、それらをろ過滅菌に供することができることから好ましい。
【０１１８】
エマルジョンは、動物(例えば魚)又は植物性供給源由来のものなどの油を含むことができる。植物油のための供給源は、ナッツ、種子及び穀物を含む。ピーナッツ油、ダイズ油、ココナッツ油及びオリーブ油は、最も一般的に入手可能であり、ナッツ油の例となる。例えばホホバ豆から得られるホホバ油は使用できる。種子油は、ベニバナ油、綿実油、ヒマワリ種子油、ゴマ種子油などを含む。穀物群では、コーン油が最も容易に入手できるが、コムギ、カラスムギ、ライムギ、イネ、テフ、ライコムギなどの他の穀物の油も使用しうる。グリセロールの6〜10炭素脂肪酸エステル及び1,2-プロパンジオールは、種子油中に天然では存在しないが、ナッツ及び種子油から出発した適切な物質の加水分解、分離及びエステル化によって調製しうる。哺乳動物のミルク由来の脂肪及び油は、代謝可能であり、したがって本発明の実施において使用してよい。動物性供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化及び他の手段についての手順は、当技術分野において周知である。大部分の魚は、容易に回収しうる代謝可能な油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油、及び鯨ろうなどのクジラ油は、本明細書において使用しうる魚油のいくつかの例となる。いくつかの分枝鎖油は、5-炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、一般にテルペノイドと称される。サメ肝油は、スクアレンとして公知の分枝状不飽和テルペノイド、2,6,10,15,19,23-ヘキサメチル-2,6,10,14,18,22-テトラコサヘキサエンを含有し、本明細書において特に好ましい。スクアラン、スクアレンの飽和類似体も、好ましい油である。スクアレン及びスクアランを含む魚油は、商業的供給源から容易に入手でき、又は当技術分野において公知の方法によって得てよい。他の好ましい油は、トコフェロール(下を参照されたい)である。油の混合物は使用できる。
【０１１９】
サーファクタントは、それらの「HLB」(親水性/親油性バランス)によって分類できる。本発明の好ましいサーファクタントは、少なくとも10、好ましくは少なくとも15、より好ましくは少なくとも16のHLBを有する。本発明は、これだけに限らないが、以下を含むサーファクタントと共に使用できる: ポリオキシエチレンソルビタンエステルサーファクタント(一般にTweenと称される)、特にポリソルベート20及びポリソルベート80; エチレンオキシド(EO)、プロピレンオキシド(PO)、及び/又はブチレンオキシドル(BO)の共重合体、DOWFAX(商標)の商標で販売されているもの、例えば直鎖状EO/POブロック共重合体; オクトキシノール(反復エトキシ(オキシ-1,2-エタンエジイル)基の数が変動しうる)、オクトキシノール-9(Triton X-100、若しくはt-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール)は特に注目される; (オクチルフェノキシ)ポリエトキシエタノール(IGEPAL CA-630/NP-40); リン脂質、例えばホスファチジルコリン(レシチン); ノニルフェノールエトキシレート、例えばTergitol(商標)NPシリーズ; ラウリル、セチル、ステアリル及びオレイルアルコール由来のポリオキシエチレン脂肪エーテル(Brijサーファクタントとして公知)、例えばトリエチレングリコールモノラウリルエーテル(Brij30); 並びにソルビタンエステル(一般にSPANとして公知)、例えばソルビタントリオレエート(SPAN 85(商標))及びソルビタンモノラウレート。非イオン性サーファクタントは好ましい。エマルジョンに含まれる好ましいサーファクタントは、TWEEN 80(商標)(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート)、SPAN 85(商標)(ソルビタントリオレエート)、レシチン及びTriton X-100である。
【０１２０】
サーファクタントの混合物、例えばTWEEN 80(商標)/SPAN 85(商標)混合物は使用できる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート(TWEEN 80(商標))などのポリオキシエチレンソルビタンエステルと、t-オクチルフェノキシポリエトキシエタノール(Triton X-100)などのオクトキシノールとの組合せも好適である。別の有用な組合せは、ラウレス(laureth)9+ポリオキシエチレンソルビタンエステル及び/又はオクトキシノールを含む。
【０１２１】
サーファクタントの好ましい量(重量％)は: ポリオキシエチレンソルビタンエステル(例えば、TWEEN 80(商標))0.01〜1％、特に約0.1％; オクチル又はノニルフェノキシポリオキシエタノール(例えば、Triton X-100、若しくはTritonシリーズの他の界面活性剤)0.001〜0.1％、特に0.005〜0.02％; ポリオキシエチレンエーテル(例えば、ラウレス9)0.1〜20％、好ましくは0.1〜10％及び特に0.1〜1％又は約0.5％である。
【０１２２】
好ましいエマルジョンアジュバントは、<1μm、例えば≦750nm、≦500nm、≦400nm、≦300nm、≦250nm、≦220nm、≦200nm又はより小さい平均液滴サイズを有する。これらの液滴サイズは、マイクロ流動化などの技術によって好都合に達成できる。
【０１２３】
本発明において有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントは、これだけに限らないが次を含む:
【０１２４】
・スクアレン、TWEEN 80(商標)及びSPAN 85(商標)のサブミクロンエマルジョン。体積による本エマルジョンの組成は、約5％スクアレン、約0.5％ポリソルベート80及び約0.5％SPAN 85(商標)であってよい。重量ではこれらの比は、4.3％スクアレン、0.5％ポリソルベート80及び0.48％SPAN 85(商標)になる。このアジュバントは、「MF59(商標)」として公知であり(6-7)、参考文献8の10章及び参考文献9の12章に、より詳細に記載されている。MF59(商標)エマルジョンは、クエン酸イオン、例えば10mMクエン酸ナトリウム緩衝液を有利には含む。
【０１２５】
・スクアレン、トコフェロール及びTWEEN 80(商標)のエマルジョン。本エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水を含んでよい。それはまた、SPAN 85(商標)(例えば1％で)及び/又はレシチンを含んでもよい。これらのエマルジョンは、2〜10％スクアレン、2〜10％トコフェロール及び0.3〜3％ TWEEN 80(商標)を有してよく、スクアレン:トコフェロールの重量比は、これがより安定なエマルジョンを提供することから、好ましくは≦1である。スクアレン及びTWEEN 80(商標)は、約5:2の体積比で存在してよい。1つのそのようなエマルジョンは、TWEEN 80(商標)をPBS中に2％溶液をもたらすように溶解し、次いでこの溶液90mlを(DL-α-トコフェロール5g及びスクアレン5ml)の混合物と混合し、次いで混合物をマイクロ流動化することによって作製できる。生じたエマルジョンは、例えば100〜250nmの間、好ましくは約180nmの平均直径を有する、サブミクロン油滴を有しうる。
【０１２６】
・スクアレン、トコフェロール及びTriton界面活性剤(例えば、Triton X-100)のエマルジョン。本エマルジョンはまた、3d-MPL(下を参照されたい)を含んでもよい。本エマルジョンは、リン酸緩衝液を含有してもよい
【０１２７】
・ポリソルベート(例えば、ポリソルベート80)、Triton界面活性剤(例えば、Triton X-100)及びトコフェロール(例えば、α-トコフェロールコハク酸)を含むエマルジョン。本エマルジョンは、これら3つの成分を約75:11:10の質量比(例えば、750μg/mlポリソルベート80、110μg/ml Triton X-100及び100μg/ml α-トコフェロールコハク酸)で含んでよく、これらの濃度は、抗原由来のこれらの成分のいずれの寄与をも含むべきである。本エマルジョンはまた、スクアレンを含んでもよい。本エマルジョンはまた、3d-MPL(下を参照されたい)を含んでもよい。水相は、リン酸緩衝液を含有してよい。
【０１２８】
・スクアラン、ポリソルベート80及びポロクサマー401(「PLURONIC(商標) L121」)のエマルジョン。本エマルジョンは、リン酸緩衝生理食塩水、pH7.4中に製剤化することができる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドのための有用な送達ビヒクルであり、「SAF-1」アジュバント(10)(0.05〜1％ Thr-MDP、5％スクアラン、2.5％ PLURONIC(商標) L121及び0.2％ポリソルベート80)中でスレオニル-MDPと共に使用されている。それは、「AF」アジュバント(11)(5％スクアラン、1.25％PLURONIC(商標) L121及び0.2％ポリソルベート80)中におけるように、Thr-MDPを含まずにも使用できる。マイクロ流動化は好ましい。
【０１２９】
・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン性サーファクタント(例えば、ポリオキシエチレン(12)セトステアリルエーテル)及び疎水性非イオン性サーファクタント(例えばソルビタンエステル又はマンニドエステル、例えばソルビタンモノオレエート又は「SPAN 80(商標)」)を含むエマルジョン。本エマルジョンは、好ましくは熱可逆性であり、及び/又は油滴の少なくとも90％(体積により)がサイズ200nm未満である(12)。本エマルジョンはまた、以下の1つ以上を含んでよい: アルジトール、凍結保護剤(例えば糖、例えばドデシルマルトシド及び/若しくはショ糖)並びに/又はアルキルポリグリコシド。そのようなエマルジョンは、凍結乾燥されてよい。
【０１３０】
・スクアレン、ポロクサマー105及びAbil-Care(13)のエマルジョン。アジュバント化ワクチン中のこれらの成分の最終濃度(重量)は、5％スクアレン、4％ポロクサマー105(プルロニックポリオール)及び2％ Abil-Care 85(Bis-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16ジメチコーン、カプリル/カプリントリグリセリド)である。
【０１３１】
・0.5〜50％の油、0.1〜10％のリン脂質及び0.05〜5％の非イオン性サーファクタントを有するエマルジョン。参考文献14に記載のとおり、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン及びカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズは有利である。
【０１３２】
・非代謝可能油(例えば、軽鉱油)及び少なくとも1種のサーファクタント(例えば、レシチン、TWEEN 80(商標)又はSPAN 80(商標))のサブミクロン水中油型エマルジョン。添加物、例えばQuilAサポニン、コレステロール、サポニン親油性コンジュゲート(例えば、GPI-0100、参考文献15に記載、グルクロン酸のカルボキシル基を介した、脂肪族アミンのデスアシルサポニン(desacylsaponin)への付加によって産生される)、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム(dimethyidioctadecylammonium bromide)及び/又はN,N-ジオクタデシル-N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)プロパンジアミンは含まれてよい。
【０１３３】
・サポニン(例えば、QuilA又はQS21)及びステロール(例えば、コレステロール)がらせんミセルとして会合しているエマルジョン(16)。
【０１３４】
・鉱油、非イオン性親油性エトキシ化脂肪アルコール、及び非イオン性親水性サーファクタント(例えば、エトキシ化脂肪アルコール及び/又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体)(17)を含むエマルジョン。
【０１３５】
・鉱油、非イオン性親水性エトキシ化脂肪アルコール、及び非イオン性親油性サーファクタント(例えば、エトキシ化脂肪アルコール及び/又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロック共重合体)(17)を含むエマルジョン。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、エマルジョンは、送達時に抗原と即時混合されてよく、したがって、アジュバント及び抗原は包装又は流通されるワクチンでは別々に、使用時の最終製剤のために準備されてよい。他の実施形態では、エマルジョンは、製造の際に抗原と混合され、したがって、組成物は液体アジュバント化形態で包装される。抗原は、一般に水性形態であり、それによりワクチンは、2つの液体を混合することによって最終的に調製される。混合のための2つの液体の体積比は変動しうる(例えば、5:1〜1:5の間)が、一般に約1:1である。成分の濃度が具体的なエマルジョンの上の記載において示されている場合、これらの濃度は典型的には未希釈組成物のためのものであり、したがって、抗原溶液との混合後の濃度は減少する。
【０１３７】
トコフェロール、α、β、γ、δ、ε又はζのいずれかのトコフェロールを含む組成物は使用できるが、α-トコフェロールは好ましい。トコフェロールはいくつかの形態、例えばさまざまな塩及び/又は異性体を取ることができる。塩は、有機塩、例えばコハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩などを含む。D-α-トコフェロール及びDL-α-トコフェロールは、両方とも使用できる。トコフェロールは、高齢患者(例えば、60歳以上)における使用のためのワクチンに有利に含まれる。なぜならば、ビタミンEがこの患者群における免疫応答に良い影響を有すると報告されている(18)からである。それらはまた、エマルジョンを安定化する助けとなりうる抗酸化特性を有する(19)。好ましいα-トコフェロールはDL-α-トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。コハク酸塩は、TNF関連リガンドとin vivoで協同することが見出されている。
【０１３８】
C.  サポニン製剤(参考文献1の22章)
サポニン製剤はまた、本発明においてアジュバントとして使用してよい。サポニンは、多種多様な植物種の樹皮、葉、茎、根及び花でも見出されるステロールグリコシド及びトリテルペノイドグリコシドの不均一な群である。クイライア・サポナリア・モリナ(Quillaia saponaria Molina)の木の樹皮由来のサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンはまた、スミラックス・オルナタ(Smilax ornata)(サルサパリラ(sarsaprilla))、ジプソフィラ・パニキュラータ(Gypsophilla paniculata)(ブライズベール(brides veil))及びサポナリア・オフィシアナリス(Saponaria officianalis)(ソープルート(soap root))から商業的に得ることができる。サポニンアジュバント製剤は、QS21などの精製製剤及び、例えばISCOMなどの脂質製剤を含む。QS21はStimulon(商標)として市販されている。
【０１３９】
サポニン組成物はHPLC及びRP-HPLCを使用して精製されている。これらの技術を使用する特定の精製画分が同定されており、QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B及びQH-Cを含む。好ましくはサポニンはQS21である。QS21の産生方法は、参考文献20に開示されている。サポニン製剤はまた、コレステロールなどのステロールを含んでもよい(21)。
【０１４０】
サポニンとコレステロールとの組合せは、免疫賦活性複合体(ISCOM)と称される特有の粒子を形成するために使用できる(参考文献1の23章)。ISCOMはまた、リン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミン又はホスファチジルコリンを典型的には含む。任意の公知のサポニンがISCOMにおいて使用できる。好ましくはISCOMは、QuilA、QHA及びQHCの1つ以上を含む。ISCOMは、参考文献21〜22にさらに記載されている。場合によりISCOMは、追加的界面活性剤を欠いていてよい(23)。
【０１４１】
サポニンに基づくアジュバントの開発の概説は参考文献24及び25に見出すことができる。
【０１４２】
D.  ビロソーム及びウイルス様粒子
ビロソーム及びウイルス様粒子(VLP)も本発明においてアジュバントとして使用できる。これらの構造は、一般にウイルス由来の1種以上のタンパク質を、場合によりリン脂質と組み合わせて又は共に製剤化されて含有する。それらは、一般に非病原性、非増殖性であり、一般にいかなる天然ウイルスゲノムも含有しない。ウイルスタンパク質は、組換え的に産生されてよく、又は全ウイルスから単離されてもよい。ビロソーム又はVLPにおける使用のために好適なこれらのウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルス(例えば、HA又はNA)、B型肝炎ウイルス(例えば、コア又はカプシドタンパク質)、E型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、HIV、RNAファージ、Qβファージ(例えば、コートタンパク質)、GAファージ、frファージ、AP205ファージ及びTy(例えば、レトロトランスポゾンTyタンパク質p1)由来のタンパク質を含む。VLPは、参考文献26〜27においてさらに考察されている。ビロソームは、例えば参考文献28においてさらに考察されている。
【０１４３】
E.  細菌又は微生物誘導体
本発明における使用のために好適なアジュバントは、細菌又は微生物誘導体、例えば腸内細菌性リポ多糖(LPS)の無毒性誘導体、リピドA誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチド並びにADP-リボシル化毒素及びその解毒誘導体を含む。
【０１４４】
LPSの無毒性誘導体は、モノホスホリルリピドA(MPL)及び3-O-脱アシル化MPL(3dMPL)を含む。3dMPLは、4個、5個又は6個のアシル化鎖を有する3脱-O-アシル化モノホスホリルリピドAの混合物である。3脱-O-アシル化モノホスホリルリピドAの好ましい「小粒子」形態は参考文献29に開示されている。3dMPLのそのような「小粒子」は、0.22μm膜を通じて滅菌ろ過されるために十分小さい(29)。他の無毒性LPS誘導体は、モノホスホリルリピドA模倣体、例えばアミノアルキルグルコサミニドリン酸誘導体、例えばRC-529(30,31)を含む。
【０１４５】
リピドA誘導体は、OM-174などの大腸菌(Escherichia coli)由来のリピドAの誘導体を含む。OM-174は例えば参考文献32及び33に記載されている。
【０１４６】
本発明におけるアジュバントとしての使用のために好適な免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、CpGモチーフ(リン酸結合によってグアノシンに結合した非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列)を含有するヌクレオチド配列を含む。パリンドローム又はポリ(dG)配列を含有する2本鎖RNA及びオリゴヌクレオチドも免疫賦活性であることが示されている。
【０１４７】
CpGは、ホスホロチオエート修飾などのヌクレオチド修飾/類似体を含むことができ、2本鎖又は1本鎖であってよい。参考文献34、35及び36は、可能性がある類似体置換、例えばグアノシンの2'-デオキシ-7-デアザグアノシンでの置き換えを開示している。CpGオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献37〜38においてさらに考察されている。
【０１４８】
CpG配列は、TLR9に方向付けられてよく、例えばモチーフGTCGTT又はTTCGTTがある(39)。CpG配列は、Th1免疫応答を誘導することに特異的であってよく(例えば、CpG-A ODN)、又はB細胞応答を誘導することにより特異的であってよい(例えば、CpG-B ODN)。CpG-A及びCpG-B ODNは参考文献40〜41において考察されている。好ましくはCpGはCpG-A ODNである。
【０１４９】
好ましくはCpGオリゴヌクレオチドは、5'末端が受容体認識のためにアクセス可能であるように構築される。場合により2つのCpGオリゴヌクレオチド配列は、「イムノマー(immunomer)」を形成するようにそれらの3'末端で結合していてよい。例えば参考文献39及び42〜43を参照されたい。
【０１５０】
有用なCpGアジュバントはCpG7909であり、ProMune(商標)(Coley Pharmaceutical Group, Inc.)としても公知である。もう1つはCpG1826である。CpG配列を使用することに対する代替として又は付加的に、TpG配列を使用でき(44)、これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化CpGモチーフを含まなくてもよい。免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、ピリミジンリッチであってよい。例えば、それは2個以上の連続するチミジンヌクレオチド(例えば、参考文献44に開示のTTTT)を含んでよく、及び/又は>25％チミジン(例えば、>35％、>40％、>50％、>60％、>80％など)を有するヌクレオチド組成を有してよい。例えば、それは2個以上の連続するシトシンヌクレオチド(例えば、参考文献44に開示のCCCC)を含んでよく、及び/又は>25％シトシン(例えば、>35％、>40％、>50％、>60％、>80％など)を有するヌクレオチド組成を有してよい。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化CpGモチーフを含まなくてよい。免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも20個のヌクレオチドを含む。それらは、100個未満のヌクレオチドを含んでもよい。
【０１５１】
免疫賦活性オリゴヌクレオチドなどに基づく特に有用なアジュバントは、IC-31(商標)として公知である(45)。したがって、本発明で使用されるアジュバントは、(i)少なくとも1つの(及び好ましくは複数の)CpIモチーフ(すなわち、ジヌクレオチドを形成するようにイノシンに結合したシトシン)を含むオリゴヌクレオチド(例えば、15個〜40個の間のヌクレオチド)と、(ii)少なくとも1つの(及び好ましくは複数の)Lys-Arg-Lysトリペプチド配列(複数可)を含むオリゴペプチド(例えば、5個〜20個の間のアミノ酸)などのポリカチオン性ポリマーとの混合物を含んでよい。オリゴヌクレオチドは、26マーの配列5'-(IC)13-3'(配列番号51)を含むデオキシヌクレオチドであってよい。ポリカチオン性ポリマーは、11マーのアミノ酸配列KLKLLLLLKLK(配列番号52)を含むペプチドであってよい。
【０１５２】
細菌性ADP-リボシル化毒素及びその解毒誘導体は、本発明においてアジュバントとして使用しうる。好ましくはこのタンパク質は、大腸菌(大腸菌熱不安定性エンテロトキシン「LT」)、コレラ(「CT」)又は百日咳(「PT」)由来である。解毒ADP-リボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用は参考文献46に、及び非経口アジュバントとしての使用は参考文献47に記載されている。毒素又はトキソイドは、好ましくは、A及びBの両方のサブユニットを含むホロ毒素の形態にある。好ましくはAサブユニットは解毒変異を含有しており、好ましくはBサブユニットは変異化されていない。好ましくはアジュバントは、解毒LT変異体、例えばLT-K63、LT-R72及びLT-G192である。ADP-リボシル化毒素及びその解毒誘導体、特にLT-K63及びLT-R72のアジュバントとしての使用は、参考文献48〜49に見出すことができる。有用なCT変異体はCT-E29Hである(50)。アミノ酸置換についての数に関する基準は、好ましくは、参考文献51に記載のADP-リボシル化毒素のA及びBサブユニットのアライメントに基づき、参考文献51は、そのアライメント及びアミノ酸番号付けの目的のためにのみその全体において参照により具体的に本明細書に組み込まれる。
【０１５３】
F.  ヒト免疫調節物質
本発明におけるアジュバントとしての使用のために好適なヒト免疫調節物質は、サイトカイン、例えばインターロイキン(例えば、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(52)など)(53)、インターフェロン(例えば、インターフェロン-γ)、マクロファージコロニー刺激因子及び腫瘍壊死因子を含む。好ましい免疫調節物質はIL-12である。
【０１５４】
G.  生物付着剤(Bioadhesive)及び粘膜付着剤(Mucoadhesive)
生物付着剤及び粘膜付着剤も本発明におけるアジュバントとして使用できる。好適な生物付着剤は、エステル化ヒアルロン酸ミクロスフェアを含み(54)、又は粘膜付着剤、例えばポリ(アクリル酸)、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖及びカルボキシメチルセルロースの架橋結合誘導体を含む。キトサン及びその誘導体も本発明におけるアジュバントとして使用してよい(55)。
【０１５５】
H.  微粒子
微粒子も本発明におけるアジュバントとして使用してよい。生分解性及び無毒性である材料(例えば、ポリ(α-ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど)からポリ(ラクチド-コ-グリコリド)と共に形成される微粒子(すなわち、直径約100nm〜約150μm、より好ましくは直径約200nm〜約30μm、最も好ましくは直径約500nm〜約10μmの粒子)は好ましく、場合により、負に荷電した表面を有するように(例えば、SDSで)、又は正に荷電した表面を有するように(例えば、CTABなどのカチオン性界面活性剤で)処理される。
【０１５６】
I.  リポソーム(参考文献1の13及び14章)
アジュバントとしての使用のために好適なリポソーム製剤の例は参考文献56〜57に記載されている。
【０１５７】
J.  ポリオキシエチレンエーテル及びポリオキシエチレンエステル製剤
本発明における使用のために好適なアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテル及びポリオキシエチレンエステルを含む(58)。そのような製剤は、ポリオキシエチレンソルビタンエステルサーファクタントをオクトキシノールとの組合せで(59)、並びにポリオキシエチレンアルキルエーテル若しくはエステルサーファクタントをオクトキシノールなどの少なくとも1種の追加的非イオン性サーファクタントとの組合せで(60)さらに含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、次の群から選択される: ポリオキシエチレン-9-ラウリルエーテル(ラウレス9)、ポリオキシエチレン-9-ステオリル(steoryl)エーテル、ポリオキシエチレン-8-ステオリルエーテル、ポリオキシエチレン-4-ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン-35-ラウリルエーテル及びポリオキシエチレン-23-ラウリルエーテル。
【０１５８】
K.  ホスファゼン
例えば参考文献61及び62に記載のポリ(ジ(カルボキシラトフェノキシ)ホスファゼン)(「PCPP」)などのホスファゼンは使用してよい。
【０１５９】
L.  ムラミルペプチド
本発明におけるアジュバントとしての使用のために好適なムラミルペプチドの例は、N-アセチル-ムラミル-L-トレオニル-D-イソグルタミン(thr-MDP)、N-アセチル-ノルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミン(nor-MDP)、及びN-アセチルムラミル-L-アラニル-D-イソグルタミニル-L-アラニン-2-(1'-2'-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ヒドロキシホスホリルオキシ)-エチルアミン(MTP-PE)を含む。
【０１６０】
M.  イミダゾキノロン化合物
本発明におけるアジュバントとしての使用のために好適なイミダゾキノロン化合物の例は、イミキモド(「R-837」)(63、64)、レシキモド(「R-848」)(65)及びそれらの類似体、並びにそれらの塩(例えば、塩酸塩)を含む。免疫賦活性イミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献66〜67に見出すことができる。
【０１６１】
N.  置換尿素
アジュバントとして有用な置換尿素は、式I、II若しくはIIIの化合物又はその塩を含む:
【化３】
2015532276.tif 000006
参考文献68に定義のとおり、例えば、「ER 803058」、「ER 803732」、「ER 804053」、「ER 804058」、「ER 804059」、「ER 804442」、「ER 804680」、「ER 804764」、「ER 803022」又は「ER 804057」、例えば:
【化４】
2015532276.tif 000007
【化５】
2015532276.tif 000008
【０１６２】
O.  さらなるアジュバント
本発明で使用しうるさらなるアジュバントは次を含む:
【０１６３】
・アミノアルキルグルコサミニドリン酸誘導体、例えばRC-529(69,70)。
【０１６４】
・チオセミカルバゾン化合物、例えば参考文献71に開示のもの。活性化合物を製剤化、製造及びスクリーニングする方法も参考文献71に記載されている。チオセミカルバゾンは、TNF-αなどのサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。
【０１６５】
・トリプタントリン化合物、例えば参考文献72において開示もの。活性化合物を製剤化、製造及びスクリーニングする方法も参考文献72に記載されている。チオセミカルバゾンは、TNF-αなどのサイトカインの産生のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。
【０１６６】
・ヌクレオシド類似体、例えば: (a)イサトラビン(Isatorabine)(ANA-245、7-チア-8-オキソグアノシン):
【化６】
2015532276.tif 000009
及びそのプロドラッグ、(b)ANA975、(c)ANA-025-1、(d)ANA380、(e)参考文献73〜74に開示の化合物ロキソリビン(7-アリル-8-オキソグアノシン)(75)。
【０１６７】
・参考文献76に開示の化合物、次を含む: アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン(THIQ)化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン(ABIQ)化合物(77、78)、ヒドラフタルアミド(Hydrapthalamide)化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン(Quinazilinone)化合物、ピロール化合物(79)、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン(Pyrazalopyrimidine)化合物及びベンザゾール(Benzazole)化合物(80)。
【０１６８】
・リン酸含有非環式骨格に結合した脂質を含有する化合物、例えばTLR4アンタゴニストE5564(81、82):
【０１６９】
・ポリオキシドニウム(polyoxidonium)ポリマー(83、84)又は他のN-酸化ポリエチレン-ピペラジン誘導体。
【０１７０】
・メチルイノシン5'-モノホスフェート(「MIMP」)(85)。
【０１７１】
・ポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物(86)、例えば、式:
【化７】
2015532276.tif 000010
を有するもの:
[式中、Rは、水素、直鎖状若しくは分枝状、未置換若しくは置換、飽和若しくは不飽和アシル、アルキル(例えばシクロアルキル)、アルケニル、アルキニル及びアリール基を含む群から選択される]又は薬学的に許容されるその塩若しくは誘導体。例は、これだけに限らないが: カスアリン(casuarine)、カスアリン-6-α-D-グルコピラノース、3-エピ-カスアリン、7-エピ-カスアリン、3,7-ジエピ-カスアリンなどを含む。
【０１７２】
・CD1dリガンド、例えばα-グリコシルセラミド(87〜88)(例えば、α-ガラクトシルセラミド)、フィトスフィンゴシン含有α-グリコシルセラミド、OCH、KRN7000((2S,3S,4R)-1-O-(α-D-ガラクトピラノシル)-2-(N-ヘキサコサノイルアミノ)-1,3,4-オクタデカントリオール)、CRONY-101、3''-O-スルホ-ガラクトシルセラミドなど。
【０１７３】
・γイヌリン(89)又はその誘導体、例えばアルガムリン(algammulin)。
【化８】
2015532276.tif 000011
【０１７４】
アジュバントの組合せ
本発明はまた、上で同定したアジュバントの1種以上の態様の組合せを含んでもよい。例えば、次のアジュバント組成物は、本発明において使用してよい: (1)サポニン及び水中油型エマルジョン(90)、(2)サポニン(例えばQS21)+無毒性LPS誘導体(例えば3dMPL)(91)、(3)サポニン(例えばQS21)+無毒性LPS誘導体(例えば3dMPL)+コレステロール、(4)サポニン(例えばQS21)+3dMPL+IL-12(場合により+ステロール)(92)、(5)3dMPLと、例えばQS21及び/又は水中油型エマルジョンとの組合せ(93)、(6)10％スクアラン、0.4％ TWEEN 80(商標)、5％ PLURONIC(商標)-ブロックポリマーL121及びthr-MDPを含有するSAF、サブミクロンエマルジョンにマイクロ流動化されたか、又はより大きな粒径のエマルジョンを生成するようにボルテックスされたかのいずれか。(7)2％スクアレン、0.2％TWEEN 80(商標)並びに、モノホスホリルリピドA(MPL)、トレハロースジミコレート(TDM)及び細胞壁骨格(CWS)からなる群由来の1つ以上の細菌細胞壁成分、好ましくはMPL+CWS(Detox(商標))を含有するRibi(商標)アジュバント系(RAS)(Ribi Immunochem)、並びに(8)1種以上の無機塩(例えば、アルミニウム塩)+LPSの無毒性誘導体(例えば、3dMPL)。
【０１７５】
免疫賦活性薬剤として作用する他の物質は、参考文献1の7章に開示されている。
【０１７６】
水酸化アルミニウム及び/又はリン酸アルミニウムアジュバントの使用は特に好ましく、抗原は一般にこれらの塩に吸着される。リン酸カルシウムは、別の好ましいアジュバントである。他の好ましいアジュバントの組合せは、CpGとアラム又はレシキモドとアラムなどのTh1及びTh2アジュバントの組合せを含む。リン酸アルミニウム及び3dMPLの組合せも使用しうる。
【０１７７】
本発明の組成物は、細胞媒介性免疫応答及び体液性免疫応答の両方を誘発しうる。この免疫応答は、好ましくは、持続性の(例えば中和)抗体と、免疫化された病原体への曝露の際にすぐに応答できる細胞媒介性免疫とを誘導する。
【０１７８】
2種類のT細胞、CD4及びCD8細胞は、細胞媒介性免疫及び体液性免疫を開始する及び/又は増強するために必要であると一般に考えられている。CD8 T細胞は、CD8共受容体を発現でき、一般に細胞傷害性Tリンパ球(CTL)と称される。CD8 T細胞は、MHCクラスI分子に提示された抗原を認識又はこれと相互作用できる。
【０１７９】
CD4 T細胞は、CD4共受容体を発現でき、一般にヘルパーT細胞と称される。CD4 T細胞は、MHCクラスII分子に結合している抗原性ペプチドを認識できる。MHCクラスII分子との相互作用の際に、CD4細胞は、サイトカインなどの因子を分泌しうる。これらの分泌サイトカインは、B細胞、細胞傷害性T細胞、マクロファージ、及び免疫応答に関与する他の細胞を活性化できる。ヘルパーT細胞又はCD4+細胞は、それらのサイトカイン及びエフェクター機能において異なる2つの機能的に異なるサブセット: TH1表現型及びTH2表現型にさらに分類することができる。
【０１８０】
活性化TH1細胞は、細胞性免疫を増強し(抗原特異的CTL産生の増大を含む)、したがって、細胞内感染に対する応答において特に有用である。活性化TH1細胞は、IL-2、IFN-γ及びTNF-βの1つ以上を分泌しうる。TH1免疫応答は、マクロファージ、NK(ナチュラルキラー)細胞及びCD8細胞傷害性T細胞(CTL)を活性化することによって局所炎症性反応を生じうる。TH1免疫応答はまた、IL-12でB及びT細胞の増殖を刺激することによって免疫応答を拡大するように作用しうる。TH1によって刺激されたB細胞はIgG2aを分泌しうる。
【０１８１】
活性化TH2細胞は、抗体産生を増強し、したがって、細胞外感染に対する応答において特に有用である。活性化TH2細胞は、IL-4、IL-5、IL-6及びIL-10の1つ以上を分泌しうる。TH2免疫応答は、将来の防御のためのIgG1、IgE、IgA及びメモリーB細胞の産生をもたらしうる。
【０１８２】
増強された免疫応答は、増強されたTH1免疫応答及びTH2免疫応答の1つ以上を含みうる。
【０１８３】
TH1免疫応答は、CTLの増大、TH1免疫応答に関連するサイトカイン(例えば、IL-2、IFN-γ及びTNF-β)の1種以上の増大、活性化マクロファージの増大、NK活性の増大又はIgG2aの産生の増大のうちの1つ以上を含みうる。好ましくは、増強されたTH1免疫応答は、IgG2a産生の増大を含む。
【０１８４】
TH1免疫応答は、TH1アジュバントを使用して誘発されうる。TH1アジュバントは、アジュバントを含まない抗原の免疫処置と比較して、IgG2a産生のレベルの増大を一般に誘発する。本発明における使用のために好適なTH1アジュバントは、例えば、サポニン製剤、ビロソーム及びウイルス様粒子、腸内細菌リポ多糖(LPS)の無毒性誘導体、免疫賦活性オリゴヌクレオチドを含みうる。CpGモチーフを含有するオリゴヌクレオチドなどの免疫賦活性オリゴヌクレオチドは、本発明における使用のための好ましいTH1アジュバントである。
【０１８５】
TH2免疫応答は、TH2免疫応答に関連するサイトカイン(例えば、IL-4、IL-5、IL-6及びIL-10)の1種以上の増大、又はIgG1、IgE、IgA及びメモリーB細胞の産生の増大のうちの1つ以上を含みうる。好ましくは、増強されたTH2免疫応答は、IgG1産生の増大を含む。
【０１８６】
TH2免疫応答は、TH2アジュバントを使用して誘発されうる。TH2アジュバントは、アジュバントを含まない抗原の免疫処置と比較して、IgG1産生のレベルの増大を一般に誘発する。本発明における使用のために好適なTH2アジュバントは、例えば無機物含有組成物、油エマルジョン並びにADP-リボシル化毒素及びその解毒誘導体を含む。アルミニウム塩などの無機物含有組成物は、本発明における使用のための好ましいTH2アジュバントである。
【０１８７】
好ましくは、本発明は、TH1アジュバント及びTH2アジュバントの組合せを含む組成物を含む。好ましくは、そのような組成物は、増強されたTH1及び増強されたTH2応答、すなわちアジュバントを含まない免疫処置と比較して、IgG1及びIgG2a産生の両方の産生の増大を誘発する。さらにより好ましくは、TH1及びTH2アジュバントの組合せを含む組成物は、単一のアジュバントでの免疫処置と比較して(すなわち、TH1アジュバント単独での免疫処置又はTH2アジュバント単独での免疫処置と比較して)、増大したTH1及び/又は増大したTH2の免疫応答を誘発する。
【０１８８】
免疫応答は、TH1免疫応答及びTH2応答の1つ又は両方であってよい。好ましくは、免疫応答は、増強されたTH1応答及び増強されたTH2応答の1つ又は両方を提供する。
【０１８９】
増強された免疫応答は、全身性及び粘膜性免疫応答の1つ又は両方であってよい。好ましくは、免疫応答は、増強された全身性及び増強された粘膜性免疫応答の1つ又は両方を提供する。好ましくは、粘膜性免疫応答は、TH2免疫応答である。好ましくは、粘膜性免疫応答は、IgAの産生の増大を含む。
【０１９０】
医薬組成物
本発明の一態様は、(a)本明細書に開示の糖コンジュゲート、(b)薬学的に許容される担体、及び場合により(c)先行する節に記載のアジュバントを含む医薬組成物を含む。
【０１９１】
本発明の組成物は、種々の形態に調製されてよい。例えば、組成物は、注射可能な、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして調製されてよい。注射前の液体ビヒクル中の溶液に又は懸濁液に好適な固体形態も調製できる(例えば、凍結乾燥組成物又はスプレー凍結乾燥組成物)。組成物は、局所投与のための、例えば、軟膏、クリーム又は粉剤として調製してよい。組成物は、経口投与のために、例えば、錠剤若しくはカプセルとして、スプレー剤として又はシロップ剤として(場合により風味付けて)調製してよい。組成物は、経肺投与のために、例えば、微粉末又はスプレーを使用する吸入剤として調製してよい。組成物は、座薬又は膣座薬として調製してよい。組成物は、経鼻、経耳又は眼内投与のために、例えば、滴下剤として調製してよい。組成物は、組み合わせた組成物が患者への投与の直前に再構築されるように設計されたキット形態であってよい。そのようなキットは、液体形態にある1種以上の抗原及び1種以上の凍結乾燥抗原を含んでよい。
【０１９２】
組成物が使用前に即時調製され(例えば、成分が凍結乾燥形態で提供される場合)、キットとして提供される場合、キットは2つのバイアルを含んでよく、又は1つの充填済みシリンジ及び1つのバイアルを含み、注射の前にシリンジの内容物を使用してバイアルの内容物を再活性化してもよい。
【０１９３】
ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原(複数可)(例えば、多糖及び/又は担体タンパク質)並びに任意の他の成分を必要に応じて含む。「免疫学的有効量」は、単一投与における又は一連の一部としての、個体へのその量の投与が、治療又は予防に有効であることを意味する。この量は、治療される個体の健康及び全身状態、年齢、治療される個体の分類学的群(例えば、非ヒト霊長類、霊長類など)、抗体を合成する個体の免疫系の能力、望ましい防御の程度、ワクチンの剤型、医学的状態の主治医の判断及び関連する他の要因に応じて変動する。量は、日常的検査を通じて決定できる比較的広い範囲にあることが予測される。
【０１９４】
治療方法及びワクチン投与
本発明はまた、本発明の組成物の有効量を投与するステップを含む、哺乳動物において免疫応答を生じさせる方法を提供する。免疫応答は、好ましくは防御的であり、好ましくは抗体及び/又は細胞媒介性免疫を伴う。本方法は、追加免疫応答を生じさせうる。
【０１９５】
本発明はまた、医薬としての使用のため、例えば、哺乳動物において免疫応答を生じさせるのに使用するための本発明のペプチドを提供する。
【０１９６】
本発明はまた、哺乳動物において免疫応答を生じさせるための医薬の製造における本発明のペプチドの使用を提供する。
【０１９７】
本発明はまた、本発明の免疫原性組成物を予め充填された送達デバイスを提供する。
【０１９８】
グルカン(特にβ-グルカン)は、ほとんどすべての病原性真菌、特に免疫不全被験体における感染に関与するもの並びに細菌性病原体及び原虫においても不可欠で主要な多糖成分であることから、抗グルカン免疫は幅広い病原体及び疾患に対して有効でありうる。例えば、出芽酵母(S. cerevisiae)での免疫処置後に生じる抗グルカン血清は、C.アルビカンスと交差反応性である。これらのヒト感染性真菌病原体について、化学療法が不十分であり、抗真菌剤耐性が出現し、防御的及び治療用ワクチンに対する必要性がますます認識されていることから、幅広いスペクトルの免疫は特に有用である。
【０１９９】
したがって、本明細書で開示する多糖コンジュゲートの多糖免疫原がグルカンである場合、本明細書で開示するグルカン多糖コンジュゲートの使用及び方法は、以下の感染に対する治療/予防のために特に有用である: カンジダ種、例えばC.アルビカンス; クリプトコッカス種、例えばC.ネオフォルマンス(C. neoformans); エンテロコッカス種、例えばフェカリス菌; 連鎖球菌種、例えば肺炎球菌、S.ミュータンス(S. mutans)、S.アガラクチア及び化膿性連鎖球菌; リーシュマニア種、例えば森林型リーシュマニア(L. major); アカントアメーバ種、例えばA.カステラーニ(A. castellani); アスペルギルス種、例えばA.フミガーツス(A. fumigatus)及びA.フラバス(A. flavus); ニューモシスチス種、例えばP.カリニ(P. carinii); マイコバクテリウム種、例えば結核菌; シュードモナス種、例えば緑膿菌; スタフィロコッカス種、例えば黄色ブドウ球菌; サルモネラ種、例えばネズミチフス菌(S. typhimurium); コクシジオイデス種、例えばC.イミチス(C. immitis); トリコフィトン種、例えばT.ベルコースム(T. verrucosum); ブラストミセス種、例えばB.デルマチジス(B. dermatidis); ヒストプラズマ種、例えばH.カプスラーツム(H. capsulatum); パラコクシジオイデス種、例えばP.ブラジリエンシス(P. brasiliensis); フィチウム種、例えばP.インシジオスム(P. insidiosum); 及びエシェリキア種、例えば大腸菌。
【０２００】
本使用及び方法は、これだけに限らないが、以下を含む疾患を予防する/治療するために特に有用である: カンジダ症(肝脾カンジダ症、侵襲性カンジダ症、慢性粘膜皮膚カンジダ症及び播種性カンジダ症を含む)、カンジダ血症、アスペルギルス症、クリプトコッカス症、皮膚真菌症、スポロトリクス症及び他の皮下真菌症、ブラストミセス症、ヒストプラズマ症、コクシジオイデス症、パラコクシジオイデス症、ニューモシスチス症、鵞口瘡、結核、マイコバクテリア症、呼吸器感染、猩紅熱、肺炎、膿痂疹、リウマチ熱、敗血症、敗血症(septicaemia)、皮膚及び内臓リーシュマニア、角膜アカントアメーバ症、嚢胞性線維症、腸チフス熱、胃腸炎及び溶血性尿毒症症候群。抗C.アルビカンス活性は、AIDS患者において感染症を治療するために特に有用である。
【０２０１】
免疫処置の有効性は、組成物投与後のβ-グルカンに対する免疫応答(例えば、抗β-グルカン抗体)をモニタリングすることによって検査できる。治療的処置の有効性は、本発明の組成物の投与後の微生物感染をモニタリングすることによって検査できる。
【０２０２】
哺乳動物は、好ましくはヒトであるが、例えばウシ、ブタ、ネコ又はイヌであってもよい。大腸菌疾患がこれらの種においても問題であるからである。明細書は哺乳動物及び哺乳動物被験体に言及するが、本明細書で開示の多糖コンジュゲートは、鳥類、例えばニワトリ及びアヒルについても有用であり、したがって、哺乳動物又は哺乳類の動物について本明細書で引用されているどの場合でも、鳥類も含まれうる。ワクチンが予防的使用のためである場合、ヒトは好ましくは小児(例えば、幼児若しくは乳児)又はティーンエイジャーであり、ワクチンが治療的使用のためである場合、ヒトは好ましくはティーンエイジャー又は成人である。小児用ワクチンはまた、例えば安全性、用量、免疫原性などを評価するために成人に投与してもよい。
【０２０３】
治療的処置の有効性を調べる1つの方法は、本発明の組成物の投与後の大腸菌感染をモニタリングすることを含む。予防的処置の有効性を調べる1つの方法は、組成物の投与後に、本発明の組成物中の抗原に対する免疫応答を、全身的(例えば、IgG1及びIgG2a産生のレベルのモニタリング)及び/又は粘膜的(例えば、IgA産生のレベルのモニタリング)にモニタリングすることを含む。典型的には、抗原特異的血清抗体応答は免疫処置後でチャレンジ前に決定されるが、一方、抗原特異的粘膜抗体応答は免疫処置後でチャレンジ後に決定される。
【０２０４】
本発明の組成物の免疫原性を評価する別の方法は、免疫ブロット及び/又はマイクロアレイによって患者血清又は粘膜分泌物をスクリーニングするためにタンパク質を組換え的に発現させることである。タンパク質と患者試料との間の陽性反応は、患者が問題のタンパク質に対する免疫応答を開始していることを示す。この方法はまた、抗原中の免疫優性抗原及び/又はエピトープを同定するために使用してもよい。
【０２０５】
ワクチン組成物の有効性はまた、大腸菌感染の動物モデル、例えばモルモット又はマウスをワクチン組成物でチャレンジすることによってin vivoで決定できる。ExPEC及び致死性敗血症のマウスモデルは、参考文献94に記載されている。コットンラットモデルは参考文献95に開示されている。
【０２０６】
本発明の組成物は、一般に患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射によって(例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内若しくは組織の間質腔に)、又は粘膜によって、例えば直腸、経口(例えば、錠剤、スプレー剤)、膣内、局所、経皮(transdermal)若しくは経皮(tran scutaneous)、鼻腔内、眼内、経耳、経肺、若しくは他の粘膜投与によって達成される。新規直接送達形態はまた、本明細書に開示のペプチドの食品中でのトランスジェニック発現、例えばジャガイモでのトランスジェニック発現を含みうる。
【０２０７】
本発明は、全身性及び/又は粘膜性免疫を誘発するため、好ましくは増強された全身性及び/又は粘膜性免疫を誘発するために使用してよい。
【０２０８】
好ましくは、増強された全身性及び/又は粘膜性免疫は、増強されたTH1及び/又はTH2免疫応答に反映される。好ましくは、増強された免疫応答は、IgG1及び/又はIgG2a及び/又はIgAの産生の増大を含む。
【０２０９】
投薬は、単回投与スケジュール又は複数回投与スケジュールによってであってよい。複数回投与は、初回免疫処置スケジュール及び/又は追加免疫処置スケジュールにおいて使用してよい。複数回投与スケジュールでは、種々の用量が同じ又は異なる経路、例えば非経口初回及び粘膜追加、粘膜初回及び非経口追加などによって与えられてよい。複数回投与は少なくとも1週間(例えば、約2週間、約3週間、約4週間、約6週間、約8週間、約10週間、約12週間、約16週間など)離して典型的には投与される。
【０２１０】
本発明のワクチンは、小児及び成人の両方を治療するために使用しうる。したがって、ヒト患者は、1歳未満、1〜5歳、5〜15歳、15〜55歳又は少なくとも55歳であってよい。ワクチンを受けるために好ましい患者は、高齢者(例えば、≧50歳、≧60歳及び好ましくは≧65歳)、若年者(例えば、≦5歳)、入院患者、医療従事者、軍務及び軍関係者、妊婦、慢性疾患若しくは免疫不全患者である。しかし、ワクチンは、これらの群だけに好適であるのではなく、集団においてより一般的に使用してもよい。
【０２１１】
本発明のワクチンは、外科手術を予定している患者又は他の入院患者について特に有用である。それらはまた、カテーテルを挿入される患者において有用である。それらはまた、青年期女性(例えば、11〜18歳)及び慢性尿路感染症を有する患者において有用である。
【０２１２】
本発明のワクチンは、他のワクチンと実質的に同時に(例えば、同じ受診又は医療専門家若しくはワクチン接種センターへの訪問の際に)、例えば、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、MMRワクチン、水痘ワクチン、MMRVワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、DTPワクチン、コンジュゲートインフルエンザ菌b型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、B型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌コンジュゲートワクチン(例えば、四価A-C-W135-Yワクチン)、呼吸器合胞体ウイルスワクチンなどと実質的に同時に患者に投与されてよい。
【０２１３】
全般
本発明の実施は、他に示す場合を除いて、当業者の技能の範囲内にある化学、生化学、分子生物学、免疫学及び薬理学の従来法を使用する。そのような技術は、文献に完全に説明されている。例えば参考文献96〜97などを参照されたい。
【０２１４】
用語「含む(comprising)」は「含む(including)」及び「からなる(consisting)」を包含し、例えば、Xを「含む」組成物は、Xのみからなるか、又は何かを追加的に含み、例えばX+Yであってよい。
【０２１５】
数値xに関連して用語「約(about)」は、例えばx±10％を意味する。
【０２１６】
「GI」番号付けが本明細書において使用される。GI番号又は「GenInfo識別子(GenInfo Identifier)」は、配列がデータベースに追加される際にNCBIによって処理される各配列記録に連続的に割り当てられる一連の数字である。GI番号は、配列記録の受託番号に何の類似性も有さない。配列が更新される(例えば、修正のため、又はさらなるアノテーション若しくは情報の追加のため)際は、新たなGI番号を受ける。したがって所与のGI番号と関連する配列は、変更されない。
【０２１７】
2つのアミノ酸配列間の配列同一性百分率への言及は、アライメントの際に、2つの配列を比較して同じであるアミノ酸の百分率を意味する。このアライメント及び相同性百分率又は配列同一性は、当技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば参考文献98の節7.7.18に記載のものを使用して決定できる。好ましいアライメントは、gapオープンペナルティー12及びgap伸長ペナルティー2、BLOSUMマトリクス62でアフィンgap検索を使用するSmith-Waterman相同性検索アルゴリズムによって決定される。Smith-Waterman相同性検索アルゴリズムは参考文献99に開示されている。
【０２１８】
当業者は「単離された」が「人の手によって」その天然の状態から変更されたことを意味し、すなわち天然に存在する場合、その元の環境から変更されている若しくは回収されていること又はその両方を意味することを理解する。例えば、生きている生物に天然に存在するポリヌクレオチド又はペプチドは、そのような生きている生物中にある場合は「単離されて」いないが、その天然状態の共存材料から分離された同じポリヌクレオチド又はペプチドは、該用語が本開示で使用される場合、「単離されて」いる。さらに、形質転換、遺伝子操作によって又は任意の他の組換え方法によって生物に導入されるポリヌクレオチド又はペプチドは、そのような形質転換、遺伝子操作又は他の組換え方法が天然に存在する生物から他に識別不能である生物を産生する場合を除いて、それがまだ前記生物(その生物は生きていても、生きていなくても)中に存在する場合でも「単離されて」いると理解される。
【実施例】
【０２１９】
概説
髄膜炎菌疾患は、その非常に急速な発症及び進行のために、著しい公衆衛生の注目を受けている; 疾患は数時間の内に致死的でありうる。表面多糖は、長い間、主要な疾患を引き起こす髄膜炎菌血清群A、C、W-135及びYに対するワクチンのための鍵となる抗原であった[Bardotti, A. et al. Vaccine, 2008, 26(18), 2284〜2296、Broker, M. et al. Vaccine, 2009, 27(41), 5574〜5580、Fusco, P.C. et al. Clin Vaccine Immunol. 2007, 14(5), 577〜584.]。担体タンパク質への多糖のコンジュゲーションは、重要な公衆衛生の利益を付与し、その免疫原性を改善し、T細胞依存性(TD)応答の誘導を可能にする[Pollard, A.J. et al. Nat. Rev. Immunol. 2009, 9(3), 213〜220、Ada, G. et al. Clin. Microbiol. Infect. 2003, 9(2), 79〜85]。したがって、髄膜炎菌血清群由来の糖は、本明細書に開示のコンジュゲートの例示のための例示的糖を提供する。非直鎖状コンジュゲート及びPV1ポリエピトープコンジュゲートを調査するために、本発明者らは、担体タンパク質全体が直鎖状又は非直鎖状コンジュゲーションのいずれかを伴って合成T細胞エピトープペプチドで置換された場合の糖コンジュゲートの免疫学的特性を研究した。
【０２２０】
下に記載のとおり、ペプチドの第一のパネルを、それらのC末端で髄膜炎菌血清群C由来オリゴ糖にコンジュゲートした。ペプチドは、カンジダ・アルビカンスの細胞壁タンパク質由来[Xin, H. et al. PNAS 2008, 105, 13526〜13531]及びN19ポリエピトープ担体ペプチドにおいて使用された破傷風毒素エピトープ由来[Baraldo, K. et al. Infect. Immun. 2004, 72, 4884〜4887]であった。ペプチドを2つの異なる髄膜炎菌血清群C糖にコンジュゲートした: オリゴ糖(オリゴMenC)及び多糖(ポリMenC)。いずれのコンジュゲート(アジュバントとしての水酸化アルミニウムを含んで又は含まずに製剤化した)も糖に対するIgG応答を誘導しなかった。ポリMenC-Fbaコンジュゲート及びポリMenC-Met6コンジュゲートだけがペプチドに対するIgG応答を誘導した(両者ともカンジダ・アルビカンスの細胞壁タンパク質由来)。
【０２２１】
コンジュゲートの免疫原性及びコンジュゲートは、すべてのペプチドが同じエピトープであるか、又は糖に結合した異なるエピトープが存在するかに関わらず、いくつかのパラメーター、例えばペプチドのN末端対C末端での又は付近でのペプチドの結合、糖鎖にロードしているペプチドの程度、リンカー又はスペーサーの長さによって影響を受けうる[例えば、Chong, P. et al. Infection and Immunity, 1997, 65, 4918〜4925を参照されたい]。これらのすべてのパラメーターは、下の実施例において評価されたが、関係があると証明されたパラメーターはなかった(最初のセットの実験のために選択されたペプチドが、T細胞エピトープとしての低い免疫原性だけを示したためであると考えらえた)。ペプチドの第二のパネルの試験から、本発明者らは、タンパク質ポリオウイルス1型由来のPV1ペプチドが、伝統的担体タンパク質についての特に有効な代替物であり、特に、そのN末端で結合したPV1ペプチドが従来の担体タンパク質: MenC-CRMコンジュゲートに匹敵する抗体力価を誘導したことを発見した。
【０２２２】
さらに、オボアルブミンタンパク質(OVA)由来のペプチドがまた、多糖GBS III型のための有効な担体ペプチドであることが示されていることから[Avci1, F.Y. et al. Nature Medicine, 2011, 17, 1602〜1610]、本発明者らは、そのペプチドが、髄膜炎菌多糖血清群C、W-135及びYコンジュゲートなどの伝統的な担体タンパク質全体-糖コンジュゲートを置換できることを下の実施例において実証した。下の免疫学的評価は、Ovaペプチドが血清群C由来の髄膜炎菌多糖のための良い担体であったが、血清群W-135及びY由来の髄膜炎菌多糖のためにはあまり好ましくなかったことを示している。
【０２２３】
序論
初回の実験のために、T細胞エピトープを直鎖状コンジュゲートとして血清群C由来髄膜炎菌オリゴ糖に、及び非直鎖状コンジュゲートとして血清群C由来髄膜炎菌多糖にコンジュゲートした。本発明者らは、N19ポリエピトープ担体ペプチド、異なる病原体由来の複数のCD4+T細胞エピトープを有して設計された組換えペプチドからのT細胞エピトープ選択された2つの破傷風由来ペプチド(P30TT及びP32TT)を使用した。本発明者らは、カンジダ・アルビカンスの細胞壁タンパク質由来の5つのペプチド(Hpw1、Eno1、Gap1、Fba、Met6)も試験した。
【０２２４】
これらの合成ペプチドは、外部研究所から購入した。ペプチドを、糖への結合のためにC末端にペプチドリンカーと共に合成した。
【０２２５】
これらの実施例において使用するP30TT及びP32TTペプチドは、N19ペプチド中に見出される破傷風毒素エピトープ由来であった。N19ペプチドは、大腸菌で発現され、いくつかのヒトCD4+T細胞ユニバーサルエピトープからなる遺伝子操作されたポリエピトープ担体ペプチドであり、Hib多糖にコンジュゲートされた場合に強い担体として挙動する。ヒト細胞でのin vitro研究は、N19ペプチド中のこれらのエピトープが正しくプロセス及び認識され、エピトープ特異的T細胞増殖を誘導できたことを示した。続く研究は、エピトープ(P32TT、P30TT、P23TT)に特異的なT細胞前駆体が、N19-MenACWYコンジュゲートでの免疫処置後にマウスにおいてin vivoで生成されたことを示した; 他の結果は、マウス抗原提示細胞がin vitroでN19ペプチドをプロセスでき、正確なエピトープを生成でき、それにより単一ペプチドでのin vivo免疫処置によって初回刺激された特異的T細胞を再活性化できたことを明確に実証した[Baraldo, K. et al. Infect Immun. 2005, 73(9), 5835〜5841]。
【０２２６】
この最初のセットの実施例のための追加的ペプチドは、ヒト播種性カンジダ症の病態形成の際のそれらの公知の発現に基づいて、菌糸壁タンパク質-1(Hpw1)、エノラーゼ(Eno1)、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(Gap1)、フルクトース-ビスホスフェートアルドラーゼ(Fba)及びメチルテトラヒドロプテロイルトリグルタメート(Met6)を含むカンジダ・アルビカンス細胞壁タンパク質から選択された。抗原-パルス樹状細胞(DC)に基づくワクチン戦略を使用するマウス免疫処置後、各合成ペプチドに結合された合成β-1,2-結合マンノトリオースを含むコンジュゲートは免疫原性であった; さらにワクチン接種は、実験的播種性カンジダ症に対する防御を示した[Xin, H. et al. PNAS, 2008, 105, 13526〜13531]。さらなる研究は、これらすべてのペプチド間で、Fbaだけがカンジダ症に対する抗体応答及び防御を誘導したことを示した。
【０２２７】
この最初のセットの実験のために、本発明者らは、av DP18(平均的程度の重合)を有するオリゴ糖、並びに細菌から抽出及び精製された髄膜炎菌血清群C由来の天然多糖(全長)を使用した。
【０２２８】
一価髄膜炎菌血清群Cコンジュゲートワクチンは、世界中の多くの国々に良好に導入されており、Menjugate(登録商標)及びMeningitec(商標)(担体タンパク質がCRM197である)、又はNeisVac-C(商標)(担体がTTである)又はMenitorix(登録商標)(MenCがHibとの組合せでTTにコンジュゲートされている)がある[Trotter, C.L. et al. Lancet, 2004, 364(9431), 365〜7、Balmer, P. et al. J Med Microbiol, 2002, 51(9), 717〜22]。さらに、血清群A、C、W135及びYを網羅する四価コンジュゲートワクチンが開発されており、世界中での髄膜炎の発症率を強力に低減することに貢献している。現在商業的に入手できる四価髄膜炎菌コンジュゲートワクチン、Menactra(商標)、Menveo(登録商標)及びNimenrix(商標)は、糖鎖長、担体タンパク質(それぞれ、DT、CRM197及びTT)並びにコンジュゲーション化学について異なっている[Gasparini, R. and Panatto, D. Human Vaccines 2011, 7(2), 170〜82、Jackson, L.A. et al. Clin Infect Dis 2009, 49(1), 1〜10、Reisinger, K.S. et al. Clin Vaccine Immunol 2009, 16(12),1810〜5、Halperin, S.A. et al. Vaccine 2010, 28(50), 7865〜72]。したがって、本発明のコンジュゲートと比較できる、伝統的担体タンパク質にコンジュゲートした髄膜炎菌血清群C糖に関する豊富なデータがある。
【０２２９】
第二のセットの実験は、糖ペプチドの免疫原性に影響を与えうるいくつかの特徴、例えば、N末端に結合したペプチド対C末端に結合したペプチド、糖鎖に結合したペプチドの密度、ペプチドを糖にコンジュゲートするためのさまざまなリンカー長、同じ糖鎖に結合した異なるエピトープを有するペプチドの使用を評価して実施した。これらのパラメーターが本明細書に開示のコンジュゲートの免疫原性にどのように影響を与えるかに関して、当業者に追加的ガイダンスを提供できるかなりの量の文献がある。例えば、インフルエンザ菌B型糖コンジュゲートで得られた結果は、T細胞エピトープに対する糖部分の方向が、糖に対する宿主免疫応答に影響を与えうることを示唆した。ペプチドのC末端で糖に結合しているペプチドを有する糖コンジュゲートは、ペプチドのN末端で結合しているそれらの位置的異性体よりも5〜10分の1の低い抗糖抗体応答を誘導した[Chong, P.  et al. Infection and Immunity, 1997, 65, 4918〜4925]。これらの結果は、T細胞エピトープのN末端にコンジュゲートされた肺炎球菌の多糖が、ペプチドのC末端で結合したPSを有するコンジュゲートによって誘発されるよりも顕著に高い抗PS抗体応答を誘発した、Alonso De Velascoの研究によって支持された。C末端にPSを有するコンジュゲートに関する免疫原性における差異は、PSからT細胞エピトープ(C末端)を効率的に切断し、主要組織適合性複合体(MHC)クラスII分子の関連においてそれをヘルパーT細胞に提示する抗原提示細胞の能力が欠如しているためであった[De Velasco, E.A. et al. Infection and Immunity, 1995, 63, 961〜968]。
【０２３０】
糖ペプチドのワーキングモデルについての研究は、この後者のコンジュゲートが、クラスII MHC分子に結合でき、特異的T細胞応答を誘発したことを示した。実際に、糖ペプチドに対する特異的T細胞ハイブリドーマを生成できたが、対応する非グリコシル化ペプチドに対してはできなかった。さらに、糖質部分はT細胞によって認識される決定基に重要な立体構造的影響を有した; T細胞は糖質の影響下でペプチド残基を認識し、ペプチド中のハプテンの位置はT細胞認識に対して決定的であった。また、糖ハプテンとペプチドとの間の距離は免疫原性に影響を与えることができた[Harding, C.V. et al. The Journal of Immunology, 1993, 151, 2419〜2425]。
【０２３１】
このバックグラウンドを考慮して、本発明者らは、B細胞(糖)とT細胞エピトープ(ペプチド)との間の距離を低減させるために、さまざまな長さのリンカーを有するコンジュゲートを試験した。
【０２３２】
ペプチドローディングに関して、インフルエンザ菌B型コンジュゲートでは、著者らは、ポリリジン骨格系でのペプチド抗原の複数コピーの提示(MAP)の系がその免疫原性を増強できたことを記載している; そのため、複数のT細胞エピトープがMHCクラスII遺伝子的制限を克服するために構築物に組み込まれた。これらの研究は、MAP系が直鎖状ペプチドの代わりに担体として使用された場合に、糖ペプチドの免疫原性を増強できることを示した[Chong, P. et al. Infection and Immunity, 1997, 65, 4918〜4925]。
【０２３３】
これに基づいて、本発明者らは、より高いペプチドローディングを可能にし、異なるペプチドが、同じ糖についてであるが、N19ペプチドなどのポリエピトープ担体ペプチドとは違って異なるペプチドについて結合されることを可能にする非直鎖状コンジュゲート形態で、ペプチドが多糖鎖に結合されているコンジュゲートを調製した。
【０２３４】
このセットの実験では、本発明者らはまた、N19ペプチドにおいて使用された破傷風毒素エピトープからの別のペプチドであるP2TTペプチド[Baraldo, K. et al. Infect. Immun. 2004, 72, 4884〜4887]4及びポリオウイルス1型のVP1タンパク質のT細胞エピトープとして同定されたPV1ペプチド[Leclerc, C. et al. Journal of Virology, 1991, 65, 711〜718.]を含む、他の合成T細胞エピトープペプチドを試験した。がんワクチン研究の分野では、PV1ペプチドは、Tn抗原、グリコシド腫瘍マーカーにコンジュゲートされた樹状複数抗原糖タンパク質(MAG)構造において使用されている。MAG:Tn-PVは、ヒト腫瘍細胞株を認識した抗Tn IgG抗体を誘導でき、この完全合成免疫原で実施された治療的免疫処置プロトコールは、腫瘍保有マウスの生存率を増大させた[Bay, S. et al. J. Peptide Res. 1997, 49, 620〜625、Lo-Man, R. et al. Cancer Research, 1999, 59, 1520〜1524]。
【０２３５】
最後に、実施例は、髄膜炎菌多糖血清群W-135、Y及びCなどの糖にコンジュゲートされた伝統的な担体タンパク質全体を置き換えるオボアルブミンタンパク質由来Ovaペプチドの免疫学的能力を実証する。実際に、Avcil et al.は、このOvaペプチドが多糖GBS III型についての良好な担体であることを示した[Avci1, F.Y. et al. Nature Medicine, 2011, 17, 1602〜1610]。
【０２３６】
Avcil et al.は、多糖GBS III型-OVApワクチンの免疫応答を、いくつかのワクチンの工業的製造において現在使用されている技術によって構築された多糖GBS III型-OVA糖コンジュゲートのものと比較した。研究は、糖質特異的T細胞エピトープの提示を最大化するように構築されたIII-Ovapが、ワクチン産業によって現在使用されている方法によって構築されたワクチンと比較して、B群連鎖球菌感染の新生仔マウスモデルにおいて50〜100倍強力であり、実質的により防御的であったことを示した[Avci, F.Y. and Kasper, D.L. Annu. Rev. Immunol. 2010, 28, 107〜130、Paoletti, L.C. and Kasper, D.L. Expert Opin. Biol. Ther. 2003, 3(6), 975〜984]。
【０２３７】
結果
C末端方向でのT細胞エピトープペプチドのスクリーニング: 物理化学的特徴付け及びマウスモデルにおける免疫学的評価
コンジュゲートの有効性を実証するために、本発明者らは、さまざまな供給源に由来するT細胞エピトープを含有し、かつ、ペプチドの空間的方向、糖鎖上のペプチドの密度及び様々な種類のペプチドの複数提示(multipresentation)などの免疫原性に影響を与えうるいくつかの特質を組み合わせた、合成ペプチドを試験した。
【０２３８】
最初のセットの実験では、7種のペプチドが選択された: その2つは破傷風毒素由来であり、かつ、N19ペプチドにおいて使用されたエピトープであり、その5つはカンジダ・アルビカンスの細胞壁タンパク質由来のエピトープであった。
【０２３９】
【表２】
2015532276.tif 000012
【０２４０】
これらのペプチドは、C末端に糖抗原を導入するための遊離チオール基(Gly-Gly-Cys)を備えたリンカーを含有して外部研究所から購入した。それらは、逆相HPLCによる精製後に少なくとも85％の純粋な産生物として供給された。
【０２４１】
糖は、血清群C由来髄膜炎菌オリゴ糖avDP 18(コンジュゲートにおける使用のため)及び血清群C由来髄膜炎菌多糖(コンジュゲートにおける使用のため)であった。それらの天然鎖は、反復単位としてのシアル酸分子の会合によって特徴付けられる(例えば図3を参照されたい)。
【０２４２】
コンジュゲートは、さまざまなペプチドをコンジュゲート(「オリゴMenC」)のためのオリゴ糖に、及びコンジュゲート(「ポリMenC」)のための多糖にコンジュゲートすることによって調製し、2種の異なる構造: 直鎖状コンジュゲート又は非直鎖状コンジュゲートを得た。オリゴMenC-ペプチドコンジュゲートは、糖が還元末端だけでリンカーで誘導体化されたことから、オリゴ糖とペプチドエピトープとの間での1:1モル比を有するとして特徴付けられる直鎖状コンジュゲートとして合成された。ポリMenC-ペプチドコンジュゲートは、糖鎖に沿ったシアル酸分子のカルボキシル基でのリンカーの導入のために、天然多糖鎖に沿って結合したペプチドエピトープによって特徴付けられる非直鎖状コンジュゲートとして合成された(例えば図4を参照されたい)。
【０２４３】
オリゴMenCコンジュゲート
還元アミノ化後に、髄膜炎菌オリゴ糖血清群Cを、スルホ-EMCS(N-ε-マレイミドカプロイル-オキシスルホスクシンイミドエステル)リンカーで誘導体化した。したがって、各ペプチドの遊離チオール基と反応できるマレイミドを糖鎖の還元末端に導入した(図5)。
【０２４４】
誘導体化後のオリゴ糖をアセトンでの沈殿によって精製し、次いで1H NMRによって特徴付け、還元末端でのマレイミド部分の導入を確認した(図6)。
【０２４５】
誘導体化及び一晩のコンジュゲーション後、コンジュゲーション反応をSDS-Page 4〜12％ Bis-Tris(例えば図7を参照されたい)によって確認した。そのC末端を通じて結合したそれぞれ異なるペプチドを有する全部で7種のオリゴMenCコンジュゲートを得た。
【０２４６】
コンジュゲートを、遊離ペプチドを除去するためのプレパックSuperdexペプチドカラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーと、それに続く遊離糖を除去するための硫酸アンモニウムでの沈殿によって精製した。
【０２４７】
精製した糖ペプチドをJupiter C18カラムを使用するRP-HPLC分析によって特徴付けた(図8)。オリゴMenC-Met6コンジュゲートについての例示的HPLCプロファイルを1例だけ含む。すべてのコンジュゲートは類似のプロファイルを示した。
【０２４８】
HPLCプロファイルに示すとおり、コンジュゲーション後のオリゴMenCコンジュゲートは、それがオリゴMenCよりも長時間だがペプチドよりも短時間カラムに保持されたことから(ピンク線)、ペプチドとオリゴMenC単独との中間的挙動を示した。
【０２４９】
精製後、タンパク質含有量を、マイクロBCA比色分析アッセイによって、及びシアル酸含有量をレゾルシノール比色分析アッセイによって推定した。糖とペプチドとの間の比は、表3に報告するとおり、直鎖状構造の調製に一致し、かつ、オリゴMenC部分が多分散性であることを考慮して、すべての糖ペプチドについておよそ1:1であった。
【０２５０】
【表３】
2015532276.tif 000013
【０２５１】
ポリMenCコンジュゲート
髄膜炎菌多糖血清群Cを誘導体化して、各ペプチドのチオール基と反応できるマレイミド部分を導入した。KMUH(N-κ-マレイミドウンデカン酸ヒドラジド-TFA)リンカーを、EDAC(N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N'-エチルカルボジイミドハイドロクロリド)化学を使用してシアル酸のカルボキシル基と反応できることから、使用した(図9は反応スキームを示す)。この最初のセットの実験では、1H NMRスペクトルによって証明されたとおり(図10を参照されたい)、糖約35molあたりKMUHリンカー1molが導入された。
【化９】
2015532276.tif 000014
【０２５２】
この最初のセットの実験では、ペプチドとのコンジュゲーション反応での立体障害の問題を回避するために、炭素原子10個を有するKMUHをリンカーに使用した。
【０２５３】
糖鎖へのマレイミド部分の導入後、各ペプチドとのコンジュゲーション反応をリン酸緩衝液中で適切に実行し、SDS-Page 4〜12％Bis-Trisによって証明されたとおり、一晩後に糖ペプチドが形成された(図11)。
【０２５４】
7種の糖ペプチドを、遊離ペプチドを除去するためにvivaspinカットオフ30kDaによって精製し、次いでC18カラムを使用するRP-HPLCによって特徴付けた。HPLCプロファイルの一例だけをポリMenC-Met6コンジュゲートについて提供する; すべてのコンジュゲートは類似のプロファイルを示した(図12)。
【０２５５】
糖鎖上でのより多いペプチドの存在によると考えられる、カラムとの疎水性相互作用の増大のために、これらのコンジュゲートは、ペプチド単独よりも長くRP-HPLCカラムに保持された。一方、ポリMenC糖単独は、カラムによって保持されず、カラムのボイド容量に溶出された。
【０２５６】
精製後、コンジュゲートの糖含有量及びタンパク質含有量を比色分析アッセイ、具体的にはそれぞれレゾルシノール及びマイクロBCAアッセイを使用して決定した。
【０２５７】
表4に報告するとおり、ポリMenCを有して調製された7種の糖ペプチドは、糖鎖上にペプチドエピトープを複数提示し、非直鎖状構造を示した。
【０２５８】
【表４】
2015532276.tif 000015
【０２５９】
この手法では、7種の直鎖状コンジュゲートが、オリゴ-MenC:ペプチドおよそ1:1の比で得られ、7種の非直鎖状コンジュゲートが、各ポリMenC糖鎖上に同じペプチドエピトープの複数コピーを有して得られた。HPLCプロファイルは、それらの構造を確認し、糖-ペプチドの異なる比に起因して、オリゴMenCコンジュゲートとポリMenCコンジュゲートとの間で、C18カラムとの異なる相互作用を証明している(図13)。したがって、オリゴMenCコンジュゲート及びポリMenCコンジュゲートは、ペプチドT細胞エピトープの異なる提示を有する。
【０２６０】
最初のセットのコンジュゲートの免疫学的評価
上に記載の調製されたコンジュゲートをマウスにおける免疫学的研究において試験した。
【０２６１】
免疫原性をBalb/cマウスで評価した。マウス8匹の群を使用した。コンジュゲートをアジュバントとしての水酸化アルミニウムと共に製剤化した。それらを糖に関して1μg又は0.2μgの用量で単独で又は混合物で製剤化した(表5); アジュバントを含まないポリMenCコンジュゲートの混合物でワクチン接種したマウスの群も含んだ。オリゴMenC-CRM及びオリゴMenC-TTコンジュゲートを陽性対照として使用した; PBS+アジュバントを陰性対照として使用した。コンジュゲートを1、14及び28日目に皮下に投与した。ワクチン接種した及び対照の動物を2回目及び3回目のコンジュゲート注射の14日後に採血した。
【０２６２】
【表５】
2015532276.tif 000016
【０２６３】
最初に、3回目の免疫処置後の血清のプールを、IgG抗ポリMenCの含有量を決定するためにELISAアッセイによって分析した。オリゴMenCコンジュゲート又はポリMenCコンジュゲートのいずれも糖に対するIgG応答を誘導できなかった。
【０２６４】
糖ペプチドの投与がまた、ペプチド部分に対するIgG応答を誘導できることが報告されており、IgG抗ペプチド応答も分析した。ELISAアッセイによる血清分析後、ペプチドに対するIgG応答は、アジュバントを含んで及び含まずに、単独で又は混合物中で、Met6及びFbaにコンジュゲートされたポリMenCによってのみ誘導された(図14)。
【０２６５】
これら2つのコンジュゲートはまた、図15に示すとおり、それぞれの糖ペプチドに対するIgG力価を誘導できた。
【０２６６】
C末端方向のこれらのT細胞エピトープのスクリーニングから、コンジュゲートに対するIgG応答が、Fba及びMet6ペプチド(カンジダ・アルビカンスの細胞壁タンパク質のエピトープ)に対してだけ観察され、このことは、ペプチド部分だけを認識することへの免疫応答のシフトを示す。
【０２６７】
ペプチド方向、糖鎖へのペプチドローディング、リンカー長及び異なるペプチドの複数提示の影響: 物理化学的特徴付け及びマウスモデルにおける免疫学的評価
さらなる研究を、糖ペプチドの免疫原性に影響を与えうる追加的パラメーターを評価するために実施した。
【０２６８】
以前の実施例を発端として、コンジュゲート中の髄膜炎菌多糖血清群Cだけを試験した。
【０２６９】
いくつかの特質を試験した: N末端に結合したペプチド対C末端に結合したペプチド; 糖鎖上でのペプチドのより高い密度; B細胞及びT細胞のエピトープ間距離を低減する、ペプチドをポリMenCにコンジュゲートするための異なるリンカー長; 同じ糖鎖上の異なるペプチドの複数提示。さらに、P2TT(破傷風毒素由来であり、N19タンパク質で使用した別のペプチドエピトープ)並びにPV1(ポリオウイルス1型のVP1タンパク質由来ペプチドT細胞エピトープ)を含む、合成T細胞エピトープペプチドも試験した(表6)。
【０２７０】
【表６】
2015532276.tif 000017
【０２７１】
この研究では、遊離チオール基を備えたリンカーを、選択されたペプチドのC末端又はN末端に導入し、それらの異なる空間的方向を誘導した。
【０２７２】
より高いペプチド密度を有する糖ペプチド
糖鎖上のペプチド密度を増強するために、1H NMRによって確認されるように糖約16molあたりリンカー約1molを導入するために、同じリンカーKMUHを使用して多糖鎖の誘導体化の程度を増大させた(図16)。
【０２７３】
各ペプチド(N及びC末端)との続くコンジュゲーション反応は、一晩、室温の後に完了していることがSDS-Page 4〜12％ Bis-Trisを使用して示され(例えば図17を参照されたい)、免疫学的研究で試験するために、糖鎖上により多くローディングされたエピトープペプチドを含む非直鎖状コンジュゲートを得た(図18を参照されたい)。
【０２７４】
コンジュゲートを、遊離ペプチドを除去するためにvivaspin 30kDaによって精製した。C末端で結合したPV1を有するコンジュゲートだけは、回収されなかった。精製の際に、ゲルが形成され、それが再溶解を困難にした。この問題は、より長い親油性リンカーKMUHでの糖の誘導体化の増大及びそれに続くいくつかの疎水性アミノ酸を含むペプチドの導入のためであると考えられた。
【０２７５】
精製後、糖ペプチドを、Superdexペプチドカラムを使用するHPLC-SECによって特徴付けた。代表的な例を1例だけ示す(PV1ペプチドN末端); すべてのコンジュゲートが類似のプロファイルを示した(図19)。
【０２７６】
C18 jupiterカラムは、糖鎖上のペプチドの密度が増大していることによるカラムとのより高い疎水性相互作用のために、これらのコンジュゲートには好適でなかった。
【０２７７】
最後に、糖含有量をシアル酸アッセイによって、及びタンパク質含有量をマイクロBCAアッセイによって又はPV1 C及びN末端結合に対するローリーアッセイによって決定した; これらのデータは、糖約16molあたりペプチド1molの導入を確認した(表7を参照されたい)。
【０２７８】
【表７】
2015532276.tif 000018
【０２７９】
より短いリンカー: BMPHを有するコンジュゲート
糖抗原とT細胞エピトープペプチドとの間の距離を低減するために、KMUHよりも短い別の二官能性リンカーも多糖を誘導体化するために使用した。BMPH(N-β-マレイミドプロピオン酸ヒドラジド-TFA)を、EDAC化学を使用して糖鎖のカルボキシル基上にマレイミド基を導入するためのリンカーとして使用し、糖とT細胞エピトープとの間の距離を炭素原子2個だけに低減した。
【化１０】
2015532276.tif 000019
【０２８０】
BMPHリンカーでの多糖MenCの誘導体化後、本発明者らは糖約17molあたりマレイミド基1molを導入し、それにより、同様にこのリンカーを使用した、より高いペプチド密度を有する糖ペプチドの調製が可能になった(図20)。
【０２８１】
誘導体化されると、各ペプチドとのコンジュゲーション反応は、SDS-Page 4〜12％ Bis-Trisによって証明されたとおり、一晩、室温で完了したことが示された(図21及び図22)。
【０２８２】
コンジュゲートを、遊離ペプチドを除去するためにvivaspin 30kDaによって精製した; プレパックカラムSuperdexペプチドを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製された、C末端及びN末端で結合したPV1を有するコンジュゲートを除いて。精製後に糖及びタンパク質含有量をシアル酸及びマイクロBCA若しくはローリー比色分析アッセイによってそれぞれ決定した; これらのデータは、糖約17molあたりペプチド1molの導入を確認した(表8)。
【０２８３】
【表８】
2015532276.tif 000020
【０２８４】
したがって、異なる特徴を組み合わせた6種の糖ペプチドを得た: より高密度のペプチド、糖抗原とエピトープペプチドとの間のより短い距離、及び異なる空間的方向を有するペプチドの使用。
【０２８５】
同じ糖鎖上に異なるペプチドの複数提示を有するコンジュゲート
糖鎖上での異なるペプチドの同時存在が、MenCに対する免疫応答を誘導出来るかどうかを評価するために、異なるペプチドを同じポリMenC糖にコンジュゲートした。次のペプチドを使用した: それらの構造が表2に報告されたFba、Met6及びHpw1(C末端)。これらのペプチドは、それらのコンジュゲーション後に1H NMR実験による簡単な評価を可能にする、各ペプチドに共通しない特徴的1H NMRシグナルに基づいて選択された。
【０２８６】
これらのペプチドを、BMPHリンカーでのマレイミド部分の導入後にポリMenCにコンジュゲートした(図24中化合物7a)。
【０２８７】
コンジュゲーション反応は、SDS-PAGE 4〜12％ Bis-Trisによって証明されたとおり、一晩、室温で実施した(図23)。反応は、ペプチドの混合物を多糖溶液に添加して実行した(図24)。
【０２８８】
コンジュゲートを、遊離ペプチドを除去するためにvivaspinカットオフ30kDaによって精製し、コンジュゲートの1H NMRスペクトルは3種の異なるペプチドの導入を確認した(図28)。
【０２８９】
糖鎖上でMet6、Hpw1及びFbaの間を識別するために、本発明者らは各ペプチドの1H NMRスペクトルを分析し、いくつかの代表的なシグナルを評価することによって1H NMR分析を使用した。
【０２９０】
図25に示すとおり、Fbaのアミノ酸配列中に、そのプロトンが6〜7.5ppmの間のシグナルを示したTyr(8H)2個及びPhe(5H)1個、約1ppmのシグナルを有するLeu(6H)1個及びVal(6H)1個が存在する。
【０２９１】
Met6ペプチドの構造において、本発明者らは約1ppmにシグナルを有するIle(12H)2個及びLeu(6H)1個を同定した(図22)。
【０２９２】
Hpw1ペプチドについて、そのプロトンが約7ppmであったTyr(4H)1個、約1ppmのシグナルを有するIle(6H)1個及びLeu(6H)1個が存在する(図23)。
【０２９３】
糖ペプチドの1H NMRスペクトルから、本発明者らは、異なるペプチド間の比がFba:Hpw1:Met6=1:1:2であったことを決定した。
【０２９４】
図28に示すとおり、芳香族プロトンのインテグレーションによって、本発明者らは、FbaとHpw1との間の比1:1を同定した。Val、Ile、Leuのプロトンの帰属は、Fba及びHpw1に対するMet6の量の決定を可能にした。シグナルのインテグレーションは、本発明者らがFba及びHpw1ペプチドに対してMet6ペプチド2molを導入したことを示した(図28)。
【０２９５】
純粋なコンジュゲートの糖含有量を、シアル酸比色分析アッセイによって推定し、タンパク質における含有量を、マイクロBCA比色分析アッセイによって決定した。
【０２９６】
同じポリMenC鎖にコンジュゲートした異なる合成ペプチドを有するこのコンジュゲートの免疫原性を、糖鎖にコンジュゲートした1種類だけのペプチドを有するコンジュゲートと比較した。
【０２９７】
ポリMenC-BMPH 7aを、Met6及びHpw1それぞれとのコンジュゲートを調製するために使用した; コンジュゲートFba-MenC 8aは既に調製された(表8)。
【０２９８】
【表９】
2015532276.tif 000021
【０２９９】
第二セットのコンジュゲートの免疫学的評価
コンジュゲートを、マウスにおける第二の免疫学的研究において試験した。免疫原性を、マウス8匹の群を使用してBalb/cマウスで評価した。コンジュゲートを、アジュバントとしての水酸化アルミニウムと共に(糖含有量に基づいて)1μgの用量で製剤化した。オリゴMenC-CRMを陽性対照として使用した; PBS+アジュバントを陰性対照として使用した。コンジュゲートを1、14及び28日目に皮下に投与した。ワクチン接種した及び対照の動物を2回目及び3回目のコンジュゲート注射の14日後に採血した。
【０３００】
ポスト3での血清を、IgG抗ポリMenC含有量を決定するためにELISAアッセイによって分析した。
【０３０１】
Fba、P2TT、Met6及びHpw1ペプチドを用いて調製したすべてのコンジュゲートは、マウスにおいて低い免疫原性を示しただけであった。さらに、これらの合成ペプチドのさまざまなパラメーター(N方向のペプチド、糖鎖上でのペプチドのより高い密度、異なる長さを有するリンカー、同じ糖鎖上での異なるペプチドの複数提示)の評価は、観察された低い免疫原性のせいで顕著な差異を導かなかった。これらの選択されたペプチドは、T細胞エピトープとしてほとんど認識されなかったと考えられ、したがってそれら自体が担体タンパク質全体を置き換える良い候補であった(図30)。
【０３０２】
1つのT細胞エピトープペプチド、タンパク質ポリオウイルス1型由来合成PV1ペプチドは、髄膜炎菌多糖血清群Cについての良い担体であることが見出された。図30に示すとおり、PV1ペプチドを用いて調製されたコンジュゲート8f及び8gは、免疫原性が高く、PBS+アジュバントで免疫化した対照マウスと比較して、ポリMenCに対して顕著なIgG力価を誘導する(P値=0.0007)。
【０３０３】
特に、N末端で結合したPV1ペプチドは、従来のオリゴMenC-CRMコンジュゲートによって誘導されたものに匹敵するIgGレベルを誘導した(MenC-CRMコンジュゲート対MenC-PV1 N末端コンジュゲートに有意差はない、P値=0.5625)。さらに重要なことに、以下の表14に示すとおり、PV1ペプチドコンジュゲートは、従来のオリゴMenC-CRMコンジュゲートと同様に強い血清殺菌性応答を誘導できた。
【０３０４】
【表１０】
2015532276.tif 000022
【０３０５】
2回目及び3回目の免疫処置後の血清の分析は(図31)、両方のコンジュゲートについて追加免疫効果を示した(ポスト2とポスト3との間に顕著な差異、PV1 C末端コンジュゲートについて**P=0.0036及びPV1 N末端コンジュゲートについて***P=0.0008)。
【０３０６】
さらに、ポスト3でのさらなる血清分析は(図32)、コンジュゲートによって導入された抗MenC IgMの含有量が非常に低かったことを示した。このデータは、IgMからIgGアイソタイプへのシフトが生じ、PV1ペプチドを有する糖ペプチドがメモリー細胞応答を誘導できたことを証明した。
【０３０７】
追加的な重要な観察は、このペプチドに対するIgG力価が、PV1 C末端について非常に低く、PV1 N末端についてほとんど存在しないことを見出したことであり(図33)、このことは、このペプチドが、担体タンパク質全体の置換において、担体としての良い候補である可能性があることを示している。図48はまた、PV1ペプチド非直鎖状コンジュゲートによって誘導された異なるIgGサブタイプを示している。
【０３０８】
担体としてOvaペプチドを用いて調製された糖ペプチドの物理学的化学的特徴付け及びマウモデルにおける免疫原性評価
担体としてのOvaペプチドを試験するための異なるB細胞エピトープのスクリーニング
追加的例は、担体タンパク質としてのオボアルブミン(OVA)由来合成ペプチドの使用を含む。Ovaペプチドが多糖GBS III型のための良い担体であることが示された文献を発端として、担体タンパク質全体を置き換える能力も、髄膜炎菌多糖血清群W-135、Y及びCなどの他のB細胞抗原との組合せで試験した。
【０３０９】
この実施例では合成Ovaペプチドは、そのC末端で結合された。
【０３１０】
【表１１】
2015532276.tif 000023
【０３１１】
表に報告されたとおり、C末端に2種の異なるリンカーを有する合成Ovaペプチドを使用した:
-  髄膜炎菌多糖血清群W-135及びY(シアル酸の酸化後の還元アミノ化)を有する、並びに髄膜炎菌多糖血清群C(カルボキシル基の誘導体化後)を有するコンジュゲートを調製するための遊離アミノ基を有するリンカーE-S-G-K。
-  前述の実施例との比較のために、マレイミド基(前述の実施例において使用された化合物7a及び5a)で誘導体化したポリMenCを使用するコンジュゲートを調製するための遊離チオール基を有するリンカーG-G-C。
【０３１２】
髄膜炎菌多糖血清群W-135及びYを有するOvaペプチドコンジュゲートの合成
ポリMenW-135及びYを有するコンジュゲートを調製するために、シアル酸の酸化反応(反復単位について30％酸化)を実施し、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下での、Ovaペプチドを用いた還元アミノ化が続いた(図35)。
【０３１３】
最初に本発明者らは、メタ過ヨウ素酸ナトリウムでのシアル酸の酸化反応を実施し、所望の目標に一致して30％の酸化程度を得た。酸化多糖をvivaspinカットオフ30kDaによって精製し、酸化百分率を推定するために1H NMRによって特徴付けた(図36〜37)。
【０３１４】
図36〜37に示すとおり、アルデヒド水和物のプロトンと比較したシグナルを考慮して酸化百分率を推定した; 実際には、アルデヒド及び水和物アルデヒド形態の両方に対して期待されたプロトンNMRシグナルは、実験を集めるために使用した実験条件が平衡をその方向に移動させたことから、5.15ppmでの水和物アルデヒド形態だけについて明らかにされた。
【０３１５】
シアル酸の酸化後、ペプチドとの続くコンジュゲーション反応は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムの存在下で還元アミノ化によって実施した。両方の反応は37℃で5日間実行し、SDS-Page 4〜12％ Bis-Trisによって証明されたとおり、それらは適切に実行された(図38)。
【０３１６】
両方のコンジュゲートを、過剰のペプチドを除去するためにvivaspinカットオフ30kDaによって精製した。精製後に、2種のコンジュゲートを糖及びペプチド含有量に関してレゾルシノール及びローリー比色分析アッセイをそれぞれ使用して特徴付けた。
【０３１７】
これらのデータは、シアル酸4molあたりペプチド約1molが導入されたことを示し(表12)、糖鎖上に高密度のT細胞エピトープを有する糖ペプチドを得た。
【０３１８】
【表１２】
2015532276.tif 000024
【０３１９】
髄膜炎菌多糖血清群Cを有するOvaペプチドコンジュゲートの合成
Ovaペプチドのコンジュゲートを、2つの異なる合成手法を使用して髄膜炎菌多糖血清群Cを用いて調製した:
1- C末端にG-G-Cリンカーを有するOvaペプチドを、マレイミド基で誘導体化したポリMenCにコンジュゲートした(化合物7a及び5a)、
2- C末端にE-S-G-Kリンカーを有するOvaペプチドを、EDAC化学を使用してポリMenCのカルボキシル基にコンジュゲートした。
【０３２０】
最初の手法について、KMUHリンカー(5a)又はBMPH(7a)で誘導体化したポリMenCを、シアル酸約16〜17molあたりマレイミド基1molの導入で使用した。それによりペプチド上の遊離チオール基は、糖鎖のマレイミド部分と反応でき、コンジュゲーション反応は既に記載のとおり実施された(図39)。
【０３２１】
2つの反応は、SDS-Page 4〜12％ Bis-Trisによって証明されたとおり、一晩、室温で行われ(図33)、T細胞エピトープとB細胞エピトープとの間に2種の異なるリンカー(KMUH及びBMPH)を有する2種のコンジュゲート(14及び15)を得た。
【０３２２】
糖ペプチドを、遊離ペプチドを除去するためにvivaspinカットオフ30kDaによって精製した。
【０３２３】
純粋なコンジュゲートを、糖及びペプチド含有量に関してレゾルシノール及びローリー比色分析アッセイをそれぞれ使用して特徴付けた。これらのデータは、シアル酸約15〜18molあたりリンカー1molの導入を示した(表13)。
【０３２４】
【表１３】
2015532276.tif 000025
【０３２５】
第二の手法、リンカーE-S-G-Kを有するペプチドを使用するコンジュゲートポリMenC-Ovapについて、ペプチドの遊離アミノ基とMenCのカルボキシル基との間の縮合反応を、アミド結合を得るために使用した。
【０３２６】
反応は、ペプチドのアミノ基との反応のために、糖上のカルボキシル基を活性化するためのEDAC及びスルホ-NHSの存在下で実施した(スキーム8)。
【０３２７】
最初のステップとして、EDACとスルホ-NHSとの混合物(糖molに関して1当量)を0.03M MES pH6中の多糖溶液に添加した。反応を穏やかに撹拌しながら暗所、15分間実行し、次いで水中のOvaペプチド溶液(1当量)を加えた。
【０３２８】
室温、一晩後、SDS-Pageは、反応が実行されたことを示した(図42)。
【０３２９】
コンジュゲート16を、vivaspinカットオフ30kDaによって精製し、純粋なコンジュゲートを糖含有量及びペプチド含有量に関して特徴付けた。Ovap-MenCコンジュゲート16は、80の低いSacc/ペプチド(mol糖/molペプチド)比を有した。MenCへのペプチドローディングを増大させる試みは成功せず、実際にはEDACの量の増大は、副反応に起因して再溶解されなかったゲル状態の形成を多糖に生じさせた。ペプチドの量の増大は、精製ステップの際に問題を生じた。
【０３３０】
したがって、12、13、14及び15コンジュゲートについてペプチドのローディングが低い場合でも、本発明者らはマウスにおける免疫学的研究でこのコンジュゲートを使用した。
【０３３１】
担体としてOvaペプチドを有するコンジュゲートの免疫学的評価
担体としてOvaペプチドを有するコンジュゲートを、マウスにおける免疫学的研究において試験した。免疫原性をマウス8匹の群を使用してBalb/cマウスで評価した。コンジュゲートをアジュバントとしての水酸化アルミニウムと共に(糖含有量に基づいて)1μgの用量で製剤化した。オリゴMenC-CRM、オリゴMenW-CRM及びオリゴMenY-CRMを陽性対照として使用し、PBS+アジュバントを陰性対照として使用した。ポリコンジュゲートを1、14及び28日目に皮下に投与した。ワクチン接種した及び対照の動物を2回目及び3回目のコンジュゲート注射の14日後に採血した。
【０３３２】
図43に報告するとおり、血清ポスト3のELISAアッセイは、PBS+アジュバントで免疫化された対照マウスと比較して、髄膜炎菌多糖血清群CにコンジュゲートされたOvaペプチドを有する糖ペプチドだけが、マウスにおいて免疫原性であることが見出されたことを示した(P値<0.05)。特に、KMUHリンカーを使用して結合されたOvaペプチドを有するOvap-MenCコンジュゲートが、最も免疫原性があった(対照マウスに対してP値=0.006)。
【０３３３】
ポスト3と比較したポスト2での抗糖IgGの分析は、コンジュゲート14及び15について追加免疫効果があったことを証明し(P値<0.05)、特にOvap-MenC(KMUHリンカー)についてP値0.0033であった。対照的に、コンジュゲートOvap(ESGK)-MenC(16)は、追加免疫効果を生じなかった(P値0.0594)(図44)。
【０３３４】
しかし、Ovaペプチドを有するすべてのコンジュゲートは、MenC-CRMコンジュゲートと比較して、より低い抗MenC IgG応答を誘導した(MenC-CRM対Ovap-MenCコンジュゲート間に有意差***P=0.0009)。
【０３３５】
髄膜炎菌血清群W及びY多糖を有する他のコンジュゲート(12及び13)は、免疫原性がほんのわずかであるか、又は免疫原性が検出できない程度であった(図45)。図45に報告するとおり、ポスト3血清は、抗糖IgG力価を誘導せず、PBS+アジュバントで免疫化された対照マウスと比較して差異はなかった(P>0.05)。3回目の免疫処置後に抗Ovap IgG力価は、力価が非常に高くはなくても、すべての糖ペプチドがペプチドに対する抗体応答を誘導したことを示した: 特に、図46に報告するとおり、KMUHリンカーでコンジュゲートされたポリMenCを有する糖ペプチドは、最も高い抗ペプチドIgG力価を誘導した。
【０３３６】
実施例において用いる材料及び方法
髄膜炎菌血清群C、W及びYオリゴ糖及び多糖の調製
還元アミノ化による髄膜炎菌血清群Cオリゴ糖の還元末端への一級アミノ基の導入
オリゴ糖1を糖の還元末端にアミノ基を導入するために、還元アミノ化によって処理した。この反応は、有機溶媒中で実施し、それによりオリゴ糖を対イオンとしてのテトラブチルアンモニウムブロミド(TAB)で置き換えた。この対イオンを導入するために、本発明者らは、0.7M TABで平衡化したCAPTO Sレジンを使用するイオン交換クロマトグラフィーを実施し、対イオンとしてのTAB+でカラムからオリゴ糖を溶出した。次いで、乾燥産生物(20mg)を10％ DMSO、90％メタノールにシアル酸最終濃度5mg/mlで溶解した。酢酸アンモニウム(最終濃度50mM)及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム(最終濃度10mM)を次いで添加した。反応混合物を24〜72時間、50℃でインキュベートした。次いで過剰メタノールを減圧下でロータリーエバポレーターによって、容量が還元アミノ化の前に添加したDMSOの2倍量以下になるまで除去した。その後、反応混合物を20％ MeOH溶液を得るように0.5M NaClで希釈した。次いで糖を、アミノ化オリゴMenCから還元アミノ化試薬を除去するためにG10レジンを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。最後に対イオンTABを1M NaClで平衡化したCAPTO Sレジンで再び置き換え、オリゴ糖1aは対イオンとしてのNa+でカラムから溶出された。導入されたアミノ基の量を比色分析アッセイによって推定し[Habeeb AF Anal Biochem 1966, 14, 328〜38]、アミノ化が約50％であったことが示された(その1H NMRスペクトルによって続いて確認された)。
【０３３７】
N-ε-マレイミドカプロイル-オキシスルホスクシンイミドエステル(スルホ-EMCS)でのオリゴMenC-NH2の誘導体化
還元アミノ化後、オリゴ糖1aをH2O-DMSO 1:9の混合物に溶解し、次いでEt3N 5当量を添加し、スルホ-EMCSリンカー10当量の添加が続いた。反応物を室温で穏やかに撹拌しながら2時間保持した。次いで誘導体化オリゴ糖1bを1:4アセトンでの沈殿によって試薬から分離し、1:4アセトンでの沈殿物の洗浄及び減圧下での乾燥が続いた。
【０３３８】
オリゴ糖鎖上のマレイミド基の導入を1H NMRスペクトルによって確認した。
【０３３９】
N-κ-マレイミドウンデカン酸ヒドラジド-TFA(KMUH)での多糖MenCの誘導体化
髄膜炎菌多糖血清群C3のシアル酸のカルボキシル基を、エピトープペプチドが非直鎖状形態で結合できるように、糖鎖上にマレイミド部分を導入するために、KMUHリンカー上のヒドラジド基と反応させた。反応を実施するために、多糖3を0.1M MES pH4.56中、最終濃度2mg/mlで溶解し、次いでEDAC(20mol％)を添加し、反応物を穏やかに撹拌しながら暗所に保持した。10分後、KMUH(シアル酸約35molあたり又はシアル酸約17molあたりリンカー1molを導入するためにそれぞれ20mol％又は46mol％)を混合物に添加し、反応を室温で2時間、穏やかに撹拌しながら実行した。最後に誘導体化多糖を、30kDaカットオフ膜(Sartorius)での接線流ろ過によって精製し、誘導体化多糖を残余成分中に回収した。
【０３４０】
糖鎖上のマレイミド基の量を1H NMRスペクトルによって推定した: 本発明者らは、反応において使用したリンカーの量に応じて、シアル酸約35molあたりマレイミド部分1mol(3a)又はシアル酸約16molあたりマレイミド部分1mol(5a)を導入した。
【０３４１】
N-β-マレイミドプロピオン酸ヒドラジド-TFA(BMPH)での多糖MenCの誘導体化
髄膜炎菌多糖血清群C3のシアル酸のカルボキシル基を、糖鎖上にマレイミド部分を導入するために、BMPHリンカー上のヒドラジド基と反応させた。反応を実施するために、多糖3を最終濃度2mg/mlで0.1M MES pH4.56に溶解し、次いでEDAC(20mol％)を添加し、反応物を暗所に穏やかに撹拌しながら保持し、10分後、BMPH(46mol％)を混合物に添加し、反応を室温で2時間、穏やかに撹拌しながら実行した。最後に誘導体化多糖を、30kDaカットオフ膜(Sartorius)での接線流ろ過によって精製し、誘導体化多糖を残余成分中に回収した。
【０３４２】
糖鎖上のマレイミド基の量を1H NMRスペクトルによって推定し、本発明者らがシアル酸約17molあたりマレイミド部分1molを導入したことを確立した(7a)。
【０３４３】
髄膜炎菌多糖血清群W及びYの酸化
多糖MenW 10及びMenY 11のシアル酸を酸化して、還元アミノ化反応によってペプチドのアミノ基と反応できるアルデヒド基を導入した。両方の多糖を濃度10mg/mlで10mM NaPi pH7に溶解した。0.1M NaIO4を、30％の酸化を得るために、30mol％当量で添加した。反応物を暗所で穏やかに撹拌しながら室温、2時間保持した。その時間後、酸化多糖10a及び11aを、30kDaカットオフ膜を使用するVivaspin system(Sartorius)での限外ろ過によって精製した。純粋な化合物の酸化程度を1H NMRスペクトルによって推定し、所望の目標と一致する30％酸化を示した。
【０３４４】
コンジュゲートの調製
オリゴMenC-ペプチドコンジュゲート(2a、2b、2c、2d、2e、2f、2g)の合成
オリゴ糖1bと合成ペプチドとの間のコンジュゲーション反応を、糖上のマレイミド部分とペプチド上のチオール基との間の反応性を活用して適切に行った(表1)。コンジュゲーションは、ペプチドmol:糖鎖上のマレイミドmol比3:1で、PBS緩衝液pH7中で実施し(ペプチドについて3mg/ml)、一晩、室温で穏やかに撹拌しながらインキュベートした。すべてのコンジュゲートを、遊離ペプチドを除去するためのSuperdexペプチドプレパックカラムカラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、遊離糖を除去するための硫酸アンモニウムでの沈殿が続いた。
【０３４５】
ポリMenCKMUH-ペプチドコンジュゲート(4a、4b、4c、4d、4e、4f、4g)の合成
多糖3aと合成ペプチドとの間のコンジュゲーション反応を、糖上のマレイミド部分とペプチド上のチオール基との間の反応性を活用して適切に行った(表1)。コンジュゲーションは、ペプチドmol:糖鎖上のマレイミドmol比3:1で、PBS緩衝液pH7中で実施し(ペプチドについて3mg/ml)、一晩、室温で穏やかに撹拌しながらインキュベートした。すべてのコンジュゲートを、30kDaカットオフ膜を使用するVivaspin system(Sartorius)での限外ろ過によって精製した。
【０３４６】
ポリMenCKMUH-ペプチドコンジュゲート(6a、6b、6c、6d、6e)の合成
多糖5aと合成ペプチド(表5)との間のコンジュゲーション反応を、多糖3aについて上に報告のとおり実施した。すべてのコンジュゲートを、30kDaカットオフ膜を使用するVivaspin system(Sartorius)での限外ろ過によって精製した。
【０３４７】
ポリMenCBMPH-ペプチドコンジュゲート(8a、8b、8c、8d、8e、8f、8g)の合成
多糖7aと合成ペプチド(表5)との間のコンジュゲーション反応を、多糖3aについて上に報告のとおり実施した。VP1 C及びN末端ペプチドを有するコンジュゲート8f及び8gを、superdexペプチドプレパックカラムカラムを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって精製したことを除いて、すべてのコンジュゲートを、30kDaカットオフ膜を使用するVivaspin system(Sartorius)での限外ろ過によって精製した。
【０３４８】
ポリMenCBMPH-MIX Met6+Fba+Hpw1ペプチドコンジュゲート(9)の合成
コンジュゲーション反応を、ペプチドの調製混合物を使用し、この混合物を多糖7aに添加して実行した。本発明者らは、mol Met6ペプチド:mol Hpw1ペプチド:mol Fbaペプチド:mol糖鎖上のマレイミドの比1:1:1:1で反応を実施した。反応をPBS緩衝液pH7中で実行し(ペプチドについて3mg/ml)、一晩、室温で穏やかに撹拌しながらインキュベートした。コンジュゲート9を、30kDaカットオフ膜を使用するVivaspin system(Sartorius)での限外ろ過によって精製した。
【０３４９】
コンジュゲートポリMenW-Ovap及びポリMenY-Ovap(12及び13)の合成
コンジュゲートのためのコンジュゲーション反応は、両方の酸化多糖のアルデヒド部分上にOvap-ESGKのアミノ基を導入する還元アミノ化によって実施した。10mM NaPi pH7中の1mg/ml多糖(10又は11)溶液に、シアノ水素化ホウ素ナトリウム(30当量)を添加し、Ovaペプチド(3当量)、緩衝液コンジュゲーション60Mm NaPi 250mM NaCl pH7の添加が続いた。両方のコンジュゲーション反応物を37℃で5日間インキュベートした。コンジュゲート12及び13を、30kDaカットオフ膜を使用するVivaspin system(Sartorius)での限外ろ過によって精製した。
【０３５０】
コンジュゲートポリMenCKMUH-Ovap及びポリMenCBMPH-Ovap(14及び15)の合成
コンジュゲーション反応を、多糖3aについて上に報告のとおり実施した。本発明者らは、コンジュゲート14を調製するために多糖5a(KMUHリンカーで誘導体化)を、及びコンジュゲート15を調製するために多糖7a(BMPHリンカーで誘導体化)をそれぞれ使用した。両方のコンジュゲートを、30kDaカットオフ膜を使用するVivaspin system(Sartorius)での限外ろ過によって精製した。
【０３５１】
コンジュゲートポリMenC-Ovap(16)の合成
ペプチドOvap-ESGKが糖鎖に直接コンジュゲートされた糖ペプチド16を調製するために、本発明者らは、アミド結合を挿入するためのペプチドの遊離アミノ基と多糖3のカルボキシル基との間の縮合反応を活用した。30mM MES pH6中3mg/ml糖溶液に、EDAC(3当量)及びスルホ-NHS(3当量)の混合物を添加し、反応を室温で穏やかに撹拌しながら実行した; 15分後、Ovaペプチド(3当量)を混合反応物に添加した。混合物を室温で一晩穏やかに撹拌しながら保持した。コンジュゲート16を、30kDaカットオフ膜を使用するVivaspin system(Sartorius)での限外ろ過によって精製した。
【０３５２】
分析方法
ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-Page)
SDS-Pageを、プレキャストポリアクリルアミドゲル(NuPAGE(登録商標)Invitrogen)4〜12％ Bis-Trisを使用して実施した。電気泳動をMES SDSランニングバッファー(NuPAGE(登録商標)Invitrogen)中で、各試料ペプチド2.5〜5μgをローディングし、150V電圧、約40分間で電気泳動チャンバーを使用して実施した。試料は、NuPAGE(登録商標)LDSサンプルバッファー3μlを添加することによって調製した。電気泳動後、ゲルをH2Oで3回洗浄し、次いでゲルを50％MeOH及び10％酢酸の溶液中で30分間固定した。固定後、ゲルを水で3回洗浄し、最後にクマシー染料で染色した。
【０３５３】
比色分析
コンジュゲート上のペプチド含有量を、使用したペプチドの種類に応じて、マイクロBCA(Thermo)[Smith, P.K. et al. Anal. Biochem. 1985, 150, 76〜85]又はローリー(Thermo)[Lowry, O.H. et al. J. Biol. Chem. 1951, 193, 265〜275]比色分析アッセイによって決定した。
【０３５４】
シアル酸含有量は、レゾルシノール比色分析アッセイによって決定した[Svennerholm, L. Biochim. Biophys. Acta 1957, 24(3), 604〜611]。
【０３５５】
アミノ基は、比色分析アッセイによって決定した[Habeeb, A.F. Anal Biochem 1966, 14, 328〜38]。
【０３５６】
サイズ排除高速液体クロマトグラフィー(SEC-HPLC)
SEC-HPLCを、PDA、RF2000蛍光検出器及びRI-101 Shodex検出器を備えたULTIMATE(商標)3000 HPLCシステム(Dionex part of Thermo Fisher Scientific)で実施した。クロマトグラフィーを、0.02M NaPi 0.250M NaCl pH7.2中、Superdexペプチド分析用カラムで流速0.05ml/分、タンパク質含有量で試料15〜25μgをローディングする注入容量50μlで実施した。得られたクロマトグラフィーデータを、CHROMELEON(商標)6.7ソフトウェアを使用して処理した。
【０３５７】
逆相高速液体クロマトグラフィー(RP-HPLC)
RP-HPLCを、PDA、RF2000蛍光検出器を備えたULTIMATE(商標)3000 HPLCシステム(Dionex part of Thermo Fisher Scientific)で実施した。クロマトグラフィーをH2O中のアセトニトリルの勾配5％から45％まで+0.1％TFAでJupiter C18分析用カラムで流速0.1ml/分、注入容量50μlで実施した。得られたクロマトグラフィーデータを、CHROMELEON(商標)6.7ソフトウェアを使用して処理した。
【０３５８】
NMR分析
1H NMR実験を、高精度温度調節器を備えたBruker Avance III 400 MHz分光計、5mmブロードバンドプローブ(Bruker)を使用して、25±0.1℃で記録した。すべての試料は、0.75mLの重水(D2O、99.9％原子D、Aldrich)に溶解し、5mm NMRチューブ(Wilmad)に挿入した。データ取得及び処理のために、TopSpin version 2.6ソフトウェア(Bruker)を使用した。
【０３５９】
1H NMRスペクトルを、400MHzで分光幅10ppmで回収し、およそ128スキャン蓄積した。トランスミッターを基準シグナル(4.79ppm)として使用するHDO周波数に設定した。すべてのNMRスペクトルを、各シグナルの完全な回収を確実にするために全回復時間を使用する定量的手法で得た(5×縦緩和時間T1)。
【０３６０】
ワクチン製剤化及び免疫学的研究
糖コンジュゲート製剤の調製
抗原製剤を滅菌フード下で滅菌器具及び溶液を使用して調製した。すべての製剤は、PBS pH7.2を緩衝液として使用して作製し、ワクチンをマウス1匹あたりに必要な糖の用量を得るために総量200μlに希釈した。
【０３６１】
水酸化アルミニウム(アラムOH)をアジュバントとして使用し、PBSの総量へ1:1で混合するために2×溶液として調製した。各用量は0.36mgの水酸化アルミニウムを含有していた。
【０３６２】
コンジュゲート及びコンジュゲートワクチンを、糖含有量で用量あたり1μgでメスBalb/cマウス8匹の群に投与した。
【０３６３】
マウスを、皮下で1、14及び28日目に免疫化した。採血を0日目(免疫化前)、28日目(ポスト2)及び42日目(ポスト3)に実施した。対照群はPBS+アジュバントを受けた。Novartis Animal Care Departmentによって示されたAnimal experimental guidelinesにすべての動物研究行為において従った。
【０３６４】
応答の免疫化学的評価
同種多糖及びペプチドに対する糖コンジュゲートによって誘導された抗体応答をELISAアッセイによって測定した。96ウェルMaxisorpプレート(Nunc、Thermo Fisher Scientific)を、PBS緩衝液pH8.2中、5μg/ml多糖溶液100μl/ウェル、又はPBS緩衝液pH7.2中、10μg/mlペプチド溶液100μl/ウェルの添加、それに続く一晩(o.n.)、4℃でのインキュベーションによって、さまざまな髄膜炎菌多糖又はペプチドでコーティングした。コーティング後、プレートを1ウェルあたり300μlのTPBS(0.05％Tween20を含むPBS、pH7.4)で3回洗浄し、100μL/ウェルの3％BSA(Sigma Aldrich)で1時間、37℃でブロッキングした。続いて各インキュベーションステップに、3回のTPBS洗浄が続いた。TPBSに1:25、1:100、1:200で予め希釈された血清を、コーティングされたプレートに移し(200μL)、次いで段階的に2倍希釈し、その後、2時間、37℃のインキュベーションを行った。TPBSでの3回の洗浄後、二次抗体アルカリリン酸コンジュゲート(抗マウスIgG 1:10000)の100μl TPBS溶液を添加し、プレートを1時間、37℃でインキュベートした。TPBSでのさらに3回の洗浄後、0.5Mジエタノールアミン緩衝液pH9.8中、1mg/mlのp-NPP(Sigma)100μl/ウェルを添加した。30分間の室温でのインキュベーション後、プレートをBioradプレートリーダーを使用して405nmで読み取った。生データ取得をMicroplate Managerソフトウェア(Biorad)によって実施した。血清力価を、カットオフOD=1又はカットオフOD=0.2に対応する血清希釈の逆数として表した。各免疫処置群を単一のマウスの力価の幾何平均(GMT)として表した。統計的及びグラフによる分析をGraphPad Prismソフトウェアを使用して実施した。
【０３６５】
本発明が、例示のためだけに記載され、変更が本発明の範囲及び精神の範囲内にありながらなされうることは理解される。
【０３６６】
参考文献(内容全体が参照により本明細書に組み込まれる)
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２６】
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【図２９】
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【図３０】
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【図４０】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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