(57)【要約】  皮膚細胞の代謝を改善するスキンケア活性剤を特定又は評価する方法。方法は、細胞をストレッサー及び被検物質と接触させること、解糖及び／又は酸化的リン酸化と関連付けられる代謝指標における変化に基づき、細胞のストレッサー及び被検物質への応答を判定すること、を含む。酸化的リン酸化及び／又は解糖の応答が細胞代謝における改善と一致するとき、被検物質をスキンケア活性剤として特定することができる。
2015534644.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
角化細胞の代謝を改善するスキンケア活性剤として被検物質を特定する方法であって、
ａ．複数個の角化細胞を提供すること、
ｂ．前記角化細胞をストレッサーに曝露すること、
ｃ．解糖及び酸化的リン酸化のそれぞれと関連付けられる代謝指標を非致死的に検出して、前記ストレッサーに対するそれぞれの応答を提供すること、
ｄ．前記複数個の角化細胞を被検物質に曝露すること、
ｅ．解糖及び酸化的リン酸化のそれぞれと関連付けられる代謝指標を非致死的に検出して、前記被検物質に対するそれぞれの応答を提供すること、並びに
ｆ．（ｅ）の応答のうち少なくとも１つが、（ｃ）の対応する応答と比較して角化細胞の代謝における改善を示す場合に、前記被検物質をスキンケア活性剤として特定すること、を含む、方法。
【請求項２】
前記ストレッサーが、紫外線放射、煙草の煙、オゾン、エンジン排気、ディーゼル排気、煙霧、界面活性剤、及びコンピューターのモニター又はテレビからの放射線からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ストレッサーが、約３１５ｎｍ〜約２８０ｎｍの波長を有する紫外線放射である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
解糖及び酸化的リン酸化に関連付けられる代謝指標のそれぞれの基礎値を提供すること、並びに（ｃ）の応答を前記対応する基礎値と比較して、１つの代謝経路が別の代謝経路よりも著しい低下を示すか判定することを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
（ｅ）における応答のうち１つが、代謝において大幅な低下を示す前記代謝経路における改善に一致する場合に、前記被検物質が、スキンケア活性剤として特定される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記基礎値が、前記ストレッサーに曝露されていない角化細胞における前記代謝指標を測定することにより提供される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記代謝指標が、同一の試験容器で検出される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記代謝指標が、実質的に同時に検出される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記代謝指標の前記検出が、制御環境下で実施される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記代謝指標が、前記ストレッサーへの曝露から少なくとも１時間後に検出される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記酸化的リン酸化経路に関連付けられる前記代謝指標が、酸素消費速度及び二酸化炭素生成速度のうち少なくとも１つで測定されることにより検出される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記解糖経路に関連付けられる前記代謝指標が、細胞外酸性化速度、細胞外乳酸生成速度及び乳酸濃縮速度のうち少なくとも１つを測定することにより検出される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
線維芽細胞、メラニン産生細胞、筋細胞、幹細胞、脂腺細胞、神経細胞、及び脂肪細胞からなる群から選択される複数個の非角化細胞に対し工程（ａ）〜（ｆ）を繰り返し、繰り返された工程（ｅ）に関する応答のうち少なくとも１つが、繰り返された工程（ｃ）の対応する応答と比較して前記非角化細胞の代謝における改善を示す場合に、前記被検物質をスキンケア活性剤として特定することを更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
皮膚健康効果を提供し、皮膚への局所塗布に好適であるパーソナルケア組成物の製造方法であって、前記方法が、
ａ．請求項１〜１３のいずれかに記載の方法に従って活性剤を特定すること、及び
ｂ．安全かつ有効な量の前記活性剤を製薬上許容され得る担体に組み込むこと、を含む、方法。
【請求項１５】
皮膚の健康を改善する方法であって、
ａ．スキンケア効果を必要としている皮膚の対象領域を特定すること、
ｂ．請求項１４に記載の方法により作成した、美容上有効な量のパーソナルケア組成物を、対象領域に塗布すること、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的に、パーソナルケア組成物に使用するための有益剤成分を特定又は評価する方法を目的とする。より詳細には、本発明は、皮膚細胞に対する酸化的ストレスの影響に有効である活性剤を特定又は評価する方法を目的とする。
【背景技術】
【０００２】
生命の基本原則として、生物はエネルギーの生成を必要とし、及びエネルギー生成能を有する。ヒトでは食物が摂取され、アデノシン三リン酸（「ＡＴＰ」）及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（「ＮＡＤ」）などの化合物へと変換される。これらの化合物は、生体の細胞により、生命を維持する生物学的なプロセスを実施するために使用される、エネルギーを貯蔵する。細胞が食品の有用な成分（例えば、炭水化物、脂肪及びタンパク質）を利用可能エネルギーへと変換する代謝経路は複雑であり、完全には理解されていない様式で様々な要因から影響を受ける。哺乳類の皮膚細胞も例外ではない。皮膚細胞が、動的で複雑な関係下で皮膚の健康を維持するよう協調して機能する異なる種類の多様な細胞を含むことは既知である。例えば、角化細胞は、増殖及び分化して継続的な皮膚代謝をもたらす。メラニン産生細胞は、皮膚色素沈着に関係するメラニン合成を提供することが既知である。並びに、線維芽細胞は、皮膚の厚み及び弾性を維持する助けとなる細胞外マトリックス及びコラーゲンを合成することが既知である。同様にして、皮膚又はその他の身体組織において又はその周辺に見られるその他の細胞、例えば、筋細胞、幹細胞、脂腺細胞、神経細胞、及び脂肪細胞などは、いずれも、異なる多様な要因により望ましくない影響を生じ得る複雑な代謝経路に由来するエネルギーを必要とする。
【０００３】
多様なストレッサーが、細胞の生体エネルギー、及び細胞老化、並びにその他の疾患（例えば、がん、神経変性疾患、糖尿病、並びに循環器疾患）に影響を与えるという認識が強まっている。疾患状態において変更された代謝に関係する影響のいくつかには、理論上、加齢にまつわるフリーラジカル理論が根底に存在する。すなわち、哺乳類細胞を活性酸素種（「ＲＯＳ」）に曝露することで、細胞構造及び細胞小器官（ミトコンドリアなど）に損傷が生じる。ＲＯＳは、酸素（例えば、酸素イオン及び過酸化物）を含有する高活性の分子である。ＲＯＳは、正常な酸素代謝の天然の副生成物として細胞内で生成され、細胞のシグナル伝達及び恒常性維持に関与する。しかしながら、細胞が熱又は紫外線などのストレッサーに曝露されたとき、ＲＯＳ濃度は増加する場合があり、場合によっては劇的に増加する場合がある。
【０００４】
ＲＯＳの経時的な蓄積により損傷が生じるにつれて、酸化的ストレスが細胞レベルで高くなり、最終的には、組織の損傷及び／又は臓器障害がもたらされる場合がある。細胞に対する酸化的ストレスの影響のうちの１つには、細胞の生体エネルギー論的容量の減少があり、これによりＡＴＰ及び／又はＮＡＤ濃度が減少し得る。ヒト皮膚細胞に対する酸化的ストレスは、視認され得る加齢サインとして現れる場合があることから、これはヒトの皮膚で特に問題となり得る。更に、紫外線（「ＵＶ」）及び汚染物質（例えば、煙草の煙、排ガス、オゾン）などの環境的なストレッサーは、ＲＯＳの産生レベルを増大させ得る。これにより、時間の経過とともに、皮膚の構造及び形態（例えば、「光損傷」）には視認され得る変化が生じる場合があり、極端な場合には皮膚癌が生じる場合がある。
【０００５】
ヒト皮膚細胞は、グルタチオン及びＮＡＤ、並びにＲＯＳを中和し得る多様な酵素などの酸化還元調節因子を使用して、ＲＯＳに対抗する。しかしながら、これらの防衛が、ストレッサーにより誘導されたＲＯＳの急増により圧倒され、エネルギー恒常性及び代謝効率において即時的なものだけでなく慢性的な変化がもたらされることで、最終的に細胞機能障害が生じ得る。厄介なことに、ヒトの皮膚に関連する細胞型の多様性及びこれらの細胞の代謝経路の複雑性が、特定の酸化ストレッサー又は酸化ストレッサーの組み合わせへの曝露に関連する老化防止効果に有効な好適な化合物を特定することを難しくしている。特定の酸化ストレッサーは、異なる種類の細胞及び／又は代謝経路に別個に作用する。これが、特定のストレッサー（１つ又は複数）の望ましくない影響に有効である好適なスキンケア活性剤又は活性剤の組み合わせ（作用は、細胞型又は代謝経路に応じて多岐にわたって変化し得る）を選択することを難しくする。少なくとも一部の消費者は、酸化的ストレスに関連する望ましくない老化効果に有効であるスキンケア組成物を所望していることから、各種ストレッサー、特に日常的な環境的ストレッサーに関連する望ましくない酸化的ストレスを減少、予防、及び／又は逆転させる助けとなるスキンケア組成物を調合するのに使用できる、好適なスキンケア化合物を特定する方法が必要とされている。
【０００６】
酸化的ストレスが関係する代謝への影響に有効な好適なスキンケア活性剤を発見する第１工程として、細胞代謝においてストレッサー及び活性物質により生じる変化を検出し得る方法を特定する必要がある。細胞のエネルギー生成プロセスを評価するための各種方法が既知である。例えば、酸素消費量の測定にはクラーク型電極プローブが既知である。クラーク電極は、動的情報（すなわち、応答速度）を提供するものの、酸素の連続的な消費により、測定チャンバ内の細胞又は単離されたミトコンドリアに対する酸素圧が低下しているように示すアーティファクト（すなわち、試験結果に影響する何らかの望ましくない及び／又は外来性の要因）がもたらされる。酸素消費量はミトコンドリア機能の指標をもたらし得るものの、細胞の生体エネルギーの一成分のみを測定し、生体エネルギー的な平衡、すなわち解糖に関与する他の代謝経路の評価は提供しない。
【０００７】
細胞のエネルギー産生を評価する別の従来法は、細胞中のＡＴＰ量を測定するものである。全体的なエネルギー代謝を定量するための発光ＡＴＰアッセイキットが市販されている。ＡＴＰアッセイは比較的高感度であることが知られているものの、細胞は固有の必要ＡＴＰを維持し、ひいては代謝を調節するよう働くことから、ミトコンドリア機能の理想的な定量法ではない。したがって、ＡＴＰ濃度の変化は、通常、病態生理的な変化中にのみ検出され得る。加えて、ＡＴＰアッセイは破壊的であり（すなわち、細胞はＡＴＰの量を測定する目的で破壊される）、それらは動態情報を欠く。更に、瀕死細胞又は死細胞中に存在する残留ＡＴＰ由来のアーティファクトが報告されている。クラーク電極アッセイ法と同様、ＡＴＰでは、全ＡＴＰ産生量に対する各代謝経路の相対的な貢献度を求めることはできない。
【０００８】
細胞エネルギーを評価するための更に別の従来法は、市販のＭＴＴ／ＸＴＴ又はａｌａｍａｒＢｌｕｅ（商標）キットによるものである。これらのキットは、細胞の健康を評価するための比較的簡単な方法を提供するものの、ＡＴＰアッセイほど高感度ではない。加えて、細胞毒性により、測定されるべき多様なパラメータに誤差がもたらされることが報告されている。更に、いずれのアッセイも破壊的であり、動態情報を提供しない。
【０００９】
したがって、特定のストレッサーと関連する特定の種類の皮膚細胞に対する望ましくない酸化的ストレスを軽減、予防及び／又は逆転させる活性を特定及び／又は評価する方法を提供することは望ましい。前述の方法により特定されたスキンケア活性剤を含有するスキンケア組成物を提供することも望ましい。更に、特定の種類の皮膚細胞に対する特定のストレッサーからの酸化的ストレスの影響により損傷を受けた皮膚を処置する方法を提供することも望ましい。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前述の課題に対する解決策を提供するため、本明細書では、角化細胞及び線維芽細胞などの皮膚細胞の代謝を改善させるスキンケア活性剤を特定又は評価する方法が開示される。方法は、皮膚細胞をストレッサー及び被検物質に曝露すること、並びに解糖及び酸化的リン酸化に関連する代謝指標における変化を元に被検物質に対する応答を判定することを目的とする。酸化的リン酸化及び／又は解糖の応答が細胞代謝における改善と一致するとき、被検物質をスキンケア活性剤として特定することができる。
【００１１】
同様に、本明細書では、皮膚健康効果を提供し、かつ皮膚への局所塗布に好適である、パーソナルケア組成物の作製方法が開示され、方法は、本明細書で開示される方法に従う活性剤を特定すること、並びに安全かつ有効な量の活性剤を製薬上許容され得る担体に組み込むこと、を含む。
【００１２】
更に、本明細書では、皮膚健康を改善する方法が開示され、スキンケア効果を必要としている皮膚の対象領域を特定すること、並びに本明細書で開示される方法に従って作製された美容上有効な量のパーソナルケア組成物を対象領域に塗布すること、を含む。
【００１３】
更には、線維芽細胞の代謝を改善する皮膚に有効な成分を特定する方法が開示され、複数個の線維芽細胞を用意すること、線維芽細胞をストレッサーに曝露すること、解糖代謝経路及び酸化的リン酸化代謝経路のそれぞれと関連する代謝指標を非致死的に検出して、ストレッサーに対する各代謝経路の応答を用意すること、複数個の線維芽細胞を被検物質に曝露すること、解糖及び酸化的リン酸化代謝経路のそれぞれと関連する代謝指標を非致死的に検出して、被検物質に対する各代謝経路の応答を用意すること、並びに少なくとも１つの応答が、同一の代謝経路と比較したときに線維芽細胞の代謝における改善に一致するとき、被検物質を皮膚に有効な成分として特定すること、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】角化細胞の酸素消費速度を示す。
【図１Ｂ】角化細胞の酸素消費速度を示す。
【図１Ｃ】角化細胞の酸素消費速度を示す。
【図２】角化細胞の酸素消費速度を示す。
【図３Ａ】角化細胞の細胞外酸性化速度を示す。
【図３Ｂ】角化細胞の細胞外酸性化速度を示す。
【図３Ｃ】角化細胞の細胞外酸性化速度を示す。
【図４】角化細胞の細胞外酸性化速度を示す。
【図５Ａ】線維芽細胞の酸素消費速度を示す。
【図５Ｂ】線維芽細胞の酸素消費速度を示す。
【図５Ｃ】線維芽細胞の酸素消費速度を示す。
【図５Ｄ】線維芽細胞の酸素消費速度を示す。
【図５Ｅ】線維芽細胞の酸素消費速度を示す。
【図６】線維芽細胞の酸素消費速度を示す。
【図７Ａ】線維芽細胞の細胞外酸性化速度を示す。
【図７Ｂ】線維芽細胞の細胞外酸性化速度を示す。
【図７Ｃ】線維芽細胞の細胞外酸性化速度を示す。
【図７Ｄ】線維芽細胞の細胞外酸性化速度を示す。
【図７Ｅ】線維芽細胞の細胞外酸性化速度を示す。
【図８】線維芽細胞の細胞外酸性化速度を示す。
【図９】線維芽細胞の細胞外酸性化速度を示す。
【図１０】線維芽細胞の細胞外酸性化速度を示す。
【図１１】線維芽細胞の酸素消費速度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
全ての百分率は、特に記載のない限り、パーソナルケア組成物の重量による。全ての比率は、特に記述のない限り、重量比である。全ての数範囲は、より狭い範囲を包含し、表現された上方及び下方範囲の限界値は互換可能であって、明示されていない範囲を更に作成する。有効数字の数は、指示されている量を限定するものでもなく、測定の精度を限定するものでもない。全ての測定は、約２５℃及び周囲条件で行われると理解され、ここで「周囲条件」とは、約１気圧及び相対湿度約５０％という条件を意味する。
【００１６】
定義
「美容上」は、人体の領域に所望の外観上の効果をもたらすことを意味する。外観上の美容効果は、一時的、半永久的、又は永久的なものであり得る。「化粧品」のいくつかの非限定例としては、ファンデーション、マスカラ、コンシーラー、アイライナー、アイブロウ、アイシャドウ、頬紅、口紅、リップクリーム、フェイスパウダー、固形エマルションコンパクトなどといった、顔に色を乗せる製品が挙げられる。
【００１７】
「皮膚科学的に許容可能な」は、皮膚科学的に許容可能であると記述されている組成物又はそれらの成分が、過度の毒性、不適応性、不安定性、アレルギー反応などを有さず、ヒトの皮膚と接触させて用いるのに適していることを意味する。
【００１８】
「異なる細胞型」は、細胞が、意図される生物学的機能において、互いに異なっていることを意味する。互いに異なる細胞型の例としては、線維芽細胞、角化細胞、メラニン産生細胞、筋細胞、脂腺細胞、及び脂肪細胞が挙げられるがこれらに限定されない。
【００１９】
「配置される」とは、別の要素に対して特定の場所に位置付けされることを意味する。
【００２０】
「非致死的」は、試験又は観察する細胞を殺傷又は破壊することを意図しない試験方法を意味する。例えば、代謝指標の非致死的な検出は、検出後に細胞の少なくとも７５％が生存することを意味する（例えば、細胞の８０％、８５％、９０％、９５％又は更には９９％以上が生存したままである）。理想的には、非致死的試験後には１００％の細胞が生存するものの、ある程度の細胞破壊は不可避であり得ること及び／又は試験とは無関係に生じ得ることが認識される。
【００２１】
「酸化的ストレッサー」は、細胞において望ましくない活性酸素種の形成をもたらす環境要素を意味する。酸化的ストレッサーのいくつかの非限定例としては、紫外線、煙草の煙、オゾン、エンジン排気、ディーゼル排気、煙霧、界面活性剤、及びコンピューターのモニター又はテレビからの放射線が挙げられる。
【００２２】
「パーソナルケア組成物」とは、哺乳類の皮膚に対する局所適用に関して好適な組成物を意味する。本発明のパーソナルケア組成物は、スキンケア、化粧及びヘアケア製品に使用され得る。その非限定的用途としては、制汗剤、脱臭剤、ローション（例えば、ハンドローション及びボディローション）、スキンケア製品（例えば、フェイス及びネックローション、美容液、スプレー）、サンレスタナー、化粧品（例えば、ファウンデーション、コンシーラー、ブラシ、リップスティック、リップグロス）、脱毛剤、シャンプー、コンディショニングシャンプー、ヘアコンディショナー、毛髪染料、ボディウォッシュ、加湿ボディウォッシュ、シャワーゲル、皮膚クレンザー、クレンジングミルク、ヘア及びボディウォッシュ、インシャワーボディモイスチャー、ペットシャンプー、剃毛調剤、アフターシェーブ、かみそり加湿／潤滑ストリップ、かみそりシェーブゲルバー、固形石鹸、洗浄製品、女性用ケア製品、口腔ケア製品及び乳児ケア製品が挙げられる。上記組成物の使用方法もまた、パーソナルケア組成物の意味の中に含まれる。
【００２３】
「皮膚の状態を制御する」は、外観及び／又は感触における劣化が僅かであるようあるいは全く存在しないよう皮膚の外観及び／又は感触を維持することを意味する。
【００２４】
「安全かつ有効な量」は、望ましい効果、好ましくは、本明細書に開示される効果を個別に又は組み合わせて包含する、皮膚又は感触に対する望ましい効果を明白にもたらすために十分な量で、但し深刻な副作用を防ぐ（すなわち、当事者の通常の判断の範囲内で妥当な効果対リスク比を提供する）ためには十分に少ない、化合物又は組成物の量を意味する。
【００２５】
「皮膚」は、角化細胞、線維芽細胞及びメラニン産生細胞などの細胞から構成され、哺乳類の最外保護被覆を意味する。皮膚は、外側の表皮層及びその下の真皮層を含む。皮膚には、毛髪及び爪、並びに一般に皮膚に関連付けられる、例えば、筋細胞、メルケル細胞、ランゲルハンス細胞、マクロファージ、幹細胞、脂腺細胞、神経細胞及び脂肪細胞などのその他の種類の細胞も含まれる。
【００２６】
「スキンケア」は、皮膚の状態の制御及び／又は改善を意味する。いくつかの非限定例としては、滑らかでより均一な外観及び／又は感触を提供することによる皮膚の外観及び／又は感触の改善、１つ以上の皮膚層の厚みの増加、皮膚の弾性又は弾力性の改善、皮膚の硬さの改善、並びに皮膚外観の油っぽさ、てかり、及び／又はくすみの低減、皮膚の水和状態又は保湿の改善、小じわ及び／又はしわの外観の改善、皮膚の剥脱又は剥離の改善、皮膚をふっくらさせる、皮膚バリア特性の改善、皮膚の色調の改善、赤み又は皮膚のしみの外観の低減、並びに／あるいは皮膚の輝き、艶、又は透明感の改善が挙げられる。「スキンケア製品」のいくつかの非限定例としては、肌用クリーム、保湿剤、ローション剤、及びボディウォッシュが挙げられる。
【００２７】
「スキンケア組成物」は、皮膚の状態を制御及び／又は改善する組成物を意味する。
【００２８】
「スキンケア活性剤」は、皮膚に適用したときに、即時的及び／又は持続的な効果を、皮膚又は一般に皮膚において見られる細胞型にもたらす化合物又は化合物の組み合わせを意味する。スキンケア活性剤は、皮膚又は皮膚に関連する細胞を制御及び／又は改善し得る（例えば、皮膚の弾性を改善する、皮膚の水和を改善する、皮膚の状態を改善する、並びに細胞の代謝を改善する）。
【００２９】
「局所塗布」は、本発明の組成物をケラチン組織の表面に塗布する又は広げることを意味する。
【００３０】
ヒトの加齢に伴い、身体の細胞に対し、外的及び内的ストレッサー由来の損傷（すなわち、酸化的ストレス）が蓄積され、組織及び器官の効率及び機能の低下がもたらされ得る。酸化的ストレスが、細胞がエネルギーを産生する能力の低下として現れるのは一般的なものである。スキンケア活性剤は、皮膚に対する酸化的損傷の影響を減少、停止、又は更には逆転させることが知られている。しかしながら、細胞の代謝経路及び／又は皮膚において見られる異なる細胞型の数の複雑性に起因し、新しい及び／又はより良好なスキンケア活性剤を特定することは困難である。驚くべきことに、ある種の酸化的ストレッサーは、これまでに真価を認められていなかった経路で、ある種の皮膚細胞型の生体エネルギーに影響を与えることが判明している。この新しい知識を利用して、特定の皮膚細胞型に対するある種のストレッサーによる特定の代謝への影響に有効であるスキンケア活性剤を特定し、ひいては皮膚のケアに対するより全人的なアプローチをもたらすことができる。特に、特定の皮膚細胞型に対する特定の酸化的ストレッサーの影響に有効であるよう調合されたスキンケア活性剤、活性剤の組み合わせ及び／又はスキンケアレジメンは、ヒトの皮膚の全般的な健康の改善をもたらし得る。したがって、本明細書における新規方法は、特定の皮膚細胞型に対する特定のストレッサーと関連する望ましくない代謝による影響に有効であるスキンケア活性剤を特定するための、簡単で精確な手法を提供する。
【００３１】
本明細書におけるいくつかの例は、紫外線と併せて角化細胞及び線維芽細胞などの皮膚細胞を目的とする。方法は、所望される通りの任意のストレッサーと組み合わせて任意の種類の細胞とともに使用するのに非常に有利なものとなるよう調整することができることは評価される。
【００３２】
哺乳類細胞がエネルギーを産生するために重要な２つの代謝経路は、酸化的リン酸化（「ｏｘｐｈｏｓ」）経路及び解糖経路である。いずれの経路も、ほとんどの哺乳類細胞内で健康的なエネルギー平衡を維持するのに必要とされる。酸化的リン酸化は、電子供与体から電子受容体（酸化還元反応における酸素などの）への電子の移動に関与し、これによりＡＴＰの生成に使用されるエネルギーの放出が生じる。哺乳類では、ミトコンドリア膜内の一連のタンパク質複合体より酸化還元反応が実施され、この連結しているタンパク質セットは電子伝達系と呼ばれる。電子がこの電子伝達系を通過することにより放出されたエネルギーを利用して、ミトコンドリア膜を通過して化学浸透と呼ばれるプロセスでプロトンが輸送され、これにより膜を介してｐＨ勾配及び電位の形態で位置エネルギーが生成される。ＡＴＰ合成酵素として一般に知られる酵素は、位置エネルギーを利用してＡＴＰを生成することができる。酸化的リン酸化経路は酸素を利用してＡＴＰを生成することから、細胞が酸素を消費する速度を細胞の代謝指標として利用することもできる。すなわち、細胞の酸素消費速度は、細胞による酸化的リン酸化を介するエネルギー産生に直接関連し得る。追加的に又は別の方法として、二酸化炭素は細胞代謝の副生成物であることから、二酸化炭素産生速度を代謝指標として利用することもできる。酸素消費速度又は二酸化炭素産生速度が高くなるほど、酸化的リン酸化経路からのエネルギー産生が増加していること、ひいては細胞の代謝及び／又は健康における改善が意味され得る。反対に、酸素消費速度又は二酸化炭素産生速度が低くなるほど、酸化的リン酸化代謝が低下していることが意味され得る。結果として、酸化的ストレスにより生じる酸化的リン酸化代謝の低下を軽減、予防及び／又は逆転する化合物を特定及び／又は評価することが望ましい。
【００３３】
解糖はグルコースをピルビン酸に変換する代謝経路である。この手法で放出される自由エネルギーを利用して、ＡＴＰ及びＮＡＤＨ（還元ＮＡＤ）が形成される。解糖は、１０種の中間体化合物を包含する確実な一連の１０の反応（工程のうちの１つには２つの中間体が関与する）であり、典型的には細胞の細胞質基質で生じる。中間体は、解糖の開始点を提供する。単糖（例えば、フルクトース、グルコース、及びガラクトースなど）のほとんどは、これらの中間体のいずれかに変換され得る。中間体が直接的に有用である場合もある。例えば、中間体ジヒドロキシアセトンリン酸（ＤＨＡＰ）は、脂肪酸と結合して脂肪を形成するグリセロール源である。解糖の副生成物は、溶液中で乳酸アニオンに加えてプロトンを形成し得る乳酸である。したがって、乳酸、乳酸塩又はプロトン濃度を解糖の代謝指標として使用できる。すなわち、細胞外ｐＨ又は細胞外酸性化速度における変化は、細胞による、解糖経路を介したエネルギー産生と直接関連付けられ得る。細胞外酸性化速度が高くなるほど、解糖経路を介したエネルギー産生が増加し、ひいては細胞の代謝及び／又は健康が向上することが意味され得る。反対に、細胞外酸性化速度が低くなるほど、解糖代謝が低下していることが意味され得る。結果として、酸化的ストレスにより生じる解糖代謝の低下を軽減、予防及び／又は逆転する化合物を特定及び／又は評価することが望ましい。
【００３４】
角化細胞
角化細胞は、一般に表皮において顕著な細胞型として認識されており、典型的には表皮で見られる細胞の約９５％を構成する。角化細胞は、表皮の基底層の下部に存在する表皮幹細胞から分化により形成される。角化細胞は分裂し、表皮層（例えば、有棘細胞層及び顆粒層）内を上方に移動するにつれて分化し、最終的には角質層中で角質細胞となる。分化プロセス中、角化細胞はますますケラチンを産生するようになり（「角質化」）、最終的には、細胞周期から永久に離脱して、角質層の硬性の外層を構成する角質細胞を形成するようになる。最終的には、角質細胞は新しい細胞が追加されるにつれて落屑により脱離する。酸化的ストレスが角化細胞の代謝を低下させるとき、角化細胞の分裂及び分化速度は低下し又は更には停止さえし得る。これは同様に、損失分の角質細胞を角質層に補充する速度も低下させ、最終的には皮膚のバリア特性の望ましくない低下を招き得る。したがって、角化細胞に対するある種のストレッサー（例えば、紫外線Ａ波、紫外線Ｂ波、巻き煙草／煙草の煙、煙霧、オゾン、エンジン排気、揮発性有機化合物）からの酸化的ストレスに関する望ましくない代謝による影響を軽減、予防及び／又は逆転するスキンケア活性剤を特定することは望ましいものであり得る。
【００３５】
皮膚を紫外線に曝露することで皮膚細胞に酸化的ストレスがもたらされ得ることは周知である。しかしながら、これまで、特定の皮膚細胞型が、どのようにして異なる波長の紫外線放射に代謝応答するのか、又は紫外線放射への曝露後、時間の経過とともに紫外線放射に対する特定の皮膚細胞型の代謝応答がどのように変化し得るのかは完全には認識されていなかった。今では、角化細胞の酸化的リン酸化及び解糖代謝経路は、紫外線Ｂ波放射（すなわち、３１５〜２８０ｎｍの波長の電磁放射線）に対し異なる応答を示すことが判明している。特に、角化細胞の紫外線Ｂ波放射への曝露により、酸化的リン酸化経路における代謝活性が低下することが判明しているものの、曝露後２時間以内であれば解糖に著しい影響は有さないようである。これらを踏まえ、角化細胞に対する紫外線Ｂ波放射に関する望ましくない代謝による影響を直接的に（すなわち、ストレッサー又はＲＯＳを存在させずとも）及び／又は間接的に（例えば、細胞をストレッサー又はＲＯＳに曝露したときにのみ）軽減、予防及び／又は逆転するスキンケア活性剤を特定することは望ましいものであり得る。
【００３６】
角化細胞は、特定の照射量及び／又は曝露後経過時間にて、紫外線Ｂ波放射に対し、以前は評価されていなかった代謝応答を示すことも判明している。この発見は、紫外線Ｂ波放射による角化細胞に対する酸化的ストレスの影響に有効であるスキンケア活性剤の選別に特有の見識を提供する。特に、現在では、１平方センチメートル当たり５ミリジュール（「ｍＪ／ｃｍ2」）〜５０ｍＪ／ｃｍ2（例えば、７．５〜４０ｍＪ／ｃｍ2、１０〜３０ｍＪ／ｃｍ2、又は更には１５〜３０ｍＪ／ｃｍ2）の紫外線Ｂ波放射は、角化細胞を殺傷しないものの、角化細胞の酸化的リン酸化及び／又は解糖経路において、測定され得る代謝応答を誘導するのに十分なエネルギーを提供することが既知である。更に、場合によっては、ストレッサーに対する角化細胞の曝露から少なくとも１時間後、但し典型的には、曝露から７２時間以下（例えば、２〜２４時間、３〜２３時間、４〜２２時間、５〜２１時間、６〜２０時間、７〜１９時間、８〜１８時間、９〜１７時間、１０〜１６時間、１１〜１５時間、又は更には１２〜１４時間）に望ましい代謝指標を検出することは重要であり得る。あまりに早く代謝指標が検出された場合、細胞はストレッサーに完全に応答するのに十分な時間を得ていない恐れがある。その一方で、曝露後、時間が経過し過ぎている場合、応答は失われる恐れがある（例えば、細胞の代謝が基礎値に戻る場合）。更に、場合によっては、特定の時間で観察される動態データは、一般的な静的検出方法（例えば、ＡＴＰアッセイ）を利用したときには明白にならない、角化細胞の酸化的ストレッサー及び／又はＲＯＳに対する応答に関する重要な見識を提供し得ることが既知である。
【００３７】
場合によっては、本明細書に記載の方法は、複数個の角化細胞を、紫外線Ｂ波放射などのストレッサー及び／又は過酸化水素などのＲＯＳに曝露し、次に角化細胞を被検物質に接触させることを含む。角化細胞のストレッサー及び被検物質に対する代謝応答は、酸化的リン酸化及び解糖代謝経路のそれぞれに対応する代謝指標を検出することにより得られる。代謝応答は、制御環境下でリアルタイムで検出され、酸化的リン酸化及び解糖指標が、同一の細胞から同時に得られる。一部の実施態様では、角化細胞の酸化的リン酸化及び解糖代謝経路のそれぞれについて基礎値を提供し、代謝応答を基礎値と、及び／又は互いに比較して、ストレッサー及び／又は被検物質に対する代謝経路の応答を判定することは望ましいものであり得る。「基礎値」は、細胞をストレッサー又は被検物質に曝露する前の、通常の安静時の代謝指標の値を意味する。細胞の基礎値は、代謝指標を測定することにより、及び／又は科学文献及び／又は他の好適な情報源を閲覧することにより提供され得る。しかしながら、細胞の基礎代謝値は、各種環境及び内部要因に起因して多様に変化し得ることが周知であることから、基礎値を測定することは好ましい場合があり得る。
【００３８】
図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃは、紫外線Ｂ波放射（３１２ｎｍ）に対する曝露後の角化細胞の酸素消費速度（「ＯＣＲ」）の検出により得られた動態データを示す。図に示す角化細胞は、Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）から得られた初代角化細胞である。以降の試験方法において記載の方法により細胞を調製し、試験した。図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃにおいてそれぞれ上側にプロットされている３０Ａ、３０Ｂ及び３０Ｃは、角化細胞の基礎ＯＣＲ値（すなわち、紫外線Ｂ波に曝露しなかった場合のＯＣＲ）を示す。図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃのそれぞれにおいて下側にプロットされている３５Ａ、３５Ｂ及び３５Ｃは、それぞれ、照射量７．５、１５及び３０ｍＪ／ｃｍ2の紫外線Ｂ波放射への曝露後の角化細胞の応答ＯＣＲ値を示す。提供する適切な照射量（すなわち、７．５、１５又は３０ｍＪ／ｃｍ2）は、多様な周知の因子に応じ変化し得る（例えば、望ましい照射量、電球の寿命、電球の型、機器が熱を帯びているか否か）ことは認識されるであろうし、望ましい紫外線放射量の提供は十分当業者の能力の範囲内である。対照プロット３７Ａ、３７Ｂ及び３７Ｃは、角化細胞は全く含有していないものの他のウェルと同一の培地を含有しているウェルで測定された対照ＯＣＲ値を示す。対照値は、存在し得る任意のバックグラウンド効果について、基礎値及び応答値を補正することができる。各プロットの最初のデータ点は、紫外線Ｂ波放射への曝露から約１時間後にとった。図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに示されるように、紫外線Ｂ波への曝露後の角化細胞の応答ＯＣＲ値は、一般的に、対応する基礎ＯＣＲ値よりも低い。理論に制限されるものではないが、図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに示されるデータは、紫外線Ｂ波放射が角化細胞の酸化的リン酸化代謝を低下させることを示すと考えられている。これらを踏まえ、角化細胞の酸化的リン酸化代謝経路に対する、紫外線Ｂ波放射などのストレッサーに関する望ましくない影響に有効であり、及び／又は酸化的リン酸化代謝経路の改善に直接的に作用する（すなわち、ストレッサー又はＲＯＳの存在しない場合でさえ改善をもたらす）、スキンケア活性剤を特定し、このような活性剤を安全かつ有効な量でパーソナルケア組成物に組み込むことは望ましいものであり得る。
【００３９】
図２は、紫外線Ｂ波放射（３１２ｎｍ）への曝露から２４時間後の角化細胞ＯＣＲの応答を示す。図２に示される、２４時間の値は、角化細胞を紫外線Ｂ波放射に曝露し、次にプレートを３７℃かつ５％  ＣＯ2で２４時間インキュベートすることにより得られた。紫外線放射から２４時間後、以降に記載の方法により細胞を分析した。２４時間の基礎値４０は、チャート４９の左端に示す。基礎値４０のすぐ右隣にあるのは、照射量７．５ｍＪ／ｃｍ2の紫外線Ｂ波放射についての２４時間での応答ＯＣＲ値４１であり、その隣は照射量１５ｍＪ／ｃｍ2についての２４時間での応答ＯＣＲ値４２である。チャート４９の右端は、照射量３０ｍＪ／ｃｍ2についての２４時間応答ＯＣＲ値４３である。図２に示されるように、角化細胞は、引き続き、照射量７．５、１５及び３０ｍＪ／ｃｍ2の紫外線Ｂ波への曝露後２４時間のＯＣＲが低下していることを示した。したがって、特に、角化細胞の酸化的リン酸化代謝に対する紫外線Ｂ波の負の影響を阻害及び／又は軽減するスキンケア活性剤を選別するとき、紫外線Ｂ波への曝露後最大２４時間又はそれ以上（例えば、４８又は７２時間）の角化細胞の酸化的リン酸化応答を測定することは重要であり得る。
【００４０】
図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃは、紫外線Ｂ波放射（３１２ｎｍ）に対する曝露後の角化細胞の細胞外酸性化速度（「ＥＣＡＲ」）の検出により得られた動態データを示す。角化細胞は、図１Ａ、１Ｂ及び１Ｃに関し上記のものと同一の方法で得た初代角化細胞であり、試験は以降の試験方法に記載の方法により実施した。図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃにおいてそれぞれ上側にプロットされている６５Ａ、６５Ｂ及び６５Ｃは、それぞれ、照射量７．５、１５及び３０ｍＪ／ｃｍ2の紫外線Ｂ波放射への曝露後の角化細胞の応答ＥＣＡＲ値を示す。下側プロット６０Ａ、６０Ｂ及び６０Ｃは、角化細胞の基礎ＥＣＡＲ値（すなわち、紫外線Ｂ波曝露はなし）を示す。対照プロット６７Ａ、６７Ｂ及び６７Ｃは、角化細胞は全く含有していないものの他のウェルと同一の培地を含有しているウェルで測定された対照ＥＣＡＲ値を示す。図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃに示されるように、対照値６７Ａ、６７Ｂ及び６７Ｃは、時間経過後も、測定され得る変化を全く示さなかったのに対し、角化細胞の応答ＥＣＡＲ値は、一般的に、対応する基礎ＥＣＡＲ値よりも高い。ＥＣＡＲ応答データの統計分析は、ダネット補正を用い、一元配置分散分析（「ＡＮＯＶＡ」）を使用して実施した。統計分析は、対応する基礎値６０Ａ、６０Ｂ及び６０Ｃと比較して、ＥＣＡＲ応答値６５Ａ、６５Ｂ及び６５Ｃにおいて統計的に有意な変化はなかったことを示した。
【００４１】
図４は、紫外線Ｂ波放射（３１２ｎｍ）への曝露から２４時間後の角化細胞ＥＣＡＲの応答を示す。図４に示される、２４時間の値は、角化細胞を紫外線Ｂ波放射に曝露し、次にプレートを３７℃かつ５％  ＣＯ2で２４時間インキュベートすることにより得られた。紫外線放射から２４時間後、以降に記載の方法により細胞を分析した。２４時間の基礎ＥＣＡＲ値７０は、チャート７９の左端に示す。基礎値７０のすぐ右隣にあるのは、照射量７．５ｍＪ／ｃｍ2の紫外線Ｂ波放射についての２４時間での応答ＥＣＡＲ値７１であり、その隣は照射量１５ｍＪ／ｃｍ2についての２４時間での応答ＥＣＡＲ値７２である。チャート７９の右端は、照射量３０ｍＪ／ｃｍ2についての２４時間応答ＥＣＡＲ値７３である。２４時間ＥＣＡＲ応答データの統計分析は、ダネット補正を用い、一元配置分散分析（「ＡＮＯＶＡ」）を使用して実施した。分析は、基礎値と比較して、ＥＣＡＲ応答値において統計的に有意な変化があったことを示す。したがって、紫外線Ｂ波放射などのストレッサーに対する角化細胞の曝露後に経過する時間量は、角化細胞の解糖代謝に対する紫外線Ｂ波の負の影響を阻害及び／又は緩和するスキンケア活性剤を選別するときに考慮するための重要な因子となり得る。特に、紫外線Ｂ波などのストレッサーへの曝露後、２時間以上待機して（例えば、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４、４８、又は７２時間）、角化細胞における解糖の代謝指標を検出することは望ましいものであり得る。
【００４２】
線維芽細胞
場合によっては、特定のストレッサーによる線維芽細胞に対する望ましくない酸化的ストレス効果を軽減、予防及び／又は逆転するスキンケア活性剤を特定することが望ましいものであり得る。線維芽細胞は、皮膚及び皮下（すなわち、皮膚下）層の真皮層に見られ、一般に、細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）及びコラーゲンを合成して哺乳類組織の構造骨格を提供する細胞として認識されている。ＥＣＭ及びコラーゲンは、皮膚に引張り強さ及び弾性を提供することにより、身体に対する応力及びひずみを和らげるよう機能する。線維芽細胞は、創傷治癒において重要な役割も果たす。酸化的ストレスが線維芽細胞の代謝を低下させると、身体がコラーゲン及びＥＣＭを合成する能力が低下して、結果として皮膚の外見は垂れ下がり、薄くなる場合がある。及び、身体が創傷を治癒する能力が妨害され得る。
【００４３】
上述した通り、特定の皮膚細胞型が、どのようにして異なる波長の紫外線放射に代謝により反応するのか、又は紫外線への曝露後、時間の経過とともに紫外線に対する特定の皮膚細胞型の代謝応答がどのように変化し得るのかは完全には認識されていなかった。これにより、好適なスキンケア活性剤を特定するプロセスには不確実性及び困難さが加わる。驚くべきことに、線維芽細胞の酸化的リン酸化及び解糖代謝経路は、紫外線Ａ波放射に対し異なる応答を示すことが判明している。皮膚に接触する紫外線Ｂ波放射のほとんどは角化細胞により吸収又は反射される一方、より長波長の紫外線Ａ波放射は、表皮を透過して、その下の線維芽細胞に、並びに真皮及び皮下組織に一般に見られるその他の細胞に損傷を与え得る。特に、線維芽細胞を、閾値エネルギー強度を超える紫外線Ａ波放射に曝露することで、酸化的リン酸化経路において代謝活性の低下が生じることが判明している。同様に、紫外線Ａ波放射への線維芽細胞の曝露は、解糖経路における代謝活性の低下も引き起こし得る。加えていずれの代謝経路も、異なるエネルギー強度及び曝露後経過時間下での応答の変化を示し得る。この発見は、線維芽細胞に対する、紫外線Ａ波放射などの酸化的ストレッサーによる影響に有効なスキンケア活性剤の特定に重要な固有の見識を提供する。例えば、現在では、１平方センチメートル当たり１〜５０ジュール（「Ｊ／ｃｍ2」）の紫外線Ａ波放射は、一般的には線維芽細胞を殺傷しないものの、酸化的リン酸化及び／又は解糖経路において測定可能な代謝応答を誘導するのに十分なエネルギーをもたらすことが既知である。好適な紫外線Ａ波放射範囲には、５〜４０、１０〜３０、又は更は約２０Ｊ／ｃｍ2を含む。更に、現在では、場合によっては、ストレッサーに対する線維芽細胞の曝露から少なくとも１時間後、但し典型的には、曝露から２４時間以下（例えば、２〜２４時間、３〜２３時間、４〜２２時間、５〜２１時間、６〜２０時間、７〜１９時間、８〜１８時間、９〜１７時間、１０〜１６時間、１１〜１５時間、又は１２〜１４時間）に代謝指標を検出することは重要であり得ることも既知である。あまりに早く代謝指標が検出された場合、細胞はストレッサーに完全に応答するのに十分な時間を得ていない恐れがある。一方で、あまりにも時間が経過している場合、ストレッサーに対する重要な一過性の応答が検出されなくなってしまう恐れがある。更に、場合によっては、特定の時間で観察される動態データは、一般的な静的検出方法（例えば、ＡＴＰアッセイ）を利用したときには明白にならない、線維芽細胞の酸化的ストレッサー及び／又はＲＯＳに対する応答に関する重要な見識を提供し得ることが既知である。
【００４４】
一部の実施態様では、本明細書に記載の方法は、複数個の線維芽細胞を、紫外線Ａ波放射などのストレッサー及び／又は過酸化水素などのＲＯＳに曝露し、次に線維芽細胞を被検物質と接触させることを含む。線維芽細胞のストレッサー及び／又は被検物質に対する代謝応答は、酸化的リン酸化及び解糖代謝経路のそれぞれに対応する代謝指標を検出することにより得ることができる。代謝応答は、制御環境下でリアルタイムで検出され、酸化的リン酸化及び解糖指標が、同一の細胞から同時に得られる。一部の実施態様では、線維芽細胞の酸化的リン酸化及び解糖代謝経路の少なくとも１つについて基礎値を提供し、代謝応答を基礎値と、及び／又は互いに比較して、ストレッサー及び／又は被検物質に対する代謝経路の応答を決定することは望ましいものであり得る。
【００４５】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ及び５Ｅは、紫外線Ａ波放射（３６５ｎｍ）への曝露後の線維芽細胞の酸素消費速度を検出することにより得られる動態データを示す。線維芽細胞は、ＡＴＣＣ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（ＢＪ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）から得られる真皮線維芽細胞である。以降のより詳細に記載される方法により細胞を調製し、試験した。図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ及び５Ｅにおいてそれぞれ上側にプロットされている９０Ａ、９０Ｂ、９０Ｃ、９０Ｄ、及び９０Ｅは、それぞれ線維芽細胞の基礎ＯＣＲ値を示す（すなわち、紫外線Ａ波に未曝露のＯＣＲ）。図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ及び５Ｅのそれぞれにおいて下側にプロットされている９５Ａ、９５Ｂ、９５Ｃ、９５Ｄ及び９５Ｅは、それぞれ、照射量１、５、１０、２０及び３０Ｊ／ｃｍ2の紫外線Ａ波放射への曝露後の角化細胞の応答ＯＣＲ値を示す。対照プロット９７Ａ、９７Ｂ、９７Ｃ、９７Ｄ及び９７Ｅは、線維芽細胞は全く含有していないものの他のウェルと同一の培地を含有しているウェルで測定された対照ＯＣＲ値を示す。対照値は、存在し得る任意のバックグラウンド効果について、基礎値及び応答値を補正することができる。図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ及び５Ｅに示されるように、紫外線Ａ波への曝露後の線維芽細胞の応答ＯＣＲ値は、一般的に、対応する基礎ＯＣＲ値よりも低い。したがって、理論に束縛されるものではないが、図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ及び５Ｅに示されるデータは、照射量１Ｊ／ｃｍ2超の紫外線Ａ波放射は、線維芽細胞の酸化的リン酸化代謝を低下させ得ることを意味すると考えられている。これらを踏まえ、線維芽細胞の酸化的リン酸化代謝経路に対する、紫外線Ａ波放射などのストレッサーに関する望ましくない影響に有効であり、及び／又は直接作用して酸化的リン酸化代謝経路を改善させる（すなわち、ストレッサー又はＲＯＳの存在しない場合でさえ改善をもたらす）スキンケア活性剤を特定し、このような活性剤を安全かつ有効な量でパーソナルケア組成物に組み込むことは望ましいものであり得る。
【００４６】
図６は、紫外線Ａ波放射（３６５ｎｍ）への曝露後２４時間での線維芽細胞ＯＣＲを示す。図６に示される、２４時間の値は、線維芽細胞を紫外線Ｂ波放射に曝露し、次にプレートを３７℃かつ５％  ＣＯ2で２４時間インキュベートすることにより得られた。紫外線Ａ波に対する曝露から２４時間後、以降に記載の方法により細胞を分析した。２４時間の基礎値８０は、チャート８９の左端に示す。基礎値８０のすぐ右隣にあるのは、照射量１Ｊ／ｃｍ2の紫外線Ａ波放射についての２４時間での応答ＯＣＲ値８１であり、その隣は照射量５Ｊ／ｃｍ2についての２４時間での応答ＯＣＲ値８２である。チャート８９の右端は、照射量１０ｍＪ／ｃｍ2についての２４時間応答ＯＣＲ値８３である。図６に示されるように、線維芽細胞は、照射量僅か１０Ｊ／ｃｍ2で２４時間後のＯＣＲにおいて低下を示すことが明らかである。したがって、例えば、照射量５Ｊ／ｃｍ2超又は１０Ｊ／ｃｍ2の紫外線Ａ波放射に関する望ましくない影響に有効なスキンケア活性剤を選別するとき、紫外線Ａ波放射への曝露後２４時間又はそれ以上の時間（例えば、４８又は７２時間）で線維芽細胞の酸化的リン酸化応答を測定することは重要であり得る。しかしながら、線維芽細胞に対する照射量１０Ｊ／ｃｍ2未満又は５Ｊ／ｃｍ2の紫外線Ａ波放射に関する望ましくない代謝による影響に有効であるスキンケア活性剤を選別するとき、低照射量での試験は行わないことで、選別プロセスにおいて時間及び資源を消費する工程を回避することができる。
【００４７】
図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ及び７Ｅは、線維芽細胞の細胞外酸性化速度を検出することにより得られる動態データを示す。線維芽細胞は、図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ及び５Ｅに関し上記したものと同一の方法で得て、試験は以降の試験方法に記載の方法により実施した。図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ及び−７Ｅでは、基礎ＥＣＡＲ値は、プロット１２０Ａ、１２０Ｂ、１２０Ｃ、１２０Ｄ及び１２０Ｅにより表され、応答ＥＣＡＲ値は、プロット１２５Ａ、１２５Ｂ、１２５Ｃ、１２５Ｄ及び１２５Ｅにより表され、対照ＥＣＡＲ値は、プロット１２７Ａ、１２７Ｂ、１２７Ｃ、１２７Ｄ及び１２７Ｅにより表される。基礎値１２０Ａ、１２０Ｂ、１２０Ｃ、１２０Ｄ及び１２０Ｅ並びに対照値１２７Ａ、１２７Ｂ、１２７Ｃ、１２７Ｄ及び１２７Ｅは、上記のものと同一の方法で得た。応答値１２５Ａ、１２５Ｂ、１２５Ｃ、１２５Ｄ及び１２５Ｅは、それぞれ１、５、１０、２０及び３０Ｊ／ｃｍ2（３６５ｎｍ）の紫外線Ａ波放射への曝露後の線維芽細胞の応答に相当する。図７Ａに見ることができる通り、１Ｊ／ｃｍ2の紫外線Ａ波放射への曝露後の線維芽細胞の応答ＥＣＡＲ値１２５Ａは、一般に、基礎値１２０Ａのものとおおよそ同値であり、線維芽細胞の解糖代謝経路は一般にこの照射では影響を受けないことが示される。但し、図７Ｂ及び７Ｃに示される通り、５及び１０Ｊ／ｃｍ2のそれぞれの紫外線Ａへの曝露後の線維芽細胞の応答ＥＣＡＲ値１２５Ｂ及び１２５Ｃは、相当する基礎値１２０Ｂ及び１２０Ｃよりも高かった。驚くべきことに、線維芽細胞を２０Ｊ／ｃｍ2の紫外線Ａ波に曝露したとき、図７Ｄに示される通り、応答ＥＣＡＲ値１２５Ｄは最初は基礎値１２０Ｄよりも高かったものの、結局（すなわち、約８５〜１０２分）基礎値１２０Ｄと交差し、最終的には基礎値１２０Ｄよりも低下することが見て取れる。図７Ｅに示す通り、３０Ｊ／ｃｍ２への曝露後の線維芽細胞の応答ＥＣＡＲ値１２５Ｅは、基礎値よりも大幅に低いことから、線維芽細胞の解糖代謝経路が完全に停止されていることが示される。したがって、理論に束縛されるものではないが、図７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ及び７Ｅに示されるデータは、線維芽細胞の解糖に対する紫外線Ａ波放射の影響に有効であるスキンケア活性剤を選別するとき、曝露後の時間及び照射量の両方が、検討に値する重要な因子であることを示すと考えられる。特に、照射量２０Ｊ／ｃｍ2超及び未満は、線維芽細胞の解糖代謝に対し非常に異なる影響を有する可能性があり、これらの差異を認識することが、望ましい効果を阻害せずに紫外線Ａ波の望ましくない影響に対し有効であるスキンケア活性剤の効果的な組み合わせを特定する助けとなり得る。
【００４８】
図８は、紫外線Ａ波放射（３６５ｎｍ）への曝露後２４時間での線維芽細胞ＥＣＡＲを示す。図８に示される、２４時間の値は、線維芽細胞を紫外線Ｂ波放射に曝露し、次にプレートを３７℃かつ５％  ＣＯ2で２４時間インキュベートすることにより得られた。紫外線Ａ波への曝露から２４時間後、以降の試験方法に記載の方法により細胞を分析した。２４時間の基礎ＥＣＡＲ値９０は、チャート９９の左端に示す。基礎値９０のすぐ右隣にあるのは、照射量１Ｊ／ｃｍ2の紫外線Ａ波放射についての２４時間での応答ＥＣＡＲ値９０であり、その隣は照射量５Ｊ／ｃｍ2についての２４時間での応答ＥＣＡＲ値９２である。チャート９９の右端は、照射量１０ｍＪ／ｃｍ2についての２４時間応答ＥＣＡＲ値９３である。図８に示されるように、線維芽細胞は、照射量僅か１０Ｊ／ｃｍ2で２４時間後のＥＣＡＲにおいて低下を示すことが明らかである。したがって、紫外線Ａ波の照射量に応じ、線維芽細胞の解糖に対する紫外線Ａ波放射の影響に有効であるスキンケア活性剤を選別するとき、曝露後時間、特に２４時間又はそれ以上の時間を、重要な因子として検討することができる。
【００４９】
パーソナルケア組成物及びこれを使用する方法
皮膚の健康及び／又は外観上の効果は健康な皮膚細胞により提供されることから、本願における方法により特定された１つ以上のスキンケア活性剤を化粧品組成物に組み込むことは望ましいものであり得る。すなわち、本願における方法によりスキンケア活性剤を特定すること、及びスキンケア活性剤（１種又は複数）を成分として化粧品組成物に含有させることは望ましいものであり得る。このような化粧品組成物は、角化細胞、線維芽細胞及び／又は皮膚に一般に見られる他の種類の細胞（例えば、メラニン産生細胞、筋細胞、幹細胞、脂腺細胞、神経細胞、及び脂肪細胞）に対する酸化的ストレスに関する望ましくない代謝による影響を減少、予防及び／又は逆転させる皮膚科学的に許容され得る担体、並びにナイアシンアミドなどのスキンケア活性剤を含有し得る。本願における化粧品組成物は、提供される具体的な化粧品組成物中に一般的に含有される種類の１つ以上の追加成分を含み得る。例えば、化粧品組成物には、哺乳類の皮膚の状態を制御及び／又は改善することが既知である追加のスキンケア活性剤を含有させてよい。このような追加の成分の非限定的な例としては、皮膚軟化剤、保湿剤、ビタミン類、ペプチド、及び糖アミン類が挙げられる。他の任意の成分は日焼け止め活性剤（又は日焼け止め薬剤）及び／又は紫外光吸収体を含む。ある実施形態では、化粧品組成物は着色剤、界面活性剤、フィルム形成組成物、及び／又はレオロジー変性剤を含み得る。本明細書中の好適な化粧品組成物は例えば、乳濁液、ローション、乳、液体、固体、クリーム、ジェル、マウス、軟膏、ペースト、血清、スティック、スプレー、トニック、エアロゾル、フォーム、鉛筆形のもの等を含む、本分野において既知の様々な形態のうちの任意の１つであってよい。化粧品組成物は、例えば、ジェル、フォーム、ローション及びクリーム等のひげ剃り準備製品にも組み込まれてもよく、エアゾールタイプと非エアゾールタイプとの両方が含まれ得る。その他の化粧品組成物として、制汗剤、脱臭剤、並びに石鹸及びシャンプー等のパーソナル洗浄組成物が挙げられる。これらへの使用に好適な化粧品組成物及び追加成分の非限定的な例は、米国特許出願第２０１０／０２３９５１０号（Ｈａ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０年１月２１日出願）に記載される。
【００５０】
本願に記載の新規方法により特定されたスキンケア活性剤を組み込む組成物は、一般的に、組成物及び局所用組成物の作製に関係する技術分野で既知の従来法により調製される。かかる方法は、典型的には、加熱、冷却、真空の適用等を用いて、又はそれらを用いずに、１つ又はそれ以上の工程で、成分を比較的均一な状態になるまで混合する工程を伴う。例えば、エマルションは、最初に水相物質を脂肪相物質とは別個に混合し、その後２つの相を適宜組み合わせて、所望の連続層を得ることにより調製してよい。特定の実施形態では、組成物を調製し、好適な安定性（物理的安定性、化学的安定性、光安定性等）及び／又は活性物質の送達を提供してよい。本組成物は、治療期間の間十分な量の組成物を保存するように寸法設定されたパッケージ中で提供されてもよい。パッケージの寸法、形状、及びデザインは幅広く様々であり得る。一部のパッケージ例は、米国デザイン特許第Ｄ５７０，７０７号、同第Ｄ３９１，１６２号、同第Ｄ５１６，４３６号、同第Ｄ５３５，１９１号、同第Ｄ５４２，６６０号、同第Ｄ５４７，１９３号、同第Ｄ５４７，６６１号、同第Ｄ５５８，５９１号、同第Ｄ５６３，２２１、並びに米国特許出願公開第２００９／００１７０８０号、同第２００７／０２０５２２６号、及び同第２００７／００４０３０６号に記載されている。
【００５１】
本明細書で開示されるパーソナルケア組成物は、皮膚の弾性を改善する、水和を改善する、皮膚の状態を制御又は改善する、皮膚の老化のサインを維持又は改善する、侵襲の影響のあるケラチン性組織を維持又は改善するための量及び頻度で、皮膚に適用することができる。例えば、スキンケア効果を必要としている皮膚の対象領域を特定して、美容上安全かつ有効な量のパーソナルケア組成物を対象領域に塗布することは、望ましいものであり得る。場合によっては、スキンケア組成物は、顔全体の、表情線、しわ、望ましくない色調又はしみを有する領域に高濃度で用いる、専門化した処置として使用することもできる。更に、本願におけるパーソナルケア組成物を使用して、このような処置を必要としている哺乳類の皮膚に安全かつ有効な量のスキンケア組成物を局所塗布することにより、持続的及び／又は即時的皮膚又は化粧品効果をもたらすこともできる。
【００５２】
試験方法
この方法は、制御された環境下での酸化的リン酸化及び解糖代謝経路に関連する代謝指標を、非致死的に同時に検出することを可能にする。この方法は、動態データの取得も可能にする。ストレッサー又は被検物質に対する代謝応答を評価するとき、２つの代謝経路がどのようにしてストレッサー又は被検物質と相互作用するのか及び／又は互いに相互作用するのかを理解するためには、代謝経路の両方を同時に評価することが重要である。加えて、代謝経路をリアルタイムで（すなわち、周期的な測定を繰り返して）モニターして、静的なデータのみを提供する方法を使用したときには損なわれ得る傾向及び／又は一過性の応答を観察することが重要である。したがって、破壊試験は、典型的にはそれらの試験は単回測定のみを可能にすることから、本願における使用に好適ではない。
【００５３】
アーティファクトが混入する可能性を低減させるため、制御環境下で代謝指標を検出することも重要である。好適な制御環境は、外的な環境条件による、何らかの望ましくない影響（例えば、温度、圧力、湿度、光、並びに望ましくない気体、液体及び／又は固体夾雑物による接触）を最低限に抑え、又は予防する。例えば、検出される代謝指標が酸素消費速度であり、試験サンプルが環境に対し露出されているとき、消費酸素の少なくとも一部は環境中の酸素により置き換えられ得ることから、測定される酸素濃度は細胞により消費される酸素量を精確には反映しない場合がある。加えて、試験方法そのものがアーティファクトを測定値に混入させてはならない。例えば、クラーク電極が、検出すべき酸素そのものを消費することは既知である。したがって、クラーク電極装置により測定される酸素濃度は、試験中に細胞により消費される酸素量を精確に反映しない恐れがある。
【００５４】
培地の温度変化などの環境変化が望ましくない環境誤差をもたらし得ることは明らかである。具体的には、培地が溶存気体を保持する容量は温度により変化し、したがって、培地が周囲環境と平衡に近づくにつれて、溶存気体濃度において明白な変化が生じ得る。更に、少なくとも一部の種類のセンサーの測定特性は温度により変化し得る。したがって、試験容器内及び／又は周囲環境下の培地温度などの環境条件を制御すること、あるいは測定値に補正係数を適用することは特に望ましいものであり得る。同様にして、湿度などの他の未調節の環境条件、あるいは気流への曝露に由来する、培地からの任意の蒸発は、溶存気体、イオン、及び温度などを含む、各種センサーにより得られる測定値にアーティファクトによる影響を与える恐れがある。したがって、これらの要因を最小限に抑える又は排除するためには制御環境を提供することが重要であり得る。
【００５５】
場合によっては、代謝パラメータの検出に使用される装置は、細胞を保持する試験容器（例えば、マルチウェルマイクロプレート）を受容させるのに適したステージを含有し得る。装置には、試験容器内の環境を外部環境から単離するためのバリアを受容するよう構成されたプランジャを含有させてもよい。バリアは、例えば、シートと噛み合わせることにより、あるいは試験容器の壁における段差と噛み合わせることにより試験容器の一部分と機械的に協働させて、試験容器の開口部を密閉するよう構成することもできる。追加的に又は別の方法として、プランジャ及びバリアは、試験容器の容量、及び少なくとも一部（例えば、５〜５０％）の細胞を含む試験容器内の培地体積を減少及び／又は増加するよう構成することもできる。例えば、バリアは、ステージ及びプランジャを相対的に移動させることにより試験容器に挿入してもよく、及び／又は取り出してもよい。一部の実施態様では、方法は、容器中に追加の培地を灌流すること、及び／又は培地を補充することを含み得る。培地量を減少させることにより、大量の細胞培地内の細胞を一時的に高濃度に濃縮させて、センサーの、細胞の生物活性により生じる培地中の代謝指標における高感受性の変化を検出する性能を、改善することができる。永久的にではなく、一時的に培地量を減少させることで（及びしたがって、細胞／培地混合物を濃縮することで）、細胞は非常に僅かな時間だけ異常環境に曝露されることになり、したがって測定プロセスによる悪影響（例えば、死滅）を及ぼさずに済む。
【００５６】
機器は、所望の代謝指標（１種以上）を分析し得るセンサーも含み得る。一部の実施態様では、センサーは、バリア及び／又はプランジャ上に配置され得る。センサーは、培地との連絡を検知するものであるべきであり、所望の代謝指標を検出するよう構成される。センサーは、代謝指標の存在及び／又は濃度を検出するよう構成することができ、並びに／あるいは代謝指標の濃度変化速度を検出するよう構成することができ、並びに／あるいは第１代謝指標の第１濃度を検出し、第２代謝指標の第２濃度を検出し、第１濃度と第２濃度の間の関係を決定するよう構成することもできる。細胞の妨害をせずに代謝パラメータを検出するためのセンサーを構成することは望ましいことであり得る。この機器には、データ収集及び記録、１つ以上の試験工程の繰り返し、並びに細胞外環境への被検物質又はストレッサーの移行を含む、１つ以上の試験態様を自動化するようプログラムされたコンピューターを包含させることもできる。一部の実施態様では、センサーはコンピューターと接続させることもできる。
【００５７】
制御された環境、代謝指標の非致死的かつ同時検出、並びに動態データを提供する装置の好適な非限定的な例は、米国特許第７，２７６，３５１号、米国特許第７，６３８，３２１号、及び米国特許第７，８５１，２０１号（Ｔｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．）、及び米国特許第８，２０２，７０２号（Ｎｅｉｌｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．）に開示されている。特に好適な装置は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から入手可能なＸＦ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒである。
【００５８】
細胞培養及びサンプル調製
本明細書に記載の方法により試験される細胞は、当該技術分野において既知の任意の好適な手法により得ることができる。例えば、細胞は、天然環境から単離することができ（例えば、ヒトの皮膚）、又は好適な市販元から購入することもできる。細胞は、初代細胞株であっても（すなわち、生体組織源から単離し、通常の組織培養条件下で増殖させた細胞株）、不死化細胞株であってもよい（すなわち、増殖及び倍加指数が、初代細胞株より得られるものよりも大幅に増加するよう、化学的又は遺伝的改変により改変を受けている細胞株）。一部の実施態様では、好適な市販元から凍結初代又は不死化細胞株を得て、インキュベート（例えば、３７℃）のため組織培養フラスコ（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なコラーゲンコートＴ−７５フラスコ）内で適切な増殖培地に希釈することができる。試験用の細胞が用意できたならば、好適な試験容器（例えば、マルチウェル容器、１ウェル容器、１本以上のチューブ、及び１２ウェルプレート又は９６ウェルプレートなどの従来の試験プレート）内に入れることができる。試験培地は、試験容器内で調製して、細胞外環境を提供してもよい。試験培地は、試験中（例えば、少なくとも４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間又は７２時間）、細胞を生存させかつ健康に維持する必要がある。各ウェル中の細胞数は、好適な測定値を取得するのに十分なものとすべきである（例えば、角化細胞については４×１０4個／ウェル、及び線維芽細胞については１×１０5個／ウェル）。試験中、細胞は、試験培地に懸濁してよく、試験容器内に配置した好適な基質に接着させてよく、及び／又は試験容器に接着させてもよいことは理解される。
【００５９】
例えば、図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、２、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び４に関し上記で議論されている角化細胞は、Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから得た凍結ヒト初代角化細胞である。角化細胞は、ヒト角化細胞増殖用添加成分及びゲンタマイシン／アンホテリシンＢ  ｘ５００溶液（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能）を添加した、ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）製角化細胞用培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）から入手可能）で７０〜８０％コンフルエンスまで増殖させた。各試験に関し、２種の別個の角化細胞提供源を培養し、それぞれの提供源の同数の細胞を試験容器内で組み合わせた。この実施例では、各ウェル中の角化細胞の合計が約４×１０4個となるよう、提供源それぞれから２×１０4個の角化細胞をゼラチンコート２４ウェルプレートに入れた。存在する細胞数は、当該技術分野において既知の任意の好適な手法により測定することができる（例えば、コールターカウンターを使用する）。試験の２４時間前に角化細胞をゼラチンコートプレートに入れ、上記の角化細胞用培地１００μＬを各ウェルに入れた。緩衝剤、カルシウム、グルコース、ピルビン酸及びグルタミンを不含のものとして市販のＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）培地を改変し、試験培地を作製した。ＥｐｉＬｉｆｅ（登録商標）培地には、１０ｎｇ／ｍＬインスリン、１０ｎｇ／ｍＬハイドロコルチゾン、６０μＭ塩化カルシウム、１０ｍＭグルコース、１ｍＭピルビン酸、及び２ｍＭグルタミンを加えて改変した。試験培地を３７℃に加温し、水酸化ナトリウムによりｐＨを７．４に調整した。測定の１時間前に、ウェル中の角化細胞用培地を試験培地と置き換えた。
【００６０】
上記図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ、６、７Ａ、７Ｂ、７Ｃ、７Ｄ、７Ｅ及び８において議論された線維芽細胞に関し、ＡＴＣＣ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）から市販のＢＪ細胞株から、凍結ヒト真皮線維芽細胞を得た。線維芽細胞は、１０％ウシ胎児血清（「ＦＢＳ」）及びゲンタマイシン／アンホテリシンＢ  ｘ５００溶液（ＥＭＥＭ及びＦＢＳはＡＴＣＣから入手可能であり、ゲンタマイシン／アンホテリシンＢ  ｘ５００溶液はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）を添加したイーグル最小必須培地（「ＥＭＥＭ」）の培養培地で７０〜８０％コンフルエンスにまで増殖させた。線維芽細胞は、試験の２４時間前にゼラチンコートプレートに、ウェル当たり１×１０5個で播種した。各ウェルには、上記の線維芽細胞培地１００μＬを含有させた。試験培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手可能）、２５ｍＭグルコース及び１ｍＭピルビン酸から構成した。試験培地を３７℃に加温し、ｐＨを７．４に調整した。細胞を増殖させ、３７℃かつ５％  ＣＯ2下で播種した。測定の１時間前に、ウェル中の線維芽細胞用培地を試験培地と置き換えた。
【００６１】
ゼラチンコートプレートは、マルチウェルプレート（例えば、２４ウェル又は９６ウェルプレート（Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から入手可能）の各ウェルを、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）で希釈した０．２％ゼラチン（Ｓｉｇｍａから入手可能なタンパク質溶液）でコートすることにより用意することができる。ゼラチンを、３７℃の滅菌ＰＢＳで１：１０〜０．２％希釈し、次に５０ｕＬの希釈ゼラチン溶液を各ウェルに加え、室温で３０分間インキュベートする。ウェルに触れないよう過剰な液体を吸引除去し、表面を少なくとも２時間乾燥させる。
【００６２】
ストレッサー又は被検物質への細胞の曝露
細胞は、当該技術分野において既知の任意の好適な手法によりストレッサー又は被検物質に曝露することができる。一部の実施態様では、細胞は、代謝パラメータを検出するのに使用される機器に配置する前にストレッサーに曝露することができる。例えば、細胞は、ＸＦ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒに細胞を配置する前に、ＢＩＯ−ＳＵＮ製太陽シミュレーター（Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ（Ｆｒａｎｃｅ）から入手可能）を使用して紫外線に曝露することもできる。この実施例では、試験培地をプレートウェルから除去し、１００ｕＬ  ＰＢＳにより置き換えて、試験培地が紫外線により受ける望ましくない影響（例えば、吸光度又は反射率）を低減させることもできる。代謝指標が曝露後の好適な時間内に検出されない実施形態では（例えば、２４時間で測定値を取得したとき）、ストレッサーへの曝露後すぐに（但しインキュベータ内に細胞を移動させる前に）、ＰＢＳを適切な培地（例えば、上記の角化細胞又は線維芽細胞用培地）で置き換えてもよい。非照射細胞からデータを取得するため、非照射細胞を入れるプレートの一部分は、アルミホイルなどのＵＶ不透過性材料により覆うこともできる。場合によっては、ストレッサー及び／又は被検物質は、細胞を試験装置に配置する前及び／又は後に試験容器内に導入され得る。例えば、試験装置は、試験前、中及び／又は後に、剤を直接試験容器に導入することのできる、１つ以上の注入口を含み得る。
【００６３】
酸化的リン酸化及び解糖代謝指標の測定
酸素消費速度及び細胞外酸性化速度は、ＸＦ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒ又は等価物を使用して検出することができる。装置は、制御環境下で、酸化的リン酸化及び解糖経路の代謝指標を非致死的かつ同時に検出でき、並びに動態データを提供できるものであるべきである。細胞は、機器に使用するのに好適なマルチウェルプレート（例えば、２４ウェルプレート又は９６ウェルプレート）中に用意し、試験前に洗浄してもよい。細胞は、当該技術分野において既知の任意の好適な手法により（例えば、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＸＦ  ｐｒｅｐ  ｓｔａｔｉｏｎを使用して）洗浄することもできる。細胞を洗浄するとき、ウェルからは培地を除去し、その後、細胞は好適な量の試験培地で３回洗浄することが望ましいものであり得る（例えば、９６ウェルプレートでは１８０μＬ、又は２４ウェルプレートでは６００μＬ）。細胞の洗浄後、好適な量の試験培地を各ウェルに入れ、細胞は、試験のためプレートを機器内に配置する前に、ＣＯ2−インキュベータ内、３７℃下で、１〜１．５時間平衡化する。平衡期間後、細胞を含有しているプレートを機器に装填し、製造元の指示に従い平衡化する。試験全体は３７℃で実施する。一部の実施態様では、角質細胞については、３分の混合サイクル、２分の待機サイクル、及び３分の測定サイクルを、並びに線維芽細胞については、２分の混合サイクル、２分の待機サイクル、及び３分の測定サイクルを提供するよう機器を設定することは望ましいものであり得る。このサイクルは少なくとも８８分間反復すべきである。サイクル及び時間は、所望される細胞型及び実験デザインに従い変更できることは認識されるであろう。
【実施例】
【００６４】
（実施例１）
次の実施例は、本願の方法をどのように使用すればスキンケア活性剤を特定できるのかを例示する。過酸化水素は周知のＲＯＳであり、本例には、細胞の酸化ストレッサーへの曝露に関連する望ましくない代謝による影響を例示するために使用する。過酸化水素は、上記の線維芽細胞試験培地における使用濃度の１０倍で調製した。被検物質はＳｉｇｍａから市販のナイアシンアミド（ビタミンＢ3としても既知）である。被検物質は、上記の線維芽細胞試験培地における最終的な使用濃度の１０倍で調製し、被検物質溶液を用意した。ストレッサー溶液及び被検物質溶液は、いずれも３７℃に加温し、ｐＨは７．４に調整した。細胞は、ＡＴＣＣ（ＢＪ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）から得た凍結ヒト皮膚線維芽細胞とする。上記の試験方法に従い、細胞を培養し、用意した。線維芽細胞を、２枚の、ゼラチンコート、２４ウェル、Ｖ７プレートに配置した。各ウェルには、約１×１０5個の細胞と、３７℃かつｐＨ  ７．４の６００μＬ線維芽細胞試験培地（すなわち、ＤＭＥＭ、２５ｍＭグルコース及び１ｍＭピルビン酸）を入れた。
【００６５】
ＸＦ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ  Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して、解糖及び酸化的リン酸化代謝経路（すなわち、細胞外酸性化速度及び酸素消費速度）に対応する代謝指標を検出した。製造元の指示に従いプレートを分析器に装填し、平衡化した。被検物質溶液及びストレッサー溶液を、それぞれＸＦカートリッジプレートの自動注入口に配置した。分析器は、少なくとも８８分間にわたって継続的に、２分間の混合サイクル、２分間の待機サイクル、及び３分間の測定サイクルを連続的に実施するようプログラムした。データポイントは分析器により収集及び記録した。ストレッサー溶液又は被検物質溶液を添加する前に、分析器により３回のサイクルを完了し、各代謝指標についての基礎値を得た。３番目のサイクルの完了後（すなわち、検出開始から約２１分後）、分析器により適切な注入口から試験溶液及び／又はストレッサー溶液をウェルに加えた。各ウェルに１．５ｍＭ過酸化水素を提供するのに十分な量のストレッサー溶液をウェルに加えた。０．１ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ又は１．０ｍＭナイアシンアミドを提供するのに十分な量の試験溶液を各ウェルに加えた。試験した最初のプレートは１．５ｍＭ過酸化水素のみを有する６つのウェル（ウェル番号４、５、６、１１及び１２）、０．２５ｍＭナイアシンアミドのみを有する６つのウェル（ウェル番号２、３、７、８及び９）、同時に加えた０．１ｍＭナイアシンアミド及び１．５ｍＭ過酸化水素を組み合わせて有する６つのウェル（ウェル番号１３、１４、１９、２０及び１２）、並びに同時に加えた０．２５ｍＭナイアシンアミド及び１．５ｍＭ過酸化水素を組み合わせて有する６つのウェル（ウェル番号１６、１７、１８、２２、及び２３）を有した。第２のプレートは、１．５ｍＭ過酸化水素のみを有する６つのウェル（ウェル番号４、５、６、１１、及び１２）、１．０ｍＭナイアシンアミドのみを有する６つのウェル（ウェル番号２、３、７、８、及び９）、同時に加えた０．５ｍＭナイアシンアミド及び１．５ｍＭ過酸化水素を組み合わせて有する６つのウェル（ウェル番号１３、１４、１９、２０、２１）、並びに同時に加えた１．０ｍＭナイアシンアミド及び１．５ｍＭ過酸化水素を組み合わせて有する１つのウェル（ウェル番号１６、１７、１８、２２、２３）を有した。ウェル番号１、１０、１５、及び２４をブランクウェルとした。結果を以下の表１、表２及び表３、並びに図９、１０及び１１に示す。
【００６６】
【表１】
2015534644.tif 000003
【００６７】
表１は、試験する線維芽細胞の第１プレート由来の線維芽細胞の細胞外環境の酸性化速度に対する、過酸化水素及びナイアシンアミドの単独での及び組み合わせての効果を示す。表１から得たデータは、ＸＦソフトウェア（バージョン１．８）により分析して、各時点で各処置群の平均値を計算し、図９に視覚的に表される通り割合（％）として、基準からの変化率を比較した。上述の通り、過酸化水素又はナイアシンアミドを加える前に最初に３回の測定を行い基礎値を得た。図９は、表１中の各状態のプロットを示し、すなわち１．５ｍＭ  Ｈ2Ｏ2単独１０１、０．２５ｍＭナイアシンアミド単独１００、０．２５ｍＭナイアシンアミド及び１．５ｍＭ  Ｈ2Ｏ２の組み合わせ１０３、並びに０．１ｍＭナイアシンアミド及び１．５ｍＭ過酸化水素の組み合わせ１０２を示す。表１及び図９に示されるように、過酸化水素単独が、細胞外酸性化速度の大幅な低下をひき起こすようである。したがって、過酸化水素はヒト線維芽細胞における解糖代謝において低下をもたらすという合理的な結論が導かれ得る。０．２５ｍＭでナイアシンアミドを単独で加えたとき、酸性化速度に初期低下が生じた後、ウェルへの追加後約２０分以内に、基礎濃度又は僅かに高い濃度に戻るようである。これにより、０．２５ｍＭナイアシンアミドでは解糖代謝に著しい影響は生じないという合理的結論が導かれ得る。しかしながら、過酸化水素と組み合わせて加えた場合、ナイアシンアミドは、解糖代謝に対する過酸化水素の悪影響を軽減させるようである。すなわち、０．１ｍＭ及び０．２５ｍＭナイアシンアミド濃度のいずれもが、細胞外酸性化速度の低下を緩徐にさせ、過酸化水素を単独で加えた場合の基礎値から酸性化速度がはるかに下回ることを予防するようである。
【００６８】
【表２】
2015534644.tif 000004
【００６９】
表２は、試験する線維芽細胞の第２プレート由来の線維芽細胞の細胞外環境の酸性化速度に対する、過酸化水素及びナイアシンアミドの単独での及び組み合わせての効果を示す。表２から得たデータは、ＸＦソフトウェア（バージョン１．８）により分析して、各時点で各処置群の平均値を計算し、図１０に視覚的に表される通り割合（％）として、基準からの変化率を比較した。図１０は、表２中の各状態のプロットを示し、すなわち１．５ｍＭ  Ｈ2Ｏ2単独２０１、１．０ｍＭナイアシンアミド単独２００、０．５ｍＭナイアシンアミド及び１．５ｍＭ  Ｈ2Ｏ２の組み合わせ２０２、並びに１．０ｍＭナイアシンアミド及び１．５ｍＭ過酸化水素の組み合わせ２０３を示す。表２及び図１０に示される通り、１．５ｍＭ過酸化水素は、表１に示されるものと同様に代謝応答をもたらすようである。同様にして、１．０ｍＭナイアシンアミド単独では、０．２５ｍＭナイアシンアミドについて上記表１に示されるものとほとんど同程度の代謝応答の損失をもたらすようである。しかしながら、過酸化水素と組み合わせて加えた場合、０．５ｍＭ及び１．０ｍＭナイアシンアミドは、０．１ｍＭ及び０．２５ｍＭ濃度と比較した場合に、両方共、解糖の低下を更に減少させるようである。更に、０．５ｍＭ及び１．０ｍＭナイアシンアミド濃度は、酸性化速度が基礎値未満に低下することを予防するようである。重要なことに、ナイアシンアミド単独では、線維芽細胞の解糖に対し実質的に全く影響を及ぼさないものの、過酸化水素とともに加えたときに、ナイアシンアミドは濃度の増加とともに代謝効果を示すようである。したがって、ナイアシンアミドは、解糖そのものを直接改良するものであるというよりも、解糖における過酸化水素への望ましくない代謝による影響に有効なものである、という合理的結論が導かれ得る。
【００７０】
【表３】
2015534644.tif 000005
【００７１】
表３は、試験する線維芽細胞の第２プレート由来の線維芽細胞の細胞外環境の酸素消費量に対する、ナイアシンアミドの単独での及び組み合わせての効果を示す。表３から得たデータは、ＸＦソフトウェア（バージョン１．８）により分析して、各時点で各処置群の平均値を計算し、図１１に視覚的に表される通り割合（％）として、基準からの変化率を比較した。図１１は、表３中の各状態のプロットを示し、すなわち１．５ｍＭ  Ｈ2Ｏ2単独３０１、１．０ｍＭナイアシンアミド単独３００、０．５ｍＭナイアシンアミド及び１．５ｍＭ  Ｈ2Ｏ２の組み合わせ３０２、並びに０．１ｍＭナイアシンアミド及び１．５ｍＭ過酸化水素の組み合わせ３０３を示す。表３及び図１１に示される通り、１．５ｍＭ過酸化水素単独により、ＯＣＲにおいて相対的に著しい低下と、その後にそれほど迅速ではない増加がもたらされる。過酸化水素の添加から２０分後又はそれ以上経過後、ＯＣＲは、基礎速度よりもはるかに低い比較的一定の速度に近づく。したがって、過酸化水素はヒト線維芽細胞における酸化的リン酸化代謝において低下をもたらすという合理的な結論が導かれ得る。ナイアシンアミドを１．０ｍＭで単独で加えた場合、ヒト線維芽細胞の酸化的リン酸化代謝に有意な影響は全く生じなかったようである。ナイアシンアミドを０．２５μＭの濃度で１．５ｍＭ過酸化水素と加えた場合、ナイアシンアミドはＯＣＲに対し有意な影響は示さないようである。ナイアシンアミドを、１．５ｍＭ過酸化水素と組み合わせて１．０ｍＭの濃度で加えた場合、ＯＣＲにおける最初の低下はある程度抑制されるものの、これを上回る著しい影響は有していないようである。したがって、０．５ｍＭ及び１．０ｍＭ濃度のナイアシンアミドは、ヒト線維芽細胞の酸化的リン酸化代謝に対する過酸化水素の影響に有意に有効ではないという合理的結論が導かれ得る。ナイアシンアミドの濃度を高くするほど、酸化的リン酸化代謝に対する過酸化水素の悪影響を更に低減させることができるものの、このような濃度は、例えば、費用がかさみ又は望ましくない副作用をもたらすなどすることから、局所塗布用スキンケア組成物における使用に好適なものではない恐れがある。
【００７２】
本明細書に開示した寸法及び値は、記載された正確な数値に厳密に限定されるものと理解されるべきではない。むしろ、特に断らない限り、そのような寸法のそれぞれは、記載された値及びその値の周辺の機能的に同等の範囲の両方を意味するものとする。例えば、「４０ｍｍ」として開示した寸法は、「約４０ｍｍ」を意味することを意図したものである。更に、本明細書に記載される特性は、１つ又は２つ以上の範囲の値を含み得る。当然のことながら、これらの値は、範囲内の個々の値が特に開示されていない場合でも範囲内の全ての値を包含するということが理解されるべきである。
【００７３】
「発明を実施するための形態」で引用する全ての文献は、関連部分において本明細書に参照により組み込まれるが、いずれの文献の引用も、それが本発明に関する先行技術であることを容認するものとして解釈されるべきではない。特に、米国仮出願特許第６１／７１１，５００号及び米国仮出願特許第６１／７１１，５２１号は、参照によりその全体が本明細書に援用される。本明細書中の用語の任意の意味又は定義が、参照により組み込まれた文献中の同一用語の任意の意味又は定義と相反する限りにおいては、本明細書においてその用語に与えられた意味又は定義を適用する。
【００７４】
本発明の特定の実施形態が例示され記載されてきたが、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の様々な変更及び修正を実施できることが、当業者には自明であろう。したがって、本発明の範囲内にあるそのような全ての変更及び修正を添付の特許請求の範囲で扱うものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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