(57)【要約】  本発明は、L-乳酸生産菌株においてL-乳酸脱水素酵素(Ｌ-LDH)の活性を抑制し、D-乳酸脱水素酵素(D-LDH)の活性を導入する工程を含む変異したD-乳酸の生産菌株の製造方法、前記方法で製造された変異したD-乳酸生産菌株および前記菌株を培養し、培養物からD-乳酸を回収する工程を含むD-乳酸の製造方法に関するものである。本発明のD-乳酸生産菌株は、L-乳酸生産能に優れた生産菌株を変異させて製造されたものであり、D-乳酸の生産性に優れているので、D-乳酸を原料として使用する各種製品の生産性を向上させるために広く活用されるであろう。
2015514434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
L-乳酸脱水素酵素(L-lactate dehydrogenase、L-LDH)の活性が低下または不活性化され、D-乳酸脱水素酵素(D-lactate dehydrogenase、D-LDH)の活性が増強されるように変異したD-乳酸生産用菌株。 
【請求項２】
L-LDHをコードするポリヌクレオチドが不活性化した、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
前記L-LDHをコードするポリヌクレオチドが、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)由来のldh (配列番号25)およびldh1 (配列番号26)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)由来のldh1 (配列番号27)およびldh2 (配列番号28)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)由来のldh (LGG_02523)(配列番号29)およびldh (LGG_00606)(配列番号30)からなる群から選択される、請求項２に記載の菌株。
【請求項４】
D-LDHをコードするポリヌクレオチドが導入された、請求項１に記載の菌株。
【請求項５】
前記D-LDHをコードするポリヌクレオチドが、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)またはラクトバチルス・デルブリュッキー(Lactobacillus delbrueckii)に由来する、請求項４に記載の菌株。
【請求項６】
前記D-LDHをコードするポリヌクレオチドが、ラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドまたはラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドである、請求項５に記載の菌株。
【請求項７】
１個以上の外来性D-LDHをコードするポリヌクレオチドが、染色体内のL-LDHをコードするポリヌクレオチドの位置に置換されて過剰発現される、請求項１に記載の菌株。
【請求項８】
変異前の菌株が、L-型乳酸を大量に生産する菌株である、請求項１に記載の菌株。
【請求項９】
生産用菌株がラクトバチルス属由来の菌株である、請求項８に記載の菌株。 
【請求項１０】
ラクトバチルス・カゼイのLDH1をコードするポリヌクレオチド(配列番号27)およびLDH2をコードするポリヌクレオチド(配列番号28)が、それぞれラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドおよびラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドに置換された、請求項８に記載の菌株。
【請求項１１】
ラクトバチルス・パラカゼイのLDHをコードするポリヌクレオチド(配列番号25)およびLDH1をコードするポリヌクレオチド(配列番号26)が、それぞれラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドおよびラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドに置換された、請求項８に記載の菌株。
【請求項１２】
ラクトバチルス・ラムノサスのLDH(LGG_02523)をコードするポリヌクレオチド(配列番号29)およびLDH(LGG_00606)をコードするポリヌクレオチド(配列番号30)が、それぞれラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドおよびラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドに置換された、請求項８に記載の菌株。
【請求項１３】
Lactobacillus paracasei CC02-0095(受託番号：KCCM11273P)である、請求項１２に記載の菌株。
【請求項１４】
(a)L-乳酸生産菌株において、L-乳酸脱水素酵素(L-lactate dehydrogenase、L-LDH)の活性を低下または不活性化させることによって、変異した乳酸生産菌株を取得する工程と、  (b)前記変異した乳酸生産菌株にD-乳酸脱水素酵素(D-lactate dehydrogenase、D-LDH)の活性を導入または増強させる工程とを含む、変異したD-乳酸生産菌株の製造方法。
【請求項１５】
前記L-乳酸生産菌株が、ラクトバチルス属由来の菌株である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記L-乳酸生産菌株が、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・パラプランタルム(Lactobacillus paraplantarum)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバシルス・ジョンソニイ(Lactobacillus johnsonii)およびラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)からなる群から選択される菌株である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記L-LDH活性の低下または不活性化が、L-LDHをコードするポリヌクレオチドの置換、欠失、挿入または付加によって行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記L-LDHをコードするポリヌクレオチドが、ラクトバチルス・パラカゼイ由来のldh(配列番号25)およびldh1(配列番号26)、ラクトバチルス・カゼイ由来のldh1(配列番号27)およびldh2(配列番号28)、ラクトバチルス・ラムノサス由来のldh(LGG_02523)(配列番号29)およびldh(LGG_00606)(配列番号30)からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
D-LDH活性の導入または増強が、変異した乳酸生産菌株の染色体にD-LDHをコードするポリヌクレオチドを導入することによって行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
D-LDH活性の導入または増強が、変異した乳酸生産菌株のD-LDHをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することによって行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記D-LDHをコードするポリヌクレオチドが、ラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドまたはラクトバチルス・プランタルム由来の配列番号32のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
(a)請求項１〜13のいずれか一項に記載の変異したD-乳酸生産菌株を培養して培養物を取得する工程と、
(b)前記培養物からD-乳酸を回収する工程とを含む、D-乳酸の生産方法。 
【請求項２３】
前記変異したD-乳酸生産菌株が、Lactobacillus paracasei CC02-0095(KCCM11273P)である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記D-乳酸の回収が、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解、クロマトグラフィーおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって行われる、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なD-乳酸生産菌株およびその使用に関し、より具体的には、本発明はL-乳酸生産菌株においてL-乳酸脱水素酵素(L-LDH)の活性を抑制し、D-乳酸脱水素酵素(D-LDH)の活性を導入する工程を含む、変異したD-乳酸生産菌株の製造方法、前記方法で製造された変異したD-乳酸生産菌株および前記菌株を培養して、培養物からD-乳酸を回収する工程を含むD-乳酸の製造方法に関する。 
【背景技術】
【０００２】
乳酸は食品分野、医薬分野、化粧品分野などの産業分野で様々に利用され、最近ではポリ乳酸の単量体として利用されており、その需要量が大幅に増加している。 
【０００３】
乳酸を生産する方法としては、従来の化学合成法と炭水化物を基質とする生物学的発酵法がある。商業的には後者の方法が好まれるが、その理由としては化学合成法を用いて乳酸を製造する場合、原油価格の上昇によるコスト上昇や環境汚染の問題に加え、D-乳酸とL-乳酸が50％ずつ混合したラッセミック混合物形態の非活性であるDまたはL-乳酸が生成されるという欠点があるからである。この時、DおよびL-乳酸の混合物の組成比の調節が不可能であり、セラセミック混合物形態の乳酸を原料としてポリ乳酸を製造する場合、融点が低い無定形高分子となるので、用途開発においても多くの制限が伴う。一方、微生物を用いた生物学的発酵法は、使用する菌株によってDあるいはL-乳酸のみを選択的に生産することが可能である。例えば、ラクトバチルス属(Lactobacillus sp.)、バチルス属(Bacillus sp.)、リゾプス属(Rhizopus sp.)、ストレプトコッカス属(Streptococcus sp.)、エンテロコッカス属(Enterococcus sp.)などの微生物はL-乳酸を主に生産し、リューコノストッック属(Leuconostoc sp.)微生物とラクトバチルス・ブルガリクス(Lactobacillus bulgaricus)はD-乳酸を主に生産することが知られている。特に、D-乳酸は、体内で代謝されないという特徴があるので、それを利用して医療分野での生体適合性材料用として用いられるだけでなく、エステル化および塩素化することにより、光学活性除草剤としても使用されるが、除草剤が光学活性を有すると薬効がはるかに向上し、少ない散布量でも同様の効果を示すことが確認されているため、D-乳酸の需要が増加している。さらに、ステレオコンプレックス型ポリ乳酸(sc-PLA)は、従来のポリ乳酸に比べて融点と熱分解温度が大幅に上昇して高耐熱性プラスチックの原料としての利用が可能であり、これは純粋なL-ポリ乳酸に純粋なD-ポリ乳酸が混合されて製造される。結果的にD-ポリ乳酸の単量体としてD-乳酸が必要となるので、その需要は漸次増加する。
【０００４】
このような光学的に純粋なD-乳酸は、微生物酵素の光学特異的な基質選択性を利用した生物学的発酵法が好ましいが、自然界に存在する一般的な野生型のD-乳酸生産微生物は、産業用に使用するには乳酸の光学純度、生産性のいずれの面においても依然として不利な点を有している。代表的なD-乳酸生産微生物としては、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス・デルブリュッキー(Lactobacillus delbrueckii)などが挙げられるが、一般に高収率・高生産性を維持して乳酸を生産することはできず、光学不純物としてL-乳酸を20〜40％含むという欠点がある。このような欠点を克服するために、エチルメタンスルホン酸(EMS)処理をした変異乳酸菌を誘導、選別し、高濃度ブドウ糖含有培地で高濃度の乳酸を生産する変異株の確保を試みた(非特許文献１)。その結果、対照群に比べて生産性が約4.8倍向上した菌株は選別したが、菌株の長期間の保管による活性減少が伴った。一方、変異株を用いた菌株の開発は、一般に収率を向上させた菌株は生産性が低くなり、逆に生産性が向上すると収率が低下する傾向があることが見受けられた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国公開特許20060025190
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】J. Industrial Microbiol、11：23-28、1992
【非特許文献２】J. Ind. Microbiotechnol.、2008、35：579-586
【非特許文献３】Appl.Environ.Microbiol.(2009)462〜467
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明者らは、これまで産業的に安定した乳酸発酵の母菌株がL-乳酸の生産をベースとした微生物であり、大部分これらの微生物がD-乳酸を生産する微生物よりも乳酸の生産性および収率に優れているという点に着目して、高生産性L-乳酸生産微生物からL-乳酸脱水素酵素(L-lactate dehydrogenase、L-LDH)をコードする遺伝子を不活性化させて外来のD-乳酸脱水素酵素(D-lactate dehydrogenase、D-LDH)をコードする遺伝子を導入することによって、D-乳酸を高収率で生産できることを明らかにし、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一つの目的は、L-乳酸生産菌株においてL-乳酸脱水素酵素の活性を低下または不活性化させて、D-乳酸脱水素酵素の活性を導入または増強させる工程を含む、変異したD-乳酸生産菌株の製造方法を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、前記方法で製造されて変異したD-乳酸生産菌株を提供することである。
【００１０】
また、本発明の他の目的は、前記変異したD-乳酸生産菌株を用いて、D-乳酸を生産する方法を提供することである。 
【発明の効果】
【００１１】
本発明のD-乳酸生産菌株は、乳酸の生産性に優れたL-乳酸生産菌株を変異させて製造されたものであり、D-乳酸の生産性に優れているので、D-乳酸を原料として用いる各種製品の生産性を向上させるために広く活用されるであろう。 
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】10種の野生型乳酸菌から生産されたD-乳酸とL-乳酸の比率を分析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
上述した本発明の目的を達成するための一実施態様として、本発明はL-乳酸生産菌株においてL-乳酸脱水素酵素(L-LDH)の活性を低下または不活性化させて、D-乳酸脱水素酵素(D-LDH)の活性を導入または増強することによって変異したD-乳酸生産菌株を製造する方法を提供する。 
【００１４】
具体的には、本発明の変異したD-乳酸生産菌株の製造方法は、(a)L-乳酸生産菌株においてL-乳酸脱水素酵素(L-LDH)の活性を低下または不活性化させ、変異した乳酸生産菌株を取得する工程と、(b)前記変異した乳酸生産菌株にD-乳酸脱水素酵素(D-LDH)の活性を導入または増強するる工程とを含む。 
【００１５】
ここで、前記L-乳酸生産菌株は、L-LDHをコードするポリヌクレオチドのみを単独で発現させてL-乳酸を生産する菌株、またはL-LDHをコードするポリヌクレオチドとD-LDHをコードするポリヌクレオチドを同時に発現させてL-乳酸とD-乳酸を共に生産する菌株であってもよく、L-LDHの活性を低下または不活性化させる方法は、L-LDHをコードするポリヌクレオチドの１箇所以上の位置で１個または数個のヌクレオチドを置換、欠失、挿入または付加させて行うことができる。D-LDHの活性を導入または増強させる方法は、変異した乳酸生産菌株の染色体にD-LDHをコードするポリヌクレオチドを導入する方法、変異した乳酸生産菌株の染色体に改良された活性を示すように変異したD-LDH変異体をコードするポリヌクレオチドを導入する方法、変異した乳酸生産菌株の染色体に存在するD-LDHをコードするポリヌクレオチドの上流に改良された活性を示すプロモーターを導入する方法、変異した乳酸生産菌株の染色体に改良された活性を示すプロモーターおよび前記プロモーターと作動可能に連結されたD-LDHをコードするポリヌクレオチドを導入する方法、変異した乳酸生産菌株の染色体に改良された活性を示すプロモーターおよび前記プロモーターと作動可能に連結され、かつ改良された活性を示すように変異したD-LDH変異体をコードするポリヌクレオチドを導入する方法、変異した乳酸生産菌株のD-LDHをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する方法、変異した乳酸生産菌株に改良された活性を示すように変異したD-LDH変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する方法、変異した乳酸生産菌株に改良された活性を示すプロモーターおよび前記プロモーターと作動可能に連結されたD-LDHをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する方法、または変異した乳酸生産菌株に改良された活性を示すプロモーターおよび前記プロモーターと作動可能に連結され、改良された活性を示すように変異したD-LDH変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する方法などを用いて行うことができる。 
【００１６】
本発明における用語「乳酸脱水素酵素(lactate dehydrogenase、LDH)」とは、NADHを用いて乳酸から水素を除去してピルビン酸を生成したり、ピルビン酸を還元させて乳酸を生成する反応を触媒する細胞質性の酵素を意味する。前記LDHは約140kDaの分子量を示し、L-乳酸を生成するL-LDH(EC 1.1.1.27)、D-乳酸を生成するD-LDH(EC 1.1.1.28)、FMNおよびヘムを含有するL-LDH(シトクロムb2、EC 1.1.2.3)などに分類することができる。 
【００１７】
本発明の用語「L-乳酸生産菌株」とは、L-LDHをコードするポリヌクレオチドを自ら発現させ、生成されたL-LDHを用いてL-乳酸を生産する菌株を意味するが、L-LDHをコードするポリヌクレオチドのみを単独で発現させてL-乳酸を生産する菌株だけでなく、L-LDHをコードするポリヌクレオチドとD-LDHをコードするポリヌクレオチドを同時に発現させてL-乳酸とD-乳酸を同時に生産する菌株を含む。前記L-乳酸生産菌株は、L-乳酸を生産できるものであれば特に限定されないが、好ましくは、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・パラプランタルム(Lactobacillus paraplantarum)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・ジョンソニイ(Lactobacillus johnsonii)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)などであってもよく、より好ましくはラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・カゼイなどであってもよく、最も好ましくはラクトバチルス・パラカゼイであってもよい。 
【００１８】
前記L-乳酸生産菌株からL-LDHの活性を低下または不活性化させる方法は、当業界に公知された方法を用いて行うことができる。例えば、前記L-乳酸生産菌株に内在したL-LDHをコードするポリヌクレオチドの１箇所以上または数箇所の位置で、1個または数個、好ましくは2〜20個、より好ましくは2〜10個、最も好ましくは2〜5個のヌクレオチドを置換、欠失、挿入、または付加することによってL-LDHをコードするポリヌクレオチドの発現を抑制したり、または不活性化したL-LDHを製造する方法を用いてもよく、それ以外にも、L-乳酸生産菌株からL-LDHの活性を低下または不活性化させる結果へと導く方法であれば、特に限定されずに用いることができる。
【００１９】
本発明において、活性を低下させたり、または不活性化させる対象となるL-LDHは、前記L-乳酸生産菌株において内在的に生成されるL-LDHであってもよく、L-LDHのアミノ酸配列またはそれをコードするポリヌクレオチドの配列は、特に限定されないが、好ましくは、ラクトバチルス・パラカゼイのLDHをコードするポリヌクレオチド配列(配列番号25)およびLDH1をコードするポリヌクレオチド配列(配列番号26)、ラクトバチルス・カゼイのLDH1をコードするポリヌクレオチド配列(配列番号27)およびLDH2をコードするポリヌクレオチド配列(配列番号28)、ラクトバチルス・ラムノサスのLGG_02523をコードするポリヌクレオチド配列(配列番号29)およびLGG_00606酵素をコードするポリヌクレオチド配列(配列番号30 )であってもよい。 
【００２０】
本発明の用語「変異した乳酸生産菌株」とは、L-LDHの活性を低下または不活性化させたL-乳酸生産菌株を意味する。前記変異した乳酸生産菌株は、通常のL-乳酸生産菌株に人為的に突然変異を誘発し、L-LDHの活性を低下または不活性化させた変異菌株であってもよく、人為的な変異を誘発せずに、天然に発生する突然変異によってL-LDHの活性が低下または不活性化された変異菌株であってもよい。 
【００２１】
前記変異した乳酸生産菌株にD-LDHの活性を導入または増強させる方法は、特にこれに限定されないが、変異した乳酸生産菌株の染色体にD-LDHをコードするポリヌクレオチドを導入する方法、変異した乳酸生産菌株の染色体に改良された活性を示すように変異したD-LDH変異体をコードするポリヌクレオチドを導入する方法、変異した乳酸生産菌株の染色体に存在するD-LDHをコードするポリヌクレオチドの上流に改良された活性を示すプロモーターを導入する方法、変異した乳酸生産菌株の染色体に改良された活性を示すプロモーターおよび前記プロモーターと作動可能に連結されたD-LDHをコードするポリヌクレオチドを導入する方法、変異した乳酸生産菌株の染色体に改良された活性を示すプロモーターおよび前記プロモーターと作動可能に連結され、かつ改良された活性を示すように変異したD-LDH変異体をコードするポリヌクレオチドを導入する方法、変異した乳酸生産菌株にD-LDHをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する方法、変異した乳酸生産菌株の改良された活性を示すように変異したD-LDH変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する方法、変異した乳酸生産菌株に改良された活性を示すプロモーターおよび前記プロモーターと作動可能に連結されたD-LDHをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する方法、変異した乳酸生産菌株に改良された活性を示すプロモーターおよび前記プロモーターと動作可能に連結され、かつ改良された活性を示すように変異したD-LDH変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入する方法などを用いることができる。
【００２２】
本発明の用語「発現ベクター」とは、適切な宿主内で標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを発現させることができるように、適切な調節配列に作動可能に連結された前記標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含有するDNA産物を意味する。前記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なmRNAリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳の終結を調節する配列を含む。ベクターは、適切な宿主内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能でき、ゲノム自体内に組み込まれてもよい。
【００２３】
本発明で使用される発現ベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、当業界で公知の任意のベクターを用いることができる。通常使用される発現ベクターの例としては、天然または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクターまたはコースミドベクターとして、pWE15、M13、λMBL3、λMBL4、λIXII、λASHII、λAPII、λt10、λt11、Charon4A、およびCharon21Aなどを用いることができ、プラスミドベクターとしてpBR系、pUC系、pBluescriptII系、pGEM系、pTZ系、pCL系およびpET系などを用いることができる。 
【００２４】
具体的には、本発明の実施例で用いられるベクターは、グラム陽性菌において広い範囲の宿主に用いられるベクターのpG+ host6である。このベクターの特徴としては、大腸菌での使用を可能にするためのアンピシリン耐性遺伝子と大腸菌の複製起点と、グラム陽性菌での使用を可能にするためのエリスロマイシン耐性遺伝子とグラム陽性菌の複製起点を有するという点が挙げられる。特に、グラム陽性菌の複製起点は温度感受性変異が含まれているので37℃以上の温度では複製されず、これらの特徴はグラム陽性菌での相同な塩基配列を介した遺伝子挿入を可能にする(特許文献１)。 
【００２５】
本発明の用語「形質転換」とは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に導入して宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドを発現させ、発現産物であるmRNAタンパク質を生産する一連の作業を意味する。前記宿主細胞に導入されるポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、どのような形態であってもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドはそれ自体に発現に必要なすべての要素(前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター、転写終結シグナル、リボソーム結合部位、翻訳終結シグナルなど)を含む構造体である発現カセットの形で宿主細胞に導入されてもよく、前記発現カセットは、自己複製が可能な発現ベクターの形でもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよい。
【００２６】
本発明において用いられるD-LDHは、特にこれ限定されないが、好ましくは、D-乳酸を大量に生産する菌株に由来したものであってもよく、より好ましくはラクトバチルス・プランタルム、またはラクトバチルス・デルブリュッキーなどに由来するもであってもよく、最も好ましくはラクトバチルス・デルブリュッキー由来の配列番号31のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはラクトバチルス・プランタルム由来の配列番号32のアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。また、前記配列番号31または32のアミノ酸配列の１箇所以上の位置で、1個または多数個(タンパク質のアミノ酸残基の立体構造における位置や種類によって異なるが、具体的には2〜20個、好ましくには2〜10個、より好ましくは2〜5個)のアミノ酸が置換、欠失、挿入、付加、または逆位されたアミノ酸配列を含むことができ、前記D-LDHの活性を維持または増強できるものであれば、配列番号31または32のアミノ酸配列に対して、80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95％以上、特に好ましくは97％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むことができ、微生物の種または菌株により前記ポリペプチドの活性を示す酵素におけるアミノ酸配列が異なることがあるため、特にこれに限定されず、前記アミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位などには、前記D-LDHの活性を含有する微生物の個体または種の違いに基づいた場合などの天然に生じる変異配列もしくは人為的な変異配列をも含むことができる。 
【００２７】
本発明の用語「相同性」とは、互いに異なる２つのアミノ酸配列または塩基配列間の同一性を意味し、スコア、同一性、類似度などのパラメーターを計算するBLAST 2.0を用いた、当業者に公知の方法により決定されうるが、特にこれに限定されない。
【００２８】
通常、L-乳酸を生産する菌株のほうがD-乳酸を生産する菌株より全体的な乳酸の生産収率において優れていることが知られているため、本発明者らは、L-乳酸を生産する菌株をD-乳酸を生産する菌株に変異させることにより、D-乳酸の生産性に優れた菌株の製造を試みた。このため、野生型ラクトバチルス属菌株のDおよびL-乳酸の発酵率を比較した結果、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ラムノサス菌株が乳酸の全体的な生産性に優れており、L-乳酸の比率が圧倒的に優れていることを確認し、これらの変異菌株の作製を試みた(図1)。例えば、ラクトバチルス・パラカゼイ由来のL-LDH遺伝子であるldhおよびldh1を欠損させ、同時にD-LDHを挿入するためのカセットであるδldh1-ldhA(Lb.db)とδldh-ldhD(Lb.pl)をそれぞれ作製し、これを温度感受性ベクターであるpG+ host6に導入して、pG+ host6-δldh1-ldhA(Lb.db)とpG+ host6-δldh-ldhD(Lb.pl)の2種類のベクターを作製した(実施例3)。続いて、L-LDH遺伝子が欠失したラクトバチルス・パラカゼイに前記各ベクターを導入し、L-LDHの活性が低下または不活性化され、D-LDHの活性が増強された形質転換体を製造した(実施例4)。製造された前記形質転換体を培養し、それから生産される乳酸を分析した結果、D-乳酸が41.6g/ Lの濃度で生産され、L-乳酸は生産されず、生産された前記D-乳酸の生産収率は、公知のD-乳酸生産菌株において生産されるD-乳酸の生産収率よりも優れていることが確認された(実施例5)。 
【００２９】
したがって、全体的な乳酸の生産収率に優れたL-乳酸生産菌株において、L-LDHの活性を低下または不活性化させて、D-LDHの活性を導入または増強させる場合、従来のD-乳酸生産菌株に比べより優れた生産収率でD-乳酸を生産できることを見出した。
【００３０】
本発明の前述の目的を達成するための他の実施様態として、本発明は、前記方法を用いて製造され、L-LDHの活性を示すL-乳酸生産菌株において前記L-LDHの活性が低下または不活性化され、D-LDHの活性を示すか、または増強するように変異したD-乳酸生産菌株を提供する。 
【００３１】
前記変異したD-乳酸生産菌株は、D-LDHをコードするポリヌクレオチドがL-乳酸生産菌株の染色体内のL-LDHをコードするポリヌクレオチドの位置に置換されて過剰発現した菌株であってもよい。前記変異したD-乳酸生産菌株は、特にこれ限定されないが、好ましくは、ラクトバチルス・カゼイのLDH1をコードするポリヌクレオチド(配列番号27)およびLDH2をコードするポリヌクレオチド(配列番号28)が、それぞれラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドおよびラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドに置換された菌株;ラクトバチルス・ラムノサスのLDH(LGG_02523)をコードするポリヌクレオチド(配列番号29)およびLDH(LGG_00606)をコードするポリヌクレオチド(配列番号30)が、それぞれラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドおよびラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドに置換された菌株;ラクトバチルス・パラカゼイのLDHをコードするポリヌクレオチド(配列番号25)およびLDH1をコードするポリヌクレオチド(配列番号26)が、それぞれラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドおよびラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドに置換された菌株などであってもよく、より好ましくはラクトバチルス・パラカゼイのLDHをコードするポリヌクレオチド(配列番号25)およびLDH1をコードするポリヌクレオチド(配列番号26)が、それぞれラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドおよびラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドに置換された菌株であってもよく、最も好ましくはLactobacillus paracasei CC02-0095(KCCM11273P)であってもよい。 
【００３２】
本発明者らは、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・カゼイ、およびラクトバチルス・ラムノサス菌株に存在するそれぞれのL-LDHをコードするポリヌクレオチドを欠損させ、ラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドおよびラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドを導入したそれぞれの形質転換体を用いてD-乳酸を生産し、D-乳酸の収率、生産性、生成量等を比較した結果、ラクトバチルス・パラカゼイ由来の形質転換体(Lb.paracasei ldh:: ldhA ldh1:: ldhD)が収率、生産性、およびD-乳酸の生成量において最も高いレベルを示すことが確認された。 
【００３３】
よって、本発明者らは、収率、生産性、およびD-乳酸の生成量において最も高いレベルを示すラクトバチルス・パラカゼイのLDHをコードするポリヌクレオチド(配列番号25)およびLDH1をコードするポリヌクレオチド(配列番号26)をそれぞれラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドおよびラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドに置換させた形質転換体(Lb.paracasei ldh :: ldhA ldh1:: ldhD)をLactobacillus paracasei CC02-0095と命名し、2012年4月2日付けでブダペスト条約下の国際寄託機関である韓国微生物保存センター(Korean Culture Center of Microorganisms、以下、「KCCM」と略称する)に受託番号KCCM11273Pで寄託した。 
【００３４】
本発明の前述の目的を達成するためのもう一つの実施態様として、本発明は、(a)前記変異したD-乳酸生産菌株を培養し、培養物を取得する工程と、(b)前記培養物からD-乳酸を回収する工程とを含む、D-乳酸の生産方法を提供する。
【００３５】
本発明において提供される変異したD-乳酸生産菌株は、乳酸の生産性に優れたL-乳酸生産菌株を変異させてD-乳酸を生産できるように作製された。したがって、前記変異したD-乳酸生産菌株を培養すると、前記培養された菌株において生産されたD-乳酸が菌株の内部または培養液に蓄積されることがあるため、前記培養された菌株の内部または培養液に蓄積されたD-乳酸を回収することにより、D-乳酸を生産することができる。 
【００３６】
本発明の用語「培養」とは、微生物を適切に人工的に調節された環境条件において生育するためのあらゆる行為を意味する。本発明において、前記培養は変異したD-乳酸生産菌株からD-乳酸を生産する目的で行われ、前記培養を行うための具体的な方法は、前記変異したD-乳酸生産菌株からD-乳酸を生産できるるようにする方法であれば、特に限定されないが、当業界に公知のあらゆる方法で行うことができ、好ましくは、回分式培養方法、流加式培養方法または連続式培養方法を用いて行うことができる。 
【００３７】
培養に用いられる培地は、適当な炭素源、窒素源、アミノ酸、ビタミンなどを含有した通常の培地において好気性条件下で、温度、pHなどを調節しながら適切な方法で、特定の菌株の要件を満たすことが好ましい。使用できる炭素源としては、グルコースおよびキシロースの混合糖を主に使用し、それ以外にはスクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、澱粉、セルロースなどの糖および炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油脂、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセロール、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が含まれる。これらの物質は、個別にまたは混合物として使用することができる。 使用可能な窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、および硝酸アンモニウムなどの無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、およびペプトン、NZ-アミン、肉エキス、酵母エキス、麦芽エキス、コーン浸漬液、カゼインの加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などの有機窒素源を使用してもよい。これらの窒素源は、単独または組み合わせて使用してもよい。前記培地には、リン源として第一リン酸カリウム、第二リン酸カリウムおよび対応するナトリウム含有の塩が含まれてもよい。使用できるリン源としては、リン酸二水素カリウムまたはリン酸水素二カリウムもしくは対応するナトリウム含有の塩が含まれる。また、無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガンおよび炭酸カルシウムなどを使用してもよい。最後に、前記物質に加えて、アミノ酸およびビタミンのような成長に必須の物質を使用してもよい。また、培養培地に適切な前駆体を使用してもよい。前記原料は、培養過程で培養物に適切な方法により、回分式、流加式または連続式で添加することができる。水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの基礎化合物またはリン酸または硫酸のような酸化合物を適切な方法で使用して培養物のpHを調節することができる。
【００３８】
また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を使用して気泡の生成を抑制することができる。呼気状態を維持するために、培養物内に酸素または酸素含有気体(例えば、空気)を注入する。培養物の温度は、通常27℃〜37℃、好ましくは30℃〜35℃である。培養は、D-乳酸の生成量が最大限に得られるまで継続する。これらの目的は、通常10〜100時間で達成される。大部分、D-乳酸は培養培地中に排出されるが、場合によっては細胞中に含まれている場合もある。
【００３９】
さらに、培養物からD-乳酸を回収する工程は、当業界に公知の方法によって行うことができる。具体的には、公知のD-乳酸の回収方法は、培養物に存在するD-乳酸を回収できるものであれば、特に限定されないが、好ましくは、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解(例えば硫酸アンモニウム沈殿など)、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど)などの方法を用いることができる。 
発明を実施するための形態
【００４０】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００４１】
実施例１：野生型ラクトバチルス属菌株のＤおよびL-乳酸発酵率の確認 
50mLのGY培地(5％デキストロース、1％酵母エキス 、0.05％クエン酸ナトリウム 、3％CaCO3、0.02％MgSO4、0.001％MnSO4、0.001％FeSO4と0.001％NaCl)に10種の野生型乳酸菌を接種して、37℃で40時間嫌気培養した後、発酵液に存在するD-乳酸とL-乳酸の比率をHPLC分析した(図１)。図１は、10種の野生型乳酸菌から生産されたD-乳酸とL-乳酸の比率を分析した結果を示すグラフである。
【００４２】
通常、L-乳酸を生産する菌株のほうがD-乳酸を生産する菌株よりも全体的な乳酸の生産収率が優れていることが公知であるので、前記10種の菌株のうち乳酸の全体的な生産性に優れ、L-乳酸の割合が圧倒的に多い菌株であるラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)およびラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)を選抜し、前記選抜した菌株をD-乳酸生産用の菌株に変異させることを試みた。
【００４３】
実施例２：L-乳酸脱水素酵素(L-lactate dehydrogenase、L-LDH)の塩基配列の比較 
前記実施例１で選抜された各菌株についてL-乳酸の過剰生産を誘発する遺伝子を欠損させるために、米国国立生物工学情報センター(NCBI)(www.ncbi.nlm.nih.gov//www.ncbi.nlm.nih.gov)での検索によりL-LDHをコードする各遺伝子間の類似性を比較分析した(表1)。
【００４４】
【表１】
2015514434.tif 000003
【００４５】
前記表１に示されるように、３種の乳酸菌のL-LDHをコードする各遺伝子は、互いに非常に類似した塩基配列を有しており、特にラクトバチルス・カゼイのldh1は主要なL-乳酸生産遺伝子として知られている(非特許文献２)。一方、ラクトバチルス・カゼイのldh2 は第2のL-乳酸生産遺伝子として相対的に光学的に純粋なD-乳酸菌を製造するためにldh1と共に同時欠損した。総合すると、全3種の母菌株からそれぞれラクトバチルス・パラカゼイのldh、ldh1とラクトバチルス・カゼイのldh1、ldh2、およびラクトバチルス・ラムノサスの2種のldhを欠損対象の遺伝子として選定した。
【００４６】
実施例3：Ｌ-LDH欠損/ Ｄ-LDH挿入ベクターの作製
前記実施例2で選定したラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・カゼイおよびラクトバチルス・ラムノサスのＬ-LDH遺伝子欠損のためのベクターを作製した。 Ｌ-LDHの欠損と同時にＤ-LDHを挿入するためのカセットを製造するために、ラクトバチルス・パラカゼイのldhとldh1、ラクトバチルス・カゼイのldh1とldh2、そしてラクトバチルス・ラムノサスのLGG02523とLGG00606遺伝子の翻訳領域(ORF)周辺の配列を相同な塩基配列に指定して、配列番号1から24のプライマーを作製した(表2)。
【００４７】
【表２】
2015514434.tif 000004
【００４８】
ラクトバチルス・パラカゼイの誘電体を鋳型として、配列番号1および2のプライマーと配列番号5および6のプライマーを用いてldh 遺伝子ORFの5'領域の700本の塩基配列(ldh.pc_UP_700)と3'領域の700本塩基配列(ldh.pc_DOWN_700)を増幅した。また、配列番号7および8のプライマーと配列番号11および12のプライマーを用いてldh1 遺伝子ORFの5'領域の700本の塩基配列(ldh1.pc_UP_700)と3'領域の700本の塩基配列(ldh1.pc_DOWN_700)を増幅した。
【００４９】
一方、Ｄ-LDH遺伝子を増幅するために、ラクトバチルス・デルブリュッキー(Lactobacillus delbrueckii)とラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)の誘電体を鋳型として、配列番号3および4と9と10を用いて、ldhA(Lb.db)とldhD(Lb.pl)のDNAフラグメントを作製した。
【００５０】
次に、前記増幅されたDNAフラグメントのldh.pc_UP_700、ldh.pc_DOWN_700およびldhA(Lb.db)に対して配列番号1および6のプライマーを用いたオーバーラップPCRを行い、ldh ORF周辺と相同な塩基配列を有し、中央にはＤ-乳酸ジヒドロゲナーゼが位置するδldh.pc-ldhA(Lb.db)のカセットを作製した。また、ldh1 遺伝子についても同様のプロセスを行い、δldh1.pc-ldhD(Lb.pl)カセットを作製した。このとき、それぞれのカセットは、5'末端にXhoI、3'末端にSpeI制限酵素領域を含むように設計した。
【００５１】
ラクトバチルス・カゼイのldh1とldh2 遺伝子は、ラクトバチルス・パラカゼイのldhおよびldh1 遺伝子とそれぞれ高い類似性を有しているので、同じプライマーを用いた。ラクトバチルス・カゼイの誘電体を鋳型として、配列番号1および2のプライマーと配列番号5および6のプライマーを用いて(ldh1.ca_UP_700)と3'領域の700本の塩基配列(ldh1.ca_DOWN_700)を増幅した。また、配列番号7および8のプライマーと配列番号11および12のプライマーを用いてldh2 遺伝子ORFの5'領域の700本の塩基配列(ldh2.ca_UP_700)と3'領域の700本の塩基配列(ldh2.ca_DOWN_700 )を増幅した。
【００５２】
次に、ldh1.ca_UP_700、ldh1.ca_DOWN_700、およびldhA(Lb.db)に対して配列番号1および6のプライマーを用いたオーバーラップPCRを行い、ldh1 ORF周辺と相同な塩基配列を有し、中央にはＤ-乳酸ジヒドロゲナーゼが位置するδldh1.ca-ldhA(Lb.db)のカセットを作製した。また、ldh2 遺伝子についても同様のプロセスを行いδldh2.ca-ldhD(Lb.pl)カセットを作製した。
【００５３】
ラクトバチルス・ラムノサスの誘電体を鋳型として、配列番号13および14のプライマーと配列番号17および18のプライマーを用いてLGG_02523遺伝子ORFの5'領域の700本の塩基配列(LGG_02523_UP_700)と3'領域の700本の塩基配列(LGG_02523_DOWN_700)を増幅した。また、配列番号19および20のプライマーと配列番号23および24のプライマーを用いてLGG_00606遺伝子ORFの5'領域の700本の塩基配列(LGG_00606_UP_700)と3'領域の700本の塩基配列(LGG_00606_DOWN_700)を増幅した。
【００５４】
一方、Ｄ-LDH遺伝子を増幅するためにラクトバチルス・デルブリュッキーとラクトバチルス・プランタルムの誘電体を鋳型として、配列番号15および16と21と22を用いて、ldhA(Lb.db)とldhD(Lb.pl )のDNAフラグメントを作製した。
【００５５】
次に、前記増幅されたDNAフラグメントであるLGG_02523_UP_700、LGG_02523 _DOWN_700およびldhA(Lb.db)に対して配列番号13および18のプライマーを用いたオーバーラップPCRを行い、LGG_02523 ORF周辺と相同な塩基配列を有し、中央にはＤ-乳酸デヒドロゲナーゼが位置するδLGG_02523-ldhA(Lb.db)のカセットを作製した。また、LGG_00606遺伝子についても同様のプロセスを行い、δLGG_00606-ldhD(Lb.pl)カセットを作製した。このとき、それぞれのカセットは、5'末端にXhoI、3'末端にSpeI制限酵素領域を含むように設計した。
【００５６】
続いて、アンピシリンとエリスロマイシン耐性遺伝子を有し、大腸菌と乳酸菌をのシャトルベクターとして用いられ、ラクトバチルスにおいては42℃で増幅されないという特徴を持つ温度感受性ベクターであるpG+ host6にXhoI、SpeI制限酵素領域を用いて、前記で製造した6種のカセットをそれぞれクローニングし、pG+ host6-δldh.pc-ldhA(Lb.db)とpG+ host6-δldh1.pc-ldhD(Lb.pl)、pG+ host6-δldh1.ca-ldhA( Lb.db)とpG+ host6-δldh2.ca-ldhD(Lb.pl)、pG+ host6-δLGG_02523-ldhA(Lb.db)とpG+ host6-δLGG_00606-ldhD(Lb.pl)の6種のベクターを製造した。
【００５７】
実施例4：形質転換体の作製
MRS固体培地で一日培養したラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・カゼイまたはラクトバチルス・ラムノサス菌株を10mLのMRS培地に接種して、37℃で1日 静置培養した。50mLのチューブに50mLのMRSを入れた後、1日培養した菌体を500μL接種し、37℃で3時間30分間静置培養し、OD600=0.8に達した時点で培養物を氷浴(ice bath)で5分間放置した。次に、前記培養物を遠心分離して培地を除去して菌体を取得し、これを洗浄用緩衝液(5mMのリン酸ナトリウム、1mMのMgCl2、pH.7.4)で2回洗浄した。続いて、前記菌株に25μLの0.5Mスクロース溶液を加えて懸濁した後、50μLずつ分注した。分注した菌株に前記実施例3で作製したそれぞれのベクターを200ngずつ加え、1800v、25Fおよび200Ωの条件で電気穿孔法を行った。その後、前記菌株を500μLのMRS培地において37℃で2時間培養し、10μg/mLのエリスロマイシンを含有した固体MRS培地(MRSE)に塗抹して、30℃で3日間培養することによってコロニーを取得した。
【００５８】
実施例5：Ｄ-ldh挿入菌株の作製 
前記実施例4で取得したコロニーの中から、ラクトバチルス・パラカゼイ由来の形質転換体(ラクトバチルス・デルブリュッキー由来のldhAを含むプラスミドpG+ host6-δldh1-ldhAが導入されたラクトバチルス菌株)から取得したコロニーの一部を10μg/mLのエリスロマイシンが含まれた1mLの液体MRS培地に接種し、42℃で1日静置培養して1次クロスオーバーを誘導した。前記培養物100μLを固体MRSE培地に塗抹して7日培養した後、コロニーを取り出して固形MRSEバッジに継代した後、42℃で2日間培養して菌体を確保した。1mLのMRSを分注した1.5mLチューブに取得したコロニーをそれぞれ接種し、37℃で1日静置培養して2次クロスオーバーを誘導した。37℃で培養した菌体の一部を取り出してコロニーPCRを行い、ldh1の領域にldhA(Lb.db)遺伝子が挿入されたことを確認して固体MRS培地で単独コロニーを選別した。個別の単独コロニーに対してldh 遺伝子欠損とＤ-乳酸デヒドロゲナーゼの挿入を確認するPCRを再び行い、ldh1:: ldhA(Lb.db)菌株を最終的に作製した。この菌株を母菌株にして同様の方法でldh を欠損させ、ldhD(Lb.pl)を挿入してL-乳酸デヒドロゲナーゼの2種が欠損した最終的なD-乳酸生産菌株を作製した。
【００５９】
一方、ラクトバチルス・カゼイとラクトバチルス・ラムノサスに対しても同様のロセスで、各菌株の2種のＬ-乳酸デヒドロゲナーゼを欠損させ、D-乳酸生産菌株を作製した。
【００６０】
比較例1：新規組換えD-ラクトバチルスの乳酸発酵試験 
本発明により新規製造された組換えD-ラクトバチルスを、本発明者らが保有している既存の通常の組換えD-乳酸生産菌株であるLb. plantarum に基づいた2種の菌株と発酵成績を比較した。ここでLb.plantarum を母菌株とするD-乳酸生成菌株とは、自らのL-乳酸脱水素酵素2種のうち1種または2種がいずれも欠損した菌株であり、Okanoらが発表した論文(非特許文献３)と類似したアプローチで製造された菌株である。本菌株は、L-乳酸脱水素酵素でldhL1 またはldhL2 が欠損した遺伝子型を有しており、2種の菌いずれも光学純度99％以上のD-乳酸を生産する菌株である。
【００６１】
具体的な比較実験において、ラクトバチルス・プランタルムに基づいた2種のD-乳酸生産菌株と新規製造した3種の組換えラクトバチルス菌株を固体MRS培地で1日培養し、得られた細胞を1ループ取り出して液体MRSに接種し、37℃でさらに1日培養した。全5種の組換えラクトバチルス菌株を250mLバッフルフラスコで25mLGY液体培地に600nmの初期細胞濃度で光学密度が0.1になるように接種した。培養温度37℃、撹拌条件100rpmのインキュベーターで実験を行い、合計42時間の培養を行った。試料培養液は、最初の接種時点と最終発酵の時点でそれぞれ採取し、適量を遠心分離した後、上澄み液を採取し、HPLC分析した。分析の結果、初期のブドウ糖濃度は53g/Lであった。分析されたデータは、2回繰り返して平均値で示し、その結果を表3にまとめた。全ての試料で生成された乳酸は、光学的に純粋なＤ-乳酸であることが酵素的定量によって分析された(Lactic acid、R-Biopharm、ドイツ)。
【００６２】
【表３】
2015514434.tif 000005
【００６３】
前記表3に示すように、従来知られている、菌株自体の持つL-乳酸脱水素酵素2種のうち1種または2種をいずれも欠損した菌株(Lb.plantarumΔldhL1およびLb.plantarumΔldhL1ΔldhL2)より、本発明で新規製造した3種の組換え乳酸菌バチルス菌株が収率、生産性、およびD-乳酸の生成量において高いレベルを示すことが確認された。特に、ラクトバチルス・パラカゼイ由来の形質転換体(Lb.paracasei ldh:: ldhA ldh1:: ldhD)の場合には、収率、生産性、およびD-乳酸の生成量において最も高いレベルを示すことが確認された。
【００６４】
よって、本発明は、収率、生産性、およびD-乳酸の生成量において最も高いレベルを示すラクトバチルス・パラカゼイのldh (配列番号25)およびldh1 (配列番号26)をそれぞれラクトバチルス・デルブリュッキー由来のldhA (配列番号31)をコードする遺伝子およびラクトバチルス・プランタルム由来のldhD (配列番号32)をコードする遺伝子に置換させた形質転換体(Lb.paracasei ldh:: ldhA ldh1:: ldhD)をLactobacillus paracasei CC02-0095と命名し、2012年4月2日付で韓国微生物保存センター(KCCM)に受託番号KCCM11273Pで寄託した。
【００６５】
以上の説明から、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず他の具体的な形態で実施できることを理解しうるであろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面において例示的なものであり、限定的なものではないということを理解するべきである。本発明の範囲は後述する特許請求の範囲の意味および範囲とその等価概念から導出されるすべての変更または変形した形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
【００６６】
【表４】
2015514434.tif 000006
【図１】
2015514434.tif 000007
【配列表】
2015514434000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月31日(2014.10.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
L-乳酸脱水素酵素(L-lactate dehydrogenase、L-LDH)の活性が低下または不活性化され、D-乳酸脱水素酵素(D-lactate dehydrogenase、D-LDH)の活性が増強されるように変異したD-乳酸生産用菌株。 
【請求項２】
L-LDHをコードするポリヌクレオチドが、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)由来のldh (配列番号25)およびldh1 (配列番号26)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)由来のldh1 (配列番号27)およびldh2 (配列番号28)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)由来のldh (LGG_02523)(配列番号29)およびldh (LGG_00606)(配列番号30)からなる群から選択される、請求項１に記載の菌株。
【請求項３】
D-LDHをコードするポリヌクレオチドが、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)またはラクトバチルス・デルブリュッキー(Lactobacillus delbrueckii)に由来する、請求項１に記載の菌株。
【請求項４】
前記D-LDHをコードするポリヌクレオチドが、ラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドまたはラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドである、請求項３に記載の菌株。
【請求項５】
１個以上の外来性D-LDHをコードするポリヌクレオチドが、染色体内のL-LDHをコードするポリヌクレオチドの位置に置換されて過剰発現される、請求項１に記載の菌株。
【請求項６】
生産用菌株がラクトバチルス属由来の菌株である、請求項１に記載の菌株。 
【請求項７】
ラクトバチルス・カゼイのLDH1をコードするポリヌクレオチド(配列番号27)およびLDH2をコードするポリヌクレオチド(配列番号28)が、それぞれラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドおよびラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドに置換された、請求項１に記載の菌株。
【請求項８】
ラクトバチルス・パラカゼイのLDHをコードするポリヌクレオチド(配列番号25)およびLDH1をコードするポリヌクレオチド(配列番号26)が、それぞれラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドおよびラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドに置換された、請求項１に記載の菌株。
【請求項９】
ラクトバチルス・ラムノサスのLDH(LGG_02523)をコードするポリヌクレオチド(配列番号29)およびLDH(LGG_00606)をコードするポリヌクレオチド(配列番号30)が、それぞれラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドおよびラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドに置換された、請求項１に記載の菌株。
【請求項１０】
Lactobacillus paracasei CC02-0095(受託番号：KCCM11273P)である、請求項8に記載の菌株。
【請求項１１】
(a)L-乳酸生産菌株において、L-乳酸脱水素酵素(L-lactate dehydrogenase、L-LDH)の活性を低下または不活性化させることによって、変異した乳酸生産菌株を取得する工程と、
(b)前記変異した乳酸生産菌株にD-乳酸脱水素酵素(D-lactate dehydrogenase、D-LDH)の活性を導入または増強させる工程とを含む、変異したD-乳酸生産菌株の製造方法。
【請求項１２】
前記L-LDH活性の低下または不活性化が、L-LDHをコードするポリヌクレオチドの置換、欠失、挿入または付加によって行われ、前記L-LDHをコードするポリヌクレオチドが、ラクトバチルス・パラカゼイ由来のldh(配列番号25)およびldh1(配列番号26)、ラクトバチルス・カゼイ由来のldh1(配列番号27)およびldh2(配列番号28)、ラクトバチルス・ラムノサス由来のldh(LGG_02523)(配列番号29)およびldh(LGG_00606)(配列番号30)からなる群から選択される、請求項１1に記載の方法。
【請求項１３】
D-LDH活性の導入または増強が、変異した乳酸生産菌株のD-LDHをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することによって行われ、前記D-LDHをコードするポリヌクレオチドが、ラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドまたはラクトバチルス・プランタルム由来の配列番号32のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
(a)請求項１〜１０のいずれか一項に記載の変異したD-乳酸生産菌株を培養して培養物を取得する工程と、
(b)前記培養物からD-乳酸を回収する工程とを含む、D-乳酸の生産方法。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６５】
以上の説明から、本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者は、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更せず他の具体的な形態で実施できることを理解しうるであろう。これに関連し、以上で記述した実施例はすべての面において例示的なものであり、限定的なものではないということを理解するべきである。本発明の範囲は後述する特許請求の範囲の意味および範囲とその等価概念から導出されるすべての変更または変形した形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されるべきである。
本発明は以下の態様を包含し得る。
［1］  L-乳酸脱水素酵素(L-lactate dehydrogenase、L-LDH)の活性が低下または不活性化され、D-乳酸脱水素酵素(D-lactate dehydrogenase、D-LDH)の活性が増強されるように変異したD-乳酸生産用菌株。 
［2］  L-LDHをコードするポリヌクレオチドが不活性化した、上記［１］に記載の菌株。
［3］  前記L-LDHをコードするポリヌクレオチドが、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)由来のldh (配列番号25)およびldh1 (配列番号26)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)由来のldh1 (配列番号27)およびldh2 (配列番号28)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)由来のldh (LGG_02523)(配列番号29)およびldh (LGG_00606)(配列番号30)からなる群から選択される、上記［２］に記載の菌株。
［4］  D-LDHをコードするポリヌクレオチドが導入された、上記［１］に記載の菌株。
［5］  前記D-LDHをコードするポリヌクレオチドが、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)またはラクトバチルス・デルブリュッキー(Lactobacillus delbrueckii)に由来する、上記［４］に記載の菌株。
［6］  前記D-LDHをコードするポリヌクレオチドが、ラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドまたはラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドである、上記［５］に記載の菌株。
［7］  １個以上の外来性D-LDHをコードするポリヌクレオチドが、染色体内のL-LDHをコードするポリヌクレオチドの位置に置換されて過剰発現される、上記［１］に記載の菌株。
［8］  変異前の菌株が、L-型乳酸を大量に生産する菌株である、上記［１］に記載の菌株。
［9］  生産用菌株がラクトバチルス属由来の菌株である、上記［８］に記載の菌株。
［10］  ラクトバチルス・カゼイのLDH1をコードするポリヌクレオチド(配列番号27)およびLDH2をコードするポリヌクレオチド(配列番号28)が、それぞれラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドおよびラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドに置換された、上記［８］に記載の菌株。
［11］  ラクトバチルス・パラカゼイのLDHをコードするポリヌクレオチド(配列番号25)およびLDH1をコードするポリヌクレオチド(配列番号26)が、それぞれラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドおよびラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドに置換された、上記［８］に記載の菌株。
［12］  ラクトバチルス・ラムノサスのLDH(LGG_02523)をコードするポリヌクレオチド(配列番号29)およびLDH(LGG_00606)をコードするポリヌクレオチド(配列番号30)が、それぞれラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドおよびラクトバチルス・プランタルム由来のLDHD(配列番号32)をコードするポリヌクレオチドに置換された、上記［８］に記載の菌株。
［13］  Lactobacillus paracasei CC02-0095(受託番号：KCCM11273P)である、上記［１２］に記載の菌株。
［14］  (a)L-乳酸生産菌株において、L-乳酸脱水素酵素(L-lactate dehydrogenase、L-LDH)の活性を低下または不活性化させることによって、変異した乳酸生産菌株を取得する工程と、
(b)前記変異した乳酸生産菌株にD-乳酸脱水素酵素(D-lactate dehydrogenase、D-LDH)の活性を導入または増強させる工程とを含む、変異したD-乳酸生産菌株の製造方法。
［15］  前記L-乳酸生産菌株が、ラクトバチルス属由来の菌株である、上記［１４］に記載の方法。
［16］  前記L-乳酸生産菌株が、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・ペントーサス(Lactobacillus pentosus)、ラクトバチルス・ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス・ジェンセニイ(Lactobacillus jensenii)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・パラプランタルム(Lactobacillus paraplantarum)、ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ラクトバチルス・パラカゼイ(Lactobacillus paracasei)、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバシルス・ジョンソニイ(Lactobacillus johnsonii)およびラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)からなる群から選択される菌株である、上記［１４］に記載の方法。
［17］  前記L-LDH活性の低下または不活性化が、L-LDHをコードするポリヌクレオチドの置換、欠失、挿入または付加によって行われる、上記［１４］に記載の方法。
［18］  前記L-LDHをコードするポリヌクレオチドが、ラクトバチルス・パラカゼイ由来のldh(配列番号25)およびldh1(配列番号26)、ラクトバチルス・カゼイ由来のldh1(配列番号27)およびldh2(配列番号28)、ラクトバチルス・ラムノサス由来のldh(LGG_02523)(配列番号29)およびldh(LGG_00606)(配列番号30)からなる群から選択される、上記［１７］に記載の方法。
［19］  D-LDH活性の導入または増強が、変異した乳酸生産菌株の染色体にD-LDHをコードするポリヌクレオチドを導入することによって行われる、上記［１４］に記載の方法。
［20］  D-LDH活性の導入または増強が、変異した乳酸生産菌株のD-LDHをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを導入することによって行われる、上記［１４］に記載の方法。
［21］  前記D-LDHをコードするポリヌクレオチドが、ラクトバチルス・デルブリュッキー由来のLDHA(配列番号31)をコードするポリヌクレオチドまたはラクトバチルス・プランタルム由来の配列番号32のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである、上記［１９］または［２０］に記載の方法。
［22］  (a)上記［１］〜［13］のいずれか一項に記載の変異したD-乳酸生産菌株を培養して培養物を取得する工程と、
(b)前記培養物からD-乳酸を回収する工程とを含む、D-乳酸の生産方法。 
［23］  前記変異したD-乳酸生産菌株が、Lactobacillus paracasei CC02-0095(KCCM11273P)である、上記［２２］に記載の方法。
［24］  前記D-乳酸の回収が、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧、乾燥、蒸発、沈殿、結晶化、電気泳動、分別溶解、クロマトグラフィーおよびこれらの組み合わせからなる群から選択される方法によって行われる、上記［２２］に記載の方法。
【国際調査報告】
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