(57)【要約】  本開示は、活動性結核感染を治療するための方法及び組成物に関し、並びに活動性結核感染に対する化学療法レジメンの有効性を改善するための方法及び組成物に関する。本開示は、活動性結核菌感染、又は哺乳動物における潜伏感染の再活性化に起因した活動性感染を治療する方法、並びに活動性結核菌感染に対する化学療法レジメンの有効性を改善する方法に関する。【選択図】図３Ａ
2015525784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における活動性結核感染を治療する方法であって、該方法は、活動性結核感染を有する哺乳動物に、1つ以上の化学療法剤と併用した、免疫学的に有効な量の治療用ワクチンを投与するステップを含み、ここで、該ワクチンは、単離された融合ポリペプチドを含む医薬組成物を含み、該融合ポリペプチドは、(a)結核菌群のマイコバクテリウム属種由来の抗原Rv1813、Rv3620及びRv2608の組み合わせを含み、該抗原は共有結合している、又は(b)該抗原の組み合わせに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、上記方法。
【請求項２】
治療用ワクチンが、(a)マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813の組み合わせ、又は(b)該抗原の組み合わせに対して少なくとも90％の同一性を有する配列、を含む融合ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813が、結核菌抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
融合ポリペプチドが、配列番号1に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
融合ポリペプチドが、配列番号2に記載のアミノ酸配列又はそれに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
治療用ワクチンが、(a)マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3620及びRv1813の組み合わせ、又は(b)該抗原の組み合わせに対して少なくとも90％の同一性を有する配列、を含む融合ポリペプチドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3620及びRv1813が、結核菌抗原Rv2608、Rv3620及びRv1813である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
融合ポリペプチドが、配列番号3若しくは配列番号4に記載のアミノ酸配列、又は配列番号3若しくは配列番号4に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
活動性結核感染が、結核菌の活動性一次感染である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
活動性結核感染が、再活性化結核感染である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
活動性結核感染が、脱力、疲労、発熱、悪寒、体重減少、食欲不振、無食欲、寝汗、又はそれらの任意の組み合わせの臨床症状と関連する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
活動性結核感染が、肺活動性TB感染である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
肺活動性結核感染が、持続性の咳、粘り気の強い粘液、胸痛、喀血、又はそれらの任意の組み合わせの臨床症状と関連する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
活動性結核感染が、哺乳動物の臓器において、指数関数的な速度、対数関数的な速度、又は半対数関数的な速度で増殖し、繁殖し、増大し又は活動的に増えるMtb細菌によって特徴付けられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
活動性結核感染が、抗酸性染色(AFS)アッセイ、細菌培養アッセイ、IGRテスト、皮膚テスト、及び抗原刺激後の全血若しくは単離されたPBMCの細胞内サイトカイン染色からなる群から選択されるアッセイを用いて同定される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物が多剤耐性(MDR)結核菌に感染している、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
哺乳動物が、カルメット・ゲラン桿菌(Bacillus Calmette-Guerin)(BCG)を用いて事前に免疫されていた、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物がヒトである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
1つ以上の化学療法剤が、イソニアジド、リファンピン又はそれらの組み合わせである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物が、最初に、一定期間にわたって1つ以上の化学療法剤を投与され、続いて、治療用ワクチンを投与される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
哺乳動物が、最初に、治療用ワクチンを投与され、続いて、一定期間にわたって1つ以上の化学療法剤を投与される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
1つ以上の化学療法剤と治療用ワクチンの投与が同時である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
1回以上のその後の時に、哺乳動物に治療用ワクチンを投与することをさらに含み、ここで、1回以上のその後の時に哺乳動物に残存する結核感染が、活動性結核感染であってもよく又はそうでなくてもよい、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ワクチンがアジュバントをさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
アジュバントが、以下の構造:
【化１】
2015525784.tif 000020
(式中、R1、R3、R5及びR6はC11〜C20アルキルであり、R2及びR4はC9〜C20アルキルである)
を有するGLAである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
R1、R3、R5及びR6がC11〜14アルキルであり、R2及びR4がC12〜15アルキルである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
R1、R3、R5及びR6がC11アルキルであり、R2及びR4がC13アルキルである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
R1、R3、R5及びR6がC11アルキルであり、R2及びR4がC9アルキルである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
活動性結核感染に対する化学療法の時間経過を減少させる方法であって、該方法は、活動性結核感染を有する哺乳動物に、化学療法と併用した、免疫学的に有効な量の治療用ワクチンを投与することを含み、それによって、活動性結核感染に対する化学療法の時間経過の減少をもたらし、ここで、該ワクチンは、単離された融合ポリペプチドを含む医薬組成物を含み、該融合ポリペプチドは、(a)結核菌群のマイコバクテリウム属種由来の抗原Rv1813、Rv3620及びRv2608の組み合わせを含み、該抗原は共有結合しており、又は(b)該抗原の組み合わせに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、またここで、該ワクチンは、結核に対する免疫応答を誘導する、上記方法。
【請求項３０】
治療用ワクチンが、(a)マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813の組み合わせ、又は(b)該抗原の組み合わせに対して少なくとも90％の同一性を有する配列、を含む融合ポリペプチドを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813が、結核菌抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
融合ポリペプチドが、配列番号1に記載の配列又はそれに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
融合ポリペプチドが、配列番号2に記載の配列又はそれに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
治療用ワクチンが、(a)マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3620及びRv1813の組み合わせ、又は(b)該抗原の組み合わせに対して少なくとも90％の同一性を有する配列、を含む融合ポリペプチドを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3620及びRv1813が、結核菌抗原Rv2608、Rv3620及びRv1813である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
融合ポリペプチドが、配列番号3若しくは4に記載の配列、又は配列番号3若しくは配列番号4に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
化学療法の時間経過が、約3カ月以下、約5カ月以下又は約7カ月以下に短縮される、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
ワクチンがアジュバントをさらに含む、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
アジュバントが、以下の構造:
【化２】
2015525784.tif 000021
(式中、R1、R3、R5及びR6はC11〜C20アルキルであり、R2及びR4はC9〜C20アルキルである)
を有するGLAである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
R1、R3、R5及びR6がC11〜14アルキルであり、R2及びR4がC12〜15アルキルである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
R1、R3、R5及びR6がC11アルキルであり、R2及びR4がC13アルキルである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
R1、R3、R5及びR6がC11アルキルであり、R2及びR4がC9アルキルである、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願への相互参照
本出願は、それら全てが全体として参照により本明細書に組み込まれる、2012年8月3日に出願された米国仮特許出願第61/679,612号及び2013年3月15日に出願された同第61/791,213号の優先権を主張する。
【０００２】
ASCIIテキストファイルにおける配列表の提出物
ASCIIテキストファイルにおける次の提出物の内容は、全体として参照により本明細書に組み込まれる: 配列表(ファイル名:712192000940SeqList.txt、記録された日:2013年7月31日、大きさ:36KB)のコンピュータ読み取り可能な形態(CRF)。
【０００３】
技術分野
本開示は、哺乳動物における、活動性結核菌(Mycobacterium tuberculosis)一次感染、又は潜伏感染の再活性化から生じる活動性感染を治療するための方法及び組成物、並びに活動性結核菌感染に対する化学療法レジメンの有効性を改善するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
結核(TB)は、結核菌及び他のマイコバクテリウム(Mycobacterium)属種の感染によって引き起こされる慢性感染症である。TBは、発展途上国における主要な汎発流行病であり、世界の先進地域においても増加しつつある問題であり、毎年170〜200万人の生命が奪われる。感染はかなりの期間、無症候性であり得るが、疾患は、最も一般的には、発熱及び乾性咳を生じさせる肺の急性炎症として現れる。未処置の場合、典型的には、重篤な合併症を起こし死亡に至る。多剤耐性TB(MDR-TB)の増加は、この脅威をさらに高めている(Dye, Nat Rev Microbiol 2009; 7:81-7)。
【０００５】
結核菌感染の経過は、原則的に3段階を経て進行する。急性期又は活動期には、免疫応答が、感染を制御でき、細菌負荷がピークに達し、低下し始めるポイントに上昇するまで、細菌は、臓器において指数関数的、対数関数的、若しくは半対数関数的な速度で増殖し又は活動的に増える。機序は十分に理解されていないが、感作されたCD4+ Tリンパ球が、インターフェロンガンマ(IFN-ガンマ、γ-IFN)と協調して、感染の制御を媒介すると考えられている。能動免疫応答が細菌負荷を低下させ、安定した低レベルに細菌負荷を抑止すると、潜伏期が確立される。以前に、研究は、潜伏期に結核菌が活動性繁殖から休止に移行し、原則的に複製しなくなり、肉芽腫内に留まることを報告した。しかしながら、最近の研究では、一定の低細菌数によって特徴付けられる感染の段階である潜伏期においてさえ、少なくとも一部の細菌集団が活性な代謝の段階に留まることが実証されている(Talaat et al. 2007, J of Bact 189, 4265-74)。
【０００６】
したがって、これらの細菌は、強い免疫応答に直面して、生存し、活性な代謝を維持し、最小限に複製する。よって、潜伏期の感染した個体において、複製しない細菌(細胞内に位置するため、免疫系が検出するのは非常に困難であり得る)と、ゆっくりと複製している細菌との間に均衡が存在する。いくつかの場合において、潜伏感染は再活性化に入り、この場合、休止細菌は、初期感染よりも幾分低い速度であっても、再度複製を開始する。初期感染から潜伏への結核菌の移行は、遺伝子発現の変化を伴って生じることが示唆されている(Honer zu Bentrup, 2001)。また、細菌は、活動性複製から休止への移行中に遺伝子発現を調節するため、免疫応答の抗原特異性における変化が生じる可能性が高い。潜伏感染を制御する免疫応答の十分な性質と、再活性化をもたらす要因については、大部分が分かっていない。しかしながら、関与する支配的な細胞型におけるシフトについてはいくつかの証拠がある。CD4 T細胞は、急性期の感染制御に必須かつ十分であるが、研究は、CD8 T細胞応答が潜伏期においてより重要であることを示唆している。古典的な予防ワクチンを潜伏感染させた実験動物に与えた場合、この段階での細菌は、典型的には、活動性の欠如によって例示されるように、TB分野において現在開発中である予防ワクチンの大部分によって標的とされない(Turner et al. 2000 Infect Immun. 68:6:3674-9)。
【０００７】
TBは、一般的に、長期の抗生物質療法を用いて制御することができるが、このような処置は疾患の蔓延を防止するには十分でない。感染した個体は、しばらくの間、無症候性であるが、伝染性であり得る。潜伏性TB(無症候性及び非伝染性)に対する現在の臨床診療は、6〜9カ月のイソニアジド若しくは他の抗生物質又は代替的に4カ月のリファンピンを用いた治療である。活動性TBは、大部分の細菌が死滅すると考えられる6〜8週間の間、4種の薬剤の組み合わせで治療され、続いて、全6〜9カ月の期間、2つの薬物で治療される。治療期間は、毎週与えられる投薬回数に依存する。さらに、治療レジメンのコンプライアンスは重要であるが、患者の行動を監視することは困難である。一部の患者は、副作用又は極端に長い治療期間(6〜9カ月)のいずれかにより治療経過を完了しない。これは、研究によって示されてきたように、効果のない治療及び薬剤耐性の発生をもたらす可能性がある。
【０００８】
結核の蔓延を制御するために、効果的な予防ワクチン接種と活動性疾患の正確な早期診断の両者、それに続く、治療用ワクチン、及び高い費用効率で、かつ患者によって受け入れられる化学療法剤を含む、より効果的な治療レジメンが最も重要なものである。現在、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)の非病原性株であるカルメット・ゲラン桿菌(Bacillus Calmette-Gueerin)(BCG)などの生菌を用いた予防ワクチン接種が、防御免疫を誘導するための最も有効な方法である。しかしながら、BCGの安全性及び有効性は、議論の原因であり、米国などの一部の国は、一般市民にこの薬剤によるワクチン接種を行わない。選択組換えタンパク質と組み合わせた分子アジュバントの開発は、感染症を治療及び予防するために、予防的及び治療的に使用され得る新世代のワクチンの開発を可能にしてきた。例えば、EP2457926を参照されたい。必要とされるものは、治療時間を短縮させ、細菌を一掃し、疾患に関連した肺病理を制限し、及びMDR-TBの蔓延を潜在的に制限する、化学療法剤に対する補助物を提供するために、高い細菌負荷にもかかわらずに、活動性TB疾患に対する免疫応答の刺激において有効な治療用ワクチンである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】EP2457926
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Dye, Nat Rev Microbiol 2009; 7:81-7
【非特許文献２】Talaat et al. 2007, J of Bact 189, 4265-74
【非特許文献３】Honer zu Bentrup, 2001
【非特許文献４】Turner et al. 2000 Infect Immun. 68:6:3674-9
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、TB伝染を減少させるために、治療時間を短縮させることによって、治療コンプライアンスを高める、活動性結核菌感染に対する新規で、より効果的な治療レジメンが緊急に必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本開示は、哺乳動物における活動性結核菌感染、又は潜伏感染の再活性化から生じる活動性感染を治療する方法、並びに活動性結核菌感染に対する化学療法レジメンの有効性を改善する方法に関する。
【００１３】
本開示は、活動性結核菌感染を、治療用Mtbワクチンなどの治療用Mtb組成物と、結核菌感染に対して有効な化学療法剤とを含む治療レジメンによって効果的に治療することができ、それによって、防御に必要とされる化学療法時間を短縮し、細菌負荷を減少させ、及び/又は生存を延期し得るという驚くべき発見に基づいている。さらに、驚くべきことに、本発明者らは、抗生物質治療に対する補助物として活動性TB感染中に送達される治療用Mtb組成物が、TB疾患に対する化学療法レジメンの有効性を改善する、結核菌に対する有益な免疫応答を生じさせることができることを発見した。本発明者らは、さらに、結核菌感染に対して有効な化学療法剤に対して補助的に用いた、活動性TB感染中の治療用ワクチンなどの治療用Mtb組成物の投与が、有意により強固で、高品質(多機能性)で、永続性のあるTH1型CD4+ T細胞応答を刺激することを発見した。
【００１４】
したがって、一態様において、哺乳動物における活動性結核感染を治療する方法が提供され、該方法は、結核(例えば、結核菌)による活動性感染を有する哺乳動物に、化学療法剤と、免疫学的に有効な量の治療用ワクチンを投与するステップを含み、ここで、該ワクチンは、結核菌群のマイコバクテリウム属種由来のMtb抗原又はその免疫原性断片と、アジュバントとを含む医薬組成物を含む。
【００１５】
本開示のこの方法及び関連方法において、治療用ワクチンを投与する少なくとも1つのステップ、典型的には、治療用ワクチンを投与する最初のステップは、哺乳動物が結核菌に活動性感染したとき、及び/又は活動性感染に関連した少なくとも1つの臨床症状若しくは陽性のアッセイ結果を示したときに行われることが理解される。また、本開示の方法は、活動性感染又はその症状が哺乳動物になおも存在しているかどうかに関係なく、さらに、活動性感染に関連したアッセイ結果がなおも陽性であるかどうかに関係なく、化学療法レジメンの有効性を改善するために、その後の1つ以上の追加の時点で本開示の同一又は別の治療用ワクチンを投与する追加ステップをさらに含んでもよいことは理解される。また、本開示の方法は、治療用ワクチンの単独での又は他の薬剤と併用した投与を含んでよく、そのため、治療用ワクチンは、より幅広い治療的処置レジメンの一部として、複数の処置成分の1つであってもよいことは理解される。したがって、本開示の方法は、有利には、活動性結核感染を治療するための化学療法による治療レジメンの有効性を改善する。
【００１６】
特定の実施形態において、治療用ワクチンは、2つ以上の共有結合した結核菌抗原、又はその免疫原性断片の組み合わせを含む単離された融合ポリペプチドを含み、ここで、該抗原は、Rv0164、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv3876、Rv0054、Rv0410、Rv0655、Rv0831、Rv1009、Rv1099、Rv1240、Rv1288、Rv1410、Rv1569、Rv1789、Rv1818、Rv1860、Rv1886、Rv1908、Rv2220、Rv2032、Rv2623、Rv2875、Rv3044、Rv3310、Rv3881、Rv0577、Rv1626、Rv0733、Rv2520、Rv1253、Rv1980、Rv3628、Rv1884、Rv3872、Rv3873、Rv1511及びRv3875、並びに前述の配列のいずれかと少なくとも90％の同一性を有する抗原からなる群から選択される。
【００１７】
特定の実施形態において、治療用ワクチンは、抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813を含むID93融合ポリペプチドを含む。
【００１８】
別の特定の実施形態において、治療用ワクチンは、抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813を含むID93融合ポリペプチドを含み、ここで、該抗原の配列は結核菌由来である。より具体的な実施形態において、ID93融合ポリペプチドは、配列番号1に記載の配列、又はそれに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む。
【００１９】
また、本明細書において、哺乳動物における活動性結核感染を治療する方法であって、該方法は、活動性結核感染を有する哺乳動物に、1つ以上の化学療法剤と併用した、免疫学的に有効な量の治療用ワクチンを投与するステップを含み、ここで、該ワクチンは、単離された融合ポリペプチドを含む医薬組成物を含み、該融合ポリペプチドは、(a)結核菌群のマイコバクテリウム属種由来の抗原Rv3620及びRv2608の組み合わせを含み、該抗原は共有結合している、又は(b)該抗原の組み合わせに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、上記方法が提供される。
【００２０】
本明細書において、哺乳動物における活動性結核感染を治療する方法であって、該方法は、活動性結核感染を有する哺乳動物に、1つ以上の化学療法剤と併用した、免疫学的に有効な量の治療用ワクチンを投与するステップを含み、ここで、該ワクチンは、単離された融合ポリペプチドを含む医薬組成物を含み、該融合ポリペプチドは、(a)結核菌群のマイコバクテリウム属種由来の抗原Rv1813、Rv3620及びRv2608の組み合わせを含み、該抗原は共有結合している、又は(b)該抗原の組み合わせに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、上記方法も提供される。
【００２１】
特定の実施形態において、開示されている方法に従って治療されるべき活動性感染は、脱力、発熱、悪寒、体重減少、無食欲及び寝汗からなる群から選択される、哺乳動物における活動性TBの臨床症状を引き起こしている活動性感染である。他の実施形態において、活動性感染は、持続性の咳、粘り気の強い粘液、胸痛及び喀血からなる群から選択される、哺乳動物における肺TB症状の臨床症状を引き起こしている。さらに他の実施形態において、活動性感染は、哺乳動物の臓器において、指数関数的な速度、対数関数的な速度、又は半対数関数的な速度で増殖し(proliferate)、繁殖し(reproduce)、増大し(expand)又は活動的に増える(multiply)Mtb細菌によって特徴付けられる。他のより具体的な実施形態において、活動性感染は、抗酸性染色(AFS)アッセイ; 細菌培養アッセイ、例えば、BACTEC MGIT 960アッセイ; IGRテスト、例えば、QFT(登録商標)-Goldテスト又はQFT(登録商標)-Gold In-tube T SPOT(商標)TBテスト; 皮膚テスト、例えば、TST Mantoux皮膚テスト(TST); 及び抗原刺激後の全血若しくは単離されたPBMCの細胞内サイトカイン染色からなる群から選択されるアッセイを用いて同定される。
【００２２】
いくつかの実施形態において、活動性感染は、結核菌の活動性一次感染であり、一方、他においては、結核菌の潜伏感染の再活性化から生じることは明らかである。いくつかの実施形態において、哺乳動物は、結核菌の多剤耐性(MDR)株に感染している。他の実施形態において、哺乳動物は、カルメット・ゲラン桿菌(Bacillus Calmette-Guerin)(BCG)で事前に免疫されている。
【００２３】
開示された方法の特定の実施形態は、イソニアジド及び/又はリファンピンなどの結核菌感染の治療に有効な1つ以上の化学療法剤の投与を含む。いくつかの状況において、哺乳動物は、最初に、一定期間にわたって1つ以上の化学療法剤を投与され、次に、治療用ワクチンを投与される。他の状況において、哺乳動物は、最初に治療用ワクチンを投与され、次に、一定期間にわたって1つ以上の化学療法剤を投与される。さらに他の状況において、1つ以上の化学療法剤と治療用ワクチンの投与は同時に開始される。さらにまた、開示された方法を実施するとき、哺乳動物に、複数回、例えば、最初の投与後の1回以上のその後の時に、医薬組成物及び/又は治療用ワクチンを投与することが望ましい場合があることは理解される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、治療用ワクチンは、アジュバントをさらに含む。いくつかの実施形態において、治療用ワクチンに使用されるアジュバントは、GLAアジュバントであって、例えば、GLAアジュバントは、以下の構造:
【００２５】
【化１】
2015525784.tif 000003
(式中、R1、R3、R5及びR6は、C11〜C20アルキルであり、R2及びR4はC12〜C20アルキル又はC9〜C20アルキルである)
を有する。
【００２６】
より具体的な実施形態において、上記の構造を有するGLAを用いる場合、R1、R3、R5及びR6はC11〜14アルキルであり、R2及びR4はC12〜15アルキルである。さらにより具体的な実施形態において、上記構造のGLAは、R1、R3、R5及びR6がC11アルキルであり、R2及びR4がC13アルキルであるものである。さらにより具体的な実施形態において、上記構造のGLAは、R1、R3、R5及びR6がC11アルキルであり、R2及びR4がC9アルキルであるものである。
【００２７】
別の態様において、組成物は、被験体における活動性結核感染の化学療法の時間経過を減少させる方法に使用され、該方法は、活動性結核菌感染を有する哺乳動物に、免疫学的に有効な量の、例えば、結核菌群のマイコバクテリウム属種由来の融合タンパク質若しくはポリペプチド又はその免疫原性断片とアジュバントとを含む、本明細書に記載されている治療用ワクチンを、結核菌感染に対して有効な1つ以上の化学療法剤とともに補助的に投与するステップであって、それによって、結核菌感染に対する化学療法の時間経過を減少させる、前記ステップを含む。別の態様において、本明細書において、活動性結核感染に対する化学療法の時間経過を減少させる方法が提供され、該方法は、活動性結核感染を有する哺乳動物に、化学療法と併用した、免疫学的に有効な量の治療用ワクチンを投与することを含み、それによって、活動性結核感染に対する化学療法の時間経過の減少をもたらし、ここで、該ワクチンは、単離された融合ポリペプチドを含む医薬組成物を含み、該融合ポリペプチドは、(a)結核菌群のマイコバクテリウム属種由来の抗原Rv1813、Rv3620、及びRv2608の組み合わせを含み、該抗原は共有結合しており、又は(b)該抗原の組み合わせに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含み、またここで、該ワクチンは、結核に対する免疫応答を誘導する。いくつかの態様において、治療の時間経過は、約3、4、5、6又は7カ月に、例えば、約3、4、5、6又は7カ月以下に短縮される。結核菌感染に対する化学療法の時間経過を短縮させることによって、本方法はまた、治療の全過程の完了における、活動性結核菌感染について治療される個体のコンプライアンスを高めることに効果的である。
【００２８】
さらなる態様において、組成物は、被験体の活動性結核感染における多機能性の永続的なTH1型CD4+ T細胞応答を刺激する方法に使用され、該方法は、活動性結核菌感染を有する哺乳動物に、免疫学的に有効な量の、例えば、結核菌群のマイコバクテリウム属種由来の融合タンパク質又はその免疫原性断片とアジュバントとを含む、本明細書に記載されている治療用ワクチンを、結核菌感染に対して有効な1つ以上の化学療法剤とともに補助的に投与するステップであって、それによって、多機能性の永続的なTH1型CD4+ T細胞応答を刺激する、前記ステップを含む。結核菌感染に対する化学療法の時間経過を短縮させることによって、本方法はまた、治療の全過程の完了における、活動性結核菌感染について治療される個体のコンプライアンスを高めることに効果的である。
【００２９】
前述の実施形態のいずれかにおいて、哺乳動物はヒトであってもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】結核菌(Mtb)に感染させ、抗生物質で処置されたSWR/J及びC57BL/6マウスの細菌負荷及び生存を示す図である。SWR/J及びC57BL/6マウスを、Mtb H37Rv(ATCC #27294)の低用量(50〜100個の細菌)エアロゾル(LDA)に感染させた。(図1A)肺における生菌数(5匹のマウス/群)は、感染から15、30及び100日後に決定された。記号は平均+/-標準偏差を示す。(図1B)SWR/J及びC57BL/6マウスの生存は、Mtb H37Rvに感染させ、擬似処置されるか、又は30〜120日目に投与されたINHとRIFからなる90日間の抗生物質レジメン(Rx 90d)で処置された、動物(8匹のマウス/群)においてモニターされた。(図1C)SWR/JマウスをMtb H37RvのLDAに感染させ、15日目(Rx 30d、60d、90d)又は30日目(Rx 90d (30))に開始する30、60又は90日間の抗生物質により処置した。SWR/Jマウス(7匹のマウス/群)の生存を示す。(図1D)擬似処置されるか、又は30〜120日目に投与された90日間のINH/RIFレジメン(Rx 90d)で処置された動物(5匹のマウス/群)の肺における生菌数は、感染から30、60、90、120及び150日後に決定された。*P<0.05(一元配置分散分析、続く、Dunnettの多重比較検定又はログランク検定)は有意であるとみなされる。2つの実験のうち1つの代表的なものを示す。
【図２Ａ】MtbのLDAに感染させ、抗生物質及びID93/GLA-SEで処置されたSWR/Jマウスのコロニー形成単位カウント及び生存を示す図である。SWR/Jマウスは、MtbのLDAに感染させた(0日目)。15日後(15日目)、マウスは擬似処置されるか、又は抗生物質で90日間処置された(Rx 90d)。それぞれの群における抗生物質で処置されたマウスの一部はまた、抗生物質の治療的処置中(DTT; 15日目、36日目、57日目)又は抗生物質の治療的処置後(PTT; 107日目、128日目、149日目)のいずれかでID93/GLA-SEで3回、3週間の間隔で免疫された。(図2A)免疫療法実験のスキーム。
【図２Ｂ−Ｃ】MtbのLDAに感染させ、抗生物質及びID93/GLA-SEで処置されたSWR/Jマウスのコロニー形成単位カウント及び生存を示す図である。SWR/Jマウスは、MtbのLDAに感染させた(0日目)。15日後(15日目)、マウスは擬似処置されるか、又は抗生物質で90日間処置された(Rx 90d)。それぞれの群における抗生物質で処置されたマウスの一部はまた、抗生物質の治療的処置中(DTT; 15日目、36日目、57日目)又は抗生物質の治療的処置後(PTT; 107日目、128日目、149日目)のいずれかでID93/GLA-SEで3回、3週間の間隔で免疫された。(図2B)動物(6又は7匹のマウス/群)の肺における生菌数は、感染から177日後に決定された。*P<0.05は有意であるとみなされる。(図2C)防御は、経時的にMtbによって引き起こされた動物の死亡(9又は10匹のマウス/群)をモニターすることによって評価された。4つの実験のうちの1つの代表的なものを示す。P<0.05(ログランク検定)は有意であるとみなされる。
【図３Ａ】Mtbに感染させ、ID93/GLA-SEワクチンと減少させた抗生物質化学療法で処置されたSWR/Jマウスの生存を示す図である。SWR/JマウスをMtb H37RvのLDAに感染させた。15日後、マウスは、抗生物質で60又は90日間処置された(それぞれ、Rx 60d及びRx 90)。60日の抗生物質レジメンの完了に続いて、マウスは、ID93/GLA-SEで3回、3週間の間隔で免疫された。(図3A)防御は、経時的にMtbによって引き起こされた動物の死亡(7匹のマウス/群)をモニターすることによって評価された。P<0.05(ログランク検定)は有意であるとみなされる。
【図３Ｂ．Ｃ．Ｆ．Ｇ．Ｊ．Ｋ】Mtbに感染させ、ID93/GLA-SEワクチンと減少させた抗生物質化学療法で処置されたSWR/Jマウスの生存を示す図である。SWR/JマウスをMtb H37RvのLDAに感染させた。15日後、マウスは、抗生物質で60又は90日間処置された(それぞれ、Rx 60d及びRx 90)。60日の抗生物質レジメンの完了に続いて、マウスは、ID93/GLA-SEで3回、3週間の間隔で免疫された。(図3B-3M)Mtb H37Rvによるチャレンジ後の肺組織の組織病理学的評価。炎症反応及び肉芽腫(g)形成は、H&E切片において示され(図3B-3I)、AFB(矢印)の存在が評価された(図3J-3M)。(図3B、3F、3J)擬似処置されたマウス、106日目; (図3C、3J及び3K)90日間の抗生物質療法、106日目; (図3D、3H、3L)90日間の抗生物質療法+ID93/GLA-SE、241日目; (図3E、3I及び3M)60日間の抗生物質療法+ID93/GLA-SE、295日目。示されるデータは、5匹のマウス/群の代表的なものである。3つの実験のうち1つの代表的なものを示す。
【図３Ｄ．Ｅ．Ｈ．Ｉ．Ｌ．Ｍ】Mtbに感染させ、ID93/GLA-SEワクチンと減少させた抗生物質化学療法で処置されたSWR/Jマウスの生存を示す図である。SWR/JマウスをMtb H37RvのLDAに感染させた。15日後、マウスは、抗生物質で60又は90日間処置された(それぞれ、Rx 60d及びRx 90)。60日の抗生物質レジメンの完了に続いて、マウスは、ID93/GLA-SEで3回、3週間の間隔で免疫された。(図3B-3M)Mtb H37Rvによるチャレンジ後の肺組織の組織病理学的評価。炎症反応及び肉芽腫(g)形成は、H&E切片において示され(図3B-3I)、AFB(矢印)の存在が評価された(図3J-3M)。(図3B、3F、3J)擬似処置されたマウス、106日目; (図3C、3J及び3K)90日間の抗生物質療法、106日目; (図3D、3H、3L)90日間の抗生物質療法+ID93/GLA-SE、241日目; (図3E、3I及び3M)60日間の抗生物質療法+ID93/GLA-SE、295日目。示されるデータは、5匹のマウス/群の代表的なものである。3つの実験のうち1つの代表的なものを示す。
【図４Ａ】免疫療法後のSWRマウスにおけるID93特異的サイトカイン反応を示す図である。SWRマウスをLDA Mtb H37Rvに感染させ、90日間の抗生物質単独、又は抗生物質とそれに続くID93/GLA-SEで3回、3週間の間隔での免疫化のいずれかで処置した。(図4A)感染後177日目又は241日目のいずれかで回収した、ID93で刺激された脾細胞のサイトカインプロファイル。細胞を、抗原の存在下又は培地対照において24時間インキュベートし、上清を回収し、IFN-γ、IL-2、TNF、IL-5、IL-10、IL-13、及びIL-17について多重ビーズアレイによって分析した。ボックスプロットは、バックグラウンド減算後の中央値と四分位範囲を示す。Wilcoxon順位和検定からのP値。
【図４Ｂ−Ｃ】免疫療法後のSWRマウスにおけるID93特異的サイトカイン反応を示す図である。SWRマウスをLDA Mtb H37Rvに感染させ、90日間の抗生物質単独、又は抗生物質とそれに続くID93/GLA-SEで3回、3週間の間隔での免疫化のいずれかで処置した。(図4B-4D)感染後149日目及び177日目のID93特異的T細胞応答についての細胞内サイトカイン染色。細胞を、ブレフェルジンAの存在下で、8〜12時間、ID93又は培地対照で刺激し、CD3、CD4、CD8、CD44、IFN-γ、IL-2及びTNFに対する、蛍光色素を結合させた抗体を用いて染色した。(図4B及び4C)パネルは、FACS分析のためのゲーティングスキームを示す。
【図４Ｄ】免疫療法後のSWRマウスにおけるID93特異的サイトカイン反応を示す図である。SWRマウスをLDA Mtb H37Rvに感染させ、90日間の抗生物質単独、又は抗生物質とそれに続くID93/GLA-SEで3回、3週間の間隔での免疫化のいずれかで処置した。(図4B-4D)感染後149日目及び177日目のID93特異的T細胞応答についての細胞内サイトカイン染色。細胞を、ブレフェルジンAの存在下で、8〜12時間、ID93又は培地対照で刺激し、CD3、CD4、CD8、CD44、IFN-γ、IL-2及びTNFに対する、蛍光色素を結合させた抗体を用いて染色した。(図4D)下段パネルのボックスプロットは、バックグラウンド減算後の中央値と四分位範囲を示す。Wilcoxon順位和検定からのP値。2つの実験のうちの1つの代表的なものを示す。
【図５Ａ−Ｄ】Mtbに感染させ、抗生物質とID93/GLA-SEで処置された非ヒト霊長類(NHP)の生存、臨床パラメータ及び細菌負荷を示す図である。カニクイザルは、1000CFUの病原性の結核菌(Erdman株)を用いて気管内に接種された。感染を60日間継続させ、続いて、強制経口投与によって送達された30日間のINH/RIF抗生物質又は生理食塩水(擬似)で処置された。サル(7匹/群)は、3回、2週間の間隔で投与されるID93/GLA-SE(Rx+ID93/GLA-SE)を注射されるか、又は更なる処置を受けなかった(擬似、Rx)。(図5A)NHP免疫療法実験のスキーム。(図5B)生存を曝露後の50週間モニターした。(図5C)また、CYR変化は、曝露後の50週間、毎月評価された。(図5D)剖検で、細菌は、サル肺における細菌学的負荷(CFU)を数えることによって定量された。
【図５Ｅ】Mtbに感染させ、抗生物質とID93/GLA-SEで処置された非ヒト霊長類(NHP)の生存、臨床パラメータ及び細菌負荷を示す図である。カニクイザルは、1000CFUの病原性の結核菌(Erdman株)を用いて気管内に接種された。感染を60日間継続させ、続いて、強制経口投与によって送達された30日間のINH/RIF抗生物質又は生理食塩水(擬似)で処置された。サル(7匹/群)は、3回、2週間の間隔で投与されるID93/GLA-SE(Rx+ID93/GLA-SE)を注射されるか、又は更なる処置を受けなかった(擬似、Rx)。(図5E)NHPから回収された肺組織のH&E染色された切片の組織学的外観。
【図６】処置から(図6A)6週後と(図6B)12週後の肺log10CFUカウントを示す図である。
【図７】治療終了後の細菌増殖を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
特許又は出願ファイルは、少なくとも1つのカラーで作成された図面を含有する。カラーの図面を含む本特許又は特許出願公開公報の写しは、請求及び必要な費用の支払いにより特許庁により提供される。
【００３２】
本明細書に記載されているように、本開示は、概して、治療時間の短縮、TB細菌のクリアランス、及びMDR-TBの蔓延の潜在的な制限をもたらし得る、抗TB化学療法剤と組み合わせた治療用TBワクチンを用いた、活動性TB感染を治療するための組成物及び方法に関する。
【００３３】
本発明の治療用ワクチン組成物は、概して、結核菌群のマイコバクテリウム属種の少なくとも2つの異種ポリペプチドを含む。結核菌群のマイコバクテリウム属種としては、伝統的には疾患の結核を引き起こすものと考えられるそれらの種、並びに免疫低下した患者、例えばAIDSの患者において結核及び肺疾患を引き起こすマイコバクテリウム環境種及び日和見種、例えば、結核菌(Mtb)、ウシ型結核菌、又はマイコバクテリウム・アフリカヌム(Mycobacterium africanum)、BCG、トリ型結核菌(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・イントラセルラーエ(Mycobacterium intracellulare)、マイコバクテリウム・セラツム(Mycobacterium celatum)、マイコバクテリウム・ゲナベンス(Mycobacterium genavense)、マイコバクテリウム・ヘモフィルム(Mycobacterium haemophilum)、マイコバクテリウム・カンサシ(Mycobacterium kansasii)、マイコバクテリウム・シミアエ(Mycobacterium simiae)、マイコバクテリウム・バカエ(Mycobacterium vaccae)、マイコバクテリウム・フォーツイツム(Mycobacterium fortuitum)、及びマイコバクテリウム・スクロフラセウム(Mycobacterium scrofulaceum)などが挙げられる(例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine, volume 1, pp. 1004-1014及び1019-1020参照)。好ましい実施形態において、本発明に従って予防、治療又は診断されるべきマイコバクテリウム属種は、結核菌(Mtb)である。マイコバクテリウム属種由来の抗原の配列は、容易に入手可能である。例えば、結核菌配列は、Coleら, Nature 393:537 (1998)に見出すことができ、例えば、Wellcome Trust, Sanger Institute及びInstitut Pasteurによって維持されているものなど、ウェブサイトで見出すことができる。
【００３４】
特定の実施形態において、治療用ワクチンは、米国特許出願公開第2010/0129391号(その内容は、全体として参照により本明細書に具体的に組み込まれる)に記載されている融合ポリヌクレオチド、融合ポリペプチド、又は組成物を含む。
【００３５】
例えば、特定の具体的な実施形態において、治療用ワクチンは、2つ以上の共有結合した結核菌抗原、又はその免疫原性断片の組み合わせを含む、単離された融合ポリペプチド若しくはタンパク質、又はそれらをコードするポリヌクレオチドを含み、ここで、該抗原は、米国特許出願公開第2010/0129391号に記載されている、Rv0164、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv3876、Rv0054、Rv0410、Rv0655、Rv0831、Rv1009、Rv1099、Rv1240、Rv1288、Rv1410、Rv1569、Rv1789、Rv1818、Rv1860、Rv1886、Rv1908、Rv2220、Rv2032、Rv2623、Rv2875、Rv3044、Rv3310、Rv3881、Rv0577、Rv1626、Rv0733、Rv2520、Rv1253、Rv1980、Rv3628、Rv1884、Rv3872、Rv3873、Rv1511及びRv3875、並びに前述の配列のいずれかと少なくとも90％の同一性を有する抗原からなる群から選択される。
【００３６】
いくつかの実施形態において、治療用ワクチンは、(a)結核菌群のマイコバクテリウム属種由来の抗原Rv3620及びRv2608の組み合わせを含み、該抗原は共有結合している、又は(b)該抗原の組み合わせに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、単離された融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、治療用ワクチンは、(a)結核菌群のマイコバクテリウム属種由来の抗原Rv1813、Rv3620及びRv2608の組み合わせを含み、該抗原は共有結合している、又は(b)該抗原の組み合わせに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、単離された融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、治療用ワクチンは、マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813の組み合わせ、又は該抗原の組み合わせに対して少なくとも90％の同一性を有する配列、を含む、融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813は、結核菌抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813である。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号1に記載の配列又はそれに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号2に記載の配列又はそれに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、治療用ワクチンは、マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3620及びRv1813の組み合わせ、又は該抗原の組み合わせに対して少なくとも90％の同一性を有する配列、を含む、融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3620及びRv1813は、結核菌抗原Rv2608、Rv3620及びRv1813である。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号3若しくは4に記載の配列、又は配列番号3若しくは配列番号4に対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態において、抗原Rv1813は、配列番号5のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗原Rv3620は、配列番号6のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗原Rv2608は、配列番号7のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗原Rv3619は、配列番号8のアミノ酸配列を含む。当業者は、1つ以上のN末端アミノ酸(例えば、シグナル配列)が除かれてもよいことを理解する。
【００３７】
より具体的な実施形態において、治療用ワクチンは、米国特許出願公開第2010/0129391号(全体として参照により本明細書に具体的に組み込まれる)に記載されている、病原性(Rv2608、Rv3619、Rv3620)又は潜伏(Rv1813)に関連したMtbタンパク質のファミリーに属する4つの抗原を含む、ID93融合タンパク質、又はそれをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００３８】
いくつかの特定のさらなる実施形態において、融合タンパク質、例えば、ID93融合タンパク質は、ワクチンとして製剤化される。さらなる具体的な実施形態において、治療用ワクチンは、米国特許出願公開第2008/0131466(全体として参照により具体的に本明細書に組み込まれる)に記載されている安定な水中油型エマルジョン(SE)及びGLA、合成TLR-4アゴニスト(GLA)を含む。当業者が理解するように、いくつかの実施形態において、治療用ワクチンは、当該技術分野において公知の結核菌群のマイコバクテリウム属種に由来する単離されたポリペプチド、単離された融合ポリペプチド又は断片(例えば、抗原性/免疫原性部分)を含む。本開示のMtbポリペプチド、その抗原性/免疫原性断片、及び他の改変体は、従来の組換え技術及び/又は合成技術を用いて調製され得る。
【００３９】
いくつかの実施形態において、核酸分子又は融合タンパク質は、結核菌感染に対して有効な1つ以上の化学療法剤とともに投与される。このような化学療法剤の例としては、限定されないが、アミカシン、アミノサリチル酸、カプレオマイシン、サイクロセリン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド、カナマイシン、ピラジナミド、リファマイシン(すなわち、リファンピン、リファペンチン及びリファブチン)、ストレプトマイシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン及びフルオロキノロン類が挙げられる。このような化学療法は、好ましい薬物の組み合わせを用いて治療する医師の判断によって決定される。薬物耐性でない結核菌感染を治療するために使用される「第一選択」化学療法剤としては、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、ストレプトマイシン及びピラジナミドが挙げられる。1つ以上の「第一選択」薬物に対する実証された薬物耐性を有する結核菌感染を治療するために使用される「第二選択」化学療法剤としては、限定されないが、オフロキサシン、シプロフロキサシン、エチオナミド、アミノサリチル酸、サイクロセリン、アミカシン、カナマイシン及びカプレオマイシンが挙げられる。
【００４０】
いくつかの実施形態において、治療用ワクチンは、結核菌感染に対して有効な1つ以上の化学療法剤の投与前に、投与と同時に、又は投与後に活動性TBを有する哺乳動物に投与される。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、同時に、並行して投与される。代替的に、化学療法剤は、数分、例えば、約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50分以内、数時間、例えば、約1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21時間以内、又はさらには数日、例えば、約1、2、3、4、5又は6日以内に投与される。いくつかの実施形態において、化学療法剤は、治療用ワクチンの約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11又は12週間前に投与される。一実施形態において、核酸分子又は融合タンパク質は、1つ以上の化学療法剤の投与開始から約2週間後に投与される。1つ以上の化学療法剤は、一般に、一定期間にわたって、例えば、約1、2、3若しくは4週間、又は約2、3、4、5、6若しくは8カ月間、又は約1年間若しくはそれを超えて投与される。
【００４１】
いくつかの実施形態において、活動性TB感染を有する哺乳動物における、核酸分子、融合ポリペプチド、又はワクチンを含む、免疫応答を刺激するための治療用組成物の初回投与は、核酸、融合ポリペプチド、又はワクチンの1回以上のその後の投与へと続く。例えば、核酸分子又は融合ポリペプチドを用いた初回投与は、核酸分子又は融合タンパク質の1回以上のその後の投与へと続く。一実施形態において、核酸分子又は融合ポリペプチドを用いた初回投与は、融合ポリペプチドの1回以上のその後の投与へと続く。一実施形態において、核酸分子又は融合ポリペプチドを用いた初回投与は、核酸分子の1回以上のその後の投与へと続く。通常、初回若しくは第2回又はその後の投与は、約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11若しくは12週間の間隔で、又は最大約4、5若しくは6カ月の間隔で与えられる。さらなる投与は、約6カ月の間隔で、又は1、2、3、4若しくは5年もの長い間隔で与えられる。
【００４２】
別の態様において、組成物は、結核菌感染に対する化学療法の時間経過を低減又は短縮する方法に使用され、該方法は、すでに結核菌に感染した哺乳動物に、結核菌感染に対して有効な1つ以上の化学療法剤、及び、結核菌群のマイコバクテリウム属種由来の融合ポリペプチド、例えばID93、若しくはその免疫原性断片とアジュバントとを含む免疫学的に有効な量の医薬組成物を投与することを含み、ここで、該ID93融合ポリペプチドは、結核菌に対する免疫応答を誘導し、それによって結核菌感染に対する化学療法の時間経過の低減又は短縮を可能にする。通常、核酸分子、融合ポリペプチド、又はワクチンの投与は、6カ月以内、5カ月以内、4カ月以内、3カ月以内又はそれ未満以内に、結核菌感染に対して有効な化学療法による治療を可能にする。
【００４３】
本開示の組成物及び方法は、通常、ヒトに投与されるが、家畜哺乳動物(すなわち、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、チンチラ)及び農業用哺乳動物(すなわち、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ)を含む他の哺乳動物において有効である。
【００４４】
定義
本明細書において、「約」及び「から本質的になる」という用語は、他に指示がなければ、指示された範囲、値又は構造の±20％を意味する。用語「1つの(a)」及び「1つの(an)」は、本明細書で使用するとき、「1つ以上の」列挙の成分を指すものと理解するべきである。代替(例えば、「又は」)の使用は、選択肢のいずれか1つ、両方又はそれらの任意の組合せを意味するものと理解するべきである。本明細書で使用するとき、「含む(include)」、「有する」及び「含む(comprise)」なる用語は同義的に使用され、これらの用語及び変形体は非限定的なものと見なすことが意図される。
【００４５】
「化学療法」、「化学療法剤」又は「化学療法レジメン」は、結核菌のいずれかの種に感染した、又は曝露された患者を治療するために、又はその治療において使用される薬物又は薬物の組み合わせであり、限定されないが、アミカシン、アミノサリチル酸、カプレオマイシン、サイクロセリン、エタンブトール、エチオナミド、イソニアジド(INH)、カナマイシン、ピラジナミド、リファマイシン(すなわち、リファンピン、リファペンチン及びリファブチン)、ストレプトマイシン、オフロキサシン、シプロフロキサシン、クラリスロマイシン、アジスロマイシン及びフルオロキノロン類、並びに当該技術分野における他の誘導類似体又はバイオシミラーを含む。「第一選択」化学療法剤は、薬物耐性ではない結核菌感染を治療するために使用される化学療法剤であり、限定されないが、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、ストレプトマイシン及びピラジナミド、並びに当該技術分野における他の誘導類似体又はバイオシミラーを含む。1つ以上の「第一選択」薬物に対して実証された薬物耐性を有する結核菌感染を治療するために使用される「第二選択」化学療法剤としては、限定されないが、オフロキサシン、シプロフロキサシン、エチオナミド、アミノサリチル酸、サイクロセリン、アミカシン、カナマイシン及びカプレオマイシン、並びに当該技術分野における他の誘導類似体又はバイオシミラーが挙げられる。
【００４６】
本明細書で使用するとき、「化学療法レジメンの有効性を改善すること」とは、所望の臨床結果を達成するのに必要とされる治療期間を短縮すること、所望の臨床結果を達成するのに必要とされる異なる化学療法剤の数を減らすこと、所望の臨床結果を達成するのに必要とされる化学療法剤の投薬量を減らすこと、活動性臨床感染に関連した宿主若しくは宿主臓器の病理を減少させること、本方法によって治療される宿主若しくは宿主臓器の生存率を改善すること、MDR-TB株の発生若しくは発生率を低下させること、及び/又は化学療法レジメンによる患者のコンプライアンスを増加させることを指す。
【００４７】
「治療用Mtb組成物(複数可)」とは、本明細書で使用するとき、活動性TB感染を有する宿主に投与した場合、結核菌に対する有益な免疫応答を誘発することができる組成物(複数可)を指す。「有益な免疫応答」は、活動性TB疾患の徴候若しくは症状を軽減し、細菌数を減少させ、活動性TB疾患に関連した病理を減少させ、疾患の消散に関連した適切なサイトカインプロファイルを誘発し、抗原特異的CD4+及びCD8+ T細胞を増大させ、又は化学療法レジメンの有効性を改善させるものである。本開示の治療用Mtb組成物は、限定されないが、当該技術分野において公知の方法によって医薬として許容される製剤において送達される、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗原性断片、ペプチドを含み、並びにワクチン製剤を含む。
【００４８】
「宿主」、「被験体」、「患者」、「哺乳動物」又は「個体」は全て本明細書において同義的に使用される。
【００４９】
「結核菌(M. tuberculosis)」、「Mtb」、「結核菌(Mycobacterium tuberculosis)」、「細菌(bacteria)」、「細菌(bacterium)」、「細菌(bacillus)」は全て、本明細書で使用するとき、哺乳動物においてTB疾患を引き起こすことに関与する細菌を指す。
【００５０】
「薬物耐性」結核菌感染とは、感染株が、結核菌感染の治療において有効な1つ以上のいわゆる「第一線の」化学療法剤(例えば、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、ストレプトマイシン及びピラジナミド)によって静止を保持されず又は死滅しない(それらに耐性である)結核菌感染を指す。
【００５１】
「多剤耐性」、「MDR-TB」結核菌感染とは、感染株が、結核菌感染の治療において有効な2つ以上の「第一線の」化学療法剤に耐性である結核菌感染を指す。また、多剤耐性結核菌感染とは、本明細書で使用するとき、フルオロキノロン類(FQ)のいずれか1つと、カナマイシン、アミカシン及びカプレオマイシンなどの注射可能な薬物の少なくとも1つとに対して耐性を有する多剤耐性TBとして、World Health Global task Force(2006年10月)によって定義された「超多剤耐性結核菌」(「XDR-TB」)を指す。
【００５２】
「活動性結核」、「活動性TB」、「TB疾患」、「TB」又は「活動性感染」とは、本明細書で使用するとき、Mtb細菌が、最も一般的には肺において(肺活動性TB)、活動的に増え、哺乳動物の臓器に侵入し、症状を引き起こしているか、又は徴候、症状若しくは他の臨床所見をまさに引き起こそうとしている、あるいは宿主の初期感染に起因し得る、哺乳動物(例えば、ヒトなどの霊長類)における疾病、状態又は様子を指す。活動性TBの臨床症状は、脱力、疲労、発熱、悪寒、体重減少、食欲不振、無食欲、又は寝汗を含んでもよい。肺活動性TBの症状には、数週間(例えば、少なくとも3週間)の持続性の咳、粘り気の強い粘液、胸痛、及び喀血が含まれる。「再活性化結核」とは、本明細書で使用するとき、LTBIを有する個体において発症する活動性TBを指し、その個体では、感染の休止巣の活性化がMtb細菌の活動的な増殖をもたらす。「活動的に増えること」とは、本明細書で使用するとき、感染した宿主の臓器において、指数関数的な速度、対数関数的な速度、又は半対数関数的な速度で増殖し、繁殖し、増大し又は活動的に増えるMtb細菌を指す。特定の実施形態において、感染した哺乳動物(例えば、ヒト)は、抑制された免疫系を有する。免疫抑制は、年齢(例えば、非常に若い若しくは年配である)による場合もあり、又は他の因子(例えば、薬剤乱用、臓器移植)若しくは他の条件、例えば、別の感染(例えば、HIV感染)、糖尿病(例えば、真性糖尿病)、珪肺、頭頸部癌、白血病、ホジキン病、腎臓病、低体重、コルチコステロイド処置、又は関節炎(例えば、関節リウマチ)若しくはクローン病の治療などによる場合もある。
【００５３】
活動性TBの存在、又は活動的に増えているMtb細菌によって引き起こされる状態を決定するための試験は、当該技術分野において公知であり、限定されないが、痰、気管支肺胞洗浄液、胸膜滲出、組織生検、脳脊髄液滲出の抗酸性染色(AFS)及び直接的な顕微鏡検査; 細菌培養、例えば、BACTEC MGIT 960(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA); IGRテスト、例えば、QFT(登録商標)-Goldテスト又はQFT(登録商標)-Gold In-tube T SPOT(商標)TBテスト; 皮膚テスト、例えば、TST The Mantoux皮膚テスト(TST); 及び抗原刺激後の全血若しくは単離されたPBMCの細胞内サイトカイン染色を含む。
【００５４】
「潜伏結核感染」、「LTBI」、「潜伏」、又は「潜伏疾患」、「休止感染」とは、本明細書で使用するとき、一定の低い細菌数によって特徴付けられるが、定常維持状態での複製を含む活性代謝の状態のままでいる細菌集団の少なくとも一部を含有してもよい、休止をもたらす宿主免疫系によって含有されている結核菌(MTB)による感染を指す。潜伏TB感染は、活動性TB疾患の徴候、症状及び放射線画像証拠がない陽性TST又はIGRAによって臨床的に決定される。潜伏感染した哺乳動物は、「伝染性」ではなく、潜伏感染に関連した非常に低い細菌数により疾患を広めることができない。潜伏結核感染(LTBI)は、休止細菌を死滅させるための薬剤(単数又は複数)を用いて治療される。LTBIの治療は、高齢期に活動性結核(TB)に進行する感染の危険性を大いに減少させる(すなわち、再活性化を予防するために施される)。
【００５５】
「結核菌群のマイコバクテリウム属種」としては、伝統的には結核症を引き起こすものと考えられるそれらの種、並びに免疫低下した患者、例えばAIDSの患者において結核及び肺疾患を引き起こすマイコバクテリウム環境種及び日和見種、例えば、結核菌、ウシ型結核菌、又はマイコバクテリウム・アフリカヌム、BCG、トリ型結核菌、マイコバクテリウム・イントラセルラーエ、マイコバクテリウム・セラツム、マイコバクテリウム・ゲナベンス、マイコバクテリウム・ヘモフィルム、マイコバクテリウム・カンサシ、マイコバクテリウム・シミアエ、マイコバクテリウム・バカエ、マイコバクテリウム・フォーツイツム、及びマイコバクテリウム・スクロフラセウムなどが挙げられる(例えば、Harrison's Principles of Internal Medicine, Chapter 150, pp. 953-966 (第16版, Braunwaldら編, 2005)参照)。
【００５６】
「進行性一次結核」とは、本明細書で使用するとき、宿主の免疫系が初期感染を十分に阻止しないことに起因して、Mtbへの初期曝露及びMtbによる感染後の最初の数年以内に発症するTB疾患を指す。
【００５７】
「治療方法」とは、本明細書に開示されるように、概して、化学療法による治療レジメンと併用した治療用ワクチンを用いて、哺乳動物における活動性結核感染を治療する方法を指す。本開示のこの方法及び関連方法において、治療用ワクチンを投与する少なくとも1つのステップ、典型的には、治療用ワクチンを投与する最初のステップは、哺乳動物が、結核菌に活動性感染したとき、及び/又は活動感染に関連した少なくとも1つの臨床症状若しくは陽性アッセイ結果を示したときに行われるものと理解される。また、本開示の方法は、活動性感染又はその症状が哺乳動物においてなおも存在しているかどうかに関係なく、さらに、活動性感染に関連したアッセイ結果がなおも陽性であるかどうかに関係なく、化学療法レジメンの有効性を改善するために、その後の1つ以上の追加の時点で本開示の同一又は別の治療用ワクチンを投与する追加ステップをさらに含んでもよいことが理解される。また、本開示の方法は、治療用ワクチンの単独での又は他の薬剤と併用した投与を含んでもよく、そのため、治療用ワクチンは、より幅広い治療的処置レジメンの一部として複数の処置成分の1つであってもよいことが理解される。したがって、本開示の方法は、有利には、活動性結核感染を治療するための化学療法による治療レジメンの有効性を改善する。
【００５８】
ポリペプチド組成物
記載した通り、本開示は、一態様において、本明細書に記載されている、融合ポリペプチドを含む単離されたマイコバクテリウム属種ポリペプチド、及びそれを含有する組成物、並びに活動性TB感染を治療するための化学療法剤と組み合わせたそれらの使用を提供する。概して、本開示のポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり、本明細書に開示されているアミノ酸配列に由来する断片(例えば、抗原性/免疫原性部分)であってもよく、又は本明細書に開示されているアミノ酸配列全体を含んでもよい。本開示のポリペプチド、その抗原性/免疫原性断片、及び他の改変体は、従来の組換え技術及び/又は合成技術を用いて調製し得る。
【００５９】
特定の実施形態において、本開示のポリペプチドは、抗原性/免疫原性であり、すなわち、それらは、感染被験体由来の抗血清及び/又はT細胞を用いたイムノアッセイ(例えば、ELISA又はT細胞刺激アッセイ)において検出可能に反応する。免疫原性活性についてのスクリーニングは、当業者に周知の技術を用いて行うことができる。例えば、このようなスクリーニングは、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988に記載されているスクリーニングなどの方法を用いて行うことができる。1つの例示的な例において、ポリペプチドは、固体支持体上に固定化され、固定化されたポリペプチドへの血清中の抗体の結合が可能となるように患者血清と接触させてもよい。次に、未結合の血清を除去し、例えば125I標識したプロテインAを用いて、結合した抗体を検出してもよい。
【００６０】
当業者によって認識されるように、本明細書に開示されているポリペプチドの免疫原性部分はまた、本開示によって包含される。「免疫原性部分」は、本明細書で使用するとき、本開示の免疫原性ポリペプチドの断片であって、それ自体、該ポリペプチドを認識するB細胞及び/又はT細胞表面抗原受容体と免疫学的に反応性である(すなわち、特異的に結合する)該断片である。免疫原性部分は、一般的に、例えば、Paul, Fundamental Immunology, 第3版, 243-247(Raven Press, 1993)とそこで引用されている参考文献において概説されているものなどの、周知の技術を用いて同定されてもよい。このような技術には、抗原特異的抗体、抗血清及び/又はT細胞株若しくはクローンと反応する能力について、ポリペプチドをスクリーニングすることが含まれる。本明細書で使用するとき、抗血清及び抗体は、それらが抗原と特異的に結合する(すなわち、イムノアッセイにおいてタンパク質と反応し、無関係なタンパク質とは検出可能に反応しない)場合に「抗原特異的」である。このような抗血清及び抗体は、本明細書に記載されているように調製され、周知の技術を用いて調製されてもよい。
【００６１】
特定の実施形態において、本開示のポリペプチドの抗原性/免疫原性部分は、(例えば、ELISA及び/又はT細胞反応性アッセイにおいて)全長ポリペプチドの反応性より実質的に小さくないレベルで、抗血清及び/又はT細胞と反応する部分である。好ましくは、抗原性/免疫原性部分の免疫原性活性のレベルは、全長ポリペプチドに対する免疫原性の少なくとも約50％であり、好ましくは少なくとも約70％であり、及び最も好ましくは約90％を超える。いくつかの例では、対応する全長ポリペプチドよりも大きい免疫原性活性レベルを有し、例えば、約100％若しくは150％又はそれ以上と同等又はそれよりも大きい免疫原性活性を有する、好ましい免疫原性部分が同定される。
【００６２】
本開示のポリペプチド組成物はまた、本開示のポリペプチド、特に本明細書に開示されているアミノ酸配列を有するポリペプチド、又はその免疫原性断片若しくは改変体、に対して生じたT細胞及び/又は抗体と免疫学的に反応性である、1つ以上のポリペプチドを含んでもよい。
【００６３】
本開示の別の実施形態において、本明細書に記載されている1つ以上のポリペプチドと免疫学的に反応性であるT細胞及び/若しくは抗体を誘発することができる1つ以上のポリペプチド、あるいは本明細書に開示されているポリヌクレオチド配列に含有される連続ポリヌクレオチド配列によってコードされる1つ以上のポリペプチド又はその免疫原性断片若しくは改変体、あるいは中程度から高度なストリンジェンシー条件下でこれらの配列の1つ以上にハイブリダイズする1つ以上のポリヌクレオチド配列によってコードされる1つ以上のポリペプチドを含むポリペプチドが提供される。
【００６４】
本開示はまた、抗原性/免疫原性断片を含むポリペプチド断片であって、本明細書に記載されているポリペプチド組成物若しくは本明細書に記載されているポリヌクレオチド配列によってコードされるものの、全ての中間長を含む、少なくとも約5、10、15、20、25、50又は100個の連続するアミノ酸を含む、ポリペプチド断片を提供する。
【００６５】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載されているポリペプチド組成物の改変体を提供する。一般に本開示に包含されるポリペプチド改変体(例えば、本明細書に記載されている任意の抗原及び融合ポリペプチド)は、本明細書に記載されているポリペプチド配列に対して、その長さに沿って、少なくとも約70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％若しくは99％又はそれを超える同一性(後述するように決定される)を典型的に示す。
【００６６】
ポリペプチド「改変体」は、その用語が本明細書で使用されるとき、1つ以上の置換、欠失、付加及び/又は挿入において、本明細書に具体的に開示されているポリペプチドとは典型的に異なるポリペプチドである。このような改変体は、天然に存在してもよく、又は、例えば、当該技術分野において周知の多数の技術のいずれかを用いて、本開示の上記ポリペプチド配列の1つ以上を修飾すること、及び本明細書に記載されているそれらの免疫原性活性を評価することによって、合成的に生じさせてもよい。
【００６７】
例えば、本開示のポリペプチドの特定の例示的な改変体には、N末端リーダー配列又は膜貫通ドメインなどの1つ以上の部分が除かれているものが含まれる。他の例示的な改変体は、小さな部分(例えば、約1〜30個のアミノ酸)が、成熟タンパク質のN末端及び/又はC末端から除かれている改変体を含む。
【００６８】
多くの場合において、改変体は保存的置換を含有する。「保存的置換」は、アミノ酸が、類似した特性を有する別のアミノ酸の代わりに置換されているものであり、そのため、ペプチド化学の分野における当業者は、ポリペプチドの二次構造及びハイドロパシー性質が実質的に変化していないことを期待するものである。上述したように、修飾は、本開示のポリヌクレオチド及びポリペプチドの構造において行われ、依然として、所望の特徴、例えば、免疫原的特徴を有する改変体又は誘導体ポリペプチドをコードする機能分子を得ることができる。本開示のポリペプチドの同等物、又はさらには、本開示のポリペプチドの改善された免疫原性改変体若しくは部分を作製するために、ポリペプチドのアミノ酸配列を変更することが望まれる場合、当業者は、典型的には、表Aに従って、コードしているDNA配列のコドンの1つ以上を変化させる。
【００６９】
例えば、特定のアミノ酸は、例えば、抗体の抗原結合領域又は基質分子上の結合部位などの構造との相互作用結合能力を大きく喪失させることなく、タンパク質構造において他のアミノ酸の代わりに置換されてもよい。そのタンパク質の生物学的機能活性を定義するのはタンパク質の相互作用能力と性質であるため、特定のアミノ酸配列置換が、タンパク質配列及び当然にその基礎となるDNAコード配列においてなされ、それにもかかわらずに同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。このようにして、生物学的有用性及び活性を大きく喪失せずに、様々な変更が、開示されている組成物のペプチド配列又は該ペプチドをコードする対応するDNA配列においてなされてもよいことが意図される。
【００７０】
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【００７１】
このような変更を行う場合、アミノ酸のハイドロパシー指数が考慮され得る。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する上でのアミノ酸のハイドロパシー指数の重要性は、当該技術分野において一般的に理解されている(Kyte and Doolittle, 1982、参照により本明細書に組み込まれる)。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性は、得られるタンパク質の二次構造に寄与し、次いで、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが受け入れられている。それぞれのアミノ酸には、その疎水性及び電荷の特徴に基づいて、ハイドロパシー指数が割り当てられている(Kyte and Doolittle, 1982)。これらの値は、イソロイシン(+4.5)、バリン(+4.2)、ロイシン(+3.8)、フェニルアラニン(+2.8)、システイン/シスチン(+2.5)、メチオニン(+1.9)、アラニン(+1.8)、グリシン(-0.4)、スレオニン(-0.7)、セリン(-0.8)、トリプトファン(-0.9)、チロシン(-1.3)、プロリン(-1.6)、ヒスチジン(-3.2)、グルタミン酸(-3.5)、グルタミン(-3.5)、アスパラギン酸(-3.5)、アスパラギン(-3.5)、リシン(-3.9)、及びアルギニン(-4.5)である。
【００７２】
特定のアミノ酸は、類似のハイドロパシー指数又はスコアを有する他のアミノ酸によって置換され、なおも類似の生物学的活性を有するタンパク質をもたらし、すなわち、なおも生物学的に機能的に同等のタンパク質を得ることができることが、当該技術分野において公知である。このような変更を行う場合、ハイドロパシー指数が±2以内のアミノ酸の置換が好ましく、±1以内が特に好ましく、±0.5以内がさらにより特に好ましい。同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的になされ得ることも当該技術分野において理解されている。
【００７３】
米国特許第4,554,101号に詳述されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている: アルギニン(+3.0)、リシン(+3.0)、アスパラギン酸(+3.0±1)、グルタミン酸(+3.0±1)、セリン(+0.3)、アスパラギン(+0.2)、グルタミン(+0.2)、グリシン(0)、スレオニン(-0.4)、プロリン(-0.5±1)、アラニン(-0.5)、ヒスチジン(-0.5)、システイン(-1.0)、メチオニン(-1.3)、バリン(-1.5)、ロイシン(-1.8)、イソロイシン(-1.8)、チロシン(-2.3)、フェニルアラニン(-2.5)、トリプトファン(-3.4)。アミノ酸は、類似の親水性値を有する別のアミノ酸の代わりに置換されることができ、なおも生物学的に同等な、及び特に免疫学的に同等なタンパク質を得ることができることが理解されている。このような変更において、親水性値が±2以内のアミノ酸の置換が好ましく、±1以内が特に好ましく、±0.5以内がさらにより特に好ましい。
【００７４】
したがって、上で概説されるように、アミノ酸置換は、一般に、アミノ酸側鎖の置換基、例えばそれらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどの相対的類似性に基づく。上記の様々な特徴を考慮した例示的な置換は当業者に周知であり、アルギニンとリシン、グルタミン酸とアスパラギン酸、セリンとスレオニン、グルタミンとアスパラギン、並びにバリンとロイシンとイソロイシンを含む。
【００７５】
さらに、任意のポリヌクレオチドをさらに修飾して、インビボにおける安定性を増加させてもよい。可能な修飾としては、限定されないが、5'末端及び/又は3'末端にフランキング配列を付加すること、骨格においてホスホジエステラーゼ結合ではなくむしろホスホロチオエート又は2'O-メチルを使用すること、並びに/又はイノシン、キューオシン及びワイブトシンなど伝統的でない塩基、並びにアセチル、メチル、チオ及び他の修飾された形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンを含めることが挙げられる。
【００７６】
アミノ酸置換は、さらに、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び/又は両親媒性性質の類似性に基づいて行ってよい。例えば、負に荷電したアミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ、正に荷電したアミノ酸としてはリシン及びアルギニンが挙げられ、同様の親水性値を有する非荷電極性頭部基を伴うアミノ酸としてはロイシン、イソロイシン及びバリン; グリシン及びアラニン; アスパラギン及びグルタミン; 並びにセリン、スレオニン、フェニルアラニン及びチロシンが挙げられる。保存的な変化を示し得る他のアミノ酸の群としては、(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr、(2)cys、ser、tyr、thr、(3)val、ile、leu、met、ala、phe、(4)lys、arg、his、及び(5)phe、tyr、trp、hisが挙げられる。改変体は、さらに又はその代わりに、非保存的な変化を含有してよい。好ましい実施形態において、改変体ポリペプチドは、天然配列とは、5つ以下のアミノ酸の置換、欠失又は付加によって異なる。改変体は、さらに(又はその代わりに)、例えば、免疫原性、ポリペプチドの二次構造及びハイドロパシーの性質に対して最小限の影響を有するアミノ酸の欠失又は付加によって修飾されていてよい。
【００７７】
上記したように、ポリペプチドは、タンパク質のN末端に、翻訳と同時に又は翻訳後にタンパク質の転移を導くシグナル(又はリーダー)配列を含んでよい。ポリペプチドはまた、ポリペプチドの合成、精製若しくは同定を容易にするために、又はポリペプチドと固体支持体の結合を増強するために、リンカー又は他の配列(例えば、ポリHis)とコンジュゲートされてもよい。例えば、ポリペプチドは、免疫グロブリンFc領域とコンジュゲートされてよい。
【００７８】
ポリペプチド配列を比較した場合、2つの配列は、下記の通り、対応が最大になるようにアラインメントしたときに、2つの配列内のアミノ酸の配列が同じであれば、「同一」であると言える。2つの配列間の比較は、典型的には、配列類似性の局所的な領域を同定し、比較するための比較窓にわたって配列を比較することによって実施される。「比較窓」とは、本明細書で使用するとき、ある配列を同じ数の連続した位置の参照配列と、2つの配列を最適にアラインメントした後に比較し得る、少なくとも約20、通常、30〜約75、40〜約50個の連続した位置のセグメントを指す。
【００７９】
比較のための配列の最適なアラインメントは、バイオインフォマティックスソフトウェアのLasergene suite(DNASTAR,Inc.、Madison、WI)内のMegalignプログラムを用いて、初期設定のパラメータを使用して行ってよい。このプログラムにより、以下の参考文献に記載のいくつかのアラインメントスキームが具体化される: Dayhoff, M.O. (編) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC中のDayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983) Proc. Nat'l Acad., Sci. USA 80:726-730。
【００８０】
あるいは、比較のための配列の最適なアラインメントは、Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482の局所的同一性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443の同一性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman (1988) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85: 2444の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータへの実装によって(Wisconsin Genetics Software Package、Genetics Computer Group(GCG)、575 Science Dr.、Madison、WI内のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、及びTFASTA)、又は検査によって行い得る。
【００８１】
配列同一性パーセント及び配列類似性を決定するために適したアルゴリズムの好ましい一例は、BLASTアルゴリズム及びBLAST2.0アルゴリズムであり、それぞれAltschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402、及びAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410に記載されている。BLAST及びBLAST2.0を、例えば、本明細書に記載のパラメータと一緒に使用して、本開示のポリヌクレオチド及びポリペプチドについて配列同一性パーセントを決定することができる。BLAST解析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Informationを通じて公けに利用可能である。アミノ酸配列について、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを算出することができる。累積的なアラインメントスコアがその最大実現値からX量減少したとき、1つ以上のネガティブスコアリング残基アラインメントが蓄積したことに起因して累積スコアがゼロ以下になったとき、又はいずれかの配列の末端に到達したときに、それぞれの方向へのワードヒットの伸長を停止する。BLASTアルゴリズムパラメータであるW、T及びXによりアラインメントの感度及びスピードが決定される。
【００８２】
1つの好ましいアプローチでは、「配列同一性のパーセンテージ」を、2つの最適にアラインメントされた配列を少なくとも20個の位置の比較窓にわたって比較することによって決定し、ここで、比較窓内のポリペプチド配列の部分は、2つの配列を最適にアラインメントするために、参照配列(付加又は欠失を含まない)と比較して20パーセント以下、通常5〜15パーセント、又は10〜12パーセントの付加又は欠失(すなわち、ギャップ)を含んでよい。パーセンテージは、両方の配列において同一のアミノ酸残基が見いだされる位置の数を決定してマッチする位置の数を得て、マッチする位置の数を参照配列内の位置の総数(すなわち、ウィンドウサイズ)で割り、結果に100を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出する。
【００８３】
本開示の特定の好ましい実施形態において、結核菌融合ポリペプチド、及び融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。融合ポリペプチド及び融合タンパク質とは、直接又はアミノ酸リンカーを介してのいずれかで共有結合された、結核菌ポリペプチドなどの、少なくとも2つの異種のマイコバクテリウム属種ポリペプチドを有するポリペプチドを指す。融合タンパク質を形成するポリペプチドは、典型的には、C末端がN末端に連結されているが、それらはまた、C末端がC末端に、N末端がN末端に、又はN末端がC末端に連結されてもよい。融合タンパク質のポリペプチドは任意の順序であってもよい。融合ポリペプチド又は融合タンパク質はまた、保存的に修飾された改変体、多型改変体、対立遺伝子、変異体、サブ配列、種間ホモログ、及び融合タンパク質を構成する抗原の免疫原性断片を含んでもよい。結核菌抗原は、完全な結核菌ゲノムを開示しているColeら, Nature 393:537 (1998)に記載されている。結核菌抗原に対応する他のマイコバクテリウム属種由来の抗原は、例えば、本明細書に記載されている配列比較アルゴリズム、又は当業者に公知の他の方法、例えば、ハイブダイゼーションアッセイ及び抗体結合アッセイを用いて同定することができる。
【００８４】
本開示の融合ポリペプチドは、概して、本明細書に記載されている少なくとも2つの抗原性ポリペプチドを含み、他の無関係な配列、例えば、Tヘルパーエピトープ(免疫学的融合パートナー)、好ましくはヒトによって認識されるTヘルパーエピトープをもたらすことに役立つ配列、又は、ネイティブな組換えタンパク質よりも高い収率でタンパク質を発現させることに役立つ配列(発現エンハンサー)をさらに含んでもよい。ある特定の好ましい融合パートナーは、免疫学的融合パートナーと発現増強性融合パートナーの両方である。他の融合パートナーは、タンパク質の溶解性が増加するように、又はタンパク質が所望の細胞内コンパートメントに標的化されることが可能になるように選択し得る。なおさらに融合パートナーには、タンパク質の精製を容易にするアフィニティータグが含まれる。
【００８５】
融合タンパク質は、一般に、標準な技術を用いて調製し得る。好ましくは、融合タンパク質は、組換えタンパク質として発現される。例えば、所望の融合のポリペプチド成分をコードするDNA配列は、適切な発現ベクターに別々にアセンブリされ、ライゲートされてもよい。1つのポリペプチド成分をコードするDNA配列の3'末端を、第2のポリペプチド成分をコードするDNA配列の5'末端と、ペプチドリンカーを用いて又は用いずに、配列のリーディングフレームが一致するようにライゲートする。これにより、両方の成分ポリペプチドの生物活性を保持する単一の融合タンパク質に翻訳することができる。
【００８６】
所望の場合に、ペプチドリンカー配列を使用して、第1及び第2のポリペプチド成分を、それぞれのポリペプチドが、その二次構造及び三次構造にフォールディングすることを確実にするのに十分な距離によって分離してもよい。このようなペプチドリンカー配列は、当該技術分野において周知の標準的な技術を用いて融合タンパク質に組み込まれる。特定のペプチドリンカー配列は、以下の因子に基づいて選択されてもよい: (1)柔軟な広がった立体配置をとることができること、(2)第1及び第2のポリペプチド上の機能的なエピトープと相互作用することができる二次構造をとることができないこと、及び(3)ポリペプチドの機能的なエピトープと反応する可能性がある疎水性残基又は荷電残基が欠如していること。好ましいペプチドリンカー配列は、Gly残基、Asn残基及びSer残基を含有する。また、他のほぼ中性のアミノ酸、例えば、Thr及びAlaもリンカー配列に使用し得る。リンカーとして有益に使用し得るアミノ酸配列としては、Marateaら, Gene 40:39 46 (1985); Murphyら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258 8262 (1986); 米国特許第4,935,233号及び米国特許第4,751,180号に開示されているものが挙げられる。リンカー配列は、一般に、1個〜約50個のアミノ酸の長さであってよい。第1及び第2のポリペプチドが、機能的ドメインを分離し、立体的な干渉を防止するために用いることができる非必須N末端アミノ酸領域を有する場合、リンカー配列は必要ない。
【００８７】
ライゲートされたDNA配列は、適切な転写調節エレメント又は翻訳調節エレメントに作動可能に連結される。DNAの発現に関与する調節エレメントは、第1のポリペプチドをコードするDNA配列の5'側にのみ位置する。同様に、翻訳を終了させるために必要とされる終止コドン及び転写終結シグナルは第2のポリペプチドをコードするDNA配列の3'側にのみ存在する。
【００８８】
好ましい実施形態内では、本開示の融合ポリペプチドにおいて使用するための免疫学的融合パートナーは、グラム陰性菌のB型インフルエンザ菌(Haemophilus influenza B)の表面タンパク質であるプロテインD由来である(WO91/18926)。好ましくは、プロテインD誘導体は、タンパク質の約3分の1(例えば、最初のN末端の100〜110個のアミノ酸)を含み、プロテインD誘導体は脂質付加されていてもよい。特定の好ましい実施形態内では、リポプロテインD融合パートナーの最初の109残基はN末端に含められ、追加の外因性T細胞エピトープを有するポリペプチドが与えられ、大腸菌(E. coli)における発現レベルを増加させる(すなわち、発現エンハンサーとして機能する)。脂質テールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を確実にする。他の融合パートナーは、インフルエンザウイルス由来の非構造タンパク質NS1(ヘマグルチニン)を含む。Tヘルパーエピトープを含む異なる断片を用いてもよいが、典型的には、N末端の81個のアミノ酸が使用される。
【００８９】
別の実施形態において、免疫学的融合パートナーは、LYTAとして公知のタンパク質、又はその部分(好ましくはC末端部分)由来のアミノ酸配列を含む。LYTAは、アミダーゼLYTA(LytA遺伝子によってコードされる; Gene 43:265-292 (1986))として公知のN-アセチル-Lアラニンアミダーゼを合成する肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)に由来する。LYTAは、ペプチドグリカン骨格中の特定の結合を特異的に分解する自己溶菌酵素である。LYTAタンパク質のC末端ドメインは、コリン又はDEAEなどのいくつかのコリン類似体に対する親和性に関与する。この特性は、融合タンパク質の発現に有用な大腸菌(E. coli)C-LYTAを発現するプラスミドの開発に利用されている。アミノ末端にC-LYTA断片を含有するハイブリッドタンパク質の精製はすでに説明されている(Biotechnology 10:795-798 (1992)参照)。好ましい実施形態内では、LYTAの反復部分を融合タンパク質に組み込んでもよい。反復部分は、残基178から開始するC末端領域に見出される。特に好ましい反復部分は、残基188-305を組み込む。
【００９０】
一般に、ポリペプチド及び融合ポリペプチド(並びにそれらをコードするポリヌクレオチド)が単離される。「単離された」ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、その元の環境から取り出されたものである。例えば、天然に存在するタンパク質は、それが、自然系では共存している材料の一部又は全部から分離されている場合に単離されている。好ましくは、このようなポリペプチドは、少なくとも約90％純粋であり、より好ましくは少なくとも約95％純粋であり、最も好ましくは少なくとも約99％純粋である。ポリヌクレオチドは、例えば、それが、自然環境の一部でないベクターにクローニングされている場合に単離されていると考えられる。
【００９１】
ポリヌクレオチド組成物
本開示はまた、別の態様において、単離されたポリヌクレオチド、特に、本開示の融合ポリペプチド(例えば、ID93)をコードするポリヌクレオチド、並びにこのようなポリヌクレオチドを含む組成物を提供する。本明細書で使用するとき、用語「DNA」及び「ポリヌクレオチド」及び「核酸」とは、特定の種の全ゲノムDNAを含まない単離されているDNA分子を指す。したがって、ポリペプチドをコードするDNAセグメントとは、まだ1つ以上のコード配列を含有し、DNAセグメントが得られる種の全ゲノムDNAから実質的に離れて単離されたか、又は精製されたDNAセグメントを指す。用語「DNAセグメント」及び「ポリヌクレオチド」には、DNAセグメント及びこのようなセグメントのより小さな断片が含まれ、さらに、例えば、プラスミド、コスミド、ファージミド、ファージ、ウイルスなどを含む組換えベクターが含まれる。
【００９２】
当業者によって理解される通り、本開示のポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列、ゲノム外配列及びプラスミドによってコードされる配列、並びにタンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現する又は発現するように適合させ得るより小さな遺伝子操作された遺伝子セグメントを含むことができる。このようなセグメントは、自然に単離し得るか、又はヒトによって合成的に修飾し得る。
【００９３】
当業者によって理解される通り、ポリヌクレオチドは、一本鎖(コード若しくはアンチセンス)又は二本鎖であってもよく、DNA(ゲノム、cDNA又は合成)若しくはRNA分子であってもよい。追加的なコード配列又は非コード配列は、本開示のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、必ずしも存在しなくてよく、ポリヌクレオチドは、他の分子及び/又は支持材料に連結していてよいが、必ずしも連結していなくてよい。ポリヌクレオチドは、ネイティブな配列(すなわち、マイコバクテリウム属種抗原又はその部分をコードする内在性の配列)を含んでもよく、あるいはこのような配列の改変体、又は生物学的若しくは抗原性の機能性同等物を含んでもよい。ポリヌクレオチド改変体は、好ましくは、コードされたポリペプチドの免疫原性が、ネイティブなタンパク質と比べて減弱しないように、下にさらに記載されているように、1つ以上の置換、付加、欠失及び/又は挿入を含有してもよい。コードされたポリペプチドの免疫原性における効果は、一般的に、本明細書に記載されているように評価し得る。用語「改変体」はまた、異種起源の相同遺伝子を包含する。
【００９４】
さらなる実施形態において、本開示は、本明細書に開示されている配列の1つ以上と同一又は相補的である、様々な長さの連続した配列のストレッチを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。例えば、本明細書に開示されている配列の1つ以上の、少なくとも約15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500若しくは1000個又はそれ以上の連続したヌクレオチド、並びにその間の中間の長さの全てを含むポリヌクレオチドが本開示によって提供される。「中間の長さ」とは、この場合、例えば、16、17、18、19など; 21、22、23など; 30、31、32など; 50、51、52、53など; 100、101、102、103など; 150、151、152、153など; 200 500; 500 1,000などを通した全ての整数を含む、引用された値の間の任意の長さを意味することは容易に理解される。
【００９５】
本開示のポリヌクレオチド又はその断片は、コード配列それ自体の長さにかかわらず、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、追加的な制限酵素部位、マルチクローニングサイト、他のコードセグメントなどの他のDNA配列と組み合わせてよく、それにより、それらの全体的な長さは大幅に変動する場合がある。したがって、ほとんどの任意の長さのポリヌクレオチド断片を用いてもよいことが意図され、全長は、調製の容易さ及び意図された組換えDNAプロトコールにおける使用によって限定されることが好ましい。
【００９６】
さらに、遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載されているポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が多数存在することは当業者に理解される。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意のネイティブな遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小の相同性を有する。それにもかかわらず、使用されるコドンが異なることに起因して変化するポリヌクレオチドは、本開示によって具体的に意図され、例えば、ヒト及び/又は霊長類のコドン選択に最適化されているポリヌクレオチドが挙げられる。さらに、本明細書において提供されるポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本開示の範囲内である。対立遺伝子は、1つ以上の変異、例えば、ヌクレオチドの欠失、付加及び/又は置換などの結果として変更された内在性遺伝子である。生じたmRNA及びタンパク質は、変更された構造又は機能を有していてもよいが、必ずしもそれを有する必要はない。対立遺伝子は、標準的な技術(例えば、ハイブリダイゼーション、増幅及び/又はデータベース配列比較など)を用いて同定し得る。
【００９７】
マイコバクテリウム属種ポリヌクレオチド及びその融合体は、当該技術分野において公知の、利用可能な、十分に確立された様々な技術のいずれかを用いて、調製され、操作され、及び/又は発現されてもよい。
【００９８】
例えば、本開示のポリペプチド、又はその融合タンパク質若しくは機能的同等物をコードするポリヌクレオチド配列又はその断片は、適切な宿主細胞において、ポリペプチドの直接発現のために、組換えDNA分子において使用され得る。遺伝暗号の固有の縮重に起因して、実質的に同じ又は機能的に同等なアミノ酸配列をコードする他のDNA配列を生成してもよく、これらの配列は、所定のポリペプチドをクローニングし、発現するために使用されてもよい。
【００９９】
当業者には理解される通り、いくつかの場合には、天然に存在しないコドンを保有する、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成することが有利であり得る。例えば、特定の原核生物宿主又は真核生物宿主に好まれるコドンは、タンパク質発現の速度が上昇するように、又は、天然に存在する配列から生成される転写産物の半減期よりも長い半減期などの望ましい特性を有する組換えRNA転写産物を生成するように、選択することができる。
【０１００】
さらに、本開示のポリヌクレオチド配列は、限定されないが、遺伝子産物のクローニング、プロセッシング、発現及び/又は免疫原性を修飾する変更などの様々な理由で、ポリペプチドをコードする配列を変更するために、当該技術分野において一般的に公知の方法を用いて遺伝子操作され得る。
【０１０１】
所望のポリペプチドを発現させるために、ポリペプチド又は機能的同等物をコードするヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたコード配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含有するベクターに挿入し得る。当業者に周知である方法を用いて、目的とするポリペプチドをコードする配列、並びに適切な転写制御エレメント及び翻訳制御エレメントを含有する発現ベクターを構築してもよい。これらの方法は、インビトロの組換えDNA技術、合成技術、及びインビボの遺伝子組換えを含む。このような技術は、例えば、Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989)、及びAusubelら, Current Protocols in Molecular Biology (1989)に記載されている。様々な発現ベクター/宿主系が公知であり、それらを利用して、ポリヌクレオチド配列を含有させ、発現させてよい。これらとしては、限定されないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド、又はコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌などの微生物、酵母発現ベクターで形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター(例えば、バキュロウイルス)に感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター(例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CaMV、タバコモザイクウイルス、TMV)又は細菌発現ベクター(例えば、Ti又はpBR322プラスミド)で形質転換された植物細胞系、又は動物細胞系が挙げられる。
【０１０２】
発現ベクターに存在する「制御エレメント」又は「調節配列」は、転写及び翻訳を行うために宿主細胞のタンパク質と相互作用するベクターの翻訳されない領域-エンハンサー、プロモーター、5'非翻訳領域及び3'非翻訳領域-である。このようなエレメントは、それらの強度及び特異性が変化し得る。利用するベクター系及び宿主に応じて、任意の数の、構成的プロモーター及び誘導性プロモーターを含めた適切な転写エレメント及び翻訳エレメントを用いてよい。例えば、細菌系におけるクローニングの場合、PBLUESCRIPTファージミド(Stratagene, La Jolla, Calif.)又はPSPORT1プラスミド(Gibco BRL, Gaithersburg, Md.)のハイブリッドlacZプロモーターなどの誘導性プロモーターを使用してよい。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来のプロモーター又は哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが一般に好ましい。ポリペプチドをコードする配列の多数のコピーを含有する細胞株を生成する必要がある場合、SV40又はEBVに基づくベクターを適切な選択マーカーとともに有利に使用し得る。
【０１０３】
細菌系では、発現されるポリペプチドについて意図された使用に応じて、多数の発現ベクターを選択し得る。例えば、大量に必要とする場合、精製が容易な融合タンパク質の高レベルの発現を指向するベクターを用いてもよい。このようはベクターとしては、限定されないが、ハイブリッドタンパク質が産生されるように、目的とするポリペプチドをコードする配列をβ-ガラクトシダーゼのアミノ末端Metとそれに続く7残基の配列とインフレームでベクターにライゲーションし得る、BLUESCRIPT(Stratagene)などの多機能性大腸菌(E.coli)クローニング及び発現ベクター、pINベクター(Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 264:5503 5509 (1989))などが挙げられる。また、pGEXベクター(Promega, Madison, Wis.)を用いて、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)との融合タンパク質として発現させてもよい。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオン-アガロースビーズへの吸着、続く、遊離グルタチオン存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製することができる。このような系で作製されたタンパク質をヘパリン、トロンビン又は因子XAプロテアーゼ切断部位を含むように設計して、クローニングされた目的ポリペプチドをGST部分から随意に遊離できるようにしてもよい。
【０１０４】
酵母サッカロマイセス・セレヴィシエ(Saccharomyces cerevisiae)では、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ及びPGHなどの構成的プロモーター又は誘導性プロモーターを含有する多数のベクターを使用し得る。総説として、Ausubelら(上述)及びGrantら, Methods Enzymol. 153:516-544 (1987)を参照されたい。
【０１０５】
植物発現ベクターを用いる場合では、多数あるプロモーターのいずれかによって、ポリペプチドをコードする配列の発現を駆動させてよい。例えば、CaMVの35S及び19Sプロモーターなどのウイルスプロモーターを単独で、又はTMV由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用してもよい(Takamatsu, EMBO J. 6:307-311 (1987))。あるいは、RUBISCOの小サブユニットなどの植物プロモーター又は熱ショックプロモーターを使用してもよい(Coruzzi et al., EMBO J. 3:1671-1680 (1984); Broglie et al., Science 224:838-843 (1984); 及びWinter et al., Results Probl. Cell Differ. 17:85-105 (1991))。これらの構築物を、直接DNA形質転換又は病原体の媒介によるトランスフェクションによって、植物細胞内に導入することができる。このような技術は、一般的に入手可能な多数の総説に記載されている(例えば、Hobbs in McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, pp. 191-196 (1992)参照)。
【０１０６】
また、昆虫系を用いて、目的とするポリペプチドを発現させてもよい。例えば、1つのこのような系では、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)をベクターとして使用し、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞又はトリコプラシア(Trichoplusia)幼虫内で外来遺伝子を発現させる。ポリペプチドをコードする配列を、ポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域内にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に配置し得る。ポリペプチドをコードする配列の挿入が成功することにより、ポリヘドリン遺伝子が不活性化され、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが産生される。次に、組換えウイルスを用いて、例えば、スポドプテラ・フルギペルダ(S. frugiperda)細胞又はトリコプラシア(Trichoplusia)幼虫に感染させ、目的とするポリペプチドを発現させ得る(Engelhard et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91:3224-3227 (1994))。
【０１０７】
哺乳動物宿主細胞では、多数のウイルスベースの発現系が一般に利用可能である。例えば、発現ベクターとしてアデノウイルスを使用する場合、目的とするポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターと三部のリーダー配列(tripartite leader sequence)からなるアデノウイルス転写/翻訳複合体内にライゲートされてもよい。ウイルスゲノムの非必須であるE1又はE3領域への挿入を用いて、感染宿主細胞内でポリペプチドの発現が可能な生存ウイルスを入手し得る(Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 3655-3659 (1984))。さらに、ラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞内での発現を増加させてもよい。
【０１０８】
また、特定の開始シグナルを用いて、目的とするポリペプチドをコードする配列のより効率的な翻訳を達成し得る。このようなシグナルには、ATG開始コドン及び隣接する配列が含まれる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン及び上流配列を適切な発現ベクターに挿入する場合、追加の転写又は翻訳制御シグナルは必要としなくてもよい。しかしながら、コード配列又はその一部分のみを挿入する場合、ATG開始コドンを含む外来性翻訳制御シグナルを加えるべきである。さらに、開始コドンは、挿入物全体が確実に翻訳されるように正確なリーディングフレーム内にあるべきである。外来性翻訳エレメント及び開始コドンは、天然及び合成の両方の様々な起源であり得る。文献(Scharf. et al., Results Probl. Cell Differ. 20:125-162 (1994))に記載されているように、使用される特定の細胞系に適したエンハンサーを含ませることによって、発現効率を増強させ得る。
【０１０９】
さらに、挿入配列の発現を調節し、又は所望の方式で発現タンパク質をプロセッシングするその能力について宿主細胞株を選択してもよい。このようなポリペプチドの修飾としては、限定されないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化などが挙げられる。また、「プレプロ(prepro)」形態のタンパク質を切断する翻訳後プロセッシングを用いて、正確な挿入、フォールディング及び/又は機能を促進し得る。このような翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特有の機序を有するCHO、HeLa、MDCK、HEK293及びW138などの様々な宿主細胞を選択して、外来タンパク質の正確な修飾及びプロセッシングを確実に行わせ得る。
【０１１０】
長期間にわたる高収率での組換えタンパク質の生成には、安定な発現が、一般的に好ましい。例えば、ウイルスの複製起点及び/又は内因性発現エレメント及び選択可能マーカー遺伝子を同じ又は別のベクター上に含有し得る発現ベクターを用いて、目的とするポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株を形質転換させることができる。ベクターの導入後、細胞を強化培地で1〜2日間増殖させてから選択培地に切り替えてもよい。選択可能マーカーの目的は、選択に対する耐性を付与することであり、それが存在することにより、導入配列を首尾よく発現する細胞の増殖及び回収が可能となる。細胞型に適した組織培養技術を用いて、安定に形質転換された細胞の耐性クローンを増殖させ得る。
【０１１１】
形質転換された細胞株を回収するために、任意の数の選択系を使用し得る。これらとしては、限定されないが、それぞれtk-細胞又はaprt-細胞で使用することができる、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al., Cell 11:223-232 (1977))及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al., Cell 22:817-823 (1990))遺伝子が挙げられる。また、代謝拮抗剤、抗生物質又は除草剤に対する耐性を選択基準として使用することができ、例えば、メトトレキサートに対する耐性を付与するdhfr(Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77:3567-70 (1980))、アミノグリコシド、ネオマイシン及びG-418に対する耐性を付与するnpt(ColbereGarapin et al, J.Mol.Biol.150:1-14(1981))、並びにそれぞれクロルスルフロン及びホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を付与するals又はpat(Murry, 上記)がある。さらなる選択可能遺伝子、例えば、細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB、又は細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用できるようにするhisDが記載されている(Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8047-51 (1988))。アントシアニン、β-グルクロニダーゼとその基質GUS、及びルシフェラーゼとその基質ルシフェリンなどのマーカーを用いた可視マーカーの使用が普及してきており、これらは形質転換体の同定だけでなく、特定のベクター系による一過性の又は安定なタンパク質発現量の定量化にも広く用いられている(Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55:121-131 (1995))。
【０１１２】
ポリヌクレオチドによってコードされる産物の発現を、その産物に特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかを用いて、検出及び測定するための様々なプロトコールが当該技術分野で公知である。例としては、酵素結合免疫吸着測定(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)及び蛍光活性化細胞分類(FACS)が挙げられる。これら及び他のアッセイは、特にHamptonら, Serological Methods, a Laboratory Manual (1990)及びMaddoxら, J. Exp. Med. 158:1211-1216 (1983)に記載されている。
【０１１３】
多種多様な標識及びコンジュゲーション技術は当業者に公知であり、これらを様々な核酸及びアミノ酸のアッセイに使用してもよい。ポリヌクレオチドに関連した配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションプローブ又はPCRプローブを製造するための手段としては、標識ヌクレオチドを使用したオリゴ標識、ニックトランスレーション、末端標識又はPCR増幅が挙げられる。あるいは、配列又はその任意の一部分をmRNAプローブ産生用のベクター中にクローニングし得る。このようなベクターは当該技術分野において公知であり、市販され、T7、T3又はSP6などの適切なRNAポリメラーゼ及び標識ヌクレオチドを加えてインビトロでRNAプローブを合成するために使用してもよい。これらの手段は、市販の各種キットを用いて実施してもよい。使用し得る適切なレポーター分子又は標識としては、放射性核種、酵素、蛍光、化学発光剤又は発色剤、並びに基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などが挙げられる。
【０１１４】
目的とするポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培養物からタンパク質を発現及び回収するのに適切な条件下で培養され得る。組換え細胞によって生成されるタンパク質は、使用される配列及び/またベクターに応じて、細胞内に分泌又は含有されてもよい。当業者に理解されるように、本開示のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核細胞又は真核細胞の細胞膜を通して、コードされたポリペプチドの分泌を指示するシグナル配列を含有するように設計されてもよい。他の組換え構築物を用いて、目的とするポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合してもよい。
【０１１５】
組換え生成法に加えて、本開示のポリペプチド及びその断片は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成されてもよい(Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963))。タンパク質合成は、手作業による技術を用いて、又は自動化によって行い得る。自動合成は、例えば、Applied Biosystems 431 A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)を用いて達成され得る。あるいは、様々な断片を別々に化学合成し、化学的方法により結合させて全長分子を作製し得る。
【０１１６】
医薬組成物及びワクチン組成物
別の態様では、本開示は、細胞又は動物に対して、単独で、又は1つ以上の他の治療様式と組み合わせて投与するための、医薬として許容される又は生理学的に許容される溶液中の、本明細書に開示されているポリヌクレオチド、ポリペプチド若しくは他の組成物の1つ以上の製剤に関する。このような医薬組成物は、適した免疫刺激剤/アジュバント系と一緒に製剤化される場合、ワクチンとして使用するのに特に好ましい。組成物はまた、診断に関する用途にも適している。
【０１１７】
また、所望の場合、本開示の組成物は、他の薬剤、例えば、他のタンパク質若しくはポリペプチド又は様々な医薬として活性な薬剤と組み合わせて投与されてもよいことが理解される。追加の薬剤が、本開示の目的に重大な悪影響を引き起こすものでない限り、含有させてもよい他の成分について実質的に制限はない。
【０１１８】
特定の好ましい実施形態において、本開示の組成物はワクチンとして使用され、1つ以上の免疫刺激剤と組み合わせて製剤化される。免疫刺激剤は、外来抗原に対する免疫応答(抗体及び/又は細胞媒介性)を増強又は強化する任意の物質でよい。免疫刺激剤の例として、アジュバント、生分解性マイクロスフィア(例えば、ポリ乳酸ガラクチド)及びリポソーム(それに化合物を組み込む、例えば、Fullerton、米国特許第4,235,877号参照)が挙げられる。ワクチン調製物は、一般に、例えば、Powell & Newman, 編, Vaccine Design(the subunit and adjubant approach)(1995)に記載されている。
【０１１９】
様々な免疫刺激剤のいずれを本開示のワクチンに用いてもよい。例えば、アジュバントを含有させてもよい。多くのアジュバントは、急速な異化から抗原を保護するように設計された物質を含有し、例えば、水酸化アルミニウム又は鉱油、並びに、免疫応答の刺激剤、例えば、リピドA(天然又は合成)、百日咳菌(Bortadella pertussis)、又はマイコバクテリウム属種、若しくはマイコバクテリウム属由来のタンパク質などが挙げられる。適したアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバント及び完全アジュバント(Difco Laboratories, Detroit, Mich.)、Merck Adjuvant 65(Merck and Company, Inc., Rahway, N.J.)、AS-2及びその誘導体(SmithKline Beecham, Philadelphia, Pa.)、CWS、TDM、Leif、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムゲル(alum)又はリン酸アルミニウム、カルシウム、鉄若しくは亜鉛の塩、アシル化チロシンの不溶性懸濁液、アシル化糖、カチオン又はアニオンにより誘導体化した多糖、ポリホスファゼン、生分解性マイクロスフィア、モノホスホリルリピドA及びクイルAとして市販されている。また、サイトカイン、例えば、GM-CSF又はインターロイキン-2、-7、若しくは-12もアジュバントとして用いてよい。
【０１２０】
本開示に関して有用な他の例示的なアジュバントとして、トール様受容体アゴニスト、例えば、TLR7アゴニスト、TLR7/8アゴニストなどが挙げられる。さらに別の例示的なアジュバントとして、イミキモド、ガルジキモド、レシキモド、及び関連化合物が挙げられる。
【０１２１】
特定の好ましいワクチンは、主としてTh1型の免疫応答を誘導するように設計されたアジュバント系を用いる。高レベルのTh1型サイトカイン(例えば、IFN-γ、TNF-αβ、IL-2及びIL-12)は、投与された抗原に対する細胞媒介性免疫応答の誘導を優先する傾向がある。対照的に、高レベルのTh2型サイトカイン(例えば、IL-4、IL-5、IL-6及びIL-10)は、体液性免疫応答の誘導を優先する傾向がある。本明細書に記載されているワクチンの投与後、患者は、Th1及びTh2型反応を含む免疫応答を支持する。反応が主としてTh1型である好ましい実施形態内では、Th1型サイトカインのレベルが、Th2型サイトカインのレベルより大幅に上昇することになる。これらサイトカインのレベルは、標準的なアッセイを用いて容易に評価し得る。サイトカインのファミリーについての概説に関しては、Mossman & Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173 (1989)を参照されたい。
【０１２２】
主としてTh1型反応を誘発するのに用いる特定のアジュバントとして、例えば、モノホスホリルリピドA、好ましくは、3-O-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL(商標))と、アルミニウム塩との組み合わせ(米国特許第4,436,727号、同第4,877,611号、同第4,866,034号、及び同第4,912,094号)が挙げられる。また、CpG含有オリゴヌクレオチド(ここで、CpGジヌクレオチドはメチル化されていない)も、主にTh1型反応を誘導する。このようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えば、以下: WO 96/02555、WO 99/33488及び米国特許第6,008,200号及び同第5,856,462号に記載されている。さらに、免疫刺激性DNA配列も、例えば、Satoら、Science 273:352 (1996)に記載されている。別の例示的なアジュバントとしては、サポニン、例えば、クイルA、又はその誘導体、例えば、QS21及びQS7など(Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, Mass.)、エスシン、ジギトニン、又はカスミソウ(Gypsophila)若しくはキヌア(Chenopodium quinoa)サポニンが挙げられる。他の例示的な製剤は、本開示のアジュバントの組合せにおける2つ以上のサポニンを含み、例えば、QS21、QS7、クイルA、β-エスシン、若しくはジギトニンを含む群からの少なくとも2つの組み合わせを含む。
【０１２３】
他の実施形態において、アジュバントは、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2008/0131466号に記載されているグルコピラノシルリピドA(GLA)アジュバントである。例えば、一実施形態において、本開示の関連で使用されるGLAアジュバントは、以下の構造:
【０１２４】
【化２】
2015525784.tif 000005
(式中、R1、R3、R5及びR6はC11〜C20アルキルであり、R2及びR4はC12〜C20アルキルである)
を有する。
【０１２５】
より具体的な実施形態において、GLAは、R1、R3、R5及びR6がC11〜14アルキルであり、R2及びR4がC12〜15アルキルである上記式を有する。
【０１２６】
より具体的な実施形態において、GLAは、R1、R3、R5及びR6がC11アルキルであり、R2及びR4がC13アルキルである上記式を有する。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、アジュバントは、以下の構造:
【０１２８】
【化３】
2015525784.tif 000006
を有するGLAアジュバント(例えば、合成物)である。
【０１２９】
上記GLA構造の特定の実施形態において、R1、R3、R5及びR6はC11〜C20アルキルであり、R2及びR4はC9〜C20アルキルである。より具体的な実施形態において、R1、R3、R5及びR6はC11アルキルであり、R2及びR4はC13アルキルである。別のより具体的な実施形態において、R1、R3、R5及びR6はC10アルキルであり、R2及びR4はC8アルキルである。上記GLA構造の特定の実施形態において、R1、R3、R5及びR6はC11〜C20アルキルであり、R2及びR4はC9〜C20アルキルである。特定の実施形態において、R1、R3、R5及びR6はC11アルキルであり、R2及びR4はC9アルキルである。
【０１３０】
特定の実施形態において、アジュバントは、以下の構造:
【０１３１】
【化４】
2015525784.tif 000007
を有するGLAアジュバント(例えば、合成物)である。
【０１３２】
上記GLA構造の特定の実施形態において、R1、R3、R5及びR6はC11〜C20アルキルであり、R2及びR4はC9〜C20アルキルである。特定の実施形態において、R1、R3、R5及びR6はC11アルキルであり、R2及びR4はC9アルキルである。
【０１３３】
特定の実施形態において、アジュバントは、以下の構造:
【０１３４】
【化５】
2015525784.tif 000008
を有する合成GLAアジュバントである。
【０１３５】
上記GLA構造の特定の実施形態において、R1、R3、R5及びR6はC11〜C20アルキルであり、R2及びR4はC9〜C20アルキルである。特定の実施形態において、R1、R3、R5及びR6はC11アルキルであり、R2及びR4はC9アルキルである。
【０１３６】
特定の実施形態において、アジュバントは、以下の構造:
【０１３７】
【化６】
2015525784.tif 000009
を有する合成GLAアジュバントである。
【０１３８】
上記GLA構造の特定の実施形態において、R1、R3、R5及びR6はC11〜C20アルキルであり、R2及びR4はC9〜C20アルキルである。特定の実施形態において、R1、R3、R5及びR6はC11アルキルであり、R2及びR4はC9アルキルである。
【０１３９】
特定の実施形態において、アジュバントは、以下の構造:
【０１４０】
【化７】
2015525784.tif 000010
を有する合成GLAアジュバントである。
【０１４１】
特定の実施形態において、アジュバントは、以下の構造:
【０１４２】
【化８】
2015525784.tif 000011
を有する合成GLAアジュバントである。
【０１４３】
特定の実施形態において、アジュバントは、以下の構造:
【０１４４】
【化９】
2015525784.tif 000012
を有する合成GLAアジュバントである。
【０１４５】
特定の実施形態において、アジュバント系は、モノホスホリルリピドA及びサポニン誘導体の組み合わせ、例えば、WO94/00153に記載のQS21及び3D-MPL(商標)アジュバントの組み合わせ、又はWO96/33739に記載されるように、QS21がコレステロールでクエンチされる場合の低反応原性組成物を含む。他の製剤は、水中油型エマルジョン及びトコフェロールを含む。QS21、3D-MPL(商標)アジュバント及びトコフェロールを水中油型エマルジョンで使用する別のアジュバント製剤は、WO95/17210に記載されている。
【０１４６】
別の増強アジュバント系は、WO00/09159に開示されている、CpGを含有するオリゴヌクレオチド及びサポニン誘導体の組み合わせを伴う。他の例示的なアジュバントとしては、Montanide ISA 720(Seppic, France)、SAF(Chiron, Calif., United States)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBASシリーズのアジュバント(例えば、SmithKline Beecham, Rixensart, Belgiumから入手可能なSBAS-2、AS2'、AS2''、SBAS-4、又はSBAS6)、Detox、RC-529(Corixa, Hamilton, Mont.)及び他のアミノアルキルグルコサミニド4-ホスフェート(AGP)、例えば、その開示が全体として参照により本明細書に組み込まれる、係属中の米国特許出願第08/853,826号及び同第09/074,720号に記載されているもの、並びにポリオキシエチレンエーテルアジュバント、例えば、WO99/52549A1に記載されているものが挙げられる。
【０１４７】
本開示の組成物は、さらに又はその代わりに、マイコバクテリウム属種抗原に特異的なT細胞を含み得る。このような細胞は、一般に、標準的な手法を用いて、インビトロ又はエクスビボで調製し得る。例えば、T細胞は、骨髄、末梢血、又は患者の骨髄若しくは末梢血の画分から単離し得る。あるいは、T細胞は、関連する又は無関係のヒト、非ヒト哺乳動物、細胞株又は培養物から得てよい。
【０１４８】
T細胞は、本開示のポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、及び/又はこのようなポリペプチドを発現する抗原提示細胞(APC)を用いて刺激し得る。このような刺激は、ポリペプチドに特異的なT細胞の生成を可能にするのに十分な条件及び時間で実施される。好ましくは、ポリペプチド又はポリヌクレオチドは、特異的なT細胞の生成を容易にするために、マイクロスフェアなどの送達ビヒクル中に存在する。
【０１４９】
T細胞が、特異的に増殖する場合、サイトカインを分泌する場合、又はポリペプチドでコーティングした標的細胞、若しくはポリペプチドをコードする遺伝子を発現している標的細胞を死滅させる場合に、T細胞は、本開示のポリペプチドに特異的であるとみなされる。T細胞特異性は、様々な標準技術のいずれかを用いて評価し得る。例えば、クロム放出アッセイ又は増殖アッセイでは、溶解及び/又は増殖において、陰性対照と比較して2倍を超えて増加する刺激指数は、T細胞の特異性を示す。このようなアッセイは、例えば、Chenら、Cancer Res. 54:1065-1070 (1994)に記載の通り実施し得る。あるいは、T細胞の増殖の検出は、様々な公知技術によって実現し得る。例えば、T細胞の増殖は、DNA合成の速度の上昇を測定することによって(例えば、トリチウム標識チミジンを用いてT細胞をパルス標識培養し、DNAに組み込まれたトリチウム標識チミジンの量を測定することによって)検出することができる。本開示のポリペプチド(100ng/ml 100μg/ml、好ましくは200ng/ml〜25μg/ml)と3〜7日間接触させることにより、T細胞の増殖が少なくとも2倍に増加する結果をもたらすべきである。上記の通りの2〜3時間の接触は、サイトカイン放出(例えば、TNF又はIFN-γ)のレベルが2倍に上昇することによりT細胞の活性化が示される標準のサイトカインアッセイを用いて測定したとき、T細胞が活性化される結果をもたらすべきである(Coligan et al、Current Protocols in Immunology、vol. 1 (1998)参照)。ポリペプチド、ポリヌクレオチド又はポリペプチドを発現しているAPCに応答して活性化されたT細胞はCD4+及び/又はCD8+であり得る。タンパク質に特異的なT細胞は、標準的な技術を用いて増大させ得る。好ましい実施形態内では、T細胞は、患者、関連するドナー又は無関係のドナーに由来し、刺激及び増大の後に患者に投与される。
【０１５０】
本開示の医薬組成物において、医薬として許容される賦形剤及び担体溶液の製剤化は、例えば、経口、非経口、静脈内、鼻腔内、及び筋肉内投与及び製剤を含めた様々な治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するための適切な投薬レジメン及び治療レジメンの開発であるために、当業者に周知である。
【０１５１】
特定の適用では、本明細書に開示されている医薬組成物は、経口投与によって被験体に送達してよい。このように、これらの組成物は、不活性な希釈剤を用いて又は同化可能な食用担体を用いて製剤化してよく、又は硬殻若しくは軟殻ゼラチンカプセルに封入してよく、又は圧縮して錠剤にしてよく、又は食事の食品に直接組み込んでもよい。
【０１５２】
特定の状況では、本明細書に開示されている医薬組成物を非経口的に、静脈内に、筋肉内に、又はさらに腹腔内に送達することが望ましく、これらは、例えば、米国特許第5,543,158号、米国特許第5,641,515号及び米国特許第5,399,363号(それぞれは全体として参照により本明細書に具体的に組み込まれる)に記載されている。遊離塩基又は薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水で調製し得る。分散剤はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物並びに油で調製してもよい。貯蔵及び使用の通常の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を妨げるために防腐剤を含有する。
【０１５３】
注射用途に適した医薬形態としては、滅菌水溶液又は分散液、及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末(全体として参照により本明細書に具体的に組み込まれる米国特許第5,466,468号)が挙げられる。すべての場合において、形態は、滅菌されていなければならず、容易なシリンジ操作性(syringability)が存在する程度に流体でなければならない。それは、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、それらの適切な混合物、及び/又は植物油を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合に必要とされる粒径の維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持し得る。微生物の作用の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどの様々な抗菌剤及び抗真菌剤によって促進することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物における使用によってもたらすことができる。
【０１５４】
水溶液における非経口投与について、例えば、溶液は、必要であれば適切に緩衝化され、液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水又はグルコースを用いて等張性にするべきである。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に適している。これに関連して、使用することができる滅菌水媒体は、本開示に照らして当業者に公知である。例えば、1回の投薬量を、1mlの等張なNaCl溶液に溶解し、1000mlの皮下注入液に添加するか、又は提示された注入部位に注射し得る(例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第15版, pp. 1035-1038及び1570-1580参照)。治療される被験体の状態に応じて、投与量のいくらかの変更は必然的に起こる。いずれにしても、投与担当者が個々の被験体に適切な投薬量を決定する。さらに、ヒトへの投与については、調製物は、FDA Office of Biologics standardsにより要求される滅菌性、発熱性、並びに一般的な安全性及び純度の基準を満たすべきである。
【０１５５】
滅菌注射溶液は、必要量の活性化合物を適切な溶媒に、上に列挙された様々な他の成分とともに組み込み、必要に応じて、続く濾過滅菌によって調製される。一般的に、分散剤は、基本的な分散媒及び上に列挙されたものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに様々な滅菌有効成分を組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、予め濾過滅菌したその溶液から有効成分+任意のさらなる所望の成分の粉末をもたらす、真空乾燥技術及び凍結乾燥技術である。
【０１５６】
本明細書に開示されている組成物は、中性の形態又は塩の形態に製剤化してよい。医薬として許容される塩としては、酸付加塩(タンパク質の遊離アミノ基で形成される)及び、例えば、塩酸若しくはリン酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される塩が挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄などの無機塩基、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩基に由来してもよい。製剤化されると、溶液は、投与製剤と適合する様式で、治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、注射溶液、薬剤放出カプセルなどの様々な剤形で容易に投与される。
【０１５７】
本明細書で使用するとき、「担体」は、任意かつ全ての溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。このような媒体及び作用剤の医薬として活性な物質への使用は当該技術分野において周知である。有効成分と適合しない任意の従来の媒体又は作用剤を除く限りでは、治療用組成物におけるその使用が意図されている。また、補足的な有効成分を組成物に組み入れることができる。
【０１５８】
「医薬として許容される」という句は、ヒトに投与したときに、アレルギー性反応又は同様の不都合な反応を生じない分子実体及び組成物を指す。有効成分としてタンパク質を含有する水性組成物の調製は、当該技術分野において十分に理解されている。典型的には、このような組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとしての、注射剤として調製される; 注射前の液体中の溶液又は懸濁液に適した固体形態もまた調製され得る。調製物は乳化することもできる。
【０１５９】
特定の実施形態において、医薬組成物は、鼻腔内噴霧器、吸入器、及び/又は他のエアロゾル送達ビヒクルによって送達してよい。遺伝子、ポリヌクレオチド、及びペプチド組成物を経鼻エアロゾル噴霧器によって肺に直接送達する方法は、例えば、米国特許第5,756,353号及び米国特許第5,804,212号(それぞれは全体として参照により本明細書に具体的に組み込まれる)に記載されている。同様に、鼻腔内微小粒子樹脂(Takenaga et al., 1998)及びリゾホスファチジル-グリセロール化合物(米国特許第5,725,871号、全体として参照により本明細書に具体的に組み込まれる)を使用した薬物の送達もまた製薬技術分野において周知である。同様に、ポリテトラフルオロエチレン支持マトリックスの形態の経粘膜薬物送達は、米国特許第5,780,045号(全体として参照により本明細書に具体的に組み込まれる)に記載されている。
【０１６０】
特定の実施形態において、適切な宿主細胞に本開示の組成物を導入するために、送達は、リポソーム、ナノカプセル、微小粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、小胞などの使用によって生じさせ得る。特に、本開示の組成物は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェア、ナノ粒子などのいずれかに封入して送達するために製剤化し得る。製剤及びこのような送達ビヒクルの使用は、公知技術及び従来技術を用いて行うことができる。
【０１６１】
典型的な実施形態
1.哺乳動物における活動性結核感染を治療する方法であって、該方法は、活動性結核感染を有する哺乳動物に、化学療法剤と、免疫学的に有効な量の治療用ワクチンを投与するステップを含み、ここで、該ワクチンは、結核菌群のマイコバクテリウム属種由来のMtb抗原又はその免疫原性断片を含む医薬組成物を含む、上記方法。
【０１６２】
2.治療用ワクチンが、2つ以上の共有結合した結核菌抗原又はその免疫原性断片の組み合わせを含む単離された融合ポリペプチドを含み、ここで、該抗原は、Rv0164、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv3876、Rv0054、Rv0410、Rv0655、Rv0831、Rv1009、Rv1099、Rv1240、Rv1288、Rv1410、Rv1569、Rv1789、Rv1818、Rv1860、Rv1886、Rv1908、Rv2220、Rv2032、Rv2623、Rv2875、Rv3044、Rv3310、Rv3881、Rv0577、Rv1626、Rv0733、Rv2520、Rv1253、Rv1980、Rv3628、Rv1884、Rv3872、Rv3873、Rv1511及びRv3875、並びに前述の配列のいずれかと少なくとも90％の同一性を有する抗原からなる群から選択される、実施形態1に記載の方法。
【０１６３】
3.治療用ワクチンがID93融合ポリペプチドを含み、ここで、ID93融合ポリペプチドが、マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813を含む、実施形態1に記載の方法。
【０１６４】
4.マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813が、結核菌抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813である、実施形態3に記載の方法。
【０１６５】
5.ID93融合ポリペプチドが、配列番号1に記載の配列又はそれに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、実施形態3に記載の方法。
【０１６６】
6.活動性結核感染が、脱力、疲労、発熱、悪寒、体重減少、食欲不振、無食欲、寝汗、又はそれらの任意の組み合わせの臨床症状と関連する、実施形態1に記載の方法。
【０１６７】
7.活動性結核感染が肺活動性TB感染である、実施形態1に記載の方法。
【０１６８】
8.肺活動性結核感染が、持続性の咳、粘り気の強い粘液、胸痛、喀血、又はそれらの任意の組み合わせの臨床症状と関連する、実施形態7に記載の方法。
【０１６９】
9.活動性結核感染が、哺乳動物の臓器において、指数関数的な速度、対数関数的な速度、又は半対数関数的な速度で増殖し、繁殖し、増大し又は活動的に増えるMtb細菌によって特徴付けられる、実施形態1に記載の方法。
【０１７０】
10.活動性結核感染が、抗酸性染色(AFS)アッセイ; 細菌培養アッセイ、例えば、BACTEC MGIT 960アッセイ; IGRテスト、例えば、QFT(登録商標)-Goldテスト又はQFT(登録商標)-Gold In-tube T SPOT(商標)TBテスト; 皮膚テスト、例えば、TST Mantoux皮膚テスト(TST); 及び抗原刺激後の全血若しくは単離されたPBMCの細胞内サイトカイン染色からなる群から選択されるアッセイを用いて同定される、実施形態1に記載の方法。
【０１７１】
11.活動性結核感染が、結核菌の活動性一次感染である、実施形態1に記載の方法。
【０１７２】
12.活動性結核感染が、再活性化結核感染である、実施形態1に記載の方法。
【０１７３】
13.哺乳動物が多剤耐性(MDR)結核菌に感染している、実施形態1に記載の方法。
【０１７４】
14.哺乳動物が、カルメット・ゲラン桿菌(Bacillus Calmette-Guerin)(BCG)を用いて事前に免疫されていた、実施形態1に記載の方法。
【０１７５】
15.哺乳動物がヒトである、実施形態1に記載の方法。
【０１７６】
16.結核菌感染の治療に有効な1つ以上の化学療法剤の投与をさらに含む、実施形態1に記載の方法。
【０１７７】
17.1つ以上の化学療法剤が、イソニアジド、リファンピン又はそれらの組み合わせである、実施形態16に記載の方法。
【０１７８】
18.哺乳動物が、最初に、一定期間にわたって1つ以上の化学療法剤を投与され、続いて、治療用ワクチンを投与される、実施形態16に記載の方法。
【０１７９】
19.哺乳動物が、最初に、治療用ワクチンを投与され、続いて、一定期間にわたって1つ以上の化学療法剤を投与される、実施形態16に記載の方法。
【０１８０】
20.1つ以上の化学療法剤と治療用ワクチンの投与が同時である、実施形態16に記載の方法。
【０１８１】
21.1回以上のその後の時に、哺乳動物に治療用ワクチンを投与することをさらに含み、ここで、1回以上のその後の時に哺乳動物に残存する結核感染が、活動性結核感染であってもよく又はそうでなくてもよい、実施形態1に記載の方法。
【０１８２】
22.ワクチンがアジュバントをさらに含む、実施形態1に記載の方法。
【０１８３】
23.アジュバントが、以下の構造:
【０１８４】
【化１０】
2015525784.tif 000013
(式中、R1、R3、R5及びR6はC11〜C20アルキルであり、R2及びR4はC12〜C20アルキルである)
を有するGLAである、実施形態22に記載の方法。
【０１８５】
24.R1、R3、R5及びR6がC11〜14アルキルであり、R2及びR4がC12〜15アルキルである、実施形態23に記載の方法。
【０１８６】
25.R1、R3、R5及びR6がC11アルキルであり、R2及びR4がC13アルキルである、実施形態23に記載の方法。
【０１８７】
26.活動性結核感染に対する化学療法の時間経過を減少させる方法であって、該方法は、活動性結核感染を有する哺乳動物に、結核菌に対して有効な1つ以上の化学療法剤と、免疫学的に有効な量の治療用ワクチンを投与することを含み、それによって、活動性結核菌感染に対する化学療法の時間経過の減少をもたらし、ここで、該ワクチンは、結核菌群のマイコバクテリウム属種由来の融合ポリペプチド又はその免疫原性断片を含む医薬組成物を含み、該融合ポリペプチドは結核菌に対する免疫応答を誘導する、上記方法。
【０１８８】
27.融合ポリペプチドが、2つ以上の共有結合した結核菌抗原又はその免疫原性断片の組み合わせを含み、ここで、該抗原は、Rv0164、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv3876、Rv0054、Rv0410、Rv0655、Rv0831、Rv1009、Rv1099、Rv1240、Rv1288、Rv1410、Rv1569、Rv1789、Rv1818、Rv1860、Rv1886、Rv1908、Rv2220、Rv2032、Rv2623、Rv2875、Rv3044、Rv3310、Rv3881、Rv0577、Rv1626、Rv0733、Rv2520、Rv1253、Rv1980、Rv3628、Rv1884、Rv3872、Rv3873、Rv1511及びRv3875、並びに前述の配列のいずれかと少なくとも90％の同一性を有する抗原からなる群から選択される、実施形態26に記載の方法。
【０１８９】
28.融合ポリペプチドがID93融合ポリペプチドを含み、ここで、ID93融合ポリペプチドが、抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813を含む、実施形態27に記載の方法。
【０１９０】
29.ID93融合ポリペプチドが、配列番号1に記載の配列又はそれに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、実施形態28に記載の方法。
【０１９１】
30.化学療法の時間経過が、約3カ月以下、約5カ月以下又は約7カ月以下に短縮される、実施形態26に記載の方法。
【０１９２】
31.ワクチンがアジュバントをさらに含む、実施形態26に記載の方法。
【０１９３】
32.アジュバントが、以下の構造:
【０１９４】
【化１１】
2015525784.tif 000014
(式中、R1、R3、R5及びR6はC11〜C20アルキルであり、R2及びR4はC12〜C20アルキルである)
を有するGLAである、実施形態31に記載の方法。
【０１９５】
33.R1、R3、R5及びR6がC11〜14アルキルであり、R2及びR4がC12〜15アルキルである、実施形態32に記載の方法。
【０１９６】
34.R1、R3、R5及びR6がC11アルキルであり、R2及びR4がC13アルキルである、実施形態32に記載の方法。
【０１９７】
35.活動性結核感染であると診断された患者を治療する方法であって、該方法は、患者に化学療法剤と、免疫学的に有効な量の治療用ワクチンを投与することを含み、ここで、該ワクチンは、結核菌群のマイコバクテリウム属種由来のMtb抗原又はその免疫原性断片を含む医薬組成物を含む、上記方法。
【０１９８】
36.患者がヒトである、実施形態35に記載の方法。
【０１９９】
37.治療用ワクチンが、2つ以上の共有結合した結核菌抗原又はその免疫原性断片の組み合わせを含む単離された融合ポリペプチドを含み、ここで、該抗原は、Rv0164、Rv0496、Rv2608、Rv3020、Rv3478、Rv3619、Rv3620、Rv1738、Rv1813、Rv3810、Rv2389、Rv2866、Rv3876、Rv0054、Rv0410、Rv0655、Rv0831、Rv1009、Rv1099、Rv1240、Rv1288、Rv1410、Rv1569、Rv1789、Rv1818、Rv1860、Rv1886、Rv1908、Rv2220、Rv2032、Rv2623、Rv2875、Rv3044、Rv3310、Rv3881、Rv0577、Rv1626、Rv0733、Rv2520、Rv1253、Rv1980、Rv3628、Rv1884、Rv3872、Rv3873、Rv1511及びRv3875、並びに前述の配列のいずれかと少なくとも90％の同一性を有する抗原からなる群から選択される、実施形態35に記載の方法。
【０２００】
38.治療用ワクチンがID93融合ポリペプチドを含み、ここで、ID93融合ポリペプチドが、マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813を含む、実施形態35に記載の方法。
【０２０１】
39.マイコバクテリウム属種抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813が、結核菌抗原Rv2608、Rv3619、Rv3620及びRv1813である、実施形態38に記載の方法。
【０２０２】
40.ID93融合ポリペプチドが、配列番号1に記載の配列又はそれに対して少なくとも90％の同一性を有する配列を含む、実施形態38に記載の方法。
【０２０３】
41.活動性結核感染が、脱力、疲労、発熱、悪寒、体重減少、食欲不振、無食欲、寝汗、又はそれらの任意の組み合わせの臨床症状と関連する、実施形態35に記載の方法。
【０２０４】
42.活動性結核感染が肺活動性TB感染である、請求項35に記載の方法。
【０２０５】
43.肺活動性結核感染が、持続性の咳、粘り気の強い粘液、胸痛、喀血、又はそれらの任意の組み合わせの臨床症状と関連する、実施形態42に記載の方法。
【０２０６】
44.活動性結核感染が、患者の臓器において、指数関数的な速度、対数関数的な速度、又は半対数関数的な速度で増殖し、繁殖し、増大し又は活動的に増えるMtb細菌によって特徴付けられる、実施形態35に記載の方法。
【０２０７】
45.活動性結核感染が、抗酸性染色(AFS)アッセイ; 細菌培養アッセイ、例えば、BACTEC MGIT 960アッセイ; IGRテスト、例えば、QFT(登録商標)-Goldテスト又はQFT(登録商標)-Gold In-tube T SPOT(商標)TBテスト; 皮膚テスト、例えば、TST Mantoux皮膚テスト(TST); 及び抗原刺激後の全血若しくは単離されたPBMCの細胞内サイトカイン染色からなる群から選択されるアッセイを用いて同定される、実施形態35に記載の方法。
【０２０８】
46.活動性結核感染が、結核菌の活動性一次感染である、実施形態35に記載の方法。
【０２０９】
47.活動性結核感染が、再活性化結核感染である、実施形態35に記載の方法。
【０２１０】
48.患者が多剤耐性(MDR)結核菌に感染している、実施形態35に記載の方法。
【０２１１】
49.患者が、カルメット・ゲラン桿菌(Bacillus Calmette-Guerin)(BCG)を用いて事前に免疫されていた、実施形態35に記載の方法。
【０２１２】
50.患者が哺乳動物である、実施形態35に記載の方法。
【０２１３】
51.結核菌感染の治療に有効な1つ以上の化学療法剤の投与をさらに含む、実施形態35に記載の方法。
【０２１４】
52.1つ以上の化学療法剤が、イソニアジド、リファンピン又はそれらの組み合わせである、実施形態51に記載の方法。
【０２１５】
53.患者が、最初に、一定期間にわたって1つ以上の化学療法剤を投与され、続いて、治療用ワクチンを投与される、実施形態51に記載の方法。
【０２１６】
54.患者が、最初に、治療用ワクチンを投与され、続いて、一定期間にわたって1つ以上の化学療法剤を投与される、実施形態51に記載の方法。
【０２１７】
55.1つ以上の化学療法剤と治療用ワクチンの投与が同時である、実施形態51に記載の方法。
【０２１８】
56.1回以上のその後の時に、患者に治療用ワクチンを投与することをさらに含み、ここで、1回以上のその後の時に患者に残存する結核感染が、活動性結核感染であってもよく又はそうでなくてもよい、実施形態35に記載の方法。
【０２１９】
57.ワクチンがアジュバントをさらに含む、実施形態35に記載の方法。
【０２２０】
58.アジュバントが、以下の構造:
【０２２１】
【化１２】
2015525784.tif 000015
(式中、R1、R3、R5及びR6はC11〜C20アルキルであり、R2及びR4はC12〜C20アルキルである)
を有するGLAである、実施形態57に記載の方法。
【０２２２】
59.R1、R3、R5及びR6がC11〜14アルキルであり、R2及びR4がC12〜15アルキルである、実施形態58に記載の方法。
【０２２３】
60.R1、R3、R5及びR6がC11アルキルであり、R2及びR4がC13アルキルである、実施形態58に記載の方法。
【０２２４】
以下の実施例は、例証として提供され、限定を目的としない。
【実施例】
【０２２５】
[実施例1]
TB再発及び活動性TB感染の再活性化のSWR/Jマウスモデルの開発
週齢を合わせた(4〜6週間の)雌性SWR/Jマウス及びC57BL/6マウスを、それぞれJackson及びCharles River Laboratoriesから購入した。UW-Madisonエアロゾルチャンバーを用いて、低用量(50〜100個の細菌)エアロゾル(LDA)のMtb H37Rv(ATCC #35718)でマウスを感染させた。活動性感染を有するマウスに存在する細菌数、肺内生菌数(5匹のマウス/群)を、当該技術分野において公知の方法によって、感染から15日、30日及び100日後に決定した。記号は平均+/-標準偏差を示す。活動性TB感染を有するSWR/JとC57BL/6株のマウスは、記載されるようにMtb H37Rvを感染させ(8匹のマウス/群)、生存をモニターした。モデルにおける化学療法の効果を評価するするために、感染から15日後、マウスの一部は、30日、60日又は90日間の連続日数投与される(Rx 30d、Rx 60d、Rx 90d)、イソニアジド(INH)(85mg/飲料水1L)とリファンピン(RIF)(50mg/飲料水1L)の投薬レジメンが開始された。マウスの追加群は、感染から30日目に、90日間の連続日数投与される、イソニアジド(INH)(85mg/飲料水1L)とリファンピン(RIF)(50mg/飲料水1L)の投薬レジメン(まとめて本明細書では化学療法による処置と称する)が開始された。雌性マウスは、0.15〜0.37mL/gを飲むことが推定されている(Bachmanov AA et al., 2002)。Mtb H37Rvについての最小阻害濃度は、RIFについては0.25μMであり、INHについては1.0μMである。
【０２２６】
C57BL/6マウス(Russsell et Al., 2010)とは対照的に、そして以前の観察(Baldwin et al., J. of Immunology 2012)と一致して、SWR/Jマウスは、C57BL/6マウスと比較してSWR/Jにおけるウイルス力価の増加によって示されるように、Mtb感染後に慢性状態に移行せず(図1A)、活動性MTB感染のモデルとして典型的である。擬似処置されたSWR/Jマウスは、致死Mtb感染により死亡し、生存期間中央値(MST)は116.5日であった。一方、90日間、化学療法(RIF/INH)で処置されたマウスは、擬似又は化学療法剤で処置されたC57/BL/6マウスと比較して、MSTが247.5日であった(P<0.001、ログランク検定)(図1B)。
【０２２７】
SWR/Jマウスにおける化学療法による処置の最適な長さを決定するために、動物は、感染後15日目に開始するRIF/INHを用いて30日、60日若しくは90日間のいずれかの間、処置され、又は追加群は、曝露後30日目に開始する化学療法を90日間受けた。生存曲線をモニターした。30日間(P<0.0005、ログランク検定)、60日間(P<0.05、ログランク検定)又は90日間(P<0.005、ログランク検定)、擬似処置又は薬物処置された動物間の生存と回収可能肺CFUにおける有意差を観察した(図1C)。感染後の15日目から30日目の化学療法の開始の変化は、処置の長期有効性を有意に変化させなかった(P>0.50、ログランク検定)(図1C)。化学療法の60日又は90日は、生存肺細菌数を検出限界未満に減少させるには十分であったが(図1D)、これらの処置レジメンは、SWR/JマウスにおけるMtbのクリアランスを達成するには不十分であった。
【０２２８】
[実施例2]
TB再発及び活動性TB感染の再活性化のSWR/JマウスモデルにおけるTBワクチンID93+化学療法の治療的有効性の評価
TLR4アンタゴニストGLA-SEとともに製剤化されたTBワクチン融合タンパク質ID83とID93又はそれらの成分抗原は、三用量で投与した場合、マウス及びモルモットモデルにおいて、TBに対する予防的防御を与えることが以前に実証されている(Baldwin et al., 2009, Bertholet et al., 2010)。ID93/GLA-SEワクチンは、CFUの減少又は生存率の改善によって測定した場合に、この製剤が、免疫治療的利益を与えるかどうかを決定するために、活動性感染のSWR/Jモデルにおいて試験された。SWR/Jマウス(群あたり6又は7匹のマウス)を、実施例1に記載されるようにMtbのLDAで感染させた。15日後(15日目)、マウスは、90日間(Rx 90d)、擬似処置又は抗生物質処置された。また、各群の抗生物質処置されたマウスの一部は免疫された。マウスは、抗生物質の治療的処置中(DTT; 15日目、36日目、57日目)又は抗生物質の治療的処置後(PTT; 107日目、128日目、149日目)のいずれかに、20μgのGLA-SEとともに製剤化された8μgのID93タンパク質を用いて、3回、3週間の間隔で免疫された。治療有効性は、経時的な生存率を追跡し、かつ、以前に記載(Bertholet et al., 2008)されたように肺ホモジネートをプレーティングすることによって決定された。活動性TB感染のSWR/Jマウスモデルにおいて治療的に投与されたID93/GLA-SEワクチン(--)は、感染後の生存頻度を増加させた(P<0.01)。
【０２２９】
化学療法(Rx)単独(黒丸)と比較して、化学療法の補助物としてID93/GLA-SEワクチンによる免疫化(黒四角)は、CFUを0.643log10さらに減少させた(P<0.05)(図2B)。化学療法単独Rx(黒丸)と比較して、GLA-SEアジュバント+化学療法を投与された群(Rx+GLA-SE(
2015525784.tif 000016
))との間に、肺CFUの差は観察されなかった(P>0.05)(図2B)。さらに、Rx+ID93/GLA-SE群とRx+GLA-SE群によって誘導された曝露後の有効性において有意差があり(4.419±0.17対4.938±0.16log10、P<0.05)、これは、これらの研究において観察された補助的な殺菌効果は抗原依存的であることを実証した。
【０２３０】
90日の化学療法後(PTT)又はその間(DTT)の化学療法に対する免疫療法補助物としてのワクチンの投与は、それぞれ、Mtb感染マウスの死亡を52％及び67％に防いだ(P<0.0001)(図2C)。
【０２３１】
[実施例3]
化学療法の補助物としての治療的ID93/GLA-SEワクチンの投与は、活動性TB感染における生存を延長するのに必要とされる薬物療法の期間を減少させる
TB再発及び活動性TB感染の再活性化のSWR/Jマウスモデルにおいてさらに実験を行い、治療的ID93/GLASEワクチンの投与が、活動性TB感染における生存を延長するのに必要とされる薬物療法の期間を減少させ得るのかどうかを評価した。SWR/JマウスをMtb H37RvのLDAで感染させた。15日後、マウスは、上に記載されるとおり抗生物質を用いて60日又は90日間処置された(それぞれ、Rx 60d及びRx 90)。60日の抗生物質レジメンの完了後、マウスは、20μgのGLASEとともに製剤化された8μgのID93タンパク質を用いて、3回、3週間の間隔で免疫された(Rx 60d+ID93/GLA-SE; 77日目、98日目、119日目)。経時的にMtbによって引き起こされた動物の死亡(7匹のマウス/群)をモニターすることによって防御を評価した(P<0.05(ログランク検定)は有意であると考えられる)。(B-M)Mtb H37Rvによるチャレンジ後の肺組織の組織病理学的評価。炎症反応及び肉芽腫(g)形成は、H&E切片に示され(B-I)、AFB(矢印)の存在(J-M)が評価された。(B、F、J)擬似処置されたマウス、106日目; (C、J及びK)90日間の抗生物質療法、106日目; (D、H、L)90日間の抗生物質療法+ID93/GLA-SE、241日目; (E、I及びM)60日間の抗生物質療法+ID93/GLA-SE、295日目。示されたデータは、5匹のマウス/群の代表的なものである。
【０２３２】
90日間の化学療法単独を受けた動物(Rx90d;黒三角)の40％がMtb感染に対して生存した(MST214日間)一方で、60日間の化学療法後にワクチン免疫療法を受けた動物(黒丸)の100％が、少なくとも250日間生存した(P<0.05)(図3A)。これらの研究は、ワクチン免疫療法が、化学療法を取り止めた後の延長期間に死亡を防ぎながら、薬物療法の期間を少なくとも3分の1減少させることができたことを実証する。
【０２３３】
ID93/GLA-SEと組み合わせた抗生物質がTB肺の病理を減少させるかどうかを決定するために、擬似処置、Rx処置、及びRx+ID93/GLA-SE処置されたマウスから切片を組織学的分析のために採取した(組織学的所見を表1(以下)と図3B-Mに示す)。
【０２３４】
【表１】
2015525784.tif 000017
【０２３５】
擬似処置されたマウスの肺は、以前に報告[29、38]されているように、大きく炎症を起こし、壊死であるように見える肺実質を伴う、グレード3〜4(40〜100％)のびまん性肺胞浮腫(図3B、F)を有し、無数の抗酸菌が存在した(>30/600x高倍率視野(HPF))(図3J)。化学療法単独(Rx90d)群の肺切片は、炎症性病変の明らかな消散を示し(図3C、G)、細菌はごく稀であった(<1/HPF)(図3K、表1)。241日目、Rx90d+ID93/GLA-SEマウスの肺は、無数の肉芽腫を有し(図D、H)、細菌は少なかった(<6生物/HPF、600x)(図3L、表1)。295日目、60日抗生物質で処置され、ID93/GLA-SEで免疫されたマウスの肺は、顕著な病変を示さず(図3E、I、表1)、細菌は少なかった(図3M)。
【０２３６】
データは、抗生物質と併用して投与されたID93/GLA-SEワクチンを使用して、活動性TB感染における標準的な化学療法レジメンを短縮し得ることを実証する(図3A)。
【０２３７】
[実施例4]
化学療法単独又は化学療法+ID93/GLA-SEワクチン接種を受けるSWR/Jマウスにおける免疫応答
ID93で刺激された脾細胞のサイトカインプロファイル
SWR/JマウスをLDA Mtb H37Rvで感染させ、実施例2に記載されるように、90日間の抗生物質単独、又は抗生物質とそれに続くID93/GLA-SEによる、3週間の間隔で3回の免疫のいずれかで処置した。ID93で刺激された脾細胞(感染後177日目又は241日目)の上清からのサイトカインプロファイルは、IFN-γ、IL-2、TNF、IL-5、IL-10、IL-13、及びIL-17に対する多重ビーズアレイによって、抗原又は培地のみの存在下で24時間インキュベーション後に分析された。ボックスプロットは、バックグラウンド減算後の中央値と四分位範囲を示す。Wilcoxon順位和検定からのP値。
【０２３８】
感染後149日目及び177日目でのID93特異的T細胞応答についての細胞内サイトカイン染色
細胞をブレフェルジンAの存在下でID93又は培地対照で8〜12時間刺激し、CD3、CD4、CD8、CD44、IFN-γ、IL-2及びTNFに対する蛍光色素を結合させた抗体で染色し、FACSによって分析した。(B及びC)パネルは、FACS分析のためのゲーティングスキームを示す。(D)下部パネルのボックスプロットは、バックグラウンド減算後の中央値と四分位範囲を示す。Wilcoxon順位和検定からのP値。ID93によるインビトロでの再刺激に応答して、炎症誘発性を示すサイトカインの一部、並びにTH1及びTH2機能群が有意に上方制御された(図4A)。感染した個体におけるMtb特異的免疫の可溶性メディエーターであるTNFは、ID93/GLA-SEで免疫された群において、241日目に有意に上方制御された(P<0.05)。さらに、ID93特異的IFN-γ、IL-2、及びIL-17応答が検出され、ワクチン接種されていない動物と比較して、ワクチン接種された動物において有意に高かった。TH2型IL-5サイトカインの濃度に有意差は検出されなかったが、有意なID93特異的IL-10及びIL-13応答が241日目に測定された。
【０２３９】
多機能性CD4+ TH1細胞は、最近、リーシュマニア・メジャー(Leishmania major)に対する防御と相関するものとして記載され、ヒトTBにおける疾患の進行を制限することに関与している[39、40]。したがって、IFN-γ、IL-2及びTNFを生成するCD4+及びCD8+ T細胞の頻度は、ID93特異的T細胞応答の表現型を決定するために調べられた(図4B-D、S2B)。ID93特異的な多機能性三重陽性及びIFN-γ+TNF+二重陽性CD4+ T細胞のより高い頻度は、化学療法のみを受けているマウスと比較して、補助的な免疫療法を受けているマウスにおいて観察された(P<0.05)(図4B-D)。CD4+及びCD8+ T細胞サブセットの両方におけるID93特異的TNFの高いバックグラウンド応答が観察され、これは、これらの動物において進行中のMtb感染の免疫活性化の増大に起因している可能性が高かった。CD8+ T細胞におけるID93特異的応答はCD4+コンパートメントにおいて観察された応答よりも大きさが低かったが、補助的なID93/GLA-SEワクチン接種を受けているマウスにおいて二重(IFN-γ+TNF+)及び三重陽性(IFN-γ+IL-2+TNF+)のCD8+ T細胞の頻度は有意に高かった。要するに、これらのデータは、潜在的にプライミングされ、連続してブースティングされ得るMtb感染後の多数の抗原が存在するが、抗生物質とともに補助的に投与されたID93/GLA-SEは、有意により強固であり、高品質(多機能性)であり、及び持続的なTH1型抗ID93 CD4+ T細胞応答の刺激において成功したことを示す。
【０２４０】
[実施例5]
カニクイザル(cynomolgus macaque)における抗生物質処置に対する補助物としてのID93/GLA-SE
NHPにおいて抗生物質に対する補助物として投与した場合の、ID93/GLA-SEの安全性を実証するために、カニクイザル(macaque)は1カ月のRIF/INH抗生物質の後、3回のワクチン投薬を投与された(図5A)。注射部位反応は最小であり、せいぜい僅かに知覚できる紅斑と浮腫(Draizeスケール範囲0〜1)を有し、体重及び体温に有意な変化はなかった(データ示さず)。7匹全部(100％)のRx+ID93/GLA-SE免疫されたNHPは、評価された最後の時点まで生存したが、一方、抗生物質単独群の6匹のNHP(85.7％)と擬似処置群の3匹のNHP(42.8％、P=0.44)がこの時点まで生存した(図5B)。Rx+ID93/GLA-SEで処置された4匹のサルは、(以前には陽性であった胸部X線における肺浸潤物によって評価したとき)実験の終了前に放射線学上の変化を示さないか、又はMtb感染を消散するかのいずれかであったが、一方、Rx単独又は擬似処置を受けているカニクイザルのいずれも、それらのMtb感染を消散せず、胸部X線は陽性のままであった(図5C)。Rx+ID93/GLA-SEで処置されたカニクイザルのうち40パーセントが、Rx単独群と比較した場合、Mtb細菌数における定量的差異を示すことによって、補助的免疫療法に対して劇的に反応した(P＜0.05)(図5D)。興味深いことに、より低いCFUカウントを有するRx+ID93/GLA-SEカニクイザルはまた、実験の終了時に胸部X線が陰性であった。また、群割り当てと疾患組織の存在との間には組織病理学による相関があり、ID93/GLA-SEを受けている動物は最も健康な臓器を含有し、生理食塩水群は最も罹患した臓器を有した(p=0.003)(図5E)。全体として、これらの結果は、ID93/GLA-SEワクチンが、カニクイザルにおいて、曝露後の免疫療法剤として耐容性良好であることを実証した。
【０２４１】
[実施例6]
化学療法単独又は化学療法+ID83/GLA-SEワクチン接種を受けているBALB/cマウスにおける免疫応答
6週齢の雌性BALB/cマウス(Charles River, Wilmington, MA)を、吸入曝露システム(Glas-Col, Terre Haute,IN)と、肺に2.5〜3.0 log10 CFUを植え付けることを目的して7H9ブロスに10倍希釈した対数期ブロス培養物(600nmでの光学濃度は1.0)を用いて、結核菌H37Rvで感染させた。結核菌H37Rvはマウス継代から調製され、分注して凍結され、感染前に、10％オレイン酸-アルブミン-デキストロース-カタラーゼ(OADC)(Fisher, Pittsburgh, PA)と0.05％ Tween 80を用いて、Middlebrook 7H9ブロスに継代培養された。5匹のマウスを感染から1日後に屠殺し、植え付けられた細菌数を確認した。残りのマウスは、表2に示される処置群に無作為化された。リファンピン(R)、イソニアジド(H)及びピラジナミド(Z)、総称してRHZでの処置は、感染から26日後に0日目で開始した。リファンピンとイソニアジド(Sigma, St. Louis, MO)は蒸留水中に1mg/mlで別々に溶解し、投薬溶液を生じさせた。ピラジナミド(Fisher Scientific, Suwanee, GA)は蒸留水中に15mg/mlになるように溶解し、投薬溶液を生じさせた。毎週溶液を調製し、分注し、使用前に4℃で維持した。4匹の対照群は、薬物ビヒクル(水)+GLA-SEアジュバント、薬物ビヒクル+ID83ワクチン、RHZ+ワクチンビヒクル(生理食塩水)、及びRHZ+GLA-SEアジュバントを受けた。試験群は、RHZ+ID83ワクチンを受けた。RHZ及び薬物ビヒクルは、強制経口投与によって、1週間に5日、12週間投与された。R又はビヒクルは、R吸収を制限する、以前に記載された薬物動態的薬物-薬物相互作用を避けるために、HZ又はビヒクルの少なくとも1時間前に投与された。
【０２４２】
ID83は、2mlのGLA-SE(0.040mg/ml、4％油)、0.1mlのID83(0.2mg/ml)及び1.9mlの生理食塩水(NaCl)を用いて調製された4mlのワクチン混合物を混合することによって、GLA(GLA-SE)で補助された安定な水中油型エマルジョンとして製剤化された。ワクチン調製物は、使用前に短くボルテックスされた。100μlのワクチンを皮下に投与した。注射された投薬量は2μgのGLA-SE+/-0.5μgのID83であった。
【０２４３】
感染したマウスのワクチン接種を感染から6週間後(RHZの処置開始から2週間後)に開始した。ワクチン又は対照(生理食塩水若しくはアジュバントのみ)の3回の投薬は、100マイクロリットルで3週間の間隔で皮下に投与された(すなわち、処置の2、5及び8週間後)。ワクチンは、2マイクログラムのGLA-SEアジュバントと0.5マイクログラムのID83を含有した。対照は、生理食塩水のみとアジュバントのみを含んだ。注射部位は順番に変えた。
【０２４４】
【表２】
2015525784.tif 000018
【０２４５】
病理学的評価。代表的な肺の画像は、滅菌PBS中での72時間のインキュベーション後、及び定量的培養物についてのホモジナイゼーション前に撮影され、肺病変の巨視的外観を記録した。他の肺を洗浄し、10％中性緩衝ホルマリン溶液に入れた。これらの肺をパラフィン中に包埋し、切片にし、スライドガラス上で固定し、組織病理学を検討するために、H&E及び抗酸性染色で染色した。
【０２４６】
組織病理学的評価。CFUカウント(x)は、分析前に(x+1)として対数変換した。群平均は、ボンフェローニポスト検定を用いた一元配置分散分析によって比較された。
【０２４７】
結果
処置中の肺CFUカウント。D-26での平均(±SD)肺log10CFUカウントは2.78±0.21であった。処置開始時(DO)の平均CFUカウントは7.60+0.23であった。6週間の処置の後、肺CFUカウントは、ビヒクル+アジュバント群及びビヒクル+ワクチン群において約0.9 log10減少し、一方、RHZ+生理食塩水群、RHZ+アジュバント群及びRHZ+ワクチン群におけるCFUカウントは、それぞれ4.27、4.19及び4.44log10下がった(図6A)。12週間の処置の後、薬物ビヒクル処置群におけるCFUカウントは大いに安定であり、一方、抗生物質単独(RHZ+生理食塩水)、抗生物質+TLR4アジュバント(RHZ+アジュバント)、及び抗生物質+ID83ワクチン(RHZ+ワクチン)で処置された、それぞれ5匹のうち3匹のマウス、4匹のうち2匹のマウス、及び5匹のうち4匹のマウスは培養陰性であった(図6)。
【０２４８】
処置完了後の肺CFUカウント。いずれの処置も停止後の5週間のフォローアップの後、各群における5匹のマウスのうち4匹が、陽性の肺培養物(下記表3)を有していた。RHZ+生理食塩水群、RHZ+アジュバント群及びRHZ+ワクチン群における平均肺log10 CFUカウントは、それぞれ1.14±1.14、0.72±0.49及び0.63±0.42であった。培養陰性マウスを除くと、CFUカウントは、それぞれ1.42±1.09、0.90±0.32及び0.78±0.27であった。10週間のフォローアップの後、RHZ+ワクチン群における5匹のマウスのうちたった1匹だけが、陽性培養物を有しており、RHZ+アジュバント群及びRHZ+生理食塩水群における5匹のマウスのうち3匹と対比される。培養陰性マウスを除くと、RHZ+生理食塩水群、RHZ+アジュバント群及びRHZ+ワクチン群における平均肺log10 CFUカウントは、それぞれ1.82±1.85、1.37±1.56及び0.75±1.68であった。処置終了から10週後に(図7)、RHZ+生理食塩水又はRHZ+アジュバントだけで処置された両群における陽性肺培養物を有する3匹の動物におけるCFUカウントは、対数関数的細菌再増殖を示したが、一方、RHZ+ワクチン群における陽性肺培養物を有する唯一の動物は、他の2つの群と比較して減少した細菌再増殖を示した。
【０２４９】
研究はCFUカウントに関する統計学的有意性を与えなかったが、これらのデータは、本発明の方法による活動性結核の処置が、結核の徴候又は症状における永続的な改善をもたらし、抗生剤療法単独と比較して、化学療法の期間の短縮をもたらすことを実証した。
【０２５０】
【表３】
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【０２５１】
本明細書に言及され、及び/又は出願データシートに列挙された上記米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願及び非特許文献の全ては、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５２】
前述から、本発明の特定の実施形態は、例証を目的として本明細書に説明されているが、様々な変更が、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく行われてもよいことは承認される。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によるものを除いて限定されない。
【０２５３】
例示的なアミノ酸配列
随意的なHisタグを伴うID93融合ポリペプチド(配列番号1)
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTINYQFGDVDAHGAMIRAQAGSLEAEHQAIISDVLTASDFWGGAGSAACQGFITQLGRNFQVIYEQANAHGQKVQAAGNNMAQTDSAVGSSWAGTHLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLVVGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST
【０２５４】
ID93融合ポリペプチド(配列番号2)
MTINYQFGDVDAHGAMIRAQAGSLEAEHQAIISDVLTASDFWGGAGSAACQGFITQLGRNFQVIYEQANAHGQKVQAAGNNMAQTDSAVGSSWAGTHLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLVVGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST
【０２５５】
随意的なHisタグを伴うID83融合ポリペプチド(配列番号3)
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMGTHLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLVVGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST
【０２５６】
ID83融合ポリペプチド(配列番号4)
HLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACNELMTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSSVDINFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLVVGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLFST
【０２５７】
Rv1813(配列番号5)
MITNLRRRTAMAAAGLGAALGLGILLVPTVDAHLANGSMSEVMMSEIAGLPIPPIIHYGAIAYAPSGASGKAWHQRTPARAEQVALEKCGDKTCKVVSRFTRCGAVAYNGSKYQGGTGLTRRAAEDDAVNRLEGGRIVNWACN
【０２５８】
Rv3620(配列番号6)
MTSRFMTDPHAMRDMAGRFEVHAQTVEDEARRMWASAQNISGAGWSGMAEATSLDTMTQMNQAFRNIVNMLHGVRDGLVRDANNYEQQEQASQQILSS
【０２５９】
Rv2608(配列番号7)
MNFAVLPPEVNSARIFAGAGLGPMLAAASAWDGLAEELHAAAGSFASVTTGLAGDAWHGPASLAMTRAASPYVGWLNTAAGQAAQAAGQARLAASAFEATLAATVSPAMVAANRTRLASLVAANLLGQNAPAIAAAEAEYEQIWAQDVAAMFGYHSAASAVATQLAPIQEGLQQQLQNVLAQLASGNLGSGNVGVGNIGNDNIGNANIGFGNRGDANIGIGNIGDRNLGIGNTGNWNIGIGITGNGQIGFGKPANPDVLVVGNGGPGVTALVMGGTDSLLPLPNIPLLEYAARFITPVHPGYTATFLETPSQFFPFTGLNSLTYDVSVAQGVTNLHTAIMAQLAAGNEVVVFGTSQSATIATFEMRYLQSLPAHLRPGLDELSFTLTGNPNRPDGGILTRFGFSIPQLGFTLSGATPADAYPTVDYAFQYDGVNDFPKYPLNVFATANAIAGILFLHSGLIALPPDLASGVVQPVSSPDVLTTYILLPSQDLPLLVPLRAIPLLGNPLADLIQPDLRVLVELGYDRTAHQDVPSPFGLFPDVDWAEVAADLQQGAVQGVNDALSGLGLPPPWQPALPRLF
【０２６０】
Rv3619(配列番号8)
MTINYQFGDVDAHGAMIRAQAGSLEAEHQAIISDVLTASDFWGGAGSAACQGFITQLGRNFQVIYEQANAHGQKVQAAGNNMAQTDSAVGSSWA
【図１】
2015525784.tif 000022
【図２Ａ】
2015525784.tif 000023
【図２Ｂ−Ｃ】
2015525784.tif 000024
【図３Ａ】
2015525784.tif 000025
【図３Ｂ．Ｃ．Ｆ．Ｇ．Ｊ．Ｋ】
2015525784.tif 000026
【図３Ｄ．Ｅ．Ｈ．Ｉ．Ｌ．Ｍ】
2015525784.tif 000027
【図４Ａ】
2015525784.tif 000028
【図４Ｂ−Ｃ】
2015525784.tif 000029
【図４Ｄ】
2015525784.tif 000030
【図５Ａ−Ｄ】
2015525784.tif 000031
【図５Ｅ】
2015525784.tif 000032
【図６】
2015525784.tif 000033
【図７】
2015525784.tif 000034
【配列表】
2015525784000001.app
【国際調査報告】
2015525784.tif 000035
2015525784.tif 000036