(57)【要約】本発明者らは、ヒトEGFRvIII変異型タンパク質を表面に発現する腫瘍細胞に特異的に結合する1つのアームと、T細胞活性化リガンドCD3に特異的に結合する第2のアームを有する、二重特異性抗体結合分子を構築した。この結合分子は高度に細胞傷害性および抗原特異性である。これらは有望な治療薬である。2015521587.tif 000007
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
EGFRvIIIに結合しかつSEQ ID NO：2および3によりコードされるセグメントを含む、第1の単鎖ヒト可変領域と、
T細胞活性化リガンドCD3に結合しかつSEQ ID NO：5および6によりコードされるセグメントを含む、第2の単鎖ヒト可変領域と
を直列に含む、二重特異性ポリペプチド。
【請求項２】
SEQ ID NO：2、3、4、5、および6によりコードされるセグメントを含む、請求項1記載の二重特異性ポリペプチド。
【請求項３】
SEQ ID NO：2、3、4、5、6、および7によりコードされるセグメントを含む、請求項1記載の二重特異性ポリペプチド。
【請求項４】
請求項1記載の二重特異性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項５】
SEQ ID NO：8の配列を含む、請求項4記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
EGFRvIII発現腫瘍を有する患者を治療する方法であって、
請求項1記載の二重特異性ポリペプチドを該患者に投与する段階であって、それにより該腫瘍に対する細胞溶解性T細胞応答が誘導される、段階
を含む、方法。
【請求項７】
スペーサーポリペプチドセグメントが第1および第2の単鎖可変領域を連結する、請求項1記載の二重特異性ポリペプチド。
【請求項８】
スペーサーポリペプチドセグメントが(G4S)nであり、nが1〜5である、請求項7記載の二重特異性ポリペプチド。
【請求項９】
スペーサーポリペプチドセグメントが第1の単鎖可変領域内でVHドメインとVLドメインを連結する、請求項1記載の二重特異性ポリペプチド。
【請求項１０】
スペーサーポリペプチドセグメントが第2の単鎖可変領域内でVHドメインとVLドメインを連結する、請求項1記載の二重特異性ポリペプチド。
【請求項１１】
スペーサーポリペプチドセグメントが(G4S)nであり、nが1〜5である、請求項9記載の二重特異性ポリペプチド。
【請求項１２】
スペーサーポリペプチドセグメントが(G4S)nであり、nが1〜5である、請求項10記載の二重特異性ポリペプチド。
【請求項１３】
各単鎖可変領域がVHドメインとVLドメインの間にジスルフィド結合を含む、請求項1記載の二重特異性ポリペプチド。
【請求項１４】
請求項4記載のポリヌクレオチドを含む細胞を培養培地中で培養する段階、および
該細胞または培養培地から二重特異性ポリペプチドを回収する段階
を含む、二重特異性ポリペプチドを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、米国政府からの基金を用いて行われた。米国政府は、NIH/NCI認可番号CA11898の条項に従って一定の権利を保持する。
【０００２】
発明の技術分野
本発明は、癌治療の分野に関係している。特に、本発明は、EGFRvIIIを発現する癌を治療することに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
最もよく見られる原発性の悪性脳腫瘍である多形性膠芽腫（glioblastoma multiforme: GBM）は、外科的切除、放射線療法、および化学療法にもかかわらず、一様に致命的なままである1。免疫療法は、集学的治療（multimodality therapy）にさらなる毒性を追加することなく、比類のない特異性で腫瘍細胞を排除する強力な腫瘍特異的免疫応答を誘導することを約束する。実質的証拠によって、癌の根絶におけるT細胞の役割は支持されている。最近、T細胞をリダイレクトするために特異的な抗体を使用するという概念は、組換え二重特異性T細胞動員分子、つまりCD3などのT細胞活性化リガンドに対する単鎖抗体に連結された腫瘍標的化単鎖抗体から成る二重特異性T細胞動員分子という形で最適化された。こうした二重特異性T細胞動員分子は、T細胞を腫瘍細胞につなぐことができ、結果的に、T細胞の非常に局部的かつ特異的な活性化をもたらし、同時に腫瘍細胞の溶解を起こす。最近、CD19×CD3二重特異性T細胞動員分子を用いたヒト試験では、たった0.06mg/m2の用量で非ホジキンリンパ腫の患者7人中7人において観察された、血液、骨髄、および肝臓からの腫瘍のクリアランスを伴う腫瘍退縮によって、これらの構築物の効力が確認された4。しかしながら、頻繁にかつ均一に発現される腫瘍特異的標的が欠如していることが、これらの有望な構築物の最も重要な制限となっている。
【０００４】
体細胞遺伝子の変異に由来する腫瘍特異的抗原は、自己免疫に関連する可能性が少ないが、腫瘍の遺伝的不安定性の結果としてランダムに発生することが多く、したがって、患者特有のものであり、かつ発癌過程に偶発的に生じる傾向がある。しかし、EGFRvIIIは、腫瘍形成過程の中心となる、頻繁かつ一貫性のある腫瘍特異的変異であり、これは、コドンを分割して融合接合部（fusion junction）で新しいグリシンを生成する、EGFRの細胞外ドメイン（ECD）からの801塩基対のインフレーム欠失から成る。この変異は、腫瘍細胞の増殖と移動を促進し9、かつ腫瘍細胞に放射線および化学療法耐性を付与する、構成的に活性なチロシンキナーゼをコードしている。EGFRvIII変異は、GBMの患者に最も頻繁に見られるが、広範囲にわたる他の一般的な癌にも見出されている。ECDの通常は離れた部分の融合接合部に挿入された新しいグリシンは、正常な組織には見出されない腫瘍特異的エピトープ（図1）をもたらす。
【０００５】
当技術分野では、脳腫瘍などの癌のより良い、より成功した治療法を見つけることが、引き続き必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の一局面は、二重特異性ポリペプチドである。二重特異性ポリペプチドは、EGFRvIIIに結合する第1のヒト単鎖可変領域を含む。第1の単鎖可変領域は、第2のヒト単鎖可変領域と直列に存在する。第2の単鎖可変領域は、T細胞活性化リガンドCD3に結合する。第1の単鎖可変領域は、SEQ ID NO：2および3によりコードされるセグメントを含む。第2の単鎖可変領域は、SEQ ID NO：5および6によりコードされるセグメントを含む。
【０００７】
本発明の別の局面は、二重特異性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。二重特異性ポリペプチドは、EGFRvIIIに結合する第1のヒト単鎖可変領域を含む。第1の単鎖可変領域は、第2のヒト単鎖可変領域と直列に存在する。第2の単鎖可変領域は、T細胞活性化リガンドCD3に結合する。第1の単鎖可変領域は、SEQ ID NO：2および3によりコードされるセグメントを含む。第2の単鎖可変領域は、SEQ ID NO：5および6によりコードされるセグメントを含む。
【０００８】
本発明の別の局面は、患者におけるEGFRvIII発現腫瘍を治療する方法である。二重特異性ポリペプチドが患者に投与され、それによって該腫瘍に対する細胞溶解性T細胞応答が誘導される。二重特異性ポリペプチドは、EGFRvIIIに結合する第1のヒト単鎖可変領域を含む。第1の単鎖可変領域は、第2のヒト単鎖可変領域と直列に存在する。第2の単鎖可変領域は、T細胞活性化リガンドCD3に結合する。第1の単鎖可変領域は、SEQ ID NO：2および3によりコードされるセグメントを含む。第2の単鎖可変領域は、SEQ ID NO：5および6によりコードされるセグメントを含む。
【０００９】
本発明のさらに別の局面は、二重特異性ポリペプチドを製造する方法である。細胞を培養培地中で培養する。該細胞は、二重特異性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含んでいる。二重特異性ポリペプチドは、EGFRvIIIに結合する第1のヒト単鎖可変領域を含む。第1の単鎖可変領域は、第2のヒト単鎖可変領域と直列に存在する。第2の単鎖可変領域は、T細胞活性化リガンドCD3に結合する。第1の単鎖可変領域は、SEQ ID NO：2および3によりコードされるセグメントを含む。第2の単鎖可変領域は、SEQ ID NO：5および6によりコードされるセグメントを含む。培養した後、二重特異性ポリペプチドを該細胞から、または培養培地から回収する。
【００１０】
これらの態様、および本明細書を読むことで当業者には明らかな他の態様は、当技術分野に以下を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】野生型EGFRおよび変異型EGFRvIIIを示す概略図である。PEPvIII：LEEKKGNYVVTDH（SEQ ID NO：1）。
【図２】EGFR特異的Fv-PEPvIII（SEQ ID NO：1）複合体のモデルを示す。
【図３】図3A〜3Bは、EGFRvIII特異的ワクチン接種を受けたGBM患者からの抗体産生を示す。図3A：GBM患者の血清力価は、各ワクチン接種後にEGFRvIII特異的PEPvIIIに対するELISAにより試験した。図3B：BIAcore分析によりアッセイされたEGFRvIII ECDへの患者血清試料の結合。
【図４Ａ】図4A〜4Cは、EGFRvIII特異的エピトープ（PEPvIII）を含むペプチドで免疫したGBM患者由来の不死化ヒトB細胞からのEGFRvIII特異的抗体の結合を示す。図4A（左）：EGFRvIIIをトランスフェクトした3T3線維芽細胞（NR6M）上のPEPvIIIおよび野生型EGFRトランスフェクタント（NR6W）で刺激したワクチン接種GBM患者（ACT II-18）のヒトB細胞由来の上清の蛍光フローサイトメトリー分析。
【図４Ｂ】図4A〜4Cは、EGFRvIII特異的エピトープ（PEPvIII）を含むペプチドで免疫したGBM患者由来の不死化ヒトB細胞からのEGFRvIII特異的抗体の結合を示す。図4B（中央）：刺激の2週間後、NR6M細胞またはNR6W細胞を用いて、上清を特異性について分析する。形質転換されたヒトB細胞由来の上清はNR6M細胞を認識する抗体を生成することができる。
【図４Ｃ】図4A〜4Cは、EGFRvIII特異的エピトープ（PEPvIII）を含むペプチドで免疫したGBM患者由来の不死化ヒトB細胞からのEGFRvIII特異的抗体の結合を示す。図4C（右）：E4、G5およびF12は、ヒトB細胞濃縮キット（Stem Cell社 #19054）を用いてB細胞を濃縮した後に、患者試料Act II-18の96ウェルプレートから単一ウェル採取された。患者の末梢血単核細胞を、10mg/mLのシクロスポリンの存在下に20％EBVウイルス（95.8細胞上清）で形質転換する。形質転換効率を向上させるために、CpG 2006を2.5ng/mLで添加した。
【図５】組換えタンパク質MR1-1 scFv-抗CD3 scFv-His6（MR1-1二重特異性T細胞動員分子）の作製を示すフロー図である。G4S＝Gly4Ser；MR1-1×CD3 BiteはSDS-PAGEにおいて示される。
【図６】図6A〜6Bは、MR1-1×CD3二重特異性T細胞動員分子の結合を示す。図6A（左）：NR6MおよびNR6W細胞への結合。予想されたように、MR1-1はより高い濃度で野生型EGFRへの若干の結合を示す。図6B（右）：ヒトGBM細胞株へのMR1-1二重特異性T細胞動員分子の結合。MR1-1×CD3二重特異性T細胞動員分子で染色されたU87MG.EGFR（野生型）（上）およびU87MG.ΔEGFRvIII（下）。
【図７】フローサイトメトリーによるCD3発現ヒトPBMCへのMR1-1×CD3二重特異性T細胞動員分子の結合を示す。上のパネルでは、MR1-1二重特異性T細胞動員分子をFITCで標識して、抗CD4-PEまたは抗CD8-PEと一緒に直接PBMC細胞を染色した。下のパネルでは、細胞へのMR1-1二重特異性T細胞動員分子の結合を抗His Alex 488により検出した。
【図８】図8A〜8Bは、MR1-1×CD3がインビトロで用量依存的な特異的溶解を媒介することを示す。グリオーマ細胞株U87MG（897）およびU87MG-EGFRvIII（898）のリダイレクト溶解（redirected lysis）は、18時間のアッセイ期間にわたり増加する濃度の二重特異性T細胞動員分子の存在下でヒトPBLを用いて試験した。エフェクターおよび標的細胞を20：1のE：T比で混合した。エラーバーは三つ組の測定値のSDを示す。特異的溶解は標準的なクロム放出アッセイによって評価した。
【図９】NSGマウスにおける皮下U87MG-EGFRvIII腫瘍増殖のMR1-1×CD3による用量依存的抑制を示す。3×105個のU87MG-EGFRvIII細胞を3×105個のヒトPBLと混合し（1：1のE：T）、1群8匹の雄NSGマウスの右脇腹に皮下注入した。腫瘍細胞を移植してから1時間後に、1μg、10μg、100μg、およびビヒクル対照を尾静脈に注射して治療を開始した。4日間連続して治療を繰り返した。腫瘍を週3回キャリパーで測定した。
【図１０】GBM患者からの完全ヒト抗EGFRvIII抗体のクローニングを詳述するフロー図である。
【図１１】mAb 139および28F11に基づく完全ヒトEGFRvIII特異的BiTEのためのcDNA配列および設計を示す。（139 VH；SEQ ID NO：2）；（139 VL；SEQ ID NO：3）；（Gly4Ser；SEQ ID NO：4）；（28F11 VH；SEQ ID NO：5）；（28F11 VL；SEQ ID NO：6）；（ヘキサヒスチジン；SEQ ID NO：7）。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明者らは、EGFRvIIIとT細胞活性化リガンドCD3の両方を標的とするヒト二重特異性T細胞動員分子を開発した。それらは、EGFRvIIIを発現する癌細胞に細胞傷害性T細胞を補充しかつ細胞傷害性T細胞を活性化し、それによってEGFRvIII分子を発現する癌細胞を死滅させることが見出された。二重特異性T細胞動員分子は、細胞外環境からの該抗体に接近可能な、哺乳動物細胞の表面上に提示されたEGFRvIIIおよびT細胞活性化リガンドCD3と選択的に反応する。
【００１３】
多くのタイプの二重特異性抗体を構築して使用することが可能である。これらには、限定するものではないが、クアドローマ由来のF(ab')2、ヘテロ二量体のscFv、ヘテロ二量体のFab、ダイアボディ、タンデムダイアボディ、およびタンデムscFv分子が含まれる。二重特異性抗体はまた、三官能性抗体、すなわち、EGFRvIIIとT細胞活性化リガンドに対する最初の2つだけでなく第3の特異性を有する抗体、を用いて作製することもできる。多くの形態が当技術分野で周知である。
【００１４】
ひとたび二重特異性T細胞動員分子が構築されたら、それらは組換え細胞内で産生され得る。適切であればどのような細胞型を使用してもよい。二重特異性T細胞動員分子が分泌される場合には、それらを培養培地から回収することができる。それらが細胞内に残っている場合には、細胞を採取して適当な条件下で破壊し、適切な細胞画分から二重特異性T細胞動員分子を回収することができる。二重特異性T細胞動員分子を産生させるために、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、藻類細胞、哺乳動物細胞を含めて、便利な細胞宿主はどれも使用することができる。ある状況では、二重特異性T細胞動員分子は安定にトランスフェクトされたCHO細胞において産生され、その上清が産生された二重特異性T細胞動員分子を含むであろう。
【００１５】
EGFRvIIIを発現する腫瘍はどれでも標的として、二重特異性T細胞動員分子を用いて治療することができる。EGFRvIII抗原を発現することが見出された腫瘍としては、多形性膠芽腫などの脳腫瘍、乳癌、および肺癌が挙げられる。これらのまたは他の腫瘍のいずれも、それがこの変異抗原を発現する場合には、標的とすることができる。
【００１６】
定義
単位、接頭辞、および記号は、国際単位系（Systeme International de Unites: SI）に受け入れられた形態で表示される。数値範囲は、その範囲を既定している数値を含む。特に断らない限り、核酸は5'から3'の方向で左から右に向かって書かれる；アミノ酸配列はアミノからカルボキシの方向で左から右に向かって書かれる。本明細書に提供される見出しは、本明細書全体を参照することにより得られる本開示のさまざまな局面または態様を限定するものではない。したがって、以下に定義される用語は、本明細書全体を参照することによりさらに十分に定義される。
【００１７】
「EGFRvIII」は、MR1 scFvによって認識され、かつアミノ末端付近のエクソン2から7までの801塩基対のインフレーム欠失により特徴づけられる、上皮成長因子受容体の変異型を意味する。前記受容体のこの変異型は、「背景」で引用したWickstrandら、Moscatelloら、およびLorimerらの文献に示されるように、当技術分野で知られている。用語の変更のため、EGFRvIIIは当初、米国特許第5,212,290号に示されるように、当分野のいくつかの以前の研究ではタイプII変異と呼ばれていた。
【００１８】
用語「CD3」は、T細胞受容体に関連するタンパク質複合体を指す。CD3に対する抗体は、Tリンパ球の活性化シグナルを発生することができる。他のT細胞活性化リガンドも同様に使用することができ、限定するものではないが、CD28、CD134、CD137、およびCD27などが含まれる。
【００１９】
本明細書で使用する「抗体」は、特定の抗原と免疫学的に反応する免疫グロブリン分子への言及を含み、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を含む。この用語はまた、遺伝子操作された形態、例えば、キメラ抗体（例：ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例：二重特異性抗体）、および組換え単鎖Fvフラグメント（scFv）、ジスルフィド安定化（dsFv）Fvフラグメント（米国出願第08/077,252号参照；参照により本明細書に組み入れられる）、またはpFvフラグメント（米国仮特許出願第60/042,350号および第60/048,848号参照；これらの両方は参照により本明細書に組み入れられる）を包含する。用語「抗体」はまた、抗体の抗原結合形態（例えば、Fab'、F(ab')2、Fab、FvおよびrIgG）をも包含する（Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995（Pierce Chemical社, Rockford, イリノイ州）を参照されたい）。
【００２０】
特定の抗原と免疫学的に反応する抗体は、ファージまたは同様のベクター中の組換え抗体のライブラリーの選択など、組換え法によって作製することができる（例えば、Huse, et al., Science 246:1275-1281 (1989); Ward, et al., Nature 341:544-546 (1989); およびVaughan, et al. , Nature Biotech. 14:309-314 (1996)を参照されたい）。
【００２１】
典型的には、免疫グロブリンは重鎖および軽鎖を有する。重鎖および軽鎖はそれぞれが定常領域と可変領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、相補性決定領域またはCDRとも呼ばれる3つの超可変領域で中断された「フレームワーク」領域を含む。フレームワーク領域およびCDRの範囲は規定されている（SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, Kabat, E., et al., U.S. Department of Health and Human Services, (1987)参照；これは参照により本明細書に組み入れられる）。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、すなわち構成要素である軽鎖と重鎖の組み合わされたフレームワーク領域は、CDRを三次元空間に位置づけて整列させるのに役立つ。CDRは主に、抗原のエピトープへの結合に関与している。CDRは通常、CDR1、CDR2、およびCDR3と呼ばれており、N末端から開始して順に番号が付けられている。
【００２２】
語句「単鎖Fv」または「scFv」は、従来の2本鎖抗体の重鎖と軽鎖が1本の鎖を形成するように連結された抗体を指す。一般的には、適切な折りたたみと活性結合部位の構築を可能にするために、2本の鎖の間にリンカーペプチドが挿入される。
【００２３】
用語「リンカーペプチド」は、可変重鎖を可変軽鎖に間接的に結合させるのに役立つ、抗体結合フラグメント（例えば、Fvフラグメント）内のペプチドへの言及を含む。リンカーは、例えば、一連の単一アミノ酸またはアミノ酸類の交互のパターンとすることができる。
【００２４】
用語「接触」は、直接的な物理的会合での配置への言及を含む。本発明に関しては、この用語は抗体-抗原結合を指す。
【００２５】
本明細書で使用する用語「二重特異性T細胞動員分子」（bispecific T-cell engaging molecule）は、所望の分子を発現する腫瘍細胞を標的とすることによって癌細胞を死滅させるために、対象者のT細胞を利用するように設計された分子を指す。特定の態様では、所望の分子はヒトEGFRvIIIである。他の態様では、二重特異性T細胞動員分子は2つのFvドメインを含む。他の態様では、二重特異性T細胞動員分子は、EGFRvIIIに対する第1のFvドメインおよびCD3に対する第2のFvドメインを含む。これらのFvドメインはscFvドメインであり得る。
【００２６】
用語「選択的に反応する」は、EGFRvIIIまたはCD3を欠く細胞または組織とではなく、EGFRvIIIまたはCD3を保持する細胞または組織との、全体もしくは部分としての、抗体の優先的な会合への言及を含む。当然、ある程度の非特異的相互作用が分子と非標的細胞または組織の間で起こり得ることは認識されている。それでもなお、選択的反応性は、EGFRvIIIおよびCD3の特異的認識を介して媒介されるとして区別することができる。選択的に反応する抗体は抗原に結合するが、それらは低い親和性でそのようにしてもよい。一方、特異的結合は、結合した抗体とEGFRvIIIまたはCD3を欠く細胞との間または低親和性の抗体-抗原結合よりもむしろ、抗体とEGFRvIIIまたはCD3を保持する細胞との間に、はるかに強い会合をもたらす。特異的結合は、典型的には、EGFRvIIIまたはCD3を欠く細胞または組織と比較して、EGFRvIIIまたはCD3を保持する細胞または組織に結合した抗体の量（単位時間あたり）の2倍以上、好ましくは5倍以上、より好ましくは10倍以上、最も好ましくは100倍以上の増加をもたらす。このような条件下でのタンパク質への特異的結合は、特定のタンパク質に対するその特異性について選択された抗体を必要とする。さまざまなイムノアッセイフォーマットは、特定のタンパク質と特異的に免疫反応する抗体を選択するのに適している。例えば、固相ELISAイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応するモノクローナル抗体を選択するために通常使用されている。特異的な免疫反応性を測定するために用いることができるイムノアッセイのフォーマットおよび条件の説明については、Harlow & Lane, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York（1988）を参照されたい。本発明のいくつかの態様では、抗体は野生型EGFRに結合するよりもEGFRvIIIによく結合するだろう。場合によっては、抗体は両方に結合するだろう。示差結合は、より強い結合に、またはより速い結合に、または一定の時間で一定量の抗原へのより多くの結合に反映され得る。より良い結合は、少なくとも2、4、6、8、または10倍であってよい。いくつかの病的状態の下では、EGFRの変異型と野生型の両方にある程度結合することが有利な場合があり、例えば、両方の型が腫瘍標的上に共発現される場合がそうである。他の病的状況の下では、例えば、有害な副作用を減らすために、変異型に対して利用可能な特異性の最大量を有することが望ましいかもしれない。
【００２７】
本明細書で使用する「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーへの言及を含む。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸ポリマーにだけでなく、1個または複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工的な化学類似体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。これらの用語はまた、タンパク質が機能性のままであるような保存的アミノ酸置換を含むポリマーにも適用される。
【００２８】
用語「残基」または「アミノ酸残基」または「アミノ酸」は、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（まとめて「ペプチド」）に組み込まれるアミノ酸への言及を含む。アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸とすることができ、別途に限定した場合を除き、天然に存在するアミノ酸と同様に機能しうる天然アミノ酸の公知の類似体を包含する。
【００２９】
語句「ジスルフィド結合」または「システイン-システインジスルフィド結合」は、2個のシステイン間の共有結合性相互作用を指し、これらのシステインの硫黄原子が酸化されてジスルフィド結合を形成している。ジスルフィド結合の平均結合エネルギーは約60 kcal/molであるのに対して、水素結合のそれは1〜2 kcal/molである。本発明との関係においては、ジスルフィド結合を形成しているシステインは、単鎖抗体のフレームワーク領域内にあり、抗体のコンフォメーションを安定化するのに役立つ。安定化するためのジスルフィド結合が分子内に形成され得るように、システイン残基を、例えば部位特異的変異誘発によって、導入することができる。
【００３０】
本明細書で使用する「組換え」は、あるタンパク質を発現することができるDNAの内因性コピーを、その天然状態では持たない細胞を用いて産生された該タンパク質への言及を含む。前記細胞は組換えタンパク質を産生するが、それは、それらが適切な単離された核酸配列の導入によって遺伝的に改変されているためである。この用語はまた、異種核酸の導入によって、または天然ではその細胞にない形態への天然核酸の変化によって、改変されているか、あるいはそのように改変された細胞に由来する、細胞、または核酸、またはベクターへの言及を含む。したがって、例えば、組換え細胞は、該細胞の天然（非組換え）形態内では見出されない遺伝子を発現するか、天然形態内で見出される遺伝子の変異体を発現するか、さもなければ異常に発現される、過少発現される、または全く発現されない天然の遺伝子を発現する。
【００３１】
本明細書で使用する「核酸」または「核酸配列」は、一本鎖または二本鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーへの言及を含み、別途に限定した場合を除き、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で核酸にハイブリダイズする天然のヌクレオチドの公知の類似体を包含する。特に指示しない限り、特定の核酸配列は、その相補配列ならびに保存的変異体、すなわちタンパク質に翻訳されたときアミノ酸の保存的置換をもたらす、コドンおよび変異体のウォブル位（wobble position）に存在する核酸、を含む。
【００３２】
本明細書で使用する場合、特定の核酸に関して「コードする」とは、特定のタンパク質への翻訳のための情報を含んでいる核酸への言及を含む。その情報はコドンの使用によって特定される。一般的に、アミノ酸配列は「普遍的」遺伝子コードを用いる核酸によってコードされる。しかし、一部の植物、動物、および真菌のミトコンドリア、細菌マイコプラズマ・カプリコラム（Mycoplasma capricolum）（Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:2306-2309 (1985)）、または繊毛虫の大核（Macronucleus）に存在するような、普遍的コードの変異体は、核酸がこれらの生物の翻訳機構を用いて発現される場合に、使用することができる。
【００３３】
語句「インフレームに融合する」とは、連結された核酸配列が、元のポリペプチド鎖を含む単鎖のタンパク質に翻訳されるように、ポリペプチドをコードする2つ以上の核酸配列を連結することを指す。
【００３４】
本明細書で使用する「発現された」とは、核酸のタンパク質への翻訳への言及を含む。タンパク質は、発現されて細胞内にとどまるか、細胞表面膜の構成成分になるか、または細胞外マトリックスまたは培地に分泌され得る。
【００３５】
「宿主細胞」とは、発現ベクターの複製または発現を支持することができる細胞を意味する。宿主細胞は、大腸菌（E. coli）などの原核細胞、または酵母、昆虫、両生類、もしくは哺乳動物細胞などの真核細胞とすることができる。
【００３６】
語句「ファージディスプレイライブラリー」は、各バクテリオファージが表面タンパク質に組換え的にインフレームで融合された外来cDNAを含む、バクテリオファージの集団を指す。ファージは、その表面上にcDNAによりコードされた外来タンパク質を表示する。細菌宿主、一般的には大腸菌内で複製させた後、関心対象の外来cDNAを含むファージがファージ表面上での外来タンパク質の発現によって選択される。
【００３７】
2つの核酸またはポリペプチド配列との関連で「配列同一性」は、指定された比較ウィンドウにわたって最大一致のためにアライメントさせた場合に同じである、2つの配列中のヌクレオチド（または残基）への言及を含む。配列同一性の割合がタンパク質に関して使用される場合に、同一でない残基位置はしばしば保存的アミノ酸置換によって相違しており、そうした置換ではアミノ酸残基は、同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換されており、したがって、その分子の機能的特性を変更しないことが認識されている。配列が保存的置換において相違する場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質を補正するために上方に調整され得る。この調整を行うための手段は当業者に周知である。通常、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングし、それにより配列同一性パーセントを増加させることを含む。こうして、例えば、同一のアミノ酸が1のスコアを与えられ、かつ非保存的置換がゼロのスコアを与えられる場合、保存的置換はゼロと1の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えばプログラムPC/GENE (Intelligenetics社, Mountain View, カリフォルニア州, 米国）で実行されるように、例えばMeyers & Miller, Computer Applic. Biol. Sci. 4: 11-17 (1988）のアルゴリズムに従って、計算される。2つのペプチド配列が実質的に類似していることの指標は、一方のペプチドが他方のペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に反応することである。したがって、例えば、2つのペプチドが保存的置換によってのみ相違する場合、一方のペプチドは他方のペプチドに実質的に類似している。
【００３８】
本明細書で使用する「比較ウィンドウ」は、約10〜20残基のセグメントへの言及を含み、ここでは、ある配列を同数の連続した位置の参照配列と比較する前に、これら2つの配列が最適にアライメントされる。比較のための配列のアライメント方法は当技術分野で周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、以下により行うことができる：Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981）のローカル相同性アルゴリズム；Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970）の相同性アライメントアルゴリズム；Pearson & Lipman, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 85:2444 (1988）の類似性検索法；これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Intelligenetics社（Mountain View, カリフォルニア州）のPC/Geneプログラム中のCLUSTAL、Genetics Computer Group（GCG）（Madison, ウィスコンシン州, 米国）のWisconsin Geneticsソフトウェアパッケージ中のGAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、およびTFASTAを含むが、これらに限定されない）；CLUSTALプログラムは、Higgins & Sharp, Gene 73:237-244 (1988）およびHiggins & Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989）; Corpet, et al, Nucl. Acids Res. 16:10881-90 (1988); Huang, et al. Computer Applications in the Biosciences 8:155-65 (1992); ならびにPearson, et al., Meth. in Molec. Biol. 24:307-31 (1994）によく説明されている。
【００３９】
用語「有効量」または「〜に有効な量」または「治療的有効量」は、細胞タンパク質合成を少なくとも50％阻害する、または細胞を死滅させるなどの、所望の結果を生じさせるのに十分な治療薬の投与量への言及を含む。
【００４０】
用語「治療薬」は、抗悪性腫瘍薬、抗炎症薬、サイトカイン、抗感染症薬、酵素活性化剤もしくは阻害剤、アロステリック調節剤、抗生物質、または患者において所望の治療効果を引き出すために投与される他の薬剤として作用することが現在知られている、または将来開発される化合物を幾つでも包含する。
【００４１】
用語「インビボ」は、細胞が得られた生物の体内への言及を含む。「エクスビボ」および「インビトロ」は、細胞が得られた生物の身体の外側を意味する。
【００４２】
ひとたび本開示の二重特異性T細胞動員分子をコードする核酸が単離され、クローン化されたら、細菌、植物、酵母、昆虫、および哺乳動物細胞などの組換え的に操作された細胞において所望のタンパク質を発現させることが可能である。当業者は、大腸菌、他の細菌宿主、酵母、ならびに種々の高等真核細胞、例えばCOS、CHO、HeLaおよびミエローマ細胞株などを含めて、タンパク質の発現に利用可能な多数の発現系に精通していると予想される。原核生物または真核生物においてタンパク質を発現させるための種々の公知方法を詳細に説明するつもりはない。手短に述べると、本発明の単離されたタンパク質をコードする天然または合成核酸の発現は、典型的には、そのDNAまたはcDNAをプロモーター（構成的または誘導性のいずれかである）に機能的に連結し、続いて発現カセットに組み込むことによって達成される。こうしたカセットは、原核生物または真核生物における複製および組み込みに適している。典型的な発現カセットは、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、ならびにタンパク質をコードするDNAの発現の調節に有用なプロモーターを含む。クローン化遺伝子の高レベル発現を得るためには、最低でも、転写を指令するための強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、および転写/翻訳ターミネーターが含まれている発現カセットを構築することが望ましい。大腸菌の場合、これは、T7、trp、lac、またはλプロモーターなどのプロモーター、リボソーム結合部位、および好ましくは転写終結シグナルを含む。真核細胞の場合、制御配列は、プロモーターと、好ましくは免疫グロブリン遺伝子、SV40、サイトメガロウイルスに由来するエンハンサー、およびポリアデニル化配列を含むことができ、さらにスプライスドナーおよびアクセプター配列を含んでもよい。本発明のカセットは、例えば大腸菌のための塩化カルシウム形質転換またはエレクトロポレーション、および哺乳動物細胞のためのリン酸カルシウム処理、エレクトロポレーションまたはリポフェクションなどの周知の方法によって、選択された宿主細胞に導入することができる。カセットで形質転換された細胞は、amp、gpt、neoおよびhyg遺伝子など、カセットに含まれる遺伝子により付与される抗生物質に対する耐性によって選択することができる。また、DNAは、例えばナノ粒子または他のDNA送達システム上で、レシピエント患者に送達することができ、患者は、インビボで自身の二重特異性T細胞動員分子を産生することができると考えられる。
【００４３】
当業者は、本開示のポリペプチド（すなわち、抗EGFRvIIIまたは抗CD3）をコードする核酸に対して、その生物学的活性を低減することなく、改変がなされ得ることを認識するであろう。いくつかの改変は、クローニング、発現、または融合タンパク質へのターゲティング分子の組み込みを容易にするために行うことができる。こうした改変は当業者に周知であり、例えば、開始部位を提供するためにアミノ末端に追加されるメチオニン、または適当な位置にある制限部位もしくは終止コドンもしくは精製配列を作製するためにいずれかの末端に配置される追加のアミノ酸（例えば、ポリHis）が含まれる。
【００４４】
語句「悪性細胞」または「悪性腫瘍」は、侵襲性でありかつ/または転移可能である腫瘍もしくは腫瘍細胞、すなわち癌性細胞を意味する。
【００４５】
組換え法に加えて、本開示の二重特異性T細胞動員分子はまた、標準的なペプチド合成を用いて、全体的にまたは部分的に構築することができる。長さが約50アミノ酸より少ない本発明のポリペプチドの固相合成は、その配列のC末端アミノ酸を不溶性支持体に結合させ、続いて該配列中の残りのアミノ酸を逐次付加することによって達成することができる。固相合成のための技術は、Barany & Merrifieid, THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS, BIOLOGY. VOL. 2: SPECIAL METHODS IN PEPTIDE SYNTHESIS, PART A. pp. 3-284; Merrifieid, et al. J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963）およびStewart, et al., SOLID PHASE PEPTIDE SYNTHESIS, 2ND ED., Pierce Chem. Co., Rockford, I11. (1984）に記載されている。より長いタンパク質は、より短い断片のアミノ末端とカルボキシル末端の縮合によって合成することができる。カルボキシル末端の活性化（例えば、カップリング試薬N,N'-ジシクロヘキシルカルボジイミドの使用による）によってペプチド結合を形成する方法は、当業者に知られている。
【００４６】
T細胞を腫瘍特異的抗原にリダイレクトすることに加えて、二重特異性T細胞動員分子はまた、表面上にEGFRvIIIを発現する細胞に他の診断用または治療用化合物を運ぶために使用することができる。こうして、二重特異性T細胞動員分子は、薬物がEGFRvIIIを保持する細胞に直接送達されるように、薬物に直接または間接的に、例えばリンカーを介して、結合させることができる。治療薬には、核酸、タンパク質、ペプチド、アミノ酸もしくは誘導体のような化合物、糖タンパク質、放射性同位体、脂質、炭水化物、または組換えウイルスが含まれる。核酸の治療用および診断用成分には、アンチセンス核酸、一重鎖もしくは二重鎖DNAと共有結合架橋するための誘導体化オリゴヌクレオチド、および三重鎖を形成するオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００４７】
あるいは、二重特異性T細胞動員分子に連結される分子は、カプセル化システムとすることができ、例えば、薬物、核酸（例えば、アンチセンス核酸）、または循環系への直接曝露から遮蔽されることが好ましい他の治療成分などの治療用組成物を含有するリポソームまたはミセルであり得る。抗体に結合されたリポソームを調製する手段は当業者に周知である。例えば、米国特許第4,957,735号；およびConnor, et al., Pharm. Ther. 28:341-365 (1985）を参照されたい。
【００４８】
本開示の二重特異性T細胞動員分子は、非経口投与、例えば、静脈内投与または体腔もしくは器官の内腔への投与などに特に有用である。例えば、卵巣の悪性腫瘍は、静脈内投与によって、または腫瘍の周囲の組織への局所的送達によって治療することができる。脳内の腫瘍の治療では、該分子は、例えば注射によって、脳に直接送達されるか、または該分子は静脈内に投与され、その後血液脳関門を通過することができる。
【００４９】
投与のための組成物は、通常、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体中に溶解された二重特異性T細胞動員分子の溶液を含む。さまざまな水性担体、例えば緩衝生理食塩水などを使用することができる。こうした溶液は無菌であり、かつ望ましくない物質を通常含まない。これらの組成物は従来の周知の滅菌技術で滅菌することができる。組成物は、生理的条件に近づけるために、必要に応じてpH調整剤、緩衝剤、毒性調整剤などの薬学的に許容される補助物質、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有することができる。これらの製剤中の融合タンパク質の濃度は、広範囲に変えることができ、主に流体の体積、粘度、体重などに基づいて、選択された特定の投与方法および患者のニーズに従って選択される。
【００５０】
このようにして、静脈内投与用の本発明の典型的な薬学的組成物は、患者あたり約0.1〜10mg/日である。患者あたり0.1〜約100mg/日の投与量は、特に薬物が、循環系またはリンパ系にではなく、隔離された部位に、例えば体腔または器官の内腔に投与される場合に、使用することができる。投与可能な組成物を調製するための実際の方法は知られているか、当業者には明らかであり、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE、第19版（1995)（Mack Publishing社, Easton, ペンシルバニア州）のような刊行物に詳細に記載されている。
【００５１】
本発明の組成物は、治療的処置のために投与することができる。治療用途では、組成物は、疾患に罹患している患者に、疾患およびその合併症を治癒するか、または少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与される。これを達成するのに十分な量は、「治療的有効量」として定義される。この用途に有効な量は、疾患の重症度および患者の一般的な健康状態に依存する。本化合物の有効量は、1つまたは複数の症状の主観的な軽減、または臨床医もしくは他の資格のある観察者が気づくような客観的に確認できる改善のいずれかを提供する量である。
【００５２】
組成物の単回または複数回投与は、患者が必要としかつ耐えられる投与量および頻度に応じて投与される。いずれにしても、組成物は、患者を有効に治療するのに十分な量の本発明のタンパク質を提供すべきである。好ましくは、投与量は1回投与されるが、治療結果が達成されるまで、または副作用により治療の中止を必要とするまで、定期的に適用することができる。一般に、用量は、容認できない毒性を患者にもたらすことなく、疾患の症状もしくは兆候を治療または改善するのに十分なものである。
【００５３】
本開示の薬学的組成物の制御放出型非経口製剤は、インプラント、油性注射剤、または粒子状システムとして製造することができる。タンパク質の送達システムの概観については、参照により本明細書に組み入れられるBanga, A. J., THERAPEUTIC PEPTIDES AND PROTEINS: FORMULATION, PROCESSING, AND DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing社, Lancaster, ペンシルバニア州, (1995）を参照されたい。粒子状システムとしては、ミクロスフェア、微粒子、マイクロカプセル、ナノカプセル、ナノスフェア、およびナノ粒子が挙げられる。マイクロカプセルには、中心コアとして治療用タンパク質が含まれる。ミクロスフェアでは、治療薬が粒子全体に分散される。約1μmより小さい粒子、ミクロスフェア、およびマイクロカプセルは一般に、それぞれ、ナノ粒子、ナノスフェア、およびナノカプセルと呼ばれている。毛細血管は約5μmの直径を有し、その結果ナノ粒子のみが静脈内に投与される。微粒子は、典型的には約100μmの直径であり、皮下または筋肉内に投与される。例えば、Kreuter, J., COLLOIDAL DRUG DELIVERY SYSTEMS, J. Kreuter編, Marcel Dekker社, New York, N.Y., pp. 219-342 (1994）; およびTice & Tabibi, TREATISE ON CONTROLLED DRUG DELIVERY, A. Kydonieus編, Marcel Dekker社, New York, N.Y., pp. 315-339 (1992）を参照されたい；これらの両方は参照により本明細書に組み入れられる。
【００５４】
ポリマーは、本発明の薬学的組成物のイオン制御放出のために使用され得る。薬物の制御送達に使用される種々の分解性および非分解性ポリマーマトリックスは、当技術分野で公知である（Langer, R., Accounts Chem. Res. 26:537-542 (1993)）。例えば、ブロックコポリマーのポロキサマー407は、低温では粘性の、まだ流動性の液体として存在するが、体温では半固体のゲルを形成する。これは、組換えインターロイキン-2とウレアーゼの製剤化および持続送達のための有効なビヒクルであることが示されている（Johnston, et al., Pharm. Res. 9:425-434 (1992); およびPec, et al., J. Parent. Sci. Tech. 44(2):58-65 (1990)）。あるいは、ヒドロキシアパタイトは、タンパク質の制御放出のためのマイクロキャリアとして使用されている（Ijntema, et al., Int. J. Pharm. 112:215-224 (1994)）。さらに別の側面では、リポソームが、脂質カプセル化薬物の薬物ターゲティングだけでなく制御放出のためにも使用されている（Betageri, et al., LIPOSOME DRUG DELIVERY SYSTEMS, Technomic Publishing社, Lancaster, ペンシルバニア州(1993)）。治療用タンパク質の制御送達のためのさらなるシステムは多数知られている。例えば、以下の米国特許を参照されたい：5,055,303; 5,188,837; 4,235,871; 4,501,728; 4,837,028; 4,957,735; 5,019,369; 5,055,303; 5,514,670; 5,413,797; 5,268,164; 5,004,697; 4,902,505; 5,506,206; 5,271,961; 5,254,342および5,534,496；それぞれは参照により本明細書に組み入れられる。
【００５５】
本発明の二重特異性T細胞動員分子のさまざまな用途には、この融合タンパク質の毒性作用によって取り除くことができる、特定のヒト細胞により引き起こされる種々の病的状態が含まれる。本発明の二重特異性T細胞動員分子の1つの好ましい用途は、EGFRvIIIを発現する悪性細胞の治療である。代表的な悪性細胞としては、星状細胞腫、膠芽細胞腫、メラノーマなどが挙げられる。
【００５６】
本明細書で使用する「哺乳動物細胞」は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、チンパンジーまたはマカクなどの哺乳動物に由来する細胞への言及を含む。こうした細胞はインビボまたはインビトロで培養することができる。
【００５７】
上記の開示は本発明を概略的に説明するものである。本明細書に開示された全ての参考文献は、参照により明示的に組み入れられる。より完全な理解は以下の具体的な実施例を参照することによって得ることができ、これらの実施例は、例示のみの目的で本明細書に提供され、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５８】
実施例1
本発明者らは、マウス抗ヒトEGFRvIII単鎖FvであるMR1-1と、マウス抗ヒトCD3単鎖FvであるaCD3とから成る、分子MR1-1×aCD3を構築した。MR1-1×aCD3を細菌BL21（DE3）において発現させて、該細菌から精製した。この二重機能分子の活性は、EGFRvIIIを発現する細胞株ならびにヒトT細胞へのその特異的結合を示すFACSによって確認した。EGFRvIIIを発現するGBM D54MG.EGFRvIII細胞株に対するMR1-1×aCD3の細胞傷害性は、標準的なクロム放出アッセイによってインビトロで測定した。MR1-1×aCD3の有効性は、ヒトEGFRvIII発現細胞株を移植したNOD/SCIDγマウスにおいて評価した。本発明者らの結果は、MR1-1×aCD3構築物が高度に細胞傷害性および抗原特異性であって、野生型対照と比べてD54MG.EGFRvIIIに対して特異的溶解が8倍増加を有することを示した。皮下モデルでは、腫瘍増殖が用量依存的に抑制された。完全抑制は100mcg/マウス/日で達成されたが、低用量は最適化することで効果的に作用する可能性がある。まとめると、本発明者らの実験では、ヒトEGFRvIII特異性T細胞動員分子MR1-1×aCD3は、EGFRvIIIを発現する腫瘍に対して有効であることが示された。
【００５９】
EGFRvIIIに特異的な、マウスMAb scFvのMR1-1（図2）は、組換え免疫毒素のフォーマットでGBM治療に適したビヒクルであることが実証されており、現在本発明者らの研究機関で臨床試験中である（BB-IND-12,589）。しかし、マウス由来の抗体の生得的な特性は、それらの広い用途を制限する中和抗体を誘発する可能性がある。そのため、臨床試験用の組換え二重特異性T細胞動員分子の構築のためには完全にヒトのMAbがより望ましい。
【００６０】
高親和性のヒト抗EGFRvIII MAbおよびscFvを得るために、本発明者らは、（1）電気融合法を用いてEGFRvIII特異的B細胞をHMMA2.5非分泌性骨髄腫パートナーに融合するか、または（2）EGFRvIII特異的エピトープでワクチン接種したGBM患者に直接由来する抗体分泌B細胞クローンから作製されたDNAライブラリーからの可変重鎖および軽鎖をクローン化する。
【００６１】
これらの患者での進行中の臨床試験において、本発明者らは、EGFRvIII特異的ペプチド：（PEPvIII：LEEKKGNYVVTDH；SEQ ID NO：1）によるワクチン接種が、43人中32人の患者に高力価のEGFRvIII特異的抗体を誘導し、一部の患者は力価＞1：2,000,000を生じることを示した（図3A、左）。平均6nM（KD）の高親和性EGFRvIII特異的抗体の産生は、BIAcore SPR分析を用いてEGFRvIII ECDを分析することにより確認された（図3B、右）。
【００６２】
MAbを直接ヒトB細胞から効率的にクローン化することは、しばしば困難である。本発明者らの予備段階の結果では、PEPvIIIで刺激した後のワクチン接種GBM患者（図4のACT II-18）のヒトB細胞由来の上清は、後日、EGFRvIIIトランスフェクト細胞（NR6M）および野生型EGFRwtトランスフェクタント（NR6W）に陽性反応を示した（図4A、左）。本発明者らの患者からの試料を用いて、本発明者らは、エプスタイン・バーウイルス（EBV）でB細胞を形質転換することができ、これらの細胞が少なくとも2週間の長期間にわたってペプチド刺激後に高力価のEGFRvIII特異的抗体を分泌する能力を維持することを実証した（図4B、中央）。本発明者らのパイロット研究では、4つのうち3つの患者試料が首尾よく形質転換されて、高力価の高親和性抗体の産生を実証した（図4C、右）。
【００６３】
実施例2
これらのヒトEGFRvIII特異的scFvに基づく組換え二重特異性T細胞動員分子を構築するために、本発明者らは、MR1-1×CD3分子（図5）を作製するために以前に使用した既存のカセットに、MR1-1 scFv部分を置換することによって、ヒト抗EGFRvIII scFvをサブクローニングする。マウス抗ヒトCD3 scFvはハイブリドーマ株OKT3（ATCC, CRL 8001）からクローン化した。精製後のMR1-1二重特異性T細胞動員分子は、SDS-PAGEゲルで示され、55kDaの分子量を有していた（図5；挿入図）。MR1-1二重特異性T細胞動員分子は、EGFRvIIIに特異的に結合し、かつCD3への結合を介して付随的にT細胞を動員する（図6）。EGFRvIIIへの結合能および特異性は、NR6M（EGFRvIII）およびNR6W（EGFRwt）細胞株ならびにEGFRvIIIでトランスフェクトされたGBM細胞株（U87MG.ΔEGFR）を用いることによって確認した（図6）。同様に、CD3への結合はヒト末梢血単核細胞（PBMC）およびJurkat細胞を染色することによって確認し、これはヒトPBMCまたはJurkat細胞からの同じT細胞亜集団上での二重特異性T細胞動員分子と抗CD4または抗CD8の共結合を示していた（図7）。二重特異性T細胞動員分子を作製するためにヒトscFvを使用することは、中和抗体の生成を低減して、反復投与を可能にするが、既存のMR1-1二重特異性T細胞動員分子も使用することが可能である。
【００６４】
実施例3
腫瘍細胞に対する潜在的な同種免疫反応を最小限に抑えるために、本発明者らは、既存の適合したヒト末梢血リンパ球（PBL）およびGBM細胞株の本発明者らのバンクをこれらのアッセイにおいて使用した。MR1-1二重特異性T細胞動員分子の細胞傷害性は、エフェクター細胞として非刺激PBLを、標的細胞として野生型EGFRを発現するヒトGBM細胞株U87MGおよびトランスフェクトされたU87MG-EGFRvIII細胞株を用いて、標準的なクロム放出アッセイにより測定した。結果は、MR1-1構築物が高度に細胞傷害性および抗原特異性であって、野生型対照のU87MGと比べてU87MG-EGFRvIIIに対して特異的溶解（％）のほぼ25倍増加を有することを示す（図8A、左）。これらの結果は、二重特異性構築物bscCD19×CD34についてインビトロで最初に報告された試験結果を、超えないまでも、反映している。二重特異性構築物bscCD19×CD34は、それ以来、ヒト臨床治験で試験されて、非ホジキンリンパ腫の患者において強力な腫瘍退縮を誘導することが見出されている。MR1-1二重特異性T細胞動員分子による特異的溶解は、18時間後に、対照細胞が約1％〜2％であることに比べて、U87MG-EGFRvIIIは30％であり（図8B、右）、MR1-1二重特異性T細胞動員分子がインビトロで用量依存的な特異的溶解を媒介したことを示している。
【００６５】
実施例4
MR1-1二重特異性T細胞動員分子の有効性はNSGマウスで評価した。本発明者らは、NSGマウスの皮下でU87MG-EGFRvIIIに対するMR1-1二重特異性T細胞動員分子の有効性を確認した。簡単に説明すると、0.25％トリプシン-EDTAを用いてU87MG-EGFRIII細胞（集密度70％〜80％）を採取した。細胞を滅菌PBSで2回洗浄した。PBLは、AIM-V 2％HABS中での1時間のインキュベーション後に健康なドナーのPBMC白血球搬出から非接着性部分として回収した。3×105個のU87MG-EGFRvIII細胞を3×105個のヒトPBLと混合し（1：1のE：T）、1群8匹の雄NSGマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍細胞の移植の1時間後に1μg、10μg、100μg、およびビヒクル対照を尾静脈に注射することによる治療を開始した。治療は4日連続して繰り返した。その結果により、MR1-1×CD3によるNSGマウスにおける皮下U87MG-EGFRvIII腫瘍の増殖抑制が28日間の観察後に用量依存的であることが示された（図9）。未治療の腫瘍は着実に増殖し続けた。1μg群には8匹のうち2匹に触知可能な腫瘍が認められた。10μg治療群には1匹に触知可能な腫瘍が存在した。100μg治療群には腫瘍が認められなかった。U87MG-EGFRvIIIの治療に対するMR1-1二重特異性T細胞動員分子の有効性は、効力および用量依存性の面で非常に顕著でありかつ有望であった。
【００６６】
実施例5
EBV形質転換B細胞は、ヒトゲノムへのウイルス組み込みが非常に不安定であるため、多クローン性抗EGFRvIII抗体の一過性の貯蔵所を提供するにすぎない。抗体を分泌する安定した細胞株を作製するために、かつこれらの試料からEGFRvIII特異的scFvをクローン化するために、本発明者らは、以前に記載されたような13、ヒトハイブリドーマ技術と電気融合を用いる。簡単に説明すると、CytoPulse Hybrimune電気融合システム（Cytopulse社）を用いることによって、EBV形質転換PBMCをヘテロミエローマ細胞株HMMA2.5と融合させる。単一細胞クローンを、HAT（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジン）選択によってスクリーニングして、組換えEGFRvIII ECDに対する上清のELISAによって、またはEGFRvIII発現細胞株および種々のB細胞マーカーに対するフローサイトメトリーによって確認する。代替として本発明者らは、EGFRvIII ECDでスクリーニングされ得る、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するファージscFvディスプレイライブラリーを構築し、必要な場合には、以前に記載されたように、親和性成熟を行うであろう。別のアプローチは、記載されたように19、抗体可変領域（V）遺伝子レパートリーを形質細胞から取り出すために、ハイスループットDNA配列決定およびバイオインフォマティクス解析を用いることによって、スクリーニング段階を迂回する方法である。選択されたEGFRvIII特異的MAbを発現するハイブリドーマのVHおよびVL CDRを、アイソタイプ特異的プライマーを用いて増幅し、scFvを構築し、その際scFvタンパク質はそのカルボキシ末端で精製・検出用のヘキサヒスチジン配列でタグ付けされる。scFvの発現、産生および特性評価は、金属アフィニティーカラムを用いて、記載されたとおりに実施される。scFvの結合は、EGFRvIIIを発現する細胞に対するフローサイトメトリーにより確認される。少なくとも1つの完全ヒト抗EGFRvIII MAbが単離され、そのscFvはMR1-1（1.5nM）よりも高い親和性を有することが期待される。
【００６７】
実施例6
完全なヒト抗EGFRvIII二重特異性T細胞動員分子を作製するために、本発明者らは、ヒトscFvファージディスプレイライブラリーからスクリーニングすることによって、CD3抗原と反応するマウスMAb OKT3のヒトscFvミモトープを生成する。Los Alamos国立研究所から入手される、ヒトscFvファージミドライブラリー21は、非常に大きいサイズ（7.1×1013pfu/mL）および多様性（3×1011）を有する。選択時に、ビオチン化標的抗原CD3（Sino Biological社）をscFvライブラリーとインキュベートし、形成された複合体を磁性ストレプトアビジン被覆ビーズ上に捕捉する。非特異的または低親和性結合ファージを除去するために、ビーズ＋Ag/scFv複合体を洗浄する。ビーズ＋Ag/scFv複合体を酸（0.1M HCl）で処理して、標的抗原に結合する全てのscFvを回収する。マウス抗体の模倣体を回収するには、ビーズ＋Ag/scFv複合体を、結合するscFv抗体の競合/溶出のための対応するマウスOKT3 IgGとインキュベートする。最も高い親和性を有するscFv抗体を生成するには、3ラウンドの各ラウンドを通して選択圧を高める。CD3に結合するscFvが回収されたら、競合ELISAを実施して、それらがマウスOKT3の真の模倣体であるかどうかを判定し、必要ならば親和性成熟を行う。その後、（1）Tリンパ球増殖アッセイ、（2）サイトカイン放出アッセイ、および（3）初期のT細胞活性化マーカーの発現のFACSによる検出を、記載されたとおりに22、実施することによって、抗CD3 scFvのヒト型OKT3のT細胞活性化機能7を確認する。
【００６８】
実施例7
本発明者らは、(Gly4Ser)3ペプチドリンカーでVHおよびVLフラグメントを連結することによって、ヒト抗EGFRvIII scFvおよびヒト抗CD3 scFvを構築する。検出と精製を容易にするために、ヒト抗CD3 scFvのC末端にヘキサヒスチジンタグを導入した。新しい完全ヒト抗EGFRvIII二重特異性T細胞動員分子の発現および精製は、本発明者らの以前のプロトコルに従って、MR1-1二重特異性T細胞動員分子について上述したのと同じプロトコルに従うものとする。
【００６９】
実施例8
本発明者らのMR1-1二重特異性T細胞動員分子研究からのこれらの有望な予備的データを足場にして、本発明者らは、上記と同じプロトコルに従うことによって、新しい完全ヒトEGFRvIII標的化二重特異性T細胞動員分子の細胞傷害活性を評価する。陰性対照実験は、二重特異性T細胞動員分子またはエフェクター細胞の代わりに培地を用いて実施する。その後、特異的溶解を次のように計算する：[（cpm、実験的放出）−（cpm、自然放出）]／[（cpm、最大放出）−（cpm、自然放出）]。
【００７０】
実施例9
新規な完全ヒトEGFRvIII二重特異性T細胞動員分子の有効性は、予備研究と同様に、前述の通りNSGマウスにおいて評価される。本発明者らのプログラムでは、いくつかのEGFRvIII発現ヒトGBM異種移植片および細胞株を、冷凍保存された適合自己リンパ球と共に自由に使用することができる。簡単に説明すると、二重特異性T細胞動員分子の投与に先立って、腫瘍細胞とリンパ球を1：1の比で混合し、本発明者らが以前に記載したように24、Kopf定位固定フレーム（stereotactic frame）を用いてNSGマウスの尾状核に移植する。このNSGマウスモデルは、CNSでEGFRvIIIを発現するGBMに対する「概念実証（proof-of-concept）」有効性試験を提供する。しかし、有効性実験を開始する前に、これらのマウスにおいて、各候補二重特異性T細胞動員分子の最大耐量（MTD）を確立する。それぞれ40匹の動物の個々のコホートに候補分子を投与し、MTDが確立されるまで、群間の用量を0.001μgから1μgまでlog10の2分の1ずつ増量する。以前の研究に基づいて、マウスに二重特異性T細胞動員分子の1日用量を5日間静脈内（i.v.）投与して治療する。生存期間中央値（median survival time）の約3分の1が経過した後に、これらの腫瘍を用いた本発明者らの以前の実験に従ってMTDでの治療を開始する。治療は、所定の用量の二重特異性T細胞動員分子構築物のi.v.投与から成る。
【００７１】
実施例10
完全ヒトBiTE設計
本発明者らは、139×28F11と指定された完全ヒトEGFRvIII特異的BiTEをコードするcDNAを作製した（図11）。mAb139（US 2010/0111979 A1）および28F11（US 7728114 B2）は、それぞれ、EGFRvIII腫瘍抗原およびヒトCD3複合体に対する特異性を有する完全ヒト抗体である。28F11は、マウスOKT3クローンの完全ヒト類似体として記載されており、このアプローチではCD3に結合しかつOKT3と同様にこの受容体を介してT細胞活性化を誘導する能力について選択された。
【００７２】
本発明者らは、「139」と指定された完全ヒト抗EGFRvIII mAbおよび「28F11」と指定された完全ヒト抗CD3活性化mAbからVHおよびVL遺伝子をサブクローニングした。周知の技術を用いて、本発明者らは、（Gly4Ser）3ペプチドリンカーで各抗体のVHおよびVLフラグメントを連結することによってヒト単鎖Fvを構築した。本発明者らは以前、これらの同じ操作を、上述した既存のMR1-1×OKT3 BiTEを製造するために市販のヒトCD3特異的mAb OKT3とマウス抗EGFRvIII mAb MR1-1に対して実施した。この技術を用いて、本発明者らは、完全ヒトBiTE（したがって、中和抗体の潜在的発生を低減させ、反復投与を可能にする）を作製し、既存のMR1-1×OKT3構築物は、マウス抗体から誘導されたBiTEを用いる臨床試験で以前に成功を収めたものに代わるものとして、臨床的にさらに検討され得る。
【００７３】
139×28F11構築物の細胞傷害性は、エフェクター細胞として非刺激ヒト末梢血リンパ球（PBL）を、標的細胞としてヒトGBM細胞株U87MGおよびU87MG.ΔEGFRを用いて、標準的なクロム放出アッセイにより測定される。
【００７４】
本発明者らが予備的データを得るために使用した異種移植系は、ヒト腫瘍組織を用いる動物系で薬物候補を有効性について評価することの明確な利点を有しており、対象となる治療用分子を臨床研究に直接移せる可能性がある。しかし、このモデルの主な欠点は内因性免疫系の欠如であり、このことは、本発明者らが分子の安全性および毒性を適切に評価し、かつ同系宿主でのみ適切に行われ得る多くの機構研究を実施するのを大きく妨げている。重要なことには、他のT細胞活性化抗体は、少なくとも一部には、ヒトで見られるものと同等の結合親和性および機能の表面分子を保有する適切な免疫応答性の齧歯動物モデルの欠如のため、早期の臨床試験に移されたとき予期しない毒性に歴史上遭遇している（25）。
【００７５】
本発明者らのCD3結合BiTEであるEGFRvIII×CD3の前臨床評価におけるヒトCD3トランスジェニックマウスの使用は、まれなことである。これらのマウスは、染色体に不明の位置で組み込まれた約3コピーのヒトCD3導入遺伝子を持つことが以前に記載されている（26）。ヘテロ接合体であるとき、tgε600±マウスは、ヒトCD3とマウスCD3の両方を発現する末梢T細胞を正常に近い数で保有している。特に、tgε600±マウス系統は、T細胞枯渇および移植片生存の前臨床モデルにおいて抗ヒトCD3免疫毒素の機能を試験するために使用され成功を収めている（27）。
【００７６】
本発明者らは、Cox Terhorst博士（Beth Israel Deaconess医療センター）からtgε600±マウス系統を胚として首尾よく得た。本発明者らは、tgε600±のコロニーを樹立することを目的とし、本発明者らの既存のマウスEGFRvIII発現細胞株を標的として用いて、まず標準クロム放出アッセイにより、インビトロで腫瘍細胞に対してtgε600±マウス由来の脾細胞をリダイレクトするEGFRvIII×CD3の能力を検討する。tgε600±マウスモデルで最小腫瘍形成用量を確立した後、本発明者らは、以前に免疫不全異種移植系で行った実験から得られた結果の検証を進める。
【００７７】
参考文献
引用した各参考文献の開示は、本明細書に明示的に組み入れられる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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