(57)【要約】  1つから4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド及び変種ヒトFc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物及びその医薬としての使用が本明細書で報告され、前記変種ヒトFc領域は、329位のアミノ酸残基の変異並びに228、233、234、235、236、237、297、318、320、322及び331位のアミノ酸残基を含む群から選択される少なくとも1つのアミノ酸の異なる残基への少なくとも1つのさらに別の変異を有し、ここで該Fc領域の残基はKabatのEUインデックスにしたがって番号を付けられる。【選択図】  図９ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
各々がFc領域に共有結合により連結される、1つ、2つ、3つ若しくは4つの天然に存在するか又は合成のインクレチン受容体リガンドポリペプチドを含むFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物であって、該融合ポリペプチド又は複合物がアミノ酸配列LPXTG（配列番号：75）、場合によってLPETG（配列番号：74）を含む、前記Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項２】
該インクレチン受容体リガンドポリペプチドのアミノ酸配列及び該Fc領域のアミノ酸配列の間にアミノ酸配列LPETG（配列番号：74）を含む、請求項1に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項３】
LPETG（配列番号：74）のC-末端にGly-Gly又はGly-Gly-Ser又はGly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：88）、Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：85）、又はGly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：90）を含む、請求項2に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項４】
(GGGS)n（式中n＝1−6（配列番号：57−60、88及び89））、(GGGGS)m（式中m＝1−6（配列番号：61−64、90及び91））、又は(GGGGGS)o（式中o＝1−6（配列番号：65−67及び92−94））を含む、請求項3に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項５】
配列番号：57−67のいずれか1つを含む、請求項4に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項６】
LPXTG（配列番号：75）のN-末端にGly又はGly-Glyを含む、請求項1から5のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項７】
該Fc領域が、329位のアミノ酸残基の変異、並びに228、233、234、235、236、237、297、318、320、322及び331位のアミノ酸残基を含む群から選択される少なくとも1つのアミノ酸の異なる残基への少なくとも1つのさらに別の変異を有するヒトFc領域であることを特徴とし、ここでFc領域の残基がKabatのEUインデックスにしたがって番号を付けられる、請求項1から6のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項８】
該変種ヒトFc領域が、野生型IgG Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物と比較して、ヒトFcγRIIIA及び／又はFcγRIIA及び／又はFcγRIに対して親和性の低下を有することを特徴とする、請求項1から7のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項９】
該Fc領域の少なくとも1つのアミノ酸の該少なくとも1つのさらに別の変異が、S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D又はP331Sであることを特徴とする、請求項7及び8のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項１０】
該Fc領域の該少なくとも1つのさらに別の変異が、Fc領域がヒトIgG1アイソタイプならばL234A及びL235Aであるか、又はFc領域がヒトIgG4アイソタイプならばS228P及びL235Eであることを特徴とする、請求項9に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項１１】
該Fc領域融合ポリペプチド又は複合物によって誘発される血小板凝集が、野生型ヒトIgG Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物によって誘発される血小板凝集と比較して低下することを特徴とする、請求項1から10のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項１２】
1つ又は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドを含むことを特徴とする、請求項1から11のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項１３】
該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々が1つのFc領域ポリペプチド鎖のN-末端に融合又は結合され、各Fc領域ポリペプチド鎖が1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドにのみ融合又は結合されることを特徴とする、請求項1から12のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項１４】
該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々が1つのFc領域ポリペプチド鎖のC-末端に融合又は結合され、各Fc領域ポリペプチド鎖が1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドにのみ融合又は結合されることを特徴とする、請求項12及び13のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項１５】
該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、GIP、GLP-1、エクセンジン-3、エクセンジン-4、GIP-GLP-1二重アゴニスト、GIP-GLP-1-グルカゴン受容体三重アゴニスト、キメラGIP/GLPアゴニスト及び前記の前駆体、誘導体又は機能的フラグメントから互いに別個に選択されることを特徴とする、請求項1から14のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項１６】
該Fc領域が、配列番号：42−56から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1から15のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項１７】
該インクレチン受容体リガンドポリペプチドが、配列番号：1−39、76及び77から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1から16のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項１８】
該Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物が、該Fc領域及び該インクレチン受容体リガンドポリペプチドの間にリンカーを含み、該リンカーが配列番号：57−69及び82−94から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1から17のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項１９】
配列番号：95のアミノ酸配列を含む、Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項２０】
配列番号：96のアミノ酸配列を含む、Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項２１】
配列番号：97のアミノ酸配列を含む、Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項２２】
配列番号：98のアミノ酸配列を含む、Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物。
【請求項２３】
請求項1から22のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物を含む医薬組成物。
【請求項２４】
請求項1から22のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物の医薬としての使用。
【請求項２５】
ある疾患の治療用医薬の製造のための、請求項1から22のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物の使用であって、野生型ヒトIgG Fc領域の変種Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物のエフェクター機能が、野生型ヒトIgG Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物によって誘発されるエフェクター機能と比較して低下することが有益である、前記使用。
【請求項２６】
野生型ヒトIgG Fc領域の変種Fc領域を含む請求項1から22のいずれか1項に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物の使用であって、野生型ヒトIgG Fc領域のPro329がグリシンで置換され（ここで該残基はKabatのEUインデックスにしたがって番号を付けられる）、該融合ポリペプチド又は複合物が、野生型ヒトIgG Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物によって誘発されるADCCの少なくとも20％のADCCの下方調整のために、及び／又はADCPの下方調整のためにヒトFcγRIIIA及びFcγRIIAに対して親和性の低下を示す、前記使用。
【請求項２７】
該疾患が2型糖尿病又は肥満である、請求項24から26のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２８】
該疾患が1型糖尿病である、請求項24から26のいずれか1項に記載の使用。
【請求項２９】
インクレチン受容体リガンドポリペプチドのアミノ酸配列及びLPXTG（配列番号：75）（Xは任意のアミノ酸である）を含むポリペプチド。
【請求項３０】
Xが酸性アミノ酸である、請求項29に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
該酸性アミノ酸がGluである、請求項30に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
LPETG（配列番号：74）のC-末端にGly-Gly又はGly-Gly-Ser又はGly-Gly-Gly、Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：88）、Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：85）、又はGly-Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：90）を含む、請求項29から31のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
(GGGS)n（式中n＝1−6（配列番号：57−60、88及び89））、(GGGGS)m（式中m＝1−6（配列番号：61−64、90及び91））、又は(GGGGGS)o（式中o＝1−6（配列番号：65−67及び92−94））を含む、請求項32に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
配列番号：57−67のいずれか1つを含む、請求項33に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
LPXTG（配列番号：75）のN-末端にGly又はGly-Glyを含む、請求項29から34のいずれか1項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
ある疾患の治療用医薬の製造における請求項29から35のいずれか1項に記載のポリペプチドの使用。
【請求項３７】
該医薬の製造がソルターゼA及びヒトFc領域の使用を含む、請求項36に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、米国仮特許出願No.61/662,576（2012年6月21日出願：前記文献の内容は参照によりその全体が本明細書に含まれる）の優先権を主張する。
電子提出資料の参照による組み入れ
本明細書と一緒に提出され、下記のように特定されるコンピュータ読み出し可能ヌクレオチド/アミノ酸配列リストは参照によりその全体が本明細書に含まれる：76202キロバイトACII（テキスト）ファイル、名称“31050_SL.txt”、2013年5月22日作成。
インクレチン受容体リガンドポリペプチドと抗体Fc-領域との融合物及び複合物が本明細書で報告される。前記では、該Fc領域は、天然に存在する抗体のFc領域と比較して、当該Fc領域の1つ以上のアミノ酸の置換によって達成される改変エフェクター機能を有する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は大きな治療潜在能力を有し、今日の医療ポートフォリオで重要な役割を果たしている。ここ10年間、製薬業界における目覚ましい動向は、多数の疾患（例えば癌、喘息、関節炎、多発性硬化症など）の治療用薬剤としてのモノクローナル抗体（mAb）及び抗体Fc領域融合ポリペプチドの開発であった。
抗体のFc領域（すなわち、CH3ドメイン、CH2ドメイン及びヒンジ領域の一部分を含む抗体の重鎖ペアのカルボキシ末端領域）は限定的な可変性を有し、抗体又はFc領域を含む融合ポリペプチド若しくは複合物の生理学的作用の少なくとも一部分で必要である。抗体のFc領域に起因すると考えることができるエフェクター機能は抗体のクラス及びサブクラスで変動し、当該機能には、例えばそのFc領域を介する抗体と細胞上の特異的Fc受容体（FcR）との結合が含まれる（前記結合は多様な生物学的応答を始動させる）。
【０００３】
例えば、Fc領域/Fcガンマ受容体（Fc/FcγR）複合体の形成は、結合された抗原の部位にエフェクター細胞を補給し、典型的には細胞内シグナリング事象及びその後に続く重要な免疫応答（例えば炎症媒介物質の放出、B細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用又は細胞傷害性攻撃）をもたらす。FcγRを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応は、抗体依存細胞媒介細胞傷害（ADCC）と称される（Ravetch, et al., Annu.Rev.Immunol.19 (2001) 275-290）。FcγRを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞食作用を引き起こす細胞媒介反応は、抗体依存細胞媒介食作用（ADCP）と称される。さらにまた、当該分子のFc領域のオーバーラップする部位はまた、補体によって媒介される細胞非依存細胞傷害性機能（また別に補体依存細胞傷害作用（CDC）として知られている）の活性化を制御する。
【０００４】
IgGクラスの抗体に関しては、ADCC及びADCPは、該Fc領域とFcガンマ（Fcγ）受容体（FcγR）と称される受容体ファミリーとの嵌合によって支配される。ヒトでは、このタンパク質ファミリーは、FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）（アイソフォームFcγRIIA、FcγRIIB及びFcγRIICを含む）、及びFcγRIII（CD16）（アイソフォームFcγRIIIA及びFcγRIIIBを含む）を含む（Raghavan and Bjorkman, Annu.Rev.Cell Dev.Biol.12 (1996) 181-220；Abes, et al., Expert Reviews (2009) 735-747）。FcγRは多様な免疫細胞上で発現され、Fc/FcγR複合体の形成は、結合された抗原の部位にこれらの細胞を補給し、典型的にはシグナリング及びその後に続く免疫応答（例えば炎症媒介物質の放出、B細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用及び細胞傷害性攻撃）をもたらす。さらにまた、FcγRI、FcγRIIA/C及びFcγRIIIAは、細胞内イムノレセプターチロシン系活性化モチーフ（ITAM）を特徴とする活性亢進性受容体であるが、FcγRIIBは阻害性モチーフ（ITIM）を有ししたがって阻害性である。さらにまた、de Reysら（de Rey et al., Blood 81 (1993) 1792-1800）は、モノクローナル抗体によって（例えばCD9のように）誘発される血小板活性化及び凝集は、抗原認識とそれに続くFc領域依存工程によって開始されると結論した（前記工程はFcγRII受容体を必要とする（以下もまた参照されたい：Taylor, et al., Blood 96 (2000) 4254-4260））。FcγRIはモノマーIgGと高い親和性で結合するが、FcγRIII及びFcγRIIは低親和性受容体であり、複合体を形成した又は凝集したIgGと相互作用する。
【０００５】
補体炎症カスケードは生来の免疫応答の一部分であり、個体が感染を免れる能力のために重要である。別の重要なFc領域リガンドは補体タンパク質C1qである。C1qと結合するFc領域は補体依存細胞傷害作用と称されるプロセスを媒介する。C1qは6つの抗体と結合できるが、ただし補体カスケードの活性化には2つのIgGとの結合で十分である。C1qはC1r及びC1sセリンプロテアーゼと複合体を形成して、補体経路のC1複合体を形成する。
多くの状況で、当該結合及び免疫グロブリンのFc領域によって媒介されるエフェクター機能の刺激は、例えばCD20抗体にとって極めて有益であるが、しかしながらある種の事例では、エフェクター機能の低下又は排除すらより有益であり得る。このことは特に、標的細胞に薬剤（例えば毒素又は放射性同位元素）をデリバーするために設計された抗体に当てはまる（前記では、Fc/FcγR媒介エフェクター機能は、健康な免疫細胞を致死性弾頭に接近させて、標的細胞とともに正常なリンパ様組織の枯渇を生じる（Hutchins, et al., PNAS USA 92 (1995) 11980-11984；White, et al., Annu.Rev.Med.52 (2001) 125-145）。これらの事例では、補体又はエフェクター細胞をほとんど補充しない抗体の使用が極めて有益であろう（以下の文献もまた参照されたい：Wu, et al., Cell Immunol 200 (2000) 16-26；Shields, et al., J.Biol.Chem.276 (2001) 6591-6604；US 6,194,551；US 5,885,573；及びPCT公開WO 04/029207）。
【０００６】
例えば、広範囲に発現される受容体とその同系リガンドとの相互作用を遮断することが目的である他の例では、全ての抗体エフェクター機能を低下させるか又は排除して、望ましくない傷害性を軽減することは有益であろう。さらに、治療用抗体が多数のヒト組織で見境のない結合を示す事例では、エフェクター機能の多様な組織セットへの標的照準を制限して傷害性を限定することは賢明と言えよう。最後にはなったが重要なことは、特にFcγRIIに対する抗体の親和性の低下は、FcγRII受容体結合を介して血小板の活性化及び凝集を誘発する抗体にとって有益である（血小板の活性化及び凝集はそのような抗体の重大な副作用であろう）。
特定のエフェクター機能を欠くある種のヒト免疫グロブリンサブクラスが存在するが、全てのエフェクター機能を完全に欠く天然に存在する公知の免疫グロブリンは存在しない。また別のアプローチは、エフェクター機能に必要なFc領域中の重要残基を操作するか又は変異させることであろう。例えば以下を参照されたい：WO 2009/100309、WO 2006/076594, WO 1999/58572、US 2006/0134709、WO 2006/047350、WO 2006/053301、US 6,737,056、US5,624,821及びUS 2010/0166740。
【０００７】
IgGと活性亢進性及び阻害性Fcγ受容体又は補体の第一成分（C1q）との結合は、ヒンジ領域及びCH2ドメインに位置する残基に左右される。CH2ドメインの2つの領域が、FcγR及び補体C1q結合に重要である。233−236位のヒトIgG1及びIgG2の残基並びに327、330及び331位のIgG4の残基の置換はADCC及びCDCを大きく低下させる（Armour, et al., Eur.J.Immunol.29 (1999) 2613-2624；Shields, et al., J.Biol.Chem.276 (2001) 6591-6604）。Idusogieら（Idusogie et al., J.Immunol 166 (2000) 2571-2575）は、治療用抗体リツキシマブ(R)のC1q結合部位をマッピングし、Pro329Ala置換はリツキシマブのC1q結合及び補体活性化能力を低下させることを示した。Pro329のAlaによる置換は、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIA受容体との結合低下をもたらすことが報告されているが（Shields, et al., J.Biol.Chem.276 (2001) 6591-6604）、この変異はまた、FcγRI及びFcγRIIとの野生型様結合、並びにFcγRIIIA受容体との結合では非常に小さな減少のみを示すと記載されている（EP1068241（Genentech）の表1及び表2）。
Oganesyanら（Oganesyan et al., Acta Cristallographica D64 (2008) 700-704）は、三重変異L234F/L235E/P331Sをより下部のヒンジ及びCH2ドメインに導入し、ヒトIgG1分子とヒトC1q、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIAとの結合能力の低下を示した。
【０００８】
インスリン親和性ポリペプチドはインスリン親和性活性有する、すなわちホルモンインスリンの合成若しくは発現を刺激する能力又は当該刺激を引き起こす能力を有する。インスリン親和性ペプチドには、GLP-1、エクセンジン-3、エクセンジン-4及び前記の前駆体、誘導体又はフラグメントが含まれるが、ただしこれらに限定されない。
プログルカゴン由来ペプチド（グルカゴン及びグルカゴン様ペプチド-1（GLP-1）を含む）は、種々の生理学的機能（例えばインスリン分泌及び食物摂取の調節）に必要な多くの代謝経路で見出される。
プレプログルカゴンは158アミノ酸のポリペプチドであり、前記は多数の異なる活性物質にプロセッシングされる。例えばGLP-1は、プレプログルカゴンのアミノ酸残基72から108に一致する。とりわけGLP-1の機能は、インスリン合成及び分泌の刺激、並びに食物摂取の抑制をもたらす。GLP-1は、糖尿病患者の高血糖症（グルコースレベルの上昇）を軽減することが示された。
グルコース依存インスリン親和性ペプチド（GIP）は42アミノ酸の胃腸管調節性ペプチドであり、グルコースの存在下で膵臓のベータ細胞のインスリン分泌を刺激する。前記は133アミノ酸の前駆体、プレプロGIPからタンパク分解プロセッシングによって誘導される。
【０００９】
WO2010/011439では、代謝異常及び肥満の治療のためのGIP系混合アゴニストが報告されている。自然のままのグルカゴン配列に対する修正は、自然のままのグルカゴンの活性と同等又はより強い強力なグルカゴン活性、自然のままのGIPの活性と同等又はより強い強力なGIP活性、及び／又は自然のままのGLP-1の活性と同等又はより強い強力なGLP-1活性を示すことができることが報告されている。提供されたデータは、GIP活性及びGLP-1活性の両方を有するペプチドは、体重減少の誘発又は体重増加の予防とともに高血糖症（糖尿病を含む）の治療に特に有益であることを示し、それによってGIPアゴニスト活性とGLP-1アゴニスト活性の組み合わせは、GLP-1単独よりも体重低下でより強い作用を生じることを報告している。
インスリン親和性ポリペプチドと抗体又は抗体フラグメントの複合物は、例えばWO2010/011439、US6,329,336及びUS7,153,825で仮説的に概略されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本明細書に報告するある特徴は、各々がFc領域に共有結合により連結される、1つ、2つ、3つ若しくは4つの天然に存在するか又は合成のインクレチン受容体リガンドポリペプチドを含むFc領域複合物であり、ここで該複合物はアミノ酸配列LPXTG（配列番号：73）を含み、式中Xは場合によって酸性アミノ酸、例えばD又はEである。例えば、該アミノ酸配列はLPETG（配列番号：74）であり得る。
抗体重鎖Fc領域の329位のプロリン残基のグリシン残基への変更は、FcγRIIIA及びFcγRIIA受容体結合の阻害並びにADCC及びCDCの阻害を生じることが見出された。さらに、P329G並びに例えばL234A及びL235A（本明細書で“LALA”と称される二重点変異）の組み合わせ変異は、C1q、FcγRI、FcγRIIA及びFcγRIIIAの思いがけない強力な阻害をもたらすことが見出された。したがって、329位のグリシン残基は、他のアミノ酸残基（例えばアラニン）と比較して意外なほど有益である。
【００１１】
本明細書に報告するある特徴は、Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域ポリペプチド複合物（本明細書ではまた“Fc領域複合物”と称される）であり、前記は、1つから4つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド及び（変種）ヒトFc領域を含み、ここで該Fc領域は、329位の天然に存在するアミノ酸残基の変異、並びに228、233、234、235、236、237、297、318、320、322及び331位のアミノ酸残基を含む群から選択される少なくとも1つのアミノ酸の少なくとも1つのさらに別の変異を含む（Fc領域の残基はKabatのEUインデックスにしたがって番号を与えられる）。アミノ酸残基の改変は、非修正（野生型）Fc領域と比較して、Fc領域のエフェクター機能の改変を生じる。
ある実施態様では、融合物又は複合物の（変種）ヒトFc領域は、野生型IgG Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較して、ヒトFcγRIIIA及び／又はFcγRIIA及び／又はFcγRIに対する親和性の低下を有する。
ある実施態様では、（変種）ヒトFc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物によって誘発されるADCCは、野生型ヒトIgG Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物によって誘発されるADCCの少なくとも20％低下する。
【００１２】
ある実施態様では、該ヒトFc領域は、ヒトIgG1アイソタイプ又はヒトIgG4アイソタイプのヒトFc領域である。
LPXTG（配列番号：75）又はLPETG（配列番号：74）を含む本明細書に記載の融合ポリペプチド又は複合物のある実施態様では、該融合ポリペプチド又は複合物におけるヒトFc領域の329位のアミノ酸残基は、グリシン若しくはアルギニン、又はFc領域内のプロリンサンドイッチを破壊するために十分に大きなアミノ酸で置換される。
ある実施態様では、Fc領域の少なくとも1つのアミノ酸の少なくとも1つのさらに別の変異は、S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D及び／又はP331Sである。ある実施態様では、Fc領域の少なくとも1つのさらに別の変異は、Fc領域がヒトIgG1アイソタイプであるならばL234A及びL235Aであり、Fc領域がヒトIgG4アイソタイプであるならばS228P及びL235Eである。S228P及びL235Eの二重点変異は本明細書では“SPLE”と称される。
ある実施態様では、融合ポリペプチド又は複合物は、野生型ヒトIgG Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較して、ヒトFcγRI受容体、ヒトFcγRIIA受容体、及びC1qから成る群の少なくとも1つのさらに別の受容体に対して親和性の低下を有する。
【００１３】
ある実施態様では、融合ポリペプチド又は複合物によって誘発される血小板凝集は、野生型ヒトIgG Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物によって誘発される血小板凝集と比較して低下する。
ある実施態様では、融合ポリペプチド又は複合物は、野生型ヒトIgG Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物によって誘発されるCDCと比較してCDCの低下を示す。
例示的特徴では、Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域ポリペプチド複合物のFc領域は、配列番号：42−56のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。
例示的特徴では、Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域ポリペプチド複合物のインクレチン受容体リガンドポリペプチドは、配列番号：1−39、76及び77のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。
例示的特徴では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドはリンカーを介してFc領域に連結され、該リンカーは配列番号：57−69及び82−94のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。
【００１４】
例示的特徴では、Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域ポリペプチド複合物は、YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGGPSSGAPPPSKLPETGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：95）のアミノ酸配列を含み、式中XはAIBである。
例示的特徴では、Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域ポリペプチド複合物は、YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGGGLPETGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：96）のアミノ酸配列を含み、式中XはAIBである。
【００１５】
例示的特徴では、Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域ポリペプチド複合物は、YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGGPSSGAPPPSKLPETGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：97）のアミノ酸配列を含み、式中XはAIBである。
例示的特徴では、Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域ポリペプチド複合物は、YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGGGLPETGGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：９８）のアミノ酸配列を含み、式中XはAIBである。
【００１６】
例示的特徴では、Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域ポリペプチド複合物は1つ以上の医薬的に許容できる担体と一緒にされる。したがって、本明細書に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域ポリペプチド複合物及び1つ以上の医薬的に許容できる担体を含む医薬組成物が本明細書で提供される。
本明細書に報告するある特徴は、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物の医薬としての使用である。
本明細書に報告するある特徴は、ある疾患の治療のための本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物の使用であり、ここで、該融合ポリペプチド又は複合物のエフェクター機能は、野生型IgG Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物によって誘発されるエフェクター機能と比較して低下することが有利である。
本明細書に報告するある特徴は、ある疾患の治療用医薬の製造のための、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物の使用であり、ここで、該融合ポリペプチド又は複合物のエフェクター機能は、野生型IgG Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物によって誘発されるエフェクター機能と比較して低下することが有利である。
本明細書に報告するある特徴は、ある疾患を有する個体を治療する方法であり、前記方法は、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物の有効な量を個体に投与する工程を含み、ここで、該融合ポリペプチド又は複合物のエフェクター機能は、野生型ヒトFc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物によって誘発されるエフェクター機能と比較して低下することが有利である。
【００１７】
本明細書に報告するある特徴は、野生型ヒトIgG Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物によって誘発されるADCCと比較して少なくとも20％ADCCを下方調整するための、及び／又はADCPの下方調整のための本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物の使用であり、ここで、野生型ヒトIgG Fc領域のPro239はグリシンで置換され（該残基の番号付与はKabatのEUインデックスにしたがう）、さらに該融合ポリペプチド又は複合物はヒトFcγRIIIA及びFcγRIIAに対する親和性の低下を示す。
本明細書に報告するある特徴は、野生型ヒトIgG Fc領域を含むポリペプチドによって誘発されるADCCと比較して少なくとも20％ADCCを下方調整するための、及び／又はADCPの下方調整のための本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物の使用であり、ここで、該Fc領域はヒトIgGクラスであり、さらにヒトIgG1 Fc領域の場合には少なくともアミノ酸置換P329G並びにL234A及びL235Aを含み（該残基はKabatのEUインデックスにしたがって番号が与えられる）、該融合ポリペプチド又は複合物はヒトFcγRIIIA及びFcγRIIAに対する親和性の低下を示す。
【００１８】
本明細書に報告するある特徴は、ある疾患を有する個体を治療する方法であり、前記方法は、アミノ酸配列LPXTG（配列番号：75）又はLPETG（配列番号：74）を含む本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物の有効量を該個体に投与する工程を含み、ここでヒトIgG Fc領域のPro329はグリシンで置換され（該残基はKabatのEUインデックスにしたがって番号を与えられる）、該融合ポリペプチド又は複合物は、野生型ヒトIgG Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較してFcγRIIIA及び／又はFcγRIIAとの結合の低下を特徴とする。例示的実施態様では、そのような融合ポリペプチド又は複合物のヒトIgG Fc領域は、少なくともアミノ酸置換P329G並びにL234A及びL235Aを有するヒトIgG1 Fc領域の変種である（該残基はKabatのEUインデックスにしたがって番号が与えられる）。例示的実施態様では、そのような融合ポリペプチド又は複合物のヒトIgG Fc領域は、少なくともアミノ酸置換P329G並びにS228P及びL235Eを有するヒトIgG4 Fc領域の変種である（該残基はKabatのEUインデックスにしたがって番号が与えられる）。
【００１９】
ある実施態様では、疾患は2型糖尿病又はインスリン耐性である。
ある実施態様では、疾患は肥満である。
ある実施態様では、疾患は1型糖尿病である。
ある実施態様では、疾患は骨粗鬆症である。
ある実施態様では、疾患は脂肪性肝炎又は非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）である。
ある実施態様では、疾患は代謝症候群である。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、さらに別の2型糖尿病薬と一緒に投与される。ある実施態様では、さらに別の2型糖尿病薬はインスリンである。
【００２０】
ある実施態様では、アミノ酸配列LPXTG（配列番号：75）又はLPETG（配列番号：74）を含む本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、少なくとも2つのさらに別のアミノ酸置換、ヒトIgG1 Fc領域の場合にはL234A及びL235A（KabatのEUインデックスにしたがって番号が与えられる）、ヒトIgG4 Fc領域の場合にはS228P及びL235E（KabatのEUインデックスにしたがって番号が与えられる）を含む。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドを含む。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドを含む。
ある実施態様では、1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドは、1つのFc領域ポリペプチド鎖のN-末端に融合又は結合される。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、1つのFc領域ポリペプチド鎖のN-末端に融合又は結合され、ここで各Fc領域ポリペプチド鎖は1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドにだけ融合又は結合される。
【００２１】
ある実施態様では、1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドは、1つのFc領域ポリペプチド鎖のC-末端に融合又は結合される。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドの各々は、1つのFc領域ポリペプチド鎖のC-末端に融合又は結合され、ここで各Fc領域ポリペプチド鎖は1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドにだけ融合又は結合される。
ある実施態様では、1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドは、あるFc領域ポリペプチド鎖のN-末端に融合又は結合され、さらに1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドは、同じ又は異なるFc領域ポリペプチド鎖のC-末端に融合又は結合される。
ある実施態様では、2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドは同じFc領域ポリペプチド鎖に融合される。
ある実施態様では、2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドは異なるFc領域ポリペプチド鎖に融合される。
【００２２】
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、GIP、GLP-1、エクセンジン-3、エクセンジン-4、GIP-GLP-1二重アゴニスト、GIP-GLP-1-グルカゴン受容体三重アゴニスト、キメラGIP/GLPアゴニスト及び前記の前駆体、誘導体又は機能的フラグメントから選択される。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、GLP-1（7−37）（HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRG、配列番号：01）、又はインクレチン受容体リガンド活性を有する前記の前駆体、誘導体又はフラグメントであるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、GLP-1（7−36）（HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR、配列番号：02）、又はインクレチン受容体リガンド活性を有する前記の前駆体、誘導体又はフラグメントであるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、エクセンジン-3（HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGG PSSGAPPPS、配列番号：3）、又はインクレチン受容体リガンド活性を有する前記の前駆体、誘導体又はフラグメントであるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、エクセンジン-4（HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS、配列番号：04）、又はインクレチン受容体リガンド活性を有する前記の前駆体、誘導体又はフラグメントであるか、又は前記を含む。
【００２３】
本発明のいくつかの実施態様にしたがえば、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、配列番号：01−04のいずれかの誘導体であり、前記はインクレチン受容体リガンド活性を示す。例示的特徴では、該誘導体は、配列番号：01−04と対比して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸修正を有する、配列番号：01から04のアミノ酸配列を含む。例示的特徴では、該誘導体は、配列番号：01−04の1つと少なくとも65％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、該誘導体は、配列番号：01−04の1つと少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92.5％、少なくとも95％、少なくとも97.5％、又は前記より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列エクセンジン-4（1−31）desGlu（17）Tyr（32）（HGEGTFTSDLSKQMEEAVRLFIEWLKNGGPY、配列番号：05）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列エクセンジン-4（1−30）Tyr（31）（HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGY、配列番号：06）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列エクセンジン-4（9−39）（DLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS、配列番号：07）であるか、又は前記を含む。
【００２４】
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝K又はRである、アミノ酸配列SYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号：08）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝K又はRである、アミノ酸配列SSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号：09）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝K又はRである、アミノ酸配列VSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号：10）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝K又はRである、アミノ酸配列DVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号：11）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝K又はRである、アミノ酸配列SDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号：12）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝K又はRである、アミノ酸配列TSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号：13）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝K又はRである、アミノ酸配列FTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号：14）であるか、又は前記を含む。
【００２５】
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝K又はRである、アミノ酸配列TFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号：15）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝K又はRである、アミノ酸配列GTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号：16）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝K又はRである、アミノ酸配列EGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号：17）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝K又はRである、アミノ酸配列AEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号：18）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝K又はRである、アミノ酸配列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号：19）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝K又はRである、アミノ酸配列HDAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVXGR（配列番号：20）であるか、又は前記を含む。
【００２６】
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRPSSGAPPPS（配列番号：21）（ハイブリッドGLP-1/エクセンジンポリペプチド）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HDEFERHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK（配列番号：22）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRK（配列番号：23）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK（配列番号：24）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HSDGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPSK（配列番号：25）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HGEGTFTSDLSKEMEEEVRLFIEWLKNGGPY（配列番号：26）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列HGEGTFTSDLSKEMEEEVRLFIEWLKNGGY（配列番号：27）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、アミノ酸配列DLSKQMEEEAVRLFIEWLKGGPSSGPPPS（配列番号：28）であるか、又は前記を含む。
【００２７】
本発明のある実施態様にしたがえば、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは自然のままのグルカゴン（配列番号：76）の誘導体であり、グルカゴン受容体リガンド活性、GLP-1受容体リガンド活性、及び／又はGIP受容体リガンド活性を示す。例示的特徴では、該誘導体は、配列番号：76と対比して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸修正を有する、配列番号：76のアミノ酸配列を含む。例示的特徴では、該誘導体は、配列番号：76と少なくとも65％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、該誘導体は、配列番号：76と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92.5％、少なくとも95％、少なくとも97.5％、又は前記より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
本発明のいくつかの実施態様にしたがえば、インクレチン受容体リガンドポリペプチドはGLP-1（配列番号：1又は2）の誘導体であり、GLP-1受容体リガンド活性を示す。例示的特徴では、該誘導体は、それぞれ配列番号：1又は2と対比して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸修正を有する、配列番号：1又は2のアミノ酸配列を含む。例示的特徴では、該誘導体は、配列番号：1又は2と少なくとも65％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、該誘導体は、配列番号：1又は2と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92.5％、少なくとも95％、少なくとも97.5％、又は前記より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００２８】
本発明のいくつかの実施態様にしたがえば、インクレチン受容体リガンドポリペプチドはGIP（配列番号：77）の誘導体であり、GIP受容体リガンド活性を示す。例示的特徴では、該誘導体は、配列番号：77と対比して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸修正を有する、配列番号：77のアミノ酸配列を含む。例示的特徴では、該誘導体は、配列番号：77と少なくとも65％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、該誘導体は、配列番号：77と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92.5％、少なくとも95％、少なくとも97.5％、又は前記より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
本発明のいくつかの実施態様にしたがえば、インクレチン受容体リガンドポリペプチドはエクセンジン-3又は-4（それぞれ配列番号：3又は4）の誘導体であり、エクセンジンリガンド活性を示す。例示的特徴では、該誘導体は、それぞれ配列番号：3又は4と対比して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のアミノ酸修正を有する、配列番号：3又は4のアミノ酸配列を含む。例示的特徴では、該誘導体は、配列番号：3又は4と少なくとも65％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、該誘導体は、配列番号：3又は4と少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも92.5％、少なくとも95％、少なくとも97.5％、又は前記より高いアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。
【００２９】
本発明のいくつかの実施態様にしたがえば、インクレチン受容体リガンドポリペプチドはGIPアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号：76）のアナローグであり、ここで該アナローグは、（a）GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸の修正、（b）該アナローグのC-末端部分（アミノ酸12−29）のアルファヘリックス構造を安定化させる修正、及び（c）場合によって、配列番号：76と対比して1から10（例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10）のさらに別のアミノ酸修正を有する、配列番号：76を含む。いくつかの実施態様では、該アナローグは、GIP受容体において自然のままのGIPの少なくとも約1％の活性、又はWO2010/011439に記載されたGIP受容体における任意の他の活性レベルを示す。例示的特徴では、該アナローグのGIP受容体におけるEC50は、GLP-1受容体におけるそのEC50とは約50倍未満相違する。
【００３０】
ある種の実施態様では、アルファヘリックス構造を安定化させる修正は、分子内架橋（例えば共有結合分子内架橋（例えばWO2010/011439に記載されたもののいずれか）を含む）を提供するか又は導入するものである。いくつかの実施態様における共有結合分子内架橋はラクタム架橋である。これら実施態様のアナローグのラクタム架橋は本明細書に記載のラクタム架橋であり得る。例えば、WO2010/011439の“アルファヘリックス構造の安定化”のセクションのラクタム架橋の教示を参照されたい。例えば、ラクタム架橋は、i位及びi+4位のアミノ酸の側鎖間、又はj位及びj+3位のアミノ酸の側鎖間に存在するものであり得る（ここでiは12、13、16、17、20又は24であり、jは17である）。ある種の実施態様では、ラクタム架橋は16位及び20位のアミノ酸間に存在することができ、16位及び20位のアミノ酸の1つはGluで置換され、16位及び20位のアミノ酸の他方はLysで置換される。
【００３１】
また別の実施態様では、アルファヘリックス構造を安定化させる修正は、アナローグの16、20、21及び24位に1つ、2つ、3つ又は4つのα,α-二置換アミノ酸を導入することである。いくつかの実施態様では、α,α-二置換アミノ酸はAIBである。ある種の特徴では、α,α-二置換アミノ酸（例えばAIB）は20位に存在し、16位のアミノ酸は陽性荷電アミノ酸、例えば本明細書に記載する式IVのアミノ酸で置換される。式IVのアミノ酸はホモLys、Lys、Orn、又は2,4-ジアミノ酪酸（Dab）であり得る。
本発明の具体的な特徴では、1位のアミノ酸修正は、イミダゾール側鎖を欠くアミノ酸（例えば芳香族アミノ酸、例えばTyr）によるHisの置換である。
ある種の特徴では、グルカゴンのアナローグは、27、28及び29位の1つ、2つ又は全てのアミノ酸修正を含む。例えば27位のMetは大きな脂肪族アミノ酸（場合によってLeu）で置換でき、28位のAsnは小さな脂肪族アミノ酸（場合によってAla）で置換できる。29位のThrは小さな脂肪族アミノ酸、場合によってGly、又は前述の2つ若しくは3つの組み合わせで置換できる。具体的な実施態様では、グルカゴンのアナローグは、27位にLeu、28位にAla、及び29位にGly又はThrを含む。
【００３２】
本発明のある種の実施態様では、グルカゴンのアナローグは、29位のアミノ酸のC-末端に1から21アミノ酸の延長部を含む。該延長部は、例えば、GPSSGAPPPS（配列番号：78）又はXGPSSGAPPPS（配列番号：79）のアミノ酸配列を含むことができる。さらにまた或いはまた別に、グルカゴンのアナローグは、延長部の1−6アミノ酸が陽性荷電アミノ酸である延長部を含むことができる。該陽性荷電アミノ酸は、下記式IVのアミノ酸であり得る：
【００３３】
【化１】
2015531748.tif 000003
【００３４】
[式IV]
式中、nは1から16、又は1から10、又は1から7、又は1から6、又は2から6であり、R1及びR2の各々は、別個にH、C1−C18アルキル、(C1−C18アルキル)OH、(C1−C18アルキル)NH2、(C1−C18アルキル)SH、(C0−C4アルキル)(C3−C6)シクロアルキル、(C0−C4アルキル)(C2−C5複素環式)、(C0−C4アルキル)(C6−C10アリール)R7、及び(C1−C4アルキル)(C3−C9ヘテロアリール)から成る群から選択され、ここでR7はH又はOHであり、さらに式IVのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含む。例示的特徴では、式IVのアミノ酸はLys、ホモLys、Orn又はDabである。
さらにまた、いくつかの実施態様では、グルカゴン（配列番号：76）のアナローグは、配列番号：76と対比して以下の修正のいずれか1つ又は組み合わせを含む：
（a）2位のSerはD-Ser、Ala、D-Ala、Gly、N-メチル-Ser、AIB、Val又はα-アミノ-N-酪酸で置換される；
（b）10位のTyrはTrp、Orn、Glu、Phe又はValで置換される；
（c）12位のLysはArg又はIleで置換される；
（d）16位のSerはGlu、Gln、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸、Thr、Gly又はAIBで置換される；
（e）17位のArgはGlnで置換される；
（f）18位のArgはAla、Ser、Thr又はGlyで置換される；
（g）20位のGlnはSer、Thr、Ala、Lys、シトルリン、Arg、Orn又はAIBで置換される；
（h）21位のAspはGlu、ホモグルタミン酸、ホモシステイン酸で置換される；
（i）23位のValはIleで置換される；
（j）24位のGlnはAsn、Ser、Thr、Ala又はAIBで置換される；さらに
（k）2、5、9、10、11、12、13、14、15、16、18、19、20、21、24、27、28及び29位のいずれかの保存的置換。
【００３５】
例示的実施態様では、GIPアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号：76）のアナローグは、以下の修正：（a）GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸修正、（b）i及びi+4位のアミノ酸の側鎖間、又はj及びj+3位のアミノ酸の側鎖間のラクタム架橋（ここでiは12、13、16、17、20又は24であり、jは17である）、（c）27、28及び29位の1つ、2つ又は全てのアミノ酸修正、例えば27及び／又は28位のアミノ酸修正、及び（d）配列番号：76と対比して、1−9又は1−6のさらに別のアミノ酸修正、例えば1、2、3、4、5、6、7、8又は9のさらに別のアミノ酸修正を含み、
GIP受容体活性化のための該アナローグのEC50は約10nM以下である。例示的特徴では、GIP受容体における該アナローグのEC50は、GLP-1受容体におけるそのEC50とは約50倍未満相違する。
これら実施態様のアナローグのラクタム架橋は本明細書に記載のラクタム架橋であり得る。例えば、WO2010/011439の“アルファヘリックス構造の安定化”のセクションのラクタム架橋の教示を参照されたい。例えば、ラクタム架橋は16位及び20位のアミノ酸の間に存在でき、ここで16及び20位のアミノ酸の1つはGluで置換され、16位及び20位のアミノ酸の他方はLysで置換される。
【００３６】
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、以下の修正：（a）GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸修正、（b）アナローグの16、20、21及び24位のアミノ酸の1つ、2つ、3つ又は全てがα,α-二置換アミノ酸で置換される、（c）27、28及び29位の1つ、2つ又は全てのアミノ酸修正、及び（d）自然のままのグルカゴン（配列番号：76）と対比して、1−9又は1−6のさらに別のアミノ酸修正、例えば1、2、3、4、5、6、7、8又は9のさらに別のアミノ酸修正を有する、
GIPアゴニスト活性を示すグルカゴンのアナローグであり、ここでGIP受容体活性化のための該アナローグのEC50は約10nM以下である。例示的特徴では、GIP受容体における該アナローグのEC50は、GLP-1受容体におけるそのEC50とは約50倍未満相違する。
これらの実施態様のアナローグのα,α-二置換アミノ酸は任意のα,α-二置換アミノ酸でよく、前記には、アミノイソ酪酸（AIB）、同じ又は異なる基（メチル、エチル、プロピル及びn-ブチルから選択される）で、又はシクロオクタン若しくはシクロヘプタン（例えば1-アミノシクロオクタン-1-カルボン酸）で二置換されたアミノ酸が含まれるが、ただしこれらに限定されない。ある実施態様では、α,α-二置換アミノ酸はアミノイソ酪酸（aib）である。
【００３７】
さらにまた他の例示的実施態様では、GIPアゴニスト活性を有するグルカゴン（配列番号：76）のアナローグは、以下の修正：（a）GIPアゴニスト活性を付与する1位のアミノ酸修正、（b）下記式IVのアミノ酸による16位のSerのアミノ酸置換：
【００３８】
【化２】
2015531748.tif 000004
【００３９】
[式IV]
（式中、nは1から16、又は1から10、又は1から7、又は1から6、又は2から6であり、R1及びR2の各々は、別個にH、C1−C18アルキル、(C1−C18アルキル)OH、(C1−C18アルキル)NH2、(C1−C18アルキル)SH、(C0−C4アルキル)(C3−C6)シクロアルキル、(C0−C4アルキル)(C2−C5複素環式)、(C0−C4アルキル)(C6−C10アリール)R7、及び(C1−C4アルキル)(C3−C9ヘテロアリール)から成る群から選択され、ここでR7はH又はOHであり、さらに式IVのアミノ酸の側鎖は遊離アミノ基を含む）、
（c）20位のGlnのアルファ、アルファ-二置換アミノ酸によるアミノ酸置換、（d）27、28及び29位の1つ、2つ又は全てのアミノ酸修正、例えば27及び／又は28位のアミノ酸修正、及び（e）1−9又は1−6のさらに別のアミノ酸修正、例えば1、2、3、4、5、6、7、8又は9のさらに別のアミノ酸修正を含み、
GIP受容体活性化のための該アナローグのEC50は約10nM以下である。例示的特徴では、GIP受容体における該アナローグのEC50は、GLP-1受容体におけるそのEC50とは約50倍未満相違する。
【００４０】
これら実施態様のアナローグの式IVのアミノ酸は、任意のアミノ酸、例えばnが1、2、3、4、5、6、7、8、9，10、11、12、13、14、15又は16である、式IVのアミノ酸であり得る。ある種の実施態様では、nは2、3、4又は5であり、その場合、アミノ酸はそれぞれDab、Orn、Lys又はホモLysである。
これら実施態様のアナローグのアルファ、アルファ-二置換アミノ酸は任意のアルファ、アルファ-二置換アミノ酸であり得る。前記には、アミノイソ酪酸（AIB）、同じ又は異なる基（メチル、エチル、プロピル及びn-ブチルから選択される）で、又はシクロオクタン若しくはシクロヘプタン（例えば1-アミノシクロオクタン-1-カルボン酸）で二置換されたアミノ酸が含まれるが、ただしこれらに限定されない。ある実施態様では、アルファ、アルファ-二置換アミノ酸はAIBである。
【００４１】
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝aibである、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVCWLLAGGPSSGAPPPSK（配列番号：29）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝aibである、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSK（配列番号：30）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝aibである、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGGPSSGAPPPSK（配列番号：31）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝aibである、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGG（配列番号：32）であるか、又は前記を含む。本明細書に報告するある特徴は、X＝aibであるアミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGG（配列番号：32）を含むインクレチン受容体リガンドポリペプチドである。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝aibである、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGG G（配列番号：33）であるか、又は前記を含む。本明細書に報告するある特徴は、X＝aibである、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVAWLLAGGG（配列番号：33）を含むインクレチン受容体リガンドポリペプチドである。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝aibである、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC（配列番号：34）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝aibである、アミノ酸配列YXEGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC（配列番号：35）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝aibである、アミノ酸配列YXQGTFTSDYSIYLDKQAAXEFVNWLLAGGPSSGAPPPSK（配列番号：36）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝aibであり、さらに残基16と20の間にラクタム環を有するアミノ酸配列YXQGTFTSDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC（配列番号：37）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝aibであり、さらに残基16と20の間にラクタム環を有するアミノ酸配列YXQGTFISDYSIYLDEQAAKEFVNWLLAGGPSSGAPPPSC（配列番号：38）であるか、又は前記を含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、X＝aibであり、さらに残基16と20の間にラクタム環を有するアミノ酸配列YXQGTFISDYSIYLDEQAAKEFVCWLLAG（配列番号：39）であるか、又は前記を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】BIAcore T100（GE Healthcare）を用い25℃で表面プラズモン共鳴（SPR）によって測定した種々のFcγRの免疫グロブリンに対する結合親和性：a）種々の変種Fc領域（IgG1-P329G、IgG4-SPLE及びIgG1-LALA）を有する抗CD20抗体、及び種々の変種Fc領域（IgG1-P329G、IgG1-LALA及びIgG4-SPLE）を有する抗P-セレクチン抗体、並びに野生型Fc領域を含むこれらの抗体のFcγRI結合親和性；b）種々のFc領域（IgG1-野生型、IgG1-P329G、IgG1-LALA、IgG4-SPLE、IgG1-P329G / LALA、IgG4-SPLE/P329G）を有する抗CD9抗体のFcγRI結合親和性；c）種々のFc領域（IgG1-野生型、IgG1-P329G、IgG1-LALA、IgG4-SPLE、IgG1-P329G/ LALA、SPLE/P329G）を有する抗DC9抗体のFcγRIIA結合親和性（標準化応答は該受容体の濃度の関数として示される）；d）種々のFc領域（IgG1-野生型、IgG4-SPLE/P329G、IgG1-LALA、IgG1-LALA/P329G）を有する抗CD9抗体、及び種々のFc領域（IgG4-野生型、IgG4-SPLE）を有する抗P-セレクチン抗体のFcγRIIB結合親和性；e）種々のFc領域（IgG1-野生型、IgG4-SPLE、IgG1-LALA、IgG4-SPLE/P329G、IgG1-P329G、IgG1-LALA/P329G）を有する抗CD9抗体のFcγRIIIAV158結合親和性（標準化応答は該受容体の濃度の関数として示される）。
【図２】種々のFc領域（IgG1野生型、P329G、IgG4-SPLE）を有する抗P-セレクチン抗体、及び種々のFc領域（IgG1野生型、P329G及びIgG4-SPLE）を有する抗CD20抗体のC1q結合。
【図３】免疫エフェクター細胞を補給する潜在能力：Fc領域変種でELISAプレートを被覆し、ヒトFcγRIIIAをトランスフェクトしたヒトエフェクター細胞を添加した。エステラーゼアッセイを用いて活性化NK細胞の細胞溶解活性の誘発を測定した：a）種々のFc領域（野生型、LALA、P329G、P329G/LALA）を有する抗CD20抗体、b）種々のFc領域（P329R、P329G）を有する抗CD9抗体。
【図４】免疫エフェクター細胞を補給する潜在能力：ヒトFcγRIIIAをトランスフェクトしたヒトエフェクター細胞をエフェクターとして用い、CD20陽性Raji細胞を標的細胞として用いた。a）種々のFc領域（P329G、LALA及びP329G/LALA）を有する非糖操作抗CD20抗体、b）種々のFc領域（P329G、P329A及びLALA）を有する糖操作抗CD20抗体、コントロール：非糖操作抗CD20抗体。
【図５】補体依存細胞傷害（CDC）アッセイ：種々のFc領域を有する種々の抗体を、SUDH-L4標的細胞でCDCを媒介するそれらの効率について分析した。a）種々のFc領域（P329G、LALA及びP329G/LALA）を有する非糖操作抗CD20抗体、b）種々のFc領域（P329G、P329A及びLALA）を有する糖操作抗CD20抗体。
【図６】a）ヒトIgG1変種のFc結合グリカンの炭水化物プロフィール。LALA、P329G、P329A又はP329G/LALA変異を含むhIgG1のFc結合オリゴ糖のガラクトシル化のパーセンテージは、野生型抗体のそれとはほんのわずかの相違である。b）相対的ガラクトシル化：IgG1 P329G/LALA変異を導入した別個の4つのIgG。4つの別個のVドメインを、Hek293 EBNA細胞で発現させたときのそれらのガラクトシル化の量について比較した。
【図７】全血アッセイにおける抗体誘発血小板凝集。抗体濃度にしたがいその応答が異なる2人のドナーで決定されたように、ネズミIgG1は血小板凝集を誘発した：a）ドナーA、b）ドナーB。
【図８】ソルターゼ媒介ペプチド転移反応のSDS-PAGE分析。
【図９】雄のDIOマウスにおける、化合物ペプチド-ロング-G3Fc及びペプチド-ショート-G3Fcの単回投与（20nmol/kg、s.c.）後の体重増加（パートa）及び5日間累積食物摂取（パートb）の過程。ベヒクル：三角形／1；ヒトIgG1 Fc領域コントロール：丸／2；ペプチド-ショート-G3Fc：逆三角形／3；ペプチド-ロング-G3Fc：四角形／4。
【図１０】雄のdb/dbマウスへの化合物ペプチド-ロング-G3Fc及びペプチド-ショート-G3Fcの投与（20nmol/kg、s.c.）後の腹腔内グルコースチャレンジに応答するグルコース移動の過程（10a：ipGTT；10b：AUCipGTT）。図10aについて、ベヒクル：三角形；ヒトIgG1 Fc領域コントロール：丸；ペプチド-ショート-G3Fc：逆三角形；ペプチド-ロング-G3Fc：四角形。図10bについて、ベヒクル：１；ヒトIgG1 Fc領域コントロール：２；ペプチド-ショート-G3Fc：３；ペプチド-ロング-G3Fc：４。
【図１１】雄のdb/dbマウスへの化合物ペプチド-ロング-G3Fc及びペプチド-ショート-G3Fcの投与（20nmol/kg、s.c.）後の腹腔内グルコースチャレンジに応答するグルコース移動の用量依存過程（11a：ipGTT；11b：AUCipGTT）。図11aについて、ヒトIgG1 Fc領域コントロール：丸；1nmol/kgでのペプチド-ロング-G3Fc：逆三角形；3nmol/kgでのペプチド-ロング-G3Fc：三角形；10nmol/kgでのペプチド-ロング-G3Fc：四角形。図11bについて、ヒトIgG1 Fc領域コントロール：１；1nmol/kgでのペプチド-ロング-G3Fc：２；3nmol/kgでのペプチド-ロング-G3Fc：３；10nmol/kgでのペプチド-ロング-G3Fc：４。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
１．定義
本明細書及び特許請求の範囲では、免疫グロブリン重鎖Fc領域の残基の番号付けは、KabatのEUインデックスの番号付けである（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242（前記文献は参照により本明細書に含まれる））。“KabatのEUインデックス”という用語はヒトIgG1 EU抗体の残基番号付けを意味する。
“親和性”という用語は、分子（例えばの抗体）の単独結合部位とその結合パートナー（例えば抗原又はFc受容体）との間の非共有結合性相互作用の総合計の強度を意味する。特段の指示がなければ、本明細書で用いられるように、“結合親和性”は、結合ペア（例えば抗体/Fc受容体又は抗体と抗原）のメンバー間の1：1相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子XのそのパートナーYに対する親和性は、一般的には解離定数（Kd）によって表すことができる。親和性は、当業界で公知の通常的方法（本明細書に記載するものを含む）によって測定できる。
【００４４】
“改変”という用語は、変種抗体又は融合ポリペプチドを入手するための、親アミノ酸配列（例えば、Fc領域の少なくとも1つのFcRn結合部分を含む抗体又は融合ポリペプチドの親アミノ酸配列）中の1つ以上のアミノ酸残基の変異、付加又は欠失を意味する。
“アミノ酸変異”という用語は、親アミノ酸配列のアミノ酸配列における修正を意味する。例示的修正には、アミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失が含まれる。ある実施態様では、アミノ酸変異は置換である。“該位置のアミノ酸変異”という用語は、指定された残基の置換若しくは欠失、又は指定残基近傍への少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入を意味する。“指定残基近傍への挿入”は、その1つ又は2つの残基内への挿入を意味する。挿入は該指定残基のN-末端でも又はC-末端でもよい。
【００４５】
“アミノ酸置換”という用語は、予め定められた親アミノ酸配列中の少なくとも1つのアミノ酸残基の異なる“取替え”アミノ酸残基による取替えを意味する。取替え残基（1つ又は複数）は“天然に存在するアミノ酸残基”（すなわち遺伝暗号によってコードされる）であり得る。前記は、以下から成る群から選択される；アラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、アスパラギン酸（Asp）、システイン（Cys）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（Glu）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、リジン（Lys）、メチオニン（Met）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、セリン（Ser）、スレオニン（Thr）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）及びバリン（Val）。ある実施態様では、取替え残基はシステインではない。1つ以上の天然に存在しないアミノ酸残基による置換もまた、本明細書のアミノ酸置換の定義に包含される。“天然に存在しないアミノ酸残基”は、上記に列挙した天然に存在するアミノ酸残基以外の残基を意味する（前記はポリペプチド鎖中の近傍のアミノ酸残基と共有結合できる）。天然に存在しないアミノ酸残基の例にはノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン、aib及び他のアミノ酸残基アナローグ（例えば以下に記載されたもの：Ellman, et al., Meth.Enzym.202 (1991) 301-336）が含まれる。そのような天然に存在しないアミノ酸残基を生成するために、Norenら（Noren, et al., Science 244 (1989) 182）及び／又はEllmanら（上掲書）の手順を利用することができる。略記すれば、これらの方法は、サプレッサーtRNAを天然に存在しないアミノ酸残基で化学的に活性化する工程と前記に続く該RNAのin vitro転写及び翻訳を必要とする。天然に存在しないアミノ酸はまた化学的なペプチド合成によりペプチドへ取り込むことができ、さらにその後これらペプチドを組換え製造したポリペプチド（例えば抗体又は抗体フラグメント）と融合させることができる。
【００４６】
“アミノ酸の挿入”という用語は、予め定められた親アミノ酸配列への少なくとも1つの追加されるアミノ酸残基の取り込みを意味する。挿入は通常1つ又は2つのアミノ酸残基の挿入から成るが、本出願はより大きな“ペプチド挿入”、例えば約3つから約5つ又は約10までものアミノ酸残基の挿入を意図する。挿入される残基は、天然に存在しても、又は上記に規定したように天然に存在しなくてもよい。
“アミノ酸の欠失”という用語は、あるアミノ酸配列中の予め定められた位置における少なくとも1つのアミノ酸残基の除去を意味する。
“抗体変種”という用語は野生型抗体の変種を意味し、前記は、野生型アミノ酸配列と対比して、該アミノ酸配列における少なくとも1つの改変が該抗体変種アミノ酸配列に存在すること、例えば1つ以上のアミノ酸残基の変異によって野生型抗体に導入されることを特徴とする。
本出願では、アミノ酸の改変を記述するときはいつでも、意図的なアミノ酸改変であり偶発的アミノ酸改変ではない。
【００４７】
“抗体依存細胞媒介細胞傷害作用”、略して“ADCC”という用語は、FcRを発現する非抗原特異的細胞傷害性細胞（例えばナチュラルキラー細胞（NK細胞）、好中球及びマクロファージ）が、免疫グロブリンFc領域との結合によって標的細胞を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介反応を意味する。ADCCを媒介する主要細胞（NK細胞）はFcγRIIIのみを発現するが、一方、単球はFcγRI、FcγRII及びFcγRIIIを発現する。造血細胞上でのFcR発現は、下記文献の464ページの表3に要約されている：Ravetch and Kinet, Annu.Rev.Immunol.9 (1991) 457-492。
“抗体依存細胞性食作用”、略して“ADCP”という用語は、免疫グロブリンFc領域と結合する食細胞性免疫細胞（例えばマクロファージ、好中球又は樹状細胞）によって、抗体被覆細胞が全体的に又は部分的に内在化されるプロセスを意味する。
“Fc受容体と結合する”という用語は、（例えばBIAcore(R)アッセイ（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）における）Fc領域とFc受容体との結合を意味する。
【００４８】
BIAcore(R)アッセイでは、Fc受容体は表面に結合され、分析物（例えばFc領域含有融合ポリペプチド又は抗体）の結合は表面プラズモン共鳴（SPR）によって測定される。結合の親和性は、用語ka、kd及びKD（kd/ka）によって規定される（kaは結合定数、すなわちFc領域融合ポリペプチド又は複合物がFc領域/Fc受容体複合体を形成する結合速度定数であり、kdは解離定数、すなわちFc領域/Fc受容体複合体からFc領域融合ポリペプチド又は複合物が解離する速度定数である）。また別には、SPRセンサーグラムの結合シグナルは、共鳴シグナルの高さ及び解離態様に関して参照の応答シグナルと直接比較することができる。
“Ciq”という用語は、免疫グロブリンのFc領域のための結合部位を含むポリペプチドである。C1qは、2つのセリンプロテアーゼ（C1r及びC1s）と一緒に複合体C1（補体依存細胞傷害作用（CDC）経路の第一成分）を形成する。ヒトC1qは、例えば業者（Quidel, San Diego, Calif）から市場で購入できる。
“インクレチン受容体リガンドポリペプチド”という用語は、グルカゴン受容体、又は／及びグルカゴン様ペプチド-I（GLP-1）受容体、又は／及びグルコース依存インスリン親和性ペプチド（GIP）受容体と結合する天然に存在するか又は合成のポリペプチド、すなわちこれら受容体の少なくとも1つに対してアゴニスト活性を有する分子を意味する。
【００４９】
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、グルコース依存インスリン親和性ペプチド受容体と結合する。ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、グルコース依存インスリン親和性ペプチド受容体及びグルカゴン様ペプチド-I受容体と結合する。ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、グルコース依存インスリン親和性ペプチド受容体及びグルカゴン様ペプチド-I受容体及びグルカゴン受容体と結合する。
血液グルコースが下落し始めると、グルカゴン（膵臓によって産生されるホルモン）が肝臓にグリコゲンを分解してグルコースを放出するように信号を送り、血液グルコースレベルを正常レベルに上昇させる。GLP-1はグルカゴンと比較して異なる生物学的活性を有する。その作用には、インスリン合成及び分泌の刺激、グルカゴン分泌の阻害、及び食物摂取の阻害が含まれる。GLP-1は、糖尿病患者で高血糖症（グルコースレベルの上昇）を軽減することが示された。エクセンジン-4（GLP-1と約50％のアミノ酸配列同一性を共有するトカゲ毒に由来するペプチド）はGLP-1受容体を活性化し、同様に糖尿病患者で高血糖症を軽減することが示された。グルコース依存インスリン親和性ペプチド（GIP）は、42アミノ酸の胃腸管調節性ペプチドであり、グルコースの存在下で膵臓のベータ細胞のインスリン分泌を刺激する。前記は133アミノ酸の前駆体、プレプロGIPからタンパク分解プロセッシングによって誘導される。
【００５０】
本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、自然のままのグルカゴン配列に対して修正を有するインクレチン受容体リガンドを含み、前記は、自然のままのグルカゴンの活性と同等又はより強い強力なグルカゴン活性、自然のままのGIPの活性と同等又はより強い強力なGIP活性、及び／又は自然のままのGLP-1の活性と同等又はより強い強力なGLP-1活性を示す。
本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物の作用には、グルコース恒常性、インスリン分泌、胃内容の排除（gastric emptying）、腸成長、食物摂取の調節が含まれる。GIP活性及びGLP-1活性の両方を有するペプチドは、体重減少の誘発又は体重増加の予防と同様に高血糖症（糖尿病を含む）の治療に特に有益である。
インクレチン受容体リガンドポリペプチドには、GLP-1、エクセンジン-3、エクセンジン-4及び前記の前駆体、誘導体又はフラグメントが含まれるが、ただしこれらに限定されない。例示的なインクレチン受容体リガンドポリペプチドは、US 5,574,008、US 5,424,286、US 6,514,500、US 6,821,949、US 6,887,849、US 6,849,714、US 6,329,336、US6,924,264、WO 2003/103572、US 6,593,295、WO 2011/109784、WO 2010/011439、US 6,329,336及びUS 7,153,825に報告されている。
【００５１】
“CH2ドメイン”という用語は、およそEU231位からEU340位（EU番号付けはKabatにしたがう）に及ぶ、抗体重鎖ポリペプチドの部分を意味する。ある実施態様では、CH2ドメインは、APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQESTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK（配列番号：40）のアミノ酸配列を有する。CH2ドメインは、もう一方のドメインとぴったりと対合しているわけではないという点で特有である。それどころか、2つのN-結合分枝炭水化物鎖が、無傷の自然のままのFc領域の2つのCH2ドメインの間に差し挟まれている。この炭水化物はドメイン-ドメイン対合のための代替物を提供し、CH2ドメインの安定化を助けることができると考えられている（Burton, Mol.Immunol.22 (1985) 161-206）。
“CH3ドメイン”という用語は、およそEU341位からEU446位に及ぶ、重鎖抗体の部分を意味する。ある実施態様では、CH3ドメインは、GQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG（配列番号：41）のアミノ酸配列を有する。
抗体の“クラス”という用語は、その重鎖がもつ定常ドメイン又は定常領域のタイプを意味する。ヒトでは5つの主要な抗体クラス（IgA、IgD、IgE、IgG及びIgM）が存在し、さらにこれらのいくつかはサブクラス（サブタイプ）にさらに分割され得る（例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2）。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常ドメインは、α、δ、ε、γ及びμとそれぞれ呼ばれる。
【００５２】
“補体依存細胞傷害作用”、略して“CDC”という用語は、標的に結合したFc領域融合ポリペプチド又は複合物のFc領域が、該標的細胞膜に孔を形成するに至る一連の酵素反応を活性化させる細胞死誘発メカニズムを意味する。典型的には、抗原-抗体複合体（例えば抗体に被覆された標的細胞上のもの）が、補体成分C1qと結合してこれを活性化し、順次補体カスケードを活性化して標的細胞死に至る。補体の活性化はまた標的細胞表面上に補体成分の沈積をもたらし、前記は、白血球上の補体受容体（例えばCR3）と結合することによってADCC又はADCPを促進することができる。
“エフェクター機能”という用語は、抗体のFc領域に帰属させ得る生物学的活性を意味し、前記は抗体のアイソタイプにより変動する。抗体のエフェクター機能の例には以下が含まれる：C1q結合及び補体依存細胞傷害作用、Fc受容体結合、抗体依存細胞媒介細胞傷害作用（ADCC）、食作用（ADCP）、細胞表面受容体（例えばB細胞受容体）の下方調整、及びB細胞活性化。そのような機能は、例えば、Fc領域と食作用又は溶解活性を有する免疫細胞上のFc受容体との結合によって、又はFc領域と補体系の成分との結合によって達成され得る。
“エフェクター機能の低下”という用語は、コントロール分子（例えば野生型Fc領域を有するポリペプチド）と比較して、ある分子が関係する具体的なエフェクター機能（例えばADCC又はCDC）の少なくとも20％の低下を意味する。“エフェクター機能の強い低下”という用語は、コントロール分子と比較して、ある分子が関係する具体的なエフェクター機能（例えばADCC又はCDC）の少なくとも50％の低下を意味する。
【００５３】
薬剤（例えば医薬処方物）の“有効量”という用語は、所望の治療結果及び予防結果を達成するために必要な投薬及び期間での有効量を意味する。
“Fc領域”という用語は免疫グロブリンのC-末端領域を意味する。Fc領域は、ジスルフィドによって連結された抗体重鎖フラグメント（Fc領域ポリペプチド鎖）、場合によって1つ、2つ、3つ又は4つ以上のジスルフィド結合を含むダイマー分子である。Fc領域は、無傷の（完全長）抗体のパパイン消化、又はIdeS消化又はトリプシン消化によって生成できるが、組換えによってもまた製造することができる。
完全長抗体又は免疫グロブリンから入手できるFc領域は、完全長重鎖の残基226（Cys）からC-末端を含み、したがってヒンジ領域の一部分及び2つ又は3つの定常ドメイン（すなわちCH2ドメイン、CH3ドメイン及び場合によってCH4ドメイン）を含む。US5,648,260及びUS 5,624,821から、Fc領域中の規定アミノ酸の修正は表現型への影響をもたらすことが判明している。
【００５４】
2つの同一又は非同一の抗体重鎖フラグメントを含むダイマーFc領域の形成は、含有されるCH3ドメイン（含まれるアミノ酸残基については例えば以下を参照されたい：Dall'Acqua, Biochem.37 (1998) 9266-9273）の非共有結合ダイマー化によって媒介される。Fc領域は、ヒンジ領域内のジスルフィド結合の形成によって共有結合により安定化される（例えば以下を参照されたい：Huber, et al., Nature 264 (1976) 415-420; Thies, et al., J.Mol.Biol.293 (1999) 67-79）。CH3-CH2ドメイン相互作用のダイマー化を破壊するために、CH3ドメイン内へアミノ酸残基の変更を導入することは、新生児Fc領域（FcRn）結合に有害な影響を与えないが（CH3-CH3ドメインダイマー化に巻き込まれる残基の位置はCH3ドメインの内部境界面に位置するため）、Fc領域-FcRn相互作用に巻き込まれる残基はCH2-CH3ドメインの外側に位置する。
Fc領域のエフェクター機能に関係する残基は、完全長抗体分子で決定したときヒンジ領域、CH2及び／又はCH3ドメインに位置する。FC領域関連/媒介機能は以下である：（i）抗体依存細胞性細胞傷害作用（ADCC）、（ii）補体（C1q）結合、活性化及び補体依存細胞傷害作用（CDC）、（iii）抗原抗体複合体の食作用/除去、（iv）いくつかの事例におけるサイトカイン放出、及び（v）抗体及び抗原-抗体複合体の半減/除去速度。
【００５５】
Fc領域関連エフェクター機能は、Fc領域とエフェクター機能特異的分子又は受容体との相互作用によって開始する。IgG1アイソタイプの大半の抗体が受容体活性化に影響を及ぼすことができるが、IgG2及びIgG4アイソタイプの抗体はエフェクター機能をもたないか、又は限定的なエフェクター機能をもつ。
エフェクター機能誘引受容体は以下のFc受容体タイプ、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIである。IgG1アイソタイプと関係するエフェクター機能は、下方ヒンジ領域における特異的アミノ酸変化、例えばL234A及び／又はL235Aを導入することによって低下させることができ、前記はFcγR及びC1q結合で必要である。さらにまたある種のアミノ酸残基（特にCH2及び／又はCH3ドメインに位置する残基）は、血流中の抗体分子又はFc領域融合ポリペプチドの循環半減期と密接に関係する。循環半減期は、Fc領域と新生児Fc受容体（FcRn）との結合によって決定される。
Fc領域糖構造に存在するシアリル残基は、Fc領域の抗炎症媒介活性に必要である（例えば以下を参照されたい：Anthony, R.M., et al.Science 320 (2008) 373-376）。
抗体定常領域のアミノ酸残基の番号付けはKabatのEUインデックスにしたがって実施される（Kabat, E.A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91 3242）。
【００５６】
“ヒト起源のFc領域”という用語はヒト起源の免疫グロブリン重鎖のC-末端領域を意味し、前記はヒンジ領域の少なくとも一部分、CH2ドメイン及びCH3ドメインを含む。ある実施態様では、ヒトIgG重鎖Fc領域は、約Cys226から、又は約Pro230から該重鎖のカルボキシ末端に及ぶ。しかしながら、該Fc領域のC-末端リジン（Lys447）は存在してもしなくてもよい。
“変種Fc領域”という用語は、少なくとも1つの“アミノ酸改変/変異”のために“自然のままの”又は“野生型”Fc領域のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を意味する。ある実施態様では、変種Fc領域は、自然のままのFc領域又は親ポリペプチドのFc領域と比較して、少なくとも1つのアミノ酸変異、例えば約1つから約10のアミノ酸変異を有し、ある実施態様では、自然のままのFc領域又は親ポリペプチドのFc領域に約1つから約5つのアミノ酸変異を有する。ある実施態様では、（変種）Fc領域は、野生型Fc領域及び／又は親ポリペプチドのFc領域と少なくとも約80％の相同性を有し、ある実施態様では、変種Fc領域は少なくとも90％の相同性、ある実施態様では、変種Fc領域は少なくとも約95％の相同性を有する。
【００５７】
本明細書に報告する変種Fc領域は、含まれるアミノ酸改変によって規定される。したがって、例えばP329Gという用語は、親（野生型）Fc領域と対比して、アミノ酸329位でプロリンからグリシンへの変異を有する変種Fc領域を意味する。野生型アミノ酸の実体が未確認ということもあり得る（その場合は、前述の変種は329Gと示される）。本発明で考察する全ての位置について、番号付けはEUインデックスにしたがう。EUインデックス又はKabatのEUインデックス又はEU番号付け体系はEU抗体の番号付けを指す（Edelman, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 63 (1969) 78-85（前記文献は参照により完全に本明細書に含まれる））。改変は、付加、欠失又は変異であり得る。“変異”という用語は、天然に存在するアミノ酸の変更と同様に天然に存在しないアミノ酸の変更を意味する。例えば以下を参照されたい：US 6,586,207、WO98/48032、WO03/073238、US2004/0214988、WO2005/35727、WO2005/74524、Chin, J.W., et al., J.Am.Chem.Soc.124 (2002) 9026-9027；Chin, J.W.and Schultz, P.G., ChemBioChem 11 (2002) 1135-1137；Chin, J.W., et al., PICAS United States of America 99 (2002) 11020-11024；及びWang, L.and Schultz, P.G., Chem.(2002) 1-10（前記文献の全てが参照により完全に本明細書に含まれる）。
【００５８】
IgG1アイソタイプの野生型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：42）。
変異L234A、L235Aを有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：43）。
ホール変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：44）。
ノブ変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：45）。
【００５９】
L234A、L235A及びホール変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：46）。
L234A、L235A及びノブ変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：47）。
P239G変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：48）。
L234A、L235A及びP329G変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：49）。
【００６０】
P239G及びホール変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：50）。
P239G及びノブ変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：51）。
L234A、L235A、P329G及びホール変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：52）。
L234A、L235A、P329G及びノブ変異を有する、IgG1アイソタイプの変種ヒトFc領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：53）。
【００６１】
IgG4アイソタイプの野生型ヒトFc領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号：54）。
S228P及びL235E変異を有する、IgG4アイソタイプの変種ヒトFc領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号：55）。
S228P、L235E及びP329G変異を有する、IgG4アイソタイプの変種ヒトFc領域のポリペプチド鎖は以下のアミノ酸配列を有する：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号：56）。
【００６２】
“Fc受容体”、略して“FcR”という用語は、Fc領域と結合する受容体を意味する。ある実施態様では、FcRは自然のままのヒトFcR配列である。さらにまた、ある実施態様では、FcRはIgG抗体と結合するFcR（Fcガンマ受容体）であり、前記は、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIサブクラスの受容体を含む（前記の対立遺伝子変種及びまた別にはスプライス形を含む）。FcγRII受容体はFcγRIIA（“活性亢進性受容体”）及びFcγRIIB（“阻害性受容体”）を含み、前記は主として細胞質ドメインが相違する類似のアミノ酸配列を有する。活性亢進性受容体FcγRIIAは、イムノレセプターチロシン系活性化モチーフ（ITAM）をその細胞質ドメインに含む。阻害性受容体FcγRIIBは、イムノレセプターチロシン系阻害モチーフ（ITIM）をその細胞質ドメインに含む（例えば以下を参照されたい：Daoron, M., Annu.Rev.Immunol.15 (1997) 203-234）。FcRは以下の文献で概括されている：Ravetch and Kinet, Annu.Rev.Immunol 9 (1991) 457-492；Capel, et al., Immunomethods 4 (1994) 25-34；de Haas, et al., J.Lab.Clin.Med.126 (1995) 330-341。他のFcR（将来同定されるものも含む）も本明細書の“FcR”という用語に包含される。前記用語はまた新生児受容体FcRnを含む（FcRnは母親のIgGの胎児への移転に必要である、例えば以下を参照されたい：Guyer, et al., J.Immunol.117 (1976) 587；Kim, et al., J.Immunol.24 (1994) 249）。
【００６３】
“IgG Fcリガンド”という用語は、IgG抗体のFc領域と結合してFc領域/Fcリガンド複合体を形成する、任意の生物由来の分子（ある実施態様ではポリペプチド）を意味する。Fcリガンドには、FcγR、FcRn、C1q、C3、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、スタフィロコッカスタンパク質A、ストレプトコッカスタンパク質G及びウイルスFcγRが含まれるが、ただしこれらに限定されない。FcリガンドにはまたFc受容体ホモローグ（FcRH）が含まれ、前記はFcγRと同族のFc受容体ファミリーである（例えば以下を参照されたい：Davis, et al., Immunological Reviews 190 (2002) 123-136（前記文献は参照により完全に本明細書に含まれる））。FcリガンドはFcと結合する未発見分子を含むことができる。ある実施態様では、IgG FcリガンドはFcRn及びFcガンマ受容体である。
【００６４】
“Fcガンマ受容体”、略して“FcγR”という用語は、IgG抗体のFc領域と結合し、FcγR遺伝子によってコードされるタンパク質ファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトでは、このファミリーには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：FcγRI（CD64）（アイソフォームFcγRIA、FcγRIB及びFcγRICを含む）、FcγRII（CD32）（アイソフォームFcγRIIA（アロタイプH131及びR131を含む）、FcγRIIB（FcγRIIB-1及びFcγRIIB-2を含む）及びFcγRIICを含む）、及びFcγRIII（CD16）（アイソフォームFcγRIIIA（アロタイプV158及びF158を含む）及びFcγRIIIB（アロタイプFcγRIIB-NA1及びFcγRIIB-NA2を含む）（例えば以下を参照されたい：Jefferis, et al., Immunol.Lett.82 (2002) 57-65（前記文献は参照により完全に本明細書に含まれる））とともに任意の未発見ヒトFcγR又はFcγRアイソフォーム若しくはアロタイプ。FcγRは任意の生物に由来し得る。前記生物には、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、及びサルが含まれる（ただしこれらに限定されない）。マウスFcγRには以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：FcγRI（CD64）、FcγRII（CD32）、FcγRIII（CD16）及びFcγRIII-2（CD16-2）とともに任意の未発見のマウスFcγR又はFcγRアイソフォーム若しくはアロタイプ。Fc領域-FcγR相互作用に必要とされるアミノ酸残基は234−239（下方ヒンジ領域）、256−269（B/Cループ）、297−299（D/Eループ）及び327−332（F/Gループ）である（Sondermann, et al., Nature 406 (2000) 267-273）。FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIB及び／又はFcγRIIIAに対する結合/親和性の低下をもたらすアミノ酸変異は、N297A（同時に免疫原性の低下及び結合/親和性半減期の延長をもたらす）（Routledge, et al., Transplantation 60 (1995) 847；Friend, et al., Transplantation 68 (1999) 1632；Shields, et al., J.Biol.Chem.276 (1995) 6591-6604）、残基233−236を含む（Ward and Ghetie, Ther.Immunol.2 (1995) 77; Armour, et al., Eur.J.Immunol.29 (1999) 2613-2624）。いくつかの例示的アミノ酸置換はUS 7,355,008及びUS 7,381,408に記載されている。
【００６５】
“新生児Fc受容体”、略して“FcRn”という用語はIgG抗体のFc領域と結合し、少なくとも部分的にFcRn遺伝子によってコードされるタンパク質を意味する。FcRnは任意の生物（ヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルが含まれるが、ただしこれらに限定されない）に由来し得る。当業界で知られているように、機能的なFcRnタンパク質は、2つのポリペプチド（しばしば重鎖及び軽鎖と称される）を含む。軽鎖はベータ-2-ミクログロブリンであり、重鎖はFcRn遺伝子によってコードされる。本明細書では特段の記載がなければ、FcRn又はFcRnタンパク質は、FcRn重鎖とベータ-2-ミクログロブリンとの複合体を指す。FcRｎと相互作用するFc領域のアミノ酸残基はCH2及びCH3ドメインの結合部近くに存在する。Fc領域-FcRn接触残基はいずれも単一IgG重鎖内に存在する。巻き込まれるアミノ酸残基は、248、250−257、272、285、288、290−291、308−311及び314（全てCH2ドメイン内）並びにアミノ酸残基385−387、428及び433−436（全てCH3ドメイン内）である。FcRnに対する結合/親和性の増加をもたらすアミノ酸変異には、T256A、T307A、E380A及びN434Aが含まれる（Shields, et al., J.Biol.Chem.276 (2001) 6591-6604）。
【００６６】
“野生型ポリペプチド”又は“親ポリペプチド”という用語は、未修正（野生型ポリペプチド）であるか又は野生型と区別させる少なくとも1つの改変を既に含んでいる出発ポリペプチドを意味し、前記は続いて改変されて変種を生じる。“野生型ポリペプチド”という用語は、ポリペプチドそのもの、該ポリペプチドを含む組成物、又は該ポリペプチドをコードする核酸配列を意味する。したがって、“野生型Fc領域ポリペプチド又は複合物”という用語は、変種を生成するために改変される、天然に存在するFc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物を意味する。
“完全長抗体”という用語は、自然のままの抗体構造と実質的に同一の構造及びアミノ酸配列を有する抗体とともに、本明細書に報告するFc領域を含むポリペプチドを意味する。
“ヒンジ領域”という用語は、CH1ドメイン及びCH2ドメインを結合する抗体重鎖ポリペプチドの部分、例えば、KabatのEU番号系にしたがえば約216位から約230位を意味する。他のIgGアイソタイプのヒンジ領域は、該IgG1アイソタイプのヒンジ領域システイン残基を用いてアラインメントを実施することによって決定できる。
【００６７】
通常、ヒンジ領域は、同一のアミノ酸配列を有する2つのポリペプチドから成るダイマー分子である。ヒンジ領域は一般的には約25アミノ酸残基を含み、さらに可撓性で抗原結合部位が自由に動くことを可能にする。ヒンジ領域は3つのドメイン、上方、中央及び下方ヒンジドメインに細分割することができる（例えば以下を参照されたい：Roux, et al., J.Immunol.161 (1998) 4083）。
Fc領域の“下方ヒンジ領域”という用語は、該ヒンジ領域のC-末端に接する一続きのアミノ酸残基、すなわちKabatのEU番号付けにしたがえばFc領域の残基233から239を意味する。
“野生型Fc領域”という用語は、天然に見出されるFc領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を意味する。野生型ヒトFc領域には、自然のままのヒトIgG1 Fc領域（非A及びアロタイプ）、自然のままのヒトIgG2 Fc領域、自然のままのヒトIgG3 Fc領域、及び自然のままのヒトIgG4 Fc領域とともに天然に存在する前記の変種が含まれる。
【００６８】
参照配列に対する“パーセント（％）アミノ酸配列同一性”とは、最大のパーセント配列同一性を達成するために必要ならばギャップを導入し、さらに一切の保存的置換を配列同一性の部分と考えないで配列をアラインメントした後で、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性の決定を目的とするアラインメントは、当業界の技術範囲内にある多様な方法で、例えば公開コンピューターソフトウェア（例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign（DNASTAR）ソフトウェア）を用いて達成できる。当業者は、配列アラインメントの適切なパラメーター（比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む）を決定できる。しかしながら、本明細書の目的のためには、％アミノ酸配列同一性の値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて作出される。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムは、ジェネンテック社（Genentech, Inc.,）が製作者であり、ソースコードはユーザー参考文書類とともに米国著作権局（Washington D.C., 20559）に提出され、著作権登録No.TXU510087で登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテック社（Genentech, Inc., South San Francisco, California）から一般に入手可能であり、ソースコードからコンパイルすることもできる。ALIGN-2プログラムはUNIX操作系（デジタルUNIX V4.0D.を含む）での使用のためにコンパイルされるべきである。全ての配列比較パラメーターはALIGN-2プログラムによって設定され、変更はない。
【００６９】
ALIGN-2をアミノ酸配列比較に利用する状況では、あるアミノ酸配列Aのあるアミノ酸配列Bに対する、Bに関する又はBに対比される％アミノ酸配列同一性（前記表現はまた別には、あるアミノ酸配列Bに対する、Bに関する又はBと対比されるある％アミノ酸配列同一性を有するか又は含むあるアミノ酸配列Aと表現することができる）は、以下のように計算される：
分数X/Yの100倍
式中、Xは、配列アラインメントプログラムALIGN-2によって当該プログラムのA及びBのアラインメントにおいて同一マッチと採点されたアミノ酸残基の数であり、Yは、Bのアミノ酸残基総数である。アミノ酸配列Aの長さはアミノ酸配列Bの長さと等しくはないこと、AのBに対する％アミノ酸配列同一性はAに対するBの％アミノ酸配列同一性と等しくはないことは理解されよう。特段の記載がなければ、本明細書で用いられる全ての％アミノ酸配列同一性の値が、ALIGN-2コンピュータプログラムを利用する直前のパラグラフの記載にしたがって入手されれる。
【００７０】
“医薬処方物”という用語は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効であることを可能にする形態を有し、さらに当該処方物が投与される対象動物に許容不能なほど有害である追加成分を含まない調製物を指す。
“医薬的に許容できる担体”は医薬処方物中の活性成分以外の成分を指し、前記は対象動物にとって非毒性である。医薬的に許容できる担体には、緩衝剤、安定化剤又は保存料が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
“位置”という用語は、あるポリペプチドのアミノ酸配列中のアミノ酸残基の場所を意味する。位置は、連続的に又は確立された様式（例えば抗体の番号付けのためのKabatのEUインデックス）にしたがって番号を付され得る。
“治療”（及びその文法的変化形、例えば“治療する”又は“治療の”）という用語は、治療される個体の自然な過程の改変を試みる臨床的介入を意味し、予防のために又は臨床病変の過程中に実施することができる。所望され得る治療効果には、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、該疾患の一切の直接的又は間接的な病理学的帰結の軽減、転移の予防、疾患の進行速度の低下、病状の緩和又は一時的緩和、及び緩解又は予後改善が含まれるが、ただしこれらに限定されない。いくつかの実施態様では、本発明の抗体を用いて、発症を先送りするか又は病気の進行を遅くする。
【００７１】
“変種”という用語は、親ポリペプチドのアミノ酸配列とは相違するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。典型的には、そのような分子は、1つ以上の改変、挿入又は欠失を有する。ある実施態様では、変種アミノ酸配列は親アミノ酸配列と100％未満の配列同一性を有する。ある実施態様では、変種アミノ酸配列は、親ポリペプチドのアミノ酸配列と約75％から100％未満のアミノ酸配列同一性のアミノ酸配列を有する。ある実施態様では、変種アミノ酸配列は、親ポリペプチドのアミノ酸配列と約80％から100％未満の、ある実施態様では約85％から100％未満の、ある実施態様では約90％から100％未満の、さらにある実施態様では約95％から100％未満のアミノ酸配列同一性を有する。
【００７２】
“改変”FcR結合親和性又はADCC活性という用語は、親ポリペプチド（例えば野生型Fc領域を含むポリペプチド）と比較して、FcR結合活性及び／又はADCC活性の強化又は低下を有するポリペプチドを意味する。FcRとの“結合の増加を示す”変種ポリペプチドは、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドよりも低い解離定数（すなわちより良好な/より高い親和性）で少なくとも1つのFcRと結合する。FcRとの“結合の低下を示す”ポリペプチド変種は、親ポリペプチド又は野生型ポリペプチドよりも高い解離定数（すなわちより不良の/より低い親和性）で少なくとも1つのFcrと結合する。FcRとの結合の低下を示す変種は、FcRに対してほとんど又は評価し得る結合を保持し得ない。例えば本明細書に記載の実施例で決定したとき、野生型又は親IgG Fc領域と比較して該FcRとの結合は例えば0−20％である。
【００７３】
親又は野生型ポリペプチドと比較して“低下した親和性”でFcRと結合するポリペプチドは、結合アッセイ中のポリペプチド変種と親ポリペプチドの量が（本質的に）ほぼ同じ量であるときに、親ポリペプチドと比較して上記で認定したFcRのいずれか1つ以上と（実質的に）低下した結合親和性で結合するポリペプチドである。例えば、低下したFcR結合親和性を有するポリペプチド変種は、親ポリペプチドと比較してFcR結合親和性で約1.15倍から約100倍、例えば約1.2倍から約50倍の低下を示し得る（ここでFcR結合親和性は、例えば本明細書に開示する実施例で示すように決定される）。
“ヒトエフェクター細胞の存在下でより低い効率で抗体依存細胞媒介細胞傷害作用（ADCC）を媒介する”変種Fc領域を含むポリペプチドは、アッセイで用いられる変種ポリペプチドと親ポリペプチドの量が（本質的に）ほとんど同じ量であるときに、in vitro又はin vivoでのADCC媒介の効率がより低いポリペプチドである。一般的には、そのような変種は、本明細書で開示するin vitroのADCCアッセイを用いて同定されるであろう（ただしADCC活性を決定する他のアッセイ又は方法（例えば動物モデルにおけるものなど）も意図される）。ある実施態様では、例えば本明細書に開示するin vitroアッセイで、該変種は、ADCC媒介において親よりも約1.5倍から約100倍、例えば約2倍から約50倍効率が低い。
【００７４】
“受容体”という用語は、少なくとも1つのリガンドと結合することができるポリペプチドを意味する。ある実施態様では、受容体は細胞表面受容体であり、前記は、細胞外リガンド結合ドメイン、場合によって他のドメイン（例えばトランスメンブレンドメイン、細胞内ドメイン及び／又は膜アンカー）を有する。本明細書に記載するアッセイで評価される受容体は、無傷の受容体又はそのフラグメント若しくは誘導体（例えば1つ以上の異種ポリペプチドと融合した受容体の結合ドメインを含む融合タンパク質）であり得る。さらにまた、その結合特性について評価される受容体は、細胞内に存在しても又は単離され、場合によってアッセイプレート若しくはいくつかの他の固相上に被覆されてもよい。
“受容体結合ドメイン”という用語は、ある受容体のための任意の自然のままのリガンド（細胞粘着分子を含む）、又は対応する自然のままのリガンドの少なくとも定性的な受容体結合能力を保持するそのような自然のままのリガンドの任意の領域若しくは誘導体を意味する。とりわけ、この定義は、特に上述の受容体のためのリガンドの結合配列を含む。
【００７５】
II.Fc領域融合ポリペプチド又は複合物
変種Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物が本明細書で報告される。しかしながら、親ポリペプチドはFc領域を含む任意のポリペプチドであり得る。
本発明は、Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物のFc領域内の既定された位置における2つの変異の組み合わせがFc領域関連エフェクター機能の完全な低下をもたらすという発見に部分的に基づいている。
エフェクター機能を誘引するFc領域の選択は、該Fc領域融合ポリペプチド又は複合物の意図される使用に左右される。
所望される使用が可溶性標的の機能の中和であるならば、非エフェクター機能を誘引するアイソタイプ又は変種が選択されるべきである。
所望の使用が標的の除去であるならば、エフェクター機能を誘引するアイソタイプ又は変種が選択されるべきである。
所望の使用が細胞結合標的の拮抗であるならば、非エフェクター機能を誘引するアイソタイプ又は変種が選択されるべきである。
所望の使用が標的提示細胞の除去であるならば、エフェクター機能を誘引するアイソタイプ又は変種が選択されるべきである。
【００７６】
Fc領域融合ポリペプチド又は複合物の循環半減期はFc領域-FcRn相互作用を調整することによって影響を受け得る。前記は、Fc領域の特定のアミノ酸残基を変更することによって達成できる（Dall'Acqua, W.F., et al., J.Biol.Chem.281 (2006) 23514-23524；Petkova, S.B., et al., Internat.Immunol.18 (2006) 1759-1769；Vaccaro, C., et al.Proc.Natl.Acad.Sci.103 (2007) 18709-18714）。
抗体依存細胞媒介細胞傷害作用（ADCC）及び補体依存細胞傷害作用（CDC）の最小限化又は除去さえも、いわゆるヒンジ領域アミノ酸の変更/置換によって達成できる。置換のために選択されるアミノ酸残基は、Fc領域とヒトFc受容体（FcRnではない）との結合に必要であると予想される残基である。この/これらのアミノ酸残基の変更は、野生型IgG Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して改善された安全性プロフィールを生じる。
古典的補体カスケードは、抗原/IgG免疫複合体によるC1qの結合及び活性化によって開始される。この活性化は炎症性及び／又は免疫調節性応答をもたらす。古典的補体カスケードの活性化の最小限化又は除去さえも、いわゆるヒンジ領域アミノ酸の変更/置換によって達成できる。置換のために選択されるアミノ酸残基は、Fc領域と補体C1qとの結合に必要であると予想されるアミノ酸残基である。C1q結合の低下又は排除さえ示す例示的なFc領域変種は、変異L234A及びL235A（LALA）を含むFc領域変種である。
【００７７】
Fc領域融合ポリペプチド又は複合物と新生児受容体（FcRn）との結合は、該ポリペプチドの胎盤通過移転をもたらし、該Fc領域融合ポリペプチド又は複合物の循環半減期に影響を及ぼす。Fc領域融合ポリペプチド又は複合物の循環半減期の延長は、有効性の改善、投与用量若しくは頻度の減少、又は標的への分布の改善をもたらす。Fc領域融合ポリペプチド又は複合物の循環半減期の短縮は、全身曝露の短縮又は標的対非標的結合比の改善をもたらす。
種を通して保存されるFcRn結合に必要なアミノ酸残基は、Fc領域内の310位及び435位のヒスチジン残基である。これらの残基は、Fc領域FcRn相互作用のpH依存性の要因である（例えば以下を参照されたい：Victor, G., et al., Nature Biotechnol.15 (1997) 637-640；Dall'Acqua, W.F., et al.J.Immunol.169 (2002) 5171-5180）。FcRnとの相互作用を弱めるFc領域の変異は抗体半減期を短縮させ得る。
【００７８】
一般的には、親Fc領域融合ポリペプチド又は複合物のFc領域は、野生型又は改変Fc領域のどちらかのFc領域を含む。ある実施態様では、Fc領域はヒト起源のFc領域である。しかしながら、親Fc領域融合ポリペプチド又は複合物のFc領域は、野生型Fc領域と比較して既に1つ以上のアミノ酸配列改変を有し得る。例えば、親Fc領域のC1q又はFcγR結合活性は改変されてあってもよい（Fc領域修正の他のタイプは下記でさらに詳細に記載される）。ある実施態様では、親Fc領域は“概念的”であり、前記は自然には存在しないが、抗体操作が使用されるべき変種Fc領域を決定することができる。
ある実施態様では、親Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域ポリペプチド複合物の部分をコードする核酸が改変されて、変種Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物の部分をコードする変種核酸配列が生成される。
変種Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域複合物の部分のアミノ酸配列をコードする核酸は、当業界で公知の多様な方法によって調製できる。これらの方法には、より早い段階で調製されたFc領域融合ポリペプチドコードDNAの位置指定（又はオリゴヌクレオチド媒介）変異導入、PCR変異導入、及びカセット変異導入による調製が含まれるが（ただし前記に限定されない）、DNA合成によって化学的に生成することもできる。
【００７９】
位置指定変異導入は置換変種の調製に適切な方法である。この技術は当業界で周知である（例えば以下を参照されたい：Carter, et al., Nucl.Acids Res.13 (1985) 4431-4443；Kunkel, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 (1985) 488）。略記すれば、DNAの位置指定変異導入の実施では、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドを先ず初めに出発DNAの一本鎖とハイブリダイズさせることによって、出発DNAが改変される。ハイブリダイゼーション後に、前記ハイブリダイズさせたオリゴヌクレオチドをプライマーとして、さらに前記出発DNA一本鎖を鋳型として利用し、DNAポリメラーゼを用いて完全な第二の鎖を合成する。したがって、所望の変異をコードするオリゴヌクレオチドは生成二本鎖DNAに取り込まれる。
PCR変異もまた出発ポリペプチドのアミノ酸配列変種の作製に適切である（例えば以下を参照されたい：Higuchi, in PCR Protocols, Academic Press (1990) pp.177-183, Vallette, et al., Nucl.Acids Res.17 (1989) 723-733）。略記すれば、少量の鋳型DNAがPCRで出発物質として用いられるときは、鋳型DNAの対応する領域と配列がわずかに相違するプライマーを用いて、比較的大量の固有のDNAフラグメントを生成できる（前記フラグメントは、プライマーが鋳型と相違する位置でのみ鋳型配列と相違する）。
変種を調製するもう1つの方法（カセット変異導入）は、Wellsらが記載した技術による（Wells, et al., Gene 34 (1985) 315-323）。
【００８０】
本明細書で報告するある特徴は、抗体のFc領域（ある実施態様ではヒト抗体のFc領域）を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物であり、前記では、少なくとも1つのアミノ酸残基が付加、変異又は欠失により改変されてあり、親又は野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、少なくとも1つのFc受容体に対する該Fc領域融合ポリペプチド又は複合物の親和性の低下又は除去がもたらされる。
Fc領域は、多数の受容体又はリガンド（Fc受容体（例えばFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA）、補体タンパク質C1q、及び他の分子（例えばタンパク質A及びG）を含むが、ただしこれらに限定されない）と相互作用する。これらの相互作用は、多様なエフェクター機能及び下流のシグナリング事象（抗体依存細胞媒介細胞傷害作用（ADCC）、抗体依存細胞性食作用（ADCP）及び補体依存細胞傷害作用（CDC）を含むが、ただしこれらに限定されない）に必須である。
【００８１】
ある実施態様では、本明細書に報告するFc領域融合ポリペプチド又は複合物は、親又は野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、Fc受容体（エフェクター機能を誘引することができる）に対して低下した又は改変された親和性を有するFc領域を含み、ここで該Fc領域融合ポリペプチド又は複合物のアミノ酸配列は、親Fc領域融合ポリペプチド又は複合物のアミノ酸配列と少なくとも1つのアミノ酸残基の少なくとも1つの付加、変異又は欠失により相違する。
ある実施態様では、本明細書に報告するFc領域融合ポリペプチド又は複合物は少なくとも1つ以上の以下の特性を有する：エフェクター機能（ADCC及び／又はCDC及び／又はADCP）の低下若しくは除去、Fc受容体との結合の低下若しくは除去、C1qとの結合の低下若しくは除去、又は傷害性の低下若しくは除去。
ある実施態様では、本明細書に報告するFc領域融合ポリペプチド又は複合物は、KabatのEUインデックスにしたがえば329位のプロリンアミノ酸残基の少なくとも1つの変異又は欠失を有するFc領域を含む。
あるアミノ酸配列から1つのアミノ酸が欠失する場合、残余のアミノ酸残基は、該アミノ酸配列における実際の位置は変化するが、多段変異Fc領域で固有のアミノ酸残基の正確な特定を可能にするためにそれらのEUインデックス番号を維持する。
【００８２】
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、KabatのEUインデックスにしたがえば29位にアミノ酸変異を有する野生型ヒトFc領域を含む。ある実施態様では、Fc領域は少なくとも1つのさらに別のアミノ酸変異を含む。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、Fc領域におけるプロリンサンドイッチの機能を低下又は下落させるアミノ酸置換、欠失又は付加を有する野生型ヒトFc領域を含む。
ある実施態様では、Fc領域のアミノ酸239位のプロリン残基は、プロリンより小さい又は大きいアミノ酸残基に変異させられる。ある実施態様では、該アミノ酸残基はグリシン、アラニン又はアルギニンに変異させられる。ある実施態様では、KabatのEUインデックスにしたがえば、Fc領域の329位のアミノ酸残基プロリンはグリシンに変異させられる。
ある実施態様では、本明細書に報告するFc領域融合ポリペプチド又は複合物は、少なくとも2つのアミノ酸変異、付加又は欠失を有する野生型Fc領域を含む。
ある実施態様では、本明細書に報告するFc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型ヒトFc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、ヒトFc受容体（FcγR）及び／又はヒト補体受容体に対して親和性の低下を有する。
ある実施態様では、融合ポリペプチド又は複合物中のFc領域のFcγRI、FcγRII及び／又はFcγRIIIAの少なくとも1つに対する親和性が低下する。ある実施態様では、FcγRI及びFcγRIIIAに対する親和性が低下する。ある実施態様では、FcγRI、FcγRII及びFcγRIIIAに対する親和性が低下する。
【００８３】
ある実施態様では、FcγRI、FcγRIIIA及びC1qに対する親和性が低下する。
ある実施態様では、FcγRI、FcγRII、FcγRIIIA及びC1qに対する親和性が低下する。
ある実施態様では、本明細書に報告するFc領域融合ポリペプチド又は複合物によって誘発されるADCCは、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して低下する。ある実施態様では、ADCCは、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物によって誘発されるADCCと比較して少なくとも20％低下する。
ある実施態様では、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物によって誘発されるADCC及びCDCは減少又は除去される。
ある実施態様では、本明細書に報告するFc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較してADCC、CDC及びADCPの減少を有する。
ある実施態様では、本明細書に報告するFc領域融合ポリペプチド又は複合物は、S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D及びP331Sを含む群から選択される少なくとも1つのアミノ酸置換をFc領域に含む。
ある実施態様では、野生型Fc領域はヒトIgG1 Fc領域又はヒトIgG4 Fc領域である。
【００８４】
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、329位のアミノ酸残基プロリンの変異の他に、少なくとも1つのさらに別のアミノ酸付加、変異又は欠失をFc領域に含み、前記は該融合ポリペプチド又は複合物の安定性の増加と相関性を有する。
ある実施態様では、該Fc領域融合ポリペプチド又は複合物のFcRに対する親和性は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物の親和性の多くとも10から20％である。
ある実施態様では、本明細書に報告するFc領域融合ポリペプチド又は複合物のさらに別のアミノ酸残基付加、変異又は欠失は、該Fc領域がIgG4アイソタイプであるならば228位及び／又は235位に存在する。ある実施態様では、228位のアミノ酸残基セリン及び／又は235位のアミノ酸残基ロイシンが別のアミノ酸で置換される。ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、228位にプロリン残基を含む（セリン残基のプロリン残基への変異）。ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、235位にグルタミン酸残基を含む（ロイシン残基のグルタミン酸残基への変異）。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は3つのアミノ酸変異を含む。ある実施態様では、3つのアミノ酸変異はP329G、S228P及びL235E変異である（P329G/SPLE）。
ある実施態様では、本明細書に報告するFc領域融合ポリペプチド又は複合物のさらに別のアミノ酸残基付加、変異又は欠失は、該Fc領域がIgG1アイソタイプであるならば234位及び／又は235位に存在する。ある実施態様では、234位のアミノ酸残基ロイシン及び／又は235位のアミノ酸残基ロイシンは別のアミノ酸に変異させられる。
【００８５】
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、234位にアミノ酸変異を含むFc領域を含み、ここで該ロイシンアミノ酸残基はアラニンアミノ酸残基に変異させられる。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、235位にアミノ酸変異を含むFc領域を含み、ここで該ロイシンアミノ酸残基はセリンアミノ酸残基に変異させられる。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、329位のアミノ酸変異（ここでプロリンアミノ酸残基はグリシンアミノ酸残基に変異させられる）、234位のアミノ酸変異（ここでロイシンアミノ酸残基はアラニンアミノ酸残基に変異させられる）、及び235位のアミノ酸変異（ここでロイシンアミノ酸残基はアラニンアミノ酸残基に変異させられる）を含むFc領域を含む。
ある実施態様ではFcγRとの結合が改変されるが、新生児受容体（FcRn）に対して結合親和性が改変されたFc領域融合ポリペプチド又は複合物もまた本明細書に報告する特徴におけるある実施態様である、
FcRnに対する親和性が増したFc領域変種はより長い血清半減期を有し、そのような分子は、（例えば慢性疾患又は異常の治療のために）投与したFc領域融合ポリペプチド又は複合物の長い半減期が所望される哺乳動物の治療方法で有益に利用されるであろう。
【００８６】
FcRn結合親和性が減少したFc領域融合ポリペプチド又は複合物はより短い血清半減期を有し、そのような分子は、（例えば有害な副作用を回避するため又はin vivo診断画像化で利用するために）投与したFc領域融合ポリペプチド又は複合物のより短い半減期が所望される哺乳動物の治療方法で有益に利用されるであろう。FcRn結合親和性が減少したFc領域融合ポリペプチド又は複合物は胎盤を通過する蓋然性がより少なく、したがって妊婦の疾患又は異常の治療で利用され得る。
FcRnに対する結合親和性が改変されたFc領域融合ポリペプチド又は複合物は、ある実施態様では、238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439及び／又は447位のアミノ酸の１つ以上でアミノ酸改変を有するFc領域を含むものを含む。
FcRnとの結合が低下したFc領域融合ポリペプチド又は複合物は、ある実施態様ではアミノ酸252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439及び／又は447位に1つ以上のアミノ酸改変を有するFc領域を含む。
FcRnとの結合の増加を示すFc領域融合ポリペプチド又は複合物は、ある実施態様ではアミノ酸238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424及び／又は434位に1つ以上のアミノ酸改変を有するFc領域を含む。
【００８７】
Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、任意のクラス（例えばIgG、IgM及びIgEを含むが、ただしこれらに限定されない）のFc領域を含むことができる。ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物はIgGクラスのFc領域を含む。ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、IgG1、IgG2、IgG3又はIgG4サブクラスのFc領域を含む。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物はIgG1サブクラスのFc領域を含み、アミノ酸変異P329G及び／又はL234A及びL235AをFc領域に含む。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物はIgG4サブクラスのFc領域をを含む。ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、IgG4サブクラスのFc領域を含み、アミノ酸変異P329G及び／又はS228P及びL235EをFc領域に含む。
ある実施態様では、本明細書に報告するFc領域融合ポリペプチド又は複合物は、生物学的に活性なポリペプチドを1つ以上のアミノ酸変異を含む本明細書に報告するFc領域と組換えにより融合又は結合させることによって製造される。ある実施態様では、本明細書に報告するFc領域融合ポリペプチド又は複合物は、親Fc領域融合ポリペプチド又は複合物を1つ以上の本明細書に報告するアミノ酸変異を導入することによる修正によって製造される。
【００８８】
ソルターゼAを用いる酵素的複合物形成
Fc領域及び1つ以上のインクレチン受容体リガンドポリペプチドを含む複合物は酵素ソルターゼAを用いることによって得ることができる。
ソルターゼA（SrtA）は膜結合酵素であり、前記は共有結合によりタンパク質を細菌の細胞壁に付着させる。SrtA基質上の固有の認識モチーフはLPXTG（配列番号：75）であり、それによって該酵素は残基スレオニンとグリシン間を切断する。ペプチドグリカン上の認識モチーフはペンタグリシンである。N-末端のトリグリシンさらにジグリシンさえもSrtA反応を支援するために十分であることが示されている（Clancy, K.W., et al., Peptide science 94 (2010) 385-396）。反応はチオエステルアシル-酵素中間体を介して進行し、前記はオリゴグリシンに由来する求核アミンの攻撃によって分解され、ペプチドグリカンをタンパク質基質に共有結合により連結し、SrtAを再生する。SrtAを用いて、化学合成ペプチドと組換え発現タンパク質との共有結合複合物を生成することができる。
インクレチン受容体リガンドポリペプチド（例えばGIP受容体及びGLP-1受容体二重アゴニスト活性を有する）とサブクラスIgG1のヒトFc領域との酵素的複合物形成のために、可溶性SrtA（黄色ブドウ球菌（Staph. Aureus）のアミノ酸残基60−206）を用いることができる。該酵素は大腸菌（E. coli）で製造できる。各重鎖のN-末端にトリプルGモチーフを有するFc領域を真核細胞（例えばHEK293細胞、CHO細胞）で発現させることができる。SrtA認識モチーフをインクレチン受容体リガンドポリペプチドのC-末端に導入する。
【００８９】
本明細書に報告するある特徴は、Fc領域インクレチン受容体リガンドポリペプチド複合物であり、前記は、酵素ソルターゼAを用いてインクレチン受容体リガンドポリペプチドとFc領域との複合物を形成することによって得られる。ここでは、ソルターゼ認識配列は、インクレチン受容体リガンドポリペプチドのC-末端及び／又はFc領域重鎖フラグメントの一方又は両方のC-末端に位置し、トリプルモチーフは、インクレチン受容体リガンドポリペプチドのN-末端及び／又はFc領域重鎖フラグメントの一方若しくは両方のどちらかに位置する。
したがって、本発明は、インクレチン受容体リガンドポリペプチドのアミノ酸配列及びソルターゼ認識配列のアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供する。例示的特徴では、本発明は、インクレチン受容体リガンドポリペプチドのアミノ酸配列及びLPXTG（配列番号：75）（Xは任意のアミノ酸）を含むポリペプチドを提供する。例示的特徴では、XはGluである。例示的特徴では、ポリペプチドは、LPXTG（配列番号：75）（Xは任意のアミノ酸である）のN-末端に（N-terminally to LPXTG (SEQ ID NO: 75)）1つ以上のGly残基を含む。また別の或いは追加の実施態様では、ポリペプチドは、LPXTG（配列番号：73）のC-末端に（C-terminally to LPXTG (SEQ ID NO: 73)）Gly-Gly又はGly-Gly-Ser又はGly-Gly-Gly、 Gly-Gly-Gly-Ser（配列番号：79）、Gly-Gly-Gly-Gly（配列番号：80）、又はGly-Gly-Gly-Gly-Serを含む。例示的特徴では、ポリペプチドは、(GGS)n（式中n＝1−4；配列番号：82−84）、又はGn（式中n＝2−6；配列番号：85−87）、(GGGS)n（式中n＝1−6；配列番号：57−60、88及び89）、(GGGGS)m（式中m＝1−6；配列番号：61−64、90及び91）、又は(GGGGGS)o（式中o＝1−6；配列番号：65−67及び92−94）を含む。
【００９０】
ある実施態様では、Fc領域重鎖フラグメントの一方又は両方が、トリプルGモチーフのC-末端とFc領域重鎖のN-末端との間に配置されたリンカーポリペプチドを含む。
ある実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、SrtA認識配列のN-末端とインクレチン受容体リガンドポリペプチドのC-末端との間に配置されたリンカーポリペプチドを含む。
ある実施態様では、リンカーポリペプチドは9から25アミノ酸残基の長さを有する。ある実施態様では、リンカーポリペプチドは、(GGGS)3（配列番号：57）、(GGGS)4（配列番号：58）、(GGGS)5（配列番号：59）、(GGGS)6（配列番号：60）、(GGGGS)2（配列番号：61）、 (GGGGS)3（配列番号：62）、(GGGGS)4（配列番号：63）、(GGGGS)5（配列番号：64）、(GGGGGS)2（配列番号：65）、(GGGGGS)3（配列番号：66）及び(GGGGGS)4（配列番号：67）から選択される。
例示的特徴では、本発明は、インクレチン受容体リガンドポリペプチドのアミノ酸配列及びリンカー（例えば配列番号：57−67のいずれかのアミノ酸配列を含むリンカー）を含むポリペプチドを提供する。
ある実施態様では、融合ポリペプチド又は複合物は1つのインクレチン受容体リガンドポリペプチドを含む。この実施態様では、インクレチン受容体リガンドポリペプチドは、Fc領域の単一N-末端又はC-末端と結合する複合物を形成する。この実施態様ではまた、Fc領域は、2つの抗体重鎖Fc領域フラグメントをもつヘテロダイマーであり、そのただ1つがインクレチン受容体リガンドポリペプチド又はオリゴグリシンモチーフを含む。
【００９１】
2つのインクレチン受容体リガンドポリペプチド（GIP受容体及びGLP-1受容体を活性化することによって二重アゴニスト特性を有する）と結合して複合物を形成するヒトIgG1 Fc領域を含む複合物は、血液グルコースの制御及び激しい脂肪量減少のために用いることができる。
そのような複合物は、腹腔内グルコースチャレンジの後、糖尿病db/dbマウスで血液グルコース移動を減少させることが示された。
さらに、食餌誘発肥満（DIO）のマウスで、そのようなインクレチン受容体リガンドポリペプチドFc領域複合物の投与は、一用量で食物摂取の低下及び激しい体重減少を誘発できることが観察された。
インクレチン受容体（例えばGLP-1及びGIP受容体）の活性化は、グルコース依存インスリン分泌、膵臓ベータ細胞の増殖及び脂肪傷害作用からの防御、並びにアポトーシスの予防（PKA及び／又はEPAC活性化の下流経路によって媒介される）をもたらす（Dzhura, I., et al., Islets 3 (2011) 121-128；Ehses, J.A., et al., Endocrin.144 (2003) 4433-4445；Kang, G., et al., J.Biol.Chem.278 (2003) 8279-8285；Miura, Y.and Matsui, H., Tox.Appl.Pharmacol.216 (2006) 363-372；Mukai, E., et al., Diabetes 60 (2011) 218-226；Natalicchio, A., et al., Endocrin.151 (2010) 2019-2029；Quoyer, J., et al., J.Biol.Chem.285 (2010) 1989-2002；Uhles, S., et al., Diabetes Obes.Metabol.13 (2010) 326-336）。
さらにまた、インクレチン受容体（例えばGLP-1及びGIP受容体）は、グルカゴンを分泌する膵臓アルファ細胞で検出された。
【００９２】
インクレチン受容体（例えばGLP-1受容体）の存在は、迷走神経とともに広域CNSでの分布が報告された。門脈GLP-1受容体の活性化はグルコース恒常性において決定的な役割を果たすと報告されている（Burcelin, R., et al., Diabetes 50 (2001) 1720-1728；Vahl, T.P., et al., Endocrin.148(2007) 4965-4973）。さらに、フレクシッヒ半月核で発現されるGLP-1受容体はグルコースレベルの調節に関係することが示唆された（Sandoval, D.A., et al., Diabetes 57 (2008) 2046-2054）。
後脳及び視床下部におけるGLP-1受容体の活性化は、食物消費の制限及び肥満の予防に重要な役割を果たす（Hayes, M.R., et al., Endocrinol.150 (2009) 2654-2659；McMahon, L.R.and Wellman, P.J., Am.J.Physiol.274 (1998) R23-29；Turton, M.D., et al., Nature 379 (1996) 69-72）。
GIP及びGIP受容体はCNSに存在する。CNSのGIPは神経発生及び記憶に役割を有する（Figueiredo, C.P., et al., Behav.Pharmacol.21 (2010) 394-408; Nyberg, J., et al., J.Neurosci.25 (2005) 1816-1825）。
インクレチン受容体（例えばGIP受容体）は脂肪細胞に存在し、脂肪分解及び脂肪酸の再エステル化を誘発する（Getty-Kushik, L., et al., Obesity 14 (2006) 1124-1131）。さらに、GIP受容体活性化はヒト脂肪細胞のLPL発現の増加をもたらす（Kim, S.J., et al., J.Biol.Chem.282 (2007) 8557-8567; Kim, S.J., et al., J.Lipid Res.51 (2010) 3145-3157）。
【００９３】
Fcリガンドとの結合の低下
本明細書に報告するFc領域融合ポリペプチド又は融合物は、（未修正Fc領域融合ポリペプチド又は複合物と対比して）改変されたFcγR及び／又はC1q結合特性（結合特性の例には、結合特異性、平衡解離定数（KD）、解離及び結合速度（それぞれkoff及びkon）、結合親和性及び／又はアビジチーが含まれるが、ただしこれらに限定されない）を有すること、及びある種の改変は多かれ少なかれ所望される得るものであることは当業者には理解されるであろう。平衡解離定数（KD）はkd/kaと定義されることは当業界では公知である。当業者は、どの動力学的パラメーターが与えられた適用についてもっとも重要であるかを決定することができる。例えば、１つ以上の正の調製物質（例えばFcγRIIIA）との結合を低下させる修正及び／又は阻害性Fc受容体（例えばFcγRIIB）との結合の強化はADCC活性の低下のために適切であろう。したがって、結合親和性（例えば平衡解離定数（KD））の比率は、ADCC活性が強化されるか又は緩和されるかを示すことができる。さらに、C1qとの結合を低下させる修正はCDC活性の低下又は除去のために適切であろう。
【００９４】
Fc領域のそのリガンドに対する親和性及び結合特性は、Fc領域/FcR相互作用（すなわちFc領域とFcγRとの特異的結合）を決定するための当業界で公知の多様なin vitroアッセイ方法（生化学又は免疫学依存アッセイ）によって決定できる。前記には例えば以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：平衡方法（例えば酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）又は放射性免疫アッセイ（RIA））又は動力学（例えばBIACORE(商標)分析）及び他の方法（例えば間接結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー転移（FRET）、ゲル電気泳動及びクロマトグラフィー（例えばゲルろ過））。これらの方法及び他の方法は、1つ以上の被検成分上の標識を利用するか、及び／又は多様な検出方法（発色団系、蛍光系、化学発光系又は放射性同位元素系標識を含むが、ただしこれらに限定されない）を用いることができる。結合親和性及び動力学に関する詳細な記述は以下で見出すことができる：Paul, W.E., (ed.), Fundamental Immunology, 4th Ed., Lippincott-Raven, Philadelphia, 1999。
【００９５】
ある実施態様では、変種Fc領域を含む本明細書で報告するFc領域融合ポリペプチド又は複合物（前記ではアミノ酸329位のアミノ酸残基プロリンが変異し、少なくとも1つのさらに別のアミノ酸残基が変異する）は、親Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較してヒトFc受容体（FcR）及び／又はヒト補体に対する親和性の低下を示す。ある実施態様では、本明細書で報告するFc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型ヒトFc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物よりも少なくとも2倍、又は少なくとも3倍、又は少なくとも5倍、又は少なくとも7倍、又は少なくとも10倍、又は少なくとも20倍、又は少なくとも30倍、又は少なくとも40倍、又は少なくとも50倍、又は少なくとも60倍、又は少なくとも70倍、又は少なくとも80倍、又は少なくとも90倍、又は少なくとも100倍、又は少なくとも200倍低いFc受容体に対する親和性を有する。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、1つ以上のFc受容体（FcγRI（CD64）（アイソフォームFcγRIAを含む）、FcγRII及びFcγRIII（CD16、アイソフォームFcγRIIIAを含む）を含むが、ただしこれらに限定されない）に対して低下した結合親和性を有する。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、FcγRI（CD64）、FcγRIIA及びFcγRIIIAに対して低下した結合親和性を有する。
【００９６】
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、FcγRIIA及びFcγRIIIAに対して低下した結合親和性を有する。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、FcγRI（CD64）及びFcγRIIIAに対して低下した結合親和性を有する。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、少なくとも１つのFc受容体に対して低下した結合親和性及びC1qに対して低下した結合親和性を有する。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、FCγRIIBに対して結合の増加をもたない。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、ヒト受容体FCγRIIIA並びにヒト受容体FcγRIIA、FcγRIIIB及びC1qを含む群の少なくとも1つのさらに別の受容体に対して親和性の増加を有する。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、ヒト受容体FcγRIIIA並びにFcγRIIA、FcγRIIIB及びC1qを含む群の少なくとも2つのさらに別の受容体に対して親和性の増加を有する。
【００９７】
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、ヒトFcγRIA、FcγRIIIA、FcγRIIA、FcγRIIIB及びC1qに対して低下した親和性を有する。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、ヒト受容体FcγRIA、FcγRIIIA、FcγRIIA、FcγRIIIB及びC1qに対して低下した親和性を有する。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、FcγRI又はFcγRIIAに対して減少した親和性を有する。ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物の親和性よりも少なくとも2倍、又は少なくとも3倍、又は少なくとも5倍、又は少なくとも7倍、又は少なくとも10倍、又は少なくとも20倍、又は少なくとも30倍、又は少なくとも40倍、又は少なくとも50倍、又は少なくとも60倍、又は少なくとも70倍、又は少なくとも80倍、又は少なくとも90倍、又は少なくとも100倍、又は少なくとも200倍低いFcγRI又はFcγRIIAに対する親和性を有する。
【００９８】
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物の親和性よりも少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも40％、少なくとも30％、少なくとも20％、少なくとも10％、又は少なくとも5％低いFcγRI又はFcγRIIAに対する親和性を有する。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、FcγRIIIAに対して減少した親和性を有する。ある実施態様では、FcγRIIIAに対する親和性は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物の親和性よりも少なくとも2倍、又は少なくとも3倍、又は少なくとも5倍、又は少なくとも7倍、又は少なくとも10倍、又は少なくとも20倍、又は少なくとも30倍、又は少なくとも40倍、又は少なくとも50倍、又は少なくとも60倍、又は少なくとも70倍、又は少なくとも80倍、又は少なくとも90倍、又は少なくとも100倍、又は少なくとも200倍低い。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物の親和性よりも少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも40％、少なくとも30％、少なくとも20％、少なくとも10％、又は少なくとも5％低いFcγRIIIAに対する親和性を有する。
【００９９】
FcγRIIIAのF1-58V対立遺伝子変種はFc領域に対して改変された結合の特徴を有することが当業界では知られている。ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、FcγRIIIA(F1-58V)受容体に対して減少した親和性を有する。ある実施態様では、FcγRIIIA(F1-58V)に対する親和性は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物の親和性よりも少なくとも2倍、又は少なくとも3倍、又は少なくとも5倍、又は少なくとも7倍、又は少なくとも10倍、又は少なくとも20倍、又は少なくとも30倍、又は少なくとも40倍、又は少なくとも50倍、又は少なくとも60倍、又は少なくとも70倍、又は少なくとも80倍、又は少なくとも90倍、又は少なくとも100倍、又は少なくとも200倍低い。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較してC1qに対して減少した親和性を有する。ある特徴では、C1qに対する親和性は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物の親和性よりも少なくとも2倍、又は少なくとも3倍、又は少なくとも5倍、又は少なくとも7倍、又は少なくとも10倍、又は少なくとも20倍、又は少なくとも30倍、又は少なくとも40倍、又は少なくとも50倍、又は少なくとも60倍、又は少なくとも70倍、又は少なくとも80倍、又は少なくとも90倍、又は少なくとも100倍、又は少なくとも200倍低い。
【０１００】
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物の親和性よりも少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも40％、少なくとも30％、少なくとも20％、少なくとも10％、又は少なくとも5％低いC1qに対する親和性を有する。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物の親和性よりも少なくとも90％、少なくとも80％、少なくとも70％、少なくとも60％、少なくとも50％、少なくとも40％、少なくとも30％、少なくとも20％、少なくとも10％、又は少なくとも5％低いヒトFcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcγRIIIA(F1-58V)又はC1qに対する親和性を有する。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcγRIIIA(F158V)及び／又はC1qに対して、それぞれ約10nMから100nM、10nMから1μM、100nMから約100μM、又は約100nMから約10μM、又は約100nMから約1μM、又は約1nMから約100μM、又は約10nMから約100μM、又は約1μMから約100μM、又は約10μMから約100μMの間の親和性を有する。ある実施態様では、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcγRIIIA(F158V)又はC1qに対する親和性は、100nM、500nM、1μMより強いか、5μMより強いか、10μMより強いか、25μMより強いか、50μMより強いか、又は100μMより強い。
【０１０１】
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、FcγRIIBに対して増加した親和性を有する。ある実施態様では、FcγRIIBに対する親和性は変化がないか、又は野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物の親和性よりも少なくとも2倍、又は少なくとも3倍、又は少なくとも5倍、又は少なくとも7倍、又は少なくとも10倍、又は少なくとも20倍、又は少なくとも30倍、又は少なくとも40倍、又は少なくとも50倍、又は少なくとも60倍、又は少なくとも70倍、又は少なくとも80倍、又は少なくとも90倍、又は少なくとも100倍、又は少なくとも200倍増加する。ある実施態様では、FcγRIIB受容体に対する親和性は、野生型Fc領域を含むFc領域融合ポリペプチド又は複合物と比較して、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％増加する。
ある実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又は複合物は、FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA、FcγRIIIA(F1-58V)及び／又はC1qに対して少なくとも100μM未満、50μM未満、10μM未満、5μM未満、2.5μM未満、1μM未満、又は100nM未満、又は10nM未満の親和性を有する。
【０１０２】
エフェクター機能の低下
本発明のある種の特徴では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較してエフェクター機能を調整する。
ある実施態様では、該調整は、ADCC及び／又はADCP及び／又はCDCの調整である。
ある実施態様では、該調整はダウン調整又は効果の軽減である。
ある実施態様では、該調整はADCCの調整である。ある実施態様では、該調整はADCC及び／又はADCPのダウン調整である。
ある実施態様では、該調整はADCC及びCDCのダウン調整である。ある実施態様では、該調整はADCCのみのダウン調整である。ある実施態様では、該調整はADCC及びCDC及び／又はADCPのダウン調整である。ある実施態様では、該調整はADCC、CDC及びADCPのダウン調整又は軽減である。
ある実施態様では、ADCC及び／又はCDC及び／又はADCPの軽減又はダウン調整は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物によるADCC及び／又はCDC及び／又はADCPの誘発についてそれぞれ観察される値の0％、2.5％、5％、10％、20％、50％又は75％の軽減である。
ある実施態様では、ADCCの調整は、融合ポリペプチド又は複合物のEC50値が、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較して少なくとも約10倍低下するような潜在能力の減少である。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較して、ヒトエフェクター細胞の存在下でADCC及び／又はCDC及び／又はADCPを実質的に欠く。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較して、ADCC、CDC及び／又はADCPの低下（例えば少なくとも20％の低下）又は強力な低下（例えば少なくとも50％の低下）を有する（前記はダウン調整又は軽減であり得る）。
【０１０３】
ADCC活性の低下
in vitro及び／又はin vivo細胞傷害アッセイを用いて、CDC及び／又はADCC活性の低下/枯渇を決定できる。例えば、Fc受容体（FcR）結合アッセイを用いて、融合ポリペプチド又は複合物がFcγR結合を欠く（したがっておそらくADCC活性を欠く）が、FcRn結合能力は維持することを担保することができる。ADCCを媒介する主要細胞、NK細胞はFcγRIIIのみを発現するが、単球はFcγRI、FcγRII及びFcγRIIIを発現する。造血細胞上でのFcR発現は以下の文献の464ページの表3に要約されている：Ravetch and Kinet, Annu.Rev.Immunol.9 (1991) 457-492。対象となる分子のADCC活性を評価するin vitroアッセイの非限定的な例は例えば以下に記載されている：US5,500,362；Hellstrom, I., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83 (1986) 7059-7063；Hellstrom, I., et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82 (1985) 1499-1502；US5,821,337；又はBruggemann, M., et al., J.Exp.Med.166 (1987) 1351-1361。非放射能細胞傷害アッセイもまた利用できる。例えば、フローサイトメトリー用ACTTTM非放射能細胞傷害アッセイ（CellTechnology, Inc.Mountain View, CA）及びCytoTox96(商標)非放射能細胞傷害アッセイ（Promega, Madison, WI）を用いることができる。そのようなアッセイのために有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（PBMC）及びナチュラルキラー（NK）細胞が含まれる。また別には或いは追加的に、融合ポリペプチド又は複合物のADCCは、in vivoで、例えば動物モデル（例えば以下の文献で報告されたもの：Clynes, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95 (1998) 652-656）で評価してもよい。C1q結合アッセイもまた実施して、融合ポリペプチド又は複合物がC1qと結合せず、したがってCDC活性を欠くことを確認することができる。例えば、WO2006/029879及びWO2005/100402で報告されたC1q及びC3c結合ELISAを参照されたい。補体の活性化を評価するために、CDCアッセイを実施することができる（例えば以下を参照されたい：Gazzano-Santoro, et al., J.Immunol.Meth.202 (1996) 163；Cragg, M.S., et al., Blood 101 (2003) 1045-1052；及びCragg, M.S., and Glennie, M.J., Blood 103 (2004) 2738-2743）。FcRn結合及びin vivo除去/半減期決定もまた当業界で公知の方法を用いて実施できる（例えば以下を参照されたい：Petkova, S.B., et al., Int.Immunol.18 (2006) 1759-1769）。
【０１０４】
本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、1つ以上のFcγR媒介エフェクター細胞機能を決定するin vitro機能アッセイによってその特徴が明らかにされることが意図される。
ある種の実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、in vitro系アッセイで決定された結合特性及びエフェクター細胞機能と類似するin vivoモデル（例えば本明細書に記載及び開示するもの）における結合特性及びエフェクター細胞機能を有する。しかしながら、本明細書で報告する融合ポリペプチド又は複合物はin vitro系アッセイでは所望の表現型を示さないが、in vivoで所望の表現形を示すということも排除されない。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較して減少したADCC活性を有する。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物のADCC活性より少なくとも少なくとも2倍、又は少なくとも3倍、又は少なくとも5倍、又は少なくとも10倍、又は少なくとも50倍、又は少なくとも100倍低いADCC活性を有する。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と対比して、少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％、又は少なくとも60％、又は少なくとも70％、又は少なくとも80％、又は少なくとも90％、又は約100％低下したADCC活性を有する。
【０１０５】
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物によるADCC又はCDC又はADCPのそれぞれの誘発について観察される値の0％、2.5％、5％、10％、20％、50％、又は75％である低下又はダウン調整ADCC活性を有する。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、検出可能なADCC活性をもたない。
ある実施態様では、ADCC活性の低下及び／又は除去は、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物のFcリガンド及び／又は受容体に対する親和性の低下による。
ある実施態様では、ADCCのダウン調整は、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物のEC50値が、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較してほぼ10倍低下するような潜在能力の減少である。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、ADCC及び／又はCDC及び／又はADCPを調整する。ある実施態様では、融合ポリペプチド又は複合物は、低下CDC及びADCC及び／又はADCP活性を有する。
【０１０６】
CDC活性の低下
補体活性化経路は、ある分子、例えば同族抗原と複合体を形成したFc領域含有分子と補体系（C1q）の第一成分との結合によって開始する。補体活性化を評価するために、CDCアッセイ（例えば以下に記載されたもの：Gazzano-Santoro, et al., J.Immunol.Methods, 202 (1996) 163）を実施できる。
本明細書に報告する種々の融合ポリペプチド又は複合物の結合特性をELISAサンドイッチ型免疫アッセイによって分析することができる。1/2最大応答時の融合ポリペプチド又は複合物濃度によってEC50値が決定される。前記情報が、サンプルプレートで測定される参照スタンダードに対する相対的相違として、サンプルと参照の変動係数とともに提示される。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と対比して、C1qに対して減少した親和性を有する。ある実施態様では、融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物の親和性よりも少なくとも2倍、又は少なくとも3倍、又は少なくとも5倍、又は少なくとも7倍、又は少なくとも10倍、又は少なくとも20倍、又は少なくとも30倍、又は少なくとも40倍、又は少なくとも50倍、又は少なくとも60倍、又は少なくとも70倍、又は少なくとも80倍、又は少なくとも90倍、又は少なくとも100倍、又は少なくとも200倍低いC1q親和性を有する。
【０１０７】
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物のC1q親和性よりも少なくとも90％、又は少なくとも80％、又は少なくとも70％、又は少なくとも60％、又は少なくとも50％、又は少なくとも40％、又は少なくとも30％、又は少なくとも20％、又は少なくとも10％、又は少なくとも5％低い親和性を有する。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、約100nMと約100μM、又は約100nMと約10μM、又は約100nMと約1μM、又は約1nMと約100μM、又は約10nMと約100μM、又は約1μMと約100μM、又は約10μMと約100μMの間のC1q親和性を有する。ある実施態様では、融合ポリペプチド又は複合物は、1μM以上、又は5μM以上、又は10μM以上、又は25μM以上、又は50μM以上、又は100μM以上のC1q親和性を有する。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較して低下したCDC活性を有する。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物のCDC活性よりも少なくとも2倍、又は少なくとも3倍、又は少なくとも5倍、又は少なくとも10倍、又は少なくとも50倍、又は少なくとも100倍低いCDC活性を有する。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と対比して、少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％、又は少なくとも60％、又は少なくとも70％、又は少なくとも80％、又は少なくとも90％、又は約100％低下したCDC活性を有する。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は検出可能なCDC活性をもたない。
ある実施態様では、CDC活性の低下及び／又は除去は、該融合ポリペプチド又は複合物のFcリガンド及び／又は受容体に対する親和性の低下に起因する。
【０１０８】
抗体関連傷害性の低下
生物学療法は、望ましくない細胞及び／又は標的の認識及び攻撃を免疫系に指示するという複雑な性質に関連する有害な傷害性に関する問題を有し得ることは当業界で知られている。治療を必要とする場所で攻撃のための認識又は標的誘導が発生しないとき、例えば有害な傷害性のような結果が生じ得る。例えば非標的組織の抗体染色は潜在的傷害性の問題の指標となり得る。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較して低い抗体関連傷害性を有する。ある実施態様では、該融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物の傷害性よりも少なくとも2倍、又は少なくとも3倍、又は少なくとも5倍、又は少なくとも7倍、又は少なくとも10倍、又は少なくとも20倍、又は少なくとも30倍、又は少なくとも40倍、又は少なくとも50倍、又は少なくとも60倍、又は少なくとも70倍、又は少なくとも80倍、又は少なくとも90倍、又は少なくとも100倍、又は少なくとも200倍低い傷害性を有する。ある実施態様では、該融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と対比して少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％、又は少なくとも60％、又は少なくとも70％、又は少なくとも80％、又は少なくとも90％、又は約100％低い傷害性を有する。
【０１０９】
血小板凝集（Thrombocyte aggregation）
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較して、低い血小板活性化及び／又は血小板凝集を有する。ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、血小板活性化及び／又は凝集の減少又は除去さえ示す。
生物学療法は有害作用として血小板凝集を有し得ることは当業界では知られている。血小板凝集の測定にin vitro及びin vivoアッセイを用いることができよう。in vitroアッセイはin vivoの状況を反映すると思われる。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較して、in vitroアッセイで低い血小板凝集誘発を示す。
ある実施態様では、該融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物の血小板凝集誘発よりも少なくとも2倍、又は少なくとも3倍、又は少なくとも5倍、又は少なくとも7倍、又は少なくとも10倍、又は少なくとも20倍、又は少なくとも30倍、又は少なくとも40倍、又は少なくとも50倍、又は少なくとも60倍、又は少なくとも70倍、又は少なくとも80倍、又は少なくとも90倍、又は少なくとも100倍、又は少なくとも200倍低い血小板凝集誘発をin vitroアッセイで示す。
【０１１０】
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と対比して少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％、又は少なくとも60％、又は少なくとも70％、又は少なくとも80％、又は少なくとも90％、又は約100％低い血小板凝集誘発をin vitroアッセイで示す。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチドと比較して低い血小板凝集in vivo誘発を有する。ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物の血小板凝集誘発よりも少なくとも2倍、又は少なくとも3倍、又は少なくとも5倍、又は少なくとも7倍、又は少なくとも10倍、又は少なくとも20倍、又は少なくとも30倍、又は少なくとも40倍、又は少なくとも50倍、又は少なくとも60倍、又は少なくとも70倍、又は少なくとも80倍、又は少なくとも90倍、又は少なくとも100倍、又は少なくとも200倍低い血小板凝集誘発をin vivoアッセイで示す。
ある実施態様では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチドと対比して少なくとも10％、又は少なくとも20％、又は少なくとも30％、又は少なくとも40％、又は少なくとも50％、又は少なくとも60％、又は少なくとも70％、又は少なくとも80％、又は少なくとも90％、又は約100％低い血小板凝集誘発の緩和をin vivoアッセイで示す。
【０１１１】
III．組換え体方法
Fc融合ポリペプチド又はFc領域複合物の部分は組換え体方法又は組成物を用いて製造することができる（例えばUS4,816,567を参照されたい）。
ある特徴では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物の部分をコードする単離核酸が提供される。
ある特徴では、そのような核酸を含む1つ以上のベクター（例えば発現ベクター）が提供される。
ある特徴では、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。ある実施態様では、宿主細胞は以下を含む（例えば以下で形質転換されてある）：（1）該融合ポリペプチドの第一の重鎖Fc領域又は該複合物の第一の完全若しくは部分重鎖Fc領域を含むアミノ酸配列、及び該融合ポリペプチドの第二の重鎖Fc領域又は該複合物の第二の完全若しくは部分重鎖Fc領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、又は（2）該融合ポリペプチドの第一の重鎖Fc領域又は該複合物の第一の完全若しくは部分重鎖Fc領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第一のベクター、及び該融合ポリペプチドの第二の重鎖Fc領域又は該複合物の第二の完全若しくは部分重鎖Fc領域を含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第二のベクター。
ある実施態様では、宿主細胞は真核細胞（例えばヒト胎児腎（HEK）細胞、又はチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、又はリンパ様細胞（例えばY0、NS0、Sp20細胞））である。
【０１１２】
ある特徴では、本明細書に報告する融合ポリペプチドの作製方法が提供され、前記方法は、上記で提供した融合ポリペプチド又は複合物をコードする核酸を含む宿主細胞を該融合ポリペプチド又は複合物の発現に適切な条件下で培養する工程、及び場合によって宿主細胞（又は宿主細胞培養媒体）から該融合ポリペプチド又は複合物を回収する工程を含む。
ある特徴では、本明細書に報告するポリペプチド複合物を作製する方法が提供され、前記方法は、上記に提供したポリペプチド融合物の一部分をコードする核酸を含む宿主細胞を該ポリペプチド複合物の部分の発現に適切な条件下で培養する工程、及び場合によって該宿主細胞（又は宿主細胞培養媒体）から該ポリペプチド複合物の部分を回収する工程、及び該ポリペプチド複合物の組換え製造部分と該ポリペプチド複合物の対応する他の部分との複合物を化学的又は酵素的に形成させる工程を含む。前記ポリペプチド複合物の対応する他の部分は組換えにより製造してその後で修正するか、又は完全に合成により製造してもよい。
【０１１３】
融合ポリペプチド又はポリペプチド複合物の部分の組換え製造のために、例えば上記に記載の融合ポリペプチド又はポリペプチド複合物の部分をコードする核酸を単離し、更なるクローニング及び／又は宿主細胞での発現のために1つ以上のベクターに挿入する。
ポリペプチドコードベクターのクローニング又は発現に適切な宿主細胞には、本明細書に記載の原核細胞又は真核細胞が含まれる。例えば、ポリペプチドは、（特にグリコシル化及びエフェクター機能が必要とされないときには）細菌で製造される（例えば以下を参照されたい：US 5,648,237、US 5,789,199及びUS 5,840,523；Charlton, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 245-254 (B.K.C.Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ)（大腸菌での抗体フラグメントの発現について記載する））。発現後、可溶性分画中の細菌細胞ペーストから該ポリペプチドを単離し更なる精製を実施することができる。
原核細胞に加えて、真核微生物（例えば糸状菌又は酵母）もポリペプチドコードベクターの適切なクローニング又は発現宿主である。前記には、そのグリコシル化経路が“ヒト化”されてあり、部分的又は完全にヒトグリコシル化パターンを有するポリペプチドの生成をもたらす真菌及び酵母株が含まれる（例えば以下を参照されたい：Gerngross, Nat.Biotech.22 (2004) 1409-1414, and Li, et al., Nat.Biotech.24 (2006) 210-215）。
【０１１４】
グリコシル化ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞はまた多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例には植物及び昆虫細胞が含まれる。昆虫細胞と一緒に（特にスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞のトランスフェクションのために）用いることができる多数のバキュロウイルス株が同定されている。
植物細胞培養もまた宿主として利用できる（例えば以下を参照されたい：US 5,959,177、US6,040,498、US6,420,548、US7,125,978及びUS6,417,429（トランスジェニック植物で抗体を製造するPLANTBODIESTM技術を記載する））。
脊椎動物細胞もまた宿主として用いことができる。例えば、懸濁増殖に順化させた哺乳動物細胞株は有用であり得る。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は以下である：SV40で形質転換させたサル腎CV1株（COS7）；ヒト胎児腎株（293）又は腎細胞（BHK）；マウスセルトリ細胞（例えば以下の文献に記載されたTM4細胞：Mather, Biol.Reprod.23 (1980) 243-251）；サル腎細胞（CV1）；アフリカミドリザル腎細胞（VERO-76）；ヒト子宮頸癌細胞（HELA）；イヌ腎細胞（MDCK）；バッファローラット肝細胞（BRL3A）；ヒト肺細胞（W138）；ヒト肝細胞（HepG2）；マウス乳癌（MMT060562）；TRI細胞（例えば以下に記載：Mather, et al., Annals N.Y.Acad.Sci.383 (1982) 44-68）；MRC5細胞；及びFS4細胞。他の有用な哺乳動物宿主細胞株には以下が含まれる：チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞（DHFR陰性CHO細胞を含む（Urlaub, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77 (1980) 4216））及びミエローマ細胞株、例えばY0、NS0及びSp2/0。ポリペプチド製造に適切なある種の哺乳動物宿主細胞株の概要については例えば以下を参照されたい：Yazaki, and Wu, Methods in Molecular Biology 248 (2003) 255-268 (B.K.C.Lo, (ed.), Humana Press, Totowa, NJ)。
【０１１５】
IV．医薬処方物
本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物の医薬処方物は、所望の純度を有する当該融合ポリペプチド又は複合物を凍結乾燥処方物又は水溶液の形態で医薬的に許容できる1つ以上の随意の担体と混合することによって調製できる（Osol, A., (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, 1980）。医薬的に許容できる担体は一般的には利用される投薬量及び濃度でレシピエントに無害であり、以下が含まれる（ただしこれらに限定されない）：緩衝剤（例えばリン酸、クエン酸及び他の有機酸）；抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）；保存料（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン（例えばメチル又はプロピルパラベン）；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール及びm-クレゾール）；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えばポリ(ビニルピロリドン)）：アミノ酸（例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン）；単糖類、二糖類及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリン）；キレート剤（例えばEDTA）；糖類（例えばシュクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール）；塩形成対イオン（例えばナトリウム）；金属複合体（例えばZn-タンパク質）；及び／又は非イオン性表面活性剤（例えばポリエチレングリコール）。医薬的に許容できる本明細書の例示的担体にはさらに以下が含まれる：薬剤間隙分散剤、例えば中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（sHASEGP）、例えばrHuPH20（HYLENEX(商標)、Baxter International, Inc.）。ある種の例示的なsHASEGP（rHuPH20を含む）及び使用方法はUS 2005/0260186及びUS 2006/0104968に記載されている。ある特徴では、sHASEGPは1つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼ（例えばコンドロイチナーゼ）と併用される。
【０１１６】
例示的な凍結乾燥抗体処方物はUS6,267,958に記載されている。水性抗体処方物にはUS6,171,586及びWO2006/044908に記載されたものが含まれ、後者の処方物はヒスチジン-酢酸緩衝剤を含む。
本明細書の処方物はまた、治療される個別の適用症に必要な2つ以上の活性成分、特に互いに悪影響を及ぼさない補完的活性を有するものを含むことができる。そのような活性成分は、意図される目的のために有効な量で組み合わされて適切に存在する。
活性成分は、例えばコアセルベーション技術によって又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル（それぞれ、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル）中に捕捉されたコロイド薬剤デリバリー系（例えばリポソーム、アルブミン微小球、ミクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセル）として又はマクロエマルジョンとして存在し得る。そのような技術はレミントンの著書に開示されている（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A., (ed.), 1980）。
持続放出調製物を製造してもよい。持続放出調製物の適切な例には、抗体を含む緻密な疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、前記マトリックスは成形品（例えばフィルム又はマイクロカプセル）の形態である。
in vivo投与に用いられる処方物は一般的には無菌的である。無菌性は、例えば滅菌ろ過膜によるろ過によって容易に達成できる。
【０１１７】
V．治療方法及び組成物
本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物のいずれも治療向け方法で用いことができる。
本発明のある特徴では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は疾患の治療に用いられる。ある実施態様では、該疾患は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較して該融合ポリペプチド又は複合物のエフェクター機能が強力に、少なくとも50％低下するのが好ましい疾患である。
ある特徴では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は疾患治療用医薬の製造で用いられ、ここで、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較して該融合ポリペプチド又は複合物のエフェクター機能は強力に低下するのが好ましい。
ある特徴では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は疾患治療用医薬の製造で用いられ、ここで、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較して該融合ポリペプチド又は複合物のエフェクター機能は少なくとも20％低下するのが好ましい。
本明細書に報告するある特徴はある疾患を有する個体を治療する方法であって、前記方法は該個体に本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物の有効量を投与する工程を含み、ここで本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物のエフェクター機能は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物と比較して強力に低下するのが好ましい。
エフェクター機能の強力な低下は、野生型Fc領域を含む融合ポリペプチド又は複合物によって誘発されるエフェクター機能の少なくとも50％のエフェクター機能の低下である。
【０１１８】
そのような疾患は、例えば、標的細胞がADCC、ADCP又はCDCによって破壊されるべきでない全ての疾患である。
該ポリペプチド変種で治療できる症状は多数あり、代謝疾患が含まれる。
本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は任意の適切な手段によって投与され、前記手段には、経腸（経口又は直腸から）、胃腸管、舌下、口唇下、非経口、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、肺内、及び鼻内手段が含まれる。ある実施態様では、投与は錠剤、カプセル又は小滴によって与えられる。
疾患の予防又は治療のために、融合ポリペプチド又は複合物の適切な投与薬量は、治療される疾患のタイプ、該疾患の重篤度及び経過、融合ポリペプチド又は複合物が予防又は治療目的で投与されるのか否か、以前の治療方法、患者の病歴及び融合ポリペプチド又は複合物に対する応答、担当医師の自由裁量に左右される。融合ポリペプチド又は複合物は、一時に又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。
疾患のタイプ及び重篤度に応じて、融合ポリペプチド又は複合物の約１μg/kgから15mg/kg（例えば0.1−20mg/kg）が、例えば1回以上の分割投与又は連続輸液のいずれにせよ患者への投与のための最初の候補投薬量である。典型的な1日の投薬量は、上述の要因に応じて約1μg/kgから100mg/kg以上であり得る。症状に応じて数日間以上に及ぶ反復投与のためには、症状の所望の抑制が生じるまで治療は継続される。しかしながら、他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療方法の進み具合は通常的な技術及びアッセイによって容易にモニターされる。
【０１１９】
代謝症候群（代謝症候群X、インスリン耐性症候群又はリーベン症候群としても知られている）、は5千万を超えるアメリカ人が罹患する疾患である。代謝症候群は、典型的には以下のリスク因子の少なくとも3つ以上の集合を特徴とする：（1）異常な肥満（腹部又は腹部周辺の過剰な脂肪組織）、（2）アテローム原性異常脂肪血症（dyslipidemia）（動脈壁におけるプラークの蓄積を亢進する、高トリグリセリド、低HDLコレステロール及び高LDLコレステロールを含む血液脂肪異常）、（3）血圧上昇、（4）インスリン耐性又はグルコース不耐性、（5）前血栓症状態（例えば血中の高フィブリノゲン又はプラスミノゲンアクチベーター阻害因子-1）及び（6）前炎症状態（例えば血中のC-反応性タンパク質の上昇）。他のリスク因子には加齢、ホルモンの不均衡及び遺伝的素因が含まれ得る。
【０１２０】
代謝症候群は、冠状動脈心疾患及び血管プラークの蓄積と関連する他の疾患（例えば卒中及び末梢血管疾患（アテローム硬化症性心脈管疾患（ASCVD）と称される））のリスク上昇と密接に関係する。代謝症候群の患者は、その初期症状のインスリン耐性状態から更なるASCVDのリスクの上昇を示す完全な（full blown）II型糖尿病へ進行し得る。特定の理論に拘束されないが、インスリン耐性、代謝症候群及び血管疾患における関係は、以下を含む1つ以上の同時発生性病理メカニズムを必要とし得る：インスリン刺激血管拡張の障害、酸化ストレス増強によるNO利用能のインスリン耐性関連低下、及び脂肪細胞由来ホルモン（例えばアジポネクチン）の異常（Lteif and Mather, Can.J.Cardiol.20 (suppl.B):66B-76B, 2004）。
【０１２１】
2001年の国のコレステロール教育プロジェクト成人治療会議（National Cholesterol Education Program Adult Treatment Panel（ATP III））によれば、同一個体で以下の特徴のいずれか3つが存在すれば代謝症候群の基準に合致する：（a）異常な肥満（ウェスト周りが男性で102cm、女性で88cmを超える）；（b）血清トリグリセリド（150mg/dL以上）；（c）HDLコレステロール（男性で40mg/dL以下及び女性で50mg/dL以下）；（d）血圧（130/85以上）；及び（e）空腹時血糖（110mg/dL以上）。世界保健機関（WHO）にしたがえば、下記基準の少なくとも2つを有する高インスリンレベル（空腹時血糖の上昇又は食後グルコース単独上昇）を示す個体は代謝症候群の基準に合致する：（a）異常肥満（0.9を超えるウェストヒップ比、少なくとも30kg/m2の体容積指数、又は約94.0cm（37インチ）を超えるウェスト測定値）；（b）少なくとも150mg/dLのトリグリセリドレベル又は35mg/dL未満のHDLコレステロールを示すコレステロールパネル；（c）140/90以上の血圧、又は高血圧治療中（Mathur, Ruchi, “Metabolic Syndrome,” ed.Shiel, Jr., William C., MedicineNet.com, May 11, 2009）。
本明細書の目的のためには、ある個体が、2001年の国のコレステロール教育プロジェクト成人治療会議又はWHOで示された基準の一方又は両方の基準に合致するならば、当該個体は代謝症候群に罹患しているとみなされる。
【０１２２】
特定の理論に拘束されないが、本明細書に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域ポリペプチド複合物は代謝症候群の治療に有用である。したがって、本発明は、対象動物で代謝症候群を予防又は治療するか、又はそのリスク因子の1つ、2つ、3つ若しくは4つ以上を軽減する方法を提供し、前記方法は、該対象動物に本明細書に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域ポリペプチド複合物を代謝症候群又はそのリスク因子を予防若しくは治療するために有効な量で投与する工程を含む。
本明細書に報告するある特徴は、糖尿病又は肥満の個体を治療する方法で使用される本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物であり、前記方法は本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物の有効量を該個体に投与する工程を含む。ある実施態様では、前記方法はさらに、少なくとも1つの追加の治療用薬剤の有効量を該個体に投与する工程を含む。
ある特徴は、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物が、個体のインスリン合成及び／又は分泌の刺激、グルカゴン分泌の抑制、食物摂取の抑制、又は／及び高血糖症の軽減で使用するために提供され、前記使用は、個体のインスリン合成及び／又は分泌の刺激、グルカゴン分泌の抑制、食物摂取の抑制、又は／及び高血糖症の軽減のために本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物の有効な用量を該個体に投与することを含む。ある実施態様では該個体はヒトである。
【０１２３】
ある特徴では、体重減少を誘発するか又は体重増加を予防する方法が本明細書で提供され、前記方法は、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物（GIP受容体及びGLP-1受容体の両方で活性を示し、場合によってグルカゴン受容体でもまた活性を示す）の有効量をその必要がある患者に投与する工程を含む。そのような化合物には、本明細書に記載するGIP/GLP-1コアゴニスト及びグルカゴン/GIP/GLP-1トリアゴニストが含まれる。
本明細書に報告するある特徴は、医薬の製造又は調製における本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物の使用である。ある実施態様では、該医薬は糖尿病又は肥満の治療用である。さらに別の実施態様では、該医薬は糖尿病又は肥満を治療する方法での使用用であり、前記方法は糖尿病又は肥満の個体に該医薬の有効量を投与する工程を含む。ある実施態様では、前記方法はさらに、少なくとも1つの追加の治療用薬剤の有効量を該個体に投与する工程を含む。さらに別の実施態様では、該医薬は、インスリン合成及び／又は分泌の刺激、グルカゴン分泌の抑制、食物摂取の抑制、又は／及び高血糖症の軽減用である。
さらに別の実施態様では、該医薬は、個体でインスリン合成及び／又は分泌を刺激、グルカゴン分泌を抑制、食物摂取を抑制、又は／及び高血糖症を軽減する方法での使用用であり、前記方法は、インスリン合成及び／又は分泌を刺激、グルカゴン分泌を抑制、食物摂取を抑制、又は／及び高血糖症を軽減するために該医薬の有効量を該個体に投与する工程を含む。上記実施態様のいずれかに記載の“個体”はヒトであり得る。
【０１２４】
非アルコール性脂肪肝（NAFLD）は、単純な脂肪肝（脂肪症）から非アルコール性脂肪性肝炎（NASH）、さらに肝硬変（肝臓の不可逆性進行性瘢痕形成）に至る広域肝疾患を指す。NAFLDの病期のいずれも共通して肝臓の細胞（肝細胞）に脂肪の蓄積（脂肪浸潤）を有する。単純な脂肪肝は、炎症又は瘢痕形成を伴わない、肝臓細胞におけるある種のタイプの脂肪（トリグリセリド）の異常な蓄積である。NASHでは、脂肪の蓄積は、肝臓の種々の程度の炎症（肝炎）及び瘢痕形成（線維症）を伴う。炎症性細胞は肝臓細胞を破壊することができる（肝細胞壊死）。“脂肪性肝炎”及び“脂肪性壊死”という用語で、脂肪性は脂肪の浸潤を指し、肝炎は肝臓の炎症を指し、壊死は破壊された肝細胞を指す。NASHは最終的には肝臓の瘢痕形成（線維症）に至り、続いて不可逆性で進行した瘢痕形成（肝硬変）をもたらす。NASHによって引き起こされる肝硬変は、NAFLDスペクトルの最後のかつ最も重篤な病期である（Mendler, Michel, “Fatty Liver:  Nonalcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) and Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH),” ed.Schoenfield, Leslie J., MedicineNet.com, August 29, 2005）。
【０１２５】
アルコール性肝疾患（又はアルコール誘発肝疾患）は、過剰なアルコール消費に関連する又は前記によって引き起こされる、3つの病理学的に別個の肝臓疾患、すなわち脂肪肝（脂肪症）、慢性又は急性肝炎、及び肝硬変を包含する。アルコール性肝炎は、軽度の肝炎（尋常ではない検査室試験だけが疾患を指摘する）から、合併症（例えば黄疸（ビリルビン保持による黄色皮膚）、肝性脳症(肝不全によって引き起こされる神経学的機能不全）、復水（腹部における液体貯留）、食道静脈瘤（食道の静脈拡張）出血、異常な血液凝固及び昏睡）を伴う重篤な肝臓機能不全にまで及び得る。組織学的には、アルコール性肝炎は、肝細胞の気球状変性を示す特徴的外観、好中球及び時にはマロリー小体（細胞間隙フィラメントタンパク質の異常な凝集）を伴う炎症を示す。肝硬変は、解剖学的には線維症と合体した肝臓の広範囲結節を特徴とする（Worman, Howard J., “Alcoholic Liver Disease”, Columbia University Medical Center website）。
【０１２６】
特定の理論に拘束されないが、本明細書に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域ポリペプチド複合物は、アルコール性肝疾患（NAFLD）又はその任意の病期（例えば脂肪症、脂肪性肝炎、肝炎、肝性炎症、NASH、肝硬変又はその合併症を含む）の治療に有用である。したがって、本開示は、対象者でアルコール性肝疾患、NAFLD又はその任意の病期を予防又は治療する方法を提供し、前記方法は、本明細書に記載のFc領域融合ポリペプチド又はFc領域ポリペプチド複合物をアルコール性肝疾患、NAFLD又はその病期を予防又は治療するために有効な量で対象動物に提供する工程を含む。そのような治療方法は以下の1つ、2つ、3つ、又は4つ以上の軽減を含む：肝臓の脂肪含有量、肝硬変の発生又は進行、肝細胞の癌腫の発生、炎症の徴候、例えば異常な肝臓酵素レベル（例えばアスパルテートアミノトランスフェラーゼAST及び／又はアラニンアミノトランスフェラーゼALT又はLDH）、血清フェリチンの上昇、血清ビリルビンの上昇、及び／又は線維症の徴候、例えばTGF-ベータレベルの上昇。好ましい実施態様では、Fc領域融合ポリペプチド又はFc領域ポリペプチド複合物は、単純な脂肪肝（脂肪症）を超えて進行し、炎症又は肝炎の徴候を示す患者の治療に用いられる。そのような方法は、例えばAST及び／又はALTレベルの低下をもたらし得る。
【０１２７】
本明細書のある特徴では、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物のいずれかを含む医薬処方物が提供され、前記は、例えば上記の治療用方法のいずれかで使用される。ある実施態様では、医薬処方物は、本明細書で提供する融合ポリペプチド又は複合物のいずれか及び医薬的に許容できる担体を含む。ある実施態様では、医薬処方物は、本明細書で提供する融合ポリペプチド又は複合物のいずれか及び少なくとも１つの追加の治療薬剤を含む。
本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、単独で又は他の薬剤と併用して治療方法で用いることができる。例えば、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、少なくとも1つの追加の治療薬剤とともに共投与することができる。
上記に記載の併用療法は合同投与及び分離投与を包含し、前者では2つ以上の治療用薬剤は同一又は別々の処方物に含まれ、後者の事例では、本発明の抗体の投与は追加の治療用薬剤及び／又はアジュバントの投与前、同時及び／又は投与後に生じ得る。
【０１２８】
本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物は、医療実施基準に一致する態様で処方され、用量決定され、さらに投与される。この文脈における考慮要件には、治療される個別の疾患、治療される個別の哺乳動物、個々の患者の症状、疾患の原因、薬剤デリバリー部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に公知の他の要件が含まれる。融合ポリペプチド又は複合物は、問題の疾患の予防又は治療に従来用いられる1つ以上の薬剤とともに存在する必要はないが、場合によって前記とともに処方される。そのような他の薬剤の有効量は、処方物に存在する該融合ポリペプチド又は複合物の量、疾患又は治療のタイプ、及び上記で考察した他の要件に左右される。前記は、一般的には本明細書に記載の投薬量及び投与ルートと同じように、又は本明細書に記載するものの約1％から99％で、又は経験的/臨床的に適切と決定される任意の投薬量及び任意の投与ルートで用いられる。
【０１２９】
疾患の予防又は治療のために、本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物の適切な投薬量は、（単独で又は1つ以上の他の追加の治療薬剤と併用して用いるとき）治療される疾患のタイプ、融合ポリペプチド又は複合物のタイプ、疾患の重篤度及び経過、融合ポリペプチド又は複合物が予防目的で又は治療目的で投与されるか否か、患者の病歴及び融合ポリペプチド又は複合物に対する応答、並びに担当医師の自由裁量に左右される。融合ポリペプチド又は複合物は、一時に又は一連の治療にわたって適切に患者に投与される。融合ポリペプチド又は複合物のある例示的投薬量は約0.05mg/kgから約10mg/kgの範囲であろう。したがって、約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg又は10mg/kgの1用量以上（又は前記の任意の組み合わせ）を患者に投与できる。そのような用量は間欠的に、例えば毎週又は3週毎に投与できる（例えば患者は約2から約20用量、例えば約6用量の融合ポリペプチド又は複合物を受け取るように投与される）。初期により高い負荷用量、続いて1用量以上低い用量を投与できる。しかしながら他の投薬レジメンも有用であり得る。この治療方法の進み具合は、通常的な技術及びアッセイで容易にモニターされる。
【０１３０】
VI．製品
本発明の別の特徴では、上記に記載の疾患の治療及び／又は予防に有用な物質を含む製品が提供される。製品は、容器及び容器上に又は容器に結合させたラベル又はパッケージ挿入物を含む。適切な容器には、例えばビン、バイアル、注射筒、IV溶液バッグなどが含まれる。容器は多様な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成され得る。容器は、単独で存在するか又は症状の治療若しくは予防に有効な別の組成物と一緒に存在する組成物を保持し、無菌的なアクセス口を有し得る（例えば容器は静脈内溶液バッグ又はバイアルで、皮下注射針で穿刺できる栓を有し得る）。組成物中の少なくとも1つの活性薬剤は本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物である。ラベル又はパッケージ挿入物は、該組成物が選択した症状の治療に用いられることを提示する。さらにまた、製品は以下を含むことができる：（a）その中に収納された組成物を有する第一の容器（ここで該組成物は本明細書に報告する融合ポリペプチド又は複合物を含む）；及び（b）その中に収納された組成物を有する第二の容器（ここで該組成物はさらに別の治療用薬剤を含む）。本発明のこの実施態様の製品はさらに、該組成物を用いて具体的な症状を治療できることを提示するパッケージ挿入物を含むことができる。また別に或いは前記に加えて、製品はさらに第二（又は第三）の容器を含むことができ、前記容器は、医薬的に許容できる緩衝剤（例えば注射用制菌水（BWFI）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル溶液、及びデキストロース溶液を含む。前記はさらに商業的視点及び使用者の視点から所望される他の物質を含むことができ、前記には他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、注射針及び注射筒が含まれる。
本明細書に引用された全ての特許及び学術文献の記述は参照によりそれらの全体が明確に本明細書に含まれる。
【０１３１】
配列リストの詳細
配列番号：01から39：インクレチン受容体リガンドポリペプチド
配列番号：40：ヒト免疫グロブリン重鎖CH2ドメイン
配列番号：42：ヒト免疫グロブリン重鎖CH3ドメイン
配列番号：43：IgG1アイソタイプのヒトFc領域
配列番号：44から53：IgG1アイソタイプの変種ヒトFc領域
配列番号：54：IgG4アイソタイプのヒトFc領域
配列番号：55及び56：IgG4アイソタイプの変種ヒトFc領域
配列番号：57から67：リンカーポリペプチド
配列番号：68：リンカーをもたない例示的インクレチン受容体リガンドポリペプチドFc領域複合物
配列番号：69：リンカーを含む例示的インクレチン受容体リガンドポリペプチドFc領域複合物
配列番号：70：ソルターゼタグを有する長いインクレチン受容体リガンドポリペプチド
配列番号：71：ソルターゼタグを有する短いインクレチン受容体リガンドポリペプチド
配列番号：72：ソルターゼタグ
【０１３２】
実施例
以下の実施例は本発明の方法及び組成物の例である。上記に提供した一般的な記述が与えられたならば、多様な他の実施態様を実行できることは理解されよう。
前述の発明は明瞭な理解のために解説及び例によってある程度詳細に記述されてきたが、これらの記述及び例は本発明の範囲を限定すると解されるべきではない。
【実施例１】
【０１３３】
抗体
下記に記載する実験のために、抗CD9抗体（PCT/EP2012/055393の配列番号：8−14を参照されたい）、抗P-セレクチン抗体（WO2005/100402に記載の配列）及び抗CD20抗体（EP 1 692 182に記載の配列）を用いた。
本明細書に記載した全ての変種（抗P-セレクチン抗体、抗CD9抗体及び抗CD20抗体のP329G、P329A、P329R SPLE、LALA、P329G/LALA、P329G/SPLE変種（KabatのEUインデックスによる番号付け））をPCR変異導入により調製した。IgG分子はHEK-EBNA又はHEK293（抗CD9抗体）細胞で発現させ、タンパク質A及びサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。
【実施例２】
【０１３４】
種々のFcγ受容体と免疫グロブリンとの結合親和性の決定
種々のFcγRの免疫グロブリンに対する結合親和性を、BIAcore  T100装置（GE Healthcare）を25℃で用い表面プラズモン共鳴（SPR）により測定した。
BIAcore(商標)システムは分子の相互作用の研究のためにしっかり確立されている。前記システムはリガンド/分析物結合の連続的なリアルタイムモニタリングを可能にし、したがって結合速度定数（ka）、解離速度定数（kd）及び平衡定数（KD）の決定を可能にする。屈折率の変化は、固定されたリガンドと溶液中に注入された分析物との相互作用によって引き起こされる表面の質量の変化を提示する。分子が表面の固定リガンドと結合するならば、解離の場合には質量は減少する。
1：1の相互作用については、結合分子が表面に注入されたとしても又は表面に固定されたとしても、結果に相違は認められないはずである。したがって（それぞれリガンドとしてのFcγ受容体又は分析物に関して）異なる設定が、リガンド又は対応する分析物の可溶性及び利用性に応じて用いられた。
FcγRIについては、ポリヒスチジン配列（5His-モノクローナル抗体、Qiagen Hilden, cat.no.34660）を認識する捕捉システムの10,000共鳴単位（RU）を、GEヘルスケア（GE Healthcare）が供給したアミンカップリングキット及びCM5チップをpH4.5で用いて固定した。FcγRIは、5μL/分の流量、60秒パルスにより5μg/mLの濃度で捕捉された。0から100nMの範囲の種々の濃度の抗体を298Kで120秒間フローセル中を30μL/分の流速で通過させて結合相を記録した。解離相は240秒までモニターし、サンプル溶液から泳動緩衝液に切り替えることによって始動させた。表面をグリシン溶液（pH2）で30mL/分の流速で2分間洗浄することによって再生させた。全実験について、GEヘルスケア供給HBS-P+緩衝液を選択した（10mM HEPES（pH7.4）、150mM NaCl、0.05％（v/v）表面活性剤P20）。バルク屈折率の相違は、捕捉FcγRIをもたない表面から得られた応答を差し引いて修正した。ブランク注入もまた差し引いた（＝二重参照）。
平衡解離定数（KD）（ka/kdと定義される）は、BIA評価ソフトウェアパッケージを用いていくつかの異なる濃度で得られたセンサーグラム曲線を分析することにより決定した。データのフィッティングでは適切な結合モデルにしたがった。
【０１３５】
FcγRIIA及びFcγRIIIA V158については、被検モノクローナル抗体の10,000共鳴単位（RU）を、GE供給アミンカップリングキットを使用してCM5チップ上に固定した（濃度10μg/mLでpH4.5）。
0から12.8μMの範囲の種々の濃度のFcγRIIA及びIIIAを298Kで120秒間フローセル中を5μL/分の流速で通過させて結合相を記録した。解離相は240秒までモニターし、サンプル溶液から泳動緩衝液に切り替えることによって始動させた。表面を30mL/分の流速で3mM NaOH/1M NaCl溶液により0.5分間、洗浄して再生させた。全実験について、GEヘルスケア供給HBS-P+緩衝液を選択した（10mM HEPES（pH7.4）、150mM NaCl、0.05％（v/v）表面活性剤P20）。
バルク屈折率の相違は、捕捉抗体をもたない表面から得られた応答を差し引いて修正した。ブランク注入もまた差し引いた（＝二重参照）。
平衡解離定数（KD）は、BIA評価ソフトウェアパッケージを用いていくつかの異なる濃度で得られたセンサーグラム曲線を分析することにより決定した。データのフィッティングでは適切な結合モデルにしたがった。
FcγRIIBについては、ポリヒスチジン配列（5His-モノクローナル抗体、Qiagen Hilden, cat.no.34660）を認識する捕捉システムの10,000共鳴単位（RU）を、GEヘルスケア（GE Healthcare）が供給したアミンカップリングキット及びCM5チップをpH4.5で用いて固定した。FcγRIIBは、5μL/分の流量、120秒パルスにより5μg/mLの濃度で捕捉された。異なる抗体を1,340nMの濃度でフローセル中を5μL/分の流速で、298Kで60秒間通過させて結合相を記録した。解離相は120秒までモニターし、サンプル溶液から泳動緩衝液に切り替えることによって始動させた。表面をグリシン溶液（pH2.5）で30mL/分の流速で0.5分間洗浄することによって再生させた。全実験について、GEヘルスケア供給HBS-P+緩衝液を選択した（10mM HEPES（pH7.4）、150mM NaCl、0.05％（v/v）表面活性剤P20）。
バルク屈折率の相違は、捕捉FcγRIIBをもたない表面から得られた応答を差し引いて修正した。ブランク注入もまた差し引いた（＝二重参照）。
FcγRIIBと野生型IgG1との非常に低い固有の親和性のために、親和性を計算せず、むしろ定性的結合を評価した。
下記の表は、Fc部分への変異導入によるFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIB及びFcγRIIIA V1-58との結合の影響（A）とともにADCC（標的細胞非存在下（BLT）及び標的細胞存在下（ADCC）で測定）及びC1q結合に対する影響（B）の要旨である。
【０１３６】
表1a：
2015531748.tif 000005
【０１３７】
表1b
2015531748.tif 000006
--野生型と対比して強力に低下/不活性
-野生型と対比して低下
+野生型に匹敵し得る相互作用
n.d.決定されず/結果無し
より詳細な以下の結果が得られた。
【０１３８】
FcγRI受容体に対する親和性
P329G、P329A、SPLE及びLALA変異をP-セレクチン、CD20及びCD9抗体のFcポリペプチドに導入し、FcγRIに対する結合親和性をBIAcoreシステムで測定した。P329G変異を有する抗体はなおFcγRIと結合するが（図1a及び1b）、三重変異P329G/LALA及びP329G/SPLEの導入はそれぞれ結合をほとんど検出できない抗体をもたらした（図1b）。LALA又はSPLE変異は、P329G単独変異よりも大きいが、P329Gとの組み合わせ変異よりも小さい受容体との結合の減少をもたらした（図1a及び1b）。したがって、P329GとLALA又はSPLEのどちらかとの組み合わせは、P329G変異又は二重変異LALA若しくはSPLE単独よりもはるかに有効である。CD20 IgG1野生型抗体のkd値は4.6nMであり、同じ抗体のP329G変異体のそれは5.7nMであるが、三重変異体P329G/LALAについては、kd値はFcγRI受容体との該抗体のほぼ検出不能な結合のために決定できなかった。抗体そのものは（すなわちCD9又はCD20又はP-セレクチンのいずれを試験しても）、結合親和性に対してほとんど影響をもたない。
FcγRIIA受容体との親和性
P329G、SPLE及びLALA変異をCD9抗体のFcポリペプチドにそれぞれ導入し、FcγRIIA-R13受容体との結合親和性をBIAcoreシステムで測定した。結合レベルは、例えば捕捉mAbが100RUであるように標準化する。1：1の化学量論ではほぼ20RUを超えないと予想される。図1cは、FcγRIIA受容体との結合は、Fc変種へのLALA、SPLE/P329G、P329G及びLALA/P329G変異の導入によって強力に低下することを示している。FcγRI受容体との結合と対比して、P329G変異の単独導入は、前記受容体との結合を強力に、三重変異P329G/LALAと多少とも類似する程度で遮断することができる（図1c）。
FcγRIIB受容体との親和性
SPLE、LALA、SPLE/P329G及びLALA/P329G変異をそれぞれCD9及びP-セレクチン抗体のFcポリペプチドに導入し、FcγRIIB受容体との結合親和性をBIAcoreシステムにより測定した。図1dは、FcγRIIB受容体との結合は、LALA及び三重変異体P329G/LALA、P329G/SPLEで強力に低下することを示している。
FcγRIIIA受容体との親和性
P329G、LALA、SPLE、P329G/LALA、及びSPLE/P329G変異をCD9のFcポリペプチドに導入し、FcγRIIIA-V158受容体との結合親和性をBIAcoreシステムにより測定した。P329G変異及び三重変異P329G/LALAはFcγRIIIA受容体との結合を最も強力に、ほぼ検出不能レベルまで低下させた。P329G/SPLEもまた強力な結合親和性の低下をもたらし、SPLE及びLALAはそれぞれFcγRIIIA受容体との結合親和性をほんのわずか減少させた（図1e）。
【実施例３】
【０１３９】
C1q ELISA
Fc変種を含む種々のポリペプチドのC1q結合特性をELISAサンドイッチ型免疫アッセイによって分析した。各変種を10μg/mLから0μg/mLの間の8つの濃度で疎水性マキシソーブ（Maxisorb）96ウェルプレートにカップリングさせる。このカップリングは抗体の複合体を模倣し、前記はC1q分子の高親和性結合の前提条件である。洗浄後、サンプルをインキュベートしてC1qと結合させる。更なる洗浄後、結合したC1q分子をポリクローナルウサギ抗hC1q抗体で検出する。次の洗浄工程に続いて、酵素標識抗ウサギFcγ特異抗体を添加する。該酵素によって発色生成物に変換される基質を添加することによって、免疫学反応を可視化する。生じた吸収（測光法により測定）は、被検抗体と結合したC1qの量に比例する。変種-C1q相互作用のEC50値を計算する。発色反応から生じた吸収単位を抗体の濃度に対してプロットする。1/2最大応答時の抗体濃度によってEC50値が決定される。この情報を、同じプレートで測定した参照スタンダードに対する相対的相違としてサンプル及び参照の変動係数とともに記録する。
P-セレクチン又はCD20抗体に導入したP329G変異はC1qとの結合を強力に低下させ、SPLE変異と同様であった（図2）。表3は、変種とC1qとの結合について計算したEC50値の要旨である。C1qは補体活性化タンパク質に属し、古典的補体経路（膜攻撃複合体の形成をもたらす）の活性化で主要な役割を果たす。C1qはまた、他の免疫学的プロセス（例えば食作用の強化、アポトーシス細胞の除去又はウイルスの中和）で必要とされる。したがって、ここでC1qとの結合の低下が示される変異体（例えばP329G及びSPLE）は、おそらく上述の単一変異を含む三重変異もまた同様に、上述のC1q機能を強力に低下させると予想できる。
【０１４０】
表2：
2015531748.tif 000007
【実施例４】
【０１４１】
標的細胞非存在下のADCC、BLTアッセイ
被検抗体（CD20及びCD9）で適切な96平底ウェルプレートを4℃にて一晩PBS中で被覆した。プレートをPBSで洗浄した後、残留結合部位をPBS/1％BSA溶液でRTにて1時間ブロックした。その間に、エフェクター細胞（トランスフェクションにより低又は高親和ヒトFcγRIIIを発現するNK細胞株）を採集し、ブロッキング緩衝液を廃棄した後でAIMVメジウム100μL/ウェル中の200,000生細胞/ウェルを前記ウェルに播種した。100μL/ウェルのサポニン緩衝液（0.5％サポニン＋PBS中の1％BSA）を用いて、エフェクター細胞による最大エステラーゼ放出を決定した。細胞をインキュベーターで3時間37℃、5％CO2でインキュベートした。3時間後、20μL/ウェルの上清を180μL/ウェルBLT基質（0.2 mM BLT＋0.11mM DTNB/0.1 M Tris-HCl（pH 8.0））と混合し、37℃で30分インキュベートしてから405nmでマイクロプレートリーダーによりプレートを判読した。エステラーゼ放出パーセンテージは、最大放出（サポニン処理細胞）を100％に非刺激細胞（抗体被覆無し）を0％放出に設定して決定した。
野生型抗CD20抗体は強力な細胞傷害活性の誘発を示す。LALA変種はエステラーゼ放出の顕著な低下を示すが、P329G及びP329G/LALA変種はADCC活性を全く示さない（図3a）。図3bは、P329位でのGによる交換だけでなくP329からR329への交換（CD20抗体）もまた顕著な細胞傷害活性の低下をもたらすことを示している。したがって、アルギニンは、グリシンと同様に、抗体でプロリンサンドイッチの機能を破壊するように思われる。ここで観察されるP329G変異体のこの強力なADCC低下は、おそらくFcγRIIA及びFcγRIIIA受容体との結合の強力な低下から生じたのであろう（図1c及び図1e参照）。
【実施例５】
【０１４２】
標的細胞存在下のADCC
ヒト末梢血単核球（PBMC）をエフェクター細胞として用い、本質的に製造業者の指示にしたがいヒストパーク-1077（Histopaque-1077）（Sigma Diagnostics Inc., St.Louis, MO63178 USA）を用いて調製した。略記すれば、志願者から静脈血をヘパリン処理注射筒により採取した。血液を1：0.75−1.3にPBS（Ca2+又はMg2+を含まない）で稀釈し、ヒストパーク-1077に重層した。このグラディエントをブレーキ無しに400ｘg、30分室温（RT）で遠心分離した。PBMCを含む界面を収集し、PBS（2つのグラディエントから得た細胞につき50mL）で洗浄し、300ｘgで10分間（RT）の遠心分離により採集した。ペレットをPBSに再懸濁した後、PBMCを計測し、2回の200ｘgで10分間（RT）の遠心分離によって洗浄した。続いてその後の工程のために細胞を適切な媒体に再懸濁した。ADCCアッセイに用いるエフェクター対標的比は、PBMC及びNK細胞についてそれぞれ25：1及び10：1であった。エフェクター細胞はAIM-Vメジウムにて適切な濃度で調製し、丸底96ウェルプレートの各ウェルにつき50mLを添加した。標的細胞は、10％FCS含有DMEMで増殖させたヒトBリンパ腫細胞（例えばRaji細胞）であった。標的細胞をPBSで洗浄し、計測して300,000/mLでAIM-Vに再懸濁し、マイクロウェル当たり100mL中に30,000細胞を添加した。抗体をAIM-Vで稀釈し、予めプレートしておいた標的細胞に50mLを添加し、RTで10分間標的と結合させた。続いてエフェクター細胞を添加し、5％CO2を含む湿潤大気中でプレートを37℃で4時間インキュベートした。標的細胞の殺滅は、細胞傷害検出キット（Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland）を用い、損傷細胞のラクテートデヒドロゲナーゼ（LDH）放出を測定することによって評価した。4時間のインキュベーションの後で、プレートを800ｘgで遠心分離した。各ウェルから上清100mLを新しい透明な平底96ウェルに移した。キットの着色基質緩衝液100mLを各ウェルに添加した。SOFTmax PROソフトウェア（Molecular Devices, Sunnyvale, CA94089, USA）を用いて、少なくとも10分間490nmでELISAリーダーにより着色反応のVmax値を決定した。偶発的なLDH放出は、抗体を含まず標的及びエフェクター細胞のみを含むウェルで測定した。最大放出は、標的細胞及び1％トリトンX-100のみを含むウェルで決定した。特異的な抗体媒介殺滅のパーセンテージは以下のように決定した：(x−SR)/(MR−SR)*100（式中ｘは特定の抗体濃度におけるVmaxの平均であり、SRは偶発的放出のVmaxの平均であり、MRは最大放出のVmax平均である）。
古典的ADCCアッセイで測定される、免疫エフェクター細胞を補充する潜在能力はFc変種のタイプに左右される。ここでは、ヒトFcγRIIIAをトランスフェクトしたヒトNK細胞株をエフェクターとして用い、CD20陽性Raji細胞を標的細胞として用いた。図4aから分かるように、ADCCは、抗CD20抗体Fc変種（グリシンがプロリンに取り替えられている（P329G））で強力に、さらにまた二重変異体P329G/LALAで同程度に低下する。対照的に、ADCC減少はLALA変異ではそれほど強くない。異なる変種間の区別をさらに明確にするために、これらの変種をまた糖操作型として作製してADCC潜在能力を強化した。親分子（抗CD20抗体）は予想通り強力なADCCを示すことが観察できる。LALA型はそのADCC潜在能力が強力に阻害される。P329G変異体はADCCを非常に強力に減少させ、それは抗CD20抗体のP329A変種よりもはるかに強かった（図4b）。
【実施例６】
【０１４３】
補体活性
標的細胞を計測し、PBSで洗浄し、AIM-V（Invitrogen）に1,000,000細胞/mLで再懸濁した。平底96ウェルプレートにウェル当たり50mLの細胞をプレートした。抗体稀釈物をAIM-Vで調製し、50mLを前記細胞に添加した。抗体を細胞に10分間室温で結合させた。ヒト血清補体（Quidel）を新しく融解し、AIM-Vで3倍に稀釈し、50mLをウェルに添加した。製造業者の記載にしたがいウサギ補体（Cedarlane Laboratories）を調製し、AIM-Vで3倍に稀釈し、50mLをウェルに添加した。コントロールとして、アッセイに添加する前に補体源を56℃で30分加熱した。アッセイプレートを37℃で2時間インキュベートした。細胞の殺滅はLDH放出の測定により決定した。略記すれば、プレートを300ｘgで3分間遠心分離した。ウェル当たり50mLの上清を新しい96ウェルプレートに移し、細胞傷害キット（Roche）のアッセイ試薬の50mLを添加した。ELISAリーダーによる動的変化の測定によってLDH濃度に対応するVmaxが決定された。最大放出は、1％のトリトンX-100の存在下で細胞をインキュベートすることによって決定された。
SUDH-L4標的細胞でのCDC媒介について種々のFc変種を分析した。非糖操作抗CD20抗体分子はCDCの明瞭な誘発を示す。LALA変種は最高濃度でのみ活性を示し、一方、P329G及びP329G/LALA変種はCDC活性を全く示さない（図5a）。さらにまた、LALA変種は、糖操作抗CD20抗体分子のP329G及びP329A変種と同様にCDC活性を全く示さない（図5b）。
【実施例７】
【０１４４】
ヒトIgG1の炭水化物プロフィール
Fcγ受容体との結合の停止を目的としてFc内に変異を含むヒトIgG1抗体の炭水化物プロフィールを、MALDI/TOF-MSによって陽イオンモード（中性オリゴ糖）で分析した。
製造業者の指示にしたがい、ヒト（h）IgG1変種をシアリダーゼ（QA-Bio）で処理し、末端シアリン酸を除去した。以前に記載されたように、続いてhIgG1の中性オリゴ糖をPNGase（QA-Bio）消化によって遊離させた（Ferrara, C., et al., Biotech.Bioeng.93 (2006) 851-861）。炭水化物プロフィールは、以前に記載されたように陽性イオンモードで質量分析法（Autoflex, Bruker Daltonics GmbH）によって分析した（Ferrara, C., et al., Biotech.Bioeng.93 (2006) 851-861）。
ヒトIgG1の中性Fc結合グリカンの炭水化物プロフィールは3つの主要なm/zピークを特徴とし、前記は、末端ガラクトース残基がない（G0）、1残基（G1）、2残基（G2）を有するフコシル化複合オリゴ糖に割り当てることができる。
Fcγ受容体との結合の停止を目的としてFc内に変異を含むhIgG1抗体の炭水化物プロフィールを分析して、野生型抗体で得られたものと比較した。Fc内に変種（P329G、LALA、P329A、P329G/LALA）の1つを含むIgG変種は、野生型抗体と同様な炭水化物プロフィールを示し、Fc結合グリカンはフコシル化複合オリゴ糖である（データは示されていない）。Fc内の変異は、241位、243位、263位、265位又は301位のアミノ酸のアラニンによる取替えによって観察されるように、末端ガラクトシル化及び末端シアリデーションのレベルに影響を与える（Lund, J., et al., J.Immunol.157 (1996) 4963-4969）。
図6aは、ここに記載する種々のhIgG1 Fc変種のガラクトシル化の相対的パーセンテージを示す。抗体が種々の宿主で発現されるときわずかな変動が観察され得るが、末端ガラクトシル化に顕著な相違を認めることはできなかった。
図6bは、4つの異なる抗体の野生型及びIgG1-P329G/LALAのガラクトシル化における多様性を示す（ここでは、4つの異なるV-ドメインが、Hek293 EBNA細胞で発現させたときのそれらのガラクトシル化の量について比較された）。
【実施例８】
【０１４５】
全血アッセイにおける抗体誘発血小板凝集
全血血小板凝集分析をダイナバイト（Dynabyte）のマルチプレート装置を用いて実施した。最初に、正常なヒトドナーから20mLの血液を採血しヒルジンチューブ（Dynabyte Medical, # MP0601）に移した。プラグミニセルインピーダンス装置（Plug minicell impedance device；Dynabead #MP0021）をマルチプレート装置に搭載してこのアッセイに用いた。続いて0.9％のNaCl（175μL）をミニセルに添加した。抗体をミニセルに加え、最終試験濃度を得た。続いて175μLのヒト血液を添加し、37℃で3分間インキュベートした。37℃でさらに6分間のインピーダンス分析は自動的に開始された。血小板凝集の測定として、データを曲線下面積の定量によって分析した。
抗CD9抗体は血小板活性化及び血小板凝集を誘発することが示された（Worthington, et al., Br.J.Hematol.74(2) (1990) 216-222）。血小板と結合する抗体によって誘発される血小板凝集は、FcγRIIAとの結合を必要とすることは以前に示されている（de Reys, et al., Blood 81 (1993) 1792-1800）。上記で示したように、抗CD9抗体に導入した変異LALA、P329G、P329G/LALA及びP329G/SPLEは、抗CD9抗体とFcγRIIA受容体との結合を強力に低下させた（図1c）。
抗CD抗体によって誘発される活性化（Ca流出によって測定、データは示されていない）は血小板凝集と同様に、P329G及びLALA三重変異を該抗体に導入することによって、FcγRIIA結合が野生型抗体と比較して強力に低下して除去された（図7a及び7b参照）。ネズミIgG1は低い抗体濃度（0.1−1μ/mL）で血小板凝集を誘発した。より高い濃度（3−30μg/mL）での血小板過剰刺激は凝集応答のサイレンシングをもたらす。ドナー変動性がchim-hu-IgG4-SPLEで観察された。図6aではより高い抗体濃度でのchim-hu-IgG4-SPLE応答者のデータ及び図6bではchim-hu-IgG4-SPLE非応答者のデータが示されている。抗体変種（chim-hu-IgG1-LALA、chim-hu-IgG-WT-P329G、chim-hu-IgG1-LALA-P329G、chim-hu-IgG4-SPLE-P329G及びchim-hu-IgG4-SPLE-N297Q）による凝集応答は、いずれの血液サンプルでも全く示されなかった。コントロール：未処理血液サンプルの偶発的凝集（バックグラウンド）；ADP誘発（ADP）及びトロンビンアナローグ誘発（TRAP6）血小板凝集。アイソタイプコントロール：ネズミIgG1（ネズミアイソタイプ）及びヒトIgG4-SPLE（hu-IgG4-SPLEアイソタイプ）。
これらのデータの1つの可能な説明は、三重変異を有する抗CD9抗体とFcγRIIA受容体との結合の低下がこれらの種類の変異体抗体で観察された血小板凝集の減少の理由であるということである。原則として、血小板凝集（抗体治療の有害な副作用）の予防は、したがって抗体のFc部分に上述の変異（FcγRIIA受容体との結合を低下させることができる）を導入することによって可能であるかもしれない。
【実施例９】
【０１４６】
Fc領域とインクレチン受容体リガンドポリペプチドとのソルターゼAによる複合物形成
G3-Fc：
GGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：68）
G4S3-Fc：
GGGGSGGGGSGGGGSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号：69）
ロングペプチド：
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVAWLLAGGPSSGAPPPSKLPETGGSGS-アミド（配列番号：70）
ショートペプチド：
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVAWLLAGGGLPETGGSGS-アミド（配列番号：71）
ソルターゼ媒介ペプチド転移反応のために、N-末端短縮黄色ブドウ球菌ソルターゼA（Δ1-59）を用いた。反応は以下を含むソルターゼ緩衝液中で実施した：50mMトリス-HCl、150mM NaCl、5mM CaCl（pH7.5）。該反応では、ソルターゼモチーフをそのC-末端に有する化学合成ペプチド（LPETGGSGS、配列番号：72）及びオリゴグリシンモチーフをそのN-末端に有するFc領域が連結され、連結配列ペプチド-LPETGGG-重鎖Fc領域が得られる。反応を実施するために、全試薬をソルターゼ緩衝液で溶液にした。最初の工程で、GGG-Fc及びペプチドを混合し、続いてソルターゼAを添加して反応を開始させた。成分をピペット操作又はヴォルテックスで混合し、ペプチドに応じて1時間及び24時間37℃でインキュベートした。ペプチド転移反応の後で連結生成物を直接精製するか、又は反応混合物を凍結して反応を停止させ精製まで-20℃で保存する。
ペプチド：Fc：ソルターゼのモル比は10：8：1である。
結果
ロング及びショート合成ペプチドの両方をソルターゼ媒介ペプチド転移により、短いトリグリシンモチーフ又は長いGGGGSGGGGSGGGGS（配列番号：62）配列のどちらかをそれぞれN-末端に有するIgG-Fcフラグメントにカップリングした。組み合わせは表3に示す。
【０１４７】
表3：Fc領域とペプチドとの複合物の形成
2015531748.tif 000008
Fc領域-インクレチン受容体リガンドポリペプチド複合物は、ロングペプチド-G3-Fc、ショートペプチド-G3-Fc、ロングペプチドG4S3-Fc、ショートペプチドG4S3-Fcについて配列番号：95−98のアミノ酸配列をそれぞれ有する。
ソルターゼ媒介ペプチド転移の分析
ペプチド転移反応のアリコットをSDS-PAGEで分析した。例を図8に提示する。前記はロング又はショートペプチドとG3-Fcとの複合物形成の結果を示す。ゲルから連結効率がデンシトメトリーにより概算された。表4に示すように、約5％のFcがペプチドと複合物を形成できなかったが、おおよそ90％のFcが2つのペプチド部分と複合物を形成した。
【０１４８】
表4：ペプチドとG3-Fcとのソルターゼ媒介ペプチド転移の効率
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種々の複合物の生物学的活性は表5に示される。
【０１４９】
表5：ソルターゼ媒介ペプチド転移によって生成されたペプチド-Fc融合分子のin vitro有効性
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【実施例１０】
【０１５０】
環状AMPアッセイ
以下の材料を用いた：cAMP HunterTM CHO-K1 GLP-1又はGIP細胞株（DiscoveRx Corporation）、ハム（Ham's）F-12（Gibco Cat.# 21765）、10％熱不活化FBS（Gibco Cat # 16000）、ペニシリン/ストレプトマイシン/Lグルタミン（Gibco Cat # 10378）及び800μg/mL G418（ゲネチシン、Gibco Cat.# 10131）。」
GLP-1又はGIP受容体を発現するCHO-K1細胞は、100,000細胞/mLの細胞密度で10mLのアッセイ緩衝液に懸濁させた（アッセイ緩衝液は0.5mM IBMX（Sigma-Aldrich Cat# 17018）及び0.1％BSA（Sigma-Aldrich Cat.# A-2153）を含むクレブス-リンゲル重炭酸緩衝液（Sigma-Aldrich Cat.# K4002）である）。続いてこの細胞懸濁物（25μL）をハーフエリアプエート（Costar Cat.# 3694）に移し、薬剤溶液（25μL）を適切な濃度でウェルに添加した。細胞を室温にて30分間プレートシェーカーでインキュベートした。をCisbio“cAMPダイナミックキット”を製造業者（Cisbio Bioassays, France）の指示にしたがって用い、cAMP含有量を決定した。全ての実験をデュープリケートで実施し、薬剤は少なく尾tも2回試験した（Nは2以上）。
【実施例１１】
【０１５１】
急性DIOマウス実験
雄のC57Bl/6マウス（約７か月齢；Jackson laboratories, Bar Harbor, ME, USA）を温度と湿度が管理された環境に12時間照明：12時間消灯サイクルで収容した。前記マウスを水及び高脂肪固形飼料（HED：食餌のkcalの58％がシュクロースを有する脂肪；Research Diets D12331）に随意に接近させ、8週齢で開始し、接近は実験の間ずっと維持した。マウスを処置期間の開始前に体重及び食物摂取によって分類し、1ケージにつき4匹で収容した。使用前に少なくとも6日間マウスを環境に馴らした。これらのマウスに暗サイクルの開始前に1回、ベヒクル（s.c.）、コントロール（ヒトIgG1-Fc；s.c.）、又は化合物（20nmol/kgのペプチド-ロング-G3Fc又はペプチド-ショート-G3Fc（s.c.））を投与した。その後、体重及び食物摂取を毎日5日間モニターした（N＝8マウス/グループ）。
データ分析：
提示した全データが平均+/-標準誤差（s.e.m.）である。データの統計評価は、一元配置ANOVA、続いてDunnett検定を用いて実施し、統計的に有意な相違がベヒクルと薬剤処理グループの間に存在するか否かを決定した。相違はP＜0.05で有意であると考えた．データ分析はGraphPadソフトウェア（GraphPad Prism）で実施した。
結果：
雄のDIOマウスで化合物（ペプチド-ロング-G3Fc及びペプチド-ショート-G3Fc）の単回投与は、ベヒクル処置動物と対比して有意な体重増加減少及び累積的食物摂取の低下を誘発した（図9）。
【実施例１２】
【０１５２】
急性db/dbマウス実験
10週齢の雄のdb/dbマウス（C57BLKS; BKS.Cg-m +/+ Lepr (000642); Jackson Laboratories, USA）を温度と湿度が管理された環境に12時間照明：12時間消灯サイクルで収容し、通常の固形飼料及び水に随意に接近させた（固形飼料、脂肪として5％kcal；Harlan 7912）。マウス（約42g）を、随意の血液グルコースレベルを基準にして種々の処置グループに任意抽出した。これらのマウスに暗サイクルの開始前にベヒクル（s.c.）、コントロール（s.c.）、又は化合物（20nmol/kg（s.c.））を投与した。次の日、腹腔内グルコースチャレンジ試験前に6時間マウスを空腹にさせた（N＝8マウス/グループ）。6時間の空腹に続いて、基準値の決定（携帯フリースタイルフリーダムライトグルコースメーター（Abott）を用いる）のために尾部クリップから血液サンプルを収集した（t＝0分）。続いて前記マウスにグルコースの腹腔内ボーラス注射を実施し（1g/kg；25％デキストロース溶液）、グルコース測定のために規則的な間隔（t＝15、30、60及び120分）で追加の血液サンプルを収集した。腹腔内グルコース耐性に対する化合物の影響を分析するために、台形法を用いて血液グルコースの移動について曲線下面積（AUC0-120min）を決定した。
データ分析：
提示した全データが平均+/-標準誤差（s.e.m.）である。データの統計評価は、一元配置ANOVA、続いてDunnett検定を用いて実施し、統計的に有意な相違がベヒクルと薬剤処理グループの間に存在するか否かを決定した。相違はP＜0.05で有意であると考えた．データ分析はGraphPadソフトウェア（GraphPad Prism）で実施した。
結果：
雄のdb/dbマウスへの急激な化合物（ペプチド-ロング-G3Fc及びペプチド-ショート-G3Fc）の投与（20nmol/kg, s.c.）は、腹腔内グルコースチャレンジに応答するグルコース移動を有意に減少させた（ipGTT；AUC ipGTT）（図10）。前記効果は用量依存性である（図11）。
【図１ｂ】
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【図１ｄ】
2015531748.tif 000012
【図１ｅ】
2015531748.tif 000013
【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
2015531748.tif 000016
【図４ａ】
2015531748.tif 000017
【図４ｂ】
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【図５ａ】
2015531748.tif 000019
【図５ｂ】
2015531748.tif 000020
【図１ａ】
2015531748.tif 000021
【図１ｃ】
2015531748.tif 000022
【図６ａ】
2015531748.tif 000023
【図６ｂ】
2015531748.tif 000024
【図７ａ】
2015531748.tif 000025
【図７ｂ】
2015531748.tif 000026
【図８】
2015531748.tif 000027
【図９ａ】
2015531748.tif 000028
【図９ｂ】
2015531748.tif 000029
【図１０ａ】
2015531748.tif 000030
【図１０ｂ】
2015531748.tif 000031
【図１１ａ】
2015531748.tif 000032
【図１１ｂ】
2015531748.tif 000033
【配列表】
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【国際調査報告】
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