(57)【要約】本発明は、数ある中で、無血清培地中の哺乳類細胞の懸濁培養を使用して、組換えＩ２Ｓタンパク質を大規模に製造するための方法および組成物を提供する。具体的には、本発明は、哺乳類細胞を使用し、組換えＩ２Ｓおよびホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を共発現する。このような様式で製造された組換えＩ２Ｓは、Ｉ２Ｓの活性に必要とされる尋常でないほど高いレベルのＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）（例えば、７０％以上、最大１００％）を有するため、無動物性懸濁液培養系を使用して製造された組換えＩ２Ｓ酵素は、酵素活性も大きく向上させた。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血清を欠いた培地を含有する大規模な培養容器中の懸濁液で、組換えＩ２Ｓタンパク質およびホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を共発現する哺乳類細胞を培養することを含む、哺乳類細胞の組換えイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質の大規模製造の方法。
【請求項２】
細胞が平均して約１５ピコグラム／細胞／日超の比生産率で組換えＩ２Ｓタンパク質を製造するような条件下、血清を欠いた培地を含有する大規模な培養容器中の懸濁液で、組換えＩ２Ｓタンパク質およびホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を共発現する哺乳類細胞を培養することを含む、哺乳類細胞の組換えイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質の大規模製造の方法であって、さらに製造された組換えＩ２Ｓタンパク質は、平均して、ヒトＩ２Ｓタンパク質のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシンに、少なくとも約６０％転換することを含む、方法。
【請求項３】
培養ステップは灌流プロセスを含む請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
灌流プロセスの灌流速度が新鮮培地／リアクターの作業体積／日（ＶＶＤ）の約０．５〜２容量の範囲にある、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
灌流プロセスの細胞特異的灌流速度が約０．０５〜５ナノリットル／細胞／日（ｎＬ／細胞／日）の範囲にある、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
細胞が平均して約３０ピコグラム／細胞／日超の比生産率で組換えＩ２Ｓタンパク質を製造する、前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項７】
細胞が少なくとも６ｍｇ／リットル／日の平均回収力価で組換えＩ２Ｓタンパク質を製造する、前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項８】
製造された組換えＩ２Ｓタンパク質は、平均して、ヒトＩ２Ｓタンパク質のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシンに、少なくとも約７０％転換することを含む、前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
製造された組換えＩ２Ｓタンパク質は、平均して、ヒトＩ２Ｓタンパク質のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＦＧｌｙに、少なくとも約８０％転換することを含む、前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項１０】
製造された組換えＩ２Ｓタンパク質は、平均して、ヒトＩ２Ｓタンパク質のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約９７％転換することを含む、前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項１１】
哺乳類細胞はヒト細胞である前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
哺乳類細胞はＣＨＯ細胞である請求項１〜１０いずれか１つに記載の方法。
【請求項１３】
大規模培養容器はバイオリアクターである前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
バイオリアクターの規模が１０Ｌ、２００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、１５００Ｌ、若しくは２０００Ｌまたはそれ以上である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
培地は動物性由来の成分を欠いている前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項１６】
培地は既知組成培地である前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
培地にはタンパク質がない前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
培地は少なくとも１つの酸化還元調節因子を含む前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも１つの酸化還元調節因子は、グルタチオン、グルコース-６−リン酸、カルノシン、カルノソール、スルホラファン、トコフェロール、アスコルビン酸塩、デヒドロアスコルビン酸、セレン、２−メルカプトエタノール、Ｎ-アセチルシステイン、システイン、リボフラビン、ニコチン酸、葉酸塩、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）から成る群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの酸化還元調節因子はシステインを含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
システインの濃度は約０．１ｍｇ／Ｌ〜約６５ｍｇ／Ｌの範囲にある請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１つの酸化還元調節因子は２−メルカプトエタノールを含む請求項１８〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
２−メルカプトエタノールの濃度は、約０．００１ｍＭ〜約０．０１ｍＭの範囲にある請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも１つの酸化還元調節因子はＮ-アセチルシステインを含む請求項１８〜２３のいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
Ｎ-アセチルシステインの濃度は、約３ｍＭ〜約９ｍＭの範囲にある請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
培地は少なくとも１つの成長因子を含む前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１つの成長因子はヒポキサンチンを含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ヒポキサンチンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの範囲にある請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つの成長因子はチミジンを含む請求項２６〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３０】
チミジンの濃度は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲にある請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
培地のｐＨは６．８〜７．５の範囲にある前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項３２】
培地のｐＨは６．９〜７．３の範囲にある請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
培養ステップは成長期および生産期を含む前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項３４】
哺乳類細胞は３０〜３７℃の範囲の温度で培養される前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項３５】
哺乳類細胞は成長期および生産期の間、異なる温度で培養される請求項３３または３４のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３６】
成長期および生産期の培地は異なるｐＨを有する請求項３３〜３５のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３７】
哺乳類細胞は、生産期に約１．０〜５０Ｘ１０６生細胞／ｍＬの範囲の生細胞密度で保持される、請求項３３〜３６のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３８】
生産期は約５〜９０日間続く請求項３３〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【請求項３９】
方法はさらに組換えＩ２Ｓタンパク質を回収するステップを含む前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項４０】
組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項４１】
組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号１と同一のアミノ酸配列を含む請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＦＧＥは配列番号５と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項４３】
ＦＧＥは配列番号５と同一のアミノ酸配列を含む請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
細胞は組換えＩ２Ｓタンパク質および／またはＦＧＥをコードする１つ以上の外因性核酸を含む前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項４５】
１つ以上の外因性核酸は細胞のゲノムに取り込まれる請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
１つ以上の外因性核酸は１つ以上の染色体外の構築物上に存在する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
細胞は組換えＩ２Ｓタンパク質を過剰発現する前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項４８】
細胞はＦＧＥを過剰発現する前記請求項いずれか１つに記載の方法。
【請求項４９】
前記請求項のいずれか１つの方法を使用して製造される組換えイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質。
【請求項５０】
組換えイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を有し、配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約７０％転換することを含む、当該組換えＩ２Ｓタンパク質の調製。
【請求項５１】
組換えＩ２Ｓタンパク質は配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＦＧｌｙに少なくとも約８０％転換することを含む、請求項５０に記載の調製。
【請求項５２】
組換えＩ２Ｓタンパク質は配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＦＧｌｙに少なくとも約９０％転換することを含む、請求項５０または５１に記載の調製。
【請求項５３】
組換えＩ２Ｓタンパク質は配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＦＧｌｙに少なくとも約９５％転換することを含む、請求項５０〜５２のいずれか１つに記載の調製。
【請求項５４】
組換えＩ２Ｓタンパク質は配列番号１のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＦＧｌｙに少なくとも約９７％転換することを含む、請求項５０〜５３のいずれか１つに記載の調製。
【請求項５５】
組換えＩ２Ｓタンパク質は、基質としてヘパリン二糖を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏの硫酸塩放出活性アッセイによって決定されるように、少なくとも４０Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する、請求項５０〜５４のいずれか１つに記載の調製。
【請求項５６】
組換えＩ２Ｓタンパク質は、基質としてヘパリン二糖を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏの硫酸塩放出活性アッセイによって決定されるように、少なくとも６０Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する、請求項５０〜５５のいずれか１つに記載の調製。
【請求項５７】
組換えＩ２Ｓタンパク質は、基質としてヘパリン二糖を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏの硫酸塩放出活性アッセイによって決定されるように、少なくとも８０Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する、請求項５０〜５６のいずれか１つに記載の調製。
【請求項５８】
組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項５０〜５７のいずれか１つに記載の調製。
【請求項５９】
組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号１と同一のアミノ酸配列を含む、請求項５０〜５８のいずれか１つに記載の調製。
【請求項６０】
請求項５０〜５９のいずれか１つの組換えＩ２Ｓタンパク質および薬剤的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【請求項６１】
請求項６０に記載の医薬組成物を治療が必要な対象に投与することを含むハンター症候群の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年６月２９日に提出した米国仮出願第６１／６６６，７１２号に基づく優先権を主張するものであり、該仮出願は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【０００２】
配列表
本発明の明細書は、２０１３年６月２７日に「２００６６８５-０３３９＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴ」と名付けたＡＳＣＩＩテキストファイルとして電子形式で提出された配列表を参照する。当該テキストファイルは２０１３年６月２５日に生成され、サイズは２１ＫＢである。配列表の全内容は、参照により本明細書に取り込まれる。
【背景技術】
【０００３】
ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ、ハンター症候群）は、酵素イズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の欠損から生じるＸ染色体劣性リソソーム貯蔵障害である。Ｉ２Ｓは、末端２-Ｏ-硫酸部分をグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）デルマタン硫酸およびヘパラン硫酸から切断する。ハンター症候群の患者のＩ２Ｓが失われたか欠陥があることにより、ＧＡＧが、様々な細胞型のリソソームに進行的に蓄積し、細胞の拡張、臓器肥大、組織破壊、および臓器系の機能不全を引き起こす。
【０００４】
一般的に、ハンター症候群の人々の身体的徴侯には、身体的な症状とニューロンの症状の両方がある。例えば、ハンター症候群のいくつかの事例では、中枢神経系の関与が発育遅延および神経系の問題を引き起こす。ハンター症候群の非ニューロン症状は、誕生時には通常ないものの、時が経過するにつれて身体の細胞にＧＡＧが進行的に蓄積することによって、身体の周辺組織に劇的な影響をもたらす可能性がある。周辺組織のＧＡＧの蓄積は、患者の顔特徴に特有の粗悪さをもたらし、突起した額、平坦な鼻梁および肥大した舌を招き、ハンター患者の顕著な特徴である。同様に、ＧＡＧの蓄積は身体の臓器系に有害に影響する可能性がある。初期に、心臓、肺および気道の壁が厚くなり、肝臓、脾臓および腎臓の異常な肥大といった徴侯が見られ、これらの重大な変化は、究極的には、破滅的な臓器不全を拡散させる可能性がある。結果として、ハンター症候群は常に重症であり、進行性であり、寿命を制限する。
【０００５】
酵素補充療法（ＥＲＴ）はハンター症候群（ＭＰＳＩＩ）を治療するための承認された療法であり、ハンター症候群の患者に、外因性補充Ｉ２Ｓ酵素を投与することを伴う。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、数ある中で、ハンター症候群の効果的な治療を促進するために、組換えＩ２Ｓ酵素を大規模に製造するための改善した方法を提供する。本発明に先立ち、大規模に組換えＩ２Ｓを製造するための血清を含有する培地を使用してローラーボトル付着性培養系の開発に成功している。しかしながら、動物性成分のない、既知組成培地を使用して大規模な容器中の懸濁液で、Ｉ２Ｓおよびホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を共発現する哺乳類細胞を効果的に培養し、大量の組換えＩ２Ｓ酵素を効率的に製造することができる系を、本出願の発明者は開発した。意外なことに、このような様式で製造された組換えＩ２Ｓは、Ｉ２Ｓの活性に必要とされる尋常でないほど高いレベルのＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）（例えば、７０％以上、最大１００％）を有するため、無動物性懸濁液培養系を使用して製造された組換えＩ２Ｓ酵素は、酵素活性も大きく向上させた。さらに、本発明に従い製造された組換えＩ２Ｓ酵素は、シアル酸の容量およびグリカンマップ等の特有の特徴を有し、組換えＩ２Ｓタンパク質の生物学的利用能を向上させ得る。さらに、無動物性培養系は下流の精製プロセスを単純にし、フェチュイン等の血清から生じる汚染物質を減少させ、または取り除く。したがって、本発明は、より効率的、経済的、再生可能で、安全な大規模な製造系を提供し、もっと強力な組換えＩ２Ｓを製造する。
【０００７】
したがって、ある態様では、本発明は、血清を欠いた培地を含有する大規模な培養容器中の懸濁液で、組換えＩ２Ｓタンパク質およびホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を共発現する哺乳類細胞を培養することによって、哺乳類細胞中の組換えイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質を大規模に製造する方法を提供する。いくつかの実施形態では、培養ステップは灌流プロセスを伴う。
【０００８】
別の態様では、本発明は、哺乳類細胞の組換えイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質を大規模に製造する方法を提供し、細胞が平均して約１５ピコグラム／細胞／日超の比生産率で組換えＩ２Ｓタンパク質を製造するような条件下、血清を欠いた培地を含有する大規模な培養容器で、組換えＩ２Ｓタンパク質およびホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を共発現する哺乳類細胞を培養することを含み、さらに、製造された組換えＩ２Ｓタンパク質は、平均して、ヒトＩ２Ｓタンパク質のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約６０％転換することを含む。いくつかの実施形態では、培養ステップは灌流プロセスを伴う。
【０００９】
いくつかの実施形態では、灌流プロセスの灌流速度は、新鮮培地／リアクターの作業体積／日（ＶＶＤ）の約０．５〜２容量の範囲にある（例えば、約０．５〜１．５ＶＶＤ、約０．７５〜１．５ＶＶＤ、約０．７５〜１．２５ＶＶＤ、約１．０〜２．０ＶＶＤ、約１．０〜１．９ＶＶＤ、約１．０〜１．８ＶＶＤ、約１．０〜１．７ＶＶＤ、約１．０〜１．６ＶＶＤ、約１．０〜１．５ＶＶＤ、約１．０〜１．４ＶＶＤ、約１．０〜１．３ＶＶＤ、約１．０〜１．２ＶＶＤ、約１．０〜１．１ＶＶＤ）。いくつかの実施形態では、灌流プロセスの灌流速度は、約０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１．０、１．０５、１．１０、１．１５、１．２、１．２５、１．３、１．３５、１．４、１．４５、１．５、１．５５、１．６、１．６５、１．７、１．７５、１．８、１．８５、１．９、１．９５、または２．０ＶＶＤである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、灌流プロセスの細胞特異的灌流速度は、約０．０５〜５ナノリットル／細胞／日（ｎＬ／細胞／日）の範囲にある（例えば、約０．０５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．０５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．０５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．０５〜１ｎＬ／細胞／日、約０．１〜５ｎＬ／細胞／日、約０．１〜４ｎＬ／細胞／日、約０．１〜３ｎＬ／細胞／日、約０．１〜２ｎＬ／細胞／日、約０．１〜１ｎＬ／細胞／日、約０．１５〜５ｎＬ／細胞／日、約０．１５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．１５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．１５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．１５〜１ｎＬ／細胞／日、約０．２〜５ｎＬ／細胞／日、約０．２〜４ｎＬ／細胞／日、約０．２〜３ｎＬ／細胞／日、約０．２〜２ｎＬ／細胞／日、約０．２〜１ｎＬ／細胞／日、約０．２５〜５ｎＬ／細胞／日、約０．２５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．２５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．２５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．２５〜１ｎＬ／細胞／日、約０．３〜５ｎＬ／細胞／日、約０．３〜４ｎＬ／細胞／日、約０．３〜３ｎＬ／細胞／日、約０．３〜２ｎＬ／細胞／日、約０．３〜１ｎＬ／細胞／日、約０．３５〜５ｎＬ／細胞／日、約０．３５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．３５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．３５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．３５〜１ｎＬ／細胞／日、約０．４〜５ｎＬ／細胞／日、約０．４〜４ｎＬ／細胞／日、約０．４〜３ｎＬ／細胞／日、約０．４〜２ｎＬ／細胞／日、約０．４〜１ｎＬ／細胞／日、約０．４５〜５ｎＬ／細胞／日、約０．４５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．４５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．４５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．４５〜１ｎＬ／細胞／日、約０．５〜５ｎＬ／細胞／日、約０．５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．５〜１ｎＬ／細胞／日）。いくつかの実施形態では、灌流プロセスの細胞特異的灌流速度は、約０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０ｎＬ／細胞／日である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本発明に従い培養された細胞は、平均して、約２０ピコグラム／細胞／日超の比生産率で（例えば、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００ピコグラム／細胞／日超）組換えＩ２Ｓタンパク質を製造する。いくつかの実施形態では、本発明に従い培養された細胞は、少なくとも６ｍｇ／リットル／日（ｍｇ／Ｌ／日）の平均回収力価（ｈａｒｖｅｓｔ  ｔｉｔｅｒ）で組換えＩ２Ｓタンパク質を製造する（例えば、少なくとも８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０若しくは５００ｍｇ／Ｌ／日、またはそれ以上）。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って製造された組換えＩ２Ｓタンパク質は、ヒトＩ２Ｓタンパク質のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、１００％）転換することを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本発明に適した哺乳類の細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、本発明に適した哺乳類の細胞はＣＨＯ細胞である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明に適した大規模な培養容器は、バイオリアクターである。いくつかの実施形態では、適切なバイオリアクターの規模は、１０Ｌ、２００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、１５００Ｌ、２０００Ｌ、２５００Ｌ、３０００Ｌまたはそれ以上である。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本発明に適した培地は、動物に由来する成分を欠いている。いくつかの実施形態では、適切な培地は、既知組成の培地である。いくつかの実施形態では、適切な培地はタンパク質がない。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本発明に適した培地は、少なくとも１つの酸化還元調節因子（ｒｅｄｏｘ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明に適した酸化還元調節因子は、グルタチオン、グルコース-６−リン酸、カルノシン、カルノソール、スルホラファン、トコフェロール、アスコルビン酸塩、デヒドロアスコルビン酸、セレン、２−メルカプトエタノール、Ｎ-アセチルシステイン、システイン、リボフラビン、ニコチン酸、葉酸塩、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）およびその組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、適切な酸化還元調節因子は、システインである。いくつかの実施形態では、システインの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ〜約６５ｍｇ／Ｌ（例えば、１〜５０ｍｇ／Ｌ、１〜４０ｍｇ／Ｌ、１〜３０ｍｇ／ｌ、１〜２０ｍｇ／Ｌ、１〜１０ｍｇ／Ｌ）の範囲である。いくつかの実施形態では、適切な酸化還元調節因子は、２−メルカプトエタノールである。いくつかの実施形態では、２−メルカプトエタノールの濃度は、約０．００１ｍＭ〜約０．０１ｍＭ（例えば、約０．００１〜０．００８ｍＭ、約０．００１〜０．００７ｍＭ、約０．００１〜０．００６ｍＭ、約０．００１〜０．００５ｍＭ、約０．００１〜０．００４ｍＭ、約０．００１〜０．００３ｍＭ、約０．００１〜０．００２ｍＭ）の範囲である。いくつかの実施形態では、適切な酸化還元調節因子は、Ｎ-アセチルシステインである。いくつかの実施形態では、Ｎ-アセチルシステインの濃度は、約３ｍＭ〜約９ｍＭ（例えば、約３〜８ｍＭ、約３〜７ｍＭ、約３〜６ｍＭ、約３〜５ｍＭ、約３〜４ｍＭ）の範囲である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明に適した培地は、少なくとも１つの成長調節因子を含む。いくつかの実施形態では、適切な成長調節因子は、ヒポキサンチンである。いくつかの実施形態では、ヒポキサンチンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１〜９ｍＭ、約０．１〜８ｍＭ、約０．１〜７ｍＭ、約０．１〜６ｍＭ、約０．１〜５ｍＭ、約０．１〜４ｍＭ、約０．１〜３ｍＭ、約０．１〜２ｍＭ、約０．１〜１ｍＭ）の範囲である。いくつかの実施形態では、適切な成長調節因子は、チミジンである。いくつかの実施形態では、チミジンの濃度は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ（例えば、約１〜９０ｍＭ、約１〜８０ｍＭ、約１〜７０ｍＭ、約１〜６０ｍＭ、約１〜５０ｍＭ、約１〜４０ｍＭ、約１〜３０ｍＭ、約１〜２０ｍＭ、約１〜１０ｍＭ）の範囲である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、培地のｐＨは、約６．８〜７．５（例えば、約６．９〜７．４、約６．９〜７．３、約６．９５〜７．３、約６．９５〜７．２５、約７．０〜７．３、約７．０〜７．２５、約７．０〜７．２、約７．０〜７．１５、約７．０５〜７．３、約７．０５〜７．２５、約７．０５〜７．１５、約７．０５〜７．２０、約７．１０〜７．３、約７．１０〜７．２５、約７．１０〜７．２０、約７．１０〜７．１５）の範囲にある。いくつかの実施形態では、培地のｐＨは、約６．８、６．８５、６．９、６．９５、７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、７．４、７．４５、または７．５である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の様々な方法の培養ステップは、成長期と生産期を含む。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、約３０〜３７℃（例えば、約３１〜３７℃、約３２〜３７℃、約３３〜３７℃、約３４〜３７℃、約３５〜３７℃、約３６〜３７℃）の範囲の温度で培養される。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、約３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、または３７℃の温度で培養される。本明細書に記載の温度は、成長および／または生産期で使用してもよい。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、成長期と生産期とで異なる温度で培養される。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、成長期と生産期とで実質的に同じ温度で培養される。本明細書に記載の培地のｐＨは、成長および／または生産期で使用してもよい。いくつかの実施形態では、成長期および生産期の培地のｐＨは異なる。いくつかの実施形態では、成長期および生産期の培地のｐＨは実質的に同じである。
【００２０】
いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、生産期で約１．０〜５０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ（例えば、約１．０〜４０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜３０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜２０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜１０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜４．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜４Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜３．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜３Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜２．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜２．０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜１．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜１０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜４．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜４Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜３．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜３．０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜２．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜２．０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ）の範囲の生細胞密度で保持される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、生産期は約５〜９０日間（例えば、約５〜８０日、約５〜７０日、約５〜６０日、約５〜５０日、約５〜４０、約５〜３０日、約５〜２０日、約５〜１５日、約５〜１０日、約１０〜９０日、約１０〜８０日、約１０〜７０日、約１０〜６０日、約１０〜５０日、約１０〜４０日、約１０〜３０日、約１０〜２０日、約１５〜９０日、約１５〜８０日、約１５〜７０日、約１５〜６０日、約１５〜５０日、約１５〜４０日、約１５〜３０日）続く。いくつかの実施形態では、生産期は約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０日間続く。
【００２２】
様々な実施形態では、哺乳類細胞は、配列番号１と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）同一のアミノ酸配列を有する組換えＩ２Ｓタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発明方法を使用して、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有する組換えＩ２Ｓタンパク質を製造する。
【００２３】
様々な実施形態では、哺乳類細胞は、配列番号５と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）同一のアミノ酸配列を有するＦＧＥタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、哺乳類細胞は、配列番号５と同一のアミノ酸配列を有するＦＧＥタンパク質を発現する。
【００２４】
様々な実施形態では、哺乳類細胞は、組換えＩ２Ｓタンパク質および／またはＦＧＥをコードする外因性核酸を１つ以上含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性核酸は、細胞のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上の外因性核酸が１つ以上の染色体外の構築物上に存在する。いくつかの実施形態では、本明細書の方法で使用される哺乳類細胞は、組換えＩ２Ｓタンパク質を過剰発現する。いくつかの実施形態では、本明細書の方法で使用される哺乳類細胞は、ＦＧＥを過剰発現する。
【００２５】
様々な実施形態では、本発明記載の発明方法は、組換えＩ２Ｓタンパク質を回収するステップをさらに含む。
【００２６】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法を使用して製造される組換えイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、組換えＩ２Ｓタンパク質の調製を提供し、組換えＩ２Ｓタンパク質は、ヒトＩ２ＳのＣｙｓ５９（配列番号１）に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に、少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７７％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）転換する。いくつかの実施形態では、本発明は組換えＩ２Ｓタンパク質の調製を提供し、組換えＩ２Ｓタンパク質は、ヒトＩ２ＳのＣｙｓ５９（配列番号１）に対応するシステイン残基をＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に実質的に１００％転換する。いくつかの実施形態では、本発明は組換えイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の調製を提供し、当該Ｉ２Ｓタンパク質は、配列番号１と少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質は、基質としてヘパリン二糖を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏの硫酸塩放出活性アッセイによって決定されるように、少なくとも約２０Ｕ／ｍｇ、３０Ｕ／ｍｇ、４０Ｕ／ｍｇ、５０Ｕ／ｍｇ、６０Ｕ／ｍｇ、７０Ｕ／ｍｇ、８０Ｕ／ｍｇ、９０Ｕ／ｍｇ、または１００Ｕ／ｍｇの特異的活性を有する。
【００２８】
数ある中で、本発明は、本明細書の様々な実施形態に記載の組換えＩ２Ｓタンパク質を含む医薬組成物、および薬剤的に許容可能な担体、並びに本明細書に記載の組換えＩ２Ｓタンパク質または同タンパク質を含む医薬組成物を、治療を必要とする対象に投与することによって、ハンター症候群を治療する方法も提供する。
【００２９】
本明細書に使用されるように、用語「Ｉ２Ｓタンパク質」、「Ｉ２Ｓ」、「Ｉ２Ｓ酵素」、または文法的に等価な用語は、別に特に示されなければ、組換えＩ２Ｓタンパク質分子を調製することを意味する。
【００３０】
当該出願に使用されるように、用語「約」および「およそ」は、等価なものとして使用される。約／およそを付けたまたは付けていない当該出願に使用される数字は、関連技術分野の当業者によって認識される通常の増減を含むことを意味する。
【００３１】
本発明のその他の特徴、目的、および利点は、以下の詳細な記述で明らかにする。しかしながら、詳細な記述は、本発明の実施形態を示すが、説明のためだけにあり、限定することを意味しないことを理解されたい。本発明の範囲内での様々な変更または修正は、詳細な記述から、当業者に明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
以下に記載の図は、一緒に図を構成し、説明のためだけにあり、限定することを意味しない。
【図１】ヒトのイズロン酸２スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）の成熟型をコードするアミノ酸配列（配列番号１）を記述し、Ｎ結合グリコシル化およびシステイン転換のために、タンパク質配列内に潜在的な領域を示す。
【図２】Ｉ２ＳおよびＦＧＥ（すなわち、ＳＵＭＦ１）の共発現のための例示的な構築設計図を記述する。（Ａ）（同時形質移入または続く形質移入についての）別個のベクター上の発現単位、（Ｂ）同じベクター上の発現単位（１つの形質移入）：（１）別個のシストロンおよび（２）転写的に結合されたシストロン。
【図３】Ｉ２Ｓ標準試料と比較したときの、無血清または血清に基づく細胞培養条件のいずれかで成長した細胞株を使用して産生されたＳＤＳ-ＰＡＧＥによる完全長の組換えＩ２Ｓの例示的発現を説明する。
【図４】参照の組換えＩ２Ｓ酵素に対して、無血清培養条件（パネル上）下で成長したＩ２Ｓ-ＡＦ  ２Ｄ細胞株から製造された組換えＩ２Ｓ酵素についての例示的なペプチドマップを示す。
【図５】参照の組換えＩ２Ｓ酵素と比較したときの無血清培養条件下で成長したＩ２Ｓ-ＡＦ  ２Ｄおよび４Ｄ細胞株を使用して製造された組換えＩ２Ｓ酵素のために生成された例示的なグリカンの特性を記述する。
【図６】参照の組換えＩ２Ｓ酵素と比較したときの無血清培養条件下で成長したＩ２Ｓ-ＡＦ  ２Ｄ細胞株を使用して製造された組換えＩ２Ｓ酵素について、発生した例示的な電荷特性を記述する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
本発明をもっとわかり易く理解するために、初めに特定の用語を定義する。以下の用語およびその他の用語についての追加の定義は明細書全体にわたって記載する。
【００３４】
アミノ酸：用語「アミノ酸」は、本明細書で使用するとき、最も広義な意味でポリペプチド鎖に組み込むことができる任意の化合物および／または物質を意味する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は通常の構造Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。いくつかの実施形態では、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸である。いくつかの実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はＤ-アミノ酸であり、いくつかの実施形態では、アミノ酸はＬ-アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドに多く認められる２０個の標準Ｌ-アミノ酸のいずれかを意味する。「非標準アミノ酸」は、合成的に調製されるか、天然資源から得られるかに関わらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を意味する。「合成アミノ酸」は、本明細書で使用するとき、化学修飾されたアミノ酸を含み、塩類に限定するものではないが、アミノ酸誘導体（アミド等）および／または置換を含む。アミノ酸は、ペプチドの中のカルボキシおよび／またはアミノ末端アミノ酸が挙げられ、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、および／または活性に有害な影響を与えることなく、ペプチドの循環半減期を変化させることができるその他の化学基で置換することよって修正することができる。アミノ酸はジスルフィド結合に関与してもよい。アミノ酸は、１つ以上の化学成分（例えば、メチル基、酢酸基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分等）と結合する等、１つまたは翻訳後修飾を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、本発明のアミノ酸は、細胞培養のための培地を補充するために提供または使用してもよい。いくつかの実施形態では、細胞培養培地を補充するために提供または使用されるアミノ酸は、塩類として、または水和物の形態で提供されもよい。
【００３５】
およそ：目的の１つ以上の値に付けられる用語「およそ」または「約」は、本明細書で使用するとき、定められた基準値とほぼ同じ値を意味する。ある実施形態では、用語「およそ」または「約」は、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内にある値の範囲、または別に特に示されなければ、若しくは文脈から別に明白に示されなければ（ただし当該数字が可能な値の１００％を超える場合は除く）、定められた基準値のどちらかの方向でより少ない（超または未満）にある値の範囲を意味する。
【００３６】
バッチ培養：用語「バッチ培養」は、本明細書で使用するとき、細胞を培養するときに究極的には使用される全成分、そこには培地（以下の「培地」の定義を参照）および細胞それ自体を含むが、培養プロセスの最初に提供される細胞の培養方法を意味する。したがって、バッチ培養は、典型的に新鮮な培地で培養された細胞を再給食することなく、播種から終わりまで培養を進めることを意味する。バッチ培養は典型的にいくつかの時点で停止し、培地中の細胞および／または成分が回収され、精製されてもよい。
【００３７】
生物学的利用能：用語「生物学的利用能」は、本明細書で使用されるとき、対象の血流に達する投与量の率を通常、意味する。
【００３８】
生物学的に活性：フレーズ「生物学的に活性な」は、本明細書で使用されるとき、生物系（例えば、細胞培養、有機体等）に活性を有する任意の物質の特徴を意味する。例えば、物質が有機体に投与され、有機体に生物学的影響をもたらすとき、生物学的に活性であると考えられる。生物学的活性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって決定することもできる（例えば、硫酸塩放出アッセイ等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ酵素試験）。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である場合、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を分かち合うタンパク質またはポリペプチドの部分は、典型的に「生物学的に活性な」部分として意味する。いくつかの実施形態では、タンパク質は細胞培養系から産生および／または精製され、対象に投与されると生物学的活性を表す。いくつかの実施形態では、タンパク質は、生物学的に活性になるために、更なる処理を必要とする。いくつかの実施形態では、タンパク質は、限定されないが、生物学的に活性になるために、グリコシル化（例えば、シアリル化）、ファルネシル化、切断、折りたたみ、ホルミルグリシン転換およびその組み合わせ等の翻訳後修飾を必要とする。いくつかの実施形態では、プロ形態（すなわち未成熟形態）として産生されるタンパク質は、生物学的に活性になるために、追加の修飾を必要とし得る。
【００３９】
バイオリアクター：用語「バイオリアクター」は、本明細書で使用するとき、宿主細胞培養の増殖に使用される容器を意味する。バイオリアクターは、哺乳類細胞の培養に有用であれば、サイズは問わない。典型的には、バイオリアクターは少なくとも１リットルであり、１０、１００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，００００リットルまたはそれ以上、またはその間の容量であってもよい。バイオリアクターの内部条件は、限定されないが、ｐＨ、モル浸透圧濃度、ＣＯ２飽和、Ｏ２飽和、温度およびその組み合わせが挙げられるが、典型的には培養期間中に制御される。バイオリアクターは、本発明の培養条件下、培地中で細胞を保持するのに適した任意の材料から構成することができ、ガラス、プラスチックまたは金属が挙げられる。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは動物細胞を培養するために使用してもよい。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは哺乳類細胞を培養するために使用してもよい。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、限定されないが、哺乳類細胞、昆虫細胞、微生物細胞、イースト細胞およびヒト細胞等の有機体に由来する細胞および／または細胞株と使用してもよい。いくつかの実施形態では、バイオリアクターは大規模な細胞培養の製造に使用し、典型的には少なくとも１００リットルであり、２００、５００、１０００、２５００、５０００、８０００、１０，０００、１２，００００リットルまたはそれ以上、またはその間の容量であってもよい。当業者は本発明を実施するときに使用する適切なバイオリアクターを知っており、選択することができるだろう。
【００４０】
細胞密度：用語「細胞密度」は、本明細書で使用するとき、所与の容量の培地に存在する細胞の数を意味する。
【００４１】
細胞培養または培養：本明細書で使用するこれらの用語は、細胞集団の生存および／または成長に適した条件下で、培地中で成長する細胞集団を意味する。当業者に明白なように、本明細書で使用するこれらの用語は、細胞集団を含む組み合わせ、およびその集団が成長する培地を意味してもよい。
【００４２】
培養：用語「培養」または文法的に等価な用語は、本明細書で使用するとき、増殖または生存に好ましい条件下で細胞を保持するプロセスを意味する。用語「培養」および「細胞培養」または同意語は、本明細書では交換可能に使用する。
【００４３】
培養容器：用語「培養容器」は、本明細書で使用するとき、細胞を培養するための無菌の環境を提供することのできる容器を意味する。例示的な培養容器として、限定されないが、ガラス、プラスチックまたは金属の容器が挙げられる。
【００４４】
剤形：用語「剤形」および「単位剤形」は、本明細書で使用するとき、治療を受ける患者のための治療用タンパク質の物理的に個別の単位を意味する。各単位は、望ましい治療効果をもたらすために計算された活性物質の事前に定められた量を含む。しかしながら、組成物の全用量は、安全な医療の範囲にある担当医師によって決定されるであることを理解されたい。
【００４５】
投与計画：「投与計画」（または「治療計画」）とは、本明細書で使用されるとき、典型的には時間毎に分けられた、対象に独立して投与される一組の単位用量（典型的には１つ以上）である。いくつかの実施形態では、所与の治療薬には推奨される投与計画があり、１つ以上の用量を伴ってもよい。いくつかの実施形態では、投与計画は複数の用量を含み、それぞれが同じ長さの時間によって互いに分けられる。いくつかの実施形態では、投与計画は、複数の用量および個別の用量を分ける少なくとも２つの異なる時間を含む。
【００４６】
酵素補充療法（ＥＲＴ）：用語「酵素補充療法（ＥＲＴ）」は、本明細書で使用するとき、失われた酵素を提供することによって酵素欠損を直す治療戦略を意味する。いくつかの実施形態では、髄腔内の投与によって失われた酵素を提供する。いくつかの実施形態では、血流に注入することによって失われた酵素を提供する。一度投与されると、酵素は細胞によって取り込まれ、リソソームに輸送され、そこで酵素は、酵素欠損のためにリソソーム内に蓄積された物質を取り除くように作用する。典型的にはリソソーム酵素補充療法が効果的であり、治療用酵素が、蓄積欠陥が現れる標的細胞の適切な細胞内のリソソームに運ばれる。
【００４７】
賦形剤：用語「賦形剤」は、本明細書で使用されるとき、物理的な質（いわゆる一貫性）、薬物動態特性（いわゆる生物学的利用能）、薬力学的特性およびその組み合わせを向上させるために、薬物および／または製剤に加える不活性物質を意味する。
【００４８】
発現：核酸配列の「発現」は、本明細書で使用するとき、以下の１つ以上の事象を意味する。（１）ＤＮＡ配列から（例えば、転写によって）ＲＮＡテンプレートの作製。（２）（例えば、スプライシング、エディティング、５'キャップ形成および３'エンド形成によって）ＲＮＡ転写物のプロセッシング。（３）ポリペプチドまたはタンパク質へのＲＮＡの翻訳。および／または（４）ポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾。
【００４９】
流加培養法：用語「流加培養法」は、本明細書で使用するとき、培養プロセスの開始後にいくらかの時間に追加の成分を培地に与える細胞の培養方法を意味する。与える成分は、典型的に、培養プロセス中に枯渇した細胞のための栄養補助を含む。典型的に、いずれ流加培養法を停止し、培地中の細胞および／または成分を回収し、精製してもよい。
【００５０】
断片：用語「断片」は、本明細書で使用するとき、ポリペプチドを意味し、そのポリペプチドに特有または特徴的な所与のポリペプチドの分離した部分として定義される。この用語は、本明細書で使用するとき、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも一部分を保持する所与のポリペプチドの分離した部分も意味する。好ましくは、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも１０％である。より好ましくは、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％である。より好ましくは、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましくは、保持される活性の割合は、完全長ポリペプチドの活性の１００％である。本明細書で使用されるときのこの用語は、完全長ポリペプチドに認められる少なくとも確立された配列要素を含む所与のポリペプチドの部分も意味する。好ましくは、配列要素は少なくとも４〜５に及び、より好ましくは、完全長ポリペプチドの少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個以上のアミノ酸に及ぶ。
【００５１】
遺伝子：用語「遺伝子」は、本明細書で使用するとき、任意のヌクレオチド配列、ＤＮＡまたはＲＮＡ、別個の最終産物、典型的に、限定されないが、ポリペプチドをコードする少なくともいくつかの部分を意味し、細胞プロセスのいくつかの態様で機能する。この用語は、ポリペプチドまたはその他の別個の最終産物をコードするコード配列のみを意味するものではないが、発現の基礎レベルを調整するコード配列および個々のコードセグメント（「エキソン」）間の介在配列（「イントロン」）に先行しおよび続く領域も含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化配列、終止配列、コザック配列、ＴＡＴＡボックス等）および／または修飾配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子は、タンパク質をコードしないがｔＲＮＡ、ＲＮＡｉ誘導剤等の機能的ＲＮＡ分子をコードする核酸への参照を含んでもよい。
【００５２】
遺伝子産物または発現産物：用語「遺伝子産物」または「発現産物」は、通常、遺伝子（プロセッシング前および／または後）から転写されるＲＮＡ、または遺伝子から転写されるＲＮＡによってコードされるポリペプチド（修飾前および／または後）を意味する。
【００５３】
遺伝子制御要素：用語「遺伝子制御要素」は、本明細書で使用するとき、操作可能に結合される遺伝子の発現を調整する配列要素を意味する。遺伝的な制御要素は、発現レベルを増加させるか減少させるかによって機能してもよく、コード配列の前、内、または後に位置してもよい。遺伝子制御要素は、転写の開始、伸長若しくは終止、ｍＲＮＡスプライシング、ｍＲＮＡエディティング、ｍＲＮＡ安定性、細胞内のｍＲＮＡ局在、翻訳の開始、伸長、若しくは終止、または遺伝子発現のその他のステージを調整することによって任意のステージで作用してもよい。遺伝子制御要素は、独立して機能してもよいし、互いに組み合わせて機能してもよい。
【００５４】
相同性：用語「相同性」は、本明細書で使用するとき、高分子分子の間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）の間、および／またはポリペプチド分子の間の全体的な関連性を意味する。いくつかの実施形態では、高分子分子は、配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であれば、互いに「相同」であると考えられる。いくつかの実施形態では、高分子分子は、配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同様であれば、互いに「相同」であると考えられる。
【００５５】
同一性：用語「同一性」は、本明細書で使用するとき、高分子分子の間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子および／またはＲＮＡ分子）および／またはポリペプチド分子の間の全体的な関連性を意味する。２つの核酸配列の同一性の割合の計算は、例えば、最適な比較のために（例えば、最適な配列比較のために第一および第二の核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、非同一配列は比較のために無視することができる）２つの配列比較をすることによって実施することができる。ある実施形態では、比較のために配列比較された配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または実質的に１００％である。対応するヌクレオチド部分のヌクレオチドをその後比較する。第一の配列内の位置が、第二の配列内の対応する位置によって占有される場合、分子はその位置で同一である。２つの配列の同一性の割合は、配列によって共有される同一の位置の数の関数であり、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮し、２つの配列の最適な配列比較のために導入される必要がある。配列の比較および２つの配列間の同一性の割合の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性の割合は、Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９、４：１１-１７）のアルゴリズムを使用して決定することができ、ＰＡＭ１２０重量残基表を使用したＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれており、ギャップ長ペナルティーは１２であり、ギャップペナルティーは４である。あるいは、２つのヌクレオチド配列の同一性の割合をＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用したＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して決定することができる。様々なその他の配列比較プログラムが利用可能であり、例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ等で配列同一性を決定するために使用することができる。
【００５６】
改善する、増加するまたは減少する：用語「改善する」、「増加する」、若しくは「減少する」、または文法的に等価な用語は、本明細書で使用するとき、本明細書に記載の治療を開始する前の同じ個体の測定、または本明細書に記載の治療のない対照個体（若しくは複数の対照個体）の測定等の基線測定に関連がある値を示す。「対照個体」は、治療を受けている個体と同じ形態のリソソーム蓄積病に苦しむ個体であり、（治療を受けている個体と対照個体の疾患のステージを確実に比較できるように）治療を受けている個体とほぼ同じ年齢である。
【００５７】
積算生細胞密度（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｖｉａｂｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｎｓｉｔｙ）：用語「積算生細胞密度」は、本明細書で使用するとき、培養中の生細胞の平均密度に、培養が行われた時間量を掛けたものを意味する。製造されたポリペプチドおよび／またはタンパク質の量の推測は、培養中に存在する生細胞の数に比例し、積算生細胞密度は、培養中に製造されたポリペプチドおよび／またはタンパク質の量を推定するのに有用な道具である。
【００５８】
脊髄内投与：用語「脊髄内投与」または「脊髄内注射」は、本明細書で使用するとき、脊柱管（脊髄を囲む髄腔内の空間）への注射を意味する。限定されないが、穿頭孔若しくは大槽、または腰椎穿刺等によって脳室側部の注射を含む様々な手技を使用してもよい。いくつかの実施形態では、本発明の「脊髄内投与」または「脊髄内送達」は、大槽範囲または領域を経由した脊髄内投与または送達を意味する。用語「大槽範囲」または「大槽領域」は、本明細書で使用するとき、第３および第４番目の大槽（下背）脊椎の間の領域、およびもっと含めると脊椎のＬ２〜Ｓ１領域を意味する。
【００５９】
単離された：用語「単離された」は、（１）（天然および／または実験的設定のいずれかで）最初に製造したときに結合された少なくともいくつかの成分から分離された、および／または（２）人の手によって生産、調製、および／または製造された物質および／または実体を意味する。単離された物質および／または実体は、最初に結合されたその他の成分から、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、若しくは約９９％以上単離してもよい。いくつかの実施形態では、単離された剤は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％，若しくは約９９％以上純粋である。本明細書で使用するとき、物質にその他の成分が実質的に存在しない場合、物質は「純粋」である。本明細書で使用するとき、単離された物質および／または実体の純度の計算は、賦形剤（例えば、バッファ、溶剤、水等）を含むべきではない。
【００６０】
培地：この用語は本明細書で使用するとき、成長している細胞に栄養を与える栄養物を含む溶液を意味する。典型的には、これらの溶液は、必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、並びに最小限の増殖および／または生存に細胞が必要とする微量元素を提供する。溶液は、ホルモンおよび成長因子を含む最小限の割合を超える成長および／または生存を促す成分を含んでもよい。いくつかの実施形態では、培地は細胞の生存および増殖に適したｐＨおよび塩濃度に処方される。いくつかの実施形態では、培地は、「既知組成の培地」、すなわちタンパク質、加水分解産物または未知の組成物の成分を含まない無血清培地であってもよい。いくつかの実施形態では、既知組成の培地は動物由来の成分がなく、培地内の全成分は、周知の化学構造を有する。いくつかの実施形態では、培地は「血清に基づいた培地」、すなわち、限定されないがウシ胎仔血清、ウマ血清、ヤギ血清、ロバ血清および／またはその組み合わせ等の動物由来の成分を補充した培地であってもよい。
【００６１】
代謝廃棄物：用語「代謝廃棄物」は、本明細書で使用するとき、細胞培養にとっていくらか有害な正常または正常でない代謝プロセスの結果として、細胞培養によって生じる化合物を意味し、特に、望ましい組換えポリペプチドまたはタンパク質の発現または活性に関係する。例えば、代謝廃棄物は、細胞培養の成長若しくは生存能に有害となり得、製造される組換えポリペプチド若しくはタンパク質の量を減少させ得、発現されるポリペプチド若しくはタンパク質の折りたたみ、安定性、グリコシル化若しくはその他の翻訳後修飾を変化させ得、またはいくつかの他の方法では、細胞および／または組換えポリペプチド若しくはタンパク質の発現若しくは活性にとって有害になり得る。例示的な代謝廃棄物として、グルコース代謝の結果として産生される乳酸塩およびグルタミン代謝の結果として産生されるアンモニウムが挙げられる。本発明の目的の１つは、哺乳類細胞培養の代謝廃棄物の産生を緩やかにし、減少させ、または取り除くことである。
【００６２】
核酸：用語「核酸」は、本明細書で使用するとき、広義にはオリゴヌクレオチド鎖に組み込むまたは組み込むことができる化合物および／または物質を意味する。いくつかの実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合によってオリゴヌクレオチド鎖に組み込むまたは組み込むことができる化合物および／または物質である。いくつかの実施形態では、「核酸」は、独立した核酸残基を意味する（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）。いくつかの実施形態では、「核酸」は、独立した核酸残基を含むオリゴヌクレオチドを意味する。用語「オリゴヌクレオチド」と「ポリヌクレオチド」は、本明細書で使用するとき、交換可能に使用することができる。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡ並びに単一鎖および／または二重鎖ＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または同様の用語は核酸類似体、すなわちホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。例えば、当該技術分野で周知であり、骨格にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有するいわゆる「ペプチド核酸」は、本発明の範囲内に考えられる。用語「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの変性したバージョンであり、および／または同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質および／またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含んでもよい。核酸は天然資源から精製され、組換え発現系を使用して製造することができ、精製しても、化学的に合成しもよい。適切な場合、例えば、化学的に合成された分子の場合、核酸は、化学修飾塩基または糖類、骨格修飾等を有する類似体等のヌクレオシド類似体を含むことができる。核酸配列は、特に断りがない限り５'末端から３'末端の方向で表される。用語「核酸断片」は、本明細書で使用するとき、より長い核酸配列の一部である核酸配列を意味する。多くの実施形態では、核酸断片は少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０以上の残基を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ-ピリミジン、３-メチルアデノシン、５-メチルシチジン、Ｃ-５プロピニル-シチジン、Ｃ-５プロピニル-ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５-ブロモウリジン、Ｃ５-フルオロウリジン、Ｃ５-ヨードウリジン、Ｃ５-プロピニル-ウリジン、Ｃ５-プロピニル-シチジン、Ｃ５-メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７-デアザアデノシン、７-デアザグアノシン、８-オキソアデノシン、８-オキソグアノシン、Ｏ（６）-メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学修飾塩基；生物修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；介在塩基；修飾糖類（例えば、２’-フルオロリボース、リボース、２’-デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’-Ｎ-亜ホスホルアミド酸結合）であり、またはそれらを含む。���くつかの実施形態では、本発明は、特に、送達を促進または達成するために、化学的に修飾されていない核酸（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドを含むポリヌクレオチドおよび残基）を意味する「無修飾核酸」に関する。
【００６３】
モル浸透圧濃度および重量オスモル濃度：「モル浸透圧濃度」は、水溶液中に溶解した粒子の浸透圧の測定値である。溶解した粒子はイオンとイオン化されていない分子の両方を含む。モル浸透圧濃度は、１ｋｇの溶液に溶解した浸透圧的に活性な粒子（いわゆるオスモル）の濃度として表される（３８℃で１ｍＯｓｍ／ｋｇのＨ２Ｏは１９ｍｍＨｇの浸透圧と等価である）。対照的に、「重量オスモル濃度」は、１リットルの溶液に溶解した粒子の数を意味する。略語「ｍＯｓｍ」は、本明細書で使用するとき、「ミリオスモル／ｋｇ溶液（ｍｉｌｌｉｏｓｍｏｌｅｓ／ｋｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）」を意味する。
【００６４】
灌流プロセス：用語「灌流プロセス」は、本明細書で使用するとき、培養プロセスの開始後に、追加の成分が、連続してまたは半連続して培養に提供される細胞の培養方法を意味する。提供される成分は、典型的に、培養プロセス中に枯渇した細胞のための栄養補助物を含む。培地中の細胞および／または成分の部分は、典型的に、連続的または半連続的に回収され、精製されてもよい。典型的に、灌流プロセスを伴う細胞培養プロセスは、「灌流培養」として意味する。典型的に、栄養補助物は灌流プロセスの最中に新鮮な培地に提供される。いくつかの実施形態では、新鮮な培地は細胞培養プロセスに使用されるベース培地と同一または同様であってもよい。いくつかの実施形態では、新鮮な培地はベース培地と異なるが、所望の栄養補助物を含んでもよい。いくつかの実施形態では、新鮮な培地は、既知組成の培地である。
【００６５】
タンパク質：用語「タンパク質」は、ポリペプチド（すなわち、ペプチド結合によって互いに結合される一続きの少なくとも２つのアミノ酸）を意味する。タンパク質は、アミノ酸以外の部分を含んでもよく（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカン等であってもよい）、および／またはさもなければ処理されまたは改変されてもよい。当業者は、（シグナル配列があってもなくても）細胞によって産生されるように、完全なポリペプチドであってもよく、またはその特徴的な部分であってもよいことを認識するだろう。いくつかの実施形態では、タンパク質は１つ以上のポリペプチド鎖を含むときがあり、例えば、１つ以上のジスルフィド結合によって結合されても、その他の方法によって結合されてもよい。いくつかの実施形態では、ポリペプチドはＬアミノ酸、Ｄアミノ酸、またはその両方を含んでもよく、当該技術分野に周知の様々なアミノ酸修飾または類似体を含んでもよい。有用な修飾として、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化等が挙げられる。いくつかの実施形態では、タンパク質は天然のアミノ酸、非天然のアミノ酸、合成アミノ酸、およびその組み合わせを含んでもよい。用語「ペプチド」は、通常、長さが約１００個未満のアミノ酸、約５０個未満のアミノ酸、約２０個未満のアミノ酸、または約１０個未満のアミノ酸を有するポリペプチドを意味するために使用される。いくつかの実施形態では、タンパク質は抗体、抗体断片、その生物学的に活性の部分、および／またはその特徴的な部分である。
【００６６】
組換えタンパク質および組換えポリペプチド：これらの用語は、本明細書で使用するとき、宿主細胞から発現されるポリペプチドを意味し、そのポリペプチドを発現するように遺伝学的に操作されている。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、動物に由来する宿主細胞内で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は昆虫に由来する宿主細胞内で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質はイーストに由来する宿主細胞内で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は原核生物に由来する宿主細胞内で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は哺乳類に由来する宿主細胞内で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質はヒトに由来する宿主細胞内で発現されてもよい。いくつかの実施形態では、組換え発現されたポリペプチドは、宿主細胞内で正常に発現されたポリペプチドと同一、または同様であってもよい。いくつかの実施形態では、組換え発現されたポリペプチドは、宿主細胞に対して外来であってもよく、宿主細胞内で正常に発現されるペプチドと異種性であってもよい。あるいは、いくつかの実施形態では、組換え発現されたポリペプチドは、キメラであってもよく、ポリペプチドの部分が宿主細胞内で正常に発現されるペプチドと同一または類似のアミノ酸配列を含むことができ、その他の部分は宿主細胞に対して外来である。
【００６７】
置換酵素：用語「置換酵素」は、本明細書で使用するとき、治療対象の疾患で酵素が欠損または喪失した酵素を少なくとも部分的に置換するように作用することができる酵素を意味する。いくつかの実施形態では、用語「置換酵素」は、治療対象のリソソーム蓄積疾患で酵素が欠損または喪失した酵素を少なくとも部分的に置換するように作用することができる酵素を意味する。いくつかの実施形態では、置換酵素は、哺乳類のリソソームに蓄積された物質を減少することができ、または１つ以上のリソソーム蓄積疾患の症状を救うまたは寛解させることができる。本発明に適した置換酵素として野生型または改変型リソソーム酵素の両方が挙げられ、組換えおよび合成方法を使用して製造することができ、または天然資源から精製することができる。置換酵素は、組換えの、合成の、遺伝的に活性のまたは天然の酵素であってよい。
【００６８】
播種する：用語「播種する」は、本明細書で使用するとき、大規模な細胞培養製造について、細胞培養をバイオリアクターまたは別の容器に提供するプロセスを意味する。いくつかの実施形態では、播種する前に、小さな細胞培養容器、いわゆる細胞培養フラスコ、細胞培養皿、細胞培養ローラーボトル等に細胞を増殖させた「種培養」が使用される。あるいは、いくつかの実施形態では、細胞は凍結されていてもよいし、バイオリアクターまたは容器に与える前に、細胞を即座に解かしてもよい。この用語は、単一細胞を含む任意の数の細胞を意味する。
【００６９】
対象：用語「対象」は、本明細書で使用するとき、ヒトを含む哺乳類を意味する。本発明の特定の実施形態では、対象は成人、青年または乳児である。本発明では、子宮内で医薬組成物の投与および／または治療方法の実施も考慮される。
【００７０】
力価：用語「力価」は、本明細書で使用するとき、所与の培地容量によって分割された細胞培養によって製造される組換え的に発現されたポリペプチドまたはタンパク質の総量を意味する。
【００７１】
ベクター：「ベクター」は本明細書で使用するとき、別の核酸を、結合される場所まで輸送することのできる核酸分子を意味する。いくつかの実施形態では、ベクターは、真核および／または原核生物の細胞等の宿主細胞内で結合する核酸を染色体外複製および／または発現をすることができる。操作可能に結合された遺伝子の発現を方向付けることができるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
【００７２】
生細胞密度：「生細胞密度」は、本明細書で使用するとき、単位体積あたりの生細胞の数を意味する。
【００７３】
（本発明の詳細な説明）
本発明は、とりわけ、無血清培地中の哺乳類細胞の懸濁培地を使用して組換えＩ２Ｓを大規模に製造するための方法及び組成物を提供する。具体的には、本発明は組換えＩ２Ｓタンパク質およびホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を共発現する哺乳類細胞を共発現する哺乳類細胞を使用する。
【００７４】
以下の小節にて本発明の種々の態様をさらに詳細に説明する。小節の使用は本発明を限定するものではない。各小節は本発明の任意の態様に適用され得る。本出願では「又は」の使用は、言及されない限り、「及び／又は」を意味する。
【００７５】
イズロン酸-２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）
本明細書で使用されるとき、Ｉ２Ｓタンパク質は、天然に存在するイズロン酸-２−スルファターゼ（Ｉ２Ｓ）タンパク質の少なくとも部分的な活性と置き換わることができる又はＩ２Ｓ欠損に関連した１以上の表現型若しくは症状を救済することができるタンパク質又はタンパク質の一部である。本明細書で使用されるとき、用語「Ｉ２Ｓ酵素」及び「Ｉ２Ｓタンパク質」及び文法的な同等物は交換可能に使用される。
【００７６】
通常、ヒトのＩ２Ｓタンパク質は前駆体形態として産生される。ヒトＩ２Ｓの前駆体形態は、シグナルペプチド（完全長前駆体のアミノ酸残基１〜２５）と、プロペプチド（完全長前駆体のアミノ酸残基２６〜３３）と、さらに４２ｋＤａの鎖（完全長前駆体の残基３４〜４５５）にプロセシングされ得る鎖（完全長前駆体の残基３４〜５５０）と、１４ｋＤａの鎖（完全長前駆体の残基４４６〜５５０）を含有する。通常、前駆体形態は、５５０のアミノ酸を含有する完全長前駆体又は完全長Ｉ２Ｓタンパク質とも呼ばれる。通常野生型の又は天然の存在するヒトのＩ２Ｓタンパク質のシグナルペプチドが除去された成熟形態（配列番号１）及び完全長前駆体（配列番号２）のアミノ酸配列を表１に示す。シグナルペプチドには下線を引く。加えて、ヒトＩ２Ｓタンパク質アイソフォームａ及びｂの前駆体のアミノ酸配列もそれぞれ、表１の配列番号３及び４にて提供する。
【００７７】
【表１−１】
2015523074.tif 000003
【表１−２】
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【表１−３】
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【００７８】
従って、いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素はヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質（配列番号１）である。本明細書で開示されるとき、配列番号１はヒトのＩ２Ｓタンパク質の標準的なアミノ酸配列を表す。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓタンパク質は、Ｉ２Ｓ遺伝子の５’ＵＴＲ内での選択的出発部位での転写の結果生じる配列番号１のスプライスアイソフォーム及び／又は変異体であってもよい。いくつかの実施形態では、好適な置換酵素はヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、ヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質の同族体又は類似体は、野生型の又は天然に存在するＩ２Ｓタンパク質（たとえば、配列番号１）に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＩ２Ｓタンパク質の活性を保持する修飾されたヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、本発明に好適な置換酵素は、ヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質（配列番号１）に実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な置換酵素は、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な置換酵素は、ヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質（配列番号１）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に好適な置換酵素は、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適な置換酵素は、ヒトの成熟Ｉ２Ｓタンパク質の断片又は一部を含有する。
【００７９】
或いは、Ｉ２Ｓ酵素は完全長のＩ２Ｓタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は完全長のヒトＩ２Ｓタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、完全長のヒトＩ２Ｓタンパク質の同族体又は類似体は、野生型の又は天然に存在する完全長のＩ２Ｓタンパク質（例えば、配列番号２）に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＩ２Ｓタンパク質の活性を保持する修飾された完全長のヒトＩ２Ｓタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は完全長のヒトＩ２Ｓタンパク質（配列番号２）に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓ酵素は、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓ酵素は配列番号２と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓ酵素は、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓ酵素はヒトの完全長のＩ２Ｓタンパク質の断片又は一部を含有する。本明細書で使用されるとき、完全長のＩ２Ｓタンパク質は通常シグナルペプチド配列を含有する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質である。いくつかの実施形態では、好適なＩ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、ヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質の同族体又は類似体は、野生型の又は天然に存在するヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質（たとえば、配列番号３）に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＩ２Ｓタンパク質の活性を保持する修飾されたヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質（配列番号３）に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は、配列番号３に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は、配列番号３と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は、配列番号３に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質の断片又は一部を含有する。本明細書で使用されるとき、ヒトのＩ２Ｓアイソフォームａタンパク質は通常シグナルペプチド配列を含有する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、ヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質の同族体又は類似体は、野生型の又は天然に存在するヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質（たとえば、配列番号４）に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＩ２Ｓタンパク質の活性を保持する修飾されたヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質（配列番号４）に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は、配列番号４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は、配列番号４と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は、配列番号４に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＩ２Ｓ酵素はヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質の断片又は一部を含有する。本明細書で使用されるとき、ヒトのＩ２Ｓアイソフォームｂタンパク質は通常シグナルペプチド配列を含有する。
【００８２】
ヒトのＩ２Ｓタンパク質の同族体又は類似体は、そのような方法を蓄積する参考文献にて見いだされるような当業者に既知のポリペプチド配列を変える方法に従って調製することができる。いくつかの実施形態では、アミノ酸の保存的置換には、以下の群：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；及び（ｇ）Ｅ、Ｄの範囲内でのアミノ酸の間で行われる置換が挙げられる。いくつかの実施形態では、「保存的なアミノ酸の置換」は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対電荷又はサイズ特性を変えないアミノ酸の置換を指す。
【００８３】
いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ酵素は、細胞の表面上の受容体に結合して細胞の取り込み及び／又はリソソームの標的化を促進する部分を含有する。たとえば、そのような受容体は、マンノース-６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基を結合するカチオン依存性のマンノース-６−リン酸受容体（ＣＩ-ＭＰＲ）であり得る。加えて、ＣＩ-ＭＰＲはＩＧＦ-ＩＩを含む他のタンパク質も結合する。好適なリソソーム標的化部分は、ＩＧＦ-Ｉ、ＩＧＦ-ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７、及びその変異体、同族体又は断片（たとえば、ヒトの野生型成熟ＩＧＦ-Ｉ、ＩＧＦ-ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７ペプチド配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は９５％同一である配列を有するそれらのペプチドを含む）であり得る。いくつかの実施形態では、Ｍ６Ｐ残基が結合する好適な受容体はカチオン依存性であり得る。
【００８４】
ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）
通常、Ｉ２Ｓの酵素活性は、保存されたシステイン（たとえば、ヒトの成熟Ｉ２Ｓ（配列番号１）のアミノ酸５９に相当する）の２〜アミノ-３-オキソプロピオン酸又はオキソ-アラニンとも呼ばれるホルミルグリシンへの翻訳後修飾によって影響を受ける。この翻訳後修飾はタンパク質合成の間に小胞体にて生じ、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によって触媒される。Ｉ２Ｓの特異的な酵素活性は通常、Ｉ２Ｓがホルミルグリシン修飾を有する程度と正の相関を示す。たとえば、相対的に高い量のホルミルグリシン修飾を有するＩ２Ｓタンパク質調製物は通常、相対的に高い酵素比活性を有し；相対的に低い量のホルミルグリシン修飾を有するＩ２Ｓタンパク質調製物は通常、相対的に低い酵素比活性を有する。
【００８５】
従って、本発明に従って組換えＩ２Ｓタンパク質を産生させるのに好適な細胞は通常、ＦＧＥタンパク質も発現する。いくつかの実施形態では、好適な細胞は内在性のＦＧＥタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、好適な細胞は組換えＩ２Ｓと組み合わせて外来性（組換えともいう）ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を発現するように操作される。いくつかの実施形態では、好適な細胞は、ＦＧＥタンパク質の発現レベル又は活性が高まるように内在性のＦＧＥ遺伝子を活性化するように操作される。
【００８６】
通常、ヒトのＦＧＥタンパク質は前駆体の形態で産生される。ヒトのＦＧＥタンパク質の前駆体形態は、シグナルペプチド（完全長前駆体のアミノ酸残基１〜３３）及び鎖（完全長前駆体の残基３４〜３７４）を含有する。通常、前駆体形態は、完全長の前駆体又は完全長のＦＧＥタンパク質とも呼ばれ、３７４アミノ酸を含有する。典型的な野生型の又は天然に存在するヒトのＦＧＥタンパク質のシグナルペプチドを取り除いた成熟形態（配列番号５）及び完全長の前駆体（配列番号６）のアミノ酸配列を表２に示す。
【００８７】
【表２−１】
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【表２−２】
2015523074.tif 000007
【００８８】
従って、いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素はヒトの成熟ＦＧＥタンパク質（配列番号５）である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、ヒトの成熟ＦＧＥタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、ヒトの成熟ＦＧＥタンパク質の同族体又は類似体は、野生型の又は天然に存在するＦＧＥタンパク質（配列番号５）に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＦＧＥタンパク質活性を保持する修飾されたヒトの成熟ＦＧＥタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、ヒトの成熟ＦＧＥタンパク質（配列番号５）に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、配列番号５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、ヒトの成熟ＦＧＥタンパク質（配列番号５）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、配列番号５に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素はヒトの成熟ＦＧＥタンパク質の断片又は一部を含有する。
【００８９】
或いは、本発明に好適なＦＧＥ酵素は完全長ＦＧＥタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＦＧＥ酵素は、ヒトの完全長ＦＧＥタンパク質の同族体又は類似体であってもよい。たとえば、ヒトの完全長ＦＧＥタンパク質の同族体又は類似体は野生型の又は天然に存在する完全長ＦＧＥタンパク質（配列番号６）に比べて１以上のアミノ酸の置換、欠失及び／又は挿入を含有するが、実質的なＦＧＥタンパク質活性を保持する修飾されたヒトの完全長ＦＧＥタンパク質であってもよい。従って、いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、ヒトの完全長ＦＧＥタンパク質（配列番号６）に対して実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、配列番号６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、配列番号６に対して実質的に同一である。本発明に好適なＦＧＥ酵素は、配列番号６に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明に好適なＦＧＥ酵素は、ヒトの完全長ＦＧＥタンパク質の断片又は一部を含有する。本明細書で使用されるとき、完全長ＦＧＥタンパク質は通常シグナルペプチド配列を含有する。
【００９０】
例となるＦＧＥタンパク質をコードする例となる核酸配列及びアミノ酸配列は米国特許公開番号２００４０２２９２５０にて開示されており、その全内容が参照によって本明細書に組み入れられる。
【００９１】
宿主細胞
本明細書で使用されるとき、用語「宿主細胞」は、使用されて組換えＩ２Ｓ酵素を製造することができる細胞を指す。宿主細胞は、組換えＩ２Ｓ酵素を大規模に製造するのに適している。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、約５ピコグラム／細胞／日超（例えば、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ピコグラム／細胞／日超）の量で、Ｉ２Ｓ酵素を製造することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、約５〜１００ピコグラム／細胞／日（例えば、約５〜９０ピコグラム／細胞／日、約５〜８０ピコグラム／細胞／日、約５〜７０ピコグラム／細胞／日、約５〜６０ピコグラム／細胞／日、約５〜５０ピコグラム／細胞／日、約５〜４０ピコグラム／細胞／日、約５〜３０ピコグラム／細胞／日、約１０〜９０ピコグラム／細胞／日、約１０〜８０ピコグラム／細胞／日、約１０〜７０ピコグラム／細胞／日、約１０〜６０ピコグラム／細胞／日、約１０〜５０ピコグラム／細胞／日、約１０〜４０ピコグラム／細胞／日、約１０〜３０ピコグラム／細胞／日、約２０〜９０ピコグラム／細胞／日、約２０〜８０ピコグラム／細胞／日、約２０〜７０ピコグラム／細胞／日、約２０〜６０ピコグラム／細胞／日、約２０〜５０ピコグラム／細胞／日、約２０〜４０ピコグラム／細胞／日、約２０〜３０ピコグラム／細胞／日）の範囲の量でＩ２Ｓ酵素を製造することができる。いくつかの実施形態では、好適な宿主細胞は、エンドソームの酸性化を欠損する細胞ではない。
【００９２】
好適な宿主細胞は、哺乳類、植物、鳥類（たとえば、鳥類系）、昆虫、酵母及び細菌を含むが、これらに限定されない種々の生物に由来することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は哺乳類細胞である。細胞培養し易い及びポリペプチドを発現し易い哺乳類の細胞は本発明に従って宿主細胞として利用され得る。本発明に従って使用され得る哺乳類細胞の非限定例には、ヒト胚性腎臓２９３細胞（ＨＥＫ２９３），ＨｅＬａ細胞；ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／ｌ，ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜細胞芽（ＰＥＲ．Ｃ６（オランダ、ライデンのＣｒｕＣｅｌｌ））；ＳＶ４０で形質転換したサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト線維肉しゅ細胞株（例えば、ＨＴ-１０８０）；ヒト胚性腎臓株（浮遊培養での増殖するようにサブクローニングした２９３又は２９３細胞，Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））；幼若ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／-ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ及びＣｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３-２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ-７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ-１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２，ＨＢ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４〜６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒト肝癌株（ＨｅｐＧ２）、ヒト細胞株ＣＡＰ  およびＡＧＥ１．ＨＮ、並びにグリコトープのパネルが挙げられる。
【００９３】
さらに、多数の利用可能なハイブリドーマ細胞株を本発明に従って利用し得る。当業者は、ハイブリドーマ細胞株が異なる栄養要求を有し得る及び／又は最適な増殖及びポリペプチド又はタンパク質の発現について異なる条件を有し得ることを十分に理解するであろうし、必要に応じて条件を改変することができるであろう。
【００９４】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は非哺乳類細胞である。本発明に適した非哺乳類の宿主細胞及び細胞株の非限定例には、酵母についてはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ；昆虫についてはＳｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉｓ  ｎｉ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｇｏｓｔｅｒ及びＭａｎｄｕｃａ  ｓｅｘｔａ並びに細菌についてはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｎｎｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ；並びに両生類に由来するＸｅｎｏｐｕｓ  Ｌａｅｖｉｓに由来する細胞及び細胞株が挙げられる。
【００９５】
ベクターおよび核酸構築物
様々な核酸構築物を使用して、宿主細胞に本明細書に記載のＩ２Ｓおよび／またはＦＧＥ酵素を発現することができる。好適なベクターとして、典型的には、Ｉ２Ｓおよび／またはＦＧＥタンパク質をコードする配列（Ｉ２ＳまたはＦＧＥ導入遺伝子とも呼ばれる）の他に、制御配列、遺伝子制御配列、プロモーター、非コード配列および／またはタンパク質発現のため、および構築物の複製のためであってもよいその他の適切な配列が挙げられる。典型的に、コード領域はこれらの核酸成分の１つ以上と操作可能に結合される。
【００９６】
「制御配列」は典型的にコード配列の上流（５'非コード配列）、その中、または下流（３'非コード配列）に位置されるヌクレオチド配列を意味し、転写、ＲＮＡプロセッシング若しくは安定性、または関連するコード配列の翻訳に影響する。制御配列として、プロモーター、エンハンサー、５'非翻訳配列、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化認識配列等の３'非翻訳配列が挙げられる。「制御配列」は、「遺伝子制御配列」としても意味することがある。
【００９７】
「プロモーター」は典型的にコード配列または機能ＲＮＡの発現を制御することができるヌクレオチド配列を意味する。通常、コード配列はプロモーター配列の３位に位置される。プロモーター配列は、近位または遠位の上流要素から成り、後者の要素はエンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるヌクレオチド配列であり、生得的なプロモーターの要素またはプロモーターのレベルまたは組織特異性を高めるために挿入された異種性要素であってもよい。プロモーターは全体的に、野生型の遺伝子に由来してもよいし、または自然に認められる異なるプロモーターに由来する異なる要素から構成されてもよいし、または合成ヌクレオチド断片を含んでいてもよい。異なるプロモーターが、異なる組織または細胞型で、または発現の異なる段階で、または異なる環境条件に反応して、遺伝子の発現を方向付けてもよい。
【００９８】
「３'非コード配列」は、典型的にコード配列の下流に位置されるヌクレオチド配列を意味し、ポリアデニル化認識配列およびｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響を及ぼすことのできる制御シグナルをコードするその他の配列が挙げられる。ポリアデニル化シグナルはたいていｍＲＮＡ前駆体の３'末端へのポリアデニル酸のトクラトの添加に影響することを特徴とする。
【００９９】
「翻訳リーダー配列」または「５'非翻訳配列」は典型的に遺伝子のプロモーター配列とコード配列の間に位置されるヌクレオチド配列を意味する。翻訳リーダー配列は、翻訳開始配列の完全に加工されたｍＲＮＡ上流に存在する。翻訳リーダー配列は、ｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ安定性または翻訳効率に対する一次転写のプロセッシングに影響を与え得る。
【０１００】
典型的に、用語「操作可能に結合される」は、１つの機能が他によって影響を受けるように、単一の核酸断片上の２つ以上の核酸断片の結合を意味する。例えば、プロモーターは、コード配列の発現に影響を及ぼすことができる（いわゆるコード配列がプロモーターの転写制御下にある）とき、コード配列と操作可能に結合される。コード配列は、センスまたはアンチセンス方向の制御配列に操作可能に結合することができる。
【０１０１】
導入遺伝子のコード領域は、特定の細胞型についてのコドンの使用を最適化するために、１つ以上のサイレント変異を含んでいてもよい。例えば、Ｉ２Ｓ導入遺伝子のコドンを、脊椎動物細胞の発現のために最適化してもよい。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ導入遺伝子のコドンを、哺乳類細胞の発現のために最適化してもよい。いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓ導入遺伝子のコドンを、ヒト細胞の発現のために最適化してもよい。
【０１０２】
構築物は以下の１つ以上の追加の成分を含んでいてもよい。以下、スプライス部位、エンハンサー配列、適切なプロモーター制御下の選択可能な標識遺伝子、適切なプロモーター制御下の増幅可能なマーカー遺伝子、およびマトリックス結合領域（ＭＡＲ）または挿入された領域の発現を高める当業者に周知のその他の要素。
【０１０３】
宿主細胞に形質移入または形質導入されると、適切なベクターは染色体外に（エピソームに）発現することができ、または宿主細胞のゲノムに組み込まれる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、細胞のゲノムに取り込まれるＤＮＡ構築物は、導入遺伝子核酸配列のみを含む必要がある。この場合、導入遺伝子の発現は、典型的に組込み部位で制御配列によって制御される。本明細書に記載の様々な制御配列を含んでいてもよい。
【０１０５】
培養培地
用語「培地」および「培養培地」は、本明細書で使用するとき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を保持および／または成長させるのに適した栄養物を含有する通常のクラスの溶液を意味する。典型的に、培地溶液は、限定されないが、必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、および少なくとも最小の成長および／または生存のために細胞によって必要とされる微量元素を提供する。他の実施形態では、培地は、当業者に周知の任意の源または方法に由来するアミノ酸を含有し、限定されないが単一アミノ酸添加またはペプトン若しくは（動物性または植物性源を含む）タンパク質加水分解物のいずれかに由来するアミノ酸が挙げられる。限定されないが、ビオチン、パントテン酸、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、ビタミンＢ１２、チアミン、プトレッシンおよび／またはその組み合わせ等のビタミン。限定されないが、ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、塩基性リン酸ナトリウム、二塩基性リン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、ＣｕＳＯ４、ＺｎＣｌ２および／またはその組み合わせ等の塩類。限定されないが、アラキドン酸、リノール酸、オレイン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、並びにメチル-β-シクロデキストリンおよび／またはその組み合わせ等の脂肪酸。いくつかの実施形態では、培地はグルコース、グルタミン、Ｎａ-ピルビン酸塩、インシュリンまたはエタノールアミン、プルロニックＦ６８等の保護剤等の追加の成分を含む。いくつかの実施形態では、培地は、ホルモンおよび成長因子を含む最小の割合を上回る成長および／または生存を高める成分を含んでもよい。培地は１つ以上の緩衝剤を含んでもよい。緩衝剤は、培地を特定のｐＨ（例えば、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ６．８〜ｐＨ７．４））に保つように設計されおよび／または選択される。細胞を培養するのに適した様々な緩衝液は当該技術分野で周知であり、方法に使用してもよい。適切な緩衝液（例えば、重炭酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、Ｇｏｏｄ緩衝液等）は、細胞の呼吸に関連する二酸化炭素の濃度を変化させるにも関わらず、生理学的ｐＨを保つ能力および効率性を有する。好ましくは、溶液は、細胞の生存および増殖に最適なｐＨおよび塩濃度に処方される。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、培地は既知組成の培地であってもよい。用語「既知組成の栄養培地」は本明細書で使用するとき、実質的に全ての化学成分が周知である培地を意味する。いくつかの実施形態では、既知組成の栄養培地は、動物性由来の成分がない。いくつかの場合では、既知組成の栄養培地は、既知組成の培地は１つ以上のタンパク質（例えば、タンパク質成長因子またはサイトカイン）を含む。いくつかの場合では、既知組成の栄養培地は、１つ以上のタンパク質加水分解産物を含む。他の場合では、既知組成の栄養培地はタンパク質のない培地、いわゆるタンパク質、加水分解産物または未知の組成物の成分を含有しない無血清培地である。
【０１０７】
典型的に、既知組成の培地は、例えば、事前に定められた重量または分子百分率または比の必須および非必須アミノ酸、ビタミン、エネルギー源、脂質、塩類、緩衝剤、並びに微量元素等の様々な個別の成分を組み合わせることによって調製することができる。例示的な無血清、特に既知組成培地は、米国特許第２００６／０１４８０７４号に記載され、本開示は参照により本明細書に取り込まれる。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本発明に適した既知組成培地は、限定されないが、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ  Ｆ１２（１：１）、Ｈａｍ'ｓ  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ-１０、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、ＭＣＤＢ  １３１、Ｗｉｌｌｉａｍ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅ、ＣＤ  ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、ＣＤ  ２９３培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））、ＥＸ-Ｃｅｌｌ  ＣＤＣＨＯ、Ｅｘ-Ｃｅｌｌ  ＣＤＣＨＯ  Ｆｕｓｉｏｎ、ＣＤ-ＯｐｔｉＣＨＯ、ＣＤ-ＦｏｒｔｉＣＨＯ、ＣＤＭ４ＣＨＯ、ＣＤ１０００、ＢａｌａｎＣＤ-ＣＨＯ、ＩＳ-ＣＨＯ-ＣＤ、ＣＤ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、ＣＤ-ＤＧ４４等の市販の培地である。いくつかの実施形態では、本発明に適した既知組成培地は、１つ以上の市販の既知組成培地の混合物である。様々な実施形態では、適切な培地は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の市販の既知組成培地の混合物である。いくつかの実施形態では、各個別の市販の既知組成培地（例えば、本明細書に記載されているもの）は、混合物の１重量％、２．５重量％、５重量％、７．５重量％、１０重量％、１２．５重量％、１５重量％、２０重量％、２５重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、５５重量％、６０重量％、６５重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、８５重量％、９０重量％、９５重量％またはそれ以上の重量％を構成する。各個別の成分培地の比は、混合物中に存在する相対重量パーセントによって決定してもよい。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、既知組成培地は、１つ以上の動物性由来成分によって補充されてもよい。当該動物性由来成分として、限定されないが、ウシ胎児血清、ウマ血清、ヤギ血清、ロバ血清、ひと血清、およびアルブミン等の血清由来タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン）が挙げられる。
【０１１０】
酸化還元調節因子
いくつかの実施形態では、適切な培地は１つ以上の酸化還元調節因子を含有する。特定の理論に縛られることを望むものではないが、酸化還元調節因子はＩ２Ｓの製造および／または活性を向上させ得、高いレベルの活性酵素を有する組換えＩ２Ｓ組成物を導く。「酸化還元調節因子」は、本明細書で使用するとき、混合物の構成成分が電子を獲得し、それによって還元される可能性に影響を与える分子（小分子、ポリペプチド）である。酸化還元調節因子は、混合物の構成成分が電子を獲得し、それによって還元される可能性を増加または減少させ得る。いくつかの実施形態では、酸化還元調節因子は、例えば、既知組成培地が市販の源から得られ、または培地に添加物として提供され得るとき、培地に既に存在し得る。いくつかの場合では、本発明の培地は、２つ以上の酸化還元調節因子を含有する。酸化還元調節因子の非限定的な例として、グルタチオン、グルコース-６−リン酸、カルノシン、カルノソール、スルホラファン、トコフェロール、アスコルビン酸塩、デヒドロアスコルビン酸、セレン、２−メルカプトエタノール、Ｎ-アセチルシステイン、システイン、リボフラビン、ニコチン酸、葉酸塩、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、ジチオトレイトールおよびニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）等が挙げられる。その他の適切な酸化還元調節因子は当業者に明らかであろう。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、システインは、本発明の培地に加えられ、または存在する。システインは様々な濃度で存在してもよい。いくつかの実施形態では、培地中のシステインの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ〜約１０ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ〜約２５ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ〜約５０ｍｇ／Ｌ、約２５ｍｇ／Ｌ〜約６５ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ〜約１００ｍｇ／Ｌ、または約２５ｍｇ／Ｌ〜約２５０ｍｇ／Ｌの範囲にある。いくつかの実施形態では、システインの濃度は、約０．１ｍｇ／Ｌ〜約６５ｍｇ／Ｌ（例えば、１〜５０ｍｇ／Ｌ、１〜４０ｍｇ／Ｌ、１〜３０ｍｇ／ｌ、１〜２０ｍｇ／Ｌ、１〜１０ｍｇ／Ｌ）の範囲にある。いくつかの場合では、培地中のシステインの濃度は、最大約０．１ｍｇ／Ｌ、約１ｍｇ／Ｌ、約５ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ、約２０ｍｇ／Ｌ、約２５ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約６５ｍｇ／Ｌ、約７５ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、またはそれ以上である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、２−メルカプトエタノールは、本発明の培地に加えられ、または存在する。様々な濃度で使用してよい。いくつかの実施形態では、２−メルカプトエタノールの濃度は、約０．１ｎＭ〜約０．００１ｍＭ、約０．００１ｍＭ〜約０．０１ｍＭ、約０．００１ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭの範囲にある。いくつかの場合では、２−メルカプトエタノールの濃度は、最大約０．１ｎＭ、約０．００１ｍＭ、約０．０１ｍＭ、約０．１ｍＭ、約１ｍＭまたはそれ以上である。いくつかの実施形態では、２−メルカプトエタノールの濃度は、約０．００１ｍＭ〜約０．０１ｍＭ（例えば、約０．００１-０．００８ｍＭ、約０．００１-０．００７ｍＭ、約０．００１-０．００６ｍＭ、約０．００１-０．００５ｍＭ、約０．００１-０．００４ｍＭ、約０．００１-０．００３ｍＭ、約０．００１-０．００２ｍＭ）の範囲にある。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、Ｎ-アセチルシステインは、本発明の培地に加えられ、または存在する。様々な濃度で使用してよい。いくつかの実施形態では、Ｎ-アセチルシステインの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約３ｍＭ〜約９ｍＭ、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲にある。いくつかの実施形態では、Ｎ-アセチルシステインの濃度は、約３ｍＭ〜約９ｍＭ（例えば、約３〜８ｍＭ、約３〜７ｍＭ、約３〜６ｍＭ、約３〜５ｍＭ、約３〜４ｍＭ）の範囲にある。いくつかの実施形態では、Ｎ-アセチルシステインの濃度は、最大約０．１ｍＭ、約１ｍＭ、約３ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、またはそれ以上である。
【０１１４】
成長調節因子
いくつかの実施形態では、Ｉ２Ｓの製造を向上させるために、培地は１つ以上の成長調節因子を含有してよい。用語「成長調節因子」は、本明細書で使用するとき、細胞の成長に影響する分子を意味する。例えば、細胞増殖を高めるまたは誘導する、細胞周期の進行によって、成長調節因子は細胞の成長を増加させることができ、または例えば、細胞周期停止を促進することによって、細胞の成長を減少させることができる。市販の培地は、複数の異なる成長調節因子を含むことが多いが、いくつかの場合では、栄養培地に追加の成長調節因子を与えることが望ましい。したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上の成長調節因子を培地に加える。
【０１１５】
いくつかの場合では、本発明に適した成長調節因子として、ヒポキサンチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ヒポキサンチンの濃度は、約０．０１ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲にある。いくつかの実施形態では、ヒポキサンチンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ（例えば、約０．１〜９ｍＭ、約０．１〜８ｍＭ、約０．１〜７ｍＭ、約０．１〜６ｍＭ、約０．１〜５ｍＭ、約０．１〜４ｍＭ、約０．１〜３ｍＭ、約０．１〜２ｍＭ、約０．１〜１ｍＭ）の範囲にある。いくつかの場合では、ヒポキサンチンの濃度は、約０．０１ｍＭ、約０．１ｍＭ、約１ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭまたはそれ以上である。
【０１１６】
いくつかの場合では、本発明に適した成長調節因子として、チミジンが挙げられる。いくつかの実施形態では、チミジンの濃度は、約０．０１ｍＭ〜約０．１ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲にある。いくつかの実施形態では、チミジンの濃度は、約１ｍＭ〜約１００ｍＭ（例えば、約１〜９０ｍＭ、約１〜８０ｍＭ、約１〜７０ｍＭ、約１〜６０ｍＭ、約１〜５０ｍＭ、約１〜４０ｍＭ、約１〜３０ｍＭ、約１〜２０ｍＭ、約１〜１０ｍＭ）の範囲にある。いくつかの実施形態では、チミジンの濃度は、約０．０１ｍＭ、約０．１ｍＭ、約１ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭまたはそれ以上である。
【０１１７】
培養条件
本発明は大規模に組換えＩ２Ｓを製造する方法を提供する。対象の組換えポリペプチドの典型的な製造の大規模手順として、バッチ培養および流加培養法が挙げられる。バッチ培養手順は、伝統的に特定の細胞密度の種培養物を有する大規模製造培地に播種し、細胞成長、生存能、および／または生産性に伝導力のある条件下（例えば、適切な培養培地、ｐＨ、および温度）で、細胞を成長させ、細胞が特定の細胞密度に達したら培養物を回収し、発現されるポリペプチドを精製する。流加培養手順は、追加のステップ、または細胞の成長中に消費される栄養物およびその他の成分でバッチ培養を補充するステップを含む。いくつかの実施形態では、本発明の大規模製造方法は、流加培養系を使用する。
【０１１８】
培養の開始
典型的に、Ｉ２Ｓタンパク質を発現する望ましい細胞を、当業者に周知の様々な方法によって、最初の培養で増殖させる。細胞は、典型的に細胞の生存、成長および生存能に伝導性の温度および培地中で成長させることによって、増殖する。最初の培養の容量は問わないが、最終の製造に使用される製造バイオリアクターの培養容量より小さいことが多く、製造バイオリアクターに播種する前に、数回の増加した培養容量に継代培養される。細胞培養を撹拌しまたは振とうし、培地の酸素添加および細胞への栄養物の分散を増加させる。あるいは、または追加として、当該技術分野に周知の特別なスパージング装置を使用して、培養物の酸素添加を増加し、制御することができる。
【０１１９】
開始の細胞密度は当業者によって選択することができる。本発明に従い、開始の細胞密度を、培養容量あたりの単一細胞と同じくらい低くすることができる。いくつかの実施形態では、開始の細胞密度を約１Ｘ１０２生細胞／ｍＬ〜約１Ｘ１０３、１Ｘ１０４、１Ｘ１０５生細胞／ｍＬおよびそれより高い範囲にすることができる。
【０１２０】
最初および中間の細胞培養は、次の中間または最終の製造バイオリアクターに播種する前に望ましい密度で成長させてもよい。いくつかの実施形態では、製造バイオリアクターに播種する前の最終の生存能は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％超またはそれ以上である。例えば、低速の遠心分離によって細胞を上清から取り除いてもよい。望ましくは、必要のない代謝排気産生物または培地成分を取り除くために、次のバイオリアクターに播種する前に、培地と共に、取り除かれた細胞を洗浄してもよい。培地は、細胞を以前に育てた培地であってもよいし、本発明の実施者によって選択された異なる培地または洗浄溶液であってもよい。
【０１２１】
細胞を製造バイオリアクターの播種について適切な密度に希釈してもよい。いくつかの実施形態では、製造バイオリアクター中で使用される同じ培地に、細胞を希釈する。あるいは、本発明の実施者の必要性および望みに依存して、または、例えば、製造バイオリアクターに播種する前に、短い時間細胞を保存する場合、細胞それ自体の特定の要求に適応させるために、細胞を別の培地または溶液に希釈することができる。
【０１２２】
成長期
典型的に、製造バイオリアクターに上述のように播種されると、細胞培養の生存、成長および生存能に伝導性の条件下で、細胞培養を最初の成長期に保持する。本発明に従い、製造バイオリアクターは、タンパク質の大規模製造に適した容量であってもよい。以下の「バイオリアクター」の小節を参照のこと。
【０１２３】
主に細胞培養が生存できる温度範囲に基づいて、成長期における細胞培養物の温度を選択する。成長期の温度は、単一、一定の温度、またはある温度範囲にあってよい。例えば、温度は成長期中に着実に増加または減少する。通常、大部分の哺乳類細胞は、約２５℃〜４２℃（例えば、３０℃〜４０℃、約３０℃〜３７℃、約３５℃〜４０℃）の範囲で良く育つ。いくつかの実施形態では、約３０〜３７℃（例えば、約３１〜３７℃、約３２〜３７℃、約３３〜３７℃、約３４〜３７℃、約３５〜３７℃、約３６〜３７℃）の範囲の温度で哺乳類細胞を培養する。典型的に、成長期中に、細胞は約２８℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃で成長する。
【０１２４】
実施者の必要性および細胞それ自体の必要性に依存して、より多い時間、または少ない時間で、最初の成長期中に細胞を成長させてもよい。ある実施形態では、成長が乱されていない場合に、結果的に細胞が到達する最大の生細胞密度の所与の割合である生細胞密度に達するのに十分な時間で、細胞を成長させる。例えば、最大の生細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントの望ましい生細胞密度に達するのに十分な時間細胞を成長させてもよい。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、定めた時間、細胞を成長させることができる。例えば、細胞培養の開始濃度、細胞が成長する温度、および細胞の内在的成長速度に依存して、細胞を０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上成長させてもよい。いくつかの場合では、細胞を１ヵ月以上成長させてもよい。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、望ましい細胞密度にまで細胞を成長させることができる。例えば、成長期の最後までに望ましい生細胞密度は、約１．０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ超、１．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ超、２．０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ超、２．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ超、５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ超、１０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ超、２０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ超、３０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ超、４０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ超、または５０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ超である。
【０１２７】
細胞への酸素添加および栄養物の分散を増加させるために、細胞培養を、最初の成長期中に撹拌し、または振とうしてもよい。本発明に従い、当業者は、限定されないが、ｐＨ、温度、酸素添加等の最初の成長期のバイオリアクターの特定の内部条件を制御または調製することに利益がある可能性があることを理解するだろう。例えば、ｐＨは適切な量の酸または塩基を供給することによって制御することができ、酸素添加は、当該技術分野で周知のスパージング装置で制御することができる。いくつかの実施形態では、成長期について望ましいｐＨは、約６．８〜７．５（例えば、約６．９〜７．４、約６．９〜７．３、約６．９５〜７．３、約６．９５〜７．２５、約７．０〜７．３、約７．０〜７．２５、約７．０〜７．２、約７．０〜７．１５、約７．０５〜７．３、約７．０５〜７．２５、約７．０５〜７．１５、約７．０５〜７．２０、約７．１０〜７．３、約７．１０〜７．２５、約７．１０〜７．２０、約７．１０〜７．１５）である。いくつかの実施形態では、成長期の望ましいｐＨは約６．８、６．８５、６．９、６．９５、７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、７．４、７．４５、または７．５である。
【０１２８】
転換期
いくつかの実施形態では、細胞は生産期の準備が整うとき、培養条件を対象の組換えタンパク質の製造を最大限にするために変化させてもよい。当該培養条件の変化は典型的に転換期に行われる。いくつかの実施形態では、当該変化は、限定されないが、温度、ｐＨ、モル浸透圧濃度および培地を含むいくつかの培養条件の一つ以上を変更してもよい。ある実施形態では、培養のｐＨを変化する。例えば、培地のｐＨを成長期から生産期へと増加、または減少させてもよい。いくつかの実施形態では、このｐＨの変化は急速である。いくつかの実施形態では、このｐＨの変化は、長い時間をかけてゆっくりと起こる。いくつかの実施形態では、炭酸水素ナトリウムを加えることによってｐＨの変化を制御する。いくつかの実施形態では、ｐＨの変化は転換期に開始され、次の生産期中に保持される。
【０１２９】
ある実施形態では、細胞培養培地のグルコース濃度が変化する。当該実施形態に従い、転換期が開始されると、細胞培養中のグルコース濃度は、７．５ｍＭより高い割合に調整される。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、温度は、成長期から生産期にかけてシフトアップまたはシフトダウンする。例えば、成長期から生産期にかけて温度は、約０．１℃、０．２℃、０．３℃、０．４℃、０．５℃、１．０℃、１．５℃、２．０℃、２．５℃、３．０℃、３．５℃、４．０℃、４．５℃、５．０℃、またはそれ以上にシフトアップまたはシフトダウンする。
【０１３１】
生産期
本発明に従い、転換期があってもなくても、細胞培養が望ましい密度および生存能に達すると、細胞培養の生存および生存能に伝導性の培養条件下、および市販するのに十分なレベルでＩ２Ｓおよび／またはＦＧＥタンパク質の発現に適切な培養条件下で、次の生産期のために、細胞培養は保持される。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、生産期中に、成長期の温度または温度範囲より低い温度または温度範囲で、培養物を保持する。例えば、生産期に、約２５℃〜３５℃（例えば、約２８℃〜３５℃、約３０℃〜３５℃、約３２℃〜３５℃）の範囲で、組換えＩ２Ｓおよび／またはＦＧＥタンパク質を良好に発現し得る。いくつかの実施形態では、生産期に、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃の温度で、組換えＩ２Ｓおよび／またはＦＧＥタンパク質を良好に発現し得る。他の実施形態では、生産期に、成長期の温度または温度範囲より高い温度または温度範囲で、培養物は保持される。
【０１３３】
追加でまたはあるいは、生産期に、成長期のｐＨまたはｐＨ範囲とは異なる（低いまたは高い）ｐＨまたはｐＨ範囲に培養物は保持される。いくつかの実施形態では、生産期のための培地のｐＨは、約６．８〜７．５（例えば、約６．９〜７．４、約６．９〜７．３、約６．９５〜７．３、約６．９５〜７．２５、約７．０〜７．３、約７．０〜７．２５、約７．０〜７．２、約７．０〜７．１５、約７．０５〜７．３、約７．０５〜７．２５、約７．０５〜７．１５、約７．０５〜７．２０、約７．１０〜７．３、約７．１０〜７．２５、約７．１０〜７．２０、約７．１０〜７．１５）の範囲にある。いくつかの実施形態では、培地のｐＨは約６．８、６．８５、６．９、６．９５、７．０、７．０５、７．１、７．１５、７．２、７．２５、７．３、７．３５、７．４、７．４５、または７．５である。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、細胞は製造全体にわたって望ましい生細胞密度内で保持される。例えば、細胞培養の生産期の望ましい生細胞密度は、約１．０〜５０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ（例えば、約１．０〜４０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜３０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜２０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜１０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜４．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜４Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜３．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜３Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜２．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜２．０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．０〜１．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜１０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜４．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜４Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜３．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜３．０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜２．５Ｘ１０６生細胞／ｍＬ、約１．５〜２．０Ｘ１０６生細胞／ｍＬ）の範囲にあってよい。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、最大の生細胞密度の１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセントの生細胞密度に達するのに十分な期間、細胞は保持される。いくつかの場合では、生細胞密度が最大に達することが望ましい。いくつかの実施形態では、生細胞密度が最大に達し、培養物を回収する前に生細胞密度をいくらかのレベルに降下させることが望ましい。いくつかの実施形態では、生産期の最後の総生存能は、約９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、５％未満である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、細胞を生産期の定めた期間に成長させることができる。例えば、続く成長期の開始時の細胞培養の条件、細胞を成長させる温度、細胞の内在的な成長速度に依存して、細胞を約５〜９０日（例えば、約５〜８０日、約５〜７０日、約５〜６０日、約５〜５０日、約５〜４０、約５〜３０日、約５〜２０日、約５〜１５日、約５〜１０日、約１０〜９０日、約１０〜８０日、約１０〜７０日、約１０〜６０日、約１０〜５０日、約１０〜４０日、約１０〜３０日、約１０〜２０日、約１５〜９０日、約１５〜８０日、約１５〜７０日、約１５〜６０日、約１５〜５０日、約１５〜４０日、約１５〜３０日）間育てる。いくつかの実施形態では、生産期は約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、または９０日間続く。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質に対する力価が最大に達するまで、生産期の細胞を保持する。他の実施形態では、培養物をこの時点の前に回収する。例えば、いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質に対する力価が望ましい力価に達するまで、生産期の細胞を保持する。したがって、組換えＩ２Ｓタンパク質に対する望ましい平均回収力価は、少なくとも一日あたり、１リットルあたり６ｍｇ（ｍｇ／Ｌ／日）（例えば、少なくとも８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００ｍｇ／Ｌ／日、またはそれ以上）であってもよい。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質に対する望ましい平均回収力価は、約６〜５００ｍｇ／Ｌ／日（例えば、約６〜４００ｍｇ／Ｌ／日、約６〜３００ｍｇ／Ｌ／日、約６〜２００ｍｇ／Ｌ／日、約６〜１００ｍｇ／Ｌ／日、約６〜９０ｍｇ／Ｌ／日、約６〜８０ｍｇ／Ｌ／日、約６〜７０ｍｇ／Ｌ／日、約６〜６０ｍｇ／Ｌ／日、約６〜５０ｍｇ／Ｌ／日、約６〜４０ｍｇ／Ｌ／日、約６〜３０ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜５００ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜４００ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜３００ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜２００ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜１００ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜９０ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜８０ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜７０ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜６０ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜５０ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜４０ｍｇ／Ｌ／日、約１０〜３０ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜５００ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜４００ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜３００ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜２００ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜１００ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜９０ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜８０ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜７０ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜６０ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜５０ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜４０ｍｇ／Ｌ／日、約２０〜３０ｍｇ／Ｌ／日）の範囲にあってよい。
【０１３８】
追加で、またはあるいは、製造される組換えＩ２Ｓタンパク質が望ましいＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）転換率に達するような条件下で、生産期の細胞を保持する。いくつかの実施形態では、製造される組換えＩ２Ｓタンパク質は、少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％）のＣα-ホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）に対するヒトＩ２Ｓタンパク質のＣｙｓ５９に対応するシステイン残基の転換率を含む。
【０１３９】
追加で、またはあるいは、製造される組換えＩ２Ｓタンパク質が望ましい酵素活性に達するような条件下で、生産期の細胞を保持する。当業者によって理解することができるように、組換えＩ２Ｓタンパク質の酵素活性は、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによって測定してもよい。いくつかの実施形態では、基質としてヘパリン二糖類を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏの硫酸塩放出活性アッセイによって測定されるように、製造される組換えＩ２Ｓタンパク質の望ましい酵素活性は、少なくとも約２０Ｕ／ｍｇ、３０Ｕ／ｍｇ、４０Ｕ／ｍｇ、５０Ｕ／ｍｇ、６０Ｕ／ｍｇ、７０Ｕ／ｍｇ、８０Ｕ／ｍｇ、９０Ｕ／ｍｇ、または１００Ｕ／ｍｇである。いくつかの実施形態では、基質としてヘパリン二糖類を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏの硫酸塩放出活性アッセイによって測定されるように、製造される組換えＩ２Ｓタンパク質の望ましい酵素活性は、約２０〜１００Ｕ／ｍｇ（例えば、約２０〜９０Ｕ／ｍｇ、約２０〜８０Ｕ／ｍｇ、約２０〜７０Ｕ／ｍｇ、約２０〜６０Ｕ／ｍｇ、約２０〜５０Ｕ／ｍｇ、約２０〜４０Ｕ／ｍｇ、約２０〜３０Ｕ／ｍｇ、約３０〜１００Ｕ／ｍｇ、約３０〜９０Ｕ／ｍｇ、約３０〜８０Ｕ／ｍｇ、約３０〜７０Ｕ／ｍｇ、約３０〜６０Ｕ／ｍｇ、約３０〜５０Ｕ／ｍｇ、約３０〜４０Ｕ／ｍｇ、約４０〜１００Ｕ／ｍｇ、約４０〜９０Ｕ／ｍｇ、約４０〜８０Ｕ／ｍｇ、約４０〜７０Ｕ／ｍｇ、約４０〜６０Ｕ／ｍｇ、約４０〜５０Ｕ／ｍｇ）の範囲にある。基質としてヘパリン二糖類を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏの硫酸塩放出活性アッセイを実施するための例示的な条件は、以下に提供する。典型的に当該アッセイは、天然に由来する基質であるヘパリン二糖類から硫酸イオンを放出するＩ２Ｓの能力を測定する。放出される硫酸塩は、イオンクロマトグラフィーによって定量化してもよい。いくつかの場合では、イオンクロマトグラフィーは、電気伝導度検出器を備える。非限定的な例として、試料を最初に１０ｍＭのＮａ酢酸塩、ｐＨ６に緩衝液交換し、緩衝処方物中のリン酸イオンによる阻害を取り除く。その後、試料を反応緩衝液（１０ｍＭのＮａ酢酸塩、ｐＨ４．４）で０．０７５ｍｇ／ｍｌに希釈し、３０μＬ反応容量中、０．３μｇのＩ２Ｓ／１００μｇの基質に対する酵素で、ヘパリン二糖類で、３７℃で２時間インキュベートする。その後、試料を１００℃で３分間加熱することによって、反応を止める。ＩｏｎＰａｃ  ＡＧ１８ガードカラムを有するＤｉｏｎｅｘ  ＩｏｎＰａｃ  ＡＳ１８分析カラムを使用して分析を実施する。１．０ｍＬ／分の３０ｍＭの水酸化カリウムで、１５分間イソクラテッィク法を使用する。Ｉ２Ｓの試料によって放出される硫酸塩の量は、１．７〜１６．０ナノモルの範囲の硫酸塩標準の線形回帰分析から計算する。報告可能な値をタンパク質のｍｇ当たりの単位として表し、１単位は、時間あたり放出される硫酸塩の１マイクロモルとして定義され、タンパク質濃度はＡ２８０の測定によって決定する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓタンパク質の酵素活性は、当該技術で既知の種々の他の方法、たとえば、４−メチルウンベリフェリル-硫酸塩の硫酸塩と自然に蛍光を発する４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵＦ）への加水分解を測定する４−ＭＵＦアッセイを用いても決定され得る。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの４−ＭＵＦアッセイによって測定されるように、製造される組換えＩ２Ｓタンパク質の望ましい酵素活性は、少なくとも約２Ｕ／ｍｇ、４Ｕ／ｍｇ、６Ｕ／ｍｇ、８Ｕ／ｍｇ、１０Ｕ／ｍｇ、１２Ｕ／ｍｇ、１４Ｕ／ｍｇ、１６Ｕ／ｍｇ、１８Ｕ／ｍｇ、または２０Ｕ／ｍｇである。いくつかの実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの４−ＭＵＦアッセイによって測定されるように、製造される組換えＩ２Ｓタンパク質の望ましい酵素活性は、約０〜５０Ｕ／ｍｇ（例えば、約０〜４０Ｕ／ｍｇ、約０〜３０Ｕ／ｍｇ、約０〜２０Ｕ／ｍｇ、約０〜１０Ｕ／ｍｇ、約２〜５０Ｕ／ｍｇ、約２〜４０Ｕ／ｍｇ、約２〜３０Ｕ／ｍｇ、約２〜２０Ｕ／ｍｇ、約２〜１０Ｕ／ｍｇ、約４〜５０Ｕ／ｍｇ、約４〜４０Ｕ／ｍｇ、約４〜３０Ｕ／ｍｇ、約４〜２０Ｕ／ｍｇ、約４〜１０Ｕ／ｍｇ、約６〜５０Ｕ／ｍｇ、約６〜４０Ｕ／ｍｇ、約６〜３０Ｕ／ｍｇ、約６〜２０Ｕ／ｍｇ、約６〜１０Ｕ／ｍｇ）の範囲にある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの４−ＭＵＦアッセイを実施するための例示的な条件を以下に提供する。典型的に、４−ＭＵＦアッセイは、４−メチルウンベリフェリル-硫酸塩（４−ＭＵＦ−ＳＯ４）を硫酸塩と自然に蛍光を発する４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵＦ）に加水分解するＩ２Ｓタンパク質の能力を測定する。活性の１ミリ単位は、３７℃にて１分間で１ナノモルの４−ＭＵＦ−ＳＯ４を４−ＭＵＦに変換するのに必要とされる酵素の量として定義される。通常、活性が既知のＩ２Ｓ試験試料によって生成される平均蛍光単位（ＭＦＵ）を用いて検量線を生成することができ、それを用いて対象の試料の酵素活性を算出することができる。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、生産期の間に、細胞によって枯渇または代謝された栄養物またはその他の培地成分を細胞培養に補充することは有益、または必要となり得る。例えば、細胞培養に、細胞培養中に枯渇したことが観察された栄養物またはその他の培地成分を補充することは有利になり得る。あるいは、または追加で、生産期の前に細胞培養を補充することは有益、または必要となり得る。非限定的な例として、細胞培養に、酸化還元調節因子、成長因子（例えば、ホルモンおよび／またはその他の成長因子）、特定のイオン（ナトリウム、塩化物、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩等）、緩衝液、ビタミン、ヌクレオシド若しくはヌクレオチド、微量元素（極めて低い最終濃度で通常存在する無機化合物）、アミノ酸、脂質、またはグルコース若しくはその他のエネルギー源を補充することは有益、または必要となり得る。
【０１４２】
これらの補充成分を一回に全て細胞培養に加えてもよいし、または一連の添加物中に細胞培養に与えてもよい。いくつかの実施形態では、補充成分を比例量で、複数回に細胞培養に与える。他の実施形態では、細胞培養は、これらの補充成分で連続して与えられる。典型的に、このプロセスは、灌流として周知であり、灌流を含む細胞培養は、「灌流培養」として知られる。用語「灌流培養」は、本明細書で使用するとき、培養プロセスの開始後に、培養物に追加の成分を連続的または半連続的に与える細胞の培養方法を意味する。培地中の一部の細胞および／または成分は、典型的に連続的または半連続的に回収され、精製されてもよい。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、生産期の間に、灌流プロセスによって培地を連続的に交換する。典型的に、１日あたりの反応器の作業体積に対する新鮮培地の容量（ＶＶＤ）は、灌流速度として定義される。本発明に従い様々な灌流速度を使用してよい。いくつかの実施形態では、灌流プロセスは、最小量を保ちながら、細胞培養に全量を加えるような灌流速度を有する。いくつかの実施形態では、灌流プロセスは、約０．５〜２新鮮培地の量／反応器の作業体積／日（ＶＶＤ）（例えば、約０．５〜１．５ＶＶＤ、約０．７５〜１．５ＶＶＤ、約０．７５〜１．２５ＶＶＤ、約１．０〜２．０ＶＶＤ、約１．０〜１．９ＶＶＤ、約１．０〜１．８ＶＶＤ、約１．０〜１．７ＶＶＤ、約１．０〜１．６ＶＶＤ、約１．０〜１．５ＶＶＤ、約１．０〜１．４ＶＶＤ、約１．０〜１．３ＶＶＤ、約１．０〜１．２ＶＶＤ、約１．０〜１．１ＶＶＤ）の範囲の灌流速度を有する。いくつかの実施形態では、灌流プロセスは、約０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１．０、１．０５、１．１０、１．１５、１．２、１．２５、１．３、１．３５、１．４、１．４５、１．５、１．５５、１．６、１．６５、１．７、１．７５、１．８、１．８５、１．９、１．９５、または２．０ＶＶＤの灌流速度を有する。
【０１４４】
灌流プロセスは、１日当りに加えられる新鮮培地の量も特徴とし、細胞特異的な灌流速度として定められる。様々な細胞特異的灌流速度を使用してもよい。いくつかの実施形態では、灌流プロセスの細胞特異的灌流速度は、１日あたり細胞あたり約０．０５〜５ナノリットル（ｎＬ／細胞／日）（例えば、約０．０５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．０５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．０５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．０５〜１ｎＬ／細胞／日、約０．１〜５ｎＬ／細胞／日、約０．１〜４ｎＬ／細胞／日、約０．１〜３ｎＬ／細胞／日、約０．１〜２ｎＬ／細胞／日、約０．１〜１ｎＬ／細胞／日、約０．１５〜５ｎＬ／細胞／日、約０．１５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．１５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．１５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．１５〜１ｎＬ／細胞／日、約０．２〜５ｎＬ／細胞／日、約０．２〜４ｎＬ／細胞／日、約０．２〜３ｎＬ／細胞／日、約０．２〜２ｎＬ／細胞／日、約０．２〜１ｎＬ／細胞／日、約０．２５〜５ｎＬ／細胞／日、約０．２５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．２５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．２５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．２５〜１ｎＬ／細胞／日、約０．３〜５ｎＬ／細胞／日、約０．３〜４ｎＬ／細胞／日、約０．３〜３ｎＬ／細胞／日、約０．３〜２ｎＬ／細胞／日、約０．３〜１ｎＬ／細胞／日、約０．３５〜５ｎＬ／細胞／日、約０．３５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．３５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．３５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．３５〜１ｎＬ／細胞／日、約０．４〜５ｎＬ／細胞／日、約０．４〜４ｎＬ／細胞／日、約０．４〜３ｎＬ／細胞／日、約０．４〜２ｎＬ／細胞／日、約０．４〜１ｎＬ／細胞／日、約０．４５〜５ｎＬ／細胞／日、約０．４５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．４５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．４５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．４５〜１ｎＬ／細胞／日、約０．５〜５ｎＬ／細胞／日、約０．５〜４ｎＬ／細胞／日、約０．５〜３ｎＬ／細胞／日、約０．５〜２ｎＬ／細胞／日、約０．５〜１ｎＬ／細胞／日）の範囲である。いくつかの実施形態では、灌流プロセスの細胞特異的灌流速度は、約０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０ｎＬ／細胞／日である。
【０１４５】
細胞に対する栄養物の酸素添加および分散を増加させるために、生産期の間に細胞培養を撹拌し、または振とうさせてもよい。本発明に従い、当業者は、成長期に、限定されないが、ｐＨ、温度、酸素添加等のバイオリアクターの特定の内部条件を制御し、または調節することは有益になり得ることを理解するだろう。例えば、適切な量の酸または塩基を供給することによって、ｐＨを制御することができ、当該技術分野に周知のスパージング装置で酸素添加を制御することができる。１つ以上の消泡剤を与えてもよい。
【０１４６】
成長期、生産期および多量を含む製造プロセス全体にわたり、同じ培養培地を使用してもよい。いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓの製造に少なくとも２つの異なる培地を使用する。例えば、細胞の成長のために処方された栄養培地を使用して細胞成長期全体にわたり細胞の成長を補助することが多く、タンパク質の製造のために処方された栄養培地をプロセスの生産期の間に使用して、Ｉ２Ｓの発現および回収を補助する。どちらの場合も、栄養培地は血清または動物性由来の成分（例えば、フェチュイン）を含んでいても、含んでいなくてもよい。
【０１４７】
本発明に従い、典型的に懸濁液で細胞を育てる。しかしながら、細胞は、基質に付着していてもよい。ある実施例では、細胞を栄養培地に懸濁されるミクロビーズまたは粒子に付着させてもよい。
【０１４８】
バイオリアクター
本発明は、また、組換えイズロン酸２スルファターゼを製造するのに有用なバイオリアクターを提供する。バイオリアクターは、例えば、灌流、バッチ、流加培養、繰り返しバッチ、または連続性（例えば、連続的撹拌タンクリアクターモデル）であってよい。典型的に、バイオリアクターは設計された少なくとも１つの容器を含み、培地を収容するために構成される（例えば、既知組成の栄養培地）。容器は、典型的に、新鮮な栄養培地を容器に流すように設計され、構成された少なくとも１つの入口を含む。容器は、また、典型的に廃棄培地を容器から外へ流すように設計され、構成された少なくとも１つの出口を含む。いくつかの実施形態では、容器は、容器中の単離された細胞が、廃棄培地と共に、少なくとも１つの出口を通って通過する程度を最小限にするように設計され、構成された少なくとも１つのフィルターをさらに含んでもよい。細胞の成長に適した条件を維持するために設計された１つ以上のその他の成分に、バイオリアクターを適合させてもよい。例えば、容器内で栄養培地を循環させ、または混合するために設計され、構成された１つ以上の循環または混合装置に、バイオリアクターを適合させてもよい。典型的に、組換えＩ２Ｓを発現するように操作される単離された細胞を、栄養培地に懸濁する。したがって、いくつかの場合では、循環装置は、栄養培地の懸濁液に単離された細胞を確実に留まらせる。いくつかの場合では、細胞が基質に付着する。いくつかの場合では、細胞が１つ以上の栄養培地中で懸濁された基質（例えばミクロビーズ）に付着する。バイオリアクターは、容器から細胞懸濁液の試料を得るために、１つ以上のポートを含んでもよい。バイオリアクターは、気体の容量（例えば、空気、酸素、窒素、二酸化炭素）、流速、温度、ｐＨ、および溶解される酸素レベル、並びに撹拌速度／循環速度等の条件を含む培養条件をモニターおよび／または制御するために１つ以上の要素で構成してもよい。
【０１４９】
適切な大きさの容器をバイオリアクターに使用してもよい。典型的に、容器のサイズは、組換えＩ２Ｓを製造する製造要求を満たすのに適している。いくつかの実施形態では、容器は、最大１Ｌ、最大１０Ｌ、最大１００Ｌ、最大５００Ｌ、最大１０００Ｌ、最大１５００Ｌ、最大２０００Ｌ、またはそれ以上の栄養培地を含有するように設計され、構成される。いくつかの実施形態では、製造バイオリアクターの容量は、少なくとも１０Ｌ、少なくとも５０Ｌ、１００Ｌ、少なくとも２００Ｌ、少なくとも２５０Ｌ、少なくとも５００Ｌ、少なくとも１０００Ｌ、少なくとも１５００Ｌ、少なくとも２０００Ｌ、少なくとも２５００Ｌ、少なくとも５０００Ｌ、少なくとも８０００Ｌ、少なくとも１０，０００Ｌ、若しくは少なくとも１２，０００Ｌ、またはそれ以上、またはその間の容量である。製造バイオリアクターは、製造されるＩ２Ｓタンパク質の発現、または安定性または活性を干渉しない細胞成長および生存能に伝導性の材料から構成してもよい。例示的な材料として、限定されないが、ガラス、プラスチック、または金属が挙げられる。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、バイオリアクターの容器に収容される既知組成培地に、細胞を培養してもよい。培養方法は、少なくとも１つの入口を通って、容器に新鮮な栄養培地を灌流すること、および少なくとも１つの出口を通って、容器から廃棄栄養物を流出させることを伴うことが多い。流出は、１日あたり最大約０．１容器量、１日あたり約０．２容器量、１日あたり約０．３容器量、１日あたり約０．４容器量、１日あたり約０．５容器量、１日あたり約１容器量、１日あたり約１．５容器量またはそれ以上の速度で行われる。方法は、組換えＩ２Ｓを含む栄養培地を回収することも伴う。回収は、１日あたり最大約０．１容器量、１日あたり約０．２容器量、１日あたり約０．３容器量、１日あたり約０．４容器量、１日あたり約０．５容器量、１日あたり約１容器量、１日あたり約１．５容器量またはそれ以上の速度で行ってもよい。灌流は、典型的に、流出速度と回収速度の和と等しい速度でも行われる。例えば、灌流速度は、１日あたり約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０容器量超であってもよい。いくつかの実施形態では、灌流速度は、１日あたり約５．０、４．５、４．０、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１．０、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５容器量未満である。例示的な灌流速度を明細書全体にわたって記載する。
【０１５１】
培養条件のモニター
本発明のある実施形態では、実施者は、成長する細胞培養の特定の条件を定期的にモニターすることが有益であり、または重要であることを理解する。細胞培養条件をモニターすることによって、実施者は細胞培養が最適下限レベルで組換えポリペプチドまたはタンパク質を製造しているかどうかを決定し、培養が最適下限生産期にまさに入ろうとしているのかを決定することができる。特定の細胞培養条件をモニターするために、分析のために少量の培養物を取り除くことが必要となるだろう。
【０１５２】
非限定的な例として、温度、ｐＨ、細胞密度、積算生細胞密度、モル浸透圧濃度、または発現されるＩ２Ｓタンパク質の力価若しくは活性をモニターすることが有益でありまたは重要となり得る。当業者がこれらの条件を測定することができる多くの手技が当該技術分野に周知である。例えば、細胞密度を血球計数器、コールターカウンター、または細胞密度検査（ＣＥＤＥＸ）を使用して測定してもよい。培養試料をトリパン青で染色することによって、生細胞の密度を決定してもよい。死細胞のみがトリパン青を取り込むため、細胞の総数を数え、染色を取り込む細胞数を細胞の総数で割り、その逆数を取ることによって、生細胞の密度を決定することができる。あるいは、ＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色、ウエスタンブロット法、ブラッドフォード法、ローリー法、ビウレット法、およびＵＶ吸光度等の標準的な分子生物学的手技によって、発現されるＩ２Ｓタンパク質のレベルを決定することができる。リン酸化およびグリコシル化を含む発現される組換えＩ２Ｓタンパク質の翻訳後修飾をモニターすることが有益または重要でもある。
【０１５３】
発現されたＩ２Ｓタンパク質の精製
種々の方法を用いて、本明細書に記載される種々の方法に従って作出されるＩ２Ｓタンパク質を精製し、単離し得る。いくつかの実施形態では、精製過程の第１の工程として、発現されたＩ２Ｓタンパク質は培地に分泌されるので、たとえば、遠心又は濾過によって細胞及び他の固形物を取り除き得る。代わりに又はさらに、発現されたＩ２Ｓタンパク質は宿主細胞の表面に結合する。この実施形態では、ポリペプチド又はタンパク質を発現している宿主細胞（例えば、イースト細胞）が精製のために溶解される。ガラスビーズによる物理的な粉砕及び高いｐＨ条件への暴露を含む当業者に周知の多数の手段によって宿主細胞の溶解を達成することができる。
【０１５４】
クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換アフィニティクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー及びハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー）、ゲル濾過、遠心、若しくは示差溶解度、エタノール沈殿を含むが、これらに限定されない定法によって、又はタンパク質の精製に利用可能な他の技法によってＩ２Ｓタンパク質を単離し、精製し得る（たとえば、すべて参照によって本明細書に組み入れられるＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ-Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８７；  Ｈｉｇｇｉｎｓ、Ｓ．  Ｊ．  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ、Ｂ．  Ｄ．（ｅｄｓ．）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９；  および  Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍ．  Ｐ．、Ｓｉｍｏｎ、Ｍ．  Ｉ．、Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｊ．  Ｎ．（ｅｄｓ．）、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｉｅｓ、Ｖｏｌ  １８２）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９９７を参照のこと）。特に免疫アフィニティクロマトグラフィーについては、タンパク質に対して作られ、固定支持体に取り付けられた抗体を含むアフィニティカラムにタンパク質を結合することによってそのタンパク質を単離し得る。或いは、標準の組換え法によって、たとえば、インフルエンザコーティング配列、ポリヒスチジン又はグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼのようなアフィニティタグをタンパク質に結合させ、適当なアフィニティカラムを通すことによって容易な精製を可能にすることができる。精製過程の間でポリペプチド又はタンパク質の分解を減らす又は除外するために任意の段階又はすべての段階で、たとえば、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、リューペプチン、ペプスタチン又はアプロチニンのようなプロテアーゼ阻害剤を添加し得る。発現されたポリペプチド又はタンパク質を単離し、精製するために細胞を溶解しなければならない場合、プロテアーゼ阻害剤は特に所望である。
【０１５５】
例となる精製方法は以下の実施例の項で記載される。追加の精製方法は、その開示全体が参照によって本明細書に組み入れられる、同日付で同封して出願された「組換えＩ２Ｓタンパク質の精製」と題する仮特許出願にて記載されている。
【０１５６】
医薬組成物及び投与
精製された組換えＩ２Ｓタンパク質を既知の方法に従ってハンター症候群患者に投与し得る。たとえば、精製された組換えＩ２Ｓタンパク質は、静脈内に、皮下に、筋肉内に、非経口で、経皮で又は経粘膜で（たとえば、経口若しくは経鼻）送達され得る。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物は静脈内投与によって対象に投与される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物はクモ膜下投与によって対象に投与される。本明細書で使用されるとき、用語「クモ膜下投与」又は「クモ膜下注入」は、脊柱管（脊髄を取り囲むクモ膜下空間）への注入を指す。穿頭孔又は大槽穿刺又は腰椎穿刺等を介した側脳室内注入含むが、限定されない種々の技法を使用し得る。いくつかの実施形態では、本発明に係る「クモ膜下投与」又は「クモ膜下送達」は、腰椎の域又は領域を介したＩＴ投与又は送達、すなわち、腰椎ＩＴ投与又は送達を指す。本明細書で使用されるとき、用語「腰椎領域」又は「腰椎域」は第３と第４の腰椎（腰背部）、さらに包括的には脊椎のＬ２〜Ｓ１の領域を指す。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物は皮下（すなわち、皮膚の下）投与によって対象に投与される。そのような目的では、製剤は注射器を用いて注入され得る。しかしながら、たとえば、注入用具（Ｉｎｊｅｃｔ-ｅａｓｅ（商標）Ｇｅｎｊｅｃｔ（商標）用具）；注入ペン（たとえば、ＧｅｎＰｅｎ（商標））；針なし装置（たとえば、ＭｅｄｉＪｅｃｔｏｒ（商標）及びＢｉｏＪｅｃｔｏｒ（商標））；及び皮下添付送達方式のような製剤の投与用の他の用具が利用可能である。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、投与の他の経路（たとえば、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、経皮、又は経粘膜（たとえば、経口若しくは経鼻））との併用でクモ膜下投与が使用され得る。
【０１６１】
本発明は、治療上有効な量の、本明細書で記載される組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物の単回投与と同様に複数回投与を熟考する。組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物は、定期的な間隔で、対象の状態（たとえば、リソソーム蓄積症）の性質、重症度及び程度に応じて投与することができる。いくつかの実施形態では、治療上有効な量の組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物が、定期的な間隔で（たとえば、毎年１回、６ヵ月ごとに１回、５ヵ月ごとに１回、３ヵ月ごとに１回、２ヵ月に１回（２ヵ月ごとに１回）、１ヵ月に１回（１ヵ月ごとに１回）、２週間に１回（２週間ごとに１回）、毎週、毎日又は連続的に）定期的に投与され得る。
【０１６２】
組換えＩ２Ｓ又はそれを含有する医薬組成物は、生理的に許容可能な担体又は賦形剤と共に製剤化されて医薬組成物を調製することができる。担体及び治療剤は無菌であることができる。製剤は投与の方式に適合すべきである。
【０１６３】
好適な薬学上許容可能な担体には、水、塩溶液（たとえば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、アルコール類、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、たとえば、ラクトース、アミロース又はデンプンのような炭水化物、たとえば、マンニトール、スクロース等のような糖類、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、芳香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等、と同様にそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。医薬製剤は所望であれば、活性化合物と有害に反応しない、又はその活性を妨害しない補助剤（たとえば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響するための塩、緩衝液、着色剤、風味剤及び／又は芳香物質等）と混合することができる。いくつかの実施形態では、静脈内投与に好適な水溶性担体が使用される。
【０１６４】
組成物又は薬物は所望であれば、軽微な量の湿潤剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝剤も含有することもできる。組成物は、液状溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、徐放性製剤、又は粉剤であることができる。組成物はまたトリグリセリドのような従来の結合剤又は担体と共に座薬として製剤化することもできる。経口製剤は、たとえば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような標準のキャリアを含むことができる。
【０１６５】
組成物又は薬物はヒトに投与するのに適合した医薬組成物として日常の手順に従って製剤化することができる。たとえば、いくつかの実施形態では、静脈内投与用の組成物は通常、等張の水性緩衝液における溶液である。必要に応じて組成物は可溶化剤及び局所麻酔剤を含んで注射の部位で痛みを軽くし得る。一般に、成分は別々に供給される、又は、たとえば、活性剤の量を示すアンプル若しくはサシェのような密封した容器にて凍結乾燥粉末若しくは水を含まない濃縮物として、単位剤形にて一緒に混合される。組成物が点滴で投与されるべきである場合、無菌の医薬等級の水、生理食塩水又はデキストロース／水を含有する点滴ビンでそれを調剤することができる。組成物が注射で投与される場合、投与に先立って成分が混合され得るように無菌の注射用水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０１６６】
本明細書で使用されるとき、用語「治療上有効な量」は、本発明の医薬組成物に含有される治療剤の総量に基づいて主に決定される。一般に、治療上有効な量は、対象にとって意味のある利益（たとえば、根底にある疾患又は状態を治療すること、調節すること、治癒すること、予防すること及び／又は改善すること）を達成するのに十分である。たとえば、治療上有効な量は、所望の治療効果及び／又は予防効果を達成するのに十分な量、たとえば、リソソーム酵素受容体又はその活性を調節し、それによってリソソーム蓄積症又はその症状を治療する（たとえば、本発明の組成物の対象への投与に続く、「ゼブラ小体」又は細胞の空胞変性の存在又は発生の軽減又は排除）のに十分な量であり得る。一般に、それを必要とする対象に投与される治療剤（たとえば、組換えリソソーム酵素）の量は対象の特徴に左右されるであろう。そのような特徴には、対象の状態、疾患の重症度、全身状態、年齢、性別及び体重が挙げられる。当業者は、それら及び関連する因子に応じて適当な投与量を容易に決定することができるであろう。加えて、客観的なアッセイ及び主観的なアッセイの双方を任意で採用して最適な投与量範囲を特定し得る。
【０１６７】
治療上有効な量は一般に複数の単位用量を含む投与計画にて投与される。特定の治療用のタンパク質については、治療上有効な量（及び／又は有効な投与計画の範囲内での適当な単位用量）は、たとえば、投与経路、他の医薬剤との併用に応じて変化し得る。また、特定の患者のための具体的な治療上有効な量（及び／又は単位用量）は、治療される障害及び障害の重症度、採用される具体的な医薬剤の活性、採用される具体的な組成物、患者の年齢、体重、全身状態、性別及び食事、投与の時間、投与の経路及び／又は採用される具体的な融合タンパク質の排泄若しくは代謝の速度、治療の持続時間、及び医療技術で周知のような類似の因子を含む種々の因子に左右され得る。
【０１６８】
追加の例となる医薬組成物及び投与方法は、双方の開示全体が参照によって本明細書に組み入れられる２０１２年３月３０日に出願された「イズロン酸-２−スルファターゼのＣＮＳ送達のための方法及び組成物」と題されるＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／１６３６４９及び「イズロン酸-２−スルファターゼの皮下投与」と題される仮特許出願番号６１／６１８，６３８にて記載されている。
【０１６９】
特定の対象については、具体的な投与計画は、個々の必要性及び酵素補充療法を投与する又はその投与を監督する人の専門的な判断に従って時間をかけて調整されるべきであり、本明細書で述べられる投与量範囲は単に例となるだけであって、請求される本発明の実践の範囲を限定するようには意図されないことがさらに理解されるべきである。
【実施例】
【０１７０】
実施例１：組換えＩ２ＳおよびＦＧＥを共発現する最適化された細胞株の発生
当該実施例は、組換えＩ２Ｓタンパク質を製造するために使用することができる組換えＩ２ＳおよびＦＧＥを共発現する例示的な細胞株を説明する。代替のアプローチ、発現ベクターおよびクローニング技術が利用可能であることは、当業者に明白だろう。
【０１７１】
ヒトイズロン酸２スルファターゼ酵素（Ｉ２Ｓ）の典型的な成熟形態は、グリコシル化およびホルミルグリシンへのシステイン転換（図１）等の酵素活性化について、広範囲なプロセッシングおよび翻訳後修飾を実施する５２５アミノ酸糖タンパク質である。哺乳類細胞では、（いわゆるアミノ酸５９で）Ｉ２Ｓ酵素内の保存されたシステイン残基は、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によってホルミルグリシンに転換される。Ｉ２Ｓ酵素の活性部位内のホルミルグリシンへのシステインの転換は、ヒトスルファターゼ酵素の活性形態を発生させるのに重要なステップである。当該実験の目的は、活性の組換えＩ２Ｓを発生させるためにＩ２ＳおよびＦＧＥを共発現する最適化されたヒト細胞株を操作することであった。
【０１７２】
図２は、Ｉ２ＳおよびＦＧＥの共発現について、いくつかの例示的な構築物の設計を示す。例えば、Ｉ２ＳおよびＦＧＥの発現単位は、別個のベクターに位置することができ、別個のベクターは同時形質移入することも、別個に形質移入こともできる（図２Ａ）。あるいは、Ｉ２ＳおよびＦＧＥの発現単位は、同じベクターに位置することができる（図２Ｂ）。ある構造では、別個のシストロンにも言及されるように、Ｉ２ＳおよびＦＧＥは、同じベクターにあるが、別個のプロモーターの制御下に置くことができる（図２Ｂ（１））。あるいは、Ｉ２ＳおよびＦＧＥを転写的に結合されたシストロンとして設計することができ、すなわち、同じプロモーターの制御下で、Ｉ２ＳおよびＦＧＥを１つのオープンリーディングフレームとして設計する（図２Ｂ（２））。典型的には、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の中間に、翻訳開始を可能にするように設計する（図２Ｂ（２））。
【０１７３】
配列番号２に示されるアミノ酸配列でヒトＩ２Ｓタンパク質を、および配列番号６に示されるアミノ酸配列でヒトホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を共発現するように、ヒト細胞株を操作した。
配列番号２
完全長前駆体イズロン酸２スルファターゼ：
MPPPRTGRGLLWLGLVLSSVCVALGSETQANSTTDALNVLLIIVDDLRPSLGCYGDKLVRSPNIDQLASHSLLFQNAFAQQAVCAPSRVSFLTGRRPDTTRLYDFNSYWRVHAGNFSTIPQYFKENGYVTMSVGKVFHPGISSNHTDDSPYSWSFPPYHPSSEKYENTKTCRGPDGELHANLLCPVDVLDVPEGTLPDKQSTEQAIQLLEKMKTSASPFFLAVGYHKPHIPFRYPKEFQKLYPLENITLAPDPEVPDGLPPVAYNPWMDIRQREDVQALNISVPYGPIPVDFQRKIRQSYFASVSYLDTQVGRLLSALDDLQLANSTIIAFTSDHGWALGEHGEWAKYSNFDVATHVPLIFYVPGRTASLPEAGEKLFPYLDPFDSASQLMEPGRQSMDLVELVSLFPTLAGLAGLQVPPRCPVPSFHVELCREGKNLLKHFRFRDLEEDPYLPGNPRELIAYSQYPRPSDIPQWNSDKPSLKDIKIMGYSIRTIDYRYTVWVGFNPDEFLANFSDIHAGELYFVDSDPLQDHNMYNDSQGGDLFQLLMP
配列番号６
完全長ヒトＦＧＥ前駆体：
MAAPALGLVCGRCPELGLVLLLLLLSLLCGAAGSQEAGTGAGAGSLAGSCGCGTPQRPGAHGSSAAAHRYSREANAPGPVPGERQLAHSKMVPIPAGVFTMGTDDPQIKQDGEAPARRVTIDAFYMDAYEVSNTEFEKFVNSTGYLTEAEKFGDSFVFEGMLSEQVKTNIQQAVAAAPWWLPVKGANWRHPEGPDSTILHRPDHPVLHVSWNDAVAYCTWAGKRLPTEAEWEYSCRGGLHNRLFPWGNKLQPKGQHYANIWQGEFPVTNTGEDGFQGTAPVDAFPPNGYGLYNIVGNAWEWTSDWWTVHHSVEETLNPKGPPSGKDRVKKGGSYMCHRSYCYRYRCAARSQNTPDSSASNLGFRCAADRLPTMD
【０１７４】
Ｉ２Ｓの発現もＦＧＥの発現も、ヒトＣＭＶプロモーターによって制御される。Ｉ２Ｓ  ｍＲＮＡの翻訳は、５５０アミノ酸完全長のＩ２Ｓタンパク質（配列番号２）を合成し、２５アミノ酸シグナルペプチドを含む。シグナルペプチドは取り除かれ、可溶性の酵素は細胞から分泌される。
【０１７５】
細菌性ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）コード配列および／またはブラストサイジンＳデアミナーゼ（ＢＳＤ）遺伝子を使用して、ネオマイシン類似体Ｇ４１８および／またはブラストサイジンをそれぞれ使用して、形質移入された細胞を選択することができる。さらに、マウスのジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子をＩ２Ｓおよび／またはＦＧＥコードベクター上で使用して、メトトレキサート（ＭＴＸ）選択によって増加したＩ２Ｓおよび／またはＦＧＥコード配列の複製を含む細胞株を単離することができる。
【０１７６】
Ｉ２Ｓを製造する細胞を単離し、適切な薬物選択に供し、数が増加した形質移入されたＩ２Ｓおよび／またはＦＧＥ遺伝子の複製で、細胞を単離する。Ｉ２Ｓの定量化はＥＬＩＳＡによって実施する。
【０１７７】
また、細胞集団をメトトレキサート（ＭＴＸ）のステップワイズ変数選択に供し、Ｉ２Ｓの増加した生産性で細胞を単離する。Ｉ２Ｓの生産性をＥＬＩＳＡによるＭＴＸ選択の間にモニターした。
【０１７８】
幾巡かの増殖後、１０％の仔ウシ血清を含有するＤＭＥＭから無血清既知組成培地に段階的に還元させることによって、いくつかのＩ２Ｓを産生するクローンを無血清培地中の懸濁適合に供した。限界希釈クローニング（ｌｉｍｉｔｅｄ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ  ｃｌｏｎｉｎｇ）によって、いくつかの独立したクローン集団を確立した。コロニーをＩ２Ｓ酵素活性アッセイおよびＥＬＩＳＡによって選別した。２つの安定した細胞株２Ｄおよび４Ｄが高い割合の生物能およびＩ２Ｓの強固な発現を示し、これをさらなる開発に選択した。
【０１７９】
実施例２：無血清懸濁細胞培養
本実施例は、組換えＩ２Ｓを製造するために、無血清懸濁細胞培養系を使用してＩ２ＳおよびＦＧＥを共発現する細胞株の培養が成功し得ることを説明する。
【０１８０】
種培養の生成
端的には、実施例１の２Ｄまたは４Ｄ細胞株を使用して種培養を確立した。無血清既知組成拡張培地を含有する２５０ｍｌの通気組織培養振とうフラスコに細胞を移し、選択のためにメトトレキサートを補充し、炭酸水素ナトリウムでｐＨを７．３に調整し、標準条件下で成長させた。
【０１８１】
細胞培養拡張
望ましい生細胞密度に達したとき、最初の種培養を使用して、５００ｍｌの組織培養振とうフラスコから成る最初の一連の段階的細胞培養拡張に播種し、次に、１Ｌの組織培養振とうフラスコに２回播種した。各場合に、望ましい生細胞密度に達したとき、先の細胞培養を全体的に移動させ、次のより大きい培養フラスコに播種した。
【０１８２】
１Ｌを２回の各培養物を１０ＬのＣｅｌｌｂａｇ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（登録商標）（Ｗａｖｅ  Ｅｕｒｏｐｅ）に移動し、２．５ｋｇの最終重量に拡張培地を加えることによって、バッチ培養拡張を実施した。望ましい細胞密度に達した後、５．０ｋｇの最終重量に新しい拡張培地を加え、細胞は望ましい密度にまで成長した。１０ＬのＣｅｌｌｂａｇをＷａｖｅ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（登録商標）系（Ｗａｖｅ  Ｅｕｒｏｐｅ）に移動し、連続的な培地灌流下で成長できるように培養条件を修正した。拡張成長培地を１日あたり５．０Ｌ（１．０ｖｖｄ）の標的重量で運び、ｐＨ、グルタミン、グルタミン酸、グルコース、アンモニウム、乳酸塩、ｐＣＯ２およびモル浸透圧濃度のオフラインの代謝物質解析を行うために、試料を回収した。
【０１８３】
望ましい細胞密度に達したとき、全体の１０Ｌの細胞培地を、２０ｋｇの新鮮な拡張培地を含有する５０ＬのＷａｖｅ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ（登録商標）に移動させ、再び、望ましい細胞密度になるまで成長させた。
【０１８４】
バイオリアクターの拡張
灌流中に媒介される細胞培養を再利用するために細胞を濃縮し、触媒を浄化するために設計された、２００Ｌの使い捨てのバイオリアクターおよび遠心分離灌流装置（Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ（登録商標）ＣＥＬＬ  ＩＩユニット、Ｐｎｅｕｍａｔｉｃ  Ｓｃａｌｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、次に細胞拡張を行った。拡張培地を、十分な細胞密度になるのに十分な５０Ｌの培養物の一部で播種した。
【０１８５】
次に、２００Ｌの培養物の一部を使用して、２０００Ｌの使い捨てのバイオリアクターおよび遠心分離灌流装置（Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ（登録商標）ＣＥＬＬ  ＩＩユニット、Ｐｎｅｕｍａｔｉｃ  Ｓｃａｌｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に蒔いた。細胞は２日間、バッチ成長条件下で成長した。２日間の成長の後、連続的な灌流のために条件を調整し、転換期を開始した。
【０１８６】
バイオリアクター製造
生産期について、２つのＣｅｎｔｒｉｔｅｃｈＣＥＬＬ  ＩＩユニットを使用した。転換期の開始から約２４時間後に生産期を開始し、その時点に、典型的に細胞は望ましい細胞密度に達した。流出速度を制御することによって、細胞密度を望ましい生産期間を保持した。
【０１８７】
実施例３：無血清細胞培地中で製造された組換えＩ２Ｓ酵素の生理化学的および生物学的特徴付け
この実施例の目的は、上述の無血清細胞培養を使用して製造された組換えＩ２Ｓタンパク質の詳細な特徴付けをすることである。
【０１８８】
ＳＤＳ-ＰＡＧＥ
この実験について、上述の方法を使用した２つの別個の無血清培養反応物中で、２Ｄまたは４Ｄヒト細胞株を使用して組換えＩ２Ｓタンパク質を発生させた。生産期に試料を回収し、精製されたＩ２Ｓ酵素をＳＤＳ-ＰＡＧＥによって分析し、視覚化のために銀染色で処理した。図３は、それぞれ別個の製造実験において、分子量タンパク質標準（レーン１）と市販のＩ２Ｓアッセイ対照（レーン２および３）を比較したときに示されるように、適切な大きさで移動された無血清条件下の２Ｄまたは４Ｄ細胞株から製造されたＩ２Ｓタンパク質（レーン５および６）を示す。さらに、無血清条件下で製造された組換えＩ２Ｓタンパク質（レーン５および６）はまた、Ｉ２Ｓ参照標準（レーン４）と同じサイズで移動した。
【０１８９】
ペプチドマップ
上述の無血清培養条件下で成長したＩ２Ｓ-ＡＦ  ２Ｄ細胞株を使用して、組換えＩ２Ｓタンパク質を発生させた。Ｉ２Ｓ-ＡＦ  ２Ｄ細胞株および参照ヒトＩ２Ｓの試料から発生した単離された組換えＩ２Ｓをそれぞれ、タンパク質消化物（例えば、トリプシンによって）に供し、ＨＰＬＣ分析によって検査した。例示的な結果を図４に示す。
【０１９０】
ホルミルグリシンの転換率
ペプチドマッピングを使用して、ＦＧｌｙ転換率を決定した。Ｉ２Ｓ活性は、以下に示されるように、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）によってホルミルグリシン転換をするために、システイン（成熟したヒトＩ２Ｓの５９位に対応する）を必要とする。
【化１】
2015523074.tif 000008
したがって、ホルミルグリシン転換率（％ＦＧ）を以下の公式を使用して計算することができる。
【数１】
2015523074.tif 000009
【０１９１】
例えば、５０％のＦＧは、精製された組換えＩ２Ｓの半分は、治療効果のない酵素的に不活性であることを意味する。
【０１９２】
ペプチドマッピングを使用して％ＦＧを計算した。端的には、組換えＩ２Ｓタンパク質は、タンパク分解酵素（例えば、トリプシンまたはキモトリプシン）を使用して、短いペプチドに消化された。短いペプチドを分離し、ＨＰＬＣを使用して特徴付けした。成熟したヒトＩ２Ｓの５９位に対応する位置を含むペプチドが、対照（例えば、ＦＧｌｙ転換のないＩ２Ｓタンパク質または１００％ＦＧｌｙ転換したＩ２Ｓタンパク質）と比較して、５９位のＣｙｓがＦＧｌｙに転換されるかどうかを特徴付けした。ＦＧｌｙを含むペプチドの量（活性Ｉ２Ｓ分子の数に対応する）、およびＦＧｌｙとＣｙｓの両方を有するペプチドの総量（総Ｉ２Ｓ分子の数に対応する）を、対応するピーク領域に基づいて特定してもよく、％ＦＧを反映する比を計算した。例示的な結果を表４に示す。
【０１９３】
グリカンマップ−マンノース６リン酸およびシアル酸量
無血清細胞培養条件下で製造される組換えＩ２Ｓタンパク質のグリカンおよびシアル酸組成物を決定した。アニオン交換クロマトグラフィーを使用してグリカン組成物の定量化を行った。以下に記載するように、これらの条件下で製造される組換えＩ２Ｓのグリカンマップは、７つのピーク群から構成され、負電荷の増加量に従って溶離し、少なくとも部分的に、酵素消化物から生じるシアル酸およびマンノース-６−リン酸グリコフォームに由来する。端的には、無血清細胞培養法（Ｉ２Ｓ-ＡＦ  ２Ｄ無血清およびＩ２Ｓ-ＡＦ  ４Ｄ無血清）を使用して得られる精製された組換えＩ２Ｓおよび参照の製造された組換えＩ２Ｓを、（１）シアル酸残基を取り除くための精製されたノイラミニダーゼ酵素（アルスロバクター・ウレアファシエンス（１０ｍＵ／μＬ）、Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（インディアナポリス、インディアナ州）、カタログ番号２６９  ６１１（１Ｕ／１００μＬ）から単離された）、（２）マンノース-６−リン酸残基を完全に放出するためのアルカリホスファターゼを、３７±１℃で２時間、（３）アルカリホスファターゼ＋ノイラミニダーゼ、または（４）処理なし、のいずれかで処理した。各酵素消化物を、Ｄｉｏｎｅｘ  ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１  Ｇｕａｒｄ  Ｃｏｌｕｍｎを備えたＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ１  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｏｌｕｍｎを使用して、Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  Ｐｕｌｓｅｄ  Ａｍｐｅｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＨＰＡＥ-ＰＡＤ）によって分析した。０．４〜２．０ナノモルの範囲の一連のシアル酸およびマンノース-６−リン酸標準を、各アッセイについて実施した。１００ｍＭの水酸化ナトリウム中の４８ｍＭの酢酸ナトリウムを使用して、定組成法を、雰囲気カラム温度、流速１．０ｍＬ／分で最小１５分間実施し、各ピークを溶離した。Ｉ２Ｓ-ＡＦとＩ２Ｓ標準試料の両方について、個別の実施から生成されたデータを、単一のクロマトグラフにそれぞれまとめ、各個別の組換えタンパク質についてグリカンマップを表した。図５に示されるように、ヒト細胞無血清法を使用して製造されたＩ２Ｓの例示的なグリカンマップは、代表的な溶離ピーク（溶離の順序で）を表し、中性、モノ、ジシアリル化、モノホスホリル化、トリシアリル化、およびハイブリッド（モノシアリル化およびキャップされたマンノース-６−リン酸）、テトラシアリル化、およびハイブリッド（ジシアリル化およびキャップされたマンノース-６−リン酸）並びにジホスホリル化グリカンを構成した。
【０１９４】
各組換えＩ２Ｓ試料の平均的なシアル酸量（モルタンパク質あたりのモルシアル酸）を、シアル酸標準の線形回帰分析から計算した。ＰｅａｋＮｅｔ６ソフトウェアを使用して、各クロマトグラフの実施を視覚化した。組換えＩ２Ｓアッセイ対照および試験試料から放出されたシアル酸標準およびシアル酸は、単一のピークとして現れる。Ｉ２Ｓについてシアル酸の量（ナノモル）を、以下の公式を使用して生値として計算した。
【数２】
2015523074.tif 000010
ここで、Ｃは試料または組換えＩ２Ｓアッセイ対照のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）である。
各試験試料について、タンパク質のモルあたりシアル酸のモルとしてシアル酸の補正値を以下の公式を使用して計算した。
【数３】
2015523074.tif 000011
【０１９５】
Ｉ２Ｓ-ＡＦ  ２Ｄまたは４Ｄ細胞株によって製造された組換えＩ２Ｓのシアル酸量を指示する例示的なデータを表４に示す。
【表４−１】
2015523074.tif 000012
【表４−２】
2015523074.tif 000013
【０１９６】
組換えＩ２Ｓの特異的活性
４−ＭＵＦアッセイとしてｉｎ  ｖｉｔｒｏの硫酸塩放出アッセイを使用して、無血清細胞培養条件下で２Ｄおよび４Ｄ細胞株を使用して製造されたＩ２Ｓ酵素の特異的活性を分析した。
【０１９７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの硫酸塩アッセイ
ヘパリン二糖類を基質として使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの硫酸塩アッセイを実施した。特に、このアッセイでは、天然由来の基質であるヘパリン二糖類から硫酸イオンを放出するＩ２Ｓの能力を測定する。電気伝導度検出器を備えたイオンクロマトグラフィーによって、放出される硫酸塩を定量化してもよい。端的には、最初に試料をｐＨ６、１０ｍＭのＮａ酢酸塩に緩衝液交換し、緩衝液処方物中のリン酸イオンによる阻害を取り除いた。その後、試料を反応緩衝液（１０ｍＭのＮａ酢酸塩、ｐＨ４．４）で、０．０７５ｍｇ／ｍｌに希釈し、３０μＬの反応容量中、基質比が０．３μgのＩ２Ｓ／１００μgの酵素の基質ヘパリン二糖類で、３７℃で２時間インキュベートした。試料を１００℃で３分間加熱することによって、反応を停止した。ＩｏｎＰａｃ  ＡＧ１８  ガードカラムを備えたＤｉｏｎｅｘ  ＩｏｎＰａｃ  ＡＳ１８分析カラムを使用して分析を行った。１．０ｍＬ／分で１５分間、３０ｎＭの水酸化カリウムで定組成法を使用した。Ｉ２Ｓから放出される硫酸塩の量を、１．７〜１６．０ナノモルの範囲の硫酸塩標準の線形回帰分析から計算した。報告できる値をｍｇあたりの単位のタンパク質として表し、単位１は一時間あたりに放出される硫酸塩の１マイクロモルとして定め、タンパク質濃度をＡ２８０測定法によって決定した。例示的な結果を表４に表す。
【０１９８】
４−ＭＵＦアッセイ
無血清細胞培養条件下で２Ｄおよび４Ｄ細胞株を使用して製造された組換えＩ２Ｓ酵素の特異的活性についても、蛍光に基づく４−ＭＵＦアッセイを使用して分析してもよい。端的には、アッセイはＩ２Ｓ基質の４−メチルウンベリフェリル-硫酸塩（４−ＭＵＦ−ＳＯ４）の加水分解を測定する。Ｉ２Ｓによって４−ＭＵＦ−ＳＯ４基質を切断したとき、分子が硫酸塩および自然に蛍光を発する４−メチルウンベリフェロン（４−ＭＵＦ）に転換される。結果として、経時的な蛍光シグナルの全体的な変化を評価することによってＩ２Ｓ酵素活性を決定することができる。当該実験について、Ｉ２Ｓ-ＡＦ  ２Ｄおよび４Ｄヒト細胞株から製造された精製されたＩ２Ｓ酵素を、４−メチルウンベリフェリル-硫酸（４−ＭＵＦ−ＳＯ４）、カリウム塩（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｍ-７１３３）の溶液でインキュベートした。一連の対照の標準試料を使用して、保存液の１：１００、１：２００および１：２０，０００で希釈された市販のＩ２Ｓ酵素を使用して、アッセイの較正を行った。３７℃で酵素アッセイを実施し、較正した蛍光光度計を使用して分析した。各標準試料について、得られる蛍光値を使用して、以下の等式を使用して、変動係数率を決定した。
【数４】
2015523074.tif 000014
【０１９９】
その後、報告可能な酵素活性を決定するために、率ＣＶ値を使用して、各試料の補正した平均蛍光を計算し、以下の公式を使用してｍＵ／ｍＬで表した。
【数５】
2015523074.tif 000015
ＣＦＵ＝負に補正された平均蛍光
ＤＦ＝希釈係数
【０２００】
活性の１ミリ単位は、３７℃、１分で、４−メチルウンベリフェリル-硫酸の１ナノモルを４−メチルウンベリフェロンに転換するのに必要とされる酵素の量である。
【０２０１】
電荷特性
それぞれ精製された組換えＩ２Ｓの電荷分布を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）系を有する強アニオン交換（ＳＡＸ）クロマトグラフィーによって決定した。この方法は、表面電荷差に基づいて、試料内の組換えＩ２Ｓ変異体を分離する。ｐＨが８．００では、負電荷した種が、ＳＡＸカラムの固定された正電荷上で吸収される。増加しているイオン強度の勾配を使用してカラムとのイオン相互作用の強度に比例して、各タンパク質の種を溶離する。無血清成長条件下の２Ｄ細胞株または参照の組換えＩ２Ｓ酵素から単離された１００マイクログラムの精製されたＩ２Ｓを、雰囲気温度で保持されたＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｍｉｎｉ  Ｑ  ＰＥ（４．６ｘ５０ｍｍ）カラムに負荷し、２０ｍＭのトリス-ＨＣ１、ｐＨ８．００に平衡した。２０ｍＭのトリス-ＨＣ１、１．０Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ８．００の移動相を使用して、流速０．８０ｍＬ／分で勾配溶離を行った。２８０ｎｍの波長で試料の溶離の吸光度を測定することによって、実施中にタンパク質濃度を連続して決定した。例示的な結果を図６に示す。
【０２０２】
本明細書に記載の特定の化合物、組成物および方法は、特定の実施形態に従って特定性を有して記載されているが、以下の実施例は、本発明の化合物を説明するためだけにあり、同化合物を限定することを意図しない。
【０２０３】
英語の冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書および請求項で使用されるとき、逆であると明白に示されない限り、複数の指示物を含むことを理解されたい。１つ以上のメンバーの群の「または」を含む請求項または記述は、逆であると明白に示されない限り、または、文脈から他に明白的に示されない限り、１つ、１つ以上、または全ての群のメンバーが存在する場合、そこで使用される場合、さもなければ所与の生成物またはプロセスに関連する場合を満たすと考えられる。本発明は、群が厳密に１つのメンバーが存在する、そこで使用される、またはさもなければ所与の生成物またはプロセスに関連する実施形態を含む。本発明はまた、１つ以上、または全体の群のメンバーが存在する、そこで使用される、またはさもなければ所与の生成物またはプロセスに関連する実施形態も含む。さらに、本発明は、すべての変形例、組み合わせ、および置換例を包含し、そうではないと示されない限り、または、矛盾または不一致が生じることが当業者に明白である限り、１つ以上の列挙される請求項からの１つ以上の制限、要素、節、記述用語等は、同じベースの請求項（若しくは関連のその他の請求項）に依存する別の請求項に導入される。要素が列挙として表される場合（例えば、マーカッシュ群、または同様の形式）要素の副要素もそれぞれ開示され、どの要素も群から取り除くことができる。通常、本発明、または本発明の態様は、特定の要素、特性等を含むものとして意味され、本発明の特定の実施形態または本発明の態様は、当該要素、特性等から成り、または本質的に成る。簡潔さのために、これらの実施形態は、特に、本明細書にすべての場合を非常に多くの言葉で記載していない。本発明の実施形態または態様は、特別な除外が明細書に記載されない限り、請求項から明示的に除外することができることも理解されたい。本発明の背景を説明するために、および実施について追加の詳述を提供するために、本明細書に参照される刊行物、ウェブサイト、およびその他の参考文献は、参照により本明細書に取り込まれる。
【図１】
2015523074.tif 000016
【図３】
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【図５】
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【図６】
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【図２】
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【図４】
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【配列表】
2015523074000001.app
【国際調査報告】
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2015523074.tif 000023
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