(57)【要約】  本発明は細胞傷害分子にリンクする神経ペプチドY受容体(NPY-1)と癌およびその他の疾病の治療を目的とするその利用に関わる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)で表される化合物、または、式(I)で表される化合物の、薬理学的に許容できる塩、溶媒和物若しくは水和物、または薬理学的に許容できるこれらの組成物。
A-L-Pep    
(I)
上記式(I)において、
Aは、その細胞活性が100ナノモル濃度未満の細胞損傷性または細胞増殖抑制性の分子であり、
Lは、AとPepとの間のリンカーまたは結合であり、
Pepは、NPY-1受容体を活性化し、内在化させる特性を示すNPY-1受容体結合リガンドである。
【請求項２】
Pepが
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2(PepX、SEQ ID NO: 1)であり；
位置18(Ala)、22(Ser)および26(His)におけるアミノ酸の1個、2個または3個(好ましくは1個)は他のアミノ酸で置換されていてもよく；
1個の水素原子はLまたはLとの結合で置換されていてもよく；
1個または2個以上の水素原子はアシル基で置換されていてもよく；および/または
1個または2個以上の水素原子は、ポリエチレングリコール、ポリグルタミン、重合プロリン-アラニン-セリンおよびヒドロキシエチルデンプンから選択される基で置換されていてもよい
ことを特徴とする請求項1に記載の化合物。
【請求項３】
Pepが
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(Palmitoyl-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
Ac-Tyr-Pro-Ser-Lys(Palmitoyl-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
Palmitoyl-β-Ala-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-Lys(Palmitoyl-Glu)-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Lys(Palmitoyl-Glu)-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(XL-β-Ala-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(XL-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(XL)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH-XL; および
XL-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2、
から選択され、
XLはLとの結合を表すか、またはLが結合である場合には、Aとの結合を表すことを特徴とする請求項1に記載の化合物。
【請求項４】
Pepが
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-βAla-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(palmitoyl-Cys-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-Lys(palmitoyl-Glu)-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Lys(palmitoyl-Glu)-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Lys(palmitoyl-Glu)-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
acetyl-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2; または
palmitoyl-βAla-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2; 
から選択され、
XLがLとの結合、またはLが結合である場合にはAとの結合であることを特徴とする請求項1に記載の化合物。
【請求項５】
Lが結合、または置換基を有していてもよい、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、ヘテロアルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、ヘテロシクロアルキレン基、アルキルシクロアルキレン基、ヘテロアルキルシクロアルキレン基、アラルキレン基若しくはヘテロアラルキレン基であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項６】
Lが結合、または1乃至20個の炭素原子を含み、かつO、SおよびNから選択される1乃至12個のヘテロ原子を含む、置換基を有していてもよいヘテロアルキル基であることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項７】
Lが結合、または下記の基：
-CH2-CH2-S-;
-O-CH2-CH2-S-；
-NH-CH2-CH2-S-；
-NH-NH-C(=O)-O-CH2-CH2-S-;
から選択される基であり、
基Lの左側がAと結合しており、基Ｌの硫黄原子がPepと結合していることを特徴とする請求項1乃至4のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項８】
Aが天然および合成チューブリシン、天然および合成エポチロン、アウリスタチン、ドラスタチン、天然および合成ビンクリスチン、天然および合成ビンブラスチン、アマニチン、メイタンシン、タキサン、ネモルビシン、PNU-159682、ピロロベンゾジアゼピンとその二量体およびデュオカルマイシンから選択され、1個の水素原子がLまたはLとの結合によって置換されていることを特徴とする請求項1乃至7のいずれか1項に記載の化合物。
【請求項９】
Aが下記の式（Tub）又は下記の式（IV）で表されることを特徴とする請求項1乃至7項のいずれか1項に記載の化合物。
【化１】
2015531794.tif 000038
上記式（Tub）において、R’’はH，アルキル、アルケニル、アリール、またはヘテロアリールであり、
R’’’は、HまたはOHであり、
1個の水素原子がLまたはLとの結合によって置換されている；
【化２】
2015531794.tif 000039
上記の式（IV）において、1個の水素原子はLまたはLとの結合によって置換されおり、
R41は、H、または、置換基を有していてもよい、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、CO-アルキル基、ヘテロアルキル基、アラルキル基若しくはヘテロアラルキル基を表し；
R42は、置換基を有していてもよい、OH、アルキル基、アルケニル基、-O-アルキル基、-O-アルケニル基、-O-アルキニル基、-O-CO-アルキル基またはヘテロアルキル基を表し；
R43は、式CO2H、CO2R45、CONHR45、CONR245で表される基、または式CH2OH若しくは下記の［化３］で表される基を表し；
【化３】
2015531794.tif 000040
R45は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基を表し；
X4は、SまたはOを表し；
R44は、それぞれ独立に、置換基を有していてもよいアルキル(例えば、メチル)、置換基を有していてもよいヘテロアルキル(例えば、OMe)、ハロゲン、CN、NO2、OHを表し；
Rは、0、1、2、3、4または5を表す。
【請求項１０】
Aが下記の式(Epo)で表されることを特徴とする請求項1乃至7のいずれか1項に記載の化合物。
【化４】
2015531794.tif 000041
上記式(Epo)において、
Tは、ヘテロアルキル-基、ヘテロシクロアルキル-基、ヘテロアルキルシクロアルキル-基、ヘテロアリール-基またはヘテロアリールアルキル-基を表し、
Uは、水素、ハロゲン、アルキル基、ヘテロアルキル-基、ヘテロシクロアルキル-基、ヘテロアルキルシクロアルキル基、ヘテロアリール-基またはヘテロアリールアルキル-基を表し、
G-Eは、下記の［化５］で表される基から選択される基、または置換基を有していてもよいフェニル環の一部を表し、
【化５】
2015531794.tif 000042
これらの［化５］において、R’は、FまたはC１-C３アルキル基を表し、
R１５は、C１-C４-アルキル-基、C１-C４-アルケニル-基、C１-C４-アルキニル-基、またはC３-C４-シクロアルキル-基を表し、
Y-V-Wは、式CH=CH-CH、CH2-CH2-CHまたはCH2-CH=Cで表される基であり、二重結合によってシス型またはトランス型異性体が形成され、
D１は、C=OまたはS(=O)pを表し、pは0、1または2を表し、
D２は、CHOH、OまたはS(=O)qを表し、qは0，1または2を表し、
Bは、酸素または式NR18で表される基を表し、R18は水素、アルキル-基、アルケニル-基、ヘテロアルキル-基、アリール-基、ヘテロアリール-基、シクロアルキル-、アルキルシクロアルキル-基、ヘテロアルキルシクロアルキル-基、ヘテロシクロアルキル-基、アラルキル-基またはヘテロアリールアルキル基を表し、
R16およびR17は、それぞれ独立に、水素、C1-C4-アルキル、または双方一体として3個または4個の環原子を含むシクロアルキル基の一部を表し、
式(Epo)で表される化合物の1個の水素原子がLまたはLとの結合によって置換されている。
【請求項１１】
下記の式(II)を有する請求項1乃至7のいずれか1項に記載の化合物、またはその薬理学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくは水和物、または薬理学的に許容可能なそれらの組成物。
【化６】
2015531794.tif 000043
上記式(II)において、
nは、0、1、2を表し;
R1は、アルキル基またはヘテロアルキル基を表し；
R2は、水素、置換基を有していてもよい、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、ヘテロアルキルシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基またはヘテロアラルキル基を表し；
R3は、水素、OH、置換基を有していてもよい、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、ヘテロアルキルシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基またはヘテロアラルキル基を表し；
Xは、OまたはS(特にS)を表し；
R4は、置換基を有していてもよい、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、ヘテロシクロアルキレン基、ヘテロアルキルシクロアルキレン基、アラルキレン基またはヘテロアラルキレン基を表し；
R5は、水素、置換基を有していてもよいC1-C6アルキル基、または、置換基を有していてもよい、アリール基若しくはヘテロアリール基を表し；
R6は、-CO2-、-CONH-、-CO-、-C0NHNH-、-O-、-NH-、-S-、-SO-、-SO2-、-OP(=O)O2-、または、分岐若しくは非分岐の置換された若しくは非置換の、アルキレン、シクロアルキレン、ヘテロアルキレンまたはヘテロシクロアルキレン基を表し；
mは、0、1、2または3を表し；
X1は、-L-Pepを表し、かつX2はHを表すか、またはX1がHを、X2が-L-Pepを表す。
【請求項１２】
下記の式(III)を有する請求項1に記載の化合物、または、その薬理学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくは水和物、または薬理学的に許容可能なこれらの組成物。
【化７】
2015531794.tif 000044
上記式(III)において、
R２は、C1-C6アルキル、CH2Ph、CH2OC1-C6-アルキル(特にCH2OCH2CH3若しくはCH2OCH2CH(CH3)2)、CH2OCOC1-C6-アルキル、CH2CONHC1-C6-アルキル、CH2OCOCH2PhまたはCH2OCOPhを表し; 
R3は、H、OAcまたはO-C1-C6-アルキルを表し;
R5は、CH3またはHを表し;
R6は、-CO-を表し;
R14は、H、F、OH、NH2、CH3、OMeまたはPhを表し;
Lは、下記の基
-O-CH2-CH2-S-、
-NH-CH2-CH2-S-、
-NH-NH-C(=O)-O-CH2-CH2-S-、
から選択される基を表し、
上記式(III)において、
基Lの硫黄原子がPepと結合しており；かつ
Pepは、下記の構造から選択され：
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(palmitoyl-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-Lys(palmitoyl-Glu)-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Lys(palmitoyl-Glu)-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Lys(palmitoyl-Glu)-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
acetyl-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2: または
palmitoyl-βAla-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
XLがLとの結合を表すか；または
Lが結合を表し；且つ
Pepが
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(XL-βAla-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-AlaGlu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2である。
【請求項１３】
請求項1乃至12のいずれか1項に記載の化合物、および随意に1種類または複数種類の担体および／またはアジュバントをも含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項1乃至12のいずれか1項に記載の化合物または請求項13に記載の医薬組成物の癌の治療を目的とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規な細胞傷害分子、並びに癌およびその他の疾病の治療を目的とするその利用に関わる。
【背景技術】
【０００２】
本発明の１つの目的は、受容体リガンドとリンクし、癌細胞に対する活性を有し、特に、神経ペプチドY受容体１で表される癌細胞を効果的に標的とする、同調可能な薬理学的特性を有する新規な細胞傷害分子を提供することにある。具体的には、本発明は、リンカー部分を介して、神経ペプチドY受容体1のリガンドであるペプチドと結合した化合物にターゲティング特性を与えることにより、細胞傷害分子の選択度および治療濃度域を強化した、細胞傷害分子の誘導体である、受容体リガンドにリンクさせた細胞傷害化合物を開示する。
【０００３】
例えば、多様な癌細胞株に対して極めて強力な細胞傷害活性を示す自然発生的なチューブリシンおよびその誘導体等のような種々の細胞傷害化合物が周知となっている(A. Domling, W. Richter, Mol. Diversity 2005, 9, 141-147)。しかし、治療濃度域が狭く、非癌細胞に対する選択特性が充分でないため、癌に対する新規な治療手段としてこれらの化合物を使用することには限界がある。極めて強力な細胞傷害化合物の治療濃度域を広げるための公知の術策としては、これらの化合物を癌特異リガンド、例えば、抗体と(US 2010/0092496およびUS 2011/0166319)、ペプチドと(US 2011/0166319)または例えば葉酸塩受容体のような受容体の小分子リガンドと(US 2011/0017274および2011/0172254)または生体内に吸収される分子、例えば、ビタミンと(US 2010/0004276)結合させる、という方法が提案されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
この原理は公知であるが、このような複合体を治療に使用するとしても、多くの要因の影響下にあるから、どの特異化合物が有用な細胞傷害複合体であるかを予測することは不可能である。一般に、有用な複合体であるためには、癌細胞を選択的に且つ強力に死滅させるのに必要な下記の４つの重要な特性をすべて具えていなけらばならない：
【０００５】
1．  癌細胞に到達するのに充分な生体内での充分な生物学的半減期；
2．  癌細胞との選択的な結合。
3．  細胞内への複合体の効率的な移動；および
4．  細胞内の複合体から細胞傷害分子が開裂して、効率的に腫瘍細胞を死滅させること。
【０００６】
これらの特性を一括して１個の分子に兼備させることは困難である。例えば、結合の結果として、ターゲットに対する癌特異リガンドの親和性および/または選択性またはその他の結合特性が著しく低下する可能性がある。細胞傷害性ドラッグ複合体の内在化が非特異移動、例えば、エンドサイトーシスの形で行われ、結果として治療濃度域を低下させる可能性がある。例えば、受容体の活性化およびこれに続く内在化の過程を辿るリガンドの特異な内在化が結合によって阻害される可能性がある。標的リガンドからの細胞傷害分子の開裂が細胞外空間または血液中で既に起こり、結果として、結合物の毒性が広く拡散することになる。あるいはまた、リンカーの一部または全部が付着した状態のままであるため、細胞内での分子開裂が遅延するか、または毒素の活性が低下する可能性がある。
【０００７】
乳癌、特に転移性乳癌のほか、ユーイング肉腫、腎細胞癌、消化管間質腫瘍、腎芽細胞腫症、神経芽細胞腫瘍、傍神経節腫、褐色細胞腫、副腎皮質腫瘍、卵巣性索腫瘍、卵巣腺癌のような他の癌状態においても、NPY-1受容体が過剰に発現することが開示されている(Korner and Reubi, Peptides 28, 419-425 (2007))。興味深いことに、NPY-1受容体はそのネイティブ・リガンドであるNPYペプチドによって活性化されるとインターナライズする。
【０００８】
当然の結果として、ターゲッティングに関して、NPY-1受容体を考察することに関心を持つことになる。このアプローチはツワンツィガーによって発表され(Zwanziger et al. Bioconjutate Chem. 2008, 19, 1430-1438)、ここでは診断のために変性NPYペプチドと結合させたキレート剤が使用されている。幾つかの複合体の半減期は組織の異なるネイティブ・ペプチドの半減期(Ｔ1/2  >  4時間)と比較した場合，遙かに長い(Ｔ1/2  >  24時間)ことが判明した。例えば、変性NPYペプチドは位置7においてフェニルアラニンに、位置34においてプロリンへの変化を含んだ。この変性NPY分子は競合するNPYペプチド-2，-4，-5または-6受容体と比較してNPY  1ペプチドに対する選択性が際立って高いと主張された。これらの考察結果は有望なものであったが、腫瘍による複合体の摂取量は極めて低く、上記必須条件1および2を満たすものの、必須条件3を満たすものではなかった。
【０００９】
細胞傷害薬剤としてネイティブ・ペプチドと結合させたダウノルビシンおよびドキソルビシンを使用したNPY-1  リガンド毒素複合体がランガーによって発表された(Langer et al. J. Med. Chem. 2001, 44, 1341-1348).  25乃至51 nM 程度の親和性で受容体と結合できる複合体は他にもあるが、遊離ダウノルビシンに匹敵する細胞傷害活性を示したのは酸感受性ヒドラゾン結合ダウノルビシンだけであった。しかし、ヒドラゾン・リンカーは既に血清中で分子開裂しているから、上記必須条件1および4を満たすことが出来ず、このような複合体を治療手段として利用することは出来ない。これらの例は今後治療に実用可能な新規の標的細胞傷害性複合体を発明しようとする場合に解決すべき問題を提示している。
【００１０】
本発明の目的は標的薬物複合体に関する4つの必須条件を満たし且つ適当なストラテジーを介して細胞傷害分子に結合させたNPY-1受容体特異リガンドを利用する新規の化合物および方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
式(I)で表される化合物、または、式(I)で表される化合物の、薬理学的に許容できる塩、溶媒和物若しくは水和物、または薬理学的に許容できるこれらの組成物を提供する。
A-L-Pep
(I)
上記式(I)において、
Aは、その細胞活性が100ナノモル濃度未満であり、好ましくは、例えば、細胞増殖抑制、細胞損傷、抗血管形成活性などの特性によって癌細胞を死滅させる能力を有する、適当な(好ましくは極めて強力な)分子(特に、毒性の、例えば、細胞損傷性の分子)を表し；
Lは、AとPepとの間の解除可能なまたは解除不可能なリンカーまたは結合を表し；
Pepは、NPY-1受容体を活性化し、インターナライズさせる特性をも含むNPY-1受容体結合リガンドを表す。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図1は、種々の細胞株の細胞増殖阻害を示す。
【図２】図2は、各種乳癌細胞株、即ち、(A)MCF-7、(B)T-47D、(C)MDA-MB-231、および(D)MDA-MB-468の細胞増殖阻害を示す。
【図３】図3は、OC519(A)およびパルミトイル化類似体(B)による種々の細胞株の増殖阻害を示す。
【図４】図4は、機能IP３アッセイによって決定されて、NPYとCytoPepとの複合体OC500およびOC508によるヒトY1およびY2の機能活性化を示す。
【図５】図5は、機能的リポーター遺伝子アッセイを用いることによって決定された、ネイティブNPY (非選択性)およびhY1R-選択性NPY誘導体OC502(本発明のペプチド-ドラッグ複合体のコア・ペプチド)によるヒトY1およびY2受容体の機能的活性化を示す。
【図６】図6は、機能的リポーター遺伝子アッセイを利用することによって求められた、パルミトイル化ペプチドOC522、OC523、OC524およびOC525(OC502の誘導体)によるヒトY1およびY2受容体の機能的活性化を示す。
【図７】図7は、機能的リポーター遺伝子アッセイを利用すことで解明されたペプチド-ドラッグ複合体OC500、OC508、OC519およびOC528によるヒトY1およびY2受容体の機能的活性化を示す。
【図８】図8A-Dは、カスパーゼ3/7(カラム)の活性化効果と乳癌細胞種MDA-MB-468(A、B)および184B5(C、D)の細胞生残率(三角形)を示す。
【図９】図9は、EYFP-標識付きヒトNPY Y1(白線)およびY2受容体(黒線)をそれぞれ安定的に発現するHEK293細胞のOC500の濃度に関する核フラグメンテーション・アッセイを示す。
【図１０】図10は、細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識付け(SILAC)を利用することによって、OC169およびOC500でそれぞれ処理した後、MCF-7(A)およびMDA-MB-468(B)をプロテオーム分析した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
好ましくは、Aは特に強力な分子、例えば、天然および合成チューブリシンとその誘導体、天然および合成エポチロンとその誘導体、アウリスタチン、ドラスタチン、天然および合成ビンクリスチンとその類似物、天然および合成ビンブラスチンとその類似物、アマニチンとその類似物、メイタンシンとその類似物、タキサン、ネモルビシン、PNU-159682、ピロロベンゾジアゼピンとその二量体、デュオカルマイシンとその類似体等から選択される細胞損傷または細胞増殖抑制分子(好ましくは細胞活性が１００ナノモル濃度以下の分子)である。
【００１４】
好ましくは、本発明は式(II)の化合物、またはその薬理学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくは水和物、または薬理学的に許容可能なそれらの組成物を提供する。
【化１】
2015531794.tif 000002
式中、
R1はアルキル基またはヘテロアルキル基を表し；
R2は水素、置換基を有していてもよい、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、ヘテロアルキルシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基またはヘテロアラルキル基を表し；
R3は水素、OH、置換を有していてもよい、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、シクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、ヘテロアルキルシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アラルキル基またはヘテロアラルキル基を表し；
XはOまたはS(特にS)を表し；
R4は、置換基を有していてもよい、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、ヘテロシクロアルキレン基、ヘテロアルキルシクロアルキレン基、アラルキレン基またはヘテロアラルキレン基を表し；
R5は水素、置換基を有していてもよいC1-C6アルキル基、または置換基を有していてもよいアリール基若しくはヘテロアリール基を表し；
R6は-CO2-、-CONH-、-CO-、-C0NHNH-、-O-、-NH-、-S-、-SO-、-SO2-、-OP(=O)O2-または分岐の若しくは非分岐の、置換された若しくは非置換の、アルキレン基、シクロアルキレン基、ヘテロアルキレン基またはヘテロシクロアルキレン基を表し；
mが0、1、2または3を表し；
X1は-L-Pepを表し、かつX2はHを表すか、またはX1はHを表し、かつX2は-L-Pepを表し; 
LおよびPepが上述した内容を表す。
【００１５】
好ましくは、R1はメチル基である。
【００１６】
好ましくは、R2は、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、n-ブチル基、イソブチル基、CH2OR7、C(O)R7またはCH2OCOR8のような、分岐していてもよいアルキル基であり、R7は分岐していてもよいアルキル基、特にイソプロピル基であり、R8は分岐していてもよいC1-C6アルキル基またはC2-C6アルケニル基である。
【００１７】
より好ましいR2は、置換基を有していてもよいアルキル基；-R9-O-R10、ここでR9はアルキレン基(特にメチレン基またはエチレン基)を表す、R10はアルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、ヘテロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、またはヘテロアリール基を表す；C(O)R7、ここでR7はアルキル基、特にイソプロピル基を表す;CH2OCOPh;CH2OCOCH2Ph;-R9-NR11R12、ここでR9がアルキレン基を表し、R11およびR12は、互いに独立に、Hまたはアルキル基を表す； R13-OH、ここでR13はアルキレン基を表す；または、CH2OCOR8であり、R8は分岐していてもよい、C1-C6アルキル基またはC2-C6アルケニル基を表す。
【００１８】
さらに好ましいR2は、C1-C8-アルキル基；-R9-O-R10、ここでR9はC1-C6-アルキレン基、特にメチレン基若しくはエチレン基を表し、R10がC1-C6-アルキル基、C2-C6-アルケニル基、シクロアルキル基、ヘテロアルキル基、アリール基、若しくはヘテロアリール基を表す; C(O)R7、ここでR7はC1-C6-アルキル基、特に、イソプロピル基を表す；CH2OCOPh；またはCH2OCOCH2Phである。
【００１９】
好ましくは、R3がH、-O(C=O)-(C1-4)アルキル基、O-アルキル基またはO-アセチル基を表す。
【００２０】
好ましくは、X1が水素である場合、R4がアラルキル基またはヘテロアラルキル基を表し；特に好ましいR4は下記の式である。
【００２１】
【化２】
2015531794.tif 000003
式中、R14はH、ハロゲン、OH、NO2、NH2、CN、アルキル基、ヘテロアルキル基、シクロ-アルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、アルキルオキシ基、アルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基を表す。
【００２２】
特に好ましくは、R14はH、OH、ハロゲン、NH2、アルキルオキシ基、フェニル基、アルキルアミノ基またはジアルキルアミノ基を表す。
【００２３】
mは0または1であることが好ましい。
X1が水素であり、X2が-L-Pepであることがより好ましい。
【００２４】
下記式(III)で表される化合物、またはその薬理学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくは水和物、または薬理学的に許容可能なそれらの組成物が特に好ましい。
【００２５】
【化３】
2015531794.tif 000004
式中、R2は、C1-C6アルキル基(特にCH3，エチル基、プロピル基、イソプロピル基、イソブチル基、n-ペンチル基若しくはn-ヘキシル基)、CH2Ph、CH2OC1-C6-アルキル基(特にCH2OCH2CH3若しくはCH2OCH2CH(CH3)2)、CH2OCOC1-C6-アルキル基、CH2CONHC1-C6-アルキル基、CH2OCOCH2PhまたはCH2OCOPhを表し;
R3はH、OAcまたはOC1-C6アルキル基(特にOPr)を表し；
R5はCH3またはHを表し;
R6は-CO-、-COO-、-CONH-、-CONHNH-、-O-、-NH-、-CH2O-、-CH2NH-または-CH2S-を表し;
R14はH、F、OH、NH2、CH3、OMe またはPhを表し；かつ
LおよびPepが上述の通りである。
【００２６】
R6が-CO-である場合の式(III)の化合物がより好ましい。
【００２７】
更に好ましくは、Aが下記の式(Tub)の化合物である。
【００２８】
【化４】
2015531794.tif 000005
式中、R’’はH、アルキル基、アルケニル基、アリール基、またはヘテロアリール基を表し、R’’’はHまたはOHを表し、
式中、1個の水素原子がLまたはLとの結合によって置換されている。
【００２９】
より好ましくは、Aが下記化合物：チューブリシンA、B、C、D、E、F、G、HおよびIから選択され、その化合物において、1個の水素原子がLまたはLとの結合によって置換されている。
【００３０】
より好ましくは、Aは式(IV)の化合物であり、式中、1個の水素原子がLまたはLとの結合によって置換されている。
【００３１】
【化５】
2015531794.tif 000006
式中
R41はH、または、置換基を有していてもよい、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、CO-アルキル基、ヘテロアルキル基、アラルキル基若しくはヘテロアラルキル基を表し；
R42は、置換基を有していてもよいOH、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、-O-アルキル基、-O-アルケニル基、-O-アルキニル基、-O-CO-アルキル基若しくはヘテロアルキル基を表し；
R43が式CO2H、CO2R45、CONHR45、CONR245で表される基、または式CH2OH若しくは下記の式で表される基を表し；
【化６】
2015531794.tif 000007
R45は、それぞれ独立に、アルキル基、アリール基、アラルキル基またはヘテロアルキル基を表し；
X4がSまたはOを表し；
R44がそれぞれ独立に、置換基を有していてもよいアルキル基(例えば、メチル基)、置換基を有していてもよいヘテロアルキル基(例えば、OMe)、ハロゲン、CN、NO2、OHを表し；
rが0、1、2、3、4または5を表す。
【００３２】
好ましくは、R41はHまたはC1-C6アルキル基；特にメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソプロピル基、イソブチル基、n-ペンチル基若しくはn-ヘキシル基を表す。
【００３３】
好ましくは、R42は-O-CO-アルキル基、アルキル基またはヘテロアルキル基(例えば、-O-アルキル基、-O-アルキル-O-アルキル基)；特に-O-アセチル基(OAc基、OCOCH3基)、-O-プロピル基または-OCH2OCH3基を表す。
好ましくは、R43は式CO2HまたはCO2R45であり、R45はアルキル基であることが好ましい。
R43が下記の式で表される基または-CH2OHであることがより好ましい。
【００３４】
【化７】
2015531794.tif 000008
【００３５】
X4がSであることが好ましい。
R44は、それぞれ独立に、置換基を有していてもよいアルキル基、ハロゲン(例えば、FまたはCl)またはOHを表すことが好ましい。
rは、好ましくは0、1、2または3、特に好ましくは0または1を表す。
【００３６】
式（IV）において、
R41がC1-C6アルキル基、特に-CH3、エチル基、プロピル基、ブチル基、イソプロピル基、イソブチル基、n-ペンチル基、n-ヘキシル基を表し；
R42が-O-CO-アルキル基またはヘテロアルキル基、特に-O-CO-CH3、-O-プロピル基またはOCH2OCH3基を表し；
R43が-CO2H、-CO2R45、-CH2OHまたは下記の式で表される基を表し；
X4がSを表し；
R44が、それぞれ独立に、置換基を有していてもよいアルキル基、ハロゲン(例えば、F若しくはCl)またはOHを表し;
rが0または1を表す、式（IV）の化合物が特に好ましい。
【００３７】
【化８】
2015531794.tif 000009
【００３８】
Aが下記式(Epo)の化合物であることがより好ましい：
【００３９】
【化９】
2015531794.tif 000010
上記式（Epo）において、
Tがヘテロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアルキルシクロアルキル基、ヘテロアリール基またはヘテロアリールアルキル基を表し、
Uが水素、ハロゲン、アルキル基、ヘテロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、ヘテロアルキルシクロアルキル基、ヘテロアリール基またはヘテロアリールアルキル基を表し、
G-Eが下記の式で表される基から選択される基、または置換基を有していてもよいフェニル環の一部を表し、
R15がC1-C4-アルキル基、C1-C4-アルケニル基、C1-C4-アルキニル基またはC3-C4-シクロアルキル基を表し、
Y-V-Wが式CH=CH-CH、CH2-CH2-CHまたはCH2-CH=Cで表される基であり、二重結合によってシス型またはトランス型異性体が形成され、
D1がC=Oまたは(S=O)pを表し、ｐが0、1または2を表し、
D2がCHOH、OまたはS(=O)qを表し、qが0、1または２を表し、
Bが酸素または式NR18で表される基を表し、R18が水素、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、ヘテロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、シクロアルキル基、アルキルシクロアルキル基、ヘテロアルキルシクロアルキル基、ヘテロシクロアルキル基、アラルキル基またはヘテロアリールアルキル基を表し、
R16およびR17が、それぞれ独立に、水素、C1-C4-アルキル、または双方一体として3個または4個の環原子を含むシクロアルキル基の一部を表し、
式(Epo)で表される化合物の1個の水素原子がLまたはLとの結合によって置換されている。
【００４０】
【化１０】
2015531794.tif 000011
式中、R’がFまたはC1-C3アルキル基を表す。
【００４１】
Tが-C(CH3)=CHR19またはCH=CHR19で表される基であり、R19がヘテロアリール基またはヘテロアリールアルキル基である式(Epo)の化合物が好ましい。
【００４２】
式(Epo)の化合物は、Tが下記式(EpoI)または(EpoII)で表される基(特に基(EpoI)であれば、より好ましい：
【００４３】
【化１１】
2015531794.tif 000012
上記式において、Qが硫黄、酸素またはNR21(特に酸素または硫黄)を表し、R21が水素、C1-C4アルキル基またはC1-C4ヘテロアルキル基を表し、zが窒素またはCH(特にCH)を表し、R20がOR22、NHR22、C1-C4アルキル基、C1-C4アルケニル基、C1-C4アルキニル基またはC1-C6ヘテロアルキル基(特にメチル基、CH2OR22またはCH2NHR22)を表し、R22が水素、C1-C4アルキル基またはC1-C4ヘテロアルキル基(特に水素)を表す。
【００４４】
D1がC=Oであり、かつD2がCHOHまたはS(=O)qであればより好ましく、qは0、1または2を表す。
D1がS(=O)ｐであり、かつD2がCHOHであればより好ましく、ｐは0、1または2を表す。
R18が水素またはC1-C4アルキル基である式(Epo)の化合物がより好ましい。
Bが酸素またはNH(特に酸素)である式(Epo)の化合物がさらに好ましい。
R15がメチルまたはエチル(特にメチル)である式(Epo)の化合物がさらに好ましい。
R16およびR17がメチル基である式(Epo)の化合物がもっと好ましい。
Uが水素、フッ素、メチル、トリフルオロメチルまたはCOOH(特に水素)である式(Epo)の化合物がより好ましい。
絶対立体化学が天然のエポチロンBおよび/またはDと同じである式(Epo)の化合物がさらにもっと好ましい。
R’がCH3またはCF3である式(Epo)がさらにより好ましい。
DがC=Oである(Epo)の化合物がもっと好ましい。
【００４５】
好ましくは、Lが結合、または置換基を有していてもよい、アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基、ヘテロアルキレン基、アリーレン基、ヘテロアリーレン基、シクロアルキレン基、ヘテロシクロアルキレン基、アルキルシクロアルキレン基、ヘテロアルキルシクロアルキレン基、アラルキレン基若しくはヘテロアラルキレン基を表す。
【００４６】
より好ましくは、Lが結合、またはヘテロアルキレン基、ヘテロアルキルシクロアルキレン基、若しくはヘテロアラルキレン基（すなわち、好ましくはヘテロアルキレン基を含む基）を表す。
【００４７】
好ましい実施態様においては、LはAとPepとを共有結合する、C、N、O、S、SiおよびPから選択される原子鎖を表す。Lの長さは多様であり、約2個乃至約100個の原子の範囲である。Lの形成に使用される原子は、あらゆる化学的形態、例えば，アルキレン基、アルケニレン基、アルキニレン基などを形成する炭素原子鎖；エーテル基、ポリオキシアルキレン基を形成し、場合によってはカルボニル基と組み合わせられてエステルや炭酸塩などを形成する炭素原子および酸素原子の鎖；アミン、イミン、ポリアミン、ヒドラジン、ヒドラゾンを形成し、場合によってはカルボニル基と組み合わされてアミド、尿素、セミカルバジド、カルバジドなどを形成する炭素および窒素原子の鎖；アルコキシアミン、アルコキシルアミンを形成し，場合によってはカルボニル基と組み合わされてウレタン、アミノ酸、アシルオキシアミン、ヒドロキサム酸などを形成する炭素、窒素および酸素原子の鎖；その他多様である。尚、上記実施態様のそれぞれにおいて鎖を形成している原子は、飽和であっても、不飽和であってもよく、例えば、アルカン、アルケン、アルキン、イミンなどはLに含まれる基であってもよい。また、Lを形成する原子を互いに環状にし、シクロアルカン、環状エーテル、環状アミン、アリーレン、ヘテロアリーレンなどを含むリンカーを形成する二価環状構造を形成することも可能である。
【００４８】
より好ましくは、Lは少なくとも1個の解除可能なリンカー、および随意に1個または2個以上のスペーサーリンカーを形成するラジカルを含む。ここで使用する「解除可能なリンカー」という用語は、pHに関して不安定な、酸に不安定な、塩基に不安定な、酸化に不安定な、代謝に不安定な、生化学的に不安定な、または酵素に不安定な結合等の、生理的条件下で破壊される可能性がある少なくとも1個の結合を含むリンカーを意味する。尚、結合破壊を惹起するこのような生理的状態は必ずしも生物的または代謝的プロセスを含む必要はなく、その代りに、例えば、生理的pHにおける加水分解等の標準的な化学反応や、細胞質pHよりも低いpHを含むエンドソープおよび/またはリソソームのような細胞器官への細分化の結果である場合もある。
より好ましくは、Lは結合である。
また、好ましくは、Lは1乃至20個の炭素原子、並びにO、SおよびNから選択される1乃至12個のヘテロ原子を含む、置換基を有していてもよいヘテロアルキル基であり、好ましい置換基は=OおよびNH2である。
より好ましくは、Lは-S-S-基を含むか、またはPep若しくはAと共に-S-S-基を形成する。
さらに好ましくは、Lは、式-S-CH2-CH2-O-C(=O)-、-S-CH2-CH(NH2)-C(=O)-および/若しくは-N-CH(CO2H)-CH2-S-で表される基、並びに/または、好ましくはアスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、リシン、アルギニン、オルニチンおよびこれらの組合せから選択されるアミノ酸から成る群から選択された、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド含む。
【００４９】
また、好ましくは、Lは、US2010/0004276、EP2481427、WO2006/012527およびWO2008/112873に記載されているリンカーであり、これらすべてのリンカーは本願明細書中に組み込まれている。特に好ましくは、Lは、EP2481427A1の段落[0039]から[0132]、およびクレーム6からクレーム12までに記載されているリンカーから選択される。
【００５０】
特に好ましくは、Lは結合であるかまたは下記の基から選択される。
-CH2-CH2-S-;
-O-CH2-CH2-S-;
-NH-CH2-CH2-S-; または
-NH-NH-C(=O)-O-CH2-CH2-S-
好ましくは、下記の基においては、Lの左側がAと結合し、かつ右側がPepに結合している。特に好ましくは，基Lの硫黄原子がPepのシステイン側鎖の硫黄原子に結合している。
【００５１】
特に好ましくは、Lは下記の基から選択される。
【００５２】
【化１２】
2015531794.tif 000013
好ましくは、基中、Lの左側がAと結合し、かつ右側がPepと結合している。
【００５３】
好ましくは、Pepは下記のものから選択された基(ペプチド残基)である：
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(Palmitoyl-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
Ac-Tyr-Pro-Ser-Lys(Palmitoyl-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
Palmitoyl-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-Lys(Palmitoyl-Glu)-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Lys(Palmitoyl-Glu)-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(XL-β-Ala-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(XL-β-Ala)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(XL)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH-XL; および
XL-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NHzであり、XLはLとの結合点を表す。
【００５４】
さらに好ましくは、Pepは下記のペプチド(PepX)である：
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2(PepX, SEQ ID NO: 1)
上記ペプチドにおいて、位置18(Ala)、22(Ser)および26(His)のうちの１、２、または３(好ましくは１)は、他のアミノ酸、好ましくは天然のアミノ酸、特にリシン(Lys)、オルニチン(Orn)およびグルタミン(Gln)によって置換されていてもよく(PepY、 SEQ ID NO: 2をも参照)、
Pepの1個の水素原子はLまたはLとの結合によって置換さている。
【００５５】
好ましい実施態様によれば、Pepの1個または2個以上の水素原子は、例えば、パルミトイルまたはアセチル等のアシル基に置換されていてもよい。
好ましくは、アシル基は、式-CO-C1-20アルキル、-CO-C5-20アルケニルで表される基または式-CO-ヘテロアルキルで表される基であり、ヘテロアルキル基は、1個乃至25個の炭素原子、並びにO、SおよびNから選択される、1個乃至6個のヘテロ原子を含む。このヘテロアルキル基は、好ましくは、置換されていてもよい(例えば、1個乃至2個以上の＝O基および/または1個乃至2個以上のNH2基)。
【００５６】
より好ましくは、Pepの1個または2個以上の水素原子は、ポリエチレングリコール(PEG化)、ポリグルタミン、プロリン-アラニン-セリン重合体(PAS化)およびヒドロキシエチルデンプン(HES化)から選択される基と置換されていてもよい。
好ましくは、ポリエチレングリコールは、分子量が100乃至2.000Daである。
【００５７】
特に好ましくは、Pepがリシンを含有し、このリシンの側鎖が、その窒素原子において、式H-βAla-βAla-、H-Cys-βAla-、H-Cys-、パルミトイル-Cys-またはパルミトイル-Cys-βAla-で表される基によって置換されている。この場合、LまたはLとの結合によって置換される水素原子が、その基の水素原子、特にシステインのSH基の水素原子であることが好ましい。
【００５８】
Pepが下記のペプチド(PepX)であることがより好ましい：
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2(PepX, SEQ ID NO: 1)；このペプチドにおいて、1個の水素原子がLまたはLとの結合によって置換される。
【００５９】
Pepが、1個の水素原子がLまたはLとの結合によって置換され、これとは別の1個または2個以上の水素原子が、例えば、パルミトイルまたはアセチルのようなアシル基によって置換されるペプチドPepXであることがより好ましい。
【００６０】
Pepが、1個の別の水素原子がLまたはLとの結合によって置換され、これとは別の1個の水素原子がポリエチレングリコール(PEG化)、ポリグルタミン酸塩、プロリン-アラニン-セリン重合体(PAS化)およびヒドロキシエチル・デンプン(HES化)から選択される基によって置換されるペプチドPepXであることが、さらに好ましい。
【００６１】
下記の式(III)を有する化合物、またはその薬理学的に許容可能な塩、溶媒和物若しくは水和物、または薬理学的に許容可能なそれらの組成物が最も好ましい。
【００６２】
【化１３】
2015531794.tif 000014
上記式（III）において、
R2はC1-C6アルキル(特にCH3、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、n-ペンチル若しくはn-ヘキシル)、CH2Ph、CH2OC1-C6-アルキル(特にCH2OCH2CH3若しくはCH2OCH2CH(CH3)2)、CH2OCOC1-C6-アルキル、CH2CONHC1-C6-アルキル、CH2OCOCH2PhまたはCH2OCOPhを表し; 
R3はH、OAｃまたはO-C1-C6-アルキル（特にOpr)を表し;
R5はCH3またはHを表し;
R6は-CO-を表し;
R14はH、F、OH、NH2、CH3、OMeまたはPhを表し;
Lは下記の基
-O-CH2-CH2-S-、
-NH-CH2-CH2-S-、
-NH-NH-C(=O)-O-CH2-CH2-S-、
から選択される基を表し、
上記式(II)において、
基Lの硫黄原子がPepと結合しており；且つ
Pepは下記の構造から選択され： 
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(palmitoyl-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-Lys(palmitoyl-Glu)-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Lys(palmitoyl-Glu)-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Lys(palmitoyl-Glu)-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
acetyl-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2: または
palmitoyl-βAla-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys(XL)-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2;
XLがLとの結合を表すか；または
上記式(II)において、
Lが結合を表し；且つ
Pepが
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(XL-βAla-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-AlaGlu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2を表す。
【００６３】
用語「アルキルまたはアルク」とは、好ましくは1個乃至20個の炭素原子、より好ましくは1個乃至12個の炭素原子、最も好ましくは1個乃至6個の炭素原子を有する、飽和の、直鎖または分岐の、置換基を有していてもよい炭化水素基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、n-ブチル、sec-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、2，2-ジメチルプロピル、2-メチルブチル、n-ヘキシル、2，2-ジメチルブチルまたは2，3-ジメチルブチルを意味する。
【００６４】
用語「アルケニルおよびアルキニル」は、好ましくは2個乃至20個の炭素原子、より好ましくは2個乃至12個の炭素原子、最も好ましくは2個乃至6個の炭素原子を含む、少なくとも部分的に不飽和の、直鎖または分岐の、置換基を有していてもよい炭化水素基、例えば、エテニル、アリル、アセチレニル、プロパルギル、イソプレニル、またはヘクス-2-エニルを意味する。好ましくは、アルケニル基は1個または2個の、最も好ましくは1個の二重結合を含み、アルキニル基は1個または2個の、最も好ましくは1個の三重結合を含む。
【００６５】
任意に、用語「アルキル、アルケニルおよび/またはアルキニル」は、1個または数個、好ましくは1個、2個若しくは3個の水素原子が、ハロゲン原子、好ましくはフッ素若しくは塩素、2、2、2，-トリクロルエチルまたはトリフルオロメトキシ基によって置換される基を意味する。
【００６６】
用語「ヘテロアルキル」は1個または2個以上の、好ましくは1個、2個または3個の炭素原子が、O、N、P、B、Se、Si、またはS原子、好ましくはO、SまたはNによって置換された、アルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を意味する。用語「ヘテロアルキル」もまた、カルボン酸またはカルボン酸から誘導される基、例えば、アシル（アルキル-CO)、アシルアルキル、アルコキシカルボニル、アシルオキシ、アシルオキシアルキル、カルボキシアルキルアミドまたはアルコキシカルボニルオキシを意味する。
【００６７】
ヘテロアルキル基の例としては、式Ra-O-Ya-,Ra-S-Ya-, Ra-N(Rb)-Ya-, Ra-CO-Ya-, Ra-O-CO-Ya-, Ra-CO-O-Ya-, Ra-CO-N(Rb)-Ya-, Ra-N(Rb)-CO-Ya-, Ra-O-CO-N(Rb)-Ya-, Ra-N(Rb)-CO-O-Ya-, Ra-N(Rb)-CO-N(Rc)-Ya-, Ra-O-CO-O-Ya-, R-N(Rb)-C(=NRd)-N(Rc)-Ya-, Ra-CS-Ya-, Ra-O-CS-Ya-, Ra-CS-O-Ya-, Ra-CS-N(Rb)-Ya-, Ra-N(Rb)-CS-Ya-, Ra-O-CS-N(Rb)-Ya-, Ra-N(Rb)-CS-O-Ya-, R-N(Rb)-CS-N(Rc)-Ya-, Ra-O-CS-O-Ya-, Ra-S-CO-Ya-, Ra-CO-S-Ya-, Ra-CO-S-Ya-, Ra-S-CO-N(Rb)-Ya-, Ra-N(Rb)-CO-S-Ya-, Ra-S-CO-O-Ya-, Ra-O-CO-S-Ya-, Ra-S-CO-S-Ya-, Ra-S-CO-Ya-, Ra-CS-S-Ya-, Ra-CS-S-Ya-,  Ra-S-CS-N(Rb)-Ya-, Ra-N(Rb)-CS-S-Ya-, Ra-S-CS-O-Ya-, Ra-O-CS-S-Ya-で表される基であり、上記式において、RaはH、 C1-C6-アルキル、C2-C6-アルケニルまたは C2-C6-アルキニル基； RbはH、C1-C6-アルキル、C2-C6-アルケニルまたはC2-C6-アルキニル基；RcはH、C1-C-アルキル、C2-C6-アルケニルまたはC2-C6- アルキニル基；RdはH、C1-C6-アルキル、C2-C6-アルケニルまたはC2-C6-アルキニル基、Yaは直接ボンディング、C1-C6-アルキレン、C2-C6-アルケニレンまたはC2-C6-アルキニレン基であり、それぞれのヘテロアルキルを炭素原子によって置換可能であり，1個または数個の水素原子をフッ素または塩素原子によって置換可能である。ヘテロアルキル基の例としては、メトキシ、トリフルオロメトキシ、エトキシ、n-プロピロキシ、イソ-プロピロキシ、t-ブチロキシ、メトキシメチル、エトキシメチル、メトキシエチル、メチルアミノ、エチルアミノ、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、イソ-プロピルエチルアミノ、メチル-アミノメチル、エチルアミノエチル、ジイソ-プロピルアミノエチル、エノールエーテル、ジメチルアミノメチル、ジメチルアミノエチル、アセチル、  プロピオニル、ブチルオキシ、アセチルオキシ、メトキシカルボニル、エトキシーカルボニル、N-エチル-N-メチルカルバモイル、N-メチルカルバモイルなどが挙げられる。ヘテロアルキル基のその他の例としては、ニトリル、イソ二トリル、シアネート、チオシアネート、イソシアネート、イソチオシアネートおよびアルキルニトリルが挙げられる。
【００６８】
用語「シクロアルキル」は3個乃至14個の環炭素原子、好ましくは3個乃至10個、より好ましくは3個、4個、5個、6個または7個の環炭素原子を含む1個または数個、好ましくは1個または2個の環から成る、飽和または部分不飽和(例えば、シクロアルケニル)の、置換基をゆうしていてもよい環状基を意味する。用語「シクロアルキル」はまた、1個または2個以上の水素原子がF、Cl、Br、I、OH、=O、SH、=S、NH2、=NHまたはNO2によって置換されている基、または、例えば、シクロヘキサノン、2-シクロヘキサノンまたはシクロペンタノン等の環状ケトンを意味する。シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンテニル、素ピロ[4、5]-デカニル、ノルボルニル、シクロヘキシル、シクロペンテニル、シクロヘキサジエニル、デカリニル、クバニル、ビシクロ[4．3．0]ノニル、テトラリン、シクロペンチルシクロヘキシル、フルオルシクロヘキシルまたはシクロヘクス-2-エニル基が挙げられる。
【００６９】
用語「ヘテロシクロアルキル」は、1個または数個、好ましくは1個、2個または3個の環炭素原子がO、N、Si、Se、P、またはS、好ましくはO、SまたはNによって置換されている、上述したシクロアルキルを意味する。好ましくは、ヘテロシクロアルキル基は3個乃至10個の、特に、3個、4個、5個、6個または7個の環原子を含む1個または2個の環から構成されている。用語「ヘテロシクロアルキル」はまた、1個または数個の水素原子がF、Cl、Br、I、OH、=O、SH、=S、NH2またはNO2によって置換されている基をも意味する。ヘテロシクロアルキルの例としては、ピペリジル、モルホリニル、ウロトロピニル、ピロリジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロ-フリル、オキサシクロプロピル、アザシクロプロピルまたは2-ピラゾリニル基のほか、ラクタム、ラクトン、環状イミドおよび環状無水物が挙げられる。
【００７０】
用語「アルキルシクロアルキル」はシクロアルキルのほか、先に定義したアルキル基、アルケニル基またはアルキニル基を有する基を意味し、例えば、アルキルシクロアルキル、アルキルシクロアルケニル、アルケニルシクロアルキルおよびアルキニルシクロアルキルを意味する。好ましくは、アルキルシクロアルキル基は3個乃至10個、特に3個、4個、5個、6個または7個の炭素原子を含む1個または2個以上の環を含むシクロアルキル基と、1個または2個乃至6個の炭素原子を含む1個または2個のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基とで構成される。
【００７１】
用語「ヘテロアルキルシクロアルキル」は1個または数個、特に、1個、2個または3個の炭素原子がO、N、Si、Se、PまたはS、特にO、SまたはNによって置換されている、先に定義したアルキルシクロアルキル基を意味する。好ましくは、3個乃至10個、特に3個、4個、5個、6個または7個の環原子を含む1個または2個の環系と、1個または2個乃至6個の炭素原子を含む1個または2個のアルキル基、アルケニル基、アルキニル基またはヘテロアルキル基とで構成される。このような基の例としては、アルキルヘテロシクロアルキル、アルキルヘテロシクロアルケニル、アルケニルヘテロシクロアルキル、アルキニルヘテロシクロアルキル、ヘテロアルキルシクロアルキル、ヘテロアルキルヘテロシクロアルキルおよびヘテロアルキルヘテロシクロアルケニルが挙げられ、これらの基において、環状基は飽和状態にあるかまたは部分的に(分かり易く言えば、2倍または3倍に)不飽和化される。
【００７２】
用語「アリール」または「ar」は、6個乃至14個、好ましくは6個乃至10個、好ましくは6個の炭素原子を含む1個または数個の環で構成された、置換基を有していてもよい芳香族基を意味する。用語「アリール」または「ar」はまた、1個または数個のH原子がF、Cl、Br若しくはI、OH、SH、NH2またはNO2によって置換された、芳香族基を意味する。例としては、フェニル-、ナフチル-、ビフェニル-、2-フルオロフェニル、アニリニル-、3-ニトロフェニルまたは4-ヒドロキシ-フェニルが挙げられる。
【００７３】
用語「ヘテロアリール」は、5個乃至14個の、好ましくは5個乃至10個の環原子を含み、そのうちの1個または数個、好ましくは、1個、2個、3個または4個の環原子がO、N、PまたはS、特にO、SまたはNである、1個または数個の環で構成された芳香族基を意味する。用語「ヘテロアリール」はまた、1個または数個のH原子が    F、Cl、BrまたはIまたはOH、SH、NH2またはNO2によって置換される基を意味する。例としては、4-ピリジル、2-イミダゾリル、3-フェニルピロリル、チアゾリル、オキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソオキサゾリル、インダゾリル、インドリル、ベンズイミダゾリル、ピリダジニル、キノリニル、プリニル、カルバゾリル、アクリジニル、ピリミジル、2、3’-ビフリル、3-ピラゾリルおよびイソキノリニルが挙げられる。
【００７４】
用語「アラルキル(またはアリールアルキルまたはアルキルアリール)」は、アリールとアルキル、アルケニル、アルキニルおよび/またはシクロアルキルとから構成される基、例えば、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、アリールシクロアルキル、アリールシクロアルケニル、アルキルアリールシクロアルキルおよびアルキルアリールシクロアルケニルなどを意味する。アラルキルの例としては、トルール、キシロール、メシチレン、スチレン、ベンジルクロライド、o-フルオロトルエン、1H-インデン、テトラリン、ジヒドロナフタリン、インダノン、フェニルシクロペンチル、クメン、シクロ-ヘキシルフェニル、フルオレンおよびインダンが挙げられる。好ましくは、アラルキル基は6個乃至10個の環炭素原子と1個または2個乃至6個の炭素原子を含む1個または2個のアルキル、アルケニルおよび/またはアルキニルおよび/または5個または6個の環炭素原子を含む1個のシクロアルキルとで構成される。
【００７５】
用語「ヘテロアラルキル(またはヘテロアリールアルキルまたはヘテロアルキルアリール)」は、1個または数個の、好ましくは1個、2個、3個または4個の炭素原子がO、N、Si、Se、P、BまたはSによって、好ましくはO、NまたはSによって置換された、先に定義したアラルキル基を意味し、且つアリール、ヘテロアリール並びにアルキル、アルケニル、アルキニル、および/またはヘテロアルキルおよび/またはシクロアルキルおよび/またはヘテロシクロアルキルを含む基をも意味する。好ましくは、ヘテロアラルキル基は5個または6個乃至10個の炭素原子を含む1個または2個の芳香環系と、1個または2個乃至6個の炭素原子を含む1個若しくは2個のアルキル、アルケニルおよび/または1個若しくは2個乃至6個の炭素原子を含むアルキニルおよび/または5個若しくは6個の環炭素原子を含む1個のシクロアルキルとで構成され、1個、2個、3個または4個の炭素原子はO、NまたはSによって置換されていてもよい。
【００７６】
例としては、アリールヘテロアルキル、アリールヘテロシクロアルキル、アリールヘテロシクロアルケニル、アリールアルキルヘテロシクロアルキル、アリールアルケニルヘテロシクロアルキル、アリールアルキニルヘテロシクロ-アルキル、アリールアルキルヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロアリールヘテロアルキル、ヘテロアリールシクロアルキル、ヘテロアリールシクロアルケニル、ヘテロアリールヘテロシクロアルキル、ヘテロアリールヘテロシクロアルケニル、ヘテロアリールアルキルシクロアルキル、ヘテロアリールアルキルヘテロシクロアルケニル、ヘテロアリールヘテロアルキルシクロアルキル、ヘテロアリールヘテロアルキルシクロアルケニルおよびヘテロアリールヘテロアルキル。但し、環状基は飽和であってもよいし、既に不飽和にあるか、2倍、3倍または4倍に不飽和化処理してもよい。例としては、テトラヒドロイソキノリニル、ベンゾイル、2-または3-エチルインドリル、4-メチルピリジン、2-、3-または4-メトキシフェニル、4-エトキシフェニル、2-、3-または4-カルボキシフェニルアルキルが挙げられる。
【００７７】
用語「シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アルキルシクロアルキル、ヘテロアルキルシクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、アラルキルおよびヘテロアラルキル」はまた、1個または数個のH原子がF、Cl、Br若しくはIまたはOH、SH、NH2、NO2によって置換されている基を意味する。
【００７８】
「置換基を有していてもよい」という表現は、1個または数個のH原子がF、Cl、Br若しくはIまたはOH、=O、SH、=S、NH2、=NHまたはNO2によって置換可能な基を意味する。この表現は、更に、非置換の、C1-C6アルキル基、C2-C6アルケニル基、C2-C6アルキニル基、C１-C6ヘテロアルキル基、C3-C10シクロアルキル基、C2-C9ヘテロシクロアルキル基、C6-C10アリール基、C1-C9ヘテロアリール基、C7-C12アラルキル基またはC2-C11ヘテロアラルキル基と、排他的にまたは追加的に置換可能な基を意味する。
【００７９】
保護基は当業者に公知であり、P. J. Kocienski, Protecting Groups, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1994 およびT. W. Greene, P. G. M. Wuts, ProtectiveGroups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1999に記載されている。公知のアミノ保護基としては、例えば、t-ブチルオキシカルボニル(Boc)、ベンジルオキシカルボニル(Cbz)、ベンジル(Bn)、ベンゾイル(Bz)、フルオレニルメチルオキシカルボニル(Fmoc)、アリルオキシカルボニル(Alloc)、トリクロロエチルオキシカルボニル(Troc)アセチルまたはトリフルオロアセチルが挙げられる。
【００８０】
ここに述べる化合物はその置換パターンに応じて数個のキラル中心を含む。本発明は既に定義済みのすべての鏡像-および非鏡像-異性体、およびあらゆる比率でのその混合物に関わる。本発明はまた、ここに述べる化合物のあらゆるシス/トランス異性体およびその混合物にも関わる。さらに、本発明はここに述べる化合物のあらゆる互変異性型に関わる。
【００８１】
ここに述べる化合物の薬理的に許容できる塩の例としては、生理的に許容できる鉱酸、例えば、塩酸、硫酸、リン酸の塩、または有機酸、例えば、メタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、乳酸、ギ酸、トリフルオロ酢酸、クエン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸およびサリチル酸の塩などが挙げられる。ここに述べる化合物は溶媒和、特に水和することができる。水和は合成の過程で起こるか、または当初は乾燥状態にあった化合物の吸湿性の結果として起こる可能性がある。上述の通り、不斉炭素原子を含む、ここに述べる化合物はジアステレオマーの混合物として、または鏡像異性体の混合物として、または光学的に純粋な化合物として存在する可能性がある。
【００８２】
本発明の医薬組成物は、ここに述べる化合物の少なくとも１つと、随意に選択される担体および/またはアジュバントから成る。
【００８３】
プロドラッグもまた本発明の主題であり、ここに述べる化合物と、生理的条件下で分子開裂する少なくとも１つの薬理的に許容できる保護基、例えば、アルコキシ、アラルキルオキシ、アシルまたはアシルオキシ、より正確には、エトキシ、ベンジルオキシ、アセチルまたはアセチルオキシとから構成される。
【００８４】
ここに述べる化合物、その薬理的に許容できる塩および/または溶媒和物および水和物、さらには、目的に応じた組成物、並びに薬理的組成物の治療上の使用もまた本発明の主題である。
【００８５】
癌治療ドラッグの調製を目的にここに述べる化合物を利用することも本発明の主題である。さらに、この化合物はリュウマチ性関節炎、炎症性疾患(例えば、I型糖尿病)、自己免疫疾患、眼疾患、例えば、AMD(加齢に関係する黄斑疾患)または糖尿病性網膜症、その他の腫瘍性疾患の予防および/または治療のほか、例えば、ステントのようなプラスチックおよび金属製インプラントの表面処理(含浸)にも有用である。
【００８６】
より具体的には、ここに述べる化合物は癌、特に、NPY-1受容体が過剰発現するタイプの癌、例えば、乳癌、特に、転移性乳癌のほか、ユーイング肉腫、腎細胞癌、消化管間質腫瘍、腎芽細胞腫、神経芽細胞腫瘍、傍神経節腫、クロム親和性細胞腫、副腎皮質腫瘍、卵巣性索腫瘍、および卵巣腺癌のような他の癌疾患の治療にも有用である。
【００８７】
一般に、ここに述べる化合物は、一回だけの処置にも複数回の治療の使用でき、いずれの場合にもこの化合物単独で、または公知の許容される方式で任意の治療剤と組み合わせて使用され、また、有効成分を、例えば移植可能なヒドロゲルのようなマトリックスに埋め込む持続治療の形で使用することもできる。
【００８８】
本発明の組成物は以下に述べる方式のいずれかで投与することができる：溶液、エマルションまたは懸濁液；注射剤などの非経口投与；粉末剤吸入または経皮または鼻孔スプレー。溶液およびシロップの調製には、例えば、水、アルコール、食塩水、含水デキストラン、ポリオール、グリセリン、植物油、石油、動物油または合成油のような担体を使用すればよい。坐薬の調製には、例えば、植物油、石油、動物油または合成油、ワックス、脂質およびポリオールのような賦形剤を使用することができる。エアロゾルの調製には、例えば、酸素、窒素、希ガス、二酸化炭素のような、この目的に適した圧縮ガスを使用することができる。調剤に有用な物質としては、保存用添加剤、例えば、UVスタビライザーのような安定化剤、乳化剤、甘味料、芳香剤、浸透圧調整のための塩、緩衝剤、コーティング添加剤および酸化防止剤も含まれる。
【００８９】
他の治療剤との組合せには、上述した疾病、特に癌幅治療に広く使用されるさらに他の治療剤も含むことができる。
【００９０】
式(I)、(II)およびの(III)の化合物は、公知の結合試薬、例えば、ヒドロキシベンゾトリアゾール(HOBt)およびジイソプロピルカルボジイミド(DIC)またはジシクロヘキシルカルボジイミド(DCC)のような公知の結合試薬を使用することでペプチド結合法を介してリンク可能な構成要素から製造することができる。
【００９１】
チューブリシンおよびその誘導体は当業者には公知であり、例えば、WO2008/138561、WO2004/046170、WO2004/005327、WO2011/057806、WO2011/057805およびこれらに引用されている文献に記載さているように調製することができる。   
【００９２】
エポチロンおよびその誘導体は当業者には公知であり、Nicolaou et al. Angew. Chem. Int. Ed. 1998、37、2014-2045、WO2004/007492、WO2004/048372およびこれらに引用されている文献に記載されているように調製することができる。
【実施例】
【００９３】
構成要素A、LおよびPepから下記の誘導体を合成した。当業者に公知の方法に従って構成要素を合成した。
【００９４】
Pepの自動化固相ペプチド合成
自動マルチプル固相ペプチド合成装置Syro II(マルチシンテック社、ボーフム、ドイツ)を使用し、Fmoc/tBu法に従ってペプチドを合成した。C-末端ペプチド・アミドを得るため、ローディング能力が0.63mmol/gのリンクアミド樹脂を使用した。
【００９５】
それぞれのアミノ酸結合工程に先立って、塩基に不安定なNa-保護基Fmocを構成要素から分子開裂させる必要があり、第1工程においてもリンクアミド樹脂から分子開裂させる必要があった。Fmocを分子開裂させるため、ピペリジンのDMF溶液(40％v/v)を樹脂に加え、攪拌しながら3分間インキュベートした。ピペリジンのDMF溶液(20％v/v)400mLで10分間に亘り脱保護処理を繰り返した。次いで、4´600mLのDMFで樹脂を洗浄した。
【００９６】
アミノ酸構成要素溶液200mL(DMF中0.5モル)とオキシマの3モルDMF溶液100mLで2分間、樹脂を前インキュベートすることによってアミノ酸を結合させた。次いで、DICの3.3モルDMF溶液100mLを加えることによって、攪拌しながら反応させた。800mLのDMFで洗浄した後、それぞれのアミノ酸について1回ずつ結合工程を繰り返した。
【００９７】
Dde-保護されているリシン残渣を選択的に脱保護するため、完全保護されている樹脂結合ペプチドを、調製したばかりのヒドラジンの3％DMF溶液1mL溶液で12´10分間インキュベートした。各１２工程後、樹脂をDMFで洗浄した。第1および第12工程後、取り除いたヒドラジン溶液を回収し、その吸着を、調製したばかりのヒドラジンDMF溶液を比較基準として301nmにおいて測定した。10分の1画分の吸着が<0.1ならばDde脱保護は成功であった。
【００９８】
分析および調製を目的とする樹脂からの分子開裂
分析を目的に、少量のペプチドを有する樹脂をTFA/チオアにソール/1、2-エタンジチオール(900：70：30v/v)と共に室温で3時間インキュベートして、酸に不安定な保護基をすべて除去した。次いで、ペプチドを、1mLの氷冷ジエチルエーテル中で20分間、−20°Cの温度において沈殿させ、遠心分離処理(7，000g、2分間)によって回収し、氷冷ジエチルエーテルで少なくとも5回洗浄した。ペプチド・ペレットを乾燥させ、最終的には分析のため100mLのH2O/tBuOH(1：3v/v)中に溶解させた。
【００９９】
調製上の分子開裂を目的とした場合にも、樹脂全体を上記のように処理した。但し、沈殿は10mLの氷冷ジエチルエーテル中で行われ、遠心分離処理は4，400gで実施した。SpeedVac(スピードバック、商品名)を使用してペプチドを乾燥させ、最後に、1−2 mLのH2O/tBuOH(1:3  v/v)から凍結乾燥させた。
【０１００】
分析のためのRP-HPLC(逆相高速液体クロマトグラフィー)
逆相の分析用RP-HPLCによる合成ペプチドの分析には、Phenomenex Jupiter Proteo C18 カラム(4.6mm´250mm、5mm)と、(A)TFAの0.1％水溶液と(B)TFAの0.08％ACN溶液とから成る溶離系とを使用した。流量0.6 mL/min-1で40minに亘って溶剤BがAに対して20〜70％の直線勾配を呈するようにした。220nmにおいてペプチドが検出された。
【０１０１】
調製のためのRP-HPLC
合成ペプチドの精製は、(A)TFAの0.1％水溶液と(B)TFAの0.08％ACN溶液から成る溶離系を使用し、流量10 mL/min-1で40−50 minに亘って溶剤BがAに対して適当な直線勾配を呈するようにしたPhenomenex Jupiter Proteo C18 カラム(4.6 mm ´ 250 mm、5 mm)における調製用RP-HPLCによって達成された。ペプチド検出のため、220 nmにおける吸着を測定した。複数の画分を手動で採取し、MALDI-TOF質量分析と分析用RP-HPLCによって分析した。純粋であると識別された画分を一体化し、凍結乾燥した。
【０１０２】
MALDI-TOF(マトリックス支援レーザー脱離イオン化法)質量分析
MALDI-TOF質量分析法による質量分析には、2、5-ジヒドロキシ安息香酸、2-ヒドロキシ-5-メトキシ安息香酸および2-ヒドロキシ-5-メトキシ安息香酸(10g/L中に、CAN/H2O/TFAが50:49.7:0.3(v/v))から成るマトリックスを使用した。MALDIの測定にはBruker Daltonis Ultraflex III TOF/TOFを使用した。
【０１０３】
ESI ION Trap(エレクトロスプレイイオン化)質量分析
ESI ION Trap質量分析法による質量分析に際しては、サンプルをACNを含むH2O中に20mM(0.1％HCOOH)となるようにで希釈し、注入し、分析した。水とACNとの混合比は7：3（v/v)であった。ESIの測定にはBrukerのHCT質量測定器を使用した。
【０１０４】
ジスルフィド・リンケージを介した構成要素A-LとPepとの結合
ジスルフィド・リンケージを介してOC169、OC504、OC505、OC506をK4(βAla-Cys)-[F7 P34]-NpYと結合させるため、精製ペプチドをセーレンセン(pH 6.0)による0.1mMリン酸塩緩衝液に溶解させ、アルゴンを使用して脱気処理した。カップリング反応は(A-Lおよびペプチド)等モル条件下、室温で進行させた。60分後、反応が完結し、MALDI-TOP質量分析によって生成物の実体が確認された。生成物を調製用RP-HPLCによって直ちに精製した。
【０１０５】
ペプチド・リンケージを介した構成要素A-LとPepとの結合
ペプチド・リンケージを介してOC501またはOC503をK4(βAla-βAla)Cys-[F7、P34]-NPYまたは[K4、F7、P34]に結合させるため、上述のリシン残基の選択的脱保護の後、上述したように標準的なアミド結合を採用した。カップリング反応は室温において(A-Lおよびペプチド)等モル条件下、室温において進行させた。次いで、最終生成物を樹脂から分子開裂させた。MALDI-TOP質量分析によって生成物の実体が確認された。生成物を調製用RP-HPLCによって直ちに精製した。
【０１０６】
機能的受容体活性化(シグナル変換)
NPY-誘導体であるペプチド-ドラッグ複合体がhY1Rを機能的に活性化できるか、さらには軽度ながらhY2Rをも機能的に活性化できるかを評価するため、2つの異なるタイプの試験を実施した。即ち、機能的IP3二次メッセンジャー試験と機能的リポーター遺伝子試験を実施した(cAMP応答要素-CREを使用)。
【０１０７】
IP3二次メッセンジャー分析では、EYFPとC-末端融合しているヒトY1受容体およびEYFPとC-末端融合しているヒトY2受容体を符号化するcDNAで安定的に形質変換しているCos-7細胞およびキメラGタンパク質GaD6qi4myr(Cos 7_hY1R_EYFP_GaD6qi4myrおよびCos 7_hY2R_EYFP_GaD6qi4myr)を24ウェル-プレートに播種した。播種の24時間後、細胞を3H-myo-イノシトール(それぞれのウェルに300mLDMEM/0.6mL3H-ミオ-イノシトール)と共に16時間培養した。次いで、細胞培養地を取り除き、10 mMのLiClを含有する500mLのDMEMで細胞を洗浄した。1時間後、10mMLiClを含有するDMEM中のペプチド濃度を変化させながら(10−５乃至10−１２)刺激処理した。リン酸３H-イノシトールが蓄積された。刺激処理後、150mL、0.1 NのNaOHで5分間、サンプルを加水分解した。50mLの0.2Mギ酸を添加することによって中和処理を実施した。次いで、サンプルをIP希釈緩衝液で希釈し、ピペットで細胞ペレットを取り除いた。陰イオン交換クロマトグラフィーでリン酸3H-イノシトールを分離した。
【０１０８】
それぞれEYFPとC-末端融合するヒトY1 受容体およびY2 受容体を符号化するcDNAおよびCREレポーター・ベクトルpGL4.29(Promega社、マンハイム、ドイツ)をCHO細胞に同時遺伝子導入することによってCREリポーター遺伝子試験を実施した。このため、2．5．10６CHO細胞を25cm2の細胞培養フラスコに播種し、一晩に亘って付着させた。次いで、10mgのhYxRベクトル、2mgのpGL4.29 レポーター・ベクトルおよび25mLメタフェクテン商標プロトランスフェクチオン試薬(Biontex Laboratories 社、マルチンリート、ドイツ)を使用して、培養フラスコごとに細胞の共形質変換を実施した。標準的な増殖条件下でのPBS(リン酸塩緩衝生理食塩水)での3時間の形質変換の後、形質変換された溶液を廃棄し、形質変換された細胞を剥がし、白色/透明な底を有する96-ウェル・プレート(50、000個の細胞/ウェル)に播種した。受容体およびリポーター遺伝子の発現を可能にするため、標準的な増殖条件下で細胞を４８時間培養した。次いで、細胞を、10−６Mホルスコリン(環状アデノシン-リン酸を高めるためのアデ二リルシクラーゼ)および10-１１-10−５Mのペプチド/研究中のペプチド-ドラッグ複合体(活性化hYxのGai-媒介シグナル変換によるcAMPレベルの低下)と共刺激処理した。37°Cで6時間刺激処理した後、培養基を取り除き、60mL/96-ウェル分のPromega’s ONE-GloTM試薬(DMEM中1：1、v/v)を添加した。室温で10分間培養した後、Synergy2多ウェル・プレート・リーダー(バイオテック社、バート・フリードリッヒシャル、ドイツ)を使用してリポーター遺伝子による発光信号を測定した。
【０１０９】
内在化の考察
EYFP(HEK293_hY1_EYFP)とC-末端融合するヒトY1受容体およびEYFPとC-末端融合するヒトY2受容体で安定的に形質変換させたHEK293細胞とHAタグ(HEK293_HA_hY2_EYFP)を、無菌m-スライド8ウェル-プレート(イビジ社、マルチンスリート、ドイツ)に播種し、80％の密集度に達するまで培養した。リガンド刺激処理の前に、30分間に亘ってOptiMEM中で細胞を培養した。細胞核をHOECHST 33342で着色した。NPYの1mM OptiMEM溶液で60分間、37℃で刺激処理した。Axio Observer顕微鏡およびApoTome撮像システム(ツァイス社、イエナ、ドイツ)で生細胞の画像を得た。ツァイス社のAxio Viosionソフトウエアリリース3.0で蛍光画像を分析した。
【０１１０】
チューブリン・ネットワークの不安定化
EYFP(HEK293_hY1_EYFP)とC-末端融合するヒトY1受容体およびEYFPとC-末端融合するヒトY2受容体で安定的に形質変換させたHEK293細胞とHAタグ(HEK293_HA_hY2_EYFP)を、無菌m-スライド8ウェル-プレート(イビジ社、マルチンスリート、ドイツ)に播種し、37°Cの温度で培養した。pTub_ECFP_C1(各ウェルに1 mgのDNA、各ウェルに1 mLのリポフェクタミン2000、37°Cで60分間に亘って形質変換)。一晩かけてTubulin_ECFPを発現させた。翌日、OptiMem中で16時間に亘ってOC500または遊離細胞溶解素で細胞を刺激した。Axio Observer顕微鏡およびApoTome撮像システム(ツァイス社、イエナ、ドイツ)で生細胞の画像を得た。ツァイス社のAxio Viosionソフトウエアリリース3.0で蛍光画像を分析した。
【０１１１】
緩衝液中での安定性の考察
K4(βAla-Cys-OC169)-F7、P34-NPYを10−４M、pH4およびpH6となるまで0.1 Mのクエン酸塩緩衝液で、また10−４M、pH4となるまで0.2Mの酢酸ナトリウム緩衝液で希釈した。0時間後、1時間後、2時間後、4時間後、6時間後、24時間後、72時間後および96時間後に、ESI質量分析によってペプチドの実体を突き止めた。
【０１１２】
MCF-7(ヒト乳癌細胞)培養上澄み中での安定性の考察
K4(βAla-Cys-OC169)-F7、P34-NPYを10−４Mとなるまで0.1MのMCF-7細胞培養上澄みで希釈し、0時間後、1時間後、3時間後、5時間後、7時間後および24時間後に、ESI質量分析によってペプチドの実体を突き止めた。
【０１１３】
還元環境での安定性の考察
K4(βAla-Cys-OC169)-F7、P34-NPYを10−４M、pH6となるまで、20xシステイン含有0.1Mリン酸塩緩衝液で希釈した。1時間後および24時間後、ESI質量分析によってペプチドの実体を突き止めた。
【０１１４】
細胞増殖試験
化合物の抗増殖および細胞傷害効果を評価するため、蛍光レザズリンに基づく細胞生存率試験を利用した。ヒト癌および非癌細胞種(主として乳癌)を低密度で96-ウェル・プレートに播種し(各ウェルに1，500−20，000細胞)、24時間付着したままとした。次いで、適当な濃度で培養液に溶解させた化合物を細胞に添加し、4−72時間培養した。化合物処理が72時間よりも短い場合には、培養液を廃棄し、細胞を一度細胞培養液でリンスし、72時間に達するまで、化合物無しの培養液中で増殖するに任せた。次いで、培養液を、50mMのレザズリンを含む培養液に替えた後、細胞を2時間培養した。最後に、540nm励起フィルターおよび590 nm 放射フィルターを装備するSynergy2マルチウェル・プレート・リーダー(バイオテック社、バート・フリードリッヒシャル、ドイツ)を使用して、生存能力のある、代謝的に活性の細胞によるレザズリンからレゾルフィンへの変換を測定した。
【０１１５】
細胞自然死試験
市販の発光カスパーゼ・アッセイ(Promega社、マンハイム、ドイツ)を使用して化合物に起因する細胞自然死を試験した。ヒトの癌および非癌細胞株(主として乳癌)を培養時間に応じた密度で96-ウェル・プレート内に播種し(48時間培養の場合には各ウェルに5，000−20，000個の細胞；16−24時間培養の場合には各ウェルに15，000−40，000個の細胞)、24時間付着するに任せた。次いで、適当な濃度にまで培養液に溶解させた化合物を各ウェルに70 mL添加した。標準的な増殖条件下で細胞を16−48時間培養した。培養の最後の1時間に、カスパーゼ活性に細胞個数/細胞生存率を乗算するため、10mL/ウェルの8X レザズリン溶液(400 mM)を添加した。自然死が終了した後、レゾリンのレゾルフィンへの転換を上述の通り測定した。次いで、Promegaのガイドラインに従ってCaspase-Glo試薬を添加し、室温で1時間培養した。Synergy 2マルチウェル・プレート・リーダー(バイオテック社、バート・フリードリッヒシャル、ドイツ)を使用して発光読み出しを実施した。
【０１１６】
細胞核の分裂は進行中の細胞自然死という事象を示すものでもあるから、発明者等はCytoPep複合体が細胞核の分裂を誘発できたのかどうかを検証した。この目的のため、EYFP(HEK293_hY1_EYFP)とC-末端融合するヒトY1受容体およびEYFPとC-末端融合するヒトY2受容体で安定的に形質変換させたHEK293細胞とHAタグ(HEK293_HA_hY2_EYFP)を、無菌m-スライド8ウェル-プレート(イビジ社、マルチンスリート、ドイツ)に播種し、80％の密集度に達するまで培養した。30分間に亘ってOptiMEM中で細胞をOC500または遊離シトリシンで刺激処理した。細胞核をHOECHST 33342で着色した。Axio Observer顕微鏡およびApoTome撮像システム(ツァイス社、イエナ、ドイツ)で生細胞の画像を得た。ツァイス社製のAxio Viosionソフトウエアリリース 3.0で蛍光画像を分析した。
【０１１７】
siRNAの利用によるY 受容体のノックダウン
細胞表面におけるhY1受容体密度に応じた化合物の生物学的効果を検証するため、一時的なNPY1RノックダウンにsiRNAを使用した。特定の標的としてsiGENOME SMARTpool ヒトNPY1R、および、対照例として、siGENOME非標的siRNA pool #2(ダーマコン社、ラファイエット、米国)を使用した。
【０１１８】
24時間後に細胞の形質変換に必要な50％細胞密集度に達するように、ヒトY1受容体発現乳癌細胞株を25 cm２の培養フラスコに播種した。Metafectane Pro(Biontex社)を使用して過渡的なリポソーム細胞の形質変換を実施した。即ち、それぞれの25 cm２培養フラスコにおいて、500mLのPBS中で0−400ピコモルのsiRNAを5分間、室温において前培養し、500mL PBSを溶媒とする32 mLのMetafectene Proとゆっくり混合した。室温で20分間かけて錯体を形成した後、各培養フラスコにおいて、4ｍLの新鮮な培養液(10％ではなく、4−5％のFCS)に形質変換混合物を添加した。
【０１１９】
24時間後に培養を停止し、形質変換した細胞を示すように使用した。細胞の増殖および自然死を観察するため、96-ウェル・プレートに細胞を播種した。受容体の発現レベルを評価するため、細胞を採取し、RNA抽出およびRT-PCRを実施した。
【０１２０】
RT-PCR利用による発現分析
Bio&Sell(ホイヒト社、ドイツ)、RNA Mini KitおよびQiagen’s(ヒルデン社、ドイツ)およびRNeasy Mini Kitによって発現分析用のサンプルを作成し、次いで、RevertAid Premium Reverse Transcriptase(フェルメンタス社、ザンクト・レーオン-ロート、ドイツ)を使用してDNase I 消化ステップおよびcDNA合成を実施した。すべてはメーカーのガイドラインに沿って行われた。最後に、適当なプライマーを使用することによってNPY Y受容体、エストロゲンおよびプロゲステロン受容体などの発現を分析するとともに、通常のPCRのほか、Bio-Rad社(ミュンヘン、ドイツ)のCFX96TMリアル-タイムPCR検出システムを使用して定量的リアルタイムPCR(qPCR)の発現をも分析した。qPCRに関しては、Bio-Rad社のSsoFast EvaGreen Supermixを、メーカーのガイドラインに従って使用した。
【０１２１】
細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識化(SILAC)
化合物を介して起こる細胞中の脱制御現象を検証するのにSILACを使用した。第1段階では、使用した細胞株について、13C-標識付きL-アルギニン(“重”培養基)の摂り込み率を測定した。
【０１２２】
摂り込み率が95％以下である場合、化合物培養 (例えば、24時間)を、未処置の対照細胞に対しては“軽”培養基で開始し、処置済み細胞に対しては“重”培養基で開始した。培養完了後、細胞を採取し、溶解させた。タンパク質の含有量を定量化し、20 mgの“軽”-標識タンパク質抽出物を20 mgの“重”-標識タンパク質抽出物と混合し、12％SDS-PAGEで分離させた。ゲルをカットしてゲル・スライスとし、トリプシンでゲル中に消化させた。ナノ-HPLCと連動させたLTQ Orbitrap Velos(サーモ  サイエンティフィック社)でサンプルを測定した。得られた質量スペック-データをMaxQuantソフトウエアで分析した。基準化比“重”/“軽”を利用して顕著な上方または下方調節タンパク質を同定した (上方調節>1.5；下方調節 < 0.666)。
【０１２３】
データ分析
データ分析にはGraphPad Prism 5.03とLibreOffice Calcを使用した。
【０１２４】
動物異種移植の考察
生体内有効性の検証には、NMRIヌード・マウスにおける皮下ヒト乳癌腫(MDA-MB-468) および皮下ヒトユーイング肉腫(SK-N-MC) 動物異種移植モデルを使用した。5´10６個の腫瘍細胞を接種した(2.5´10７個の細胞/mLを懸濁させた200mLのリン酸緩衝生理食塩水を右脇腹に注射)雌のNMRIヌード・マウス (ジャンビエール社、サン・ベルトバン、フランス)は生後７週間であった。
【０１２５】
それぞれ実験グループを5頭の動物で編成した (未処置の対照グループとOC 化合物で処置済みのグループ)。処置は腫瘍容積〜100mm3(70−130mm3)から開始した。動物の側尾静脈に1−4mmol/kg(無菌PBSを溶媒；投与量5mL/kg)を2週間に亘り、1週間に3回投与した。最終処置後、さらに3週間、動物を観察した。
【０１２６】
調査の対象となったパラメータ−：生残の臨床的兆候、(日々の)動物の挙動、体重、腫瘍の大きさ(1週間に2x)。腫瘍の成長をキャリパー測定でモニターし、
腫瘍の大きさを式W２´L/2(L=長さ、W=腫瘍の垂直方向の幅、L > W)で算出した。
【０１２７】
調査の終わりに剖検を行い、原発腫瘍の正味重量を測定し、血清および腫瘍のサンプを採取した。
【０１２８】
上述の態様でPep1およびPep2を合成した。上記文献に記載されているようにチューブリシン誘導体を調製した。
【０１２９】
Pep 1:
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-βAla-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
算出平均分子量：4397.86
分子式：C201H299N55O57
MS-TOF:4396.1 [M+H]+
【０１３０】
Pep 2(OC502):
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
算出平均分子量：4429.924 
分子式：C201H299N55O57S
MS-ESI: 1108.3  [M+4H]4+; MS-TOF: 4428.2 [M+H]+
【０１３１】
Pep 3(OC522):
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(palmitoyl-Cys-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
算出平均分子量：4668.333 
分子式：C217H329N55O58S 
MS-ESI: 1557.0  [M+H]3+
【０１３２】
Pep 4(OC523): 
H-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-Lys(palmitoyl-Glu)-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
算出平均分子量：4788.48 
分子式：C217H334N54O58S
MS-ESI:1198.1  [M+4H]4+
【０１３３】
Pep 5(OC524):
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Lys(palmitoyl-Glu)-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
算出平均分子量：4680.32 
分子式：C219H333N55O59 
MS-TOF:4678.5  [M+H]+
【０１３４】
Pep6(OC525):
H-Tyr-Pro-Ser-Lys-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Lys(palmitoyl-Glu)-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
算出平均分子量：4664.3 
分子式：C203H301N55O58S 
MS-ESI:778.3  [M+6H]6+
【０１３５】
Pep 7(OC502Ac):
acetyl-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
算出平均分子量：4471.961 
分子式：C203H301N55O58S 
MS-TOF:4470.1  [M+H]+
【０１３６】
Pep 8(OC531)
palmitoyl-βAla-Tyr-Pro-Ser-Lys(H-Cys-βAla)-Pro-Asp-Phe-Pro-Gly-Glu-Asp-Ala-Pro-Ala-Glu-Asp-Leu-Ala-Arg-Tyr-Tyr-Ser-Ala-Leu-Arg-His-Tyr-Ile-Asn-Leu-Ile-Thr-Arg-Pro-Arg-Tyr-NH2
算出平均分子量：4739.41 
分子式：C220H334N56O59S 
MS-TOF:4737.6  [M+H]+
【０１３７】
OC501:
【化１４】
2015531794.tif 000015
算出平均分子量：773.997
分子式：C40H60FN5O7S
MS-ESI:774.6  [M+H]+
【０１３８】
OC169
【化１５】
2015531794.tif 000016
算出平均分子量：942.28
分子式：C47H68FN7O6S3
MS-ESI:942.6  [M+H]+
【０１３９】
OC506
【化１６】
2015531794.tif 000017
算出平均分子量：1001.304
分子式：C48H69FN8O8S3
MS-ESI:501.3  [M+2H]2+; MS-TOF:  999.4  [M+H]+
【０１４０】
OC503:
【化１７】
2015531794.tif 000018
算出平均分子量：756.05
分子式：C41H65N5O6S
MS-ESI:756.4  [M+H]+
【０１４１】
OC504:
【化１８】
2015531794.tif 000019
算出平均分子量：924.332
分子式：C48H73N7O5S3
MS-ESI:924.7  [M+H]+
【０１４２】
OC505
【化１９】
2015531794.tif 000020
算出平均分子量：925.317
分子式：C48H72N6O6S3
MS-ESI:925.7  [M+H]+
【０１４３】
OC509:
【化２０】
2015531794.tif 000021
算出平均分子量： 727.95
分子式：C38H57N5O7S
MS-ESI:928.1  [M+H]+
【０１４４】
OC515
【化２１】
2015531794.tif 000022
算出平均分子量：772.05
分子式：C41H65N5O7S
MS-ESI:772.4  [M+H]+
【０１４５】
OC516:
【化２２】
2015531794.tif 000023
算出平均分子量：940.33
分子式：C48H73N7O6S3
MS-ESI:470.8  [M+2H]2+
【０１４６】
OC517:
【化２３】
2015531794.tif 000024
算出平均分子量：1012.35
分子式：C50H73N7O9S3
MS-ESI:506.8  [M+2H]2+
【０１４７】
OC175:
【化２４】
2015531794.tif 000025
算出平均分子量：5135.85
分子式：C241H358N60O63S
MS-ESI:1028.0   [M+5H]5+
【０１４８】
OC500:
【化２５】
2015531794.tif 000026
算出平均分子量：5261.039
分子式：C243H362FN61O63S3
MS-ESI:1053.0  [M+5H]5+; MS-TOF: 5258.5  [M+H]+
【０１４９】
OC508:
【化２６】
2015531794.tif 000027
算出平均分子量：5320.063
分子式：C244H363FN62O65S3
MS-TOF:5317.5  [M+H]+
【０１５０】
OC510:
【化２７】
2015531794.tif 000028
算出平均分子量：5243.09
分子式：C244H367FN61O62S3
MS-TOF:5242.8  [M+H]+
【０１５１】
OC511
【化２８】
2015531794.tif 000029
算出平均分子量：5244.08
分子式：C244H366FN60O63S3
MS-ESI:1049.6  [M+5H]5+
【０１５２】
OC518:
【化２９】
2015531794.tif 000030
算出平均分子量：5259.09
分子式：C244H367N61O63S3
MS-ESI:1052.6   [M+5H]5+
【０１５３】
OC519:
【化３０】
2015531794.tif 000031
算出平均分子量： 5331.11
分子式：C246H367N61O66S3
MS-TOF:5331.5  [M+H]+
【０１５４】
OC529:
【化３１】
2015531794.tif 000032
算出平均分子量： 5314.13
分子式：C246H368N62O64S3
MS-ESI:1063.7  [M+5H]5+
【０１５５】
OC528:
【化３２】
2015531794.tif 000033
算出平均分子量： 5569.52
分子式：C262H397N61O67S3
MS-ESI: 929.1  [M+6H]6+
【０１５６】
抗増殖/細胞損傷活性
蛍光細胞増殖アッセイを利用して本発明の新規な分子の細胞増殖抑制/細胞損傷効果を評価した。一連の細胞株(多くは乳癌細胞)を化合物で4−72時間に亘って処理した。いずれの場合も、細胞生存度のための蛍光定量読み出しを７２時間後に行った。特に、本発明のペプチド-ドラッグ複合体の場合、6時間の処理でペプチド複合体の生体内半減期の短縮が予測されるから、72時間処理よりも6時間の初期処理でのアッセイの方が有意義である。
【０１５７】
対照として、チューブリシンA およびパクリタクセルを使用した。72時間処理の結果は表1に示す通りであり、例えば、T-47D細胞におけるOC515のような遊離毒素の効果は対照化合物パクリタクセルと比較して300倍以上の効果を示した。(例えばOC517のような)リンカー-活性化化合物でもパクリタクセルよりも数倍高い活性を示した(図1をも参照)。
【０１５８】
化合物による処置の72時間後、細胞増殖アッセイで得られたIC５０の値
【表１】
2015531794.tif 000034
【０１５９】
図1は種々の細胞株の細胞増殖阻害を示す。MCF-7、T-47D、MDA-MB-231およびMDA-MB-468は乳癌細胞、184B5は化学的に不死化された乳腺細胞、SK-N-MCはユーイング肉腫ファミリーに属する細胞株、HEK293はヒトの胚腎臓からの細胞(非癌、但し未分化)である。細胞をOC517で72時間処理した。レザズリンによる細胞生残アッセイによって細胞増殖を検知した。化合物の効果はIC50値で表される。
【０１６０】
本発明のペプチド-ドラッグ複合体は72時間の処理後、中範囲-ナノメーターで表されるIC５０値(例えば、OC500、OC508、OC529)または低範囲-ナノメーターで表されるIC５０値(例えば、OC519、OC528)を示した。ベースであるペプチド(OC502またはOC522)だけでは、細胞損傷性を示さなかった。
【０１６１】
図2は各種乳癌細胞株、即ち、(A)MCF-7、(B)T-47D、(C)MDA-MB-231、および(D)MDA-MB-468の細胞増殖阻害を示す。細胞を72時間に亘ってOC501およびその誘導体OC169、OC500並びにベースであるコア/ペプチドOC502で処理した。72時間後、レザズリンによる細胞生残値アッセイを利用して細胞増殖を検知した。化合物の効果をIC５０値で表現した。
【０１６２】
表2には、当初の6時間細胞処理後に検出された幾つかのペプチド-ドラッグ複合体に関して得られたIC５０値と、これに続く72時間までに得られた細胞増殖を表すIC５０を示す。この種の分子の半減期が短縮することで、このアッセイは予測性の点で優れている。図3にOC517およびOC528に関連して例示した曲線から統計的にIC５０値を算出した。
【０１６３】
表2は当初の6時間に亘る化合物処理を含む72時間までに得られた細胞増殖アッセイで得られた値IC５０を要約する表である。
【０１６４】
【表２】
2015531794.tif 000035
【０１６５】
図3はOC519(A)およびパルミトイル化類似体(B)による種々の細胞株の増殖阻害を示す。MCF-7は乳癌細胞、184B5は化学的に不死化された乳腺細胞、SK-N-MCはユーイング肉腫ファミリーに属する細胞株、HEK293はヒトの胚腎臓からの細胞(非癌、但し未分化)である。細胞を先ずOC528で6時間処理した。次いで、培養液を化合物を含まない培養液と交換し、72時間に達するまで培養した。最後にレザズリンによる細胞生残値アッセイによって細胞増殖を検知した。化合物の効果はIC50値で表される。
【０１６６】
OC 528は−72時間までの増殖に先行する僅か6時間の処理後でも−低-ナノモル範囲のIC５０値で表される極めて高い抗増殖/細胞損傷活性を示す。表2に示すすべてのペプチド-ドラッグ複合体はRT-qPCRによる測定結果が示すように、幾つかの細胞株のhY1受容体とは良い意味の逆相関関係にある：即ち、SK-N-MC > MCF-7 > T-47D > MDA-MB-468 > MDA-MB-231 > 184B5 > HEK293 (hY1R-欠損)。
【０１６７】
概して、本発明のペプチド-ドラッグ複合体は、細胞がhY1受容体を発現させる場合、ホルモン受容体陽性乳癌細胞(例えば、MCF-7およびT-47Dのようなルミナル-タイプ)のほか、特にトリプル-陰性およびベーサル-タイプの乳癌細胞(MDA-MB-468およびMDA-MB-231)の治療に有効である。更にまた、腫瘍細胞を過剰発現させるその他のhY1R、例えば、ユーイング肉腫(SK-N-MC)もまた本発明の新規なペプチド-ドラッグ複合体を使用することで治療できる。
【０１６８】
シグナル変換
ペプチド/ペプチド-ドラッグ複合体がhY1受容体を機能的に活性化する能力−受容体-リガンドの内在化およびドラッグ活性の前提条件−を評価するため、cAMP応答エレメントのシグナル発信によるIP３二次メッセンジャーアッセイおよびリポーター遺伝子アッセイを利用して機能的な受容体シグナル変換アッセイを実施した。hY2受容体の活性化と比較することによって本発明の新規分子のNPY Y1受容体選択特性を評価した。
【０１６９】
IP３二次メッセンジャー・アッセイ：
図4は機能IP３アッセイによって決定されて、NPYとCytoPepとの複合体OC500およびOC508によるヒトY1およびY2の機能活性化を示す。
【０１７０】
表3は機能IP３アッセイから得られたNPY誘導体とCytoPepとの複合体OC500およびOC 508によるY受容体活性化のEC５０を要約した表である。
【表３】
2015531794.tif 000036
【０１７１】
IP３二次メッセンジャー測定によって実証され、図4および表3に示すように、
OC 500はナノモル未満のEC５０でヒトY1受容体を活性化し、そのhY1R選択特性はヒトY2受容体に対してよりも高い。OC508は低-ナノモルEC５０で、即ち、ヒトY2受容体に対した場合の約50倍の効率でヒトY1受容体を活性化することが実証された。
【０１７２】
CREリポーター遺伝子アッセイ
図5は機能的リポーター遺伝子アッセイを用いることによって決定された、ネイティブNPY(非選択性)およびhY1R-選択性NPY誘導体OC502(本発明のペプチド-ドラッグ複合体のコア・ペプチド)によるヒトY1およびY2受容体の機能的活性化を示す。
【０１７３】
図5に示すように、対照としてのネイティブY受容体リガンドNPYはhY1RおよびhY2Rに対して比較的アクティブであり、その非選択性の作用モードを示した。これとは対照的に、ほぼすべてのペプチドおよび本発明のペプチド-ドラッグ複合体のコア・ペプチドである本発明のOC502が高いhY1R-選択性であることが実証された(但し、OC175、OC524およびOC525は例外)。
【０１７４】
図6は、機能的リポーター遺伝子アッセイを利用することによって求められた、パルミトイル化ペプチドOC522、OC523、OC524およびOC525(OC502の誘導体)によるヒトY1およびY2受容体の機能的活性化を示す。
【０１７５】
hY1RおよびhY2Rをそれぞれ機能的に活性化するパルミトイル化ペプチドOC522、OC523、OC524およびOC525の能力を図6に示す。hY1Rに対する活性化効果濃度EC５０は常に低-ナノモルまたはナノモル-未満である。hY2Rに対する活性化が著しく異なることから判断して、パルミトイル化ペプチドはhY1R選択性の点で際だって特異である。OC522のhY1R選択性が最も高く、OC525のそれが最も低い(hY2Rの場合と比較して、それぞれ〜100-倍および〜5-倍高い)。
【０１７６】
図7に示すように、ペプチド-ドラッグ複合体OC500、OC508、OC519およびOC528が低-ナノモルまたはナノモル未満の範囲のEC５０値でhY1Rを活性化することが判明した。hY2Rに対する活性化度が微弱であることから判断して、いずれの場合にも、500 nM以上の強いhY1R選択度が確保される。
【０１７７】
図7は機能的リポーター遺伝子アッセイを利用すことで解明されたペプチド-ドラッグ複合体OC500、OC508、OC519およびOC528によるヒトY1およびY2受容体の機能的活性化を示す。
【０１７８】
表4は機能的CREリポーター遺伝子アッセイを利用することで解明された、NPY誘導体とCytoPepとの複合体OC500およびOC508によるY受容体活性化のEC５０値を総括した表である。
【０１７９】
【表４】
2015531794.tif 000037
【０１８０】
内在化に関する考察
[F７、P３４]-NPYおよびOC500ヒトY受容体に関する蛍光顕微鏡による内在化の観察から、エンドサイトシス経路による選択的な細胞内在化が明らかになった。内因性且つ非選択性リガンドNPYが4種のY受容体すべてと結合して内在化することが、細胞膜から細胞内小胞へのEYFP-標識付き受容体の移動(濃灰色で示す)で立証された。[F７、P３４]-NPYおよびOC500の場合、この位置移動は−未処理対照とは異なり−hY1受容体を発現する細胞で観察され、hY2を発現する細胞には観察されず、hY4またはhY5受容体を発現する細胞では僅かしか観察されなかった。
【０１８１】
蛍光顕微鏡による観察で、ペプチドを介したヒトY受容体群の細胞内在化が明らかになった。EYFP-標識付けひとY1、Y2、Y4およびY5受容体を安定的に発現するHEK293細胞のそれぞれを、1mMのネイティブ・リガンドNPY、Y1受容体選択性ペプチド[F７、P３４]-NPYおよびOC500で1時間処理した。Axio Observer顕微鏡とApoTome撮像システム(ツァイス社、イエナ、ドイツ)を使用して生細胞を撮像した。EYFP-標識付きヒトY1、Y2、Y4およびY5受容体を安定的に発現する未刺激処理(対照)は、それぞれ細胞膜内の受容体の位置を受容体-融合EYFPの蛍光で明確に示した。NPY刺激と同時に、細胞内への受容体内在化の結果として、細胞表面における受容体からの蛍光が弱まった。しかし、細胞内の小胞には受容体の蛍光がはっきり視認され、リガンドを介した受容体の内在化を示した。細胞を[F７、P３４]-NPY処理した結果、NPY Y1受容体のみに顕著な受容体内在化が認められた。他のNPY受容体は、未刺激処理対象細胞の場合と比較して、内在化を全く示さないか、示したとしても極く軽微であった。NPY Y1受容体のみに明確な受容体内在化を観察することができた。NPY Y2、Y4およびY5受容体は、未処理対照細胞と比較して全く受容体内在化を示さないか、または極く軽微な受容体内在化しか示さなかった。
【０１８２】
チューブリン・ネットワークの不安定化
ECFP-標識付きチュ−ブリンおよびEYFP-標識付きヒトY1受容体を発現するHEK293細胞の蛍光顕微鏡観察を利用して、チューブリン-ネットワークの完全性に対する化合物の作用効果を検討した。Axio Observer顕微鏡およびApoTome撮像システム(ツァイス社、イエナ、ドイツ)で生細胞を撮像した。ECFP-標識付きチューブリンおよびEYFP-標識付きヒトY1受容体を発現する未刺激処理HEK293細胞ではNPY Y1受容体が細胞膜に位置しているのに対して、チューブリンは細胞質中に典型的なネットワーク構造を構成することが判明した。これらの細胞を100 nM OC 500で16時間処理した結果は、(1)NPY Y1受容体の内在化、(2)劣化、拡散したチューブリン・ネットワークおよび(3) 細胞膜の小胞状膨出によって示される自然死状細胞形態であった。
【０１８３】
細胞自然死のアッセイ
化合物による処理後、数種類の乳癌細胞株におけるエフェクターとしてのカスパーゼ3および7の活性化レベルを検討したところ、遊離の細胞溶解素(例えば、OC169)および細胞損傷性ペプチド複合体(例えば、OC50)によって(カスパーゼ依存の)細胞自然死のメカニズムが誘発されるが、基礎ペプチドOC502は自然死事象をトリガーしないことが判明した。MDA-MB-468および184B5細胞に関して述べたように、自然死、従って、細胞生残値の低下は時間と濃度に依存する(図8参照)。
【０１８４】
図8A-Dは、カスパーゼ3/7(カラム)の活性化効果と乳癌細胞種MDA-MB-468(A、B)および184B5(C、D)の細胞生残率(三角形)を示す。細胞を図に示した化合物濃度で24時間(A、C)および48時間(B、C)それぞれ処理した。次いで、エフェクターとしてのカスパーゼ3/7の活性化効果を蛍光利用のカスパーゼGloTMアッセイ・キット(Promega社)を使用して測定し、レザズリンに基づく細胞生残値アッセイを使用して細胞生残値を蛍光定量法で検知した。細胞生残カウントを利用してカスパーゼ活性データを標準化し、基定値(未処理細胞)の´-倍の形で示す。
【０１８５】
核フラグメンテーションは細胞自然死を示唆する1つの兆候である。図9は、EYFP-標識付きヒトNPY Y1(白線)およびY2受容体(黒線)をそれぞれ安定的に発現するHEK293細胞のOC500の濃度に関する核フラグメンテーション・アッセイを示す。OC500で処理した細胞の核をヘキスト33342で着色し、蛍光顕微鏡観察による目視検査によって非分裂核を数えた(Axio Observer 顕微鏡およびApoTome撮像システム；ツァイス社、イエナ、ドイツを使用)。核フラグメンテーション・アッセイの結果、濃度50-100nMにおいてhY1発現細胞の核が著しく分裂することが判明した。hY2受容体を発現する細胞においては、これらの化合物濃度における分裂は微弱であった。即ち、OC500はhY1受容体選択性を示した。これらの試験をOC508でも実施し、同様の結果を得た。尚、OC508の方がその効果においてやや勝っていた。これらの所見はシグナル変換データと符合し、OC500およびOC508によって自然死メカニズムがトリガーされるこを示唆するものである。
【０１８６】
細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識付け(SILAC)
SILACを利用するプロテオーム解析によってタンパク質発現の細胞レギュレーションに果たす化合物の効果を評価した（図10）。例えば、OC169およびC500でそれぞれ処理したところ、種々の乳癌細胞株における比較可能なタンパク質レギュレーションが観察された。観察された種々のタンパク質の発現アップレギュレーションは少なくとも3つの機能に大別することができる。即ち、タンパク質発現のアップレギュレーション、細胞骨格関連事象のアップレギュレーションおよびタンパク質分解事象に関するアップレギュレーション。一般に、OC169およびOC500によってトリガーされる、これらすべてのタンパク質のレギュレーションは化合物によって誘発される細胞チューブリン・ネットワークの劣化および細胞骨格を再生・修復しようとする細胞の努力と関連づけることができる。
【０１８７】
図10は、細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識付け(SILAC)を利用することによって、OC169およびOC500でそれぞれ処理した後、MCF-7(A)およびMDA-MB-468(B)をプロテオーム分析した結果を示す。細胞を示された濃度の化合物で示された時間にわたって処理し、ナノHPLC/質量分析を利用してアップ-またはダウンレギュレートされたタンパク質を検出した。ここではアップレギュレートされたタンパク質のみを示し、3つの作用、即ち、タンパク質発現のレギュレーション、チューブリン・ネットワークの形成およびプロテアソーム・リサイクル・プロセスに関わるタンパク質に分類する。IMA2、インポルチン(輸送タンパク質)サブユニットa-2；DNAJ、DnaJ同族体亜科Bメンバー1；KIF11キネシン様タンパク質11；TPX2、Xklp2に対する標的タンパク質；PSMG1、プロテアソーム集合体シャペロン；UBE2S、ユビキチン結合酵素E2S；CKAP5、細胞骨格-関連タンパク質5；RLA1、60S酸性リボソームタンパク質P1；RL21、60Sリボソームタンパク質L21；RL29、60Sリボソームタンパク質L29；ZN428、ジンクフィンガータンパク質428；KIF20A、キネシン様タンパク質20A；KIFC1、キネシン様タンパク質C1；UBE2N、ユビキチン結合酵素E2N；USP10、ユビキチンカルボキシ末端側ヒドロラーゼ 10；UBE2I、ユビキチン結合酵素E2I；RM40、39Sリボソームタンパク質L40 (ミトコンドリアの)；RS13、40Sリボソームタンパク質S13；EIF2A、真核性翻訳開始因子2A；CENPF、動原体タンパク質F；ZYX、ジクシン；ACTBL、β-アクチン様タンパク質2；UBE2C、ユビキチン結合酵素E2C；UBE2K、ユビキチン結合酵素E2K。
【図１】
2015531794.tif 000045
【図２】
2015531794.tif 000046
【図３】
2015531794.tif 000047
【図４】
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【図５】
2015531794.tif 000049
【図６】
2015531794.tif 000050
【図７】
2015531794.tif 000051
【図８】
2015531794.tif 000052
【図９】
2015531794.tif 000053
【図１０】
2015531794.tif 000054
【配列表】
2015531794000001.xml
【国際調査報告】
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2015531794.tif 000058
2015531794.tif 000059
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