(57)【要約】ヒト胚性幹細胞由来微小胞を含む治療用組成物、ならびに眼病態の治療を含めたその使用方法、ならびに網膜神経細胞および網膜幹細胞を得る方法が開示される。2015514760.tif 000004
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
眼神経前駆細胞を再生させるのに有効な量のヒト胚性幹細胞を含む、治療用組成物。
【請求項２】
前記眼神経前駆細胞が網膜前駆細胞である、請求項１に記載の治療用組成物。
【請求項３】
前記眼神経前駆細胞がミクログリア細胞およびミュラー細胞である、請求項２に記載の治療用組成物。
【請求項４】
網膜前駆細胞を網膜神経細胞に分化させるのに有効な量の胚性幹細胞由来微小胞（ＥＳＭＶ）画分で網膜前駆細胞を処理することを含む、網膜神経細胞を得る方法。
【請求項５】
前記網膜前駆細胞がミクログリア細胞および／またはミュラー細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記網膜前駆細胞から網膜神経細胞への細胞分化を、処理細胞中のグルタミン合成酵素、Ｇａｄ６７、ＮｅｕＮ、Ｂｒｎ３ａ、およびシンタキシン１ａの存在によって測定する、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＳＭＶ画分がヒトＥＳＭＶを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
網膜幹細胞形質を有する細胞を得る方法であって、ミクログリア細胞およびミュラー細胞を有効量の胚性幹細胞由来微小胞（ＥＳＭＶ）画分で少なくとも８時間処理することと、処理した前記細胞における上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のレベルを測定することとを含み、網膜幹細胞形質を有する細胞におけるＥＧＦＲのレベルが、未処理のミクログリア細胞およびミュラー細胞におけるＥＧＦＲのレベルに比べて減少している、方法。
【請求項９】
哺乳動物の眼病態を治療する方法であって、それを必要とする前記哺乳動物の眼球に、哺乳動物胚性幹細胞から得られた胚性幹細胞由来微小胞（ＥＳＭＶ）画分を治療有効量で投与することを含む、方法。
【請求項１０】
前記ＥＳＭＶ画分を硝子体内注射、網膜下注射、もしくは眼内注射によって、または局所投与によって眼球に投与する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＥＳＭＶ画分を持続放出または急速放出によって投与する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記眼病態が加齢黄斑変性、近視性変性、糖尿病性網膜症、緑内障、網膜色素変性複合症、遺伝性網膜変性、ブドウ膜炎、ドライアイ、視神経症、角膜もしくは前眼部疾患、眼部瘢痕性類天疱瘡、良性もしくは悪性モーレン角膜潰瘍、または関節リウマチである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記眼病態が緑内障であり、前記ＥＳＭＶ画分が局所的に、眼内に、または硝子体内注射によって投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記眼病態が加齢黄斑変性（ＡＭＤ）または光受容体／ＲＰＥ変性であり、前記ＥＳＭＣ画分が硝子体内注射、眼内注射、または網膜下注射によって投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記眼病態が網膜変性であり、前記ＥＳＭＶ画分が網膜下注射によって投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記眼病態がドライアイ、角膜疾患、または前眼部疾患であり、前記ＥＳＭＶ画分が局所適用によって投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物がヒトであり、前記ＥＳＭＶ画分がヒトＥＳＭＶを含む、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１２年４月１６日に出願された「Ｏｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ」と題する米国仮特許出願第６１／６２４，７０１号の恩典を主張する。上記出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は眼科医学の分野、より具体的には、網膜変性および網膜ジストロフィー疾患、視神経変性、白内障、角膜およびドライアイ疾患などの前眼部疾患ならびに眼球に悪影響を及ぼす全身性および局所性自己免疫疾患の治療の分野に属するものである。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
世界では網膜変性および網膜ジストロフィーなどの眼疾患が不可逆的な失明の主要な原因となっており、何百万人もの人々が糖尿病性網膜症ならびに加齢黄斑変性をはじめとする遺伝性の網膜変性および黄斑変性症などの様々な形態の黄斑変性症に罹患している。白内障、緑内障、角膜およびドライアイの病態が非網膜性の失明病態の大部分を占めている。例えば、網膜などの眼組織の再生能を改善することによって、眼疾患の進行速度を低下させ、組織の修復および／または再生を増強する治療法が喫緊に必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）由来微小胞（ＥＳＭＶ）の治療用画分ならびに眼疾患および眼障害治療のための眼球の様々な区画でのその治療的使用に関する。
【０００５】
幹細胞が眼球内でその環境に影響を及ぼす機序が発見されている。この発見を利用して、幹細胞を移植するのではなく、幹細胞の再生シグナルを回収し、その再生シグナルのみを用いて罹患眼組織を治療する本発明の治療法が開発された。本開示は、このような治療用画分を単離し、その選択を鑑別する方法を提供する。本開示はさらに、ミュラー細胞およびミクログリア細胞などの内在性前駆細胞を誘導し、網膜細胞系の脱分化をより網膜に近い幹細胞形質に誘導し、特定の眼細胞の脱分化を促進することによって、眼球での再生を惹起させる方法ならびに眼疾患および眼障害を治療する方法を提供する。
【０００６】
一態様では、網膜神経細胞を入手する方法が提供され、この方法は、眼神経前駆細胞を網膜神経細胞に分化させるのに有効な量のＥＳＭＶ画分で眼神経前駆細胞を処理することを含む。いくつかの実施形態では、処理細胞中のグルタミン合成酵素、Ｇａｄ６７、ＮｅｕＮ、Ｂｒｎ３ａおよびシンタキシン１ａの存在によって、網膜前駆細胞の分化あるいはミクログリア細胞および／またはミュラー細胞の分化を測定する。
【０００７】
別の態様では、本開示は、網膜幹細胞形質を有する細胞を入手する方法を提供し、この方法は、ミクログリア細胞およびミュラー細胞を胚性幹細胞由来微小胞画分で少なくとも８時間処理することと、処理細胞の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）のレベルを測定することとを含み、網膜幹細胞形質を有する細胞のＥＧＦＲレベルが未処理のミクログリア細胞およびミュラー細胞のＥＧＦＲレベルよりも低下している。一実施形態では、ＥＳＭＶ画分はヒトＥＳＭＶを含む。
【０００８】
さらに別の態様では、哺乳動物の眼球に治療有効量の胚性幹細胞由来微小胞（ＥＳＭＶ）画分を投与することを含む、哺乳動物の眼病態を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、硝子体内注射、網膜下注射、眼間注射または局所投与によってＥＳＭＶ画分を投与する。ある実施形態では、持続放出または急速放出によってＥＳＭＶ画分を投与する。
【０００９】
特定の実施形態では、コンタクトレンズなどの装置またはポンプを含めた装置によって投与を実施し得る。いくつかの実施形態では、投与の形態は持続放出または急速放出によるものである。
【００１０】
ある実施形態では、ＥＳＭＶ画分はヒトＥＳＭＶを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、治療する眼病態は加齢黄斑変性、近視性変性、糖尿病性網膜症、緑内障、網膜色素変性複合症、遺伝性網膜変性、ブドウ膜炎、ドライアイ、視神経症、角膜または前眼部疾患、例えば、特に限定されないが、眼部瘢痕性類天疱瘡、良性および悪性モーレン角膜潰瘍または関節リウマチなどである。
【００１２】
ある実施形態では、眼病態は緑内障であり、ＥＳＭＶ画分を局所的に、眼内に、または硝子体内注射によって投与する。他の実施形態では、眼病態は加齢黄斑変性（ＡＭＤ）または光受容体／ＲＰＥ変性であり、硝子体内、眼内または網膜下注射によってＥＳＭＣ画分を投与する。また別の実施形態では、眼病態は網膜変性であり、網膜下注射によってＥＳＭＶ画分を投与する。さらに別の実施形態では、眼病態はドライアイ、角膜疾患または前眼部疾患であり、局所適用によってＥＳＭＶ画分を投与する。
【００１３】
特定の実施形態では、治療する哺乳動物はヒトであり、ＥＳＭＶ画分はヒトＥＳＭＶを含む。
【００１４】
本開示は他にも、眼神経前駆細胞を再生させるのに有効な量のヒト胚性幹細胞を含む治療用組成物を提供する。いくつかの実施形態では、眼神経前駆細胞は網膜前駆細胞である。特定の実施形態では、眼神経前駆細胞はミクログリア細胞および／またはミュラー細胞である。
【００１５】
以下の説明を添付図面と併せて読めば、本開示の上記のものをはじめとする目的、様々な特徴および本発明自体が一層十分に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１Ａ】未処理ミュラー細胞が均一で双極性、紡錘形の接着細胞の「シート」として増殖していることを示す顕微鏡像である。各処理後にＥＳＭＶ処理細胞（Ｔ）および対照細胞（Ｃ）を計数し、対照細胞に対する処理細胞の比を計算した（Ｔ／Ｃ  ６  Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。
【図１Ｂ】９回のＥＳＭＶ処理後のミュラー細胞が形態学的に不均一な個別の細胞として増殖し、多数の細胞突起を有する細胞や核が肥大した細胞、多核となった細胞が存在し、多くのものに中期板が見られ、星形のものが多数存在することを示す顕微鏡像である。各処理後にＥＳＭＶ処理細胞（Ｔ）および対照細胞（Ｃ）を計数し、対照細胞に対する処理細胞の比を計算した（Ｔ／Ｃ  ６  Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。
【図１Ｃ】形態学的にＥＳＭＶ処理群に特有の個々の細胞のコラージュを示す顕微鏡像である。各処理後にＥＳＭＶ処理細胞（Ｔ）および対照細胞（Ｃ）を計数し、対照細胞に対する処理細胞の比を計算した（Ｔ／Ｃ  ６  Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。
【図１Ｄ】ＥＳＭＶ処理後にミュラー細胞に見られる形態学的変化を時系列で示した略図である。
【図２Ａ】ＥＳＭＶ処理後８時間、２４時間および４８時間における胚性幹細胞特異的マウスＯｃｔ４  ｍＲＮＡ発現の変化倍数を対照（培地のみ）と比較して示すグラフである。ＧａｐｄｈをｑＲＴ−ＰＣＲの投入対照として使用し、エラーバーは、実験ミュラー細胞群と対照ミュラー細胞群との間の差を検定するため、Ｎａｎｏｇ  ｍＲＮＡ以外はｐ値＜０．０５で実施したＳ．Ｅ．Ｍ．スチューデントｔ検定を表す。
【図２Ｂ】ＥＳＭＶ処理後８時間、２４時間および４８時間における胚性幹細胞特異的マウスＳｏｘ２  ｍＲＮＡ発現の変化倍数を対照（培地のみ）と比較して示すグラフである。ＧａｐｄｈをｑＲＴ−ＰＣＲの投入対照として使用し、エラーバーは、実験ミュラー細胞群と対照ミュラー細胞群との間の差を検定するため、Ｎａｎｏｇ  ｍＲＮＡ以外はｐ値＜０．０５で実施したＳ．Ｅ．Ｍ．スチューデントｔ検定を表す。
【図２Ｃ】ＥＳＭＶ処理後８時間、２４時間および４８時間における胚性幹細胞特異的マウスＮａｎｏｇ  ｍＲＮＡ発現の変化倍数を対照（培地のみ）と比較して示すグラフである。ＧａｐｄｈをｑＲＴ−ＰＣＲの投入対照として使用し、エラーバーは、実験ミュラー細胞群と対照ミュラー細胞群との間の差を検定するため、Ｎａｎｏｇ  ｍＲＮＡ以外はｐ値＜０．０５で実施したＳ．Ｅ．Ｍ．スチューデントｔ検定を表す。
【図２Ｄ】ＥＳＭＶ処理後８時間、２４時間および４８時間における胚性幹細胞特異的ヒトＯｃｔ４  ｍＲＮＡ発現の変化倍数を対照（培地のみ）と比較して示すグラフである。ＧａｐｄｈをｑＲＴ−ＰＣＲの投入対照として使用し、エラーバーは、実験ミュラー細胞群と対照ミュラー細胞群との間の差を検定するため、Ｎａｎｏｇ  ｍＲＮＡ以外はｐ値＜０．０５で実施したＳ．Ｅ．Ｍ．スチューデントｔ検定を表す。
【図２Ｅ】ＥＳＭＶ処理後８時間、２４時間および４８時間における胚性幹細胞特異的ヒトＰａｘ６  ｍＲＮＡ発現の変化倍数を対照（培地のみ）と比較して示すグラフである。ＧａｐｄｈをｑＲＴ−ＰＣＲの投入対照として使用し、エラーバーは、実験ミュラー細胞群と対照ミュラー細胞群との間の差を検定するため、Ｎａｎｏｇ  ｍＲＮＡ以外はｐ値＜０．０５で実施したＳ．Ｅ．Ｍ．スチューデントｔ検定を表す。
【図２Ｆ】ＥＳＭＶ処理後８時間、２４時間および４８時間における胚性幹細胞特異的ヒトＲａｘ  ｍＲＮＡ発現の変化倍数を対照（培地のみ）と比較して示すグラフである。ＧａｐｄｈをｑＲＴ−ＰＣＲの投入対照として使用し、エラーバーは、実験ミュラー細胞群と対照ミュラー細胞群との間の差を検定するため、Ｎａｎｏｇ  ｍＲＮＡ以外はｐ値＜０．０５で実施したＳ．Ｅ．Ｍ．スチューデントｔ検定を表す。
【図３Ａ】ＥＳＭＶ処理後８時間、２４時間および４８時間後のミュラー細胞におけるＥＳＣ特異的ｍｉＲＮＡ  ２９２レベルの変化倍数を対照と比較して示すグラフである。ｙ軸は処理ミュラー細胞群と対照ミュラー細胞群（淡緑色）との間の変化倍数に対応し、エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。スチューデントｔ検定により、実験群と対照群との間の有意差を全ｐ値＜０．０１で求めた。
【図３Ｂ】ＥＳＭＶ処理後８時間、２４時間および４８時間後のミュラー細胞におけるＥＳＣ特異的ｍｉＲＮＡ  ２９５レベルの変化倍数を対照と比較して示すグラフである。ｙ軸は処理ミュラー細胞群と対照ミュラー細胞群（淡緑色）との間の変化倍数に対応し、エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。スチューデントｔ検定により、実験群と対照群との間の有意差を全ｐ値＜０．０１で求めた。
【図４Ａ】ＥＳＭＶ曝露後８時間、２４時間および４８時間におけるＥＳＭＶ処理ミュラー細胞および対照ミュラー細胞でマイクロアレイにより測定した遺伝子発現変化を示すベン図である。
【図４Ｂ】ＥＳＭＶ処理後のミュラー細胞および対照において差次的に制御されることが明らかになった１８９４種類のプローブに基づく１６種類の試料の階層的クラスタリングのヒートマップの図であり（ｐ値０．００１、発現の差の最小値３倍）、赤色はアップレギュレーションを表し、青色はダウンレギュレーションを表す。行は試料を表し、列は遺伝子を表す。
【図５Ａ】特定の機能においてＥＳＭＶ処理ミュラー細胞と対照ミュラー細胞との間でｐ＜０．００１のレベルおよび変化倍数３以上で、試験した全時点で差次的に制御される１８９４種類の遺伝子の独創的な経路の解析を示すグラフである。有意性を上回る標準的な経路の遺伝子相互作用の総括データベースにおいてランダムに変化する関係に対する特定の細胞機能のシグナル伝達経路に関係する有意性について、遺伝子を試験した。
【図５Ｂ】標準的な細胞シグナル伝達経路においてＥＳＭＶ処理ミュラー細胞と対照ミュラー細胞との間でｐ＜０．００１のレベルおよび変化倍数３以上で、試験した全時点で差次的に制御される１８９４種類の遺伝子の独創的な経路の解析を示すグラフである。有意性を上回る標準的な経路の遺伝子相互作用の総括データベースにおいてランダムに変化する関係に対する特定の標準的なシグナル伝達経路に関係する有意性について、遺伝子を試験した。
【図６】ＥＳＭＶ処理後２４時間および４８時間のミュラー細胞においてマイクロアレイで同定された遺伝子の発現変化を未処理対照と比較して示す、ｑＲＴ−ＰＣＲ解析のグラフである。各バーはＥＳＭＶ処理ミュラー細胞および未処理ミュラー細胞で試験した遺伝子の相対存在量を表し、エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を表す。
【図７Ａ】ＥＳＭＶ処理後８時間、２４時間および４８時間のＥＳＭＶ処理ミュラー細胞および対照ミュラー細胞におけるｍｉＲＮＡの発現変化のベン図を示すグラフである。
【図７Ｂ】試験した全時点でＥＳＭＶ処理ミュラー細胞および対照ミュラー細胞において差次的に制御される２５種類のｍｉＲＮＡプローブに基づく１６種類の試料の階層的クラスタリングのヒートマップのグラフ（ｐ値＜０．０５、発現の差の最小値３倍）である。各行は単一の試料を表し、各列は単一のｍｉＲＮＡを表す。赤色または青色は、それぞれ高発現または低発現を表す。
【図８】ＥＳＭＶ処理ミュラー細胞および対照ミュラー細胞における多能性の維持、脱分化、細胞運命決定および分化に関与する選択されたｍｉＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ解析を示すグラフである。各バーはＥＳＭＶ処理ミュラー細胞および未処理対照細胞で試験したｍｉＲＮＡの相対存在量を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図９】図９Ａ〜図９Ｒは、様々な網膜系のマーカーに対して免疫染色したＥＳＭＶ処理ミュラー細胞および対照ミュラー細胞を示す共焦点顕微鏡写真である。図Ａ〜Ｌは、Ｇａｄ６７（アマクリン細胞および水平細胞；緑色）またはＮｅｕＮ（アマクリン細胞および神経節細胞；緑色）およびミュラー細胞のマーカー、グルタミン合成酵素（赤色）で二重染色した細胞を示す。図９Ａ〜９ＣはＧａｄ６７で染色したＥＳＭＶ処理ミュラー細胞を示し；図９Ｄ〜９ＦはＧａｄ６７で染色した対照ミュラー細胞を示し；図９Ｇ〜９ＩはＮｅｕＮで染色したＥＳＭＶ処理ミュラー細胞を示し；図９Ｊ〜９ＬはＮｅｕＮで染色した対照ミュラー細胞を示し；各行の３番目のパネルは最初の２つの画像を重ね合わせた画像を示し；図９Ｍは網膜神経節細胞のマーカー、Ｂｒｎ３ａ（緑色）で染色したＥＳＭＶ処理ミュラー細胞を示し、図９ＮはＢｒｎ３ａで染色した対照ミュラー細胞を示し；図９Ｏはアマクリン細胞のマーカー、シンタキシン１ａ（緑色）で染色したＥＳＭＶ処理ミュラー細胞を示し、図９Ｐはシンタキシン１ａで染色した対照ミュラー細胞を示し；図９Ｑは桿体光受容体のマーカー、ロドプシン（緑色）で染色したＥＳＭＶ処理ミュラー細胞を示し、図９Ｒはロドプシンで染色した対照ミュラー細胞を示す。細胞核を４９６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、青色）で標識し、画像付きの全パネルの１０ｍｍスケールバーはいずれのチャンネルも１５６１ｍｍのｚ軸投影を示す。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｆは、注射後７日（図１０Ａ〜１０Ｃ）および３０日（図１０Ｄ〜１０Ｆ）のＧａｄ６７発現（図１０Ａおよび１０Ｃ）、ＢｒｄＵ発現（図１０Ｂおよび１０Ｄ）および重ね合わせた発現（図１０Ｃおよび１０Ｄ）を示す共焦点顕微鏡像である。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｆは、注射後７日（図１１Ａ〜１１Ｃ）および３０日（図１１Ｄ〜１１Ｆ）のシンタキシン１ａ発現（図１１Ａおよび１１Ｃ）、ＢｒｄＵ発現（図１１Ｂおよび１１Ｄ）および重ね合わせた発現（図１１Ｃおよび１１Ｄ）を示す共焦点顕微鏡像である。
【図１２】図１２Ａ〜図１２Ｆは、注射後７日（図１２Ａ〜１２Ｃ）および３０日（図１２Ｄ〜１２Ｆ）のＣＲＡＬＢＰ発現（図１２Ａおよび１２Ｃ）、ＢｒｄＵ発現（図１２Ｂおよび１２Ｄ）および重ね合わせた発現（図１２Ｃおよび１２Ｄ）を示す共焦点顕微鏡像である。
【図１３】ＥＳＭＶ処理後に改善が認められた個体の内の１個体の任意に選択した刺激強度０．０５３４５ｃｄ／ｍ２における暗順応ＥＲＧのトレースである。未処理の右眼（赤色）の波の最大振幅が約３３０μＶにとどまったのに対して、ＥＳＭＶ処理した左眼（青色）の波の最大振幅は４５０μＶを上回るまで改善した。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
本出願全体を通して様々な特許、特許出願および刊行物が参照される。これらの特許、特許出願および刊行物の開示は、本明細書に記載および特許請求される本発明の日付の時点で当業者に公知の技術水準を一層十分に記載するため、その全体が参照により本願に組み込まれる。これらの特許、特許出願および刊行物と本開示との間に何らかの矛盾点が生じた場合、本開示が優先される。
【００１８】
本開示は、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）微小胞（ＥＳＭＶ）の画分を含む治療用組成物、治療用画分の単離および同定、眼球に悪影響を及ぼす疾患の大部分を治療する治療法としてのこの画分の適用を提供する。
【００１９】
胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、細胞外環境中に不均一な大きさ（３０ｎｍ〜１μｍ）の一群の微小胞（ＥＳＭＶ）を放出することが知られている（Ｒａｔａｊｃｚａｋら（２００６）Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０：１４８７−１４９５）。この微小胞にはその内容物を別の起源の細胞に移入する能力がある（Ｙｕａｎら（２００９）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，４（３）；ｅ４７２２：１−８）。ＥＳＭＶには初期転写因子のｍＲＮＡおよび幹細胞の多能性に重要なｍｉＲＮＡが大量に含まれている。ＥＳＭＶ中にはＥＳＣの多能性の維持に重要なｍＲＮＡとともに、幹細胞の多能性の維持およびほとんどの細胞の細胞運命決定に極めて重要な役割を果たす低分子非コードＲＮＡ分子、ｍｉＲＮＡが豊富に存在する。
【００２０】
ミュラー細胞はミクログリア細胞と同じく、光受容体および内部網膜神経細胞などの複数の網膜系に沿って分化する能力があることから、網膜前駆細胞である。
【００２１】
ＥＳＭＶが幹細胞のｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびタンパク質といった内容物を培養ヒト網膜前駆細胞（ミュラー細胞およびミクログリア細胞）に移入して、損傷組織に内在する成体の静止状態にある前駆細胞の活性化を誘導することが発見されている。いかなる特定の理論にも制限されるわけではないが、この移入は、部分的にはＥＳＭＶ膜と他の細胞膜との融合によって生じると考えられている。
【００２２】
網膜ミュラー細胞の培養物に添加されたＥＳＭＶが、より脱分化した前駆細胞形質への形態学的変化を誘導することが明らかになった（図１）。このＥＳＭＶ画分がＥＳＣのｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを選択的に移入することにより、ミュラー細胞の胚性遺伝子および初期遺伝子を誘導する。さらに、ミュラー細胞をＥＳＭＶで処理すると、網膜再生プログラムの脱分化および活性化を示すトランスクリプトームの変化が誘導された。ミュラー細胞の処理により、多能性遺伝子、初期網膜遺伝子、網膜保護および網膜再生誘導物質の他、網膜再生が可能な環境を生じさせる複数の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）修飾分子に関与する遺伝子のアップレギュレーションがもたらされた。他にもＥＳＭＶ処理により、分化を促進する遺伝子ならびに抑制性のＥＣＭおよび瘢痕成分のダウンレギュレーションがもたらされた。さらに、ＥＳＭＶにより、ミュラー細胞のｍｉＲＮＡトランスクリプトームの脱分化した前駆細胞状態への移行が誘導された。以上の結果は、ＥＳＭＶが網膜の内在的な再生能を活性化し得る治療薬であることを示すものである。
【００２３】
従って、ＥＳＭＶはその移入能によって、培養網膜前駆細胞からより脱分化した形質への形態学的変化を誘導し、また網膜組織の再生を引き起こすことが可能である。
【００２４】
ＥＳＭＶに曝露した培養ミュラー細胞は、多能性に関連する遺伝子（Ｏｃｔ４、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４およびＬＩＦ）をアップレギュレートし、初期網膜遺伝子（ＢＭＰ７、Ｐａｘ６およびＲａｘ）をアップレギュレートし、網膜の保護（ＩＬ６、ＣＳＦ２）および再生（ＦＧＦ２、ＩＧＦ２、ＧＤＮＦ）に関与する遺伝子をアップレギュレートし、組織リモデリングが可能な環境を生じさせることが知られている細胞外マトリックス修飾遺伝子（例えば、ＭＭＰ３）をアップレギュレートすることができる。これに対して、ＥＳＭＶは分化を促進する遺伝子（例えば、ＤＮＭＴ３ａおよびＧＡＴＡ４）をダウンレギュレートすることができる。損傷網膜内でミュラー細胞を活性化させれば、ある程度再生に成功する。しかし、これまで網膜機能の回復には至っていない。
【００２５】
ＥＳＭＶは網膜変性マウスモデルの損傷網膜の機能を改善する。ＥＳＭＶは、少なくとも部分的には内在性網膜前駆細胞を誘導して再増殖させ、損傷網膜を修復させることによって、再生を刺激する。ＥＳＭＶ適用後、マウスＥＲＧのａ波およびｂ波の有意な（７０％）改善の他、網膜細胞再増殖の免疫組織化学的証拠が認められた。
【００２６】
ヒトへの治療適用にＥＳＣではなくｈＥＳＭＶを使用する利点は、ｈＥＳＭＶが細胞ではなく、表面分子を活発に産生することがなく、拒絶反応および腫瘍形成を引き起こす可能性が低いという点にある。使用するｈＥＳＭＶ調製物は内毒素を含まず、非免疫原性、非腫瘍原性であり、汚染物を含まない。ｈＥＳＭＶを使用すれば、移植したインタクトなＥＳＣの長期的に見た異常分化の可能性が回避され、その悪性形質転換のリスクが排除される。
【００２７】
本開示は、ＥＳＭＶが他にも、再生および損傷修復する眼区画の再生を特異的に刺激または惹起し得ることを示すものである。内因性の再生作用物質を作動させるＥＳＭＶによって修復される損傷の例は、角膜剥離、角膜潰瘍および／または角膜瘢痕からあらゆる形態の網膜疾患に及ぶ。以下の非限定的な例に示される通り、ＥＳＭＶは網膜の内在的な再生能を誘導することによって、損傷網膜の再生を惹起する。
【００２８】
治療用ＥＳＭＶ画分は、以下の例に記載される通り、分画遠心法によってヒトＥＳＣなどの天然または培養哺乳動物ＥＳＣから得る。その存在は、既知のＥＳＣ特異的ｍＲＮＡ（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４）およびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−２９２、−２９４および−２９５）の存在の他、特定のＥＳＣ特異的表面タンパク質抗原（ＣＤ９、デルタ１、インテグリンα６、インテグリンβ１、ソニックヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグホモログ、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４およびＴＲＡ−１−６０）によって確認することができる。従って、治療用ＥＳＭＶ画分の存在は、多能性因子の特定の組合せを用いて確認することができる。このＥＳＭＶ画分をさらに分画して、細胞の脱分化を引き起こすか、特定の分化眼細胞の発生および機能に関与する遺伝子の発現を惹起し得る、ＥＳＭＶの全ＲＮＡまたは特定のｍＲＮＡとｍｉＲＮＡを含有するＲＮＡ画分を得てもよい。
【００２９】
ＥＳＭＶ画分は、眼科医により治療する疾患に有効であると判定された任意の送達方式によって眼球に投与することができる。例えば、緑内障には硝子体内適用が適すると考えられ、ＡＭＤおよび光受容体／ＲＰＥ変性は網膜下注射によって治療されると考えられる。送達はボーラス送達であっても、間欠送達であっても、持続送達であってもよく、特に限定されないが、送達ポンプまたはコンタクトレンズなどの装置によって投与してもよい。
【００３０】
他の非限定的な例では、ＥＳＭＶを眼球に局所投与して、例えば、網膜上皮異常およびドライアイを治療することができる。局所投与するためには、治療用ＥＳＭＶ画分をヒドロゲルマトリックス（例えば、Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｅｄｉｔｏｒ：Ｄａｎｉｅｌ  Ｅｂｅｒｌｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １６，ｐｐ．３４１−３６４のＺａｒｅｍｂｉｎｓｋｉら（２０１１）を参照されたい）などの持続放出性の媒体に包埋し、これをコンタクトレンズの角膜に隣接する側に付着させて、角膜疾患を治療したり、角膜再生を刺激したりすることができる。この画分は他にも、ポンプを備えた装置によって持続的または間欠的に投与してもよい。
【００３１】
本開示に従って治療することができる眼疾患としては、全眼区画内、涙産生腺内の細胞および眼球表面上または眼球表面付近の細胞の喪失、角膜細胞の喪失、前眼房疾患ならびに特に限定されないが加齢黄斑変性、糖尿病性網膜症、緑内障、網膜色素変性複合症および遺伝性網膜変性を含めた大部分の網膜変性疾患が挙げられる。本開示に従って治療することができるその他の眼球疾患としては、特に限定されないがブドウ膜炎、ドライアイ、眼部瘢痕性類天疱瘡、良性および悪性モーレン角膜潰瘍ならびに関節リウマチを含めた眼球に悪影響を及ぼす全身性ならびに局所性自己免疫障害が挙げられる。
【００３２】
眼科医の判断に従い、ＥＳＭＶ画分を罹患部位に反復投与することによって、特定の眼疾患を１回または複数回治療することができる。ＥＳＭＶ画分は単独で投与してもよく、また二次治療が投与するＥＳＭＶを不活性化しない限り、障害を治療することが知られている他の治療法と併用して投与してもよい。
【００３３】
以下、具体例を参照しながら本発明を説明する。ここに挙げる例は実施形態を説明するために記載されるものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解するべきである。
【実施例】
【００３４】
実施例１
マウスＥＳＭＶの単離および特徴付け
分化を抑制するＧＳＫ３β阻害剤を添加したＥＳＧＲＯ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＰＬＵＳクローングレード培地（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）中、ＳＶ１２９系統マウス由来の胚性幹細胞（ＥＳＣ）を無血清、無フィーダー条件下で拡大した。ゼラチンをコートしたＴ１７５ｃｍ２の培養フラスコに３．５×１０６個の細胞を播いた。ＥＳＣを３７℃、５％ＣＯ２の加湿したインキュベーターで培養した。毎日、ＥＳＣの増殖を顕微鏡でモニターし、新鮮な培地を加え、４８時間ごとに収集してＥＳＭＶを単離した。ＥＳＣの分化を回避しながらＥＳＭＶ収量を最大限にするため、４８〜７２時間ごとにＥＳＧＲＯ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いてＥＳＣを継代し、ＥＳＣコロニーを８０％のコンフルエンスで維持した。
【００３５】
毎日、ＥＳＣコロニーの分化の徴候を顕微鏡で視覚的に検査し、ＰｒｉｍｅｒＱｕｅｓｔ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ＤＮＡｓｉｔｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）によって設計されたマウス特異的プライマーペア：
2015514760.tif 000003
を用いたｑＲＴ−ＰＣＲによりＯｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇ  ｍＲＮＡの発現を評価した。
【００３６】
ＥＳＭＶを単離するため、５０ｍｌの遠心管に上清を収集し、３，５００ｇ、４℃で１時間回転させて、細片および破砕細胞をペレット化した。上清を慎重に超遠心管に移し、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｔｙｐｅ  ５０．２Ｔｉローターにより４℃、２００，０００ｇで３．５時間回転させて、ＥＳＭＶをペレット化した。次いで、ＥＳＭＶを使用するか分画して、小胞から得られたＲＮＡおよび／またはタンパク質を含む治療用組成物が得られる。
【００３７】
実施例２
ＥＳＭＶ分画によるＲＮＡの単離
低分子ＲＮＡ種を保持するｍｉｒＶａｎａ  ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を用いてマウスＥＳＭＶから全ＲＮＡを単離し、ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理してＤＮＡの痕跡を除去し、ＲＴ−ＰＣＲによりマウスＯｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ（実施例１のプライマーペア）およびＫｌｆ４、Ｌｉｎ２８ならびにｍｍｕ−ｍｉＲ−２９２−３ｐ、−２９４および−２９５（Ｔａｑｍａｎ（登録商標）プライマー）の転写産物の存在を調べた。
【００３８】
同様に、全ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを単離するｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて、ｈＥＳＣ由来ヒトＥＳＭＶ（ｈＥＳＭＶ）中のＲＮＡを抽出する。全ＲＮＡをＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０ヒト遺伝子発現アレイ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）とハイブリダイズさせる。標的の調製およびアレイのハイブリダイゼーションは、標準的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓプロトコルに従って実施する。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ７Ｇスキャナを用いてアレイをスキャンし、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｃｏｍｍａｎｄ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  １．１（ＡＧＣＣ）を用いて画像を得る。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘのプレゼントコールによって発現遺伝子を特定し、Ｐａｒｔｅｋ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ  ６．４およびデータ正規化のためのＲＭＡアルゴリズムを用いて解析する。有意な遺伝子を選定するための閾値を２倍以上に設定し、ＦＤＲ補正ｐ値を０．０５未満に設定する。マイクロＲＮＡには、Ｅｘｉｑｏｎ  ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡマイクロＲＮＡアレイを製造業者の指示書に従って使用する（Ｅｘｉｑｏｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ  ０１８０１）。Ａｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ  ４１００Ａスキャナを用いてｍｉＲＮＡアレイをスキャンし、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０ソフトウェアで処理する。ハウスキーピングｍｉＲＮＡと不変異体ｍｉＲＮＡとＮＬＹＺＥＤとの組合せを用いて生のｍｉＲＮＡデータを正規化し、Ｐａｒｔｅｋ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｕｉｔｅ  ６．４を閾値２倍以上およびＦＤＲ補正ｐ値０．０５未満で用いて解析する。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とのハイブリダイゼーションによりｈＥＳＭＶタンパク質の特徴付けを実施する。ｈＥＳＭＶ表面抗原をＥＳＣ表面マーカー１、インテグリンα６、インテグリンβ１、ソニックヘッジホッグ、ソニックヘッジホッグホモログ、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０およびＴＲＡ−１−８１についてフローサイトメトリーにより分析する。ｈＥＳＣ培養物から複数のバッチのｈＥＳＭＶを単離し、ＰＢＳで洗浄し、ＢＳＡおよびアジ化ナトリウムを添加したＰＢＳに再懸濁させ、対応する蛍光色素結合モノクローナル抗体を用いて染色する。ｈＥＳＭＶを培地に再懸濁させ、フローサイトメトリー分析に用いる。必要に応じてフローサイトメトリー分析および実験条件の最適化を最適化する。得られたデータをＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて解析する。
【００３９】
改変カブトガニアメーバ様細胞溶解物および合成発色基質を用いて内毒素を発色により広範囲（０．００５〜１ＥＵ／ｍｌ）で定量的に検出する、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用してｈＥＳＭＶ調製物をスクリーニングし、ｈＥＳＭＶ中に細菌内毒素が存在しないことを確認する。
【００４０】
実施例３
ミュラー細胞の培養
死後のヒト神経網膜に最初に由来するＭｏｏｒｆｉｅｌｄ／Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙのヒトミュラー１（ＭＩＯ−Ｍ１）細胞系が既に確立され、特性付けされた（Ｌｉｍｂら（２００２）Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４３：８６４〜８６９）。４５００ｍｇ／Ｌグルコース、ピルビン酸ナトリウムおよび安定化したＬ−グルタミンを含有し、１０％ｖｏｌ／ｖｏｌウシ胎仔血清（ろ過し、加熱不活性化したもの；Ｇｅｍｉｎｉ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ、ＣＡ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたＤＭＥＭ培地（ＧｌｕｔａＭＡＸ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中、ＭＩＯ−Ｍ１細胞を増殖には１７５ｃｍ２の組織培養フラスコで、ＥＳＭＶ処理実験には６ウェル細胞培養プレートで、３７℃、５％ＣＯ２の加湿したインキュベーター内で接着細胞系として維持した。コンフルエンスに達した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でフラスコから剥離し、完全細胞培地で洗浄し、いくつかの新たなフラスコに分けた。ミュラー細胞が６０％のコンフルエンスに達したときにＥＳＭＶ処理実験を開始した。
【００４１】
実施例４
ＥＳＭＶに誘導されたミュラー細胞の形態学的変化
２つの６ウェル細胞培養プレートにミュラー細胞を１×１０６個／ウェルで播き、６０％のコンフルエンスに達した後、ＥＳＭＶ処理を開始した。このＥＳＭＶ処理では、マウスＥＳＣを無血清、無フィーダー条件で増殖させた（上を参照されたい）Ｔ１７５ｃｍ２のフラスコ６個の培地を超遠心分離することによってペレット化したＥＳＭＶを直ちにミュラー細胞の培地に再懸濁させ、ミュラー細胞を培養した６ウェルプレートの内の１つの各ウェルに等体積で加えた。この手順を４８時間ごとに繰り返し、連続９回処理した。他の６ウェルプレートの対照ミュラー細胞培養物には、ＥＳＭＶ処理の代わりに培地の交換を実施した。６０％のコンフルエンスを維持するため、ＥＳＭＶ処理後、処理細胞および対照細胞ともに必要に応じて継代した。各処理後、Ｌｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＬ  ＬＥＤ顕微鏡を用いてＥＳＭＶ曝露ミュラー細胞および対照ミュラー細胞を観察した。
【００４２】
各処理の終了時、ＥＳＭＶによって誘導された形態学的変化を評価するため、ミュラー細胞を１００％エタノールで１５分間固定し、ハリスヘマトキシリンおよびエオシンＹで染色し、連続エタノール洗浄で脱水し、空気乾燥させ、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止試薬を加えてカバーガラスをかけた。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １３５Ｍ顕微鏡をＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＣｏｏｌＳｎａｐカメラとともに用いて、透過光微分干渉コントラスト画像を得た。各処理後のＥＳＭＶ曝露ミュラー細胞培養物と対照ミュラー細胞培養物に存在する細胞数を比較するため、Ｌｅｉｃａ  ＤＣＦ２９５デジタルカメラを用いて３〜４種類の視野の画像（６ウェル細胞培養プレートの各ウェルについて倍率２０倍で得た）を得た。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて各画像中の個々の細胞に印を付けて計数し、処理細胞／対照細胞比を計算した。
【００４３】
ＥＳＭＶ処理終了時、ＥＳＭＶ曝露ミュラー細胞の培地を吸引し、次いで、細胞を十分な量のＰＢＳで３回洗浄して、残ったＥＳＭＶを完全に除去し、ＲＮＡ単離および遺伝子発現試験のために収集した。
【００４４】
処理培養物も未処理（対照）培養物も、同じ継代、細胞数、およびコンフルエンスレベルのミュラー細胞から開始したものであるが、早くも１回目の処理後には対照細胞とＥＳＭＶ曝露細胞との間に形態学的な差が明白に現れた。対照細胞が典型的なミュラー細胞培養物に特徴的な均一な紡錘形の接着細胞のシートとして増殖したのに対して（図１Ａ）、曝露ミュラー細胞はＥＳＭＶ処理の進行に伴って個別の不均一な細胞として増殖し、細胞間の接着の減少、多数の突起をもつ細胞、星状細胞、多核細胞および片側にブートンと伸長突起をもつ細胞の存在を示した（図１Ｂおよび１Ｃ）。多くの場合、ＥＳＭＶ処理細胞の核が肥大し、多くのものに中期板が見られた。ＥＳＭＶ処理培養物と対照培養物との間の細胞数の比較では、処理群に総細胞数の有意な減少は認められなかった（図１Ｄ）。
【００４５】
上記のものとは別に、各治療後にＬｅｉｃａ  ＤＭ  ＩＬ  ＬＥＤ顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＥＳＭＶ曝露ミュラー細胞および対照ミュラー細胞を観察し、細胞数を求めるため、Ｌｅｉｃａ  ＤＣＦ２９５デジタルカメラを用いて３〜４種類の視野の画像（処理細胞および対照細胞の６ウェルプレートの各ウェルについて倍率２０倍で得た）を得た。Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて各画像中の個々の細胞に印を付け、計数した。処理群および対照群の各時点で１視野当たりの細胞数を求め、処理細胞／対照細胞の比を計算した。形態学的試験には、ミュラー細胞を１００％エタノールで１５分間固定し、ハリスヘマトキシリンおよびエオシンＹ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）で染色し、連続エタノール洗浄で脱水し、空気乾燥させ、ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えてカバーガラスをかけた。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  １３５Ｍ顕微鏡をＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃｓ  ＣｏｏｌＳｎａｐカメラ（Ｒｏｐｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔｕｃｓｏｎ、ＡＺ）とともに用いて、透過光微分干渉コントラスト画像を得た。
【００４６】
実施例５
ＥＳＭＶ処理ミュラー細胞のＲＮＡの解析
ｈＥＳＭＶをミュラー細胞培地に再懸濁させることによってヒトミュラー細胞培養物に加え、処理後８時間、２４時間および４８時間にＥＳＭＶ処理細胞および未処理細胞からＲＮＡを単離した。ＥＳＭＶ処理後のミュラー細胞における遺伝子発現変化の最初の解析には、３つの異なる条件下で培養したＥＳＭＶ処理ミュラー細胞および対照ミュラー細胞（ＥＳＭＶに曝露していないミュラー細胞、２００，０００ｇで３．５時間の超遠心分離後に残存していたＥＳＧＲＯ培地成分とともにインキュベートしたミュラー細胞および２００，０００ｇで３．５時間の超遠心分離後、ＭＥＦ培養物の馴化培地の成分で処理したミュラー細胞）から、ｍｉｒＶａｎａ（商標）ｍｉＲＮＡ単離キット（Ａｍｂｉｏｎ）を用いて全ＲＮＡを単離した。Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）を用いてＲＮＡを定量化および定性評価し、ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ）で処理した後、次の操作を実施した。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  ｆｏｒ  ｑＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＲＮＡをｃＤＮＡに転換した。マウスＥＳＭＶからヒトミュラー細胞への胚性遺伝子の移入を解析するため、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇに対する上記マウス特異的プライマーペアを使用し、Ｍｘ３０００ｐ  ｑＰＣＲ機器（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）にＢｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｓｙｂｒ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて増幅を検出した。全結果を、市販のプライマー（ＩＤＴ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）を用いて増幅したヒトハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（Ｇａｐｄｈ）に対して正規化した。比較定量化の２−ΔΔＣｔ法を用いて、遺伝子発現の相対的変化を求めた。
【００４７】
ヒトミュラー細胞におけるＥＳＭＶによる内在胚性遺伝子および初期網膜遺伝子の発現誘導を検出するため、ヒトＯｃｔ４、Ｐａｘ６およびＲａｘ遺伝子に対するＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマーならびにＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓのプロトコルおよび試薬（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用し、正規化にはＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｇａｐｄｈプライマーを使用した。
【００４８】
ｑＲＴ−ＰＣＲおよび種特異的プライマーを使用することにより、ＥＳＭＶによるマウスＥＳＣからのｍＲＮＡ転写産物の移入と、ＥＳＭＶによるヒトミュラー細胞の内在性転写産物の誘導とを判別した。マウスＯｃｔ４およびＳｏｘ２  ｍＲＮＡがＥＳＭＶから移入され、ＥＳＭＶ処理後４８時間のミュラー細胞で高値が維持されたのに対して（図２Ａおよび２Ｂ）、Ｎａｎｏｇの移入は処理後のいずれの時点でも観察されず（図２Ｃ）、ＥＳＭＶが選択的機序によって遺伝情報を移入することが示された。
【００４９】
ＥＳＭＶ処理ミュラー細胞のヒトＯｃｔ４  ｍＲＮＡは早くもＥＳＭＶ曝露後８時間で３倍に増加し、その後４０時間高値を維持したことから（図２Ｄ）、ＥＳＭＶによるミュラー細胞の内在性Ｏｃｔ４  ｍＲＮＡの誘導が曝露後間もなく開始され、数日間持続することが示された。網膜形成全体を通して多能性網膜前駆細胞により発現される転写因子をコードするＰａｘ６およびＲａｘ  ｍＲＮＡのレベルは、ＥＳＭＶ曝露後８時間で高値を示し、４８時間の時点でも持続することがわかった（図２Ｅおよび２Ｆ）。
【００５０】
ＥＳＭＶに曝露していないミュラー細胞の他にも２つの対照を用いることによって、上に挙げた結果がＥＳＭＶ処理に特異的なものであるという事実を裏付けた。すなわち、（ａ）ＥＳＣからＥＳＭＶを単離するのに使用したものと等体積のＥＳＧＲＯ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＰＬＵＳ培地を２００，０００ｇで３．５時間超遠心分離した後の残渣をミュラー細胞培地に再懸濁させ、次いで、ミュラー細胞培養物とともに８時間、２４時間または４８時間インキュベートして、特異的ｍＲＮＡの発現を変化させ得るかどうかを判定し；（ｂ）ＥＳＣからＥＳＭＶを単離するのに使用したものと同じ体積のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）培養物の培地を（ａ）と同様に処理して、ＥＳＣと異なる細胞によって放出された微小胞が被験ｍＲＮＡの発現を変化させ得るかどうかを調べた。
【００５１】
特異的プライマーを用いたｑＲＴ−ＰＣＲの後、ＥＳＭＶに曝露しなかったミュラー細胞およびＥＳＧＲＯ培地成分またはＭＥＦ馴化培地で処理した対照ミュラー細胞におけるマウスＯｃｔ４およびＳｏｘ２ならびにヒトＯｃｔ４、Ｐａｘ６およびＲａｘ  ｍＲＮＡのレベルは同じであった。これらの結果は、ＥＳＭＶとともにインキュベートした場合にのみミュラー細胞の特異的ｍＲＮＡのレベルが変化することを示している。
【００５２】
ｍｉＲＮＡ、低分子非コードＲＮＡは、ＥＳＣ多能性の遺伝子発現および維持ならびに細胞運命決定に重要な制御因子である。ＥＳＭＶには、ＥＳＣ多能性の維持に関与する２９０クラスターのＥＳＣ特異的ｍｉＲＮＡを含めたｍｉＲＮＡ［６］が極めて豊富に存在する。
【００５３】
実施例６
ｍｉＲＮＡ解析
ＥＳＭＶ処理ミュラー細胞および対照ミュラー細胞から全ＲＮＡを採取した後、ＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡ  ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイおよびＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を製造業者のプロトコルに従い使用して、３〜６つの生物試料についてｍｍｕ−ｍｉＲ−２９２−３ｐおよびｍｍｕ−ｍｉＲ−２９５とｓｎＲＮＡ  Ｕ６（内在性対照）との比較定量化を並行して実施し、各プライマーについて三つ組で実施し、２−ΔΔＣｔ法を用いてｍｉＲＮＡレベルの変化倍数を調べた。スチューデントｔ検定を用いてｍｉＲＮＡレベルの変化の有意性を評価した。ＴａｑＭａｎ（登録商標）アッセイ用の市販のプライマー配列は製造業者のウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ｇｅｎｏｍｅ／ｄａｔａｂａｓｅ／ｇｅｎｅ／ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．ｈｔｍｌ）からダウンロードすることができる。
【００５４】
ｍｉＲＮＡの移入が、ＥＳＭＶがミュラー細胞の遺伝子発現に影響を及ぼす機序の内の１つである可能性があることを示すため、以下の実験を実施した。ＥＳＭＶ処理後８時間、２４時間および４８時間のミュラー細胞について、ｑＲＴ−ＰＣＲを用い、哺乳動物細胞に遍在する低分子核ＲＮＡ、Ｕ６  ｓｎＲＮＡを正規化群として使用してｍｉＲＮＡ−２９２および−２９５の存在を試験した。成熟ｍｉＲＮＡ転写産物は長さが極めて短いため、ステムループＲＴプライマーを使用する戦略を用いた。ＥＳＭＶの濃縮法によってこのような短い転写産物のレベルが混合されるのを避けるため、ｍｉＲＮＡ移入をアッセイするｍＲＮＡ移入試験に以前使用したものと同じ全ＲＮＡ試料を使用した。
【００５５】
ｍｉＲＮＡ−２９２（図３Ａ）および２９５（図３Ｂ）はともに効率的にミュラー細胞に移入し、処理後４８時間持続することが明らかになり、ｍｉＲＮＡが分解されずにミュラー細胞の遺伝子発現変化に何らかの役割を果たすことが示された。
【００５６】
その他の試験では、ＥＳＭＶをミュラー細胞培地に再懸濁させることによってヒトミュラー細胞培養物に加え、曝露後８時間、２４時間および４８時間、ＥＳＭＶ処理細胞および未処理細胞からＲＮＡを単離する。
【００５７】
未処理ミュラー細胞に対するＥＳＭＶ処理ミュラー細胞のＲＮＡ発現の変化を、上に記載した通り、Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０ヒト遺伝子発現アレイ（Ａｆｆｉｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）とのハイブリダイゼーションにより確認する。
【００５８】
幹細胞の多能性維持に重要なｍＲＮＡ、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２およびＮａｎｏｇ、幹細胞特異的ｍｉＲＮＡ２９２および２９５ならびに初期網膜転写産物Ｐａｘ６およびＲａｘを、上に記載した通り、Ｔａｑｍａｎ（商標）Ａｓｓａｙを製造業者のプロトコルに従い使用してｑＲＴ−ＰＣＲにより調べる。
【００５９】
実施例７
ＥＳＭＶ処理網膜前駆細胞における遺伝子発現の解析
対照ミュラー細胞およびＥＳＭＶ処理ミュラー細胞の３つ（８時間および２４時間）および２つ（４８時間）の独立した生物試料由来のｃＤＮＡを、それぞれ三つ組でＡｇｉｌｅｎｔヒト８×６０Ｋ  ｃＤＮＡアレイ（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ、ＵＳＡ）とハイブリダイズさせることにより、ＥＳＭＶ曝露後８時間、２４時間および４８時間のミュラー細胞の転写応答と、同じ時間数培養した対照ミュラー細胞のトランスクリプトームとを比較した。ＲＭＡアルゴリズムをデータの正規化に用いた［３０］。有意な遺伝子を選択するための最小閾値を３ｌｏｇ２形質転換変化倍数以上に設定し、ＦＤＲ補正ｐ値を０．００１未満に設定した。２つの基準を同時に満たす遺伝子を有意に変化したものとした。
【００６０】
ミュラーグリアの既知のマーカー遺伝子をマイクロアレイで検出した（グルタミン合成酵素（Ｇｌｕ１）、クラスタリン（Ｃｌｕ）、ｄｉｃｋｋｏｐｆホモログ３（Ｄｋｋ３）、アクアポリン４（Ａｑｐ４）、Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１６、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、ビメンチン（ＶＩＭ）およびグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ））。
【００６１】
ＥＳＭＶ処理後の全３時点で１８９４種類の遺伝子が差次的に発現し、８０１種類の遺伝子がアップレギュレートされ、１０９３種類の遺伝子がダウンレギュレートされた（図４Ａ）。対照ミュラー細胞に対してＥＳＭＶ処理ミュラー細胞には密な遺伝子のクラスタリングが観察され、様々な遺伝子についてほぼ同じ遺伝子発現プロファイルが共通してみられた（図４Ｂ）。遺伝子発現変化の６０％超が処理後８時間までに生じた。ＥＳＭＶ処理後８時間では１４４４種類の遺伝子がアップレギュレートされ、１８７８種類の遺伝子がダウンレギュレートされ、ＥＳＭＶ処理後２４時間では１６２３種類の遺伝子がアップレギュレートされ、１８２８種類の遺伝子がダウンレギュレートされ、ＥＳＭＶ処理後４８時間では１７１１種類の遺伝子がアップレギュレートされ、１９０７種類の遺伝子がダウンレギュレートされていた。遺伝子発現変化の大部分（９５％）は２４時間後までに生じ、６２４種類の遺伝子のみが４８時間後の時点に特有なものであった（図４Ａ）。
【００６２】
遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析から、処理後２４時間および４８時間に差次的にレギュレートされていた遺伝子の多くが転写因子ファミリー、網膜形成、器官および生体の発生に関与する遺伝子、細胞間シグナル伝達分子、形態形成に関与する受容体、多数のサイトカインをコードする遺伝子、ならびに免疫応答遺伝子に属するものであることが明らかになった。機能的カテゴリーに分類すると（図５Ａ）、ＥＳＭＶ処理ミュラー細胞は、細胞移動および細胞外マトリックス組成、炎症、細胞の成長および増殖、傷害に対する組織応答、分子輸送、エネルギー代謝、胚発生、細胞の生存、ＤＮＡ複製に関与する多数の遺伝子、ならびに眼疾患に関与する遺伝子を差次的に発現したことがわかる（表Ｓ１）。全時点でＥＳＭＶ処理ミュラー細胞に差次的に発現した１８９４種類の遺伝子の多くが、特に以下に挙げる標準的なシグナル伝達経路と関係があることがわかっている：自然免疫細胞と獲得免疫細胞との間のコミュニケーション、Ｇ−タンパク質共役レセプターのシグナル伝達、ビタミンＤ受容体およびレチノイン酸Ｘ受容体の活性化（神経網膜の発生に関与する）、ＩＬ６シグナル伝達（網膜保護経路）、ニューレグリンシグナル伝達（網膜発生時の網膜神経細胞の生存および神経突起伸長の促進に何らかに役割を果たしている経路（Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ−ＭｃＤｏｎｏｇｈら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２２：１４２７〜１４３８））、ならびに軸索誘導（図５Ｂ）。
【００６３】
アップレギュレートされた遺伝子には、多能性遺伝子Ｏｃｔ４、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、およびＬＩＦ、初期網膜遺伝子Ｂｍｐ７、Ｏｌｉｇ２、ＦｏｘＮ４、Ｄｌｌ１、Ｐａｘ６、およびＲａｘ、ＩＬ６遺伝子、網膜保護特性を有することが知られているＣＳＦ２遺伝子および網膜再生誘導物質（ＦＧＦ２、ＩＧＦ２、ＧＤＮＦ）の遺伝子、ならびに組織リモデリングが可能な環境を生じさせることが知られているマトリックスメタロプロテイナーゼ３（ＭＭＰ３）の遺伝子などの多数の細胞外マトリックス修飾分子の遺伝子が含まれていた。ダウンレギュレートされた遺伝子には、ＤＮＭＴ３ａおよびＧＡＴＡ４などの分化を促進する遺伝子、アグリカン、ヘパリン硫酸、およびテネイシンなどの抑制性細胞外マトリックス成分の遺伝子、ならびにＧＦＡＰおよびコンドロイチン硫酸プロテオグリカンなどの抑制性瘢痕組織成分が含まれていた。上に挙げた遺伝子の発現変化は処理後２４時間および４８時間でより顕著であった。よく特徴付けられた多能性誘導因子、ｃ−Ｍｙｃの発現がミュラー細胞に検出されたが、これにはＥＳＭＶ処理の経過全体を通して変化が見られなかった。細胞周期への再進入、脱分化およびミュラー細胞における網膜幹細胞形質の活性化を制御する遺伝子、Ｈｅｓ１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ２、およびＮｅｕｒｏＤ１がＥＳＭＶ処理後８時間に大幅にアップレギュレートされ、ベースラインを上回るレベルの増加が維持されたが、他の時点では減少していた。網膜形成時に網膜前駆細胞をミュラーグリアへの運命に導くことに関与する遺伝子、ＥＧＦＲの発現は、全時点でダウンレギュレートされていた。
【００６４】
これらのミュラー細胞のトランスクリプトームに観察された、ＥＳＭＶ処理により誘導された変化は、おそらくこれらの細胞の増殖および再生プログラムの活性化を介したさらに脱分化した状態への移行を示している。
【００６５】
さらに、マイクロアレイデータの解析から、ＥＳＭＶに曝露したミュラー細胞において、水平およびアマクリン網膜神経細胞のマーカー、カルビンジン１、アマクリン細胞のマーカー、シンタキシン１ａ、および桿体光受容体のマーカー、ロドプシンを含めた様々な網膜系のマーカーをコードするいくつかの遺伝子がアップレギュレートされることが明らかになった。カルビンジン１の発現がＥＳＭＶ後４８時間で最も高かったのに対して、ロドプシンおよびシンタキシン１ａの発現は試験した全時点で増加していた。
【００６６】
以上の観察結果は、脱分化しているミュラー細胞のサブセットが他の網膜系の細胞にトランス分化することを示している。
【００６７】
実施例８
ＥＳＭＶ処理網膜前駆細胞におけるｍｉＲＮＡ発現の解析
ｍｉＲＮＡは網膜形成、網膜前駆細胞の初期段階から後期段階への進行の制御およびその様々な網膜細胞系への分化に何らかの役割を果たしている。そこで、ＥＳＭＶによってミュラー細胞に送達されたｍｉＲＮＡがミュラー細胞のｍｉＲＮＡおよびｍＲＮＡ発現プロファイルを変化させ、ミュラー細胞を脱分化状態に移行させるかどうかを明らかにする試験を実施した。
【００６８】
上に述べた通りに調製した全ＲＮＡ試料１μｇをＨｙ３（商標）で標識し、標識されたｍｉＲＮＡをｍｉＲＮＡアレイとハイブリダイズさせた。９２７／６４８／３５１のヒト／マウス／ラットｍｉＲＮＡおよび４３８のｍｉＲＰｌｕｓ  ｍｉＲＮＡを含むＥｘｉｑｏｎ  ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ  ｍｉＲＮＡアレイ（マイクロアレイｖ１１）を製造業者の指示書に従って用いた。ｍｉＲＮＡアレイスライドをＡｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ  ４１００Ａスキャナ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）でスキャンし、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で処理した。ハウスキーピングｍｉＲＮＡと不変異体ｍｉＲＮＡとの組合せを用いて生のｍｉＲＮＡデータを正規化した。６．４を閾値３倍以上およびＦＤＲ補正ｐ値０．０５未満で用いて、統計的な差のあるｍｉＲＮＡを選別した。ｍｉＲＢａｓｅオンラインデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｉｒｂａｓｅ．ｏｒｇ／）を用いて個々のｍｉＲＮＡを検討し、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ６．０ソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／）を用いてｍｉＲＮＡ標的予測解析を実施した。
【００６９】
結果
全体的には１７３種類のｍｉＲＮＡの発現がＥＳＭＶ処理によって変化し、この内２５種類のｍｉＲＮＡが試験した全時点で差次的に発現し（図７Ａ）、１１種類がアップレギュレートされ、１４種類がダウンレギュレートされていた（図７Ａ）。ＥＳＭＶ処理後８時間では２５種類のｍｉＲＮＡがアップレギュレートされ、１６種類がダウンレギュレートされ、ＥＳＭＶ処理後２４時間では３２種類のｍｉＲＮＡがアップレギュレートされ、２８種類がダウンレギュレートされ、ＥＳＭＶ処理後４８時間では８７種類のｍｉＲＮＡがアップレギュレートされ、６１種類がダウンレギュレートされていた（図７Ｂ）。ｍｉＲＮＡ発現の変化の大部分はＥＳＭＶ曝露後４８時間までに生じた。
【００７０】
発生中の網膜に高発現するｍｉＲ−１、ｍｉＲ−９６、ｍｉＲ−１８２およびｍｉＲ−１８３を含めたいくつかのｍｉＲＮＡがＥＳＭＶ処理ミュラー細胞においてアップレギュレートされた。ＥＳＣ多能性の維持に関与するｍｉＲＮＡクラスターである２９０クラスターに属するｍｉＲＮＡ（ｍｉＲ−２９１ｂ−５ｐ、−２９２、−２９４および−２９５）がアップレギュレートされ、ＥＳＭＶ曝露後４８時間にわたって増加が維持された。同時に、細胞周期進行を阻害し細胞分化を促進する、ｍｉＲ−ｌｅｔ−７クラスターに属するｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｂおよびｍｉＲ−ｌｅｔ−７ｃの発現がＥＳＭＶ処理後に減少した。Ｙａｎタンパク質の発現を抑制し光受容体の分化を促進するｍｉＲ−７［４４］および成体網膜中に極めて豊富に存在するｍｉＲ−１２５−２ｂが、ＥＳＭＶ処理後４８時間にわたってダウンレギュレートされた。試験した全３時点で大幅にアップレギュレートされたｍｉＲＮＡには、それぞれ細胞増殖を促進するｍｉＲＮＡ、骨格筋芽細胞および筋原性幹細胞の分化を阻害するｍｉＲＮＡのｍｉＲ−１３３ａ（３０倍に増加）およびｍｉＲ−１４６ａ（３７倍に増加）が含まれ、ｍｉＲ−１４６ａは網膜前駆細胞の分化を制御する経路と同じＮｏｔｃｈシグナル伝達経路を介して作用する。試験した全時点で大幅にダウンレギュレートされたｍｉＲＮＡには、それぞれＥＳＣ、神経芽細胞および平滑筋前駆細胞の分化を促進するｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ（７０分の１に減少）、ｍｉＲ−２１４（３７分の１に減少）およびｍｉＲ−１４３（１３分の１に減少）（Ｃｏｒｄｅｓら（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６０：７０５〜Ｕ７８０；Ｌｅｔｚｅｎら（２０１０）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５：ｅ１０４８０；Ｆｉｓｃｈｅｒら（２００１）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．４：２４７〜２５２）が含まれていた（図８）。ＥＳＭＶ曝露後のミュラー細胞に観察されたｍｉＲＮＡ発現変化のプロファイルは、ｍＲＮＡ発現変化に観察されたものと同じく脱分化を示している。
【００７１】
マイクロアレイの結果の妥当性を検証するため、多能性（ｍｉＲ−２９４、−１４６ａ、−１３３ａ）の維持および分化（ｍｉＲ−１９９ｂ−５ｐ、−２１４、−１４３）に関与するｍｉＲＮＡをいくつか選択した。ＥＳＭＶ処理後２４時間および４８時間（大部分のｍｉＲＮＡ発現変化に対応する時点）のミュラー細胞ならびに未処理対照細胞の全ＲＮＡ試料を、各ｍｉＲＮＡに特異的なステムループＲＴプライマーを含むＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡ  Ａｓｓａｙｓを用いたｑＲＴ−ＰＣＲに供した。ｑＲＴ−ＰＣＲの結果は、マイクロアレイスクリーニングによって観察された全被験ｍｉＲＮＡの発現パターンを裏付けるものであった（図８）。
【００７２】
実施例９
ＥＳＭＶに誘導された網膜前駆細胞のトランス分化の免疫細胞化学的解析
ＥＳＭＶで処理したミュラー細胞の培養物に観察された形態学的に不均一な細胞集団をさらに特徴付け、マイクロアレイデータの妥当性を検証するため、ＥＳＭＶ処理ミュラー細胞における様々な網膜細胞系のマーカーの発現を免疫細胞化学により未処理対照細胞と比較して検討した。
【００７３】
結果
６ウェル培養プレートに設置したポリ−Ｄ−リジンコートカバーガラスに、ＥＳＭＶによる処理を８回実施したミュラー細胞を播き、接着させ、６個のＴ１７５フラスコ由来のＥＳＭＶで上に述べた通りに処理した。２４時間後、ＥＳＭＶ処理細胞および対照細胞を０．１Ｍ  ＰＢＳで洗浄し、４％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ）で３０分間固定した後、０．１Ｍ  ＰＢＳで洗浄し、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有する１０％血清により室温で１時間ブロックした。３％血清、１％ＢＳＡおよび０．５％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含有するＰＢＳで一次抗体および二次抗体を希釈した。細胞を以下に挙げる一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした：ウサギモノクローナル抗Ｂｒｎ３ａ（１：５００、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、マウス抗−神経細胞核（ＮｅｕＮ）モノクローナル抗体（１：５００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗ＨＰＣ１（シンタキシン１ａ）モノクローナル抗体（１：１０００、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、マウス抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ６７（Ｇａｄ６７）モノクローナル抗体（１：０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、マウス抗１Ｄ４（ロドプシン）モノクローナル抗体（１：１０，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ウサギ抗ＧＳポリクローナル抗体（１：１０００、Ｓｉｇｍａ）、マウス抗パルブアルブミンモノクローナル抗体（１：１０００、Ｓｗａｎｔ、Ｍａｒｌｙ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびモルモット抗小胞グルタミン酸トランスポーター２（ｖＧｌｕＴ２）（１：１０，０００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）。次いで、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８、またはＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）と結合させ１：１０００に希釈したしかるべき二次抗体とともに、ＥＳＭＶ処理細胞および対照細胞を、室温で１〜２時間インキュベートした。核対比染色色素ＤＡＰＩ（４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いてスライドにカバーガラスを載せ、乾燥させ、画像の取り込みおよび処理にＯｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗソフトウェアを用いるＯｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１０００共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ）で画像を得た。
【００７４】
少数のＥＳＭＶ処理細胞にミュラー細胞マーカーの他、グルタミン合成酵素（ＧＳ）（図９Ａおよび９Ｂ）、アマクリン細胞および水平細胞のマーカー、Ｇａｄ６７（図９Ａおよび９Ｃ）、アマクリン細胞および網膜神経節細胞のマーカー、ＮｅｕＮ（図９Ｇおよび９Ｉ）、網膜神経節細胞のマーカー、Ｂｒｎ３ａ（図９Ｍ）、ならびにアマクリン細胞のマーカー、シンタキシン１ａ（図９Ｏ）に対する免疫反応性が観察された。ここに挙げたマーカーはいずれも、未処理対照培養物には存在しなかった（図９Ｇ〜９Ｌ、９Ｎ、９Ｐおよび９Ｒ）。興味深いことに、ごく少数の処理細胞では桿体光受容体のマーカー、ロドプシンに対する免疫反応性が主に細胞質顆粒中に局在して見られた（図９Ｑ）。双極細胞および水平細胞のマーカーであるパルブアルブミンならびに双極細胞および光受容体細胞終末のマーカーである小胞グルタミン酸トランスポーター１に対する免疫反応性は認められなかった。一次抗体を加えない場合、染色は観察されなかった。
【００７５】
このデータは、ＥＳＭＶ処理がミュラー細胞から網膜神経系の細胞へのトランス分化、水平細胞や双極細胞ではなく主としてアマクリン細胞および網膜神経節細胞へのトランス分化を誘導することを示唆している。他にもＥＳＭＶ曝露後のロドプシンのごくわずかな発現は、ＥＳＭＶ処理が光受容体系の遺伝子を少なくとも部分的に活性化することを示唆している。
【００７６】
実施例１０
処理網膜前駆細胞における転写レベル変化の妥当性の検証
ＥＳＭＶ処理を２４時間および４８時間実施したミュラー細胞（再生細胞集団の代表的な細胞）のＲＮＡをｑＲＴ−ＰＣＲで検証した通り、脱分化（サイクリンＤ２、ＢＭＰ７）、網膜保護（ＩＬ６、ＩＧＦ２）、修復および組織リモデリング（ＭＭＰ３）の過程に関与する遺伝子ならびに瘢痕形成（ＧＦＡＰ）およびＥＣＭ成分阻害（アグリカン）に関与する遺伝子のサブセットの発現プロファイルではいずれも、マイクロアレイでＥＳＭＶ処理群に有意な変化が見られた。この２つの時点は、網膜の保護および再生の過程に関与する遺伝子の発現変化の大部分が２４時間および４８時間以内に観察されたことを理由に選択した。
【００７７】
被験遺伝子はいずれも、マイクロアレイで観察されたものと同じ制御パターンを示した（図６）。特に、成体イモリの網膜を含めた器官の修復時にアップレギュレートされるマトリックスメタロプロテイナーゼをコードし、高レベルで存在する場合には移植された光受容の網膜への組込みを促進するＭＭＰ３  ｍＲＮＡが、マイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲ実験で大幅にアップレギュレートされることが明らかになり、ＩＬ６  ｍＲＮＡも同じく大幅にアップレギュレートされた。このｍＲＮＡが発現するインターロイキンは内部網膜神経細胞に対する保護効果を示すことが明らかにされている。一方、正常なグリア細胞の分化および発生に必要なコンドロイチン硫酸プロテオグリカンをコードするアグリカン遺伝子は、マイクロアレイおよびｑＲＴ−ＰＣＲ試験でダウンレギュレートされた遺伝子に含まれ、マウスゲノムから削除すると網膜移植片の組込みが改善される遺伝子、ＧＦＡＰもこれと同様であった。
【００７８】
ＥＳＭＶ処理ミュラー細胞および対照ミュラー細胞の独立した試料のｑＲＴ−ＰＣＲ解析を実施して、ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡマイクロアレイのデータの発現変化の妥当性を検証した。マイクロアレイ解析では、目的とする遺伝子の発現変化の大部分がＥＳＭＶ曝露後２４時間および４８時間に生じることが示されたため、この２つの時点をアレイの妥当性検証に用いた。ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡを単離し、プロトコルに従ってオンカラムＤＮアーゼ消化に供した。遺伝子発現変化の妥当性検証には、上に記載した通りにＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙプロトコル（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ｈｔｔｐｓ：／／ｐｒｏｄｕｃｔｓ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ／ａｂ／ｅｎ／ＵＳ／ａｄｉｒｅｃｔ／ａｂ？ｃｍｄ＝ｃａｔＮａｖｉ−ｇａｔ２＆ｃａｔＩＤ＝６０１８０３）により、ゲノムＤＮＡが増幅される可能性を排除するためエキソン−エキソンジャンクションを挟むよう選択された以下に挙げるＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー：ＢＭＰ７、ＩＬ６、ＭＭＰ３、ＩＧＦ２、サイクリンＤ２、アグリカンおよびＧＦＡＰを用いてｑＰＣＲを実施し、Ｇａｐｄｈを内在性対照として用いた。各実験には、特異性がありＤＮＡ汚染がないことを示すため、逆転写酵素を加えない試料および鋳型を加えない試料を含めた。
【００７９】
ｍｉＲＮＡアレイの妥当性検証には、以下に挙げるＴａｑＭａｎ（登録商標）ｍｉＲＮＡ  ａｓｓａｙｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、上記リンク）：ｈｓａ−ｍｉＲ−１４６ａ、ｈｓａ−ｍｉＲ１３３ａ、ｍｍｕ−ｍｉＲ−２９４、ｈｓａ−ｍｉＲ−１９９−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１４＊、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３を製造業者のプロトコルに従って使用し、ｓｎＲＮＡ  Ｕ６に対して正規化した。試験した各ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡに２−ΔΔＣｔ法を用いて遺伝子発現の変化倍数を計算し、各試料について３つの生物学的複製物を並行して実施し、各プライマーについて三つ組で実施した。スチューデントｔ検定を用いて遺伝子発現変化の有意性を評価した。
【００８０】
実施例１１
ＮＭＤＡ損傷マウス網膜におけるｈＥＳＭＶの治療活性の妥当性検証
網膜グリア細胞およびミュラー細胞をＥＳＭＶに曝露する上記試験の結果は、網膜ではＥＳＭＶが静止状態のグリア前駆体ミュラー細胞から幹細胞形質への脱分化、細胞周期への再進入、ミュラー細胞微小環境の組織再生が一層可能な状態への変化および再生に導く網膜形成プログラムを誘導することを示唆するものである。
【００８１】
マウス２７匹を用いた初期の試験では、若年成体（約７週齢）の各マウスの両眼にＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ、ＮＭＤＡ受容体を活性化することによって細胞内へのカルシウムイオン流入、活性酸素種発生を引き起こし、最終的には網膜の神経節細胞層および内顆粒層の両方の神経細胞アポトーシスをもたらす興奮性毒物）を硝子体内注射することによって網膜神経節細胞（ＲＧＣ）および内部網膜神経細胞の損傷を誘発した。影響を受けたニューロンの細胞死がＮＭＤＡ投与後２４時間以内に起こるため、４８時間後、ＢｒｄＵとフルオレセインとを含有するＥＳＭＶ懸濁液１μｌ（５０μｇ〜２５０ｇ）を左眼の網膜下に注射し、損傷を受けた右眼（対照）にはＥＳＭＶ懸濁液と同じ濃度のＢｒｄＵとフルオレセインとを含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１μｌを注射した（網膜下注射とともに、または網膜下注射を実施せずに、硝子体内に注射してもよい）。硝子体内のＢｒｄＵのほとんどが６時間以内に眼内から除去されるため、注射当日およびその後６日間毎日、ＢｒｄＵを腹腔内に注射した。ＥＳＭＶ曝露後のＮＤＭＡ損傷網膜内で増殖する細胞がＣＲＡＬＢＰ（ミュラーグリアマーカー）、シンタキシン１ＡおよびＧａｄ６７（ともにアマクリン細胞マーカー）を発現する。
【００８２】
結果
ＰＢＳを注射した網膜には、蛍光顕微鏡法によりＢｒｄＵ標識細胞は観察されなかったが、ＥＳＭＶ処理眼には、注射後７日（図１０Ｂ、図１１Ｂおよび図１２Ｂ）および注射後３０日（図１０Ｅ、図１１Ｅ、図１２Ｅ）に少数の細胞のＢｒｄＵ染色が観察された。ＢｒｄＵ陽性細胞は、内顆粒層（ＩＮＬ）の最も深い列にあり、主としてアマクリンニューロンの核によって占められる領域およびＧＣＬ（図１０Ｂ、図１１Ｂおよび図１２Ｂ）に位置していた。ＥＳＭＶ注射後３０日（図１０Ｅ、図１１Ｅおよび図１２Ｅ）には、ＢｒｄＵ陽性細胞の数が注射後３日（図１０Ｂ、図１１Ｂおよび図１２Ｂ）のＢｒｄＵ陽性細胞の数に比べて減少していたが、ＩＮＬに隣接する内網状層（ＩＰＬ）には依然としてＢｒｄＵ陽性細胞が見られた。増殖細胞の大部分が、よく特徴付けられたミュラー細胞マーカー、ＣＲＡＬＢＰを発現し（図１２Ａおよび図１２Ｄ）、ミュラー細胞がＥＳＭＶ処理に応答して増殖することが示された。ＥＳＭＶ注射後３０日に観察した増殖細胞の一部はシンタキシン１ａ（図１１Ｄ）およびＧａｄ６７（図１０Ｄ）を発現し、これらの細胞がアマクリン系に沿って分化したことを示していた。さらに、９個体の内５個体にＥＳＭＶ注射後３０日のＥＲＧ  ｂ波の顕著な改善（ＮＭＤＡ損傷後よりも約５１％〜６５％高い振幅）が認められ、ＥＳＭＶ処理による網膜機能の回復を反映していた（図１３）。
【００８３】
実施例１２
ヒトＥＳＭＶの単離
Ｈ１およびＨ９ヒトＥＳＣ系（ｈＥＳＣ）を無血清、無フィーダー条件下で培養し拡大する。簡潔に述べれば、ｈＥＳＣをＣＥＬＬｓｔａｒｔ（商標）ＣＴＳ（商標）合成基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、無フィーダーでｈＥＳＣを培養するのに通常使用される２種類の合成異種成分不含培地、ＴｅＳＲ２とＮｕｔｒｉｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の比を１：１にして増殖させる。培地を毎日交換して細胞を維持する。このような条件下では、ｈＥＳＣは典型的な未分化の形態を示し、多能性マーカー、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４およびＳｏｘ２を発現する。しかし、ｈＥＳＣ組成の一貫性を維持するため、培養物を毎日観察し、分化したと思われるコロニーがあれば、培地を交換する前に手作業で除去する。４〜６日ごとに細胞を機械的に継代する（Ｋａｒｕｍｂａｙａｒａｍら（２０１２）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１（１）：３６−４３）。コンフルエントなプレートは通常、１：６に分割する。
【００８４】
ｈＥＳＭＶの収集には、第４日〜６日のＨ１およびＨ９  ｈＥＳＣ培養物から培地を収集し、３，５００ｇで１時間回転させて細片および破砕細胞をペレット化する。次いで、上清に２００，０００ｇの超遠心分離および洗浄段階を連続的に実施して精製ｈＥＳＭＶペレットを得る（Ｋａｔｓｍａｎら（２０１２）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７（１１）：ｅ５０４１７））。ＥＳＭＶ調製物中のタンパク質およびＲＮＡ含有量を測定して、単離プロトコルの一貫性を確認する。
【００８５】
ＵＣＬＡ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ研究所でｈＥＳＭＶをマイコプラズマ、内毒素、好気性細菌、嫌気性細菌および真菌について試験する。
【００８６】
実施例１３
ｈＥＳＭＶの特徴付け
上記２種類のｈＥＳＣ系には外因性シグナルに対する応答および様々なマーカーの発現に差が見られるため、この２種類の細胞に由来するｈＥＳＭＶのｍＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびタンパク質をｍＥＳＭＶと比較する（Ｇｉｎｉｓら（２０１２）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２６９（２）：３６０−３８０）。全ＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを単離するｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、Ｈ１およびＨ９  ｈＥＳＣ由来のｈＥＳＭＶならびにＹｕａｎら（（２００９）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４（３）：ｅ４７２２）に記載されているプロトコルに従って作製されたｍＥＳＣ系由来のｍＥＳＭＶのＲＮＡを抽出する。各ＲＮＡ試料を分ける。一方をｍＲＮＡ解析に使用し、他方をｍｉＲＮＡ解析に使用する。ＲＮＡ定量化の相対標準曲線法を用いて、ｑＲＴ−ＰＣＲによりＥＳＣ特異的ｍＲＮＡ（Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８およびＫｌｆ４）ならびに２９０および３０２〜３６７クラスターのｍｉＲＮＡの存在を解析する。さらに、ＵＣＬＡ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｃｏｒｅ施設で標準的なＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓプロトコルに従って、ヒトおよびマウスの全ＲＮＡをそれぞれＡｆｆｉｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０ヒト遺伝子発現アレイおよびＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  ４３０  ２．０発現アレイとハイブリダイズさせる。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ７Ｇスキャナを用いてアレイをスキャンし、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｃｏｍｍａｎｄ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  １．１を用いて画像を得る。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘプレゼントコールにより発現遺伝子を同定する。Ｐａｒｔｅｋ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｓｕｉｔｅ  ６．４を用いて、差次的に発現したヒトおよびマウスの遺伝子を解析し、データの正規化にはＲＭＡアルゴリズムを用いる。有意な遺伝子を選択するための閾値を２倍以上に設定し、ＦＤＲ補正ｐ値を０．０５未満に設定する。２つの基準を同時に満たす遺伝子に有意差があるものとする。
【００８７】
他にもヒトおよびマウスのマイクロＲＮＡ解析を実施する。Ｅｘｉｑｏｎ  ｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡマイクロＲＮＡアレイを製造業者の指示書に従って使用する。Ａｘｏｎ  ＧｅｎｅＰｉｘ  ４１００Ａスキャナを用いてｍｉＲＮＡアレイをスキャンし、ＧｅｎｅＰｉｘ  Ｐｒｏ  ６．０ソフトウェアで処理する。ハウスキーピングｍｉＲＮＡと不変異体ｍｉＲＮＡとの組合せを用いて生のｍｉＲＮＡデータを正規化する。Ｐａｒｔｅｋ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｕｉｔｅ  ６．４を閾値２倍以上およびＦＤＲ補正ｐ値０．０５未満で用いて、統計的な差のあるｍｉＲＮＡを選別する。
【００８８】
マイクロアレイ実験で明らかになったヒトＥＳＭＶとマウスＥＳＭＶとの間の転写産物およびｍｉＲＮＡレベルの差の妥当性を、ｈＥＳＭＶおよびｍＥＳＭＶ試料中の対応するｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ解析により検証する。ｑＲＴ−ＰＣＲ用のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて全ＲＮＡをｃＤＮＡに変換し、ゲノムＤＮＡが増幅される可能性を排除するためエキソン−エキソンジャンクションを挟むよう選択されたＴａｑＭａｎ（登録商標）プライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｑＰＣＲを実施し、内在性対照としてｃＤＮＡにはＧａｐｄｈ、マイクロＲＮＡにはｓｎＲＮＡ  Ｕ６を用いる。試験した各遺伝子およびｍｉＲＮＡに２−ΔΔＣｔ法を用いて遺伝子発現の倍数差を計算し、各試料について３つの生物学的複製物を並行して実施する。スチューデントｔ検定を用いて発現差の有意性を評価する。
【００８９】
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＰｒｏｔｏＡｒｒａｙ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭｉｃｒｏａｒｒａｙとのハイブリダイゼーションによりｈＥＳＭＶタンパク質の特徴付けを行う。ｍＥＳＭＶを用いて損傷網膜の再生を刺激することが明らかになっているＩＬ６、ＦＧＦ２およびＩＧＦ２などのタンパク質の存在および量を、ｈＥＳＭＶについてウエスタンブロット分析により調べる。
【００９０】
ｈＥＳＭＶおよびｍＥＳＭＶ表面抗原をＥＳＣ表面マーカー、ＣＤ９、ＣＤ１３３、デルタ１、インテグリンα６およびβ１、ソニックヘッジホッグ、Ｔｈｙ１、ＳＳＥＡ１、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＴＲＡ−１−６０ならびにＴＲＡ−１−８１についてフローサイトメトリーにより比較する。ｈＥＳＣおよびｍＥＳＣの培養物から複数のバッチのｈＥＳＭＶおよびｍＥＳＭＶをそれぞれ単離し、ＢＳＡおよびアジ化ナトリウムを添加したＰＢＳに再懸濁させ、対応する蛍光色素結合モノクローナル抗体を用いて染色する。必要に応じて実験の最適化を実施し、ＵＣＬＡのＦｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｃｏｒｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙでフローサイトメトリー解析を実施する。ＣＥＬＬＱｕｅｓｔソフトウェアを用いて、得られたデータを解析する。
【００９１】
実施例１４
別法によるｈＥＳＭＶの単離および特徴付け
Ｈ１由来ｈＥＳＭＶに高度に発現し、Ｈ９由来ｈＥＳＭＶには発現しないｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡがあるか、その逆のｍＲＮＡまたはｍｉＲＮＡがある場合、別の試験方法を用いる。
【００９２】
ミュラー細胞をｈＥＳＭＶ（ｍＥＳＭＶのインキュベーションとほぼ同じ量のタンパク質）とともに８時間、２４時間および４８時間培養する。未処理対照ミュラー細胞との比較により形態学的変化を評価し、ｍＥＳＭＶに曝露した後も同様に評価する。培地を吸引後、ミュラー細胞を十分な量のＰＢＳで３回洗浄して、残ったｈＥＳＭＶを完全に除去する。次いで、細胞からＲＮＡを単離し、ＲＴ−ｑＰＣＲによって遺伝子発現変化（ｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ）を判定する。
【００９３】
実施例１５
ｈｉＰＳＭＶを用いる損傷網膜の再生
以下の試験を実施して、培養したヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）から得られたヒト微小胞、ヒト誘導多能性幹細胞微小胞（ｈｉＰＳＭＶ）が、選択されたｈＥＳＭＶのｍＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ組成と同等の組成を有するかどうかを判定し、培養した前駆体網膜ミュラー細胞に対するｈｉＰＳＭＶの効果を試験する。Ｋａｒｕｍｂａｙａｒａｍら（（２０１２）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１（１）：３６−４３））に記載されているプロトコルに従ってｈｉＰＳＣの系列がいくつか作製されている。異種成分不含条件下で誘導および再プログラムし（Ｓｏｍｍｅｒら（２００９）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２７：５４３−５４９）、ＧＭＰに従って特徴付けを行ったＮＨＤＦおよびＦｉｂｒｏｇｒｏ  ｈｉＰＳＣ系を用いる。上記ｈＥＳＣからｈＥＳＭＶを得るのに用いたプロトコルと同じプロトコルに従って、第１５継代ｈｉＰＳＣから微小胞を単離し、ｈＥＳＭＶについて記載した通りにミュラー細胞に対するｈｉＰＳＭＶの効果を試験する。
【００９４】
選択されたｈＥＳＭＶによって、ｍＥＳＭＶで観察された結果とほぼ同じ結果が前駆体ミュラー細胞に対して得られることがインビトロ試験で示された場合、対応するＧＭＰグレードのｈＥＳＣ系をＷｉＣＥＬＬ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）から得る。この細胞を、選択された社内ＧＭＰ適合ｈｉＰＳＣ系とともにＵＣＬＡ  ｉＰＳＣ  ＧＭＰ研究所にてＧＭＰ適合条件下で培養し、マウスに対するインビボ効果の試験のために確立された上記プロトコルに従って、ＧＭＰグレードのｈＥＳＭＶおよびｈｉＰＳＭＶを得る。
【００９５】
実施例１６
急性ＮＭＤＡ損傷マウスモデルにおけるｈＥＳＭＶによる損傷網膜の再生
ＥＳＭＶが損傷網膜の内在的な再生能を誘導して、静止状態の常在前駆細胞の脱分化、増殖および初期網膜プログラムの発動を刺激し、場合によっては網膜を再構成するかどうかを判定するため、以下の試験を実施した。
【００９６】
１．網膜機能
Ｊｕｌｅｓ  Ｓｔｅｉｎ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＬＩＦＥ（Ｌｉｆｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）Ｃｏｒｅ施設で暗順応および明順応ＥＲＧを測定する。ＥＲＧの利点は、生きている動物の網膜の機能の評価が可能であり、連続的に反復して経時的に機能を測定することができる点にある。試験前にＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスのコホートの各眼球から記録を取り、その網膜機能に関する情報を収集する。次いで、ＮＭＤＡの眼内注射によってすべての網膜に急性の損傷を引き起こし、翌日、各マウスの両眼にＥＲＧを実施して、損傷のレベルを評価する。マウスを２つのグループに分ける。ＮＭＤＡ注射後３日目に、様々な用量（無菌生理食塩水１μｌ当たり１０ｎｇ、２５ｎｇ、５０ｎｇ、１７５ｎｇおよび２５０ｎｇのＲＮＡ）の上記の通りに選択されたｈＥＳＭＶを一方のグループは網膜内に、他方のグループには網膜下に注射する。一方の眼球にｈＥＳＭＶを注射し、他方の眼球は対照としてＰＢＳを注射する。送達方法の効果を比較するため、ｈＥＳＭＶ注射後１４日目および３０日目に、眼球内に注射したマウスおよび網膜下に注射したマウスについてＥＲＧにより網膜機能を検査し、ｈＥＳＭＶ処理眼および未処理眼のＥＲＧ  ｂ波のピーク振幅から機能回復の％を計算する。各実験群の一部の個体を同じ時点で屠殺し、眼球を固定し、共焦点顕微鏡および電子顕微鏡を用いた形態学的検査用に処理する。網膜形態の改善とＥＲＧ所見とを相関させて、ｈＥＳＭＶの最も効果的な送達方法および投与量を決定し、これを次の試験に用いる。
【００９７】
ＮＭＤＡ損傷網膜を有するマウスにおいてＧＭＰ適合ｈＥＳＭＶの統計的に有意で再現性のある治療活性を得るため、最も効果的であることが明らかになった投与量および送達方法を用いて、それぞれ１５個体からなる３つのコホートのマウスの左眼をｈＥＳＭＶで処理し、右眼をＰＢＳで処理する。ｈＥＳＭＶ注射後１４日目および３０日目に、８個体の未処理マウスの眼およびコホート１の各マウスの両眼から暗順応および明順応ＥＲＧ応答を記録する。機能回復および細胞救出を定量化する。さらに、１回目の注射後５日目に、コホート２および３のマウスに２回目のｈＥＳＭＶ投与を実施し、さらに５日後、コホート３の個体に３回目のｈＥＳＭＶ投与を実施する。他にも、１回目のｈＥＳＭＶ注射後１４日目および３０日目にコホート２および３のマウス３０個体の眼のＥＲＧを記録する。得られた結果から、より良好な転帰を確実に得るのにｈＥＳＭＶ処理を反復する必要があるかどうかを判定することができる。
【００９８】
実施例１７
ｈＥＳＭＶ処理後の細胞増殖の特徴付け
免疫組織化学を用いて、細胞増殖のマーカーのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）と網膜細特異的マーカーとの共局在を調べる。ＮＭＤＡ損傷網膜を有するマウスの左眼にＢｒｄＵを上に記載した通りにｈＥＳＭＶとともに注射する。同じマウスの右眼を対照として使用し、ＰＢＳで希釈したＢｒｄＵを投与する。しかるべき時点でマウスを灌流し、眼球を摘出して固定し、免疫組織化学用に処理する。いずれの細胞型が増殖および網膜再生によってｈＥＳＭＶ曝露に応答しているかを判定するため、網膜切片をＢｒｄＵおよび網膜細胞特異的マーカー（ロドプシン（桿体）、錐体オプシン（錐体）、Ｂｒｎ３ａ（神経節細胞）、シンタキシン１ａおよびＧａｄ６７（アマクリン細胞）、およびグルタミン合成酵素（ミュラー細胞））に対する抗体で二重染色または三重染色する。
【００９９】
実施例１８
ｈＥＳＭＶ処理の安全性プロファイル
安全性を評価するため、マウスの長期生存を判定し、組織学的検査により眼球、脳、肝臓および腎臓における器官損傷および腫瘍形成の徴候を調べる。組織学的プロファイリング、プロテオミクスプロファイリングおよび遺伝子発現プロファイリングを用いて、眼球微小環境内におけるｈＥＳＭＶの免疫原性の可能性を評価する。硝子体内および網膜下の２つの投与経路を独立して試験する。ＮＭＤＡによる損傷を与えていないマウスの無傷眼球で最初の試験を実施する。経時的な免疫反応の試験を評価し、初期および後期両方の効果を検討する。
【０１００】
炎症性細胞の流入、ブドウ膜炎は、異種タンパク質曝露後２４時間以内に起こるか、発症に２〜３週間かかり得る。１時点当たり計５〜１０個体のｈＥＳＭＶ注射眼および対照眼（注射後１日、７日、１４日および２１日）ともに組織学的に評価して、炎症性細胞の有無および網膜の完全性を確認する（Ｃａｓｐｉら（２００８）Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｒｅｓ．４０：１６９−１７４；Ｃａｓｐｉら（２０１０）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２０：３０７３−３０８３）。固定プロトコルにより、保存組織の免疫組織化学を実施する能力を維持する。細胞の浸潤が観察される場合、標準的な盲検化により眼球を等級分けし、免疫組織化学を用いて浸潤細胞を同定する。ＣＤ３、ＣＤ２０およびＣＤ６８マーカーを用いて、その細胞がＴ細胞系であるのか、Ｂ細胞系であるのか、マクロファージ系であるのかを確定する。
【０１０１】
組織学的検査に加えて、網膜細胞のアポトーシスを探すためトンネル染色を実施する。これらの試験では、視神経に隣接する網膜を通る水平切片を染色し、顕微鏡を用いて分析および定量化する。ヒト由来ＭＶのマウス内への移入が異種間移植に続発する応答を誘導する場合、これらの試験を免疫不全マウスで再び実施する。
【０１０２】
細胞炎症性応答が認められなければ、炎症誘発性分子ならびに免疫および炎症に関与する遺伝子のアップレギュレーションのプロテオーム解析を用いて、ｈＥＳＭＶに曝露した眼球を試験する。全眼を、ＲＮＡ単離には無ＲＮアーゼ条件を用いて調製し、タンパク質抽出にはプロテアーゼ阻害剤のカクテルを用いて調製する。ブドウ膜組織およびガラス体を単離してホモゲナイズし、ＲＮＡ用には標準的なキットを用いて抽出するか、タンパク質用には特異的抽出緩衝液（５０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＮＰ−４０、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍｌロイペプチン、１０μｇ／ｍｌアプロチニンおよび１ｍＭオルトバナジウム酸ナトリウム）を用いて抽出する。これらの試験は他にも、ｈＥＳＭＶ注射後１日、７日、１４日および２１日の４つの時点で実施する。最初に、１グループ当たり４眼のプール（実験眼、もう一方の対照眼および注射を実施しなかった個体の未処理眼）をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ２．０  ＳＴアレイでの遺伝子発現解析に使用し、結果の評価には遺伝子発現ソフトウェアを用いる。２６−ｐｌｅｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘアレイを用いてタンパク質抽出物にマウスサイトカイン解析を実施する。この解析では以下のものについて試験する：エオタキシン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ４０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１−アルファ、ＩＬ−１−ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＩＰ−１０、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１アルファ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファおよびＶＥＧＦ。免疫応答が誘発される予想外の事象が生じた場合、短期培養での免疫細胞を用いるリンパ球刺激試験によってその病理学的帰結を確認する。
【０１０３】
実施例１９
ｈＥＳＭＶによるヒトａｒＲＰのｒｄ１マウスモデルの損傷網膜の修復
ｒｄ１マウスは、Ｐｄｅ６ｂ遺伝子の欠損：エキソン７のコドン３４７のＣ−＞Ａ変異によって引き起こされる網膜変性を有する。ｒｄ１の網膜に生後間もなく桿体光受容体の喪失が始まり、急速に進行する。生後８日（Ｐ８）に桿体の内節にミトコンドリアの膨潤が見られ、次いで規則正しく積み重なった外節円盤が崩壊し、Ｐ１２までに最大長が極めて短くなり（正常な桿体と比較して）；Ｐ１０に光受容体の核が濃縮し始める。その後数日間で桿体の細胞死が相次いで起こることにより、光受容体の核が含まれている網膜外顆粒層（ＯＮＬ）が急速に薄くなる。Ｐ２１までに桿体のほとんどが死滅し、この時点で網膜には錐体のみ（光受容体全体の３％）が残り、その後死滅する。
【０１０４】
上に記載した実施例で決定した送達方法および投与量を用いて、ｒｄ１マウスにおけるｈＥＳＭの治療活性を調べる。様々な発生時点でｈＥＳＭＶ処理の効果を試験し、網膜損傷のレベルがミュラー細胞のｈＥＳＭＶ活性化に影響を及ぼすかどうかを判定する。Ｐ５、Ｐ８、Ｐ１２、Ｐ１５およびＰ２０にｈＥＳＭＶを注射し、ＥＳＭＶ注射後１４日目および３０日目に記録したＥＲＧのａ波（光受容体応答）の振幅の増加によって網膜機能の改善が示される。変性開始時、変性中および変性後の外顆粒層の幅を定量化し（Ｄａｎｃｉｇｅｒら（２０００）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  １１：４２２−４２７）、その数値を同週齢正常マウスの網膜のＯＮＬの数値と比較して％回復を求めることにより、また修復された細胞型の免疫組織化学的同定により、結果をｈＥＳＭＶ処理網膜およびｒｄ１未処理網膜の形態学的検査によって裏付ける。
【０１０５】
ｈＥＳＭＶ処理によりｒｄ１マウス網膜においてＥＲＧ  ａ波の増幅の少なくとも３０％が改善し、光受容体細胞の約３０％が補充され、ＮＭＤＡ損傷マウスモデルにおいてＥＲＧ  ｂ波の振幅の３０％およびアマクリン細胞および神経節細胞の３０％が回復すれば、ｈＥＳＭＶによって活性化したミュラー細胞が変性網膜に内在する何らかの再生能を支持すると判断される。
【０１０６】
均等物
当業者はルーチンの実験のみを用いて、本明細書に具体的に記載される特定の実施形態の多数の均等物を認識し、また確認することが可能であろう。このような均等物は以下の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１Ａ】
2015514760.tif 000005
【図１Ｂ】
2015514760.tif 000006
【図１Ｃ】
2015514760.tif 000007
【図１Ｄ】
2015514760.tif 000008
【図２Ａ】
2015514760.tif 000009
【図２Ｂ】
2015514760.tif 000010
【図２Ｃ】
2015514760.tif 000011
【図２Ｄ】
2015514760.tif 000012
【図２Ｅ】
2015514760.tif 000013
【図２Ｆ】
2015514760.tif 000014
【図３】
2015514760.tif 000015
【図４Ａ】
2015514760.tif 000016
【図４Ｂ】
2015514760.tif 000017
【図５Ａ−１】
2015514760.tif 000018
【図５Ａ−２】
2015514760.tif 000019
【図５Ｂ−１】
2015514760.tif 000020
【図５Ｂ−２】
2015514760.tif 000021
【図６】
2015514760.tif 000022
【図７Ａ】
2015514760.tif 000023
【図７Ｂ】
2015514760.tif 000024
【図８】
2015514760.tif 000025
【図９−１】
2015514760.tif 000026
【図９−２】
2015514760.tif 000027
【図９−３】
2015514760.tif 000028
【図１０】
2015514760.tif 000029
【図１１】
2015514760.tif 000030
【図１２】
2015514760.tif 000031
【図１３】
2015514760.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】平成26年12月24日(2014.12.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015514760000001.app
【国際調査報告】
2015514760.tif 000033