(57)【要約】  本発明は、細菌感染症に対する治療用組成物としてバクテリオファージパネルを設計する方法を提供する。本発明は、細菌感染症の予防又は治療において使用するためのバクテリオファージパネルも提供する。
2015523850.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）それぞれが標的細菌種又は標的細菌株の増殖を独立に遅らせる２又は３以上の異なるバクテリオファージを準備するステップと、
（ｂ）前記２又は３以上の異なるバクテリオファージの少なくとも２つを組み合わせるステップと、
（ｃ）前記２又は３以上の異なるバクテリオファージの組合せの存在下で前記標的細菌種又は標的細菌株の増殖を決定するステップと
を含む、細菌感染症に対する治療用組成物としてバクテリオファージパネルを設計する方法であって、
ステップ（ａ）及び（ｃ）において前記標的細菌種又は標的細菌株の増殖条件が同じ又は同等であり、
（ｄ）前記組合せが、前記２又は３以上の異なるバクテリオファージのいずれか１つによって独立に実現される最も大幅な増殖遅延と少なくとも同程度、前記標的細菌種又は標的細菌株の増殖を遅らせる場合に、前記組合せをバクテリオファージパネルとして受け入れ、
（ｅ）前記組合せが、前記２又は３以上の異なるバクテリオファージのいずれか１つによって独立に実現される最も大幅な増殖遅延より前記標的細菌種又は標的細菌株の増殖を遅らせない場合に、前記組合せをバクテリオファージパネルとして最初に却下する、
前記方法。
【請求項２】
（ａ）標的細菌種又は標的細菌株の増殖を独立に遅らせる少なくとも１つの追加の異なるバクテリオファージを準備するステップと、
（ｂ）前記少なくとも１つの追加の異なるバクテリオファージを、請求項１の（ｄ）及び（ｅ）に規定された組合せの少なくとも１つのバクテリオファージと組み合わせて、追加の組合せを形成するステップと、
（ｃ）前記追加の組合せの存在下で前記標的細菌種又は標的細菌株の増殖を決定するステップと
をさらに含み、
（ｄ）前記追加の組合せが、前記異なるバクテリオファージ又は前記追加の異なるバクテリオファージのいずれか１つによって独立に実現される最も大幅な増殖遅延と少なくとも同程度、前記標的細菌種又は標的細菌株の増殖を遅らせる場合に、前記組合せをバクテリオファージパネルとして受け入れ、
（ｅ）前記組合せが、前記異なるバクテリオファージ又は前記追加の異なるバクテリオファージのいずれか１つによって独立に実現される最も大幅な増殖遅延より前記標的細菌種又は標的細菌株の増殖を遅らせない場合に、前記組合せをバクテリオファージパネルとしてさらに却下する、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）において、少なくとも１つの追加の異なるバクテリオファージを、最初に却下された組合せからの少なくとも１つのバクテリオファージと組み合わせる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
バクテリオファージパネルが、３又は４以上の異なるバクテリオファージを含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
（ａ）標的細菌種又は標的細菌株の増殖を遅らせる第１のバクテリオファージを準備するステップと、
（ｂ）前記第１のバクテリオファージを、前記第１のバクテリオファージに対する細菌耐性が発達するまで細菌標的種又は細菌標的株の培養物中で繁殖させて、第１の耐性細菌培養物を得るステップと、
（ｃ）第２のバクテリオファージを準備するステップと、
（ｄ）前記第２のバクテリオファージの存在下で前記第１の耐性細菌培養物の増殖を決定するステップと
を含む、細菌感染症に対する治療用組成物としてバクテリオファージパネルを設計する方法であって、
（ｅ）前記第２のバクテリオファージが前記第１の耐性細菌培養物の増殖を遅らせる場合に、前記第２のバクテリオファージをバクテリオファージパネルにおいて使用するために選択する、
前記方法。
【請求項６】
第２のバクテリオファージが第１の耐性細菌培養物の増殖を遅らせる場合に、第１のバクテリオファージ及び第２のバクテリオファージの組合せを、バクテリオファージパネルにおいて使用するために選択する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
（ａ）第２のバクテリオファージを、前記第２のバクテリオファージに対する細菌耐性が発達するまで第１の耐性細菌培養物中で繁殖させて、第２の耐性細菌培養物を形成するステップと、
（ｂ）第３のバクテリオファージを準備するステップと、
（ｃ）前記第３のバクテリオファージの存在下で前記第２の耐性細菌培養物の増殖を決定するステップと
をさらに含み、
（ｄ）前記第３のバクテリオファージが前記第２の耐性細菌培養物の増殖を遅らせる場合に、前記第３のバクテリオファージをバクテリオファージパネルにおいて使用するために選択する、
請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
第３のバクテリオファージが第２の耐性細菌培養物の増殖を遅らせる場合に、前記第３のバクテリオファージと第１のバクテリオファージ及び第２のバクテリオファージの少なくとも１つとの組合せを、バクテリオファージパネルにおいて使用するために選択する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
第３のバクテリオファージが第２の耐性細菌培養物の増殖を遅らせる場合に、第１のバクテリオファージ、第２のバクテリオファージ、及び前記第３のバクテリオファージの組合せを、バクテリオファージパネルにおいて使用するために選択する、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項１０】
２又は３以上のバクテリオファージが、請求項５に記載の方法において同定される第１のバクテリオファージ及び第２のバクテリオファージによって準備される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
２又は３以上のバクテリオファージが、請求項７に記載の方法において同定される第１のバクテリオファージ、第２のバクテリオファージ、及び第３のバクテリオファージから選択される２又は３以上のバクテリオファージによって準備される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
細菌培養物が細菌液体培養物である、請求項５〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
細菌液体培養物において増殖を決定する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
細菌液体培養物の光学濃度を測定することによって前記細菌液体培養物において増殖を決定し、好ましくは光学濃度が６００ｎｍで測定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細菌標的種又は細菌標的株が、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumanii）、クロストリジウム・ジフィシル（Clostridium difficile）、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）、シュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、体臭の原因である細菌種、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、及びストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）から選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれかに記載の方法によって得ることができるバクテリオファージパネル。
【請求項１７】
細菌感染症の予防又は治療において使用するための、請求項１６に記載のバクテリオファージパネル。
【請求項１８】
対象が家畜又は農場動物である、請求項１７に記載の使用のためのバクテリオファージパネル。
【請求項１９】
対象がヒトである、請求項１７に記載の使用のためのバクテリオファージパネル。
【請求項２０】
細菌感染症が、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumanii）感染症、クロストリジウム・ジフィシル（Clostridium difficile）感染症、大腸菌（Escherichia coli）感染症、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）感染症、シュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）感染症、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）感染症、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）感染症、又はストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）感染症である、請求項１７〜１９のいずれかに記載の使用のためのバクテリオファージパネル。
【請求項２１】
食品衛生において使用するための、請求項１６に記載のバクテリオファージパネル。
【請求項２２】
農業又は作物保護において使用するための、請求項１６に記載のバクテリオファージパネル。
【請求項２３】
環境衛生アプリケーションにおいて使用するための、請求項１６に記載のバクテリオファージパネル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている２０１２年５月４日に出願した英国特許出願公開第１２０７９１０．９号明細書及び２０１２年１０月９日に出願した英国特許出願公開第１２１８０８３．２号明細書の優先権を主張するものである。
【０００２】
本発明は、（予備混合されたカクテルとしての、又は使用前に混合するための）バクテリオファージパネルを調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗生物質耐性は、現代医学が直面する主な難題の１つとして現在認識されている。新規の抗生物質が不足していることから、治療用作用物質としてのバクテリオファージの使用（Harper, Anderson & Enright, Therapeutic Delivery (2011), 2, 935-947; Hausler T, Viruses vs. Superbugs: A Solution to the Antibiotics Crisis? (2006) MacMillan, New York）を含めて、いくつかの代替アプローチが調査されている。
【０００４】
バクテリオファージ（多くの場合、単に「ファージ」として公知）は、細菌内で増殖するウイルスである。この名称は「細菌を食べるもの」と解釈され、大半のバクテリオファージが、増殖する際に次世代のバクテリオファージを放出して細菌宿主を死滅させることを反映している。バクテリオファージを用いた初期の研究は、多くの要因によって妨げられ、これらの要因の１つは、ただ１種類のバクテリオファージ、すなわち、あらゆる細菌を死滅させる非特異的ウイルスが存在するという見解が広く行き渡っていたことであった。対照的に、現在では、バクテリオファージの宿主域（それらが感染させることができる細菌のスペクトル）は多くの場合、非常に特異的であることが理解されている。しかし、この特異性には、細菌標的種／株の全般に範囲が及ぶ十分なバクテリオファージ効力の幅を実現するのが困難であるという不都合な点がある。したがって、細菌種／株に対して効果的な標的能力を有するバクテリオファージの向上した組合せを同定する方法が、当技術分野において必要とされている−例えば、Pirsi, The Lancet (2000) 355, 1418を参照されたい。これらの理由で、妥当な臨床的効力を示すファージ組成物の例は、極めて限定されている。例として、シュードモナス・アエルギノーザ種（Pseudomonas aeruginosa）を標的とするバクテリオファージのパネルを用いて行って成功した出願者の治験（動物及びヒト）が参照される−Wright et al, Clinical Otolaryngology (2009) 34, 349-357を参照されたい。したがって、最適な臨床的応用性を有する別のバクテリオファージパネルを開発することが、当技術分野において必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Harper, Anderson & Enright, Therapeutic Delivery (2011), 2, 935-947
【非特許文献２】Hausler T, Viruses vs. Superbugs: A Solution to the Antibiotics Crisis? (2006) MacMillan, New York
【非特許文献３】Pirsi, The Lancet (2000) 355, 1418
【非特許文献４】Wright et al, Clinical Otolaryngology (2009) 34, 349-357
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
特に、細菌標的種／株に対するバクテリオファージの個々の効力と比べて前記細菌標的種／株に対する十分な効力を提供する、同じ細菌宿主種／株を標的とする２又は３以上のバクテリオファージからなるパネルを設計することが、当技術分野において必要とされている。これに関して、パネルのバクテリオファージメンバーが組み合わさって一緒にうまく働くことが必要である（例えば、パネルは、その個々のメンバーと比べて同等又は向上した効力を示す）。
【０００７】
本発明は、上記の課題の１又は２以上に取り組む。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、特許請求の範囲において指定するように、バクテリオファージパネルを設計するための方法を提供することによって、前述の課題を解決する。本発明は、特許請求の範囲において指定するように、バクテリオファージパネル及びその使用も提供する。
【０００９】
１つの態様において、本発明は、（２又は３以上のバクテリオファージを含む）最適な治療用バクテリオファージパネルを設計するための方法を提供する。前記方法は、標的細菌種／株の液体培養物において個々のバクテリオファージの活性をアッセイして、前記培養物において細菌標的が持つようになる耐性の発達及び特異性と共に、細菌増殖の動態を決定（determine）することを含む。この方法は、前記培養物におけるバクテリオファージパネルの効力を決定すること、及びしたがって、標的細菌種／株に対して使用するための有利なバクテリオファージパネルを同定することもさらに含む。
【００１０】
同じ細菌種／株に感染するバクテリオファージは、同様の感染機序を使用し得るが、これは、１種のバクテリオファージに対する細菌種／株の耐性は、他のバクテリオファージに対する交差耐性を与えることを意味する−Gill & Hyman, Curr. Pharm. Biotech. (2010) 11, 2-14及びGuidolin & Manning, Eur. J. Biochem (1985) 153, 89-94を参照されたい。これが望ましくないことは明らかである。さらに、本発明者らは、バクテリオファージが、所与の細菌種／株を標的とする場合、互いに対して拮抗的であり得、それによって、バクテリオファージを同時感染させる効果が限定されることも予想外に確認した。
【００１１】
したがって、１つの態様において、本発明は、パネル中の個々のバクテリオファージのそれぞれに対する標的細菌種／株の耐性（すなわち、交差耐性）、及び／又は細菌種／株を標的とする場合の前記バクテリオファージ間の拮抗作用を最小限に抑える、（２又は３以上のバクテリオファージを含む）バクテリオファージパネルを設計するための方法を提供する。前記方法は、バクテリオファージがそれらの宿主（標的）細菌の液体培養物中に存在する場合の細菌標的の増殖特性及び／又はバクテリオファージの増殖特性を測定するプロセスと、それに続く治療用バクテリオファージパネルの選択を使用する。
【００１２】
個々の溶解性バクテリオファージは、プラークアッセイ及び／又はそれらの細菌宿主との液体（ブロス）培養において試験され得る−好ましくは、両方の試験が使用される（例えば、１つの試験が逐次的に若しくは次の試験の前に実施されてもよく、又は両方が実質的に同時に実施されてもよい）。これら２つの系において細菌宿主の効率的な死滅を示すものは、必ずしも同一ではない。例として、プラークアッセイは、複雑な動力学的プロセスであるのに対し（Abedon & Yin, Methods Mol. Biol. (2009) 501, 161-174）、ブロス培養は、細菌宿主の溶解（死滅）をモニタリングするためのそれほど体系化されていない環境を提供する。
【００１３】
このような液体培養物中の細菌数は、培地の一定分量（aliquot）の生菌数によって直接的にモニタリングされ得る。或いは、細菌数は、培養物の光学濃度をアッセイすることによって測定され得る。例として、プレートリーダー系によって、ハイスループットな系でそのような培養物を直接的にモニタリングすることが可能になり、典型的には、６００ｎｍで測定される光学濃度が使用される。
【００１４】
バクテリオファージで処理されていない液体培養物において、細菌数は、数時間にわたって増加し、栄養物が使い尽くされ細菌数が最大レベルに達するため、最終的に遅くなる。バクテリオファージで処理した場合、典型的には、細菌数は短期間増加し、その後、急速に減少する。しかし、単一の（例えば、第１の）バクテリオファージ（又は交差耐性が生じるバクテリオファージ混合物）で処理した場合、数時間後、耐性細菌が出現し始め、細菌数が再び増加する。
【００１５】
これらの耐性細菌を試料採取し、異なるバクテリオファージ（例えば、第２のバクテリオファージ及び／又は第３のバクテリオファージなど）がそれらに与える影響をアッセイすることにより、１種のファージ（例えば、第１のファージ）に対する細菌耐性が他のファージ（例えば、第２及び／又は第３の異なるバクテリオファージなど）に対する耐性を与えない−本明細書においてファージに対する交差耐性の欠如と呼ばれる−バクテリオファージ（例えば、第２及び／又は第３の異なるバクテリオファージなど）が同定される。標的細菌種／株に対する交差耐性の欠如を示すバクテリオファージを含むバクテリオファージパネルの選択及び使用は、抗微生物治療物質として使用するために設計されるバクテリオファージパネルにおいて極めて望ましい。
【００１６】
（本明細書において先に特定した所望の特性を有する）バクテリオファージパネルが得られると、次いで、そのパネルは、液体培養において試験され得る。驚くべきことに、個々のバクテリオファージの一部の混合物は、必ずしも相加効果をもたらさない。特に、組み合わされたファージの効果が、対応する個々のバクテリオファージを単独で用いて実現されるよりも、細菌数を減少させる効果が低い場合、拮抗作用が生じている。このような混合物が液体培養において細菌数を減少させる効力をモニタリングすることは、候補治療物質としてさらに開発するのに最適ではないとみなされるこのような拮抗的組合せを同定する手段となる。
【００１７】
細菌（例えば、標的細菌種又は標的細菌株）の増殖を決定するための方法は、当技術分野において公知である。例として、液体培養物などの培養物において増殖する標的細菌種又は標的細菌株の増殖を決定することができる。これに関して、細菌が繁殖し数が増加するにつれ、（存在する細菌細胞の数が増加することが原因で）液体培養物の光学濃度が上昇する。したがって、光学濃度の上昇は、細菌増殖を示す。光学濃度は、６００ｎｍで測定され得る（ＯＤ６００）。例えば、６００ｎｍにおける光学濃度は、自動プレートリーダー（例えば、BMG Labtech社製FLUOstar Omegaプレートリーダー）を用いて、マルチウェルプレート（例えば、９６ウェルプレート）のウェル内で決定することができる。
【００１８】
標的細菌種又は標的細菌株の増殖は、所定の期間（例えば、少なくとも２、４、８、１２、１６、２０、２４、３６、又は４８時間）にわたって決定及び／又はモニタリングされ得る。
【００１９】
いくつかの実施形態において、期間は、標的細菌種又は標的細菌株への１又は２以上の異なるバクテリオファージの添加から開始すると定義され得る。或いは、期間は、標的細菌種又は標的細菌株への１又は２以上の異なるバクテリオファージの添加後の予め定められた時点に開始する（例えば、少なくとも０．２５、０．５、１、１．５、２、３、４、６、８、１０、又は１２時間後に開始する）と定義され得る。
【００２０】
バクテリオファージ又はバクテリオファージの組合せが、所与の細菌集団（例えば、特許請求の範囲において指定するような標的細菌種若しくは標的細菌株、又は特許請求の範囲において指定するような耐性培養物）の増殖を遅らせる（すなわち、増殖遅延をもたらす）かを判定する方法は、当技術分野において公知である。
【００２１】
バクテリオファージ（又はバクテリオファージの組合せ）が宿主細菌中で繁殖するにつれて、細菌溶解が起こって、細菌が死滅し、細菌増殖が低減する。細菌増殖の低減は、増殖速度（例えば、細菌細胞数が増加する速度）の低下、増殖の停止（その結果、細菌細胞数が一定のままとなる）、又は細菌細胞総数の低減を含み得る。
【００２２】
１つの実施形態において、増殖遅延（すなわち、バクテリオファージ又はバクテリオファージの組合せが増殖を遅らせる場合）とは、所与のバクテリオファージ又はバクテリオファージの組合せの存在下での細菌増殖が、前記バクテリオファージ又はバクテリオファージの組合せの不在下での（同じ又は同等の条件下での）同等の細菌集団の細菌増殖と比べて低減していることを意味する。
【００２３】
前述のように、細菌増殖を決定するための方法は、当技術分野において公知である。したがって、（例えば、細菌数の測定によって）細菌増殖を決定するのに使用される方法は、増殖遅延を決定するのにも使用され得る。したがって、例として、増殖遅延は、細菌集団にバクテリオファージ又はバクテリオファージの組合せを添加した後に、指定された時点又は指定された期間にわたって（例えば、少なくとも２、４、８、１２、１６、２０、２４、３６、又は４８時間）決定されてよい。例として、指定された期間は、細菌増殖の対数期を包含してよい。
【００２４】
請求項１〜４のいずれかにおいて指定されるように、本発明が、細菌感染症に対する治療用組成物としてバクテリオファージパネルを設計する方法を提供する１つの実施形態において、バクテリオファージのある組合せが、２又は３以上の異なるバクテリオファージのいずれか１つによって独立に実現される最も大幅な増殖遅延と少なくとも同程度、標的細菌種又は標的細菌株の増殖を遅らせる場合、その組合せはバクテリオファージパネルとして受け入れられ、前記組合せを構成するバクテリオファージは拮抗作用が欠如しているとみなされる。
【００２５】
バクテリオファージ又はバクテリオファージの組合せに対する細菌耐性の発達を判定するための方法は、当技術分野において公知である。例として、細菌耐性の発達は、バクテリオファージ又はバクテリオファージの組合せの存在下での細菌増殖をモニタリングすることによって判定され得る。細菌増殖は、前述したようにモニタリングされ得る。すなわち、バクテリオファージ又はバクテリオファージの組合せに対する細菌耐性がない場合、（前述したような）増殖遅延が観察され得る。細菌耐性が発達するにつれ、増殖遅延の効果が大きく弱まり、細菌増殖が増加する。細菌耐性の発達は、前述したように、指定された期間（例えば、少なくとも２、４、８、１２、１６、２０、２４、３６、又は４８時間）、細菌増殖をモニタリングすることによって判定され得る。
【００２６】
細菌耐性の発達を判定することにより、１種のバクテリオファージに対する細菌耐性が組合せ中の別のバクテリオファージに対する耐性を与えない（前述したように、交差耐性の欠如と呼ばれる）バクテリオファージの組合せを同定することもできるようになる。
【００２７】
したがって、後述する請求項５において指定されるように、本発明が、細菌感染症に対する治療用組成物としてバクテリオファージパネルを設計する方法を提供する１つの実施形態において、第２のバクテリオファージが第１の耐性細菌培養物の増殖を遅らせる場合、標的細菌種又は標的細菌株は、第１のバクテリオファージ及び第２のバクテリオファージの組合せに対する交差耐性が欠如しているとみなされる。
【００２８】
後述する請求項７において指定されるように、本発明が、細菌感染症に対する治療用組成物としてバクテリオファージパネルを設計する方法を提供する別の実施形態において、第３のバクテリオファージが第２の耐性細菌培養物の増殖を遅らせる場合、標的細菌種又は標的細菌株は、少なくとも第２のバクテリオファージ及び第３のバクテリオファージの組合せに対する交差耐性が欠如しているとみなされ、好ましくは、標的細菌種又は標的細菌株は、第１、第２、及び第３のバクテリオファージの組合せに対する交差耐性が欠如しているとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
なし
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３０】
ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するための混合物を、シュードモナス・アエルギノーザ種のＰＡＫ株に対して開発した。この開発の段階は、本発明の段階を例示する。
【００３１】
初期スクリーニング：
感染の部位及びレベルを非侵襲的に同定するために挿入されたルミネセンスレポーター遺伝子を用いるマウス肺感染の研究において、シュードモナス・アエルギノーザ種のＰＡＫ株を使用する。
【００３２】
ＰＡＫ株に対して使用する治療用バクテリオファージミックスのためのバクテリオファージを同定するために、許容宿主株において増殖させたバクテリオファージを、次いで、菌叢上でのスポット試験、計数（enumerative）プラークアッセイ、及びプレートリーダーアッセイ系を用いるブロス培養によって、ＰＡＫ株に対して試験した。プレートリーダーは、マルチウェルプレート形式で好適な宿主と共にバクテリオファージを含有するブロス培養物の光学濃度を徹底的にモニタリングする。この後者の方法により、感染プロセスの詳細な動態を評価することが可能になる。
【００３３】
プラークアッセイによる及び液体培養における個々のバクテリオファージのスクリーニングから、表１に示す結果が得られた。［ＭＯＩ＝感染多重度（multiplicity of infection）（細菌宿主細胞に対する感染性バクテリオファージの割合）］。
【００３４】
バクテリオファージＢＣＰ３７による乏しいプラーク形成と液体培養におけるその効力との著しい矛盾に、留意すべきである。
【００３５】
表１に示すデータに基づき、バクテリオファージＢＣＰ１、ＢＣＰ１２、ＢＣＰ１４、及びＢＣＰ３７を、さらに調査するために選択した。
【００３６】
バクテリオファージの繁殖及び精製：
候補バクテリオファージを液体（ブロス）培養で繁殖させ、さらに研究するためにこれらから溶解物を調製した。清澄化した溶解物を、ショ糖クッションを介した遠心分離によって精製した（遠心分離の前に、３６ｍｌ容ポリプロピレンチューブに入れた滅菌済み１０重量体積パーセント（％ ｗ／ｖ）ショ糖「クッション」５ｍｌ上に、各溶解物２７ｍｌを慎重に重ねて置いた）。ショ糖「クッション」は、エンドトキシンを除去するのを助け、一方で、チューブの底にウイルス粒子のペレットが形成するのを可能にする。バクテリオファージペレットをリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁し、０．２μＭシリンジフィルターを通過させて滅菌を徹底した。
【００３７】
バクテリオファージ混合物の初期試験：
次に、個々のバクテリオファージＢＣＰ１２、ＢＣＰ１４、及びＢＣＰ３７を、より高いＭＯＩで個別にと混合物としてとの両方で再試験した。結果を表２に示す。
【００３８】
この試験の結果は、意外であった。表２に示すデータから認めることができるように、バクテリオファージＢＣＰ３７は、細菌宿主数の効果的な減少をもたらし、耐性の発達は非常に限られていた。バクテリオファージＢＣＰ１２及びＢＣＰ１４の方が、耐性の発達を許容した。しかし、３種すべてのバクテリオファージの混合物を使用した場合、最初は細菌数が制御されたものの、耐性型の発達はＢＣＰ３７単独の場合より明らかに速く、このことから、混合されたバクテリオファージの感染には、細菌のエスケープ（escape）の増加を許容する拮抗作用があることが示された。
【００３９】
さらに試験することにより、バクテリオファージＢＣＰ１４が、細菌耐性の発達を低減させる上でバクテリオファージＢＣＰ３７の効果に対して特異的に拮抗性であるらしいことが明らかになった。データを表３に示す。
【００４０】
表３に示す光学濃度最終値（ＯＤ６００）は、２４時間後の細菌耐性の発達を反映している。ＢＣＰ３７とＢＣＰ１又はＢＣＰ１２との混合物を用いた場合、未処理の対照と比べて、これは大きく低下していた。３種すべてのバクテリオファージ（ＢＣＰ１、ＢＣＰ１２、ＢＣＰ３７）の混合物を使用した場合、これはなおいっそう低下した。しかし、ＢＣＰ１の代わりにバクテリオファージＢＣＰ１４を使用した場合、最終ＯＤ６００（及びすなわち細菌数）は著しく高いことから、拮抗作用が示される。
【００４１】
交差耐性の確認：
宿主細菌を処理したバクテリオファージに対する耐性を発達させていた宿主細菌は、感染後２４時間目までに著しい増殖を示した。初期のバクテリオファージ混合物によって観察された効果が交差耐性に起因するかどうかを判定するために、各アッセイからの耐性（「エスケープ」）変異体を収集し、他の候補バクテリオファージで処理した。これにより、４種のバクテリオファージのそれぞれに対する耐性型が、他のすべてに対しても耐性であることが示された。データを表４に示す。
【００４２】
したがって、４種すべてのバクテリオファージ（ＢＣＰ１、ＢＣＰ１２、ＢＣＰ１４、ＢＣＰ３７）が、同じ相補群（complementation group）に分類され、宿主細菌の共通の交差耐性型の発生が可能になる。したがって、そのような交差耐性の発達を許容しない少なくとも１種のバクテリオファージを同定することが望ましかった。
【００４３】
その他のバクテリオファージの評価：
個々の候補バクテリオファージに対する耐性を発達させたＰＡＫ変異体は、試験群の他のバクテリオファージに対する交差耐性を示したため、その他のバクテリオファージをスクリーニングして、同じ耐性機序によって弱められないと思われる候補を既存のストックから同定した。感受性試験により、ＢＣＰ１２耐性ＰＡＫ変異体とＢＣＰ３７耐性ＰＡＫ変異体の両方に対する活性を示すものとしてバクテリオファージＢＣＰ６、ＢＣＰ２１Ｌ、ＢＣＰ２６、ＢＣＰ２８、及びＢＣＰ４５が同定された。液体培養におけるＰＡＫに対するこれらのバクテリオファージの活性を評価した。データを表５に示す。
【００４４】
これらの結果から、ＢＣＰ３７と同様の効果を示し耐性の発達が最小限であるＢＣＰ２８が、最も有望な候補であることが示された。
【００４５】
次いで、候補バクテリオファージのすべてをＢＣＰ１２及びＢＣＰ３７との混合物において評価した。データを表６に示す。
【００４６】
個々のアッセイにおいてＢＣＰ６、ＢＣＰ２１Ｌ、ＢＣＰ２６、及びＢＣＰ４５の効果は限定されていたものの、混合物中ではこれらは比較的効果的であった。ＢＣＰ６及びＢＣＰ２８が、最も限定された耐性発達を示した。
【００４７】
個別培養において明らかに優れていることから、ＢＣＰ１２及びＢＣＰ３７と組み合わせるべく、候補治療用混合物のためにＢＣＰ２８を選択した。したがって、この混合物（ファージ３種の混合物）は、２つの相補群からの３種のバクテリオファージを有する。
【００４８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの候補治療用混合物の最終評価：
最終評価のデータを表７に示す。
【００４９】
このようにして、宿主細菌の増殖を「横ばいにし（flatlined）」て、細菌標的の迅速且つ効果的な死滅をもたらし、細菌耐性の発達を著しく限定する、バクテリオファージ３種の候補混合物を同定した。
【００５０】
ファージ３種のミックスのｉｎ  ｖｉｖｏでの評価：
上記のように３種のバクテリオファージを精製し、ＰＡＫのルミネセンス株（ＰＡＫ−ｌｕｍｉ）を用いて感染を確立するｉｎ  ｖｉｖｏ研究において使用するために組み合わせた。
【００５１】
Ｐ．アエルギノーザ種ＰＡＫ株に対する効力を有する溶解性バクテリオファージを宿主細菌の液体培養物中でアッセイして、最適化された治療用混合物を開発するにあたっての特定のバクテリオファージ間の交差耐性及び明らかな拮抗作用の両方に取り組んだ。選択した３種のバクテリオファージを混合し、ＰＡＫのルミネセンス株（ＰＡＫ−ｌｕｍｉ）を用いて感染を確立するｉｎ  ｖｉｖｏ研究において使用した。
【００５２】
次のように、ＢＡＬＢ／Ｃマウス８匹からなる４群にＰＡＫ−ｌｕｍｉを鼻腔内感染させ、処置した：
【００５３】
３２匹のマウスすべてに、ＰＢＳ中ＰＡＫ  Ｌｕｍｉ  ２５μｌ中の９×１０６ＣＦＵを鼻腔内感染させた。
群１（ｎ＝８）：画像を撮影し、感染後ｔ＝２時間の時点で安楽死させた。
群２（ｎ＝８）：画像を撮影し、感染後ｔ＝２時間の時点でＰＢＳで処置した。
群３（ｎ＝８）：画像を撮影し、感染後２時間目に２００ｍｇ／ｋｇのシプロフロキサシンを皮下注射して処置し、感染後２、４、６、８、及び２４時間目に画像を撮影し、感染後２４時間目に安楽死させた（これは、極めて高い用量である）。
群４（ｎ＝８）：画像を撮影し、感染後２時間目にファージ３種のミックス３０μｌを鼻腔内に処置し、感染後６時間目及び８時間目に画像を撮影し、感染後２４時間目に安楽死させた。マウスの臨床徴候及び感染によるルミネセンスを観察した−IVIS  ｉｎ  ｖｉｖｏイメージングシステムを用いて測定した。２４時間目に動物を安楽死させ、肺ホモジネートのＣＦＵ／ＰＦＵを決定した。
【００５４】
ファージ３種のミックスのｉｎ  ｖｉｖｏでの効力を、蛍光イメージング及び肺中の細菌の計数の両方によって実証した（抗生物質（Antibiotic）＝ＡＴＢ＝説明したシプロフロキサシン）［図１〜５］。
【００５５】
提示した方法を用いて得たファージ３種のミックスの効力をｉｎ  ｖｉｖｏで確認した。
【００５６】
バクテリオファージミックスは、２４時間目にｉｎ  ｖｉｔｒｏで強力な活性を示し、耐性を示さなかった。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、バクテリオファージで処置したマウスは、６時間後にルミネセンスの著しい低減を示し、シプロフロキサシン群と比べて、全体的に減少の程度は大きかった。ルミネセンスの減少は腹部エリアでも認められたが、これは鼻咽頭エリアで特に著しかった。肺のルミネセンスは大まかに言えば同程度であったが、シプロフロキサシンとバクテリオファージ混合物の両方によって著しく減少した。２４時間目まで、ファージ及び抗生物質で処置したマウスはすべて生き延び、両方の群において肺ＣＦＵの約１０００分の１への（〜3 log.）減少が観察された。
【００５７】
結論として：
ファージ３種のミックスは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで極めて効果的である。
これは、急性期モデルにおいてＰ．アエルギノーザ種のＰＡＫ株に感染したマウスの口腔咽頭及び肺の細菌を迅速に制御することもできる。
その効力は、感染性生物に対して有効であることが証明されている抗生物質の高用量と同等であるか、又はそれより優れている。
その作用は抗生物質より速いと思われ、感染の拡散が減少する。
この急性モデルから先へ進んで、実験室のバイオフィルム研究と慢性的に感染した耳の治験データとの両方によって、多量にコロニーを形成したバイオフィルムに富む環境が、バクテリオファージ療法のための最適条件を提供し得ることが示唆されている。
嚢胞性線維症の肺は、そのような環境を提供し得る。
【００５８】
項
項１）ａ）細菌増殖速度の変化、個々のバクテリオファージに対する細菌耐性の発達、及び個々のバクテリオファージに対する耐性の発達の特異性のうち、１又は２以上をモニタリングすることによって、それぞれが標的細菌種／株（細菌感染症の原因である）の集団からなるか又は前記集団を含む別々の液体培養物における２又は３以上の個々のバクテリオファージの活性を評価するステップと、
ｂ）場合によっては、細菌増殖速度の変化、バクテリオファージ組合せに対する細菌耐性の発達、及び前記バクテリオファージ組合せに対する耐性の発達の特異性のうち、１又は２以上をモニタリングすることによって、バクテリオファージの最適化された混合物を同定する意向で、標的細菌種／株（細菌感染症の原因である）の集団からなるか又は前記集団を含む液体培養物における（例えば、前記２又は３以上の個々のバクテリオファージの）前記バクテリオファージ組合せの効力を決定するステップと、
ｃ）前記標的細菌種／株に対する抗微生物効力を示すバクテリオファージパネルを選択するステップと
を含む、細菌感染症に対する治療用組成物として使用するためのバクテリオファージパネルを設計する方法。
項２）標的細菌種／株に対する治療的使用のために最適な抗細菌効力を有するバクテリオファージパネルを同定するステップを含む、項１に記載の方法。
項３）バクテリオファージを長期間のインキュベーションによってそれらの細菌宿主の液体培養物中で培養すること、耐性型の収集、及び液体培養において同じ前記細菌宿主に特異的な他のバクテリオファージを対象とする（against）アッセイ又は他の適切なアッセイ系によって、項１又は２に記載の方法において交差耐性を検出するための方法。
項４）バクテリオファージをそれらの細菌宿主の液体培養物において単独及び指定された組合せで培養することによって、項１又は２に記載のバクテリオファージの拮抗活性を検出するための方法。
項５）ｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおいて活性を別々に検証して、標的細菌種／株に対する抗細菌効力及び細菌感染症の抑制を確認する、項１又は２に記載の方法。
項６）細菌標的が、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumanii）、クロストリジウム・ジフィシル（Clostridium difficile）、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumonia）、シュードモナス・アエルギノーザ（Pseudomonas aeruginosa）、ステノトロホモナス・マルトフィリア（Stenotrophomonas maltophilia）、体臭の原因である細菌種、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）、又はストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）である、項１〜５のいずれかに記載の方法。
項７）治療物質が、家畜又は農場動物において使用するためのものである、項１〜６のいずれかに記載の方法。
項８）治療物質が、ヒトにおいて使用するためのものである、項１〜７のいずれかに記載の方法。
項９）治療物質が、食品衛生において使用するためのものである、項１〜８のいずれかに記載の方法。
項１０）治療物質が、農業又は作物保護において使用するためのものである、項１〜９のいずれかに記載の方法。
項１１）治療物質が、環境衛生アプリケーションにおいて使用するためのものである、項１〜１０のいずれかに記載の方法。
項１２）項１〜１１のいずれかに記載の方法によって得ることができるバクテリオファージパネル。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
【表２】
2015523850.tif 000004
【００６１】
【表３】
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【００６２】
【表４】
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【００６３】
［表４続き］
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【００６４】
【表５】
2015523850.tif 000008
【表６】
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【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【国際調査報告】
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