(57)【要約】  主に軟組織構造を補強する生体適合性、生分解性の医療装置パッチである。この装置は、縫合層と、模倣的な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）でコーティングできる厚い多孔性のスキャフォールドへの機械的な支持との層構造である。装置は、特定の要求に合うように切断されて組み立てできる独立層形状で、エンドユーザーと患者に供給される。層は、接着剤なしで組み立てることができる。全体的に、血液適合性で、軟組織の修復に使用されるポリテトラフルオロエチレンより優れている。本発明の分野は、心臓血管の治療で実証されたが、これに限定されるものではなく、血管、腱、ヘルニア、皮膚治療にも実用上関連している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ポリ乳酸、グリコール酸、ラクトン、ポリグリセロール・セバケート、合成ポリマーのコポリマーおよびそれの組合せから選ばれる合成ポリマーと、キトサン、アルギン酸ナトリウムおよびセルロースから選ばれる天然ポリマーとを含む生体適合性および生分解性のスキャフォールド、
ｂ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、及びこれらからの組合せから選ばれる配列でなる自己集合ペプチドを含むヒドロゲル、及び
ｃ）ポリウレタンを含む支持体、
を含んでなることを特徴とする構成物。
【請求項２】
前記ラクトンがポリカプロラクトン（ＰＣＬ）であることを特徴とする請求項１に記載の構成物。
【請求項３】
前記合成ポリマーのコポリマーが、Ｌ−ラクチド／ε−カプロラクトンコポリマー、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、及びＬ−ラクチド／ε−カプロラクトンであることを特徴とする請求項１に記載の構成物。
【請求項４】
前記セルロースが、セルロース・アセチル・ブチレート（ＣＡＢ）、カルボキシル化セルロース、又は微晶質セルロースであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項５】
前記合成ポリマーが、ＰＣＬであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項６】
前記天然ポリマーが、キトサンであることを特徴とする請求項５に記載の構成物。
【請求項７】
前記天然ポリマーが、アルギン酸ナトリウムであることを特徴とする請求項５に記載の構成物。
【請求項８】
前記自己集合ペプチドが、ＦＥＦＥＦＫＦＫであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項９】
前記支持体が、ポリウレタンであることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項１０】
さらに、可塑剤を含むことを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項１１】
前記可塑剤が、トリブチル・シトレート及びアセチル・トリブチル・シトレートから選ばれることを特徴とする請求項１０に記載の構成物。
【請求項１２】
さらに、ガラス粉末を含むことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項１３】
前記ガラス粉末の粒径が、４５〜１６５μｍ、好ましくは４５μｍ、１２５μｍ又は１６０μｍであることを特徴とする請求項１２に記載の構成物。
【請求項１４】
さらに、発泡剤を含むことを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項１５】
−前記合成ポリマーの濃度が、６０重量％から１０重量％の間、好ましくは２５重量％、
−前記天然ポリマーの濃度が、６０重量％から１０重量％の間、好ましくは５０重量％、
−前記自己集合ペプチドの濃度が、４重量％から０重量％の間、好ましくは２重量％、
−前記可塑剤の濃度が、４０重量％から２０重量％の間、好ましくは２０重量％、及び
−前記ガラス粉末の濃度が、６０重量％から２０重量％の間、好ましくは２０重量％、
であることを特徴とする請求項１乃至１４のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項１６】
さらに、ポリビニルアルコール、ポリカプロラクトンとポリ（３、４−エチレンジオキシチオフェン・ポリ（スチレンスルホネート）、或いはその組合せから選ばれるファイバーを含むことを特徴とする請求項１乃至１５のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項１７】
厚さが５００から１０００μｍの間、孔径が１０μｍから２５０μｍの間、ヤング率が０．２ＭＰａから０．５ＭＰａの間、引張強度が３ｋＰａから１５ｋＰａの間であることを特徴とする請求項１乃至１６のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項１８】
生分解期間が６箇月であることを特徴とする請求項１乃至１７のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項１９】
さらに、リポソーム、好ましくは大豆由来のＬ−α−ホスファチジルコリンから選ばれるリポソームを含むことを特徴とする請求項１乃至１８のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項２０】
さらに、少なくとも１種の栄養剤、好ましくはＢＭＰ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦ及びＰＲＰから選ばれる栄養剤を含むことを特徴とする請求項１乃至１９のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項２１】
さらに、肝細胞成長因子及び／又はインシュリン成長因子の少なくとも１つの成長因子を含むことを特徴とする請求項１乃至２０のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項２２】
さらに、５−アザシチジン（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）とデキサタソン（ｄｅｘａｍｅｔａｓｏｎｅ）から選ばれる少なくとも１種の薬剤を含むことを特徴とする請求項１乃至２１のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項２３】
さらに、細胞を含むことを特徴とする請求項１乃至２２のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項２４】
治療に使用されることを特徴とする請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項２５】
心筋梗塞の処置、掻爬または経壁梗塞の処置、好ましくは心筋梗塞の処置に使用されることを特徴とする請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項２６】
前記処置が、心臓の組織再生を含むことを特徴とする請求項２５に記載の構成物。
【請求項２７】
請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の構成物が、イン−ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）方法に使用されることを特徴とする構成物の使用。
【請求項２８】
請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の構成物を含むことを特徴とする心臓修復パッチ。
【請求項２９】
心筋梗塞の処置に使用されることを特徴とする請求項２８に記載の心臓修復パッチ。
【請求項３０】
請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の構成物を得るための方法であって、
ｉ．−有機および無機の全成分を、ハーケ（Ｈａａｋｅ）中で混合し、溶融ブレンディングする、
ｉｉ．−フッ化水素酸処理をしてガラスポロゲンを溶解させ、次いで洗浄してスキャフォールドのｐＨを中性にする、
ｉｉｉ．酸の除去、
ｉｉｉ．−自己集合ペプチドを、遠心分離重力又は単純な含浸によりポリマー中に導入する、
ｉｖ．−乾燥、及び
ｖ．−殺菌、
を含んでなることを特徴とする構成物の作製方法。
【請求項３１】
請求項１乃至２３のいずれか１項に記載の構成物を得るための方法であって、
ｉ．材料の溶解、
ｉｉ．溶剤流涎（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｃａｓｔｉｎｇ）及び低温析出、
ｉｉｉ．溶剤抽出、
ｉｖ．自己集合ペプチドを、遠心分離又は重力によりポリマー中に導入、
ｉｖ．−乾燥、及び
ｖ．−殺菌、
を含んでなることを特徴とする構成物の作製方法。
【請求項３２】
前記（ｉ）ステップと（ｉｉ）ステップの間に、
−電界紡糸によるファイバーの生成、及び
−ポリマー上に同軸電界紡糸法による電界紡糸ファイバーのデポジット、
のステップを行うことを特徴とする請求項３０又は３１に記載の構成物の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
心臓血管疾患（ＣＶＤ）は、西洋社会における大きな健康問題であり、主要な死因となっている。例えば、英国では、一年にＣＶＤで２３８，０００人が死亡し、死亡原因の３９％となっている（Ｊａｗａｄ  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．，２００７，１，３２７）。心臓発作（Ｈｅａｒｔ  ａｔｔａｃｋｓ）は、ＣＶＤを持った患者の主要死因である。毎年、心臓発作に苦しむ患者２７０，０００人の凡そ３０％は、病院に到着する前に急死している。成人の心臓は、成熟して収縮する心筋細胞が分割できないので、損傷した組織を修復することができない。心筋梗塞は、正常な心筋とは異なる収縮特性、機械的特性および電気的特性をもつ損傷組織を生成してしまい、体の代謝作用に合う充分な血液を供給できない。
【０００２】
心筋の梗塞部分を修復し再生する新しい方法を開発することに多くの関心が寄せられている。損傷した組織を、骨髄に由来した細胞（間葉細胞および造血性細胞）あるいは胚性幹細胞（ＥＳＣｓ）の骨格筋細胞に置き換えることが提案された（Ｌａｆｌａｍｍｅ，Ｍ．Ａ．，Ｍｕｒｒｙ  Ｃ．Ｅ．；Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００５，２３，８４５）。現在、これらの細胞を死んだ心筋に導入する好ましい方法は、細胞を懸濁させて、循環血液に注入する、あるいは心筋に直接注入することである。細胞のデリバリールートは、本質的な細胞のロスを伴い非効率的である（Ｈｏｆｍａｎｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００５，１１１，２１９８：Ｇｒｏｓｓｍａｎ  Ｐ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．；Ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ，２００２，５５，３９２）。そこで、組織工学（ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＴＥ）のように、別の細胞デリバリー技術を探索することが急務となっている。
【０００３】
心筋組織工学（Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ＭＴＥ）は、心筋機能の回復により心筋梗塞患者の延命を意図した概念であり、継続的に向上している。
【０００４】
細胞療法および心筋組織工学に、様々な細胞タイプが提案されている。これらには、自己由来幹細胞と胚性幹細胞がある。この特定の組織工学に提案されている生体材料は、心臓細胞に生体適合し、患者の心筋に合った特定の機械的性状を持っていて、デリバリーされた細胞と融合し、イン−ビボ（ｉｎ−ｖｉｖｏ）で影響を受けないことが必要である。
【０００５】
心臓組織工学（ＣＴＥ）の目的は、心臓の損傷部分を修復または再生することである。ＣＴＥは、スキャフォールド、すなわち生体材料に細胞を結合して作られたパッチの作製を含んでいる。
【０００６】
細胞療法を展望してみると、生体材料の主要な役割は、細胞を損傷部位（つまり、損傷組織）にデリバリーさせるビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ、媒介体）として機能することである。細胞が所望の部位にデリバリーされると、細胞は、ホスト組織と一体になり、新しい心筋を形成していく。
【０００７】
生体材料の研究は、広い主題であり、ＣＴＥパッチに適した生体材料の候補が絶えず求められている。ＣＴＥには、複合材料と同様に種々の合成および天然ポリマーが提案されてきた。
【０００８】
冠動脈潅流と薬剤ベースの医学治療における最近の進歩にも拘わらず、左心室（ＬＶ）肥大の患者の割合が大きくなって、心臓修復パッチによるアプローチが注目されてきた。この状況は、その後の心筋梗塞（ＭＩ）の再構築で明らかとなった（Ｂｏｌｏｇｎｅｓｅ  Ｌ．，Ｎｅｓｋｏｖｉｃ  Ａ．Ｎ．，Ｐａｒｏｄｉ  Ｇ．，Ｃｅｒｉｓａｎｏ  Ｇ．，Ｂｕｏｎａｍｉｃｉ  Ｐ．，Ｓａｎｔｏｒｏ  Ｇ．；Ｍ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，２００２，１０６，２３５１−７：Ｓａｖｏｙｅ  Ｃ．，Ｅｑｕｉｎｅ  Ｏ．，Ｔｒｉｃｏｔ  Ｏ．，Ｎｕｇｕｅ  Ｏ．，Ｓｅｇｒｅｓｔｉｎ  Ｂ．，Ｓａｕｔｉｅｒｅ  Ｋ．；Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ，２００６，９８，１１４４−９：Ｐｆｅｆｆｅｒ  Ｍ．Ａ．，Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  Ｅ．；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９０，８１，１１６１−７２）。ポストＭＩのＬＶ再構築は、梗塞した部位と梗塞していない部位での非順応性心筋変化と関係し（Ｐｆｅｆｆｅｒ  Ｍ．Ａ．，Ｂｒａｕｎｗａｌｄ  Ｅ．；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９０，８１，１１６１−７２）、ＬＶ肥大収縮機能障害により心不全で死に至る危険性が高くなる（Ｐｆｅｆｆｅｒ  Ｍ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９４，８９，６８７５；Ｐｆｅｆｆｅｒ  Ｍ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．；Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１９９４，８９，６８７５）。
【０００９】
異なる外科的アプローチとして、深刻なＬＶ肥大と不全から難治性心不全（ＨＦ）に苦しむ患者に対して、ＬＶ空洞容積を小さくする（Ｄｏｒ  Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ，１９９８，１１６，５０−９）、あるいは更なる肥大を抑える（Ｂａｔｉｓｔａ  Ｒ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．；Ａｎｎ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｕｒｇ，１９９７，６４，６３４ｅ８．）ことが提案された。一般的に、これらの方法は、主な再構築手術か、あるいは心外膜の拡張被包（コンテンション）を行うことにある。
【００１０】
ＭＩ後に体内に埋め込まれた心臓修復パッチは、ＬＶ再構築ができ、最終的に心臓機能を改善することが実証された。
【００１１】
Ｈｕｎｇ  Ｆａｔ  Ｔｓｅら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｃａｒｄｉｏ，２０１０，５８，５９０−５９８）は、慢性ＭＩの大型動物モデルで、生体適合性のポリ（プロピレン）／拡張ポリテトラフルオロエチレン（ＰＰ／ＰＴＦＥ）の２つの層を用いた簡単な不活性合成心外膜パッチにより、梗塞部位のＬＶ壁厚を増し、ＬＶ肥大を緩和し、左心室駆出率（ＬＶＥＦ）の改善ができ、心臓修復パッチ概念の必要性を確立した。
【００１２】
生体材料のような心臓修復パッチは、最初に細胞治療のベクターとして報告されたが、無細胞治療に向い、これにより主要作用形態としての医学的支持体となり、さらに微少環境と構築により、細胞分化、組織化、そしてアノイキス（ａｎｏｉｋｉｓ）の防止といったさらなる利点が加わった医療用具（ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅ）として予見された（Ｓａｒｉｇ，Ｕ．，Ｍａｃｈｌｕｆ，Ｍ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１１，１１，１０５５−７７）。しかしながら、今日では、スキャフォールドを通しての栄養素の移動に制限があることで、使用に限界がある。
【００１３】
この用具の製作に提案された材料の中で、コラーゲンは、ＣＴＥ中の小区分ポリマーに報告されて広く使用されてきた。この蛋白質スキャフォールドは、血管形成（Ｃａｌｌｅｇａｒｉ  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００７，２８，５４４９−６１）と細胞治療（Ｐｏｚｚｏｂｏｎ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２０１０，１９，１２４７−６）に適合している。
【００１４】
心臓修復パッチの創出に、脱細胞臓器も提案された（Ｏｔｔ  Ｈ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００８，１４，２１３−２１：Ｇｏｄｉｅｒ−Ｆｕｒｎｅｍｏｎｔ  Ａ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２０１１，１０８，７９７４−７９７９．）。臓器由来のスキャフォールドを使用した研究の数に限りがあるにも拘わらず、今日までの心臓弁交換治療に脱細胞牛大動脈弁を用いる例は、組織工学における脱細胞スキャフォールドの急速な拡大を示唆している。
【００１５】
生体由来の材料とは別に、生分解性ポリエステルウレタン（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  Ｋ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ，２００７，４９，２２９２−２３００）、あるいはポリ（グリコライド−コ−カプロラクトン）（Ｐｉａｏ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００７，２８，６４１−６４９）など多くの合成材料が、細胞と無細胞治療用に開発されてきた。
【００１６】
作用すると予見される機能的環境では回復すると考えられていたが、生物学的な手懸りを与えるスキャフォールドの機能化は、固定化剤の生体有効性や超分子構築での濃度プロフィールを考慮しなければならないなど、まだ議論の最中である。
【００１７】
ヒドロゲルなどの柔かいスキャフォールドは、無細胞治療、ドラッグデリバリーシステム、および細胞デリバリーやイン−ビトロ心筋組織工学用の支持体として提案された（Ｙｅ  Ｚ．  ｅｔ  ａｌ．；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０１１，６３，６８８−６９７）。このタイプの生体材料は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）−タイプの化学的および生物物理学的環境を作り、これにより、埋め込み補充された心臓細胞の維持、存続および機能の改善に適するようにすると考えられる（Ｄａｖｉｓ  Ｍ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，２００５，９７，８−１５：Ｊａｗａｄ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．，２００８，８７，３１−４７）。
【００１８】
実際、３Ｄゲルは、イン−ビトロの細胞増殖と心筋分化の進歩した培養システムとなる。生化学的、局所解剖的および物理的な手懸りで、幹細胞の心筋分化を引き起すことができる。一方、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮｉＰＡｍｍ）は、イン−ビトロの細胞シート工学に提案された（Ｊａｗａｄ  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．，２００８，８７，３１−４７）が、コラーゲン、フィブリン、アルギネートとＰＥＧ、およびペプチドのようなその他ポリマーは、心臓の細胞療法／組織工学でヒドロゲル形成能が評価されてきた。
【００１９】
一方、ヒドロゲルは、捕捉、細胞シグナル剤濃度勾配の創出、及び細胞デリバリーなどの単純なスキャフォールド機能化で、イン−ビトロおよびイン−ビボでの幹細胞分化をコントロールする新しい可能性を提供している。この心筋組織工学における成功は、その弱い機械的性状で限界があったが、イン−ビボで鼓動環境に耐え、体液に晒されて完全に流せる構築を可能にしたことにある（Ｆｒｅｅｄ  Ｌ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．；Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．，２００９，２１，３４１０−３４１８）。
【００２０】
そこで、天然または合成ポリマー材料から作られた多孔性スキャフォールドまたは厚いパッチで、心臓中の疾患域への細胞輸送を助ける生体材料ベースの“ビークル（媒介体、運搬具）”の開発が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２１】
【非特許文献１】ジャワド（Ｊａｗａｄ）ら、Ｊ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ．Ｒｅｇｅｎ．Ｍｅｄ．、２００７年、１巻、ｐ．３２７．
【非特許文献２】ラフラメ，Ｍ．Ａ．（Ｌａｆｌａｍｍｅ，Ｍ．Ａ．）他、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００５年、２３巻、ｐ．８４５．
【非特許文献３】ホフマン  Ｍ（Ｈｏｆｍａｎｎ  Ｍ．）ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００５年、１１１巻、ｐ．２１９８．
【非特許文献４】グロスマン  Ｐ．Ｍ．（Ｇｒｏｓｓｍａｎ  Ｐ．Ｍ．）ら、Ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ、２００２年、５５巻、ｐ．３９２．
【非特許文献５】ボロネセ，Ｌ．（Ｂｏｌｏｇｎｅｓｅ，Ｌ．）他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、２００２年、１０６巻、ｐ．２３５１−７．
【非特許文献６】サボエ，Ｃ．（Ｓａｖｏｙｅ，Ｃ．）他、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ、２００６年、９８巻、ｐ．１１４４−９．
【非特許文献７】フェファー，Ｍ．Ａ．（Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｍ．Ａ．）他、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９０年、８１巻、ｐ．１１６１−７２．
【非特許文献８】フェファー，Ｍ．Ａ．（Ｐｆｅｆｆｅｒ，Ｍ．Ａ．）ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１９９４年、８９巻、ｐ．６８７５・
【非特許文献９】ドール，Ｖ．（Ｄｏｒ，Ｖ．）ら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．、１９９８年、１１６巻、ｐ．５０−９．
【非特許文献１０】バティスタ，Ｒ．Ｊ．（Ｂａｔｉｓｔａ，Ｒ．Ｊ．）ら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．、１９９７年、６４巻、ｐ．６３４−８．
【非特許文献１１】ハング  ファト  Ｔｓｅ（Ｈｕｎｇ  Ｆａｔ  Ｔｓｅ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｃａｒｄｉｏ、２０１０年、５８巻、ｐ．５９０−５９８．
【非特許文献１２】サリグ，Ｕ．（Ｓａｒｉｇ，Ｕ．）他、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２０１１年、１１巻、ｐ．１０５５−７７．
【非特許文献１３】カレガリ，Ａ．（Ｃａｌｌｅｇａｒｉ，Ａ．）ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００７年、２８巻、ｐ．５４４９−６１．
【非特許文献１４】ポツォボン，Ｍ．（Ｐｏｚｚｏｂｏｎ，Ｍ．）ら、Ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、２０１０年、１９巻、ｐ．１２４７−６．
【非特許文献１５】オット，Ｈ．Ｃ．（Ｏｔｔ，Ｈ．Ｃ．）ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、２００８年、１４巻、ｐ．２１３−２１．
【非特許文献１６】ゴディエール−フルネモント，Ａ．Ｆ．（Ｇｏｄｉｅｒ−Ｆｕｒｎｅｍｏｎｔ，Ａ．Ｆ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、２０１１年、１０８巻、ｐ．７９７４−９．
【非特許文献１７】フジモト，Ｋ．Ｌ．（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ，Ｋ．Ｌ．）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ、２００７年、４９巻、ｐ．２２９２−３００．
【非特許文献１８】ピアオ，Ｈ．（Ｐｉａｏ，Ｈ．）ら、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００７年、２８巻、ｐ．６４１−９．
【非特許文献１９】イェ，Ｚ．（Ｙｅ，Ｚ．）ら、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２０１１年、６３巻、ｐ．６８８−６９７．
【非特許文献２０】デイビス，Ｍ．Ｅ．（Ｄａｖｉｓ，Ｍ．Ｅ．）ら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．、２００５年、９７巻、ｐ．８−１５．
【非特許文献２１】ジャワド，Ｈ．（Ｊａｗａｄ，Ｈ．）ら、Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｂｕｌｌ．、２００８年、８７巻、３１−４７．
【非特許文献２２】フリード，Ｌ．Ｅ．（Ｆｒｅｅｄ，Ｌ．Ｅ．）ら、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．、２００９年、２１巻、ｐ．３４１０−３４１８．
【発明の概要】
【００２２】
本発明は、第１に損傷した柔らかい組織の構造上の補強を行う医療装置（医療用具：ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅ）を意図した多層構築に関するものである。それは、多孔性ポリウレタンベースで、ポリ（ε−カプロラクトン）／天然ポリマーの上に厚い多孔性スキャフォールドでなっている構成物である。任意に、限定するものではないが、ペプチドとポリウレタンでなる自己集合ゲル（ｓｅｌｆ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｇｅｌｓ）に結合していてもよい。この装置の適用は、細胞治療において有用である。
【００２３】
本発明の１つの形態は、
ａ）合成ポリマーと天然ポリマーとを含む生体適合性（ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ）および生分解性のスキャフォールド。ここで、合成ポリマーは、ポリ乳酸、グリコール酸、ラクトン、ポリグリセロール・セバケート（ｐｏｌｙｇｌｉｃｅｒｏｌ  ｓｅｂａｃａｔｅ）、合成ポリマーのコポリマーおよびそれの組合せから選ばれ、天然ポリマーは、キトサン、アルギン酸ナトリウムおよびセルロースから選ばれる。
ｂ）自己集合ペプチド（ｓｅｌｆ  ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ）を含むヒドロゲルで、この自己集合ペプチドは、ＦＥＦＥＦＫＦＫ（配列番号１）、ＶＥＶＥＶＫＶＫ（配列番号２）、ＰＧＳＰＦＥＦＥＦＫＦＫ（配列番号３）、ＩＧＦ−ＦＥＦＥＦＫＦＫ（配列番号４）、及びこれらからの組合せから選ばれる。
ｃ）ポリウレタンを含む支持体。
を含んでなる構成物に関するものである。
【００２４】
本発明の別の形態は、上記した構成物が、治療に使用されることに関するものである。
【００２５】
別の実施形態で、本発明が上記定義した構成物が、掻爬（ｃｕｒｅｔｔａｇｅ）、または経壁梗塞（ｔｒａｎｓｍｕｒａｌ  ｉｎｆａｒｃｔ）の患者の処置、好ましくは心筋梗塞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆｒａｃｔｉｏｎ）の処置、より好ましくは心臓の組織再生を含む処置に使用されることに関するものである。
【００２６】
本発明の別の実施形態で、上記定義した構成物を、イン−ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での使用することに関するものである。
【００２７】
本発明の別の形態は、上記定義した構成物を含む心臓修復パッチ（ｃａｒｄｉａｃ  ｐａｔｃｈ）に関するものである。
【００２８】
また本発明の別の形態で、上記定義した心臓修復パッチが、心筋梗塞の治療に使用されることに関するものである。
【００２９】
本発明の別の形態は、上記定義した構成物を得るための構成物の作製方法であって、
ｉ．−  有機および無機の全成分を、ハーケ（Ｈａａｋｅ）中で混合し、溶融ブレンディングする、
ｉｉ．−  フッ化水素酸処理をしてガラスポロゲン（ｇｌａｓｓ  ｐｏｒｏｇｅｎ）を溶解させ、次いで洗浄してスキャフォールドのｐＨを中性にする、
ｉｉｉ  酸の除去、
ｉｉｉ．−  遠心分離重力または単純な含浸による自己集合ペプチドのポリマーへの導入、
ｉｖ．−  乾燥、及び
ｖ．−  殺菌（滅菌：ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、
を含んでなる。
【００３０】
本発明の別の形態は、上記定義した構成物を得るための構成物の作製方法であって、
ｉ．−  材料の溶解、
ｉｉ  溶剤流涎（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｃａｓｔｉｎｇ）および低温析出、
ｉｉｉ  溶剤抽出、
ｉｖ  遠心分離または重力によるポリマーへの自己集合ペプチドの導入、
ｉｖ．−  乾燥、及び
ｖ．−  殺菌（滅菌）、
を含んでなる。
【００３１】
好ましい実施形態で、上記した構成物の作製方法は、さらに上述の（ｉ）ステップと（ｉｉ）ステップの間に、
電界紡糸（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）によりファイバーを生成する、
ポリマー上に同軸電界紡糸法により電界紡糸ファイバー（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｕｎ  ｆｉｂｅｒｓ）をデポジットさせる、
のステップを行う。
【００３２】
本発明の別の形態で、上記定義した構成物の作製方法は、凍結／相反転（ｐｈａｓｅ  ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）を含んでいる。好ましい実施形態において、さらに上述の（ｉ）ステップと（ｉｉ）ステップの間に、
−電界紡糸によりファイバーを生成する、
−ポリマー上に同軸電界紡糸法により電界紡糸ファイバーをデポジットさせる、
のステップを行う。
【００３３】
本発明の別の形態は、心筋梗塞の患者の治療方法であって、上記定義した心臓修復パッチを心臓心膜（ｈｅａｒｔ  ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ）に埋め込むこと（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）からなり、好ましくは、心臓心膜の表面に支持体を縫合する、または心臓心膜及び心筋（ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）を介して支持体を縫合する。
【００３４】
本発明の記載で、用語“スキャフォールド”は、置き換えの必要がある組織の形状に形成された加工板状物である（例として、回旋筋腱板（ｒｏｔａｔｏｒ  ｃｕｆｆ））。スキャフォールドは、生物由来（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ）または合成材料であり得る。スキャフォールド材料は、ヒトに埋込まれるために生物学的に適合したものでなければならない。スキャフォールドは、典型的には埋込み前に患者の細胞に含浸される（ｉｍｐｒｅｇｎａｔｅｄ）（播種される（ｓｅｅｄｅｄ））。スキャフォールドは、スキャフォールド上で細胞の成長とともに、“分解”するようにデザインされなくてはならない。典型的には、数ヵ月で、スキャフォールドは消滅し、新しい組織で置き換えられる。
【００３５】
従って、スキャフォールドは、一時的な３Ｄ構築支持体として使用され、単離細胞をイン−ビトロで、すなわち埋込む前に新しい組織に成長させてホストに戻す、またはイン−ビボで、すなわち埋込んだ後に新しい組織に成長させる。
【００３６】
スキャフォールドのデザインにより、かなりの程度で構築の機能性が決ってしまう。最終必要条件は、スキャフォールドの特定な目的に依るが、いくつかの一般的特性および必要条件が全てのデザインで考慮される必要がある。
【００３７】
そこで、スキャフォールドは、次のとおりでなくてはならない。
−生体適合性；スキャフォールドは、特定の適用での適切な生物学的反応を起こさせ、周囲組織での如何なる有害な反応を抑えるものでなくてはならない。
−生分解性；スキャフォールド材料は、組織再生及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の再構築と並行して、周囲組織の機能に障害のない無毒物に分解するものでなくてはならない。
−細胞接着、延展（ｓｐｒｅａｄｉｎｇ）、および増殖の促進；細胞の成長と分化を規制するためのバイタル（ｖｉｔａｌ）。
−適切な機械的強度；強度は、埋め込み場所のイン−ビボ組織と明らかに同程度でなくてはならない。スキャフォールドは、例えば、心血管対骨補綴（骨義装具：ｂｏｎｅ  ｐｒｏｓｔｈｅｓｅｓ）のように、適用に依り、より柔軟性又は強剛性（ｒｉｇｉｄｉｔｙ）が要求される。
−良好な輸送特性；細胞への栄養の輸送、老廃物の除去を充分確実に行わせるために、スキャフォールドは、高度に孔が連結した多孔性でなくてはならないが、しかし、最適な多孔度にしつつも、充分な機械的強度を維持すべきである。
−ホストの血管形成（血管新生：ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）システムへの容易な接続；埋め込み後に、スキャフォールドを通して確実に栄養の供給を行うべく、スキャフォールドは、生体本来の栄養供給システムに接続されなくてはならない。
−適切な表面特性；最適な生理化学的特性（ｐｈｙｓｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）とは別に、検討の結果、スキャフォールドの表面形状（ｓｕｒｆａｃｅ  ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）を変えることで、スキャフォールドの組織の構造化を改善でき、組織の機能を高めることができることが示された。
【００３８】
用語“ヒドロゲル”は、架橋化されたポリマーネットワークとして定義でき、その多孔構造内に水を保持する能力を有する。ヒドロゲルの水保持力は、主にポリマー鎖中の親水性基、すなわちアミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基の存在により生じる。Ｈｏｆｆｍａｎｎ（２００２）によると、ヒドロゲル中の水の量は、キセロゲル（ｘｅｒｏｇｅｌ）の重量の１０％から数千倍であり、ここで、キセロゲルは、水のない状態でのポリマーネットワークとして定義される（Ｈｏｆｆｍａｎ  ＡＳ．；Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，２００２，５４，３−１２）。キセロゲルの水保持力は、親水性基の数と架橋密度に依って変わる。親水性基の数が多い程、水保持力が高くなり、架橋密度が高くなると、親水性基の減少により平衡膨潤（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｓｗｅｌｌｉｎｇ）が小さくなる。架橋密度が増えると、実質的に疎水性が増し、同時にポリマーネットワークの伸展性（ｓｔｒｅｔｃｈａｂｉｌｉｔｙ）が低下する。
【００３９】
ヒドロゲルは、架橋化されたポリマーネットワークであり、それ故ヒドロゲルに３−次元のポリマーネットワーク構造を提供する。
【００４０】
ヒドロゲルは、その架橋の性質により２つのグループにサブ分類することができる。あるものは、架橋が共有結合の形成を含み、それ自体として永久ヒドロゲルと考えられる。自己集合ペプチドあるいは天然ポリマー由来の物理的ヒドロゲルは、ポリマー鎖の物理的相互作用、すなわち分子のもつれ（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｔａｎｇｌｅｍｅｎｔ）、イオン相互作用および水素結合により形成される。
【００４１】
“パッチ”は、経皮的処方（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）の一つの形態であり、全身的治療（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）に適用される。
【００４２】
“ＣＴＥ”は、材料ベースによるアプローチで；細胞（心臓の、または非心臓の）培養したメッシュ、パッチあるいは泡状に予め形成された３次元スキャフォールドを含んでいる。
【００４３】
“可塑剤”は、ポリマーに加えられる低分子量化合物であって、ポリマーの脆性（ｂｒｉｔｔｌｅｎｅｓｓ）を下げ、ガラス転移温度を下げ、柔軟性を与え、フィルムの耐久性を高める。
【００４４】
“ＭＴＥのポリマー”は、天然ポリマーと合成ポリマーの両方で、今日心筋組織再構築に使用される加工生体材料の最大クラスのものであり；これらは、広く種々の組成と特性で利用できる。
【００４５】
合成ポリマーの開発は、ポリマーが軟組織の特性に合うよう注文のとおりに（オーダーメイド：ｔａｉｌｏｒ−ｍａｄｅ）作製できることから、軟組織埋め込み用に驚くべき成功率に結びついた。
【００４６】
熱可塑性エラストマーは、特異的に、ナノ構造マルチブロック（セグメント化：ｓｅｇｍｅｎｔｅｄ）コポリマーであり、例えば、マルチブロックポリウレタンは、今日知られている生体かつ血液に最も適合しており、医学分野で重要なポリマーと認知されている（Ｅｌ−Ｆｒａｙ  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．；Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２００５，５９，２３００）。心臓組織工学（パッチ）に使用される第１のポリマー材料は、加水分解性かつ生体適合性のポリマーで、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、およびそれらのコポリマーで乳酸−グリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）がある。研究と実験の試みが増えるに従い、生体構築物からの細胞離脱（細胞剥離：ｃｅｌｌｓ  ｄｅｔａｃｈｉｎｇ）を防ぐためには、生体材料の弾性が、心臓の弾性にできるだけ近く合致しなければならないことが分かった。そこで、それに代るポリマーが、絶えず開発されている。
【００４７】
【表１】
2015532845.tif 000002
【００４８】
一般的なＴＥアプローチでは、心筋工学用の生体適合性および生分解性の生体材料選択とパッチデザインは、（ｉ）細胞のデリバリー及び成長能力、（ｉｉ）生分解性、（ｉｉｉ）生体適合性、および（ｉＶ）適度な機械的性状、の基準で行われる。多孔度（Ｐｏｒｏｓｉｔｙ）は、特に３Ｄ組織工学構築において、考慮すべき別の重要なファクターである。
【００４９】
一般的なＴＥアプローチでは、心筋工学用の生体材料選択とパッチデザインは次の基準で行われる。
（ｉ）細胞のデリバリー及び育成（ｆｏｓｔｅｒ）能力、
（ｉｉ）生分解性、
（ｉｉｉ）生体適合性、
（ｉＶ）適度な機械的性状、
（Ｖ）多孔度は、特に３Ｄ組織工学構築において、考慮すべき別の重要なファクターである。
【００５０】
心臓組織工学に適用されるアプローチに依り、生分解性は、必ずしも必須なものではない。天然と合成を含む分解性ポリマーは、心臓修復パッチのアプローチ、及び特に３Ｄ組織工学構築に適用される。
【００５１】
機械的性状に関しては、それが拡張期（ｄｉａｓｔｏｌｅ）の終りで機械的な支持体になり得る限り、パッチに使用される生体材料の機械的性状に厳密な必要条件はない。
【００５２】
しかしながら、実用上、パッチは、心臓の表面にスムースに適合するよう、最適な順応性を持っていなければならない。さらに、支持装置は、心臓と一緒に変形し、心臓拡張期の終りのみならず、鼓動周期（ｂｅａｔｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）の始めから終りまでを通して心臓を支持できるような心臓筋肉の非線形的な弾性を示すのが理想的である。心臓修復パッチへのアプローチの一つの特記すべき長所は、心室の形状（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｇｅｏｍｅｔｒｙ）で単純に変化し、局部的な壁応力の高まりを減じさせるような力学機構である。
【００５３】
生体適合性、生分解性、および（物理的、化学的、そして生物学な）手懸り（ｃｕｅｓ）などの機械的性質以外の事項は、細胞接着、延展および分化を促進するために備えられなければならない。細胞が生存し、潜在的にもつ機能を充分発揮するために、気孔をもつ３Ｄスキャフォールドで埋め込まれなければならない。このシナリオでは、加工される構築の必要機能を考えなければならない。パッチは、細胞を患者に輸送する“ビークル（運搬具）”として機能するだけであるならば、短期間（例えば、３箇月以内）に分解する厚いパッチが適している。また別に、構築が、保持期間に損傷域を支持するのであれば、それらが多くの要因中で、スキャフォールドと接しているときに細胞が生存できる多孔性構造とするのが重要である。
【００５４】
さらに、ポリマー支持体は、縫合可能な支持体にして、外科的処置時に用具（装置、デバイス：ｄｅｖｉｃｅ）の固定化を容易にするだけでなく、デバイス全体の機械的性状の改善に寄与できるようにする。
【００５５】
以上を要約すれば、最終デバイスの主要形態は以下の通りである。
−多孔度：スキャフォールドマトリックスに２つの孔サイズが分布していなければならない。少なくとも１００μｍの孔は、細胞の大きさに合わせるのに必要であり、１０μｍの構造内部孔は、細胞の定着に必要である。
−パッチの厚さ：パッチの厚さは、少なくとも５００μｍでなくてはならない。
−機械的性質：パッチの堅さ（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）は、ヒトの心筋の堅さ（剛直性）と同じか、それより高くしなくてはならない。因みに、人の心筋の機械的性状は、以下の通りである。
ヤング率：０．２〜０．５ＭＰａ
引張強度：３〜１５ｋＰａ
−生分解性：重量基準または機械的性質のいずれかで、６箇月で生分解する。非常にゆっくりな分解性材料で、長期間に亘って心室壁の機械的支持体とする考え方も選択肢にあるであろう。
−血管新生：ネオ血管新生は、心臓組織修復の基本要求点である。目標は、２４００〜３３００毛細管（ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ）／ｍｍ２で、毛細管間距離〜２０μｍである。
【００５６】
【表２】
2015532845.tif 000003
【００５７】
上記定義した本発明構成物の別の実施形態では、ラクトンが、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）である。
【００５８】
上記定義した本発明構成物の別の実施形態で、合成ポリマーのコポリマーが、カプロラクトンおよびＬ−ラクチド／ε−カプロラクトンである。
【００５９】
上記定義した本発明構成物の別の実施形態では、セルロースが、セルロース・アセチル・ブチレート（ＣＡＢ）、カルボキシル化セルロース、または微晶質セルロースである。
【００６０】
上記定義した本発明構成物の別の実施形態では、合成ポリマーがＰＣＬである。
【００６１】
上記定義した本発明構成物の別の実施形態では、天然ポリマーがキトサンである。
【００６２】
上記定義した本発明構成物の別の実施形態では、天然ポリマーがアルギン酸ナトリウムである。
【００６３】
上記定義した本発明構成物の別の実施形態では、自己集合ペプチドがＦＥＦＥＦＫＦＫ（配列番号１）である。上記定義した本発明構成物の別の実施形態では、支持体がポリウレタンである。
【００６４】
本発明の別の実施形態で、上記定義した構成物は、さらに可塑剤を含むものである。また、上記定義した本発明構成物の別の実施形態で、その可塑剤が、トリブチル・シトレートおよびアセチル・トリブチル・シトレートから選ばれる。
【００６５】
別の実施形態で、本発明の上記定義した構成物は、さらにガラス粉末を含むものである。
【００６６】
上記定義した本発明構成物の別の実施形態では、ガラス粉末の粒径が、４５〜１６５μｍ、好ましくは４５μｍ、１２５μｍまたは１６０μｍである。
【００６７】
別の実施形態では、本発明の上記定義した構成物は、さらに発泡剤を含むものである。
【００６８】
別の実施形態では、本発明の上記定義した構成物は：
−合成ポリマーの濃度が、７５重量％から１０重量％の間で、好ましくは２５重量％；
−天然ポリマーの濃度が、６０重量％から１０重量％の間で、好ましくは５０重量％；
−自己集合ペプチドの濃度が、４重量％から０重量％の間で、好ましくは２重量％；
−可塑剤の濃度が、４０重量％から０重量％の間で、好ましくは２０重量％；
−ガラス粉末の濃度が、６０重量％から２０重量％の間で、好ましくは２０重量％である。
【００６９】
別の本発明の実施形態では、上記定義した構成物は、さらに、ポリビニルアルコール、ポリカプロラクトンとポリ（３、４−エチレンジオキシチオフェン・ポリ（スチレンスルホネート）、あるいはそれの組合せから選ばれるファイバーを含むものである。
【００７０】
本発明の別の実施形態で、上記定義した構成物は、厚さが５００μｍから１０００μｍの間、孔径が１０μｍから２５０μｍの間、ヤング率が０．２ＭＰａから０．５ＭＰａの間、引張強度が３ｋＰａから１５ｋＰａの間である。
【００７１】
本発明の別の実施形態で、上記定義した構成物は、生分解期間が６ヵ月である。
【００７２】
本発明の別の実施形態で、上記定義した構成物は、さらにリポソーム、好ましくは大豆油由来のＬ−α−ホスファチジルコリンから選ばれるリポソームを含むものである。
【００７３】
本発明の別の実施形態では、上記定義した構成物は、さらに少なくとも１種の栄養剤（ｔｒｏｐｈｉｃ  ａｇｅｎｔ）、好ましくはＢＭＰ（骨形態形成蛋白質：ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＩＧＦ、ＶＥＧＦおよび血小板リッチな血漿（ＰＲＰ：ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｒｉｃｈ  ｐｌａｓｍａ）から選ばれる栄養剤を含むものである。
【００７４】
本発明の別の実施形態で、上記定義した構成物は、肝細胞成長因子および／またはインシュリン成長因子の少なくとも１つの成長因子を含むものである。
【００７５】
本発明の別の実施形態で、上記定義した構成物は、さらに５−アザシチジン（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）とデキサメタソン（ｄｅｘａｍｅｔａｓｏｎｅ）から選ばれる少なくとも１種の薬剤を含むものである。
【００７６】
本発明の別の実施形態で、上記定義した構成物は、さらに細胞を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】心臓修復パッチ医療装置の概要である。
【図２】心臓修復パッチ用に、寸法と多孔度が制御可能で生体適合性および生分解性のポリマーを生産するために検討したポリマー加工技術である。
【図３】ＰＣＬとＰＶＡ複合体から、Ａ）溶剤流涎（溶剤キャスティング：ｓｏｌｖｅｎｔ  ｃａｓｔｉｎｇ）／粒子浸出（ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｌｅａｃｈｉｎｇ）、Ｂ）凍結乾燥、およびＣ）溶融プレスによるアプローチで得られたスキャフォールドの例である。
【図４】心臓修復パッチ構成物の概要を示している。
【図５】パッチ作製での実験作業を、順を追って説明している。
【図６】異なる濃度のＣＡＢと可塑剤（アセチル・トリブチル・シトレート、エポキシ化大豆油、トリブチル・シトレート）を用いたパッチの最大負荷（ロード）下での伸度（伸長：Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）を示している。
【図７】フッ化水素酸で５分および１０分処理した［ＰＣＬ＋キトサン＋ガラス］パッチのＳＥＭ写真である。
【図８】フッ化水素酸で処理した［ＰＣＬ／セルロース／ＴＢＣ／ガラス粉末（径が１２５μｍと１６０μｍ）／ＮａＨＣＯ３］パッチのＳＥＭ写真である。
【図９】Ａ）ＰＣＬのみ、Ｂ）ＰＣＬ＋キトサン３０％、Ｃ）ＰＣＬ＋キトサン４０％、およびＤ）ＰＣＬ＋キトサン６０％のＤＳＣサーモグラムである。ここで、ブレンドＢ、ＣおよびＤは、トリブチル・シトレート／ガラス粉末（粒径が１２５および１６０μｍ）／ＮａＨＣＯ３を処理なしで混合している。
【図１０】溶融成型（ｍｅｌｔ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）および凍結／相反転で作製したパッチのＳＥＭ写真である。
【図１１】応力−ひずみ曲線（Ｓｔｒｅｓｓ−ｓｔｒａｉｎ  ｃｕｒｖｅｓ）である。ここで、Ａ）は、ＰＣＬ−３（ＰＣＬ＋キトサン＋可塑剤＋バイオガラス）、Ｂ）は、コポリマー３（Ｌ−ラクチド／ε−カプロラクトン＋キトサン＋可塑剤＋バイオガラス）についてである。
【図１２】支持された心臓修復パッチの概念であり、１）ＰＥＵＵの生分解性のフィルム、２）ポリ（ヒドロキシウレタン）の接着剤、３）自己集合ペプチドゲルを浸漬したＰＣＬベース複合体である。
【図１３】ＰＣＬ／ＣＡＢシステム中のＦＥＦＥＦＫＦＫ濃度の評価である。
【図１４】３成分心臓修復パッチの概要図である。
【図１５】４成分心臓修復パッチの概要図である。数字は、化学的および／または生物学的手懸りの場所を表わしている。
【図１６】３Ｄスキャフォールド、ポリウレタン支持体およびポリウレタン接着剤で縫合可能な心臓修復パッチを形成するステップを順に説明している。
【図１７】電界紡糸ナノファイバーのデポジション前後のＳＥＭ写真と、ＦＩＴＣデキストランで含ませた［心臓修復パッチ＋同軸ナノファイバーＰＣＬ／ＰＶＡ］でのデキストラン放出プロファイルである。
【図１８】ＰＢＳ媒体中での、ＰＣＬ／セルロースアセチルブチレートブレンドの重量増加率（％）である。ここで、Ａ）は、■；ＰＣＬ＋１０％ＣＡＢ、●；ＰＣＬ＋２０％ＣＡＢ、▲；ＰＣＬ＋３０％ＣＡＢで、３つのブレンドは、２０％のトリブチル・シトレート、１０％の１２５μｍガラス粉末、１０％の１６０μｍガラス粉末、３％のＮａＨＣＯ３で作製した後、ＨＦで１０分間処理した。Ｂ）は、■；ＰＣＬ＋１０％ＣＡＢ、●；ＰＣＬ＋２０％ＣＡＢ、▲；ＰＣＬ＋３０％ＣＡＢで、３つのブレンドは、２０％のトリブチル・シトレート、２０％の１２５μｍガラス粉末、２０％の１６０μｍガラス粉末、３％のＮａＨＣＯ３で作製した後、ＨＦで１０分間処理した。
【図１９】ＰＢＳ媒体中での、Ｌ−ラクチド−ε−カプロラクトン／キトサンブレンドの重量増加率（％）である。図中、■は４０％キトサン、●は２０％キトサンで、２つのブレンドは、２０％のトリブチル・シトレート、２０％の１２５μｍガラス粉末、２０％の１６０μｍガラス粉末、３％のＮａＨＣＯ３で作製した後、ＨＦで１０分間処理した。
【図２０】ラットの心臓から単離した心臓始原細胞（心臓前駆細胞、ＣＰＣ：Ｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ）およびＥＧＦＰ遺伝子組み換えラットからの骨髄始原細胞（骨髄前駆細胞、ＢＭＣ：Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃｅｌｌｓ）を、（ＰＣＬあるいはＬ−ラクチド／ε−カプロラクトン）アルギン酸ベースの心臓修復パッチ上で７日間培養し、共焦点分析した。データは、パルマ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐａｒｍａ）のＱｕａｉｎｉ教授のご好意によるものである。
【図２１】ポリ（ε−カプロラクトン）：キトサン上ににシードされたｒＡｏＥＣについて、蛍光細胞トラッカー（ｔｒａｃｋｅｒ）としてＤＩＬとｅＧＦＰを用いた蛍光写真である。
【図２２】ポリ（ε−カプロラクトン）：キトサン上ににシードされたｒＣＰＣについて、蛍光細胞トラッカーとしてＤＩＬとｅＧＦＰを用いた蛍光写真である。
【図２３】提唱されたスキャフォールド上、心臓修復パッチの中心要素（ｃｅｎｔｒａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔ）にイン−ビトロｒＡｏＥＣｓ／ｒＣＰＣｓの生存（ｓｕｒｖｉｖａｌ）を示している。
【図２４】ラット動物モデルに埋め込みされた心臓修復パッチの、屠殺時の開胸写真である。
【図２５】屠殺後のラット心臓とプレ−免疫組織化学的特性を示す写真である。
【図２６】動物モデル上に損傷形成、その後のＬＶの低温化（ｃｒｙｏｇｅｎｉｓａｔｉｏｎ）、損傷組織の外科的除去、およびスキャフォールド（シードされていない）の埋め込みの組織写真である。
【図２７】ポリ（ε−カプロラクトン）：キトサン心臓修復パッチ上にシードされたＣＰＣの免疫化学的染色である。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
上記したように、本発明は、細胞治療のベクターとして使用されるイン−ビトロでの細胞播種（細胞シード：ｃｅｌｌ  ｓｅｅｄｉｎｇ）および細胞培養に適合したスキャフォールドを提案するものである。その主作用は構造の補強にあるが、装置（デバイス、用具：ｄｅｖｉｃｅ）は、細胞治療に完全に適合している。この装置を、ＣＴＥに対しての実証で記載しているが、装置の適用は、掻爬、心臓経壁に制限されるものではない。この装置は、限定するものではないが、ヘルニアや血管治療などのソフト組織工学にも使用できる。スキャフォールドの成分は、ポリ（ε−カプロラクトン）、アルギネート、それらと天然ポリマーとの複合体である。ここで、この天然ポリマーとしては、キトサン、アルギネート・フィブロインなどである。装置の多孔度は、１０〜２５０μｍの孔範囲にオーダーメード（ｔａｉｌｏｒｅｄ）され、これによって血管形成と細胞シードが可能になる。
【００７９】
医療装置（医療用具：ｍｅｄｉｃａｌ  ｄｅｖｉｃｅ）として使用される生体材料は、補綴用（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）であるのが重要であるが、ＴＥの主機能は、細胞接着、成長および分化を高めることである。そのため、医療装置は、細胞シグナル剤の能力を備えた機能化である。本発明によって提案した装置は、生体適合性と生分解性の自己集合ゲルで機能化できる。機能化は必ずしも必要でないが、この医療装置は、スキャフォールドを、ＥＣＭのようなミクロ環境のポリマー自己集合構造にする、つまり、限定するものではないが、両親媒性のペプチドやポリウレタンでなり、捕捉または共有結合により化学的および生物学的手掛りをもたせることができる。そのような手掛りは、外因的であるか、あるいはＰＲＰであることができる。ＰＲＰとすると、医療用具は医療用具のままで、薬剤規制の対象に入らない。
【００８０】
ホスト組織の再生を始めるために、生体材料は、イン−ビボ血管新生を促進し、ホスト組織との好ましい統合ができることが必要である。同時に、装置は、所定の速度で分解し、新しく形成された組織に入れ替わるようにする。すなわち、新組織形成速度と同じ速度で安全に分解し、有毒副産物を生成せずに自然の代謝経路で体内から除かれる。
【００８１】
心筋の生体エンジニア構築の基礎的必要条件は、強靭で柔軟な機械的性状、収縮に耐える能力、電気生理学的安定性および血管新生能力である。実際、パッチは、再生が進行しても、残りの部分に悪影響を及ぼすことをなくし、梗塞部位での動脈瘤（ａｎｅｕｒｉｓｍ）が起きることなく、梗塞した心筋を一時的に機械的に支持することが期待される。我々は、掻爬と経壁の両方に適用できる心臓修復パッチを提案している。
【００８２】
心臓修復パッチ適用の従来の解決についての上記批判的なレビューから、本発明は、縫合することができ、生体適合性と生分解性のフィルム支持体に付されて、所望の多孔度と寸法をもつポリマースキャフォールド構造／薬剤デリバリーシステム／機能化ゲルでなる心臓修復パッチ最終製品を提供する（図１）。
【００８３】
掻爬、機械的な支持、心膜コンテンション（ｐｅｒｉｃａｒｄｉｕｍ  ｃｏｎｔｅｎｓｉｏｎ）および経壁が、想定される適用である。
【００８４】
４成分システムは、この医療装置を構造補強する目的で提案されている。ポリマー構造は、接着剤なしの方法でフィルム支持体上に固定化される。
【００８５】
電界紡糸ファイバーベースのドラッグデリバリーシステムは、ポリマースキャフォールドのフィルム開放面（自由面：ｆｒｅｅ  ｓｉｄｅ）に固定化される。ゲル成分は、含浸、遠心分離および重力で上記した構築上に固定化できる。ここでの記載は、心筋梗塞治療のための医療装置に関している。
【００８６】
適用するのは、イン−ビトロおよびイン−ビボ両方が考えられる。ドラッグデリバリーシステムは、装置（デバイス）のゲル成分を相補うために導入される。デバイスは、研究と使用のための薬剤である細胞シグナル剤（ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を負荷（ロード：ｌｏａｄ）することができる。イン−ビボ適用では、ファイバーベースのドラッグデリバリーシステムが、患者の血液成分でゲル機能化する直接的な手段となると考えられる。
【００８７】
固有特性（Ｉｎｈｅｒｅｎｔ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ）：ここに提案した心臓修復パッチは、心膜と心筋組織の構造支持体となる医療装置である。４成分システムの機械的性状は、置換される組織の機械的性状と一致させる。３Ｄ疎水性／親水性スキャフォールド成分は、スキャフォールド可塑剤の役割をするゲルの機械的支持体となり、ホスト環境に対して親水性の境界を作る。ゲルは、細胞シグナル剤を捕捉（ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ）して容易に機能化される。ゲルは、接する環境から細胞シグナル剤を集めることもできる。電界紡糸ファイバーベースのドラッグデリバリーシステムは、細胞シグナル剤、薬剤などを担持（ロード：ｌｏａｄｉｎｇ）している装置のゲルに対し、補足的なツールとして使用することができる。電界紡糸ファイバーは、イン−ビボとイン−ビトロに適用するゲル機能化の固有成分として使用できる。提案した心臓修復パッチの全ての成分は、心臓前駆細胞（心臓始原細胞）および骨髄前駆細胞（骨髄始原細胞）と結果的に１０９９３：５で適合性があり、生体適合性である。
【実施例】
【００８８】
〔実施例１：天然ポリマー／可塑剤、ＰＣＬおよびその誘導体／天然ポリマー／可塑剤の厚い多孔性材料〕
所望の厚さと多孔度をもつＰＣＬベースの複合体（ハイブリッド：ｈｙｂｒｉｄｓ）スキャフォールドの開発に、異なる方針を定義した。この複合体スキャフォールドは、大量生産に容易に応じ得る（ａｍｅｎａｂｌｅ）べきである。図２に示すように、作製ルートを検討し、適合性をもつポリマー溶液を検討した。
【００８９】
これまでのアプローチと種々の研究したポリマーシステムの中で、塩浸出と溶剤流延は、高多孔性システムに対して充分な解決策とはならなかった。確かに、両方のケースで、水溶性または有機溶剤溶解性のポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）と、ＦＤＡ認可のブロー剤を選択して行った検討で、多孔度が満足のいくものではなかった。
【００９０】
一方、ロールを繰り返す技術に適合して所望の厚さと多孔度とした複合体構造は、溶融成型方法により達成された（図３）。
【００９１】
ポリマーの熱−カロリー的挙動の特質は、明かにシステムの選択に影響（ｄｉｃｔａｔｅｓ）する。例えば、ＰＣＬは、低ガラス転移温度の熱成型できるポリマーであり、従って複合体の条件に適合する条件で処理／溶融プレス加工できる。これに反して、この技術によって作製できない。
【００９２】
最終製品の制限から、溶融とプレスによるアプローチに焦点が合わせられ、このようなデザインに熱可塑性ポリマーを使用した（図４）。
【００９３】
天然ポリマー、最終的に複合体の本来もつ堅さ（ｓｔｉｆｆｎｅｓｓ）から、構成物に可塑剤を導入する必要があった。これに使用される可塑剤は全て、生体材料適用の文献に報告されているＦＤＡ認可のものである。スキャフォールドマトリックスの機械的性質に及ぼす可塑剤の影響を測定し、図６に例示している。
【００９４】
ブロー剤とガラスベッド（ｇｌａｓｓ  ｂｅｄｓ）を、孔形成剤として検討した（図７および図８）。
【００９５】
天然及び合成ポリマーと可塑剤の異なる組合せで混合物を作製した（表３）。
【００９６】
【表３】
2015532845.tif 000004
【００９７】
パッチに最も適した構成成分を選ぶに行った方法を図５に示す。
【００９８】
合成ポリマー（ＰＣＬ、Ｌ−ラクチド／ε−カプロラクトンコポリマー）、天然ポリマー（アルギン酸のナトリウム塩、キトサン、ＣＡＢ）、および可塑剤（トリブチル・シトレート）を用いてパッチを作製した。
【００９９】
これらの材料は、分子分光学と熱量測定法で特性を測定した（図９）。結晶性ポリマーの融点（Ｔｍ）変化は、混和性に関する情報を与えてくれる。ＰＣＬのみを用いたとき、融点が６０．８℃である。可塑剤、天然ポリマーおよびガラスを導入すると、ＰＣＬの融点に影響する。ＰＣＬは、水素結合によって天然ポリマーと相互作用できる。
【０１００】
初めは、ポリマーを溶融成型し、さらにフッ化水素酸で処理して高度に多孔性の三次元スキャフォールドを得ることに焦点を絞ったが、凍結乾燥および相反転方法など他の方法も検討した。
【０１０１】
この方法では、各成分のブレンド（キトサンおよびガラス粉末のもの）を、比較的凝固点が高い（１８．５℃）ジメチルスルホキシドに溶解または分散させた。スキャフォールドで検討した構成物は、合成ポリマーとしてＰＣＬとＬ−ラクチド／ε−カプロラクトン、天然ポリマーとしてキトサン、および孔形成剤として４５μｍ以下の大きさのバイオガラスＳ５３Ｐ４である。
【０１０２】
２つの成型技術（溶融成型および相反転）の利点と欠点を表４にまとめる。
【０１０３】
【表４】
2015532845.tif 000005
【０１０４】
ＳＥＭによる表面多孔度の検討では、相反転方法で作製されたサンプル（約２０μｍ）は、溶融成型方法でのものより気孔が小さい（５０μｍ）。さらに、溶融成型方法のサンプルの多孔度は、用いるガラス粉末の大きさでコントロールすることができる（図１０参照）。
【０１０５】
相反転方法で作製されたパッチの機械的性質は、心臓修復パッチに適した弾性（ＰＣＬパッチで１９１％、Ｌ−ラクチド／ε−カプロラクトンパッチで２５７％）と引張強度である（図１１参照）。
【０１０６】
〔実施例２：ＰＣＬ／天然ポリマー（キトサン、セルロース・アセチル・ブチレート、アルギン酸）／ＦＥＦＥＦＫＦＫ（ＰＥＲＡ−ＵｎｉＭａ−ＰＰＩ）〕
ＣＰ最終製品の生産を簡単にし、末端ユーザーが使い易いように、特徴的な薄膜（ｌａｍｉｎａｓ）をもつ多層構造を提案した。ここで、この多層構造は、限定するものではないがポリウレタンなどの生体適合エラストマーを、限定するものではないがポリ（ε−カプロラクトン）と、アルギンとキトサンの天然ポリマーでなる厚い多孔性スキャフォールドの支持体として使用した。ミクロおよびマクロの構造的特徴は、血管形成（血管新生：ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）、細胞シード、架橋構造栄養輸送に適合し、自己集合ペプチドが中心成分をコーティングするに使用されて、装置にＥＣＭのような特徴を与えている。化学的及び生物学的な手懸りをもつ装置の機能化は、ペプチドの集合などの機能化によって達成される。この構造により、濃度勾配が作られ、細胞の分化、延展、増殖ができる。
【０１０７】
ステッチ可能または縫合可能な医療装置は、３成分で、自己集合ポリペプチドゲルを含浸または支持してから溶融プレス、凍結−融解、凍結−乾燥したスキャフォールドでなる。この形態では、合成−天然ポリマーは、機能化容易なペプチドゲルに対しての支持体となる。問題は、機械的性状をもつ合成構造に連結したゲル内に、化学的および生物学的な手懸りを組み込み易いかどうかである。この装置は、損傷組織の代わりに置いて、ホスト組織の再生治療を行わせるが、生体適合性で生分解性のポリウレタン支持体は、パッチを心血管組織上に固定化させて使用される（図１２）。
【０１０８】
評価された組合せの中で、最良の結果は、低表面電荷（低濃度のキトサンまたはアルギン酸）の複合体構造、あるいはＰＣＬ／セルロース・アセチル・ブチレートなどの中性ポリマーで得られた（図１３）。
【０１０９】
上述のように作製されたスキャフォールドは、３成分パッチ概念に基いている。スキャフォールド以外の成分は、パッチの縫合をするポリウレタン層、スキャフォールド、成長因子あるいは他の捕捉された薬剤をリリースするゲルである。ここで、捕捉された薬剤は、限定するものではないが、次のものがある：
−幹細胞の回復、接着、増殖および分化を促進させる生活性分子：ＩＧＦ−１（インスリン状の成長因子−１）、ＨＧＦ（肝細胞成長因子）、５−アザシチジン（５−ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）など。
−血管形成を促進する生活性分子：ＶＥＧＦ−Ａ（血管内皮成長因子Ａ）、ＨＧＦ。
−血小板を濃縮した血漿（Ｐｌａｓｍａ  Ｅｎｒｉｃｈｅｄ  Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ）を、患者の血液成分から準備し、ゲルに捕捉させて内因性の化学的および生物学的手懸りに機能化して医療装置とした。
【０１１０】
図１４は、３成分パッチの概念を示す代表図である。次の実施例（実施例３および４）で、３成分システムの開発を示す。
【０１１１】
装置は、さらに、限定するものではないが、ポリ（ε−カプロラクトン）と、第２成分として天然ポリマーが配合された複合体でなるドラッグデリバリーシステムで機能化できる（図１５）。
【０１１２】
〔実施例３：心臓修復パッチの作製〕
心臓修復パッチの縫合（ｓｕｔｕｒｅ）を容易にするために、縫合可能なポリウレタン支持体を、ＰＣＬベーススキャフォールド上に固定化した。図１６は、縫い付可能（ステッチ可能：ｓｔｉｔｃｈａｂｌｅ）な心臓修復パッチの作製過程を、順を追って説明している。
【０１１３】
〔実施例４：パッチの機能化〕
［ポリペプチドの含浸］
限定するものではないが、ＦＥＦＥＦＫＦＫ（配列番号１）ポリペプチドゲルなどの自己集合ペプチドを、ＰＣＬ／キトサン、ＰＣＬ／アルギネートおよびＰＣＬ／セルロース・アセチル・ブチレート（ＣＡＢ）パッチ上／内に固定化した。ポリペプチドのゲルは、遠心分離と加熱でパッチに導入した。ポチペプチド含浸パッチは、ワイヤー棒またはブレードによる適用技術を用いて薄膜にして適用できる。クロマトグラフィー分析により、テストに用いた全てのパッチは、ポリペプチドを含んでいることが確認できた。パッチのゲル含量は、作製方法やゲル濃度には依存せず、スキャフォールドの多孔度と天然ポリマー構造に依存する。最も良い結果は、ＣＡＢのような中性ポリマーで得られた（図１３）。
【０１１４】
［ポリウレタンゲル含浸］
２つのタイプのポリウレタンゲルを作製した。
−物理的架橋ゲル：水中２４時間後に、容積で２０〜２５倍に増える。
−熱的可逆ゲル：ＬＣＳＴ（下限極限溶液温度）が低い、２８℃におけるゲル化時間が６２秒のポリウレタンヒドロゲル。
【０１１５】
スキャフォールド中のＰＵヒドロゲル吸収を測定した。この値は、スキャフォールドの多孔度と組成、およびポリウレタン固定層の多孔度に依存し、０．５重量％から５．７０重量％であった。
【０１１６】
［電界紡糸機能化ナノファイバー］
ゲル含浸とは別に、機能化ファイバーパッチに導入して、局所薬物／栄養剤放出性とした（４成分システム：ポリウレタン層、バイオポリマーパッチ、電界紡糸ファイバーベースのドラッグデリバリーシステム、機能化可能な自己集合ペプチド）。ファイバーの導入は、パッチに細胞シグナル剤や成長要素をさらに負荷（ロード）させるビークルとすることができ、電界紡糸ファイバーを同軸電界紡糸技術（図１７）によりポリカプロラクタムパッチ上にデポジットさせた。
【０１１７】
同軸電界紡糸技術は、ナノファイバーのコアをある一つの材料で、シェルを別の材料にして作製できる。この技術を用いて、ＰＶＡ溶液中でリポソームと成長因子をファイバーのコアに封入し、ファイバーのシェルはＰＣＬで作製した。同軸電界紡糸ファイバーに封入された成長因子薬剤のプロフィールを測定した。これらナノファイバーは、材料と良く接着し、生物学的活性物質と組合わせての使用に適していた。その結果をみると、同軸電界紡糸は、スキャフォールドの機能化に充分適しているようにみえる。さらに、この技術は、ゲルを固定化できる。
【０１１８】
〔実施例５：特性評価〕
［膨潤テスト］
ＰＣＬは、ポリマーの疎水性により、水又はリン酸塩バッファー培養液（ＰＢＳ）のような細胞培養液中で顕著に膨潤しない。ＰＣＬと天然ポリマーとのブレンドは、ＰＢＳ中で膨潤する。ＰＣＬ／ＣＡＢブレンドは、ＣＡＢが増える程膨潤が大きくなり、ＰＣＬが３０重量％のサンプルで、１０〜１２．５％に迄になる（図１８）。
【０１１９】
Ｌ−ラクチド／−カプロラクトンコポリマーブレンドのＰＢＳ中での膨潤を検討した。コポリマー／キトサンブレンドは、Ｌ−ラクチド／ε−カプロラクトンの親水性が高いことから、ＰＣＬより膨潤が大きい。キトサン２０％のブレンドは、ＰＣＬブレンドで１６％の重量増、Ｌ−ラクチド／ε−カプロラクトンコポリマーで４２％迄の重量増であった（図１９）。
【０１２０】
〔実施例６：生物学的評価〕
［生分解性／生体適合性（長期毒性）テスト］
テストは、供給されたプロトコール（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）で実行した。
プロトコール：イン−ビトロの分解性は、３つの異なる溶液で評価した：
−リン酸塩バッファー液（ＰＢＳ）、
−高グルコースのダルベッコー改質イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）、牛胎児血清１０％、グルタミン２ｍＭ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）でなる細胞培養液、
−コラゲナーゼ（１６Ｕ／ｍＬ）含有ＰＢＳ。
【０１２１】
指定期間、分解中のスキャフォールドの重量減少を、培養後の乾燥重量の変化で測定する。実験はすべて３重（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅｓ）で行う。結果は３回測定の平均値（±ＳＥ）とする。
【０１２２】
１）材料サンプルを１ｃｍ２の正方形に切り、３７℃のオーブン中で一定重量になる迄乾燥する。
２）各サンプルのスタート時の乾燥重量Ｗ０を測定する。
３）サンプルを溶液１０ｍｌに入れ、３７℃の撹拌浴に指定期間（例えば、１、３、７、１４、２１、３０、４５、６０…日）保持する。
４）予め決めた回数で、サンプルを溶液から取り出し、再蒸留水（ｂｉ−ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）中ですすぎ、３７℃オーブン中で一定重量になる迄乾燥する。
５）各サンプルの分解時間ｔでの乾燥重量Ｗｔを測定する。
６）パーセント重量減少を、次式に従って評価する。
式：  （Ｗ０−Ｗｔ）／Ｗ０×１００
【０１２３】
ある場合には、次の追加形態を考慮に入れる。
−ＨＰＬＣ法またはＵＶ法を使用して、分解生成物を定量的に測定する。
−ＦＴ−ＩＲ、ＤＳＣ、ＧＰＣにより、分解生成物と分解サンプルの物理化学的特性を評価する。
−分解溶液のｐＨ変化を測定する。
【０１２４】
上記プロトコールは、次のように修正して使用した。（１）表面積を増すため、サンプルを３ｃｍ２に切断した。（２）乾燥工程を改善するため、サンプルを４５℃で乾燥させた。（３）微生物汚染を防ぐため、サンプルを、採取時に約３０秒間エタノールに漬けて殺菌し、残存エタノールを空気中で乾かして除いた。（４）ｐＨ変化をモニターした。試験は、リン酸塩バッファー液（ＰＢＳ）、ダルベッコー改良イーグル培地ＤＭＥＭ、およびＰＢＳ／コラゲナーゼ中で行った。
【０１２５】
（ＰＣＬあるいはＬ−ラクチド／−カプロラクトン）アルギン酸ベースの心臓修復パッチは、ｐＨの変化がなかった。
【０１２６】
細胞毒性試験は、ピサ大学によって行なわれた。さらに、細胞培養試験も行った。図２０は、培養７日後のｒＣＰＣ（ラット心臓前駆細胞）とＢＭＣ（骨髄前駆細胞）の細胞培養を示しており、（ＰＣＬあるいはＬ−ラクチド／−カプロラクトン）アルギン酸ベースの心臓修復パッチの長期および短期無毒性を裏付けている。
【０１２７】
［ポリ（ε−カプロラクトン）：キトサンスキャフォールド装置の細胞シード培養試験］
ポリ（ε−カプロラクトン）キトサンに、大動脈内皮細胞（ｒＡｏＥＣｓ：ａｏｒｔｉｃ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）およびラット心臓前駆細胞（ｒＣＰＣｓ）を、それぞれ４５．１０３細胞／ｃｍ２シードした。図２１と図２２は、長期および慢性毒性下の生物学的評価での細胞生存を表わしている。この結果から、スキャフォールド支持体が、ｒＡｏＥＣｓとｒＣＰＣｓの増殖を支援し、促進していることを示している（図２３）。
【０１２８】
〔実施例７：イン−ビボ研究〕
シードされたポリウレタン（支持体）／ポリ（ε−カプロラクトン）：ネズミの心臓を凍傷させた後、左心室（ＬＶ）壁にキトサンベース構造心臓修復パッチをイン−ビボに埋め込み、縫合した（図２４）。
【０１２９】
埋め込みから＋４日および＋１０日のそれぞれで、動物を屠殺し、免疫組織学的分析を行った。
【０１３０】
図２５に屠殺後の装置（デバイス）の安定性を示す。
【０１３１】
図２６と図２７は、軟組織構造支持体／無細胞（ａｃｅｌｌｕｌａｒ）治療（図２６）、炎症の発生を伴わない細胞治療に対して装置が適性であることを示している。
【０１３２】
図２７から、イン−ビトロのデータは、静的生物学的評価と同じであり、このスキャフォールド材料が、無毒で、幹細胞の培養ができることを認定（ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）する。さらに、ここに提案した装置の特許請求の範囲の記載を裏付けたものである。
ａ．  損傷組織に対しての構造的支持体を提供。
ｂ．  細胞治療と細胞シート治療に使用できる。
ｃ．  スキャフォールド上にシードされた細胞は、イン−ビトロで成長し、イン−ビボで埋め込みできる。損傷（ｌｅｓｉｏｎ）領域に向って内部に移っていく。さらに、提案されたスキャフォールドは、経壁適用に適切なものである。
【０１３３】
〔実施例８：機械的性能〕
心臓修復パッチの機械的性能を、天然ポリマー濃度について、ドライ及びウェット環境でその機能として測定した。ここに提案したポリマーのスキャフォールドは、適切な機械的性能を示した（表５）。
【０１３４】
【表５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2015532845.tif 000012
【図７】
2015532845.tif 000013
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2015532845.tif 000017
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成27年9月24日(2015.9.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ポリ乳酸、グリコール酸、ラクトン、ポリグリセロール・セバケートおよびそれの組合せから選ばれる合成ポリマーと、キトサン、アルギン酸ナトリウムおよびセルロースから選ばれる天然ポリマーとを含む生体適合性および生分解性のスキャフォールド、
ｂ）ＦＥＦＥＦＫＦＫ、ＶＥＶＥＶＫＶＫ、ＰＧＳＰＦＥＦＥＦＫＦＫ、ＩＧＦ−ＦＥＦＥＦＫＦＫ、及びこれらからの組合せから選ばれる自己集合ペプチドを含むヒドロゲル、及び
ｃ）ポリウレタンを含む支持体、
を含んでなることを特徴とする構成物。
【請求項２】
前記ラクトンがポリカプロラクトン（ＰＣＬ）であることを特徴とする請求項１に記載の構成物。
【請求項３】
前記合成ポリマーのコポリマーが、Ｌ−ラクチド／ε−カプロラクトンコポリマー、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、及びＬ−ラクチド／ε−カプロラクトンであることを特徴とする請求項１に記載の構成物。
【請求項４】
前記セルロースが、セルロース・アセチル・ブチレート（ＣＡＢ）、カルボキシル化セルロース、又は微晶質セルロースであることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項５】
前記合成ポリマーが、ＰＣＬであることを特徴とする請求項１乃至４のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項６】
前記天然ポリマーが、キトサンであることを特徴とする請求項５に記載の構成物。
【請求項７】
前記天然ポリマーが、アルギン酸ナトリウムであることを特徴とする請求項５に記載の構成物。
【請求項８】
前記自己集合ペプチドが、ＦＥＦＥＦＫＦＫであることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項９】
前記支持体が、ポリウレタンであることを特徴とする請求項１乃至８のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項１０】
さらに、可塑剤を含むことを特徴とする請求項１乃至９のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項１１】
さらに、ガラス粉末を含むことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項１２】
さらに、発泡剤を含むことを特徴とする請求項１乃至１１のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項１３】
さらに、ポリビニルアルコール、ポリカプロラクトンとポリ（３、４−エチレンジオキシチオフェン・ポリ（スチレンスルホネート）、或いはその組合せから選ばれるファイバーを含むことを特徴とする請求項１乃至１２のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項１４】
治療に使用されることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項１５】
心筋梗塞の処置、掻爬または経壁梗塞の処置に使用されることを特徴とする請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の構成物。
【請求項１６】
前記処置が、心臓の組織再生を含むことを特徴とする請求項１５に記載の構成物。
【請求項１７】
請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の構成物を含むことを特徴とする心臓修復パッチ。
【請求項１８】
請求項１乃至１３のいずれか１項に記載の構成物を得るための方法であって、
ｉ．材料の溶解、
ｉｉ．溶剤流涎（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｃａｓｔｉｎｇ）及び低温析出、
ｉｉｉ．溶剤抽出、
ｉｖ．自己集合ペプチドを、遠心分離又は重力によりポリマー中に導入、
ｉｖ．−乾燥、及び
ｖ．−殺菌、
を含んでなることを特徴とする構成物の作製方法。
【国際調査報告】
2015532845.tif 000034
2015532845.tif 000035