(57)【要約】式（Ｉ）［式中、Ｒ０、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は本明細書で定義されるものである］に記載の構造を有するエンジイン化合物は、癌などの疾患の治療のための化学療法剤、特に抱合体として用いることができる。
2015508074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2015508074.tif 000037
［式中、
Ｒ０は、ＮＨＲ１ａ、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１ｂ、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、（ＣＨ２）１−４ＮＨＲ１ａ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ１ａまたはＳＲ１ｂであり；
Ｒ１ａは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ８ＮＨ２またはＣ（＝Ｏ）Ｒ９ＮＨ２であり；
Ｒ１ｂは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、（ＣＨ２）ｎＮＨ２、
【化２】
2015508074.tif 000038
であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｒ１０、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０またはＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０であり；
Ｒ３は、Ｈまたは無置換もしくは置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＯＲ１０、ＳＲ１０、ＮＨＲ１０、Ｎ（Ｒ１０）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１０またはＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０であり；
Ｒ５は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＯＲ１０、ＳＲ１０、ＮＨＲ１０、Ｎ（Ｒ１０）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１０またはＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０であり；
Ｒ６は、Ｈまたは無置換もしくは置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであるか；あるいはＲ５およびＲ６は、結合して＝Ｏを形成し；
Ｒ７は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＯＲ１０、ＳＲ１０、ＮＨＲ１０、Ｎ（Ｒ１０）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１０またはＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０であり；
Ｒ８は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群から選択されるα−アミノ酸の側鎖残基であり；
Ｒ９は、無置換もしくは置換アリーレン、無置換もしくは置換ヘテロアリーレン、無置換もしくは置換アルキルアリーレン、無置換もしくは置換シクロアルキレン、または無置換もしくは置換ヘテロシクロアルキレンであり；
各Ｒ１０は、独立して、無置換もしくは置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、無置換もしくは置換シクロアルキル、無置換もしくは置換ヘテロシクロアルキル、無置換もしくは置換アリールアルキル、無置換もしくは置換アリール；または無置換もしくは置換ヘテロアリールであり；ならびに
ｎは、２、３、４、５または６である］
によって表される構造を有する化合物またはその医薬的に許容される塩。
【請求項２】
式（Ｉａ）：
【化３】
2015508074.tif 000039
によって表される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
式（Ｉｂ）：
【化４】
2015508074.tif 000040
によって表される構造を有する、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ１ａが、Ｈ、Ｍｅ、
【化５】
2015508074.tif 000041
からなる群から選択されるものである、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
標的細胞上の化学物質に特異的または選択的に結合する標的部分に共有結合している請求項１に記載の化合物を含む、抱合体。
【請求項６】
前記標的部分が、抗体またはその抗原結合部位であり、前記標的細胞が、腫瘍細胞であり、ならびに化学物質が、腫瘍関連抗原である、請求項５に記載の抱合体。
【請求項７】
式（ＩＩＩ）
［Ｄ（ＸＤ）ａＣ（ＸＺ）ｂ］ｍＺ      （ＩＩＩ）
［式中、
Ｚは、標的部分であり；
ＸＤは、第１のスペーサー部分であり；
ＸＺは、第２のスペーサー部分であり；
Ｃは、切断可能な基であり；
下付き文字ａおよびｂは、独立して、０または１であり；
下付き文字ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；ならびに
Ｄは、
【化６】
2015508074.tif 000042
からなる群から選択されるものであって、式中、
Ｒ２は、Ｈ、Ｒ１０、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０、またはＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０であり；
Ｒ３は、Ｈまたは無置換もしくは置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＯＲ１０、ＳＲ１０、ＮＨＲ１０、Ｎ（Ｒ１０）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、またはＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０であり；
Ｒ５は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＯＲ１０、ＳＲ１０、ＮＨＲ１０、Ｎ（Ｒ１０）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、またはＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０であり；
Ｒ６は、Ｈまたは無置換もしくは置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであるか；あるいはＲ５およびＲ６は、結合して＝Ｏを形成し；
Ｒ７は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＯＲ１０、ＳＲ１０、ＮＨＲ１０、Ｎ（Ｒ１０）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、またはＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０であり；
Ｒ８は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群から選択されるα−アミノ酸の側鎖残基であり；
Ｒ９は、無置換もしくは置換アリーレン、無置換もしくは置換ヘテロアリーレン、無置換もしくは置換アルキルアリーレン、無置換もしくは置換シクロアルキレン、または無置換もしくは置換ヘテロシクロアルキレンであり；
各Ｒ１０は、独立して、無置換もしくは置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、無置換もしくは置換シクロアルキル、無置換もしくは置換ヘテロシクロアルキル、無置換もしくは置換アリールアルキル、無置換もしくは置換アリール；または無置換もしくは置換ヘテロアリールであり；
Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり；ならびに
ｎは、２、３、４、５または６である］
によって表される構造を有する、請求項５に記載の抱合体。
【請求項８】
式（ＩＶ）
Ｄ−（ＸＤ）ａＣ（ＸＺ）ｂ−Ｒ３１    （ＩＶ）
［式中、
Ｒ３１は、反応性官能基であり；
ＸＤは、第１のスペーサー部分であり；
ＸＺは、第２のスペーサー部分であり；
Ｃは、切断可能な基であり；
下付き文字ａおよびｂは、独立して、０または１であり；
下付き文字ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり；ならびに
Ｄは、
【化７】
2015508074.tif 000043
からなる群から選択されるものであって；式中、
Ｒ２は、Ｈ、Ｒ１０、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０、またはＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０であり；
Ｒ３は、Ｈまたは無置換もしくは置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＯＲ１０、ＳＲ１０、ＮＨＲ１０、Ｎ（Ｒ１０）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、またはＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０であり；
Ｒ５は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＯＲ１０、ＳＲ１０、ＮＨＲ１０、Ｎ（Ｒ１０）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、またはＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０であり；
Ｒ６は、Ｈまたは無置換もしくは置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであるか；あるいはＲ５およびＲ６は、結合して＝Ｏを形成し；
Ｒ７は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＯＲ１０、ＳＲ１０、ＮＨＲ１０、Ｎ（Ｒ１０）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、またはＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０であり；
Ｒ８は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群から選択されるα−アミノ酸の側鎖残基であり；
Ｒ９は、無置換もしくは置換アリーレン、無置換もしくは置換ヘテロアリーレン、無置換もしくは置換アルキルアリーレン、無置換もしくは置換シクロアルキレン、または無置換もしくは置換ヘテロシクロアルキレンであり；
各Ｒ１０は、独立して、無置換もしくは置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、無置換もしくは置換シクロアルキル、無置換もしくは置換ヘテロシクロアルキル、無置換もしくは置換アリールアルキル、無置換もしくは置換アリール；または無置換もしくは置換ヘテロアリールであり；
Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり；ならびに
ｎは、２、３、４、５、または６である］
に記載の構造を有する組成物。
【請求項９】
Ｒ３１が、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＨ、マレイミド、シクロオクチン、アジド、ヒドロキシルアミノ、またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
癌にかかっている対象における癌の治療方法であって、治療上有効量の請求項１に記載の化合物または標的部分とのその抱合体を対象に投与することを特徴とする方法。
【請求項１１】
前記化合物が、抗体である標的部分に抱合されているものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が、癌によって過剰発現され、または唯一発現される抗原に結合するものである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌が、白血病、腎臓癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、乳癌および前立腺癌からなる群から選択されるものである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の化合物および医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
前記化合物が、標的部分に抱合されているものである、請求項１４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エンジイン化合物およびその抱合体、このような化合物および抱合体の調製および使用方法、ならびにこのような化合物および抱合体を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
エンジイン化合物は、Ｚ−炭素−炭素の二重結合および２つの炭素−炭素の三重結合を含む著しく歪んだ九員または十員環基を有する抗生物質の一種であり、通常、後者の２つが前者に隣接して構成される。エンジイン化合物は、一本鎖および二本鎖を切断する強力なＤＮＡ損傷因子である。それらの効力は、ＤＮＡに結合し、歪んだ環基が高い反応性の１，４−ベンゼノイドジラジカルに変換されるバーグマン転位を経て、そこから水素を除去するそれらの能力に起因するものである。
【化１】
2015508074.tif 000003
【０００３】
ウンシアラマイシンは、地衣類Cladonia uncialisで見出されたストレプトマイセス株から単離されたエンジインである（非特許文献１および特許文献１）。（最初の著者名または発明者名および年による本明細書で引用される全ての文献は、本明細書の最後の項目「参考文献」で提供される。）
【化２】
2015508074.tif 000004
【０００４】
ウンシアラマイシンの構造は、全合成によって確認された（非特許文献２および３）。合成の過程において、非天然２６（Ｓ）エピマーは、天然２６（Ｒ）エピマーとほぼ同一の活性であり−すなわち、Ｃ２７メチルの立体化学は、生物学的活性についてわすかな効果を有することを見出した。両方のエピマーは、数種類の卵巣腫瘍細胞株に対して活性であった。ＩＣ５０値は、そのエピマーおよび細胞株または亜細胞株に依存して、９ｘ１０−１２〜１ｘ１０−１０の範囲であった（非特許文献４）。
【０００５】
抱合体は、極めて高い細胞毒性を有することもあり、あるいは全身にわたる毒性のリスクのため投与することに問題がありうる抗癌剤の重要な送達方法である。抱合体において、薬物は、癌細胞に特有の化学物質に特異的にまたは選択的に結合する標的部分に抱合（共有結合）されており、それによりこの薬物を高い特異性をもってそこに送達する。さらに、この薬物は、通常、共有リンカーの切断によって抱合体から放出されるまで不活性な形で保たれる。
【０００６】
典型的には、標的部分は、抗体またはその抗原結合部分であり、その抗原は、癌細胞によって過剰発現されるか、または唯一発現されている（「腫瘍関連抗原」）。このような例において、得られた抱合体は、「免疫抱合体」または「抗体−薬物抱合体」（ＡＤＣ）と称されることもある。好ましくは、腫瘍関連抗原は癌細胞の表面上に局在するが、近隣の細胞外スペースに分泌されていることもありうる。結合することにより、抗原抱合体複合体は、内部に取り込まれ、最終的にリソソームなどの小胞体内部に抜け出し、その共有リンカーが切断され、活性薬剤を遊離させてその化学療法効果を発揮する。
【０００７】
有利なことに、共有リンカーは、切断が、血漿中ではなく癌細胞内部で高頻度にて見られる因子によって引き起こされるように設計される。１つのこのような因子は、低いリソソームｐＨであり、共有リンカーはヒドラゾンなどの酸性感受性の基でありうる。他のこのような因子は、一般に、ジスルフィド交換メカニズムによるジスルフィド共有リンカーの切断を可能にするグルタチオンのより高い細胞内濃度である。さらに別のこのような因子は、好ましい基質となるように設計されたペプチドリンカーを切断できるカテプシンＢなどのリソソーム酵素の存在である（非特許文献５）。
【０００８】
抱合体は、癌治療においてエンジイン薬物を送達するために用いられてきた。ゲムツズマブオゾガマイシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））は、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体およびエンジイン誘導体カリチアマイシンの抱合体である。これは、急性骨髄性白血病の治療について認可されたが、後に市場から撤退された。いくつかの他のエンジイン薬物は、特に、抱合した形態において開発努力の対象となっている。総説として、非特許文献６を参照のこと。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】Ｄａｖｉｅｓら，ＷＯ２００７／０３８８６８Ａ２（２００７）
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Davies et al., Org. Lett. 2005, 7 (23), 5233-5236
【非特許文献２】Nicolaou et al., Ang. Chem. 2007, 119, 4788-4791
【非特許文献３】Nicolaou et al., Ang. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 4704-4707
【非特許文献４】Nicolaou et al., Ang. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 185-189
【非特許文献５】Davies et al., Org. Lett. 2005, 7 (23), 5233-5236
【非特許文献６】Shao, Curr. Mol. Pharmacology 2008, 1, 50-60
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、それ自体として、または組み合わせて用いられる化学療法剤として有用性を有する強力な細胞毒素である、ウンシアラマイシン骨格に基づく化合物を提供する。ある態様において、式（Ｉ）：
【化３】
2015508074.tif 000005
［式中、
Ｒ０は、ＮＨＲ１ａ、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１ｂ、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、（ＣＨ２）１−４ＮＨＲ１ａ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＯＲ１ａまたはＳＲ１ｂであり；
Ｒ１ａは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ８ＮＨ２またはＣ（＝Ｏ）Ｒ９ＮＨ２であり；
Ｒ１ｂは、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、（ＣＨ２）ｎＮＨ２、
【化４】
2015508074.tif 000006
であり；
Ｒ２は、Ｈ、Ｒ１０、Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１０またはＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０であり；
Ｒ３は、Ｈ、または無置換もしくは置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであり；
Ｒ４は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＯＲ１０、ＳＲ１０、ＮＨＲ１０、Ｎ（Ｒ１０）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１０またはＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０であり；
Ｒ５は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＯＲ１０、ＳＲ１０、ＮＨＲ１０、Ｎ（Ｒ１０）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１０またはＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０であり；
Ｒ６は、Ｈ、または無置換もしくは置換Ｃ１−Ｃ６アルキルであるか；あるいはＲ５およびＲ６は、結合して＝Ｏを形成し；
Ｒ７は、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨ２、ＯＲ１０、ＳＲ１０、ＮＨＲ１０、Ｎ（Ｒ１０）２、ＮＨＣ（＝Ｏ）ＯＲ１０、ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨＲ１ｂ、ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０、ＳＣ（＝Ｏ）Ｒ１０またはＮＨＣ（＝Ｏ）Ｒ１０であり；
Ｒ８は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリンからなる群から選択されるα−アミノ酸の側鎖残基であり；
Ｒ９は、無置換もしくは置換アリーレン、無置換もしくは置換ヘテロアリーレン、無置換もしくは置換アルキルアリーレン、無置換もしくは置換シクロアルキレンまたは無置換もしくは置換ヘテロシクロアルキレンであり；
各Ｒ１０は、独立して、無置換もしくは置換Ｃ１−Ｃ６アルキル、無置換もしくは置換シクロアルキル、無置換もしくは置換ヘテロシクロアルキル、無置換もしくは置換アリールアルキル、無置換もしくは置換アリール；または無置換もしくは置換ヘテロアリールであり；ならびに
ｎは、２、３、４、５または６である］
で表される構造を有する化合物またはその医薬的に許容される塩が提供される。
【００１２】
好ましくは、式（Ｉ）において、Ｒ０は、ＮＨＲ１ａである。
【００１３】
基ＮＨＲ１ａは、６、７、８、または９位における炭素原子のいずれにも結合することができる（炭素原子の番号付けについては、上述のウンシアラマイシンの構造式を参照）。よって、式（Ｉ）の構造は、式（Ｉ’）
【化５】
2015508074.tif 000007
［式中、Ｒ１１基のうちの１つは、Ｒ０であり、残りのＲ１１基は、各々、Ｈであり、Ｒ０、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７は、式（Ｉ）について上記で定義されるとおりである］
によって同等に表すことができる。
【００１４】
ウンシアラマイシンは、抱合体中の薬物成分の潜在的な候補であるが、生物学的活性を損なうことなく標的部分に抱合するための部位として容易に利用可能な官能基を欠いている。我々は、式（Ｉ）に示されるように、生物学的活性を許容できないほどに失うことなく、Ｒ０基をアントラキノン部分における最も左の芳香族環に導入することができ、さらにこのＲ０基は、抱合のための多用途の部位であることを見出した。よって、別の実施態様において、本発明は、標的細胞（好ましくは、癌細胞）上の化学物質に特異的または選択的に結合する標的部分に共有結合している式（Ｉ）の化合物を含む抱合体を提供する。 好ましくは、標的部分は、抗体、より好ましくは、モノクローナル抗体、さらにより好ましくは、ヒトモノクローナル抗体であり、化学物質は、腫瘍関連抗原である。
【００１５】
別の態様において、本発明の化合物および標的部分への抱合に適する反応性官能基を有するリンカー部分を含む組成物が提供される。
【００１６】
別の態様において、本発明は、癌にかかっている対象における癌細胞の細胞増殖の阻害方法であって、治療上有効量の本発明の化合物または標的部分（特に、抗体）とのその抱合体を前記対象に投与することを特徴とする方法を提供する。前記癌細胞は、白血病、腎臓癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、乳癌または前立腺癌細胞でありうる。
【００１７】
別の態様において、このような癌にかかっている対象における癌の治療方法であって、治療上有効量の本発明の化合物または標的部分（特に、抗体）とのその抱合体を前記対象に投与することを特徴とする方法が提供される。別の態様において、このような癌にかかっている対象における癌の治療剤の製造のための、本発明の化合物または標的部分（特に、抗体）とのその抱合体の使用が提供される。前記癌は、白血病、腎臓癌、卵巣癌、肺癌、大腸癌、乳癌または前立腺癌でありうる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の化合物の合成スキームを示す。
【図２】図２は、本発明の化合物の合成スキームを示す。
【図３】図３は、本発明の化合物の合成スキームを示す。
【図４】図４は、本発明の化合物の合成スキームを示す。
【図５】図５は、本発明の化合物の合成スキームを示す。
【図６】図６は、本発明の化合物の合成スキームを示す。
【図７】図７は、抱合の調製時におけるリンカーおよび反応性官能基の本発明化合物への結合のための反応スキームを示す。
【図８】図８は、抱合の調製時におけるリンカーおよび反応性官能基の本発明化合物への結合のための反応スキームを示す。
【図９】図９は、抱合の調製時におけるリンカーおよび反応性官能基の本発明化合物への結合のための反応スキームを示す。
【図１０】図１０は、抱合の調製時におけるリンカーおよび反応性官能基の本発明化合物への結合のための反応スキームを示す。
【図１１】図１１ａおよび１１ｂは、選択した対照化合物と比較した本発明化合物の抗増殖活性のプロットを示す。
【図１２】図１２ａおよび１２ｂは、選択した対照化合物と比較した本発明のさらなる化合物の抗増殖活性のプロットを示す。
【図１３】図１３ａ、１３ｂおよび１３ｃは、本発明の化合物から作り出した抗体−薬物抱合体の抗増殖活性のプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
定義
「抗体」は、全体の抗体およびその抗原結合フラグメント（すなわち、「抗原結合部分」）または単鎖変異型を意味する。全体の抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質である。各重鎖には、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む）が含まれる。各軽鎖には、軽鎖可変領域（ＶＬまたはＶｋ）および軽鎖定常領域（１つの単一ドメインであるＣＬを含む）が含まれる。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）に散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細かく分けられる。各ＶＨおよびＶＬには、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲが含まれ、アミノ末端からカルボキシル基に下記の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４で配列される。可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。定常領域は、抗体の宿主組織または因子（免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を含む）への結合を介在しうる。抗体は、５ｘ１０−８Ｍまたはそれ以下、より好ましくは、１ｘ１０−８Ｍまたはそれ以下、より好ましくは、６ｘ１０−９Ｍまたはそれ以下、より好ましくは、３ｘ１０−９Ｍまたはそれ以下、さらにより好ましくは、２ｘ１０−９Ｍまたはそれ以下のＫＤで抗原Ｘに結合する場合、抗原Ｘに「特異的に結合する」と言われている。前記抗体は、キメラ、ヒト化、または好ましくはヒトでありうる。重鎖定常領域は、糖鎖結合のタイプまたは程度で作用し、抗体半減期を延長し、エフェクター細胞もしくは補体系との相互作用を高めもしくは減少させ、いくつかの他の特性を調節するように操作することができる。前記操作は、１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、付加もしくは欠失、またはドメインの別の免疫グロブリン型のドメインへの置換、あるいはこれらの組み合わせによって行うことができる。
【００２０】
抗体の「抗原結合フラグメント」および「抗原結合部分」（あるいは単に「抗体部分」または「抗体フラグメント」）は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたはそれ以上のフラグメントを意味する。抗体の抗原結合機能は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）；（ｉｉｉ）必須としてヒンジ領域の一部を有するＦａｂであるＦａｂ’フラグメント（例えば、Abbas et al., Cellular and Molecular Immunology, 6th Ed., Saunders Elsevier 2007を参照のこと）；（ｉｖ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｖ）抗体の単一腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｖｉ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；（ｖｉｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）；ならびに（ｖｉｉｉ）ナノボディ（１つの可変ドメインおよび２つの定常ドメインを含有する重鎖可変領域）などの全長抗体のフラグメントによって担われうることが示されている。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）が別々の遺伝子にコードされているが、それらは、ＶＬおよびＶＨ領域がペアとなって一価分子を形成する単一タンパク質鎖（単一鎖ＦｖまたはｓｃＦｖとして知られる）として調製することができる合成リンカーによって、組み換え方法を用いて繋ぐことができる。；例えば、Bird et al.(1988) Science 242:423-426；およびHuston et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883を参照のこと）。このような単一鎖抗体はまた、抗体の用語「抗原結合部分」内に含まれる。
【００２１】
「単離された抗体」は、異なる抗原特性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体（例えば、抗原Ｘに特異的に結合する単離された抗体は、抗原Ｘ以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）を意味する。しかしながら、抗原Ｘに特異的に結合する単離された抗体は、他の種に由来する抗原Ｘ分子などの他の抗原に対して交差反応を示す。ある実施態様において、単離された抗体は、ヒト抗原Ｘに特異的に結合し、他（非ヒト）抗原Ｘ抗原とは交差反応しない。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含み得ない。
【００２２】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一の結合特異性および特定のエピトープに対する親和性を示す、単一分子組成物の抗体分子の調製物を意味する。
【００２３】
「ヒト抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方（存在すれば、定常領域）がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を意味する。ヒト抗体には、天然または合成修飾を含む後の修飾が含まれうる。ヒト抗体には、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列にコードされていないアミノ酸残基が含まれうる（例えば、インビトロでランダムもしくは部位特異的な変異誘発またはインビボで体細胞突然変異によって導入される突然変異）。しかしながら、「ヒト抗体」には、マウスなどの別の哺乳類の種に由来するＣＤＲ配列がヒトのフレームワーク配列に移植された抗体は含まれない。
【００２４】
「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する、単一結合特異性を示す抗体を意味する。ある実施態様において、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有する遺伝子組み換え非ヒト動物（例えば、遺伝子組み換えマウス）から得られるＢ細胞を不老化細胞と融合させたハイブリドーマによって産生される。
【００２５】
「脂肪族」は、特定数の炭素原子（例えば、「Ｃ３脂肪族」、「Ｃ１−Ｃ５脂肪族」または「Ｃ１からＣ５脂肪族」などのように、後半の２つの用語は、１から５個の炭素原子を有する脂肪族部分を意味する）または、炭素原子数が明確に特定されていない場合、１から４個の炭素原子（不飽和脂肪族部分の場合には、２から４個の炭素）を有する、直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和非芳香族炭化水素部分を意味する。
【００２６】
「アルキル」は、適用される炭素原子数を表記するための同一の規則で飽和脂肪族部分を意味する。例示として、Ｃ１−Ｃ４アルキル部分には、以下に限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、イソブチル、ｔ−ブチル、１−ブチル、２−ブチルなどが挙げられる。「アルキレン」は、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２およびＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２などのアルキル基の二価の同等物を意味する。
【００２７】
「アルケニル」は、適用される炭素原子数を表記するための同一の規則で少なくとも１つの炭素−炭素の二重結合を有する脂肪族部分を意味する。例示として、Ｃ２−Ｃ４アルケニル部分には、以下に限定されないが、エテニル（ビニル）、２−プロペニル（アリルまたはプロパ−２−エニル）、シス−１−プロペニル、トランス−１−プロペニル、Ｅ−（またはＺ−）２−ブテニル、３−ブテニル、１，３−ブタジエニル（ブタ−１，３−ジエニル）などが含まれる。
【００２８】
「アルキニル」は、適用される炭素原子数を表記するための同一の規則で少なくとも１つの炭素−炭素の三重結合を有する脂肪族部分を意味する。例示として、Ｃ２−Ｃ４アルキニル基には、エチニル（アセチレニル）、プロパルギル（プロパ−２−イニル）、１−プロピニル、ブタ−２−イニルなどが含まれる。
【００２９】
「シクロ脂肪族」は、１〜３個の環を有し、各環は、３から８個（好ましくは、３から６個）の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和の非芳香族炭化水素部分を意味する。「シクロアルキル」は、各環が飽和されているシクロ脂肪族部分を意味する。「シクロアルケニル」は、少なくとも１つの環が少なくとも１つの炭素−炭素の二重結合を有するシクロ脂肪族部分を意味する。「シクロアルキニル」は、少なくとも１つの環が少なくとも１つの炭素−炭素の三重結合を有するシクロ脂肪族部分を意味する。例示として、シクロ脂肪族部分には、以下に限定されないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル、シクロオクチルおよびアダマンチルが含まれる。好ましいシクロ脂肪族部分は、シクロアルキル、特に、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルである。「シクロアルキレン」は、シクロアルキル基の二価の同等物を意味する。
【００３０】
「ヘテロシクロ脂肪族」は、シクロ脂肪族部分であって、その少なくとも１つの環において、３個まで（好ましくは、１から２個）の炭素が、Ｎ、ＯまたはＳから独立して選択されるヘテロ原子で置換されており、前記ＮおよびＳは、適宜酸化されていてもよく、前記Ｎは、四級化されていてもよいものを意味する。同様に、「ヘテロシクロアルキル」、「ヘテロシクロアルケニル」、および「ヘテロシクロアルキニル」は、それぞれ、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはシクロアルキニル部分であって、その少なくとも１つの環が修飾されているものを意味する。典型的なヘテロシクロ脂肪族部分としては、アジリジニル、アゼチジニル、１，３−ジオキサニル、オキセタニル、テトラヒドロフリル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロチオピラニルスルホン、モルホリニル、チオモルホリニル、チオモルホリニルスルホキシド、チオモルホリニルスルホン、１，３−ジオキソラニル、テトラヒドロ−１，１−ジオキソチエニル、１，４−ジオキサニル、チエタニルなどが挙げられる。「ヘテロシクロアルキレン」は、ヘテロシクロアルキル基の二価の同等物を意味する。
【００３１】
「アルコキシ」、「アリールオキシ」、「アルキルチオ」および「アリールチオ」は、それぞれ、−Ｏ（アルキル）、−Ｏ（アリール）、−Ｓ（アルキル）、および−Ｓ（アリール）を意味する。例としては、それぞれ、メトキシ、フェノキシ、メチルチオ、およびフェニルチオである。
【００３２】
「ハロゲン」または「ハロ」は、フッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。
【００３３】
「アリール」は、単環、二環、または三環式環基を有し、各環が３から７個の炭素原子を有し、少なくとも１つの環が芳香族である炭化水素部分を意味する。環基中の環は、相互に縮合されていてもよく（ナフチルのように）、または相互に結合していてもよく（ビフェニルのように）、非芳香族環に縮合され、もしくは結合していてもよい（インダニルまたはシクロヘキシルフェニルのように）。さらなる例示として、アリール部分としては、以下に限定されないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、ビフェニル、フェナントリル、アントラセニル、およびアセナフチルが挙げられる。「アリーレン」は、アリール基の２価の同等物、例えば、１，２−フェニレン、１，３−フェニレンまたは１，４−フェニレンを意味する。
【００３４】
「ヘテロアリール」は、単環、二環、または三環式環基を有する部分であって、各環が３から７個の炭素原子を有し、少なくとも１つの環がＮ、Ｏ、またはＳから独立して選択される１から４個のヘテロ原子を含有する芳香族環であって、前記ＮおよびＳは酸化されていてもよく、前記Ｎは、四級化されていてもよいものを意味する。このような少なくとも１つのヘテロ原子を含有する芳香族環は、他のタイプの環に縮合されていてもよく（ベンゾフラニルまたはテトラヒドロイソキノリルのように）、あるいは他のタイプの環に直接結合していてもよい（フェニルピリジルまたは２−シクロペンチルピリジルのように）。さらなる例示として、ヘテロアリール部分には、ピロリル、フラニル、チオフェニル（チエニル）、イミダゾリル、ピラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピリジル、Ｎ−オキソピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、シンノリニル、キノザリニル（quinozalinyl）、ナフチリジニル、ベンゾフラニル、インドリル、ベンゾチオフェニル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、フェノチアゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンゾトリアゾリル、ジベンゾフラニル、カルバゾリル、ジベンゾチオフェニル、アクリジニルなどが含まれる。「ヘテロアリーレン」は、アリール基の二価の同等物を意味する。
【００３５】
部分が置換されていてもよいと記載されている場合、「無置換または置換」または「適宜置換されていてもよい」の使用によるなど、例えば、「無置換または置換Ｃ１−Ｃ５アルキル」または「適宜置換されていてもよいヘテロアリール」のような場合、このような部分は、１つまたはそれ以上、好ましくは１〜５個、より好ましくは、１または２個の独立して選択される置換基を有していてもよい。置換基および置換パターンは、置換基が結合する部分に関して、化学的に安定であり、当該技術分野で公知の技術および本明細書に記載の方法によって合成することができる化合物を提供するために、当業者によって選択されうる。
【００３６】
「アリールアルキル」、「（ヘテロシクロ脂肪族）アルキル、「アリールアルケニル」、「アリールアルキニル」、「ビアリールアルキル」などは、場合によっては、アリール、ヘテロシクロ脂肪族、ビアリールなどの部分で置換されていてもよく、場合によっては、アルキル、アルケニルまたはアルキニル部分で空の（open）（充足されていない（unsatisfied））原子価を有するアルキル、アルケニルまたはアルキニル部分を意味し、例えば、ベンジル、フェネチル、Ｎ−イミダゾイルエチル、Ｎ−モルホリノエチルなどである。逆に、「アルキルアリール」、「アルケニルシクロアルキル」などは、場合によっては、アルキル、アルケニルなどの部分で置換されていてもよいアリール、シクロアルキルなどの部分を意味し、場合によっては、例えば、メチルフェニル（トリル）またはアリルシクロヘキシルなどである。「ヒドロキシアルキル」、「ハロアルキル」、「アルキルアリール」、「シアノアリール」などは、場合によっては、１つまたはそれ以上の同定された置換基で置換されていてもよいアルキル、アリールなどの部分を意味する（場合によっては、ヒドロキシル、ハロなど）。
【００３７】
例示として、許容可能な置換基としては、以下に限定されないが、アルキル（特に、メチルまたはエチル）、アルケニル（特に、アリル）、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、ハロ（特に、フルオロ）、ハロアルキル（特に、トリフルオロメチル）、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル（特に、ヒドロキシエチル）、シアノ、ニトロ、アルコキシ、−Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｏ（ハロアルキル）（特に、−ＯＣＦ３）、−Ｏ（シクロアルキル）、−Ｏ（ヘテロシクロアルキル）、−Ｏ（アリール）、アルキルチオ、アリールチオ、＝Ｏ、＝ＮＨ、＝Ｎ（アルキル）、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、アジド、−ＮＨ２、−ＮＨ（アルキル）、−Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ（アリール）、−ＮＨ（ヒドロキシアルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＯＳＯ２（アルキル）、−ＳＨ、−Ｓ（アルキル）、−Ｓ（アリール）、−Ｓ（シクロアルキル）、−Ｓ（＝Ｏ）アルキル、−ＳＯ２（アルキル）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（アルキル）２などが含まれる。
【００３８】
置換される部分が脂肪族部分である場合、好ましい置換基は、アリール、ヘテロアリール、シクロ脂肪族、ヘテロシクロ脂肪族、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、−Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｏ（ハロアルキル）、−Ｏ（シクロアルキル）、−Ｏ（ヘテロシクロアルキル）、−Ｏ（アリール）、アルキルチオ、アリールチオ、＝Ｏ、＝ＮＨ、＝Ｎ（アルキル）、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ（アルキル）、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、アジド、−ＮＨ２、−ＮＨ（アルキル）、−Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ（アリール）、−ＮＨ（ヒドロキシアルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＯＳＯ２（アルキル）、−ＳＨ、−Ｓ（アルキル）、−Ｓ（アリール）、−Ｓ（＝Ｏ）アルキル、−Ｓ（シクロアルキル）、−ＳＯ２（アルキル）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（アルキル）、および−ＳＯ２Ｎ（アルキル）２である。より好ましい置換基は、ハロ、ヒドロキシル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、−Ｏ（アリール）、＝Ｏ、＝ＮＯＨ、＝ＮＯ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、アジド、−ＮＨ２、−ＮＨ（アルキル）、−Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ（アリール）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、および−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２である。特に好ましいのは、フェニル、シアノ、ハロ、ヒドロキシル、ニトロ、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、Ｏ（Ｃ２−Ｃ４アルキレン）ＯＨ、およびＯ（Ｃ２−Ｃ４アルキレン）ハロである。
【００３９】
置換される部分がシクロ脂肪族である場合、ヘテロシクロ脂肪族、アリール、またはヘテロアリール部分、好ましい置換基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、−Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｏ（ハロアルキル）、−Ｏ（アリール）、−Ｏ（シクロアルキル）、−Ｏ（ヘテロシクロアルキル）、アルキルチオ、アリールチオ、−Ｃ（＝Ｏ）（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、アジド、−ＮＨ２、−ＮＨ（アルキル）、−Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ（アリール）、−ＮＨ（ヒドロキシアルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２、−ＯＳＯ２（アルキル）、−ＳＨ、−Ｓ（アルキル）、−Ｓ（アリール）、−Ｓ（シクロアルキル）、−Ｓ（＝Ｏ）アルキル、−ＳＯ２（アルキル）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（アルキル）、および−ＳＯ２Ｎ（アルキル）２である。より好ましい置換基は、アルキル、アルケニル、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシル、ヒドロキシアルキル、シアノ、ニトロ、アルコキシ、−Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｈ、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨＯＨ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＯＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ（ヒドロキシアルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ２、−ＮＨ（アルキル）、−Ｎ（アルキル）２、−ＮＨ（アリール）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｈ、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ２、−ＮＨＣ（＝Ｏ）ＮＨ（アルキル）、−ＮＨＣ（＝Ｏ）Ｎ（アルキル）２、および−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２である。特に好ましいのは、Ｃ１−Ｃ４アルキル、シアノ、ニトロ、ハロおよびＣ１−Ｃ４アルコキシである。
【００４０】
「Ｃ１−Ｃ５アルキル」または「５から１０％」のように、範囲が記載される場合、このような範囲には、最初の例におけるＣ１およびＣ５、および２番目の例における５％および１０％のように、範囲の終点が含まれる。
【００４１】
特定の立体異性体が特に示されていなければ（例えば、構造式中の関連する立体中心で太字または点線の結合により、構造式中のＥまたはＺ配置を有するように二重結合の表記により、または立体化学表記命名法の採用により）、全ての立体異性体が、純粋な化合物ならびにその混合物として本発明の範囲内に含まれる。特に断りがなければ、各エナンチオマー、ジアステレオマー、幾何異性体、ならびにその組み合わせおよび混合物は全て本発明に包含される。
【００４２】
当業者は、化合物が、本明細書で用いられる構造式に表されるものと同等である互変異性体型（例えば、ケトおよびエノール型）、共鳴構造、および双性イオン型を有しうるものであり、前記構造式が、このような互変異性体型、共鳴構造または双性イオン型を包含することを評価する。
【００４３】
「医薬的に許容されるエステル」は、インビボ（例えば、ヒト体内）で加水分解されて親化合物またはその塩を生じ、あるいはそれ自身、親化合物の活性と同様の活性を有するエステルを意味する。適するエステルとしては、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ２−Ｃ５アルケニルまたはＣ２−Ｃ５アルキニルエステル、特に、メチル、エチルまたはｎ−プロピルが含まれる。
【００４４】
「医薬的に許容される塩」は、医薬製剤に適切な化合物の塩を意味する。化合物が１つまたはそれ以上の塩基性基を有する場合、前記塩は、硫酸塩、臭化水素酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、マレイン酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、酢酸塩、パモ酸塩（embonate）、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、塩酸塩、乳酸塩、メチル硫酸塩、フマル酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、メシル酸塩、ラクトビオン酸塩、スベリン酸塩、トシレートなどの酸付加塩でありうる。化合物が１つまたはそれ以上の酸性基を有する場合、前記塩は、カルシウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、メグルミン塩、アンモニウム塩、亜鉛塩、ピペラジン塩、トロメタミン塩、リチウム塩、コリン塩、ジエチルアミン塩、４−フェニルシクロヘキシルアミン塩、ベンザチン塩、ナトリウム塩、テトラメチルアンモニウム塩などの塩でありうる。多形結晶形および溶媒和物もまた、本発明の範囲内に含まれる。
【００４５】
組成物
式（Ｉ）による好ましい実施態様は、式（Ｉａ）によって表される構造を有する化合物またはその医薬的に許容される塩である。この実施態様において、基ＮＨＲ１ａは、Ｃ６に結合しており、Ｒ１ａは、式（Ｉ）：
【化６】
2015508074.tif 000008
に関して上記で定義されるとおりである。
【００４６】
より好ましい実施態様は、式（Ｉｂ）によって表される構造を有する化合物またはその医薬的に許容される塩であって、Ｒ１ａは、式（Ｉ）について上記で定義されるとおりである。式（Ｉｂ）において、Ｃ２７−メチルの立体化学は、天然に存在するウンシアラマイシン（上記のウンシアラマイシンについての構造式を参照）のものに相当する。
【化７】
2015508074.tif 000009
【００４７】
Ｒ０、Ｒ１ａ、Ｒ１ｂ、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６およびＲ７の各々において、式（Ｉ）または本明細書の他の式中に存在する場合、アルキル、アルキレン、アリール、アリーレン、ヘテロアリール、ヘテロアリーレン、シクロアルキル、シクロアルキレン、ヘテロシクロアルキルまたはヘテロシクロアルキレン基は、無置換または置換のいずれかであることが示され、無置換の態様が好ましい。式（Ｉ）または本明細書の他の式中に存在する場合、Ｒ２は、好ましくは、ＨまたはＣ１−Ｃ３アルキルであり、より好ましくは、Ｈである。式（Ｉ）または本明細書の他の式中に存在する場合、Ｒ３は、好ましくは、Ｃ１−Ｃ３アルキルであり、より好ましくは、Ｍｅである。式（Ｉ）または本明細書の他の式中に存在する場合、Ｒ４は、好ましくは、ＯＨ、ＯＲ１０またはＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０（Ｒ１０は、好ましくは、Ｃ１−Ｃ３アルキルである）であり、より好ましくは、ＯＨである。式（Ｉ）または本明細書の他の式中に存在する場合、Ｒ５は、好ましくは、ＯＨ、ＯＲ１０またはＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０（Ｒ１０は、好ましくは、Ｃ１−Ｃ３アルキル）であり、より好ましくは、ＯＨである。式（Ｉ）または本明細書の他の式中に存在する場合、Ｒ６は、好ましくは、Ｈである。式（Ｉ）または本明細書の他の式中に存在する場合、Ｒ７は、好ましくは、ＯＨ、ＯＲ１０またはＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１０（Ｒ１０は、好ましくは、Ｃ１−Ｃ３アルキルである）であり、より好ましくは、ＯＨである。式（Ｉ）または本明細書の他の式中に存在する場合、Ｒ９は、好ましくは、
【化８】
2015508074.tif 000010
である。
【００４８】
より好ましくは、Ｒ９は、
【化９】
2015508074.tif 000011
であり、特に前者である。
【００４９】
式（Ｉ）または本明細書の他の式中に存在する場合、Ｒ１０は、好ましくは、Ｃ１−Ｃ６アルキル、シクロヘキシル、シクロペンチル、フェニル、フラニルまたはピリジルである。より好ましくは、Ｒ１０は、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルである。
【００５０】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）または本明細書の他の式中に存在する場合、Ｒ８は、好ましくは、アルギニン、アスパラギン酸、シトルリン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、リジン、フェニルアラニン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群から選択されるα−アミノ酸の側鎖残基である。より好ましくは、Ｒ８は、グリシン、リジン、シトルリン、またはセリンの側鎖残基である。好ましくは、キラル炭素における立体化学は、天然に存在するタンパク質を構成するα−アミノ酸、すなわち、Ｌ−異性体のものに相当する。
【００５１】
式（Ｉ）、（Ｉａ）および／または（Ｉｂ）による構造を有する化合物の好ましい実施態様において、基Ｒ１ａは、Ｈ、Ｍｅ、
【化１０】
2015508074.tif 000012
からなる群から選択される。
【００５２】
式（Ｉ）、（Ｉａ）、および／または（Ｉｂ）による構造を有する化合物のより好ましい実施態様において、基Ｒ１ａは、Ｈ、
【化１１】
2015508074.tif 000013
である。
【００５３】
本発明の特定の化合物には、式（ＩＩａ）〜（ＩＩｈ）：
【化１２】
2015508074.tif 000014
による構造を有する化合物またはそれらの医薬的に許容される塩が含まれる。
【００５４】
抱合体
本発明の別の実施態様には、癌細胞上の化学物質に特異的または選択的に結合する標的部分に抱合されている式（Ｉ）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（ＩＩａ）、（ＩＩｂ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）、（ＩＩｅ）、（ＩＩｇ）または（ＩＩｈ）によって表される構造を有する化合物が含まれる。好ましくは、標的部分は、抗体またはその抗原結合部分であり、化学物質は、腫瘍関連抗原である。好ましくは、抱合体は、基Ｒ０への化学結合によって生じる。
【００５５】
別の実施態様において、式（ＩＩＩ）
［Ｄ（ＸＤ）ａＣ（ＸＺ）ｂ］ｍＺ      （ＩＩＩ）
［式中、Ｚは、リガンドであり；Ｄは、本発明による細胞毒性化合物（例えば、式（Ｉ）、（Ｉａ）または（Ｉｂ）による化合物）であり；ならびに−（ＸＤ）ａＣ（ＸＺ）ｂ−は、ＺとＤを連結させているため、「リンカー部分」または「リンカー」と総称される］
によって表される本発明による細胞毒性化合物およびリガンドを含む抱合体が提供される。リンカー内において、Ｃは、化合物Ｄの目的とする生物学的な活性部位で、またはその近くで切断されるように設計された切断可能な基であり；ＸＤおよびＸＺは、ＤとＣおよびＣとＺとの間隔を空けるため、スペーサー部分（または「スペーサー」）と呼ばれ；下付き文字ａおよびｂは、独立して、０または１であり（すなわち、ＸＤおよび／またはＸＺの存在は、任意である）；ならびに下付き文字ｍは、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０（好ましくは、１、２、３、または４）である。Ｄ、ＸＤ、Ｃ、ＸＺおよびＺは、下記でより十分に記載される。
【００５６】
リガンドＺ（例えば、抗体）は、目的の機能を提供する。抗原または受容体が局在する標的組織または細胞に結合することによって、リガンドＺは、そこへその抱合体を向かわせる。好ましくは、標的組織または細胞は、癌組織または細胞であり、抗原または受容体は、腫瘍関連抗原、すなわち、非癌性細胞と比較して、癌性細胞によって唯一発現されるか、または癌細胞によって過剰発現される抗原である。標的組織または細胞における基Ｃの切断は、化合物Ｄを放出して、その細胞毒性効果を局所で発揮させる。ある例において、抱合体は、エンドサイトーシスによって標的細胞に内在化され、切断は標的細胞内で生じる。このようにして、化合物Ｄの正確な送達は、必要とされる投薬量が減少されつつ、目的とする作用部位で達成される。また、化合物Ｄは、通常、その抱合された状態において生物学的に不活性であり（もしくは著しく低い活性であり）、それゆえ、標的としていない組織または細胞に対する所望していない毒性が減少される。抗癌剤は、一般的に、細胞に対して高い毒性を有するため、これは重要な留意事項である。
【００５７】
下付き文字ｍによって表されるように、リガンドＺの各分子は、リガンドＺが抱合に利用できる部位の数および用いられる実験条件に応じて、１つ以上の化合物Ｄと抱合することができる。当業者は、リガンドＺの各個別の分子が整数個の化合物Ｄに抱合され、前記抱合体の製造は、化合物ＤのリガンドＺへの非整数比について解析されてもよいことを理解する。
【００５８】
リガンドＺおよびその抱合体
好ましくは、リガンドＺは、抗体である。利便的で簡潔のためであって、限定のためではなく、リガンドＺの抱合体についての本明細書の下記の詳細な説明は、その抗体に関して記載されているが、当業者は、適宜変更すべきところを変更して、他のタイプのリガンドＺが抱合されうることを理解する。例えば、リガンドとしての葉酸との抱合体は、それらの表面上の葉酸受容体を有する細胞を標的とすることができる（Vlahov et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 2008, 18(16), 4558-4561; Leamon et al., Cancer Res. 2008, 68 (23), 9839-9844）。同一の理由のため、下記の詳細な説明は、主に、抗体Ｚの化合物Ｄに対する１：１の割合で記載される。
【００５９】
好ましくは、リガンドＺは、腫瘍関連抗原に対する抗体であり、このようなリガンドＺを含む抱合体を、癌細胞に選択的な標的とすることができる。このような抗原の例としては：メソテリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＣＤ２００（ＯＸ−２としても知られる）、Ｂ７Ｈ４（Ｏ８Ｅとしても知られる）、タンパク質チロシンキナーゼ７（ＰＴＫ７）、ＲＧ１、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ４４が挙げられる。前記抗体は、動物（例えば、マウス）、キメラ、ヒト化、または好ましくは、ヒトでありうる。前記抗体は、好ましくは、モノクローナル、特に、ヒトモノクローナル抗体である。前記抗原のいずれかに対するヒトモノクローナル抗体の製造は、出典明示により本明細書に取り込まれる、ＫｏｒｍａｎらのＵＳ２００９／００７４６６０Ａ１（Ｂ７Ｈ４）；Ｒａｏ−ＮａｉｋらのＵＳ２００９／０１４２３４９Ａ１Ａ２（ＣＤ１９）；ＫｉｎｇらのＵＳ２０１０／０１４３３６８Ａ１（ＣＤ２２）；ＫｅｌｅｒらのＵＳ７，３８７，７７６Ｂ２（２００８）（ＣＤ３０）；ＴｅｒｒｅｔｔらのＵＳ２００９／００２８８７２Ａ１（ＣＤ７０）；ＧｏｒｃｚｙｎｓｋｉらのＵＳ７，２３８，３５２Ｂ２（２００７）（ＣＤ２００）；ＫｏｒｍａｎらのＵＳ６，９８４，７２０Ｂ１（２００６）（ＣＴＬＡ−４）；ＫｏｒｍａｎらのＵＳ８，００８，４４９Ｂ２（２０１１）（ＰＤ−１）；ＨｕａｎｇらのＵＳ２００８／０２７９８６８Ａ１（ＰＳＭＡ）；ＴｅｒｒｅｔｔらのＵＳ２０１０／００３４８２６Ａ１（ＰＴＫ７）；ＨａｒｋｉｎｓらのＵＳ７，３３５，７４８Ｂ２（２００８）（ＲＧ１）；ＴｅｒｒｅｔｔらのＷＯ２００９／０４５９５７Ａ１（メソテリン）；およびＸｕらのＵＳ２０１０／００９２４８４Ａ１（ＣＤ４４）に開示されている。
【００６０】
リガンドＺはまた、アフィボディ（affibody）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ナノボディ、ユニボディ（unibody）、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン（anticalin）、ヴァーサボディ（versabody）、デュオカリン（duocalin）、リポカリン（lipocalin）、またはアビマー（avimer）などの抗体フラグメントまたは抗体模倣物でありうる。
【００６１】
リジン残基中のε−アミノ基、ペンダント炭水化物部分、カルボン酸基、ジスルフィド基、およびチオール基を含む、リガンドＺ上のいくつかの異なる反応基のいずれか１つは、抱合部位でありうる。反応基の各タイプは、有利な点と不利な点を有するトレードオフを示す。抱合に適する抗体基についての総説に関して、例えば、出典明示により本明細書に取り込まれる、Garnett, Adv. Drug Delivery Rev. 53 (2001), 171-216およびDubowchik and Walker, Pharmacology & Therapeutics 83 (1999), 67-123を参照のこと。
【００６２】
ある実施態様において、リガンドＺは、リジンε−アミノ基により抱合される。ほとんどの抗体は、複数の露出したリジンε−アミノ基を有し、（下記の本明細書でさらに記載されるような）ヘテロ二官能性物質による修飾を含む当該技術分野で公知の技術を用いて、アミド、ウレア、チオウレア、またはカルバメート結合により抱合されうる。しかしながら、どのε−アミノ基がどのくらい反応して、抱合調製物中のバッチ間の変動を引き起こす可能性を調整することは困難である。また、抱合は、抗体の元々の構造を維持するために重要なプロトン化ε−アミノ基の中和を引き起こしうるか、または抗原結合部位の近くのリジンもしくは抗原結合部位で生じ、いずれも望ましくないことを生じる。
【００６３】
別の態様において、リガンドＺは、多くの抗体がグリコシル化されているため、炭水化物側鎖により抱合することができる。炭水化物側鎖は、過ヨウ素酸塩で酸化させてアルデヒド基を生じ、次いで、セミカルバゾン、オキシムまたはヒドラゾン中などでアミンと反応してイミン基を形成することができる。望ましい場合、前記イミン基は、シアノ水素化ホウ素ナトリウムで還元することによってより安定なアミン基に変換することができる。炭水化物側鎖による抱合についてのさらなる開示に関しては、例えば、出典明示により本明細書に取り込まれる、Rodwell et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83, 2632-2636 (1986)を参照のこと。リジンε−アミノ基と同様に、抱合部位の位置および立体化学の再現性が懸念されている。
【００６４】
さらに別の実施態様において、リガンドＺは、カルボン酸基により抱合されうる。ある実施態様において、末端カルボン酸基は、官能化されてカルボヒドラジドを生じ、次いでアルデヒド保有の抱合部分と反応される。Fisch et al., Bioconjugate Chemistry 1992, 3, 147-153を参照のこと。
【００６５】
さらに別の実施態様において、抗体Ｚは、抗体Ｚ上のシステイン残基と抱合体の他の部分の硫黄とを架橋するジスルフィド基により抱合することができる。ある抗体は、遊離チオール（スルフヒドリル）基を欠失しているが、例えば、ヒンジ領域にジスルフィド基を有する。このような場合において、遊離チオール基は、元々のジスルフィド基の還元によって作り出すことができる。このように作り出された前記チオール基は、抱合のために用いることができる。例えば、出典明示により本明細書に取り込まれる、Packard et al., Biochemistry 1986, 25, 3548-3552; King et al., Cancer Res. 54, 6176-6185 (1994);およびDoronina et al., Nature Biotechnol. 21(7), 778-784 (2003)を参照のこと。再度、抱合部位の位置および立体化学の再現性および抗体本来の構造を妨げる可能性が懸念されている。
【００６６】
元々のジスルフィド結合を破壊することなく、遊離チオール基を抗体に導入するための多くの方法は公知であり、この方法は、本発明のリガンドＺを用いて実施することができる。用いられる方法に応じて、予測可能な数の遊離スルフヒドリルを所定の位置に導入することが可能でありうる。あるアプローチにおいて、システインが別のアミノ酸に置換されている変異を有する抗体が調製される。例えば、ＥｉｇｅｎｂｒｏｔらのＵＳ７，５２１，５４１Ｂ２（２００９）; Chilkoti et al., Bioconjugate Chem. 1994, 5, 504-507; ＵｒｎｏｖｉｔｚらのＵＳ４，６９８，４２０（１９８７）; Stimmel et al., J. Biol. Chem., 275 (39), 30445-30450 (2000); ＢａｍらのＵＳ７，３１１，９０２Ｂ２（２００７）; Kuan et al., J. Biol. Chem., 269 (10), 7610-7618 (1994); Poon et al., J. Biol. Chem., 270 (15), 8571-8577 (1995)を参照のこと。別のアプローチにおいて、さらなるシステインがＣ末端に付加される。例えば、Cumber et al., J. Immunol., 149, 120-126 (1992); King et al, Cancer Res., 54, 6176-6185 (1994); Li et al., Bioconjugate Chem., 13, 985-995 (2002); Yang et al., Protein Engineering, 16, 761-770 (2003);およびOlafson et al., Protein Engineering Design & Selection, 17, 21-27 (2004)を参照のこと。遊離システインを導入するための好ましい方法は、ＬｉｕらのＷＯ２００９／０２６２７４Ａ１によって開示され、この文献では、システインを保有するアミノ酸配列が抗体の重鎖のＣ末端に付加される。この方法は、抗原結合部位から非常に遠い公知の位置で公知の数のシステイン残基（１重鎖あたり１つ）を導入する。この段落で引用される文献の開示は、出典明示によりその全てが本明細書により取り込まれる。
【００６７】
さらに別の実施態様において、リジンε−アミノ基は、２−イミノチオランまたはＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）などのヘテロ二官能性試薬で改変して、ε−アミノ基をチオールまたはジスルフィド基に変換し−いわば、システイン代替物を作り出す。しかしながら、この方法は、適切なε−アミノ基に関連した同一の抱合位置および化学量論の制限を課題とする。
【００６８】
なお別の好ましい実施態様において、リガンドＺは、チオール基の受容部分への求核付加生成により抱合される。好ましい受容部分は、マレイミド基であり、この基の抗体チオール基との反応は、一般に下記に示される。このチオール基は、本来のものであるか、あるいは上記に記載されるように導入されたものでありうる。
【化１３】
2015508074.tif 000015
【００６９】
リガンドＺはまた、本明細書の下記に記載されるように、「クリック」ケミストリーによる使用に用いられる官能基を介して抱合することができる。
リンカー−（ＸＤ）ａＣ（ＸＺ）ｂ−
【００７０】
上記に記載されるように、本発明の抱合体のリンカー部分は、３つまでの構成部分を含む：切断可能な基Ｃおよび任意のスペーサーＸＺおよびＸＤ。
【００７１】
切断可能な基Ｃは、生理学的条件下で切断可能な基であり、好ましくは、抱合体が血液血漿中の全身循環にある時に比較的安定であるが、一旦抱合体がその目的の作用部位（すなわち、標的細胞の近く、標的細胞または標的細胞内）に到達すると容易に切断されるように選択される基である。好ましくは、抱合体は、抗体Ｚの標的細胞の表面に提示される抗原に結合することによって、標的細胞によるエンドサイトーシスにより内部移行される。後に、基Ｃの切断は、標的細胞の小胞体（初期エンドソーム、後期エンドソーム、または、特に、リソソーム）中で起こる。
【００７２】
ある実施態様において、基Ｃは、ｐＨ感受性基である。血液血漿中のｐＨは、中性よりわずかに高く、一方でリソソーム内部のｐＨが酸性（約５）である。よって、切断が酸で触媒される基Ｃは、血液血漿速度よりリソソーム内部で数オーダーの規模でより早い速度で切断する。適当な酸感受性基の例としては、出典明示により本明細書に取り込まれる、Ｓｈｅｎら，ＵＳ４，６３１，１９０（１９８６）；Ｓｈｅｎら，ＵＳ５，１４４，０１１（１９９２）；Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102, 1048-1054 (1981)およびYang et al., Proc. Natl Acad. Sci (USA), 85, 1189-1193 (1988)で開示されるように、シス−アコニチルアミドおよびヒドラゾンが挙げられる。
【００７３】
別の実施態様において、基Ｃは、ジスルフィドである。ジスルフィドは、周囲チオール濃度に依存した速度でチオール−ジスルフィド交換メカニズムによって切断することができる。グルタチオンおよび他のチオールの細胞内濃度がそれらの血清濃度より高いため、ジスルフィドの切断速度は、細胞内でより高い。さらに、チオール−ジスルフィド交換速度は、ジスルフィドの立体構造および電気的性質（例えば、アリール環上のアルキル−アリールジスルフィド対アルキル−アルキルジスルフィドの置換など）の調整によって調節し、血清安定性または特定の切断速度を高めたジスルフィド結合の設計をすることができる。抱合体中のジスルフィド切断可能な基に関するさらなる開示については、例えば、出典明示により本明細書に取り込まれる、Thorpe et al., Cancer Res. 48, 6396-6403 (1988)；Ｓａｎｔｉら，ＵＳ７，５４１，５３０Ｂ２（２００９）；Ｎｇら，ＵＳ６，９８９，４５２Ｂ２（２００６）；Ｎｇら，ＷＯ２００２／０９６９１０Ａ１；Ｂｏｙｄら，ＵＳ７，６９１，９６２Ｂ２；およびＳｕｆｉら，ＵＳ２０１０／０１４５０３６Ａ１を参照のこと。
【００７４】
好ましい基Ｃには、血清中のプロテアーゼによる場合とは対照的に、目的の作用部位におけるプロテアーゼによって選択的に切断されるペプチド結合が含まれる。典型的には、基Ｃには、１〜２０個のアミノ酸、好ましくは、１〜６個のアミノ酸、より好ましくは、１〜３個のアミノ酸が含まれる。前記アミノ酸は、天然および／または非天然α−アミノ酸でありうる。天然アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびにそこから生じるアミノ酸が含まれ、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、シトルリン、およびＯ−ホスホセリンである。用語アミノ酸にはまた、アミノ酸アナログおよび模倣物が含まれる。アナログは、Ｒ基が天然アミノ酸で見出されないものであることを除き、天然アミノ酸と同一の一般的なＨ２Ｎ（Ｒ）ＣＨＣＯ２Ｈ構造を有する化合物である。アナログの例としては、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン−スルホキシド、およびメチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。アミノ酸模倣物は、α−アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、それと同様の様式で機能する化合物である。用語「非天然アミノ酸」は、「Ｄ」立体化学型を示すものとされ、天然アミノ酸は、「Ｌ」型を示すものとされる。
【００７５】
好ましくは、基Ｃは、プロテアーゼの切断認識配列であるアミノ酸配列を含有する。多くの切断認識配列は当該技術分野で知られている。例えば、出典明示により本明細書に取り込まれる、Matayoshi et al. Science 247: 954 (1990); Dunn et al. Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah et al. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber et al. Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith et al. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994);およびBouvier et al. Meth. Enzymol. 248: 614 (1995)を参照のこと。
【００７６】
細胞によって内部移行されるものとされていない抱合体については、基Ｃは、標的組織の近くで細胞外マトリックス中に存在するプロテアーゼ、例えば、死細胞近くに放出されたプロテアーゼまたは腫瘍関連プロテアーゼによって切断されるように選択することができる。典型的な細胞外腫瘍関連プロテアーゼは、マトリックス金属プロテアーゼ（ＭＭＰ）、サイメットオリゴペプチダーゼ（thimet oligopeptidase）（ＴＯＰ）およびＣＤ１０である。
【００７７】
細胞によって内部移行されるように設計された抱合体については、基Ｃは、好ましくは、エンドソームまたはリソソームのプロテアーゼ、特に、後者による切断について選択されるアミノ酸配列を含む。このようなプロテアーゼの非限定的な例としては、カテプシンＢ、Ｃ、Ｄ、Ｈ、ＬおよびＳ、特に、カテプシンＢが含まれる。カテプシンＢは、配列−ＡＡ２−ＡＡ１−（ここで、ＡＡ１は、塩基性であるか、または強力に水素結合したアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、またはシトルリンなど）であり、ＡＡ２は、疎水性アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、バリン、アラニン、ロイシン、またはイソロイシン）、例えば、Ｖａｌ−Ｃｉｔ（Ｃｉｔは、シトルリンを示す）またはＶａｌ−Ｌｙｓである）でペプチドを選択的に切断する。（本明細書中、アミノ酸配列は、特に他で明確に示されていない限り、Ｈ２Ｎ−ＡＡ２−ＡＡ１−ＣＯ２Ｈのように、Ｎ−から−Ｃ方向に記載される。）カテプシン−切断可能な基に関するさらなる情報については、出典明示により本明細書に取り込まれる、Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 8, 3341-3346 (1998); Dubowchik et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8 3347-3352 (1998);およびDubowchik et al., Bioconjugate Chem. 13, 855-869 (2002)を参照のこと。ペプチジルリンカーの切断に有用でありうる別の酵素は、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎで選択的に切断するリソソームのシステインプロテアーゼであるｌｅｇｕｍａｉｎである。
【００７８】
ある実施態様において、基Ｃは、二アミノ酸配列−ＡＡ２−ＡＡ１−を含むペプチドであって、ＡＡ１は、リジン、アルギニンまたはシトルリンであり、ＡＡ２は、フェニルアラニン、バリン、アラニン、ロイシンまたはイソロイシンである。別の態様において、Ｃは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ、およびＧｌｕからなる群から選択される１〜５個のアミノ酸の配列からなる。
【００７９】
単一アミノ酸からなる切断可能な基Ｃの製造および設計は、出典明示により本明細書に取り込まれるＣｈｅｎらのＵＳ２０１０／０１１３４７６Ａ１に開示される。
【００８０】
基Ｃはまた、光切断可能なもの、例えば、光への露出によって切断されるニトロベンジルエーテルでありうる。
【００８１】
基Ｃは、抗体Ｚまたは化合物Ｄに直接結合することができ；すなわち、スペーサーＸＺおよびＸＤは、場合によっては、非存在でありうる。例えば、基Ｃがジスルフィドである場合、２つの硫黄のうちの１つは、抗体Ｚ上のシステイン残基またはその代替物（surrogate）でありうる。あるいは、基Ｃは、抗体の炭水化物側鎖上のアルデヒドに結合したヒドラゾンでありうる。あるいは、基Ｃは、抗体Ｚのリジンε−アミノ基と形成されたペプチド結合でありうる。好ましい態様において、化合物Ｄは、化合物Ｄ中のカルボキシルまたはアミン基に対するペプチジル結合により基Ｃに直接結合する。
【００８２】
スペーサーＸＺは、存在する場合、基Ｃおよび抗体Ｚの間の空間的な分離を提供し、それにより基Ｃが抗体Ｚによる抗原の結合を立体的に妨げず、または抗体Ｚが基Ｃの切断を立体的に妨げないようにする。また、スペーサーＸＺは、溶解性の増加または凝集特性の減少を抱合体に付与するために用いることができる。スペーサーＸＺは、あらゆる組み合わせで構築することができる１つまたはそれ以上の調節セグメントを含みうる。スペーサーＸＺの適当なセグメントの例は：
【化１４】
2015508074.tif 000016
であって、式中、下付き文字ｑは、０または１であり、下付き文字ｒは、１〜２４であり、好ましくは、２〜４である。これらのセグメントは、下記に示されるように組み合わせることができる：
【化１５】
2015508074.tif 000017
【００８３】
スペーサーＸＤは、存在する場合、基Ｃおよび化合物Ｄの間の空間的な分離を提供することにより、化合物Ｄが基Ｃの切断を立体的または電気的に妨げないようにする。スペーサーＸＤはまた、さらなる分子量および化学官能性を抱合体に導入するために供給することができる。一般に、さらなる量および官能性は、血清半減期および他の抱合体の特性に影響する。よって、スペーサー基を賢明に選択することにより、抱合体の血清半減期は調節することができる。スペーサーＸＤはまた、スペーサーＸＺに関して上記に記載されるように、調節セグメントから構築することができる。
【００８４】
スペーサーＸＺおよび／またはＸＤは、存在する場合、好ましくは、それぞれ、ＺおよびＣまたはＤおよびＣの間に５〜１５個の原子、より好ましくは、５〜２０個の原子の直線的な分離を提供する。
【００８５】
スペーサーＸＺまたはＸＤのいずれかあるいはその両方は、自己犠牲部分を含むことができる。自己犠牲部分は、（１）基Ｃおよび抗体Ｚまたは細胞毒素Ｄのいずれかに結合し、（２）場合により、基Ｃからの切断により反応順序が開始し、それにより自己犠牲部分自体が抗体Ｚまたは細胞毒素Ｄから剥離する構造を有する部分である。すなわち、抗体Ｚまたは細胞毒素Ｄから遠位部位における反応（基Ｃからの切断）は、ＸＺ−ＺまたはＸＤ−Ｄ結合の分裂をも引き起こす。自己犠牲部分の存在は、抱合体の切断後、スペーサーＸＤまたはその部分が細胞毒素Ｄに結合したままであると、細胞毒素Ｄの生物学的活性が損なわれうるため、スペーサーＸＤの場合に望ましい。自己犠牲部分の使用は、切断可能な基Ｃがポリペプチドである場合に特に望ましい。
【００８６】
パートナー分子Ｄ上のヒドロキシルまたはアミノ基に結合した典型的な自己犠牲部分（ｉ）−（ｖ）は下記に示される：
【化１６】
2015508074.tif 000018
【００８７】
自己犠牲部分は、斜線ａとｂの間の構造であって、隣接する構造的特徴との関係を供することが示されている。自己犠牲部分（ｉ）および（ｖ）は、化合物Ｄ−ＮＨ２に結合し（すなわち、化合物Ｄは、アミノ基により抱合される）、自己犠牲部分（ｉｉ）、（ｉｉｉ）および（ｉｖ）は、化合物Ｄ−ＯＨに結合する（すなわち、化合物Ｄは、ヒドロキシルまたはカルボキシル基により抱合される）。場合によっては、斜線ｂでのアミド結合の切断により、アミド窒素がアミン窒素として遊離されて、反応順序が開始し、斜線での結合の切断、続いてＤ−ＯＨまたはＤ−ＮＨ２の遊離を生じる。自己犠牲部分に関するさらなる開示については、出典明示により本明細書に取り込まれる、Carl et al., J. Med. Chem., 24 (3), 479-480 (1981)；Ｃａｒｌら，ＷＯ８１／０１１４５（１９８１）；Dubowchik et al., Pharmacology & Therapeutics, 83, 67-123 (1999)；Ｆｉｒｅｓｔｏｎｅら，ＵＳ６，２１４，３４５Ｂ１（２００１）；Toki et al., J. Org. Chem. 67, 1866-1872 (2002); Doronina et al., Nature Biotechnology 21 (7), 778-784 (2003) (erratum, p. 941)；Ｂｏｙｄら，ＵＳ７，６９１，９６２Ｂ２；Ｂｏｙｄら，ＵＳ２００８／０２７９８６８Ａ１；Ｓｕｆｉら，ＷＯ２００８／０８３３１２Ａ２；Ｆｅｎｇ，ＵＳ７，３７５，０７８Ｂ２；およびＳｅｎｔｅｒら，ＵＳ２００３／００９６７４３Ａ１を参照のこと。
【００８８】
別の実施態様において、抗体標的部分および細胞毒素化合物Ｄは、切断可能ではないリンカーによって連結される。抗体の分解は、最終的に、リンカーを、細胞毒素化合物Ｄの生物学的活性を妨げない小さい付加部分にまで減少させる。
【００８９】
化合物Ｄ−リンカー組成物
本発明の化合物において、抱合体は、好ましくは、式（Ｉ）に定義されるように、基Ｒ０への結合により生じる。好ましくは、Ｒ０は、ＮＨＲ１ａである。Ｒ１ａがＨまたはアルキルである場合、結合は、Ｒ１ａＮＨの窒素にされうる。Ｒ１ａが（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｃ（＝Ｏ）ＣＨＲ８ＮＨ２、またはＣ（＝Ｏ）Ｒ９ＮＨ２である場合、抱合は、Ｒ１ａのアミノ（ＮＨ２）基を介して生じうる。よって、Ｒ１ａＮＨの構造に応じて、Ｄは：
【化１７】
2015508074.tif 000019
［式中、Ｒ１２は、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、Ｒ８、Ｒ９、およびｎは、式（Ｉ）について定義されるとおりである］
として示されうる。
【００９０】
対応する構造は、変更すべきところは変更して、式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、または（ＩＩａ）から（ＩＩｈ）から生じうる。
【００９１】
好ましくは、Ｄは、
【化１８】
2015508074.tif 000020
である。
【００９２】
本発明の抱合体は、好ましくは、まず、化合物Ｄおよびリンカー（ＸＤ）ａＣ（ＸＺ）ｂを繋いで、式（ＩＶ）：
Ｄ−（ＸＤ）ａＣ（ＸＺ）ｂ−Ｒ３１        （ＩＶ）
［式中、Ｒ３１は、抗体Ｚ上の官能基と反応して抱合体を形成するために適切な官能基である］
によって表される薬物リンカー組成物を形成することによって調製される。適切な基Ｒ３１の例としては、アジド、シクロオクチン、
【化１９】
2015508074.tif 000021
［式中、Ｒ３２は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｆ、メシレートまたはトシレートであり、Ｒ３３は、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、Ｆ、ＯＨ、−Ｏ−Ｎ−スクシニミジル、−Ｏ−（４−ニトロフェニル）、−Ｏ−ペンタフルオロフェニル、または−Ｏ−テトラフルオロフェニルである］
が含まれる。適切な部分Ｄ−（ＸＤ）ａＣ（ＸＺ）ｂ−Ｒ３１の製造に一般的に使用可能な化学方法は、出典明示により本明細書に取り込まれる、Ｎｇら，ＵＳ７，０８７，６００Ｂ２（２００６）；Ｎｇら，ＵＳ６，９８９，４５２Ｂ２（２００６）；Ｎｇら，ＵＳ７，１２９，２６１Ｂ２（２００６）；Ｎｇら，ＷＯ０２／０９６９１０Ａ１；Ｂｏｙｄら，ＵＳ７，６９１，９６２Ｂ２；Ｃｈｅｎら，ＵＳ７，５１７，９０３Ｂ２（２００９）；Ｇａｎｇｗａｒら，ＵＳ７，７１４，０１６Ｂ２（２０１０）；Ｂｏｙｄら，ＵＳ２００８／０２７９８６８Ａ１；Ｇａｎｇｗａｒら，ＵＳ７，８４７，１０５Ｂ２（２０１０）；Ｇａｎｇｗａｒら，ＵＳ７，９６８，５８６Ｂ２（２０１１）；Ｓｕｆｉら，ＵＳ２０１０／０１４５０３６Ａ１；およびＣｈｅｎら，ＵＳ２０１０／０１１３４７６Ａ１に開示される。
【００９３】
好ましい反応性官能基−Ｒ３１は、−ＮＨ２、−ＯＨ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＨ、マレイミド、シクロオクチン、アジド（−Ｎ３）、ヒドロキシルアミノ（−ＯＮＨ２）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミドである。
【００９４】
−ＯＨ基は、抗体、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸側鎖上のカルボキシル基とエステル化することができる。
【００９５】
−ＣＯ２Ｈ基は、抗体上（例えば、リジン側鎖上）の−ＯＨ基とエステル化し、またはアミノ基とアミド化することができる。
【００９６】
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド基は、機能的に活性化されたカルボキシル基であり、（例えば、リジンからの）アミノ基との反応によって利便的にアミド化することができる。
【００９７】
マレイミド基は、マイケル付加反応で（例えば、システインまたはスルフヒドリル官能基を導入するための抗体の化学的修飾からの）抗体上の−ＳＨ基と抱合することができる。
【００９８】
−ＳＨ基は、抗体が、上記に記載の「鏡像」であるマイケル付加反応でそこにマレイミドを導入するように修飾される場合、抱合に特に有用である。抗体は、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）−シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）またはそのスルホン化変異型であるスルホＳＭＣＣ（両方の試薬は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）を用いてマレイミド基を有するように修飾することができる。
【００９９】
アジドおよびシクロオクチンは、アジドがシクロアクチンの歪んだアルキン結合に交差して付加し、１，２，３−トリアゾール環を形成する、いわゆる、銅を含まない「クリックケミストリー」により抱合を生じることができる補完的な官能基である。例えば、Agard et al., J. Amer. Chem. Soc. 2004, 126, 15046-15047; Best, Biochemistry 2009, 48, 6571-6584を参照のこと。アジドは、式（ＩＶ）中の反応性官能基Ｒ３１であり得、シクロアクチンは、抗体またはその抗原結合部分上に位置し得、あるいはその逆であり得る。シクロオクチン基は、ＤＩＢＯ試薬（インビトロジェン／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（オレゴン州，ユージーン）から入手可能）によって供することができる。
【０１００】
非天然アミノ酸を抗体に導入するための技術は、反応性官能基との抱合のための官能性を提供する非天然アミノ酸を用いて利用することができる。例えば、非天然アミノ酸ｐ−アセチルフェニルアラニンは、Ｔｉａｎら，ＷＯ２００８／０３０６１２Ａ２（２００８）に開示されるように抗体に取り込むことができる。ｐ−アセチルフェニルアラニン中のケトン基は、ヒドロキシルアミノ反応性官能基を有するオキシムの形成によって抱合部位でありうる。
【０１０１】
アミン（ＮＨ２）基は、Jeger et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 9995 -9997に開示されるように、酵素トランスグルタミナーゼを用いて抱合に用いることができる。
【０１０２】
抱合はまた、Levary et al., PLoS One 2011, 6(4), e18342; Proft, Biotechnol. Lett. 2010, 32, 1-10；Ｐｌｏｅｇｈら，ＷＯ２０１０／０８７９９４Ａ２（２０１０）；およびＭａｏら，ＷＯ２００５／０５１９７６Ａ２（２００５）に開示されるように、酵素ソルターゼ（Sortase）Ａを用いて生じさせることができる。ソルターゼＡ認識モチーフ（典型的には、ＬＰＸＴＧ、Ｘは、天然アミノ酸のいずれかである）は、リガンドＺ上に位置していてもよく、求核受容体モチーフ（典型的には、ＧＧＧ）は、式（ＩＶ）中の基Ｒ３１であってもよく、あるいはその逆であってもよい。
【０１０３】
式（ＩＶ）に記載の組成物の例としては、式（ＩＶａ）−（ＩＶｇ）：
【化２０】
2015508074.tif 000022
【化２１】
2015508074.tif 000023
によって表される構造を有するものが挙げられる。
【０１０４】
抱合体の調製
下記は、リジンε−アミノ基を２−イミノチオランと反応させ、続いて上記に記載されるようにマレイミドを含有する薬物−リンカー部分と反応させることによる遊離チオール基の抗体への導入に基づいた例示の方法である。まず、抗体を、５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）を含有する０．１Ｍ  リン酸緩衝液（ｐＨ８．０）中で緩衝液交換し、５−１０ｍｇ／ｍＬまで濃縮する。チオール化は、２−イミノチオランを抗体に加えることにより行う。加える２−イミノチオランの量は、予備実験によって決定することができ、抗体ごとに変動する。予備実験において、滴定したさらなる量の２−イミノチオランを抗体に加え、次いで抗体とＲＴ（室温，約２５℃）で１時間インキュベートし、該抗体をＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標）Ｇ−２５カラムを用いて５０ｍＭのｐＨ６．０でＨＥＰＥＳ緩衝液中にて脱塩処理し、ジチオジピリジン（ＤＴＤＰ）と反応させることによって導入されたチオール基の数を迅速に決定した。チオール基をＤＴＤＰと反応させることにより、チオピリジンの遊離が生じ、３２４ｎｍで分光学的にモニターすることができる。０．５−１．０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度での試料を典型的に用いる。２８０ｎｍにおける吸光度は、試料中のタンパク質濃度を正確に決定するために用いることができ、続いて各試料の一定分量（０．９ｍＬ）をＲＴで０．１ｍＬ  ＤＴＤＰ（エタノール中で５ｍＭストック溶液）と１０分間インキュベートする。緩衝液のみにＤＴＤＰを加えたブランク試料もまた、平行してインキュベートする。１０分後、３２４ｎｍにおける吸光度を測定し、チオール基の数は、１９，８００Ｍ−１のチオピリジンについての吸光係数を用いて定量する。
【０１０５】
典型的に、１抗体あたり約３個のチオール基のチオール化レベルが望ましい。例えば、ある抗体とともに、１５倍モル過剰量の２−イミノチオランを加え、続いてＲＴで１時間インキュベートすることによって行うことができる。次いで、該抗体を所望されるモル比で２−イミノチオランとインキュベートし、続いて抱合緩衝液（５ｍＭ  グリシンおよび２ｍＭ  ＤＴＰＡを含有する５０ｍＭでｐＨ６．０のＨＥＰＥＳ緩衝液）中で脱塩処理する。チオール化された物質を氷上に置いたまま、導入されたチオール数を上記に記載されるように定量する。
【０１０６】
導入されたチオール数の検証後、薬物−リンカー部分を１チオールあたり３倍モル過剰量で加える。抱合反応は、最終濃度５％でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含有する抱合緩衝液、または同様の異なる溶媒中で進行させる。一般に、薬物−リンカーストック溶液は、１００％  ＤＭＳＯ中に溶解する。該ストック溶液をチオール化抗体に直接加え、十分量のＤＭＳＯを加えて最終濃度を１０％とし、または最終濃度１０％のＤＭＳＯを含有する抱合緩衝液中に予め希釈し、続いて同等体積のチオール化抗体に加えた。
【０１０７】
抱合反応混合物を攪拌しながらＲＴで２時間インキュベートする。インキュベート後、該抱合反応混合物を遠心分離し、０．２μｍフィルターに通して濾過する。抱合体の精製は、多くの方法を用いてクロマトグラフィーにより行うことができる。ある方法において、抱合体は、５ｍＭ  グリシンおよび５０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭでｐＨ７．２のＨＥＰＥＳ緩衝液で予め平衡化したＳＥＰＨＡＣＲＹＬ（登録商標）Ｓ２００カラム上でサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製する。クロマトグラフィーは、２８ｃｍ／ｈの線流速で行う。抱合体を含有するフラクションを収集し、プールし、濃縮する。別の方法において、精製は、イオン交換クロマトグラフィーにより行うことができる。条件は、抗体ごとに変動し、各場合において最適化されるべきである。例えば、抗体−薬物抱合体反応混合物は、５ｍＭ  グリシンを含有する５０ｍＭでｐＨ５．５のＨＥＰＥＳで予め平衡化したＳＰ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）カラムに適用する。抗体抱合体は、ｐＨ５．５で平衡緩衝液中の０〜１Ｍ  ＮａＣｌのグラジエントを用いて溶出する。抱合体を含有する関連フラクションをプールし、製剤化緩衝液（５ｍＭ  グリシンおよび１００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する５０ｍＭでｐＨ７．２のＨＥＰＥＳ緩衝液）に対して透析する。
【０１０８】
当業者は、上記に記載の条件および方法が例示であって、限定されるものではなく、抱合のための他の方法が当該技術分野で公知であり、本発明で使用できることを理解するものである。
【０１０９】
本発明によるいくつかの好ましい抱合体の構造は、式（Ｖａ）から（Ｖｇ）：
【化２２】
2015508074.tif 000024
【化２３】
2015508074.tif 000025
によって示され、式中、Ａｂは、抗体を表し、ｍは、１、２、３、または４である。
【０１１０】
生物学的活性
本発明の化合物および抱合体の生物学的活性についてのデータは、本明細書の実施例１３および１４で提供する。
【０１１１】
当業者は、式（Ｉ）、（Ｉａ）または（Ｉｂ）［式中、基Ｒ１ａは、（化合物（ＩＩｂ）、（ＩＩｆ）、（ＩＩｇ）または（ＩＩｈ）で例示されるような）Ｈ２ＮＣＨＲ８Ｃ（＝Ｏ）−である］の化合物が抱合体中で用いられる場合、部分Ｒ１ａは、酵素学的に切断可能なペプチジルリンカー（その切断が元々の化合物−例えば、（ＩＩｂ）、（ＩＩｆ）、（ＩＩｇ）または（ＩＩｈ）−を再生するものではないが、化合物（ＩＩａ）を再生する）の一部でありうることを評価する。
【０１１２】
医薬組成物
別の態様において、本開示は、医薬的に許容される担体または賦形剤とともに製剤化された、本発明の化合物またはその抱合体を含む医薬組成物を提供する。抗体または別の薬物などの１つまたはそれ以上のさらなる医薬的な活性成分を適宜含んでいてもよい。前記医薬組成物は、別の治療剤、特に、別の抗癌剤との組み合わせ治療で投与することができる。
【０１１３】
医薬組成物には、１つまたはそれ以上の賦形剤が含まれうる。用いられうる賦形剤には、担体、界面活性剤、増粘もしくは乳化剤、固形結合剤、分散もしくは懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、香料、コーティング剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味料、保存剤、等張剤、およびこれらの組み合わせが含まれる。適当な賦形剤の選択および使用は、出典明示により本明細書に取り込まれる、Gennaro, ed., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 2003)に開示される。
【０１１４】
好ましくは、医薬組成物は、（例えば、注射または吸入による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与に適切である。投与経路に応じて、活性な化合物は、物質中でコーティングされて、それを不活性化する酸および他の自然条件の作用から保護されうる。用語「非経口投与」は、通常、注射による腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、下記に限定されることなく、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および吸入が挙げられる。あるいは、医薬組成物は、例えば、鼻腔内、経口、膣、直腸、舌下または局所などによる局所、表皮または粘膜投与経路のような、非−非経口経路により投与することができる。
【０１１５】
医薬組成物は、滅菌水溶液または分散物の形態でありうる。それらはまた、マイクロエマルション、リポソーム、または高い薬物濃度を達成するために適切な他の秩序構造中に製剤化されうる。該組成物はまた、投与前に水中で再構成するための凍結乾燥物の形態で提供されうる。
【０１１６】
活性成分の量は、担体物質と組み合わせて単一の製剤を生じることができ、治療されるべき対象および特定の投与様式によって変動し、一般に、治療効果をもたらす組成物の量でありうる。一般に、１００パーセントのうち、この量は、医薬的に許容される担体と組み合わせて、活性成分の約０．０１パーセントから約９９パーセント、好ましくは、活性成分の約０．１パーセントから約７０パーセント、最も好ましくは、約１パーセントから約３０パーセントの範囲である。
【０１１７】
投薬計画は、治療反応を提供するように調整される。例えば、１回のボーラスが投与されてもよく、数回の分割用量が長期間にわたり投与されてもよく、あるいは用量は、状況の緊急性によって示されるように比例的に増加または減少されてもよい。投与の簡便性および投薬の均一性のために用量単位中で非経口組成物を製剤化することが特に有利である。「用量単位形態」は、治療されるべき対象のための単位用量として適する物理的に別個の単位を意味し；各単位は、必要な医薬担体とともに、所望される治療反応を生じるように算出された活性な化合物の所定量を含有する。
【０１１８】
用量は、宿主体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重または１０ｍｇ／ｋｇ体重、あるいは１−１０ｍｇ／ｋｇの範囲でありうる。典型的な治療計画は、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヶ月に１回、３ヶ月に１回、３〜６ヶ月に１回の投与である。好ましい投薬計画としては、下記の投薬スケジュール：（ｉ）６回の投薬について４週間ごと、次いで３ヶ月ごと；（ｉｉ）３週間ごと；（ｉｉｉ）３週間に１回、３ｍｇ／ｋｇ体重、続いて１ｍｇ／ｋｇ体重のうちの１つを用いて、静脈内投与による１ｍｇ／ｋｇ体重または３ｍｇ／ｋｇ体重が挙げられる。ある方法において、用量は、約１−１０００μｇ／ｍＬの血漿抗体濃度を達成するように調整され、ある方法では、約２５−３００μｇ／ｍＬである。
【０１１９】
本発明の化合物の「治療上有効量」は、好ましくは、病状の重症度の軽減、病状を呈さない期間の頻度および期間の増加、または疾患の苦痛による機能障害や身体障害の予防を生じる。例えば、腫瘍を有する対象に関して、「治療上有効量」は、未処理の対象と比較して、好ましくは、少なくとも約２０％、より好ましくは、少なくとも約４０％、さらにより好ましくは、少なくとも約６０％、なおより好ましくは、少なくとも約８０％まで腫瘍の増殖を阻害する。治療化合物の治療上有効量は、腫瘍サイズを減少し、あるいは、典型的にはヒトであるが、他の哺乳類でありうる対象の症状を軽減することができる。
【０１２０】
医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ、およびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御または徐放製剤でありうる。酢酸エチレンビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの生物分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照のこと。
【０１２１】
治療組成物は、出典明示により本明細書に取り込まれる（１）針なし皮下注射機器（例えば、ＵＳ５，３９９，１６３；５，３８３，８５１；５，３１２，３３５；５，０６４，４１３；４，９４１，８８０；４，７９０，８２４；および４，５９６，５５６）；（２）微量注入ポンプ（ＵＳ４，４８７，６０３）；（３）経皮装置（ＵＳ４，４８６，１９４）；（４）点滴装置（ＵＳ４，４４７，２３３および４，４４７，２２４）；および（５）浸透圧機器（ＵＳ４，４３９，１９６および４，４７５，１９６）などの医療機器により投与することができる。
【０１２２】
ある実施態様において、医薬組成物は、インビボで適正な分布を確実にするために製剤化することができる。例えば、本発明の治療化合物が血液脳関門を確実に通過させるために、それらは、リポソーム中に製剤化され、さらに、特定の細胞または器官への輸送の選択性を高めるために標的部分を含んでいてもよい。例えば、ＵＳ４，５２２，８１１； ５，３７４，５４８；５，４１６，０１６；および５，３９９，３３１；V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685; Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038; Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180; Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134; Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090; Keinanen and Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; and Killion and Fidler (1994) Immunomethods 4:273を参照のこと。
【０１２３】
用途
本発明化合物またはこれらの抱合体は、以下に限定されないが、頭、頸、鼻腔、副鼻腔、上咽頭、口腔、中咽頭、喉頭、下咽頭、唾液腺および傍神経節腫の腫瘍を含む、頭頸部の癌；肝臓および胆管の癌、特に、肝細胞癌；腸癌、特に、結腸直腸癌；卵巣癌；小細胞および非小細胞肺癌（ＳＣＬＣおよびＮＳＣＬＣ）；乳癌肉腫、例えば、線維肉腫、悪性線維性組織球、胎児性横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、神経線維肉腫、骨肉腫、滑膜肉腫、脂肪肉腫および胞巣状軟部肉腫を含む過剰増殖性疾患；白血病、例えば、急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）；中枢神経系の腫瘍、特に、脳癌；多発性骨髄腫（ＭＭ）、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｂ系列大細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫およびＴ細胞未分化大細胞リンパ腫などの疾患を治療するために用いることができる。臨床的に、本明細書に記載の組成物の方法および使用の実施は、癌の増殖のサイズまたは数を減少させ、および／または関連症状（適用可能）を軽減させる。病理学的に、本明細書に記載の組成物の方法および使用の実施は、癌細胞の増殖の阻害、癌または腫瘍のサイズの減少、さらなる転移の予防、および腫瘍血管形成の抑制などの病理学的に関連する反応を生じる。このような疾患の治療方法は、治療上有効量の本発明の組み合わせを対象に投与することを特徴とする。前記方法は、必要に応じて繰り返されてもよい。特に、癌は、結腸直腸癌、肝臓癌、前立腺癌、乳癌、メラノーマ、膠芽腫、肺癌、膵臓癌、卵巣癌、多発性骨髄腫、腎臓癌、白血病（特に、ＡＬＬ、ＡＰＬまたはＡＭＬ）またはリンパ腫でありうる。
【０１２４】
本発明化合物またはこれらの抱合体は、抗体、アルキル化剤、血管形成阻害剤、代謝拮抗剤、ＤＮＡ切断因子（cleaver）、ＤＮＡクロスリンカー、ＤＮＡ挿入剤、ＤＮＡ副溝結合剤、エンジイン、熱ショックタンパク質９０阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、免疫修飾因子、微小管安定化剤、ヌクレオシド（プリンまたはピリミジン）類似物質、核外輸送阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ（ＩまたはＩＩ）阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、およびセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤を含む他の治療剤と組み合わせて投与することができる。具体的な治療剤としては、アダリムマブ、アンサマイトシンＰ３、オーリスタチン、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カリスタチンＡ、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、シスプラチン、クラドリビン、シタラビン、クリプトフィシン、ダカルバジン、ダサチニブ、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、ダイネマイシン（dynemycin）Ａ、エポシロン、エトポシド、フロキシウリジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、イピリムマブ、ヒドロキシ尿素、イマチニブ、インフリキシマブ、インターフェロン、インターロイキン、β−ラパコン、レナリドミド、イリノテカン、メイタンシン、メクロレタミン、メルファラン、６−メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシンＣ、ニロチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、プロカルバジン、スベロイルアニリドヒドロキサム酸（ＳＡＨＡ）、６−チオグアニジン、チオテパ、テニポシド、トポテカン、トラスツズマブ、トリコスタチンＡ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビンデシンが挙げられる。
【実施例１】
【０１２５】
実施例
本発明の実施は、下記の実施例を参照してさらに理解されうるものであり、例示のためであって、限定のために提供されるものではない。
【０１２６】
実施例１−化合物（ＩＩａ）
この実施例は、化合物（ＩＩａ）、または８−アミノウンシアラマイシンの調製を記載する。その調製のための合成スキームは、表１に示され、化合物９と表記される。
【０１２７】
２，２，２−トリクロロエチル（３−オキソ−１，３−ジヒドロイソベンゾフラン−５−イル）カルバメート２
０℃でジクロロメタン（ＤＣＭ，２００ｍＬ）中の６−アミノイソベンゾフラン−１（３Ｈ）−オン１（Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ，１３．４３ｇ，９０ｍｍｏｌ）の懸濁液に、２，２，２−トリクロロエチルカルボノクロリダート１ａ（１８．２３ｍＬ，１３５ｍｍｏｌ）およびピリジン（１７．７９ｍＬ，１８０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合液を室温（ＲＴ，約２５℃）で１時間攪拌した。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）および高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、反応が完了したことが示された。反応混合液を濾過し、ＤＣＭで洗浄し（２ｘ３０ｍＬ）、カルバメート化合物２を白色の固形物（１７．０３ｇ，５８％）として得た。LCMS: [M+1] = 324.
【０１２８】
ヒドロキシフタリド化合物３
ＣＣｌ４（１５０ｍＬ）中のカルバメート化合物２（１７．０ｇ，５２．４ｍｍｏｌ）、Ｎ−ブロモコハク酸イミド（ＮＢＳ，１０．２６ｇ，５７．６ｍｍｏｌ）の懸濁液を攪拌し、加熱還流した（８５℃  油浴）。反応混合液をフラスコから約１０ｃｍに置いた太陽灯からの光にさらした。２時間後、ＴＬＣにより、反応が完了したことが示された。ＨＰＬＣにより、中間体ブロミド化合物の不安定な形態のため複数のピークが示された。ロータリーエバポレーターで濃縮して、褐色の固形物を得た。水（２００ｍＬ）をインサイチューで褐色固形物に加え、５時間加熱還流して、ほぼ清澄な溶液がいくらかの不溶性物質とともに生成した。ＴＬＣおよびＨＰＬＣにより、反応が完了したことが示された。ロータリーエバポレーターで濃縮し、１２０ｇのシリカカラム上にてヘキサン中で０−５０％  ＥｔＯＡｃグラジエントを用いてＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）ユニットで精製して、ヒドロキシフタリド化合物３（１３．５５ｇ，７６％）を得た。LCMS: [M+1] = 340.
【０１２９】
シアノフタリド化合物５
水（４ｍＬ）中のヒドロキシフタリド化合物３（１．３９１ｇ，４．０９ｍｍｏｌ）およびシアン化カリウム（３９９ｍｇ，６．１４ｍｍｏｌ，１．５当量）の懸濁液に、０℃（氷浴）で３３％  ＨＣｌ溶液（１．２ｍＬ）をゆっくり加えた。氷浴を取り外し、２時間攪拌し続けた。ＬＣＭＳ（ｍ＋１＝３６８）により、化合物４の形成が示された。反応混合液をＥｔＯＡｃで抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、２０ｍＬまで濃縮した。０℃に冷却し、該溶液をジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，１．２当量）で処理し、ＲＴで８時間攪拌し続けた。反応混合液を濾過して、ウレア副生成物を取り除き、該濾液を３０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサングラジエントを用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーにより濃縮して、シアノフタリド化合物５（１．１１６ｇ，収率７８％）を白色の固形物として得た。1H NMR(400 MHz, CDCl3): δ 8.10 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 7.93 (dd, J = 8.8, 2.0 Hz, 1H), 7.67 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 6.06 (s, 1H), 4.87 (s, 1H).
【０１３０】
アミノシアノフタリド化合物６
亜鉛（８．５８ｇ，１３１ｍｍｏｌ）を、ＲＴで酢酸（８２ｍＬ）および水（４．３ｍＬ）中のシアノフタリド化合物５（３ｇ，８．５８ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。３０分後、ＴＬＣおよびＨＰＬＣにより、反応が生成物およびモノ脱塩素化された副生成物の３：１の比で完了したことが示された。セライト（登録商標）により濾過し、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）で洗浄し、続いて濃縮し、０−５０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサングラジエントを用いてＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）４０ｇのシリカカラム上で精製して、アミノシアノフタリド化合物６を白色の固形物（９８０ｍｇ，収率６６％）として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.46 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.05 (dd, J = 8.4, 2.4 Hz, 1H), 6.95 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 6.47 (s, 1H).
【０１３１】
８−アミノウンシアラマイシン−ＯＴＥＳ８
ハウザー環化反応法を用いた。−７０℃でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ，５．３ｍＬ）中のアミノシアノフタリド化合物６（１５５ｍｇ，０．８９１ｍｍｏｌ）の溶液に、リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＬｉＨＭＤＳ，１．７８２ｍＬ，１．７８２ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合液を２０分間攪拌した。ＴＨＦ（１２．５ｍＬ）中のイミノキノン化合物７（Nicolaou et al. 2007aに従って調製、１２５ｍｇ，０．２９７ｍｍｏｌ）の予め冷却した溶液を加えた。反応混合液を同一温度で５分間攪拌し、３０分かけてゆっくりＲＴに温めた。該反応物をリン酸緩衝液（ｐＨ６．８，１００ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した（３ｘ７５ｍＬ）。抽出物を合わせて、ＭｇＳＯ４で乾燥させて、粗生成物を得た。０−５０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサングラジエントを用いてＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）１２ｇのシリカゲルカラム上で精製して、生成物８を紫色の固形物として得た（６０ｍｇ，収率３６％）。LCMS: [M+1] = 569.  1H NMR (400 MHz, CD3CN): δ 13.14 (s, 1H), 9.96 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 8.40 (m, 1H), 8.03 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 7.38 (m, 1H), 7.02 (td, J = 8.0 Hz, J = 1.6 Hz 1H), 5.92 (dd, J = 24, 9.6 Hz, 2H), 5.20 (s, 2H), 5.12 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 4.94 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.55 (q, J = 6.4 Hz, 1H), 4.46 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 3.41 (m, 1H), 1.40 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 1.00 (t, J = 8.0 Hz, 9H), 0.68 (q, J = 7.2 Hz, 3H).
【０１３２】
８−アミノウンシアラマイシン化合物９
アミノウンシアラマイシン−ＯＴＥＳ８（３０ｍｇ）をＴＨＦ（３ｍＬ）中に溶解させ、ＲＴでＴＨＦ中のＥｔ３Ｎ・３ＨＦの溶液（１：１，１．５ｍＬ）で処理した。１時間後、ＴＬＣおよびＨＰＬＣによってモニターされるように、脱シリル化が完了した。反応混合液をＥｔＯＡｃ中に入れ、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。０−５５％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサングラジエントを用いてＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）シリカゲルカラムで精製して、８−アミノウンシアラマイシン化合物９を紫色の固形物として得た（収率８０％）。LCMS: [M+1] = 455.
【０１３３】
当業者は、他の環位に位置するアミノ基を有する化合物（ＩＩａ）の異形が：
【化２４】
2015508074.tif 000026
のように、環中の他の位置にそのアミノ基を有し、または異なる基で置換された化合物１を出発物質の異形として用いることによって作り出すことができることを理解する。
【０１３４】
実施例２−化合物（ＩＩｂ）、（ＩＩｇ）および（ＩＩｈ）
８−アミノウンシアラマイシン中の８−アミノ基は特に反応性を有するものではないが、シアン化銀の存在下でα−アミノ酸クロリドでアミド化することができる。図２は、この方法により、化合物（ＩＩｂ）、（ＩＩｈ）および（ＩＩｇ）を調製するための例示的な手順を示す。図２において、化合物（ＩＩｂ）、（ＩＩｈ）および（ＩＩｇ）は、それぞれ、１３ａ、１３ｂおよび１３ｃ’と表記する。
【０１３５】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ウンシアラマイシン−ＯＴＥＳ１１ａ
アミノウンシアラマイシン−ＯＴＥＳ８（５ｍｇ）およびＦｍｏｃ保護グリシニルクロリド１０ａ（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ，８．４ｍｇ，３当量）をアセトニトリル（２ｍＬ）中に溶解させ、ＡｇＣＮ（７ｍｇ，６当量）の存在下で終夜攪拌した。ＴＬＣおよびＨＰＬＣによってモニターされるように、反応が完了した。濃縮し、０−４０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサングラジエントを用いてＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）シリカゲルカラム上で精製して、生成物１１ａを紫色の固形物として得た（収率９０％）。LCMS: [M+1] = 848.
【０１３６】
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ウンシアラマイシン１２ａ
生成物１１ａ（４ｍｇ）をＴＨＦ（０．５ｍＬ）中に溶解させ、ＲＴでＥｔ３Ｎ・３ＨＦ・ＴＨＦの溶液（１：１，０．２５ｍＬ）で処理した。１時間後、ＴＬＣおよびＨＰＬＣによってモニターされるように、脱シリル化が完了した。反応混合液をＥｔＯＡｃ中に入れ、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濃縮した。０−５５％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサングラジエントを用いてＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）シリカゲルカラム上で精製して、化合物１２ａを紫色の固形物（収率８０％）として得た。LCMS: [M+1] = 734.
【０１３７】
Ｇｌｙ−ＮＨ−ウンシアラマイシン１３ａ
化合物１２ａ（２ｍｇ）を、ＲＴでＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ，１ｍＬ）中の２０％  ピペリジンで１５分間処理した。濃縮し、アセトニトリル／水中の０．１％  ＴＦＡで溶出して逆相ＨＰＬＣ（Ｒ−ＨＰＬＣ）を用いて精製して、化合物１３ａ（収率５０％）を得た。LCMS: [M+1] = 512.
【０１３８】
類似のリジンおよびセリン化合物１３ｂおよび１３ｃ’は、同一の一般的な方法を用いて調製した。酸クロリド化合物１０ｂおよび１０ｃは、対応するカルボン酸（両方ともＣｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘから入手）から塩化チオニルまたはゴーセズ（Ghosez's）試薬と反応させることによって調製した。化合物１３ｃからのＴＥＳ基の除去は、酢酸を用いて行うことができる。
化合物１３ｂ：LCMS [M+1] = 583.2；化合物１１ｃ：LCMS [M+1] = 770.3.
【０１３９】
実施例３−化合物（ＩＩｆ）
これまでの実施例の手順は、シトルリン酸クロリドの不安定性のため、シトルリンを用いることができなかった。図３に示されるように、シトルリンを化合物７との縮合前にフタリドに結合させて、化合物（ＩＩｆ）（図中、化合物１７と表記）を生成する別の合成アプローチを考え出した。
【０１４０】
Ｆｍｏｃ−シトルリンをカップリングさせたシアノフタリド化合物１４
ＤＣＭ：ＤＭＦ（１７：３，２０ｍＬ）中のＢｏｃ保護シトルリン化合物６ａ（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ，０．７２６ｇ，２．６４ｍｍｏｌ）およびＮ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ，０．５７８ｇ，２．９ｍｍｏｌ）をＲＴで３０分間攪拌した。次いで、アミノシアノフタリド化合物６（０．２３ｇ，１．３２ｍｍｏｌ）を加え、ＲＴで１８時間攪拌した。反応混合液を酢酸エチルでワークアップし、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、水および食塩水でさらに洗浄した。濃縮し、ＤＣＭ中の１７％  ＭｅＯＨで溶出するＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨカラムで精製して、シアノフタリド化合物１４（収率４０％）を得た。LCMS: [M+1] = 432. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.50 (s, 1H), 8.37 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.96 (m, 1H), 7.91 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.16 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 6.72 (s, 1H), 5.40 (s, 2H), 4.02 (m, 2H), 2.92 (m, 2H), 1.60 (m, 2H), 1.36 (m, 9H). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d6): δ 172.7, 168.3, 159.3, 156.0, 141.9, 137.0, 126.7, 125.0, 124.5, 115.7, 114.8, 78.5, 66.7, 55.3, 29.4, 28.6, 27.3.
【０１４１】
化合物１５
フタリド化合物１４をＤＣＭ−トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（１：１）で処理して、化合物１５を得た。LCMS: [M+1] = 332.
【０１４２】
化合物１７
さらに精製することなく、化合物１５のＴＦＡ塩を、上記に記載の一般的な条件を用いてイミノキノン化合物７とのハウザー（Hauser）環化反応にかけて、ＴＥＳ保護化合物１６（収率１０％）を得た。Ｅｔ３Ｎ・３ＨＦを用いた化合物１６の脱シリル化、続いてＣＨ３ＣＮ／水中の０．１％  ＴＦＡを用いたＲ−ＨＰＬＣにより、化合物１７を供した。LCMS: [M+1] = 612.
【０１４３】
実施例４−化合物（ＩＩｃ）
図４は、図中、化合物２２と表記した化合物（ＩＩｃ）の合成スキームを示す。
【０１４４】
化合物１９
ＣｌＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ（３０ｍＬ）中のアミノシアノフタリド化合物６（３００ｍｇ，１．７２３ｍｍｏｌ）、化合物１８（Ａｌｄｒｉｃｈ−Ｓｉｇｍａ，８２３ｍｇ，５．１７ｍｍｏｌ）および酢酸（５当量）の溶液に、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（３当量）を加え、ＲＴで５時間攪拌した。ＨＰＬＣにより、９０％の変換が示された。反応混合液をＤＣＭ（１００ｍＬ）中に入れ、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。濃縮し、溶離液として４０％  ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いてＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）カラムで精製して、化合物１９を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 7.53 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.07 (dd, J = 8.8, 2.4 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 6.85 (brs, 1H), 6.56 (s, 1H), 4.0 (brs, 1H), 3.06-3.13 (m, 4H), 1.34 (m, 9H).
【０１４５】
化合物２０ａ
化合物１９をＤＣＭ（６ｍＬ）中に溶解させ、０℃にてＴＦＡ（３ｍＬ）で処理した。温度をＲＴまで昇温させ、該反応混合物を３０分間攪拌した。ＨＰＬＣにより、反応が完了したことが示された。反応混合液を濃縮して、ゴム状物質を得て、エーテルで洗浄し（２ｘ２０ｍＬ）、アセトニトリル／水中に溶解させ、凍結乾燥させて、化合物２０ａを得た（６０１ｍｇ，収率７８％）。LCMS: [M+1] = 218.
【０１４６】
化合物２０ｂ
０℃でＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物２０ａ（２００ｍｇ，０．４５１ｍｍｏｌ，ビス−ＴＦＡ塩として）の溶液に、トリエチルアミン（０．３１４ｍＬ，２．２５６ｍｍｏｌ）、続いて、ＤＣＭ（２ｍＬ）中の（クロロ（４−メトキシフェニル）メチレン）ジベンゼン（１６７ｍｇ，０．５４１ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合液をＲＴで１時間攪拌し、ＥｔＯＡｃおよび水でワークアップした。ヘキサン中の３０％  ＥｔＯＡｃを用いて中性アルミナカラム上で精製して、ｐ−メトキシフェニルジフェニルメチル（ＭＭＴ）で保護した生成物２０ｂを淡黄色の固形物として得た（１０５ｍｇ，収率４８％）。純度は、トリエチルアミン：ＥｔＯＡｃ：ヘキサン（１：３０：７０）移動相を用いてＴＬＣにより調べた。1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.2-7.7 (m, 16H), 7.0 (m, 2H), 6.8 (m, 3H), 6.19 (s, 1H), 4.57 (brs, 1H), 3.77 (m, 3H), 3.28 (m, 2H), 2.50 (m, 2H).
【０１４７】
化合物２２
−７０℃でＴＨＦ（２ｍＬ）中の生成物２０ｂ（９２ｍｇ，０．１８８ｍｍｏｌ）の溶液に、ＬｉＨＭＤＳ（０．３７６ｍＬ，０．３７６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合液を２０分間攪拌した。ＴＨＦ（２．６ｍＬ）中のイミノキノン化合物７（５２．８ｍｇ，０．１２５ｍｍｏｌ）の予め冷却した溶液を加え、同一温度で５分間攪拌した。反応混合液を２０分かけてゆっくりＲＴまで昇温させ、リン酸緩衝液（ｐＨ６．８，２０ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃで抽出した（３ｘ１５ｍＬ）。有機相を合わせて、食塩水で洗浄し（３０ｍＬ）、ＭｇＳＯ４で乾燥させて、粗生成物２１を得た。未精製生成物２１をＤＭＳＯ（２ｍＬ）中に溶解させ、４℃にてＥｔ３Ｎ・３ＨＦ（０．５ｍＬ）で処理し、ＲＴで攪拌した。１時間後、ＬＣＭＳにより、生成物の形成が示された。粗生成物を、アセトニトリル／水中の０．１％  ＴＦＡを移動相として用いてＸ−Ｂｒｉｄｇｅ  ｐｒｅｐ  Ｃ１８カラム５μｍＯＢＤ（３０ｘ１５０ｍｍ）上で精製した。凍結乾燥させて、生成物２２を得た（１４．４ｍｇ，２工程で収率２３％）。LCMS [M+1] = 498.3.
【０１４８】
実施例５−化合物（ＩＩｅ）
図５は、図中、化合物２５と表記された化合物（ＩＩｅ）の合成スキームを示す。
【０１４９】
８−メチルアミノウンシアラマイシン２５
ＣｌＣＨ２ＣＨ２Ｃｌ（２ｍＬ）中のアミノシアノフタリド化合物６（３４ｍｇ，０．１９５ｍｍｏｌ）、パラホルムアルデヒド（１１．７２ｍｇ，０．３９０ｍｍｏｌ）および酢酸の溶液に、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウムを加えた。反応混合液をＲＴで２４時間保った。ＨＰＬＣにより、９０％の変換が示された。反応混合液をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）中に入れ、飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１０ｍＬ）で洗浄した。濃縮し、Ｒ−ＨＰＬＣで精製して、生成物２３（１５ｍｇ，収率４１％）を得た。MS (m+１) = 189.
生成物２３は、ハウザー環化反応にかけ、続いて、上記に記載されるようにＴＥＳ脱保護して、８−メチルアミノウンシアラマイシン２５を供した。LCMS: (M+1) = 467.
【０１５０】
実施例６−化合物（ＩＩｄ）
図６は、図中、化合物３０と表記された化合物（ＩＩｄ）の合成スキームを示す。
【０１５１】
化合物３０
ＤＣＭ（２４ｍＬ）中の４−（（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ）安息香酸２６（Ｆｌｕｋａ，１．８８５ｇ，７．９５ｍｍｏｌ）およびＥＤＣ（１．６７６ｇ，８．７４ｍｍｏｌ）の組み合わせをＲＴで３０分間攪拌した。次いで、ＤＭＦ（６．００ｍＬ）中のアミノシアノフタリド化合物６（０．３４６ｇ，１．９８７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合液をＲＴで５時間攪拌した。温度を５０℃に昇温し；４０時間後、ＤＣＭを留去した。残渣をＥｔＯＡｃ中に入れた。ＥｔＯＡｃを飽和ＮａＨＣＯ３、水および食塩水で洗浄した。濃縮し、ＤＣＭ中の１５％  ＭｅＯＨを溶離液として用いてＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）ユニット上で精製して、化合物２７を黄色の固形物として得た（５８７ｍｇ，収率７５％）。LCMS: [M+1] = 394.  1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 10.53 (s, 1H), 9.71 (s, 1H), 8.42 (d, J = 2.0 Hz, 1H), 8.19 (dd, J = 8.4, 2.0 Hz, 1H), 7.9 (m, 3H), 7.59 (dd, J = 7.2, J = 2.0 Hz, 2H), 6.74 (s, 1H), 1.47 (m, 9H).
この物質２７（５６７ｍｇ，１．４４１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２ｍＬ）中に懸濁し、ＴＦＡ（２ｍＬ，２６．０ｍｍｏｌ）を加えた。ＲＴで５０分間攪拌し、ＬＣＭＳおよびＨＰＬＣにより、反応が完了したことが示された。濃縮し、高減圧下で２時間乾燥させて、化合物２８を得て、ハウザー環化反応にかけ、続いて上記に記載されるようにＥｔ３Ｎ・３ＨＦでＴＥＳ脱保護して、化合物３０（収率１８％）を供した。LCMS: M+1=574.2.
【０１５２】
実施例７−化合物（ＩＩｂ）の抱合のための適応
図７は、化合物（ＩＩｂ）を抱合に適応させるための反応スキームを示す。
【０１５３】
化合物３２
ＤＭＳＯ中の化合物１３ａ（１当量）および３１（Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋら，２００２；１．２当量）を、ＲＴにてＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ，３当量）で１時間処理した。ＣＨ３ＣＮ／水中の０．１％  ＴＦＡを溶離液として用いてＲ−ＨＰＬＣで精製して、化合物３２（収率５０％）を得た。LCMS: [M+1] = 1082. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 13.12 (s, 1H), 10.62 (s, 1H), 9.67 (m, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.29 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.19 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 8.07 (m, 1H), 7.83 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.57 (m, 2H), 7.29 (m, 2H), 6.98 (m, 1H), 6.65 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 5.99 (dd, J = 30, 9.2 Hz, 2H), 5.38 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 5.14 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 5.03 (m, 1H), 4.97 (s, 1H), 4.16 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 4.08 (q, J = 5.2 Hz, 4H), 3.86 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 3.38 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.90 (m, 2H), 1.94 (m, 2H), 1.69 (m, 2H), 1.29 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.83 (m, 6H). 
【０１５４】
化合物３４
マレイミドブタン酸３３のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル（ＴＣＩ）の同様の反応により、化合物３４を得た。LCMS: [M+1] = 677.
【０１５５】
実施例８−化合物（ＩＩｆ）の抱合のための適応
図８は、化合物（ＩＩｆ）を抱合に適用させるための反応スキームを示す。
【０１５６】
化合物３８
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の化合物１７（５ｍｇ）および３５（Ｂａｃｈｅｍ，１０ｍｇ，２２μｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（１６μｌ）を加えた。反応混合液をＲＴで７時間攪拌した。濃縮し、ＤＣＭ中の３０％  ＭｅＯＨを溶離液として用いてＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）ユニットで精製して、化合物３６を得た（収率２９％）。化合物３６をＤＭＦ（２ｍＬ）中の２０％  ピペリジンで処理した。ＲＴで１５分間攪拌し、ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。ピペリジンをロータリーエバポレーターで取り除いた。反応混合液をシリカゲル上に吸着させ、ＤＣＭ中の３０％  メタノールを溶離液として用いてＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）ユニットで精製して、生成物３７を得た（収率６０％）。生成物３７を、ＲＴにてＤＭＳＯ（１ｍＬ）中のＤＩＰＥＡ（１６μｌ）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル３３（６ｍｇ）で３時間カップリングさせた。Ｒ−ＨＰＬＣにより精製して、生成物３８（１．５６ｍｇ）を得た。LC MS (m+1 = 876).
【０１５７】
化合物３９
ＤＭＦ（０．５ｍＬ）中の化合物１７（１．６８ｍｇ）および３３（２ｍｇ，２２μｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（５μl）を加えた。反応混合液をＲＴで１時間攪拌した。Ｒ−ＨＰＬＣにより精製して、生成物３９を得た（０．７７６ｍｇ）。LC MS (m+1 = 777).
【０１５８】
実施例９−化合物（ＩＩｃ）の抱合のための適応
図９は、化合物（ＩＩｃ）を抱合に適用させるための反応スキームを示す。
【０１５９】
化合物４０
ＤＭＳＯ（３ｍＬ）中の化合物２２（４．８９ｍｇ，８μｍｏｌ）、化合物３１（５．６８ｍｇ，８．００μｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（６．９５μｌ，４０．０μｍｏｌ）の溶液をＲＴで１時間攪拌した。Ｒ−ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥させて、４．６ｍｇの所望化合物４０を得た（収率５４％）。LC MS (m/2+1 = 535 ). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 13.07 (s, 1H), 9.87 (m, 1H), 8.37 (s, 1H), 8.01 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.91 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.2 (m, 5H), 6.95 (m, 3H), 5.92 (dd, J = 30, 9.2 Hz, 2H), 5.35 (m, 2H), 5.08 (s, 1H), 4.08 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 3.31 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.93 (m, 2H), 2.09 (m, 2H), 1.90 (m, 1H), 1.63 (m, 2H), 1.29 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.78 (m, 6H).
【０１６０】
化合物４１
ＤＭＳＯ（３ｍＬ）中の化合物２２（４．８９ｍｇ，８μｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＰＥＡ（４．３５μl，２５．００μｍｏｌ）および化合物３３ａ（ＴＣＩ，２．４６６ｍｇ，８．００μｍｏｌ）を加えた。反応混合液をＲＴで攪拌した。３０分後、さらに０．５当量の化合物３３ａおよびＤＩＰＥＡ（５当量）を加え、３０分間攪拌し続けた。ＨＰＬＣおよびＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。Ｒ−ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥させて、２．３５ｍｇの化合物４１（収率４３％）を得た。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ 13.07 (s, 1H), 9.87 (m, 1H), 8.38 (s, 1H), 7.89 (m, 2H), 7.1 - 7.5 (m, 2H), 6.7-7.0 (m, 4 H), 6.4- 6.6 (m, 2 H), 5.92 (dd, J = 30.4, 10.0 Hz, 2H), 5.28 (m, 1H), 5.08 (s, 1H), 4.91 (m, 1H), 4.24 (m, 1H), 1.98 (m, 4H), 1.40 (m, 2H), 1.24 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 1.0 - 1.2 (m, 4H).
【０１６１】
実施例１０−化合物（ＩＩｄ）の抱合のための適応
図１０は、化合物（ＩＩｄ）（化合物３０と表記）を抱合に適応させるための反応スキームを示す。
【０１６２】
化合物４３
ＤＩＰＥＡ（０．０１２ｍＬ，６８．３μｍｏｌ）を、ＤＭＦ（１ｍＬ）中の化合物 ３０（６．５３ｍｇ，１１．３９μｍｏｌ）、Ｆｍｏｃ保護シトルリン化合物４２（Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ，９．０５ｍｇ，２２．７７μｍｏｌ）およびＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ，８．６６ｍｇ，２２．７７μｍｏｌ）の溶液に加えた。反応混合液をＲＴで１６時間攪拌し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液および食塩水でワークアップした。ＤＣＭ中の１２％  ＭｅＯＨを溶離液として用いて１２ｇシリカカラム上のＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）クロマトグラフィーにより精製して、生成物４３（収率２９％）を得た。LCMS [[M+1] = 953.
【０１６３】
化合物４４
ＤＭＦ（０．８ｍＬ）中の化合物４３（４ｍｇ，４．２０μｍｏｌ）の溶液に、ピペリジン（２００μＬ，２．０２０ｍｍｏｌ）を加えた。ＲＴで１５分間攪拌し、ＬＣＭＳにより、反応が完了したことが示された。ピペリジンをロータリーエバポレーターで除去した。反応混合液をシリカゲル上に吸着させ、２５−６５％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭグラジエントを溶離液として用いてＣＯＭＢＩＦＬＡＳＨ（登録商標）クロマトグラフィーで精製して、化合物４４（収率８０％）を得た。LCMS [M+1] = 731.
【０１６４】
マレイミド化合物４５
ＥＤＣ（２当量）を、ＲＴでＤＣＭ（５０ｍＬ）中のｔ−ブタノール（１当量）、ｔ−ブチルバリン（１．０５当量）およびマレイミド（２．１１ｇ，１．０当量）の溶液に加えた。１時間後、該混合物をＥｔＯＡｃ中に入れ、クエン酸水溶液、炭酸水素ナトリウム水溶液および食塩水で洗浄した。有機相を乾燥させ、蒸発により濃縮して、溶媒を取り除いた。残渣をカラム（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン０−８０％グラジエント）に通して、３．０２ｇの油状物を得た。この油状物をＲＴでＤＣＭ−ＴＦＡ（３：２；２０ｍＬ）中に溶解させた。４時間後、該溶液を蒸発させ、高真空下で終夜乾燥させて、化合物４５を白色の固形物として得た（２．１ｇ，収率６８％）。LCMS: (M+1) = 311.
【０１６５】
化合物４６
ＤＭＦ（１ｍＬ）中のマレイミド化合物４５（３．１２ｍｇ，１０．０６μｍｏｌ）および化合物４４（２．４５ｍｇ，３．３５μｍｏｌ）の溶液に、ＨＡＴＵ（４．５９ｍｇ，０．０１２ｍｍｏｌ）、続いてＤＩＰＥＡ（５．２６μｌ，０．０３０ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合液をＲＴで１７時間攪拌した。Ｒ−ＨＰＬＣにより精製して、生成物４６を得た（０．４５５ｍｇ，収率１３％）。LCMS (m+1 = 1023).
【０１６６】
実施例１１−抗メソテリン抗体との抱合体
この実施例は、化合物（ＩＶｅ）（図９中で化合物４１と表記）および化合物（ＩＶｆ）（図９中で４０と表記）と抗メソテリン抗体との抱合体を記載する。 
【０１６７】
１００ｍＭ  リン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０中で５．３ｍｇ／ｍＬの濃度でのモノクローナル抗メソテリン抗体６Ａ４（ＴｅｒｒｅｔｔらのＷＯ２００９／０４５９５７Ａ１）を、１０倍モル過剰量の２−イミノチオランでチオール化した。チオレーション反応は、攪拌しながらＲＴで１時間進行させた。
【０１６８】
チオレーション後、抗体６Ａ４を、ＰＤ１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）により抱合緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，５ｍＭ  グリシン，ｐＨ７．０）に緩衝液交換した。チオール化させた抗体の濃度は、２８０ｎｍでのＵＶ分光法により決定した。チオール濃度は、ジチオジピリジンアッセイを用いて測定した。
【０１６９】
ＤＭＳＯ中の化合物（ＩＶｅ）または（ＩＶｆ）の２ｍＭ  ストック溶液を、場合によっては、抗体６Ａ４中のチオール基あたり１．５倍モル過剰量で加えた。ＤＭＳＯを２０％の最終濃度に、続いてＴＷＥＥＮ−８０（登録商標）を０．１％の最終濃度になるように加えた。反応混合液をＲＴで２時間攪拌した。この抱合ステップ後、ＤＭＳＯ中の１００ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を、抗体６Ａ４中のチオール基に対して１０倍モル過剰量で加えて、未反応のチオール基をクエンチした。クエンチした反応物を攪拌し続けながら１時間進行させた。
【０１７０】
抱合された抗体６Ａ４を０．２μｍフィルターに通して濾過し、続いて陽イオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフ精製にかけた。ＳＰセファロースＨｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＣＥＸカラムを５カラム体積（ＣＶ）の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  グリシン、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液で再生させた。再生後、該カラムを、３ＣＶの平衡緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，５ｍＭ  グリシン，ｐＨ７．０）で平衡化した。化合物（ＩＶｅ）または（ＩＶｆ）との抗体６Ａ４抱合体は、場合によっては、該カラム上に載せ、該カラムを平衡緩衝液で１回洗浄した。前記抱合体を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  グリシン、１１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で溶出した。溶離液をフラクションで収集した。続いて、該カラムを、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  グリシン、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で再生して、タンパク質凝集物および未反応の化合物（ＩＶｅ）または（ＩＶｆ）を除去した。
【０１７１】
単量体の抗体抱合体を含有する溶出フラクションをプールした。抗体抱合濃度および置換率は、２８０および５６０ｎｍで吸光度を測定することによって決定した。
【０１７２】
抱合体の精製されたＣＥＸ溶出プールは、１０ＭＷＣＯメンブレンを用いて透析により５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  グリシン、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％  ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）、ｐＨ７．０に緩衝液交換した。透析後、抗体抱合濃度および置換率は、２８０および５６０ｎｍで吸光度を測定することによって決定する。得られた抱合体の特徴付けは、下記の表１にまとめる：
【表１】
2015508074.tif 000027
【０１７３】
実施例１２−抗ＣＤ７０抗体との抱合
この実施例は、化合物（ＩＶｅ）および（ＩＶｆ）と抗ＣＤ７０抗体との抱合体を記載する。
【０１７４】
２０ｍＭ  リン酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０２％  ＴＷＥＥＮ−８０（登録商標）、ｐＨ７．５中で５．５ｍｇ／ｍＬの濃度でのモノクローナル抗ＣＤ７０抗体２Ｈ５（Ｔｅｒｒｅｔｔら，ＵＳ２００９／００２８８７２Ａ１）を、１５倍モル過剰量の２−イミノチオランでチオール化した。チオレーション反応は、攪拌し続けながらＲＴで１時間進行させた。
【０１７５】
チオレーション後、抗体２Ｈ５は、ＰＤ１０カラム（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）により抱合緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  グリシン、ｐＨ７．０）に緩衝液交換した。チオール化抗体の濃度は、２８０ｎｍでＵＶ分光法によって決定した。チオール濃度は、ジチオジピリジンアッセイを用いて測定した。
【０１７６】
ＤＭＳＯ中の化合物（ＩＶｅ）または（ＩＶｆ）の２ｍＭストック溶液を、場合によっては、抗体２Ｈ５中のチオール基あたり１．５倍モル過剰量で加えた。ＤＭＳＯを２０％の最終濃度、ならびにＴＷＥＥＮ−８０（登録商標）を０．１％の最終濃度となるように加えた。該反応物をＲＴで２時間攪拌した。この抱合ステップ後、ＤＭＳＯ中の１００ｍＭ  ＮＥＭを、抗体６Ａ４中のチオール基に対して１０倍モル過剰量で加えて、未反応のチオール基をクエンチした。クエンチした反応物を、攪拌し続けながらＲＴで１時間進行させた。
【０１７７】
抱合された抗体２Ｈ５を、０．２μｍフィルターに通して濾過し、続いてＣＥＸクロマトグラフ精製にかけた。ＳＰセファロースＨｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＣＥＸカラムを、５ＣＶの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  グリシン、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０緩衝液で再生させた。再生後、該カラムを、３ＣＶの平衡緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  グリシン、ｐＨ７．０）で平衡化した。化合物（ＩＶｅ）または（ＩＶｆ）との抗体２Ｈ５抱合体を、場合によっては、該カラム上に載せ、該カラムを平衡緩衝液で１回洗浄した。該抱合体を、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  グリシン、１１０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で溶出した。溶出物をフラクション内に収集した。次いで、該カラムを、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  グリシン、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０で再生して、タンパク質凝集物および未反応の化合物（ＩＶｅ）または（ＩＶｆ）を除去した。
【０１７８】
抱合体を含有するフラクションをプールし、緩衝液交換し、上記の実施例で記載されるように透析した。得られた抱合体の特徴付けを表２にまとめる。
【表２】
2015508074.tif 000028
【０１７９】
実施例１３−化合物の生物学的活性
本発明化合物またはこれらの抱合体の抗増殖性活性は以下のとおりにアッセイした。ヒト腫瘍細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）（P.O.Box 1549, Manassas, VA 20108, USA）から入手し、ＡＴＣＣからの説明書に従って培養した。細胞は、ＡＴＰアッセイまたは３Ｈチミジンアッセイ用にそれぞれ、９６ウェルプレート中にて１．０ｘ１０３または１．０ｘ１０４細胞／ウェルで３時間撒種した。遊離（未抱合）化合物またはそれらの抱合体の１：３連続希釈物をウェルに加えた。プレートを２４〜７２時間インキュベートさせた。３Ｈチミジンプレートを、１ウェルあたり１．０Ｃｉの３Ｈ−チミジンで全インキュベーション期間の最後の２４時間パルスし、収集し、続いてＴｏｐ  Ｃｏｕｎｔ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，コネチカット州，メリデン）で読み取った。ＡＴＰプレート中のＡＴＰレベルは、製造業者の説明書に従って、ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｋｉｔを用いて測定し、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）２０／２０ルミノメーター（両方ともＰｒｏｍｅｇａ、米国，ウィスコンシン州，マディソン）で読み取った。ＥＣ５０値（細胞増殖を５０％まで阻害し、または減少させる薬剤の濃度）は、ＰＲＩＳＭ（登録商標）ソフトウェア，バージョン４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，米国，カリフォルニア州，ラホヤ）を用いて決定した。
【０１８０】
図１１ａは、３つの参照化合物：ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ウンシアラマイシンおよび下記の構造を有するＤＮＡアルキル化剤である化合物Ａ：
【化２５】
2015508074.tif 000029
と比較した、７２時間のインキュベーション時間を用いてＡＴＰアッセイによって測定されるような、ＨＬ−６０白血病細胞に対する化合物（ＩＩａ）の抗増殖性活性のプロットである。
【０１８１】
図１１ａに由来するＥＣ５０値を表３に示す。化合物（ＩＩａ）の能力は、ウンシアラマイシン自体より高い。
【表３】
2015508074.tif 000030
【０１８２】
図１１ｂは、ＡＴＰアッセイおよび７２時間のインキュベーション期間を用いたドキソルビシン耐性卵巣癌細胞株（Ａｄｒ）に対する抗増殖性活性の類似プロットである。対応するＥＣ５０値を表４に示す。化合物（ＩＩａ）の能力（ウンシアラマイシン自体の能力よりも高い）は、耐性細胞株に対する場合にドキソルビシンおよび化合物Ａの能力の喪失を考慮すると注目すべきである。
【表４】
2015508074.tif 000031
【０１８３】
表５は、抱合体で用いられた２つの他の毒素：化合物Ａおよびドキソルビシンと比較した化合物（ＩＩａ）についてのさらなる抗増殖性データを示す。このアッセイ方法は、ＡＴＰ法であった。試験した癌細胞株は、Ａ２７８０（卵巣）、Ａ５４９（肺）、ＣＣＲＦ−ＣＥＭ（急性リンパ芽球性白血病）、ＣＯＬＯ２０５（結腸）、ＤＵ４４７５（乳房）、Ｈ２０８７（肺，非小細胞）、Ｈ６６１（肺，大細胞）、ＨＣＴ１１６（結腸）、ＬＮＣａＰ（前立腺）、ＬＳ１７４Ｔ（結腸）、ＭＤＡ  ＭＢ４６８（乳房）、ＭＤＡ  ＭＢ２３１（乳房）およびＳＥＴ２（白血病）であった。抗増殖性効果は、ＩＣ５０値（すなわち、５０％阻害効果を生じる毒素の濃度）として記載する。
【表５】
2015508074.tif 000032
【０１８４】
図１２ａは、７８６−Ｏ腎臓癌細胞に対する、対照化合物としてのドキソルビシンと共に化合物（ＩＩａ）、（ＩＩｃ）、（ＩＩｄ）および（ＩＩｅ）についてのさらなる抗増殖性データを示す。図１２ａからのＥＣ５０値を表６で提供する。ＡＴＰアッセイは、７２時間のインキュベーション期間で用いた。
【表６】
2015508074.tif 000033
【０１８５】
図１２ｂは、同様の抗増殖性プロットであるが、Ｈ２２６肺癌細胞に対するものである。得られたＥＣ５０値を表７で提供する。ＡＴＰアッセイは、７２時間のインキュベーション期間で用いた。
【表７】
2015508074.tif 000034
【０１８６】
実施例１４−抱合体の生物学的活性
上記の本明細書に記載の同一のアッセイ方法を用いて、本発明化合物から作り出された抱合体の抗増殖性活性を測定した。
【０１８７】
図１３ａは、本発明化合物から作り出した４つの抱合体：（ａ）抗体２Ｈ５（抗ＣＤ７０，Ｔｅｒｒｅｔｔら，ＵＳ２００９／００２８８７２Ａ１）の化合物（ＩＶｆ）との抱合体、（ｂ）抗体６Ａ４（抗メソテリン，Ｔｅｒｒｅｔｔら，ＷＯ２００９／０４５９５７ Ａ１）の化合物（ＩＶｆ）との抱合体、（ｃ）抗体２Ｈ５の化合物（ＩＶｅ）との抱合体、および（ｄ）抗体６Ａ４の化合物（ＩＶｅ）との抱合体の３Ｈチミジン取り込みアッセイ（７２時間のインキュベーション）を用いた、７８６−Ｏ細胞に対する抗増殖性活性を示す。図１３ａ（および下記の図１３ｂおよび１３ｃ）において、「毒素濃度」についてのＸ軸の値を置換率（ＳＲ）について調整する−すなわち、前記値は、抱合体時間ＳＲのモル濃度と同等である。図１３ａにおけるプロットからのＥＣ５０値を表８で供する。
【表８】
2015508074.tif 000035
【０１８８】
図１３ｂは、３Ｈチミジン取り込みアッセイおよび７２時間のインキュベーション期間を用いた、Ｈ２２６細胞に対する同一の４つの抱合体の抗増殖性活性を示す。得られたＥＣ５０値を表９に示す。
【表９】
2015508074.tif 000036
【０１８９】
図１３ｃは、Ｈ２２６細胞に対する抱合体２Ｈ５−（ＩＶｆ）および６Ａ４−（ＩＶｆ）の抗増殖性活性の別のプロットであるが、７２時間のインキュベーション期間でＡＴＰアッセイを用いて測定した。得られたＥＣ５０値は、それぞれ６．６３０および０．１５４８ｎＭであった。
【０１９０】
前記の発明の詳細な説明には、本発明の特定の部分または態様に主として、または単独で関連する部分が含まれる。これは、明確化と利便性のためであり、特定の特徴が、開示される単に一部のみより大きく関連しうるものであり、本明細書の開示には、異なる部分で見出される情報のあらゆる適当な組み合わせが含まれるものと理解されるべきである。同様に、本明細書の様々な形および記載は、本発明の具体的な実施態様に関連するが、ある特徴がある形または実施態様の中で開示される場合、このような特徴は、適当である限り、別の形または実施態様で、別の特徴との組み合わせで、または一般的に本発明でも用いることができるものと理解されるべきである。
【０１９１】
さらに、本発明は特定の好ましい実施態様で特に記載されているが、本発明のこのような好ましい実施態様に限定されるものではない。むしろ、本発明の範囲は、特許請求の範囲によって定義されるものである。
【０１９２】
参考文献
最初の著者（または発明者）および本明細書より早い日付によって省略された形で引用した下記の参考文献についての全文献を以下に提供する。これらの参考文献の各々は、あらゆる目的のために本明細書に取り込まれるものである。
Davies et al., Org. Lett. 2005, 7 (23), 5233-5236.
Davies et al., WO 2007/038868 A2 (2007).
Dubowchik et al., Bioconjugate Chem. 2002, 13, 855-869.
Nicolaou et al., Ang. Chem. 2007, 119, 4788-4791 [2007a].
Nicolaou et al., Ang. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 4704-4707 [2007b].
Nicolaou et al., Ang. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 185-189.
Shao, Curr. Mol. Pharmacology 2008, 1, 50-60.
【図１】
2015508074.tif 000044
【図２】
2015508074.tif 000045
【図３】
2015508074.tif 000046
【図４】
2015508074.tif 000047
【図５】
2015508074.tif 000048
【図６】
2015508074.tif 000049
【図７】
2015508074.tif 000050
【図８】
2015508074.tif 000051
【図９】
2015508074.tif 000052
【図１０】
2015508074.tif 000053
【図１１Ａ】
2015508074.tif 000054
【図１１Ｂ】
2015508074.tif 000055
【図１２Ａ】
2015508074.tif 000056
【図１２Ｂ】
2015508074.tif 000057
【図１３Ａ】
2015508074.tif 000058
【図１３Ｂ】
2015508074.tif 000059
【図１３Ｃ】
2015508074.tif 000060
【国際調査報告】
2015508074.tif 000061
2015508074.tif 000062
2015508074.tif 000063