(57)【要約】  本発明は、ポドスポラ・アンセリナの新規なラッカーゼ、それを作製する方法、及びその使用、とりわけ紙の脱リグニン化への、漂白剤、汚染除去剤及び消臭剤としての、又は更には酸素含有量の低下へのその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
精製ラッカーゼであって、配列番号１のポドスポラ・アンセリナのラッカーゼに対して少なくとも９０％の同一性パーセントを有し、フェノール核の酸化に対する反応を触媒し、４つの銅原子に結合することを特徴とする、精製ラッカーゼ。
【請求項２】
配列番号１、配列番号３及び配列番号５の配列のラッカーゼから選択されることを特徴とする、請求項１に記載の精製ラッカーゼ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のラッカーゼをコードすることを特徴とする核酸分子。
【請求項４】
配列番号２及び配列番号４から選択される配列である、請求項２に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項３又は４に記載の核酸分子を含むことを特徴とする、発現ベクター。
【請求項６】
請求項５に記載の発現ベクターによって形質転換されることを特徴とする、請求項１に記載のラッカーゼを発現する宿主細胞。
【請求項７】
請求項１に記載のラッカーゼを作製する方法であって、
ａ）請求項６に記載の宿主細胞を準備する工程と、
ｂ）工程ａ）で準備した宿主細胞を培養する工程と、
ｃ）タンパク質が分泌された又は前記宿主細胞が溶解した場合に、培養培地を回収するとともに、前記宿主細胞を取り除く工程と、
ｄ）工程ｃ）で得られた前記培地又は溶解物を疎水性相互作用クロマトグラフィによって処理する工程と、
ｅ）前記精製ラッカーゼを回収する工程と、
を含み、工程ａ）で準備した前記宿主細胞がｐＦＤ５６ベクターによって形質転換されたピキア・パストリス酵母株であり、前記ラッカーゼの発現がメタノールの添加によって誘導されることを特徴とする、方法。
【請求項８】
ケラチン繊維の酸化染色用組成物中の試薬としての請求項１又は２に記載のラッカーゼの使用。
【請求項９】
紙パルプの脱リグニン化及び／又は漂白への請求項１又は２に記載のラッカーゼの使用。
【請求項１０】
とりわけ紙及び繊維用インクの漂白剤としての請求項１又は２に記載のラッカーゼの使用。
【請求項１１】
ホエータンパク質の架橋によるゲル形成への請求項１又は２に記載のラッカーゼの使用。
【請求項１２】
食品の防腐剤としての請求項１又は２に記載のラッカーゼの使用。
【請求項１３】
食品の味感向上剤としての請求項１又は２に記載のラッカーゼの使用。
【請求項１４】
フェノール系製品の汚染除去への請求項１又は２に記載のラッカーゼの使用。
【請求項１５】
とりわけ衣類の洗濯用又は皿洗い用の洗剤組成物における請求項１又は２に記載のラッカーゼの使用。
【請求項１６】
デオドラント、石鹸、及び歯磨き粉等の衛生製品における、請求項１又は２に記載のラッカーゼの使用。
【請求項１７】
エタノール産生への請求項１又は２に記載のラッカーゼの使用。
【請求項１８】
医薬化合物の合成への請求項１又は２に記載のラッカーゼの使用。
【請求項１９】
少なくとも１つの請求項１又は２に記載のラッカーゼを含む被覆材で覆われている導電性材料を含む、ラッカーゼ含有電極。
【請求項２０】
請求項１９に記載の電極で構成されることを特徴とする、酸素、フェノール化合物又は有機アミンのバイオセンサー。
【請求項２１】
請求項１９に記載の電極で構成されることを特徴とする、酸素センサー。
【請求項２２】
酸化反応を触媒する酵素が上に固定されているアノードと、カソードとしての請求項１９に記載の電極とを含む、酵素バイオ燃料電池。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポドスポラ・アンセリナ（Podospora anserina）から単離された新規なラッカーゼ、それを作製する方法、及びその使用、とりわけ紙の脱リグニン化への、漂白剤、汚染除去剤及び消臭剤としての、又は更には酸素還元へのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラッカーゼは銅含有酵素であり、酸素を最終的な電子受容体として使用してポリフェノールを酸化する。ラッカーゼは植物、非常に多くの菌類（リグニン分解）、また一部の細菌に存在する。
【０００３】
ラッカーゼの構造は、活性部位が、４つの銅原子、すなわち、単独でフェノール酸化を担う１つのタイプ１（Ｔ１）、及びＯ２の活性化を担う３つの銅原子のクラスター（１つのタイプ２（Ｔ２）及び２つのタイプ３（Ｔ３））で構成される。
【０００４】
ラッカーゼの作用機構、とりわけ金属中心の役割は、依然不明な点があるが、二段階機構が受け入れられている。
１．Ｔ１銅が基質から電子を引き出す（drags）、
２．電子は、およそ１２．５Åの距離を超えてＴ２／Ｔ３中心へと移される。三核中心の還元が完了した後、分子酸素の還元が行われる。
【化１】
2015525064.tif 000002
【０００５】
ここで本発明者らは、商業的に入手可能なラッカーゼ、とりわけトラメテス・ベルシコロル（Trametes versicolor）のラッカーゼよりも有利な特徴を呈するポドスポラ・アンセリナにより産生される新規なラッカーゼを特定した。
【発明の概要】
【０００６】
第１の主題によれば、本発明は、ポドスポラ・アンセリナから精製され、単離された配列番号１のラッカーゼに関する。この酵素は、ポドスポラ・アンセリナゲノムの配列により予測されるタンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔデータベースにおいてアクセッション番号Ｂ２ＡＮＫ８を有する遺伝子から翻訳される。この完全な遺伝子は、配列番号２の配列を有する）から上記タンパク質のＮ末端に位置する３０個のアミノ酸を除いたものに相当する。とりわけ、本発明による精製ラッカーゼ（純度９５％超）は、配列番号１のポドスポラ・アンセリナのラッカーゼに対して少なくとも９０％の同一性パーセント、また好ましさの低い順に（in increasing order of preference）少なくとも９５％、９７％、９８％及び９９％の同一性を有する。１つの特定の多様体によれば、Ｎ末端に位置する３０個のアミノ酸の全ての又は部分的な切断を含む。本発明による精製ラッカーゼは、フェノール核の酸化に関する反応を触媒するとともに、４つの銅原子に結合する。配列番号４の核酸配列（Ｎ末端に位置する３０個のアミノ酸をコードする断片を除く配列番号２に相当する）はこの配列番号１のラッカーゼをコードするものである。
【０００７】
配列番号３のラッカーゼも本発明の主題とするものである。配列番号３のラッカーゼは、Ｎ末端位置に更なるアミノ酸、セリンを含むという点で配列番号１のラッカーゼとは異なる。このラッカーゼは、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）酵母においてｐＦＤ５６発現ベクターにクローニングされている配列番号４の核酸分子を発現することによって得られ、その構造はＮ末端位置に更なるセリンを有するタンパク質の発現が可能となるようなものである。
【０００８】
配列番号２によってコードされるポリペプチドに相当するものであり、Ｎ末端の３０個のアミノ酸を含む、配列番号５のラッカーゼも本発明の主題とするものである。
【０００９】
概して本発明者らは、Ｎ末端に導入される配列修飾は、Ｎ末端内でのアミノ酸の付加若しくは置換、欠失、又は挿入のどれを含むかにかかわらず、配列番号１との少なくとも９０％の同一性を維持する限りにおいて、本発明によるラッカーゼの酵素特性に影響を与えないことを見出した。そのために、本発明の１つの多様体は、Ｎ末端に位置する３０個のアミノ酸の配列内の少なくとも１つの修飾（置換、欠失又は挿入）を含む配列番号１のラッカーゼに関し、この配列中に位置しない他のアミノ酸は変化していないことが好ましく、配列番号１とのこの酵素の同一性は少なくとも９０％、好ましくは９５％、９７％、９８％及び９９％である。
【００１０】
基準配列としてのポドスポラ・アンセリナのラッカーゼの配列（配列番号１）に対する配列の同一性は、２つの配列の間で最大の一致が得られるように２つの配列を整列させた場合に、同一であるアミノ酸残基のパーセントによって評価される。
【００１１】
当業者は、同一性パーセントを、配列比較コンピュータープログラム、例えばＢＬＡＳＴシリーズのコンピュータープログラム（Altschul et al., NAR, 25, 3389-3402）等を使用して算出することができる。ＢＬＡＳＴプログラムは、基準配列として示される配列番号１の全体からなる比較ウインドウに対して実行される。
【００１２】
基準配列と少なくともＸ％の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドは、本発明においては、配列が、上記基準ペプチドの機能特性を保持しながら、同時に、基準配列のアミノ酸１００個当たり最大１００−Ｘ個の変化を含み得るペプチドと定義される。本発明のため、「変化」という用語は、基準配列におけるアミノ酸の連続又は分散した欠失、置換又は挿入を含む。
【００１３】
ポドスポラ・アンセリナゲノムの系統的なシークエンシング（systematic sequencing）から予測された配列番号５のタンパク質配列は、ＵｎｉＰｒｏｔデータベース（アクセッション番号Ｂ２ＡＮＫ８）に記載される。ＵｎｉＰｒｏｔデータベースに提示される情報は、予測及び推定であり、ポドスポラ・アンセリナタンパク質の実験的単離及び特性評価による結果ではないことが強調されるべきである。さらに、ＵｎｉＰｒｏｔデータベースは、この予測されたタンパク質について何らの正確な酵素活性も示していない。
【００１４】
本発明による新規のラッカーゼは、トラメテス・ベルシコロル、ラス・ベルニシフェラ（Rhus vernicifera）、アガリクス・ビスポルス（Agaricus bisporus）、又は更にはプレウロタス・オストレアタス（Pleurotus ostreatus）由来の商業的に入手可能なラッカーゼと比べて特性の改善を示す。
【００１５】
本発明は、本発明によるラッカーゼをコードする核酸分子にも関する。好ましくは、該核酸分子は配列番号２から選択される配列の核酸分子であるか、又は優先的には、該配列はタンパク質のＮ末端に位置する最初の３０個のアミノ酸の位置で切断された、ポドスポラ・アンセリナのラッカーゼをコードする配列番号４である。
【００１６】
本発明によるラッカーゼをコードする核酸分子は、プラスミド等の発現ベクターへとクローニングした後、それを用いて細菌、酵母、又は細胞培養物等の適切な宿主を形質転換することができる。
【００１７】
「発現ベクター」という用語は、発現に不可欠なシグナル、特に（構成的又は誘導性）プロモーター、リボソーム結合部位、転写終結シグナル、及び任意で抗生物質抵抗性用遺伝子等の選択マーカーの間へのコーディングヌクレオチド配列の挿入を可能にする領域を有するベクターを意味する。
【００１８】
本発明は、上記核酸分子を含む発現ベクター、及び上記発現ベクターによって形質転換され、本発明によるラッカーゼを発現する宿主細胞に更に関する。
【００１９】
宿主細胞への発現ベクターの導入は、当業者に既知の任意の方法、とりわけ例えばカルシウムイオンの存在下での宿主細胞の膜透過性の変更、又はエレクトロポレーションによって実施することができる。
【００２０】
本発明によるラッカーゼを発現するように形質転換された宿主細胞の培養後に、該細胞を遠心分離により回収し、溶解することで、上記の本発明によるラッカーゼを含む酵素を放出させることができる。
【００２１】
本発明の好ましい変形形態によれば、本発明によるラッカーゼはピキア・パストリス酵母によって産生される。
【００２２】
ピキア・パストリス酵母培養培地中へのラッカーゼの過剰産生及び分泌を可能とするため、後述されるｐＦＤ５６ベクターへとクローニングする際に配列番号３の配列のラッカーゼをコードする配列番号４の核酸分子を、相同組換えによりＡＯＸ１遺伝子のレベルで酵母ゲノム中へと導入する。そのために、ｐＦＤ５６プラスミドを、ｐｍｅＩ酵素を用いた消化によって線形化してから、エレクトロポレーションによって酵母に導入し、１００μｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤ培地＋寒天において陽性クローンを選択する。ゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した２００ｍｌのＹＰＤ培地の前培養物に、シャーレで単離したクローンを用いて播種を行う。２２０ｒｐｍ、３０℃で一晩振盪した後、存在する全てのグルコースを取り除くためにこの前培養物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを２００ｍｌの滅菌水中に取る。２回目の遠心分離の後、５ｌ容の三角フラスコ内の１ｍＭのＣｕＳＯ４を含むＭＭＨ培地中の培養物２ｌに、このペレットを播種する。酵母を２時間、振盪しながら（２２０ｒｐｍ）、２５℃でインキュベートした後、誘導を開始するために、０.５％メタノールを添加する。最大量の酵素を得るために、この誘導工程を５日間繰り返す。
【００２３】
以下の材料は、本質的に限定されることなく、本方法の実施に使用することができる。
ピキア・パストリスにおける発現用ベクター（ｐＦＤ５６）：サッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）のα因子分泌因子を有するフレーム中にポドスポラ・アンセリナのラッカーゼをコードするＤＮＡ配列を含み、メタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーターを含むｐＰＩＣＺαプラスミド、
ＡＯＸ１プロモーター、α因子シグナルペプチド及びポドスポラ・アンセリナのラッカーゼをコードするＤＮＡ配列を含むｐＦＤ５６ベクターに由来するカセットの組込み後に本発明によるラッカーゼの産生に使用されるピキア・パストリス酵母株ＧＳ１１５、
培養培地：
ＹＰＤ富栄養培地（酵母用）：
１％酵母エキス
２％バクトペプトン
２％グルコース
ｐＨは調整せず、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理する
ＭＭＨ最少培地（酵母用）：
１．３４％酵母窒素ベース
１％カザミノ酸
０．４％ヒスチジン
４×１０−５％ビオチン
ｐＨは調整せず、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理する
ＬＢ富栄養培地（細菌用）：
トリプトン  １０ｇ／ｌ
酵母エキス  ５ｇ／ｌ
ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ
蒸留Ｈ２Ｏ  １ｌまで適量
ｐＨは調整せず、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理する。
【００２４】
別の変形形態によれば、大腸菌（Escherichia coli）を宿主微生物として選択することができる。その際使用することができるプラスミドは、とりわけプラスミドｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣ１８、ｐＥＴ、ｐＧＥＸ、ｐＧＳ、ｐＭＡＬ−ｃ２等である。
【００２５】
本発明によるラッカーゼの調製のこの変形形態によれば、ラッカーゼは、Ｃ末端位置で６ＨＩＳタグと並ぶように配置した酵素をコードするｐＥＴ２１ａ発現ベクターによって形質転換された大腸菌（E. coli）細菌によって有利に発現される。
【００２６】
この方法は迅速かつ単純なものであり、実際、大腸菌細菌におけるポドスポラ・アンセリナのラッカーゼの発現の誘導は、４時間〜２４時間で実施される。
【００２７】
さらに、純粋な酵素を得るために、６ＨＩＳタグによって、ニッケル樹脂でのアフィニティクロマトグラフィによりポドスポラ・アンセリナのラッカーゼを単一段階で精製することが可能となる。
【００２８】
この調製方法の実施のため、当業者は使用する発現ベクターに応じて宿主細胞を選択する。
【００２９】
好ましくは、ｐＥＴ２１ａ発現ベクターを使用する場合、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主細胞、例えば大腸菌株ＢＬ２１、ＤＥ３、ＢＬ２１−ＳＩ、ＢＬ２１  ｐＬｙｓ、Ｎｏｖａｂｌｕｅ（ＤＥ３）又はＢＬ２１  Ｓｔａｒが選択される。
【００３０】
本発明は、本発明によるラッカーゼを作製する方法であって、
ａ）本発明によるラッカーゼを発現する宿主細胞を準備する工程と、
ｂ）工程ａ）で準備した宿主細胞を培養する工程と、
ｃ）培養培地を回収するとともに、例えば遠心分離によって宿主細胞を取り除く工程と、
ｄ）工程ｃ）で得られた培養培地を疎水性相互作用クロマトグラフィによって処理する工程と、
ｅ）上記精製ラッカーゼを回収する工程と、
含む、方法にも関する。
【００３１】
１つの好ましい実施の形態によれば、本発明による方法は、以下のようなものである。
使用されるピキア・パストリス酵母株はＧＳ１１５株である。
ピキア・パストリスにおける発現用ベクター（ｐＦＤ５６）は、サッカロマイセス・セレビジエのα因子分泌因子を有するフレーム中にポドスポラ・アンセリナのラッカーゼをコードするＤＮＡ配列を含み、メタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーターを含むｐＰＩＣＺαプラスミドである。
工程ｂ）において行われる培養は、１８℃〜３７℃、好ましくは２５℃の温度で振盪しながら、その間にラッカーゼの発現がメタノールの添加によって誘導され、任意にメタノールの添加による誘導が繰り返され得る、液相における少なくとも１つの培養工程を含む。
【００３２】
これらの好ましい条件に従って上記方法が実施される場合、約３日〜７日の短い誘導時間によるラッカーゼの産生を可能とし、ラッカーゼの精製は単回の疎水性相互作用クロマトグラフィ工程において実施され、そのようにして産生されたラッカーゼは、実際にその活性に必要な４つの銅原子を含む。
【００３３】
本発明によるラッカーゼが大腸菌等の株によって産生される場合、本発明によるラッカーゼの作製方法は、
ａ）本発明によるラッカーゼを発現する宿主細胞を準備する工程と、
ｂ）工程ａ）で準備した宿主細胞を培養する工程と、
ｃ）宿主細胞を溶解する工程と、
ｄ）工程ｃ）で得られた溶解物をアフィニティクロマトグラフィによって処理する工程と、
ｅ）上記精製ラッカーゼを回収する工程と、
を含む。
【００３４】
尿素、塩化グアニジニウム、ＳＤＳ、トリトン等の変性剤の存在下においてラッカーゼを産生させることも可能であり、このようにして産生されたラッカーゼは、銅を欠いており、銅原子を添加することによって活性化することができる。
【００３５】
本出願人は、本発明によるラッカーゼは、商業的に入手可能なラッカーゼ、とりわけトラメテス・ベルシコロルのラッカーゼよりも良好な電気化学的特性を呈する（実験欄の項１０を参照されたい）ことを示した。
【００３６】
そのために、本発明によるラッカーゼの有利な酵素特性によって、本発明によるラッカーゼは、以下の適用に特に興味がもたれている。
【００３７】
紙産業における用途
ラッカーゼの最も通例の適用は、紙パルプの脱リグニン化及び／又は漂白に関する。
【００３８】
紙の工業的な調製において、木材パルプ中のリグニンの分離及び分解は、従来法では、塩素及び／又は化学酸化物剤を使用して得られる。これらの従来法は、汚染の欠点がある。本発明によるラッカーゼは、脱リグニン化を実施するための有利な代替手段のみならず、塩素によらない紙パルプの漂白を提供する。
【００３９】
漂白剤としての用途
ラッカーゼの持つ紙漂白力を他の分野にも適用することができる。とりわけ紙をリサイクルする観点から、本発明によるラッカーゼを紙からインクを除去する及び／又は紙を漂白するのにも使用することができる。また本発明によるラッカーゼを繊維の処理、とりわけ綿の漂白、又はジーンズの藍色の漂白を生じるのにも使用することができる。
【００４０】
汚染除去剤としての用途
ラッカーゼの別の非常に頻繁な適用は、それらの汚染除去剤としての使用に関する。この酵素は、実際に、フェノール（任意に、塩素化フェノール汚染物質）及びプラスチックを含む幅広い望ましくない環境汚染物質を分解することができる。そのために、本発明によるラッカーゼの有利な用途は、フェノール系製品の汚染除去に関する。
【００４１】
消臭剤としての用途及び洗剤組成物における用途
ラッカーゼの汚染物質を分解する能力によって、ラッカーゼは、布等の材料の消臭も可能とする。そのために、ラッカーゼは、衣類の洗濯用又は皿洗い用の洗剤組成物において有用である。
【００４２】
食品産業における用途
ラッカーゼは、とりわけ酸化試薬を排除する（脱酸素）ための添加剤、例えば、果汁及びワインの安定化のため、食品の防腐剤として食品産業において使用される。
【００４３】
また、ラッカーゼは、食品の味感向上剤（taste enhancer）としても使用される。例えば、ラッカーゼは、（乾燥又はロースティングの前にラッカーゼ溶液に浸漬して）ココアの味感を向上するため、ココアを作製する方法に含まれる。
【００４４】
また、本発明に係るラッカーゼは、ホエータンパク質の架橋を可能にしてオリゴマー又はポリマーを生じ、そのようにしてゲル形成をもたらすという利点を有する（Faergemand et al. 1998 J. Agric. Food Chem. 46, 1326-1333、Mattinen et al. 2005 FEBS Journal 272, 3640-3650）。
【００４５】
有機合成の実施への用途
ラッカーゼは、再利用された原料からエタノールを産生する工程に含まれる。
【００４６】
医薬分野における用途
さらに、ラッカーゼは、麻酔化合物、抗炎症化合物若しくは抗生物質化合物、又はヨードの合成に使用される。
【００４７】
化粧料分野における用途
化粧料分野において数多くの開発が行われている。これらは、とりわけ、酸化染色組成物中の試薬としての使用であり、ラッカーゼはより刺激の少ない製品の調製を可能とする。また、ラッカーゼは、美白製品の調製を可能とする。
【００４８】
最後に、ラッカーゼは、デオドラント、又は石鹸及び歯磨き粉等の衛生製品に使用され得る。
【００４９】
電極及びバイオ燃料電池の作製に対する用途
本発明によるラッカーゼは、上に酵素が固定されている電極の作製に関して特に興味がもたれている。
【００５０】
そのために、本発明は、導電性金属、とりわけ白金、銅、銀、アルミニウム、金若しくはスチール、若しくは炭素、例えばガラス状炭素、炭素繊維、カーボンナノチューブの繊維、又はダイアモンド製のもの等の導電性材料等を含むラッカーゼ含有電極にも関する。上記導電性材料は少なくとも１つの本発明によるラッカーゼを含む被覆材で覆われており、上記被覆材は酵素と電極との間の電気伝導とシステムの安定性とを改善するために、レドックスポリマーを更に含むことができる。
【００５１】
レドックスポリマーは例えば、フェロセン系、オスミウム系及びルテニウム系のポリマー、並びに導電性ポリマー、例えばポリピロール及びポリアニリン等から選択することができる。
【００５２】
上記導電性材料上にラッカーゼを固定する方法は、とりわけポリマーマトリクス中へのラッカーゼの内包、ポリマー膜表面上でのラッカーゼの吸着、共有結合による連結、電着を含む当業者が自由に使える従来法（Gao et al., Chem. Int. ED. 2002, 41, No. 5, 810-813）、又は米国特許出願第２００９／００５３５８２号に記載の技法から選択することができる。
【００５３】
１つの実施の変形形態によれば、ラッカーゼが固定されているラッカーゼ含有電極は、電極からの上記酵素の脱離を防止する膜にも覆われている。想定される用途に応じて、上記膜は、ナフィオン、セルロース、又は任意の生体適合性材料、すなわち生理環境と適合性の材料で構成することができる。
【００５４】
そのために、本発明はまた、本発明によるラッカーゼ含有電極で構成される酸素、フェノール化合物又は芳香族アミンのバイオセンサーに関する。一般的に、バイオセンサーは、生物学的標的を認識することが可能なバイオレセプターが固定されている電極で構成される。バイオレセプターへの生物学的標的の結合によって、膜の物理化学的変化、及び電極と連結した電気化学的変換器（電流測定的変換器、電位差測定的変換器、電気伝導度測定的変換器等）による電気的シグナルの生成がもたらされる。本発明の場合では、バイオセレセプターは本発明によるラッカーゼであり、生物学的標的は酸素、フェノール化合物又は芳香族アミンから選択される化合物である。
【００５５】
本発明は、本発明による電極で構成される酸素センサーにも関する。
【００５６】
本発明によるラッカーゼ含有電極は更に、酵素バイオ燃料電池におけるカソードとして有利に使用することができる。図１Ａに、酵素バイオ燃料電池の作動原理を概略的に示す。本発明による酵素バイオ燃料電池は、カソードとしてのラッカーゼ含有電極（ｌａｃｃａ）と、基質の酸化反応（「酵素Ｘ」によって触媒される）が起こるアノードとを備える装置である。例示としては、基質はグルコースとすることができ、「酵素Ｘ」はグルコースオキシダーゼとすることができる。この種のバイオ燃料電池は、医療用途で個体に埋め込む場合に、特に関心が持たれる。基質は、例えば亜硝酸塩、硝酸塩、スルフィド、尿酸塩（urates）、アスコルビン酸塩、グルタミン酸塩、ピルビン酸塩、乳酸塩、セルロース等から選択することもできる。除染用途が想定される場合、酵素は分解対象の基質に応じて選択する。例えば、以下の酵素を使用することができ、これらの酵素が分解することができる基質の種類を丸括弧内に示す：グルコースオキシダーゼ（グルコース、又はこの酵素によって酸化される全ての糖）、乳酸オキシダーゼ（乳酸塩）、ピルビン酸オキシダーゼ（ピルビン酸塩）、アルコールオキシダーゼ（アルコール）、コレステロールオキシダーゼ（コレステロール）、グルタミン酸オキシダーゼ（グルタミン酸塩）、ピラノースオキシダーゼ（ピラノース）、コリンオキシダーゼ（コリン）、セロビオースデヒドロゲナーゼ（セロビオース）、グルコースデヒドロゲナーゼ（グルコース、又はこの酵素によって酸化される全ての糖）、ピラノースデヒドロゲナーゼ（ピラノース）、フルクトースデヒドロゲナーゼ（フルクトース）、アルデヒドオキシダーゼ（アルデヒド）、グルコノラクトン（gluconolactam）オキシダーゼ（グルコノラクトン）、アルコールデヒドロゲナーゼ（アルコール）、アスコルビン酸オキシダーゼ（酸素又はアスコルビン酸塩）、又は硫黄ジオキシゲナーゼ（硫黄）。バイオ燃料電池の電極での酸化及び還元の同時的なプロセスによって、電流が生成される。
【００５７】
図１Ｂに、グルコースの酵素バイオ燃料電池をより具体的に示す。このような酵素バイオ燃料電池は、酵素の固定によって修飾された２つの電極で構成されている。グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）が導電性ポリマー「Ｉ」によってアノード（１）に結合され、ラッカーゼ（ＬＡＣ）が導電性ポリマー「ＩＩ」によってカソード（２）に結合されている。作動中にアノードでは、電子は生理液中に存在するグルコースからＧＯｘ、次いでＧＯｘから導電性ポリマー「Ｉ」、導電性ポリマー「Ｉ」からアノードへと移動する。カソードでは、電子はカソードから導電性ポリマー「ＩＩ」、次いでラッカーゼへと、最終的にはラッカーゼから生理液中に存在する酸素へと移動する。
【００５８】
バイオ燃料電池は任意に、それぞれの酵素によって電極を修飾すること、及び可溶性の媒介因子、例えばアノードにフェロセンメタノール及びカソードにフェリシアン化カリウムを添加すること、並びに、必要に応じて、アノードとカソードとを分離する膜を付加することによって作動させることもできることに留意すべきである。
【００５９】
かかるバイオ燃料電池は、小型のエネルギー源として使用され、生体に移植され得る。
【００６０】
上記の構成に加えて、本発明は、本発明の実施態様の例及びまた添付の図面を参照する以下の記載から明らかになる他の構成も含む。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】酵素バイオ燃料電池の作動原理を概略的に表す図である。
【図１Ｂ】グルコースの酵素バイオ燃料電池を表す図である。
【図２】ｐＦＤ５６ベクターのプラスミドマップを表す図である。
【図３】３７℃でのＡＢＴＳ濃度に応じた本発明による配列番号３のラッカーゼの触媒活性を表すグラフである。
【図４】３７℃でのＳＧＺ濃度に応じた本発明による配列番号３のラッカーゼの触媒活性を表すグラフである。
【図５】ＡＢＴＳの酸化に対する、ｐＨに応じた本発明による配列番号３のラッカーゼの相対活性を表す曲線である。
【図６】４℃の様々なｐＨでの本発明による配列番号３のラッカーゼの安定性を示す図である。
【図７】ＡＢＴＳの酸化に対する、温度に応じた本発明による配列番号３のラッカーゼの相対活性を表すグラフである。
【図８】ＡＢＴＳの酸化に対する、３７℃及び６０℃においての時間に応じた本発明による配列番号３のラッカーゼの安定性を表すグラフである。
【図９】ｐＨ７での本発明による配列番号３のラッカーゼの活性に対するＮａＣｌの効果を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００６２】
Ｉ.  真菌ポドスポラ・アンセリナ由来のラッカーゼの調製
材料
１．  大腸菌細菌株
ＤＨ５α：ｓｕｐＥ４４、ΔｌａｃＵ１６９、（θ８０  ｌａｃＺＤＭ１５）、ｈｓｄＲ１７、ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｇｙｒＡ９６、ｔｈｉ−１、ｒｅｌＡ１（Hanahan, 1983）。この株を、タンパク質発現ベクターを構築する工程の間にプラスミドを増幅するために用いる。
【００６３】
２.  ベクター
ｐＦＤ５６：サッカロマイセス・セレビジエのα因子分泌因子を有するフレーム中にポドスポラ・アンセリナ由来の本発明による配列番号３のラッカーゼをコードするＤＮＡ配列を含み、メタノール誘導性ＡＯＸ１プロモーターを含むｐＰＩＣＺαプラスミド。該プラスミドは図２に示される。
【００６４】
３．  ピキア・パストリス酵母株
ＧＳ１１５：ＡＯＸ１プロモーター、α因子シグナルペプチド、及びポドスポラ・アンセリナ由来の本発明による配列番号３のラッカーゼをコードするＤＮＡ配列を含む、ｐＦＤ５６ベクターに由来するカセットの組込み後にラッカーゼを産生するため使用されるピキア・パストリス酵母株。
【００６５】
４．  培養培地
ＹＰＤ富栄養培地（酵母用）：
１％酵母エキス
２％バクトペプトン
２％グルコース
ｐＨは調整せず、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理する
ＭＭＨ最少培地（酵母用）：
１．３４％酵母窒素ベース
１％カザミノ酸
０．４％ヒスチジン
４×１０−５％ビオチン
ｐＨは調整せず、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理する
ＬＢ富栄養培地（細菌用）：
トリプトン  １０ｇ／ｌ
酵母エキス  ５ｇ／ｌ
ＮａＣｌ  ５ｇ／ｌ
蒸留Ｈ２Ｏ  １ｌまで適量
ｐＨは調整せず、１２０℃で２０分間オートクレーブ処理する。
【００６６】
遺伝子工学技法
５．  スーパーコンピテント細菌の形質転換
Ｉｎｏｕｅ法（Sambrook and Russell）を使用してスーパーコンピテントＤＨ５α細菌を調製する。
【００６７】
６．  ピキア・パストリス酵母の形質転換
ＤＮＡを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｅｐｏｒａｔｏｒ（Eppendorf、フランス）でのエレクトロポレーションによりピキア・パストリス酵母ＧＳ１１５に導入する。
【００６８】
７．  ＤＮＡの調製
プラスミドＤＮＡ精製キット（Qiagen）を使用して、少量及び大量のＤＮＡを調製する。
【００６９】
８．  二本鎖ＤＮＡのシークエンシング
二本鎖ＤＮＡを、Millegen社（フランス、トゥールーズ）でシークエンシングする。
【００７０】
９．  ラッカーゼ発現ベクターの構築
Ｎ末端の最初の３０個のアミノ酸をコードする部分が切断された、ポドスポラ・アンセリナのラッカーゼ（アクセッションＢ２ＡＮＫ８）をコードする配列に相当する配列番号４の配列の遺伝子を、Genecust Europe社（ルクセンブルク）により合成した。クローニングを容易にするため、ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩ制限酵素部位を、配列の３’位置と５’位置とにそれぞれ付加した。次いでｐＰＩＣＺαプラスミド及び合成した遺伝子を２つの制限酵素ＮｈｅＩ及びＮｏｔＩで処理し、消化産物を「ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ」キットを用いてゲル上で精製した。その後ラッカーゼの遺伝子を、３７℃で一晩、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼとともに同時インキュベートすることによってプラスミドにライゲーションする。続いて新たに形成したプラスミド（ｐＦＤ５６）を、２５μｇ／ｍｌのゼオシンの入ったシャーレでＤＨ５α細菌の形質転換によって選択及び増幅させる。
【００７１】
１０．  ピキア・パストリスのゲノムへのラッカーゼをコードする配列の組込み
ピキア・パストリス酵母の培養培地中に酵素を過剰産生及び分泌させるために、対応する遺伝子を相同組換えによってＡＯＸ１遺伝子の位置に導入する。このために、ｐＦＤ５６プラスミドを、酵素ｐｍｅＩを用いた消化によって線形化してから、エレクトロポレーションによって酵母に導入し、１００μｇ／ｍｌのゼオシンを含有するＹＰＤ培地＋寒天において陽性クローンを選択する。
【００７２】
得られたプラスミドの配列は、配列番号６である。
【００７３】
ポドスポラ・アンセリナ由来のラッカーゼ酵素の産生、精製及び特性評価
ラッカーゼの産生
配列番号３のラッカーゼ酵素をメタノール誘導によってピキア・パストリス酵母から産生させる。このために、ｐＦＤ５６プラスミドに含有されたカセットを組み込んだ後、ゼオシン（１００μｇ／ｍｌ）を添加した２００ｍｌのＹＰＤ培地の前培養物にＧＳ１１５株を播種する。２２０ｒｐｍ、３０℃で一晩振盪した後、存在する全てのグルコースを取り除くために、この前培養物を４００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ペレットを２００ｍｌの滅菌水に再懸濁する。２回目の遠心分離の後、５ｌ容の三角フラスコ内の２ｍＭのＣｕＳＯ４を含むＭＭＨ培地中の培養物２ｌに、このペレットを播種する。酵母を２時間、振盪しながら（２２０ｒｐｍ）、２５℃でインキュベートした後、誘導を開始するために、０.５％メタノールを添加する。最大量の酵素を得るために、この誘導工程を５日間繰り返す。分泌タンパク質を回収するために、２ｌの培養物を遠心分離し、対象の酵素を含む上清を、カット閾値が１０ｋＤａのＹＭ１０膜を備える撹拌セルにおいて濃縮することで、４ｍｌ〜５ｍｌの最終容量を達成する。
【００７４】
疎水性相互作用クロマトグラフィによるラッカーゼの精製
濃縮してから、１.７Ｍの硫酸アンモニウムを４ｍｌ〜５ｍｌの培養上清に添加した後、０.２２μｍフィルターで濾過し、ＡＫＴＡ精製装置システム（GE Healthcare（商標））に接続し、５０ｍＭリン酸カリウム、１.７Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４（ｐＨ６）緩衝液中に平衡化した疎水性相互作用クロマトグラフィカラム、６０ｍｌ  ＰｈｅｎｙｌＨＰ（GE Healthcare（商標））に注入する。溶出を０％から１００％の勾配の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）を用いて２．５ｍｌ／分の流速で行う。ラッカーゼタンパク質を含む画分を、ＡＢＴＳ活性試験を用いて同定し、それらを合わせて、Ａｍｉｃｏｎ  ＹＭ１０膜での遠心分離によって５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）中で濃縮し、保管した。この段階で、ラッカーゼタンパク質は純粋であり、−２０℃において可溶性形態で保管することができる。
【００７５】
他の商業的に入手可能なラッカーゼと比較すると、精製プロトコルに関してこのタンパク質を使用する実際の利点が明らかである。これは、他の酵素については、連続してクロマトグラフィ（サイズ排除、陰イオン又は陽イオン交換、疎水性等）を使用するのに対し、純粋な酵素を得るために単一の精製工程で足りるからである［１］。
【００７６】
ＩＩ．  酵素の特性評価
１．  濃度の測定
溶液中の酵素の濃度をブラッドフォード技法［２］に従ってＢＳＡ範囲から算出する。
【００７７】
２．  酵素試験
酵素試験を３ｍｌの容量の３７℃の０．１Ｍのクエン酸／リン酸緩衝液中でVarianの分光光度計を用いて、時間に応じた所与の波長での様々な基質の酸化をモニタリングすることにより行う。酵素の比活性を１分当たりタンパク質１ｍｇに付き酸化される基質（μｍｏｌ単位）で表す。この研究で使用される基質は、ＡＢＴＳ（ε４２０ｎｍ＝３６ｍＭ−１ｃｍ−１）、及びシリンガルダジン（ＳＧＺ）（ε５３０ｎｍ＝６４ｍＭ−１ｃｍ−１）である。
【００７８】
ポドスポラ・アンセリナのラッカーゼの酵素特性の研究
定常期での速度定数（ｋｃａｔ）及びミカエリス定数（ＫＭ）の決定
３．  ＡＢＴＳ
実験を３７℃の０.１Ｍのクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ３．４）中でVarianの分光光度計で行う。ＡＢＴＳ濃度は試験において０ｍＭ〜１．５ｍＭの中で変える。試験を酵素の添加により開始する。実験点を、以下の方程式に従ってＳｉｇｍａ−ｐｌｏｔ  ６．０ソフトウェアを用いてミカエリス−メンテンモデルによる非線形回帰によって分析する。
ミカエリス−メンテンモデル
ｋｓｓ＝ｋｃａｔ×［Ｓ］／（ＫＭ＋［Ｓ］）
結果：ｋｃａｔ＝１３７２ｓ−１、Ｋｍ＝３０７μＭ。
【００７９】
図３は、３７℃でのＡＢＴＳ濃度に応じた配列番号３のラッカーゼの触媒活性を表す。
【００８０】
４．  シリンガルダジン（ＳＧＺ）
５０ｍＭクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ７）中でVarianの分光光度計により、３７℃にて実験を行う。メタノールで希釈したＳＧＺの濃度は、試験において０μＭ〜５０μＭの中で変える。酵素を添加して開始される試験は、比色分析による変化（ε５３０ｎｍ＝６４ｍＭ−１ｃｍ−１）により５３０ｎｍでＳＧＺの酸化をモニターすることからなる。
結果：ｋｃａｔ＝１．３ｓ−１、ＫＭ＝１０．９μＭ。
これらの結果は、図４に提示される。
【００８１】
５．  ｐＨに応じた活性
基質として１ｍＭのＡＢＴＳを使用し、０．１Ｍクエン酸／リン酸緩衝液中、３〜７のｐＨ範囲で、ｐＨに応じた反応の速度定数の変化の検討を行う。Varianの分光光度計を使用して３７℃にて実験を行った。４２０ｎｍで測定される比色分析による変化を生じるＡＢＴＳの酸化を介して、上記活性をモニターする。上記酵素を添加して試験を開始する。
【００８２】
図５は、ＡＢＴＳの酸化に対する、ｐＨに応じた配列番号３のラッカーゼの相対活性を表す。
【００８３】
６．  ｐＨに応じた安定性
４℃にて所与のｐＨで、５０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液（又はｐＨ８及びｐＨ９については５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｈ２ＳＯ４）中、０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度にて酵素をプレインキュベートする。定期的に５μｌの試料を採取し、１５０μＭのＡＢＴＳの存在下で、３７℃にて０．１Ｍクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ３．４）中、４４０ｎｍでVarianの分光光度計を使用し、様々なｐＨにてインキュベートした酵素の残存活性を決定する。上記酵素を添加して試験を開始する。得られた結果を図６に表す。
【００８４】
７．  温度に応じた活性
温度に応じた反応の速度定数における変化の検討を、０．５ｍＭのＡＢＴＳの存在下にて０．１Ｍクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ４）中で行う。温度は１５℃〜８０℃の中で変える。温度調整されたVarianのＣＡＲＹ  ＵＶ  Ｂｉｏｍｅｌｔ分光光度計により活性をモニターする。上記酵素を添加して試験を開始する。得られた結果を図７に表す。
【００８５】
８．  温度に応じた酵素の安定性
酵素を、５０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６）中で６０℃及び３７℃にて乾燥浴内において０．１５ｍｇ／ｍｌの濃度でプレインキュベートする。定期的に５μｌの試料を採取し、１５０μＭのＡＢＴＳの存在下で３７℃にて０．１Ｍクエン酸／リン酸緩衝液（ｐＨ３．４）中、４４０ｎｍでVarianの分光光度計を使用して、これらの温度でインキュベートした酵素の残存活性を決定する。上記酵素を添加して試験を開始する。得られた結果を図８に示す。
【００８６】
９．  ＮａＣｌの存在下での酵素活性の検討
ラッカーゼの活性に対する塩化ナトリウム（生理的な培地中に存在する）の影響を確認するため、５０ｍＭリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ７）中、３７℃、５３０ｎｍでのＳＧＺの酸化をモニタリングすることからなる活性試験にＮａＣｌの濃度を漸増して添加した。
【００８７】
図９（ｐＨ７でのラッカーゼの活性に対するＮａＣｌの効果）に示されるように、生理的条件に相当する濃度である１５０ｍＭのＮａＣｌの存在下であっても、上記酵素は７０％の酸化活性を呈する。
【００８８】
１０．  電気化学測定
この新規酵素の利点を示すため、比較例として、本発明による配列番号３のラッカーゼ、又はトラメテス・ベルシコロルのラッカーゼ（電気化学において一般的に使用されるラッカーゼ）のいずれかとレドックスポリマーとを含む２つの酵素電極を調製した。ｐＨ７でＣｌの存在下において、Ｏ２の還元に対する接触電流は、新規な酵素で修飾された電極では４０％大きかった。さらに、経時的な安定性は２００％を上回って大きかった。
【００８９】
参照文献
1. Colao, M.C., et al., Heterologous expression of lcc1 gene from Trametes trogii in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme. Microb Cell Fact, 2006. 5: p. 31.
2. Bradford, M.M., A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem, 1976. 72: p. 248-54.
3. Kataoka, K., et al., High-level expression of Myrothecium verrucaria bilirubin oxidase in Pichia pastoris, and its facile purification and characterization. Protein Expr Purif, 2005. 41(1): p. 77-83.
4. Sakasegawa, S., et al., Bilirubin oxidase activity of Bacillus subtilis CotA. Appl Environ Microbiol, 2006. 72(1): p. 972-5.
5. Felsenfeld, G., The determination of cuprous ion in copper proteins. Arch Biochem Biophys, 1960. 87: p. 247-51.
【図１Ａ】
2015525064.tif 000003
【図１Ｂ】
2015525064.tif 000004
【図２】
2015525064.tif 000005
【図３】
2015525064.tif 000006
【図４】
2015525064.tif 000007
【図５】
2015525064.tif 000008
【図６】
2015525064.tif 000009
【図７】
2015525064.tif 000010
【図８】
2015525064.tif 000011
【図９】
2015525064.tif 000012
【配列表】
2015525064000001.app
【国際調査報告】
2015525064.tif 000013
2015525064.tif 000014