(57)【要約】  本発明は、細胞培養培地用のトウモロコシ活性ペプチド添加剤であって、トウモロコシ活性ペプチド添加剤中、１０００ダルトン未満の分子量を有するオリゴペプチドが全タンパク質の９０重量％以上を占め、オリゴペプチドがＡＰ、ＳＡＰ、ＰＡＬ、ＶＮＡＰ、ＰＳＳＱ、およびＴＱＰＧＰＱの１つまたは複数を少なくとも含む、トウモロコシ活性ペプチド添加剤を提供する。本発明のトウモロコシ活性ペプチド添加剤は、様々な動物細胞を無血清培養するための様々な基礎培養培地と混ぜ合わせることができ、それは細胞培養に関するコストを実質的に低下させ、動物由来成分によって引き起こされる汚染および他の問題を減らすだけでなく、細胞増殖を促進し、細胞生存率を改善し、細胞産物の発現を高めることもできる。
2015536660.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養培地用のトウモロコシ活性ペプチド添加剤であって、トウモロコシ活性ペプチド添加剤中、１０００ダルトン未満の分子量を有するオリゴペプチドが全タンパク質の９０重量％以上を占め、オリゴペプチドがＡＰ、ＳＡＰ、ＰＡＬ、ＶＮＡＰ、ＰＳＳＱ、およびＴＱＰＧＰＱの１つまたは複数を少なくとも含む、トウモロコシ活性ペプチド添加剤。
【請求項２】
オリゴペプチドがＡＹ、ＮＡＰ、ＰＶＩＮ、およびＡＹＰＱの１つまたは複数をさらに含む、請求項１に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤。
【請求項３】
トウモロコシ活性ペプチド添加剤中のエンドトキシン含量が２００ＥＵ／ｇ未満である、請求項１に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤。
【請求項４】
非特異的プロテアーゼと特異的プロテアーゼを順に使用したコーングルテンミールに対する酵素分解を実施し、次いで分離および精製を実施することによって得られる、請求項１に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤。
【請求項５】
非特異的プロテアーゼがパパイン、アルカリ性プロテアーゼ、中性プロテアーゼおよびブロメラインの１つまたは複数から選択され、特異的プロテアーゼがカルボキシペプチダーゼとフレーバーザイムの１つまたは２つから選択される、請求項４に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤。
【請求項６】
無血清細胞培養における請求項１から５のいずれか一項に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤の使用。
【請求項７】
細胞がＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＭＡＲＣ−１４５細胞、ハイブリドーマ細胞、およびＭＤＣＫ細胞の１つまたは複数から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
細胞増殖の促進、細胞生存率の改善および／または細胞産物の発現の増加における請求項１から５のいずれか一項に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤の使用。
【請求項９】
細胞がＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＭＡＲＣ−１４５細胞、ハイブリドーマ細胞、およびＭＤＣＫ細胞の１つまたは複数から選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
請求項１から５のいずれか一項に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤を含む無血清培養培地であって、トウモロコシ活性ペプチド添加剤が無血清培養培地において０．０１〜２０ｇ／Ｌの濃度を有する、無血清培養培地。
【請求項１１】
請求項１から５のいずれか一項に記載のトウモロコシ活性ペプチド添加剤を調製する方法であって、以下のステップ：
１）非特異的プロテアーゼを使用してコーングルテンミールに対する第１の酵素分解プロセスを実施して第１の酵素加水分解産物を得；次いで特異的プロテアーゼを使用して第１の酵素加水分解産物に対する第２の酵素分解プロセスを実施してトウモロコシタンパク質酵素加水分解産物を得るステップ；および
２）トウモロコシタンパク質酵素加水分解産物に遠心分離を実施し、次いで遠心分離上清にマイクロ濾過、カチオン交換、ナノ濾過および限外濾過を順に実施してトウモロコシ活性ペプチドを得るステップであって、ここで５０〜５００ｎｍの口径を有する濾過膜によりマイクロ濾過を実施し、１００〜３００ダルトンの分子量カットオフ値を有する濾過膜によりナノ濾過を実施し、５０００〜１３０００ダルトンの分子量カットオフ値を有する濾過膜により限外濾過を実施する、ステップ
を含む方法。
【請求項１２】
非特異的プロテアーゼが、０〜１０００単位のパパイン、５００〜２０００単位のアルカリ性プロテアーゼ、５００〜２０００単位の中性プロテアーゼおよび０〜１５００単位のブロメラインの２つ以上を含み、タンパク質１グラム当たり２０００〜６０００単位の酵素レベルを有し；特異的プロテアーゼが、５００〜２０００単位のカルボキシペプチダーゼと１０００〜２０００単位のフレーバーザイムの１つまたは２つを含み、タンパク質１グラム当たり２０００〜３０００単位の酵素レベルを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ１）が、コーングルテンミールと水を混合してタンパク質溶液を得、次いで非特異的プロテアーゼをタンパク質溶液に加えてタンパク質１グラム当たり２０００〜６０００単位の酵素レベルに到達させ、１．５〜４．５時間４０〜６０℃で第１の酵素分解プロセスを実施して第１の酵素加水分解産物を得るステップ；および次いで特異的プロテアーゼを第１の酵素加水分解産物に加えてタンパク質１グラム当たり２０００〜３０００単位の酵素レベルに到達させ、２〜３時間４０〜６０℃で第２の酵素分解プロセスを実施し、滅菌してトウモロコシタンパク質酵素加水分解産物を得るステップ、を具体的に含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ２）中のマイクロ濾過が、２００〜５００ｎｍの口径を有する濾過膜を使用して遠心分離上清に第１のマイクロ濾過を実施して第１のマイクロ濾過物を得、次いで５０〜２００ｎｍの口径を有する濾過膜を使用して第１のマイクロ濾過物に第２のマイクロ濾過を実施して第２のマイクロ濾過物を得るステップ、を具体的に含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ２）中のナノ濾過が、カチオン交換後に１００〜３００ダルトンの分子量カットオフ値を有するロール状膜を使用して５〜１０％のタンパク質含量まで遠心分離上清を濃縮し、次いで洗浄および濾過して、洗浄および濾過した遠心分離上清が５％以下の無機塩含量を有するようにするステップ；ならびに次いで２０〜４０％のタンパク質含量まで洗浄および濾過した遠心分離上清を濃縮するステップ、を具体的に含む、請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞培養培地添加剤、特に細胞培養培地用のトウモロコシ活性ペプチド添加剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
培養培地は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて培養細胞の増殖と代謝を決定する最も直接的で重要な環境因子である。動物細胞培養培地は、血清などの動物由来の添加剤を典型的に含有する。しかしながら、狂牛病の世界規模の爆発的な蔓延と共に、血清などの動物由来添加剤の使用は、生物薬品産業において伝達性海綿状脳症（ＴＳＥ）ウイルスおよび他の危険物質をもたらし、生物薬品産業のセキュリティーリスクが急激に増大する。世界中の薬剤規定は、医薬品製造中のウシ由来成分の使用を減らすことを薬剤メーカーに要求し、関連機関は医薬品分野におけるウシ血清などの動物由来成分の使用にますます反対している。培養培地の工業生産における動物由来成分の使用は、患者の医療上の安全性を確かにするため、アメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）および欧州医薬品庁（ＥＭＡ）により厳格に制御されている。一方、血清および他の動物由来培養培地添加剤は、増殖因子、輸送タンパク質、固定因子およびホルモンなどのマクロ分子タンパク質を含有し、これが抗体−医薬品およびワクチンなどの生物製剤の事後分離および精製に影響を与え、得られる製品の収率に最終的に影響を与え、生産コストが増大する。したがって、非動物由来細胞培養培地添加剤の開発および適用は現在の開発方向と一致し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの動物細胞培養および生物薬品分野における重要な主題となっている。
【０００３】
コーングルテンミールは、トウモロコシを湿式製粉して粗製スターチミルクを得、粗製スターチミルクからタンパク質を分離してグルテン水を得、次いでグルテン水を濃縮し乾燥させることにより得ることができる。コーングルテンミールは、スターチ生成のためのトウモロコシの湿式製粉プロセス中の主な副産物であり、それは６０％を超えるタンパク質、および無機塩、および様々なビタミンを含有する。トウモロコシ活性ペプチドは、予備処理、酵素加水分解、多段階分離および精製、濃縮および乾燥および他のプロセスにより、原材料としてコーングルテンミールから得た低分子ペプチドの混合物である。トウモロコシ活性ペプチドは、バイオプロセシングの分野では高機能の製品であり、天然トウモロコシタンパク質源の転換利用である。トウモロコシ活性ペプチドは植物タンパク質由来であり、したがって血清などの動物由来成分がウイルス微生物によって潜在的に汚染されているという問題を回避し得、その性質はバッチ間で一致しており、それは細胞産物の生産安定性を改善するのに有利である。トウモロコシ活性ペプチドはマクロ分子タンパク質を含有せず、これは細胞産物の下流分離および精製に有益である。
【０００４】
トウモロコシ活性ペプチドは栄養物質が豊富であり、処理および保存中に細菌微生物によって汚染され易く、したがって多量の細菌エンドトキシンをもたらす。細胞培養用の添加剤として使用した場合、それは、細胞形態を変え、細胞膜構造にダメージを与え、細胞アポトーシスなどを誘導し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される細胞の増殖に不利益である。さらに、プロセスの違いは得られるトウモロコシ活性ペプチド産物の組成に多大な影響を与えるが、一方、動物血清の成分は複合体であり、多くの成分は現在まで知られておらず、従って、１個または数個の成分の有無が細胞増殖に悪影響を与えるかどうか決定することはできない。これは、無血清培養培地添加剤としてのトウモロコシ活性ペプチドの適用に困難をもたらす。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明はトウモロコシ活性ペプチド添加剤およびその適用を提供し、トウモロコシ活性ペプチドはエンドトキシン含量が低く、細胞培養培地添加剤として使用した場合、それは様々な細胞系を無血清培養するための様々な基礎培養培地と混ぜ合わせることができ、したがって細胞増殖を促進し、細胞生存率を改善し、細胞産物の発現を高める。
【０００６】
本発明は、細胞培養培地用のトウモロコシ活性ペプチドの調製法も提供する。この方法は操作するのが容易で、高い酵素分解効率を有し、この方法は高分子タンパク質から低分子活性ペプチド、細菌エンドトキシンおよび低分子塩を効率よく分離することができ、したがって大規模な工業生産に適している。
【０００７】
本発明は、細胞培養培地用のトウモロコシ活性ペプチド添加剤であって、１０００ダルトン未満の分子量を有するオリゴペプチドが全タンパク質の９０重量％以上を占め、オリゴペプチドがＡＰ、ＳＡＰ、ＰＡＬ、ＶＮＡＰ、ＰＳＳＱ、およびＴＱＰＧＰＱの１つまたは複数を少なくとも含む、トウモロコシ活性ペプチド添加剤を提供する。
【０００８】
さらに、オリゴペプチドはＡＹ、ＮＡＰ、ＰＶＩＮ、およびＡＹＰＱの１つまたは複数も含む。
【０００９】
さらに、トウモロコシ活性ペプチド添加剤中のエンドトキシン含量は２００ＥＵ／ｇ未満、特に５０ＥＵ／ｇ未満である。
【００１０】
本発明によるトウモロコシ活性ペプチド添加剤は、非特異的プロテアーゼと特異的プロテアーゼを順に使用したコーングルテンミールに対する酵素分解を実施し、次いで分離および精製を実施することによって得られる。
【００１１】
本発明における非特異的プロテアーゼは、作用する基質に対して低い特異性を有するプロテアーゼ、ならびに様々なタンパク質分子のペプチド鎖を加水分解してポリペプチドまたはアミノ酸を得ることができるアルカリ性プロテアーゼ、および様々なタンパク質、ペプチド、エステル、アミドなどを分解することができるブロメラインなどの広範囲の基質特異性を有するプロテアーゼを指す。本発明における特異的プロテアーゼは、比較的厳密な基質特異性を有し、カルボキシル含有末端アミノ酸のカルボキシペプチダーゼ触媒加水分解により形成されるペプチド結合などの、タンパク質分子内の幾つかの特定ペプチド結合のみに作用するプロテアーゼを指す。
【００１２】
本発明の具体的実施形態では、非特異的プロテアーゼはパパイン、アルカリ性プロテアーゼ、中性プロテアーゼおよびブロメラインの１つまたは複数から選択され、特異的プロテアーゼはカルボキシペプチダーゼとフレーバーザイムの１つまたは２つから選択され、具体的には、非特異的プロテアーゼはパパイン、アルカリ性プロテアーゼ、中性プロテアーゼおよびブロメラインの２つ以上から選択される。本発明では、特異的プロテアーゼを最初に使用してコーングルテンミールに対する酵素分解を実施し、次いで非特異的プロテアーゼを使用してさらなる酵素分解を実施して加水分解産物を得る。これら２種類のプロテアーゼを一緒に使用すると、高い酵素分解効率に到達することができ、酵素加水分解産物における活性ペプチド、具体的には低分子量活性ペプチドの含量を高レベルに到達させることが可能である。
【００１３】
さらに、非特異的プロテアーゼは、０〜１０００単位のパパイン、５００〜２０００単位のアルカリ性プロテアーゼ、５００〜２０００単位の中性プロテアーゼおよび０〜１５００単位のブロメラインの２つ以上を含めてタンパク質１グラム当たり２０００〜６０００単位の酵素レベルを有し、特異的プロテアーゼは、５００〜２０００単位のカルボキシペプチダーゼと１０００〜２０００単位のフレーバーザイムの１つまたは２つを含めてタンパク質１グラム当たり２０００〜３０００単位の酵素レベルを有する。本発明では、各プロテアーゼの酵素活性単位は以下のように定義する。実験条件下で、カゼインの加水分解により１分間当たり１ｇのチロシンを生成するのに使用する酵素レベルを１酵素活性単位として定義し、タンパク質１グラム中のタンパク質はコーングルテンミール中のタンパク質を具体的に指し、すなわち、各プロテアーゼの添加単位はコーングルテンミール中に含有される１グラムのタンパク質に相当する。
【００１４】
本発明で提供する非特異的プロテアーゼと特異的プロテアーゼを使用したコーングルテンミールに対する酵素分解の実施により、１０００ダルトン未満の分子量を有する様々なオリゴペプチドを生成することができる。当業者は、例えば遠心分離、マイクロ濾過、限外濾過などの、従来技術における従来手段を使用して、生成した酵素加水分解産物からオリゴペプチドを分離し精製することができる。本発明の具体的実施形態では、分離および精製は遠心分離、マイクロ濾過、カチオン交換、ナノ濾過および限外濾過の１つまたは複数を含み、特に本発明における分離および精製は具体的には以下のようなものである。酵素加水分解産物に遠心分離、マイクロ濾過、カチオン交換、ナノ濾過および限外濾過を順に実施し、５０〜５００ｎｍの口径を有する濾過膜によりマイクロ濾過を実施し、１００〜３００ダルトンの分子量カットオフ値を有する濾過膜によりナノ濾過を実施し、５０００〜１３０００ダルトンの分子量カットオフ値を有する濾過膜により限外濾過を実施する。
【００１５】
本発明は、無血清細胞培養培地における前述のトウモロコシ活性ペプチド添加剤の使用も提供する。
【００１６】
さらに、細胞はＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＭＡＲＣ−１４５細胞、ハイブリドーマ細胞、およびＭＤＣＫ細胞の１つまたは複数から選択される。
【００１７】
本発明は、細胞増殖の促進、細胞生存率の改善および／または細胞産物の発現の増加における、前述のトウモロコシ活性ペプチド添加剤の使用も提供する。
【００１８】
さらに、細胞はＣＨＯ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞、ＢＨＫ−２１細胞、ＭＡＲＣ−１４５細胞、ハイブリドーマ細胞、およびＭＤＣＫ細胞の１つまたは複数から選択される。
【００１９】
本発明は、前述のトウモロコシ活性ペプチド添加剤のいずれか１つを含む無血清培養培地であって、無血清培養培地中のトウモロコシ活性ペプチド添加剤の濃度が０．０１〜２０ｇ／Ｌ、例えば１〜１０ｇ／Ｌ、さらには２〜４ｇ／Ｌである無血清培養培地も提供する。
【００２０】
本発明は、前述のトウモロコシ活性ペプチド添加剤のいずれか１つを調製する方法であって、以下のステップ：
【００２１】
１）非特異的プロテアーゼを使用してコーングルテンミールに対する第１の酵素分解プロセスを実施して第１の酵素加水分解産物を得、次いで特異的プロテアーゼを使用して第１の酵素加水分解産物に対する第２の酵素分解プロセスを実施してトウモロコシタンパク質酵素加水分解産物を得るステップ、および
【００２２】
２）トウモロコシタンパク質酵素加水分解産物に遠心分離を実施し、次いで遠心分離上清にマイクロ濾過、カチオン交換、ナノ濾過および限外濾過を順に実施してトウモロコシ活性ペプチドを得るステップであって、５０〜５００ｎｍの口径を有する濾過膜によりマイクロ濾過を実施し、１００〜３００ダルトンの分子量カットオフ値を有する濾過膜によりナノ濾過を実施し、５０００〜１３０００ダルトンの分子量カットオフ値を有する濾過膜により限外濾過を実施するステップ
を含む方法も提供する。
【００２３】
本発明の調製法によれば、非特異的プロテアーゼは、０〜１０００単位のパパイン、５００〜２０００単位のアルカリ性プロテアーゼ、５００〜２０００単位の中性プロテアーゼおよび０〜１５００単位のブロメラインの２つ以上を含めてタンパク質１グラム当たり２０００〜６０００単位の酵素レベルを有し、特異的プロテアーゼは、５００〜２０００単位のカルボキシペプチダーゼと１０００〜２０００単位のフレーバーザイムの１つまたは２つを含めてタンパク質１グラム当たり２０００〜３０００単位の酵素レベルを有する。当業者は、使用する酵素の組成に応じて、第１の酵素分解プロセスと第２の酵素分解プロセスの酵素分解温度およびｐＨ値などの条件を調節することができる。
【００２４】
さらに、ステップ１）は、コーングルテンミールと水を混合してタンパク質溶液を得、次いで非特異的プロテアーゼをタンパク質溶液に加えてタンパク質１グラム当たり２０００〜６０００単位の酵素レベルに到達させ、１．５〜４．５時間４０〜６０℃で第１の酵素分解プロセスを実施して第１の酵素加水分解産物を得るステップ、および次いで特異的プロテアーゼを第１の酵素加水分解産物に加えてタンパク質１グラム当たり２０００〜３０００単位の酵素レベルに到達させ、２〜３時間４０〜６０℃で第２の酵素分解プロセスを実施し、次いで酵素を不活性化してトウモロコシタンパク質酵素加水分解産物を得るステップを具体的に含む。酵素の不活性化は、以下のようにして具体的に実施することができる：第２の酵素分解プロセスにより処理した酵素加水分解産物を８５〜１３０℃に加熱し、次いでこの温度に１０〜２０分間保つ。
【００２５】
さらに、第１の酵素分解プロセスを実施する前に、方法は、タンパク質溶液を９０〜９５℃に加熱し、この温度に１５〜６０分間保ちタンパク質溶液中のタンパク質を変性させるステップをさらに含み、これは以下の酵素分解プロセスに有益である。
【００２６】
本発明の調製法によれば、ステップ２）における遠心分離は４０００〜１２０００ｒ／分の回転スピードであり、ディスク型セパレーターによって実施することができる。
【００２７】
本発明の調製法によれば、ステップ２）中のマイクロ濾過は、２００〜５００ｎｍの口径を有する濾過膜を使用して遠心分離上清に第１のマイクロ濾過を実施して第１のマイクロ濾過物を得、次いで５０〜２００ｎｍの口径を有する濾過膜を使用して第１のマイクロ濾過物に第２のマイクロ濾過を実施して第２のマイクロ濾過物を得るステップを具体的に含む。
【００２８】
さらに、第１のマイクロ濾過と第２のマイクロ濾過で使用する濾過膜はセラミック膜であり、操作圧（膜透過圧）は１０〜３０ｐｓｉであり、第１のマイクロ濾過物と第２のマイクロ濾過物中のタンパク質含量は１〜５％であり、本発明中で言及するタンパク質含量は質量含量である。タンパク質含量が少なすぎる場合、マイクロ濾過時間は増大し生成効率は低減し、タンパク質含量が多すぎる場合は、濾過膜の濾過負荷量は増大し濾過膜の耐用年数は低減する。研究後、本発明者は、１〜５％のタンパク質含量が適していることを発見した。さらに本発明中では、濾過はセラミック膜による２ステップ濾過、すなわち順に一次濾過とインデプス濾過であり、一次濾過は、遠心分離により除去されない大分子量を有する可溶性タンパク質を除去するのに使用し、インデプス濾過は主に、不純タンパク質などを除去するためのさらなる精製用である。２ステップ濾過は濾過効率を改善することができるだけでなく、より良い濾過効果も有する。
【００２９】
本発明の調製法によれば、ステップ２）中のカチオン交換は、カチオン交換樹脂をクロマトグラフィーカラムに充填し、カラム体積の３〜５倍の蒸留水で樹脂を洗浄し、次いで０．５〜３ｃｍ／分のリニアフローでクロマトグラフィーカラムに濾過物を導入し、カラム体積の２〜５倍の蒸留水で濾過物を洗浄し、次いで１〜５ｃｍ／分のリニアフローで１ＭのＮａＣｌ溶液を使用した溶出を実施し、溶出物を回収して精製液を得るステップを具体的に含むことができる。カチオン交換樹脂が、Ｄ００１カチオン交換樹脂などの水素カチオン交換樹脂であってよい場合、本発明の具体的実施形態では、Ｄ００１−ＦＤカチオン交換樹脂を採択する。本発明では、前述の濾過物をイオン交換によってさらに分離および精製し、これによって弱電流、反対電荷を有する他の不純物、および電気的に中性な物質（スターチなど）から濾過物中の活性ペプチドをさらに効率よく分離して、活性ペプチド産物の純度および性質をさらに保証することができる。
【００３０】
本発明の調製法によれば、ステップ２）中のナノ濾過は、カチオン交換後に１００〜３００ダルトンの分子量カットオフ値を有するロール状膜を使用して５〜１０％のタンパク質含量まで遠心分離上清を濃縮し、次いで洗浄および濾過して、洗浄および濾過した遠心分離上清が５％以下の無機塩含量を有するようにするステップ、ならびに次いで２０〜４０％のタンパク質含量まで洗浄および濾過した遠心分離上清を濃縮するステップを具体的に含む。本発明者は、ナノ濾過を直接実施したときこの効果が乏しいことを発見しており、これは活性ペプチド分子によって遮断されやすいナノ濾過膜の小さな口径に原因がある可能性がある。したがって、ナノ濾過を実施する際には、本発明者により洗浄および濾過のステップが加えられ、研究後、本発明者は、洗浄および濾過前に溶液中のタンパク質含量を５〜１０％に調節したとき、より良いナノ濾過効果を得ることができることを発見した。
【００３１】
本発明の調製法によれば、５０００〜１３０００ダルトンの分子量カットオフ値を有するロール状膜によってステップ２）中の限外濾過を実施して処理溶液中のエンドトキシンをさらに除去し、ここで操作圧は１０〜３０ｐｓｉである。
【００３２】
さらに調製法は、限外濾過の実施後に乾燥させて１．５〜５％の含水率を有するトウモロコシ活性ペプチドを得るステップをさらに含む。
【００３３】
本発明の技術的解決策は以下の利点を少なくとも有する：
【００３４】
１．本発明のトウモロコシ活性ペプチドは、多量のオリゴペプチド含量および少ないエンドトキシン含量を有し、細胞培養培地添加剤として使用するとき、それは他の血清を加えずに様々な基礎培養培地と柔軟に混ぜ合わせることができ、すなわちそれは様々な動物細胞の無血清培養に使用することができる。
【００３５】
２．本発明の調製法は操作するのが容易で、高い酵素分解効率を有し、酵素加水分解産物中の低分子活性ペプチドの含量が高く、さらに調製法は大分子タンパク質、細菌エンドトキシンおよび低分子塩から低分子活性ペプチドを効率よく分離することができ、したがって大規模な工業生産に適している。
【００３６】
３．本発明の無血清培養培地は製剤化するのに都合がよく、低コストであり、様々な細胞系を培養するのに使用することができ、さらに細胞増殖を促進し、細胞生存率を改善し、細胞産物の発現を高めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施形態１に記載のトウモロコシ活性ペプチドの高速液体クロマトグラフィーの図である。
【図２】実験実施形態１で培養したＣＨＯ細胞の細胞密度の図である。
【図３】実験実施形態１で培養したＣＨＯ細胞の抗体発現量の図である。
【図４】実験実施形態２で培養したＣＨＯ細胞の細胞生存率の図である。
【図５】実験実施形態３で培養したＶｅｒｏ細胞の細胞密度の図である。
【図６】実験実施形態４で培養したハイブリドーマ細胞の抗体発現量の図である。
【図７】実験実施形態５で培養したＨＥＫ−２９３細胞の細胞生存率の図である。
【図８】実験実施形態６で培養したＢＨＫ−２１細胞の細胞密度の図である。
【図９】実験実施形態７で培養したＭＡＲＣ−１４５細胞の細胞密度の図である。
【図１０】実験実施形態８で培養したＭＤＣＫ細胞の細胞生存率の図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明の目的、技術的解決策および利点をより明らかにするため、添付の図面と共に本発明を明確かつ完全に記載する。記載する実施形態は、全ての実施形態がそうであるわけではないが、本発明の実施形態の一部であることは明らかである。本発明の実施形態に基づくと、創造的作業なしで当業者により得られる他の全ての実施形態は、本発明の保護範囲に属する。
【００３９】
実施形態１
１．酵素分解プロセス
１２倍の脱イオン水を６０％以上のタンパク質含量を有するコーングルテンミールに加え、それらを均一に混合し、次いで約９０℃まで加熱し、１５〜２０分間その温度を保ち、次いで約５５℃まで温度を低下させてタンパク質溶液を得、タンパク質溶液のｐＨ値を７〜８に調節し、中性プロテイナーゼＮＥＵＴＲＡＳＥ  Ｏ．Ｄ．Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  ｃｏｍｐａｎｙ）とアルカリ性プロテアーゼＡＬＫＡＬＩＮＥ  ＰＲＯＴＥＡＳＥ  ＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＥ（ＤＳＭ  ｃｏｍｐａｎｙ）の混合によって得た化合物非特異的プロテアーゼを、タンパク質１グラム当たり約４０００単位の酵素レベルでタンパク質溶液に加え（中性プロテイナーゼＮＥＵＴＲＡＳＥ  Ｏ．Ｄ．Ｌとアルカリ性プロテアーゼＡＬＫＡＬＩＮＥ  ＰＲＯＴＥＡＳＥ  ＣＯＮＣＥＮＴＲＡＴＥの両方が約２０００単位の酵素レベルを有する）、温度を約５５℃に保ちながら第１の酵素分解プロセスを２．５時間実施して第１の酵素加水分解産物を得、第１の酵素加水分解産物のｐＨ値を７．５〜８．５に調節し、次いでカルボキシペプチダーゼＡＣＣＥＬＥＲＺＹＭＥ  ＣＰＧ（ＤＳＭ  ｃｏｍｐａｎｙ）をタンパク質１グラム当たり約２０００単位の酵素レベルで第１の酵素加水分解産物に加え、温度を約５０℃に保ちながら第２の酵素分解プロセスを２．５時間実施し、次いで生成した酵素加水分解産物を１１０〜１２０℃まで加熱し、酵素失活のため１５〜２０分間その温度を保ちトウモロコシタンパク質酵素加水分解産物を得る。
【００４０】
２．マイクロ濾過
トウモロコシタンパク質酵素加水分解産物をディスク型セパレーターに置き、４０００〜１２０００ｒ／分の回転速度で遠心分離を実施して、その残りかすからトウモロコシタンパク質酵素加水分解産物の液体を分離し、次いでさらなる使用のため遠心分離上清を得る。
【００４１】
２００〜５００ｎｍの口径を有するセラミック膜を使用し、遠心分離上清に第１のマイクロ濾過（一次濾過）を実施して第１のマイクロ濾過物溶液を得、ここで第１のマイクロ濾過の時間は１〜３時間に調節し、操作圧は１０〜３０ｐｓｉに調節する。
【００４２】
５０〜２００ｎｍの口径を有するセラミック膜を使用し、第１のマイクロ濾過物溶液に第２のマイクロ濾過（インデプス濾過）を実施して第２のマイクロ濾過物溶液を得、ここで第２のマイクロ濾過の時間は１〜３時間に調節し、操作圧は１０〜３０ｐｓｉに調節する。
【００４３】
３．カチオン交換
食品産業用カチオン交換樹脂Ｄ００１−ＦＤをクロマトグラフィーカラムに充填し、カラム体積の３〜５倍の蒸留水で樹脂を洗浄し、次いで０．５〜３ｃｍ／分のリニアフローでクロマトグラフィーカラムに第２のマイクロ濾過物溶液を導入し、第２のマイクロ濾過物溶液の注入体積をクロマトグラフィーカラム体積の２０〜１００％に調節し、それをカラム体積の２〜５倍の蒸留水で洗浄し、次いで１〜５ｃｍ／分のリニアフローで１ＭのＮａＣｌ溶液を使用した溶出を実施し、溶出物を回収して精製液を得る。
【００４４】
４．ナノ濾過および限外濾過
１００〜３００ダルトンの分子量カットオフ値を有するロール状膜を使用して５〜１０％のタンパク質含量まで精製液を濃縮し、次いで蒸留水を加え、洗浄および濾過を実施して一次体積の３〜５倍に到達させ、洗浄および濾過した精製液中の無機塩含量が５％未満となるようにし、次いで２０〜４０％のタンパク質含量まで濃縮をさらに実施し、濃縮溶液を回収する。
【００４５】
５０００〜１３０００ダルトンの分子量カットオフ値を有するロール状膜を使用し濃縮溶液に限外濾過を実施し、濃縮溶液中のエンドトキシンを除去し、５０ＥＵ／ｇ未満のエンドトキシン含量を有するトウモロコシ活性ペプチド溶液を得る。
【００４６】
５．乾燥処理
トウモロコシ活性ペプチド溶液に噴霧乾燥を実施して、１．５％〜５％の含水率を有する薄黄色のトウモロコシ活性ペプチド粉末を得、ここで噴霧乾燥精製エアーの入口温度と出口温度は、それぞれ１２０〜１８０℃と６５〜９０℃に調節する。
【００４７】
６．検出
従来の方法を使用して、得られたトウモロコシ活性ペプチドにおける各成分の物理化学的基本組成および分子量分布に関する分析を実施する。結果はそれぞれ表１および表２中に示す。
【００４８】
ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−２０Ａ高速液体クロマトグラフィー、ＳＨＩＭＡＤＺＵ、日本企業）を使用して得られたトウモロコシ活性ペプチドを分離し、Ｑ−ＴＯＦ２質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、英国企業）を使用して主要成分に関する一次構造の確認を実施する。具体的には、以下の通りである：
【００４９】
前で得たトウモロコシ活性ペプチドサンプル１ｇをとり、移動相Ａを１００ｍｌに希釈し、１０分間超音波振動処理を実施し、サンプルを溶かし充分混合し、次いで溶解および混合したサンプルを０．１ｍｇ／ｍｌの濃度でトウモロコシ活性ペプチド溶液に調合し、次いで０．２μｍの口径を有するポリテトラフルオロエチレン膜を使用した濾過後に溶液を注入し、ここでクロマトグラフィー条件は以下の通りである。移動相ＡはＶ（水）：Ｖ（トリフルオロ酢酸）＝１００：０．１ｍｌ／分であり、移動相ＢはＶ（アセトニトリル）：Ｖ（水）：Ｖ（トリフルオロ酢酸）＝８０：２０：０．１であり、検出波長：ＵＶ２２０ｎｍ、流速：０．６ｍＬ／分、カラム温度：３２℃、注入体積：５０μｌ。図１は得られたトウモロコシ活性ペプチドの高速液体クロマトグラムを示す。
【００５０】
ピークに相当する異なる成分を異なるチューブに回収し（図１中のシリアルナンバー１〜１２でピークに相当する成分を少なくとも回収し）、窒素ガス送風機を使用して有機溶媒を除去し、凍結乾燥を実施して粉末を得、次いで質量分析検出を実施し、ここでクロマトグラフィー条件は以下の通りである。イオン化法：ナノエレクトロスプレーポジティブイオン、霧状ガス：Ｎ２、衝突ガス：Ａｒ、ソース温度：８０℃、コーン電圧：５０Ｖ、ＴＯＦ加速電圧：９．１ｋＶ、ＭＣＰ検出器電圧：２１５０Ｖ、キャピラリー電圧：８００Ｖ、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳの質量精度：０．１ダルトン。一次ＭＳスキャニングによってＥＳＩ−ＭＳクロマトグラムを得た後、ＥＳＩ−ＭＳクロマトグラムから検出したイオンを選択し、次いでＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析し、質量分析計のＭａｘＥｎｔ３によりクロマトグラムを変換した後、ペプチド配列決定によりペプチド断片の配列を推測する。トウモロコシ活性ペプチドの主要成分の一次構造は表３中に示す通りである。
【００５１】
表１および表２の結果から見ることができるように、本発明の実施形態で得たトウモロコシ活性ペプチドにおける全体タンパク質含量は最大９１％以上であってよく、ここで１０００ダルトン以下の分子量を有するオリゴペプチドが全タンパク質の９８重量％以上を占める。表３の結果から見ることができるように、トウモロコシ活性ペプチドの主要成分には、ＡＰ、ＳＡＰ、ＰＡＬ、ＶＮＡＰ、ＰＳＳＱ、ＡＹ、ＮＡＰなどがあり、トウモロコシ活性ペプチドから初めて同定したペプチドには、ＡＰ（１８６．２１ダルトンの分子量）、ＳＡＰ（２７３．２９ダルトンの分子量）、ＰＡＬ（２９９．３７ダルトンの分子量）、ＶＮＡＰ（３９９．４５ダルトンの分子量）、ＰＳＳＱ（４１７．１９ダルトンの分子量）、ＴＱＰＧＰＱ（６２６．２７ダルトンの分子量）がある。
【００５２】
実施形態２
この実施形態は、実施形態１中に記載したのと同様に実施する。ただし、９倍の蒸留水を６０％以上のタンパク質含量を有するコーングルテンミールに加え、それらを均一に混合し、次いで９０〜９５℃まで加熱し、５５〜６０分間その温度を保ち、次いで５５〜５５℃まで温度を低下させ、タンパク質溶液のｐＨ値を７〜８に調節し、パパイン（Ｎａｎｎｉｎｇ  Ｐａｎｇｂｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）とブロメライン（Ｎａｎｎｉｎｇ  Ｐａｎｇｂｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）の混合によって得た化合物非特異的プロテアーゼを、タンパク質１グラム当たり約２５００単位の酵素レベルでタンパク質溶液に加え（この場合パパインとブロメラインは、それぞれ約１０００単位と約１５００単位の酵素レベルを有する）、温度を５０〜５５℃に保ちながら第１の酵素分解プロセスを１．５時間実施して第１の酵素加水分解産物を得、第１の酵素加水分解産物のｐＨ値を８〜９に調節し、次いでカルボキシペプチダーゼＶａｌｉｄａｓｅ  ＥＰ  Ｃｏｎｃ．（ＤＳＭ  Ｃｏｍｐａｎｙ）とフレーバーザイムＦＬＡＶＯＵＲＺＹＭＥ  ５００ＭＧ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）の混合によって得た化合物特異的プロテアーゼを、タンパク質１グラム当たり約３０００単位の酵素レベルで第１の酵素加水分解産物に加え（カルボキシペプチダーゼＡＣＣＥＬＥＲＺＹＭＥ  ＣＰＧとフレーバーザイムＦＬＡＶＯＵＲＺＹＭＥ  ５００ＭＧの両方が約１５００単位の酵素レベルを有する）、温度を５０〜５５℃に保ちながら第２の酵素分解プロセスを３時間実施し、次いで酵素加水分解産物を９０〜１００℃まで加熱し、酵素失活のため１５〜２０分間その温度を保ちトウモロコシタンパク質酵素加水分解産物を得る。最後に得る薄黄色のトウモロコシ活性ペプチド粉末は１．５％〜５％の含水率を有する。
【００５３】
検出によって、本発明の実施形態で得たトウモロコシ活性ペプチドでは、１０００ダルトン未満の分子量を有するオリゴペプチドが全タンパク質の９５重量％以上を占め、エンドトキシン含量は５０ＥＵ／ｇ未満である。トウモロコシ活性ペプチドは、表３中に示すその一次構造を有する１８種のポリペプチドを含有する。トウモロコシ活性ペプチドの各成分の物理化学的基本組成および分子量分布は表１および表２中に示す。
【００５４】
実施形態３
この実施形態は、実施形態１中に記載したのと同様に実施する。ただし、１０倍の蒸留水を６０％以上のタンパク質含量を有するコーングルテンミールに加え、それらを均一に混合し、次いでそれらを９５℃まで加熱し、３５〜４０分間その温度を保ち、次いで４５〜５０℃まで温度を低下させ、タンパク質溶液のｐＨ値を７〜８に調節し、中性プロテアーゼＶａｌｉｄａｓｅ  ＢＮＰ−Ｌ（ＤＳＭ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、アルカリ性プロテアーゼＡｌｃａｌａｓｅ  ２．４Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、パパイン（Ｎａｎｎｉｎｇ  Ｐａｎｇｂｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）およびブロメライン（Ｎａｎｎｉｎｇ  Ｐａｎｇｂｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）の混合によって得た化合物非特異的プロテアーゼを、タンパク質１グラム当たり約６０００単位の酵素レベルでタンパク質溶液に加え（中性プロテアーゼＶａｌｉｄａｓｅ  ＢＮＰ−Ｌ、アルカリ性プロテアーゼＡｌｃａｌａｓｅ  ２．４Ｌ、パパインおよびブロメラインは、それぞれ約２０００単位、約２０００単位、約１０００単位および約１０００単位の酵素レベルを有する）、温度を４５〜５０℃に保ちながら第１の酵素分解プロセスを３時間実施して第１の酵素加水分解産物を得、第１の酵素加水分解産物のｐＨ値を約５．５に調節し、次いでフレーバーザイムＭＡＸＺＰＲＯ  ＸＦ（ＤＳＭ  Ｃｏｍｐａｎｙ）をタンパク質１グラム当たり約２０００単位酵素の量で第１の酵素加水分解産物に加え、温度を約５５℃に保ちながら第２の酵素分解プロセスを約２．５時間実施し、次いで酵素加水分解産物を１２０〜１３０℃まで加熱し、酵素失活のため１０〜１５分間その温度を保ちトウモロコシタンパク質酵素加水分解産物を得る。最後に得る薄黄色のトウモロコシ活性ペプチド粉末は１．５％〜５％の含水率を有する。
【００５５】
検出によって、本発明の実施形態で得たトウモロコシ活性ペプチドでは、１０００ダルトン未満の分子量を有するオリゴペプチドが全タンパク質の９８重量％以上を占め、エンドトキシン含量は５０ＥＵ／ｇ未満である。トウモロコシ活性ペプチドは、表３中に示すその一次構造を有する１８種のポリペプチドを含有する。得られたトウモロコシ活性ペプチドにおける各成分の物理化学的基本組成および分子量分布は表１および表２中に示す。
【００５６】
【表１】
2015536660.tif 000003
【００５７】
【表２】
2015536660.tif 000004
【００５８】
【表３】
2015536660.tif 000005
【００５９】
比較実施形態１
比較実施形態１として中国特許出願Ｎｏ．２００８１００８４９９２．５中に開示された方法により得たトウモロコシオリゴペプチド粉末を採用し、この方法は以下のことを具体的に含む：
【００６０】
２．５ｋｇの水と１５０ｇのトウモロコシタンパク質粉末をスラリーに混合し、ｐＨ値を８に調節し、６０℃に加熱し、６０分間この温度で水浴において攪拌を実施し、スラリーを遠心分離し上清を捨て、２．５ｋｇの水を加えることにより生成したスラグを希釈し、６０℃に加熱し、６０分間この温度で水浴において攪拌を実施し、遠心分離を実施し上清を捨て、スラリー処理のため２ｋｇの水を加え、ｐＨ値を８に調節し、次いで６０℃に加熱し、１ｇのアルカリ性プロテアーゼを３時間の酵素分解用に加え、ｐＨ値は再度７に調節し、４５℃に温度を低下させ、次いで１ｇの中性プロテアーゼを５時間の酵素分解用に加え、高温での酵素失活後に遠心分離を実施し、セラミック膜とロール状ナノ濾過膜を使用し生成した上清を濾過し、濃縮を実施し、乾燥させてトウモロコシオリゴペプチド粉末を得る。検出により、トウモロコシオリゴペプチド粉末における１０００ダルトン未満の分子量を有するオリゴペプチドの含量は８０％であり、エンドトキシン含量は２０００ＥＵ／ｇを超える。
【００６１】
実験実施形態１
１．無血清培養培地の調製
実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびＭＥＷＭ／Ｆ１２（体積比＝１：１）培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の４倍の濃度をそれぞれ有するペプチド溶液とＭＥＷＭ／Ｆ１２培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地溶液と混合し、最終体積の９５％まで超純水を加え、ｐＨ値を７．２〜７．３に調節し、最終体積まで希釈し、０．２２μｂの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチドはそれぞれ、細胞密度検出に使用するとき、その各無血清培養培地において０．５ｇ／Ｌの濃度を有し、抗体発現量検出に使用するときはそれぞれ６ｇ／Ｌまたは１０ｇ／Ｌの濃度を有する。それらは実験群１〜３および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群としてトウモロコシ活性ペプチドを加えないＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地を採用する。
【００６２】
２．細胞培養
前述の実験群１〜３、比較群およびブランク群それぞれの培養培地を２Ｌのバイオリアクターに加え、９５％を超える活性があるＣＨＯ細胞を懸濁培養用にバイオリアクターに接種し、ここで培養条件は３７℃、および５％二酸化炭素であり、タイミングサンプリングを行い、フローサイトメトリーおよび逆相高速液体クロマトグラフィーを使用して、細胞密度および抗体発現量に関する検出を実施する。結果は図２および図３中に示す。
【００６３】
図２中に示すように、トウモロコシ活性ペプチドとトウモロコシオリゴペプチドを培養期間中の第２日に０．５ｇ／Ｌの量で加えると、実験群１〜３の培養培地における細胞密度は、それぞれブランク群の培養培地における細胞密度の１３５％、１３３％、および１３５％であり、培養期間中の第２日と第５日では、比較群における細胞密度はそれぞれブランク群の培養培地における細胞密度の１２０％および９６％である。図３中に示すように、トウモロコシ活性ペプチドとトウモロコシオリゴペプチドを６日間の培養後、つまり第６日に６ｇ／Ｌの量で加えると、実験群１〜３の培養培地における細胞抗体発現量は、それぞれブランク群の培養培地における細胞抗体発現量の１５４％、１５６％および１５４％であり、トウモロコシ活性ペプチドとトウモロコシオリゴペプチドを１０ｇ／Ｌの量で加えると、実験群１〜３の培養培地における細胞抗体発現量は、それぞれブランク群の細胞抗体発現量の１４６％、１５１％および１４４％であり、一方比較群の培養培地における細胞抗体発現量は、６ｇ／Ｌと１０ｇ／Ｌの場合、それぞれブランク群におけるそれの１３１％および１１３％である。細胞培養培地の添加剤として実施形態１〜３により得たトウモロコシ活性ペプチドを使用すると細胞は非常に増殖し、トウモロコシ活性ペプチドはＣＨＯ細胞に総合的な栄養を与えることができ、ペプチドの一部は細胞増殖と代謝の機能因子として与えることもでき、それは細胞増殖の促進および細胞産物の発現の増加に有益であり、さらに、トウモロコシ活性ペプチドの効果はその濃度と関連する可能性があり、０．５ｇ／Ｌは細胞増殖に一層適しており、６ｇ／Ｌ〜１０ｇ／Ｌの範囲の濃度は抗体発現量を有意に改善し得ることを見ることができる。本発明は、トウモロコシタンパク質の酵素加水分解産物を使用し、血清使用時のコストよりはるかに低いコストを有する細胞培養培地添加剤を生成し、このような培養培地添加剤は植物に由来し、したがって高い安全性がある。
【００６４】
実験実施形態２
１．無血清培養培地の調製
実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびＩＭＤＭ培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の４倍の濃度をそれぞれ有するペプチド溶液とＩＭＤＭ培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれＩＭＤＭ培養培地溶液と混合し、最終体積の９５％まで超純水を加え、ｐＨ値を７．２〜７．３に調節し、最終体積まで希釈し、０．２２μｍの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチドはそれぞれその各無血清培養培地において４ｇ／Ｌの濃度を有し、それらは実験群１〜３および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群としてトウモロコシ活性ペプチドを加えないＩＭＤＭ培養培地を採用する。
【００６５】
２．細胞培養
前述の実験群１〜３、比較群およびブランク群それぞれの培養培地を振とうフラスコに加え、増殖状態が良いＣＨＯ細胞を培養用に振とうフラスコに接種し、ここで培養条件は３７℃、および５％二酸化炭素であり、振とうフラスコのスピードは１００ｒｐｍであり、タイミングサンプリングを行い、フローサイトメトリー、ＡＯ／ＰＩ染色を使用して、細胞生存率に関する検出を実施する。結果は図４中に示す。
【００６６】
図４中に示すように、比較群およびブランク群に対して、実験群１〜３の培養培地は、同じ培養時間内、特に培養期間中の第１０日でより高い細胞生存率を得ることができ、実験群１〜３における細胞生存率はそれぞれ８１％、８０％および７９％であり、比較群における細胞生存率は６５％であり、ブランク群の細胞生存率は著しく低下し、わずか４３％である。本発明の実施形態１〜３により得たトウモロコシ活性ペプチドはＣＨＯ細胞に総合的な栄養を与えることができ、血清の欠如が原因である時期尚早な細胞死および不飽和の細胞形態などの問題をある程度解決し、したがって細胞生存率の改善および細胞産物の発現の増加に有益であることを見ることができる。
【００６７】
実験実施形態３
１．無血清培養培地の調製
実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびＤＭＥＭ（高グルコース）培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の４倍の濃度をそれぞれ有するペプチド溶液とＤＭＥＭ培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれＤＭＥＭ（高グルコース）培養培地溶液と混合し、最終体積の９５％まで超純水を加え、ｐＨ値を７．２〜７．３に調節し、最終体積まで希釈し、０．２２μｍの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチドはそれぞれその各無血清培養培地において２ｇ／Ｌの濃度を有し、それらは実験群１〜３および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群としてトウモロコシ活性ペプチドを加えないＤＭＥＭ（高グルコース）培養培地を採用する。
【００６８】
２．細胞培養
前述の実験群１〜３、比較群およびブランク群それぞれの培養培地を細胞培養プレートに加え、９５％を超える活性があるアフリカミドリザル腎臓（Ｖｅｒｏ）細胞を培養用に細胞培養プレートに接種し、ここで培養条件は３７℃、および５％二酸化炭素であり、ＭＴＴを使用して細胞密度に関する検出を実施する。結果は図５中に示す。
【００６９】
図５中に示すように、実験群１〜３のＶｅｒｏ細胞には急速な増殖および活発な代謝があり、実験群１〜３の細胞密度はそれぞれブランク群の細胞密度の１２０．９％、１２１．８％および１２２．３％であり、比較群のＶｅｒｏ細胞の密度はブランク群の細胞密度のわずか１０６．３％であり、これは、Ｖｅｒｏ細胞を培養するため本発明のトウモロコシ活性ペプチド添加剤を含む培養培地を使用することにより、同じ培養時間内でより高い細胞密度が得られることを示す。
【００７０】
実験実施形態４
実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびＭＥＷＭ／Ｆ１２（体積比＝１：１）培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の４倍の濃度をそれぞれ有するペプチド溶液とＭＥＷＭ／Ｆ１２培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地溶液と混合し、ビタミン、脂肪酸および微量元素を適量加え、次いで最終体積の９５％まで超純水を加え、ｐＨ値を７．２〜７．３に調節し、最終体積まで希釈し、０．２２μｍの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで、その各無血清培養培地における実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチドの濃度は全て５ｇ／Ｌであり、それらは実験群１〜３および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群として同量のビタミン、脂肪酸および微量元素を加えたＤＭＥＭ／Ｆ１２培養培地を採用する。
【００７１】
前述の実験群１〜３、比較群およびブランク群それぞれの培養培地を２Ｌのバイオリアクターに加え、９５％を超える活性があるハイブリドーマ細胞を懸濁培養用にバイオリアクターに接種し、ここで培養条件は１Ｌの操作体積、飽和空気濃度の５０％で調節した溶存酸素、２．５×１０５個細胞／ｍｌの接種密度、３７℃、および９０ｒｐｍの攪拌スピードであり、６日間の培養後に抗体を得、ＥＬＩＳＡ法を使用して抗体発現量に関する検出を実施する。結果は図６中に示す。
【００７２】
図６中に示すように、実験群１〜３における抗体発現量はブランク群における抗体発現量と比較してそれぞれ６２％、５６％および５８％増大し、比較群における抗体発現量はブランク群における抗体発現量と比較してわずか２２％増大し、これは、ハイブリドーマ細胞を培養するため本発明のトウモロコシ活性ペプチド添加剤を含む培養培地を使用することにより、同じ培養時間内でより高い抗体発現量が得られることを示す。
【００７３】
実験実施形態５
実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびＭＥＭ培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の４倍の濃度がそれぞれ得られたペプチド溶液とＭＥＭ培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれＭＥＭ培養培地溶液と混合し、ビタミン、脂肪酸および微量元素を適量加え、最終体積の９５％まで超純水を加え、ｐＨ値を７．２〜７．３に調節し、最終体積まで希釈し、０．２２μｍの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで、実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチドは、その各無血清培養培地において７ｇ／Ｌの濃度をそれぞれ有し、それらは実験群１〜３および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群として同量のビタミン、脂肪酸および微量元素を加えたＭＥＭ培養培地を採用する。
【００７４】
前述の実験群１〜３、比較群およびブランク群それぞれの培養培地を２Ｌのバイオリアクターに加え、９５％を超える活性があるＨＥＫ−２９３細胞を懸濁培養用にバイオリアクターに接種し、ここで培養条件は１Ｌの操作体積、飽和空気濃度の５０％で調節した溶存酸素、２．０×１０５個細胞／ｍｌの接種密度、３７℃、および８０ｒｐｍの攪拌スピードであり、タイミングサンプリングを行い、ＡＯ／ＰＩ染色を使用して細胞生存率に関する検出を実施する。結果は図７中に示す。
【００７５】
図７中に示すように、比較群とブランク群に対して、実験群１〜３の培養培地で培養したＨＥＫ−２９３細胞は同じ培養時間内でより高い細胞生存率を有し、これは本発明のトウモロコシ活性ペプチド添加剤が、ＨＥＪ−２９３細胞の細胞生存率を有意に改善し得ることを示す。
【００７６】
実験実施形態６
実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびＤＭＥＭ（低糖）培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の４倍の濃度をそれぞれ有するペプチド溶液とＤＭＥＭ培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれＤＭＥＭ（低糖）培養培地溶液と混合し、ビタミン、脂肪酸および微量元素を適量加え、最終体積の９５％まで超純水を加え、ｐＨ値を７．０〜７．２に調節し、最終体積まで希釈し、０．２２μｍの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで、実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチドは、その各無血清培養培地においてそれぞれ３ｇ／Ｌの濃度を有し、それらは実験群１〜３および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群として同量のビタミン、脂肪酸および微量元素を加えたＤＭＥＭ（低糖）培養培地を採用する。
【００７７】
前述の実験群１〜３、比較群およびブランク群それぞれの培養培地を１５０ｍｌの振とうフラスコに加え、９５％を超える活性があるＢＨＫ−２１細胞を懸濁培養用に振とうフラスコに接種し、ここで培養条件は４０ｍＬの操作体積、３．０×１０５個細胞／ｍｌの接種密度、３７℃、および１００ｒｐｍの攪拌スピードであり、タイミングサンプリングを行い、細胞計数装置を使用して細胞密度に関する検出を実施する。結果は図８中に示す。
【００７８】
図８中に示すように、実験群１〜３の細胞密度はそれぞれブランク群の細胞密度の１３８％、１４１％および１３６％であり、比較群の細胞密度はブランク群の細胞密度のわずか１０３％であり、これは、ＢＨＫ−２１細胞を培養するため本発明のトウモロコシ活性ペプチド添加剤を含む培養培地を使用すると、同じ培養時間内でそれらの細胞密度を有意に増大させ、それらの増殖を促進することが可能であることを示す。
【００７９】
実験実施形態７
実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびＭＥＭ培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の４倍の濃度をそれぞれ有するペプチド溶液とＭＥＭ培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれＭＥＭ培養培地溶液と混合し、ビタミン、脂肪酸および微量元素を適量加え、最終体積の９５％まで超純水を加え、ｐＨ値を７．０〜７．２に調節し、最終体積まで希釈し、０．２２μｍの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで、実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチドは、その各無血清培養培地において６．５ｇ／Ｌの濃度をそれぞれ有し、それらは実験群１〜３および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群として同量のビタミン、脂肪酸および微量元素を加えたＭＥＭ培養培地を採用する。
【００８０】
前述の実験群１〜３、比較群およびブランク群それぞれの培養培地を２Ｌのバイオリアクターに加え、９５％を超える活性があるＭＡＲＣ−１４５細胞を懸濁培養用にバイオリアクターに接種し、ここで培養条件は１Ｌの操作体積、２．０×１０５個細胞／ｍｌの接種密度、飽和空気濃度の５０％で調節した溶存酸素、３７℃、および８０ｒｐｍの攪拌スピードであり、タイミングサンプリングを行い、細胞計数装置を使用して細胞密度に関する検出を実施する。結果は図９中に示す。
【００８１】
図９中に示すように、実験群１〜３の培養培地で培養したＭＡＲＣ−１４５細胞は同じ培養時間内でより高い細胞密度を有し、これは、本発明のトウモロコシ活性ペプチド添加剤がＭＡＲＣ−１４５細胞の増殖を促進するのに有益であることを示す。
【００８２】
実験実施形態８
実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチド、比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチド、およびＤＭＥＭ（高グルコース）培養培地をそれぞれ、発熱物質を含まない超純水を使用して溶かして、対応する従来濃度の４倍の濃度をそれぞれ有するペプチド溶液とＤＭＥＭ培養培地溶液を得、調製したペプチド溶液をそれぞれＭＥＭ培養培地溶液と混合し、ビタミン、脂肪酸および微量元素を適量加え、最終体積の９５％まで超純水を加え、ｐＨ値を７．０〜７．２に調節し、最終体積まで希釈し、０．２２μｍの濾過膜により病原菌除去を実施して、対応する無血清培養培地を得、ここで、実施形態１〜３で得たトウモロコシ活性ペプチドと比較実施形態１で得たトウモロコシオリゴペプチドは、その各無血清培養培地においてそれぞれ２．５ｇ／Ｌの濃度を有し、それらは実験群１〜３および比較群としてそれぞれ働き、一方、ブランク群として同量のビタミン、脂肪酸および微量元素を加えたＤＭＥＭ（高グルコース）培養培地を採用する。
【００８３】
前述の実験群１〜３、比較群およびブランク群それぞれの培養培地を１５０ｍｌの振とうフラスコに加え、９５％を超える活性があるＭＤＣＫ細胞を懸濁培養用に振とうフラスコに接種し、ここで培養条件は４０ｍＬの操作体積、３．０×１０５個細胞／ｍｌの接種密度、３７℃、および１００ｒｐｍの攪拌スピードであり、タイミングサンプリングを行い、ＡＯ／ＰＩ染色を使用して細胞生存率に関する検出を実施する。結果は図１０中に示す。
【００８４】
図１０中に示すように、比較群とブランク群に対して、実験群１〜３の培養培地で培養したＭＤＣＫ細胞は同じ培養時間内でより高い細胞生存率を有し、これは本発明のトウモロコシ活性ペプチド添加剤が、ＭＤＣＫ細胞の細胞生存率を有意に改善し得ることを示す。
【００８５】
前述の実施形態は、本発明の技術的解決策を単に記載するためのものであり、限定するためのものではないことを記さなければならない。前述の実施形態を参照しながら詳細に本発明を記載してきたが、当業者は、前述の実施形態で開示した技術的解決策に対する変更形態、またはこれらの実施形態における技術的特徴の一部もしくは全部の均等な代替を行うこともでき、これらの変更形態または代替は、対応する技術的解決策の本質を、本発明の実施形態の技術的解決策の範囲から逸脱させるものではないことを理解しているはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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