(57)【要約】【課題】本明細書中で、新血管形成を調節するための方法および組成物が開示される。【解決手段】開示される組成物は、子宮癌、具体的には子宮内膜癌の処置において特定の用途がある。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
子宮癌に対して患者を処置する方法であって、子宮癌に対する処置を必要とする対象に対する有効量の抗血管形成剤または化学療法剤および有効量の抗ＥＭＰ２抗体を前記患者に共投与することを含み、
前記抗ＥＭＰ２抗体が、ＥＭＰ２の第二の細胞外ループ中のエピトープに特異的に結合し、
ＥＭＰ２の前記第二の細胞外ループ中の前記エピトープが、アミノ酸配列ＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧを含む、前記方法。
【請求項２】
前記抗ＥＭＰ２抗体がヒト化または完全ヒト抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗ＥＭＰ２抗体がダイアボディである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗ＥＭＰ２抗体がトリアボディである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗ＥＭＰ２抗体がミニボディである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗ＥＭＰ２抗体が１本鎖抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記有効量の抗血管形成剤または化学療法剤および有効量の抗ＥＭＰ２抗体が、生理学的に許容可能な担体または医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１から６の何れかに記載の方法。
【請求項８】
前記抗ＥＭＰ２抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３またはＫＳ８９ダイアボディの重および軽鎖可変領域を含む抗体と競合する、請求項１から７の何れかに記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３またはＫＳ８９ダイアボディの重および軽鎖可変領域と９０％のアミノ酸同一性を共有する、請求項１から８の何れかに記載の方法。
【請求項１０】
前記抗血管形成剤がＶＥＧＦ阻害剤である、請求項１から９の何れかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ＶＥＧＦ阻害剤が抗ＶＥＧＦ抗体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ＶＥＧＦ抗体が、パゾパニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、バンデテアニブ、カボザニチニブ、ポナチニブ、アキシチニブおよびアフリベルセプトを含む群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記化学療法剤がＤＮＡ損傷化学療法剤である、請求項１から９の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡ損傷化学療法剤が、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、アルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、フリーラジカル発生剤およびヌクレオシド模倣物を含む群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記トポイソメラーゼＩ阻害剤が、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシンおよびその類似体または代謝物並びにドキソルビシンを含む群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記トポイソメラーゼＩＩ阻害剤が、エトポシド、テニポシドおよびダウノルビシンを含む群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルキル化剤が、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン、メトトレキサート、マイトマイシンＣおよびシクロホスファミドを含む群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＤＮＡ挿入剤が、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチンを含む群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記フリーラジカル発生剤がブレオマイシンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ヌクレオシド模倣物が、５−フルオロウラシル、カペシチビン、ゲムシタビン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよびヒドロキシウレアを含む群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記化学療法剤が、細胞複製破壊剤である、請求項１から９の何れかに記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞複製破壊剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サリドマイド、レナリドミド、ＣＣ−５０１３、ＣＣ−４０４７、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ＮＦ−κＢ阻害剤およびその関連類似体を含む群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤が、メシル酸イマチニブおよびゲフィチニブを含む群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記プロテアソーム阻害剤がボルテゾミブである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＮＦ−κＢ阻害剤がＩκＢキナーゼの阻害剤である、請求項２３に記載の方法
【請求項２７】
前記細胞複製破壊剤が抗体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記子宮癌が子宮内膜癌である、請求項１から２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
有効量の少なくとも１つのさらなる抗癌剤を患者に投与することをさらに含む、請求項１から２８の何れか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記少なくとも１つのさらなる抗癌剤が、白金を用いた化学療法薬、タキサン、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ２抗体およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１つのさらなる抗癌剤が、ＥＧＦＲ阻害剤を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が抗ＥＧＦＲ抗体を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗ＥＧＦＲ抗体がセツキシマブを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗ＥＧＦＲ抗体が、マツズマブ、パニツムマブおよびニモツズマブからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、ＥＧＦＲシグナル伝達の低分子阻害剤である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＥＧＦＲシグナル伝達の低分子阻害剤が、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０およびＡＧ１４７８からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗ＥＭＰ２抗体が、エフェクター部分と複合化されている、請求項１から３６の何れかに記載の方法。
【請求項３８】
前記エフェクター部分が毒物である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記毒物がリシンなどである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗ＥＭＰ２および前記抗血管形成剤が同時に投与される、請求項１から３９の何れか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗ＥＭＰ２および前記抗血管形成剤が連続的に投与される、請求項１から３９の何れか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗ＥＭＰ２および前記化学療法剤が同時に投与される、請求項１から３９の何れか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗ＥＭＰ２および前記化学療法剤が連続的に投与される、請求項１から３９の何れか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗ＥＭＰ２抗体が前記癌に対するワクチン療法において使用される、請求項１から４３の何れかに記載の方法。
【請求項４５】
前記患者がヒトまたは哺乳動物である、請求項１から４４の何れかに記載の方法。
【請求項４６】
コンパニオン診断をさらに含む、請求項１から４５の何れか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記コンパニオン診断が抗ＥＭＰ２抗体を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗ＥＭＰ２抗体が診断部分に複合化される、請求項１から４７の何れか１項に記載の方法。
【請求項４９】
非腫瘍状態を処置することを必要とする対象に有効量のＥＭＰ２阻害剤を投与することを含む、非腫瘍状態を処置する方法。
【請求項５０】
前記抗ＥＭＰ２抗体が、ＥＭＰ２の前記第二の細胞外ループ中のエピトープに特異的に結合する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＥＭＰ２の前記第二の細胞外ループ中の前記エピトープが、アミノ酸配列ＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗ＥＭＰ２抗体が、ヒト化または完全ヒト抗体である、請求項４９から５１の何れかに記載の方法。
【請求項５３】
前記抗ＥＭＰ２抗体がダイアボディである、請求項４９から５２の何れかに記載の方法。
【請求項５４】
前記抗ＥＭＰ２抗体がトリアボディである、請求項４９から５２の何れかに記載の方法。
【請求項５５】
前記抗ＥＭＰ２抗体がミニボディである、請求項４９から５２の何れかに記載の方法。
【請求項５６】
前記抗ＥＭＰ２抗体が１本鎖抗体である、請求項４９から５２の何れかに記載の方法。
【請求項５７】
前記有効量の抗ＥＭＰ２抗体が、生理学的に許容可能な担体または医薬的に許容可能な担体をさらに含む、請求項４９から５６の何れかに記載の方法。
【請求項５８】
前記抗ＥＭＰ２抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３またはＫＳ８９ダイアボディの重および軽鎖可変領域を含む抗体と競合する、請求項４９から５７の何れかに記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３またはＫＳ８９ダイアボディの重および軽鎖可変領域と９０％のアミノ酸同一性を共有する、請求項４９から５７の何れかに記載の方法。
【請求項６０】
前記ＥＭＰ２阻害剤が、ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたは抗ＥＭＰ２抗体である、請求項４９または５９の何れかに記載の方法。
【請求項６１】
前記ＥＭＰ２阻害剤が、抗血管形成剤の前に、その後にまたはそれと同時に投与される、請求項４９から６０の何れかに記載の方法。
【請求項６２】
前記抗血管形成剤がＶＥＧＦ阻害剤である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＶＥＧＦ阻害剤が抗ＶＥＧＦ抗体を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記抗ＶＥＧＦ抗体が、パゾパニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、バンデテアニブ、カボザニチニブ、ポナチニブ、アキシチニブおよびアフリベルセプトを含む群から選択される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＥＭＰ２阻害剤が、化学療法剤の前に、その後にまたはそれと同時に投与される、請求項４９から６０の何れかに記載の方法。
【請求項６７】
前記化学療法剤が、ＤＮＡ損傷化学療法剤または複製破壊剤である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記患者に有効量の少なくとも１つのさらなる抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項４９から６７の何れか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記少なくとも１つのさらなる抗癌剤が、白金を用いた化学療法薬、タキサン、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ２抗体およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記少なくとも１つのさらなる抗癌剤がＥＧＦＲ阻害剤を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が抗ＥＧＦＲ抗体を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記抗ＥＧＦＲ抗体がセツキシマブを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記抗ＥＧＦＲ抗体が、マツズマブ、パニツムマブおよびニモツズマブからなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が、ＥＧＦＲシグナル伝達の低分子阻害剤である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＥＧＦＲシグナル伝達の低分子阻害剤が、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０およびＡＧ１４７８からなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗ＥＭＰ２抗体がエフェクター部分と複合化される、請求項４９から７５の何れかに記載の方法。
【請求項７７】
前記エフェクター部分が毒物である、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記毒物がリシンなどである、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記抗ＥＭＰ２抗体が、前記癌に対するワクチン療法において使用される、請求項４９から７８の何れかに記載の方法。
【請求項８０】
前記患者が、ヒトまたは哺乳動物である、請求項４９から７９の何れかに記載の方法。
【請求項８１】
コンパニオン診断をさらに含む、請求項４９から８０の何れか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記コンパニオン診断が抗ＥＭＰ２抗体を含む、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記抗ＥＭＰ２抗体が診断部分に複合化される、請求項４９から８２の何れか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記非腫瘍状態が、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症（ｒｅｔｒｏｌｅｎｔｒａｌ  ｆｉｂｒｏｐｌａｓｉａ）、甲状腺過形成、慢性炎症、肺の炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水、心外膜液または胸水を含む、請求項４９から８３の何れかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本願は、その開示がその全体において参照により組み込まれる、２０１２年２月６日提出の米国特許出願第６１／５９５，６１７号の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府の支援に関する申し立て
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより支給された助成金番号ＣＡ１６０４２およびＣＡ１３１７５６ならびにＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより支給された助成金番号ＣＡ−８６３６６のもと、連邦政府の支援により行った。連邦政府は本発明においてある一定の権利を有する。
【０００３】
本研究は、米国のＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓによる支援を受けており、連邦政府は本発明においてある一定の権利を有する。
【０００４】
電子提出した配列表に対する参照
本明細書とともにＥＦＳ−Ｗｅｂを介して、２０１３年２月６日作成の、サイズが３２．２キロバイトであるファイル名「００８０７４−５０５０−ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」に含まれる配列表を電子提出したが、そのテキストファイルの内容は、それらの全体において参照により本明細書によって組み込まれる。
【背景技術】
【０００５】
癌は、無制御の細胞成長および正常組織由来の異常な、すなわち癌の細胞の増殖を特徴とする疾患である。無制御の成長および増殖は、癌細胞の隣接組織への浸潤につながり得る。一部の例において、癌細胞は、動物のリンパまたは循環系に侵入し、局所のリンパ節および遠隔部位に拡散、すなわち転移し得る。
【０００６】
多くのタイプの癌には、血管形成、すなわち既存の血管からの新しい血管の形成の過程が付随する。血管形成は、例えば成長、発生、創傷治癒中、および肉芽組織において正常な過程である。しかし、これは腫瘍形成の基礎段階でもある。血管形成は、癌におけるその役割に加え、多くの他の疾患の病態に関連する。例えば、血管形成は、増殖性網膜症、加齢性黄斑変性、関節リウマチ（ＲＡ）および乾癬と関連があるとされている。
【０００７】
血管形成には２つのタイプ：嵌入型（ｉｎｔｕｓｓｕｓｃｅｐｔｉｖｅ）血管形成および発芽型血管形成がある。開裂型（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ）血管形成としても知られる嵌入型（Ｉｎｔｕｓｓｕｓｃｅｐｔｉｖｅ）血管形成は、既存の腫瘍血管における経毛細血管性のピラーの反復的な付加を含む。嵌入型（ｉｎｔｕｓｓｕｓｃｅｐｔｉｖｅ）血管形成において、毛細血管壁が管腔に伸長し、１本の血管を２本の血管に分ける。発芽型血管形成は、新しい血管が既存の血管から成長する過程である。発芽型血管形成は、健康および疾患状態においてユビキタスな現象である。これは、胚発生から創傷治癒、そして腫瘍成長までの多様な過程において中心的な役割を果たす。
【０００８】
腫瘍の血管新生に関して、固形腫瘍成長は、新血管形成がうまくいくことおよびいくつかの要因に依存することが示されている。要因のうち最も注目すべきものは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である。ＶＥＧＦは、最初、肥満細胞脱顆粒または内皮細胞の損傷なく微小血管浸透性の急速かつ可逆的な向上を刺激する、腫瘍細胞により分泌される強力な血管透過因子（ＶＰＦ）として記載された。ＶＥＧＦは、正常および異常血管形成両方の中心的な制御因子として報告されている、血管内皮細胞に対する強力なマイトジェンである。ＦｅｒｒａｒａおよびＤａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ．１８：４−２５；Ｆｅｒｒａｒａ（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．７７：５２７−５４３。血管形成の過程に寄与する他の成長因子と比較して、ＶＥＧＦは、血管系内の内皮細胞に非常に特異的である点で独特である。ＶＥＧＦはまた、胚の脈管形成および血管形成に対して必須であることも示唆されている。Ｃａｒｍｅｌｉｅｔら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３５−４３９；Ｆｅｒｒａｒａら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８０：４３９−４４２。さらに、ＶＥＧＦは、女性生殖器における周期的血管増殖および骨成長および軟骨形成に必要である。Ｆｅｒｒａｒａら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．４：３３６−３４０；Ｇｅｒｂｅｒら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．５：６２３−６２８。
【０００９】
血管形成および脈管形成における血管新生因子であることに加え、ＶＥＧＦは、生理的過程において複数の生物学的効果を示す多面的な成長因子である。例えば、ＶＥＧＦは、内皮細胞の生存、血管浸透性および血管拡張、単球化学走性およびカルシウム流入をもたらす。ＦｅｒｒａｒａおよびＤａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ（１９９７）、上出。最近の研究はまた、非内皮細胞型、例えば網膜色素上皮細胞、膵管細胞およびシュワン細胞などにおけるＶＥＧＦの細胞分裂促進効果も報告している。Ｇｕｅｒｒｉｎら（１９９５）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６４：３８５−３９４；Ｏｂｅｒｇ−Ｗｅｌｓｈら（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１２６：１２５−１３２；Ｓｏｎｄｅｌｌら（１９９９）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：５７３１−５７４０。
【００１０】
ＶＥＧＦはまた、病的な血管形成を含む疾患発症にも関連付けられている。例えば、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡは、ヒト腫瘍で過剰発現されることが示されている。ＢｅｒｋｍａｎらＪ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９１：１５３−１５９（１９９３）；Ｂｒｏｗｎら、Ｈｕｍａｎ  Ｐａｔｈｏｌ．２６：８６−９１（１９９５）；Ｂｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：４７２７−４７３５（１９９３）；Ｍａｔｔｅｒｎら、Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．７３：９３１−９３４（１９９６）；およびＤｖｏｒａｋら、Ａｍ  Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４６：１０２９−１０３９（１９９５）。また、眼球の液体中のＶＥＧＦ濃度は、糖尿病および他の虚血関連網膜症の患者における活発な血管増殖の存在と高い相関がある。Ａｉｅｌｌｏら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３３１：１４８０−１４８７（１９９４）。さらに、研究から、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）患者におけるＶＥＧＦの脈絡膜新生血管膜の局在が示唆されている。Ｌｏｐｅｚら、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔａｌｍｏ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３７：８５５−８６８（１９９６）。
【００１１】
ＶＥＧＦは、病的状態における血管形成の主要な制御因子であるので、ＶＥＧＦ活性を阻止するために多くの試みが行われてきた。ＶＥＧＦシグナル伝達を妨害するために、阻害性の抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性の受容体コンストラクト、アンチセンスストラテジー、ＶＥＧＦに対するＲＮＡアプタマーおよび低分子ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤が開発されてきた。Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．１７：２４１−２４８（１９９８）。具体的には、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦカスケードを阻止し、様々なヒト腫瘍細胞株の成長を抑制することが示されている。Ｋｉｍら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：８４１−８４４（１９９３）；Ｗａｒｒｅｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９５：１７８９−１７９７（１９９５）；Ｂｏｒｇｓｔｒｏｍら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：４０３２−４０３９（１９９６）；およびＭｅｌｎｙｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：９２１−９２４（１９９６）。さらに、抗ＶＥＧＦ抗体は、虚血性網膜障害のモデルにおいて眼内血管形成を阻害することも示されている。Ａｄａｍｉｓら、Ａｒｃｈ．Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ．１１４：６６−７１（１９９６）。したがって、抗ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシズマブ（アバスチン（登録商標）；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）など、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体が広く研究されており、腫瘍およびＶＥＧＦ関連障害の処置において使用されている。ＶＥＧＦポリペプチドは、成長因子のＰＤＧＦファミリーに属しており、血管形成を制御するおそらく最も重要な因子である。ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ、−Ｄおよび胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）を含む遺伝子ファミリーによりコードされる。これらは、分子量が〜４０ｋＤａの二量体のシステイン連結分泌型糖タンパク質である。ＶＥＧＦは、低酸素症、特異的な成長および分化因子に反応し、癌遺伝子により生成されるので、腫瘍細胞を含む多くの細胞型により産生される。腫瘍において、ＶＥＧＦ−Ａは、血管成長因子の最強の血管新生因子であると思われ、その分泌は、腫瘍成長に非常に重要であることが示されている。したがって、血管形成を調節する、および特にＶＥＧＦ−Ａ発現を調節する機構を理解することは、腫瘍生物学において最重要事項である。
【００１２】
焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）シグナル伝達がＶＥＧＦ産生に関連することが示唆されてきた。ＦＡＫは、細胞基層−細胞外マトリクス（ＥＣＭ）に局在する非受容体タンパク質−チロシンキナーゼである。接着性細胞において、ＦＡＫは、接着点でインテグリンと会合することが多い。Ｓｃｈａｌｌｅｒら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５１９２−５１９６。多くの他のシグナル伝達タンパク質は、他のタンパク質チロシンキナーゼを含め、これらの領域でＦＡＫと会合する。ＦＡＫのリン酸化の結果、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ経路の活性化が起こる。さらに、ＦＡＫは、アポトーシスを防ぐのに寄与し得るホスファチジルイノシトール３’−キナーゼの活性化を制御する。
【００１３】
ＦＡＫの過剰発現は、癌の進行に関与する。例えば、高レベルのＦＡＫは、結腸腫瘍、乳癌および口腔癌における侵襲性および転移能に相関する。Ｗｅｉｎｅｒら（１９９３）Ｌａｎｃｅｔ  ３４２：１０２４−１０２５；Ｏｗｅｎｓら（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、５５：２７５２−２７５５）；Ｋｏｒｎｂｅｒｇ（１９９８）Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  ２０：６３４−６３９。さらに、細胞移動においてＦＡＫが果たす役割は、ＦＡＫが発生および他の疾患の病態、例えば胚発生および血管新生性障害などにおいて関連のある役割を果たすという推論につながった。Ｋｏｒｎｂｅｒｇ（１９９８）Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  ２０：６３４−６３９。
【００１４】
ＧＡＳ−３／ＰＭＰ２２ファミリーの４回膜貫通タンパク質のメンバーである上皮膜タンパク質２（ＥＭＰ２）は、ＦＡＫおよびＳｒｃ活性化を制御することが示されている。ＥＭＰ２は、肺、眼および泌尿生殖器の上皮細胞において高レベルで発現される。いくつかの４回膜貫通タンパク質（ＣＤ９、ＣＤ８１、ＰＭＰ２２）のように、マウス繊維芽細胞におけるＥＭＰ２は、脂質ラフトドメインに局在化する。ＥＭＰ２は、細胞表面輸送およびある種のインテグリン、ＧＰＩ結合タンパク質およびクラスＩ  ＭＨＣ分子の機能を調節し、カベオリン発現を相互に制御する。Ｃｌａａｓら（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：７９７４−８４；Ｈａｓｓｅら（２００２）Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ  ６９：２２７−３２；Ｗａｄｅｈｒａら（２００３）Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ７４：１０６−１２；Ｗａｄｅｈｒａら（２００４）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １５：２０７３−２０８３；Ｗａｄｅｈｒａら（２００２）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４１０９４−４１１００；Ｗａｄｅｈｒａら（２００３）Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０７：１２９−１３６。
【００１５】
子宮内膜癌（ＥＣ）は、最も一般的な婦人科の悪性腫瘍である。米国において、ＥＣによる死亡率は過去２０年間で倍増しており、現在、女性が一生のうちにＥＣを発症する可能性はおよそ３％である。Ｓｉｌｖｅｒｂｅｒｇら（２００３）Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒｓ：Ｔｕｍｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｒｅａｓｔ  ａｎｄ  Ｆｅｍａｌｅ  Ｇｅｎｉｔａｌ  Ｔｒａｃｔ，Ｌｙｏｎ：ＩＡＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ｐ．２２１−５７；Ｓｏｒｏｓｋｙ（２００８）Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １１１：４３６−４７。ＥＣは、組織学、臨床的挙動および疫学に基づき２種類の主要なサブグループに分類される。より一般的なＩ型は、エストロゲン優位性および前癌状態子宮内膜過形成を付随する。Ｈｅｃｈｔら（２００６）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４：４７８３−９１；Ｓｈｅｒｍａｎ（２０００）Ｍｏｄ  Ｐａｔｈｏｌ  １３：２９５−３０８。ＩＩ型は、非ホルモン性のリスク因子が介在し、高悪性度の臨床を伴う高グレードおよび高リスク組織を有することが多い。Ｈｅｃｈｔら（２００６）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４：４７８３−９１。ＥＣの発症率は、一般的に加齢により上昇し、新規症例の７５から８０％が閉経後の女性である。Ｃｒｅａｓｍａｎ（１９９７）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２４：Ｓ１−１４０−Ｓ１−５０。
【００１６】
ＥＣに対する主要な治療は、外科的手術による腫瘍の切除であるが、再発することが多く、他の治療的介入（放射線療法、化学療法および内分泌療法）が有益であるのは一部の患者のみである。Ｍａｒｋｍａｎ（２００６），Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３３：Ｓ３３−８；Ｅｎｇｌｅｍａｎら（２００３）Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３０：８０−９４。現在、腫瘍形成過程の基礎となる標的化分子に対して新たな取り組みが行われているものの、前癌状態の段階でＥＣを識別するバイオマーカーは殆どない。Ｋｅｌｌｏｆｆら（２００６）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １２：３６６１−９７；Ｇｏｓｓｅｔｔら（２００４）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｃａｎｃｅｒ  １４：１４５−５１。同様に、現在のところ、腫瘍抑制および排除の標的となり得るバイオマーカーはない。したがって、前癌状態および率直に言うと疾患の悪性ステージでのＥＣの早期検出および処置に対する新しい手順では、管理および予後診断を改善することが必要とされる。
【００１７】
ある有望なバイオマーカーはＥＭＰ２であると思われる。ＥＭＰ２発現は、ＥＭＰ２新生組織形成と関連がある。Ｗａｄｅｈｒａら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  １０７：９０−８。子宮内膜癌において、ＥＭＰ２は、臨床転帰不良の腫瘍に対する独立した予後指標である。ＥＭＰ２陰性腫瘍と比較して、ＥＭＰ２陽性腫瘍は、子宮筋侵襲性が顕著に大きく、病態が悪く、外科手術による切除後の再発または持続疾患があり、より早期に死亡する。ＥＭＰ２発現は、エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体などの他の既知のバイオマーカーと独立であったので、ＥＭＰ２は、最新のホルモンまたは化学療法に反応しない患者に対する特有のバイオマーカーとなる。Ｗａｄｅｈｒａら（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  １０７：９０−８。さらに、ＥＭＰ２発現レベルは、増殖期の子宮内膜の前癌状態の可能性の上昇と正の相関がある。言い換えると、子宮内膜ＥＭＰ２発現の漸次的変化があり、正常な増殖または休止状態の閉経前の子宮内膜では発現は最小限であり、異常のある増殖期の子宮内膜、子宮内膜過形成および子宮内膜癌患者での発現が増加している。
【００１８】
子宮内膜において、ＥＭＰ２発現は、プロゲステロンによって制御され、胚盤胞の着床の成功に必要である。Ｗａｄｅｈｒａら（２００６）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２９２：４３０−４１；Ｗａｄｅｈｒａら（２００８）Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  ６：１５。ＥＭＰ２は、分子の輸送を促進することによって、ポストゴルジエンドソーム区画から適切な形質膜位置への様々なタンパク質および糖脂質の輸送を制御すると思われる。具体的に、ＥＭＰ２は、糖脂質に富む脂質ラフトミクロドメイン（ＧＥＭ）への選択分子の適切な輸送を促進すると考えられる。Ｗａｄｅｈｒａら（２００４）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  １５：２０７３−８３。ＧＥＭは、効率的なシグナル伝達にとって重要である、シャペロン、レセプトソームおよびタンパク質複合体と会合することが多いコレステロールに富むミクロドメインである。Ｌｅｉｔｉｎｇｅｒら（２００２）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１５：９６３−７２；Ｍｏｆｆｅｔｔら（２０００）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：２１９１−８。さらに、ＧＥＭは、ゴルジ装置から形質膜へのタンパク質の正しい選別に関与する。Ａｂｒａｍｉら（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：３０７２９−３６；Ｇａｌｂｉａｔｉら（２００１）Ｃｅｌｌ  １０６：４０３−１１；Ｇｒｕｅｎｂｅｒｇら（１９９５）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７：５５２−６３。この点において、ＥＭＰ２発現レベルまたは形質膜におけるその位置の調節は、インテグリン、焦点接着キナーゼ、クラスＩ主要組織適合性分子および他の免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー、例えばＣＤ５４およびＧＰＩ連結タンパク質などを含め、分子のいくつかのクラスの表面レパートリーを変化させる。Ｗａｄｅｈｒａら（２００５）Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２８７：３３６−４５；Ｗａｄｅｈｒａら（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０７：１２９−３６；Ｍｏｒａｌｅｓら（２００８）Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ５０（１）：４６２−９。さらに、４回膜貫通の役割と調和して、ＥＭＰ２は、特異的なシグナル伝達複合体の活性を制御するために形質膜上で分子を監督すると考えられる。
【００１９】
したがって、癌を処置および予防するための、血管形成関連疾患および障害を処置し、予防するための、および新血管形成（すなわち、それらを正常に含有しない組織における血管の増殖）を減少させるための新しい組成物および方法が必要とされる。ＥＭＰ２を標的とすることによって新血管形成を減少させるための方法および組成物が本明細書中で開示される。子宮癌を処置および予防するための方法および組成物も本明細書中で開示される。具体的に、子宮内膜癌を処置および予防するための方法および組成物が本明細書中で開示される。
【発明の概要】
【００２０】
ある実施形態において、本発明は、子宮癌に対して患者を処置する方法に関する。具体的な実施形態において、本方法は、子宮癌の処置を必要とする対象に対する有効量の抗血管形成剤または化学療法剤および有効量の抗ＥＭＰ２抗体を患者に共投与することを含む。具体的な実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、ＥＭＰ２の第二の細胞外ループ中のエピトープに特異的に結合する。具体的な実施形態において、ＥＭＰ２の第二の細胞外ループ中のエピトープは、アミノ酸配列ＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧを含む。
【００２１】
ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、ヒト化または完全ヒト抗体である。ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体はダイアボディである。ある一定の実施形態において、前記抗ＥＭＰ２抗体はトリアボディである。ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体はミニボディである。ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は１本鎖抗体である。
【００２２】
ある一定の実施形態において、有効量の抗血管形成剤または化学療法剤および有効量の抗ＥＭＰ２抗体は、生理学的に許容可能な担体または医薬的に許容可能な担体をさらに含む。
【００２３】
ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３またはＫＳ８９ダイアボディの重および軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。ある一定の実施形態において、本抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３またはＫＳ８９ダイアボディの重および軽鎖可変領域と９０％のアミノ酸同一性を共有する。
【００２４】
ある一定の実施形態において、抗血管形成剤はＶＥＧＦ阻害剤である。具体的な実施形態において、ＶＥＧＦ阻害剤は抗ＶＥＧＦ抗体である。具体的な実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブである。具体的な実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、パゾパニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、バンデテアニブ、カボザニチニブ、ポナチニブ、アキシチニブまたはアフリベルセプトである。
【００２５】
ある一定の実施形態において、化学療法剤はＤＮＡ損傷化学療法剤である。具体的な実施形態において、ＤＮＡ損傷化学療法剤は、トポイソメラーゼＩ阻害剤、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、アルキル化剤、ＤＮＡ挿入剤、フリーラジカル発生剤またはヌクレオシド模倣物である。具体的な実施形態において、トポイソメラーゼＩ阻害剤は、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシンおよびその類似体もしくは代謝物またはドキソルビシンである。具体的な実施形態において、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤は、エトポシド、テニポシドまたはダウノルビシンである。具体的な実施形態において、アルキル化剤は、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン、メトトレキサート、マイトマイシンＣまたはシクロホスファミドである。具体的な実施形態において、ＤＮＡ挿入剤は、シスプラチン、オキサリプラチンまたはカルボプラチンである。具体的な実施形態において、フリーラジカル発生剤はブレオマイシンである。具体的な実施形態において、ヌクレオシド模倣物は、５−フルオロウラシル、カペシチビン、ゲムシタビン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンまたはヒドロキシウレアである。
【００２６】
ある一定の実施形態において、化学療法剤は細胞複製破壊剤である。具体的な実施形態において、細胞複製破壊剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サリドマイド、レナリドミド、ＣＣ−５０１３、ＣＣ−４０４７、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、プロテアソーム阻害剤、ＮＦ−κＢ阻害剤またはその関連類似体である。
【００２７】
具体的な実施形態において、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤は、メシル酸イマチニブまたはゲフィチニブである。具体的な実施形態において、プロテアソーム阻害剤はボルテゾミブである。具体的な実施形態において、ＮＦ−κＢ阻害剤はＩκＢキナーゼの阻害剤である。具体的な実施形態において、細胞複製破壊剤は抗体である。
【００２８】
ある一定の実施形態において、子宮癌は子宮内膜癌である。
【００２９】
ある一定の実施形態において、本方法は、有効量の少なくとも１つのさらなる抗癌剤を患者に投与することをさらに含む。ある一定の実施形態において、この少なくとも１つのさらなる抗癌剤は、白金を用いた化学療法薬、タキサン、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ２抗体およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３０】
ある一定の実施形態において、この少なくとも１つのさらなる抗癌剤はＥＧＦＲ阻害剤である。ある一定の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は抗ＥＧＦＲ抗体である。ある一定の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブである。ある一定の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、マツズマブ、パニツムマブまたはニモツズマブである。ある一定の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲシグナル伝達の低分子阻害剤である。ある一定の実施形態において、ＥＧＦＲシグナル伝達の低分子阻害剤は、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０またはＡＧ１４７８である。
【００３１】
ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体はエフェクター部分と複合化される。ある一定の実施形態において、エフェクター部分は毒物である。ある一定の実施形態において、毒物はリシンなどである。
【００３２】
ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２および抗血管形成剤が同時に投与される。ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２および抗血管形成剤が連続的に投与される。ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２および化学療法剤が同時に投与される。ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２および化学療法剤が連続的に投与される。
【００３３】
ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、癌に対するワクチン療法で使用される。
【００３４】
ある一定の実施形態において、患者はヒトまたは哺乳動物である。
【００３５】
ある一定の実施形態において、本方法は、コンパニオン診断をさらに含む。ある一定の実施形態において、コンパニオン診断は、抗ＥＭＰ２抗体を含む。ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は診断部分に複合化される。
【００３６】
別の実施形態において、本発明は、非腫瘍状態の処置を必要とする対象に有効量のＥＭＰ２阻害剤を投与することを含む、非腫瘍状態を処置する方法に関する。ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、ＥＭＰ２の第二の細胞外ループ中のエピトープに特異的に結合する。ある一定の実施形態において、ＥＭＰ２の第二の細胞外ループ中のエピトープは、アミノ酸配列ＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧを含む。
【００３７】
ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、ヒト化または完全ヒト抗体である。ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体はダイアボディである。ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体はトリアボディである。ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体はミニボディである。ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は１本鎖抗体である。
【００３８】
ある一定の実施形態において、有効量の抗ＥＭＰ２抗体は、生理学的に許容可能な担体または医薬的に許容可能な担体をさらに含む。
【００３９】
ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３またはＫＳ８９ダイアボディの重および軽鎖可変領域を含む抗体と競合する。ある一定の実施形態において、本抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３またはＫＳ８９ダイアボディの重および軽鎖可変領域と９０％のアミノ酸同一性を共有する。
【００４０】
ある一定の実施形態において、ＥＭＰ２阻害剤は、ｓｈＲＮＡ、リボザイムまたは抗ＥＭＰ２抗体である。
【００４１】
ある一定の実施形態において、ＥＭＰ２阻害剤は、抗血管形成剤の前に、その後にまたはそれと同時に投与される。ある一定の実施形態において、抗血管形成剤はＶＥＧＦ阻害剤である。ある一定の実施形態において、ＶＥＧＦ阻害剤は、抗ＶＥＧＦ抗体を含む。ある一定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブである。
【００４２】
ある一定の実施形態において、抗ＶＥＧＦ抗体は、パゾパニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、バンデテアニブ、カボザニチニブ、ポナチニブ、アキシチニブまたはアフリベルセプトである。
【００４３】
ある一定の実施形態において、ＥＭＰ２阻害剤は、化学療法剤の前に、その後にまたはそれと同時に投与される。
【００４４】
ある一定の実施形態において、化学療法剤は、ＤＮＡ損傷化学療法剤または複製破壊剤である。ある一定の実施形態において、本方法は、有効量の少なくとも１つのさらなる抗癌剤を患者に投与することをさらに含む。ある一定の実施形態において、この少なくとも１つのさらなる抗癌剤は、白金を用いた化学療法薬、タキサン、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ２抗体およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００４５】
ある一定の実施形態において、この少なくとも１つのさらなる抗癌剤は、ＥＧＦＲ阻害剤を含む。ある一定の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤は抗ＥＧＦＲ抗体を含む。ある一定の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体はセツキシマブを含む。ある一定の実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、マツズマブ、パニツムマブまたはニモツズマブである。ある一定の実施形態において、ＥＧＦＲ阻害剤はＥＧＦＲシグナル伝達の低分子阻害剤である。ある一定の実施形態において、ＥＧＦＲシグナル伝達の低分子阻害剤は、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０またはＡＧ１４７８である。
【００４６】
ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体はエフェクター部分と複合化される。ある一定の実施形態において、エフェクター部分は毒物である。ある一定の実施形態において、毒物はリシンなどである。
【００４７】
ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は癌に対するワクチン療法で使用される。
【００４８】
ある一定の実施形態において、患者はヒトまたは哺乳動物である。
【００４９】
ある一定の実施形態において、本方法は、コンパニオン診断をさらに含む。ある一定の実施形態において、コンパニオン診断は抗ＥＭＰ２抗体を含む。ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は診断部分に複合化される。
【００５０】
ある一定の実施形態において、非腫瘍状態は、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症（ｒｅｔｒｏｌｅｎｔｒａｌ  ｆｉｂｒｏｐｌａｓｉａ）、甲状腺過形成、慢性炎症、肺の炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水、心外膜液または胸水を含む。
【００５１】
別の実施形態において、本発明は、新血管形成を特徴とする状態を処置する方法に関する。ある一定の実施形態において、本方法は、新血管形成を特徴とする状態の処置を必要とする対象に有効量のＥＭＰ２阻害剤を投与することを含む。
【００５２】
別の実施形態において、ＥＭＰ２阻害剤はｓｈＲＮＡである。ある実施形態において、ＥＭＰ２阻害剤はリボザイムである。ある実施形態において、ＥＭＰ２阻害剤は抗ＥＭＰ２抗体である。具体的な実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体はヒト抗体である。
【００５３】
別の実施形態において、新血管形成を特徴とする状態は腫瘍状態である。具体的な実施形態において、腫瘍状態は、乳癌、肺癌、食道癌、胃癌、結腸癌、直腸癌、肝臓癌、卵巣癌、子宮頸癌、前立腺癌、膵臓癌または腎臓癌である。ある一定の実施形態において、腫瘍状態は、卵胞膜細胞腫、男化腫瘍、線維肉腫、絨毛腫、頭部癌、頸部癌、鼻咽腔癌、喉頭癌、肝芽腫、カポジ肉腫、メラノーマ、皮膚癌、血管腫、血管芽細胞腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫（ａｓｔｒｏｃｙｓｔｏｍａ）、膠芽細胞腫、神経鞘腫、乏突起膠腫、髄芽腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨肉腫、平滑筋肉腫、尿路癌、甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、母斑病（ｐｈａｋｏｍａｔｏｓｅｓ）を伴う異常血管増殖およびメーグス症候群である。
【００５４】
別の実施形態において、新血管形成を特徴とする状態は非腫瘍状態である。具体的な実施形態において、非腫瘍状態は、関節リウマチ、乾癬、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、水晶体後線維増殖症（ｒｅｔｒｏｌｅｎｔｒａｌ  ｆｉｂｒｏｐｌａｓｉａ）、甲状腺過形成、慢性炎症、肺の炎症、ネフローゼ症候群、子癇前症、腹水、心外膜液または胸水である。
【００５５】
ある実施形態において、ＥＭＰ２阻害剤は、ＶＥＧＦ阻害剤の前に、その後にまたはそれと同時に投与される。ある実施形態において、ＥＭＰ２阻害剤は、本明細書中に記載の抗血管形成剤または化学療法剤と同時に投与される。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、ＥＭＰ２  ＩｇＧ１処置によって腫瘍負荷が減少することを示す。（Ａ）ＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２細胞をヌードＢａｌｂ／ｃ雌マウスにｓ．ｃ．注射した。腫瘍が４ｍｍ２に到達したら、ＥＭＰ２  ＩｇＧ１抗体の対照を１０ｍｇ／ｋｇで全身的に注射した。マウスを毎週処置し、ノギスを用いて腫瘍体積を監視した。ｎ＝６．＊、ｐ＜０．０５。（Ｂ）抗ＥＭＰ２  ＩｇＧ１または対照抗体で処置した無胸腺マウスの転帰のカプラン−マイヤー生存分析。Ｎ＝６；ｐ＝０．０２。（Ｃ）処置した腫瘍を回収し、固定した。ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて腫瘍を可視化した。倍率：４Ｘ。
【図２】図２は、ＥＭＰ２発現が腫瘍脈管構造を増加させることを示す。（Ａ）１ｘ１０６個のＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２、ＨＥＣ１ａ／ＶまたはＨＥＣ１ａ／ＲＩＢＯ細胞をＢａｌｂ／ｃヌードマウスに注射した。ａｙｓ後、腫瘍を回収し、固定し、マッソントリクロームで染色した。Ｎ＝６。（Ｂ）リコペルシコン・エスキュレントゥム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）レクチンおよびＤＡＰＩを使用して腫瘍を染色した。（Ｃ）ＣＤ３４発現について腫瘍を染色した。全画像において、矢印は腫瘍脈管構造を強調する。倍率：２０Ｘ。スケールバー＝１００μＭ。（Ｄ）少なくとも２個の独立した腫瘍からの６ヶ所の高倍率視野（ｘ２００）でのＣＤ３４−陽性血管数を計数し、平均値を算出した。バー、平均±ＳＥ。
【図３】図３は、ＥＭＰ２が血管形成を促進することを示す。（Ａ）標準的なボイデンチャンバー−アッセイを用いて、ＨＵＶＥＣの移動における化学走性効果を測定した。実験を３回繰り返し、データは平均±ＳＥを示す。（Ｂ）「スクラッチ」創傷治癒アッセイを用いて、ＨＵＶＥＣ細胞移動を測定した。腫瘍細胞上清中で内皮細胞を培養し、顕微鏡を用いて創閉鎖を測定した。（Ｃ）ＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２、ＨＥＣ１ａ／ＶまたはＨＥＣ１ａ／ＲＩＢＯ細胞からの培地存在下で低成長因子マトリゲル上にＨＵＶＥＣ細胞をプレーティングした。実験を少なくとも３回繰り返し、代表的な画像を示す。管の数（Ｄ）ならびに管径（Ｅ）を測定することによって、毛細管様管形成を定量した。グラフ中のデータは、３回の独立した実験を用いた、３視野の平均±ＳＥＭである。
【図４】図４は、ＥＭＰ２がＶＥＧＦ発現を制御することを示す。（Ａ）ボイデンチャンバーアッセイを使用して、培養腫瘍細胞上清に対するヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）の反応を調べた。いくつかの実験において、可溶性ＶＥＧＦに結合する抗ＶＥＧＦ抗体アバスチン（登録商標）をｌ０μｇ／ｍＬで培養上清に添加した。（Ｂ）ウエスタンブロット分析を用いて総ＶＥＧＦ発現を測定した。ＥＭＰ２発現を可視化して、細胞株におけるＥＭＰ２の調整を確認し；ローディング対照として１３−アクチンを使用した。（Ｃ）ＥＬＩＳＡを用いて分泌性ＶＥＧＦを測定した。（Ｄ）ＲＴＰＣＲを用いてＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの半定量的発現を調べた。本実験を３回繰り返したところ、同様の結果となり、代表的なブロットを示す。ＧＡＰＤＨ発現は、ローディング対照となる。（Ｅ）左、ＶＥＧＦ制御に対する機構を調べるために、ウエスタンブロット分析を用いてＨＩＦ−１ａおよびＰＰ  ＡＲｙ発現を調べた。１３−アクチン発現はローディング対照となる。右、３回の独立した実験に対する１３−アクチンに対するＨＩＦ−１ａ発現の量子化（Ｑｕａｎｔｉｚａｔｉｏｎ）。このデータは、平均±ＳＥＭを表す。（Ｆ）リボザイム（ＨＥＣ１ａ／ＲＩＢＯ）またはｓｈＲＮＡレンチウイルスコンストラクト（ＨＥＣ１ａ／ｓｈＲＮＡ）の何れかを用いて、ＥＭＰ２発現を下方制御した。適切なビヒクル対照細胞が含まれる。これらの細胞におけるＥＭＰ２、ＨＩＦ−１ａおよび１３−アクチンの発現を示すために、ウエスタンブロット分析を使用した。
【図５】図５は、ＥＭＰ２が、ＦＡＫ−Ｓｒｃ経路を通じてＶＥＧＦを制御することを示す。（Ａ）外因性ＶＥＧＦを２０または５０ｇ／ｍＬでＨＥＣ１ａ／ＲＩＢＯまたはＨＥＣ１ａ／ｓｈＲＮＡ細胞に添加した。１２から２４時間後、位相差顕微鏡を用いて、毛細管様管形成を測定した。この実験を３回繰り返し、このデータを平均±ＳＥＭとして表した。（Ｂ）１．０％低酸素チャンバー中で、ＰＰ２、ＰＰ３、ダサチニブ、エルロチニブ、Ｌｙ２９４００２、ＡＫＴｉ  ＶＩＩＩ、ＤＭＳＯビヒクル対照または培地対照とともに、ＨＥＣ−１Ａ／ＥＭＰ２細胞を２４時間温置した。ＨＩＦ−１ａ、ｐ−ＦＡＫ、ｐ−ＳＲＣ、ｐ−ＡＫＴおよび１３アクチンのタンパク質発現について、細胞を精査した。
【図６】図６は、ＥＭＰ２  ＩｇＧ１処理が腫瘍微小環境を変化させることを示す。（Ａ）同等数のＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２子宮内膜腫瘍細胞を１２時間にわたり様々な濃度のＥＭＰ２  ＩｇＧ１または対照ＩｇＧで１２時間処置した。上清を回収し、低成長因子マトリゲル上にプレーティングされたＨＵＶＥＣに添加した。１２から２４時間後、位相差顕微鏡を用いて毛細管形成を測定した。この実験を３回繰り返し、データを平均±ＳＥＭとして示した。（Ｂ）生存腫瘍クラスター中でリコペルシコン・エスキュレントゥム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）レクチンおよびＤＡＰＩを用いて、ＥＭＰ２  ＩｇＧ１または対照抗体で処理したＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２腫瘍の新血管形成を可視化した。（Ｃ）腫瘍の中央領域の基底膜スリーブを同定するために、マッソントリクローム染色を使用した。Ｎ＝３、代表的画像を示す。倍率、１０ｘ。
【図７】図７は、抗ＥＭＰ２抗体の重および軽鎖可変領域の配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
導入
子宮癌は、女性で見られる第四位のごくありふれたタイプの癌である。最も一般的なタイプの子宮癌は子宮内膜癌である。子宮内膜癌は、子宮を裏打ちする細胞を起源とする。２０１２年、米国で毎年約４７，１３０例の子宮内膜癌の新規症例が診断され、その結果、年間８，０１０人が死亡すると推定された。子宮内膜癌についてはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅウェブサイトを参照。本疾患は、最も一般的には閉経後の女性で生じ、診断時の平均年齢は約６０歳である。子宮内膜癌の発症に先行して、通常は組織学検査において異型過形成として明らかになる状態である、子宮内膜腺細胞の前癌状態の腫瘍成長または子宮内膜上皮内腫瘍（ＥＩＮ）が起こることが多い。Ｈｅｃｈｔら（２００５）Ｍｏｄ．Ｐａｔｈｏｌ  １８：３２４−３３０；Ｍｕｔｔｅｒら（２０００）Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ  １９０：４６２−４６９。しかし、ＥＩＮが検出された時点で、およそ３９％の女性において癌が既に存在する。Ｂａａｋら（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．５８：１−６。
【００５８】
ＥＭＰ２（配列番号１）は、女性の多くの癌において上方制御される新規癌遺伝子である。子宮内膜癌において、例えばＥＭＰ２発現はインビボで子宮内膜癌成長を促進し、現在のところ、これは、子宮内膜癌予後および生存を予測すると認定された唯一のバイオマーカーである。疾病病因におけるその発現プロファイルおよび重要性を前提とし、ＥＭＰ２に対する組み換え抗体断片（ダイアボディ）が作製され、それがインビボで壊死を誘発することが示された。
【００５９】
配列番号１（ＥＭＰ２；ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ  Ｐ５４８５ｌ）ＭＬＶＬＬＡＦＩＩＡ  ＦＨＩＴＳＡＡＬＬＦ  ＩＡＴＶＤＮＡＷＷＶ  ＧＤＥＦＦＡＤＶＷＲ  ＩＣＴＮＮＴＮＣＴＶ  ＩＮＤＳＦＱＥＹＳＴ  ＬＱＡＶＱＡＴＭＩＬ  ＳＴＩＬＣＣＩＡＦＦ  ＩＦＶＬＱＬＦＲＬＫ  ＱＧＥＲＦＶＬＴＳＩ  ＩＱＬＭＳＣＬＣＶＭ  ＩＡＡＳＩＹＴＤＲＲ  ＥＤＩＨＤＫＮＡＫＦ  ＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧ  ＹＳＹＩＬＡＷＶＡＦ  ＡＣＴＦＩＳＧＭＭＹ  ＬＩＬＲＫＲＫ
【００６０】
子宮内膜癌細胞を用いて、抗ＥＭＰ２  ＩｇＧ１処置によって腫瘍負荷が顕著に減少し、最終的な生存率が改善した。腫瘍内で顕著な壊死が観察された。また、ＥＭＰ２を減少させるリボザイムまたは特異的なｓｈＲＮＡコンストラクトの発現からも同様の組織構造が明らかとなった。特に、ＥＭＰ２が減少した腫瘍において激しい壊死が観察された。発明者らは、ＥＭＰ２を認識する抗体への曝露後にインビトロで細胞死が増加したことを以前に観察したが、壊死性の反応および本開示で報告する研究により、ＥＭＰ２と、ＨＩＦ−１ａを通じたＶＥＧＦ発現の調節とが結び付けられる。とりわけ、ＥＭＰ２発現について遺伝子改変されたＨＥＣ−１Ａ細胞は、ＥＭＰ２レベルと腫瘍血管分布との間で正の相関を示した。ＥＭＰ２発現について遺伝子改変された細胞からの細胞上清によって、ＥＭＰ２レベルと、２種類の独立した内皮タイプの内皮細胞移動および管形成との間の正の相関が示された。ＶＥＧＦおよびＨｉｆ−１ａのレベルは、ＥＭＰ２の発現レベルとも一致し、抗ＥＭＰ２抗体を用いたＥＭＰ２の封鎖によって、血管新生の用量依存的な減少が示された。さらなる研究は、ＥＭＰ２がどのようにして低酸素反応を調節するかを同定する一助となろう。ここで与えられる研究は全て、ＥＭＰ２発現の調節を通じたＨＩＦ−１ａおよびＶＥＧＦにおける顕著な効果を指摘し、高悪性度のより進行した腫瘍と高ＥＭＰ２発現との臨床的関連性に対する機構を示唆する。
【００６１】
いくつかの癌遺伝子は血管形成を刺激する。理論により縛られるものではないが、Ｓｒｃ依存性の機構を通じてＥＭＰ２がＨＩＦ−１ａを活性化することが想定される。この刺激は、ＡＫＴ活性化と独立であると思われ、ＥＭＰ２およびＡＫＴ機能が互いに独立であることが示唆される。さらに、ＡＫＴ阻害剤はＥＭＰ２介在性のＨＩＦ−１ａ活性化を抑制しなかったものの、ＰＩ３キナーゼ阻害剤であるエルロチニブおよびＬｙ２９４００２は、その発現を阻害するのに十分である。
【００６２】
抗体
本発明は、一般に本明細書中で記載のような治療および／または診断抗体である、抗ＥＭＰ２抗体を提供する。本発明で用途がある抗体は、下記の、従来からの抗体ならびに抗体誘導体、断片および模倣物を含む、本明細書中に記載のような多くの方式を呈し得る。基本的に、本発明は、本明細書中で定められるような、（下記のような少数のアミノ酸変化を含む）一連の６ＣＤＲを含有する抗体構造を提供する。その全体において参照により組み込まれる米国特許第８，３１８，９０６号において抗ＥＭＰ２  ＣＤＲが提供される。
【００６３】
図７において抗ＥＭＰ２抗体の重および軽鎖可変領域配列が提供される。
【００６４】
従来からの抗体構造単位は、一般的には四量体を含む。各四量体は、一般的には、各ペアが１本の「軽」（一般的には分子量が約２５ｋＤａである。）および１本の「重」鎖（一般的には分子量が約５０から７０ｋＤａである。）を有する、ポリペプチド鎖の２組の同一ペアから構成される。ヒト軽鎖は、カッパおよびラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはイプシロンとして分類され、それぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定める。ＩｇＧにはいくつかのサブクラスがあり、これには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が含まれるが限定されない。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むが限定されないサブクラスを有する。したがって、「アイソタイプ」は、本明細書中で使用される場合、それらの定常領域の化学的および抗原性特性により定義される免疫グロブリンのサブクラスの何れかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤおよびＩｇＥである。治療抗体はまた、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドも含み得ることを理解されたい。
【００６５】
各鎖のアミノ末端部分は、抗原認識に主に関与する約１００から１１０またはより多くのアミノ酸の可変領域を含む。可変領域において、３個のループが重鎖および軽鎖のＶドメインのそれぞれに対して集まり、抗原結合部位を形成する。各ループは、相補性決定領域（本明細書中で以後、「ＣＤＲ」と呼ぶ。）と呼ばれ、ここではアミノ酸配列の多様性が最も顕著である。「多様」とは、可変領域のある一定のセグメントの配列が抗体間で広く異なることを指す。可変領域内の変動性は均等に分布しない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９から１５アミノ酸長以上である「超可変領域」と呼ばれる超変動性のより短い領域により分けられる、１５から３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的変化のないストレッチからなる。
【００６６】
各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に、次の順序：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４で並んでいる３個の超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）および４個のＦＲから構成される。
【００６７】
超可変領域は、一般に、軽鎖可変領域中のアミノ酸残基約２４−３４（ＬＣＤＲ１；「Ｌ」は軽鎖を示す。）、５０−５６（ＬＣＤＲ２）および８９−９７（ＬＣＤＲ３）および重鎖可変領域中の約３１−３５Ｂ前後（ＨＣＤＲ１；「Ｈ」は重鎖を示す。）、５０−６５（ＨＣＤＲ２）および９５−１０２（ＨＣＤＲ３）；Ｋａｂａｔら、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈＥｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）および／または超可変ループを形成するこれらの残基のアミノ酸残基を包含する（例えば、軽鎖可変領域中の残基２６−３２（ＬＣＤＲ１）、５０−５２（ＬＣＤＲ２）および９１−９６（ＬＣＤＲ３）および重鎖可変領域中の２６−３２（ＨＣＤＲ１）、５３−５５（ＨＣＤＲ２）および９６−１０１（ＨＣＤＲ３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７。本発明の特異的なＣＤＲを下記で述べる。
【００６８】
本明細書を通じて、可変ドメイン（凡そ、軽鎖可変領域の残基１−１０７および重鎖可変領域の残基１−１１３）中の残基を参照する場合、全般的にＫａｂａｔの付番体系を使用する（例えば、Ｋａｂａｔら、上出（１９９１））。
【００６９】
ＣＤＲは、抗原−結合またはより具体的には抗体のエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」は、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域中の特異的な抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の集団であり、通常、特異的な構造的特徴ならびに特異的な電荷の特徴を有する。１つの抗原は、複数のエピトープを有し得る。例えば、本明細書中で記載のように、抗体は、ＥＭＰ２の推定第二細胞外ドメイン中のエピトープに結合する。
【００７０】
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優勢成分とも呼ばれる。）および結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば特異的に抗原に結合するペプチドにより効果的に阻止されるアミノ酸残基など、を含み得；言い換えると、このアミノ酸残基は、特異的に抗原に結合するペプチドのフットプリント内である。
【００７１】
いくつかの実施形態において、エピトープは配列番号２由来であり、ここで配列番号２は、ＥＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧであり、ヒトＥＭＰ２の第二の細胞外ループからの２０−マーのポリペプチド配列に相当する。
【００７２】
エピトープは、立体構造または直線状の何れかであり得る。立体構造エピトープは、直線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントから空間的に並置されるアミノ酸により生成される。直線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基により生成されるものである。立体構造的および非立体構造的エピトープは、後者ではなく前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるという点で区別され得る。
【００７３】
エピトープは、一般的には特有の空間的配座において少なくとも３以上、通常は少なくとも５または８から１０アミノ酸を含む。同じエピトープを認識する抗体は、ある抗体が標的抗原に対する別の抗体の結合を阻止する能力を示す単純な免疫アッセイ、例えば「ビニング（ｂｉｎｎｉｎｇ）」において証明され得る。
【００７４】
各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能に主に関与する定常領域を定める。Ｋａｂａｔらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多くの一次配列を収集した。配列の保存度に基づき、Ｋａｂａｔらは個々の一次配列をＣＤＲおよびフレームワークに分類し、そのリストを作成した（全体的に参照により組み込まれる、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｎｏ．９１−３２４２，Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔら参照）。
【００７５】
免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスにおいて、重鎖中にいくつかの免疫グロブリンドメインがある。本明細書中で「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、明らかな三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明での関心は、定常重（ＣＨ）ドメインおよびヒンジドメインを含む、重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体との関連で、ＩｇＧアイソタイプはそれぞれ３個のＣＨ領域を有する。したがって、ＩｇＧの関連における「ＣＨ」ドメインは次のとおりである：「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによれば、位置１１８−２２０を指す。「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによれば、位置２３７−３４０を指し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによれば、位置３４１−４４７を指す。
【００７６】
重鎖の別のタイプのＩｇドメインはヒンジ領域である。「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」は、本明細書中で、抗体の第一と第二の定常ドメインとの間のアミノ酸を含むフレキシブルなポリペプチドを意味する。構造的に、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインはＥＵ位置２２０で終わり、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインが残基ＥＵ位置２３７から始まる。したがって、ＩｇＧに対して、抗体ヒンジは、本明細書中で位置２２１（ＩｇＧ１中のＤ２２１）から２３６（ＩｇＧ１中のＧ２３６）を含むように定められ、ここで付番はＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態において、例えばＦｃ領域の関連において、より低いヒンジが含まれ、「より低いヒンジ」は一般に位置２２６または２３０を指す。
【００７７】
本発明での関心は、Ｆｃ領域である。「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」は、本明細書中で使用される場合、第一の定常領域免疫グロブリンドメインを除き、場合によってはヒンジ部を除き、抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。したがって、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２個の定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３個の定常領域免疫グロブリンドメインおよびこれらのドメインに対するフレキシブルなヒンジＮ末端を指す。ＩｇＡおよびＩｇＭの場合、ＦｃはＪ鎖を含み得る。ＩｇＧの場合、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３（Ｃγ２およびＣγ３）およびＣγ１（Ｃγ１）とＣγ２（Ｃγ２）との間のより低いヒンジ領域を含む。Ｆｃ領域の境界が変動し得るものの、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は通常、そのカルボキシル末端に対して残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むように定められ、ここで付番はＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックスによる。いくつかの実施形態において、より詳細に下記で述べるように、例えば１以上のＦｃγＲ受容体へまたはＦｃＲｎ受容体への結合を変化させるために、Ｆｃ領域に対してアミノ酸修飾がなされる。
【００７８】
いくつかの実施形態において、抗体は全長である。「全長抗体」は、本明細書中で、本明細書中で概説されるような１以上の修飾を含む、可変および定常領域を含む、抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。
【００７９】
あるいは、抗体は、それぞれ、抗体断片、モノクローナル抗体、二特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書中で「抗体模倣物」と呼ぶ場合がある。）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合物（「抗体複合体」と呼ぶ場合がある。）およびそれぞれの断片を含むが限定されない、様々な構造であり得る。依然として依存する構造。
【００８０】
ある実施形態において、本抗体は抗体断片である。具体的な抗体断片としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）１つの抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｉｖ）１つの可変領域からなるｄＡｂ断片（全体的に参照により組み込まれる、Ｗａｒｄら、１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、（ｖ）単離ＣＤＲ領域、（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２個の連結されたＦａｂ断片を含む二価断片、（ｖｉｉ）１本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（ここでＶＨドメインおよびＶＬドメインは、抗原結合部位を形成するためにこの２個のドメインを会合させるペプチドリンカーにより連結される。）（全体的に参照により組み込まれる、Ｂｉｒｄら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−５８８３）、（ｖｉｉｉ）二特異性１本鎖Ｆｖ（参照により本明細書によって組み込まれるＷＯ０３／１１１６１）および（ｉｘ）「ダイアボディ」または「トリアボディ」、遺伝子融合により構築される多価または多特異性断片（全て全体的に参照により組み込まれる、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、２０００，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２６：４６１−４７９；ＷＯ９４／１３８０４；Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４−６４４８）が挙げられるが限定されない。いくつかの実施形態において、抗体は、異なる種からの混合物、例えばキメラ抗体および／またはヒト化抗体であり得る。つまり、本発明において、本明細書中で配列により具体的に記載されるもの以外のフレームワークおよび定常領域とともにＣＤＲセットを使用し得る。
【００８１】
一般に、「キメラ抗体」および「ヒト化抗体」の両者とも、複数の種からの領域を結び付ける抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、従来、マウス（または場合によってはラット）からの可変領域およびヒトからの定常領域を含む。「ヒト化抗体」は、一般に、ヒト抗体で見られる配列と交換された可変ドメインフレームワーク領域を有した非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体において、ＣＤＲを除く抗体全体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによりコードされるか、または、そのＣＤＲ内を除きこのような抗体と同一である。ＣＤＲ、非ヒト生物起源の核酸によりコードされる一部または全てをヒト抗体可変領域のβシートフレームワークに移植して抗体を作製し、その特異性は、移植ＣＤＲにより決定される。このような抗体の作製は、例えば、全て全体的に参照により組み込まれる、ＷＯ９２／１１０１８、Ｊｏｎｅｓ，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５，Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６に記載される。対応するドナー残基に対する選択されるアクセプターフレームワーク残基の「復帰突然変異」は、最初の移植コンストラクトで失われる親和性を取り戻すことが必要となることが多い（全て全体的に参照により組み込まれる、ＵＳ５５３０１０１；ＵＳ５５８５０８９；ＵＳ５６９３７６１；ＵＳ５６９３７６２；ＵＳ６１８０３７０；ＵＳ５８５９２０５；ＵＳ５８２１３３７；ＵＳ６０５４２９７；ＵＳ６４０７２１３）。ヒト化抗体は、最適に、一般的にはヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部も含み、したがって一般的にはヒトＦｃ領域を含む。ヒト化抗体はまた、遺伝子操作された免疫系を有するマウスを用いて作製され得る。全体的に参照により組み込まれる、Ｒｏｑｕｅら、２００４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２０：６３９−６５４。非ヒト抗体をヒト化し、再形成するための様々な技術および方法は当技術分野で周知である（全て全体的に参照により組み込まれる、ＴｓｕｒｕｓｈｉｔａおよびＶａｓｑｕｅｚ、２００４，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂ  Ｃｅｌｌｓ，５３３−５４５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＵＳＡ）およびその中で引用される参考文献参照）。ヒト化法としては、全て全体的に参照により組み込まれる、Ｊｏｎｅｓら、１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８；Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６；Ｑｕｅｅｎら、１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ８６：１００２９−３３；Ｈｅら、１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１０２９−１０３５；Ｃａｒｔｅｒら、１９９２，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−９，Ｐｒｅｓｔａら、１９９７，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７（２０）：４５９３−９；Ｇｏｒｍａｎら、１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４１８１−４１８５；Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒら、１９９８，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎ���  １１：３２１−８に記載の方法が挙げられるが限定されない。非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低下させるヒト化または他の方法としては、例えば全体的に参照により組み込まれるＲｏｇｕｓｋａら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９６９−９７３に記載のようなリサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）法を挙げることができる。ある実施形態において、親抗体は、当技術分野で公知であるように親和性成熟されている。ヒト化および親和性成熟のために、例えばＵＳＳＮ１１／００４，５９０に記載のような、構造に基づく方法が採用され得る。抗体可変領域をヒト化しおよび／または親和性成熟させるために、全て全体的に参照により組み込まれる、Ｗｕら、１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９４：１５１−１６２；Ｂａｃａら、１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８−１０６８４；Ｒｏｓｏｋら、１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１（３７）：２２６１１−２２６１８；Ｒａｄｅｒら、１９９８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：８９１０−８９１５；Ｋｒａｕｓｓら、２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６（１０）：７５３−７５９に記載の方法を含むが限定されない、選択に基づく方法が採用され得る。他のヒト化は、全て全体的に参照により組み込まれる、ＵＳＳＮ０９／８１０，５１０；Ｔａｎら、２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９−１１２５；Ｄｅ  Ｐａｓｃａｌｉｓら、２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：３０７６−３０８４に記載の方法が含まれるが限定されない、ＣＤＲの一部のみを移植することを含み得る。
【００８２】
ある実施形態において、本発明の抗体は、多特異性抗体およびとりわけ二特異性抗体であり得る。これらは、２個（またはそれ以上）の異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに結合する抗体である。
【００８３】
いくつかの実施形態において、抗体はダイアボディである。
【００８４】
ある実施形態において、本抗体はミニボディである。ミニボディは、ＣＨ３ドメインに連結されたｓｃＦｖを含む最小化抗体様タンパク質である。全体的に参照により組み込まれるＨｕら、１９９６，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５６：３０５５−３０６１。いくつかのケースにおいて、ｓｃＦｖはＦｃ領域に連結され得、一部のまたは全ヒンジ領域を含み得る。
【００８５】
本発明の抗体は、一般に単離されているかまたは組み換えられている。「単離されている」とは、本明細書中で開示される様々なポリペプチドを記載するために使用する場合、同定されており、それが発現される細胞または細胞培養物から分離および／または回収されているポリペプチドを意味する。通常は、単離ポリペプチドは少なくとも１回の精製段階により調製される。「単離抗体」とは、異なる抗原特性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。例えば、ＥＭＰ２に特異的に結合する単離抗体は、ＥＭＰ２以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない。
【００８６】
しかし、ヒトＥＭＰ２またはマウスＥＭＰ２のエピトープ、アイソフォームまたは変異体に特異的に結合する単離抗体は、他の関連抗原、例えば他の種、例えばＥＭＰ２種ホモローグなどと交差反応性を有し得る。さらに、単離抗体は、他の細胞性物質および／または化学物質を実質的に含み得ない。
【００８７】
異なる特性を有する単離モノクローナル抗体を明確に定められた組成物中で組み合わせ得る。したがって、必要に応じて、例えば開示される抗体の全ての可能な組み合わせを１つの処方物中で組み合わせ得る。
【００８８】
例えば、米国特許第８，３１８，９０６号に記載のように、次のヒト起源抗体配列は、ヒト（ＫＳ４９、ＫＳ８３）およびマウス（ＫＳ８３）ＥＭＰ２に特異的な高い結合活性抗体をコードし、本発明の何れかの態様での使用に適切な抗体可変領域重および軽鎖を有する：
ＫＳ４９重鎖−
Ｍ  Ａ  Ｑ  Ｖ  Ｑ  Ｌ  Ｖ  Ｑ  Ｓ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｖ  Ｖ  Ｑ  Ｐ  Ｇ  Ｒ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｌ  Ｓ  Ｃ  Ａ  Ａ  Ｓ  Ｇ  Ｆ  Ｔ  Ｆ  Ｓ  Ｓ  Ｙ  Ａ  Ｍ  Ｈ  Ｗ  Ｖ  Ｒ  Ｑ  Ａ  Ｐ  Ｇ  Ｋ  Ｇ  Ｌ  Ｅ  Ｗ  Ｖ  Ａ  Ｖ  Ｉ  Ｓ  Ｙ  Ｄ  Ｇ  Ｓ  Ｎ  Ｋ  Ｙ  Ｙ  Ａ  Ｄ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｒ  Ｆ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｒ  Ｄ  Ｎ  Ｓ  Ｋ  Ｎ  Ｔ  Ｌ  Ｙ  Ｌ  Ｑ  Ｍ  Ｎ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ａ  Ｅ  Ｄ  Ｔ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ａ  Ｒ  Ｄ  Ｒ  Ｒ  Ｇ  Ｒ  Ｋ  Ｓ  Ａ  Ｇ  Ｉ  Ｄ  Ｙ  Ｗ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｌ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ｓ  Ｓ  
ＫＳ４９  軽鎖−
Ｄ  Ｉ  Ｑ  Ｍ  Ｔ  Ｑ  Ｓ  Ｐ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ｖ  Ｇ  Ｄ  Ｒ  Ｖ  Ｔ  Ｉ  Ｔ  Ｃ  Ｑ  Ａ  Ｓ  Ｑ  Ｄ  Ｉ  Ｓ  Ｎ  Ｙ  Ｌ  Ｎ  Ｗ  Ｙ  Ｑ  Ｑ  Ｋ  Ｐ  Ｇ  Ｋ  Ａ  Ｐ  Ｋ  Ｌ  Ｌ  Ｉ  Ｙ  Ａ  Ａ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｑ  Ｓ  Ｇ  Ｖ  Ｐ  Ｓ  Ｒ  Ｆ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｔ  Ｄ  Ｆ  Ｔ  Ｌ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｑ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｆ  Ａ  Ｔ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ｌ  Ｑ  Ｄ  Ｙ  Ｎ  Ｇ  Ｗ  Ｔ  Ｆ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｋ  Ｖ  Ｄ  Ｉ  Ｋ  Ｒ  Ａ  Ａ  Ａ  Ｅ  Ｑ  Ｋ  Ｌ  Ｉ  Ｓ  Ｅ  Ｅ  Ｄ  Ｌ  Ｎ  Ｇ  Ａ  Ａ
ＫＳ８３重鎖−
Ｍ  Ａ  Ｑ  Ｖ  Ｑ  Ｌ  Ｖ  Ｅ  Ｓ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｌ  Ｖ  Ｑ  Ｐ  Ｇ  Ｇ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｌ  Ｓ  Ｃ  Ａ  Ａ  Ｓ  Ｇ  Ｆ  Ｔ  Ｆ  Ｓ  Ｓ  Ｙ  Ａ  Ｍ  Ｈ  Ｗ  Ｖ  Ｒ  Ｑ  Ａ  Ｐ  Ｇ  Ｋ  Ｇ  Ｌ  Ｅ  Ｗ  Ｖ  Ａ  Ｖ  Ｉ  Ｓ  Ｙ  Ｄ  Ｇ  Ｓ  Ｎ  Ｋ  Ｙ  Ｙ  Ａ  Ｄ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｒ  Ｆ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｒ  Ｄ  Ｎ  Ｓ  Ｋ  Ｎ  Ｔ  Ｌ  Ｙ  Ｌ  Ｑ  Ｍ  Ｎ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ａ  Ｅ  Ｄ  Ｔ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ａ  Ｒ  Ｔ  Ｖ  Ｇ  Ａ  Ｔ  Ｇ  Ａ  Ｆ  Ｄ  Ｉ  Ｗ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｍ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ｓ  Ｓ  Ｓ  
ＫＳ８３軽鎖−
Ｄ  Ｉ  Ｖ  Ｍ  Ｔ  Ｑ  Ｓ  Ｐ  Ｓ  Ｔ  Ｖ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ｖ  Ｇ  Ｄ  ＲＶ  Ｉ  Ｉ  Ｐ  Ｃ  Ｒ  Ａ  Ｓ  Ｑ  Ｓ  Ｉ  Ｇ  Ｋ  Ｗ  Ｌ  ＡＷ  Ｙ  Ｑ  Ｑ  Ｋ  Ｐ  Ｇ  Ｋ  Ａ  Ｐ  Ｋ  Ｌ  Ｌ  Ｉ  Ｙ  Ｋ  Ａ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｅ  Ｇ  Ｗ  Ｖ  Ｐ  Ｓ  Ｒ  Ｆ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｔ  Ｅ  Ｆ  Ｓ  Ｌ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｑ  Ｐ  Ｄ  Ｄ  Ｓ  Ａ  Ｔ  Ｙ  Ｖ  Ｃ  Ｑ  Ｑ  Ｓ  Ｈ  Ｎ  Ｆ  Ｐ  Ｐ  Ｔ  Ｆ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｔ  Ｋ  Ｌ  Ｅ  Ｉ  Ｋ  Ｒ  Ａ  Ａ  Ａ  Ｅ  Ｑ  Ｋ  Ｌ  Ｉ  Ｓ  Ｅ  Ｅ  Ｄ  Ｌ  Ｎ  Ｇ  Ａ  Ａ
【００８９】
本発明の何れかの態様による使用に対する他のダイアボディはＫＳ４１およびＫＳ８９を含む：
ＫＳ４１重鎖−
Ｍ  Ａ  Ｑ  Ｖ  Ｑ  Ｌ  Ｖ  Ｑ  Ｓ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｌ  Ｖ  Ｑ  Ｐ  Ｇ  Ｒ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｌ  Ｓ  Ｃ  Ａ  Ａ  Ｓ  Ｇ  Ｆ  Ｓ  Ｆ  Ｓ  Ｅ  Ｙ  Ｐ  Ｍ  Ｈ  Ｗ  Ｖ  Ｒ  Ｑ  Ａ  Ｐ  Ｇ  Ｒ  Ｇ  Ｌ  Ｅ  Ｓ  Ｖ  Ａ  Ｖ  Ｉ  Ｓ  Ｙ  Ｄ  Ｇ  Ｅ  Ｙ  Ｑ  Ｋ  Ｙ  Ａ  Ｄ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｒ  Ｆ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｒ  Ｄ  Ｄ  Ｓ  Ｋ  Ｓ  Ｔ  Ｖ  Ｙ  Ｌ  Ｑ  Ｍ  Ｎ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｔ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ａ  Ｒ  Ｔ  Ｉ  Ｎ  Ｎ  Ｇ  Ｍ  Ｄ  Ｖ  Ｗ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｔ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ｓ  Ｓ
ＫＳ４１軽鎖−
Ｄ  Ｉ  Ｖ  Ｍ  Ｔ  Ｑ  Ｓ  Ｐ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ｖ  Ｇ  Ｄ  Ｒ  Ｖ  Ｔ  Ｉ  Ｔ  Ｃ  Ｒ  Ａ  Ｓ  Ｑ  Ｇ  Ｉ  Ｒ  Ｎ  Ｄ  Ｌ  Ｇ  Ｗ  Ｙ  Ｑ  Ｑ  Ｋ  Ｐ  Ｇ  Ｋ  Ａ  Ｐ  Ｅ  Ｌ  Ｌ  Ｉ  Ｙ  Ｇ  Ａ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｑ  Ｓ  Ｇ  Ｖ  Ｐ  Ｓ  Ｒ  Ｆ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｔ  Ｄ  Ｆ  Ｔ  Ｌ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｑ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｓ  Ａ  Ｔ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ｌ  Ｑ  Ｄ  Ｙ  Ｎ  Ｇ  Ｗ  Ｔ  Ｆ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｋ  Ｌ  Ｅ  Ｉ  Ｋ  Ｒ  Ａ  Ａ  Ａ  Ｅ  Ｑ  Ｋ  Ｌ  Ｉ  Ｓ  Ｅ  Ｅ  Ｄ  Ｌ  Ｎ  Ｇ  Ａ  Ａ
ＫＳ８９重鎖−
Ｍ  Ａ  Ｑ  Ｖ  Ｑ  Ｌ  Ｖ  Ｑ  Ｓ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｌ  Ｖ  Ｑ  Ｐ  Ｇ  Ｒ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｌ  Ｓ  Ｃ  Ａ  Ａ  Ｓ  Ｇ  Ｆ  Ｓ  Ｆ  Ｓ  Ｅ  Ｙ  Ｐ  Ｍ  Ｈ  Ｗ  Ｖ  Ｒ  Ｑ  Ａ  Ｐ  Ｇ  Ｒ  Ｇ  Ｌ  Ｅ  Ｓ  Ｖ  Ａ  Ｖ  Ｉ  Ｓ  Ｙ  Ｄ  Ｇ  Ｅ  Ｙ  Ｑ  Ｋ  Ｙ  Ａ  Ｄ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｒ  Ｆ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｒ  Ｄ  Ｄ  Ｓ  Ｋ  Ｓ  Ｔ  Ｖ  Ｙ  Ｌ  Ｑ  Ｍ  Ｎ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｔ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ａ  Ｒ  Ｔ  Ｉ  Ｎ  Ｎ  Ｇ  Ｍ  Ｄ  Ｖ  Ｗ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｔ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ｓ  Ｓ
ＫＳ８９軽鎖−
Ｄ  Ｉ  Ｖ  Ｍ  Ｔ  Ｑ  Ｓ  Ｐ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ｖ  Ｇ  Ｄ  Ｒ  Ｖ  Ｔ  Ｉ  Ｔ  Ｃ  Ｒ  Ａ  Ｓ  Ｑ  Ｇ  Ｉ  Ｒ  Ｎ  Ｄ  Ｌ  Ｇ  Ｗ  Ｙ  Ｑ  Ｑ  Ｋ  Ｐ  Ｇ  Ｋ  Ａ  Ｐ  Ｅ  Ｌ  Ｌ  Ｉ  Ｙ  Ｇ  Ａ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｑ  Ｓ  Ｇ  Ｖ  Ｐ  Ｓ  Ｒ  Ｆ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｔ  Ｄ  Ｆ  Ｔ  Ｌ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｑ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｓ  Ａ  Ｔ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ｌ  Ｑ  Ｄ  Ｙ  Ｎ  Ｇ  Ｗ  Ｔ  Ｆ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｋ  Ｌ  Ｅ  Ｉ  Ｋ  Ｒ  Ａ  Ａ  Ａ  Ｅ  Ｑ  Ｋ  Ｌ  Ｉ  Ｓ  Ｅ  Ｅ  Ｄ  Ｌ  Ｎ  Ｇ  Ａ  Ａ
【００９０】
ネイティブ抗体、断片抗体または合成バックボーンを含むバックボーン上のタンパク質をコードするために使用される抗ＥＭＰ−２可変領域配列は、ＥＭＰ−２に強く結合し得る。この結合を介して、これらのタンパク質は、ＥＭＰ−２検出のために、およびＥＭＰ−２機能を阻止するために使用され得る。ネイティブ抗体バックボーン上の、または放射性核種で標識される、ｓｃＦｖ、トリアボディ、ダイアボディまたはミニボディとしての、これらの可変領域配列の発現は、ＥＭＰ−２を有する細胞のインビボ検出において特に有用である。これらのバックボーンまたはネイティブ抗体バックボーンにおける発現は、インビボでＥＭＰ−２の機能を阻止し、および／またはＥＭＰ−２を有する細胞（例えば婦人科系腫瘍）を死滅させるために有利である。
【００９１】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１およびＫＳ８９から選択される抗体のＣＤＲ領域を含む抗ＥＭＰ−２配列を提供する。本発明により提供されるＣＤＲ領域は、抗体、ｓｃＦｖ、トリアボディ、ダイアボディ、ミニボディなどを含むが限定されない抗ＥＭＰ−２結合タンパク質を構築するために使用され得る。ある一定の実施形態において、本発明の抗ＥＭＰ−２結合タンパク質は、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１およびＫＳ８９から選択される抗体からの少なくとも１個のＣＤＲ領域を含む。抗ＥＭＰ−２結合タンパク質は、本明細書中で提供される抗体からの、例えばＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３またはそれらの組み合わせを含み得る。本発明の特定の実施形態において、抗ＥＭＰ−２結合タンパク質は、本明細書中で提供される抗体の全３個のＣＤＲ−Ｈ配列、本明細書中で提供される抗体の全３個のＣＤＲ−Ｌ配列またはそれらの両方を含み得る。抗ＥＭＰ２ＣＤＲ配列は、抗体バックボーンまたはそれらの断片上で使用され得、同様に、ヒト化抗体またはヒト化配列を含有する抗体を含み得る。例えばＥＭＰ−２を検出するために、インビボでＥＭＰ−２を発現する細胞を検出するために、またはＥＭＰ−２機能を阻止するために、これらの抗体を使用し得る。いくつかの実施形態において、ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔの定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、コンタクト定義（ｃｏｎｔａｃｔ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）または何らかの他の適切なＣＤＲ付番体系を用いて定義され得る。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ＣＤＲは次のとおりである：
ＣＤＲ１重
ＳＹＡＭＨ（４９）（配列番号１４）
ＳＹＡＭＨ（８３）（配列番号１４）
ＥＹＰＭＨ（４１）（配列番号１５）
ＥＹＰＭＨ（８９）（配列番号１５）
ＣＤＲ２重
ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（４９）（配列番号１６）
ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹ  ＡＤＳＶＫＧ（８３）（配列番号１６）
ＶＩＳＹＤＧＥＹＱＫＹＡＤＳＶＫＧ（４１）（配列番号１７）
ＶＩＳＹＤＧＥＹＱＫＹ  ＡＤＳＶＫＧ（８９）（配列番号１７）
ＣＤＲ３重
ＤＲＲＧＲＫＳＡＧＩＤＹ（４９）（配列番号３９）
ＴＶＧＡＴＧＡＦＤＩ（８３）（配列番号３７）
ＴＩＮＮＧＭＤＶ（４１）（配列番号４１）
ＴＩＮＮＧＭＤＶ（８９）（配列番号４１）
ＣＤＲ１軽
ＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（４９）（配列番号１９）
ＲＡＳＱＳＩＧＫＷＬＡ（８３）（配列番号１８）
ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ（４１）（配列番号２０）
ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ（８９）（配列番号２０）
【００９３】
いくつかの実施形態において、ＣＤＲは次のとおりである：
【００９４】
ダイアボディ配列（ＫＳ４９）
重鎖、ＫＳ４９
Ｍ  Ａ  Ｑ  Ｖ  Ｑ  Ｌ  Ｖ  Ｑ  Ｓ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｖ  Ｖ  Ｑ  Ｐ  Ｇ  Ｒ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｌ  Ｓ  Ｃ  Ａ  Ａ  Ｓ  Ｇ  Ｆ  Ｔ  Ｆ  Ｓ  Ｓ  Ｙ  Ａ  Ｍ  Ｈ  Ｗ  Ｖ  Ｒ  Ｑ  Ａ  Ｐ  Ｇ  Ｋ  Ｇ  Ｌ  Ｅ  Ｗ  Ｖ  Ａ  Ｖ  Ｉ  Ｓ  Ｙ  Ｄ  Ｇ  Ｓ  Ｎ  Ｋ  Ｙ  Ｙ  Ａ  Ｄ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｒ  Ｆ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｒ  Ｄ  Ｎ  Ｓ  Ｋ  Ｎ  Ｔ  Ｌ  Ｙ  Ｌ  Ｑ  Ｍ  Ｎ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ａ  Ｅ  Ｄ  Ｔ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ａ  Ｒ  Ｄ  Ｒ  Ｒ  Ｇ  Ｒ  Ｋ  Ｓ  Ａ  Ｇ  Ｉ  Ｄ  Ｙ  Ｗ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｌ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ｓ  
ＣＤＲ１  ＳＹＡＭＨ
ＣＤＲ２  ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ
軽鎖、ＫＳ４９
Ｄ  Ｉ  Ｑ  Ｍ  Ｔ  Ｑ  Ｓ  Ｐ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ｖ  Ｇ  Ｄ  Ｒ  Ｖ  Ｔ  Ｉ  Ｔ  Ｃ  Ｑ  Ａ  Ｓ  Ｑ  Ｄ  Ｉ  Ｓ  Ｎ  Ｙ  Ｌ  Ｎ  Ｗ  Ｙ  Ｑ  Ｑ  Ｋ  Ｐ  Ｇ  Ｋ  Ａ  Ｐ  Ｋ  Ｌ  Ｌ  Ｉ  Ｙ  Ａ  Ａ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｑ  Ｓ  Ｇ  Ｖ  Ｐ  Ｓ  Ｒ  Ｆ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｔ  Ｄ  Ｆ  Ｔ  Ｌ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｑ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｆ  Ａ  Ｔ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ｌ  Ｑ  Ｄ  Ｙ  Ｎ  Ｇ  Ｗ  Ｔ  Ｆ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｋ  Ｖ  Ｄ  Ｉ  Ｋ  Ｒ  Ａ  Ａ  Ａ  Ｅ  Ｑ  Ｋ  Ｌ  Ｉ  Ｓ  Ｅ  Ｅ  Ｄ  Ｌ  Ｎ  Ｇ  Ａ  Ａ  
ＣＤＲ  １  ＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ
ＣＤＲ２  ＡＡＳＳＬＱＳ
ダイアボディ配列（ＫＳ８３）
重鎖、ＫＳ８３
Ｍ  Ａ  Ｑ  Ｖ  Ｑ  Ｌ  Ｖ  Ｅ  Ｓ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｌ  Ｖ  Ｑ  Ｐ  Ｇ  Ｇ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｌ  Ｓ  Ｃ  Ａ  Ａ  Ｓ  Ｇ  Ｆ  Ｔ  Ｆ  Ｓ  Ｓ  Ｙ  Ａ  Ｍ  Ｈ  Ｗ  Ｖ  Ｒ  Ｑ  Ａ  Ｐ  Ｇ  Ｋ  Ｇ  Ｌ  Ｅ  Ｗ  Ｖ  Ａ  Ｖ  Ｉ  Ｓ  Ｙ  Ｄ  Ｇ  Ｓ  Ｎ  Ｋ  Ｙ  Ｙ  Ａ  Ｄ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｒ  Ｆ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｒ  Ｄ  Ｎ  Ｓ  Ｋ  Ｎ  Ｔ  Ｌ  Ｙ  Ｌ  Ｑ  Ｍ  Ｎ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ａ  Ｅ  Ｄ  Ｔ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ａ  Ｒ  Ｔ  Ｖ  Ｇ  Ａ  Ｔ  Ｇ  Ａ  Ｆ  Ｄ  Ｉ  Ｗ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｍ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ｓ  Ｓ  
ＣＤＲ１  ＳＹＡＭＨ
ＣＤＲ２  ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ
軽鎖、ＫＳ８３
Ｄ  Ｉ  Ｖ  Ｍ  Ｔ  Ｑ  Ｓ  Ｐ  Ｓ  Ｔ  Ｖ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ｖ  Ｇ  Ｄ  ＲＶ  Ｉ  Ｉ  Ｐ  Ｃ  Ｒ  Ａ  Ｓ  Ｑ  Ｓ  Ｉ  Ｇ  Ｋ  Ｗ  Ｌ  ＡＷ  Ｙ  Ｑ  Ｑ  Ｋ  Ｐ  Ｇ  Ｋ  Ａ  Ｐ  Ｋ  Ｌ  Ｌ  Ｉ  Ｙ  Ｋ  Ａ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｅ  Ｇ  Ｗ  Ｖ  Ｐ  Ｓ  Ｒ  Ｆ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｔ  Ｅ  Ｆ  Ｓ  Ｌ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｑ  Ｐ  Ｄ  Ｄ  Ｓ  Ａ  Ｔ  Ｙ  Ｖ  Ｃ  Ｑ  Ｑ  Ｓ  Ｈ  Ｎ  Ｆ  Ｐ  Ｐ  Ｔ  Ｆ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｔ  Ｋ  Ｌ  Ｅ  Ｉ  Ｋ  Ｒ  Ａ  Ａ  Ａ  Ｅ  Ｑ  Ｋ  Ｌ  Ｉ  Ｓ  Ｅ  Ｅ  Ｄ  Ｌ  Ｎ  Ｇ  Ａ  Ａ
ＣＤＲ１    ＲＡＳＱＳＩＧＫＷＬＡ
ＣＤＲ２  ＫＡＳＳＬＥＧ
ダイアボディ配列（ＫＳ４１）
重鎖、ＫＳ４１
Ｍ  Ａ  Ｑ  Ｖ  Ｑ  Ｌ  Ｖ  Ｑ  Ｓ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｌ  Ｖ  Ｑ  Ｐ  Ｇ  Ｒ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｌ  Ｓ  Ｃ  Ａ  Ａ  Ｓ  Ｇ  Ｆ  Ｓ  Ｆ  Ｓ  Ｅ  Ｙ  Ｐ  Ｍ  Ｈ  Ｗ  Ｖ  Ｒ  Ｑ  Ａ  Ｐ  Ｇ  Ｒ  Ｇ  Ｌ  Ｅ  Ｓ  Ｖ  Ａ  Ｖ  Ｉ  Ｓ  Ｙ  Ｄ  Ｇ  Ｅ  Ｙ  Ｑ  Ｋ  Ｙ  Ａ  Ｄ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｒ  Ｆ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｒ  Ｄ  Ｄ  Ｓ  Ｋ  Ｓ  Ｔ  Ｖ  Ｙ  Ｌ  Ｑ  Ｍ  Ｎ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｔ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ａ  Ｒ  Ｔ  Ｉ  Ｎ  Ｎ  Ｇ  Ｍ  Ｄ  Ｖ  Ｗ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｔ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ｓ  Ｓ
ＣＤＲ  １  ＥＹＰＭＨ
ＣＤＲ  ２    ＶＩＳＹＤＧＥＹＱＫＹＡＤＳＶＫＧ
軽鎖、ＫＳ４１
Ｄ  Ｉ  Ｖ  Ｍ  Ｔ  Ｑ  Ｓ  Ｐ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ｖ  Ｇ  Ｄ  Ｒ  Ｖ  Ｔ  Ｉ  Ｔ  Ｃ  Ｒ  Ａ  Ｓ  Ｑ  Ｇ  Ｉ  Ｒ  Ｎ  Ｄ  Ｌ  Ｇ  Ｗ  Ｙ  Ｑ  Ｑ  Ｋ  Ｐ  Ｇ  Ｋ  Ａ  Ｐ  Ｅ  Ｌ  Ｌ  Ｉ  Ｙ  Ｇ  Ａ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｑ  Ｓ  Ｇ  Ｖ  Ｐ  Ｓ  Ｒ  Ｆ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｔ  Ｄ  Ｆ  Ｔ  Ｌ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｑ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｓ  Ａ  Ｔ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ｌ  Ｑ  Ｄ  Ｙ  Ｎ  Ｇ  Ｗ  Ｔ  Ｆ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｋ  Ｌ  Ｅ  Ｉ  Ｋ  Ｒ  Ａ  Ａ  Ａ  Ｅ  Ｑ  Ｋ  Ｌ  Ｉ  Ｓ  Ｅ  Ｅ  Ｄ  Ｌ  Ｎ  Ｇ  Ａ  Ａ
ＣＤＲ  １  ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ
ＣＤＲ  ２  ＧＡＳＳＬＱＳ
ダイアボディ配列（ＫＳ８９）
重鎖、ＫＳ８９
Ｍ  Ａ  Ｑ  Ｖ  Ｑ  Ｌ  Ｖ  Ｑ  Ｓ  Ｇ  Ｇ  Ｇ  Ｌ  Ｖ  Ｑ  Ｐ  Ｇ  Ｒ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｌ  Ｓ  Ｃ  Ａ  Ａ  Ｓ  Ｇ  Ｆ  Ｓ  Ｆ  Ｓ  Ｅ  Ｙ  Ｐ  Ｍｔ  Ｈ  Ｗ  Ｖ  Ｒ  Ｑ  Ａ  Ｐ  Ｇ  Ｒ  Ｇ  Ｌ  Ｅ  Ｓ  Ｖ  Ａ  Ｖ  Ｉ  Ｓ  Ｙ  Ｄ  Ｇ  Ｅ  Ｙ  Ｑ  Ｋ  Ｙ  Ａ  Ｄ  Ｓ  Ｖ  Ｋ  Ｇ  Ｒ  Ｆ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｒ  Ｄ  Ｄ  Ｓ  Ｋ  Ｓ  Ｔ  Ｖ  Ｙ  Ｌ  Ｑ  Ｍ  Ｎ  Ｓ  Ｌ  Ｒ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｔ  Ａ  Ｖ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ａ  Ｒ  Ｔ  Ｉ  Ｎ  Ｎ  Ｇ  Ｍ  Ｄ  Ｖ  Ｗ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｔ  Ｖ  Ｔ  Ｖ  Ｓ  Ｓ
ＣＤＲ１  ＥＹＰＭＨ
ＣＤＲ  ２    ＶＩＳＹＤＧＥＹＱＫＹＡＤＳＶＫＧ
軽鎖、ＫＳ８９
Ｄ  Ｉ  Ｖ  Ｍｅｔ  Ｔ  Ｑ  Ｓ  Ｐ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｓ  Ａ  Ｓ  Ｖ  Ｇ  Ｄ  Ｒ  Ｖ  Ｔ  Ｉ  Ｔ  Ｃ  Ｒ  Ａ  Ｓ  Ｑ  Ｇ  Ｉ  Ｒ  Ｎ  Ｄ  Ｌ  Ｇ  Ｗ  Ｙ  Ｑ  Ｑ  Ｋ  Ｐ  Ｇ  Ｋ  Ａ  Ｐ  Ｅ  Ｌ  Ｌ  Ｉ  Ｙ  Ｇ  Ａ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｑ  Ｓ  Ｇ  Ｖ  Ｐ  Ｓ  Ｒ  Ｆ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｓ  Ｇ  Ｔ  Ｄ  Ｆ  Ｔ  Ｌ  Ｔ  Ｉ  Ｓ  Ｓ  Ｌ  Ｑ  Ｐ  Ｅ  Ｄ  Ｓ  Ａ  Ｔ  Ｙ  Ｙ  Ｃ  Ｌ  Ｑ  Ｄ  Ｙ  Ｎ  Ｇ  Ｗ  Ｔ  Ｆ  Ｇ  Ｑ  Ｇ  Ｔ  Ｋ  Ｌ  Ｅ  Ｉ  Ｋ  Ｒ  Ａ  Ａ  Ａ  Ｅ  Ｑ  Ｋ  Ｌ  Ｉ  Ｓ  Ｅ  Ｅ  Ｄ  Ｌ  Ｎ  Ｇ  Ａ  Ａ
ＣＤＲ  １  ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ
ＣＤＲ  ２  ＧＡＳＳＬＱＳ
【００９５】
いくつかの実施形態において、本発明は、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１およびＫＳ８９から選択されるダイアボディのＣＤＲを有する、抗体（例えば、ダイアボディ、ミニボディ、トリアボディ）またはその断片を提供する。いくつかの実施形態において、これらの抗体は、ポリヒスチジンタグを欠く。その他の実施形態において、ダイアボディは、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１またはＫＳ８９ダイアボディの軽および重鎖を保持する。さらに他の実施形態において、本抗体は、ポリヒスチジンタグありまたはなしの、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１およびＫＳ８９からなる群から選択されるダイアボディと配列が実質的に同一である。さらに他の実施形態において、本抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１およびＫＳ８９からなる群から選択されるダイアボディの軽および重鎖配列と配列が実質的に同一である。これらの同一性は、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％および好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上のアミノ酸配列同一性であり得る。上記の何れかのいくつかのさらなる実施形態において、本抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１またはＫＳ８９ダイアボディの配列と同一であるＣＤＲ配列を含む。
【００９６】
本発明の抗ＥＭＰ２抗体は、ＥＭＰ２リガンド（例えば配列番号１および２のヒトおよびマウスＥＭＰ２タンパク質）に特異的に結合する。
【００９７】
例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ以上の抗原またはエピトープに対するＫＤを有する抗体によって、特定の抗原またはエピトープに対する特異的な結合が示され得るが、ＫＤとは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。一般的には、抗原に特異的に結合する抗体のＫＤは、抗原またはエピトープに対して、対照分子の、２０−、５０−、１００−、５００−、１０００−、５，０００−、１０，０００−倍以上大きい。また、対照に対してエピトープについて、少なくとも２０−、５０−、１００−、５００−、１０００−、５，０００−、１０，０００−倍以上大きい、抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａを有する抗体は、特定の抗原またはエピトープに対する特異的な結合を示し得、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。
【００９８】
本発明の抗ＥＭＰ２抗体は、ＥＭＰ２リガンド（例えば配列番号１および２のヒトおよびマウスＥＭＰ２タンパク質）に特異的に結合する。「特異的な結合」または「に特異的に結合する」または特定の抗原またはエピトープ「に特異的な」は、例えば、非特異的な相互作用と、測定可能な程度異なる結合を意味する。一般に結合活性を有しない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して分子の結合を調べることによって、特異的な結合を測定し得る。例えば、標的と類似する対照分子との競合によって特異的な結合を調べ得る。
【００９９】
例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ以上の抗原またはエピトープに対するＫＤを有する抗体は、特定の抗原またはエピトープに対する特異的な結合を示し得るが、ＫＤは特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を指す。一般的には、抗原に特異的に結合する抗体のＫＤは、抗原またはエピトープに対して、対照分子の、２０−、５０−、１００−、５００−、１０００−、５，０００−、１０，０００−倍以上大きい。
【０１００】
また、例えば、対照に対して、エピトープについて少なくとも２０−、５０−、１００−、５００−、１０００−、５，０００−、１０，０００−倍以上大きい抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａを有する抗体も特定の抗原またはエピトープに対する特異的な結合を示し得るが、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。
【０１０１】
抗体修飾
本発明は変異体抗体をさらに提供する。すなわち、ＣＤＲ中のアミノ酸修飾（親和性成熟）Ｆｃ領域のアミノ酸修飾、グリコシル化変異、他のタイプの共有修飾などを含むが限定されない本発明の抗体に対してなされ得る多くの修飾がある。
【０１０２】
「変異体」は、本明細書中で、少なくとも１個のアミノ酸修飾に基づく、親ポリペプチドとは異なるポリペプチド配列を意味する。アミノ酸修飾は、置換、挿入および欠失を含み得、多くの場合、置換が好ましい。
【０１０３】
一般に、変異体は、本明細書中で記載のように、タンパク質の機能が依然として存在する限り、あらゆる数の修飾を含み得る。
【０１０４】
しかし、一般に、最小数の修飾で機能を変化させることが目的であることが多いので、１から、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸の置換が一般に利用される。いくつかのケースにおいて、１から５個の修飾があり、多くの実施形態では１から２、１から３および１から４個の修飾も見られる。
【０１０５】
注目すべきは、アミノ酸修飾の多くが、機能的ドメイン内であり得ることであり：例えば、野生型または改変タンパク質のＦｃ領域中の１から５個の修飾ならびに例えばＦｖ領域中の１から５個の修飾を有することが所望され得る。変異ポリペプチド配列は、親配列（例えば可変領域、定常領域および／または重および軽鎖配列。）に対して、好ましくは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％または最大で９８もしくは９９％の同一性を保持する。注目すべきは、配列のサイズに依存して、％同一性がアミノ酸数に依存することである。
【０１０６】
「アミノ酸置換」または「置換」は、本明細書中で、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の別のアミノ酸での置き換えを意味する。例えば、置換Ｓ１００Ａは、位置１００のセリンがアラニンで置き換えられる変異ポリペプチドを指す。「アミノ酸挿入」または「挿入」は、本明細書中で使用される場合、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の付加を指す。「アミノ酸欠失」または「欠失」は、本明細書中で使用される場合、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。
【０１０７】
「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆ポリペプチド」または「前駆タンパク質」は、本明細書中で使用される場合、変異体を生成させるためにその後に修飾される未修飾ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、ポリペプチドそのもの、親ポリペプチドを含む組成物またはそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。したがって、「親Ｆｃポリペプチド」は、本明細書中で使用される場合、変異体を作製するために修飾されるＦｃポリペプチドを意味し、「親抗体」は、本明細書中で使用される場合、変異抗体を作製するために修飾される抗体を意味する。
【０１０８】
「野生型」または「ＷＴ」または「ネイティブ」は、本明細書中で、対立遺伝子変異を含め、天然で見出されるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質、ポリペプチド、抗体、免疫グロブリン、ＩｇＧなどは、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【０１０９】
「変異Ｆｃ領域」は、本明細書中で、少なくとも１個のアミノ酸修飾の点で野生型Ｆｃ配列とは異なるＦｃ配列を意味する。Ｆｃ変異体は、Ｆｃポリペプチドそのもの、Ｆｃ変異ポリペプチドまたはアミノ酸配列を含む組成物を指し得る。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、抗体のＣＤＲの１以上において１以上のアミノ酸修飾がなされる。一般に、何れか１個のＣＤＲにおいてアミノ酸が１または２または３個のみ置換され、一般には、４、５、６、７、８  ９または１０個を超えない変更が一連のＣＤＲ内でなされる。しかし、当然のことながら、何れかのＣＤＲ中の、置換なし、１、２または３個の置換の何れの組み合わせも、独立に、および場合によっては、何らかの他の置換と組み合わせられ得る。
【０１１１】
いくつかのケースにおいて、ＣＤＲ中のアミノ酸修飾は、「親和性成熟」と呼ばれる。「親和性成熟された」抗体は、このような変更を保持しない親抗体と比較して抗原に対する抗体の親和性が向上する、１以上のＣＤＲ中の１以上の変更を有するものである。いくつかのケースにおいて、稀ではあるが、その抗原に対する抗体の親和性を低下させることが望ましい場合があり得るが、これは一般に好ましくない。
【０１１２】
「親」抗体と比較した場合、少なくとも約１０％から５０−１００−１５０％以上、または１から５倍、抗原に対する抗体の結合親和性を向上させるために、親和性成熟が行われ得る。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはさらにピコモルレベルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、公知の手順によって作製される。例えば、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインシャッフリングによる親和性成熟を記載する、Ｍａｒｋｓら、１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３を参照。ＣＤＲおよび／またはフレームワーク残基のランダム突然変異誘発は、例えば、Ｂａｒｂａｓら、１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３；Ｓｈｉｅｒら、１９９５，Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５；Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９；およびＨａｗｋｉｎｓら、１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６に記載されている。
【０１１３】
あるいは、本発明の抗体のＣＤＲの１以上において、「サイレント」である、例えば、抗原に対する抗体の親和性を顕著に変化させないアミノ酸修飾がなされ得る。これらは、発現を最適化することを含むいくつかの理由のためになされ得る（本発明の抗体をコードする核酸に対してなされ得る。）。
【０１１４】
したがって、ＣＤＲおよび本発明の抗体の定義内に含まれるものは変異ＣＤＲおよび抗体であり；すなわち、本発明の抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３またはＫＳ８９のＣＤＲの１以上におけるアミノ酸修飾を含み得る。さらに、下記で概説されるように、アミノ酸修飾がまた、フレームワークおよび定常領域を含め、ＣＤＲ外の何れかの領域において、独立に、および場合によっては、なされ得る。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＥＭＰ２抗体は、変異Ｆｃドメインから構成される。当技術分野で公知であるように、抗体のＦｃ領域は、多くのＦｃ受容体およびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と呼ばれる数々の重要な機能をもたらす。これらのＦｃ受容体としては、（ヒトにおいて）アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂおよびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγκＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む。）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む。）およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；およびアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（抗体−依存的細胞毒性（ＡＤＣＣ）と相関する、アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む。）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む。）、ＦｃＲｎ（新生児受容体）、Ｃ１ｑ（補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に関与する補体タンパク質）およびＦｃＲｎ（血清半減期に関与する新生児受容体）を含む、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が挙げられるが限定されない。適切な修飾は、例えば、全てその全体において明らかに参照により組み込まれる、米国特許出願第１１／８４１，６５４号およびその中で引用される参考文献、ＵＳ２００４／０１３２１０号、ＵＳ２００５／００５４８３２号、ＵＳ２００６／００２４２９８号、ＵＳ２００６／０１２１０３２号、ＵＳ２００６／０２３５２０８号、ＵＳ２００７／０１４８１７０号、ＵＳＳＮ１２／３４１，７６９号、米国特許第６，７３７，０５６号、米国特許第７，６７０，６００号、米国特許第６，０８６，８７５号で全般的に概説されるように、１以上の位置で、および特にＦｃ受容体への結合を増加させる特異的なアミノ酸置換に対して、なされ得る。
【０１１６】
上記で概説される修飾に加えて、他の修飾がなされ得る。例えば、ＶＨおよびＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みによって、分子が安定化され得る（全体的に参照により組み込まれる、Ｒｅｉｔｅｒら、１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：１２３９−１２４５）。さらに、下記で概説されるようになされ得る抗体の様々な共有修飾がある。
【０１１７】
抗体の共有修飾は、本発明の範囲内に含まれ、一般に、必ずではないが、翻訳後に行われる。例えば、選択された側鎖またはＮもしくはＣ末端残基と反応することが可能な有機誘導体化剤と抗体の特異的なアミノ酸残基を反応させることによって、抗体のいくつかのタイプの共有修飾が分子に導入される。
【０１１８】
最も一般的には、システイニル残基をα−ハロアセテート（および対応するアミン）、例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミドと反応させ、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体が得られる。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロ安息香酸水銀、２−クロロ水銀−４−ニトロフェノールまたはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールなどとの反応によっても誘導体化され得る。
【０１１９】
さらに、システインにおける修飾は、下記でさらに記載される抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）適用において特に有用である。いくつかの実施形態において、抗体の定常領域は、薬物部分の配置をより特異的で調節されたものとするために、特に「チオール反応性」である１以上のシステインを含有するように改変され得る。例えば、本明細書中でその全体において参照により組み込まれる米国特許第７，５２１，５４１号を参照。
【０１２０】
ジエチルピロカルボネートはヒスチジル側鎖に比較的特異的なので、ｐＨ５．５から７．０でのジエチルピロカルボネートとの反応によってヒスチジル残基が誘導体化される。パラ−ブロモフェナシルブロミドもまた有用であり；この反応は、好ましくはｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。
【０１２１】
コハク酸または他のカルボン酸無水物とリジニル（Ｌｙｓｉｎｙｌ）およびアミノ末端残基を反応させる。これらの薬剤での誘導体化は、リジニル（Ｌｙｓｉｎｙｌ）残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の適切な試薬としては、イミドエステル、例えばメチルピコリンイミデート；ピリドキサルホスフェート；ピリドキサル；クロロホウ化水素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソウレア；２，４−ペンタンジオン；およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ−触媒反応などが挙げられる。
【０１２２】
１またはいくつかの従来の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンおよびニンヒドリンとの反応によって、アルギニル残基が修飾される。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基のｐＫａが高いために、アルカリ条件下で反応を行う必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンの基ならびにアルギニンイプシロン−アミノ基と反応し得る。
【０１２３】
チロシル残基の特異的な修飾がなされ得るが、特に、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によってチロシル残基にスペクトル標識を導入することに関心がある。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール（ａｃｅｔｙｌｉｍｉｄｉｚｏｌｅ）およびテトラニトロメタンを使用して、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成させる。ラジオイムノアッセイでの使用のための標識タンパク質を調製するために、１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてチロシル残基をヨウ素化するが、上記のクロラミンＴ法が適切である。
【０１２４】
カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−−Ｒ’）（式中、ＲおよびＲ’は、場合によっては異なるアルキル基、例えば１−シクロへキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。）との反応によって、カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）が選択的に修飾される。さらに、アンモニウムイオンとの反応によってアスパルチルおよびグルタミル残基がアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【０１２５】
二官能性薬剤での誘導体化は、下記の方法に加えて、様々な方法における使用のため、不水溶性支持マトリクスまたは表面に抗体を架橋するために有用である。一般に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステルおよびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光存在下で架橋を形成させることができる光活性化可能な中間体を生じさせる。あるいは、シノモルグソゲン（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓｏｇｅｎ）ブロミド活性化炭水化物などの反応性の不水溶性マトリクスおよび、全て全体的に参照により組み込まれる米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；および同第４，３３０，４４０号に記載の反応性基質がタンパク質固定化のために採用される。
【０１２６】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基へとそれぞれ脱アミド化されることが多い。あるいは、弱酸性条件下でこれらの残基が脱アミド化される。これらの残基の何れの形態も本発明の範囲内に入る。
【０１２７】
他の修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（全体的に参照により組み込まれる、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ｐｐ．７９−８６［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化および何れかのＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１２８】
さらに、当業者とって当然のことながら、標識（蛍光、酵素性、磁気性、放射性などを含む。）は全て、抗体（ならびに本発明の他の組成物）に付加され得る。別のタイプの共有修飾はグリコシル化における改変である。別の実施形態において、１以上の改変された糖型を含むように、本明細書中で開示される抗体を修飾し得る。「改変糖型」は、本明細書中で使用される場合、抗体に共有結合される炭水化物組成物を意味し、この場合、この炭水化物組成物は、親抗体とは化学的に異なる。改変糖型は、エフェクター機能を促進するかまたは低下させることを含むが限定されない様々な目的のために有用であり得る。改変糖型の好ましい形態はアフコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）であり、これは、おそらくはＦｃγＲＩＩＩａ受容体へのより堅い結合を通じて、ＡＤＣＣ機能の向上と相関することが示されている。この内容において、「アフコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」は、宿主細胞において産生される抗体の大部分が、実質的にフコースを欠くことを意味し、例えば産生される抗体の９０−９５−９８％が、抗体の炭水化物部分の構成成分として（一般にＦｃ領域のＮ２９７に連結される）明らかに認識できるフコースを有しない。機能的に定義される、アフコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体は一般に、ＦｃγＲＩＩＩａ受容体に対して少なくとも５０％以上の親和性を示す。
【０１２９】
当技術分野で公知の様々な方法によって、改変糖型が産生され得る（全て全体的に参照により組み込まれる、Ｕｍａｎａら、１９９９，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓら、２００１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓら、２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａら、２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３；ＵＳ６，６０２，６８４；ＵＳＳＮ１０／２７７，３７０；ＵＳＳＮ１０／１１３，９２９；ＰＣＴ  ＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴ  ＷＯ０１／２９２４６Ａ１；ＰＣＴ  ＷＯ０２／３１１４０Ａ１；ＰＣＴＷＯ０２／３０９５４Ａ１；（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）技術［Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ］；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（登録商標）グリコシル化改変技術［Ｇｌｙｃａｒｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ］）。多くのこれらの技術は、例えば、改変されているかまたは改変されていない様々な生物または細胞株（例えばＬｅｃ−１３ＣＨＯ細胞またはラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）においてＩｇＧを発現させることによって、グリコシル化経路に関与する酵素（例えばＦＵＴ８［α１，６−フコシルトランスエラーゼ（ｔｒａｎｓｅｒａｓｅ）］および／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を制御することによって、またはＩｇＧが発現された後に炭水化物を修飾することによって、フコシル化レベルを調節しおよび／またはＦｃ領域に共有結合されるオリゴ糖を二等分することに基づく。例えば、「糖改変抗体」またはＳｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓの「ＳＥＡ技術」は、産生中にフコシル化を阻害する修飾糖類を添加することによって機能する；例えばその全体において参照により本明細書によって組み込まれる２００９０３１７８６９を参照。改変糖型は、一般的には、異なる炭水化物またはオリゴ糖を指し；したがって抗体は改変糖型を含み得る。
【０１３０】
あるいは、改変糖型は、異なる炭水化物またはオリゴ糖を含むＩｇＧ変異体を指し得る。当技術分野で公知であるように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、下記で論じられる特定のグリコシル化アミノ酸残基の有無）またはタンパク質が産生される宿主細胞または生物の両方に依存し得る。特定の発現系を下記で論じる。
【０１３１】
ポリペプチドのグリコシル化は、一般的にはＮ結合型またはＯ結合型の何れかである。Ｎ結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。Ｘがプロリンを除く何らかのアミノ酸であるトリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−スレオニンは、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の結合に対する酵素性結合に対する認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列の何れかの存在によって、潜在的なグリコシル化部位が生じる。Ｏ結合型グリコシル化とは、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用され得るものの、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニンへの、糖Ｎ−アセチルガラクトースアミン、ガラクトースまたはキシロースのうち１つの結合を指す。
【０１３２】
（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）上述のトリペプチド配列の１以上を含有するようにアミノ酸配列を変化させることによって、抗体へのグリコシル化部位の付加が都合よく遂行され得る。この変化はまた、（Ｏ結合型グリコシル化部位のための）出発配列への１以上のセリンまたはスレオニン残基の付加またはそれによる置換によってもなされ得る。容易にするために、特に、望ましいアミノ酸に翻訳するコドンが生成されるように、前もって選択された塩基において標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを突然変異させることによって、好ましくはＤＮＡレベルでの変化を通じて、抗体アミノ酸配列を変化させる。
【０１３３】
抗体上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、タンパク質へのグリコシドの化学的または酵素的カップリングによる。これらの手順は、それらがＮおよびＯ結合型グリコシル化に対するグリコシル化能を有する宿主細胞でのタンパク質産生を必要としない点で有利である。使用されるカップリング方式に依存して、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファンのものなどの芳香族残基または（ｆ）グルタミンのアミド基に糖が連結され得る。これらの方法は、両者とも全体的に参照により組み込まれるＷＯ８７／０５３３０ならびにＡｐｌｉｎおよびＷｒｉｓｔｏｎ、１９８１，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，ｐｐ．２５９−３０６に記載されている。
【０１３４】
（例えば翻訳後の）出発抗体上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に遂行され得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または同等の化合物へのタンパク質の曝露を必要とする。この処理の結果、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く殆どまたは全ての糖の切断が起こり、一方でポリペプチドは完全なままである。化学的脱グリコシル化は、両方とも全体的に参照により組み込まれる、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎら、１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２およびＥｄｇｅら、１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１に記載されている。全体的に参照により組み込まれるＴｈｏｔａｋｕｒａら、１９８７、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０により記載のような様々なエンドおよびエキソグリコシダーゼの使用によって、ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素性切断が達成され得る。全体的に参照により組み込まれるＤｕｓｋｉｎら、１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５により記載されるような化合物ツニカマイシンの使用によって、潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化を防ぎ得る。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を阻止する。
【０１３５】
抗体の別のタイプの共有修飾は、例えば、全て全体的に参照により組み込まれる、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓからの２００５−２００６  ＰＥＧカタログ（Ｎｅｋｔａｒウェブサイトで入手可能）米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に記載の方式において、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンなどの様々なポリオールを含むが限定されない様々な非タンパク性ポリマーに抗体を連結することを含む。さらに、当技術分野で公知であるように、ＰＥＧなどのポリマーの付加を促進するために抗体内の様々な位置でアミノ酸置換がなされ得る。例えば、全体的に参照により組み込まれる米国特許公開第２００５／０１１４０３７Ａ１号参照。本発明は、それぞれが特異的な一連のＣＤＲを有する多くの抗体を提供する（上記で概説されるとおり、いくつかのアミノ酸置換を含む。）。上記で概説されるとおり、抗体は、６ＣＤＲのセットによるか、可変領域によるか、または、定常領域を含め、全長重および軽鎖によって、定義され得る。さらに、上記で概説されるとおり、アミノ酸置換もなされ得る。一般に、ＣＤＲ内の変化の内容において、ＣＤＲの長さが比較的短いために、アミノ酸修飾は一般に、なされ得るアミノ酸修飾の数の観点から記載される。これが、可変、定常または全長配列において導入され得るアミノ酸修飾の数の考察にも適用されるが、一方で、変化の数に加えて、「％同一性」の点でこれらの変化を定義することも適切である。したがって、本明細書中で記載のように、本発明内に含まれる抗体は、本明細書中に記載のＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３またはＫＳ８９に対して、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９８または９９％同一である。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、ヒトＥＭＰ２および／またはマウスＥＭＰ２への結合に対して本発明の抗体と（例えばＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３またはＫＳ８９と）競合する抗体が提供される。２以上の抗ＥＭＰ２抗体によるＥＭＰ２またはＥＭＰ２の一部分への結合に対する競合は、当技術分野で公知であるような何らかの適切な技術によって決定され得る。
【０１３７】
本発明の内容における競合は、本発明の抗体（例えばＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３またはＫＳ８９）が、試験化合物存在下でその特定の結合パートナー、例えばＥＭＰ２に結合する傾向が、あらゆる程度、検出可能に顕著に低下することを指す。一般的には、競合は、ＥＬＩＳＡまたはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイなどの標準的技術により測定した場合の、競合物質存在下での、ＥＭＰ２への本発明の抗体の結合の、少なくとも約１０から１００％の低下を意味する。ある一定の実施形態において、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％阻害がある。ある一定の実施形態において、１００％阻害がある。したがって、例えば、抗体が十分に競合的であるとみなす前に、少なくとも約１０％の相対的阻害が検出されるか；少なくとも約１５％の相対的阻害が検出されるか；または少なくとも約２０％の相対的阻害が検出されるという、競合性に対する基準を設定することが可能である。競合抗体に属するエピトープが抗原において近接して位置する場合、ＥＭＰ２結合の約４０％を超える相対的阻害（例えば、少なくとも約４５％阻害、例えば少なくとも約５０％阻害など、例えば少なくとも約５５％阻害、例えば少なくとも約６０％阻害など、例えば少なくとも約６５％阻害、例えば少なくとも約７０％阻害など、例えば少なくとも約７５％阻害、例えば少なくとも約８０％阻害など、例えば少なくとも約８５％阻害、例えば少なくとも約９０％阻害など、例えば少なくとも約９５％阻害以上のレベルの相対的阻害）によって競合が示され得る。
【０１３８】
いくつかのケースにおいて、競合的結合アッセイの構成要素の１以上が標識される。
【０１３９】
例えば、様々な被験断片または十分に大きいＥＭＰ２断片において、ならびにＥＭＰ２において与えられる立体構造的エピトープに位置する良好に提示された直線状エピトープの場合などにおいて、ＥＭＰ２の特定の領域の抗体−結合特性がその断片において保持される内容で、複数のＥＭＰ２エピトープおよび／またはＥＭＰ２の一部分に対して抗ＥＭＰ２抗体間で競合が存在し得ることも事実であり得る。
【０１４０】
競合を推定することは、一般的に、本発明の抗体、ＥＭＰ２（ヒトまたはマウスの何れかまたは両方）および試験分子を用いた、相対的阻害結合の評価を含む。試験分子は、他の抗体、低分子、ペプチドなどを含め、何らかの分子を含み得る。他の提示分子に対する未解決の分子の選択性および／または特異性についての情報を与える比較を行うのに十分な量で、本化合物を混合する。
【０１４１】
試験化合物、ＥＭＰ２および本発明の抗体の量は変動し得る。例えば、ＥＬＩＳＡ評価の場合、競合が存在するか否かを評価するために約５から５０μｇ（例えば約１０から５０μｇ、約２０から５０μｇ、約５から２０μｇ、約１０から２０μｇなど）の抗ＥＭＰ２抗体および／またはＥＭＰ２標的が必要とされる。条件はまた、結合にも適切であるはずである。一般的には、生理学的または生理学的状態に近い状態（例えば約２０から４０℃の温度、約７から８のｐＨなど）は、抗ＥＭＰ２：ＥＭＰ２結合に適切である。
【０１４２】
しばしば、競合は、ＥＬＩＳＡおよび／またはＦＡＣＳ分析により測定した場合に約５％を超える、顕著により大きい相対的阻害を特徴とする。特定の内容（例えばＥＭＰ２に結合する別のペプチドまたは分子（例えば、ＥＭＰ２の天然の結合パートナーまたは天然の抗ＥＭＰ２抗体）の結合を阻止するという、目的とする機能を考慮して設計される新しい抗体を選択またはスクリーニングするために競合的分析が使用される場合）において何が適切な競合レベルであるかという基準／判定因子として、より高い相対的阻害の閾値を設定することが望ましい場合がある。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＥＭＰ２抗体は、ＥＭＰ２中の１以上の残基または領域に特異的に結合するが、またＥＭＰ２に対して相同性を有する他のタンパク質とは交差反応しない。
【０１４４】
一般的には、交差反応性の欠如とは、適切なアッセイ条件下で十分な量の分子を使用したＥＬＩＳＡおよび／またはＦＡＣＳ分析により評価した場合に、分子間の相対的競合阻害が約５％未満であることを意味する。
【０１４５】
開示される抗体は、リガンド−受容体相互作用を阻止するかまたは受容体構成成分相互作用を阻害することにおいて用途があり得る。本発明の抗ＥＭＰ２抗体は、「阻止」または「中和」であり得る。「中和抗体」は、ＥＭＰ２への結合の結果、ＥＭＰ２の生物学的活性、例えばリガンドとのその相互作用能、酵素性活性および／またはシグナル伝達能の阻害が起こる抗体を指すものとする。ＥＭＰ２の生物学的活性の阻害は、当技術分野で公知のいくつかの標準的なインビトロまたはインビボアッセイの１以上によって評価され得る。
【０１４６】
「結合を阻害する」または「結合を阻止する」（例えばＥＭＰ２へのＥＭＰ２結合パートナーの結合を阻害／阻止することを指す場合）は、部分的および完全阻害／阻止の両方を包含する。ＥＭＰ２へのＥＭＰ２結合パートナーの結合の阻害／阻止は、阻害または阻止なしにＥＭＰ２結合パートナーがＥＭＰ２に結合するときに起こる、正常なレベルまたはタイプの細胞シグナル伝達を低下または変化させ得る。抗ＥＭＰ２抗体と接触していないリガンドと比較した場合、阻害および阻止はまた、抗ＥＭＰ２抗体と接触した際のＥＭＰ２へのＥＭＰ２結合パートナーの結合親和性の何らかの測定可能な低下も含むものとし、例えばＥＭＰ２へのＥＭＰ２結合パートナーの結合の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％または１００％の阻止である。
【０１４７】
本発明は、開示される抗ＥＭＰ２抗体を作製するための方法をさらに提供する。これらの方法は、本発明の抗体をコードする単離核酸を含有する宿主細胞を培養することを包含する。当業者にとって当然のことながら、抗体の性質に依存して、様々な方法でこれを行い得る。いくつかの実施形態において、抗体が産生され、単離され得るような条件下で、本発明の抗体が全長の従来の抗体である場合、例えば重鎖可変領域および軽鎖可変領域は。
【０１４８】
一般に、本発明の抗体をコードする核酸が提供される。このようなポリヌクレオチドは、重および軽鎖のそれぞれの可変および定常領域の両方をコードするが、本明細書中に記載の組成物にしたがって、他の組み合わせも本発明により企図される。本発明はまた、これらのポリヌクレオチドに対して相補的な開示ポリヌクレオチドおよび核酸配列由来のオリゴヌクレオチド断片も企図する。
【０１４９】
本ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核酸類似体および合成ＤＮＡの形態のポリヌクレオチドは、本発明の範囲内である。ＤＮＡは２本鎖または１本鎖であり得、１本鎖の場合は、コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖であり得る。本ポリペプチドをコードするコード配列は、本明細書中で提供されるコード配列と同一であり得るか、または異なるコード配列であり得、遺伝コードの重複性または縮重の結果として、この配列は、本明細書中で提供されるＤＮＡと同じポリペプチドをコードする。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体をコードする核酸を発現ベクターに組み込むが、この発現ベクターは染色体外であり得るかまたは、それが導入される宿主細胞のゲノムに統合するように設計され得る。発現ベクターは、あらゆる数の適切な制御配列（転写および翻訳調節配列、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点などを含むが限定されない。）または他の構成要素（選択遺伝子など）を含有し得、これらは全て、当技術分野で周知であるように操作可能に連結される。いくつかのケースにおいて、２つの核酸を使用し、それぞれを異なる発現ベクターに入れるか（例えば第一の発現ベクター中に重鎖、第二の発現ベクター中に軽鎖）またはあるいは、それらを同じ発現ベクターに入れ得る。当業者にとって当然のことながら、制御配列の選択を含む発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの要因に依存し得る。
【０１５１】
一般に、核酸分子が１以上の発現調節エレメントに操作可能に連結されるように（例えば、ベクター中、細胞中でのプロセシングにより作製され、宿主細胞ゲノムに統合されるコンストラクト中）、選択される宿主細胞に適切な何らかの方法（例えば、形質転換、形質移入、エレクトロポレーション、感染）を用いて、組み換え宿主細胞を作製するために、核酸および／または発現を適切な宿主細胞に導入し得る。得られる組み換え宿主細胞は、発現に適切な条件下で維持され得（例えば、誘導因子の存在下で、適切な非ヒト動物において、適切な塩、成長因子、抗生物質、栄養補助物などが供給された適切な培地中で）、それにより、コードされるポリペプチドが産生される。いくつかのケースにおいて、ある細胞中で重鎖が産生され、別の細胞中で軽鎖が産生される。
【０１５２】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は当技術分野で公知であり、これには、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから入手可能な多くの不死化細胞株が含まれ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えばＨｅｐ  Ｇ２）および多くの他の細胞株が挙げられるが限定されない。組み換え抗体を発現させるために、細菌、酵母、昆虫および植物を含むが限定されない非哺乳動物細胞も使用され得る。いくつかの実施形態において、ウシまたはニワトリなど、トランスジェニック動物中で抗体を産生させ得る。
【０１５３】
処置の方法
インビボ投与のための抗体組成物
任意の医薬的に許容可能な担体、賦形剤または安定化剤と所望の程度の純度を有する抗体を混合することによって（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］）、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、本発明により使用される抗体の処方物が保管用に調製される。許容可能な担体、賦形剤または安定化剤は、使用される投与量および濃度で受容者にとって無毒性であり、緩衝剤、例えばリン酸、クエン酸および他の有機酸など；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存料（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベンなど；カテコール；レゾルシノール；シクロへキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンなど；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなど；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類および他の炭水化物；キレート剤、例えばＥＤＴＡなど；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなど；塩形成対イオン、例えばナトリウムなど；金属錯体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【０１５４】
本明細書中の処方物はまた、処置される特定の適応に対する必要に応じて、複数の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を与えない補完的活性のあるもの、も含有し得る。例えば、他の特異性を有する抗体を提供することが望ましい場合がある。あるいは、またはさらに、本組成物は、細胞毒、サイトカイン、成長抑制剤および／または低分子アンタゴニストを含み得る。このような分子は、意図する目的に有効である量で組み合わせられて適切に存在する。
【０１５５】
活性成分はまた、例えばコアセルべーション技術によるかまたは界面重合によって調製されるマイクロカプセル中に、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルション中にも封入され得る。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）で開示されている。
【０１５６】
インビボ投与のために使用しようとする処方物は滅菌状態またはそれに近い状態であるべきである。これは、滅菌ろ過膜を通じたろ過によって容易に達成される。
【０１５７】
持続放出製剤を調製し得る。持続放出製剤の適切な例としては、抗体を含有する固形疎水性ポリマーの半透性マトリクスが挙げられ、このマトリクスは造形品の形態、例えばフィルムまたはマイクロカプセルである。持続放出マトリクスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なミクロスフェア）など、およびポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸などのポリマーでは１００日を超える分子放出が可能となる一方で、ある種のヒドロゲルはタンパク質を放出する期間がより短い。
【０１５８】
封入された抗体が長時間体内に残存する場合、これらは、３７℃で湿気に曝露される結果として変性または凝集し得、その結果、生物学的活性が失われ、免疫原性が変化する可能性がある。合理的なストラテジーは、関与する機構に依存して安定化のために考案され得る。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通じた分子間Ｓ−−Ｓ結合形成であることが発見されたら、スルフィドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、含水量を調節し、適切な添加物を使用し、特異的なポリマーマトリクス組成物を開発することによって、安定化が達成され得る。
【０１５９】
投与様式
既知の方法、例えばボーラスとしてまたは長時間にわたる連続注入による静脈内投与に従い、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（ｉｎｔｒａｃｅｒｏｂｒｏｓｐｉｎａｌ）、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所または吸入経路によって、本発明の抗体および化学療法剤が対象に投与される。抗体の静脈内または皮下投与が好ましい。
【０１６０】
ある一定の態様において、本発明の抗体および化学療法剤が、癌である対象に投与される。ある一定の態様において、本発明の抗体および化学療法剤が、子宮内膜癌である対象に投与される。
【０１６１】
ある一定の態様において、本発明の抗体および化学療法剤が、血管形成障害がある対象に投与される。ある一定の態様において、本発明の抗体および化学療法剤が、血管形成を特徴とする疾患を持つ対象に投与される。ある一定の態様において、本発明の抗体および化学療法剤が、新血管形成を特徴とする疾患を持つ対象に投与される。
【０１６２】
処置様式
本発明の方法において、疾患または状態に対して好ましい治療反応をもたらすために治療が使用される。「好ましい治療反応」は、疾患または状態の改善および／または疾患または状態に付随する症状の改善を意図する。例えば、好ましい治療反応は、疾患における次の改善の１以上を指す：（１）腫瘍細胞数の減少；（２）腫瘍細胞死の増加；（３）腫瘍細胞生存の阻害；（５）腫瘍成長の阻害（すなわち、ある程度遅延させる、好ましくは停止させる。）；（６）患者生存率の上昇；および（７）疾患または状態に付随する１以上の症状の幾分かの緩和。
【０１６３】
いかなる疾患または状態における好ましい治療反応も、その疾患または状態に対して特異的な標準化された反応基準によって決定され得る。磁気共鳴画像（ＭＲＩ）スキャン、ｘ線画像、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャン画像、内視鏡検査および腫瘍生検組織採取などのスクリーニング技術を用いて、腫瘍形態の変化（すなわち全体的な腫瘍量、腫瘍サイズなど）の変化について腫瘍反応を評価することができる。
【０１６４】
これらの好ましい治療反応に加えて、治療を受けている対象において、疾患に付随する症状の改善の有益な効果が生じ得る。
【０１６５】
このような反応は、本発明の方法による処置後、少なくとも４から８週間またはある場合は６から８週間持続し得る。あるいは、疾患の改善は、部分反応であるものとしてカテゴリー分類され得る。「部分反応」は、新しい病巣なく、全ての測定可能な腫瘍量（すなわち、対象に存在する悪性細胞数または腫瘍量の測定バルクまたは異常なモノクローナルタンパク質の量）が少なくとも約５０％低下し、これが４から８週間または６から８週間持続し得るものとする。
【０１６６】
本発明による処置は、使用される薬剤の「治療的有効量」を含む。「治療的有効量」は、必要な投与量および期間の、所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。
【０１６７】
治療的有効量は、病状、年齢、性別および個体の体重および個体において薬剤が所望の反応を導く能力などの要因により変動し得る。治療的有効量はまた、抗体または抗体部分の何らかの毒性または有害な影響よりも治療面での有益な効果が上回るものでもある。
【０１６８】
腫瘍治療のための「治療的有効量」はまた、その疾患進行安定化能によっても評価され得る。ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において化合物の癌阻害能が評価され得る。
【０１６９】
あるいは、組成物のこの特性は、熟練者にとって公知のインビトロアッセイによって化合物の細胞成長阻害能またはをアポトーシス誘導能を調べることにより評価され得る。治療的有効量の治療用化合物は、腫瘍サイズを縮小させるか、またはそうでなければ対象における症状を改善させ得る。当業者は、対象の体格、対象の症状の重症度および特定の組成物または選択される投与経路などの要因に基づき、このような量を決定できる。
【０１７０】
最適の所望の反応（例えば治療反応）をもたらすために、投薬計画を調整する。例えば、単回ボーラスを投与し得るか、数回に分割した用量を長時間にわたり投与し得るか、または、治療状況の要求により示されるように、この用量を均等に増減させ得る。非経口組成物は、投与の簡便性および投与量の均一性のために投与単位形態で処方され得る。投与単位形態は、本明細書中で使用される場合、処置しようとする対象に対する単位投与量として適している物理的に分かれている単位を指し；各単位は、必要とされる医薬担体とともに所望の治療効果を生じるように計算される所定量の活性化合物を含有する。
【０１７１】
本発明の投与単位形態に対する規格は、（ａ）活性化合物の特有の特徴および達成しようとする特定の治療効果および（ｂ）個体での感受性の処置のためにこのような活性化合物を化合する技術分野に特有の制限により決定され、これに直接依存する。
【０１７２】
本発明で使用される抗ＥＭＰ２抗体に対する効率的な投与量および投薬計画は、処置しようとする疾患または状態に依存し、当業者により決定され得る。
【０１７３】
本発明において使用される抗ＥＭＰ２抗体の治療的有効量に対する代表的な非限定的範囲は、約０．１から１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１から５０ｍｇ／ｋｇなど、例えば約０．１から２０ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．１から１０ｍｇ／ｋｇなど、例えば約０．５、約、例えば０．３、約１など、または約３ｍｇ／ｋｇである。別の実施形態において、本抗体は、１ｍｇ／ｋｇ以上の用量、例えば１から２０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば５から２０ｍｇ／ｋｇの用量、例えば８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０１７４】
当技術分野の通常の技術を有する医療専門家は、必要とされる医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方し得る。例えば、医師または獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要とされるレベルよりも低いレベルの、医薬組成物中で使用される薬物の用量で開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させ得る。
【０１７５】
ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体をＶＥＧＦ阻害剤と共投与し得る。ある一定の実施形態において、ＶＥＧＦ阻害剤は、ベバシズマブ、パゾパニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、バンデテアニブ、カボザニチニブ、ポナチニブ、アキシチニブ、アフリベルセプトまたはそれらの組み合わせもしくは誘導体である。
【０１７６】
「共投与」という用語は、１個の単回処方として、または２回の個別の処方（抗ＥＭＰ２抗体に対して１回およびＶＥＧＦ阻害剤に対して１回）としての、抗ＥＭＰ２抗体およびＶＥＧＦ阻害剤の投与を指す。共投与は、同時に行われるものかまたは何れかの順序で連続したものであり得、両方（または全て）の活性薬剤が同時にそれらの生物学的活性を導く時間がある。そうであるので、抗ＥＭＰ２および抗体およびＶＥＧＦ阻害剤の「共投与」は、抗ＥＭＰ２および抗体およびＶＥＧＦ阻害剤を含む２以上の化学または生物学的物質の併用療法を指す。抗ＥＭＰ２および抗体およびＶＥＧＦ阻害剤の連続投与において、両薬剤は、同時にそれらの生物学的活性を導き得る。あるいは、抗ＥＭＰ２および抗体およびＶＥＧＦ阻害剤の連続投与において、これらの薬剤は、同時にそれらの生物学的活性を導き得る。
【０１７７】
ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２および抗体およびＶＥＧＦ阻害剤の連続投与間の時間は、１０分未満、およそ３０分間、３０分間から１時間の間、１時間から２時間の間、２時間から５時間の間、５時間から１０時間の間、６時間から１２時間の間、１２時間から２４時間の間、およそ１日、およそ２日間、およそ３日間、およそ４日間、およそ５日間、およそ６日間、およそ７日間、およそ８日間、およそ９日間、およそ１０日間、およそ１１日間、およそ１２日間、およそ１３日間、およそ１４日間、およそ１５日間、およそ１６日間、およそ１７日間、およそ１８日間、およそ１９日間、およそ２０日間、およそ２１日間、およそ２２日間、およそ２３日間、およそ２４日間、およそ２５日間、およそ２６日間、およそ２７日間、およそ２８日間、およそ２９日間、およそ３０日間、およそ３５日間、およそ４０日間またはおよそ４５日間であり得る。
【０１７８】
ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体およびＶＥＧＦ阻害剤はおよそ１日１回、７日に１回、１４日に１回、２８日に１回、３０日に１回、４５日に１回、６０日に１回、９０日に１回、共投与される。
【０１７９】
ある実施形態において、１０から５００ｍｇ／ｋｇ、例えば２００から４００ｍｇ／ｋｇなどの週投与量で点滴によって抗ＥＭＰ２抗体が投与される。例えば１から８回、例えば３から５回など、このような投与が反復され得る。２から２４時間、例えば２から１２時間などにわたる連続点滴によって投与が行われ得る。
【０１８０】
ある実施形態において、毒性を含む副作用を低減させることが必要とされる場合、２４時間を超えるような長時間にわたるゆっくりとした連続点滴によって抗ＥＭＰ２抗体が投与される。
【０１８１】
ある実施形態において、８回以下、例えば４から６回など、２５０ｍｇから２０００ｍｇ、例えば３００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇまたは２０００ｍｇなどの週投与量で抗ＥＭＰ２抗体が投与される。２から２４時間、例えば２から１２時間などにわたり、連続点滴によって投与が行われ得る。必要に応じて１回以上、例えば６ヵ月または１２ヶ月後、このような計画が反復され得る。例えば生体試料を採取し、抗ＥＭＰ２抗体の抗原結合領域を標的とする抗イディオタイプ抗体を用いることにより投与時の血中の本発明の化合物の量を測定することによって、投与量が決定または調整され得る。
【０１８２】
さらなる実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体が週に１回、２から１２週間、例えば３から１０週間など、例えば４から８週間などにわたり投与される。
【０１８３】
ある実施形態において、維持療法によって、例えば６ヶ月以上にわたり週に１回など、抗ＥＭＰ２抗体が投与される。
【０１８４】
ある実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体の１回の点滴とそれに続く放射性同位体と複合化した抗ＥＭＰ２抗体の点滴を含む計画によって抗ＥＭＰ２抗体が投与される。例えば７から９日後、この計画が反復され得る。
【０１８５】
非限定例として、本発明による処置は、単回用量もしくは２４、１２、８、６、４または２時間ごとの分割用量またはそれらの何らかの組み合わせを用いて、治療開始後、第１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０日のうち少なくとも１回、またはあるいは、第１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０週のうち少なくとも１回、またはそれらの何らかの組み合わせで、１日あたり約０．１から１００ｍｇ／ｋｇ、例えば０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００ｍｇ／ｋｇの量で、抗体の１日投与量として提供され得る。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体は、１以上のさらなる治療剤、例えば化学療法剤または抗血管形成剤と組み合わせて使用される。ＤＮＡ損傷化学療法剤の非限定例としては、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシンおよびその類似体または代謝物およびドキソルビシン）；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、エトポシド、テニポシドおよびダウノルビシン）；アルキル化剤（例えば、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン、メトトレキサート、マイトマイシンＣおよびシクロホスファミド）；ＤＮＡ挿入剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン）；ＤＮＡ挿入剤およびフリーラジカル発生剤、例えばブレオマイシンなど；およびヌクレオシド模倣物（例えば、５−フルオロウラシル、カペシチビン、ゲムシタビン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチンおよびヒドロキシウレア）が挙げられる。
【０１８７】
細胞複製を破壊する化学療法剤としては、パクリタキセル、ドセタキセルおよび関連類似体；ビンクリスチン、ビンブラスチンおよび関連類似体；サリドマイド、レナリドミドおよび関連類似体（例えば、ＣＣ−５０１３およびＣＣ−４０４７）；タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、メシル酸イマチニブおよびゲフィチニブ）；プロテアソーム阻害剤（例えばボルテゾミブ）；ＩκＢキナーゼの阻害剤を含むＮＦ−κＢ阻害剤；癌で過剰発現されるタンパク質に結合する抗体および癌において上方制御されるか、過剰発現されるかまたは活性化されることが知られているタンパク質または酵素の他の阻害剤が挙げられ、この阻害は細胞複製を下方制御する。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体は、本明細書中に記載のまたは当業者にとって公知の化学療法剤の何れかでの処置の前、それと同時、または後に、この時にまたは連続して使用され得る。
【０１８９】
ある一定の実施形態において、抗血管形成剤は、例えば、ベバシズマブ、イトラコナゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＴＮＰ−４７０、ＣＭ１０１、ＩＦＮ−α、ＩＬ−１２、血小板因子−４、スラミン、ＳＵ５４１６、トロンボスポンジン、ＶＥＧＦＲアンタゴニスト、血管新生抑制ステロイド＋ヘパリン、軟骨由来血管形成阻害因子、マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤、アンギオスタチン、エンドスタチン、２−メトキシエストラジオール、テコガラン、テトラチオモリブデート、サリドマイド、トロンボスポンジン、プロラクチン、ＶＥＧＦαＶβ３阻害剤、リノミドおよびタスキニモドである。
【０１９０】
本明細書中に記載の方法の有効性
本発明のある一定の態様において、抗ＥＭＰ２療法の有効性は、腫瘍特異的マーカーの血清濃度低下、全生存期間の延長、腫瘍サイズ縮小、癌の寛解、転移マーカー反応の低下および化学療法の悪影響の減少によって評価される。
【０１９１】
本発明のある一定の態様において、有効性は、コンパニオン診断法および製品によって測定される。抗ＥＭＰ２処置の前、その最中またはその後に、コンパニオン診断測定が行われ得る。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、非腫瘍状態を処置または診断するために本発明の抗体が使用され得る。本明細書中で使用される場合、「非腫瘍状態」は、新生物ではないかまたは新生物により引き起こされない疾患を指す。
【０１９３】
コンパニオン診断
他の実施形態において、本開示は、コンパニオン診断法および製品に関する。ある実施形態において、本明細書中で記載のように、子宮癌、具体的には子宮内膜癌の処置を監視するために、本比較診断法および製品を使用し得る。いくつかの実施形態において、コンパニオン診断法および製品は、タンパク質、遺伝子または特異的な遺伝子突然変異のレベルを測定するための分子アッセイを含む。例えば、抗ＥＭＰ２療法が具体的な個体に利益があるか否かを予測するために、抗ＥＭＰ２療法の有効な投与量を予測するために、抗ＥＭＰ２療法を監視するために、抗ＥＭＰ２療法を調整するために、抗ＥＭＰ２療法を個体に対して調整するために、癌進行および寛解を追跡するために、このような測定を使用し得る。このような測定は、例えば、抗ＥＭＰ２およびＶＥＧＦ阻害剤の共投与療法が具体的な個体に利益があるか否かを予測するために、抗ＥＭＰ２およびＶＥＧＦ阻害剤共投与療法の有効な投与量を予測するために、抗ＥＭＰ２およびＶＥＧＦ阻害剤の共投与療法を監視し、抗ＥＭＰ２およびＶＥＧＦ阻害剤共投与療法を調節し、抗ＥＭＰ２およびＶＥＧＦ阻害剤共投与療法を個体に対して調整し、癌進行および寛解を追跡するためにも、使用され得る。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、併用療法を監視するためにコンパニオン診断を使用し得る。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、コンパニオン診断は、本明細書中に記載の抗ＥＭＰ２抗体を含み得る。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、抗ＥＭＰ２療法の前、その最中またはその後に、コンパニオン診断を使用し得る。
【０１９７】
製品
他の実施形態において、上述の障害の処置に有用な材料を含有する製品が提供される。製品は、容器および標識を含む。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジおよび試験管が挙げられる。容器は、硝子またはプラスチックなどの様々な材料から形成され得る。容器は、状態を処置するのに有効である組成物を保持し、滅菌アクセスポート（例えばこの容器は静脈内用溶液バッグまたは、皮下注射針により穴あけ可能なストッパーを有するバイアルであり得る。）を有し得る。組成物中の活性剤は抗体である。容器上のまたは容器に連結されるラベルは、選択状態を処置するために組成物が使用されることを示す。製品は、医薬的に許容可能な緩衝液、例えばリン酸緩衝食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などを含む第二の容器をさらに含み得る。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用説明がある添付文書を含む、商業的および使用者の観点から所望される他の材料をさらに含み得る。
【０１９８】
ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体およびＶＥＧＦ阻害剤は単一容器中で合わせられる。ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体およびＶＥＧＦ阻害剤は、個別の容器中にあり、個別に投与される。ある一定の実施形態において、抗ＥＭＰ２抗体およびＶＥＧＦ阻害剤は、個別の容器中で保管され、投与前に合わせられる。
【０１９９】
次の参考文献はそれらの全体において参照により組み込まれる。
Travasso, R. D. M., Corvera Pointe., Castro, M., Rodrguez-Manzaneque, L. C. & Hernandez-Machado, A. Tumor Angiogenesis and Vascular Patterning: A Mathematical Model. PLoS One 6, e19989 (2011). 
Park, J. E., Keller, H. A. & Ferrara, N. The vascular endothelial growth factor isoforms (VEGF): differential deposition into the subepithelial extracellular matrix and bioactivity of extracellular matrixbound VEGF. Mol. Biol. Cell 4, 1317-1326 (1993). 
Ferrara, N. VEGF and the quest for tumour angiogenesis factors. Nat Rev Cancer 2, 795-803 (2002).
Ferrara, N., Hillan, K. J., Gerber, H.-P. & Novotny, W. Discovery and development ofbevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov 3,391-400 (2004). 
Cebe-Suarez, S., Zehnder-Fjallman, A. & Ballmer-Hofer, K. The role ofVEGF receptors in angiogenesis; complex partnerships. Cellular and Molecular Life Sciences 63, 601-615, doi: 1 0.1 007/s000 18-005-5426-3 (2006). 
Tang, N. et al. Loss of HIF-1[alpha] in endothelial cells disrupts a hypoxia-driven VEGF autocrine loop necessary for tumorigenesis. Cancer Cell 6, 485-495 (2004).
Inoue, M., Hager, 1. H., Ferrara, N., Gerber, H.-P. & Hanahan, D. VEGF-A has a critical, nonredundant role in angiogenic switching and pancreatic 2 cell carcinogenesis. Cancer Cell 1, 193-202 (2002).
Robinson, C. J. & Stringer, S. E. The splice variants of vascular endothelial growth factor (VEGF) and their receptors. J Cell Sci 114,853-865 (2001). 
Bates, D. O. et al. The endogenous anti-angiogenic family of splice variants ofVEGF, VEGFxxxb, are down-regulated in pre-eclamptic placentae at term. Clin Sci (London) 110, 575-585 (2006).
Zerefos, P. G. et al. Characterization of the human urine proteome by preparative electrophoresis in combination with 2-DE. Proteomics 6, 4346-4355, doi:IO.1002/pmic.200500671 [doi] (2006).
Wadehra, M. et al. Knockdown of the tetraspan protein epithelial membrane protein-2 inhibits implantation in the mouse. Dev.Biol. 292,430-441 (2006).
Wadehra, M. et al. Epithelial membrane protein-2 regulates surface expression of alphavbeta3 integrin in the endometrium. Dev.Biol. 287,336-345 (2005).
Wadehra, M. et al. Expression of epithelial membrane protein-2 is associated with endometrial adenocarcinoma ofunfavorable outcome. Cancer 107,90-98, doi:10.1002/cncr.21957 [doi] (2006).
Arnaoutova,1. & Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat. Protocols 5, 628-635 (2010). 
Merdzhanova, G. et al. The transcription factor E2F 1 and the SR protein SC35 control the ratio ofproangiogenic versus antiangiogenic isoforms of vascular endothelial growth factor-A to inhibit neovascularization in vivo. Oncogene 29,5392-5403, doi:hypertext transfer protocol://www.nature.com/onc/journal/v29/n39/suppinfo/onc20 1 0281 s 1.html (2010).
Wadehra, M., Braun, 1. & Goodglick, L. One Step RT-PCR for Screening Microdissected Tissue. Biotechniques 32, 242-247 (2002).
Morales, S. et al. Collagen Gel Contraction by ARPE-19 is mediated by a FAK-Src dependent pathway. Experimental Eye Research 85, 790-798 (2007).
Barnett, S. F. et al. Identification and characterization ofpleckstrin-homology-domain-dependent and isoenzyme-specific Akt inhibitors. Biochem J 385,399-408, doi: 1O.1042/BJ20041140 [doi] BJ20041140 [pii] (2005).
Wang, M. Y. et al. Mammalian target of rap amy cin inhibition promotes response to epidermal growth factor receptor kinase inhibitors in PTEN-deficient and PTEN-intact glioblastoma cells. Cancer Res 66, 7864-7869, doi:66/1617864 [pii] 10.1158/0008-5472.CAN-04-4392 [doi] (2006).
Lu, K. V. et al. Fyn and SRC are effectors of oncogenic epidermal growth factor receptor signaling in glioblastoma patients. Cancer Res 69, 6889-6898, doi:0008-5472.CAN-09-0347 [pii] 10.1158/0008-5472.CAN-09-0347 [doi] (2009).
Shimazaki, K. et al. Diabodies targeting epithelial membrane protein 2 reduce tumorigenicity ofhuman endometrial cancer cell lines. Clin Cancer Res 14, 7367-7377, doi: 14/2217367 [pii]10.1158/1078-0432.CCR-08-1016 [doi] (2008).
Mancuso, M. R. et al. Rapid vascular regrowth in tumors after reversal ofVEGF inhibition. The Journal of Clinical Investigation 116, 2610-2621 (2006).
Kadenhe-Chiweshe, A. et al. Sustained VEGF Blockade Results in Microenvironmental Sequestration ofVEGF by Tumors and Persistent VEGF Receptor-2 Activation. Molecular Cancer Research 6, 1-9, doi: 1 0.l158/1541-7786.mcr-07-0101 (2008).
Kilarski, W. W., Samolov, B., Peters son, L., Kvanta, A. & Gerwins, P. Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization. Nat Med 15,657-664, doi:hypertext transfer protocol://www.nature.com/nm/joumal/v 1 5/n6/suppinfo/nm. 1985 S l.html (2009). 
Fu, M. et al. Epithelial Membrane Protein-2 Promotes Endometrial Tumor Formation through Activation of FAK and Src. PLoS One 6, e 19945 (2011).
Habeeb, O. et al. Epithelial membrane protein-2 expression is an early predictor of endometrial cancer development. Cancer 116,4718-4726, doi:l0.1002/cncr.25259 [doi] (2010).
Fu, M. et al. Epithelial membrane protein-2 is a novel therapeutic target in ovarian cancer. Clin Cancer Res 16, 3954-3963, doi: 16/15/3954 [pii] 10.1158/1078-0432.CCR-10-0368 [doi] (2010).
Dvorak, H. F. Vascular Permeability Factor/Vascular Endothelial Growth Factor: A Critical Cytokine in Tumor Angiogenesis and a Potential Target for Diagnosis and Therapy. Journal of Clinical Oncology 20, 4368-4380, doi: 10. 1200/jco.2002.10.088 (2002).
Mahimainathan, L., Ghosh-Choudhury, N., Venkatesan, B. A., Danda, R. S. & Choudhury, G. G. EGF stimulates mesangial cell mitogenesis via PI3-kinase-mediated MAPK-dependent and AKT kinaseindependent manner: involvement of c-fos and p27Kip 1. American Journal of Physiology -Renal Physiology 289, F72-F82, doi:10.1152/ajprenal.00277.2004 (2005).
Vivanco, I. & Sawyers, C. L. The phosphatidylinositol3-Kinase AKT pathway in human cancer. Nat Rev Cancer 2,489-501, doi:l0.1038/nrc839 [doi] nrc839 [pii] (2002).
Wadehra, M., Iyer, R., Goodglick, L. & Braun, J. The tetraspan protein epithelial membrane protein-2 interacts with beta1 integrins and regulates adhesion. J Bioi Chern 277, 41094-41100 (2002). 
Aplin, A. E., Short, S. M. & Juliano, R. L. Anchorage-dependent regulation ofthe mitogen-activated protein kinase cascade by growth factors is supported by a variety of integrin alpha chains. J.Biol. Chern. 274,31223-31228 (1999).
Leite de Oliveira, R., Hamm, A. & Mazzone, M. Growing tumor vessels: More than one way to skin a cat -Implications for angiogenesis targeted cancer therapies. Molecular Aspects of Medicine 32, 71-87, doi: 10.1 016/j.mam.2011.04.001 (2011).
Zagzag, D. et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab Invest 86, 1221-1232 (2006)．
【０２００】
ここで、次の実施例を参照しながら本発明を説明する。これらの実施例は、単なる説明を目的として提供されるものであり、本発明は、これらの実施例に対して何ら限定されると解釈されるものではなく、本明細書中で提供される教示の結果として明らかになるあらゆる全ての変形物を包含するものと解釈されるべきものである。
【０２０１】
説明を目的として本発明の特定の実施形態を本明細書中で説明してきたが、当業者にとって当然のことながら、添付の特許請求の範囲に記載されるように、本発明から逸脱することなく、細部の多くの変更がなされ得る。
【実施例】
【０２０２】
実施例１：ＥＭＰ２  ＩｇＧ１は、子宮内膜癌生存率を向上させる。
子宮内膜癌に対するＥＭＰ２  ＩｇＧ１の有効性を調べるために、ＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２細胞株を用いて皮下異種移植物を作製した。
【０２０３】
加湿した５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で、１０％ウシ胎仔血清を供給したＭｃＣｏｙｓ培地中でヒト子宮内膜腺癌細胞株ＨＥＣ−１Ａ（ＨＴＢ１１２、ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）を培養した。凍結アリコートの再成後２ヶ月以内に細胞株を使用し、生存能、回復、成長、形態およびアイソエンザイムに基づき供給者が確認を行った。安定に形質移入された、ヒトＥＭＰ２−ＧＦＰ融合タンパク質または対照ＧＦＰを含有するＨＥＣ−１Ａ細胞。
【０２０４】
ＥＭＰ２  ＩｇＧ１を全身的に毎週注射することによって、対照ＩｇＧと比較して腫瘍負荷が減少した（図１Ａ）。この腫瘍負荷の減少は、ＥＭＰ２  ＩｇＧ１で処置したマウスに対して生存率が顕著に向上することにつながった（図１Ｂ；ｐ＝０．０２）。８４日後でさえも、生存マウスでは測定可能な腫瘍サイズの変化が示されなかった。組織学的検査において、対照と比較して、抗ＥＭＰ２抗体処置後、中心壊死が顕著となった（図１Ｃ）。
【０２０５】
実施例２：腫瘍関連脈管構造
ＥＭＰ２（ＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２）を過剰発現させるか、ベクター対照（ＨＥＣ１ａ／Ｖ）を発現させるか、またはそのレベル（ＨＥＣ１ａ／ＲＩＢＯ）を低下させるためにリボザイムを発現させた子宮内膜癌細胞から腫瘍を作製した。
第２継代からのヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）をＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入し、全実験に対して第３から第７継代の間に使用した。初代ヒト冠動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）（Ｊ．Ｂｅｒｌｉｎｅｒ博士、ＵＣＬＡより贈与）も利用した。完全ＭＣＤＢ−１３１完全培地（ＶＥＣ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｅｎｅｓｓｅｌａｅｒ，ＮＹ）中で全内皮細胞を増殖させた。ｐＬＫＯ．１−ｐｕｒｏ中で非標的ｓｈＲＮＡ対照またはＥＭＰ２特異的なｓｈＲＮＡを含有する安定感染ＨＥＣ−１Ａ細胞（３８５；ＴＲＣＮ０００００７２３８５，９１１；ＴＲＣＮ００００３２２９１１）を製造者の説明書に従い作製した（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。
【０２０６】
４から６週齢ヌードＢＡＬＢ／ｃ雌マウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から入手し、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓで維持した。１ｘ１０６ＨＥＣ−ＩＡ／ＯＥ、ＨＥＣ−ＩＡ１ＶまたはＨＥＣ−ＩＡ／ＲｌＢＯ細胞を動物の左右の肩胴部（ｓｈｏｕｌｄｅｒ  ｆｌａｎｋｓ）皮下（ｓ．ｃ．）にそれぞれ接種した。ノギスを用いて腫瘍を測定し、式：長さｘ幅２／２を用いて体積を計算した。群あたり６匹のマウスを使用した。第３０日に腫瘍を切り出し、ホルマリン中で固定し、次いでＵＣＬＡのＴｉｓｓｕｅ  Ｐｒｏｃｕｒｅｍｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙがヘマトキシリンおよびエオシン染色のために、またはマッソントリクローム染色により処理した（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）。
【０２０７】
いくつかの実験において、１ｘｌ０６個のＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２細胞を５％マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で懸濁し、雌無胸腺マウスの肩にｓ．ｃ．注射した。腫瘍が４ｍｍ２に近付いたら、腹腔内（ｉ．ｐ．）経路を介して１０ｍｇ／ｋｇ用量の抗ＥＭＰ２  ＩｇＧＩまたは対照ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）での全身処置を毎週行った。腫瘍サイズを監視し、腫瘍が直径１．５ｃｍに近付いたらマウスを安楽死させるか、または潰瘍化させた。腫瘍を単離し、固定して、ヘマトキシリンおよびエオシン染色のために処理した。
【０２０８】
定量的に（ｑｕａｎｉｔａｖｅｌｙ）腫瘍脈管構造の同一性について試料を分析した。製造者の説明書（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）に従い、マッソントリクローム染色を行った。試料を脱パラフィン処理し、アルコール中で脱水した。いくつかの実験において、１％正常ヤギ血清中でブロッキング処理した後、１：５０希釈のＦＩＴＣ−標識Ｌ．エスキュレントゥム（Ｌ．ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）レクチン（０．９％ＮａＣｌ中１ｍｇ／ｍＬ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともに試料を温置した。次いで、試料をＤＡＰＩで対比染色し、載せた。ＣＤ３４発現を定量するために、試料を脱パラフィン処理し、次いで０．１Ｍクエン酸、ｐＨ６．０中、９５℃で２０分間温置した。既に述べられているように１：２５の希釈でラット抗ＣＤ３４（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用し、続いて製造者の説明書に従い、ベクターＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて可視化した。６ヶ所の高倍率視野（ｘ２００）中のＣＤ３４陽性血管の数を計数し、平均を算出した。
【０２０９】
異種移植片のマッソントリクローム染色から、ＥＭＰ２発現によって腫瘍脈管構造が変化したことが示唆された（図２Ａ）。ＨＥＣ１ａ１  ＥＭＰ２腫瘍は高度に血管形成しており、一方でＥＭＰ２（ＨＥＣ１ａ／ＲＩＢＯ）レベルが低下した腫瘍では、脈管構造に乏しく、壊死領域が大きい、小さな腫瘍が形成された。
【０２１０】
毛細管様管形成を行った。簡潔に述べると、低増殖因子基底膜（Ｇｅｌｔｒｅｘ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でカバースリップを被覆し、３７℃で３０分間温置してゲル化を促進した。ＨＥＣＩａ／ＥＭＰ２、ＨＥＣ１ａ／ＶまたはＨＥＣ１ａ／ＲＩＢＯ細胞からの培地中で５ｘ１０５個のＨＵＶＥＣを再懸濁した。馴化培地を一般的には次のように調製した：コンフルエントの細胞を１０％ＦＢＳ−ＭｃＣｏｙｓ中で７２時間増殖させるか、または最長で２４時間低酸素チャンバーに入れた。移動アッセイ。既に報告されているように、ボイデンチャンバー中でＨＵＶＥＣおよびＨＡＥＣ移動アッセイを行った。上述のように馴化培地を調製した。いくつかの実験において、腫瘍細胞からの培養上清をベバシズマブ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  ＢｉｏＯｎｃｏｌｏｇｙ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）で処理した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｄａｖｉｓの薬局からベバシズマブを入手した。３つ組のウェルで各状態をアッセイした。ＨＵＶＥＣ細胞のコンフルエントの単層を作製することによって、「スクラッチ」創閉鎖アッセイを行った。パスツールピペットの先端を使用して、スクラッチを作製した。ＨＥＣ１ａ１ＥＭＰ２、ＨＥＣ１ａ／ＶまたはＨＥＣ１ａ／ＲＩＢ０細胞からの馴化培地をウェルに添加した。３つの創傷のそれぞれに対するこれらの無作為測定を各試験条件に対して測定した。この実験を３回繰り返した。
【０２１１】
次に培地を回収し、遠心して細胞残屑を除去した。いくつかの実験において、ＨＥＣ１ａ細胞を１００／ｌｇ／ｍＬの全長ＥＭＰ２  ＩｇＧＩで２４時間１３処理するか、または０から５０ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＶＥＧＦ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を誘導因子として使用した。１８時間後、カルセインＡＭで細胞を染色し、分析した。
【０２１２】
ＥＭＰ２レベルが血管の増加数と相関することを確認するために、内皮の管腔表面に均一に結合するリコペルシコン・エスキュレントゥム（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）レクチンおよびＤＡＰＩで腫瘍を染色した。ＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２腫瘍は、ＨＥＣ１ａ／Ｖ腫瘍と比較して、腫瘍関連の脈管構造の増加を示した。ＨＥＣ１ａ／ＲＩＢＯ腫瘍の同様の染色から、腫瘍脈管構造が乏しく、壊死領域で幾分バックグラウンド染色があることが示された（図２Ｂ）。ＣＤ３４抗体で異種移植変も染色し、調和する結果となった（図２Ｃ）。
【０２１３】
実施例３：ＥＭＰ２発現は内皮細胞管形成を促進する。
いくつかのアプローチを使用して、ＥＭＰ２が内皮細胞の挙動を制御し得るか否かおよびどのように制御し得るかを調べた。最初にボイデンチャンバーを用いてＥＭＰ２改変細胞株からの上清に対するＨＵＶＥＣの化学走性反応を試験した。４から６時間後、ＥＭＰ２腫瘍発現によって、対照細胞と比較して定方向移動が有意に促進された（ｐ＝０．０４；図３Ａ）。ＥＭＰ２発現の低下によって、対照細胞の２倍、細胞移動がさらに減少した（ｐ＝０．０３）。ＥＭＰ２発現によって内皮細胞移動が変化することを確認するために、ＨＵＶＥＣ細胞のコンフルエントの単層上で「スクラッチ」試験を行った。前の結果と調和して、ＥＭＰ２用量依存的反応も観察された（図３Ｂ）。
【０２１４】
ＥＭＰ２によって内皮細胞の機能的挙動が変化するか否かを判定するために、ＨＵＶＥＣ細胞を基底膜マトリクス上に置き、毛細管様の管形成を誘導した。ＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２、ＨＥＣ１ａ／ＶおよびＨＥＣ１ａ／ＲＩＢＯからの培養上清中で細胞を温置した（図３Ｃ）。ＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２が、ＨＥＣ１ａ／Ｖより多くの管形成を誘導し、直径がより大きくなったので、毛細管様管形成においてＥＭＰ２−依存性反応が認められた（図３Ｄ、Ｅ）。ＨＥＣ１ａ細胞におけるＥＭＰ２発現の減少によって、ＨＥＣ１ａ／Ｖと比較して形成される管の数がさらに減少し、このことから、子宮内膜腫瘍の血管新生にＥＭＰ２発現が必要であることが示唆される。この効果はまた、ｓｈＲＮＡを用いてＥＭＰ２レベルを低下させた場合にも観察された（データは示さない。）実験の枠内でＨＵＶＥＣ細胞増殖の有意差は認められなかった（データは示さず。）。
【０２１５】
内皮細胞におけるＥＭＰ２の効果が細胞型に特異的であるか否かを判定するために、初代ヒト大動脈内皮細胞（ＨＡＥＣ）において同様の実験を行った。化学誘引物質としてＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２、ＨＥＣ１ａ／ＶまたはＨＥＣ１ａ／ＲＩＢＯからの上清を用いて、ＨＡＥＣにおいてボイデンチャンバー−アッセイを行った。ＨＵＶＥＣ培養物を用いた結果と同様に、ＥＭＰ２の腫瘍発現によって、ＨＡＥＣ浸潤が促進された（図４Ａ）。これらの結果の組み合わせから、ＥＭＰ２上方制御が、血管新生促進事象の増加を導くことが示唆される。いくつかの細胞性および分子的変化が腫瘍の血管新生を促進することが示されており、最も強力な誘導因子は血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である。ＶＥＧＦがＨＡＥＣ浸潤に寄与するか否かを判定するために、ベバシズマブ、ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体とともに腫瘍細胞上清を温置した。ベバシズマブでの処置により、対照レベルに対してＨＡＥＣ移動が減少し、このことから、ＥＭＰ２がＶＥＧＦ発現を制御し得ることが示唆される。
【０２１６】
実施例４：ＥＭＰ２はＶＥＧＦ発現を制御する。
ＥＭＰ２発現によってＶＥＧＦ発現および分泌が変化するか否かを判定するために、細胞を２４時間、低酸素チャンバーに入れた。ＥＭＰ２発現は、ＶＥＧＦタンパク質レベル（図４Ｂ）ならびに分泌性タンパク質（図４Ｃ）と直接相関した。対照的に、ＥＭＰ２の減少の結果、ＶＥＧＦがウエスタンによって検出できないレベルとなり、分泌性タンパク質が低レベルとなった。によってウエスタンブロット分析を行った。レムリー緩衝液中で細胞を溶解させた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりタンパク質を分離し、ニトロセルロース膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に転写し、ポンソーＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色して転写効率を調べた。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ中の１０％低脂肪乳で膜をブロッキング処理し、ＥＭＰ２抗血清（１：１０００）、抗ＶＥＧＦ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、抗ＨＩＦ−１ａ（１：８００；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＰＰＡＲ−ｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、抗ｐ−Ｓｒｃ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｄａｎｖｅｒｓ）で精査した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識二次抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と、続いて化学発光（ＥＣＬ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてタンパク質バンドを可視化した。上述のようなＮＩＨプログラムＩｍａｇｅ  Ｊを用いてバンドの強度を定量した。ローディングの変動性を説明するために、β−アクチンを使用して各試料を正規化した。少なくとも３回の独立した実験を行い、必要であれば、スチューデントｔ検定（対応なし、片側）を用いて統計的有意性について結果を評価した。Ｐ値＜０．０５は、統計学的に有意であるとみなした。
【０２１７】
ＭＡ）、抗ｐ−ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、抗）７６／Ｓ７７ｐ＿ＦＡＫ（１：５００；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）または〜−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）。
【０２１８】
これらの結果を確認するために、ＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２、ＨＥＣ１ａ／ＶおよびＨＥＣ１ａ／ＲＩＢＯ細胞において半定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲ分析に対して、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いてトータル細胞ＲＮＡを単離した。全条件において、オリゴ（ｄＴ）プライマーおよびＭｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１μｇのトータルＲＮＡを逆転写した。全部で４つのスプライシング変異体を含むＶＥＧＦ増幅に対して、既に述べられるようなＰＣＲ条件およびプライマーを使用した。記載のような個別のＰＣＲ反応においてＧＡＰＤＨ  ｃＤＮＡ断片の増幅を行った。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル上で泳動し、臭化エチジウム染色により可視化した。
【０２１９】
ＶＥＧＦ−Ａは、全般的にＶＥＧＦｘｘｘと呼ばれ、８個のエクソンのプレｍＲＮＡオルタナティブスプライシングの結果である、複数のアイソフォームとして存在する。ＶＥＧＦ−Ａのオルタナティブスプライシングは、最初、１２１、１６５、１８９および２０６アミノ酸（ＶＥＧＦ１２ｌ、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６、ここのウェル）の４種類の異なるアイソフォームを生成させることが示された。ＥＭＰ２レベルは、いくつかのＶＥＧＦアイソフォーム（ＶＥＧＦ１６５およびＶＥＧＦ１２ｌ）のｍＲＮＡ発現を直接増加させ、一方でＥＭＰ２の減少によって調和した結果が得られた（図４Ｄ）。低レベルのＶＥＧＦ１８９ｍＲＮＡがＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２細胞で観察され、何れの細胞株でもＶＥＧＦ２０６の発現は検出されなかった。
【０２２０】
いくつかの発癌性ならびに成長因子−駆動性経路が、ＶＥＧＦ発現を制御することが示されている。低酸素状態が多くの発癌性シグナル伝達経路を動作させることが示されているので、発明者らは、最初に、ＥＭＰ２レベルが低酸素誘導性転写因子（ＨＩＦ−１ａ）発現を変化させるのに十分であるか否かを調べた。ＨＩＦ−１ａの最大発現レベルは、低酸素条件下でＥＭＰ２発現の最大濃度に直接相関した（図４Ｅ）。ＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２細胞は、ＨＥＣ１ａ／Ｖ細胞と比較して、ＨＩＦ−１ａ発現を有意に誘導した（Ｐ＝０．０００８）。相互に、ＨＥＣ１ａ／ＲＩＢＯ細胞が産生したＨＩＦ−１ａのレベルは、同じ条件下で検出レベルを下回った。ＥＭＰ２レベルがより低いことによりＨＩＦ−１ａ発現が低下することを確認するため、ＥＭＰ２発現を減少させるようにｓｈＲＮＡコンストラクトを作製した（図４Ｆ）。
【０２２１】
いくつかの実験において、ＨＩＦ−１ａ発現に対する特異的な経路の寄与を判定するために、阻害剤を添加した。ＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２細胞をｌ０μＭのキナーゼ阻害剤Ｌｙ２９４００２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＥＧＦＲ阻害剤エルロチニブｅ；１０μＭ、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）またはＳｒｃファミリーチロシンキナーゼ阻害剤ダサチニブｅ；１０μＭ、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）で処理した。製造者の推奨投与量で阻害剤の有効性を試験し、トリパンブルー排除を用いて潜在的毒性を測定した。試料を回収し、上記のＦＡＫ−Ｓｒｃ低分子阻害剤ＰＰ２または低分子対照ＰＰ３  １６、５ｆ−ｌＭのＡｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ（１７；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、５０ｆ−ｌＭのＰＩ３のように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ／ウエスタンブロット分析によって精査した。
【０２２２】
リボザイムによる実験と同様に、ｓｈＲＮＡ対照と比較して、ＥＭＰ２  ｓｈＲＮＡによりＨＩＦ−１ａレベルが低下した。
【０２２３】
共培養アッセイを用いて、腫瘍細胞におけるＥＭＰ２の下方制御によって、毛細管形成および内皮細胞の運動性が低下したことが明らかとなった。これは、これらの細胞によるＶＥＧＦ分泌低下の結果であり得るか、または抗血管形成剤の発現によるものであり得る。この論点に取り組むために、ビヒクル対照またはＥＭＰ２レベルが低下した細胞（ＨＥＣ１ａ／ＲＩＢＯまたはＨＥＣ１ａ／ｓｈＲＮＡ９１１）からの上清に様々な量のＶＥＧＦを添加した。外因性ＶＥＧＦは、ＨＵＶＥＣ細胞管形成を誘導するのに十分であり（図５Ａ）、このことから、ＶＥＧＦがないことが、管形成の欠失に寄与したことが示唆される。
【０２２４】
実施例５：ＥＭＰ２は、Ｓｒｃ介在経路を通じてＨＩＦ−１ａ発現を促進する。
ＥＭＰ２は、インテグリン介在ＦＡＫおよびＳｒｃ活性化を促進することが示されており、したがって発明者らは次に、ＥＭＰ２−刺激性ＦＡＫ／Ｓｒｃ活性化がＨＩＦ−１ａ発現上昇と直接相関するか否かを調べた。ＡＫＴ、ＰＩ３−キナーゼ、ＥＧＦＲおよびＳｒｃチロシンキナーゼの一般的な阻害剤を用いて、低酸素チャンバー中に入れながらＨＥＣ１ａ／ＥＭＰ２細胞をこれらの薬剤で処理した。図５Ｂで示されるように、Ｓｒｃ阻害剤ＰＰ２およびダサチニブをそれぞれ用いて、ＨＩＦ−１ａのＥＭＰ２誘導性過剰発現を逆転させた。ＰＩ３−キナーゼ阻害剤であるエルロチニブおよびＬｙ２９４００２の両方によってもまた同様の効果が生じ、このことから、ＥＭＰ２とシグナリング伝達において重複することが示唆される。対照的に、ＡＫＴｉは、これらの細胞においてＨＩＦ−１ａ発現を変化させなかった（図５Ｂ）。
【０２２５】
実施例６：抗ＥＭＰ２抗体療法は新血管形成を抑制する。
ＥＭＰ２処置からの腫瘍血管分布の減少が、血管退縮または血管形成減少ゆえのものであるか否かをさらに調べるため、壊死領域でのコラーゲンスリーブの存在を検出するためにマッソントリクローム染色で腫瘍を染色した（図６Ｃ）。全処置群で基底膜の断片が散乱していた（図６Ｃ、矢印）が、抗ＥＭＰ２抗体後、対照処理よりも壊死領域で空の基底膜スリーブがより豊富であった。このことから、ＥＭＰ２の遮断が、腫瘍新血管形成を減少させるための新規機構であることが示唆される。
【図１】
2015508066.tif 000002
【図２】
2015508066.tif 000003
【図３】
2015508066.tif 000004
【図４】
2015508066.tif 000005
【図５】
2015508066.tif 000006
【図６】
2015508066.tif 000007
【図７−１】
2015508066.tif 000008
【図７−２】
2015508066.tif 000009
【図７−３】
2015508066.tif 000010
【図７−４】
2015508066.tif 000011
【図７−５】
2015508066.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成26年10月7日(2014.10.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2015508066000001.app
【国際調査報告】
2015508066.tif 000013
2015508066.tif 000014