(57)【要約】  対象のマラリア状態を決定する方法であって、対象から得られる生物サンプルを準備し；生物サンプル中のPF10_0121 (ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ, pHPRT)および／またはPF11_0208 (ホスホグリセリン酸ムターゼ, pPGM)のレベルまたは存在を測定する工程を含む方法。
2015531483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のマラリア状態を決定する方法であって、
i. 対象から得られる生物サンプルを準備し；
ii. 生物サンプル中のPF10_0121 (ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ, pHPRT)および／またはPF11_0208 (ホスホグリセリン酸ムターゼ, pPGM)のレベルまたは存在を測定する
工程を含む方法。
【請求項２】
pHPRTおよび／またはpPGMの存在が、対象のマラリアの指標／診断である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１以上の予め決められた参照値と工程(ii)で測定されたレベルを比較する工程をさらに含む、請求項１〜２の１項以上に記載の方法。
【請求項４】
pHPRTの存在が、急性または症候性マラリアの診断である、請求項１〜３の１項以上に記載の方法。
【請求項５】
マラリアを診断する；マラリアを有する対象の予後について助言する；疾患の進行をモニターする；および特定の処置への対象の有効性または応答をモニターする、の何れか１つ以上のために方法を使用する、請求項１〜４の１項以上に記載の方法。
【請求項６】
対象のための適切な処置を決定する方法であって、
(ａ) 対象から得た生物サンプルを準備する；
(ｂ) 当該対象の生物サンプル中のpHPRTおよび／またはpPGMのレベルまたは存在を測定する；および
(ｃ) (ｂ)の結果を使用して最も適切な治療を決定する
工程を含む方法。
【請求項７】
サンプル中のpHPRTおよび／またはpPGMの存在が、対象が、マラリアを有するとして処置されるべきであり、抗マラリア剤を投与されるべきであることを示す、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程(ｂ)で測定されたpHPRTおよび／またはpPGMのレベルを、工程(ｃ)の前に１以上の予め決められた参照値と比較するさらなる工程を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
マラリアを有する対象の特定の処置への応答を決定する方法であって、
(ａ) 対象から得た生物サンプルを準備する；
(ｂ) 対象の生物サンプル中のpHPRTおよび／またはpPGMのレベルを測定する；
(ｃ) 工程(ｂ)で測定したpHPRTおよび／またはpPGMのレベルを１以上の参照値と比較する
工程を含む方法。
【請求項１０】
参照値が、同じ対象の以前のサンプル中のpHPRTおよび／またはpPGMのレベルである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
対象において、マラリアを診断する方法であって、
i. 対象から得た生物サンプルを入手する；
ii. 生物サンプル中のPF10_0121 (ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ, pHPRT)および／またはPF11_0208 ホスホグリセリン酸ムターゼ, pPGM)の存在と、所望によりそのレベルを測定する；
iii. サンプル中にpHPRTおよび／またはpPGMが存在するならば、マラリアを診断する
ことを含む方法。
【請求項１２】
対照において、マラリアを処置する方法であって、
i. 対象から得た生物サンプルを入手する；
ii. 生物サンプル中のPF10_0121 (ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ, pHPRT)および／またはPF11_0208 ホスホグリセリン酸ムターゼ, pPGM)の存在と、所望によりそのレベルを測定する；
iii. サンプル中にpHPRTおよび／またはpPGMが存在するならば、抗マラリア剤を投与する
ことを含む方法。
【請求項１３】
生物サンプルが血漿サンプルである、請求項１〜１２の１項以上に記載の方法。
【請求項１４】
対象によって提供される生物サンプル中のpHPRTおよび／またはpPGMのレベルを測定するための少なくとも１種の試薬を含む、対象のマラリア状態の決定に使用するためのキット。
【請求項１５】
ラベルまたは添付文書の形態の、適当な操作パラメーターについての説明書をさらに含む、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象のマラリア状態を決定するための１種以上のバイオマーカーおよび１種以上の当該バイオマーカーの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトのマラリアは、マラリア原虫によって引き起こされる生命を危うくする疾患であり、アフリカの子供が主で、年間約６５５,０００人の死亡原因である。５種のマラリア原虫がヒトマラリアを起こすが、死亡の大多数は熱帯熱マラリア原虫が原因である。重度マラリアで病院に収容される子供の大部分の死亡は最初の２４時間以内であるため、マラリア患者を適切に診断して処置することが重大である。
【０００３】
マラリア感染を診断する標準的な方法は、光学顕微鏡を用いて血中の寄生虫を視覚化することを要する。しかし、マラリアを診断する研究施設は、多くの資金の乏しい流行地では利用できず、抗マラリア剤の投与は、しばしば非特異的な臨床的症状に基づいている。臨床症状に基づく処置割り付けは、マラリアの過剰診断、したがって抗マラリア剤の過剰使用をもたらし、利用可能な薬物に対する熱帯熱マラリア原虫の耐性増加の一因となっている。その結果、世界保健機関は、全てのマラリアが疑われる症例を、寄生虫をベースとする診断アッセイで確認することを推奨している。熱帯熱マラリア原虫タンパク質を検出するラテラルフロー免疫クロマトグラフィーアッセイ(ディップスティック)をベースとする幾つかの市販の迅速な診断試験(ＲＤＴ)が開発されており、様々な成功率で実施されている。ＲＤＴは比較的安価で使用が簡単であり、その結果は約２０分で得られる。
【０００４】
マラリアで使用される最も広く利用可能なＲＤＴは、ヒスチジンリッチタンパク質２(HRP 2)、乳酸デヒドロゲナーゼ(pLDH)およびアルドラーゼ(pFBPA)を検出する。これらのマーカーは有用であるが制限がある。例えば、HRP2抗原は、抗マラリア剤で処置後３３日まで血中に残留し得る。このため、処置成功をモニターするためにこの試験を使用できない。同様に、現在のおよび最近の感染におけるHRP-2の同定は、高伝染力を有するマラリアの流行地域でのHRP-2の診断的価値を制限する。さらに、hrp2遺伝子のヒスチジンリッチ反復領域の欠損を有する寄生虫集団が報告されている。pLDHは血中に残留しないが、急性感染を起こさないマラリア寄生虫の生殖段階である熱帯熱マラリア原虫生殖母細胞がpLDHを産生し、これにより、急性感染を起こしていた無性生殖形態が排除できているにもかかわらず陽性試験結果を生じ得る。
従って、マラリアのためのさらなるバイオマーカーについての必要性が残存する。
【発明の概要】
【０００５】
従って、個体のマラリア状態の指標を与えるために使用され得る、および／またはこのような個体に適切な処置のタイプを評価するために使用され得る１種以上のバイオマーカーを提供することが本発明の目的である。
【０００６】
第一の局面において、本発明は、対象のマラリア状態を決定する方法であって、
i. 対象から得られる生物サンプルを準備し；
ii. 生物サンプル中のPF10_0121 (ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ, pHPRT)および／またはPF11_0208 (ホスホグリセリン酸ムターゼ, pPGM)のレベルまたは存在を測定する
工程を含む方法を提供する。
【０００７】
他の態様において、本発明の方法の工程(ii)では、図４に示す１種以上のタンパク質のレベルまたは存在を測定する。図４に示すタンパク質は、表に示された名前および／または表に示された受入番号によって定義でき、当該タンパク質は、本明細書で、“代替バイオマーカー”という。代替バイオマーカーは、図４に示す何れのタンパク質であってもよく、特に次に示すものの何れか１つ以上であり得る：14-3-3タンパク質、熱ショックタンパク質86、熱ショック70kDaタンパク質、QF122抗原、エノラーゼ、リボソームリン酸化タンパク質P0、液胞型ＡＴＰ合成酵素触媒性サブユニットａ、伸長因子１α、増殖細胞核抗原、リボヌクレオシド二リン酸還元酵素大サブユニット、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素、Rab1、熱ショックタンパク質シグナルペプチド、PfmpC 1 TM ヘリックス、高移動度群タンパク質、シャペロニン cpn60 ミトコンドリア前駆体およびアクチン。
【０００８】
好ましくは、pHPRTおよび／またはpPGMおよび／または何れかの代替バイオマーカーの存在は、対象のマラリアの指標／診断である。
【０００９】
本発明の方法は、pHPRTおよび／またはpPGMおよび／または１種以上の代替バイオマーカーがサンプル中に存在するならば対象がマラリアを有すると結論付ける、さらなる工程を含み得る。pHPRTおよびpPGMおよび代替バイオマーカーは共に、マラリアを有しない対象ではどんなレベルでも存在すべきでない寄生虫タンパク質である。
【００１０】
本発明の方法は、１個以上の予め決められた参照値と(ii)で測定されたレベルを比較する工程をさらに含み得る。
使用した試験方法での何らかの誤差またはバックグラウンドを考慮するために、pHPRTおよび／またはpPGMおよび／または１種以上の他のバイオマーカーのレベルを、対照サンプル、好ましくは非感染サンプルのレベルと比較し得る。
好ましい態様において、工程(ii)では、少なくともpHPRTのレベルが測定される。
【００１１】
本発明の方法は、急性または症候性マラリアの診断を可能にし得る。すなわち、pHPRTの存在、さらに所望によりpPGMおよび／または１種以上の代替バイオマーカーの存在が、急性マラリアの診断を可能にし得る。ここで、急性マラリアは、マラリア寄生虫およびマラリアの症状、例えば発熱の存在と定義される。
【００１２】
サンプルを得る工程は、好ましくは、本発明の一部を形成しない。
【００１３】
用語“生物サンプル”は、対象の診断または評価を目的として得られる生物液体サンプルをいう。好ましい生物サンプルは、血液、血清、血漿、唾液および脳脊髄液を含むが、これらに限定されない。さらに、当業者は、幾つかの試験サンプルは、分画または精製後、例えば全血を血清または血漿成分に分離した後、より容易に分析されることを認めるであろう。
生物サンプルは、対象から得た血漿サンプルであってよい。
【００１４】
用語“レベル”は、本明細書で定義されるとき、生物サンプルに含まれるpHPRTおよび／またはpPGMおよび／または１種以上の代替バイオマーカーの量または濃度をいう。
【００１５】
用語“マラリア状態”は、マラリアの何らかの所見を含む。例えば、マラリアの存在または非存在、マラリアの進行およびマラリアのための処置に対する有効性または対象の応答。
【００１６】
本発明の方法は、例えば、次に示す何れか１つ以上のために使用し得る：マラリアを診断する；マラリアを有する対象の予後について助言する；疾患の進行をモニターする；および特定の処置に対する有効性または対象の応答をモニターする。
【００１７】
好ましくは、本発明の方法は、患者のサンプル中のpHPRTおよび／またはpPGMおよび／または１種以上の代替バイオマーカーのレベルの分析から、マラリアの診断を可能にする。好ましくは、少なくともpHPRTレベルを測定する。
【００１８】
pHPRTおよび／またはpPGMおよび／または１種以上の代替バイオマーカーのレベルを参照値と比較し得る。ここで、参照値は、例えば光学顕微鏡による寄生虫視覚化によってマラリアを有しないと決定された１以上の対象由来のサンプル中の同じタンパク質の発現レベルである。これらのサンプルは、バイオマーカーの、いわゆる“正常値”を有する。
【００１９】
あるいは、参照値は、特定の対象について以前に得た値であってもよい。この種の参照は、本方法を感染の進行をモニターするためにまたは特定の処置への対象の応答をモニターするために使用するならば使用され得る。
【００２０】
pHPRTおよび／またはpPGMおよび／または１種以上の他のバイオマーカーのレベルを、何らかの適当な方法によって評価し得る。例えば、タンパク質レベルを測定するならば、イムノアッセイ、分光法、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、スロットまたはドットブロットアッセイ、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗体マイクロアレイ免疫組織学的染色、放射性イムノアッセイ(ＲＩＡ)、蛍光免疫測定、アビジン−ビオチンまたはストレプトアビジン−ビオチン系を用いたイムノアッセイなど、およびそれらの組み合わせを含む群の何れかを使用し得る。これらの方法は当業者によく知られている。他の方法も使用し得る。
【００２１】
単にpHPRTおよび／またはpPGMおよび／または１種以上の代替バイオマーカーがサンプル中に存在するか否かを測定するだけで十分であって、絶対値は必要でないかもしれない。
【００２２】
好ましくは、本発明の方法は、結果を２４時間未満、好ましくは１２時間未満、６時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、より好ましくは３０分未満で得ることを可能にする。
【００２３】
本発明の方法は、マラリアのより有効な診断を提供するために、臨床的症状の評価と合わせて使用してよい。
【００２４】
また、本発明は、対象のための適切な処置を決定する方法であって、
(ａ) 対象から得た生物サンプルを準備する；
(ｂ) 当該対象の生物サンプル中のpHPRTおよび／またはpPGMのレベルまたは存在を測定する；および
(ｃ) (ｂ)の結果を使用して最も適切な治療を決定する
工程を含む方法を提供し得る。
【００２５】
他の態様において、工程(ｂ)では、１種以上の代替バイオマーカーのレベルまたは存在を測定し得る。
【００２６】
例えば、サンプル中にpHPRTおよび／またはpPGMおよび／または１種以上の代替バイオマーカーを有する患者は、マラリアを有するとして処置され得て、抗マラリア剤を投与される。
【００２７】
本発明の方法は、工程(ｂ)で測定されたpHPRTおよび／またはpPGMおよび／または１種以上の代替バイオマーカーのレベルを、工程(ｃ)の前に、１以上の予め決められた参照値と比較する、さらなる工程を含み得る。好ましくは、pHPRTのレベルを測定する。
【００２８】
本発明の他の態様において、マラリアの診断を決定するためにpHPRTおよび／またはpPGMおよび／または１種以上の他のバイオマーカーを使用する本発明の方法を、マラリアの診断を決定するために、発熱などの臨床的特徴と合わせて使用し得る。
【００２９】
本発明の方法を、インビトロで行ってよい。
【００３０】
対象はヒトであってよい。他の態様において、対象は、哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、サル、類人猿、齧歯動物、ハムスター、ラットまたはモルモットであってよい。
【００３１】
本発明の他の局面に従って、本発明は、マラリアを有する対象の特定の処置への応答を決定する方法であって、
(ａ) 対象から得た生物サンプルを準備する；
(ｂ) 対象の生物サンプル中のpHPRTおよび／またはpPGMのレベルを測定する；
(ｃ) 工程(ｂ)で測定したpHPRTおよび／またはpPGMのレベルを１以上の参照値と比較する
工程を含む方法を提供する。
【００３２】
他の態様において、工程(ｂ)で１種以上の代替バイオマーカーのレベルを測定してよく、工程(ｃ)で１種以上の他のバイオマーカーのレベルを参照値と比較する。
【００３３】
参照値は、同じ対象由来の以前のサンプル中のpHPRTおよび／またはpPGMおよび／または１種以上の代替バイオマーカーのレベルであってよい。
【００３４】
本発明の他の局面に従って、本発明は、患者において、マラリアを処置する方法であって、患者の生物サンプル中にpHPRTおよび／またはpPGMが存在するか否かを測定する分析結果を提供する試験を要求し、pHRTおよび／またはpPGMが生物サンプル中で発見されたならば、患者に抗マラリア処置剤を投与することを含む方法を提供する。
【００３５】
また、さらなる局面に従って、本発明は、ヒト対象において、pHRTおよび／またはpPGMの存在によって特徴付けられるマラリアを診断する方法であって、
i) 対象から生物サンプルを得る；
ii) pHRTまたはpPGMに特異的なモノクローナル抗体を適用し、ここで、pHPRTまたはpPGMの存在が抗体−バイオマーカー複合体を形成する；
iii) 抗体−バイオマーカー複合体を検出する検出剤を適用する：
iv) 工程(iii)の検出剤を検出し、マラリアを診断する
ことを含む方法を提供する。
【００３６】
本発明のさらに他の局面に従って、本発明は、対象のマラリア状態の決定に使用するキットであって、対象によって提供される生物サンプル中のpHPRTおよび／またはpPGMおよび／または１種以上の代替バイオマーカーのレベルを測定するための、少なくとも１種の試薬を含むキットを提供する。
該試薬は抗体であってよい。
【００３７】
キットは、さらに、ラベルまたは添付文書の形態の、適当な操作パラメーターについての説明書を含んでよい。
【００３８】
キットは、さらに、較正および比較のための標準として使用される１以上のpHPRTおよび／またはpPGMサンプルを含んでよい。
【００３９】
本発明は、さらに、対象のマラリア状態を決定するためのバイオマーカーとしての、pHPRTおよび／またはpPGMおよび／または１種以上の代替バイオマーカーのレベルの使用を提供する。
【００４０】
他の局面に従って、本発明は、対象において、マラリアを診断する方法であって、
i. 対象から得た生物サンプルを得る；
ii. 生物サンプル中のPF10_0121 (ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ, pHPRT)および／またはPF11_0208 (ホスホグリセリン酸ムターゼ, pPGM)の存在と、所望によりそのレベルを測定する；
iii. サンプル中にpHPRTおよび／またはpPGMが存在するならば、マラリアを診断する
ことを含む方法を提供し得る。
【００４１】
他の態様において、工程(ii)で１種以上の代替バイオマーカーの存在と、所望によりそのレベルを測定し、これを工程(iii)でマラリアを診断するために使用する。
好ましくは、少なくともpHPRTのレベルを測定する。
【００４２】
他の局面に従って、本発明は、対象において、マラリアを処置する方法であって、
i. 対象から得た生物サンプルを入手する；
ii. 生物サンプル中のPF10_0121 (ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ, pHPRT)および／またはPF11_0208 ホスホグリセリン酸ムターゼ, pPGM)の存在と、所望によりそのレベルを測定する；
iii. サンプル中にpHPRTおよび／またはpPGMが存在するならば、抗マラリア剤を投与する
ことを含む方法を提供し得る。
【００４３】
他の態様において、工程(ii)で１種以上の代替バイオマーカーの存在と、所望によりそのレベルを測定し、これを工程(iii)で抗マラリア剤を投与すべきか否かを決定するために使用する。
【００４４】
当業者は、本発明の何れか１つの態様および／または局面の好ましい特徴が、本発明の他の全ての態様および／または局面に適用され得ることを認めるであろう。
次に示す図面の記載を参照した本発明の詳細な説明を、単なる例として下に示す。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図１は、熱帯熱マラリア原虫タンパク質pPGM(図１ａ(配列番号１))およびpHPRT(図１ｂ(配列番号２))を詳述する。それぞれの図において、上のパネルはタンパク質配列包括度および高信頼度で寄生虫タンパク質を同定するために使用されるペプチド配列(強調および下線)を示す。下のパネルは選択されたプロテオタイプのペプチドについての代表的な最適化ＳＲＭアッセイを示す。左のパネルは、血漿中の安定重同位体標識ペプチド(ＳＩＳ) 対 内在性ペプチドの相対存在量を示す。中央のパネルは血漿中のＳＩＳペプチドにつて測定された遷移強度を示し、右のパネルは代表的な個体の血漿中で測定された内在性ペプチドの遷移強度を示す。
【図２】図２は、熱帯熱マラリア原虫タンパク質pPGM(図２ａ(配列番号３、４、５および６))、および、pHPRT (図２ｂ(配列番号７、８、９および１０))の配列アラインメントおよび選択されたプロテオタイプのペプチドおよび対応するホモ・サピエンスのタンパク質配列を示す。データは、ヒトマラリアを引き起こし得る寄生虫(熱帯熱マラリア原虫、三日熱マラリア原虫、卵形マラリア原虫、四日熱マラリア原虫および二日熱マラリア原虫)およびホモ・サピエンスについてのタンパク質アラインメントを示す。
【図３】図３は、ＳＲＭアッセイを用いた熱帯熱マラリア原虫プロテオタイプペプチド(ＰＴＰ)の定量化を示す。データは、重度マラリア(N=15)、軽度マラリア(N=15)および回復期対照(処置28日後)(N=15)のガンビア人の子供から得た血漿サンプルで測定された熱帯熱マラリア原虫タンパク質pPGMおよびpHPRTに対応する軽い(内在性)対重原子標識ペプチド(Ｌ／Ｈ面積比)の平均の比を示す。エラーバーは平均値の標準誤差を示す。*** Ｐ＜０.００１およびＮＳ：有意でない。
【図４】図４は、重度マラリアを有する子供の血漿サンプルで識別される熱帯熱マラリア原虫タンパク質を詳述する表である。* ＞２０のスコアはタンパク質同定のために許容される。記載されたペプチド配列は配列番号１１〜８７として配列表に含まれる。
【実施例】
【００４６】
＜方法＞
サンプル
サンプル処理および保存は、ガンビアのＭＲＣ研究所で、優良臨床研究所(ＧＣＬＰ)規範に従う標準的な操作手順に従って行われた。血液サンプルを採取して２時間以内に処理した。血漿を分離し、−８０℃で保存した。
【００４７】
選択的反応モニタリング(ＳＲＭ)検証アッセイ
サンプル調製：  ４８人の各患者から１２μｌの血漿サンプルを、脱脂し、１４の最も豊富なタンパク質を枯渇させ(MARS Human-14, Agilent Technologies)、沈殿させ、定量化した。
【００４８】
ペプチド選択および合成：  各タンパク質について、３〜５種のプロテオタイプペプチド(ＰＴＰ)を選択した。γ−シリーズフラグメントイオンに基づいて、３〜５の遷移を各ペプチドの２つの主要な電荷状態それぞれに含めた。予測されたＰＴＰを、Ｃ末端Arg(１３Ｃ６、１５Ｎ４)またはＣ末端Lys(１３Ｃ６、１５Ｎ２)の何れかを有する同位体標識アミノ酸で、ＳＰＯＴ合成 (JPT Peptide Technology, Germany)を使用して合成し(未精製)、対応するＳＲＭアッセイを開発するための参照値として使用する。内在性ペプチドと重原子標識ペプチドの間の１＋フラグメントの質量差は、８Daまたは１０Daの何れかであった。安定な同位体標準ペプチドは、タンパク質消化前に添加し、内部標準として使用した。
【００４９】
精製重原子標識ペプチドを、APEX396固相合成装置(AAPPTec, Louisville, KY, US)で合成した。９−フルオレニルメチルオキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)法をペプチドの合成に使用した。最初に、第１Ｆｍｏｃアミノ酸を酸に不安定なリンカーによって不溶性支持体樹脂に結合させた。Ｆｍｏｃ基の脱保護を、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)中２０％のピペリジンでアミノ酸を処理することによって行った。第２Ｆｍｏｃアミノ酸を、アミノ酸のインサイツ活性化を利用して伸長するペプチド鎖にカップリングさせた。望ましいペプチドを合成した後、樹脂に結合したペプチドを脱保護し、トリフルオロ酢酸(ＴＦＡ)によって固体支持体から分離させた。ペプチドをエーテルで沈殿させ、乾燥し、逆相ＨＰＬＣカラムおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置(Ultraflex, Bruker Daltonics, Germany)で分析した。
【００５０】
ペプチドＳＲＭ標準曲線および直線範囲：  ペプチドを高精度天秤で秤量し、１０％  ＡＣＮおよび０.５％  ＦＡで可溶化し、スピードバキューム遠心分離器で乾燥した。２３ng/μLのストック濃度から、GILAADESTQTIK (配列番号８８) および VLVPNGVIK (配列番号８９)のペプチドについて、２％  ＡＣＮおよび０.１％  ＦＡで連続希釈液を作成した。
【００５１】
ＳＲＭアッセイ：  ＳＲＭアッセイについて、２〜３種のペプチドおよびペプチド当たり３〜５の遷移を、pPGMまたはpHPRTタンパク質を標的とするために使用した。枯渇させた血漿サンプルを、等モル量の安定な同位体標準(ＳＩＳ)ペプチドの混合物と混合し、１０９.１fmolの各ＳＩＳペプチドおよび１μｇの血漿タンパク質を１μｌとした。混合物を、１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液(ｐＨ ７.８)中２００ｍＭ  ＤＴＴで３０分間還元し、１００ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液(ｐＨ ７.８)中２００ｍＭ  ヨードアセトアミドで３０分間アルキル化し、続いてＤＴＴと共にさらに３０分間インキュベートした。タンパク質を、シークエンシング等級修飾トリプシン(Promega)で、１：２０の酵素：基質比を用いて、３７℃で一夜消化した。５％  蟻酸を添加することによって、消化を終了した。サンプルを、Sep-Pak Light C18 cartridge(Waters)によって脱塩し、スピードバキュームによって乾燥し、緩衝液Ａ(２％  ＡＣＮ、０.１％  ＦＡ)に再度懸濁して、血漿サンプルについて１μg/μｌおよび各重原子標識ペプチドについて１０９.１fmol/μｌの最終濃度とした。１μｌを、Chip-cube (Agilent Technologies)を備えたAgilent 1200 HPLC系と連結したAgilent 6460 Triple Quadrupole 装置に注入した。
【００５２】
４５または４７の遷移それぞれで２種の別のＭＲＭ法を使用して、１.８秒のサイクル時間および３５ミリ秒のドゥエル時間を使用した。半量の高さでの全幅は０.３分であった。ＳＲＭアッセイを使用した最適コリジョンエネルギー(ＣＥ)を、6520 Q-TOF 装置(Agilent Technologies)でのＳＩＳペプチドフラグメンテーションの経験によるデータから導出した。ＭＳ／ＭＳデータを検索するために、ＳＩＳペプチドのＱ−ＴＯＦ ＭＳ／ＭＳデータを、(１)全合成ペプチドの連結配列、(２)熱帯熱マラリア原虫 3D7および(３)ホモ・サピエンス・プロテオームを含むＦＡＳＴＡファイルに対して検索した。
【００５３】
ＨＰＬＣ：  サンプルを、Agilent 1200 Series HPLC-Chip (C18 チップ、160nLトラップカラム)で、流速０.３μl/分および濃度勾配６０分(ショットガン実験に関して)を使用して分析した。簡単には、我々は、３〜４０％  緩衝液Ｂ(９５％  ＡＣＮ、０.１％  ＦＡ)、４６.６７分の直線的濃度勾配、続いて１００％まで４分以内で急激に増加、５.３３分維持、続いて１００〜３％、４分の直線的濃度勾配、最後に３％  緩衝液Ｂで９分間平衡化、を使用した。
【００５４】
データ分析
ＳＲＭデータを、Skyline software (v1.2) (MacLean, B., et al (2010) Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics 26, 966-968)を使用して分析した。相対定量を面積比(軽／重)を使用して行い、各ペプチドについて、３つの最も強度の高い遷移のみを考慮した。それぞれの選択されたペプチドについては、最も強度の高いピークをクアンティファイヤー(quantifier)として使用し、測定されたペプチドの比および保持時間を確認するためにその他をクオリファイヤー(qualifier)として使用した。保持時間およびピーク選択は、最初はソフトウェアによって自動的に行われ、個別のクロマトグラムを調べることによって認証し、選択は重原子標識ペプチドで得られた保持時間に基づいた。結果は、内在性ペプチドと重原子標識ペプチドとのアラインメントであった。内在性ペプチドについての遷移がうまく分解できなかった場合は(例えば保持時間ミスマッチ)、分析を中止した。
【００５５】
タンパク質配列アラインメントは、Clustal Omegaを使用して行い、ClustalX v2.1. (Larkin, M. A et al (2007) Clustal W and Clustal X version 2.0. Bioinformatics 23, 2947-2948; Sievers, F., et al (2011) Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol Syst Biol 7, 539)で可視化した。統計学的分析は、GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc, USA) および Stata 11 (StataCorp LP, USA)で行った。
【００５６】
結果
熱帯熱マラリア原虫タンパク質を定量化するための選択された反応モニタリングアッセイ
熱帯熱マラリア原虫タンパク質pPGMおよびpHPRTを実証し、定量化するために、ＳＲＭアッセイを使用した。最初に６種のプロテオタイプのペプチドをpHPRTについて、８種をpPGMについて選択した(表１参照)。ＳＲＭをベースとする定量化は、重原子標識ペプチドと内在性ペプチドの両方が一貫して同一の保持時間および少なくとも３の遷移を示す場合(n=45)にのみ行った。これらの基準を、pPGMおよびpHPRTについて、１個のプロテオタイプのペプチドによって満たした。
【００５７】
【表１】
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【００５８】
各ペプチドについて検出された遷移を図１に示す。ＳＩＳおよび内在性ペプチドは同じ保持時間で溶出された。症例の大多数で、前駆体の強度はＳＩＳペプチドより高かった。しかし、強度が低いにもかかわらず、内在性ペプチドで検出された遷移数は、混合されたペプチドの遷移数より多かった。全てのタンパク質についてペプチドを検出し、最も多い症例で分析した。内在性ペプチド(軽)の最も強度が高い(クアンティファイヤー)遷移の面積および重原子標識ペプチド(混合された)の対応する面積を、個々のサンプル中のペプチドの相対定量化を行うための比を計算するために使用した。pPGMをFTGWTDVPLSEK (配列番号96)ペプチドで測定し、３６人の患者で定量化し、pHPRTをVLVPNGVIK (配列番号94)で測定し、２８人の患者で定量化した。
【００５９】
熱帯熱マラリア原虫タンパク質のＰＴＰ選択に使用される特異性基準は、ヒトのマラリアを起こし得る他の寄生虫の種との違いではなく、宿主のタンパク質配列(ホモ・サピエンス)との違いに基づいた。配列アラインメントは、熱帯熱マラリア原虫 PGM および HPRTを定量化するために選択されたペプチドは、種特異的であることを示す。
【００６０】
血漿中の熱帯熱マラリア原虫タンパク質検証および臨床的相互関係
ＳＲＭを用いて、寄生虫ペプチドは、主に重度マラリア症例(N=15)の血漿で検出されたが、軽度マラリア症例(N=15)および回復期症例(N=15)の血漿サンプルでも見られた。pHPRTについてのＳＲＭアッセイは、このタンパク質が、重度マラリア症例で、軽度マラリア症例より著しく高濃度であることを示した。pPGMは、急性マラリア症例で、回復期対照より高かった(図３)。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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