(57)【要約】  昆虫における組換えタンパク質の発現の改善を可能にする試薬および方法が提供される。より詳しくは、昆虫幼虫への組換えＤＮＡエレメントの導入によって、組換えタンパク質の発現の増大、前記タンパク質の正しいフォールディングの改善および昆虫の感染後の生存率の増大が可能となる。これらの組換えＤＮＡエレメントは、例えば、前記エレメントを組み込んだ組換えバキュロウイルスによって昆虫幼虫に導入され得る。組換えＤＮＡエレメントは、ＩＥ−０およびＩＥ−１などの転写調節因子をコードする核酸、相同領域（ｈｒ）などの転写エンハンサーエレメントおよびプロモーターを含む。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写調節因子として機能するタンパク質ＩＥ−１、ＩＥ−０および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現を可能にする核酸配列を含む昆虫であって、核酸は、
（ａ）配列番号１〜５のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸、
（ｂ）配列番号１〜５のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるタンパク質をコードする核酸配列、
（ｃ）配列番号６〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列を含有するアミノ酸をコードする核酸配列、および
（ｄ）配列番号６〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるアミノ酸配列をコードする核酸配列
からなる群から選択される、昆虫。
【請求項２】
組換えタンパク質の発現を駆動するのに適している任意のプロモーターと作動可能に連結した、エンハンサー領域としての少なくとも１種の組換え相同領域（ｈｒ）をさらに含む、請求項１に記載の昆虫。
【請求項３】
組換え相同領域（ｈｒ）が、配列番号２７に示される配列（ｈｒ１）である、請求項２に記載の昆虫。
【請求項４】
相同領域（ｈｒ）と作動可能に連結したプロモーターが、
（ａ）配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸と、
（ｂ）組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列と
を含む核酸の群から選択される、請求項２または３に記載の昆虫。
【請求項５】
配列番号１７〜２６を含む群から選択される組換えプロモーター、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む核酸配列を含む、請求項１から４のいずれかに記載の昆虫。
【請求項６】
組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み、前記核酸配列が、請求項１から５に記載の核酸配列からなる群から選択される核酸配列と作動可能に連結している、請求項１から５のいずれかに記載の昆虫。
【請求項７】
鱗翅目の属に由来する、請求項１から６のいずれかに記載の昆虫。
【請求項８】
イラクサギンウワバ、ヨトウガ、スポドプテラ・エキシグア、アスカラファ・オドラタ、カイコ、ラチプルシア・ニおよびスチグメネ・アクレアからなる群から選択される、請求項１から７のいずれかに記載の昆虫。
【請求項９】
核酸配列（複数可）が、組換えバキュロウイルス、好ましくは、ＡｃＭＮＰＶまたはＢｍＮＰＶによって昆虫に導入される、請求項１から８のいずれかに記載の昆虫。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の昆虫の使用ならびに従来手段による組換えタンパク質の抽出および精製を含む、組換えタンパク質を産生するための方法。
【請求項１１】
組換えタンパク質が、サブユニット単量体ワクチン、サブユニット多量体ワクチン、ウイルス様粒子、治療用タンパク質、抗体、酵素、サイトカイン、血液凝固因子、抗凝固薬、受容体、ホルモンまたは診断用タンパク質試薬を含む群から選択される、請求項１０に記載の組換えタンパク質を産生するための方法。
【請求項１２】
請求項１から６のいずれかに記載の核酸配列（複数可）を含む昆虫のための飼育、給餌または注入媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に含まれるということができるものであり、例えば、昆虫幼虫における、組換えタンパク質発現の効率を増大させることができる、例えば、プロモーター、エンハンサーとしての相同領域（ｈｒ）および転写調節因子をコードする配列、例えば、バキュロウイルスＡｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡまたはそれらの任意の組合せを含む核酸配列を包含する。さらに、本発明はまた、上記の本発明の核酸配列を含むベクター自体、それらの配列またはベクターで感染させ、形質転換し、形質導入またはトランスフェクトした昆虫および前記の配列、ベクターまたは昆虫を使用することによってタンパク質を産生するための方法を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
バキュロウイルス発現ベクター系（ＢＥＶＳ）は、ワクチン、治療分子または診断試薬として使用される組換えタンパク質を産生するための、十分に確立された方法である。過剰発現および迅速な発達速度の潜在性があるので、ＢＥＶＳは、任意の目的のために組換えタンパク質を産生するための最も魅力的な選択肢の１つである。組換えタンパク質発現のために産業上使用されるものとして、最も採用されているバキュロウイルスベクターは、オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ  ｖｉｒｕｓ）（ＡｃＭＮＰＶ）をベースとし、適した発現宿主としてスポドプテラ・フルギペルダ  ９（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ  ９）（Ｓｆ９）またはスポドプテラ・フルギペルダ  ２１（Ｓｆ２１）昆虫細胞を用い（非特許文献１）、ならびに生存している生物工場としてイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）（Ｔ．ｎｉ）昆虫幼虫を用いる（非特許文献２）。ＢＥＶＳは、８０年代に開発され（非特許文献３）、細胞質酵素から膜結合タンパク質に至る数百種の組換えタンパク質が、バキュロウイルス感染昆虫細胞において成功裏に産生されてきた。
【０００３】
世界中で、低付加価値の基質、クワの木の葉を、高付加価値のタンパク質ベースの生成物：絹糸に変換するプロセスで年に約７０，０００トンの絹糸が産生される。昆虫は、その加速された代謝のために高度に有効なタンパク質産生者である。カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）またはイラクサギンウワバなどの鱗翅目（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）は、バイオテクノロジーにおいて最も使用される昆虫のうちの２種である。それらは、２週間未満で約５０００倍の大きさに成長し、昆虫あたり１キロメートル超の絹糸を産生する。絹糸腺に由来する細胞は、約８０μｇのタンパク質／細胞／日を産生し得るが、最良の哺乳類細胞培養系は、約５０ｐｇタンパク質／細胞／日しか産生しない。培養哺乳類細胞から得られた組換えタンパク質の外来の物質（ウイルスまたはプリオンなど）による汚染の潜在性に起因する懸念は、ヒトまたは動物使用のための昆虫由来の生成物の場合には、完全に存在しないとはいえないとしても実質的に低い。ヒト治療用タンパク質を産生するようトランスジェニックカイコが作製されたが（非特許文献４）、この技術は、ワクチン抗原を産生するためにはまだ使用されていない。しかし、遺伝子改変されたバキュロウイルス（オートグラファカリフォルニカ核多角体病ウイルスおよびカイコ核多角体病ウイルス）を使用して、昆虫由来ワクチン（インセクチゲン（ｉｎｓｅｃｔｉｇｅｎｓ））が作製されている。基本的に、昆虫細胞培養物における抗原発現のために使用された同一バキュロウイルスが、昆虫幼虫に感染させるために使用され得る。感染の際、組換え抗原は、昆虫組織中に蓄積され、感染の３〜４日後に、幼虫は、感染幼虫あたり数百μｇ〜数ミリグラムの間に達し得る量で組換え抗原を得るよう処理され得る。動物の感染性疾患に対する実験ワクチンが試験されており、幼虫から得られた非精製可溶性抗原を使用する場合であっても極めて良好な結果が得られ、反復性免疫処置プロトコール後に動物において何ら副作用を伴わない（非特許文献５、６、７、８）。酵素（非特許文献９、１０）、抗体（非特許文献１１、１２）、ホルモン（非特許文献１３、１４）、サイトカイン（非特許文献１５、１６）および診断用タンパク質（非特許文献１７、１８、１９、２０）など、種々の適用を有するその他のタンパク質も、生存している生物工場として昆虫において産生されている。これら上記のタンパク質のほとんどは、合成後に正しくプロセシングされ、その機能的活性は、可溶性幼虫タンパク質抽出物中に完全なまま残った。生きた生物工場としての昆虫は、生産多用途性、拡張性、効率および開発速度のために、従来の発酵技術に対する、また植物由来タンパク質に対する有望な代替手段を構成する。
【０００４】
昆虫幼虫の細胞機構がバキュロウイルス感染によって深刻に損なわれる前にタンパク質発現が起こるよう、組換えタンパク質発現を加速することは、ＢＥＶＳの重要な改善となろう。ポリヘドリン（ｐｏｌｈ）またはｐ１０遺伝子の従来の強力なウイルスプロモーターによって駆動される遅い発現は、外来タンパク質翻訳後修飾において深刻な不利益をもたらす。従来使用されていたｐｏｌｈまたはｐ１０プロモーターよりも早期の発現を可能にするバキュロウイルスプロモーターが性状解析されており、異種タンパク質産生のために使用されてきたが、産生性の低下を示した（非特許文献２１）。
【０００５】
ＢＥＶＳを改善するための別の可能性は、ウイルス誘導性細胞死を低減することによって、感染後の遅い時間に細胞完全性の保存を増強させることであろう。ＢＥＶＳによって引き起こされる感染後の遅い時間の昆虫細胞機構の深刻な機能障害の低減は、組換えタンパク質（分泌型または比分泌型）を産生し、蓄積するための時間枠を増大するだけでなく、複雑なタンパク質のフォールディングのための、または産生されたタンパク質の任意の翻訳後修飾のためのより多くの時間を可能にするはずである。バキュロウイルス感染昆虫幼虫は、感染の過程の間に、ウイルス用量依存的に組換えタンパク質を産生し、蓄積する。感染幼虫の長期の生存は、高感染用量に対する特定の保護と一緒に、生存している生物工場として役立つ昆虫の産生性を著しく増大しよう。
【０００６】
いくつかのバキュロウイルスＤＮＡエレメントは、ウイルス増殖に必要である後期発現因子遺伝子の活性化に関与していることが判明している。それらのうち１種として、ＡｃＭＮＰＶ（オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス）由来の最初期（ｉｅ）タンパク質ＩＥ−１およびそのスプライシング変異体ＩＥ−０がある。Ａｃ−ｉｅ−０１  ｃＤＮＡによってコードされるＡｃＭＮＰＶ  ｍＲＮＡの翻訳は、内部翻訳開始によってＩＥ−０およびＩＥ−１産生の両方をもたらす。両者は、転写調節因子としてのその効力のためにバキュロウイルス遺伝子発現の重大なメディエーターであると考えられる（非特許文献２２）。ＡｃＭＮＰＶ  ＩＥ−１は、感染の際に極めて早期に合成され、そのＮ末端酸性ドメインの活性によってプラスミドトランスフェクションアッセイにおいて転写を刺激する、６７ｋＤａの二量体のＤＮＡ結合タンパク質である（非特許文献２３、２４）。ＩＥ−１は、核内に蓄積し、そこで、後期の間、維持される（非特許文献２５）。ＩＥ−１によるトランス活性化は、転写エンハンサーとして機能し、ウイルスＤＮＡ複製の起点である、バキュロウイルス相同領域（ｈｒ）配列にホモ二量体として結合することによって増強される。ＡｃＭＮＰＶ最初期タンパク質ＩＥ−０（７４ｋＤａ）は、そのＮ末端のさらなる５４アミノ酸残基を除いてＩＥ−１と同一である。ＡｃＭＮＰＶ  ＩＥ−０は、７２．６−ｋＤａの、ｏｒｆ１４１（エキソン０）によってコードされる３８個のアミノ酸、ｉｅ１の上流非翻訳リーダーによってコードされる１６個のアミノ酸および全５８２個のアミノ酸ＩＥ−１タンパク質からなる６３６個のアミノ酸のタンパク質である。したがって、最終生成物は、Ｎ末端と融合しているさらなる５４個のアミノ酸を除いてＩＥ−１と同一である。おそらく、その共通配列のために、ＩＥ−０およびＩＥ−１は、ｈｒエンハンサー結合および転写調節を含めた生化学的活性を共有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｎｅｔｔｌｅｓｈｉｐ, Ｊ.Ｅ., Ａｓｓｅｎｂｅｒｇ, Ｒ., Ｄｉｐｒｏｓｅ, Ｊ.Ｍ., Ｒａｈｍａｎ−Ｈｕｑ, Ｎ., Ｏｗｅｎｓ, Ｒ.Ｊ. Ｒｅｃｅｎｔ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ａｎｄ ｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｂｉｏｌｏｇｙ. Ｊ. Ｓｔｒｕｃｔ. Ｂｉｏｌ. ２０１０, １７２, ５５−６５.
【非特許文献２】Ｇｏｍｅｚ−Ｃａｓａｄｏ Ｅ, Ｇｏｍｅｚ−Ｓｅｂａｓｔｉａｎ Ｓ, Ｎｕｎｅｚ ＭＣ, Ｌａｓａ−Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ Ｒ, Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｐｕｌｇａｒｉｎ Ｓ, Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ ＪＭ. Ｉｎｓｅｃｔ ｌａｒｖａｅ ｂｉｏｆａｃｔｏｒｉｅｓ ａｓ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ. Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ. ７９： ３５−４３. ２０１１.
【非特許文献３】Ｓｍｉｔｈ, Ｇ.Ｅ., Ｍ.Ｄ. Ｓｕｍｍｅｒｓ, ａｎｄ Ｍ.Ｊ. Ｆｒａｓｅｒ. １９８３. Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｂｅｔａ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ. Ｍｏｌ. Ｃｅｌｌ. Ｂｉｏｌ. ３： ２１５６−２１ ６５.
【非特許文献４】Ｔｏｍｉｔａ, Ｍ., Ｍｕｎｅｔｓｕｎａ, Ｈ., Ｓａｔｏ, Ｔ., Ａｄａｃｈｉ, Ｔ., Ｈｉｎｏ, Ｒ., Ｈａｙａｓｈｉ, Ｍ., Ｓｈｉｍｉｚｕ, Ｋ., Ｎａｋａｍｕｒａ, Ｎ., Ｔａｍｕｒａ, Ｔ., Ｙｏｓｈｉｚａｔｏ, Ｋ., ２００３. Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｓｉｌｋｗｏｒｍｓ ｐｒｏｄｕｃｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ ｉｎ ｃｏｃｏｏｎｓ. Ｎａｔ. Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. ２１ （１）, ５２−５６.
【非特許文献５】Ｐｅｒｅｚ−Ｆｉｌｇｕｅｉｒａ, Ｄ.Ｍ, Ｒｅｓｉｎｏ−Ｔａｌａｖａｎ, Ｐ., Ｃｕｂｉｌｌｏｓ, Ｃ., Ａｎｇｕｌｏ, Ｉ., Ｂａｒｄｅｒａｓ, Ｍ.Ｇ., Ｂａｒｃｅｎａ, Ｊ., Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ, Ｊ.Ｍ., ２００７. Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｌｏｗ−ｃｏｓｔ, ｉｎｓｅｃｔ ｌａｒｖａｅｄｅｒｉｖｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ＲＨＤＶ. Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３６４ （２）, ４２２−４３０.
【非特許文献６】Ｐｅｒｅｚ−Ｍａｒｔｉｎ, Ｅ., Ｇｏｍｅｚ−Ｓｅｂａｓｔｉａｎ, Ｓ., Ａｒｇｉｌａｇｕｅｔ, Ｊ.Ｍ., Ｓｉｂｉｌａ, Ｍ., Ｆｏｒｔ, Ｍ., Ｎｏｆｒａｒｉａｓ, Ｍ., Ｋｕｒｔｚ, S., Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ, Ｊ.Ｍ., Ｓｅｇａｌｅｓ, Ｊ., Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ, Ｆ., ２０１０. Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｃｏｎｆｅｒｒｅｄ ｂｙ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＰＣＶ２ Ｃａｐ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ−ｌａｒｖａｅ. Ｖａｃｃｉｎｅ ２８ （１１）, ２３４０−２３４９.
【非特許文献７】Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓａｎ Ｍｉｌｌａｎ Ａ,    Ｇｏｍｅｚ−Ｓｅｂａｓｔｉａｎ Ｓ,    Ｎｕｎｅｚ  ＭＣ, Ｖｅｒａｍｅｎｄｉ Ｊ, Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ ＪＭ. Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ ａ ｎｏｎ−ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｉｎｓｅｃｔ ｌａｒｖａ. Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ. Ｐｕｒｉｆ.    ２０１０, ７４： １−８
【非特許文献８】Ｇｏｍｅｚ−Ｃａｓａｄｏ Ｅ, Ｇｏｍｅｚ−Ｓｅｂａｓｔｉａｎ Ｓ, Ｎｕｎｅｚ ＭＣ, Ｌａｓａ−Ｃｏｖａｒｒｕｂｉａｓ Ｒ, Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｐｕｌｇａｒｉｎ Ｓ, Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ ＪＭ. Ｉｎｓｅｃｔ ｌａｒｖａｅ ｂｉｏｆａｃｔｏｒｉｅｓ ａｓ ａ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ. Ｐｕｒｉｆ.    ２０１１, ７９： ３５−４３
【非特許文献９】Ｊ.Ａ. Ｍｅｄｉｎ, Ｌ. Ｈｕｎｔ, Ｋ. Ｇａｔｈｙ, Ｒ.Ｋ. Ｅｖａｎｓ, Ｍ.Ｓ. Ｃｏｌｅｍａｎ, Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ, ｌｏｗ−ｃｏｓｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ： ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｉｎ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｉｎｆｅｃｔｅｄ ｉｎｓｅｃｔ ｌａｒｖａｅ, Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ Ａｃａd. Ｓｃｉ. ＵＳＡ ８７ （１９９０） ２７６０−２７６４.
【非特許文献１０】Ｎ.Ｍ. Ｔｒｅｍｂｌａｙ, Ｂ.Ｐ. Ｋｅｎｎｅｄｙ, Ｉ.Ｐ. Ｓｔｒｅｅｔ, Ｗ.Ｊ. Ｋａｕｐｐ, Ｆ. Ｌａｌｉｂｅｒｔｅ, Ｐ.Ｋ. Ｗｅｅｃｈ, Ｈｕｍａｎ ｇｒｏｕｐ ＩＩ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ Ａ２ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ｌａｒｖａｅ−ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ, Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ. Ｐｕｒｉｆ. ４ （１９９３） ４９０−４９８.
【非特許文献１１】Ｕ. Ｒｅｉｓ, Ｂ. Ｂｌｕｍ, Ｂ.Ｕ. ｖｏｎ Ｓｐｅｃｈｔ, Ｈ. Ｄｏｍｄｅｙ, Ｊ. Ｃｏｌｌｉｎｓ, Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｉｌｋｗｏｒｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｓｉｌｋｗｏｒｍ ｌａｒｖａｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｄｕａｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ, Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ） １０ （１９９２） ９１０−９１２.
【非特許文献１２】Ｆ. Ｇｉｌ, Ｍ. Ｐｅｒｅｚ−Ｆｉｌｇｕｅｉｒａ, Ｍ.Ｇ. Ｂａｒｄｅｒａｓ, Ｃ. Ｐａｓｔｏｒ−Ｖａｒｇａｓ, Ｃ. Ａｌｏｎｓｏ, Ｆ. Ｖｉｖａｎｃｏ, Ｊ.Ｍ. Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ, Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｔｏ ａｎ ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｆ ｔｈe ＭＨＣ Ｃｌａｓｓ ＩＩ ＤＲ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅｓ, Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ. （２０１０）.
【非特許文献１３】Ｓ. Ｍａｔｈａｖａｎ, Ｖ.Ｔ. Ｇａｕｔｖｉｋ, Ｅ. Ｒｏｋｋｏｎｅｓ, Ｏ.Ｋ. Ｏｌｓｔａｄ, Ｂ.Ｎ. Ｋａｒｅｅｍ, Ｓ. Ｍａｅｄａ, Ｋ.Ｍ. Ｇａｕｔｖｉｋ, Ｈｉｇｈ−ｌｅｖｅl ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｌａｒｖａｅ ａｎｄ ＢｍＮ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ, Ｇｅｎｅ １６７ （１９９５） ３３−３９.
【非特許文献１４】Ｓ. Ｓｕｍａｔｈｙ, Ｖ.Ｂ. Ｐａｌｈａｎ, Ｋ.Ｐ. Ｇｏｐｉｎａｔｈａｎ, Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍｏｎｅ ｉｎ ｓｉｌｋｗｏｒｍ ｌａｒｖａｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ, Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ. Ｐｕｒｉｆ. ７ （１９９６） ２６２−２６８.
【非特許文献１５】Ｘ. Ｓｈｉ, Ｊ. Ｑｉｎ, Ｊ. Ｚｈｕ, Ｄ. Ｚｈｕ, Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｈｕｍａｎ ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｌｋｗｏｒｍ （Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ）, Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ａｐｐｌ. Ｂｉｏｃｈｅｍ. ２４ （Ｐｔ ３） （１９９６） ２４５−２４９.
【非特許文献１６】Ｍ.Ｑ. Ｐｈａｍ, Ｓ. Ｎａｇｇｉｅ, Ｍ. Ｗｉｅｒ, Ｈ.Ｊ. Ｃｈａ, Ｗ.Ｅ. Ｂｅｎｔｌｅｙ, Ｈｕｍａｎ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ （Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ） ｌａｒｖａｅ： ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｐａｒｔｉａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ, Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ. Ｂｉｏｅｎｇ. ６２ （１９９９） １７５−１８２.
【非特許文献１７】Ｊ.Ｂ. Ｋａｔｚ, Ａ.Ｌ. Ｓｈａｆｅｒ, Ｋ.Ａ. Ｅｅｒｎｉｓｓｅ, Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｓｅｃｔ ｌａｒｖａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｅｓｉｃｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｉｔｓ ｕｓｅ ｉｎ ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ, Ｊ. Ｖｉｒｏｌ. Ｍｅｔｈｏｄｓ ５４ （１９９５） １４５−１５７.
【非特許文献１８】Ｄ.Ｍ. Ｐｅｒｅｚ−Ｆｉｌｇｕｅｉｒａ, Ｆ. Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｍａｃｈｏ, Ｃ. Ｇａｌｌａｒｄｏ, Ｐ. Ｒｅｓｉｎｏ−Ｔａｌａｖａｎ, Ｅ. Ｂｌａｎｃｏ, Ｅ. Ｇｏｍｅｚ−Ｃａｓａｄo, Ｃ. Ａｌｏｎｓｏ, Ｊ.Ｍ. Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ, Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｔｅｓｔｓ ｆｏｒ Ａｆｒｉｃａｎ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐ３０ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｉｎ Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ ｌａｒｖａｅ, Ｊ. Ｃｌｉｎ. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ. ４４ （２００６） ３１１４−３１２１.
【非特許文献１９】Ｓ. Ｇｏｍｅｚ−Ｓｅｂａｓｔｉａｎ, Ｄ.Ｍ. Ｐｅｒｅｚ−Ｆｉｌｇｕｅｉｒａ, Ｅ. Ｇｏｍｅｚ−Ｃａｓａｄｏ, Ｍ.Ｃ. Ｎｕｎｅｚ, Ｉ. Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ, Ｅ. Ｔａｂａｒｅｓ, Ｊ.Ｍ. Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ, ＤＩＶＡ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｏｆ Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｕｓｉｎｇ ａｎ ｉｎｓｅｃｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｖｉｒｕｓ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ, Ｊ. Ｖｉｒｏｌ. Ｍｅｔｈｏｄｓ １５３ （２００８） ２９−３５.
【非特許文献２０】Ｆ. Ｔｏｄｏｌｉ, Ｍ. Ｐｅｒｅｚ−Ｆｉｌｇｕｅｉｒａ, Ｉ. Ｇａｌｉｎｄｏ, Ｓ. Ｇｏｍｅｚ−Ｓｅｂａｓｔｉａｎ, Ｊ.Ｍ. Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ, Ａ. Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃｏｒｔｅｓ, Ｊ. Ａｌｂｅｒｏｌａ, Ｓｅｒｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ ｒａｗ ｉｎｓｅｃｔ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＫＭＰＩＩ, ＴＲＹＰ, ａｎｄ ＬＡＣＫ Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｉｎｆａｎｔｕｍ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｄｏｇｓ, Ｖｅｔ. Ｐａｒａｓｉｔｏｌ. １６４ （２００９） １５４−１６１.
【非特許文献２１】Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ ＭＳ, Ｐｏｓｓｅｅ ＲＤ. Ａ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ. Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ. １９９０, ７１ （ Ｐｔ ４）：９７１−６.
【非特許文献２２】Ｐａｓｓａｒｅｌｌｉ, Ａ. Ｌ., ａｎｄ Ｌ. Ｋ. Ｍｉｌｌｅｒ. Ｔｈｒｅｅ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｇｅｎｅｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｌａｔｅ ａｎｄ ｖｅｒｙ ｌａｔｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ： ｉｅ−１, ｉｅ−ｎ, ａｎｄ ｌｅｆ−２. Ｊ. Ｖｉｒｏｌ. １９９３, ６７：２１４９−２１５８
【非特許文献２３】Ｒｏｄｅｍｓ, Ｓ. Ｍ., Ｓ. Ｓ. Ｐｕｌｌｅｎ, ａｎｄ Ｐ. Ｄ. Ｆｒｉｅｓｅｎ. ＤＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ＩＥ１ ｏｆ Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ： ＩＥ１ ｄｏｍａｉｎs ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ. Ｊ. Ｖｉｒｏｌ. １９９７, ７１： ９２７０−９２７７.
【非特許文献２４】Ｌｉｎ Ｘ, Ｃｈｅｎ Ｙ, Ｙｉ Ｙ, Ｚｈａｎｇ Ｚ： Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ ｅａｒｌｙ １, ａ ｍｅｄｉａｔｏｒ ｆｏｒ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｉｏｎｓ ｅｎｈａｎｃｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｒａｎｓ. Ｖｉｒｏｌ Ｊ ２０１０, ７：３２.
【非特許文献２５】Ｏｋａｎｏ Ｋ, Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ ＶＳ, Ｍａｅｄａ Ｓ： Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ ＩＥ−１ ａｎｄ ｔｗｏ ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ, ＤＢＰ ａｎｄ ＬＥＦ−３, ｔｏ ｖｉｒａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｉｅｓ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９９９, ７３（１）：１１０−１１９.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
商業的に使用されているもの（ｐｏｌｈおよびｐ１０）より強力な新規代替プロモーターがないことおよびウイルス誘導性細胞損傷を低減することによってバキュロウイルス系における長期発現を実行するための何らかの代替手段がないことを考えて、本発明は、バキュロウイルス発現カセットへの組換えＤＮＡエレメントの組込みによって前記問題を解決することに焦点を当てている。本発明は、驚くべきことに、バキュロウイルス転写調節因子、エンハンサー相同領域（ｈｒ）配列およびプロモーターまたはプロモーターの組合せを含有する前記発現カセットは、昆虫幼虫において組換えタンパク質産生を前例のないレベルに増大できることを示す。さらに、本発明の発現カセットはまた、高感染用量を使用して感染後の遅い時間にバキュロウイルス感染昆虫幼虫の生存率を増大し、したがって、バキュロウイルス感染によって引き起こされる昆虫における病原性効果を最小化する。他方、バキュロウイルス感染の間の細胞機能の完全性の改善もまた、昆虫幼虫における正しい組換えタンパク質翻訳後プロセシングに寄与する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、バキュロウイルス感染した昆虫幼虫における組換えタンパク質の発現の改善のための生成物および方法を提供する。
【００１０】
以下の項は、この発現の改善を可能にするための好ましい実施形態である：
１．転写調節因子として機能するタンパク質ＩＥ−１、ＩＥ−０および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現を可能にする核酸配列を含む昆虫であって、核酸は、
（ａ）配列番号１〜５のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸
（ｂ）配列番号１〜５のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるタンパク質をコードする核酸配列、
（ｃ）配列番号６〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列を含有するアミノ酸をコードする核酸配列、および
（ｄ）配列番号６〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるアミノ酸配列をコードする核酸配列
からなる群から選択される、昆虫。
【００１１】
２．組換えタンパク質の発現を駆動するのに適している任意のプロモーターと作動可能に連結した、エンハンサー領域としての少なくとも１種の組換え相同領域（ｈｒ）をさらに含む、項１に記載の昆虫。
【００１２】
３．組換え相同領域（ｈｒ）が、配列番号２７に示される配列（ｈｒ１）である、項２に記載の昆虫。
【００１３】
４．相同領域（ｈｒ）と作動可能に連結したプロモーターが、
（ａ）配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸と、
（ｂ）組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する、核酸配列と
を含む核酸の群から選択される、項２または３に記載の昆虫。
【００１４】
５．配列番号１７〜２６を含む群から選択される組換えプロモーター、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む核酸配列を含む、項１〜４のいずれかに記載の昆虫。
【００１５】
６．組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み、前記核酸配列が、項１〜５の核酸配列からなる群から選択される核酸配列と作動可能に連結している、項１〜５のいずれかに記載の昆虫。
【００１６】
７．鱗翅目の属に由来する、項１〜６のいずれか１項に記載の昆虫。
【００１７】
８．イラクサギンウワバ、ヨトウガ、スポドプテラ・エキシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）、アスカラファ・オドラタ（Ａｓｃａｌａｐｈａ  ｏｄｏｒａｔａ）、カイコ、ラチプルシア・ニ（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）およびスチグメネ・アクレア（Ｓｔｉｇｍｅｎｅ  ａｃｒｅａ）からなる群から選択される、項１〜７のいずれかに記載の昆虫。
【００１８】
９．核酸配列（複数可）が、組換えバキュロウイルス、好ましくは、ＡｃＭＮＰＶまたはＢｍＮＰＶによって昆虫中に導入される、項１〜８のいずれかに記載の昆虫。
【００１９】
１０．項１〜９のいずれかの昆虫の使用ならびに従来手段による組換えタンパク質の抽出および精製を含む、組換えタンパク質を産生するための方法。
【００２０】
１１．組換えタンパク質が、サブユニット単量体ワクチン、サブユニット多量体ワクチン、ウイルス様粒子、治療用タンパク質、抗体、酵素、サイトカイン、血液凝固因子、抗凝固薬、受容体、ホルモンまたは診断用タンパク質試薬を含む群から選択される、項１０に記載の組換えタンパク質を産生するための方法。
【００２１】
１２．項１〜６のいずれかにおいて特定されるような核酸配列（複数可）を含む昆虫のための飼育、給餌または注入媒体。
からなる群から選択される、核酸配列。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】４種の主要なエレメント：発現が、プロモーター（Ｂ；例えば、ｐｏｌｈまたはｐＢ２９）によって駆動される、転写調節因子（Ａ；例えば、ＩＥ０およびＩＥ１）をコードする配列；組換えタンパク質をコードする外来遺伝子の発現を駆動するプロモーター（Ｄ；例えば、ｐ１０、ｐＢ２９ｐ１０またはｐ６．９ｐ１０）の上流の、エンハンサー相同領域（ｈｒ）配列（Ｃ；例えば、ｈｒ１）を含む、本発明のバキュロウイルス組換えＤＮＡエレメントの模式図である。スキームは、組換えタンパク質の前例のない過剰発現をもたらす本発明の組換えＤＮＡエレメント間の相互作用の理論的機序を示す図である。
【図２】「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）」クローニング系（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））による組換えバキュロウイルスの生成をもたらす異なる方法論を示す図である。
【図３】組換えバキュロウイルスを作製するために使用されるその他の市販の技術と適合するクローニング、ドナーおよびトランスファーベクターを作製するための一般スキームを示す図である。
【図４】Ａ）５００または５０，０００ＰＦＵの、ｐｏｌｈプロモーターの制御下でタンパク質を発現する従来のバキュロウイルスで、または本発明のバキュロウイルスカセットｐｏｌｈ  Ａｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐ６．９ｐ１０ＧＦＰを含有するバキュロウイルスによって播種されたイラクサギンウワバ昆虫幼虫（第５齢）における感染の９６時間後の組換えＧＦＰ産生を示す図である。Ｂ）パネルＡと同一の、２種の異なる感染用量、すなわち、５００および５０，０００ＰＦＵのバキュロウイルスでの感染の９６時間後に生存している幼虫のパーセンテージを示す図である。
【図５】Ａ）異なる感染用量での、従来のバキュロウイルス（ｐｏｌｈＧＦＰ）に対する、本発明の発現カセットｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐ６．９ｐ１０ＧＦＰを含有するバキュロウイルスでの感染の９６時間後に生存する幼虫のパーセンテージを示す図である。Ｂ）従来のバキュロウイルス（ｐｏｌｈＧＦＰ）での、または本発明の発現カセットを含有するバキュロウイルス（ｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐ６．９ｐ１０ＧＦＰ）での感染の瞬間の昆虫バイオマスおよび感染の９６時間後の回収されたバイオマスを示す図である。感染用量は、５×１０４ＰＦＵとした。
【図６】Ａ）ｐｏｌｈプロモーターの下でＡｃ−ｉｅ−０１  ｃＤＮＡを過剰発現するバキュロウイルス（ｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１）の感染用量として５×１０４ＰＦＵを使用する、またはｐｏｌｈプロモーターの下でＧＦＰを発現する従来のバキュロウイルス（ｐｏｌｈＧＦＰ）を使用する感染の９６時間後に生存する幼虫のパーセンテージを示す図である。Ｂ）パネルＡと同一のバキュロウイルスを用いる感染の時点での昆虫バイオマスおよび感染の９６時間後の回収されたバイオマスを示す図である。感染用量は、５×１０４ＰＦＵとした。
【図７】ｐｏｌｈプロモーターの制御下で従来のバキュロウイルスによって（２）、または本発明の発現カセットｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐ６．９ｐ１０ＧＦＰを含有するバキュロウイルス（１）によって発現される組換えＧＦＰタンパク質の比較を示す図である。感染の９６時間後に、すべてのバキュロウイルスの５×１０５ＰＦＵで感染した幼虫から抽出物を得た。Ａ）組換えＧＦＰタンパク質のクーマシーブルー染色。Ｂ）特異的抗血清を用いるチューブリン検出によって決定される、バキュロウイルス感染後の細胞完全性。Ｃ）特異的抗ＧＦＰ血清を使用することによる組換えＧＦＰタンパク質のウエスタンブロット検出。
【図８】組換えタンパク質をコードする外来遺伝子のプロモーター（単数または複数）によって誘導される転写を増強する、転写調節因子、相同領域（ｈｒ）のコード配列を含む、本発明のバキュロウイルス発現カセットに含有される好ましいエレメントの模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、組換えタンパク質の発現を、昆虫への組換えＤＮＡエレメントの導入によって改善する。
【００２４】
本発明のこれらの組換えＤＮＡエレメントは、内因性レベルを上回るバキュロウイルス転写調節因子の発現を引き起こす配列ならびに任意選択でエンハンサー相同領域（ｈｒ）およびこれらの上記のエレメントと作動可能に連結したプロモーターである。
【００２５】
さらに、組換えＤＮＡエレメントは、発現カセットの一部を形成し得る。
【００２６】
「発現カセット」とは、遺伝子発現を制御する（例えば、プロモーター）および／または遺伝子発現に必要である（例えば、遺伝子自体）組換えＤＮＡエレメントを含有する核酸配列を指す。発現カセットは、組換えベクターまたはバキュロウイルス中に導入され得る。
【００２７】
組換えＤＮＡエレメントは、単一の核酸配列、単一のクローニングベクター、単一のトランスファーベクター、単一の組換えバキュロウイルスまたは単一の細胞に組み込まれ得る。しかし、それらはまた、異なる核酸配列、異なるクローニングベクター、異なるトランスファーベクターまたは異なる組換えバキュロウイルス中にそれぞれ存在し、かつ同一細胞中に導入されてもよい。
【００２８】
本発明は、驚くべきことに、内因性レベルを上回るバキュロウイルス転写調節因子の発現を引き起こす配列の昆虫幼虫への導入、および任意選択でエンハンサー相同領域（ｈｒ）配列、プロモーターまたはプロモーターの組合せの導入が、組換えタンパク質の産生を前例のないレベルに増大させることができることを示す。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組換えタンパク質の発現についてのこの系の有用性を示す。
【００２９】
さらに、バキュロウイルスを用いる昆虫幼虫へのこれらの組換えＤＮＡエレメントの導入は、従来のバキュロウイルスに感染した幼虫と比較して、感染後遅くの、特に、感染に高ウイルス用量を使用した後の幼虫の生存率を増大する（バイオマスの回収量、すなわち、系の産生性を最大化する）。産生プロセスの最後に回収される昆虫バイオマスが、同様に大幅に増大される。
【００３０】
また、前記バキュロウイルス感染幼虫の分子細胞機構および細胞形態の完全性が、従来のバキュロウイルスに感染した幼虫と比較して改善される。バキュロウイルス感染の間の細胞機能の完全性の改善はまた、組換えタンパク質の正しい翻訳後プロセシングに寄与する。
【００３１】
したがって、本発明の一態様は、転写調節因子の内因性レベルを上回る発現を可能にする核酸配列を含有する昆虫に関する。好ましい実施形態では、転写調節因子は、ＩＥ−１、ＩＥ−０および／またはそれらの断片である。さらに好ましい一実施形態では、昆虫は、トランスジェニック昆虫である。
【００３２】
「転写調節因子」とは、特定の遺伝子の転写を調節する能力を有する調節タンパク質を指し、調節が、例えば、エンハンサーまたはレプレッサー領域との結合および／または転写に関与しているさらなるタンパク質を補充することによって行われるものを指す。
【００３３】
ＩＥ−１およびそのスプライシング変異体ＩＥ−０は、バキュロウイルス感染の間に内因性に発現される転写調節因子である。本発明によれば、ＩＥ−１、ＩＥ−０および／またはそれらの断片は、これらのタンパク質の総レベルが内因性レベルを上回って増大させるよう組換えによって発現される。これは、例えば、内因性遺伝子の更なるコピーを導入することまたはプロモーターによる内因性遺伝子の発現を操作することによって達成され得る。さらに、内因性遺伝子のコピーは、ｐｏｌｈまたはｐＢ２９などの適したプロモーターの制御下で導入遺伝子として導入され得る。
【００３４】
タンパク質ＩＥ−１、ＩＥ−０および／またはそれらの断片の発現レベルは、定量的ＰＣＲおよびウエスタンブロット解析などの当業者に従来公知である方法を用いて、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方で決定され得る。
【００３５】
本発明によれば、ＩＥ−１、ＩＥ−０およびそれらの断片は、配列番号１（Ａｃ−ｉｅ−０１とも呼ばれる）〜配列番号５の核酸によってコードされる。配列番号１は、ＩＥ−１およびＩＥ−０の両方をコードするＡｃ−ｉｅ−０１  ｃＤＮＡであり、配列番号２は、ＩＥ−１のコード配列（ＣＤＳ）であり、配列番号３は、ＩＥ−０のＣＤＳである。配列番号４および５は、それぞれ、触媒的転写調節因子活性を保持するＩＥ−１およびＩＥ−０のＮ末端ドメインのＣＤＳである。配列番号２〜５によってコードされるタンパク質は、それぞれ、配列番号６〜９によって表されている。
【００３６】
本発明はさらに、転写調節因子として機能できるアミノ酸であるか、またはそれをコードする配列番号１〜９の変異体を開示する。これらの変異体は、そのヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、１つまたは複数の位置で、これらの元となる核酸鎖またはアミノ酸鎖と異なっており、それによる相違が、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換であり得る核酸鎖またはアミノ酸鎖である。
【００３７】
本発明の核酸配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、デフォルトパラメータを用いるＥＭＢＯＳＳ  Ｎｅｅｄｌｅを使用して決定される配列同一性または配列類似性の程度によって、その他の核酸およびアミノ酸配列と区別されなければならない（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）。このような変異体を作製する方法として、ランダムまたは部位特異的突然変異誘発、部位飽和突然変異誘発、ＰＣＲベースのフラグメントアセンブリー、ＤＮＡシャッフリング、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの相同組換えおよび遺伝子合成の方法が挙げられる。
【００３８】
配列番号１〜５の変異体の配列は、配列番号１〜５の配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％同一である。
【００３９】
配列番号６〜９の変異体の配列は、配列番号６〜９の配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％類似である。
【００４０】
昆虫は、好ましくは、鱗翅目のもの、より好ましくは、イラクサギンウワバ、ヨトウガ、スポドプテラ・エキシグア、アスカラファ・オドラタ、カイコ、ラチプルシア・ニおよびスチグメネ・アクレアからなる群から選択される昆虫である。好ましい実施形態では、昆虫は、幼虫である。
【００４１】
好ましい実施形態では、本発明の昆虫は、タンパク質ＩＥ−１、ＩＥ−０および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現を可能にする核酸配列に加えて、それぞれのプロモーターと作動可能に連結していることによって組換えタンパク質の発現を増強し得る組換え相同領域（ｈｒ）をさらに含有する。
【００４２】
相同領域、ｈｒは、その中心付近に不完全な３０ｂｐのパリンドロームを有する約７０ｂｐの反復されたユニットからなる。相同領域は、ＡｃＭＮＰＶゲノム中の８つの位置で反復され、各側に２〜８の反復配列を有する。相同領域は、転写エンハンサーおよびバキュロウイルスＤＮＡ複製の起点の両方として意味づけられている。
【００４３】
「エンハンサー領域」とは、転写調節因子が結合することにより、関連する遺伝子の転写のレベルを増大させる制御配列を指す。
【００４４】
「組換えタンパク質」とは、組換えＤＮＡに起因するタンパク質を指す。このようなタンパク質は、ヒトおよび動物の利益のために使用され得、工業的、商業的または治療的用途を有し得る。
【００４５】
「作動可能に連結している」とは、一方が、他方に影響を及ぼすような方法で連結している２種の核酸配列であって、他方への影響が、例えば、転写調節に関するものであるものを指す。
【００４６】
「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合して、転写を開始できるＤＮＡ配列を指す。配列は、転写因子などの転写を調節する種々のタンパク質の結合部位をさらに含有し得る。プロモーター配列は、ＤＮＡ配列中で近接して位置し、リンカーまたはスペーサーによって分離され得る種々のプロモーター断片（異なるまたは同一断片のいずれか）からなり得る。このようなプロモーターは、キメラプロモーターと呼ばれる。
【００４７】
プロモーター（単数または複数）の上流のエンハンサー相同領域配列ｈｒは、ｈｒ１（配列番号２７）であることが好ましい。組換えタンパク質の発現を駆動するプロモーターは、配列番号１０〜１６またはプロモーターとして機能でき、配列番号１０〜１６のいずれかにおいて示されたヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む群から選択されることが好ましい。
【００４８】
好ましい実施形態では、核酸配列は、配列番号１７〜２６を含む群から選択される組換えプロモーター、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む。
【００４９】
上記で示されるように、本発明の組換えプロモーター、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域は、単一分子の一部を形成する必要はなく、代わりに、これらの配列は、それらが作動可能に連結されている限り、すなわち、同一細胞内に含有される限り、別個の分子の一部を形成し得る。
【００５０】
本発明の昆虫は、組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むことが好ましい。この核酸配列は、タンパク質ＩＥ−１、ＩＥ−０および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現を可能にする核酸配列、および任意選択で相同領域（ｈｒ）と作動可能に連結している。
【００５１】
上記の組換えＤＮＡエレメントは、好ましくは、組換えバキュロウイルスによって昆虫に導入される。好ましくは、バキュロウイルスは、ＡｃＭＮＰＶまたはＢｍＮＰＶであり、昆虫は、昆虫幼虫である。バキュロウイルスは、経口投与（経口）によって、またはより好ましくは、注入によって幼虫に投与される。さらなる一実施形態では、昆虫は、本発明の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクター、クローニングベクターまたは核酸配列で感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換する。好ましくは、昆虫幼虫は、例えば、西国特許出願公開第ＥＳ２２３２３０８号明細書に記載されるような飼育モジュール中で飼育される。
【００５２】
さらなる態様において、本発明は、本発明の昆虫を使用して組換えタンパク質を産生するための方法を開示する。この目的のために、昆虫は、本発明の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクター、クローニングベクターまたは核酸配列で感染させ、トランスフェクトし、形質導入または形質転換し得る。組換えタンパク質の発現後、組換えタンパク質の抽出および精製は、従来手段によって行われる。
【００５３】
タンパク質産生のための好ましい実施形態では、幼虫を、高ウイルス用量（１０４プラーク形成単位より高い）の本発明の組換えバキュロウイルスを注入することによって感染させる。感染の３〜４日後、感染幼虫を処理し、適当な抽出バッファーの使用によって総可溶性タンパク質抽出物を得る。抽出物を遠心分離し、脂質画分を排除する。次いで、従来手段によって組換えタンパク質を精製する。
【００５４】
好ましくは、本発明の方法によって産生される組換えタンパク質は、サブユニット単量体ワクチン、サブユニット多量体ワクチン、ウイルス様粒子、治療用タンパク質、抗体、酵素、サイトカイン、血液凝固因子、抗凝固薬、受容体、ホルモンまたは診断用タンパク質試薬を含む群から選択されるタンパク質である。
【００５５】
本発明の一態様は、昆虫のための飼育、給餌または注入媒体における、本発明の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクター、クローニングベクターまたは核酸配列の使用に関する。
【００５６】
本発明は、本発明の昆虫を生産するために使用され得る、タンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための前記配列を含むバキュロウイルスを開示する。
【００５７】
「バキュロウイルス」とは、主に昆虫および節足動物に感染する無脊椎動物の感染ウイルスのファミリーを指す。「組換えバキュロウイルス」は、例えば、相同組換えまたは転位によってさらに導入された組換えＤＮＡを有する。組換えバキュロウイルスは、好ましくは、ＡｃＭＮＰＶ（オートグラファ・カリフォルニカ核多角体病ウイルス）またはＢｍＮＰＶ（カイコ核多角体病ウイルス）を起源とする。
【００５８】
「組換えＤＮＡ」とは、一または複数のＤＮＡ鎖の組合せまたは挿入によって作製されており、それによって通常は一緒には生じないＤＮＡを組み合わせる人工ＤＮＡの形態を指す。
【００５９】
「組換えＤＮＡエレメント」とは、プロモーター、エンハンサーまたは遺伝子などの組換えＤＮＡ内の機能的エレメントを指す。上記のように、本発明の組換えＤＮＡエレメントとは、内因性レベルを上回るバキュロウイルス転写調節因子の発現を引き起こす配列、これらの上記のエレメントと作動可能に連結したエンハンサー相同領域（ｈｒ）およびプロモーターである。好ましくは、バキュロウイルス転写調節因子ＩＥ−１、ＩＥ−０またはそれらの断片は、内因性レベルを上回って発現される。
【００６０】
組換えバキュロウイルスは、好ましくは、（ｉ）タンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための配列に加えて、（ｉｉ）（ｉｉｉ）組換えタンパク質の発現を駆動するのに適したプロモーターと連結している組換え相同領域（ｈｒ）を含有する。これらの組換えＤＮＡエレメントの好ましい組合せは、昆虫について上記で記載されたとおりである。さらに、組換えバキュロウイルスは、好ましくは、組換えタンパク質をコードする核酸配列を含有する。
【００６１】
本発明は、昆虫および／または本発明の組換えバキュロウイルスを生産するために使用され得、バキュロウイルスにおける組込みまたは転位に適した配列に加えて、タンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のために前記配列を含むトランスファーベクターを開示する。
【００６２】
トランスファーベクターは、一般に、バキュロウイルスへの遺伝情報の挿入を可能にする。
【００６３】
トランスファーベクターは、好ましくは、（ｉ）タンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための配列に加えて、（ｉｉｉ）組換えタンパク質の発現を駆動するのに適したプロモーターと連結した（ｉｉ）組換え相同領域（ｈｒ）を含有する。これらの組換えＤＮＡエレメントの好ましい組合せは、昆虫について上記で記載されたとおりである。
【００６４】
好ましい一態様では、トランスファーベクターは、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むが、別の好ましい実施形態では、トランスファーベクターは、このような配列を欠く。
【００６５】
好ましい実施形態では、トランスファーベクターは、バクミドである。
【００６６】
「バクミド」とは、細胞にトランスフェクトした場合にバキュロウイルスを作製するのに十分なＤＮＡ配列を含有するプラスミド構築物を指す。
【００６７】
さらに好ましい一実施形態では、トランスファーベクターは、市販のバキュロウイルス発現系「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）」（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、「ＢａｃＰＡＫ（商標）」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（商標））、「ＦｌａｓｈＢＡＣ（商標）」（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））、「ＢａｃｕＶａｎｃｅ（商標）」（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標））、「Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡ（商標）」（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、「ＢａｃｕｌｏＤｉｒｅｃｔ（商標）」（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））、「ＢａｃＶｅｃｔｏｒ（登録商標）」１０００、２０００、３０００（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標））、「ＤｉａｍｏｎｄＢａｃ（商標）」（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））または「ＢａｃｕｌｏＧｏｌｄ（商標）」（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））のいずれかに由来する。
【００６８】
本発明は、昆虫、本発明の組換えバキュロウイルスおよび／またはトランスファーベクターを生産するために使用され得、タンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のために前記配列を含み、細菌複製にさらに適しているクローニングベクターを開示する。
【００６９】
「クローニングベクター」とは、一般に、制限酵素認識部位、細菌増殖の複製起点および選択マーカーの存在を含む、クローニングに適している任意のベクターを指す。
【００７０】
クローニングベクターは、好ましくは、（ｉ）タンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための配列に加えて、（ｉｉｉ）組換えタンパク質の発現を駆動するのに適したプロモーターと連結した（ｉｉ）組換え相同領域（ｈｒ）を含有する。これらの組換えＤＮＡエレメントの好ましい組合せは、昆虫について上記で記載されたとおりである。
【００７１】
好ましい一態様では、クローニングベクターは、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むが（「ドナーベクター」とも呼ばれる）、別の好ましい実施形態では、クローニングベクターは、このような配列を欠く。
【００７２】
本発明は、昆虫、本発明の組換えバキュロウイルス、トランスファーベクターおよび／またはクローニングベクターを生産するために使用され得、タンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための前記配列を含む核酸配列を開示する。
【００７３】
核酸配列は、好ましくは、（ｉ）タンパク質ＩＥ−０、ＩＥ−１および／またはそれらの断片の内因性レベルを上回る発現のための配列に加えて、（ｉｉｉ）組換えタンパク質の発現を駆動するのに適したプロモーターと連結した（ｉｉ）組換え相同領域（ｈｒ）を含有する。これらの組換えＤＮＡエレメントの好ましい組合せは、昆虫について上記で記載されたとおりである。
【００７４】
好ましい一態様では、核酸配列は、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むが、別の好ましい実施形態では、核酸配列は、このような配列を欠く。
配列の概要
【００７５】
【表１】
2015521464.tif 000002
【００７６】
ブタペスト条約に従う微生物の供託
プラスミドは、２０１１年１０月４日に受託番号ＣＥＣＴ８０３１で、Ｓｐａｎｉｓｈ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＥＣＴ）（ｗｗｗ．ｃｅｃｔ．ｏｒｇ）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｐａｒｃ  Ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ  ｄｅ  Ｖａｌｅｎｃｉａ；  Ｃａｔｅｄｒａｔｉｃｏ  Ａｇｕｓｔｉｎ  Ｅｓｃａｒｄｉｎｏ、９；  ４６９８０  Ｐａｔｅｒｎａ  （Ｖａｌｅｎｃｉａ）、Ｓｐａｉｎに供託された。
［実施例］
【実施例１】
【００７７】
バキュロウイルス転写調節因子の過剰発現は、バキュロウイルスベクター発現系（ＢＥＶＳ）における組換えタンパク質発現を増大するプロモーターと機能的に連結している相同領域ｈｒのエンハンサー機能を増強する。
【００７８】
ＡｃＭＮＰＶに由来する、Ａｃ−ｉｅ−０１ ｃＤＮＡによってコードされる最初期ウイルスタンパク質、すなわち、ＩＥ−１およびＩＥ−０は、バキュロウイルスにおける強力な転写調節因子である。これらのタンパク質によって媒介されるトランス活性化は、バキュロウイルス相同領域（ｈｒ）配列との、ホモ二量体としてのその結合によって増強され、これは、転写エンハンサーとして作用する。ＡｃＭＮＰＶ  ＩＥ−１／ＩＥ−０は、そのＮ末端酸性ドメインの活性によってプラスミドトランスフェクションアッセイにおいて転写を刺激する、６７〜７２ｋＤａの二量体ＤＮＡ結合タンパク質である（７、８）。ＩＥ−１およびＩＥ−０は、感染の際、極めて早期に合成され、核内に蓄積し、後期の間中、そこで維持される。ｄｕａｌプラスミドｐＦａｓｔＢａｃ（商標）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用して、Ａｃ−ｉｅ−０１  ｃＤＮＡをｐｏｌｈプロモーターの制御下でクローニングした。同一プラスミド中であるが、別の遺伝子座中に、これまでに合成され、プロモーターｐ６．９およびｐ１０と融合している相同領域ｈｒ１を含有するｈｒ１ｐ６．９ｐ１０キメラプロモーターの下流に、ＧＦＰをコードする遺伝子をクローニングした。得られた本発明のバキュロウイルス発現カセットおよび組換えＤＮＡエレメントの推定機能の模式図が、図１に示されている。得られたプラスミドを使用し、「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）」系（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））によって組換えバキュロウイルスを作製した。並行して、ｐｏｌｈプロモーターの制御下でＧＦＰタンパク質を発現する従来のバキュロウイルスを、同一系によって作製した。
【００７９】
異なるバキュロウイルスによって媒介されるＧＦＰタンパク質の発現を、低または高感染用量（それぞれ、５×１０２または５×１０４）を使用してイラクサギンウワバ幼虫において、感染の９６時間後に蛍光定量によって研究した。ＧＦＰの発現レベルは、使用されるウイルス用量に応じて、幼虫抽出物において、本発明の上記の発現カセットを含有するバキュロウイルスによって約１３〜４０％超増大した（図４Ａ）。同様の結果が、Ａｃ−ｉｅ−０１  ｃＤＮＡが昆虫由来ｐＢ２９プロモーターの制御下で発現されるバキュロウイルスを使用することによって、またはＧＦＰが、ｈｒ１ｐＢ２９ｐ１０プロモーターの制御下で発現される場合に（示されていないデータ）観察された。
【実施例２】
【００８０】
本発明のバキュロウイルス発現カセットは、高感染用量を使用するバキュロウイルス感染昆虫幼虫生存率および回収される昆虫バイオマスを、Ａｃ−ｉｅ−０１  ｃＤＮＡによってコードされる転写調節因子によって増大する
先の実施例において、タンパク質産生性の点での本発明のバキュロウイルスカセットに関連した組換えタンパク質を発現するバキュロウイルスの利点が示された。しかし、観察された主な相違は、高感染用量での生存幼虫のパーセンテージ（最大産生性）に関してであった。このような感染条件下では、本発明の発現カセットを含有するバキュロウイルスは、幼虫生存率を約７０％増大した（図４Ｂ）。これは、従来のバキュロウイルスを使用することによる、最適感染条件は、５×１０２ＰＦＵの感染用量を使用すること（最大幼虫生存率）であったことを意味する。対照的に、本発明の発現カセットを含有するバキュロウイルスを使用することによって、生産プロセスの最後に同数の幼虫を回収しながら、５×１０４の用量が使用され得る（図４Ｂ）。このような最適製造条件（５×１０４ＰＦＵを用いる感染）下で、本発明の発現カセットを含有するバキュロウイルスは、従来のバキュロウイルスの最適用量（５×１０２ＰＦＵ）に感染した昆虫幼虫において産生された組換えタンパク質の量の２倍超をもたらす（図４ＡおよびＢ）。
【００８１】
種々の感染用量の、両方ともＧＦＰタンパク質を発現する、従来のバキュロウイルス（ｐｏｌｈＧＦＰ）または本発明の発現カセットｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐ６．９ｐ１０ＧＦＰを含有するバキュロウイルスを使用する幼虫感染研究は、本発明の発現カセットを含有するバキュロウイルスが使用された場合に感染幼虫の増大する生存率を示した（図５Ａ）。最高感染用量（５×１０４）では、本発明の発現カセットで感染した幼虫の生存率は、従来のバキュロウイルスで感染した幼虫と比較して７０％超増大した。感染幼虫生存率におけるこの増大は、生産プロセスの最後で回収される昆虫バイオマスにおいて直接的な劇的な結果を有しており、本発明の発現カセットを含有するバキュロウイルスが、最高感染用量（最大産生性）で使用された場合に８０％増大した（図５Ｂ）。
【００８２】
高用量の本発明のバキュロウイルスでの感染後の生存率の増大と関連するこのような興味深い特性に関与する遺伝エレメント（単数または複数）を決定するために、ｐｏｌｈプロモーターの制御下でＡｃ−ｉｅ−０１  ｃＤＮＡによってコードされる転写調節因子を発現する組換えバキュロウイルスを作製した。次いで、Ｔ．ｎｉ幼虫を、高感染用量（５×１０４ＰＦＵ）のこのバキュロウイルスに感染させた。対照として、本発明者らは、同一プロモーターの制御下でＧＦＰタンパク質を発現するバキュロウイルスを使用した。本発明の発現カセットｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐ６．９ｐ１０ＧＦＰを用いて感染した幼虫と同様に、Ａｃ−ｉｅ−０１  ｃＤＮＡを過剰発現するバキュロウイルス（ｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１）に感染した幼虫も、同一プロモーターの制御下でＧＦＰリポータータンパク質を発現する従来のバキュロウイルス（ｐｏｌｈＧＦＰ）に感染した幼虫と比較した場合に生存率の増大を示した（図６Ａ）。これは、本発明のバキュロウイルス発現カセットにおいて使用される転写調節因子の過剰発現が、昆虫幼虫をバキュロウイルス誘導性死亡から保護し、長期発現（より多くの組換えタンパク質産生）を可能にし、高感染用量を使用する昆虫バイオマス回収率（最大産生性）を増大させるということを強力に示唆する（図６Ｂ）。
【実施例３】
【００８３】
Ａｃ−ｉｅ−０１  ｃＤＮＡによってコードされる転写調節因子のバキュロウイルス発現系における過剰発現は、生物工場として使用される感染昆虫幼虫における組換えタンパク質の翻訳後プロセシングを促進する。
【００８４】
バキュロウイルス感染の際の細胞完全性は、この系によって発現された外来タンパク質の正しいフォールディングまたは任意のその他の翻訳後修飾を確認するために非常に重要である。ｐｏｌｈおよびｐ１０などの、研究および生産のためによく使用されるバキュロウイルスの強力なプロモーターは、感染細胞がすでに、深刻な細胞変性効果を示し、細胞生存率が低下している場合には、感染後の遅い時間にしか外来遺伝子を発現しない。上記のように、本発明のバキュロウイルス発現カセットにおいて使用される転写調節因子の過剰発現は、細胞を、バキュロウイルス感染の発病効果から保護し、十分に生存したままである細胞における組換えタンパク質産生のための広い時間ウィンドウを可能にする。
【００８５】
生存している生物工場としての昆虫幼虫における組換えタンパク質の翻訳後修飾に関連した、本発明の発現カセット中に組み込まれる組換えＤＮＡエレメントの関連性を研究した。この目的のために、ｐｏｌｈプロモーターの制御下でリポータータンパク質ＧＦＰを発現する従来のバキュロウイルスおよび本発明のバキュロウイルスカセットを組み込み、ＧＦＰタンパク質も発現するバキュロウイルス（ｐｏｌｈＡｃ−ｉｅ−０１／ｈｒ１ｐ６．９ｐ１０ＧＦＰ）を使用して、５×１０４ＰＦＵの用量で昆虫幼虫に感染させた。
【００８６】
感染幼虫抽出物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびクーマシーブルー染色によって感染の９６時間後に分析した（図７Ａ）。興味深いことに、従来のバキュロウイルスによって発現されたＧＦＰタンパク質は、低減した分子量（予測されたものより小さい）を有するバンドを示し、これは、組換えタンパク質の分解またはミスフォールディングを示唆した。対照的に、ＧＦＰタンパク質発現が、本発明のバキュロウイルス発現カセットによって媒介された場合には、ＧＦＰバンドは、このタンパク質の予測された分子量、すなわち、約２７ｋＤａを示した。
【００８７】
感染幼虫抽出物はまた、抗ＧＦＰモノクローナル抗体（ｍａｂ２５１５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標））を使用するウエスタンブロットによって分析した（図７Ｃ）。両バキュロウイルスによって感染した幼虫抽出物においてＧＦＰタンパク質を検出したが、クーマシーブルー染色によって観察されるように、組換えタンパク質の電気泳動移動度において相違を示した。
【００８８】
並行して、特異的抗血清を使用する細胞性チューブリンタンパク質のウエスタンブロット解析によって、感染後の種々の時間で細胞機構の完全性を測定した（図７Ｂ）。従来のバキュロウイルスを用いる感染は、感染後９６時間で細胞完全性を深刻に損なったが、これは、検出されるチューブリンバンドが、この時点以後著しく低減したからである（細胞完全性の完全な喪失の結果としての分解）。本発明のバキュロウイルス発現カセット中に含有される組換えＤＮＡエレメントによって誘導される細胞保護と一致して、細胞性チューブリンは、発現カセットを用いて工学的に作製した組換えバキュロウイルスに感染した細胞では、同等には影響を受けなかった。
【実施例４】
【００８９】
細胞培養およびウイルス
ヨトウガＳｆ２１またはＳｆ９細胞系統を、１０％熱不活化ウシ胎児血清（Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（商標）、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含有するＴＮＭ−ＦＨ昆虫培地（Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（商標）、Ｇｅｒｍａｎｙ）中、２７℃で、６ウェルの組織培養プレートで培養した（１×１０６個細胞／ウェル）。ＡｃＭＮＰＶ組換えバキュロウイルスは、「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）」バキュロウイルス発現系（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、ＵＳＡ）によって得た。本発明の組換えＤＮＡエレメントを含有する種々のトランスファーベクターは、ｐＦａｓｔＢａｃ（商標）−ＤＵＡＬプラスミド（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））を使用して作製した。ｐＦａｓｔＢａｃ（商標）−ＤＵＡＬ中に組み込まれたプロモーターおよび調節エレメントは、クローニングを容易にするための適切な隣接する制限酵素認識配列を用いて合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標）、ＵＳＡ）。これらのトランスファーベクターを使用し、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）、ＵＳＡ）を用いてＳｆ２１細胞をトランスフェクトした。次いで、Ｓｆ２１細胞の感染から得られた組換えバキュロウイルスを、細胞において２回継代し、プラークアッセイ法によって力価測定した。得られたバキュロウイルス発現カセットの遺伝子構築物が、図８に模式的に示されており、Ａｃ−ｉｅ−０１  ｃＤＮＡまたは外来遺伝子（例えば、ＧＦＰ）の発現を駆動するプロモーターの種々の潜在的な組合せを示す。種々の発現カセットを使用して、図４〜７に示される実施例において使用した組換えバキュロウイルスを作製した。
【実施例５】
【００９０】
クローニングベクターの作製
クローニングベクターは、外来ＤＮＡ断片が、媒介物および外来ＤＮＡを同一のオーバーハングを生成する制限酵素で処理すること、次いで断片を一緒にライゲーションすることによって挿入され得る本発明のバキュロウイルス発現カセットを含有するＤＮＡの小片である。クローニングベクターの本質的な特徴は、選択された配向に向けられた外来遺伝子、正に形質転換された細胞の選択を可能にするための抗生物質耐性などの選択マーカー、および細菌における増殖のための機能的複製起点（ＯＲＩ）の挿入を容易にするために合成多重クローニング部位（ＭＣＳ）を含まなくてはならない。
【実施例６】
【００９１】
本発明のバキュロウイルス発現カセットを含有するドナーベクターの作製
ドナーベクターは、外来遺伝子が、適当な制限酵素を使用してクローニングされている、バキュロウイルス発現カセットを含有するクローニングベクター、例えば、ｐＵＣ５７プラスミドからなる。本発明のバキュロウイルス発現カセットは、以下のＤＮＡ配列：（ｉ）ｐｏｌｈまたはｐＢ２９プロモーターなどのプロモーター配列の下流およびＨＳＶ  ＴＫポリアデニル化シグナルの上流に、バキュロウイルス転写調節因子をコードする配列Ａｃ−ｉｅ−０１および（ｉｉｉ）プロモーター配列、例えば、ｐＢ２９ｐ１０、ｐ１０、ｐ６．９ｐ１０またはｐｏｌｈの上流に、（ｉｉ）別の遺伝子座中に、エンハンサー配列、例えば、相同領域ｈｒ１とそれに続く、対象の遺伝子のクローニングのための多重クローニング部位（ＭＣＳ）およびＭＣＳの下流にＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（図１）をライゲートすることによって合成した。バキュロウイルス発現カセットは、市販のバキュロウイルス作製系（転位をベースとする、例えば、「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）」系（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））または相同組換えをベースとする、例えば、「ｆｌａｓｈＢＡＣ（商標）」（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（商標））、「Ｂａｃｕｌｏｇｏｌｄ（商標）」（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（商標））、「ＢａｃＰＡＫ６（商標）」（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（商標））、「Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ  ＤＮＡ（商標）」（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標））（図２および３）のトランスファーベクターへのサブクローニングを容易にするよう、特定の制限酵素認識部位（例えば、５’末端のＢｇｌＩＩおよびＢｓｔＺ１７ｌならびに３’末端のＢｇｌ  ＩＩおよびＳｇｆ  Ｉ）によってフランキングされる。
【００９２】
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子を、Ｎｃｏ  ＩおよびＳｐｅ  Ｉ制限酵素認識部位を使用してクローニングベクターのＭＣＳ中にクローニングし、ドナープラスミドベクターを作製した（図２）。
【実施例７】
【００９３】
本発明のバキュロウイルス発現カセットを含有するトランスファーベクターの作製
トランスファーベクターを、５’フランキング部位のＢｓｔＺ１７  ｌおよびＸｂａ  Ｉを用いてドナーベクターを消化し、それを同様に同一酵素で消化したトランスファーベクターｐＦａｓｔＢａｃ（商標）１中にクローニングすることによって作製した。この場合には、サブクローニングの結果として、バキュロウイルス発現カセットのＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、トランスファーベクター由来のＳＶ４０ポリアデニル化シグナルによって交換される。これとは別に、発現カセットのすべてのエレメントは、元の市販のトランスファーベクターのｐｏｌｈプロモーターおよびＭＣＳと代わって、ｐＦａｓｔＢａｃトランスファーベクター中に含まれる（図２）。
【実施例８】
【００９４】
「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）」系を使用する、本発明のバキュロウイルス発現カセットを含有するバキュロウイルス発現ベクターの作製
改変されたトランスファーベクターｐＦａｓｔＢａｃ（商標）１および個々のバキュロウイルス発現カセットを使用し、「Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）」バキュロウイルス発現系を使用して組換えバキュロウイルスを作製した。より詳しくは、改変されたトランスファーベクターを使用して、バキュロウイルスシャトルベクター（バクミド）およびヘルパープラスミドを含有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）宿主株ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）を形質転換し、発現カセットの転位後に組換えバクミドの作製を可能にした。次いで、本発明のバキュロウイルス発現カセットおよびＧＦＰをコードする遺伝子を含有する組換えバクミドのＤＮＡを使用し、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（登録商標）を使用して昆虫細胞、例えば、Ｓｆ２１細胞をトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後、細胞を回収し、第１組換えバキュロウイルス世代を得た（図２）。次いで、この組換えバキュロウイルスは、従来のプロトコールに従ってさらに増幅され、および／または力価測定され得る。市販のＢＥＶＳによって提供されるその他のトランスファーベクターを有する組換えバキュロウイルスを作製するために、同様の手順が使用され得る（図３）。
【実施例９】
【００９５】
昆虫幼虫の飼育および感染。
【００９６】
イラクサギンウワバ（キャベッジ・ルーパー（ｃａｂｂａｇｅ  ｌｏｏｐｅｒ））幼虫を、レベル２バイオセイフティー条件下で飼育した。卵を、人工昆虫食を含有する特別に設計した幼虫発育ケージ中に置き、制御された湿度（５０％）および明期（８時間／日）条件下、２２℃で成長チャンバー中で維持した。
【００９７】
すべての感染実験に、第５齢幼虫（蛹化前の終齢幼虫）を使用した。各幼虫の標準体重はおよそ１２０〜１３０ｍｇであり、幼虫に、選択された用量あたりのプラーク形成単位（ＰＦＵ）数を達成するよう希釈した５μｌの組換えバキュロウイルスを用いて腹脚（体腔の前方の）付近に注入した。幼虫を９６ｈｐｉで処理した。回収した幼虫を直ちに凍結し、それらが組換えタンパク質定量のために処理されるまで−２０℃で保存した。バキュロウイルスによって感染した凍結Ｔ．ｎｉ幼虫から得た総可溶性非変性タンパク質（ＴＳＮＤＰ）は、Ｂａｇ  Ｍｉｘｅｒ（登録商標）ブレンダー（Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（商標）、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して２分間ホモジナイズすることによって得た。抽出バッファーは、ＰＢＳ  １×、０．０１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、完全プロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｒｏｃｈｅ（商標）、Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＤＴＴ２５ｍＭからなっていた。
【実施例１０】
【００９８】
蛍光定量的分析
種々の量の組換えＧＦＰタンパク質を含有する感染細胞に由来する約２０μｇの総可溶性タンパク質を分析し、Ｔｅｃａｎ（商標）ＧＥＮｉｏｓ（商標）（ＣＡ、ＵＳＡ）蛍光プレートリーダー（励起［Ｅｘ］、４８５／発光［Ｅｍ］、５３５）によって定量化した。
【実施例１１】
【００９９】
ウエスタンブロット解析
組換えバキュロウイルスに感染した幼虫からの総可溶性タンパク質画分（１０μｇ）を、１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。ゲルをクーマシーブルー染色法によって染色するか、またはニトロセルロースメンブランにトランスファーした。ウエスタンブロットを、抗ＧＦＰモノクローナル抗体ｍａｂ２５１５（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（商標）、ＵＳＡ）または１：１０００のチューブリン抗血清（Ｔ５１６８；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（商標））を用いて探索し、免疫複合体は、二次抗体として、それぞれ、１：２，０００希釈した抗マウスＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識コンジュゲート（ＫＰＬ（商標）、ＵＫ）を用いて示された。タンパク質バンドは、ＥＣＬウエスタンブロッティング検出系を使用して検出し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳゲルイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（商標）、ＵＳＡ）によって分析した。
参考文献
【０１００】
【表２】
2015521464.tif 000003
2015521464.tif 000004
2015521464.tif 000005
2015521464.tif 000006
【図１】
2015521464.tif 000007
【図２】
2015521464.tif 000008
【図３】
2015521464.tif 000009
【図４】
2015521464.tif 000010
【図５】
2015521464.tif 000011
【図６】
2015521464.tif 000012
【図７】
2015521464.tif 000013
【図８】
2015521464.tif 000014
【配列表】
2015521464000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年4月17日(2014.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写調節因子として機能するタンパク質ＩＥ−１、ＩＥ−０および／またはそれらの断片のバキュロウイルス感染の間における内因性レベルを上回る発現を可能にする核酸配列を含む昆虫であって、核酸は、
（ａ）配列番号１〜５のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸、
（ｂ）配列番号１〜５のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるタンパク質をコードする核酸配列、
（ｃ）配列番号６〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列を含有するアミノ酸をコードする核酸配列、および
（ｄ）配列番号６〜９のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列類似性を有し、組換えバキュロウイルスにおいて転写調節因子として機能できるアミノ酸配列をコードする核酸配列
からなる群から選択され、
前記核酸配列およびプロモーターと作動可能に連結している、組換えタンパク質をコードする以下の核酸配列をさらに含み、前記プロモーターが、前記組換えタンパク質の発現を駆動するものであり：
（ａ）配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸；および
（ｂ）組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列、
組換えタンパク質の発現を駆動するのに適している任意のプロモーターと作動可能に連結した、エンハンサー領域としての少なくとも１種の組換え相同領域（ｈｒ）をさらに含み、
鱗翅目の属に由来し、かつ
核酸配列（複数可）が、組換えバキュロウイルスによって昆虫に導入される、昆虫。
【請求項２】
組換え相同領域（ｈｒ）が、配列番号２７に示される配列（ｈｒ１）である、請求項１に記載の昆虫。
【請求項３】
相同領域（ｈｒ）と作動可能に連結したプロモーターが、
（ａ）配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列を含有する核酸と、
（ｂ）組換えバキュロウイルスにおいてプロモーターとして機能でき、配列番号１０〜１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する核酸配列と
を含む核酸の群から選択される、請求項１または２に記載の昆虫。
【請求項４】
配列番号１７〜２６を含む群から選択される組換えプロモーター、転写調節因子をコードする配列およびエンハンサー領域の組合せを含む核酸配列を含む、請求項１から３のいずれかに記載の昆虫。
【請求項５】
組換えタンパク質をコードする核酸配列をさらに含み、前記核酸配列が、請求項１から４に記載の核酸配列からなる群から選択される核酸配列と作動可能に連結している、請求項１から４のいずれかに記載の昆虫。
【請求項６】
イラクサギンウワバ、ヨトウガ、スポドプテラ・エキシグア、アスカラファ・オドラタ、カイコ、ラチプルシア・ニおよびスチグメネ・アクレアからなる群から選択される、請求項１から５のいずれかに記載の昆虫。
【請求項７】
核酸配列（複数可）が、ＡｃＭＮＰＶまたはＢｍＮＰＶから選択される組換えバキュロウイルスによって昆虫に導入される、請求項１から６のいずれかに記載の昆虫。
【請求項８】
請求項１から７のいずれかに記載の昆虫の使用ならびに従来手段による組換えタンパク質の抽出および精製を含む、組換えタンパク質を産生するための方法。
【請求項９】
組換えタンパク質が、サブユニット単量体ワクチン、サブユニット多量体ワクチン、ウイルス様粒子、治療用タンパク質、抗体、酵素、サイトカイン、血液凝固因子、抗凝固薬、受容体、ホルモンまたは診断用タンパク質試薬を含む群から選択される、請求項８に記載の組換えタンパク質を産生するための方法。
【国際調査報告】
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