(57)【要約】  本発明は、ｅＩＦ４Ｅ−ｅＩＦ４Ｇ相互作用を破壊するための化合物及びこのような化合物の薬学的に許容可能な塩を提供する。一般的に、該化合物はほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅに結合する細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ−ｅＩＦ４Ｅ）であり、該ペプチドは配列番号７、９−１１、１２−２６、２７−４４及び４５−５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、アミノ酸配列は少なくとも９〜約４０アミノ酸を含み、ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅはヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅに結合する細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ−ｅＩＦ４Ｅ）であって、該ペプチドが配列番号：７、９−１１、１２−２６、２７−４４及び４５−５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列が少なくとも９〜約４０アミノ酸であり、さらに、ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅがヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅである、請求項１に記載の細胞浸透性ペプチド。
【請求項３】
ペプチドが配列番号：７、９及び１０−４４のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列が、一部において、
ａ）ＹｘｘｘｘｚｚｘＦ（配列番号：１）、ここで、Ｙがチロシン（Ｔｙｒ）であり、ｘが任意のアミノ酸であり、ｚがロイシン（Ｌｅｕ）又はノルロイシン（Ｎｌｅ）であり、Ｆがフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であるか、又は
ｂ）Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号：２）
からなる群から選択されるアミノ酸配列モチーフをさらに含む、
請求項１又は２に記載の細胞浸透性ペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列が少なくとも９〜約４０アミノ酸であり、さらに、ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅがヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅである、請求項３に記載の細胞浸透性ペプチド。
【請求項５】
配列番号：７、１２及び１３−２６からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、さらにアミノ酸配列モチーフがＹｘｘｘｘｚｚｘＦ（配列番号：９０）であり、ここで、Ｙがチロシン（Ｔｙｒ）であり、ｘが任意のアミノ酸であり、ｚがロイシン（Ｌｅｕ）であり、Ｆがフェニルアラニン（Ｐｈｅ）である、請求項４に記載の細胞浸透性ペプチド。
【請求項６】
式ＩのペプチドＡｃ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｒ１１（配列番号：６）を含み、ここでＲ１１が約５〜約２０アミノ酸の細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）である、請求項５に記載のペプチド。
【請求項７】
Ｒ１１がＶａｌ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（（配列番号：５）である、請求項６に記載のペプチド。
【請求項８】
配列番号：７からなる、請求項５に記載のペプチド。
【請求項９】
配列番号：９−１１及び２７−４４を含み、さらにアミノ酸配列モチーフがＴｙｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号：２）である、請求項４に記載の細胞浸透性ペプチド。
【請求項１０】
Ａｃ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｒ１−Ｌｅｕ−Ｒ２−Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｒ３−Ｌｅｕ−Ｒ４−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−NH2（配列番号：８）のアミノ酸配列を含み、
ここでＲ１がＬｙｓ又はＡｓｎであり、Ｒ２がＬｙｓ又はＡｌａであり、Ｒ３がＬｅｕ又はＡｒｇであり、且つＲ４がＰｈｅ又はｔ−ＢｕｔＡｌａである、請求項９に記載のペプチド。
【請求項１１】
配列番号：９、１０又は１１からなる群から選択される、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１２】
配列番号：９のペプチドである、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１３】
配列番号：１０のペプチドである、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１４】
配列番号：１１のペプチドである、請求項１０に記載のペプチド。
【請求項１５】
約９〜約４０アミノ酸の単離され、精製されたポリペプチドであって、第１のペプチドと任意の第２のペプチドからなり、第１のペプチドが、
ｉ．  少なくとも９アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．  ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅ（より好ましくは、ヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅ）への結合能を有し、
ｉｉｉ．  該第１のペプチドが、一部において、Ａｃ−Ｒ１−Ｔｙｒ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｒ６−Ｐｈｅ−Ｒ７−NH2（配列番号：３）のアミノ酸配列モチーフをさらに含み、
ここで、Ｒ１がＬｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ及びＬｙｓ−Ａｌａからなる群から選択され、
Ｒ２がＡｓｐ、Ａｓｎ又はＡｌａであり、
Ｒ３がＡｒｇであり、
Ｒ４がＧｌｕ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｎ又はＰｈｅであり、
Ｒ５がＰｈｅであり、
Ｒ６がＡｓｐ、Ｃｙｓ、Ａｌａ又はＡｉｂであり、
Ｒ７がＧｌｎ−Ｐｈｅ−Ｒ８−Ｒ９−Ｒ１０−Ｒ１１（配列番号：４）であり、ここで、Ｒ８がＭｅｔ、Ａｌａ，（Ｄ）Ｍｅｔ又はＮｌｅであり、Ｒ９がＰｒｏ，（Ｄ）ＰｒｏかＡｌａであるか又は存在せず、Ｒ１０がＡｌａか（Ｄ）Ａｌａであるか又は存在せず、Ｒ１１が約５〜約２０アミノ酸の細胞浸透性ペプチドを含む任意の第２のペプチドである、ポリペプチド。
【請求項１６】
式ＩのペプチドＡｃ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｎｌｅ−Ｒ１１（配列番号：６）を含む、請求項１５に記載のペプチド。
【請求項１７】
少なくとも９〜約４０アミノ酸の単離され、精製されたペプチドであって、第１と任意の第２のペプチドからなり、第１のペプチドが、
ｉ．  少なくとも９アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．  ヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅへの結合能を有し、
ｉｉｉ．  該第１のペプチドが、一部において、
Ｔｙｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ（配列番号：２）のアミノ酸モチーフを含み、且つ
任意の第２のペプチドが細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）である、ペプチド。
【請求項１８】
少なくとも９〜約４０アミノ酸の単離され、精製されたペプチドであって、第１と任意の第２のポリペプチドからなり、第１のペプチドが、
ｉ．  少なくとも９アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．  ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅ（より好ましくは、ヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅ）への結合能を有し、
ｉｉｉ．  該第１のペプチドが、配列番号：５２−８５のアミノ酸配列を含み、且つ
任意の第２のペプチドが細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）である、ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ほ乳類翻訳開始因子ｅＩＦ４ＥとｅＩＦ４Ｇとの間のタンパク質−タンパク質間相互作用を抑制する細胞浸透性ペプチドを構成する。ｅＩＦ４Ｅは、転写後のレベルで、主要な癌関連遺伝子の発現を制御することにより腫瘍形成に基本的に寄与する、有望な治療標的である。本発明のペプチド、又はその薬学的に許容可能な塩が、腫瘍成長及び腫瘍サイズを低減させるために使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
ほ乳類開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）は、ｍＲＮＡ翻訳の開始において重要な役割を果たす２４ｋＤａのタンパク質である。ｍＲＮＡ翻訳の開始時に、ｅＩＦ４ＥはｍＲＮＡの５’端の７−メチルグアノシンキャップに結合し、足場タンパク質ｅＩＦ４Ｇ及びヘリカーゼｅＩＦ４Ａと複合体（ｅＩＦ４Ｆと称される）を形成する。この複合体の形成は、ｍＲＮＡのキャップ依存性翻訳の開始に要求され、故にｅＩＦ４ＥのｅＩＦ４Ｇへの結合は、この過程において重大な事象である。
【０００３】
ｅＩＦ４Ｅは、形質転換と腫瘍形成におけるその重要な役割を示す多くの実証的データにより、腫瘍学の分野における有望な標的として同定されている。例えば、トランスジェニックマウスにおけるｅＩＦ４Ｅの過剰発現は、腫瘍の形成を促進する（Silvera, D. et al.Nat. Rev. Cancer 2010, 10, 254-266とその引用文献を参照; Konicek, B. W. et al.Cell Cycle 2008, 7, 2466-2471とその引用文献を参照）。ｅＩＦ４Ｅの過剰発現は、乳癌、肺癌、皮膚癌、直腸癌、前立腺癌及び子宮頸癌を含むヒトの様々な癌において観察され、予後の不良と生存減少と関連している。（例えば、Zhou, S. et al.BMC Cancer 2006, 6, 231を参照）。ｅＩＦ４Ｅは、子宮内膜癌において、疾病の進行に関連し、ｅＩＦ４ＥのｓｉＲＮＡノックダウンは子宮内膜癌細胞の細胞増殖を阻害する（Choi, H. C. et al.J. Cancer Res.Clin.Oncol.2011, 137, 463-469）。
【０００４】
ｅＩＦ４Ｇの配列に基づいた、らせん状に安定化されたペプチドは、ｅＩＦ４Ｅに結合し、高濃度においてではあるが、ＭＣＦ−７細胞でのレポーター遺伝子アッセイにおいてもキャップ依存性翻訳の阻害を示す（Brown, C. J. et al.J. Mol.Biol.2011, 405, 736-753）。ｅＩＦ４Ｅに結合し、慢性リンパ性白血病細胞株においてアポトーシスを引き起こすペプチドのセットが特許出願で開示されている（Cosson, B. et al.WO 2010100351）。
【０００５】
ｅＩＦ４Ｅ−ｅＩＦ４Ｇ相互作用の低分子阻害剤がGerhard Wagnerと同僚らにより開示されている(Moerke, N. J. et al.Cell 2007, 128, 257-267)。これら化合物のｅＩＦ４Ｆ複合体の形成に依存する作用が、恐怖強化のラットモデルにおいてインビボで実証されている（Hoeffer, C. A. et al.Proc.Nat. Acad.Sci.USA 2011, 108, 3383-3388）。ｅＩＦ４Ｅ−ｅＩＦ４Ｇ相互作用の多くの低分子阻害剤がＭｉｎと同僚らにより、ＮＩＨモレキュラーライブラリプログラム（HTS for inhibitors of Eukaryotic Translation Initiation, Probe Report by J. Min, Grant Number 1 R03 MH081216-01, Probe PubChem Compound Identifier:16195554, June 23rd 2009）の一部として開示されている。
【０００６】
ｅＩＦ４Ｅのキャップ結合部位に結合する一連のｅＩＦ４ＥアンタゴニストがCarston Wagnerと同僚らにより開示されている（Jia, Y. et al.Eur.J. Med.Chem.2010, 45, 1304-1313 and Jia, Y. PhD dissertation, University of Minnesota, Jan 2011; AN 2011:418548）。ｍ７−ＧＴＰ部位に結合するさらなる化合物が２４０回米国化学会国内会議（August 22-26, 2010）で開示された（Kopecky, D. et al.MEDI-227; abstracted in Chemical Abstracts as AN 2010:1011833を参照）。ｍ７−ＧＴＰ部位に結合するさらなる化合物が特許出願において開示された（Brown, C. J. WO 2010138084）。
【０００７】
ｅＩＦ４Ｅは細胞質内標的であるため、ペプチド−又は低分子−ｅＩＦ４Ｅアンタゴニストは、該化合物が例えば、受動的拡散により、又はエンドサイトーシス等の何らかの能動的メカニズムを介して細胞膜を横切る等により、細胞質内に伝達されることを要する。しかしながら、ほとんどのペプチドは細胞浸透性でないため、これはペプチドに基づくアンタゴニストに対する挑戦である。
【０００８】
細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰｓ）は、そうでなければ非浸透性である様々な分子を、比較的毒性の無い様式で細胞の形質膜を通過して運ぶ能力を有するクラスのペプチドである。ＣＰＰペプチドは典型的には、カチオン性、両親媒性、又は疎水性の性質を有する５〜約３０アミノ酸（ａａ）長のアミノ酸である。特記すべき細胞浸透性ペプチドにはＴａｔ、Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ及びＴｒａｎｓｐｏｒｔａｎが含まれる（Fawell, S. et al.Proc.Natl.Acad.Sci.1994, pp 664-668; Theodore, L. et al.J. Neurosci.1995, pp 7158-7167; Pooga, M. et al.FASEB J. 1998, pp 67-77）。Ｔａｔ等の細胞浸透性ペプチドは、エフェクターペプチドに結合させることができ、又はエフェクターペプチドは、内在的に細胞浸透性であり得る。内在的に細胞浸透性であるエフェクターペプチドの例として、Arf(1-22)及びp28、他が挙げられる（Johansson, H. J. et al.Mol.Ther.2007, 16(1), pp 115-123; Taylor, B. N. et al.Cancer Res.2009, 69 (2), pp. 537-546）。
【０００９】
本発明は、一般的に、細胞浸透性であり、ｅＩＦ４Ｅに結合し、ｅＩＦ４Ｅ−ｅＩＦ４Ｇ相互作用を破壊する能力を有し、腫瘍細胞株に侵入するペプチドに関する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、ｅＩＦ４Ｅ−ｅＩＦ４Ｇ相互作用を破壊するための化合物及びこのような化合物の薬学的に許容可能な塩を提供する。一般的実施態様において、該化合物はほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅに結合する細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ−ｅＩＦ４Ｅ）であり、該ペプチドは配列番号：７，９−１１，１２−２６，２７−４４及び４５−５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。より好ましくは、アミノ酸配列は少なくとも９〜約４０アミノ酸を含み、ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅはヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅである。
【００１１】
好ましい実施態様において、該化合物はほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅに結合する細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ−ｅＩＦ４Ｅ）であり、該ペプチドは、配列番号：７、９及び１０−４４のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は、一部に、ＹｘｘｘｘｚｚｘＦ（配列番号：１）、ここで、Ｙがチロシン（Ｔｙｒ）であり、ｘが任意のアミノ酸であり、ｚがロイシン（Ｌｅｕ）又はノルロイシン（Ｎｌｅ）であり、Ｆがフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であるか、又はTyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr（配列番号：２）、からなる群から選択されるアミノ酸配列モチーフをさらに含む、細胞浸透性ペプチドである。より好ましくは、アミノ酸配列は少なくとも９〜約４０アミノ酸であり、ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅはヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅである。
【００１２】
別の好ましい実施態様において、本発明は、約９〜約４０アミノ酸の単離され、精製されたポリペプチドであって、第１のペプチドと任意の第２のペプチドからなるポリペプチドを提供し、ここで、第１のペプチドは、
ｉ．  少なくとも９アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．  ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅ、より好ましくは、ヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅへの結合能を有し、
ｉｉｉ．  該第１のペプチドが、一部において、Ac-R1-Tyr-R2-R3-R4-R5-Leu-Leu-R6-Phe-R7-NH2（配列番号：３）のアミノ酸モチーフをさらに含み、
ここで、Ｒ１がLys-Lys、Lys-Gln、Lys-Arg及びLys-Alaからなる群から選択され、
Ｒ２がＡｓｐ、Ａｓｎ又はＡｌａであり、
Ｒ３がＡｒｇであり、
Ｒ４がＧｌｕ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｎ又はＰｈｅであり、Ｒ５がＰｈｅであり、
Ｒ６がＡｓｐ、Ｃｙｓ、Ａｌａ又はＡｉｂであり、
Ｒ７がGln-Phe-R8-R9-R10-R11（配列番号：４）であり、ここで、Ｒ８がＭｅｔ、Ａｌａ，（Ｄ）Ｍｅｔ又はＮｌｅであり、Ｒ９がＰｒｏ，（Ｄ）ＰｒｏかＡｌａであるか又は存在せず、Ｒ１０がＡｌａか（Ｄ）Ａｌａであるか又は存在せず、Ｒ１１が約５〜約２０アミノ酸の細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）を含む任意の第２のペプチドである。
【００１３】
他の好ましい実施態様において、本発明は、少なくとも９〜約４０アミノ酸の単離され、精製されたペプチドであって、第１と任意の第２のポリペプチドからなるペプチドを提供し、
ここで、第１のペプチドは、少なくとも９アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．  ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅ、（より好ましくは、ヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅ）への結合能を有し、
ｉｉｉ．  該第１のペプチドが、一部において、
Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr（配列番号：２）のアミノ酸モチーフを含み、及び任意の第２のペプチドは細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）である。
【００１４】
他の実施態様において、本発明は、ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅ、より好ましくはヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅに結合する細胞浸透性ペプチドである、配列番号：４５−５１を提供する。代替的に、本発明は、ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅ、より好ましくはヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅに結合する能力を有する、配列番号：５２−８５を提供する。
【００１５】
さらに他の好ましい実施態様において、本発明は、少なくとも９〜約４０アミノ酸の単離され、精製されたペプチドであって、第１と任意の第２のポリペプチドからなるペプチドを提供し、ここで、第１のペプチドは、
ｉ．  少なくとも９アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ．  ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅ、より好ましくは、ヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅへの結合能を有し、
ｉｉｉ．  該第１のペプチドが、配列番号：５２−８５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、及び
任意の第２のペプチドは細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）である。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ｍ７−ＧＴＰプルダウンアッセイに基づく、配列番号：７、９、１０及び１１のペプチドに対するメカニズムのインビトロ細胞試験の結果を示す。
【図２】配列番号：９及び１０のペプチドが下流の標的遺伝子の発現を阻害し、アポトーシスを誘発することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明は、ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅに結合する細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ−ｅＩＦ４Ｅ）であり、該ペプチドが配列番号７、９−１１、１２−２６、２７−４４及び４５−５１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、化合物を開示する。より好ましくは、アミノ酸配列は少なくとも９〜約４０アミノ酸を含み、ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅはヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅである。
【００１８】
より特定的には、本発明は、ｅＩＦ４Ｅに結合可能な化合物であって、より特定的には、該化合物は、ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅに結合可能な細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ−ｅＩＦ４Ｅ）であり、該ペプチドは、配列番号：７、９及び１０−４４のアミノ酸配列を含み、該アミノ酸配列は、一部に、
ａ）ＹｘｘｘｘｚｚｘＦ（配列番号：１）、ここで、Ｙがチロシン（Ｔｙｒ）であり、ｘが任意のアミノ酸であり、ｚがロイシン（Ｌｅｕ）又はノルロイシン（Ｎｌｅ）であり、Ｆがフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であるか、又は
ｂ）Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr（配列番号：２）、からなる群から選択されるアミノ酸配列モチーフをさらに含む、化合物を開示する。より好ましくは、アミノ酸配列は少なくとも９〜約４０アミノ酸であり、ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅはヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅである。
【００１９】
さらなる実施態様において、ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅに結合可能な細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ−ｅＩＦ４Ｅ）は、Ac-R1-Tyr-R2-R3-R4-R5-Leu-Leu-R6-Phe-R7-NH2（配列番号：３）のアミノ酸モチーフの配列番号：７、１２及び１３−２６のアミノ酸配列、
ここで、Ｒ２−Ｒ６は任意のアミノ酸であり、Ｒ１とＲ７は任意のアミノ酸であるか又は任意のアミノ酸配列であり、ここで、Ｒ１又はＲ７はさらに、細胞浸透性ペプチドを含む約８〜約２５アミノ酸のアミノ酸配列である、
を含むか、あるいは、前記アミノ酸配列からなる（この実施態様は配列番号：８９として開示される）。より特に好ましい実施態様において、Ｒ１はＬｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ及びＬｙｓ−Ａｌａからなる群から選択され、
Ｒ２がＡｓｐ、Ａｓｎ又はＡｌａであり、
Ｒ３がＡｒｇであり、
Ｒ４がＧｌｕ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｎ又はＰｈｅであり、
Ｒ５がＰｈｅであり、
Ｒ６がＡｓｐ、Ｃｙｓ、Ａｌａ又はＡｉｂであり、
Ｒ７がGln-Phe-R8-R9-R10-R11（配列番号：４）であり、ここで、Ｒ８がＭｅｔ、Ａｌａ，（Ｄ）Ｍｅｔ又はＮｌｅであり、Ｒ９がＰｒｏ、（Ｄ）ＰｒｏかＡｌａであるか又は存在せず、Ｒ１０がＡｌａか（Ｄ）Ａｌａであるか又は存在せず、Ｒ１１が約５〜約２０アミノ酸の細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）である。より好ましい実施態様において、Ｒ１１は、Val-Tyr-Asp-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg（配列番号：５）である。
【００２０】
さらなる実施態様において、ｅＩＦ４Ｅに結合可能な細胞浸透性ペプチドは、式ＩのペプチドAc-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-R11（配列番号：６）を含み、ここでＲ１１は約５〜約２０アミノ酸の細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。より好ましい実施態様において、Ｒ１１は、Val-Tyr-Asp-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg（配列番号：５）である。
【００２１】
より特に好ましくは、本発明のペプチドは、配列番号：７からなる（Ac-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-Val-Tyr-Asp-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-NH2）。
【００２２】
他のより好ましい、上記配列番号：１及び／又は３を含み、加えて細胞浸透性である本発明のペプチドは、以下の配列、表２に示される配列番号：７、１２、１３−２６を含む。上記配列番号：１及び／又は３を含むか又は該配列番号で構成されるが、細胞浸透性でない、配列番号：５２−８５は、表１に挙げられる。
【００２３】
別の実施態様において、ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅに結合可能な細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ−ｅＩＦ４Ｅ）は、配列番号：９−１１及び２７−４４のアミノ酸配列を含むか又は該配列番号で構成され、該配列はさらにTyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr（配列番号：２）のアミノ酸モチーフを含む。より特定的には、アミノ酸配列は、Ac-Met-Ala-R1-Leu-R2-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-R3-Leu-R4-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：８）のアミノ酸モチーフを含み、
ここでＲ１がＬｙｓ又はＡｓｎであり、
Ｒ２がＬｙｓ又はＡｌａであり、
Ｒ３がＬｅｕ又はＡｒｇであり、及び
Ｒ４がＰｈｅ又はｔ−ＢｕｔＡｌａである。より好ましくは、アミノ酸配列は、配列番号：９、１０又は１１からなる群から選択される。（(II)Ac-Met-Ala-Lys-Leu-Lys-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Leu-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：９）；(III):Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：１０）；(IV)Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-tBuAla-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：１１））。
【００２４】
より特定的には、上記配列番号：２を含む本発明のペプチドは、以下の配列、表２ａに示される配列番号：９−１１及び２７−４４（表２ａは、ＣＰＰであり、ｅｉｆ４ｅに結合し、配列番号：２のモチーフを有する本発明のペプチドの例を挙げる）。
【００２５】
さらなる実施態様において、ｅｉｆ４ｅに結合し、細胞浸透性である本発明のペプチドは、表３に反映されるように配列番号：４５−５１を含む。
【００２６】
別に、本願発明は、約９〜約４０アミノ酸の単離され、精製されたポリペプチドであって、第１のペプチドと任意の第２のペプチドを含むか又はこれらペプチドで構成され、第１のペプチドが、ｉ．  少なくとも９アミノ酸のアミノ酸配列を含み、ｉｉ．  ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅ（より好ましくは、ヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅ）への結合能を有し、ｉｉｉ．  且つ、該第１のペプチドが、一部において、ＹｘｘｘｘＬＬｘＦ（配列番号：９０）のアミノ酸配列モチーフを含み、ここで、Ｙがチロシン（Ｔｙｒ）であり、ｘが任意のアミノ酸であり、Ｌがロイシン（Ｌｅｕ）であり、及びＦがフェニルアラニン（Ｐｈｅ）であり、及び
任意の第２のペプチドが細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）である、ポリペプチドを開示する。
【００２７】
別のより好ましい実施態様において、本発明は、約９〜約４０アミノ酸の単離され、精製されたポリペプチドであって、第１のペプチドと任意の第２のペプチドを含むか又はこれらペプチドで構成され、第１のペプチドが、ｉ．  少なくとも９アミノ酸のアミノ酸配列を含み、ｉｉ．  ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅ（より好ましくは、ヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅ）への結合能を有し、ｉｉｉ．  該第１のペプチドが、一部において、Ａｃ−Ｒ１−Ｔｙｒ−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４−Ｒ５−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｒ６−Ｐｈｅ−Ｒ７−NH2（配列番号：３）のアミノ酸モチーフの９〜約３０アミノ酸のアミノ酸配列をさらに含み、ここで、Ｒ２−Ｒ６は任意のアミノ酸であり、Ｒ１とＲ７は任意のアミノ酸又は任意のアミノ酸配列であり、Ｒ１又はＲ７は任意のＣＰＰ（この実施態様は配列番号：８９として開示される）である、ポリペプチドを開示する。より好ましい実施態様において、Ｒ１はＬｙｓ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ−Ｇｌｎ、Ｌｙｓ−Ａｒｇ及びＬｙｓ−Ａｌａからなる群から選択され、Ｒ２がＡｓｐ、Ａｓｎ又はＡｌａであり、Ｒ３がＡｒｇであり、Ｒ４がＧｌｕ、Ｌｙｓ、Ｃｙｓ、Ａｌａ、Ｇｌｎ又はＰｈｅであり、Ｒ５がＰｈｅであり、Ｒ６がＡｓｐ、Ｃｙｓ、Ａｌａ又はＡｉｂであり、Ｒ７がGln-Phe-R8-R9-R10-R11（配列番号：４）であり、ここで、Ｒ８がＭｅｔ、Ａｌａ，（Ｄ）Ｍｅｔ又はＮｌｅであり、Ｒ９がＰｒｏ、（Ｄ）ＰｒｏかＡｌａであるか又は存在せず、Ｒ１０がＡｌａか（Ｄ）Ａｌａであるか又は存在せず、Ｒ１１が約５〜約２０アミノ酸の細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）である。さらにより好ましい実施態様において、ポリペプチドは、Ac-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-R11（配列番号：６）を含むか又はこれから構成される。より特定的には、上記配列番号：１を含むか又はこれから構成される本実施態様の第一のペプチドは、以下の配列、表１に示される配列番号：５２−８５（ｅＩＦ４Ｅに結合するが、細胞浸透性でないペプチド）を含む。
【００２８】
別に、本発明は、少なくとも９〜約４０アミノ酸の単離され、精製されたペプチドであって、第１と任意の第２のポリペプチドからなり、第１のペプチドが、ｉ．  少なくとも９アミノ酸のアミノ酸配列を含み、ｉｉ．  ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅ（より好ましくはヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅ）への結合能を有し、ｉｉｉ．  且つ該第１のペプチドが、一部において、Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr（配列番号：２）のアミノ酸モチーフを含み、及び
任意の第２のペプチドが細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）である、ペプチドも提供する。
【００２９】
他の実施態様において、本発明は、少なくとも９〜約４０アミノ酸の単離され、精製されたペプチドであって、第１と任意の第２のポリペプチドからなるペプチドも提供し、
ここで、第１のペプチドは、
ｉ）少なくとも９アミノ酸のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）ほ乳類開始因子ｅＩＦ４Ｅ（より好ましくは、ヒト開始因子ｅＩＦ４Ｅ）への結合能を有し、
ｉｉｉ）配列番号：５３−８６のアミノ酸配列を含み、さらに、
任意の第２のペプチドは細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）である。係る第１のペプチドの代表的な例が表３に列挙される。
定義
【００３０】
別に規定されない限り、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるように、使用されるすべての技術用語および科学用語は、本明細書と同じ意味を持つ。本明細書に記載したものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実行又は試験において使用することができるが、適切な方法及び材料が以下に記載される。
【００３１】
本発明の細胞浸透性ペプチド（ＣＰＰ）は、一般的に、細胞膜に浸透可能で、異なる積荷を細胞に運搬可能なペプチドを指す。より好ましくは、本明細書に規定されるＣＰＰは、加えて、配列が２以上の非天然又は人工の配列を含み、加えて側鎖架橋又は環状ペプチドとして規定される、いわゆる「一括りの」ペプチドが排除する。
【００３２】
語句「ｅＩＦ４ｅに結合するペプチド（単数又は複数）」又は「ｅＩＦ４Ｅに結合可能なペプチド（単数又は複数）」は、標的がｅＩＦ４ｅである生物学的アッセイにおいて陽性である（本明細書においてＩＣ５０＜２０ｕＭとして規定される）ペプチド群を指す。
【００３３】
用語「ｅＩＦ４Ｅ」又は真核生物開始因子４Ｅは２４ｋＤのタンパク質、より好ましくは、アミノ酸配列（配列番号：８６）を含むヒトｅＩＦ４Ｅを指す。より具体的には、ヒトｅＩＦ４Ｅは、アミノ酸配列２８−２１７（ａａ２８−２１７）ＶＡＮ
PEHYIKHPLQ NRWALWFFKN DKSKTWQANLRLISKFDTVE DFWALYNHIQ LSSNLMPGCD YSLFKDGIEP MWEDEKNKRG GRWLITLNKQ QRRSDLDRFW LETLLCLIGE SFDDYSDDVC GAVVNVRAKG DKIAIWTTEC ENREAVTHIG RVYKERLGLP PKIVIGYQSH ADTATKSGST TKNRFVV（配列番号：８７）から構成される。あるいは、ヒトｅＩＦ４Ｅ（上記の残基２８−２１７）は、精製の補助のために、Ｃ末端残基の後に追加の６つのヒスチジンを伴って大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に発現され得る（配列番号：８８）。
【００３４】
用語「アミノ酸モチーフ」は、保存されたアミノ酸配列（例えば、Ｙ−−−−ＬＬ−Ｆ）を指す。この配列は、モチーフの各アミノ酸を隔てる残基の数を示すギャップを含んでもよい。
【００３５】
用語「アミノ酸」は、Ｒが任意の有機基であり得る、一般式NH2ＣＨＲＣＯＯＨの有機化合物を指す。具体的には、用語アミノ酸は、Ａｉｂ＝アルファ−アミノ酪酸；ｔＢｕＡｌａ＝Ｔｅｒｔ−ブチルアラニン；Ｔｈｒ−ＯＢｚｌ＝スレオニンベンジルエステル；５Ａｖａ＝５−アミノ吉草酸；Ａｓｐ＝Ｄ＝アスパラギン酸；Ａｌａ＝Ａ＝アラニン；Ａｒｇ＝Ｒ＝アルギニン；Ａｓｎ＝Ｎ＝アスパラギン；Ｇｌｙ＝Ｇ＝グリシン；Ｇｌｕ＝Ｅ＝グルタミン酸；Ｇｌｎ＝Ｑ＝グルタミン；Ｈｉｓ＝Ｈ＝ヒスチジン；Ｉｌｅ＝Ｉ＝イソロイシン；Ｌｅｕ＝Ｌ＝ロイシン；Ｌｙｓ＝Ｋ＝リジン；Ｍ＝メチオニン；Ｍａｍｂ＝（３−アミノメチル）安息香酸；Ｍａｍｐ＝Ｍｅｔ＝（３−アミノメチル）フェニル酢酸；Ｎｌｅ＝ノルロイシン；Ｎｖａ＝ノルバリン；Ｐｈｅ＝Ｆ＝フェニルアラニン；Ｐｒｏ＝Ｐ＝プロリン；Ｓｅｒ＝Ｓ＝セリン；Ｔｈｒ＝Ｔ＝スレオニン；Ｔｒｐ＝Ｗ＝トリプトファン；Ｔｙｒ＝Ｙ＝チロシン；及びＶａｌ＝Ｖ＝Ｖａｌｉｎｅ等の天然及び非天然（人工）のアミノ酸を指してもよい。
【００３６】
用語「薬学的に許容可能な」とは、一般的に安全、無毒性で、生物学的でも望ましくないものでもなく、獣医学的並びにヒトの薬学的使用に許容可能である薬学的組成物の調製に有用な材料の特質のことをいう。
【００３７】
用語「薬学的に許容可能な塩」とは、生物学的でも、又はそうでなければ望ましくないものでない塩のことをいう。薬学的に許容可能な塩は、酸及び塩基付加塩を含む。
【００３８】
用語「薬学的に許容可能な酸付加塩」は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、炭酸、リン酸等の無機酸、及び脂肪酸、環状脂肪酸、芳香族酸、ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ酸（ａｒａｌｉｐｈａｔｉｃ）、複素環酸、カルボキシル酸から選択される有機酸、及びギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸（ｍａｌｏｎｅｉｃ ａｃｉｄ）、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、アスパラギン酸、アスコルビン酸、グルタミン酸、アントラニル酸、芳香族酸、ケイ皮酸、マンデル酸、エンボン酸（ｅｍｂｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、フェニル酢酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン及びサリサイクリック酸（ｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ ａｃｉｄ）等のスルホン酸クラスの有機酸で形成される、薬学的に許容可能な塩のことをいう。
【００３９】
用語「薬学的に許容可能な塩基付加塩」は、有機又は無機塩基を用いて形成される薬学的に許容可能な塩であるものをいう。許容可能な無機塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、銅塩、マンガン塩、及びアルミニウム塩を含む。薬学的に許容可能な無毒性有機塩基から誘導される塩は、一次、二次、及び三次アミンの塩、天然に生じる置換アミンを含む置換アミンの塩、環状アミンの塩、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、２−ジエチルアミノエタノール、トリメタミン、ジシクロヘキシルアミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン（ｈｙｄｒａｂａｍｉｎｅ）、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、メチルグルカミン、テオブロミン、プリン類、ピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｚｉｎｅ）、ピペリジン、Ｎ−エチルピペリジン、及びポリアミンレジン等の塩基性イオン交換レジンの塩を含む。
【００４０】
用語「ＩＣ５０値」又は「最大半量阻害濃度」（ＩＣ５０）は、インビトロで生物学的プロセスの５０％阻害を得るために要求される特定の化合物の濃度をいう。ＩＣ５０値は対数的にｐＩＣ５０値（−ｌｏｇ ＩＣ５０）に転換され得、高い値は、指数関数的に大きな能力を示す。ＩＣ５０値は、絶対値ではないが、採用される濃度等の実験条件に依存する。ＩＣ５０値は、Ｃｈｅｎｇ−Ｐｒｕｓｏｆｆ式を用いて、絶対阻害定数（Ｋｉ）に転換され得る（Biochem.Pharmacol.(1973)22:3099）。
【００４１】
本明細書に記載される全てのペプチド配列は、別に述べない限り、Ｎ端アミノ酸が左側に、Ｃ端アミノ酸が右側に存在する通常の習慣に従って記載される。２つのアミノ酸残基の間の短線は、ペプチド結合を示す。アミノ酸が異性体形態を有する場合、別に明示的に示さない限り、これはアミノ酸のＬ形態である。
【００４２】
本発明を記載する便宜のために、従来の及び従来のものでない略称が、諸種のアミノ酸に関して使用される。これらの略称は当業者には周知であるが、明確性のために以下に列挙する：
Ａｉｂ＝アルファ−アミノ酪酸；ｔＢｕＡｌａ＝Ｔｅｒｔ−ブチルアラニン；Ｔｈｒ−ＯＢｚｌ＝スレオニンベンジルエステル；５Ａｖａ＝５−アミノ吉草酸；Ａｓｐ＝Ｄ＝アスパラギン酸；Ａｌａ＝Ａ＝アラニン；Ａｒｇ＝Ｒ＝アルギニン；Ａｓｎ＝Ｎ＝アスパラギン；Ｇｌｙ＝Ｇ＝グリシン；Ｇｌｕ＝Ｅ＝グルタミン酸；Ｇｌｎ＝Ｑ＝グルタミン；Ｈｉｓ＝Ｈ＝ヒスチジン；Ｉｌｅ＝Ｉ＝イソロイシン；Ｌｅｕ＝Ｌ＝ロイシン；Ｌｙｓ＝Ｋ＝リジン；Ｍ＝メチオニン；Ｍａｍｂ＝（３−アミノメチル）安息香酸；Ｍａｍｐ＝Ｍｅｔ＝（３−アミノメチル）フェニル酢酸；Ｎｌｅ＝ノルロイシン；Ｎｖａ＝ノルバリン；Ｐｈｅ＝Ｆ＝フェニルアラニン；Ｐｒｏ＝Ｐ＝プロリン；Ｓｅｒ＝Ｓ＝セリン；Ｔｈｒ＝Ｔ＝スレオニン；Ｔｒｐ＝Ｗ＝トリプトファン；Ｔｙｒ＝Ｙ＝チロシン；及びＶａｌ＝Ｖ＝Ｖａｌｉｎｅ。
【００４３】
当業者には容易に知られているが、また便宜のために、以下の略称又はシンボルが、部分、試薬等を表すために用いられる。
Ｅｔ２Ｏ        ジエチルエーテル
ｈｒ（ｓ）      時間
ＴＩＳ          トリイソプロピルシラン
（Ｄ）Ｔｙｒ    Ｄ−チロシン
（Ｄ）Ｐｈｅ    Ｄ−フェニルアラニン
ＳＳＡ          サクシニミジル サクシンアミド
Ｆｍｏｃ        ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＤＭＦ          ジメチルホルムアミド
ＤＩＰＥＡ      Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミド
ＴＦＡ          トリフルオロ酢酸
ＨＯＢＴ        Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ＢＯＰ          ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス−（ジメチルアミノ）ホスホニウム−ヘキサフルオロホスフェート
ＨＢＴＵ        ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート
ＮＭＰ          Ｎ−メチル−ピロリドン
ＦＡＢ−ＭＳ    高速原子衝撃マススペクトロメトリー
ＥＳ−ＭＳ      エレクトロスプレーマススペクトロメトリー
【００４４】
本発明の化合物は、アミノ酸間のペプチド結合の形成のための任意の既知の従来法により、容易に合成し得る。係る従来法は、例えば、カルボキシル基と他の反応性基が保護されたアミノ酸又はその断片の遊離のアルファアミノ基と、アミノ基と他の反応性基が保護された別のアミノ酸又はその断片の遊離の一次カルボキシル基との間の縮合を認容する任意の溶液相手順を含む。
【００４５】
係る本発明の新規化合物を合成するための従来法は、例えば、任意の固相ペプチド合成法を含む。係る方法において、新規化合物の合成は、固相法の一般的原理に従って、所望のアミノ酸を１つずつ伸展中のペプチド鎖に順次組み込むことにより実行され得る。係る方法は、例えば、Merrifield、R. B., J. Amer.Chem.Soc.85、2149-2154(1963);Barany et al., The Peptides, Analysis, Synthesis and Biology, Vol. 2, Gross, E. and Meienhofer, J., Eds.Academic Press 1-284(1980)に開示されおり、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００４６】
ペプチドの合成の間、例えば、アルファアミノ基、ヒドロキシル基、及び／又は反応性側鎖基等のアミノ酸の一定の反応性基が、それらでの化学反応を防ぐために保護されていることが所望され得る。これは、例えば、反応性基を後で除去され得る保護基で反応させることにより達成されてもよい。例えば、アミノ酸又はその断片のアルファアミノ基が化学反応を防ぐために保護される一方、このアミノ酸又はその断片のカルボキシル基が別のアミノ酸又はその断片と反応してペプチド結合を形成され得る。これには、アルファアミノ保護基の選択的除去が続いてもよく、例えば、別のアミノ酸又はその断片のカルボキシル基との、この部位での続く反応が起こることを可能にする。
【００４７】
アルファアミノ基は、例えば、アリルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル（Ｚ）等、及びｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−ビフェニル−イソプロピルオキシカルボニル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（９−ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）（Ｆｍｏｃ）、及びｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）等の置換ベンジルオキシカルボニル等の芳香族ウレタン型の保護基；及び、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ジイソプロピルメチルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル及びアリルオキシカルボニル等の脂肪族ウレタン型の保護基から選択される適切な保護基により保護されてもよい。ある実施態様において、Ｆｍｏｃがアルファアミノ保護のために使用される。
【００４８】
アミノ酸のヒドロキシル基（ＯＨ）は、例えば、ベンジル（Ｂｚｌ）、２，６−ジクロロベンジル（２，６ ｄｉＣｌ−Ｂｚｌ）、及びｔｅｒｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）から選択される適切な保護基により保護されてもよい。チロシン、セリン、又はスレオニンのヒドロキシル基が保護されることが企図されるある実施態様において、例えば、ｔ−Ｂｕが使用されてもよい。
【００４９】
イプシロン−アミノ酸基は、例えば、２−クロロ−ベンジルオキシカルボニル（２−Ｃｌ−Ｚ）、２−ブロモ−ベンジルオキシカルボニル（２−Ｂｒ−Ｚ）、アリカルボニル（ａｌｌｙｃａｒｂｏｎｙｌ）及びｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）から選択される適切な保護基により保護されてもよい。リジンのイプシロン−アミノ基が保護されることが企図されるある実施態様において、例えば、Ｂｏｃが使用されてもよい。
【００５０】
ベータ−及びガンマ−アミド基は、例えば、４−メチルトリチル（Ｍｔｔ）、２、４、６−トリメトキシベンジル（Ｔｍｏｂ）、４、４’−ジメトキシジチル（Ｄｏｄ）、ｂｉｓ−（４−メトキシフェニル）−メチル及びトリチル（Ｔｒｔ）から選択される適切な保護基により保護されてもよい。アスパラギン又はグルタミンのアミド基が保護されることが企図されるある実施態様において、例えば、Ｔｒｔが使用されてもよい。
【００５１】
インドール基は、例えば、ホルミル（Ｆｏｒ）、メシチル−２−スルホニル（Ｍｔｓ）及びｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）から選択される適切な保護基により保護されてもよい。トリプトファンのインドール基が保護されることが企図されるある実施態様において、例えば、Ｂｏｃが使用されてもよい。
【００５２】
イミダゾール基は、例えば、ベンジル（Ｂｚｌ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、及びトリチル（Ｔｒｔ）から選択される適切な保護基により保護されてもよい。ヒスチジンのイミダゾール基が保護されることが企図されるある実施態様において、例えば、Ｔｒｔが使用されてもよい。
【００５３】
固相合成は、保護されたアルファアミノ酸の適切なレジンへの結合により、ペプチドのＣ末端から開始されてもよい。係る開始材料は、アルファ−アミノ−保護されたアミノ酸を、エステル結合により、ｐ−ベンジルオキシベンジルアルコール（Ｗａｎｇ）レジンに付着させることにより、又はｐ−（（Ｒ、Ｓ）−α−（１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−メトキシホルムアミド）−２，４−ジメチルオキシベンジル）−フェノキシ酢酸（Ｒｉｎｋ ｌｉｎｋｅｒ）等のＦｍｏｃ−リンカーとベンズヒドリルアミン（ＢＨＡ）レジンとの間のアミド結合により、調製されてもよい。ヒドロキシルメチルレジンの調製は当該分野においてよく知られている。Ｆｍｏｃ−リンカー−ＢＨＡレジン支持体は商業的に利用可能であり、合成されるべき所望のペプチドがＣ端に非置換アミドを有する場合に一般的に使用される。
【００５４】
ある実施態様において、ペプチド合成は、マイクロ波で補助される。マイクロ波補助ペプチド合成は、固相ペプチド合成を促進するために魅力的な方法である。これは、例えば、リバティ ペプチド シンセサイザー（Liberty peptide synthesizer)(CEM Corporation、Matthews、NC）等のマイクロ波ペプチドシンセサイザーを用いて行われてもよい。マイクロ波補助ペプチド合成は、設定長さの時間、設定温度で反応を制御する方法を創成することを可能にする。シンセサイザーは、反応に伝達する電力量を自動的に制御して、設定点に温度を保持する。
【００５５】
典型的には、２〜５当量のアミノ酸又及び適切なカップリング試薬と共にＦｍｏｃ保護型のアミノ酸又は模倣物を用いて、アミノ酸又は模倣物がＦｍｏｃ−リンカー−ＢＨＡレジン上にカップリングされる。カップリング後、レジンは洗浄されて、真空下乾燥されてもよい。アミノ酸のレジン上への負荷は、Ｆｍｏｃ−アミノ酸レジンのアリコートのアミノ酸分析又はＵＶ解析によるＦｍｏｃ基の測定により決定されてもよい。任意の無反応アミノ基は、レジンを無水酢酸及び塩化メチレン中のジイソプロピルエチルアミン（ｄｉｉｓｐｒｏｐｙｌｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）と反応させることにより、キャッピングされてもよい。
【００５６】
レジンは、複数の反復サイクルで実行されてアミノ酸が順次付加される。アルファアミノＦｍｏｃ保護基は、塩基性条件下で除去される。ＤＭＦ中のピペリジン、ピペラジン又はモルホリン（２０−４０％ｖ／ｖ）が、この目的のために使用されてもよい。ある実施態様において、ＤＭＦ中の２０％ ピペリジンが利用される。
【００５７】
アルファアミノ保護基の除去に続いて、引き続く保護されたアミノ酸が所望の順序で段階的にカップリングされ、中間体の保護されたペプチド−レジンが得られる。ペプチドの固相合成においてアミノ酸をカップリングするために使用される活性化試薬は、当該分野でよく知られている。例えば、係る合成に適当な試薬は、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリ−（ジメチルアミノ）ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＢＯＰ）、ブロモ−トリス−ピロリジノ− ホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢｒｏＰ）２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、及びジイソプロピルカルビジイミド（ＤＩＣ）である。ある実施態様において、試薬はＨＢＴＵ又はＤＩＣである。他の活性化剤は、Barany と Merrifield（The Peptides, Vol. 2, J. Meienhofer, ed., Academic Press, 1979, pp 1-284）により記載される。ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）及び３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢＴ）等の諸種の試薬が、合成サイクルを最適化するためにカップリング混合物に付加されてもよい。ある実施態様において、ＨＯＢＴが付加される。
【００５８】
ペプチドの合成に続き、保護基が除去され、該ペプチドがレジンから切り離されてもよい。例えば、ペプチド−レジンは、グラムレジン当たり、１００μＬのエタンジチオール、１００μＬのジメチルスルフィド、３００μＬのアニソール、及び９．５ｍＬのトリフルオロ酢酸で、１８０分間室温で処理されてもよい。別に、ペプチド−レジンは、グラムレジン当たり、１．０ｍＬのトリイソプロピルシラン及び９．５ｍＬのトリフルオロ酢酸で、９０分間室温で処理されてもよい。レジンは次いで濾過され、ペプチドが氷冷エチルエーテルの付加により沈降されてもよい。沈渣は次いで遠心され、エーテル層がデカントされてもよい。
【００５９】
粗ペプチドの精製は、例えば、逆相Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ、３００A、１０μｍ）での高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により島津ＬＣ−８Ａシステム上で行われてもよい。ペプチドは最小量の水とアセトニトリル中に溶解され、カラムに注入されてもよい。勾配溶出は、７０分を超えて、流速６０ｍｌ／分、２％−９０％Ｂで通常開始される（緩衝液Ａ：０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、緩衝液Ｂ：０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）。ＵＶ検出は２２０／２８０ｎｍに設定する。産生物を含有する画分が分離されてもよく、それらの純度が、流速２．５ｍｌ／分、１０分間を超える勾配（２−９０％）［緩衝液Ａ：０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、緩衝液Ｂ：０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）］の逆相Ｐｕｒｓｕｉｔ Ｃ１８カラム（４．６ｘ５０ｍｍ）を使用して、島津ＬＣ−１０ＡＴ分析システムで判定された［緩衝液Ａ：０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ、緩衝液Ｂ：０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）］。高純度であると判定された画分がプールされ、凍結乾燥されてもよい。
【００６０】
本発明のペプチドを作製するためのさらに別の可能な方法は、室温でのペプチドの合成のための以下の手順である。この手順において、一般的に以下の工程が取られる：
工程    試薬                      時間
１      ＤＭＦ                    ２ｘ３０秒
２      ２０％ ピペリジン/ＤＭＦ  ５分
３      ２０％ ピペリジン/ＤＭＦ  １５分
４      ＤＭＦ                    ２ｘ３０秒
５      ｉＰｒＯＨ                ２ｘ３０秒
６      ＤＭＦ                    ３ｘ３０秒
７      カップリング              ６０分−１８時間
８      ＤＭＦ                    ２ｘ３０秒
９      ｉＰｒＯＨ                １ｘ３０秒
１０    ＤＭＦ                    １ｘ３０秒
１１    ＣＨ２Ｃｌ２                ２ｘ３０秒
【００６１】
全ての洗浄及びカップリングのための溶媒は、１０−２０ｍｌ／ｇレジン容量と計測された。カップリング反応は、合成を通じてカイザー・ニンヒドリン（Ｋａｉｓｅｒ Ｎｉｎｈｙｄｒｉｎ）試験により監視され、完成の程度が決定される（Kaiser et at.Anal.Biochem.34, 595-598(1970)）。任意の不完全なカップリング反応は、新たに調製された活性化アミノ酸と再カップリングされるか又は上述のようにペプチドレジンを無水酢酸で処置することによりキャッピングされる。完全に構築されたペプチド−レジンは、数時間、通常終夜、残存する溶媒の量に応じて、真空中で乾燥される。
【００６２】
本発明のアミノ酸配列はまた、当業者に知られた方法により合成されてもよい。係る方法は、限定はされないが、マイクロ波ペプチド合成を含み（Murray J.K., Aral J., and Miranda L.P.Solid-Phase Peptide Synthesis Using Microwave Irradiation In Drug Design and Discovery.Methods in Molecular Biology, 2011, Volume 716, 73-88, DOI:10.1007/978-1-61779-012-6_5）、アミノ酸配列の固相合成（Steward and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freemantle, San Francisco, Calif.(1968)）を含む。例示的な固相合成法は、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）法（Merrifield, Recent Progress in Hormone Res., 23:451(1967)）である。
【００６３】
本明細書に記載されるように、本発明の化合物は、薬学的に許容可能な塩の形態においても提供され得る。好ましい塩の例は、薬学的に許容可能な有機酸、例えば、酢酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、コハク酸、安息香酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸又はパモン酸、並びにタンニン酸又はカルボキシメチルセルロース等の重合体酸と形成される塩、及びハロゲン化水素酸（例えば、塩酸）、硫酸、又はリン酸等の無機酸との塩である。当業者に知られた薬学的に許容可能な塩を得るための任意の手順が使用できる。
【００６４】
本明細書に記載する全ての出版物、特許出願、特許、及び他の参考文献が、参照によりその全体が組み込まれる。
【実施例】
【００６５】
本発明は以下の実施例を参照することにより、さらに十分に理解されるであろう。しかし、それらは本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきものではない。
【００６６】
全ての溶媒、イソプロパノール（ｉＰｒＯＨ）、塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｌ２）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）及びＮ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）は、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）又はＢｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎから購入し、追加の蒸留なしで使用した。
トリフルオロ酢酸は、ハロカーボン（Ｈａｌｏｃａｒｂｏｎ）又はフルカ（Ｆｌｕｋａ）から購入し、さらなる精製なしで使用した。
ジイソプポピルカルボジイミド（ＤＩＣ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）は、フルカ又はアルドリッチから購入し、さらなる精製なしで使用した。
ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、ジメチルスルフィド（ＤＭＳ）及び１、２−エタンジチオール（ＥＤＴ）はシグマ社（Sigma Chemical Co.）から購入し、さらなる精製なしで使用した。
保護されたアミノ酸は一般的にＬ形態であり、Ｂａｃｈｅｍ又はＮｅｏｓｙｓｔｅｍから商業的に得た。
これら試薬の純度は、薄層クロマトグラフィー、ＮＭＲ及び融点により、使用前に確認された。
【００６７】
ベンズヒドリルアミンレジン（ＢＨＡ）は、Ｂａｃｈｅｍ又はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｔｅｃｈから得た、スチレン−１％ジビニルベンゼン（１００−２００又は２００−４００メッシュ）のコポリマーであった。これらレジンの総窒素含量は、一般的に０．３−１．２ｍｅｑ／ｇであった。
【００６８】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は、ＣＬＡＳＳ−ＶＰ−７．３ソフトウエアシステムを搭載する自動化島津ＨＰＬＣで行われた。分析的ＨＰＬＣ）は、Ｐｕｒｓｕｉｔ Ｃ１８ カラム（４．５ｘ５０ｍｍ）を用いて、逆相様式で行われた。
分取ＨＰＬＣ分離は、逆相Ｖａｒｉａｎ（Ｐｕｒｓｕｉｔ）又はＷａｔｅｒｓ（Ｘｔｅｒａ又はＸｂｒｉｄｇｅ）Ｃ１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ）で行われた。
【００６９】
実施例１
以下の例は、マイクロ波ペプチド合成のための代表的な例示的手順を記載する。
リバティペプチドシンセサイザー（CEM Corporation, Matthews, NC）は、製造者により提供されたソフトウエアを使用して、前負荷された０．２５ｍｍｏｌサイクルの修飾により二重カップリングとキャッピングのためにプログラムされた。Ｆｍｏｃ脱保護、アミノ酸カップリング及び無水酢酸を用いたキャッピングの間に使用するために、マイクロ波エディタが使用されて、マイクロ波パワー法がプログラムされた。アミノ酸付加及び最終脱保護のための初期設定サイクルは、サイクルエディタ中で選択され、ペプチド生成のあいだ自動的に負荷された。
【００７０】
合成は、Ｆｍｏｃ−Ｌｉｎｋｅｒ−ＢＨＡレジン（４５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ；AnaSpec, Inc., Fremont, CAから入手可能）を使用して、０．２５ｍｍｏｌスケールで行われた。脱保護は、ＤＭＦ溶液中の２０％ピペリジンを用いて行われた。全てのカップリング反応は０．５Ｍ ＨＢＴＵ及び２Ｍ Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）を用いて行われ、各アミノ酸カップリング後に２５％無水酢酸を用いてキャッピングされた（プロトコル２）。各脱保護、カップリング及びキャッピング反応は、７５oＣで３６０秒間、３５ワット電力及び窒素通気下でマイクロ波を使用して行われた。
各アミノ酸カップリングに対して、以下の０．２５ｍｍｏｌカップリングサイクルが使用された。
【００７１】
プロトコル２
レジンを容器に移動
２０％ ピペリジン付加  脱保護（１０ｍＬ）
第１の脱保護のためのマイクロ波法  最大７５oＣで３０秒
レジンをＤＭＦ（１０ｍＬ）で洗浄
第２の脱保護のためのマイクロ波法  最大７５oＣで１８０秒
レジンをＤＭＦ（１０ｍＬ）で３回洗浄
０．２Ｍ アミノ酸（５ｍＬ）を付加
０．５Ｍ 活性化因子（ＨＢＴＵ）（２ｍＬ）を付加
２Ｍ 活性化塩基（ＮＭＭ）（１ｍＬ）を付加
カップリングのためのマイクロ波法  最大７５oＣで６分
レジンをＤＭＦ（１０ｍＬ）で洗浄
０．２Ｍ アミノ酸（５ｍＬ）を付加
０．５Ｍ 活性化因子（ＨＢＴＵ）（２ｍＬ）を付加
２Ｍ 活性化塩基（ＮＭＭ）（１ｍＬ）を付加
カップリングのためのマイクロ波法  最大７５oＣで６分
レジンをＤＭＦ（１０ｍＬ）で３回洗浄
最後のアミノ酸カップリングの後、ペプチドは、ＤＭＦ中の２５％ 無水酢酸を用いてキャッピングされた（プロトコル３）。
【００７２】
プロトコル３
レジンをＤＭＦ（１０ｍＬ）で３回洗浄
２０％ ピペリジン付加  脱保護（１０ｍＬ）
第１の脱保護のためのマイクロ波法  最大７５oＣで３０秒
レジンをＤＭＦ（１０ｍＬ）で洗浄
第２の脱保護のためのマイクロ波法  最大７５oＣで１８０秒
レジンをＤＭＦ（１０ｍＬ）で３回洗浄
キャッピング（無水酢酸１０ｍＬ）付加
マイクロ波法（キャッピング）最大７５oＣで１８０秒
レジンをＤＭＦ（１０ｍＬ）で３回洗浄
【００７３】
実施例２
Ac-Met-Ala-Lys-Leu-Lys-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Leu-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：９）の合成
上記ペプチドは、ＣＥＭ マイクロ波ペプチドシンセサイザー上でＦｍｏｃ化学を使用して合成された。シンセサイザーは、実施例１のプロトコル２及び３に記載のモジュールを使用して二重カップリングのためにプログラムされた。合成は、Ｆｍｏｃ ＲｉｎｋＡｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジン（Ｓｕｂ：．４５ｍｅｑ／ｇ；４５０ｍｇ使用）を使用して、０．２５ｍｍｏｌサイクルで実施された。合成の最後で、レジンは、切断のためにシェイカー上の反応容器に移された。ペプチドは、１７ｍＬの９７％ ＴＦＡ（３％水）及び１ｍＬのＴＩＳとプロパンチオール（１：２）を使用して、１．５時間、室温で切断された。脱保護溶液は１００ｍＬ冷Ｅｔ２Ｏに付加され、１ｍＬＴＦＡ及び３０ｍＬ冷Ｅｔ２Ｏで洗浄され、ペプチドが沈降された。ペプチドは、２ｘ５０ｍＬポリプロピレンチューブ中で遠心された。個々のチューブからの沈降物は、単一のチューブに集められ、冷Ｅｔ２Ｏで３回洗浄され、室内真空（ｈｏｕｓｅ ｖａｃｕｕｍ）下乾燥器内で乾燥された。
【００７４】
粗ペプチドは、ＸｔｅｒａＣ１８−カラム（２５０ｘ５０ｍｍ、１０μｍ粒子径）で分取ＨＰＬＣ（島津）により精製され、１０−９９％Ｂの線形勾配（緩衝液Ａ：０．１％ ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ；緩衝液Ｂ：０．１％ ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ）で、９０分以内、流速６０ｍＬ／分、及び検出２２０／２８０ｎｍを用いて溶出された。画分が収集され、分析的ＨＰＬＣによりチェックされた。全ての分析的実行は、Ａ：０．１％水／ＴＦＡ及びＢ：０．１％アセトニトリル／ＴＦＡを用いた１０−９９％Ａ勾配を使用するＣ１８逆相Ｗａｔｅｒｓ Ｘｔｅｒａ／ｐｕｒｓｕｉｔ ４．６ｘ５０ｍｍカラムを使用して、島津ＨＰＬＣ上で行われた。純粋な生成物を含有する画分が合わされ、凍結乾燥され、１９７ｍｇ（１９％）の白色非晶質粉末を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（“ｃａｌｃｄ”）Ｃ１７７Ｈ２７３Ｎ３９Ｏ３４Ｓ２ ３５５５．５２ 測定値３５５５２．４９。
【００７５】
実施例３
Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：１０）の合成
Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジン（４５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）が、一般的に実施例２に記載の手順に従うことにより固相合成と精製に供され、７３ｍｇ（７％）の白色非晶質粉末を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（“ｃａｌｃｄ”） Ｃ１７３Ｈ２６１Ｎ４１Ｏ３５Ｓ２ ３５２７．３９ 測定値３５２７．３１。
【００７６】
実施例４
Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-tBuAla-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：１１）の合成
Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジン（４５０ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）が、一般的に実施例２に記載の手順に従うことにより固相合成と精製に供され、５４ｍｇ（５％）の白色非晶質粉末を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳｍ／ｅ 計算値（“ｃａｌｃｄ”）Ｃ１７０Ｈ２６５Ｎ４１Ｏ３５Ｓ２３５０７．３９ 測定値３５０６．９８。
【００７７】
実施例５
一定の配列の合成（配列番号：７、１２−２１及び２３−３０、４５−４６、５２−６７及び８１−８３）が［ＣＳＢｉｏ（Menlo Park、California、USA）により］固相合成を介して合成された。（Steward and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, Freemantle, San Francisco, Calif.(1968）。上記配列のための以下の一般的例示的な固相合成法が記載される。
【００７８】
材料：
ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）、ＤＣＭ（塩化メチレン）、ＤＩＥＡ（ジイソプロピルエチルアミン）、及びピペリジン等の全ての化学物質と溶媒は、ＶＷＲ及びＡｌｄｒｉｃｈから購入され、さらなる精製なしに購入したままで使用された。マススペクトルは、エレクトロスプレーイオン化様式で記録された。保護されたアミノ酸の自動的段階的な組立ては、ポリマー支持体としてＲｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンを用いて、ＣＳ ３３６Ｘ シリーズペプチドシンセサイザー（C S Bio Company、Menlo Park、California、USA）上で構築された。Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学が、合成のために採用された。Ｆｍｏｃアミノ酸（ＡＡｓ）のための保護基は以下の様であった、Ａｒｇ：（Ｐｂｆ）、Ａｓｎ／Ｇｌｎ／Ｃｙｓ／Ｈｉｓ：（Ｔｒｔ）、Ａｓｐ／Ｇｌｕ：（ＯｔＢｕ）、Ｌｙｓ／Ｔｒｐ：（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ／Ｔｙｒ：（ｔＢｕ）。
【００７９】
合成：
一般に、合成経路は、すべての順序について、前負荷Ｒｉｎｋ ＡｍｉｄｅレジンのｄｅＦｍｏｃと所与の配列に従った所望のＡＡｓのカップリング／脱保護から開始した。カップリング試薬はＤＩＣ／ＨＯＢｔであり、反応溶媒はＤＭＦ及びＤＣＭであった。ペプチジルレジン／ＡＡ／ＤＩＣ／ＨＯＢＴの比率は、１／４／４／４（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であった。カップリングプログラム後、ＤｅＦｍｏｃがＤＭＦ中の２０％ピペリジンを使用して実行された。例えば、０．４ｍｍｏｌ合成が最後のＡＡが付加されるまで行われた。ｄｅＦｍｏｃ後、レジンがＡｃ２Ｏ／ＤＩＥＡを用いてアセチル化され、Ｎ−端Ａｃ配列を与えた。
【００８０】
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅレジン（０．８５ｇ、０．４ｍｍｏｌ、ｓｕｂ：０．４７ｍｍ／ｇ、Ｌｏｔ＃１１０８１０、Ｃ Ｓ Ｂｉｏ）を、２５ｍＬ反応容器（ＲＶ）中でＤＭＦ（１０ｍＬ）と混合させ、１０−３０分間膨張させた。ＲＶはＣＳ３３６ ペプチド自動化シンセサイザーにのせられ、所与のペプチド配列に従ってアミノ酸がアミノ酸（ＡＡ）ホイールに負荷された。ＨＯＢｔ（ＤＦＭ中０．５Ｍ）及びＤＩＣ（ＤＦＭ中０．５Ｍ）は、Ｎ２下、移動可能なボトルに別々に全て前溶解された。Ｆｍｏｃ−アミノ酸（ＡＡｓ、４ｅｑ）を秤量し、粉末としてＡＡホイールに前負荷した。例えば、０．４ｍｍｏｌ合成は、１．６ｍｍｏｌのＡＡを必要とした。現プログラムはＡＡチューブ内でのＡＡ溶解から開始し、溶液はＭ−ＶＡを通ってＴ−ＶＡへ汲み出された。ＨＯＢｔ溶液が後にＡＡと混合された。混合を補助するのにＮ２通気が使用された。ＤＩＣ溶液がＡＡ／ＨＯＢｔ溶液と合わされ、全混合物が排出されたレジンと一緒にＲＶへ５分内に移され、同時にカップリングが開始された。３−６時間の振盪後、反応混合物が濾過され、レジンが３回洗浄され、ＤＭＦ中の２０％ Ｐｉｐを使用した現プログラムに従うｄｅＦｍｏｃが続いた。次のＡＡが同一の経路に従い付着した。ＤＭＦ／ＤＣＭを別に用いて７の洗浄工程が行われた。最後のＡＡがカップリングされるまで、所与の配列に従ったそれぞれの基本単位を用いて、カップリング工程が反復された。カップリング時間：各ＡＡ付着に対して３−６時間。
最後のＡＡのｄｅＦｍｏｃ後、レジンはＤＭＦ中のＡｃ２Ｏ／ＤＩＥＡによりアセチル化された。
【００８１】
切断：
最後のペプチジルレジン（１−１．５ｇ）をＴＦＡ カクテル（ＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ／Ｈ２Ｏ）と混合し、混合物を室温で４時間振盪した。切断されたペプチドは濾過され、レジンはＴＦＡにより洗浄された。エーテル沈降及び洗浄後、粗ペプチド（２００−５００ｍｇ）が５０−９０％の収率で得られた。該粗ペプチドは、凍結乾燥しないで直接精製された。
【００８２】
精製
粗ペプチド、２００−５００ｍｇのアセチル化ペプチドは、緩衝液Ａ（水及びＡＣＮ中の０．１％ ＴＦＡ）中に溶解され、ペプチド溶液は、プレップＨＰＬＣ精製システムを有するＣ１８カラム（２インチ）に負荷された。２５−４０ｍＬ／分の流速では、精製は、６０分勾配でのＴＦＡ（０．１％）緩衝液システム中で終了した。期待されるＭＷを含有する画分（ペプチド純度＞９５％）が収集された。プレップＨＰＬＣは、次いで８０％緩衝液Ｂにより、少なくとも３カラム空隙容量で洗浄され、次の負荷前に５％緩衝液Ｂと平衡化された。
【００８３】
凍結乾燥：
画分（純度＞９０％）が合わされ、液体窒素で完全に凍らせた１Ｌの凍結乾燥広口瓶に移された。凍結後、広口瓶を凍結乾燥器（Ｖｉｒｔｉｓ Ｆｒｅｅｚｅｍｏｂｉｌｅ ３５ＥＬ）に置き、終夜乾燥させた。真空は５００ｍＴより低く、チャンバー温度は−６０℃より低かった。凍結乾燥は室温（環境温度）で１２−１８時間以内に完了させた。
【００８４】
結果：
工程は、各配列に対して、約０．４ｍｍ合成で開始した。合成収率はおよそ５０−９０％であり、粗純度は３０−７０％の範囲であった。精製はＴＦＡシステム中で行われ、最終収率は、各オーダーに対して約１０％であった。
【００８５】
実施例５ａ
Ac-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-Val-Tyr-Asp-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-NH2（配列番号：７）の合成
上記ペプチドは、上記実施例５に従い固相合成を介して合成された。配列番号：７の特定の調製において、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジン（０．５５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）が、実施例５に記載の手順に従うことにより固相合成と精製に供され、１７ｍｇ（２．６％）を得た。（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ計算値（“ｃａｌｃｄ”）Ｃ１８６Ｈ３０７Ｎ６５Ｏ４１ 測定値４１１０．４０。
【００８６】
実施例６
生物学的アッセイを行って、ヒトｅＩＦ４Ｅへのペプチド結合を試験した。
Ｃ末端Ｈｉｓタグを有するヒトｅＩＦ４Ｅ（ａａ２８−２１７、配列番号：８７）（ＨＨ−ｅＩＦ４Ｅ、配列番号：８８）が大腸菌の封入体中に発現させた。タンパク質は、８Ｍ尿素用いて可溶化され、ニッケル−負荷ＨｉｓトラップＨＰ（ｎｉｃｋｅｌ−ｃｈａｒｇｅｄ ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰ）カラム（GE Healthcare）を使用して変性条件下精製された。タンパク質は、６Ｍ尿素、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び０．５ Ｍアルギニン?ＨＣｌを用いておよそ０．２５ｍｇ／ｍＬに希釈され、次いで尿素を含まない同じ緩衝液中に終夜透析されることにより、リフォールディングされた。タンパク質は、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ６．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及び１ｍＭ ＤＴＴ中にさらに透析され、濾過され、次いでＨｉｔｒａｐ ＳＰセファロースＦＦ（Ｈｉｔｒａｐ ＳＰ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ）カラム（GE Healthcare）を使用して濃縮された。タンパク質は、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ｐＨ７．０、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、及び１０％ グリセロール中に透析され、使用まで−８０℃にて保存された。
【００８７】
試験ペプチド（１．６ｍＭ ＤＭＳＯ中ストック）は、ＤＭＳＯ中に順次に３倍に希釈され、溶液は、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ ＮａＰｉ、ｐＨ６．５、５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００４％ ＮＰ４０及び０．５ｍｇ／ｍｌ ガンマグロブリン）中に４倍に希釈された。ウェル当たり６マイクロリットルの希釈ペプチド溶液と、ウェル当たり１２マイクロリットルのアッセイ緩衝液中の１８７．５ｎＭ ＨＨ−ｅＩＦ４Ｅが、３８４−ウェル ポリプポピレンマイクロプレート（Matrix、Thermal Scientific）に添加された。ウェル当たり１２マイクロリットルのアッセイ緩衝液中の１８７．５ｎＭ ビオチン標識 ４Ｇ２ペプチド（Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Lys(Aha-Bio)-NH2（配列番号：９１）１：２ ＴＦＡ）が添加された。試料は室温で２０分間インキュベートされた。
【００８８】
アッセイ緩衝液（ＤＴＴ不含）中の、ウェル当たり６マイクロリットルの４．８ｎＭ Ｅｕ−ストレプタビジン（Columbia Biosciences）及び４８ｎＭ アロフィコシアニン−抗Ｈｉｓ抗体（Columbia Biosciences）が次いで添加され、試料は室温で３０分間インキュベートされた。アッセイ信号は、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ Ｒｅａｄｅｒ（PerkinElmer Life and Analytical Sciences）上で６６５ｎｍの発光蛍光を読むことにより監視された。ＩＣ５０値は、Ｃｏｎｄｏｓｅｏソフトウェア（Genedata AG、Basel、Switzerland）を使用して計算された。本発明の目的にために、２０μＭより低いＩＣ５０値は良好とみなされ、１０μＭより低いＩＣ５０値では好ましいとみなされ、５μＭより低いＩＣ５０値、特に１μＭより低いＩＣ５０値は最も好ましいとみなされた。
結合親和性−ＩＣ５０として表される − は、０．２１μＭ（配列番号：７）、４．４０４μＭ（配列番号：９）、６．６１４（配列番号：１０）及び２．３７３μＭ（配列番号：１１）であった。
【００８９】
実施例７
以下の研究が、ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞におけるｅＩＦ４ＥからのｅＩＦ４Ｇの置換を評価するのに実施された。
ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞４は、ＡＴＣＣ（Manassas, Virginia）から入手し、５％ ＣＯ２中３７℃で、１０％牛胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持された。細胞は、ウェル当たり０．７５ｘ１０６の濃度で、６−ウェルプレートに播かれた。２４時間後、ＤＭＳＯ（対照）（Sigma-Aldrich D2650）又はペプチドが指摘の濃度で添加され、３７℃で３時間インキュベートされた。処置された細胞は、２ｍｌの氷冷ＰＢＳで洗浄された。プレートが氷上に置かれ、プロテアーゼ阻害剤（Roche Applied Science 04 693 159 001）を含有する５００μｌＲＩＰＡ溶解緩衝液（Sigma Aldrich R0278）が各ウェルに添加された。５分後、細胞単層が掻爬されて細胞がはがされ、溶解物が１．５ｍｌ コニカルチューブに移されて氷上で３０分間インキュベートされた。各試料は次いで氷上で１０秒間超音波処理され、不溶性画分が遠心分離により除去された。ｅＩＦ４Ｅと関連タンパク質の親和性精製のために、２５μｌの前洗浄された７−メチル−ＧＴＰ セファロース（登録商標）４Ｂ（GE Healthcare 275025）が澄明化溶解物に添加され、ロッキングプラットフォーム上、４℃で１６時間インキュベートされた。セファロースビーズを１０００ｇで沈渣し、ＲＩＰＡ緩衝液で２回及びＰＢＳで２回洗浄した。セファロースビーズを２Ｘ ＬＤＳ試料緩衝液（InVitrogen NP007）に懸濁し、９５℃で５分間加熱して、ｅＩＦ４Ｅと関連タンパク質を溶出した。
【００９０】
タンパク質は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ ４−１２％勾配ゲル上での電気泳動により分離された。ゲルは、ＰＶＤＦ膜へのタンパク質のセミドライ電気泳動トランスファー前に、１０％メタノールを含有する２Ｘトランスファー緩衝液（InVitrogen NP0006-1）に２０分間浸された。タンパク質は、ｅＩＦ４Ｇに対する抗体（Cell Signaling Technology #2858）、ｅＩＦ４Ｅに対する抗体（Cell Signaling Technology #9742）、及び４Ｅ−ＢＰ１に対する抗体（Cell Signaling Technology #9644）をそれぞれ、１：１，０００、１：１０，０００及び１：５０００の希釈で使用して、検出された。化学発光シグナルは、エンハンスド ケミルミネッセンス プラス（enhanced chemiluminescence plus）（ＥＣＬ）（GE Healthcare RPN2132）を用いて生成させ、フジフィルム ＬＡＳ−３０００画像装置で検出した。
【００９１】
実施例８
以下の乳酸ジヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）遊離アッセイが、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥTM Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ（カタログ番号Ｇ７８９０；プロメガ社、Madison WI）を用いて実施され、ペプチド細胞傷害性が評価された。
【００９２】
試薬調製：基質混合物及びアッセイ緩衝液が２２℃に平衡化された。ＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（登録商標）試薬が、１１ｍｌのアッセイ緩衝液を基質混合物の各バイアルに添加し、穏やかに混合して基質を溶解することにより調製された。
実験では、以下の３つの対照が使用された：１）細胞不含対照：存在し得るバックグラウンド蛍光を決定するための陰性対照として働く、細胞を含まないウェル；２）無処置細胞対照：対照として働く、ビヒクル（ＤＭＳＯ）処理細胞を含むウェル；３）最大ＬＤＨ遊離対照：最大ＬＤＨ遊離を決定するためのウェルは、４０μｌの溶解溶液を陽性対照ウェルに添加することにより調製された。
【００９３】
細胞傷害性アッセイプロトコル：
１．ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞は、ＡＴＣＣ（Manassas, Virginia）から入手し、５％ ＣＯ２中３７℃で、１０％牛胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持された。細胞は、ウェル当たり０．７５ｘ１０６の濃度で、アッセイの２４時間前に６−ウェルプレートに播かれた。
２．２４時間後、ＤＭＳＯ（対照）又はペプチドが指摘の濃度で添加され、３７℃で３時間インキュベートされた。最大ＬＤＨ遊離対照は、処置期間の開始時に溶解溶液を添加することにより調製された。この対照に対して得られる値は、１００％ ＬＤＨ遊離を提示した。
３．アッセイプレートは３７℃インキュベーターから取り出され、２２℃に平衡化された（およそ２０-３０分）。
４．１００μｌの培地が、対照及び処置細胞から取り出され、９６−ウェルプレートに３つ組で移された。
５．１００μｌのＣｙｔｏＴｏｘ−ＯＮＥ（登録商標）試薬が各ウェルに添加され、３０秒間混合された。
６．アッセイプレートは、２２℃で１０分間インキュベートされた。
７．５０μｌの停止溶液が各ウェルに添加された。
８．プレートは１０秒間混合され、５６０ｎｍの励起波長と５９０ｎｍの発光波長を用いて蛍光が記録された。
【００９４】
結果の計算
培養培地のバックグラウンドの平均蛍光値が、実験ウェルの全ての蛍光値から差し引かれた。
パーセント細胞傷害性が、実験値、最大ＬＤＨ遊離、及び培養培地のバックグラウンドからの平均蛍光値を使用して計算された。
パーセント細胞傷害性＝１００ｘ（実験値−培養培地のバックグラウンド）／（最大ＬＤＨ遊離−培養培地のバックグラウンド）。
対照と比較したＬＤＨ遊離（＜１０％）では、配列番号：７及び９−１１を有するペプチドは、２０μＭの濃度まで、細胞傷害性ではなかった。
【００９５】
実施例９
以下の研究は、実施例２−４の化合物（配列番号：９、１０及び１１）の安定性を評価するために、４及び２４時間後にハノーヴァー・ウィスター ラット（Hannover Wistar rat）とヒト血漿において実施された。
およそ、２．０ｍｇの実施例２−４の化合物（配列番号：９、１０及び１１）が秤量され、４ｍＬのアンバーバイアルに置かれた。１．０ｍＬ ＤＭＳＯが、これに添加された。バイアルが注意深くボルテックスされ、およそ６００μＭの溶液が生成された。
ハノーヴァー・ウィスター ラット血漿及びヒト血漿（抗凝固剤ＥＤＴＡナトリウム）が、水槽中で３０分間、３７℃に前−加温された。両血漿のｐＨがｐＨ７．４に調製された。１．５ｍＬの微量遠心機バイアルが使用された。
実施例２−４の化合物のストック溶液が、ラット又はヒト血漿中に、最終濃度１０μＭに希釈された。２つのバイアルが、適切な混合を確実にするように穏やかにボルテックスされた。
６つの新たなバイアルが以下のように標識された：ラットＴ０、ラットＴ４、ラットＴ２４、ヒトＴ０、ヒトＴ４、ヒトＴ２４。これらの各バイアルに、５０μＬの処置血漿が添付された。Ｔ４及びＴ２４バイアルにふたをし、３７℃インキュベーターに、それぞれ、４時間及び２４時間置いた。
各Ｔ０バイアルに、５０μＬのソレンセン（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ）緩衝液及びアセトニトリル中の２００μＬ １．０％酢酸を添付した。Ｔ０バイアルに次いでふたをし、ボルテックスし、１００００ｘ ｇで１０分間遠心分離した。遠心分離完了時、各バイアルの１００μＬ上清を９６−ウェル注入ブロックの別々のウェルに添付した。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ(R)水（Millipore）中の２００μＬ０．１％酢酸を、次いで各ウェルに添付した。
Ｔ０バイアルに関して記載した上記手順が、４時間の時間点でＴ４に、２４時間の時間点でＴ２４バイアルに対して繰り返された。試料の分解がないことを確実にするために、各時間点で新鮮なＴ０試料が調製された。
【００９６】
全ての試料がＬＣ／ＭＳ／ＭＳにより分析された。結果として生じるクロマトグラフが処理され、各試料に対してピーク領域を得た。比較Ｔ０試料に存在する量と比較された、各時間点での残存する化合物のパーセントが計算された。
2015523373.tif 000002
データは、化合物は４時間時点のラット血漿中で安定であったが、２４時間の時点では、許容範囲をわずかに下回ったことを示す。ペプチドはヒト血漿中では、４時間と２４時間の両時間点で安定であった。
【００９７】
実施例１０−８３：配列番号：１２−８５の合成
以下の配列（配列番号：１２−８５）は、示されるように実施例２及び５（ＣＳＢＩＯ）の一般的方法に従って調製された。マススペクトロメトリー及び収量の結果が、可能であれば、各配列番号に対して示される。
【００９８】
１０．
Ac-Met-Val-Lys-Tyr-Lys-Ile-Gly-Ser-Leu-Leu-Leu-Phe-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Gly-Leu-Cys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：１２）の合成。実施例５の手順に従い、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジン（０．６１ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）が固相合成及び精製に供され、５３ｍｇ（６％）を得た。Ｃ１６７Ｈ２７０Ｎ４０Ｏ３６Ｓ３に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３５１０．４１。
【００９９】
１１．
Ac-Met-Val-Lys-Ser-Lys-Tyr-Gly-Ser-Trp-Ile-Leu-Leu-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Gly-Leu-Cys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：１３）の合成。実施例５の手順に従い、Ｆｍｏｃ ＲｉｎｋＡｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジン（０．６１ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）が固相合成及び精製に供され、１２８ｍｇ（１４．５％）を得た。Ｃ１６６Ｈ２６５Ｎ４１Ｏ３７Ｓ３に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３５２３．３７。
【０１００】
１２．
Ac-Met-Tyr-Lys-Ser-Lys-Ile-Leu-Leu-Trp-Phe-Leu-Val-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Gly-Leu-Cys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：１４）の合成。実施例５の手順に従い、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジン（０．６１ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）が固相合成及び精製に供され、８５ｍｇ（９．３％）を得た。Ｃ１７６Ｈ２７７Ｎ４１Ｏ３６Ｓ３に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３６３９．５７。
【０１０１】
１３．
Ac-Met-Val-Lys-Ser-Lys-Ile-Tyr-Ser-Trp-Ile-Leu-Leu-Leu-Phe-Phe-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Gly-Leu-Cys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：１５）の合成。実施例５の手順に従い、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジン（０．６１ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）が固相合成及び精製に供され、８７ｍｇ（９．６％）を得た。Ｃ１７４Ｈ２７３Ｎ４１Ｏ３７Ｓ３に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３６２７．５２。
【０１０２】
１４．
Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Gly-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Leu-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：１６）の合成。実施例５の手順に従い、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジン（０．６１ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）が固相合成及び精製に供され、１００ｍｇ（１１．５％）を得た。Ｃ１７１Ｈ２５８Ｎ３８Ｏ３５Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３４７０．２８。
【０１０３】
１５．
Ac-Met-Val-Lys-Tyr-Lys-Ile-Ala-Ser-Leu-Leu-Leu-Phe-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：１７）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ１６９Ｈ２７４Ｎ４０Ｏ３６Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３５０６．４。
【０１０４】
１６．
Ac-Met-Val-Lys-Tyr-Lys-Ile-Ala-Ser-Leu-Leu-Leu-Phe-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Lys-Leu-Lys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：１８）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ１７５Ｈ２８８Ｎ４２Ｏ３６Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３６２０．５９。
【０１０５】
１７．
Ac-Met-Tyr-Lys-Ser-Lys-Ile-Leu-Leu-Trp-Phe-Leu-Val-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：１９）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ１７７Ｈ２７９Ｎ４１Ｏ３６Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３６２１．５３。
【０１０６】
１８．
Ac-Met-Val-Lys-Ser-Lys-Ile-Tyr-Ser-Trp-Ile-Leu-Leu-Leu-Phe-Phe-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：２０）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ１７５Ｈ２７５Ｎ４１Ｏ３７Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３６０９．４８。
【０１０７】
１９．
Ac-Met-Val-Lys-Ser-Lys-Ile-Tyr-Ser-Trp-Ile-Leu-Leu-Leu-Phe-Phe-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Lys-Leu-Lys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：２１）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ１８１Ｈ２８９Ｎ４３Ｏ３７Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３７２３．６７。
【０１０８】
２０．
Ac-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-Glu-Arg-Val-Arg-Ala-NH2（配列番号：２２）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、４４ｍｇ（３％）を得た。Ｃ１８１Ｈ３０６Ｎ７０Ｏ４０に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値４１０２．８６。
【０１０９】
２１．
Ac-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-Val-Tyr-Asp-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-Glu-Arg-Val-Arg-Ala-NH2（配列番号：２３）の合成。実施例５の手順に従い、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジン（０．５５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）が固相合成及び精製に供され、３８．６ｍｇ（３．３％）を得た。Ｃ２１１Ｈ３５２Ｎ７６Ｏ４８に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値４７２１．５９。
【０１１０】
２２．
Ac-Ala-Arg-Val-Tyr-Asp-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-Glu-Arg-Val-Arg-Ala-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2（配列番号：２４）の合成。実施例５の手順に従い、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジン（０．６８ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）が固相合成及び精製に供され、６ｍｇ（０．５％）を得た。Ｃ２２０Ｈ３６９Ｎ８１Ｏ５０に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値４９４８．８５。
【０１１１】
２３．
Ac-Gly-Ala-Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Tyr-Val-Tyr-Asp-Leu-Leu-Leu-Arg-Phe-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg-Leu-Arg-Arg-Glu-Arg-Val-Arg-Ala-NH2（配列番号：２５）の合成。実施例５の手順に従い、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジン（０．５５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）が固相合成及び精製に供され、３３ｍｇ（３．６％）を得た。Ｃ１６０Ｈ２７１Ｎ５９Ｏ３９に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３６４５．２７。
【０１１２】
２４．
Ac-Gly-Ala-Ala-Glu-Ala-Ala-Ala-Arg-Val-Tyr-Asp-Leu-Gly-Leu-Arg-Arg-Leu-Arg-Gln-Arg-Arg-Tyr-Leu-Arg-Arg-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-NH2（配列番号：２６）の合成。実施例５の手順に従い、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジン（０．７３ｇ、０．３ｍｍｏｌ）が固相合成及び精製に供され、２１ｍｇ（２．３％）を得た。Ｃ１６０Ｈ２７１Ｎ５９Ｏ３９に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３６４５．２７。
【０１１３】
２５．
Ac-Met-Ala-Ala-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Leu-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：２７）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ１７１Ｈ２５９Ｎ３７Ｏ３４Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３４４１．２８。
【０１１４】
２６．
Ac-Met-Ala-Ala-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Nle-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：２８）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ１７１Ｈ２５９Ｎ３７Ｏ３４Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３４４１．２８。
【０１１５】
２７．
Ac-Met-Ala-Lys-Leu-Lys-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Nle-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：２９）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ１７７Ｈ２７３Ｎ３９Ｏ３４Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３５５５．４７。
【０１１６】
２８．
Ac-Met-Ala-Lys-Leu-Lys-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Leu-Leu-tBuAla-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：３０）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ１７５Ｈ２７７Ｎ３９Ｏ３４Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３５３５．４８。
【０１１７】
２９．
Ac-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：３１）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、１２０ｍｇ（１％）を得た。Ｃ１６０Ｈ２４１Ｎ３７Ｏ３１Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３２１０．９６。
【０１１８】
３０．
Ac-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-t-Butyl-Ala-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：３２）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、５５ｍｇ（６％）を得た。Ｃ１５８Ｈ２４５Ｎ３７Ｏ３１Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３１９０．９７。
【０１１９】
３１．
Ac-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Ala-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：３３）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、４６ｍｇ（５％）を得た。Ｃ１５４Ｈ２３７Ｎ３７Ｏ３１Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３１３４．８６。
【０１２０】
３２．
Ac-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：３４）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、７１ｍｇ（７％）を得た。Ｃ１６７Ｈ２５２Ｎ４０Ｏ３４Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３３９６．１４。
【０１２１】
３３．
Ac-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：３５）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、９３ｍｇ（１０％）を得た。Ｃ１６４Ｈ２４７Ｎ３９Ｏ３３Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３３２５．０６。
【０１２２】
３４．
Ac-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：３６）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、７４ｍｇ（８％）を得た。Ｃ１５４Ｈ２３０Ｎ３６Ｏ３０Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３０９７．８。
【０１２３】
３５．
Ac-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：３７）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、６０ｍｇ（７％）を得た。Ｃ１５１Ｈ２２５Ｎ３５Ｏ２９Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３０２６．７２。
【０１２４】
３６．
Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Leu-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：３８）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、７．６ｍｇ（１％）を得た。Ｃ１７３Ｈ２６３Ｎ４１Ｏ３５Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３５０９．３。
【０１２５】
３７．
Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Nle-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：３９）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、９．７ｍｇ（１％）を得た。Ｃ１７３Ｈ２６３Ｎ４１Ｏ３５Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３５０９．３。
【０１２６】
３８．
Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Lys-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：４０）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、８１．６ｍｇ（８％）を得た。Ｃ１７４Ｈ２６５Ｎ４１Ｏ３５Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３５２３．３３。
【０１２７】
３９．
Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Arg-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：４１）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、８１．６ｍｇ（８％）を得た。Ｃ１７３Ｈ２６４Ｎ４４Ｏ３５Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３５５２．３３。
【０１２８】
４０．
Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Phe-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：４２）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、４８．７ｍｇ（５５％）を得た。Ｃ１７０Ｈ２６０Ｎ４０Ｏ３５Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３４８８．３。
【０１２９】
４１．
Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-1Nal-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：４３）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、３５．５ｍｇ（３％）を得た。Ｃ１７４Ｈ２６２Ｎ４０Ｏ３５Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３５３８．３６。
【０１３０】
４２．
Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-2Nal-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：４４）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、２４ｍｇ（２％）を得た。Ｃ１７７Ｈ２６２Ｎ４０Ｏ３５Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３５３８．３６。
【０１３１】
４３．
Ac-Met-Val-Lys-Tyr-Lys-Ile-Ala-Ser-Leu-Nle-Leu-Phe-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Ala-Leu-Ala-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：４５）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ１６９Ｈ２７４Ｎ４０Ｏ３６Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３５０６．４。
【０１３２】
４４．
Ac-Met-Tyr-Lys-Ser-Lys-Ile-Nle-Leu-Trp-Phe-Leu-Val-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Ser-Asp-Val-Lys-Leu-Lys-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：４６）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ１８３Ｈ２９３Ｎ４３Ｏ３６Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３７３５．７２。
【０１３３】
４５．
Ac-Met-Ala-Lys-Leu-Lys-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Thr-Obzl-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Leu-Leu-tBuAla-Lys-Lys-Arg-Pro-NH2（配列番号：４７）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ１７７Ｈ２８１Ｎ３９Ｏ３４Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３５６３．５４。
【０１３４】
４６．
Ac-Met-Ala-Asn-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Thr-Obzl-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-tBuAla-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：４８）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ１７２Ｈ２６９Ｎ４１Ｏ３５Ｓ２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３５３５．４。
【０１３５】
４７．
Ac-Leu-Ala-Tyr-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Ala-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：４９）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、１２０ｍｇ（１３％）を得た。Ｃ１５４Ｈ２３７Ｎ３７Ｏ３０Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値３１１８．８６。
【０１３６】
４８．
Ac-Trp-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：５０）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、９６ｍｇ（１１％）を得た。Ｃ１４２Ｈ２１６Ｎ３４Ｏ２７Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２８６３．５５。
【０１３７】
４９．
Ac-Leu-Leu-Ala-Leu-Phe-Val-Tyr-Met-Trp-Thr-Asp-Leu-Arg-Leu-Phe-Lys-Lys-Arg-Pro-Lys-Pro-NH2（配列番号：５１）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、１３７ｍｇ（１７％）を得た。Ｃ１３１Ｈ２０６Ｎ３２Ｏ２６Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２６７７．３３。
【０１３８】
５０．
Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2 1:2 TFA（配列番号：５２）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９８Ｈ１４１Ｎ２３Ｏ２６Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２０８９．３９。
【０１３９】
５１．
Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-NH2（配列番号：５３）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９５Ｈ１３６Ｎ２２Ｏ２５Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２０１８．３１。
【０１４０】
５２．
Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-NH2（配列番号：５４）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９０Ｈ１２９Ｎ２１Ｏ２４Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１９２１．２。
【０１４１】
５３．
Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-NH2（配列番号：５５）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ８５Ｈ１２０Ｎ２０Ｏ２３に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１７９０。
【０１４２】
５４．
Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-NH2（配列番号：５６）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ７１Ｈ１０３Ｎ１７Ｏ２０に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１５１４．６９。
【０１４３】
５５．
Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Ala-Ala-NH2（配列番号：５７）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９６Ｈ１３９Ｎ２３Ｏ２６Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２０６３．３６。
【０１４４】
５６．
Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Ala-Pro-Ala-NH2（配列番号：５８）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９６Ｈ１３７Ｎ２３Ｏ２６に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２０２９．２７。
【０１４５】
５７．
Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2（配列番号：５９）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９７Ｈ１４１Ｎ２３Ｏ２４Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２０４５．３８。
【０１４６】
５８．
Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Ala-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2（配列番号：６０）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９６Ｈ１３９Ｎ２３Ｏ２４Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２０３１．３６。
【０１４７】
５９．
Ac-Lys-Gln-Tyr-Ala-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2（配列番号：６１）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９７Ｈ１４１Ｎ２３Ｏ２４Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２０４５．３８。
【０１４８】
６０．
Ac-Lys-Ala-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2（配列番号：６２）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９６Ｈ１３８Ｎ２２Ｏ２５Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２０３２．３４。
【０１４９】
６１．
Ac-Ala-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2（配列番号：６３）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９５Ｈ１３４Ｎ２２Ｏ２６Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２０３２．３。
【０１５０】
６２．
Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-(D)Ala-NH2（配列番号：６４）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９８Ｈ１４１Ｎ２３Ｏ２６Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２０８９．３９。
【０１５１】
６３．
Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-(D)Pro-Ala-NH2（配列番号：６５）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９８Ｈ１４１Ｎ２３Ｏ２６Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２０８９．３９。
【０１５２】
６４．
Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-(D)Met-Pro-Ala-NH2（配列番号：６６）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９８Ｈ１４１Ｎ２３Ｏ２６Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２０８９．３９。
【０１５３】
６５．
Ac-Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-(D)Phe-Met-Pro-Ala-NH2（配列番号：６７）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９８Ｈ１４１Ｎ２３Ｏ２６Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２０８９．３９。
【０１５４】
６６．
Ac-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-NH2（配列番号：６８）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、５ｍｇ（１％）を得た。Ｃ７９Ｈ１０９Ｎ１７Ｏ２１Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１６６４．８９。
【０１５５】
６７．
Ac-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-NH2（配列番号：６９）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、６９ｍｇ（１７％）を得た。Ｃ７４Ｈ１００Ｎ１６Ｏ２０に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１５３３．７。
【０１５６】
６８．
Ac-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2（配列番号：７０）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、１２８ｍｇ（２９％）を得た。Ｃ８０Ｈ１１１Ｎ１７Ｏ２１に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１６４６．８５。
【０１５７】
６９．
Ac-Tyr-Asp-Arg-Gln-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2（配列番号：７１）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、１５７ｍｇ（３５％）を得た。Ｃ８０Ｈ１１２Ｎ１８Ｏ２０に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１６４５．８７。
【０１５８】
７０．
Ac-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2（配列番号：７２）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、１４５．５ｍｇ（３４％）を得た。Ｃ７９Ｈ１１１Ｎ１７Ｏ１９に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１６０２．８５。
【０１５９】
７１．
Ac-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Aib-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2（配列番号：７３）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、６４ｍｇ（１５％）を得た。Ｃ８０Ｈ１１３Ｎ１７Ｏ１９に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１６１６．８７。
【０１６０】
７２．
Ac-Tyr-Asn-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2（配列番号：７４）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、１８ｍｇ（３％）を得た。Ｃ８０Ｈ１１２Ｎ１８Ｏ２０に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１６４５．８７。
【０１６１】
７３．
Ac-Tyr-Asn-Arg-Gln-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2（配列番号：７５）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、９ｍｇ（２％）を得た。Ｃ８０Ｈ１１３Ｎ１９Ｏ１９に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１６４４．８９。
【０１６２】
７４．
Ac-Tyr-Mamb-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2（配列番号：７６）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ６３Ｈ８５Ｎ１１Ｏ１２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１１８８．４３。
【０１６３】
７５．
Ac-Tyr-Mamp-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2（配列番号：７７）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ６４Ｈ８７Ｎ１１Ｏ１２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１２０２．４６。
【０１６４】
７６．
Ac-Tyr-NVa-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2（配列番号：７８）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ６０Ｈ８７Ｎ１１Ｏ１２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１１５４．４１。
【０１６５】
７７．
Ac-Phe-5Ava-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2（配列番号：７９）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ６０Ｈ８７Ｎ１１Ｏ１１に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１１３８．４１。
【０１６６】
７８．
Ac-Lys-Arg-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2（配列番号：８０）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、６０ｍｇ（１２％）を得た。Ｃ９１Ｈ１３５Ｎ２３Ｏ２１に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１８８７．２１。
【０１６７】
７９．
Ac-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2（配列番号：８１）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９２Ｈ１２９Ｎ２１Ｏ２５Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１９６１．２２。
【０１６８】
８０．
Ac-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2（配列番号：８２）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ８７Ｈ１２１Ｎ１９Ｏ２３Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１８３３．０９。
【０１６９】
８１．
Ac-(D)Lys-Gln-Tyr-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Asp-Phe-Gln-Phe-Met-Pro-Ala-NH2（配列番号：８３）の合成。実施例５の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ９８Ｈ１４１Ｎ２３Ｏ２６Ｓに対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２０８９．３９。
【０１７０】
８２．
Ac-Lys-Arg-Phe-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2（配列番号：８４）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供され、６４ｍｇ（１１％）を得た。Ｃ９１Ｈ１３５Ｎ２３Ｏ２０に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値１８７１．２１。
【０１７１】
８３．
Ac-Lys-Arg-Lys-Arg-Phe-Asp-Arg-Glu-Phe-Leu-Leu-Ala-Phe-Gln-Phe-Nle-NH2（配列番号：８５）の合成。実施例２の手順に従って、Ｆｍｏｃ Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ ＭＢＨＡレジンが固相合成と精製に供された。Ｃ１０３Ｈ１５９Ｎ２９Ｏ２２に対して計算された（ＥＳ）＋−ＬＣＭＳ ｍ／ｅ測定値２１５５．５７。
【０１７２】
実施例８４
ｅＩＦ４Ｅへの結合に関する測定されたＩＣ５０を有する本発明の他の例示的ペプチド、並びにｅＩＦ４Ｅへの結合に関する測定されたＩＣ５０を有する本発明の他の例示的細胞浸透性ペプチドの表およびリスト。
【０１７３】
2015523373.tif 000003
2015523373.tif 000004
【０１７４】
2015523373.tif 000005
2015523373.tif 000006
【０１７５】
2015523373.tif 000007
2015523373.tif 000008
【０１７６】
2015523373.tif 000009
【０１７７】
完全長ｅｉｆ４Ｅ配列（配列番号：８６）
MATVEPETTPTPNPPTTEEEKTESNQEVANPEHYIKHPLQNRWALWFFKNDKSKTWQANLRLISKFDTVEDFWALYNHIQLSSNLMPGCDYSLFKDGIEPMWEDEKNKRGGRWLITLNKQQRRSDLDRFWLETLLCLIGESFDDYSDDVCGAVVNVRAKGDKIAIWTTECENREAVTHIGRVYKERLGLPPKIVIGYQSHADTATKSGSTTKNRFVV
【０１７８】
Ｅｉｆ４ｅ配列  ２８−２１７（配列番号：８７）
2015523373.tif 000010
【図１】
2015523373.tif 000011
【図２】
2015523373.tif 000012
【配列表】
2015523373000001.app
【国際調査報告】
2015523373.tif 000013
2015523373.tif 000014
2015523373.tif 000015
2015523373.tif 000016
2015523373.tif 000017
2015523373.tif 000018