(57)【要約】  本開示は、全般に、心臓幹細胞の作製のための組織の処理増加のための方法に関し、幹細胞が心臓幹細胞療法における使用に適切である。特に、いくつかの実施形態は、心臓幹細胞の複数患者用量の作製のための、同種異系ドナー心臓組織の処理に関する。
2015521054.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同種異系心臓幹細胞療法に適切な、ろ過された心筋球由来細胞（ＣＤＣ）の調製方法であって、
ドナー心臓組織を対象から受け取るステップ、
前記ドナー心臓組織の小片を、約２００μｍ3から約６００μｍ3の範囲の複数の組織外植片に処理し、前記外植片が約０．３から約０．６グラムの範囲であるステップ；
前記外植片を、約３０秒から約５分の範囲の時間、酵素的に消化するステップ；
前記外植片を、約１外植片／４００から７００ｃｍ2培養表面積の密度で、細胞が前記外植片から遊走するまで培養するステップ；
外植片から遊走する細胞を収集するステップ；
収集した細胞を、ＣＤＣを作製するために培養するステップ；
ＣＤＣを採取するステップ；および
前記採取されたＣＤＣを、直径５０μｍより大きい粒子を除去して、直径５０μｍ未満のＣＤＣを単離して、同種異系心臓幹細胞療法を容易にするためにろ過するステップ；
を含む方法。
【請求項２】
直径５０μｍ未満にサイズ分けされた単離ＣＤＣが、冠動脈内送達および内径約５０μｍを有する心臓細動脈への通過に適切である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ろ過ステップが、前記採取されたＣＤＣを、第１のフィルターを介してろ過し、約１４０μｍより大きい粒子を除去するステップおよび第２のフィルターを介してろ過し、約５０μｍより大きい粒子を除去するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１および前記第２のフィルターが、単一の２段階フィルター装置を構成する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ドナー心臓組織が、前記処理の前に、約１から約９０日の範囲の期間、場合により凍結保存される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記処理ステップが、培養容器中の外植片を手動で配置するのではなく、外植片を培養培地であふれさせることによって、前記外植片を解剖容器から培養容器に移動させるステップをさらに含み、前記あふれさせることによる移動が、汚染の危険性を低下させ、前記外植片の攪乱を低下させる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の外植片が、ドナー心臓組織の１つの領域から得られた複数の外植片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の外植片が、ドナー心臓組織の複数の領域から得られた複数の外植片を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記培養ステップが、前記外植片から遊走する細胞の凝集を減少させるために、ヘパリンおよびＬ−グルタミンの１つ以上を培養培地に加えるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
同種異系心臓幹細胞療法に適切なＣＤＣを凍結するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ドナー心臓組織が、約１グラムから約３００グラムのサイズに及ぶ、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記処理ステップが、立方体形状である複数の組織外植片をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ドナー心臓組織が、前記対象から摘出されてから３日以内に処理される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
同種異系心臓幹細胞療法に適切な前記ＣＤＣが、１４０μｍより大きい粒子を１％未満含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
同種異系心臓幹細胞療法に適切な前記ＣＤＣが、１５０μｍより大きい粒子を実質的に０％含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
同種異系心臓幹細胞療法に適切な前記ＣＤＣが、５０μｍより大きい粒子を１％未満含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記単離ＣＤＣを、冠動脈内送達により対象に送達するステップをさらに含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法に従って作製された単離ＣＤＣ。
【請求項１９】
同種異系心臓幹細胞療法に適切な心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を調製する方法であって、
ドナー心臓組織を第１の対象から受け取るステップ；
前記ドナー心臓組織の小片を、約０．３から約０．６グラムの範囲の複数の立方体状組織外植片に処理するステップ；
前記外植片を、約１外植片／４００から７００ｃｍ2培養表面積の密度で、細胞が前記外植片から遊走するまで培養するステップ；
外植片から遊走する細胞を収集するステップ；
収集した細胞を、ＣＤＣを作製するために培養するステップ；
ＣＤＣを採取するステップ；
前記採取されたＣＤＣをろ過し、約５０μｍより大きい粒子を除去して、それによって、同種異系心臓幹細胞療法に適切なＣＤＣを作製するステップ；
を含む方法。
【請求項２０】
同種異系心臓幹細胞療法に適切な心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を含む組成物であって：
第１の対象由来のドナー心臓組織から作製された複数のＣＤＣ；
１％未満の１４０μｍより大きいサイズの粒子；
１％未満の５０μｍより大きいサイズの粒子、
を含み、
前記組成物が、冠動脈内送達経路による対象への投与に適切である組成物。
【請求項２１】
前記組成物が、ＣＤＣの実質的に純粋な集団を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記組成物が、実質的に均一なサイズのＣＤＣ集団を含み、全ＣＤＣの９８％より多くが４０μｍ未満である、請求項２０または２１のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１２年６月５日出願の米国特許仮出願第６１／６５５，９２８号の利益を請求するものであり、この全開示は参照により本明細書に組み込まれる。
（連邦政府資金による研究開発の記載）
【０００２】
本研究は、少なくとも一部は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）ＮＨＬＢＩ  ＲＣ３認可番号ＨＬ１０３３５６およびＮＨＬＢＩ  ＳＢＩＲ  認可番号ＨＬ０９５２０３からの助成金によりＣａｐｒｉｃｏｒ，Ｉｎｃ．に資金援助された。政府は、本明細書において開示された本発明に特定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
本出願は、概して、損傷した細胞または組織の修復または再生のための幹細胞を作製する方法および組成物に関する。例えば、いくつかの実施形態において、本明細書に開示の方法および組成物は、心臓組織の修復および／または再生に使用可能である。特に、本明細書に開示の方法は、組織試料、例えば心臓組織の処理をスケールアップし、処理された組織を培養し、心臓組織修復を必要とする１以上の対象の治療における使用に十分な組織から大量の心臓幹細胞を作製する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
細胞の喪失または損傷に関与するヒト疾患の範囲は広く、限定するものではないが、神経変性疾患、内分泌疾患、癌および心血管疾患を含む。例えば、冠動脈心疾患は、現在米国において死亡の主因であり、年間６５０，０００を超える命を奪っている。米国心臓協会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）によれば、米国において毎年１２０万の人々が心臓発作（または心筋梗塞、ＭＩ）を患っている。初回のＭＩを生き残った人々のうち、数多く（男性生存者の２５％および女性生存者の３８％）が、ＭＩの１年以内にさらに死亡する。現在、１６００万の米国人がＭＩの生存者または狭心症（冠動脈心疾患のための胸部痛）を患っている。冠動脈心疾患は、数多くの患者が心不全に悪化し得る。５００万人の米国人が現在心不全を患っており、毎年５５０，０００人が新たに診断される。それらの病態の病因とは関係なく、冠動脈心疾患または心不全を患う人々の多くは、永続的な心臓組織の損傷を患っており、これは多くの場合生活の質の低下につながる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
罹患または損傷した心臓組織の修復または再生のために、心臓幹細胞の即時使用の必要性を考慮して、ドナー心臓組織を対象から受け取るステップ、ドナー心臓組織の小片を複数の組織外植片に処理するステップ、外植片を酵素的に消化するステップ、外植片範囲を、細胞が外植片から遊走するまで培養するステップ、外植片から遊走する細胞を収集するステップ、収集した細胞を、ＣＤＣ作製のために培養するステップ、ＣＤＣを採取するステップ、採取したＣＤＣをろ過して、約５０μｍより大きい粒子を除去するステップ、それによって、同種異系心臓幹細胞療法に適切なＣＤＣを作製するステップを含む、同種異系心臓幹細胞療法に適切な心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を調製する方法を、本明細書において提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
いくつかの実施形態において、対象由来のドナー心臓組織を複数の組織外植片に処理するステップ、前記外植片を部分的に酵素的に消化するステップ、前記外植片を、前記外植片から細胞が遊走するまで培養するステップ、外植片から遊走する細胞を収集するステップ、収集した細胞を、ＣＤＣ作製のために培養するステップ、ＣＤＣを採取するステップ、および前記採取されたＣＤＣをろ過し、直径約５０μｍより大きい粒子を除去し、直径約５０μｍ未満のＣＤＣを単離して、同種異系心臓幹細胞療法を容易にするステップ、を含む、同種異系細胞療法のためのろ過されたＣＤＣを調製する方法論をさらに提供にする。特に、いくつかの実施形態において、直径５０μｍより大きい粒子が除去された、ろ過されたＣＤＣは、内径約５０μｍを有する心臓細動脈への冠内の送達および通過に適しており、これは、ＣＤＣ投与に伴う有害な副作用、例えば、不整脈、血管閉塞、療法誘導性虚血などの危険性を有利に低下させる。
【０００７】
いくつかの実施形態において、ドナー心臓組織の処理は、培養容器中の外植片を手動で配置（自動配置を含む）するのではなく、外植片を培養培地であふれさせることによって、外植片を消化（および／または解剖）容器から培養容器に移動させるステップを伴う。有利には、いくつかの実施形態において、外植片を培地であふれさせることによる移動は、汚染の危険性を低下させるだけでなく、外植片の攪乱もまた低下させ、それによって、外植片からの細胞の収量、外植片由来のＣＤＣの効力および外植片からＣＤＣを作製する時間の短縮の１つ以上を改善する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、複数の外植片は、ドナー心臓組織の単一の領域から得られる複数の外植片を含む（例えば、複数の外植片のそれぞれは、例えば心房に由来する）。対称的に、いくつかの実施形態において、複数の外植片は、ドナー心臓組織の複数の領域から得られた外植片を含む。一部の実施形態において、さまざまな領域から得られた外植片の混合物は、外植片は、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境に非常に良く似ている培養液中のサイトカインおよび／またはシグナル伝達環境条件に曝露されるので、ＣＤＣの収量、効力および／または成長が改善される。例えば、中隔由来の外植片と同時培養された心房由来の外植片は、心臓のより分離された領域由来の外植片より非常に、化学的に相互作用（例えば、サイトカイン、ケモカインまたはパラクリン因子のクロストークまたはシグナリング）可能である。しかし、いくつかの実施形態において、心臓の別個の領域由来の外植片は、互いに容易に同時培養される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、外植片から発生した細胞は、外植片から離れて遊走するので凝集し得る。一部の実施形態において、凝集は、ＣＤＣの最終収量または質を低下させ、したがって、一部の実施形態において、抗凝集剤が利用される。例えば、一部の実施形態において、細胞の凝集を減少させるために、ヘパリンを使用して、外植片培養培地を補う。一部の実施形態において、外植片培養培地は、前記外植片から遊走する細胞の凝集を減少させるために、Ｌ−グルタミンが補足されている。ヘパリンおよびＬ−グルタミン（および／または他の薬剤）の組み合わせが、一部の実施形態において使用される。細胞凝集体の手動の解離もまた、いくつかの実施形態において用いられる。しかし、いくつかの実施形態において、細胞の凝集を減少させるために、追加のステップまたは薬剤は利用されない。
【００１０】
いくつかの実施形態において、組織外植片は、約１００μｍ3から約８００μｍ3の範囲のサイズに処理され、この範囲は、約１００μｍ3から約７００μｍ3、約２００μｍ3から約６００μｍ3、約１００μｍ3から約６００μｍ3、約２００μｍ3から約５００μｍ3、約２００μｍ3から約４００μｍ3、約３００μｍ3から約５００μｍ3、約３００μｍ3から約４００μｍ3およびこれらの重複範囲を含む。いくつかの実施形態において、処理は完全に自動である。一部の実施形態において、手動の処理または手動および自動の処理が組み合わせで使用される。一部の実施形態において、ドナー組織は、場合により処理前に凍結される。一部の実施形態において、他の処理（例えば、生理食塩水による灌流または酸素化Ｋｒｅｂｓ溶液）が処理の前、処理中または処理後に用いられる。いくつかの実施形態において、外植片のサイズは、ドナーの年齢、健康、疾患状態および／またはドナー組織の採取からの時間の１つ以上により決定される。いくつかの実施形態において、外植片は、約０．１から約０．９グラムの範囲であり、この範囲は、約０．１から約０．８グラム、約０．１から約０．７グラム、約０．１から約０．６グラム、約０．２から約０．６グラム、約０．３から約０．６グラム、約０．３から約０．５グラム、約０．３から約０．４グラムおよびこれらの重複範囲を含む。実施形態に依存して、より重いまたは軽い質量も使用されてよい。組織の質量もまた、一部の実施形態において、組織が収集された心臓の領域により、ある程度決定される。いくつかの実施形態において、外植片は、立方体の形状に処理されるが、一部の実施形態において、他の形状または近似の形状が使用される。したがって、いくつかの実施形態において、サイズおよび組織質量の組み合わせが使用され、特定のドナー組織（またはドナー組織の領域）に関する外植片の全体の大きさが決定される。いくつかの実施形態において、全体の大きさは、所与の作製作業で、および／または所与の培養容器内で培養される外植片の数（例えば、外植片密度）に基づく。いくつかの実施形態において、全体の大きさは、外植片が由来する心臓の領域（複数可）に基づく。
【００１１】
一部の実施形態において、組織外植片は、約３０秒から約５分の範囲の時間で消化され、この時間は、約３０秒から約４分、約３０秒から約３分、約３０秒から約２分、約３０秒から約１分、約３０秒から約９０秒、約３０秒から約１２０秒、約３０秒から約２００秒、約３０秒から約２５０秒およびこれらの重複範囲を含む。ドナー組織の全体のサイズおよび質量の決定と同様に、酵素的消化は、最適な組織消化および得られた細胞の生存能力を提供するパラメーターに基づき、（酵素の選択、酵素の濃度および／または消化時間により）適合させることができる。例えば、一部の実施形態において、より大きな外植片を使用する場合、より長い消化時間を使用して、酵素が外植片の中心部に確実に到達するようにできる。一部の実施形態において、酵素的消化は、場合により削除される。いくつかの実施形態において、消化は完全であり（例えば、断片が完全に細胞内に分散される）、一方、一部の実施形態において、消化は部分的である（例えば、外植片の一部が無傷のままである）。
【００１２】
いくつかの実施形態において、外植片は、約１外植片／４００から７００ｃｍ2培養表面の密度で培養され、この密度は、約１外植片／４００ｃｍ2、約１外植片／４５０ｃｍ2、約１外植片／５００ｃｍ2、約１外植片／５５０ｃｍ2、約１外植片／６００ｃｍ2、約１外植片／６５０ｃｍ2およびこれらの間の重複密度を含む。一部の実施形態において、複数の外植片が、単一の培養容器内で培養される。一部の実施形態において、複数の外植片が、１つの外植片由来の細胞が別の外植片由来の細胞と直接相互作用しないように、単一の容器内で個別に（例えば分割されて）培養される。一部の実施形態において、細胞は相互作用できないが、培養容器のさまざまな領域が、互いに流体連通しており、それによって、例えば、さまざまな外植片とそれらのそれぞれの細胞の間で、パラクリン相互作用が可能である。
【００１３】
いくつかの実施形態において、本方法は、同種異系心臓幹細胞療法に適切なＣＤＣを凍結するステップをさらに含む。一部の実施形態において、培養工程は、ＣＤＣの作製前（例えば、心筋球段階において）に終了するように適合される。したがって、心筋球は、一部の実施形態において、保存され、その後、ＣＤＣの作製に使用することもできる。
【００１４】
いくつかの実施形態において、ドナー心臓組織は、約１グラムから約３００グラムのサイズの範囲であり、この範囲は、約１から約２０グラム、約２０から約５０グラム、約５０から約７５グラム、約７５から約１５０グラム、約１５０から約２００グラム、約２００から約２５０グラム、約２５０から約３００グラムおよびこれらの重複範囲を含む。一部の実施形態において、全心臓が使用される。一部のこのような実施形態において、心臓の一部分を最初に処理して、残りを後の時点で処理してもよい。例えば、一部の実施形態において、組織の一部分を処理し、ＣＤＣの作製に使用して、一方、組織の残りは、場合により処理段階の間凍結される。しかし、一部の実施形態において、組織の残りは冷心筋保護液（またはその機能的等価物）において保存される。いくつかの実施形態において、ドナー心臓組織は、対象から摘出されてから約３日以内に処理されるが、一部の実施形態（例えば、凍結または低体温保存状態）において、より長い時間が、細胞の作製にさらに適切である。いくつかの実施形態において、組織試料は、処理前に約１から約９０日の間凍結されてよく、この日数は、約１から約４日、約４から約７日、約７から約１０日、約１０から約１４日、約１４から約２８日、約２８から約３６日、約３６から約４８日、約４８から約６０日、約６０から約７５日、約７５から約９０日およびこれらの間の凍結保存の重複時間を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ろ過は、約１４０μｍより大きなサイズの粒子を除去するための第１のフィルターによる採取されたＣＤＣのろ過、および約５０μｍより大きい粒子を除去するための第２のフィルターによるろ過を含む。一方、一部の実施形態において、フィルターは、別々の装置であってよく、一部の実施形態において、第１および第２のフィルターが単一の２段階のフィルター装置を構成する。いくつかの実施形態において、１００％未満のろ過効率を考慮して、１つ以上のフィルターによる複数回通過が実施される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、同種異系心臓幹細胞療法に適切なＣＤＣは、１５０μｍより大きい粒子を１％未満含む。いくつかの実施形態において、同種異系心臓幹細胞療法に適切なＣＤＣは、１５０μｍより大きい粒子を実質的に０％含む。いくつかの実施形態において、同種異系心臓幹細胞療法に適切なＣＤＣはまた、５０μｍを超える粒子を１％未満含む。特許請求する方法から得られる細胞性組成物中の粒子（および細胞）のサイズの結果として、同種異系心臓幹細胞療法に適切なＣＤＣは、冠動脈内送達に適切である。得られた細胞性組成物の成分は、１５０μｍより大きいものは事実上ないので、この組成物は、冠動脈（直径平均１５０〜１７０μｍ）内を自由に流れることができる。さらに、５０μｍより大きい得られた細胞性組成物の成分の割合が非常に少ないことで、心臓細動脈を流れる血液または酸素の減少による有害事象（例えば、不整脈）の危険性が低下する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本方法は、例えば細胞を対象に投与する時間まで、細胞を極低温で保存するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、対照的に、本方法は、前記単離ＣＤＣを対象に直接送達するステップをさらに含む。いくつかの実施形態において、この送達は冠動脈内送達によるが、本明細書にて述べるように、他の経路も場合により使用される（例えば、静脈内、直接注入など）。
【００１８】
本明細書において、第１の対象からドナー心臓組織を受け取るステップ、ドナー心臓組織の小片を、約０．３から約０．６グラムの範囲の複数の立方体状組織外植片に処理するステップ、外植片を、約１外植片／４００から７００ｃｍ2培養表面積の密度で、細胞が外植片から遊走するまで培養するステップ、外植片から遊走する細胞を収集するステップ、収集した細胞を、心臓幹細胞の作製のために培養するステップ、心臓幹細胞を採取するステップ、および採取した心臓幹細胞をろ過して、約５０μｍを超える粒子を除去するステップ、それによって、同種異系心臓幹細胞療法に適切な心臓幹細胞を作製するステップを含む、同種異系心臓幹細胞療法に適切な心臓幹細胞を調製する方法を提供する。
【００１９】
本明細書において、本明細書に開示の方法のいずれかにより作製されるＣＤＣを含む組成物もまた提供される。本明細書において、第１の対象由来のドナー心臓組織から作製された複数のＣＤＣ、１％未満の１４０μｍより大きいサイズの粒子、１％未満の５０μｍより大きいサイズの粒子を含み、冠動脈内送達経路により対象に投与するために適切である、同種異系心臓幹細胞療法に適切な単離ＣＤＣもまた提供される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、組成物は、ＣＤＣの実質的に純粋な集団を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、実質的に均一のサイズのＣＤＣの集団を含み、全ＣＤＣの約９０％より多くの、約９５％より多くの、約９８％より多くの、約９９％より多くの、または約１００％のＣＤＣが４０μｍ未満である。
【００２１】
本明細書において、同種異系心臓幹細胞療法に適切なＣＤＣの集団を含み、第１の対象由来のドナー心臓組織から作製された複数のＣＤＣを含み、前記ＣＤＣの少なくとも約７０％が、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１／６１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ２００、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ベータ２ミクログロブリン、上皮成長因子受容体およびヒト白血球抗原Ａ、Ｂ、Ｃの１つ以上を発現する組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも約８０％のＣＤＣがリスト化されたマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも約９０％のＣＤＣがリスト化されたマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも約９５％のＣＤＣがリスト化されたマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも約９７％のＣＤＣがリスト化されたマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも約９９％のＣＤＣがリスト化されたマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、全集団が、少なくとも１つのマーカーを発現する。いくつかの実施形態において、ＣＤＣの集団は、他の細胞（例えば、他の幹細胞および／または本明細書に開示の方法の間に作製される他の中間細胞）から、発現されるさまざまなマーカー（および／または発現のレベル）のおかげで識別可能である。したがって、いくつかの実施形態において、ＣＤＣのマーカープロファイルを使用して、ＣＤＣである（またはＣＤＣでない）細胞を特異的に同定、ＣＤＣ調製物の純度の決定、および／またはＣＤＣ作製作業の間の変動性の同定（およびその変動性の潜在的供給源、ドナーごとの変動、作製毎の変動など）ができる。
【００２２】
いくつかの実施形態において、第１の対象由来のドナー心臓組織から作製された複数のＣＤＣ、約１％未満の約１４０μｍより大きいサイズの粒子、約１％未満の約５０μｍより大きいサイズの粒子を含み、前記ＣＤＣの少なくとも約７０％が、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１／６１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ２００、ＣＤ２７３、ＣＤ２７４、ベータ２ミクログロブリン、上皮成長因子受容体およびヒト白血球抗原Ａ、Ｂ、Ｃの１つ以上を発現する、同種異系心臓幹細胞療法に適切なＣＤＣを含む組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態において、少なくとも約８０％のＣＤＣが、リスト化されたマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも約９０％のＣＤＣが、リスト化されたマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも約９５％のＣＤＣが、リスト化されたマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも約９７％のＣＤＣが、リスト化されたマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも約９９％のＣＤＣが、リスト化されたマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、全集団が、少なくとも１つのマーカーを発現する。
【００２３】
一部の実施形態において、約２０パーセントから約８０パーセントのＣＤＣが、ＣＤ１０、ＣＤ１５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４９ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ８７、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９７、ＣＤ９９Ｒ、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０８、ＣＤ１０９、ＣＤ１１９、ＣＤ１３０、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１６４、ＣＤ２２０、ＣＤ２２１、ＣＤ２２７、ＣＤ３２１、ＣＤ３４０、ヒト白血球抗原Ａ２、ヒト白血球抗原ＤＱ、ＭＩＣ  Ａ／Ｂ、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ２０１の１つ以上を発現する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ＣＤＣ組成物は、ドナー心臓組織を複数の組織外植片に処理するステップ、および外植片を、細胞が前記外植片から遊走するまで培養し、それによって外植片由来細胞（ＥＤＣ）を作製し、これをさらに処理してＣＤＣを作製し得るステップ、によって作製される。いくつかの実施形態において、前記ＥＤＣの少なくとも約７０％が、ＣＤ９、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ５１／６１、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６３、ＣＤ７３、ＣＤ８１、ＣＤ９０、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１０５、ＣＤ１０８、ＣＤ１３０、ＣＤ１４２、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６、ＣＤ２００、ＣＤ２７４、ＣＤ３４０、ベータ２ミクログロブリン、上皮成長因子受容体およびヒト白血球抗原Ａ、Ｂ、Ｃの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも約８０％のＥＤＣが、リスト化されたマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも約９０％のＥＤＣが、リスト化されたマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも約９５％のＥＤＣが、リスト化されたマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも約９７％のＥＤＣが、リスト化されたマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、少なくとも約９９％のＥＤＣが、リスト化されたマーカーの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態において、全ＥＤＣ集団が、少なくとも１つのマーカーを発現する。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ＥＤＣのマーカープロファイルは、得られたＣＤＣのマーカープロファイルと一致する。しかし、いくつかの実施形態において、ＥＤＣに存在する１つ以上のマーカーは、ＣＤＣにおいて発現の増加または減少を示し得るという点から、マーカープロファイルは変動することがある。いくつかの実施形態において、マーカー発現の差は、ＣＤＣ集団を、その前駆体であるＥＤＣ集団と識別可能にする。いくつかの実施形態において、ＣＤＣの純度が検証できることから、この識別能力は有利である。したがって、いくつかの実施形態において、ＣＤＣ集団は、約３０％未満、約２０％未満、約１５％未満、約５％未満、または約１％未満のＥＤＣを含むものとして同定され得る。さらに、いくつかの実施形態において、ＣＤＣは、前記ＥＤＣと比較した、前記ＣＤＣによるＳＳＥＡ−４、ＣＤ１４１およびＣＤ２２７の１つ以上の発現の減少を検出することによって、ＥＤＣと識別することができる。
【００２６】
いくつかの実施形態において、ＥＤＣのマーカープロファイルは、得られたＣＤＣ集団の生存能力のおよび／または治療効力の予測因子として使用可能である。いくつかの実施形態において、例えば、ＥＤＣにおける特定のマーカープロファイルの存在は、適切な臨床有効性を有するＣＤＣと相関し得る。したがって、いくつかの実施形態において、ＥＤＣのプロファイリングは、特定の組織供給源からＣＤＣの作製を継続すべきかどうか（例えば、ＣＤＣが治療的に有効であると予測される場合、作製を継続する価値があるとみなすことができる）を決定するスクリーニングステップとして使用可能である。実施形態および評価される変動性に依存して、スクリーニングを使用して、ＥＤＣおよびＣＤＣの間の発現の潜在的相違（例えば、増減が公知であるそれらのマーカー）またはＥＤＣおよびＣＤＣの間の類似性（例えば、ＥＤＣにおける特定のマーカーの存在は、ＣＤＣにおいて同様の量でそのマーカーの存在をもたらし、したがって、ＣＤＣが所望の特徴を有するか、または有さないかを示すものである）が特定される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ドナー心臓からマスターセルバンクを作製するための模式的なプロセスフローを表し、このマスターセルバンクから心筋球および／または心筋球由来細胞（ＣＤＣ）が作製される。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａ−２Ｂは、心臓のさまざまな領域から作製されたＣＤＣの成長に関するデータを表す。Ａ）心房、心尖、右心室、左心室または中隔から、時間と共に作製されたＣＤＣの量。Ｂ）５つの領域のそれぞれに対するＣＤＣ／グラム組織／日の成長速度。ＡＮＯＶＡ＝０．００３。テューキー検定を使用した、すべてのペアに関する比較：＊ｐ＜０．０５対ＬＶ、†ｐ＜０．０５対心尖。
【図３Ａ−３Ｃ】図３Ａ−３Ｃは、同種異系ＣＤＣ製造のために使用されるヒトドナー心臓の外観を表す図である。Ａ）ドナー心臓１番、解剖前。Ｂ）ドナー心臓２番、解剖前。Ｃ）細胞増殖７日目の外植片（左のパネル）、ポリ−Ｄ−リジン上に播種された３日後の心筋球（中央のパネル）、フィブロネクチン上に播種された９０％集密のＣＤＣの単層（右のパネル）を含む、ＣＤＣ培養工程。
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ−４Ｃは、組織および同種異系ＣＤＣの保存条件の効果を表す図である。Ａ）解剖の当日（新鮮）、冷蔵保存の３日後（３日後）、または凍結および解凍後（凍結）のいずれかに播種された外植片から継時的に作製したＣＤＣ細胞の量。Ｂ）新鮮、冷蔵保存、凍結処理された、発現されたＣＤＣ／グラム組織／日の成長速度。ＡＮＯＶＡ＝０．０６１２。Ｃ）さまざまな時点における、凍結および解凍されたＣＤＣの生存能力、回復性および増殖に対する効果。
【図５】図５は、同種異系ＣＤＣの例示的表現型を表す図である。ヒストグラムは、ＣＤ１０５およびＣＤ９０のＣＤＣ発現を示す。実線は、標識細胞を表す。点線はアイソタイプの対照である。ドットプロットは、ｃ−ＫｉｔおよびＭＤＲ−１、ＣＤ９０およびＤＤＲ２、ならびにＣＤ９０およびαＳＭＡの同時発現を示す。
【図６Ａ−６Ｃ】図６Ａ−６Ｃは、同種異系ＣＤＣの収量のドナーの差を表す図である。Ａ）継時的に各ドナーから成長したＣＤＣの量。Ｂ）各ドナーに関するＣＤＣ／グラム組織／日の成長速度。ｔ検定を使用した群の比較：＊ｐ＜０．０５対ＤＣＤ。Ｃ）マスターセルバンクの作製および各ドナーに関する全ＣＤＣ収量。全収量はＭＣＢの一部を拡大して収集されたデータから推定される。
【図７】図７は、ヒトおよびブタ両方の細胞を使用して、小規模および大規模な方法により作製された心筋球を表す図である。
【図８】図８は、マスターセルバンクの作製および同種異系ブタドナー組織に関する全ＣＤＣ収量を表す図である。
【図９】図９は、ブタＣＤＣの免疫表現型を表す図である。
【図１０Ａ−１０Ｂ】図１０Ａ−１０Ｂは、ブタ同種異系ＣＤＣに対するろ過の効果を表す図である。Ａ）解凍され、ろ過されなかった同種異系ブタＣＤＣ、大型の希薄なＣＤＣ凝集体が表される。Ｂ）解凍およびろ過された同種異系ブタＣＤＣ。小型の希薄なＣＤＣ凝集体がいまだ残っていることが表される。
【図１１】図１１は、さまざまなＣＤＣ調整物中に存在する細胞凝集体および微粒子の分析を表す図である。表６の試料１、３、４、６および１７を表す。
【図１２Ａ−１２Ｊ】図１２Ａ−１２Ｊは、４つの別個の作製作業による、ＥＤＣにおける２４２の細胞表面マーカーの平均発現レベルを表す図である。
【図１３Ａ−１３Ｊ】図１３Ａ−１３Ｊは、６つの別個の作製作業による、ＣＤＣにおける２４２の細胞表面マーカーの平均発現レベルを表す図である。
【図１４】図１４は、心筋梗塞のマーカーに対するリガンドである、ＣＤＣにおいて発現された特定マーカーの同定を表す図である。
【図１５Ａ−１５Ｃ】図１５Ａ−１５Ｃは、ＣＤ１４６（Ａ）、ＣＤ１０７ｂ（Ｂ）およびＣＤ１４０ｂの発現と駆出率の変化との負の相関を表す図である（ＣＤＣ治療効力の一態様の代表）。
【図１６Ａ−１６Ｂ】図１６Ａ−１６Ｂは、ＣＤＣにおけるさまざまな免疫学的マーカーの間の発現の相関を表す図である。
【図１７Ａ−１７Ｊ】図１７Ａ−１７Ｊは、４つの別個の作製作業による、ＥＤＣにおける２４２の細胞表面マーカーの発現レベルを、対応するＣＤＣにおけるマーカー発現と比較した差の平均を表す図である。
【発明の詳細な説明】
【００２８】
疾患を治療するために新しい細胞を組織に導入する細胞療法は、罹患組織を修復または健康な組織に置き換えるための有望な新しい方法となる。いくつかの実施形態において、組織から常在幹細胞を採取する、または拡大するための、さまざまな組織の調製方法を開示する。いくつかの実施形態において、本明細書に開示の方法は、比較的小質量の出発物質から非常に大量の細胞を作製させ、それによって「マスターセルバンク」の作製を可能にする。いくつかの実施形態において、このマスターセルバンクは、心臓幹細胞療法を必要とする複数の患者の治療に使用できる幹細胞の宝庫として機能する。
心臓幹細胞療法
【００２９】
本明細書において、損傷または罹患した心臓組織の解剖学的形態および／または機能を、修復、再生および／または改善するために、損傷または罹患した心臓組織を有する対象に投与するために使用される幹細胞を作製するための最適化方法を提供する。複数のタイプの幹細胞が、本明細書に開示の方法に従って処理できるが、いくつかの実施形態において、心臓幹細胞は心臓組織を処理するステップにより作製される。
【００３０】
複数のタイプの心臓幹細胞が、本明細書に開示の方法に従って得ることができ、これらのタイプは、限定するものではないが、心筋球および心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を含む。心筋球およびＣＤＣに関する追加の情報は、例えば、２０１２年９月１８日発行の米国特許第８，２６８，６１９号、および２００７年４月２１日出願の米国特許出願第１１／６６６，６８５号および２０１２年３月５日出願の米国特許出願第１３／４１２，０５１号に見出すことができ、これらそれぞれの全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
いくつかの実施形態において、本明細書におけるいくつかの心臓の実施形態は、急性心不全（例えば、発作またはＭＩ）または慢性心不全（例えば、鬱血性心不全）の１つ以上からもたらされる、損傷した、または罹患した心臓組織を治療または修復するために使用される。いくつかの実施形態において、約１×１０5から約１×１０7の心臓幹細胞が投与される。いくつかの実施形態において、用量は、細胞を与えられる対象のサイズおよび／または年齢に依存して変動される。一部の実施形態において、より少数またはより多数の細胞が、場合により投与される。さまざまな投与経路もまた、実施形態に依存して使用される。例えば、心臓幹細胞は、静脈内、動脈内、冠動脈内または心筋内（または他の経路）の投与経路により投与され得る。
【００３２】
心臓幹細胞療法（および本明細書に開示の方法）は、実施形態に依存して、自己、同種異系、同系間または異種間であってよい。いくつかの実施形態において、組織供給源（例えば、臓器ドナーなど）の即時利用の可能性が、保存可能で、後に「オフ・ザ・シェルフ」様式で使用可能な大量の細胞のスケールアップ作製を可能にするので、同種異系療法が用いられる。
【００３３】
興味深いことに、同種異系組織供給源を使用する場合、即時使用のスケールアップの可能性はさまざまな技術的課題を提示し、これらはより詳細に述べられ、本明細書に開示の方法により対処される。
心臓組織調製のスケールアップの間に対応する問題
【００３４】
研究室プロトコルまたは料理レシピのスケールアップと同様に、治療的使用のための心臓幹細胞作製のための組織処理および培養のスケールアップは、「倍加」またはバッチサイズの増加によって単純に達成されるものではない。１つの課題は、同種異系心臓幹細胞療法に関連して得られる、より大きい可能性もあるドナー組織試料サイズを、時宜に即して処理する能力である。自己細胞療法は、通常は、１つ以上の心内膜心筋生検試料（全組織質量約０．２７ｇ）が用いられるが、同種異系組織供給源は、約８から約４０グラムの間の範囲に容易になり得る（これより大きくない場合、例えば全ドナー心臓）。この量の組織の処理は、組織が使用に不適切になる前に可能な限り多くの組織を利用するために、規模および時間の効率の改善を必要とする。
【００３５】
大規模な心臓幹細胞の処理に対処するための別の問題は、細胞の凝集である。心臓幹細胞療法のいくつかの実施形態は、血管系の投与経路（例えば、冠動脈内、静脈内など）を用いるので、細胞の凝集により、投与における有害副作用の危険性が増加する。これらは、限定するものではないが、不整脈、塞栓症またはより細い心臓血管系の閉塞を含む。
【００３６】
一部の実施形態において、複数の異なる心臓組織サブタイプ（例えば、心房、中隔、心室）が、単一のドナー試料から受け取られ、処理され得るので、得られた心臓幹細胞のプールの整合性もまた問題である。組織のこれらのサブタイプはそれぞれ、培養液中で異なる特徴（例えば、成長速度）を有し、いくつかの実施形態において、違う領域から単離し得る細胞をプールしてマスターセルバンクを作ることになるので、バッチごとの特徴は変動し得る。下記に述べるように、本明細書に開示の方法は、上記の問題に、特に、心臓幹細胞作製の最適化されたスケールアップを提供するために対処する。
組織の採取および処理
【００３７】
上で述べたように、同種異系ドナー心臓組織を用いるいくつかの実施形態において、大量となる可能性もある得られた組織は、特定の処理方法を必要とし得る。手動処理は多くの場合、心内膜心筋生検に使用されるが（自動操作も使用可能であるが）、いくつかの実施形態において、受け取った大量の組織を処理するための時間的視点から、手動処理は不十分であると思われる。したがって、いくつかの実施形態において、自動方法および／または機械を使用して、受け取った組織は、より効率的で、時宜にかなった、コスト効率的手段で処理される。結果として、いくつかの実施形態において、これらの方法に基づきより優れた収量が得られる。
【００３８】
例えば、いくつかの実施形態において、ドナー心臓組織の受け取りおよび扱いやすい組織断片を作製するための大まかな解剖標本を作製後、一部の実施形態において、自動皮膚採取器を使用して、例えばｚ軸に初期切断を行う。いくつかの実施形態において、この初期切断によって、（単一の培養皿に使用される）約０．２から約１．５ｇの範囲の心臓組織の断片を切断する。一部の実施形態において、初期断片は、約０．２から約０．３ｇ、約０．３から約０．４ｇ、約０．４から約０．５、約０．５から約０．６ｇ、約０．６から約０．８ｇ、約０．８から約１．０ｇ、約１．０から約１．２ｇ、約１．２から約１．５ｇおよびこれらの重複範囲に及ぶ。初期断片を作製後、ｘ軸およびｙ軸の切断を行い、組織の立方体（例えば、外植片）を作製する。いくつかの実施形態において、外植片サイズは、組織のサブタイプに依存して変動するが、他の実施形態において、組織のサブタイプに関係なく、一定サイズの外植片が全ドナー組織に関して使用される。一部の実施形態において、外植片は、約１００から約２００μｍ3、約２００から約３００μｍ3、約３００から約４００μｍ3、約４００から約５００μｍ3、約５００から約６００μｍ3、約６００から約７００μｍ3、約７００から約８００μｍ3、約８００から約９００μｍ3、約９００から約１０００μｍ3およびこれらの重複範囲に及ぶ。一部の実施形態において、外植片サイズは、組織の質（例えば、新鮮なドナー組織対古いドナー組織）に依存して決定される。一部の実施形態において、外植片サイズは、下流のステップの効率を改善するように選択され、この下流のステップは、限定するものではないが、（例えば、酵素が外植片の中心部分にさらにより浸透するための）外植片の酵素的処理を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態において、得られた外植片は解剖皿から培養皿に、外植片を培養培地であふれさせることによって移動され、（外植片の手による配置とは反対に）外植片を培養容器に静止させる。その後、外植片は数日間平静に培養することができ、その間追加のドナー心臓を時宜にかなった様式で処理することができる。一部の実施形態において、本明細書に開示の方法は、１つ以上のロボットシステムを本工程の１つ以上のステップにおいて使用可能であり、このロボットシステムは、限定するものではないが、自動フラスコ処理ステーションを含む。したがって、一部の実施形態において、ヒューマン・エラーは減少し、一部の実施形態において、培養液の汚染の危険性などの過誤が減少する。マスターセルバンクの処理および作製のための全スキームを、図１に大まかに示す。
組織外植片の培養
【００４０】
上で述べたドナー組織の処理に続き、心臓組織外植片は、数日間適切な培養培地で平静に培養される。いくつかの実施形態において、攪乱の欠如は、（いくつかの実施形態において、基底膜様材料、例えば、ラミニン、フィブロネクチン、ポリ−Ｌ−オルニチンまたはこれらの組み合わせによりコーティングされた）培養皿表面への外植片の付着をより効果的に可能にし、順に、採取ために細胞のより迅速および強固な作製を可能にする。いくつかの実施形態において、培養フラスコは、コーティングが必要ないように処理される（例えば、外植片は、一部の実施形態において、フィブロネクチンなどの不在下で培養され得る）。
【００４１】
組織外植片は、間質様細胞の層が付着外植片から発生するまで培養される。培養のこの相は、間質細胞を越えて遊走する小型で、丸く、相が明るい細胞によりさらに同定可能である。特定の実施形態において、外植片は、間質様細胞が集密に成長するまで培養される。この段階またはその段階の前で、相が明るい細胞は採取される。特定の実施形態において、相が明るい細胞は手動方法により採取されるが、他においては、酵素消化、例えばトリプシン（または非動物由来等価酵素）が使用される。これらの採取された細胞（外植片由来細胞またはＥＤＣと呼ばれる）は、次いで、心筋球、ＣＤＣの作製に使用、後に心筋球もしくはＣＤＣを作製するために凍結、またはさまざまな品質管理分析に供することができる。心筋球およびＣＤＣの作製に関する追加の情報は、例えば、２００６年７月１３日出願の米国特許出願第１０／５６７，００８号、２００７年４月２１日出願の第１１／６６６，６８５号および２０１２年３月５日出願の第１３／４１２，０５１号に見出すことができ、これらそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
いくつかの実施形態において、サイズ分けされた外植片を受け取るために選択される培養容器のサイズは変動する。一部の実施形態において培養容器の表面積は、１つ以上の外植片が、単一の容器内に付着可能なように選択される。一部の実施形態において、外植片に割り当てられる表面積は、約２００から約３００ｃｍ2、約３００から約４００ｃｍ2、約４００から約５００ｃｍ2、約５００から約６００ｃｍ2、約６００から約７００ｃｍ2、約７００から約８００ｃｍ2、約８００から約９００ｃｍ2、約９００から約１０００ｃｍ2、約１０００から約１１００ｃｍ2、約１１００から約１２００ｃｍ2およびこれらの重複範囲に及ぶ。いくつかの実施形態において、約４００ｃｍ2と４５０ｃｍ2との間、約４５０ｃｍ2と５００ｃｍ2との間、約５００ｃｍ2と５５０ｃｍ2との間、約５５０ｃｍ2と６００ｃｍ2との間、約６００ｃｍ2と５５０ｃｍ2との間、約６５０ｃｍ2と７００ｃｍ2との間の範囲、およびこれらの重複する範囲（／外植片）が使用される。一部の実施形態において、市販の培養容器が使用され、一方、他の実施形態において、注文容器が作製される。
【００４３】
いくつかの実施形態において、特定の表面積が単一の外植片に専有されることにより、移植片からの細胞成長が改善される。一部の実施形態において、これは、接触阻止または他の外植片から発生する細胞による他のタイプの成長阻害の減少によるものである。一部の実施形態において、得られた細胞の密度は、十分な細胞同士の相互作用（接触、パラクリンまたは他）を、細胞が過剰成長することなく可能にする。収量全体の改善に加えて、これはまた、細胞採取が最適化され得るように（例えば、低成長または過剰成長の回避）、細胞成長の予測可能性を改善する。本明細書に開示の方法を利用することにより、多数の細胞を、ドナー組織から作製できる。いくつかの実施形態において、（出発組織のグラム量当たりで比較して）、本明細書に開示の方法の結果として作製された細胞の数は、実施形態に依存して、約１×１０5、約２×１０5、約４×１０5、約６×１０5、約８×１０5、約１×１０6、約２×１０6、約４×１０6、約１０×１０6、約２０×１０6、約３０×１０6、約３５×１０6、約４０×１０6、約１×１０7、約１×１０8であるか、またはそれを超える。したがって、本明細書の方法に基づく臨床的品質の細胞の予期しない有利な拡大に基づき、出発組織質量対臨床用量の比は、約１：４、約１：５、約１：６、約１：７、約１：８、約１：９、約１：１０であり、いくつかの事例において、約１：２０またはそれより多い。したがって、出発材料質量が、約２４グラムの心臓ドナー組織である場合、約３０の凍結保存バイアルの外植片由来細胞が得られ、これは、用量に依存して、およそ１５０人の患者の治療用量に適切である。
【００４４】
外植片に割り当てられた、専有表面積に加えて、いくつかの実施形態において、ドナー試料に由来する心臓組織のサブタイプが最適化される。本明細書に記載の処理に供した場合、心臓組織の特定領域は、違う成長特徴を示す。例えば、いくつかの実施形態において、心房外植片は、他の領域由来の外植片より前に培養容器が集密になる（採取の準備ができている）ような、急速な細胞成長を示す。興味深いことに、他の領域は異なる成長パターンを示す。例えば、図２Ａ−２Ｂを参照されたい。一部の実施形態において、異なる領域のさまざまな特徴を、単一の培養フォーマットにおいて活用することができ、例えば、複数領域由来の外植片を組み合わせ（例えば、一緒に培養する）、外植片と細胞との間の相乗的相互作用を可能にし、それによって、いくつかの実施形態において、（任意の領域単独に由来する細胞の成長と比較して）予想外にさらなる成長強化が得られる。例えば、いくつかの実施形態において、心房外植片が他の心臓領域、例えば右心室、中隔、左心室または心尖由来の１つ以上の外植片と組み合され、一緒に培養される。一部の実施形態において、第１の領域の質量の比は、第２の領域の質量に対して適合される。例えば、一部の実施形態において、この比は、約１：１、約１：２、約１：３、約１：４、約１：５、約１：６、約１：１０、約１：２０、約２０：１、約１０：１、約６：１、約５：１、約４：１、約３：１、約２：１および上記の比の範囲内の他の比である。一部の実施形態において、第１の組織の量（例えば、心房対中隔、心房対心室、心室対中隔、心房対心尖、心尖対中隔など）は、第２のサブタイプの量の約５％、第２のサブタイプの量の約１０％、第２のサブタイプの量の約１５％、第２のサブタイプの量の約２０％、第２のサブタイプの量の約２５％、第２のサブタイプの量の約３０％、第２のサブタイプの量の約３５％、第２のサブタイプの量の約４０％、第２のサブタイプの量の約４５％、第２のサブタイプの量の約５０％、またはこれらの重複範囲である。一部の実施形態において、他の比または組み合わせが使用される。一部の実施形態において、この比率の選択は、ドナー組織の状況（例えば、質および／または量）に基づく。いくつかの実施形態において、さまざまな成長細胞の間に、全体の収量および／または細胞世代の速度の予期しない増加を可能にする相乗的な情報伝達（例えば、接触またはパラクリン）が存在する。いくつかの実施形態において、異なる細胞により沈着されたさまざまな細胞外マトリックスタンパク質が、異なる組織サブタイプ由来の細胞の成長および／または生存能力を促進する。さらに追加の実施形態において、他のタンパク質同士の相互作用が、細胞タイプの間で起こり、細胞の組み合わせの成長に利益を与える。さらに、マスターセルバンクは、いくつかの実施形態において、複数の移植片それぞれから採取された細胞の組み合わせであるので、２つ（またはそれ以上）の心臓組織サブタイプの組み合わせは、より整合性のある最終幹細胞バッチをもたらす。
培養後の処理
【００４５】
外植片からの成長した細胞の採取および心筋球またはＣＤＣの作製の後で、対象の損傷した心臓組織の治療に使用される幹細胞の最終品質に対処するために、（単独または組み合わせで）いくつかの処理ステップが用いられる。上で述べたように、スケールアップした組織の処理および成長の１つの副作用は、細胞の凝集であり得る。この副作用は、大規模培養の間に外植片／細胞が経験した条件の変化によるものと思われる（例えば、より高い播種密度などから近隣細胞とより多く接触する）。本明細書に開示の方法により作製された幹細胞を使用する心臓修復のいくつかの実施形態は血管系によるので、不整脈誘導、血管閉塞などの可能性ため、細胞の凝集は限られた範囲しか容認されない。冠動脈内経路（直径約１５０〜１７０μｍ）を介して心臓細動脈（直径約４０〜５０μｍ）に通過する投与は、したがって、細胞凝集を制限することに特に注意が必要である。
【００４６】
いくつかの実施形態において、培養培地に１つ以上の試薬を加えることにより、特定の細胞が凝集または接合する傾向が減少する。いくつかの実施形態において、Ｌ−グルタミンを培地に加えることにより、細胞凝集の減少が助けられる。一部の実施形態において、ヘパリンの補足により、細胞凝集が減少する。心臓血管系通路が事実上管状であるとすれば、線形（例えば、デイジーチェーン）に接合した細胞は、一次元においてそれらのサイズが心臓血管系を通り抜けるために十分であれば、別の次元においてそれらのサイズが大きすぎたとしても、使用に適切である。
【００４７】
いくつかの実施形態において、不整脈（または他の有害事象）の危険性を減少させるために、ろ過もまた使用される。いくつかの実施形態において、ろ過はまた、肉芽腫形成の危険性を減少させるためにも機能し、肉芽腫は、免疫系が、外来であるが除去不可能であると知覚した物質を、免疫系が遮断しようとする場合に起こり得る。しかし、いくつかの実施形態において、微粒子非含有培養生成物の維持および使用は、肉芽腫の減少を目的とするフィルターの必要性を大きく（または完全に）削減する。
【００４８】
いくつかの実施形態において、大まかなろ過および／または沈降は、大型の異物、細胞凝集体および／または外植片断片を除去するための初回通過として使用される。一部の実施形態において、１５０μｍの細孔サイズを有する微粒子フィルターを介したろ過は、約１５０μｍより大きい粒子（例えば、顕微鏡的異物）の存在を減少させる。一部の実施形態において、１００％未満であり得るろ過効率を考慮して、１５０μｍのフィルターを介した複数回通過が使用される。一部の実施形態において、このろ過は、結果として生じる、約５％未満、約１％未満、約０．１％未満、または約０．０１％未満の１５０μｍより大きい粒子を有する細胞組成物をもたらす。いくつかの実施形態において、得られた細胞組成物は、細胞組成物中の全粒子の約８０％より多くの、約８５％より多くの、約９０％より多くの、約９５％より多くの、約９８％より多くの（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｔ）、約９９％より多くの、またはそれより多くの１５０μｍ未満である粒子を含む。いくつかの実施形態において、組成物は、１５０μｍより大きい粒子を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、組成物は、１５０μｍより大きい粒子が存在しないという点で純粋である。他のフィルターサイズが、例えば、約１００から約１１０μｍ、約１１０から約１２０μｍ、約１２０から約１２５μｍ、約１２５から約１３０μｍ、約１３０から約１３５μｍ、約１３５から約１４０μｍ、約１４０から約１４５、約１４５μｍから約１５０μｍおよびこれらの重複範囲に及ぶ細孔サイズを有するフィルターが他の実施形態において使用できることを理解すべきである。加えて、「フィルター」という用語は、その普通の意味を与えられ、さらに、サイズ、形状、表面特徴、質量、密度などの１つ以上に基づき、第１の物質を第２の物質から分離する任意の手段を指すものである。したがって、さらなるろ過手段を使用してもよく、限定するものではないが、フィルター、篩、膜、機械的フィルター、ケミカルフィルター、光学フィルター、生物学的濾過器などを含む。
【００４９】
不整脈または他の有害事象の危険性をさらに減少させるために、いくつかの実施形態において、さらなるろ過ステップ（複数可）が実施される。一部の実施形態において、４０μｍの細孔直径を有するフィルターを使用して、既に１５０μｍにおいてろ過された細胞組成物をろ過する。他の実施形態において、他の細孔サイズ、例えば、約２０から約２５μｍ、約２５から約３０μｍ、約３０から約３５μｍ、約３５から約４０μｍおよびこれらの重複する範囲に及ぶ細孔のフィルターを使用してよい。一部の実施形態において、１００％未満であり得るろ過効率を考慮して、このような二次フィルターを介した複数回通過を使用する。一部の実施形態において、したがって、得られた細胞混合物は、約５％未満、約１％未満、約０．１％未満、または約０．０１％未満の４０μｍより大きい粒子を含む。いくつかの実施形態において、得られた細胞組成物は、全ＣＤＣの約８０％より多く、約８５％より多く、約９０％より多く、約９５％より多く、約９８％より多く、約９９％より多く、またはそれより多くが、約４０μｍ未満であるＣＤＣを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、約４０μｍより大きい粒子を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、組成物は、約４０μｍより大きい粒子が存在しないという点で純粋である。
【００５０】
さらに追加の実施形態および試料操作の減少（および付随する汚染の危険性の減少）という追加の有利性において、単回ろ過を、細孔直径約４０μｍを有するフィルター（複数可）を使用して実施し、細胞組成物のろ過に使用する。上で述べたように、他の細孔サイズ、例えば、約２０から約２５μｍ、約２５から約３０μｍ、約３０から約３５μｍ、約３５から約４０μｍおよびこれらの重複範囲に及ぶ細孔の他のフィルターが、一部の実施形態において使用できる。一部の実施形態において、１００％未満であり得るろ過効率を考慮して、このようなフィルターを介した複数回通過を使用する。したがって、一部の実施形態において、得られた細胞混合物は、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．１％未満、または約０．０１％未満の４０μｍより大きい粒子を含み、約５％未満、約１％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満の１５０μｍより大きい粒子を含むか、または１５０μｍより大きい粒子を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、得られた細胞組成物は、全ＣＤＣの約８０％より多く、約８５％より多く、約９０％より多く、約９５％より多く、約９８％より多く、約９９％より多く、またはそれより多くの４０μｍ未満であるＣＤＣを含む。いくつかの実施形態において、組成物は、４０μｍより大きい粒子を実質的に含まない。いくつかの実施形態において、組成物は、４０μｍより大きい粒子が存在しないという点で純粋である。
【００５１】
実施形態およびろ過される細胞培養液の量に依存して、さまざまなろ過機構が使用できることもまた、理解すべきである。一部の実施形態において滅菌済の使い捨てフィルターが使用される。他の実施形態において、繰り返して滅菌可能な再使用可能なフィルター装置が用いられる。一部の実施形態において、遠心濾過システムが使用される。一部の実施形態において、インラインフィルターまたはシリンジチップフィルターが使用される。いくつかの実施形態において、スクリーンフィルターが使用される。同心円状フィルターが、追加の実施形態において使用される。２ステップ（またはマルチステップ）フィルター（例えば、連続ろ過領域において複数のフィルター細孔サイズを有するフィルター）が、一部の実施形態において使用される。有利には、いくつかの実施形態において、このようなフィルターは、汚染の危険性を減少させ、一部の実施形態において、多段階フィルターが自己内臓型である。フィルターの組み合わせもまた、一部の実施形態において使用される。
【００５２】
したがって、一部の実施形態において、得られた細胞混合物は、５％未満、１％未満、０．１％未満、または０．０１％未満の１５０μｍより大きい粒子を含み、５％未満、１％未満、０．１％未満または０．０１％未満の５０μｍより大きい粒子を含む。このような実施形態は、対象への投与における、不整脈の発生（または他の有害事象、例えば肉芽腫）の危険性を有利に減少させる。上記のサイズは、いくつかの事例において、細胞の群に対するサイズ制限であることを理解すべきである。言い換えれば、サイズ２０μｍの２つのＣＤＣが接合またはそうでなければ互いに付着している場合、全体のサイズが心臓細動脈を通過するために十分に小さいので、細胞のペアは、それでもろ過を通過すると思われる。
【実施例】
【００５３】
下記に提供する実施例は、本明細書に開示の発明の実施形態を限定する意図の物ではない。
実施例１−スケールアップした同種異系製造の開発
【００５４】
心筋球は、自己供給源組織として、経皮心内膜心筋生検からあらかじめ採取されている（例えば、ヒトまたはブタから得られた心筋球）。いくつかの事例において、同種異系幹細胞療法の取り組みが好ましいと思われる。本研究は、心臓幹細胞（例えば、臓器ドナーから収集された試験同種異系全心臓由来の心筋球またはＣＤＣ）のスケールアップした作製を成功させる能力を試験した。２つのヒト心臓（１つは心臓死後のドナー［ＤＣＤ］由来）を、調査目的で入手した。心臓を、自己ＣＤＣの確立された製造工程に供し、得られた生成物を、成長および表現型同定に関して特徴付けした。組織保存の効果および心臓のさまざまな領域からの組織サンプリングを検査した。本明細書に開示の比較方法は、工程のスケールアップを可能にするように開発された。さらに、２つのブタ心臓から前臨床試験のために製造されたブタＣＤＣを得、１つは工程変更の分析用および１つは前臨床研究のために製造した。ヒトＣＤＣはまた、工程変更の効果を評価するために利用した。
材料および方法
【００５５】
受け取り次第すぐに、心臓を、対象となる５つの別個の領域：心房（右および左の両方）、心尖、左心室心外膜（ＬＶ）、右心室心外膜（ＲＶ）および右中隔心外膜（通常、心内膜心筋生検が得られる領域）に大まかに解剖した。各領域由来の組織を、外植片と称される、それぞれ約２５ｍｇの生検サイズ小片に切断した（５００μｍ×５００μｍ×５００μｍ；しかし、一部の実施形態において、他のサイズが使用される）。ヒト心臓を、はさみおよび外科用メスを使用して、記載のように切断し（例えば、２００６年７月１３日出願の米国特許出願第１０／５６７，００８を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、一方ブタ心臓は、自動組織スライサー（Ｚｉｍｍｅｒ（登録商標）Ｄｅｒｍａｔｏｍｅ）および自動組織チョッパー（ＭｃＩｌｗａｉｎ（商標）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｈｏｐｐｅｒ，Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ，Ｉｎｃ．）を使用して切断した。次いで、外植片を前記のように処理するか（例えば、Ｓｍｉｔｈら、２００７年、および２００７年４月２１日出願の米国特許出願第１１／６６６，６８５号および２０１２年３月５日出願の第１３／４１２，０５１号を参照されたく、これらは参照によりそれぞれその全体が本明細書に組み込まれる）、または保存に供した。冷蔵保存組織を、４℃において３日または６日間、１００Ｕ／ｍＬのヘパリン（ＡＰＰ  Ｐｈａｒｍａ）を含む心筋保護溶液（ＶＩＡＳＰＡＮ、ＤｕＰｏｎｔ  Ｍｅｒｃｋ）中で維持した。凍結保存組織を、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５またはＣＳ１０（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）に凍結保存バイアル中で再懸濁（７５ｍｇ／ｍＬ）し、ＣｒｙｏＭｅｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）速度調節フリーザーに直接配置し、次いで、液体窒素に移した。
同種異系ＣＤＣの保存および製剤化
【００５６】
同種異系ＣＤＣを作製するために、１ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼにより１５分間３７℃において消化後、外植片を、１００ｍｍのフィブロネクチン（２５ｎｇ／ｍＬ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりコーティングされた皿またはＣＥＬＬＢＩＮＤ（登録商標）ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に配置した。１〜２週間後、外植片からの細胞増殖出現が集密になった。これらの外植片由来細胞（ＥＤＣ）を、１×ＴｒｙｐＬＥ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して採取した。ＥＤＣは、マスターセルバンク（ＭＣＢ）として凍結保存して、次いで心筋球（ＣＳｐ）として培養されるか、またはＣＳｐ培養条件に迅速に配置されるかのいずれかであった。ＣＳｐを、ポリ−Ｄ−リジン（２０ｍｇ／ｍＬ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりコーティングされたプレートまたはＵｌｔｒａＬｏｗ（登録商標）ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）において成長させた。同種異系ＣＤＣを、ＣＳｐをフィブロネクチンによりコーティングされた皿またはＣＥＬＬＢＩＮＤ（登録商標）ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（登録商標）容器（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＮｕｎｃ＊ＴｒｉｐｌｅＦｌａｓｋ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種することによって成長させ、集密したら継代させた。いくつかの（非臨床実験に使用のための）例において、ＣＤＣを、低体温利用（凍結せずに）した。これらの事例において、ＣＤＣを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した。または、凍結保存のための調製において、同種異系ＣＤＣを、１００Ｕ／ｍＬのヘパリンを含む、または含まないＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ５またはＣＳ１０に再懸濁した（２５０万／ｍＬ［ヒト］または１２５万／ｍＬ［ブタ］）（注記）。注記したいくつかの例において、ＣＤＣを、凍結保存前に細孔サイズ４０μｍを有するメッシュ（Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ（登録商標）Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を介してろ過したが、他の細孔サイズも、他の実施形態において使用可能である。ＣＤＣ懸濁液を凍結バッグ（ＰＬ０７  ＰｅｒｍａＬｉｆｅ  Ｂａｇｓ、ＯｒｉＧｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ）に充填し、ＣｒｙｏＭｅｄ速度調節フリーザーに直接配置し、次いで、液体窒素に移した。解凍において、（注記した）いくつかの例において、同種異系ＣＤＣを、使用前に１５０μｍの細孔径を有する小児用血液フィルター（Ｃｈａｒｔｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ）によりろ過した。細胞凝集体を、各調製品においてＭｕｌｔｉｓｉｚｅｒ（商標）４  ＣＯＵＬＴＥＲ  ＣＯＵＮＴＥＲ（登録商標）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して評価した。
統計解析
【００５７】
すべての結果は、平均±ＳＤとして表した。２つの群の統計的有意性を、対応のない両側ｔ検定を使用して決定し、群内をＡＮＯＶＡにより、その後全ペアを比較するためにテューキー検定を使用して決定した。差は、ｐ＜０．０５に関して有意であるとみなした。
結果
ヒトドナープロファイル
【００５８】
２つの心臓をＮＤＲＩから入手した（表１）。第１のドナー心臓（ＯＤ３５２１１、図３ａ）は、１１歳のＤＣＤ（心臓死後の提供）男性から得、より典型的には５分である温阻血時間（ｗａｒｍ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｔｉｍｅ）に３９分供され、クロスクランプ（ｃｒｏｓｓ−ｃｌａｍｐ）の２８．５時間以内に届けられ、外植片は、クロスクランプの４９時間以内に播種された。この心臓は弁の採取の候補であり、したがって、中隔の両側の右心室および左心室において切断を行った。切り口はわずかに茶色であり、縁からの組織は廃棄した。第２のドナー心臓（ＯＤ３５２２０、図３ｂ）は、ＤＣＤではない３歳の男性から入手し、クロスクランプの２７時間以内に届けられ、外植片は、クロスクランプの３４．５時間以内に播種された。図３ｃは、培養工程のさまざまなステップを表す。先行する研究において使用された自己供給源組織と比較して、同種異系供給源組織由来のＣＤＣの培養に大きな差は観察されなかった。
【表１】
2015521054.tif 000003
組織保存の効果
【００５９】
組織保存の潜在的効果を、両方のドナー心臓を使用して検査した。ＤＣＤ心臓から採取し、６日間保存した１２の被検査物のうちの４つ（全部で被検査物の１７％）は、ＣＤＣが得られず、６日保存は、一部の実施形態において最適なＣＤＣ収量より低いことを例示している。ＣＤＣを産出したそれらの被検査物を考慮に入れるとして、データは、同様のＣＤＣ収量を達成するために要求される時間に関する３日の冷蔵保存のわずかな効果（図４ａ）、および平均収量の減少および処理時間の増加の両方を示す、被検査物の凍結および解凍後に見られる大きな効果（図４ａ）を実証している。全体として、計算された成長速度は、凍結保存によりいくらか影響を受けたが（新鮮＝１３±１３、３日目＝１４±１５、凍結＝２±１Ｍ  ＣＤＣ／ｇ／日；図４ｂ）；冷蔵保存または凍結保存の３日目後はいずれも工程の失敗は起こらなかった。凍結組織により作り出された大幅な融通性を前提として、一部の実施形態において、処理前の組織貯蔵が場合により使用される。さらに、冷蔵保存は、数日間のさらなる融通性を処理において可能にする。
ＣＤＣ保存の効果
【００６０】
細胞の生存能力、回復および増殖に対する凍結保存の潜在的効果を、新鮮なＣＤＣと、凍結および１〜９０日間の後解凍されたＣＤＣとを比較することによって評価した（図４ｃ）。ＣＤＣの解凍後の生存能力は、凍結保存１日後平均してベースラインの８０±９％、回復が７９±２２％および６日にわたる増殖が８２±６％であった。凍結保存の期間を９０日まで延長した場合、１日目の対照と比較して任意のパラメーターに有意な変化は起こらなかった。これらのデータは、いくつかの実施形態において、一時的に保存された全心臓およびバンキングセルからＣＤＣを作製することは、いくつかの製造実施形態において実行可能な方法論であることを実証している。
ＣＤＣの領域的差
【００６１】
２つのドナーからプールされたデータは、心房および右心室からの収量が、他の領域からの収量より大きいが、ＣＤＣは、すべての領域由来の組織を使用して、確実に作製可能であることをさらに実証している（図２ａ）。計算による成長速度を比較した場合、心房および右心室由来の組織試料は、他の領域と比較して４から６倍多いＣＤＣをもたらした（心房＝２６±１０、ＲＶ＝２５±２２、心尖＝６±４、ＬＶ＝５±５、中隔＝７±４Ｍ  ＣＤＣ／ｇ／日；図２ｂ）。
【００６２】
次にマーカーのパネルを使用して、各領域から作製されたＣＤＣを定義した（表２）。ヒトＣＤＣはＣＤ１０５（ＴＧＦ−β受容体複合体の調節成分）を発現し、ＣＤ４５陰性であり、心臓前駆細胞（ｃ−Ｋｉｔ＋ＣＤ９０−）、心臓間葉様細胞（ＣＤ９０＋ｃ−Ｋｉｔ−）および内皮前駆細胞（ＣＤ３１＋ｃ−Ｋｉｔ−またはＣＤ３４＋ｃ−Ｋｉｔ−）の多細胞亜集団を含有することが確立されている。ここに示されたデータは、先行する発現プロファイルと一致する。両方とも多剤耐性ポンプであるＭＤＲ−１およびＡｂｃｇ２もまた、成人心臓前駆細胞に存在する抗原として記載されており、ＣＤＣのほんのわずかを構成しており、ＭＤＲ−１は、ｃ−Ｋｉｔ＋細胞の３１％において同時発現される（図５）。ＣＤ１３３はまた、内皮前駆体の同定に使用される別の抗原であるが、ＣＤＣでは大きく欠けている。ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３およびＣＤ１６６は、成人骨髄間葉幹細胞およびＣＤＣに存在する。心臓間葉様細胞を、心臓線維芽細胞およびαＳＭＡと識別し、心臓筋線維芽細胞を同定するために、ＤＤＲ２をマーカーパネルに加えた。結果は、ＣＤ９０＋ＣＤＣが相対的に均一な集団であり、心臓線維芽細胞または心筋線維芽細胞は均一な集団でないが、心臓間葉細胞は均一な集団であることを示している（図４）。線維芽細胞および筋線維芽細胞は、実際には、ＣＤＣ集団の＜５％を構成している。心臓前駆体（すなわち、ｃ−Ｋｉｔ＋、ＭＤＲ１＋またはＳｃａ−１＋ＣＤＣ）のごく一部または派生した支持細胞（すなわち、ＣＤ９０＋、ＤＤＲ２＋またはαＳＭＡ＋ＣＤＣ）は、領域の間で大きく変動はせず、平均して、前駆体より１．９倍多くの支持体が存在していた。
【表２】
2015521054.tif 000004
ヒトドナーの差
【００６３】
２つのドナーに由来するＣＤＣ培養の間に有意差は観察されなかったが、非ＤＣＤドナー由来のＣＤＣは、ＤＣＤドナーよりいくらかよく成長し（図６ａ）、計算による成長速度は、非ＤＣＤドナーが有意に速かった（２１±１６対７±８Ｍ  ＣＤＣ／ｇ／日；図６ｂ）。収量に差があるにもかかわらず、ＣＤＣは、ＤＣＤおよび非ＤＣＤ両方の心臓に由来する組織を使用して、確実に作製された。
【００６４】
次に、心内膜心筋生検と同等の量（２５０ｍｇ）の組織を、２つの心臓それぞれの中隔から収集した。ＣＤＣのマスターセルバンク（ＭＣＢ）および理論的使用のために調製されたＰ５のＣＤＣのバッチの両方を作製した。ＤＣＤ心臓により、４１４０万のＣＤＣのＭＣＢおよび計算上合計４４億のＰ５のＣＤＣが作製された。非ＤＣＤ心臓により、３７２０万のＣＤＣのＭＣＢおよび計算上合計６０６億のＰ５のＣＤＣが調製された（図６ｃ）。非ＤＣＤ心臓由来のＣＤＣは、Ｐ１０において起こったｉｎ  ｖｉｔｒｏの老化までにさらに拡大した。老化は、ＭＣＢの１５の集団倍加により起こり、このことはｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍形成性（ｔｕｍｏｒｇｅｎｉｃｉｔｙ）の懸念を低下させ得るので有利である（ＣＤＣにより治療された数百の動物において理論的懸念は認識されていないが、臨床研究においてさらモニターされている）。いくつかの実施形態において、継代５は、Ｐ５のＣＤＣがそれらの成長曲線の直線部にあれば、ＣＤＣを治療的に使用するには最適な時を表す。これらのデータは、同種異系組織供給源から妥当なスケールにおいて製造することの実現可能性を実証している。
製造のスケールアップ最適化
【００６５】
より大量の組織による出発を可能にし、得られた細胞数を培養する負担を軽減する、製造工程の複数の変形を試験するために、組織をブタ心臓から収集した。組織スライサーおよび組織チョッパーを、外植片作製段階に組み込み、生存能力のある、均一な組織片の迅速な作製を可能にした。それぞれ、２つのタイプの表面処理により利用可能な２つのタイプの培養容器を、ＥＤＣの増殖、ＣＳｐの形成およびＣＤＣの拡大段階に組み込み、容器のフットプリントを低下させ、培養容器の総数を減少させ、２つの試薬を削除した（ポリ−Ｄ−リジンおよびヒトフィブロネクチン、しかし、これらの試薬、またはそれらの機能的等価物／代替品が、いくつかの実施形態において、場合により使用可能である）。小規模および大規模な方法の比較（表３）により、ＥＤＣを採取する前に必要な培養時間において差はなく、ＥＤＣの収量（ＭＣＢを構成する細胞集団）に有意な差はなく、ＣＳｐ収集前に必要な培養時間が減少し、ＣＳｐ出現（図７）、または収量（続くＰ１のＣＤＣの収量として表す）に有意差がなく、同じブタ供給源組織および／またはヒトＭＣＢを使用する直接の比較においてＣＤＣ倍加時間に有意差がないことが明らかにされた。特定の製造の変化の影響の概要を、表４に示す。
【００６６】
いくつかの実施形態において、開示の方法は、大量のドナー心臓組織の処理に適切である。例えば、開示の方法を使用する平均的な研究室は、４０グラムのドナー組織を同時に、日常的に処理することができる。この規模において、上記のヒトのデータから推定すると、（ＭＣＢに要求されるウイルス剤試験により大きく駆動される）必要な品質管理による損失を考慮しても、同種異系心臓幹細胞のおよそ８５０の冠動脈内用量を得ることができる。本明細書に開示の最適化手順の視点から、（例えば、追加の組織を処理することによる）さらなるスケールアップにより、いくつかの実施形態において、より大きな能力およびフロースルーを得ることができることを理解すべきである。自己および同種異系工程から外植片由来細胞の成長効率の比較を表５に示す。これらのデータにより証明されるように、本明細書に開示のスケールアップ工程は、より多くの時間を消費し、自動化が少ない、以前に使用された方法と比較して、細胞採取の全体効率（／グラム組織ベースに対して）を維持しており、さらに予期していない全体収量の増加を可能にする。さらに、利用可能な出発材料の増加、（例えば、少なくとも一部の自動化の増加による）労働力の減少との組み合わせにより、開示の方法は、治療用細胞の大きな収量ならびに実質的コストおよび時間節約を可能にする。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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ブタＣＤＣの製造
【００６７】
第２のブタ心臓（０１１１）を、スケールアップした手順を使用して処理した。ドナーの豚は、ドナーと研究中のレシピエントとの間の最も大きい不一致を確実にするために、ＳＬＡ（豚白血球抗原）タイプであった。組織（全部で８．５ｇ）を、ドナーブタ心臓の中隔、心房、ＬＶおよびＲＶから収集し、マスターセルバンクの作製に使用した。ＭＣＢは４９５００万細胞から構成され、このＭＢＣは、完全に拡大した場合、１０７億の同種異系ＣＤＣを作製する（図８）。
【００６８】
図９は、ブタ由来のＣＤＣが、ＣＤ１０５+であり、ＣＤ４５に対して大きく陰性であるという点で、ヒト由来のＣＤＣと同じ基本的マーカーを含有することを実証している。
カテーテルによる適合性試験
【００６９】
ヒトおよびブタＣＤＣの両方を、さまざまな市販のカテーテルにより試験した。ＣＤＣは、生存能力を低下させることなく（試験前８０±７％対試験後８０±８％）、非常に優れた回復で（９８±３％、付着による損失２±３％により裏付けられる）、このようなカテーテルのいずれをも容易に通過した（生データ非掲載）。
安全性のための製造最適化
【００７０】
投与前の細胞凝集を回避するために、生成物解凍後および投与前のろ過ステップを試験した。ろ過の効果を、まずｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。細孔サイズ１５０μｍの小児用血液フィルターを使用するろ過は、ＣＤＣの生存能力に対して影響を与えないこと（トリパンブルーにより、ろ過前７４％対ろ過後８５％の生存能力）、生成物の損失がわずかであること（１２．５Ｍのうち１３０，０００の同種異系ＣＤＣが、逆洗により得られた、約１％の生成物損失）および細胞凝集のサイズおよび頻度の両方が減少したことが見出された（図１０Ａ−１０Ｂ）。上で述べたように、さまざまな他の細孔サイズのフィルターおよびろ過エピソードも、さまざまな実施形態において使用可能である。併せて、いくつかの実施形態において、特定の培養容器において検出可能な微粒子状物質の相対頻度が評価可能であり、これは必要に応じてろ過プロトコルの変更をもたらし得る（例えば、より多くの微粒子状物質を含むフラスコは、より大きなろ過ストリンジェンシーにより使用可能である）。
【００７１】
後続の試験により、凍結保存前にヘパリンを含有することが、凍結／解凍工程の間の細胞凝集体の形成の防止を援助し、ＣＤＣ生存能力には影響を与えない（トリパンブルーにより８３％の生存能力）ことが明らかになった。ＣＡＤＵＣＥＵＳ臨床試験に利用された臨床試料を、ゴールドスタンダードおよび細胞凝集体の許容され得るレベルの基準として分析し、微粒子をそれらの試料に基づき定義した（図１１）。それらの試料は、１５０μｍより大きい粒子を含有せず、＜１％の粒子が５０μｍより大きかったことが見出された（表６：試料１および２）。上で述べたように、複数のろ過エピソードが、ろ過の全体効率を上げるために、いくつかの実施形態において使用される。データは、ブタ由来のＣＤＣが、ヒト由来のＣＤＣより細胞凝集体になりやすく（表６：試料５と８を比較、試料９と１０を比較）、フィブロネクチンコーティングを使用せずに成長したＣＤＣは、フィブロネクチンコーティングにおいて成長したＣＤＣより細胞凝集体になりやすく（表６：試料５と１１を比較（試料１１は合格）、試料１２と１３を比較）、および凍結／解凍工程それ自体は細胞凝集体を形成しなかった（表６：試料１４と１５を比較、両方の試料とも合格；試料１６と１７を比較、両方の試料とも合格）ことを明らかにした。実行された第４および第５の工程変更は、製造のＣＤＣ拡大相の間のフィブロネクチンコーティング使用の再設定からなり（これは、ＣＡＤＵＣＥＵＳにおいて製造された生成物に対して行われた）、凍結保存前に４０μｍのメッシュを介したろ過により、＞５０μｍの粒子の大部分を確実に除去した。臨床使用に指定された生成物の安全性を試験するために、臨床使用のためのＣＤＣは、ヒトＭＣＢ（ＹＫＴ２６０、臨床使用に指定）に由来し、ブタＭＣＢではなかった。これらのＣＤＣは、要求されるＱＣ基準を満たした（図１１および表６：試料１７）。
【表６】
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【００７２】
表７は、本明細書に開示のさまざまな実施形態を実行した製造工程中の変形を要約している。
【表７】
2015521054.tif 000009
【００７３】
ＣＤＣがＭＨＣ不一致株の２つの同系繁殖体に由来し、同種異系および同系のＣＤＣを比較できるように交差移植された、ＭＩのラットモデルにおいて収集されたデータは、同種異系ＣＤＣが、心臓において、単に一時的な、軽度の局所免疫反応を、拒絶の組織学的証拠または免疫原性の全身性証拠なく誘導したことを示した（Ｍａｌｌｉａｒａｓら、２０１２年）。さらに、心臓機能の改善は、同系および同種異系のＣＤＣに対して同等であり、衰退していくＣＤＣの生着レベルにもかかわらず６ヶ月の間持続した。同種異系ＣＤＣおよび自己は、分泌因子（ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＨＧＦ）およびこれまでのところ同定されていない他の作用機序によって内因性再生機序（心筋細胞の細胞周期再進入、ｃ−Ｋｉｔ＋細胞の動員、血管新生）を刺激すると考えられる。本研究およびＣＡＤＵＣＥＵＳ（Ｍａｋｋａｒら、２０１２年）による臨床データは、ＭＩ後の患者に同種異系ＣＤＣを注入し、安全性ならびに梗塞サイズを評価する臨床研究を開始するための正当な基盤を提供する。
【００７４】
そのために、本研究は、同種異系ＣＤＣ作製のための強固な製造戦略を実証した。実施形態に依存して、さまざまな組織供給源を使用し、この組織供給源は、限定するものではないが、外科手術の廃棄物、死体ドナー、組織ドナー、臓器ドナーを含む。しかし、いくつかの実施形態において臓器提供が用いられ、したがって供給源は、十分に試験され、関連する伝染性疾患に関してスクリーニングされるという理由で、ＦＤＡのドナー必要条件に準拠して容易に作製され、無菌であり、臓器が冷心筋保護液中で保存されているという点でＣＤＣ培養における使用のために最適に調製される。製造工程に必要とされる組織はわずか数グラムであり、本研究は、組織は、事実上心臓のいかなる領域に由来してもよいことを示しているので（例えば、弁の採取の場合は心尖）、組織ドナーは容易に有用とすることができる。加えて、本研究は、心臓死のドナーからの提供が、組織供給源として実行可能であることを実証している。ＵＮＯＳ（全米臓器配分ネットワーク（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｎｅｔｗｏｒｋ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎ  Ｓｈａｒｉｎｇ））は、２００８年に、他の臓器（通常、腎臓、肝臓および膵臓）が利用された８３２のＤＣＤドナーのうち、移植の可能性により収集された心臓はわずか１つであり、残りの８３１は使用されなかったことを報告した。このサブ供給源単独は、現在の製造規模において理論的に年に４Ｍの用量をもたらすことができ、毎年新規または再発のＭＩを患う１．３Ｍの米国人に十分な用量を供給し、数多くを他の徴候に対してより利用可能に残すことが可能である。
【００７５】
本研究はまた、より大量のドナー組織を同時に処理し、処理に必要な労働力を減少させる技術を最適化する。４０グラム以下から全心臓までの、ドナー心臓由来の任意の量の組織を、特に短期および長期の組織保存の生存能力に関して、本明細書において提示した陽性の日数の観点から、実施形態に依存して使用可能であることを理解すべきである。さらに、本研究によるデータは、心臓のすべての領域（および一部の実施形態において、領域の組み合わせ）を、ＣＤＣの作製のために使用できることを示している。最終的に、ＣＤＣ凍結保存の実現可能性が、同様に実証された。
実施例２−外植片由来細胞および心筋球由来細胞の特徴付け
【００７６】
下記の実験を、本明細書に開示の最適化された作製方法により作製されたＣＤＣおよび培養された組織外植片から収集された第１の細胞集団である選択された中間細胞、すなわち外植片由来細胞（ＥＤＣ）の特徴を、より完全に特徴付けるために実施した。この特徴付は、心筋球および／またはＣＤＣの作製に使用される方法の、作製された心筋球および／またはＣＤＣの得られた遺伝子型および／または表現型に対する効果のより詳細な理解を提供する。さらに、外植片由来細胞（ＥＤＣ）の特徴付けは、作製工程における中間細胞の遺伝子型および／または表現型について提供されたデータにより、作製方法の効果のより完全な理解を可能にする。さらに、作製工程のさまざまな段階における細胞の特徴付けは、いくつかの実施形態に従って、本方法のステップの１つ以上の変形により、得られた細胞を目的に合わせることができる。
【００７７】
特徴付けを、６つの最初の心臓組織供給源に由来する６つの細胞系について実施した。ＣＤＣを、本明細書に開示の方法により作製した。２４２の異なる細胞表面マーカーの発現を評価するために、ＣＤＣを、確立された方法により、ハイスループットフローサイトメトリーに供した。６つの組織供給源のうち４つに由来するＥＤＣもまた、ハイスループットフローサイトメトリーに供し、中間体（ＥＤＣ）と最終（ＣＤＣ）の細胞集団との間の発現の差を同定するために、マーカーの発現を、対応するＣＤＣの発現と比較した。ＥＤＣ系１番は、ＣＤＣ系１番に対応し、ＥＤＣ系２番はＣＤＣ系２番に対応し、ＥＤＣ系５番はＣＤＣ系５番に対応し、ＥＤＣ系６番はＣＤＣ系６番に対応する。評価した細胞表面マーカーを、表９にリスト化する。
外植片由来細胞の特徴付け
【００７８】
上で述べたように、外植片由来細胞（ＥＤＣ）は、上で開示したＣＤＣ作製方法に従って、培養組織外植片から収集された第１の細胞集団である。最初の中間体として、その特徴付けは、製造ステップが作製されたＣＤＣにどのように影響を与えるかについてさらなる情報をもたらすことができ、４つのＥＤＣ集団の表面マーカーの発現を調査した。
【００７９】
４つのＥＤＣ系それぞれにわたる個別のマーカー発現データおよび４つすべての系の平均を表１０に提供し、図１２Ａ−１２Ｊにグラフにより示す。ＥＤＣに関して、表１０は、ＥＤＣの（平均して）８０％より多くにおいて存在するマーカーを特定しており、「マーカー」と表題を付けた列において適切な細胞に黒く影を付けてある。ＥＤＣの２０〜８０％において存在するマーカーは、灰色の影をつけて特定している。ＥＤＣの２０％未満において存在するマーカーには影をつけていない。ＥＤＣマーカープロファイルのより詳細な考察を、下記に提供する。
心筋球由来細胞の特徴付け
【００８０】
ＥＤＣに関して上で述べたように、ＣＤＣもまた、同じ様式で特徴付けした。フローサイトメトリーを使用して、６つのヒトＣＤＣ系（このうち４つは上で特徴付された４つのＥＣＤ集団に対応する）由来の２４２の表面マーカーを特徴付けた。６つのＣＤＣ系それぞれにわたる個別のマーカー発現データおよび６つの系の平均を表１１に提供し、図１３Ａ−１３Ｊにグラフにより示す。表１１は、ＣＤＣの（平均して）８０％より多くにおいて存在するマーカーを特定しており、「マーカー」と表題を付けた列において適切な細胞に黒く影を付けている。ＣＤＣの２０〜８０％において存在するマーカーは、灰色の影をつけて特定している。ＣＤＣの２０％未満において存在するマーカーには影をつけていない。
【００８１】
下記により詳細に述べるように、本実験的分析は、いくつかの実施形態において、ＣＤＣである細胞を特異的に同定するために使用されたマーカーの「パネル」を同定した。さらに、いくつかの実施形態において、これらのマーカーパネルは、本明細書に開示のプロトコルのさまざまな態様が、得られた細胞集団（中間体であっても、または最終の細胞集団であっても）にどのように影響を与えるかに対するより深い理解を容易にし、それらの集団の特徴の改変、細胞の単離の特異性の変化、および／またはＣＤＣ作製作業の中の潜在的変動性の他の供給源の理解を支援する。さらに、いくつかの実施形態において、マーカーは、ＣＤＣの純度の特徴付け、および／またはＣＤＣと、より早期の細胞中間体との識別のために使用される。
【００８２】
およそ３０のマーカーが、約８０％より多くのＣＤＣにより発現されることを同定した（表１１中の黒）。いくつかの実施形態において、これらのマーカーの１つ以上が集団中のＣＤＣの約８０％より多く、約８５％より多く、約９０％より多く、約９２％より多く、約９４％より多く、約９６％より多く、約９７％より多く、約９８％より多く、約９９％より多く、約９９．５％より多く、約９９．８％より多く、または約９９．９％より多くに存在する。これらのマーカーのいくらかが、ＣＤＣの推定の作用機序に関連していると思われる（例えば、これらのマーカーが、いくつかの実施形態において、ＣＤＣの治療有効性において役割を果たすことができる特定の経路に関与している）。これらのマーカーを使用して、いくつかの実施形態において、どの細胞集団をＣＤＣ集団であるとみなすことできるかを定義することができる（例えば、本明細書に開示の方法により処理され、これらのマーカーの１つ以上を発現する細胞を、ＣＤＣとして同定可能である）。
【００８３】
およそ３０のマーカーが、より変動するパーセンテージのＣＤＣ（例えば、約２０％から約８０％；表１１の灰色）により発現されることを同定した。ほぼ６０のマーカーは、変動するレベルで発現され、平均発現の標準偏差が１０％より大きいことを同定した（表１１中のイタリック）。これらのマーカーの変動する発現は、ＣＤＣ作製のバッチごとの変動の可能性についての追加の情報を提供する。一部の実施形態において、この変動は、組織供給源特異的変動によるものである（例えば、ドナーからドナーへの遺伝的変動）。この変動性はまた、実施形態に依存して、細胞の効力、免疫応答の誘導および他の臨床的に関連のある考慮すべき事柄における変動との相関をもたらし得る。１７５を超えるマーカーを、２０％未満のＣＤＣにより発現されるとして同定した（表１１中の影をつけていないもの）。ＣＤＣのかなりの部分におけるこれらのマーカーの不在が、いくつかの実施形態において、本明細書に開示の方法に従って作製された所与のＣＤＣ集団の純度を評価するために有用である。
ＣＤＣを定義するマーカー
【００８４】
上で述べたように、評価したおよそ３０の細胞表面マーカーが、およそ８０％より多くのＣＤＣにおいて発現される。マーカーのさらなる分析により、５つのマーカーがＣＤＣの作用機序に潜在的に関係し、３つのマーカーが、心筋梗塞後上方制御されることが公知である受容体に対するリガンドであることが示されている。７つのマーカーは、インテグリンファミリーの一部であり、一方４つのマーカーは、免疫原性シグナル伝達経路に関係する。マーカーのうちの３つは、ＣＤＣの効力と相関し、７つのマーカーは、成長因子および／またはホルモン受容体に関連し、これらはＣＤＣのパラクリン系作用機序の可能性にも関連する。
ＣＤＣの作用機序候補に関連するマーカー
【００８５】
ＣＤＣのスクリーニングにおいて同定されたいくらかのマーカーは、ＣＤＣの作用機序の候補に関係がある。被験ＣＤＣ系において、９９％より多くのＣＤＣがＣＤ１０５を発現した（９９．５±０．５％；エンドグリンとしても公知である）。ＣＤ１０５は、ＴＧＦβ受容体複合体の調節成分である。ＣＤ１０５は、この能力において、ＴＧＦβ受容体サブタイプＩおよびＩＩと会合することによって機能し、これらは一緒に複合体化した場合、ＴＧＦ−ｂ１およびＴＧＦ−ｂ３と高い親和性で結合する。いくつかのＴＧＦβファミリーメンバーは、梗塞した心筋において有意に誘導され、梗塞の治癒、心臓の修復および／または左心室のリモデリングの１つ以上において役割を果たすことができる。したがって、この効果に加えて、血管新生、造血および心臓の発達において、ＣＤ１０５は、ＣＤＣの治療有効性の主要なプレイヤーであり得る。ＣＤ１０５はまた、活性内皮細胞および間葉幹細胞においても高いレベルで発現される。さらに、ＣＤ１０５の可溶性形態の増加は、心臓線維症を弱めることができる。したがって、高レベルのＣＤ１０５を発現する細胞集団、例えばＣＤＣの投与は、ＣＤ１０５関連シグナル伝達経路による心臓組織の修復および／または再生を容易にすることができる。
【００８６】
被験ＣＤＣ系において、ＣＤ８１は、９７％より多くのＣＤＣにおいて発現された（９８．２±２．７％）。ＣＤ８１は、Ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＡｎｔｉＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ１（ＴＡＰＡ−１）およびＴｅｔｒａｓｐａｎｉｎ−２８（Ｔｓｐａｎ−２８）とも称される。ＣＤ８１は、トランスメンブラン４スーパーファミリーのメンバーであるタンパク質をコードする。ＣＤ８１のコードされたタンパク質は、インテグリンと複合体を形成する糖タンパク質であり、したがって、細胞発生、細胞活性化、細胞成長および細胞運動性の調節に関係する。ＣＤ８１はまた、特定のタイプの間葉幹細胞、例えば、心臓組織に由来する間葉幹細胞および心筋原性脂肪組織に由来する間葉幹細胞などにおいて発現されることが見出された。
【００８７】
被験細胞系において、ＣＤ１５１は、９９％より多くのＣＤＣにおいて発現された（９９．６±０．３％）。ＣＤ１５１はまた、トランスメンブラン４スーパーファミリーのタンパク質（テトラスパニンとも称される）をコードする。これらのタンパク質は、細胞発生、細胞接着、細胞運動性、細胞成長および細胞活性化に関与する特定のシグナル伝達事象を仲介する。ＣＤ１５１はまた血管新生にも関与し、ＣＤ１５１の過剰発現は、心臓の新血管形成の誘導に関与している。ＣＤ１５１は内皮細胞において発現され、白血球を動員するために、炎症の間にＣＤ９、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４とも称される）およびＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６とも称され、これは、いくつかの実施形態において、ＣＤＣにおいて発現されない）と複合体を形成することが公知である。
【００８８】
被験細胞系において、ＣＤ９は、９８％より多くのＣＤＣにおいて発現された（９８．９±１．４％）。ＣＤ９はまた、トランスメンブラン４スーパーファミリーのタンパク質をコードする。ＣＤ９は、ＭＲＰ−１（ｍｏｔｉｌｉｔｙ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）および／またはｐ２４抗原としても公知である。ＣＤ９は、細胞接着の調節に関係し、細胞の遊走／運動性にも関与している。ＣＤ９は、細胞の分化および／または細胞増殖において役割を果たすことができ、状況に依存して、腫瘍抑制因子としても機能できる。ＣＤ９は、Ｗｎｔ遺伝子発現の下方制御にも関係している。ＣＤＣにおける発現に加えて、ＣＤ９は、エクソソーム、内皮細胞および肥満細胞において発現される。いくつかの実施形態において、ＣＤ９発現のエクソソームとの共有に加えて、ＣＤＣはまた、ＣＤ８１の発現をエクソソームと共有している。同様に、内皮細胞もまた、ＣＤ１５１、ＣＤ５４およびＣＤ１０６を発現する。いくつかの実施形態において、ＣＤＣはまた、ＣＤ１５１、ＣＤ５４およびＣＤ１０６の１つ以上を発現する。しかし一部の実施形態において、ＣＤＣは、ＣＤ１０６を発現しない。肥満細胞はまたＣＤ１１７を発現することが公知であり、いくつかの実施形態において、ＣＤ１１７は、ＣＤＣにより発現されない。
【００８９】
被験細胞系において、ＣＤ１４７は９８％より多くのＣＤＣにより発現された（９８．６±２．１％）。ＣＤ１４７は、細胞外マトリックスメタロプロテアーゼ誘導物質（ＥＭＭＰＲＩＮ）および／またはベイシジンとも称される。ＣＤ１４７は、さまざまなマトリックスメタロプロテアーゼの産生および活性化を刺激する。いくつかの事例において、この活性化は、心臓のリモデリングをもたらす（しかし、その効果は他の組織において変動し得る、例えば、間質コラゲナーゼの改変による腫瘍細胞の浸潤の促進）。ＣＤ１４７は、初期発生の間に心臓前駆細胞に存在し、心臓前駆細胞に由来するエクソソームにも存在する。心臓療法の分野における特定の対象のうち、心筋細胞におけるＣＤ１４７の発現は、心筋梗塞または心不全の後で有意に増加される。実験的証拠により、ＣＤ１４７の過剰発現が有害な心臓のリモデリングにつながることが示されている。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ＣＤＣにおいてこれらのトランスメンブラン４スーパーファミリーのマーカーの１つ以上が存在することは、それらの治療効果の１つ以上の態様を有するＣＤＣを発生させる（例えば、投与後のＣＤＣの心臓組織への接着、損傷または罹患した心臓組織へのＣＤＣのホーミング；血管新生など）。
【００９１】
したがってこれらのデータは、いくつかの実施形態において、ＣＤＣが、トランスメンブラン４スーパーファミリーおよび／またはＴＧＦβ介在性シグナル伝達において役割を果たす特定の分子のうち１つ以上のメンバーを発現することを実証している。一部の実施形態において、これらのマーカーは、個別または組み合わせ（例えば２つ以上、３つ以上など）のいずれかで、約８０％より多くの、約８５％より多くの、約９０％より多くの、約９５％より多くの、約９７％より多くの、約９８％より多くの、および／または約９９％より多くのＣＤＣにおいて発現される。したがって、いくつかの実施形態において、これらのマーカーの１つ以上の検出に基づいて、本明細書に開示の方法により作製された細胞集団が、ＣＤＣ集団として陽性に同定され得る。
心筋梗塞のマーカーに対するリガンド
【００９２】
図１４は、心筋梗塞に対する応答において発現が変化される遺伝子を同定するデータを表す。それらの遺伝子のいくつかは、作製されたＣＤＣ系において研究される細胞マーカーのいくつかに対するリガンド（または受容体）であることが公知である。例えば、心筋梗塞に対する応答においてほぼ２倍に増加するエピレグリンは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦ−ｒ）のリガンドであり、エピレグリンは評価されたＣＤＣのおよそ８５％において発現される（８５．１±２４．６％；４８．４〜９９．６％の範囲）。ＥＧＦ−ｒはチロシンキナーゼであり、受容体を介したシグナル伝達は、さまざまな異なるシグナル伝達経路、例えばマイトジェン活性化プロテインキナーゼ、ホスホイノシチド３−キナーゼ、プロテインキナーゼＣ、ＳＴＡＴ（シグナル伝達性転写因子（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ））およびホスホリパーゼＣなどの活性化をもたらす。概して、ＥＧＦ−ｒおよびその活性化経路は、血管新生の調節、細胞増殖および／またはアポトーシスの減少に関与する。したがって、ＭＩ後の心臓におけるエピレグリンの存在は、ＣＤＣ中のＥＧＦ−ｒを活性化でき、血管新生の増加および／またはアポトーシスの減少をもたらす、ＥＧＦ−ｒを介したシグナル伝達カスケードを開始し得る。単独または他のシグナル伝達経路と併せて、これらの効果のいずれか（または両方）は、心臓組織に対する機能的能力の増加（例えば、血流の改善によって）および／または組織生存能力の増加（直接細胞死の減少および他の細胞を殺す局所アポトーシスシグナルによる有害効果の減少）をもたらし得る。
【００９３】
シンデカン３はアクセサリータンパクとして機能し、成長因子とそれらの受容体との結合を支援し、心筋梗塞に対する応答においてさらに２倍以上に上方制御される。シンデカン３はまた、特定の細胞接着反応においてもアクセサリーとして機能し、限定するものではないが、β１インテグリン（ＣＤ２９としても公知）およびα５インテグリン（ＣＤ４９ｅとしても公知）を含む、特定のインテグリンの作用を容易にする。インテグリンは、特定の生物学的工程に依存してさまざまな役割を有するが、インテグリンは、一般的には発生の間の細胞の遊走、創傷治癒、細胞分化およびアポトーシスに関係する。β１インテグリンは、研究したＣＤＣのおよそ９０％において発現され（９１．０±７．３％；８４．１〜９９．７％の範囲）、α５インテグリンは、評価したＣＤＣの９９％より多くに存在する（９９．３±１．１％；９７．４〜９９．８％の範囲）。したがって、ＭＩ後の心臓における増加レベルのシンデカン３の存在は、β１インテグリンおよび／またはα５インテグリンとのその相互作用を増加せることができ、ＣＤＣの心筋への遊走および／または生着促進、および／または投与後のＣＤＣのアポトーシスの減少をもたらし得る。
【００９４】
いくつかの追加のインテグリン分子は、ＣＤＣにより比較的高レベルで発現される。例えば、接着マーカーのＣＤ４９ｄが、８０％より多くのＣＤＣにおいて発現される（８４．６±１１．４％；７１．０〜９９．８％の範囲）。ＣＤ４９ｄはインテグリンアルファ（タイプ４）のサブユニットをコードし、これは、白血球ホーミングに関与する受容体の一部である。
【００９５】
ＣＤ５１／６１は、９５％より多くのＣＤＣにおいて発現される（平均９８．４±３．１％、９２．８〜９９．９％の範囲）。ＣＤ５１／６１は、αｖインテグリンサブユニットをコードする。ＣＤ６１はまた、９５％より多くのＣＤＣに存在する（平均９８．８±％１．９；９５．０〜９９．９％の範囲）。ＣＤ６１は、β３インテグリンサブユニットをコードする。
【００９６】
ＣＤ４９ｃは、評価したＣＤＣの９５％より多くにおいて発現される（平均９９．６±０．５％；９８．７〜９９．９％の範囲）。ＣＤ４９ｃはα３インテグリンをコードし、さまざまな他の接着細胞、例えば内皮細胞、上皮細胞および線維芽細胞において発現される。
【００９７】
ＣＤ４９ｂは、評価したＣＤＣの９５％より多くにおいて発現される（平均９９．４±０．７％；９８．０〜９９．８％の範囲）。ＣＤ４９ｂはα２インテグリンサブユニットをコードし、他のインテグリンと一緒に、細胞接着および細胞表面介在性シグナル伝達において役割を果たす。全被験ＣＤＣ中にいくつかの接着分子が非常に高いパーセンテージで存在することから、ＣＤＣは、いくつかの実施形態において、心臓細胞および／またはＣＤＣに接着する（例えば生着する）、またはこれらを刺激する（例えば、細胞表面および／またはパラクリンシグナル伝達）それらの能力のおかげで、心臓組織の機能的および解剖学的な修復および／または再生を容易にする。
免疫マーカーとの会合
【００９８】
およそ９０％のＣＤＣがＣＤ２７４を発現し、ＣＤ２７４はプログラム死リガンド−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  ｄｅａｔｈ  ｌｉｇａｎｄ−１）としても公知である（ＰＤ−Ｌ１；８９．９±１０．５％；７４．２〜９８．６％の範囲）。ＣＤ２７４は、免疫拒絶の危険性の増加が存在する特定の事象、例えば、妊娠、組織同種移植片および自己免疫疾患の間の免疫系の抑制において役割を果たす。免疫系は通常、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を誘発することによって外来抗原に反応するが、ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１リガンドとその受容体であるＰＤ−１受容体との相互作用が、これらのＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を減少させる阻害シグナルを伝える。したがって、ＣＤＣにより発現される相対的に高いレベルのＣＤ２７４は、投与における免疫応答を減少／回避する能力の強化をもたらし得る。ＣＤ２７４／ＰＤ−Ｌ１は、心臓前駆細胞の免疫抑制および／または調節効果に必要であることが示されている。いくつかの実施形態において、例えば、ＣＤＣが同種異系投与において使用される場合、この特徴は特に有利である。
【００９９】
ＣＤ１１９は、ヘテロ二量体ガンマインターフェロン受容体（ＩＮＦγ−Ｒ）の１つのリガンド結合鎖（アルファ鎖）をコードし、これはマクロファージにおいて見出され、平均しておよそ４０％のＣＤＣにおいて発現される（平均３８．４±２６．４％；８．１〜６２．１％の範囲）。ＩＮＦγ−Ｒはまた、インターフェロンガンマと相互作用し、インターフェロンガンマは、先天性免疫応答および適応免疫応答に複雑に関与する。ＣＤＣにおけるＣＤ１１９の発現は、ＣＤＣが投与された場合に予期される免疫応答を改変する能力をＣＤＣが持つ可能性が示唆される。いくつかの実施形態において、この改変は、ＣＤＣの生着、保持、治療効果の強化および／またはＣＤＣ投与に対して開始される任意の免疫応答の改変をもたらす。
【０１００】
ＣＤ１４２（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒとしても公知である）は、平均して５０％より多くのＣＤＣにおいて発現される（平均５６．３±２４．７％；１６．７〜９１％の範囲）。ＣＤ１４２は、血液凝固におけるその役割に関して最も一般的に知られている（ＣＤ１４２は、Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａとの複合体形成により、不活性なＦａｃｔｏｒ  Ｘの活性Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａへの転換を触媒する）。しかし、ＣＤ１４２はまた、血管新生およびアポトーシスの両方に関係している。ＣＤ１４２は、正常な状況下で、血流に曝露されない細胞（例えば、平滑筋細胞または線維芽細胞）により発現される。肉体的な傷害、例えば、アテローム性動脈硬化巣の破裂または細胞を損傷する虚血事象によりＣＤ１４２発現細胞が血流に曝露された場合、ＣＤ１４２とＦａｃｔｏｒ  ＶＩＩとの間で複合体形成が起こり、順に、Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩの活性化（その結果Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａとして公知）につながり得る。ＣＤ１４２／Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ複合体は、その後血管新生および／またはアポトーシスに強い影響を与え得る。
【０１０１】
Ｂ７−１としても公知であるＣＤ８０は、評価したＣＤＣの約２０％未満において発現される（平均１７．５±１３．９％；１．４〜３８．０％の範囲）。ＣＤ８０は、活性化されたＢ細胞および単球において通常見出され、発現した場合、Ｔ細胞の活性化および生存に必要とされる刺激性シグナルを提供する。ＣＤ８０は、Ｔ細胞の表面の２つの受容体、ＣＤ２８（自己調節および細胞間会合を促進する）またはＣＴＬＡ−４（Ｔ細胞調節および細胞解離の減少）のいずれかのうちの１つに対するリガンドとして作用する。ＣＤ８０の比較的低いレベルの発現は、いくつかの実施形態において、ＣＤＣがＴ細胞により限定された活性を誘導し、同種異系投与が実施された場合、再度ＣＤＣに有利性をもたらし得ることを示唆している。
治療効力と相関しているマーカー
【０１０２】
マーカーの別の群は、ＣＤＣの治療効力と相関していた。治療効力は、駆出率の変化、すなわち、ＣＤＣによる治療後の対象の駆出率と比較した、心筋梗塞後の対象の駆出率（図１５Ａ−１５ＣのＸ軸）により表される。ＣＤ１４６、ＣＤ１０７ＢおよびＣＤ１４０ｂの発現レベル（それぞれ、図１５Ａ、ＢおよびＣ）は、ＣＤＣの治療有効性が増加した場合、それぞれ減少している。ＣＤ１４６は、メラノーマ細胞接着分子（ＭＣＡＭ）としても公知である。最も低い治療効力レベルにおいて、ＣＤ１４６は、ほぼ８０％のＣＤＣにおいて発現されたが、一方で、最も高い治療効力において、ＣＤ１４６は、およそ１４％のＣＤＣにおいて発現された（平均４８．０±２２．９％；１４．１〜７７．９％の範囲）。ＣＤ１４６は、内皮細胞に対するマーカーとして使用され、いくつかの状況において、内皮細胞とアクチン細胞骨格の接合点の形成に関係していると思われる。ＣＤ１４６はまた、いくつかの臓器において、周皮細胞に対するマーカーとして使用される。
【０１０３】
同様に、ＣＤ１０７ｂは、およそ５％のＣＤＣにおいて最も高いレベルの治療効力で発現され、２０％より多くのＣＤＣにおいて、最も低いレベルの治療効力で発現された（１２．０±５．９％、５．５〜２０．９％の範囲）。ＣＤ１０７ｂまたはリソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ−２）は、糖タンパク質のメンバーをコードし、セレクチンに対するリガンドである炭水化物の提供に関与していると思われる。
【０１０４】
最後に、ＣＤ１４０ｂ（血小板由来成長因子ベータ；ＰＤＧＦＲβとしても公知である）は、ほぼ５０％のＣＤＣにおいて最も低いレベルの治療効力で発現され、ＣＤＣが最も高いレベルの治療効力をもたらした場合、発現はほぼ存在しなかった（平均９．８±１７．６％、０．９〜４５．６％の範囲）。ＣＤ１４０ｂは、血小板由来成長因子ファミリーのさまざまなメンバーと相互作用する、細胞表面チロシンキナーゼ受容体をコードする。このような成長因子は通常、間葉細胞のマイトジェンとして機能する。
追加のマーカー
【０１０５】
いくつかの他の成長因子受容体は、ＣＤＣにおいて中程度のレベルから低レベルで発現されることが見出された。例えば、血小板由来成長因子受容体アルファとしても公知であるＣＤ１４０ａは、およそ４０％のＣＤＣにおいて発現される（平均４５．７±２２．１％；２８．０〜７５％の範囲）。ＣＤ２２１（インスリン様成長因子タイプ−１受容体としても公知である）はＣＤＣにおけるその発現レベルが同様であり、ＣＤ１４０ａよりわずかに低いレベルで発現される（平均４２．７±２８．２％、４．２〜７５．７％の範囲）。インスリン受容体であるＣＤ２２０は、約１５％のＣＤＣにおいて発現される（平均２４．３±２４．４％、３．１〜６９．２％の範囲）。腫瘍壊死因子受容体タイプ１であるＣＤ１２０ａは、約１５％未満のＣＤＣにおいて発現される（平均１５．３±４．７％、９．６〜１５．２％の範囲）。これらのデータは、ＣＤＣが、特定の成長因子、例えばインスリン様成長因子タイプ−１またはＰＤＧＦに対して中程度に応答性であり得るが、おそらく腫瘍壊死因子またはインスリンなどの他の成長因子に対する応答性はこれより低いことを示唆している。発現の変動は、実施形態に依存して、特定の成長因子に対する機能または応答性と必ずしも直接相関しておらず、むしろより大きなシグナル伝達カスケードと相関している可能性がある。
ＣＤＣと比較した、ＥＤＣにおけるマーカー発現の比較
【０１０６】
上で述べた方法の最終生成物、すなわちＣＤＣと、中間生成物のＥＤＣとの比較において、２つの細胞集団の間のいくつかの違いは明らかである。ＣＤＣ対ＥＤＣにおいて発現された２４２の細胞表面マーカーの差を、表１２に提供し、図１７Ａ−１７Ｊに可視的に表す。比較１番は、ＥＤＣ／ＣＤＣ系１番に対応し、比較２番は、ＥＤＣ／ＣＤＣ系２番に対応し、比較５番は、ＥＤＣ／ＣＤＣ系５番に対応し、比較６番は、ＥＤＣ／ＣＤＣ系６番に対応する。違うマーカープロファイルの認識を使用して、いくつかの実施形態において、本明細書に開示の方法に従って作製された細胞集団が、真のＣＤＣ集団を表すか、またはＥＤＣで「汚染された」ＣＤＣ集団を表すかどうかを決定する。これらの集団の識別は、いくつかの実施形態において、細胞処理の品質管理の基準として機能できる（例えば、マーカープロファイルは、作製プロトコルに特定の細胞集団が存在する場合、同定を支援することができる）。ＣＤＣをＥＤＣから識別する大まかに１５のマーカーのうち、３つのマーカー、すなわちＳＳＥＡ−４、ＣＤ２２７およびＣＤ１４１が、ＣＤＣをＥＤＣから明確に識別すると思われる。
【０１０７】
ステージ特異的胎児抗原−４（ＳＳＥＡ−４）は、約１％から約１８％の間のＣＤＣにおいて発現されるが、約３０％から約５２％のＥＤＣにおいて発現される（ＥＤＣからＣＤＣの発現で平均して２８％の減少）。ＳＳＥＡ−４はグリコスフィンゴリピドであり、多能性および／または幹細胞様の特徴を有するさまざまな細胞の同定に関係する。ＣＤＣにおけるＳＳＥＡ−４の発現の、ＥＤＣと比較した減少は、一部の実施形態において、ＥＤＣがより多能性および／またはより幹細胞様の集団であることに関連すると思われる。
【０１０８】
ＣＤ２２７（ＭＵＣ１としても公知）は、トランスメンブラン上皮ムチン糖タンパク質であり、腺癌および造血細胞悪性腫瘍（例えば、ＴおよびＢ細胞のリンパ腫および骨髄腫（ｍｙｌｅｏｍａｓ））において過剰発現する傾向がある。ＣＤ２２７は、およそ９％〜６８％のＣＤＣにおいて発現されるが、約７２％から約８２％のＥＤＣにおいて発現される。したがって、本明細書に開示のＣＤＣの作製手順は、ＥＤＣ段階からＣＤＣ段階まででＣＤ２２７発現の減少をもたらす。
【０１０９】
ＣＤ１４１（トロンボモジュリンとしても公知である）は、内皮細胞の表面において発現され、トロンビンの補因子として機能する。通常、血液凝固の減少に関係するが、上で述べたようにＣＤ１４１の発現の減少（ＥＤＣにおいて７２％から約８６％、ＣＤＣにおいて約３０％〜５９％）は、血管新生を促進するＣＤＣの能力において役割を果たすと思われる。
【０１１０】
本明細書に開示のＣＤＣの作製方法のため、いくつかの実施形態において（ＥＤＣと比較して）より低いレベルでＣＤＣにおいて発現される、上で述べたＳＳＥＡ−４に加えて、ＣＤ１４６もまた、一般的にＥＤＣと比較してＣＤＣにおいてより低いレベルで発現されると思われる（ＥＤＣの約６５％〜９０％およびＣＤＣの約１４％〜７８％の発現）。上で述べたように、ＣＤ１４６もまた、メラノーマ細胞接着分子（ＭＣＡＭ）として公知であり、治療効力と負に相関し、内皮細胞に対するマーカーであり、内皮細胞とアクチン細胞骨格との接合点の形成に関係すると思われる。ＣＤ１４６もまた、周皮細胞に対するマーカーとして使用され、ＥＤＣと比較してＣＤＣにおいて発現が減少することは、一部の実施形態において、心臓の周皮細胞からのＣＤＣ誘導に関連すると思われる。
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【０１１１】
本発明の実施形態は、特定の好ましい実施形態および実施例と関連して開示されているが、本発明が具体的に開示された実施形態を越えて、他の代替の実施形態および／または本発明の使用ならびにこれらの明らかな改良および等価物へと拡大することは、当業者には理解されると思われる。加えて、本発明の多数の変形が示され、詳細に記載されているが、本発明の範囲内である他の改良は、この開示に基づき当業者には容易に明らかであると思われる。本実施形態の具体的特徴および態様のさまざまな組み合わせまたは部分的組み合わせが実施可能であり、それもまた本発明の１つ以上の範囲内に入ることもまた、企図されている。さらに実施形態に関連した任意の特定の特長、態様、方法、特性、特徴、質、属性、要素などの本明細書における開示は、本明細書において説明したすべての他の実施形態において使用可能である。したがって、開示された実施形態のさまざまな特長および態様が、開示された発明の変動様式を形成するために、互いに組み合わせ、または置き換えることができることを理解すべきである。本明細書に記載のすべての実施形態に関して、方法のステップは、必ずしも連続して実施される必要はない。したがって、本明細書において開示された本発明の範囲は、上記の特定の開示された実施形態により限定されるものでは決してないことが意図される。
【０１１２】
本明細書に開示された範囲は、ありとあらゆる重複、部分範囲およびこれらの組み合わせもまた包含する。「まで」「少なくとも」「より大きい」「未満」「の間」などの言葉は、列挙された数字を含む。「約」または「およそ」などの用語に先行される数は、列挙された数字を含む。例えば、「約１０ナノメーター」は、「１０ナノメーター」を含む。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１２Ｈ】
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【図１２Ｉ】
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【図１２Ｊ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【国際調査報告】
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