(57)【要約】【解決手段】  平行に巻かれた複数のワイヤと当該コイルに接続された電子回路部品とを含む中空のコイルを含むバイオセンサーを製造するための方法であって、１）少なくとも第１のワイヤ、第２のワイヤ、および第３のワイヤを含むワイヤが平行に巻かれたマンドレルを提供するステップと、２ａ）マンドレルを、第１のバイオレセプター、第１のモノマーおよび任意の添加剤を含む第１のバッファー溶液中に浸すステップと、２ｂ）電解重合工程に使用される三電極電気化学セルについて、第１のワイヤが作用電極として、第２のワイヤが対電極として、第３のワイヤが基準電極として使用されうるように前記複数のワイヤを配置するステップと、３）第１のワイヤ中に電流を流すことによって、第１のバイオレセプターを含む第１のモノマーから重合された第１のポリマーの第１の生体適合被覆を、第１のワイヤ上に形成させるステップと、４）マンドレルからコイルを取り除くステップと、５）前記複数のワイヤのそれぞれを電子回路部品の各地点に接続することによって、第１のワイヤが作用電極として、第１のワイヤが対電極として、第３のワイヤが基準電極としてそれぞれ使用されうるようにするステップと、を含み、電子回路部品は、バイオレセプターの活動に基づいて無線受信機に対する入力シグナルを生成し、入力シグナルを無線受信機に無線にて送信できるように構成されていることを特徴とする方法である。【選択図】図１
2015514484.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平行に巻かれた複数のワイヤと当該コイルに接続された電子回路部品とを含む中空のコイルを含むバイオセンサーを製造するための方法であって、
１）少なくとも第１のワイヤ、第２のワイヤ、および第３のワイヤを含むワイヤが平行に巻かれたマンドレルを提供するステップと、
２ａ）マンドレルを、第１のバイオレセプター、第１のモノマーおよび任意の添加剤を含む第１のバッファー溶液中に浸すステップと、
２ｂ）電解重合工程に使用される三電極電気化学セルについて、第２のワイヤが作用電極として、第１のワイヤが対電極として、第３のワイヤが基準電極として使用されうるように前記複数のワイヤを配置するステップと、
３）第２のワイヤ中に電流を流すことによって、第１のバイオレセプターを含む第１のモノマーから重合された第１のポリマーの第１の生体適合被覆を、第２のワイヤ上に形成させるステップと、
４）マンドレルからコイルを取り除くステップと、
５）前記複数のワイヤのそれぞれを電子回路部品の各地点に接続することによって、第２のコイルが作用電極として、第１のワイヤが対電極として、第３のワイヤが基準電極としてそれぞれ使用されうるようにするステップと、を含み、
電子回路部品は、バイオレセプターの活動に基づいて無線受信機に対する入力シグナルを生成し、入力シグナルを無線受信機に無線にて送信できるように構成されていることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記複数のワイヤは、追加的なワイヤを含み、
２ａ’）第１のバイオレセプターとは異なる第２のバイオレセプター、第２のモノマーおよび任意の添加剤を含む第２のバッファー溶液中にマンドレルを浸すステップと、
２ｂ’）電解重合工程に使用される三電極電気化学セルについて、前記追加的なワイヤが作用電極として、第１のワイヤが対電極として、第３のワイヤが基準電極として使用されうるように前記複数のワイヤを配置するステップと、
３’）前記追加的なワイヤ中に電流を流すことによって、第２のバイオレセプターを含む第２のモノマーから重合された第２のポリマーの第２の生体適合被覆を、前記追加的なワイヤ上に形成させるステップと、をさらに含み、
ステップ５）は、前記追加的なワイヤを電子回路部品に接続することによって、前記追加的なワイヤが作用電極として使用されうるようにするステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ５）の後に、電気回路部品の上に生体適合性樹脂キャッピングを提供するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のワイヤは、絶縁層にて被覆された第４のワイヤを含み、
ステップ５）は、第４のワイヤを電気回路部に接続することによって、第４のワイヤをアンテナとして使用可能とすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のワイヤは、絶縁層にて被覆された第５のワイヤをさらに含み、当該ワイヤはスペーサーとして使用されうることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ４）と５）の間において、コイルを５〜５０ｍｍの長さに切断するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ５）の後において、バイオセンサー上の生体適合材料の上塗りを提供するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
センサは、直径が０．１〜３ｍｍであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第１のコイル状ワイヤは、Ｐｔ表面を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第１のモノマーは、任意的に置換５員複素環である
【化１】
2015514484.tif 000005
〔式中、Ｒ１は、ヘテロ原子、好ましくはＮ、ＳまたはＯを表し、
Ｒ２、Ｒ３は、各々独立に、Ｈ、所望により置換されている、好ましくは１〜４個の炭素原子からなるアルキルの群から選択され、この際、アルキルは、例えばヒドロキシル基、アルキル基およびアルキルエーテル、所望により置換ｏ−アルキルで置換されてよく、かつ、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合している炭素原子と一緒に環を形成することができる〕ことを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第３のコイル状ワイヤは、銀／塩化銀基準電極であることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
バイオレセプターは、オキシドレダクターゼであることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
バイオレセプターは、Ｘが１〜１７であるＥＣ１．Ｘ．３のＥＣ番号のオキシドレダクターゼであることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
バイオレセプターは、グルコースオキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよびピルビン酸オキシダーゼからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオセンサーの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血糖モニタリングは、血液中のグルコースの濃度（糖血症）を試験する一方法である。それは真性糖尿病の管理に重要である。
【０００３】
血糖試験は、皮膚（一般に、指先）を穿刺して血液を流し、次に該血液を化学的に活性な使い捨て型の試験片の上に載せることによって通常実施される。この試験片は色を変えることによるか、または電気的特性を変えることによって結果を示す。後者は、電子メーターによって測定される。
【０００４】
大部分の２型糖尿病患者は、少なくとも１日１回（通常朝食前に）試験して、かれらの食事および運動の有効性を評価する。
【０００５】
大部分の２型糖尿病患者は、そのインスリン抵抗性を抑えるために経口薬を用い、朝食の前後にその血糖を試験してかれらの投薬量の有効性を評価する。インスリンを使用する糖尿病患者（すべての１型糖尿病患者と多くの２型糖尿病患者）は、これまでのインスリン用量の有効性を評価し、次のインスリン用量の時間の決定を助けるために、通常、より頻繁に（例えば１日３〜１０回）自分たちの血糖を試験する。
【０００６】
血糖測定技術の改善は、すべての糖尿病患者の管理の基準を急速に変えている。現在利用可能な血糖試験の方法はいくつか存在する。
【０００７】
化学試験片：化学試験片は、中程度のコストの血糖モニタリング方法である。かなり大きな１滴の血液（通常指先から採取する）を、血糖試験片と呼ばれる化学的に調製された片の上に載せる。試験片中の化学物質が血液と反応し、グルコースの濃度に従って色を変化させる。次にそれは試験片容器の側面の図表と色を比較することによって読み取ることができる。
【０００８】
血糖メーター：血糖メーターは、血糖値を測定するための電子装置である。比較的小さい１滴の血液を、デジタルメーターとインターフェース接続した使い捨て型の試験片の上に載せる。数秒以内に、血糖の濃度がデジタル表示器に示される。サンプルの大きさは、３０から０．３μｌに及ぶ。試験時間は５秒から２分に及ぶ（最新式のメーターは一般に１５秒未満である）。
【０００９】
より高価であるが、血糖メーターは、糖尿病の自己管理の突破口に思われる。血糖メーターに必要な血液の滴が小さくなり得るので、試験に伴う痛みは軽減され、自分たちの試験計画に対する糖尿病患者の応諾が改善される。血糖メーターを使用するコストは高いと思われる；しかし、回避される糖尿病の合併症の医学的コストと比較して有益なコストであると思われる。
【００１０】
最近の歓迎される利点は、血糖試験に指先以外の場所からの小さい血液滴を用いることである。この代替部位試験は、同じ試験片およびメーターを使用し、ほとんど痛みがなく、指先が痛くなった場合に必要な中断を与える。
【００１１】
更なる改善は、連続的な血糖モニタリングによって提供される：連続的な血糖モニタリング（ＣＧＭ）は、連続的（数分毎）に血糖値を測定する。典型的なシステムは以下からなる：
ａ）皮膚の直下に設置され、取替えまでの数日間の使用に耐える、使い捨て型グルコースバイオセンサー；
ｂ）センサーから、無線受信機と通信する非埋め込み型送信機へのリンク；
ｃ）ほぼ連続的な方法で血糖値を表示し、血糖変動の上昇傾向および下降傾向をモニターする、ページャ（またはインスリンポンプ）のように装着される電子受信機。
【００１２】
連続的な血糖モニターは、間質液のグルコース濃度を測定する。連続的なモニタリングによって、血糖値がインスリン、運動、食事およびその他の要素にどのように反応するかという検査が可能となる。さらなるデータは、食物摂取に対する正しいインスリン投与量比の設定および高血糖症の矯正に有用であり得る。血糖値が一般にチェックされない期間（例えば一晩）中のモニタリングは、インスリン投薬の問題を確認するのに役立ち得る（例えばインスリンポンプ使用者に関する基礎レベルまたは注射を打つ患者に関する長時間作用型インスリン濃度など）。また、たとえ患者がいずれの症状も感じない場合でさえも、患者が（必要であればフィンガースティック試験の後に）補正行為をとることができるように、モニターにアラームを装備して高血糖症または低血糖症の患者に警報を出すこともできる。
【００１３】
研究によって、連続的なセンサーを備えた患者は高血糖を経験することが少なく、グリコシル化ヘモグロビン濃度を低下させることが示された。この技術は、センサーからの即座の血糖データに基づくインスリンポンプのリアルタイム自動制御を接続するクローズド・ループ・システムを開発する努力において重要な構成要素である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明の目的は、バイオセンサーを製造するための柔軟な工程を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、本発明が提供するのは、平行に巻かれた複数のワイヤと当該コイルに接続された電子回路部品とを含む中空のコイルを含むバイオセンサーを製造するための方法であって、
１）少なくとも第１のワイヤ、第２のワイヤ、および第３のワイヤを含むワイヤが平行に巻かれたマンドレルを提供するステップと、
２ａ）マンドレルを、第１のバイオレセプター、第１のモノマーおよび任意の添加剤を含む第１のバッファー溶液中に浸すステップと、
２ｂ）電解重合工程に使用される三電極電気化学セルについて、第２のワイヤが作用電極として、第１のワイヤが対電極として、第３のワイヤが基準電極として使用されうるように複数のワイヤを配置するステップと、
３）第２のワイヤ中に電流を流すことによって、第１のバイオレセプターを含む第１のモノマーから重合された第１のポリマーの第１の生体適合被覆を、第２のワイヤ上に形成させるステップと、
４）マンドレルからコイルを取り除くステップと、
５）複数のワイヤのそれぞれを電子回路部品の各地点に接続することによって、第２のコイルが作用電極として、第１のワイヤが対電極として、第３のワイヤが基準電極としてそれぞれ使用されうるようにするステップと、を含み、
電子回路部品は、バイオレセプターの活動に基づいて無線受信機に対する入力シグナルを生成し、入力シグナルを無線受信機に無線にて送信できるように構成されていることを特徴とする方法である。
【００１６】
当然のことながら、ステップ２ｂ）では、ステップ３）の間の電解重合工程に使用される三電極電気化学セルについて、第２のワイヤが作用電極として、第１のワイヤが対電極として、第３のワイヤが基準電極として使用されうるように、複数のワイヤが配置される。同様に、ステップ５）では、複数のワイヤのそれぞれを電子回路部品の各地点に接続することによって、バイオセンサーの操作中に、第２のコイルが作用電極として、第１のワイヤが対電極として、第３のワイヤが基準電極としてそれぞれ使用可能になる。
【００１７】
被覆は、選択されたワイヤの表面にてモノマーの電解重合によって提供される。電解重合工程の利点は、ポリマーが電極上において単一のステップにて合成および被覆される点である。これは、本願発明に従って、第２のワイヤを作用電極として、第１のワイヤを対電極として、第３のワイヤを基準電極として用いた、電解重合工程に使用される三電極電気化学セルを形成することによって行われる。電解重合工程では、モノマーとバイオレセプターを含む溶液に対して電位がかけられる。電位は特定の電位範囲内で所定の速度にて所定のサイクル数にてサイクルされる。当業者は、異なる溶液に対して電解重合工程を可能にするための適切な条件、たとえば電位範囲、サイクルの速度や数などを知っている。たとえば、電位範囲は０．１〜５０Ｖの範囲であってもよく、好適には１〜５Ｖである。速度は、０．００１〜５０Ｖ／秒の範囲であってもよく、好適には０．１〜５Ｖ／秒の範囲である。サイクル数は、たとえば１〜１００回であってもよく、好適には１〜３０回である。バイオセンサーに使用される電極は電解重合工程用の電極として使用されるため、電解重合工程用の電解重合槽中に余計な電極が要らないことが本発明の利点である。
【００１８】
本発明による方法によると、ワイヤを被覆とともにマンドレルに巻くかわりに、バイオレセプターを含む被覆は、ワイヤがマンドレルに巻かれた後に提供される。これには、巻き工程中に被覆に対する潜在的な損傷を回避することができるという利点がある。本発明によるさらなる利点は、本方法によって被覆においてサンプルに依存したばらつきがより少なくできることである。１つの長いコイルを被覆することによって多くのコイルを得て、その後それをそれぞれが適切な長さを有する複数のコイルに切断することができるため、これによって得られた複数のコイルは実質的に同一の被覆を有することである。たとえば、マンドレルに巻かれたコイルの長さは１０〜５０ｃｍである。
【００１９】
本発明による工程のさらなる利点は、工程の柔軟さである。被覆されていないコイルが巻かれたマンドレルは、大量生産されて被覆ステップまで保管されてもよい。コイル状ワイヤを被覆する準備ができたときに、コイル状ワイヤが巻かれたマンドレルは好適な溶液中に浸され、好適なワイヤを通して電流がかけられる。
【００２０】
バッファー溶液は、好適にはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。生体適合層を形成するためのバッファー溶液は、たとえば溶解度、形成される被覆の均一性、溶液または形成される被覆の導電特性を増すための添加剤を含んでもよい。たとえばジエチルアミノメチル−デキストラン（ＤＥＡＥ）などの置換デキストランは、センサー中のバイオレセプターの安定性を増すことが示されてきた。導電特性を増すための添加剤の例には、直鎖状または環状の脂肪族ポリエーテルまたはポリスチレン・スルホン酸が含まれる。界面活性剤の例には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が含まれる。
【００２１】
溶液中のバイオレセプターの濃度は、モノマーおよびバイオレセプターの種類に依存する。この濃度は１〜１０６Ｕ／ｍＬの範囲であってもよい。
【００２２】
ワイヤ上に電解重合したポリマーおよび電子回路部品にキャッピングされた樹脂は、いずれも生体適合性である。
【００２３】
ワイヤが巻かれるマンドレルは、絶縁体から製造されている。
【００２４】
ステップ２ａ）とステップ２ｂ）は、いずれの順序にて実行されてもよい。マンドレルはバッファー溶液中に浸されてもよく、続いてワイヤへの関連する接続が行われることによって、三電極電気化学セルが形成されてもよい。または、ワイヤへの関連する接続が行われることによって三電極電気化学セルが形成され、次にマンドレルがバッファー溶液中に浸されてもよい。
【００２５】
複数のワイヤは、追加的なワイヤを含み、上述の方法は、
２ａ’）第１のバイオレセプターとは異なる第２のバイオレセプター、第２のモノマーおよび任意の添加剤を含む第２のバッファー溶液中にマンドレルを浸すステップと、
２ｂ’）電解重合工程に使用される三電極電気化学セルについて、追加的なワイヤが作用電極として、第１のワイヤが対電極として、第３のワイヤが基準電極として使用されうるように複数のワイヤを配置するステップと、
３’）追加的なワイヤ中に電流を流すことによって、第２のバイオレセプターを含む第２のモノマーから重合された第２のポリマーの第２の生体適合被覆を、追加的なワイヤ上に形成させるステップと、をさらに含み、
ステップ５）は、追加的なワイヤを電子回路部品に接続することによって、追加的なワイヤが作用電極として使用されうるようにするステップを含むことが好ましい。
【００２６】
この実施形態では、異なるワイヤが異なるバイオレセプターに選択的に設けられる。選択的な被覆は、選択されたワイヤだけを通じて電流を流すことによって、簡便な方法によって提供される。１つ以上の種類のバイオレセプターをコイル上に設けてもよいという点で、これは極めて有利である。バイオレセプターを適切に組み合わせることによって、より正確な検出が提供される。本発明の方法は、追加的なワイヤに追加的な被覆を提供する１以上のステップをさらに含んでもよい。つまり、本発明の方法に従って、バイオレセプターを有する３、４、５またはそれ以上のワイヤを含むコイルが提供されてもよい。
【００２７】
２ａ’）と２ｂ’）は任意の順序にて実施されてもよいことに再び注目する。マンドレルはバッファー溶液中に浸され、続いてワイヤに対する関連する接続が行われることによって、三電極電気化学セルが形成されてもよい。または、ワイヤに対する関連する接続が行われることによって三電極電気化学セルが形成され、次にマンドレルがバッファー溶液中に浸されてもよい。
【００２８】
本発明の方法は、ステップ５）の後に、電気回路部の上に生体適合性樹脂キャッピングを提供するステップをさらに含んでもよい。電子回路部品を封入する生体適合性樹脂キャッピングによって、バイオセンサーの全ユニットをヒトの体内に配置することが可能となる。眼瞼下などヒトの体の敏感な部位にバイオセンサーが配置される場合には、センサーの小ささおよび柔軟性は極めて有利である。したがって本発明のバイオセンサーは、着用および使用が非常に快適である。
【００２９】
ＵＳ２００７２１３６１１の図１１には、平行に巻かれたワイヤを含むコイルが開示されている点に注目する。ワイヤは２つの作用電極および基準電極として使用されている。この構造は、生体外の末端を含む。したがって、ＵＳ２００７２１３６１１に開示されたバイオセンサーは、ヒトの体内に配置することができない。
【００３０】
複数のワイヤは、絶縁層にて被覆された第４のワイヤを含み、ステップ３）は、第４のワイヤを電気回路部に接続することによって、第４のワイヤをアンテナとして使用可能とすることが好ましい。絶縁層は、第４のワイヤの上に、第４のワイヤがマンドレルに巻かれる前に設けられることが好ましい。複数のワイヤは、絶縁層にて被覆された第５のワイヤをさらに含み、当該ワイヤはスペーサーとして使用されうることが好ましい。絶縁層は、第５のワイヤの上に、第４のワイヤがマンドレルに巻かれる前に設けられることが好ましい。本発明によるセンサーのワイヤは、アンテナまたはスペーサーとして機能しうる１つ以上の追加的なコイル状ワイヤをさらに含んでもよい。絶縁層は、たとえばパリレン、ポリテトラフルオロエチレン、フッ素化エチレンプロピレン、ペルフルオロアルコキシ（ｐｅｒｆｌｕｒｏｘａｌｋｏｘｙ）共重合体、ポリフェニレン・サルファイド樹脂、ポリエーテルブロックアミド、ポリエーテルケトン、ポリアミド、ポリイミド、ポリエステルイミド、高密度ポリエチレンや低密度ポリエチレンなどのポリエチレン、フッ化ビニリデン、またはポリウレタンなどから製造されてもよい。
【００３１】
本発明による方法は、ステップ４）と５）の間において、コイルを好適な長さ、たとえば５〜５０ｍｍの長さ、より好ましくは５〜１０ｍｍの長さに切断するステップをさらに含むことが好ましい。
【００３２】
本発明による方法は、ステップ４）と５）の間、またはステップ５）の後において、バイオセンサー上の生体適合材料の上塗りを提供するステップをさらに含むことが好ましい。
【００３３】
本発明による工程により得られたセンサー（以下、本発明によるセンサーという）は、平行に巻かれたワイヤを備える中空のコイルと、前記コイルに動作可能に接続された電子回路部品とを備えたバイオセンサーを提供する。この際、前記ワイヤは、少なくとも、対電極として使用することのできる第１のコイル状ワイヤ、作用電極として使用することのできる第２のコイル状ワイヤ、および基準電極として使用することのできる第３のコイル状ワイヤを含み、前記第２のコイル状ワイヤはバイオレセプターを有する生体適合性層を備え、前記電子回路部品は、前記バイオレセプターの活性に基づいてトランシーバーへの入力シグナルを生成して前記入力シグナルを前記トランシーバーに無線で送信することができ、前記電子回路部品は、生体適合性樹脂に封入されている。
【００３４】
本発明によるセンサーは、通常、円筒形の形状を有し、２つの部品：中空のコイルおよび前記コイルに取り付けられた電子回路部品から本質的になる。電子回路部品は、コイル状ワイヤにその適切なポイントで接続されている。電子回路部品は、好ましくはコイルの端に取り付けられている。電子回路部品は、コイルの内側に設置されていてもコイルの外側に設置されていてもよい。回路部品がコイルの外側に設置されている場合、半径方向にセンサーから突き出ている回路部品によってセンサーの直径があまり増加しないように、回路部品はコイルの軸方向に伸びていることが好ましい。本明細書において、センサーの直径は、コイルの軸方向に対して垂直の、センサーの最大寸法と理解される。好ましくは、センサーの直径は、０．１〜３ｍｍである。好ましくは、センサーの長さは、５〜２０ｍｍである。本明細書において、センサーの長さは、コイルの軸方向のコイルと電子回路部品の合計寸法と理解される。コイルの直径とコイルの長さの比は、１：１．５〜１：２００であることが好ましい。電子回路部品の長さは、０．１〜５ｍｍであることが好ましい。
【００３５】
本明細書において、用語「中空のコイル」は、本体の円周の周りに巻かれた１以上のワイヤによって定義される、空の筒状体と理解される。すなわち、別の電極、マンドレルまたはその他の要素に巻きつけられていない。
【００３６】
中空のコイルは、センサーが曲がりやすく、センサーが設置されている周囲環境の形状をたどることができる点で有利である。したがって、バイオセンサーは周囲の環境を傷つけない。平行に巻かれた対電極、作用電極および基準電極によって、空間が同じ機能に対して有効に利用されたバイオセンサーがもたらされる。バイオセンサーが小型であることによって、センサーが周囲の環境を傷つける可能性をさらに低くすることができる。
【００３７】
上述したように様々な方法（たとえば電気回路部品上の生体適合性樹脂キャッピング、コイル上の生体適合材料の上塗り、バイオセンサーの上塗りなど）にてバイオセンサーを生体適合材料中にカプセル化することによって、バイオセンサーの全ユニットをヒトの体内に配置することが可能となる。これとバイオセンサーが機械的に柔軟で小型であるという事実とによって、着用と使用に非常に快適なバイオセンサーを提供することができる。したがって、本願発明のバイオセンサーは、ヒトの体内に、とりわけ眼瞼下において使用されることが特に有利である。
【００３８】
使用の間、センサーは、センサー中のバイオレセプターと相互作用するバイオマーカーを含有する水性環境中に設置される。水性環境は、例えば、脈管系、尿路、または体内のその他の場所、例として腹腔内または関節内、嚢内または眼内であってよい。特に、本発明によるセンサーは、涙液中のグルコース濃度の自己モニタリングを好都合に可能にし、それによって血液中のグルコース濃度の指標を得るために、上眼瞼または下眼瞼の下に装着することができる。この環境での使用に適した本発明によるセンサーは、グルコースオキシダーゼをバイオレセプターとして含む。
【００３９】
グルコースオキシダーゼは、次の反応を触媒する：
【化１】
2015514484.tif 000003
【００４０】
生成されるＨ２Ｏ２の量は、涙液中のグルコースの量の指標である。
【００４１】
センサーを作動させるために、電磁場を生成する無線トランシーバーを眼の近くに設置する。電磁場はセンサーに誘導的に動力を供給する。グルコースの濃度は、電位差測定によって測定される。電子回路部品は、涙液中に存在するグルコースの量を示す入力シグナルを生成して該シグナルをトランシーバーに伝達する。
【００４２】
そのような作用の可能な電子回路部品は、それ自体公知であり、そのような電子回路部品の例は、説明の中の他所に図を参照して記載されている。そのような電子回路部品の例のさらなる詳細は、ＤＥ１０２００７０３８４０２号、ＤＥ１０２００８０４９６４８Ａ１号およびＥＰ１４７５８８６Ｂ１号に見出すことができる。
【００４３】
生体適合性層は、バイオレセプターが漏出することまたは例えば液体環境に存在するプロテアーゼによって分解されることを防ぐ。
【００４４】
生体適合性層は、バイオレセプターを含む、すなわち、バイオレセプターは、生体適合性層の中に含まれるか、生体適合性層によって覆われるか、または生体適合性層に取り付けられることによって、生体適合性層の中または上に固定されている。生体適合性層は、上述したように作用電極として使用されるコイルに重合させるバイオレセプターを含む溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水などの緩衝液）から形成することができる。
【００４５】
生体適合性層を形成するために使用する材料は、生体適合性層を導電性にすることも非導電性にすることもできる。生体適合性層を形成するための溶液は、例えば溶解度を高めるために、形成される被膜の均一性を増強するために、あるいは溶液または形成される被膜の導電性を増加させるために、添加剤を含んでよい。例えば、ジエチルアミノエチル−デキストラン（ＤＥＡＥ）などの置換デキストランが、センサー中のバイオレセプターの安定性を増加させることが示されている。導電性を促進するための添加剤の例としては、線状または環状脂肪族ポリエーテルまたはポリスチレンスルホネートが挙げられる。界面活性剤の例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。
【００４６】
回路部品は、生体適合性樹脂キャッピングに埋設されている。樹脂は回路部品を外部環境から保護する。樹脂の例としては、ＵＶ硬化性医療用粘着剤、例えばシアノアクリレート、アクリル化ウレタンおよびシリコーンなどが挙げられる。コイルの他方の端も、樹脂キャッピングを備えていてよい。したがって、本発明の実施形態によっては、電子回路部品はコイルの末端にて取り付けられ生体適合性樹脂中に埋め込まれている。コイルの他端には、生体適合性樹脂が取り付けられている。
【００４７】
第２のコイル状ワイヤは、バイオレセプターの活性によって生成される電流を通過させるように配置されている。
【００４８】
このことが実現される一実施形態は、第２のコイル状ワイヤがＰｔ表面を有する本発明によるセンサーである。このことは、その上に施される被膜の材料の選択範囲が広いという点で有利である。Ｈ２Ｏ２は白金作用電極上で水と酸素に分解される。電気化学的分解は電位差測定によって測定される。
【００４９】
このことが実現されるさらなる実施形態は、バイオレセプターを含む生体適合性層が導電性である、本発明によるセンサーである。Ｈ２Ｏ２の分解によって生成される電子は、バイオレセプターが存在する導電層を介して第２のコイル状ワイヤに渡される。この場合、第２のコイル状ワイヤは、任意の電極材料、例えばＰｔ、Ｐｄまたはその合金の表面を有する材料であってよい。
【００５０】
コイル状ワイヤの表面は、ワイヤの内側とは異なる材料から作られていてもよいし、コイル状ワイヤの表面と内側に同じ材料を用いてもよい。例えば、コイル状ワイヤは、その他の金属、例えばＰｔ、ＰｄおよびＡｇなどがコーティングされているステンレス鋼から作られていてよい。
【００５１】
好ましくは、コイルは、生体適合性材料からなる最外層に封入されている。最外層は、コイルが湿潤環境に置かれている場合にコイルを封入する。この追加の層は、敏感なヒト身体、例えば眼瞼の下などでバイオセンサーを使用する適合性をさらに増加させる。
【００５２】
好ましい実施形態では、バイオレセプターを含む生体適合性層は、導電性であり、コイルは、生体適合性材料からなる最外層に封入されている。
【００５３】
本発明によるセンサーの以下の具体的な実施形態が言及される：
第２のコイル状ワイヤはＰｔ表面を有し、バイオレセプターを含む生体適合性層は導電性であり、コイルは生体適合性材料からなる最外層に封入されている；
第２のコイル状ワイヤはＰｔ表面を有し、バイオレセプターを含む生体適合性層は導電性であり、コイルは生体適合性材料からなる最外層に封入されていない；
第２のコイル状ワイヤはＰｔ表面を有し、バイオレセプターを含む生体適合性層は導電性でなく、コイルは生体適合性材料からなる最外層に封入されている；
第２のコイル状ワイヤはＰｔ表面を有し、バイオレセプターを含む生体適合性層は導電性でなく、コイルは生体適合性材料からなる最外層に封入されていない；
第２のコイル状ワイヤは非Ｐｔ金属から作られた表面を有し、バイオレセプターを含む生体適合性層は導電性であり、コイルは生体適合性材料からなる最外層に封入されている、および
第２のコイル状ワイヤは非Ｐｔ金属から作られた表面を有し、バイオレセプターを含む生体適合性層は導電性であり、コイルは生体適合性材料からなる最外層に封入されていない。
【００５４】
本発明によれば、コイルだけが最外層に封入されていてもよいし、センサー（コイルおよび電子回路部品）が最外層に封入されていてもよい。
【００５５】
最外層に使用される生体適合性材料は、本発明によるセンサー中のバイオレセプターと相互作用するバイオマーカーに浸透性でありさえすれば、任意の公知の適した材料であってよい。
【００５６】
好ましくは、最外層の生体適合性材料は、親水性材料である。好ましくは、生体適合性材料は、生体適合性ヒドロゲルである。
【００５７】
一部の実施形態では、ヒドロゲルは、好ましくは疎水性反応性モノマーと親水性反応性モノマーの共重合体である。適した例は、親水性および疎水性のモノマー構成単位の以下の組み合わせでありうる：（ｉ）親水性：Ｎ−ビニルピロリジノン、疎水性：ｎ−ブチルメタ−クリレート；（ｉｉ）、親水性：ヒドロキシエチルメタクリレート、疎水性：メチルメタクリレート；（ｉｉｉ）、親水性：Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート、疎水性：シクロヘキシルアクリレート。
【００５８】
一部の実施形態では、ヒドロゲルは、多糖、例としてヒアルロン（ｈｙｕｌａｒｏｎ）またはキトサンに基づくもの、および合成多糖に基づくもの、例えばセルロースエチルスルホナートまたはカルボキシメチルセルロースまたはその混合物などである。
【００５９】
一部の実施形態では、ヒドロゲルは、脂肪族領域の少なくとも１つの炭素が異なるポリエーテルのブロック共重合体、例えばポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのＡＢＡブロック共重合体である。
【００６０】
一部の実施形態では、ヒドロゲルは、ナフィオン（テトラフルオロエチレン−パーフルオロ−３，６−ジオキサ−４−メチル−７−オクテンスルホン酸共重合体）である。
【００６１】
バイオレセプターを含む生体適合性層の導電性ポリマーは、好ましくは、式（Ｉ）
【化２】
2015514484.tif 000004
〔式中、Ｒ１は、ヘテロ原子、好ましくはＮ、ＳまたはＯを表し、
Ｒ２、Ｒ３は、各々独立に、Ｈ、所望により置換されている、好ましくは１〜４個の炭素原子からなるアルキルの群から選択され、この際、アルキルは、例えばヒドロキシル基、アルキル基およびアルキルエーテル、所望により置換ｏ−アルキルで置換されてよく、かつ、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合している炭素原子と一緒に環を形成することができる〕
の所望により置換されている５員複素環から合成されたポリマーである。
【００６２】
ヘテロ原子が硫黄である置換５員複素環の例は、３，４−アルキレンジオキシチオフェンである。３，４−アルキレンジオキシチオフェンの好ましい例としては、２，３−ジヒドロチエノ［３，４−ｂ］［１，４］ダイオキシン
３，４−ジヒドロ−２Ｈ−チエノ［３，４−ｂ］［１，４］ジオキセピン
または２，３，４，５−テトラヒドロチエノ［３，４−ｂ］［１，４］ジオキソシンが挙げられる。３，４−アルキレンジオキシチオフェンのその他の好ましい例としては、
２，３−二置換−２，３−ジヒドロチエノ［３，４−ｂ］［１，４］ダイオキシン
２−置換−２，３−ジヒドロチエノ［３，４−ｂ］［１，４］ダイオキシン
３−置換−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−チエノ［３，４−ｂ］［１，４］ジオキセピン
３，３−二置換−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−チエノ［３，４−ｂ］［１，４］ジオキセピン３，３−ビス（置換）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−チエノ［３，４−ｂ］［１，４］ジオキセピン
または２，３，４，５−四置換−２，３，４，５−テトラヒドロチエノ［３，４−ｂ］［１，４］ジオキソシンが挙げられる。
特に好ましいものは、
２，３−ジメチル−２，３−ジヒドロチエノ［３，４−ｂ］［１，４］ダイオキシン
３，３−ジメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−チエノ［３，４−ｂ］［１，４］ジオキセピン
３，３−ビス（メトキシメチル）−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−チエノ［３，４−ｂ］［１，４］ジオキセピン
２，３，４，５−テトラメチル−２，３，４，５−テトラヒドロチエノ［３，４−ｂ］［１，４］ジオキソシン
２，３−ジヒドロチエノ［３，４−ｂ］［１，４］ダイオキシン−２−オール
２−メチル−２，３−ジヒドロチエノ［３，４−ｂ］［１，４］ダイオキシン
２，３−ジヒドロチエノ［３，４−ｂ］［１，４］ダイオキシン−２−イルメタノール
２−フェニル−２，３−ジヒドロチエノ［３，４−ｂ］［１，４］ダイオキシン
４−（２，３−ジヒドロチエノ［３，４−ｂ］［１，４］ダイオキシン−２−イルメトキシ）ブタン−１−スルホン酸ナトリウム
３−メチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−チエノ［３，４−ｂ］［１，４］ジオキセピン
３，４−ジヒドロ−２Ｈ−チエノ［３，４−ｂ］［１，４］ジオキセピン−３−イルメタノール
３，４−ジヒドロ−２Ｈ−チエノ［３，４−ｂ］［１，４］ジオキセピン−３−オール
５，１０−ジヒドロチエノ［３，４−ｃ］［２，５］ベンゾジオキソシン
または２−メチル−２，３−ジヒドロチエノ［３，４−ｂ］［１，４］ダイオキシンである。もっとも好ましいモノマーは、非置換３，４−エチレンジオキシチオフェンである。
【００６３】
バイオレセプターを含む生体適合性層に使用される非導電性材料の例としては、３，４−ジヒドロキシ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）、キトサン、ナフィオン（テトラフルオロエチレン−パーフルオロ−３，６−ジオキサ−４−メチル−７−オクテンスルホン酸共重合体）が挙げられる。
【００６４】
好ましくは、第３のコイル状ワイヤは、銀／塩化銀基準電極である。基準電極は、電子回路部品の適切なポイントに接続されていることによってアンテナとしても機能することができる。
【００６５】
本発明によるセンサーの平行なワイヤには、アンテナとして使用することのできる絶縁層を有する第４のコイル状ワイヤおよび／またはスペーサーとして使用することのできる絶縁層を有する第５のコイル状ワイヤがさらに含まれてよい。また、本発明によるセンサーのワイヤには、アンテナまたはスペーサーとして働く２以上のさらなるコイル状ワイヤが含まれてよい。絶縁層は、例えば、パリレン、ポリテトラフルオロエチレン、フッ化エチレンプロピレン、パーフルオロアルコキシ（ｐｅｒｆｌｕｒｏｘａｌｋｏｘｙ）共重合体、ポリフェニレンスルフィド、ポリエーテルブロックアミド、ポリエーテルケトン、ポリアミド、ポリイミド、ポリエステルイミド、高密度ポリエチレンおよび低密度ポリエチレンなどのポリエチレン、ポリフッ化ビニリデン、またはポリウレタンから作られてよい。
【００６６】
本発明によるセンサーの平行なワイヤには、さらなる作用電極として使用することのできるバイオレセプターを有する生体適合性層を備えたさらなるコイル状ワイヤが含まれてよい。さらなるコイル状ワイヤは、第２のコイル状ワイヤと同じ構造を有してよい。また、さらなるコイル状ワイヤは、電子回路部品との適した接続によって作用電極として働くことができる限り、第２のコイル状ワイヤとは異なる構造を有してもよい。特に、異なる作用電極のバイオレセプターは異なっていてよい。また、本発明によるセンサーのコイルは、さらなる作用電極として働く２以上のさらなるコイル状ワイヤをさらに含んでもよい。
【００６７】
本発明によるセンサー中のバイオレセプターは、好ましくはオキシドレダクターゼ、すなわち、レドックス酵素である。好ましくは、バイオレセプターは、Ｘが１〜１７であるＥＣ１．Ｘ．３のＥＣ番号のオキシドレダクターゼである。この種類のオキシドレダクターゼの例としては、ＥＣ１．１．３（例えばグルコースオキシダーゼ、Ｌ−グロノラクトオキシダーゼ、チアミンオキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ）、ＥＣ１．３．３（例えばプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ）、ＥＣ１．４．３（例えばモノアミンオキシダーゼ）、ＥＣ１．５．３（例えばサルコシンオキシダーゼ、ジヒドロベンゾフェナントリジンオキシダーゼ）、ＥＣ１．７．３（例えば尿酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．８．３（例えば亜硫酸塩オキシダーゼ）、ＥＣ１．９．３（例えばチトクロムＣオキシダーゼ）、ＥＣ１．１０．３（例えばカテコールオキシダーゼ、ラッカーゼ）およびＥＣ１．１６．３（例えばセルロプラスミン）が挙げられる。
【００６８】
バイオレセプターは、好ましくは、グルコースオキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ｐｙｒｕｂａｔｅ  ｄｅｈｙｒｒｏｇｅｎａｓｅ）およびピルビン酸オキシダーゼからなる群から選択することができる。
【００６９】
本発明を、図面を参照して以下に詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】本発明によるセンサーの実施形態を概略的に説明する図である。
【図２】本発明によるセンサーの実施形態の模式図であり、電子回路部品の詳細を示す図である。
【図３】本発明によるセンサーのさらなる実施形態の模式図であり、電子回路部品の詳細を示す図である。
【図４】本発明によるセンサーの電子回路部品中の定電位電解装置の動作原理を説明する図である。
【図５】本発明によるバイオセンサーの構成の様々な実施例を説明する図である。
【図６】本発明によるバイオセンサーの構成の様々な実施例を説明する図である。
【図７】本発明によるバイオセンサーの構成の様々な実施例を説明する図である。
【図８】本発明によるバイオセンサーの構成の様々な実施例を説明する図である。
【図９】本発明に関連する実験から得られる様々なグラフを示す図である。
【図１０】本発明に関連する実験から得られる様々なグラフを示す図である。
【図１１】本発明に関連する実験から得られる様々なグラフを示す図である。
【図１２】本発明に関連する実験から得られる様々なグラフを示す図である。
【図１３】本発明に関連する実験から得られる様々なグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
図１は、本発明によるセンサー１００の実施形態を説明する。センサー１００は、平行に巻かれている、第１のコイル状ワイヤ１、第２のコイル状ワイヤ２、第３のコイル状ワイヤ３、第４のコイル状ワイヤ４、および第５のコイル状ワイヤ５を含む中空コイル１０を含む。中空コイル１０は、電子回路２０に接続されている。電子回路２０はコイル１０の端に取り付けられている。この実施例において中空コイル１０は１ｍｍの直径を有する。
【００７２】
第１のコイル状ワイヤ１は、対電極として機能する。第２のコイル状ワイヤ２は、作用電極として機能する。第３のコイル状ワイヤ３は、基準電極として機能する。第４のコイル状ワイヤ４は、アンテナとして機能する。第５のコイル状ワイヤ５は、スペーサーとして機能する。
【００７３】
中空コイル１０および電子回路２０は、連続的な最外層１１で覆われている。電子回路２０は、最外層１１の内側の樹脂層２１に埋設されている。
【００７４】
第１のコイル状ワイヤ１は、白金めっきを施したステンレス鋼で作られ、最外層１１だけを備えている。
【００７５】
第２のコイル状ワイヤ２は、白金めっきを施したステンレス鋼で作られ、最外層１１の内側にポリマー層２Ａを備えている。ポリマー層２Ａは電子伝導性であり、バイオレセプター２Ｂ、この実施例においてはグルコースオキシダーゼを含む。
【００７６】
第３のコイル状ワイヤ３は、銀めっきを施したステンレス鋼であり、最外層１１の内側で、塩化銀層３Ａでコーティングされている。
【００７７】
第４のコイル状ワイヤ４は、ステンレス鋼で作られ、最外層１１の内側で、絶縁層４Ａでコーティングされている。絶縁層４Ａは、例えば、ＰＴＦＥから作られる。
【００７８】
第５のコイル状ワイヤ５は、ステンレス鋼で作られ、最外層１１の内側で、絶縁層５Ａでコーティングされている。絶縁層５Ａは、例えば、ＰＴＦＥから作られる。
【００７９】
アンテナ４のためのリターンワイヤ２２は、電子回路部品２から第４のコイル状ワイヤ４の異なるループ（図示せず）へと延び、閉ループアンテナが形成される。
【００８０】
使用時、この実施形態のセンサーは、涙液で満たされた下眼瞼に留置される。第２のコイル状ワイヤ２のポリマー層２Ａにおけるグルコースオキシダーゼの触媒機能により、涙液中のグルコースはＨ２Ｏ２を生成する。
【００８１】
センサーは、下眼瞼の近くに置かれたトランシーバー（図示せず）により生じる電磁場によって作動する。電磁場は、コイルを介して電流を誘導する。電流のレベルは、Ｈ２Ｏ２濃度に依存し、同様にそれは涙液中のグルコース濃度に依存する。電子回路２０は、グルコース濃度を示すシグナルを生成し、コイル４を介して外部装置へ送信する。
【００８２】
図２は、本発明によるセンサーの実施形態を概略的に説明する。電子回路２０の部品が、さらに詳細に説明される。この実施例において、コイル１０は、アンテナとして使用されるコイル状ワイヤを含む。電子回路部品２０は、定電位電解装置４０、基準電源８０、Ａ／Ｄコンバータ５０、マイクロプロセッサ６０、およびＲＦトランシーバー７０からなる。定電位電解装置４０は、作用電極の電流を電圧に変換する。この電圧は、Ａ／Ｄコンバータ５０によりカウントにデジタル化される。基準電源８０は、必要なバイアス電圧を定電位電解装置４０に与える。マイクロプロセッサ６０は、センサーの処理を制御する。カウント、すなわちセンサーの生データは、例えば、Ｎｏｒｍ  ＩＳＯ  １８０００−３に記載されるように、マイクロプロセッサ６０により送信データパケットに変換される。ＲＦトランシーバー７０は、誘導結合を用いて、リーダーユニット（ここでは図示せず）に、無線接続されている。ＲＦトランシーバー７０は、リターンワイヤ３０によりアンテナコイルに接続されている。ＲＦトランシーバー７０は、アンテナコイルを用いて、センサー生データを含むデータパケットをリーダーユニットに送信する。また、センサーには、誘導結合を用いて、無線で動力が供給される。データおよび送電のために、同じアンテナコイルが使用される。
【００８３】
図３は、本発明によるセンサーの電子回路部品の実施形態を概略的に説明する。図３は、アンテナを除けば図２と全く同じである。この実施例では、コイルは、アンテナとして使用されるコイル状ワイヤを含まない。その代わりに、電子回路部品がデータおよび送電のためのアンテナを含む。
【００８４】
図４は、本発明によるセンサーの電子回路部品中の定電位電解装置の動作原理を説明する。定電位電解装置は、差動入力増幅器（ＯｐＡｍｐ）、およびトランスインピーダンス増幅器（ＴＩＡ）からなる。差動入力増幅器は、作用電極（ＷＥ）と基準電極（ＲＥ）との間の電位を比較して、必要な作用バイアス電位を調節する。この目的のために、作用電極と基準電極の間の電圧が増幅され、エラーシグナルとして対電極に印加される。このようにして、作用電極と基準電極の間の電圧は一定に維持される。トランスインピーダンス増幅器は、作用電極に接続され、セル電流を電圧（Ｏｕｔ）に変換する。トランスインピーダンス増幅器は、仮想接地で作用電極の電位を維持する。
【００８５】
図５〜８は、本発明のバイオセンサーの構成の様々な実施例を説明する。
【００８６】
図５において、コイルは平行に巻きつけられている４本のワイヤからなる。ワイヤは電子回路部品のそれぞれのポイントに接続されており、それらはそれぞれ、対電極１、作用電極２、基準電極３、およびアンテナ４として機能する。
【００８７】
図６において、コイルは平行に巻かれている３本のワイヤからなる。ワイヤは、電子回路部品のそれぞれのポイントに接続されており、それらはそれぞれ、対電極１、作用電極２、基準電極３’として機能する。この実施形態において、基準電極として機能するワイヤは、アンテナとしても機能する。
【００８８】
図７において、コイルは平行に巻かれている５本のワイヤからなる。ワイヤは、電子回路部品のそれぞれのポイントに接続されており、それらはそれぞれ、対電極１、作用電極２、基準電極３、アンテナ４、およびスペーサー５として機能する。
【００８９】
図８において、コイルは平行に巻かれている４本のワイヤからなる。ワイヤは、電子回路部品のそれぞれのポイントに接続されており、それらはそれぞれ、対電極１、作用電極２、基準電極３’、およびスペーサー５として機能する。この実施形態において、基準電極３’として機能するワイヤは、アンテナとしても機能する。
【００９０】
本発明による方法の例が、図９を参照して説明される。
【００９１】
図９（ａ）に示されるように、４つのワイヤがマンドレルに対して平行に巻かれる。この例では、３つのワイヤは白金めっきステンレス鋼により製造され、被覆されていない。残る１つのワイヤは銀めっきステンレス鋼であって、塩化銀層によって被覆されている。
【００９２】
続いて、図９（ｂ）示すように、コイル状ワイヤを備えたマンドレルがＥＤＯＴ、グルコースオキシダーゼおよびＰＥＧのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に配置される。２つの白金めっきステンレス鋼ワイヤおよび１つの銀／塩化銀ワイヤが外部の電気回路に接続されることによって、電解重合工程が可能な三電極電気化学セルが形成される。作用電極として作用する被覆されていない白金めっきステンレス鋼ワイヤを通して電流が流される。たとえば、電位は０．３Ｖから０．２と１．２Ｖの間で０．１Ｖ／秒の走査速度にて３０回サイクルされる。ＥＤＯＴはワイヤの表面にて重合化することによって、ワイヤ上にグルコースオキシダーゼを含むＰＥＤＯＴの被覆を形成する。その結果、グルコースオキシダーゼを含むＰＥＤＯＴにて被覆されたワイヤが１つだけであるコイルが得られる。
【００９３】
マンドレルは溶液から取り出され、拭き取りによって過剰な溶液が除去される。次にマンドレルはＥＤＯＴ、乳酸脱水素酵素および添加剤を含む第２のバッファー溶液中に配置される。再び電解重合が可能な三電極電気化学セルが形成される。しかし残った被覆されていない白金ワイヤが作用電極として使用される。電流が作用電極を通過する。ＥＤＯＴがワイヤ表面にて重合することによって、乳酸脱水素酵素を含むＰＥＤＯＴの被覆がワイヤ上に形成される。
【００９４】
その結果、ワイヤの１つがグルコースオキシダーゼを含むＰＥＤＯＴにより被覆され、別のワイヤが乳酸脱水素酵素を含むＰＥＤＯＴにより被覆されたコイルが得られる。マンドレルが溶液から取り出され、余分な溶液は拭き取りによって除去される。４つのワイヤのコイルはマンドレルから除去される。
【００９５】
続いてコイルは、適切な長さを有する多くのコイルに切断される（たとえば図９（ｃ）に示されるように１ｃｍ）。適切な長さを有するコイルの４つのワイヤが電気回路部に接続される。その結果、４つのワイヤは以下のように機能する。
・グルコースオキシダーゼを含むＰＥＤＯＴにより被覆されたワイヤおよび乳酸脱水素酵素を含むＰＥＤＯＴにより被覆されたワイヤ：作用電極
・被覆されていないワイヤ：対電極
・塩化銀層を有する銀めっきステンレス鋼：基準電極
【００９６】
接続が形成された後、電子回路部品は生体適合樹脂によって封入される。コイルの他端にも生体適合樹脂の末端キャッピングが取り付けられる。結果を図９（ｄ）に示す。
【００９７】
コイルと電子回路部品の組み立て部は多糖により被覆される。これにより、多糖ヒドロゲルに封入されたセンサーが得られる。
【実施例】
【００９８】
（実施例１）最外層を含まない、ＰＥＤＯＴ導電層を有するＰｔ作用電極の作製（非平行ワイヤ）
３，４−エチレンジオキシチオフェン（ＥＤＯＴ）（約１０−２Ｍ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に分散させ、ＧＯＸ（約１１０Ｕ／ｍＬ）を加えて、撹拌せずに溶解させることにより、（酵素）作用電極を作製した。
【００９９】
コイル状白金ワイヤ（直径０．０１ｍｍ）が作用電極（ＷＥ）として機能し、コイル状白金ワイヤが対電極（ＣＥ）として機能し、コイル状Ａｇ／ＡｇＣｌ／飽和ＫＣｌが基準電極（ＲＥ）として機能する、三電極電気化学システムを用いた。ワイヤは、平行に巻きつけられているのではなく、別々の部品として存在した。これらの電極は、電解重合プロセスのための電気化学セルを形成した。
【０１００】
ＷＥは、使用前に超純水中で超音波洗浄した。電極をＥＤＯＴ／ＧＯｘ／ＰＢＳ溶液に入れ、電位を０．２〜１．２Ｖ／秒の間で周期的に変化させ、これを１５サイクル繰り返した。得られる被覆電極を新鮮なＰＢＳ溶液で洗浄すると、すぐに使用することができ、その結果、白金ワイヤにＧＯｘ  ＰＥＤＯＴマトリックスが固定化された（Ｐｔ／ＰＥＤＯＴ／ＧＯｘ）。
【０１０１】
（実施例２）センサー機能
実施例１で得られた三電極装置を用いて、グルコース較正曲線を作成した。
【０１０２】
グルコースＰＢＳ溶液を、０．００〜０．４０ｍＭの範囲は０．０５ｍＭごと、０．５０〜８．００ｍＭの範囲は０．５ｍＭごとに調製した。
【０１０３】
様々な溶液の電流測定を行った。溶液を継続的に撹拌しながら、ひとつの電位段階６００ｍＶをＡｇ／ＡｇＣｌ／飽和ＫＣｌに印加し、電流を６００秒間測定した。平均電流および６０秒〜６００秒の間の標準偏差を計算し、グルコース濃度に対してプロットした。
【０１０４】
電流は、０〜１０ｍＭの間の範囲でグルコース濃度に直線的に比例することが認められた。低い濃度範囲（０〜０．７ｍＭ）に対して作成した較正曲線を図１０に示す。記号は個々の測定ポイントを表し、直線はこれらのポイントに対する最小二乗適合を表す。高血糖濃度、生理学的濃度、および低血糖濃度におけるグルコースの検出を実証するさらなる実施例を図１１に示す。０ｍＭ〜３．９ｍＭの領域は低血糖領域を表し、３．９ｍＭ〜５．５ｍＭの領域は正常グルコース領域、そして５．５ｍＭを超える領域は高血糖領域を表す。
【０１０５】
（実施例３）最外層を含まない、ＰＥＤＯＴ導電層を有するＰｔ作用電極の作製（非平行ワイヤ）
３，４−エチレンジオキシチオフェン（ＥＤＯＴ）（０．０１Ｍ）を、ＰＥＧ８０００（０．００１Ｍ）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に分散させることにより、（酵素）作用電極を作製した。ＥＤＯＴ溶液にＧＯｘ（５３１２．７Ｕ）を添加し、それを攪拌せずに溶解させた。
【０１０６】
直径１．５ｍｍのコイル状作用電極（ＷＥ）、対電極（ＣＥ）としてのコイル状白金ワイヤ、およびＡｇ／ＡｇＣｌ／飽和ＫＣｌ基準電極（ＲＥ）からなる、三電極電気化学システムを使用した。これらの電極は、電解重合プロセスのための電気化学セルを形成した。
ＷＥは、Ｈ２ＳＯ４、超純水、最後にＰＢＳ中で順次洗浄することにより、事前に清浄した。電極をＥＤＯＴ／ＧＯｘ／ＰＥＧ／ＰＢＳ溶液中に入れ、電位を０．３Ｖから、０．２〜１．２Ｖの間で、走査速度０．１Ｖ／秒で周期的に変化させ、これを３０サイクル繰り返した。
【０１０７】
このようにして、ＧＯｘを含有するＰＥＤＯＴの導電性被膜でコーティングされたコイル状白金ワイヤが得られた。
【０１０８】
（実施例４）センサー機能
実施例２を繰り返したが、作用電極は実施例３で得た電極を使用した。図１２に示すように、作成した較正曲線は、作用電極を通して測定された電流が実質的にグルコース濃度に比例していることを示した。
【０１０９】
（実施例５）平行ワイヤ
ＷＥ、ＣＥ、およびＲＥとして使用されるワイヤが平行に巻かれていることを除いて、実施例１〜４を繰り返す。平行に巻きつけられていないワイヤが使用されている実施例（実施例１〜４）と、平行に巻かれているワイヤが使用されている実施例（実施例５）では、センサー動作に実質的な差異は認められない。
【０１１０】
（実施例６）最外層を有する平行ワイヤ
ＷＥ、ＣＥ、およびＲＥとして使用されるワイヤが平行に巻かれており、コイルがナフィオン（テトラフルオロエチレン−パーフルオロ−３，６−ジオキサ−４−メチル−７−オクテンスルホン酸共重合体）（水中１０重量％）溶液で浸漬コーティングされ、室温にて乾燥させたものであることを除いて、実施例１〜４を繰り返す。ナフィオンの中に封入されたコイルが得られる。センサー動作において実施例５と６の間に実質的な差異は認められない。
【０１１１】
（実施例７）ＰＥＤＯＴ導電層を有するＰｔ作用電極の作製（平行ワイヤ）
直径０．１５２ｍｍの白金めっきを施したステンレス鋼のワイヤは、ＢＭＡおよびＮＶＰの共重合体でコーティングすることができる。直径０．１５２ｍｍの、白金めっきを施したステンレス鋼の別のワイヤは、ＰＥＤＯＴ／ＧＯｘで電気化学的にコーティングすることができ、それはさらに、ＢＭＡおよびＮＶＰの共重合体でコーティングすることができる。直径０．１５２ｍｍの、銀めっきを施したステンレス鋼ワイヤは、塩化銀層でコーティングすることができ、それはまた共重合体でコーティングすることもできる。これらの３つのワイヤは、マンドレルの周囲に平行に巻きつけられていてもよい。その後に形成されるコイルの外径は０．８７ｍｍである。マンドレルを取り除いた後、コイルを１ｃｍの長さに切断してよい。コイルの端部の一方は、ＵＶ硬化ポリマーを一滴用いて塞ぐことができる。次に、コイルのもう一方の端部で３つのワイヤを電子回路に接続することができる。
【０１１２】
実施例２と同様の手順に従い、較正曲線を作成する。作用電極を通して測定された電流はグルコース濃度に実質的に比例している。
【０１１３】
（実施例８）
実施例１〜７に従って作製したコイルを電子回路部品に接続してバイオセンサーを形成する。センサーから得られる電子シグナルは、アンテナシステムによって送信され、例えばメガネなどに取り付けられた外部装置によって受信することができる。これを、今度はシグナルを増幅し、別の装置、例えばインスリンポンプなどに伝達することができる。
【０１１４】
（実施例９）
作用電極および対電極として使用されるために、以下のステップにおいて直径０．１２７ｍｍの白金ワイヤが提供される。白金ワイヤは、使用に先立って硫酸、超純粋、最後にリン酸緩衝生理食塩水を用いた一連の洗浄によって、洗浄される。
【０１１５】
基準電極は以下のように構築される：電気化学セルが塩化カリウムの飽和溶液（３．４ｇのＫＣｌ、１０ｍｌのＭｉｌｌｉＱ）中にて作用電極として使用される直径０．１２７ｍｍの銀ワイヤを用いて製造される。次に基準電極に対して６Ｖの電位が５０秒間×２回印加される。次に電極が電解質溶液中にて一晩維持される。続いて電位差滴定測定が行われる（ゼロ電流）。
【０１１６】
上述のように得られた２つのワイヤが、図９（ｂ）に示すように非導電性のマンドレルの周囲に平行に巻かれる。
【０１１７】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、１０ｍｌ、ｐＨ７．４）の撹拌された溶液に対して、室温においてＥＤＯＴ（２０Ｌ、２×１０−２ｍ）が添加される。続いて５分後にポリエチレングリコール（ＰＥＧ、３０ｍｇ、平均分子量（Ｆｗ）＝６０００ｇ／モル、５×１０−４ｍ）が添加される。得られた溶液をさらに５分間撹拌する。続いてグルコースオキシダーゼ（７ｍｇ、アスペルギルス・ニガー、２７０Ｕ／ｍｇの物質、ＢＢＩ酵素）を添加して穏やかに撹拌する。
【０１１８】
平行コイル状ワイヤおよびマンドレルは、ＥＤＯＴおよびグルコースオキシダーゼを含むリン酸緩衝生理食塩水溶液中に浸された。作用電極の表面にＥＤＯＴを電解重合するために、循環式ボルタンメトリー（ｖｏｌｔａｍｅｔｒｙ）（０〜１．２Ｖ、４０サイクル、０．０５Ｖ／Ｓ、基準電極に対して）が使用された。平行コイル状ワイヤがマンドレルから除去された。その後、電極が適切な長さに切断された。
【０１１９】
平行コイル状ワイヤに対して上塗りが適用された。平行コイル状ワイヤは、キトサン（２ｍｌ、ＭｉｌｌｉＱ／ＡｃＯＨ（９９：１）中に１％）とグルタルアルデヒド（２０μＬ、水の中に２５％）の混合物中にて浸漬被覆によって被覆された。被覆は室温にて２時間乾燥させてもよい。そうすればセンサーシステムは使用に好適である。
【０１２０】
（実施例１０）
実施例９により得られた平行コイル状電極装備を用いて、グルコース較正曲線が作られた。
【０１２１】
０．２５ｍＭ間隔の０．００〜１ｍＭおよび１ｍＭ間隔の１．０〜５．０ｍＭのグルコースリン酸緩衝生理食塩水溶液が調製された。
【０１２２】
異なる溶液に対して電流測定が行われた。５００ｍＶ対銀／塩化銀という１つの電位ステップが印加され、撹拌することなく１５０秒にわたり電流が測定された。６０〜１５０秒の間における平均電流および標準偏差が計算され、グルコース濃度に対してプロットされた。
【０１２３】
結果を図１３に示す。０〜５ｍＭの範囲において、電流はグルコース濃度と直線的に比例することが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図９（ａ）】
2015514484.tif 000009
【図９（ｂ）】
2015514484.tif 000010
【図９（ｃ）】
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【図９（ｄ）】
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【図９（ｅ）】
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【図１３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成26年12月26日(2014.12.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
平行に巻かれた複数のワイヤとコイルに接続された電子回路部品とを含む中空のコイルを含むバイオセンサーを製造するための方法であって、
１）少なくとも第１のワイヤ、第２のワイヤ、および第３のワイヤを含むワイヤが平行に巻かれたマンドレルを提供するステップと、
２ａ）マンドレルを、第１のバイオレセプター、第１のモノマーおよび任意の添加剤を含む第１のバッファー溶液中に浸すステップと、
２ｂ）電解重合工程に使用される三電極電気化学セルについて、第２のワイヤが作用電極として、第１のワイヤが対電極として、第３のワイヤが基準電極として使用されるように前記複数のワイヤを配置するステップと、
３）第２のワイヤ中に電流を流すことによって、第１のバイオレセプターを含む第１のモノマーから重合された第１のポリマーの第１の生体適合被覆を、第２のワイヤ上に形成させるステップと、
４）マンドレルからコイルを取り除くステップと、
５）前記複数のワイヤのそれぞれを電子回路部品の各地点に接続することによって、第２のコイルが作用電極として、第１のワイヤが対電極として、第３のワイヤが基準電極としてそれぞれ使用されるようにするステップと、を含み、
電子回路部品は、バイオレセプターの活動に基づいて無線受信機に対する入力シグナルを生成し、入力シグナルを無線受信機に無線にて送信できるように構成されており、
第１のモノマーは、任意的に置換５員複素環であり
【化１】
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〔式中、Ｒ１は、ヘテロ原子、好ましくはＮ、ＳまたはＯを表し、
Ｒ２、Ｒ３は、各々独立に、Ｈ、所望により置換されている、好ましくは１〜４個の炭素原子からなるアルキルの群から選択され、この際、アルキルは、例えばヒドロキシル基、アルキル基およびアルキルエーテル、所望により置換ｏ−アルキルで置換されてよく、かつ、Ｒ２およびＲ３は、それらが結合している炭素原子と一緒に環を形成することができる〕、
バイオレセプターは、オキシドレダクターゼであることを特徴とする方法。
【請求項２】
前記複数のワイヤは、追加的なワイヤを含み、
２ａ’）第１のバイオレセプターとは異なる第２のバイオレセプター、第２のモノマーおよび任意の添加剤を含む第２のバッファー溶液中にマンドレルを浸すステップと、
２ｂ’）電解重合工程に使用される三電極電気化学セルについて、前記追加的なワイヤが作用電極として、第１のワイヤが対電極として、第３のワイヤが基準電極として使用されるように前記複数のワイヤを配置するステップと、
３’）前記追加的なワイヤ中に電流を流すことによって、第２のバイオレセプターを含む第２のモノマーから重合された第２のポリマーの第２の生体適合被覆を、前記追加的なワイヤ上に形成させるステップと、をさらに含み、
ステップ５）は、前記追加的なワイヤを電子回路部品に接続することによって、前記追加的なワイヤが作用電極として使用されるようにするステップを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ５）の後に、電気回路部品の上に生体適合性樹脂キャッピングを提供するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のワイヤは、絶縁層にて被覆された第４のワイヤを含み、
ステップ５）は、第４のワイヤを電気回路部に接続することによって、第４のワイヤをアンテナとして使用可能とすることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のワイヤは、絶縁層にて被覆された第５のワイヤをさらに含み、当該ワイヤはスペーサーとして使用されることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ４）と５）の間において、コイルを５〜５０ｍｍの長さに切断するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ５）の後において、バイオセンサー上の生体適合材料の上塗りを提供するステップをさらに含むことを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
センサは、直径が０．１〜３ｍｍであることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第１のコイル状ワイヤは、Ｐｔ表面を有することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第３のコイル状ワイヤは、銀／塩化銀基準電極であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
バイオレセプターは、Ｘが１〜１７であるＥＣ１．Ｘ．３のＥＣ番号のオキシドレダクターゼであることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
バイオレセプターは、グルコースオキシダーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼおよびピルビン酸オキシダーゼからなる群から選択されることを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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