(57)【要約】  本発明は、インターフェロン類似体（ＩＦＮＬ４）タンパク質、並びにそのＨＣＶ感染症の自然消失及びＨＣＶ感染症の治療に対する反応との遺伝的関連性の特定に関するものである。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも約３０個の連続するアミノ酸を含む単離タンパク質。
【請求項２】
ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化することが可能である、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項３】
配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも約４０個の連続するアミノ酸を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項４】
配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも約６０個の連続するアミノ酸を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項５】
配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも約８０個の連続するアミノ酸を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項６】
配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも約１００個の連続するアミノ酸を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項７】
配列番号２及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも約１１０個の連続するアミノ酸を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項８】
配列番号２由来の少なくとも約１４０個の連続するアミノ酸を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項９】
少なくとも５０個の連続するアミノ酸の配列を含む単離タンパク質であって、該少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一である、単離タンパク質。
【請求項１０】
配列番号２由来の少なくとも１５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一である少なくとも１５０個の連続するアミノ酸の配列を含む、請求項９に記載の単離タンパク質。
【請求項１１】
前記少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列が下記のものからなる群から選択される少なくとも１つの配列特徴を含む、請求項９に記載の単離タンパク質：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｍ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｎ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｏ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｑ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｒ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｓ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｔ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｕ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｖ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ｗ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｘ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｙ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
ｚ．
【請求項１２】
配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の単離タンパク質。
【請求項１３】
配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項１４】
配列番号２からなるタンパク質に選択的に結合する抗体の誘発、配列番号２からなるタンパク質と結合する化合物への選択的な結合、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の発現の活性化、及び図１５に挙げられる少なくとも１つのＩＳＧの発現の誘導からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項１５】
ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を活性化する、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項１６】
下記のものからなる群から選択される核酸配列を含む単離核酸分子：
ａ．請求項１に記載の単離タンパク質をコードする核酸配列、及び、
ｂ．（ａ）の核酸配列に完全に相補的な核酸配列。
【請求項１７】
配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７及び配列番号９からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１６に記載の単離核酸分子。
【請求項１８】
請求項１６に記載の核酸分子を含むプラスミド。
【請求項１９】
請求項１６に記載の核酸分子を含むウイルス。
【請求項２０】
請求項９に記載の単離タンパク質と選択的に結合する抗体の結合を阻害する単離抗体。
【請求項２１】
請求項９に記載の単離タンパク質と選択的に結合する単離抗体。
【請求項２２】
ＩＦＮＬ４−ｐ１７９、ｐ１３１及びｐ１０７（配列番号２、配列番号５及び配列番号８）に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む変異型ＩＦＮＬ４ポリペプチドであって、
（ａ）配列番号２と比較して、Ａ１０Ｐ、Ａ１１Ｐ、Ｌ１３Ｍ、Ｖ１５Ｆ、Ｃ１７Ｙ、Ｖ１９Ｍ、Ｉ２０Ｖ、Ａ２１Ｐ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ２８Ｍ、Ｌ３５Ｍ、Ｌ４０Ｍ、Ｅ５２Ｋ、Ｌ５５Ｍ、Ｗ５７Ｒ、Ｒ６０Ｐ、Ｎ６１Ｈ、Ｓ６３Ｐ、Ｆ６４Ｖ、Ｒ６５Ｇ、Ｄ６９Ｈ、Ｐ７０Ｓ、Ｐ７１Ｔ、Ｒ７２Ｇ、Ｒ７８Ｇ、Ｖ９２Ｍ、Ｌ９３Ｉ、Ｌ１０１Ｍ、Ｌ１０２Ｆ、Ｇ１１６Ｒ、Ａ１２１Ｐ、Ａ１２６Ｐ、Ｐ１２８Ａ、Ｇ１２９Ａ、Ｓ１３０Ｐ、Ｒ１３２Ｇ、Ｐ１３５Ａ、Ｋ１３９Ｒ、Ｒ１４０Ｇ、Ｋ１４３Ｅ、Ｒ１４６Ｋ、Ｓ１４９Ｐ、Ｐ１５０Ａ、Ｋ１５４Ｅ、Ａ１５５Ｐ、Ｓ１５６Ｇ、Ｖ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｖ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６４Ｍ及びＬ１６９Ｆから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、
（ｂ）配列番号２と比較して、Ａ１０Ｐ、Ａ１１Ｐ、Ｌ１３Ｍ、Ｖ１５Ｆ、Ｃ１７Ｙ、Ｖ１９Ｍ、Ｉ２０Ｖ、Ａ２１Ｐ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ２８Ｍ、Ｌ３５Ｍ、Ｌ４０Ｍ、Ｅ５２Ｋ、Ｌ５５Ｍ、Ｗ５７Ｒ、Ｒ６０Ｐ、Ｎ６１Ｈ、Ｓ６３Ｐ、Ｆ６４Ｖ、Ｒ６５Ｇ、Ｄ６９Ｈ、Ｐ７０Ｓ、Ｐ７１Ｔ、Ｒ７２Ｇ、Ｇ１１６Ｒ、Ａ１２１Ｐ、Ａ１２６Ｐ、Ｐ１２８Ａ、Ｇ１２９Ａ、Ｓ１３０Ｐ、Ｒ１３２Ｇ、Ｐ１３５Ａ、Ｋ１３９Ｒ、Ｒ１４０Ｇ、Ｋ１４３Ｅ、Ｒ１４６Ｋ、Ｓ１４９Ｐ、Ｐ１５０Ａ、Ｋ１５４Ｅ、Ａ１５５Ｐ、Ｓ１５６Ｇ、Ｖ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｖ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６４Ｍ及びＬ１６９Ｆから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、
（ｃ）配列番号２と比較して、Ａ１０Ｐ、Ａ１１Ｐ、Ｌ１３Ｍ、Ｖ１５Ｆ、Ｃ１７Ｙ、Ｖ１９Ｍ、Ｉ２０Ｖ、Ａ２１Ｐ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ２８Ｍ、Ｌ３５Ｍ、Ｌ４０Ｍ、Ｇ１１６Ｒ、Ａ１２１Ｐ、Ａ１２６Ｐ、Ｐ１２８Ａ、Ｇ１２９Ａ、Ｓ１３０Ｐ、Ｒ１３２Ｇ、Ｐ１３５Ａ、Ｋ１３９Ｒ、Ｒ１４０Ｇ、Ｋ１４３Ｅ、Ｒ１４６Ｋ、Ｓ１４９Ｐ、Ｐ１５０Ａ、Ｋ１５４Ｅ、Ａ１５５Ｐ、Ｓ１５６Ｇ、Ｖ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｖ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６４Ｍ及びＬ１６９Ｆから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、又は、
（ｄ）配列番号２と比較して、Ｃ２７Ｇ、Ｓ３４Ｐ、Ｐ３７Ａ、Ｄ４８Ｈ、Ｃ６２Ｒ、Ａ８７Ｐ、Ｄ１１８Ｈ、Ａ１２０Ｐ、Ｃ１２２Ｇ、Ｃ１５２Ｇ、Ｖ１５７Ｌ、Ｎ１６０Ｄ、Ｌ１６１Ｆ、Ｌ１６４Ｍ、Ｌ１６５Ｆ、Ｔ１６６Ｐ、Ｌ１６９Ｆ及びＡ１７３Ｐから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、
変異型ＩＦＮＬ４ポリペプチド。
【請求項２３】
個体のＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を予測する方法であって、
ａ）個体から生物サンプルを得る工程と、
ｂ）前記サンプルを分析する工程であって、それにより本発明のＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質の有無を判断する、工程と、
を含み、本発明のＩＦＮＬ４タンパク質の有無は前記個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を示すものである、方法。
【請求項２４】
ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質の非存在は前記個体がＨＣＶ感染症を自然消失させると予測されることを示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質の存在は前記個体がＨＣＶ感染症を自然消失させることが不可能であると予測されることを示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性を予測する方法であって、
ａ）個体から生物サンプルを得る工程と、
ｂ）前記サンプルを分析する工程であって、それにより本発明のＩＦＮＬ４タンパク質の有無を判断する、工程と、
を含み、本発明のＩＦＮＬ４タンパク質の有無は前記個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性を示すものである、方法。
【請求項２７】
ＩＦＮＬ４タンパク質の非存在は前記個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示すと予測されることを示す、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＩＦＮＬ４タンパク質の存在は前記個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示すことが不可能であると予測されることを示す、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
個体のＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を予測する方法であって、
ａ）個体から生物サンプルを得る工程と、
ｂ）存在する場合に前記サンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベルを決定する工程と、
を含み、前記サンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベルは、前記個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を示すものである、方法。
【請求項３０】
ＨＣＶ感染症を消失させることが可能であることが既に知られている被験体に存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベル未満の前記サンプルにおけるＩＦＮＬ４のレベルは、前記個体がＨＣＶ感染症を消失させることが可能であると予測されることを示す、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＨＣＶ感染症を消失させることが不可能であることが既に知られている被験体に存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベルを上回る前記サンプルにおけるＩＦＮＬ４のレベルは、前記個体がＨＣＶ感染症を消失させることが不可能であると予測されることを示す、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染症を患う患者を治療する方法であって、
ａ）個体から生物サンプルを得る工程と、
ｂ）前記サンプルを分析する工程であって、それにより該サンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質の存在、不存在又はレベルを決定する、工程と、
ｃ）前記サンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質の有無又は量に基づき治療を施すか否かを判断する工程と、
を含む、方法。
【請求項３３】
ＩＦＮＬ４タンパク質活性の調節因子を同定する方法であって、
ａ）ＩＦＮＬ４タンパク質活性の測定を可能にする条件下でＩＦＮＬ４タンパク質をインキュベートする工程と、
ｂ）得られたＩＦＮＬ４活性を測定する工程と、
ｃ）工程（ａ）で用いた条件下で試験化合物の存在下においてＩＦＮＬ４タンパク質をインキュベートする工程と、
ｄ）得られたＩＦＮＬ４活性を測定する工程と、
ｅ）工程（ｂ）で得られたＩＦＮＬ４活性と、工程（ｄ）で得られたＩＦＮＬ４活性とを比較する工程と、
を含み、工程（ｂ）で得られたＩＦＮＬ４活性と工程（ｄ）で得られたＩＦＮＬ４活性との差が統計学的に有意である場合、前記試験化合物はＩＦＮＬ４活性の調節因子として同定される、方法。
【請求項３４】
ＩＦＮＬ４が検出された場合、１つ又は複数の突然変異の存在について検出タンパク質を分析する工程を更に含む、請求項２３、２６又は２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記突然変異が、Ｃｙｓ１７Ｔｙｒ、Ａｒｇ６０Ｐｒｏ及びＰｒｏ７０Ｓｅｒからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
請求項２１に記載の抗体を含む、サンプルにおけるＩＦＮＬ４タンパク質の存在、不存在又はレベルを決定するキット。
【請求項３７】
個体のＨＣＶ感染症を自然消失させる能力を判断するための取扱説明書を含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
個体のＨＣＶ感染症の治療に反応を示す能力を判断するための取扱説明書を含む、請求項３６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インターフェロン−λ４（ＩＦＮＬ４）と称される新規のヒトインターフェロンの同定と、個体におけるＨＣＶ感染症の臨床転帰を予測するのにＩＦＮＬ４のｍＲＮＡ、タンパク質発現又はタンパク質活性を使用する方法とに関する。本発明は、ＨＣＶ感染症を治療する新規化合物の同定のためのこの新規タンパク質の使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は、ウイルスの中でもフラビウイルス科の一本鎖ＲＮＡウイルスである。世界中でおよそ１億７０００万及び米国において少なくとも４００万の人がＨＣＶに感染していると推定されている（非特許文献１）。米国では、ＨＩＶ感染症よりもＨＣＶにより死亡する人の方が多い（非特許文献２）。このことからＨＣＶによる感染は世界的に重大な健康問題となっている。
【０００３】
大抵の人は、ＨＣＶによる急性感染により一般的に疲労、食欲低下及びインフルエンザ様症状等の軽度の症状を引き起こす。慣例により、急性肝炎とは推定曝露時間後６ヶ月以内の肝炎の臨床兆候又は症状の出現を指す。しかしながら場合によっては、新たに感染した個体は無症候性のままであることもある。一部の個体ではウイルスが自然に消失するが、ＨＣＶに感染した人のおよそ８５％は、初期曝露の少なくとも６ヶ月後に起こる持続性ウイルス血症として定義される慢性Ｃ型肝炎を発症する（非特許文献３）。ＨＣＶによる慢性感染症は肝臓がん及び末期肝疾患の主な原因である。またこの慢性感染症は米国において肝移植をする理由として最も一般的である。現在、ＨＣＶ感染症の標準的治療は、ペグ化（pegylated）インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）とリバビリンとの併用療法である。治療が成功すると、慢性ＨＣＶ感染症は消散し、それによりＨＣＶ関連の罹患率及び死亡率が顕著に減少するが、ペグ化ＩＦＮ−α／リバビリン治療方式は患者の４５％未満にしか有効ではなく、費用がかかるとともに、多くの有害作用を伴う。最近では、ペグ化ＩＦＮ−α、リバビリン及びＨＣＶプロテアーゼ阻害剤を含む三剤併用療法が推奨されている。この新たな方式はペグ化インターフェロン−α／リバビリンによる治療よりも有効であるが、かなりの割合の患者で反応を示さない可能性があり、この治療方式を用いて治療した患者はペグ化ＩＦＮ−α／リバビリン療法で見られる有害作用を被ることになる。そのため、インターフェロンに基づく治療法による治療に反応を示す可能性の低い患者を特定する方法が、これらの患者が無駄な治療に伴う費用及び有害作用を回避することができるという理由から早急に望まれている。加えて、一部の患者が治療に反応を示さないことは、Ｃ型肝炎感染症に対する新たな治療が必要であることを示す。
【０００４】
慢性ＨＣＶ感染症の自然経過及び治療法に対する反応の両方が宿主の遺伝的要因の影響を受けることを示唆する証拠が増えてきている（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７）。例えば、ＨＣＶの単一株を混入した免疫グロブリン調製物により類似の条件下で感染させた２つの妊婦群において、半分は感染症が自然消失し、半分は慢性Ｃ型肝炎へと進行した（非特許文献８、非特許文献９）。慢性感染症となった患者において、類似のＨＣＶ−ＲＮＡレベル及び同一の遺伝子型を有する症例の中でも治療に対する反応は異なる（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。奏効率は民族性に強く関連している（非特許文献１３）。これまでの報告から、ＨＣＶ感染症の転帰に対するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）（非特許文献１４、非特許文献１５）、キラー免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）（非特許文献１６）、サイトカイン（特許文献１）、ケモカイン及びインターロイキン、並びにインターフェロン刺激遺伝子の遺伝的多型の影響が明らかとなっている（非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献１３、非特許文献２０）。
【０００５】
これまでの研究では、ＨＣＶ感染症における遺伝子の潜在的役割の推測的知識に基づき候補遺伝子アプローチが用いられてきた。しかしながら、これまでのデータでは自然消失又は治療に対する反応を正確に予測することは不可能である（非特許文献１５）。２００９年に、幾つかのグループによって、独立したゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）により、慢性Ｃ型肝炎の患者の中でのペグ化ＩＦＮ−α／リバビリン治療に対する反応及びＨＣＶ感染症の自然消失に関連するＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）遺伝子領域における単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を同定したという結果が報告された。例えば、Bochud et alによる米国特許出願公開第２０１１／０１６５１２４号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）には、ＨＣＶのインターフェロンに基づく治療に対する反応及び自然消失の両方に関連する多くのＳＮＰが開示されている。これらのＧＷＡＳで同定されたＳＮＰの中で、現在ｒｓ１２９７９８６０に基づく遺伝子型が自然消失及び治療反応の最良な予測因子として認められている（非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４、非特許文献２５）。単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）ｒｓ１２９７９８６０は、ＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）の翻訳開始部位のおよそ３ｋｂ上流に位置している。今のところｒｓ１２９７９８６０に基づく民間試験所の試験が患者の治療に反応を示す可能性を予測するのに利用可能である。
【０００６】
ヨーロッパ系の人と比較して、アフリカ系アメリカ人患者は、慢性Ｃ型肝炎の頻度が高く、ＩＦＮ−α／リバビリンによる治療法に対する反応性が低い。ＧＷＡＳマーカーｒｓ１２９７９８６０の頻度の人種差ではこれらの差異を完全には説明できない。全集団群において最適な予測的価値のある遺伝的マーカーの同定によって、慢性Ｃ型肝炎の治療のための臨床決定モデルが改善され、全ＨＣＶ感染患者にオーダーメイド医療の普及が支援される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第００／０８２１５号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Thomas DL, Astemborski J, Rai RM, Anania FA, Schaeffer M, Galai N, Nolt K, Nelson KE, Strathdee SA, Johnson L, Laeyendecker O, Boitnott J, Wilson LE, Vlahov D., The Natural History of Hepatitus C Virus Infection. JAMA 2000; 284 (4): 450-456
【非特許文献２】Ly, K., Xing J, Klevens RM, Jiles RB, Ward JW, Holmberg SD. The Increasing Burden of Mortality From Viral Hepatitis in the United States Between 1999 and 2007. Annals of Internal Medicine 156, 271-278 (2012)
【非特許文献３】Blackard JT, Shata MT, Shire NJ, Sherman KE., Acute Hepatitus C Virus Infection: A Chronic Problem., Hepatology 2008; 47(1):321-331
【非特許文献４】Lauer G M, Walker B D. Hepatitis C virus infection. N Engl J Med 2001 Jul. 5; 345(1):41-52
【非特許文献５】Manns M P, McHutchison J G, Gordon S C, Rustgi V K, Shiffman M, Reindollar R, et al. Peginterferon alfa-2b plus ribavirin compared with interferon alfa-2b plus ribavirin for initial treatment of chronic hepatitis C: a randomised trial. Lancet 2001 Sep. 22; 358(9286):958-965
【非特許文献６】Fried M W, Shiffman M L, Reddy K R, Smith C, Marinos G, Goncales F L, Jr., et al. Peginterferon α-2a plus ribavirin for chronic hepatitis C virus infection. N Engl J Med 2002 Sep. 26; 347(13):975-982
【非特許文献７】Kau A, Vermehren J, Sarrazin C. Treatment predictors of a sustained virologic response in hepatitis B and C. J Hepatol 2008 October; 49(4):634-651
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【非特許文献２０】Ghany, M., Nelson, D.R., Strader, D.B., Thomas, D.L. & Seeff, L.B. An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis c virus infection: 2011 practice guidelines by the American association for the Study of Liver Diseases. Hepatology, Dec 12 (doi: 10.1002/hep.25524) (2011)
【非特許文献２１】Rauch, A. et al. Genetic variation in IL28B Is associated with chronic hepatitis C and treatment failure: a genome-wide association study. Gastroenterology 138, 1338-1345 (2010)
【非特許文献２２】Thomas, D.L. et al. Genetic variation in IL28B and spontaneous clearance of hepatitis C virus. Nature 461, 798-801 (2009)
【非特許文献２３】Ge, D. et al. Genetic variation in IL28B predicts hepatitis C treatment-induced viral clearance. Nature 461, 399-401 (2009)
【非特許文献２４】Suppiah, V. et al. IL28B is associated with response to chronic hepatitis C interferon-alpha and ribavirin therapy. Nat Genet 41, 1100-4 (2009)
【非特許文献２５】Tanaka, Y. et al. Genome-wide association of IL28B with response to pegylated interferon-alpha and ribavirin therapy for chronic hepatitis C. Nat Genet 41, 1105-9 (2009)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
現在の試験が慢性ＨＣＶ感染症の治療に対する反応者（responders）を特定するのに有用であることは分かっているが、自然消失及び治療に対する反応を予測する、よりロバストでかつ正確な試験が依然として必要とされている。さらに、現在の試験では個体からの核酸分子の単離及び遺伝子型決定が必要とされる。最後に、上述のように、或る一定の集団は未だに現在の治療法を用いた慢性ＨＣＶ感染症の治療に反応を示さない。そのため、これらの患者に対して新規の方法及び治療が必要とされている。本発明は、これらの必要性を満たすとともに、他の恩恵を与えるものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、新規のヒトタンパク質であるインターフェロン−λ４（ＩＦＮＬ４）及び関連の核酸分子（例えばＤＮＡ、ｍＲＮＡ）の同定と、それらのＨＣＶ感染症の自然消失及びＨＣＶ感染症の治療に対する反応との関連性とに関する。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の連続アミノ酸を含む単離タンパク質を提供する。特定の実施形態では、単離タンパク質はＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化する。特定の実施形態では、単離タンパク質は配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも約３０個の連続するアミノ酸、少なくとも約４０個の連続するアミノ酸、少なくとも約６０個の連続するアミノ酸、少なくとも約８０個の連続するアミノ酸、少なくとも約１００個の連続するアミノ酸、少なくとも約１１０個の連続するアミノ酸、少なくとも約１４０個の連続するアミノ酸を含む。
【００１２】
一実施形態では、単離タンパク質は少なくとも５０個の連続するアミノ酸の配列を含み、該少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一である。
【００１３】
一実施形態では、単離タンパク質は、配列番号２由来の少なくとも１５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一である少なくとも１５０個の連続するアミノ酸の配列を含む。
【００１４】
一実施形態では、単離タンパク質は少なくとも５０個の連続するアミノ酸の配列を含み、該少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列は配列番号２からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一であり、下記のものからなる群から選択される少なくとも１つの配列特徴を更に含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の５１位に相当する位置のグルタミン酸残基、
ｍ．配列番号２の６２位に相当する位置のシステイン残基、
ｎ．配列番号２の７６位に相当する位置のシステイン残基、
ｏ．配列番号２の８７位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｑ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｒ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｓ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｔ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｕ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｖ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｗ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｘ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｙ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｚ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ａａ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｂｂ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｃｃ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００１５】
一実施形態では、単離タンパク質は配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一のアミノ酸配列を含み、該単離タンパク質は下記のものからなる群から選択される少なくとも１つの配列特徴を含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｍ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｎ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｏ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｑ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｒ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｓ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｔ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｕ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｖ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ｗ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｘ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｙ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００１６】
一実施形態では、単離タンパク質は配列番号２に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一のアミノ酸配列を含み、該単離タンパク質は下記のものからなる群から選択される少なくとも１つの配列特徴を含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の５１位に相当する位置のグルタミン酸残基、
ｍ．配列番号２の６２位に相当する位置のシステイン残基、
ｎ．配列番号２の７６位に相当する位置のシステイン残基、
ｏ．配列番号２の８７位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｑ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｒ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｓ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｔ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｕ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｖ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｗ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｘ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｙ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｚ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ａａ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｂｂ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｃｃ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００１７】
一実施形態では、タンパク質は、配列番号２からなるタンパク質に選択的に結合する抗体の誘発、配列番号２からなるタンパク質に対して産生される抗体への選択的な結合、配列番号２からなるタンパク質と結合する化合物への選択的な結合、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の発現の活性化、及び図１５に挙げられる少なくとも１つのインターフェロン刺激遺伝子（Interferon Stimulated Genes：ＩＳＧ）の発現の誘導からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、本発明の単離タンパク質をコードする核酸配列及びそれと完全に相補的な核酸配列から選択される核酸配列を含む単離核酸分子を提供する。或る特定の実施形態では、核酸分子は、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７及び配列番号９からなる群から選択される核酸配列を含む。本発明の一実施形態は本発明の単離核酸分子を含有するプラスミドを提供する。同様に、本発明の別の実施形態は、本発明の単離核酸分子を含有するウイルスを提供する。
【００１９】
本発明の一実施形態は、本発明のＩＦＮＬ４タンパク質と選択的に結合する単離抗体である。本発明の別の実施形態は、本発明のＩＦＮＬ４タンパク質と選択的に結合する抗体の結合を阻害する単離抗体を提供する。
【００２０】
本発明の一実施形態は、個体から生物サンプルを得て、サンプルを分析することで、本発明のＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質の有無を判断することによって、個体のＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を予測する方法である。この方法では、ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質の非存在は個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性の増大を示す。この方法では、ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質の存在は個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性の低減を示す。
【００２１】
本発明の一実施形態は、個体から生物サンプルを得て、サンプルを分析することで、本発明のＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質の有無を判断することによって、個体のＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性を予測する方法である。この方法では、本発明のＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質の非存在は個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性の増大を示唆する。代替的にはこの方法では、ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質の存在は個体がＨＣＶ感染症に反応を示す可能性の低減を示す。一実施形態では、ＩＦＮＬ４タンパク質の存在は、個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示すことが不可能であると予測されることを示す。
【００２２】
本発明の一実施形態は、個体から生物サンプルを得て、存在する場合にサンプルに存在するＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質のレベルを決定することによって個体のＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を予測する方法である。この実施形態では、サンプルに存在するＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質のレベルは、個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を示すものである。この方法では、ＨＣＶ感染症を消失させることが可能であることが既に知られている被験体に存在するＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質のレベル未満のサンプルにおけるＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質のレベルは、個体がＨＣＶ感染症を消失させることが可能であると予測されることを示す。この方法では、ＨＣＶ感染症を消失させることが不可能であることが既に知られている被験体に存在するＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質のレベルを上回るサンプルにおけるＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質のレベルは、個体がＨＣＶ感染症を消失させることが不可能であると予測されることを示す。
【００２３】
本発明の一実施形態は、個体から生物サンプルを得て、サンプルを分析することで、サンプルに存在するＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質の存在、不存在又はレベルを決定し、サンプルに存在するＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質の有無又は量に基づき治療を施すか否かを判断することによって慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染症を患う患者を治療する方法である。
【００２４】
本発明の一実施形態は、サンプルにおけるＩＦＮＬ４タンパク質の存在、不存在又はレベルを決定するのに有用なキットである。このキットは本発明のＩＦＮＬ４タンパク質を特異的に認識する抗体を含む。一実施形態では、キットは個体のＨＣＶ感染症を自然消失させる能力を判断するための取扱説明書を含む。一実施形態では、キットは個体のＨＣＶ感染症の治療に反応を示す能力を判断するための取扱説明書を含む。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、ＩＦＮＬ４−ｐ１７９、ｐ１３１及びｐ１０７（配列番号２、配列番号５及び配列番号８）からなる群から選択されるタンパク質に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する変異型ＩＦＮＬ４ポリペプチドであって、配列番号２の付番方式を用いて、Ａ１０Ｐ、Ａ１１Ｐ、Ｌ１３Ｍ、Ｖ１５Ｆ、Ｃ１７Ｙ、Ｖ１９Ｍ、Ｉ２０Ｖ、Ａ２１Ｐ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ２８Ｍ、Ｌ３５Ｍ、Ｌ４０Ｍ、Ｇ１１６Ｒ、Ａ１２１Ｐ、Ａ１２６Ｐ、Ｐ１２８Ａ、Ｇ１２９Ａ、Ｓ１３０Ｐ、Ｒ１３２Ｇ、Ｐ１３５Ａ、Ｋ１３９Ｒ、Ｒ１４０Ｇ、Ｋ１４３Ｅ、Ｒ１４６Ｋ、Ｓ１４９Ｐ、Ｐ１５０Ａ、Ｋ１５４Ｅ、Ａ１５５Ｐ、Ｓ１５６Ｇ、Ｖ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｖ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６４Ｍ及びＬ１６９Ｆからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、変異型ＩＦＮＬ４ポリペプチドを提供する。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、ＩＦＮＬ４  ｐ１７９、ｐ１３１及びｐ１０７（配列番号２、配列番号５及び配列番号８）からなる群から選択されるタンパク質に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する変異型ＩＦＮＬ４ポリペプチドであって、配列番号２の付番方式を用いて、Ａ１０Ｐ、Ａ１１Ｐ、Ｌ１３Ｍ、Ｖ１５Ｆ、Ｃ１７Ｙ、Ｖ１９Ｍ、Ｉ２０Ｖ、Ａ２１Ｐ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ２８Ｍ、Ｌ３５Ｍ、Ｌ４０Ｍ、Ｅ５２Ｋ、Ｌ５５Ｍ、Ｗ５７Ｒ、Ｒ６０Ｐ、Ｎ６１Ｈ、Ｓ６３Ｐ、Ｆ６４Ｖ、Ｒ６５Ｇ、Ｄ６９Ｈ、Ｐ７０Ｓ、Ｐ７１Ｔ、Ｒ７２Ｇ、Ｇ１１６Ｒ、Ａ１２１Ｐ、Ａ１２６Ｐ、Ｐ１２８Ａ、Ｇ１２９Ａ、Ｓ１３０Ｐ、Ｒ１３２Ｇ、Ｐ１３５Ａ、Ｋ１３９Ｒ、Ｒ１４０Ｇ、Ｋ１４３Ｅ、Ｒ１４６Ｋ、Ｓ１４９Ｐ、Ｐ１５０Ａ、Ｋ１５４Ｅ、Ａ１５５Ｐ、Ｓ１５６Ｇ、Ｖ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｖ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６４Ｍ及びＬ１６９Ｆからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、変異型ＩＦＮＬ４ポリペプチドを提供する。
【００２７】
一実施形態では、本発明は、ＩＦＮＬ４−ｐ１７９、ｐ１３１及びｐ１０７（配列番号２、配列番号５及び配列番号８）からなる群から選択されるタンパク質に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する変異型ＩＦＮＬ４ポリペプチドであって、配列番号２の付番方式を用いて、Ａ１０Ｐ、Ａ１１Ｐ、Ｌ１３Ｍ、Ｖ１５Ｆ、Ｃ１７Ｙ、Ｖ１９Ｍ、Ｉ２０Ｖ、Ａ２１Ｐ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ２８Ｍ、Ｌ３５Ｍ、Ｌ４０Ｍ、Ｅ５２Ｋ、Ｌ５５Ｍ、Ｗ５７Ｒ、Ｒ６０Ｐ、Ｎ６１Ｈ、Ｓ６３Ｐ、Ｆ６４Ｖ、Ｒ６５Ｇ、Ｄ６９Ｈ、Ｐ７０Ｓ、Ｐ７１Ｔ、Ｒ７２Ｇ、Ｒ７８Ｇ、Ｖ９２Ｍ、Ｌ９３Ｉ、Ｌ１０１Ｍ、Ｌ１０２Ｆ、Ｇ１１６Ｒ、Ａ１２１Ｐ、Ａ１２６Ｐ、Ｐ１２８Ａ、Ｇ１２９Ａ、Ｓ１３０Ｐ、Ｒ１３２Ｇ、Ｐ１３５Ａ、Ｋ１３９Ｒ、Ｒ１４０Ｇ、Ｋ１４３Ｅ、Ｒ１４６Ｋ、Ｓ１４９Ｐ、Ｐ１５０Ａ、Ｋ１５４Ｅ、Ａ１５５Ｐ、Ｓ１５６Ｇ、Ｖ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｖ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６４Ｍ及びＬ１６９Ｆからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を有する、変異型ＩＦＮＬ４ポリペプチドを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】５０ｕｇ／ｍｌのＰｏｌｙＩ：Ｃを用いて０時間、１時間、２時間、４時間、８時間又は２４時間活性化させた正常な初代ヒト肝細胞におけるＲＮＡ−シークエンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）の結果を示す図である。結果は、ＩＦＮＬ１（ＩＬ２９）、ＩＦＮＬ２（ＩＬ２８Ａ）、ＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）及び非関連対照として使用される幾つかの他の遺伝子を包含するヒト第１９染色体の１５０Ｋｂゲノム領域について提示されている。関連の遺伝子変異体ｒｓ１２９７９８６０及びｒｓ８０９９９１７の場所が示されている。
【図２】ＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）遺伝子の上流にあるインターフェロン−λ４タンパク質をコードする新規のＩＦＮＬ４遺伝子のＲＮＡ−ｓｅｑによる同定を示す図である。ＲＮＡ−ｓｅｑから、ＰｏｌｙＩ：Ｃで処理した初代ヒト肝細胞におけるＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）及び新規の転写領域の時間依存性の活性化が示される。
【図３】１０種の新規の転写産物（ＮＣＢＩアクセッション番号は図４に与えられる）のスプライシング構造を示す図である。ＧＷＡＳマーカーｒｓ１２９７９８６０はイントロン１内に位置しており、ＴＴ又はΔＧ対立遺伝子を有する新規のマーカーｓｓ４６９４１５５９０はエクソン１内に位置しており、全ての転写産物に共通するものである。転写開始部位を矢印で示し、ＯＲＦを青色で影付けし、ａａはアミノ酸である。ＩＦＮＬ４特異的なタンパク質コーディングフレームは、ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ転写産物の第１エクソン内のｓｓ４６９４１５５９０のΔＧ欠失対立遺伝子によって生成される。１０７、１３１又は１７９ａａのＩＦＮＬ４タンパク質アイソフォームは、３つ、４つ又は５つのエクソンを有する転写産物によって生成される。
【図４】ＩＦＮＬ４領域内で同定され、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに提出された転写産物の情報を示す図である。
【図５】遺伝的変異体ｓｓ４６９４１５５９０のΔＧ又はＴＴ対立遺伝子についてホモ接合型であり、ＰｏｌｙＩ：Ｃを用いて０時間、２時間、４時間及び２４時間活性化させたヒト肝細胞サンプルにおける完全長ＩＦＮＬ４アイソフォームのｍＲＮＡ発現を示す図である。欠失（ΔＧ）対立遺伝子は１７９、１３１又は１０７ａａのタンパク質を生成するフレームシフトを導入する。挿入（ＴＴ）対立遺伝子は、ナンセンス変異依存分解機構（nonsense-mediated decay）によって分解されると考えられる幾つかの早期終結（prematurely terminated）転写産物を生成する。プライマーは開始コドン及び停止コドンを包含するＩＦＮＬ４の完全長アンプリコンを検出するものである。ＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）及びＩＦＮＬ１（ＩＬ２９）転写産物の発現も示されるが、これは両遺伝子型を有するサンプルにおけるＰｏｌｙＩ：Ｃ処理によって誘導される。同じサンプルにおける内部対照であるＰＰＩＡの発現をローディング対照（loading control）として使用する。全サンプルをＤＮアーゼＩで処理して、シグナルはＲＮＡ発現のみに特異的であるとされる。
【図６】ＩＦＮＬ４−ｐ１７９タンパク質とクラス２のサイトカインファミリーの選択成員との比較を示す図である。
【図７】ＩＦＮＬ４タンパク質アイソフォームｐ１７９、ｐ１３１及びｐ１０７、並びにヒトＩＦＮＬ１（ＩＬ２９）、ＩＦＮＬ２（ＩＬ２８Ａ）、ＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）及びＩＦＮ−αタンパク質のアミノ酸配列アラインメントを示す図である。影付き処理は同一のアミノ酸であり、ＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）タンパク質におけるジスルフィド結合に関わるシステインの位置（Ｃ１６−Ｃ１１５、Ｃ５０−Ｃ１４８、Ｃ１６７−Ｃ１７４）と、フレームシフト変異体ｓｓ４６９４１５５９０、ＩＬ−２８Ｒ１との相互作用に重要なアミノ酸（＃２７、３３、３４、３６、３７、４４、５３、１５５、１５８）及びＩＬ−１０Ｒ２との相互作用に重要なアミノ酸（＊９７、＊１００）の位置とが矢印で示される。付番は、リーダーペプチドを除去した後の成熟ＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）タンパク質（Ｑ８ＩＺＩ９）に基づく（Gad H, Dellgren, C, et al. Interferon-λ is functionally an interferon but structurally related to the interleukin-10 family, the Journal of Biological Chemistry, 2009）。ヘリックスタンパク質構造は、Trivella et al. Structure and function of interleukin-22 and other members of the interleukin-10 family, Cell. Mol. Life Sci., 2010に従って示される。ＩＦＮＬ４遺伝的変異体の位置も示される。
【図８】マウス抗ＩＦＮＬ４モノクローナル抗体によるウェスタンブロットタンパク質検出を示す図である。使用するタンパク質は、４つの濃度の精製された組換えＩＦＮＬ４−ｐ１７９、ＩＦＮＬ４−ｐ１７９−Ｈａｌｏ発現構築物を一過性トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞由来の粗溶解物又は馴化培地、並びに精製されたＩＦＮＬ４−ｐ１０７、ＩＦＮ−α及びＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）タンパク質である。
【図９】ＩＦＮＬ４−Ｈａｌｏ発現構築物を一過性トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における抗ＩＦＮＬ４マウスモノクローナル抗体又は抗Ｈａｌｏ抗体によるＩＦＮＬ４発現の共焦点画像を示す図である。両抗体はＩＦＮＬ４の細胞内発現を同じように検出した。ｓｓ４６９４１５５９０についてヘテロ接合型の個体由来の初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）で内因性発現したＩＦＮＬ４の共焦点画像において、ＩＦＮＬ４発現はＰｏｌｙＩ：Ｃによる処理又はＨＣＶによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染によって誘導される。
【図１０】５０μｇ／ｍｌのｐｏｌｙＩ：Ｃで０時間、２時間、４時間、８時間又は２４時間処理したｓｓ４６９４１５５９０の異なる遺伝子型（ＴＴ／ＴＴ、ＴＴ／ΔＧ又はΔＧ／ΔＧ）の保因者由来のＰＨＨの共焦点画像を示す図である。赤色がＩＦＮＬ４であり、緑色が細胞骨格（α−チューブリン）であり、青色が核である。細胞内ＩＦＮＬ４発現はリスク遺伝子型（ＴＴ／ΔＧ又はΔＧ／ΔＧ）の保因者由来のＰＨＨでのみ検出される。
【図１１】マウス及びウサギ抗ＩＦＮＬ４モノクローナル抗体の概要：タンパク質内の位置及びＨｅｐＧ２細胞における対応する発現構築物の一過性トランスフェクション後の異なるタンパク質アイソフォームの検出パターンを示す図である。
【図１２】ＨｅｐＧ２細胞における４５のヒトシグナリング経路を表すルシフェラーゼレポーター構築物を用いた経路ファインダ分析（Pathway Finder Analysis）を示す図である。細胞に発現構築物若しくは空ベクターを一過性トランスフェクトするか、又は細胞を１０ｎｇ／ｍｌの精製された組換えＩＦＮ−α、ＩＦＮＬ３、ＩＦＮＬ４で、若しくはＰＢＳで処理した。全ての結果を２回の独立した生物学的トランスフェクション及び／又は処理反復の平均値で表す。誤差バーは標準偏差である。矩形の印は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮＬ３による処理、及びＩＦＮＬ４構築物の一過性トランスフェクションによって有意に誘導されたレポーター（ＩＳＲＥ−Ｌｕｃ及びＩＲＦ３−Ｌｕｃ）である。
【図１３】ＩＳＲＥ−Ｌｕｃレポーターを一過性同時トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞株におけるＩＦＮＬ４、ｐ１３１又はｐ１０７を発現する構築物のトランスフェクション、及び精製された組換えＩＦＮ−α又はＩＦＮＬ３での処理後のルシフェラーゼ活性を示す図である。結果を空ベクター（モック（mock））のトランスフェクション後に見られる活性に対して正規化して、８回の生物学的反復の平均値で示す。ＩＳＲＥ−Ｌｕｃレポーターを安定して発現するＨｅｐＧ２細胞株におけるＩＦＮＬ４、ｐ１３１又はｐ１０７を発現する構築物の一過性トランスフェクション後のルシフェラーゼ活性。結果は空ベクター（モック）のトランスフェクション後に見られる活性に対して正規化して、１１回の生物学的反復の平均値で示す。空ベクター（モック）のトランスフェクション後に見られる効果と比較したサブゲノムルシフェラーゼ発現ＨＣＶレプリコン（ＨＣＶ−Ｌｕｃ）を安定して発現するＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞へと一過性トランスフェクトしたＩＦＮＬ４、ｐ１３１及びｐ１０７についての発現構築物の抗ウイルス効果の試験。結果は４回の生物学的反復の平均値で示す。誤差バーは標準誤差である。
【図１４】ＩＦＮＬ４−ｐ１７９−Ｈａｌｏを包含する６種のタンパク質アイソフォームを発現する構築物を一過性トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞におけるＴｙｒ７０１でリン酸化したＳＴＡＴ１（ｐＳＴＡＴ１）及びＴｙｒ６８９でリン酸化したＳＴＡＴ２（ｐＳＴＡＴ２）のタンパク質ブロット分析を示す図である。全ての構築物はＨａｌｏタグと融合させ、Ｈａｌｏタグに対する抗体で検出可能なタンパク質を産生する。ＩＦＮＬ４に対するウサギモノクローナル抗体は、ｐ１７９と非機能性アイソフォームｐ１３１及びｐ１０７とを認識する。
【図１５】大域ＲＮＡ−ｓｅｑ分析に基づく、ＨｅｐＧ２細胞におけるＩＦＮＬ４構築物の一過性過剰発現によって活性化した上位の標準経路及び個々の転写産物の分析を示す図である。異なる条件でのＨｅｐＧ２細胞における選択ＩＳＧの発現を、未処理の、又は空ベクター（モック）、ＩＦＮＬ４−ｐ１７９、ＩＦＮＬ４−ｐ１３１若しくはＩＦＮＬ４−ｐ１０７をトランスフェクトした、又は１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−α若しくはＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）単独で処理した、又はモック若しくはＩＦＮＬ４−ｐ１７９でのトランスフェクション後に１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−α若しくはＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）で処理した細胞において分析した。ＩＳＧの発現は特異的アッセイを用いたｑＲＴ−ＰＣＲによって分析して、同じサンプルで測定された４つの内部対照の発現に対して正規化した。データをｌｏｇ２スケールで表し、負の値がより小さければ、発現がより高いことを示す。誤差バーは９５％信頼区間での平均値を示す。
【図１６】ＨｅｐＧ２、２９３Ｔ及びＨｅＬａ細胞へと一過性トランスフェクトしたＩＳＲＥ−Ｌｕｃ  Ｃｉｇｎａｌレポーターを用いたＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化の試験を示す図である。一過性同時トランスフェクトしたＩＦＮＬ４−ｐ１７９、ｐ１０７及びｐ１３１発現構築物による、又は指定濃度での精製された組換えＩＦＮ−α及びＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）タンパク質による活性化。反応の倍数（Fold response）はモック対照（空ベクターのトランスフェクション）と比較したものである。誤差バーは９５％信頼区間で４回〜８回の独立した生物学的反復の平均値を示す。
【図１７】ＩＦＮＬ４の８３の部位特異的突然変異体の分析を示す図である。ＩＦＮＬ４のタンパク質配列をＩＦＮＬ３とともに並べて、保存アミノ酸は影付き処理をしている。特定位置でのＩＦＮＬ４単一点突然変異はアミノ酸番号（上方）で示し、変化のタイプは配列（の下方）に示している。生物活性は、ＨｅｐＧ２細胞における一過性トランスフェクトしたＩＳＲＥ−Ｌｕｃ  Ｃｉｇｎａｌレポーター構築物の導入として測定されるＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を活性化する能力と定義され、構築物それぞれに対して４回の生物反復を行う。全ての突然変異体の結果はＷＴ−ＩＦＮＬ４の活性に対して正規化したものである。
【図１８】特定カテゴリーにおける８３のＩＦＮＬ４突然変異体（システイン残基（ｎ＝７）及びＩＦＮＬ３とＩＦＮＬ４とで保存される非システイン残基（ｎ＝３８）又はＩＦＮＬ３とＩＦＮＬ４とで保存されない非システイン残基（ｎ＝３８））の生物活性を示す図である。６つの非多型システインの突然変異はいずれもＩＦＮＬ４の活性を排除する。例外はＩＦＮＬ４のＩＳＲＥ−Ｌｕｃレポーターを活性化する能力に影響を及ぼさなかった自然遺伝的変異体Ｃｙｓ１７Ｔｙｒである。ＩＦＮＬ３とＩＦＮＬ４とで保存される残基の割合が有意に高いこと（両側独立（two-sided non-paired）ｔ検定でｐ＝０.００５）は、これらの残基がＩＦＮＬ４の生物活性を保持するのに重要であることを示唆するものである。７つの非保存ＩＦＮＬ４特異的残基はＩＦＮＬ４の生物活性に重要であることが見出された。
【図１９】ＩＦＮＬ４遺伝子内の遺伝的変異体によって引き起こされるアミノ酸変化を示す図である。アミノ酸変化のぞれぞれはｓｓ４６０４１５５９０変異体のΔＧ対立遺伝子を保有する特定のハプロタイプに属するものであり、そのためこれらのアミノ酸変化はＩＦＮＬ４タンパク質が産生される場合にのみ存在する。ｓｓ４６０４１５５９０のＴＴ対立遺伝子を有するハプロタイプではアミノ酸変化は起こらず、その場合ＩＦＮＬ４は産生されない。
【図２０】抗ウイルス反応に関わる３３の転写産物の発現に基づき、特異的な対立遺伝子タンパク質構築物（ＷＴ−ＩＦＮＬ４、Ｃｙｓ１７Ｔｙｒ、Ａｒｇ６０Ｐｒｏ及びＰｒｏ７０Ｓｅｒ）を一過性トランスフェクトしたＨｅｐＧ２におけるｑＲＴ−ＰＣＲによって３回の生物反復で測定された、主成分分析（ＰＣＡ）を示す図である。ＰＣＡプロットは、Ｐｒｏ７０Ｓｅｒ突然変異体がＷＴ−ＩＦＮＬ４タンパク質並びに互いに近くでクラスターを形成しているＣｙｓ１７Ｔｙｒ及びＡｒｇ６０Ｐｒｏ突然変異体群の両方とは異なることを示している。
【図２１】図２０で提示される実験の結果に基づく、発現がＨｅｐＧ２細胞におけるＩＦＮＬ４対立遺伝子タンパク質構築物（ＷＴ−ＩＦＮＬ４、Ｃｙｓ１７Ｔｙｒ、Ａｒｇ６０Ｐｒｏ及びＰｒｏ７０Ｓｅｒ）の一過性発現による影響を有意に受けた転写産物についてのＨｅａｔｍａｐプロットを示す図である。突然変異体Ｃｙｓ１７Ｔｙｒ及びＡｒｇ６０Ｐｒｏがこれらの転写産物に対して同じような効果を示す一方で、Ｐｒｏ７０Ｓｅｒは、ＷＴ−ＩＦＮＬ４をトランスフェクトした細胞と比較してのＩＬ１５、ＩＬ１８、ＣＴＳＢ、ＦＯＳ及びＳＰＰ１転写産物の発現の低下と、ＷＴ−ＩＦＮＬ４をトランスフェクトした細胞と比較してのＤＡＫ、ＩＲＦ７、ＤＨＸ５８及びＡＰＯＢＥＣ３Ｇ転写産物の発現の上昇と、を引き起こしているという点でＷＴ−ＩＦＮＬ４との大きな違いを示した。カラーチャートは、ＷＴ−ＩＦＮＬ４と比較しての突然変異体によって引き起こされるｌｏｇ２スケールの発現の変化に対応するものである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本発明は概して、ｓｓ４６０４１５５９０遺伝的変異体の少なくとも１つの欠失（ΔＧ）対立遺伝子を保有する個体において生成されるＩＦＮＬ４と呼ばれる新規のインターフェロン遺伝子、並びに対応するｍＲＮＡ及びタンパク質に関する。本発明は、個体がＨＣＶ感染症を自然消失させるか、又はＨＣＶ感染症の治療的処置に反応を示す可能性を決定するのにＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質を使用する方法にも関する。より具体的には本発明は、個体によって産生されるＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質の量が、個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる又はＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性と相関するという発見に基づくものである。本発明は、ＨＣＶ感染症の個体を治療するのに使用することができる化合物の同定のためのＩＦＮＬ４タンパク質の使用にも関する。
【００３０】
本発明は、米国仮出願第６１／５４３６２０号、現在の２０１２年１０月５日付けで出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／５９０４８号（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）で詳細に記載された本発明者のこれまでの研究の延長線上にある。本発明者らのこれまでの研究において、ｓｓ４６９４１５５９０（ＮＣＢＩ参照番号ＮＣ＿００００１９．９：［ｇ．３９７３９１５４ｄｅｌＴ；ｇ．３９７３９１５５Ｔ＞Ｇ］）と称される新規の化合物多型が発見されている。ｓｓ４６９４１５５９０多型は、ヒト第１９染色体上の３９７３９１５４位と３９７３９１５５位とで起こる２つのヌクレオチド変異からなるものであり、その座標は２００９年２月のヒトゲノム参照（ＧＲｃｈ３７／ｈｇ１９）に基づく。より具体的には、ｓｓ４６９４１５５９０多型は、単一塩基欠失多型（Ｔ／Δ）と単一塩基置換多型（Ｔ／Ｇ）とからなるものであり、これらは完全な連鎖不平衡にある（ｒ２＝１.０）。本発明者らは、ＰｏｌｙＩ：Ｃでの処理後に、この領域から新規のｍＲＮＡ転写産物が産生されることも発見している（図１）。これらの転写産物の分析から単一転写部位とその後のタンパク質翻訳開始部位とが同定され、このことはこの領域から新規のタンパク質が産生されることを示唆している（図２）。さらに、３９７３９１５４位のチミジンの欠失が推定タンパク質のアミノ酸２２でのフレームシフトを引き起こし、それにより下流のリーディングフレームが改変する（図３）。この領域由来の転写産物の分析から、かかるフレームシフトが、１７９アミノ酸のタンパク質（本明細書ではＩＦＮＬ４−ｐ１７９と称される）と、選択的エクソンの包含に違いがある１３１アミノ酸及び１０７アミノ酸を有するＩＦＮＬ４の２種のアイソフォーム（それぞれｐ１３１及びｐ１０７）との３種の新規の関連タンパク質を包含する６種の推定タンパク質の産生をもたらすことが示された。合計１０種の転写産物がＩＦＮＬ４領域で検出され、ＮＣＢＩ  ＧｅｎＢａｎｋに寄託されている（図４）。ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡの発現は、リスクｓｓ４６９４１５５９０  ΔＧ対立遺伝子についてホモ接合型の個体由来のＰｏｌｙＩ：Ｃによって活性化された肝細胞でのみ検出され、非リスクＴＴ対立遺伝子についてホモ接合型の個体由来のものでは検出されなかった（図５）。ＩＦＮＬ４−ｐ１７９配列の分析から、このタンパク質がヒトＩＦＮ−λタンパク質、特にＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）、及び一部の他のクラス２のサイトカインファミリータンパク質との強い類似性を有することが示された（図６、図７）。
【００３１】
したがって、本発明の一実施形態は、配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも約３０個の連続するアミノ酸、少なくとも約４０個の連続するアミノ酸、少なくとも約５０個の連続するアミノ酸、少なくとも約６０個の連続するアミノ酸、少なくとも約７０個の連続するアミノ酸、少なくとも約８０個の連続するアミノ酸、少なくとも約９０個の連続するアミノ酸又は少なくとも約１００個の連続するアミノ酸を含む単離タンパク質である。一実施形態では、単離タンパク質は、配列番号２及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも約１１０個の連続するアミノ酸、少なくとも約１２０個の連続するアミノ酸又は少なくとも約１３０個の連続するアミノ酸を含む。一実施形態では、単離タンパク質は、配列番号２由来の少なくとも約１４０個の連続するアミノ酸又は少なくとも約１５０個の連続するアミノ酸を含む。アミノ酸配列に関して本明細書で使用される「約」という用語は連続アミノ酸の数が最大５％まで変更し得ることを意味する。そのため、約４０個の連続するアミノ酸は、単離タンパク質が３８連続アミノ酸〜４２連続アミノ酸を含み得ることを意味する。一実施形態では、単離タンパク質は、配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３２】
更なる実施形態の記載に先立って、当然のことながら、特に規定がなければ本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本明細書の主題が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有するものとする。さらに、読み手を助ける上で本発明の理解を促すために、下記の一般的定義が与えられる。
【００３３】
数量を特定していない単数形（"a" "an"）、「１つ又は複数」、及び「少なくとも１つ」という用語は本明細書で区別なく使用することができることに留意する。「含む（comprising）」、「包含する（including）」及び「有する」という用語も区別なく使用することができる。さらに「からなる群から選択される」という語句は、その語句の前に述べられた（follows）リストにおける群の１つ又は複数の成員を指すものであり、２つ以上の成員の混合物（すなわち組合せ）を包含する。本明細書で使用される「少なくとも１つ」は１つ又は複数を意味する。「含む」という用語は一般的に「包含する」、すなわち「１つ又は複数の特徴又は構成要素の存在を許容する」の意味で使用される。様々な実施形態の記載で「含む」という用語が用いられる場合、一部の具体例において、一実施形態では「から本質的になる」という語句を用いて代替的に記載することができることを当業者が理解するであろうことが更に理解される。
【００３４】
本明細書で使用される「単離（isolated, isolating）」、「精製」等の用語は、必ずしも本発明の細胞又は分子の純度を表すものではない。かかる用語は寧ろ、細胞又は分子が自然環境から又は細胞若しくは分子が産生される環境要素から分離されていることを表すものである。例えば、ヒトを包含する、生きている動物に存在する自然発生的な細胞又は分子（例えばＤＮＡ分子、タンパク質等）は単離されていない。しかしながら、同じ細胞又は分子が動物における共存物質（coexisting materials）の一部又は全てから分離されている場合は単離されていると見なす。更なる例として、本発明によれば、個体から得られた血液サンプルに存在するタンパク質分子は単離されていると見なす。当然のことながら、単離とは細胞の純度を表すものではないという考えを踏まえると、更なる精製工程を用いてかかる血液サンプルから得られたタンパク質分子も単離されていると称される。さらに、本発明の単離タンパク質は、例えばその天然源（例えばヒト）から得ることができるか、組換えＤＮＡ技法を用いて産生することができるか、又は化学合成することができる。
【００３５】
タンパク質配列は、そのタンパク質の活性にほとんど又は全く影響を及ぼすことなく変更又は改変することができることが当業者によって理解される。本発明によれば、かかるタンパク質は変異体、対立遺伝子変異体、突然変異体、アイソフォーム、又はホモログと称される。かかる変異体は個体が対立遺伝子変異体をコードする２つの異なる対立遺伝子を保有する結果として自然に生じ得るか、又は遺伝子操作等の技法を用いて構築することができる。タンパク質及びその変異体の命名法に関して、或る形態のタンパク質を参照形態（例えば野生型）と任意に指定すると、他の形態は突然変異体、変異体、アイソフォーム又はホモログと指定される。例えば、特定の対立遺伝子、ひいてはそのコードタンパク質が特定の表現型特徴（例えば疾患の非存在）に関連するか、又は集団の大部分に見られる場合、タンパク質のコード形態は「野生型形態」と称することができ、他の形態を変異体、突然変異体、アイソフォーム又はホモログと称することができる。本発明に関しては、配列番号２、配列番号５又は配列番号８の配列を含むタンパク質が野生型（ｗｔ）タンパク質と見なされる。
【００３６】
このため、本発明の一実施形態はＩＦＮＬ４タンパク質変異体である。より具体的には、本発明の一実施形態は、配列番号２、配列番号５又は配列番号８由来の少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一である、少なくとも９４％同一である、少なくとも９６％同一である、又は少なくとも９８％同一である少なくとも５０個の連続するアミノ酸の配列を含む単離タンパク質である。更なる実施形態では、単離タンパク質は、配列番号２、配列番号５又は配列番号８由来の少なくとも１００個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一である、少なくとも９４％同一である、少なくとも９６％同一である、又は少なくとも９８％同一である少なくとも１００個の連続するアミノ酸の配列を含む。より更なる実施形態では、単離タンパク質は、配列番号２由来の少なくとも１５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一である、少なくとも９４％同一である、少なくとも９６％同一である、又は少なくとも９８％同一である少なくとも１５０個の連続するアミノ酸の配列を含む。一実施形態では、単離タンパク質は、配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも９２％同一である、少なくとも９４％同一である、少なくとも９６％同一である、又は少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含む。２種のタンパク質又は核酸分子間のパーセント同一性を決定する方法は当業者にとって既知である。
【００３７】
かかる変異体に関して、変異体が本明細書に記載の少なくとも１つのＩＦＮＬ４タンパク質活性を保持していれば、アミノ酸配列においていずれのタイプの改変も許容される。かかる変異の例としては、アミノ酸欠失、アミノ酸挿入、アミノ酸置換及びそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。例えば多くの場合、タンパク質の活性に多大な影響を及ぼすことなく１つ又は複数（例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）のアミノ酸をタンパク質のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端から除去することができることが当業者に十分に理解されている。同様に多くの場合、タンパク質の活性に多大な影響を及ぼすことなく１つ又は複数（例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）のアミノ酸をタンパク質に挿入することができる。
【００３８】
上述のように、本発明の単離された変異体タンパク質は、本明細書に開示される野生型ＩＦＮＬ４と比較してアミノ酸置換を含有することもできる。タンパク質の活性に多大な影響を及ぼさなければ、いずれのアミノ酸置換も許容される。これに関して、アミノ酸をその物理的特性に応じてグループ分けすることができることが当該技術分野において認識されている。かかるグループの例としては、荷電アミノ酸、非荷電アミノ酸、極性非荷電アミノ酸及び疎水性アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。置換を含有する変異体はアミノ酸が同じグループのアミノ酸で置換されているものが好ましい。かかる置換は保存的置換と称される。
【００３９】
自然発生的残基を共通する側鎖特性に基づきクラス分けすることができる：
１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、
２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、
３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ、
４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、
５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、及び、
６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００４０】
例えば、非保存的置換はこれらのクラスの内の一つの成員と別のクラスの成員との交換を含み得る。好ましい実施形態では、かかる置換残基をＩＦＮ−α及びＩＦＮ−γタンパク質に対して非ホモ接合型の領域内のヒトＩＦＮＬ４タンパク質に導入することができる。
【００４１】
アミノ酸変化を加える際に、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。各アミノ酸には、その疎水性及び荷電特徴に基づき疎水性親水性指標が割り当てられている。疎水性親水性指標は下記のとおりである：イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン／シスチン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リシン（−３．９）及びアルギニン（−４．５）。タンパク質に対して相互作用的な生物学的機能を与える際にアミノ酸疎水性親水性指標が重要であることは当該技術分野において一般的に理解されている（Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-31）。或る特定のアミノ酸を同じような疎水性親水性指標又はスコアを有する他のアミノ酸へと置換して、同程度の生物活性を保持したままにすることができることが知られている。疎水性親水性指標に基づき変化を加える際に、疎水性親水性指標が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内の置換が特に好ましく、±０.５以内の置換が特により一層好ましい。
【００４２】
さらに、同様なアミノ酸の置換は、特に本発明の場合のように置換により生成される生物学的機能が同等のタンパク質又はペプチドが免疫学的実施形態での使用を目的とする場合に、親水性に基づき有効に行うことができることが当該技術分野において理解される。隣接アミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最大局所平均親水性は、その免疫原性及び抗原性、すなわちタンパク質の生物学的特性と相関する。下記の親水性値がこれらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）、リシン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）及びトリプトファン（−３．４）。同程度の親水性値に基づき変化を加える際、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内の置換が特に好ましく、±０.５以内の置換が特により一層好ましい。親水性に基づき一次アミノ酸配列からエピトープを同定することもできる。
【００４３】
所望のアミノ酸置換（保存的又は非保存的に関わらない）は、かかる置換が望まれる時点で当業者が決定することができる。例えば、アミノ酸置換を用いて、ＩＦＮＬ４タンパク質の重要な残基を同定するか、又は本明細書に記載のＩＦＮＬ４タンパク質の親和性を増減させることができる。アミノ酸置換の例を下記の表１に示す。
【００４４】
【表１】
2015514709.tif 000003
【００４５】
このため本発明の一実施形態では、ＩＦＮＬ４タンパク質変異体は、保存的置換である少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、元のアミノ酸を表１に示される置換例で置換する。
【００４６】
アミノ酸置換に関して、本発明のＩＦＮＬ４タンパク質は、ヒトＩＦＮ−λタンパク質に対して最大２９％の配列同一性（４０％の配列類似性）を有することがこれまでに述べられている。さらに、インターフェロンタンパク質は保存された幾つかのアミノ酸を有することが当業者によって理解される。本発明で開示されたＩＦＮＬ４タンパク質はこれらの保存アミノ酸を多く含有する。かかるアミノ酸は図７において反転表示されている。アミノ酸２７、３３、３４、３６、３７、４４、５３、１５５及び１５８は、第１の受容体ＩＦＮＬＲ１（ＩＬ２８Ｒ１）とのＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）の相互作用に重要であり、アミノ酸９７及び１００は、第２の受容体ＩＬ１０Ｒ２との相互作用に重要である（Gad H, Dellgren, C, et al. Interferon-λ is functionally an interferon but structurally related to the interleukin -10 family, the Journal of Biological Chemistry, 2009）。このため様々な実施形態では、本発明の単離された変異体タンパク質は、これらの保存インターフェロン残基の内の少なくとも１つ又は全てを含有する。したがって、本発明の一実施形態は、少なくとも５０個の連続するアミノ酸の配列を含む単離タンパク質であり、該少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列は配列番号２、配列番号５又は配列番号８由来の少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一又は少なくとも９８％同一であり、該少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列は、下記のものからなる群から選択される少なくとも１つの配列特徴を含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｍ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｎ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｏ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｑ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｒ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｓ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｔ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｕ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｖ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ｗ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｘ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｙ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００４７】
一実施形態では、単離タンパク質は配列要素ａ〜ｙのいずれかの内の少なくとも２種、３種、４種、５種、５種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種又は２５種を含む。
【００４８】
一実施形態では、単離タンパク質は少なくとも５０個の連続するアミノ酸の配列を含み、該少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列は配列番号２、配列番号５又は配列番号８由来の少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一又は少なくとも９８％同一であり、単離タンパク質は下記のものを含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｍ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｎ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｏ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｑ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｒ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｓ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｔ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｕ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｖ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ｗ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｘ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｙ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００４９】
一実施形態では、単離タンパク質は少なくとも１００個の連続するアミノ酸の配列を含み、該少なくとも１００個の連続するアミノ酸配列は配列番号２、配列番号５又は配列番号８由来の少なくとも１００個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一又は少なくとも９８％同一であり、該少なくとも１００個の連続するアミノ酸配列は、下記のものからなる群から選択される少なくとも１つの配列特徴を含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｍ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｎ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｏ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｑ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｒ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｓ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｔ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｕ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｖ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ｗ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｘ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｙ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００５０】
一実施形態では、単離タンパク質は配列要素ａ〜ｙのいずれかの内の少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種又は２５種を含む。
【００５１】
一実施形態では、単離タンパク質は少なくとも１００個の連続するアミノ酸の配列を含み、該少なくとも１００個の連続するアミノ酸配列は配列番号２、配列番号５又は配列番号８由来の少なくとも１００個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一又は少なくとも９８％同一であり、単離タンパク質は下記のものを含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｍ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｎ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｏ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｑ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｒ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｓ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｔ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｕ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｖ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ｗ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｘ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｙ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００５２】
一実施形態では、単離タンパク質は少なくとも１３０個の連続するアミノ酸の配列を含み、該少なくとも１３０個の連続するアミノ酸配列は配列番号２又は配列番号５由来の少なくとも１３０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一であり、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一又は少なくとも９８％同一であり、該少なくとも１３０個の連続するアミノ酸配列は、下記のものからなる群から選択される少なくとも１つの配列特徴を含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の５１位に相当する位置のグルタミン酸残基、
ｍ．配列番号２の６２位に相当する位置のシステイン残基、
ｎ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｏ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｐ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｑ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｒ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｓ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｔ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｕ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｖ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｗ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｘ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ｙ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｚ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ａａ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００５３】
一実施形態では、単離タンパク質は配列要素ａ〜ａａのいずれかの内の少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種、２５種、２６種又は２７種を含む。
【００５４】
一実施形態では、単離タンパク質は少なくとも１３０個の連続するアミノ酸の配列を含み、該少なくとも１３０個の連続するアミノ酸配列は配列番号２又は配列番号５由来の少なくとも１３０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一又は少なくとも９８％同一であり、単離タンパク質は下記のものを含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の５１位に相当する位置のグルタミン酸残基、
ｍ．配列番号２の６２位に相当する位置のシステイン残基、
ｎ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｏ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｐ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｑ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｒ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｓ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｔ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｕ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｖ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｗ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｘ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ｙ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｚ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ａａ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００５５】
一実施形態では、単離タンパク質は少なくとも１５０個の連続するアミノ酸の配列を含み、該少なくとも１５０個の連続するアミノ酸配列は配列番号２由来の少なくとも１５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一又は少なくとも９８％同一であり、該少なくとも１５０個の連続するアミノ酸配列は、下記のものからなる群から選択される少なくとも１つの配列特徴を含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の５１位に相当する位置のグルタミン酸残基、
ｍ．配列番号２の６２位に相当する位置のシステイン残基、
ｎ．配列番号２の７６位に相当する位置のシステイン残基、
ｏ．配列番号２の８７位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｑ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｒ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｓ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｔ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｕ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｖ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｗ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｘ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｙ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｚ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ａａ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｂｂ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｃｃ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００５６】
一実施形態では、単離タンパク質は配列要素ａ〜ｃｃのいずれかの内の少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種、２５種、２６種、２７種、２８種又は２９種を含む。
【００５７】
一実施形態では、単離タンパク質は少なくとも１５０個の連続するアミノ酸の配列を含み、該少なくとも１５０個の連続するアミノ酸配列は配列番号２由来の少なくとも１５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一又は少なくとも９８％同一であり、単離タンパク質は下記のものを含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の５１位に相当する位置のグルタミン酸残基、
ｍ．配列番号２の６２位に相当する位置のシステイン残基、
ｎ．配列番号２の７６位に相当する位置のシステイン残基、
ｏ．配列番号２の８７位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｑ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｒ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｓ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｔ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｕ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｖ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｗ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｘ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｙ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｚ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ａａ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｂｂ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｃｃ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００５８】
本発明の一実施形態は、配列番号８に対してその全長にわたって少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む単離タンパク質であり、該単離タンパク質は、下記のものからなる群から選択される少なくとも１つの配列特徴を含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｍ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｎ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｏ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｑ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｒ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｓ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｔ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｕ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｖ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ｗ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｘ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｙ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００５９】
一実施形態では、単離タンパク質は配列要素ａ〜ｙのいずれかの内の少なくとも２種、３種、４種、５種、５種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種又は２５種を含む。
【００６０】
本発明の一実施形態は、配列番号８に対してその全長にわたって少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む単離タンパク質であり、該単離タンパク質は下記のものを含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｍ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｎ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｏ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｑ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｒ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｓ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｔ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｕ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｖ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ｗ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｘ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｙ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００６１】
本発明の一実施形態は、配列番号５に対してその全長にわたって少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む単離タンパク質であり、該単離タンパク質は、下記のものからなる群から選択される少なくとも１つの配列特徴を含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の５１位に相当する位置のグルタミン酸残基、
ｍ．配列番号２の６２位に相当する位置のシステイン残基、
ｎ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｏ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｐ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｑ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｒ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｓ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｔ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｕ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｖ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｗ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｘ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ｙ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｚ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ａａ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００６２】
一実施形態では、単離タンパク質は配列要素ａ〜ａａのいずれかの内の少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種、２５種、２６種又は２７種を含む。
【００６３】
本発明の一実施形態は、配列番号５に対してその全長にわたって少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含む単離タンパク質であり、該単離タンパク質は下記のものを含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の５１位に相当する位置のグルタミン酸残基、
ｍ．配列番号２の６２位に相当する位置のシステイン残基、
ｎ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｏ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｐ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｑ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｒ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｓ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｔ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｕ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｖ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｗ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｘ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ｙ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｚ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ａａ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００６４】
一実施形態では、単離タンパク質は配列番号２に対してその全長にわたって少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含み、該単離タンパク質は、下記のものからなる群から選択される少なくとも１つの配列特徴を含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の５１位に相当する位置のグルタミン酸残基、
ｍ．配列番号２の６２位に相当する位置のシステイン残基、
ｎ．配列番号２の７６位に相当する位置のシステイン残基、
ｏ．配列番号２の８７位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｑ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｒ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｓ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｔ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｕ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｖ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｗ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｘ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｙ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｚ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ａａ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｂｂ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｃｃ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００６５】
一実施形態では、単離タンパク質は配列要素ａ〜ｃｃのいずれかの内の少なくとも１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種、２５種、２６種、２７種、２８種又は２９種を含む。
【００６６】
一実施形態では、単離タンパク質は配列番号２に対してその全長にわたって少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９４％同一、少なくとも９６％同一又は少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を含み、該単離タンパク質は下記のものを含む：
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の５１位に相当する位置のグルタミン酸残基、
ｍ．配列番号２の６２位に相当する位置のシステイン残基、
ｎ．配列番号２の７６位に相当する位置のシステイン残基、
ｏ．配列番号２の８７位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｑ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｒ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｓ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｔ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｕ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｖ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｗ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｘ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｙ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｚ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ａａ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｂｂ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｃｃ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基。
【００６７】
上述のように、本発明のＩＦＮＬ４タンパク質は、それらのタンパク質がＨＣＶに感染した個体及びかかる感染症のリスクがある個体の診断及び治療の開発に有用な手段となる特定の活性を有する。かかる活性の例としては下記のものが挙げられる：
１）配列番号２からなるタンパク質に選択的に結合する抗体を誘発する能力、
２）配列番号２からなるタンパク質に対して生成される抗体への選択的結合、
３）配列番号２からなるタンパク質と結合する化合物への選択的な結合、及び、
４）ＩＦＮＬ４のＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を誘導する能力。
【００６８】
ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の誘導を測定する方法は当業者にとって既知である。かかる方法の１つはＩＦＮＬ４タンパク質のインターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）の発現を刺激する能力に基づくアッセイである。
【００６９】
一実施形態では、本発明の単離タンパク質は配列番号２からなるタンパク質と選択的に結合する抗体を誘発することができる。一実施形態では、ヒトＩＦＮＬ４のアミノ酸４４〜７４に対応する合成ペプチドを認識する特異的なマウス抗ＩＦＮＬ４抗体が産生された。ウェスタンブロット法による特異的検出は、精製された組換えＩＦＮＬ４タンパク質を用いて行い（図８）、ＩＦＮＬ４−Ｈａｌｏ構築物を一過性トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞及びＰｏｌｙＩ：Ｃでの処理又はＨＣＶのｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染により活性化されたｓｓ４６９４１５５９０についてヘテロ接合型の個体由来の初代ヒト肝細胞の共焦点画像解析を行った（図９）。このため、本発明の実施形態は、ＩＦＮＬ４タンパク質又はその断片を特異的に認識するとともに、それらと結合する抗体を包含する（図１１）。特定の実施形態では、抗体はマウス又はウサギにおいて産生されたモノクローナル抗体であり得る。
【００７０】
一実施形態では、本発明の単離タンパク質は配列番号２からなるタンパク質と結合する化合物に結合することができる。一実施形態では、本発明の単離タンパク質はＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を誘導することが可能である。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「タンパク質の活性にほとんど影響を及ぼすことなく」という語句は、変異体が配列番号２からなるタンパク質の活性の少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を有することを意味する。このため一実施形態では、単離タンパク質は、配列番号２からなるタンパク質の活性の少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を有する。一実施形態では、単離タンパク質は配列番号２からなるタンパク質の活性の少なくとも９８％を有する。場合によっては、単離タンパク質のアミノ酸配列における変異はタンパク質の活性を増大させる。このため、本発明の一実施形態は、配列番号２からなるタンパク質の活性の少なくとも１．２５倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１.７５倍、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも６倍、少なくとも８倍又は少なくとも１０倍のレベルを有する単離タンパク質である。かかる活性の測定及び比較は当該技術分野で既知の方法を用いて達成することができる。例えば、タンパク質に対する抗体を誘発する能力は一般的に、本発明の単離タンパク質を用いて動物（例えばマウス）に免疫付与した後、得られた抗体をタンパク質、例えば配列番号２からなるタンパク質に選択的に結合する能力について試験することによって達成される。本明細書で使用される「選択的に（selectively）」、「選択的な（selective）」、「特異的な」等の用語は、抗体がＩＦＮＬ４に非関連のタンパク質に対するよりも単離ＩＦＮＬ４タンパク質に対してより大きい親和性を有することを示す。より具体的には、「選択的に」、「選択的な」、「特異的な」等の用語は、標準アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ）を用いて測定されるように、単離ＩＦＮＬ４タンパク質に対する抗体の親和性が、陰性対照（例えば非関連タンパク質、例えばアルブミン等）に対する親和性よりも統計学的に有意に高いことを示す。さらに、化合物の本発明のＩＦＮＬ４タンパク質に結合する能力を測定するのに当業者に既知の類似の技法が存在する。
【００７２】
抗体を誘発する能力の試験に加えて、本発明のＩＦＮＬ４タンパク質のＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を活性化する能力を試験することができる。かかるアッセイは一般的に、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ系の構成要素の活性を測定することによって行われる。例えば、ルシフェラーゼアッセイを用いて、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ活性の評価基準として働くレポーター遺伝子の活性を測定することができる。これらのアッセイでは、ルシフェラーゼタンパク質はインターフェロン刺激応答配列（ＩＳＲＥ）の調節下、レポーター遺伝子として使用される。試験された４５のヒトシグナリング経路の中で、ＩＳＲＥ−Ｌｕｃ及びＩＲＦ３−ＬｕｃレポーターのみがＩ型及びＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−ａ及びＩＦＮＬ３）並びにＩＦＮＬ４に対する一過性トランスフェクトした発現構築物によって活性化されたが、精製された組換えＩＦＮＬ４タンパク質又は他のタンパク質アイソフォームに対する発現構築物では活性化されなかった（図１２）。これは、ＩＳＲＥ−Ｌｕｃを一過性又は安定してトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における個々のＩＳＲＥ−Ｌｕｃアッセイによって確認された（図１３）。ＩＦＮＬ４は、サブゲノムＨＣＶレプリコンと連結したルシフェラーゼレポーターを発現するＨｕｈ７細胞株での特定の実験において抗ウイルス反応も示した（図１３）。別の実施形態では、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路のタンパク質構成要素のタンパク質活性（例えばウェスタンブロット法によって測定）を測定することができる。例えば、ＳＴＡＴ１タンパク質のチロシンリン酸化を、サイトカイン受容体シグナリング経路の活性の指標としてウェスタンブロット法によって測定することができる。別の実施形態では、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性を、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化をもたらすインターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）の発現レベル、すなわちインターフェロンによって直接又は間接的に刺激される遺伝子の遺伝子発現レベルの測定によって測定することができる。一過性トランスフェクトしたＩＦＮＬ４のみで、ＩＦＮＬ３によって引き起こされるものと同様のＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ２のリン酸化が引き起こされたが、他のタンパク質アイソフォームでは引き起こされなかった（図１４）。
【００７３】
ＩＦＮＬ４タンパク質の生物活性について検査するのに好適な技法が本明細書で開示されるとともに、当業者に既知である。かかるアッセイはｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイとすることができる。有用なアッセイの例としては、酵素結合免疫測定法、競合酵素結合免疫測定法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、化学発光アッセイ、側方流動アッセイ、フロースルーアッセイ、凝集アッセイ、粒子ベースのアッセイ（例えば限定するものではないが、磁気粒子又はプラスチックポリマー、例えばラテックス又はポリスチレンビーズ等の粒子を使用する）、免疫沈降アッセイ、免疫ブロットアッセイ（例えばウェスタンブロット法）、リン光アッセイ、フロースルーアッセイ、クロマトグラフィーアッセイ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）ベースのアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、分光学的定量アッセイ、粒子ベースのアッセイ、電子センサーアッセイ及びフローサイトメトリーアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。かかるアッセイを行う方法は当業者に既知である。アッセイは、その使用方法及び望まれる結果のタイプに応じて定性的、定量的又は半定量的な結果が得られるように設計することができる。
【００７４】
本発明の単離タンパク質は、本明細書に開示される配列及び開示されるその変異体のみからなるものとすることができるが、かかるタンパク質がＩＦＮＬ４活性を与えないが、他の有用な機能を有するアミノ酸配列を更に含有していてもよい。いずれの有用な付加的なアミノ酸配列は、付加的な配列が、配列番号２からなるタンパク質に対する抗体を誘発する、配列番号２からなるタンパク質と選択的に結合する抗体に選択的に結合する、配列番号２からなるタンパク質と結合する化合物に結合する、又はＪＡＫ／ＳＴＡＴ経理の発現を活性化するタンパク質の能力に対して不要な効果を有していなければ、単離タンパク質配列に付加することができる。例えば、本発明の単離タンパク質はペプチドを可視化又は精製するのに有用なアミノ酸配列を含有することができる。かかる配列は標識（例えば酵素）又はタグ（抗体結合部位）として作用する。かかる標識及びタグの例としては、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ、チオレドキシン、ＨＩＳタグ、ビオチンタグ及び蛍光タグが挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質を標識及びタグ付けするのに有用な他の配列が当業者に既知である。
【００７５】
上記の修飾に加えて、配列番号２からなるタンパク質に対する抗体を誘発する、配列番号２からなるタンパク質と選択的に結合する抗体に選択的に結合する、配列番号２からなるタンパク質と結合する化合物に結合する、又はＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の発現を活性化する、タンパク質の能力にほとんど影響を及ぼさなければ、本発明の単離タンパク質を更に修飾することができる。かかる修飾は例えばタンパク質の安定性、可溶性又は吸収性を増大させるために行うことができる。かかる修飾の例としては、ペプチドのペグ化、グリコシル化、リン酸化、アセチル化、ミリスチル化、パルミトイル化、アミド化、及び／又は他の化学修飾が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
本発明の単離タンパク質は自然から得る（例えば植物、動物又は微生物から得る）ことができるか、又は実験室において（例えば組換えにより又は合成により）産生することができる。天然分子と合成分子との組合せであるペプチドも包含される。組換えペプチド又は合成ペプチドを生成及び単離する一般的方法は当業者に既知である。
【００７７】
本発明のタンパク質は本発明の単離核酸分子によってコードされる。本発明によると、単離核酸分子はその自然環境から取り出された（すなわち人の操作を受けた）ものである。そのため単離は核酸分子が精製されている程度を反映するものではない。本発明の単離核酸分子を全（すなわち完全な）遺伝子又は本発明の単離タンパク質をコードするその一部分のいずれかとしてその天然源から得ることができる。代替的には、本発明の単離核酸分子を合成（例えば化学合成、固相合成、ポリメラーゼ連鎖反応）によって得ることができる。さらに、本発明の単離核酸分子は、天然源から得られた分子と合成（例えば本発明の単離タンパク質をコードするゲノム断片のクローニング）によって得られた分子との組合せとすることができる。加えて、本発明の単離核酸分子はＤＮＡ、ＲＮＡ又はその誘導体を含み得る。
【００７８】
本発明の単離核酸分子を、当業者に既知の多くの方法を用いて生成することができる（例えばSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, 2001（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい）。例えば核酸分子は、従来型の突然変異誘発法及び組換えＤＮＡ技法、例えば部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘導する核酸分子の化学処理、核酸断片の制限酵素切断、核酸断片のライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅及び／又は核酸配列の選択領域の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び核酸分子の混合物を「構築する」混合物群のライゲーション、並びにそれらの組合せを含むが、これらに限定されない多様な技法を用いて修飾することができる。核酸分子変異体は、核酸によってコードされるタンパク質の機能（例えば配列番号２からなるタンパク質に対する抗体を誘発する、配列番号２からなるタンパク質と結合する化合物に結合する、又はＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の発現を活性化するタンパク質の能力）についてスクリーニングすることによって修飾核酸の混合物から選択することができる。かかるスクリーニング法は本明細書に記載されており、当業者によって日常的に行われている。
【００７９】
このため本発明の一実施形態は、配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも約３０個の連続するアミノ酸、少なくとも約４０個の連続するアミノ酸、少なくとも約５０個の連続するアミノ酸、少なくとも約６０個の連続するアミノ酸、少なくとも約７０個の連続するアミノ酸、少なくとも約８０個の連続するアミノ酸、少なくとも約９０個の連続するアミノ酸又は少なくとも約１００個の連続するアミノ酸を含む単離タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子である。一実施形態では、単離核酸分子は、配列番号２及び配列番号５からなる群から選択されるアミノ酸由来の少なくとも約１１０個の連続するアミノ酸、少なくとも約１２０個の連続するアミノ酸又は少なくとも約１３０個の連続するアミノ酸を含む単離タンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、単離核酸分子は配列番号２由来の少なくとも約１４０個の連続するアミノ酸又は少なくとも約１５０個の連続するアミノ酸を含む単離タンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、単離核酸分子は配列番号１、配列番号４及び配列番号７からなる群から選択される核酸配列由来の少なくとも９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００個の連続するヌクレオチドを含む。本発明の核酸分子に存在する核酸配列に完全に相補的な核酸配列を含む核酸分子も包含される。このため、本発明の一実施形態は配列番号３、配列番号６及び配列番号８からなる群から選択される核酸配列由来の少なくとも９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００個の連続するヌクレオチドを含む単離核酸分子である。
【００８０】
論考されているように、本発明は配列番号２、配列番号５又は配列番号８の配列を含むタンパク質の変異体を包含する。このため、本発明の一実施形態は、配列番号２、配列番号５又は配列番号８由来の少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一である、少なくとも９４％同一である、少なくとも９６％同一である、又は少なくとも９８％同一である少なくとも５０個の連続するアミノ酸の配列を含むタンパク質をコードする単離核酸分子である。更なる実施形態では、単離核酸分子は、配列番号２、配列番号５又は配列番号８由来の少なくとも１００個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一である、少なくとも９４％同一である、少なくとも９６％同一である、又は少なくとも９８％同一である少なくとも１００個の連続するアミノ酸の配列を含むタンパク質をコードする。また更なる実施形態では、単離核酸分子は、配列番号２由来の少なくとも１５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一である、少なくとも９４％同一である、少なくとも９６％同一である、又は少なくとも９８％同一である少なくとも１５０個の連続するアミノ酸の配列を含むタンパク質をコードする。一実施形態では、単離核酸分子は、配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも９２％同一である、少なくとも９４％同一である、少なくとも９６％同一である、又は少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする。一実施形態では、単離核酸分子は、配列番号１、配列番号４及び配列番号７からなる群から選択される核酸配列由来の少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０又は少なくとも５００個の連続するヌクレオチドに対してその全長にわたって少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％又は少なくとも９８％同一である、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０又は少なくとも５００個の連続するヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、単離核酸分子は本明細書に開示される保存アミノ酸を含むタンパク質をコードする。
【００８１】
本発明は、ＩＦＮＬ４タンパク質の少なくとも一部分をコードする本発明の他の、好ましくはより長い核酸分子又はそれらの変異体の相補領域とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能なオリゴヌクレオチドである核酸分子も包含する。好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号２由来の少なくとも３０個の連続するアミノ酸を含むタンパク質又はその変異体タンパク質をコードすることが可能な核酸分子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能である。或る特定の好ましいオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号４及び配列番号７からなる群から選択される核酸配列由来の少なくとも９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００個の連続するヌクレオチドを含む核酸分子又はそれらの相補体とハイブリダイズすることが可能である。オリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号６、配列番号７又は配列番号９の少なくとも一部分に対してその全長にわたって少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９６％又は少なくとも９８％の同一性を有するものであるのが好ましい。
【００８２】
本発明のオリゴヌクレオチドはＲＮＡ、ＤＮＡ又はそのいずれかの誘導体とすることができる。かかるオリゴヌクレオチドの最小サイズは、所与のオリゴヌクレオチドと本発明のもう一方の核酸分子上の相補配列との間で安定したハイブリッドを形成するのに要求されるサイズである。オリゴヌクレオチドのサイズは、本発明に従ったオリゴヌクレオチドの使用に十分なものでもなければならない。本発明のオリゴヌクレオチドを、付加的な核酸分子を同定するプローブとしての用途、核酸分子を増幅若しくは伸長するプライマーとしての用途、又は例えばＩＦＮＬ４タンパク質の発現を阻害する治療用途を包含するが、これらに限定されない多様な用途に使用することができる。かかる治療用途は、例えばアンチセンス、三重鎖（triplex）形成、リボザイム及び／又はＲＮＡ薬物ベース技術におけるかかるオリゴヌクレオチドの使用を包含する。かかる技術は当業者に既知である。したがって本発明は、かかる技術の内の１つ又は複数の使用によってＩＦＮＬ４タンパク質の産生を妨げるようなオリゴヌクレオチド及び方法を包含する。
【００８３】
本発明は核酸分子を宿主細胞に送達することが可能な任意のベクターに挿入された本発明の核酸分子を含む組換え構築物も包含する。かかる構築物は異種核酸配列、すなわち自然には本発明のＩＦＮＬ４タンパク質をコードする核酸分子に隣接して見られることがない核酸配列を含有する。ベクターはＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか、原核性又は真核性のいずれかとすることができ、通例ウイルス又はプラスミドである。組換えベクターはクローニング、シークエンシング及び／又は他の方法での本発明のＩＦＮＬ４タンパク質及び／又はＩＦＮＬ４核酸分子の操作に使用することができる。本明細書で組換え分子と称され、下記でより詳細に記載される或るタイプの組換え構築物を本発明の核酸分子の発現に使用することができる。好ましい組換えベクターは形質転換細胞株において複製することが可能である。
【００８４】
本発明の組換えベクターに包含される好ましい核酸分子は、少なくとも１つの本発明のＩＦＮＬ４タンパク質の少なくとも一部分をコードする核酸分子又はその変異体である。組換えベクターに包含される具体的な核酸分子は、配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも約３０個の連続するアミノ酸、少なくとも約４０個の連続するアミノ酸、少なくとも約５０個の連続するアミノ酸、少なくとも約６０個の連続するアミノ酸、少なくとも約７０個の連続するアミノ酸、少なくとも約８０個の連続するアミノ酸、少なくとも約９０個の連続するアミノ酸、又は少なくとも約１００個の連続するアミノ酸をコードする核酸分子、又はその変異体である。そのため、配列番号１、配列番号４及び配列番号７からなる群から選択される核酸配列由来の少なくとも９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０又は５００個の連続するヌクレオチドを含む核酸分子、その相補体及びその変異体も包含される。
【００８５】
一実施形態では、本発明のＩＦＮＬ４タンパク質は、タンパク質を産生するのに有効な条件下でタンパク質を発現することが可能な細胞を培養して、タンパク質を回収することによって産生される。好ましい培養細胞はＩＦＮＬ４タンパク質を発現することが可能な組換え細胞であり、組換え細胞は宿主細胞を１つ又は複数の本発明の核酸分子で形質転換することによって作製される。核酸分子の細胞への形質転換は、核酸分子を細胞に挿入することができる任意の方法によって達成することができる。形質転換法としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着及び原形質融合が挙げられるが、これらに限定されない。組換え細胞は単細胞を保持しても、又は組織、器官若しくは多細胞生物へと成長させてもよい。本発明の形質転換核酸分子は、染色体外に保持しても又はその発現される能力が保持されるように形質転換（すなわち組換え）細胞の染色体内の１つ若しくは複数の部位に組み込んでもよい。宿主細胞を形質転換する核酸分子は、本明細書に開示されるように本発明の組換えベクターに包含されるものである。
【００８６】
形質転換するのに好適な宿主細胞は、形質転換することができ、かつ導入されたＩＦＮＬ４タンパク質を発現することができる任意の細胞を包含する。したがってかかる細胞は、少なくとも１つの本発明の核酸分子で形質転換した後、本発明のＩＦＮＬ４タンパク質を産生することが可能である。宿主細胞は形質転換していない細胞又は少なくとも１つの核酸分子で既に形質転換している細胞のいずれであってもよい。好適な本発明の宿主細胞には細菌、真菌（酵母を包含する）、昆虫、動物及び植物の細胞が包含され得る。好ましい宿主細胞としては細菌、酵母、昆虫及び哺乳動物の細胞が挙げられ、細菌（例えば大腸菌（E. coli））及び昆虫（例えばスポドプテラ属（Spodoptera））の細胞が特に好ましい。
【００８７】
組換え細胞は、宿主細胞を、１つ又は複数の転写制御配列を含有する発現ベクターに操作可能に連結した１つ又は複数の本発明の核酸分子をそれぞれ含む１つ又は複数の組換え分子で形質転換することによって作製するのが好ましい。「操作可能に連結した（operatively linked）」という語句は、宿主細胞へと形質転換した場合に分子を発現することが可能となるように核酸分子が発現ベクターに挿入されていることを指す。本明細書で使用される場合、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換するとともに、特定の核酸分子の発現を生じさせることが可能なＤＮＡ又はＲＮＡベクターである。発現ベクターは宿主細胞内で複製することが可能であるのも好ましい。発現ベクターは原核性又は真核性のいずれかとすることができ、通例ウイルス又はプラスミドである。本発明の発現ベクターには、細菌、真菌、昆虫、動物及び／又は植物の細胞を包含する本発明の組換え細胞において機能（すなわち直接遺伝子発現）するあらゆるベクターが包含される。そのため、本発明の核酸分子は、プロモーター、オペレーター、リプレッサー、エンハンサー、終止配列、複製起点、及び組換え細胞に適合し、かつ本発明の核酸分子の発現を制御する他の調節配列等の調節配列を含有する発現ベクターに操作可能に連結することができる。本明細書で使用される場合、転写制御配列には、転写の開始、延長及び終結を制御することが可能な配列が包含される。特に重要な転写制御配列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター及びリプレッサー配列等の転写開始を制御するものである。好適な転写制御配列には、本発明の組換え細胞の少なくとも１つで機能することができる任意の転写制御配列が包含される。多様なかかる転写制御配列が当業者に既知である。好ましい転写制御配列には、細菌、酵母、蠕虫、昆虫及び哺乳動物の細胞で機能するもの、例えば限定するものではないがｔａｃ、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｔｒｃ、ｏｘｙ−ｐｒｏ、ｏｍｐ／ｌｐｐ、ｒｒｎＢ、バクテリオファージラムダ（λ）(λｐＬ及びλｐＲ、並びにかかるプロモーターを包含する融合体等）、バクテリオファージＴ７、Ｔ７ｌａｃ、バクテリオファージＴ３、バクテリオファージＳＰ６、バクテリオファージＳＰ０１、メタロチオネイン、α接合因子、ピキア属（Pichia）アルコールオキシダーゼ、αウイルスサブゲノムプロモーター（シンドビスウイルスサブゲノムプロモーター等）、バキュロウイルス、ヘリオチス・ゼア（Heliothis zea）昆虫ウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス４０、レトロウイルスアクチン、レトロウイルス長鎖末端反復配列、ラウス肉腫ウイルス、熱ショック、リン酸及び硝酸転写制御配列、並びに原核細胞又は真核細胞において遺伝子発現を制御することが可能な他の配列が包含される。更なる好適な転写制御配列には、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、並びにリンホカイン誘導性プロモーター（例えばインターフェロン又はインターロイキンによって誘導されるプロモーター）が包含される。本発明の転写制御配列には、ＩＦＮＬ４タンパク質をコードするＤＮＡ配列に自然状態で関連する自然発生的な転写制御配列も包含され得る。
【００８８】
本発明の発現ベクターは更に、発現タンパク質を細胞から分泌させる分泌シグナル（すなわちシグナルセグメント核酸配列）、又は本発明の融合タンパク質を包含するＩＦＮＬ４タンパク質を分泌させることが可能な任意の異種シグナルセグメントを含有することができる。好ましいシグナルセグメントとしては、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−ＰＡ）、インターフェロン、インターロイキン、成長ホルモン、組織適合性及びウイルスエンベロープ糖タンパク質シグナルセグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
本発明の発現ベクターは更に、挿入された本発明の核酸分子を融合タンパク質として発現させる融合配列を含有することができる。本発明の核酸分子の一部として融合配列を包含することで、核酸分子によってコードされるタンパク質の産生、貯蔵及び／又は使用中の安定性を高めることができる。さらに融合セグメントは、アフィニティークロマトグラフィーを用いた得られる融合タンパク質の精製を可能にする等といったようなＩＦＮＬ４タンパク質の精製を単純化する手段として機能することができる。好適な融合セグメントは、所望の機能（例えば安定性の増大及び／又は精製手段）を有する任意のサイズのドメインとすることができる。１つ又は複数の融合セグメントを使用することは本発明の範囲内である。融合セグメントをＩＦＮＬ４タンパク質のアミノ末端及び／又はカルボキシル末端に繋げることができる。融合セグメントとＩＦＮＬ４タンパク質との間の連結は、ＩＦＮＬ４タンパク質の単純な回収を可能にする切断を起こしやすいように構築され得る。融合タンパク質は、ＩＦＮＬ４タンパク質のカルボキシル末端及び／又はアミノ末端のいずれかと結び付いた融合セグメントを包含するタンパク質をコードする融合核酸配列で形質転換された組換え細胞を培養することによって産生されるのが好ましい。
【００９０】
本発明の組換え分子は、形質転換される細胞において核酸分子（複数の場合もあり）の発現を効果的に調節することが可能な任意の転写制御配列の少なくとも１つと操作可能に連結するこれまでに記載された任意の核酸分子を少なくとも１つ包含し得る分子である。好ましい組換え分子は、配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも約３０個の連続するアミノ酸、少なくとも約４０個の連続するアミノ酸、少なくとも約５０個の連続するアミノ酸、少なくとも約６０個の連続するアミノ酸、少なくとも約７０個の連続するアミノ酸、少なくとも約８０個の連続するアミノ酸、少なくとも約９０個の連続するアミノ酸、若しくは少なくとも約１００個の連続するアミノ酸をコードする１つ若しくは複数の核酸分子、又はその変異体を包含する。組換え分子に包含される核酸分子は、本明細書に開示されるように本発明の組換えベクターに包含されるものであるのが特に好ましい。
【００９１】
本発明の組換え細胞には、少なくとも１つの本発明の任意の核酸分子で形質転換された任意の細胞が包含される。組換え細胞は、配列番号２、配列番号５及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列由来の少なくとも約３０個の連続するアミノ酸、少なくとも約４０個の連続するアミノ酸、少なくとも約５０個の連続するアミノ酸、少なくとも約６０個の連続するアミノ酸、少なくとも約７０個の連続するアミノ酸、少なくとも約８０個の連続するアミノ酸、少なくとも約９０個の連続するアミノ酸若しくは少なくとも約１００個の連続するアミノ酸をコードする少なくとも１つの核酸分子又はその変異体で形質転換された細胞であるのが好ましい。
【００９２】
組換えＤＮＡ技術の使用が、例えば宿主細胞内の核酸分子のコピー数、それらの核酸分子の転写効率、得られた転写産物の翻訳効率、及び翻訳後修飾の効率を操作することによって、形質転換された核酸分子の発現を改善することができることが当業者によって認識される。本発明の核酸分子の発現を増大させるのに有用な組換え法としては、核酸分子を高コピー数プラスミドへと操作可能に連結すること、１つ又は複数の宿主細胞の染色体への核酸分子の組込み、ベクター安定性配列のプラスミドへの付加、転写制御シグナル（例えばプロモーター、オペレーター、エンハンサー）の置換又は修飾、翻訳制御シグナル（例えばリボソーム結合部位、シャイン−ダルガノ配列）の置換又は修飾、宿主細胞のコドン使用頻度に対応させるための本発明の核酸分子の修飾、転写産物を不安定化させる配列の欠失、及び発酵中、組換え細胞の成長を組換えタンパク質の産生と一時的に分離させる制御シグナルの使用が挙げられるが、これらに限定されない。発現される本発明の組換えタンパク質の活性は、得られるタンパク質の断片化、修飾又は誘導体化によって改善することができる。
【００９３】
本発明によれば、組換え細胞は、かかる細胞を本発明のＩＦＮＬ４タンパク質を産生するのに効果的な条件下で培養して、そのタンパク質を回収することによって本発明のＩＦＮＬ４タンパク質を産生するのに使用することができる。タンパク質を産生するのに有効な条件としては、適切な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ、及びタンパク質産生を可能にする酸素条件が挙げられるが、これらに限定されない。適切な又は有効な培地は、培養することで本発明の細胞がＩＦＮＬ４タンパク質を産生することが可能な任意の培地を指す。かかる培地は通例、同化可能な炭水化物、窒素及びリン酸源と、適切な塩、無機物、金属及びビタミン等の他の栄養素とを含む水性培地である。培地は複合栄養素を含んでいてもよく、又は規定の最少培地であってもよい。
【００９４】
本発明の細胞を、限定するものではないが、回分式、流加回分(fed-batch)式、細胞再循環式及び連続式の発酵槽を包含する従来型の発酵バイオリアクター内で培養することができる。培養は振盪フラスコ、試験管、マイクロタイター皿及びペトリ皿においても行うことができる。培養は組換え細胞に適切な温度、ｐＨ及び酸素含量で行われる。かかる培養条件は十分当業者の専門知識内である。
【００９５】
産生に使用されるベクター及び宿主系に応じて、得られるＩＦＮＬ４タンパク質は、組換え細胞内に留まっていても、発酵培地に分泌されても、２つの細胞膜間の空間、例えば大腸菌におけるペリプラズム空間に分泌されても、又は細胞膜若しくはウイルス膜の外面上に保持されていてもよい。「タンパク質を回収する」という語句は、タンパク質を含有する全発酵培地を回収することを単に表すものであり、必ずしも追加の分離又は精製工程を示唆するものではない。本発明のＩＦＮＬ４タンパク質は、限定するものではないがアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、等電点電気泳動（chromatofocusing）及び分別可溶化（differential solubilization）等の多様な標準的なタンパク質精製法を用いて精製することができる。
【００９６】
本発明は、単離された本発明のＩＦＮＬ４タンパク質及び／又は個体若しくは個体由来のサンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質と選択的に結合する単離された（すなわち自然環境から取り出された）抗体も包含する。本発明の単離抗体は、血清中の抗体、又は様々な程度まで精製されている抗体を包含し得る。本発明の抗体は、ポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体であってもよく、又は本発明のＩＦＮＬ４タンパク質上の１つ若しくは複数のエピトープと結合することができる一本鎖抗体若しくはキメラ抗体を包含する、抗体断片及び遺伝子操作した抗体等の機能的均等物であってもよい。本発明での使用に有効な抗体を産生するのに適した方法は、（ａ）動物に有効量のＩＦＮＬ４タンパク質又はその断片を投与して抗体を産生することと、（ｂ）抗体を回収することとを包含する。規定のタンパク質又は断片に対して産生される抗体は、かかる抗体には、混入すると診断アッセイにおいて干渉を引き起こし得る他の物質に対する抗体がほとんど混入されていないことから有益であり得る。かかる抗体を産生する方法は当該技術分野において既知であり、Harlow et al., Antibodies, a Laboratory Manual（Cold Spring Harbor Labs Press, 1988）に詳細に記載されており、例えば腹水から回収され、当該技術分野で既知の方法によって精製されるポリクローナル抗体の調製物を作製することで、ＩＦＮＬ４タンパク質に対して反応性の調製物を得るために動物に免疫付与することを含む。多くの種が、関連配列を共有するタンパク質を有しており、そのため標準的な免疫付与プロトコルを用いて、１つの種のみに由来するタンパク質を認識する抗体を産生するのは困難であり得る。したがって、例えばサブトラクティブハイブリダイゼーション法（subtractive hybridization techniques）等の抗体を産生するのに用いられる標準的な方法の変法も企図されている。かかる変法は当業者に既知である。別の方法では、本発明で使用する抗体はSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Labs Press, 1989)に開示される技法を用いて組換えによって産生される。
【００９７】
本発明の一実施形態は、ＩＦＮＬ４タンパク質の変異体と選択的に結合する抗体である。一実施形態では、抗体はＣｙｓ１７Ｔｙｒ）、Ａｒｇ６０Ｐｒｏ）及びＰｒｏ７０Ｓｅｒ）からなる群から選択される変異体に選択的に結合する。
【００９８】
他の好適な方法はモノクローナル抗体の産生を包含する。要約すると、モノクローナル抗体を免疫付与された動物由来の脾臓細胞と骨髄腫細胞との融合体から産生することで、ハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマを適切な抗体の産生についてスクリーニングした後、培養して抗体を回収することができる。かかるハイブリドーマを作製及びスクリーニングする方法は当業者に既知であり、Harlow, et al.（同上）に記載されている。さらに、産生された抗体がＩＦＮＬ４タンパク質に対して反応性となるような抗原を調製する方法が当該技術分野において既知であり、例えばHarlow, et al.（同上）に記載されている。動物に注入する抗原材料の調製は、当該技術分野で既知の任意の技法を包含し、例えば完全長タンパク質の使用、タンパク質の免疫原性領域から選択されるペプチドの使用、例えばジニトロフェノールカップリング、アルシニルカップリング、抗原の変性、抗原と、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、クラスＩＩ−Ｔ細胞受容体結合部位を含有するペプチド、ビーズ等のタンパク質担体とのカップリング等の方法及び当該技術分野で既知の任意の他の方法による抗原の修飾が挙げられる。Harlow, et al.（同上）を参照されたい。
【００９９】
本発明の抗体は、多官能性抗体、例えばＩＦＮＬ４タンパク質と特異的に結合する少なくとも１つの官能性部分を有する二重官能性抗体を包含し得る。かかる多官能性抗体は、例えばＩＦＮＬ４タンパク質と結合する分子部分と、ＩＦＮＬ４タンパク質との結合が損なわれないようにキメラ分子を基質と結合させるか又は検出することを可能にする第２の部分とを含むキメラ分子を包含し得る。好適な第２の部分の例としては、免疫グロブリン分子、蛍光タンパク質又は酵素の断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１００】
本発明に使用される抗体は配合物中に含有されていてもよい。例えば、抗体を抗体が可溶化しているバッファー及び／又は担体と混ぜ合わせることができる。好適なバッファー及び担体は当業者に既知である。好適なバッファーの例としては、限定するものではないが、リン酸緩衝生理食塩水、水、生理食塩水、リン酸バッファー、ＨＥＰＥＳバッファー（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸緩衝生理食塩水）、ＴＥＳバッファー（Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝生理食塩水）、Ｔｒｉｓバッファー及びＴＡＥバッファー（Ｔｒｉｓ−酢酸−ＥＤＴＡ）等の、抗体がＩＦＮＬ４タンパク質と選択的に結合するように機能することができる任意のバッファーが挙げられる。担体の例としては、ポリマーマトリクス、トキソイド及び血清アルブミン、例えばウシ血清アルブミンが挙げられるが、これらに限定されない。担体は、ＩＦＮＬ４タンパク質と選択的に結合する抗体の能力を大きく妨げないように抗体と混ぜ合わせるか、又は抗体と共役させる（すなわち結び付ける）ことができる。
【０１０１】
記載されているように、ＩＦＮＬ４タンパク質は、個体がｓｓ４６９４１５５９０多型の特定の対立遺伝子（すなわち欠失対立遺伝子）を保有する結果として産生される。さらに記載されているように、本発明者らは、ｓｓ４６９４１５５９０多型の少なくとも１つの欠失対立遺伝子の保有が、個体がＨＣＶ感染症を自然消失させることが不可能となる可能性、及び個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示さなくなる可能性を増大させることをこれまでに発見している（米国仮出願第６１／５４３６２０号、現在の２０１２年１０月５日付けで出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１２／５９０４８号に記載されている）。そのため、個体に存在するＩＦＮＬ４タンパク質の有無及び／又はレベルを用いて、個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性及び／又は個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性を決定することができる。
【０１０２】
したがって、本発明の一実施形態は、個体由来の生物サンプルを分析して、サンプル中の本発明のＩＦＮＬ４タンパク質の有無を判断することによって個体のＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を予測する方法である。サンプル中の本発明のＩＦＮＬ４タンパク質の存在は個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性が低いことを示す。
【０１０３】
一実施形態では、サンプル中のＩＦＮＬ４タンパク質の非存在は、個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性が高いと予測されることを示す。一実施形態では、サンプル中のＩＦＮＬ４タンパク質の存在は、個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性が低いと予測されることを示す。
【０１０４】
本発明の別の実施形態は、個体由来の生物サンプルを分析して、個体における本発明のＩＦＮＬ４タンパク質の有無を判断することによって個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性を予測する方法である。本発明のＩＦＮＬ４タンパク質の存在は、個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示さない、又はＨＣＶ感染症の治療の実施による恩恵がない可能性を示す。
【０１０５】
一実施形態では、サンプル中のＩＦＮＬ４タンパク質の非存在は、個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性が高いと予測されることを示す。一実施形態では、サンプル中のＩＦＮＬ４タンパク質の存在は、個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性が低いと予測されることを示す。
【０１０６】
記載されているように、ＩＦＮＬ４タンパク質は、ヒトの第１９染色体上の遺伝子によってコードされている。哺乳動物が染色体を対で有していることから、哺乳動物はこの遺伝子を２コピー有し、その配列は必ずしも同一ではないことが、当業者によって認識されている。すなわち、一方の染色体のこの領域は多型の或る対立遺伝子（例えばｒｓ６７２７２３８２）を含有し得るが、他方の染色体の同じ領域は、この多型の同じ又は異なる対立遺伝子を含有し得る。個体における２つの遺伝子座が、異なる配列（例えば対立遺伝子と野生型配列、２種の異なる対立遺伝子）を含有する場合、個体はこの遺伝子座についてヘテロ接合型であると称される。個体における２つの遺伝子座が、同じ配列を含有する（例えば両方とも同じ対立遺伝子を含有する）場合、個体はこの遺伝子座についてホモ接合型であると称される。多型が１コピー存在することは、ＨＣＶ感染症を自然消失させる、又はＨＣＶ治療に反応を示す可能性について同じ多型が２コピー存在する場合とは異なる影響を有し得る。例えば、両染色体が挿入対立遺伝子を含有する（したがって欠失対立遺伝子を欠いている）場合、個体はＩＦＮＬ４タンパク質を産生しない。しかしながら、一方の染色体が挿入対立遺伝子を含有し、姉妹染色体が欠失対立遺伝子を含有する場合、個体は或る程度の量のＩＦＮＬ４タンパク質を産生する。最後に、個体が欠失対立遺伝子を２コピー有する場合、かかる個体はこの対立遺伝子についてヘテロ接合型である個体よりも多くのＩＦＮＬ４タンパク質を産生し得る。結論として、挿入対立遺伝子を２コピー有する個体は、かかる対立遺伝子を１コピーしか有しない個体よりもＨＣＶ感染症を自然消失させる、又はＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性が高い。同様に、１コピーの挿入対立遺伝子と１コピーの欠失対立遺伝子とを有する個体は、欠失対立遺伝子を２コピー有する個体よりもＨＣＶ感染症を自然消失させる、又はＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性が高い。
【０１０７】
一実施形態では、本発明の挿入対立遺伝子についてヘテロ接合型である個体は、かかる対立遺伝子を保有しない個体よりもＨＣＶ感染症を自然消失させる、又はＨＣＶ治療に反応を示す可能性が高い。別の実施形態では、本発明の挿入対立遺伝子についてホモ接合型である個体は、かかる対立遺伝子についてヘテロ接合型である個体よりもＨＣＶ感染症を自然消失させる、又はＨＣＶ治療に反応を示す可能性が高い。一実施形態では、本発明の欠失対立遺伝子についてヘテロ接合型である個体は、本発明の欠失対立遺伝子を全く保有しない個体よりもＨＣＶ感染症を自然消失させる、又はＨＣＶ治療に反応を示す可能性が低い。別の実施形態では、本発明の欠失対立遺伝子についてホモ接合型である個体は、本発明の欠失対立遺伝子についてヘテロ接合型である個体よりもＨＣＶ感染症を自然消失させる、又はＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性がより一層低い。
【０１０８】
したがって、本発明の一実施形態は、個体由来の生物サンプルを分析して、存在する場合、サンプルに存在するＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質のレベルを決定することによって、個体のＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を予測する方法である。サンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベルは、個体のＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を示すものである。
【０１０９】
本発明の別の実施形態は、個体由来の生物サンプルを分析することで、存在する場合、サンプルに存在するＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質のレベルを決定することによって、個体のＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性を予測する方法である。サンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベルは、個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性を示すものである。
【０１１０】
「個体」、「被験体」及び「患者」という用語は当該技術分野で十分に認識されており、本明細書ではイヌ、ネコ、ラット、マウス、サル、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ラクダ、及び最も好ましくはヒトを包含する哺乳動物を表すために互換的に使用される。幾つかの実施形態では、被験体はＣ型肝炎治療の必要がある。例えば、一実施形態では、被験体はＨＣＶに感染している。しかしながら他の実施形態では、被験体はＨＣＶに感染していない。一実施形態では、被験体はＨＣＶに感染する危険性がある。一実施形態では、被験体はＨＣＶに暴露されている。本明細書で使用される「暴露される（exposed）」、「曝露（exposure）」等の用語は、被験体がＨＣＶに感染している別の個体由来の体液に接触していることを示す。接触は例えば針刺し、性的接触又は出産過程のような事例によって起こり得る。
【０１１１】
「個体」、「被験体」及び「患者」という用語自体は特定の年齢、性別、人種等を指定するものではない。そのため、雄雌関係なくあらゆる年齢の個体が本開示に包含されることが意図される。同様に、本発明の方法は、例えばコーカサス人（白人）、アフリカ系アメリカ人（黒人）、ネイティブアメリカン、ネイティブハワイアン、ヒスパニック系、ラテン系、アジア系及びヨーロッパ系を包含するあらゆる人種に適用することができる。本発明の幾つかの実施形態では、このような特徴が重要である場合がある。かかる場合には、重要な特徴（複数の場合もあり）（年齢、性別、人種等）が示される。
【０１１２】
「Ｃ型肝炎ウイルス」すなわち「ＨＣＶ」という用語は、病原株が非Ａ非Ｂ型肝炎としても知られるＣ型肝炎を引き起こすＲＮＡウイルス種を規定するのに本明細書で使用される。ＨＣＶ単離株間の遺伝的差異に基づき、Ｃ型肝炎ウイルス種は６種の主遺伝子型（１〜６）に分類され、各遺伝子型内には数種の亜型がある。亜型は更に、その遺伝的多様性に基づき擬似種に分かれる。ＨＣＶ遺伝子型の優勢及び分布は地球規模で多様化している。例えば、北米では、遺伝子型１ａが優勢であり、１ｂ、２ａ、２ｂ及び３ａが続く。ヨーロッパでは、遺伝子型１ｂが優勢であり、２ａ、２ｂ、２ｃ及び３ａが続く。遺伝子型４及び５はほぼアフリカでのみ見られる。ウイルス遺伝子型はインターフェロンに基づく治療法に対する潜在的反応性及びかかる治療法の要求期間を決定するのに臨床的に重要である。遺伝子型１及び４は一般的に、他の遺伝子型（２、３、５及び６）よりもインターフェロンに基づく治療に対して反応性が低い。遺伝子型５及び６は米国集団では稀であることに留意されたい。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）によって引き起こされる肝臓を冒す感染性疾患である。ＨＣＶによる初期感染によって急性症状が生じ得るか又は個体は無症候性（症状を伴わない）であり得るが、一度確立すると慢性Ｃ型肝炎感染症が、肝臓の瘢痕化（線維症）及び一般的に何年も後に現れる進行性瘢痕化（肝硬変）へと進行する場合がある。場合によっては、慢性Ｃ型肝炎の人がその後、肝不全又は肝がんを包含する慢性Ｃ型肝炎の他の合併症を発症することもある。
【０１１４】
本発明によれば、慢性Ｃ型肝炎は６ヶ月を超えて持続するＨＣＶによる感染症を指す。臨床的に、慢性Ｃ型肝炎はほとんどの場合で無症候性であり、偶然発見されることが多い。慢性Ｃ型肝炎の自然経過は人によって大幅に異なる。ＨＣＶに感染したほぼ全ての人で肝生検に炎症の痕跡があるが、肝臓の瘢痕化（線維症）の進行速度は個体間で大きな変動を示す。経時的なリスクの正確な推定は、このウイルスの試験が利用可能である期間が限定されることから確定が困難である。
【０１１５】
幾つかの実施形態では、個体が、例えばＢ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、黄色ブドウ球菌（staphylococcus aureus）及び／又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等の少なくとも１種の他の生物に同時感染している。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、自然消失はかかる消失を補助するように設計された治療的処置を実施することなく感染個体の血液からＨＣＶを消失させる能力を指す。個体がＨＣＶ感染症を自然消失させることが可能である場合、かかる消失は通例、急性感染症中に観察される。信頼できる臨床総説では総じて、１０％〜１５％と低い消失率が引用されている。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「治療する（treat）」、「治療（treatment）」等の用語は、治療的処置及び予防的処置、又は予防対策を表すものであり、その目的は望ましくない生理学的病態若しくは疾患を予防若しくは減速（軽減）する、又は有益な若しくは所望の臨床結果を得ることである。これに関して、治療は望ましくない生理学的病態若しくは疾患、又は該病態若しくは疾患に関連する症状を減速又は予防するための治療剤の投与を指す。一実施形態では、治療はかかる治療に反応を示す患者がその体内に存在するＨＣＶ  ＲＮＡのレベルを低減させるのを助けるものである。関連して、かかる低減は患者の体内に存在するＨＣＶのレベルの低減を反映するものである。一実施形態では、治療によって患者の体内のＨＣＶ  ＲＮＡの量が治療過程中に少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％低減する。一実施形態では、治療によってＨＣＶ  ＲＮＡが患者から完全に排除される。
【０１１８】
ＨＣＶの治療に関して、本発明の方法を用いて、ＨＣＶ感染症を治療するのに有用な任意の治療剤に対する反応を予測することができる。一般的に、ＨＣＶ感染症の治療はインターフェロンに基づく治療である。このため一実施形態では、治療はインターフェロンに基づく治療である。様々な好ましい実施形態では、インターフェロンに基づく治療はＩＦＮ−α、ＩＦＮ−λ又は任意のペグ化インターフェロンを含む群から選択される。別の実施形態では、インターフェロンに基づく治療はリバビリンと併用される。様々な実施形態では、更なる併用には抗プロテアーゼ薬及び／又は他の抗ウイルス薬が包含され得る。一実施形態では、治療はＩＦＮ、リバビリン及びＨＣＶプロテアーゼ阻害剤を含む。
【０１１９】
ＨＣＶ感染症の治療を、患者がＨＣＶ感染症を消失させるのを助けるのに実施することができるが、全ての患者がかかる治療に反応を示すわけではない。すなわち患者によっては、治療がＨＣＶ  ＲＮＡのレベルの幾らかの低減をもたらすことができるが、持続的なウイルス学的反応は起こらない。治療では持続的なウイルス学的反応が起こらない患者は非反応者（non-responder）と呼ばれる。同様に、治療によって持続的なウイルス学的反応が起こる患者は反応者と呼ばれる。持続的なウイルス学的反応は、治療中止の２４週間後の血中のＨＣＶ  ＲＮＡの喪失と定義される。かかる結果を決定する際に、治療反応を測定するためにＨＣＶ  ＲＮＡレベルは通例、治療過程中の幾つかの時点で測定される。これらの時点でのＨＣＶ  ＲＮＡレベルが低下していれば、患者が持続的なウイルス学的反応を達成する可能性が高くなる。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、臨床反応の予測は、患者がＨＣＶによる感染の急性期前に又は急性期中にＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を知ることを指す。臨床反応の予測は、患者に対して治療を実施する前にＨＣＶ感染症の治療が患者においてＨＣＶ  ＲＮＡのレベルの十分な低減を引き起こす可能性を知ることも指す。本発明に関して、臨床反応の予測は、患者のＨＣＶ感染症の治療に対する反応若しくは非反応への感受性、又は患者のウイルスの自然消失への感受性を決定することと呼ぶこともできる。
【０１２１】
本明細書で使用される「感受性の（susceptible）」、「感受性（susceptibility）」等の用語は、個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる、又はかかる感染症の治療に反応を示す可能性又は見込みを指す。かかる可能性は素因（predisposition）と呼ぶこともできる。本発明に関連して、ＨＣＶ感染症を自然消失させる及び／又は治療に反応を示す可能性は絶対的なものである必要はない。すなわち例えば、個体におけるＩＦＮＬ４タンパク質の存在が、全てｓｓ４６９４１５５９０欠失対立遺伝子を保有する（したがってＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質を産生する）患者集団において個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる、又は治療に反応を示す可能性を低減させるが、かかる集団の一部（some percentage）がＨＣＶ感染症を自然消失させる又は治療に反応を示す場合がある。これは例えばウイルスの遺伝子型、人種、年齢、性別、及びＩＦＮＬ４遺伝子以外の遺伝子座での個体の遺伝的構成等の他の要因の組合せによるものであると考えられる。このため一実施形態では、個体由来のサンプルにおけるＩＦＮＬ４タンパク質の非存在は、その個体がＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ及びＩＦＮＬ４タンパク質を産生する患者よりもＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性が高いことを示す。一実施形態では、個体由来のサンプルにおけるＩＦＮＬ４タンパク質の非存在は、その個体がＩＦＮＬ４タンパク質を産生する患者よりもＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性が高いことを示す。したがってＩＦＮＬ４タンパク質を産生しない患者は、ＩＦＮＬ４を産生する患者よりも治療の実施による利益を受ける可能性が高い。他の実施形態では、個体由来のサンプルにおけるＩＦＮＬ４タンパク質の存在は、その個体がＩＦＮＬ４を産生しない患者よりもＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性が低いことを示す。更に別の実施形態では、個体由来のサンプルにおけるＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ及びＩＦＮＬ４タンパク質の存在は、ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ及びＩＦＮＬ４タンパク質を産生しない患者よりもＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性が低いことを示す。したがってＩＦＮＬ４タンパク質を産生する患者はこのような特性を有しない患者よりも治療の実施による利益を受ける可能性が低い。
【０１２２】
したがって、可能性、感受性、素因等は関連用語であることが当業者によって認識される。患者の治療に反応を示す又はＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を定量及び報告するための方法及び専門用語が当業者に既知である。例えばかかる一方法は、ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ及びＩＦＮＬ４タンパク質を産生し、ＨＣＶ感染症を自然消失させる個体の数を、ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ及びＩＦＮＬ４タンパク質を産生せず、かつＨＣＶ感染症を自然消失させる個体の数と比較することによって決定される相対的指標である。同様の比較を、ＩＦＮＬ４タンパク質を産生し、ＨＣＶ感染症の治療に反応を示す個体の数と、ＩＦＮＬ４タンパク質を産生せず、ＨＣＶ感染症の治療に反応を示す個体の数との間で行うことができる。かかる相対的比較は倍数増加、例えば１.５倍（１.５×）、２×、３×、５×等を用いて表すことができる。かかる相対的比較はパーセント増加を用いて表すこともできる。例えば、ＩＦＮＬ４タンパク質を産生せず、治療に反応を示す又はＨＣＶを自然消失させる患者の数が、ＩＦＮＬ４タンパク質を産生し、治療に反応を示す又はウイルスを自然消失させる患者の数の２倍である場合、ＩＦＡＮＡＮタンパク質を欠いた患者は、治療に反応を示す又はＨＣＶを自然消失させる可能性が１００％高いと言うことができる。したがって様々な実施形態では、ＩＦＮＬ４タンパク質を産生しない個体は少なくとも１．５×（倍）、２．０×、２．５×、３．０×、４．０×又は５．０×である。このため個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性が２×高いと求められる場合、かかる比較数は個体を代表する集団において、ＨＣＶ感染症を自然消失しない個体の数より２倍多くの個体がＨＣＶ感染症を自然消失させると予測されることを意味する。
【０１２３】
相対的比較はオッズ比を用いても説明することができ、これは研究対象の選択を対象の臨床転帰に基づき行う場合に使用される統計的な相対的比較方法である。一実施形態では、個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる、又はＨＣＶの治療に反応を示す可能性のオッズ比は少なくとも約１．２、少なくとも約１．４、少なくとも約１．６、少なくとも約１．８、少なくとも約２．０、少なくとも約２．２、少なくとも約２．４、少なくとも約２．６、少なくとも約２．８、少なくとも約３．０、少なくとも約３．２、少なくとも約３．４、少なくとも約２．６、少なくとも約３．８、少なくとも約４．０、少なくとも約４．２、少なくとも約４．４、少なくとも約４．６、少なくとも約４．８又は少なくとも約５．０である。オッズ比を算出する方法は当業者に既知であり、Rothman, Kenneth J.; Greenland, Sander; Lash, Timothy L. (2008).  Modern Epidemiology, Lippincott Williams & Wilkins, Third edition（その全体が引用することにより本明細書の一部をなす）に例示されている。
【０１２４】
様々な実施形態では、サンプルにおけるＩＦＮＬ４タンパク質のレベルは、ＩＦＮＬ４タンパク質の参照レベル（参照基準とも呼ばれる）と比較する。かかる参照基準は様々なソースから得ることができる。例えば、参照基準はＨＣＶ感染症を自然消失させる又はＨＣＶ感染症の治療に反応を示すことが可能であることが既知である個体由来のものとすることができる。別の例では、参照基準はＨＣＶ感染症を自然消失させる又はＨＣＶ感染症の治療に反応を示すことが不可能であることが既知である個体由来のものとすることができる。参照基準はＨＣＶ感染症を消失させる又はＨＣＶ感染症の治療に反応を示すことができる又はできない個体の集団に存在するタンパク質の平均レベルであるのが理想である。
【０１２５】
一実施形態では、第１の個体由来のサンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベルが、ＨＣＶ感染症を消失する若しくはＨＣＶ感染症の治療に反応を示すことが可能であることが既知である第２の個体、又はかかる個体の集団由来の参照基準に存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベル未満である場合、第１の個体はＨＣＶ感染症を消失させる又はＨＣＶ感染症の治療に反応を示すことが可能であると予測される。一実施形態では、第１の個体由来のサンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベルが、ＨＣＶ感染症を消失させる若しくはＨＣＶ感染症の治療に反応を示すことが可能であることが既知である第２の個体、又はかかる個体の集団由来の参照基準に存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベルよりも大きい場合、第１の個体はＨＣＶ感染症を消失させる又はＨＣＶ感染症の治療に反応を示すことが不可能であると予測される。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、生物サンプルは、ＩＦＮＬ４タンパク質の発現レベル、タンパク質レベル又は生物活性を包含するＩＦＮＬ４タンパク質の活性を分析することができる個体由来の任意の流体又は組織を指す。本発明を実行するのに用いることができるサンプルのタイプの例としては、血液サンプル、尿サンプル、涙液サンプル、組織サンプル及び口腔スワブが挙げられるが、これらに限定されない。ＤＮＡの抽出及び遺伝子型決定に好ましいサンプルは血液及び口腔スワブサンプルである。ｍＲＮＡの存在、不存在又はレベル及びタンパク質レベルを検出するのに有用なサンプルは当業者に既知である。その上、かかるサンプルを得る方法も当業者に既知である。ＩＦＮＬ４発現はリスク遺伝子型のＨＣＶに感染させた保因者の肝生検で決定することができる。
【０１２７】
サンプルを得た後、それを分析して、本発明のＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ及びＩＦＮＬ４タンパク質の存在、不存在又はレベルを決定する。本明細書で使用される「決定する」、「ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ及びＩＦＮＬ４タンパク質のレベルを決定する」、「ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ及びＩＦＮＬ４タンパク質の量を決定する」、「ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ及びＩＦＮＬ４タンパク質のレベルを決定する」等の用語は、サンプルにおけるＩＦＮＬ４の存在を検出又は測定するのに用いることができる任意の技法を包含するように意図される。これに関連して、ＩＦＮＬ４は分析物の一例である。かかる技法によって定性的又は定量的な結果を与えることができる。ＩＦＮＬ４レベルは、ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ及びＩＦＮＬ４タンパク質全体を検出することによって、又はＩＦＮＬ４の断片、分解産物若しくは反応産物を検出することによって決定することができる。好ましい方法では、ＩＦＮＬ４のレベルを、好適なＩＦＮＬ４結合化合物を用いて決定する。
【０１２８】
本発明に従ってＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性又はかかる治療に対する抵抗性を決定する方法の場合、本発明のＩＦＮＬ４タンパク質の存在、不存在又はレベルは、個体のかかる治療に反応を示す可能性を示す。本発明に従ってＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を決定する方法の場合、本発明のＩＦＮＬ４タンパク質の存在、不存在又はレベルは、個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を示す。
【０１２９】
分析物についてサンプルを分析する既知の方法はいずれも、ＩＦＮＬ４タンパク質の有無又は量が検出できれば、本発明を実行するのに用いることができる。かかる方法の例としては、免疫学的検出アッセイ及び非免疫学的方法（例えば酵素検出アッセイ）が挙げられるが、これらに限定されない。免疫学的検出アッセイでは、分析物の存在、不存在又はレベルについて試験するサンプルを結合分子、例えば抗体に接触させる。本明細書で使用される「接触（contact, contacted, contacting）」という用語等は、ＩＦＮＬ４を含有すると推測されるサンプルをＩＦＮＬ４結合化合物へと、例えばサンプルをＩＦＮＬ４結合化合物と混ぜ合わせる又は混合することによって導入することを指す。ＩＦＮＬ４結合化合物の一例はＩＦＮＬ４と選択的に結合する抗体である。しかしながら、ＩＦＮＬ４と結合する他の分子も包含される。例えば、ＩＦＮＬ４が結合する受容体を本発明のアッセイにおけるＩＦＮＬ４結合化合物として使用することができる。
【０１３０】
ＩＦＮＬ４がサンプルに存在する場合、ＩＦＮＬ４−化合物複合体が形成される。かかる複合体形成は、検出することができる安定した複合体を形成するために、ＩＦＮＬ４結合化合物がＩＦＮＬ４と選択的に結合することができたことを意味する。検出は定性的、定量的又は半定量的とすることができる。サンプルにおけるＩＦＮＬ４とＩＦＮＬ４結合化合物との結合は、複合体を形成するのに適した条件下で達成される。かかる条件（例えば適切な濃度、バッファー、温度、反応時間）及びかかる条件を最適化させる方法が当業者に既知である。結合は、限定するものではないが酵素免疫測定法（例えばＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、免疫ブロットアッセイ、並びに例えばSambrook et al.（同上）及びHarlow, et al.（同上）に記載される他の免疫測定法を包含する当該技術分野で標準的なものである多様な方法を用いて測定することができる。これらの参考文献には、複合体形成条件の例も与えられている。
【０１３１】
一実施形態では、ＩＦＮＬ４／ＩＦＮＬ４結合化合物複合体（本明細書においてＩＦＮＬ４−化合物複合体、又は単に複合体とも称される）は溶液中に形成され得る。別の実施形態では、複合体はＩＦＮＬ４結合化合物を基板上に固定（例えば被覆）しながら形成され得る。固定法は当業者に既知である。好適な基板材料としては、プラスチック、ガラス、ゲル、セルロイド、ファブリック、紙及び粒子材料が挙げられるが、これらに限定されない。基板材料の例としては、ラテックス、ポリスチレン、ナイロン、ニトロセルロース、アガロース、綿、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）及び磁性樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。基板材料に適した形状としては、ウェル（例えばマイクロタイターディッシュウェル）、マイクロタイタープレート、ディップスティック、ストリップ、ビーズ、側方流動装置、メンブレン、フィルター、チューブ、ディッシュ、セルロイド型マトリクス、磁気粒子及び他の粒状物質が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい基板としては、例えばＥＬＩＳＡプレート、ディップスティック、イムノドット（immunodot）ストリップ、ラジオイムノアッセイプレート、アガロースビーズ、プラスチックビーズ、ラテックスビーズ、スポンジ、綿糸、プラスチックチップ、免疫ブロットメンブレン、免疫ブロット紙及びフロースルーメンブレンが挙げられる。一実施形態では、基板、例えば粒状物質には検出可能なマーカーが包含され得る。基板材料の例の記載については、例えばKemeny, D. M. (1991) A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press, Elmsford, N.Y. pp 33-44及びPrice, C. and Newman, D. eds. Principles and Practice of Immunoassay, 2nd edition (1997) Stockton Press, NY, N.Y.（どちらもその全体が引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。
【０１３２】
一実施形態では、ＩＦＮＬ４結合化合物は基板、例えばマイクロタイターディッシュプレート、ディップスティック、イムノドットストリップ又は側方流動装置上に固定される。個体から回収されるサンプルを基板に適用して、結合化合物とサンプルに存在する任意のＩＦＮＬ４との複合体を形成させるのに適した（すなわち十分な）条件下でインキュベートする。
【０１３３】
本発明によれば、複合体が形成された後に検出される。本明細書で使用される「複合体形成を検出する」という用語は、ＩＦＮＬ４と複合体形成するＩＦＮＬ４結合化合物の存在を特定することを指す。複合体が形成される場合、形成される複合体の量は定量可能であってもよいが、定量可能である必要はない。推定ＩＦＮＬ４組成物とＩＦＮＬ４結合化合物との複合体形成又は選択的結合を、当該技術分野で標準的なものである多様な方法（例えばSambrook et al.（同上）を参照されたい）を用いて測定（すなわち検出、決定）することができ、その方法の例が本明細書に開示されている。複合体は、限定されるものではないが下記アッセイの１つ又は複数の使用を包含する多様な方法で検出することができる：酵素結合免疫測定法、競合酵素結合免疫測定法、放射免疫測定法、蛍光免疫測定法、化学発光アッセイ、側方流動アッセイ、フロースルーアッセイ、凝集アッセイ、粒子ベースのアッセイ（例えば限定するものではないが、磁気粒子又はプラスチックポリマー、例えばラテックス又はポリスチレンビーズ等の粒子を使用する）、免疫沈降アッセイ、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）アッセイ（例えばコロイド金を使用する）、イムノドットアッセイ（例えばCMG's Immunodot System、スイス、フリブール）、及び免疫ブロットアッセイ（例えばウェスタンブロット法）、リン光アッセイ、フロースルーアッセイ、クロマトグラフィーアッセイ、ＰＡＧＥベースのアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、分光学的定量法、粒子ベースのアッセイ、及び電子センサーアッセイ。かかるアッセイは当業者に既知である。
【０１３４】
アッセイを用いて、その使用方法に応じて定性的又は定量的な結果を得ることができる。アッセイ結果は、ＩＦＮＬ４分子全体、又はＩＦＮＬ４の断片、分解産物若しくは反応産物の検出に基づくものであり得る。一部のアッセイ、例えば凝集、粒子分離及び免疫沈降は、検出可能なマーカーを必要とせずに視覚的に（例えば目視又は機器、例えばデンシトメーター若しくは分光光度計によって）観察することができる。
【０１３５】
他のアッセイでは、検出可能なマーカーと抗ＩＦＮＬ４化合物又は抗ＩＦＮＬ４化合物と選択的に結合する試薬との共役（すなわち結び付き）は複合体形成の検出を助ける。検出可能なマーカーは、抗ＩＦＮＬ４化合物のＩＦＮＬ４タンパク質に結合する能力を妨げない部位で抗ＩＦＮＬ４化合物又は試薬と共役することができる。共役方法は当業者に既知である。検出可能なマーカーの例としては、放射性標識、蛍光標識、化学発光標識、発色標識、酵素標識、リン光標識、電子標識；金属ゾル標識、着色ビーズ、物理的標識又はリガンドが挙げられるが、これらに限定されない。リガンドは別の分子と選択的に結合する分子を指す。好ましい検出可能なマーカーとしては、フルオレセイン、放射性同位体、ホスファターゼ（例えばアルカリホスファターゼ）、ビオチン、アビジン、ペルオキシダーゼ（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、及びビオチン関連化合物又はアビジン関連化合物（例えばストレプトアビジン又はＩＭＭＵＮＯＰＵＲＥ（商標）  ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３６】
かかるマーカーを検出する方法は当業者に既知である。したがって例えば、放射標識は写真フィルム又はシンチレーションカウンターを用いて検出することができる。蛍光マーカーは発光を検出する光検出器を用いて検出することができる。酵素マーカーは通例、酵素に基質を与え、基質上の酵素の作用によって産生される反応産物を検出することによって検出され、発色マーカーは単純に着色標識を視覚化することによって検出される。
【０１３７】
一実施形態では、ＩＦＮＬ４−化合物複合体はサンプルを、検出可能なマーカーと共役する、化合物に特異的な抗体と接触させることによって検出することができる。検出可能なマーカーは、抗ＩＦＮＬ４抗体又はＩＦＮＬ４結合化合物に結合する他の化合物へと、抗化合物抗体又は他の化合物の検出するＩＦＮＬ４結合化合物と結合する能力を妨げないように共役することができる。好ましい検出可能なマーカーとしては、フルオレセイン、放射性同位体、ホスファターゼ（例えばアルカリホスファターゼ）、ビオチン、アビジン、ペルオキシダーゼ（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ）、β−ガラクトシダーゼ、及びビオチン関連化合物又はアビジン関連化合物（例えばストレプトアビジン又はＩＭＭＵＮＯＰＵＲＥ（商標）  ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３８】
別の実施形態では、複合体は複合体を指示分子と接触させることによって検出される。好適な指示分子としては、ＩＦＮＬ４／ＩＦＮＬ４結合分子複合体又はＩＦＮＬ４タンパク質と結合することができる分子が挙げられる。そのため、指示分子は例えば、ＩＦＮＬ４結合試薬、例えば抗体を含み得る。好ましい指示分子は抗体であり、例としては抗ＩＦＮＬ４抗体が産生される動物種由来の抗体と反応性である抗体が挙げられる。指示分子自体を本発明の検出可能なマーカーに結び付けることができる。例えば、抗体をビオチン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はフルオレセインと共役することができる。
【０１３９】
本発明は１つ若しくは複数の層及び／又はタイプの二次分子又は指示分子の存在を検出することが可能な他の結合分子を更に含むことができる。例えば、指示分子と選択的に結合するタグ付けされていない（すなわち検出可能なマーカーと共役していない）二次抗体を、二次抗体と選択的に結合するタグ付けされた（すなわち検出可能なマーカーと共役している）三次抗体と結合することができる。好適な二次抗体、三次抗体、及び他の二次又は三次分子は当業者によって容易に選択することができる。好ましい三次分子は二次分子の特徴に基づいても当業者によって選択することができる。同じ戦略を続く層に適用することができる。
【０１４０】
指示分子は検出可能なマーカーと共役するのが好ましい。必要に応じて展開剤を添加して、基質を分析用検出デバイスに投入する。幾つかのプロトコルでは、過剰な試薬を取り除くために、一方又は両方の複合体形成工程の後に洗浄工程を加える。かかる工程を用いる場合、これらの工程は過剰な試薬を取り除くが、複合体は保持されるような当業者に既知の条件を包含する。
【０１４１】
本発明の一実施形態は側方流動アッセイの使用を包含し、その例はPronovost et al.に対して１９９５年６月１３日に発行された米国特許第５，４２４，１９３号、Imrich et alによる１９９５年５月１６日に発行された米国特許第５，４１５，９９４号、Miller et al.による１９９４年１２月２２日に公開された国際公開第９４／２９６９６号、及びPawlak et al.による１９９４年１月２０日に公開された国際公開第９４／０１７７５号（全て引用することにより本明細書の一部をなす）に記載されている。側方流動アッセイは一段階アッセイの一例である。一段階アッセイでは、サンプルが得られ、試験準備が整えば、ユーザー側では分析物の存在を検出するのに単一行動のみが必要である。例えば、サンプルを全部又は一部、サンプルにおける分析物を測定するデバイスに適用することができる。一実施形態では、サンプルを下記の構成要素を備える側方流動装置に入れる：（ａ）流路を区画形成する支持構造体、（ｂ）標識域において支持構造体内に含浸される、特異的な抗体と共役するビーズを含む標識試薬、及び（ｃ）捕捉試薬。好ましい抗体としては本明細書で開示されるものが挙げられる。捕捉試薬は、標識試薬が標識域から捕捉域へと流れ得るように標識域と流体連通した捕捉域内の標識試薬の下流に位置する。支持構造体は標識域から捕捉域へのビーズの流れを妨げない材料を含む。支持構造体としての使用に適した材料としては、イオン性（すなわちアニオン性又はカチオン性）材料が挙げられる。かかる材料の例としては、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ又はカルボキシメチルセルロースが挙げられるが、これらに限定されない。支持構造体は、側方にあり、複数の区域、すなわち標識域及び捕捉域に分けられる流路を区画形成する。この装置は流路に沿って、好ましくは標識試薬の上流に位置するサンプル受容域を更に包含し得る。支持構造体における流路は、捕捉域の下流にある、好ましくは流路の末端の支持構造体の一部分を、標識域及び捕捉域から過剰な液体を吸収することが可能な吸収剤と接触させることによって作り出される。
【０１４２】
別の実施形態では、ＩＦＮＬ４を検出するのに用いられる側方流動装置は、（ａ）流路を区画形成する支持構造体、（ｂ）標識域において支持構造体内に含浸される、上記の抗ＩＦＮＬ４抗体を含む標識試薬、及び（ｃ）標識試薬が標識域から捕捉域へと流れ得るように標識域と流体連通した捕捉域内の標識試薬の下流に位置する、捕捉試薬を包含する。この装置は流路に沿って、好ましくは標識試薬の上流に位置するサンプル受容域を更に包含し得るのが好ましい。この装置は流路の末端に位置する吸収剤を更に包含するのが好ましい。好ましい一実施形態は抗ＩＦＮＬ４抗体を含む捕捉試薬を包含する。
【０１４３】
本発明の一実施形態は、個体においてＩＦＮＬ４を検出することができる「ディップスティック」デバイスである。ディップスティックは、一部その使用方法に応じた多様な方法で構築することができる。ディップスティックは、サンプル（例えば尿流）中に直接保持するか、回収容器に入れられたサンプル中に直接浸漬させるか、又はサンプルをプラスチックカセット若しくはプラットフォームに入れられたストリップに適用させることができる。ディップスティックの別の例は、吸収剤リザーバに付着したメンブレン上に固定された捕捉抗体に基づく異種免疫測定アッセイシステムの一例である「フロースルー」デバイスである。「ビーズ」はラテックス又はポリスチレン等のマトリックスで構成される粒子状基板を指し、検出分子に共有結合的に又は非共有結合的に架橋することができる。「ディップスティック」アッセイの好ましい実施形態は、MacKay及びFredricksonに対して１９９７年８月１２日に発行された米国特許第５，６５６，５０２号、並びにFredricksonに対して１９９９年１２月１４日に発行された米国特許第６，００１，６５８号（どちらも引用することにより本明細書の一部をなす）に記載の免疫測定システムである。Diagnostic Chemicals Ltd.（カナダ、プリンスエドワードアイランド州）から入手可能なＩＭＭＵＮＯＤＩＰ（商標）デバイスが特に好ましい。
【０１４４】
サンプルを分析して、ＩＦＮＬ４の存在、不存在又はレベルを決定した後、個体を、ＨＣＶ感染症を自然消失させる又はかかる感染症の治療に反応を示すことが可能であるものとして又は不可能であるものとして選択又は特定することができる。かかる選択は開示の方法の分析工程による結果を用いて行われる。例えば、分析工程の結果を得た人はその後、ＨＣＶ感染症の治療に反応を示すことが可能であるか否かを判断し、不可能である場合には代替治療の使用を決めることができる。更なる例としては、分析工程により得られたデータを再検討した人はその後、ＨＣＶ感染症を自然消失させることが可能であるか否かを判断して、不可能である場合には治療の実施に取り掛かることを決めることができる。一実施形態では、この選択はデバイスを用いて行われる。例えばデバイスは、ＩＦＮＬ４タンパク質がサンプルに存在する場合、デバイスの出力が、個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる又はかかる感染症の治療に反応を示すことが不可能であることを示すように設計することができる。一実施形態では、デバイスは電子デバイスである。例えばＥＬＩＳＡアッセイの結果を分析するデバイスは、個体のＨＣＶ感染症を自然消失させる又はかかる感染症の治療に反応を示す能力に関する結果が表示されるように設計することができる。一実施形態では、デバイスはマイクロプロセッサーを含む。一実施形態では、デバイスはコンピューターである。
【０１４５】
ＩＦＮＬ４がｓｓ４６９４１５５９０−ΔＧ対立遺伝子によって生成される場合、タンパク質はタンパク質の生物活性に影響を与える非同義変異体を保有し得ることが本明細書において開示されている。かかる変異体の例としては、（エクソン１におけるｒｓ７３５５５６０４（Ｃｙｓ１７Ｔｙｒ）、エクソン２におけるｒｓ１４２９８１５０１（Ａｒｇ６０Ｐｒｏ）及びｒｓ１１７６４８４４４（Ｐｒｏ７０Ｓｅｒ））が挙げられる。配列におけるかかる変異は、ＩＦＮＬ４遺伝子座のコーディング部分に存在する場合、ＩＦＮＬ４活性に影響を与えることにより、個体のウイルスを消失させる又は治療に反応を示す能力の全体的影響を変える場合があることが、当業者によって認識されている。例えば限定的な集団研究において、ｒｓ１１７６４８４４４（Ｐｒｏ７０Ｓｅｒ）の存在は、この変異体を欠いた個体と比較した自然消失率の増大に相関するようであった。さらにこの変異体は、ｒｓ１４２９８１５０１（Ａｒｇ６０Ｐｒｏ）及びｒｓ１１７６４８４４４（Ｐｒｏ７０Ｓｅｒ）のプロファイルと比較して大幅に異なるＨｅａｔｍａｐプロファイルを有している（図２１）。このため一実施形態では、ＩＦＮＬ４が検出された場合、この方法は、検出されたＩＦＮＬ４を１つ又は複数の配列変異の存在について分析する追加の工程を含み、ここで１つ又は複数の配列変異の存在は、個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性及び／又は個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性の指標となる。
【０１４６】
本発明の方法を個体の治療的処置に対する反応を予測するのに使用することができることから、かかる方法を治療計画に組み込むことができる。このため本発明の一実施形態は、個体由来の生物サンプルを分析して、生物サンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質の存在、不存在又はレベルを決定することによって慢性Ｃ型肝炎ウイルス感染症を患う患者を治療する方法である。個体に対するＣ型肝炎ウイルス感染症の治療の実施の決定は、サンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質の有無又は量に基づくものである。
【０１４７】
一実施形態では、患者は急性ＨＣＶ感染症に罹っている。一実施形態では、患者は慢性ＨＣＶ感染症に罹っている。一実施形態では、サンプルにおけるＩＦＮＬ４タンパク質の非存在は、個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性があることを示しており、このため治療が実施される。別の実施形態では、サンプルにおけるＩＦＮＬ４タンパク質の存在は、個体がＨＣＶ感染症の治療の実施に対して反応を示す可能性がないことを示しており、治療は実施されない。一実施形態では、サンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベルが、治療に反応を示すことが既知の第２の個体又は個体のプール由来の参照サンプルで見られるレベル未満であることは、個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性があることを示しており、このため治療が実施される。一実施形態では、サンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベルが、治療に反応を示すことが不可能であることが既に知られている又はそうでなければＨＣＶ感染症の治療に対する反応を欠いている、第２の個体又は個体のプール由来の参照サンプルで見られるレベルを超えていることは、個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性がないことを示しており、このため治療は実施される。
【０１４８】
慢性Ｃ型肝炎を患う患者におけるＩＦＮＬ４レベルの決定によって、医療関係者がその患者に合った最良のＣ型肝炎治療方式（例えばＣ型肝炎治療及び／又は他の抗ウイルス薬の性質、用量及び期間）を確定することが可能となる。例えば上記方法によって、患者が、被験体がＣ型肝炎治療に反応を示す可能性がないことを示すＩＦＮＬ４タンパク質を産生することが明らかになる場合、この被験体は新たな治療戦略（例えばより高用量の現在利用している薬物による治療法、現在利用している薬物によるより長期的な治療期間及び／又は新たな薬物）に対する良好な候補であると見なすことができる。
【０１４９】
本発明は本発明の分子を使用する更なる治療方法も包含する。例えば、これまでに認識されているように、個体におけるＩＦＮＬ４タンパク質の存在が、個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる又はかかる感染症の治療に反応を示すことを不可能にする。理論によって束縛されるものではないが、本発明者らは、かかる効果が１つ又は複数の免疫学的経路におけるＩＦＮＬ４タンパク質の作用、例えばＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の活性化によるものであると考えている。結論として、かかる作用を排除することでこの効果は取り除かれるはずである。このためＩＦＮＬ４を産生し、そのためＨＣＶ感染症を自然消失させる又はかかる感染症の治療に反応を示すことが不可能である個体は、ＩＦＮＬ４活性を排除する治療化合物を投与することで、ＨＣＶ感染症を自然消失させる又はかかる感染症の治療に反応を示すことが可能になるはずである。したがって本発明の一実施形態は、患者においてＩＦＮＬ４タンパク質と選択的に結合し、かかる結合が患者におけるＩＦＮＬ４活性の低減又は排除をもたらす化合物を患者に投与することを含む、ＨＣＶ感染症の患者を治療する方法である。
【０１５０】
かかる治療化合物の一例はＩＦＮＬ４と選択的に結合する本発明の抗体である。かかる抗体の投与が、抗体結合及びＩＦＮＬ４との複合体の形成をもたらす。かかる結合によって、２つの方法の少なくとも１つでＩＦＮＬ４活性が排除される。抗体とＩＦＮＬ４との物理的結合がＩＦＮＬ４活性の実際の物理的阻害をもたらし得る。第２に、ＩＦＮＬ４−抗体複合体は身体によって認識され、身体から取り除かれる。本発明の方法を用いて同定されたＩＦＮＬ４結合化合物を用いて、患者においてＩＦＮＬ４活性を排除又は低減することもできる。
【０１５１】
ＩＦＮＬ４結合化合物に加えて、ＩＦＮＬ４活性の低減は、ＩＦＮＬ４をコードするｍＲＮＡ転写産物の産生を低減又は排除することによって達成することができる。かかる低減又は排除は、ＩＦＮＬ４をコードするｍＲＮＡ分子に特異的な低分子干渉ＲＮＡの投与によって達成することができる。したがって本発明の一実施形態は、ＩＦＮＬ４をコードするｍＲＮＡに選択的な低分子干渉ＲＮＡを患者に投与することを含み、かかる投与が患者におけるＩＦＮＬ４活性の低減又は排除をもたらす、ＨＣＶ感染症の患者を治療する方法である。
【０１５２】
本発明はＩＦＮＬ４活性を調節する化合物を同定する方法も包含する。かかる化合物は調節因子と称される。例えばこれまでに論考されているように、本発明者らは、ＩＦＮＬ４がＥＬＩＳＡアッセイフォーマットを用いて容易に行うことができる反応であるＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を活性化することを示している。このためＩＦＮＬ４活性の調節因子は、本発明のＩＦＮＬ４タンパク質を用いてＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路活性化アッセイを行い、アッセイに試験化合物を添加することによって同定することができる。次いでかかるアッセイの結果を、任意の試験化合物を欠いた又はＩＦＮＬ４活性に影響しないことが既知の化合物を添加した、第２のＪＡＫ／ＳＴＡＴ活性化アッセイの結果と比較する。したがって、本発明の一実施形態は、ＩＦＮＬ４タンパク質活性の測定が可能な条件下でＩＦＮＬ４タンパク質をインキュベートして、得られたＩＦＮＬ４タンパク質活性を測定することによってＩＦＮＬ４タンパク質活性の調節因子を同定する方法である。次いでＩＦＮＬ４タンパク質を、初期タンパク質活性アッセイに用いたのと同じ条件下において試験化合物の存在下でインキュベートすることができ、得られたＩＦＮＬ４タンパク質活性を測定する。その後２つのタンパク質活性を比較する。試験化合物の非存在下と存在下とで得られたＩＦＮＬ４活性間の差が統計学的に有意である場合、試験化合物がＩＦＮＬ４活性の調節因子として同定される。
【０１５３】
本明細書で使用される「調節因子」は、ＩＦＮＬ４タンパク質の機能的活性にｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ  ｖｉｖｏで影響を及ぼす化合物を指す。調節因子はＩＦＮＬ４タンパク質のアゴニスト及びアンタゴニストとすることができ、発現、翻訳後修飾、ＩＦＮＬ４タンパク質との直接的な相互作用、又は他の手段によってＩＦＮＬ４タンパク質に対する効果を発揮する化合物とすることができる。ＩＦＮＬ４タンパク質のアゴニストは、ＩＦＮＬ４タンパク質と結合すると、タンパク質の機能的活性を増大又は延長させる分子である。ＩＦＮＬ４タンパク質のアゴニストとしては、タンパク質、核酸、炭水化物、小分子、又はＩＦＮＬ４タンパク質を活性化させる任意の他の分子が挙げられる。ＩＦＮＬ４タンパク質のアンタゴニストは、ＩＦＮＬ４タンパク質と結合すると、タンパク質の機能的活性の量又は期間を低減させる分子である。アンタゴニストとしては、タンパク質、核酸、炭水化物、抗体、小分子、又はＩＦＮＬ４タンパク質の活性を低減させる任意の他の分子が挙げられる。
【０１５４】
「調整する」という用語は、本明細書で見られる場合、ＩＦＮＬ４タンパク質の活性の変化を指す。例えば、調整は機能的活性、結合特徴、又はＩＦＮＬ４タンパク質の任意の他の生物学的、機能的若しくは免疫学的特性の増大又は低減を引き起こし得る。
【０１５５】
ＩＦＮＬ４活性の調節因子は、自然に若しくは遺伝子操作（例えば組換え細胞）の結果としてＩＦＮＬ４を発現する細胞を用いるアッセイ（細胞ベースのアッセイ）、又は単離したＩＦＮＬ４タンパク質によるアッセイ（無細胞アッセイ）のいずれかで同定される。様々なアッセイは、ＩＦＮＬ４タンパク質の多様な変異体（例えば完全長ＩＦＮＬ４タンパク質、ＩＦＮＬ４タンパク質の生物学的に活性な断片、又はＩＦＮＬ４タンパク質の全部若しくは一部分を包含する融合タンパク質）を用いることができる。このアッセイは試験化合物又はＩＦＮＬ４タンパク質に対する既知のリガンドの結合の直接又は間接的な測定を伴う結合アッセイとすることができる。このアッセイはＩＦＮＬ４タンパク質活性の直接又は間接的な測定を伴う活性アッセイとすることもできる。このアッセイはＩＦＮＬ４タンパク質をコードするｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質自体の発現の直接又は間接的な測定を伴う発現アッセイとすることもできる。
【０１５６】
本発明のスクリーニングアッセイでの使用に適した試験化合物を任意の好適なソース、例えば従来の化合物ライブラリーから得ることができる。試験化合物を、生物学的ライブラリー、空間的にアドレス指定可能な平行固相又は液相ライブラリー（spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries）、デコンボリューション（deconvolution）を必要とする合成ライブラリー法、「一ビーズ一化合物（one-bead one-compound）」ライブラリー法、及びアフィニティークロマトグラフィー選別を用いた合成ライブラリー法を包含する、当該技術分野で既知のコンビナトリアルライブラリー法における多くのアプローチのいずれかを用いても得ることができる。生物学的ライブラリーはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチはペプチド、非ペプチドオリゴマー又は化合物の小分子ライブラリーに適用可能である。分子ライブラリーの合成方法の例を当該技術分野に見ることができる。化合物のライブラリーは溶液中に、又はビーズ、細菌、胞子、プラスミド若しくはファージ上に提示することができる。
【０１５７】
開示される本発明の方法を実施するのに有用なキットも本発明に包含される。このため、本発明の一実施形態は、ｉ）被験体から得られたサンプルにおいて少なくともＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ又はＩＦＮＬ４タンパク質の存在、不存在又はレベルを選択的に検出するための試薬と、ｉｉ）キットを使用するための取扱説明書と、を含む、本発明に従って被験体におけるＣ型肝炎治療に対する反応の可能性を決定するキットである。
【０１５８】
本発明の一実施形態は、ｉ）被験体から得られたサンプルにおいて少なくともＩＦＮＬ４タンパク質の存在、不存在又はレベルを選択的に検出するための試薬と、ｉｉ）キットを使用するための取扱説明書と、を含む、本発明に従ってＣ型肝炎ウイルスに感染した被験体におけるウイルスの自然消失の可能性を決定するキットである。
【０１５９】
本発明のキットはＩＦＮＬ４タンパク質の存在、不存在又はレベルを決定するのに要求される試薬を少なくとも幾つか含有する。本発明のキット用の試薬としては、本発明の単離核酸分子、本発明のＩＦＮＬ４タンパク質及びＩＦＮＬ４結合化合物（例えばＩＦＮＬ４と選択的に結合する抗体）が挙げられ得るが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、ＩＦＮＬ４タンパク質及び／又はＩＦＮＬ４結合化合物は固体基板に固定することができる。キットは対照タンパク質を更に含んでいてもよい。当業者であれば、過度の実験を行うことなく通常の要件に従って本明細書の開示から必要な試薬を選択することが可能である。キットの試薬は分子標識又はタグを含んでいてもよい。
【０１６０】
本発明のキットは、当該技術分野で知られているように本発明の方法を実施するのに必要な様々な試薬、例えばバッファーを含んでいてもよい。これらの試薬又はバッファーは、例えば被験体から得られる生物サンプルからＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ／タンパク質を抽出及び／又は精製するのに有用であり得る。キットは本発明の方法を実施するのに必要な微小遠心分離管等の必要とされる材料を全て含んでいてもよい。
【０１６１】
下記の特定の実施形態の記載は、他者が過度の実験を行うことなく当該技術分野の技能の範囲内の知識を用いて、本発明の一般概念に逸脱することなく様々な用途に合わせてかかる特定の実施形態を容易に変更及び／又は適合させることができるように十分に本発明の一般的性質を示している。そのためかかる適合及び変更は、本明細書に与えられる教示及び指針に基づき開示される実施形態の均等物の意味及び範囲内であることが意図される。本明細書中の語句又は用語は、教示及び指針を鑑みて当業者によって解釈されるように説明を目的とするものであり、限定するものではないことが理解される。
【０１６２】
当然のことながら、本明細書に記載されるものと類似する又は均等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、好適な方法及び材料が以下に記載されている。本明細書で言及される公報、特許出願、特許及び他の参考文献は全てその全体が、引用することにより本明細書の一部をなす。本明細書に開示される公報及び出願は、本出願の出願日より前の開示に対してのみ与えられる。本明細書では本発明が先行発明のためにかかる公報に先行する権利がないことを認めるものと解釈されるものではない。さらに、材料、方法及び実施例は説明的なものに過ぎず、限定を意図するものではない。
【実施例】
【０１６３】
実施例１．初代ヒト肝細胞におけるＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）領域での誘導発現ランドスケープの分析
正常なヒト肝細胞の活性化
ＨＣＶ非感染肝臓由来の新たに単離した正常なヒト肝細胞の初代培養物を、Lonza Inc.（メリーランド州、ウォーカーズビル）から購入した。細胞を６ウェルのコラーゲンコート組織培養プレート上にプレーティングしたところ、高い生存能力を示した。次いで細胞を５０μｇ／ｍＬの最終濃度のＰｏｌｙＩ：Ｃで０時間、１時間、２時間、４時間、８時間又は２４時間処理した。ＰｏｌｙＩ：Ｃ（ポリイノシン酸：ポリシチジル酸）は、ウイルス感染をシミュレートするＴｏｌｌ様受容体−３（ＴＬＲ３）アゴニストである（Alexopoulou L, Holt AC, Medzhitov R, Flavell RA. (2001) Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappa B by Toll-like receptor 3.  Nature 413(6857):732-8）。ＰｏｌｙＩ：Ｃは、多くのタイプのウイルスの複製サイクルにおける中間相である二本鎖ＲＮＡに構造的に類似している。ＰｏｌｙＩ：Ｃは、ウイルス感染を模倣する合成剤として広く使用されており、多くの細胞型においてＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−α）及びＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−λ）の両方の発現を誘導する（Doyle SE, Vaidya SA, O'Connell R, Dadgostar H, Dempsey PW, Wu T, Rao G, Sun R, Haberland ME, Modlin RL, Cheng G. (2002) IRF3 mediates a TLR3/TLR4-specific antiviral gene program.  Immunity 17(3):251-63、Doyle SE, O'Connell R, Vaidya SA, Chow EK, Yee K, Cheng G. (2003) Toll-like receptor 3 mediates a more potent anti-viral response than Toll-like receptor 4.  J. Immunol. 170(7):3565-71）。指定の期間、肝細胞培養物をＰｏｌｙＩ：Ｃで処理した後、細胞を回収し、ＤＮＡ抽出物及びＲＮＡ抽出物を標準的な方法で調製した。ＤＮＡ及びＲＮＡの質及び量をＮａｎｏｄｒｏｐ及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒ分析によって測定した。
【０１６４】
ＲＮＡシークエンシング
１μｇの全ＲＮＡを、０時間、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、ＰｏｌｙＩ：Ｃで処理した肝細胞サンプルのそれぞれに使用した。ＰｏｌｙＡ  ｍＲＮＡの選択後、標準的なIlluminaのプロトコルに従ってＲＮＡサンプルを断片化して、それを６５ｂｐのアダプタへとライゲートして、２００ｂｐ〜２５０ｂｐの断片を含むペアエンド（paired end）（ＰＥ）ｃＤＮＡライブラリーを作成した。このライブラリーは１２回のＰＣＲサイクルによって濃縮され、１サンプルに付き１つのＧｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（ＧＡＩＩ）レーンを用いて４．５ｐＭの濃度でシークエンシングすることで、１０７ｂｐのシークエンシングリードが生じる。１サンプルに付き平均して４７２０±６６０万のＰＥ  ＲＮＡ−ｓｅｑリードが生じた。分析用のヒト参照ゲノムを、Ｂｏｗｔｉｅソフトウェアを用いてＵＣＳＣのｈｇ１９インデックスに基づき構築した。シークエンシングリードを、IlluminaのＰｉｐｅｌｉｎｅ  ＯＬＢ  １．９．０及びＣＡＳＡＶＡ  １．７．０を用いて処理して、標準的な品質管理設定に従って幾つかのリードを取り除いた後、ＴｏｐＨａｔ  ｖ１．２．０を用いて参照ゲノムにアラインした。Ｅｎｓｅｍｂｌｅのデータベースからの全てのヒト転写産物のライブラリー（バージョンＧＲＣｈ３７．６１：useast.ensembl.org/info/data/ftp/index）を用いて、エクソン連結のライブラリーを作成して、スプライシング型を再構築した。デフォルトのＴｏｐＨａｔアルゴリズムによって、２つ以上のゲノム領域にマッピングするＲＮＡ−ｓｅｑリードが分析から取り除かれる。ＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）遺伝子周囲の領域の複雑さを考慮して、特別な戦略を実行した。ＩＦＮＬ１（ＩＬ２９）、ＩＦＮＬ２（ＩＬ２８Ａ）、ＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）等の類似性の高い領域へのリードの非排他的なマッピングが可能となるように、ＴｏｐＨａｔの設定を変更して、多重アライメント（最大で１０）を可能にした。このマッピングによって、潜在的なエクソンを表す発現クラスターが特定された。作成した潜在的なスプライス部位（splice junctions）のデータベースに基づき、これまでにマッピングされていないリードを、ＴｏｐＨａｔ  ｖ１．２．０によって再度マッピングした。新規の転写産物を検出するために、最終アラインメントリードファイルをＣｕｆｆｌｉｎｋｓ  ｖ０．９．３によって処理した。転写産物の相対存在量を、ＦＰＫＭ（Fragments Per Kilobase of exon per Million fragments mapped algorithm）を用いて測定した。ＦＰＫＭ推定についての信頼区間はベイズ推論法を用いて算出した。スプライシング型の存在下では、各遺伝子の最大の発現型の比を１に指定し、主型の少なくとも１％レベル（比＞０．０１）で発現する他の全ての型を分析に使用した。全ての個々のセグメントが正確にマッピングされると、ＴｏｐＨａｔアラインメントアルゴリズムは、独立してマッピングされ、配列リードへと再構築される２５ｂｐのセグメントへの配列リードを止める。可能性のある遺伝的変異体を発見するために、１セグメント当たり２又は３のミスマッチを許容した。マッピングの結果は、ＵＣＳＣゲノムブラウザー及びＩＧＶ（Integrative Genomics Viewer）ソフトウェア（broadinstitute.org/igv/）のローカルコピーの両方を用いて可視化した。こ���領域における遺伝的変異体をＩＧＶによって可視化した後、手動で検査した。この分析の結果を図１に示す。
【０１６５】
ＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）遺伝子周囲１５０Ｋｂの領域の詳細分析から、処理の０時間又は１時間後では既知のＩＦＮ−λ遺伝子ＩＦＮＬ１（ＩＬ２９）、ＩＦＮＬ２（ＩＬ２８Ａ）、ＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）の発現は示されなかったが、処理の２時間〜２４時間後ではこれらの遺伝子の強い活性化が示された（図１、図２）。さらにこの分析によって、ｒｓ１２９７９８６０付近に位置する新規の約２．５ｋｂ長の転写領域の同定がもたらされた（図１、図２、図３）。この領域の発現は、ＰｏｌｙＩ：Ｃ処理なし又はＰｏｌｙＩ：Ｃ処理の１時間後では検出されなかったが、２時間、４時間又は８時間後に誘導され、その後２４時間で激減した。ペアエンドＲＮＡ−ｓｅｑリードの分析から、この領域における推定転写産物の全てに存在する１つのスプライス部位が同定された。この配列を５’ＲＡＣＥ分析の開始点として使用した。かかる分析によって、単一の転写開始部位と、それに続く下流にある２７７ｂｐのタンパク質翻訳開始部位とが同定された（図３）。
【０１６６】
実施例２．ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡ発現の分析
ＩＦＮＬ４  ｍＲＮＡの定量用の対立遺伝子特異的なＴａｑＭａｎアッセイをＰｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅによって設計し、要求に合わせてApplied Biosystemsによって製造された。アッセイは下記のプライマー：
ＩＦＮＬ４−ｐ１７９＿ｆｏｒｗ：ＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴ（配列番号１３）、
ＩＦＮＬ４−ｐ１７９＿ｒｅｖ：ＡＧＣＣＧＡＧＣＧＣＡＧＧＡＣＧＡ（配列番号１４）、及び、
下記のプローブ：
ＩＦＮＬ４＿ＶＩＣ  ＡＡ（非リスク対立遺伝子）：ＡＴＣＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣ（配列番号１５）、
ＩＦＮＬ４  ＦＡＭ−Ｃ（リスク対立遺伝子）：ＡＴＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＣ（配列番号１６）、
からなる。
【０１６７】
このアッセイではｃＤＮＡによって２５５ｂｐの断片がもたらされ、ＤＮＡを用いても生成物は得られない。このアッセイはＩＦＮＬ４−ｐ１７９をコードする転写産物に対する特異性が高く、任意の他の転写産物（ＩＦＮＬ４−ｐ１３１、ｐ１０７等）を検出しない。ＦＡＭフルオロフォアは欠失対立遺伝子を標識し、そのためＩＦＮＬ４−ｐ１７９発現に特異的である一方で、ＩＦＮＬ４  ｐ１７９が、挿入対立遺伝子を有するｍＲＮＡ転写産物では検出されないことから、ＶＩＣフルオロフォアによる検出は陰性対照として働く。
【０１６８】
非常に高い特異性に起因して、このアッセイは非ＤＮアーゼＩ処理ＲＮＡサンプルであっても検出が可能である。代替的な発現アッセイは、
ＩＦＮＬ４＿ａｌｔ＿Ｆ：ＧＣＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＣＡＧＡＧＡＴ（配列番号１７）、
ＩＦＮＬ４＿ａｌｔ＿Ｒ：ＧＣＴＣＣＡＧＣＧＡＧＣＧＧＴＡＧＴＧ（配列番号１８）、及び、
下記のプローブ：
ＩＦＮＬ４＿ａｌｔ＿ＶＩＣ  ＡＡ（非リスク対立遺伝子）：ＡＴＣＧＣＡＧＡＡＧＧＣＣ（配列番号１９）、
ＩＦＮＬ４＿ａｌｔ  ＦＡＭ−Ｃ（リスク対立遺伝子）：ＡＴＣＧＣＡＧＣＧＧＣＣＣ（配列番号２０）、
である。このアッセイはより高効率であるが、ＩＦＮＬ４−ｐ１７９よりも特異性は低い。ＦＡＭフルオロフォアはリスク対立遺伝子を有する全ての形態及びＶＩＣ、すなわち非リスク対立遺伝子を有する全ての形態（ＶＩＣ）の発現を検出する。
【０１６９】
実施例３．新規のＩＦＮＬ４遺伝子の同定及び配列分析
ＩＦＮＬ４転写産物に関する完全長オープンリーディングフレームをＰｏｌｙＩ：Ｃで処理した初代ヒト肝細胞のｃＤＮＡから下記プライマーを用いてＰＣＲ増幅した：
ＩＦＮＬ４  ｆｏｒｗ：ＡＴＧＣＧＧＣＣＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＣＣ（配列番号２１）、
ＩＦＮＬ４  ｒｅｖ：ＧＡＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＡＧＡＧＴＧＴＧＣＡＧ（配列番号２２）。
【０１７０】
追加の配列を、特異的なベクターにクローニングするのにプライマーに付加した。このアンプリコンの非常に高いＧＣ含量に起因して、ＰＣＲ反応を、９５℃で１０分の初期変性工程、その後の２０サイクル（９５℃で３０秒、各工程で温度を７０℃から６０℃へと１℃ずつ低下させる２サイクルを４５秒、７２℃で４５秒）、追加の２５サイクル（９５℃で３０秒、６０℃で４５秒及び７２℃で４５秒）、及び最後に７２℃で７分の伸長時間を包含するタッチダウンＰＣＲプログラムを用いてＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ３６０  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ及び３６０  ＧＣ  Ｅｎｈａｎｃｅｒによって行った。
【０１７１】
ゲル精製ＰＣＲ断片（図５）をＣ末端ｐＦＣ１４Ａ−Ｈａｌｏタグ発現ベクター（Promega）にクローニングして、検証のためにシークエンシングを行った。ＲＮＡ−ｓｅｑデータに一致して、５、４及び３エクソンを包含し、それぞれ１７９（配列番号２）、１３１（配列番号５）及び１０７（配列番号８）アミノ酸のオープンリーディングフレームをコードしている、ＩＦＮＬ４転写産物の３種のスプライス型が検出された。図６及び下記の表２に、各種オープンリーディングフレーム及び関連する核酸分子、並びに本明細書に開示される他の配列に割り当てられた配列識別子を挙げる。
【０１７２】
【表２】
2015514709.tif 000004
【０１７３】
2015514709.tif 000005
【０１７４】
全てのＩＦＮＬ４スプライス型の第１エクソンには、２つの対立遺伝子：ＴＴ（挿入対立遺伝子）及びΔＧ（欠失対立遺伝子）を含むこれまでに報告のないジヌクレオチド変異体（ｓｓ４６９４１５５９０）のｓｓ４６９４１５５９０−ΔＧ対立遺伝子が包含される。ＢＬＡＳＴ及びＣｌｕｓｔａｌＷによるタンパク質分析によって、ＩＦＮＬ４−ｐ１７９タンパク質とＩＦＮ−λタンパク質との間の強い類似性が特定され、ＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）が２９．１％というアミノ酸同一性及び４０．８％という類似性を伴う最も類似のタンパク質であった（図６）。ｐ１７９とＩＦＮ−λタンパク質との間の最も強い同一性が、第１のＩＦＮ−λ受容体ＩＦＮＬＲ１（ＩＦＮ２８Ｒ１）に対する結合部位を表す、ＩＦＮ−λのＡヘリックス及びＦヘリックスに対応するタンパク質配列内で見出された。しかしながら、第２のＩＦＮ−λ受容体（ＩＬ１０Ｒ２）に対する結合部位に対応するｐ１７９の領域はＩＦＮ−λタンパク質で見られるものと大きく異なっていた（図７）。そのため、新規のｐ１７９タンパク質はインターフェロン−λファミリー及び他の既知のクラス２サイトカインに関連はしているが、異なるものである。
【０１７５】
実施例４．組換えＩＦＮＬ４タンパク質の産生及び抗ＩＦＮＬ４モノクローナル抗体によるその検出
ＩＦＮＬ４−ｐ１７９、ｐ１３１及びｐ１０７の完全長ｃＤＮＡ形態を保有するＣ末端Ｈｉｓタグ融合構築物をバキュロウイルス株ｓｆ９に形質導入した。発現が細胞培地で検出されなかったことから、タンパク質を細胞から精製した。数回の精製によって高純度（８５％〜９０％）を達成して、クマシー染色、並びに抗Ｈｉｓ抗体及び抗ＩＦＮＬ４抗体によるウェスタンブロット分析によって確認した（図８）。
【０１７６】
実施例５．マウスのモノクローナル抗ＩＦＮＬ４抗体の開発
ＩＦＮＬ４−ｐ１７９タンパク質のアミノ酸４４〜７４に対応する合成ペプチドKALRDRYEEEALSWGQRNCSFRPRRDSPRPS（配列番号２３）を、マウスの免疫付与ではＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin：キーホールリンペットヘモシアニン）、さらにスクリーニングではウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と共役させた。免疫付与後の力価を、ＢＳＡ共役ペプチドに対する直接酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）によって尾血の血清サンプルを用いて３匹のマウスで評価した。ＩＦＮＬ４特異的な力価が最良のマウスを１匹、モノクローナル抗体産生のために選んだ。選択された動物由来の脾臓Ｂ細胞を単離して、骨髄腫パートナー（partner）と融合して、ＩｇＧハイブリドーマを生成した。３５個のハイブリドーマクローンから上清を回収し、精製された組換えＩＦＮＬ４タンパク質の認識についてスクリーニングした結果、Ｍｕ抗ヒトＩＦＮＬ４  ４Ｇ１と称されるモノクローナル抗体が単離された。Ｍｕ抗ヒトＩＦＮＬ４  ４Ｇ１を発現するハイブリドーマは、ＡＴＣＣアクセッション番号：ＰＴＡ−１２５７５として２０１２年２月２３日付けでアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ（商標））による寄託を受けた。本実施例は、抗ＩＦＮＬ４モノクローナル抗体クローン４Ｇ１によるＩＦＮＬ４タンパク質の特異的検出をウェスタンブロット法及び共焦点画像によって説明するものである（図８、図９、図１０）。抗ＩＦＮＬ４抗体は、ＩＦＮ−α、ＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）又はＩＦＮＬ４−ｐ１０７を認識しないが、ＩＦＮＬ４−ｐ１７９、及び場合によってはｐ１３１（少なくとも共焦点画像による）の検出に特異的なものである。肝細胞癌ＨｅｐＧ２細胞における一過性トランスフェクトしたＩＦＮＬ４発現構築物及びＰｏｌｙＩ：Ｃで活性化した初代ヒト肝細胞における内因性ＩＦＮＬ４発現の共焦点画像によって細胞内発現が示される（図１０）。ＩＦＮＬ４は陰性アイソトープ対照、すなわち抗ＩｇＧ抗体では検出されなかった。類似の細胞局在化は、融合体ＩＦＮＬ４−Ｈａｌｏタンパク質に対する抗Ｈａｌｏ抗体及びＩＦＮＬ４−ｐ１７９構築物をトランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における抗ＩＦＮＬ４抗体の両方によって検出された。マウス及びウサギの抗ＩＦＮＬ４抗体に対するエピトープの位置及び特異的な検出パターンを図１１に示す。
【０１７７】
実施例６．ＩＦＮＬ４タンパク質のＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路を活性化する能力
ＩＦＮＬ４発現構築物及び精製されたＩＦＮＬ４組換えタンパク質と、５種の他のタンパク質アイソフォームに対する発現構築物との生物活性を、一過性トランスフェクトしたＨｅｐＧ２細胞における４５のヒトシグナリング経路に対するレポーター構築物を活性化する能力として評価した。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｃｉｇｎａｌ  ４５−Ｐａｔｈｗａｙ  Ｆｉｎｄｅｒ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｒｒａｙを取扱説明書に従って使用した（Qiagen、試験レポーターの全リストは、http://www.sabiosciences.com/reporter_assay_product/HTML/CCA-901L.htmlで入手可能である）。細胞に、ｐ１７９、ｐ１７０、ｐ１４３、ｐ１３１、ｐ１２４及びｐ１０７に対する発現構築物をトランスフェクトするか、又は細胞を精製組換えタンパク質、すなわち１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−α若しくはＩＦＮＬ３及び／又はＩＦＮＬ４−ｐ１７９で２４時間処理した。試験した全ての構築物及びタンパク質の中で、ＩＦＮＬ４に対する発現構築物の一過性トランスフェクション、並びに精製ＩＦＮ−ａ（Ｉ型インターフェロン）及びＩＦＮＬ３（ＩＩＩ型インターフェロン）による処理のみがインターフェロン刺激応答配列（ＩＳＲＥ）−Ｌｕｃ及びＩＲＦ３−Ｌｕｃレポーターを活性化した（図１２）。
【０１７８】
Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−β）、及びＩＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ−λ）がＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路のＳＴＡＴ１成分及びＳＴＡＴ２成分を通したシグナル伝達を媒介する。ＩＳＲＥ−Ｌｕｃ  Ｃｉｇｎａｌレポーター（Qiagen）は、ＩＳＲＥを構築するＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ２結合部位（ＴＡＧＴＴＴＣＡＣＴＴＴＣＣＣ）ｎからなる、タンデムリピートと連結した最小（ｍ）ＣＭＶプロモーターの制御下においてホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードしている。細胞に、トランスフェクション効率の正規化及び細胞生存率のモニタリングのための内部対照として働く構成的に発現するウミシイタケルシフェラーゼを同時トランスフェクトした。さらに幾つかの細胞に、ＩＦＮＬ４タンパク質を発現する構築物（ｐ１７９、ｐ１３１及びｐ１０７）又は空ベクター（モック構築物）を７２時間同時トランスフェクトした。他の細胞を、精製組換えタンパク質、すなわち１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ若しくは１００ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−α若しくはＩＦＮＬ３（ＩＬ２８Ｂ）、又はＩＦＮＬ４−ｐ１７９、ｐ１０７で２４時間処理した。研究はすべて、少なくとも８回の生物反復を用いて行った。指定の期間の後、ルシフェラーゼ及びウミシイタケの発現レベルを測定して、ルシフェラーゼ／ウミシイタケ比をモックトランスフェクトしたサンプルとの関連で算出した。
【０１７９】
個々のＩＳＲｅ−Ｌｕｃアッセイの分析結果（図１３）は、ＩＦＮ−α又はＩＦＮＬ３による有意な用量応答シグナリング、及びＩＦＮＬ４−ｐ１７９タンパク質の２５％未満の活性を示したトランスフェクトしたｐ１０７、ｐ１３１によるものではなくトランスフェクトしたＩＦＮＬ４−ｐ１７９による活性化を示している。全ての研究は少なくとも８回の生物反復を用いて行った。同じＩＳＲＥ−Ｌｕｃレポーター構築物を安定して発現するＨｅｐＧ２細胞株を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｃｉｇｎａｌ  Ｌｅｎｔｉ  ＩＳＲＥレポーター構築物（Qiagen）の細胞への形質導入、及び１×抗真菌性抗生物質（Antibiotic-Antimycotic）（Life Technologies）と２ｕｇ／ｍＬのピューロマイシンとを含むＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中での成長による陽性クローンの選択によって生成した。最良のＨｅｐＧ２−ＩＳＲＥ安定性クローンを精製された組換えＩＦＮ−α及びＩＦＮＬ３による試験によって同定した。４５のレポーターのスクリーニングにより検出された結果を、ＨｅｐＧ２安定性ＩＳＲＥ−Ｌｕｃ細胞株における一過性トランスフェクションにより独立検証した（図１３）。さらにＩＦＮＬ４構築物の一過性トランスフェクションは、非機能的タンパク質アイソフォームｐ１３１若しくはｐ１０７に対する構築物又は空ＧＦＰベクター（モック）と比較して、ルシフェラーゼレポーターと連結したサブゲノムＨＣＶレプリコンを保有するＨｕｈ７−Ｌｕｎｅｔ細胞において抗ウイルス活性を誘導した。この実験は４８ウェルプレートで行い、ルシフェラーゼ発現をトランスフェクション後４８時間で測定した（図１３）。
【０１８０】
実施例７．ＳＴＡＴ１／ＳＴＡＴ２リン酸化の分析
６ウェルプレート内のＨｅｐＧ２細胞を、処理しないか、又はこの細胞に発現構築物若しくは空Ｈａｌｏタグベクターをトランスフェクトするか、又はこの細胞を５０ｎｇ／ｍｌの組換えＩＦＮＬ３を用いて３７℃で１時間処理した。トランスフェクション後４８時間で準備した同量（５０μｇ／レーン）の全細胞溶解物をウェスタンブロット法による分析に使用した。検出はウサギ抗リン−Ｔｙｒ７０１−ＳＴＡＴ１抗体（Cell Signaling Technology）及びウサギ抗リン−Ｔｙｒ６８９−ＳＴＡＴ２抗体（Millipore）を用いて行った。ブロットをストリッピングして、ウサギ抗ＳＴＡＴ１抗体及び抗ＳＴＡＴ２抗体（Santa Cruz Biotechnology）を用いて再度プロービングして、全体のＳＴＡＴ１タンパク質及びＳＴＡＴ２タンパク質レベルを測定した。ＩＦＮＬ３による処理及びＩＦＮＬ４構築物による一過性発現のみが、ＳＴＡＴ１及びＳＴＡＴ２のリン酸化を誘導した（図１４）。
【０１８１】
実施例８．トランスクリプトーム及び経路分析及び細胞内で発現したＩＦＮＬ４タンパク質のインターフェロン刺激遺伝子（ＩＳＧ）の発現を誘導する能力の大域分析
ＨｅｐＧ２細胞に空Ｈａｌｏタグベクターをモックトランスフェクト又はＩＦＮＬ４−Ｈａｌｏ発現構築物をトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞から調製した（４８時間）高品質ＲＮＡ（ＲＩＮ  約１０）をＨｉＳｅｑ  ２０００（Illumina）によるシークエンシングに使用し、１サンプル当たり約３００Ｍのリードが生じた。標準的な分析により、発現が２倍を超えて異なり、ＦＤＲが０．０５未満の５３５の転写産物が同定された。この設定で行われるＩＰＡ（Ingenuity Pathway Analysis）によって経路リスト及び特異的な転写産物が挙げられた（図１５）。選択された転写産物のｍＲＮＡ発現は、特定条件下において４回の生物反復で経路ベースのＲＴ２プロファイラーＰＣＲアレイを用いて、取扱説明書（Qiagen）に従って評価した（図１５）。ＨｅｐＧ２細胞を、処理しないか、又は細胞に空ベクター（モック）、ＩＦＮＬ４−ｐ１７９、ＩＦＮＬ４−ｐ１３１若しくはＩＦＮＬ４−ｐ１０７をトランスフェクトするか、又は細胞を単独で若しくはモック若しくはＩＦＮＬ４−ｐ１７９のトランスフェクション後に１０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ−α若しくはＩＦＮ−λで２４時間処理した。トランスフェクトした細胞とトランスフェクトしていない細胞とを、トランスフェクト後２４時間に相当する同時点でＩＦＮ−α又はＩＦＮ−λで処理して、同時に回収した。アレイ上の全ての転写産物の発現（ｎ＝９０）を、個々の特異的なアッセイを用いてｑＲＴ−ＰＣＲ経路プロファイラーアレイによって分析し、同じサンプルで測定した４種の内部対照（ＡＣＴＢ、ＧＡＰＤＨ、ＨＰＲＴ１及びＲＰＬ１３Ａ）の発現に対して正規化した。データをｌｏｇ２スケールで表し、負の値がより小さければ、発現がより高いことを示す。誤差バーは９５％信頼区間での平均値を示す（図１５）。
【０１８２】
ＩＦＮＬ４構築物の一過性トランスフェクションは、インターフェロンによって誘導された同じＩＳＧセットを活性化した。既にＩＦＮＬ４を発現しているサンプルでは、インターフェロンによる追加の処理によってはＩＳＧの更なる活性化を達成することができなかった。
【０１８３】
実施例９．ヒト細胞株におけるＩＳＲＥ−Ｌｕｃレポーターの差次的な活性化
ＩＳＲＥ−Ｌｕｃレポーターを、ＨｅｐＧ２（肝細胞癌）、２９３Ｔ（胚腎臓）及びＨｅＬａ（子宮頸癌）細胞株に、空ベクター、又はＩＦＮＬ４に対する構築物、又は非機能的な形態ｐ１３１若しくは１０７とともに一過性トランスフェクトした。代替的には、ＩＳＲＥ−Ｌｕｃレポーターをトランスフェクトした細胞を指定濃度のインターフェロンで処理した。ＩＦＮＬ４によるＩＳＲＥ−Ｌｕｃの活性化はＨｅｐＧ２細胞及び２９３Ｔ細胞でのみ誘導された（図１６）。
【０１８４】
実施例１０．ＩＦＮＬ４の部位特異的突然変異誘発
さらに、ＩＦＮＬ４−ｐ１７９の８３種の単一点突然変異体を生成し、その活性を、ＩＳＲＥ−Ｌｕｃレポーターを用いてＨｅｐＧ２細胞における一過性発現後にＩＦＮＬ４−ｐ１７９の活性と比較して評価した（図１７）。部位特異的突然変異誘発はＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Agilent）を用いて行った。プライマーは、特異的なＩＦＮＬ４アミノ酸を突然変異させるためにコドンの第１塩基を変更させるように設計された。元のＩＦＮＬ４−ｐ１７９プラスミドを個々のＰＣＲ反応の鋳型として、突然変異誘発プライマー対とともに使用した。ＰＣＲ産物をＤｐｎＩ酵素で消化して、元の突然変異していない鋳型を排除し、誘導されたプラスミドをプールして、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ  ＴＯＰ１０  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｃｅｌｌへと形質転換した。個々のコロニーを検証のためにシークエンシングした。図１７及び表３に、ＩＦＮＬ４突然変異体の分布及びタイプ、並びにＩＦＮＬ４突然変異体のＩＳＲＥ−Ｌｕｃレポーター構築物を転写活性化する相対的可能性を示す。
【０１８５】
【表３】
2015514709.tif 000006
【０１８６】
2015514709.tif 000007
【０１８７】
８３種のＩＦＮＬ４突然変異体の分析は３グループに分けられた：システイン（ｎ＝７）、ＩＦＮＬ３において保存された非システイン残基（ｎ＝３８）及びＩＦＮＬ３において保存されていない非システイン残基（ｎ＝３８）。この分析から、６種の非多型システインが、それらの突然変異がＩＦＮＬ４生物活性を排除することから、ＩＦＮＬ４の生物活性に必須であることが示された。天然の遺伝的多型Ｃｙｓ１７Ｔｙｒに対応する１つのシステインだけがＩＦＮＬ４の生物活性に影響を及ぼさなかった。ＩＦＮＬ３とＩＦＮＬ４との間で保存された残基の突然変異体はＩＦＮＬ４の生物活性に対するより強い影響を示している（図１８）。
【０１８８】
実施例１１．ＩＦＮＬ４の３種の天然の多型変異体の生物活性の分析
ＩＦＮＬ４がｓｓ４６９４１５５９０−ΔＧ対立遺伝子によって生成される場合、タンパク質は、全て異なるＩＦＮＬ４ハプロタイプに存在する３種の追加のコーディング非同義変異体（エクソン１におけるｒｓ７３５５５６０４（Ｃｙｓ１７Ｔｙｒ）、エクソン２におけるｒｓ１４２９８１５０１（Ａｒｇ６０Ｐｒｏ）及びｒｓ１１７６４８４４４（Ｐｒｏ７０Ｓｅｒ））を保有し得る（図１９）。これらの変異体（Ｃｙｓ１７Ｔｙｒ、Ａｒｇ６０Ｐｒｏ及びＰｒｏ７０Ｓｅｒ）の生物活性を、全ての発現構築物のＨｅｐＧ２細胞への一過性発現後に３回の生物反復で野生型ＩＦＮＬ４に対する構築物と比較した。ＲＮＡをトランスフェクション後４８時間で抽出し、ｃＤＮＡへと変換させ、抗ウイルスｑＰＣＲパネル（Qiagen）に包含される９６  ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを検査した。全ての転写産物の発現を４種の内部対照の発現に対して正規化した。ＷＴ−ＩＦＮＬ４及び突然変異体をトランスフェクトした細胞間で有意に異なる転写産物（ｎ＝３３）を主成分分析（ＰＣＡ）による更なる分析に使用した。３３種の転写産物の発現に基づく主成分分析（ＰＣＡ）は、３回の生物反復で特異的な対立遺伝子タンパク質構築物を一過性トランスフェクトしたＨｅｐＧ２におけるｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された抗ウイルス反応に関わるものであった。ＰＣＡプロットから、Ｐｒｏ７０Ｓｅｒ突然変異体が、転写産物の発現に対して、ＷＴ−ＩＦＮＬ４、並びに互いに近くにクラスター形成するＣｙｓ１７Ｔｙｒ及びＡｒｇ６０Ｐｒｏ突然変異体グループの両方とも異なる影響を及ぼすことが示される。ＨｅｐＧ２細胞におけるＩＦＮＬ４対立遺伝子タンパク質構築物（ＷＴ−ＩＦＮＬ４、Ｃｙｓ１７Ｔｙｒ、Ａｒｇ６０Ｐｒｏ及びＰｒｏ７０Ｓｅｒ）の一過性発現が大きな影響を及ぼす発現を有する転写産物のＨｅａｔｍａｐプロットは図２０の実験結果に基づく。突然変異体Ｃｙｓ１７Ｔｙｒ及びＡｒｇ６０Ｐｒｏはこれらの転写産物に対して類似の効果を示すが、Ｐｒｏ７０Ｓｅｒは、ＷＴ−ＩＦＮＬ４をトランスフェクトした細胞と比較してＩＬ１５、ＩＬ１８、ＣＴＳＢ、ＦＯＳ及びＳＰＰ１転写産物の発現の低下、並びにＷＴ−ＩＦＮＬ４をトランスフェクトした細胞と比較してＤＡＫ、ＩＲＦ７、ＤＨＸ５８及びＡＰＯＢＥＣ３Ｇ転写産物の発現の増大を引き起こすというように大部分がＷＴ−ＩＦＮＬ４との差異を示した。カラーチャートは、ＷＴ−ＩＦＮＬ４と比較して突然変異体によって引き起こされる発現のｌｏｇ２スケールの差異に対応する。
【０１８９】
本発明の外延及び範囲（breadth and scope）は上記の例示的な実施形態のいずれによっても限定されず、下記の特許請求の範囲及びその均等物に従ってのみ規定される。
【図４】
2015514709.tif 000008
【図６】
2015514709.tif 000009
【図１２】
2015514709.tif 000010
【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１４】
2015514709.tif 000024
【図１７】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
2015514709000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月26日(2014.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号８のアミノ酸配列由来の少なくとも３０個の連続するアミノ酸配列を含む単離タンパク質、及び
ｂ）少なくとも５０個の連続するアミノ酸の配列を含む単離タンパク質であって、該少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号５又は配列番号８のアミノ酸配列由来の少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９０％同一である、単離タンパク質、
からなる群から選択される単離タンパク質であって、
配列番号２からなるタンパク質に選択的に結合する抗体の誘発、配列番号２からなるタンパク質と結合する化合物への選択的な結合、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の発現の活性化、及び図１５に挙げられる少なくとも１つのＩＳＧの発現の誘導からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する、単離タンパク質。
【請求項２】
前記少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列が、
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｍ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｎ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｏ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｑ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｒ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｓ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｔ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｕ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｖ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ｗ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｘ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｙ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基、
からなる群から選択される少なくとも１つの配列特徴を含む、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項３】
（ａ）配列番号２と比較して、Ａ１０Ｐ、Ａ１１Ｐ、Ｌ１３Ｍ、Ｖ１５Ｆ、Ｃ１７Ｙ、Ｖ１９Ｍ、Ｉ２０Ｖ、Ａ２１Ｐ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ２８Ｍ、Ｌ３５Ｍ、Ｌ４０Ｍ、Ｅ５２Ｋ、Ｌ５５Ｍ、Ｗ５７Ｒ、Ｒ６０Ｐ、Ｎ６１Ｈ、Ｓ６３Ｐ、Ｆ６４Ｖ、Ｒ６５Ｇ、Ｄ６９Ｈ、Ｐ７０Ｓ、Ｐ７１Ｔ、Ｒ７２Ｇ、Ｒ７８Ｇ、Ｖ９２Ｍ、Ｌ９３Ｉ、Ｌ１０１Ｍ、Ｌ１０２Ｆ、Ｇ１１６Ｒ、Ａ１２１Ｐ、Ａ１２６Ｐ、Ｐ１２８Ａ、Ｇ１２９Ａ、Ｓ１３０Ｐ、Ｒ１３２Ｇ、Ｐ１３５Ａ、Ｋ１３９Ｒ、Ｒ１４０Ｇ、Ｋ１４３Ｅ、Ｒ１４６Ｋ、Ｓ１４９Ｐ、Ｐ１５０Ａ、Ｋ１５４Ｅ、Ａ１５５Ｐ、Ｓ１５６Ｇ、Ｖ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｖ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６４Ｍ及びＬ１６９Ｆから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、
（ｂ）配列番号２と比較して、Ａ１０Ｐ、Ａ１１Ｐ、Ｌ１３Ｍ、Ｖ１５Ｆ、Ｃ１７Ｙ、Ｖ１９Ｍ、Ｉ２０Ｖ、Ａ２１Ｐ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ２８Ｍ、Ｌ３５Ｍ、Ｌ４０Ｍ、Ｅ５２Ｋ、Ｌ５５Ｍ、Ｗ５７Ｒ、Ｒ６０Ｐ、Ｎ６１Ｈ、Ｓ６３Ｐ、Ｆ６４Ｖ、Ｒ６５Ｇ、Ｄ６９Ｈ、Ｐ７０Ｓ、Ｐ７１Ｔ、Ｒ７２Ｇ、Ｇ１１６Ｒ、Ａ１２１Ｐ、Ａ１２６Ｐ、Ｐ１２８Ａ、Ｇ１２９Ａ、Ｓ１３０Ｐ、Ｒ１３２Ｇ、Ｐ１３５Ａ、Ｋ１３９Ｒ、Ｒ１４０Ｇ、Ｋ１４３Ｅ、Ｒ１４６Ｋ、Ｓ１４９Ｐ、Ｐ１５０Ａ、Ｋ１５４Ｅ、Ａ１５５Ｐ、Ｓ１５６Ｇ、Ｖ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｖ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６４Ｍ及びＬ１６９Ｆから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、
（ｃ）配列番号２と比較して、Ａ１０Ｐ、Ａ１１Ｐ、Ｌ１３Ｍ、Ｖ１５Ｆ、Ｃ１７Ｙ、Ｖ１９Ｍ、Ｉ２０Ｖ、Ａ２１Ｐ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ２８Ｍ、Ｌ３５Ｍ、Ｌ４０Ｍ、Ｇ１１６Ｒ、Ａ１２１Ｐ、Ａ１２６Ｐ、Ｐ１２８Ａ、Ｇ１２９Ａ、Ｓ１３０Ｐ、Ｒ１３２Ｇ、Ｐ１３５Ａ、Ｋ１３９Ｒ、Ｒ１４０Ｇ、Ｋ１４３Ｅ、Ｒ１４６Ｋ、Ｓ１４９Ｐ、Ｐ１５０Ａ、Ｋ１５４Ｅ、Ａ１５５Ｐ、Ｓ１５６Ｇ、Ｖ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｖ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６４Ｍ及びＬ１６９Ｆから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、又は、
（ｄ）配列番号２と比較して、Ｃ２７Ｇ、Ｓ３４Ｐ、Ｐ３７Ａ、Ｄ４８Ｈ、Ｃ６２Ｒ、Ａ８７Ｐ、Ｄ１１８Ｈ、Ａ１２０Ｐ、Ｃ１２２Ｇ、Ｃ１５２Ｇ、Ｖ１５７Ｌ、Ｎ１６０Ｄ、Ｌ１６１Ｆ、Ｌ１６４Ｍ、Ｌ１６５Ｆ、Ｔ１６６Ｐ、Ｌ１６９Ｆ及びＡ１７３Ｐから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換
を有する、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項４】
（ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号８のアミノ酸配列由来の少なくとも１００個の連続するアミノ酸を有する単離タンパク質、及び
（ｂ）配列番号２由来の少なくとも１５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９２％同一である少なくとも１５０個の連続するアミノ酸を有する単離タンパク質、
からなる群から選択される、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項５】
前記単離タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号５又は配列番号８のアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９０％同一である、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項６】
請求項１に記載の単離タンパク質に選択的に結合する単離抗体。
【請求項７】
ｃ）配列番号２、配列番号５又は配列番号８のアミノ酸配列由来の少なくとも３０個の連続するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸配列、
ｄ）少なくとも５０個の連続するアミノ酸の配列を含むタンパク質をコードする核酸配列であって、該少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列が、配列番号２、配列番号５又は配列番号８のアミノ酸配列由来の少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列に対してその全長にわたって少なくとも９０％同一である、核酸配列、
ｅ）前記ｃ）又は前記ｄ）の核酸配列に対して完全に相補的な核酸配列、
からなる群から選択される核酸配列を有する単離核酸分子であって、
前記ｃ）又は前記ｄ）の核酸配列によりコードされたタンパク質は、配列番号２からなるタンパク質に選択的に結合する抗体の誘発、配列番号２からなるタンパク質と結合する化合物への選択的な結合、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の発現の活性化、及び図１５に挙げられる少なくとも１つのＩＳＧの発現の誘導からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する、単離核酸分子。
【請求項８】
前記少なくとも５０個の連続するアミノ酸配列が、
ａ．配列番号２の２７位に相当する位置のシステイン残基、
ｂ．配列番号２の２９位に相当する位置のロイシン残基、
ｃ．配列番号２の３０位に相当する位置のセリン残基、
ｄ．配列番号２の３２位に相当する位置のチロシン残基、
ｅ．配列番号２の３４位に相当する位置のセリン残基、
ｆ．配列番号２の３７位に相当する位置のプロリン残基、
ｇ．配列番号２の４０位に相当する位置のロイシン残基、
ｈ．配列番号２の４２位に相当する位置のアラニン残基、
ｉ．配列番号２の４４位に相当する位置のリシン残基、
ｊ．配列番号２の４８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｋ．配列番号２の５０位に相当する位置のチロシン残基、
ｌ．配列番号２の１１１位に相当する位置のロイシン残基、
ｍ．配列番号２の１１２位に相当する位置のロイシン残基、
ｎ．配列番号２の１１８位に相当する位置のアスパラギン酸残基、
ｏ．配列番号２の１２０位に相当する位置のアラニン残基、
ｐ．配列番号２の１２２位に相当する位置のシステイン残基、
ｑ．配列番号２の１５２位に相当する位置のシステイン残基、
ｒ．配列番号２の１５７位に相当する位置のバリン残基、
ｓ．配列番号２の１６０位に相当する位置のアスパラギン残基、
ｔ．配列番号２の１６１位に相当する位置のロイシン残基、
ｕ．配列番号２の１６３位に相当する位置のアルギニン残基、
ｖ．配列番号２の１６５位に相当する位置のロイシン残基、
ｗ．配列番号２の１６６位に相当する位置のスレオニン残基、
ｘ．配列番号２の１７３位に相当する位置のアラニン残基、及び、
ｙ．配列番号２の１７８位に相当する位置のシステイン残基、
からなる群から選択される少なくとも１つの配列特徴を含む、請求項７に記載の単離核酸分子。
【請求項９】
（ａ）配列番号２と比較して、Ａ１０Ｐ、Ａ１１Ｐ、Ｌ１３Ｍ、Ｖ１５Ｆ、Ｃ１７Ｙ、Ｖ１９Ｍ、Ｉ２０Ｖ、Ａ２１Ｐ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ２８Ｍ、Ｌ３５Ｍ、Ｌ４０Ｍ、Ｅ５２Ｋ、Ｌ５５Ｍ、Ｗ５７Ｒ、Ｒ６０Ｐ、Ｎ６１Ｈ、Ｓ６３Ｐ、Ｆ６４Ｖ、Ｒ６５Ｇ、Ｄ６９Ｈ、Ｐ７０Ｓ、Ｐ７１Ｔ、Ｒ７２Ｇ、Ｒ７８Ｇ、Ｖ９２Ｍ、Ｌ９３Ｉ、Ｌ１０１Ｍ、Ｌ１０２Ｆ、Ｇ１１６Ｒ、Ａ１２１Ｐ、Ａ１２６Ｐ、Ｐ１２８Ａ、Ｇ１２９Ａ、Ｓ１３０Ｐ、Ｒ１３２Ｇ、Ｐ１３５Ａ、Ｋ１３９Ｒ、Ｒ１４０Ｇ、Ｋ１４３Ｅ、Ｒ１４６Ｋ、Ｓ１４９Ｐ、Ｐ１５０Ａ、Ｋ１５４Ｅ、Ａ１５５Ｐ、Ｓ１５６Ｇ、Ｖ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｖ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６４Ｍ及びＬ１６９Ｆから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、
（ｂ）配列番号２と比較して、Ａ１０Ｐ、Ａ１１Ｐ、Ｌ１３Ｍ、Ｖ１５Ｆ、Ｃ１７Ｙ、Ｖ１９Ｍ、Ｉ２０Ｖ、Ａ２１Ｐ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ２８Ｍ、Ｌ３５Ｍ、Ｌ４０Ｍ、Ｅ５２Ｋ、Ｌ５５Ｍ、Ｗ５７Ｒ、Ｒ６０Ｐ、Ｎ６１Ｈ、Ｓ６３Ｐ、Ｆ６４Ｖ、Ｒ６５Ｇ、Ｄ６９Ｈ、Ｐ７０Ｓ、Ｐ７１Ｔ、Ｒ７２Ｇ、Ｇ１１６Ｒ、Ａ１２１Ｐ、Ａ１２６Ｐ、Ｐ１２８Ａ、Ｇ１２９Ａ、Ｓ１３０Ｐ、Ｒ１３２Ｇ、Ｐ１３５Ａ、Ｋ１３９Ｒ、Ｒ１４０Ｇ、Ｋ１４３Ｅ、Ｒ１４６Ｋ、Ｓ１４９Ｐ、Ｐ１５０Ａ、Ｋ１５４Ｅ、Ａ１５５Ｐ、Ｓ１５６Ｇ、Ｖ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｖ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６４Ｍ及びＬ１６９Ｆから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、
（ｃ）配列番号２と比較して、Ａ１０Ｐ、Ａ１１Ｐ、Ｌ１３Ｍ、Ｖ１５Ｆ、Ｃ１７Ｙ、Ｖ１９Ｍ、Ｉ２０Ｖ、Ａ２１Ｐ、Ｒ２６Ｇ、Ｌ２８Ｍ、Ｌ３５Ｍ、Ｌ４０Ｍ、Ｇ１１６Ｒ、Ａ１２１Ｐ、Ａ１２６Ｐ、Ｐ１２８Ａ、Ｇ１２９Ａ、Ｓ１３０Ｐ、Ｒ１３２Ｇ、Ｐ１３５Ａ、Ｋ１３９Ｒ、Ｒ１４０Ｇ、Ｋ１４３Ｅ、Ｒ１４６Ｋ、Ｓ１４９Ｐ、Ｐ１５０Ａ、Ｋ１５４Ｅ、Ａ１５５Ｐ、Ｓ１５６Ｇ、Ｖ１５８Ｉ、Ｆ１５９Ｖ、Ｌ１６２Ｍ、Ｌ１６４Ｍ及びＬ１６９Ｆから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換、又は、
（ｄ）配列番号２と比較して、Ｃ２７Ｇ、Ｓ３４Ｐ、Ｐ３７Ａ、Ｄ４８Ｈ、Ｃ６２Ｒ、Ａ８７Ｐ、Ｄ１１８Ｈ、Ａ１２０Ｐ、Ｃ１２２Ｇ、Ｃ１５２Ｇ、Ｖ１５７Ｌ、Ｎ１６０Ｄ、Ｌ１６１Ｆ、Ｌ１６４Ｍ、Ｌ１６５Ｆ、Ｔ１６６Ｐ、Ｌ１６９Ｆ及びＡ１７３Ｐから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換
を有するタンパク質をコードする請求項７に記載の単離核酸分子。
【請求項１０】
ａ）配列番号１、配列番号４、又は配列番号７の核酸配列由来の少なくとも１００個の連続するヌクレオチドを含む単離核酸配列、
ｂ）配列番号１、配列番号４、又は配列番号７に対して少なくとも９０％同一である単離核酸配列
からなる群から選択される請求項７に記載の単離核酸分子。
【請求項１１】
配列番号２、配列番号５、又は配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする請求項７に記載の単離核酸分子。
【請求項１２】
ａ）個体のＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を予測する方法であって、
存在する場合に、個体から得られた生物サンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベルを決定する工程を含み、前記サンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベルは、前記個体がＨＣＶ感染症を自然消失させる可能性を示すものである、方法、及び
ｂ）個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性を予測する方法であって、
存在する場合に、個体から得られた生物サンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベルを決定する工程を含み、前記サンプルに存在するＩＦＮＬ４タンパク質のレベルは、前記個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示す可能性を示すものである、方法
からなる群から選択される方法。
【請求項１３】
工程ａ）で決定されたＩＦＮＬ４のレベルが、ＨＣＶ感染症を自然消失させることが可能であることが既に知られている被験体に存在するＩＦＮＬ４のレベル未満である場合に、前記個体がＨＣＶ感染症を自然消失させることが可能であると同定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
工程ａ）で決定されたＩＦＮＬ４のレベルが、ＨＣＶ感染症の治療に反応を示すことが可能であることが既に知られている被験体に存在するＩＦＮＬ４のレベル未満である場合に、前記個体がＨＣＶ感染症の治療に反応を示すことが可能であると同定する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
サンプルにおけるＩＦＮＬ４タンパク質を検出するための少なくとも一つの手段を含む、請求項１２に記載の方法を実施するためのキット。
【国際調査報告】
2015514709.tif 000029
2015514709.tif 000030
2015514709.tif 000031