(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明は、食欲を減少させ、及び/又は減量を促進し、及び/又は肥満を治療し、及び/又は代謝を増加させ、及び/又は熱産生を増加させ、及び/又は白色脂肪を褐色脂肪に転換する方法に用いる、SorCS1と、SorCS1及びそのフラグメントの発現をコードする核酸分子と、前記核酸分子を含むベクターとが含まれるSorCS1用作用剤、並びにSorCS1及び前記フラグメントを発現する細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
作用剤であって
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択され、
食欲を減少させ、及び/又は減量を促進し、及び/又は肥満を治療し、及び/又は代謝を増加させ、及び/又は熱産生を増加させ、及び/又は白色脂肪を褐色脂肪に転換する方法に用いる作用剤。
【請求項２】
前記作用剤は、ポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号15、5、1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、55、56、57、58、59、60、61、62、63、及び64からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む生物学的に活性な配列変異体である、請求項1記載の作用剤。
【請求項３】
前記作用剤は、ポリペプチドであって、前記ポリペプチドは、配列番号15、5、1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、55、56、57、58、59、60、61、62、63、及び64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する生物学的に活性な配列変異体である、請求項1記載の作用剤。
【請求項４】
前記ポリペプチドは、配列番号15、5、1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、55、56、57、58、59、60、61、62、63、及び64からなる群から選択される配列の天然に存在する対立遺伝子変異体である、請求項1記載の作用剤。
【請求項５】
前記ポリペプチドは、配列番号15、5、63、62、21、27、33、37、39、43、47、51からなる群から選択される可溶性SorCS1のアミノ酸配列を含む、請求項1記載の作用剤。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、記載の変異体ポリペプチドであり、前記選択される配列内で指定された任意のアミノ酸は、200個以下のアミノ酸が変更されるという条件で、保存的置換をもたらすように変更される、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項７】
前記ポリペプチドは、記載の変異体ポリペプチドであり、前記選択される配列内で指定された任意のアミノ酸は、100個以下のアミノ酸が変更されるという条件で、保存的置換をもたらすように変更される、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項８】
前記ポリペプチドは、記載の変異体ポリペプチドであり、前記選択される配列内で指定された任意のアミノ酸は、50以下のアミノ酸が変更されるという条件で、保存的置換をもたらすように変更される、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項９】
前記ポリペプチドは、記載の変異体ポリペプチドであり、前記選択される配列内で指定された任意のアミノ酸は、25以下のアミノ酸が変更されるという条件で、条件で、保存的置換をもたらすように変更される、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、配列番号15、5、1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、55、56、57、58、59、60、61、62、63、及び64からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも65％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、好ましくは少なくとも80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも91％、より好ましくは少なくとも92％、より好ましくは少なくとも93％、より好ましくは少なくとも94％、より好ましくは少なくとも95％、より好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％、より好ましくは少なくとも98％、より好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有する、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項１１】
前記作用剤はポリペプチドであり、前記ポリペプチドは、配列番号1、2、3、4、6、7、8、9、11、12、13、14、61、及び62からなる群から選択される、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項１２】
前記ポリペプチドは、配列番号16、17、18、19、20、22、26、28、29、30、31、及び32からなる群から選択される、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項１３】
前記作用剤は、配列番号61、62、63、及び64からなる群から選択されるポリペプチドである、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項１４】
前記作用剤は、配列番号55、56、57、58、59、及び60からなる群から選択されるポリペプチドである、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項１５】
前記作用剤は、配列番号62及び64からなる群から選択されるポリペプチドである、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項１６】
前記作用剤は、生物学的に活性なフラグメントであり、前記フラグメントは、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、及び64からなる群から選択されるアミノ酸配列の何れかの、500個未満の連続するアミノ酸残基、例として450個未満の連続するアミノ酸残基、例えば400個未満の連続するアミノ酸残基、例として350個未満の連続するアミノ酸残基、例えば300個未満の連続するアミノ酸残基、例えば250個未満の連続するアミノ酸残基、例として240個未満の連続するアミノ酸残基、例えば225個未満の連続するアミノ酸残基、例として200個未満の連続するアミノ酸残基、例えば180個未満の連続するアミノ酸残基、例として160個未満の連続するアミノ酸残基、例えば150個未満の連続するアミノ酸残基、例として140個未満の連続するアミノ酸残基、例えば130個未満の連続するアミノ酸残基、例として120個未満の連続するアミノ酸残基、例えば110個未満の連続するアミノ酸残基、例として100個未満の連続するアミノ酸残基、例えば90個未満の連続するアミノ酸残基、例として85個未満の連続するアミノ酸残基、例えば80個未満の連続するアミノ酸残基、例として75個未満の連続するアミノ酸残基、例えば70個未満の連続するアミノ酸残基、例として65個未満の連続するアミノ酸残基、例えば60個未満の連続するアミノ酸残基、例として55個未満の連続するアミノ酸残基、例えば50個未満の連続するアミノ酸残基、例として45個未満の連続するアミノ酸残基、例えば40個未満の連続するアミノ酸残基、例として35個の連続するアミノ酸残基、例えば30の連続するアミノ酸残基、例として25個の連続するアミノ酸残基、例として20個の連続するアミノ酸残基、例えば15個の連続するアミノ酸残基を含む、請求項1記載の作用剤。
【請求項１７】
前記作用剤は、生物学的に活性なフラグメントであり、前記フラグメントは、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、及び64からなる群から選択されるアミノ酸配列の何れかの、少なくとも15個の連続するアミノ酸残基、例として20個超の連続するアミノ酸残基、例えば25個超の連続するアミノ酸残基、例えば50個超の連続するアミノ酸残基、例として75個超の連続するアミノ酸残基、例えば100個超の連続するアミノ酸残基、例として125個超の連続するアミノ酸残基、例えば150個超の連続するアミノ酸残基、例として175個超の連続するアミノ酸残基、例えば200個超の連続するアミノ酸残基、例として225個超の連続するアミノ酸残基、例えば250個超の連続するアミノ酸残基、例として275個超の連続するアミノ酸残基、例えば300個超の連続するアミノ酸残基、例として325個超の連続するアミノ酸残基、例えば350個超の連続するアミノ酸残基、例として375個超の連続するアミノ酸残基、例えば400個超の連続するアミノ酸残基、例として425個超の連続するアミノ酸残基、例えば450個超の連続するアミノ酸残基、例として475個超の連続するアミノ酸残基、例えば500個超の連続するアミノ酸残基、例として525個超の連続するアミノ酸残基、例えば550個超の連続するアミノ酸残基、例として575個超の連続するアミノ酸残基、例えば600個超の連続するアミノ酸残基、例として625個超の連続するアミノ酸残基、例えば650個超の連続するアミノ酸残基、例として675個超の連続するアミノ酸残基、例として700個超の連続するアミノ酸残基を含む、請求項1記載の作用剤。
【請求項１８】
前記ポリペプチドは、グリコシル化される、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項１９】
前記ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸位置184、352、433、765、776、816、847、908、及び929に対応する1個以上のアスパラギンアミノ酸残基において、N-グリコシル化される、請求項18記載の作用剤。
【請求項２０】
前記ポリペプチドは、以下の配列の1つ以上を含む、先行請求項の何れかに記載の作用剤:
配列番号1 aa103-124
配列番号1 aa125-143
配列番号1 aa144-162
配列番号1 aa197-218
配列番号1 aa391-409
配列番号1 aa661-684
配列番号1 aa763-783
配列番号1 aa859-876。
【請求項２１】
シグナルペプチドは、異種シグナルペプチドに置き換えられている、請求項1記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドは、少なくとも1つの分子内シスチン架橋を形成することができる、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項２３】
少なくとも1つの分子間シスチン架橋を介して連結された前記ポリペプチドの二量体を含む、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項２４】
前記ポリペプチドは、更に、poly-hisタグ、GSTタグ、HAタグ、Flagタグ、C-mycタグ、HSVタグ、V5タグ、マルトース結合タンパク質タグ、セルロース結合ドメインタグ等のアフィニティタグを含む、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項２５】
前記ベクターは、更に、前記核酸配列と適切に作用可能に連結し得るプロモータを含む、請求項1記載の作用剤。
【請求項２６】
前記プロモータは、CMV、ヒトUbiC、RSV、Tet調節可能プロモータ、Mo-MLV-LTR、Mx1、EF-1α、PDGFβ、及びCaMK IIからなる群から選択される、請求項25記載の作用剤。
【請求項２７】
前記ベクターは、レンチウイルス、HIV、SIV、FIV、EAIV、CIVを含む、レトロウイルス科由来のベクターからなる群から選択される、請求項1記載の作用剤。
【請求項２８】
前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、HSV、コロナウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、Mo-MLVからなる群から選択される、請求項1記載の作用剤。
【請求項２９】
前記ベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)である、請求項1記載の作用剤。
【請求項３０】
前記宿主細胞は、Saccharomyces cerevisiae、大腸菌、アスペルギルス、及びSf9昆虫細胞等の昆虫細胞からなる群から選択される、請求項1記載の作用剤。
【請求項３１】
前記宿主細胞は、ヒト、ネコ、ブタ、サル、イヌ、ネズミ、及びラット細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞からなる群から選択される、請求項1記載の作用剤。
【請求項３２】
前記哺乳動物細胞は、筋細胞と、肝細胞と、脂肪細胞と、α細胞、β細胞、及びδ細胞等の膵臓の細胞とからなる群から選択される、請求項31記載の作用剤。
【請求項３３】
前記宿主細胞は、CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、HiB5、RN33b、及びBHK細胞からなる群から選択される、請求項1記載の作用剤。
【請求項３４】
前記被験体は、インスリン抵抗性及び/又は2型糖尿病を有してない、請求項1記載の作用剤。
【請求項３５】
前記作用剤は、患者に投与された際の半減期、特に血漿半減期を増加させるために化学修飾される、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項３６】
前記作用剤は、患者に投与された際の半減期、特に血漿半減期を増加させるために化学修飾される、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項３７】
前記作用剤は、更に、前記作用剤に結合されることにより、成分結合作用剤を生成する成分を含む、先行請求項の何れかに記載の作用剤。
【請求項３８】
前記成分結合作用剤は、非成分結合作用剤の血漿及び/又は血清半減期よりも長い血漿及び/又は血清半減期を有する、請求項37記載の作用剤。
【請求項３９】
前記成分は、血液脳関門を越える輸送を促進する、請求項37記載の作用剤。
【請求項４０】
前記成分は、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、又はグアナコ由来の組換え又は天然単鎖抗体等、ラクダ科の種由来の抗体である、請求項37記載の作用剤。
【請求項４１】
前記作用剤に結合される前記成分は、アルブミン、脂肪酸、ポリエチレングリコール(PEG)、アシル化基、抗体、及び抗体フラグメントからなる群から選択される1種類以上の成分である、請求項37乃至40の何れかに記載の作用剤。
【請求項４２】
前記作用剤及び前記成分は、リンカーにより互いに結合される、請求項37乃至41の何れかに記載の作用剤。
【請求項４３】
前記1つより多くの成分が、前記作用剤に結合される、請求項37乃至41の何れかに記載の作用剤。
【請求項４４】
前記リンカーは、配列番号65、66、67、68、及び69からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項42及び43の何れかに記載の作用剤。
【請求項４５】
先行請求項の何れかに記載の作用剤を含む医薬組成物。
【請求項４６】
更に、医薬的に許容可能な担体を含む、請求項45記載の医薬組成物。
【請求項４７】
前記組成物のpHは、pH4乃至pH10である、請求項45及び46の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項４８】
前記組成物は、非経口投与用に製剤化される、請求項45乃至47の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記組成物は、経口投与用に製剤化される、請求項45乃至47の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項５０】
前記非経口投与は、注入である、請求項48記載の医薬組成物。
【請求項５１】
前記投与は、静脈内、筋肉内、脊髄内、腹腔内、皮下、ボーラス、又は連続投与である、請求項48及び49の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項５２】
前記投与は、30分乃至24時間の間隔、例として1乃至6時間の間隔で行われ、例として1日に3回行われる、請求項45乃至51の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項５３】
治療の継続期間は、6乃至72時間である、請求項45乃至52の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項５４】
治療の継続期間は、24時間乃至7日間である、請求項45乃至52の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項５５】
治療の継続期間は、4乃至150日間である、請求項45乃至52の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項５６】
治療の継続期間は、生涯である、請求項45乃至52の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項５７】
活性成分の投与量は、体重1kg当たり10μg乃至500mg、例として体重1kg当たり50μg乃至250mgである、請求項35乃至43の何れかに記載の医薬組成物。
【請求項５８】
請求項45乃至57の何れかに記載の医薬組成物と、使用説明書とを備えるキット。
【請求項５９】
作用剤の使用であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択される作用剤の、
食欲を減少させ、及び/又は減量を促進し、及び/又は代謝を増加させ、及び/又は熱産生を増加させ、及び/又は白色脂肪を褐色脂肪に転換する薬剤の調製のための使用。
【請求項６０】
食欲を減少させ、及び/又は減量を促進し、及び/又は肥満を治療し、及び/又は代謝を増加させ、及び/又は熱産生を増加させ、及び/又は白色脂肪を褐色脂肪に転換する方法であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択される作用剤の治療有効量を、必要とする個体に投与することを含む方法。
【請求項６１】
肥満を治療する方法であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択される作用剤の治療有効量を、必要とする個体に投与することを含む方法。
【請求項６２】
代謝を増加させる方法であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択される作用剤の治療有効量を、必要とする個体に投与することを含む方法。
【請求項６３】
哺乳動物における熱産生を増加させる方法であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択される作用剤の治療有効量を、哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項６４】
白色脂肪を褐色脂肪に転換するインビボの方法であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択される作用剤の治療有効量を、哺乳動物に投与することを含む方法。
【請求項６５】
白色脂肪を褐色脂肪に転換するインビトロの方法であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択される作用剤の有効量に、細胞を接触させることを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2012年4月17日に出願されたデンマーク特許出願第PA 2012 70191号に基づく優先権を主張する。当該出願及び本願に引用された全ての参考文献は、出典を明記することによりその開示内容全体を本願明細書に援用する。
【０００２】
本発明は、SorCS1、好ましくはSorCS1ポリペプチド及びその可溶性フラグメント及び変異体を投与することにより、食欲を減少させ、空腹感を抑制し、及び/又は肥満を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
肥満は、健康に悪影響を与え得る程度まで体脂肪が蓄積された医学的状態である。臨床的には、肥満は、世界保健機関(WHO)により、30を超える肥満度指数(body mass index, BMI)を有することとして定義されている。肥満個体群内では、肥満の重症度に基づいて、3種類のサブクラスを、肥満クラスI(BMI30.0乃至34.9)、肥満クラスII(BMI35.0乃至39.9)、及び肥満クラスIII(BMI40超)の範囲で定めることが可能であり、これらは公衆衛生活動にとって累積的な問題でもある。デンマークでは全成人の15％までが肥満であると推定される(BMI>30)。
【０００４】
肥満による有害事象には、負の社会的イメージ、心血管疾患、及び2型糖尿病(Darvall et al., Eur J Vasc Endovasc Surg 2007, Haslam & James, Lancet 2005, Vernochet et al., FEBS J 2009, Yusuf et al., Lancet 2004)と共に、幾つかの癌が挙げられる(Roberts et al., Annu Rev Med 2009)。こうした悪影響に加え、肥満は、精神系及び神経系の障害等、他の多数の共存症にも関連する(Beydoun et al., Obes Rev 2008, Harney et al., Pain Med 2007)。
【０００５】
現在、肥満は、世界的に疾病負荷の原因となる最も重要な危険因子の1つであり、米国では予防可能な死亡原因の第2位(喫煙の次)である(Mokdad et al., JAMA 2004)。2005年には、成人11億人及び子供の10％が過体重又は肥満に分類された(Haslam & James, Lancet 2005)。欧州では、肥満発生率が増加しており、恐らくは更に憂慮されることとして、小児肥満症がより一層広まりつつある。(Livingstone, Public Health Nutr 2011)。
【０００６】
現在の肥満治療には、食事の変更、運動及び活動、行動の変更、処方減量薬、及び減量手術が含まれる。販売及び開発中の減量薬には、胃腸(GI)管からの吸収を減少させることを目的とした分子(オルリスタット)、或いは様々な形で食物摂取を制限し、空腹感を抑えるもの(フェンテルミン、プラムリンチド、エクセナチド、リラグルチド)が含まれる。しかしながら、オルリスタット及びフェンテルミンのみが、減量薬としての販売を承認されている。オルリスタット(ゼニカル)は、膵リパーゼを阻害することで腸管の脂肪吸収を減少させる。オルリスタットの使用による副作用の一部には、油質の便通(脂肪便)の頻発が含まれる。但し、食事の脂肪を減らすことで、症状は改善することが多い。当初は処方でのみ利用可能であったが、2007年2月にFDAにより店頭販売が認められた。フェンテルミンは、フェネチルアミンクラスの精神刺激薬であり、アンフェタミンに類似する薬理を有する。短期間、運動、食事、行動の改善と組み合わせて用いる場合、肥満症患者の減量を支援する食欲抑制剤として承認されている。プラムリンチド(シムリン)は、通常の人において摂食に応答して膵臓により分泌されるホルモン、アミリンの合成類似物である。様々な効果の中で特に、アミリンは、胃内容排出を遅延させ、満腹感を促進する。多くの糖尿病患者は、アミリンが不足している。シムリンは、1型及び2型糖尿病患者がインスリンと共に使用することのみが承認されている。しかしながら、シムリンは、現在、肥満の治療法として、非糖尿病患者において試験されている。エクセナチド(バイエッタ)は、食物の存在に応答して腸が分泌するホルモンGLP-1の、長時間作用型の類似物である。様々な効果の中で特に、GLP-1は、胃内容排出を遅延させ、満腹感を促進する。糖尿病の人の一部は、GLP-1が不足しており、ダイエットすることによりGLP-1は更に減少する。バイエッタは、現在、2型糖尿病の治療に利用することができる。全てではないが、一部の患者では、バイエッタを服用した際に、体重が実質的に減少する。しかしながら、バイエッタは、2型糖尿病患者に対してのみ承認及び推奨されている。リラグルチド(ビクトーザ)は、長期作用型のグルカゴン様ペプチド1(GLP-1)類似物である。様々な効果のうち、特に、ビクトーザは、インスリンの分泌を増加させ、胃内容排出を遅延させ、食事によるグルカゴンの分泌を抑制する。ビクトーザは、現在、2型糖尿病患者の治療に利用することができる。一部の患者では、ビクトーザを服用した際に、体重が実質的に減少する。しかしながら、ビクトーザは、2型糖尿病患者に対してのみ承認及び推奨されている。
【０００７】
減量手術には、胃バイパス術、腹腔鏡下調節性胃バンディング術(LAGB)、胃スリーブ術、及び胆膵路バイパス/十二指腸スイッチ術が含まれる。
【０００８】
Vps10pドメイン(Vps10p-D)受容体ファミリーは、受容体ソルチリン、SorLA、SorCS1、SorCS2、及びSorCS3を含む。これらは全て1型膜貫通受容体であり、酵母のソーティングタンパク質であるVps10pとの高い配列同一性を有するN末端Vps10pドメインの構造的特徴を共有している(10)。最近の発見では、ソルチリン及びSorLAの両方が、ニューロンの生存及び死の制御因子として重要な役割を果たすことが示唆されている(11、12、WO2004/056385、WO2008/074329)。興味深いことに、ソルチリンは、細胞内区画から形質膜へのグルコース輸送体GLUT4の移行を促進し得ることから、インスリン調節グルコース取り込みにも関連していた(13、14、WO2010/142296)。
【０００９】
SorCS1は、多数の組織の中で特に、脳、膵臓、脂肪組織、及び筋肉において発現される受容体である。遺伝的研究から、ヒト(Nat Genet. 2006 Jun;38(6):688-93)、ラット(Genetics. 2006 Nov;174(3):1565-72)、及びマウス(Diabetes. 2007 Jul;56(7):1922-9)のSorCS1遺伝子における多型が、2型糖尿病の発症リスクに関連することが明らかとなっている。
【００１０】
SorCS1は、Vps10p-D受容体の中で唯一、同一の細胞外部分及び膜貫通部分と、長さ及び配列の異なる細胞質ドメインとをコードする、SorCS1-a、b、c、c+、及びdにより表される数種類のスプライスバリアントで存在する(10、11)。SorCS1は、神経系に加え、脂肪組織、骨格筋、及び膵臓のβ細胞において発現されることが実証されている(WO2010/142296)。
【００１１】
更に、SorCS1は、インスリン受容体(IR)に結合し、その発現を筋肉組織及び脂肪組織において安定させることにより、インスリンに応答する能力を確保可能であることが実証されている(WO2010/142296)。この概念を支持するものとして、SorCS1(可溶性SorCS1)の細胞外ドメインによる処置は、db/dbマウス(肥満依存性2型糖尿病マウス)において、血漿グルコース値及びインスリン値の両方に顕著な低下をもたらす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO2010/142296
【発明の概要】
【００１３】
SorCS1は、哺乳類のVps10pドメイン(Vps10p-D)受容体ファミリーの5つの構成要素の1つであり、他には、ソルチリン、SorLA、SorCS2、及びSorCS3が含まれる。SorCS1は、Vps10p-D受容体の中で唯一、数種類のスプライスバリアントで存在する。
【００１４】
本発明者らは、SorCS1、及び特にSorCS1ポリペプチド(可溶性SorCS1又はsSorCS1)の細胞外ドメインの被験体への投与が、処置した被験体における有意な体重減少をもたらすことを発見した。
【００１５】
したがって、本発明の目的は、食欲を減少させること、及び/又は空腹感を抑制すること、及び/又は空腹感の抑制を増進すること、及び/又は予測消費量(prospective consumption)の減少を増進すること、及び/又は食欲の減少を増進すること、及び/又は満腹感を高めること、及び/又は肥満を治療すること、及び/又は減量を促進すること、及び/又は代謝を増加させること、及び/又は白色脂肪を褐色脂肪に転換することが可能な方法及び作用剤を提供することである。後者は、SorCS1療法を受けた被験体の熱産生を増加させるものである。したがって、本発明は、被験体における熱産生を増加させる方法にも関する。
【００１６】
したがって、主要な態様において、本発明は、作用剤であって
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択され、
食欲を減少させ、及び/又は減量を促進し、及び/又は肥満を治療し、及び/又は代謝を増加させ、及び/又は熱産生を増加させ、及び/又は白色脂肪を褐色脂肪に転換する方法に用いる作用剤に関する。
【００１７】
本発明の作用剤は、被験体への送達に適した形で製剤化し得る。したがって、一態様において、本発明は、上述した作用剤を含む医薬組成物に関する。一態様において、本発明は、前記医薬組成物と、被験体への投与の指示等の使用説明書とを含むキットに関する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
【００１９】
特に指摘しない限り、全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当該技術分野における当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本発明の目的から、以下の用語を定義する。
【００２０】
アシル化:「アシル化」又は「アシル化基」という用語は、本明細書での使用において、R-(C=O)基を意味し、ここで、Rは、直鎖又は分岐鎖アルカンカルボン酸等、1個以上のO、N、S、又はPを随意により含む、直鎖又は分岐鎖、飽和又は不飽和炭素鎖から選択される。適切なアシル化基の様々な例は、WO2006/037810、WO00/34331、WO2006/097537、WO2011/080103に記載されている。適切なアシル化基の特定の例は、CH3(CH2)nCO-の構造を有し、ここで、nは、4乃至40、例えば8乃至22であり、例として、以下を含む群から選択されるアシル化基である:
CH3(CH2)8CO-、CH3(CH2)9CO-、CH3(CH2)10CO-、CH3(CH2)11CO-、CH3(CH2)12CO-、CH3(CH2)13CO-、CH3(CH2)14CO-、CH3(CH2)15CO-、CH3(CH2)16CO-、CH3(CH2)17CO-、CH3(CH2)18CO-、CH3(CH2)19CO-、CH3(CH2)20CO-、CH3(CH2)21CO-、及びCH3(CH2)22CO-。適切なアシル化基の他の例は、HOOC-(CH2)nCO-の構造を有し、ここで、nは、4乃至40、例えば12乃至20であり、一般には、HOOC-(CH2)14CO-、HOOC-(CH2)15CO-、HOOC-(CH2)16CO-、HOOC-(CH2)17CO- and HOOC-(CH2)18CO-である。アシル化基の他の例については、US5,905,140を参照されたい。
【００２１】
アジュバント:投与された免疫原決定基/抗原との混合が、前記決定基に対する免疫応答を増加させる、或いは他の形で修飾する任意の物質。
【００２２】
親和性:殆どのリガンドのその結合部位との相互作用は、結合親和性の観点から性質決定することができる。一般に、高親和性のリガンド結合は、リガンドと受容体との間の大きな分子間力により生じ、低親和性のリガンド結合は、リガンドと受容体との間の分子間力が小さい。一般に、高親和性結合では、受容体結合部位におけるリガンドの滞留時間は、低親和性結合の場合よりも長くなる。受容体に対するリガンドの高親和性結合は、結合エネルギーの一部を用いて、受容体の立体配座の変化を発生させることが可能である際に、生理学的に重要となる場合が多く、関連するイオンチャネル又は酵素の作用の変化をもたらす。
【００２３】
受容体に結合し、受容体の機能を変化させ、生理反応を引き起こすことが可能なリガンドは、受容体のアゴニストと呼ばれる。受容体に結合するアゴニストは、どのくらいの生理反応を引き起こすことが可能か、及び、生理反応を生成するために必要なアゴニストの濃度との両方の観点から性質決定することができる。高親和性リガンド結合は、リガンド結合部位を最大限に占有して生理反応を引き起こす上で比較的低濃度のリガンドで充分であることを意味する。低親和性結合は、結合部位が最大限に占有され、リガンドに対する最大の生理反応が達成されるまでに、比較的高濃度のリガンドが必要であることを意味する。リガンド結合は、解離定数(kd)として知られる受容体結合部位の半分が占有されるリガンドの濃度の観点から性質決定される場合が多い。親和性は、受容体及びそのリガンド間、例えば、抗体及び抗原間の結合の力でもある。
【００２４】
アゴニスト:アゴニストは、受容体の活性を増加させること或いはこれに影響を与えることが可能な化合物である。具体的には、Vps10pドメイン受容体アゴニストは、Vps10pドメイン受容体の1つ以上の結合部位に結合することにより、特定の内因性アゴニストリガンド化合物と同じ生理反応を誘発可能な化合物である。
【００２５】
アンタゴニスト:アンタゴニストは、この場合、阻害剤と同義である。アンタゴニストは、受容体等のエフェクターの活性を減少させることが可能な化合物である。具体的には、Vps10pドメイン受容体アンタゴニストは、Vps10pドメイン受容体の1つ以上の結合部位に結合することにより、他のリガンドの結合を阻害し、生理反応を阻害することが可能な化合物である。
【００２６】
抗体:「抗体」という用語は、本明細書での使用において、抗体全体と、その任意の抗原結合性フラグメント(即ち「抗原結合部分」)又は単鎖とを示す。
【００２７】
ポリクローナル抗体:ポリクローナル抗体は、特異的な一定の抗原を認識する抗体分子の混合物であり、したがってポリクローナル抗体は、前記抗原内の異なるエピトープを認識し得る。
【００２８】
芳香族基:「芳香族基」又は「アリル基」という用語は、単環又は多環式炭化水素基を意味する。
【００２９】
結合部位:「結合部位」又は「結合ポケット」という用語は、本明細書での使用において、その形状の結果として、他の分子、分子複合体、化学成分、又は化合物と良好に結び付く、分子又は分子複合体の領域を示す。本明細書での使用において、ポケットは、少なくとも深い空洞を含み、随意により浅い空洞を含む。
【００３０】
生体反応剤又は生物学的に活性な又は生物学的活性:これらの用語は、本明細書での使用において、本発明による治療的又は他の形で有用な応用に関連して使用し得る任意の化合物又は物質の効果を示す。
【００３１】
静電相互作用:「静電相互作用」という用語は、本明細書での使用において、反対の電荷の成分が互いに引き合う時に、荷電成分、分子、又はイオン間で引力により発生する任意の相互作用を示す。例には、限定ではないが、イオン性相互作用、共有結合性相互作用、イオン及び双極子(イオン及び極性分子)間の相互作用、2つの双極子(極性分子の部分電荷)間の相互作用、水素結合、及びロンドン分散結合(分極性分子の誘起双極子)が含まれる。したがって、例えば、「イオン性相互作用」又は「静電相互作用」は、第1の正荷電分子と第2の負荷電分子の間の誘引を示す。イオン性相互作用又は静電相互作用には、例えば、負荷電生理活性剤との間の誘引が含まれる。
【００３２】
Fcフラグメント:「哺乳類抗体のFcフラグメント」という用語は、本明細書での使用において、定常領域、即ち、哺乳類抗体又はそのフラグメントのFcフラグメントであって、こうした哺乳類抗体を、霊長類、例えばヒト、類人猿、又はサルや、ウマ科、例えばウマ等、哺乳動物のIgM、IgG、IgA、IgD、及びIgEから選択し得るものを意味する。代表的な哺乳類抗体のFcフラグメントは、ヒトIgG抗体の組換えFcフラグメント等、ヒト抗体の組換えFcフラグメントである。
【００３３】
本発明の文脈において、「哺乳類抗体のFcフラグメントの変異体」又は「Fc変異体」という用語(本明細書の全体で相互交換可能に用いられる)は、本明細書での使用において、哺乳類抗体のFcフラグメントであって、Fcフラグメントの1個以上のアミノ酸残基、例として1乃至10個のアミノ酸残基が、他のアミノ酸残基により置換されたもの、及び/又は、1個以上のアミノ酸残基、例として1乃至10個のアミノ酸残基が、Fcフラグメントから欠失したもの、及び/又は、1個以上のアミノ酸残基、例として1乃至10個のアミノ酸残基が、Fcフラグメントに付加されたもの、及び/又は、Fcフラグメント内の1個以上のアミノ酸残基、例として1乃至10個のアミノ酸残基が、修飾されたものを意味する。こうしたアミノ酸残基の付加又は欠失は、例えば、FcフラグメントのN末端、及び/又はFcフラグメントのC末端で起こる可能性がある。天然とは、人間により修飾されていないFcを示す。WO96/32478には、Fc変異体の例が記載されている。したがって、「Fc変異体」は、一実施形態において、非ヒト天然Fcからヒト化された分子又は配列を含む。更に、天然Fcは、本発明の融合分子に必要ではない構造的特徴又は生物学的活性をもたらすことから除去してもよい部位を含む。
【００３４】
フラグメント:本発明によるポリペプチドフラグメントは、その任意の機能的等価物を含め、一実施形態において、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、及び64からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は前記配列に対して少なくとも70％(例えば、少なくとも85％、90％、95％、97％、98％、又は99％)の同一性を有するその変異体の、500個未満のアミノ酸残基、例として450個未満のアミノ酸残基、例えば400個未満のアミノ酸残基、例として350個未満のアミノ酸残基、例えば300個未満のアミノ酸残基、例えば250個未満のアミノ酸残基、例として240個未満のアミノ酸残基、例えば225個未満のアミノ酸残基、例として200個未満のアミノ酸残基、例えば180個未満のアミノ酸残基、例として160個未満のアミノ酸残基、例えば150個未満のアミノ酸残基、例として140個未満のアミノ酸残基、例えば130個未満のアミノ酸残基、例として120個未満のアミノ酸残基、例えば110個未満のアミノ酸残基、例として100個未満のアミノ酸残基、例えば90個未満のアミノ酸残基、例として85個未満のアミノ酸残基、例えば80個未満のアミノ酸残基、例として75個未満のアミノ酸残基、例えば70個未満のアミノ酸残基、例として65個未満のアミノ酸残基、例えば60個未満のアミノ酸残基、例として55個未満のアミノ酸残基、例えば50個未満のアミノ酸残基、例として45個未満のアミノ酸残基、例えば40個未満のアミノ酸残基、例として35個のアミノ酸残基、例えば30個のアミノ酸残基、例として25個のアミノ酸残基、例として20個のアミノ酸残基、例えば15個のアミノ酸残基、例として10個のアミノ酸残基、例えば5個の連続するアミノ酸残基を含む。更に、本発明によるポリペプチドフラグメントは、その任意の機能的等価物を含め、一実施形態において、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、及び64からなる群から選択されるアミノ酸配列、又は前記配列に対して少なくとも60％(例えば、少なくとも65％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、又は少なくとも99％)の同一性を有するその変異体の、5個超のアミノ酸残基、例として10個超のアミノ酸残基、例えば15個超のアミノ酸残基、例として20個超のアミノ酸残基、例えば25個超のアミノ酸残基、例えば50個超のアミノ酸残基、例として75個超のアミノ酸残基、例えば100個超のアミノ酸残基、例として125個超のアミノ酸残基、例えば150個超のアミノ酸残基、例として175個超のアミノ酸残基、例えば200個超のアミノ酸残基、例として225個超のアミノ酸残基、例えば250個超のアミノ酸残基、例として275個超のアミノ酸残基、例えば300個超のアミノ酸残基、例として325個超のアミノ酸残基、例えば350個超のアミノ酸残基、例として375個超のアミノ酸残基、例えば400個超のアミノ酸残基、例として425個超のアミノ酸残基、例えば450個超のアミノ酸残基、例として475個超のアミノ酸残基、例えば500個超のアミノ酸残基、例として525個超のアミノ酸残��、例えば550個超のアミノ酸残基、例として575個超のアミノ酸残基、例えば600個のアミノ酸残基、例として625個のアミノ酸残基、例えば650個のアミノ酸残基、例として675個のアミノ酸残基、例として700個のアミノ酸残基を含む。活性フラグメントの例には、以下の1つ以上が含まれる:配列番号1 aa103-124、配列番号1 aa125-143、配列番号1 aa144-162、配列番号1 aa197-218、配列番号1 aa391-409、配列番号1 aa661-684、配列番号1 aa763-783、又は配列番号1 aa859-876。フラグメントは、5乃至500個のアミノ酸の長さ、例えば5乃至400個、10乃至300個、20乃至250個、15乃至50個、5乃至15個、7乃至15個、10乃至25個、10乃至20個、及び7乃至25個のアミノ酸の長さとなり得る。
【００３５】
機能等価性:「機能等価性」は、本発明での使用において、好適な一実施形態によれば、配列の所定のフラグメントの対応する機能性を参照することにより達成される。
【００３６】
SorCS1ポリペプチドの機能的等価物又は変異体、或いはそのフラグメントは、挿入、欠失、及び置換が、保存的置換を含め増加するにつれ、この文脈ではSorCS1ポリペプチドの生物学的活性を保持しつつ、それぞれ好適な所定のSorCS1ポリペプチド又はSorCS1フラグメント配列から徐々に異なるアミノ酸配列を示すと理解されよう。この差異は、好適な所定の配列とフラグメント又は機能的等価物との間の同一性の低下として測定される。
【００３７】
1個以上のアミノ酸残基の置換により得られる機能性変異体は、機能的に類似するアミノ酸側鎖を含む残基が置換された場合、何らかの形態又は度合いの天然SorCS1活性を十分に示しつつ、相同性が低くなり得る。この点における機能的な類似とは、疎水性、塩基性、中性、又は酸性等の側鎖の支配的特性、或いは立体容積の有無を示す。したがって、本発明の一実施形態において、同一性の度合いは、フラグメントが本発明による好適な所定のフラグメントの変異体又は機能的等価物であることの主要な尺度ではない。
【００３８】
好適な所定のSorCS1ポリペプチド又はそのフラグメントの任意の位置に導入される保存的置換に加えて、こうしたSorCS1ポリペプチド又はそのフラグメントの任意の1つ以上の位置に非保存的置換を導入することが望ましい場合もある。
【００３９】
SorCS1ポリペプチド又はそのフラグメントの機能的等価フラグメントの形成につながる非保存的置換は、例えば、i)極性が実質的に異なり、例えば、非極性側鎖を有する残基(Ala、Leu、Pro、Trp、Val、Ile、Leu、Phe、又はMet)によるGly、Ser、Thr、Cys、Tyr、Asn、又はGln等の極性側鎖を有する残基又はAsp、Glu、Arg、又はLys等の荷電アミノ酸の置換、或いは、荷電又は極性残基による非極性残基の置換であり、及び/又は、ii)ポリペプチド骨格の配向性に対する影響が実質的に異なり、例として、Pro又はGlyによる置換又は他の残基によるこれらの置換であり、及び/又は、iii)電荷が実質的に異なり、例えば、Glu又はAsp等の負荷電残基による、Lys、His、又はArg等の正荷電残基の置換(及びその逆)であり、及び/又は、iv)立体容積が実質的に異なり、例えば、His、Trp、Phe、又はTyr等の大きな残基による、Ala、Gly、又はSer等の小さな側鎖を有するものの置換(及びその逆)となる。
【００４０】
アミノ酸の置換により得られた変異体は、好適な一実施形態において、疎水性値及び親水性値と、電荷、大きさ等を含むアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性とに基づいて作成される。様々な前記特性を考慮に入れたアミノ酸置換基の例は、当業者に周知であり、アルギニン及びリジンと、グルタミン酸塩及びアスパラギン酸塩と、セリン及びトレオニンと、グルタミン及びアスパラギンと、バリン、ロイシン、及びイソロイシンとを含む。
【００４１】
好適な所定のSorCS1ポリペプチド又はそのフラグメントの突然変異生成は、通常は、約1乃至10個程度のアミノ酸残基、好ましくは約1乃至5個のアミノ酸残基でのアミノ酸挿入、或いは、約1乃至10個の残基、例として2乃至5個の残基の欠失を形成することにより実施可能である。
【００４２】
一実施形態において、結合部位1、2、又は3のリガンドは、自動合成により合成されるオリゴペプチドである。成長するアミノ酸鎖に連続的にアミノ酸を付加するメリフィールド固相合成法(Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963参照)等、商業的に利用可能な固相法の何れかを採用し得る。
【００４３】
ポリペプチドの自動合成用の機器は、カリフォルニア州フォスターシティのApplied Biosystems,Inc.等の供給業者から市販されており、一般的には製造業者の指示に従って操作し得る。固相合成により、本発明によるSorCS1の任意のフラグメントへの所望のアミノ酸置換の組み込みが可能となる。置換、欠失、挿入、又はその任意の部分的組み合わせは、機能的等価物の最終的な配列に到達するように組み合わせ得ることは理解されよう。挿入は、例えば、疎水性又は免疫原性タンパク質、或いは任意のポリペプチド等の担体、或いは担体の役割を果たすことが可能なスカフォールド構造とのアミノ末端及び/又はカルボキシル末端融合を含むと理解されるものとする。
【００４４】
本発明によるソルチリン阻害剤のフラグメントのホモ二量体及びヘテロ二量体を含む二量体を含めたオリゴマーも、本発明の範囲内に提供及び分類される。SorCS1ポリペプチド及びフラグメント、その機能的等価物及び変異体は、他のアミノ酸配列又は天然ソルチリン阻害剤配列とのホモ二量体及びヘテロ二量体として生産可能である。ヘテロ二量体には、免疫反応性ソルチリン阻害フラグメントと共に生物学的活性を有する又は発揮する必要が無いソルチリン阻害フラグメントを含む二量体が含まれる。
【００４５】
SorCS1ポリペプチド又はそのフラグメント及び変異体は、インビトロ及びインビボで合成し得る。インビトロ合成の方法は、周知であり、ソルチリン阻害剤のインビトロ合成に適した、或いは適切に適用可能な方法は、従来技術においても説明されている。インビトロでの合成の際には、ソルチリンペプチド阻害剤又はそのフラグメントをコードするDNAを含むベクターにより、宿主細胞を形質転換する。ベクターは、複製可能な核酸構築物として定義される。ベクターは、SorCS1ポリペプチド、及び/又は断片及び変異体の発現を仲介するために用いられる。発現ベクターは、インビボで発現可能な所定のソルチリン阻害フラグメント又はその任意の機能的等価物をコードする核酸配列が、適切な宿主における当該フラグメント又は等価物の発現を達成可能な適切な制御配列と適切に作用可能に連結された、複製可能なDNA構築物である。こうした制御配列は、当該技術分野において周知である。原核細胞及び真核細胞は、共にリガンドを合成するために使用し得る。
【００４６】
しかしながら、多細胞生物由来の細胞の培養物は、好適な宿主細胞となる。原則として、高等真核生物培養物は、脊椎動物の培養物か無脊椎動物の培養物かを問わず、何れも有効となる。有用な宿主細胞株の例としては、VERO及びHeLa細胞、チャイニーズハムスタ卵巣(CHO)細胞株、及びWI38、BHK、COS-7、293、及びMDCK細胞株が挙げられる。好適な宿主細胞は、内因性ソルチリン阻害剤を合成することが既知な真核細胞である。こうした宿主細胞の培養物は、フラグメントのソースとして単離及び使用し得るものであり、或いは、成長状態の促進又は阻害を目的とした治療方法を含む治療の方法、或いは人体又は動物体に対して実施される診断方法において使用し得る。
【００４７】
インビトロ/インビボ:これらの用語は、その通常の意味において用いられる。
【００４８】
リガンド:生物学的な目的を果たすために、(第2の)生体分子に結合して複合体を形成可能な、受容体を含むタンパク質等の物質、化合物、又は生体分子。狭義には、イオン結合、水素結合、及びファンデルワールス力等の分子間力により、標的タンパク質の部位に結合する信号トリガー分子である。ドッキング(会合)は、通常、可逆的である(解離)。リガンドと標的分子との間で不可逆的な共有結合が実際に起きることは、生物系では稀である。有機金属及び無機化学での意味とは反対に、リガンドがヘモグロビンの場合のように実際に金属部位に結合するか否かとは関係が無い。受容体に結合するリガンドは、化学的な立体配座、即ち、受容体タンパク質の3次元形状を変更し得る。受容体タンパク質の立体配座状態は、受容体の機能状態を決定する。結合の傾向又は強度は、親和性と呼ばれる。リガンドには、基質、阻害剤、活性剤、非自己受容体、共受容体、及び神経伝達物質が含まれる。
【００４９】
リンカー:「リンカー」という用語は、本明細書において、原子価結合又は多官能性成分を意味し、例として、SorCS1作用剤と、SorCS1と結合して血漿半減期の増加等の半減期の増加をもたらす医薬的に許容可能な分子とを分離する二官能性成分を意味する。
【００５０】
ポリマー:「ポリマー」という用語は、本明細書での使用において、2つ以上のモノマーの共有結合により形成される分子であり、ポリマーがヒトアルブミン又は他の豊富な血漿タンパク質である場合を除き、モノマーが何れもアミノ酸残基ではないものを意味する。「ポリマー」という用語は、「ポリマー分子」という用語と相互に交換可能に使用し得る。この用語は、インビトログリコシル化により付加された炭水化物分子を範囲に含むものである。N-又はO-グリコシル化(以下で更に説明する)等のインビボグリコシル化により付加された炭水化物分子は、本明細書において、「オリゴ糖成分」と呼ばれる。ポリマー分子数が明示されている場合を除き、「ポリマー」、「ポリマー分子」、「前記ポリマー」、又は「前記ポリマー分子」への言及は全て、本発明において、1個以上のポリマー分子への言及であるものとする。ポリマーは、PEG成分等、水溶性又は不水溶性ポリマーとなり得る。PEG成分は、500Da乃至200,000Da、例として500Da乃至100,000Da、例として2000Da乃至50,000Daから選択される平均サイズを有し得る。こうしたPEG成分は、特に、Shearwater Inc.から入手し得る。
【００５１】
医薬品:「医薬品」又は「薬物」又は「薬剤」という用語は、患者の疾病、苦痛、状態、疾患、又は損傷の治療(予防、診断、緩和、又は治癒を含む)に使用し得る、本発明による作用剤の任意の治療的又は予防的使用を示す。治療的に有用な遺伝的決定因子、ペプチド、ポリペプチド、及びポリヌクレオチドは、医薬又は薬物という用語の意味に含まれ得る。本明細書での定義において、「治療薬」、「予防薬」、或いは「薬物」又は「薬剤」は、生理活性剤の一種である。
【００５２】
医薬組成物:又は薬物、薬剤、又は作用剤は、患者に適切に投与された時に所望の治療効果を誘導可能な任意の化学的又は生物学的材料、化合物、又は組成物を示す。一部の薬物は、医薬活性を有する代謝産物へインビボで転換される不活性形態で販売される。本発明の目的では、「医薬組成物」及び「薬剤」という用語は、好ましくは、このような活性作用剤、或いは不活性薬物及び活性代謝産物を包含する。
【００５３】
精製抗体:「精製抗体」という用語は、その少なくとも60重量パーセントが自然状態で結合しているポリペプチド及び天然に存在する有機分子を含まない抗体を示す。好ましくは、調製物は、少なくとも75重量パーセント、より好ましくは90重量パーセント、最も好ましくは99重量パーセントの量で抗体を含む。
【００５４】
配列同一性:「配列同一性」又は「同一性」という用語は、本明細書での使用において、配列を比較することで決定されるような、2つ以上のタンパク質の配列間の関係を示す。2配列間の同一性パーセントは、数学アルゴリズムを用いて決定することができる。2配列の比較に利用される数学アルゴリズムの好適な非限定的な例は、Karlin and Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムであり、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877のように修正されたものである。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410のBLASTN及びBLASTPプログラムに組み込まれている。
【００５５】
同一性を特徴付けるためには、最上位の相同性(一致)が得られるように対象配列をアライメントする。こうした一般原則に基づき、2つの核酸配列の「同一性パーセント」は、全米バイオテクノロジー情報センタ(NCBI)ウェブサイト(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)から入手可能なBLASTNアルゴリズム[Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden: Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences; FEMS Microbiol. Lett. 1999 174 247-250]を使用すると共に、本明細書において提案した初期設定を用いて決定し得る(即ち、一致の加点(Reward for a match)=1、不一致の減点(Penalty for a mismatch)=-2、ストランドオプション(Strand option)=両ストランド(both strands)、オープンギャップ(Open gap)=5、延長ギャップ(Extension gap)=2、ペナルティギャップx_dropoff(Penalties gap x_dropoff)=50、予想(Expect)=10、ワードサイズ(Word size)=11、フィルタオン(Filter on))。BLASTNアルゴリズムは、2つのアライメントしたヌクレオチド配列間の重複範囲における配列同一性％を決定する。
【００５６】
配列の比較に利用される数学アルゴリズムの他の好適な非限定的な例は、CLUSTAL W(1.7)アライメントアルゴリズムである(Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties 及び weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680.)。CLUSTAL Wは、好ましくはBLOSUM62をスコア行列として使用して、複数の配列アライメントに用いることができる。配列同一性を計算する時、CLUSTAL Wは、アライメントにより形成された任意のギャップを基準配列の長さに含める。したがって。図2において、ギャップを有するアライメント配列の全長は322だが、参照配列(hMETRNL)は、311個のアミノ酸の長さしかない。
【００５７】
配列同一性は、ギャップを有するアライメント配列の長さで一致の数を割ることにより計算される。
【００５８】
高レベルの配列同一性は、第1の配列が第2の配列に由来する可能性を示す。アミノ酸配列同一性には、アライメントした2配列間での同一のアミノ酸配列が必要となる。したがって、基準配列と70％のアミノ酸同一性を共有する候補配列では、アライメント後、候補配列内の70％のアミノ酸が基準配列内の対応するアミノ酸と同一であることが必要となる。
【００５９】
処置:処置(治療)という用語は、本明細書での使用において、人体又は動物体を含む個体における臨床状態の手術を含む治療法に関連する方法を示す。治療法は、改善的、治癒的、又は予防的なもの、即ち、精神症状及び行動症状を低減するものとなり得る。
【００６０】
変異体:「変異体」という用語は、本明細書での使用において、アミノ酸配列変異体を示し、前記変異体は、好ましくは、所定の配列の何れかとの少なくとも60％の同一性、例えば少なくとも63％の同一性、例として少なくとも66％の同一性、例えば少なくとも70％の配列同一性、例えば少なくとも72％の配列同一性、例えば少なくとも75％の配列同一性、例えば少なくとも80％の配列同一性、例として少なくとも85％の配列同一性、例えば少なくとも90％の配列同一性、例として少なくとも91％の配列同一性、例えば少なくとも91％の配列同一性、例として少なくとも92％の配列同一性、例えば少なくとも93％の配列同一性、例として少なくとも94％の配列同一性、例えば少なくとも95％の配列同一性、例として少なくとも96％の配列同一性、例えば少なくとも97％の配列同一性、例として少なくとも98％の配列同一性、例えば99％の配列同一性を有する。
【００６１】
発現の上方制御:遺伝子、好ましくは、内在性遺伝子の発現増加につながるプロセス。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】SorCS1のアライメント  ヒト(homo sapiens)、チンパンジ(Pan troglodytes)、ウシ(Bos Taurus)、マウス(Mus musculus)、ラット(Rattus norvegicus)、イヌ(Canis lupus familiaris)、及びニワトリ(Gallus gallus)由来のSorCS1の配列アライメント。配列同一性は、表A(原文Table 2)に示す通りである。
【表Ａ】
2015514726.tif 000002
【図２】SorCS1ノックアウトマウス由来の脂肪組織のPCRアレイによる遺伝子発現プロファイリング。SorCS1ノックアウト野生型脂肪マウス由来の脂肪組織の遺伝子アレイ解析を用いて、本発明者らは、A)マウスインスリンシグナル経路に関連する84遺伝子と、B)リポタンパク質シグナル伝達及びコレステロール代謝に関連する84遺伝子との発現を試験した。 実施の際、第一鎖cDNAは、50週齢雌マウス(n=3)のSorCS1ノックアウト(-/-)及び野生型(+/+)脂肪組織由来の全RNA(Applied Biosystems)から合成した。その後、A)Mouse Insulin Signalling Pathway(PAMM-030A RT2 Profiler PCRアレイ)又はB)Mouse Lipoprotein Signalling & Cholesterol Metabolismタイプ(PAMM-080-A RT2 Profiler PCRアレイ)のスーパーアレイを、ABI7900プラットフォーム(Applied Biosystems)及びSYBR Green/Rox PCR(SABiosciences)を用いて処理した。発現解析は、デンマーク、オーフスのAROS Applied Biotechnologyが行った。野生型マウスと比較して、SorCS1ノックアウトマウスにおいて3倍を超えて上方制御又は下方制御された発現を示した遺伝子は、上段の表に記載しており、その既知の機能を下段の表に示している。A及びBの幾つかの遺伝子は、野生型マウスと比較して、SorCS1ノックアウトマウスにおいて発現の変化を示しており、インスリン及びコレステロールシグナル経路及び代謝がSorCS1ノックアウトマウスにおいて変化したことを示唆している。
【図３】可溶性SorCS1の過剰発現後の糖尿病db/dbマウスにおける体重減少。2型糖尿病を自然発症した肥満マウスモデルにおける可溶性SorCS1の体重に対する効果を評価するため、db/dbマウス株を用いた(TaconicからのBKS.Cg-m+/+Lprdb/BomTac)。これらのマウスにはレプチン受容体が欠如しており、結果として、マウスは、肥満となり、インスリン抵抗性を生じ、最終的には6乃至8週齢で重度の糖尿病を発症する。本発明者らは、ヒト可溶性(hsol.)SorCS1又は対照としてのLacZを発現するアデノウイルスを注入し(実施例2に記載)、体重に対する効果を調べた。詳しくは、6週齢のdb/db雌マウスの尾静脈に、hsol.SorCS1又は陰性対照ウイルスとしてのLacZ(ViraQuest Inc、アイオワ州ノースリバティ)を含む2E9pfuのアデノウイルスベクターを注入した。0、9、14、及び16日目の朝に、マウスの体重を秤で計測した。データは、各群の5匹毎の平均値±SEMである。9乃至16日目に、可溶性SorCS1の過剰発現を有するdb/db雌マウスは、対照LacZウイルスを受け取ったマウスと比較して、体重の有意な減少を示した。したがって、可溶性SorCS1の過剰発現は、この肥満マウスモデルにおいて肥満状態を改善する。
【図４】可溶性SorCS1の過剰発現後の糖尿病db/dbマウスにおける食物摂取及び体重の減少。2型糖尿病を自然発症した肥満マウスモデルにおける可溶性SorCS1の体重に対する効果を評価するため、本発明らは、db/dbマウス株(TaconicからのBKS.Cg-m+/+Lprdb/BomTac)を用いた。これらのマウスにはレプチン受容体が欠如しており、結果として、マウスは、肥満となり、インスリン抵抗性を生じ、最終的には6乃至8週齢で重度の糖尿病を発症する。本発明者らは、hsol.SorCS1又は対照としてのLacZを発現するアデノウイルスを注入し(実施例2に記載)、体重に対する効果を調べた。詳しくは、6週齢のdb/db雌マウスの尾静脈に、hsol.SorCS1又は陰性対照ウイルスとしてのLacZ(ViraQuest Inc、アイオワ州ノースリバティ)を含む2E9pfuのアデノウイルスベクターを注入した。A)ウイルス処置後9日目の朝に、各マウスを、計量した飼料と共に代謝ケージに移動した。24時間後、マウスを通常のマウスケージに戻し、代謝ケージ内の飼料を計量して食物摂取を判定した。24時間の摂取食物の量を示している。データは、各群の4匹のマウスの平均値±SEMである。可溶性SorCS1の過剰発現を有するマウスは、LacZを発現する対照マウスに比べ、食べる量が有意に低かった。B)ウイルス処置後0及び11日目の朝に、マウスの体重を秤で計測した。期間全体の相対的な体重変化を示している。データは、各群の4匹のマウスの平均値±SEMである。11日目に、可溶性SorCS1の過剰発現を有するdb/db雌マウスは、対照LacZウイルスを受け取ったマウスと比較して、体重の有意な減少を示した。
【図５】可溶性SorCS1の過剰発現後の肥満DIO雄マウスにおける食物摂取及び体重の減少。15週齢の肥満の前糖尿病「食事性肥満」(diet induced obesity, DIO)雄マウスに、SorCS1の可溶性細胞外ドメイン又はLacZ(対照)をコードするアデノウイルスを静脈内注入した。A)10日目に、ウイルス処置マウスの各群をケージに入れ、その後4日間の食物摂取を24時間毎に計測した。可溶性SorCS1の過剰発現を有するマウスは、ウイルス注入後11及び14日目の両方において、LacZを発現する対照マウスに比べ、摂取が有意に低かった。B)ウイルス処置後0、11、及び14日目に、マウスを計量した。期間全体の相対的な体重変化を示している。結論として、可溶性SorCS1の過剰発現は、LacZ対照と比較して有意な体重減少につながる(P<0.05、SorCS1対LacZ)。
【図６】可溶性SorCS1の過剰発現後の肥満糖尿病ob/ob雌マウスにおける食物摂取及び体重の減少。2型糖尿病を自然発症した8週齢の肥満ob/obマウスに、SorCS1又はLacZ(対照)の可溶性細胞外ドメインをコードするアデノウイルスを静脈内注入した。A)9日目に、マウスを代謝ケージに入れ、その後24時間の食物摂取を測定した。可溶性SorCS1の過剰発現を有するマウスは、LacZを発現する対照マウスに比べ、食べる量が有意に低かった。B)ウイルス処置後0及び10日目に、マウスを計量した。期間全体の相対的な体重変化を示している。結論として、可溶性SorCS1の過剰発現は、有意な体重減少につながる。
【図７】アデノウイルスによるヒト可溶性SorCS1の過剰発現によるdb/dbマウス由来の脂肪組織におけるPRDM16及びPGC-1αの発現の増加。db/dbマウスに、2E9PFU/マウスのAV-hsol.SorCS1又はAV-LacZを静脈内注入し、注入後14日目に生殖腺脂肪を採取した。生殖腺脂肪からのmRNAの単離後、特異的な肥満遺伝子のqPCRを、CD137(ブライト脂肪組織マーカ)、PRDM16、及びPGC-1a(褐色脂肪組織マーカ)について、GAPDHをハウスホールド遺伝子として実施した。マウスにおけるWATからBATへの転換プロセスには幾つかのタンパク質、例えば、PRDM16及びPGC-1αが関与している。PRDM16は、BATにおいて選択的に発現され、共受容体PGC-1αとの相互作用により、BAT特異的遺伝子発現を活性化し、WAT特異的遺伝子発現を抑制する。PRDM16及びPGC-1αからのmRNAは、AV-hsol.SorCS1ウイルスを受け取ったdb/dbマウス由来の脂肪組織において、2倍超の上方制御を示した。p<0.05(スチューデントのt検定、両側、2標本、等分散)。
【図８】アデノ随伴ウイルスにより発現されたヒト可溶性SorCS1で処置した動物における通常食(ND)での体重増加の低下。マウス(C57BL6/j bom tac)(各群につきn=5乃至6)に、可溶性ヒトSorCS1(AAV-hsol.SorCS1)又はLacZ(AAV-LacZ)アデノ随伴ウイルス(AAV)を静脈内注入した。注入したウイルスの力価は、1E11vgc/マウスとした(vgc=ウイルスゲノムコピー数)。マウスは、2週間毎に計量した。AAV-hsol.SorCS1により処置したマウスの通常食での増量は、LacZ対照群と比較して、150日間で32％少なかった。ウイルスの体重増加に対する効果は、ウイルスの注入後、最長150日間持続する(p=0.0296、2元配置ANOVA、処置)。
【００６３】
本発明の作用剤及びその医学的使用
【００６４】
本発明は、様々な態様において、Vps10pドメイン受容体SorCS1及びSorCS3に関し、例として配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、及び64の群から選択されるアミノ酸を含むポリペプチドに関する。
【００６５】
一態様において、本発明は、配列番号61、62、63、及び64からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドに関する。一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号61のアミノ酸配列を有する。他の実施形態においあて、ポリペプチドは、配列番号62のアミノ酸配列を有する。更に他の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号63のアミノ酸配列を有する。更に他の実施形態において、ポリペプチドは、配列番号64のアミノ酸配列を有する。一実施形態において、本発明は、医療用の配列番号61、62、63、及び64からなる群から選択されるポリペプチドの何れかに関する。
【００６６】
本発明者らは、被験体における可溶性SorCS1の過剰発現が被験体の体重減少をもたらすことを発見した。本発明者らは、更に、マウスにおける可溶性SorCS1の過剰発現が、食べることに対するマウスの欲求を低減すること、即ち食欲を減少させることを発見した。
【００６７】
本発明者らは、マウスにおける可溶性SorCS1の投与の効果を研究してきた。本発明者らは、驚くべきことに、SorCS1投与後、対照と比較して、マウスが体重を減らすことを発見した。理論に束縛されるものではないが、体重減少は、SorCS1処置を受けた被験体における食べる欲求の減少と相関した。加えて、本発明者らは、SorCS1により処置したマウスが、LacZを受け取った対照マウスと比較して高い代謝率を示し、褐色脂肪の度合いが高いことを発見した。褐色脂肪は、白色細胞よりミトコンドリアの度合いが高く、そのため褐色脂肪組織は、白色脂肪組織より多くの熱を産生する。そのため、本発明は、一態様において、熱産生を増加させるための本発明のSorCS1作用剤の使用にも関する。
【００６８】
具体的には、本発明者らは、肝臓でのアデノウイルス性及びアデノ随伴ウイルス性の可溶性SorCS1(細胞外ドメイン、プレプロ可溶性SorCS1、配列番号15)の過剰発現による16日間の処置により、対照ウイルスにより処置したマウスと比較して約23％体重が減少することを実証した。同期間の食物摂取も対照マウスと比較して減少していることから、体重減少は、少なくとも部分的には食欲抑制によるものである。体重減少は、SorCS1処置後の全体的な代謝増加にも関係し得る。プレプロ可溶性SorCS1(配列番号5)は、投与後、生体内での翻訳後修飾により、活性成熟可溶性SorCS1(配列番号15)に転換される。
【００６９】
したがって、主要な態様において、本発明は、作用剤であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択され、
食欲を減少させ、及び/又は減量を促進し、及び/又は肥満を治療し、及び/又は代謝を増加させ、及び/又は熱産生を増加させ、及び/又は白色脂肪を褐色脂肪に転換する方法に用いる作用剤に関する。
【００７０】
他の態様において、本発明は、作用剤であって
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)及びii)の何れかの少なくとも150個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、選択される配列内で指定された任意のアミノ酸が、配列内の30個以下のアミノ酸残基が変化するという条件で、異なるアミノ酸に変化している生物学的に活性なフラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択され、
食欲を減少させ、及び/又は減量を促進し、及び/又は肥満を治療し、及び/又は代謝を増加させ、及び/又は熱産生を増加させ、及び/又は白色脂肪を褐色脂肪に転換する方法に用いる作用剤に関する。
【００７１】
一実施形態において、本発明は、作用剤の使用であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択される作用剤の、
食欲を減少させ、及び/又は減量を促進し、及び/又は代謝を増加させ、及び/又は熱産生を増加させ、及び/又は白色脂肪を褐色脂肪に転換し、及び/又は肥満を治療する薬剤の調製のための使用に関する。
【００７２】
一態様において、本発明は、食欲を減少させ、及び/又は減量を促進し、及び/又は肥満を治療し、及び/又は代謝を増加させ、及び/又は熱産生を増加させ、及び/又は白色脂肪を褐色脂肪に転換する方法であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択される作用剤の治療有効量を、必要とする個体に投与することを含む方法に関する。
【００７３】
一態様において、本発明は、肥満を治療する方法であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択される作用剤の治療有効量を、必要とする個体に投与することを含む方法に関する。
【００７４】
一態様において、本発明は、代謝を増加させる方法であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択される作用剤の治療有効量を、必要とする個体に投与することを含む方法に関する。
【００７５】
一態様において、本発明は、哺乳動物における熱産生を増加させる方法であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択される作用剤の治療有効量を、哺乳動物に投与することを含む方法に関する。
【００７６】
一態様において、本発明は、白色脂肪を褐色脂肪に転換するインビボの方法であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択される作用剤の治療有効量を、哺乳動物に投与することを含む方法に関する。
【００７７】
他の態様において、本発明は、白色脂肪を褐色脂肪に転換するインビトロの方法であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択される作用剤の有効量に、細胞を接触させることを含む方法に関する。
【００７８】
他の態様において、本発明は、作用剤であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択され、
肥満の美容的処置の方法に用いる作用剤に関する。
【００７９】
一実施形態において、本発明の作用剤は、本発明の作用剤を含む製剤の、人間等の哺乳動物への局所投与による局所の脂肪の低減等により、一般に美容用途で用いるものである。
【００８０】
他の態様において、本発明は、本発明の作用剤を含む機能性食品又は栄養補助食品を投与することを含む、減量を支援する方法に関する。
【００８１】
本研究と共に、本発明者らは、SorCS1の過剰発現が高度であっても、正常血糖のマウスに低血糖を引き起こさないことを発見した。したがって、SorCS1は、インスリン抵抗性又は糖尿病を有していない過体重及び/又は肥満患者を治療するために用いることができる。
【００８２】
したがって、一実施形態において、本発明の作用剤は、非糖尿病患者、即ち、如何なる種類の糖尿病にも罹患していない患者、例えば、2型糖尿病を罹患していない患者に用いるものである。
【００８３】
他の実施形態において、本発明の作用剤は、非インスリン抵抗性患者、即ち、インスリン抵抗性を有していない患者に用いるものである。
【００８４】
一実施形態において、本発明の作用剤による治療法を受ける被験体は、インスリン抵抗性及び/又は2型糖尿病を有していない。
【００８５】
一実施形態において、本発明の作用剤は、肥満及びインスリン抵抗性の複合治療に用いるものである。
【００８６】
他の実施形態において、本発明の作用剤は、肥満及び2型糖尿病の複合治療に用いるものである。
【００８７】
他の実施形態において、本発明の作用剤は、過体重及びインスリン抵抗性の複合治療に用いるものである。
【００８８】
特定の実施形態において、複合治療には、治療対象の状態の効果を増強させること、或いは、上述した複数の状態を効果的に標的とすることが関連し得る。したがって、本発明による作用剤は、少なくとも1種類の他の化合物と共に投与し得る。
【００８９】
一実施形態において、本発明の作用剤は、ポリペプチド変異体であり、選択される配列内で指定された任意のアミノ酸は、保存的置換をもたらすように変更される。
【００９０】
本発明の一実施形態において、本明細書に定める作用剤は、配列番号15、5、1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、及び64からなる群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも65％、より好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも75％、好ましくは80％、より好ましくは少なくとも85％、より好ましくは少なくとも90％、より好ましくは少なくとも91％、より好ましくは少なくとも92％、より好ましくは少なくとも93％、より好ましくは少なくとも94％、より好ましくは少なくとも95％、より好ましくは少なくとも96％、より好ましくは少なくとも97％、より好ましくは少なくとも98％、より好ましくは少なくとも99％の配列同一性を有するポリペプチドである。
【００９１】
本発明の作用剤は、好ましくは、成熟形態にあるか、或いは、無傷シグナルペプチド(プレドメイン)及び/又はプロドメインペプチドを有する、ヒトSorCS1ポリペプチドである。一実施形態において、作用剤は、配列番号1、2、3、4、6、7、8、9、11、12、13、及び14からなる群から選択されるポリペプチドである。
【００９２】
他の実施形態において、作用剤は、配列番号16、17、18、19、20、22、26、28、29、30、31、及び32からなる群から選択される非ヒトポリペプチドである。
【００９３】
一実施形態において、上述した本発明の活性ポリペプチドは、配列番号15、5、1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、及び64からなる群から選択される。
【００９４】
上記アミノ酸配列の生物学的に活性な変異体も、本発明の範囲に含まれると考えられる。したがって、一実施形態において、ポリペプチドは、変異体ポリペプチドであり、選択される配列内で指定された任意のアミノ酸は、上述したように保存的置換をもたらすように変更される。したがって、ポリペプチドは、好ましくは、配列番号15、5、1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、及び64からなる群から選択される配列を有するタンパク質に対して、少なくとも40％、例として少なくとも41％、例として少なくとも42％、例として少なくとも43％、例として少なくとも44％、例として少なくとも45％、例として少なくとも46％、例として少なくとも47％、例として少なくとも48％、例として少なくとも49％、例えば50％、例として少なくとも51％、例として少なくとも52％、例として少なくとも53％、例として少なくとも54％、例として55％、例として少なくとも56％、例として少なくとも57％、例として少なくとも58％、例として少なくとも59％、例えば60％、例として61％、例えば62％、例として63％、例えば64％、例として65％、例として少なくとも66％、例として少なくとも67％、例として少なくとも68％、例として少なくとも69％、例えば70％、例として少なくとも71％、例として少なくとも72％、例として少なくとも73％、例として少なくとも74％、例えば75％、例として少なくとも76％、例として少なくとも77％、例として少なくとも78％、例として少なくとも79％、例として80％、例として少なくとも81％、例として少なくとも82％、例として少なくとも83％、例として少なくとも84％、例えば85％、例として少なくとも86％、例として少なくとも87％、例として少なくとも88％、例として少なくとも89％、例として90％、例として少なくとも91％、例として少なくとも92％、例として少なくとも93％、例として少なくとも94％、例えば95％、例として少なくとも96％、例として少なくとも97％、例として少なくとも98％、例えば少なくとも99％、例として100％の配列同一性を有する。
【００９５】
一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号15、5、1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、及び64からなる群から選択される配列の天然に存在する対立遺伝子変異体であり、好ましくは、ポリペプチドは、配列番号15、5、10、21、27、33、37、39、43、及び47からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００９６】
更に好ましくは、本発明の作用剤は、配列番号15、5、64、62、10、21、27、33、37、39、43、及び47からなる群から選択される配列を有するタンパク質に対して、少なくとも40％、例として少なくとも45％、例えば50％、例として55％、例えば60％、例として65％、例えば70％、例えば75％、例として80％、例えば85％、例として90％、例えば95％、例として98％、例えば99％の配列同一性を有するポリペプチド変異体である。
【００９７】
真核細胞において発現されたポリペプチドは、N-又はO-グリコシル化等、グリコシル化される場合が多い。グリコシル化パターンは、折り畳まれたポリペプチドの他の分子との相互作用にとって重要であり、ポリペプチドの極性に影響する。
【００９８】
したがって、一実施形態において、本発明のポリペプチド作用剤は、グリコシル化され、作用剤は、配列番号1、2、3、4、6、7、8、9、11、12、13、14からなる群から選択されるポリペプチドとなり、ポリペプチドは、以下のアミノ酸残基位置184、352、433、765、776、816、847、908、及び929の1つ以上においてグリコシル化されてよく、及び/又は、ポリペプチドは、配列番号16、17、18、19、20、22、26、28、29、30、31、及び32からなる群から選択され、ポリペプチドは、以下のアミノ酸残基位置184、352、433、765、776、816、847、908、及び929の1つ以上においてグリコシル化されてよく、他の実施形態において、グリコシル化フラグメントは、配列番号5、10、及び15からなる群から選択される配列を有し、或いは、グリコシル化ポリペプチドフラグメントは、配列番号21、27、及び33からなる群から選択される配列を有する。
【００９９】
一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1のアミノ酸位置184、352、433、765、776、816、847、908、及び929又は配列番号1の翻訳後修飾変異体における等価の位置に対応する1個以上のアスパラギンアミノ酸残基において、N-グリコシル化される。
【０１００】
しかしながら、一部の実施形態において、発現されるポリペプチドは、その後、脱グリコシル化されることが好ましい。これは、当業者に公知の方法により達成し得る。
【０１０１】
天然SorCS1、及び他の天然Vps10pドメイン受容体が、I型膜タンパク質である場合、本発明の作用剤は、単一の膜貫通ヘリックス及び細胞内C末端を除去するためにC末端を欠損させる等、遺伝子操作されていることが好ましい。したがって、一実施形態において、本発明の作用剤は、本明細書に定めるポリペプチドの可溶性フラグメント又は変異体のフラグメントを含み、したがって、こうした一実施形態において、ポリペプチドは、配列番号1、2、3、4、6、7、8、9、11、12、13、14からなる群から選択される配列のフラグメントである可溶性ポリペプチドであり、或いはポリペプチドは、配列番号15の配列のフラグメントである可溶性ポリペプチドである。
【０１０２】
特定の実施形態では、システイン架橋を形成することにより分子内の安定性を高めることが有利となり得る。一実施形態において、本明細書に定めるポリペプチドは、少なくとも1つの分子内シスチン架橋を形成することができる。場合によっては、本発明のポリペプチドの二量体等の多量体を投与することが、安定性及び有効性にとって有利となる。一実施形態において、本明細書に定めたポリペプチドは、少なくとも1つの分子間シスチン架橋により連結された前記ポリペプチドの二量体を含む。
【０１０３】
本発明のポリペプチドは、精製にとって有用なタグを含み得る。一実施形態において、本発明によるポリペプチドは、poly-hisタグ、GSTタグ、HAタグ、Flagタグ、C-mycタグ、HSVタグ、V5タグ、マルトース結合タンパク質タグ、セルロース結合ドメインタグ等のアフィニティタグを含む。アフィニティタグに加え、本発明のポリペプチドは、半減期が増加した本発明の作用剤に関する節にて以下で説明するような、哺乳動物に投与されたSorCS1の血漿及び/又は血清中の半減期を変更するタグ又は共役基等、ポリペプチドの機能性を変更するタグを含み得る。
【０１０４】
他のVps10pドメイン受容体の医学的使用
【０１０５】
上述したように、本発明は、成熟可溶性SorCS1に限定されず、その任意の生物学的に活性な配列変異体にすること、更にSorCS1又はそのフラグメント又は変異体をコードするヌクレオチドにすることが可能であり、これにはSorCS1ポリペプチドをコードするヌクレオチドを有するベクターが含まれる。したがって、一実施形態において、本発明は、食欲の抑制、空腹感の低減、及び/又は予測消費量の低減、及び/又は食べる欲求の低減、及び/又は満腹感の増加、及び/又は肥満の治療、及び/又は、減量の促進、及び/又は代謝の増加、及び/又は熱産生の増加、及び/又は白色脂肪の褐色脂肪への転換に用いる、本明細書に定めるポリペプチドをコードする核酸配列に関する。本発明は、更に、核酸配列又は前記発現ベクターを含む細胞にも関する。
【０１０６】
本発明に定めるSorCS1の変異体には、特定の実施形態において、他のVps10pドメイン受容体の全長又はフラグメントが含まれる。
【０１０７】
【表Ｂ】
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【０１０８】
一実施形態において、本発明の作用剤は、SorCS3である。したがって、一態様において、本発明は、作用剤であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号55、56、57、58、59、及び60のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号55、56、57、58、59、及び60に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号55、56、57、58、59、及び60に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択され、
食欲を減少させ、及び/又は減量を促進し、及び/又は肥満を治療し、及び/又は代謝を増加させ、及び/又は熱産生を増加させ、及び/又は白色脂肪を褐色脂肪に転換する方法に用いる作用剤に関する。
【０１０９】
一実施形態において、作用剤は、配列番号55、56、57、58、59、及び60、の何れかの生物学的に活性なフラグメントであり、フラグメントは、配列番号55、56、57、58、59、及び60からなる群から選択されるアミノ酸配列の何れかの、500個未満の連続するアミノ酸残基、例として450個未満の連続するアミノ酸残基、例えば400個未満の連続するアミノ酸残基、例として350個未満の連続するアミノ酸残基、例えば300個未満の連続するアミノ酸残基、例えば250個未満の連続するアミノ酸残基、例として240個未満の連続するアミノ酸残基、例えば225個未満の連続するアミノ酸残基、例として200個未満の連続するアミノ酸残基、例えば180個未満の連続するアミノ酸残基、例として160個未満の連続するアミノ酸残基、例えば150個未満の連続するアミノ酸残基、例として140個未満の連続するアミノ酸残基、例えば130個未満の連続するアミノ酸残基、例として120個未満の連続するアミノ酸残基、例えば110個未満の連続するアミノ酸残基、例として100個未満の連続するアミノ酸残基、例えば90個未満の連続するアミノ酸残基、例として85個未満の連続するアミノ酸残基、例えば80個未満の連続するアミノ酸残基、例として75個未満の連続するアミノ酸残基、例えば70個未満の連続するアミノ酸残基、例として65個未満の連続するアミノ酸残基、例えば60個未満の連続するアミノ酸残基、例として55個未満の連続するアミノ酸残基、例えば50個未満の連続するアミノ酸残基、例として45個未満の連続するアミノ酸残基、例えば40個未満の連続するアミノ酸残基、例として35個の連続するアミノ酸残基、例えば30個の連続するアミノ酸残基、例として25個の連続するアミノ酸残基、例として20個の連続するアミノ酸残基、例えば15個の連続するアミノ酸残基を含む。
【０１１０】
他の実施形態において、作用剤は、配列番号55、56、57、58、59、及び60の何れかの生物学的に活性なフラグメントであり、フラグメントは、配列番号55、56、57、58、59、及び60からなる群から選択されるアミノ酸配列の何れかの、少なくとも15個の連続するアミノ酸残基、例として20個超の連続するアミノ酸残基、例えば25個超の連続するアミノ酸残基、例えば50個超の連続するアミノ酸残基、例として75個超の連続するアミノ酸残基、例えば100個超の連続するアミノ酸残基、例として125個超の連続するアミノ酸残基、例えば150個超の連続するアミノ酸残基、例として175個超の連続するアミノ酸残基、例えば200個超の連続するアミノ酸残基、例として225個超の連続するアミノ酸残基、例えば250個超の連続するアミノ酸残基、例として275個超の連続するアミノ酸残基、例えば300個超の連続するアミノ酸残基、例として325個超の連続するアミノ酸残基、例えば350個超の連続するアミノ酸残基、例として375個超の連続するアミノ酸残基、例えば400個超の連続するアミノ酸残基、例として425個超の連続するアミノ酸残基、例えば450個超の連続するアミノ酸残基、例として475個超の連続するアミノ酸残基、例えば500個超の連続するアミノ酸残基、例として525個超の連続するアミノ酸残基、例えば550個超の連続するアミノ酸残基、例として575個超の連続するアミノ酸残基、例えば600個超の連続するアミノ酸残基、例として625個超の連続するアミノ酸残基、例えば650個超の連続するアミノ酸残基、例として675個超の連続するアミノ酸残基、例として700個超の連続するアミノ酸残基を含む。
【０１１１】
一実施形態において、本発明の作用剤は、SorCS2である。したがって、一態様において、本発明は、作用剤であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号54のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号54に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号54に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択され、
食欲を減少させ、及び/又は減量を促進し、及び/又は肥満を治療し、及び/又は代謝を増加させ、及び/又は熱産生を増加させ、及び/又は白色脂肪を褐色脂肪に転換する方法に用いる作用剤に関する。
【０１１２】
一実施形態において、本発明の作用剤は、ソルチリンである。したがって、一態様において、本発明は、作用剤であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号52のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号52に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号52に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択され、
食欲を減少させ、及び/又は減量を促進し、及び/又は肥満を治療し、及び/又は代謝を増加させ、及び/又は熱産生を増加させ、及び/又は白色脂肪を褐色脂肪に転換する方法に用いる作用剤に関する。
【０１１３】
肥満関連障害
【０１１４】
特定の態様において、本発明は、肥満関連睡眠障害等の肥満関連障害、例えば肥満関連呼吸障害に関する。
【０１１５】
したがって、一実施形態において、本発明は、作用剤であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択され、
必要とする個体における睡眠関連呼吸障害を治療又は予防する、或いはその発生を低減する方法に用いる作用剤に関する。
【０１１６】
一実施形態において、肥満関連及び/又は睡眠関連呼吸障害は、中枢性睡眠時無呼吸(CSA)、チェーンストークス呼吸様中枢性睡眠時無呼吸(CSB-CSA)、肥満低換気症候群(OHS)、先天性中枢性低換気症候群(CCHS)、閉塞性睡眠時無呼吸(OSA)、及び特発性中枢性睡眠時無呼吸(ICSA)から選択される。
【０１１７】
一態様において、本発明は、作用剤であって、
a)単離ポリペプチドであり、
i)配列番号15のアミノ酸配列、又は
ii)前記配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する、i)のアミノ酸配列の生物学的に活性な配列変異体、
iii)i)乃至ii)の何れかの少なくとも15個の連続するアミノ酸の生物学的に活性なフラグメントであり、少なくとも15個のアミノ酸の重複範囲において、配列番号15に対して少なくとも60％の配列同一性を有する前記フラグメント、を含む単離ポリペプチドと、
b)a)に定めたポリペプチドをコードする核酸配列と、
c)b)に定めた核酸分子を含むベクターと、
d)b)の核酸又はc)のベクターにより形質転換又は形質導入された単離宿主細胞と、からなる群から選択され、
非アルコール性脂肪性肝疾患、睡眠時無呼吸、肥満関連代謝障害、例えば骨関節炎、不必要な体重増加又は肥満度指数、及び不必要な体重増加をもたらす過度の食欲からなる群から選択される肥満関連障害を治療又は予防する、或いはその発生を低減する方法に用いる作用剤に関する。
【０１１８】
半減期が増加した本発明の作用剤
【０１１９】
本発明のSorCS1又はSorCS3等の治療用のタンパク質の有効性を改善する一手法は、血清中での持続性を高め、これにより循環レベルを更に高くして、及び/又は循環レベルを更に長時間に亘って存在させて、より高い曝露(AUC)、より少ない投与回数、及び用量の低減をもたらすことである。
【０１２０】
例えば、市販の製品及び候補薬物等の2製品間で生物学的同等性を判定する際には、薬物動態研究が実施され、調製物のそれぞれを、一般には健康な個体であるが患者の場合もある志願被験体に対して、交差試験において投与する。血清/血漿試料を一定の間隔で取得し、親薬物(場合によっては代謝産物)の濃度を分析する。血中濃度レベルは、2製品間での比較が実行又は実現不可能となることもあり、この場合は、薬物動態学的エンドポイントではなく薬力学的エンドポイントを用いて比較する。薬物動態比較では、血漿濃度データを用いて、曲線下面積(AUC)、ピーク濃度(Cmax)、ピーク濃度までの時間(Tmax)、及び吸収遅延時間(tlag)等の主要な薬物動態パラメータを評価する。試験は、特に薬物が非線形の薬物動態を示す場合、数種類の用量で実施することができる。
【０１２１】
生物学的同等性の研究からのデータに加え、生物学的同等性の規制上の要件を満たすために他のデータの提出が必要となる場合もある。こうした証拠には、解析方法の検証及び/又はインビトロ-インビボ相関研究(in vitro-in vivo correlation studies, IVIVC)が含まれる場合がある。
【０１２２】
特定の一実施形態において、本発明のポリペプチド等の本発明の作用剤は、より高い曝露(AUC)、より少ない投与回数、及び低減された用量を提供するために修飾される。
【０１２３】
他の実施形態において、本発明のポリペプチド等の本発明の作用剤は、患者への投与時の半減期、特に血漿半減期を増加させるために修飾される。特に、ポリペプチド等の作用剤は、血漿半減期を増加させるために修飾される。半減期を増加させるために、当該技術分野においてペプチド薬物を修飾する多数の方法を利用することが可能であり、こうした当該技術分野の方法は、本発明のSorCS1ポリペプチド及びその変異体を修飾するために採用することができる。短い血漿半減期は、速い腎クリアランスと、体循環中に生じる酵素的分解とにより生じる場合が多い。ペプチド/タンパク質の修飾は、血漿半減期の延長につなげることができる。半減期の増加は、例えば、ポリペプチドの全体的なアミノ酸量を少なくすることにより得ることができる。
【０１２４】
エキソペプチダーゼは、血漿、肝臓、及び腎臓内に生じる代表的なタンパク質分解酵素群であり、治療用のペプチド及びタンパク質に影響を与える。したがって、ペプチド薬物の末端の一方又は両方の修飾は、多くの場合、酵素の安定性を高め、したがって、血漿半減期を増加させる。したがって、一手法では、1つ以上の付加的な化合物を本発明のポリペプチドに結合させ、血漿半減期を増加させる。一実施形態において、末端修飾は、N-アセチル化及び/又はC-アミド化である。他のこうした実施形態において、N及び/又はC末端は、ポリエチレングリコール(PEG)化合物に結合させる。ポリペプチドの特異的修飾の1つは、N末端パルミトイル及びC末端PEG化の二重修飾である。C末端及びN末端間のアミド結合の形成によるポリペプチド薬物の頭-尾環化も、エキソペプチダーゼによるSorCS1ポリペプチドの分解を防止することが可能である。
【０１２５】
他の実施形態において、血漿半減期の増加は、酵素切断を受けやすいことが既知である1個以上のアミノ酸を置き換え、ポリペプチドがタンパク質分解を免れるようにすることで得られる。例えば、1個以上のLアミノ酸は、一方又は両方のポリペプチド末端及び/又はポリペプチド内においてDアミノ酸に置換し、分解を回避することで血漿半減期を増加させることができる。
【０１２６】
本発明のポリペプチドの半減期の増加は、更に、ポリペプチドを1種類以上の特異的酵素阻害剤と同時投与することで得ることができる。こうした酵素阻害剤は、本発明のパーツキットに含めることができる。更に他の手法において、半減期の増加は、本発明のSorCS1ポリペプチドの分子質量の増加により得ることができる。
【０１２７】
原則として、血漿タンパク質に結合しない、血漿分子質量が5kDaを下回る物質は、腎臓経路を介して排出される一方、分子質量が50kDaを超える分子は、糸球体限外濾過において、全く或いは極めて少量しか見ることができない。したがって、酵素的分解以外で、ペプチド及びタンパク質半減期が短くなる主な理由は、速い腎排泄である。そのため、ポリペプチド薬物のサイズを大きくすることにより、半減期を延長することができる。更に、付加的な酵素阻害により相乗効果を与え得る。エキソペプチダーゼを阻害する効果的な方法であるN末端及びC末端の化学修飾と、不安定なアミノ酸の置き換えとに加えて、PEG化により、危険のある末端を特異的に保護し、分子質量を更に増加させる。加えて、薬物分子内でのPEG化は、タンパク質分解酵素の立体障害により仲介される酵素安定性の改善につながると予測される。
【０１２８】
ポリ(エチレングリコール)(PEG)は、幾つかの有益な特性を示す:高水溶性、溶液中での高移動性、毒性及び免疫原性の欠如、及び身体からの素早い排出。多くの場合、こうした特性は、PEG-タンパク質又はPEG-ペプチドコンジュゲートに伝えられる。こうした特徴の程度は、付着したPEGの分子量に応じて決まる。
【０１２９】
また、N-アセチルノイラミン酸のポリマー(ポリシアル酸)は、本発明のポリペプチドに対するコンジュゲートとして使用し得る。ポリシアル酸は、人体において既知の受容体が存在しない、天然に存在する生分解性高親水性化合物である。PEG化及びシアリル化は、酵素安定性の改善と、分子質量の増加による腎排泄の低減という2つの機構の組み合わせにより、半減期を延長する。
【０１３０】
アルブミンは、長い血漿半減期を有することが知られており、この特性のため、薬物の半減期を増加させるために、薬物送達に用いられてきた。この目的で、アルブミンは、こうした医薬組成物に結合されてきた。特に適しているのは、例えば、WO2010092135に記載の方法、特に、PDPH(3-(2-ピリジルジチオ)プロピオニルヒドラジド)を用いて、アルブミンを、SorCS1ポリペプチドとのヒドラゾン連結を介して、フラグメントを含めた本発明のSorCSポリペプチドに連結する方法による、アルブミン分子上の遊離システイン残基(Cys 34)との結合である。他の結合手法は、酵素による複合糖質化を用いて、Neoseにより説明されている(例えば、US2004/0126838を参照)。この手法では、適切なリンカーを用いて、例えば、アルブミンを本発明のSorCS1ポリペプチドに連結することができる。
【０１３１】
特定の実施形態において、本発明は、長期作用型の修飾SorCS1ポリペプチドに関する。前記修飾ポリペプチドは、医薬的に許容可能な分子に連結された哺乳動物のSorCS1又はその類似体を含み、それは、例えば、アルブミンに連結、例えば、融合された、或いは適切な長さの脂肪酸に融合された、或いは哺乳類抗体のFcフラグメント又は哺乳類抗体のFcフラグメントの変異体に融合された、或いはアシル化基又はPEGに結合された、ヒトSorCS1である。それは、一部の実施形態では、哺乳動物において、2乃至48時間以上、一般に4乃至28時間、例として6乃至8時間となる、哺乳動物SorCS1又はその類似体、或いは修飾SorCS1の、インビボ血漿半減期を提供する。
【０１３２】
興味の対象のタンパク質又はそのフラグメントに連結される、免疫グロブリン定常領域を含む融合タンパク質の作成は、説明されている(例えば、米国特許第5,155,027号、第5,428,130号、第5,480,981号、及び第5,808,029号参照)。こうした分子は、通常、連結された興味の対象の分子に関連する生物学的活性と、免疫グロブリン定常領域に関連するエフェクター機能、或いは他の何らかの所望の特性とを共に有する。免疫グロブリンのFc部分を含む融合タンパク質は、安定性の増加、血清半減期の増加(Capon et al. (1989) Nature 337:525参照)、及び新生児Fc受容体(FcRn)等のFc受容体との結合(米国特許第6,086,875号、第6,030,613号、及び第6,485,726号)を含め、幾つかの望ましい特性を融合タンパク質に与えることができる。
【０１３３】
一実施形態において、半減期の増加をもたらす成分は、二官能性又は三官能性等の多官能性成分であり、1個以上の哺乳類SorCS1分子等の1個以上のSorCS1分子と共有結合し、1個以上の医薬的に許容可能な分子と共有結合して、修飾SorCS1化合物を形成し得る。リンカーは、安定しており、これは、有意な化学反応、例えば、加水分解が、生理的条件(例えば、温度37℃、pH7.4)において、処置期間全体で発生しないことを意味する。これは、当該技術分野において公知の安定性研究により決定することができる。リンカーは、生体細胞の外部で有機化学的に生成されるという意味で、化学リンカーにし得る。リンカーは、タンパク質上のグリコシル化体等の糖成分にしてよく、或いは、化学的に調製し、SorCS1分子と、PEG変異体、アルブミン、脂肪酸、又はFcフラグメント等の抗体又は抗原フラグメント等の第2の医薬的に許容可能な分子とを連結するために用いてもよい。
【０１３４】
一実施形態において、本発明のSorCS1ポリペプチド等の作用剤は、IgG-Fc等の免疫グロブリンFcに結合される。
【０１３５】
本発明のSorCS1化合物は、少なくとも1種類のペプチドリンカーを随意により含み得る。一実施形態において、リンカーは、ペプチド結合により一緒に連結された複数のアミノ酸を含み、このアミノ酸は、20種類の天然に存在するアミノ酸から選択される。様々な実施形態において、リンカーは、1乃至5個のアミノ酸、1乃至10個のアミノ酸、1乃至20個のアミノ酸、10乃至50個のアミノ酸、50乃至100個のアミノ酸、又は100乃至200個のアミノ酸を含むことができる。一実施形態において、アミノ酸は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択される。一実施形態において、リンカーは、グリシン及びアラニン等、立体障害のないアミノ酸により大部分が構成される。リンカーは、一実施形態において、配列Gn(-(Gly)n-に等しい)を含むことができる。リンカーは、一実施形態において、配列(GGS)n又は(GGGGS)nを含むことができる。何れの場合も、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10等の整数である。リンカーの例には、限定では無いが、GGG、SGGSGGS(配列番号65)、GGSGGSGGSGGSGGG(配列番号66)、GGSGGSGGSGGSGGSGGS(配列番号67)、GGGGSGGGGSGGG-GS、(配列番号68)、及びEFAGAAAV(配列番号69)が含まれる。
【０１３６】
一実施形態において、ペプチドリンカーは、少なくとも1個のアミノ酸、例として1乃至200個のアミノ酸、一般に1乃至50個のアミノ酸を含み、アミノ酸は、20種類の天然に存在するアミノ酸から選択される。一般に、ペプチドリンカーは、1乃至40個のアミノ酸、例として1乃至30個、例として1乃至20個、例として1乃至10個のアミノ酸を有する。他の実施形態において、ペプチドリンカーは、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択されるアミノ酸で構成されたリンカーから選択される。一般に、ペプチドリンカーは、グリシン及びアラニン等、立体障害のないアミノ酸により大部分が構成される。特に、ペプチドリンカーは、-(G)n-、(GGS)n、又は(GGGGS)nから選択される配列を含み、ここで、nは、1乃至50の整数である。一般に、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、又は10等、1乃至10から選択される整数である。
【０１３７】
抗体、抗体フラグメント、アルブミン、脂肪酸、又は半減期を延長する他の任意のものは、任意の適切なリンカー又はリンカー領域を介してSorCS1に結合させることができる。リンカーは、SorCS1及び医薬的に許容可能な分子それぞれの2個のシステイン(Cys)アミノ酸残基間での-S-S-結合等、ジスルフィド架橋にし得る。リンカーは、融合リンカーにしてよく、これは、SorCS1を1つのポリペプチド又はタンパク質として生体細胞において発現させることが可能であることを意味する。リンカーは、SorCS1と、化学的成分(moiety)を有する医薬的に許容可能な分子とを分離し、少なくとも5個の非水素原子を含み、その30乃至50％がN又はOである親水性リンカーにし得る。リンカーは、US6,515,100、US7,122,189、US7,700,551、WO2004/089280、WO2006/138572、及びWO2009/095479に記載のように、加水分解性にし得る。本発明においてリンカーとして有用な代表的化合物は、ジカルボン酸、マレイミドヒドラジド、PDPH、SPDP、LC-SPDP、GMBS、カルボン酸ヒドラジド、及び小ペプチドを有する群から選択される。本発明によるリンカーとして有用な化合物の更に具体的な例には、(a)コハク酸、グルタル酸、及びアジピン酸等のジカルボン酸、(b)N-[マレイミドカプロン酸]ヒドラジド(EMCH)、N-[マレイミドプロパン酸]ヒドラジド(MPH又はBMPH)、4-[N-マレイミドメチル]シクロヘキサン-1-カルボキシルヒドラジド、及びN-[k-マレイミドウンデカン酸]ヒドラジド(KMUH)、4-(4-N-マレイミドフェニル)酪酸ヒドラジド(MPBH)等のマレイミドヒドラジド、(c)NHS-3-マレイミドプロピオネートスクシンイミドエステル(MPS-EDA)、(d)スルフヒドリル反応性タンパク質に結合された(3-[2-ピリジルジチオ]プロピオニルヒドラジド)等のPDPHリンカー、(e)N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオネート(SPDP)、(f)スクシンイミジル6-(3-[2-ピリジルジチオ]-プロピオンアミド)ヘキサノエート(LC-SPDP)、(g)N-(v-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミドエステル(GMBS)、及び(h)2乃至5個の炭素原子から選択されるカルボン酸ヒドラジドが含まれる。他の非ペプチドリンカーにすることも可能である。例えば、-NH-(CH2)m-C(0)-等のアルキルリンカーが使用可能であり、ここで、mは、2乃至20から選択される整数である。こうしたアルキルリンカーは、更に、低級アルキル(例えば、C1乃至C6)、低級アシル、ハロゲン(例えば、CI、Br、I、F)、CN、NH2、フェニル等、任意の非立体障害性の基により置換し得る。非ペプチドリンカーの例は、PEGリンカーである。本発明による有用な付加的なリンカーは、米国特許第6,660,843号に記載されている。
【０１３８】
SorCS1及び医薬的に許容可能な分子等の2個以上の分子を、随意により二官能性リンカー等の多官能性リンカーを介して、共に連結するための様々な手法は、従来技術において利用可能であり、適切な参考文献は、WO01/58493であり、これに列挙及び引用された全ての関連文書が含まれる。
【０１３９】
本発明の文脈において、「医薬的に許容可能な分子」という用語は、本明細書での使用において、SorCS1と連結された際に、SorCS1又はその変異体の血清半減期を増加させる、有機小分子、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質、受容体、グリコシル化体、糖、ポリマー(例えば、ポリエチレングリコール、PEG)、核酸(例えばDNA及びRNA)、ホルモンの何れかから選択される分子を意味する。一般に、医薬的に許容可能な分子は、制限ではないが、ヒトアルブミン、組換えアルブミン等のアルブミンであり、或いは、PEG等のポリマー、例えば分子量が少なくとも10kDa、例として10kDa乃至150kDaのPEGである。更に、医薬的に許容可能な分子は、哺乳動物抗体のFcフラグメント、トランスフェリン、ヒトアルブミン、組換えアルブミン等のアルブミン、アルブミンの変異体、CH3(CH2)nCO-でnが8乃至22であるもの、或いは、PEG等のポリマー、例えば分子量が少なくとも5kDa、例として10kDa乃至150kDa、一般に10乃至40kDaのPEGから選択し得る。
【０１４０】
本発明の文脈において、「インビボ血漿半減期」は、通常の意味で用いられ、即ち、SorCS1の量が、生物学的プロセスにより生物系において半分の値に減少するのに要する時間である。
【０１４１】
「血清半減期」という用語は、「血漿半減期」又は「半減期」と相互に交換可能に用い得る用語であり、通常の意味で用いられ、即ち、SorCS1の量が、生物系において半分の濃度に減少するのに要する時間である。したがって、本明細書での使用において、「血清半減期」は、インビボでの血清半減期を意味する。血清半減期の判定は、機能的半減期を判定することよりも簡単である場合が多く、血清半減期の長さは、通常、機能的インビボ半減期の長さの良好な指標となる。好ましくは、血清半減期は、哺乳動物において測定され、更に好ましくは、ヒト科の種、例としてオランウータン、チンパンジ、又はゴリラ、更に好ましくは、ヒトにおいて測定される。本願にて言及した血清半減期は、ヒトにおいて判定された半減期である。半減期の指標、又は半減期の何らかの変化は、マウス又はラット又はハムスタ等の齧歯類においても得ることができる。更に、半減期は、人間と同程度の体重、又は齧歯類より人間の体重に近い体重を有する大型哺乳類、好ましくは、サル、イヌ、ブタ、又はウシ(子ウシ)において測定することができる。
【０１４２】
血漿半減期に関連して使用される「増加」という用語は、比較可能な条件下で判定された、SorCS1化合物の関連半減期を示すために用いられる。例えば、関連半減期は、少なくとも約25％、例として少なくとも約50％、例えば少なくとも約100％、150％、200％、250％、又は500％増加し得る。インビボ血漿半減期の測定は、文献に記載の多数の方法で実施することができる。インビボ血漿半減期の増加は、クリアランスの減少として、或いは平均滞留時間(MRT)の増加として定量し得る。適切なアッセイにおいて、SorCS1のクリアランスの70％未満、例として50％未満、例として20％未満、例として10％未満までクリアランスが減少した本発明のSorCS1化合物は、インビボ血漿半減期が増加したと考えられる。適切なアッセイにおいて、SorCS1のMRTの130％超、例として150％超、例として200％超、例として500％超までMRTが増加した本発明のSorCS1は、インビボ血漿半減期が増加したと考えられる。クリアランス及び平均滞留時間は、適切な試験動物を用いた標準的な薬物動態試験において評価することができる。特定のタンパク質に適した試験動物を選択することは、当業者の能力の範囲内である。ヒトでの試験は、当然ながら、最終的な試験を意味する。適切な試験動物には、通常のSprague-Dawley雄ラット、マウス、及びカニクイザルが含まれる。一般に、マウス及びラットでは、単一の皮下ボーラスを注入するが、サルでは、単一の皮下ボーラス又は単一の静脈投与量を注入してもよい。注入する量は、試験動物に応じて決まる。その後、血液試料を1乃至10日間(アッセイの感度により、最長30日までとし得る)に亘って適宜採取し、クリアランス及びMRTを評価する。血液試料は、ELISA法又は他の免疫学的手法により簡便に解析される。
【０１４３】
本発明の文脈において、「血漿濃度」という用語は、本明細書での使用において、SorCS1の注入後、任意の時点に循環中で測定可能な濃度を意味する。本発明の文脈において、「注入」という用語は、本明細書での使用において、注射器又は他の投与機器を用いた、皮下、筋肉内、腹腔内、又は静脈内注入等、非経口経路での投与を意味する。
【０１４４】
哺乳動物種の循環血液中で最も豊富なタンパク質成分は、血清アルブミンであり、通常、全血100ミリリットル当たり略3乃至4.5グラムの濃度で存在する。血清アルブミンは、循環系において幾つかの重要な機能を有する、略70,000ダルトン(Da)の血液タンパク質である。血中に見られる様々な有機分子の輸送体として、脂肪酸及びビリルビン等の様々な代謝産物の血液を介する主要な輸送体として、更に、多量に存在することから、循環血液の浸透圧性の制御因子として機能する。本発明の文脈において、「アルブミン」という用語は、本明細書での使用において、Peters, T., Jr. (1996) All about Albumin: Biochemistry, Genetics, 及び Medical, Applications pp10, Academic Press, Inc., Orlando (ISBN 0-12-5521 10-3)に記載のヒト血清アルブミン又は組換えヒトアルブミン等の哺乳動物由来又は非哺乳動物由来のアルブミン、或いはWO2011051489及びWO2010092135に記載の修飾されたヒトアルブミン等の修飾アルブミンを意味する。WO2011051489では、明細書は、親アルブミンと比較して血漿半減期が変更された、親アルブミンの変異体に関する。本発明は、更に、前記変異アルブミンを含む融合ポリペプチド及びコンジュゲートに関する。
【０１４５】
WO2010092135では、アルブミンの3次元構造に基づいて、本発明者らは、遊離チオール基を含む1個以上のシステイン残基を有する変異ポリペプチド(ムテイン)を設計した(以下、「チオールアルブミン」という)。変異ポリペプチドは、システイン残基の硫黄原子を介して、生理活性化合物等の結合相手に結合され得る。
【０１４６】
WO2005054286では、明細書は、アルブミン(限定では無いが、アルブミンのフラグメント及び変異体を含む)に融合された、血小板新生又は抗炎症特性を示す、インタロイキン11(IL-11)を含むタンパク質(限定では無いが、そのフラグメント及び変異体を含む)に関する。
【０１４７】
WO2004083245では、MSを有する患者において自然生成されるアルブミンよりも長い半減期を有する作用剤を説明しており、作用剤は、第二のポリペプチドに結合された、アルブミン様の第一のポリペプチドを含む。
【０１４８】
WO03066681では、高度に生成された組換えヒト血清アルブミンの添加により安定化された非アルブミンタンパク質を含む組成物を説明している。非アルブミンタンパク質は、Factor VIIIにしてよい。
【０１４９】
他の態様において、本発明は、医薬的に許容可能な分子に連結されたSorCS1ポリペプチドを含む、本明細書に開示した本発明のコンジュゲートの何れか等、長期作用型の生物学的に活性なSorCS1化合物を調製する方法に関し、方法は、SorCS1を、医薬的に許容可能な分子に付着させたリンカーと反応させること、或いは、SorCS1ポリペプチドをリンカーと反応させ、その後、前記リンカーを医薬的に許容可能な分子に付着させること、或いは、リンカーを医薬的に許容可能な分子と反応させ、その後、SorCS1ポリペプチドを、医薬的に許容可能な分子に付着したリンカーと反応させることを含み、或いは、SorCS1ポリペプチド及び医薬的に許容可能な分子を宿主細胞から発現させることによる。
【０１５０】
一実施形態において、本発明は、長期作用型の修飾哺乳動物SorCS1、例えば、融合等によりアルブミンと連結された、或いはアシル化基又はPEGと結合された、ヒトSorCS1に関し、哺乳動物SorCS1又はその類似体、或いは修飾SorCS1ポリペプチドのインビボ血漿半減期を、哺乳動物において2乃至48時間にする。長期作用型の修飾SorCS1は、SorCS1の投与頻度を減らすことにより、患者の利便性及び治療結果を改善すると考えられる。
【０１５１】
他の実施形態において、半減期の増加は、持続送達系又は徐放性送達の使用により得られる。例えば、リポソームは、本発明のポリペプチドの送達に利用可能な周知の薬物担体である。この場合、本発明のSorCS1ポリペプチドを含むリポソームを生成することができる。生分解性ポリマーであるポリ(乳酸)(PLA)及びポリ(乳酸/グリコール酸)(PLGA)に基づく持続送達系も、本発明のポリペプチド薬物の送達に適している。
【０１５２】
一実施形態において、本発明の作用剤は、患者に投与した際の半減期、特に血漿半減期を増加させるために修飾される。修飾は、本発明の作用剤に結合される成分の形態として、成分結合作用剤を生成するようにしてよく、前記成分結合作用剤は、非成分結合作用剤の血漿及び/又は血清半減期よりも長い血漿及び/又は血清半減期を有する。こうした一実施形態において、作用剤に結合される成分は、アルブミン及びその変異体、脂肪酸、ポリエチレングリコール(PEG)、アシル化基、抗体、及び抗体フラグメントからなる群から選択される1種類以上の成分である。本発明のポリペプチドに対する成分の結合は、本発明のポリペプチドの任意の適切なアミノ酸残基(骨格又は側鎖)に対するものにし得る。成分は、リンカーにより、本発明のポリペプチドに結合してもよい。特定の実施形態において、前記リンカーは、配列番号67、68、69、70、及び71からなる群から選択される配列を有する。
【０１５３】
一実施形態において、本発明によるポリペプチドに結合する成分は、血液脳関門(BBB)を越える輸送を促進する成分である。こうしたBBB通過輸送促進剤の例は、ラクダ科の種由来の抗体である。ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカ、ビクーニャ、及びグアナコ等のラクダ類は、BBBを通過可能な単鎖抗体を有する。方法は、当業者に知られている。Li et al (2012) FASEB J. (10):3969-79を参照されたい。
【０１５４】
核酸、ベクター、及び宿主細胞
【０１５５】
上述したように、本発明は本明細書に定めたポリペプチドをコードすることが可能なヌクレオチドを更に含み、コードされるポリペプチドは、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、及び54からなる群から選択される配列又はそのフラグメントに対して、少なくとも60％、例えば65％、例えば70％、例えば75％、例として80％、例えば85％、例として90％、例えば95％、例として98％、例えば99％の配列同一性を有するもの等となる。
【０１５６】
一態様において、本発明は、個体において食欲を減少させる方法に用いる、本明細書に定めた少なくとも1つのヌクレオチドを含むベクターに関する。
【０１５７】
他の態様において、本発明は、減量を促進する方法に用いる、本明細書に定めた少なくとも1つのヌクレオチドを含むベクターに関する。
【０１５８】
他の態様において、本発明は、肥満を治療する方法に用いる、本明細書に定めた少なくとも1つのヌクレオチドを含むベクターに関する。
【０１５９】
他の態様において、本発明は、代謝を増加させる方法に用いる、本明細書に定めた少なくとも1つのヌクレオチドを含むベクターに関する。
【０１６０】
他の態様において、本発明は、熱産生を増加させる方法に用いる、本明細書に定めた少なくとも1つのヌクレオチドを含むベクターに関する。
【０１６１】
他の態様において、本発明は、白色脂肪を褐色脂肪に転換するインビボ及び/又はインビトロの方法に用いる、本明細書に定めた少なくとも1つのヌクレオチドを含むベクターに関する。
【０１６２】
本発明のベクターは、更に、本発明の核酸分子と適切に作用可能に連結し得るプロモータを含み得る。プロモータは、限定では無いが、CMV、ヒトUbiC、RSV、Tet調節可能プロモータ、Mo-MLV-LTR、Mx1、EF-1α、PDGFβ、及びCaMK IIからなる群から選択し得る。
【０１６３】
本発明のベクターは、レンチウイルス、HIV、SIV、FIV、EAIV、CIVを含む、レトロウイルス科由来のベクターからなる群から選択してもよい。本発明の他のベクターは、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、バキュロウイルス、HSV、コロナウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、Mo-MLVからなる群から選択され、好ましくは、アデノ随伴ウイルスである。
【０１６４】
他の実施形態において、本発明は、上述した核酸を含む宿主細胞に関し、単離宿主細胞は、本明細書に定めた少なくとも1つのベクターにより形質転換又は形質導入される。したがって、宿主細胞は、裸の状態で又は生体適合性カプセルに入れて、移植することにより、本発明のポリペプチドを生産する。
【０１６５】
一態様において、本発明は、個体において食欲を減少させる方法に用いる、本明細書に定めた少なくとも1つのヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【０１６６】
他の態様において、本発明は、減量を促進する方法に用いる、本明細書に定めた少なくとも1つのヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【０１６７】
他の態様において、本発明は、肥満を治療する方法に用いる、本明細書に定めた少なくとも1つのヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【０１６８】
他の態様において、本発明は、代謝を増加させる方法に用いる、本明細書に定めた少なくとも1つのヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【０１６９】
他の態様において、本発明は、熱産生を増加させる方法に用いる、本明細書に定めた少なくとも1つのヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【０１７０】
他の態様において、本発明は、白色脂肪を褐色脂肪に転換するインビボ及び/又はインビトロの方法に用いる、本明細書に定めた少なくとも1つのヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。
【０１７１】
単離宿主細胞は、Saccharomyces cerevisiae、大腸菌、アスペルギルス、及びSf9昆虫細胞からなる群、及びヒト、ネコ、ブタ、サル、イヌ、ネズミ、及びラット細胞からなる群から選択される哺乳動物細胞からなる群から選択してよく、哺乳動物細胞は、限定では無いが、筋細胞と、肝細胞と、脂肪細胞と、α細胞、β細胞、及びδ細胞等の膵臓の細胞とからなる群から選択し得る。
【０１７２】
一実施形態において、単離宿主細胞は、CHO、CHO-K1、HEI193T、HEK293、COS、PC12、HiB5、RN33b、及びBHK細胞からなる群から選択される。
【０１７３】
一実施形態において、宿主細胞は、ヒト幹細胞であり、他の実施形態において、宿主細胞は、ヒト幹細胞ではない。
【０１７４】
上述したように、本発明の作用剤は、食欲を減少させること、及び/又は空腹感を抑制すること、及び/又は予測消費量を減少させること、及び/又は減量を促進すること、及び/又は肥満を治療すること、及び/又は代謝を増加させること、及び/又は哺乳動物における熱産生を増加させること、及び/又はインビボ又はインビトロの細胞培養において白色脂肪を褐色脂肪に転換することに関連する可溶性SorCS1の例において実証される生物学的活性を有する任意の作用剤である。作用剤は、ポリペプチドであることが好ましいが、原則として、SorCS1ポリペプチドと同じ生物学的反応を示す任意の種類の分子、例として、他のポリペプチド、特に他のVps10pドメイン受容体、抗体、及び有機小分子にしてよく、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、単鎖抗体、及び組換え抗体からなる群から選択し得る。
【０１７５】
更に、本明細書で説明したように、食欲の低減、空腹感の抑制、又は食べる欲求の低減のための、本明細書で説明したSorCS1ポリペプチド(群)をコードすることが可能な核酸の、裸の状態、又は宿主細胞内、又はパッケージング細胞内での投与も、本発明の態様となる。
【０１７６】
本発明の作用剤のスクリーニング方法
【０１７７】
本発明は、SorCS1ペプチド及びポリペプチドフラグメント並びにその突然変異体及び変異体を含む他の候補作用剤をスクリーニング及び評価する特異的標的及び方法を提供する。
【０１７８】
特定の生理学的活性について多数のペプチドをスクリーニングすることは困難な作業となり得るが、実施すべき本明細書のアッセイの正確な開示により、当業者は、実験による過度の負担無く、独創的な技能を必要とせずに、本発明を再現することができる。
【０１７９】
この目的で、候補作用剤のスクリーニングライブラリは、市販のものを容易に利用することができる。ライブラリがペプチドライブラリであるか化学ライブラリであるかは、化学ライブラリのスクリーニングも日常業務であることから、現状においては全く影響しない。実際、化学ライブラリのスクリーニングは商業的な会社が提供するサービスとなっており、こうした会社がスクリーニング作業をそれほど独創的なものと考えていないことは、プレゼンテーション資料から明らかである。
【０１８０】
最初に、SorCS1様作用剤、即ち、食欲の低減、減量の促進、肥満の治療、代謝増加、熱産生減少、及び/又は白色脂肪の褐色脂肪への転換等、SorCS1と同じ生物学的反応を示す作用剤をスクリーニングするプロセスには、本明細書で説明した研究を実行して、作用剤が生物学的活性を有することを検証することが有意義である。本明細書で述べたように、これは、SorCS1様作用剤の投与がマウス等の試験モデルにおいて実際に食欲の減少をもたらすことを示すことにより、間接的に実行し得る。
【０１８１】
したがって、一実施形態において、本発明は、食欲を減少させ、減量を促進し、肥満を治療し、代謝を増加させ、熱産生を増加させ、及び/又は白色脂肪を褐色脂肪に転換する、本明細書に定めたSorCS1様作用剤の能力をスクリーニングするインビボ及び/又はインビトロの方法に関する。
【０１８２】
医薬組成物及び投与形態
【０１８３】
本発明には、本明細書に定めた作用剤を含む医薬組成物も含まれる。本発明の文脈において、作用剤及び化合物という用語は、医薬組成物を説明する際には同義語と見做される。
【０１８４】
本発明の文脈において、「医薬組成物」という用語は、本明細書での使用において、本発明のSorCS1及び/又はSorCS1変異体と、随意により1種類以上の医薬的に許容可能な担体又は賦形剤とを含む組成物を一般に意味し、例えばRemington: The Science, and Practice of Pharmacy 1995, edited by E. W. Martin, Mack Publishing Company, 19th edition, Easton, Paに記載のもの等、従来の手法により調製し得る。組成物は、従来の形態、例えば、カプセル、錠剤、エアロゾル、溶液、懸濁液、又は局所投与物にしてよい。一般に、本発明の医薬組成物は、非経口投与、例えば、静脈内又は皮下注入用に製剤化し得ると共に、アンプル、充填済みシリンジ、少量の注入液、又は複数回投与用容器において、保存料を添加して、単位用量の形態で提供し得る。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、又は乳液の形態、例えば、水性ポリエチレングリコール中の溶液の形態をとり得る。油性又は非水性担体、希釈剤、溶媒、又はビヒクルの例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、野菜油(例えば、オリーブ油)、及び注入可能有機エステル(例えば、オレイン酸エチル)が含まれ、保存剤、湿潤剤、乳化剤、又は懸濁化剤、安定化剤、及び/又は分散剤等の製剤用作用剤を含有し得る。或いは、活性成分は、滅菌固体の無菌分離により、或いは、適切なビヒクル、例えば発熱性物質除去蒸留水と共に使用する前の構成の溶液からの凍結乾燥により得られる粉末形態としてもよい。非経口製剤に有用な油には、石油、動物油、野菜油、又は合成油が含まれる。こうした製剤において有用な油の具体例には、ラッカセイ、ダイズ、ゴマ、綿実、トウモロコシ、オリーブ、ワセリン、及び鉱油が含まれる。非経口製剤において用いられる適切な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸が含まれる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、適切な脂肪酸エステルの例である。非経口製剤は、一般に、約0.0001乃至約25％、例として約0.5乃至約25％の重量の活性成分を溶液中に含む。保存剤及び緩衝剤を用いてもよい。注入部位の刺激を最小化又は除去するために、こうした組成物は、約12乃至約17の親水性-親油性バランス(HLB)を有する1種類以上の非イオン界面活性剤を含み得る。こうした製剤の界面活性剤の量は、一般に、約0.000001乃至約15重量％、例として約0.000001乃至約5重量％、或いは約5乃至約15重量％の範囲となる。適切な界面活性剤には、ソルビタンモノオレエート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、及びプロピレングリコールを有する酸化プロピレンの濃縮により形成される、疎水性塩基を有する酸化エチレンの高分子量付加物が含まれる。非経口製剤は、アンプル及びバイアル等の単位用量又は複数回用量の密封容器内で提供することが可能であり、使用直前に、例えば、水である注入用滅菌液体賦形剤の添加のみを必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保管することができる。
【０１８５】
しかしながら、本発明による薬物送達の主要経路は、作用剤を血流に導入し、最終的に関連する組織を標的とするために、非経口的なものとなる。
【０１８６】
作用剤は、生物学的に活性な物質の投与対象となる動物の任意の粘膜、例えば、鼻、膣、眼、口、生殖管、肺、消化管、又は直腸、好ましくは鼻又は口の粘膜を介して投与してもよい。
【０１８７】
好適な実施形態において、本発明の作用剤は、非経口投与、即ち、静脈内、筋肉内、皮下、鼻腔内、直腸内、膣内、又は腹腔内投与される。皮下及び筋肉内の形態での非経口投与が、一般に好適となる。こうした投与に適した剤形は、従来の手法により調製し得る。化合物は、吸入による投与、即ち、鼻腔内及び経口吸入投与してもよい。エアロゾル製剤又は定量吸入器等、このような投与に適した剤形は、従来の手法により調製し得る。
【０１８８】
一実施形態において、本発明による医薬組成物は、注入等の非経口投与用に製剤化される。
【０１８９】
他の実施形態において、本発明による医薬組成物は、静脈内、筋肉内、脊髄内、腹腔内、皮下、ボーラス、又は連続投与用に製剤化される。
【０１９０】
投与の速度及び頻度は、症例毎に医師が決定し得る。一実施形態において、投与は、30分乃至24時間の間隔、例として1乃至6時間の間隔で行われる。
【０１９１】
治療の継続期間は、状態の重症度に応じて変化し得る。一実施形態において、治療の継続期間は、6乃至72時間である。慢性の場合、治療の継続期間は、生涯となり得る。
【０１９２】
投与量は、担当の医師が患者の特性と投与の手段及び様式とに基づいて決定することができる。本発明の一実施形態において、本明細書に定めた医薬組成物の活性成分の投与量は、体重1kg当たり10μg乃至500mg、例として20μg乃至400mg、例えば30μg乃至300mg、例として40μg乃至200mg、例えば50μg乃至100mg、例として60μg乃至90μg、例えば70μg乃至80μgである。
【０１９３】
投与量は、ボーラス投与又は連続投与として投与し得る。ボーラス投与に関して、医薬組成物は、30分乃至24時間の間隔、例として1乃至6時間の間隔で投与し得る。投与が連続的な場合、通常は6時間乃至7日間の期間に亘り投与される。しかしながら、通常、投与量は、ボーラスとして1日に1乃至3回投与される。
【０１９４】
製剤
【０１９５】
本発明の組成物又は塩は、未加工の化学物質として投与することが可能だが、医薬製剤の形態で提供することが好ましい、したがって、本発明は、本明細書に定める本発明の化合物又はその医薬的に許容可能な塩と、その医薬的に許容可能な担体とを含む、医療用の医薬製剤を更に提供する。
【０１９６】
一実施形態において、本明細書に定めた医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体を含む。
【０１９７】
本発明の作用剤は、上述した様々な投与形態に適した、広範な剤形で製剤化し得る。
【０１９８】
医薬組成物及び剤形は、本発明の作用剤、又はその医薬的に許容可能な塩又は結晶形態を活性成分として含み得る。
【０１９９】
更に医薬組成物は、固体又は液体にすることが可能な医薬的に許容可能な担体を含み得る。
【０２００】
固体形態の調製物は、通常、粉末、錠剤、丸薬、カプセル、カシェ剤、坐薬、及び分散性顆粒等、経口又は腸内投与用に提供される。固体担体は、希釈剤、香味剤、可溶化剤、潤滑剤、懸濁化剤、結合剤、保存剤、湿潤剤、錠剤崩壊剤、又は封入材料としても機能し得る。
【０２０１】
好ましくは、組成物は、本発明の化合物又は化合物群の約0.5乃至75重量％であり、残りは、適切な医薬賦形剤からなる。経口投与用では、こうした賦形剤には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、炭酸マグネシウム等が含まれる。
【０２０２】
粉末において、担体は、微粉化した活性成分との混合物である微粉化固体である。錠剤において、活性成分は、必要な結合能力を有する担体と適切な割合で混合され、所望の形状及び大きさに圧縮される。粉末及び錠剤は、1乃至約70パーセントの活性化合物を含む。適切な担体は、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、砂糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、カカオバター等である。「調製」という用語は、担体を含む又は含まない活性成分が、それに関連する担体に囲まれた状態となるカプセルを提供する担体としての封入材料を用いた活性成分の製剤化を含むものとする。同様に、カシェ剤及びトローチが含まれる。錠剤、粉末、カプセル、丸薬、カシェ剤、及びトローチは、経口投与に適した固体形態にすることができる。
【０２０３】
本発明による滴剤は、滅菌又は非滅菌の水性又は油性溶液又は懸濁液を含み得ると共に、有効成分を適切な水溶液に溶解し、随意により殺菌剤及び/又は防黴剤及び/又は他の任意の適切な保存剤を含め、随意により表面活性剤を含めることにより調製し得る。結果的に生じた溶液は、その後、濾過により浄化し、適切な容器に移した後、密封し、オートクレーブすること、或いは30分間98乃至100℃に維持することにより滅菌し得る。或いは、溶液は、濾過により滅菌し、無菌状態で容器に移してもよい。滴剤に含めるのに適した殺菌剤及び防黴剤の例は、硝酸フェニル水銀又は酢酸フェニル水銀(0.002％)、塩化ベンザルコニウム(0.01％)、及び酢酸クロルヘキシジン(0.01％)である。油性溶液の調製に適した溶媒には、グリセリン、希釈アルコール、及びプロピレングリコールが含まれる。
【０２０４】
更に、使用の少し前に、経口投与用の液体調製物に転換することを意図した固体調製物が含まれる。こうした液体形態には、溶液、懸濁液、及び乳液が含まれる。こうした調製物は、活性成分に加えて、着色剤、香料、安定化剤、緩衝剤、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤等を含み得る。
【０２０５】
経口投与に適した他の形態には、乳液、シロップ、エリキシル剤、水溶液、水性懸濁液、練り歯みがき、ゲル歯磨き剤、チューインガムを含む液体調製物、或いは、使用の少し前に液体調製物に転換することを意図した固体調製物が含まれる。乳液は、水性プロピレングリコール溶液中の溶液において調製してよく、或いはレシチン、ソルビタンモノオレエート、又はアカシア等の乳化剤を含有し得る。水溶液は、活性成分を水に溶解させ、適切な着色剤、香味料、安定化剤、及び増粘剤を添加することにより調整し得る。水性懸濁液は、微粉化した活性成分を、天然又は合成ゴム、樹脂、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等の粘性材料、及び他の周知の懸濁化剤と共に水中に分散させることにより調製可能である。固体調製物には、溶液、懸濁液、及び乳液が含まれ、活性成分に加えて、着色剤、香料、安定化剤、緩衝剤、人工及び天然甘味料、分散剤、増粘剤、可溶化剤等を含み得る。
【０２０６】
本発明の化合物は、非経口投与(例えば、注射、例えば、ボーラス注射又は連続注入)用に製剤化し得ると共に、アンプル、充填済みシリンジ、少量の注入液、又は複数回投与用容器において、保存料を添加して、単位用量の形態で提供し得る。組成物は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、又は乳液の形態、例えば、水性ポリエチレングリコール中の溶液の形態をとり得る。油性又は非水性担体、希釈剤、溶媒、又はビヒクルの例には、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、野菜油(例えば、オリーブ油)、及び注入可能有機エステル(例えば、オレイン酸エチル)が含まれ、保存剤、湿潤剤、乳化剤、又は懸濁化剤、安定化剤、及び/又は分散剤等の製剤用作用剤を含有し得る。或いは、活性成分は、滅菌固体の無菌分離により、或いは、適切なビヒクル、例えば発熱性物質除去蒸留水と共に使用する前の構成の溶液からの凍結乾燥により得られる粉末形態としてもよい。
【０２０７】
非経口製剤に有用な油には、石油、動物油、野菜油、又は合成油が含まれる。こうした製剤において有用な油の具体例には、落花生、大豆、胡麻、綿実、トウモロコシ、オリーブ、ワセリン、及び鉱油が含まれる。非経口製剤において用いられる適切な脂肪酸には、オレイン酸、ステアリン酸、及びイソステアリン酸が含まれる。オレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルは、適切な脂肪酸エステルの例である。
【０２０８】
非経口製剤での使用に適したセッケンには、脂肪酸アルカリ金属塩、アンモニウム塩、及びトリエタノールアミン塩が含まれ、適切な洗剤には、(a)例えばジメチルジアルキルハロゲン化アンモニウム及びアルキルピリジニウムハライド等の陽イオン洗剤、(b)例えばアルキル、アリール、及びオレフィンスルホン酸塩、アルキル、オレフィン、エーテル、及びモノグリセリド硫酸塩、並びに、スルホコハク酸塩等の陰イオン洗浄剤、(c)例えば脂肪酸アミンオキシド、脂肪酸アルカノールアミド、及びポリオキシエチレンポリプロピレン共重合体等の非イオン洗剤、(d)例えばアルキルβ-アミノプロピオネート及び2-アルキルイミダゾリン第4級アンモニウム塩等の両性洗剤、及び(e)それらの混合物等が含まれる。
【０２０９】
非経口製剤は、一般に、約0.5乃至約25重量％の活性成分を溶液中に含む。保存剤及び緩衝剤を用いてもよい。注入部位の刺激を最小化又は除去するために、こうした組成物は、約12乃至約17の親水性-親油性バランス(HLB)を有する1種類以上の非イオン界面活性剤を含み得る。こうした製剤の界面活性剤の量は、一般に、約5乃至約15重量％の範囲となる。適切な界面活性剤には、ソルビタンモノオレエート等のポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、及びプロピレングリコールを有する酸化プロピレンの濃縮により形成される、疎水性塩基を有する酸化エチレンの高分子量付加物が含まれる。非経口製剤は、アンプル及びバイアル等の単位用量又は複数回用量の密封容器内で提供することが可能であり、使用直前に、例えば、水である注入用滅菌液体賦形剤の添加のみを必要とするフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保管することができる。即時注入溶液及び懸濁液は、上述した種類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。
【０２１０】
本発明の化合物は、経皮投与又は経粘膜投与用に局所的に送達することができる。局所投与の領域には、皮膚表面、更に、膣、直腸、鼻、口、及び喉の粘膜組織が含まれる。皮膚及び粘膜を介した局所投与用の組成物は、腫れ又は発赤等の炎症の兆候を引き起こすべきではない。経皮投与には、一般に、患者の体循環内に至る薬物の経皮通過のために医薬品を送達することが伴う。皮膚部位には、薬物を経皮的に投与するための解剖学的領域が含まれ、前腕、腹部、胸部、背部、臀部、乳頭部等が含まれる。
【０２１１】
局所組成物は、局所投与に適した医薬的に許容可能な担体を含み得る。したがって、組成物は、例えば、懸濁液、溶液、軟膏、ローション、性交用潤滑剤、クリーム、フォーム、エアロゾル、スプレ、坐薬、移植物、吸入剤、舌下錠等の錠剤、カプセル、乾燥粉末、シロップ、バルム、又はトローチの形態をとり得る。こうした組成物を調整する方法は、製薬業において公知である。
【０２１２】
本発明の化合物は、表皮に対する局所投与用に、軟膏、クリーム、又はローションとして、或いは、経皮パッチとして、製剤化し得る。軟膏及びクリームは、水性又は油性基剤に、適切な増粘剤及び/又はゲル化剤を添加して製剤化し得る。ローションは、水性又は油性基剤により製剤化し得ると共に、一般に、一種類以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤、又は着色剤を含む。口内での局所投与に適した製剤には、通常はスクロース及びアカシア又はトラガントである風味の付いた基剤中に活性剤を含むトローチと、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア等の不活性基剤中に活性成分を含むパステル剤と、適切な液体担体中に活性成分を含む洗口剤とが含まれる。
【０２１３】
本発明によるクリーム、軟膏、又はペーストは、外用の活性成分の半固形製剤である。微粉化又は粉末化形態の活性成分を、単独で、或いは水性又は非水性の流体中の溶液又は懸濁液中で、適切な機械を用いて、油脂性又は非油脂性基剤と混合することで作成し得る。基剤は、固形パラフィン、軟パラフィン、又は流動パラフィン、グリセリン、蜜蝋、金属セッケン等の炭化水素と、粘液と、アーモンド油、コーン油、ラッカセイ油、ヒマシ油、又はオリーブ油等の天然由来の油と、羊毛脂又はその誘導体と、又はステアリン酸又はオレイン酸等の脂肪酸とを、プロピレングリコール又はマクロゴール等のアルコールと共に含み得る。製剤には、ソルビタンエステル又はそのポリオキシエチレン誘導体といった陰イオン、陽イオン、又は非イオン界面活性剤等の任意の適切な表面活性剤を含めてもよい。天然ゴム、セルロース誘導体、ケイ素質シリカ等の無機材料、及びラノリン等の他の成分といった懸濁化剤も含まれ得る。
【０２１４】
本発明によるローションには、皮膚又は眼への付与に適したものが含まれる。点眼薬は、殺菌剤を随意により含有する滅菌水溶液を含み得ると共に、滴剤の調製用のものと同様の方法で調製し得る。皮膚に付与するローション又は塗布剤には、アルコール又はアセトン等、乾燥を早め皮膚を冷却する作用剤、及び/又は、例えば、グリセロール或いはヒマシ油又はラッカセイ油等の油といった保湿剤も含まれ得る。
【０２１５】
経皮送達は、複合体のソースを長期間に亘り患者の皮膚に触れさせることで達成し得る。経皮パッチは、医薬品-化学修飾剤複合体の身体に対する制御送達をもたらすという追加の利点を有する。Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues, and Research Initiatives, Hadgraft, and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989)、Controlled Drug Delivery: Fundamentals, and Applications, Robinson, and Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987)、and Transdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus, and Berner (eds.), CRC Press, (1987)を参照されたい。こうした剤形は、医薬品-化学修飾剤複合体を、エラストママトリクス材料等の適切な媒体に溶解、分散、又は他の形で組み入れることにより作成可能となる。吸収促進剤を用いて、皮膚を通る化合物の流動を増やすこともできる。こうした流動の速度は、速度制御膜を設けること、又はポリマーマトリクス又はゲル中に化合物を分散させることにより制御することができる。
【０２１６】
例えば、単純な接着パッチは、裏当材とアクリル酸系接着剤とにより作成することができる。医薬品-化学修飾剤複合体及び任意の促進剤を接着剤流延溶液に配合し、完全に混合させる。溶液は、裏当材に直接流延し、流延溶媒をオーブンで蒸発させ、接着フィルムを残す。剥離ライナを付着させて、システムを完成させることができる。
【０２１７】
フォームマトリクスパッチは、同様の設計であり、液体貯留システムの構成要素は、ゲル状の医薬品-化学修飾剤溶液を除き、一般にポリウレタンである薄いフォーム層に閉じ込める。このフォーム層は、パッチの周囲で熱融着させた裏当てと膜との間に位置する。
【０２１８】
受動的送達システムでは、放出速度は、一般に、貯留部と皮膚との間に配置された膜、モノリシックデバイスからの拡散、又は送達システムにおいて速度制御障壁の役割を果たす皮膚自体により制御される。米国特許第4,816,258号、第4,927,408号、第4,904,475号、第4,588,580号、第4,788,062号等を参照されたい。薬物送達速度は、部分的には、膜の性質に応じて決まる。例えば、体内の膜を通る薬物送達速度は、一般に、皮膚障壁を通るものよりも速い。複合体がデバイスから膜へ送達される速度は、貯留部と皮膚との間に配置された速度制限膜を用いて制御することが最も有利となる。皮膚が複合体に対して充分な透過性を有する(即ち、皮膚を介した吸収が、膜を通過する速度よりも大きい)と仮定すると、膜は、患者が受ける投薬率を制御する役割を果たす。
【０２１９】
適切な透過膜材料は、所望の透過性の度合い、複合体の性質、及びデバイスの構築に関する機械的考慮事項に基づいて選択し得る。透過膜材料の例には、広範な天然及び合成ポリマーが含まれ、例として、ポリジメチルシロキサン(シリコーンゴム)、エチレン酢酸ビニル共重合体(EVA)、ポリウレタン、ポリウレタン-ポリエーテル共重合体、ポリエチレン、ポリアミド、ポリ塩化ビニル(PVC)、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、セルロース材料、例えば三酢酸セルロース及び硝酸/酢酸セルロース、及びヒドロゲル、例えばメタクリル酸-2-ヒドロキシエチル(HEMA)が含まれる。
【０２２０】
本発明の化合物は、坐薬としての投与用にも製剤化し得る。脂肪酸グリセリド又はココアバターの混合物等の低融点ワックスを最初に溶融させ、活性成分を、例えば撹拌により、均質に分散させる。次に、溶融均質混合物を都合の良いサイズの鋳型に注ぎ、冷却させて凝固させる。
【０２２１】
活性化合物は、例えば、約0.5％乃至約50％の本発明の化合物が、ポリエチレングリコール(PEG)担体(例えば、PEG1000[96％]及びPEG4000[4％])中に含まれた坐薬として製剤化し得る。
【０２２２】
本発明の化合物は、膣内投与用に製剤化し得る。活性成分に加え担体を含むペッサリ、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、又はスプレは、当該技術分野において適切なものとして知られている。
【０２２３】
本発明の化合物は、経鼻投与用に製剤化し得る。溶液又は懸濁液は、従来の手段、例えば、点滴器、ピペット、又はスプレにより、鼻腔に直接付与される。製剤は、単一又は複数回用量の形態で提供し得る。後者で点滴器又はピペットを用いる場合、これは、患者が適切な所定量の溶液又は懸濁液を投与することにより達成し得る。スプレの場合、これは、例えば、定量式噴霧スプレポンプにより達成し得る。
【０２２４】
本発明の化合物は、特に鼻腔内投与を含む気道へのエアロゾル投与用に製剤化し得る。化合物は、一般に、例えば5ミクロン未満程度の小さな粒子サイズを有する。こうした粒子サイズは、当該技術分野において公知の手段、例えば、微粒子化により達成し得る。活性成分は、クロロフルオロカーボン(CFC)、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、又はジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素、又は他の適切なガス等、適切な噴射剤と共に加圧パック内に提供される。エアロゾルは、更にレシチン等の界面活性剤を含むことが都合の良い場合もある。薬物の用量は、計量弁により制御し得る。或いは、活性材料は、乾燥粉末の形態、例えば、ラクトース、デンプン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びポリビニルピロリジン(PVP)等のデンプン誘導体等の適切な粉末基剤中の化合物の粉末混合物の形態で提供し得る。粉末担体は、鼻腔内でゲルを形成する。粉末組成物は、例えば、ゼラチン等のカプセル又はカートリッジ、或いは 吸入器を用いて粉末が投与され得るブリスタパックの形態において、単位用量で提供し得る。
【０２２５】
望ましい場合には、製剤は、活性成分の持続又は制御放出投与用の腸溶コーティングと共に調製することができる。
【０２２６】
医薬調製物は、単位剤形であることが好ましい。こうした形態では、調製物は、適切な量の活性成分を含む単位用量に再分割される。単位剤形は、パケット錠剤、カプセル、バイアル又はアンプル入り粉末等、パッケージに調製物の個別の量が含まれたパッケージ調製物にすることができる。更に、単位剤形は、カプセル、錠剤、カシェ剤、又はトローチ自体にすることが可能であり、或いは、これらが適切な数量でパッケージ化された形態にすることもできる。
【０２２７】
医薬的に許容可能な塩
【０２２８】
即時化合物(instant compounds)の医薬的に許容可能な塩も、調整可能である場合には、本発明の対象になるものとする。こうした塩は、医薬用途での応用が許容される塩となる。これは、塩が親化合物の生物学的活性を保持しており、疾患を治療する際の応用及び使用において不都合又は有害な影響を有していないことを意味する。
【０２２９】
医薬的に許容可能な塩は、標準的な方法で調整される。親化合物が塩基である場合には、適切な溶媒中で、過剰な有機又は無機酸により処理する。親化合物が酸である場合には、適切な溶媒中で、無機又は有機塩基により処理する。
【０２３０】
本発明の化合物は、そのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩の形態で、医薬的に許容可能な担体又は希釈剤と並行して、同時に、又は共に投与してよく、特に好ましくは、その医薬組成物の形態で、経口、直腸、又は非経口(皮下を含む)経路により、有効量を投与し得る。
【０２３１】
本発明の医薬組成物において使用する医薬的に許容可能な酸付加塩の例には、例えば、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、及び硫酸等の鉱酸と、酒石酸、酢酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸、安息香酸、グリコール酸、グルコン酸、コハク酸、p-トルエンスルホン酸、及びアリールスルホン酸等の有機酸とに由来するものが含まれる。
【０２３２】
医薬組成物のpHは、生理学的な目的に適した任意のpHにしてよく、例としてpH4乃至pH9、好ましくは5乃至8、更に好ましくはpH7程度にしてよい。
【０２３３】
パーツキット
【０２３４】
一態様において、本発明は、以下を備えるパーツキットに関する。
-本明細書に定めた医薬組成物
-薬剤を投与するための医療器具又は他の手段
-パーツキットの使用方法の説明書
-随意により、本明細書に定めた第2の活性成分。
【０２３５】
他の実施形態において、本明細書に定めた器具は、米国特許第5,462,535号、第5,999,323号、及び第5,984,906号に記載の所謂インスリンペンである。
【０２３６】
第2の成分は、肥満又は過体重である個体に通常投与される任意の適切な活性成分にし得る。
【０２３７】
本発明の他の態様において、本発明は、上述した作用剤、又は上述した単離核酸配列、又は上述した発現ベクター、又は宿主細胞の組成物、又は上述したパッケージング細胞株、又はそれらの組み合わせを含む医薬組成物に関する。
【実施例】
【０２３８】
実施例1:PCRアレイによるSorCS1ノックアウトマウス由来の脂肪組織の遺伝子発現プロファイリング
【０２３９】
SorCS1ノックアウトマウスの遺伝子発現プロファイルを調べるため、マウスインスリンシグナル経路に関連する84遺伝子と、リポタンパク質シグナル伝達及びコレステロール代謝に関連する84遺伝子との発現を、マイクロアレイ解析により判定した。マイクロアレイ解析は、SorCS1ノックアウト野生型脂肪マウスの脂肪組織由来のRNAを用いて実施した。実施の際、第一鎖cDNAは、50週齢雌マウス(n=3)のSorCS1ノックアウト(-/-)及び野生型(+/+)脂肪組織由来の全RNA(Applied Biosystems)から合成した。その後、Mouse Insulin Signalling Pathway(PAMM-030A RT2 Profiler PCRアレイ)又はB)Mouse Lipoprotein Signalling & Cholesterol Metabolismタイプ(PAMM-080-A RT2 Profiler PCRアレイ)のスーパーアレイを、ABI7900プラットフォーム(Applied Biosystems)及びSYBR Green/Rox PCR(SABiosciences)を用いて処理した。発現解析は、デンマーク、オーフスのAROS Applied Biotechnologyが行った。野生型マウスと比較して、SorCS1ノックアウトマウスにおいて3倍を超えて上方制御又は下方制御された発現を示した遺伝子は、上段の表に記載しており、その既知の機能を下段の表に示している。図2A及び2Bのデータは、幾つかの遺伝子の発現が、野生型マウスと比較して、SorCS1ノックアウトマウスにおいて変化していることを示しており、インスリン及びコレステロールシグナル経路及び代謝がSorCS1ノックアウトマウスにおいて変化したことを示唆している。
【０２４０】
実施例2:可溶性SorCS1の過剰発現後の糖尿病db/dbマウスにおける体重減少
【０２４１】
2型糖尿病を自然発症した肥満マウスモデルにおける可溶性SorCS1の体重に対する効果を評価するため、db/dbマウス株を用いた(TaconicからのBKS.Cg-m+/+Lprdb/BomTac)。これらのマウスにはレプチン受容体が欠如しており、結果として、マウスは、肥満となり、インスリン抵抗性を生じ、最終的には6乃至8週齢で重度の糖尿病を発症する。
【０２４２】
ヒト可溶性(hsol.)SorCS1又は対照としてのLacZを発現するアデノウイルスを注入し、体重に対する効果を調べた。ヒト可溶性SorCS1(hsol.SorCS1)の発現用の組換えアデノウイルスは、次のように生成した。
【０２４３】
ヒト可溶性SorCS1 cDNA(アミノ酸1乃至1100)をコードするpcDNA3.1/Zeo(-)/hsol.SorCS1を、Pme1及びApa1により消化し、hsol.SorCS1をコードするフラグメントをシャトルプラスミドpVQpacAd5CMVK-NpA(ViraQuest Inc、アイオワ州ノースリバティ)に挿入した。その後、アイオワ州ノースリバティのViraQuest Incが、このシャトルプラスミドを用いて、hsol.SorCS1を過剰発現するアデノウイルスの生成及び増殖を行った。陰性対照としてLacZを発現するアデノウイルスは、アイオワ州ノースリバティのViraQuest Incから入手した。
【０２４４】
詳しくは、6週齢のdb/db雌マウスの尾静脈に、hsol.SorCS1又は陰性対照ウイルスとしてのLacZ(ViraQuest Inc、アイオワ州ノースリバティ)を含む2E9pfuのアデノウイルスベクターを注入した。0、9、14、及び16日目の朝に、マウスの体重を秤で計測した。データは、各群の5匹毎の平均値±SEMである。9乃至16日目に、可溶性SorCS1の過剰発現を有するdb/db雌マウスは、対照LacZウイルスを受け取ったマウスと比較して、体重の有意な減少を示した。したがって、可溶性SorCS1の過剰発現は、この肥満マウスモデルにおいて肥満状態を改善する。結果を図3に示す。
【０２４５】
実施例3:可溶性SorCS1の過剰発現後の糖尿病db/dbマウスにおける食物摂取及び体重の減少
【０２４６】
2型糖尿病を自然発症した肥満マウスモデルにおける可溶性SorCS1の体重に対する効果を評価するため、db/dbマウス株(TaconicからのBKS.Cg-m+/+Lprdb/BomTac)を用いた。これらのマウスにはレプチン受容体が欠如しており、結果として、マウスは、肥満となり、インスリン抵抗性を生じ、最終的には6乃至8週齢で重度の糖尿病を発症する。hsol.SorCS1又は対照としてのLacZを発現するアデノウイルスを注入し(実施例2参照)、体重に対する効果を調べた。詳しくは、6週齢のdb/db雌マウスの尾静脈に、hsol.SorCS1又は陰性対照ウイルスとしてのLacZ(ViraQuest Inc、アイオワ州ノースリバティ)を含む2E9pfuのアデノウイルスベクターを注入した。A)ウイルス処置後9日目の朝に、各マウスを、計量した飼料と共に代謝ケージに移動した。24時間後、マウスを通常のマウスケージに戻し、代謝ケージ内の飼料を計量して食物摂取を判定した。24時間の摂取食物の量を図4Dに示している。データは、各群の4匹のマウスの平均値±SEMである。可溶性SorCS1の過剰発現を有するマウスは、LacZを発現する対照マウスに比べ、食べる量が有意に低かった。B)ウイルス処置後0及び11日目の朝に、マウスの体重を秤で計測した。期間全体の相対的な体重変化を示している。データは、各群の4匹のマウスの平均値±SEMである。11日目に、可溶性SorCS1の過剰発現を有するdb/db雌マウスは、対照LacZウイルスを受け取ったマウスと比較して、体重の有意な減少を示した。結果を図4Bに示す。
【０２４７】
実施例4:肥満の治療用の可溶性SorCS1又はSorCS1ペプチドの投与
【０２４８】
IRとの結合が可能なマウスSorCS1ペプチド(群)の可溶性ドメインは、哺乳動物細胞培養において、組換え技術により大きな規模で発現させた後、例えば、免疫親和性クロマトグラフィーにより精製する。タンパク質又はペプチドは、腹膜、静脈内、筋肉内、又は皮下注入により、例えば重度の肥満を示す肥満動物モデル(ob/ob又はdb/dbマウスモデル)に対して、野生型基準マウスと並行して投与される(毎日又は毎週1mg乃至1g/kg体重)。良好な効果が得られ、ヒトSorCS1を用いて、同じ方法を肥満の患者に応用する。
【０２４９】
実施例5:肥満マウス由来の単離初代脂肪細胞における研究
【０２５０】
脂肪細胞の初代培養物を、肥満マウス(db/db又はob/ob)から単離し、可溶性SorCS1又は対照タンパク質(ウイルスとして、又は直接的にタンパク質として送達)により処理する。形態及びアディポカインの量を研究し、異なる細胞株における3H-グルコース摂取を試験する。研究は、インスリン受容体及びGLUT4(安定性、細胞内位置、ターンオーバ)、細胞内シグナルカスケード、及び脂肪細胞の初代培養物の分化について実施する。
【０２５１】
実施例6:ヒト脂肪組織におけるSorCS1の異なる変異体の発現
【０２５２】
SorCS1の多型及びスプライスバリアントの発現を、肥満及び/又は2型糖尿病のヒト由来の脂肪組織において定量PCRを用いて調べる。
【０２５３】
実施例7:SorCS1により処置した肥満マウスにおけるNMRIによる脂肪分布
【０２５４】
脂肪分布を、可溶性SorCS1又は対照タンパク質(ウイルスとして、又は直接的にタンパク質として送達)により処置した肥満マウスにおいて調査する。調査は、NMR画像化(例えば、デンマークのオーフス大学化学部にて利用可能なSiemens3 Tesla又は特注の7 Teslaスキャナ)を用いて実施する。
【０２５５】
実施例8:活性ポリペプチドの同定のためのスクリーニングアッセイ
【０２５６】
本アッセイは、これまでに試験した作用剤に類似する活性を有するSorCS1様作用剤を同定するために用いられる。こうしたSorCS1様作用剤には、限定では無いが、他のVps10p-D受容体であるソルチリン(配列番号52)、SorLA(配列番号53)、SorCS2(配列番号53)、及びSorCS3(配列番号54)が含まれる。
【０２５７】
ソルチリン、SorLA、SorCS2、及びSorCS3又は他のポリペプチドのフラグメント等、候補ポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを、NIH3T3-L1マウスの胚線維芽細胞にトランスフェクトする。前脂肪細胞である3T3-L1細胞は、0.5Mメチルイソブチルキサンチン、1μMデキサメタゾン、5μg/mlインスリン、及び10％ウシ胎仔血清の存在下で2日間培養すると、成熟脂肪細胞に分化する。細胞には、2日毎に添加物を全く含まない標準培地を約10日間に亘って供給する。その時点で、脂肪滴が位相差顕微鏡により視認可能となり、脂肪滴の量を測定及び定量し、脂肪沈着及び肥満の進行に対するペプチドの効果を確認する。更に、CCAAT/エンハンサ結合タンパク質(C/EBP)及びペルオキシソーム増殖因子活性化受容体(PPAR)等の異なる分化マーカに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、線維芽細胞の成熟脂肪細胞への分化に対する様々なペプチドの効果を測定する。
【０２５８】
実施例9:脂肪分布、食物摂取、及び体重変化に対する他のVps10pドメイン受容体の類似する効果の調査
【０２５９】
ソルチリン、SorLA、SorCS2、及びSorCS3のペプチドフラグメントの体重増加及び食物摂取に対する効果を調べるため、雌db/dbマウスに、ソルチリン/SorLA/SorCS2/SorCS3等の候補ポリペプチドの可溶性ペプチドフラグメント又は対照ウイルスとしてのLacZを発現するアデノウイルスを注入する(可溶性フラグメントを有するウイルスの生成については実施例2を参照)。詳しくは、6週齢のdb/db雌マウスの尾静脈に、上述したVPS10Pドメイン受容体フラグメント(実施例8において3T3-L1細胞に対する効果を有することが確認されたもの)又は陰性対照ウイルスとしてのLacZ(ViraQuest Inc、アイオワ州ノースリバティ)を含む2E9pfuのアデノウイルスベクターを注入する。ウイルス処置後9日目の朝に、各マウスを、計量した飼料と共に代謝ケージに移動する。24時間後、マウスを通常のマウスケージに戻し、代謝ケージ内の飼料を計量して食物摂取を判定する。ウイルス処置後0及び11日目の朝に、マウスの体重を秤で計測する。期間全体の相対的な体重変化を測定する。マウスの体内の脂肪分布は、実施例7に記載したようにNMRIを用いて判定し、候補ポリペプチドの薬物としての評価を行う。
【０２６０】
実施例10:可溶性SorCS1の過剰発現後の肥満DIO雄マウスにおける食物摂取及び体重の減少
【０２６１】
肥満マウスモデルにおける体重に対する可溶性SorCS1の効果を評価するために、食事性肥満(DIO)マウスモデル(TaconicからのC57BL/6J DIO)の15週齢雄マウスを用いた。これらのマウスには、60kcal％高脂肪食を6週齢から与えており、結果として、通常食のマウスと比較して肥満となっている。hsol.SorCS1又は対照としてのLacZを発現するアデノウイルスを注入し、体重に対する効果を調べた(ウイルスの詳細については実施例2を参照)。詳しくは、15週齢のDIO雄マウスの尾静脈にhsol.SorCS1又は陰性対照ウイルスとしてのLacZ(ViraQuest Inc、アイオワ州ノースリバティ)を含む2E9pfuのアデノウイルスベクターを注入した。A)ウイルス処置後10日目の朝に、ウイルス処置マウスの各群を、計量した飼料と共に代謝ケージに移動した。その後4日間、24時間毎に、ケージ内の飼料を計量して食物摂取を判定した。24時間に食べた飼料の量を、11及び14日目について示している。データは、各群の5匹毎の平均値±SEMである。可溶性SorCS1の過剰発現を有するマウスは、LacZを発現する対照マウスに比べ、食べる量が有意に低かった。結果を図5Aに示す。B)ウイルス処置後0、11、及び14日目の朝に、マウスの体重を秤で計測した。0日目と比較した期間全体での相対的な体重変化を示している。データは、各群の5匹毎の平均値±SEMである。11及び14日目に、可溶性SorCS1の過剰発現を有するDIO雌マウスは、対照LacZウイルスを受け取ったマウスと比較して、体重の有意な減少を示した。結果を図5Bに示す。
【０２６２】
実施例11:可溶性SorCS1の過剰発現後の肥満糖尿病ob/ob雌マウスにおける食物摂取及び体重の減少
【０２６３】
2型糖尿病を自然発症した肥満マウスモデルにおける可溶性SorCS1の体重に対する効果を評価するため、ob/obマウス株(Charles RiverからのB6.V-Lepob/J)を用いた。これらのマウスにはレプチンタンパク質が欠如しており、結果として、マウスは、肥満となり、インスリン抵抗性を生じ、最終的には8乃至10週齢で重度の糖尿病を発症する。hsol.SorCS1又は対照としてのLacZを発現するアデノウイルスを注入し、体重に対する効果を調べた(ウイルスの詳細については実施例2を参照)。詳しくは、8週齢のob/ob雌マウスの尾静脈にhsol.SorCS1又は陰性対照ウイルスとしてのLacZ(ViraQuest Inc、アイオワ州ノースリバティ)を含む2E9pfuのアデノウイルスベクターを注入した。A)ウイルス処置後9日目の朝に、各マウスを、計量した飼料と共に代謝ケージに移動した。24時間後、マウスを通常のマウスケージに戻し、代謝ケージ内の飼料を計量して食物摂取を判定した。24時間の摂取食物の量を示している。データは、各群の4匹のマウスの平均値±SEMである。可溶性SorCS1の過剰発現を有するマウスは、LacZを発現する対照マウスに比べ、食べる量が有意に低かった。結果を図6Aに示す。B)ウイルス処置後0及び10日目の朝に、マウスの体重を秤で計測した。期間全体の相対的な体重変化を示している。データは、各群の4匹のマウスの平均値±SEMである。10日目に、可溶性SorCS1の過剰発現を有するob/ob雌マウスは、対照LacZウイルスを受け取ったマウスと比較して、体重の有意な減少を示した。結果を図6Bに示す。
【０２６４】
実施例12:アデノウイルスによる可溶性SorCS1の過剰発現によるdb/dbマウス由来の脂肪組織におけるPRDM16及びPGC-1αの発現の増加
【０２６５】
6週齢のdb/db雌マウスに、可溶性SorCS1を過剰発現するアデノウイルス又は陰性対照としてのlacZを過剰発現する2E9PFU/マウスのアデノウイルスを注入した(ウイルスの詳細については実施例2を参照)。注入後14日目にマウスから生殖腺脂肪を採取し、定量RT-PCR(pPCR)を行い、特異的な肥満遺伝子CD137(ブライト脂肪組織マーカ)、PRDM16、及びPGC-1α(褐色脂肪組織マーカ)と、ハウスホールド遺伝子としてのGAPDHとの発現を判定した。詳しくは、hsol.SorCS1(n=5)又はlacZ(n=4)を注入したdb/dbの雌の脂肪から、Nucleospin RNA/proteinキット(Macherey-Nagel)を用いて、mRNAを単離する。cDNA逆転写キット(Applied Biosystems)を用いて、mRNAから第一鎖cDNAを合成し、その後、定量RT-PCRを、TaqMan遺伝子発現アッセイ(Applied Biosystems)として、CD137(Mm00441899_m1)、PRDM16(Mm00712556_m1)、PGC-1α(Mm01208835-mM)、GAPDH(Mm99999915_g1)用の特異的プライマー/プローブ(Applied Biosystems)により、Fluidigm Biomarkシステム(48.48チップ)を用いて実施した。発現解析は、デンマーク、オーフスのAROS Applied Biotechnologyが行った。アレイデータは、GAPDHデータを内部対照として解析して標本データを標準化し、AV-sol.SorCS1ウイルスを受け取ったdb/dbマウス由来の脂肪組織において、PRDM16及びPGC-1αのmRNAが、AV-lacZウイルスを受け取った対照db/dbマウスと比較して、2倍を越えて有意に(p<0.05)上方制御されたことが分かった。遺伝子発現の差の統計的有意性は、スチューデントのt検定(両側、2標本、等分散)により評価した。マウスにおける白色脂肪組織(WAT)から褐色脂肪組織(BAT)へ転換するプロセスには幾つかのタンパク質、例えば、PRDM16及びPGC-1αが関与している。PRDM16は、BATにおいて選択的に発現され、共受容体PGC-1αとの相互作用により、BAT特異的遺伝子発現を活性化し、WAT特異的遺伝子発現を抑制する。したがって、AV-sol.SorCS1を注入したdb/db雌マウス由来の脂肪組織におけるPRDM16及びPGC-1α両方での2倍の上方制御は、肝臓での可溶性SorCS1の過剰発現がWATからBATへの転換につながると共に、これが熱の産生増加をもたらし、最終的に体重増加の低下をもたらす可能性があることを示している。結果を図7に示す。
【０２６６】
実施例13:アデノ随伴ウイルスにより発現された可溶性SorCS1で処置した動物における通常食(ND)での体重増加の低下
【０２６７】
標準のマウスにおける体重増加に対する可溶性SorCS1の長期的効果を評価するため、C57BL6/j株(C57BL6/j bom tac)(各群につきn=5乃至6)を用いた。ヒト可溶性SorCS1(hsol.SorCS1)発現用の組換えアデノ随伴ウイルスを、ViraQuest(ViraQuest Inc、アイオワ州ノースリバティ)により次のように生成した。ヒト可溶性SorCS1 cDNA(アミノ酸1乃至1100)をコードするpVQAd5CMVK-NpA/hsol.SorCS1を、SaIIにより消化し、hsol.SorCS1をコードする3363bpフラグメントを、AAV8/hsol.SorCS1を生成するAAV8プラスミド(ViraQuest Inc、アイオワ州ノースリバティ)に挿入した。プラスミドpVQAd5CMVK-NpA/hsol.SorCS1は、ViraQuestに送られ、このシャトルプラスミドを用いて、hsol.SorCS1を過剰発現するアデノ随伴ウイルスのサブクローニング、生成、及び増殖(propagation)が行われた。陰性対照としてのLacZを過剰発現するウイルスAAV8/ntLacZも、ViraQuestから購入した。
【０２６８】
可溶性SorCS1(AAV8-hsol.SorCS1)又はLacZ(AAV8-LacZ)アデノ随伴ウイルスを、8週齢のマウスに静脈内注入した。注入したウイルスの力価は、1E11vgc/マウスとした(vgc=ウイルスゲノムコピー数)。48時間の隔離後、動物を通常の収容施設に戻し、全実験期間に亘って標準の食事を与えた。その後22週間、マウスを2週間毎に計量した。AAV8-hsol.SorCS1により処置したマウスは、追跡期間中、体重の増加が少ない。体重増加の減少は、対照(LacZ処置動物)と比較して32％となった。AAV8-hsol.SorCS1群及びAAV8-LacZ群における増量は、それぞれ3.62±0.14g及び5.32±0.50gでとなった。データは、平均値±SEMである。AAV-hsol.SorCS1ウイルスの体重増加に対する効果は、ウイルスの注入後、最長150日間持続する(p=0.0296、2元配置ANOVA、処置)。結果を図8に示す。
【０２６９】
実施例14:長期作用型SorCS1を生産する方法
【０２７０】
長期作用型SorCS1作用剤は、SorCS1のヒト血清アルブミン又はヒト血清アルブミンの変異体に対する化学的結合により生産し得る。
【０２７１】
化学的結合は、当該技術分野において公知の多数の異なる反応及びリンカーを用いて実施可能であり、リンカーには、高い共有結合安定性を有するリンカー及び典型的には弱い化学結合の加水分解によりアルブミン分子から活性成分を放出させる可能性を有する低い共有結合安定性を有するリンカーが含まれる。
【０２７２】
特に適切なものは、アルブミンをSorCS1とのヒドラゾン連結を介してSorCS1に連結する方法により、アルブミン分子上の遊離システイン残基(Cys34)に結合することである。例えば、WO2010092135に記載の方法、特に、PDPH(3-(2-ピリジルジチオ)プロピオニルヒドラジド)を用いて行う。他の態様では、EMCH((3,3’-N-(ε-マレイミドカプロン酸)ヒドラジド)を用いて、アルブミンをSorCS1とのヒドラゾン連結を介してSorCS1に連結するWO2010092135の方法が用いられる。
【０２７３】
SorCS1分子上の適切な付着基には、SorCS1分子のグリコシル化成分と結合するための反応が含まれる。グリコシル化成分との結合が好ましいのは、SorCS1受容体との直接的な相互作用を有しておらず、結合が機能に干渉しないことが予想されるためである。
【０２７４】
更に他の結合手法は、酵素による複合糖質化を用いて、Neoseにより説明されている(例えば、US2004/0126838を参照)。この手法では、適切なリンカーを用いて、例えば、アルブミンをSorCS1に連結することができる。
【０２７５】
SorCS1分子との化学的結合が機能活性を強く減少させる特殊な場合には、機能性SorCS1を放出可能な不安定なリンカーを用いることが好ましい。SorCS1分子1個当たりアルブミン分子を1個のみ付着させることが好ましい。
【０２７６】
他の例において、SorCS1及びアルブミン分子の結合は、2分子の遺伝的融合により行うことができる。2種類の配向性の可能性がある。
NH2-アルブミン-SorCS1-COOH
NH2-SorCS1-アルブミン-COOH
【０２７７】
アルブミン又はアルブミン変異体は、WO2010092135に記載の通りに生産することができる。
【０２７８】
SorCS1及びアルブミンは、WO2010092135に記載の通り、PDPH又はEMCHの化学的性質を用いて結合させることができる。
【０２７９】
長期作用型SorCS1の生物作用能は、確立されたインビボアッセイを用いて判定する。長期作用型SorCS1化合物の生物学的利用能及び動態を考慮すると、マウスにおける効果を測定する方法は、食物摂取量(g/日/マウス)、食嗜好試験、及び体重変化(マウスの毎週の計量)の測定、及び毎週のMRIスキャン(脂肪及び除脂肪体重)となる。
【０２８０】
更に、長期作用型SorCS1のインビトロ生物学的活性は、標準的な細胞アッセイを用いて判定する。細胞培養(例えば、3T3、初代肥満細胞、又はHEK293細胞)において、長期作用型SorCS1を、培地に添加し、細胞の溶解物において、a)インスリン受容体、b)リン酸化インスリン受容体(活性型)、及びc)GLUT4(細胞内でのグルコース流入を促進)の発現と、d)ビオチン化試験におけるGLUT4の局在化(細胞膜又は小胞性)とを判定する。脂肪細胞(3T3又は初代脂肪細胞)において、更に、長期作用型SorCS1の添加後の白色脂肪組織(WAT)から褐色脂肪組織(BAT)への遷移に関連するタンパク質を測定する。測定対象の関連タンパク質は、UCP1、PRDM16、及びPGC-αにすることができる。
【０２８１】
全てのアッセイについて、長期作用型SorCS1の生物学的活性を、国立生物学的製剤研究所(National Institute of Biological Standards and Controls、NIBSC、イギリス、ハートフォードシャ)の適切な基準を用いて組換えSorCS1と比較する。
【０２８２】
特定の組成物におけるSorCS1タンパク質の量は、ELISAアッセイ又はRIAアッセイ等の標準の免疫学的手法を用いて判定し、ウェスタンブロッティングと、ブラッドフォード及び/又はローリー法を用いた総タンパク質含有量の測定とにより特徴付ける。
【０２８３】
実施例15:PEGのSorCS1との共有結合
【０２８４】
SorCS1及びその変異体は、後述の通り(「溶液中のSorCS1のPEG化」)、限定では無いが、SPA-PEG5000、SPA-PEG12000、及びSPA-PEG20000(NOF Corporation)等の任意の適切なポリエチレン(PEG)分子に共有結合で連結させ得る。
【０２８５】
溶液中のSorCS1のPEG化
【０２８６】
ヒトSorCS1は、50mMリン酸ナトリウム、100mM NaCl、pH8.5において、250μg/mlの濃度でPEG化される。PEGのモル過剰は、タンパク質のPEG化部位に対して5乃至100倍となる。反応混合物は、37℃、1200rpmで30分間サーモミキサに入れる。30分後、モル過剰のグリシンを添加することにより、反応を停止させる。
【０２８７】
陽イオン交換クロマトグラフィーを応用して、過剰なPEG、グリシン、及び他の副産物を反応混合物から除去する。PEG化反応混合物は、pH2.5の20mMクエン酸ナトリウムにより、イオン強度が7mS/cm未満となるまで希釈する。pHは、5N HClを用いて、2.5に調節する。混合物は、pH2.5の30mMクエン酸ナトリウムにより平衡化したSPセファロースFFカラムに付与する。非結合材料は、4カラム体積の平衡緩衝液によりカラムから洗い落とす。PEG化タンパク質は、20mMクエン酸ナトリウム、750mM塩化ナトリウムを添加することにより、3カラム体積中に溶出させる。純粋なPEG化SorCS1を濃縮し、VivaSpin濃縮デバイスを用いて、分画分子量(MWCO):10kDaで、緩衝液交換を行う。
【０２８８】
参考文献
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20. WO 2004/022719 (Attie et al.)
【０２８９】
配列の概要
配列番号1:ホモサピエンスpreproSorCS1b(Isoform1)
配列番号2:ホモサピエンスpreproSorCS1(Isoform2)
配列番号3:ホモサピエンスpreproSorCS1c(Isoform3)
配列番号4:ホモサピエンスpreproSorCS1a(Isoform4)
配列番号5:可溶性ホモサピエンスpreproSorCS1
配列番号6:ホモサピエンスproSorCS1b(Isoform1)
配列番号7:ホモサピエンスproSorCS1(Isoform2)
配列番号8:ホモサピエンスproSorCS1c(Isoform3)
配列番号9:ホモサピエンスproSorCS1a(Isoform4)
配列番号10:可溶性ホモサピエンスproSorCS1
配列番号11:ホモサピエンス成熟SorCS1b(Isoform1)
配列番号12:ホモサピエンス成熟SorCS1(Isoform2)
配列番号13:ホモサピエンス成熟SorCS1c(Isoform3)
配列番号14:ホモサピエンス成熟SorCS1a(Isoform4)
配列番号15:可溶性ホモサピエンス成熟SorCS1
配列番号16:マウスpreproSorCS1b(Isoform1)
配列番号17:マウスpreproSorCS1a(Isoform2)
配列番号18:マウスpreproSorCS1c(Isoform3)
配列番号19:マウスpreproSorCS1c+(Isoform4)
配列番号20:マウスpreproSorCS1d
配列番号21:可溶性マウスpreproSorCS1
配列番号22:マウスproSorCS1b(Isoform1)
配列番号23:マウスproSorCS1a(Isoform2)
配列番号24:マウスproSorCS1c(Isoform3)
配列番号25:マウスproSorCS1c+(Isoform4)
配列番号26:マウスproSorCS1d
配列番号27:可溶性マウスproSorCS1
配列番号28:マウス成熟SorCS1b(Isoform1)
配列番号29:マウス成熟SorCS1a(Isoform2)
配列番号30:マウス成熟SorCS1c(Isoform3)
配列番号31:マウス成熟SorCS1c+(Isoform4)
配列番号32:マウス成熟SorCS1d
配列番号33:可溶性マウス成熟SorCS1
配列番号34:チンパンジpreproSorCS1
配列番号35:チンパンジproSorCS1
配列番号36:チンパンジ成熟SorCS1
配列番号37:チンパンジ可溶性SorCS1
配列番号38:イヌ成熟SorCS1
配列番号39:イヌ可溶性SorCS1
配列番号40:ウシpreproSorCS1
配列番号41:ウシproSorCS1
配列番号42:ウシ成熟SorCS1
配列番号43:ウシ可溶性SorCS1
配列番号44:ラットpreproSorSC1
配列番号45:ラットproSorCS1
配列番号46:ラット成熟SorCS1
配列番号47:ラット可溶性SorCS1
配列番号48:ニワトリpreproSorCS1
配列番号49:ニワトリproSorCS1
配列番号50:ニワトリ成熟SorCS1
配列番号51:ニワトリ可溶性SorCS1
配列番号52:ホモサピエンスpreproソルチリン
配列番号53:ホモサピエンスpreproSorLA
配列番号54:ホモサピエンスpreproSorCS2
配列番号55:ホモサピエンスpreproSorCS3
配列番号56:ホモサピエンスproSorCS3
配列番号57:ホモサピエンス成熟SorCS3
配列番号58:ホモサピエンス可溶性preproSorCS3
配列番号59:ホモサピエンス可溶性proSorCS3
配列番号60:ホモサピエンス可溶性成熟SorCS3
配列番号61:ホモサピエンスproSorCS1B変異体
配列番号62:ホモサピエンス可溶性proSorCS1B変異体
配列番号63:ホモサピエンス成熟SorCS1B変異体
配列番号64:ホモサピエンス可溶性成熟SorCS1B変異体
配列番号65:リンカー-SGGSGGS
配列番号66:リンカー-GGSGGSGGSGGSGGG
配列番号67:リンカー-GGSGGSGGSGGSGGSGGS
配列番号68:リンカー-GGGGSGGGGSGGGGS
配列番号69:リンカー-EFAGAAAV
【符号の説明】
【０２９０】
[図1]
Alignment of the SorCS1 protein from different species: 様々な種に由来するSorCS1タンパク質のアライメント
Sequence: 配列
Human: ヒト
Chimpanzee: チンパンジ
Cow: ウシ
Mouse: マウス
Rat: ラット
Dog: イヌ
Chicken: ニワトリ
[図2A]
Insulin signalling: インスリンシグナル伝達
adipose tissue SorCS1 KO: 脂肪組織SorCS1ノックアウト
wild type: 野生型
Gene: 遺伝子
Fold regulation: 制御倍数
p-value: p値
Function: 機能
A transcriptional repressor with carboxypeptidase activity. Binds promotor of adipose P2 gene.: カルボキシペプチダーゼ活性を有する転写抑制因子。肥満細胞P2遺伝子のプロモータに結合。
A member of the IRS family. Function as a scaffolding protein that recruits signalling molecules (ras-GTP, Nck): IRSファミリーの一員。シグナル伝達分子(ras-GTP、Nck)をリクルートする足場タンパク質として機能。
Binds IGF with high affinity. Has tyrosine kinase activity. Plays a critical role in transformation events.: IGF1に高親和性で結合。チロシンキナーゼ活性を有する。形質転換イベントにおいて重要な役割を果たす。
A cytoplasmic signaling molecule that mediates effects of insulin, insulin-like growth factor 1, and other cytokines by acting as a molecular adaptor between diverse receptor tyrosine kinases and downstream effectors.: 様々な受容体チロシンキナーゼと下流エフェクターとの間の分子アダプタとして作用することによりインスリン、インスリン様成長因子1、及び他のサイトカインの効果を仲介する細胞質シグナル伝達分子。
PI3k phosphorylate the inositol ring in inositol lipids. Is a participant in signaling pathways regulating cell growth.: PI3kは、イノシトール脂質内のイノシトール環をリン酸化する。細胞増殖を制御するシグナル経路に関与。
Play a role in heat production by uncoupling oxidative phosphorylation from the respiratory chain.: 呼吸鎖からの酸化的リン酸化の脱共役による熱産生において役割を果たす。
[図2B]
Gene: 遺伝子
Fold reg.: 制御倍数
p-value: p値
Function: 機能
Aldo-keto reductase family 1, member D1: アルド・ケト還元酵素ファミリー1, メンバーD1
collectin sub-family member 12: コレクチンサブファミリーメンバー12
7-dehydrocholesterol reductase: 7-デヒドロコレステロール還元酵素
3-hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzyme A synthase 2: 3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-CoA合成酵素2
Lecithin cholesterol acyltransferase: レシチン・コレステロールアシル基転移酵素
Low density protein receptor: 低密度タンパク質受容体
mevalonate (diphospho) decarboxylase: メバロン酸(ジホスホ) デカルボキシラーゼ
Nuclear receptor subfamily 1, member 4: 核内受容体サブファミリー, メンバー4
Oxysterol binding protein-like 5: オキシステロール結合タンパク質様5
Protein kinase, AMP-activated, gamma 2 non-catalytic: プロテインキナーゼ, AMP活性化, ガンマ2非触媒性
Sterol O-acyltransferase 1: ステロールO-アシルトランスフェラーゼ
very low density lipoprotein receptor: 超低密度リポタンパク質受容体
Catalysis of the 5-beta-reduction of bile acid intermediates and steroid hormones.: 胆汁酸中間体及びステロイドホルモンの5-β-還元の触媒作用
A scavenger receptor binding to carbohydrate antigens on microorganisms and oxidized phospholipids of oxidatively damaged or apoptotic cells.: 微生物の炭水化物抗原及び酸化的損傷又はアポトーシス細胞の酸化リン脂質に結合するスカベンジャ受容体
A penultimate enzyme of sterol biosynthesis that converts 7-dehydro cholesterol to cholesterol: 7-デヒドロコレステロールをコレステロールに転換するステロール生合成の最後から2番目の酵素
Mediates the first reaction in ketogenesis, a metabokic pathway that provides lipid-derived energy during carbohydrate deprivation: 炭水化物欠乏中の脂質由来エネルギーを提供する代謝経路であるケトン体生成における第1の反応を仲介
An extracellular cholesterol esterifying enzyme. The esterification of cholesterol is required for cholesterol transport.: 細胞外コレステロールエステル化酵素。コレステロールのエステル化は、コレステロール輸送に必要となる。
A cell surface protein involved in receptor mediated endocytosis of specific ligands e.g. LDL: 特異的リガンド、例えばLDL、の受容体仲介エンドサイトーシスに関与する細胞表面タンパク質
Catalyzes the conversion of mevalonate pyrophosphate into isopentyl pyrophosphate - one of the early step in cholesterol biosynthesis: コレステロール生合成の初期ステップの1つであるメバロン酸ピロリン酸塩のイソペンチルピロリン酸塩への転換を触媒
Regulates the expression of various transport proteins and biosynthetic enzymes crucial to the physiological maintenance of cholesterol and bile acid homeostasis.: コレステロール及び胆汁酸恒常性の生理学的維持に重要な様々な輸送タンパク質と生合成酵素の発現を調節
An intracellular lipid receptor - a member of the oxysterol-binding protein family.: 細胞内脂質受容体、オキシステロール結合タンパク質ファミリーの一員
Subunit of AMPK an important energy-sensing enzyme that monitors cellular energy status and functions by inactivating key enzymes involved in regulating de novo biosynthesis of fatty acid and cholesterol: AMPKのサブユニット。脂肪酸及びコレステロールのデノボ生合成の調節に関与する主要な酵素を不活性化することにより、細胞のエネルギー状態及び機能を監視する重要なエネルギー検出酵素である。
Forms cholesterol esters from cholesterol. Accumulation of cholesterol esters as cytoplasmic lipid droplets is a characteristic feature of early stages of atherosclerotic plaques: コレステロールからコレステロールエステルを形成。コレステロールエステルの細胞質脂肪滴としての蓄積は、アテローム性動脈硬化のプラークの初期段階における特性である。
Mediates cholesterol uptake possible in collaboration with ldl: ldlとの連携で可能となるコレステロール取り込みを仲介
[図3]
weight gain, fold increase: 体重増加、増加倍数
Virus days: ウイルス日数
[図4]
Food intake, g/mouse: 食物摂取、g/マウス
virus: ウイルス
Relative weight: 相対重量
[図5]
Food intake pr mouse (in g) pr day: 1日の1マウス当たりの食物摂取(単位g)
Food intake (g/g BW/day): 食物摂取(g/g体重/日)
Day (post injection): 日数(注入後)
Weight gain in DIO mice: DIOマウスの体重増加
ΔWeight (g): Δ重量(g)
[図6]
Food intake Ob/ob mice: 食物摂取、ob/obマウス
Food intake (g/g BW/day): 食物摂取(g/g体重/日)
Virus: ウイルス
Weight gain in Ob/ob mice: ob/obマウスの体重増加
ΔWight (g): Δ重量(g)
[図7]
Sor CS ectodomain increases brown adipose tissue content in Db/Db mice: SorCS1外部ドメインはdb/dbマウスにおける褐色脂肪組織含有量を増加させる
Expression (%): 発現(％)
[図8]
Fold change in weight: 体重の変化倍数
Fold weight change: 体重変化倍数
Days post injection: 注入後日数
Weight gain: 体重増加
【図１−１】
2015514726.tif 000004
【図１−２】
2015514726.tif 000005
【図１−３】
2015514726.tif 000006
【図１−４】
2015514726.tif 000007
【図１−５】
2015514726.tif 000008
【図１−６】
2015514726.tif 000009
【図１−７】
2015514726.tif 000010
【図１−８】
2015514726.tif 000011
【図２Ａ】
2015514726.tif 000012
【図２Ｂ】
2015514726.tif 000013
【図３】
2015514726.tif 000014
【図４】
2015514726.tif 000015
【図５】
2015514726.tif 000016
【図６】
2015514726.tif 000017
【図７】
2015514726.tif 000018
【図８】
2015514726.tif 000019
【配列表】
2015514726000001.app
【国際調査報告】
2015514726.tif 000020
2015514726.tif 000021
2015514726.tif 000022
2015514726.tif 000023
2015514726.tif 000024