(57)【要約】Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質が神経潜在性を有する細胞の集団に供給され、細胞ストレスが細胞の集団の間に誘導され、神経前駆細胞が産生されるまで生存細胞が培養される、神経前駆細胞を産生する方法が提供される。Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質が神経潜在性を有する細胞の集団に供給され、細胞ストレスが細胞の集団の間に誘導され、神経前駆細胞が産生されるまで生存細胞が培養される、治療用途のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を適応させる方法も提供される。本方法は、神経系細胞が産生されるまで神経前駆細胞を培養するステップ、および神経前駆細胞または神経系細胞を患者への投与のために好適な組成物中に配合するステップを場合により追加的に含んでもよい。本発明は、これらの方法によって産生される細胞も提供する。方法は、幹細胞、詳細にはｉＰＳＣに対して実施することができる。細胞および方法は、層別化医療を含む応用において有用性を有する。
2015536143.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経前駆細胞を産生する方法であって、
・  神経潜在性を有する細胞の集団にＥ−カドヘリン活性の阻害物質を供給するステップ；
・  細胞の集団の間に細胞ストレスを誘導するステップ；および
神経前駆細胞が産生されるまで生存細胞を培養するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
治療用途のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を適応させる方法であって、
・  神経潜在性を有する細胞の集団にＥ−カドヘリン活性の阻害物質を供給するステップ；
・  細胞の集団の間に細胞ストレスを誘導するステップ；
・  神経前駆細胞が産生されるまで生存細胞を培養するステップ；
・  場合により、神経系細胞が産生されるまで神経前駆細胞を培養するステップ；および
神経前駆細胞または神経系細胞を患者への投与のために好適な組成物中に配合するステップ
を含む方法。
【請求項３】
神経潜在性を有する細胞が幹細胞である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
幹細胞が、複能性細胞；全能性細胞；および多能性細胞からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
幹細胞が、胚性幹細胞；臍帯血幹細胞；間葉幹細胞；および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
幹細胞がヒト胚の破壊を必要とせずに産生されるヒト胚性幹細胞株の細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質がＥ−カドヘリン活性の外来性阻害物質である、請求項１〜６の何れか一項に記載の方法。
【請求項８】
Ｅ−カドヘリン活性の外来性阻害物質が細胞培養培地に供給される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質がペプチドＳＷＥＬＹＹＰＬＲＡＮＬ（配列番号１）およびペプチドＳＷＥＬＹＹＰＬ（配列番号２６）からなる群から選択される、請求項１〜８の何れか一項に記載の方法。
【請求項１０】
Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質がペプチドＳＷＥＬＹＹＰＬＲＡＮＬ（配列番号１）、またはペプチドＳＷＥＬＹＹＰＬ（配列番号２６）を含む、請求項１〜９の何れか一項に記載の方法。
【請求項１１】
Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質が、Ｅ−カドヘリン中和抗体；Ｅ−カドヘリンＨＡＶドメインの阻害物質；トリプトファン２結合部位の阻害物質；Ｅ−カドヘリン中和アプタマー；Ｅ−カドヘリンを阻害するＲＮＡｉ分子；Ｓlｕｇ；Ｓｎａｉｌ；ＳＩＰ１；Ｅ２Ａ；Ｔｒｐ１５６を含むペプチド；およびアミノ酸配列ＣＨＡＶＣ（配列番号３）を含むペプチドからなる群から選択される、請求項１〜１０の何れか一項に記載の方法。
【請求項１２】
Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質がＥ−カドヘリン活性の内在性阻害物質である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質が、Ｅ−カドヘリン中和抗体；Ｅ−カドヘリンＨＡＶドメインの阻害物質；トリプトファン２結合部位の阻害物質；およびアミノ酸配列ＣＨＡＶＣ（配列番号３）を含むペプチドからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｅ−カドヘリン中和抗体がＳＨＥ７８．７である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質が細胞ストレスの誘導より前に細胞に供給される、請求項１〜１４の何れか一項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質が細胞ストレスの誘導と同時に細胞に供給される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
生理学的ストレスを誘導する手段が、培養細胞に有益である薬剤の使用中止；細胞の集団が曝される温度の上昇；細胞の集団が増殖する培地のｐＨの上昇または低下；および細胞の集団への細胞傷害性薬剤の供給からなる群から選択される、請求項１〜１６の何れか一項に記載の方法。
【請求項１８】
細胞ストレスが、細胞集団に供給される血清を培地から取り除くことによって誘導される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞ストレスが、細胞の集団の間で細胞死を引き起こす、請求項１〜１８の何れか一項に記載の方法。
【請求項２０】
産生された神経前駆細胞がネスチンを発現する、請求項１〜１９の何れか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１から２０の何れか一項に記載の方法によって産生される、神経前駆細胞。
【請求項２２】
請求項１から２０の何れか一項に記載の方法において神経前駆細胞を産生するステップ、および神経系細胞が産生されるまで神経前駆細胞をさらに培養するステップを含む、神経系細胞を産生する方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法によって産生される、神経系細胞。
【請求項２４】
請求項１から２０の何れか一項に記載の方法において神経前駆細胞を産生するステップ、およびグリア細胞が産生されるまで神経前駆細胞をさらに培養するステップを含む、グリア細胞を産生する方法。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法によって産生される、グリア細胞。
【請求項２６】
請求項１から１８の何れか一項に記載の方法において神経前駆細胞を産生するステップ、および神経細胞が産生されるまで神経前駆細胞をさらに培養するステップを含む、神経細胞を産生する方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法によって産生される、神経細胞。
【請求項２８】
・  Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質；
・  血清不含細胞培地；および
・  血清または血清代替組成物
を含む、キット。
【請求項２９】
Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質が請求項９から１３の何れかで言及したものである、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
およそ４５０μＭからおよそ１．１ｍＭの間の濃度でＥ−カドヘリン活性の阻害物質を含む、細胞培養培地。
【請求項３１】
Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質がペプチドＳＷＥＬＹＹＰＬＲＡＮＬ（配列番号１）を含む、請求項３０に記載の細胞培養培地。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経前駆細胞および／または神経系細胞を産生する方法に関する。本発明は、そのような方法によって産生された細胞、ならびに本発明の方法における使用のために好適なキットおよび細胞培養培地にも関する。方法、細胞、キットおよび細胞培養培地は、層別化医療の開発および実行を含む応用範囲を有する。
【背景技術】
【０００２】
導入
特異的細胞型の再現性があり、費用対効果が高く、測定可能な産生は、薬物の効果および毒性検査のための信頼できるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイから細胞療法までの幅広い応用に影響を与えることができる。この様式で神経前駆細胞および／または神経系細胞を産生する能力は、アルツハイマー病またはパーキンソン病などの疾患および神経系損傷を含む神経系に悪影響を及ぼす状態に関するアッセイ、検査および療法などを利用可能にする可能性を開くことができる。
【０００３】
所望の細胞型が多能性幹細胞の分化によって産生される現在のプロトコールは、複雑で高価な増殖因子カクテルを利用する。本発明者らは、外来性増殖因子の非存在下でＥＳ細胞の分化を神経系列に方向付ける新規工程を開発し、測定可能、高効率、費用対効果が高く、再現可能な方法を提供する。
【０００４】
カドヘリンは、カルシウム依存性細胞接着に関与する膜内在性タンパク質のファミリーである。Ｅ−カドヘリンは、上皮とそれが会合するためにそのように称されている。古典的カドヘリンは、およそ６００アミノ酸残基の細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび１５０アミノ酸残基の細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、カルシウムイオン結合に関連すると考えられている４個の反復配列を含む。Ｅ−カドヘリンをコードする遺伝子は、ｃｄｈ１として周知である。
【０００５】
ヒトＥ−カドヘリンのアミノ酸配列は、配列番号４に記載されており、このタンパク質をコードしているＤＮＡの配列は配列番号２３に記載されている。マウスＥ−カドヘリンのアミノ酸配列は、配列番号２４に記載されており、このタンパク質をコードしているＤＮＡの配列は配列番号２５に記載されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｊ  ｌｍｍｕｎｏｌ．２００５  Ｊｕｌ  １５；１７５（２）：１０１４〜２１
【非特許文献２】Ｄｅｖｅｍｙ  ＆  Ｂｌａｓｈｕｋ（２００９）
【非特許文献３】Ｍｏｈａｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ、２０１０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
外来性増殖因子の非存在下で神経前駆細胞および／または神経系細胞の産生のために使用できる方法、キットおよび細胞培養培地に対する必要性がある。そのような方法、キット、または培養培地は、先行技術の方法と比較して測定可能および／または高効率な、および／または費用対効果の高いおよび／または再現性がある産生経路を提供することにおいて有益である可能性がある。
【０００８】
先行技術の方法を使用して産生できる細胞の集団よりもさらに純粋である神経前駆細胞を産生する方法を提供することは、本発明の少なくともいくつかの態様の目的である。先行技術の方法でなされるよりも高い程度の再現性を有する神経前駆細胞を産生する方法を提供することは、本発明の少なくともいくつかの態様の目的である。先行技術の方法よりも簡単である神経前駆細胞を産生する方法を提供することは、本発明の少なくともいくつかの態様の目的である。先行技術の方法よりも費用対効果が高い神経前駆細胞を産生する方法を提供することは、本発明の少なくともいくつかの態様の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様では、神経前駆細胞を産生する方法が提供され、方法は、
・  神経潜在性（ｎｅｕｒａｌ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）を有する細胞の集団にＥ−カドヘリン活性の阻害物質を供給するステップ；
・  細胞の集団の間に生理学的ストレスを誘導するステップ；および
神経前駆細胞が産生されるまで生存細胞を培養するステップ
を含む。
【００１０】
細胞に誘導されるストレスは、集団の間で細胞死を引き起こすのに十分であってよい。
【００１１】
本発明者らは、Ｅ−カドヘリン活性が阻害されている細胞の集団内でストレスまたは細胞死を誘導し、次いで培養物中の生存細胞の数を増やすことによって、それらが神経前駆細胞を高い割合で含む細胞集団を産生できることを驚くべきことに見出した。所望の型の細胞を得ることを目的として培養される細胞の集団に、培養細胞の間に細胞死を誘導する点まで意図的にストレスを与えることが反直感的であることは理解される。この様式でストレスまたは細胞死を誘導することは、残った細胞の性質に有益な効果を有するとのいかなる期待もなく、望ましくなく全細胞数を低減することが予測される。
【００１２】
本明細書の他所により詳細に記載される実験結果は、神経前駆細胞および／または神経系細胞が全細胞数の９５％以上を占める細胞の集団を産生する本発明の方法を記載する。これらの割合は、同等の対照技術を使用して産生されるものよりも顕著に高い。
【００１３】
本発明の方法は、代替法によって産生されたものと比較して高い純度を有する神経前駆細胞および／または神経系細胞の集団を生じることができる。好適な実施形態では、本発明の方法は、神経前駆細胞を少なくとも７０％、神経前駆細胞を少なくとも７５％、神経前駆細胞を少なくとも８０％以上含む集団を生じさせることができる。例として、好適な実施形態では、本発明の方法は、神経前駆細胞を少なくとも８５％、神経前駆細胞を少なくとも９０％以上を含む集団を生じさせることができる。特定の実施形態では本発明の方法は、神経前駆細胞を少なくとも９１％、神経前駆細胞を少なくとも９２％、神経前駆細胞を少なくとも９３％、神経前駆細胞を少なくとも９４％、神経前駆細胞を少なくとも９５％、神経前駆細胞を少なくとも９６％、神経前駆細胞を少なくとも９７％、神経前駆細胞を少なくとも９８％または神経前駆細胞を少なくとも９９％含む集団を生じさせることができる。特定の実施形態では、本発明の方法は、神経前駆細胞の実質的に純粋な集団を生じさせることができる。
【００１４】
そのような集団のこれらの純度は、同等の方法または先行技術の方法を使用して達成できるものよりも相当に高い。例として、同じ生理学的ストレスが細胞に適用されるが、Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質が省かれている同等の方法は、最大で神経前駆細胞を７０％含む集団を生じる。先行技術において記載された最も有効な方法は、最大で神経前駆細胞を９０％含む集団を生じる。
【００１５】
本発明の方法は、得ることができる細胞集団の純度の改善に加えて多数の他の有利点も提示する。本発明の方法は、現在利用できる多数の方法よりも簡単である。多数の先行技術の方法は、懸濁培養を含む３つまたは４つの別々のステップを含むプロトコールを利用する。対照的に本発明の方法は、接着培養を利用し、単純な培地補充および外来性シグナルの除去が生理学的ストレスを与える実施形態による単一ステッププロトコールで実行できる。
【００１６】
さらに本発明の方法は、高度に再現性があり、分化を制御するために外来性増殖因子の使用に主に依存する先行技術の方法によって提示されるものを越える顕著な利益を提供する。そのような増殖因子はバッチ間でしばしば大きな変動を示すことから、他の可変物が適切に制御されている場合でさえも、それらが生じさせる細胞集団において顕著な変動がある場合がある。
【００１７】
本発明の方法によって提示されるさらなる有利点は、多数の先行技術よりもさらに安価に実行に移すことができることである。例えば本発明の方法は、高価な外来性増殖因子の使用を必要とする技術よりも安価に実行できる。
【００１８】
いかなる仮説にも束縛されることなく本発明者らは、本発明の方法が多数のさまざまな種類の動物由来の細胞において有効である一方で、それらはその作用を異なる動物において異なる手段によって生じさせる場合があると考える。
【００１９】
ヒト細胞および細胞培養からの神経前駆細胞および／または神経系細胞の産生の場合には、本発明者らは生理学的ストレスの誘導は生存している細胞の分化を誘導するが、Ｅ−カドヘリン阻害物質の存在は大部分の細胞系列について分化を遅延させ、しかし驚くべきことに神経前駆細胞への分化は遅延させず、それによりこれらの細胞の産生を引き起こすと考える。
【００２０】
対照的にネズミ細胞の場合には、本発明者らはＥ−カドヘリン阻害が神経前駆細胞を次いで生じる細胞亜集団を保護すると考える。細胞死を誘導することによってこの亜集団のもの以外の細胞が実質的に除去され、それにより高純度の神経前駆細胞集団をもたらしている。この様式でのネズミ細胞集団における神経前駆細胞の生成は、具体的には本発明の方法が懸濁培養で増殖された細胞に適用される場合に生じる。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明の方法は、神経系細胞が産生されるまで神経前駆細胞を培養するさらなるステップを場合により含んでよい。したがって、本発明は、神経系細胞を産生する方法も提供できる。そのような実施形態は、神経前駆細胞の神経系細胞への分化を支持する培養条件、および本明細書の他所にさらに詳細に記載されるそのような条件を利用できる。
【００２２】
代替的実施形態では、本発明の方法は、オリゴデンドロサイトまたは星状細胞などのグリア細胞が産生されるまで神経前駆細胞を培養するステップを場合によりさらに含むことができる。したがって、本発明は、グリア細胞（オリゴデンドロサイトまたは星状細胞など）を産生する方法も提供できる。この種類の実施形態は、神経前駆細胞のグリア細胞への分化を支持する培養条件を利用でき、オリゴデンドロサイトまたは星状細胞への分化を支持するために使用できるそのような条件の好適な例は、本明細書の他所により詳細に記載される。
【００２３】
下により詳細に示されるとおり幹細胞は、本発明の方法において使用できる神経潜在性を有する細胞の例である。
【００２４】
他の選択肢を除外することなく、Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質はＥ−カドヘリン活性の外来性阻害物質であってよい。好適には、例えばＥ−カドヘリン活性の阻害物質が外来性阻害物質である実施形態では、阻害物質は培養培地に供給されてよい。Ｅ−カドヘリン活性の好適な阻害物質に関するさらなる詳細は、明細書の他所に示される。
【００２５】
本発明の方法を実行する際に、生理学的ストレスが細胞の間に誘導される時点で細胞はＥ−カドヘリン活性の阻害に供されるべきである。これは、例えばストレスの誘導の前または同時のＥ−カドヘリン活性の阻害物質の供給によって達成できる。
【００２６】
細胞集団において生理学的ストレス、および細胞死の可能性を誘導する大部分の方法は、即効性の結果を達成しないことは理解される。したがって本発明の方法は、生理学的ストレスを誘導する好適な手段がＥ−カドヘリン活性の阻害物質の供給と同時に細胞の集団に提供される場合に有効なままであってよい。そのような実施形態は、生理学的ストレスが生じるより先に阻害物質が少なくともいくらかの阻害を発揮するという条件でまだ有効であると証明できる。代替的にストレスは、Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質の供給に続いて細胞の集団において誘導されてよい。
【００２７】
ヒト細胞について方法が実行される場合、細胞の間に生理学的ストレスが誘導された後の少なくとも最初の５、６または好ましくは７日間Ｅ−カドヘリン活性を阻害することは非常に望ましいと本発明者らは考える。
【００２８】
細胞死の誘導を利用する実施形態は、培養細胞の８５％までの死を誘導することを含む場合がある。死んだ細胞の割合が本発明の方法の実行の際に経時的に増加する場合があることは理解される。単なる例として、本発明の方法の１日目に細胞集団のおよそ２％の死が誘導される場合がある。本発明の方法の３日目までに、細胞集団のおよそ２３％の死が誘導される場合がある。本発明の方法の６日目までに、細胞集団のおよそ６９％の死が誘導される場合がある。本発明の方法の９日目までに、細胞集団のおよそ７９％の死が誘導される場合がある。本発明の方法の１２日目までに、細胞集団のおよそ８１％の死が誘導される場合がある。本発明の方法の１５日目までに細胞集団のおよそ８５％の死が誘導される場合がある。上記の値は、ネズミ細胞に関して実行された本発明の方法に関して特に適切であってよい。
【００２９】
生理学的ストレス、および場合により細胞死は、培養細胞の集団において多数の好適なさまざまな手段によって誘導できる。例えば、生理学的ストレス、および場合により細胞死は、有益な培地補充物の使用中止（取り除くこと）など培養細胞に有益である薬剤を使用中止（取り除くこと）によって細胞の集団の間で誘導される場合がある。例えば、生理学的ストレス、および場合により細胞死は、血清または血清代替組成物（ｓｅｒｕｍ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を含有する細胞培養培地中で維持されている細胞集団に供給されている培地での血清の使用中止（取り除くこと）によって誘導できる。
【００３０】
細胞の集団において誘導される場合がある生理学的ストレスを増大させるために使用できる別の手法は、ストレスが誘導される時点で細胞を低密度で維持することである。これは、細胞と細胞の接着を阻害する働きがある場合があり、細胞が多能性を維持する助けとなる条件を除く。例えば細胞は、生理学的ストレスが誘導される時点で８０％コンフルエンス未満、７０％コンフルエンス未満または６０％コンフルエンス未満に対応する密度で維持されてよい。好適な実施形態では、細胞は、生理学的ストレスが誘導される時点で５０％コンフルエンス以下であってよい。
【００３１】
生理学的ストレスを誘導できる代替方法は、細胞の集団が曝露される温度の上昇、細胞の集団が増殖される培地のｐＨの上昇または低下、細胞の集団への細胞傷害性薬剤の供給を含む。
【００３２】
培養細胞に有益である薬剤の使用中止によって生理学的ストレスが誘導される実施形態では、この使用中止は必要な生理学的ストレスが誘導されるために必要である限り継続されてよい。生理学的ストレスが培養培地での血清の使用中止によって誘導される実施形態では、本発明者らはそのような使用中止が無期限に継続されてよいことを見出した。
【００３３】
細胞傷害性薬剤などの生理学的ストレスを誘導するための刺激の添加の場合では、刺激は一過的に与えられてよい。刺激は、必要な程度の生理学的ストレスを誘導するために十分な時間および十分な量で与えられるべきである。
【００３４】
好適な実施形態では、本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。好適なｉｎ  ｖｉｔｒｏ法は、Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質の供給の前または後に細胞を培養するステップを含む場合がある。好適な実施形態は、接着または非接着培養方法を利用する場合がある。
【００３５】
第２の態様では、本発明は、治療用途のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞を適応させる（ａｄａｐｔｉｎｇ）方法を提供し、方法は、
・  神経潜在性を有する細胞の集団にＥ−カドヘリン活性の阻害物質を供給するステップ；
・  細胞の集団の間に細胞ストレスを誘導するステップ；
・  神経前駆細胞が産生されるまで生存細胞を培養するステップ；
・  場合により、神経系細胞が産生されるまで神経前駆細胞を培養するステップ；および
・  神経前駆細胞または神経系細胞を患者への投与のために好適な組成物中に配合する（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｎｇ）ステップ
を含む。
【００３６】
文脈上別段に必要とする場合を除いて、本発明の第１の態様による方法に関して示される種々の基準は、本発明の第２の態様による方法にも適用できる。
【００３７】
神経前駆細胞または神経系細胞を配合するステップは、神経系の細胞への障害を含む状態の処置のための薬の製造を含む場合がある。そのような状態は、疾患（神経変性疾患など）または障害である場合がある。単なる例として、好適な疾患は、アルツハイマー病またはパーキンソン病を含む場合がある。
【００３８】
本発明の態様による方法における使用のための細胞は、好ましくはヒト細胞であってよい。本発明の本態様の方法の特定の実施形態では、細胞は、好ましくは治療を必要とする患者の細胞であってよい。組成物は、それが投与される患者由来の細胞を含んでよい。
【００３９】
処置を必要とする患者の細胞は、そのような細胞（またはその後代）の直接の治療用途に関するもの以外の本発明の実施形態において使用できる有用な材料も構成する。単なる例として、処置を必要とする疾患を有する患者の細胞は、神経前駆細胞の産生およびこれらの神経前駆細胞（またはその後代）の調査される潜在的療剤への応答のための出発材料として使用できる。したがって、例として、神経系の疾患または障害を有する患者の細胞は、問題となる疾患または障害の特徴となる応答または表現型を表す神経前駆細胞（またはその後代）を産生するために使用できる。次いで細胞は、疾患または障害を処置する可能性がある薬剤に曝露されてよく、この潜在的療剤へのこれらの細胞の応答は評価される。潜在的療剤が問題となる疾患または障害の特徴となる応答または表現型を緩和できるという知見は、同じ（または類似の）薬剤が患者における疾患または障害の処置において使用できることを示している。同様に、潜在的療剤が応答を緩和しないという知見は、この薬剤がそのような処置において用いられるべきでないことを示している。
【００４０】
治療剤に関して上に記載の考察は、処置／投与計画などにも適用できる。
【００４１】
本発明の方法において個体の細胞が使用される好適な実施形態では、個体の幹細胞または前駆体細胞が方法のための出発材料として直接使用される場合がある。代替的に個体由来の非幹細胞が多能性を誘導され（それによりｉＰＳＣを生じる）、これらのｉＰＳＣは本発明の方法において利用される場合がある。
【００４２】
第３の態様において、本発明は、
・  Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質；
・  血清不含細胞培地；および
・  血清または血清代替組成物
を含むキットも提供する。
【００４３】
第４の態様において、本発明は、およそ２５０μＭからおよそ１．３ｍＭの間の濃度でＥ−カドヘリン活性の阻害物質を含む細胞培養培地も提供する。
【００４４】
マウス細胞の培養における使用のための本発明の細胞培養培地の場合では、Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質は６００μＭから１．３ｍＭの間の濃度で提供されてよい。好適にはＥ−カドヘリン阻害物質は、およそ１ｍＭの濃度で提供されてよい。
【００４５】
ヒト細胞の培養における使用のための本発明の細胞培養培地の場合では、Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質は２５０μＭから１．３ｍＭの最大濃度の間の濃度で提供されてよい。好適にはＥ−カドヘリン阻害物質は、およそ５００μＭの濃度で提供されてよい。
【００４６】
特定の実施形態では、本発明の細胞培養培地は、血清不含培地である。他の実施形態では本発明の細胞培養培地は血清、または血清代替組成物を含む場合がある。
【００４７】
本発明の種々の実施形態によるキットまたは培地が本発明の方法における使用のために十分に適していることは認識される。
【００４８】
本発明のキットまたは細胞培養培地における使用のためのＥ−カドヘリン活性の好適な阻害物質は、明細書の他所に提供される示唆を参照して選択できる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】図１は、振とうフラスコ懸濁培養中での神経系列へのＥＮＰＳ細胞の分化を例示する図である。
【図２】図２は、振とうフラスコ懸濁培養中で神経系列に分化したＥＮＰＳ細胞の特徴付けを示す図である。
【図３】図３は、接着培養中での神経系列へのヒトＥＳ細胞の分化を例示する図である。
【図４】図４は、接着培養中で神経系列に分化されたヒトＥＳ細胞の特徴付けの詳細を示す図である。
【図５】図５は、接着培養中で神経系列に分化されたヒトＥＳ細胞の特徴付けのさらなる詳細を示す図である。
【図６】図６は、神経型分化に方向付けられたヒトＥＳ細胞の非ニューロン系列の評価を示す図である。
【図７】図７は、（ａ）培地のみまたは（ｂ）ペプチド補充培地中で（７日間）培養されたヒトＥＳ細胞をニューロン系列に分化させたことを示す図である。
【図８】図８は、（ａ）培地のみまたは（ｂ）ペプチド補充培地中で（７日間）培養されたヒトＥＳ細胞をグリア系列に分化させたことを示す図である。
【図９Ａ】この図は、多能性ｈｉＰＳＣ中の細胞間接着におけるＥ−カドヘリンの効果を例示する図である。
【図９Ｂ】この図は、多能性ｈｉＰＳＣ中の細胞間接着におけるＥ−カドヘリンの効果を例示する図である。
【図１０】この図は、Ｅ−カドヘリン阻害物質を使用するｈｉＰＳＣの神経型分化を例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
定義
本発明がより良く理解される目的で、次の用語は本開示の文脈においてここにさらに定義される。文脈上別段に必要とする場合を除いて、次の定義において考慮されるすべての実施形態が、実施形態および態様の詳細な組合せが具体的に開示されているかどうかに関わらず、本発明のすべての態様における使用のために好適であると考えられるべきであることは理解される。
【００５１】
「神経潜在性を有する細胞」
本開示の目的のためにこの用語は、分化し、それにより神経前駆細胞を生じる能力を有するあらゆる細胞を包含すると理解されるべきである。幹細胞は、本開示の文脈において神経潜在性を有する好適な細胞の例である。
【００５２】
「幹細胞」
上で言及したとおり幹細胞は、本発明の方法において使用できる神経潜在性を有する細胞の好適な形状を表す。
【００５３】
幹細胞が利用される実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞；複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞；全能性幹細胞；成体幹細胞；胚性幹細胞；臍帯血幹細胞；間葉系幹細胞；上皮幹細胞；脂肪幹細胞；エピ幹細胞；がん幹細胞；および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなる群から独立に選択されてよい。幹細胞が「成体」よりも「胚性」幹細胞型に関連する生物学的活性（多能性など）を示すことが好ましい場合がある。胚性特徴を示すそのような幹細胞の好適な例は、胚性幹細胞株などの胚性幹細胞だけでなく、ｉＰＳＣも含む。特許性の目的のために、ヒト幹細胞を使用する特定の実施形態の場合に、ヒト幹細胞はヒト胚性幹細胞以外であってもよいことは理解される。
【００５４】
本発明の特定の実施形態では、好適な幹細胞株は、ヒト胚の破壊を必要とせずに産生されるものであってよい。好適な実施形態では、好適な胚性幹細胞株は、初期胚盤胞からのヒト胚性幹細胞の単離によって開発されたものであってよい。胚性幹細胞株が単一の割球由来であるなどの技術が、細胞が採取された胚を害することなくヒト胚性幹細胞を単離および培養できるようにすることは周知である。
【００５５】
単なる例として、本発明の方法は、ＨＵＥＳ−７（Ｈａｒｖａｒｄ、Ｍｅｌｔｏｎ）；Ｈ９（ＷｉＣｅｌｌ）；ＭＡＮ−７（ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、Ｋｉｍｂｅｒ）；Ｈ１（Ｗｉｃｅｌｌ）；ＳＨＥＦ３（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ、Ｍｏｏｒｅ）；Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ（Ｋａｐａｃｅｅ）で産生されたものなどのｉＰＳＣ；ｉＰＳ−ＤＦ６−９−９Ｔ．Ｂ−ＭＣＢ−０１（ＷｉＣｅｌｌ）；およびＥＮＰＳ細胞（Ｄ３（１２９ｓ２／ＳｖＰａｓ親株−ＡＴＣＣ）からなる群から独立に選択される細胞株を使用して実行することができる。上記の例は、ネズミである最後に言及した細胞株を除いてすべてヒト幹細胞株である。
【００５６】
「神経前駆細胞」
本文脈において、神経前駆細胞は、自己複製および神経系列に関わる能力を示すあらゆる細胞を含んで理解されてよい。神経前駆細胞の好適な例は、神経系細胞；および神経細胞；およびオリゴデンドロサイトまたは星状細胞などのグリア細胞からなる群から選択される細胞型を生じることができる細胞を含んでよい。
【００５７】
神経前駆細胞は、特定のマーカーの発現のそれらのプロファイルによって同定できる。例えば、好適な実施形態では、神経前駆細胞は、ネスチンを発現する場合がある。ネスチンは、神経細胞において主に発現される中間体線維である。ネスチンに加えてまたは代替的に、本発明の方法によって産生される神経前駆細胞は、ＳＯＸ−２およびビメンチンからなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現する場合がある。
【００５８】
好適なマーカーの発現は、これだけに限らないが、免疫標識；免疫蛍光顕微鏡；ウエスタンブロッティング；蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）；蛍光フローサイトメトリー；ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；および逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）からなる群から選択されるものを含む任意の好適な技術によって評価されてよい。
【００５９】
好適な実施形態では、神経前駆細胞は、接着培養で増殖された場合に最も明らかである場合があるそれらの形態によって識別できる。神経前駆細胞または神経系細胞に特徴的な形態学的特質は、ロゼット様構造および紡錘様形態の存在を含んでよい。これらの特質は、内胚葉細胞の平板化形態（「舗道様」と称される）から識別できる。
【００６０】
好ましくは形態学的特質を識別することは、例えば免疫細胞化学標識および顕微鏡を使用する、特徴的マーカーとの組合せで使用できる。
【００６１】
初期神経コミットメントを受けた神経前駆細胞は、ニューロン特異的β−ＩＩＩチューブリン；ＮＥＵＲＯＤ１；および神経フィラメントからなる群から選択されるマーカーの発現によって同定できる。
【００６２】
「Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質」
Ｅ−カドヘリン活性の多数の異なる阻害物質は、本発明による使用のために好適である。単なる例として、Ｅ−カドヘリン活性の好適な阻害物質は、Ｅ−カドヘリン中和抗体；Ｅ−カドヘリンＨＡＶドメインの阻害物質；Ｅ−カドヘリンの細胞外ドメインでのトリプトファン２の阻害物質；およびアミノ酸配列ＣＨＡＶＣ（配列番号３）を含むペプチドからなる群から選択されてよい。
【００６３】
上に示すとおりＥ−カドヘリン中和抗体は、本発明による使用のために好適なＥ−カドヘリン活性の阻害物質の例を表す。好適な中和抗体は、Ｅ−カドヘリン上に存在するエピトープに結合する場合に、それによってＥ−カドヘリンの活性を低減するものである。例えば抗Ｅ−カドヘリン抗体、ＤＥＣＭＡ−Ｉ（Ｓｉｇｍａ、Ｄｏｒｓｅｔ、ＵＫからカタログ番号Ｕ３２５４で入手可能）は、本発明による使用のために好適なＥ−カドヘリン活性の阻害物質として使用できる。代替的にＥ−カドヘリン活性の好適な阻害物質は、ＤＥＣＭＡ−Ｉ以外の抗体であってよい。本発明により使用できるさらなるＥ−カドヘリン中和抗体の一例は、ＳＨＥ７８−７（ＳＨＥ７８．７とも称される）であり、Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｓ．Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１３−５７００）から商業的に入手できる。したがって、ＤＥＣＭＡ−Ｉ抗体は、マウス胚性細胞腫細胞株ＰＣＣ４  Ａｚａ  ＲＩに対して作られ、ＳＨＥ７８．７はヒト胎盤に対して作られたものである。この観点から、ＤＥＣＭＡ−Ｉはマウス（マウス胚性幹細胞などのマウス幹細胞を含む）においてＥ−カドヘリン活性の阻害にさらに有効である場合があり、ＳＨＥ７８．７はヒト細胞（ヒト胚性幹細胞などのヒト幹細胞を含む）においてＥ−カドヘリン活性の阻害のためにさらに有効である場合があることは理解される。
【００６４】
具体的には、ヒト細胞に関連してＥ−カドヘリン活性を阻害したい場合にＳＨＥ７８．７をＥ−カドヘリン活性の阻害物質として使用することが好ましい場合がある。本発明者らは、ネズミ細胞に関連してＥ−カドヘリン活性を阻害したい場合にＤＥＣＭＡ−ＩをＥ−カドヘリン活性の好ましい阻害物質として使用することを見出した。
【００６５】
本発明によるＥ−カドヘリン活性の阻害物質としての使用のために好適な抗体は、モノクローナル活性中和抗体およびポリクローナル活性中和抗体、ならびに中和活性を保持しているそのような抗体の断片を含む。使用できる断片の好適な例は、これだけに限らないがＦａｂまたはＦ（ａｂ’）ｈｄ２、およびＦｖ断片を含む。
【００６６】
Ｅ−カドヘリンなどの標的に特異的に結合できる抗体の生成および／または同定のために好適な方法は、当業者に十分周知である。一般に好適な抗体は、免疫原として単離されたＥ−カドヘリンの使用によって生成されてよい。Ｅ−カドヘリンは、ラット、ウサギまたはマウスなどの哺乳動物に投与されてよく、抗体は免疫応答の一部として誘発される。好適な免疫原は、全長Ｅ−カドヘリンまたはその抗原性ペプチド断片（Ｅ−カドヘリンの生物学的機能に関連する好ましいエピトープなど）を含んでよい。Ｅ−カドヘリン活性を中和できるモノクローナル抗体は、融合細胞、特異的モノクローナル抗体を分泌できる不死化細胞株によって産生されてよい。好適な不死化細胞株は、通常はリンパ球で、その１つは腫瘍細胞である２つの異なる細胞型を融合することによってｉｎ  ｖｉｔｒｏで作られてよい。
【００６７】
本発明により使用できる好適なＥ−カドヘリン活性の阻害物質のさらなる例は、Ｅ−カドヘリンに結合でき、それによりその生物学的活性を妨げるタンパク質（またはタンパク質誘導体）を含んでよい。そのようなタンパク質または誘導体は、Ｅ−カドヘリン活性を阻害できる天然に存在するタンパク質、およびそのような天然に存在するタンパク質に基づく誘導体、ならびに好適な活性を保有する新規タンパク質または誘導体を含む。
【００６８】
例えばＥ−カドヘリンが他のＥ−カドヘリン分子に最も末端のＣＡＤ細胞外ドメイン（ＣＡＤ−ＨＡＶ）を介して結合することは周知である。同様にトリプトファン残基Ｔｒｐ１５６がＥ−カドヘリンの二量体化のために連結されることが示されている。したがって本発明による使用のためのＥ−カドヘリン活性の好適な阻害物質は、ＣＡＤ−ＨＡＶ配列または残基Ｔｒｐ１５６を組み込んでいる配列に結合できるタンパク質または他の結合分子を含む場合がある。Ｅ−カドヘリン活性の好ましい阻害物質は、ＣＡＤ−ＨＡＶ配列を含む場合があり、そのようなＥ−カドヘリン活性の阻害物質の好適な例はＣＡＤ−ＨＡＶ配列からなる。好適な阻害物質は、ＣＡＤ−ＨＡＶおよび／またはＴｒｐ１５６を組み込んでいる可溶性Ｅ−カドヘリン断片を含む場合がある。代替的に、本発明によるＥ−カドヘリン活性の阻害物質としての使用のために好適なタンパク質または他の結合分子は、ＣＡＤ−ＨＡＶ配列、またはＴｒｐ１５６を組み込んでいる配列の修飾形態に基づいていてよい。そのような修飾形態は、それらの生物学的活性を増大させる、タンパク質分解へのそれらの耐性を増大させる、それらの半減期を増大させる、または他にそれらの有効性を増大させるために修飾された誘導体を含んでよい。
【００６９】
ＣＡＤ−ＨＡＶ配列またはＴｒｐ１５６を含む好適なペプチド阻害物質は、配列番号４に示すＥ−カドヘリンの配列から３個以上の近接アミノ酸を含む場合がある、またはＣＡＤ−ＨＡＶ配列またはＴｒｐ１５６を含む配列番号４から５個、１０個、２０個以上の近接アミノ酸残基を含む場合がある。
【００７０】
ペプチド阻害物質（ＣＡＤ−ＨＡＶ配列および／またはＴｒｐ１５６を組み込んでいる配列を含むものなど）は、本発明による使用のためのＥ−カドヘリン活性の好適な阻害物質を構成してよい。Ｅ−カドヘリン活性の他の好適な阻害物質は、そのようなペプチド阻害物質に由来してよい。ペプチド誘導体などのこの種の誘導体は、分解により大きな抵抗性を有する場合があり、それによりそれらが由来するペプチドと比較して改善された保存期間を有する場合がある。
【００７１】
Ｅ−カドヘリン活性の好適な阻害物質は、多価／一価合成ポリマーにコンジュゲートされてもよく、それによりそれらの標的タンパク質への阻害物質の結合力が増大する。例えば、好適な実施形態では、本発明による使用のために好適な阻害物質の多数の形状は、単一のポリマーにコンジュゲートされていてよい。代替的にまたは追加的に、好適な阻害物質は、多能性を維持するために必要な１つまたは複数の他の因子（例えば好適なオリゴ糖）との組合せで好適なポリマーにコンジュゲートされてよい。
【００７２】
本発明による使用のために好適なＥ−カドヘリン活性の阻害物質は、代替的にまたは追加的に、Ｅ−カドヘリンの膜近位領域に結合できる場合がある。
【００７３】
本発明による使用のために好適なさらなるＥ−カドヘリン活性の阻害物質は、Ｅ−カドヘリンの天然に存在する結合パートナーであるαＥβ７インテグリンを含む。他の好適な阻害物質は、αＥβ７インテグリンのＥ−カドヘリン−結合断片、またはこのインテグリンもしくはその断片の誘導体を含む場合がある。好適な断片は、Ｓｈｉｒａｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ、（Ｊ  ｌｍｍｕｎｏｌ．２００５  Ｊｕｌ  １５；１７５（２）：１０１４〜２１）の開示に照らして選択できる。
【００７４】
Ｅ−カドヘリンの小分子阻害物質は、本発明による使用のための好適な阻害物質を表す場合がある。
【００７５】
本発明の好適な実施形態では、細胞は、Ｅ−カドヘリン活性の天然に存在する阻害物質を過発現するように誘導できる。培養細胞による天然に存在する阻害物質のそのような過発現が一過的に達成され、神経前駆細胞、または神経系細胞が産生されると停止することが好ましい場合がある。
【００７６】
Ｅ−カドヘリン活性のそのような天然に存在する阻害物質の一例は、「Ｓｌｕｇ」（「Ｓｎａｉ２」および「ｓｎａｉｌ  ｈｏｍｏｌｏｇ  ２」としても周知である）である。Ｓｌｕｇ（ＮＣＢＩ参照番号ＮＰＪ３０３０５９）のヒト型のアミノ酸配列は配列番号５に示されており、Ｓｌｕｇ（ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿０３５５４５）のマウス型のアミノ酸配列は配列番号２２に示されている。
【００７７】
Ｅ−カドヘリン活性の好適な天然に存在する阻害物質の別の例は、「Ｓｎａｉｌ」である。Ｓｎａｉｌのヒト型のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿００５９７６）は、配列番号６に示されており、Ｓｎａｉｌのネズミ型のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照番号ＮＰ＿０３５５５７）は配列番号７に示されている。
【００７８】
本発明による使用のために好適なＥ−カドヘリン活性のさらなる天然に存在する阻害物質は、ＳＭＡＤ相互作用タンパク質１「ＳＩＰ１」を含む。ＳＩＰ１のヒト型のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照番号ＢＡＢ４０８１９）は配列番号８に示されており、ＳＩＰ１のマウス型のアミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照番号ＡＡＤ５６５９０）は配列番号９に示されている。
【００７９】
Ｅ２Ａは、本発明による使用のために好適なＥ−カドヘリン活性のさらなる天然に存在する阻害物質を含む。Ｅ２Ａのヒト型は、「ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）転写因子３」、「Ｅ２Ａ免疫グロブリンエンハンサー結合因子Ｅ１２／Ｅ４７」および「ＴＣＦ３」としても周知である。Ｅ２Ａのヒト型は、ＮＣＢＩ参照番号ＮＭ＿００３２００に示されている。ヒトＥ２Ａのアミノ酸配列は配列番号１０に示されており、Ｅ２Ａのヒト型をコードしているＤＮＡは配列番号１１に示されている。Ｅ２Ａのネズミ型は「Ｍｕｓ筋肉転写因子Ｅ２ａ」としても周知であり、ＮＣＢＩ参照番号ＢＣ００６８６０を有する。ネズミＥ２Ａのアミノ酸配列は配列番号１２に示されており、Ｅ２Ａのネズミ型をコードしているＤＮＡの配列は配列番号１３に示されている。
【００８０】
上に記載のＥ−カドヘリンの天然に存在する阻害物質が本発明により使用できる天然に存在する阻害物質の範囲の例を単に表すことは理解される。これら（および他の）阻害物質は、単独でまたは他の阻害物質（天然に存在するおよび人工の阻害物質の組合せを含む）との組合せで使用できる。
【００８１】
本発明者らは、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、ＳＩＰ１およびＥ２ＡがＥ−カドヘリンプロモーターのメチル化／高メチル化によってＥ−カドヘリン発現を阻害し、それにより遺伝子転写を妨げるまたは低減すると考える。したがって、Ｅ−カドヘリンプロモーターのメチル化または高メチル化を引き起こすことができる薬剤は、本発明のすべての態様による使用のために好適なＥ−カドヘリンの好適な阻害物質を表す。そのような薬剤がＥ−カドヘリンプロモーターのメチル化または高メチル化を引き起こすと、それらがもはや細胞に供給される必要はないことは理解される。
【００８２】
アプタマーは、本発明による使用のために好適なＥ−カドヘリン活性の好ましい阻害物質のさらなる例を含む。アプタマーは、特異的、配列依存性形態をとり、アプタマーとリガンドの間の鍵と鍵穴適合に基づいて特異的標的リガンドに結合する核酸分子である。したがって好適なアプタマーは、Ｅ−カドヘリンタンパク質とまたはＥ−カドヘリンをコードしている核酸と相互作用するように設計されてよい。
【００８３】
典型的にはアプタマーは、１本鎖もしくは２本鎖ＤＮＡ分子（ｓｓＤＮＡもしくはｄｓＤＮＡ）または１本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓＲＮＡ）のいずれかを含む場合がある。
【００８４】
上に記載のとおりアプタマーは、Ｅ−カドヘリンタンパク質および／またはＥ−カドヘリンタンパク質をコードしている核酸に結合（およびそれにより阻害）するために使用できる。ｓｓＤＮＡアプタマーは、Ｅ−カドヘリンをコードしている核酸の調査における使用のために好ましい場合がある。
【００８５】
好適なアプタマーは、特異的アプタマーがＥ−カドヘリンタンパク質または核酸標的に対して適度に高い親和性を有するとして同定される場合がある無作為配列プールから選択されてよい。望ましい特異性を有するアプタマーの産生および選択のための方法は当業者に十分周知であり、ＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｂｙ  ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ））工程を含む。簡潔には、オリゴヌクレオチドの大きなライブラリーが作製され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択および続くポリメラーゼ連鎖反応を通じた増幅の反復性の工程によって多量の機能性核酸の単離を可能にする。
【００８６】
アプタマーが比較的安定な保存期間を有することから本発明によるＥ−カドヘリン活性の阻害物質としてのアプタマーの使用は、有利である場合がある。これは本発明の細胞培養培地に関連して特に好ましい場合がある。本発明による使用のために好適なアプタマーは、化学的修飾（例えば２’−ＮＨ２および２’−Ｆ修飾）によって安定化できる。
【００８７】
本発明者らはいかなる仮説によっても束縛されることを望まないが、上に述べた抗体ＤＥＣＭＡ−Ｉなどのある種の阻害物質が、それらの効果をＥ−カドヘリンの内部移行を通じて達成すると考える。そのような内部移行されたタンパク質は、その通常の生物学的機能を達成できず、そのため生物学的活性は阻害される。したがってＥ−カドヘリンの内部移行を引き起こすことができる薬剤は、本発明による使用のための好適な阻害物質を表す。
【００８８】
先行する例は、生物学的活性を妨げることができ、他に既に発現されたＥ−カドヘリンに会合することもできる阻害物質に主に集中している。他の好適な阻害物質は、Ｅ−カドヘリンの発現を妨げることができる薬剤を含む場合があることは理解される。そのような阻害物質は、Ｅ−カドヘリン遺伝子の転写を妨げられるもしくは低減できる、またはＥ−カドヘリン遺伝子転写物の翻訳を妨げられるもしくは低減できる。
【００８９】
Ｅ−カドヘリンの発現を妨げることができるそのような阻害物質の例は、アプタマー（上に考察のとおり）、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムを含む。好適な阻害物質は、Ｅ−カドヘリン遺伝子を破壊できる薬剤も包含する。
【００９０】
当業者は、本明細書に記載のＥ−カドヘリン活性の多数の阻害物質、および具体的には本明細書に記載のタンパク質または核酸剤は、細胞性産生（遺伝子転写および発現の機序を使用する）のために好適であることを認識する。当業者は、好ましくはそのような薬剤が神経系前駆体細胞が産生される細胞によって産生される場合があることを認識する。好適にはそのような薬剤は、細胞に、または細胞によって一過的に組み込まれるまたは一過的に発現される遺伝子構築物中に提供されてよい。構築物によってコードされるＥ−カドヘリン活性の阻害物質は、配列番号１４〜２１に示すものなどのｓｉＲＮＡ分子を好ましくは含んでよい。
【００９１】
本発明の方法において使用できるＥ−カドヘリン活性の阻害物質がＥ−カドヘリン活性の外来性阻害物質（ペプチド、抗体など）およびＥ−カドヘリン活性の内在性阻害物質（ｓｉＲＮＡ分子など）を含むことは上記から理解される。本発明の種々の態様において内在性阻害物質を使用することが望ましい場合には、これらがＥ−カドヘリン機能に関与する因子と競合する「間接」阻害物質とは反対の「直接」阻害物質であることが好ましい場合がある。
【００９２】
本発明の方法におけるＥ−カドヘリン活性の外来性阻害物質の使用は、それらが、神経前駆体が産生される細胞を遺伝的に操作する必要性を低減する有利点を提供できる。内在性阻害物質の発現に関連するそのような細胞の修飾は、神経潜在性を有する細胞および神経前駆細胞の両方において残存すると期待できる。神経前駆体（またはその神経系細胞後代）が例えば治療適用のために宿主に提供される環境においてはそのような修飾を回避することが好ましい場合がある。Ｅ−カドヘリン活性の外来性阻害物質の使用は、供給される阻害物質の量のより良い制御も促進する場合があり、そのため本発明の方法を実行する者は供給される阻害物質の量を正確に決定できる。
【００９３】
本発明の方法を実行することにおいて特に有効であると本発明者らが見出したＥ−カドヘリン活性の阻害物質の特に好適な例は、阻害性ペプチドＳＷＥＬＹＹＰＬＲＡＮＬ（配列番号１）およびその誘導体Ｈ−ＳＷＥＬＹＹＰ−ＮＨ２（配列番号２）またはＳＷＥＬＹＹＰＬ（配列番号２６）である。Ｅ−カドヘリン活性のこの阻害物質は、細胞培養培地に供給される外来性阻害物質としての使用のために好適である。Ｅ−カドヘリン活性を阻害する能力を保持しているこのペプチドの断片または誘導体も本発明の方法において使用できる。その誘導体とは対照的に、配列番号１のペプチドを用いることが一般に好ましい場合がある。
【００９４】
Ｅ−カドヘリンの発現が本発明の方法を実行するために阻害される（全体的または部分的のいずれでも）必要がないことは理解される。本発明者らは、本発明の方法がＥ−カドヘリン活性に関連するＥ−カドヘリンのトランスホモ二量体化を低減する阻害物質を使用して有効に実行できると考える。Ｅ−カドヘリンのトランスホモ二量体化を低減できる薬剤は、したがって本発明の種々の態様における使用のためのＥ−カドヘリンの好ましい阻害物質を表す場合がある。
【００９５】
ヒト細胞および上に記載のペプチド阻害物質ＳＷＥＬＹＹＰＬＲＡＮＬ（配列番号１）を利用する好適な実施形態では、阻害物質は阻害物質の５００μＭ溶液が産生されるように細胞培養培地に加えられてよい。ネズミ細胞およびペプチド阻害物質ＳＷＥＬＹＹＰＬＲＡＮＬを利用する好適な実施形態では、阻害物質は阻害物質の１ｍＭ溶液が産生されるように細胞培養培地に加えられてよい。
【００９６】
本発明者らは、Ｅ−カドヘリン活性の外来性阻害物質が使用される場合に、これらの阻害物質が細胞に一過的に供給されてよいことを見出した。好適な実施形態では、Ｅ−カドヘリン活性の阻害物質は、１４日間まで、１２日間まで、１０日間まで、８日間まで、６日間まで、または４日間までの期間について細胞に供給される場合がある。単なる例として、次の実験結果では、ペプチド阻害物質ＳＷＥＬＹＹＰＬＲＡＮＬ（配列番号１）が細胞でのストレスの誘導後２日ごとに６から７日間細胞に供給された方法において神経前駆細胞は効率的に産生されたが、神経前駆細胞が生成および培養される残りの期間についてさらなる阻害物質は加えられる必要がなかった。
【００９７】
これは、本発明の方法の過程全体にわたって供給される必要があるそのような阻害物質の総量を低減する重要な有利点を提供し、そのような阻害物質が高価である場合があることから有益である場合がある。さらに、比較的短い期間だけの阻害が必要であるという知見は、患者に再導入される場合がある（例えば治療の一部として）細胞に供給される因子を低減する所望の目的と一致する。
【００９８】
本発明の第５の態様では、本発明による方法によって産生された神経前駆細胞が提供される。
【００９９】
本発明の第６の態様では、本発明による方法によって産生された神経系細胞が提供される。
【０１００】
本発明の第７の態様では、本発明による方法によって産生されたグリア細胞が提供される。
【０１０１】
本発明の第８の態様では、本発明による方法によって産生された神経細胞が提供される。
【０１０２】
本発明の種々の態様において検討される任意の細胞が、実験的または治療用途への適応に関連し、他の対応する種類の天然に存在する細胞から識別できるようにする修飾などの、修飾を組み込まれてもよいことは理解される。
【０１０３】
単なる例として、本発明の態様による細胞は、１つまたは複数の治療に関連する遺伝子が修飾されている修飾を、問題となる遺伝子（複数可）の発現が変化するように組み込まれてもよい。
【０１０４】
本発明の態様による細胞は、追加的または代替的に、疾患状態に特徴的な活性または表現型に関連する１つまたは複数の遺伝子が修飾されている修飾を、問題となる遺伝子（複数可）の発現が変化するように組み込まれてもよい。この変化は、問題となる疾患状態に関連する細胞の特定の活性または表現型を再現できるようにする場合がある。結果として、この様式で修飾される本発明の細胞は、疾患状態に影響を与える（回復させるまたは悪化させる）薬剤のスクリーニングまたは同定において使用できる。したがって本発明による細胞は、新規治療剤の開発または同定において使用できる。
【０１０５】
本発明は、次の実験結果および添付の図面を参照してここにさらに説明される。
【０１０６】
（図１）図１は、振とうフラスコ懸濁培養中での神経系列へのＥＮＰＳ細胞の分化を例示する図である。簡潔には、未分化ＥＮＰＳ細胞は振とうフラスコ培養の前に標準的接着培養条件下で維持された。ＥＮＰＳ細胞は１２５ｍｌ振とうフラスコ中の分化培地２５ｍｌに１．０Ｅ５  ｖｃ／ｍｌで振とうフラスコに播種され、１４０ｒｐｍで１５日間撹拌された。細胞計数および培地補充は７２時間ごとに実施された。（ａ）全生細胞数は３日間の培養後にピークになった（平均生存率７７％）。しかし、３日目以後細胞生存率における顕著な減少が観察された（実験期間中について平均生存率は２１±７％であった）。値は、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３を表す。（ｂ）位相差顕微鏡は、振とうフラスコ培養中で維持された細胞が分散増殖を有し、６日目に、細胞塊の形成が観察されることを示している。１５日目に細胞はゼラチン処置プレートに移され、分析の前に一晩接着できるようにされた。これらの細胞は、神経系細胞系列に関連する典型的な培養形態を示す。
【０１０７】
（図２）図２は、振とうフラスコ懸濁培養中で神経系列に分化したＥＮＰＳ細胞の特徴付けを示す図である。この研究では、ＥＮＰＳ細胞は分化培地（１０％血清（ＦＢＳ：ＫＳＲ、３：７部）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸（１００×、１：１００希釈）、５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを補充されたノックアウトＤＭＥＭ、３７℃／５％ＣＯ２）で、振とうフラスコ懸濁培養において１４０ｒｐｍ、１５日間にわたって培養された。細胞は、１５日目に回収され、ゼラチンコートディッシュに蒔かれ、一晩接着できるようにされた。位相差（ａ）および、神経系列（ｂ）ネスチン（赤）、（ｃ）＿１１１−チューブリン（緑）、（ｄ）ＮｅｕｒｏＤ−１（緑）、（ｅ）神経フィラメント（赤）および（ｆ）Ｐａｘ６（緑）を表すマーカーの免疫蛍光分析。全細胞はＤＡＰＩ（青）を使用して視覚化された。すべての画像は、×２０倍で撮られた。
【０１０８】
（図３）図３は、接着培養中での神経系列へのヒトＥＳ細胞の分化を例示する図である。ヒトＥＳ細胞（ＨＵＥＳ７）を分化の誘導の前に標準的接着フィーダー不含培養条件の下で増殖させた（ａｉ）および（ｂｉ）。コンフルエント未分化細胞は解離され、低密度（細胞２．０Ｅ５個／９６２ｍｍ２）で（ａ）分化培地のみまたは（ｂ）ペプチド（５００μＭ）を補充された培地でゼラチンコートウエルに播種された。培地（およびペプチド）は、２日間ごとに補充され、細胞は＜７０％コンフルエンスを維持するために分割された。位相差画像は、（ａｉｉ）培地のみで６〜７日間培養された細胞の大部分が平板化した「ギザギザの」形態（分化している細胞に伴う）を示すが、未分化細胞のわずかなコロニーが残っていることを示している。ペプチドを補充された培地（ｂｉｉ）で６〜７日間培養された細胞は、類似の形態を示すが、未分化コロニーは観察されなかった。これらの細胞の表現型を同定するために、培養物は７日目に回収され、神経前駆体細胞マーカーの免疫蛍光分析が実施された。（ａｉｉｉ）培地のみで分化した細胞は、高い割合の細胞において陽性ネスチン（緑）および（ａｉｖ）ビメンチン（緑）発現を示すが、ペプチドの存在下で培養された細胞（ｂｉｉｉ）はネスチンおよび（ｂｉｖ）ビメンチンの均質な発現を示す。全細胞は、ＤＡＰＩ（青）を使用して視覚化された。すべての画像は×１０倍で撮られた。
【０１０９】
（図４）図４は、接着培養中で神経系列に分化されたヒトＥＳ細胞の特徴付けの詳細を示す図である。これらの細胞の表現型を同定するために、培養物は７日目に回収され、神経前駆体細胞マーカーの免疫蛍光分析が実施された。（ａ）培地のみで培養されたネスチン陽性細胞の数の定量は、分化後７日間、ペプチドを補充された培地中での９５．３％と比較して、７１．１％であった（ｎ＝３）。（ｂ）ヒトＥＳ由来神経系前駆体細胞は、（ｄ）ネスチン発現の蛍光フローサイトメトリー分析によって示されるとおり、８ｎｇ／ｍｌ  ｆｇｆ２の存在下で培養された場合に長期間（９０日間）自己再生できる。ネスチン（緑線プロファイル）およびアイソタイプ対照抗体（紫塗りプロファイル）。
【０１１０】
（図５）図５は、接着培養中で神経系列に分化されたヒトＥＳ細胞の特徴付けのさらなる詳細を示す図である。（ａ）培地のみまたは（ｂ）ペプチドを補充された培地中での接着培養条件下で分化されたヒトＥＳ細胞。位相差画像は、（ａｉ）培地のみおよび（ｂｉ）ペプチド補充培地で増殖した細胞中で９日目に神経系細胞系列に関連する典型的形態を示す。培養物は９日目に二重免疫蛍光分析のために回収され、（ａｉｉ）培地のみおよび（ｂｉｉ）ペプチド補充培地中で増殖させた細胞の両方がネスチン（赤）およびニューロン特異的β−ＩＩＩチューブリン（緑）を発現しており、それによって少ない割合の陰性細胞（青）が（ａｉｉ）において同定された。（ｃｉおよびｃｉｉ）培地のみならびに（ｄｉおよびｄｉｉ）ペプチド補充培地で１２〜１５日間分化された細胞の免疫蛍光画像分析は、神経コミットメントの発現マーカー；（ｃｉおよびｄｉ）β−ＩＩＩチューブリン（緑）ならびに（ｃｉｉおよびｄｉｉ）神経フィラメント（赤）を発現している。全細胞はＤＡＰＩ（青）を使用して視覚化された。画像は、×１０または×２０倍で撮られた。
【０１１１】
（図６）図６は、神経型分化に方向付けられたヒトＥＳ細胞の非ニューロン系列の評価を示す図である。１５日目に回収された分化細胞は、評価するために非ニューロン系列に関連するマーカーで並行して染色された。（ａｉ）培地のみで増殖された細胞の小集団は、α平滑筋アクチン（中胚葉）発現（赤）を示したが、しかし（ｂｉ）ペプチドを補充された培地で培養された細胞、α平滑筋アクチン発現は評価したすべての培養物（ｎ＝３）から細胞１個でだけ検出された。（ａｉｉ）培地のみおよび（ｂｉｉ）ペプチド補充培地において１５日間分化された細胞は、内胚葉マーカーフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ｆｏｘＡ２−緑）の陽性染色を示さなかった。（ｃおよびｄ）接着未分化細胞を３つの系列についての陽性対照として役立てるために１５日間過増殖させることによって分化を誘導された。並行するこれらの細胞の免疫蛍光分析は、陽性対照試料での（ｃ）広範なα平滑筋アクチン発現（赤）および（ｄ）ｆｏｘＡ２（緑）の陽性核免疫反応性を示す。全細胞はＤＡＰＩ（青）を使用して視覚化された。
【０１１２】
（図７）図７は、（ａ）培地のみまたは（ｂ）ペプチド補充培地中で（７日間）培養されたヒトＥＳ細胞を（特殊な培地＊を使用して）ニューロン系列に分化させたことを示す図である。細胞は２１および２８日目に回収され、ニューロンのマーカーについて評価された。（ａｉおよびｂｉ）２１日目の神経フィラメント（赤）およびβＩＩＩ−チューブリン（緑）ならびに（ａｉｉおよびｂｉｉ）２８日目のＭＡＰ２（緑）の陽性二重免疫反応性。全細胞はＤＡＰＩ（青）を使用して視覚化された。（ｉｉｉ−ｖ）ニューロン型の位相差画像（２１〜３１日目）。
【０１１３】
（図８）図８は、（ａ）培地のみまたは（ｂ）ペプチド補充培地中で（７日間）培養されたヒトＥＳ細胞を（特殊な培地＊を使用して）グリア系列に分化させたことを示す図である。細胞は２１および２８日目に回収され、グリア細胞サブセットのマーカーについて評価された（ｉ）星状細胞の位相差画像（２１日目）。（ｉｉ）２１日目のＡ２Ｂ５（赤）（初期星状細胞マーカー）および（ｉｉｉ）２８日目のＧＦＡＰ（赤）（汎星状細胞マーカー）の陽性免疫反応性。（ｉｖ）オリゴデンドロサイト様細胞の位相差画像。（ｖ）２１日目のＯ４（緑）（オリゴデンドロサイト前駆体細胞マーカー）の陽性免疫反応性。全細胞はＤＡＰＩ（青）を使用して視覚化された。（ｃ）グリア分化培地＊中で２１日間培養された細胞についてＲＴ−ＰＣＲ分析が実施された。（１）培地１のみ、（２）培地１＋ペプチド（３）陽性（血清）対照（４）陰性対照（−ＲＴ）（５）陰性（鋳型不含対照）。
【０１１４】
（図９）この図は、多能性ｈｉＰＳＣ中の細胞間接着におけるＥ−カドヘリンの効果を例示する図である。ヒトｉＰＳ細胞は；（Ａ）ペプチドＡ、（Ｂ）Ｅ−カドヘリン中和抗体、（Ｃ）ペプチドＣ、（Ｄ）ペプチドＢおよび（Ｅ）対照（水のみ）のいずれかを補充された標準的接着フィーダー不含条件下でＭＴｅｓＲ完全培地中で４８時間培養された。位相差画像は、ｈｉＰＳＣの典型的な緻密な「コロニー」形態（Ｅに示す）と比較してペプチドＡおよびＥ−カドヘリン中和抗体（それぞれＡおよびＢ）と共に培養された場合に、細胞間接着の喪失が、大部分の細胞（＞８５％）において達成されていることを示している。対照的にペプチドＢの存在下で培養された細胞は、ｈｉＰＳＣ（１Ｄ）の典型的な緻密な形態を保持している。ペプチドＣを補充された培地中のｈｉＰＳＣの培養物は、細胞集団のおよそ５０〜６０％における細胞間接着の喪失を示しているが、これはペプチドＡまたは中和抗体と比較して顕著に低い。
【０１１５】
（図１０）この図は、Ｅ−カドヘリン阻害物質を使用するｈｉＰＳＣの神経型分化を例示する図である。分化を開始するためにコンフルエント未分化ｈｉＰＳ細胞は解離され、Ｅ−カドヘリン−阻害物質を補充された／補充されていない分化培地中で７日間ゼラチンコートウエルに低密度で播種された。これらの細胞の表現型を同定するために、培養物は７日目に回収され、神経前駆体細胞マーカー、ネスチンの免疫蛍光分析が実施された。細胞を（Ａ）ペプチドＡ、（Ｂ）中和抗体、（Ｃ）ペプチドＣ、（Ｄ）ペプチドＢおよび（Ｅ）対照で７日間毎日処置された。低倍率拡大（×１０）は、ＤＡＰＩ（青）を使用して染色された全核を有するネスチン陽性細胞（緑）の分布を示している。（ＩＩ）培地中で培養されたネスチン陽性細胞の数の定量は、中和抗体（８９％）、ペプチドＣ（７６％）、ペプチドＢ（３３％）および対照（６３％）を補充された培地と比較して、細胞がペプチドＡ（９４％）中で培養された場合に最大であった。
【実施例】
【０１１６】
実験結果研究１
１  材料および方法
１．１  マウスＥＮＰＳ細胞の接着培養
マウスＥ−カドヘリン陰性多能性幹細胞（ＥＮＰＳ）細胞はＤｒ  Ｗａｒｄによって誘導され（未公開データ）、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）（１×）、および５０μＭ  ２−メルカプトエタノール（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）ならびに１，０００ユニット／ｍｌ  ＬＩＦ（ＥＳＧＲＯ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を補充されたノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）でのゼラチン処置プレート上で、３７℃、５％  ＣＯ２で他に述べる場合を除いて培養された。培地は４８時間ごとに補充され、細胞はコンフルエンス（２日間）前に継代された。ゼラチン処置プレートは滅菌ｄｄＨ２Ｏ中０．１％ｗ／ｖゼラチン（Ｓｉｇｍａ）の組織培養処置プレート（Ｇｒｉｅｎｅｒ−Ｂｉｏ）への添加によって作製され、４℃で一晩インキュベートされた。
【０１１７】
１．２  マウスＥＮＰＳ細胞の懸濁培養
マウスＥＮＰＳ細胞はトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）を使用して接着培養から解離され、１２５ｍｌ三角振とうフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中の分化培地（１０％血清（３：７分割ＦＢＳ：ＫＳＲ）、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸（１００×、１：１００希釈）、５０μＭ  ２−メルカプトエタノールを補充されたノックアウトＤＭＥＭ）２５ｍｌに１ｍｌあたり生細胞１．０Ｅ５個／ｍｌ（ｖｃ／ｍｌ）で振とうフラスコに播種され、振とうプラットホームで３７℃／５％  ＣＯ２（１’’軌道１４０ｒｐｍ；Ｓａｔｏｒｉｕｓ、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）、１４０ｒｐｍで１５日間撹拌された。細胞計数および培地補充は７２時間ごとに実施された。
【０１１８】
１．３  フィーダー不含接着培養における未分化ヒトＥＳ細胞の維持
ヒトＥＳ細胞株、ＨＵＥＳ７（継代数３９〜４４）、Ｈ９（継代数５０〜５５）およびＭＡＮ７（継代数１８〜２１）を分化の誘導前に接着フィーダー不含培養条件下で増殖させた。細胞はＤＭＥＭ／Ｆ−１２＋ＧｌｕｔａＭＡＸ、８ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ塩基性因子（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）  ｈＥＳＣ  ＳＦＭ増殖補充物（１×）、１．８％  ＢＳＡおよび０．１ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを含むＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  −完全培地）中で培養された。細胞はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）−（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３５６２３４）またはＧｅｌｔｒｅｘ（商標）−（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２７６０−０２１）のいずれかでコートされた組織培養グレードプレートで培養された。Ｍａｔｒｉｇｅｌ処置プレートは予め希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中１：１００）でコートされ、使用前に室温でインキュベートされた。Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）コートプレートは予め希釈したＧｅｌｔｒｅｘ（商標）（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中１：２９）でコートされ、使用前に１時間、３７℃でインキュベートされた。培地は２４時間ごとに補充され、細胞はコンフルエンスで継代された。望まれない残存マウス線維芽細胞フィーダー細胞を除去するためにすべての細胞は最少で２継代数フィーダー不含培養物として増殖された。細胞は使用されたＥＳ細胞株に応じてトリプシン−ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ）またはコラーゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ−１ｍｇ／ｍｌ最終濃度）を使用して解離された。
【０１１９】
１．４  接着培養におけるヒトＥＳ細胞の分化
コンフルエント未分化細胞は解離され、Ｄｅｖｅｍｙ  ＆  Ｂｌａｓｈｕｋ  （２００９）に公開のとおり、分化培地のみ（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１×）（ＰＡＡ）での０．１％ｗ／ｖゼラチンコートウエルに低密度で（細胞２．０Ｅ５個／９６２ｍｍ２）、Ｅ−カドヘリン阻害ペプチド（Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−ＮＨ２、＞９５％純度、酢酸塩バックグラウンド）（Ｂａｃｈｅｍ）での培地補充の２４時間前に播種された。ペプチドはヒトＥ−カドヘリンの阻害のための実行濃度５００μＭで滅菌ｄｄＨ２Ｏ（２０ｍＭ保存濃度）中３０ｍｇ／ｍｌに再構成された。培地（およびペプチド）は２日ごとに６〜７日間補充された。この後、ペプチドはもはや必要ではない。神経前駆細胞およびさらなる成熟神経系細胞についての形態学的分析およびマーカーでの免疫染色は一連の分化プロトコールの際に実施された。
【０１２０】
１．５  ヒト神経前駆細胞の増殖
神経前駆細胞（ＮＰＣ）の自己再生を維持するために７日目以後培養物は新鮮ゼラチンコートプレートに移され、増殖培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２  Ｇｌｕｔａｍａｘ、１０％ＦＢＳ（両方ともＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、８ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ塩基性因子（Ｐｅｐｒｏｔｅｃ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１×）（ＰＡＡ）で培養された。培地は２〜３日ごとに補充され、細胞は＜７０％コンフルエンスを維持するように分割された。
【０１２１】
１．６  成熟神経およびグリア制限系列への分化
未成熟ニューロン／ＮＰＣをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから商業的に入手可能な確立されたプロトコール細胞培養培地を使用して分化させた。簡潔には、コンフルエントＮＰＣ（４．５〜５．５×１０５／９６２ｍｍ２）はトリプシンＥＤＴＡを使用して解離され、関連分化培地中の０．１％ｗ／ｖゼラチン処置６−ウエルプレート（他に述べる場合を除く）に再播種された。培地は２／３日ごとに補充された。培養物を＞２１日間増殖させた。追加的に、３種すべての体細胞系列についての陽性対照として役立てるために、未分化ヒトＥＳ細胞培養物は１０％ＦＢＳの存在下での高コンフルエント培養物によって自発的に分化誘導された。
【０１２２】
１．６．１  グリア分化
１．６．１．１  星状細胞分化
コンフルエントＮＰＣ（４．５〜５．５×１０５／９６２ｍｍ２）はトリプシンＥＤＴＡを使用して解離され、Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）コート６−ウエルプレートに再播種され、ＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ、Ｎ２、１％ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシン（１×）（ＰＡＡ）で培養された。培地は２／３日ごとに補充された。培養物は＞２１日間増殖された。
【０１２３】
１．６．１．２  オリゴデンドロサイト分化
コンフルエントＮＰＣ（４．５〜５．５×１０５／９６２ｍｍ２）はトリプシンＥＤＴＡを使用して解離され、Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標）コート６−ウエルプレートに再播種され、神経基礎（Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ）培地、Ｂ２７（１×）、安定グルタミン（１×）（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｔ３（３０ｎｇ／ｍｌ  Ｓｉｇｍａ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１×）（ＰＡＡ）で培養された。培地は２／３日ごとに補充された。培養物は＞２１日間増殖された。
【０１２４】
１．６．２  神経型分化
組織培養グレードプレートはポリ−Ｌ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ−２０μｇ／ｍｌ）を使用して一晩、室温で予めコートされた。過剰なポリ−Ｌ−オルニチンは除去され、細胞培養前にプレートはラミニンで４時間、３７℃（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−１０μｇ／ｍｌ）でコートされた。コンフルエントＮＰＣ（４．５〜５．５×１０５／９６２ｍｍ２）はトリプシンＥＤＴＡを使用して解離され、１０μｇ／ｍｌラミニン処置６−ウエルプレートに再播種され、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ（登録商標）培地、Ｂ２７（１×）、安定グルタミン（１×）、非必須アミノ酸（１×）（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（１×）（ＰＡＡ）で培養された。培地は２／３日ごとに補充された。培養物は＞２１日間増殖された。
【０１２５】
１．７  免疫蛍光画像化
細胞は４％ｗ／ｖパラホルムアルデヒドで固定され、その場所で染色された（Ｍｏｈａｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ、２０１０）。一次抗体は次のとおり；マウス抗ネスチン（１：２５０）、マウス抗ニューロン特異的β−ＩＩＩチューブリン（β−ＩＩＩ  ＴＵＢ）（１：１０００）マウス抗ＮＥＵＲＯＤ１（１：００）、ウサギ抗ＰＡＸ６（１：１００）、マウス抗α平滑筋アクチン（ＡＳＭＡ）（１：５０）、ヤギ抗ＦＯＸＡ２（１：５０）、マウス抗ビメンチン（１：２０），ウサギ抗ＭＡＰ２（１：２００）、マウス抗Ａ２８５（１：５００）、ニワトリ抗ＧＦＡＰ（１：５００）（すべてＡｂｅａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）、ウサギ抗神経フィラメント（１：５００）（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびマウス抗Ｏ４（１：５００）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒｓ４８８または５４６でコンジュゲートした適切な二次抗体が使用され（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）、すべての試料はＤＡＰＩベクターシールド（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｐｅｔｅｒｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）を使用してマウントされた。細胞はＬｅｉｃａ  ＤＭ５００蛍光顕微鏡下で観察された。
【０１２６】
１．８  蛍光フローサイトメトリー分析
細胞は解離緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）を使用して接着培養から解離された。簡潔には、細胞はＰＢＳで洗浄され、１％ｗ／ｖパラホルムアルデヒド中、１０分間、室温で固定され、７０％ｖ／ｖ氷冷メタノールを使用する−２０℃、３０分間の細胞浸透が続いた。細胞は一次抗体、抗マウスネスチン（１：１００  Ａｂｅａｍ）またはＩｇＧ対照アイソタイプを含有するＰＢＳ中の０．２％ｗ／ｖ  ＢＳＡに再懸濁され、３０分間、氷上でインキュベートされた。細胞は洗浄され、適切なフィコエリトリンコンジュゲート二次抗体（１：１００  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚバイオテクノロジー）に再懸濁され、３０分間、氷上でインキュベートされた。細胞は洗浄され、１％ｗ／ｖパラホルムアルデヒド中に再固定された。細胞蛍光はＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｌｉｂｅｒを使用して分析された。生細胞を前方および側方散乱を使用してゲート開閉し、すべてのデータがこの集団からの細胞を表した。
【０１２７】
１．９  ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）をメーカーの説明書に従って使用して細胞から全ＲＮＡは単離された。ＲＮＡ調製物はＮａｎｏｄｒｏｐ  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ  （Ｌａｂｔｅｃｈ  Ｉｎｔｌ．、Ｅ．Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）を使用して２６０ｎｍ（Ａ２６０）での吸光度によって定量された。ｃＤＮＡの合成はＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｈｉｇｈ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ＲＮＡ  ｔｏ  ｃＤＮＡキットをメーカーの説明書により１μｇ  ＲＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して使用して実施された。ＰＣＲは１μｌのｃＤＮＡを使用し、最適アニーリング温度、３５サイクルで実施された。試料は４００ｎｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含有する２％ｗ／ｖアガロースゲル上で実行され、Ｌａｂｗｏｒｋｓ４ソフトウェア（ＵＶＰ、ＣＡ、ＵＳＡ）を備えるＥｐｉ  Ｃｈｅｍｉ  ＩＩ  Ｄａｒｋｒｏｏｍ  ａｎｄ  Ｓｅｎｓｉｃａｍ  ｉｍａｇｅｒを使用して視覚化された。プライマー配列およびアニーリング温度は、下の表に示すとおりであった。
【０１２８】
【表１】
2015536143.tif 000003
【０１２９】
２  結果
２．１  手動流加培養振とうフラスコでのＥＮＰＳ細胞の分化
未分化ＥＮＰＳ細胞は懸濁培養の前に標準的接着培養条件下で維持された。３回重複でフラスコは２５ｍｌ分化培地中の１×１０５ｖｃ／ｍｌで接種され、１４０ｒｐｍで撹拌された。最適細胞播種密度は、Ｍｏｈａｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ  （２０１０）において以前実証された。フラスコは７２時間ごとに試料採取され、生細胞数が決定された（図１ａ）。平均生細胞数は、懸濁培養中で３日後にピーク（１．１９×１０６  ｖｃ／ｍｌ）になり１５日の培養期間にわたって７．６５×１０５ｖｃ／ｍｌに減少した。これは細胞生存率にも反映され、それにより全細胞生存率は培養物で３日後にピークになった（平均生存率７７±６．３％）。しかし、３日目から細胞生存率における顕著な減少が観察された（実験期間について平均生存率２１±７％）。値は、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３を表す。ＥＮＰＳ細胞はＦＢＳを加えないことを除いて上に記載のとおり培養されたが、細胞の大部分は３日目まで生存していなかった。位相差顕微鏡（図１ｂ、×２０倍）は、振とうフラスコ培養で維持された細胞は分散増殖を有し、および６日目までに細胞塊（ｃｅｌｌ  ｓｐｈｅｒｅ）の形成が観察されることを示している。１５日目に細胞はゼラチン処置プレートに移され、分析の前に一晩接着された。培養形態は、これらの細胞が神経系細胞型と類似の形態を示し、それ自体が接着し、ニューロン様突起を示すことを示している。
【０１３０】
２．２  分化したＥＮＰＳ細胞の特徴付け
１５日間手動流加培養で増殖させたＥＮＰＳ細胞が神経表現型であるかどうかを決定するために、本発明者らはニューロン系列の多数のマーカーの発現を検討した。１５日間振とうフラスコで増殖させたＥＮＰＳ細胞はゼラチンコートプレートに蒔かれ、分化培地中で通例の培養条件下で２４時間接着された。位相差画像は、線維束を形成する主な細胞体（塊）から突き出している神経様突起を示している（図２ａ）。ＥＮＰＳ細胞の分化した表現型をネスチン；β−ＩＩＩチューブリン、ＮＥＵＲＯ−Ｄ１、神経フィラメントおよびＰＡＸ６に対する陽性免疫反応性を有するタンパク質レベルで検証した（それぞれ図２（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ））。これらの結果は、手動流加培養振とうフラスコで１５日間にわたって培養されたＥＮＰＳ細胞が神経系細胞型に付随するマーカーを発現することを実証している。
【０１３１】
２．３  接着培養におけるヒトＥＳ細胞の分化は神経前駆細胞を形成する
ヒトＥＳ細胞株ＨＵＥＳ７、Ｈ９およびＭＡＮ７を標準的接着フィーダー不含培養条件で分化の誘導前増殖させた、典型的培養形態を図３ａおよびｂに示す。分化を開始するためにコンフルエント未分化細胞は解離され、分化培地のみ（図３ａ）またはＥ−カドヘリン阻害ペプチドを補充された培地（図３ｂ）でのゼラチンコートウエルに低密度で播種された。位相差画像は、培地のみで６〜７日間培養された細胞の大部分が平板化した「ギザギザの」形態（分化している細胞に伴う）を示すが、未分化細胞のわずかなコロニーが残っていることを示している（図３ａｉｉ）。ペプチドを補充された培地で６〜７日間培養された細胞は、類似の形態を示すが、未分化コロニーは観察されなかった（図３ｂｉｉ）。これらの細胞の表現型を同定するために、培養物は７日目に回収され、神経前駆細胞マーカーの免疫蛍光分析が実施された。培地のみで分化した細胞は、高い割合の細胞において陽性ネスチン（緑）（図３ａｉｉｉ）およびビメンチン（緑）（図３ａｉｖ）発現を示すが、ペプチドの存在下で培養された細胞はネスチンおよびビメンチンの均質な発現を示す（それぞれ図３ｂｉｉｉおよび３ｂｉｖ）。すべての細胞は、ＤＡＰＩ（青）を使用して視覚化された。培地のみで培養されたネスチン陽性細胞の数の定量は、ペプチドを補充された培地中の分化の７日後の９５．３±％と比較して７１．１±２．２％であった（図４ａ、ｎ＝３）。培養７日後にペプチドを除去し、ＥＳ由来神経前駆細胞は分化培地のみでさらに２１日間増殖された。位相差画像は、培地のみおよびペプチド補充培地で増殖させた細胞において９日目に神経系細胞系列に関連する典型的形態を示している（それぞれ図５ａｉおよびｂｉ）。培養物はニューロンマーカーの二重免疫蛍光のために９日目に回収された。培地のみで増殖させた細胞は、ネスチン（赤）を発現し、β−ＩＩＩチューブリン（緑）を発現し始めているが、少ない割合の陰性細胞（青）がまだ観察できる（図５ａｉｉ）。ペプチド補充培地に由来する細胞は、均一なレベルのネスチン（赤）およびβ−ＩＩＩチューブリンの線維状発現（緑）（図５ｂｉｉ）を発現する。培地のみ（図５ｃｉおよびｃｉｉ）ならびにペプチド補充培地（図５ｄｉおよびｄｉｉ）の両方で１２〜１５日間分化させた細胞の免疫蛍光画像分析は、汎神経コミットメントのマーカーを発現し；ニューロン特異的β−ＩＩＩチューブリン（緑）および神経フィラメント（赤）発現が培地のみ由来の神経前駆細胞中に観察できるが、陰性細胞も観察できる（それぞれ図５ｃｉおよびｃｉｉ）。ペプチド含有培地由来の神経前駆細胞は、β−ＩＩＩチューブリン（図５ｄｉ）および神経フィラメント（図５ｄｉｉ）のさらに成熟した線維状発現を発現している。全細胞はＤＡＰＩ（青）を使用して視覚化された。
【０１３２】
２．４  他の体細胞型の顕著な混入を伴わない神経細胞の単離
１５日目に回収された分化細胞は非ニューロン系列に関連するマーカーで並行して染色された。培地のみに由来する細胞の小集団は、α平滑筋アクチン（中胚葉）発現（赤）を示したが（図６ａｉ）、ペプチドを補充された培地由来の細胞では、α平滑筋アクチン発現は評価したすべての培養物から細胞１個でだけ検出された（図６ｂｉ）（ｎ＝３）。さらに、１５日間分化させた培地またはペプチド処置細胞は、内胚葉マーカー、フォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ｆｏｘＡ２−緑）の陽性染色を示さなかった（それぞれ図６ａｉｉおよびｂｉｉ）。接着未分化細胞を３種すべての体細胞系列についての陽性対照として役立てるために高コンフルエント培養によって血清存在下、１５日間、分化させた。並行してこれらの細胞の免疫蛍光分析は、強いα平滑筋アクチン発現（赤）（図６ｃ）およびｆｏｘＡ２（緑）に対する陽性核免疫反応性（図６ｄ）を実証している。全細胞はＤＡＰＩ（青）を使用して視覚化された。
【０１３３】
２．５  ヒトＥＳ細胞由来神経前駆体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで長期間自己再生できる。
ペプチド補充培地中で７日間いずれかの分化を誘導された神経前駆細胞は、ネスチン発現の蛍光フローサイトメトリー分析によって決定されたとおり８ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ２の存在下で培養された場合に長期間（９０日間）自己再生できる（図４ｂ）。
【０１３４】
２．６  ＥＳ細胞由来神経前駆細胞の分化は３種すべてのＣＮＳ系列を生成する。
ＥＳ細胞由来神経前駆細胞が接着培養において成熟神経細胞型を形成できるかどうかを決定するために、本発明者らは多数のグリアおよび神経限定マーカーを検討した。（ａ）培地のみまたは（ｂ）ペプチド補充培地で（７日間）培養されたヒトＥＳ細胞は規定の培地中で培養することによってグリア系列への分化を誘導され、Ｇｅｌｔｒｅｘ−コートプレートに蒔かれた。細胞は２１および２８日目に回収され、グリア細胞サブセットのマーカーについて評価された。培地のみ（図７ａｉ）およびペプチド補充培地（図７ｂｉ）に由来する神経前駆細胞由来の星状細胞（２１日目）の位相差画像。細胞だけ（それぞれ図７ａｉｉおよびａｉｉｉ）ならびにペプチド由来細胞（図７ｂｉｉおよび７ｂｉｉｉ）の培地中での２１日目のＡ２Ｂ５（赤）、初期星状細胞マーカーおよび２８日目のＧＦＡＰ（赤）汎星状細胞マーカーの陽性免疫反応性。ペプチド補充培地由来細胞がタンパク質のさらに線維性の局在を示すことは注目される。培地のみ（図７ａｉｖ）およびペプチド補充培地（図７ｂｉｖ）に由来する神経前駆細胞からのオリゴデンドロサイト細胞の位相差画像。２１日目のＯ４（緑）（オリゴデンドロサイト前駆体マーカー）の陽性免疫反応性はすべての処置において広範に見られた（図７ａｖおよびｂｖ）。全細胞はＤＡＰＩ（青）を使用して視覚化された。分化した表現型は、グリア分化培地中で２１日間培養された細胞でのＲＴ−ＰＣＲによってＧＦＡＰ（星状細胞）、Ｓβ１００（星状細胞）、ＯＬＩＧＯ２（オリゴデンドロサイト）およびＧＡＰＤＨ（ハウスキーピング）の転写物発現分析によってさらに確認された（図７ｃ）。
【０１３５】
神経型分化は規定の分化培地での培養およびオルニチン／ラミナ基質に２１〜２８日間蒔くことによって誘導された。培地のみおよびペプチド補充培地（それぞれ図８ａｉおよびｂｉ）に由来する神経前駆細胞の２１日目の神経フィラメント（赤）およびβＩＩＩ−チューブリン（緑）ならびに２８日目のＭＡＰ２（緑）（図８ａｉｉおよびｂｉｉ）の陽性二重免疫反応性。全細胞はＤＡＰＩ（青）を使用して視覚化された。位相差画像は、培地のみ（図８ａｉｉｉ−ａｖ）およびペプチド補充培地（図８ｂｉｉｉ−ｉｖ）に由来する神経前駆細胞からの異なるニューロンサブタイプ（２１〜３１日目）の存在を示している。しかし形態は、運動ニューロンの存在を示唆しており、ＴＨ−陽性細胞は検査したいかなる細胞株においても培養後４０日間は検出できなかった。
【０１３６】
実験結果研究２
さらなる研究が本発明の種々の態様における使用のためのＥ−カドヘリン活性の阻害物質の適合性範囲を例示するために実行された。２個の対照（ペプチドＢおよび水）と共に本研究で使用されたＥ−カドヘリン活性の阻害物質は次のとおりであった：
１．ペプチドＡ＊−ＳＷＥＬＹＹＰＬＲＡＮＬ（細胞間接着を阻害する１２アミノ酸長）
２．ペプチドＢ＊−ＳＲＥＬＹＹＰＬＲＡＮＬ（ＷがＲによって置き換えられた１２アミノ酸長、細胞間接着を変化させないが、いくらかの細胞性効果を有する）．
３．ペプチドＣ−ＳＷＥＬＹＹＰＬ（７アミノ酸長、細胞間接着を阻害する、Ａと比較して低い効果）．
４．Ｅ−カドヘリン中和抗体（ＳＨＥ７８．７クローン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １３−５７００から入手可能）
５．実験用ビヒクル対照（水）。
【０１３７】
方法
多能性ヒトｉＰＳ細胞の培養
ヒトｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣ）は接着フィーダー不含培養条件下で増殖された。望まれない残存マウス線維芽細胞フィーダー細胞を除去するためにすべての細胞を最少で２継代数フィーダー不含培養物として増殖させた。細胞はＭＴｅｓＲ完全培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養された。細胞はＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３５６２３４）コート組織培養グレードプレートで培養された。Ｍａｔｒｉｇｅｌ処置プレートは予め希釈したＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中１：１００）でコートされ、使用前に室温でインキュベートされた。培地は２４時間ごとに補充され、細胞はコンフルエンスに応じて継代された。細胞はトリプシン−ＥＤＴＡを使用して解離された。
【０１３８】
神経系細胞開始の際のＥ−カドヘリン阻害物質補充
ヒトｉＰＳＣを既に記載のとおり分化させた。ペプチドＡ、ＢまたはＣは培地に最終濃度１ｍＭで補充され、Ｅ−カドヘリン中和抗体は培地に２μｇ／ｍｌで毎日６〜７日間補充された。当量の水がビヒクル対照として培養物に加えられた。
【０１３９】
他のすべての方法は、神経の分化および得られた神経前駆体細胞（ＮＰＣ）の特徴付けとの関連で上に概説のとおり実施された。上で言及した追加的補充は、多能性ｈｉＰＳＣがＳｔｅｍＰｒｏ培地において十分に生存しないことから用いられる。したがって本様式での補充は、ｉＰＳＣなどの多能性幹細胞に実行する際の本発明の方法の好ましい実施形態であってよい。
【０１４０】
結果
下に記載の結果は図９および１０に例示される。
【０１４１】
多能性ｈｉＰＳＣにおける細胞間接着へのＥ−カドヘリンの効果
ヒトｉＰＳ細胞を分化の誘導前に標準的接着フィーダー不含培養条件下で増殖させた。図９は、（Ａ）ペプチドＡ、（Ｂ）Ｅ−カドヘリン中和抗体、（Ｃ）ペプチドＣ、（Ｄ）ペプチドＢおよび（Ｅ）対照を補充された培地において４８時間増殖させた細胞の典型的培養形態を示している。位相差顕微鏡画像は、ペプチドＡおよびＥ−カドヘリン中和抗体と共に培養された場合に細胞間接着の喪失が大部分の細胞（＞８５％）において達成されることを示しており（それぞれ図９ＡおよびＢに示す）、ｈｉＰＳＣの典型的な緻密な「コロニー」形態と比較して細胞は、ほとんどは単一の細胞であるようである（図９Ｅに示す）。これらの結果から、ペプチドＢの存在下で培養された細胞が、細胞間接着の喪失を伴うことなくｈｉＰＳＣの緻密な形態を保持している（図９Ｄに示す）ことは明らかである。ｈｉＰＳＣの培養物は、ペプチドＣの存在下でおよそ５０〜６０％の細胞集団において細胞間接着の喪失を示しているが、しかしこれは、ペプチドＡまたは中和抗体と比較して顕著に低い。
【０１４２】
接着培養におけるヒトｉＰＳ細胞の分化は神経系前駆体細胞を形成する
分化を開始させるために、コンフルエント未分化細胞は解離され、Ｅ−カドヘリン阻害物質を補充された／されていない分化培地で低密度でゼラチンコートウエル中に７日間播種された。これらの細胞の表現型を同定するために、培養物は７日目に回収され、神経前駆体細胞マーカー、ネスチンの免疫蛍光分析が実施された（図１０）。
【０１４３】
（Ｉ）ヒトｉＰＳ細胞は（Ａ）ペプチドＡ、（Ｂ）中和抗体、（Ｃ）ペプチドＣ、（Ｄ）ペプチドＢおよび（Ｅ）対照で６〜７日間毎日処置された。低倍率拡大（×１０）は、ＤＡＰＩ（青）を使用して染色された全核を含むネスチン陽性細胞（緑）の分布を示している。ネスチン陽性細胞はすべての処置において観察できるが、ペプチドＡ（Ａ）の存在下で培養された細胞はネスチン陽性細胞の最も高い均一な割合を示し、これは分化の際に望まれない細胞型への可能性を制限することにおいて重要である。Ｅ−カドヘリン中和抗体（Ｂ）で処置された細胞もネスチン陽性細胞の大きな割合を示し、ペプチドＣ（Ｃ）での処置も同様であった。しかし、ペプチドＢ（細胞間接着の喪失を引き起こさない）の存在下で培養された細胞（Ｄ）は、ネスチン陽性細胞（対照細胞（Ｅ）を含む）の全体に最低の割合を示した。（ＩＩ）ネスチン陽性細胞の数の定量を図表に示し、細胞がペプチドＡ（９４％）を補充された培地で培養された場合に；中和抗体（８９％）、ペプチドＣ（７６％）、ペプチドＢ（３３％）および対照（６３％）を補充された培地と比較して最大であった。ペプチドＣの存在下でｈｉＰＳＣが培養された場合にネスチン陽性細胞の数に結果の変動があったことは注目されなければならず、一例はネスチン陽性細胞およそ５０％だけを示した。この変動性は、細胞集団の大部分からのＥ−カドヘリンの抑制の失敗に至る場合がある（図１Ｃを参照されたい）。
【０１４４】
Ｅ−カドヘリン中和抗体を使用して達成できる結果が、神経系前駆体細胞（８９％ネスチン陽性細胞）も豊富にすることを示し、それにより本発明の方法における使用のために好適であることは注目されるべきである。しかし比較的安価の非抗体ペプチド阻害物質は、商業的には考慮すべき有利点を提供できる。
【０１４５】
例えば本研究を実施する場合、Ｅ−カドヘリン中和抗体を使用する場合の培地１ｍｌあたり５．７０ポンドと比較して、ペプチドＡは培地１ｍｌあたり０．６３ポンドの費用である。
[表２−１]
ヒトE-カドヘリン配列
配列番号23 DNA配列  −  NCBI NM_00436D  
2015536143.tif 000004
[表２−２]
配列番号23続き
2015536143.tif 000005
[表２−３]
配列番号23続き
2015536143.tif 000006
[表３−１]
配列番号4 タンパク質配列  −  NCBI AAY68225
2015536143.tif 000007
[表３−２]
配列番号4続き
2015536143.tif 000008
[表４−１]
マウスE-カドヘリン
配列番号25 DNA配列  −  NCBI BC098501由来
2015536143.tif 000009
[表４−２]
配列番号25続き
2015536143.tif 000010
[表５]
配列番号24 タンパク質配列  −  NCBI NP_033994由来
2015536143.tif 000011
[表６−１]
配列番号５  Ｓｌｕｇ−ヒト
2015536143.tif 000012
配列番号２２  Ｓｌｕｇ−マウス
2015536143.tif 000013
配列番号６  Ｓｎａｉｌ−ヒト
2015536143.tif 000014
配列番号７  Ｓｎａｉｌ−マウス
2015536143.tif 000015
配列番号８ ＳＩＰ１−ヒト
2015536143.tif 000016
[表６−２]
配列番号８続き
2015536143.tif 000017
[表７]
配列番号９  ＳＩＰ１−マウス
2015536143.tif 000018
2015536143.tif 000019
[表８]
配列番号10 E2A-ヒト-アミノ酸配列
2015536143.tif 000020
[表９−１]
配列番号11 E2A-ヒト-DNAコード配列
2015536143.tif 000021
[表９−２]
配列番号11続き
2015536143.tif 000022
[表９−３]
配列番号11続き
2015536143.tif 000023
[表１０−１]
配列番号12 E2A-マウス-アミノ酸配列
2015536143.tif 000024
[表１０−２]
配列番号12続き
2015536143.tif 000025
[表１１−１]
配列番号13 E2A-マウス-DNAコード配列
2015536143.tif 000026
[表１１−２］
配列番号13続き
2015536143.tif 000027
[表１２]
2015536143.tif 000028
［表１３］
2015536143.tif 000029
【図１】
2015536143.tif 000030
【図２】
2015536143.tif 000031
【図３】
2015536143.tif 000032
【図４】
2015536143.tif 000033
【図５】
2015536143.tif 000034
【図６】
2015536143.tif 000035
【図７】
2015536143.tif 000036
【図８】
2015536143.tif 000037
【図９Ａ】
2015536143.tif 000038
【図９Ｂ】
2015536143.tif 000039
【図１０】
2015536143.tif 000040
【配列表】
2015536143000001.xml
【国際調査報告】
2015536143.tif 000067
2015536143.tif 000068
2015536143.tif 000069
2015536143.tif 000070
2015536143.tif 000071