(57)【要約】  食物、呼吸器又は接触アレルゲンに起因するアレルギーの症状を軽減するための組成物であって、特定のラクトバチルス・ヘルベティカス株を含む組成物が提供される。好ましくは、組成物は、アレルギーの症状を軽減（二次予防）し、また、感作の軽減（一次予防）も可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
食物、呼吸器又は接触アレルゲンによって引き起こされるアレルギーを有する患者においてアレルギー症状を軽減するのに使用するための組成物であって、少なくとも１種のラクトバチルス・ヘルベティカス株を含み、前記菌株は、ラクトバチルス・ヘルベティカスＮＣＣ１１７６、ラクトバチルス・ヘルベティカスＮＣＣ７１４、又はそれらの組み合わせである、組成物。
【請求項２】
食物、呼吸器又は接触アレルゲンによって引き起こされるアレルギー反応に対する二次予防を提供する、請求項１に記載の使用のための組成物。
【請求項３】
前記食物、呼吸器又は接触アレルゲンへの前記患者の感作に対して効果を有する、請求項１又は２に記載の使用のための組成物。
【請求項４】
乾燥組成物１グラム当たり１０５〜１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）のラクトバチルス・ヘルベティカス及び／又は１日用量当たり１０６〜１０１３コロニー形成単位（ＣＦＵ）のラクトバチルス・ヘルベティカスを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項５】
少なくとも１種のプレバイオティクスを含み、好ましくはフラクトオリゴ糖を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項６】
ポリフェノールを含むリンゴ抽出物を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項７】
穀類タンパク質及び／又は加水分解タンパク質を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項８】
後年における他のアレルゲンへの感作を軽減する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項９】
前記症状は、胃腸症状、皮膚症状若しくは呼吸器症状、又はそれらの組み合わせである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１０】
栄養組成物、食品、飲料、食品添加物、機能性食品、ペットフード製品、乳幼児用調製乳、乳幼児用シリアル、又はベビーフードである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１１】
１〜４歳の小児に投与される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
離乳期中及び／又はその後１２か月までの乳幼児に投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
前記症状は、トリプターゼ、キマーゼ、ヒスタミン、ロイコトリエンなどの生化学的メディエーターの放出を伴う、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、アレルゲンに曝露された際のアレルギー患者のアレルギー症状を軽減するための組成物の製造におけるプロバイオティクス、特にラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）株の使用に関する。
【発明の背景】
【０００２】
アレルギーは、すべての年齢の患者の生活に影響を与える、最も頻繁に見られる健康問題の１つである。アレルギー性疾患は、今日ではＷＨＯによって流行病として認められている。アレルギーの有病率は過去数十年で増加していることが示されている。現代的な生活様式、特に都会の生活様式は、アレルギー症状の高い罹患率及びより高い重症度に関連している。
【０００３】
「アレルギー表現型」又は「アトピー」が発症すると、その後の他のアレルゲンへの感作を亢進することが示されていることから、小児期、特に幼児期におけるアレルギー感作、特に食物アレルゲンへのアレルギー感作は重大であり、関心が最も高い。すなわち、小児期におけるアレルギーは、後年に複数のアレルギーをもたらすアレルギーカスケード（「アトピーマーチ」と一般に呼ばれるプロセス）の第１ステップとなり得る。例えば、生後間もなくに持続性の食物過敏症を有する小児は、小児期後期にアレルギー性鼻炎（花粉症）又は喘息を発症するリスクが著しく高いことが、ヒトコホートにおいて実証されている（Ｏｓｔｂｌｏｍら，Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｆｏｏｄ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ８  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｌｉｆｅ．  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ａｌｌｅｒｇｙ．２００８年８月；３８巻（８号）：１３２５〜３２頁）。より軽度の形態の食物過敏症を有する小児もまた、持続性の食物過敏症を有する小児よりも程度は低いが、呼吸器アレルギーを発症する高いリスクを有する。したがって、食物過敏症の重症度を減弱することは「アトピーマーチ」を遅延させる上で重要となり得る。
【０００４】
このような状況において、アレルギーエピソードの管理及びアレルギーの予防は小児期及び乳幼児期において最も重要である。
【０００５】
乳幼児の免疫系は生後数年間活発に発達している。そのような若年の患者において、アレルギー反応に対処し、それを予防、回避、管理、軽減又は調節することは、短期にとどまらずより長期にわたって患者の以後のアレルギープロファイルに影響を与え得る。
【０００６】
アレルギーの予防は、異なるレベルで達成することができる。すなわち、
「一次予防」は、患者のアレルゲンへの感作のリスクを予防又は低減する効果であり、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体が存在しないこと又はそのレベルが低いことを特徴とする。感作を予防又は低減すると、同じアレルゲンに曝露されてもアレルギー症状が現れないか又は軽減されることになる。１種のアレルゲン又は１群のアレルゲンに関して患者がどのように感作されるかを調節すること（一次予防）によって、その後のアレルギー応答を調節することもできる。
【０００７】
「二次予防」は、１種又は複数種のアレルゲンに既に感作されている患者が該アレルゲンに再曝露された場合に、患者におけるアレルギーの症状、すなわちアレルギー反応の惹起又は強度を調節する効果である。アレルギー症状の発症又は強度を調節すること（二次予防）によって、アレルギーに伴う不自由さ及び生活の質の低下が最小限に抑えられる。
【０００８】
アレルギー予防のこのような異なる概念を前提とすると、一部の化合物は、その固有の作用機序により、上記の特定の予防レベルのいずれか一方のみで又は両方で作用すると考えられ得る。例えば、ある特定のアレルゲンへの感作をもっぱら軽減（一次予防）する化合物もあり得るし、また、もっぱら二次予防に効果があり、アレルギー反応の重症度を低減する化合物もあり得る。感作及び症状の両方に影響を与えることが可能であり、それ故、一次及び二次予防を促進するのに有効な化合物もあり得る。
【０００９】
食物アレルゲンは、乳幼児が生後間もなく遭遇する最初のアレルゲンの１つであり、典型的には、牛乳のタンパク質は、完全母乳保育を受けていない乳幼児が遭遇し得るものである。牛乳のタンパク質は実際、乳幼児期の食物アレルギーの原因の中で最も頻繁に見られるものである（卵及び小麦タンパク質がそれに続く）。概して、食物アレルギーは、乳幼児及び低年齢小児において、皮膚症状（発疹、湿疹、その他）及び胃腸症状（腹部疝痛；特に、腹部における疼痛；嘔吐）によって現れ得る。乳幼児／低年齢小児が、穀類、野菜、果実、堅果若しくは魚などの新たな食物に曝露されるか、又は樹木若しくは草の花粉、チリダニ又はペットの鱗屑などの空気アレルゲンに曝露されると、さらなる感作及びアレルギーのエピソードも惹起され得る。さらに、アレルギー反応は接触アレルゲンによっても誘発され得る。
【００１０】
低年齢小児及び乳幼児の集団において、また後年においてもアレルギー反応及び症状を軽減することが依然として必要である。このことは、腸及び免疫系の両方の成熟が低年齢小児において起こること及び低年齢小児が特に離乳前後に曝露される新たなアレルゲンの多重性を考慮すると特に重要である。
【００１１】
若年時の食物に起因するアレルギー反応の問題は、乳幼児及び低年齢小児の特定の栄養上の要求によってさらに複雑になる。カロリー摂取量、カロリー密度、種々の望ましい栄養素、タンパク質の量及びタンパク質の質はすべて、乳幼児及び低年齢小児に最も適切な栄養をもたらすのに重要な因子である。ビタミン及びミネラルなどの微量栄養素の存在も重要である（より具体的には、これらの濃度が標的患者の年齢に対応する特定の推奨範囲によって限定される場合）。そういうわけで、低年齢小児及び乳幼児については、食物送達のマトリックスは本質的に複雑であるが、多様性は少ない。すなわち、例えば、乳幼児は、潜在的にはアレルギー体質であるが、牛乳由来タンパク質のマトリックスにおいて特定のタンパク質バランスを通常必要とする。そのような複数の栄養素が存在すると、食物アレルゲンの影響は増大し得る。そのような複雑なマトリックスにおいて、単独ではアレルギー症状を引き起こすことができない穏やかな食物アレルゲンは、アレルギー反応の開始の際により強力になり得る。同様に、アレルゲンを中和するか又はアレルギー予防に影響を与え得る化合物の場合、そのような複雑な栄養マトリックスではその効果が減弱又は消滅することがあり得る。具体的には、アレルギー予防に影響を与えると通常認められている化合物が、乳幼児又は低年齢小児用の栄養組成物のような複雑なマトリックスにおいて依然として活性を有しているか、どの程度まで活性を有しているかは予測できない。
【００１２】
乳幼児及び低年齢小児の集団、あるいはアレルギーのエピソード歴がある及び／又はアレルギー体質である成人の集団において、食物又は呼吸器アレルギー症状を軽減させる必要がある。
【００１３】
乳幼児及び小児については、種々の栄養素をもたらすだけでなく、アレルギー反応の重症度を低減する完全栄養組成物を提供する必要がある。軽度から中等度の形態のアレルギーに罹患した若年患者に関しては、それらの患者は腸及び免疫系の成熟の不完全さによる特別な要求を有するため、患者のアレルギー反応を調節する栄養組成物を提供する必要がある。
【００１４】
例えば、規則的な栄養レジメンに免疫系のモジュレーターを含めるなどの栄養学的介入によって、ストリンジェントな医薬分子を許容しない低年齢小児におけるアレルギー反応を調節する必要もある。
【００１５】
呼吸器アレルギー症状を調節する必要もある。
【００１６】
離乳時は、腸管が実質的な改変を受け、新たなアレルゲン性タンパク質を潜在的に含有する新たな固形食が導入され、そのため、患者は食物アレルゲンに特に感作されやすい。そのような離乳時及びその前後の若年患者のアレルギー反応を調節する栄養組成物を提供する必要がある。
【００１７】
組成物がアレルゲンへの感作を直接軽減しない場合であっても、有効な組成物を提供することによって（場合によりインタクトなアレルゲンへの曝露を減少させることによって）アレルギー症状を緩和する必要がある。
【００１８】
アレルギーの一次予防には必ずしも影響しないが、同じアレルギーの二次予防に対してプラスの効果を有する組成物が必要である。
【００１９】
最後に、症状の軽減によって「アレルギー表現型」の減弱に寄与し、その結果、後年における新たなアレルゲンへの感作を低減することが可能な、若年患者に特に適した組成物が必要である。アトピーマーチを減弱させる必要がある。
【発明の概要】
【００２０】
第１の態様では、本発明は、食物アレルゲンによって引き起こされるアレルギーを有する患者、特に、若年患者、小児、乳児及び乳幼児において、食物に起因するアレルギー症状を軽減するのに使用するための組成物を提供する。組成物は完全栄養組成物であり得る。
【００２１】
組成物は、呼吸器アレルギーの症状を軽減するのに使用することもできる。
【００２２】
本発明の組成物は若年患者に適用可能であるが、成人患者にも良好に使用できる。
【００２３】
第２の態様では、本発明は、食物アレルゲンによって引き起こされるアレルギー反応の二次予防を促進し、場合により、同じアレルゲンに対する一次予防に影響を与えない組成物を提供する。
【００２４】
第３の態様では、本発明は、特定のプロバイオティクス、特にラクトバチルス属に属するプロバイオティクス、すなわち、Ｌ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６株及び／又はＮＣＣ７１４株を含む組成物を提供する。
【００２５】
本発明の他の態様では、本発明の組成物は、離乳時の乳幼児／低年齢小児に特に有効である。
【００２６】
本発明は、さらに、後年における他のアレルゲンへの感作の軽減に及ぶ。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ｆｉｇｕｒｅ１：Ｌ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６、ＮＣＣ２８４９、又はＮＣＣ７１４との同時培養後のＴｈ２偏向ヒトＰＢＭＣのサイトカイン分泌プロファイル。
【図２】Ｆｉｇｕｒｅ２：ＯＶＡ食物アレルギーマウスモデルの概略。
【図３】Ｆｉｇｕｒｅ３：５×１０８ＣＦＵ／ｍｌ（飲料水中）のＬ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６を摂取するマウスにおける食物アレルギーの症状の軽減を示す臨床スコアの図。記号は個々のマウスを表し、バーは中央値を示す。
【図４】Ｆｉｇｕｒｅ４：チャレンジ４時間後のマウスマスト細胞プロテアーゼ１（ＭＭＣＰ−１）の血清中濃度。記号は個々のマウスを表し、バーは中央値を示す。
【図５】Ｆｉｇｕｒｅ５：ＥＬＩＳＡによって測定された、チャレンジ４時間後の血清中のＯＶＡ特異的ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａを示すドットプロット。実線は中央値に対応する。
【図６】Ｆｉｇｕｒｅ６：ｅｘ  ｖｉｖｏで再刺激された腸間膜リンパ節（ＬＮ）リンパ球及び脾細胞によるサイトカイン産生。
【発明の詳細な説明】
【００２８】
定義：
本明細書において、以下の用語は以下の意味を有する。
【００２９】
「完全栄養組成物」。本明細書において、完全栄養組成物は、所与の年齢に推奨される相当な量（通常５０％以上）の主要栄養素を含む組成物である。そのような主要栄養素は、所与の年齢に推奨されるカロリー摂取量を提供するのに十分な量で使用される場合、通常、所与の年齢に推奨される特定の栄養素用量の５０％以上を満たす量及び割合で提供される。完全栄養組成物は、通常、タンパク質の供給源、脂質の供給源、炭水化物の供給源を、所与の年齢に対する一般的な推奨を満たすバランスのとれた割合で含む。完全栄養組成物には、通常、ビタミン、ミネラルなどの微量栄養素、並びに必須アミノ酸の供給源及び必須脂肪酸の供給源も含まれる。しかし、完全栄養組成物が、乳幼児又は低年齢小児のすべての栄養上の要求を満たす特定の栄養素のすべてを含むとは限らず、また、そのような要求を満たす推奨量のすべてを含むとは限らないことは理解される。ラクトバチルスのみを優勢な割合で含む組成物は完全栄養組成物から除外される。
【００３０】
「アレルギーの症状」には、概して、アレルゲンによって引き起こされる症状が含まれる。このような症状には、皮膚症状（皮膚の発赤、発疹、そう痒、皮膚炎、湿疹）、眼の症状（眼のそう痒及び流涙）、胃腸症状（うっ血、腹部の疼痛、疝痛、嘔吐下痢）、呼吸器症状（鼻のそう痒、鼻閉、鼻炎、喘息）が含まれ、重症例では、全身症状（めまい、精神錯乱、アナフィラキシー）が含まれる。
【００３１】
「アレルギーの一次予防」は、アレルギー性の（免疫学的な）感作の回避又は軽減、例えば、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の阻止又は低減を目的とするすべての手段を意味する。
【００３２】
「アレルギーの二次予防」は、感作された個体におけるアレルギー性疾患／アレルギー症状の発症の予防又は低減を意味する。
【００３３】
「離乳期」は、乳幼児が、純粋液体栄養から固形又は半固形食物に順応していき、ほぼ唯一の食物類型（一般的には母乳又は乳幼児用調製乳）から種々の食物に順応していく時期である。
【００３４】
「感作」は、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の誘導／発生を意味する。
【００３５】
「プロバイオティクス」は、宿主の健康又は衛生に対する有益な効果を有する、微生物細胞調製物又は微生物細胞の構成要素を意味する。（Ｓａｌｍｉｎｅｎ  Ｓ，Ｏｕｗｅｈａｎｄ  Ａ．Ｂｅｎｎｏ  Ｙ．ら，“Ｐｒｏｂｉｏｔｉｃｓ：ｈｏｗ  ｓｈｏｕｌｄ  ｔｈｅｙ  ｂｅ  ｄｅｆｉｎｅｄ”  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９年：１０巻１０７〜１０頁）。プロバイオティクスの定義は一般に認められており、ＷＨＯの定義と一致している。プロバイオティクスは、微生物の単一の菌株、種々の菌株の混合物、及び／又は種々の細菌種及び属の混合物を含み得る。混合物の場合、「プロバイオティクス」は、プロバイオティクス混合物又は調製物を指すものとしても使用できる。
【００３６】
「プレバイオティクス」は、概して、宿主の腸内に存在する微生物の増殖及び／又は活性を選択的に刺激することによって宿主に有益な影響を与え、それにより宿主の健康の改善を試みる非消化性食物成分を意味する。
【００３７】
ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌ  ヘルベティカス）株ＮＣＣ１１７６（Ｎｅｓｔｌｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  参照番号１１７６）（ＬＨ９１とも命名されている。）は、１９９１年１０月にＩＮＳＴＩＴＵＴ  ＰＡＳＴＥＵＲ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５にＣＮＣＭ  Ｉ−１１５６として寄託された。
【００３８】
ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌ  ヘルベティカス）株ＮＣＣ２８４９（Ｎｅｓｔｌｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  参照番号２８４９）は、２００８年１２月にＩＮＳＴＩＴＵＴ  ＰＡＳＴＥＵＲ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５にＣＮＣＭ  Ｉ−４０９５として寄託された。
【００３９】
ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌ  ヘルベティカス）株ＮＣＣ７１４（Ｎｅｓｔｌｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  参照番号７１４）は、１９９１年１０月にＩＮＳＴＩＴＵＴ  ＰＡＳＴＥＵＲ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５にＣＮＣＭ  Ｉ−１１５４として寄託された。
【００４０】
本発明者らは、感作された若齢の哺乳動物にＬ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６又はＮＣＣ７１４を投与するとアレルギー反応及び症状を緩和できることを証明している。この投与は、Ｌ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６又はＮＣＣ７１４を含む完全栄養組成物の形態であり得る。これは、アレルギーの二次予防に対するプラスの効果を明らかにしたものである。この効果は、若齢の哺乳動物のアレルゲンへの感作の軽減を伴っていた（すなわち、アレルギーの一次予防が証明された）。
【００４１】
注目すべきは、この効果は、全く異なる挙動を示すＬ．ヘルベティカスＮＣＣ２８４９によって証明されたため、すべてのＬ．ヘルベティカス株には一般化できないということである。すなわち、これらの知見は、プロバイオティクスの健康上の利益の菌株特異性のさらなる例である。
【００４２】
組成物の効果：
本発明は、食物、呼吸器及び／又は接触アレルゲンによって引き起こされるアレルギーを有する患者において症状を軽減するための組成物の製造における、ラクトバチルス属の微生物、より具体的にはラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌ．ヘルベティカス）、より具体的にはＬ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６株及びＮＣＣ７１４株の使用に関する。組成物は、例えば完全栄養組成物であり得る。本発明者らは、ラクトバチルス・ヘルベティカスＮＣＣ１１７６又はＮＣＣ７１４を含有する栄養組成物を摂取するマウスの群において食物アレルギーの症状を軽減する上で該ラクトバチルス株の摂取が特に顕著な効果を有することを証明している。モデルは、ヒト（典型的には乳幼児／低年齢小児）が食物アレルゲンに自然に感作され、該アレルゲンにさらに再曝露される場合の、ヒトにおける食物アレルギーを模倣している。すなわち、Ｌ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６菌株及びＮＣＣ７１４菌株は保護効果を示す。
【００４３】
本発明の一実施形態では、組成物の効果は、より具体的にはアレルギーの二次予防に対する効果である。より低いアレルギー臨床スコアによって示される通り、マウスモデルにおけるアレルギーの症状は実際有意に軽減される。概して、症状は、通常認められているアレルギーの症状のすべて又は選択されたものを含み得る。
【００４４】
症状は、下痢、皮膚刺激性若しくは呼吸器症状又はそれらの組み合わせを含み得る。症状はまた、トリプターゼ、キマーゼ、ヒスタミン、ロイコトリエンなどの生化学的メディエーターの放出を伴い得る。
【００４５】
また、組成物は、アレルゲンへの患者の感作に対して効果を有し得る。実際、アレルギーの一次予防は、Ｌ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６を含む組成物によって達成される。動物は、食物アレルゲンへの感作がより低いことを示した。症状を軽減し、かつ感作、すなわち後のアレルゲンへの再曝露の際の症状のリスクも軽減する点で、組成物の効果は非常に興味深い。
【００４６】
本発明の組成物は、後年における他のアレルゲンへの感作を軽減するために使用することができる。組成物が、免疫の成熟化の自然なプロセスを促進し（又は少なくとも遮断せず）、そのため、同じアレルゲン又は異なるアレルゲンへの感作の低減（後年の感作の軽減）に対して長期の効果を有し得ると考えられる。本発明の組成物は、アレルギーの症状を軽減すること（二次予防）、及び（一次予防の一部として）短期の感作を軽減することによって、自然な免疫の成熟化を惹起させ、そのような長期の有益な効果を有し得ると考えられる。
【００４７】
本発明の組成物又は本発明における使用のための組成物：
本発明の組成物は、例えば、栄養組成物、食品、飲料、食品添加物、機能性食品、ペットフード製品、乳幼児用調製乳、乳幼児用シリアル又はベビーフードであり得る。
【００４８】
組成物は、乳幼児用調製乳などの完全栄養組成物であっても、完全食中の相当な部分をなすものであっても、栄養補完物であってもよい。乳幼児及び小児に関しては、栄養素の唯一の供給源として摂取される場合、組成物は、対象となる身体の栄養要求量のすべて又はほとんどすべてをもたらす完全栄養組成物であることが好ましい。他の実施形態（例えばベビーフード）では、組成物は完全食の一部分、好ましくは（定量的及び定性的に）５０％を超える部分をなす。一実施形態では、組成物は乳幼児用シリアルを含む。
【００４９】
例えば、成人による摂取が予定されたものである場合、組成物はヨーグルト又は発酵乳飲料であり得る。
【００５０】
本発明者らの知る限り、上述の効果を有するラクトバチルス・ヘルベティカス株が記載されたのはこれが初めてである。異なる属又は異なる種の異なるプロバイオティクスが、例えば味に対して非常に異なる効果を有し得、また、培養及び貯蔵に関して異なる要件を有し得ることから、上述の利点を有するラクトバチルス・ヘルベティカス株が利用可能であることに対する明らかに要求がある。したがって、本発明は、特にＬ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６株及び／又はＮＣＣ７１４株に関する。
【００５１】
組成物は、乾燥組成物１ｇ当たり１０４〜１０１１コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含み得る。組成物が乳幼児用調製乳である場合、乳幼児用調製乳中のプロバイオティクスの量は、乳幼児用調製乳１ｇ当たり１０５〜１０８ＣＦＵであり得る。組成物は、１０６〜５×１０７ＣＦＵ／ｇ（生理学的効果があることが実証されている用量である。）を含み得る。低用量のプロバイオティクスは、（特に、組成物が、ある一定限度の量でプレバイオティクス及びタンパク質も含む場合に）有益な効果を有し得ることが確認されている。そのような実施形態では、プロバイオティクスは１０３〜１０５ＣＦＵ／ｇの量で組成物中に存在し得る。プレバイオティクス（例えば、オリゴ糖の形態のもの）及び／又はタンパク質は、組成物１００ｋｃａｌ当たり４ｇを超えない量又は２ｇ未満の量又は１．８ｇ未満の量又は１．５ｇ未満の量で存在し得る。
【００５２】
プロバイオティクスは、本発明の乾燥又は湿性組成物と一緒に混合することができる。組成物中のプロバイオティクスの安定性又は生存能を向上させる処理又は特定のプロセスが適用可能である。プロバイオティクスは乾燥形態又は湿潤形態で適用できる。プロバイオティクスを組成物と混合した後、混合物は、プロバイオティクスの生存能に著しい影響を与えない方法で処理することができる。他の実施形態では、プロバイオティクスは、混合前、混合中又は混合後に部分的に不活性化される。一実施形態では、プロバイオティクスは、本発明の組成物中での使用前に不活性化されており、及び／又は複製不能にされている。これは、例えば、加熱処理又は他の公知の処理によって実現できる。
【００５３】
組成物はプレバイオティクスを含み得る。プレバイオティクスが、炭水化物、より具体的にはオリゴ糖を含むことは知られている。また、プレバイオティクスが、機能的な食物成分として広く使用されていることは知られている。プレバイオティクスはヒトの消化管の酵素による加水分解に抵抗し、分解されずに結腸に到達し、ビフィズス菌又は他のプロバイオティクスの増殖に特に適した炭水化物物質を提供することができる。オリゴ糖は、例えば、グルコース、ガラクトース、キシロース、マルトース、スクロース、ラクトース、デンプン、キシラン、ヘミセルロース、イヌリン、又はそれらの混合物から生成され得る。フラクトオリゴ糖などの精製済みの市販のプレバイオティクス製品は、約９５％を超える固形物をオリゴ糖の形態で含有する。
【００５４】
好ましくは、組成物の実施形態は、少なくとも１種のプレバイオティクスを含む栄養組成物である。
【００５５】
好ましくは、プレバイオティクスの実施形態は、グルコース、ガラクトース、キシロース、マルトース、スクロース、ラクトース、デンプン、キシラン、ヘミセルロース、イヌリン、又はそれらの混合物から生成されるオリゴ糖を含む。より好ましくは、オリゴ糖はフラクトオリゴ糖を含む。最も好ましくは、プレバイオティクスはフラクトオリゴ糖とイヌリンとの混合物を含む。好ましくは、この混合物は、プレバイオ１（ＰＲＥＢＩＯ１）（登録商標）を含むか、あるいは市販のラフチロース（ＲＡＦＴＩＬＯＳＥ）（登録商標）とラフチリン（ＲＡＦＴＩＬＩＮＥ）（登録商標）との混合物を含む。
【００５６】
好ましくは、組成物のプレバイオティクス成分は約５０％〜約９０％のフラクトオリゴ糖を含み得る。より好ましくは、組成物のプレバイオティクス成分は約６０％〜約８０％のフラクトオリゴ糖を含む。最も好ましくは、組成物のプレバイオティクス成分は約７０％のフラクトオリゴ糖を含む。プレバイオティクスは、約１０％〜約５０％のイヌリン、又は約２０％〜約４０％のイヌリン、又は約３０％のイヌリンを含み得る。例えば、プレバイオティクス成分は組成物の約０．１％〜１０％を占め得る。
【００５７】
本発明の組成物は、ポリフェノールを含むリンゴ抽出物又はポリフェノールが豊富なリンゴ抽出物をさらに含み得る。リンゴ抽出物は、例えば、食物アレルゲンによって引き起こされるアレルギーを有する患者において、食物に起因するアレルギー症状を軽減するのを支援する。そういうわけで、リンゴ抽出物は、プロバイオティクスと協調して相乗的に作用して、食物アレルギーを有する患者においてアレルギーを調節、軽減又は減弱する。そのような組成物は、当然に組成物のための適切な担体となるベビーフード及び／又はベビーシリアルのために使用することができる。ベビーフード又はベビーシリアルは、リンゴ抽出物又はリンゴ由来の材料を本質的に含み得る。
【００５８】
仮説上の作用機序：
アレルギー性疾患は、過去数十年にわたって着実に増加しており、現在ＷＨＯにより流行病とされている。概して、アレルギーは、Ｔｈ２メディエーターの産生への強い偏向をもたらす、免疫系のＴｈ１及びＴｈ２応答の間の不均衡に起因すると考えられている。それ故、理論に縛られるものではないが、免疫系のＴｈ１及びＴｈ２アームの間の適切な均衡を回復させることにより、アレルギーを緩和、下方制御又は予防することができると考えられる。これは、Ｔｈ２応答を低減させるか又はＴｈ１応答を（少なくとも一時的に）増強する必要性があることを意味する。前者は、ＩＬ−５などのＴｈ２サイトカインの産生減少によって、後者は、ＩＦＮγなどのＴｈ１サイトカインの産生増加によって特徴付けられる。あるいは、感作された個体においては、一般的な抗炎症効果、例えば、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）（これは、Ｔｈ１及びＴｈ２細胞の両方の効果を下方制御できる。）の誘導によるものが最も望ましいことがある。これは、ＩＬ−１０の分泌を誘導する能力によって示され得る。
【００５９】
本発明の組成物は、加水分解された又は部分的に加水分解されたタンパク質を含み得る。加水分解タンパク質はインタクトなタンパク質に比べて消化されやすく、アレルゲン性が低いため、（部分的に）加水分解されたタンパク質をベースとする栄養組成物は、乳幼児／低年齢小児の免疫系及び胃腸管に特に適している。さらに、理論に縛られるものではないが、加水分解タンパク質は、インタクトなタンパク質に比べてプロバイオティクス又は腸内細菌（特に、種々のペプチダーゼ活性を示すもの）のための好ましい基質となり得、そのため、プロバイオティクス株の改善された効果、ひいては加水分解タンパク質とプロバイオティクスとの相乗作用をもたらすと考えられ得る。このような組成物は、食物アレルギーの乳幼児／低年齢小児の免疫系及び胃腸管に非常に適切なものとなる。そのような場合、Ｌ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６及び／又はＮＣＣ７１４と加水分解タンパク質との組み合わせは本発明に適切である。
【００６０】
一実施形態では、加水分解タンパク質は、乳清及び／又はカゼインから加水分解されたタンパク質である。加水分解タンパク質は、タンパク質（特に乳清タンパク質）に対するトリプシン及び／又はキモトリプシンの作用から生じ得る。加水分解タンパク質は、大豆タンパク質、小麦タンパク質又は／及び卵タンパク質を含み得る。例えば、加水分解タンパク質は、プロタメックス（Ｐｒｏｔａｍｅｘ）（登録商標）及び／又はフレーバーザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）などのプロテアーゼの作用から生じ得る。組成物のタンパク質（好ましくは加水分解タンパク質）は穀類タンパク質又は卵タンパク質を含み得る。一実施形態では、加水分解タンパク質はアルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）の作用から生じ得る。本発明の組成物は、前述のタンパク質供給源のうちの２種以上のものの混合物を含み得る。
【００６１】
標的集団：
本発明の組成物は、比較的若年の患者を最も適した標的としているが、適切な組成物は、同様の効果を有する成人用の食品、飲料又は栄養補完物として設計することができる。
【００６２】
実際、患者は、十分に若く、未だ免疫系及び胃腸管の成熟期の途中にあることが好ましい。そのような患者では、組成物の効果がより強く又はより速やかであり得る。一実施形態では、組成物は、乳幼児用調製乳、乳幼児用シリアル及び／又はベビーフードである。好ましくは、組成物は、６歳未満、又は出生から３歳まで、又は出生から離乳までの若年のヒトを標的とする。一実施形態では、組成物は、スターター又はフォローアップの乳幼児用調製乳である。好ましくは、栄養組成物は若年のヒトの食事に必要な栄養素の大部分を含む。
【００６３】
一実施形態では、栄養組成物は、１〜４歳の乳幼児／低年齢小児のための乳幼児用シリアル組成物である。組成物は、より具体的には、離乳期中及び／又はその後１２か月までを標的とし、投与対象とすることができる。乳幼児は離乳期中に種々の食物に曝露され、免疫系及び胃腸管の成熟及び再構築を受けるため、離乳期は本発明に関して非常に重要である。すなわち、アレルギー応答の効果的な制御は離乳期中特に重要である。
【００６４】
本発明の組成物の使用に関して、小児、乳児又は乳幼児はアレルギー体質の小児であり得る。アレルギー体質の小児は、アレルゲン（例えば、食物、呼吸器又は接触アレルゲン）に対して、アレルギー反応の少なくとも１つのエピソード（軽度、中等度又は重度）を経験している小児、乳児又は乳幼児である。本発明の一実施形態では、小児、乳児又は乳幼児は、食物アレルゲンに対する重度のアレルギーを示しており、及び／又は食物アレルギーの１回を超える中等度若しくは重度のエピソードを経験している。アレルギーの症状には、皮膚の刺激若しくは発赤、胃腸症状又は呼吸器症状などの種々の公知の症状が含まれ得る。
【００６５】
本発明の組成物は、１８歳までの若年者を含む年長の小児又は成人のために使用してもよい。
【００６６】
本発明によって包含される食物アレルゲンには、食物（特に、若年のヒト（例えば、乳幼児、乳児、小児）用の食物）にもともと存在する又は通常存在するすべてのタイプのアレルゲンが含まれ得る。典型的な食物アレルゲンの具体的な例は、牛乳、卵、魚（例えば、バス、フラウンダー、タラ）、甲殻類（例えば、カニ、ロブスター、エビ）、木の実（例えば、アーモンド、クルミ、ペカン）、ピーナッツ、小麦、又は大豆である。
【００６７】
本発明によって包含される呼吸器アレルゲンは、すべてのタイプの呼吸器アレルゲンが含まれ得る。典型的な呼吸器アレルゲンは、例えば、チリダニ、ライ麦、ブタクサ、ゴキブリ、花粉、カビ、動物の鱗屑、又は粉塵である。
【００６８】
本発明によって包含される接触アレルゲンは、すべてのタイプの接触アレルゲンが含まれ得る。典型的な接触アレルゲンは、例えば、ニッケル、金、フレグランスミックス、チメロサール、硫酸ネオマイシン、ホルムアルデヒド、塩化コバルト、バシトラシン、又はクォータニウム（Ｑｕａｔｅｒｎｉｕｍ）１５である。
【００６９】
実験結果：
プロバイオティクスは、アレルギー感作を阻害する能力又は感作された個体におけるアレルギー症状の発生を阻害する能力についてヒト及び動物試験で試験されている。ここでは、Ｌ．ヘルベティカスの特定の菌株、すなわちＬ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６及びＮＣＣ７１４が、アレルギーの感作又は症状の発生を緩和する能力を有することが実証された。
【００７０】
Ｌ．ヘルベティカスの異なる菌株によって誘導されるサイトカインプロファイルを決定するために、ヒト血液リンパ球をベースとするｉｎ  ｖｉｔｒｏ系が開発された。観察されるプロファイルは、ｉｎ  ｖｉｖｏで同じ菌株によって誘導されるサイトカイン産生を予測し、それ故、該菌株がもたらす生物学的効果を予測するものと考えられる。
【００７１】
アレルギー体質の個体又はアレルギーを発症しやすい個体の細胞は、Ｔｈ２サイトカインを産生する傾向によって特徴付けられる。この状態をｉｎ  ｖｉｔｒｏで部分的に模倣するため、Ｔｈ２偏向ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の細胞培養モデルを、アレルギー体質のドナーのＰＢＭＣを使用する代わりとして開発した。ＰＢＭＣをインターロイキン（ＩＬ）−４＋抗ＣＤ４０抗体と共に培養することによってＴｈ２偏向を誘導した（方法に詳述）。Ｔｈ２偏向を誘導する３日の培養後、乳酸菌を添加してさらに４８時間培養した（その結果、全培養期間は５日間になった）。基本的な読み出しとして、サイトカインＩＦＮγ、ＩＬ−１０及びＩＬ−５を、Ｌ．ヘルベティカス株で刺激した細胞の上清においてＥＬＩＳＡによって測定した。
【００７２】
Ｆｉｇｕｒｅ１は、Ｌ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６及びＬ．ヘルベティカスＮＣＣ７１４（以下、ＮＣＣ１１７６及びＮＣＣ７１４という。）は同様の量（１０１．３％及び１０５％）のＩＦＮ−γを誘導し、それらの量は、ＮＣＣ２８４９によって誘導された量（７７．２％）よりも高かったことを示す。ＮＣＣ１１７６は、ＮＣＣ７１４及びＮＣＣ２８４９よりも多くのＩＬ−１０を誘導する。しかし、ＩＦＮ−γ／ＩＬ−１０の比は、ＮＣＣ２８４９よりもＮＣＣ１１７６及びＮＣＣ７１４（１．４及び２．８）の方が低かった。さらに、ＮＣＣ１１７６及びＮＣＣ７１４は、ＩＬ−５分泌の効果的なインヒビターであった。これらのデータから、これらの２種の菌株が、Ｔｈ２偏向条件下でのＩＦＮγ及びＩＬ−１０の産生株であり、ＮＣＣ２８４９株とは対照的にＰＢＭＣによるＴｈ２サイトカイン産生を阻害できることが示唆される。したがって、ＮＣＣ１１７６及びＮＣＣ７１４は、その抗炎症活性を通じて抗アレルギー効果を発揮するものと思われる。
【００７３】
Ｌ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６のｉｎ  ｖｉｖｏ効果を、マウス食物アレルギーモデル（Ｆｉｇｕｒｅ２に示されるＯＶＡ食物アレルギーマウスモデル）において一例として試験した。
【００７４】
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、７週間の期間中、１週間毎に経口経路によって卵白アルブミン（ＯＶＡ）＋コレラ毒素で感作した。本モデルでは、感作期間の終了時の大用量のＯＶＡでの経口チャレンジが、下痢、引っ掻き行動、被毛の逆立ち、チアノーゼ及び移動の減少などの臨床症状を引き起こす。
【００７５】
１〜４３日目までの感作フェーズ（一次予防）の間、実験の最終週（４３〜５０日目；二次予防）の間、又は全試験期間（１〜５０日目、全期間）を通じて、飲料水を介してマウスにＮＣＣ１１７６を与えた（５×１０８ＣＦＵ／ｍｌ；自由摂取）。
【００７６】
Ｆｉｇｕｒｅ３は臨床症状を示す。ＮＣＣ１１７６で処置したマウスは、感作された未処置動物（陽性対照）よりもチャレンジ後に発生した重度の臨床症状が有意に少なかった。感作中（ＮＣＣ１１７６  一次）又は感作後（ＮＣＣ１１７６  二次）に投与すると、ＮＣＣ１１７６の効果によって臨床症状が有意に減少した。しかし、有益な効果は、動物モデル（ＮＣＣ１１７６  全期間）に全実験期間を通じてＮＣＣ１１７６を投与した場合に最も顕著であった。
【００７７】
Ｆｉｇｕｒｅ４に示されるように、臨床スコアに加えて、マウスマスト細胞プロテアーゼ１（ＭＭＣＰ−１）血清中濃度を、アレルゲンチャレンジによる腸マスト細胞活性化の尺度として決定した。ＯＶＡチャレンジでは、陰性対照群に比べて陽性対照においてＭＭＣＰ−１の血清中濃度が著しく増加した。陽性対照群と比較して、（有意ではないが、）ＭＭＣＰ−１血清中濃度を調節する傾向が、ＮＣＣ１１７６で処置したマウスにおいて見られた。
【００７８】
Ｆｉｇｕｒｅ５は、ＯＶＡ特異的血清ＩｇＥ、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａレベルが、非感作マウス（陰性対照）と比較して感作マウス（陽性対照）において増加したことを示す。感作フェーズ（一次予防又は全期間）においてＮＣＣ１１７６で処置すると、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ（Ｆｉｇｕｒｅ４Ａ）、ＩｇＧ１（Ｆｉｇｕｒｅ４Ｂ）の血清中濃度はわずかに低下し、ＩｇＧ２ａ（Ｆｉｇｕｒｅ４Ｃ）は影響されないままであった。対照的に、チャレンジ直前の処置（二次予防）は、予想通り特異的血清ＩｇＥ及びＩｇＧ１のレベルに影響を与えなかった。
【００７９】
Ｆｉｇｕｒｅ６は、ｅｘ  ｖｉｖｏで再刺激されたリンパ球によるサイトカイン産生を示す。このために、腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）からのリンパ球をチャレンジ後採取し、１ｍｇ／ｍｌのＯＶＡで再刺激し、７２時間培養した。ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＫＣ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ−１及びＩＬ−２のレベルをマルチプレックスアッセイ（メソスケール（Ｍｅｓｏｓｃａｌｅ）（登録商標））によって測定した。一次予防においてＮＣＣ１１７６で処置したマウスのＭＬＮリンパ球は、陽性対照（Ｔａｂ．２）と比較してＩＬ−４、ＩＬ−５、ＫＣ、ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＩＬ２の産生が少なかった。全期間を通じてＮＣＣ１１７６で処置したマウスでは、ＭＬＮ再刺激はＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＴＮＦα、ＩＦＮγ及びＩＬ−２の減少をもたらす。チャレンジ直前にＬ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６で処置したマウスのサイトカインプロファイルは陽性対照群と実質的に異ならなかった。
【００８０】
結論：
これらのデータは、Ｌ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６及び／又はＮＣＣ７１４を摂取すると、マウス食物アレルギーモデルにおける症状が軽減（一次、二次予防）されることを示している。これは、実験の終了まで感作フェーズの全期間を通じてＮＣＣ１１７６及び／又はＮＣＣ７１４を摂取することによって達成できる。この効果は、実験の全期間を通じてＮＣＣ１１７６及び／又はＮＣＣ７１４が摂取された場合、より顕著である。しかし、予防又は処置フェーズにおいてのみ菌株が摂取された場合も症状は軽減した。これは、ＮＣＣ１１７６が、感作プロセス並びにアレルギー症状に関与する有効な機序の両方に対して影響を与える能力があることを示唆している。Ｌ．ヘルベティカスＮＣＣ７１４は、Ｌ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６と同様のｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫特性を示すことから、Ｌ．ヘルベティカスＮＣＣ２８４９とは対照的に、ｉｎ  ｖｉｖｏでも同様の挙動を示し、それ故、同様の抗アレルギー特性を示すことが予想される。
【００８１】
分析方法：
試薬及び細菌バイオマス：
細菌バイオマスを、ＭＲＳ培地中の最適な条件下で各菌株の培養によって産生した。増殖速度を菌株毎に決定し、これらに従って、バイオマスを静止期に到達後３時間で採取した。この時点で、培養物を冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、ＰＢＳ２０％グリセロール中、−８０℃で５０μｌアリコートとして凍結した。（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の）ＬＰＳをＳｉｇｍａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）から購入した。
【００８２】
Ｔｈ２偏向ヒトＰＢＭＣの単離及び培養：
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、“Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＨＵＶ”から得たフィルターから単離した。フィルターに捕捉されている細胞を、９０ｍｌのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）（Ｓｉｇｍａ）で血液回収バッグに流し戻した。細胞をＨＢＳＳで１：２に希釈し、ＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  １０７７（Ｓｉｇｍａ）を用いて密度勾配遠心法により単離した。間期の細胞を回収し、ＨＢＳＳで２回洗浄した。ＰＢＭＣを、１０％ウシ胎仔血清ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）及び０．１％ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）を添加したＩｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地（ｃＩＭＤＭ）（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁した。ｃＩＭＤＭ中、５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ）及び１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｔｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）の存在下、１．５×１０６細胞／ｍｌで、４８ウェルプレート（Ｍｉｌｉａｎ，Ｍｅｙｒｉｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）中で細胞を培養してＴｈ２サイトカイン表現型を誘導した。ＬＰＳを１μｇ／ｍｌで使用した。培養３日後、プロバイオティクスを１０７、１０６、及び１０５ＣＦＵ／ｍｌで添加した。成分を添加後、ＰＢＭＣ培養をさらに４８時間続けた（その結果、全培養期間は５日間になった）。
【００８３】
サイトカインＥＬＩＳＡ：
ヒトＩＦＮ−γ、ヒトＩＬ−５、ヒトＩＬ−１０、マウスＩＦＮ−γ、マウスＩＬ−１３、及びマウスＩＬ−１０サイトカインを、ＤｕｏＳｅｔキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて製造業者の使用説明書に従って測定した。
【００８４】
ＥＬＩＳＡ結果の評価：
ＯＤ値を、標準曲線を用いてｐｇ／ｍｌに変換した。異なるヒトドナーからのＰＢＭＣで一般的に観察されるドナー間の大きな変動を調整するために、データを任意の内部標準に従って標準化した。ＬＰＳでの刺激により各ドナーについて得られたＩＦＮ−γのｐｇ／ｍｌ値を１００％に設定した。ＩＬ−１０値を正規化するために、Ｂ．ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）ＮＣＣ２８１８株（ＣＮＣＭ−Ｉ３４４６としてＮｅｓｔｅｃ  ＳＡにより寄託された。）で誘導されるＩＬ−１０の量を１００％とした。最後に、培地のみで（すなわちプロバイオティクスの不存在下で）ＩＬ−４及び抗ＣＤ４０抗体で誘導されるＩＬ−５の量を１００％に設定した。
【００８５】
ＯＶＡ食物アレルギーマウスモデル：
すべての試験は、Ｎｅｓｔｅｃ内部倫理委員会及びＳｅｒｖｉｃｅ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｉｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃａｎｔｏｎ  ｏｆ  Ｖａｕｄ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ（Ａｕｔｈｏｒｉｚａｔｉｏｎ  ＃１９７０）によって承認された。通常飼育の６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を、７週間の期間中、Ｆｌｕｋａ（Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）からの卵白アルブミン（ＯＶＡ）２０ｍｇ＋コレラ毒素１０μｇ／マウス（アジュバントとして使用；Ｌｉｓｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，ＬｕＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｕｃｅｒｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから購入）で１週間毎に（胃管栄養用の針（ｇａｖａｇｅ  ｎｅｅｄｌｅ）を用いて）経口経路により感作した。最後の感作から１週間後、１００ｍｇのＯＶＡによる経口チャレンジを行った。Ｌ．ヘルベティカスＮＣＣ１１７６（飲料水中に５×１０８ＣＦＵ／ｍｌ）による栄養学的介入を、実験の異なるフェーズで、すなわち、感作期間中の一次予防のために、又は感作フェーズの終了時に開始する二次予防のために、又は全試験期間を通じて行った（Ｆｉｇｕｒｅ３）。チャレンジ後３０分の時点で開始して、マウスを３０分間個別に観察した。臨床症状を記録し、次のように定量化した（アレルギースコア）。すなわち、０：症状なし、引っ掻き行動のエピソード数が４未満；１：鼻及び頭部周辺の引っ掻き行動のエピソード数が４〜１０、下痢なし；２：引っ掻き行動のエピソード数が１０を超える、若しくは被毛の逆立ち、及び不動若しくは軟便；３：下痢又は努力性呼吸又はチアノーゼ；４：下痢と共に、プロッディング（ｐｒｏｄｄｉｎｇ）後の不動、被毛の逆立ち、努力性呼吸、又はチアノーゼ；５：アナフィラキシー。チャレンジから４時間後、マウスを屠殺（頸椎脱臼）し、血液及び回腸の最後の１センチメートルを採取し、液体窒素中で凍結した。
【００８６】
血清ＭＭＣＰ−１：
ネズミマスト細胞プロテアーゼ１（ＭＭＣＰ−１）を、ＥＬＩＳＡ（Ｍｏｒｅｄｕｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｅｎｉｃｕｉｋ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）から購入）によって製造業者の使用説明書に従ってマウス血清中で定量化した。多項式標準曲線を用いてＯＤ値をｐｇ／ｍｌに変換することによってＭＭＣＰ−１濃度を得た。
【００８７】
腸間膜リンパ節細胞の単離及び培養：
腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を、注射器のプランジャーを用いてセルストレーナー（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ，Ｍｉｌｉａｎ，Ｍｅｙｒｉｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）でホモジナイズした。細胞を遠心分離し、１０％のウシ胎仔血清ＦＢＳ（Ｂｉｏｃｏｎｃｅｐｔ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、１％Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、０．１％ゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ）、０．１％β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ）を添加したＲＰＭＩ（Ｓｉｇｍａ）中で２回洗浄した。ＯＶＡ（１ｍｇ／ｍｌ）の不存在下又は存在下、３×１０６細胞／ｍｌで、９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｍｉｌｉａｎ）中で細胞を培養した。培養７２時間後、プレートを凍結した。
【００８８】
ＭＬＮ培養物の上清中のサイトカイン：
マウスＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１２Ｔを、マウスＴｈ１／Ｔｈ２  ９−ｐｌｅｘ複合キット（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて製造業者の使用説明書に従って測定した。
【００８９】
実施例１：
本発明による使用のための乳幼児用調製乳の組成の例を下表に示す。この組成はもっぱら説明目的で示されるものである。タンパク質供給源は、乳清タンパク質及びカゼインの従来の混合物である。
【００９０】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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