(57)【要約】1つの態様において、本発明は、脂肪組織の間質血管画分または間質細胞を含む組成物を対象に投与する工程を含む、対象における頭痛の頻度および／または重症度を下げるための方法に関する。別の態様において、本発明は、骨髄を含む組成物を対象に投与する工程を含む、対象における頭痛の頻度および／または重症度を下げるための方法に関する。別の態様において、本発明は、成体幹細胞を含む組成物を対象に投与する工程を含む、対象における頭痛の頻度または重症度を下げるための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞；または
骨髄由来細胞調製物
を含む組成物を対象に投与する工程を含む、対象における頭痛の頻度および／または重症度を下げる方法。
【請求項２】
脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞または骨髄由来細胞調製物が、成体幹細胞を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
成体幹細胞が、間葉系幹細胞および／もしくは初期間葉／間質前駆細胞、ならびに／または脂肪組織由来間質／幹細胞である、請求項2記載の方法。
【請求項４】
成体幹細胞を含む組成物を対象に投与する工程を含む、対象における頭痛の頻度および／または重症度を下げる方法。
【請求項５】
成体幹細胞が、間葉系幹細胞および／もしくは初期間葉／間質前駆細胞、ならびに／または脂肪組織由来間質／幹細胞である、請求項4記載の方法。
【請求項６】
間葉系幹細胞および／または初期間葉／間質前駆細胞が、脂肪組織、骨髄、または血液から取得される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
成体幹細胞が、増幅および／または培養されたものである、請求項2〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
頭痛が、片頭痛、緊張性頭痛、三叉神経痛、群発性頭痛および頭痛からなる群より選択される、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
脂肪組織または骨髄が、自己由来のものである、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
脂肪組織または骨髄が、同種異系のものである、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
成体幹細胞が、自己由来のものである、請求項4記載の方法。
【請求項１２】
成体幹細胞が、同種異系のものである、請求項4記載の方法。
【請求項１３】
脂肪組織が、酵素および／または解離剤で処理される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
酵素がコラゲナーゼであり、解離剤がレシチンである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
脂肪組織が、超音波キャビテーションに供される、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
超音波キャビテーションが、脂肪細胞を溶解させる、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
脂肪組織が、機械的撹拌に供される、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞または骨髄由来細胞調製物が、多血小板血漿または多成長因子血漿で処理される、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
成体幹細胞が、多血小板血漿または多成長因子血漿で処理される、請求項4記載の方法。
【請求項２０】
脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞または骨髄由来細胞調製物が、対象に静脈内投与される、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
成体幹細胞が、静脈内投与される、請求項4記載の方法。
【請求項２２】
臍帯（ワルトンゼリー）、臍帯血、または胎盤から取得される幹細胞を含む組成物を対象に投与する工程を含む、対象における頭痛の頻度および／または重症度を下げる方法。
【請求項２３】
脂肪組織由来および／または間質由来の細胞外マトリクスを含む組成物を対象に投与する工程を含む、対象における頭痛の頻度および／または重症度を下げる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2012年6月26日に出願されたオーストラリア国仮出願第2012902720号からの優先権を主張し、その内容の全体は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、頭痛の頻度および／または重症度を下げるための組成物および方法に関する。
【０００３】
本発明は、主として成体幹細胞を含む組成物を投与することによって片頭痛、緊張性頭痛、三叉神経痛、群発性頭痛または頭痛を処置するために開発され、そして本願に関してはそれが本明細書中以降で説明されている。しかしながら、本発明はこの特定の使用分野に限定されないことを理解されたい。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
本明細書を通してなされる先行技術の議論は、どのような形であれ、そのような先行技術が広く公知となっていることまたは当技術分野の共通の一般知識の一部を形成していることに関する承認とみなされるべきではない。
【０００５】
頭痛は、頭部、例えば頭皮、顔面、前頭または頸部の痛みである。頭痛は、原発性頭痛または2次性頭痛であり得る。原発性頭痛は、別の状態によって引き起こされたものではない頭痛である。これに対して、2次性頭痛は、疾患または医学的状態、例えば疾病、感染、外傷、発作またはその他の異常に起因するものである。したがって2次性頭痛が起こるときには、根源たる障害が存在し、それがその根源たる障害の症状として頭痛を発生させているのである。
【０００６】
緊張性頭痛は、最も一般的なタイプの原発性頭痛であり、すべての頭痛の約90％を占める。緊張性頭痛は、多くの場合、前頭において、頭頸部の裏側においてまたはその両方の領域において発生する。それは、まるで頭部が万力で挟まれているような締め付けられる感覚と表現される。肩および頸部の痛みが一般的である。
【０００７】
吐き気が緊張性頭痛と共に見られるのはまれである。緊張型頭痛は、反復性または慢性であり得る。反復性緊張型頭痛は、1月あたり15日未満発生する緊張型頭痛と定義され、慢性緊張性頭痛は少なくとも6ヶ月の間1月あたり15日またはそれ以上発生する。緊張型頭痛は、数分から数日、数ヶ月または数年間もの間持続し得るが、典型的な緊張性頭痛は4〜6時間持続する。
【０００８】
片頭痛は、反復性の頭痛であり、片側性または両側性であり得る。片頭痛は、前駆症状を伴ってまたは伴わずに発生し得る。片頭痛の前兆は、神経学的症状、例えばめまい、耳鳴り、暗点、羞明、または閃光（visual scintillation）（例えば、明るいジグザグの線）からなり得る。前兆のない片頭痛が最も一般的であり、すべての片頭痛の80％超を占める。人口のおよそ10〜20％が片頭痛を患う。米国においては、男性のおよそ6％および女性の15〜17％が片頭痛持ちである。片頭痛は女性で見られるのが最も一般的であり、女性対男性の比は3：1である。
【０００９】
典型的な片頭痛は、片側性であり（頭部の一方の側で起こる）、通常ズキズキする痛み（pulsating）があり、2〜72時間持続する。症状は、吐き気、嘔吐、羞明（光に対する感度の上昇）および音恐怖（音に対する感度の上昇）を含む。
【００１０】
片頭痛の原因は明らかにされていない。片頭痛は人によって様々であり、処置も様々である。最初の処置は、頭痛に対して鎮痛薬、吐き気に対して制吐薬、そして引き金の回避である。
【００１１】
片頭痛予防薬は、それらが片頭痛攻撃の頻度または重症度を少なくとも50％下げる場合、有効とみなされる。片頭痛攻撃を防ぐまたはその頻度、期間および重症度を下げるために、多くの医薬が利用可能となっている。ベータ遮断薬、例えばプロプラノロール、アテノロールおよびメトプロロール；カルシウムチャネル遮断薬、例えばアムロジピン、フルナリジンおよびベラパミル；抗けいれん薬バルプロ酸ナトリウム、ジバルプロエクス、ガバペンチンおよびトピラマート；ならびに三環系抗うつ薬が、一般に使用されている薬の一部である。それらの一過性である性質および相対的に効果が無い事以外の、片頭痛予防薬の大きな問題は、望ましくない副作用が多いことである。そのような副作用は、不眠症、鎮静または性機能障害を含む。
【００１２】
群発性頭痛は、片頭痛または緊張性頭痛よりも極めてまれである。群発性頭痛は、複数週間にわたる一群の有痛攻撃を示す。群発性頭痛の痛みは、約5分でピークに達し、そして1時間持続し得る。群発性頭痛を有する者は、通常様々な長さの無痛期間が介在する1回数週間、ことによると数ヶ月間の間の、1日複数回の頭痛を起こし得る。片頭痛を有する人々の場合と異なり、女性よりおそらく5〜8倍多い男性が群発性頭痛を有する。大部分の人々は最初の群発性頭痛を25歳で経験するが、最初の攻撃を10代〜50代前半で経験することもある。反復性および慢性という2つのタイプの群発性頭痛が存在する。反復性タイプがより一般的であり、約2ヶ月間の1日2または3回の頭痛、その後に長期間（例えば、1年間）の未処置持続緩和期間によって特徴づけられる。このパターンは、その後繰り返され得る。慢性タイプは、未処置持続緩和期間がないことを除いて反復性タイプと同様の挙動を示す。
【００１３】
三叉神経痛は、三叉神経から発生する顔面の激痛のエピソードによって特徴づけられる神経障害である。この障害は、数秒間〜数分間または数時間持続する顔面の激痛のエピソードによって特徴づけられる。この激痛エピソードは、発作的に起こり得る。個々の攻撃は、通常、一度に顔面の一方の側に影響し、数ヶ月または数年持続する寛解を含む周期で起こる傾向がある。特定の薬は、ときどき、痛みおよび攻撃の割合を下げるのを助ける。これらの薬は、抗けいれん薬（カルバマゼピン、ガバペンチン、ラモトリギン、フェニトイン、バルプロ酸塩およびプレガバリン）、筋弛緩剤（バクロフェン、クロナゼパム）ならびに三環系抗うつ薬（アミトリプチリン、ノルトリプチリンまたはカルバマゼピン）を含む。一部の患者は、神経に対する圧迫を和らげるための手術を必要とし得る。技術は、三叉神経の一部の切断もしくは破壊、定位放射線手術または三叉神経を圧迫している血管もしくは腫瘍を除去する手術を含む。
【００１４】
すべての頭痛の約2％は、2次性頭痛である。例えば、頸原性頭痛（cervicogenic headache）は、長時間の悪い姿勢、関節炎、上部脊椎の損傷または頸椎障害から引き起こされ得る首の問題、例えば首の筋肉の異常に起因する頭痛である。副鼻腔炎性頭痛は、別のタイプの2次性頭痛である。副鼻腔炎性頭痛は、副鼻腔における炎症および／または感染によって引き起こされ得る。
【００１５】
先行技術の欠点の少なくとも1つを克服もしくは改善する、または有用な代替法を提供することが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【００１６】
発明の要旨
驚くべきことに、本発明者らは、脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞または骨髄由来細胞調製物（そのすべてが成体幹細胞を含む）の注射が頭痛の頻度および／または重症度を下げることを発見した。
【００１７】
1つの局面において、本発明は、
脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞；または
骨髄由来細胞調製物
を含む組成物を対象に投与する工程を含む、対象における頭痛の頻度および／または重症度を下げる方法に関する。
【００１８】
別の局面において、脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞または骨髄由来細胞調製物は、成体幹細胞を含む。
【００１９】
別の局面において、本発明は、成体幹細胞を含む組成物を対象に投与する工程を含む、対象における頭痛の頻度および／または重症度を下げる方法に関する。
【００２０】
別の局面において、成体幹細胞は、脂肪組織、骨髄、または血液から取得される。
【００２１】
別の局面において、成体幹細胞は、間葉系幹細胞および／もしくは初期間葉／間質前駆細胞、ならびに／または脂肪由来間質／幹細胞ならびに／または骨髄間質／幹細胞である。
【００２２】
別の局面において、頭痛は、片頭痛、緊張性頭痛、三叉神経痛および群発性頭痛からなる群より選択される。
【００２３】
別の局面において、脂肪組織、骨髄または幹細胞は、自己由来または同種異系のものである。
【００２４】
別の局面において、脂肪組織は、脂肪吸引物である。
【００２５】
別の局面において、脂肪吸引物は、腹部脂肪吸引物である。
【００２６】
別の局面において、脂肪組織は、組織を破壊するために、酵素および／または解離剤、例えばコラゲナーゼまたはレシチンで処理される。
【００２７】
別の局面において、脂肪組織は、組織を破壊するために、機械的撹拌に供される。
【００２８】
別の局面において、脂肪組織は、脂肪細胞を溶解させるため、間質／幹細胞を分離するため、および／または細胞外マトリクスを分離するために、超音波キャビテーションで処理される。
【００２９】
別の局面において、脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞、骨髄由来細胞調製物または成体間質／幹細胞は、幹細胞活性化要素、例えば多血小板血漿（platelet-rich plasma）、多成長因子血漿、LEDもしくは低レベルレーザーまたはその他で処理される。
【００３０】
別の局面において、脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞、骨髄由来細胞調製物、または成体間質／幹細胞は、対象に、静脈内、皮下、筋内もしくは関節内投与されるかまたは脂肪注入のために脂肪に添加される。
【００３１】
別の局面において、本発明は、臍帯（ワルトンゼリー）、臍帯血、または胎盤から取得される幹細胞を含む組成物を対象に投与する工程を含む、対象における頭痛の頻度および／または重症度を下げる方法に関する。そのような幹細胞は、同種異系のものであり得、そして任意で多血小板血漿またはその他の幹細胞活性化要素、例えばLEDもしくは低レベルレーザーで処理され得る。
【００３２】
別の局面において、本発明は、脂肪由来および／または間質由来の細胞外マトリクスを含む組成物を対象に投与する工程を含む、対象における頭痛の頻度および／または重症度を下げる方法に関する。
【００３３】
別の局面において、本発明は、頭痛の頻度および／または重症度を下げるための医薬の製造のための、
脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞；または
骨髄由来細胞調製物
を含む組成物の使用に関する。
【００３４】
別の局面において、本発明は、頭痛の頻度および／または重症度を下げるための医薬の製造のための、成体幹細胞を含む組成物の使用に関する。
【００３５】
別の局面において、本発明は、頭痛の頻度および／または重症度を下げるための医薬の製造のための、臍帯（ワルトンゼリー）、臍帯血、または胎盤から取得される幹細胞を含む組成物の使用に関する。そのような幹細胞は、同種異系のものであり得、そして任意で多血小板血漿またはその他の幹細胞活性化要素、例えばLEDもしくは低レベルレーザーで処理され得る。
【００３６】
別の局面において、本発明は、頭痛の頻度および／または重症度を下げるための医薬の製造のための、脂肪組織由来および／または間質由来の細胞外マトリクスを含む組成物の使用に関する。
【００３７】
別の局面において、本発明は、頭痛の頻度および／または重症度を下げるのに使用するための、
脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞；または
骨髄由来細胞調製物
を含む組成物に関する。
【００３８】
別の局面において、本発明は、頭痛の頻度および／または重症度を下げるのに使用するための、成体幹細胞を含む組成物に関する。
【００３９】
別の局面において、本発明は、頭痛の頻度および／または重症度を下げるのに使用するための、臍帯（ワルトンゼリー）、臍帯血、または胎盤から取得される幹細胞を含む組成物に関する。
【００４０】
別の局面において、本発明は、頭痛の頻度および／または重症度を下げるのに使用するための、脂肪組織由来および／または間質由来の細胞外マトリクスを含む組成物に関する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「脂肪組織」という用語は、任意の脂肪組織を表す。脂肪組織は、褐色または白色脂肪組織であり得る。脂肪組織は、間葉または間質脂肪組織であり得る。好ましくは、脂肪組織は、皮下白色脂肪組織である。脂肪組織は、脂肪組織を有する任意の生物由来であり得る。好ましくは、脂肪組織は哺乳動物、最も好ましくは脂肪組織はヒトの脂肪組織である。ヒト脂肪組織の簡便な供給源は、脂肪吸引手術またはその他の手術から得られるものである。しかしながら、脂肪組織の供給源または脂肪組織の単離方法は、本発明にとって重要ではない。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「間質血管画分」という用語は、脂肪組織または骨髄中で見られる血管および周辺組織から得られる細胞を含む画分を表す。この画分は、例として間葉系幹細胞、初期間葉／間質前駆細胞、脂肪由来間質幹細胞、Muse-AT細胞、造血細胞、造血幹細胞、血小板、クッパー細胞、破骨細胞、巨核球、顆粒球、NK細胞、内皮前駆（precursorまたはprogenitor）細胞、前駆細胞、CD34+細胞、Stro-1+細胞、Stro-3+細胞、CD29+細胞、CD166+細胞、Thy-1+またはCD90+幹細胞、CD44+細胞、免疫細胞、例えば単球、白血球、リンパ球、BandT細胞、NK細胞、マクロファージ、好中性白血球、好中球、好中性顆粒球等を含む異なる細胞型を含み得る。間質血管画分はまた、本明細書に開示されるマーカーのいずれかまたはその任意の組み合わせを発現する細胞を含む。本明細書で使用される場合、「間質血管画分」という用語は、「間葉血管画分」、「間葉画分」、「間質画分」、「前間葉（pre-mesenchymal）画分」、「間葉前駆体」等の用語をその範囲内に含む。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「成体幹細胞」という用語は、子供および大人において胚発生後に全身で見られる、死んだ細胞を補充し傷ついた組織を再生するために分裂する未分化の細胞を表す。本明細書で使用される場合、「成体幹細胞」という用語は、胎児または胚由来の細胞を含まない。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「分化した」という用語は、十分に発達しそして特定の環境および／または機能への生物学的特化および／または適合を示すよう最終的な成熟状態に達した細胞を表す。典型的に、分化した細胞は、その細胞における分化関連タンパク質をコードする遺伝子の発現によって特徴づけられる。例えば、白血球におけるGALCの発現は、最終分化した白血球の典型例である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「間葉系幹細胞」という用語は、多能性であり、多種の異なる細胞型、例えば非限定的に脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉およびニューロン／グリア細胞系統への幹細胞様前駆体として機能し得る、間質もしくは間葉細胞または初期間葉／間質前駆細胞または脂肪組織由来間質／幹細胞を表す。間葉系幹細胞は、例えば脂肪組織および骨髄から得ることができる部分集合を構成する。本明細書で使用される場合、「間葉系幹細胞」という用語は、「間質幹細胞」、「骨髄間質細胞」、「多能性間質細胞」、「間葉前駆細胞」等の用語をその範囲内に含む。
【００４６】
「前駆細胞（precursor cell、progenitor cell）」および「幹細胞」という用語は、当技術分野および本明細書で言い換え可能に使用され、自身を再生するかまたは所望の細胞型に分化するであろう子孫細胞を生じるかのいずれかのために潜在的に無制限の有糸分裂を行うことができる、多能性または系統未決定のいずれかの前駆細胞を表す。多能性幹細胞と異なり、系統決定された前駆細胞は、一般に、表現型が相互に異なる多数の細胞型を生じることができないと考えられている。その代わり、前駆細胞は、1つまたはおそらく2つの系統決定された細胞型を生じる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「多能性（multipotent、multipotential、またはmultipotentiality）」という用語は、複数の細胞型に分化する幹細胞の能力を指すことが意図される。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「同種異系」という用語は、同一種の異なる哺乳動物から得られる任意の物質を指すことが意図される。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「自己由来」という用語は、ある個体から得られその個体に再導入される任意の物質を指すことが意図される。
【００５０】
本明細書および特許請求の範囲を通じて、文脈が明らかにそれ以外のことを必要としていない限り、「含む（comprise、comprising）」等の語は、排他的な意味と対照的な内包的なまたは網羅的な意味で、すなわち、「〜を含むがこれらに限定されない」の意味で、解釈されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】超音波キャビテーション処理された脂肪組織から得られる細胞のFACS分析 - 超音波キャビテーションによって分離された40gの脂肪組織の発蛍光性の核による細胞の計数。
【図２】超音波キャビテーション処理された脂肪組織から成長させた細胞のギムザ染色コロニー。
【図３】超音波キャビテーション処理された脂肪組織から成長させた間葉系幹細胞の細胞培養物。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞または骨髄由来細胞調製物（そのすべてが成体幹細胞を含む）の注射が片頭痛の頻度および重症度を下げるという驚くべき発見に基づいている。
【００５３】
脂肪組織は、脂肪吸引手術、脂肪の吸引を通じて取得され得、またはその他の外科的方法によって単離され得る。ドナーは、好ましくは、間質血管画分もしくは間葉系幹細胞で処置されるのと同一の患者であるかまたは処置される個体と免疫適合する同種異系ドナーであろう。当業者は、標準的な技術および基準を用いて適合するドナーを容易に同定することができる。
【００５４】
脂肪組織は、標準的な脂肪吸引技術を用いて収集され得、間質血管画分は、超音波キャビテーションおよび／または酵素処理および／または機械的撹拌によって脂肪組織から分離され得る。
【００５５】
1つの態様において、本発明の方法は、脂肪組織中の大部分の脂肪細胞を破裂または溶解させ間質血管画分を放出させるよう脂肪組織に配置して接触させるプローブを有する超音波キャビテーション装置を使用する。使用される個別の超音波キャビテーション装置は本発明にとって重要ではない。1つの適当な選択は、最先端の高出力超音波プロセッサである、HIELSCHLER超音波プロセッサである。この装置は、マイクロリットルからリットルまでの広範囲の有機および無機物質を安全に処理することができる。使用され得る他の装置は、Vibra-Cell（商標）装置（Sonics）、VASER（SoltaMedical）またはQSonica超音波プロセッサを含む。
【００５６】
別の態様において、生物学的溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液または標準生理食塩水溶液）中の脂肪組織は、冷却環境に置かれ得る（組織／細胞は2℃より低くすべきでない）。超音波キャビテーション装置用プローブが脂肪組織に配置され、そして約10秒間、約20秒間、約30秒間、約40秒間、約50秒間、約60秒間、約1分10秒間、約1分20秒間、約1分30秒間、約1分40秒間、約1分50秒間、約2分間、約3分間、約4分間、約5分間、約6分間、約7分間、約8分間、約9分間、約10分間、振幅が約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％に、サイクルが約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9に設定される。プローブは、操作中、チューブ内の異なる位置に調節され得る。この作業は、室温で行われ得、振幅、サイクルおよび時間は、脂肪組織の温度が約43℃〜約45℃を超えて上昇しないように調整される。超音波キャビテーション（特に、その振幅、サイクルおよび適用時間）の順序およびタイミングは、様々であり得るが、脂肪組織の温度が理想的には37℃を超えないようにまたは約43℃〜約45℃以下となるようにすることによって間質血管画分における幹細胞の最適な細胞数および生存能力が保証されるよう決定され得る。これらのパラメータは、簡単な試行錯誤によって容易に決定され得る。典型的に、振幅は約50％であり、サイクルは約0.4〜約0.5であり、そして時間は約1分30秒間である。振幅を増大させる場合、脂肪組織の温度が約43℃〜約45℃を超えて上昇しないことを保証するために、その結果としてサイクルまたは時間が減らされ得る（逆も同様）。超音波処理の後、チューブ内には濃溶液が存在し（これは濾過することや間質血管画分に容易に分離させることができない）、遠心分離され得る。
【００５７】
遠心分離により、3つの層 - 上部脂質層、細胞外マトリクスおよび間質血管細胞を含む中間浮動層、ならびに底部液体層が形成される。上部脂質層は除去されそして廃棄されなければならず、チューブの残りの内容物が十分に混合されて細胞外マトリクスが分離され、そして0.9％標準生理食塩水が添加される。さらなる遠心分離が、細胞および細胞外マトリクスを底部に降下させてペレット化させ - このペレットが、細胞外マトリクスおよび生存能力があり機能的な幹細胞（間葉系幹細胞を含む）を含む間質血管画分を含む。ペレットは、任意の大きな残骸を除去するために濾過され得る。
【００５８】
別の態様において、本発明は、脂肪組織からの間質血管画分または間質細胞の回収に関し、この方法は、間質血管画分内の成体幹細胞の生存能力を維持する時間、振幅、およびサイクルの超音波キャビテーションによって脂肪組織を処理する工程を含む。
【００５９】
別の態様において、脂肪組織は、振幅が約20％〜約75％およびサイクルが約0.2〜約0.9に設定された超音波装置を用いる約10秒間〜約10分間の超音波キャビテーションによって処理される。
【００６０】
別の態様において、脂肪組織の温度は、約43℃を超えない。
【００６１】
別の態様において、本発明の方法は、間質血管画分または間質細胞を分離するために遠心分離および洗浄される脂肪由来細胞懸濁物を得るために酵素、例えばコラゲナーゼ、および撹拌を使用する。
【００６２】
別の態様において、本発明の方法は、間質血管画分または間質細胞を分離するために遠心分離および洗浄される脂肪由来細胞懸濁物を得るためにレシチンおよび撹拌を使用する。
【００６３】
脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞、骨髄由来細胞調製物または成体幹細胞は、伝統的な投与経路、例えば静脈内注射によってそれを必要とする対象に直接注入され得、またはそれらは投与前に所望の細胞型、例えば間葉系幹細胞、STRO-1+細胞、STRO-3+細胞、脂肪由来間質幹細胞、間葉前駆細胞またはMuse-AT細胞を精製（および所望の場合に増幅）するためにさらに処理され得る。
【００６４】
いくつかの態様において、間葉系幹細胞が、インビトロ増幅のために、特有の細胞表面抗原および蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いる分画によって脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞または骨髄由来細胞調製物から単離、精製または濃縮され得る。
【００６５】
他の態様において、脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞、骨髄由来細胞調製物または成体幹細胞は、投与前に培養、増幅および／または分化され得る。
【００６６】
他の態様において、脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞、骨髄由来細胞調製物または成体幹細胞は、後の移植／注入のために保管され得る。細胞バンクにおける中〜長期間の保管もまた、本発明の範囲内である。
【００６７】
処理の最後に、脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞、骨髄由来細胞調製物または成体幹細胞は、皮下、関節内、静脈内、筋内または腹腔内のいずれかの技術によるレシピエントへの投与のために、送達装置、例えば注射器または静注バッグに充填され得る。換言すると、細胞は、当業者に公知の任意の手段によって患者に配置され得る、例えば、それらは全身もしくは局所送達のために血管に、組織（例えば、心筋もしくは骨格筋）に、関節（関節内）に、真皮（皮下）に、組織空間（例えば、心膜もしくは腹膜）に、または組織（例えば、尿路周囲配置）に、または他の部位に、注射され得る。好ましい態様は、添加物、例えばプレフォームマトリックスまたは脂肪由来もしくは間質由来の細胞外マトリクスと共に針もしくはカテーテルによりまたは直接的な外科移植により配置することを含む。
【００６８】
脂肪組織の間質血管画分もしくは間質細胞、骨髄由来細胞調製物または成体幹細胞は、単独でまたは他の細胞、組織、組織片、脱灰骨（demineralized bone）、例えばインスリンなどの成長因子、または例えばチアグリタゾン（thiaglitazone）ファミリーのメンバーなどの薬物、生物学的に活性もしくは不活性な化合物、吸収性プラスチックスキャホールド、脂肪由来もしくは間質由来格子（lattice）および／もしくは細胞外マトリクス、またはその細胞集団の送達、効能、耐容性もしくは機能を増強することが意図されるその他の添加物と組み合わせて適用され得る。本発明の特定の態様において、細胞は、1つまたは複数の細胞分化剤、例えばサイトカインおよび成長因子と共に患者に投与される。他の態様において、細胞は多血小板血漿または多成長因子血漿で処理される。
【００６９】
本発明は、ここから、特定の組成物および使用方法に関する特定の、しかし非限定的な実施例を参照してより詳細に説明される。しかしながら、特定の手順、組成物および方法の詳細な説明は、単に本発明を例示する目的で含まれるにすぎないことを理解されたい。いかなるかたちであれ、上記の本発明のコンセプトの広義的な説明に対する限定と理解されるべきではない。
【実施例】
【００７０】
実施例1 - 脂肪吸引による脂肪組織の調製
脂肪吸引術の前に吸引される吸引脂肪量を超える過剰量のチューメセント溶液（1リットルの標準生理食塩水中に、1mgのアドレナリン、800mgのリグノカインおよび10mLの8.4%炭酸水素ナトリウム溶液を含む）を、皮下脂肪層に注入し（チューメセント法）、その後に、例えば2〜3mmの内径を有するカニューレ（アスピレータを有する金属製のもの）を脂肪吸引術に使用した。脂肪吸引術は当技術分野で周知であり、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるBiyo Seikei Shujutsu Practice 2（Cosmetic Operation Practice 2）, ed. Masanari ICHIDA, Ryusaburo TANINO, and Yoshiaki HOSAKA, published by BUNKODO, pp.429-469を参照することができる。
【００７１】
吸引した脂肪を生理食塩水で洗浄した。約50ml〜10リットルの洗浄済吸引物が生じ得、得られた脂肪組織由来細胞物質を、間質血管画分の取得のために使用した。
【００７２】
実施例2 - 手術による脂肪組織の調製
脂肪組織を、インフォームドコンセントを得たヒト対象から手術によって取得した。分離は、当技術分野で周知の技術を用いて行った。簡単に説明すると、ヒト脂肪組織を、インフォームドコンセントを得たヒト対象から吸引した脂肪組織から無菌的に分離した。得られた脂肪組織由来細胞物質を、間質血管画分の取得のために使用する。
【００７３】
実施例3 - 多血小板血漿および多成長因子血漿の調製
1）麻酔前に血液を回収する。2 x 9mLのクエン酸デキストロース（ACD-A）血液回収チューブ（BDバキュテナー）を満たす（減圧）。せん断による血小板の活性化を回避するために、血液を18G針またはそれより大きいものを用いて吸い込む。血液チューブの内容物を、チューブを3〜4回ひっくり返すことによって混合する。
2）ACD-A血液充填チューブを450g x 10分間遠心分離する。
3）同じ移動用ピペットを用いて血漿層（上層）を各チューブから取り出し、15mL滅菌チューブに移す。血液はかき乱すべきではなく、血液の上にのっている白血球の薄い層は避けるべきである。赤血球の上に5mmの血漿層を残すのが最も良い。この濃縮血小板含有血漿（PRP）は、そのまま使用することができ、または以下のようにしてさらに処理することができる。
4）この血漿を含むチューブを2000g/10分間遠心分離する - チューブの底部に血小板の小さなペレットが形成されるはずである。
5）上部の低血小板血漿（platelet poor plasma）は、移動用ピペットで1.5mLになるまで除去しそして廃棄するべきである。ペレットは、同じ移動用ピペットを用いて残りの1.5mL中で再懸濁するべきである。これが、多血小板血漿（PRP）である。
6）PRPはそのまま使用することができ、または所望の場合、150μlのグルコン酸カルシウム（1mL注射器および針）をPRPに添加しよく混合することによって凝固処理することができる。チューブは温水槽（37℃ - 振盪なし）内に置くかまたはより長い時間室温で静置すべきである。PRPは、固形のゲルを形成するはずである。
7）固化の後、PRPは、37℃（処理を速めるため）または室温のいずれかで静置させることができ、それによって次の1〜2時間かけて部分的に溶解させる - これは、多成長因子血漿（PRGF）として公知である。
【００７４】
実施例4 - コラゲナーゼおよび／またはレシチン処理による脂肪組織の間質血管画分の調製
1）3mmカニューレおよび改変クレイン溶液（Modified Klein's solution）（1リットルの標準生理食塩水中に、1mgのアドレナリン、400mg〜800mgのリグノカインおよび10mLの8.4％炭酸水素ナトリウムを含む）を用いて患者の腹部から50〜1000mLの脂肪吸引物を得た。脂肪吸引物を標準生理食塩水でリンスし、500mL遠心ポットに入れた。
2）コラゲナーゼ（Serva）は、最終濃度0.05％（0.22μmの滅菌フィルターを通して滅菌濾過する）、および／またはレシチンの場合は10％（Adistem）、を達成するよう添加する。
3）サンプルを、水槽（37℃）中で、37℃で30〜90分間インキュベートし、そして穏やかに撹拌した。インキュベートの間、15分ごとに手作業でサンプルを穏やかにひっくり返す。
4）インキュベート後、サンプルを500g x 5分間遠心分離した。遠心分離後に3つの層が存在した。上部黄色／透明層（脂質層）。白色繊維中間層、およびチューブ底部の細胞ペレットを含む赤色／白色底部層。
5）細胞ペレットを、混合用カニューレおよび注射器を用いてペレットを吸い取ることによってポットから取り出す。
6）細胞ペレットを50mL遠心チューブに吐き出し、PBSを40mLになるよう添加する。チューブの内容物を、真空ポンプを用いて100μmステリフリップ（steriflip）（Millipore）を通じて50mLチューブへと滅菌濾過する。
7）ろ液を500gで5分間遠心分離する。
8）ペレットをかき乱さないよう上清を除去し、すべての細胞ペレットを1つの遠心チューブに集める。得られるペレットを再懸濁し、40mLのPBSを添加する。
9）細胞懸濁物を500gで5分間遠心分離し、上清を除去する。
10）20mLのPBSを添加し、細胞懸濁物を、60μmステリフリップ（Millipore）を通じて濾過する。
11）ろ液を500gで5分間遠心分離し、上清を除去する。細胞計数のためにサンプルを取り出す。（50μlの十分混合した細胞のサンプルを0.4％のトリパンブルーに添加し、混合し、そして1〜2分間静置した後、そのサンプルを血球計数器のチャンバーに入れる。細胞の数および生存能力を、グリッド領域あたり少なくとも100個の細胞を計数することによって決定する。生存能力のある細胞を、トリパンブルーの排除によって決定する）。
12）5〜10mLのPRPもしくはPRGFが添加され得または標準生理食塩水が添加され得る。
13）サンプルを注射器に吸い上げ、患者への注入のために、標準生理食塩水静注1リットルバッグに入れる。
【００７５】
実施例5 - 超音波キャビテーションによる脂肪組織の間質血管画分の調製
1）実施例1または2に記載されるようにして脂肪吸引物からまたは外科的に得た脂肪組織を適切なチューブおよび生物学的溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水溶液または標準生理食塩水溶液）に入れた。
2）過剰な液体を、注射器の端部を通じて吸い取るかまたはチューブを200g/2分間遠心分離し過剰な液体と脂肪組織を分離させるかのいずれかによって除去した。チューブの底部の過剰な液体を除去する。
3）（任意）チューブを冷却環境下に置き、組織／細胞の温度が2℃を下回らないよう注意する。
4）超音波キャビテーション装置用プローブを脂肪組織に配置し、振幅を50％、サイクルを0.4〜0.5に設定する。プローブを、チューブ内の1つまたは2つの異なる場所（すなわち、チューブの底部および上部）で1分間次いで約30〜40秒間上下させる。任意でこのプロセルを3分後に繰り返す。
5）脂肪組織の温度が理想的には37℃を超えて上昇しないようまたは最大でも約43℃以下となるように注意した。
6）超音波処理の後、濃溶液がチューブ内で観察され、これを800g/5分間遠心分離する。
7）遠心分離後、3つの層 - 上部脂質層、細胞外マトリクスおよび間質血管細胞を含む中間浮動層、ならびに底部液体層が存在する。
8）上部脂質層を、混合用カニューレおよび注射器を用いて除去および廃棄し、チューブの残りの内容物をよく混合してさらに細胞外マトリクスを分断する。
9）等張溶液（標準生理食塩水）をチューブに添加して45mlにし、そしてチューブを800g/5分間遠心分離することにより、細胞および細胞外マトリクスの降下を開始させ、底部でペレット化させる。
10）細胞外マトリクスおよび生存能力があり機能的な幹細胞を含む間質血管画分を含む大きなペレットがチューブの底部で観察される。次いでこのペレットを、混合用カニューレおよび注射器を用いて取り出し、そして任意の大きな残骸を除去するために100μmフィルターを通して濾過する。
11）細胞の計数のためにサンプルを採取する - この方法を用いて20gの脂肪組織から得られる典型的な細胞数は、約40〜約200 x 106個、すなわち、1グラムあたり約2〜約10 x 106であり、これは典型的に脂肪組織1グラムあたり約0.5 x 106をもたらすコラゲナーゼ分離のそれよりも多い。
12）注射前または注射時に、PRP、PRGFまたは他の細胞成長因子／サイトカインが細胞ペレットに添加され得る。
13）サンプルを注射器に吸い上げ、そして関節内、筋内もしくは腹腔内に注射するかまたは患者への注入のための標準生理食塩水静注1リットルバッグに注入した。
【００７６】
細胞ペレットの分析は、培養下で成長させることができ（実施例7および図2を参照のこと）かつ間葉系幹細胞を含む（図3）、生存能力のある細胞（図1）の存在を示した。
【００７７】
実施例6 - 骨髄の調製
骨髄は、胸骨、前腸骨または後腸骨から抽出される。これらの部位をベタジン溶液で準備し、局所麻酔を皮膚下で行う。長めの針を使用して腸骨稜の中間点を特定し、3〜4mLの2％キシロカインを骨膜下に注入する。「J」型の針を前／後腸骨翼に挿入する。針を、穏やかに回転させて、髄腔に1cm入れる。スタイレットを針から取り外し、5-cc注射器を装着する。注射器のプランジャーを引くことによって骨髄を吸引する。2〜3mLの骨髄を回収した後、より多くの骨髄を得ることができる場合は、針を再配置することができる。
【００７８】
かん流または吸引法のいずれかによって収集した骨髄細胞を遠心分離し、15mLのPBSに再懸濁する。それらを15mLの（1.077 g/mLの）密度溶液（density solution）（Lymphoprep）上に配置する。2,000 rpm、室温で30分間の遠心分離の後、境界の決められた層から骨髄細胞を回収する。
【００７９】
実施例7 - 増幅された間葉系幹細胞の調製
成体幹細胞は、任意の適当な方法によって脂肪組織から得ることができ、標準的な細胞培養培地（例えば、10％ウシ胎仔血清もしくはヒト血清を補充されたアルファMEM（Gibco）または無血清培地（Gibco））を用いて分化させずに培養することができる。初代培養物を、1 x 106/100mmとなるようプレーティングする。好ましくは、細胞は1〜2継代増幅されるが、5％ CO2または低酸素環境下で最大7回継代させることができる。そのような細胞は、必要な場合、単クローン継代させることができる。自己由来または同種異系の単離された細胞を、適切な点まで、一般には2継代培養し、生存能力および収量を標準的な方法によって評価する。増幅された細胞の標準的な試験は、陽性幹細胞マーカーCD29+、CD44+、CD90+、CD105+によって行われる。単離された細胞は、軟骨、骨および脂肪細胞に分化させることができる - これは異なる組織の細胞に分化するそれらの能力を示している。Good Medical Practice手順に関して、肝炎、HIVおよびトレポネーマに対する標準的な血清学的試験とは別に、細菌および真菌の16sサブユニットに対するPCR試験、マイコプラズマのdapi染色、不純度および細胞の生存能力、ならびに低温保存前の微視的形態の評価がある。適用の前に、上記のPCR試験およびLimulus Amoebocyte Lysate（LAL）による内毒素／発熱物質試験が行われ得る。
【００８０】
実施例8 - 片頭痛歴を有する患者に対する脂肪組織の間質血管画分または間質細胞の投与
患者1
この患者は、国際頭痛分類第2版第1改定版（the international classification of Headache Disorders 2nd Edition 1st Revision）の1.5.1慢性片頭痛、すなわち典型的に20日／月を超える片頭痛に苦しんでいる患者、に当てはまる長い片頭痛および頭痛歴を有する。緊張性および片頭痛の混合型の前兆は見られない。
【００８１】
実施例5（PRGF添加あり）にしたがい調製された脂肪組織由来間質血管画分（700mLの脂肪組織由来の5億4千6百万細胞）の単回静注投与の後、患者は1ヶ月後に1回頭痛を起こしただけであった。
【００８２】
患者2
この患者は、国際頭痛分類第2版第1改定版の1.5.1慢性片頭痛、すなわち典型的に20日／月を超える片頭痛に苦しんでいる患者、に当てはまる長い片頭痛／頭痛歴を有する。患者は、モルヒネパッチ、1日最大8錠のパラセタモールおよびコデインリン酸塩またはオキシコドン塩酸塩を使用していた。
【００８３】
実施例4（コラゲナーゼ）にしたがい調製された脂肪組織由来間質血管画分（1,005mLの脂肪組織に由来する4億9千5百万細胞）の単回静注投与の後、患者は5ヶ月の期間内に1回の片頭痛および数回の小さな頭痛を記録した。結果は処置の3日後に表れ、モルヒネパッチは使用中断になった。小さな頭痛が5ヶ月後に戻ってきたため、患者は7ヶ月目に、実施例4にしたがい調製された6億3千8百万細胞により静注で再処置された。改善は1日目から見られた。パラセタモールの投薬は週一回に減らされた。18ヶ月で、7回の片頭痛および数回の通常の頭痛を経験したのみであった。
【００８４】
患者3
この患者は、国際頭痛分類第2版第1改定版の1.2.1片頭痛を伴う典型的な前兆および2.2頻発反復性緊張型頭痛に当てはまる長い片頭痛および緊張性頭痛歴を有する。この患者は、生涯にわたる頭痛歴、典型的には典型的な前兆を伴う1日2回の片頭痛および高頻度の反復性の緊張型頭痛を有する。
【００８５】
実施例4（コラゲナーゼおよびレシチン）ならびに実施例5（PRGF添加あり）にしたがい調製された脂肪組織由来間質血管画分（29億3千万細胞）の単回静注投与の後。結果は処置の3日後に表れた。1ヶ月ですべての頭痛薬が使用停止になった。3ヶ月で1回の緊張性頭痛しか起こらなかった。4ヶ月目までに、ときおり軽度の緊張性頭痛が起こった。
【００８６】
患者4
この患者は、国際頭痛分類第2版第1改定版の1.5.1慢性片頭痛、すなわち典型的に20日／月を超える片頭痛に苦しんでいる患者、に当てはまる長い片頭痛および頭痛歴を有する。
【００８７】
実施例5にしたがい調製された脂肪組織由来間質血管画分（4千百万細胞）の単回静注投与の後、患者は、最後の12ヶ月の間に、約2ヶ月前に3週間の間隔で2回のひどい頭痛を起こしただけだった（片頭痛ほど重症ではないが片頭痛と同時発生する副鼻腔炎性頭痛があった）。その1年の間に片頭痛はなかった。過去に、痛みを和らげる注射のために、医師の家庭訪問を必要としていた。患者は、現在、ときおりパラセタモールを服用するのみである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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