(57)【要約】【課題】【解決手段】本発明の一部は、ＲＡＣポリペプチド変異体をコードする単離核酸分子、又はそのフラグメントの発見に基づき、ＲＡＣポリペプチド変異体は、野生型ＲＡＣポリペプチドにおいて、ＲＡＣポリペプチド変異体を構成的に活性化し発癌性にする１つ又は複数のアミノ酸の置換を含む。かかる核酸分子、並びにベクター、宿主細胞によってコードされる単離ＲＡＣポリペプチド変異体、かかる単離核酸分子を使用してコードしたポリペプチドを産生する方法、さらに癌を同定、評価、予後判定、及び治療するために変異体ＲＡＣ核酸及びポリペプチドを使用する方法も開示される。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＡＣポリペプチド変異体をコードする単離核酸分子、又はそのフラグメントであって、前記ＲＡＣポリペプチド変異体が、野生型ＲＡＣポリペプチドにおいて、前記ＲＡＣポリペプチド変異体を構成的に活性化し発癌性にする１つ又は複数のアミノ酸の置換を含む、単離核酸分子。
【請求項２】
前記ＲＡＣポリペプチド変異体の活性が、グアニジン三リン酸（ＧＴＰ）の加水分解、細胞増殖の制御、細胞周期の制御、上皮分化の制御、細胞骨格の再構成、及びタンパク質キナーゼの活性化からなる群から選択される、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
前記ＲＡＣポリペプチドが、ＲＡＣ１、ＲＡＣ１ｂ、ＲＡＣ２、及びＲＡＣ３、又はそれらのフラグメントからなる群から選択される、請求項１又は２のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項４】
前記野生型ＲＡＣポリペプチドが、配列番号２、４、６及び８のアミノ酸配列の全長と少なくとも８０％の同一性を有するポリペプチドからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項５】
前記野生型ＲＡＣポリペプチドが、配列番号２、４、６及び８のアミノ酸配列を有するポリペプチドからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項６】
前記１つ又は複数のアミノ酸置換が、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）、ＲＡＣ１（Ｃ１５７Ｙ）、ＲＡＣ１（Ｐ１７９Ｌ）、ＲＡＣ２（Ｉ１２１Ｍ）、ＲＡＣ２（Ｐ２９Ｑ）、ＲＡＣ２（Ｄ４７Ｙ）、及びＲＡＣ２（Ｐ１０６Ｈ）からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項７】
前記核酸分子が、配列番号１、３、５又は７の核酸配列に対して少なくとも８０％の同一性を有し、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）、ＲＡＣ１（Ｃ１５７Ｙ）、ＲＡＣ１（Ｐ１７９Ｌ）、ＲＡＣ２（Ｉ１２１Ｍ）、ＲＡＣ２（Ｐ２９Ｑ）、ＲＡＣ２（Ｄ４７Ｙ）、及びＲＡＣ２（Ｐ１０６Ｈ）からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸置換をコードする、請求項１〜６のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項８】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、請求項１〜７のいずれかに記載の単離核酸分子とハイブリダイズする単離核酸分子。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の単離核酸分子と相補的であるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項１０】
前記核酸分子が異種のポリペプチドをさらにコードする、請求項１〜９のいずれかに記載の単離核酸分子。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１２】
前記ベクターが発現ベクターである、請求項１１に記載のベクター。
【請求項１３】
請求項１１又は１２の前記発現ベクターでトランスフェクトされた、宿主細胞。
【請求項１４】
細胞培養培地内で請求項１３の宿主細胞を培養し、それによって前記ポリペプチドを産生することを含む、ポリペプチド産生方法。
【請求項１５】
請求項１〜１０のいずれかに記載の単離核酸分子によってコードされたポリペプチドからなる群から選択される単離ＲＡＣポリペプチド変異体、又はそのフラグメント。
【請求項１６】
請求項１５に記載のポリペプチドに選択的に結合する抗体。
【請求項１７】
請求項１５に記載のポリペプチドの存在をサンプル中で検出する方法であって、
ａ）前記ポリペプチドに選択的に結合する化合物に前記サンプルを接触させることと、
ｂ）前記化合物が前記サンプル中の前記ポリペプチドに結合するかを判定し、それによって前記サンプル中の前記ポリペプチドの存在を検出することと、
を含む方法。
【請求項１８】
対象が癌を有するかを判定する方法であって、前記対象から生物学的サンプルを取得することと、
ａ）対象サンプル中の請求項１〜１７のいずれかに記載の変異体ＲＡＣマーカーのうち少なくとも１つの量、構造、細胞内局在及び／又は活性と、
ｂ）コントロール中の前記少なくとも１つの変異体ＲＡＣマーカーの量、構造、細胞内局在及び／又は活性と、
を比較することと、を含み、
前記サンプル中の前記少なくとも１つのマーカーの前記量、構造、細胞内局在、及び／又は活性、及び前記コントロールの前記量、構造、細胞内局在、及び／又は活性の有意の増加が、前記対象が癌を有することを示す、方法。
【請求項１９】
癌を有する対象の予後判定方法であって、前記対象から生物学的サンプルを取得することと、
ａ）対象サンプル中の前記少なくとも１つの変異体ＲＡＣマーカーの量、構造、細胞内局在及び／又は活性と、
ｂ）コントロール中の前記少なくとも１つの変異体ＲＡＣマーカーの量、構造、細胞内局在及び／又は活性と、
を比較することと、を含み、
前記サンプル中の前記少なくとも１つのマーカーの前記量、構造、細胞内局在、及び／又は活性、及び前記コントロールの前記量、構造、細胞内局在、及び／又は活性の有意の増加が、前記対象が好ましくない予後を有することを示す、方法。
【請求項２０】
前記対象に、前記癌の治療に適した療法を提供するステップをさらに含む、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記コントロールが、前記対象サンプルに対して早期の時点にある対象から取得した前記対象からのサンプルである、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記コントロールが、前記対象、又は前記対象が属するのと同じ種のメンバー由来の非癌性細胞サンプルから決定される、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記コントロールの量、細胞内局在、構造、及び／又は活性が、前記対象の属する前記種の野生型の量、細胞内局在、構造、及び／又は活性である、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記対象がアジュバント化学療法を受ける前に、前記コントロール及び／又は対象サンプルを取得する、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記対象がアジュバント化学療法を受けた後に、前記コントロール及び／又は対象サンプルを取得する、請求項１８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記サンプルが、細胞、細胞株、組織学的スライド、パラフィン包埋組織、生検材料、全血、乳頭吸引液、血清、血漿、頬側掻き取り片、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、及び骨髄からなる群から選択される、請求項１７〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記癌が乳癌、卵巣癌、移行細胞膀胱癌、気管支原性肺癌、甲状腺癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、精巣癌、胃癌、軟組織及び骨原性肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、悪性リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、急性顆粒球性白血病、急性リンパ性白血病、カポジ肉腫、ユーイング腫瘍、難治性多発性骨髄腫、及び頭部、首、頚部及び膣の扁平上皮癌からなる群から選択される、請求項１８〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記マーカーの量が、前記マーカーの発現レベル又はコピー数を測定することによって判定される、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記コピー数が、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）、及び一塩基多型（ＳＮＰ）アレイからなる群から選択される少なくとも１つの技術を使用して測定される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記サンプル中の前記マーカーの発現レベルが、前記マーカーに対応するタンパク質のサンプルにおける存在を検出することによって評価される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記タンパク質が、抗体、抗体誘導体、及び抗体フラグメントからなる群から選択される試薬を使用して検出される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記サンプル中の前記マーカーの発現レベルが、前記サンプル中の転写ポリヌクレオチド又はその一部の存在を検出することによって評価され、前記転写ポリヌクレオチドが前記マーカーを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記転写ポリヌクレオチドがｍＲＮＡ又はｃＤＮＡである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記マーカーの発現レベルを判定することが、ノーザンブロット解析、逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、ＲＮＡｓｅ保護、及びマイクロアレイ解析からなる群から選択される少なくとも１つの技術を使用することを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記サンプル中の前記マーカーの発現レベルが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件で、前記マーカーとアニールする、又はポリヌクレオチドの一部とアニールする転写ポリヌクレオチドの前記サンプルにおける存在を検出することによって評価され、前記ポリヌクレオチドが前記マーカーを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で４５℃にてインキュベートし、その後に０．２×ＳＳＣ及び０．１％のＳＤＳ中で５０〜６０℃にて洗浄することである、請求項８又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記治療の結果が、死亡までの生存率、病理学的著効、臨床的完全寛解、臨床的部分寛解、臨床的不変、無再発生存、無転移生存率、及び無再発生存率からなる群から選択される少なくとも１つの基準によって測定される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３８】
対象が癌を有するか判定する、又は癌を有する対象の治療後を予後判定するためのキットであり、請求項１〜３７のいずれかに記載の１つ又は複数の変異体ＲＡＣマーカーのコピー数を評価する試薬を含むキット。
【請求項３９】
対象が癌を有するか判定する、又は癌を有する対象の治療後の予後判定するためのキットであり、請求項１〜３８のいずれかに記載の１つ又は複数の変異体ＲＡＣマーカーの量、構造、細胞内局在、及び／又は活性を評価する試薬を含むキット。
【請求項４０】
前記試薬が、前記少なくとも１つの変異体ＲＡＣマーカーとハイブリダイゼーションする核酸分子で構成される群から選択される、請求項３８又は３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記試薬が、抗体、及び抗体誘導体、及び抗体フラグメントからなる群から選択される、請求項３８又は３９に記載のキット。
【請求項４２】
請求項１〜４１のいずれかに記載の１つ又は複数の変異体ＲＡＣマーカーに対応する遺伝子又はタンパク質の細胞内局在を変化させる、又はその量及び／又は活性を調節する試薬を含む、癌に罹患した対象を治療するキット。
【請求項４３】
１つ又は複数の追加の抗癌剤をさらに含む、請求項４２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
[0001]
本出願は２０１２年７月２６日出願の米国仮特許出願第６１／６７６，１１７号に基づく優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願の発明は、ＲＡＣ変異体を含む組成物、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
[0002]  形質転換タンパク質の同定及びそれを標的とする作用物質の開発は、癌患者の治療に著しく影響し、その予後を改善した。例えば慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、融合チロシンキナーゼ切断点クラスター領域−アベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ１（ＢＣＲ−ＡＢＬ１）の成長促進活性に起因することが示されており、特異的ＡＢＬ１阻害物質、すなわちイマチニブメシル酸塩による治療はＣＭＬ患者の５年生存率をほぼ９０％まで上昇させている（Druker他 (2006)、N. Engl. J. Med. 355:2408-2417）。同様に、棘皮動物の微小管結合タンパク質様４遺伝子（ＥＭＬ４）と未分化リンパ腫受容体チロシンキナーゼ（ＡＬＫ）との融合が、非小細胞肺癌症例のサブセットの原因であり（Soda他 (2007)、Nature 448:561-566)、ＥＭＬ４−ＡＬＫキナーゼ活性を標的とする療法は、従来の化学療法で達成されたものと比較して患者の無増悪生存率を大幅に改善している（Shaw他 (2011)、Lancet Oncol. 12:1004-1012）。別の例では、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）は非小細胞肺癌のサブセット間のアミノ酸置換又は内部欠失により構成的に活性化され、ＥＧＦＲ阻害物質を用いた患者の治療は、その無増悪生存を大幅に延長することが示されている（Mok他 (2009)、N. Engl. J. Med. 361:947-957）。このように、ヒトの癌における必須増殖推進物質を標的とする療法は、難治性疾患患者の最も効果的な治療の一つである。
【０００４】
[0003]  Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２カーステンラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＫＲＡＳ）、ｖ−Ｈａ−ｒａｓハーベイラット肉腫ウイルス癌遺伝子ホモログ（ＨＲＡＳ）、及び神経芽細胞腫ＲＡＳウイルス（ｖ−ｒａｓ）癌遺伝子ホモログ（ＮＲＡＳ）は、ヒトで１５０を超えるメンバーを含むことが知られている低分子量グアノシントリホスファターゼ（ＧＴＰアーゼ）のラット肉腫（ＲＡＳ）スーパーファミリーの根本となるメンバーである（Colicelli (2004)、 Sci STKE 2004:RE13）。これら低分子量ＧＴＰアーゼの５つの亜群が同定され、ＲＡＳ、ｒａｓホモログファミリーメンバー（ＲＨＯ）、ＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（ＲＡＢ）のメンバーであるＲＡＢ１Ａ、ＲＡＳ癌遺伝子ファミリー（ＲＡＮ）のメンバーであるＲＡＮ、及びＡＤＰ−リボシル化因子（ＡＲＦ）ファミリーと命名されている。すべての低分子ＧＴＰアーゼは、ＧＤＰ結合不活性形態とＧＴＰ結合活性形態との間で転位する２進スイッチとして機能し、それにより細胞の増殖、分化、生存、運動性、細胞骨格再配置、及び形質転換などの広範囲の細胞活性の根底にある細胞内シグナル伝達に寄与する（Cox及びDer (2010)、Small GTPases 1:2-27）。様々なヒト腫瘍でＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ又はＮＲＡＳを活性化する体細胞点突然変異が同定されており、ＫＲＡＳがヒトの体内で最も頻繁に活性化される腫瘍性タンパク質である。したがって、ＫＲＡＳの細胞体活性化変異は、例えば膵臓腺癌の９０％超に存在する（Jaffee他 (2002)、Cancer Cell 2:25-28）。しかし、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ及びＮＲＡＳ以外の低分子ＧＴＰアーゼの変異活性は、それほど報告されていない。
【０００５】
[0004]  Ｒａｓ関連のＣ３ボツリヌス毒素基質（ＲＡＣ）１、ＲＡＣ２及びＲＡＣ３は、低分子ＧＴＰアーゼのＲＨＯファミリーに属する（Wertheimer他 (2012)、Cell Signal 24:353-362）。ＲＡＣタンパク質はアクチン重合を調整し、活性化されると膜の波打ち（membrane ruffles）及び膜状仮足の形成を誘導して（Ridley他 (1992)、Cell 70:401-410）、細胞の形態維持及び細胞遊走における基本的役割を果たす。ＲＡＣタンパク質が細胞形質転換の根底にある細胞内シグナル伝達の重要な中心として機能することを示す証拠も蓄積している。例えば、ＲＡＣ１は、発癌性ＲＡＳが細胞の形質転換を誘導する信号伝達路の必須の下流構成要素として働き、アミノ酸置換（Ｇ１２Ｖ）をＲＡＣ１に人為的に導入すると発癌性になる（Qiu他 (1995)、Nature 374:457-459）。さらに、ＲＡＣ１活性を抑制するとグリオーマ細胞のアポトーシスを誘発し（Senger他 (2002)、Cancer Res. 62:2131-2140）、ＲＡＣ１又はＲＡＣ２が消失するとＢＣＲ−ＡＢＬ１に推進される骨髄増殖性疾患の発現が顕著に遅れる（Thomas他 (2007)、Cancer Cell 12:467-478）。このようにＲＡＣタンパク質は癌において重要な役割を果たすが、これらのタンパク質の体細胞形質転換変異は、癌サンプルで同定されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、当技術分野では、かかるＲＡＣタンパク質変異体を同定する必要性が非常に大きい。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
[0005]  本発明の一態様は、ＲＡＣポリペプチド変異体をコードする単離核酸分子又はそのフラグメントに関し、該ＲＡＣポリペプチド変異体は、ＲＡＣポリペプチド変異体を構成的に活性かつ発癌性にする野生型ＲＡＣポリペプチドのアミノ酸の１つ又は複数の置換を含む。例えば、１つ又は複数のアミノ酸置換は、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）、ＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）、ＲＡＣ１（Ｃ１５７Ｙ）、ＲＡＣ１（Ｐ１７９Ｌ）、ＲＡＣ２（Ｉ１２１Ｍ）、ＲＡＣ２（Ｐ２９Ｑ）、ＲＡＣ２（Ｄ４７Ｙ）、及びＲＡＣ２（Ｐ１０６Ｈ）からなる群から選択することができる。本発明の別の態様は、かかる核酸分子にコードされた単離ＲＡＣポリペプチド変異体、並びに、ベクター、宿主細胞、かかる単離核酸分子を使用してコードされたポリペプチドを産生する方法に関する。本発明のさらに別の態様は、癌の同定、評価、予後の判定、及び治療に変異体ＲＡＣ核酸及びポリペプチドを使用する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】[0006]ＲＡＣ１及びＲＡＣ２変異のシーケンスを示す。ＲＡＣ１のｃＤＮＡの電気泳動図により、ＨＴ１０８０及びＭＤＡ−ＭＢ−１５７細胞のそれぞれにおいて、５１６Ａ＞Ｔ及び３２６Ｃ＞Ｔ変異が明らかとなり、その結果、Ｎ９２Ｉ及びＰ２９Ｓアミノ酸置換が生じている。同様に、ＲＡＣ２のｃＤＮＡでは、ＫＣＬ−２２及びＨＣＣ１１４３細胞のそれぞれにおいて、２０３＿２０４ＣＣ＞ＡＡ及び２０３Ｃ＞Ｔ変異が同定され、その結果、それぞれＰ２９Ｑ及びＰ２９Ｌアミノ酸変化が生じている。
【図２−１】図２Ａ〜図２ＤはＲＡＣ１及びＲＡＣ２変異の形質転換可能性を示す。図２Ａは、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、及び野生型又は変異体形態のＲＡＣ１又はＲＡＣ２をコードする遺伝子組み換えレトロウイルスを感染させ、１０％（vol/vol）ＦＢＳの存在下ｉｎ  ｖｉｔｒｏで足場非依存性増殖について検定した３Ｔ３又はＭＣＦ１０Ａ細胞を示す。１４日（３Ｔ３）又は２０日（ＭＣＦ１０Ａ）培養した後、細胞をクリスタルバイオレットで染色して、従来の顕微鏡で調べ（左側：各対の左像）、蛍光顕微鏡でＥＧＦＰの発現をモニタした（左側：各対の右像）（スケールバー、０．５ｍｍ）。細胞コロニーの数も、３つの独立した実験から平均値±ＳＤとして決定した（右側）。
【図２−２】図２Ｂは、ヌードマウスの肩に皮下注射した、野生型又は変異体形態のＲＡＣ１又はＲＡＣ２を発現する３Ｔ３細胞を示す。その結果となる腫瘍のサイズ［（長さ×幅）／２］を、その後の図示される時間に測定した。ＮＲＡＳ（Ｑ６１Ｋ）を発現する３Ｔ３の腫瘍サイズも同様にモニタした。データは、４つの注射部位における腫瘍の平均値±ＳＤである。図２Ｃは、野生型又は変異体形態のＲＡＣ１又はＲＡＣ２の発現ベクターをＳＲＥ．Ｌレポータープラスミド及びｐＧＬ−ＴＫとともにトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の結果を示す。次に、細胞溶解産物中のホタルルシフェラーゼの活性を測定し、ウミシイタケルシフェラーゼの活性で正規化した。データは、３つの独立した実験からの平均値±ＳＤである。図２Ｄは、野生型又は変異体形態のＲＡＣ１又はＲＡＣ２を発現する３Ｔ３細胞の溶解産物をＰＡＫ１−ＰＢＤでのプルダウンアッセイに供した結果を示す。次に、沈降タンパク質、さらに全細胞溶解産物を、ＲＡＣ１又はＲＡＣ２に対する抗体での免疫ブロット分析に供した。プルダウンＲＡＣタンパク質をそれに対応する全細胞溶解産物中の発現レベルと比較した相対量を、野生型ＲＡＣ１（ＲＡＣ１変異体の場合）又はＲＡＣ２（ＲＡＣ２変異体の場合）の値で正規化し、最下部に示した。
【図３】ＧＴＰアーゼを３Ｔ３細胞に導入した結果を示す。モックレトロウイルスを感染させたか、又はＮＲＡＳ又はＮＲＡＳ（Ｑ６１Ｋ）を発現する３Ｔ３細胞から得た全細胞溶解産物（１０マイクログラム）を、ＮＲＡＳ又はＡＣＴＢに対する抗体での免疫ブロット分析に供した（最上部パネル）。同様に、対応する抗体での免疫ブロット分析で、ＲＡＣ１若しくはその変異体（中央のパネル）、又はＲＡＣ２若しくはその変異体（最下部のパネル）の発現を評価した。
【図４】ＲＡＣ１／ＲＡＣ２変異体により誘発されるアクチン再配列を示す。強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、及び野生型又は変異体形態のＲＡＣ１又はＲＡＣをコードするレトロウイルスを感染させた３Ｔ３細胞をAlexa Fluor 594で標識したファロイジンで染色し、アクチン構成を目に見えるようにした（各対の左像）。同じ細胞をＥＧＦＰ蛍光でも調β（各対の右像）（スケールバー、２０マイクロメートル）。
【図５】図５Ａ〜図５Ｄは発癌性ＲＡＣタンパク質が治療標的であることを示す。図５Ａは、ＨＴ１０８０細胞に、コントロール、ＲＡＣ１、又はＮＲＡＳのｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、溶解させ、ＲＡＣ１、ＮＲＡＳ又はＡＣＴＢ（負荷コントロール）に対する抗体での免疫ブロット分析に供した結果を示す。図５Ｂは、ＨＴ１０８０細胞にコントロール、ＲＡＣ１、又はＮＲＡＳのｓｉＲＮＡを図示された通りにトランスフェクトし、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳの存在下で培養した結果を示す。細胞数は、トランスフェクト開始以降の図示された時間でカウントした。データは、３つの独立した実験からの平均値±ＳＤである。図５Ｃは、ＨＴ１０８０細胞に強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、及び、コントロール又はＲＡＣ１ｓｈＲＮＡをコードするレトロウイルスを感染させた結果を示す。図示されたように、ｓｈＲＮＡ抵抗性野生型ＲＡＣ１又はＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）をコードするレトロウイルスも感染させた。図示された時間だけ細胞を培養した後にＥＧＦＰ陽性の細胞数をフローサイトメトリで測定し、２日目における値に対するＥＧＦＰ陽性の分画のサイズを計算した。データは、パネルごとに３つの独立した実験の平均値±ＳＤである。図５Ｄは、ＭＤＡ−ＭＢ−１５７細胞に、ＥＧＦＰとコントロール又はＲＡＣ１のｓｈＲＮＡとをコードするレトロウイルスを感染させた結果を示す。図示されたように、ｓｈＲＮＡ抵抗性野生型ＲＡＣ１又はＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）をコードするレトロウイルスにも感染させた。ＥＧＦＰ陽性細胞の数を、図示された時間だけ細胞を培養した後にフローサイトメトリで測定し、３日目における値に対するＥＧＦＰ陽性の分画のサイズを計算した。データは、パネルごとに３つの独立した実験の平均値±ＳＤである。
【図６】図６Ａ〜図６Ｂは、低濃度のＦＢＳでのＲＡＣ１又はＮＲＡＳノックダウンの結果を示す。ＨＴ１０８０細胞に、図示された通りにコントロール、ＲＡＣ１、又はＮＲＡＳのｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。各細胞分画を、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）FBSが存在下（図６Ａ）又は非存在下（図６Ｂ）で培養し、トランスフェクト開始以降の図示された時間で細胞数をカウントした。データは、３つの独立した実験の平均値±ＳＤである。
【図７】図７Ａ〜図７Ｂは、ＨＴ１０８０細胞内でＲＡＣ１又はＮＲＡＳに対するｓｉＲＮＡの顕著な効果を示す。図７Ａは、コントロールのｓｉＲＮＡ又はＲＡＣ１若しくはＮＲＡＳに対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨＴ１０８０内で調β細胞周期のプロファイリングの結果を示し、細胞分画ごとにＧ１、Ｓ及びＧ２／Ｍ相の相対比（％）を示す。データは、３つの独立した実験の平均値±ＳＤである。図７Ｂは、図７Ａの場合と同じ細胞分画のＣＡＳＰ３及びＣＡＳＰ７の酵素活性を、Caspase-Glo 3/7 Assayキットで測定し、コントロールのｓｉＲＮＡをトランスフェクトした細胞に対する相対活性として示した図である。データは、３つの独立した実験の平均値±ＳＤである。
【図８】ＲＡＣ１のｓｉＲＮＡ＃７に耐性のＲＡＣ１の発現を示す。ＨＴ１０８０細胞にモックレトロウイルス、又はｓｉＲＮＡ耐性野生型ＲＡＣ１、ＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）、又はＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）を発現するウイルスを感染させ、その後にコントロールのｓｉＲＮＡ又はＲＡＣ１のｓｉＲＮＡ＃７をトランスフェクトした。ＲＡＣ１タンパク質の発現は、ＲＡＣ１のｓｉＲＮＡ＃７存在下であっても、ｓｉＲＮＡ耐性ＲＡＣ１のｃＤＮＡを導入することによって回復する。
【図９−１】図９Ａ〜図９Ｅは、ＲＡＣ１変異体の生化学的特性を示す。図９Ａは、０．８ｍＭのＭｇ2+の存在下で［35Ｓ］ＧＴＰγＳでインキュベートしたＲＡＣ１の野生型、Ｐ２９Ｓ、Ｎ９２Ｉ、又はＣ１５７Ｙ変異体（各５ピコモル）のタンパク質を細菌発現し、精製した結果を示す。［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合タンパク質の量は、図示された時間に測定した。図９Ｂは、［3Ｈ］ＧＤＰ結合ＲＡＣ１タンパク質からの［3Ｈ］ＧＤＰの分離を分析したアッセイの結果を示し、これは０．８ｍＭのＭｇ2+の存在下で非標識ＧＴＰγＳを添加することによって開始した。［3Ｈ］ＧＤＰ結合タンパク質の量を、図示された時間に測定した。
【図９−２】図９Ｃは、ＲＡＣ１タンパク質に［γ32Ｐ］ＧＴＰで前負荷を与え、次に０．８ｍＭのＭｇ2+の存在下で非標識ＧＴＰを添加することによってＧＴＰ加水分解反応させた結果を示す。タンパク質から解放されたＰiを単離し、図示された時間に測定した。図９Ｄは、０．８ｍＭのＭｇ2+の存在下で非標識ＧＴＰγＳを添加することによって開始した［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合ＲＡＣ１タンパク質からの［35Ｓ］ＧＴＰγＳの分離を示す。［35Ｓ］ＧＴＰγＳ結合タンパク質の量を、図示された時間に測定した。図９Ｅは、αへリックスとβシートを有するヒトＲＡＣ１のＧＴＰ結合ポケットの構造の略図である（ワールドワイドウェブでpdb.orgにて入手可能なタンパク質データバンクのＩＤ：１ｍｈ１）。ＧＴＰ類似体、グアノシン５’−（β、γイミド）−三リン酸塩（ＧｐｐＮｐ）、Ｍｇ2+、さらにアミノ酸残基、Ｄ１１、Ｐ２９、Ｎ９２、及びＣ１５７も示す。また、スイッチＩ及びスイッチＩＩ領域及びＰ−ループの位置を示す。
【図１０】野生型ＲＡＣ１の構造に基づきSWISS-MODELによって予測されたＰ２９Ｓ、Ｎ９２Ｉ、及びＣ１５７Ｙ置換を有する変異体ＲＡＣ１のＧＴＰ結合ポケットの構造を示す（タンパク質データバンクのＩＤ：１ｅ９６）。αへリックス、βシート、アミノ酸残基、Ｄ１１、Ｓ２９、Ｙ１５７、及びＩ９２、ＧｐｐＮｐ、及びＭｇ2+を示す。予測精度が低いループ領域も描かれている。
【図１１】ＲＡＣ１の位置９２におけるアミノ酸残基のタンパク質内相互作用を示す。野生型ＲＡＣ１の３Ｄ構造では、Ｎ９２の側鎖がＤ１１の側鎖に最も近く、Ｎ９２のアミノ基はＤ１１のカルボキシ基から２．８オングストロームしか離れていない（最上部のパネル）。しかし、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）の予測構造では、Ｉ９２はＤ１１に近いものの、アミノ−カルボキシルの相互作用はない（最下部のパネル）。
【図１２】ＨＴ１０８０細胞内の低分子ＧＴＰアーゼの内因性の発現を示す。ＲＡＣ１、ＲＡＣ２、ＲＡＣ３、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、又はＨＲＡＳのｃＤＮＡの量を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで定量し、ＲＡＣ１の場合に対する値（ＲＡＣファミリーのメンバーの場合；左側のパネル）又はＮＲＡＳの場合に対する値（ＲＡＳファミリーのメンバーの場合；右側のパネル）として示した。データは、３つの独立した実験の平均値±ＳＤである。
【図１３】ｓｉＲＮＡ媒介性の細胞形状の変化を示す。Ｈｔ１０８０細胞にコントロールのｓｉＲＮＡ、又はＲＡＣ１若しくはＮＲＡＳに対するｓｉＲＮＡをトランスフェクトし、位相差顕微鏡で調べた（スケールバー、５０マイクロメートル）。
【図１４−１】図１４Ａ〜図１４Ｃは、ＲＡＣタンパク質エフェクタ分子の同定を示す。図１４Ａは、ＲＡＣ１がそれぞれフェニルアラニン３７又はチロシン４０残基を通じてＲＯＣＫ１又はＰＡＫ１に結合し、それを活性化することを示す。
【図１４−２】図１４Ｂは、野生型ＲＡＣ１、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）、ＲＡＣ１（Ｆ３７Ａ／Ｎ９２Ｉ）又はＲＡＣ１（Ｙ４０Ｃ／Ｎ９２Ｉ）の発現に使用する遺伝子組み換えレトロウイルスを感染させた３Ｔ３細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで足場非依存性増殖させた結果を示す。図１４Ｃは、培養の４日後にコントロールのｓｉＲＮＡ、又はＲＡＣ１、ＰＡＫ１、ＲＯＣＫ１又はＲＯＣＫ２に特異的なｓｉＲＮＡをＨＴ１０８０細胞にトランスフェクトした結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
[0007]  本発明は、少なくとも部分的に、細胞を形質転換させる能力を有するＲＡＣ１及びＲＡＣ２発癌性変異体の発見に基づく。例えば、肉腫細胞株ＨＴ１０８０内のＲＡＣ１の新規のアミノ酸置換（Ｎ９２Ｉ）について記載されるが、Ｎ９２Ｉの変化によりＲＡＣ１は構造的に活性化され、高度に発癌性になる。ＨＴ１０８０はＮＲＡＳ（Ｑ６１Ｋ）腫瘍性タンパク質も有するが、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）がこの細胞株の必須増殖推進物質である。何故なら、ＮＲＡＳ（Ｑ６１Ｋ）ではなくＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンが細胞増殖を明らかに抑制したからである。癌細胞株中のＲＡＣ１／ＲＡＣ２／ＲＡＣ３変異のさらなるスクリーニング、さらに公的データベースにより、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）及びＲＡＣ２（Ｐ２９Ｑ）などのＲＡＣ１及びＲＡＣ２の新しい形質転換変異が同定された。ＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）、ＲＡＣ１（Ｃ１５７Ｙ）及びＲＡＣ２（Ｐ２９Ｌ）など、このように新しく特徴付けられていないＲＡＣ１及びＲＡＣ２変異体が形質転換する可能性を確認した。臨床関連では、発癌性ＮＲＡＳ及びＲＡＣ１が癌細胞と同時存在することがあるが、癌の増殖には後者が必須であると判断されたことは驚きである。したがって、治療薬（例えば低分子化合物、ＲＮＡ媒介ノックダウン、又は抗体）で発癌性ＲＡＣタンパク質を標的とすることは、ＲＡＣファミリーの腫瘍遺伝子を含む癌を治療する効果的な方法であると考えられ、ＲＡＣタンパク質の下流媒介物質を標的とすることも、癌治療に有益であると予想される。かかる臨床用途では、ＲＡＣ及び／又はＲＡＣ下流標的の活性化の正確な診断が、治療手順の重要な部分と考えられる。実際、本明細書ではＰＡＫ１、ＲＯＣＫ１、及びＲＯＣＫ２セリン／トレオニンキナーゼは、腫瘍遺伝子ＲＡＣ１／ＲＡＣ２媒介腫瘍形成に重要な役割を果たし、それに関して本明細書で述べる変異体ＲＡＣバイオマーカーを有する及び／又は発現した対象の臨床介入のために有用な標的となり得ることが実証されている。したがって、本明細書ではＲＡＣファミリーのＧＴＰアーゼの発癌性アミノ酸置換がヒト癌に存在し、癌の同定、評価、予後の判定及び治療に有用であると判断されている。
【００１０】
[0008]  幾つかの実施形態では、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）は診断、予後の判定、及び治療介入のための優れた標的である。本明細書で述べるように、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）を発現する線維芽細胞は、ＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）などの他のＲＡＣ１変異体と比較して大幅に増大した足場非依存性増殖能力を示し、これは、様々なＲＡＣ１／ＲＡＣ２変異体間で形質転換の能力が不均一であり、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）変異体が最も有力な腫瘍性タンパク質であることを示している。３Ｔ３細胞などのマウスの線維芽細胞が細胞のコンテクストを再利用する線維肉腫細胞株で、Ｎ９２Ｉ変異が発見されていることを考慮すれば、この結果は重要である。実際、ヌードマウスにおける皮下腫瘍の増殖速度は、本明細書ではＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）を発現する３Ｔ３細胞の場合、任意の他のＲＡＣ１／ＲＡＣ２タンパク質を発現する３Ｔ３細胞の場合よりはるかに高いことが実証されている。
【００１１】
[0009]定義
「ある（「ａ」及び「ａｎ」）」という冠詞は、１つ又は複数（すなわち少なくとも１つ）のその文法的対象を指す。例示により、「ある要素」とは１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。
【００１２】
[0010]  マーカーの「変化量」又はマーカーの「変化レベル」という用語は、コントロールサンプルのマーカーの発現レベル又はコピー数と比較して、マーカーの増大又は低減したコピー数、及び／又は癌サンプル中の１つ又は複数の特定のマーカー遺伝子の増大又は低減した発現レベルを指す。マーカーの「変化量」という用語は、正常なコントロールサンプルのマーカーのタンパク質レベルと比較して、例えば癌サンプルなどのサンプル中のマーカーの増大又は低減したタンパク質レベルも含む。
【００１３】
[0011]  対象におけるマーカーの「量」、例えばマーカー又は最小共通領域（ＭＣＲ）の発現若しくはコピー数、又はマーカーのタンパク質レベルは、マーカーの量が、正常レベルより、量の評価に使用されるアッセイの標準誤差より大きい量だけ多い又は少ない場合、好ましくはその量の少なくとも２倍、さらに好ましくは３倍、４倍、５倍、１０倍又はそれ以上の場合、それぞれマーカーの正常量より「有意に」高い又は低いという。あるいは、対象のマーカーの量は、量がマーカーの正常量よりそれぞれ少なくとも約２倍、好ましくは少なくとも約３倍、４倍、又は５倍多い又は少ない場合、正常量より「有意に」高い又は低いと見なすことができる。幾つかの実施形態では、対象のマーカーの量は、マーカーの正常量よりそれぞれ１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％以上高い又は低い場合、正常量より「有意に」高い又は低いと見なすことができる。
【００１４】
[0012]  マーカーの「発現の変化レベル」という用語は、試験サンプル、例えば癌に罹患した対象由来のサンプルの、発現又はコピー数の評価に使用されるアッセイの標準誤差より大きい、又は小さいマーカーの発現レベル又はコピー数を指し、コントロールサンプル（例えば関連疾患がない健常対象からのサンプル）のマーカー又は染色体領域の発現レベル又はコピー数、好ましくは幾つかのコントロールサンプルのマーカー又は染色体領域の平均発現レベル又はコピー数の好ましくは少なくとも２倍、さらに好ましくは３倍、４倍、５倍又は１０倍又はそれ以上である。発現の変化レベルは、発現又はコピー数の評価に使用されるアッセイの標準誤差より大きい、又は小さく、コントロールサンプル（例えば関連疾患がない健常対象からのサンプル）のマーカーの発現レベル又はコピー数、好ましくは幾つかのコントロールサンプルのマーカーの平均発現レベル又はコピー数の好ましくは少なくとも２倍、さらに好ましくは３倍、４倍、５倍、又は１０倍又はそれ以上である。
【００１５】
[0013]  マーカーの「変化した活性」という用語は、正常なコントロールサンプルのマーカーの活性と比較して、疾患状態、例えば癌サンプル中で増加又は減少しているマーカーの活性を指す。マーカーの変化した活性は、例えばマーカーの変化した発現、マーカーの変化タンパク質レベル、マーカーの変化構造、又は例えばマーカーと同じ又は異なる経路に関与する他のタンパク質の変化した相互作用、又は転写活性化剤又は阻害剤との変化した相互作用の結果であることがある。
【００１６】
[0014]  マーカーの「変化した構造」という用語は、正常又は野生型遺伝子又はタンパク質と比較して、マーカー遺伝子又はマーカータンパク質内に変異又は対立遺伝子変異型、例えばマーカーの発現又は活性に影響する変異が存在することを指す。例えば、変異は置換、欠失、又は付加変異を含むが、これらに限定されない。変異はマーカーのコード領域又は非コード領域に存在することがある。
【００１７】
[0015]  マーカーの「変化した細胞内局在」という用語は、細胞内、例えば健康及び／又は野生型細胞内の正常な局在に対して、細胞内におけるマーカーの誤った局在を指す。マーカーの正常な局在の指示は、当技術分野で知られ、マーカーポリペプチドに含まれる細胞内局在モチーフの分析を通して判断することができる。
【００１８】
[0016]  本明細書で他に規定されていない限り、「抗体」という用語は単鎖抗体、キメラ及びヒト化抗体、及び多特異的抗体などの自然発生形の抗体（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）及び組み換え抗体、並びに以上のすべてのフラグメント及び誘導体で、少なくとも１つの抗原結合部位を有するフラグメント及び誘導体を広義に含む。抗体誘導体は、抗体と共役するタンパク質又は化学的部分を含むことができる。
【００１９】
[0017]  「抗体」という用語は、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）も含む。「抗原結合部分」という用語は、抗原と特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又は複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のフラグメントによって実行できることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合フラグメントの例には、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインで構成される一価フラグメント、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2フラグメント、すなわちヒンジ領域のジスルフィド架橋によってリンクする２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインで構成されたＦｄフラグメント、（ｉｖ）抗体の１本アームのＶＬ及びＶＨドメインで構成されたＦｖフラグメント、（ｖ）ＶＨドメインで構成されたｄＡｂフラグメント（Ward他 (1989)、Nature 341:544-546）、及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つの領域、すなわちＶＬ及びＶＨは別個の遺伝子によってコーディングされるが、遺伝子組み換え法を用い、ＶＬ領域とＶＨ領域の対が一価ポリペプチドを形成するタンパク質単鎖（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばBird他 (1988)、Science 242:423-426；及びHuston他 (1988)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883；及びOsbourn他、1998、Nature Biotechnology 16: 778を参照）としてこれらを作成可能にする合成リンカーによって、これらを結合することができる。かかる単鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれるものとする。完全なＩｇＧポリペプチド又は他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、特異的ｓｃＦｖの任意のＶＨ及びＶＬ配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡ又はゲノム配列に結合することができる。ＶＨ及びＶＬも、タンパク質化学反応又は組み換えＤＮＡテクノロジを使用した免疫グロブリンのＦａｂ、Ｆｖ又は他のフラグメントの生成に使用することができる。二重特異性抗体などの他の形態の単鎖抗体も含まれる。二重特異性抗体は、ポリペプチド単鎖上にＶＨ及びＶＬドメインが発現するが、同じ鎖上の２つのドメイン間に対合できるようにするには短すぎるリンカを使用し、それによってドメインが別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合し、２つの抗原結合部位を生成する二価の二重特異性の抗体である（例えばHolliger, P.他 (1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448；Poljak, R. J.他 (1994)、Structure 2:1121-1123参照）。
【００２０】
[0018]  さらに、抗体又はその抗原結合部分は、抗体又は抗体部分と１つ又は複数の他のタンパク質又はペプチドとの共有会合又は非共有会合によって形成されたこれより大きい免疫接着（immunoadhesion）ポリペプチドの一部であることがある。かかる免疫接着ポリペプチドの例には、四量体ｓｃＦｖポリペプチドの作成にストレプトアビジンのコア領域を使用すること（Kipriyanov, S.M.他 (1995)、Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101）、及び二価及びビオチン化ｓｃＦｖポリペプチドの作成にシステイン残基、マーカーペプチド及びＣ末端ポリヒスチジンタグを使用すること（Kipriyanov, S.M.他 (1994)、Mol. Immunol. 31:1047-1058）が含まれる。Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）2フラグメントなどの抗体の部分は、抗体全体のそれぞれパパイン又はペプシン消化などの従来の技術を使用して、抗体全体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分及び免疫接着ポリペプチドは、本明細書で述べるように標準的な組み換えＤＮＡ技術を使用して取得することができる。
【００２１】
[0019]  抗体は、多クローン性又は単クローン性、異種、同種、又は同系、又はその修飾形態（例えばヒト化、キメラなど）とすることができる。抗体は完全にヒトでもよい。「単クローン抗体」及び「単クローン抗体組成物」という用語は、抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を１種のみ含む抗体ポリペプチドの集団を指す一方、「多クローン抗体」及び「多クローン抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用することができる抗原結合部位を複数の種含む抗体ポリペプチドの集団を指す。単クローン抗体組成物は通常、それが免疫反応する特定の抗原に対する単結合親和性を示す。
【００２２】
[0020]  「アンチセンス」核酸ポリペプチドという用語は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的である、例えば二本鎖ｃＤＮＡポリペプチドのコーディング鎖に相補的、ｍＲＮＡ配列に相補的、又は遺伝子のコーディング鎖に相補的であるヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸ポリペプチドは、センス核酸ポリペプチドに水素結合することができる。
【００２３】
[0021]  「バイオチップ」という用語は、本発明の結合プローブ又は複数のプローブを備える固体基板を指し、プローブは少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００個以上のプローブを備える。プローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション状態で標的配列とハイブリダイゼーション可能とすることができる。プローブは、基板上の空間的に画定されたアドレスに結合させることができる。重複するプローブか、又は特定の標的配列の様々な区間へのプローブで、標的配列ごとに複数のプローブを使用することができる。プローブは、単一の疾患に関連する標的配列とハイブリダイゼーション可能にすることができる。プローブは、当技術分野で認識されるように多種多様な方法でバイオチップに結合させることができる。プローブは、最初に合成し、その後にバイオチップに結合させるか、又はバイオチップ上に直接合成することができる。固体基板は、プローブに結合させるか会合するために適切な別個の個々の部位を含むように修正することができ、少なくとも１つの検出法に適応可能である材料でよい。基板の代表的な例にはガラス及び改質又は機能化ガラス、プラスチック（アクリル樹脂、ポリスチレン及びスチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、テフロン（登録商標）Ｊなどを含む）、多糖、ナイロン又は硝酸セルロース、樹脂、シリコン及び変性シリコンを含むシリカ又はシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス及びプラスチックが含まれる。基板は、感知できるほどの蛍光を発することなく光学的検出を可能にすることができる。基板は平面でよいが、基板の他の構成も使用することができる。例えば、サンプルの体積を最小化する流液型サンプル分析のために管の内面にプローブを配置することができる。同様に、基板は特定のプラスチックで作成した独立気泡フォームなど、軟質フォームのように可撓性とすることができる。バイオチップ及びプローブは、その後にこの２つを結合させるために化学官能基で誘導体化することができる。例えば、バイオチップは、アミノ基、カルボキシ基、オキソ基、又はチオール基を含むが、これらに限定されない化学官能基で誘導体化することができる。これらの官能基を使用することにより、プローブは、プローブ上の官能基を使用して直接、又はリンカを使用して間接的に結合させることができる。プローブは、５’末端、３’末端によって、又は内部ヌクレオチドを介して固体支持体に結合させることができる。プローブは、固体支持体に非共有結合することもできる。例えば、ビオチン化オリゴヌクレオチドを作成することができ、これをストレプトアビジンで共有結合コーティングした表面に結合することができ、その結果、結合する。あるいは、光重合及びフォトリソグラフィなどの技術を用いて、プローブを表面上に合成することができる。
【００２４】
[0022]  「体液」という用語は、身体から排出又は分泌される流体、さらに正常では排出又は分泌されない流体（例えば羊水、房水、胆汁、血液及び血漿、脳脊髄液、耳垢及び耳糞、クーパー液又は射精前液、乳び、び汁、糞便、膣液、間質液、細胞内液、リンパ、月経、乳汁、粘液、胸膜液、腹水、膿汁、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑膜、涙、尿、膣潤滑液、硝子体液、嘔吐物）を指す。
【００２５】
[0023]  「癌」又は「腫瘍」又は「過剰増殖疾患」という用語は、無秩序増殖、不死、転移能力、急速な成長及び増殖速度、及び特定の特徴的形態学的特性など、癌を引き起こす細胞に典型的な特徴を有する細胞が存在することを指す。癌細胞は腫瘍の形態であることが多いが、かかる細胞は動物の体内に単独で存在するか、又は白血病細胞などの非腫瘍発生細胞であることがある。癌にはＢ細胞癌、例えば多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、例えばアルファ鎖病、ガンマ鎖病、及びミュー鎖病、良性単クローン性免疫グロブリン血症、及び免疫細胞アミロイドーシス、メラノーマ、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳又は中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮又は子宮内膜癌、口腔又は咽頭の癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸又は虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織の癌などが含まれるが、これらに限定されない。本発明に含まれる方法に適用可能な癌のタイプの他の非限定的な例にはヒト肉腫及び癌腫、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、結腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、肝癌、絨毛上皮癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、骨癌、脳腫瘍、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭管腫瘍、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏枝神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、例えば急性リンパ球性白血病及び急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病及び慢性リンパ球性白血病）、及び真正赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病及び非ホジキン病）、多発性骨髄腫が含まれる。幾つかの実施形態では、本発明の方法により表現型が判定される癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、婦人科の癌、腎臓癌、喉頭癌、肺癌、口腔癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、又は皮膚癌を含むが、これらに限定されない上皮癌である。他の実施形態では、癌は乳癌、前立腺癌、肺癌、又は大腸癌である。さらに他の実施形態では、上皮癌は非小細胞肺癌、非乳頭状腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌（例えば漿液性卵巣癌）、又は乳癌である。上皮癌は、漿液、子宮内膜、粘液性、明細胞、ブレナー、又は未分化型を含むが、これらに限定されない他の様々な方法で特徴付けることができる。幾つかの実施形態では、本発明は、本明細書で述べるマーカーの分析に基づき、リンパ球が多い古典的ホジキンリンパ腫、混合細胞型の古典的ホジキンリンパ腫、リンパ球枯渇型古典的ホジキンリンパ腫、結節性硬化型古典的ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、びまん性大Ｂ細胞リンパ腫、（ＭＬＬ＋前Ｂ細胞ＡＬＬ）を含むが、これらに限定されないリンパ腫又はそのサブタ���プの治療、診断及び／又は予後に使用される。
【００２６】
[0024]  「分類する」という用語は、病状にサンプルを「関連づける」又は「カテゴリ化する」ことを含む。特定の場合、「分類」は統計的エビデンス、経験的エビデンス、又はその両方に基づく。特定の実施形態では、分類する方法及びシステムは、いわゆる既知の病状を有するサンプルのトレーニングセットを使用する。いったん確立されると、トレーニングデータセットは、サンプルの未知の病状を分類するために、未知のサンプルの特徴と比較されるベース、モデル、又はテンプレートとして働く。特定の場合、サンプルの分類は、サンプルの病状の診断に類似している。特定の他の場合では、サンプルの分類は、サンプルの病状を別の病状から区別することに類似している。
【００２７】
[0025]  「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指し、「非コード領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域（例えば５’及び３’非翻訳領域）を指す。
【００２８】
[0026]  「相補的」という用語は、２本の核酸鎖の領域間、又は同じ核酸鎖の２つの領域間の配列相補性という広義の概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、残基がチミン又はウラシルである場合、第１の領域と逆平行である第２の核酸領域の残基と特異的水素結合を形成できること（「塩基対形成」）が知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、残基がグアニンである場合、第１の鎖と逆平行である第２の核酸鎖の残基と塩基対形成できることが知られている。核酸の第１の領域は、同じ又は異なる核酸の第２の領域に対して、２つの領域が逆平行で配置されている場合に、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が第２の領域の残基と塩基対形成できるなら、相補的である。好ましくは、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、それにより、第１及び第２の部分が逆平行に配置されている場合、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％が第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。第１の部分の全ヌクレオチド残基が第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対形成できることが、さらに好ましい。
【００２９】
[0027]  「コントロール」という用語は、試験サンプル中の発現産物との比較を提供するために適切な任意の参照標準を指す。一実施形態では、コントロールは発現産物のレベルを検出し、試験サンプルからの発現産物レベルと比較する元となる「対照サンプル」を取得することを含む。かかる対照サンプルは、既知の結果を有するコントロールの癌患者からのサンプル（保存サンプル又は以前のサンプル測定値でもよい）、正常な患者又は癌患者などの対象から単離した正常な組織又は細胞、正常な対象又は癌患者などの対象から単離した培養一次細胞／組織、癌患者の同じ器官又は体部位から取得した隣接正常細胞／組織、正常な対象から単離した組織又は細胞サンプル、又は保管所から取得した一次細胞／又は組織を含むが、これらに限定されない任意の適切なサンプルを含むことができる。別の実施形態では、コントロールは、ハウスキーピング遺伝子、正常な組織（又は他の以前に分析した対照サンプル）からの発現産物レベル範囲、ある患者群からの試験サンプル内で以前に判定した発現産物レベル範囲、又は特定の結果（例えば１年、２年、３年、４年などの生存率）を有する、又は特定の治療を受けた一組の患者を含むが、これらに限定されない任意の適切な源からの参照標準の発現産物レベルを含むことができる。かかる対照サンプル及び参照標準発現産物レベルを組み合わせて、本発明の方法でコントロールとして使用できることが、当業者には理解される。一実施形態では、コントロールは正常又は非癌性細胞／組織資料を含むことができる。別の実施形態では、コントロールは、一組の癌患者などの一組の患者、又は特定の治療を受けた一組の癌患者、又は別の結果に対する１つの結果を有する一組の患者の発現レベルを含むことができる。前者のケースでは、各患者の特定の発現産物レベルを、パーセンタイル発現レベルに割り当てるか、参照標準発現レベルの平均値より高い又は低いと表現することができる。別の実施形態では、コントロールは正常な細胞、併用化学療法で治療した患者の細胞、及び良性腫瘍の患者の細胞を含むことができる。別の実施形態では、コントロールは測定値、例えばある母集団のハウスキーピング遺伝子の発現レベルと比較して、同じ母集団の特定の遺伝子の平均発現レベルも含むことができる。かかる母集団は、正常な対象、いかなる治療も受けていない（すなわち治療未処置）癌患者、治療中の癌患者、又は良性腫瘍の患者を含むことができる。別の実施形態では、コントロールは試験サンプル中の２つの遺伝子の発現産物レベルの比率を判断して、それを参照標準の同じ２つの遺伝子の任意の適切な比率と比較すること、試験サンプル中の２つ以上の遺伝子の発現産物レベルを判定して、任意の適切なコントロールの発現産物レベルの差を判定すること、及び試験サンプル中の２つ以上の遺伝子の発現産物レベルを判定し、試験サンプル中のハウスキーピング遺伝子の発現にその発現を正規化し、任意の適切なコントロールと比較することを含むが、これらに限定されない発現産物レベルの比率変換を含む。特に好ましい実施形態では、コントロールは試験サンプルと同じ系列及び／又はタイプである対照サンプルを含む。別の実施形態では、コントロールは、全癌患���などの一組の患者サンプル内で、又はそれに基づきパーセンタイルとして分類される発現産物レベルを含むことができる。一実施形態では、例えば特定のパーセンタイルに対して、より高い又は低いレベルの発現産物レベルを、結果予測のベースとして使用する場合、コントロールの発現産物レベルが確立される。別の実施形態では、既知の結果を有するコントロールの癌患者からの発現産物レベルを使用して、コントロールの発現産物レベルを確立し、試験サンプルからの発現産物レベルを、結果予測のベースとしてコントロールの発現産物レベルと比較する。以下のデータで実証するように、本発明の方法は、試験サンプルの発現産物レベルをコントロールと比較する際に特定の切点を使用することに限定されない。
【００３０】
[0028]  「癌の診断」という用語は、本発明の方法、システム、及びコードを使用して、個別の癌又はそのサブタイプの有無を判定することを含む。この用語は、個別の疾病の活性レベルを評価する方法、システム、及びコードも含むことができる。
【００３１】
[0029]  「診断マーカー」という用語は、治療前、治療中又は治療後に癌の診断、例えば腫瘍の活性過剰又は活性低下、発生、発現、増殖、寛解、再発又は抵抗性の診断に有用である本明細書で述べるマーカーを含む。マーカーの予測機能は、例えば（１）例えばヒト癌タイプ又は癌サンプルの約５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％以上で、コピー数の増減（例えば当技術分野で少なくともJ. Biotechnol., 86:289-301、又はqPCRで述べているように、例えばＦＩＳＨ、ＦＩＳＨ＋ＳＫＹ、単分子配列決定によって、又は定量的ＰＣＲによって）、過剰発現又は過小発現（例えばＩＳＨ、ノーザンブロット、又は定量的ＰＣＲによって）、タンパク質レベルの増減（例えばＩＨＣによる）、又は活性の増減（例えばマーカーが関与する経路の調節によって判定）によって、（２）対象、例えば癌に罹患したヒトからの生物学的サンプル、例えば組織、全血、血清、血漿、頬側切屑、唾液、脳脊髄液、尿、糞便、又は骨髄におけるその有無によって、（３）癌の対象（例えば特定の療法に反応する対象又は抵抗性を生じた対象）の臨床サブセットにおけるその有無によって確認することができる。診断マーカーは、「代理マーカー」、例えばＰＡＫ１、ＲＯＣＫ１及び／又はＲＯＣＫ２キナーゼの発現の増大又は持続のように癌進行の間接的マーカーであるマーカーも含む。かかる診断マーカーは、ＲＡＣ１及び／又はＲＡＣ２変異体の調節剤を使用した治療に適応可能な対象の集団を同定し、それによってかかる患者の層別集団を治療するのに有用なことがある。
【００３２】
[0030]  分子は、分子の有意の部分が基質から分離することなく、基質を流体（例えば標準のクエン酸食塩水、ｐＨ７．４）で濯ぐことができるように、基質と共有又は非共有会合した場合、基質に「固定」又は「添付」するものとする。
【００３３】
[0031]  「遺伝子発現データ」又は「遺伝子発現レベル」という用語は、細胞又は細胞群中で遺伝子又は一組の遺伝子が発現する相対レベル又は絶対レベルに関する情報を指す。遺伝子の発現レベルは、遺伝子によってコードされたｍＲＮＡなどのＲＮＡのレベルに基づいて判定することができる。あるいは、発現レベルは、遺伝子によってコードされたポリペプチド又はそのフラグメントのレベルに基づいて判定することができる。遺伝子発現データは、個別の細胞について、又は腫瘍又は生検サンプルなどの細胞群について取得することができる。遺伝子発現データ及び遺伝子発現レベルは、コンピュータ可読媒体、例えばマイクロアレイ又はチップ読み取り装置と組み合わせて使用するコンピュータ可読媒体に記憶させることができる。かかる遺伝子発現データを操作して、遺伝子発現シグネチャを生成することができる。
【００３４】
[0032]  「遺伝子発現シグネチャ」又は「シグネチャ」という用語は、協調的に発現した遺伝子群を指す。このシグネチャを構成する遺伝子は、特定の細胞株、分化段階、又は特定の生物学的応答中に発現することがある。遺伝子は、癌の起源となる細胞、生検材料中の良性細胞の性質、及び癌の原因である発癌の機序など、それが発現する腫瘍の生物学的態様を反映することができる。
【００３５】
[0033]  「相同」という用語は、同じ核酸鎖の２つの領域間、又は２つの異なる核酸鎖の領域間のヌクレオチド配列の類似性を指す。両方の領域のヌクレオチド残基の位置が同じヌクレオチド残基によって占有されている場合、その領域はその位置にて相同である。各領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基位置が同じ残基によって占有されている場合、第１の領域は第２の領域と相同である。２つの領域間の相同性は、同じヌクレオチド残基によって占有された２つの領域のヌクレオチド残基位置の割合で表現される。例示により、ヌクレオチド配列５’−ＡＴＴＧＣＣ−３’を有する領域と、ヌクレオチド配列５’−ＴＡＴＧＧＣ−３’を有する領域は５０％の相同性を共有する。第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含むことが好ましく、それにより各部分のヌクレオチド残基位置の少なくとも約５０％、及び好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％は、同じヌクレオチド残基によって占有される。各部分の全ヌクレオチド残基位置が、同じヌクレオチド残基によって占有されることが、さらに好ましい。
【００３６】
[0034]  「宿主細胞」という用語は、本発明の組み換え発現ベクターなどの本発明の核酸が導入されている細胞を指すものとする。「宿主細胞」及び「組み換え宿主細胞」という用語は、本明細書では区別なく使用される。かかる用語は、特定の被検体細胞ばかりでなく、かかる細胞の後代又は潜在的後代も指すと理解されたい。変異又は環境の影響により特定の修飾が後続世代に生じることがあるので、かかる後代は実際、親細胞と同一でなくなることがあるが、それでもこの用語の範囲に含まれる。
【００３７】
[0035]  「ヒト化抗体」という用語は、例えば非ヒト抗体アミノ酸配列を変更して、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列に見られるアミノ酸を組み込むことによって、ヒト細胞によって作成されるような抗体にさらに類似するように変更されている可変領域及び定常領域を有する非ヒト細胞によって作成された抗体を含むものとする。ヒト化抗体は、例えばＣＤＲ中に、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏでランダム又は部位特異的変異誘発によって、又はｉｎ  ｖｉｖｏで体細胞変異によって導入される変異）を含むことができる。「ヒト化抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳類種の細胞株由来のＣＤＲ配列を、ヒトのフレームワーク配列に移植してある抗体も含む。
【００３８】
[0036]  「阻害する」という用語は、例えば特定の作用、機能、又は相互作用の低下、制限、又は遮断を含む。例えば、過剰増殖などの癌の少なくとも１つの症状が軽減、終了、緩徐化、又は防止された場合、癌は「阻害」されている。癌の再発又は転移が軽減、緩徐化、遅延、又は防止した場合も、癌は「阻害」されている。
【００３９】
[0037]  「阻害剤」という用語は、本発明のバイオマーカーの作用、機能、又は相互作用の低下との組み合わせで使用する場合、そこからコードされ、活性状態（例えば構成的、発癌及び／又はリン酸化状態）で存在する所望の標的核酸又はタンパク質を阻害する限り、いずれでもよい。非制限的な例には核酸阻害剤、小分子阻害剤、遮断抗体、標的タンパク質と競合的に相互作用するペプチド、標的タンパク質をリン酸化する酵素の基質、標的タンパク質に作用するホスファターゼなどが含まれる。例えばＲＡＣ１、ＲＡＣ２、ＲＡＣ３、ＰＡＫ１、ＲＯＣＫ１、及びＲＯＣＫ２のリン酸化部位及び／又は生理学的活性ドメインが知られ、当業者は標的を阻害する作用物質を容易にデザイン又は合成することができる。標的の発現阻害活性、活性化阻害活性、不安定化活性などの確認は、既知の方法に従って測定することができる。例えば、ＰＡＫ１阻害活性は、例えばNat Cell Biol. (1999) 1, 253-259に記載されたＰＡＫ１によるＬＩＭＫ活性化の測定実験を修正し、試験基質を使用して実験を実行して、活性化阻害速度を考察することによって測定することができる。同様に、ＲＯＣＫ１／２阻害活性は、例えばBiochem. J. (2000) 351, 95-105に記載された方法によって、試験基質を使用して実験を実行し、（例えばタンパク質のリン酸化の測定、ウェスタンブロット法、又はこれらのタンパク質に特異的に反応するリン酸化抗体を使用するＥＬＩＳＡによって）活性化阻害速度を考察することによって測定することができる。例示的ＰＡＫ１阻害剤は当技術分野で周知であり、米国特許公開第２０１３−０１１６２６３号、第２０１２−０２７０８６６号、及び第２００５−００３７９６５号に記載されているような小分子阻害剤を含み、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。例示的ＲＯＣＫ１／２阻害剤はＹ−２７６３２及びファスジルを含み、これはキナーゼドメインと結合して、ＡＴＰ拮抗機構でその酵素活性を阻害する。ＲＯＣＫ１／２活性の負の調節因子には、ＲＯＣＫ１／２活性を減衰させるＧｅｍ、ＲｈｏＥ、及びＲａｄなどの低分子ＧＴＰ結合タンパク質が含まれる。ＲＯＣＫの自己阻害活性は、カルボキシ末端とキナーゼドメインが相互作用して、キナーゼ活性を軽減すると明らかにされる。追加のＲＯＣＫ１／２阻害剤が、ＷＯ０１／５６９８８号、ＷＯ０２／１００８３３号、ＷＯ０３／０５９９１３号、ＷＯ０２／０７６９７６号、ＷＯ０４／０２９０４５号、ＷＯ０３／０６４３９７号、ＷＯ０４／０３９７９６号、ＷＯ０５／００３１０１号、ＷＯ０２／０８５９０９号、ＷＯ０３／０８２８０８号、ＷＯ０３／０８０６１０号、ＷＯ０４／１１２７１９号、ＷＯ０３／０６２２２５号、及びＷＯ０３／０６２２２７号に記載され、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。これらのケースの幾つかでは、阻害剤のモチーフにはインダゾールコア、２−アミノピリジン／ピリミジンコア、９−デアザグアニン誘導体、ベンズアミド構成、アミノフラゼン構成、及び／又はそれらの組み合わせが含まれる。
【００４０】
[0038]  「相互作用」という用語は、２つの分子間の相互作用を指す場合、分子相互の物理的接触（例えば結合）を指す。通常、かかる相互作用は、上記分子の一方又は両方に（生物学的効果を生成する）活性をもたらす。活性は、分子の一方又は両方の直接的活性であることがある。あるいは、相互作用の一方又は両方の分子がその配位子の結合を防止され、したがって配位子結合活性（例えば配位子を結合し、免疫応答を誘発又は阻害する）に関して不活性を維持することができる。かかる相互作用を阻害すると、その結果、相互作用に関与する１つ又は複数の分子の活性が破壊される。かかる相互作用を強化するとは、上記物理的接触の可能性を延長又は増大させ、上記活性の可能性を延長又は増大させることである。
【００４１】
[0039]  「単離抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体を指すものとする。さらに、単離抗体には、他の細胞材料及び／又は化学物質が実質的にない。
【００４２】
[0040]  「単離タンパク質」は、他のタンパク質、細胞材料、分離媒質、及び細胞から単離されるか組み換えＤＮＡ技術によって産生された場合は培養基、又は化学的に合成された場合は化学前駆体又は他の化学物質が実質的にないタンパク質を指す。「単離」又は「精製」タンパク質又はその生物学的活性部分には、抗体、ポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質由来である細胞又は組織源からの細胞材料又は他の汚染タンパク質が実質的にない、又は化学的に合成された場合は化学前駆体又は他の化学物質が実質的にない。「細胞材料が実質的にない」という言い回しには、単離する又は組み換え技術で産生する元となる細胞の細胞成分から本発明の組成物を分離した製剤が含まれる。一実施形態では、「細胞材料が実質的にない」という言い回しには、（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、又は５％未満の細胞材料を有する製剤が含まれる。抗体、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質又はそのフラグメント、例えばその生物学的活性フラグメントを組み換え技術で産生する場合は、培養基が実質的にないことも好ましい。すなわち、培養基がタンパク質製剤の体積の約２０％未満、さらに好ましくは約１０％未満、及び最も好ましくは約５％未満となる。
【００４３】
[0041]  「キット」は、本発明のマーカーの発現を特異的に検出又は調節する少なくとも１つの試薬、例えばプローブを含む任意の製造品（例えばパッケージ又は容器）である。キットは、本発明の方法を実行するユニットとして宣伝、流通又は販売することができる。
【００４４】
[0042]  「マーカー」又は「バイオマーカー」は、コントロール（例えば正常又は健康な組織又は細胞）の発現レベルからの組織又は細胞の変化発現レベルが、癌又はそのサブタイプなどの病状に関連する核酸又はポリペプチドを含む。「マーカー核酸」は、本発明のマーカーによってコードされた、又はそれに対応する核酸（例えばｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はその変異型、及び当業者に知られている他のクラスの低分子ＲＮＡ）である。かかるマーカー核酸は、本明細書で述べる核酸配列のいずれかの全配列又は部分配列、又はかかる配列の補体を含むＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）を含む。マーカー核酸は、配列表に記載された核酸配列のいずれかの全配列又は部分配列、又はかかる配列の補体を含むＲＮＡも含み、全チミジン残基がウリジン残基に置換されている。「マーカータンパク質」は、本発明のマーカーによってコードされた、又はそれに対応するタンパク質を含む。マーカータンパク質は、本明細書で述べる配列のいずれかの全配列又は部分配列を含む。「タンパク質」と「ポリペプチド」という用語は、区別なく使用される。幾つかの実施形態では、バイオマーカーの特定の組み合わせが好ましい。例えば、本明細書で述べるＲＡＣ１及び／又はＲＡＣ２変異体からなる群から選択されるバイオマーカーのうち１つ又は複数の組み合わせ又は亜群である。
【００４５】
[0043]  「調節」という用語は、上方制御及び下方制御、例えば応答の強化又は阻害を含む。
【００４６】
[0044]  マーカーの「正常な」又は「コントロールの」発現レベルは、癌に罹患していない被検体、例えばヒト患者の細胞中のマーカーの発現レベルである。マーカーの「過剰発現」又は「有意に高い発現レベル」は、発現の評価に使用されるアッセイの標準誤差より大きい試験サンプルの発現レベルを指し、対照サンプル（例えばマーカー関連の疾患がない健常対象からのサンプル）のマーカーの発現活性又はレベル、及び好ましくは幾つかの対照サンプルのマーカーの平均発現レベルの好ましくは少なくとも２倍、さらに好ましくは２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍又はそれ以上高い。マーカーの「有意に低い発現レベル」は、対照サンプル（例えばマーカー関連の疾患がない健常対象からのサンプル）のマーカーの発現活性又はレベル、及び好ましくは幾つかの対照サンプルのマーカーの平均発現レベルの少なくとも２倍、さらに好ましくは２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍又はそれ以上低い試験サンプルの発現レベルを指す。
【００４７】
[0045]  「プローブ」という用語は、特に意図された標的分子、例えばマーカーによってコードされた、又はマーカーに対応するヌクレオチド転写物又はタンパク質に選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、当業者が合成するか、適切な生物製剤から誘導することができる。標的分子を検出するために、本明細書で述べるようにプローブを標識されるように特にデザインすることができる。プローブとして使用することができる分子の例にはＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、及び有機分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
[0046]  「予後の判定」という用語には、癌の起こりそうな経過及び結果、又は疾患から回復する可能性の予測が含まれる。幾つかの実施形態では、統計アルゴリズムを使用することにより、本発明の癌の予後の判定が提供される。例えば、予後の判定は、手術、癌の臨床的サブタイプの発生（例えば白血病などのリンパ系癌）、１つ又は複数の臨床要素の発生、又は疾患からの回復とすることができる。
【００４９】
[0047]  「癌療法に対する応答」又は「癌療法の結果」という用語は、癌療法に対する過剰増殖疾患（例えば癌）の何らかの応答、好ましくはネオアジュバント又はアジュバント化学療法の開始後の腫瘍質量及び／又は体積の変化に関する。例えば有効性のために、又はネオアジュバント又はアジュバント状況で、過剰増殖疾患応答を評価することができ、全身性介入後の腫瘍のサイズを、ＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波又は触診で測定したままの初期のサイズ及び寸法と比較することができる。応答は、固形癌の生検又は外科的切除の後に腫瘍のキャリパ測定又は病理検査でも評価することができる。応答は、腫瘍体積の変化百分率のような定量的方法で、又は「病理学的完全奏功」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的不変」（ｃＳＤ）、「臨床的進行性疾患」（ｃＰＤ）、又は他の定性的基準のような定性的方法で記録することができる。過剰増殖疾患応答の評価は、ネオアジュバント又はアジュバント療法の開始後早期に、例えば数時間、数日、数週後、又は好ましくは数カ月後に実行することができる。応答評価の典型的な終点は、ネオアジュバント化学療法の終了後、又は残留腫瘍細胞及び／又は腫瘍床の外科的除去後である。これは通常、ネオアジュバント療法の開始から３カ月後である。幾つかの実施形態では、本明細書で述べる治療の臨床有効性は、臨床的利益率（ＣＢＲ）を測定することによって判定することができる。臨床的利益率は、完全寛解（ＣＲ）である患者のパーセンテージ、部分寛解（ＰＲ）である患者の数、及び不変（ＳＤ）である患者の数の合計を、治療終了から少なくとも６カ月の時点で判定することによって測定される。この式の略記はＣＢＲ＝６カ月にわたるＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。幾つかの実施形態では、特定の癌療法のＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、又はそれ以上である。癌療法に対する応答を評価する追加の基準は「生存」に関し、これは以下のすべてを含む。すなわち、全生存としても知られる死亡までの生存（上記死亡は原因とは無関係、又は腫瘍関連でよい）、「無再発生存」（再発という用語は、限局的再発及び遠隔再発の両方を含むものとする）、無転移生存、無疾患生存（疾患という用語は、癌及びそれに関連する疾患を含むものとする）である。上記生存の長さは、定義された開始点（例えば診断又は治療開始の時）及び終点（例えば死亡、再発又は転移）を参照することによって計算することができる。また、治療の有効性の基準は、化学療法に対する応答、生存の確率、所与の期間内の結果の確率、及び腫瘍再発の確率を含むように拡大することができる。例えば、適切な閾値を判定するために、特定の癌療法を対象の母集団に適用することができ、結果は、本明細書で列記又は記載した１つ又は複数のバイオマーカー、又は任意の癌療法を適用する前に判定した実施例のコピー数、発現レベル、活性レベルなどに相関させることができる。結果測定値は、ネオアジュバント環境で与えられた療法に対する病理学的応答とすることができる。あるいは、全生存及び無疾患生存などの結果の尺度は、���療法後に測定値が分かっている被検体についてある期間にわたってモニタすることができる。特定の実施形態では、同じ用量の癌治療薬を各対象に投与する。関連する実施形態では、投与量は、癌治療薬について当技術分野で知られている標準的用量である。対象をモニタする期間は様々でよい。例えば、対象は少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、又は６０カ月間モニタすることができる。癌療法の結果と相関するバイオマーカー閾値は、実施例のセクションで述べるような方法を使用して判定することができる。結果は、「危険率」（１つの患者群と別の患者群との死亡率の比率；特定の時点における死亡の尤度を提供する）、「全生存」（ＯＳ）及び／又は「無進行生存」に関しても測定することができる。特定の実施形態では、予後は、１年、２年、３年、４年、又は任意の他の適切な時点における全体的生存率の尤度を含む。本発明のすべての態様において不良結果の予後に関連する有意性は、当技術分野で知られている技術で測定される。例えば、有意性はオッズ比の計算で測定することができる。別の実施形態では、有意性はパーセンテージで測定することができる。一実施形態では、不良結果の有意のリスクは、０．８未満又は少なくとも約１．２で、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、２５．０、３０．０及び４０．０を含むが、これらに限定されないオッズ比として測定される。別の実施形態では、リスクの有意の増加又は減少は、少なくとも約２０％で、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び９８％を含むが、これらに限定されない。さらに別の実施形態では、リスクの有意の増加は少なくとも約５０％である。したがって、本発明はさらに、癌患者の治療を決定する方法であって、本発明の様々な態様及び実施形態により癌患者の予後を判定する方法を実行することと、次に癌患者の治療の経緯を判定する際に、他の既知の臨床及び病理学的リスクファクタを鑑みて、結果を比較検討することを含む方法を提供する。例えば、本発明の方法により、併用化学療法によって不良結果のリスクが増大していると示された癌患者は、放射線治療、末梢血肝細胞移植、骨髄移植、又は臨床調査中の新規又は実験的療法を含むが、これらに限定されないさらに積極的な療法で治療することができる。
【００５０】
[0048]  「抵抗性」という用語は、癌治療に対する癌サンプル又は哺乳類の後天的又は先天的抵抗性（すなわち、治療に対する非応答性、応答低下、応答制限）を指し、例えば治療に対して２５％以上、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍又はそれ以上の応答低下を有する。応答低下は、抵抗性を獲得する前の同じ癌サンプル又は哺乳類と比較する、又は治療に対して抵抗性がないと分かっている別の癌サンプル又は哺乳類と比較することによって測定することができる。化学療法に対する典型的な後天的抵抗性は、「多剤耐性」と呼ばれる。多剤耐性は、Ｐ−グリコプロテインによって媒介できる、又は他の機序によって媒介できる、又は哺乳類が多剤耐性微生物又は微生物の混合に感染した場合に生じることがある。治療に対する抵抗性の判定は、当技術分野の日常業務であり、当業者の技術に含まれ、例えば本明細書で「感作」と言う細胞増殖アッセイ及び細胞死アッセイによって測定することができる。幾つかの実施形態では、「逆抵抗性」という用語は、一次癌治療（例えば化学療法又は放射線療法）と組み合わせた第２の薬剤の使用により、一次癌治療（例えば化学療法又は放射線療法）のみでは未治療腫瘍の腫瘍体積と比較して腫瘍体積を統計学的に有意に減少させることができない状況で、未治療腫瘍の腫瘍体積と比較した場合、統計学的に有意のレベル（例えばｐ＜０．０５）で腫瘍体積を有意に減少させることができるという意味である。これは通常、未治療腫瘍が対数的に増殖している時に、腫瘍体積の測定に適用される。
【００５１】
[0049]  少なくとも１つのバイオマーカーの存在又はレベルを検出又は判定するために使用される「サンプル」という用語は、通常は全血、血漿、血清、唾液、尿、糞便（例えば大便）、涙、及び任意の他の（例えば「体液」の定義で上述したような）体液、又は組織資料（例えば生検材料）、例えば小腸、大腸サンプル、又は外科的切除組織である。特定の場合、本発明の方法はさらに、サンプル中の少なくとも１つのマーカーの存在又はレベルを検出又は判定する前に、個体からサンプルを取得することを含む。
【００５２】
[0050]  「感作する」という用語は、癌治療（例えば化学療法又は放射線療法）で関連する癌のさらに効果的な治療を可能にする方法で、癌細胞又は腫瘍細胞を変化させることを意味する。幾つかの実施形態では、正常な細胞は、正常な細胞を癌治療（例えば化学療法又は放射線療法）で不当に傷害するような程度まで影響を受けない。治療に対する感度向上又は感度低下は、特定の治療について当技術分野で知られている方法、及び本明細書で下述する方法により測定され、それには細胞増殖アッセイ（Tanigawa N、Kern D H、Kikasa Y、Morton D LのCancer Res 1982; 42: 2159-2164）、細胞死アッセイ（Weisenthal L M、Shoemaker R H、Marsden J A、Dill P L、Baker J A、Moran E MのCancer Res 1984; 94: 161-173；Weisenthal L M、Lippman M EのCancer Treat Rep 1985; 69: 615-632；Weisenthal L M、In: Kaspers G J L、Pieters R、Twentyman P R、Weisenthal L M、Veerman A J P編集のDrug Resistance in Leukemia and Lymphoma. Langhorne, P A: Harwood Academic Publishers, 1993: 415-432；Weisenthal L M、Contrib Gynecol Obstet 1994; 19: 82-90）が含まれるが、これらに限定されない。感度又は抵抗性は、ある期間、例えばヒトの場合は６カ月及びマウスでは４〜６週間にわたって腫瘍のサイズ減少を測定することによって、動物でも測定することができる。組成物又は方法は、かかる組成物又は方法がない状態の治療感度又は抵抗性と比較して、治療感度の増大又は抵抗性の低下が２５％以上、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又はそれ以上から２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍又はそれ以上である場合、治療に対して応答を感作するという。治療に対する感度又は抵抗性の判定は、当技術分野の日常業務であり、当業者の技術に含まれる。癌治療の有効性を向上させるために本明細書で述べるいずれの方法も、癌治療に対して過剰増殖又は他の癌細胞（例えば耐性細胞）を感作させる方法に同等に適用できることを理解されたい。
【００５３】
[0051]  「相乗効果」という用語は、２つ以上の抗癌剤又は化学療法薬の複合硬化が、抗癌剤又は化学療法薬のみの別個の硬化の合計より大きくできることを指す。
【００５４】
[0052]  「対象」という用語は、任意の健康な動物、哺乳類又はヒト、又は該当する状態（例えば癌）に罹患した任意の動物、哺乳類又はヒトを指す。「対象」という用語は「患者」と交換可能である。
【００５５】
[0053]  「化学前駆体又は他の化学物質が実質的にない」という言い回しは、タンパク質の合成に関与した化学前駆体又は他の化学物質からタンパク質が分離されている抗体、ポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質の製剤を含む。一実施形態では、「化学前駆体又は他の化学物質が実質的にない」という言い回しは、（乾燥重量で）約３０％未満の化学前駆体又は非抗体、ポリペプチド、ペプチド、又は融合タンパク質化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学前駆体又は非抗体、ポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質化学物質、さらに好ましくは約１０％未満の化学前駆体又は非抗体、ポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質化学物質、及び最も好ましくは約５％未満の化学前駆体又は非抗体、ポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質化学物質を有する抗体、ポリペプチド、ペプチド又は融合タンパク質の製剤を含む。
【００５６】
[0054]  「実質的に純粋な細胞集団」という用語は、規定された細胞マーカーの特徴、及び全細胞集団を構成する細胞の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５〜８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５〜９０％、及び最も好ましくは少なくとも約９５％である分化能力を有する細胞の集団を指す。したがって、「実質的に純粋な細胞集団」は、指定されたアッセイ条件で規定されたマーカー特徴及び分化能力を呈さない細胞の約５０％未満、好ましくは約２０〜２５％未満、さらに好ましくは約１０〜１５％未満、及び最も好ましくは約５％未満を含む細胞の集団を指す。
【００５７】
[0055]  「生存」という用語は以下のすべてを含む。すなわち、全生存としても知られる死亡までの生存（上記死亡は原因とは無関係、又は腫瘍関連でよい）、「無再発生存」（再発という用語は、限局的再発及び遠隔再発の両方を含むものとする）、無転移生存、無疾患生存（疾患という用語は、癌及びそれに関連する疾患を含むものとする）である。上記生存の長さは、定義された開始点（例えば診断又は治療開始の時）及び終点（例えば死亡、再発又は転移）を参照することによって計算することができる。また、治療の有効性の基準は、化学療法に対する応答、生存の確率、所与の期間内の結果の確率、及び腫瘍再発の確率を含むように拡大することができる。
【００５８】
[0056]  「転写ポリヌクレオチド」又は「ヌクレオチド転写」は、本発明のマーカーの転写、及び実行する場合はＲＮＡ転写の通常の転写後処理（例えばスプライシング）、及びＲＮＡ転写の逆転写によって作成された成熟ｍＲＮＡの全部又は一部に相補的又は相同であるポリヌクレオチド（例えばａｎ  ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はその変異型又はかかるＲＮＡ転写の逆転写又はｃＤＮＡの類似体）である。
【００５９】
[0057]  「ベクター」という用語は、作用可能な状態で結合している別の核酸を輸送することができる核酸を指す。「作用可能な状態で結合」とは、発現制御配列が該当するコード配列の発現を効果的に制御するように、遺伝子構成に組み込むという意味である。発現制御配列の例には、プロモータ、エンハンサ、及び転写終結領域が含まれる。プロモータは、ＤＮＡ分子の領域、通常は転写が開始する点からヌクレオチド１００個以内の上流にある領域で構成された発現制御配列である。コード配列をプロモータの制御下にするには、プロモータから下流方向のヌクレオチド１個と約５０個の間でポリペプチドの翻訳リーディングフレームの翻訳開始部位の位置を突き止める必要がある。エンハンサは、時間、位置及びレベルに関して発現特異性を提供する。プロモータと異なり、エンハンサは、転写部位から様々な距離に位置決めされた場合に機能することができる。エンハンサも転写開始部位の下流に位置決めすることができる。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコード配列をｍＲＮＡに転写することができる場合、細胞中の発現制御配列に「作用可能な状態で結合」し、その「制御下」にあり、次にコード配列によってコードされたタンパク質に翻訳することができる。あるタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは追加のＤＮＡ部分が結合できる根系二重鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡ部分をウイルスゲノムに結合することができる。特定のベクターは、それが導入された宿主細胞の自律複製が可能である（例えば細菌の複製起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノムに統合され、それによって宿主ゲノムとともに複製されるベクター（例えば非エピソーム哺乳類ベクター）もある。さらに、特定のベクターは、作用可能な状態で結合した相手の遺伝子の発現を指示することができる。かかるベクターを本明細書では「組み換え発現ベクター」又は単に「発現ベクター」と呼ぶ。一般的に、組み換えＤＮＡ技術で有用な発現レベルは、プラスミドの形体であることが多い。本明細書では、「プラスミド」と「ベクター」は区別なく使用することができる。プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形体だからである。しかし、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクター（例えば複製異常レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルス）など、かかる他の形体の発現ベクターを含むものとする。適切な発現ベクターには、例えばバクテリオファージ、バキュロウイルス、タバコモザイクウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルスに由来するプラスミド及びウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。多数のベクター及び発現系が、Novagen（ウィスコンシン州マディソン）、Clontech（カリフォルニア州パロアルト）、Stratagene（カリフォルニア州ラホーヤ）、及びInvitrogen Life Technologies（カリフォルニア州カールスバッド）のような企業から販売されている。発現ベクターはタグ配列を含むことができる。タグ配列は通常、コードされたポリペプチドとの融合として発��される。かかるタグは、カルボキシ末端又はアミノ末端を含めポリペプチドのいずれの場所にも挿入することができる。有用なタグの例には、融合パートナとして使用するために上述したようなタグが含まれるが、これらに限定されない。
マーカーの「発現不足」又は「有意に低いレベルの発現又はコピー数」は、発現又はコピー数の評価に使用されるアッセイの標準誤差より大きいが、対照サンプル（例えば癌に罹患していない健常対象のサンプル）のマーカーの発現レベル又はコピー数、及び好ましくは幾つかの対照サンプルのマーカーの平均発現レベル又はコピー数の好ましくは少なくとも２倍、さらに好ましくは３倍、４倍、５倍、又は１０倍又はそれ以上小さい試験サンプルの発現レベル又はコピー数を指す。
【００６０】
[0058]  遺伝コード（以下に示す）で規定されているように、特定のタンパク質のアミノ酸配列と、そのタンパク質をコードすることができるヌクレオチド配列との間には既知の明確な対応がある。同様に、遺伝コードで規定されているように、特定の核酸のヌクレオチド配列と、その核酸によってコードされるアミノ酸配列との間には既知の明確な対応がある。
【００６１】
[0059]遺伝コード
アラニン(Ala,A)GCA,GCC,GCG,GCT
アルギニン(Arg,R)AGA,ACG,CGA,CGC,CGG,CGT
アスパラギン(Asn,N)AAC,AAT
アスパラギン酸(Asp,D)GAC,GAT
システイン(Cys,C)TGC,TGT
グルタミン酸(Glu,E)GAA,GAG
グルタミン(Gln,Q)CAA,CAG
グリシン(Gly,G)GGA,GGC,GGG,GGT
ヒスチジン(His,H)CAC,CAT
イソロイシン(Ile,I)ATA,ATC,ATT
ロイシン(Leu,L)CTA,CTC,CTG,CTT,TTA,TTG
ロイシンLysine(Lys,K)AAA,AAG
メチオニン(Met,M)ATG
フェニルアラニン(Phe,F)TTC,TTT
プロリン(Pro,P)CCA,CCC,CCG,CCT
セリン(Ser,S)AGC,AGT,TCA,TCC,TCG,TCT
トレオニン(Thr,T)ACA,ACC,ACG,ACT
トリプトファン(Trp,W)TGG
チロシン(Tyr,Y)TAC,TAT
バリン(Val,V)GTA,GTC,GTG,GTT
終結シグナル（終了）TAA,TAG,TGA
【００６２】
[0060]  遺伝コードの重要かつ周知の特徴は、その冗長性であり、それによって、タンパク質の作成に使用するアミノ酸の大部分で、複数のコードヌクレオチドトリプレットを使用することができる（以上で例示）。したがって、幾つかの異なるヌクレオチド配列が、所与のアミノ酸配列をコードすることができる。かかるヌクレオチド配列は、機能的に同等と見なされる。何故なら、すべての器官で同じアミノ酸配列を産生することになるからである（しかし、特定の器官は幾つかの配列を他の配列よりも効率的に翻訳することができる）。さらに、所与のヌクレオチド配列中にプリン又はピリミジンのメチル化変異型が見られることがある。かかるメチル化は、トリヌクレオチドコドンとそれに対応するアミノ酸との間のコード関係に影響を与えない。
【００６３】
[0061]  以上を鑑みて、本発明の融合タンパク質又はポリペプチド（又はその任意の部分）のＤＮＡ又はＲＮＡコードのヌクレオチド配列を使用し、ＤＮＡ又はＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳する遺伝コードを使用して融合タンパク質又はポリペプチドアミノ酸配列を導出することができる。同様に、融合タンパク質又はポリペプチドアミノ酸配列の場合、これに対応し、融合タンパク質又はポリペプチドをコードできるヌクレオチド配列を、遺伝コード（その冗長性ゆえに、任意のアミノ酸配列に対して複数の核酸配列を生成する）から推論することができる。したがって、融合タンパク質又はポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に関する本明細書の記述及び／又は開示は、ヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列の記述及び／又は開示も含むものと見なされる。同様に、本明細書の融合タンパク質又はポリペプチドアミノ酸配列の記述及び／又は開示は、アミノ酸配列をコードすることができるすべての可能な拡散配列の記述及び／又は開示も含むものと見なされる。
【００６４】
[0062]  最後に、本発明のバイオマーカーの一般的配列及び構造に関する核酸及びアミノ酸配列の情報は、当技術分野で周知であり、米国バイオテクノロジ情報センタ（ＮＣＢＩ）のような公的に入手可能なデータベースで容易に入手可能である。公的に入手可能な配列データベースから得られる例示的な核酸及びアミノ酸配列を、以下に提供する。
【００６５】
[0063]  幾つかの実施形態では、本開示の方法及び組成物は、周知のＲＡＣ１、ＲＡＣ２及び／又はＲＡＣ３遺伝子配列又はそのフラグメント、さらにＲＡＣ１、ＲＡＣ２及び／又はＲＡＣ３遺伝子配列の遺伝子産物、例えばかかる遺伝子産物に特異的に結合するポリペプチド及び抗体、又はそのフラグメントを変異体生成の開始点として使用することができる。ＲＡＣ１、ＲＡＣ２及び／又はＲＡＣ３遺伝子配列及び遺伝子産物の配列、スプライスバリアント、及び構造については、当技術分野で記述されている。例えば、ワールドワイドウェブのgenecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=RAC1、
genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=RAC2、及び
genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=RAC3
で入手可能なthe Gene Cards.comのウェブサイトを参照されたい。
【００６６】
[0064]  ＲＡＣ１、ＲＡＣ２及び／又はＲＡＣ３遺伝子配列及び遺伝子産物配列、さらにＰＡＫ１、ＲＯＣＫ１、及びＲＯＣＫ２のようなＲＡＣエフェクタのものも、多くの種で知られている。
２つのヒトＲＡＣ１イソ型をコードする少なくとも２つのスプライスバリアントが存在する。ヒトＲＡＣ１転写変異型１の配列はカノニカル配列であり、残りのイソ型に関して記述されるすべての位置情報はこの配列から判定され、配列は、GenBankのデータベースのNM_006908.4及びNP_008839.2で公開されている。ヒトＲＡＣ１転写変異型２の配列はNM_018890.3及びNP_691485.1で見ることができ、コードされたタンパク質は、転写変異型ＲＡＣ１で失われていて交互にスプライシングされた５７ｂｐの領域（エクソン３ｂ）を含む。ヒト以外の生体のＲＡＣ１オルソログの核酸及びポリペプチド配列は周知であり、例えばマウスＲＡＣ１（NM_009007.2及びNP_033033.1）、ラットＲＡＣ１（NM_134366.1及びNP_599193.1）、ニワトリＲＡＣ１（NM_205017.1及びNP_990348.1）、ゼブラフィッシュＲＡＣ１（NM_199771.1及びNP_956065.1）、雌ウシＲＡＣ１（NM_174163.2及びNP_776588.1）、及びイヌＲＡＣ１（NM_001003274.2及びNP_001003274.1）が含まれる。
【００６７】
[0065]  代表的なヒトＲＡＣ２バイオマーカーの核酸及びアミノ酸配列は、GenBankのデータベースのNM_002872.3及びNP_002863.1で公開されている。ヒト以外の生体のＲＡＣ２オルソログの核酸及びポリペプチド配列は周知であり、例えばマウスＲＡＣ２（NM_009008.3及びNP_033034.1）、ラットＲＡＣ２（NM_001008384.1及びNP_001008385.1）、チンパンジーＲＡＣ２（XM_001145815.3及びXP_001145815.3）、サルＲＡＣ２（XM_001086228.2及びXP_001086228.1）、イヌＲＡＣ２（XM_538392.4及びXP_538392.4）、雌ウシＲＡＣ２（NM_175792.2及びNP_786986.1）、ニワトリＲＡＣ２（NM_001201452.1及びNP_001188381.1）、及びゼブラフィッシュＲＡＣ２（NM_001002061.1及びNP_001002061.1）が含まれる。
【００６８】
[0066]  代表的なヒトＲＡＣ３バイオマーカーの核酸及びアミノ酸配列が、GenBankのデータベースのNM_005052.2及びNP_005043.1で公開されている。ヒト以外の生体のＲＡＣ３オルソログの核酸及びポリペプチド配列は周知であり、例えばマウスＲＡＣ３（NM_133223.4及びNP_573486.1）、サルＲＡＣ３（XM_001113336.2及びXP_00111336.2）、雌ウシＲＡＣ３（NM_001099179.1及びNP_001092649.1）、及びニワトリＲＡＣ３（NM_205016.1及びNP_990347.1）が含まれる。
【００６９】
[0067]  ２つのヒトｐ２１タンパク質（Ｃｄｃ４２／Ｒａｃ）活性キナーゼ１（ＰＡＫ１）イソ型をコードする少なくとも２つのスプライスバリアントが存在する。ヒトＰＡＫ１転写変異型１の配列はカノニカル配列であり、残りのイソ型に関して記述されるすべての位置情報はこの配列から判定され、配列は、GenBankのデータベースのNM_001128620.1及びNP_001122092.1で公開されている。ヒトＰＡＫ１転写変異型２の配列はNM_002576.4及びNP_002567.3で見ることができる。ヒトＰＡＫ１転写変異型２には３’領域にコードエクソンがなく、その結果、短縮された独特のＣ末端を有するイソ型となる。ヒト以外の生体のＰＡＫ１オルソログの核酸及びポリペプチド配列は周知であり、例えばマウスＰＡＫ１（NM_011035.2及びNP_035165.2）、ラットＰＡＫ１（NM_017198.1及びNP_058894.1）、チンパンジーＰＡＫ１（XM_508657.4及びXP_508657.3）、サルＰＡＫ１（XM_001090310.2、XP_001090310.1、XM_001090423.2、及びXP_001090423.2）、イヌＰＡＫ１（XM_844558.2及びXP_849651.1）、雌ウシＰＡＫ１（NM_001076898.1及びNP_001070366.1）、ニワトリＰＡＫ１（NM_001162372.2及びNP_001155844.1）、及びゼブラフィッシュＰＡＫ１（NM_201328.1及びNP_958485.1）が含まれる。
【００７０】
[0068]  代表的なヒトＲｈｏ関連のコイルドコイル含有タンパク質キナーゼ１（ＲＯＣＫ１）バイオマーカーの核酸及びアミノ酸配列が、GenBankのデータベースのNM_005406.2及びNP_005397.1で公開されている。ヒト以外の生体のＲＯＣＫ１オルソログの核酸及びポリペプチド配列は周知であり、例えばマウスＲＯＣＫ１（NM_009071.2及びNP_033097.1）、ラットＲＯＣＫ１（NM_031098.1及びNP_112360.1）、チンパンジーＲＯＣＫ１（XM_001151982.1及びXP_001151982.1）、サルＲＯＣＫ１（NM_001261134.1及びNP_001248063.1）、イヌＲＯＣＫ１（XM_537305.4及びXP_537305.3）、雌ウシＲＯＣＫ１（XM_003583969.1及びXP_003584017.1）、及びニワトリＲＯＣＫ１（NM_001199448.1及びNP_001186377.1）が含まれる。
【００７１】
[0069]  代表的なヒトＲｈｏ関連のコイルドコイル含有タンパク質キナーゼ２（ＲＯＣＫ２）バイオマーカーの核酸及びアミノ酸配列が、GenBankのデータベースのNM_004850.3及びNP_004841.2で公開されている。ヒト以外の生体のＲＯＣＫ２オルソログの核酸及びポリペプチド配列は周知であり、例えばマウスＲＯＣＫ２（NM_009072.2及びNP_033098.2）、ラットＲＯＣＫ２（NM_013022.2及びNP_037154.2）、チンパンジーＲＯＣＫ２（XM_525689.3及びXP_525689.3）、サルＲＯＣＫ２（XM_001096931.2及びXP_001096931.2）、イヌＲＯＣＫ２（XM_540083.3及びXP_540083.3）、雌ウシＲＯＣＫ２（NM_174452.2及びNP_776877.1）、及びゼブラフィッシュＲＯＣＫ２（NM_174863.2及びNP_777288.1）が含まれる。
以下は、本発明の変異体ＲＡＣバイオマーカーの生成に有用な代表的配列である。かかる変異体ＲＡＣバイオマーカーは、任意の起源の種から得られる。一実施形態では、変異体ＲＡＣマーカーは、哺乳類の種（例えばヒト又はマウス起源）からのものである。「変異体」又は「変異型」ポリペプチドは、対応する野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸配列の変化を含む。アミノ酸配列の変化は、例えば１つ又は複数のアミノ酸の置換、欠失、又は挿入であり得る。
【００７２】
[0070]  ＲＡＣ１  ｃＤＮＡ核酸配列（GenBank登録番号NM_006908.4；配列番号：１）：
1 gggaggccgg atgtgagtgg agcggccatt tcctgtttct ctgcagtttt cctcagcttt
61 gggtggtggc cgctgccggg catcggcttc cagtccgcgg agggcgaggc ggcgtggaca
121 gcggccccgg cacccagcgc cccgccgccc gcaagccgcg cgcccgtccg ccgcgccccg
181 agcccgccgc ttcctatctc agcgccctgc cgccgccgcc gcggcccagc gagcggccct
241 gatgcaggcc atcaagtgtg tggtggtggg agacggagct gtaggtaaaa cttgcctact
301 gatcagttac acaaccaatg catttcctgg agaatatatc cctactgtct ttgacaatta
361 ttctgccaat gttatggtag atggaaaacc ggtgaatctg ggcttatggg atacagctgg
421 acaagaagat tatgacagat tacgccccct atcctatccg caaacagatg tgttcttaat
481 ttgcttttcc cttgtgagtc ctgcatcatt tgaaaatgtc cgtgcaaagt ggtatcctga
541 ggtgcggcac cactgtccca acactcccat catcctagtg ggaactaaac ttgatcttag
601 ggatgataaa gacacgatcg agaaactgaa ggagaagaag ctgactccca tcacctatcc
661 gcagggtcta gccatggcta aggagattgg tgctgtaaaa tacctggagt gctcggcgct
721 cacacagcga ggcctcaaga cagtgtttga cgaagcgatc cgagcagtcc tctgcccgcc
781 tcccgtgaag aagaggaaga gaaaatgcct gctgttgtaa atgtctcagc ccctcgttct
841 tggtcctgtc ccttggaacc tttgtacgct ttgctcaaaa aaaaacaaaa aaaaaaaaca
901 aaaaaaaaaa acaacggtgg agccttcgca ctcaatgcca actttttgtt acagattaat
961 ttttccataa aaccattttt tgaaccaatc agtaatttta aggttttgtt tgttctaaat
1021 gtaagagttc agactcacat tctattaaaa tttagcccta aaatgacaag ccttcttaaa
1081 gccttatttt tcaaaagcgc cccccccatt cttgttcaga ttaagagttg ccaaaatacc
1141 ttctgaacta cactgcattg ttgtgccgag aacaccgagc actgaacttt gcaaagacct
1201 tcgtctttga gaagacggta gcttctgcag ttaggaggtg cagacacttg ctctcctatg
1261 tagttctcag atgcgtaaag cagaacagcc tcccgaatga agcgttgcca ttgaactcac
1321 cagtgagtta gcagcacgtg ttcccgacat aacattgtac tgtaatggag tgagcgtagc
1381 agctcagctc tttggatcag tctttgtgat ttcatagcga gttttctgac cagcttttgc
1441 ggagattttg aacagaactg ctatttcctc taatgaagaa ttctgtttag ctgtgggtgt
1501 gccgggtggg gtgtgtgtga tcaaaggaca aagacagtat tttgacaaaa tacgaagtgg
1561 agatttacac tacattgtac aaggaatgaa agtgtcacgg gtaaaaactc taaaaggtta
1621 atttctgtca aatgcagtag atgatgaaag aaaggttggt attatcagga aatgttttct
1681 taagcttttc ctttctctta cacctgccat gcctccccaa attgggcatt taattcatct
1741 ttaaactggt tgttctgtta gtcgctaact tagtaagtgc ttttcttata gaaccccttc
1801 tgactgagca atatgcctcc ttgtattata aaatctttct gataatgcat tagaaggttt
1861 ttttgtcgat tagtaaaagt gctttccatg ttactttatt cagagctaat aagtgctttc
1921 cttagttttc tagtaactag gtgtaaaaat catgtgttgc agctttatag tttttaaaat
1981 attttagata attcttaaac tatgaacctt cttaacatca ctgtcttgcc agattaccga
2041 cactgtcact tgaccaatac tgaccctctt tacctcgccc acgcggacac acgcctcctg
2101 tagtcgcttt gcctattgat gttcctttgg gtctgtgagg ttctgtaaac tgtgctagtg
2161 ctgacgatgt tctgtacaac ttaactcact ggcgagaata cagcgtggga cccttcagcc
2221 actacaacag aattttttaa attgacagtt gcagaattgt ggagtgtttt tacattgatc
2281 ttttgctaat gcaattagca ttatgttttg catgtatgac ttaataaatc cttgaatcat
2341 a
【００７３】
[0071]  ＲＡＣ１アミノ酸配列（GenBank登録番号NP_008839.2；配列番号：２）：
1 mqaikcvvvg dgavgktcll isyttnafpg eyiptvfdny sanvmvdgkp vnlglwdtag
61 qedydrlrpl sypqtdvfli cfslvspasf envrakwype vrhhcpntpi ilvgtkldlr
121 ddkdtieklk ekkltpityp qglamakeig avkylecsal tqrglktvfd eairavlcpp
181 pvkkrkrkcl ll
【００７４】
[0072]  ＲＡＣ１ｂ  ｃＤＮＡ核酸配列（GenBank登録番号NM_018890.3；配列番号：３）：
1 gggaggccgg atgtgagtgg agcggccatt tcctgtttct ctgcagtttt cctcagcttt
61 gggtggtggc cgctgccggg catcggcttc cagtccgcgg agggcgaggc ggcgtggaca
121 gcggccccgg cacccagcgc cccgccgccc gcaagccgcg cgcccgtccg ccgcgccccg
181 agcccgccgc ttcctatctc agcgccctgc cgccgccgcc gcggcccagc gagcggccct
241 gatgcaggcc atcaagtgtg tggtggtggg agacggagct gtaggtaaaa cttgcctact
301 gatcagttac acaaccaatg catttcctgg agaatatatc cctactgtct ttgacaatta
361 ttctgccaat gttatggtag atggaaaacc ggtgaatctg ggcttatggg atacagctgg
421 acaagaagat tatgacagat tacgccccct atcctatccg caaacagttg gagaaacgta
481 cggtaaggat ataacctccc ggggcaaaga caagccgatt gccgatgtgt tcttaatttg
541 cttttccctt gtgagtcctg catcatttga aaatgtccgt gcaaagtggt atcctgaggt
601 gcggcaccac tgtcccaaca ctcccatcat cctagtggga actaaacttg atcttaggga
661 tgataaagac acgatcgaga aactgaagga gaagaagctg actcccatca cctatccgca
721 gggtctagcc atggctaagg agattggtgc tgtaaaatac ctggagtgct cggcgctcac
781 acagcgaggc ctcaagacag tgtttgacga agcgatccga gcagtcctct gcccgcctcc
841 cgtgaagaag aggaagagaa aatgcctgct gttgtaaatg tctcagcccc tcgttcttgg
901 tcctgtccct tggaaccttt gtacgctttg ctcaaaaaaa aacaaaaaaa aaaaacaaaa
961 aaaaaaaaca acggtggagc cttcgcactc aatgccaact ttttgttaca gattaatttt
1021 tccataaaac cattttttga accaatcagt aattttaagg ttttgtttgt tctaaatgta
1081 agagttcaga ctcacattct attaaaattt agccctaaaa tgacaagcct tcttaaagcc
1141 ttatttttca aaagcgcccc ccccattctt gttcagatta agagttgcca aaataccttc
1201 tgaactacac tgcattgttg tgccgagaac accgagcact gaactttgca aagaccttcg
1261 tctttgagaa gacggtagct tctgcagtta ggaggtgcag acacttgctc tcctatgtag
1321 ttctcagatg cgtaaagcag aacagcctcc cgaatgaagc gttgccattg aactcaccag
1381 tgagttagca gcacgtgttc ccgacataac attgtactgt aatggagtga gcgtagcagc
1441 tcagctcttt ggatcagtct ttgtgatttc atagcgagtt ttctgaccag cttttgcgga
1501 gattttgaac agaactgcta tttcctctaa tgaagaattc tgtttagctg tgggtgtgcc
1561 gggtggggtg tgtgtgatca aaggacaaag acagtatttt gacaaaatac gaagtggaga
1621 tttacactac attgtacaag gaatgaaagt gtcacgggta aaaactctaa aaggttaatt
1681 tctgtcaaat gcagtagatg atgaaagaaa ggttggtatt atcaggaaat gttttcttaa
1741 gcttttcctt tctcttacac ctgccatgcc tccccaaatt gggcatttaa ttcatcttta
1801 aactggttgt tctgttagtc gctaacttag taagtgcttt tcttatagaa ccccttctga
1861 ctgagcaata tgcctccttg tattataaaa tctttctgat aatgcattag aaggtttttt
1921 tgtcgattag taaaagtgct ttccatgtta ctttattcag agctaataag tgctttcctt
1981 agttttctag taactaggtg taaaaatcat gtgttgcagc tttatagttt ttaaaatatt
2041 ttagataatt cttaaactat gaaccttctt aacatcactg tcttgccaga ttaccgacac
2101 tgtcacttga ccaatactga ccctctttac ctcgcccacg cggacacacg cctcctgtag
2161 tcgctttgcc tattgatgtt cctttgggtc tgtgaggttc tgtaaactgt gctagtgctg
2221 acgatgttct gtacaactta actcactggc gagaatacag cgtgggaccc ttcagccact
2281 acaacagaat tttttaaatt gacagttgca gaattgtgga gtgtttttac attgatcttt
2341 tgctaatgca attagcatta tgttttgcat gtatgactta ataaatcctt gaatcata
【００７５】
[0073]  ＲＡＣ１ｂアミノ酸配列（GenBank登録番号NP_061485.1；配列番号：４）：
1 mqaikcvvvg dgavgktcll isyttnafpg eyiptvfdny sanvmvdgkp vnlglwdtag
61 qedydrlrpl sypqtvgety gkditsrgkd kpiadvflic fslvspasfe nvrakwypev
121 rhhcpntpii lvgtkldlrd dkdtieklke kkltpitypq glamakeiga vkylecsalt
181 qrglktvfde airavlcppp vkkrkrkcll l
【００７６】
[0074]  ＲＡＣ２  ｃＤＮＡ核酸配列（GenBank登録番号NM_002872.3；配列番号：５）：
1 tgccccacca ccgctgctcc tcagcaggcg cctcaccagc ctccacaccc cttgcgcccg
61 cagaaacgcg cctggccctg agctgtcacc accgacactc tccaggctcc ggacacgatg
121 caggccatca agtgtgtggt ggtgggagat ggggccgtgg gcaagacctg ccttctcatc
181 agctacacca ccaacgcctt tcccggagag tacatcccca ccgtgtttga caactattca
241 gccaatgtga tggtggacag caagccagtg aacctggggc tgtgggacac tgctgggcag
301 gaggactacg accgtctccg gccgctctcc tatccacaga cggacgtctt cctcatctgc
361 ttctccctcg tcagcccagc ctcttatgag aacgtccgcg ccaagtggtt cccagaagtg
421 cggcaccact gccccagcac acccatcatc ctggtgggca ccaagctgga cctgcgggac
481 gacaaggaca ccatcgagaa actgaaggag aagaagctgg ctcccatcac ctacccgcag
541 ggcctggcac tggccaagga gattgactcg gtgaaatacc tggagtgctc agctctcacc
601 cagagaggcc tgaaaaccgt gttcgacgag gccatccggg ccgtgctgtg ccctcagccc
661 acgcggcagc agaagcgcgc ctgcagcctc ctctaggggt tgcaccccag cgctcccacc
721 tagatgggtc tgatcctcca ggatccccac ccaaagcctg atggcacccc ggctggccat
781 gctgtcccct ccctgtggcg tttcttagca gatggctgca gagcttcgtt gatggtcttt
841 tctgtactgg aggcctcctg aggccaggaa cgtgcaaatt tgcaggtgct gcatcccaag
901 cccctcatgc tcctgccttc ctgagggcca gaggggagcc ccaggaccca ttaagccacc
961 cccgtgttcc tgccgtcagt gccaactgcc gcatgtggaa gcatctaccc gttcactcca
1021 gtcccacccc acgcctgact cccctctgga aactgcaggc cagatggttg ctgccacaac
1081 ttgtgtacct tcagggatgg ggctcttact ccctcctgag gccagctgct ctaatatcga
1141 tggtcctgct tgccagagag ttcctctacc cagcaaaaat gagtgtctca gaagtgtgct
1201 cctctggcct cagttctcct cttttggaac aacataaaac aaatttaatt ttctacgcct
1261 ctggggatat ctgctcagcc aatggaaaat ctgggttcaa ccagcccctg ccatttctta
1321 agactttctg ctgcactcac aggatcctga gctgcactta cctgtgagag tcttcaaact
1381 tttaaacctt gccagtcagg acttttgcta ttgcaaatag aaaacccaac tcaacctgct
1441 taagcagaaa ataaatttat tgattcaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa
1501 aaaaaaaaaa aaaaaa
【００７７】
[0075]  ＲＡＣ２アミノ酸配列（GenBank登録番号NP_002863.1；配列番号：６）：
1 mqaikcvvvg dgavgktcll isyttnafpg eyiptvfdny sanvmvdskp vnlglwdtag
61 qedydrlrpl sypqtdvfli cfslvspasy envrakwfpe vrhhcpstpi ilvgtkldlr
121 ddkdtieklk ekklapityp qglalakeid svkylecsal tqrglktvfd eairavlcpq
181 ptrqqkracs ll
【００７８】
[0076]  ＲＡＣ３  ｃＤＮＡ核酸配列（GenBank登録番号NM_005052.2；配列番号：７）：
1 tgtctccggc cgatcgctcg gcgctcgggt ccgcggccgc tgcggcgccg ggcatttctc
61 cgcagctcgg ctcgcggccg cgcccgccgc cgcccggccc gcgcccatgc aggccatcaa
121 gtgcgtggtg gtcggcgacg gcgccgtggg gaagacatgc ttgctgatca gctacacgac
181 caacgccttc cccggagagt acatccccac cgtttttgac aactactctg ccaacgtgat
241 ggtggacggg aaaccagtca acttggggct gtgggacaca gcgggtcagg aggactacga
301 tcggctgcgg ccactctcct acccccaaac tgacgtcttt ctgatctgct tctctctggt
361 gagcccggcc tccttcgaga atgttcgtgc caagtggtac ccggaggtgc ggcaccactg
421 cccccacacg cccatcctcc tggtgggcac caagctggac ctccgcgacg acaaggacac
481 cattgagcgg ctgcgggaca agaagctggc acccatcacc tacccacagg gcctggccat
541 ggcccgggag attggctctg tgaaatacct ggagtgctca gccctgaccc agcggggcct
601 gaagacagtg tttgacgagg cgatccgcgc ggtgctctgc ccgcccccag tgaagaagcc
661 ggggaagaag tgcaccgtct tctagagccc tggcccaccc gagcctgagg gctggcgggg
721 agcagccctg gacgtgtccg ctgttgtgtt gagacgtgtg gtgtccctga gtcggctgtg
781 gggagcggtg ggggtgggcc ggggggaagc atggggatga ggctgggtgg caggatcctg
841 tcctctctgc cgcctcattc tggggtgtgg ctccagcctt ccctggcccc cgccggaggc
901 cgggagggag cagggtctcc ctcagggctg caggggcagg tgcagggaag ccccaggatg
961 ggcttccctg gagggggagg gtggggggga gttctgttcc ttgtgccccg aggtggggca
1021 gccccttctc attttataca ataaacattc tccacctaca aaaaaaaaaa aaaaaaa
【００７９】
[0077]  ＲＡＣ３アミノ酸配列（GenBank登録番号NP_005043.1；配列番号：８）：
1 mqaikcvvvg dgavgktcll isyttnafpg eyiptvfdny sanvmvdgkp vnlglwdtag
61 qedydrlrpl sypqtdvfli cfslvspasf envrakwype vrhhcphtpi llvgtkldlr
121 ddkdtierlr dkklapityp qglamareig svkylecsal tqrglktvfd eairavlcpp
181 pvkkpgkkct vf
【００８０】
[0078]  ＰＡＫ１転写変異型１ｃＤＮＡ核酸配列（GenBank登録番号NM_001128620.1；配列番号：９）：
1 atgtcaaata acggcctaga cattcaagac aaacccccag cccctccgat gagaaatacc
61 agcactatga ttggagccgg cagcaaagat gctggaaccc taaaccatgg ttctaaacct
121 ctgcctccaa acccagagga gaagaaaaag aaggaccgat tttaccgatc cattttacct
181 ggagataaaa caaataaaaa gaaagagaaa gagcggccag agatttctct cccttcagat
241 tttgaacaca caattcatgt cggttttgat gctgtcacag gggagtttac gggaatgcca
301 gagcagtggg cccgcttgct tcagacatca aatatcacta agtcggagca gaagaaaaac
361 ccgcaggctg ttctggatgt gttggagttt tacaactcga agaagacatc caacagccag
421 aaatacatga gctttacaga taagtcagct gaggattaca attcttctaa tgccttgaat
481 gtgaaggctg tgtctgagac tcctgcagtg ccaccagttt cagaagatga ggatgatgat
541 gatgatgatg ctaccccacc accagtgatt gctccacgcc cagagcacac aaaatctgta
601 tacacacggt ctgtgattga accacttcct gtcactccaa ctcgggacgt ggctacatct
661 cccatttcac ctactgaaaa taacaccact ccaccagatg ctttgacccg gaatactgag
721 aagcagaaga agaagcctaa aatgtctgat gaggagatct tggagaaatt acgaagcata
781 gtgagtgtgg gcgatcctaa gaagaaatat acacggtttg agaagattgg acaaggtgct
841 tcaggcaccg tgtacacagc aatggatgtg gccacaggac aggaggtggc cattaagcag
901 atgaatcttc agcagcagcc caagaaagag ctgattatta atgagatcct ggtcatgagg
961 gaaaacaaga acccaaacat tgtgaattac ttggacagtt acctcgtggg agatgagctg
1021 tgggttgtta tggaatactt ggctggaggc tccttgacag atgtggtgac agaaacttgc
1081 atggatgaag gccaaattgc agctgtgtgc cgtgagtgtc tgcaggctct ggagttcttg
1141 cattcgaacc aggtcattca cagagacatc aagagtgaca atattctgtt gggaatggat
1201 ggctctgtca agctaactga ctttggattc tgtgcacaga taaccccaga gcagagcaaa
1261 cggagcacca tggtaggaac cccatactgg atggcaccag aggttgtgac acgaaaggcc
1321 tatgggccca aggttgacat ctggtccctg ggcatcatgg ccatcgaaat gattgaaggg
1381 gagcctccat acctcaatga aaaccctctg agagccttgt acctcattgc caccaatggg
1441 accccagaac ttcagaaccc agagaagctg tcagctatct tccgggactt tctgaaccgc
1501 tgtctcgaga tggatgtgga gaagagaggt tcagctaaag agctgctaca ggtgagaaaa
1561 ctgaggtttc aagtgtttag taacttttcc atgatagctg catcaattcc tgaagattgc
1621 caagcccctc tccagcctca ctccactgat tgctgcagct aa
【００８１】
[0079]  ＰＡＫ１イソ型１アミノ酸配列（GenBank登録番号NP_001122092.1；配列番号：１０）：
1 msnngldiqd kppappmrnt stmigagskd agtlnhgskp lppnpeekkk kdrfyrsilp
61 gdktnkkkek erpeislpsd fehtihvgfd avtgeftgmp eqwarllqts nitkseqkkn
121 pqavldvlef ynskktsnsq kymsftdksa edynssnaln vkavsetpav ppvsededdd
181 dddatpppvi aprpehtksv ytrsvieplp vtptrdvats pisptenntt ppdaltrnte
241 kqkkkpkmsd eeileklrsi vsvgdpkkky trfekigqga sgtvytamdv atgqevaikq
301 mnlqqqpkke liineilvmr enknpnivny ldsylvgdel wvvmeylagg sltdvvtetc
361 mdegqiaavc reclqalefl hsnqvihrdi ksdnillgmd gsvkltdfgf caqitpeqsk
421 rstmvgtpyw mapevvtrka ygpkvdiwsl gimaiemieg eppylnenpl ralyliatng
481 tpelqnpekl saifrdflnr clemdvekrg sakellqvrk lrfqvfsnfs miaasipedc
541 qaplqphstd ccs
【００８２】
[0080]  ＰＡＫ１転写変異型２ｃＤＮＡ核酸配列（GenBank登録番号NM_002576.4：配列番号：１１）：
1 atgtcaaata acggcctaga cattcaagac aaacccccag cccctccgat gagaaatacc
61 agcactatga ttggagccgg cagcaaagat gctggaaccc taaaccatgg ttctaaacct
121 ctgcctccaa acccagagga gaagaaaaag aaggaccgat tttaccgatc cattttacct
181 ggagataaaa caaataaaaa gaaagagaaa gagcggccag agatttctct cccttcagat
241 tttgaacaca caattcatgt cggttttgat gctgtcacag gggagtttac gggaatgcca
301 gagcagtggg cccgcttgct tcagacatca aatatcacta agtcggagca gaagaaaaac
361 ccgcaggctg ttctggatgt gttggagttt tacaactcga agaagacatc caacagccag
421 aaatacatga gctttacaga taagtcagct gaggattaca attcttctaa tgccttgaat
481 gtgaaggctg tgtctgagac tcctgcagtg ccaccagttt cagaagatga ggatgatgat
541 gatgatgatg ctaccccacc accagtgatt gctccacgcc cagagcacac aaaatctgta
601 tacacacggt ctgtgattga accacttcct gtcactccaa ctcgggacgt ggctacatct
661 cccatttcac ctactgaaaa taacaccact ccaccagatg ctttgacccg gaatactgag
721 aagcagaaga agaagcctaa aatgtctgat gaggagatct tggagaaatt acgaagcata
781 gtgagtgtgg gcgatcctaa gaagaaatat acacggtttg agaagattgg acaaggtgct
841 tcaggcaccg tgtacacagc aatggatgtg gccacaggac aggaggtggc cattaagcag
901 atgaatcttc agcagcagcc caagaaagag ctgattatta atgagatcct ggtcatgagg
961 gaaaacaaga acccaaacat tgtgaattac ttggacagtt acctcgtggg agatgagctg
1021 tgggttgtta tggaatactt ggctggaggc tccttgacag atgtggtgac agaaacttgc
1081 atggatgaag gccaaattgc agctgtgtgc cgtgagtgtc tgcaggctct ggagttcttg
1141 cattcgaacc aggtcattca cagagacatc aagagtgaca atattctgtt gggaatggat
1201 ggctctgtca agctaactga ctttggattc tgtgcacaga taaccccaga gcagagcaaa
1261 cggagcacca tggtaggaac cccatactgg atggcaccag aggttgtgac acgaaaggcc
1321 tatgggccca aggttgacat ctggtccctg ggcatcatgg ccatcgaaat gattgaaggg
1381 gagcctccat acctcaatga aaaccctctg agagccttgt acctcattgc caccaatggg
1441 accccagaac ttcagaaccc agagaagctg tcagctatct tccgggactt tctgaaccgc
1501 tgtctcgaga tggatgtgga gaagagaggt tcagctaaag agctgctaca gcatcaattc
1561 ctgaagattg ccaagcccct ctccagcctc actccactga ttgctgcagc taaggaggca
1621 acaaagaaca atcactaa
【００８３】
[0081]  ＰＡＫ１イソ型２アミノ酸配列（GenBank登録番号NP_002567.3；配列番号：１２）：
1 msnngldiqd kppappmrnt stmigagskd agtlnhgskp lppnpeekkk kdrfyrsilp
61 gdktnkkkek erpeislpsd fehtihvgfd avtgeftgmp eqwarllqts nitkseqkkn
121 pqavldvlef ynskktsnsq kymsftdksa edynssnaln vkavsetpav ppvsededdd
181 dddatpppvi aprpehtksv ytrsvieplp vtptrdvats pisptenntt ppdaltrnte
241 kqkkkpkmsd eeileklrsi vsvgdpkkky trfekigqga sgtvytamdv atgqevaikq
301 mnlqqqpkke liineilvmr enknpnivny ldsylvgdel wvvmeylagg sltdvvtetc
361 mdegqiaavc reclqalefl hsnqvihrdi ksdnillgmd gsvkltdfgf caqitpeqsk
421 rstmvgtpyw mapevvtrka ygpkvdiwsl gimaiemieg eppylnenpl ralyliatng
481 tpelqnpekl saifrdflnr clemdvekrg sakellqhqf lkiakplssl tpliaaakea
541 tknnh
【００８４】
[0082]  ＲＯＣＫ１  ｃＤＮＡ核酸配列（GenBank登録番号NM_005406.2；配列番号：１３）：
1 atgtcgactg gggacagttt tgagactcga tttgaaaaaa tggacaacct gctgcgggat
61 cccaaatcgg aagtgaattc ggattgtttg ctggatggat tggatgcttt ggtatatgat
121 ttggattttc ctgccttaag aaaaaacaaa aatattgaca actttttaag cagatataaa
181 gacacaataa ataaaatcag agatttacga atgaaagctg aagattatga agtagtgaag
241 gtgattggta gaggtgcatt tggagaagtt caattggtaa ggcataaatc caccaggaag
301 gtatatgcta tgaagcttct cagcaaattt gaaatgataa agagatctga ttctgctttt
361 ttctgggaag aaagggacat catggctttt gccaacagtc cttgggttgt tcagcttttt
421 tatgcattcc aagatgatcg ttatctctac atggtgatgg aatacatgcc tggtggagat
481 cttgtaaact taatgagcaa ctatgatgtg cctgaaaaat gggcacgatt ctatactgca
541 gaagtagttc ttgcattgga tgcaatccat tccatgggtt ttattcacag agatgtgaag
601 cctgataaca tgctgctgga taaatctgga catttgaagt tagcagattt tggtacttgt
661 atgaagatga ataaggaagg catggtacga tgtgatacag cggttggaac acctgattat
721 atttcccctg aagtattaaa atcccaaggt ggtgatggtt attatggaag agaatgtgac
781 tggtggtcgg ttggggtatt tttatacgaa atgcttgtag gtgatacacc tttttatgca
841 gattctttgg ttggaactta cagtaaaatt atgaaccata aaaattcact tacctttcct
901 gatgataatg acatatcaaa agaagcaaaa aaccttattt gtgccttcct tactgacagg
961 gaagtgaggt tagggcgaaa tggtgtagaa gaaatcaaac gacatctctt cttcaaaaat
1021 gaccagtggg cttgggaaac gctccgagac actgtagcac cagttgtacc cgatttaagt
1081 agtgacattg atactagtaa ttttgatgac ttggaagaag ataaaggaga ggaagaaaca
1141 ttccctattc ctaaagcttt cgttggcaat caactacctt ttgtaggatt tacatattat
1201 agcaatcgta gatacttatc ttcagcaaat cctaatgata acagaactag ctccaatgca
1261 gataaaagct tgcaggaaag tttgcaaaaa acaatctata agctggaaga acagctgcat
1321 aatgaaatgc agttaaaaga tgaaatggag cagaagtgca gaacctcaaa cataaaacta
1381 gacaagataa tgaaagaatt ggatgaagag ggaaatcaaa gaagaaatct agaatctaca
1441 gtgtctcaga ttgagaagga gaaaatgttg ctacagcata gaattaatga gtaccaaaga
1501 aaagctgaac aggaaaatga gaagagaaga aatgtagaaa atgaagtttc tacattaaag
1561 gatcagttgg aagacttaaa gaaagtcagt cagaattcac agcttgctaa tgagaagctg
1621 tcccagttac aaaagcagct agaagaagcc aatgacttac ttaggacaga atcggacaca
1681 gctgtaagat tgaggaagag tcacacagag atgagcaagt caattagtca gttagagtcc
1741 ctgaacagag agttgcaaga gagaaatcga attttagaga attctaagtc acaaacagac
1801 aaagattatt accagctgca agctatatta gaagctgaac gaagagacag aggtcatgat
1861 tctgagatga ttggagacct tcaagctcga attacatctt tacaagagga ggtgaagcat
1921 ctcaaacata atctcgaaaa agtggaagga gaaagaaaag aggctcaaga catgcttaat
1981 cactcagaaa aggaaaagaa taatttagag atagatttaa actacaaact taaatcatta
2041 caacaacggt tagaacaaga ggtaaatgaa cacaaagtaa ccaaagctcg tttaactgac
2101 aaacatcaat ctattgaaga ggcaaagtct gtggcaatgt gtgagatgga aaaaaagctg
2161 aaagaagaaa gagaagctcg agagaaggct gaaaatcggg ttgttcagat tgagaaacag
2221 tgttccatgc tagacgttga tctgaagcaa tctcagcaga aactagaaca tttgactgga
2281 aataaagaaa ggatggagga tgaagttaag aatctaaccc tgcaactgga gcaggaatca
2341 aataagcggc tgttgttaca aaatgaattg aagactcaag catttgaggc agacaattta
2401 aaaggtttag aaaagcagat gaaacaggaa ataaatactt tattggaagc aaagagatta
2461 ttagaatttg agttagctca gcttacgaaa cagtatagag gaaatgaagg acagatgcgg
2521 gagctacaag atcagcttga agctgagcaa tatttctcga cactttataa aacccaggta
2581 aaggaactta aagaagaaat tgaagaaaaa aacagagaaa atttaaagaa aatacaggaa
2641 ctacaaaatg aaaaagaaac tcttgctact cagttggatc tagcagaaac aaaagctgag
2701 tctgagcagt tggcgcgagg ccttctggaa gaacagtatt ttgaattgac gcaagaaagc
2761 aagaaagctg cttcaagaaa tagacaagag attacagata aagatcacac tgttagtcgg
2821 cttgaagaag caaacagcat gctaaccaaa gatattgaaa tattaagaag agagaatgaa
2881 gagctaacag agaaaatgaa gaaggcagag gaagaatata aactggagaa ggaggaggag
2941 atcagtaatc ttaaggctgc ctttgaaaag aatatcaaca ctgaacgaac ccttaaaaca
3001 caggctgtta acaaattggc agaaataatg aatcgaaaag attttaaaat tgatagaaag
3061 aaagctaata cacaagattt gagaaagaaa gaaaaggaaa atcgaaagct gcaactggaa
3121 ctcaaccaag aaagagagaa attcaaccag atggtagtga aacatcagaa ggaactgaat
3181 gacatgcaag cgcaattggt agaagaatgt gcacatagga atgagcttca gatgcagttg
3241 gccagcaaag agagtgatat tgagcaattg cgtgctaaac ttttggacct ctcggattct
3301 acaagtgttg ctagttttcc tagtgctgat gaaactgatg gtaacctccc agagtcaaga
3361 attgaaggtt ggctttcagt accaaataga ggaaatatca aacgatatgg ctggaagaaa
3421 cagtatgttg tggtaagcag caaaaaaatt ttgttctata atgacgaaca agataaggag
3481 caatccaatc catctatggt attggacata gataaactgt ttcacgttag acctgtaacc
3541 caaggagatg tgtatagagc tgaaactgaa gaaattccta aaatattcca gatactatat
3601 gcaaatgaag gtgaatgtag aaaagatgta gagatggaac cagtacaaca agctgaaaaa
3661 actaatttcc aaaatcacaa aggccatgag tttattccta cactctacca ctttcctgcc
3721 aattgtgatg cctgtgccaa acctctctgg catgttttta agccaccccc tgccctagag
3781 tgtcgaagat gccatgttaa gtgccacaga gatcacttag ataagaaaga ggacttaatt
3841 tgtccatgta aagtaagtta tgatgtaaca tcagcaagag atatgctgct gttagcatgt
3901 tctcaggatg aacaaaaaaa atgggtaact catttagtaa agaaaatccc taagaatcca
3961 ccatctggtt ttgttcgtgc ttcccctcga acgctttcta caagatccac tgcaaatcag
4021 tctttccgga aagtggtcaa aaatacatct ggaaaaacta gttaa
【００８５】
[0083]  ＲＯＣＫ１アミノ酸配列（GenBank登録番号NP_005397.1；配列番号：１４）：
1 mstgdsfetr fekmdnllrd pksevnsdcl ldgldalvyd ldfpalrknk nidnflsryk
61 dtinkirdlr mkaedyevvk vigrgafgev qlvrhkstrk vyamkllskf emikrsdsaf
121 fweerdimaf anspwvvqlf yafqddryly mvmeympggd lvnlmsnydv pekwarfyta
181 evvlaldaih smgfihrdvk pdnmlldksg hlkladfgtc mkmnkegmvr cdtavgtpdy
241 ispevlksqg gdgyygrecd wwsvgvflye mLvgdtpfya dslvgtyski mnhknsltfp
301 ddndiskeak nlicafltdr evrlgrngve eikrhlffkn dqwawetlrd tvapvvpdls
361 sdidtsnfdd leedkgeeet fpipkafvgn qlpfvgftyy snrrylssan pndnrtssna
421 dkslqeslqk tiykleeqlh nemqlkdeme qkcrtsnikl dkimkeldee gnqrrnlest
481 vsqiekekml lqhrineyqr kaeqenekrr nvenevstlk dqledlkkvs qnsqlanekl
541 sqlqkqleea ndllrtesdt avrlrkshte msksisqles lnrelqernr ilensksqtd
601 kdyyqlqail eaerrdrghd semigdlqar itslqeevkh lkhnlekveg erkeaqdmln
661 hsekeknnle idlnyklksl qqrleqevne hkvtkarltd khqsieeaks vamcemekkl
721 keereareka enrvvqiekq csmldvdlkq sqqklehltg nkermedevk nltlqleqes
781 nkrlllqnel ktqafeadnl kglekqmkqe intlleakrl lefelaqltk qyrgnegqmr
841 elqdqleaeq yfstlyktqv kelkeeieek nrenlkkiqe lqneketlat qldlaetkae
901 seqlarglle eqyfeltqes kkaasrnrqe itdkdhtvsr leeansmltk dieilrrene
961 eltekmkkae eeyklekeee isnlkaafek nintertlkt qavnklaeim nrkdfkidrk
1021 kantqdlrkk ekenrklqle lnqerekfnq mvvkhqkeln dmqaqlveec ahrnelqmql
1081 askesdieql raklldlsds tsvasfpsad etdgnlpesr iegwlsvpnr gnikrygwkk
1141 qyvvvsskki lfyndeqdke qsnpsmvldi dklfhvrpvt qgdvyraete eipkifqily
1201 anegecrkdv emepvqqaek tnfqnhkghe fiptlyhfpa ncdacakplw hvfkpppale
1261 crrchvkchr dhldkkedli cpckvsydvt sardmlllac sqdeqkkwvt hlvkkipknp
1321 psgfvraspr tlstrstanq sfrkvvknts gkts
【００８６】
[0084]  ＲＯＣＫ２  ｃＤＮＡ核酸配列（GenBank登録番号NM_004850.3；配列番号：１５）：
1 atgagccggc ccccgccgac ggggaaaatg cccggcgccc ccgagaccgc gccgggggac
61 ggggcaggcg cgagccgcca gaggaagctg gaggcgctga tccgagaccc tcgctccccc
121 atcaacgtgg agagcttgct ggatggctta aattccttgg tccttgattt agattttcct
181 gctttgagga aaaacaagaa catagataat ttcttaaata gatatgagaa aattgtgaaa
241 aaaatcagag gtctacagat gaaggcagaa gactatgatg ttgtaaaagt tattggaaga
301 ggtgcttttg gtgaagtgca gttggttcgt cacaaggcat cgcagaaggt ttatgctatg
361 aagcttctta gtaagtttga aatgataaaa agatcagatt ctgccttttt ttgggaagaa
421 agagatatta tggcctttgc caatagcccc tgggtggttc agctttttta tgcctttcaa
481 gatgataggt atctgtacat ggtaatggag tacatgcctg gtggagacct tgtaaacctt
541 atgagtaatt atgatgtgcc tgaaaaatgg gccaaatttt acactgctga agttgttctt
601 gctctggatg caatacactc catgggttta atacacagag atgtgaagcc tgacaacatg
661 ctcttggata aacatggaca tctaaaatta gcagattttg gcacgtgtat gaagatggat
721 gaaacaggca tggtacattg tgatacagca gttggaacac cggattatat atcacctgag
781 gttctgaaat cacaaggggg tgatggtttc tatgggcgag aatgtgattg gtggtctgta
841 ggtgttttcc tttatgagat gctagtgggg gatactccat tttatgcgga ttcacttgta
901 ggaacatata gcaaaattat ggatcataag aattcactgt gtttccctga agatgcagaa
961 atttccaaac atgcaaagaa tctcatctgt gctttcttaa cagataggga ggtacgactt
1021 gggagaaatg gggtggaaga aatcagacag catcctttct ttaagaatga tcagtggcat
1081 tgggataaca taagagaaac ggcagctcct gtagtacctg aactcagcag tgacatagac
1141 agcagcaatt tcgatgacat tgaagatgac aaaggagatg tagaaacctt cccaattcct
1201 aaagcttttg ttggaaatca gctgcctttc atcggattta cctactatag agaaaattta
1261 ttattaagtg actctccatc ttgtagagaa actgattcca tacaatcaag gaaaaatgaa
1321 gaaagtcaag agattcagaa aaaactgtat acattagaag aacatcttag caatgagatg
1381 caagccaaag aggaactgga acagaagtgc aaatctgtta atactcgcct agaaaaaaca
1441 gcaaaggagc tagaagagga gattacctta cggaaaagtg tggaatcagc attaagacag
1501 ttagaaagag aaaaggcgct tcttcagcac aaaaatgcag aatatcagag gaaagctgat
1561 catgaagcag acaaaaaacg aaatttggaa aatgatgtta acagcttaaa agatcaactt
1621 gaagatttga aaaaaagaaa tcaaaactct caaatatcca ctgagaaagt gaatcaactc
1681 cagagacaac tggatgaaac caatgcttta ctgcgaacag agtctgatac tgcagcccgg
1741 ttaaggaaaa cccaggcaga aagttcaaaa cagattcagc agctggaatc taacaataga
1801 gatctacaag ataaaaactg cctgctggag actgccaagt taaaacttga aaaggaattt
1861 atcaatcttc agtcagctct agaatctgaa aggagggatc gaacccatgg atcagagata
1921 attaatgatt tacaaggtag aatatgtggc ctagaagaag atttaaagaa cggcaaaatc
1981 ttactagcga aagtagaact ggagaagaga caacttcagg agagatttac tgatttggaa
2041 aaggaaaaaa gcaacatgga aatagatatg acataccaac taaaagttat acagcagagc
2101 ctagaacaag aagaagctga acataaggcc acaaaggcac gactagcaga taaaaataag
2161 atctatgagt ccatcgaaga agccaaatca gaagccatga aagaaatgga gaagaagctc
2221 ttggaggaaa gaactttaaa acagaaagtg gagaacctat tgctagaagc tgagaaaaga
2281 tgttctctat tagactgtga cctcaaacag tcacagcaga aaataaatga gctccttaaa
2341 cagaaagatg tgctaaatga ggatgttaga aacctgacat taaaaataga gcaagaaact
2401 cagaagcgct gccttacaca aaatgacctg aagatgcaaa cacaacaggt taacacacta
2461 aaaatgtcag aaaagcagtt aaagcaagaa aataaccatc tcatggaaat gaaaatgaac
2521 ttggaaaaac aaaatgctga acttcgaaaa gaacgtcagg atgcagatgg gcaaatgaaa
2581 gagctccagg atcagctcga agcagaacag tatttctcaa ccctttataa aacacaagtt
2641 agggagctta aagaagaatg tgaagaaaag accaaacttg gtaaagaatt gcagcagaag
2701 aaacaggaat tacaggatga acgggactct ttggctgccc aactggagat caccttgacc
2761 aaagcagatt ctgagcaact ggctcgttca attgctgaag aacaatattc tgatttggaa
2821 aaagagaaga tcatgaaaga gctggagatc aaagagatga tggctagaca caaacaggaa
2881 cttacggaaa aagatgctac aattgcttct cttgaggaaa ctaataggac actaactagt
2941 gatgttgcca atcttgcaaa tgagaaagaa gaattaaata acaaattgaa agatgttcaa
3001 gagcaactgt caagattgaa agatgaagaa ataagcgcag cagctattaa agcacagttt
3061 gagaagcagc tattaacaga aagaacactc aaaactcaag ctgtgaataa gttggctgag
3121 atcatgaatc gaaaagaacc tgtcaagcgt ggtaatgaca cagatgtgcg gagaaaagag
3181 aaggagaata gaaagctaca tatggagctt aaatctgaac gtgagaaatt gacccagcag
3241 atgatcaagt atcagaaaga actgaatgaa atgcaggcac aaatagctga agagagccag
3301 attcgaattg aactgcagat gacattggac agtaaagaca gtgacattga gcagctgcgg
3361 tcacaactcc aagccttgca tattggtctg gatagttcca gtataggcag tggaccaggg
3421 gatgctgagg cagatgatgg gtttccagaa tcaagattag aaggatggct ttcattgcct
3481 gtacgaaaca acactaagaa atttggatgg gttaaaaagt atgtgattgt aagcagtaag
3541 aagattcttt tctatgacag tgaacaagat aaagaacaat ccaatcctta catggtttta
3601 gatatagaca agttatttca tgtccgacca gttacacaga cagatgtgta tagagcagat
3661 gctaaagaaa ttccaaggat attccagatt ctgtatgcca atgaaggaga aagtaagaag
3721 gaacaagaat ttccagtgga gccagttgga gaaaaatcta attatatttg ccacaaggga
3781 catgagttta ttcctactct ttatcatttc ccaaccaact gtgaggcttg tatgaagccc
3841 ctgtggcaca tgtttaagcc tcctcctgct ttggagtgcc gccgttgcca tattaagtgt
3901 cataaagatc atatggacaa aaaggaggag attatagcac cttgcaaagt atattatgat
3961 atttcaacgg caaagaatct gttattacta gcaaattcta cagaagagca gcagaagtgg
4021 gttagtcggt tggtgaaaaa gatacctaaa aagcccccag ctccagaccc ttttgcccga
4081 tcatctccta gaacttcaat gaagatacag caaaaccagt ctattagacg gccaagtcga
4141 cagcttgccc caaacaaacc tagctaa
【００８７】
[0085]  ＲＯＣＫ２アミノ酸配列（GenBank登録番号NP_004841.2；配列番号：１６）：
1 msrppptgkm pgapetapgd gagasrqrkl ealirdprsp inveslldgl nslvldldfp
61 alrknknidn flnryekivk kirglqmkae dydvvkvigr gafgevqlvr hkasqkvyam
121 kllskfemik rsdsaffwee rdimafansp wvvqlfyafq ddrylymvme ympggdlvnl
181 msnydvpekw akfytaevvl aldaihsmgl ihrdvkpdnm lldkhghlkl adfgtcmkmd
241 etgmvhcdta vgtpdyispe vlksqggdgf ygrecdwwsv gvflyemlvg dtpfyadslv
301 gtyskimdhk nslcfpedae iskhaknlic afltdrevrl grngveeirq hpffkndqwh
361 wdniretaap vvpelssdid ssnfddiedd kgdvetfpip kafvgnqlpf igftyyrenl
421 llsdspscre tdsiqsrkne esqeiqkkly tleehlsnem qakeeleqkc ksvntrlekt
481 akeleeeitl rksvesalrq lerekallqh knaeyqrkad headkkrnle ndvnslkdql
541 edlkkrnqns qistekvnql qrqldetnal lrtesdtaar lrktqaessk qiqqlesnnr
601 dlqdknclle taklklekef inlqsalese rrdrthgsei indlqgricg leedlkngki
661 llakvelekr qlqerftdle keksnmeidm tyqlkviqqs leqeeaehka tkarladknk
721 iyesieeaks eamkemekkl leertlkqkv enllleaekr cslldcdlkq sqqkinellk
781 qkdvlnedvr nltlkieqet qkrcltqndl kmqtqqvntl kmsekqlkqe nnhlmemkmn
841 lekqnaelrk erqdadgqmk elqdqleaeq yfstlyktqv relkeeceek tklgkelqqk
901 kqelqderds laaqleitlt kadseqlars iaeeqysdle kekimkelei kemmarhkqe
961 ltekdatias leetnrtlts dvanlaneke elnnklkdvq eqlsrlkdee isaaaikaqf
1021 ekqlltertl ktqavnklae imnrkepvkr gndtdvrrke kenrklhmel kserekltqq
1081 mikyqkelne mqaqiaeesq irielqmtld skdsdieqlr sqlqalhigl dsssigsgpg
1141 daeaddgfpe srlegwlslp vrnntkkfgw vkkyvivssk kilfydseqd keqsnpymvl
1201 didklfhvrp vtqtdvyrad akeiprifqi lyanegeskk eqefpvepvg eksnyichkg
1261 hefiptlyhf ptnceacmkp lwhmfkpppa lecrrchikc hkdhmdkkee iiapckvyyd
1321 istaknllll ansteeqqkw vsrlvkkipk kppapdpfar ssprtsmkiq qnqsirrpsr
1381 qlapnkps
【００８８】
[0086]ＩＩ．組成物及び薬剤
本発明の組成物及び薬剤は、癌及びその癌のサブタイプの診断、予後の判定、予防、及び治療で使用するために提供される。かかる組成物及び薬剤は、本明細書で列挙又は記述した本発明のバイオマーカーによってコードされる遺伝子産物又はそのフラグメントの発現及び／又は活性を検出及び／又は調節、例えば上方制御又は下方制御することができる。例示的薬剤には、本明細書で列挙又は記述したバイオマーカー、又はそのフラグメントなど、本発明のタンパク質バイオマーカーを結合及び／又は活性化若しくは阻害することができる抗体、低分子化合物、ペプチド、ペプチドミメティクス、天然配位子、及び天然配位子の誘導体、及び本明細書で列挙又は記述したバイオマーカー、又はそのフラグメントなど、本発明のバイオマーカーの発現及び／又は活性を下方制御することができるＲＮＡ干渉分子、アンチセンス分子、核酸アプタマなどのような核酸分子が含まれる。
【００８９】
[0087]  一実施形態では、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカー、又はその生物学的活性部分と特異的にハイブリダイゼーションするか、それを特異的にコードする単離核酸分子が提供される。本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（すなわちｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（すなわちｍＲＮＡ）、及びヌクレオチド類似体を使用して生成されるＤＮＡ又はＲＮＡの類似体を含むものとする。核酸分子は、１本鎖又は２本鎖でよいが、２本鎖ＤＮＡであることが好ましい。「単離」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されている核酸分子である。「単離」核酸には、核酸が由来する生体のゲノムＤＮＡ中の核酸に対して自然ではその側面に位置する配列（すなわち、核酸の５’末端及び３’末端に位置する配列）がないことが好ましい。例えば、様々な実施形態では、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーに対応する単離核酸分子は、核酸が由来する細胞（すなわち白血病細胞）のゲノムＤＮＡ中で核酸分子に対して自然ではその側面に位置するヌクレオチド配列を約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂ未満含むことができる。さらに、ｃＤＮＡ又分子のような「単離」核酸分子には、他の細胞材料、又は組み換え技術によって産生された場合は培養基、又は化学的に合成された場合は化学前駆体又は他の化学物質が実質的にないことがある。
【００９０】
[0088]  本発明の核酸分子、例えば本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのヌクレオチド配列、又は本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカー又はその一部のヌクレオチド配列（すなわち、１００、２００、３００、４００、４５０、５００個又はそれ以上のヌクレオチド）と少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％以上（例えば約９８％）相同であるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、標準的な分子生物学技術及び本明細書で提供する配列情報を使用して単離することができる。幾つかの実施形態では、核酸配列は、１，２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個又はそれ以下のアミノ酸の変化を除き、野生型バイオマーカータンパク質をコードする。例えば、ヒトｃＤＮＡは、ハイブリダイゼーションプローブ及び標準的なハイブリダイゼーション技術として（すなわち、Sambrook, J., Fritsh、E. F.、及びManiatis, T.のMolecular Cloning: A Laboratory Manual第２版（Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）に記載されているように）核酸分子又はそのフラグメントの全体又は一部を使用し、（Stratagene（カリフォルニア州ラホーラ）又はClontech（カリフォルニア州パロアルト）からの）ヒト細胞系列から単離することができる。さらに、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのヌクレオチド配列、又はヌクレオチド配列又はそのフラグメントに少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％以上相同であるヌクレオチド配列の全体又は一部を含む核酸分子は、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーの配列、又はそのフラグメント、又は相同ヌクレオチド配列に基づいてデザインされたオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ポリメラーゼ鎖反応によって単離することができる。例えば、ｍＲＮＡは筋肉細胞から（すなわち、Chirgwin他 (1979)、Biochemistry 18: 5294-5299のグアニジンチオシアネート抽出手順によって）単離することができ、ｃＤＮＡは、逆転写酵素（すなわち、Gibco/BRL（メリーランド州ベセスダ）から入手可能なＭｏｌｏｎｅｙ  ＭＬＶ逆転写酵素、又はSeikagaku America, Inc.（フロリダ州セントピータースバーグ）から入手可能なＡＭＶ逆転写酵素）を使用して調製することができる。ＰＣＲ増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、当技術分野で周知の方法によりデザインすることができる。本発明の核酸は、テンプレート及び適切なオリゴヌクレオチドプライマーとしてｃＤＮＡ、又は代替的にゲノムＤＮＡを使用して、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って増幅することができる。このように増幅した核酸は、適切なベクターにクローン化し、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けることができる。さらに、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術によ���て、すなわち自動化ＤＮＡシンセサイザを使用して調製することができる。
【００９１】
[0089]  本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのヌクレオチド配列に基づくプローブを使用して、同じ又は相同タンパク質をコードする転写物又はゲノム配列を検出することができる。好ましい実施形態では、プローブは自身に結合した標識群をさらに含む。すなわち、標識群は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、又は酵素補因子でよい。かかるプローブは、例えば対象からの細胞サンプルの核酸レベルを測定する、すなわち本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのｍＲＮＡレベルを検出することによって、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーを発現する細胞又は組織を同定する診断試験キットの一部として使用することができる。
【００９２】
[0090]  本明細書で列挙又は記述した様々な種からの１つ又は複数のバイオマーカーに対応するタンパク質をコードする核酸分子も想定される。例えば、ラット又はサルのｃＤＮＡはヒト及び／又はマウスの配列のヌクレオチド配列に基づいて同定することができ、かかる配列は当技術分野で周知である。一実施形態では、本発明の核酸分子は、タンパク質、又は本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのアミノ酸配列に十分相同であるアミノ酸配列を含むその一部をコードし、したがってタンパク質又はその一部は以下の生物学的活性のうち１つ又は複数を調節（例えば強化）する。すなわち、ａ）バイオマーカーとの結合、ｂ）バイオマーカーのコピー数の調節、ｃ）バイオマーカーの発現レベルの調節、及びｄ）バイオマーカーの活性レベルの調節である。
【００９３】
[0091]  幾つかの実施形態では、本明細書で記述する本発明のバイオマーカー（例えば変異体ＲＡＣタンパク質又はそれをコードする核酸分子）はさらに、構造的に活性かつ発癌性になる能力を有すると定義される。「構造的に活性」のポリペプチドとは、一定の活性発現（例えば通常は対応する野生型ポリペプチドで制御される活性の非制御発現）を示すポリペプチドである。「発癌性」ポリペプチドとは、細胞を過剰増殖性にする能力を有するポリペプチドである。ＲＡＣポリペプチドの活性は当技術分野で周知であり、１）グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を加水分解する、２）細胞増殖を制御する、３）細胞周期を制御する、４）上皮分化を制御する、５）細胞骨格を再構成する、及び６）タンパク質キナーゼを活性化する能力を含むが、これらに限定されない。対応する野生型ポリペプチドと比較すると、本明細書で記述する変異体ＲＡＣマーカーは、変化した量、構造、細胞内位置及び／又は活性を、対応する野生型ＲＡＣマーカーに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％以上多くすることができる。活性レベル及び発癌性を判定する例示的方法は当技術分野で周知であり、本明細書でさらに説明する（例えば足場非依存性増殖アッセイ、軟寒天アッセイ、ヌードマウス腫瘍形成能アッセイ、免疫ブロットアッセイ、ＲＮＡノックダウンアッセイ、ＧＴＰ負荷アッセイ、細胞骨格再構成アッセイなど）。
【００９４】
[0092]  本明細書で使用する「十分に相同」という言い回しは、バイオマーカーのアミノ酸配列又はそのフラグメントに対して同一又は同等の最小数のアミノ酸残基（例えば、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカー又はそのフラグメントのアミノ酸残基として同様の側鎖を有するアミノ酸残基）を含むアミノ酸配列を有するタンパク質又はその一部を指し、したがって、タンパク質又はその一部は、以下の生物学的活性の１つ又は複数を調節（例えば強化）する。すなわち、ａ）バイオマーカーとの結合、ｂ）バイオマーカーのコピー数の調節、ｃ）バイオマーカーの発現レベルの調節、ｄ）バイオマーカーの活性レベルの調節及び／又はｅ）バイオマーカーの構造的活性及び／又は発癌性状態の調節、である。
【００９５】
[0093]  別の実施形態では、タンパク質は、バイオマーカーのアミノ酸配列全体又はそのフラグメントに対して少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同である。他の実施形態では、タンパク質は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個又はそれ以下のアミノ酸を除き、野生型タンパク質のアミノ酸配列とは異なる。例えば、ＲＡＣポリペプチド変異体は、アミノ酸の置換、欠失又は挿入の任意の組み合わせを有することができる。本明細書では、ヒトＲＡＣタンパク質のアミノ酸位置名称を使用して、多数のかかるＲＡＣポリペプチド変異体について述べているが、非ヒト種のオルソログにおける対応するアミノ酸残基を容易に同定して、生成することができ、本発明の範囲に入る。一実施形態では、単離ＲＡＣポリペプチド変異体は、整数のアミノ酸変化を有し、したがってそのアミノ酸配列は、野生型ＲＡＣポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも６０、７０、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．５又は１００％の同一性を共有する。本明細書で述べるように、ＲＡＣマーカーは種間で高度に保存され、当業者に容易に理解されるように、ＲＡＣによって媒介される所望の機能に影響せずに、ＲＡＣマーカーの領域の変更できる構造が知られている。
【００９６】
[0094]  本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーの核酸分子によってコードされるタンパク質の部分は、タンパク質の生物学的に活性の部分であることが好ましい。本明細書では、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーの「生物学的活性部分」という用語は、完全長タンパク質の生物学的活性のうち１つ又は複数を有する部分、例えばドメイン／モチーフを含むものとする。例えば、本明細書で述べる変異体ＲＡＣマーカーは、完全長ＲＡＣマーカーに対応するか、又は完全長ＲＡＣマーカーのフラグメントでよい。ＲＡＣマーカーの「フラグメント」は、完全長ＲＡＣマーカーより短いマーカーの任意のサブセットを指す。一実施形態では、ＲＡＣポリペプチド変異体は、構造的に活性で発癌性となる能力を保持するポリペプチドである。かかるＲＡＣマーカーフラグメントは、例えば対応する完全長ＲＡＣマーカーよりもアミノ酸５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個分又はそれ以上短くてよい。
【００９７】
[0095]  本明細書で述べるような標準的結合アッセイ、例えば免疫沈降及び酵母ツーハイブリッドアッセイ、又は機能的アッセイ、例えばＲＮＡｉ又は過剰発現実験を実行して、タンパク質又はその生物学的活性フラグメントが完全長タンパク質の生物学的活性を維持する能力を判定することができる。
【００９８】
[0096]  本発明はさらに、遺伝子コードの縮退により、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのヌクレオチド配列又はそのフラグメントとは異なり、したがってヌクレオチド配列によってコードされたものと同じタンパク質又はそのフラグメントをコードする核酸分子を含む。別の実施形態では、本発明の単離核酸分子は、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのアミノ酸配列、又はそのフラグメントを有するタンパク質、又は本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのアミノ酸配列、又はそのフラグメントに対して少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上相同であるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。別の実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸は、長さがアミノ酸１９５、１９０、１８５、１８０、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、又は７０個未満である当該の完全長フラグメントの一部をコードする核酸配列で構成される。
【００９９】
[0097]  本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ配列多型が、ある母集団（例えば哺乳類及び／又はヒトの母集団）内に存在することがあることが、当業者には認識される。かかる遺伝的多型は、自然の対立遺伝子の変異により、ある母集団内の個体間に存在することがある。本明細書で使用する「遺伝子」及び「組換え遺伝子」という用語は、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子、好ましくは哺乳類、例えばヒトのタンパク質を指す。かかる自然の対立遺伝子の変異は通常、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーの核酸配列に１〜５％の変動をもたらすことがある。自然の対立遺伝子の変異の結果であり、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーの機能的活性を変化させることがない、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのかかるヌクレオチドの変動のいずれか及びすべて、及びその結果としてのアミノ酸多型は、本発明の範囲に入るものとする。さらに、他の種から本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーをコードする核酸分子。
【０１００】
[0098]  本明細書で列挙又は記述し、母集団に存在することがある１つ又は複数のバイオマーカーの自然に発生する対立遺伝子変異型に加えて、突然変異によってヌクレオチド配列又はそのフラグメントに変化を導入し、それによって本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーの機能的能力を変更せずに、本明細書で列挙又は記述したコードされた１つ又は複数のバイオマーカーのアミノ酸配列に変化をもたらし得ることが、当業者にはさらに認識される。例えば、「非必須」アミノ酸残基のアミノ酸置換につながるヌクレオチドの置換は、配列又はそのフラグメント内で実行することができる。「非必須」アミノ酸残基は、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーの活性を変更することなく、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーの野生型配列から変更することができる残基であり、「必須」アミノ酸残基は、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーの活性のために必要である。しかし、他のアミノ酸残基（例えばマウス及びヒトの間で保存されない、又は半保存のみであるアミノ酸残基）は、活性のために必須でないことがあり、したがって本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーの活性を変更せずに容易に変化する可能性が高い。本発明のポリペプチド中のアミノ酸置換は、「保存的」又は「非保存的」でもよい。「保存的」アミノ酸置換は、置換したアミノ酸が同様の構造的又は化学的特性を有する置換であり、「非保存的」アミノ酸置換は、置換したアミノ酸の電荷、疎水性、又は嵩が有意に変化する置換である。非保存的置換は、（ａ）置換区域のペプチドバックボーンの例えばシート又はらせんコンフォメーションとしての構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持することに対するその効果が、さらに有意に異なる。保存的アミノ酸置換の例には、置換が以下の５つの群のうち１つに入るものが含まれる。すなわち、１）低分子脂肪族非極性又はわずかに極性の残基（Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ）、２）極性で負電荷の残基及びそのアミド（Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕｔ、Ｇｌｎ）、極性で正電荷の残基（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、高分子脂肪族非極性残基（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｃｙｓ）、及び高分子芳香族残基（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）である。非保存的アミノ酸置換の例は、１）親水性残基、例えばセリル又はトレオニルが疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、又はアラニルに（又は、それによって）置換される、２）システイン又はプロリンが任意の他の残基に（又は、それによって）置換される、３）電気陽性側鎖、例えばリシル、アルギニル、又はヒスチジルが電気陰性残基、例えばグルタミル又はアスパルチルに（又は、それによって）置換される、又は４）嵩張った側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンが、側鎖を有していない残基、例えばグリシンに（又は、それによって）置換されるような置換である。
【０１０１】
[0099]  「配列同一性又は相同性」という用語は、２つのポリペプチド分子間、又は２つの核酸分子間の配列の類似性を指す。２つの比較した配列の両方における位置が、同じ塩基又はアミノ酸モノマサブユニットによって占有される場合、例えば２つのＤＮＡ分子それぞれにおける位置がアデニンに占有されている場合、その分子はその位置において相同又は配列同一性である。２つの配列間の相同性又は配列同一性のパーセントは、２つの配列が共有する一致又は相同同一位置の数を比較した位置の数で割り、１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列の１０カ所のうち６カ所が同じ場合、２つの配列は６０％相同であるか、又は６０％の配列同一性を有する。例示により、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣとＴＡＴＧＧＧは５０％の相同性又は配列同一性を共有する。通常、２つの配列を整列させて任意の最大相同性を提供する場合、比較をする。他に規定されない限り、「ループアウト領域」、例えば配列のうち１つにおける欠失又は挿入から生じる領域は、ミスマッチとカウントされる。
【０１０２】
[0100]  配列の比較、及び２つの配列間のパーセント相同性の判定は、数学的アルゴリズムを使用して遂行することができる。アラインメントは、Clustal法を使用して実行できることが好ましい。多重アラインメントパラメータにはギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝１０が含まれる。ＤＮＡのアラインメントでは、対のアラインメントパラメータはHtuple＝２、ギャップペナルティ＝５、ウィンドウ＝４、及びダイアゴナルセーブド＝４とすることができる。タンパク質のアラインメントでは、対のアラインメントパラメータはKtuple＝１、ギャップペナルティ＝３、ウィンドウ＝５、及びダイアゴナルセーブド＝５とすることができる。
【０１０３】
[0101]  好ましい実施形態では、Blossom 62マトリクス又はPAM250マトリクス、及び１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ重量及び１、２、３、４、５又は６の長さ重量を使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ（オンラインで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman及びWunsch（J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)）アルゴリズムを使用して、２つのアミノ酸配列間の同一性百分率を判定する。さらに別の好ましい実施形態では、NWSgap dna.Cmpマトリクス及び４０、５０、６０、７０又は８０のギャップ重量及び１、２、３、４、５又は６の長さ重量を使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ（オンラインで入手可能）のＧＡＰプログラムを使用して、２つの核酸配列間の同一性百分率を判定する。別の実施形態では、PAM120重量残基テーブル、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを使用するＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（オンラインで入手可能）に組み込まれているE. Meyers及びW. Millerのアルゴリズム（(CABIOS, 4:11-17 (1989)）を使用して、２つのアミノ酸又はヌクレオチド配列間の同一性百分率を判定する。
【０１０４】
[0102]  本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーに相同のタンパク質をコードする単離核酸分子、又はそのフラグメントは、１つ又は複数のアミノ酸置換、付加又は欠失をコードしたタンパク質に導入するように、１つ又は複数の核酸置換、付加又は欠失をヌクレオチド配列、又はそのフラグメント、又は相同ヌクレオチド配列に導入することによって生成することができる。変異は、部位特異的突然変異及びＰＣＲ媒介突然変異などの標準的技術によって導入することができる。保存的アミノ酸置換は、１つ又は複数の予測された非必須アミノ酸残基にて実行することが好ましい。したがって、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーの予測された非必須アミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換することが好ましい。あるいは、別の実施形態では、変異は、飽和突然変異誘発などによって、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのコード配列の全部又は一部に沿ってランダムに導入することができ、その結果の変異体を、本明細書で記述した活性についてスクリーニングし、所望の活性を保持する変異体を同定することができる。突然変異誘発の後、当技術分野で周知の方法により、コードしたタンパク質を組み換え技術で発現させることができ、タンパク質の活性は、例えば本明細書で記述したアッセイを使用して判定することができる。
【０１０５】
[0103]  本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのレベルは、転写した分子又はタンパク質の発現を検出する多種多様な周知の方法のいずれかで評価することができる。かかる方法の非限定的な例には、タンパク質を検出する免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質の機能又は活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法、及び核酸増幅法が含まれる。
【０１０６】
[0104]  好ましい実施形態では、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのレベルは、遺伝子転写物（例えばｍＲＮＡ）の測定によって、翻訳したタンパク質の量の測定によって、又は遺伝子産物の活性の測定によって確認される。発現レベルは、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、又はタンパク質活性の検出を含め、様々な方法でモニタすることができ、そのいずれも標準的技術を使用して測定することができる。検出は、遺伝子発現レベル（例えばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、又は酵素の活性）の定量を含む、又は代替的に遺伝子発現レベルの定性的評価、特にコントロールレベルと比較した評価とすることができる。検出中のレベルの種類は、状況から明白になる。
【０１０７】
[0105]  特定の実施形態では、当技術分野で知られている方法を使用し、ｉｎ  ｓｉｔｕ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方のフォーマットにより生物学的サンプル中で、ｍＲＮＡの発現レベルを判定することができる。「生物学的サンプル」という用語は、対象から単離された組織、細胞、生物学的流体及びその単離物、さらに対象内に存在する組織、細胞及び流体を含むものとする。多くの発現検出法が、単離ＲＮＡを使用している。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法では、細胞からＲＮＡを精製するために、ｍＲＮＡの単離に対して選択しない任意のＲＮＡ単離技術を使用することができる（例えばAusubel他の編集のCurrent Protocols in Molecular Biology（John Wiley & Sons, New York 1987-1999）を参照）。また、例えばChomczynskiの一段階ＲＮＡ単離プロセス（米国特許第４，８４３，１５５号、１９８９）などの当業者に周知の技術を使用して、多数の組織サンプルを容易に処理することができる。
【０１０８】
[0106]  単離したｍＲＮＡは、サザン又はノーザン解析、ポリメラーゼ鎖反応解析及びプローブアレイを含むが、これらに限定されないハイブリダイゼーション又は増幅アッセイに使用することができる。ｍＲＮＡのレベルを検出する１つの診断法は、検出中の遺伝子によってコードされたｍＲＮＡへとハイブリダイゼーションすることができる核酸分子（プローブ）に単離したｍＲＮＡを接触させることを含む。核酸プローブは、例えば完全長ｃＤＮＡ又はその一部、例えば長さが少なくともヌクレオチド７、１５、３０、５０、１００、２５０又は５００個で、ストリンジェントな条件で本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーをコードするゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡへと特異的にハイブリダイゼーションするのに十分であるオリゴヌクレオチドでよい。本発明の診断アッセイに使用するのに適切な他のプローブについて、本明細書で説明する。プローブでのｍＲＮＡのハイブリダイゼーションは、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーが発現中であることを示す。
【０１０９】
[0107]  １つのフォーマットでは、例えば単離したｍＲＮＡをアガロースゲル上で移動させ、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜に移すことによって、ｍＲＮＡを固体表面上で固定化し、プローブと接触させる。代替フォーマットでは、例えばAffymetrix（商標）遺伝子チップアレイなどの遺伝子チップアレイ内で、プローブを固体表面上で固定化し、ｍＲＮＡをプローブと接触させる。当業者は、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのｍＲＮＡ発現レベルを検出する際に使用するため、既知のｍＲＮＡ検出法を容易に適応させることができる。
【０１１０】
[0108]  サンプル中のｍＲＮＡ発現レベルを判定する代替方法は、例えばＲＴ−ＰＣＲ（参照により組み込まれるMullisの米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）に記載された実験的実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Barany、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:189-193）、自立配列複製（Guatelli他、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878）、転写増幅システム（Kwoh他、1989、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）、Ｑ−βレプリカーゼ（Lizardi他、1988、Bio/Technology 6:1197）、ローリングサークル複製（Lizardi他、米国特許第５，８５４，０３３号）、又は任意の他の核酸増幅法によって、及びその後の当業者に周知の技術を使用した増幅分子の検出による核酸増幅のプロセスを含む。これらの検出方式は、核酸分子が非常に少数で存在する場合、かかる分子の検出に特に有用である。本明細書で使用する増幅プライマーは、遺伝子の５’領域又は３’領域（それぞれ＋鎖及び−鎖、又はその逆）にアニールし、間に短い領域を含むことができる１対の核酸分子と定義される。一般的に、増幅プライマーは、長さがヌクレオチド約１０〜３０個であり、長さがヌクレオチド約５０〜２００個の領域に隣接する。適切な条件で、適切な試薬を使用すると、かかるプライマーによって、プライマーが隣接するヌクレオチド配列を含む核酸分子を増幅することができる。
【０１１１】
[0109]  ｉｎ  ｓｉｔｕの方法では、検出前にｍＲＮＡを細胞から単離する必要がない。かかる方法では、既知の組織学的方法を使用して細胞又は組織サンプルを調製／処理する。次に、サンプルを支持体、通常はスライドガラス上に固定化し、次に本明細書のｍＲＮＡで列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーにハイブリダイゼーションすることができるプローブと接触させる。
【０１１２】
[0110]  絶対発現レベルに基づく判定の代替法として、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーの正規化した発現レベルに基づいて判定することができる。発現レベルは、その発現を非バイオマーカー遺伝子、例えば構成的に発現したハウスキーピング遺伝子の発現と比較することによって絶対発現レベルを補正することにより正規化される。正規化に適した遺伝子には、アクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子、又は上皮細胞特異的遺伝子が含まれる。この正規化によって、１つのサンプル、例えば対象のサンプルの発現レベルを、別のサンプル、例えば正常なサンプルと、又は異なる源からのサンプル間で比較することができる。
【０１１３】
[0111]  本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーに対応するタンパク質のレベル又は活性は、発現したポリペプチドを検出又は定量することによって検出及び／又は定量することもできる。ポリペプチドは、当業者に周知の幾つかの手段のうちいずれかで検出し、定量することができる。それには、電気泳動、毛管電気泳動、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、薄膜クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、超核酸クロマトグラフィなどのような生化学的分析法、又は流体又はゲル沈降反応、免疫拡散（１元又は２元）、免疫電気泳動、放射免疫アッセイ、（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウェスタンブロットなどのような様々な免疫学的方法が含まれる。当業者は、細胞が該当するバイオマーカーを発現するか否かの判定に使用するために、既知のタンパク質／抗体検出法を容易に適応させることができる。
【０１１４】
[0112]  本発明はさらに、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーの精製及び／又は単離した可溶性ポリペプチド形態、又はそのフラグメントを提供する。また、同一性百分率、ポリペプチド長さ、ポリペプチドフラグメント、生物学的活性、抗体などの本明細書で記述したポリペプチドのいずれか及びすべての属性を、本明細書で列挙又は記述した任意のバイオマーカー及びそれらの組み合わせに対して、任意の順序又は組み合わせで組み合わせることができる。
【０１１５】
[0113]  一態様では、ポリペプチドは、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーに対応する完全長アミノ酸配列、又は１〜約２０の保存的アミノ酸置換を有する完全長アミノ酸配列を含むことができる。本明細書で記述したいずれかのアミノ酸配列は、本明細書で列挙又は記述した、すなわち本明細書で記述するか、当技術分野で周知である１つ又は複数のバイオマーカーの完全長配列、又はそのフラグメントに対して少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９又は９９．５％同一でもよい。別の態様では、本発明は本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーに対応する単離ポリペプチド、及び約２５％、又は代替的に１５％、又は代替的に５％未満の汚染性生物学的高分子又はポリペプチドを含む組成物を想定する。
【０１１６】
[0114]  また、本明細書で記述するバイオマーカーは、幾つかの周知の方法により修飾することもできる。例えば、変異体ＲＡＣマーカーは、正常な細胞環境のポリペプチドで存在することがある化学的部分で修飾することができ、例えばリン酸化、メチル化、アミド化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化である。幾つかの実施形態では、ポリペプチドは、直接的又は間接的に検出可能な信号を提供することができ、放射性同位体及び蛍光化合物を含むが、これらに限定されない標識で修飾することもできる。かかるポリペプチドは、通常は細胞環境でポリペプチドに付加されない化学的部分によって修飾することもできる。かかる修飾は、ポリペプチドの標的アミノ酸残基を、選択された側鎖又は末端残基と反応することができる有機誘導化剤と反応させることによって、分子に導入することができる。別の修飾は、タンパク質の環化である。
【０１１７】
[0115]  本発明はさらに、かかるポリペプチド、又はそのフラグメント、例えば核酸、ベクター、宿主細胞などのレベル又は活性を生成、検出、特徴付け、又は調節することに関する組成物を提供する。かかる組成物は、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーの発現及び／又は活性を調節する化合物として働くことができる。
【０１１８】
[0116]  本発明の１つ又は複数のバイオマーカーに対応する単離ポリペプチド又はそのフラグメント（又はかかるポリペプチドをコードする核酸）を免疫原として使用し、当技術分野で周知の方法により多クローン及び単クローン抗体を調製する標準的技術を使用して、上記免疫原に結合する抗体を生成することができる。抗原ペプチドは少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、個々の完全長分子に存在するエピトープを含み、したがってペプチドに対して生じる抗体が、個々の完全長分子とともに特異的免疫複合体を形成する。抗原ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸残基を含むことが好ましい。一実施形態では、かかるエピトープは、マウス又はヒトなどの１種からの任意のポリペプチド分子に対して特異的とすることができる（すなわち、種間で保存されないポリペプチド分子の領域に広がる抗原ペプチドを免疫原として使用し、かかる非保存的残基は、本明細書で提供するようなアラインメントを使用して判定することができる）。
【０１１９】
[0117]  例えば、ポリペプチド免疫原は通常、免疫原で適切な対象（例えばウサギ、ヤギ、マウス又は他の哺乳類）を免疫処置することによって、抗体の調製に使用される。適切な免疫抗原性製剤は、例えば組み換え技術で発現するか化学的に合成され、免疫応答を生じる分子又はそのフラグメントを含むことができる。製剤はさらに、フロイトの完全又は不完全なアジュバントのようなアジュバント、又は同様の免疫促進剤を含むことができる。免疫原性製剤で適切な対象を免疫処理すると、それに含有される抗原ペプチドに対する多クローン抗体応答を誘発する。
【０１２０】
[0118]  多クローン抗体は、ポリペプチド免疫原で適切な対象を免疫処置することによって、上述のように調製することができる。免疫処置した対象中のポリペプチド抗体タイタは、固定化したポリペプチドを使用する酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの標準的技術で、ある期間にわたってモニタすることができる。所望に応じて、抗原に方向付けられた抗体は、哺乳類から（例えば血液から）単離し、タンパク質Ａクロマトグラフィなどの周知の技術でさらに精製し、ＩｇＧフラクションを取得することができる。免疫処置後の適切な時に、例えば抗体タイタが最高になった時に、抗体産生細胞を対象から取得して、単クローン抗体の調製に使用することができるが、それにはハイブリドーマ技術（元々はKohler及びMilstein (1975)、Nature 256:495-497に記載）（Brown他 (1981)、J. Immunol. 127:539-46；Brown他 (1980)、J. Biol. Chem. 255:4980-83；Yeh他 (1976)、Proc. Natl. Acad. Sci. 76:2927-31；Yeh他 (1982)、Int. J. Cancer 29:269-75も参照）、さらに最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor他 (1983)、Immunol. Today 4:72）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole他 (1985)、Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）又はトリオーマ技術などの標準的技術による。単クローン抗体ハイブリドーマを生成するテクノロジはよく知られている（通常、Kenneth, R. H.のMonoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980)；Lerner, E. A. (1981)、Yale J. Biol. Med. 54:387-402；Gefter, M. L.他 (1977)、Somatic Cell Genet. 3:231-36参照）。簡潔に言うと、不死の細胞系列（通常は骨髄腫）を、上述したように免疫原で免疫処置した哺乳類のリンパ球（通常は脾細胞）と融合させ、その結果のハイブリドーマ細胞の培養上澄みをスクリーニングして、ポリペプチド抗原と好ましくは特異的に結合する単クローン抗体を生成するハイブリドーマを同定する。
【０１２１】
[0119]  本明細書で列挙又は記述したバイオマーカー、又はそのフラグメントなど、本発明の１つ又は複数のバイオマーカーに対する単クローン抗体を生成する目的で、リンパ球と不死化した細胞株を融合させるために使用する多くの周知のプロトコルのいずれかを適用することができる（Galfre, G.他 (1977)、Nature 266:550-52；Gefter他 (1977)、上記；Lerner (1981)、上記；Kenneth (1980)、上記を参照）。さらに、同様に有用であるかかる方法の多くの変形があることが、当業者には認識される。通常、不死細胞株（例えば骨髄腫細胞株）は、リンパ球と同じ哺乳類種から誘導される。例えば、本発明の免疫原性製剤で免疫処置したマウスからのリンパ球を不死化したマウスの細胞株と融合させることによって、マウスハイブリドーマを作成することができる。好ましい不死細胞株は、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有する培養基（「ＨＡＴ媒質」）に対して敏感なマウスの骨髄腫細胞株である。幾つかの骨髄腫細胞株のいずれも、標準的技術による融合の相手として使用することができる。例えばP3-NS1/1-Ag4-1、P3-x63-Ag8.653又はSp2/O-Ag14骨髄腫系統である。これらの骨髄腫系統は、メリーランド州ロックヴィルのAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）で入手可能である。通常、ＨＡＴ感受性マウスの骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用してマウスの脾細胞と融合させる。次に、融合の結果であるハイブリドーマ細胞を、ＨＡＴ媒質を使用して選択し、これによって未融合及び非生産的融合骨髄腫細胞が死滅する（未融合の脾細胞は、形質転換しないので数日後に死滅する）。本発明の単クローン抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、例えば標準的ＥＬＩＳＡアッセイを使用し、所与のポリペプチドと結合する後退のハイブリドーマ培養上澄みをスクリーニングすることによって検出される。
【０１２２】
[0120]  単クローン抗体分泌ハイブリドーマの調製の代替法として、上述したポリペプチドのうち１つに特異的な単クローンは、適切なポリペプチドで組換え組み合わせ免疫グロブリンライブラリ（例えば抗体ファージディスプレイライブラリ）をスクリーニングし、それによってポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリメンバーを単離することによって同定し、単離することができる。ファージディスプレイライブラリを生成し、スクリーニングするキットが販売されている（例えばthe Pharmacia Recombinant Phage Antibody System、カタログ番号27-9400-01；及びthe Stratagene SurfZAPTM Phage Display Kit、カタログ番号240612）。また、抗体ディスプレイライブラリの生成及びスクリーニングに特に使用しやすい方法及び試薬の例が、例えばLadner他の米国特許第５，２２３，４０９号；Kang他の国際特許公開第ＷＯ９２／１８６１９号；Dower他の国際特許公開第ＷＯ９１／１７２７１号；Winter他の国際特許公開第ＷＯ９２／２０７９１号；Markland他の国際特許公開第ＷＯ９２／１５６７９号；Breitling他の国際特許公開第ＷＯ９３／０１２８８号；McCafferty他の国際特許公開第ＷＯ９２／０１０４７号；Garrard他の国際特許公開第ＷＯ９２／０９６９０号；Ladner他の国際特許公開第ＷＯ９０／０２８０９号に見られ、これらの特許及び公開特許出願はすべて参照により本明細書に組み込まれ、さらにFuchs他 (1991)、Biotechnology (NY) 9:1369-1372；Hay他 (1992)、Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85；Huse他 (1989)、Science 246:1275-1281；Griffiths他 (1993)、EMBO J. 12:725-734；Hawkins他 (1992)、J. Mol. Biol. 226:889-896；Clarkson他 (1991)、Nature 352:624-628；Gram他 (1992)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580；Garrard他 (1991)、Biotechnology (NY) 9:1373-1377；Hoogenboom他 (1991)、Nucleic Acids Res. 19:4133-4137；Barbas他 (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982；及びMcCafferty他 (1990)、Nature 348:552-554に見られる。
【０１２３】
[0121]  また、ヒト部分及び非ヒト部分の両方を含み、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができるキメラ及びヒト化単クローン抗体などの組み換えポリペプチド抗体は、本発明の範囲に入る。かかるキメラ及びヒト化単クローン抗体は、当技術分野で知られている組み換えＤＮＡ技術によって、例えばRonbinson他の国際特許公開ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９号（参照により組み込まれる）；Akira他の欧州特許出願第１８４，１８７号；Taniguchi,  M.の欧州特許出願第１７１，４９６号；Morrison他の欧州特許出願第１７３，４９４号；Neuberger他のＰＣＴ特許出願ＷＯ８６／０１５３３号（参照により組み込まれる）；Cabilly他の米国特許第４，８１６，５６７号（参照により組み込まれる）；Cabilly他の欧州特許出願第１２５，０２３号；Better他 (1988)、Science 240:1041-1043；Liu 他 (1987)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443；Liu他 (1987)、J. Immunol. 139:3521-3526；Sun他 (1987)、Proc. Natl. Acad. Sci. 84:214-218；Nishimura他 (1987)、Cancer Res. 47:999-1005；Wood他 (1985)、Nature 314:446-449；Shaw他 (1988)、J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559)；Morrison, S. L. (1985)、Science 229:1202-1207；Oi他 (1986)、Biotechniques 4:214；Winterの米国特許第５，２２５，５３９号；Jones他 (1986)、Nature 321:552-525；Verhoeyan他 (1988)、Science 239:1534；及びBeidler他 (1988)、J. Immunol. 141:4053-4060に記載された方法を使用して生成することができる。
【０１２４】
[0122]  また、ヒト化抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号（参照により組み込まれる）に開示されているような標準的プロトコルにより作成することができる。別の実施形態では、抗体鎖又は特異的結合対メンバーは、例えばすべてが参照により組み込まれる米国特許第５，５６５，３３２号、第５，８７１，９０７号、又は第５，７３３，７４３号に記載されているように、当技術分野で知られている技術を使用して、特異的結合対メンバーのポリペプチド鎖と複製可能な遺伝子ディスプレイパッケージの構成要素との融合をコードする核酸分子を含むベクターと、単結合対メンバーの第２のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含有するベクターとの間の組み換えによって生成することができる。細胞内抗体を使用して細胞内のタンパク質機能を阻害することも、当技術分野で知られている（例えばCarlson, J. R. (1988)、Mol. Cell. Biol. 8:2638-2646；Biocca, S.他 (1990)、EMBO J. 9:101-108；Werge, T. M.他 (1990)、FEBS Lett. 274:193-198；Carlson, J. R. (1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7427-7428；Marasco, W. A.他 (1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7889-7893；Biocca, S.他 (1994)、Biotechnology (NY) 12:396-399；Chen, S-Y.他 (1994)、Hum. Gene Ther. 5:595-601；Duan, L他 (1994)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5075-5079；Chen, S-Y.他 (1994)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5932-5936；Beerli, R. R.他 (1994)、J. Biol. Chem. 269:23931-23936；Beerli, R. R.他 (1994)、Biochem. Biophys. Res. Commun. 204:666-672；Mhashilkar, A. M.他 (1995)、EMBO J. 14:1542-1551；Richardson, J. H.他 (1995)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:3137-3141；Marasco他のＰＣＴ特許公開第ＷＯ９４／０２６１０号（参照により組み込まれる）；及びDuan他のＰＣＴ特許公開第ＷＯ９５／０３８３２号（参照により組み込まれる）を参照されたい）。
【０１２５】
[0123]  また、本明細書で列挙又は記述したバイオマーカー、又はそのフラグメントを含め本発明のバイオマーカーに対して、完全にヒトの抗体を作成することができた。完全にヒトの抗体は、例えばHogan他の"Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manuel,"（Cold Spring Harbor Laboratory）に従い、ヒト免疫グロブリン遺伝子の遺伝子を導入したマウスで作成することができる。簡潔に言うと、遺伝子導入マウスを精製した免疫原で免疫処置する。脾臓細胞を回収し、骨髄腫細胞に融合して、ハイブリドーマを生成する。ハイブリドーマは、免疫原に結合する抗体を生成する能力に基づいて選択される。完全にヒトの抗体は、ヒトのかかる抗体の免疫原性を低下させる。
【０１２６】
[0124]  一実施形態では、本発明に使用する抗体は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、単一の抗体ポリペプチド内に２つの異なる抗原に対する結合部位を有する。抗原結合は同時又は逐次的である。トリオーマ及びハイブリッドハイブリドーマは、二重特異性抗体を分泌することができる細胞株の２つの例である。ハイブリッドハイブリドーマ又はトリオーマによって生成される二重特異性抗体の例が、米国特許第４，４７４，８９３号（参照により組み込まれる）に開示されている。二重特異性抗体は、化学的手段（Staerz他 (1985)、Nature 314:628,；及びPerez他 (1985)、Nature 316:354）、及びハイブリドーマテクノロジ（Staerz及びBevan (1986)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:1453；及びStaerz及びBevan (1986)、Immunol. Today 7:241）で構築されてきた。二重特異性抗体は米国特許第５，９５９，０８４号（参照により組み込まれる）にも記載されている。二重特異的抗体のフラグメントが、米国特許第５，７９８，２２９号（参照により組み込まれる）に記載されている。
【０１２７】
[0125]  二重特異性薬剤は、ハイブリドーマ又は様々な抗体を作成する他の細胞を融合させ、その後に両方の抗体を生成して共集合させるクローンを同定することによって、ヘテロハイブリドーマを作成することにより生成することもできる。これは、完全な免疫グロブリン鎖又はその一部、例えばＦａｂ及びＦｖ配列の化学的又は遺伝学的接合によって生成することもできる。抗体構成要素を、本発明の１つ又は複数のバイオマーカーのポリペプチド又はそのフラグメント、例えば本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントに結合することができる。一実施形態では、二重特異性抗体は、ポリペプチド又はそのフラグメント、及びその自然の結合相手又はそのフラグメントの両方に特異的に結合することができた。
【０１２８】
[0126]  本発明の別の態様では、ペプチド又はペプチドミメティクスを使用して、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの活性を拮抗又は促進することができる。一実施形態では、本明細書で列挙又は記述し、個々の完全長タンパク質の調節剤として機能する１つ又は複数のバイオマーカーの変異型は、拮抗体の活性について切断変異型などの変異体の組み合わせライブラリをスクリーニングすることによって同定することができる。一実施形態では、変異型の種々のライブラリが核酸レベルにおける組み合わせ突然変異誘発によって生成され、種々の遺伝子ライブラリによってコードされる。変異体の種々のライブラリは、潜在的ポリペプチド配列の縮重セットがポリペプチド配列のセットを自身内に含む個々のポリペプチドとして発現可能であるように、例えば合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素連結することによって生成することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列からポリペプチド変異型のライブラリを生成するために使用することができる様々な方法がある。縮重遺伝子配列の化学的合成は自動ＤＮＡ合成装置で実行し、次に合成遺伝子を適切な発言ベクターに連結することができる。遺伝子の縮重セットを使用することにより、１つの混合物中で、潜在的ポリペプチド配列の所望のセットをコードする配列をすべて提供することができる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法が当技術分野で知られている（例えばNarang, S. A. (1983)、Tetrahedron 39:3；Itakura他 (1984)、Annu. Rev. Biochem. 53:323；Itakura他 (1984)、Science 198:1056；Ike他 (1983)、Nucleic Acid Res. 11:477を参照）。
【０１２９】
[0127]  また、ポリペプチドコード配列のフラグメントのライブラリを使用して、所与のポリペプチドの変異型をスクリーニングし、その後に選択するために、ポリペプチドフラグメントの種々の集団を生成することができる。一実施形態では、コード配列フラグメントのライブラリは、ポリペプチド１個当たり約１回のみニッキングが生じる状態で、ポリペプチドコード配列の２本鎖ＰＣＲフラグメントのライブラリを処理し、２本鎖ＤＮＡを変性させ、様々なニッキング産物からセンス／アンチセンス対を含むことができる２本鎖ＤＮＡを形成するようにＤＮＡ中で核酸分子を復元し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理することによって再編成した２本鎖から１本鎖部分を除去し、その結果のフラグメントライブラリを発現ベクター内に連結することによって生成することができる。この方法により、様々なサイズのポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端及び内部フラグメントをコードする発現ライブラリを誘導することができる。
【０１３０】
[0128]  点変異又は切断によって作成した組み合わせライブラリの遺伝子産物をスクリーニングし、選択した特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリをスクリーニングするために、当技術分野で幾つかの技術が知られている。かかる技術は、ポリペプチドの組み合わせ突然変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリの迅速なスクリーニングに適応可能である。大型遺伝子ライブラリをスクリーニングするために高スループット解析に適用可能で最も広く使用されている技術は通常、遺伝子ライブラリを複製可能な発現ベクターにクローン化し、その結果のベクターのライブラリで適切な細胞を形質転換して、所望の活性の検出により、検出した産物を有する遺伝子をコードするベクターの単離が促進される状態で、組み合わせ遺伝子を発現することを含む。ライブラリの機能的変異体の頻度を向上させる技術である再帰的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）を、スクリーニングアッセイと組み合わせて使用し、当該変異型を同定することができる（Arkin及びYouvan (1992)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811-7815；Delagrave他 (1993)、Protein Eng. 6(3):327-331）。一実施形態では、細胞ベースのアッセイを開発して、種々のポリペプチドライブラリを解析することができる。例えば、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーを含む本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントを通常合成する細胞株に、発現ベクターのライブラリをトランスフェクトすることができる。次に、完全長ポリペプチド及び特定の変異体ポリペプチドを生成し、例えば幾つかの機能的アッセイのいずれかによって、細胞上澄みの完全長ポリペプチド活性に対する変異体の発現の影響を検出できるように、トランスフェクトしたこの細胞を培養する。完全長ポリペプチドの活性の阻害、又は代替的に増強をスコア化する細胞から、プラスミドＤＮＡを回収し、個々のクローンをさらに特徴付けることができる。
【０１３１】
[0129]  同じタイプのＤアミノ酸を有するポリペプチドアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸の体系的置換（例えばＬ−リシンの代わりにＤ−リシン）を使用して、さらに暗転したペプチドを生成することができる。また、当該ポリペプチドアミノ酸配列又は実質的に同一の配列変異を含む制限されたペプチドは、当技術分野で知られている方法によって生成することができ（参照により組み込まれるRizo及びGierasch (1992)、Annu. Rev. Biochem. 61:387）、例えばペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を追加する方法である。
【０１３２】
[0130]  本明細書で開示するアミノ酸配列によって、当業者はポリペプチド対応のペプチド配列及びその配列変異型を生成することができる。かかるポリペプチドは、ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの発現によって、原核生物又は真核生物の宿主細胞内に、かかるポリペプチドを生成することができ、これはこれより大きいポリペプチドの一部として生成することが多い。あるいは、かかるペプチドを化学的方法で合成することができる。組換え宿主内に非相同タンパク質を発現する方法、ポリペプチドの化学的合成、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳が当技術分野で周知であり、Maniatis他のMolecular Cloning: A Laboratory Manual (1989)（第２版、Cold Spring Harbor, N.Y.）；Berger及びKimmelのMethods in Enzymology第１５２巻、Guide to Molecular Cloning Techniques (1987)（Academic Press, Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ；Merrifield, J. (1969)、J. Am. Chem. Soc. 91:501；Chaiken I. M. (1981)、CRC Crit. Rev. Biochem. 11: 255；Kaiser他 (1989)、Science 243:187；Merrifield, B. (1986)、Science 232:342；Kent, S. B. H. (1988)、Annu. Rev. Biochem. 57:957；及びOfford, R. E. (1980)、Semisynthetic Proteins（Wiley Publishing）でさらに記載され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
[0131]  ペプチドは通常、直接的化学合成によって生成することができる。ペプチドは、Ｎ末端及び／又はＣ末端に共有結合することによって結合した非ペプチド部分を有する修飾ペプチドとして生成することができる。特定の好ましい実施形態では、カルボキシ末端又はアミノ末端、又はその両方が化学的に修飾される。末端アミノ基及びカルボキシ基の最も一般的な修飾は、それぞれアセチル化及びアミド化である。アシル化（例えばアセチル化）又はアルキル化（例えばメチル化）などのアミノ末端修飾、及びアミド化などのカルボキシ末端修飾、さらに環化などの他の末端修飾を、本発明の様々な実施形態に組み込むことができる。特定のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端の修飾及び／又はコア配列へのペプチド拡張は、安定性の向上、効力及び／又は有効性の上昇、血清プロテアーゼに対する耐性、所望の薬物動態学的特性などの有利な物理的、化学的、生化学的、及び薬学的特性を提供することができる。本明細書で開示するペプチドは、治療で使用して、例えば患者の同時刺激を変更することによって疾患を治療することができる。
【０１３４】
[0132]  ペプチドミメティクス（参照により組み込まれるFauchere, J. (1986)、Adv. Drug Res. 15:29；Veber及びFreidinger (1985)、TINS p.392；及びEvans他 (1987)、J. Med. Chem. 30:1229）は通常、コンピュータ化した分子モデリングの補助により開発される。治療に有用なペプチドに構造的に類似しているペプチドミメティクスを使用して、同等の治療又は予防効果を生成することができる。通常、ペプチドミメティクスは規範ポリペプチド（すなわち、生物学的又は薬学的活性を有するポリペプチド）に構造的に類似しているが、当技術分野で知られ、以下の参考文献でさらに記述されている方法によって、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シス及びトリス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、及び−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される結合によって任意選択で置換される１つ又は複数のペプチド結合を有する。すなわち、Spatola, A. F.の"Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins"、Weinstein, B.編集（Marcel Dekker, New York, p. 267 (1983)）；Spatola, A. F.、Vega Data (March 1983)、第１巻３号の"Peptide Backbone Modifications"（総評）；Morley, J. S. (1980)、Trends Pharm. Sci. pp. 463-468（総評）；Hudson, D.他 (1979)、Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177-185（−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２ＣＨ２−）；Spatola, A. F.他 (1986)、Life Sci. 38:1243-1249 (-CH2-S)；Hann, M. M. (1982)、J. Chem. Soc. Perkin Trans. I. 307-314（−ＣＨ−ＣＨ−、シス及びトランス）；Almquist, R. G.他 (190)、J. Med. Chem. 23:1392-1398（−ＣＯＣＨ２−）；Jennings-White, C.他 (1982)、Tetrahedron Lett. 23:2533（−ＣＯＣＨ２−）；Szelke, M.他のEuropean Appln. EP 45665 (1982) CA: 97:39405 (1982)（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；Holladay, M. W.他 (1983)、Tetrahedron Lett. (1983) 24:4401-4404（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；及びHruby, V. J. (1982)、Life Sci. (1982) 31:189-199（−ＣＨ２−Ｓ−）であり、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。特に好ましい非ペプチド結合は−ＣＨ２ＮＨ−である。かかるペプチドミメティクスは、例えば経済的生産の増加、化学的安定性の増大、薬学的特性（半減期、吸収、効力、有効性など）の向上、特異性（例えば広範囲の生物学的活性）の変更、抗原性の低下などのように、ポリペプチド実施形態に対して有意の利点を有することがある。ペプチドミメティクスの標識付けは通常、１つ又は複数の標識を直接、又はスペーサ（例えばアミノ基）を通してペプチドミメティクス上の定量的構造−活性データ及び／又は分子モデリングによって予測される非干渉位置に共有結合することを含む。かかる非干渉位置は通常、ペプチドミメティクスが治療効果を生じるために結合する相手となるマクロポリペプチドと直接接触部を形成しない位置である。ペプチドミメティクスの誘導体化（例えば標識付け）は、ペプチドミメティクスの所望の生物学的又は薬学的活性と実質的に干渉してはならない。
【０１３５】
[0133]  本発明は、本明細書で列挙又は記述したバイオマーカーなどの本発明のバイオマーカー、又はそのフラグメントのキメラ又は融合タンパク質にも関する。本明細書で使用する「キメラタンパク質」又は「融合タンパク質」は、個々のバイオマーカーと実質的に相同ではないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有する別のポリペプチドと作用可能な状態で結合する、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントを含む。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの少なくとも１つの生物学的活性部分を含む。融合タンパク質中で、「作用可能な状態で結合する」という用語は、融合とは関係なく発現した場合に提示される機能を保存するような方法で、バイオマーカー配列及び非バイオマーカー配列が相互にインフレームで融合することを示すものとする。「別の」配列をそれぞれバイオマーカー配列のＮ末端又はＣ末端に融合することができる。
【０１３６】
[0134]  かかる融合タンパク質は、第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列及び第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列の組み換え発現によって生成することができる。第２のペプチドは、第１のペプチドの可溶性、親和性、安定性又は原子価を変更する部分、例えば免疫グロブリン定常領域に、任意選択で対応することができる。別の実施形態では、第１のペプチドは、生物学的活性分子のある部分（例えばポリペプチドの細胞外部分又は配位子結合部分）で構成される。
【０１３７】
[0135]  本発明の融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって生成することが好ましい。
【０１３８】
[0136]  本明細書では、少なくとも１、２、３、４、５、１０、２０又はそれ以上の小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を含む、又はそれを発現することができる１つ又は複数の核酸を含む組成物も提供され、細胞内の上記小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体は、細胞状況で細胞核酸（例えば低分子非コードＲＮＡＳ、例えばｍｉＲＮＡｓ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡｓ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ結合部位、変異型及び／又はその機能的変異型、細胞ｍＲＮＡｓ又はそのフラグメント）と特異的にハイブリダイゼーション（例えば結合）する。一実施形態では、細胞中の小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体の発現は、天然に発生する野生型、又は合成の対応する小核酸に関連する１つ又は複数の生物学的活性を向上又は上方制御することができる。別の実施形態では、細胞中の小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体の発現は、例えば本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの転写、翻訳及び／又は小核酸処理を阻害することなどによって、細胞核酸及び／又はタンパク質の発現又は生物学的活性を阻害することができる。一実施形態では、小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体は、低分子ＲＮＡ（例えばｍｉｃｒｏＲＮＡ）又は低分子ＲＮＡの相補体である。別の実施形態では、小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体は、１本鎖又は２本鎖とすることができ、少なくともヌクレオチド６個分の長さであり、ヌクレオチド約１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、又は１０個未満の長さである。別の実施形態では、組成物は、小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を含む、又はそれを発現することができる核酸のライブラリ、又は上記小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体のプールを含むことができる。核酸のプールは、小核酸又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその誘導体を含む、又はそれを発現することができる約２〜５、５〜１０、１０〜２０、１０〜３０個又はそれ以上の核酸を含むことができる。
【０１３９】
[0137]  一実施形態では、小核酸及び／又はアンチセンスオリゴヌクレオチドは１本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む、又はそれから生成することができ、ここで細胞核酸（例えばｍＲＮＡ）に対して完全に相補的な配列が分解を媒介するか、細胞核酸（例えばｍＲＮＡ）に対して不完全に相補的な配列が、細胞内で発現時に翻訳抑制を媒介する。別の実施形態では、２本鎖ｓｉＲＮＡを処理して、１本鎖細胞ＲＮＡ転写の逆転写（例えばｍｉｃｒｏＲＮＡ）と結合してその発現を阻害する２本鎖アンチセンスＲＮＡにすることができる。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、動物及び植物中で配列特異的で転写後の遺伝子沈静化のプロセスであり、沈静化した遺伝子に配列が相同である２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始する。長いｄｓＲＮＡをリボヌクレアーゼＩＩＩによってｉｎ  ｖｉｖｏで切断し、ヌクレオチド２１個及び２２個のｓｉＲＮＡを生成する。ヌクレオチド２１個のｓｉＲＮＡ二重鎖は、ヒトの胎児腎臓（２９３）及びヒーラ細胞などの様々な哺乳類の細胞株で、内在性及び非相同性遺伝子の発現を特異的に抑制する（Elbashir他 (2001)、Nature 411:494-498）。したがって、細胞中の遺伝子の翻訳は、ヌクレオチド約１５〜３０個、又はヌクレオチド約１８〜２１個、又はヌクレオチド約１９〜２１個の長さを有する短い１本鎖ＲＮＡと細胞を接触させることによって阻害することができる。あるいは、かかるｓｉＲＮＡ又は代謝してｓｉＲＮＡになる短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするベクターを、標的細胞に導入することができる（例えばMcManus他 (2002)、RNA 8:842；Xia他 (2002)、Nature Biotechnology 20:1006；及びBrummelkamp他 (2002)、Science 296:550を参照）。使用可能なベクターが、例えばOligoEngineからpSuper RNAi System（商標）の名称で販売されている。
【０１４０】
[0138]  細胞ｍＲＮＡ転写物を触媒で切断するようにデザインされたリボザイム分子も、細胞ｍＲＮＡの翻訳及び細胞ポリペプチドの発現、又はその両方を防止するために使用することができる（例えば１９９０年１０月４日公開のＰＣＴ国際特許公開ＷＯ９０／１１３６４号（参照により組み込まれる；Sarver他 (1990)、Science 247:1222-1225、及び米国特許第５，０９３，２４６号（参照により組み込まれる）を参照）。部位特異的認識配列でｍＲＮＡを切断するリボザイムを使用して細胞ｍＲＮＡを破壊することができるが、ハンマーヘッドリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡと相補的塩基対を形成する隣接領域によって規定された位置で、ｍＲＮＡを切断する。唯一の要件は、標的ｍＲＮＡが以下の２塩基の配列を有することである。すなわち、５’−ＵＧ−３’である。ハンマーヘッドリボザイムの構造及び生成は当技術分野で周知であり、Haseloff及びGerlach (1988)、Nature 334:585-591でさらに詳細に記述されている。リボザイムは、切断認識部位が細胞ｍＲＮＡの５’末端付近に位置するように、すなわち非機能的ｍＲＮＡ転写の効率を向上させ、細胞内蓄積を最小化するように改良することができる。
【０１４１】
[0139]  本明細書で提示する方法及び組成物のリボザイムは、テトラヒメナ好温生物中に自然に発生し（ＩＶＳ、又はＬ−１９ＩＶＳ  ＲＮＡ）として知られる、Thomas Cech他によって詳細に記述されているようなＲＮＡエンドリボヌクレアーゼ（以降「チェック (Cech)型リボザイム」）も含む（Zaug他 (1984)、Science 224:574-578；Zaug他 (1986)、Science 231:470-475；Zaug他 (1986)、Nature 324:429-433；University Patents Inc.によって公開された国際特許公開ＷＯ８８／０４３００号（参照により組み込まれる）；Been他 (1986)、Cell 47:207-216）。チェック型リボザイムは、標的ＲＮＡ配列とハイブリダイゼーションし、その後に標的ＲＮＡの切断が生じる８塩基対の活性部位を有する。本明細書で提示する方法及び組成物は、細胞遺伝子内に存在する８塩基対の活性部位配列を標的とするこれらのチェック型リボザイムを含む。
【０１４２】
[0140]  アンチセンスのアプローチとして、リボザイムは（例えば安定性の改善、標的指向などのために）修飾したオリゴヌクレオチドで構成することができる。好ましい送達方法は、形質トランスフェクトされた細胞が、内因性細胞メッセージを破壊して翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを生成するように、強力な構成ｐｏｌＩＩＩ又はｐｏｌＩＩプロモータの制御下でリボザイムを「コード」するＤＮＡ構成を使用することを含む。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり触媒性であるので、効率のために細胞内濃度を低下させる必要がある。
【０１４３】
[0141]  細胞遺伝子の転写を阻害するために三重らせん体形成に使用される核酸分子は、１本差で、デオキシリボヌクレオチドで構成することが好ましい。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成物は、フーグスティーン型塩基対の規則を介して三重らせん体形成を促進するものであり、それには通常、二重鎖の１本鎖上に存在すべきプリン又はピリミジンの相当の伸長が必要である。ヌクレオチド配列はピリミジン塩基を有することができ、その結果となる三重らせん体の関連する３本の鎖にわたってＴＡＴ及びＣＧＣ三重鎖がもたらされる。ピリミジンが豊富な分子は、二重鎖のうち１本の鎖のプリンが豊富な領域に対して、その鎖に平行な方向で塩基相補性を提供する。また、プリンが豊富である、例えばＧ残基の伸長部を含む核酸分子を選択することができる。これらの分子は、ＧＣ対中に豊富なＤＮＡ中で核酸分子二重鎖で三重らせん体を形成し、ここでプリン残基の大部分は標的の二重鎖のうち１本の鎖に位置し、その結果、三重鎖の３本の鎖にわたるＣＧＣトリプレットとなる。
【０１４４】
[0142]  あるいは、三重らせん体形成のために標的とすることができる潜在的配列は、いわゆる「スイッチバック」核酸分子を生成することによって増加させることができる。スイッチバック分子は、交互になる５’−３’、３’−５’の方法で合成され、したがって、これは二重鎖の一方の第１の鎖と、次に他方と塩基対を形成し、それによって二重鎖の一方の鎖上に存在すべきプリン又はピリミジンを相当伸長させる必要がなくなる。
【０１４５】
[0143]  本明細書で提示する方法及び組成物の小核酸（例えばｍｉＲＮＡｓ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡｓ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡｓ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はその変異型）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、及び三重らせん分子は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子を合成するために当技術分野で知られている任意の方法で調製することができる。それには、例えば固相ホスホラミダイト化学合成などの当技術分野で周知のオリゴデオキシリボヌクレオチド及びオリゴリボヌクレオチドを化学的に合成する技術が含まれる。あるいは、ＲＮＡ分子は、アンチセンスＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ転写によって生成することができる。かかるＤＮＡ配列は、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモータなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを組み込んだ多種多様なベクターに組み込むことができる。あるいは、使用するプロモータに応じて構成的又は誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構成を、細胞株に安定して導入することができる。
【０１４６】
[0144]  さらに、細胞内の安定性及び半減期を増加させる手段として、核酸分子に対する様々な周知の修飾を導入することができる。可能な修飾には、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの隣接配列を分子の５’及び／又は３’末端に付加すること、又はオリゴデオキシリボヌクレオチドバックボーン内でホスホジエステラーゼ連結ではなくホスホロチオエート又は２’Ｏ−メチルを使用することを含むが、これらに限定されない。ポリペプチド、小核酸、及びアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えばタンパク質検出の手段として働くような別のペプチド又はポリペプチド（例えば非相同ペプチド）とさらに連結できることが、当業者には容易に理解される。本発明で検出に有用な標識ペプチド又はポリペプチド部分の非限定的な例には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、βガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼなどの適切な酵素と、ＦＬＡＧ、ＭＹＣ、ＨＡ、又はＨＩＳタグなどのエピトープタグと、緑色蛍光タンパク質などの蛍光体と、色素と、放射性同位体と、ジゴキシゲニンと、ビオチンと、抗体と、ポリマーと、さらに当技術分野で、例えばPrinciples of Fluorescence Spectroscopy、Joseph R. Lakowicz（編集）（Plenum Pub Corp、第２版（１９９９年７月））で知られているその他が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
[0145]  本明細書で述β調節剤（例えば抗体、小分子、ペプチド、融合タンパク質、又は小核酸）は、薬学的組成物に組み込み、ｉｎ  ｖｉｖｏで対象に投与することができる。この組成物は、単一のかかる分子又は薬剤、又は本明細書で述β薬剤の任意の組み合わせを含むことができる。本明細書で述β遺伝子経路解析に基づき、かかる薬剤の組み合わせは、癌の診断、予後、予防及び治療に特に効果的である。したがって、本明細書で述β「単一活性薬剤」は、本明細書で提供した方法及び組成物に従い、当技術分野で知られている他の薬学的活性化合物（「第２の活性薬剤」）と組み合わせることができる。特定の組み合わせは、特定のタイプの癌の治療に相乗的に作用すると考えられる。第２の活性薬剤は、大分子（例えばタンパク質）又は小分子（例えば合成無機、有機金属、又は有機分子）でよい。
【０１４８】
[0146]  大分子活性薬剤の例には、増結成長因子、サイトカイン、及び単クローン及び多クローン抗体が含まれるが、これらに限定されない。典型的な大分子活性薬剤は、自然に発生するか人工的に作製したタンパク質などの生物分子である。本発明に特に有用であるタンパク質には、造血前駆細胞及び免疫学的活性生成細胞の生存及び／又は増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで刺激するタンパク質が含まれる。細胞中の委任赤血球前駆細胞の分割及び分化をｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏで刺激するタンパク質もある。特定のタンパク質には、ＩＬ−２（組換えＩＬ−ＩＩ（「ｒＩＬ２」）及びカナリア痘瘡ＩＬ−２）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、及びＩＬ−１８などのインターロイキンと、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、インターフェロンアルファ−ｎ１、インターフェロンアルファ−ｎ３、インターフェロンβＩａ、及びインターフェロンγＩｂなどのインターフェロンと、ＧＭ−ＣＦ及びＧＭ−ＣＳＦと、ＥＰＯとが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
[0147]  本明細書で提供される方法及び組成物に使用できる特定のタンパク質には、Neupogen（登録商標）（Amgen、カリフォルニア州サウザンドオークス）という商品名で米国で販売されているフィルグラスチム、Leukine（登録商標）（Immunex、ワシントン州シアトル）という商品名で米国で販売されているサルグラモスチム、及びEpogen（登録商標）（Amgen、カリフォルニア州サウザンドオークス）という商品名で米国で販売されている組換えＥＰＯが含まれるが、これらに限定されない。ＧＭ−ＣＳＦの組換え及び変異型形態は、米国特許第５，３９１，４８５号、第５，３９３，８７０号、及び第５，２２９，４９６号に記載されているように調製することができ、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。Ｇ−ＣＳＦの組換え及び変異型形態は、米国特許第４，８１０，６４３号、第４，９９９，２９１号、第５，５２８，８２３号、及び第５，５８０，７５５号に記載されているように調製することができ、これらはすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５０】
[0148]  組み合わせた形態で使用することができる抗体には、単クローン及び多クローン抗体が含まれる。抗体の例にはトラツズマブ（Herceptin（登録商標））、リツキシマブ（Rituxan（登録商標））、ベバシズマブ（Avastin（登録商標））、パーツズマブ（Omnitarg（登録商標））、トシツモマブ（Bexxar（登録商標））、エドレコロマブ（Panorex（登録商標））、及びＧ２５０が含まれるが、これらに限定されない。本発明の化合物は、抗ＴＮＦアルファ抗体と組み合わせる、又はこれと組み合わせて使用することもできる。大分子活性薬剤は、抗癌ワクチンの形態で投与することができる。例えば、ＩＬ−２、Ｇ−ＣＳＦ、及びＧＭ−ＣＳＦなどのサイトカインを分泌する、又はその分泌を引き起こすワクチンを、本明細書で提供した方法、薬学的組成物、及びキットで使用することができる。例えばEmens, L. A.他のCurr. Opinion Mol. Ther. 3(1):77-84 (2001)を参照されたい。
【０１５１】
[0149]  小分子である第２の活性薬剤も、本明細書で提供するような組み合わせで使用することができる。小分子の第２の活性薬剤の例には抗癌剤、抗生物質、免疫抑制剤、及びステロイドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１５２】
[0150]  幾つかの実施形態では、周知の「併用化学療法」の療法を使用することができる。一実施形態では、併用化学療法は、シクロホスファミド、ヒドロキシダウノルビシン（ドキソルビシン又はアドリアマイシンとしても知られる）、オンコボリン（ビンクリスチン）、及びプレドニソンのうち２つ以上の組み合わせを含む。別の実施形態では、併用化学療法は、シクロホスファミド、オンコボリン、プレドニソン、及びアントラサイクリン、ヒドロキシダウノルビシン、エピルビシン、及びモチキサントロンからなる群から選択される１つ又は複数の化学療法剤の組み合わせを含む。
【０１５３】
[0151]ＩＩＩ．薬剤及び組成物を選択する方法
本発明の別の態様は、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカー及び／又は癌（例えば白血病などのリンパ系癌）に結合、それを上方制御、下方制御、又は調節する薬剤（例えば抗体、融合タンパク質、ペプチド、小分子、又は小核酸）を選択する方法に関する。かかる方法は、細胞系及び非細胞系アッセイなどのスクリーニングアッセイを使用することができる。
【０１５４】
[0152]  一実施形態では、本発明は、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントに結合する、又はその発現又は活性レベルを調節する候補又は試験化合物をスクリーニングするアッセイに関する。かかる化合物には抗体、タンパク質、融合タンパク質、核酸分子、及び小分子が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５５】
[0153]  一実施形態では、アッセイは、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントを発現する細胞を、試験化合物に接触させることと、直接結合によって、又は癌のパラメータを測定することによって測定されるようなバイオマーカーとその自然の結合相手との相互作用のレベルを調節する（例えば刺激又は阻害する）試験化合物の能力を判定することと、を含む細胞系アッセイである。
【０１５６】
[0154]  例えば、直接結合アッセイでは、バイオマーカーのポリペプチド又はそのフラグメントとその自然の結合相手又はそのフラグメントとの結合を、複合体中の標識した分子を検出することによって判定できるように、バイオマーカーのポリペプチド、バイオマーカーの結合相手のポリペプチド、又はそのフラグメントを、放射性同位体又は酵素の標識と結合することができる。例えば、バイオマーカーのポリペプチド、バイオマーカーの結合相手のポリペプチド、又はそのフラグメントを、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３Ｈで直接又は間接的に標識し、放射性同位体を、電波放射の直接計数によって、又はシンチレーション計数によって検出することができる。あるいは、当該のポリペプチドは、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、又はルシフェラーゼで酵素標識し、酵素標識は、産物への適切な基質の変換を判定することによって検出することができる。
【０１５７】
[0155]  化合物が、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントと、その自然の結合相手又はそのフラグメントとの相互作用を、反応体のいずれも標識せずに（例えばMcConnell, H. M.他 (1992)、Science 257:1906-1912に記述されたような微小生理機能測定装置を使用して）調節する化合物の能力を判定することも本発明の範囲に入る。本明細書で使用する「微小生理機能測定装置」（例えばCytosensor）は、光学指定ポテンショメータセンサ（ＬＡＰＳ）を使用して細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析計器である。この酸性化速度の変化を、化合物とレセプタとの相互作用の指標として使用することができる。
【０１５８】
[0156]  好ましい実施形態では、ポリペプチドの所与のセット間の相互作用を拮抗する遮断剤（例えば抗体、融合タンパク質、ペプチド、核酸分子、又は小分子）の能力の判定は、相互作用する分子のセットの１つ又は複数のメンバーの活性を判定することによって遂行することができる。例えば、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの活性は、サイトカイン又はケモカイン応答の誘導を検出する、適切な基質の触媒／酵素活性を検出する、レポータ遺伝子（例えばクロラムフェニコールアセチル転移酵素などの、検出可能なマーカーをコードする核酸と作用可能な状態で結合する標的応答性調節性元素を含む）の誘導を検出する、又はバイオマーカー又はそのフラグメントによって調整された細胞応答（例えば調節された増殖、アポトーシス、細胞周期及び／又はＥ２Ｆ転写因子結合活性など、本明細書で同定された生物学的経路の調節）を検出することによって判定することができる。上記ポリペプチドと結合又は相互作用する遮断剤の能力の判定は、薬剤が免疫応答を調節する能力を測定することによって、例えばサイトカイン分泌のタイプ及び量の変化、アポトーシス又は増殖の変化、細胞の同一性に関連する遺伝子発現又は活性の変化を検出することによって、又は上記ポリペプチドがその一部を認識する抗体に結合する能力に干渉することによって遂行することができる。
【０１５９】
[0157]  さらに別の実施形態では、本発明のアッセイは、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメント、例えばその生物学的活性フラグメントを、試験化合物と接触させ、試験化合物がポリペプチド又はその生物学的活性部分に結合する能力を判定する無細胞アッセイである。試験化合物とバイオマーカー又はそのフラグメントとの結合は、直接に又は上述したように間接的に判定することができる。バイオマーカー又はそのフラグメントがその自然の結合相手又はそのフラグメントと結合する能力の判定は、リアルタイム生体分子相互作用解析（ＢＩＡ）などのテクノロジを使用して達成することもできる（Sjolander, S.及びUrbaniczky, C. (1991)、Anal. Chem. 63:2338-2345、及びSzabo他 (1995)、Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705）。本明細書で使用する「ＢＩＡ」は、反応物（例えばＢＩＡコア）のいずれも標識せずに、リアルタイムで生物特異的相互作用を研究するテクノロジである。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象の変化も、生物学的ポリペプチド間のリアルタイム反応の指標として使用することができる。１つ又は複数のバイオマーカーポリペプチド又はそのフラグメントをＢＩＡコアチップ上に固定化することができ、固定化したバイオマーカーポリペプチド又はそのフラグメントとの結合について、例えば遮断抗体、融合タンパク質、ペプチド、又は小分子などの複数の薬剤を試験することができる。ＢＩＡコアチップ上に固定化テクノロジの使用の例が、Fitz他 (1997)、Oncogene 15:613に記載されている。
【０１６０】
[0158]  本発明の無細胞アッセイは、可溶性及び／又は膜結合形態の両方のタンパク質の使用に適している。膜結合形態のタンパク質を使用する無細胞アッセイの場合、膜結合形態のタンパク質が溶液中で維持されるように、可溶化剤を使用することが望ましいことがある。かかる可溶化剤の例にはｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、Triton（登録商標）X-100、Triton（登録商標）X-114、Thesit（登録商標）、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−クロロアミドプロピル）ジメチルアミニオ］−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−クロロアミドプロピル）ジメチルアミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸（ＣＨＡＰＳＯ）、又はＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホン酸などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１６１】
[0159]  上述したアッセイ方法の１つ又は複数の実施形態では、バイオマーカーポリペプチド、バイオマーカーの自然の結合相手のポリペプチド、又はそのフラグメントを固定化し、タンパク質の一方又は両方の非複合形から複合形を分離することを促進し、さらにアッセイ自動化に対応することが望ましいことがある。アッセイにおける試験化合物の結合は、反応物を収容するのに適切な任意の容器内で遂行することができる。かかる容器の例には微量定量プレート、試験管、及び小型遠心管が含まれる。一実施形態では、タンパク質の一方又は両方を基質に結合可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−Ｓ−転移酵素系融合タンパク質を、グルタチオンSepharose（登録商標）ビーズ（Sigma Chemical、モンタナ州セントルイス）又はグルタチオン誘導化微量定量プレートに吸着させ、次にこれを試験化合物と組み合わせ、混合物を複合物形成の助けとなる状態（例えば塩及びｐＨの生理的状態）でインキュベートすることができる。インキュベーションの後、ビーズ又は微量定量プレートのウェルを洗浄して、未結合の成分があればすべて除去し、ビーズの場合は基質を固定化して、例えば上述したように複合体を直接又は間接的に判定する。あるいは、複合体を基質から分離し、標準的技術を使用して結合又は活性のレベルを判定することができる。
【０１６２】
[0160]  代替実施形態では、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメント、又はその自然の結合相手の活性を調節する試験化合物の能力の判定は、試験化合物が相互作用の下流で機能する遺伝子、例えば核酸、又は遺伝子産物、例えばポリペプチドを調節する能力を判定することによって遂行することができる。例えば、炎症（例えばサイトカイン及びケモカイン）応答を判定することができる、適切な標的に対する相互作用物質ポリペプチドの活性を判定することができる、又は前述したように、適切な標的に対する相互作用物質の結合を判定することができる。
【０１６３】
[0161]  別の実施形態では、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの調節剤は、細胞を候補化合物と接触させ、バイオマーカーの発現又は活性レベルを判定する方法で同定される。候補化合物が存在した状態のバイオマーカーｍＲＮＡ又はポリペプチド又はそのフラグメントの発現のレベルを、候補化合物が存在しない状態のバイオマーカーｍＲＮＡ又はポリペプチド又はそのフラグメントの発現のレベルと比較する。次に、候補化合物を、この比較に基づいてバイオマーカー発現の調節剤として同定することができる。例えば、バイオマーカーｍＲＮＡ又はポリペプチド又はそのフラグメントの発現が、候補化合物の存在する状態で、存在しない状態より大きい（統計学的に有意に大きい）場合、候補化合物はバイオマーカー発現の刺激物質として同定される。あるいは、バイオマーカーｍＲＮＡ又はポリペプチド又はそのフラグメントの発現が、候補化合物が存在する状態で、存在しない状態より減少する（統計学的に有意に少ない）場合、候補化合物はバイオマーカー発現の阻害物質として同定される。細胞中のバイオマーカーｍＲＮＡ又はポリペプチド又はそのフラグメントの発現レベルは、バイオマーカーｍＲＮＡ又はポリペプチド又はそのフラグメントを検出する本明細書で記述した方法によって判定することができる。
【０１６４】
[0162]  本発明のさらに別の態様では、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明のバイオマーカー、又はそのフラグメントは、ツーハイブリッドアッセイ又はスリーハイブリッドアッセイで「ベイトタンパク質」として使用し（例えば米国特許第５，２８３，３１７号；Zervos他 (1993)、Cell 72:223-232；Madura他 (1993)、J. Biol. Chem. 268:12046-12054；Bartel他 (1993)、Biotechniques 14:920-924；Iwabuchi他 (1993)、Oncogene 8:1693-1696；及びBrentのＷＯ９４／１０３００号（参照により組み込まれる）を参照）、バイオマーカー又はそのフラグメントとけつごう又は相互作用して、バイオマーカーの活性に関与する他のポリペプチドを同定することができる。かかるバイオマーカー結合タンパク質は、例えば１つ又は複数のバイオマーカーが媒介する信号経路の下流要素として、バイオマーカーポリペプチド又はバイオマーカーの自然の結合相手による信号の伝播にも関与している可能性が高い。
【０１６５】
[0163]  ２ハイブリッドシステムは、分離可能なＤＮＡ結合及び活性化ドメインで構成される大部分の転写因子のモジュール式の性質に基づく。簡潔に言うと、アッセイは２つの異なるＤＮＡ構成を使用する。一方の構成では、１つ又は複数のバイオマーカーポリペプチドをコードする遺伝子を、既知の転写因子（例えばＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをコードする遺伝子と融合させる。他の構成では、同定されていないポリペプチド（「プレイ」又は「サンプル」）をコードするＤＮＡ配列のライブラリからのＤＮＡ配列を、既知の転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子に融合させる。「ベイト」ポリペプチドと「プレイ」ポリペプチドをｉｎ  ｖｉｖｏで相互作用させ、１つ又は複数のバイオマーカー依存性複合体を形成することができる場合、転写因子のＤＮＡ結合及び活性化ドメインが近接する。この近接性によって、転写因子に応答する転写調整部位に作用可能な状態で連結したレポータ遺伝子（例えばＬａｃＺ）を転写することができる。レポータ遺伝子の発現を検出することができ、機能的転写因子を含む細胞コロニーを分離して、それを使用し、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカーポリペプチド又はそのフラグメントと相互作用するポリペプチドをコードするクローン化遺伝子を取得することができる。
【０１６６】
[0164]  別の態様では、本発明は本明細書で記述した２つ以上のアッセイの組み合わせに関する。例えば、調節剤は細胞系又は無細胞アッセイを使用して同定することができ、１つ又は複数のバイオマーカーポリペプチド又はそのフラグメントの活性を調節する薬剤の能力は、例えば細胞の形質転換及び／又は腫瘍形成の動物モデルなどの動物で、ｉｎ  ｖｉｖｏで確認することができる。
【０１６７】
[0165]  本発明はさらに、上述したスクリーニングアッセイによって同定された新規の薬剤に関する。したがって、本明細書で記述したように適切な動物モデルで同定された薬剤をさらに使用することは、本発明の範囲に入る。例えば、本明細書で記述したように同定された薬剤を動物モデルで使用して、かかる薬剤での治療の有効性、毒性、又は副作用を判定することができる。あるいは、本明細書で記述したように同定された薬剤を動物モデルで使用して、かかる薬剤の作用機序を判定することができる。さらに、本発明は本明細書で記述したような治療のために上述したスクリーニングアッセイによって同定された新規の薬剤の使用に関する。
【０１６８】
[0166]ＩＶ．本発明の使用及び方法
本明細書で列挙又は記述したバイオマーカーなどの、本明細書で記述した本発明のバイオマーカー、又はそのフラグメントは、以下の方法の１つ又は複数で使用することができる。すなわち、ａ）スクリーニングアッセイ、ｂ）予測医療（例えば診断アッセイ、予後アッセイ、及び臨床試験のモニタリング）、及びｃ）治療方法（例えば１つ又は複数のバイオマーカーのコピー数、発現レベル及び／又は活性レベルの上方調節又は下方調節などによる治療又は予防治療）である。
【０１６９】
[0167]  本発明の単離核酸分子を使用して、以下でさらに記述するように、例えば（ａ）本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントを（例えば遺伝子治療用途の宿主細胞中の組換え発現ベクター又は合成核酸分子を介して）発現させる、（ｂ）１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子のバイオマーカーｍＲＮＡ又はそのフラグメント（例えば生物学的サンプル中にある）又は遺伝学的変化を検出する、及び／又は（ｃ）バイオマーカー活性を調節することができる。バイオマーカーポリペプチド又はそのフラグメントを使用して、１つ又は複数のバイオマーカーポリペプチド又はそのフラグメントの産生不足又は産生過剰、又はバイオマーカーポリペプチド阻害物質の産生を特徴とする症状又は疾患を治療することができる。また、バイオマーカーポリペプチド又はそのフラグメントを使用して、自然に発生するバイオマーカー結合相手のスクリーニングに使用する、バイオマーカーの活性を調節する薬物又は化合物をスクリーニングする、さらにバイオマーカーポリペプチド又はそのフラグメントの産生不足又は産生過剰、又はバイオマーカーの野生型ポリペプチド又はそのフラグメントと比較して減少した、異常の、又は望ましくない活性を有するバイオマーカーポリペプチド形体の産生を特徴とする症状又は疾患（例えば白血病などのリンパ系癌を含む癌など）を治療することができる。
【０１７０】
[0168]Ａ．スクリーニングアッセイ
一態様では、本発明は本明細書で記述した１つ又は複数のバイオマーカーの望ましくない、望ましい以上の、又は望ましいほどではない発現及び／又は活性に関連する疾患又は症状を対象内で防止する方法に関する。主張された薬剤又は方法での治療から恩恵を受けるような疾患の危険がある対象は、例えば当技術分野で知られ、本明細書で説明した診断アッセイ又は予後アッセイの任意の１つ又は組み合わせによって同定することができる（例えばＩＩＩ．薬剤及び蘇生を選択する方法で述β薬剤及びアッセイを参照）。
【０１７１】
[0169]Ｂ．予測医療
本発明は、予後の判定（予測）を目的とし、それにより個体を予防的に治療するために、診断アッセイ、予後判定アッセイ、及び臨床試験のモニタリングを使用する予測医療の分野にも関する。したがって、本発明の一態様は、生物学的サンプル（例えば血液、血清、細胞、又は組織）の関係で本明細書で列挙又は記述したバイオマーカーなどの本発明のバイオマーカー又はそのフラグメントの発現及び／又は活性レベルを判定し、それにより異常又は望ましくないバイオマーカーの発現又は活性に関連する疾患又は障害に個体が罹患しているか、又は障害を発生する危険があるかを判定する診断アッセイに関する。本発明は、個体が、バイオマーカーのポリペプチド、核酸の発現又は活性に関連する障害を発生する危険があるか判定する予後の判定（又は予測）アッセイも提供する。例えば、生物学的サンプルで１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子の変異を検定することができる。
【０１７２】
[0170]  かかるアッセイを予後の判定又は予測目的で使用し、それによりバイオマーカーのポリペプチド、核酸の発現又は活性を特徴とする、又はそれに関連する障害の発症前に個体を予防的に治療することができる。
【０１７３】
[0171]  本発明の別の態様は、臨床試験で本明細書で列挙又は記述したバイオマーカーなどの本発明のバイオマーカー又はそのフラグメントの発現又は活性に対する薬剤（例えば、医薬品、化合物、及び小核酸系分子）の影響をモニタすることに関する。以上及び他の薬剤について、以下のセクションでさらに詳細に述べる。
【０１７４】
[0172]１．診断アッセイ
本発明の一部は、生物学的サンプルが癌又はその臨床サブタイプ（例えば白血病などのリンパ系癌）に関連するかを正確に分類する方法、システム、及びコードを提供する。幾つかの実施形態では、本発明は統計アルゴリズム及び／又は経験的データ（例えば本明細書で記述した１つ又は複数のバイオマーカーの存在又はレベル）を使用して、（例えば対象からの）サンプルを癌サンプルと分類するのに有用である。
【０１７５】
[0173]  本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの発現又は活性のレベルを検出し、したがってサンプルが癌又はその臨床サブタイプ（例えば白血病などのリンパ系癌）に関連するかの分類に有用である例示的方法は、試験対象から生物学的サンプルを取得することと、生物学的サンプル中でバイオマーカーの発現又は活性のレベルを検出するように、バイオマーカーを検出可能な化合物又は薬剤（例えばバイオマーカー又はそのフラグメントをコードするポリペプチド又は核酸）に生物学的サンプルを接触させることと、を含む。幾つかの実施形態では、個体のサンプル中で本発明の少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、５０、１００個又はそれ以上のバイオマーカーの存在又はレベルを判定する。特定の場合、統計アルゴリズムは単一の学習統計的分類子システムである。例示的統計解析が実施例に提示され、特定の実施形態で使用することができる。他の実施形態では、単一の学習統計的分類子システムを使用し、本明細書で記述した１つ又は複数のバイオマーカーの予測又は確率値及び存在に基づき、サンプルを癌サンプル、癌のサブタイプサンプル、又は非癌サンプルと分類することができる。単一の学習統計的分類子システムを使用すると、通常は少なくとも約７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の感度、特異度、正の予測値、負の予測値及び／又は精度でサンプルが癌サンプルと分類される。
【０１７６】
[0174]  他の適切な統計アルゴリズムが、当業者によく知られている。例えば、学習統計的分類子システムは、複雑なデータセット（例えば当該マーカーのパネル）に適応し、かかるデータセットに基づいて決定することができる機械学習アルゴリズム技術を含む。幾つかの実施形態では、分類系統樹（例えばランダムフォレスト）などの単一の学習統計的分類子システムを使用する。他の実施形態では、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の学習統計的分類子システムの組み合わせを、好ましくはタンデムで使用する。学習統計的分類子システムの例には帰納学習（例えばランダムフォレスト、分類及び回帰系統樹（Ｃ＆ＲＴ）、ブースト系統樹などの決定／分類統系統樹）、計算機的学習理論（ＰＡＣ）、コネクショニスト学習（例えばニューラルネットワーク（ＮＮ）、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）、ニューロファジーネットワーク（ＮＦＮ）、ネットワーク構造、多層パーセプトロンなどのパーセプトロン、多層フィードフォワードネットワーク、ニューラルネットワークの応用、信念ネットワークにおけるベイズの学習など）、強化学習（例えば未処理学習、適応動的学習、及び時間差学習などの既知の環境における受動的学習、未知の環境における受動的学習、未知の環境における能動的学習、学習アクティブバリュー関数、強化学習の応用など）、及び遺伝的アルゴリズム及び進化的プログラミングを使用するシステムが含まれるが、これらに限定されない。他の学習統計的分類子システムには支持ベクターマシン（例えばカーネル法）、多変量適応回帰スプライン（ＭＡＲＳ）、Levenberg-Marquiardtアルゴリズム、ガウス−ニュートンアルゴリズム、ガウス形の混合、勾配下降アルゴリズム、及び学習ベクター量子化（ＬＶＱ）が含まれる。特定の実施形態では、本発明の方法はさらに癌分類結果を臨床医、例えば腫瘍専門医又は血液病専門医に送付することを含む。
【０１７７】
[0175]  別の実施形態では、本発明の方法はさらに、個体が癌又はその臨床サブタイプを有する確率の形態で診断を提供する。例えば、個体は、約０％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上の確率で癌又はその臨床サブタイプを有することがある。さらに別の実施形態では、本発明の方法はさらに、個体の癌の予後の判定を提供する。例えば、予後の判定は手術、癌の臨床サブタイプ（例えば白血病のサブタイプ）の発生、１つ又は複数の症状の発生、悪性癌の発生、又は疾患からの回復となることがある。幾つかの場合、サンプルを癌サンプルと分類する方法はさらに、サンプルを取得した個体の症状（例えば臨床的要素）に基づく。症状又は症状群は、例えばＩＰＩに関連する症状となることがある。幾つかの実施形態では、個体を癌又はその臨床サブタイプを有すると診断した後、癌に関連する１つ又は複数の症状又は癌を治療するために有用な医薬品を治療的に有効な量、個体に投与する。
【０１７８】
[0176]  幾つかの実施形態では、バイオマーカーｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はそのフラグメントを検出する薬剤は、バイオマーカーｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はそのフラグメントとハイブリダイゼーションすることができ、標識した核酸プローブである。核酸プローブは、例えば完全長バイオマーカー核酸、又はその一部、例えば長さがヌクレオチド少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０又は５００個分で、バイオマーカーｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡの当業者に周知の厳密な状況で特異的にハイブリダイゼーションするのに十分であるオリゴヌクレオチドでよい。本発明の診断アッセイに使用するのに適切な他のプローブについて、本明細書で述べる。
【０１７９】
[0177]  本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントを検出するために好ましい薬剤は、バイオマーカーに結合することができる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は多クローン性、又はさらに好ましくは単クローン性でよい。無傷の抗体、又はそのフラグメント（例えばＦａｂ又はＦ（ａｂ’）２）を使用することができる。プローブ又は抗体に関して、「標識する」という用語は、検出可能な物質をプローブ又は抗体に結合（すなわち物理的に連結）することによってプローブ又は抗体に直接標識する、さらに直接標識された別の試薬の反応性によってプローブ又は抗体に間接的に標識することを含むものとする。間接的標識の例には蛍光標識した二次抗体を使用し、蛍光標識したストレプトアビジンで検出できるように、ＤＮＡプローブをビオチンで最終標識して、一次抗体を検出することが含まれる。「生物学的サンプル」という用語は、対象から単離された組織、細胞、及び生物学的流体、さらに対象内に存在する組織、細胞、及び流体を含むものとする。すなわち、本発明の検出方法を使用して、生物学的サンプル内でｉｎ  ｖｉｔｒｏで、さらにｉｎ  ｖｉｖｏでバイオマーカーｍＲＮＡ、ポリペプチド、ゲノムＤＮＡ、又はそのフラグメントを検出することができる。例えば、バイオマーカーｍＲＮＡ又はそのフラグメントを検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏの技術には、ノーザンハイブリダイゼーション及びｉｎ  ｓｉｔｕのハイブリダイゼーションが含まれる。バイオマーカーポリペプチドを検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏの技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降及び免疫蛍光が含まれる。バイオマーカーのゲノムＤＮＡ又はそのフラグメントを検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏの技術には、サウザンハイブリダイゼーションが含まれる。さらに、１つ又は複数のバイオマーカーのポリペプチド又はそのフラグメントを検出するｉｎ  ｖｉｖｏの技術には、標識したアンチバイオマーカー抗体を対象に導入することが含まれる。例えば、抗体は、標準的画像技術で対象内の存在及び位置を検出することができる放射性マーカーで抗体を標識することができる。
【０１８０】
[0178]  一実施形態では、生物学的サンプルは試験対象からのポリペプチド分子を含む。あるいは、生物学的サンプルは、試験対象からのｍＲＮＡ分子、又は試験対象からのゲノムＤＮＡ分子を含むことができる。好ましい生物学的サンプルは、従来の手段で対象から単離した血液学的組織（例えば血液、血漿、Ｂ細胞、骨髄などを含むサンプル）のサンプルである。
【０１８１】
[0179]  別の実施形態では、方法はさらに、コントロールの被検体からコントロールの生物学的サンプルを取得することと、生物学的サンプル中でバイオマーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はそのフラグメントを検出するように、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、低分子ＲＮＡｓ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はその変異型、ゲノムＤＮＡ、又はそのフラグメントを検出することができる化合物又は薬剤に対照サンプルを接触させることと、対照サンプル中のバイオマーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、低分子ＲＮＡｓ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はその変異型、ゲノムＤＮＡ、又はそのフラグメントの存在を、試験サンプル中のバイオマーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、低分子ＲＮＡｓ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はその変異型、ゲノムＤＮＡ、又はそのフラグメントの存在と比較することと、を含む。
【０１８２】
[0180]  本発明は、生物学的サンプル中で本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、低分子ＲＮＡｓ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はその変異型、ゲノムＤＮＡ、又はそのフラグメントの存在を検出するキットも含む。例えば、キットは、生物学的標識中で１つ又は複数のバイオマーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、低分子ＲＮＡｓ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はその変異型、ゲノムＤＮＡ、又はそのフラグメントを検出することができる標識した化合物又は薬剤と、サンプル中でバイオマーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、低分子ＲＮＡｓ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はその変異型、ゲノムＤＮＡ、又はそのフラグメントの量を判定する手段と、サンプル中のバイオマーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、低分子ＲＮＡｓ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はその変異型、ゲノムＤＮＡ、又はそのフラグメントの量を標準と比較する手段と、を含むことができる。化合物又は薬剤は、適切な容器に入れてパッケージングすることができる。キットはさらに、バイオマーカーのポリペプチド、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、低分子ＲＮＡｓ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はその変異型、ゲノムＤＮＡ、又はそのフラグメントを検出するキットを使用するための指示書を含むことができる。
【０１８３】
[0181]  幾つかの実施形態では、記述した診断アッセイに基づいて層別化した患者集団を治療するように調整した療法をさらに投与する。
【０１８４】
[0182]２．予後判定アッセイ
本明細書で述べる診断法はさらに、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの異常発現又は活性に関連する疾患又は障害を有する、又はその発生の危険がある対象を同定するために使用することができる。本明細書で使用する「異常」という用語は、コントロール中の正常な発現又は活性から逸脱したバイオマーカーの発現又は活性レベルを含む。
【０１８５】
[0183]  先行診断アッセイ又は追従アッセイなどの本明細書で述べるアッセイを使用して、癌（例えば白血病などのリンパ系癌）にあるようなバイオマーカーの活性又は発現の誤調整に関連する障害を有する、又はそれを発生するリスクを有する対象を同定することができる。あるいは、予後判定アッセイを使用して、バイオマーカーの活性又は発現の誤調整に関連する障害を有する、又はそれを発生するリスクを有する対象を同定することができる。したがって、本発明は、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの異常発現又は活性に関連する疾患を同定及び／又は分類する方法を提供する。さらに、本明細書で述べる予後判定アッセイを使用して、異常なバイオマーカーの発現又は活性に関連する疾患又は障害を治療するために、対象に薬剤（例えば、作動剤、拮抗剤、ペプチドミメティクス、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子、又は他の医薬品候補）を投与できるか判定することができる。例えば、かかる方法を使用して、癌（例えば白血病などのリンパ系癌）用の薬剤で対象を効果的に治療できるか判定することができる。したがって、本発明は、異常なバイオマーカーの発現又は活性に関連する疾患のための薬剤で対象を効果的に治療できるか判定するために、試験サンプルを取得し、バイオマーカーのポリペプチド又は核酸の発現又は活性を検出する方法を提供する（例えば、コントロールに対するバイオマーカーのポリペプチド又は核酸の発現又は活性の有意の増加又は減少が、異常なバイオマーカーの発現又は活性に関連する障害を治療するための薬剤を投与できる対象の診断となる）。幾つかの実施形態では、バイオマーカーの発現又は活性の有意の増加又は減少は、対照サンプルのマーカーの発現又は活性レベルより少なくとも２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍又はそれ以上それぞれ高い又は低いことを含む。
【０１８６】
[0184]  本発明の方法は、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの遺伝子変化を検出し、それによってバイオマーカーが変化した対象に、異常なバイオマーカーの活性又は発現レベルを特徴とする癌（例えば白血病などのリンパ系癌）のリスクがあるか判定するためにも使用することができる。好ましい実施形態では、方法は、対象からの細胞のサンプル中で、１つ又は複数のバイオマーカーポリペプチドをコードする遺伝子の完全性に影響する少なくとも１つの変化、又はバイオマーカーの誤発現を特徴とする遺伝子変化の有無を検出することを含む。例えば、かかる遺伝子変化は、１）１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子からの１つ又は複数のヌクレオチドの欠失、２）１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子への１つ又は複数のヌクレオチドの付加、３）１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子の１つ又は複数のヌクレオチドの置換、４）１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子の染色体の配列換え、５）１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子のメッセンジャＲＮＡ転写のレベル変化、６）ゲノムＤＮＡのメチル化パターンの場合のような１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子の異常修飾、７）１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子のメッセンジャＲＮＡ転写の非野生型スプライシングパターンの存在、８）１つ又は複数のバイオマーカーポリペプチドの非野生型レベル、９）１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子の対立遺伝子の欠失、及び１０）１つ又は複数のバイオマーカーポリペプチドの不適切な翻訳後修飾、のうち少なくとも１つの存在を確認することによって検出することができる。本明細書で述べるように、１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子の変化を検出するために使用できるアッセイが当技術分野で多数知られている。好ましい生物学的サンプルは、従来の手段で対象から単離した組織又は血清サンプルである。
【０１８７】
[0185]  特定の実施形態では、変化の検出が、プローブ／プライマーをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号）、例えばアンカＰＣＲ又はＲＡＣＥ  ＰＣＲ、又は代替的に連結連鎖反応（ＬＣＲ）（例えばLandegran他 (1988) Science 241:1077-1080；及びNakazawa他 (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360-364参照）に使用することを含み、後者は１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子中の点変異を検出するのに特に有用なことがある（Abravaya他 (1995)、Nucleic Acids Res. 23:675-682参照）。この方法は、対象から細胞のサンプルを採取するステップと、サンプルの細胞から核酸（例えばゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、低分子ＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はその変異型）を単離するステップと、（存在する場合は）バイオマーカー遺伝子のハイブリダイゼーション及び増幅が生じるような状態で、本明細書で列挙又は記述したバイオマーカー遺伝子などの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントに特異的にハイブリダイゼーションする１つ又は複数のプライマーに、核酸サンプルを接触させるステップと、増幅産物の有無を検出するステップ、又は増幅産物のサイズを検出して対照サンプルの長さと比較するステップとを含むことができる。ＰＣＲ及び／又はＬＣＲは、本明細書で述べる変異の検出に使用される技術のいずれかと組み合わせて、予備増幅ステップとして使用するのが望ましいことがあると予想される。
【０１８８】
[0186]  代替的増幅方法には、自己持続配列複製（Guatelli, J. C.他 (1990)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878）、転写増幅システム（Kwoh, D. Y.他 (1989)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177）、Ｑ−βレプリカーゼ（Lizardi, P. M.他 (1988)、Bio-Technology 6:1197）、又は任意の他の核酸増幅法が含まれ、その後に当業者に周知の技術を使用した増幅分子の検出がある。これらの検出体系は、存在する核酸分子が非常に少数である場合に、かかる分子の検出に特に有用である。
【０１８９】
[0187]  代替実施形態では、サンプル細胞からの本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子、又はそのフラグメントの変異は、制限酵素切断パターンの変化によって同定することができる。例えば、１つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼでサンプル及びコントロールＤＮＡを単離し、増幅し（任意選択）、消化し、ゲル電気泳動でフラグメントの長さサイズを判定して、比較する。サンプルとコントロールＤＮＡとのフラグメントの長さサイズの差が、サンプルＤＮＡ中の変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム（例えば米国特許第５，４９８，５３１号（参照により組み込まれる）参照）の使用を、リボザイム切断部位の発生又は欠失による特異的変異の存在をスコア化するために使用することができる。
【０１９０】
[0188]  他の実施形態では、本明細書で列挙又は記述した遺伝子などの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子、又はそのフラグメントの遺伝子変異は、サンプル及びコントロール核酸、例えばＤＮＡ、  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はその変異型を、数百又は数千個のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイにハイブリダイゼーションすることによって同定することができる（Cronin, M. T.他 (1996)、Hum. Mutat. 7:244-255；Kozal, M. J.他 (1996)、Nat. Med. 2:753-759）。例えば、１つ又は複数のバイオマーカーの遺伝子変異は、特にCronin他 (1996)に記載されたように発光ＤＮＡプローブを含む２次元アレイ中で同定することができる。簡潔に言うと、プローブの第１のハイブリダイゼーションアレイを使用して、サンプル及びコントロール中の長いＤＮＡを走査し、重複する配列プローブの直線アレイを作製することによって配列間の塩基変化を同定することができる。このステップによって点変異を同定することができる。このステップの後に第２のハイブリダイゼーションアレイがあり、これによって検出される全変異型又は変異に対して相補的な比較的小さい特殊なプローブアレイを使用することにより、特異的変異を特徴付けることができる。各変異アレイは、平行プローブセットで構成され、一方は野生型遺伝子に相補的であり、他方は変異遺伝子に相補的である。
【０１９１】
[0189]  さらに別の実施形態では、当技術分野で知られている様々な配列決定反応のいずれかを使用して、本明細書で列挙又は記述した遺伝子などの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子、又はそのフラグメントの配列を直接決定し、サンプルバイオマーカー遺伝子の配列を対応する野生型（コントロール）配列と比較することによって変異を検出することができる。配列決定反応の例には、Maxam及びGilbert (1977)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560又はSanger (1977)、Proc. Natl. Acad Sci. USA 74:5463によって開発された技術に基づく反応が含まれる。様々な自動化配列決定手順のいずれも、診断アッセイを実行する場合に使用することができ (Naeve, C. W. (1995)、Biotechniques 19:448-53)、それには質量分析法による配列決定が含まれる（例えばＰＣＴ国際特許公開第ＷＯ９４／１６１０１号（参照により組み込まれる）；Cohen他 (1996)、Adv. Chromatogr. 36:127-162；及びGriffin他 (1993)、Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159を参照）。
【０１９２】
[0190]  本明細書で列挙又は記述した遺伝子などの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー遺伝子、又はそのフラグメントの変異を検出する他の方法には、切断剤からの保護を使用してＲＮＡ／ＲＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖の不適正塩基を検出する方法が含まれる（Myers他 (1985)、Science 230:1242）。一般に、当技術分野の「不適正切断」の技術は、野生型配列を含む（標識した）ＲＮＡ又はＤＮＡを、組織サンプルから取得して潜在的変異体を有するＲＮＡ又はＤＮＡとハイブリダイゼーションすることによって形成したヘテロ二本鎖を提供することから開始する。コントロールとサンプルの鎖の間の塩基対不適正により存在するような二重鎖の１本鎖領域を切断する薬剤で、２本鎖の二重鎖を処理する。例えば、ＳＩヌクレアーゼで処理したＲＮアーゼ及びＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドでＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖を処理し、不適正領域を酵素消化することができる。他の実施形態では、不適正領域を消化するために、ヒドロキシルアミン又は四酸化オスミウムで、及びピペリジンでＤＮＡ／ＤＮＡ又はＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のいずれかを処理することができる。不適正領域の消化後、次に、その結果の材料を、変性ポリアクリルアミドゲル上のサイズごとに区別し、変異の部位を判定する。例えばCotton他 (1988)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4397、及びSaleeba他 (1992)、Methods Enzymol. 217:286-295を参照されたい。好ましい実施形態では、検出するためにコントロールのＤＮＡ又はＲＮＡを標識することができる。
【０１９３】
[0191]  さらに別の実施形態では、不適正切断反応は、細胞のサンプルから取得し、本明細書で列挙又は記述した遺伝子などの本発明のバイオマーカー遺伝子、又はそのフラグメントの点変異を検出し、マッピングするように規定されたシステムで、２本鎖ＤＮＡの不適正塩基対を認識する１つ又は複数のタンパク質（いわゆる「ＤＮＡ不適正修復」酵素）を使用する。例えば、大腸菌のｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／Ａ不適正部にてＡを切断し、ヒーラ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／Ｔ不適正部にてＴを切断する（Hsu他 (1994)、Carcinogenesis 15:1657-1662）。二重鎖をＤＮＡ不適正修復酵素で処理し、切断産物がある場合は、電気泳動プロトコルなどでそれを検出することができる。例えば米国特許第５，４５９，０３９号（参照により組み込まれる）を参照されたい。
【０１９４】
[0192]  他の実施形態では、電気泳動移動度の変化を使用して、本明細書で列挙又は記述した遺伝子などの本発明のバイオマーカー遺伝子、又はそのフラグメントの変異を同定する。例えば、１本鎖コンフォメーション多形性（ＳＳＣＰ）を使用して、変異核酸と野生型核酸との電気泳動移動度の差を検出することができる（Orita他 (1989)、Proc Natl. Acad. Sci USA 86:2766；Cotton (1993)、Mutat. Res. 285:125-144及びHayashi (1992)、Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79も参照）。サンプル及びコントロールの核酸の１本鎖ＤＮＡフラグメントが変性し、復元することができる。１本鎖核酸の二次構造は、配列に従って変化し、その結果の電気泳動移動度の変化によって、単一の塩基変化さえ検出することができる。ＤＮＡフラグメントは、標識したプローブで標識又は検出することができる。アッセイの感度は、配列の変化に対して二次構造の感度が向上した（ＤＮＡではなく）ＲＮＡを使用することにより向上させることができる。好ましい実施形態では、主題の方法は、ヘテロ二重鎖解析を使用し、電気泳動移動度の変化に基づいて２本鎖ヘテロ二重鎖分子を区別する（Keen 他 (1991)、Trends Genet. 7:5）。
【０１９５】
[0193]  さらに別の実施形態では、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲル中での変異体又は野生型フラグメントの動作を、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を使用して検定する（Myers他 (1985)、Nature 313:495)）。分析法としてＤＧＧＥを使用する場合、ＤＮＡを修飾し、例えばＰＣＲによって高融点ＧＣが豊富なＤＮＡのＧＣクランプを約４０ｂｐ付加することによって、完全には変性しないことを保証する。さらに別の実施形態では、変性勾配ではなく温度勾配を使用して、コントロールとサンプルのＤＮＡの移動度の差を同定する（Rosenbaum及びReissner (1987)、Biophys. Chem. 265:12753）。
【０１９６】
[0194]  点変異を検出する他の技術の例には、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、又は選択的プライマー伸長が含まれるが、これらに限定されない。例えば、既知の変異が中心に位置するオリゴヌクレオチドプライマーを調製し、次に完全に一致したことが認められた場合のみハイブリダイゼーションが可能である状態で、標的ＤＮＡにハイブリダイゼーションすることができる（Saiki他 (1986)、Nature 324:163；Saiki他 (1989)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6230）。オリゴヌクレオチドがハイブリダイゼーション膜に結合し、標識した標的ＤＮＡとハイブリダイゼーションした場合、かかる対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドがＰＣＲ増幅標的ＤＮＡ又は幾つかの異なる変異にハイブリダイゼーションする。幾つかの実施形態では、バイオチップ、マイクロアレイなど、又は当技術分野で周知である他のアレイテクノロジを使用して、ハイブリダイゼーション反応を生じさせることができる。
【０１９７】
[0195]  あるいは、選択的ＰＣＲ増幅に依存する対立遺伝子特異的増幅を、本発明と組み合わせて使用することができる。特異的増幅のプライマーとして使用するオリゴヌクレオチドは、当該変異を、（増幅が同定的ハイブリダイゼーションに依存するように）分子の中心に（Gibbs他 (1989)、Nucleic Acids Res. 17:2437-2448）、又は適切な状態で不適正がポリメラーゼの伸長を防止するか、減少させることができる場合は一方のプライマーの最３’末端に（Prossner (1993)、Tibtech 11:238）有する。また、変異領域の新規の制限部位を導入し、切断に基づく検出部を生成することが望ましいことがある（Gasparini他 (1992)、Mol. Cell Probes 6:1）。特定の実施形態では、増幅は、増幅用のＴａｑリガーゼを使用して実行することもできる（Barany (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189）。かかる場合、５’配列の３’末端が完全に一致した場合のみ、連結が生じ、それによって増幅の有無を探索することにより特定の部位に既知の変異が存在することを検出することが可能になる。
【０１９８】
[0196]  本明細書で述べる方法は、例えば本明細書で述べる少なくとも１つのプローブ核酸又は抗体試薬を含む事前包装の診断キットを使用して実行することができ、これは例えば臨床の場で便利に使用し、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントを伴う疾患又は疾病の症状又は家族歴を示す患者を診断することができる。
【０１９９】
[0197]３．臨床試験中の効果のモニタリング
本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの発現又は活性に対する薬剤（例えば医薬品）の影響（例えば癌状態の調節）のモニタリングは、基本的な医薬品のスクリーニングばかりでなく、臨床試験にも適用することができる。例えば、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの発現及び／又は活性を増加するために、本明細書で述βようなスクリーニングアッセイによって判定される薬剤の有効性は、コントロールの基準に対して、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカーなどの１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの発現及び／又は活性の低下を示す対象の臨床試験でモニタすることができる。あるいは、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの発現及び／又は活性を増加するためにスクリーニングアッセイによって判定される薬剤の有効性は、コントロールの基準に対して、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明のバイオマーカー、又はそのフラグメントの発現及び／又は活性の低下を示す対象の臨床試験でモニタすることができる。かかる臨床試験では、バイオマーカーの発現及び／又は活性を、特定細胞のフェノタイプの「読み出し」又はマーカーとして使用することができる。
【０２００】
[0198]  幾つかの実施形態では、本発明は、作用物質（例えば作動剤、拮抗剤、ペプチドミメティクス、ポリペプチド、ペプチド、核酸、小分子、又は本明細書で述べるスクリーニングアッセイによって同定される他の候補医薬品）で対象を治療する有効性をモニタリングする方法であって、（ｉ）薬剤を投与する前に対象から投与前サンプルを獲得するステップと、（ｉｉ）投与前サンプル中で、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの発現及び／又は活性のレベルを検出するステップと、（ｉｉｉ）対象から１つ又は複数の投与後サンプルを獲得するステップと、（ｉｖ）投与後サンプル中でバイオマーカーの発現又は活性のレベルを検出するステップと、（ｖ）投与前サンプル中のバイオマーカー又はそのフラグメントの発現又は活性のレベルを、１つ又は複数の投与後サンプル中のバイオマーカーのそれと比較するステップと、（ｖｉ）それに従って対象への薬剤の投与を変更するステップと、を含む方法を提供する。例えば、１つ又は複数のバイオマーカーの発現又は活性を検出レベルより高いレベルまで増加させる（例えば薬剤の有効性を増加させる）ために、薬剤の投与増加が望ましいことがある。あるいは、バイオマーカーの発現又は活性を検出レベルより低いレベルまで低下させる（例えば薬剤の有効性を低下させる）ために、薬剤の投与減少が望ましいことがある。かかる実施形態によると、バイオマーカーの発現又は活性を、観察可能な表現型応答がなくても、薬剤の有効性の指標として使用することができる。
【０２０１】
[0199]Ｃ．治療方法
本発明は、本明細書で列挙又は記述したバイオマーカーなどの本発明のバイオマーカーの不十分又は過剰な産生を特徴とし、コントロールと比較して異常な発現又は活性を有する障害の危険がある（又はその障害にかかりやすい）対象を治療する予防的方法及び治療方法の両方を提供する。さらに、本明細書で述べる本発明の薬剤を使用して、バイオマーカー又はそのフラグメントを検出して単離し、バイオマーカー又はそのフラグメントの生物学的利用能を制御し、バイオマーカーの発現レベル又は活性を調節することができる。
【０２０２】
[0200]１．予防方法
一態様では、本発明は、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの異常発現又は活性に関連する疾患又は状態を、バイオマーカーの発現又は少なくともバイオマーカーの活性を調節する薬剤を対象に投与することによって、対象内で防止する方法を提供する。バイオマーカーの異常発現又は活性を原因とする、又はそれが一因である疾患又は障害のリスクがある対象は、例えば本明細書で述べるような診断アッセイ又は予後判定アッセイのいずれか又はそれらの組み合わせによって同定することができる。疾患又は障害を予防するか、あるいはその進行を遅らせるように、予防薬の投与は、バイオマーカーの発現又は活性異常を特徴とする症状の出現前に実行することができる。
【０２０３】
[0201]２．療法
本発明の別の態様は、治療目的で、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの発現又は活性又はその天然結合相手との相互作用を調節する方法に関する。本発明のバイオマーカーは、癌（例えば白血病などのリンパ系癌）との相関が実証されている。したがって、免疫応答を調節するために、バイオマーカーの活性及び／又は発現、さらに１つ又は複数のバイオマーカー又はそのフラグメントと、その天然結合相手又はそのフラグメントとの相互作用を調節することができる。幾つかの実施形態では、変異体ＲＡＣバイオマーカーの発現に基づき層別化された対象は、ＰＡＫ１、ＲＯＣＫ１及び／又はＲＯＣＫ２の阻害剤単独で、又は他の抗癌療法との併用で特異的に治療することができる。何故なら、かかる下流ＲＡＣシグナル伝達分子が変異体ＲＡＣバイオマーカーの形質転換能力にとって重要であることが、本明細書で実証されているからである。
【０２０４】
[0202]  本発明の調節方法は、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメント、又は細胞に関連するバイオマーカー活性の１つ又は複数の活性を調節する薬剤に細胞を接触させることを含む。バイオマーカーの活性を調節する薬剤は、本明細書で述βような薬剤、例えば核酸又はポリペプチド、バイオマーカーの自然に発生する結合相手、バイオマーカーに対する抗体、バイオマーカーに対する抗体と他の免疫関連標的に対する抗体との組み合わせ、１つ又は複数のバイオマーカーの作動剤又は拮抗剤、１つ又は複数のバイオマーカー作動剤又は拮抗剤のペプチドミメティクス、１つ又は複数のバイオマーカーペプチドミメティクス、他の小分子、又は１つ又は複数のバイオマーカー核酸遺伝子発現産物に対する、又はそれを模倣する低分子ＲＮＡとすることができる。
【０２０５】
[0203]  本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの発現を調節する薬剤は、例えばアンチセンス核酸分子、ＲＮＡi分子、ｓｈＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はその変異型、又は他の小ＲＮＡ分子、三重鎖オリゴヌクレオチド、リボザイム、又は１つ又は複数のバイオマーカーポリペプチドを発現させる組み換えベクターである。例えば、１つ又は複数のバイオマーカーポリペプチド翻訳開始部位の周囲の区域に相補的なオリゴヌクレオチドを合成することができる。１つ又は複数のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞媒質に、通常は２００マイクログラム／ｍＬで付加するか、患者に投与して、１つ又は複数のバイオマーカーポリペプチドの合成を防止することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞に取り込まれ、１つ又は複数のバイオマーカーｍＲＮＡとハイブリダイゼーションして、翻訳を防止する。あるいは、２本鎖ＤＮＡと結合して三重鎖構成を形成し、ＤＮＡの巻き戻し及び転写を防止するオリゴヌクレオチドを使用することができる。いずれかの結果として、バイオマーカーポリペプチドの合成が遮断される。バイオマーカーの発現を調節する場合、かかる調節は、バイオマーカー遺伝子のノックアウト以外の手段で実行する。
【０２０６】
[0204]  細胞中のバイオマーカーの量を制御するという事実によって発現を調節する薬剤は、細胞中のバイオマーカー活性の総量も調節する。
【０２０７】
[0205]  一実施形態では、薬剤は、本明細書で列挙又は記述した１つ又は複数のバイオマーカーなどの本発明の１つ又は複数のバイオマーカー、又はそのフラグメントの１つ又は複数の活性を刺激する。かかる調節剤の例には、細胞に導入されているバイオマーカー又はそのフラグメントをコードする活性バイオマーカーポリペプチド又はそのフラグメント及び核酸（例えばｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ*、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡ結合部位、又はその変異型又は当業者に知られている他の機能的に同等の分子）を含む。別の実施形態では、薬剤は１つ又は複数のバイオマーカー活性を阻害する。一実施形態では、薬剤はバイオマーカーとその天然結合相手との相互作用を阻害又は強化する。かかる阻害剤の例にはアンチセンス核酸分子、抗バイオマーカー抗体、バイオマーカー阻害剤、及び本明細書で述べるスクリーニングアッセイで同定される化合物が含まれる。
【０２０８】
[0206]  これらの調節方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば細胞を薬剤に接触させることによって）、又は代替的にｉｎ  ｖｉｖｏで薬剤を細胞と接触させる（例えば薬剤を対象に投与する）ことによって実行することができる。したがって、本発明は、本明細書で列挙又は記述した本発明の１つ又は複数のバイオマーカーの上方調節又は下方調節から恩恵を受けるような状態又は障害、例えばバイオマーカー又はそのフラグメントの望ましくない、不十分、又は異常な発現又は活性を特徴とする障害に悩む個体を治療する方法を提供する。一実施形態では、方法は、バイオマーカーの発現又は活性を調節する（例えば上方制御又は下方制御する）薬剤（例えば本明細書で述べるスクリーニングアッセイで同定された薬剤）、又は薬剤の組み合わせを投与することを含む。別の実施形態では、方法は、１つ又は複数のバイオマーカーポリペプチド又は核酸分子を治療として投与し、減少、異常、又は望ましくないバイオマーカーの発現又は活性を補償することを含む。
【０２０９】
[0207]  バイオマーカーが異常に下方制御される、及び／又はバイオマーカーの活性増加が有利な効果を与える可能性が高い状況では、バイオマーカーの活性を刺激することが望ましい。同様に、バイオマーカーが異常に上方制御される、及び／又はバイオマーカーの活性減少が有利な効果を与える可能性が高い状況では、バイオマーカーの活性を阻害することが望ましい。
【０２１０】
[0208]  また、これらの調節剤は、例えば化学療法薬、ホルモン、抗狭心症薬、放射性標識化合物と、又は手術、化学療法及び／又は放射線療法との併用療法で投与することもできる。前述した治療方法は、事前又は事後通常療法と継続的に、通常療法の他の形態（例えば当業者に周知の標準治療）と併用投与することができる。例えば、これらの調節剤は治療的に有効な量の化学療法剤とともに投与することができる。別の実施形態では、これらの調節剤を化学療法と併用投与して、化学療法剤の活性及び効力を強化する。医師用添付文書集（ＰＤＲ）は、様々な癌の治療に使用されてきた化学療法剤の用量を開示している。治療上有効であるこれらの前述した化学療法剤の投薬法及び投与量は、治療中の特定の癌（例えば白血病などのリンパ系癌）、疾患の程度、及び当業者医師が精通した他の要素に依存する。
【０２１１】
[0209]Ｖ．医薬組成物
別の態様では、本発明は、１つ又は複数の薬学的に許容可能なキャリア（添加剤）及び／又は希釈剤とともに製剤化される本発明のバイオマーカー（例えば変異体ＲＡＣタンパク質）の活性又はレベルを低下させる、治療上有効な量の薬剤を含む薬学的に許容可能な組成物を提供する。以下で詳細に述べるように、本発明の医薬組成物は、固体又は液体形態で投与するように特別に製剤化することができ、（１）経口投与、例えば飲薬（水性又は非水性溶液又は懸濁液）、錠剤、巨丸薬、粉末、顆粒、ペースト剤、（２）非経口投与、例えば無菌溶液又は懸濁液として、例えば皮下、筋肉、又は静脈内注射、（３）例えば皮膚に適用されるクリーム、軟膏、又は噴霧としての局所適用、（４）例えばペッサリ、クリーム又は発泡体などの膣内又は直腸内、又は（５）例えば水性エアロゾル、リポソーム製剤又は化合物を含む固体粒子としてのエアロゾル、に適応する形態が含まれる。
【０２１２】
[0210]  本明細書で使用する「治療上有効な量」という語句は、本発明のバイオマーカー（例えば変異体ＲＡＣタンパク質）ｘの活性又はレベルを低下させる薬剤、又は本発明のバイオマーカー（例えば変異体ＲＡＣタンパク質）の活性又はレベルを低下させる薬剤を含む組成物の量で、妥当なメリット／リスクの比率で何らかの望ましい治療効果、例えば癌治療を生じるのに有効である量を意味する。
【０２１３】
[0211]  「薬学的に許容可能」という語句は、健全な医療の判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギ反応、又は他の問題又は合併症がなく、妥当なメリット／リスクの比率に対応し、ヒト又は動物の皮膚と接触状態で使用するのに適しているこれらの薬剤、材料、組成物及び／又は剤形を指すものとして、本明細書では使用される。
【０２１４】
[0212]  本明細書で使用する「薬学的に許容可能なキャリア」という語句は、主題の化学物質を１つの器官又は身体部分から別の器官又は身体部分へと運搬又は輸送することに関与する液体又は固体の充填材、希釈剤、賦活剤、溶剤又は封入材料などの、薬学的に許容可能な材料、組成物又は媒介物を意味する。各キャリアは、製剤化の他の成分と適合し、対象に有害ではないという意味で、「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能なキャリアとして働くことができる材料の幾つかの例には、（１）乳糖、ブドウ糖及び蔗糖などの糖、（２）トウモロコシ澱粉及びジャガイモデンプンなどのデンプン、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロースなどのセルロース及びその誘導体、（４）粉末状トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）滑石、（８）ココアバター及び座剤蝋などの父兄剤、（９）落花生油、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油及びダイズ油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝液、（１５）アルギン酸、（１６）無パイロジェン水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液、及び（２１）医薬製剤に使用される他の非毒性相溶性物質が含まれる。
【０２１５】
[0213]  「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本発明のバイオマーカー（例えば変異体ＲＡＣタンパク質）の活性又はレベルを低下させる薬剤の比較的毒性のない無機及び有機酸添加塩を指す。これらの塩は、呼吸脱共役剤の最終単離及び精製中にｉｎ  ｓｉｔｕで調製するか、精製した呼吸脱共役剤をその遊離基形態で適切な有機又は無機酸と別個に反応させ、このように形成された塩を単離することによって調製することができる。代表的な塩には臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリル酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシラート、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナプチレート、メシレート、グルコヘプト酸塩、ラクトビオン酸塩、及びラウリルスルホン酸塩などが含まれる（例えばBerge他 (1977)、"Pharmaceutical Salts", J. Pharm. Sci. 66:1-19参照）。
【０２１６】
[0214]  他の場合、本発明の方法に有用な薬剤は、１つ又は複数の酸性官能基を含むことができ、したがって薬学的に許容可能な塩基を有する薬学的に許容可能な塩を形成することができる。これらの場合の「薬学的に許容可能な塩」という用語は、本発明のバイオマーカー（例えば変異体ＲＡＣタンパク質）の活性又はレベルを低下させる薬剤の相対的に非毒性の無機及び有機塩基添加塩を指す。これらの塩は同様に、呼吸脱共役剤の最終単離及び精製中にｉｎ  ｓｉｔｕで調製するか、精製した呼吸脱共役剤をその遊離酸形態で適切な塩基と、例えば薬学的に許容可能な金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩又は重炭酸塩をアンモニアと、又は薬学的に許容可能な有機第１級、第２級又は第３級アミンと別個に反応させることによって調製することができる。代表的なアルカリ又はアルカリ土類塩にはリチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、及びアルミニウム塩などが含まれる。塩基添加塩の形成に有用な代表的有機アミンにはエチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが含まれる（例えば上記のBerge他を参照）。
【０２１７】
[0215]  組成物中には、ラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、乳化剤及び潤滑剤、さらに着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味剤、着香料及び香料、保存剤及び酸化防止剤も存在し得る。
【０２１８】
[0216]  薬学的に許容可能な酸化防止剤の例には（１）スコルビン酸、システイン塩酸塩、重硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどのような水溶性酸化防止剤、（２）アスコルビン酸パルミテート、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−床フェノールなどのような油溶性酸化防止剤、及び（３）クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸などのような金属キレート化剤が含まれる。
【０２１９】
[0217]  本発明の方法に有用な製剤には、経口、経鼻、局所（頬側及び舌下を含む）、直腸、膣、エアロゾル及び／又は非経口投与に適切な製剤が含まれる。製剤は、単位用量の形態で便利に提示し、調剤の技術分野で周知の任意の方法で調製することができる。キャリア材料と組み合わせて単一用量の形態を生成することができる有効成分の量は、治療される受容者、特定の投与法に応じて変化する。キャリア材料と組み合わせて単一用量の形態を生成することができる有効成分の量は、通常、治療効果を生じる化合物の量となる。通常、１００パーセントのうち、この量は有効成分の約１％〜約９９％、好ましくは約５％〜約７０％、最も好ましくは約１０％〜約３０％の範囲になる。
【０２２０】
[0218]  これらの製剤又は組成物を調製する方法は、本発明のバイオマーカー（例えば変異体ＲＡＣタンパク質）の活性又はレベルを低下させる薬剤をキャリアと、及び任意選択で１つ又は複数の補助成分と会合させるステップを含む。一般的に、製剤は、呼吸脱共役剤を液体キャリア、又は微粉固体キャリア、又はその両方と均一かつ密接に会合させ、その後に必要に応じて産物を成形することによって調製される。
【０２２１】
[0219]実施例１：実施例２〜６の材料及び方法
Ａ．細胞株
ヒト胎児腎臓２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）、線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０、乳癌細胞株ＨＣＣ１１４３及びＭＤＡ−ＭＢ−１５７、及びマウス線維芽細胞株３Ｔ３を、American Type Culture Collection（ATCC、米国バージニア州マナッサス）から購入し、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウシ胎児血清及び２ｍＭのＬ−グルタミン（両方ともInvitrogenから）を添加したダルベッコ改変イーグル培地Ｆ１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）（Invitrogen、米国カリフォルニア州カールスバッド）内で維持した。ヒト乳腺上皮細胞株ＭＣＦ１０ＡをＡＴＣＣから取得し、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウマ血清（S0910、Biowest、フランスNuaille）、組換えヒト上皮成長因子（ＥＧＦ；２０ｎｇ／ｍＬ）（Peprotech、米国ニュージャージー州ロッキーヒル）、ウシインスリン（１０マイクログラム／ｍＬ）（I-1882、Sigma-Aldrich、米国モンタナ州セントルイス）、ヒドロコルチゾン（０．５マイクログラム／ｍＬ、H-0888、Sigma-Aldrich）、及びコレラ毒素（１００ｎｇ／ｍＬ、D-8052、Sigma-Aldrich）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２内で維持した。ヒトＣＭＬ細胞株ＫＣＬ−２２をＪＣＲＢ細胞バンク（大阪）から取得し、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＦＢＳを添加したＲＰＭＩ培地１６４０（Invitrogen）内で維持した。
【０２２２】
[0220]Ｂ．オリゴヌクレオチド配列
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に使用するプライマー配列は以下の通りである。
【０２２３】
[0221]  Ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質（ＲＡＣ）１完全長ｃＤＮＡ：
5'-AGTTTTCCTCAGCTTTGGGTGGTG-3'及び
5'-AAAGCGTACAAAGGTTCCAAGGGA-3';
【０２２４】
[0222]  ＲＡＣ１ゲノム  エクソン２：
5'-TCAGGGTACCAATGTGTATGTGGTG-3'及び
5'-TGGTCAAAGAAATGTGAAACCCGT-3';
【０２２５】
[0223]  ＲＡＣ１ゲノム  エクソン４：
5'-CCTTCCCAGCAACATGTAGAAAGC-3'及び
5'-CAGCCTGGACACAACAGAGTGAGA-3';
【０２２６】
[0224]  ＲＡＣ２完全長ｃＤＮＡ：
5'-CTGAGCTGTCACCACCGACACTCT-3'及び
5'-AGCTCTGCAGCCATCTGCTAAGAA-3';
【０２２７】
[0225]  ＲＡＣ２ゲノム  エクソン２：
5'-CTTCTACCCCTTCCTCCATACCCC-3'及び
5'-CCCTCTTGCACTTCCTGTCTTTCA-3'
【０２２８】
[0226]  ＲＡＣ３完全長  ｃＤＮＡ：
5'-ATTTCTCCGCAGCTCGGCTC-3'及び
5'-GGACACCACACGTCTCAACACAAC-3'. 
【０２２９】
[0227]  部位特異的突然変異には以下のプライマーを使用した。
【０２３０】
[0228]
RAC1(P29S):
5'-CTGATCAGTTACACAACCAATGCATTTTCTGGAGAATATATCCC-3'及び
5'-GGGATATATTCTCCAGAAAATGCATTGGTTGTGTAACTGATCAG-3';
【０２３１】
[0229]  RAC1(C157Y):
5'-GTAAAATACCTGGAGTACTCGGCGCTCACACAG-3'及び
5'-CTGTGTGAGCGCCGAGTACTCCAGGTATTTTAC-3';
【０２３２】
[0230]  RAC1(P179L):
5'-GCAGTCCTCTGCCTGCCTCCCGTGAAG-3'及び
5'-CTTCACGGGAGGCAGGCAGAGGACTGC-3'
【０２３３】
[0231]  RAC2(I21M):
5'-GCAAGACCTGCCTTCTCATGAGCTACACCACCAAC-3'及び
5'-GTTGGTGGTGTAGCTCATGAGAAGGCAGGTCTTGC-3'
【０２３４】
[0232]  RAC2(P29Q):
5'-CACCACCAACGCCTTTCAAGGAGAGTACATCCCCAC-3'及び
5'-GTGGGGATGTACTCTCCTTGAAAGGCGTTGGTGGTG-3'
【０２３５】
[0233]  RAC2(D47Y):
5'-CAGCCAATGTGATGGTGTACAGCAAGCCAGTGAAC-3'及び
5'-GTTCACTGGCTTGCTGTACACCATCACATTGGCTG-3'
【０２３６】
[0234]  RAC2(R106H):
5'-CGGCACCACTGCCACAGCACACCCATC-3'及び
5'-GATGGGTGTGCTGTGGCAGTGGTGCCG-3'.
【０２３７】
[0235]  リアルタイムＲＴ−ＰＣＲには以下のプライマーを使用した。
【０２３８】
[0236]  RAC1:
5'-AAGCTGACTCCCATCACCTATCCG-3'及び
5'-CGAGGGGCTGAGACATTTACAACA- 3';
【０２３９】
[0237]  RAC2:
5'-AAGAAGCTGGCTCCCATCACCTAC- 3'及び
5'-AACACGGTTTTCAGGCCTCTCTG- 3';
【０２４０】
[0238]  RAC3:
5'-AAGAAGCTGGCACCCATCACCTAC- 3'及び
5'-ATCGCCTCGTCAAACACTGTCTTC-3';
【０２４１】
[0239]  NRAS:
5'-TCAACAGCAGTGATGATGGGACTC-3'及び
5'-AGGGTGTCAGTGCAGCTTGAAAGT- 3';
【０２４２】
[0240]  KRAS:
5'-TGGGGAGGGCTTTCTTTGTGTATT- 3'及び
5'-TGCTAAGTCCTGAGCCTGTTTTGTG- 3';
【０２４３】
[0241]  HRAS:
5'-AGCAGATCAAACGGGTGAAGGACT- 3'及び
5'-GATCTCACGCACCAACGTGTAGAA- 3'.
【０２４４】
[0242]Ｃ．定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
ＨＴ１０８０中のＲＡＣ１、ＲＡＣ２、ＲＡＣ３、ＮＲＡＳ、ＨＲＡＳ及びＫＲＡＳのメッセージレベルを調べるために、RNeasy（登録商標）のMini column（Qiagen）を使用して全ＲＮＡを単離し、オリゴ（ｄＴ）プライマー及びReverTra Ace逆転写酵素（Toyobo）を使用して逆転写反応に供した。特異的ｃＤＮＡの量を、QuantiTect SYBR Green（登録商標）のPCR Kit（Qiagen）を使用したリアルタイムＰＣＲ解析で定量した。増幅プロトコルには、９４℃で１５秒間、６０℃で３０秒間、及び７２℃で６０秒間のインキュベーションが含まれた。ＰＣＲ産物へのSYBR Green（登録商標）染料の取り込みを、ABI PRISM 7700（登録商標）配列検出システム（Applied Biosystems）でリアルタイムにモニタし、それによってＰＣＲ産物の指数関数的増幅が開始するサイクル（threshold cycle; ＣＴ）を判定することができた。対応するコントロールのｃＤＮＡで生成したＣＴ標準曲線に基づき、各遺伝子のｃＤＮＡコピー数を定量した。
【０２４５】
[0243]Ｄ．次世代シーケンサでのｃＤＮＡ配列決定
９０６個のヒトタンパク質コード遺伝子のｃＤＮＡを捕捉するために、１２０塩基の特注ＲＮＡプローブをデザインし（Ueno他 (2012)、Cancer Sci. 103:131-135）、Agilent Technologiesが合成した。SureSelect（登録商標）のTarget Enrichment system（Agilent Technologies）を使用してＨＴ１０８０細胞から捕捉されたｃＤＮＡを取得し、Genome Analyzer（登録商標）のIIx（Illumina）でディープシーケンシング（deep sequenceing）に供した。学内の計算パイプラインを使用して非同義的変異についてデータセットをスクリーニングした（Ueno他 (2012)、Cancer Sci. 103:131-135）。東京大学、自治医科大学、名古屋大学大学院医学部、及びThe Cancer Instituteの倫理委員会から臨床サンプルの解析の承認を受けた。ハイスループットにするために、選択されたＲＡＣ１、ＲＡＣ２、及びＲＡＣ３のｃＤＮＡのディープシーケンシングでは、各ＲＡＣタンパク質の完全長ｃＤＮＡを細胞株からのＲＴ−ＰＣＲで増幅し、サンガーのシーケンシングに供して非同義的変異についてスクリーニングした。
【０２４６】
[0244]Ｅ．ＲＡＣ変異体の形質転換アッセイ
ＨＴ１０８０及びＨＣＣ１１４３細胞からのＲＴ−ＰＣＲでＲＡＣ１及びＲＡＣ２  ｃＤＮＡのコード配列を増幅し、強化緑色蛍光タンパク質とともにＲＡＣ１又はＲＡＣ２を発現させるためにレトロウイルスプラスミドｐＭＸＳ−ｉｒｅｓ−ＥＧＦＰ（Clontech）に挿入した。上記プラスミドでの部位特異的突然変異によって、ＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）、ＲＡＣ１（Ｃ１５７Ｙ）、ＲＡＣ１（Ｐ１７９Ｌ）、ＲＡＣ２（Ｉ２１Ｍ）、ＲＡＣ２（Ｐ２９Ｑ）、ＲＡＣ２（Ｄ４７Ｙ）、又はＲＡＣ２（Ｐ１０６Ｈ）の発現プラスミドを作製した。感染性ウイルス粒子を生成するために、両栄養性レトロウイルスパッケージングプラスミド（Takara Bio）とともにプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入した。次に、ウイルス粒子を使用して３Ｔ３及びＭＣＦ１０Ａ細胞に感染させ、その後、０．４％（ｗｔ／ｖｏｌ）の寒天（SeaPlaque（登録商標）ＧＴＧアガロース；FMC）を含む培地に懸濁し、６ウェルのプレート内の０．５３％（ｗｔ／ｖｏｌ）の寒天を含む培地の上に積層した。１４日間（３Ｔ３）又は２０日間（ＭＣＦ１０Ａ）、コロニーを形成させ、次にクリスタルバイオレットで染色した。野生型又は変異体形態のＲＡＣ１又はＲＡＣ２を発現する３Ｔ３細胞（１．０×１０6）は、ｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍形成能アッセイのためにｎｕ／ｎｕマウスに皮下（ｓｃ）注射も実施した。マウスの実験は、東京大学の動物実験委員会から承認を受けた。
【０２４７】
[0245]Ｆ．ＲＡＣタンパク質の活性
ＰＡＫ１−ｐ２１結合ドメイン（ＰＢＤ）のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質に基づくプルダウンアッセイで、ＧＴＰ結合ＲＡＣタンパク質を検出し、Rac1/Cdc42 Activation Assay Kit（Millipore）を使用してこれを実行した。ＲＡＣ依存性シグナル伝達活性をルシフェラーゼで測定するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、野生型又は変異体形態のＲＡＣ１又はＲＡＣ２の発現プラスミドをpGL-TK（Promega）及びSRE.Lレポータープラスミドとともに４８時間トランスフェクトした。SRE.Lレポータープラスミドでは、修飾血清応答因子−応答配列をホタルのルシフェラーゼｃＤＮＡに結合させた（Hill他 (1995)、Cell 81:1159-1170）。次に、細胞溶解産物中のホタルルシフェラーゼの活性を測定し、ウミシイタケルシフェラーゼで正規化した。免疫ブロット解析のために、ＲＡＣ１及びＮＲＡＳに対する抗体（クローン２３Ａ８及びＯＰ２５）をMilliporeから、ＲＡＣ２に対する抗体（ａｂ２２４４）をAbcamから、ＡＣＴＢに対する抗体（１３Ｅ５）をCell Signaling Technologyから入手した。ファロイジン染色のために、細胞を４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液にて室温で１０分間固定し、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）Triton X-100のＰＢＳ溶液で５分間透過性処理して、次にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；１０マイクログラム／ｍＬ）の存在下でAlexa Fluor 594−結合ファロイジンＶ（Molecular Probes、Invitrogen）に曝露した。次に、細胞をHoechst 33258で対比染色し、蛍光顕微鏡（Olympus）で観察した。
【０２４８】
[0246]Ｇ．ＲＮＡ干渉
コントロール、ＲＡＣ１、及びＮＲＡＳのｓｉＲＮＡをＤｈａｒｍａｃｏｎから取得し、ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したトランスフェクションによってＨＴ１０８０に導入した。ＲＮＡｉの標的シーケンスは５’−ＵＡＡＧＧＡＧＡＵＵＧＧＵＧＣＵＧＵＡ−３’（ＲＡＣ１  ｓｉＲＮＡ  ＃７及びｓｈＲＮＡ）、５’−ＣＧＧＣＡＣＣＡＣＵＧＵＣＣＣＡＡＣＡ−３’（ＲＡＣ１  ｓｉＲＮＡ  ＃９）、５’−ＡＵＡＣＧＣＣＡＧＵＡＣＣＧＡＡＵＧＡ−３’（ＮＲＡＳ  ｓｉＲＮＡ  ＃３）、及び５’−ＡＡＡＧＣＧＣＡＣＵＧＡＣＡＡＵＣＣＡ−３’（ＮＲＡＳ  ｓｉＲＮＡ  ＃４）であった。トランスフェクション後、他に断りのない限り、細胞を１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＦＢＳを含有する培地で維持した。pMKO.1プラスミド（Addgene）でｓｈＲＮＡの発現ベクターを構築した。ｓｈＲＮＡ抵抗性ＲＡＣ１  ｃＤＮＡを生成するために、ヒトＲＡＣ１  ｃＤＮＡ（GenBank登録番号NM_006908.4）のヌクレオチド６７９〜６９７のＴＡＡＧＧＡＧＡＴＴＧＧＴＧＣＴＧＴＡ配列をＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＧＧＡＧＣＡＧＴＧに変更した。かかる塩基の置換は、翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列に影響を与えない。
【０２４９】
[0247]  様々なｓｉＲＮＡをトランスフェクトしたＨＴ１０８０細胞の細胞周期を、FITC BrdU Flow Kit及びFACSCanto（登録商標）IIの計器（両方ともBD Biosciencesから）で分析した。ＣＡＳＰ３／ＣＡＳＰ７の酵素活性をCasepase-Glo 3/7（登録商標）Assay（Promega）で測定した。
【０２５０】
[0248]  他のｓｉＲＮＡとしては、ＰＡＫ１（#M-003521-04-0005）、ＲＯＣＫ１（#M-003536-02-0005）、及びＲＯＣＫ２（#M-004610-02-0005）をDharmaconから購入した。
【０２５１】
[0249]Ｈ．組換えＲＡＣ１タンパク質の生化学的分析
野生型又は変異体形態のＲＡＣ１の１−１８８のアミノ酸に対応するコードｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ６−Ｐ−１プラスミド（GE Healthcare Life Sciences）に挿入した。そのプラスミドを含む大腸菌BL21-CodonPlus（登録商標）DE3（Stratagene）中で、０．１ｍＭのイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドでＲＡＣ１又はその変異体のＧＳＴ融合タンパク質を２０℃で１６時間誘導し、グルタチオン−セファロース４Ｂビーズ（GE Healthcare Life Sciences）で精製した。各ＧＳＴ融合タンパク質を、PreScission（登録商標）Protease（GE Healthcare Life Sciences）及びグルタチオン−セファロース４Ｂビーズで１６時間、さらにインキュベートし、ＧＳＴ部分を除去した。その結果の上澄みを、５０ｍＭのトリスＨｃｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、及び０．１％（ｗｔ／ｖｏｌ）のLubro PX（Nacalai Tesque）で構成された緩衝液で平衡化したSephadex G-25ゲル濾過カラム（GE Healthcare Life Sciences）に適用し、Ｒａｃタンパク質を含有する分画を採取した。
【０２５２】
[0250]  ＲＡＣ１タンパク質の生化学的アッセイを、Kontani他 (2002)、J. Biol. Chem. 277:41070-41078に記載された方法にわずかな修正を加えて実施した。［35Ｓ］ＧＴＰγＳ−結合アッセイでは、５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．８１ｍＭのＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、０．０００８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のLubrol PX、及び２００マイクログラム／ｍＬのＢＳＡからなる５０マイクロリットルの溶液中で、精製したタンパク質（５ｐｍｏｌ）を、３０℃にて５マイクロメートルの放射性標識ヌクレオチド（７，０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）と共にインキュベートした。様々な時間でインキュベートした後、サンプルを１ｍＬの氷冷した洗浄用緩衝液［２０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭのＭｇＣｌ2、及び１００ｍＭのＮａＣｌ］で希釈し、ニトロセルロース膜（０．４５マイクロメートルのポアサイズ；Advantec MFS）で濾過した。膜は、２ｍＬの氷冷した洗浄用緩衝液で４回洗浄し、６８℃で乾燥した。膜上に残った放射能を、液体シンチレーションカウンタで測定した。
【０２５３】
[0251]  ［3Ｈ］ＧＤＰ−及び［35Ｓ］ＧＴＰγＳ−解離アッセイでは、５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．８１ｍＭ（Ｃ１５７Ｙ変異体の場合）又は０．１ｍＭ（その他の場合）のＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、０．０００７％（ｗｔ／ｖｏｌ）のLubrol PX、及び２００マイクログラム／ｍＬのＢＳＡの溶液中で、精製したタンパク質（５ｐｍｏｌ）を、５マイクロメートルの放射性標識ヌクレオチド（［3ＨＧＤＰ］の場合は２，０００ｄｐｍ／ｐｍｏｌ、［35Ｓ］ＧＴＰγＳの場合は２，０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）と共に１０分間インキュベートした。Ｃ１５７Ｙ変異体に放射性標識ヌクレオチドを前負荷するために、高Ｍｇ2+条件（終濃度０．８ｍＭ）を使用した。低Ｍｇ2+条件（終濃度４５ｎＭ）では変異体がヌクレオチドに効率的に結合できなかったからである。非標識ＧＴＰγＳ及びＭｇＣｌ2を終濃度２００マイクロメートル及び０．８ｍＭのＭｇ2+まで添加して、タンパク質からの［3Ｈ］ＧＤＰ又は［35Ｓ］ＧＴＰγＳの解離を開始した。３０℃で様々な時間だけインキュベートした後、上述したようにニトロセルロース膜を使用し、［3Ｈ］ＧＤＰ−又は［35Ｓ］ＧＴＰγＳ−結合タンパク質の量を測定した。
【０２５４】
[0252]  ＧＴＰアーゼのアッセイでは、５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１．８１ｍＭ（Ｃ１５７Ｙ変異体の場合）又は０．１ｍＭ（その他の場合）のＭｇＣｌ2、１ｍＭのＤＴＴ、０．０００８％（ｗｔ／ｖｏｌ）のLubrol PX、及び２００マイクログラム／ｍＬのＢＳＡの溶液中で、精製したタンパク質に、５マイクロメートルの［γ−32Ｐ］ＧＴＰ（４，０００ｃｐｍ／ｐｍｏｌ）を前負荷し、次に非標識ＧＴＰ及びＭｇＣｌ2をそれぞれ終濃度１及び０．８ｍＭのＭｇ2+を添加することによって、ＧＴＰの加水分解反応を開始した。３０℃で様々な時間インキュベートした後、５ｐｍｏｌのＲＡＣタンパク質（５０マイクロリットル）を含む反応混合物を、７５０マイクロリットルの５０ｍＭの氷冷ＮａＨ2ＰＯ4及び５％（ｗｔ／ｖｏｌ）の活性炭（Wako Pure Chemical Industries）と混合し、氷上で１５分間インキュベートした。次に混合物を１５，０００×ｇで１０分間、４℃で遠心分離し、タンパク質から解放された32Ｐiの量について、上澄みを液体シンチレーションカラムで分析した。
【０２５５】
[0253]実施例２：ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）腫瘍性タンパク質の同定
【０２５６】
[0254]  線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０中の形質転換遺伝子を同定するために（Rasheed他 (1974)、Cancer 33:1027-1033）、癌関連遺伝子（ｎ＝９０６）のｃＤＮＡをＨＴ１０８０細胞から単離し、Genome Analyzer IIx（GAIIx）システムでのディープシーケンシングに供した。取得した９２，０２５，７３９の読み取り値で品質フィルタリングを実行し、９０６個の標的遺伝子のうち８４３個（９３．０％）にマッピングされた４５，３２５，３７７個の固有の読み取り値が得られた。遺伝子８４３個の読み取り値の平均カバレッジは、ヌクレオチド１個当たり４９５ｘであり、遺伝子５６８個の捕捉領域の７０％以上が、１０ｘ以上のカバレッジで読み取られた。
【０２５７】
[0255]  データセット中の非同義的変異を、Ueno他 (2012)、Cancer Sci 103:131-135 に従って計算パイプラインを使用してスクリーニングすると、合計５個のミスセンス変異で３０ｘ以上のカバレッジの閾値、及び３０％以上の変異率が明らかになった（表１）。
【０２５８】
[0256]
【表１】
2015525563.tif 000002
【０２５９】
[0257]  これらの変異のうちの１つ、すなわちアミノ酸の位置６１でＧｌｎからＬｙｓに置換することになるＮＲＡＳ（GenBank登録番号NM_002524.4）のヘテロ接合性ミスセンス変異（Ｑ６１Ｋ）は、この細胞株で報告されており（Hall他 (1983)、Nature 303:396-400）、ＮＲＡＳの最もよくみられる形質転換変異である（Cox及びDer (2010)、Small GTPases 1:2-27）。別の低分子ＧＴＰアーゼ、ＲＡＣ１のミスセンス変異も発見された（図１及び表１）。したがって、ヒトＲＡＣ１  ｃＤＮＡ（GenBank登録番号NM_006908.4）の位置５１６におけるＡからＴへの転換は、コードしたタンパク質の位置９２でＡｓｎからＩｌｅへの置換になり、この位置をカバーする合計２４，２３８個の読み取り値のうち１１，５２５個（４７．５％）で同定された。
【０２６０】
[0258]  ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）の形質転換能を調べるために、マウス３Ｔ３線維芽細胞及びＭＣＦ１０Ａヒト乳腺上皮細胞（Debnath他 (2003)、Methods 30:256-268）に、ヒトＲＡＣ１の野生型又はＮ９２Ｉ変異体形態をコードするレトロウイルスを感染させ、次に足場非依存性増殖を評価するために細胞を軟寒天に播種した。野生型ＲＡＣ１を発現する３Ｔ３細胞もＭＣＦ１０Ａ細胞も軟寒天中で増殖せず（図１Ａ）、ＲＡＣ１に形質転換能が欠落していることを示した。対照的に、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）を発現する細胞は、軟寒天中で容易に増殖し（図１Ａ）、このＲＡＣ１変異体が足場非依存性増殖の性質を３Ｔ３細胞とＭＣＦ１０Ａ細胞の両方に与えたことを示す。ＲＡＳタンパク質の発癌性Ｇ１２Ｖ変異体形態の場合に対応するアミノ酸置換を含むＲＡＣ１の人為的変異体であるＲＡＣ１（Ｇ１２Ｖ）（Ridley他 (1992)、Cell 70:401-410）の形質転換能も確認された。
【０２６１】
[0259]実施例３：ＲＡＣ１及びＲＡＣ２の他の形質転換変異の同定
ＲＡＣタンパク質の別の形質転換変異を同定した。ヒトＲＡＣ１、ＲＡＣ２（GenBank登録番号NM_002872.3)、及びＲＡＣ３（GenBank登録番号NM_005052.2）のｃＤＮＡを、４０の癌細胞株から単離し（表２）、サンガー配列決定法でそのヌクレオチド配列を判定すると、乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−１５７、ＣＭＬ細胞株ＫＣＬ−２２、及び乳癌細胞株ＨＣＣ１１４３で、それぞれＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）、ＲＡＣ２（Ｐ２９Ｑ）、及びＲＡＣ２（Ｐ２９Ｌ）が発見された（図１及び表３）。癌ゲノム変異のＣＯＳＭＩＣデータベース（Release V59；cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmicのワールドワイドウェブで入手可能）でＲＡＣ１、ＲＡＣ２、及びＲＡＣ３変異を検索したところ、ヒトの腫瘍で検出される様々なアミノ酸置換が明らかになった。すなわち、ＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）、ＲＡＣ１（Ｃ１５７Ｙ）、ＲＡＣ１（Ｐ１７９Ｌ）、ＲＡＣ２（Ｉ２１Ｍ）、ＲＡＣ２（Ｐ２９Ｌ）、ＲＡＣ２（Ｄ４７Ｙ）、及びＲＡＣ２（Ｐ１０６Ｈ）である（表３）。臨床サンプルで同定されたこれらのＲＡＣ１及びＲＡＣ２変異はすべて、対になった正常細胞のゲノムに対応する変異が存在しなかったことから、体細胞性であることが確認された。
【０２６２】
[0260]
【表２】
2015525563.tif 000003
【０２６３】
[0261]
【表３】
2015525563.tif 000004
［表３］
【０２６４】
[0262]  これらの様々なＲＡＣ１及びＲＡＣ２変異体の形質転換能を調べるために、各タンパク質を３Ｔ３及びＭＣＦ１０Ａ細胞中で発現させ、細胞の足場非依存性増殖を評価した。野生形のＲＡＣ２は３Ｔ３又はＭＣＦ１０Ａ細胞を形質転換せず、軟寒天中の増殖は、ＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）、ＲＡＣ１（Ｃ１５７Ｙ）、ＲＡＣ２（Ｐ２９Ｌ）、又はＲＡＣ２（Ｐ２９Ｑ）を発現する３Ｔ３細胞では見られたが、ＲＡＣ１（Ｐ１７９Ｌ）、ＲＡＣ２（Ｉ２１Ｍ）、ＲＡＣ２（Ｄ４７Ｙ）、又はＲＡＣ２（Ｐ１０６Ｈ）を発現する３Ｔ３細胞では見れらなかった（図２Ａ）。興味深いことに、アッセイのコロニー数は、アミノ酸置換のタイプや細胞のタイプによってかなり変動した。例えば、ＲＡＣ１（Ｃ１５７Ｙ）は、他の形質転換変異体と比較して、軟寒天中で生じるコロニーが少なかった。さらに、乳癌細胞株で同定されたＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）は、３Ｔ３細胞の場合よりＭＣＦ１０Ａの方が多数のコロニーを生成した。逆に、線維肉腫細胞株で同定されたＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）は、ＭＣＦ１０Ａ細胞の場合より３Ｔ３細胞の方が多数のコロニーを生成した。
【０２６５】
[0263]  ＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）、ＲＡＣ１（Ｃ１５７Ｙ）、ＲＡＣ２（Ｐ２９Ｌ）、及びＲＡＣ２（Ｐ２９Ｑ）変異体の発癌活性を、ヌードマウスでの腫瘍形成能アッセイでさらに確認したところ（図２Ｂ）、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）の活性が、このアッセイでは３Ｔ３細胞の形質転換で最も顕著であった。ＮＲＡＳ（Ｑ６１Ｋ）を発現する３Ｔ３細胞の軟寒天中のコロニー数は、発癌性ＲＡＣ１又はＲＡＣ２変異体を発現する細胞の場合より少なく（図２Ａ）、これらの低分子ＧＴＰアーゼの発現は３Ｔ３で容易に確認された（図３）。ＮＲＡＳ（Ｑ６１Ｋ）を発現する同じ３Ｔ３細胞由来の皮下（ｓｃ）腫瘍は、ＲＡＣ１／ＲＡＣ２変異体を発現する腫瘍より高速で増殖し（図２Ｂ）たことから、ＧＴＰアーゼの形質転換能の強度測定値は、アッセイシステムによって変動し得ることが示された。
【０２６６】
[0264]  かかる発癌能がＲＡＣ１又はＲＡＣ２の活性と直接関係するのか調べるために、ＲＨＯファミリーのＧＴＰアーゼによって引き起こされる細胞内シグナル伝達に選択的に応答するルシフェラーゼレポータープラスミドを使用し、変異タンパク質の活性を評価した（Hill 他 (1995)、Cell 81:1159-1170）。軟寒天及び腫瘍形成能アッセイからのデータと一致して、ＲＡＣ１及びＲＡＣ２の形質転換変異体のみが、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞内にかなりのレベルのルシフェラーゼ活性を生じた（図２Ｃ）。
【０２６７】
[0265]  活性型ＲＡＣ１又はＲＡＣ２には、ＧＴＰが結合していると予想される。そこで、ＰＡＫ１のｐ２１−結合ドメイン（ＰＢＤ）に基づくプルダウンアッセイを使用して、ＲＡＣ１及びＲＡＣ２腫瘍性タンパク質のＧＴＰ結合状態を調べた。形質転換ＲＡＣ１及びＲＡＣ２変異体はすべて、ＧＴＰ−結合状態が優先的に存在することが判明し（図２Ｄ）、その構成的活性を示した。さらに、これらのＲＡＣ１及びＲＡＣ２変異体は、３Ｔ３細胞中のアクチン細胞骨格の著しい再構成を誘発し、その結果、原形質膜における波打ちに重合アクチンが蓄積した（図４）。
【０２６８】
[0266]実施例４：治療標的としてのＲＡＣ１及びＲＡＣ２の同定
ＮＲＡＳ（Ｑ６１Ｋ）も３Ｔ３細胞を形質転換することが知られているので（図２Ａ；Marshall他 (1982)、Nature 299:171-173）、本明細書で提供するデータは、ＨＴ１０８０細胞が２つの独立した発癌性ＧＴＰアーゼを含むことを示す。そこで、この肉腫細胞株における主たる増殖推進物質はＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）なのかＮＲＡＳ（Ｑ６１Ｋ）なのか調べた。ＲＡＣ１又はＮＲＡＳの発現を弱めるようにデザインされた幾つかの低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のうち、各ｍＲＮＡを特異的に標的とする２つの独立したｓｉＲＮＡ（図５Ａ）を選択した。いずれかのＮＲＡＳ  ｓｉＲＮＡをＨＴ１０８０細胞にトランスフェクトした結果、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＦＢＳの存在下で細胞増殖を穏やかに阻害したが、いずれかのＲＡＣ１  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたものは、細胞増殖をほとんど阻害した（図５Ｂ）。いずれかのＲＡＣ１  ｓｉＲＮＡに加えてＮＲＡＳ  ｓｉＲＮＡでトランスフェクトしても、細胞増殖に対する効果が増加しなかった（図５Ｂ）。１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ＦＢＳ存在下（図６Ａ）、又はＦＢＳ非存在下（図６Ｂ）の培養でも同様のデータが観察された。ＲＡＣ１／ＮＲＡＳのサイレンシング効果をさらに調べるために、ＲＡＣ１又はＮＲＡＳに対するｓｉＲＮＡでトランスフェクトしたＨＴ１０８０の細胞周期分配を定量した。図７Ａに示すように、ＤＮＡの合成は、ＲＡＣ１又はＮＲＡＳのノックダウンによって同等に抑制された。しかし、ＣＡＳＰ３／ＣＡＳＰ７活性（アポトーシスの代理マーカー）は、ＲＡＣ１の枯渇によってのみ顕著に誘発された（図７Ｂ）。したがって、ＲＡＣタンパク質はＲＡＳ非依存性細胞生存シグナルを提供するようであり、このことは、ＦＢＳ非存在下でもＲＡＣ１の欠乏がＮＲＡＳの欠乏よりもＨＴ１０８０に大きい抗増殖効果を与えるという事実から裏付けられる（図７Ｂ）。これらのデータは、活性ＲＡＣ１がＨＴ１０８０に必須の増殖推進物質であり、したがって治療標的となる可能性があることを示す。さらに、データは、十分に発達した癌を生じるには、発癌性ＲＡＳタンパク質に追加の形質転換が起こる必要があり得ることを示す。
【０２６９】
[0267]  次に、ＨＴ１０８０細胞に、ＲＡＣ１  ｍＲＮＡを標的とするショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を発現するレトロウイルスを感染させた。ＲＡＣ１  ｓｈＲＮＡの発現は細胞増殖を著しく抑制する一方、ｓｈＲＮＡ抵抗性ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）の発現の回復は、この効果を逆転させ（図５Ｃ及び図８）、ＲＡＣ１  ｓｈＲＮＡの効果が標的を外したことによって作り出された結果ではなかったことを示す。ｓｈＲＮＡ抵抗性の野生型ＲＡＣ１を強制的に発現させても、ＲＡＣ１  ｓｈＲＮＡが細胞増殖に与える阻害効果を逆転させることができなかったことから、ｓｈＲＮＡによる増殖抑制は、野生型タンパク質ではなくＮ９２Ｉ変異の枯渇によるものであることが示された。ＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）を含む乳癌細胞株のＭＤＡ−ＭＢ−１５７でも、同様の実験を実施した。この場合もＲＡＣ１  ｓｈＲＮＡは細胞増殖を阻害し、この効果は、野生型タンパク質の強制発現よりもｓｈＲＮＡ抵抗性ＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）の発現回復によって、より大きく逆転された（図５Ｄ及び図８）。
【０２７０】
[0268]実施例５：ＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）、ＲＡＣ１（Ｃ１５７Ｙ）は高速周期変動変異である
ヒト腫瘍に見られるＲＡＳタンパク質のＧ１２、Ｇ１３、又はＱ６１における発癌性変異は、これらのタンパク質の内因性ＧＴＰアーゼ活性を減少させ、それによってこれらをＧＴＰ結合状態に維持する（Adari他 (1988)、Science 240:518-521；Cales他 (1988)、Nature 332:548-551）。他方で、ＨＲＡＳ又はＲＨＯファミリーのタンパク質Ｃｄｃ４２ＨｓにおけるＦ２８Ｌの人為的置換は、外因性グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）が関与することなくＧＤＰ結合状態からＧＴＰ結合状態への転移を加速させることによって、構成的活性を与えることが示された（Reinstein他 (1991)、J. Biol. Chem. 266:17700-17706；Lin他 (1997)、Curr. Biol. 7:794-797）。
【０２７１】
[0269]  ＲＡＣ１の形質転換変異がこれらのタンパク質の構成的活性をいかにもたらすかを調べるために、ＧＴＰ及びＧＤＰに対するこれらの変異体の親和性を調べた。野生型ＲＡＣ１と比較して、ＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）、及びＲＡＣ１（Ｃ１５７Ｙ）のすべてが、ＧＥＦタンパク質を加えなくても、ＧＴＰγＳ（非加水分解性ＧＴＰ類似体）とｉｎ  ｖｉｔｒｏで急速に結合することが判明した（図９Ａ）。同様に、ＲＡＣ１の変異体形態からのＧＤＰの解離が大幅に加速された（図９Ｂ）。他方で、これらの変異体の内因性ＧＴＰアーゼ活性は、野生型タンパク質のそれと同等（Ｐ２９Ｓ及びＮ９２Ｉの場合）、又はそれよりわずかに高かった（Ｃ１５７Ｙの場合）（図９Ｃ）。したがって、これらのデータによると、ヒト癌に関連する形質転換ＲＡＳ変異体とは対照的に、ＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）、及びＲＡＣ１（Ｃ１５７Ｙ）は高速周期変動変異であり、ＧＴＰアーゼ活性の喪失の結果というよりも、ＧＤＰ解離の速度上昇の結果として、ＧＴＰ結合状態となる可能性が高くなる。
【０２７２】
[0270]  ＧＴＰγＳの解離も、ＲＡＣ１（Ｃ１５７Ｙ）の場合のみ加速し、ＲＡＣ１の野生型Ｐ２９Ｓ又はＮ９２Ｉの形態では加速しなかった（図９Ｄ）。したがって、ＲＡＣ１（Ｃ１５７Ｙ）は、ＧＴＰの会合と解離の両方が加速されるという点でユニークな変異体であり、そのことが、ＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）又はＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）の場合と比較して穏やかな形質転換能の分子的根拠となり得る（図２）。
【０２７３】
[0271]  ＲＡＣ１の立体構造（図７Ｅ）では、Ｐ２９はスイッチＩ領域に位置し、Ｃ１５７は結合したＧＴＰのグアニン環に隣接して配置される。したがって、これらの残基の置換は、ＧＤＰ又はＧＴＰに対するタンパク質の親和性に影響するようであり（図１０）、これはＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）について最近示された現象である（Krauthammer他 (2012)、Nat. Genet. 44:1006-1014）。対照的に、Ｎ９２はＧＤＰ／ＧＴＰの結合ポケットから離れて位置し、したがってＮ９２Ｉの置換がＲＡＣ１を構成的に活性状態にする構造的メカニズムは理解できないままである（図９Ｅ及び図１０）。しかし、残基Ｎ９２はＲＡＣ１のＰループ内でＤ１１の付近に位置し（図９Ｅ及び図１１）、この位置でイソロイシンと置換すると、Ｎ９２のアミノ基とＤ１１のカルボキシ基との相互作用が消滅する。したがって、Ｎ９２Ｉ変異がＰループへの影響を通してＧＤＰ／ＧＴＰの結合に影響する可能性がある。
【０２７４】
[0272]実施例６：ＲＡＣの下流の標的
ＲＡＣタンパク質によって推進されるシグナルは、ＰＡＫ１、ＲＯＣＫ１及び／又はＲＯＣＫ２セリン／トレオニンキナーゼを通して媒介されることが知られている。ＲＡＣ１のＰｈｅ−３７又はＴｙｒ−４０残基は、それぞれＲＯＣＫ１又はＰＡＫ１の結合／活性化に必須の役割を果たす（図１４Ａ；Lamarche他 (1996)、Cell 87:519-529）。ＲＡＣ１変異体の形質転換能にとってどの経路が不可欠であるかを判定するために、実験を実施した。ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）は、足場非依存性増殖の能力を３Ｔ３細胞に与える一方、ＲＡＣ１のＰｈｅ−３７のＡｌａへの置換により、かかる能力がほぼ完全に消滅する（図１４Ｂ）。Ｔｒｙ−４０における別の置換（Ｙ４０Ｃ）が、同様にＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）の発癌能を打ち消し、ＰＡＫ１及びＲＯＣＫ１が媒介した経路の両方が形質転換シグナル伝達に必須であることを示す。
【０２７５】
[0273]  さらに確認するために、ＰＡＫ１又はＲＯＣＫ１の発現を、対応するｓｉＲＮＡで個々に枯渇させた。ＰＡＫ１及びＲＯＣＫ１のノックダウンは両方とも、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）を含むＨＴ１０８０細胞の増殖を妨害した（図１４Ｃ）。ＲＯＣＫ１  ｓｉＲＮＡの増殖阻害効果はＰＡＫ１  ｓｉＲＮＡの効果ほど明らかではなかったので、キナーゼのＲＯＣＫファミリーの別のメンバーであるＲＯＣＫ２も枯渇させた。図１４Ｃで示すように、ＲＯＣＫ２のノックダウンはＲＯＣＫ１の場合より大幅にＨＴ１０８０の増殖を減少させた。これらのデータは、ＰＡＫ１、ＲＯＣＫ１及びＲＯＣＫ２キナーゼがすべて、タンパク質の活性型ＲＡＣファミリーを有する癌細胞の適切な治療標的であることを実証する。
【０２７６】
[0274]  以上に基づき、変異型ＲＡＣタンパク質の形質転換能が実証された。上述した細胞株を分析した結果、ＲＡＣ１及びＲＡＣ２の形質転換変異体、すなわち、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）及びＲＡＣ２（Ｐ２９Ｑ）が同定され、癌ゲノム変異のＣＯＳＭＩＣデータベースに寄託された（リリースＶ５９；ワールドワイドウェブのcancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmicで入手可能）ＲＡＣ１（Ｐ２９Ｓ）、ＲＡＣ１（Ｃ１５７Ｙ）、及びＲＡＣ２（Ｐ２９Ｌ）変異体の形質転換能が示された（表３）。対照的に、軟寒天のアッセイでは、データベースで見られたＲＡＣ１（Ｐ１７９Ｌ）、ＲＡＣ２（Ｉ２１Ｍ）、ＲＡＣ２（Ｄ４７Ｙ）、又はＲＡＣ２（Ｐ１０６Ｈ）変異体の形質転換能は明らかにならず、これらが「パッセンジャー変異体」である可能性を示唆した。しかし、体細胞的に獲得され、癌においてクローンとして選択されることから、これらの変異体もなお、腫瘍特性（転移能など）を修飾することによって癌の発生に寄与すると考えられている。
【０２７７】
[0275]  また、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）の発癌効果は、少なくともＨＴ１０８０細胞の生存シグナルに関して、ＮＲＡＳ（Ｑ６１Ｋ）の効果より顕著になり得る（図５Ｂ）。しかし、ＨＴ１０８０はＲＡＣファミリーのタンパク質の中でもＲＡＣ１をほぼ排他的に発現する一方、ＨＲＡＳ及びＫＲＡＳがＮＲＡＳに加えて弱く発現することに留意されたい（図１２）。したがって、図５ＢにおけるＮＲＡＳのノックダウンの効果は、残留ＨＲＡＳ／ＫＲＡＳタンパク質によって部分的に補償されることが可能である。
【０２７８】
[0276]  Paterson他は以前に、アルキル化薬（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）で処理し、その後に５−フルオロデオキシウリジン及び１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシンと共に培養し、ＨＴ１０８０のＮＲＡＳ減衰サブクローンを単離した（Paterson他 (1987)、Cell 51:803-812）。かかるサブクローンは平坦な細胞形状を有し、足場非依存性増殖の能力が低下している。同様に、ＮＲＡＳ  ｓｉＲＮＡをトランスフェクトすると、ＨＴ１０８０がさらに平坦な形状になる（図１３）。しかし、図５Ｂ及びPaterson他（Cell (1987) 51:803-812）で実証されているように、かかるＮＲＡＳ欠乏性ＨＴ１０８０はなお生存可能で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの増殖性を維持しており、ＮＲＡＳ（Ｑ６１Ｋ）に加えて他の癌遺伝子の存在が示唆された。したがって、ＮＲＡＳ（Ｑ６１Ｋ）及びＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）は、共同してこの線維腫瘍を完全に形質転換するようである。
【０２７９】
[0277]  ＲＡＣファミリータンパク質とＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＡＲＫタンパク質内の変異の共存に関して、メラノーマ中のＲＡＣ１の反復Ｐ２９Ｓ変異が、２つの研究で別個に報告されている（Krauthammer他 (2012)、Nat. Genet. 44:1006-1014；Hodis他 (2012)、Cell 150:251-263）。注目すべきことに、ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）は、ＲＡＣ変異陽性メラノーマのそれぞれ６個中４個及び７個中２個でも検出された。したがって、これらの観察結果は、ＨＴ１０８０細胞での知見とあわせると、ＲＡＣ１の活性化変異とＲＡＳ−ＲＡＦ−シグナル伝達経路の活性化変異は相互に排他的ではないことを示す。ＧＴＰアーゼのＲＡＣサブファミリーのメンバーは、ヒトで高レベルの配列同一性を示す。したがって、ＲＡＣ１のアミノ酸配列は、ＲＡＣ２又はＲＡＣ３の配列と９２％同一である。さらに、癌において変異したことが判明したＲＡＣ１又はＲＡＣ２のアミノ酸残基（表３）はすべて、ＲＡＣ１、ＲＡＣ２、及びＲＡＣ３で完全に保存されている。したがって、ヒト癌には同様の非同義的変異を有するＲＡＣ３の形質転換変異も存在するかもしれないが、かかる変異はこのスクリーニングでは検出されなかった。ＲＡＳファミリータンパク質の頻繁な変異部位（Ｇ１２、Ｇ１３、及びＱ６１）のいずれも、ＲＡＣ１又はＲＡＣ２において影響を受けないことが判明したが、ＲＡＣ１の人為的Ｇ１２Ｖ変異は構成的ＧＴＰ付加及び形質転換能を現さなかった。ＲＡＣタンパク質は、ＲＡＳファミリーメンバーの場合とは別個の細胞内機能（アクチン細胞骨格の組織化など）を実行するので、癌がｉｎ  ｖｉｖｏで発生するために、特異的細胞内経路のＲＡＣ推進による活性化が有利になるかもしれない。
【０２８０】
[0278]  肉腫（ＨＴ１０８０）、トリプルネガティブ乳癌（ＭＤＡ−ＭＢ−１５７及びＨＣＣ１１４３）、及び急性転化期のＣＭＬ（ＫＣＬ−２２）の細胞株でＲＡＣ１又はＲＡＣ２の活性化変異が同定されたので、トリプルネガティブ乳癌のサンプル（ｎ＝６６）について、ＲＡＣ１、ＲＡＣ２、及びＲＡＣ３  ｃＤＮＡのＧＡＩＩｘを用いたディープシーケンシングを、急性転化期のＣＭＬのサンプル（ｎ＝４３）ではＲＡＣ１及びＲＡＣ２  ｃＤＮＡのディープシーケンシングを、ＢＡＣ−ＡＢＬ１−陽性急性リンパ性白血病（ｎ＝３１）のディープシーケンシングを、さらに肉腫のサンプル（ｎ＝５３）ではＲＡＣ１  ｃＤＮＡのディープシーケンシングを実施した。これらのＲＡＣ  ｃＤＮＡで非同義的変異は検出されなかた。
【０２８１】
[0279]  本明細書で述べた結果は、ＲＡＣタンパク質が、多種多様な癌においてアミノ酸置換を通して発癌性になる可能性を有することを実証している。かかるＲＡＣ変異体が生じる頻度は低いようであるが、Krauthammer他（Nat. Genet. (2012) 44:1006-1014）及びHodis他（Cell (2012) 150:251-26324）の最近の研究は、これがメラノーマにおいて高くなる（約５％）を示唆している。ＨＴ１０８０細胞は、ＲＡＣ１（Ｎ９２Ｉ）の増大した活性に高く依存するので、低分子化合物又はＲＮＡｉで発癌性ＲＡＣタンパク質又はその下流のエフェクタを標的とすることは、かかる発癌性タンパク質を含む癌の治療に効果的なアプローチになることが明らかになるかもしれない。
【０２８２】
[0280]均等
当業者には、本明細書で述べた本発明の特定の実施形態に対して多くの均等物が認識され、又は日常的実験しか使用しないで確認することができる。かかる均等物は、請求の範囲に含まれるものとする。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【国際調査報告】
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