(57)【要約】  ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴う、新たな設計アンキリンリピートタンパク質、ならびにそのようなＰＤＧＦ結合タンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質を含む医薬的組成物、及び疾患の処置におけるそのようなタンパク質の使用を記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンキリンリピートドメインが、ＰＢＳ中で、１０−７Mを下回るＫｄを伴い、ＰＤＧＦ−ＢＢに結合する、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質。
【請求項２】
アンキリンリピートドメインが、ＰＢＳ中で、１０−７Mを下回るＩＣ５０値を伴い、ＰＤＧＦＲｂｅｔａへのＰＤＧＦ−ＢＢの結合を阻害する、請求項１記載の結合タンパク質。
【請求項３】
アンキリンリピートドメインが、１０−７Mを下回るＩＣ５０値を伴い、３Ｔ３線維芽細胞のＰＤＧＦ−ＢＢ刺激性増殖を阻害する、請求項１又は２記載の結合タンパク質。
【請求項４】
アンキリンリピートドメインが、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合について、配列番号２３〜６０からなる群より選択されるアンキリンリピートドメインと競合する、請求項１〜３のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項５】
アンキリンリピートドメインが、配列番号２３〜６０からなる群より選択される１つのアンキリンリピートドメインと少なくとも７０%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
それにおいて、該アンキリンリピートドメインの位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、場合により、欠損しており；ならびに、
該アンキリンリピートドメインの最後から二番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、場合により、Ａにより交換されている、請求項１〜４のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項６】
アンキリンリピートドメインが、配列番号２３〜６０からなる群より選択される１つのアンキリンリピートドメインと少なくとも７６%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
それにおいて、該アンキリンリピートドメインの位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、場合により、欠損しており；ならびに、
該アンキリンリピートドメインの最後から二番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、場合により、Ａにより交換されている、請求項５記載の結合タンパク質。
【請求項７】
アンキリンリピートドメインが、配列番号２３〜６０からなる群より選択される１つのアンキリンリピートドメインと、そのフレームワーク位置において少なくとも７０%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
それにおいて、該アンキリンリピートドメインの位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、場合により、欠損しており；ならびに、
該アンキリンリピートドメインの最後から二番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、場合により、Ａにより交換されている、請求項５記載の結合タンパク質。
【請求項８】
アンキリンリピートドメインが、配列番号２３〜６０からなる群より選択され、
それにおいて、該アンキリンリピートドメインの位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、場合により、欠損しており；ならびに、
該アンキリンリピートドメインの最後から二番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、場合により、Ａにより交換されている、請求項５記載の結合タンパク質。
【請求項９】
アンキリンリピートドメインが、配列番号２３〜６０からなる群より選択されるアンキリンリピートドメインと同じエピトープに付着する、請求項１〜８のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項１０】
アンキリンリピートドメインが、配列番号１２、１４、１５、１７、１８、及び１９からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびに配列（それにおいて、配列番号１２、１４、１５、１７、１８、及び１９における９つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される）を有するアンキリンリピートモジュールを含む、請求項１〜７又は９のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項１１】
アンキリンリピートドメインが、配列番号１２、１４、１５、１７、１８、及び１９からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびに配列（それにおいて、配列番号１２、１４、１５、１７、１８、及び１９における２つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される）を有するアンキリンリピートモジュールを含む、請求項１０記載の結合タンパク質。
【請求項１２】
アンキリンリピートドメインが、配列番号１２、１４、１５、１７、１８、及び１９からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびに配列（それにおいて、配列番号１２、１４、１５、１７、１８、及び１９のフレームワーク位置における８つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される）を有するアンキリンリピートモジュールを含む、請求項１０記載の結合タンパク質。
【請求項１３】
アンキリンリピートモジュールが、アミノ酸配列ＫＤＥＥＧＴＴＰＬＨＹＡＡＶＷＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１２）及び配列（それにおいて、配列番号１２における９つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換され、ならびに、それにおいて、
位置３のＥが、場合により、Ｄ、Ｗ、Ｑ、Ｉ、及びＹからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置４のＥが、場合により、Ｔ、Ｄ、Ｙ、及びＳからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置６のＴが、場合により、Ｓ及びＦからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置１１のＹが、場合により、Ｆにより交換され；
位置１４のＶが、場合により、Ａ、Ｙ、及びＴからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置１５のＷが、場合により、Ｆ、Ｋ、Ｖ、及びＹからなる群より選択されるアミノ酸により交換される）を有する、請求項１０記載の結合タンパク質。
【請求項１４】
アンキリンリピートモジュールが、アミノ酸配列ＫＤＥＥＧＴＴＰＬＨＹＡＡＶＷＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１２）（それにおいて、配列番号１２のフレームワーク位置における８つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換され、ならびに、それにおいて、
位置３のＥが、場合により、Ｄ、Ｗ、Ｑ、Ｉ、及びＹからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置４のＥが、場合により、Ｔ、Ｄ、Ｙ、及びＳからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置６のＴが、場合により、Ｓ及びＦからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置１１のＹが、場合により、Ｆにより交換され；
位置１４のＶが、場合により、Ａ、Ｙ、及びＴからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置１５のＷが、場合により、Ｆ、Ｋ、Ｖ、及びＹからなる群より選択されるアミノ酸により交換される）を有する、請求項１３記載の結合タンパク質。
【請求項１５】
アンキリンリピートドメインが、配列番号１３及び１６からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびに配列（それにおいて、配列番号１３及び１６における８つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される）を有するキャッピングモジュールを含む、請求項１〜１４のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項１６】
アンキリンリピートドメインが、配列番号１３及び１６からなる群より選択されるアミノ酸配列ならびに配列（それにおいて、配列番号１３及び１６のフレームワーク位置における７つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される）を有するキャッピングモジュールを含む、請求項１５記載の結合タンパク質。
【請求項１７】
ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合特異性を伴うアンキリンリピートドメインが、配列ＱＤＩＹＧＡＴＰＡＤＬＡＡＬＶＧＨＥＤＩＡＥＶＬＱＫＬＮ（配列番号１３）及び配列（それにおいて、配列番号１３における８つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換され、
それにおいて、
位置３のＩが、場合により、Ｋ、Ｌ、Ａ、及びＶからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置４のＹが、場合により、Ｗ、Ｆ、及びＳからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置６のＡが、場合により、Ｋにより交換され；
位置１４のＬが、場合により、Ｆ、Ｙ、及びＤからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置１５のＶが、場合により、Ｌ、Ｉ、Ａ、及びＮからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；ならびに
位置２３のＶが、Ｉ及びＬからなる群より選択されるアミノ酸により交換される）を伴う末端キャッピングモジュールを含む、請求項１５記載の結合タンパク質。
【請求項１８】
ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合特異性を伴うアンキリンリピートドメインが、配列ＱＤＩＹＧＡＴＰＡＤＬＡＡＬＶＧＨＥＤＩＡＥＶＬＱＫＬＮ（配列番号１３）（それにおいて、配列番号１３における７つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換され、
それにおいて、
位置３のＩが、場合により、Ｋ、Ｌ、Ａ、及びＶからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置４のＹが、場合により、Ｗ、Ｆ、及びＳからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置６のＡが、場合により、Ｋにより交換され；
位置１４のＬが、場合により、Ｆ、Ｙ、及びＤからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置１５のＶが、場合により、Ｌ、Ｉ、Ａ、及びＮからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；ならびに、
位置２３のＶが、Ｉ及びＬからなる群より選択されるアミノ酸により交換される）を伴うＣ末端キャッピングモジュールを含む、請求項１５記載の結合タンパク質。
【請求項１９】
アンキリンリピートドメインが、請求項１３記載のアンキリンリピートモジュール及び請求項１７記載のＣ末端キャッピングモジュールを含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項２０】
アンキリンリピートドメインが、配列番号１３のＣ末端キャッピングモジュールが直接続く、配列番号１２のアンキリンリピートモジュールを含む、請求項１９記載の結合タンパク質。
【請求項２１】
アンキリンリピートドメインのアンキリンリピートモジュールのアミノ酸残基の１つ又は複数が、アンキリンリピート単位のアラインメント上の対応する位置で見出されるアミノ酸残基により交換される、請求項１〜７及び９〜１９のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項２２】
配列配列番号１２〜１９及び２３〜６１のいずれかのペプチドを含む、請求項１〜４のいずれか一項記載の結合タンパク質。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれか一項記載の結合タンパク質をコードする核酸。
【請求項２４】
請求項１〜２２のいずれか一項記載の結合タンパク質又は請求項２３記載の核酸、ならびに、場合により、医薬的に許容可能な担体及び／又は希釈剤を含む医薬的組成物。
【請求項２５】
滲出性加齢黄斑変性症、ポリープ状脈絡膜血管新生、及び病的近視より選択される状態を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に、請求項１〜２２のいずれか一項記載の結合タンパク質の治療的に効果的な量を投与する工程を含む方法。
【請求項２６】
滲出性加齢黄斑変性症、ポリープ状脈絡膜血管新生、及び病的近視より選択される状態を処置する方法であって、そのような処置を必要とする患者に、ＰＤＧＦ−ＢＢに特異的に結合するアンキリンリピートドメイン及びＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合するアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質の治療的に効果的な量を投与する工程を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）についての結合特異性を伴う設計アンキリンリピートタンパク質、ならびにそのようなＰＤＧＦ結合タンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質を含む医薬的組成物、及び疾患の処置におけるそのようなタンパク質の使用に関する。
【０００２】
発明の背景
【０００３】
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、線維芽細胞、平滑筋細胞、及びグリア細胞のための血清成長因子として３０年以上前に同定された。生理学及び医学におけるその役割は、最近の総説において広範囲に記載されている（Andrae, J., Gallini, R. and Betsholtz, C., Genes Dev., 22, 1276-1312, 2008）。ヒトＰＤＧＦは、本来は、２つの異なるポリペプチド鎖Ａ（ＰＤＧＦ−Ａ；ヒトＰＤＧＦ−Ａは、UniProtKB/スイスプロット番号Ｐ０４０８５を有する）及びＢ（ＰＤＧＦ−Ｂ；ヒトＰＤＧＦ−Ｂは、UniProtKB/スイスプロット番号Ｐ０１１２７を有する）のジスルフィド連結された二量体として同定された。それにより、３つのタンパク質二量体を形成することができる：ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、及びＰＤＧＦ−ＢＢ。最近、２つの追加のＰＤＧＦポリペプチド鎖ＰＤＧＦ−Ｃ及びＰＤＧＦ−Ｄが同定された。現在公知のＰＤＧＦ遺伝子及びポリペプチドは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）も含む構造的及び機能的に関連する成長因子のファミリーに属する。ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ成長因子は、動物界全体にわたり保存されている。
【０００４】
ＰＤＧＦは、２つの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、ＰＤＧＦ受容体（ＰＤＧＦＲ）アルファ（ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ）及びベータ（ＰＤＧＦＲｂｅｔａ）を介して作用し、共通ドメイン構造（５つの細胞外免疫グロブリン（Ｉｇ）ループ及び分割細胞内チロシンキナーゼドメインを含む）を伴う。ＶＥＧＦは、ＲＴＫの別個の、しかし、構造的に関連するサブファミリーを通じて作用する。リガンド結合は、受容体の二量体化を促し、それはシグナル伝達を開始する。リガンド構成及び受容体発現のパターンに依存し、異なる受容体二量体を形成しうる。しかし、少数の相互作用だけが、インビボで関連すると思われる；即ち、ＰＤＧＦＲａｌｐｈａを介したＰＤＧＦ−ＡＡ及びＰＤＧＦ−ＣＣ、ならびにＰＤＧＦＲｂｅｔａを介したＰＤＧＦ−ＢＢの相互作用。
【０００５】
ＰＤＧＦは、発生中に決定的な役割を有するが、しかし、成人における正常な生理学的機能についての限定された証拠がある。動物発生におけるＰＤＧＦ及びＰＤＧＦＲの試験によって、原腸形成における、ならびに頭蓋及び心臓神経堤、生殖腺、肺、腸、皮膚、ＣＮＳ、及び骨格の発生におけるＰＤＧＦＲａｌｐｈａシグナル伝達の役割が明らかになっている。同様に、ＰＤＧＦＲｂｅｔａシグナル伝達についての役割は、血管形成及び初期造血において確立されている。ＰＤＧＦシグナル伝達は、広範な疾患に関与している。ＰＤＧＦシグナル伝達経路のオートクリン活性化は、特定の神経膠腫、肉腫、及び白血病において含まれる。パラクリンＰＤＧＦシグナル伝達は、一般に、上皮癌において観察され、そこで、それは間質補充を誘発し、上皮間葉移行において含まれ、それにより、腫瘍成長、血管新生、浸潤、及び転移に影響する。ＰＤＧＦは、血管障害（例えばアテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺高血圧症、及び網膜疾患など）における、ならびに線維性疾患（肺線維症、肝硬変、強皮症、糸球体硬化症、及び心臓線維症を含む）における病理学的な間葉系応答を駆動する。
【０００６】
このように、増加したＰＤＧＦ活性は、いくつかの疾患及び病理学的状態と関連付けられてきた。ＰＤＧＦの原因となる病原性の役割は、一部の疾患について確立されており、ＰＤＧＦアンタゴニスト（例えばＰＤＧＦ特異的抗体など）を使用した治療のための見通しを提供する。また、抗ＶＥＧＦ及び抗ＰＤＧＦ薬剤の組み合わせが、特定の眼の血管新生疾患を処置するための相乗的な治療的利益を与えることが示唆されている（ＷＯ  ２００５／０２０９７２; Jo, N., Mailhos, C., Ju, M., Cheung, E., Bradley, J., Nishijima, K., Robinson, G.S., Adamis, A.P. and Shima, D.T., Am.J.Pathol., 168(6), 2036-2053, 2006）。
【０００７】
抗体の他、標的分子に特異的に結合させ（例、Binz, H.K., Amstutz, P. and Pluckthun, A., Nat.Biotechnol.23, 1257-1268, 2005）、それにより、アンタゴニストとして作用するために使用することができる新規の結合タンパク質又は結合ドメインがある。Ｆｃを持たない結合タンパク質又は結合ドメインの１つのそのような新規のクラスは、設計リピートタンパク質又は設計リピートドメインに基づく（ＷＯ  ２００２／０２０５６５; Binz, H.K., Amstutz, P., Kohl, A., Stumpp, M.T., Briand, C., Forrer, P., Gruetter, M.G., and Plueckthun, A., Nat.Biotechnol.22, 575-582, 2004; Stumpp, M.T., Binz, H.K and Amstutz, P., Drug Discov.Today 13, 695-701, 2008）。ＷＯ  ２００２／０２０５６５には、リピートタンパク質の大きなライブラリーをどのように構築することができるのか、及びそれらの一般的な適用が記載されている。それにもかかわらず、ＷＯ  ２００２／０２０５６５には、ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴うリピートドメインも、ＰＤＧＦ−ＢＢに特異的に結合するリピートドメインの具体的なリピートモジュール又はリピート配列モチーフの選択も開示されていない。さらに、ＷＯ  ２００２／０２０５６５には、ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴うリピートドメインを使用し、ＰＤＧＦ−ＢＢ媒介シグナル伝達経路を調節し、成功裏に疾患を処置することができることは示唆されていない。これらの設計リピートドメインは、リピートタンパク質のモジュラー性質を利用しており、ドメインの疎水性コアを遮蔽することにより、設計リピートドメインを凝集から防止するためのＮ末端及びＣ末端キャッピングモジュールを持ちうる（Forrer, P., Stumpp, M.T., Binz, H.K. and Plueckthun, A., FEBS letters 539, 2-6, 2003）。
【０００８】
本発明の基盤となる技術的問題は、新規結合タンパク質（例えばアンキリンリピートタンパク質又はドメインなど）を同定することであって、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合特異性を伴い、特定の癌、血管障害（例えば網膜疾患など）、線維性疾患、及び他の病理学的状態の改善された処置のために、ＰＤＧＦ−ＢＢ媒介シグナル伝達経路を調節する。この技術的問題への解決は、特許請求の範囲において特徴付けられる実施態様を提供することにより達成される。
【０００９】
発明の概要
【００１０】
本発明は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、前記アンキリンリピートドメインは、ＰＢＳ中で、１０−７Mを下回るKdを伴い、ＰＤＧＦ−ＢＢに結合する。
【００１１】
さらに特に、本発明は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、前記アンキリンリピートドメインは、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合について、配列番号２３〜６０からなる群より選択されるアンキリンリピートドメインと競合し、又は、それにおいて、前記アンキリンリピートドメインは、配列番号２３〜６０からなる群より選択され、それにおいて、前記アンキリンリピートドメインの位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、場合により、欠損している；ならびに、前記アンキリンリピートドメインの最後から二番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、場合により、Ａにより交換されている。
【００１２】
さらなる実施態様において、本発明は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む組換えＰＤＧＦ−ＢＢ結合タンパク質に関し、それは、配列番号１２、１４、１５、１７、１８、及び１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールならびに配列（それにおいて、配列番号１２、１４、１５、１７、１８、及び１９における９つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換されている）を含む。
【００１３】
特に、本発明は、配列配列番号１２〜１９及び２３〜６１のいずれか１つのペプチドを含む組換えＰＤＧＦ−ＢＢ結合タンパク質に関する。
【００１４】
本発明は、さらに、本発明の結合タンパク質をコードする核酸分子、及び上で言及する結合タンパク質又は核酸分子の１つ又は複数を含む医薬的組成物に関する。
【００１５】
本発明は、さらに、本発明の結合タンパク質を使用した病理学的状態の処置の方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ＮＨＩ−３Ｔ３繊維芽細胞増殖の阻害。ＰＤＧＦ−ＢＢについての特異性を伴う種々の濃度のＤＡＲＰｉｎ（ＤＡＲＰｉｎ  ＃４９により例示される）によるＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞の増殖の阻害及び対応する近似阻害曲線を示す。ＩＣ５０値を、次に、近似阻害曲線から、ＤＡＲＰｉｎ  ＃４９について１．９nmであると算出した。ＯＤ、４５０nmでの光学密度；Ｃ、nMでのＤＡＲＰｉｎ  ＃４９の濃度；Ｄ１、ＤＡＲＰｉｎ  ＃４９。Ｘ軸は対数目盛で示している。ＤＡＲＰｉｎ  ＃４９の定義については、以下を参照のこと。
【図２】ＰＤＧＦＲｂｅｔａ競合アッセイ。ＰＤＧＦ−ＢＢについての特異性を伴う種々の濃度のＤＡＲＰｉｎによるＰＤＧＦＲｂｅｔａへのＰＤＧＦ−ＢＢの結合の阻害及び対応する近似阻害曲線を、別個の単一実験について示す。ＩＣ５０値を、次に、ＤＡＲＰｉｎ  ＃５０（Ｄ１）及び＃２８（Ｄ２）について約２０及び１８pMであると算出した。ＯＤ、４５０nmでの光学密度；Ｃ、pMでのＤＡＲＰｉｎの濃度。Ｘ軸を対数目盛りで示す。ＤＡＲＰｉｎ  ＃５０及び２８の定義については、以下を参照のこと。
【図３】脈絡膜血管新生の発生に対する抗ＰＤＧＦ−ＢＢ  ＤＡＲＰｉｎ対賦形剤の効果。マウスを、毎日、賦形剤又はＤＡＲＰｉｎ  ＃６１−ＰＥＧ２０（即ち、標準的な手段（例、ＷＯ  ２０１１／１３５０６７において記載する通り）により、そのＣ末端Ｃｙｓ残基にわたりＰＥＧ２０へ共役されたＤＡＲＰｉｎ  ＃６１）を用いて、０日目から１４日目まで腹腔内注射した。２日目に、レーザー熱傷を眼に適用し、脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を誘導し、１４日目に、ＣＮＶの範囲を測定した。シンボルは、個々の目を表し、３つの誘導ＣＮＶスポットの各々の平均値を表す。バーは、個々の群の中央値を表す。Ａ、mm2でのＣＮＶの面積；Ｖ、賦形剤（即ち、ＰＢＳ）；Ｄ１、注射した１用量当たり１０mg/kgでのＰＢＳ中のＤＡＲＰｉｎ  ＃６１−ＰＥＧ２０；Ｄ２、注射した１用量当たり１mg/kgでのＰＢＳ中のＤＡＲＰｉｎ  ＃６１−ＰＥＧ２０。
【００１７】
発明の詳細な説明
【００１８】
本発明に従った組換え結合タンパク質又はドメインは、哺乳動物のＰＤＧＦ−ＢＢについて特異的である。好ましくは、本発明に従った組換え結合ドメインは、マウス、ラット、イヌ、ウサギ、サル、又はヒト由来のＰＤＧＦ−ＢＢについて特異的である。より好ましくは、本発明の組換え結合ドメインは、ヒト由来のＰＤＧＦ−ＢＢについて特異的である。
【００１９】
用語「タンパク質」はポリペプチドを指し、それにおいて、ポリペプチドの少なくとも部分は、そのポリペプチド鎖内及び／又は間の二次、三次、又は四次構造を形成することにより、定義された三次元配置を有する、又は、得ることができる。タンパク質が２つ又はそれ以上のポリペプチドを含む場合、個々のポリペプチド鎖は非共有結合的又は共有結合的に、例えば、２つのポリペプチドの間のジスルフィド結合により連結されうる。タンパク質の部分は、二次又は三次構造を形成することにより定義された三次元配置を個々に有する、又は、得ることができ、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。
【００２０】
用語「組換え」は、組換えタンパク質、組換えタンパク質ドメイン、組換え結合タンパク質などで使用される通り、前記ポリペプチドが、当業者により周知である組換えＤＮＡ技術の使用により産生されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例、遺伝子合成により産生される）を、細菌発現プラスミド（例、pQE30、Qiagen）、酵母発現プラスミド、又は哺乳動物発現プラスミド中にクローン化することができる。例えば、そのような構築された組換え細菌発現プラスミドは、適切な細菌（例、大腸菌）中に挿入される場合、この細菌は、この組換えＤＮＡによりコードされるポリペプチドを産生することができる。対応して産生されたポリペプチドは、組換えポリペプチドと呼ばれる。
【００２１】
本発明に関連して、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結された複数、即ち、２つ又はそれ以上のアミノ酸の１つ又は複数の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合を介して連結された８を上回るアミノ酸からなる。
【００２２】
用語「ポリペプチドタグ」は、ポリペプチド／タンパク質に付着したアミノ酸配列を指し、それにおいて、前記アミノ酸配列は、前記ポリペプチド／タンパク質の精製、検出、又は標的化のために有用であり、あるいは、それにおいて、前記アミノ酸配列は、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善し、あるいは、それにおいて、前記アミノ酸配列はエフェクター機能を持つ。結合タンパク質の個々のポリペプチドタグ、部分、及び／又はドメインを、互いに直接的に又はポリペプチドリンカーを介して接続してもよい。これらのポリペプチドタグは、全て、当技術分野において周知であり、当業者に完全に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、小さなポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓ（例、配列番号９のＨｉｓタグ）、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、もしくはＳｔｒｅｐタグ又は部分、例えば酵素など（例えば、アルカリフォスファターゼなどの酵素）であり、それらは前記ポリペプチド／タンパク質の検出を許し、あるいは、標的化のため（例えば免疫グロブリン又はそのフラグメントなど）及び／又はエフェクター分子として使用することができる部分である。
【００２３】
用語「ポリペプチドリンカー」はアミノ酸配列を指し、それは、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインと非ポリペプチド部分（例えばポリエチレングリコールなど）、又は２つの配列タグを連結することができる。そのような追加ドメイン、タグ、非ポリペプチド部分、及びリンカーは、当業者に公知である。例のリストを、特許出願ＷＯ  ２００２／０２０５６５の記載において提供する。そのようなリンカーの特定の例は、可変長のグリシン−セリンリンカー及びプロリン−スレオニンリンカーである；好ましくは、前記リンカーは２〜２４の間のアミノ酸の長さを有する；より好ましくは、前記リンカーは、２〜１６の間のアミノ酸の長さを有する。グリシン−セリン−リンカーの例を配列番号１０において提供し、プロリン−スレオニン−リンカーの例を配列番号１１において提供する。好ましくは、配列番号１１のプロリン−スレオニン−リンカーは、ＧＳにより先行される及び／又はＧＳが続く。
【００２４】
用語「ポリマー部分」は、タンパク質性ポリマー部分又は非タンパク質性ポリマー部分のいずれかを指す。「タンパク質性ポリマー部分」は、好ましくは、安定した三次構造を形成しないポリペプチドである。タンパク質性ポリマー部分の例は、XTEN（登録商標）（Amunixの登録商標；ＷＯ  ２００７／１０３５１５）ポリペプチド、又はプロリン残基、アラニン残基、及びセリン残基を含むポリペプチド（ＷＯ  ２００８／１５５１３４に記載されている通り）である。そのようなタンパク質性ポリマー部分を、標準的なＤＮＡクローニング技術、それに続く、それらの標準的な発現及び精製を使用した遺伝子融合ポリペプチドの生成により、例えば、本発明の結合ドメインに共有結合的に付着させることができる。「非タンパク質性ポリマー部分」は、ポリペプチドから構築されていないポリマー部分である。非タンパク質ポリマー部分の例は、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンである。用語「ＰＥＧ化された」は、ＰＥＧ部分が、例えば、本発明のポリペプチドに共有結合的に付着されていることを意味する。本発明のポリマー部分は、分子量において広く変動しうる。好ましくは、前記ポリマー部分は、ポリペプチドリンカーにより、結合ドメインに接続される。
【００２５】
特定の実施態様において、ＰＥＧ部分又は任意の他の非タンパク質性ポリマーを、例えば、マレイミドリンカーを介して、システインチオールにカップリングすることができ、システインは、本明細書に記載する通り、ペプチドリンカーを介して、結合ドメインのＮ又はＣ末端にカップリングされている。
【００２６】
用語「結合タンパク質」は、下でさらに説明する通り、１つ又は複数の結合ドメイン、１つ又は複数の生物活性化合物、及び１つ又は複数のポリマー部分を含むタンパク質を指す。好ましくは、前記結合タンパク質は、４つまでの結合ドメインを含む。より好ましくは、前記結合タンパク質は、２つまでの結合ドメインを含む。最も好ましくは、前記結合タンパク質は、１つだけの結合ドメインを含む。さらに、任意のそのような結合タンパク質は、結合ドメインではない追加のタンパク質ドメイン、多量体化部分、ポリペプチドタグ、ポリペプチドリンカー、及び／又は単一のＣｙｓ残基を含みうる。多量体化部分の例は、ペアになり、機能的な免疫グロブリンＦｃドメインを提供する免疫グロブリン重鎖定常領域、及びロイシンジッパー又は２つのそのようなポリペプチド間に分子間ジスルフィド結合を形成する遊離チオールを含むポリペプチドである。単一のＣｙｓ残基は、例えば、当業者に周知のマレイミド化学を使用することにより、他の部分をポリペプチドに共役するために使用してもよい。好ましくは、前記結合タンパク質は、組換え結合タンパク質である。また、好ましくは、結合タンパク質の結合ドメインは、異なる標的特異性を持つ。
【００２７】
用語「生物活性化合物」は、前記疾患を有する哺乳動物に適用された場合に、疾患修飾性である化合物を指す。生物活性化合物は、アンタゴニスト特性又はアゴニスト特性を有しうるが、タンパク質性の生物活性化合物又は非タンパク質性の生物活性化合物でありうる。そのようなタンパク質性の生物活性化合物は、例えば、本発明の結合ドメインに、標準的なＤＮＡクローニング技術、それに続く、それらの標準的な発現及び精製を使用した遺伝子融合ポリペプチドの生成により、共有結合的に付着させることができる。そのような非タンパク質性の生物活性化合物を、例えば、本発明の結合ドメインに、化学的手段により、例えば、マレイミドリンカーを介したシステインチオールへのカップリングにより、共有結合的に付着することができ、システインは、本明細書に記載する通りに、ペプチドリンカーを介して、結合ドメインのＮ又はＣ末端にカップリングされている。タンパク質性の生物活性化合物の例は、別個の標的特異性を有する（例、それに結合することにより成長因子を中和する）結合ドメイン、サイトカイン（例、インターロイキン）、成長因子（例、ヒト成長ホルモン）、抗体及びそれらのフラグメント、ホルモン（例、ＧＬＰ−１）、及び任意の可能なタンパク質性薬物である。非タンパク質性の生物活性化合物の例は、毒素（例、ImmunoGenからのDM1）、ＧＰＣＲを標的とする小分子、抗生物質、及び任意の可能な非タンパク質性薬物である。
【００２８】
用語「結合ドメイン」は、タンパク質スキャフォールドと同じ「フォールディング」（三次元配置）を示し、所定の特性（下に定義する通り）を有するタンパク質ドメインを意味する。そのような結合ドメインは、合理的な、又は最も一般には、当技術分野において公知の技術である、コンビナトリアルタンパク質操作技術により得てもよい（Binz et al., 2005、前掲文献）。例えば、所定の特性を有する結合ドメインは、以下の工程を含む方法により得ることができる：（ａ）下にさらに定義する通りの、タンパク質スキャフォールドと同じフォールディングを示すタンパク質ドメインの多様なコレクションを提供すること；ならびに（ｂ）前記の多様なコレクションをスクリーニングし、及び／又は前記の多様なコレクションから選択し、前記の所定の特性を有する少なくとも１つのタンパク質ドメインを得ること。タンパク質ドメインの多様なコレクションは、使用中のスクリーニング及び／又は選択システムに従った、いくつかの方法により提供され、当業者に周知の方法（例えばファージディスプレイ又はリボソームディスプレイなど）の使用を含みうる。好ましくは、前記結合ドメインは、組換え結合ドメインである。
【００２９】
用語「タンパク質スキャフォールド」は、アミノ酸挿入、置換、又は欠失が高度に許容できる露出表面積を伴うタンパク質を意味する。本発明の結合ドメインを生成するために使用することができるタンパク質スキャフォールドの例は、抗体又はそのフラグメント（例えば単鎖Ｆｖ又はＦａｂフラグメントなど）、黄色ブドウ球菌からのプロテインＡ、モンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）からのビリン結合タンパク質又は他のリポカリン、アンキリンリピートタンパク質又は他のリピートタンパク質、及びヒトフィブロネクチンである。タンパク質スキャフォールドは、当業者に公知である（Binz et al., 2005、前掲文献；Binz et al., 2004、前掲文献）。
【００３０】
用語「標的」は、個々の分子、例えば核酸分子、ポリペプチドもしくはタンパク質、炭水化物、又は任意の他の天然分子（そのような個々の分子の任意の部分、あるいは、そのような分子の２つ又はそれ以上の複合体を含む）などを指す。標的は、全細胞又は組織サンプルでよく、あるいは、それは任意の非天然分子又は部分でよい。好ましくは、標的は、天然もしくは非天然ポリペプチド又は化学的修飾（例えば、天然もしくは非天然のリン酸化、アセチル化、又はメチル化により修飾される）を含むポリペプチドである。本発明の特定の適用において、標的はＰＤＧＦ−ＢＢである。
【００３１】
用語「所定の特性」は、特性、例えば標的への結合、標的の遮断、標的媒介反応の活性化、酵素活性、及び関連するさらなる特性などを指す。所望の特性の型に依存して、当業者は、所望の特性を伴う結合ドメインのスクリーニング及び／又は選択を実施するためのフォーマット及び必要な工程を同定することができるであろう。好ましくは、前記の所定の特性は、標的への結合である。
【００３２】
リピートタンパク質についての以下の定義は、特許出願ＷＯ  ２００２／０２０５６５における定義に基づく。特許出願ＷＯ  ２００２／０２０５６５は、さらに、リピートタンパク質の特色、技術、及び適用の一般的な記載を含む。
【００３３】
用語「リピートタンパク質」は、１つ又は複数のリピートドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、前記リピートタンパク質の各々は、４つまでのリピートドメインを含む。より好ましくは、前記リピートタンパク質の各々は、２つまでのリピートドメインを含む。最も好ましくは、リピートタンパク質の各々は、１つだけのリピートドメインを含む。さらに、前記リピートタンパク質は、追加の非リピートタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ、及び／又はポリペプチドリンカーを含みうる。
【００３４】
用語「リピートドメイン」は、構造単位として２つ又はそれ以上の連続リピート単位（モジュール）を含むタンパク質ドメインを指し、それにおいて、前記構造単位は、同じフォールディングを有し、堅固に積み重なり、結合疎水性コアを有する超らせん構造を作る。好ましくは、リピートドメインは、さらに、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピング単位（又はモジュール）を含む。さらにより好ましくは、前記Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピング単位（又はモジュール）は、キャッピングリピートである。
【００３５】
用語「設計リピートタンパク質」及び「設計リピートドメイン」は、特許出願ＷＯ  ２００２／０２０５６５において説明される、本発明の手順の結果として得られる、リピートタンパク質又はリピートドメインをそれぞれ指す。「設計リピートタンパク質」及び「設計リピートドメイン」は、合成であり、天然からではない。それらは、それぞれ、対応して設計された核酸の発現により得られる、人工タンパク質又はドメインである。好ましくは、発現は、真核細胞もしくは原核細胞（例えば細菌細胞など）中で、又は、無細胞インビトロ発現系を使用することにより行われる。したがって、設計アンキリンリピートタンパク質（即ち、ＤＡＲＰｉｎ）は、少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む、本発明の組換え結合タンパク質に対応する。
【００３６】
用語「構造単位」は、ポリペプチドの局所的に順序付けられた部分を指し、ポリペプチド鎖に沿って互いに近い二次構造の２つ又はそれ以上のセグメントの間の三次元相互作用により形成される。そのような構造単位は、構造モチーフを示す。用語「構造モチーフ」は、少なくとも１つの構造単位中に存在する二次構造エレメントの三次元配置を指す。構造モチーフは、当業者に周知である。構造単位単独では、定義された三次元配置を得ることはできない；しかし、それらの連続配置は、例えば、リピートドメイン中でのリピートモジュールとして、超らせん構造をもたらす隣接単位の相互安定化に導く。
【００３７】
用語「リピート単位」は、１つ又は複数の天然リピートタンパク質のリピート配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、それにおいて、前記「リピート単位」は、複数のコピーにおいて見出され、それは、タンパク質のフォールディングを決定する全ての前記モチーフに共通する定義されたフォールディングトポロジーを示す。そのようなリピート単位は、リピートタンパク質の「リピート構造単位（リピート）」（Forrer et al., 2003、前掲文献により記載される通り）又はリピートタンパク質の「連続相同構造単位（リピート）」（Binz et al, 2004、前掲文献により記載される通り）に対応する。そのようなリピート単位は、フレームワーク残基及び相互作用残基を含む。そのようなリピート単位の例は、アルマジロリピート単位、ロイシンリッチリピート単位、アンキリンリピート単位、テトラトリコペプチドリピート単位、ＨＥＡＴリピート単位、及びロイシンリッチ変異体リピート単位である。２つ又はそれ以上のそのようなリピート単位を含む天然タンパク質は、「天然リピートタンパク質」として言及される。リピートタンパク質の個々のリピート単位のアミノ酸配列は、互いに比較された場合、有意な数の変異、置換、付加、及び／又は欠失を有しうるが、リピート単位の一般的なパターン、又はモチーフを依然として実質的に保持している。
【００３８】
したがって、用語「アンキリンリピート単位」は、アンキリンリピート（例えば、Forrer et al., 2003、前掲文献により記載される通り）であるリピート単位を意味するものとする。アンキリンリピートは、当業者に周知である。用語「アンキリンリピートドメイン」は、構造単位として、好ましくは、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピング単位（又はモジュール）として２つ又はそれ以上の連続アンキリンリピート単位（モジュール）を含むリピートドメインを指す。
【００３９】
用語「フレームワーク残基」は、リピート単位のアミノ酸残基、又はリピートモジュールの対応するアミノ酸残基に関し、それは、フォールディングトポロジーに寄与し、即ち、それは、前記リピート単位（又はモジュール）のフォールディングに寄与する、又は、それは、隣接単位（又はモジュール）との相互作用に寄与する。そのような寄与は、リピート単位（又はモジュール）における他の残基との相互作用、あるいはαヘリックスもしくはβシート中に見出されるポリペプチド骨格の立体構造、又は直線状ポリペプチドもしくはループを形成するアミノ酸ストレッチに対する影響でありうる。
【００４０】
用語「標的相互作用残基」は、リピート単位のアミノ酸残基、又はリピートモジュールの対応するアミノ酸残基を指し、それらは、標的物質との相互作用に寄与する。そのような寄与は、標的物質との直接的な相互作用、又は他の直接的に相互作用する残基に対する影響（例、リピート単位（又はモジュール）のポリペプチドの立体構造を安定化し、前記標的と直接的に相互作用する残基の相互作用を許す又は増強することによる）でありうる。そのようなフレームワーク残基及び標的相互作用残基は、物理化学的方法（例えばＸ線結晶解析、ＮＭＲ、及び／又はＣＤ分光法など）により得られる構造データの分析により、あるいは、構造生物学及び／又は生物情報学における当業者に周知である公知の及び関連する構造情報との比較により同定してよい。
【００４１】
好ましくは、リピート配列モチーフの推定のために使用されるリピート単位は、相同なリピート単位であり、それにおいて、リピート単位は同じ構造モチーフを含み、それにおいて、前記リピート単位のフレームワーク残基の７０%超が互いに相同である。好ましくは、前記リピート単位のフレームワーク残基の８０%超が相同である。最も好ましくは、前記リピート単位のフレームワーク残基の９０%超が相同である。ポリペプチドの間の相同性のパーセンテージを決定するためのコンピュータプログラム（例えばＦａｓｔａ、Ｂｌａｓｔ、又はＧａｐなど）は、当業者に公知である。さらに好ましくは、リピート配列モチーフの推定のために使用されるリピート単位は、定義された標的上で選択されたリピートドメインから得られた、相同なリピート単位である。
【００４２】
用語「リピート配列モチーフ」は、アミノ酸配列を指し、それは、１つ又は複数のリピート単位又はリピートモジュールから推定される。好ましくは、前記のリピート単位又はリピートモジュールは、同じ標的についての結合特異性を有するリピートドメインからである。そのようなリピート配列モチーフは、フレームワーク残基位置及び標的相互作用残基位置を含む。前記フレームワーク残基位置は、リピート単位（又はモジュール）のフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、前記の標的相互作用残基位置は、リピート単位（又はモジュール）の標的相互作用残基の位置に対応する。リピート配列モチーフは、固定化された位置及び無作為化された位置を含む。用語「固定化された位置」は、リピート配列モチーフ中のアミノ酸位置を指し、それにおいて、前記位置は、特定のアミノ酸に設定される。ほとんどの場合、そのような固定化された位置は、フレームワーク残基の位置及び／又は特定の標的について特異的である標的相互作用残基の位置に対応する。用語「無作為化された位置」は、リピート配列モチーフ中のアミノ酸位置を指し、それにおいて、２つ又はそれ以上のアミノ酸がアミノ酸位置で許され、例えば、それにおいて、通常の２０の天然アミノ酸のいずれかが許され、あるいは、それにおいて、２０の天然アミノ酸の大半が許され、例えばシステイン以外のアミノ酸、又はグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸などである。ほとんどの場合、そのような無作為化された位置は、標的相互作用残基の位置に対応する。しかし、フレームワーク残基の一部の位置も無作為化してもよい。
【００４３】
用語「フォールディングトポロジー」は、前記のリピート単位又はリピートモジュールの三次構造を指す。フォールディングトポロジーは、αヘリックス又はβシートの少なくとも部分を形成するアミノ酸のストレッチ、あるいは直線状ポリペプチド又はループを形成するアミノ酸ストレッチ、あるいはαヘリックス、βシート、及び／又は直線状ポリペプチド／ループの任意の組み合わせにより決定されうる。例えば、アンキリンリピート単位／モジュールは、βターン、それに続く２つの逆平行αヘリックス及び次のリピート単位／モジュールのターンに達するループからなる。
【００４４】
用語「連続」は配置を指し、それにおいて、リピート単位又はリピートモジュールがタンデムに配置される。設計リピートタンパク質において、少なくとも２つ、通常は約２〜６、特に少なくとも約６、高頻度には２０又はそれ以上のリピート単位（又はモジュール）がある。大半の場合において、リピートドメインのリピート単位（又はモジュール）は、高い程度の配列同一性（対応する位置での同じアミノ酸残基）又は配列類似性（アミノ酸残基は異なるが、しかし、同様の物理化学的特性を有する）を示し、アミノ酸残基の一部は、強く保存されている重要残基でありうる。しかし、アミノ酸挿入及び／又は欠失、ならびに／あるいはリピートドメインの異なるリピート単位（又はモジュール）の間での置換による高い程度の配列変動性は、リピート単位（又はモジュール）の共通のフォールディングトポロジーが維持される限り可能でありうる。
【００４５】
物理化学的手段（例えばＸ線結晶学、ＮＭＲ、又はＣＤ分光法など）によりリピートタンパク質のフォールディングトポロジーを直接的に決定するための方法が、当業者に周知である。リピート単位又はリピート配列モチーフを同定及び決定するため、又は、そのようなリピート単位又はモチーフを含む関連タンパク質のファミリーを同定するための方法、例えば、ホモロジー検索（BLASTなど）などが、生物情報学の分野において十分に確立されており、当業者に周知である。初期リピート配列モチーフを改良する工程は、反復プロセスを含みうる。
【００４６】
用語「リピートモジュール」は、設計リピートドメインの繰り返しアミノ酸配列を指し、それらは、本来は、天然リピートタンパク質のリピート単位に由来する。リピートドメイン中に含まれる各々のリピートモジュールは、天然リピートタンパク質のファミリー又はサブファミリー（例、アルマジロリピートタンパク質又はアンキリンリピートタンパク質のファミリー）の１つ又は複数のリピート単位に由来する。さらに好ましくは、リピートドメイン中に含まれる各々のリピートモジュールは、標的上で選択されたリピートドメインから得られ（例えば、実施例１に記載される通り）、同じ標的特異性を有する、相同なリピート単位から推定されるリピート配列モチーフを含む。
【００４７】
したがって、用語「アンキリンリピートモジュール」は、リピートモジュールを意味するものとし、それは、本来は、天然アンキリンリピートタンパク質のリピート単位に由来する。アンキリンリピートタンパク質は、当業者に周知である。
【００４８】
「リピートモジュール」は、対応するリピートモジュールの全てのコピー中に存在するアミノ酸残基を伴う位置（「固定化された位置」）及び異なる又は「無作為化された」アミノ酸残基を伴う位置（「無作為化された位置」）を含みうる。
【００４９】
用語「キャッピングモジュール」は、リピートドメインのＮ又はＣ末端リピートモジュールに融合されたポリペプチドを指し、それにおいて、前記キャッピングモジュールは、前記リピートモジュールと強固な三次相互作用（即ち、三次構造相互作用）を形成し、それにより、連続リピートモジュールと接触しない側で、溶媒から前記リピートモジュールの疎水性コアを遮蔽するキャップを提供する。前記Ｎ及び／又はＣ末端キャッピングモジュールは、キャッピング単位又はリピート単位に隣接する天然リピートタンパク質中で見出される他の構造単位でありうる、又は、それに由来しうる。用語「キャッピング単位」は、天然の折り畳まれたポリペプチドを指し、それにおいて、前記ポリペプチドは、リピート単位へＮ又はＣ末端で融合された特定の構造単位を定義し、それにおいて、前記ポリペプチドは、前記リピート単位と強固な三次相互作用を形成し、それにより、一方の側の前記リピート単位の疎水性コアを、溶媒から遮蔽するキャップを提供する。好ましくは、キャッピングモジュール又はキャッピング単位は、キャッピングリピートである。用語「キャッピングリピート」は、前記の隣接リピート単位（又はモジュール）と同様の又は同じフォールディング及び／又は前記の隣接リピート単位（又はモジュール）と配列類似性を有するキャッピングモジュール又はキャッピング単位を指す。キャッピングモジュール及びキャッピングリピートは、ＷＯ  ２００２／０２０５６５において、及び、Interlandi et al., 2008（前掲文献）により記載される。Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュール（即ち、Ｎ末端キャッピングリピート）の例は、配列番号１〜３であり、アンキリンＣ末端キャッピングモジュール（即ち、Ｃ末端キャッピングリピート）の例は、配列番号４〜８、１３、及び１６である。
【００５０】
例えば、配列番号４９のＮ末端アンキリンキャッピングモジュールは、位置１〜３２のアミノ酸によりコードされ、配列番号４９のＣ末端キャッピングモジュールは、位置１３２〜１５９のアミノ酸によりコードされる。
【００５１】
本発明に従った組換え結合タンパク質は、少なくとも１つアンキリンリピートドメインを含み、それにおいて、前記アンキリンリピートドメインは、哺乳動物ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を有する。
【００５２】
用語「標的についての結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」、又は「標的特異性」などは、結合タンパク質又は結合ドメインが、ＰＢＳ中で、無関係のタンパク質（例えば大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）など）よりも低い解離定数を用いて、標的に結合することを意味する。好ましくは、標的についてのＰＢＳ中での解離定数は、ＭＢＰについての対応する解離定数よりも、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１０２、さらにより好ましくは少なくとも１０３、又は最も好ましくは少なくとも１０４倍低い。
【００５３】
ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴うアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質を、実施例において示す。
【００５４】
特に、本発明は、ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴うアンキリンリピートドメインを含む、本明細書において定義された通りの組換え結合タンパク質に関し、それは、１０−６Mを下回る解離定数（Kd）を伴い、ＰＢＳ中でＰＤＧＦ−ＢＢと結合する。好ましくは、前記アンキリンリピートドメインは、ＰＢＳ中で、１０−７Mを下回る、より好ましくは１０−８M、１０−９M、１０−１０Mを下回る、又は最も好ましくは１０−１１Mを下回るＫｄを伴い、ＰＤＧＦ−ＢＢに結合する。
【００５５】
タンパク質−タンパク質相互作用の解離定数を決定するための方法、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースの技術（例、ＳＰＲ平衡分析）又は等温滴定熱量計（ＩＴＣ）などが、当業者に周知である。特定のタンパク質−タンパク質相互作用の測定Ｋｄ値は、異なる条件（例、塩濃度、ｐＨ）下で測定した場合、変動しうる。このように、Ｋｄ値の測定は、好ましくは、タンパク質の標準化溶液及び標準化緩衝液（例えばＰＢＳなど）を用いて作られる。
【００５６】
ＰＢＳ中で１０−６Mを下回るKdを伴いＰＤＧＦ−ＢＢに結合するアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質を、実施例２において示す。
【００５７】
好ましいのは、ヒトＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴うアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質である。
【００５８】
さらに好ましいのは、７０〜３００の間のアミノ酸、特に９０〜２００の間のアミノ酸を含むアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質である。
【００５９】
本発明の結合ドメインは、アンキリンリピートドメイン又は設計アンキリンリピートドメインであり、好ましくは、ＷＯ  ２００２／０２０５６５に記載されている通りである。ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴う設計アンキリンリピートドメインの例を、実施例において示す。
【００６０】
さらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴う少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、アンキリンリピートドメインは、ＰＢＳ中で、１０−７Mを下回るＩＣ５０値を伴い、ＰＤＧＦＲｂｅｔａへのＰＤＧＦ−ＢＢの結合を阻害する。好ましくは、前記アンキリンリピートドメインは、ＰＢＳ中で、１０−７Mを下回る、より好ましくは１０−８M、１０−９M、１０−１０Mを下回る、又は最も好ましくは１０−１１Mを下回るＩＣ５０値を伴い、ＰＤＧＦＲｂｅｔａへのＰＤＧＦ−ＢＢの結合を阻害する。
【００６１】
半最大阻害濃度（ＩＣ５０）は、生物学的、生化学的、又は生物物理学的機能を阻害する際での、化合物（例えば本発明の結合ドメインなど）の有効性の測定値である。タンパク質−タンパク質相互作用の阻害のＩＣ５０値を決定するための方法（例えば競合ＥＬＩＳＡなど）は、当業者に周知である。タンパク質−タンパク質相互作用の特定の阻害剤の測定ＩＣ５０値は、異なる条件（例、塩濃度、ｐＨ）下で測定した場合、変動しうる。このように、ＩＣ５０値の測定値は、好ましくは、タンパク質の標準化溶液及び標準化緩衝液（例えばＰＢＳなど）を用いて作られる。
【００６２】
ＰＢＳ中で、１０−７Mを下回るＩＣ５０値を伴い、ＰＤＧＦＲｂｅｔａへのＰＤＧＦ−ＢＢの結合を阻害するアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質を、実施例４に示す。
【００６３】
さらなる実施態様において、本発明は、ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴う少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、それは、ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号：ＣＲＬ−１６５８）のＰＤＧＦ−ＢＢ刺激性増殖を、１０−６Mを下回るＩＣ５０値を伴い阻害する。好ましくは、前記リピートドメインは、ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞のＰＤＧＦ−ＢＢ刺激性増殖を、１０−７Mを下回る、より好ましくは１０−８M、１０−９M、１０−１０M、又は最も好ましくは１０−１１Mを下回るＩＣ５０値を伴い阻害する。
【００６４】
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は、成長のためにＰＤＧＦ−ＢＢに応答性であり、そのようなものとして、本発明の化合物の機能的阻害能力を測定するために使用することができる。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、培養培地中で成長させ、次に、ＰＤＧＦ−ＢＢの添加及び抗ＰＤＧＦ−ＢＢ  ＤＡＲＰｉｎの滴定に先立つ７時間にわたり栄養素を欠乏させた。ＰＤＧＦ−ＢＢを阻害する本発明の化合物の能力の評価は、ＮＩＨ−３Ｔ３細胞の増殖能力により決定され、当業者に周知の標準的な測定法により測定される通りである。ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞のＰＤＧＦ−ＢＢ刺激性増殖を、１０−６Mを下回るＩＣ５０値を伴い阻害するアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質を、実施例３に示す。
【００６５】
本発明は、ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴う少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質であって、それにおいて、前記結合タンパク質及び／又はアンキリンリピートドメインは、ＰＢＳ中での熱的アンフォールディング時に４０℃を上回る中点変性温度（Ｔｍ）を有し、３７℃で１日間にわたりＰＢＳ中でインキュベートされた場合、濃度１０g/Lまでで５%（ｗ／ｗ）未満の不溶性凝集物を形成する。
【００６６】
用語「ＰＢＳ」は、１３７mM  ＮａＣｌ、１０mMリン酸、及び２．７mM  ＫＣｌを含み、ｐＨ７．４を有するリン酸緩衝水溶液を意味する。
【００６７】
好ましくは、組換え結合タンパク質及び／又は結合ドメインは、ｐＨ７．４のＰＢＳ中での熱的アンフォールディング時に、４５℃を上回る、より好ましくは５０℃を上回る、より好ましくは５５℃を上回る、最も好ましくは６０℃を上回る中間点変性温度（Ｔｍ）を有する。本発明の結合タンパク質又は結合ドメインは、生理学的条件下で、定義された二次及び三次構造を持つ。そのようなポリペプチドの熱的アンフォールディングは、その三次及び二次構造の喪失をもたらし、それは、例えば、円偏光二色性（ＣＤ）測定により追跡することができる。熱的アンフォールディング時での結合タンパク質又は結合ドメインの中点変性温度は、温度を約１０℃から約１００℃までゆっくりと増加させることによる、前記のタンパク質又はドメインの熱変性時での生理学的緩衝液における協同転移の中点での温度に対応する。熱的アンフォールディング時での中点変性温度の決定は、当業者に周知である。熱的アンフォールディング時での結合タンパク質又は結合ドメインのこの中点変性温度は、前記ポリペプチドの熱的安定性を示している。
【００６８】
また、好ましいのは、５日間にわたり、好ましくは１０日間にわたり、より好ましくは２０日間にわたり、より好ましくは４０日間にわたり、最も好ましくは１００日間にわたり、３７℃で、ＰＢＳ中でインキュベートした場合、濃度２０g/Lまで、好ましくは４０g/Lまで、より好ましくは６０g/Lまで、さらにより好ましくは８０g/Lまで、最も好ましくは１００g/Lまでの５%（ｗ／ｗ）の不溶性凝集物を形成する組換え結合タンパク質及び／又はアンキリンリピートドメインである。不溶性凝集物の形成は、視覚的な沈殿の出現、ゲルろ過、又は動的光散乱により検出することができ、それらは、不溶性凝集物の形成時に強く増加する。不溶性凝集物は、タンパク質サンプルから、１０’０００ｘｇで１０分間にわたる遠心により除去することができる。好ましくは、組換え結合タンパク質及び／又はアンキリンリピートドメインは、言及したインキュベーション条件下で、３７℃で、ＰＢＳ中で、２%未満、より好ましくは１%、０．５%、０．２%、０．１%、又は、最も好ましくは０．５%（ｗ／ｗ）未満の不溶性凝集物を形成する。不溶性凝集物のパーセンテージは、可溶性タンパク質からの不溶性凝集物の分離、それに続く、標準的な定量化方法による可溶性及び不溶性画分中のタンパク質量の決定により決定することができる。
【００６９】
また、好ましいのは、１００mMジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むＰＢＳ中での１又は１０時間にわたる３７℃でのインキュベーション時に、その天然三次構造を失わない組換え結合タンパク質及び／又はアンキリンリピートドメインである。
【００７０】
１つの特定の実施態様において、本発明は、ＰＤＧＦ−ＢＢに特異的に結合し、上で定義した通りの、示した又は好ましい中間点変性温度及び非凝集特性を有する、アンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質に関する。
【００７１】
さらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴う少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、アンキリンリピートドメインは、哺乳動物ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合について、配列番号２３〜６０；好ましくは配列番号２４、４５、及び５０、特に配列番号２４及び５０からなる群より選択されるアンキリンリピートドメインと競合する。
【００７２】
また、好ましくは、前記リピートドメインは、哺乳動物ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合について、ＤＡＲＰｉｎｓ  ＃２３〜６０の群より選択される結合タンパク質と競合する。好ましくは、前記リピートドメインは、哺乳動物ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合について、ＤＡＲＰｉｎｓ  ＃２４、４５、及び５０の群からの結合タンパク質と競合する。より好ましくは、前記アンキリンリピートドメインは、哺乳動物ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合について、結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ  ＃２４又は５０と競合する。
【００７３】
用語「結合について競合する」は、同じ標的に同時に結合するための本発明の２つの異なる結合ドメインの不能を意味し、両方が個々に同一の標的に結合することができる。このように、そのような２つの結合ドメインは、前記標的への結合について競合する。好ましくは、前記の２つの競合する結合ドメインは、前記標的上のオーバーラップする又は同じ結合エピトープに結合する。２つの結合ドメインが標的への結合について競合するか否かを決定するための方法、例えば競合酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）又は競合ＳＰＲ測定（例、BioRadからのProteon機器を使用することによる）などが、当業者に周知である。例えば、配列番号＃４９又は配列番号＃５８のアンキリンリピートドメインは、ヒトＰＤＧＦへの結合について、配列番号＃５０のアンキリンリピートドメインと競合する。
【００７４】
用語「エピトープ」は、標的タンパク質（例えばＰＤＧＦ−ＢＢなど）の表面上の特定の部位を意味し、それに、本発明の結合ドメイン、例えばアンキリンリピートドメインなどが、それ自体を付着する。この用語は、抗体のエピトープへの類似性において定義され、それは、当業者に周知である。本発明の２つの結合ドメインが同じエピトープに結合する場合、それらは、ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合について競合する。エピトープの厳密な分子配置は、例えば、ＰＤＧＦ−ＢＢとの複合体中での本発明の結合ドメインのタンパク質Ｘ線結晶（当業者に周知の方法）により、解明することができる。
【００７５】
さらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴う少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、前記アンキリンリピートドメインは、配列番号２３〜６０からなる群より選択される１つのアンキリンリピートドメインと少なくとも７０%アミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
それにおいて、前記アンキリンリピートドメインの位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、場合により、欠損しており；ならびに、
前記アンキリンリピートドメインの最後から二番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、場合により、Ａにより交換される。
【００７６】
好ましくは、本発明の組換え結合タンパク質中のそのようなアンキリンリピートドメインは、配列番号２４、４５、及び５０；より好ましくは、２４及び５０からなる群より選択される１つのアンキリンリピートドメインと少なくとも７０%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００７７】
好ましくは、本発明の組換え結合タンパク質中のそのようなアンキリンリピートドメインは、配列番号２３〜６０からなる群より選択されるアンキリンリピートドメインのＮ末端とＣ末端キャッピングモジュールの間に存在する１つ、２つ、もしくは３つのリピートモジュールと、少なくとも７０%アミノ酸配列同一性、例えば、７０%、７１%、７２%、７３%、７４%、７５%、７６%、７７%、７８%、７９%、８０%、８１%、８２%、８３%、８４%、８５%、８６%、８７%、８８%、８９%、９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%アミノ酸配列同一性を伴うアミノ酸配列を含む。
【００７８】
好ましくは、７０%アミノ酸配列同一性の代わりに、本発明の組換え結合タンパク質中のそのようなアンキリンリピートドメイン又はアンキリンリピートドメイン中のＮ末端とＣ末端キャッピングモジュールの間に存在するそのような１つ、２つ、もしくは３つのリピートモジュールは、少なくとも７５%、より好ましくは少なくとも７６%、より好ましくは少なくとも８０%、より好ましくは少なくとも８５%、より好ましくは少なくとも９０%、又は最も好ましくは少なくとも９５%アミノ酸配列同一性を伴うアミノ酸配列を含む。好ましくは、アミノ酸配列同一性の言及するパーセンテージは、フレームワーク位置中にある。
【００７９】
好ましくは、リピートドメイン配列番号２３〜６０における３０アミノ酸まで、例えば、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、又は無アミノ酸が、別のアミノ酸により交換される。好ましくは、配列番号２３〜６０における２５までのアミノ酸、より好ましくは２０までのアミノ酸、より好ましくは１５までのアミノ酸、さらにより好ましくは１１までのアミノ酸、より好ましくは８つまでのアミノ酸、より好ましくは５つまでのアミノ酸、より好ましくは２つまでのアミノ酸、及び最も好ましくは無アミノ酸が交換される。
【００８０】
好ましくは、アミノ酸が配列番号１３又は１６のキャッピングモジュール、配列番号１２、１４、１５、１７、１８、及び１９のリピートモジュール、又は配列番号２３〜６０のリピートドメインにおいて交換される場合、これらのアミノ酸は、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群より；より好ましくは、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群より選択される。また、好ましくは、アミノ酸は、相同アミノ酸により交換される；即ち、アミノ酸は、同様の生物物理学的特性を伴う側鎖を有するアミノ酸により交換される。例えば、負荷電アミノ酸Ｄは、負荷電アミノ酸Ｅにより置換されうる、又は、疎水性アミノ酸（例えばＬなど）は、Ａ、Ｉ、又はＶにより置換されうる。ポリペプチド中の別のアミノ酸によるアミノ酸の交換の技術は当業者に周知である。
【００８１】
さらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴う少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、前記アンキリンリピートドメインは、配列番号２３〜６０からなる群より選択され、
それにおいて、前記アンキリンリピートドメインの位置１のＧ及び／又は位置２のＳが、場合により、欠損しており；ならびに、
前記アンキリンリピートドメインの最後から二番目の位置のＬ及び／又は最後の位置のＮが、場合により、Ａにより交換される。
【００８２】
好ましくは、そのようなアンキリンリピートドメインは、配列番号２４、４５、及び５０；より好ましくは、２４及び５０からなる群より選択される。
【００８３】
さらなる実施態様において、本発明は、組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、アンキリンリピートドメインは、配列番号２３〜６０からなる群より選択されるアンキリンリピートドメインと同じエピトープに付着する。好ましくは、そのようなアンキリンリピートドメインは、配列番号２４、４５、及び５０；より好ましくは、２４及び５０からなる群より選択される。
【００８４】
さらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴う少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、前記アンキリンリピートドメインは、配列番号１２、１４、１５、１７、１８、及び１９からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するアンキリンリピートモジュールならびに配列（それにおいて、配列番号１２、１４、１５、１７、１８、及び１９からなる群における９つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される）を含む。
【００８５】
好ましくは、前記アンキリンリピートドメインのそのようなアンキリンリピートモジュールは、配列番号１２、１４、及び１７；より好ましくは、１２及び１７からなる群より選択される。
【００８６】
好ましくは、配列番号１２、１４、１５、１７、１８、及び１９のリピートモジュールにおける８つまでのアミノ酸が、別のアミノ酸、より好ましくは７つまでのアミノ酸、より好ましくは６つまでのアミノ酸、より好ましくは５つまでのアミノ酸、さらにより好ましくは４つまでのアミノ酸、より好ましくは３つまでのアミノ酸、より好ましくは２つまでのアミノ酸、及び最も好ましくは１つのアミノ酸により交換される。好ましくは、アミノ酸の言及する交換は、フレームワーク位置中にある。したがって、配列番号１２、１４、１５、１７、１８、及び１９のフレームワーク位置中の８つまでのアミノ酸を、任意のアミノ酸、好ましくは７、６、５、４、３、又は２までのアミノ酸、最も好ましくは１つのアミノ酸により交換する。
【００８７】
さらなる実施態様において、本発明は、組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合特異性を伴うアンキリンリピートドメインは、アンキリンリピート配列ＫＤＥＥＧＴＴＰＬＨＹＡＡＶＷＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１２）及び配列（それにおいて、配列番号１１における９つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換され、ならびに、それにおいて、
位置３のＥが、場合により、Ｄ、Ｗ、Ｑ、Ｉ、及びＹ、好ましくはＤ及びＷからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置４のＥが、場合により、Ｔ、Ｄ、Ｙ、及びＳ、好ましくはＴ及びＤからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置６のＴが、場合により、Ｓ及びＦからなる群より選択されるアミノ酸により、好ましくはＳにより交換され；
位置１１のＹが、場合により、Ｆにより交換され；
位置１４のＶが、場合により、Ａ、Ｙ、及びＴからなる群より選択されるアミノ酸により、好ましくはＡにより交換され；ならびに
位置１５のＷが、場合により、Ｆ、Ｋ、Ｖ、及びＹ、好ましくはＦ及びＹからなる群より選択されるアミノ酸により交換される）を伴うリピートモジュールを含む。
【００８８】
さらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴う少なくとも１つのアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、前記アンキリンリピートドメインは、配列番号１３及び１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するキャッピングモジュールならびに配列（それにおいて、配列番号１３及び１６における９つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換される）を含む。
【００８９】
好ましくは、前記アンキリンリピートドメイン中に含まれる配列番号１３及び１６のキャッピングモジュールにおける８つまでのアミノ酸が、配列番号１３及び１６における他のアミノ酸、より好ましくは７つまでのアミノ酸、より好ましくは６つまでのアミノ酸、より好ましくは５つまでのアミノ酸、さらにより好ましくは４つまでのアミノ酸、より好ましくは３つまでのアミノ酸、より好ましくは２つまでのアミノ酸、より好ましくは１つまでのアミノ酸、及び最も好ましくは無アミノ酸により交換される。
【００９０】
さらに別の実施態様において、本発明は、組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合特異性を伴うアンキリンリピートドメインは、配列ＱＤＩＹＧＡＴＰＡＤＬＡＡＬＶＧＨＥＤＩＡＥＶＬＱＫＬＮ（配列番号１３）及び配列（それにおいて、配列番号１３における９つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換され、
それにおいて、
位置３のＩが、場合により、Ｋ、Ｌ、Ａ、及びＶ、好ましくはＬ、Ａ、及びＶからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置４のＹが、場合により、Ｗ、Ｆ、及びＳ、好ましくはＷ及びＦからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置６のＡが、場合により、Ｋにより交換され；
位置１４のＬが、場合により、Ｆ、Ｙ、及びＤ、好ましくはＦ及びＹからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；
位置１５のＶが、場合により、Ｌ、Ｉ、Ａ、及びＮ、好ましくはＬ及びＩからなる群より選択されるアミノ酸により交換され；ならびに
位置２３のＶが、Ｉ及びＬからなる群より選択されるアミノ酸により交換される）を伴うＣ末端キャッピングモジュールを含む。
【００９１】
好ましいのは、組換え結合タンパク質であり、それにおいて、アンキリンリピートドメインは、配列番号１２のアンキリンリピートモジュール及びＣ末端キャッピングモジュール配列番号１３を含む。好ましくは、前記Ｃ末端キャッピングモジュールは、前記アンキリンリピートドメイン中の前記アンキリンリピートモジュールに直接続く。
【００９２】
さらに別の実施態様において、本発明は、組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合特異性を伴うアンキリンリピートドメインは、アンキリンリピート配列ＫＤＱＥＧＴＴＰＬＨＦＡＡＳＶＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１５）及び配列（それにおいて、配列番号１５における９つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換され、ならびに、
それにおいて、
位置３のＱが、場合により、Ａにより交換され；
位置４のＥは、場合により、Ｄにより交換され；
位置６のＴは、場合により、Ｅにより交換され；
位置１１のＦは、場合により、Ｙにより交換され；
位置１４のＳは、場合により、Ｖにより交換され；及び
位置１５のＶは、場合により、Ｗにより交換される）を伴うリピートモジュールを含む。
【００９３】
さらに別の実施態様において、本発明は、組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合特異性を伴うアンキリンリピートドメインは、配列ＱＤＨＹＧＡＴＰＡＤＬＡＡＬＩＧＨＥＤＩＡＥＶＬＱＫＬＮ（配列番号１６）及び配列（それにおいて、配列番号１５における９つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換され、ならびに、
それにおいて、
位置３のＨが、場合により、Ｉにより交換され；ならびに、
位置４のＹは、場合により、Ｗにより交換される）を伴うＣ末端キャッピングモジュールを含む。
【００９４】
さらに別の実施態様において、本発明は、組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合特異性を伴うアンキリンリピートドメインは、アンキリンリピート配列ＫＤＬＮＧＱＴＰＬＨＬＡＡＤＩＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１７）及び配列（それにおいて、配列番号１７における９つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換され、ならびに、
それにおいて、
位置１のＫが、場合により、Ｑ又はＩにより交換され；
位置３のＬは、場合により、Ｎにより交換され；及び
位置２７のＡは、場合により、Ｈにより交換される）を伴うリピートモジュールを含む。
【００９５】
さらに別の実施態様において、本発明は、組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合特異性を伴うアンキリンリピートドメインは、アンキリンリピート配列ＫＤＹＡＧＳＴＰＬＲＬＡＡＷＡＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１８）及び配列（それにおいて、配列番号１８における９つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換され、ならびに、
それにおいて、
位置１のＫが、場合により、Ｑにより交換され；
位置１４のＷは、場合により、Ｈにより交換され；
位置１５のＡは、場合により、Ｖにより交換され；及び
位置２７のＡは、場合により、Ｎ又はＹにより交換される）を伴うリピートモジュールを含む。
【００９６】
さらに別の実施態様において、本発明は、組換え結合タンパク質に関し、それにおいて、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合特異性を伴うアンキリンリピートドメインは、アンキリンリピート配列ＫＤＹＦＧＹＴＰＬＨＬＡＡＹＦＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫＡＧＡＤＶＮＡ（配列番号１９）及び配列（それにおいて、配列番号１９における９つまでのアミノ酸が、任意のアミノ酸により交換され、ならびに、
それにおいて、
位置１のＫが、場合により、Ｎにより交換され；
位置１２のＡは、場合により、Ｔにより交換され；
位置１３のＡは、場合により、Ｔにより交換され；
位置２２のＥは、場合により、Ｄにより交換され；及び
位置２７のＡは、場合により、Ｈ又はＹにより交換される）を伴うリピートモジュールを含む。
【００９７】
さらに好ましいのは、Ｎ末端又はＣ末端アンキリンキャッピングリピートをそれぞれ含むＮ末端又はＣ末端アンキリンキャッピングモジュールであって、それにおいて、前記キャッピングリピート中のアミノ酸残基の１つ又は複数が、対応するアンキリンキャッピング単位又はアンキリンリピート単位のアラインメント上の対応する位置で見出されるアミノ酸残基により置換される。
【００９８】
アミノ酸の置換は、２０の、ほとんどの場合、天然アミノ酸のいずれかによりうる、好ましくは、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群より；より好ましくは、Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、及びＹからなる群より選択されるアミノ酸によりうる。また、好ましくは、アミノ酸の置換は、相同なアミノ酸による；即ち、アミノ酸は、同様の生物物理学的特性を伴う側鎖を有するアミノ酸により置換される。例えば、負荷電アミノ酸Ｄは、負荷電アミノ酸Ｅにより置換されうる、又は、疎水性アミノ酸（例えばＬなど）は、Ａ、Ｉ、又はＶにより置換されうる。相同アミノ酸によるアミノ酸の置換は、当業者に周知である。
【００９９】
また、好ましいのは、配列番号４〜８、１３、及び１６に基づく上のＣ末端キャッピングモジュールのいずれかの位置２７及び２８にアミノ酸Ａを含むＣ末端アンキリンキャッピングモジュールである。
【０１００】
また、好ましいのは、配列番号４〜８、１３、及び１６に基づく上のＣ末端キャッピングモジュールのいずれかの位置１〜２６まで又は位置１〜２７までのアミノ酸を含むＣ末端キャッピングモジュールである。
【０１０１】
配列番号１〜３の位置１のアミノ酸Ｇ及び／又は位置２のＳを、特性に対する任意の見かけ上の影響を伴わずに、Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュールから除去することができる。これらの２つのアミノ酸は、アンキリンリピートドメインを、さらなるアミノ酸及びタンパク質に接続するためのリンカーとしての役割を果たす。本発明は、また、Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュールを含む、そのようなアンキリンリピートドメインを含み、それにおいて、位置１のＧ及び／又は位置２のＳが除去されている。本明細書において定義する通りのアンキリンリピートドメインにおけるアミノ酸位置（例、「位置３３」）を、したがって、適応し、数のシフトをもたらすことが理解される。例えば、「位置３３」は「位置３２」になる（１つのアミノ酸が欠けている場合）、又は「位置３３」は「位置３１」になる（２つのアミノ酸が欠けている場合）。
【０１０２】
本発明のアンキリンリピートドメインのアンキリンキャッピングモジュールを、アンキリンキャッピングモジュールにより、当業者に公知の技術（例えばアミノ酸配列のアラインメント、変異誘発、及び遺伝子合成など）を組み合わせることにより交換することができる。例えば、配列番号４９のＣ末端キャッピングリピートを、配列番号８のＣ末端キャッピングリピートにより、（ｉ）配列番号８を伴う配列アラインメントによる、配列番号４９のＣ末端キャッピングリピート（即ち、配列位置１３２〜１５９）の決定、（ｉｉ）配列番号４９の決定されたＣ末端キャッピングリピートの配列を、配列番号８の配列を用いて置換すること、（ｉｉｉ）交換されたＣ末端キャッピングモジュールをコードするリピートドメインをコードする遺伝子の生成、（ｉｖ）大腸菌の細胞質中での改変リピートドメインの発現、及び（ｖ）標準的な手段による改変リピートドメインの精製により置換することができる。さらなる例として、配列番号４９のＮ末端キャッピングリピートを、配列番号２のＮ末端キャッピングリピートにより、（ｉ）配列番号２を伴う配列アラインメントによる、配列番号４９のＮ末端キャッピングリピート（即ち、配列位置１〜３２）の決定、（ｉｉ）配列番号４９の決定されたＮ末端キャッピングリピートの配列を、配列番号２の配列を用いて置換すること、（ｉｉｉ）交換されたＮ末端キャッピングモジュールをコードするリピートドメインをコードする遺伝子の生成、（ｉｖ）大腸菌の細胞質中での改変リピートドメインの発現、及び（ｖ）標準的な手段による改変リピートドメインの精製により置換することができる。
【０１０３】
さらに、本発明のアンキリンリピートドメインは、Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュール（例えば、配列番号２のＮ末端キャッピングリピート）、それに続く、１つ又は複数のリピートモジュール（例えば、配列番号４９の位置３３〜１３１までのアミノ酸残基を含む３つのアンキリンリピートモジュール）及びＣ末端キャッピングモジュール（即ち、配列番号８のＣ末端キャッピングリピート）を、遺伝子合成の手段により組み立てることにより遺伝的に構築することができる。遺伝的に組み立てられたリピートドメイン遺伝子を、次に、上に記載する通りに、大腸菌において発現させることができる。
【０１０４】
さらに好ましいのは、組換え結合タンパク質、リピートドメイン、リピートモジュール、アミノ酸Ｃ、Ｍ、又はＮを欠くアミノ酸配列を有するＮ末端キャッピングモジュール又はＣ末端キャッピングモジュールである。
【０１０５】
さらに好ましいのは、組換え結合タンパク質、リピートドメイン、リピートモジュール、アミノ酸Ｎ、それに続くＧを欠くアミノ酸配列を有するＮ末端キャッピングモジュール又はＣ末端キャッピングモジュールである。
【０１０６】
さらに好ましいのは、任意のそのようなＮ末端又はＣ末端キャッピングモジュールを含む組換え結合タンパク質又はリピートドメインである。
【０１０７】
本発明に従ったアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質のさらに好ましい実施態様において、前記リピートドメインのＮ末端キャッピングモジュールのアミノ酸残基の１つ又は複数を、Ｎ末端キャッピング単位のアラインメント上の対応する位置で見出されるアミノ酸残基により交換する。好ましくは、３０%までのアミノ酸残基を交換し、より好ましくは、２０%まで、さらにより好ましくは、１０%までのアミノ酸残基を交換する。最も好ましくは、そのようなＮ末端キャッピング単位は、天然Ｎ末端キャッピング単位である。
【０１０８】
本発明に従ったアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質のさらに好ましい実施態様において、前記リピートドメインのＣ末端キャッピングモジュールのアミノ酸残基の１つ又は複数を、Ｃ末端キャッピング単位のアラインメント上の対応する位置で見出されるアミノ酸残基により交換する。好ましくは、３０%までのアミノ酸残基を交換し、より好ましくは、２０%まで、さらにより好ましくは、１０%までのアミノ酸残基を交換する。最も好ましくは、そのようなＣ末端キャッピング単位は、天然Ｃ末端キャッピング単位である。
【０１０９】
さらに別の特定の実施態様において、アミノ酸残基の３０%まで、より好ましくは、アミノ酸残基の２０%まで、さらにより好ましくは、１０%までを、リピート単位、Ｎ末端キャッピング単位、又はＣ末端キャッピング単位の対応する位置において見出されないアミノ酸を用いて交換する。
【０１１０】
用語「コンセンサス配列」は、アミノ酸配列を指し、それにおいて、前記コンセンサス配列は、複数のリピート単位の構造的及び／又は配列アラインメントにより得られる。２つ又はそれ以上の構造的及び／又は配列アラインメントリピート単位を使用し、そしてアラインメントにおけるギャップを許すことで、各々の位置で最も高頻度なアミノ酸残基を決定することが可能である。コンセンサス配列は、各々の位置で最も高頻度に表わされるアミノ酸を含むその配列である。２つ又はそれ以上のアミノ酸が、平均を上回り単一の位置で表わされる事象において、コンセンサス配列は、それらのアミノ酸のサブセットを含みうる。前記の２つ又はそれ以上のリピート単位は、単一のリピートタンパク質中に含まれるリピート単位から、あるいは、２つ又はそれ以上の異なるリピートタンパク質から取ってもよい。
【０１１１】
コンセンサス配列及びそれらを決定するための方法は、当業者に周知である。
【０１１２】
「コンセンサスアミノ酸残基」は、コンセンサス配列中の特定の位置で見出されるアミノ酸である。２つ又はそれ以上、例、３、４、又は５つのアミノ酸残基が、２つ又はそれ以上のリピート単位において同様の確率で見出される場合、コンセンサスアミノ酸は、最も高頻度で見出されるアミノ酸の１つ、あるいは、２つ又はそれ以上のアミノ酸残基の組み合わせでありうる。
【０１１３】
さらに好ましいのは、非天然キャッピングモジュール、リピートモジュール、結合タンパク質、又は結合ドメインである。
【０１１４】
用語「非天然」は、合成又は天然からではないことを意味し、より具体的には、この用語はヒトの手製を意味する。用語「非天然結合タンパク質」又は「非天然結合ドメイン」は、前記結合タンパク質又は前記結合ドメインが、合成（即ち、アミノ酸からの化学的合成により産生される）又は組換えであり、天然からではないことを意味する。「非天然結合タンパク質」又は「非天然結合ドメイン」は、それぞれヒトが作ったタンパク質又はドメインであり、対応する設計核酸の発現により得られる。好ましくは、発現は、真核生物もしくは細菌の細胞中で、又は、無細胞インビトロ発現系を使用することにより行われる。さらに、この用語は、前記結合タンパク質又は前記結合ドメインの配列が、配列データベース中、例えば、GenBank、EMBL-Bank、又はSwiss-Prot中の非人工配列エントリーとして存在しないことを意味する。これらのデータベース及び他の同様の配列データベースが、当業者に周知である。
【０１１５】
１つの特定の実施態様において、本発明は、ＰＤＧＦ−ＢＢへ特異的に結合するアンキリンリピートドメインを含み、及び血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）へ特異的に結合するアンキリンリピートドメインをさらに含む組換え結合タンパク質に関する。ＰＤＧＦ−ＢＢについての特異性を伴うアンキリンリピートドメインの例を、本明細書において与え、ＶＥＧＦ−Ａへの特異性を伴うアンキリンリピートドメインの例が、ＷＯ  ２０１０／０６０７４８（ＵＳ  ２０１１／０２０７６６８）及びＷＯ  ２０１１／１３５０６７（ＵＳ  ２０１３／０１１６１９７）において記載されており、その全開示が、参照により、本明細書において組み入れられる。そのような２つのリピートドメインを、ポリペプチドリンカーにより、遺伝的手段により、当業者に公知の方法により連結することができる。本発明の１つの実施態様において、ＰＤＧＦ−ＢＢに特異的に結合するアンキリンリピートドメイン及びＶＥＧＦ−Ａに特異的に結合するアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質を使用し、網膜の疾患及び脈絡膜新生血管疾患、例えば滲出性加齢黄斑変性症、ポリープ状脈絡膜血管新生、及び病的近視などを処置してもよい。
【０１１６】
別の好ましい実施態様は、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合に関与する１、２、３又はそれ以上の内部リピートモジュールを含む、ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴うアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質である。好ましくは、そのようなアンキリンリピートドメインは、Ｎ末端キャッピングモジュール、２〜４の内部リピートモジュール、及びＣ末端キャッピングモジュールを含む。また、好ましくは、前記キャッピングモジュールは、キャッピングリピートである。また、好ましくは、前記キャッピングモジュールは、ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合に関与する。
【０１１７】
さらに好ましいのは、ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴う前記アンキリンリピートドメインの２つ又はそれ以上を含む組換え結合タンパク質である。好ましくは、前記結合タンパク質は、前記リピートドメインの２つ又は３つを含む。前記の２つ又はそれ以上のリピートドメインは、同じ又は異なるアミノ酸配列を有する。
【０１１８】
本発明に従ったアンキリンリピートドメインを含む組換え結合タンパク質のさらに好ましい実施態様において、前記アンキリンリピートドメインのリピートモジュールのアミノ酸残基の１つ又は複数を、リピート単位のアラインメント上の対応する位置で見出されるアミノ酸残基により交換する。好ましくは、３０%までのアミノ酸残基を交換し、より好ましくは、２０%まで、さらにより好ましくは、１０%までのアミノ酸残基を交換する。最も好ましくは、そのようなリピート単位は、天然リピート単位である。
【０１１９】
さらに別の特定の実施態様において、アミノ酸残基の３０%まで、例えば、アミノ酸残基の２９%、２８%、２７%、２６%、２５%、２４%、２３%、２２%、２１%、２０%、１９%、１８%、１７%、１６%、１５%、１４%、１３%、１２%、１１%、１０%、９%、８%、７%、６%、５%、４%、３%、２%、１%、又は０%を、リピート単位の対応する位置において見出されないアミノ酸を用いて交換する。より好ましくは、アミノ酸残基の２０%まで、さらにより好ましくは１０%までを、リピート単位の対応する位置において見出されないアミノ酸を用いて交換する。
【０１２０】
さらなる実施態様において、本明細書において記載する組換えＰＤＧＦ−ＢＢ結合タンパク質又はドメインのいずれかを、１つ又は複数の追加の部分、例えば、異なる標的に結合し、二重特異的結合薬剤を作る部分、生物活性化合物、標識部分（例、蛍光標識、例えばフルオレセイン、又は放射活性トレーサーなど）、タンパク質精製を促進する部分（例、小ペプチドタグ、例えばＨｉｓタグ又はｓｔｒｅｐタグなど）、改善された治療的効力のためにエフェクター機能を提供する部分（例、抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害性を提供する抗体のＦｃ部分、毒性タンパク質部分、例えば緑膿菌外毒素Ａ（ＥＴＡ）など、又は小分子毒性薬剤、例えばメイタンシノイド又はＤＮＡアルキル化薬剤など）、又は改善された薬物動態を提供する部分などに共有結合的に結合させてもよい。改善された薬物動態は、認知された治療的な必要性に従って評価されうる。しばしば、恐らくは、タンパク質が、投与後に、血清中で利用可能なままである時間を増加させることにより、バイオアベイラビリティを増加させること及び／又は用量の間の時間を増加させることが望ましい。一部の例において、経時的なタンパク質の血清濃度の連続性を改善させる（例、投与後から短時間での濃度と次の投与前から短時間での濃度の間のタンパク質の血清濃度における差を減少させる）ことが望ましい。血液からのクリアランスを遅くする傾向がある部分は、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、糖（例、シアル酸）、十分に許容されるタンパク質部分（例、Ｆｃフラグメント又は血清アルブミン）、及び豊富な血清タンパク質（例えば抗体Ｆｃフラグメント又は血清アルブミンなど）についての特異性及び親和性を伴う結合ドメイン又はペプチドを含む。血清アルブミンについての親和性を伴う、そのような結合ドメインの例が、ＷＯ  ２０１２／０６９６５４において提供されている。本発明の組換え結合タンパク質を、哺乳動物において（例、マウス、ラット、又はヒトにおいて）、ポリペプチドのクリアランス速度を、非修飾ポリペプチドと比べて、３倍より大きく低下させる部分に付着させてもよい。
【０１２１】
さらなる実施態様において、本発明は、特定の組換え結合タンパク質、特定のアンキリンリピートドメイン、特定のアンキリンリピートモジュール、及び特定のキャッピングモジュールをコードする核酸分子に関する。さらに、前記核酸分子を含むベクターを考える。
【０１２２】
さらに、上で言及した組換え結合タンパク質、特に、リピートドメインを含む結合タンパク質、又は特定の結合タンパク質をコードする核酸分子の１つ又は複数、ならびに、場合により、医薬的に許容可能な担体及び／又は希釈剤を含む医薬的組成物を考える。医薬的に許容可能な担体及び／又は希釈剤は、当業者に公知であり、下でより詳細に説明する。さらに、上で言及した結合タンパク質、特に、リピートドメインを含む結合タンパク質の１つ又は複数を含む診断用組成物を考える。
【０１２３】
医薬的組成物は、上に記載する組換え結合タンパク質及び医薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定剤を含む（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]に記載される通り）。当業者に公知の適した担体、賦形剤、又は安定剤は、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、ハンクス溶液、固定油、オレイン酸エチル、生理食塩水中の５%デキストロース、等張性及び化学的安定性を増強させる物質、緩衝液、ならびに保存剤である。他の適した担体は、それ自体が、組成物（例えば、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合アミノ酸、及びアミノ酸共重合体など）を受ける個体に有害な抗体の産生を誘導しない任意の担体を含む。医薬的組成物は、また、追加の活性薬剤（例えば抗癌剤又は抗血管形成剤など）を含む組み合わせ製剤でありうる。
【０１２４】
インビボ投与のために使用される製剤は、無菌又は滅菌でなければならない。これは、滅菌ろ過膜を通したろ過により容易に達成される。
【０１２５】
医薬的組成物は、当業者の知識内の任意の適した方法により投与されうる。
【０１２６】
さらに、上で言及する医薬的組成物のいずれかが、障害の処置のために考えられる。
【０１２７】
本発明は、さらに、処置の方法を提供する。この方法は、それを必要とする患者に、本発明の結合タンパク質の治療的に効果的な量、すなわち、患者に所望の効果を生じるのに十分な量を投与することを含む。
【０１２８】
さらに、それを必要とする患者に、上で言及する医薬的組成物の効果的な量を投与することを含む、ヒトを含む哺乳動物において病理学的状態を処置する方法が考えられる。
【０１２９】
そのような病理学的状態の例は、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、肺高血圧症、眼及び網膜疾患ならびに線維性疾患（肺線維症、肝硬変、強皮症、糸球体硬化症、及び心線維症を含む）である。また、抗ＰＤＧＦ−ＢＢ治療は、腫瘍学、病理学的状態（例えば神経膠腫、肉腫、白血病、リンパ腫、及び上皮癌など）のために有用である。
【０１３０】
本発明に従った組換え結合タンパク質又はアンキリンリピートドメインは、いくつかの方法、例えばバクテリオファージ（ＷＯ  １９９０／００２８０９、ＷＯ  ２００７／００６６６５）又は細菌細胞（ＷＯ  １９９３／０１０２１４）の表面上でのディスプレイ、リボソームディスプレイ（ＷＯ  １９９８／０４８００８）、プラスミド上でのディスプレイ（ＷＯ  １９９３／００８２７８）、又は共有結合的ＲＮＡリピートタンパク質ハイブリッド構築物を使用することにより（ＷＯ  ２０００／０３２８２３）、又は細胞内発現及び選択／スクリーニング、例えばタンパク質相補性アッセイ（ＷＯ  １９９８／３４１１２０）などにより得られうる及び／又はさらに進化されうる。そのような方法は、当業者に公知である。
【０１３１】
本発明に従った組換え結合タンパク質又はアンキリンリピートドメインの選択／スクリーニングのために使用されるアンキリンリピートタンパク質のライブラリーは、当業者に公知のプロトコールに従って得てもよい（ＷＯ  ２００２／０２０５６５、Binz, H.K., et al., J. Mol. Biol., 332, 489-503, 2003、及びBinz et al., 2004、前掲文献）。ＰＤＧＦ−ＢＢについての特異性を伴うアンキリンリピートドメインの選択のための、そのようなライブラリーの使用を、実施例１において例示する。さらに、本発明のアンキリンリピートドメインは、本発明に従ったアンキリンリピートモジュール及び適切なキャッピングモジュール又はキャッピングリピート（Forrer, P., et al., FEBS letters 539, 2-6, 2003）から、標準的な組換えＤＮＡ技術（例、ＷＯ  ２００２／０２０５６５、Binz et al., 2003、前掲文献、及びBinz et al., 2004、前掲文献）を使用して、モジュール組み立てされうる。
【０１３２】
本発明は、実施例に記載される特定の実施態様に制限されない。他の供給源を、以下に記載する一般的な概要に従って使用及び加工してよい。
【０１３３】
実施例
【０１３４】
下に開示する出発材料及び試薬の全てが、当業者に公知であり、商業的に利用可能である、又は、周知の技術を使用して調製することができる。
【０１３５】
材料
化学薬品はFluka（Switzerland）から購入した。オリゴヌクレオチドはMicrosynth（Switzerland）からであった。特記なき場合、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、New England Biolabs（ＵＳＡ）又はFermentas（リトアニア）からであった。クローニング及びタンパク質産生株は、大腸菌ＸＬ１−ｂｌｕｅ（Stratagene、ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Novagen、ＵＳＡ）であった。組換えヒト及びマウスＰＤＧＦ−ＢＢを、Reliatech（ドイツ；それぞれ、製品番号２００−０５５及びＭ１０−１２５）から購入した。ビオチン化ＰＤＧＦ−ＢＢを、標準的なビオチン化試薬及び方法を使用して、タンパク質の１級アミンへのビオチン部分のカップリングを介して化学的に得た。
【０１３６】
分子生物学
特記なき場合、方法は、記載されるプロトコールに従って実施する（Sambrook J., Fritsch E. F. and Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory 1989, New York）。
【０１３７】
設計アンキリンリピートタンパク質ライブラリー
設計アンキリンリピートタンパク質ライブラリーを生成するための方法が、記載されている（ＷＯ  ２００２／０２０５６５；Binz et al. 2003、前掲文献；Binz et al. 2004、前掲文献）。そのような方法により、無作為化アンキリンリピートモジュール及び／又は無作為化キャッピングモジュールを有する設計アンキリンリピートタンパク質ライブラリーを構築することができる。例えば、そのようなライブラリーは、したがって、固定化Ｎ末端キャッピングモジュール（例、配列番号２のＮ末端キャッピングモジュール）又は配列番号６４に従った無作為化Ｎ末端キャッピングモジュール、配列番号２０、６２、又は６３の配列モチーフに従った１つ又は複数の無作為化リピートモジュール、及び固定化Ｃ末端キャッピングモジュール（例、配列番号８のＣ末端キャッピングモジュール）又は配列番号６５に従った無作為化Ｃ末端キャッピングモジュールに基づいて組み立てることができうる。好ましくは、そのようなライブラリーを、リピート又はキャッピングモジュールの無作為化位置にアミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前に）、又はＰを有さないように組み立てる。また、配列番号２０、６２、又は６３の配列モチーフに従った無作為化リピートモジュールを、さらに、位置１０及び／又は位置１７で無作為化することができうる；配列番号６４の配列モチーフに従った無作為化Ｎ末端キャッピングモジュールを、さらに、位置７及び／又は位置９で無作為化することができうる；ならびに、配列番号６５の配列モチーフに従った無作為化Ｃ末端キャッピングモジュールを、さらに、位置１０、１１、及び／又は１７で無作為化することができうる。
【０１３８】
さらに、そのようなライブラリー中のそのような無作為化モジュールは、無作為化アミノ酸位置を伴う追加のポリペプチドループ挿入を含みうる。そのようなポリペプチドループ挿入の例は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）ループライブラリー又はデノボ生成されたペプチドライブラリーである。例えば、そのようなループ挿入を、ガイダンスとして、ヒトリボヌクレアーゼＬのＮ末端アンキリンリピートドメインの構造を使用して設計することができうる（Tanaka, N., Nakanishi, M, Kusakabe, Y, Goto, Y., Kitade, Y, Nakamura, K.T., EMBO J. 23(30), 3929-3938, 2004）。１０のアミノ酸が、２つのアンキリンリピートの境界の近くに存在するベータ−ターン中に挿入される、このアンキリンリピートドメインと同様に、アンキリンリピートタンパク質ライブラリーは、アンキリンリピートドメインの１つ又は複数のベータ−ターン中に挿入される可変長（例、１〜２０のアミノ酸）の無作為化ループ（固定化及び無作為化位置を伴う）を含んでもよい。
【０１３９】
アンキリンリピートタンパク質ライブラリーの任意のそのようなＮ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＲＩＬＬＡＡモチーフ（例、配列番号６４における位置２１から２６に存在する）の代わりに、ＲＥＬＬＫＡ又はＲＩＬＫＡＡモチーフを持ち、アンキリンリピートタンパク質ライブラリーの任意のそのようなＣ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＫＬＮモチーフ（例、配列番号６５における最後の３つのアミノ酸）の代わりに、ＫＡＡ又はＫＬＡモチーフを持つ。
【０１４０】
そのようなアンキリンリピートタンパク質ライブラリーの設計は、標的と相互作用するアンキリンリピートドメインの公知の構造により導かれうる。そのような構造の例は、それらのProtein Data Bank（ＰＤＢ）固有のアクセッション又は同定コード（ＰＤＢ−ＩＤ）により同定され、１ＷＤＹ、３Ｖ３１、３Ｖ３０、３Ｖ２Ｘ、３Ｖ２Ｏ、３ＵＸＧ、３ＴＷＱ−３ＴＷＸ、１Ｎ１１、１Ｓ７０、及び２ＺＧＤである。
【０１４１】
設計アンキリンリピートタンパク質ライブラリーの例（例えばＮ２Ｃ及びＮ３Ｃ設計アンキリンリピートタンパク質ライブラリーなど）が記載されている（ＷＯ  ２００２／０２０５６５；Binz et al. 2003、前掲文献；Binz et al. 2004、前掲文献）。Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ中の桁は、Ｎ末端とＣ末端キャッピングモジュールの間に存在する無作為化リピートモジュールの数を記載する。
【０１４２】
リピート単位及びモジュール内部の位置を定義するために使用される命名法は、Binz et al. 2004、前掲文献に基づき、アンキリンリピートモジュール及びアンキリンリピート単位の境界が、１つのアミノ酸位置だけシフトしているという改変を伴う。例えば、Binz et al. 2004（前掲文献）のアンキリンリピートモジュールの位置１は、本開示のアンキリンリピートモジュールの位置２に対応する。結果的に、Binz et al. 2004（前掲文献）のアンキリンリピートモジュールの位置３３は、本開示の以下のアンキリンリピートモジュールの位置１に対応する。
【０１４３】
全てのＤＮＡ配列をシークエンシングにより確認し、全ての記載されたタンパク質の算出された分子量を質量分析により確認した。
【０１４４】
実施例１：ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴うアンキリンリピートドメインを含む結合タンパク質の選択
【０１４５】
リボソームディスプレイ（Hanes, J. and Plueckthun, A., PNAS 94, 4937-42, 1997）を使用し、ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴う多くの設計アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）を、Binz et al. 2004（前掲文献）により記載される通りのＤＡＲＰｉｎライブラリーより選択した。特異的（ＰＤＧＦ−ＢＢ）及び非特異的（ＭＢＰ、大腸菌マルトース結合タンパク質）標的に向けた、選択されたクローンの結合を、粗抽出物ＥＬＩＳＡにより評価し、ＰＤＧＦ−ＢＢ結合タンパク質が成功裏に選択されたことを示す。例えば、配列番号２３〜６１のアンキリンリピートドメインは、ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴うアンキリンリピートドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合特異性を伴う、そのようなアンキリンリピートドメインからの個々のアンキリンリピートモジュールを、配列番号１２、１４、１５、１７、１８、及び１９において提供する。ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合特異性を伴う、そのようなアンキリンリピートドメインの個々のキャッピングモジュールを、配列番号１３及び１６において提供する。
【０１４６】
リボソームディスプレイによるＰＤＧＦ−ＢＢ特異的アンキリンリピートタンパク質の選択
ＰＤＧＦ−ＢＢ特異的アンキリンリピートタンパク質の選択は、リボソームディスプレイ（Hanes and Plueckthun、前掲文献）により、標的タンパク質としてのヒト及びマウスＰＤＧＦ−ＢＢ、上に記載される通りの設計アンキリンリピートタンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコール（Zahnd, C., Amstutz, P. and Plueckthun, A., Nat.Methods 4, 69-79, 2007）を使用して実施した。各々の選択ラウンド後の逆転写（ＲＴ）−ＰＣＲサイクルの数を、４０から３０に、一定に低下させ、結合剤の濃縮に起因する収率に調整した。選択の最初の４ラウンドでは、標準的なリボソームディスプレイ選択を用い、減少する標的濃度及び増加する洗浄ストリンジェンシーを使用し、ラウンド１からラウンド４まで選択圧を増加させた（Binz et al.2004、前掲文献）。高親和性の抗ＰＤＧＦ−ＢＢ  ＤＡＲＰｉｎを濃縮するために、標準的なリボソームディスプレイ選択（上）の第４ラウンドからのアウトプットを、増加した選択ストリンジェンシーを伴うオフ速度選択ラウンドに供した（Zahnd, 2007、前掲文献）。最後の標準的な選択ラウンドを実施し、オフ速度選択された結合タンパク質を増幅及び回収した。
【０１４７】
選択されたクローンは、粗抽出物ＥＬＩＳＡにより示される通り、ＰＤＧＦ−ＢＢに特異的に結合する
ＰＤＧＦ−ＢＢに特異的に結合する個々の選択されたＤＡＲＰｉｎを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により、ＤＡＲＰｉｎ発現細胞の大腸菌粗抽出物を使用して、標準的なプロトコールを使用して同定した。リボソームディスプレイにより選択されたＤＡＲＰｉｎを、ｐＱＥ３０（Qiagen）発現ベクター中にクローン化し、大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（Strategene）中に形質転換し、次に、３７℃で、１mlの成長培地（１%グルコース及び１００μg/mlアンピシリンを含む２ＹＴ）を含む９６深底ウェルプレート（単一ウェル中に各々のクローン）中で一晩成長させた。５０μg/mlアンピシリンを含む１mlの新鮮２ＹＴに、新鮮な９６深底ウェルプレートにおいて、１００μlの一晩培養物を用いて接種した。３７℃で２時間にわたるインキュベーション後、発現をＩＰＴＧ（１mM最終濃度）で誘導し、３時間にわたり持続した。細胞を収集し、１００μlのＢ−ＰＥＲＩＩ（Pierce）中に再懸濁させ、室温で、撹拌を伴い、１５分間にわたりインキュベートした。次に、９００μlのＰＢＳ−ＴＣ（０．２５%カゼイン加水分解物、０．１%  Tween20（登録商標）、ｐＨ７．４を添加したＰＢＳ）を加え、細胞細片を遠心により除去した。１００μｌの各々の溶解クローンを、ＰＤＧＦ−ＢＢ又はそれらのビオチン部分を介して固定化された無関係のＭＢＰのいずれかを含む、NeutrAvidinコーティングしたMaxiSorpプレートのウェルに適用し、１時間にわたり室温でインキュベートした。ＰＢＳ−Ｔ（０．１%  Tween 20（登録商標）、ｐＨ  ７．４を用いて補充したＰＢＳ）を用いた広範囲の洗浄後、プレートを、モノクローナルホースラディッシュ標識抗ＲＧＳ（Ｈｉｓ）４抗体（３４６５０，Qiagen）を使用した標準的ＥＬＩＳＡ手順を使用して現像した。結合を、次に、ＰＯＤ基質（Roche）により検出した。色の発生を、４０５ｎｍで測定した。そのような細胞粗抽出物ＥＬＩＳＡによる数百のクローンのスクリーニングによって、ＰＤＧＦ−ＢＢについての特異性を伴う百を上回る異なるＤＡＲＰｉｎが明らかになった。これらの結合タンパク質を、さらなる分析のために選んだ。ＰＤＧＦ−ＢＢに特異的に結合する、選択されたアンキリンリピートドメインのアミノ酸配列の例を、配列番号２３〜６１において提供する。
【０１４８】
ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴うこれらのアンキリンリピートドメイン及びＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴わないネガティブコントロールＤＡＲＰｉｎ（即ち、ＤＡＲＰｉｎ  ＃２１及び’＃２２）を、下に記載する通りの単純なタンパク質精製を促進するためのＮ末端Ｈｉｓタグを提供するｐＱＥ（QIAgen, Germany）ベースの発現ベクター中にクローン化した。このように、以下のＤＡＲＰｉｎをコードする発現ベクターを構築した：
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２１（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号２１）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２２（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号２２）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２３（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号２３）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２４（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号２４）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２５（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号２５）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２６（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号２６）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号２７）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号２８）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃２９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号２９）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃３０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号３０）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃３１（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号３１）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃３２（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号３２）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃３３（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号３３）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃３４（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号３４）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃３５（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号３５）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃３６（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号３６）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃３７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号３７）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃３８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号３８）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃３９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号３９）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃４０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号４０）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃４１（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号４１）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃４２（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号４２）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃４３（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号４３）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃４４（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号４４）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃４５（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号４５）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃４６（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号４６）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃４７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号４７）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃４８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号４８）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃４９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号４９）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃５０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号５０）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃５１（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号５１）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃５２（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号５２）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃５３（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号５３）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃５４（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号５４）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃５５（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号５５）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃５６（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号５６）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃５７（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号５７）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃５８（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号５８）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃５９（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号５９）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃６０（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号６０）；
ＤＡＲＰｉｎ  ＃６１（そのＮ末端に融合されたＨｉｓタグ（配列番号９）を伴う配列番号６１）。
【０１４９】
ＤＡＲＰｉｎの高レベル及び可溶性発現
さらなる分析のために、上に記載する通りの細胞粗抽出物ＥＬＩＳＡにおいて特異的なＰＤＧＦ−ＢＢ結合を示す、選択されたクローンを、大腸菌ＢＬ２１又はＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞において発現させ、標準的なプロトコールを使用し、それらのＨｉｓタグを使用して精製した。５０mlの静置一晩培養物（ＴＢ、１%グルコース、１００mg/lアンピシリン；３７℃）を使用し、１１の培養物（グルコースを伴わない同じ培地）に接種した。６００nmでの吸光度０．７（ＢＬ２１については１）で、培養物を、０．５mM  ＩＰＴＧを用いて誘導し、３７℃で４時間にわたりインキュベートした。培養物を遠心し、結果として得られたペレットを、４０mlのＴＢＳ５００（５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５００mM  ＮａＣｌ、ｐＨ８）中に再懸濁し、超音波処理した。ライセートを再遠心し、グリセロール（１０%（ｖ／ｖ）最終濃度）及びイミダゾール（２０mM最終濃度）を、結果として得られた上清に加えた。タンパク質を、製造者（QIAgen、ドイツ）の指示に従い、Ｎｉニトリロ三酢酸カラム（２．５mlカラム容積）上で精製した。あるいは、６ｘＨｉｓタグを欠くＤＡＲＰｉｎ又は選択されたリピートドメインを、陰イオン交換クロマトグラフィー、それに続くサイズ排除クロマトグラフィーにより、標準的な樹脂及び当業者に公知のプロトコールに従って精製した。ＰＤＧＦ−ＢＢへの結合特異性を伴う、高度に可溶性のＤＡＲＰｉｎの２００mgまでを、１リットルの大腸菌培養物から精製することができ、ＳＤＳ−１５%  ＰＡＧＥから推定した通り、純度＞９５%を伴う。そのような精製ＤＡＲＰｉｎを、さらなる特徴付けのために使用する。
【０１５０】
実施例２：表面プラズモン共鳴分析による、ＰＤＧＦ−ＢＢについての特異性のための結合を伴うＤＡＲＰｉｎの特徴付け
【０１５１】
ヒト及びマウスからのビオチン化ＰＤＧＦ−ＢＢ分子を、フローセルにおいて、コーディングしたストレプトアビジンへの結合を通じて固定化し、種々の選択されたＤＡＲＰｉｎとの相互作用を分析した。
【０１５２】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析
ＳＰＲを、ProteOn機器（BioRad）を使用して測定した。測定は、当業者に公知の標準的な手順に従って実施した。泳動緩衝液は、０．００５%  Tween 20（登録商標）を含むＰＢＳ（ｐＨ  ７．４）であった。ニュートラビジンを、GLCチップ（BioRad）上で、約８０００共鳴単位（ＲＵ）のレベルまで、共有結合的に固定化した。ニュートラビジンでコーティングしたチップ上でのＰＤＧＦ−ＢＢの固定化を、次に、実施した。ＤＡＲＰｉｎ  ＰＤＧＦ−ＢＢの相互作用を、次に、１２．５、６．２６、３．１３、及び１．６７nM（オン速度測定）の濃度のＤＡＲＰｉｎの連続希釈物を含む１００μlの泳動緩衝液（０．００５%  Tween（登録商標）を含むＰＢＳ）を注射することにより測定し、一定流速３０μl/分（オフ速度測定）で、１０分間から３時間までの間の泳動緩衝液流が続いた。非コーティングレファレンスセル及びレファレンス注射（即ち、泳動緩衝液だけの注射）のシグナル（即ち、共鳴単位（ＲＵ）値）を、ＰＤＧＦ−ＢＢの注射後に得られたＲＵトレースから減算した（ダブルレファレンス）。オン速度及びオフ速度の測定値から得られたＳＲＰトレースから、対応するＤＡＲＰｉｎＰＤＧＦ−ＢＢ相互作用のオン及びオフ速度を決定することができる。
【０１５３】
結果を表１にまとめる。解離定数（Kd）を、推定されたオン及びオフ速度から、当業者に公知の標準的な手順を使用して算出した。
【表１】
2015522576.tif 000002
【０１５４】
実施例３：ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴うＤＡＲＰｉｎによる線維芽細胞増殖の阻害
【０１５５】
ＮＩＨ−３Ｔ３線維芽細胞は、ＰＤＧＦ−ＢＢを含むアッセイのために使用した標準的な細胞株であった。１日目、７０%〜８０%コンフルエンスで、細胞を収集し、９６ウェルプレート中に、成長培地中で５０００個細胞／ウェルの密度を伴い播種し、培地をアッセイ培地に変えることによる約７〜８時間後での細胞の飢餓が続き、２４時間にわたりインキュベートした。全てのインキュベーション条件は、３７℃で、５%  ＣＯ２流を伴った。細胞の飢餓に続き、２日目、培地を、成長因子ヒトＰＤＧＦ−ＢＢの希釈系列を含む新鮮アッセイ培地（増殖アッセイ用）又は阻害アッセイ用のＤＡＲＰｉｎの２．５倍希釈系列（２００nM〜０．０５nM）を伴う２０ng/mLヒトＰＤＧＦ−ＢＢの阻害混合物に変えた。細胞を、別の４８時間にわたり、この条件において、２０μLのＷＳＴ−１試薬（Roche製品番号１１６４４８０７００１）の添加時にインキュベートした。この試薬によって、生細胞の数を分析する比色アッセイが可能になる。シグナルの読み出しを、ＷＳＴ−１の添加後２、４、及び６時間のいくつかの時点で、Ａ６００nmでの補正バックグラウンドを伴い、Ａ４５０nmで行った。
【０１５６】
結果を表２においてまとめる。ＩＣ５０値を、GraphPad Prismソフトウェア及び当業者に公知の標準的な手順を使用し、上に記載する通りに得られた滴定曲線から算出した。例の滴定曲線を、ＤＡＲＰｉｎ  ＃４９について、図１において与える。
【表２】
2015522576.tif 000003
【０１５７】
実施例４：受容体競合アッセイによるＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴うＤＡＲＰｉｎの特徴付け
【０１５８】
その受容体ＰＤＧＦＲｂｅｔａへのヒトＰＤＧＦ−ＢＢの結合を阻害するためのＰＥＧ化抗ＰＤＧＦ−ＢＢ  ＤＡＲＰｉｎの効力を、受容体競合ＥＬＩＳＡ（PDGF-BB Quantikine, R&D Systemsに基づく）において決定した。ＰＤＧＦＲｂｅｔａ／Ｆｃキメラをマイクロプレート上にプレコーティングしている。ＤＡＲＰｉｎを、PDGF-BB Quantikineキット（R&D Systems）からのアッセイ希釈剤中で、定められた量のＰＤＧＦ−ＢＢを用いてプレインキュベートし、室温で、２時間にわたり、７５０rpmでの撹拌を伴いインキュベートした。これらのプレインキュベーション混合物を、次に、プレコーティングしたウェル中に移し、ＤＡＲＰｉｎにより遮断されない任意のＰＤＧＦ−ＢＢを、固定化した受容体により結合させた。任意の非結合物質を洗い流した後、ＰＤＧＦ−ＢＢについて特異的なホースラディッシュペルオキシダーゼ連結ポリクローナル抗体をウェルに加えた。任意の非結合抗体−酵素試薬を除去するための洗浄に続き、基質溶液をウェルに加え、色が、結合したＰＤＧＦ−ＢＢの量に比例して発生していた。色の発生を停止させ、色の密度を４０５nmで測定した。このアッセイにおいて、テストしたＤＡＲＰｉｎは、表３においてまとめる通り、高いＰＤＧＦ−ＢＢ阻害効力を示した。例の滴定曲線を、ＤＡＲＰｉｎのセットについて、図２において与える。ＩＣ５０値を、GraphPad Prismソフトウェア及び当業者に公知の標準的な手順を使用し、上に記載する通りに得られた滴定曲線から算出した。
【表３】
2015522576.tif 000004
【０１５９】
実施例５：ＰＤＧＦ−ＢＢについての結合特異性を伴うＤＡＲＰｉｎによるマウスにおけるレーザー誘導性脈絡膜血管新生の阻害
【０１６０】
新生血管の成長に対する効果をインビボでテストした。マウスのレーザー脈絡膜血管新生モデルを選び、発表及び記載されている通りに実施した（Takahashi, K., Saishin, Y., Saishin, Y., King, A.G., Levin, R. and Campochiaro, P.A., Arch. Ophthalmol.127(4), 494 - 499, 2009）。
脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）を、以前に記載された通りに、ブルッフ膜のレーザー光凝固誘導性破裂により誘導した。２日目に、成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、塩酸ケタミン（１００mg/kg体重）を用いて麻酔し、瞳孔を、１%トロピカミドを用いて散大させた。５３２nmダイオードレーザー光凝固（７５μmスポットサイズ、０．１秒の継続時間、１２０mW）の３つの熱傷を、各々の網膜に、OcuLight GLダイオードレーザーのスリットランプ送達システムを用いて、網膜を見るためのコンタクトレンズとしてハンドヘルドカバースリップを使用して送達した。熱傷を、網膜の後極の９、１２、及び３時の位置において実施した。レーザー時の気泡の産生は、ブルッフ膜の破裂を示し、脈絡膜血管新生を得る際での重要な因子であり、従って、気泡が産生した熱傷だけを試験に含めた。ＤＡＲＰｉｎ  ＃６１−ＰＥＧ２０を、毎日、それぞれ濃度１０又は１mg/kgを用いて、図３において示す通りに投与した。１４日目、マウスを、フルオレセイン標識デキストランを用いて心臓灌流し、網膜フラットマウントを、記載される通りに調製し（Takahashi et al.、前掲文献）、新生血管形成の面積を、画像分析により定量化した。統計分析を、１方向ＡＮＯＶＡ及びダネットポストテストを使用して実施し、全てのＤＡＲＰｉｎ群を賦形剤群と比較した。これらの技術は、全て、当業者に公知である。結果を図３に示す。
【図１】
2015522576.tif 000005
【図２】
2015522576.tif 000006
【図３】
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【配列表】
2015522576000001.app
【国際調査報告】
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