(57)【要約】MALT1切断活性は、DLBCLの化学療法抵抗性型である、活性化B細胞様びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（ABC-DLBCL）の病因に関連している。本発明者らはMALT1活性検定を開発し、化学的に多様なMALT1阻害剤を特定した。選択したリード化合物MI-2は、MALT1への直接結合およびそのプロテアーゼ機能の抑制を特徴とした。MI-2はヒトABC-DLBCL細胞内に集中し、MALT1基質の切断を不可逆的に阻害した。これはNF-κBレポーター活性の抑制、c-RELの核局在の阻害およびNF-κB標的遺伝子シグネチャーのダウンレギュレーションを伴った。最も注目すべきことに、MI-2はマウスに対して非毒性で、インビトロでABC-DLBCL細胞株、およびインビボで異種移植したABC-DLBCL腫瘍に対して、強力かつ特異的な活性を示した。この化合物はエクスビボで初代ヒト非GCB-DLBCLに対しても有効であった。2015536990.tif 000033
2015536990.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
MALT1を調節する方法であって、MALT1を式（I）の化合物、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体の有効な量または濃度と接触させる段階を含む、方法：
2015536990.tif 000022
式中、
破線の結合は、結合が存在してもしなくてもよいことを示し；
Y1とY2との間に二重結合が存在する場合、Y1がNまたはCRであり、Y2がCであり、かつAr1が存在し；Y1とY2との間に一重結合が存在する場合、Y1がCR2であり、Y2がOまたはSであり、かつAr1が存在せず、それぞれ独立に選択されたRはHまたは(C1-C6)アルキルであり；
R1がアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルであり、ここで任意のアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルは、ハロまたは(C1-C6)アルコキシで一置換または独立に多置換されていてもよく、ただし酸素原子とY3を含む環との間に二重結合が存在する場合、R1が存在せずかつAr3が存在し、酸素原子と環との間に一重結合が存在する場合、R1が存在し、Y3と酸素原子を有する炭素原子との間の二重結合が存在し、かつAr3が存在せず；
Ar1が1〜3つのJ1基で置換されたフェニルであり；J1はハロまたは(C1-C6)アルコキシであり；
Ar2が1〜3つのJ2基で置換されたフェニルであり；J2は式-N(R)C(O)-R2の基であり、かつR2はアルキル、アリール、またはアリールアミノであり、ここで任意のアルキル、アリール、またはアリールアミノは0〜2つのハロ、ニトロ、または(C1-C6)アルコキシ基で置換されており；
Ar3が1〜3つのJ3基で置換されたフェニルであり；J3はハロまたは(C1-C6)アルコキシである。
【請求項２】
式（I）の化合物が、式（IA）の化合物、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体である、請求項1記載の方法：
2015536990.tif 000023
式中、R1、Ar1、およびAr2は式（I）について定義したとおりである。
【請求項３】
式（I）の化合物が、式(IB）の化合物、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体である、請求項1記載の方法：
2015536990.tif 000024
式中、Ar2およびAr3は式（I）について定義したとおりである。
【請求項４】
化合物が下記：
2015536990.tif 000025
2015536990.tif 000026
2015536990.tif 000027
のいずれか、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
MALT1を生きている動物内部で処理する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
生きている動物が、癌に罹っているヒトである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
癌を処置または予防する方法であって、式（I）の化合物、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体の有効用量を患者に投与する段階を含む、方法：
2015536990.tif 000028
式中、
破線の結合は、結合が存在してもしなくてもよいことを示し；
Y1とY2との間に二重結合が存在する場合、Y1がNまたはCRであり、Y2がCであり、かつAr1が存在し；Y1とY2との間に一重結合が存在する場合、Y1がCR2であり、Y2がOまたはSであり、かつAr1が存在せず、それぞれ独立に選択されたRはHまたは(C1-C6)アルキルであり；
R1がアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルであり、ここで任意のアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルは、ハロまたは(C1-C6)アルコキシで一置換または独立に多置換されていてもよく、ただし酸素原子とY3を含む環との間に二重結合が存在する場合、R1が存在せずかつAr3が存在し、酸素原子と環との間に一重結合が存在する場合、R1が存在し、Y3と酸素原子を有する炭素原子との間の二重結合が存在し、かつAr3が存在せず；
Ar1が1〜3つのJ1基で置換されたフェニルであり；J1はハロまたは(C1-C6)アルコキシであり；
Ar2が1〜3つのJ2基で置換されたフェニルであり；J2は式-N(R)C(O)-R2の基であり、かつR2はアルキル、アリール、またはアリールアミノであり、ここで任意のアルキル、アリール、またはアリールアミノは0〜2つのハロ、ニトロ、または(C1-C6)アルコキシ基で置換されており；
Ar3が1〜3つのJ3基で置換されたフェニルであり；J3はハロまたは(C1-C6)アルコキシである。
【請求項８】
式（I）の化合物が、式（IA）の化合物、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体である、請求項7記載の方法：
2015536990.tif 000029
式中、R1、Ar1、およびAr2は式（I）について定義したとおりである。
【請求項９】
式（I）の化合物が、式(IB）の化合物、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体である、請求項7記載の方法：
2015536990.tif 000030
式中、Ar2およびAr3は式（I）について定義したとおりである。
【請求項１０】
化合物が下記：
2015536990.tif 000031
2015536990.tif 000032
のいずれか、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体である、請求項7記載の方法。
【請求項１１】
癌がリンパ腫である、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
リンパ腫がびまん性大細胞型B細胞リンパ腫である、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
MALT1の低分子調節剤を特定する方法であって、ロイシンジッパー二量体化モティーフと融合したMALT1（340〜789）の組換え型（LZ-MALT1）と、候補調節化合物とを、蛍光発生物質AMC（7-アミノ-4-メチルクマリン）に連結されたMALT1基質ペプチドLRSRを用いて、Ac-LRSR-AMC基質のMALT1による切断がAMCおよび蛍光シグナルの放出をきたすように接触させる段階を含み、ここで候補調節剤存在下でのAc-LRSR-AMC基質のMALT1の組換え型による切断の低減は、候補調節剤がMALT1の低分子調節剤であることを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2012年11月9日提出の米国特許仮出願第61/724,650号の優先権を主張し、その開示は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
背景
非ホジキンリンパ腫（NHL）は7番目に発生頻度が高い癌である（Siegel et al., 2012）。びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）はNHLの最も一般的な亜型で、すべてのリンパ腫症例の約25％を占める（Swerdlow, 2008）。遺伝子発現プロファイリングにより、DLBCLの胚中心B細胞様（GCB）DLBCL、活性化B細胞様（ABC）DLBCLおよび原発性縦隔B細胞リンパ腫（PMBL）を含む、異なる分子亜型への細分類が可能となった（Alizadeh et al., 2000；Rosenwald et al., 2003）。これらの亜型は、その再発性体細胞変異の範囲、異なるシグナル伝達経路への依存、および現行の標準的療法への反応において著しく異なる（Lenz et al., 2008b；Wright et al., 2003）。GCB亜型を有する患者は、ABC亜型を有する患者に比べて、全生存が有意に良好である（Alizadeh et al., 2000；Rosenwald et al., 2002）。すべてのDLBCLに対する改善された療法が必要であるが、最も化学療法抵抗性のABC-DLBCLに関して最も緊急性が高い。
【０００３】
ABC-DLBCLは、いくつかの異なるメカニズムによるNF-κB経路の発癌活性化への依存によって特徴付けられる。これらは主に、下記を含むB細胞受容体（BCR）下流のシグナル伝達に関与する分子の体細胞変異を含む：CARMA1/CARD11（Lenz et al., 2008a）およびCD79A/B（Davis et al., 2010）の活性化変異、TNFAIP3/A20のホモ接合性欠失/不活化変異（Compagno et al., 2009；Honma et al., 2009）またはToll様受容体下流のMYD88の活性化変異（Ngo et al., 2011）。CARMA1はCBM複合体の一部を形成し（CARMA1-BCL10-MALT1）、B細胞受容体、T細胞受容体（Ruefli-Brasse et al., 2003；Ruland et al., 2003）およびITAM結合NK細胞受容体（Gross et al., 2008）下流のNF-κB活性化を仲介する。MALT1サブユニットはCBM複合体の活性シグナル伝達成分であり（Lucas et al., 2001）、TNFAIP3/A20（Coornaert et al., 2008）、CYLD（Staal et al., 2011）およびRELB（Hailfinger et al., 2011）またはBCL10タンパク質（Rebeaud et al., 2008）などのNF-κBシグナル伝達経路の阻害剤を切断して不活化し、NF-κBシグナル伝達を間接的に活性化する、プロテアーゼ活性を特徴とする。MALT1転座（API2-MALT1融合を生じるt(11;18)(q21;q21)およびIGH-MALT1転座を引き起こすt(14;18)(q32;q21)）は、MALT型リンパ腫を有する患者の最大55％で検出される（Farinha and Gascoyne, 2005）。この転座はMALT1の過剰発現と、API2-MALT1転座の場合、経路の構成的活性化をもたらす（Dierlamm et al., 1999；Sanchez-Izquierdo et al., 2003；Streubel et al., 2003）。マウスにおけるMALT1の構成的発現は、ヒトのMALTリンパ腫に類似の疾患を誘導し、p53欠損を背景に持つ場合ABC様DLBCLを誘導する（Vicente-Duenas et al., 2012）。DLBCLにおいてMALT1の変異または転座は見つかっていないが、BCL2と共に増加し、この低いコピー数増幅はABC-DLBCL表現型に関連している（Dierlamm et al., 2008）。さらに、ABC-DLBCL細胞株はMALT1触媒活性に依存することが明らかにされている（Ferch et al., 2009；Hailfinger et al., 2009；Ngo et al., 2006）。
【０００４】
MALT1は、プロテアーゼのカスパーゼ（システイン-アスパラギン酸プロテアーゼ）に関連するが、アスパラギン酸の代わりにアルギニンまたはリジン残基の後ろを切断する、パラカスパーゼである（Rebeaud et al., 2008）。MALT1欠損動物はBおよびT細胞機能の欠失を示すが、それ以外は健常で（Ruefli-Brasse et al., 2003；Ruland et al., 2003）、MALT1はヒトゲノムにおける唯一のパラカスパーゼである。これらの因子は、MALT1を標的とする療法はよく耐容され、毒性はほとんどないか、または管理しやすいであろうと示唆している。したがって、MALT1はABC-DLBCLおよびMALTリンパ腫に対する重要な治療標的の可能性がある。
【発明の概要】
【０００５】
概要
MALT1は、ABC-DLBCLにおいて異所性発癌シグナリングを伝達する特有のパラカスパーゼタンパク質である。本発明者らは、本明細書において低分子阻害剤のスクリーニングを可能にするMALT1の構成的活性化型の開発を開示し、B細胞リンパ腫などの医学的障害を処置するためのMALT1阻害化合物およびそれらの使用を特許請求する。化合物MI-2は不可逆的MALT1プロテアーゼ阻害剤で、細胞検定におけるナノモル活性およびABC-DLBCLに対する選択的活性を有するリード化合物として特定された。重要なことに、本発明者らは、MALT1阻害剤がインビトロおよびインビボでABC-DLBCLを死滅させ、動物に対しては無毒で、かつ初代ヒト非GCB-DLBCL試料も抑制することを示す。したがって、本発明者らは、MALT1が本物の治療標的であることを示し、B細胞リンパ腫に対する治療薬の新しいクラスの基礎となるリード化合物を提供する。
【０００６】
本発明は、様々な態様において、MALT1を調節する方法であって、MALT1を式（I）の化合物、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体の有効な量または濃度と接触させる段階を含む方法を提供する：
2015536990.tif 000003
式中、
破線の結合は、結合が存在してもしなくてもよいことを示し；
Y1とY2との間に二重結合が存在する場合、Y1がNまたはCRであり、Y2がCであり、かつAr1が存在し；Y1とY2との間に一重結合が存在する場合、Y1がCR2であり、Y2がOまたはSであり、かつAr1が存在せず、それぞれ独立に選択されたRはHまたは(C1-C6)アルキルであり；
R1がアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルであり、ここで任意のアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルは、ハロまたは(C1-C6)アルコキシで一置換または独立に多置換されていてもよく、ただし酸素原子とY3を含む環との間に二重結合が存在する場合、R1が存在せずかつAr3が存在し、また酸素原子と環との間に一重結合が存在する場合、R1が存在し、Y3と酸素原子を有する炭素原子との間の二重結合が存在し、かつAr3が存在せず；
Ar1が1〜3つのJ1基で置換されたフェニルであり；J1はハロまたは(C1-C6)アルコキシであり；
Ar2が1〜3つのJ2基で置換されたフェニルであり；J2は式-N(R)C(O)-R2の基であり、かつR2はアルキル、アリール、またはアリールアミノであり、ここで任意のアルキル、アリール、またはアリールアミノは0〜2つのハロ、ニトロ、または(C1-C6)アルコキシ基で置換されており；
Ar3が1〜3つのJ3基で置換されたフェニルであり；J3はハロまたは(C1-C6)アルコキシである。
【０００７】
本発明は、様々な態様において、癌を処置または予防する方法であって、上で定義した式（I）の化合物の有効用量を患者に投与する段階を含む方法をさらに提供する。より具体的には、癌は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）などの、リンパ腫でありうる。
【０００８】
本発明は、様々な態様において、MALT1の低分子調節剤を特定する方法であって、ロイシンジッパー二量体化モティーフと融合したMALT1（340〜789）の組換え型（LZ-MALT1）と、候補調節化合物とを、蛍光発生物質AMC（7-アミノ-4-メチルクマリン）に連結されたMALT1基質ペプチドLRSRを用いて、Ac-LRSR-AMC基質のMALT1による切断がAMCおよび蛍光シグナルの放出をきたすように接触させる段階を含み、ここで候補調節剤存在下でのAc-LRSR-AMC基質のMALT1の組換え型による切断の低減は、候補調節剤がMALT1の低分子調節剤であることを示す方法をさらに提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】MALT1の二量体化および活性化を促進するロイシンジッパー二量体化モティーフと融合したMALT1（340〜789）の組換え型（LZ-MALT1）の構造について、2つの透視図を示す。
【図１Ｂ】LZ-MALT1を用いての濃度反応検定における妥当性確認のために、化合物ライブラリから324個の候補化合物を選択した際の、結果のグラフ表示である。
【図１Ｃ】候補化合物の生化学的活性（IC50＜20μM）に基づくさらなる妥当性確認のために、19個の候補化合物を選択した際の、結果のグラフ表示である。
【図１Ｄ】化合物MI-2の化学構造を示す。
【図１Ｅ】MI-2がMALT1仲介性切断における用量依存的低減を引き起こしたことを実証する、ゲル電気泳動結果のウェスタンブロットの写真を示す。ウェスタンブロットデータのグラフ表示において示されるとおり、非切断CYLDタンパク質の増加およびタンパク質の切断型の低減によってそれが確認される。
【図２Ａ】MI-2と同等またはそれよりも高い活性を示す19個の類縁体を選択した際の、結果のグラフ表示である。
【図２Ｂ】細胞増殖検定におけるさらなる特徴付けのために選択した、MI-2とほぼ同等の範囲内の生化学的IC50を有するMI-2の5個の類縁体（MI-2A1〜MI-2A5）および同じ用量範囲で細胞増殖に対する効果を持たない化学的対照として用いた、インビトロでLZ-MALT1阻害活性を持たない2個の類縁体化合物（MI-2A6およびMI-2A7）の化学構造を示す。
【図２Ｃ】化合物MI-2A1〜MI-2A5の生物検定の結果のグラフ表示である。
【図２Ｄ】切断阻害に関して、5μMで8時間投与した5個の化合物MI-2A1〜MI-2A5から得た結果のグラフ表示であり、Z-VRPR-FMK MALT1ブロッキングペプチド（50μM）が陽性対照として用いられた。
【図３Ａ】MALT1のパラカスパーゼドメイン（残基329〜728）と結合するMI-2の異核種単一量子コヒーレンス（HSQC）核磁気共鳴（NMR）スペクトログラムである。
【図３Ｂ】MALT1のパラカスパーゼドメイン（残基329〜728）への、不活性類縁体MI-2A6およびMI-2A7による結合が存在しないことを証明するNMRスペクトログラムを示す。
【図３Ｃ】MALT1パラカスパーゼドメイン（残基329〜728）が55,988.4Daに主要ピークを提示したこと、および化合物MI-2とのインキュベーション後に、MALT1の主要ピークが56,407.5Daにシフトし、419.1Daの増大が見られたことを示す、質量分析データを示す。
【図３Ｄ】分子モデリングプログラムAutoDock 4.2の分子ドッキングルーチンにより計算した、MI-2のMALT1パラカスパーゼドメインへの結合の可能なモードの画像を示し、ここでMI-2はそのクロロメチル基で、パラカスパーゼドメインにおける活性部位C464に近い活性部位溝に結合するようである。
【図３Ｅ】LZ-MALT1を異なる濃度のMI-2（不可逆的阻害）およびMI-2A2（可逆的阻害）と5〜80分間プレインキュベートした後、蛍光レポーター基質Ac-LRSR-AMCを加えた場合の、酵素活性の時間経過を示す。
【図４Ａ】HBL-1およびTMD8細胞株をMI-2（2μM）または媒体のいずれかに30分間曝露し、続いてMALT1基質の切断型をMI-2への曝露中に蓄積させるために、5μM MG-132にさらに1時間（レーン2、3）、または2時間（レーン4、5）曝露した際の、切断生成物の可視化を促進するためにプロテアソーム阻害剤MG-132を用いた場合のゲル電気泳動結果のウェスタンブロットの写真を示す。
【図４Ｂ】HBL-1細胞を200nM MI-2、50μM Z-VRPR-FMK（陽性対照）または媒体に24時間曝露し、続いてホールセルまたは単離した核のc-RELフローサイトメトリーを行った実験の結果を示す。MI-2およびZ-VRPR-FMKはいずれも、このタンパク質のホールセルレベルに影響をおよぼすことなく、核c-RELをほぼ同程度まで低減させた。
【図４Ｃ】GI50濃度のMI-2（HBL-1に対しては200nMおよびTMD8に対しては500nM）で24時間処理したHBL-1およびTMD8細胞の核抽出物中のc-RELおよびp65のウェスタンブロットを示す。両方の細胞株で、MI-2への曝露は核c-RELの明らかな低減を引き起こしたが、p65レベルに影響はなかった。
【図４Ｄ】PMA/イオノマイシンにより誘導されるNF-κB活性化の減弱に対するMI-2の効果についてのデータのグラフ表示で、ここでは293T細胞にNF-κBレポーターベクター(NF-κB)5-luc2CP-pGL4およびTK-pRL対照を、BCL10およびMALT1WTまたはMALT1C464A（不活性変異体）のいずれかを発現するプラスミドと共に形質移入した。
【図４Ｅ】PMA/イオノマイシンにより誘導されるNF-κB活性化の減弱に対するMI-2の効果についてのデータのグラフ表示で、ここではHBL-1細胞にNF-κBレポーターベクター(NF-κB)5-luc2CP-pGL4およびTK-pRL対照を形質移入した。
【図４Ｆ】各細胞株についてMI-2処理細胞と媒体処理細胞との間の変化倍率によってあらかじめ順位付けたすべての遺伝子の差次的発現に対する、Z-VRPR-FMKシグネチャーの遺伝子セット濃縮分析（GSEA）の結果を示す。Z-VRPR-FMKシグネチャーは、両方の細胞株でMI-2処理後にダウンレギュレートされた遺伝子の間で有意に濃縮された（HBL-1：FDR＜0.0001；およびTMD8：FDR＜0.0001）。
【図５Ａ】8つの細胞株を漸増濃度のMI-2（単一用量）に曝露し、細胞増殖をATPに基づく代謝発光検定を用いて48時間の時点で測定した実験の、結果のグラフ表示である。
【図５Ｂ】HBL-1細胞を0.02、0.2または2μMのMI-2に2時間曝露し、3回洗浄し、MI-2をLC-MSで測定した、MI-2細胞内濃度実験の結果のグラフ表示である。
【図５Ｃ】図5C1、5C2、および5C3は、HBL-1、TMD8、OCI-Ly10およびGCB-DLBCL細胞株OCI-Ly1を漸増濃度のMI-2で処理した実験の結果を示す。細胞増殖を、48、72および96時間の時点で生細胞におけるフローサイトメトリーによるCFSE希釈検定を用いて試験した。MI-2はHBL-1、TMD8およびOCI-Ly10における増殖を実質的に阻害したが、OCI-Ly1には影響がなかった。
【図５Ｄ】細胞周期を評価するためのBrdU取り込み-DAPI染色およびフローサイトメトリーを用いた実験の結果のグラフ表示であり、MI-2が、S期の用量依存的減少と、G1〜0およびSub-G0期の細胞比率の相反する増加を誘導することが明らかであった。
【図５Ｅ】MI-2はOCI-Ly1細胞に対して影響しなかったが、HBL-1およびTMD8細胞の両方を著しく抑制し、前者はアポトーシス細胞をより早く、より大量に示したことを示す、実験のグラフによる結果を示す。
【図６】5匹のC57BL/6マウスを、0.05〜25mg/kgの範囲で10日間、累積用量51.1mg/kgまでの漸増用量のMI-2の1日1回腹腔内（IP）投与に曝露し、別の5匹のマウスを媒体のみ（5％DMSO、n＝5）に曝露した実験の結果を示す（図6A、毒性1）。嗜眠、体重減少（図6B、毒性1）または病気の他の身体的指標の徴候はなかった。25mg/kgの最大投与用量が14日のスケジュールで安全かどうかを確認するために、本発明者らは10匹のマウスを、25mg/kgを14日間、累積用量350mg/kgまでのMI-2の1日1回IP投与に曝露し、対照として媒体のみを注射した5匹のマウスを用いた（図6A、毒性2）。5匹のマウスをMI-2投与の14日間の過程後に（5匹の対照と共に）屠殺し、他の5匹を10日間の休薬期間後に屠殺して、遅延毒性を評価した。有毒作用または体重減少（図6B、毒性2）もしくは組織損傷（肉眼的または顕微鏡的）を含む病気の他の指標は見られなかった（図6C1および6C2）。脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、腸、脾臓、胸腺および骨髄組織を試験した。
【図７Ａ】MI-2が媒体と比べてTMD8（p＝0.015、t-検定）およびHBL1（p＝0.014、t-検定）ABC-DLBCL異種移植片両方の成長を著しく抑制したが、OCI-Ly1腫瘍（p＝0.47、t-検定）の成長には影響がなかったことを示すグラフデータを示す。
【図７Ｂ】アポトーシス細胞を検出するためのTUNEL検定を用いた組織検査のグラフ結果を示しており、媒体と比べてMI-2処理したHBL-1（p＝0.0008、t-検定）およびTMD8（p＜0.0001、t-検定）異種移植片においてはアポトーシス細胞の有意な増加を示したが、OCI-Ly1異種移植片（p＝0.5580、t-検定）では差は観察されなかった。
【図７Ｃ】HBL-1（p＜0.0001、t-検定）およびTMD8異種移植片（p＝0.0006、t-検定）におけるKi-67染色によって測定した増殖の、媒体と比べて有意な低減の証拠のグラフ結果を示す。OCI-Ly1異種移植片（p＝1.0、t-検定）では差は観察されなかった。
【図７Ｄ】MI-2処理した腫瘍がc-REL核タンパク質の低減を示したことを示す、染色した顕微鏡写真を示す。
【図７Ｅ】ハンス基準を用いた免疫組織化学により、そのGCB対非GCB状態を確認しうる、5名のDLBCL患者のリンパ節生検からの単細胞懸濁液から得たグラフデータを示す。ここではリンパ腫細胞を単離し、4つ組で0.8μM MI-2または媒体に曝露した。48時間の曝露後、細胞数および生存度を、トリパンブルーを用いて評価した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な説明
概要
様々な態様において、本発明は、MALT1を調節する方法であって、MALT1を式（I）の化合物、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体の有効な量または濃度と接触させる段階を含む方法を提供する：
2015536990.tif 000004
式中、
破線の結合は、結合が存在してもしなくてもよいことを示し；
Y1とY2との間に二重結合が存在する場合、Y1がNまたはCRであり、Y2がCであり、かつAr1が存在し；Y1とY2との間に一重結合が存在する場合、Y1がCR2であり、Y2がOまたはSであり、かつAr1が存在せず、それぞれ独立に選択されたRはHまたは(C1-C6)アルキルであり；
R1がアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルであり、ここで任意のアルキル、アルコキシアルキル、またはアリールアルキルは、ハロまたは(C1-C6)アルコキシで一置換または独立に多置換されていてもよく、ただし酸素原子とY3を含む環との間に二重結合が存在する場合、R1が存在せずかつAr3が存在し、また酸素原子と環との間に一重結合が存在する場合、R1が存在し、Y3と酸素原子を有する炭素原子との間の二重結合が存在し、かつAr3が存在せず；
Ar1が1〜3つのJ1基で置換されたフェニルであり；J1はハロまたは(C1-C6)アルコキシであり；
Ar2が1〜3つのJ2基で置換されたフェニルであり；J2は式-N(R)C(O)-R2の基であり、かつR2はアルキル、アリール、またはアリールアミノであり、ここで任意のアルキル、アリール、またはアリールアミノは0〜2つのハロ、ニトロ、または(C1-C6)アルコキシ基で置換されており；
Ar3が1〜3つのJ3基で置換されたフェニルであり；J3はハロまたは(C1-C6)アルコキシである。
【００１１】
より具体的には、式（I）の化合物は、式（IA）の化合物、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体でありうる：
2015536990.tif 000005
式中、R1、Ar1、およびAr2は式（I）の化合物について定義したとおりである。
【００１２】
より具体的には、式（I）の化合物は、式（IB）の化合物、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体でありうる：
2015536990.tif 000006
式中、Ar2およびAr3は式（I）の化合物について定義したとおりである。
【００１３】
例えば、本発明の方法を実行するために用いる式（I）の化合物は下記のいずれか、またはその任意の塩、水和物、互変異性体、もしくは立体異性体でありうる：
2015536990.tif 000007
2015536990.tif 000008
。
【００１４】
例えば、本発明の方法を実行する上で、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫などの癌に罹っているヒトである場合などの生きている動物内部で、MALT1を処理することができる。
【００１５】
したがって、本発明は、様々な態様において、癌を処置または予防する方法であって、上で定義した式（I）の化合物、例えば、式（I）、式（IA）、式（IB）の化合物、または用いうる化合物の任意の具体例の有効用量を患者に投与する段階を含む方法をさらに提供する。
【００１６】
例えば、癌は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫などの、リンパ腫でありうる。
【００１７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる単数形「一つの(a)」、「一つの(an)」および「その(the)」は、文脈が明らかにそうではないと示さないかぎり、複数の指示物を含む。
【００１８】
本明細書において用いられる「約」なる用語は、数値または範囲に言及する場合、例えば、規定する値または規定する範囲の限界の10％以内、または5％以内の、値または範囲における変動度を許容する。
【００１９】
本明細書において用いられる「個人」（処置の対象におけるような）または「患者」とは、哺乳動物および非哺乳動物の両方を意味する。哺乳動物には、例えば、ヒト；非ヒト霊長類、例えば、類人猿およびサル；ならびに非霊長類、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、およびヤギが含まれる。非哺乳動物には、例えば、魚および鳥が含まれる。
【００２０】
「疾患」または「障害」または「状態不良」なる用語は、交換可能に用いられ、MALT1が、疾患もしくは状態不良またはその症状に関与する生化学的メカニズムにおいて、MALT1に作用することにより治療的に有益な効果を達成しうるような役割を果たす、疾患または状態を指すために用いられる。MALT1に「作用すること」、またはMALT1を「調節すること」には、MALT1に結合すること、および/またはMALT1の生物活性を阻害すること、および/またはインビボでMALT1の生物活性をアロステリックに制御することが含まれうる。
【００２１】
「有効量」なる表現は、障害を患っている個人への治療を記述するために用いる場合、個人の組織においてMALT1を阻害する、またはそれ以外にMALT1に作用するのに有効な、本発明の化合物の量を意味し、ここでそのような阻害または他の作用は有益な治療効果を生じるのに十分な程度まで起こる。
【００２２】
用語が本明細書において用いられる場合、「実質的に」とは、完全に、またはほとんど完全に、を意味し、例えば、ある成分を「実質的に含まない」組成物は、成分を少しも含まないか、もしくは組成物の任意の関連する機能特性が痕跡量の存在によって影響を受けないような微量を含むか、または化合物が「実質的に純粋」であるとは、無視できる痕跡量の不純物しか存在しないことである。
【００２３】
本明細書における意味の範囲内の「処置すること」または「処置」は、障害もしくは疾患に関連する症状の軽減、またはそれらの症状のさらなる進行もしくは悪化の阻害、または疾患もしくは障害の防止もしくは予防、または疾患もしくは障害を治癒することを意味する。同様に、本明細書において用いられる本発明の化合物の「有効量」または「治療的有効量」とは、障害もしくは状態に関連する症状を、全部もしくは一部軽減する、またはそれらの症状のさらなる進行もしくは悪化を停止もしくは遅延させる、または障害もしくは状態を防止する、もしくはその予防を提供する、化合物の量を意味する。特に、「治療的有効量」とは、所望の治療結果を達成するために、必要な用量および期間で、有効な量を意味する。治療的有効量は、本発明の化合物の任意の毒性または有害効果よりも治療的に有益な効果がまさっている量でもある。
【００２４】
本明細書において用いられる合成法の文脈において、「提供するのに適した条件下」または「生じるのに十分な条件下」などの語句は、実験者にとって変動することが通常の技術の範囲内であり、反応生成物の有用な量または収率を提供する、時間、温度、溶媒、反応物濃度などの反応条件を意味する。所望の反応生成物を単離することができるか、またはそうではなくさらに用いることができるならば、所望の反応生成物が唯一の反応生成物である、または出発原料が完全に消費される必要はない。
【００２５】
「化学的に可能な」とは、有機構造の一般に理解されている規則が破られない結合配列または化合物を意味し、例えば、特定の場合に、天然には存在しない五価の炭素原子を含む請求項の定義の範囲内の構造は、その請求項の範囲内ではないことが理解されるであろう。本明細書において開示する構造は、それらの態様のすべてにおいて、「化学的に可能な」構造のみを含むことが意図され、例えば、様々な原子または基と共に示す構造において、化学的に可能ではない任意の列挙した構造は、本明細書において開示または特許請求することが意図されない。
【００２６】
用語が本明細書において用いられる場合、化学構造の「類縁体」とは、親構造との実質的な類似性を保つ化学構造を意味するが、これは親構造から合成的に容易に誘導されないこともある。親化学構造から合成的に容易に誘導される関連化学構造は「誘導体」と呼ぶ。
【００２７】
置換基が指定の同一性の原子、「または結合」であると指定される場合、立体配置は置換基が「結合」である場合には指定の置換基に直に隣接している基は化学的に可能な結合配置で互いに直接連結されているとされる。
【００２８】
特定の立体化学または異性体型が具体的に示されないかぎり、構造のすべての単一の鏡像異性体、ジアステレオマー型、およびラセミ型が意図される。いくつかの場合に、具体的に特許請求する化合物の中で個々の立体異性体を記載するが、立体化学の明示は他の異性体型がより好ましくない、望まれない、または特許請求されないことを示すものではない。本発明において用いられる化合物は、描写から明らかなとおり、任意またはすべての不斉原子で濃縮または分割された光学異性体を、任意の濃縮度で含みうる。ラセミおよびジアステレオマー混合物の両方、ならびに個々の光学異性体は、それらの鏡像異性体またはジアステレオマーの相手を実質的に含まないように、単離または合成することができ、これらはすべて本発明の範囲内である。
【００２９】
「低分子」とは、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、多糖、または複数の反復単位からなる合成ポリマーではない、約2kDa未満の分子量の、有機金属化合物を含む、有機化合物を意味する。
【００３０】
1つまたは複数の置換基を含む、本明細書に記載の任意の基に関して、そのような基は立体的に実現不可能および/または合成的に不可能な、任意の置換または置換パターンを含まないことが理解される。加えて、本開示の対象の化合物は、これらの化合物の置換から生じるすべての立体化学的異性体を含む。
【００３１】
本明細書において用いられる「安定な化合物」および「安定な構造」なる用語は、反応混合物から有用な純度までの単離、および効果的な治療薬への製剤を耐えるのに十分強い化合物を示すことになる。安定な化合物だけが本明細書において企図される。
【００３２】
構造内で複数の配向で存在して複数の分子構造を生じうる基、例えば、カルボキサミド基C(=O)NRを記載する場合、基は、文脈が分子構造内の基の配向を明らかに限定しないかぎり、任意の可能な配向、例えば、X-C(=O)N(R)-YまたはX-N(R)C(=O)-Yで存在しうることが理解される。
【００３３】
自然における原子の天然の同位体分布とは異なる、分子内の1つまたは複数の原子の同位体型の包含は、分子の「同位体標識型」と呼ぶ。原子のすべての同位体型は、原子の具体的な同位体型が示されないかぎり、任意の分子の組成における選択肢として含まれる。例えば、分子内の任意の水素原子またはその組は水素の任意の同位体型、すなわち、任意の組み合わせのプロチウム（1H）、重水素（2H）、またはトリチウム（3H）でありうる。同様に、分子内の任意の炭素原子もしくはその組は、11C、12C、13C、もしくは14Cなどの、炭素の任意の同位体型でありえ、または分子内の任意の窒素原子もしくはその組は、13N、14N、もしくは15Nなどの、窒素の任意の同位体型でありうる。分子は、分子を構成する成分原子中に同位体型の任意の組み合わせを含みことができ、分子を形成するあらゆる原子の同位体型は独立に選択される。化合物の多分子試料において、個々の分子がすべて同じ同位体組成を必ずしも有するわけではない。例えば、化合物の試料は、肉眼的試料を構成する分子の組の一部の分画だけが放射性原子を含む、トリチウムまたは14C放射標識試料におけるなどの、様々な異なる同位体組成を含む分子を含みうる。それら自体を人工的に同位体濃縮していない多くの元素は、14Nおよび15N、32Sおよび34Sなどの、天然の同位体型の混合物であることも理解される。本明細書に挙げる分子は、分子内のそれぞれの位置ですべてのその構成元素の同位体型を含むと定義される。当技術分野において周知のとおり、同位体標識化合物は、同位体標識した前駆体分子を代わりに用いる以外は、化学合成の通常の方法によって調製することができる。同位体は、放射標識または安定同位体のいずれであれ、原子炉内の前駆体核種の中性子吸収による、サイクロトロン反応による、または質量分析によるなどの同位体分離による生成などの、当技術分野において公知の任意の方法によって得ることができる。任意の特定の合成経路において用いるための必要に応じて、同位体型を前駆体に組み込む。例えば、14Cおよび3Hを原子炉内で生成した中性子を用いて調製することができる。核変換後に、14Cおよび3Hを前駆体分子に組込み、続いて必要に応じてさらに加工する。
【００３４】
一般に、「置換された」とは、その中に含まれる水素原子への1つまたは複数の結合が、ハロゲン（すなわち、F、Cl、Br、およびI）；ヒドロキシル基、アルコキシ基、アリールオキシ基、アラルキルオキシ基、オキソ(カルボニル)基、カルボン酸、カルボン酸塩、およびカルボン酸エステルを含むカルボキシル基などの基における酸素原子；チオール基、アルキルおよびアリールスルフィド基、スルホキシド基、スルホン基、スルホニル基、ならびにスルホンアミド基などの基における硫黄原子；アミン、ヒドロキシルアミン、ニトリル、ニトロ基、N-オキシド、ヒドラジド、アジド、およびエナミンなどの基における窒素原子；および様々な他の基における他のヘテロ原子などであるが、それらに限定されるわけではない、非水素原子への1つまたは複数の結合によって置き換えられている、本明細書において定義する有機基を意味する。置換された炭素（または他の）原子に結合されうる置換基J1、J2、およびJ3の非限定例には、F、Cl、Br、I、OR'、OC(O)N(R')2、CN、NO、NO2、ONO2、アジド、CF3、OCF3、R'、O（オキソ）、S（チオノ）、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、N(R')2、SR'、SOR'、SO2R'、SO2N(R')2、SO3R'、C(O)R'、C(O)C(O)R'、C(O)CH2C(O)R'、C(S)R'、C(O)OR'、OC(O)R'、C(O)N(R')2、OC(O)N(R')2、C(S)N(R')2、(CH2)0-2N(R')C(O)R'、(CH2)0-2N(R')N(R')2、N(R')N(R')C(O)R'、N(R')N(R')C(O)OR'、N(R')N(R')CON(R')2、N(R')SO2R'、N(R')SO2N(R')2、N(R')C(O)OR'、N(R')C(O)R'、N(R')C(S)R'、N(R')C(O)N(R')2、N(R')C(S)N(R')2、N(COR')COR'、N(OR')R'、C(=NH)N(R')2、C(O)N(OR')R'、またはC(=NOR')R'が含まれ、ここでR'は水素または炭素を基礎とする部分でありえ、かつここで炭素を基礎とする部分はそれ自体がさらに置換されていてもよく；例えば、ここでR'は水素、アルキル、アシル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、またはヘテロアリールアルキルでありえ、ここで任意のアルキル、アシル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロアリール、またはヘテロアリールアルキル；またはここで窒素原子もしくは隣接窒素原子に結合された2つのR'基は窒素原子と一緒にヘテロシクリルを形成してもよく、これはJで一置換または独立に多置換されていてもよい。
【００３５】
様々な態様において、J1、J2、およびJ3はそれぞれ独立にハロ、ニトロ、シアノ、OR、NR'2、もしくはR'でありえ、またはC(O)OR'、C(O)NR'2、OC(O)OR'、OC(O)NR'2、N(R')C(O)OR'、N(R')C(O)NR'2もしくはそのチオ/チオノ類縁体である。「そのチオ/チオノ類縁体」とは、Oを含む基に関して、基における任意またはすべてのO原子をS原子で置き換えうることを意味し；例えば、基C(O)ORでは、「そのチオ/チオノ類縁体」にはC(S)OR、C(O)SR、およびC(S)SRが含まれ；例えば、基OC(O)NR2では、「そのチオ/チオノ類縁体」にはSC(O)NR2、OC(S)NR2、およびSC(S)NR2が含まれ；他も同様である。
【００３６】
様々な態様において、J1、J2、およびJ3はハロ、(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルコキシ、(C1〜C6)ハロアルキル、ヒドロキシ(C1〜C6)アルキル、アルコキシ(C1〜C6)アルキル、(C1〜C6)アルカノイル、(C1〜C6)アルカノイルオキシ、シアノ、ニトロ、アジド、R'2N、R2NC(O)、R'2NC(O)O、R'2NC(O)NR、(C1〜C6)アルケニル、(C1〜C6)アルキニル、(C6〜C10)アリール、(C6〜C10)アリールオキシ、(C6〜C10)アロイル、(C6〜C10)アリール(C1〜C6)アルキル、(C6〜C10)アリール(C1〜C6)アルコキシ、(C6〜C10)アリールオキシ(C1〜C6)アルキル、(C6〜C10)アリールオキシ(C1〜C6)アルコキシ、（3〜9員)ヘテロシクリル、(3〜9員)ヘテロシクリル(C1〜C6)アルキル、(3〜9員)ヘテロシクリル(C1〜C6)アルコキシ、(5〜10員)ヘテロアリール、(5〜10員)ヘテロアリール(C1〜C6)アルキル、(5〜10員)ヘテロアリール(C1〜C6)アルコキシ、または(5〜10員)ヘテロアロイルのいずれかである。例えば、R'はそれぞれの出現時に独立にH、(C1〜C6)アルキル、または(C6〜C10)アリールでありえ、ここで任意のアルキルまたはアリール基は0〜3つのJで置換されている。
【００３７】
置換基が、例えば、FまたはClなどの、一価である場合、これは一重結合によって置換している原子に結合されている。置換基が、二価であるOなどの、一価よりも多価である場合、これは複数の結合によって置換している原子に結合されえ、すなわち、二価置換基は二重結合によって結合され；例えば、Oで置換されたCはカルボニル基、C=Oを形成し、これは「CO」、「C(O)」、または「C(=O)」と書くこともでき、ここでCおよびOは二重結合している。炭素原子が二重結合酸素（=O）基で置換されている場合、酸素置換基は「オキソ」基と呼ぶ。NR'などの二価置換基が炭素原子に二重結合している場合、得られるC(=NR')基は「イミノ」基と呼ぶ。Sなどの二価置換基が炭素原子に二重結合している場合、得られるC(=S)基は「チオカルボニル」または「チオノ」基と呼ぶ。
【００３８】
または、OまたはSなどの二価置換基は2つの一重結合によって2つの異なる炭素原子に連結されうる。例えば、二価置換基であるOは、2つの隣接炭素原子のそれぞれに結合してエポキシド基を提供することができ、またはOは、隣接もしくは非隣接炭素原子の間で「オキシ」基と呼ぶ架橋エーテル基を形成する、例えば、シクロヘキシル基の1,4-炭素を架橋して[2.2.1]-オキサビシクロ系を形成することができる。さらに、任意の置換基を炭素または他の原子に、(CH2)nまたは(CR'2)nなどのリンカーによって結合することもでき、ここでnは1、2、3、またはそれ以上であり、かつ各R'は独立に選択される。
【００３９】
別の二価置換基は、C=で表されるアルキリデン炭素であり、そのように示される炭素原子は、2つのさらなる基も有し、第三の基に二重結合していることを意味する。例えば、(CH3)2C=は、別の炭素または窒素原子に結合したイソプロピリデン基を示す。C(O)およびS(O)2基は、炭素原子ではなく、窒素または酸素などの1つまたは2つのヘテロ原子に結合していてもよい。例えば、C(O)基が1つの炭素および1つの窒素原子に結合している場合、得られる基は「アミド」または「カルボキサミド」と呼ぶ。C(O)基が2つの窒素原子に結合している場合、この官能基は「尿素」と呼ぶ。C(O)が1つの酸素および1つの窒素原子に結合している場合、得られる基は「カルバマート」または「ウレタン」と呼ぶ。S(O)2基が1つの炭素および1つの窒素原子に結合している場合、得られる単位は「スルホンアミド」と呼ぶ。S(O)2基が2つの窒素原子に結合している場合、得られる単位は「スルファミド」と呼ぶ。
【００４０】
置換アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、およびシクロアルケニル基ならびに他の置換された基には、水素原子への1つまたは複数の結合が、炭素原子、またはカルボニル（オキソ）、カルボキシル、エステル、アミド、イミド、ウレタン、および尿素基における酸素；ならびにイミン、ヒドロキシイミン、オキシム、ヒドラゾン、アミジン、グアニジン、およびニトリルにおける窒素などであるが、それらに限定されるわけではない、ヘテロ原子への二重または三重結合を含む、1つまたは複数の結合によって置き換えられている基も含まれる。
【００４１】
置換シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリールなどの置換環基には、水素原子への結合が炭素原子への結合で置き換えられている環および縮合環系も含まれる。したがって、置換シクロアルキル、アリール、ヘテロシクリルおよびヘテロアリール基は、本明細書において定義するアルキル、アルケニル、およびアルキニル基で置換されていてもよい。
【００４２】
基、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリールなどにおける炭素原子の数が範囲で指定される場合、炭素原子の数を表すそれぞれ個別の整数が意図される。例えば、(C1〜C4)アルキル基の記載は、アルキル基がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、イソブチル、またはtert-ブチルのいずれかでありうることを示す。炭素原子の数の指定は整数でなければならないことが理解される。
【００４３】
アルキル基には、1から約20個の炭素原子、典型的には1から12個の炭素、または、いくつかの態様において、1から8個の炭素原子を有する、直鎖および分枝アルキル基およびシクロアルキル基が含まれる。直鎖アルキル基の例には、メチル、エチル、n-プロピル、n-ブチル、n-ペンチル、n-ヘキシル、n-ヘプチル、およびn-オクチル基などの1から8個の炭素原子を有するものが含まれる。分枝アルキル基の例には、イソプロピル、イソ-ブチル、sec-ブチル、t-ブチル、ネオペンチル、イソペンチル、および2,2-ジメチルプロピル基が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本明細書において用いられる「アルキル」なる用語は、n-アルキル、イソアルキル、およびアンテイソアルキル基ならびにアルキルの他の分枝鎖型を含む。
【００４４】
代表的な置換アルキル基は、上に挙げた任意の基、例えば、アミノ、ヒドロキシ、シアノ、カルボキシ、ニトロ、チオ、アルコキシ、およびハロゲン基で1回または複数回置換されうる。例示的なアルキル基には、それぞれ本明細書においてC1-6アルキル、C1-4アルキル、およびC1-3アルキルと呼ぶ、炭素原子1〜6、1〜4、または1〜3個の直鎖または分枝炭化水素が含まれるが、それらに限定されるわけではない。例示的アルキル基には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、2-メチル-1-ブチル、3-メチル-2-ブチル、2-メチル-1-ペンチル、3-メチル-1-ペンチル、4-メチル-1-ペンチル、2-メチル-2-ペンチル、3-メチル-2-ペンチル、4-メチル-2-ペンチル、2,2-ジメチル-1-ブチル、3,3-ジメチル-1-ブチル、2-エチル-1-ブチル、ブチル、イソブチル、t-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ヘキシルなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４５】
アリール基は、環にヘテロ原子を含まない、環式芳香族炭化水素である。したがって、アリール基には、フェニル、アズレニル、ヘプタレニル、ビフェニル、インダセニル、フルオレニル、フェナントレニル、トリフェニレニル、ピレニル、ナフタセニル、クリセニル、ビフェニレニル、アントラセニル、およびナフチル基が含まれるが、それらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、アリール基は基の環部分に約6から約14個の炭素を含む。アリール基は、上で定義したとおり、無置換でも置換されていてもよい。2-、3-、4-、5-、もしくは6-置換フェニルまたは2〜8置換ナフチル基などであるが、それらに限定されるわけではない、代表的な置換アリール基は、一置換または複数回置換されえ、これらは上に挙げたものなどの炭素または非炭素基で置換されうる。
【００４６】
アラルキル基は、アルキル基の水素または炭素結合が上で定義したアリール基への結合で置き換えられている、上で定義したアルキル基である。代表的なアラルキル基には、ベンジルおよびフェニルエチル基ならびに4-エチル-インダニルなどの縮合(シクロアルキルアリール)アルキル基が含まれる。アラルケニル基は、アルキル基の水素または炭素結合が上で定義したアリール基への結合で置き換えられている、上で定義したアルケニル基である。
【００４７】
「アルコキシ」または「アルコキシル」なる用語は、上で定義したとおり、シクロアルキル基を含むアルキル基に連結した酸素原子を意味する。直鎖アルコキシ基の例には、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ブトキシ、ペンチルオキシ、ヘキシルオキシなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。分枝アルコキシの例には、イソプロポキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシ、イソペンチルオキシ、イソヘキシルオキシなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。例示的アルコキシ基には、それぞれ本明細書においてC1-6アルコキシ、およびC2-6アルコキシと呼ぶ、炭素原子1〜6または2〜6個のアルコキシ基が含まれるが、それらに限定されるわけではない。例示的アルコキシ基には、メトキシ、エトキシ、イソプロポキシなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００４８】
アルコキシ基は、酸素原子に結合した1から約12〜20個の炭素原子を含みえ、二重または三重結合をさらに含みえ、またヘテロ原子も含みうる。例えば、アリルオキシ基は、本明細書における意味の範囲内のアルコキシ基である。構造の2つの隣接原子がそれらにより置換されている文脈におけるメチレンジオキシ基と同様、メトキシエトキシ基も、本明細書における意味の範囲内のアルコキシ基である。
【００４９】
「ハロ」または「ハロゲン」または「ハロゲン化物」なる用語は、それら自体または別の置換基の一部として、特に記載がないかぎり、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子、好ましくは、フッ素、塩素、または臭素を意味する。
【００５０】
「ハロアルキル」基には、モノハロアルキル基、すべてのハロ原子が同じでも異なっていてもよいポリハロアルキル基、およびすべての水素原子がフルオロなどのハロゲン原子で置き換えられているペルハロアルキル基が含まれる。ハロアルキルの例には、トリフルオロメチル、1,1-ジクロロエチル、1,2-ジクロロエチル、1,3-ジブロモ-3,3-ジフルオロプロピル、ペルフルオロブチルなどが含まれる。
【００５１】
「ハロアルコキシ」基には、モノハロアルコキシ基、すべてのハロ原子が同じでも異なっていてもよいポリハロアルコキシ基、およびすべての水素原子がフルオロなどのハロゲン原子で置き換えられているペルハロアルコキシ基が含まれる。ハロアルコキシの例には、トリフルオロメトキシ、1,1-ジクロロエトキシ、1,2-ジクロロエトキシ、1,3-ジブロモ-3,3-ジフルオロプロポキシ、ペルフルオロブトキシなどが含まれる。
【００５２】
「アミン」または「アミノ」なる用語は、例えば、各基が独立にHまたはアルキル、アリールなどの非Hでありうる、式N(基)3を有する、一級、二級、および三級アミンを含む。アミンには、R'-NH2、例えば、アルキルアミン、アリールアミン、アルキルアリールアミン；R'2NH、ここで各Rは独立に選択され、例えば、ジアルキルアミン、ジアリールアミン、アラルキルアミン、ヘテロシクリルアミンなど；およびR'3N、ここで各Rは独立に選択され、例えば、トリアルキルアミン、ジアルキルアリールアミン、アルキルジアリールアミン、トリアリールアミンなどが含まれるが、それらに限定されるわけではない。「アミン」なる用語は、本明細書において用いられるアンモニウムイオンも含む。
【００５３】
「アミノ」基は、各R'が独立に選択される、-NH2、-NHR'、-NR'2、-NR'3+の型、およびプロトン化することができない-NR'3+以外の、それぞれのプロトン化型の置換基である。したがって、アミノ基で置換されている任意の化合物は、アミンと見なすことができる。本明細書における意味の範囲内の「アミノ基」は、一級、二級、三級または四級アミノ基でありうる。「アルキルアミノ」基には、モノアルキルアミノ、ジアルキルアミノ、およびトリアルキルアミノ基が含まれる。
【００５４】
「アンモニウム」イオンには、無置換アンモニウムイオンNH4+が含まれるが、特に記載がないかぎり、アミンの任意のプロトン化または四級化型も含まれる。したがって、塩酸トリメチルアンモニウムおよび塩化テトラメチルアンモニウムはいずれも、本明細書における意味の範囲内のアンモニウムイオンおよびアミンである。
【００５５】
「アミド（amide）」（または「アミド（amido）」）なる用語は、C-およびN-アミド基、すなわち、それぞれ-C(O)NR'2、および-NR'C(O)R'基を含む。したがって、アミド基には、一級カルボキサミド基（-C(O)NH2）およびホルムアミド基（-NHC(O)H）が含まれるが、それらに限定されるわけではない。「カルボキサミド」基は式C(O)NR'2の基であり、ここでR'はH、アルキル、アリールなどでありうる。
【００５６】
「塩」は、当技術分野において周知のとおり、イオン型のカルボン酸、スルホン酸、またはアミンなどの有機化合物を、対イオンとの組み合わせで含む。例えば、酸はそれらのアニオン型で、金属カチオン、例えば、ナトリウム、カリウムなどのカチオンと；NH4+などのアンモニウム塩もしくはテトラメチルアンモニウムなどのテトラアルキルアンモニウム塩を含む様々なアミンのカチオンと、またはトリメチルスルホニウムなどの他のカチオンと塩を形成しうる。「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」塩は、塩化物塩またはナトリウム塩などの、ヒトの消費のために承認されており、一般に非毒性のイオンから形成される塩である。「両性イオン」は、互いに平衡を保つのに役立つ少なくとも2つのイオン化可能な基であって、一方はアニオンを形成し、他方はカチオンを形成する基を有する分子内で形成されうるものなどの、内部塩である。例えば、グリシンなどのアミノ酸は両性イオン型で存在することができる。「両性イオン」は、本明細書における意味の範囲内の塩である。本発明の化合物は塩の形を取ってもよい。「塩」なる用語は、本発明の化合物である遊離酸または遊離塩基の付加塩を含む。塩は「薬学的に許容される塩」でありうる。「薬学的に許容される塩」なる用語は、薬学的適用において有用性を提供する範囲内の毒性を有する塩を意味する。薬学的に許容されない塩は、それにもかかわらず、高い結晶性などの特性を有することもあり、これらは、例えば、本発明の化合物の合成、精製または製剤の工程における有用性などの、本発明の実施において有用性を有する。
【００５７】
「薬学的または薬理学的に許容される」は、適宜、動物、またはヒトに投与した場合に、有害、アレルギーまたは他の都合の悪い反応を生じない分子実体および組成物を含む。ヒト投与のために、製剤はFDA生物製剤課（Office of Biologics）の基準によって求められる無菌性、発熱原性、および全般的安全性および純度の基準に適合すべきである。
【００５８】
「水和物」は、水分子との組成物で存在する化合物である。組成物は、一水和物もしくは二水和物などの、化学量論量の水を含むことができ、または無作為な量の水を含むこともできる。用語が本明細書において用いられる場合、「水和物」は固体型を意味し、すなわち、水溶液中の化合物は、水和されているかもしれないが、用語が本明細書において用いられる場合の水和物ではない。
【００５９】
加えて、本発明の特徴または局面がマーカッシュ群に関して記載される場合、当業者であれば、本発明はそれによりマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの下位群に関しても記載されることを理解するであろう。例えば、Xが臭素、塩素、およびヨウ素からなる群より選択されると記載される場合、臭素であるXに対する請求項ならびに臭素および塩素であるXに対する請求項が完全に記載される。さらに、本発明の特徴または局面がマーカッシュ群に関して記載される場合、当業者であれば、本発明はそれによりマーカッシュ群の個々のメンバーまたはメンバーの下位群の任意の組み合わせに関しても記載されることを理解するであろう。したがって、例えば、Xが臭素、塩素、およびヨウ素からなる群より選択されると記載され、Yがメチル、エチル、およびプロピルからなる群より選択されると記載される場合、臭素であるXおよびメチルであるYに対する請求項が完全に記載される。
【００６０】
必然的に整数である変数の値、例えば、アルキル基中の炭素原子の数または環上の置換基の数が範囲、例えば、0〜4で記載される場合、意味するものは値が0と4との間の両端を含む任意の整数、すなわち、0、1、2、3、または4でありうるということである。
【００６１】
様々な態様において、本発明の方法において用いるものなどの、化合物または化合物群は、上に挙げた態様の任意の組み合わせおよび/または下位の組み合わせの任意の1つでありうる。
【００６２】
様々な態様において、任意の実施例において示す、または例示的化合物の中の化合物を提供する。条件は任意の開示する範疇または態様に適用してもよく、ここで他の上で開示する態様または種の任意の1つまたは複数はそのような範疇または態様から除外してもよい。
【００６３】
本発明の方法において用いるための本明細書に記載の化合物は、本明細書に含まれる教示および当技術分野において公知の合成手順に基づき、いくつかの様式で調製することができる。以下に記載する合成法の記載において、溶媒の選択、反応雰囲気、反応温度、実験の持続時間、および後処理手順を含む、すべての提唱される反応条件は、特に記載がないかぎり、その反応に対して標準の条件であるように選択しうることが理解されるべきである。有機合成の当業者には、分子の様々な部分に存在する官能基は提唱される試薬および反応に適合すべきであることが理解される。反応条件に適合性でない置換基は当業者には明らかであり、したがって代替法が示される。実施例のための出発原料は、市販されているか、または公知の材料から標準の方法によって容易に調製されるかのいずれかである。すべての市販化学物質はAldrich、Alfa Aesare、Wako、Acros、Fisher、Fluka、Maybridgeなどから入手し、示している場合を除いて、それ以上精製せずに用いた。無水溶媒は、例えば、活性化アルミナカラムを通過させることにより得られる。
【００６４】
本発明は、単離した本発明の化合物をさらに含む。「単離した化合物」なる表現は、単離した化合物が、化合物の合成において用いた試薬、および/または生じた副生成物から分離されている、本発明の化合物、または本発明の化合物の混合物の調製物を意味する。「単離した」とは、調製物が技術的に純粋（均質）であることを意味するものではなく、治療的に用いうる形の化合物に対して十分に純粋であることを意味する。好ましくは「単離した化合物」とは、指定の本発明の化合物または化合物の混合物を全重量の少なくとも10重量パーセントの量で含む、本発明の化合物または本発明の化合物の混合物の調製物を意味する。好ましくは、調製物は指定の化合物または化合物の混合物を全重量の少なくとも50重量パーセントの量で；より好ましくは全重量の少なくとも80重量パーセント；最も好ましくは調製物の全重量の少なくとも90重量パーセント、少なくとも95重量パーセントまたは少なくとも98重量パーセントの量で含む。
【００６５】
本発明の化合物および中間体は、ろ過、液-液抽出、固相抽出、蒸溜、再結晶またはフラッシュカラムクロマトグラフィ、もしくはHPLCを含むクロマトグラフィなどの標準の技術によって、それらの反応混合物から単離し、精製してもよい。
【００６６】
本発明の化合物が1つまたは複数のキラル中心を含む場合、化合物は単一の実質的に純粋な鏡像異性型もしくはジアステレオマー型またはラセミ混合物で存在してもよく、それらとして単離してもよいことが理解されるであろう。したがって、本発明は、本発明の化合物の任意の可能な鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ体またはその混合物を含む。
【００６７】
本発明の化合物、または本発明の方法を実施する際に用いる化合物は、1つまたは複数のキラル中心を含み、したがって、立体異性体として存在してもよい。「立体異性体」なる用語は、本明細書において用いられる場合、すべての鏡像異性体およびジアステレオマーからなる。これらの化合物は、ステレオジェン炭素原子の周りの置換基の立体配置に依存して、記号「(+)」、「(-)」、「R」または「S」によって命名してもよいが、当業者であれば、構造がキラル中心を暗黙のうちに示しうることを理解するであろう。本発明は、これらの化合物の様々な立体異性体およびその混合物を含む。
【００６８】
鏡像異性体またはジアステレオマーの混合物は命名法において「(±)」と命名してもよいが、当業者であれば、構造がキラル中心を暗黙のうちに示しうることを理解するであろう。
【００６９】
本開示の化合物は、1つまたは複数の二重結合を含み、したがって、炭素-炭素二重結合の周りの置換基の配置から生じる幾何異性体として存在してもよい。記号：
2015536990.tif 000009
は、本明細書に記載の一重、二重または三重結合でありうる結合を示す。炭素-炭素二重結合の周りの置換基は、「Z」または「E」立体配置であると命名され、ここで用語「Z」および「E」はIUPAC標準に従って用いる。特に記載がないかぎり、二重結合を示す構造は「E」および「Z」異性体の両方を含む。炭素-炭素二重結合の周りの置換基は、代わりに、「シス」または「トランス」と呼ぶこともでき、ここで「シス」は二重結合の同じ側の置換基を意味し、「トランス」は二重結合の反対側の置換基を意味する。
【００７０】
本発明の化合物、または本発明の方法を実施する際に用いる化合物は、炭素環または複素環を含み、したがって環の周りの置換基の配置から生じる幾何異性体として存在してもよい。炭素環または複素環の周りの置換基の配置は「Z」または「E」立体配置であると命名され、ここで用語「Z」および「E」はIUPAC標準に従って用いる。特に記載がないかぎり、炭素環または複素環を示す構造は「Z」および「E」異性体の両方を含む。炭素環または複素環の周りの置換基は、「シス」または「トランス」と呼んでもよく、ここで用語「シス」は環の平面の同じ側の置換基を意味し、用語「トランス」は環の平面の反対側の置換基を意味する。置換基が環の平面の同じ側および反対側の両方に配置されている化合物の混合物は「シス/トランス」と命名される。
【００７１】
企図される化合物の個々の鏡像異性体およびジアステレオマーは、不斉もしくはステレオジェン中心を含む市販の出発原料から合成的に、またはラセミ混合物の調製と、続く当業者には周知の分割法により、調製することができる。これらの分割法は、（1）鏡像異性体の混合物のキラル補助剤への結合、得られたジアステレオマー混合物の再結晶またはクロマトグラフィによる分離、および補助剤からの光学的に純粋な生成物の遊離、（2）光学活性な分割剤を用いての塩形成、（3）キラル液体クロマトグラフィカラム上での光学的鏡像異性体の混合物の直接分離、または（4）立体選択的化学または酵素試薬を用いての速度論的分割によって例示される。ラセミ混合物はそれらの成分鏡像異性体に、キラル相液体クロマトグラフィまたはキラル溶媒中での化合物の結晶化などの、周知の方法によって分割することもできる。立体選択的合成、単一の反応物が新しい立体中心の創造中または既存のものの変換中に立体異性体の不均等な混合物を生成する、化学または酵素反応は当技術分野において周知である。立体選択的合成はエナンチオおよびジアステレオ選択的変換の両方を含み、キラル補助剤の使用を含んでもよい。例えば、Carreira and Kvaerno, Classics in Stereoselective Synthesis, Wiley-VCH: Weinheim, 2009を参照されたい。
【００７２】
キラル中心の存在によって生じる異性体は、「鏡像異性体」と呼ばれる重ね合わせ不可能な異性体の対を含む。純粋な化合物の単一の鏡像異性体は光学活性であり、すなわち、これらは平面偏光の平面を回転させることができる。単一の鏡像異性体はカーン-インゴールド-プレローグシステムによって表示する。置換基の順位を原子量に基づいて番号付け、系統的手順によりもとめた原子量が高いほど高い順位を有する。4つの基の順位が決定されれば、最も低い順位の基を観察者から遠くに向けるように分子を置く。次いで、他の基の下行順位が時計回りであれば、分子は（R）絶対配置を有するとされ、他の基の下行順位が反時計回りであれば、分子は（S）絶対配置を有するとされる。以下のスキームの例において、カーン-インゴールド-プレローグ順位はA＞B＞C＞Dである。最も順位が低い原子Dを観察者から遠くに向ける。
2015536990.tif 000010
【００７３】
上に示すA〜Dの原子を有する炭素原子は「キラル」炭素原子として知られ、分子におけるそのような炭素原子の位置を「キラル中心」と呼ぶ。本発明の化合物は複数のキラル中心を含んでもよく、各キラル中心の配置は同じ様式で記載する。
【００７４】
本発明は、ジアステレオマーならびにそれらのラセミ体および分割体、ジアステレオマーおよび鏡像異性体として純粋な形ならびにその塩を含むことになる。ジアステレオマーの対は、順相および逆相クロマトグラフィ、ならびに結晶化を含む、公知の分離技術によって分割してもよい。
【００７５】
「単離した光学異性体」または「単離した鏡像異性体」とは、同じ式の対応する光学異性体から実質的に精製されている化合物を意味する。好ましくは、単離した異性体は、少なくとも約80重量％、より好ましくは少なくとも90重量％鏡像異性的に純粋、さらにより好ましくは少なくとも98重量％鏡像異性的に純粋、最も好ましくは少なくとも約99重量％鏡像異性的に純粋である。「鏡像異性純度」とは、化合物の光学異性体の鏡像異性混合物における主な鏡像異性体のパーセントを意味する。純粋な単一の鏡像異性体は100％の鏡像異性純度を有する。
【００７６】
単離した光学異性体は、周知のキラル分離技術によってラセミ混合物から精製してもよい。1つのそのような方法に従い、本発明の化合物のラセミ混合物、またはそのキラル中間体を、カラムの一連のDAICEL(登録商標) CHIRALPAK(登録商標)ファミリー（Daicel Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan）のメンバーなどの、適切なキラルカラムを用いてのHPLCにより、99％重量％純粋な光学異性体へと分離する。カラムは製造者の指示に従って操作する。
【００７７】
別々の実質的に純粋な光学異性体を得る別の周知の方法は伝統的な分割であり、これによりプロトン化アミンまたはカルボキシル基などのイオン化官能基を含むキラルラセミ化合物は、反対にイオン化されたキラル非ラセミ添加物とジアステレオマーの塩を形成する。次いで、得られたジアステレオマーの塩型は、溶解度差などの標準の物理的手段によって分離することができ、次いで、キラル非ラセミ添加物を除去するか、もしくは標準の化学的手段によって別の対イオンと交換してもよく、またはジアステレオマーの塩型を治療薬として、もしくは治療薬の前駆体として用いるために、塩として保持してもよい。
【００７８】
本発明の態様の別の局面は、単独または別の薬剤との組み合わせでの本発明の化合物の組成物を提供する。本明細書において示すとおり、本発明の化合物は立体異性体、互変異性体、溶媒和物、プロドラッグ、薬学的に許容される塩およびその混合物を含む。本発明の化合物を含む組成物は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Ed., 1995、またはその新しい版に記載の、通常の技術によって調製することができ、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。組成物は通常の形態、例えば、カプセル剤、錠剤、エアロゾル、液剤、懸濁剤または局所適用で出現しうる。
【００７９】
典型的組成物は、本発明の化合物および担体または希釈剤でありうる薬学的に許容される賦形剤を含む。例えば、活性化合物を通常は担体と混合する、または担体で希釈する、またはアンプル、カプセル、サシェ、紙、もしくは他の容器の形でありうる担体内に封入することになる。活性化合物を担体と混合する場合、または担体が希釈剤として役立つ場合、これは活性化合物のための媒体、賦形剤、または媒質として作用する固体、半固体、または液体材料でありうる。活性化合物を、例えば、サシェに含まれる粒状固体担体上に吸着させることもできる。適切な担体のいくつかの例は、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ポリヒドロキシエトキシル化ヒマシ油、落花生油、オリーブ油、ゼラチン、ラクトース、白土、スクロース、デキストリン、炭酸マグネシウム、糖、シクロデキストリン、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカシア、ステアリン酸またはセルロースの低級アルキルエーテル、ケイ酸、脂肪酸、脂肪酸アミン、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリスリトール脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン、ヒドロキシメチルセルロースならびにポリビニルピロリドンである。同様に、担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルなどの、当技術分野において公知の任意の持続放出材料を、単独またはワックスと混合して含むこともできる。
【００８０】
製剤を活性化合物と有害に反応しない補助剤と混合することもできる。そのような添加物には、湿潤剤、乳化および懸濁化剤、浸透圧に影響をおよぼすための塩、緩衝剤および/もしくは着色物質、保存剤、甘味剤または着香剤が含まれうる。組成物は望まれる場合には滅菌することもできる。
【００８１】
投与経路は、経口、鼻、肺、口腔、真皮下、皮内、経皮または非経口、例えば、直腸、デポー、皮下、静脈内、尿道内、筋肉内、鼻内、眼用液剤もしくは軟膏などの、本発明の活性化合物を適切な、または所望の作用部位に有効に輸送する任意の経路でありえ、経口経路が好ましい。
【００８２】
経口投与のために固体担体を用いる場合、製剤を錠剤化するか、粉末もしくはペレットの形でゼラチン硬カプセルに入れることができ、またはトローチもしくはロゼンジの形であってもよい。液体担体を用いる場合、製剤はシロップ、乳剤、ゼラチン軟カプセル剤または水性もしくは非水性液体懸濁剤もしくは液剤などの無菌注射液の形であってもよい。
【００８３】
注射用剤形には一般に、適切な分散剤もしくは湿潤剤および懸濁化剤を用いて調製しうる、水性懸濁剤または油性懸濁剤が含まれる。注射用剤形は、溶液相または懸濁剤の形であってもよく、これは溶媒または希釈剤と共に調製する。許容される溶媒または媒体には、滅菌水、リンゲル液、または等張食塩水溶液が含まれる。または、無菌油を溶媒または懸濁化剤として用いることもできる。好ましくは、天然または合成油、脂肪酸、モノ-、ジ-またはトリ-グリセリドを含む、油または脂肪酸は不揮発性である。
【００８４】
注射のために、製剤は、前述の適切な溶液での再構成に適した粉末であってもよい。これらの例には、凍結乾燥、回転乾燥もしくは噴霧乾燥粉末、アモルファス粉末、顆粒、沈澱物、または微粒子が含まれるが、それらに限定されるわけではない。注射のために、製剤は任意に安定化剤、pH改変剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ改変剤およびこれらの組み合わせを含みうる。化合物は、ボーラス注射または持続注入などの、注射による非経口投与用に製剤することができる。注射用単位剤形はアンプルまたは複数用量容器に含まれうる。
【００８５】
本発明の製剤を、当技術分野において周知の手順を用いることにより、患者への投与後に活性成分の急速、持続、または遅延放出を提供するために、設計することができる。したがって、製剤は制御放出または低速放出のために製剤することもできる。
【００８６】
本発明によって企図される組成物には、例えば、ミセルもしくはリポソーム、またはいくつかの他の封入剤形が含まれえ、あるいは長期の保存および/または送達効果を提供するために延長放出剤形で投与することもできる。したがって、製剤はペレットまたは円柱に圧縮し、デポー注射として筋肉内または皮下に植え込むこともできる。そのような植え込み物は、シリコーンおよび生分解性ポリマー、例えば、ポリラクチド-ポリグリコリドなどの公知の不活性材料を用いることができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ(オルトエステル)およびポリ(無水物)が含まれる。
【００８７】
鼻投与のために、製剤は、エアロゾル適用のために、液体担体、好ましくは水性担体に溶解または懸濁した、本発明の化合物を含みうる。担体は、可溶化剤、例えば、プロピレングリコール、界面活性剤、レシチン（ホスファチジルコリン）もしくはシクロデキストリンなどの吸収増強剤、またはパラベンなどの保存剤などの添加物を含みうる。
【００８８】
非経口適用のために、特に適切なのは、注射液剤または懸濁剤、好ましくは活性化合物がポリヒドロキシル化ヒマシ油に溶解された水性液剤である。
【００８９】
タルクおよび/または糖質担体または結合剤などを有する錠剤、糖衣錠、またはカプセル剤が、経口適用のために特に適している。錠剤、糖衣錠、またはカプセル剤のための好ましい担体には、ラクトース、コーンスターチ、および/またはジャガイモデンプンが含まれる。加糖媒体を用いうる場合には、シロップまたはエリキシル剤を用いることもできる。
【００９０】
通常の錠剤化技術によって調製しうる典型的錠剤は下記を含むことができる：
2015536990.tif 000011
*フィルムコーティング用の可塑剤として用いたアシル化モノグリセリド。
【００９１】
経口投与用の典型的カプセル剤は、本発明の化合物（250mg）、ラクトース（75mg）およびステアリン酸マグネシウム（15mg）を含む。混合物を60メッシュのふるいを通し、No.1ゼラチンカプセルに充填する。典型的注射製剤を、250mgの本発明の化合物をバイアルに無菌的に入れ、無菌的に凍結乾燥し、密封することにより生成する。使用のために、バイアルの内容物を2mLの無菌生理食塩水と混合して、注射製剤を生成する。
【００９２】
本開示は、本発明の方法の実施において用いるための、薬学的に許容される担体と共に製剤した、本明細書において開示する化合物を含む薬学的組成物を提供する。特に、本開示は、これらの方法のために、1つまたは複数の薬学的に許容される担体と共に製剤した、本明細書において開示する化合物を含む薬学的組成物を提供する。これらの製剤には、経口、直腸、局所、口腔、非経口（例えば、皮下、筋肉内、皮内、または静脈内）直腸、膣、またはエアロゾル投与に適したものが含まれるが、任意の所与の症例における投与の最も適切な形は、治療中の状態の程度および重症度、ならびに使用中の特定の化合物の性質に依存することになる。例えば、開示する組成物は単位用量として製剤してもよく、および/または経口もしくは皮下投与のために製剤してもよい。
【００９３】
本発明の化合物を哺乳動物、特に状態不良のそのような処置、予防、除去、軽減または改善を必要としているヒトに投与することができる。そのような哺乳動物には、飼い慣らされた動物、例えば、家庭内ペット、家畜、および野生生物などの飼い慣らされていない動物両方の動物も含まれる。
【００９４】
本発明の化合物は、広い用量範囲で有効である。例えば、成人の処置において、1日に約0.05〜約5000mg、好ましくは約1〜約2000mg、より好ましくは約2〜約2000mgの間の用量を用いることができる。典型的用量は1日に約10mg〜約1000mgである。患者のための療法を選択する際に、多くの場合、より高用量で開始し、状態が制御下になれば、用量を低減することが必要でありうる。正確な用量は化合物の活性、投与の様式、所望の治療法、投与する剤形、処置する対象および処置する対象の体重、ならびに担当の医師または獣医師の好みおよび経験に依存することになる。
【００９５】
一般に、本発明の化合物は、単位用量あたり約0.05mg〜約1000mgの活性成分を薬学的に許容される担体と共に含む単位剤形で投与する。
【００９６】
通常は、経口、鼻、肺または経皮投与に適した剤形は約125μg〜約1250mg、好ましくは約250μg〜約500mg、より好ましくは約2.5mg〜約250mgの化合物を、薬学的に許容される担体または希釈剤と混合して含む。
【００９７】
剤形は1日1回、または1日に2回もしくは3回などの1日に複数回投与することができる。または、処方する医師が賢明と判明した場合、剤形は1日おき、または1週間に1回などの、1日1回よりも低頻度で投与することもできる。
【００９８】
本明細書において開示および特許請求する任意の化合物を、MALT1の阻害における有効性について、および様々な細胞検定において、前述または化学文献中に見出される手順を用いて評価することは、通常の技術の範囲内である。したがって、当業者であれば、過度の実験を行うことなく、任意の特許請求する化合物を調製し、評価することができる。
【００９９】
MALT1の有効な阻害剤であると判明した任意の化合物は同様に、用量および処置法の選択を誘導するために研究者の技術および経験を用い、動物モデル、およびヒト臨床試験において試験することができる。
【０１００】
生化学的スクリーニングによりMALT1タンパク質分解活性の低分子量阻害剤を特定する
本発明者らは、MALT1低分子阻害剤は、MALT1の生物学を試験するための、およびMALT1依存性腫瘍を処置するための有用な化学的ツールであると判断した。しかし、全長MALT1およびそのパラカスパーゼドメイン（アミノ酸340〜789）はモノマーとして生理的溶液中にもともと存在し、これは非常に低いタンパク質分解活性を有する。カスパーゼは一般に最大触媒活性のためにホモ二量体化しなければならず（Pop et al., 2006；Walker et al., 1994；Yin et al., 2006）、したがって最近報告された、ペプチド系阻害剤との複合体でのMALT1のパラカスパーゼドメインの構造は二量体である（Wiesmann et al., 2012；Yu et al., 2011）。阻害剤についてスクリーニングするための有効な検定のために触媒的に活性なMALT1を生成するために、本発明者らは、MALT1の二量体化および活性化を促進するロイシンジッパー二量体化モティーフと融合したMALT1（340〜789）の組換え型（LZ-MALT1）を生化学的に操作した（図1A）。本発明者らは、蛍光発生物質AMC（7-アミノ-4-メチルクマリン）に連結されたMALT1基質ペプチドLRSRを用いてのMALT1活性検定を開発した。Ac-LRSR-AMC基質のMALT1による切断はAMCおよび蛍光シグナルの放出を引き起こした。
【０１０１】
ハイスループットスクリーニングのための最適な条件を、二次元格子における酵素および基質の系統的変動によって決定した。蛍光測定を45秒ごとに60分間行った。測定値を時間の関数としてプロットした。蛍光と時間との間に直線関係を有する条件を、スクリーニングに適していると考えた。品質を、式Z'-因子＝1-3*(σp+σn)/(|μp-μn|)（式中σp/n、陽性および陰性対照の標準偏差；μp/n、陽性および陰性対照の平均）によって計算した、検定のダイナミックレンジおよびデータの分散を反映する係数であるZ'-因子（Zhang et al., 1999）を用いて評価した。このスクリーニングのZ'-因子は0.738で、最適範囲0.5〜1の範囲内である（Zhang et al., 1999）。合計46,464の化合物をスクリーニングした。
【０１０２】
化合物ライブラリはAlbany Molecular Research, Inc. (AMRI)、Albany、New Yorkから入手した。
MI-2について、AMRIからのID番号はALB-H03200218であり；
MI-2A1：CGX-01216062；
MI-2A2：CGX-01216044；
MI-2A3：CGX-01207032；
MI-2A4：ALB-H09612295；
MI-2A5：ALB-H01205459である。
【０１０３】
40％阻害を閾値として用い、324個の候補化合物を濃度反応検定における妥当性確認のために選択した（図1B）。これらのうち、19個の化合物を、それらの生化学的活性（IC50＜20μM）に基づくさらなる妥当性確認のために選択した（図1C）。
【０１０４】
候補阻害剤はABC-DLBCL細胞株およびMALT1触媒活性を選択的に抑制する
MALT1活性はABC-DLBCL細胞株の増殖を選択的に維持する上で重要な役割を果たす（Ngo et al., 2006）。したがって、ABCおよびGCB-DLBCL細胞株は、ペプチドZ-VRPR-FMKによるMALT1切断阻害に対して差次的選択性を示す（Ferch et al., 2009；Hailfinger et al., 2009；Rebeaud et al., 2008）。候補低分子が類似の特性を示すかどうかを調べるために、2つのABC-DLBCL細胞株、HBL-1およびTMD8、ならびに1つのGCB-DLBCL細胞株、OCI-Ly1を19個の選択した分子の漸増濃度に曝露した。細胞増殖を、単一用量の化合物への48時間の曝露後に、ATPに基づく代謝発光検定を用いて測定した（図1Cに要約）。3つの化合物は一貫してABC-DLBCL細胞の有意な選択的用量依存的抑制を誘導した（MI-2、p＜0.0001；MI-4、p＝0.006およびMI-11、p＜0.0001 - 回帰余分平方和（Regression extra sum-of-squares）F検定）。したがって、これらの化合物は細胞内で活性であり、ABC-DLBLに選択的で、かつ非特異的細胞毒性はなかった。MI-6およびMI-15もABC-DLBCL細胞の差次的阻害を示したが、統計学的有意性には達しなかった。
【０１０５】
化合物MI-2は細胞検定において最も強力で、高いナノモル濃度範囲のGI25濃度を有していた。したがって、MI-2（図1D）を次にリンパ腫細胞におけるMALT1仲介性基質切断の阻害について検定した。HBL-1細胞を漸増濃度のMI-2で24時間処理し、MALT1標的タンパク質CYLDの切断をウェスタンブロッティングおよび濃度測定によって測定した。MI-2は、非切断CYLDタンパク質の増加およびタンパク質の切断型の低減によって確認される、MALT1仲介性切断における用量依存的低減を引き起こした（図1E）。MI-2は、構造的に関連するカスパーゼファミリーメンバーのカスパーゼ-3、-8および-9に対する活性をほとんど示さなかったため、MALT1パラカスパーゼ阻害剤として選択的であった。さらに、MI-2は、MALT1を抑制する濃度で、細胞検定においてカスパーゼ-3/7活性またはアポトーシスを阻害しなかった。したがって、MI-2は治療的MALT1阻害剤としてのリード化合物である可能性がある。
【０１０６】
MI-2類縁体はMALT1阻害活性を示す
化合物MI-2がMALT1阻害剤の開発のための骨格として可能性があるかどうかを確立するために、本発明者らはMI-2を他の化学化合物とインシリコで比較して、可能性のある類縁体を特定した。利用可能なライブラリから類似性スコアが≧70％（Tanimoto類似性関数）である合計704個の類縁体化合物を、LZ-MALT1蛍光検定によりスクリーニングした。MI-2と同等またはそれよりも高い活性を示す19個の類縁体を選択した（図2A）。MI-2とほぼ同等の範囲内の生化学IC50を有する5個の類縁体を、細胞増殖検定におけるさらなる特徴付けのために選択した（図2Bおよび2C）。5個の類縁体（MI-2A1〜5）はすべて、ABC-DLBCL細胞株の選択的抑制の同じ傾向を示し、GI25濃度はマイクロモル濃度の範囲であった（図2C）。化学対照として用いた、インビトロでLZ-MALT1阻害活性のない2個の類縁体化合物（MI-2A6〜7）は、同じ用量範囲で細胞増殖に対してまったく効果がなかった。5個の活性MI-2類縁体を、CYLDのMALT1切断の阻害について検定した。5μMで投与した5個の化合物はすべて、8時間で、陽性対照として用いたZ-VRPR-FMK MALT1ブロッキングペプチド（50μM）と類似の切断阻害を示した（図2D）が、MI-2自体が依然として最も強力な化合物であった。まとめると、化学的に関連する化合物の間のインビトロおよび細胞検定におけるMALT1阻害活性の保存は、MI-2およびその類縁体のMALT1のリード化合物阻害剤としての適合性を示している。
【０１０７】
MI-2はMALT1に直接結合し、不可逆的に阻害する
本発明者らは次に、MI-2がMALT1に直接結合するのか、またはMALT1活性に間接的に、例えば、融合タンパク質のLZ領域への結合を通じて影響を及ぼすのかを調べた。異核種単一量子コヒーレンス（HSQC）核磁気共鳴（NMR）分光法を用いて、MALT1のパラカスパーゼドメイン（残基329〜728）へのMI-2の結合を特徴付けた。MI-2を滴定していくと、MALT1の非結合状態に対応する共鳴の強度が低下する一方で、MALT1-MI-2複合体に対応する別の共鳴の組が徐々に現れた（図3A）。この化学シフト変化のパターンはNMR時間スケールにおけるゆっくりした交換に特徴的で、MALT1とMI-2との間の強固な相互作用を示している。対照的に、NMR分光試験では、不活性類縁体MI-2A6およびMI-2A7による結合の証拠は見られなかった（図3B）。
【０１０８】
MI-2は反応性クロロメチルアミドを含むため、本発明者らは、MI-2がMALT1を共有結合的に改変しうるかどうかを、液体クロマトグラフィ-質量分析（LC-MS）を用いて調べた。図3Cに示すとおり、MALT1パラカスパーゼドメイン（329〜728）は55,988.4Daに主要ピークを提示した。化合物MI-2とのインキュベーション後、MALT1の主要ピークは56,407.5Daにシフトし、419.1Da増加した。これはMI-2の付加から塩化物基を差し引いたものに対応し、MI-2がMALT1に共有結合することができ、不可逆的阻害剤として作用する可能性があることを示している。クロロメチルアミド基は活性MI-2類縁体では保存されていない（図2B）ため、これがMALT1に特異性を提供するMI-2シリーズに共通の化学骨格であろう。特に、MI-2およびMALT1活性部位変異体C464Aで行ったLC-MSは、共有結合の顕著な低減を明らかにし、活性部位C464残基はMI-2による改変の主な標的であることを示唆している（図3C）。MI-2のMALT1パラカスパーゼドメインへの可能性のある結合様式をさらに調べるために、本発明者らはAutoDock 4.2を用いての分子ドッキングを用いた（Morris et al., 2009）。MALT1の結晶構造（Wiesmann et al., 2012；Yu et al., 2011）を剛体として維持する一方、MI-2の配座の柔軟性は許容した。最終結果を各ドッキング配座について予測された結合自由エネルギーおよびクラスターサイズで順位付けた。上位5つのポーズを選択し、これらはすべて類似のドッキングスコアを有していたが、それらの配向はわずかに変化した。一番目のヒットについて示したとおり、MI-2はそのクロロメチル基で、パラカスパーゼドメインにおける活性部位C464に近い活性部位溝に結合するようであり（図3D）、これら2つの基の間の共有結合形成と一致する。まとめると、データは、MI-2がMALT1活性部位に連結し、不可逆的に結合することを示唆している。
【０１０９】
MALT1のMI-2阻害が不可逆的結合の動力学に一致しているかどうかを調べるために、LZ-MALT1を異なる濃度のMI-2と5〜80分間プレインキュベートし、続いて基質Ac-LRSR-AMCを加えて、酵素活性を判定した（図3E）。特に、MALT1不活化の割合(%)は時間と共に増大して、試験終了近くでプラトーに達し、共有結合および不可逆阻害に一致していた。阻害は濃度依存性で、濃度が高いほど大きい不活化および速い飽和速度を示した。対照的に、クロロメチルアミド基を有していない活性MI-2類縁体MI-2A2は、MALT1の累積阻害の証拠を示さず、可逆的阻害に一致していた。MI-2は100％阻害の近くまで達したが、IC50が低いMI-2A2は約50％阻害に達したにすぎなかった（図3E）。ペプチジルハロメチルケトンプロテアーゼ阻害剤の場合に記述されたとおり（Powers et al., 2002）、不可逆的動力学は、クロロメチルアミド基を持たず可逆的にのみ結合するMI-2の類縁体と比べて、細胞検定におけるMI-2のより強力な効果に貢献していると考えられる。
【０１１０】
MI-2はABC-DLBCL細胞株においてMALT1機能を阻害する
MI-2をリード化合物として確認した後、本発明者らは次にABC-DLBCL細胞におけるMALT1シグナル伝達に対するその効果を調べた。本発明者らはまず、A20、BCL10およびRELBなどのさらなるMALT1基質の切断に対するMI-2の影響を調べた。これらのタンパク質は切断後にプロテアソーム分解に向けられる（Coornaert et al., 2008；Hailfinger et al., 2011；Rebeaud et al., 2008）ため、本発明者らはプロテアソーム阻害剤MG-132を用いて、切断生成物の可視化を促進した（図4A）。HBL-1およびTMD8細胞株をMI-2（2μM）または媒体のいずれかに30分間曝露し、続いてMALT1基質の切断型をMI-2への曝露中に蓄積させるために、5μMのMG-132にさらに1時間（レーン2、3）または2時間（レーン4、5）曝露した。予想どおり、MG132への曝露は、これらのDLBCL細胞においてMALT1の構成的活性によるA20、BCL10およびRELB切断生成物の蓄積を明らかにした。しかし、MI-2への曝露は、切断型の存在量を減少させ、かつ/または全長タンパク質の存在量を増加させ、MALT1酵素活性の欠損と一致していた（図4A）。
【０１１１】
MALT1はBCR刺激後にc-RELの核への移動を仲介する（Ferch et al., 2007）。したがって、HBL-1細胞を200nM MI-2、50μM Z-VRPR-FMK（陽性対照）または媒体に24時間曝露し、続いてホールセルまたは単離した核のc-RELフローサイトメトリーを行った。MI-2およびZ-VRPR-FMKはいずれも、このタンパク質のホールセルレベルに影響することなく、核c-RELをほぼ同程度まで低減させた（図4B）。この結果をさらに確認するために、本発明者らは、GI50濃度のMI-2（HBL-1に対しては200nMおよびTMD8に対しては500nM）で24時間処理したHBL-1およびTMD8細胞の核抽出物中のc-RELおよびp65についてウェスタンブロットも実施した。両方の細胞株で、MI-2への曝露は核c-RELの明らかな低減を引き起こしたが、p65レベルに影響はなかった（図4C）。このc-RELに対する選択性は以前、MALT1ノックアウトマウスにおいて、およびMALT1ブロッキングペプチドZ-VRPR-FMKによるMALT1切断阻害後にも示されている（Ferch et al., 2009；Ferch et al., 2007；Hailfinger et al., 2011）。
【０１１２】
抗原受容体仲介性NF-κBシグナル伝達は、部分的にMALT1活性に依存する（Ruefli-Brasse et al., 2003；Ruland et al., 2003）。したがって、本発明者らは、BCR活性化を模倣し、MALT1依存性切断を活性化する、PMA/イオノマイシンにより誘導されるNF-κB活性化の減弱（Coornaert et al., 2008；Rebeaud et al., 2008）に対するMI-2の効果を試験した。まず、293T細胞にNF-κBレポーターベクター(NF-κB)5-luc2CP-pGL4（NF-κBコンセンサス応答配列の5コピーおよび不安定化ホタルルシフェラーゼを有する）およびTK-pRL対照を、BCL10およびMALT1WTまたはMALT1C464A（不活性変異体）のいずれかを発現するプラスミドと共に形質移入した。PMA/イオノマイシンへの曝露は、MALT1WTを形質移入した場合に293T細胞におけるルシフェラーゼ活性を有意に増大させた（p＜0.001；ANOVAおよびボンフェローニ事後検定）が、変異体MALT1C464Aでは増大はなかった。MI-2による前処理は、Z-VRPR-FMK（p＜0.05）と同様、PMA/イオノマイシン刺激によるNF-κB誘導を有意に阻害した（p＜0.01；ANOVAおよびボンフェローニ事後検定）が、MALT1C464Aのものには有意な影響を及ぼさなかった（図4D）。HBL-1細胞は、慢性的に活性なB細胞受容体シグナル伝達と、その結果としてのNF-κB活性化を示すと報告されている（Davis et al., 2010）。HBL-1にレポーター作成物(NF-κB)5-luc2CP-pGL4およびTK-pRL対照を形質移入した。MI-2による処理は、8時間および24時間の時点でそれぞれNF-κBレポーター活性の20％および50％低下を促進した。同様の結果がZ-VRPR-FMK 50μMで観察された（図4E）。このNF-κBレポーター活性の低下は、24時間でMI-2（p＜0.001、ANOVAおよびボンフェローニ事後検定）およびブロッキングペプチドZ-VRPR-FMK（p＜0.05）について有意であった。
【０１１３】
NF-κBシグナル伝達に対するMI-2の影響を、遺伝子発現プロファイリングによりさらに特徴付けた。これらの実験のために、HBL-1およびTMD8細胞株をGI50濃度のMI-2（HBL-1、200nM；TMD8、500nM）または50μM Z-VRPR-FMKで8時間処理し、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いる遺伝子発現試験のためにRNAを抽出した。Z-VRPR-FMKは以前、ABC-DLBCL細胞株においてNF-κBシグネチャーを減弱することが示された（Hailfinger et al., 2009）。MI-2も同様の特性を示すと予想された。この試験のために、本発明者らは、各細胞株について、媒体対照に比べてZ-VRPR-FMK処理によりダウンレギュレートされた上位200の遺伝子を捕捉することによりZ-VRPR-FMKシグネチャーを割り当てた。本発明者らは次に、各細胞株についてMI-2処理細胞と媒体処理細胞との間の変化倍率によってあらかじめ順位付けたすべての遺伝子の差次的発現に対する、このZ-VRPR-FMKシグネチャーの遺伝子セット濃縮分析（GSEA）を実施した。Z-VRPR-FMKシグネチャーは、両方の細胞株でMI-2処理後にダウンレギュレートされた遺伝子の間で有意に濃縮された（HBL-1：FDR＜0.0001；およびTMD8：FDR＜0.0001、図4F）。GSEAを次に、OCI-Ly3およびOCI-Ly10のいずれか、またはHBL-1細胞株由来の2つの独立のABC-DLBCL NF-κB遺伝子発現シグネチャーを用いて実施した。本発明者らは、両方の細胞株についてMI-2処理後にダウンレギュレートされた遺伝子の間でこれらのNF-κB遺伝子セットの有意な濃縮を観察した（NF-κB OCI-Ly3/OCI-Ly10、HBL-1：FDR=0.015およびTMD8：FDR＜0.0001）および（NF-κB HBL-1、HBL-1：FDR＝0.051およびTMD8：FDR＜0.0001）。まとめると、これらのデータは、Z-VRPR-FMKで観察された効果と同様、MI-2がMALT1により誘導されたNF-κB活性を抑制することを示唆している。
【０１１４】
MI-2はMALT1依存性DLBCL細胞株を選択的に抑制する
MI-2仲介性MALT1阻害効果の範囲をさらに調べるために、本発明者らは6つのABC-DLBCLおよび2つのGCB-DLBCL細胞株のより大きいパネルに向かった。これらの細胞株におけるB細胞受容体およびNF-κB経路に影響を及ぼす遺伝的特徴を表1にまとめている。
【０１１５】
（表１）本試験において用いた細胞株に存在するABC-DLBCLのNF-κB活性化変異
2015536990.tif 000012
【０１１６】
内因性MALT1活性を、A20、BCL10およびCYLDについてのウェスタンブロッティングにより評価し、NF-κB活性化をホスホ-IκB-αおよび全IκB-αにより評価した。増殖のMALT1タンパク質分解活性への依存性を、48時間の50μM Z-VRPR-FMK処理により試験した。予想どおり、2つのGCB-DLBCL細胞株（OCI-Ly7およびOCI-Ly1）はMALT1またはNF-κBシグナル伝達の証拠を示さず、Z-VRPR-FMKに反応しなかった。U2932およびHLY1 ABC-DLBCL細胞株は、MALT1下流のNF-κBシグナル伝達を活性化するTAK1およびA20において変異を有する。したがって、これら2つの細胞株はZ-VRPR-FMKに対して比較的わずかな反応を示した。対照的に、ABC-DLBCL細胞HBL-1、TMD8、OCI-Ly3およびOCI-Ly10はMALT1活性およびZ-VRPR-FMKによる増殖の阻害の証拠を示し、これら4つの細胞株はMALT1依存性であることを示している。
【０１１７】
8つの細胞株すべてを漸増濃度のMI-2（単一用量）に曝露し、細胞増殖をATPに基づく代謝発光検定を用いて48時間の時点で測定した（図5A）。MI-2による増殖阻害はMALT1依存性細胞株に対して選択的であったが、ABC-DLBCL MALT1非依存性細胞株、U2932およびHLY-1、ならびに2つのGCB-DLBCL細胞株は抵抗性であった。HBL-1、TMD8、OCI-Ly3およびOCI-Ly10細胞におけるMI-2のGI50は、それぞれ0.2、0.5、0.4、および0.4μMで、インビトロでのそのIC50よりも低い（図1）。これは図3に示すMI-2のMALT1への不可逆的結合によって説明されると思われるが、化合物の細胞内蓄積が原因でもありうる。事実、本発明者らは、HBL-1細胞を0.02、0.2または2μMのMI-2に2時間曝露し、3回洗浄し、MI-2をLC-MSで測定した実験において、MI-2細胞内濃度の18〜30倍の増加を観察した（図5B）。0.2μMのMI-2で処理した細胞における細胞内濃度は、計算したインビトロIC50とほぼ同等の5μMであった（図5B）。遊離薬物の蓄積の動力学を調べるために、本発明者らは、0.2μMのGI50濃度で30分、2、6、12、24および48時間の時点のMI-2の細胞内濃度を測定した。12時間までに、細胞内に実質的に検出可能な遊離MI-2はなかった。しかし、HBL-1細胞の漸増濃度のMI-2単一用量への曝露後、48時間後なってはじめて細胞の回復が明らかになり始めた（0.2μM用量レベル）。これらのデータは、MI-2の強力な生物学的効果は、少なくとも部分的には、その細胞内に集中する傾向に助けられた、MALT1へのその不可逆的結合によることを示唆している。
【０１１８】
MALT1阻害の生物学的効果をより詳細に調べるために、HBL-1、TMD8、OCI-Ly10およびGCB-DLBCL細胞株OCI-Ly1を漸増濃度のMI-2で処理した。細胞増殖を、48、72および96時間の時点で生細胞におけるフローサイトメトリーによるCFSE希釈検定を用いて試験した。MI-2はHBL-1、TMD8およびOCI-Ly10における増殖を実質的に阻害したが、OCI-Ly1には影響がなかった（図5C1、5C2、5C3）。細胞周期を評価するためのBrdU取り込み-DAPI染色およびフローサイトメトリーを用いて、MI-2はS期の用量依存的減少と、G1〜0およびSub-G0期の細胞比率の相反する増加を誘導することが明らかであった（図5D）。MALT1阻害剤がアポトーシスを誘導するかどうかを調べるために、ABC-DLBCL細胞株HBL1およびTMD8を、それぞれのGI25およびGI50のMI-2で、ならびに対照OCI-Ly1細胞株をTMD8に対して用いた高い方の用量で、1日1回処理した。トリパンブルー排除およびAnnexin V+ DAPI-フローサイトメトリーにより評価したアポトーシスを、48時間ごとに14日間測定した。MI-2はOCI-Ly1細胞に対して影響がなかったが、HBL-1およびTMD8細胞の両方を著しく抑制し、前者はアポトーシス細胞をより早く、より大量に示した（図5E）。より感度の高いカスパーゼ-3/7切断検定を用いて、本発明者らは、両方のABC-DLBCL細胞株において48時間以内に用量依存的アポトーシスの証拠を観察した。したがって、MI-2はABC-DLBCL細胞株の増殖および生存を強力に抑制する。
【０１１９】
化合物MI-2は動物に対して非毒性である
インビボ試験のためのMALT1リード化合物としてのその適合性を判定するために、本発明者らはMI-2がマウスで毒性効果を誘導するかどうかを調べた。5匹のC57BL/6マウスを、0.05〜25mg/kgの範囲で10日間、累積用量51.1mg/kgまでの漸増用量のMI-2の1日1回腹腔内（IP）投与に曝露し、別の5匹のマウスを媒体のみ（5％DMSO、n＝5）に曝露した（図6A、毒性1）。嗜眠、体重減少（図6B、毒性1）または病気の他の身体的指標の徴候はなかった。25mg/kgの最大投与用量が14日のスケジュールで安全かどうかを確認するために、本発明者らは10匹のマウスを25mg/kgを14日間、累積用量350mg/kgまでのMI-2の1日1回IP投与に曝露し、対照として媒体のみを注射した5匹のマウスを用いた（図6A、毒性2）。5匹のマウスをMI-2投与の14日間の過程後に（5匹の対照と共に）屠殺し、他の5匹を10日間の休薬期間後に屠殺して、遅延毒性を評価した。有毒作用または体重減少（図6B、毒性2）もしくは組織損傷（肉眼的または顕微鏡的）を含む病気の他の指標は見られなかった（図6C1および6C2）。脳、心臓、肺、肝臓、腎臓、腸、脾臓、胸腺および骨髄組織を試験した。骨髄は、三血球系が成熟中の血液生成を示す、正形成髄であった。骨髄と赤血球との比は4〜5：1であった。巨核球の数および分布は正常であった。線維症も、芽球またはリンパ球の数の増大もなかった。全末梢血球数、生化学検査および肝機能検査は正常であった（表2）。
【０１２０】
（表２）毒性2実験からの血球数および血清化学結果（MI-2の25mg/kg 1日1回IP投与または同量の媒体を14日間）
2015536990.tif 000013
a媒体およびMI-2処理動物の両方においてグルコースの軽度の増加が見られ、これはおそらくは賦形剤としてのデキストロースの投与によるか、またはマウスが絶食でなかったためであろう。
【０１２１】
これらの試験は、抗リンパ腫有効性試験において用いるためのMI-2の安全性を確立した。
【０１２２】
MI-2はエクスビボでヒトABC-DLBCL異種移植片および初代ヒトDLBCLを抑制する
MI-2がインビボでDLBCLを抑制しうるかどうかを判定するために、本発明者らは、HBL-1およびTMD8（MALT1依存性）ならびにOCI-Ly1（MALT1非依存性）DLBCL細胞をNOD-SCIDマウスの右側腹領域に移植した。腫瘍が平均120mm3の体積に達すれば、マウスをMI-2 25mg/kg/日（TMD8ではn＝10、HBL1ではn＝5、およびOCI-Ly1ではn＝10）または媒体（5％DMSO、TMD8ではn＝10、HBL1ではn＝4、およびOCI-Ly1ではn＝10）のIP注射を受けるように無作為化した。14回目の注射の24時間後に動物を屠殺した。顕著なことに、MI-2は媒体と比べてTMD8（p＝0.015、t-検定）およびHBL1（p＝0.014、t-検定）ABC-DLBCL異種移植片両方の成長を著しく抑制したが、OCI-Ly1腫瘍（p＝0.47、t-検定）の成長には影響がなかった（図7A）。OCI-Ly1腫瘍が影響を受けなかったという事実は、MI-2活性が、宿主の微小環境ではなく、リンパ腫細胞へのその効果によることを示唆している。アポトーシス細胞を検出するための、TUNEL検定を用いての組織検査は、媒体に比べて、MI-2処理したHBL-1（p＝0.0008、t-検定）およびTMD8（p＜0.0001、t-検定）異種移植片におけるアポトーシス細胞の有意な増大を示したが、OCI-Ly1異種移植片（p＝0.5580、t-検定）では差は観察されなかった（図7B）。本発明者らはまた、媒体に比べて、HBL-1（p＜0.0001、t-検定）およびTMD8異種移植片（p＝0.0006、t-検定）におけるKi-67染色によって測定した増殖の有意な低減を観察したが、OCI-Ly1異種移植片（p＝1.0、t-検定）では差は観察されなかった（図7C）。異種移植片におけるNF-κBシグナル伝達に対するMI-2処理の効果を評価するために、c-REL免疫蛍光をパラフィン腫瘍切片で実施した。図4Bおよび4Cに示すデータと一致して、MI-2処理した腫瘍はc-REL核タンパク質の低減を示した（図7D）。したがって、MI-2低分子MALT1阻害剤は、インビボでABC-DLBCLにおける増殖、生存およびNF-κB活性を、リンパ腫細胞自発的様式で特異的に抑制する。
【０１２３】
最後に、MI-2が初代ヒトDLBCLも抑制しうるかどうかを判定するために、本発明者らは、GCB対ABC分類の代用として、ハンス基準（Hans et al., 2004）を用いての免疫組織化学により、そのGCB対非GCB状態を確認しうる、5名のDLBCL患者のリンパ節生検からの単細胞懸濁液を得た。リンパ腫細胞を単離し、4つ組で0.8μM MI-2または媒体に曝露した。48時間の曝露後、細胞数および生存度を、トリパンブルーを用いて評価した。特に、非GCB症例の2名はMI-2に反応した（媒体と比べてそれぞれp＝0.04および0.003）が、GCB症例では誰も反応しなかった（図7E）。非GCBの1名はMI-2に反応せず、おそらくこの症例はハンス基準によって正確に分類されなかったのであろう。全体として、これらの試験は、MI-2低分子阻害剤を用いてMALT1を治療的標的とすることは、ヒトABC-DLBCL細胞に対する強力な抑制効果を有し、臨床試験における使用への移行を保証することを示している。
【０１２４】
CARMA1-BCL10-MALT1（CBM）複合体は、抗原受容体活性化後に集合し、MALT1二量体化およびそのパラカスパーゼ活性の誘導を引き起こす。基質タンパク質A20、BCL10、CYLDおよびRELBのMALT1による切断は、異なるメカニズムを通してNF-κBシグナル伝達を増強する（Coornaert et al., 2008；Hailfinger et al., 2011；Rebeaud et al., 2008；Staal et al., 2011）。BCRシグナル伝達は、様々な遺伝子の体細胞変異により、ABC-DLBCLのサブセットにおいて慢性的に活性で、構成的MALT1シグナル伝達およびNF-κB活性化を引き起こす（Davis et al., 2010）。さらに、マウスにおけるMALT1の構成的発現は、MALTリンパ腫およびABC-DLBCLを模倣する（Vicente-Duenas et al., 2012）。MALT1タンパク質分解活性の低分子阻害剤は、したがって、ABC-DLBCLまたはMALTリンパ腫、ならびに様々な炎症性および自己免疫障害の処置のための非常に有用な治療薬でありうる。
【０１２５】
MALT1の触媒活性は詳細に規定されており、ペプチドの長さならびにアミノ酸の組成および位置などの、基質の特性に関与する（Hachmann et al., 2012）。精製したMALT1は、全長タンパク質またはパラカスパーゼドメインのいずれでも、溶液中ではその活性二量体型ではなくモノマーとして存在するため、あまり活性ではない。二量体化は高い塩濃度、1Mクエン酸ナトリウムによって誘導することができる（Boatright et al., 2003）。しかし、これらの高い塩状態は非生理的で、したがって生理的に関連する低分子阻害剤の生化学的スクリーニングを妨害する。これを避けるために、本発明者らは、MALT1のパラカスパーゼドメイン（340〜789）がその二量体活性配座（図1A）であるように、ロイシンジッパードメインに融合した組換えMALT1タンパク質を操作して、より生理的な条件を用いてのスクリーニングを可能にした。この方法を用いて、本発明者らは、インビトロでMALT1を阻害することができ、IC50がマイクロモル濃度の範囲の、19個の化合物を特定した。本発明者らは、最も強力な阻害剤であるMI-2に焦点を合わせた。本発明者らは、MI-2が、C型肝炎ウイルスのNS3/4Aプロテアーゼに対するテラプレビル（（Klibanov et al., 2011）、プロテアソーム阻害剤カルフィルゾミブ（Genin et al., 2010）およびその他（Powers et al., 2002）などの、プロテアーゼ阻害薬に類似の、MALT1の共有結合による不可逆的かつ選択的阻害剤であることを示す。ペプチド阻害剤であるZ-VRPR-FMKは研究ツールとして有用であったが、その比較的大きいサイズ、電荷、およびその結果としての低い細胞透過性を考慮すると、MALT1治療薬として適切ではない。したがって、MI-2は細胞検定における優れた活性および優秀な細胞浸透を示し、事実、細胞内の高い濃度を特徴とし、なお他のカスパーゼに比べてMALT1に高度に選択的であった。特に、チロシンキナーゼBTKの選択的かつ不可逆的低分子阻害剤、PCI-32765（イブルチニブ）は現在、B細胞非ホジキンリンパ腫の患者で臨床開発中である（Honigberg et al., 2010）。MI-2の不可逆性は、薬動力学的利点を提供しうる。ABC-DLBCLは慢性的に活性なBCRシグナル伝達を有するため、MALT1切断の長期抑制は、最大の抗リンパ腫活性のために必要であろう。不可逆的阻害剤を用いることで、活性は新しい酵素が合成されたときにのみ回復することになる。これにより、薬物は低い血漿濃度で有効となり、したがって投与レベルおよび頻度を下げ、有効性を損なうことなく長い血漿半減期の必要条件を限定し、かつ循環薬物への長期曝露に関連する毒性効果の可能性を最小限にしうる。事実、本発明者らの詳細な試験は、MI-2が動物において非毒性であることを示した。この結果は、MALT1がヒトにおける唯一のパラカスパーゼであり、MALT1欠損マウスは比較的健康であるとの事実と一致する（Ruefli-Brasse et al., 2003；Ruland et al., 2003）。
【０１２６】
ABC-DLBCLにおけるBCR経路の慢性的活性化は、いくつかの異なるメカニズムによって仲介され、それらの多くはMALT1の上流である。ABC-DLBCLはこの経路に依存し、多くの場合MALT1切断活性に特異的に依存している（Ferch et al., 2009；Hailfinger et al., 2009；Ngo et al., 2006）。特に、MI-2は、CD79A/B、CARMA1および/またはMYD88変異を有するが、A20同型接合性欠失またはTAK1変異を有するものを含む、MALT1下流のタンパク質で出現するものは有していない、ABC-DLBCL細胞株を選択的に死滅させた（図5Aおよび表1）。これらの知見は、標的指向治療薬の合理的展開のために、リンパ腫における、繰り返し変異する対立遺伝子を標的としたリシークエンシングの重要性を強調している。MALT1阻害剤で標的とし得るリンパ腫の全範囲は完全に明らかではないが、エクスビボ系を用いて、本発明者らは、初代ヒト非GCB-DLBCL試料もMALT1に依存しており、MI-2で抑制されることを初めて示すことができた。
【０１２７】
単一の薬剤は一般に治癒的ではなく、速やかに耐性を生ずる（Misale et al., 2012）ため、組み合わせでの標的療法にますます興味が持たれる。MALT1切断阻害の合理的な組み合わせには、Srcファミリー（ダサチニブ、サラカチニブ、ボスチニブ、およびKX01）、Syk（ホスタマチニブ2ナトリウム）またはBtk（PCI-32765）を標的とするチロシンキナーゼ阻害剤との組み合わせが含まれうる。これらの薬物は、マイトジェン活性化タンパク質（MAP）キナーゼおよびホスファチジルイノシトール（PI）3-キナーゼを含む、BCRシグナル伝達をさらに阻害することにより、NF-κBのMALT1切断阻害と相乗作用するようである（Lim et al., 2012）。PKC阻害は、MALT1依存性であるが、そのタンパク質分解活性には非依存性の活性を含む、NF-κB経路をさらに阻害しうるため、これも有益な組み合わせの可能性があろう。PKC阻害剤ソトラスタウリンは、移植拒絶の予防および乾癬の処置のための臨床試験中で（Manicassamy, 2009；Matz et al., 2011）、ABC-DLBCL異種移植腫瘍の成長を阻害することが最近示され（Naylor et al., 2011）、このリンパ腫亜型の抗リンパ腫療法としてのその使用の可能性を示している。ABC-DLBCLはBCL6転座、SPI-B増幅またはPRDM1欠失もしくは変異も特徴とする（Lenz and Staudt, 2010）。BCL6阻害剤は、重要なチェックポイント遺伝子の放出を通じて、アポトーシスおよび細胞周期停止を促進する(Cerchietti et al., 2010；Cerchietti et al., 2009；Polo et al., 2004）。MI-2およびBCL6阻害剤の組み合わせは、したがって、ABC-DLBCLにおける2つの重要な経路（BCL6およびNF-κB）を抑制し、治療的相乗作用を引き起こす可能性がある。まとめると、本明細書において報告する結果は、MI-2を、MALT1を標的とするリード化合物として特定し、NF-κBシグナルに依存性で、かつ通常の化学療法には抵抗性の、高悪性度NHLの処置のための、治療標的としてのMALT1および治療薬としてのMI-2の重要性、安全性および有効性を示す。
【実施例】
【０１２８】
MALT1タンパク質分解活性阻害剤のためのハイスループットスクリーニング
Ac-LRSR-AMCを基質として用い、反応を360/465nmの励起/発光波長で測定した。対照値の平均を阻害パーセントの計算において用いた。最終阻害パーセントを以下の式で計算した：{[蛍光試験化合物(T2-T1)-蛍光陰性対照(T2-T1)]/[蛍光陽性対照(T2-T1)-蛍光陰性対照(T2-T1)]}×100。Z-VRPR-FMK（300nM）を陽性対照として用い、緩衝液のみを陰性対照として用いた。
【０１２９】
増殖阻害の判定
細胞増殖を、発光法（CellTiter-Glo、Promega、Madison、WI）およびトリパンブルー色素排除（Sigma、St. Louis、MO）を用いてのATP定量によって判定した。薬物処理細胞における細胞生存度を、それぞれの対照に対して正規化し（分画生存度）、結果を1-分画生存度として示す。CompuSynソフトウェア（Biosoft、Cambridge、UK）を用いて、対照に比べての分画増殖を阻害する薬物濃度を求めた。
【０１３０】
マウス異種移植実験
8週齢の雄SCID NOD.CB17-Prkdcscid/Jマウスに、継代数の少ない107個のヒトHBL-1、TMD8またはOCI-Ly1細胞を注射した。処置を腹腔内注射により投与した。腫瘍体積を週に3回のデジタルキャリパー測定によりモニターした。すべての手順はUS NIHプロトコルに従い、Animal Institute Committee of the Weill Cornell Medical Collegeによって承認された。
【０１３１】
アクセッション番号
マイクロアレイデータ：GSE40003。
【０１３２】
MALT1タンパク質分解活性阻害剤のためのハイスループットスクリーニング
スクリーニングは、緩衝液A（20mM HEPES pH7.5、10mM KCl、1.5mM MgCl2、1mM EDTA、1mM DTT、0.01％トリトンX-100）中の100nM LZ-MALT1、200μM Ac-LRSR-AMC、および12.5μM試験化合物を含む、384穴黒色プレート（Greiner Bio One、Wemmel、Belgium、カタログ#784076）中の反応液20μlで構成された。反応を、Envision Multilabel Reader（Perkin-Elmer、Waltham、MA）を用い、360/465nmの励起/発光波長で測定した。各反応について2つの時点を測定し；化合物の自己蛍光による偽陽性を排除するために、時点間の蛍光の差（T2-T1）をMALT1活性と考えた。対照値の平均を阻害パーセントの計算において用いた。最終阻害パーセントを以下の式で計算した：{[蛍光試験化合物(T2-T1)-蛍光陰性対照(T2-T1)]/[蛍光陽性対照(T2-T1)-蛍光陰性対照(T2-T1)]}×100。Z-VRPR-FMK（300nM）を陽性対照として用い、緩衝液のみを陰性対照として用いた。40％阻害を閾値として用い、324個の化合物をMALT1阻害剤の可能性があるとして特定した。陽性ヒットについて、0.122μM〜62.5μMの用量範囲内の濃度-反応実験で妥当性の確認を行い、化合物のIC50（50％の阻害）を求めた。活性はまた、スクリーニングに用いたLZ-MALT1に加え、組換え全長野生型MALT1を用いて、その妥当性を確認した。
【０１３３】
タンパク質発現および精製
MALT1（340〜789）を、GCN4（251〜281）からのロイシンジッパー配列と、N-末端で融合した（LZ-MALT1）。N-末端his標識LZ-MALT1を大腸菌（E. Coli）内で発現させ、Ni-NTAアフィニティクロマトグラフィ（Qiagen、Valencia、CA）と、続いて20mMトリス（pH7.5）、150mM NaCl、および5mM DTTを含む緩衝液中、Superdex 200 HR 10/300（GE Healthcare、UK）でのゲルろ過クロマトグラフィにより精製した。
【０１３４】
細胞培養
DLBCL細胞株OCI-Ly1、OCI-Ly7およびOCI-Ly10は80％Iscove培地、20％FBSおよびペニシリンG/ストレプトマイシン中で増殖させた。DLBCL細胞株HBL-1、TMD8、U2932は90％RPMI培地、10％FBS、2mMグルタミン、10mM HepesおよびペニシリンG/ストレプトマイシン中で培養した。DLBCL細胞株OCI-Ly3およびHLY1は80％RPMI培地、20％FBS、2mMグルタミン、10mM HepesおよびペニシリンG/ストレプトマイシン中で培養した。293T細胞は90％D-MEM、10％FBSおよびペニシリンG/ストレプトマイシン中で培養した。すべての細胞株は5％CO2の加湿雰囲気下、37℃で培養した。細胞株を一塩基多型プロファイリング（フィンガープリンティング）によって確認した。
【０１３５】
増殖阻害の判定
DLBCL細胞株を、48時間の処理中、指数関数的増殖条件下で増殖させた。細胞増殖を、発光法（CellTiter-Glo、Promega、Madison、WI）およびトリパンブルー色素排除（Sigma、St. Louis、MO）を用いてのATP定量によって判定した。発光は、Synergy4マイクロプレートリーダー（BioTek Instruments、Winooski、VT）を用いて測定した。各細胞株の標準曲線を、発光値に対する細胞数（トリパンブルー法で判定）をプロットすることにより計算し、それに応じて細胞の数を計算した。薬物処理細胞における細胞生存度を、それぞれの対照に対して正規化し（分画生存度）、結果を1-分画生存度として示す。CompuSynソフトウェア（Biosoft、Cambridge、UK）を用いて、対照に比べて25％細胞株の増殖を阻害する薬物濃度を求めた（GI25）。実験は三つ組で行った。
【０１３６】
リード化合物MI-2に基づく類縁体スクリーニング
類似性検索を0.7カットオフに設定し、Collaborative Drug Discovery（CDD、Burlingame、CA）データベース（www.collaborativedrug.com）の類似性検索機能を用いて実施した。CDD検索機能はChemAxon（www.chemaxon.com、Budapest、Hungary）の（http://www.chemaxon.com/jchem/doc/dev/search/index.html#simil）に記載のハッシュフィンガープリントの標準タニモト類似性機能に基づいている。簡単に言うと、あらゆる問い合わせ構造のハッシュフィンガープリントを計算し、次いで以下の非類似性式を適用する：1-(NA&B/NA+NB-NA&B)、ここでNAおよびNBはそれぞれ分子AおよびBのフィンガープリントにおいて設定されたビット数であり、NA&Bは両方のフィンガープリントにおいて設定されたビット数である。非類似性の閾値は0と1との間の数で、類似性計算におけるカットオフ限界を規定する。非類似性値が閾値未満であれば、問い合わせ構造および所与のデータベース構造は類似であると考えられる。類縁体スクリーニングを、三つ組で行った以外は、一次スクリーニングと同じ方法を用いて実施した。MI-2よりも活性が高い19個の化合物を、さらなる妥当性確認のために選択した。
【０１３７】
NMR
均一に15Nおよび13C標識されたMALT1（329〜728）を、1g/l [15N]塩化アンモニウムおよび3g/l [13C]グルコース（Cambridge Isotope Labs、Andover、MA）を含むM9培地中で増殖中のBL21（DE3）大腸菌内で発現させ、大腸菌細胞溶解物から（Wiesmann et al., 2012）に記載のとおりに精製した。
【０１３８】
MALT1（329〜728）の標準2D 1H 13C NMRスペクトルを、50mM HEPES（pH7.5）、50mM NaCl、および10％D2O中に10.0mg/mlタンパク質を含む試料中で記録した。NMR分光法実験はBruker AV 500 MHz分光計（Bruker、Billerica、MA）により、310Kで記録した。
【０１３９】
MALT1（329〜728）の標準2D 1H 15N HSQCスペクトルを、25mMトリスpH7.5、250mM NaCl、5mM DTT、10％D2O、0.02％NaN3、2％DMSO中に70μMタンパク質を含む試料中で記録した。HSQCは600 MHz Varian（Varian、Palo Alto、CA）により37℃で行った。
【０１４０】
HPLC/ESI-MS
HPLC/ESI-MS実験を、1mg/mlタンパク質濃度の5μlの試料で実施した。タンパク質の分離をHP1100システム（Hewlett Packard、Palo Alto、CA、USA）で、POROS R1/Hを充填した1mm×150mm LC Packingsカラム（Perseptive Biosystems、Foster City、CA、USA）を用いて行った。カラムは80℃に維持した。試料をカラムに、Valco model C6UW HPLCバルブ（Valco、Houston、TX、USA）および10μl注入ループを取り付けたCTC PALオートサンプラー（CTC、Zwingen Switzerland）を用いて注入した。HPLCはMassLynxソフトウェア（Micromass、Manchester、UK）により制御した。UV検出は214nmで行った。溶離剤Aは0.05％TFAを含む水であった。溶離剤Bは水：0.045％TFA含有アセトニトリルの1：9混合物であった。20％Bから90％Bの勾配を20分間で流した。流速は典型的には60μl/分であった。LCシステムからの全流量をUV検出セルに導入した後、ESI源に導入した。MassLynxソフトウェアを用いて、HPLCシステムを制御し、UV検出器からのシグナルを処理した。質量分析を、Micromass Z-typeエレクトロスプレーイオン化源を備えたQ-tof（Micromass、Manchester、UK）四重極飛行時間ハイブリッドタンデム質量分析計を用いて行った。取得質量範囲は典型的にはm/z 500〜2000であった。データはMassLynxソフトウェアを用いて記録し、処理した。500〜2000 m/zスケールの較正は、ウマ心臓ミオグロビン（MW 16,951.5Da）の多価イオンピークにより達成した。
【０１４１】
MALT1阻害の用量-効果および時間経過
384穴黒色プレート（Greiner Bio One、Wemmel Belgium、カタログ#784076）中、8pmolの精製したLZ-MALT1を異なる濃度の化合物MI-2（125、62.5、31.25、15.625、7.8125または0μM）と共に、5％DMSO、20mM HEPES pH7.5、10mM KCl、1.5mM MgCL2、1mM EDTA、1mM DTT、0.01％トリトンX-100を含む緩衝液中、室温で、示した時間（5分から80分）インキュベートし、次いで4μmolのAc-LRSR-AMCを各混合物に加えて、反応を開始した。反応をSpectraMax M5プレートリーダー（Molecular Devices、Sunnyvale、California USA）により、360/465nmの励起/発光波長、20秒間隔でモニターした。阻害の正規化したパーセンテージを、以下の式で計算した：(M(T2-T1)-N(T2-T1))/(P(T2-T1)-N(T2-T1))*100。ここでM(T2-T1)は200sおよび0sの時点の差シグナルであり、N(T2-T1)は陰性対照の緩衝液だけの差シグナルでありP(T2-T1)は陽性対照のZ-VRPR-FMKの差シグナルである。
【０１４２】
MALT1へのMI-2ドッキング
MI-2の構造を生成し、その幾何学を最適化した。そのパラカスパーゼおよびIg3ドメインを、Z-VRPR-FMKペプチド阻害剤（PDB ID：3UOA）との複合体で含む、MALT1の原子座標（Wiesmann et al., 2012；Yu et al., 2011）を阻害剤ドッキングのために選択した。ペプチド阻害剤および溶媒分子の除去後、水素原子をMALT1構造に加えた。ドッキングシミュレーションを、MI-2に対するMALT1の可能な3D格子を規定することにより開始した。計算した格子マップは寸法60×40×40ポイントで、間隔0.375Å/ポイントのものであった。AutoDock 4.2（Morris et al., 2009）における一般的アルゴリズムを用い、ドッキングを剛性分子としてのMALT1で実施する一方で、MI-2阻害剤における柔軟性は許容した。最終結果を予測された結合自由エネルギーに基づいて順位付けた。
【０１４３】
ウェスタンブロット
同量の全タンパク質（20〜75μg）をドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）上で分離し、ニトロセルロース膜上に電気泳動転写した。膜を一次抗体（MALT1、BCL-10、CYLDはSanta Cruz Biotechnologies、Santa Cruz、CAから；A20はeBioscience、San Diego、CAから；ホスホ-IκB-α、IκB-α、c-REL、RELBはCell Signaling、Danvers、MAから、およびα-チューブリンはSigmaから）と、続いて西洋ワサビペルオキシダーゼに結合した二次抗体と共にインキュベートし、化学発光（Pierce、Thermo Scientific、Rockford、IL）により検出した。
【０１４４】
フローサイトメトリー
細胞増殖におけるMI-2の効果を試験するために、細胞をカルボキシフルオセイン二酢酸サクシンイミジルエステル（CFSE、Invitrogen、Life Technologies、Grand Island、NY）により、0.5μM、37℃で10分間標識した。CFSEは長命の細胞内分子をカルボキシフルオレセインで共有結合により標識する。各細胞分裂後、蛍光分子は娘細胞中に希釈され、細胞分裂の動力学の比較試験を可能にする。細胞をDAPI（Sigma）で染色し、続いてフローサイトメトリーを行った。DAPIneg細胞を分析のためにゲートした。
【０１４５】
細胞周期の分布を調べるために、細胞をAPC BrdU Flow Kit（BD Pharmingen、San Jose、CA）によるパルス-BrdU（ブロモデオキシウリジン）取り込みを用いてのフローサイトメトリーにより分析した。
【０１４６】
アポトーシスをAnnexinV-APC/DAPI（BD Pharmingen）染色と、続くフローサイトメトリーにより評価した。
【０１４７】
c-RELの核外移行をフローサイトメトリーによって試験した。細胞を示したとおりに処理し、全細胞または単離核を調製し、c-RELに対して染色した。全細胞を固定し、Dako（Glostrup、Denmark）のIntrastainキットを用いて透過化処理した。核抽出のために、細胞を冷却した核抽出緩衝液（320mMスクロース、5mM MgCl2、10mM HEPES、1％トリトンX-100 pH7.4）に再懸濁し、氷上で10分間インキュベートし、核洗浄緩衝液（320mMスクロース、5mM MgCl2、10mM HEPES pH7.4、トリトンX-100なし）で2回洗浄した。核の収率および完全性をトリパンブルー染色による顕微鏡検査で確認した。標識のために、核洗浄緩衝液に1％BSA、0.1％アジ化ナトリウムおよび1：100 c-REL抗体（Cell Signaling）を補足した。細胞を洗浄し、次いでInvitrogenのAlexa Fluor-488結合二次抗体と共にインキュベートした。細胞を再度洗浄し、DAPIで染色し、続いてフローサイトメトリーを行った。
【０１４８】
ルシフェラーゼ検定
レポーター検定を、12穴皿のウェルごとに2×105細胞の密度で播種した293T細胞中で実施した。100ngの(NF-κB)5-Luc2CP-pGL4および10ngのTK-Renilla内部対照プラスミドを、25ngの示したプラスミド（MIGR1-MALT1WTまたはMIGR1-MALT1C464AおよびpcDNA4-Flag-Bcl10）と共に、Lipofectamine 2000（Invitrogen）を用いて同時形質移入した。溶解物を二重ルシフェラーゼ検定に、製造者のプロトコル（Promega）に従って供した。HBL-1中、5×106細胞あたり5μgの(NF-κB)5-Luc2CP-pGL4および50ngのTK-Renilla内部対照プラスミドを、nucleofection（Amaxa、Lonza、Basel、Switzerland）を用いて同時形質移入した。形質移入の48時間後、細胞を24穴プレートのウェルごとに5×104細胞の密度で播種し、示したとおりに処理した。溶解物を二重ルシフェラーゼ検定に、製造者のプロトコル（Promega）に従って供した。
【０１４９】
マイクロアレイデータ解析
HBL-1およびTMD8細胞からのRNAを、示した濃度の化合物MI-2または媒体で8時間処理し、mRNAをRNeasy Plusキット（Qiagen、Valencia、CA）を用いて単離し、続いてRNase-Free DNase試薬（Qiagen）を用いてDNアーゼ処理した。RNAの完全性を、RNA 6000 Nano LabChip KitをAgilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies、Santa Clara、CA）で用いて判定した。試料をIlluminaの推奨に従って処理し、cRNAをHumanHT-12 v4 Expression BeadChip（Illumina、San Diego、CA）にハイブリダイズした。アレイをiScanシステム上で走査した。データの前処理および品質管理を、GenomeStudioを用いて実施した。データをクオンタイル正規化と合わせてlog2変換した（Du et al., 2008）。GEOアクセッション番号GSE40003。
【０１５０】
結果の生物学的有意性を判定するために、関連遺伝子のセットに関する濃縮試験を実施した。このために、本発明者らはGSEA（Gene Set Enrichment Analysis）ソフトウェアを用い、データセットを変化倍率の値によってあらかじめ順位付けた（Subramanian et al., 2005）。各遺伝子セットのp値を、FDR計算のための1,000回反復および多重仮説検定の補正に基づいて計算した（Storey and Tibshirani, 2003）。
【０１５１】
マウス異種移植実験
8週齢の雄SCID NOD.CB17-Prkdcscid/JマウスをJackson Laboratories（Bar Harbor、MN）から購入し、清浄な環境で飼育した。マウスに、50％マトリゲル（BD Biosciences、#354234）中の、継代数の少ない107個ヒトTMD8またはOCI-Ly1細胞を注射した。処置を、腫瘍が120mm3の平均サイズに達した時点（移植後17日）で開始した。薬物をDMSO中で再構成し、-80℃で使用まで保存し、腹腔内注射により投与した。腫瘍体積を週に3回のデジタルキャリパー測定（Fisher Scientific、Thermo Scientific、Rockford、IL）によりモニターし、式(最小径2×最大径)/2を用いて計算した。データは平均±SEMで表し、差は対応スチューデントt検定によりp＜0.05で統計学的に有意と考えた。動物を含むすべての手順はUS NIHプロトコルに従い、Animal Institute Committee of the Weill Cornell Medical College of Cornell Universityによって承認された。
【０１５２】
パラフィン中の免疫蛍光（IF-P）および免疫組織化学（IHC）
パラフィン包埋した腫瘍異種移植片を切断し、脱ろうし、抗原賦活化にかけた。IF-Pのために、InvitrogenのAlexa Fluor-488結合二次抗体を用い、細胞核をDAPIで対比染色した。蛍光画像を、Axiovert 200M蛍光顕微鏡（Carl Zeiss Inc.、Thornwood、NY）.Oberkochen、Germany）を用いて得た。IHCのために、ビオチン結合二次抗体を用いた。次いで、アビジン/ビオチンペルオキシダーゼをスライドに適用した（Vector Laboratories）。ジアミノベンゾアート色素原ペルオキシダーゼ基質（Vector）で発色させ、ヘマトキシリン-エオシンで対比染色した。写真をAxioSkop II光学顕微鏡（Carl Zeiss Inc.）に取り付けたAxioCam（Carl Zeiss Inc.）カメラを用いて得た。試料を病理学者が再検討した。
【０１５３】
TUNEL
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニック末端標識、TUNEL検定（ApopTag、Chemicon、Temecula、CA）を用いて、アポトーシスDNA断片化を検出した（Gavrieli et al.、1992）。簡単に言うと、ホルマリン固定したパラフィン包埋異種移植腫瘍を脱ろうし、トリプシン（Zymed、San Francisco、CA）で前処理して、DNAを露出した。内因性ペルオキシダーゼを、3％過酸化水素（Sigma）を用いて反応停止させ、続いてTdT酵素と共に1時間インキュベートした。次いで、抗ジゴキシゲニン-ペルオキシダーゼをスライドに適用した。ジアミノベンゾアート色素原ペルオキシダーゼ基質（Vector Laboratories、Burlingame、CA）で発色させ、メチルグリーン（Fisher Scientific、Thermo Scientific、Rockford、IL）で対比染色した。写真をAxioSkop II光学顕微鏡（Carl Zeiss Inc.）に取り付けたAxioCam（Carl Zeiss Inc.）カメラを用いて得た。試料を病理学者が再検討した。
【０１５４】
初代細胞
患者の非特定化組織をWeill Cornell Medical College Review Boardの指針および承認に従って入手した。患者試料を以前に記載されたとおりに処理した（Cerchietti et al.、2010）。簡単に言うと、リンパ節生検からの単細胞懸濁液を組織の物理的破壊によって得、続いて細胞密度勾配分離を行った（Fico/Lite LymphoH、Atlanta Biologicals、Lawrenceville、Georgia）。細胞数および生存度をトリパンブルー排除により判定した。初代DLBCL細胞を96穴プレート中で培養した。細胞を、20％FBSを含み、抗生物質を補足したアドバンストRPMI培地中で48時間増殖させた。細胞を0.8μMのMI-2（Pt.2には1μM）または対照（DMSO）に四つ組で曝露した。48時間の曝露後、生存度を、トリパンブルー（Sigma）を用いて判定した。すべての試料をそれら自体の重複する対照に対して正規化した。統計学的有意性を、対応T検定を用いて計算した。
【０１５５】
引用文献
2015536990.tif 000014
2015536990.tif 000015
2015536990.tif 000016
2015536990.tif 000017
2015536990.tif 000018
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2015536990.tif 000021
【０１５６】
本明細書において言及するすべての特許および出版物は、それぞれ個々の出版物が具体的かつ個別にその全体が参照により本明細書に組み入れられると示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１５７】
用いてきた用語および表現は、説明のための用語として用いており、限定のためのものではなく、そのような用語および表現の使用において、提示し、記載する特徴またはその一部のいかなる等価物も除外する意図はないが、特許請求する発明の範囲内で様々な改変が可能であることが理解される。したがって、本発明を好ましい態様および任意の特徴によって具体的に開示してきたが、当業者であれば本明細書に開示する概念の改変および変形を行いうること、ならびにそのような改変および変形は、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【図１Ａ】
2015536990.tif 000034
【図１Ｂ】
2015536990.tif 000035
【図１Ｃ】
2015536990.tif 000036
【図１Ｄ】
2015536990.tif 000037
【図１Ｅ】
2015536990.tif 000038
【図２Ａ】
2015536990.tif 000039
【図２Ｂ】
2015536990.tif 000040
【図２Ｃ】
2015536990.tif 000041
【図２Ｄ】
2015536990.tif 000042
【図３Ａ】
2015536990.tif 000043
【図３Ｂ】
2015536990.tif 000044
【図３Ｃ】
2015536990.tif 000045
【図３Ｄ】
2015536990.tif 000046
【図３Ｅ】
2015536990.tif 000047
【図４Ａ】
2015536990.tif 000048
【図４Ｂ】
2015536990.tif 000049
【図４Ｃ】
2015536990.tif 000050
【図４Ｄ】
2015536990.tif 000051
【図４Ｅ】
2015536990.tif 000052
【図４Ｆ】
2015536990.tif 000053
【図５Ａ】
2015536990.tif 000054
【図５Ｂ】
2015536990.tif 000055
【図５Ｃ１】
2015536990.tif 000056
【図５Ｃ２】
2015536990.tif 000057
【図５Ｃ３】
2015536990.tif 000058
【図５Ｄ】
2015536990.tif 000059
【図５Ｅ】
2015536990.tif 000060
【図６Ａ】
2015536990.tif 000061
【図６Ｂ】
2015536990.tif 000062
【図６Ｃ１】
2015536990.tif 000063
【図６Ｃ２】
2015536990.tif 000064
【図７Ａ】
2015536990.tif 000065
【図７Ｂ】
2015536990.tif 000066
【図７Ｃ】
2015536990.tif 000067
【図７Ｄ】
2015536990.tif 000068
【図７Ｅ】
2015536990.tif 000069
【国際調査報告】
2015536990.tif 000070