(57)【要約】【課題】満足いく栄養特性及びフレーバープロファイルを有する新規飲料配合の開発は、飲料業界の継続的課題である。【解決手段】本発明の原理は、複数のビタミンが自然に富化される飲料のための新規組成物及び方法を提供する。本方法は、単一の工程で、飲料、例えばフルーツジュースを、少なくとも４種のビタミン、例えばビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを産生可能な微生物で発酵させることを含む。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
未発酵の対応する飲料と比較して増加したビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを含む発酵飲料組成物であって、外来のビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、又はビオチンが添加されていない組成物。
【請求項２】
前記発酵飲料が、１日当たりの推奨摂取量の約１倍〜約２０倍のビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記発酵飲料がフルーツジュースである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記フルーツジュースが、グレープフルーツ、サクランボ、ダイオウ、バナナ、パッションフルーツ、ライチ、ブドウ、リンゴ、オレンジ、マンゴー、プラム、プルーン、クランベリー、パイナップル、モモ、セイヨウナシ、アンズ、ブルーベリー、ラズベリー、イチゴ、ブラックベリー、ハックルベリー、ボイゼンベリー、クワ、グースベリー、プレイリーベリー、エルダーベリー、ローガンベリー、デューベリー、ザクロ、パパイヤ、レモン、ライム、タンジェリン、パッションフルーツ、キーウィ、カキ、スグリ、マルメロ、及びグアバからなる群から選択されるフルーツからのジュース、又はそれらの組合せである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記発酵飲料が、フルーツジュース約１質量％〜約８０質量％を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記発酵飲料が、野菜ジュース、ダイズ、麦芽、ミルク、穀類、コーヒー、又は糖／水混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
非栄養性甘味料を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記非栄養性甘味料が、ステビア（Stevia rebaudiana）抽出物、ステビオシド、アスパルテーム、サッカリン、及びスクラロースからなる群から選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
栄養性甘味料を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記栄養性甘味料が、スクロース、フルクトース、及びグルコースからなる群から選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
塩、食品グレード酸、着色料、保存料、アスコルビン酸、精力増強剤、及びビタミンからなる群から選択される添加物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
未発酵の対応する飲料と比較して増加したビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを含む発酵飲料組成物の製造方法であって、
ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを産生できる微生物で飲料を発酵させる工程を含み、
外来のビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、又はビオチンが添加されない、
方法。
【請求項１３】
前記発酵飲料が、１日当たりの推奨摂取量の約１倍〜約２０倍のビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物が細菌である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記細菌がＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属からのものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記細菌がＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記飲料から前記微生物を除去する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記発酵飲料がフルーツジュースである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記フルーツジュースが、グレープフルーツ、サクランボ、ダイオウ、バナナ、パッションフルーツ、ライチ、ブドウ、リンゴ、オレンジ、マンゴー、プラム、プルーン、クランベリー、パイナップル、モモ、セイヨウナシ、アンズ、ブルーベリー、ラズベリー、イチゴ、ブラックベリー、ハックルベリー、ボイゼンベリー、クワ、グースベリー、プレイリーベリー、エルダーベリー、ローガンベリー、デューベリー、ザクロ、パパイヤ、レモン、ライム、タンジェリン、パッションフルーツ、キーウィ、カキ、スグリ、マルメロ、及びグアバからなる群から選択されるフルーツからのジュース、又はそれらの組合せである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記発酵飲料が、フルーツジュース約１質量％〜約８０質量％を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記発酵飲料が、野菜ジュース、ダイズ、麦芽、ミルク、穀類、コーヒー、又は糖／水混合物からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
非栄養性甘味料を添加する工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記非栄養性甘味料が、ステビア（Stevia rebaudiana）抽出物、ステビオシド、アスパルテーム、サッカリン、及びスクラロースからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
栄養性甘味料を添加する工程を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
前記栄養性甘味料が、スクロース、フルクトース、及びグルコースからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
塩、食品グレード酸、着色料、保存料、アスコルビン酸、精力増強剤、及びビタミンからなる群から選択される添加物を添加する工程をさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１２に記載の方法により調製される組成物。
【請求項２８】
未発酵の対応するジュースと比較して増加したビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを含む未加工発酵ジュースであって、
ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを産生可能な微生物を更に含む、
未加工発酵ジュース。
【請求項２９】
１日当たりの推奨摂取量の少なくとも１倍に増加したビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを含む未加工発酵ジュースであって、外来のビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、又はビオチンが添加されていない、請求項２８に記載の未加工発酵ジュース。
【請求項３０】
前記細菌が、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに受託番号ＤＳＭ  ２６４５７で寄託されたＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＣＨＣＣ１５４６０株及びそれに由来する変異株からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに受託番号ＤＳＭ  ２６４５７で寄託されたＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＣＨＣＣ１５４６０株及びそれに由来する変異株からなる群から選択される乳酸菌株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１２年１０月１７日に出願された米国仮出願第６１／７１５，１３７号の利益を主張し、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【０００２】
本発明の原理は、一般に、飲料発酵の分野に関する。特に、飲料中のビタミンを自然に産生し、そのことにより栄養価を改善するための組成物及び方法が、本発明の原理により提供される。
【背景技術】
【０００３】
ビタミンは、正常な成長及び発達のため、並びに細胞、組織、及び器官の健全な維持のために必須である。驚くべきことではないが、ビタミン欠乏は、数多くの生理障害と相関する。適量のこれらの必須栄養素が毎日得られることを確実にするため、栄養補助食品が使用されることが多い。変化する市場需要を満たすため、新規の改善した飲料配合が所望される。特に、自然由来の代替栄養特性、例えば増加したビタミン含有量を有する飲料には、相当の市場需要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、満足いく栄養特性及びフレーバープロファイルを有する新規飲料配合の開発は、飲料業界の継続的課題である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様において、本発明の原理は、発酵飲料組成物を提供する。一実施形態において、発酵飲料は、未発酵の対応する飲料と比較して増加したビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを含む。また別の実施形態において、外来のビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、又はビオチンが、発酵飲料に添加されていない。
【０００６】
ある実施形態において、発酵飲料は、１日当たりの推奨摂取量（RDI）の約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍から、約２０倍までのビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを含む。いくつかの実施形態において、ビタミンの任意の組合せが、任意の上の量だけ増加しうる。４種のビタミンの少なくともそれぞれが、未発酵の対応飲料と比較した場合、検出可能な量で増加する。
【０００７】
また別の実施形態において、発酵飲料はフルーツジュースである。ある実施形態において、フルーツジュースは、グレープフルーツ、サクランボ、ダイオウ、バナナ、パッションフルーツ、ライチ、ブドウ、リンゴ、オレンジ、マンゴー、プラム、プルーン、クランベリー、パイナップル、モモ、セイヨウナシ、アンズ、ブルーベリー、ラズベリー、イチゴ、ブラックベリー、ハックルベリー、ボイゼンベリー、クワ、グースベリー、プレイリーベリー（prairie berry）、エルダーベリー、ローガンベリー、デューベリー、ザクロ、パパイヤ、レモン、ライム、タンジェリン、パッションフルーツ、キーウィ、カキ、スグリ、マルメロ、及びグアバからなる群から選択される少なくとも１つのジュース、又はそれらの組合せである。追加又は代替のフルーツジュースが含まれてもよいことが理解されるべきである。
【０００８】
一実施形態において、発酵飲料は、フルーツジュースを約１質量％、約２質量％、約３質量％、約５質量％、約１０質量％、約１５質量％、約２０質量％、約２５質量％、約３０質量％、約３５質量％、約４０質量％、約５０質量％、約６０質量％、約６５質量％、約７０質量％、約７５質量％、又は約８０質量％以上含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、発酵飲料は、野菜ジュース、ダイズ、麦芽、ミルク、穀類、コーヒー、又は糖／水混合物からなる群から選択される。
【００１０】
ある実施形態において、発酵飲料は、非栄養性甘味料を含む。いくつかの実施形態において、非栄養性甘味料は、ステビア（Stevia rebaudiana）抽出物、ステビオシド、アスパルテーム、サッカリン、及びスクラロースからなる群から選択される少なくとも１つを含む。一実施形態において、非栄養性甘味料は、レバウジオシドＡ（Reb A）である。また別の実施形態において、発酵飲料は栄養性甘味料を含む。いくつかの実施形態において、栄養性甘味料は、スクロース、フルクトース、及びグルコースからなる群から選択される少なくとも１つを含む。ある実施形態において、発酵飲料は、塩、食品グレード酸、着色料、保存料、アスコルビン酸、精力増強剤、及びビタミンからなる群から選択される添加物を含む。
【００１１】
別の態様において、本発明の原理は、発酵飲料の製造方法を提供する。一実施形態において、本方法は、未発酵の対応する飲料と比較して、ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを増加させる。いくつかの実施形態において、本方法は、ビタミンを産生できる微生物で飲料を発酵させることを含む。一実施形態において、微生物は、ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを産生する。本方法は、未発酵の対応する飲料と比較した場合、増加したビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを有する発酵飲料をもたらす。また別の実施形態において、外来のビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンが添加されない。
【００１２】
ある実施形態において、本方法は、ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチン含有量を、１日当たりの推奨摂取量（RDI）の約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍から、約２０倍まで増加させることを含む。ビタミンは、互いと比較して同様の又は異なる量だけ増加しうる。４種のビタミンの少なくともそれぞれが、未発酵の対応飲料と比較した場合、検出可能な量で増加する。実施形態において、ビタミンＢ１２は、１日当たりの推奨摂取量（RDI）の１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍から、約２０倍まで増加し、ビタミンＫは、１日当たりの推奨摂取量（RDI）の１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍から、約２０倍まで増加し、葉酸は、１日当たりの推奨摂取量（RDI）の１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍から、約２０倍まで増加し、ビオチンは、１日当たりの推奨摂取量（RDI）の１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍から、約２０倍まで増加するか、又はそれらの組合せである。
【００１３】
一実施形態において、本方法は、細菌で飲料を発酵させる工程を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌で発酵飲料を製造することを含む。また別の実施形態において、本方法は、細菌Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉで発酵飲料を製造することを含む。一実施形態において、本開示は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに受託番号ＤＳＭ  ２６４５７で寄託されたＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＣＨＣＣ１５４６０株及びそれに由来する変異株からなる群から選択される乳酸菌株を提供する。
【００１４】
特定の実施形態において、本方法は、飲料から微生物を除去する工程を含む。ある実施形態において、本方法は、発酵後に飲料から微生物を除去する工程を含む。
【００１５】
また別の実施形態において、本方法は、フルーツジュースを含む発酵飲料を製造することを含む。ある実施形態において、本方法は、グレープフルーツ、サクランボ、ダイオウ、バナナ、パッションフルーツ、ライチ、ブドウ、リンゴ、オレンジ、マンゴー、プラム、プルーン、クランベリー、パイナップル、モモ、セイヨウナシ、アンズ、ブルーベリー、ラズベリー、イチゴ、ブラックベリー、ハックルベリー、ボイゼンベリー、クワ、グースベリー、プレイリーベリー、エルダーベリー、ローガンベリー、デューベリー、ザクロ、パパイヤ、レモン、ライム、タンジェリン、パッションフルーツ、キーウィ、カキ、スグリ、マルメロ、及びグアバの少なくとも１つのフルーツジュース、又はそれらの組合せを含む発酵飲料を製造することを含む。
【００１６】
一実施形態において、本方法は、フルーツジュース約１質量％、約２質量％、約３質量％、約５質量％、約１０質量％、約１５質量％、約２０質量％、約２５質量％、約３０質量％、約３５質量％、約４０質量％、約５０質量％、約６０質量％、約６５質量％、約７０質量％、約７５質量％、又は約８０質量％を含む発酵飲料を製造することを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、本方法は、野菜ジュース、ダイズ、麦芽、ミルク、穀類、コーヒー、又は糖／水混合物の少なくとも１つを含む発酵飲料を製造することを含む。
【００１８】
ある実施形態において、本方法は、非栄養性甘味料を添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ステビア（Stevia rebaudiana）抽出物、ステビオシド、アスパルテーム、サッカリン、及びスクラロースからなる群から選択される非栄養性甘味料を添加することを含む。一実施形態において、本方法は、非栄養性甘味料レバウジオシドＡ（Reb A）を添加することを含む。本発明のまた別の実施形態において、本方法は、栄養性甘味料を添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、スクロース、フルクトース、及びグルコースからなる群から選択される非栄養性甘味料を添加することを含む。ある実施形態において、本方法は、塩、食品グレード酸、着色料、保存料、アスコルビン酸、精力増強剤、及びビタミンからなる群から選択される添加物を添加することを含む。
【００１９】
また別の態様において、本発明の原理は、未発酵の対応する飲料と比較して、ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを増加させる工程を含む方法により調製される発酵飲料を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の原理は、ビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを産生できる微生物で飲料を発酵させる工程を含む方法により調製される発酵飲料を提供する。特定の実施形態において、本発明の原理は、外来のビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを添加することなしに、飲料のビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチン含有量を増加させる工程を含む方法により調製される発酵飲料を提供する。
【００２０】
さらなる態様において、本発明の原理は、未加工発酵ジュースを提供する。一実施形態において、未加工発酵ジュースは、未発酵のジュース対応物と比較して増加したビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを含む。また別の実施形態において、未加工発酵ジュースは、増加したビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを産生できる微生物を含む。ある実施形態において、未加工発酵ジュースは、１日当たりの推奨摂取量（RDI）の少なくとも１倍のビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを含む。ある実施形態において、未加工発酵ジュースは、添加される外来のビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを含まない。
【００２１】
本発明の原理のこれら及び他の特徴、態様、及び利点は、以下の説明及び特許請求の範囲を参照することにより、よりよく理解されるものと考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の原理は、少なくとも部分的に、ビタミン産生微生物で飲料を発酵させることが、ビタミンの濃度を自然に、そして顕著に増加させることができるという驚くべき発見に基づく。結果として飲料は、ビタミンが大きく富化され、ほとんどフレーバーの変化がなく、甘さ及び口当たりの少なくとも部分的な維持を示す。したがって、本発明の原理は、未発酵の対応する同等の飲料と比較して少なくとも増加したビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチン含有量を有する発酵飲料組成物を提供する。
【００２３】
本明細書において使用される「発酵飲料」は、一般に、微生物により使用される基質として糖を含有する溶液若しくは分散液に由来するか、或いはそれらから製造される、溶液又は分散液である。かかる発酵飲料の典型的な例は、フルーツジュースであり得る。代替的実施形態において、発酵飲料は、グレープフルーツジュース、サクランボジュース、ダイオウジュース、バナナジュース、パッションフルーツジュース、ライチジュース、ブドウジュース、リンゴジュース、オレンジジュース、マンゴージュース、プラムジュース、プルーンジュース、クランベリージュース、パイナップルジュース、モモジュース、セイヨウナシジュース、アンズジュース、ブルーベリージュース、ラズベリージュース、イチゴジュース、ブラックベリージュース、ハックルベリージュース、ボイゼンベリージュース、クワジュース、グースベリージュース、プレイリーベリージュース、エルダーベリージュース、ローガンベリージュース、デューベリージュース、ザクロジュース、パパイヤジュース、レモンジュース、ライムジュース、タンジェリンジュース、パッションフルーツジュース、キーウィジュース、カキジュース、スグリジュース、マルメロジュース、及びグアバジュース、又はそれらの組合せから選択される。
【００２４】
当業者により認められているように、水は、本明細書に開示の飲料における基本的成分であり、典型的には、残りの成分が溶解、乳化、懸濁又は分散される主要な液体部分である。便宜上、いくつかの成分が本明細書において、ある場合には、飲料製品配合に添加される成分の元の形態に言及することにより記載されることを、当業者は理解すると考えられる。かかる元の形態は、成分が完成飲料製品中に見出される形態と異なっていてもよい。例えば、オレンジジュースは、一般に、新鮮な果実からの抽出により、乾燥及びそれに続く乾燥ジュースの再構成により、又はジュースの濃縮及びそれに続く濃縮物への水の添加により製造される。発酵される飲料は、例えば、新鮮なものであり得、果肉を含有するものであり得、又は遠心分離若しくはろ過により果肉が除去されたものであり得る。
【００２５】
本明細書において使用される「ビタミン」は、正常な成長及び栄養のために必須であり、食事において一定限度の量で必要とされる任意の一群の有機化合物を指す。「ビタミン」という用語は、栄養素のミネラル、必須脂肪酸、又は必須アミノ酸を含まない。ビタミンは、それらの構造によってではなく、それらの生物学的活性により分類されるので、それぞれの「ビタミン」は総称であり、そのすべてがある特定のビタミンと関連づけられる生物学的活性を示す、多くの化合物を指す。総称「ビタミンＢ１２」は、例えば、化合物シアノコバラミン、ヒドロキソコバラミン、アデノシルコバラミン、又はメチルコバラミンを含む。総称「ビタミンＫ」は、２−メチル−１，４−ナフトキノン誘導体、例えばフィロキノン又はメナキノンを含む。総称「葉酸」（ビタミンＢ９としても知られている）は、それらの酸化状態が異なる多数の葉酸誘導体、例えばプテロイル−Ｌ−グルタミン酸、プテロイル−Ｌ−グルタメート、又はプテロイルモノグルタミン酸を含む。本明細書において使用される「ビオチン」（ＣＡＳ登録番号５８−８５−５；ビタミンＨ、バイオエピダーム（bioepiderm）、及び補酵素Ｒとしても知られている）は、総称ビタミンＢ７を指し、テトラヒドロチオフェン環と融合されたテトラヒドロイミジザロン環（tetrahydroimidizalone ring）から構成される。
【００２６】
本明細書において使用される「増加したビタミン」は、同量の標準バージョン、例えば未発酵バージョン、例えば本方法による発酵前の出発原料と比較して、ビタミンが増強された飲料を指す。いくつかの実施形態において、発酵飲料は、１日当たりの推奨摂取量（RDI）の約１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍から、約２０倍までのビタミンを含む。ビタミンは、互いと比較して同様の又は異なる量で増加しうる。４種のビタミンの少なくともそれぞれが、未発酵の対応飲料と比較した場合、検出可能な量で増加する。
【００２７】
実施形態において、ビタミンＢ１２は、１日当たりの推奨摂取量（RDI）の１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、又は約２０倍にまで増加し、ビタミンＫは、１日当たりの推奨摂取量（RDI）の１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、又は約２０倍にまで増加し、葉酸は、１日当たりの推奨摂取量（RDI）の１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、又は約２０倍にまで増加し、ビオチンは、１日当たりの推奨摂取量（RDI）の１倍、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、約９倍、約１０倍、約１５倍、又は約２０倍にまで増加するか、或いはそれらの組合せである。
【００２８】
本明細書において使用される「未発酵の対応する飲料」は、本発明の原理による発酵プロセスを経ていない飲料のバージョン又は飲料である。
【００２９】
本明細書において使用される「１日当たりの推奨摂取量」（RDI）は、米国学術研究会議の食品栄養委員会により、米国の各世代及び性別群における健常者の９７〜９８％の必要量を満たすのに十分であるとみなされる、１日当たりの栄養摂取レベルを指す。
【００３０】
本明細書において使用される「発酵」は、より単純な有機化合物をもたらす、微生物による有機物の分解である。発酵が一般に、主に嫌気条件下で生じる一方で、この用語が、厳密な嫌気条件に限定されることは意図されない。なぜなら、発酵は、酸素の存在下でも生じるからである。
【００３１】
ビタミンに関する「外来の」は、組成物に添加されるビタミンを指す。ビタミンは、個別的、選択的、及び／又は人工的に、組成物に補足されうる。ビタミンに関する「内在の」は、食品又は飲料中に自然に生じるビタミンを指す。
【００３２】
本明細書において使用される「非栄養性甘味料」は、典型的な使用量で有意なカロリー量を提供しないもの、すなわち、糖１０Ｂｒｉｘの甘味当量を達成するために、飲料８オンス分当たり５カロリー未満を付与するものである。様々な実施形態において、発酵飲料組成物は、さらに、ステビア（Stevia rebaudiana）抽出物、ステビオシド、アスパルテーム、サッカリン、及びスクラロースから選択される非栄養性甘味料を含む。一実施形態において、発酵飲料組成物は、非栄養性甘味料レバウジオシドＡ（Reb A）を含む。
【００３３】
本明細書において使用される「栄養性甘味料」は、典型的な使用量で有意なカロリー量を提供できるもの、すなわち、糖１０Ｂｒｉｘの甘味当量を達成するために、飲料８オンス分当たり５カロリー超を付与するものである。様々な実施形態において、発酵飲料組成物は、さらに、スクロース、フルクトース、グルコース、及び高フルクトースコーンシロップから選択される栄養性甘味料を含む。
【００３４】
本明細書において使用されるＢｒｉｘ度（°Bx）は、水溶液の糖含有量である。１Ｂｒｉｘ度は、溶液１００ｇ中にスクロース１ｇであり、質量パーセント（% w/w）で溶液の濃度を表す。
【００３５】
飲料及び他の飲料製品は、任意の数多くの異なった特定の配合又は組成を有しうることが理解されるべきである。一般に飲料は、典型的には、少なくとも水、酸味料、及び香味料を含む。本発明の原理による飲料製品は、飲料、すなわち即時飲用可能な配合物、飲料濃縮物等を含む。少なくとも実施形態においての使用に好適なジュースには、例えば、フルーツ、野菜、及びベリージュースが含まれる。ジュースを用いる飲料において、ジュースは、例えば、飲料の約０．２質量％、約０．５質量％、約１質量％、約２質量％、約３質量％、約５質量％、約１０質量％、約１５質量％、約２０質量％、約２５質量％、約３０質量％、約３５質量％、約４０質量％、約５０質量％、約６０質量％、約７０質量％から、約８０質量％までのレベルで使用できる。
【００３６】
したがって、本発明の原理は、未発酵の対応する飲料と比較して少なくとも増加したビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを有する発酵飲料を提供する。味覚プロファイルが甘味料の添加により改変されてもよい飲料が提供されうる。様々な飲料、例えばフルーツジュースは限られた数のビタミンを含有し、それゆえこれが健康な食事を維持しようとする消費者の間で、あまり好ましくない選択肢となる。
【００３７】
本発明の発酵飲料組成物を調製するため、標準的な発酵方法を使用できる。飲料発酵の例は、米国特許第４２１０７２０号、米国特許第４，５４４，６３３号、米国特許第４，８６７，９９２号、米国特許第７，４２７，３９７号、米国公開第２００５０１８０９６３号、米国公開第２００９０２６９４３８号、ＥＰ００８９７２０、ＥＰ０１６６２３８、ＥＰ１６２５７９４、ＥＰ１６２５７９５、国際公開ＷＯ２００４００１０２２、及び国際公開ＷＯ２０１２／０３６５７５に見出すことができ、それらのそれぞれが、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。発酵微生物の増殖は好気条件を利用できるので、増殖容器（複数可）内で微生物が十分な酸素を利用可能なようにすることができる。発酵飲料配合物中に空気又は酸素が継続的に導入されるよう、撹拌及び／又は再循環が適切に用いられてもよい。発酵微生物は嫌気条件下でも繁殖でき、その際酸素は、既知の方法、例えば窒素ガスでのスパージングを使用して繁殖環境から除去される。したがって、本発明の原理は、未発酵の対応する飲料と比較して少なくとも増加したビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンを有する発酵飲料を製造するため、ビタミンを産生できる微生物、例えば細菌とともに飲料をインキュベートすることを含む、発酵飲料の製造方法を提供する。
【００３８】
ビタミンを産生できる少なくとも１種の微生物を使用できる。発酵によりもたらされる単一のビタミンの富化は、当技術分野において知られている。しかしながら、複数の生物及び複数の発酵工程を使用する問題に対処するため、本発明の原理は、単一の微生物での単一の発酵工程により、少なくとも４種のビタミンの飲料中におけるビタミン含有量を自然に増加させるビタミン産生微生物を利用する。
【００３９】
本発明の原理による用途が見出される多くの既知のビタミン産生微生物が存在し、それらのほとんどが細菌、例えばＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属、及びＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属であるが、これに限定されない。一実施形態において、ビタミン産生生物は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉである。一実施形態において、菌株は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＣＨ１５４６０又はその変異株である。この菌株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに受託番号ＤＳＭ  ２６４５７で寄託された。
【００４０】
本文脈において、「変異株」という用語は、例えば遺伝工学、放射線及び／又は化学的処置により、本発明の菌株（又は母菌株）に由来する又は由来しうる菌株として理解されるべきである。変異株はまた、自然発生変異株でもあり得る。変異株は、機能的に対応する変異株、例えば母菌株と実質的に同じ、又は改善された特性（例えば、Ｂ１２、ビタミンＫ、葉酸及びビオチン等のビタミンの産生に関して）を有する変異株であることが好ましい。かかる変異株は、本発明の一部である。とりわけ、「変異株」という用語は、自然発生変異株或いは本発明の菌株に、化学的変異原、例えばエタンメタンスルホネート（EMS）若しくはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトログアニジン（NTG）、又はＵＶ光線での処置を含む任意の従来使用されてきた変異誘発処置を施すことにより得られる菌株を指す。変異株は、複数の変異誘発処置（単一の処置は、１つの変異誘発工程とそれに続くスクリーニング／選択工程として理解されるべきである）を施されていてもよいが、２０以下、又は１０以下、又は５以下の処置（又はスクリーニング／選択工程）が実施されることが現在好ましい。現在好ましい変異株において、母菌株と比較して、細菌ゲノムのヌクレオチドの１％未満、０．１％未満、０．０１％未満、０．００１％未満、若しくはさらに０．０００１％未満が、別のヌクレオチドに置換されているか、又は欠失している。
【００４１】
当技術分野において慣習的であるように、微生物、例えばこれに限定されないが、細菌Ｐ．  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉが、培地（例えば、フルーツジュース等の未発酵飲料）に添加され、そのことにより微生物が炭素源をアルコール及び他の分子に変換するときに、発酵は達成される。本明細書に記載されているように、培養物中のビタミンＢ１２及び葉酸の産生は、好気条件下で研究され、例えばＨｕｇｅｎｓｃｈｍｉｄｔら．及びＳｙｂｅｓｍａらにおいてそれぞれ論じられており、これらは本明細書に参照により組み込まれる。
【００４２】
ビタミンを産生できる細菌は、典型的には、約３．０〜７．０のｐＨ範囲で繁殖及び発酵する。発酵は、自然発生的に進行するままにすることができ、又は以前に発酵させておいた培養物での接種により開始でき、この場合、未発酵飲料は、当技術分野において知られている細菌集団で接種されてもよく、例えばジュース約１０６〜約１０７ｃｆｕ／ｍｌを含んでいてもよい。インキュベーションは、通気をし続けて細菌集団の繁殖を促進することができる。発酵の温度は、通常は２０℃〜４０℃であり、発酵プロセスの持続期間は、例えば、数時間から１若しくは２若しくは３若しくは４若しくは５若しくは６若しくは７若しくは８日間超又はそれを超える日数から数週間に及んでもよい。
【００４３】
したがって発酵後、本発明の原理は、少なくともビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンについて増加したビタミン含有量を有する発酵飲料組成物を提供し、これは、甘味を維持しながら栄養性の改善した飲料を提供する。例えば、１日当たりの推奨摂取量（RDI）の１倍超のビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチン含有量を有するフルーツジュースを提供できる。代替的実施形態において、本発明の原理は、自然に富化された濃度の少なくともビタミンＢ１２、ビタミンＫ、葉酸、ビオチン、及び、いくつかの実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又はそれを超える追加のビタミンを有する発酵飲料を製造するために使用できる。いくつかの実施形態において、本発明の原理は、炭酸及び非炭酸ソフトドリンク、ファウンテン飲料、冷凍の即時飲用可能な飲料、コーヒー飲料、茶飲料、乳飲料、粉末ソフトドリンク、また液体濃縮物、フレーバーウォーター、エンハンストウォーター（enhanced waters）、フルーツジュース及びフルーツジュースフレーバードリンク、スポーツドリンク、並びにアルコール製品における増加したビタミン含有量を提供するために使用できる。当業者により認められているように、任意のこれらの飲料が、本明細書における方法により発酵される出発原料であり得、又は発酵飲料を添加できる飲料である。
【００４４】
一実施形態において、発酵飲料組成物は「未加工発酵飲料」である。本明細書において使用される「未加工」は、加工又は精製がされていないことを意味する。本明細書に開示される飲料製品の自然実施形態は、人工又は合成物を何も含有しない点において自然である。したがって、本明細書において使用される「自然」飲料組成物は、以下の指針に従い定義される。すなわち、自然成分のための未加工原料は、自然界に存在又は由来する。発酵及び酵素を伴う生物学的合成が用いられうるが、化学試薬での合成は利用されない。人工着色料、保存料、及びフレーバーは、自然成分とはみなされない。
【００４５】
発酵後に、１つ又は複数の発酵後加工工程、例えば低温殺菌、ろ過、遠心分離、又は均質化を使用できる。例えば、複数の低温殺菌法が一般に使用される（例えば、本明細書に参照により組み込まれる米国特許第４，８３０，８６２号及び同第４，９２５，６８６号を参照のこと）。一般的な方法の１つは、ジュースをプレート式熱交換器に隣接するチューブに通し、そのことでジュースは加熱表面に直接接触することなく加熱される。別の方法は、入ってくる未低温殺菌ジュースを予熱するために、高温の低温殺菌されたジュースを使用する。予熱されたジュースは、蒸気又は熱水で低温殺菌温度までさらに加熱される。典型的には、約３０秒間で１８５〜２０１．２°Ｆ（８５〜９４℃）の温度に到達することが、微生物数を減少させ、個々の容器に充填するためのジュースを調製するために適当である。或いは、典型的には、発酵飲料中に存在する微生物の少なくとも約２０％が、１つ又は複数の分離器を使用して除去される。発酵飲料からの微生物含有残分を除去するために用いられてもよい分離器の例には、沈降器（sedimenters）、デカンター、遠心分離機、液体サイクロン、篩、フィルター、膜及びプレス（presses）が含まれる。したがって、一実施形態において、本方法は、ビタミンを産生できる微生物を除去する加工後工程を含む。いくつかの実施形態において、微生物は、発酵中に発酵反応から除去できる一方で、他の実施形態において、微生物は、発酵の完了後に除去される。
【００４６】
成分は、少なくとも物理的処理、発酵、及び酵素分解を含む、ある特定の技術を通じて加工又は精製できる。適切な加工及び精製技術には、少なくとも、吸収、吸着、凝集、遠心分離、チョッピング、クッキング（ベーキング、フライング（flying）、ボイリング、ロースティング）、冷却、切断、クロマトグラフィー、コーティング、結晶化、消化、乾燥（スプレー、凍結乾燥、真空）、蒸発、蒸留、電気泳動、乳化、被包、抽出、エクストルージョン（extrusion）、ろ過、発酵、摩砕、温浸、冷浸、微生物学的（レンネット、酵素）、混合、ピーリング、浸出、冷蔵／冷凍、圧搾、浸漬、洗浄、加熱、混合、イオン交換、凍結乾燥、浸透、沈殿、塩析、昇華、超音波処理、濃縮、フロキュレーション、均質化、再構成、酵素分解（自然界に見出される酵素を使用）が含まれる。加工助剤（清澄剤、触媒、凝集剤、ろ過助剤、及び結晶化抑制剤等を含む、食品成分の魅力又は有用性を高めるために製造助剤として使用される物質として現在は定義される（連邦規則法典第２１巻§１７０．３（ｏ）（２４）を参照のこと））は、付随的添加物であり、適切に除去される場合に使用できる。
【００４７】
人工甘味料とも呼ばれる非栄養性甘味料、又は高強度甘味料は、スクロースの甘味の何倍もの甘味を示す作用物質である。高強度甘味料の例には、サッカリン、シクラメート、アスパルテーム、モナチン、アリテーム、アセスルファムカリウム、スクラロース、ソーマチン、ステビオシド、グリチルリチン、スクラロース、及びネオテームが含まれる。したがって、飲料、例えばフルーツジュース、スポーツドリンク、及びソフトドリンクは、飲料の原料成分中に自然には生じえない、それゆえ一般に多くの消費者にとって望ましくないとみなされる、非栄養性甘味料で甘味づけされる。これに対し、栄養性甘味料は、一般に、自然に生じる物質を指す。栄養性甘味料の例には、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、マルトデキストリン、トレハロース、フラクトオリゴ糖、及びトリオースが含まれる。飲料中の非栄養性甘味料の普及及び人気により、これらの非栄養性甘味料を含有する飲料の味覚プロファイルを改変するための複数の方法が記述されてきた。
【００４８】
本明細書において使用される「添加物」は、食品添加物、又は、フレーバーを保存若しくはその食味及び外観を増強するために食品に添加される物質を意味する。いくつかの実施形態において、発酵飲料組成物は、塩、食品グレード酸、着色料、保存料、アスコルビン酸、精力増強剤、及びビタミンから選択される添加物をさらに含む。さらに、一般に、香味料、電解質、味覚物質（tastents）、マスキング剤、調味料、炭酸、又はカフェインを含む他の成分を、特定の飲料実施形態の配合物に添加することは、選択肢の１つである。
【００４９】
製造後は、発酵飲料は、それ自体飲料としての用途が見出されるか、又は１種又は複数の他の飲料と混合できる。二酸化炭素を、本明細書に開示の飲料のある実施形態に発泡性を提供するために使用できる。当技術分野において知られている、飲料を炭酸化するための任意の技術又は炭酸化器具が用いられうる。典型的には熱処理炭水化物から得られるカラメル着色に由来する暗褐色を示すコーラ飲料はまた、本発明の原理によるビタミン含有量増加方法から利益を得ることができる。
【００５０】
本明細書に記載の定義及び方法は、本開示をより良く定義し、本開示を実施する当業者をガイドするために提供される。特に指定しない限り、用語は、関連分野の業者による従来の用法によるものと理解されるべきである。
【００５１】
いくつかの実施形態において、本開示のある実施形態を記述及び特許請求するために使用される、成分の量、特性、例えば分子量、反応条件等を表示する数は、いくつかの例において、「約」という用語により修飾されているものとして理解されるべきである。いくつかの実施形態において、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために用いられている装置又は方法の平均の標準偏差を含むことを示すために使用される。いくつかの実施形態において、本明細書及び添付の請求項に記載の数値的パラメーターは、特定の実施形態により得ようとする所望の特性に応じて変動しうる近似値である。いくつかの実施形態において、数値的パラメーターは、報告された有効桁数を考慮して、通常の丸め手法を適用することにより解釈されるべきである。本開示のいくつかの実施形態の広範な範囲を記載する数値的範囲及びパラメーターは近似値であるとはいえ、具体的な実施例に記載の数値は、実行可能な範囲で正確に報告される。本開示のいくつかの実施形態に提示の数値は、それらのそれぞれの試験測定値に見出される標準偏差から必然的に生じる一定の誤差を含有していてもよい。本明細書における値の範囲の記載は、その範囲内のそれぞれ別個の値を個々に指定することの省略法としてのみ働くことが意図されている。本明細書において特に指定しない限り、それぞれの個々の値は、本明細書において個々に記載されているかのごとく、本明細書に組み込まれる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、特定の実施形態を記述する文脈（とりわけ、以下の請求項のいくつかの文脈）において使用される、「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語並びに同様の言及は、特に指定しない限り、単数と複数の両方を包含するものと解釈できる。いくつかの実施形態において、請求項も含め、本明細書において使用される「又は」という用語は、代替的選択肢のみを指すか、又は代替的選択肢が相互に排他的であると明示的に指定しない限り、「及び／又は」を意味するものとして使用される。
【００５３】
「含む（comprise）」、「有する（have）」及び「含む（include）」という用語は、範囲の限定されない結合動詞である。これら動詞の１つ又は複数の任意の変化形又は時制、例えば「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」、「有する（has）」、「有している（having）」、「含む（includes）」及び「含んでいる（including）」もまた、範囲が限定されない。例えば、１つ又は複数の工程を「含む（comprises）」、「有する（has）」又は「含む（includes）」任意の方法は、それらの１つ又は複数の工程のみを有することに限定されず、他の挙げられていない工程も包含しうる。同様に、１つ又は複数の特徴を「含む（comprises）」、「有する（has）」又は「含む（includes）」任意の組成物又は装置は、それらの１つ又は複数の特徴のみを有することに限定されず、他の挙げられていない特徴を包含しうる。
【００５４】
本明細書に記載のすべての方法は、本明細書において特に指定しない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施できる。本明細書におけるある実施形態に関して提供されるあらゆる例、又は例示的用語（例えば、「例えば（such as）」）の使用は、ただ本開示をよりよく例示することだけが意図されており、特に請求項に記載されない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる文言も、請求項に記載されていない任意の要素が本開示の実施に必須であることを示すと解釈されるべきではない。
【００５５】
本明細書に開示されている、本開示の代替的要素又は実施形態のグループ分けは、限定として解釈されるべきではない。各群の構成要素は、個々に、又は、その群の他の構成要素若しくは本明細書に見出される他の要素との任意の組合せで、言及され、請求項に記載されうる。ある群の１つ又は複数の構成要素は、便宜性又は特許性を理由として、ある群に含まれるか、又はそこから削除されることがあり得る。
【００５６】
本開示を詳細に記述したことで、修正、変形、及び等価な実施形態が、添付の特許請求の範囲において定義される本開示の範囲を逸脱することなく可能であることは明らかであると考えられる。さらに、本開示におけるすべての実施例が、非限定的実施例として提供されることが認められるべきである。
【実施例】
【００５７】
本開示をさらに例示するため、以下の非限定的実施例を提供する。以下の実施例に開示の手法は、本発明者らが本開示の実施においてよく機能すると見出したアプローチを代表するものであり、したがって、その実施様式の例を構成するとみなされうることが、当業者により認められるはずである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態において多くの変更がなされ、それでいて同様又は類似の結果を得ることができることを認めるはずである。
【００５８】
実施例１
菌株
ビタミン富化発酵のために使用された培養株は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＣＨ１５４６０であった。この菌株は、Ｃｈｒ  Ｈａｎｓｅｎ培養株コレクションから得られる８種の他のＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属から選択された。この菌株は、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎに受託番号ＤＳＭ  ２６４５７で寄託された。この菌株の変異株もまた、本明細書に開示の方法において用途が見出される。
【００５９】
ジュース発酵
フルーツジュースに、当技術分野において知られているとおり富栄養培養培地（ＭＲＳ培地）で繁殖させたＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ培養株１％又は１０％（v/v）のいずれかを接種することにより、初期フルーツジュース発酵を実施した。この培養物を最初に遠心分離し、それぞれのジュース中に再懸濁させ、富栄養培地がジュース発酵物に引き継がれることを回避した。ジュース発酵物を３０℃で５〜８日間インキュベートし、ビタミンの分析のため、試料を定期的に回収した。これらの試料を１０分間８０℃で加熱し、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属のさらなる繁殖を停止させ、分析前に４℃で貯蔵した。すべてのフルーツジュースは、市販の１００％低温殺菌ジュースであった。
【００６０】
ビタミンの分析
ビタミンＢ１２、葉酸及びビオチン含有量が、ドイツ、ベルリンのＳＧＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓの民間研究所により、特定の微生物学的アッセイを使用して常法で測定された。ビタミンＫ２含有量をＧＣ−ＭＳにより分析した。
【００６１】
実施例２
Ｐ．  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ（菌株CHCC15460及び菌株PA）での発酵によるビタミンＢ１２産生をオレンジジュース中で評価した（表１）。細菌のスターター培養株での接種後５〜８日で、発酵オレンジジュース試料を、ビタミン含有量、ｐＨ、及びフレーバープロファイルについて分析した。試料を好気的又は嫌気的に培養した。好気培養物は、追加の酸素でスパージングされるか、又は周囲条件下で低量の培養物を振盪することにより通気された。嫌気培養物は、窒素ガスでスパージングされるか、又は振盪せずに満たされたフラスコ内で繁殖させた。発酵後試料は、フレーバー及びｐＨにほとんど又は全く変化がなく、ビタミンＢ１２含有量の有意な増加を示した。さらに、好気的に繁殖させた試料は、有意に増加したビタミン産生を示さなかった。
【００６２】
実施例３
Ｐ．  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ（菌株CHCC15460及び菌株PA）での発酵によるビタミンＢ１２産生をバナナジュース中で評価した（表２）。細菌のスターター培養株の通常量（１％  ｖ／ｖ）又は多量（１０％  ｖ／ｖ）での接種後５〜８日で、発酵バナナジュース試料を、ビタミン含有量、ｐＨ、及びフレーバープロファイルについて分析した。試料を好気的又は嫌気的に培養した。好気培養物は、追加の酸素でスパージングされるか、又は周囲条件下で低量の培養物を振盪することにより通気された。嫌気培養物は、窒素ガスでスパージングされるか、又は振盪せずに満たされたフラスコ内で繁殖させた。菌株ＣＨＣＣ１５４６０は、菌株ＰＡよりも有意に多くのビタミンＢ１２を産生し、フレーバー若しくはｐＨにほとんど又は全く変化をもたらさなかった。菌株ＣＨＣＣ１５４６０は、発酵が酸素を伴うか伴わないかで変動する応答を示し、スターター培養株の多量の種菌が試料発酵のために使用されたとき、ビタミンＢ１２産生の２〜５倍の増加を示した。これに対し、菌株ＰＡは、全体に低量のビタミンＢ１２を産生し、ｐＨのわずかな低下をもたらした。さらに、菌株ＰＡは、発酵試料が好気的に培養されたとき、ビタミンＢ１２産生の有意な増加を示した。しかしながら、菌株ＣＨＣＣ１５４６０とは異なり、菌株ＰＡスターター培養株の多量の種菌で発酵させた試料は、フレーバープロファイルの望ましくない変化を示した。
【００６３】
実施例４
Ｐ．  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ（菌株CHCC15460及び菌株PA）での発酵によるビタミンＢ１２産生をトマトジュース中で評価した（表３）。細菌のスターター培養株での接種後５〜８日で、発酵トマトジュース試料を、ビタミン含有量、ｐＨ、及びフレーバープロファイルについて分析した。試料を好気的又は嫌気的に培養した。好気培養物は、追加の酸素でスパージングされるか、又は周囲条件下で低量の培養物を振盪することにより通気された。嫌気培養物は、窒素ガスでスパージングされるか、又は振盪せずに満たされたフラスコ内で繁殖させた。菌株ＣＨＣＣ１５４６０は、菌株ＰＡよりも有意に多くのビタミンＢ１２を産生し、フレーバーにほとんど又は全く変化をもたらさず、ｐＨのほんのわずかな増加をもたらした。これに対し、菌株ＰＡは、全体に有意により低量のビタミンＢ１２を産生し、ｐＨのわずかな低下をもたらした。さらに、発酵試料が酸素を伴って培養されたとき、菌株ＣＨＣＣ１５４６０はより多くのビタミンＢ１２を産生した一方で、菌株ＰＡは同じ条件下でより少ないビタミンＢ１２を産生した。最後に、菌株ＰＡで発酵された試料は、甘く、心地よいフレーバーをもたらした。
【００６４】
実施例５
Ｐ．  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ（菌株CHCC15460）での発酵によるビタミン産生を様々なフルーツジュース中で評価した（表４）。細菌のスターター培養株での接種後５〜８日で、発酵フルーツジュース試料を、ビタミン含有量及びｐＨについて分析した。オレンジ、バナナ、及びトマトジュースの複製試料（記載のとおり）をＳＡＲＴＯＲＩＵＳ（登録商標）発酵槽内で培養した。すべての試料が、計算の結果、有意なレベルのビタミンＢ１２、ビタミンＢ６、ビタミンＫ２、及びビオチンを示した。加えて、すべての試料が、ｐＨの変化を全く示さなかったか、又はそのわずかな増加を示した。
【００６５】
実施例６
Ｐ．  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ（菌株CHCC15460）での発酵によるビタミン産生を様々なフルーツジュース中で評価した（表５）。細菌のスターター培養株での接種後５〜８日で、発酵フルーツジュース試料を、ビタミン含有量及びｐＨについて分析した。すべての試料が、計算の結果、有意なレベルのビタミンＢ１２、ビタミンＫ２、及びビオチンを示した。また、すべての試料が、ｐＨの微少から中程度の変化を示した。最後に、マンゴーとオレンジの両方のジュース試料が、低量のスターター培養株で接種されたときにビタミン含有量の減少を示した一方で、レッドビートジュースは、高量のスターター培養株で接種されたときにビタミンＫ２レベルの減少を示した。
【００６６】
実施例７
Ｐ．  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ（菌株CHCC15460）での発酵によるビタミン産生をオレンジジュース及びマンゴージュース中で評価した（表６）。細菌のスターター培養株での接種後３、５、及び６日で、発酵フルーツジュース試料を、ビタミン含有量について分析した。すべての試料が、接種後ほんの３日後にはビタミンＢ１２含有量の有意な増加を示した。両方のジュースが、以降の時点では、ほとんど又は全くビタミンＢ１２含有量の変化を示さなかった。マンゴージュース試料が発酵後にビタミンＢ６含有量の変化を示さなかった一方で、ビタミンＫ、葉酸、及びビオチンの有意な増加が検出された。これに対し、オレンジジュースは、発酵後にビタミンＫレベルの変化を示さなかった。
【００６７】
寄託物及びエキスパートソリューション
Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ  ＣＨＣＣ１５４６０の菌株を、２０１２年１０月４日に、ドイツ、ブラウンシュヴァイク、Ｄ−３８１２４、Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒ．７ＢのＤｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（DSMZ）に受託番号ＤＳＭ  ２６４５７で寄託した。
【００６８】
寄託は、特許手続のための微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の条件下で行われた。
【００６９】
出願人は、寄託微生物の試料が、出願人により認められたエキスパートにのみ入手可能となるべきことを求める。
【００７０】
【表１】
2015532122.tif 000002
【００７１】
【表２】
2015532122.tif 000003
【００７２】
【表３】
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【００７３】
【表４】
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【００７４】
【表５】
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【００７５】
【表６】
2015532122.tif 000007
【００７６】
参考文献
以下の参考文献は、それらが例示的な手順又は他の詳細を、本明細書に記載のものに補足して提供する限りにおいて、具体的に本明細書に参照により組み込まれる。
米国特許公開第２００５／０１８０９６３号
米国特許公開第２００９／０２６９４３８号
米国特許第４，２１０，７２０号
米国特許第４，５４４，６３３号
米国特許第４，８３０，８６２号
米国特許第４，９２５，６８６号
米国特許第６，４９２，１４１号
米国特許第７，３７１，５４７号
米国特許第７，４２７，３９７号
米国特許第７，６７０，８１４号
米国特許第７，７１８，４０７号
米国特許第７，９８１，６５７号
欧州特許ＥＰ００８７９２０
欧州特許ＥＰ０６６８３５９
欧州特許ＥＰ１６２５７９４
欧州特許ＥＰ１６２５７９５
世界知的所有権機関公開ＷＯ２００４／００１０２２
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【国際調査報告】
2015532122.tif 000008