(57)【要約】本発明は、幹細胞、癌細胞、および／または初代肝細胞を含む特定の細胞型を単離、分化、または培養することに使用され得る細胞外マトリックスと関連するポリペプチドを含むアレイを提供する。アレイは、細胞外マトリックスまたはその機能性フラグメントと関連するポリペプチドを含む少なくとも一対のポリペプチドを含む。本発明は、患者の細胞試料を、細胞外マトリックスまたはその機能性フラグメントと関連するポリペプチド配列を含む少なくとも一対のポリペプチドを含むアレイと接触させることを介して、特定の疾患または障害を診断および／または予測する方法も提供する。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドのアレイであって、前記アレイが固体支持体および複数の接着セットを含み、それぞれの接着セットが、細胞外マトリックスまたはその機能性フラグメントと関連するポリペプチド配列を含む２つ以上の異なるポリペプチドを含み、前記接着セットが、前記アレイの位置指定可能な位置で前記固体支持体に結合している、前記ポリペプチドのアレイ。
【請求項２】
前記固体支持体が、任意にポリマーで被覆されているスライドである、請求項１に記載のアレイ。
【請求項３】
前記ポリマーがポリアクリルアミドである、請求項１に記載のアレイ。
【請求項４】
少なくとも１個の接着セットが、固体支持体に結合している２つの異なるポリペプチドを含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項５】
前記２つ以上の異なるポリペプチドが、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ、フィブロネクチン、ラミニン、メロシン、テネイシン−Ｒ、コンドロイチン硫酸塩、アグレッカン、エラスチン、ケラチン、ムチン、スーパーフィブロネクチン、Ｆ−スポンジン、ナイドジェン−２、ヘパリン硫酸塩、ビグリカン、デコリン、ガレクチン１、ガレクチン３、ガレクチン３ｃ、ガレクチン４、ガレクチン８、トロンボスポンジン−４、オステオポンチン、オステオネクチン、テスチカン１、テスチカン２、フィブリン、テネイシン−Ｃ、ナイドジェン−１、ビトロネクチン、ラットアグリン、ヒアルロナン、およびブレビカンから選択される、少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項６】
前記少なくとも１個の接着セットが、オステオポンチン、トロンボスポンジン−４、フィブロネクチン、ラミニン、ガレクチン３、およびガレクチン８から選択される２つの異なるポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項４に記載のアレイ。
【請求項７】
前記少なくとも１個の接着セットが、フィブロネクチンおよびラミニンと少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項６に記載のアレイ。
【請求項８】
前記少なくとも１個の接着セットが、フィブロネクチンおよびガレクチン３と少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項６に記載のアレイ。
【請求項９】
前記少なくとも１個の接着セットが、フィブロネクチンおよびガレクチン８と少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項６に記載のアレイ。
【請求項１０】
前記少なくとも１個の接着セットが、トロンボスポンジン−４およびガレクチン８と少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項６に記載のアレイ。
【請求項１１】
前記少なくとも１個の接着セットが、オステオポンチンと少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項４に記載のアレイ。
【請求項１２】
それぞれの接着セットが、前記細胞外マトリックスと関連する一対の異なるポリペプチドからなる、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１３】
前記アレイが、動物由来ＥＣＭ材料、胚線維芽細胞、またはＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から蓄積された材料を含まない、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１４】
前記アレイが、少なくとも約７００個の接着セットを含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１５】
１個または複数の哺乳類細胞を更に含む、請求項１に記載のアレイ。
【請求項１６】
前記１個または複数の哺乳類細胞が、少なくとも１個の肺細胞を含む、請求項１５に記載のアレイ。
【請求項１７】
前記細胞試料が、少なくとも１個の癌細胞または１個の幹細胞を含有する、請求項１５に記載のアレイ。
【請求項１８】
前記癌細胞が、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、脊椎、乳房、子宮頸部、胆嚢、神経節、胃腸管、胃、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、または子宮の癌に由来する、請求項１７に記載のアレイ。
【請求項１９】
前記幹細胞が、胚幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉幹細胞、臍帯幹細胞、または多能性幹細胞である、請求項１７に記載のアレイ。
【請求項２０】
前記２つ以上の異なるポリペプチドが、受動的静電気非共有結合を介して前記固体支持体に結合している、請求項１に記載のアレイ。
【請求項２１】
請求項１に記載のアレイと細胞培養容器とを含む、系。
【請求項２２】
少なくとも１個または複数の細胞を更に含む、請求項２１に記載の系。
【請求項２３】
前記少なくとも１個または複数の細胞が、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、脊椎、乳房、子宮頸部、胆嚢、神経節、胃腸管、胃、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、または子宮の癌に由来する、請求項２２に記載の系。
【請求項２４】
血清、動物由来ＥＣＭ材料、胚線維芽細胞、またはＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から蓄積された材料の少なくとも１つまたは組み合わせを含まない細胞培地を更に含む、請求項２２に記載の系。
【請求項２５】
前記少なくとも１個または複数の細胞が、胚幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉幹細胞、臍帯幹細胞、または多能性幹細胞から選択される幹細胞である、請求項２２に記載の系。
【請求項２６】
請求項１に記載のアレイを含む、キット。
【請求項２７】
細胞培地、ある量の蛍光染色または色素、細胞試料、および任意に電子媒体を介して遠隔的に利用可能な使用説明書のセットのうちの少なくとも１つを更に含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
細胞試料の接着シグネチャーを同定する方法であって、細胞試料を請求項１に記載のアレイまたは請求項２１に記載の系と接触させることと、１個または複数の接着セットに結合している細胞の量を決定することと、を含む、前記方法。
【請求項２９】
前記細胞試料が、生検材料からの少なくとも１個の細胞を含有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
細胞の分化を誘導する方法であって、細胞試料を請求項１に記載のアレイまたは請求項２１に記載の系と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３１】
前記細胞が、胚幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉幹細胞、臍帯幹細胞、または多能性幹細胞から選択される幹細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記接触させるステップが、前記細胞試料を、細胞の肝臓または膵臓の系譜への分化に十分な時間、請求項１に記載のアレイまたは請求項２１に記載の系に曝露することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
細胞を培養する方法であって、細胞試料を細胞培地の存在下で請求項１に記載のアレイまたは請求項２１に記載の系と接触させることを含む、前記方法。
【請求項３４】
前記細胞試料が、癌細胞または幹細胞の初代系譜に由来する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞試料が、胚幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉幹細胞、臍帯幹細胞、または多能性幹細胞から選択される１個または複数の幹細胞を含み、多能性幹細胞または胚幹細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記細胞が、少なくとも約３０回継代している、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞培地が、血清、動物由来ＥＣＭ材料、胚線維芽細胞、またはＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から蓄積された材料の少なくとも１つまたは組み合わせを含まない、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞試料が、１個または複数の初代肝細胞を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
請求項１に記載のアレイまたは請求項２１に記載の系が、コラーゲン１およびアグレッカンの少なくとも１０個の連続するアミノ酸、またはコラーゲンＩＶおよびナイドジェン−１の少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含む少なくとも１個の接着セットを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
過剰増殖性疾患を診断する方法であって、
（ａ）細胞試料を請求項１に記載のアレイまたは請求項２１に記載の系と接触させることと、
（ｂ）１つ以上の接着値を定量化することと、
（ｃ）前記接着値に基づいて前記細胞試料の１つ以上の接着シグネチャーを決定することと、
（ｄ）前記細胞試料の前記接着シグネチャーを対照細胞試料の接着シグネチャーと比較することと、
を含む、前記方法。
【請求項４１】
前記過剰増殖性疾患が転移性肺癌である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
対象の臨床結果を予測する方法であって、
（ａ）細胞試料を請求項１に記載のアレイまたは請求項２１に記載の系と接触させることと、
（ｂ）１つ以上の接着値を定量化することと、
（ｃ）前記接着値に基づいて前記細胞試料の１つ以上の接着シグネチャーを決定することと、
（ｄ）前記接着シグネチャーを、臨床結果と関連する細胞試料の接着シグネチャーと相関させることと、
を含む、前記方法。
【請求項４３】
治療に対する患者の応答性を決定する方法であって、
（ａ）細胞試料を請求項１に記載のアレイまたは請求項２１に記載の系と接触させることと、
（ｂ）１つ以上の接着値を定量化することと、
（ｃ）前記接着値に基づいて前記細胞試料の１つ以上の接着シグネチャーを決定することと、任意に
（ｄ）前記１つ以上の接着シグネチャーを対照細胞試料の１つ以上の接着シグネチャーと比較することと、
を含む、前記方法。
【請求項４４】
細胞を単離する方法であって、細胞試料を、請求項１に記載のアレイまたは請求項２１に記載の系と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４５】
ヒトの肝臓細胞の初代系譜に由来する肝細胞を接着させる方法であって、前記肝細胞を請求項１に記載のアレイまたは請求項２１に記載の系と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４６】
細胞型の混合物を選別する方法であって、前記方法が、細胞型の混合物を請求項１に記載のアレイまたは請求項２１に記載の系と接触させることを含む、前記方法。
【請求項４７】
前記方法が、前記接着値に基づいて前記細胞試料の１つ以上の接着シグネチャーを決定する前記ステップを更に含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記方法が、前記１つ以上の接着シグネチャーを対照細胞型の１つ以上の接着シグネチャーと比較する前記ステップを更に含む、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国を指定し、米国特許法１２０条（ｅ）に基づいて出願された国際出願であり、２０１２年３月９日に出願された米国特許仮出願第６１／６０９，１１５号の優先権を主張し、その全体が参照として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦支援研究に関する記述
本発明は、国立衛生研究所の国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所により授与された補助金番号５Ｒ０１ＤＫ５６９６６による政府支援により行われた。米国政府はこの発明に対して特定の権利を有する。
【０００３】
本発明は、一般に、装置の表面に固定化されたポリペプチドと会合し、応答する細胞リガンドの表面発現に基づいて、細胞を培養、分化、または単離する装置に関する。幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、細胞外マトリックス微環境を模倣する。本発明は、また一般に、培養もしくは単離された細胞の存在もしくは不在、または特定の細胞表現型の表示の存在もしくは不在に基づいて、特定の障害を有する患者を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
異なる種類の細胞を互いに区別すること、異なる種類の細胞を互いに分けること、および／または特定の細胞を１つもしくは別の細胞型のメンバーとして同定、特徴決定、もしくは定義することができることが重要または有用である場合が、生物学および医学の多種多様な状況において存在する。現在の単離、分化、および特徴決定の方法は、改善され得る。特定の細胞の特性または発現プロファイルの同定および特徴決定は、特定の疾患状態の診断または予後に使用され得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、細胞外マトリックス成分への細胞の親和性を具現化する「接着シグネチャー」により細胞が同定または特徴決定され得るという認識を包含する。幾つかの実施形態において、接着シグネチャーは、１つ以上のそのような細胞外マトリックス成分へ親和性を具現化または表示し、関連する細胞を少なくとも１個の他の基準細胞と比較して区別または特徴決定するために十分である。
【０００６】
例えば、幾つかの実施形態において、接着シグネチャーは、特定の細胞型（例えば、宿主または組織型、発生の状態など）を１つ以上の他の種類の細胞から区別または特徴決定するために十分である。幾つかの実施形態において、接着シグネチャーは、特定の種類および／または限定された条件下で細胞を単離および／または培養することを可能にする。幾つかの実施形態において、転移性細胞を含有する細胞試料は、フィブロネクチンをガレクチン−３、ガレクチン−８、またはラミニンと組み合わせて含む接着セットに、転移性細胞を含有しない細胞試料よりも一貫して結合し得る。
【０００７】
本発明によると、接着シグネチャーは、適切な基準細胞または細胞型に対して特定の細胞または細胞型に限定される。幾つかの実施形態において、特定の細胞は、これらが基準細胞と比較して異なる供給源（例えば、異なる細胞系譜、生物体、組織型、など）の後代である、細胞が基準細胞と異なる発生段階にある、細胞が特定の疾患、障害、もしくは状態に罹患している、もしくは感受性があるという点において、基準細胞と異なっている。幾つかの実施形態において、細胞は、異なる接着シグネチャーにより同定され得る差をもたらす特徴を除いて、基準細胞と同一である。
【０００８】
更に、本発明によると、接着シグネチャーは、細胞を同定および／または特徴決定するために使用される。例えば、幾つかの実施形態において、接着シグネチャーは、特定の疾患、障害、または状態に罹患している、または感受性のある細胞をそうではない細胞から区別するために使用される。更なる実施形態において、接着シグネチャーは、特定の発生段階、細胞系譜、または組織型の細胞を同定および／または特徴決定するために使用される。
【０００９】
本発明は、ポリペプチドのアレイであって、アレイが固体支持体および複数の接着セットを含み、それぞれの接着セットが、細胞外マトリックスまたはその機能性フラグメントと関連するポリペプチド配列を含む２つ以上の異なるポリペプチドを含み、接着セットが、アレイの位置指定可能な位置で固体支持体に結合している、ポリペプチドのアレイを提供する。幾つかの実施形態において、固体支持体は、任意にポリマーで被覆されているスライドである。幾つかの実施形態において、固体支持体は、ポリマーで被覆されている。幾つかの実施形態において、ポリマーはポリアクリルアミドである。幾つかの実施形態において、固体支持体は、ポリスチレン（ＴＣＰＳ）、ガラス、石英、石英ガラス、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）、ポリエチレン、ポリ二フッ化ビニル（ＰＶＤＦ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリオレフィン、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリビニルフェノール、ならびにこれらのコポリマーおよび混合物から選択される材料である。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の接着セットは、固体支持体に結合している２つの異なるポリペプチドを含む。
【００１０】
本発明は、ポリペプチドのアレイであって、アレイが固体支持体および複数の接着セットを含み、それぞれの接着セットが、細胞外マトリックスまたはその機能性フラグメントと関連するポリペプチド配列を含む２つ以上の異なるポリペプチドを含み、接着セットが、アレイの位置指定可能な位置で固体支持体に結合しており、２つ以上の異なるポリペプチド配列が、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ、フィブロネクチン、ラミニン、メロシン、テネイシン−Ｒ、コンドロイチン硫酸塩、アグレッカン、エラスチン、ケラチン、ムチン、スーパーフィブロネクチン、Ｆ−スポンジン、ナイドジェン−２、ヘパリン硫酸塩、ビグリカン、デコリン、ガレクチン１、ガレクチン３、ガレクチン３ｃ、ガレクチン４、ガレクチン８、トロンボスポンジン−４、オステオポンチン、オステオネクチン、テスチカン１、テスチカン２、フィブリン、テネイシン−Ｃ、ナイドジェン−１、ビトロネクチン、ラットアグリン、ヒアルロナン、ブレビカン、またはこれらの機能性フラグメントから選択される、ポリペプチドのアレイに更に関する。幾つかの実施形態において、少なくとも１個の接着セットは、オステオポンチン、トロンボスポンジン−４、フィブロネクチン、ラミニン、ガレクチン３、ガレクチン８、またはこれらの機能性フラグメントから選択される少なくとも２つの異なるポリペプチド配列を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１個の接着セットは、フィブロネクチン、ラミニン、およびこれらの機能性フラグメントから選択される少なくとも２つの異なるポリペプチド配列を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１個の接着セットは、フィブロネクチン、ガレクチン３、およびこれらの機能性フラグメントから選択される少なくとも２つの異なるポリペプチド配列を含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１個の接着セットは、フィブロネクチン、ガレクチン８、およびこれらの機能性フラグメントから選択される少なくとも２つの異なるポリペプチド配列を含む。
【００１１】
幾つかの実施形態において、少なくとも１個の接着セットは、トロンボスポンジン−４、ガレクチン８、およびこれらの機能性フラグメントから選択される少なくとも２つの異なるポリペプチド配列を含む。
【００１２】
幾つかの実施形態において、ここで本明細書に開示されているアレイまたは系は、コラーゲン１およびアグレッカン、コラーゲンＩＶおよびナイドジェン−１、またはこれらの機能性フラグメントから選択される細胞外マトリックスと関連する２つのポリペプチド配列を含む少なくとも１個の接着セットを含む。幾つかの実施形態において、少なくとも１個の接着セットは、オステオポンチンまたはその機能性フラグメントである少なくとも１つのポリペプチド配列を含む。幾つかの実施形態において、それぞれの接着セットは、細胞外マトリックスと関連する一対の異なるポリペプチドからなる。幾つかの実施形態において、アレイは、少なくとも約７００個、約７５０個、または約８００個の異なる接着セットを含む。幾つかの実施形態において、アレイは、アレイの異なる別個の位置に位置している少なくとも約７００個、約７５０個、または約８００個の異なる接着セットを含む。
【００１３】
本発明は、ポリペプチドのアレイであって、アレイが固体支持体および複数の接着セットを含み、それぞれの接着セットが、細胞外マトリックスまたはその機能性フラグメントと関連するポリペプチド配列を含む２つ以上の異なるポリペプチドを含み、接着セットが、アレイの位置指定可能な位置で固体支持体に結合しており、アレイが、動物由来ＥＣＭ材料、胚線維芽細胞、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から蓄積された材料、またはこれらの任意の組み合わせを含まない、ポリペプチドのアレイに更に関する。幾つかの実施形態において、アレイは、任意の動物種から誘導または供給された血清を含まない。
【００１４】
本発明は、ポリペプチドのアレイであって、アレイが固体支持体および複数の接着セットを含み、それぞれの接着セットが、細胞外マトリックスまたはその機能性フラグメントと関連するポリペプチド配列を含む２つ以上の異なるポリペプチドを含み、アレイが、１個または複数の哺乳類細胞を更に含む、ポリペプチドのアレイに関する。幾つかの実施形態において、１個または複数の哺乳類細胞は、少なくとも１個の肺細胞を含有する。
【００１５】
本発明は、更に、少なくとも１個の細胞または少なくとも１つの細胞試料を含むアレイまたはキットを更に提供する。幾つかの実施形態において、細胞試料は、少なくとも１個の癌細胞または１個の幹細胞を含有する。
【００１６】
幾つかの実施形態において、癌細胞は、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、脊椎、乳房、子宮頸部、胆嚢、神経節、胃腸管、胃、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、または子宮の癌に由来する。幾つかの実施形態において、アレイまたはキットは、胚幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉幹細胞、臍帯幹細胞、または多能性幹細胞である幹細胞を含む。
【００１７】
本発明は、ポリペプチドのアレイであって、アレイが固体支持体および複数の接着セットを含み、それぞれの接着セットが、細胞外マトリックスまたはその機能性フラグメントと関連するポリペプチド配列を含む２つ以上の異なるポリペプチドを含み、２つ以上の異なるポリペプチドが、受動的静電気非共有結合を介して固体支持体に結合している、ポリペプチドのアレイに関する。
【００１８】
本発明は、ポリペプチドのアレイであって、アレイが固体支持体および複数の接着セットを含み、それぞれの接着セットが、細胞外マトリックスまたはその機能性フラグメントと関連するポリペプチド配列を含む２つ以上の異なるポリペプチドを含むポリペプチドのアレイと細胞培養容器とを含む系を提供する。幾つかの実施形態において、系は、少なくとも１個または複数の細胞を更に含む。幾つかの実施形態において、系は、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、脊椎、乳房、子宮頸部、胆嚢、神経節、胃腸管、胃、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、または子宮の癌から選択される癌細胞に由来する少なくとも１個または複数の細胞を更に含む。幾つかの実施形態において、系は、血清、動物由来ＥＣＭ材料、胚線維芽細胞、またはＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から蓄積された材料の少なくとも１つを含まない細胞培地を更に含む。幾つかの実施形態において、系は、血清、動物由来ＥＣＭ材料、胚線維芽細胞、およびＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から蓄積された材料を含まない細胞培地を更に含む。幾つかの実施形態において、系は、少なくとも１個または複数の細胞を更に含み、胚幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉幹細胞、臍帯幹細胞、または多能性幹細胞から選択される幹細胞である。
【００１９】
本発明は、ポリペプチドのアレイであって、アレイが固体支持体および複数の接着セットを含み、それぞれの接着セットが、細胞外マトリックスまたはその機能性フラグメントと関連するポリペプチド配列を含む２つ以上の異なるポリペプチドを含むポリペプチドのアレイを含み、任意に細胞培養容器を含むキットも提供する。幾つかの実施形態において、キットは、以下：細胞培地、ある量の蛍光染色または色素、細胞試料、および任意に電子媒体を介して遠隔的に利用可能な使用説明書のセットのうちの少なくとも１つを更に含む。
【００２０】
本発明は、細胞試料の接着シグネチャーを同定する方法であって、細胞試料を本明細書に開示されているアレイまたは系と接触させることと、１個または複数の接着セットに結合している細胞の量を決定することと、を含む方法を更に提供する。幾つかの実施形態において、細胞試料は、生検材料からの少なくとも１個の細胞を含有する。本発明は、細胞の分化を誘導する方法であって、細胞試料を本明細書に開示されているアレイまたは系と接触させることを含む方法も提供する。幾つかの実施形態において、方法は、胚幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉幹細胞、臍帯幹細胞、または多能性幹細胞から選択される幹細胞の分化を誘導することを含む。幾つかの実施形態において、細胞または細胞試料を接触させるステップは、細胞または細胞試料を、細胞の肝臓または膵臓の系譜への分化に十分な時間、アレイまたは系に曝露することを含む。
【００２１】
本発明は、細胞を培養する方法であって、細胞または細胞試料を細胞培地の存在下で本明細書に開示されているアレイまたは系と接触させることを含む方法も提供する。幾つかの実施形態において、細胞培地は血清を含まない。幾つかの実施形態において、細胞培地は、血清、動物由来ＥＣＭ材料、胚線維芽細胞、またはＥｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から蓄積された材料の少なくとも１つまたは組み合わせを含まない。幾つかの実施形態において、細胞または細胞試料は、癌細胞または幹細胞の初代系譜に由来する。幾つかの実施形態において、本発明は細胞または細胞試料を培養する方法であって、細胞または細胞試料が、胚幹細胞、脂肪由来幹細胞、間葉幹細胞、臍帯幹細胞、または多能性幹細胞から選択される１個または複数の幹細胞を含み、多能性幹細胞または胚幹細胞である、方法に関する。幾つかの実施形態において、本発明は、細胞を培養する方法であって、細胞または細胞試料を細胞培地の存在下で本明細書に開示されているアレイまたは系と接触させることを含み、細胞を接触させることを含み、細胞が少なくとも約３０回、少なくとも４０回、または少なくとも５０回継代している、方法に関する。
【００２２】
本発明は、１個または複数の初代肝細胞を培養する方法であって、１個または複数の初代肝細胞を本明細書に開示されているアレイまたは系と接触させることを含む方法を更に提供する。
【００２３】
本発明は、過剰増殖性疾患を診断する方法であって、（ａ）細胞試料を本明細書に開示されているアレイまたは系と接触させることと、（ｂ）１つ以上の接着値を定量化することと、（ｃ）接着値に基づいて細胞試料の１つ以上の接着シグネチャーを決定することと、（ｄ）細胞試料の接着シグネチャーを対照細胞試料の接着シグネチャーと比較することと、を含む方法に更に関する。幾つかの実施形態において、過剰増殖性疾患は転移性肺癌である。幾つかの実施形態において、過剰増殖性疾患は転移性乳癌である。
【００２４】
本発明は、対象の臨床結果を予測する方法であって、（ａ）細胞または細胞試料を本明細書に開示されているアレイまたは系と接触させることと、（ｂ）１つ以上の接着値を定量化することと、（ｃ）接着値に基づいて細胞試料の１つ以上の接着シグネチャーを決定することと、（ｄ）接着シグネチャーを、臨床結果と関連する細胞試料の接着シグネチャーと相関させることと、を含む方法に関する。
【００２５】
本発明は、治療に対する患者の応答性を決定する方法であって、（ａ）細胞または細胞試料を本明細書に開示されているアレイまたは系と接触させることと、（ｂ）１つ以上の接着値を定量化することと、（ｃ）少なくとも部分的に接着値に基づいて細胞試料の１つ以上の接着シグネチャーを決定することと、（ｄ）１つ以上の接着シグネチャーを対照細胞試料の１つ以上の接着シグネチャーと比較することと、を含む方法を更に提供する。
【００２６】
本発明は、治療に対する患者の応答性を決定する方法であって、（ａ）細胞または細胞試料を本明細書に開示されているアレイまたは系と接触させることと、（ｂ）本明細書に開示されているコンピュータープログラム製品を介して細胞の蛍光を検出することにより、１つ以上の接着値を定量化することと、（ｃ）少なくとも部分的に接着値に基づいて細胞試料の１つ以上の接着シグネチャーを決定することと、（ｄ）１つ以上の接着シグネチャーを対照細胞試料の１つ以上の接着シグネチャーと比較することと、を含む方法を更に提供する。
【００２７】
本発明は、細胞を単離する方法であって、細胞試料を本明細書に開示されているアレイまたは系と接触させることを含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、細胞を単離させる方法は、細胞試料を、細胞が細胞試料の他の成分より緊密にアレイまたは系に接着するのに十分な時間および十分な条件下で、本明細書に開示されているアレイまたは系と接触させることを含む。幾つかの実施形態において、細胞を単離する方法は、細胞から細胞試料の他の成分を洗浄する緩衝液によりアレイまたは系をすすぐことを更に含む。
【００２８】
本発明は、ヒトの肝臓細胞の初代系譜に由来する肝細胞を接着させる方法であって、肝細胞を本明細書に開示されているアレイまたは系と接触させることを含む方法も提供する。本発明は、ヒトの肝臓細胞の初代系譜に由来する肝細胞の培養物を維持する方法であって、肝細胞を本明細書に開示されているアレイまたは系と接触させることを含む方法も提供する。
【００２９】
本発明は、細胞型の混合物を選別する方法であって、細胞型の混合物を本明細書に開示されているアレイまたは系と接触させることを含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、細胞型の混合物を選別する方法は、計算された接着値に基づいて細胞試料の１つ以上の接着シグネチャーを決定するステップを更に含む。幾つかの実施形態において、方法は、１つ以上の接着シグネチャーを、対照細胞型の１つ以上の接着シグネチャーと比較するステップ、および細胞型を、対照細胞型の表現型との類似性または差異に基づいて選別するステップを更に含む。
【００３０】
幾つかの実施形態において、特定の細胞は、単離される細胞には共通しており、且つ他の細胞と異なっている接着シグネチャーに基づいて、他の細胞も含む組成物から単離される。例えば、幾つかの実施形態において、１種類を超える細胞を含む組成物は１つ以上のＥＣＭ成分と接触し、単離される特定の細胞のＥＣＭ成分に対する親和性は、細胞の接着シグネチャーの一部を構成する。更なる実施形態において、細胞は、ＥＣＭ成分の組成物を含有する培地において培養される。
【００３１】
幾つかの実施形態において、本開示は、細胞を含む試料を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させることと、試料中の細胞とコレクション中のＥＣＭ成分との相互作用の存在またはレベルを検出することと、を含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、提供される方法は、検出された特定の相互作用のセットが、試料中の他の細胞または基準細胞と区別される点において試料中の特定の細胞に特徴的である、接着シグネチャーを限定するのを決定することを含む。幾つかの実施形態において、検出することは、試料中の他の細胞または基準細胞と区別される点において試料中の特定の細胞に特徴的である、相互作用のセットの存在またはレベルを検出することを含む。
【００３２】
幾つかの実施形態において、本開示は、細胞を含む試料を、相互作用のセットが試料中の特定の細胞とコレクション中のＥＣＭ成分との間に生じて細胞を試料の他の成分から単離するのに十分な条件下および時間にわたって、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させることを含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、特定の細胞が単離される試料の他の成分には、他の細胞が含まれる。
【００３３】
特定の実施形態において、他の細胞は、単離された細胞と異なるセットの相互作用をＥＣＭ成分と行う細胞である。特定の実施形態において、接触させるステップは、固相に結合しているＥＭＣ成分と、相互作用のセットが固相において生じるのに十分な条件下および時間にわたって接触させることを含む。幾つかの実施形態において、提供される方法は、固相と相互作用を行う特定の細胞が試料から単離されるように、固相を試料から分離するステップを含む。
【００３４】
幾つかの実施形態において、本開示は、細胞外マトリックス成分と相互作用する細胞に対する効果を決定する方法であって、細胞の第１の細胞個体群を、細胞外マトリックス成分のコレクションと接触させることを含む第１セットの条件に曝露することと、第２の細胞個体群が第１の細胞個体群に匹敵している、第２の細胞個体群を、第２セットの条件が、細胞外マトリックス成分の幾つかまたは全てが接触時に不在であることを除いて、第１セットの条件と匹敵している、第２セットの条件に曝露することと、曝露が生じた後に第１および第２の細胞個体群の間で異なる１つ以上の細胞個体群の特徴を決定することと、を含む方法を提供する。
【００３５】
幾つかの実施形態において、本開示は、目的の細胞型を培養する方法であって、目的の細胞型の細胞を含む試料を、１つ以上の異なる細胞型の細胞と比較して、目的の細胞型の細胞の増殖および／または複製を促進するのに適切な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させること、を含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分のコレクションは、培地に懸濁されている。特定の実施形態において、ＥＣＭ成分のコレクションは、固相に結合している。幾つかの実施形態において、方法は、目的の細胞型の細胞を固相から単離することを更に含む。
【００３６】
幾つかの実施形態において、本開示は、複数の異なる細胞型が少なくとも１つの目的の細胞型を含む、複数の異なる細胞型の細胞を含有する試料を基板と接触させたとき、目的の細胞型の細胞が、目的の細胞型の細胞を試料中の他の細胞から単離するのに十分な相互作用のセットを、コレクション中のＥＣＭ成分と形成することを特徴とする、ＥＣＭ成分のコレクションで被覆されている基板を含む、細胞の単離および増殖のためのキットを提供する。幾つかの実施形態において、単離は、目的の細胞型の細胞の増殖を含む。幾つかの実施形態において、増殖は繁殖を含む。幾つかの実施形態において、増殖は、他の細胞型と比較して、目的の細胞型の細胞により試料を過密にするのに十分である。特定の実施形態において、キットは更に培地を含む。幾つかの実施形態において、キットは、更に目的の細胞型の細胞を含む。
【００３７】
幾つかの実施形態において、本開示は、複数の異なる細胞型が少なくとも１つの目的の細胞型を含む、複数の異なる細胞型の細胞を含有する試料を基板と接触させたとき、目的の細胞型の細胞が、目的の細胞型の細胞を試料中の他の細胞から単離するのに十分な相互作用のセットを、コレクション中のＥＣＭ成分と形成することを特徴とする、ＥＣＭ成分のコレクションで被覆されている基板を含む、細胞を培養する系を提供する。幾つかの実施形態において、単離は、目的の細胞型の細胞の増殖を含む。特定の実施形態において、増殖は繁殖を含む。幾つかの実施形態において、増殖は、他の細胞型と比較して、目的の細胞型の細胞により試料を過密にするのに十分である。
【００３８】
幾つかの実施形態において、本開示は、複数の異なる細胞型が少なくとも１つの目的の細胞型を含む、複数の異なる細胞型の細胞を含有する試料を基板と接触させたとき、目的の細胞型の細胞が、目的の細胞型の細胞を試料中の他の細胞から単離するのに十分な相互作用のセットを、コレクション中のＥＣＭ成分と形成することを特徴とする、ＥＣＭ成分のコレクションで被覆されている基板を含む、癌診断のためのキットを提供する。幾つかの実施形態において、目的の細胞型は、特定の転移段階の癌細胞である。幾つかの実施形態において、単離は、特定の段階の癌細胞の増殖を含む。幾つかの実施形態において、増殖は繁殖を含む。幾つかの実施形態において、増殖は、他の細胞型と比較して、特定の段階の癌細胞により試料を過密にするのに十分である。幾つかの実施形態において、キットは更に培地を含む。幾つかの実施形態において、キットは、特定の段階の癌細胞の存在量を評価する手段を更に含む。
【００３９】
本発明は、細胞を含む試料を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させるステップと、試料中の細胞とコレクション中のＥＣＭ成分との間の相互作用の存在またはレベルを検出するステップと、を含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、方法は、検出された特定の相互作用のセットが、試料中の他の細胞または基準細胞と区別される点において試料中の特定の細胞に特徴的である、接着シグネチャーを限定するのを決定することを更に含む。幾つかの実施形態において、検出するステップは、試料中の他の細胞または基準細胞と区別される点において試料中の特定の細胞に特徴的である、相互作用のセットの存在またはレベルを検出することを含む。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分のコレクションは、固相に結合している。幾つかの実施形態において、本発明は、細胞を含む試料を細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分と接触させるステップと、試料中の細胞とコレクション中のＥＣＭ成分との間の相互作用の存在またはレベルを検出するステップと、を含む方法であって、コレクション中のＥＣＭ成分が、固相の別個の位置で別々に結合している、方法を提供する。幾つかの実施形態において、検出するステップは、１つ以上の別個の位置における結合レベルを定量化することを含む。幾つかの実施形態において、検出するステップは、別個の位置における結合レベルを全て定量化することを含む。
【００４０】
本発明は、細胞を含む試料を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させるステップと、試料中の細胞とコレクション中のＥＣＭ成分との間の相互作用の存在またはレベルを検出するステップと、検出された特定の相互作用のセットが、試料中の他の細胞または基準細胞と区別される点において試料中の特定の細胞に特徴的である、接着シグネチャーを限定することを決定するステップと、を含む方法を更に提供する。幾つかの実施形態において、検出するステップは、試料中の細胞とコレクション中のＥＣＭ成分との間の予め決定された相互作用のセットの存在またはレベルを決定することを含む。幾つかの実施形態において、方法は、基準の存在またはレベルとの同一性、類似性、または差異が決定されるように、決定された存在またはレベルを、予め決定されたセットの基準の存在またはレベルと比較することを更に含む。幾つかの実施形態において、基準の存在またはレベルは、特定の細胞型の細胞を、少なくとも１つの他の細胞型の細胞と区別する点において、特定の細胞型に特徴的である接着シグネチャーである、またはを含む。幾つかの実施形態において、基準の存在またはレベルは、そうでなければ異なる発生段階の匹敵する細胞と区別する点において、特定の発生段階の細胞の接着シグネチャーである、またはを含む。
【００４１】
本発明は、細胞を含む試料を、相互作用のセットが試料中の特定の細胞とコレクション中のＥＣＭ成分との間に生じて細胞を試料の他の成分から単離するのに十分な条件下および時間にわたって、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させるステップを含む方法も提供する。幾つかの実施形態において、特定の細胞が単離される試料の他の成分には、他の細胞が含まれる。幾つかの実施形態において、他の細胞は、単離された細胞と異なるセットの相互作用をＥＣＭ成分と行う細胞である。
【００４２】
本発明は、細胞を含む試料を、相互作用のセットが試料中の特定の細胞とコレクション中のＥＣＭ成分との間に生じて細胞を試料の他の成分から単離するのに十分な条件下および時間にわたって、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させるステップを含む方法であって、接触させるステップが、固相に結合しているＥＭＣ成分と、相互作用のセットが固相において生じるのに十分な条件下および時間にわたって接触させることを含む方法も提供する。幾つかの実施形態において、方法は、特定の細胞が試料から分離されるように、固相を試料から分離するステップを更に含む。
【００４３】
本発明は、細胞を含む試料を細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させるステップを含む方法であって、細胞外マトリックス成分のコレクションが、アグレカン、アグリン、ビグリカン、ブレビカン、コンドロイチン硫酸塩、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ、デコリン、エラスチン、ｆ−スポンジン、フィブリン、フィブロネクチン、ガレクチン１、ガレクチン３、ガレクチン３ｃ、ガレクチン４、ガレクチン８、ヘパラン硫酸塩、ヒアルロン酸、ケラチン、ラミニン、メロシン、ムチン、ナイドジェン−１、ナイドジェン−２、オステオポンチン、ＳＰＡＲＣ／オステオネクチン、スーパーフィブロネクチン、テネイシン−Ｃ、テネイシン−Ｒ、テスチカン１／ＳＰＯＣＫＩ、テスチカン２／ＳＰＯＣＫ２、トロンボスポンジン−４、ビトロネクチン、およびこれらの機能性フラグメントの１つ以上を含む方法を提供する。本発明は、細胞を含む試料を細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させるステップを含む方法であって、細胞外マトリックス成分のコレクションが、アグリンおよびコラーゲンＩＶ、アグリンおよびフィブリン、ビグリカンおよびコラーゲンＩＩ、ビグリカンおよびフィブリン、コラーゲンＩおよびトロンボスポンジン−４、コラーゲンＩＩおよびデコリン、コラーゲンＩＩおよびテネイシン−Ｃ、コラーゲンＩＩおよびテスチカン２、コラーゲンＩＩＩおよびコラーゲンＶＩ、コラーゲンＩＩＩおよびトロンボスポンジン−４、コラーゲンＩＶおよびガレクチン４、コラーゲンＩＶおよびＳＰＡＲＣ、コラーゲンＩＶおよびビトロネクチン、コラーゲンＶおよびガレクチン１、コラーゲンＶＩおよびガレクチン３、フィブリンおよびガレクチン３ｃ、フィブリンおよびガレクチン４、フィブリンおよびケラチン、フィブリンおよびオステオポンチン、フィブリンおよびＳＰＡＲＣ、ｆ−スポンジンおよびフィブロネクチン、フィブロネクチンおよびガレクチン３、フィブロネクチンおよびガレクチン８、フィブロネクチンおよびラミニン、フィブロネクチンおよびテスチカン１、ならびにまたはこれらの機能性フラグメントから選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む方法を提供する。幾つかの実施形態において、本発明は、細胞を含む試料を細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させるステップを含む方法であって、細胞外マトリックス成分のコレクションが、アグリンおよびコラーゲンＩＩ、アグリンおよびラミニン、ビグリカンおよびコラーゲンＩＩ、ブレビカンおよびフィブロネクチン、コラーゲンＩおよびテスチカン２、コラーゲンＩＩおよびコラーゲンＩＶ、コラーゲンＩＩおよびラミニン、コラーゲンＩＩおよびナイドジェン−１、コラーゲンＩＩおよびテスチカン２、コラーゲンＩＩＩおよびガレクチン８、コラーゲンＩＩＩおよびスーパーフィブロネクチン、コラーゲンＶおよびフィブロネクチン、コラーゲンＶおよびガレクチン１、コラーゲンＶＩおよびフィブロネクチン、コラーゲンＶＩおよびナイドジェン−１、コラーゲンＶＩおよびテネイシン−Ｃ、デコリンおよびフィブロネクチン、デコリンおよびガレクチン８、デコリンおよびラミニン、エラスチンおよびガレクチン４、フィブリンおよびガレクチン３、フィブロネクチンおよびガレクチン１、フィブロネクチンおよびガレクチン３、フィブロネクチンおよびガレクチン４、フィブロネクチンおよびムチン、フィブロネクチンおよびＳＰＡＲＣ、フィブロネクチンおよびテスチカン２、ガレクチン１およびガレクチン３、ガレクチン１およびケラチン、ガレクチン３およびヘパラン硫酸塩、ガレクチン３およびスーパーフィブロネクチン、ガレクチン４およびナイドジェン−１、ガレクチン８およびテネイシン−Ｃ、ケラチンおよびラミニン、ラミニンおよびメロシン、ラミニンおよびトロンボスポンジン−４、ＳＰＡＲＣおよびスーパーフィブロネクチン、スーパーフィブロネクチンおよびテスチカン１、ならびに／またはこれらの機能性フラグメントから選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む方法を提供する。
【００４４】
幾つかの実施形態において、本発明は、細胞を含む試料を細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させるステップを含む方法であって、細胞外マトリックス成分のコレクションが、ビグリカンおよびコラーゲンＩＶ、ビグリカンおよびガレクチン４、ブレビカンおよびコラーゲンＩ、ブレビカンおよびコラーゲンＩＶ、ブレビカンおよびガレクチン３ｃ、コラーゲンＩおよびガレクチン１、コラーゲンＩおよびガレクチン３、コラーゲンＩおよびガレクチン３ｃ、コラーゲンＩおよびガレクチン８、コラーゲンＩおよびナイドジェン−２、コラーゲンＩおよびＳＰＡＲＣ、コラーゲンＩおよびテネイシン−Ｃ、コラーゲンＩおよびテスチカン１、コラーゲンＩおよびビトロネクチン、コラーゲンＩＩおよびガレクチン３、コラーゲンＩＩおよびガレクチン８、コラーゲンＩＩおよびナイドジェン−１、コラーゲンＩＩおよびナイドジェン−２、コラーゲンＩＶおよびデコリン、コラーゲンＩＶおよびガレクチン８、コラーゲンＩＶおよびナイドジェン−１、コラーゲンＩＶおよびナイドジェン−２、コラーゲンＩＶおよびテスチカン１、コラーゲンＩＶおよびテスチカン２、コラーゲンＶＩおよびｆ−スポンジン、コラーゲンＶＩおよびガレクチン３、コラーゲンＶＩおよびガレクチン８、コラーゲンＶＩおよびテネイシン−Ｃ、コラーゲンＶＩおよびテスチカン２、コラーゲンＶＩおよびトロンボスポンジン−４、ｆ−スポンジンおよびビトロネクチン、フィブリンおよびガレクチン４、フィブロネクチンおよびガガレクチン４、フィブロネクチンおよびナイドジェン−１、フィブロネクチンおよびテネイシン−Ｃ、フィブロネクチンおよびテスチカン１、フィブロネクチンおよびテスチカン２、ガレクチン３およびビトロネクチン、ガレクチン３ｃおよびメロシン、ガレクチン３ｃおよびスーパーフィブロネクチン、ガレクチン４およびスーパーフィブロネクチン、ガレクチン８およびスーパーフィブロネクチン、ガレクチン８およびビトロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチン、ＳＰＡＲＣおよびテスチカン１、ならびに／またはスーパーフィブロネクチンおよびビトロネクチンから選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む方法を提供する。
【００４５】
本発明は、細胞を含む試料を、相互作用のセットが試料中の特定の細胞とコレクション中のＥＣＭ成分との間に生じて細胞を単離するのに十分な条件下および時間にわたって、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させるステップを含む方法であって、特定の細胞が、ヒト胚肝細胞、ヒト誘導多能性幹細胞、肝細胞、間葉幹細胞、または癌細胞である方法を、更に提供する。幾つかの実施形態において、間葉幹細胞は、骨髄、脂肪細胞、臍帯血、または臍帯に由来する。幾つかの実施形態において、細胞は特定の発生段階の細胞である。幾つかの実施形態において、癌細胞は、原発性腫瘍、リンパ節、または臓器部位への転移からのものである。幾つかの実施形態において、癌細胞は、原発性腫瘍、リンパ節、臓器部位への転移、または転移性組織からのものである。幾つかの実施形態において、癌細胞は、非小細胞肺癌細胞である。幾つかの実施形態において、癌細胞は、乳癌細胞である。
【００４６】
本発明は、細胞外マトリックス成分と相互作用する細胞に対する効果を決定する方法であって、細胞の第１の細胞個体群を、細胞外マトリックス成分のコレクションと接触させることを含む第１セットの条件に曝露するステップと、第２の細胞個体群が第１の細胞個体群に匹敵している、第２の細胞個体群を、第２セットの条件が、細胞外マトリックス成分の幾つかまたは全てが接触時に不在であることを除いて、第１セットの条件と匹敵している、第２セットの条件に曝露するステップと、曝露が生じた後に第１および第２の細胞個体群の間で異なる１つ以上の細胞個体群の特徴を決定するステップと、を含む方法も提供する。
【００４７】
本発明は、目的の細胞型を培養する方法であって、目的の細胞型の細胞を含む試料を、１つ以上の異なる細胞型の細胞と比較して、目的の細胞型の細胞の増殖および／または複製を促進するのに適切な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させること、を含む方法も提供する。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分のコレクションは、培地に懸濁されている。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分のコレクションは、固相に結合している。幾つかの実施形態において、目的の細胞型の細胞を培養する方法は、目的の細胞型の細胞を固相から単離することを更に含む。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分のコレクションは、異なる細胞型の、そうでなければ匹敵する細胞から目的の細胞型の細胞を区別する点において目的の細胞型に特徴的である、接着シグネチャーを限定する相互作用に参加するＥＣＭ成分を含む。幾つかの実施形態において、目的の細胞型は、目的の発生段階の細胞であり、異なる細胞型は、異なる発生段階における、そうでなければ匹敵する細胞である。
【００４８】
幾つかの実施形態において、本発明は、目的の細胞型がヒト胚幹細胞またはヒト誘導多能性胚幹細胞である、およびＥＣＭ成分のコレクションが、コラーゲンＩＩおよびガレクチン４、コラーゲンＩＶおよびガレクチン８、コラーゲンＩおよびラミニン、またはこれらの機能性フラグメントから選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む、開示されている方法のいずれかを提供する。
【００４９】
幾つかの実施形態において、本発明は、目的の細胞型がヒト間葉幹細胞である開示されている方法のいずれかを提供する。幾つかの実施形態において、間葉幹細胞は、骨髄、脂肪細胞、臍帯血、または臍帯に由来する。
【００５０】
本発明は、目的の細胞型を培養する方法であって、目的の細胞型の細胞を含む試料を、１つ以上の異なる細胞型の細胞と比較して、目的の細胞型の細胞の増殖および／または複製を促進するのに適切な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させること含み、細胞外マトリックス成分のコレクションが、ビグリカンおよびコラーゲンＩＶ、ビグリカンおよびガレクチン４、ブレビカンおよびコラーゲンＩ、ブレビカンおよびコラーゲンＩＶ、ブレビカンおよびガレクチン３ｃ、コラーゲンＩおよびガレクチン１、コラーゲンＩおよびガレクチン３、コラーゲンＩおよびガレクチン３ｃ、コラーゲンＩおよびガレクチン８、コラーゲンＩおよびナイドジェン−２、コラーゲンＩおよびＳＰＡＲＣ、コラーゲンＩおよびテネイシン−Ｃ、コラーゲンＩおよびテスチカン１、コラーゲンＩおよびビトロネクチン、コラーゲンＩＩおよびガレクチン３、コラーゲンＩＩおよびガレクチン８、コラーゲンＩＩおよびナイドジェン−１、コラーゲンＩＩおよびナイドジェン−２、コラーゲンＩＶおよびデコリン、コラーゲンＩＶおよびガレクチン８、コラーゲンＩＶおよびナイドジェン−１、コラーゲンＩＶおよびナイドジェン−２、コラーゲンＩＶおよびテスチカン１、コラーゲンＩＶおよびテスチカン２、コラーゲンＶＩおよびｆ−スポンジン、コラーゲンＶＩおよびガレクチン３、コラーゲンＶＩおよびガレクチン８、コラーゲンＶＩおよびテネイシン−Ｃ、コラーゲンＶＩおよびテスチカン２、コラーゲンＶＩおよびトロンボスポンジン−４、ｆ−スポンジンおよびビトロネクチン、フィブリンおよびガレクチン４、フィブロネクチンおよびガガレクチン４、フィブロネクチンおよびナイドジェン−１、フィブロネクチンおよびテネイシン−Ｃ、フィブロネクチンおよびテスチカン１、フィブロネクチンおよびテスチカン２、ガレクチン３およびビトロネクチン、ガレクチン３ｃおよびメロシン、ガレクチン３ｃおよびスーパーフィブロネクチン、ガレクチン４およびスーパーフィブロネクチン、ガレクチン８およびスーパーフィブロネクチン、ガレクチン８およびビトロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチン、ＳＰＡＲＣおよびテスチカン１、スーパーフィブロネクチンおよびビトロネクチン、ならびに／またはこれらの機能性フラグメントから選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む方法を、更に提供する。幾つかの実施形態において、目的の細胞型は、ヒト胚幹細胞、マウス胚幹細胞、および／またはヒト誘導多能性幹細胞である。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分のコレクションは、フィブロネクチンおよびメロシンを含む。
【００５１】
幾つかの実施形態において、本発明は、肝細胞を培養する方法であって、肝細胞を含む試料を、肝細胞の増殖および／または複製を促進するのに適切な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させることを含む方法を更に提供する。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分のコレクションは、アグリンおよびコラーゲンＩ、コラーゲンＩおよびラミニン、コラーゲンＩおよびメロシン、コラーゲンＩＩおよびガレクチン８、コラーゲンＩＩおよびＳＰＡＲＣ、ならびに／またはコラーゲンＩＶおよびナイドジェン−１から選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む。
【００５２】
本発明は、それぞれの開示されているステップが無血清環境において実施される、本明細書に開示されている方法のいずれかを更に提供する。本発明は、また、無血清培地または完全限定合成培地から単離された目的の細胞型の細胞を含む、本明細書に開示されている方法のいずれか提供する。
【００５３】
幾つかの実施形態において、本発明は、複数の異なる細胞型が少なくとも１つの目的の細胞型を含む、複数の異なる細胞型の細胞を含有する試料を基板と接触させたとき、目的の細胞型の細胞が、目的の細胞型の細胞を試料中の他の細胞から単離するのに十分な相互作用のセットを、コレクション中のＥＣＭ成分と形成することを特徴とする、ＥＣＭ成分のコレクションで被覆されている基板を含む、細胞の単離および増殖のためのキットを提供する。幾つかの実施形態において、単離は、目的の細胞型の細胞の増殖を含む。幾つかの実施形態において、細胞の増殖は、目的の細胞型の繁殖を含む。幾つかの実施形態において、増殖は、他の細胞型と比較して、目的の細胞型の細胞により試料を過密にするのに十分である。
【００５４】
本発明は、複数の異なる細胞型が少なくとも１つの目的の細胞型を含む、複数の異なる細胞型の細胞を含有する試料を基板と接触させたとき、目的の細胞型の細胞が、目的の細胞型の細胞を試料中の他の細胞から単離するのに十分な相互作用のセットを、コレクション中のＥＣＭ成分と形成することを特徴とする、ＥＣＭ成分のコレクションで被覆されている基板を含むキットを更に提供する。幾つかの実施形態において、キットは更に細胞培地を含む。幾つかの実施形態において、キットは、無血清培地または完全定義合成細胞培地を更に含む。幾つかの実施形態において、キットは、目的の細胞型の細胞を更に含む。幾つかの実施形態において、キットは、目的の細胞型の細胞を更に含み、目的の細胞型は、幹細胞、癌細胞、または肝細胞である。幾つかの実施形態において、基板は、ＥＣＭ成分のアレイにより被覆されている。幾つかの実施形態において、基板は、本明細書に開示されているＥＣＭ成分の任意の対のアレイにより被覆されている。
【００５５】
本発明は、複数の異なる細胞型が少なくとも１つの目的の細胞型を含む、複数の異なる細胞型の細胞を含有する試料を基板と接触させたとき、目的の細胞型の細胞が、目的の細胞型の細胞を試料中の他の細胞から単離するのに十分な相互作用のセットを、コレクション中のＥＣＭ成分と形成することを特徴とする、ＥＣＭ成分のコレクションで被覆されている基板を含む、細胞を培養する系を更に提供する。幾つかの実施形態において、単離は、目的の細胞型の細胞の増殖を含む。幾つかの実施形態において、増殖は繁殖を含む。幾つかの実施形態において、増殖は、他の細胞型と比較して、目的の細胞型の細胞により試料を過密にするのに十分である。幾つかの実施形態において、系は、ポリスチレンまたはポリプロピレンから構成される基板を含む。幾つかの実施形態において、目的の細胞型は、ヒト間葉幹細胞である。幾つかの実施形態において、目的の細胞型は間葉幹細胞は、骨髄、脂肪細胞、臍帯血、または臍帯に由来する。幾つかの実施形態において、目的の細胞型はヒト間葉幹細胞は、骨髄、脂肪細胞、臍帯血、または臍帯に由来する。
【００５６】
本発明は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションにより被覆された基板を含む、細胞を培養するための系であって、細胞外マトリックス成分のコレクションが、ビグリカンおよびコラーゲンＩＶ、ビグリカンおよびガレクチン４、ブレビカンおよびコラーゲンＩ、ブレビカンおよびコラーゲンＩＶ、ブレビカンおよびガレクチン３ｃ、コラーゲンＩおよびガレクチン１、コラーゲンＩおよびガレクチン３、コラーゲンＩおよびガレクチン３ｃ、コラーゲンＩおよびガレクチン８、コラーゲンＩおよびナイドジェン−２、コラーゲンＩおよびＳＰＡＲＣ、コラーゲンＩおよびテネイシン−Ｃ、コラーゲンＩおよびテスチカン１、コラーゲンＩおよびビトロネクチン、コラーゲンＩＩおよびガレクチン３、コラーゲンＩＩおよびガレクチン８、コラーゲンＩＩおよびナイドジェン−１、コラーゲンＩＩおよびナイドジェン−２、コラーゲンＩＶおよびデコリン、コラーゲンＩＶおよびガレクチン８、コラーゲンＩＶおよびナイドジェン−１、コラーゲンＩＶおよびナイドジェン−２、コラーゲンＩＶおよびテスチカン１、コラーゲンＩＶおよびテスチカン２、コラーゲンＶＩおよびｆ−スポンジン、コラーゲンＶＩおよびガレクチン３、コラーゲンＶＩおよびガレクチン８、コラーゲンＶＩおよびテネイシン−Ｃ、コラーゲンＶＩおよびテスチカン２、コラーゲンＶＩおよびトロンボスポンジン−４、ｆ−スポンジンおよびビトロネクチン、フィブリンおよびガレクチン４、フィブロネクチンおよびガガレクチン４、フィブロネクチンおよびナイドジェン−１、フィブロネクチンおよびテネイシン−Ｃ、フィブロネクチンおよびテスチカン１、フィブロネクチンおよびテスチカン２、ガレクチン３およびビトロネクチン、ガレクチン３ｃおよびメロシン、ガレクチン３ｃおよびスーパーフィブロネクチン、ガレクチン４およびスーパーフィブロネクチン、ガレクチン８およびスーパーフィブロネクチン、ガレクチン８およびビトロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチン、ＳＰＡＲＣおよびテスチカン１、ならびに／またはスーパーフィブロネクチン、ビトロネクチン、あるいはこれらの機能性フラグメントから選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む、系を提供する。幾つかの実施形態において、目的の細胞型は、ヒト胚幹細胞またはヒト誘導多能性胚幹細胞であり、ＥＣＭ成分のコレクションは、コラーゲンＩＩおよびガレクチン４、コラーゲンＩＶおよびガレクチン８、またはコラーゲンＩおよびラミニンから選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む。幾つかの実施形態において、目的の細胞型は、肝細胞を含む。
【００５７】
本発明は、ＥＣＭ成分のコレクションにより被覆されている基板を含む、細胞を培養するための系であって、ＥＣＭ成分のコレクションが、アグリンおよびコラーゲンＩ、コラーゲンＩおよびラミニン、コラーゲンＩおよびメロシン、コラーゲンＩＩおよびガレクチン８、コラーゲンＩＩおよびＳＰＡＲＣ、ならびに／またはコラーゲンＩＶおよびナイドジェン−１から選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む、系を更に提供する。
【００５８】
本発明は、複数の異なる細胞型が少なくとも１つの目的の細胞型を含む、複数の異なる細胞型の細胞を含有する試料を基板と接触させたとき、目的の細胞型の細胞が、目的の細胞型の細胞を試料中の他の細胞から単離するのに十分な相互作用のセットを、コレクション中のＥＣＭ成分と形成することを特徴とする、ＥＣＭ成分のコレクションで被覆されている基板を含む、癌の病期を診断するキットを提供する。幾つかの実施形態において、目的の細胞型は、特定の転移段階の癌細胞である。幾つかの実施形態において、キットは、複数の異なる細胞型が少なくとも１つの目的の細胞型を含む、複数の異なる細胞型の細胞を含有する試料を基板と接触させたとき、癌細胞が、特定の増殖段階の癌細胞を単離するのに十分な相互作用のセットを、コレクション中のＥＣＭ成分と形成することを特徴とする、ＥＣＭ成分のコレクションで被覆されている基板を含む。幾つかの実施形態において、増殖は繁殖を含む。幾つかの実施形態において、増殖は、他の細胞型と比較して、特定の段階の癌細胞により試料を過密にするのに十分である。幾つかの実施形態において、ここで、特定の転移段階の癌細胞は、原発性腫瘍、リンパ節、もしくは臓器部位への転移からのものである、または小細胞肺癌細胞である。幾つかの実施形態において、キットは更に細胞培地を含む。
【００５９】
幾つかの実施形態において、キットは、特定の段階の癌細胞の存在量を評価する手段を更に含む。幾つかの実施形態において、特定の転移段階の癌細胞は、乳癌細胞である。
【００６０】
本発明は、複数の異なる細胞型が少なくとも１つの目的の細胞型を含む、複数の異なる細胞型の細胞を含有する試料を基板と接触させたとき、目的の細胞型の細胞が、目的の細胞型の細胞を試料中の他の細胞から単離するのに十分な相互作用のセットを、コレクション中のＥＣＭ成分と形成することを特徴とする、ＥＣＭ成分のコレクションで被覆されている基板を含む、癌の病期を診断するキットであって、細胞外マトリックス成分のコレクションが、アグリンおよびコラーゲンＩＶ、アグリンおよびフィブリン、ビグリカンおよびコラーゲンＩＩ、ビグリカンおよびフィブリン、コラーゲンＩおよびトロンボスポンジン−４、コラーゲンＩＩおよびデコリン、コラーゲンＩＩおよびテネイシン−Ｃ、コラーゲンＩＩおよびテスチカン２、コラーゲンＩＩＩおよびコラーゲンＶＩ、コラーゲンＩＩＩおよびトロンボスポンジン−４、コラーゲンＩＶおよびガレクチン４、コラーゲンＩＶおよびＳＰＡＲＣ、コラーゲンＩＶおよびビトロネクチン、コラーゲンＶおよびガレクチン１、コラーゲンＶＩおよびガレクチン３、フィブリンおよびガレクチン３ｃ、フィブリンおよびガレクチン４、フィブリンおよびケラチン、フィブリンおよびオステオポンチン、フィブリンおよびＳＰＡＲＣ、ｆ−スポンジンおよびフィブロネクチン、フィブロネクチンおよびガレクチン３、フィブロネクチンおよびガレクチン８、フィブロネクチンおよびラミニン、および／またはフィブロネクチンおよびテスチカン１から選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む、キットを更に提供する。
【００６１】
幾つかの実施形態において、細胞外マトリックス成分のコレクションは、アグリンおよびコラーゲンＩＩ、アグリンおよびラミニン、ビグリカンおよびコラーゲンＩＩ、ブレビカンおよびフィブロネクチン、コラーゲンＩおよびテスチカン２、コラーゲンＩＩおよびコラーゲンＩＶ、コラーゲンＩＩおよびラミニン、コラーゲンＩＩおよびナイドジェン−１、コラーゲンＩＩおよびテスチカン２、コラーゲンＩＩＩおよびガレクチン８、コラーゲンＩＩＩおよびスーパーフィブロネクチン、コラーゲンＶおよびフィブロネクチン、コラーゲンＶおよびガレクチン１、コラーゲンＶＩおよびフィブロネクチン、コラーゲンＶＩおよびナイドジェン−１、コラーゲンＶＩおよびテネイシン−Ｃ、デコリンおよびフィブロネクチン、デコリンおよびガレクチン８、デコリンおよびラミニン、エラスチンおよびガレクチン４、フィブリンおよびガレクチン３、フィブロネクチンおよびガレクチン１、フィブロネクチンおよびガレクチン３、フィブロネクチンおよびガレクチン４、フィブロネクチンおよびムチン、フィブロネクチンおよびＳＰＡＲＣ、フィブロネクチンおよびテスチカン２、ガレクチン１およびガレクチン３、ガレクチン１およびケラチン、ガレクチン３およびヘパラン硫酸塩、ガレクチン３およびスーパーフィブロネクチン、ガレクチン４およびナイドジェン−１、ガレクチン８およびテネイシン−Ｃ、ケラチンおよびラミニン、ラミニンおよびメロシン、ラミニンおよびトロンボスポンジン−４、ＳＰＡＲＣおよびスーパーフィブロネクチン、ならびに／またはスーパーフィブロネクチンおよびテスチカン１から選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｅは、細胞外マトリックスマイクロアレイプラットフォームを例示する。（１Ａ）ＥＣＭアレイが、ほぼ８００個の異なる組み合わせのＥＣＭ成分を、ポリアクリルアミドにより被覆されたガラススライドにスポットし、続いて細胞をスライドに接種することによって生成される、本発明の例示的な実施形態である。
【図１Ｂ】（１Ｂ）ポリアクリルアミドは、広範囲の分子量の分子を捕捉するように作用する。
【図１Ｃ】（１Ｃ）タンパク質が増加分子量で捕獲されることの、蛍光測定の確認である。
【図１Ｄ】（１Ｄ）免疫標識またはＮＳＨ−フルオレセイン標識による、全ての分子の存在の確認である。
【図１Ｅ】（１Ｅ）核染色により細胞周期相および細胞計数について、染色されたＥＣＭの位置への選択的接着を左側パネルにおいて示す、ＥＣＭスポットへの細胞接着の代表的な画像である。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｆは、転移性の進行における主な接着変化を同定する、例示的なＥＣＭアレイを示す。（２Ａ）ＥＣＭアレイを使用して生成された、例示的な接着プロファイルの非管理階層クラスター化である。図２Ｂ（ａ〜ｅ、これは２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、および２Ｆにも対応する）において、腫瘍接着は、腫瘍進行の関数としてスポットされる。縦軸は、示されているＥＣＭ成分の異なる組み合わせを表す。横軸は、異なる細胞系を表す。明灰色棒は、原発性腫瘍を表す。暗灰色棒は、結節または遠位転移を示す。個別のＥＣＭ成分の４つの発生段階のそれぞれからの腫瘍細胞系の接着であり、細胞接着は、図２Ｂ（または左上パネルには２Ｂａと示されている）に拡大して現れており、２Ｃ（または２Ｂｂと示されている）に更に拡大して現れる。図２Ｄ（または左側の中央パネルには２Ｂｃと示されている）は、ＥＣＭ成分の全ての組み合わせを示し、接着セットの１つのポリペプチドがスライドのｙ軸に表され、接着セットの第２のポリペプチドがスライドのｘ軸に表される。腫瘍進行の全体における接着の最大増加および減少（線形回帰により決定される）との組み合わせが、図２Ｅ（または右側の３つのパネルに２Ｂｄと示されている）において示されている。図２Ｅ（または右側の３つのパネルに２Ｂｄと示されている）は、転移性の原発性腫瘍細胞系と比較した、それぞれの組み合わせに対する転移性細胞系の平均接着を示す。図２Ｆ（または、下側パネルに２Ｂｅと示されている）は、それぞれの組み合わせにおける３９３Ｍ１と、整合する原発性腫瘍系３９３Ｔ５との接着の比較を示す。明灰色ドットは、転移性の原発性腫瘍系よりも転移系による優先的な接着を示す上位の組み合わせを示す。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【図３Ａ】原発性系譜に由来する細胞試料からのマウス肺腺癌の接着シグネチャーを示し、これらの細胞試料は、性質としてより転移性であることが注目された。図３Ａは、上記の実施例２と同様にスポットおよび接種されたＥＣＭアレイを示し、次に、細胞系の４つの分類のそれぞれの細胞系を分析するために使用した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、腫瘍進行（ｘ軸）に対する細胞系に関して、ＥＣＭ成分単独（左側縦列）、組み合わせ（中央列）、および接着セットの上位の組み合わせ（右側縦列）の正規化接着値を示す。棒が高いほど、列記されたＥＣＭ成分へに接着が多く（ｙ軸）、それに対して、低い棒は低いレベルの接着を示す。
【図３Ｃ】野生型と転移性の細胞系譜に基づいた、ＥＣＭ成分への接着の確認を示し、３つのＥＣｍ接着セット（明灰色または中空円）が、高い接着値を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、フィブロネクチン／ガレクチン−３、フィブロネクチン／ラミニン、およびフィブロネクチンおよびガレクチン−８の組み合わせへの増加した結合の傾向を示し、本発明者たちが、全てのＴｎｏｎＭｅｔ、ＴＭｅｔ、Ｎ、およびＭ細胞系の平均接着を比較したとき、腫瘍進行の全体にわたって一貫していた。
【図３Ｅ】同上。
【図４Ａ】腫瘍担持肺におけるＥＣＭ蓄積の有意な存在を明らかにした、広範囲の腫瘍量を有する肺のトリクローム染色を示す。
【図４Ｂ】図４Ｂは、免疫組織学データのまとめを示し、原発性腫瘍型、リンパ節に転移した腫瘍、および遠位臓器部位に移動した転移の全体を染色しているＥＣＭ成分を示す図４Ａに表されている。
【図５Ａ】列記されたＥＣＭ成分に応答する多様な細胞系の接着シグネチャーと比較した、同族インテグリンＲＮＡ転写を示す。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図６Ａ】図６Ａは、３９３Ｔ５（ＴＭｅｔ）および３９３Ｍ１（Ｍ）細胞系におけるインテグリン表面発現のフローサイトメトリーを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、肝臓およびリンパ節への自然転移を有する自発性腫瘍を担持するマウスにおける転移関連インテグリンを示す。スケールバーは、１００μｍである。
【図６Ｃ】同上。
【図７Ａ】肺細胞の転移性タンパク質ネットワークを示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、原発性腫瘍の腺癌細胞のタンパク質ネットワークを示す。
【図８Ａ】短ヘアピン仲介ＲＮＡ干渉を使用してα３およびβ１サブユニット（それぞれ、Ｉｔｇａ３およびＩｔｇｂ１）の両方のノックダウン実験を示す。
【図８Ｂ】図８Ｂは、接着に関する別のノックダウン実験を示す。図８Ｂは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的にする対照ヘアピンと比較したとき、インビトロにおける転移関連分子への低減された接着を示す。
【図８Ｃ】図８Ｃは、処理動物の肝臓の表面における表面腫瘍の数を測定することにより、対照ノックダウンと比較したα３インテグリンの短ヘアピン仲介ＲＮＡ干渉で処理したマウスにおける肝臓転移接種を示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、３９３Ｍ１−ｓｈα３細胞を注入したマウスの肝臓試料を示す。
【図８Ｅ】同上。
【図９Ａ】図９Ａは、ヒト肺試料におけるＥＣＭ成分の相対強度を示す。
【図９Ｂ】図９Ｂは、悪性リンパ、遠位悪性腫瘍、および悪性肺の試料にわたって、ヒト肺腺癌系におけるＥＣＭ成分の染色レベルを示す。
【図１０Ａ】転移性の性質を有する乳腺上皮細胞と比較した野生型乳腺上皮細胞の接着プロファイルを示す。図１０Ａは、野生型乳腺上皮細胞の接着プロファイルを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａは、（下記に定義されるＥＭＴを受けて）ねじれを発現する転移性乳腺上皮細胞の接着プロファイルを示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、転移性乳腺上皮細胞と比較した、野生型における最高差次接着を示すＥＣＭ成分を示す。
【図１１Ａ】最高レベルの転移性乳腺上皮細胞の繁殖に関与するＥＣＭ成分を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは最高レベルの正常な乳腺上皮細胞の増殖に関与するＥＣＭ成分を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、野生型対転移性の乳腺上皮細胞における増殖の刺激に最大差次を有するＥＣＭ成分を示す。
【図１２Ａ】（ＥＭＴを受けた転移性細胞が遠位臓器において表現型をコロニー形成転移に変換するシグナルとしての）Ｅ−カドヘリンへの刺激に関与するＥＣＭ成分を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、移動性の転移性ヒト上皮細胞表現型からコロニー形成転移性ヒト上皮細胞への変換に関与する上位の接着セットを示す。
【図１３Ａ】細胞分化に関連する主な接着変化を同定する例示的なＥＣＭアレイを示す。図１３において、上側パネルでは、横軸は異なるＥＣＭ成分の組み合わせを表す。縦軸は、異なる細胞系を表す。図１３の上側パネルにおける、間葉幹細胞（ＭＳＣ）の骨形成および脂肪生成分化の際の、ＥＣＭアレイにより生成された接着プロファイルの非管理階層クラスター化。図１３の下側パネルにおける、ヒト誘導性多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の肝臓への分化の際の、ＥＣＭアレイにより生成された非管理階層クラスター化。
【図１３Ｂ】同上。
【図１３Ｃ】同上。
【図１３Ｄ】同上。
【図１４Ａ】ＥＣＭアレイにおける肝臓および膵臓系譜へのマウス胚幹（ＥＳ）細胞の分化プロファイルの棒グラフを示す。異なるＥＣＭ成分の組み合わせにおける核および分化マーカーの発現が示されている。
【図１４Ｂ】同上。
【図１５Ａ】間葉幹細胞の培養および繁殖における主な接着分子を同定する例示的なＥＣＭアレイを示す。  細胞の単離および発現。図１５Ｃは、異なる細胞個体群の代表的なＥＣＭ島を示す。アレイへの接種の前の、ＭＳＣのインビトロ分化により得られたＭＳＣまたはＭＳＣ誘導性骨形成および脂肪生成前駆体。細胞では、核（暗灰色）およびアクチン（明灰色）を染色した。
【図１５Ｂ】図１５Ｂの左側パネルは、ＭＳＣ接着プロファイルを示す。左側パネルは、ＥＣＭアレイへのＭＳＣ接着のヒートマップを示す。それぞれの軸はＥＣＭ成分を表し、交差点は、アレイに存在するＥＣＭの組み合わせである。図１５Ｂの右側パネルは、上位２０個のＭＳＣの接着組み合わせを示す。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、異なるＥＣＭの組み合わせが異なる細胞骨格組織をどのように誘導するかを示す。図１５Ｃの左上パネルは、２日間の培養の後、ＥＣＭアレイにおけるＭＳＣの免疫蛍光画像を示す。図１５Ｃの右上パネルは、ＥＣＭアレイに対するＭＳＣの接着プロファイルを示す。ヒートマップは、スポット毎の細胞の数を表す。図１５Ｃの下側パネルは、ＥＣＭアレイにおけるＭＳＣの拡大図を示し、特定のＥＣＭの組み合わせの０日目からの折り畳みの増加をｘ軸に示す。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、経時的な分化細胞の変化のＭＳＣ接着プロファイルの、脂肪生成および骨形成分化の際のＭＳＣの接着プロファイルを示す。
【図１５Ｅ】同上。
【図１５Ｆ】同上。
【図１６Ａ】非平板培養性幹細胞を平板培養するための主な接着分子を同定する例示的なＥＣＭアレイを示す。（１６、左側パネル）異なるロットの非平板培養性肝細胞においてＥＣＭアレイにより生成された接着プロファイルの非管理階層クラスター化。横軸は、異なるＥＣＭの組み合わせを表す。縦軸は、異なる細胞系を表す。（１６、右上パネル）非平板培養性肝細胞のそれぞれのロットにおける上位ＥＣＭ組み合わせ。（１６Ｃ、または右側中央パネル）全ての非平板培養性肝細胞ロットにおけるコラーゲンＩおよびアグレカン促進接着。（１６Ｄ、または右下パネル）全ての非平板培養性肝細胞ロットにおけるコラーゲンＩＶおよびナイドジェン−１促進接着。
【図１６Ｂ】同上。
【図１６Ｃ】同上。
【図１６Ｄ】同上。
【図１７Ａ】ヒトＥＳ／ｉＰＳｃ細胞の拡大、自己再生、および分化のための主な接着分子を同定する例示的なＥＣＭアレイの使用を示す。図１７Ａは、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞の接着を促進し、且つ多能性マーカーｔｒａ１−６０、ｓｓｅａ４、およびｏｃｔ３／４の発現を維持するＥＣＭ成分の組み合わせを示す。
【図１７Ｂ】ポリスチレンプレートに吸着したＥＣＭの組み合わせが、スライド全体にわたって多量にスポットされたのと同じように、且つ典型的なマトリゲル培養増殖と比較して、多能性表現型を維持することを示す。図１７Ｂの左上パネルは、選択されたＥＣＭの組み合わせにおいて５０継代にわたって培養されたｈＩＰＳＣの相画像を示す。図１７Ｂの右上パネルは、ＥＣＭの組み合わせにおける５０継代にわたるｏｃｔ３／４−ｓｓｅａ４−ｔｒａ１−６０の陽性ｈＩＰＳＣ培養物の率を示す。図１７Ｂの中央パネルは、ＥＣＭの組み合わせにおいて１０継代にわたって培養されたｈＩＰＳＣのｏｃｔ３／４−ｓｓｅａ４−ｔｒａ１−６０の免疫蛍光画像を示す。図１７Ｂの左下パネルでは、少なくとも１０継代のｏｃｔ３／４−ｓｓｅａ４−ｔｒａ１−６０の発現により示されるように、ＥＣＭの組み合わせは、限定培地におけるｈＩＰＳＣの自己再生を支持する。図１７Ｂの下側中央パネルは、限定培地条件下のＥＣＭの組み合わせにおけるｈＩＰＳＣ細胞の相画像を示す。図１７Ｂの右下パネルは、ＥＣＭの組み合わせがｈＥＳＣの自己再生を支持すること、および異なるｈＩＰＳＣ系ＥＣＭ成分の組み合わせが、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞の長期拡大を支持することを示す。ＥＣＭ成分の組み合わせは、限定培地においてヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞の長期拡大を支持する。
【図１７Ｃ】ＥＣＭの組み合わせにおいて培養されたｈＩＰＳＣが、多能性および多系譜分化の可能性を維持することを示す。左側パネルは、ｈＩＰＳＣが、ＥＣＭの組み合わせにおいて１０継代にわたって培養された後、インビボで奇形腫をどのように形成し得るかを示す。図１７Ｃの中央パネルは、ＥＣＭの組み合わせにおいて１０継代にわたって培養された後、同じｈＩＰＳＣが正常な核型をどのように維持するかを示す。図１７Ｃの右側パネルは、ＥＣＭの組み合わせにおいて培養された後、ｈＩＰＳＣがどのように胚様体を形成し、３つの胚葉から細胞を生成し得るかを示す。
【図１７Ｄ】ＥＣＭ成分が、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞（ｈｉＰＳＣ）の、肝臓系譜、心臓および神経系譜への分化をどのように支持するかを示す。分化は、ＥＣＭの組み合わせにおける１０継代後に多系譜にむかって生じ（左上および右上）、ｈＩＰＳＣは、肝臓系譜に向かって分化し、アルブミン（右上）およびα１抗トリプシン（中央右、縦軸のＡ１ＡＴ）を産生し、ｎｋｘ２．５の発現（左上パネル、中央染色列）、ミオシン重鎖  左上パネル、下側染色列）、およびカルシウムシグナルへの応答性（左下パネル）により示される心臓系譜、神経系譜への分化は、β−チューブリンの発現により確認される（右下パネル）。
【図１７Ｅ】特定のＥＣＭの組み合わせが多能性表現型の維持にとって重要であることを示す。コラーゲンＩおよびラミニン単独は、多能性を維持することができない（右上パネル）。コラーゲンＩＩ単独、またはコラーゲンＩＩとガレクチン−８は、ｈＩＰＳＣ自己再生を支持しない（左上中央パネル）。コラーゲンＩＶ単独は、ｈＩＰＳＣ自己再生を支持しない（右上中央パネル）。ガレクチン炭化水素ドメインをＬａｃＮａｃにより遮断することは、多能性の損失を誘発する（右上パネル）。特定のＥＣＭの組み合わせも、限定培地条件下において重要である（左下および中央下パネル）。インテグリンサブユニットの遮断は、特定のＥＣＭの組み合わせへの細胞接着の低減を誘発する（右下パネル）。
【図１７Ｆ】同上。
【図１７Ｇ】同上。
【図１７Ｈ】同上。
【図１７Ｉ】同上。
【図１７Ｊ】同上。
【図１７Ｋ】同上。
【図１７Ｌ】同上。
【図１７Ｍ】同上。
【図１７Ｎ】同上。
【図１７Ｏ】同上。
【図１７Ｐ】同上。
【図１７Ｑ】同上。
【図１７Ｒ】同上。
【図１７Ｓ】同上。
【図１７Ｔ】同上。
【図１７Ｕ】同上。
【図１７Ｖ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
本発明の方法および他の態様に関する多様な用語が、明細書および特許請求の範囲の全体にわたって使用される。そのような用語には、特に示されない限り、当該技術における通常の意味が与えられる。他の特定的に定義された用語は、本明細書に提供された定義に一致した方法で解釈されるべきである。
【００６４】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特に内容から明白に示されない限り、複数の対象を含む。
【００６５】
用語「約」は、本明細書で使用されるとき、量、時間の継続などのような測定可能な値を参照する場合、特定の値の±２０％、±１０％、±５％、±１％、または±０．１％の変動を包含することを意味し、そのような変動は開示されている方法を実施するには適している。
【００６６】
用語「指定可能な位置」は、本明細書で使用されるとき、生体材料または細胞を含む試料への１個または複数の接着セットの十分な時間にわたる曝露が、細胞または生体材料と接着セットとの接触をもたらすように、１個または複数の接着セットが固定化または吸収されている固体支持体上の別個の表面領域または位置を意味する。幾つかの実施形態において、本発明は、約１０ナノメートルの幅または直径を有する、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置を含むアレイに関する。幾つかの実施形態において、本発明は、約２０ナノメートルの幅または直径を有する、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置を含むアレイに関する。幾つかの実施形態において、本発明は、約３０ナノメートルの幅または直径を有する、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置を含むアレイに関する。幾つかの実施形態において、本発明は、約４０ナノメートルの幅または直径を有する、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置を含むアレイに関する。幾つかの実施形態において、本発明は、約５０ナノメートルの幅または直径を有する、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置を含むアレイに関する。幾つかの実施形態において、本発明は、約６０ナノメートルの幅または直径を有する、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置を含むアレイに関する。幾つかの実施形態において、本発明は、約７０ナノメートルの幅または直径を有する、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置を含むアレイに関する。幾つかの実施形態において、本発明は、約８０ナノメートルの幅または直径を有する、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置を含むアレイに関する。幾つかの実施形態において、本発明は、約９０ナノメートルの幅または直径を有する、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置を含むアレイに関する。幾つかの実施形態において、本発明は、約１００ナノメートルの幅または直径を有する、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置を含むアレイに関する。幾つかの実施形態において、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置は、直径が２５０ナノメートル以下である。幾つかの実施形態において、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置は、直径または幅が１２０ナノメートル以下である。幾つかの実施形態において、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置は、直径または幅が８０ナノメートル以下である。幾つかの実施形態において、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置は、直径または幅が７０ナノメートル以下である。幾つかの実施形態において、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置は、直径または幅が６０ナノメートル以下である。幾つかの実施形態において、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置は、直径または幅が５０ナノメートル以下である。幾つかの実施形態において、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置は、直径または幅が４０ナノメートル以下である。幾つかの実施形態において、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置は、直径または幅が３０ナノメートル以下である。幾つかの実施形態において、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置は、直径または幅が２０ナノメートル以下である。幾つかの実施形態において、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置は、直径または幅が１０ナノメートル以下である。幾つかの実施形態において、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置は、直径または幅が約１０ナノメートルから直径または幅が約１００ナノメートルである。幾つかの実施形態において、アレイにおける１つまたは複数の指定可能な位置は、手作業によりピペットでスポットされる、またはロボット装置により自動的にスポットされる。
【００６７】
本明細書で使用されるとき、用語「結合する」、「結合」、「接着する」、「接着された」、「接着性」などの用語は、一般に、例えば、基、化合物、または接着セットを、物理的吸収、化学的結合などのプロセス、またはこれらの組み合わせなどにより表面に固定化または固定することを意味する。
【００６８】
用語「接着セット」は、本明細書で使用されるとき、表面の別個の指定可能な位置に共有的または非共有的に固定化されているタンパク質またはタンパク質の機能性フラグメントを含む、少なくとも２つのポリペプチドを意味する。幾つかの実施形態において、接着セットは、一対のポリペプチドまたはその機能性フラグメントを含む。幾つかの実施形態において、接着セットは表面の別個の位置に共有的または非共有的に結合している複数のポリペプチドまたはその機能性フラグメントを含む。幾つかの実施形態において、接着セットは表面の別個の位置に共有的または非共有的に結合している３つ以上のポリペプチドまたはその機能性フラグメントを含む。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、用語「動物由来ＥＣＭ材料」は、ヒトを含む動物種により産生された、に由来する、またはから供給されるタンパク質、多糖、多糖により修飾されたポリペプチド、またはこれらの群を含む、細胞外マトリックスまたはこれらに由来する生体材料の任意の巨大分子成分を意味する。
【００７０】
用語「接着値」は、本明細書で使用されるとき、対照組織により計算された定量値に対して正規化した場合、接着値を対象の診断、予後、または臨床治療プランの予測モデルに使用できるように、特定の細胞または細胞試料が、特定の量のタンパク質を発現する、または発現しないかの基準として使用され得る単一定量値を意味する。幾つかの実施形態において、接着値は、基準または対照試料の計算された定量値に対して正規化した場合、接着値を対象の診断、予後、または臨床治療プランの予測モデルに使用できるように、特定の細胞または細胞試料が、特定の量のタンパク質とどのように緊密または容易に会合（もしくは、結合）する、またはしないかの基準として使用され得る単一定量値を意味する。幾つかの実施形態において、定量値は、本明細書に開示されている解釈関数またはアルゴリズムを介して、細胞または細胞試料と１個または少なくとも複数の接着セットとの会合に関する定量的データを組み合わせることによって、計算される。幾つかの実施形態において、対象は、転移性癌を有すると疑われる、発生する危険性がある、または有すると診断されている。幾つかの実施形態において、対象は、転移性肺癌、または転移性乳癌を有すると疑われる、発生する危険性がある、または有すると診断されている。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、用語「生検材料」は、分析のために、対象または患者から取り出された細胞試料、細胞のコレクション、または組織を意味する。幾つかの実施形態において、生検材料は、骨髄生検材料、パンチ生検材料、内視鏡生検材料、針生検材料、薄切り生検材料、切開生検材料、切除生検材料、または外科的切除である。
【００７２】
本明細書で使用されるとき、用語「電子媒体」は、ハードディスク、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、ＲＡＭ、フラッシュメモリー、不揮発性メモリー、または任意の実質的および機能的に同等の媒体を含む、アクセスに電子技術を用いる任意の物理的記憶域を意味する。幾つかの実施形態において、ソフトウエア記憶域は、本発明の実施形態を実施するプロセッサーと同じ場所に配置され得る、または少なくとも一部ソフトウエア記憶域は、遠隔的に配置され得るが、必要なときに利用可能であり得る。
【００７３】
本明細書で使用されるとき、用語「過剰増殖性疾患」は、細胞の過剰増殖により特徴付けられる疾患および障害を参照することを意味する。過剰増殖性疾患の例には、全形態の癌、乾癬、新形成、および過形成が含まれる。
【００７４】
本明細書で使用されるとき、「配列同一性」は、２つの配列にＢＬＡＳＴを実施する独立実行型ＢＬＡＳＴエンジンプログラムの使用により決定され（ｂｌ２ｓｅｑ）、これらは、ディフォルトパラメーターの使用により国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のｆｔｐサイトから検索され得る（Ｔａｔｕｓｏｖａ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，１９９９，１７４，２４７−２５０；これはその全体が参照として本明細書に組み込まれる）。
【００７５】
用語「対象」は、細胞試料が採取される動物を記載するために、本明細書全体にわたって使用される。幾つかの実施形態において、動物はヒトである。ヒトのような特定の対象に特定的な状態の診断では、用語「患者」が交換可能に使用され得る。本発明の記載における幾つかの場合において、用語「患者」は、特定の疾患または障害を罹患しているヒト患者を意味する。幾つかの実施形態において、対象は、過剰増殖性疾患を有すると疑われる、または発生する危険性があると同定されているヒトであり得る。幾つかの実施形態において、対象は、悪性癌を有すると診断され得、転移性の過剰増殖性疾患を有し得る、または発生する危険性があると同定され得る。幾つかの実施形態において、対象は、乳癌または肺癌を有すると疑われる、または有すると診断されている。幾つかの実施形態において、対象は、肺癌または乳癌を有すると疑われる、または発生する危険性があると同定されているヒトであり得る。幾つかの実施形態において、対象は、単離細胞試料の供給源として機能する哺乳動物であり得る。幾つかの実施形態において、対象は、細胞試料が単離または提供される非ヒト動物であり得る。用語「哺乳動物」は、ヒトおよび非ヒトの両方を包含し、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、およびブタが含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
本明細書で使用されるとき、「保存的」アミノ酸置換は、下記の表Ａ、Ｂ、またはＣに記載されているように定義され得る。機能亢進トランスポサーゼには、保存的置換が、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾により導入されたものが含まれる。アミノ酸は、物理的特性、ならびに二次および三次タンパク質構造への寄与に応じて分類され得る。保存的置換は、１つのアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸による置換として、当該技術において認識されている。例示的な保存的置換は、表Ａに記載されている。
【００７７】
【表Ａ】
2015514396.tif 000003
【００７８】
あるいは、保存的アミノ酸は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９７５），ｐｐ．７１−７７）に記載されているように分類され得、表Ｂに記載されている。
【００７９】
【表Ｂ】
2015514396.tif 000004
【００８０】
あるいは、例示的な保存的置換は、表Ｃに記載されている。
【００８１】
【表Ｃ】
2015514396.tif 000005
【００８２】
本明細書に記載されている細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列を含むポリペプチドは、１個以上のアミノ酸残基の挿入、欠失、もしくは置換、またはこれらの組み合わせ、ならびにアミノ酸残基の挿入、欠失、もしくは置換、またはこれらの組み合わせ以外の修飾を担持するポリペプチドを含むことが意図されることが、理解されるべきである。
【００８３】
本明細書で使用されるとき、用語「予測する」は、疾患の推定される経過および結果を決定することを意味する。
【００８４】
本明細書で使用されるとき、用語「機能性フラグメント」は、フラグメントが基づいている野生型ポリペプチドに類似している、または実質的に類似している生物学的機能を少なくとも部分的に保持するのに十分な長さである、ポリペプチドの任意の部分を意味する。幾つかの実施形態において、細胞外マトリックスと関連するポリペプチドの機能性フラグメントは、表１に開示されているポリペプチドのいずれかと８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を含み、且つ表１のポリペプチドに結合する１つまたは複数のリガンドへの少なくとも部分的な結合親和性を保持するのに十分な長さを有するポリペプチドである。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００個の連続するアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約５０個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約１００個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約１５０個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約２００個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約２５０個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約３００個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約３５０個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約４００個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約４５０個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約５００個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約５５０個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約６００個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約６５０個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約７００個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約７５０個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約８００個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約８５０個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約９００個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約９５０個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約１０００個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約１０５０個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約１２５０個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約１５００個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約１７５０個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約２０００個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約２２５０個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約２５００個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約２７５０個のアミノ酸の長さを有する。幾つかの実施形態において、フラグメントは、表１に開示されている任意のポリペプチドのフラグメントであり、少なくとも約３０００個のアミノ酸の長さを有する。
【００８５】
本明細書で使用されるとき、用語「細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列」は、任意の多細胞生物の細胞により天然に産生されている、且つＥＣＭ成分である、またはその構造がＥＣＭ成分に基づいている任意の巨大分子（例えば、糖分子または巨大分子）により修飾または非修飾されている任意のポリペプチドまたはそのフラグメントを意味する。幾つかの実施形態において、細胞外マトリクスと関連するポリペプチド配列は、ポリペプチド配列が表１に開示されているポリペプチドのいずれかを含む任意のポリペプチドである。幾つかの実施形態において、細胞外マトリクスと関連するポリペプチド配列は、表１に開示されているポリペプチドのいずれかを含む任意のポリペプチド配列、または表１に開示されているポリペプチドと８５、９０、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の配列同一性を共有する配列、またはこれらの機能性フラグメントである。幾つかの実施形態において、細胞外マトリクスと関連するポリペプチド配列は、表１に開示されているポリペプチドのいずれかから、または表１に開示されているポリペプチドと８５、９０、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の配列同一性を共有する配列からなる。
【００８６】
本明細書に使用されるとき、用語「異物無含有」培地は、ヒト組織またはヒト試料から誘導および／または単離されたタンパク質または他の巨大分子を除いて、動物血清、または動物由来成分もしくは巨大分子を含まない細胞培養培地を意味する。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されているアレイ、系、キット、または組成物は、異物無含有培地を含む。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている方法は、異物無含有培地の存在下で細胞（例えば、幹細胞）を培養または接触させるステップを含む。幾つかの実施形態において、アレイまたは系は、動物由来ＥＣＭ材料を含まない。幾つかの実施形態において、アレイまたは系またはキットは、異物無含有培地を含む。幾つかの実施形態において、アレイまたは系またはキットは、動物由来成分を含まない培地を含む。幾つかの実施形態において、系またはアレイは、ヒトを除いて、動物に由来する任意の巨大分子を含まない。幾つかの実施形態において、系またはアレイは、動物に由来する任意の巨大分子を含まない。
【００８７】
本明細書で使用されるとき、用語「動物由来成分を含まない培地」は、ヒトを含む動物種により産生された、に由来する、またはから供給されるタンパク質、多糖、多糖により修飾されたポリペプチド、またはこれらの群を含む、細胞外マトリックスまたはこれらに由来する生体材料の任意の巨大分子成分を含まない任意の細胞培地を意味する。幾つかの実施形態において、動物由来成分を含まない培地は、植物由来成分を含む。幾つかの実施形態において、動物由来成分を含まない培地は、合成ＥＣＭ成分のみを含む。幾つかの実施形態において、動物由来成分を含まない培地は、植物由来成分または巨大分子を含まない。幾つかの実施形態において、動物由来成分を含まない培地は、任意のヒト由来ＥＣＭ材料または成分を含まない。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されているアレイ、系、キット、または組成物は、動物由来成分を含まない培地を含む。幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている方法は、動物由来成分を含まない培地の存在下で細胞（例えば、幹細胞）を培養または接触させるステップを含む。
【００８８】
接着シグネチャー：「接着シグネチャー」は、この用語が本明細書で使用されるとき、目的の特定の細胞または細胞型を１つ以上の異なる細胞または細胞型から特徴決定または区別するのに十分なＥＣＭ結合親和性値のセット（または、値の範囲）を意味する。幾つかの実施形態において、接着シグネチャーは、少なくとも１個のＥＣＭ成分の結合親和性値または範囲を含み、幾つかの実施形態において、接着シグネチャーは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０個、またはそれ以上の異なるＥＣＭ成分および／これらの組み合わせの結合親和性値または範囲を含む。幾つかの実施形態において、接着シグネチャーは、基準もしくは対照細胞、または基準細胞試料の結合の量、強度、存在、不在に対する、１個以上の接着セットへの、細胞試料中の細胞の細胞結合の量、強度、存在、不在に関して、本明細書に開示されているアレイまたは系の使用者により収集されるデータのコレクションである。幾つかの実施形態において、接着シグネチャーは、１個以上の接着セットに結合する細胞の、同じ１個以上の接着セットに結合する基準細胞または対照細胞の量または割合と比較した量または割合に関して、本明細書に開示されているアレイまたは系の使用者により収集されるデータのコレクションである。幾つかの実施形態において、接着値は、細胞試料中の細胞を蛍光色素または他の蛍光マーカーにより染色した後、蛍光顕微鏡法を介して１個以上の接着セットに結合している細胞の数を測定することによって定量化される。
【００８９】
「細胞型」は、細胞が誘導もしくは供給される生物、臓器、および／もしくは組織型、発生の状態、表現型、または別の細胞と「類似している」もしくは「異なっている」と定義される基礎を適切に形成する特定の細胞の任意の他の分類を意味する。
【００９０】
親和性：当該技術において知られているように、「親和性」は、特定のリガンドが、そのパートナーと、結合する（例えば、非共有的に会合する）緊密度、および／または解離する割合もしくは頻度の測度である。当該技術において知られているように、多様な技術のいずれかを利用して、親和性を決定することができる。多くの実施形態において、親和性は、特異的結合の測度を表す。幾つかの実施形態において、結合親和性は、細胞とＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分のコレクションとの結合の測度である。幾つかの実施形態において、細胞とＥＣＭ成分との結合親和性は、細胞と他のＥＣＭ成分との結合親和性と比べて表される。幾つかの実施形態において、細胞とＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分のコレクションとの相対的結合親和性は、アッセイした細胞とＥＣＭ成分またはＥＣＭ成分のコレクションとの全ての結合親和性の平均に対する倍変化として表される。幾つかの実施形態において、相対的結合親和性は、０である。幾つかの実施形態において、相対的結合親和性は、０〜１である。幾つかの実施形態において、相対的結合親和性は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍またはそれ以上である。幾つかの実施形態において、相対的結合親和性は、０〜−１である。幾つかの実施形態において、相対的結合親和性は、−１、−２、−３、−４、−５、−６、−７、−８、−９、−１０倍またはそれ以上である。
【００９１】
アグレカンポリペプチド：本発明によると、用語「アグレカンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）アグレカンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【００９２】
アグリンポリペプチド：本発明によると、用語「アグリンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）アグリンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【００９３】
抗体：本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、天然、または完全もしくは部分的に合成的に産生された任意の免疫グロブリンを意味する。幾つかの実施形態において、抗体は、それぞれ可変領域および定常領域を含む４つの完全長ポリペプチド鎖から構成される複合体であり、例えば、実質的に、Ｂ細胞により天然に産生される抗体の構造である。幾つかの実施形態において、抗体は単一鎖である。幾つかの実施形態において、抗体はラクダ様である。幾つかの実施形態において、抗体は抗体フラグメントである。幾つかの実施形態において、抗体はキメラである。幾つかの実施形態において、抗体は二重特異性である。幾つかの実施形態において、抗体は多特異性である。幾つかの実施形態において、抗体は単クローン性である。幾つかの実施形態において、抗体は多クローン性である。幾つかの実施形態において、抗体は接合している（すなわち、他のタンパク質、放射標識、細胞毒素と接合または融合している抗体）。幾つかの実施形態において、抗体はヒト抗体である。幾つかの実施形態において、抗体はマウス抗体である。幾つかの実施形態において、抗体はウサギ抗体である。幾つかの実施形態において、抗体はラット抗体である。幾つかの実施形態において、抗体はロバ抗体である。
【００９４】
アレイ：「アレイ」は、この用語が本明細書で使用されるとき、典型的には、互いに空間的に別個の位置にあり、通常、配置された実体の、潜在的な相互作用パートナー（例えば、細胞）または他の試薬、基板などへの同時暴露を可能にするフォーマットである、実体（例えば、ＥＣＭ成分）の配置を意味する。幾つかの実施形態において、アレイは、固体支持体上の空間的に別個の位置に配置された実体を含む。幾つかの実施形態において、アレイ上の空間的に別個の位置は、（形状に関わりなく）「スポット」と呼ばれる。幾つかの実施形態において、アレイ上の空間的に別個の位置は、互いに規則的なパターンで（例えば、格子に）配置されている。
【００９５】
ビグリカンポリペプチド：本発明によると、用語「ビグリカンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）ビグリカンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【００９６】
結合パートナー：一般的に、用語「結合パートナー」は、所定の文脈において互いに特異的に結合する任意の２つの実体を意味するために本明細書において使用される。幾つかの実施形態において、結合は、結合剤がその環境において他の潜在的な結合パートナーよりも標的結合パートナーとより大きな親和性を有するという点において特異的である。結合パートナーは、任意の化学型であり得る。幾つかの実施形態において、結合パートナーはポリペプチドである。幾つかの実施形態において、結合パートナーは、インテグリン、シンデカン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、および／またはレクチンである。幾つかの実施形態において、結合パートナーは炭水化物である。
【００９７】
ブレビカンポリペプチド：本発明によると、用語「ブレビカンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）ブレビカンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【００９８】
コラーゲンＩポリペプチド：本発明によると、用語「コラーゲンＩポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）コラーゲンＩタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【００９９】
コラーゲンＩＩポリペプチド：本発明によると、用語「コラーゲンＩＩポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）コラーゲンＩＩタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１００】
コラーゲンＩＩＩポリペプチド：本発明によると、用語「コラーゲンＩＩＩポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）コラーゲンＩＩＩタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１０１】
コラーゲンＩＶポリペプチド：本発明によると、用語「コラーゲンＩＶポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）コラーゲンＩＶタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１０２】
コラーゲンＶポリペプチド：本発明によると、用語「コラーゲンＶポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）コラーゲンＶタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１０３】
コラーゲンＶＩポリペプチド：本発明によると、用語「コラーゲンＶＩポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）コラーゲンＶＩタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１０４】
特徴：本明細書で使用されるとき、用語「特徴」は、匹敵する細胞型と区別することを可能にする細胞型の任意の検出可能な特徴を意味する。幾つかの実施形態において、特徴は、遺伝子の量または配列である。幾つかの実施形態において、特徴は、遺伝子転写物の量または配列である。幾つかの実施形態において、特徴は、タンパク質の量、配列、または修飾である。幾つかの実施形態において、特徴は、炭水化物の量である。幾つかの実施形態において、特徴は、小分子の量である。幾つかの実施形態において、特徴は、ＥＣＭ成分の量である。
【０１０５】
匹敵する：本明細書で使用されるとき、用語「匹敵する」は、比較を可能にするほど十分に類似しているが、少なくとも１つの特徴が異なっている２つの実体を意味するために使用される。
【０１０６】
デコリンポリペプチド：本発明によると、用語「デコリンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）デコリンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１０７】
ＥＣＭ成分：本発明によると、用語「ＥＣＭ成分」は、細胞のＥＣＭの一部であり、且つ細胞の１つ以上の接着シグネチャーに寄与する任意の細胞または細胞複合体を意味するために使用される。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分はポリペプチドである、またはを含む。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は多糖である、またはを含む。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分はグリコサミノグリカンである、またはを含む。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分はプロテオグリカンである、またはを含む。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は炭水化物である、またはを含む。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、本明細書に開示されているポリペプチド、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、または炭水化物の任意のフラグメントである。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、表１に開示されているポリペプチドのいずれかと少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を共有するポリペプチドである。
【０１０８】
エラスチンポリペプチド：本発明によると、用語「エラスチンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）エラスチンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１０９】
Ｆ−スポンジンポリペプチド：本発明によると、用語「Ｆ−スポンジンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）Ｆ−スポンジンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１１０】
フィブリンポリペプチド：本発明によると、用語「フィブリンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）フィブリンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１１１】
フィブロネクチンポリペプチド：本発明によると、用語「フィブロネクチンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）フィブロネクチンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１１２】
ガレクチン１ポリペプチド：本発明によると、用語「ガレクチン１ポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）ガレクチン１タンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１１３】
ガレクチン３ポリペプチド：本発明によると、用語「ガレクチン３ポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）ガレクチン３タンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１１４】
ガレクチン３ｃポリペプチド：本発明によると、用語「ガレクチン３ｃポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）ガレクチン３ｃタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１１５】
ガレクチン４ポリペプチド：本発明によると、用語「ガレクチン４ポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）ガレクチン４タンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１１６】
ガレクチン８ポリペプチド：本発明によると、用語「ガレクチン８ポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）ガレクチン８タンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１１７】
グリコサミノグリカン：本発明によると、用語「グリコサミノグリカン」は、反復二糖単位からなる非分岐鎖多糖を意味するために使用される。反復単位は、ヘキソサミンに結合している、ヘキソースまたはヘキスロン酸からなる。
【０１１８】
ケラチンポリペプチド：本発明によると、用語「ケラチンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）ケラチンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１１９】
キット：本明細書で使用されるとき、用語「キット」は、材料を送達する送達系の文脈において提供される成分のセットを意味する。そのような送達系には、例えば、多様な診断用または治療用試薬（例えば、適切な容器中のオリゴヌクレオチド、酵素、細胞外マトリックス成分など）および／または支持材料（例えば、緩衝液、培地、細胞、アッセイを実施するための書面の使用説明書など）を１つの場所から別の場所に貯蔵、輸送、または送達することを可能にする系が含まれ得る。例えば、幾つかの実施形態において、キットは、関連する反応試薬および／または支持材料を含有する１つ以上の閉鎖容器（例えば、ボックス）を含む。本明細書で使用されるとき、用語「細分化キット」は、それぞれキットの全成分の一部分を含有する２つ以上の別々の容器を含む送達系を意味する。容器を、意図される受容者に一緒または別々に送達することができる。例えば、第１の容器は細胞培養アッセイに使用されるペトリ皿またはポリスチレンプレートを含有することができ、一方、第２の容器は細胞を含有することができる。用語「細分化キット」は、これに限定されないが、米連邦食品・医薬品・化粧品法の第５２０（ｅ）条により規制されている分析物特異的試薬（ＡＳＲ）を含有するキットを包含することが意図される。事実、それぞれキットの全成分の一部分を含有する２つ以上の別々の容器を含む任意の送達系は、用語「細分化キット」に含まれる。対照的に、「組み合わせキット」は、全ての成分を単一容器（例えば、所望の各成分を収容する単一ボックス）に含有する送達系を意味する。用語「キット」には、細分化と組み合わせの両方のキットが含まれる。
【０１２０】
ラミニンポリペプチド：本発明によると、用語「ラミニンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）ラミニンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１２１】
系譜：本発明によると、用語「系譜」は、特定の細胞型の未分化細胞から完全に分化した細胞の、発生過程における任意の時点の細胞を包含する。
【０１２２】
メロシンポリペプチド：本発明によると、用語「メロシンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）メロシンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１２３】
ムチンポリペプチド：本発明によると、用語「ムチンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）ムチンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１２４】
ナイドジェン−１ポリペプチド：本発明によると、用語「ナイドジェン−１ポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）ナイドジェン−１タンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１２５】
ナイドジェン−２ポリペプチド：本発明によると、用語「ナイドジェン−２ポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）ナイドジェン−２タンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１２６】
オステオポンチンポリペプチド：本発明によると、用語「オステオポンチンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）オステオポンチンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１２７】
ポリペプチド：用語「ポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、一般に、少なくとも３個のアミノ酸のポリマーの当該技術に認められている意味を有する。当業者は、用語「ポリペプチド」が、本明細書に列挙されている全配列を有するポリペプチドのみならず、そのような完全なポリペプチドの機能性フラグメント（すなわち、少なくとも１つの活性を保持するフラグメント）を表すポリペプチドも包含するほど十分に一般的であることが意図されることを理解する。更に、当業者は、タンパク質配列が、活性を破壊することなく幾つかの置換を耐容することを理解する。したがって、活性を保持し、且つ同じ部類の別のポリペプチドと、全体的な配列同一性を、少なくとも約３０〜４０％、多くの場合に約５０％、６０％、７０％、または８０％を超えて共有し、更には通常少なくとも１つの更に高い同一性の領域を含み、通常少なくとも３〜４個、多くの場合に２０個以上までのアミノ酸を包含する１つ以上の高度に保存された領域において、多くの場合に９０％、または９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％さえも超えて共有する任意のポリペプチドは、本明細書で使用されるとき、関連用語「ポリペプチド」の範囲内に包含される。
【０１２８】
基準細胞：文脈から理解されるように、基準細胞または細胞型は、関連する比較を可能にするために目的の特定の細胞または細胞型と十分に類似しているものである。幾つかの実施形態において、基準細胞または細胞型についての情報は、特定の細胞または細胞型についての情報と同時に得られる。幾つかの実施形態において、基準細胞または細胞型についての情報は、歴史的なものである。幾つかの実施形態において、基準細胞または細胞型についての情報は、例えば、コンピューター読み取り可能媒体に記憶されている。幾つかの実施形態において、目的の特定の細胞または細胞型と、基準細胞または細胞型との比較は、基準に対する目的の特定の細胞または細胞型の同一性、類似性、または差異を確立する。
【０１２９】
試料：本明細書で使用されるとき、用語「試料」は、本明細書に記載されている目的の供給源から得られる、または誘導される生物学的試料を意味する。幾つかの実施形態において、目的の供給源は、動物またはヒトのような生物体を含む。幾つかの実施形態において、生物学的試料は、生物学的組織または流体を含む。幾つかの実施形態において、生物学的試料は、骨髄；血液；血球；腹水；組織または細針生検試料；細胞含有体液、遊離遊走性核酸；痰；唾液；尿；脳脊髄液、腹腔水；胸膜液；糞便；リンパ液；婦人科学的流体；皮膚拭き取り検体；膣内拭き取り検体；口腔拭き取り検体；鼻腔内拭き取り検体；管洗浄液または気管支肺胞洗浄液のような洗浄液；吸引液；そぎ取り物；骨髄試験片；組織生検材料試験片；外科的試験片；糞便、他の体液、分泌物、および／または排泄物、ならびに／あるいはこれらからの細胞などであり得る、または含み得る。幾つかの実施形態において、生物学的試料は、個体から得た細胞である、またはそれを含む。幾つかの実施形態において、試料は、適切な方法により目的の供給源から直接的に得た「一次試料」である。例えば、幾つかの実施形態において、一次生物学的試料は、生検（例えば、微細針吸引または組織生検）、体液の外科的収集（例えば、血液、リンパ液、糞便など）などからなる群から選択される方法により得られる。幾つかの実施形態において、文脈から明らかなように、用語「試料」は、一次試料をプロセスする（例えば、１つ以上の成分を除去する、および／または１つ以上の薬剤を添加する）ことにより得られる調製物を意味する。例えば、半透膜を使用する濾過。そのような「プロセスされた試料」は、例えば、試料から抽出された、または一次試料をｍＲＮＡの増幅または逆転写、特定の成分の単離および／または精製などのような技術に付すことにより得た、核酸またはタンパク質を含み得る。
【０１３０】
スーパーフィブロネクチンポリペプチド：本発明によると、用語「スーパーフィブロネクチンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）スーパーフィブロネクチンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１３１】
ＳＰＡＲＣ／オステオネクチンポリペプチド：本発明によると、用語「ＳＰＡＲＣ／オステオネクチンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）ＳＰＡＲＣ／オステオネクチンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１３２】
テネイシン−Ｃポリペプチド：本発明によると、用語「テネイシン−Ｃポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）テネイシン−Ｃタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１３３】
テネイシン−Ｒポリペプチド：本発明によると、用語「テネイシン−Ｒポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）テネイシン−Ｒタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１３４】
テネイシン１／ＳＰＯＣＫ１ポリペプチド：本発明によると、用語「テネイシン１／ＳＰＯＣＫ１ポリペプチド」は、1）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）テネイシン１／ＳＰＯＣＫ１タンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１３５】
テネイシン２／ＳＰＯＣＫ２ポリペプチド：本発明によると、用語「テネイシン２／ＳＰＯＣＫ２ポリペプチド」は、1）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）テネイシン２／ＳＰＯＣＫ２タンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１３６】
トロンボスポンジン−４ポリペプチド：本発明によると、用語「トロンボスポンジン−４ポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）トロンボスポンジン−４タンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１３７】
ビトロネクチンポリペプチド：本発明によると、用語「ビトロネクチンポリペプチド」は、１）全体的なレベルで配列同一性を共有する、および／または２）ビトロネクチンタンパク質と少なくとも１つの特徴的な配列要素、例えば付録の表１に記載されたものを共有する、ポリペプチドを意味するために使用される。
【０１３８】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）
多くの有意な細胞成分が、細胞の外側表面上のゼラチン層である細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に存在する。ＥＣＭは、細胞成分の足場として役立つこと、ならびに細胞内情報伝達および組織分化に関与する生化学的および機械的な合図を提供することを含む、多様な重要な役割を果たす。ＥＣＭは、典型的には細胞内で産生され、次に分泌されたＥＣＭを形成するプロテオグリカンおよび線維性タンパク質を含む。
【０１３９】
異なる細胞型のＥＣＭは、非常に多様である。例えば、異なる種類の線維芽細胞の異なるＥＣＭ組成は、結合組織の特性を決定する。軟骨細胞は、軟骨を形成する、コラーゲンＩＩから主に構成されるＥＣＭを分泌し、一方、骨芽細胞は、骨組織の前駆体である、類骨から主に構成されるＥＣＭを分泌する。多様性は、細胞と、細胞が位置する微環境との相互作用により、発生の際に作り出される。
【０１４０】
構造的支持を提供することに加えて、ＥＣＭの別の重要な役割は、特にインテグリンを介した細胞内情報伝達である。インテグリンは、ＥＣＭへの細胞の結合を調節し、且つＥＣＭからの細胞内シグナルと細胞の内側に伝達する、細胞表面受容体である。特有のＥＣＭ組成を有することに加えて、それぞれ対応する細胞型は、特定のＥＣＭと最適に相互作用するため、細胞表面インテグリンおよび他の受容体の個別化されたプロファイルも有する。したがって、ＥＣＭ組成および細胞のＥＣＭ成分への親和性は、遺伝子的に同一な細胞型を識別する潜在的に有用な方法を表す。
【０１４１】
細胞外マトリックス成分
本発明は、一般に、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分への細胞の親和性を具現化または特徴決定する接着シグネチャーの定義および／または使用に関する。
【０１４２】
幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、ＥＣＭに存在する任意のポリペプチドである、またはを含む。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、アグレカンポリペプチド、アグリンポリペプチド、ビグリカンポリペプチド、ブレビカンポリペプチド、コラーゲンＩポリペプチド、コラーゲンＩＩポリペプチド、コラーゲンＩＩＩポリペプチド、コラーゲンＩＶポリペプチド、コラーゲンＶポリペプチド、コラーゲンＶＩポリペプチド、デコリンポリペプチド、エラスチンポリペプチド、ｆ−スポンジンポリペプチド、フィブリンポリペプチド、フィブロネクチンポリペプチド、ガレクチン１ポリペプチド、ガレクチン３ポリペプチド、ガレクチン３ｃポリペプチド、ガレクチン４ポリペプチド、ガレクチン８ポリペプチド、ケラチンポリペプチド、ラミニンポリペプチド、メロシンポリペプチド、ムチンポリペプチド、ナイドジェン−１−ポリペプチド、ナイドジェン−２ポリペプチド、オステオポンチンポリペプチド、ＳＰＡＲＣ／オステオネクチンスーパーフィブロネクチンポリペプチド、テネイシン−Ｃポリペプチド、テネイシン−Ｒポリペプチド、テネイシン１／ＳＰＯＣＫ１ポリペプチド、テネイシン２／ＳＰＯＣＫ２ポリペプチド、トロンボスポンジン−４ポリペプチド、ビトロネクチンポリペプチド、および／またはこれらの組み合わせである、またはを含む。
【０１４３】
幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、１つ以上の炭水化物部分である、またはを含む。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、細胞により産生されるＥＣＭ（例えば、ＥＣＭポリペプチド）において天然に見いだされる炭水化物の部分である、またはを含む。代表的なそのような炭水化物の部分には、例えば、ＥＣＭ成分、コンドロイチン硫酸グリコサミノグリカン、ヘパラン硫酸グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸グリコサミノグリカン、もしくはグリコサミノグリカン、および／またはこれらの組み合わせが含まれる。
【０１４４】
幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、細胞により細胞外環境に分泌されるタンパク質、ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、および／または炭水化物である、またはを含む。幾つかの実施形態において、分泌されたタンパク質、ペプチド、糖タンパク質、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、および／もしくは炭水化物、またはこれらから構成される構造は、（方向運動性の手段を提供する場合）細胞を永久的または一時的に固定化する手段として、細胞により結合され得る。
【０１４５】
ＥＣＭ成分は、典型的には、細胞表面において、またはの近くで１つ以上の実体との非共有的結合相互作用を介して、細胞と相互作用する。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分と相互作用または結合する細胞成分には、細胞膜、細胞表面実体（例えば、タンパク質、プロテオグリカン、糖タンパク質など）、分泌実体（例えば、細胞シグナル伝達分子）、ラミニン、インテグリン、シンデカン、およびアクチンからなる群から選択された実体が含まれる。
【０１４６】
細胞
多様な実施形態において、本発明は、細胞の同定、特徴決定、検出、単離、および／または培養に有用である。一般に、本発明の教示は、ＥＣＭまたはＥＣＭ成分（複数可）を有する、精製する、および／またはと相互作用する任意の細胞に関連する。
【０１４７】
幾つかの実施形態において、本発明により利用される細胞は、溶液に懸濁されたとき、生存能力および任意に増殖能力を保持する細胞である。幾つかの実施形態において、細胞は真核細胞である。幾つかの実施形態において、細胞はヒト細胞である。幾つかの実施形態において、細胞はマウス細胞である。幾つかの実施形態において、細胞は、細胞培養物から得られる。幾つかの実施形態において、細胞は、生きている生物体から得られる。幾つかの実施形態において、細胞は肝細胞である。幾つかの実施形態において、細胞は免疫細胞である。特定の実施形態において、細胞は血球である。幾つかの実施形態において、細胞は神経細胞である。特定の実施形態において、細胞は上皮細胞である。特定の実施形態において、細胞は生殖細胞である。幾つかの実施形態において、細胞は幹細胞である。幾つかの実施形態において、細胞は癌細胞である。幾つかの実施形態において、細胞試料は、個別の細胞を含む。幾つかの実施形態において、細胞試料は、複数の細胞を含む組成物である。幾つかの実施形態において、細胞試料は、癌を有すると疑われる、または癌を有すると診断される対象から採取された組織試料である。幾つかの実施形態において、細胞試料は、肺癌または乳癌を有する対象から採取された組織試料である。幾つかの実施形態において、細胞試料は、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、脊椎、乳房、子宮頸部、胆嚢、神経節、胃腸管、胃、結腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、または子宮のからの複数の細胞を含む。幾つかの実施形態において、細胞試料は、肺に由来する複数の細胞を含む。幾つかの実施形態において、細胞試料は、乳房に由来する複数の細胞を含む。
【０１４８】
多様な実施形態において、本発明は、特定の分化状態の幹細胞の同定、特徴決定、検出、単離、および／または培養に有用である。当該技術において一般的に理解されているように、幹細胞は、多種多様な特殊細胞型に分鎖する能力を有する細胞である。異なる種類の幹細胞は、完全な未分化型（分化全能性）からほぼ分化型（多分化能）の範囲の異なる分化段階のものである。幾つかの実施形態において、幹細胞は、分化全能性幹細胞（例えば、任意の成熟細胞型に分化する能力を有する未分化細胞）である。分化全能性幹細胞には、例えば、胚幹細胞が含まれる。幾つかの実施形態において、幹細胞は、（例えば、大部分の成熟細胞型に分化する能力を有する）多能性幹細胞である。多能性幹細胞には、例えば、誘導された多能性幹細胞が含まれる。幾つかの実施形態において、幹細胞は、（例えば、幾つかの関連する細胞型に分化する能力を有する）多分化能幹細胞である。多分化能性幹細胞には、例えば、間葉幹細胞が含まれる。幾つかの実施形態において、間葉幹細胞は、骨髄、脂肪細胞、臍帯血、および／または臍帯に由来する。特定の実施形態において、本発明により利用される細胞は、幹細胞から分化される細胞である。
【０１４９】
多様な実施形態において、本発明は、一般に癌細胞、とりわけ特定の転移状態の癌細胞の同定、特徴決定、検出、単離、および／または培養に有用である。当該技術において一般的なように、転移は、初期腫瘍部位からの癌の拡大過程であり、癌患者の不十分な予後と相関する。転移細胞は、転移する能力と直接的に相関する変更された遺伝子発現プロファイルにより特徴決定される（Ｒａｍａｓｗａｍｙ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．“Ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ”．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３３（１）：４９−５４，２００３）。癌細胞の種類には、肺腺癌細胞、非転移性原発性腫瘍細胞、転移性原発性腫瘍細胞、転移性リンパ節細胞、転移性肝臓細胞、乳癌細胞、結腸癌細胞、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、精巣癌細胞、および／または白血病細胞が含まれるが、これらには限定されない。
【０１５０】
本発明の特定の実施形態によると、細胞は、細胞をＥＣＭ成分に結合させるのに十分な条件下および時間にわたってＥＣＭ成分と接触する。特定の実施形態において、接触した細胞は、溶液に懸濁される。幾つかの実施形態において、細胞は、１００〜１０，０００，０００個の細胞／ｍｌ、１，０００〜１，０００，０００個の細胞／ｍｌ、または１０，０００〜１００，０００個の細胞／ｍｌの範囲の濃度で懸濁される。１つの例示的な実施形態において、細胞は、８００，０００個の細胞／ｍｌの濃度で懸濁される。特定の実施形態において、細胞およびＥＣＭ成分は、培養培地の存在下で接触する。１つ以上の細胞型または細胞系の生存および／または増殖を支持する、複合培地および／または無血清培養培地を含む多様な細胞培養培地のいずれかを、本開示に従って使用することができる。典型的には、細胞培養培地は、緩衝液、塩、エネルギー供給源、アミノ酸、ビタミン、および／または微量元素を含有する。細胞培養培地は、任意に、炭素供給源、補助因子、脂質、糖、ヌクレオシド、動物由来コモノマー、加水分解産物、ホルモン／増殖因子、界面活性剤、指示薬、ミネラル、特定の酵素のための活性化剤／阻害剤、および有機物、ならびに／または小分子代謝産物を含むが、これらに限定されない多様な他の成分を含有し得る。
【０１５１】
特定の実施形態において、本発明により利用される細胞培養培地は、無血清細胞培養培地である、またはを含む。特定の実施形態において、利用される細胞培養培地は、完全限定合成細胞培養培地である。特定の実施形態において、利用される細胞培養培地は、ダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＮ）である。特定の実施形態において、利用される細胞培養培地は、ＲＰＭＩ、ＨａｍのＦ−１２、または乳腺上皮細胞増殖培地（ＭＥＧＭ）である。幾つかの実施形態において、細胞培養培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清（ＢＳ）、および／もしくはグルタミン、またはこれらの組み合わせを含む追加の成分を含む。幾つかの実施形態において、利用される培地には、汚染を防止するために抗生物質が補充される。そのような状況に有用な抗生物質には、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン、および／またはゲンタマイシン、ならびにこれらの組み合わせが含まれる。当業者は、適切な細胞培養培地の選択に関連するパラメーターを良く知っている。
【０１５２】
系およびアレイ
多くの実施形態において、アレイは、その表面にＥＣＭ成分が空間的に別個な位置で固定されている固体支持体を含む。そのようなアレイは、（例えば、組み換え的に産生された、生化学的に単離された、市販されている、などの）任意の供給源からのＥＣＭ成分を使用して調製され得る。更に、個別のＥＣＭ成分の素性および相対量は、特定の計画の要件または特定の研究者の興味に従って決定または調整され得る。
【０１５３】
例えば、多くの実施形態において、可能な限り多くの異なるＥＣＭ成分を含むＥＣＭアレイを設計、調製、および／または利用することが望ましい。代替的に、または追加的に、幾つかの実施形態において、特定の細胞または細胞型と会合する（または会合しない）ことが知られているＥＣＭ成分のみを含むＥＣＭアレイを設計、調製、および／または利用することが望ましいことがある。幾つかの特定の例を挙げると、幾つかの実施形態において、異なるＥＣＭ成分を含有する少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上の「スポット」（物理的に別個の位置）を含有するＥＣＭアレイが利用される。幾つかの実施形態において、約１〜約１００，０００個のスポット、約１００〜約１０，０００個、または約１，０００〜約５，０００個のスポットを含有するＥＣＭアレイが利用される。
【０１５４】
幾つかの実施形態において、アレイ上のスポットは、空間的構造を示す。幾つかの実施形態において、アレイ上のスポットは、格子に配置される。
【０１５５】
幾つかの実施形態において、多様なＥＣＭ成分およびこれらの組み合わせは、ＥＣＭアレイのスポットで表され、それぞれのスポットは、ＥＣＭアレイ上の既知の位置とＥＣＭ成分の既知の組成の両方に対応する。特定の実施形態において、少なくとも１個のＥＣＭ成分がＥＣＭアレイにスポットされる。特定の実施形態において、ＥＣＭ成分は、個別にスポットされる。幾つかの実施形態において、いくつかのＥＣＭ成分の混合物が、単一スポットに含有される。幾つかの実施形態において、本発明により使用されるＥＣＭアレイは、単一ＥＣＭ成分のスポットおよびＥＣＭ成分の組み合わせのスポットの両方を含む。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、アレイが複製スポットを含むように、同じアレイに複数回スポットされる。幾つかの実施形態において、本発明に従って使用されるＥＣＭアレイは、ＥＣＭ成分を欠いているスポットを含有し、したがって、例えば、ＥＣＭ成分を含有するスポットに加えて、陰性対照として利用され得る。特定の実施形態において、ローダミンデキストランが、陰性対照スポットに含まれる。
【０１５６】
本発明に従って使用されるＥＣＭアレイは、任意の適切な基板材料上に調製され得る。多くの実施形態において、材料は、細胞、例えば哺乳類細胞の生存能力および／または増殖を支持する。幾つかの実施形態において、ＥＣＭアレイは、ポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ポリビニル化合物（例えば、ポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ニトロセルロース、綿、ポリグルコール酸（ＰＧＡ）、セルロース、デキストラン、ゼラチン、ガラス、フルオロポリマー、フッ化エチレンプロピレン、ポリビニリデン、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン、ケイ素基板（例えば、融解石英、ポリシリコン、もしくは単一ケイ素結晶）など、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される基板材料を利用する。代替的または追加的に、金属（金、銀、チタン膜）を使用することができる。幾つかの実施形態において、ポリアクリルアミドで被覆されたアクリルスライドが使用される。
【０１５７】
幾つかの実施形態において、本発明は、細胞の培養に使用されるＥＣＭアレイを提供する。幾つかの実施形態において、細胞の培養に使用されるＥＣＭアレイは、培地を備える。幾つかの実施形態において、細胞の培養に使用されるＥＣＭアレイは、１、２、３、４、５日間、またはそれ以上にわたって細胞培養物を支持するのに十分な量の培地を備える。
【０１５８】
幾つかの実施形態において、本発明は、診断アッセイに使用されるＥＣＭアレイを提供する。幾つかの実施形態において、ＥＣＭアレイは、診断または検出キットの一部として提供される。幾つかの実施形態において、ＥＣＭアレイは、検出キットの一部として提供される。特定の実施形態において、本発明に従って使用されるキットは、１つ以上の基準試料、使用説明書（例えば、試料をプロセスするため、試験を実施するため、結果を解釈するため、など）、培地、および／または試験の実施に必要な他の試薬を含み得る。
【０１５９】
本発明は、ポリペプチドのアレイであって、アレイが固体支持体および複数の接着セットを含み、それぞれの接着セットが、細胞外マトリックスまたはその機能性フラグメントと関連するポリペプチド配列を含む２つ以上の異なるポリペプチドを含み、接着セットが、アレイの位置指定可能な位置で固体支持体に結合している、ポリペプチドのアレイを提供する。幾つかの実施形態において、固体は、任意にポリマーで被覆されているスライドである。幾つかの実施形態において、固体支持体は、ポリマーで被覆されている。幾つかの実施形態において、ポリマーはポリアクリルアミドである。幾つかの実施形態において、固体支持体は、ポリスチレン（ＴＣＰＳ）、ガラス、石英、石英ガラス、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）、ポリエチレン、ポリ二フッ化ビニル（ＰＶＤＦ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリオレフィン、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリビニルフェノール、ならびにこれらのコポリマーおよび混合物から選択される材料である。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の接着セットは、固体支持体に結合している２つの異なるポリペプチドを含む。
【０１６０】
本発明は、１個または複数のアレイを含む系であって、１個または複数のアレイが固体支持体および複数の接着セットを含み、それぞれの接着セットが、細胞外マトリックスまたはその機能性フラグメントと関連するポリペプチド配列を含む２つ以上の異なるポリペプチドを含み、接着セットが、アレイの位置指定可能な位置で固体支持体に結合している、系に更に関する。幾つかの実施形態において、１個または複数のアレイは、固体支持体を含み、任意にポリマーで被覆されているスライドである。幾つかの実施形態において、固体支持体は、ポリマーで被覆されている。幾つかの実施形態において、１個または複数のアレイは、ポリアクリルアミドであるポリマーで被覆されている固体支持体を含む。幾つかの実施形態において、１個または複数のアレイは、ポリスチレン（ＴＣＰＳ）、ガラス、石英、石英ガラス、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）、ポリエチレン、ポリ二フッ化ビニル（ＰＶＤＦ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリオレフィン、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリビニルフェノール、ならびにこれらのコポリマーおよび混合物から選択される材料を含む固体支持体を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１個の接着セットは、固体支持体に結合している２つの異なるポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、その中に１個または複数の固体支持体が取り付けられている少なくとも１個の容器を含む、水平に位置している、または実質的に水平に位置している仕切りを含む。幾つかの実施形態において、系は、少なくとも１個の容器および少なくとも１個のガスケットを、ガスケットが１個または複数のアレイと仕切りの間に取り付けられるように含む、水平に位置している、または実質的に位置している仕切りを含む。幾つかの実施形態において、系は、系の上側部分および下側部分を画定する、水平に位置している、または実質的に水平に位置している仕切りを含み、仕切りは、その中に１個または複数のアレイが取り付けられている少なくとも１個の容器および少なくとも１個のガスケットを、ガスケットがアレイと仕切りの間に位置するように含む。幾つかの実施形態において、系は、（ｉ）系の上側部分および下側部分を画定する、水平に位置している、または実質的に水平に位置している仕切りであって、その中に１個または複数のアレイが取り付けられている少なくとも１個の容器および少なくとも１個のガスケットを、ガスケットがアレイと仕切りの間に位置するように含む、仕切りと、（ｉｉ）仕切りに対して直角に位置している一対の側壁と、（ｉｉｉ）仕切り、一対の側壁、および底部が空洞を画定するように、一対の側壁の間に位置している空気入口を含む底部であって、空気入口が、流体を系の上側部分から下側部分に引き抜くことができる真空を、その中を通して引き抜くコネクターを受けるように適合されている、底部と、を含む。幾つかの実施形態において、系は、（ｉ）系の上側部分および下側部分を画定する、水平に位置している、または実質的に水平に位置している仕切りであって、その中に１個または複数のアレイが取り付けられている少なくとも１個の容器および少なくとも１個のガスケットを、ガスケットがアレイと仕切りの間に位置するように含む、仕切りと、（ｉｉ）仕切りに対して直角に位置している一対の側壁と、（ｉｉｉ）仕切り、一対の側壁、および底部が空洞を画定するように、一対の側壁の間に位置している空気入口を含む底部であって、空気入口が、流体を系の上側部分から下側部分に引き抜くことができる真空を、その中を通して引き抜くコネクターを受けるように適合されている、底部と、を含む。幾つかの実施形態において、系は、空気入口に嵌まるように適合された管を介して底部に動作可能に連結されている真空ポンプを含む。
【０１６１】
本発明は、本明細書に記載されている少なくとも１、２、３、または４つのアレイを含む系に関する。本発明は、また、少なくとも１つのアレイの指定可能な位置に別個に位置している少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、または７８０個の接着セットを含む少なくとも１つのアレイを含む系に関する。幾つかの実施形態において、系は、動物由来ＥＣＭ材料、胚線維芽細胞、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞から蓄積された材料、またはこれらの任意の組み合わせを含まない。幾つかの実施形態において、アレイは、任意の動物種から誘導または供給された血清を含まない。幾つかの実施形態において、系は、少なくとも１つのアレイを含み、少なくとも１つのアレイは、表１のポリペプチドまたはその機能性フラグメントから選択された細胞外マトリックスと会合する少なくとも１つのポリペプチドを含む３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、８２５個、またはそれ以上の接着セットを含む。
【０１６２】
幾つかの実施形態において、系は、固体支持体上の別個の指定可能な位置に１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、または８２５個以上の接着セットを固定することを含むステップにより調製される、少なくとも１つのアレイを含む。
【０１６３】
幾つかの実施形態において、系は、固体支持体上の別個の指定可能な位置に１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、または８２５個以上の接着セットを固定することを含むステップにより調製される、少なくとも１つのアレイを含み、接着セットは、表１のポリペプチドから選択される、細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列またはその機能性フラグメントをそれぞれ含む少なくとも２つ以上のポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、系は、（ｉ）固体支持体上の別個の指定可能な位置に１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、または８２５個以上の接着セットを固定することを含むステップにより調製される、患者の障害の診断または予後のために少なくとも１つのアレイを含む。幾つかの実施形態において、系は、（ｉ）固体支持体上の別個の指定可能な位置に１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、または８２５個以上の接着セットを固定することを含むステップにより調製される、患者の障害の診断または予後のために少なくとも１つのアレイを含み、接着セットは、表１のポリペプチドから選択される、細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列またはその機能性フラグメントをそれぞれ含む少なくとも２つ以上のポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、系は、（ｉ）固体支持体をポリマーで被覆することと、（ｉｉ）固体支持体上の別個の指定可能な位置に１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、６２５、６５０、６７５、７００、７２５、７５０、７７５、８００、または８２５個以上の接着セットを固定することと、を含むステップにより調製される、固体支持体を含む少なくとも１つのアレイを含み、接着セットは、表１のポリペプチドから選択される、細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列またはその機能性フラグメントをそれぞれ含む少なくとも２つ以上のポリペプチドを含む。
【０１６４】
幾つかの実施形態において、系は、少なくとも１個の接着セットを固体支持体に固定することを含むステップにより調製される、固体支持体を含む少なくとも１つのアレイを含み、接着セットは、表１のポリペプチドから選択される、細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列またはその機能性フラグメントをそれぞれ含む少なくとも２つ以上のポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、系は、少なくとも１個の接着セットを固体支持体に固定することを含み、接着セットが、表１のポリペプチドから選択される、細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列またはその機能性フラグメントをそれぞれ含む少なくとも２つ以上のポリペプチドを含み、固体支持体が、ポリスチレン（ＴＣＰＳ）、ガラス、石英、石英ガラス、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）、ポリエチレン、ポリ二フッ化ビニル（ＰＶＤＦ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリオレフィン、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリビニルフェノール、およびこれらのコポリマー混合物から選択される材料を含むステップにより調製される、固体支持体を含む少なくとも１つのアレイを含む。
【０１６５】
幾つかの実施形態において、系は、（ｉ）第１および第２の溶液を調製することであって、第１および第２の溶液が、それぞれ、細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列またはその機能性フラグメントを含む既知の濃度のポリペプチドを含むことと、（ｉｉ）第１および第２の溶液を、細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列またはその機能性フラグメントを含むポリペプチドが固体支持体に吸着するのに十分な時間、固体支持体と接触させることと、を含むステップにより調製される、固体支持体を含む少なくとも１つのアレイを含み、細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列またはその機能性フラグメントは、表１のポリペプチドから選択される。幾つかの実施形態において、系は、（ｉ）第１および第２の溶液を調製することを含み、第１および第２の溶液が、それぞれ、細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列またはその機能性フラグメントを含む既知の濃度のポリペプチドを含むことと、（ｉｉ）第１および第２の溶液を、細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列またはその機能性フラグメントを含むポリペプチドが固体支持体に吸着するのに十分な時間、固体支持体と接触させることと、を含むステップにより調製される、固体支持体を含む少なくとも１つのアレイを含み、細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列またはその機能性フラグメントは、表１のポリペプチドから選択され、固体支持体は、ポリスチレン（ＴＣＰＳ）、ガラス、石英、石英ガラス、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）、ポリエチレン、ポリ二フッ化ビニル（ＰＶＤＦ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリオレフィン、エチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリ（メタ）アクリル酸、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリビニルフェノール、およびこれらのコポリマー混合物から選択される材料を含む。
【０１６６】
幾つかの実施形態において、系は、（ｉ）第１および第２の溶液を調製することであって、第１および第２の溶液が、それぞれ、細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列またはその機能性フラグメントを含む既知の濃度のポリペプチドを含むことと、（ｉｉ）第１および第２の溶液を、細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列またはその機能性フラグメントを含むポリペプチドを固体支持体に吸収させるのに十分な時間、固体支持体と接触させることと、を含むステップにより調製される、固体支持体を含む少なくとも１つのアレイを含み、細胞外マトリックスと関連するポリペプチド配列またはその機能性フラグメントは、表１のポリペプチドから選択され、溶液を調製するステップ、および溶液を固体支持体と接触させるステップは、少なくとも１つのアレイ上に存在する接着セットの数に応じて少なくとも７００回繰り返される。幾つかの実施形態において、第１および第２の溶液を固体支持体と接触させる１回以上の反復ステップは、細胞外マトリックスと関連するポリペプチドまたはそのフラグメントを含むそれぞれのポリペプチドが、少なくとも１つのアレイ上の別個の指定可能な位置に吸収されるように自動化装置により実施される。
【０１６７】
接着シグネチャー
本発明は、１つ以上の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分への細胞の親和性を具現化する「接着シグネチャー」により細胞が同定および／または特徴決定され得るという認識を包含する。幾つかの実施形態において、接着シグネチャーには、目的の特定の細胞もしくは細胞型を基準細胞もしくは細胞型と比較する、ならびに／または他の細胞もしくは細胞型に対して特定の細胞もしくは細胞型を同定、特徴決定、および／もしくは区別するのに十分な結合情報が含まれる。
【０１６８】
幾つかの実施形態において、接着シグネチャーは、アグレカン、アグリン、ビグリカン、ブレビカン、コンドロイチン硫酸塩、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ、デコリン、エラスチン、ｆ−スポンジン、フィブリン、フィブロネクチン、ガレクチン１、ガレクチン３、ガレクチン３ｃ、ガレクチン４、ガレクチン８、ヘパラン硫酸塩、ヒアルロン酸、ケラチン、ラミニン、メロシン、ムチン、ナイドジェン−１、ナイドジェン−２、オステオポンチン、ＳＰＡＲＣ／オステオネクチン、スーパーフィブロネクチン、テネイシン−Ｃ、テネイシン−Ｒ、テスチカン１／ＳＰＯＣＫＩ、テスチカン２／ＳＰＯＣＫ２、トロンボスポンジン−４、ビトロネクチン、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上のＥＣＭ成分の不在、存在、および／または結合相互作用のレベルに関する情報を含む。
【０１６９】
幾つかの実施形態において、接着シグネチャーは、細胞または細胞型を、他の組織由来の匹敵する細胞または細胞型と区別する。幾つかの実施形態において、接着シグネチャーは、細胞または細胞型を、異なる発生段階（または、発生時点）の匹敵する細胞または細胞型と区別する。幾つかの実施形態において、接着シグネチャーは、細胞または細胞型を、１つ以上の疾状、障害、または状態の存在および／またはへの感受性が異なる匹敵する細胞または細胞型と区別する。幾つかの実施形態において、接着シグネチャーは、細胞または細胞型を、生理学的状態が異なる匹敵する細胞または細胞型と区別する。幾つかの実施形態において、接着シグネチャーは、細胞または細胞型を、１つ以上の環境因子（薬剤、毒素などを含む）への曝露の範囲、程度、または種類に関して異なる匹敵する細胞または細胞型と区別する。
【０１７０】
幾つかの実施形態において、接着シグネチャーの検出または決定は、細胞により産生されたＥＣＭの１つ以上の成分、および／または細胞表面に存在する（例えば、発現する、もしくは捕捉された）１つ以上の因子の素性、程度およびまたは性質についての情報を明らかにする。一例を挙げると、と細胞の接着シグネチャーにおける特定の結合相互作用の程度および／またはレベルは、例えば結合相互作用（複数可）に参加するインテグリンのような細胞表面成分の素性、程度、およびまたは性質を明らかにすることができる。
【０１７１】
幾つかの実施形態において、接着シグネチャーは、細胞または細胞型を、本明細書に開示されているアレイまたは系と接触させることと、１つ以上の接着値を定量化することと、１つ以上の接着値をまとめて、１つ以上の接着シグネチャーまたはプロファイルを作り出す、または決定することと、により決定される。幾つかの実施形態において、１つ以上の接着値を定量化するステップは、１個または複数の接着セットに結合している細胞または細胞試料に関する定量化シグナルを検出することと、対照または基準の細胞または細胞試料と比較した定量化シグナルを正規化することと、本明細書に開示されているアルゴリズムまたは解釈関数を、本明細書に開示されているアルゴリズムまたは解釈関数の結果が、１つまたは複数の接着値になるように定量化シグナルに適用することと、を含む。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されているアルゴリズムまたは解釈関数を適用するステップは、持続性コンピュータープログラム製品により実施される。幾つかの実施形態において、本明細書で開示されている方法の１つ以上のステップは、持続性のコンピューター実施方法により実施される。幾つかの実施形態において、１つ以上の接着値を定量化するアルゴリズムまたは解釈関数は、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒソフトウエア（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ＡＥ，Ｊ．Ｔ．，Ｌａｍｐｒｅｃｈｔ  ＭＲ，Ｃｌａｒｋｅ  Ｃ，Ｋａｎｇ  ＩＨ，Ｆｒｉｍａｎ  Ｏ，Ｇｕｅｒｔｉｎ  ＤＡ，Ｃｈａｎｇ  ＪＨ，Ｌｉｎｄｑｕｉｓｔ  ＲＡ，Ｍｏｆｆａｔ  Ｊ，Ｇｏｌｌａｎｄ  Ｐ，Ｓａｂａｔｉｎｉ  ＤＭ（２００６）．ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ：ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，Ｒ１００；これはその全体が参照として本明細書に組み込まれる）を使用して実施される。核は、Ｏｔｓｕ  Ｇｌｏｂａｌ閾値化法によりＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒソフトウエアの「ＩｄｅｎｔｉｆｙＰｒｉｍａｒｙＯｂｊｅｃｔｓ」モジュールを使用して同定される。塊状の物体は「Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ」を使用して区別した。幾つかの実施形態において、所定の細胞系の接着値は、所定の細胞系に対して行った複製スライドの平均を計算することにより決定される。幾つかの実施形態において、対照または基準の細胞または細胞試料と比較した接着値を正規化するステップは、階層凝集法のＳｐｏｔｆｉｒｅソフトウエアを使用した階層クラスター化により達成される。列クラスター化では、クラスター分析は、別々のクラスターに配置されたそれぞれの横列により始められる。次に、２つの横列の全ての可能な組み合わせの間の距離が、ユークリッド距離測定を使用して計算される。次に２つの最も類似したクラスターを一緒の群にして、新たらクラスターを形成する。続くステップにおいて、新たなクラスターと残りの全てのクラスターとの距離がＵＰＧＭＡ（Ｕｎｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｐａｉｒ−Ｇｒｏｕｐ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｗｉｔｈ  Ａｒｉｔｈｍｅｔｉｃ  ｍｅａｎ）法を使用して再計算される。それにより、クラスターの数が、それぞれの反復ステップにおいて１個に低減される。最終的に、全ての横列が１つの大きなクラスターに集められる。樹状図における横列の順番は、平均値重量により確定される。幾つかの実施形態において、縦列クラスター化は実施されなかった。
【０１７２】
１つまたは複数の接着値がアルゴリズムまたは解釈関数を使用して計算されると、幾つかの実施形態において、基準細胞または基準細胞試料が接触する１個または複数の接着セットに対する細胞または細胞試料の定量化結合プロファイル（接着値のコレクション）である、細胞または細胞試料の接着シグネチャーを作り出す、または決定することができる。本明細書に開示されているアレイまたは系の使用者は、続いて、細胞または細胞試料の接着シグネチャーを、１個または複数の接着対照または基準細胞と比較することができる。幾つかの実施形態において、１つまたは複数の対照試料の接着シグネチャーは、本明細書に開示されているアレイまたは系の使用者が、細胞または細胞型のシグネチャーを予め決定された、および／または分類された対照シグネチャーと比較して、細胞または細胞試料の表現型を同定または特徴決定することができるように、予め決定されている、および／または分類されている。幾つかの実施形態において、１つまたは複数の対照の接着シグネチャーは、本明細書に開示されているアレイまたは系の使用者が、細胞または細胞型のシグネチャーを予め決定された、および／または分類された対照接着シグネチャーと比較して、細胞または細胞試料が、対照接着シグネチャーとより多くまたは少なく類似している物理的特徴を有するかを定性的に評価することができるように、予め決定されている、および／または分類されている。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されているアレイまたは系の使用者、および細部または細胞試料の接着シグネチャーと、対照接着シグネチャーとの類似性または非類似性に関するプロファイルを生成する。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、転移性組織からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、癌性組織からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、前癌性組織からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、幹細胞からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、胚幹細胞からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、間葉幹細胞からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、誘導された多能性幹細胞からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、肝細胞の初代系譜からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、本明細書に開示されている細胞のいずれかに関して発生段階の細胞からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、腫瘍増殖の多様な段階からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、１個以上の誘導された多能性幹細胞からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、１個以上の間葉幹細胞からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、１個以上の骨誘導性幹細胞からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、１個以上の胚幹細胞からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、１個以上の脂肪誘導性幹細胞からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。幾つかの実施形態において、対照接着シグネチャーは、１個以上の幹細胞からの接着値のセットを定量的に記載する接着シグネチャーである。
【０１７３】
幾つかの実施形態によると、本発明は、実行されるときに接着値および／または接着シグネチャーの計算に関する操作を引き起こす、コンピューター読み取り可能記憶媒体にコード化され、且つ使用説明書（例えば、プログラム化されたスクリプトなど）を任意に含むソフトウエアコンポーネントまたは他の持続性コンピューターを提供する。幾つかの実施形態において、コンピュータープログラム製品は、実行されるとき、１つ以上の接着値を定量化する、１つ以上の接着値を対照のデータセットに対して正規化する、接着プロファイルまたはシグネチャーを作り出す、および接着プロファイルまたはシグネチャーをコンピュータープログラム製品の使用者に表示する、コンピューター読み取り可能記憶媒体にコード化されている。幾つかの実施形態において、コンピュータープログラム製品は、実行されるとき、１つ以上の接着値を計算する、１つ以上の接着値を正規化する、および接着シグネチャーを作り出す、コンピューター読み取り可能記憶媒体にコード化されており、ここでコンピュータープログラム製品は、接着シグネチャーおよび／または接着値を、使用者により操作されるディスプレーに任意に表示する。幾つかの実施形態において、本発明は、１つ以上の接着値を定量化するため、および１つ以上の接着値をコンピュータープログラム製品の使用者に表示するための使用説明書を含むコンピューター読み取り可能記憶媒体にコード化されている、持続性コンピュータープログラム製品に関する。幾つかの実施形態において、本発明は、１つ以上の接着値を定量化するため、１つ以上の接着値を対照のデータセットに対して正規化するため、および接着プロファイルまたはシグネチャーをコンピュータープログラム製品の使用者に表示するための使用説明書を含にコンピューター読み取り可能記憶媒体にコード化されている、持続性コンピュータープログラム製品を提供する。幾つかの実施形態において、１つ以上の接着値を計算するステップは、複製スポットの計数の平均および標準偏差を定量化することを含む。幾つかの実施形態において、１つ以上の接着値を計算するステップは、計数が平均を上回る、および下回る標準偏差よりも大きい、または小さいスポットをそれぞれ廃棄すること、ならびに残りの計数の平均を計算することを含む（そのような平均を「ｘ」と示す）。幾つかの実施形態において、１つ以上の接着値を対照のデータセットに対して正規化するステップは、計数がゼロより大きい計数（Ｘ）スライド上の全てのＥＣＭの組み合わせにわたる平均計数を、最初に計算することによって実施される。幾つかの実施形態において、次にそれぞれの組み合わせにおける正規化された接着値は、組み合わせの生計数の平均をスライドの非ゼロ計数により割ること（ｘ／Ｘ）によって計算される。
【０１７４】
使用
一般に、研究者および医療専門家が直面する課題は、細胞型、分化状態、および表現型を同定する、ならびに特定の細胞個体群を適切に単離および増殖する必要性である。例えば、遺伝因子と環境因子との相互作用のため、細胞の２つの下位個体群は、遺伝子的に同一であり得、ＥＣＭ成分の組成または接着のみが検出可能に異なり得る。したがって、本明細書に提供されるように、細胞の接着シグネチャーを決定する１つの利点は、研究者が以前は区別不能であった細胞個体群を区別することを可能にし得ることである。代替的または追加的に、提供される方法および組成物は、以前は利用可能ではない、または理解されていない方法で細胞の特徴決定および／または分類を可能にする。提供される方法および組成物は、細胞を互いに、および／または他の成分、材料、もしくは実体から単離または分離する基礎も提供する。
【０１７５】
本明細書に開示されているアレイ、組成物、キット、および系は、間葉幹細胞および／または誘導された多能性幹細胞の培養物を単離、拡大、分化、および維持する方法の実施を可能にする。幾つかの実施形態において、本発明は、間葉幹細胞および／または誘導された多能性幹細胞を拡大する方法であって、間葉幹細胞および／または誘導された多能性幹細胞を、少なくとも１個の接着セットを含む、本明細書に開示されているアレイ、組成物、キット、および／または系に接触させるステップを含む方法に関する。幾つかの実施形態において、接着セットは、コラーゲンＩ、ラミニン、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＶ、ガレクチン−４、ガレクチン−８、および／またはフィブロネクチンの１つまたは組み合わせから選択される細胞外マトリックスと関連するプロイペプチド配列を含むポリペプチドを含む。幾つかの実施形態において、接着セットは、コラーゲンＩおよびラミニンからなる。幾つかの実施形態において、接着セットは、コラーゲンＩＩおよびガレクチン−４からなる。幾つかの実施形態において、接着セットは、コラーゲンＩＶおよびガレクチン−４からなる。幾つかの実施形態において、接着セットは、コラーゲンＩＶおよびガレクチン−８からなる。幾つかの実施形態において、接着セットは、コラーゲンＩおよびラミニンおよびフィブロネクチンからなる。幾つかの実施形態において、接着セットは、コラーゲンＩＩおよびガレクチン−４およびフィブロネクチンからなる。幾つかの実施形態において、接着セットは、コラーゲンIVおよびガレクチン−４およびフィブロネクチンからなる。幾つかの実施形態において、接着セットは、コラーゲンIVおよびガレクチン−８およびフィブロネクチンからなる。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されているアレイ、組成物、キット、および系は、コラーゲンI、ラミニン、コラーゲンII、コラーゲンIV、ガレクチン−４、ガレクチン−８、および／またはフィブロネクチン以外の細胞外マトリックス成分と関連する任意のポリペプチド配列を含まない。幾つかの実施形態において、本明細書に開示されているアレイ、組成物、キット、および系は、インテグリンの阻害剤または拮抗薬を含む任意の培地を含まない。
【０１７６】
幾つかの実施形態において、本発明は、細胞試料を、異物無含有培地の存在下で本明細書に記載されている１つ以上の接着セットと接触させることによる、間葉幹細胞および／または誘導された多能性幹細胞の培養物を単離、拡大、分化、および維持する方法に関する。幾つかの実施形態において、本発明は、細胞試料を、動物由来成分を含まない培地の存在下で本明細書に記載されている１つ以上の接着セットと接触させることによる、間葉幹細胞および／または誘導された多能性幹細胞の培養物を単離、拡大、分化、および維持する方法に関する。幾つかの実施形態において、本発明は、細胞試料を、任意のインテグリンの任意の阻害剤を含まない培地の存在下で本明細書に記載されている１つ以上の接着セットと接触させることによる、間葉幹細胞および／または誘導された多能性幹細胞の培養物を単離、拡大、分化、および維持する方法に関する。
【０１７７】
幾つかの実施形態において、本発明は、細胞の初代系譜に由来する培養物に肝細胞を維持または培養する方法であって、本明細書に開示されているアレイまたは系のいずれかを初代肝細胞と接触させるステップを含む方法に関する。
【０１７８】
幾つかの実施形態において、本発明は、間葉幹細胞を培養する方法であって、本明細書に開示されているアレイまたは系のいずれかをＭＳＣと接触させるステップを含む方法に関する。
【０１７９】
幾つかの実施形態において、本発明は、ＭＳＣを分化する方法であって、本明細書に開示されているアレイまたは系のいずれかをＭＳＣと接触させるステップを含む方法に関する。
【０１８０】
幾つかの実施形態において、本発明は、ｉＰＳＣを心臓系譜、肝臓系譜、または神経系譜に分化する方法であって、本明細書に開示されているアレイまたは系のいずれかをｉＰＳＣと接触させるステップを含む方法に関する。
【０１８１】
幾つかの実施形態において、本発明は、ｉＰＳＣを培養する方法であって、本明細書に開示されているアレイまたは系のいずれかをｉＰＳＣと接触させるステップを含む方法に関する。
【０１８２】
幾つかの実施形態において、本発明は、培養物中に正常な乳腺上皮細胞を培養する方法であって、本明細書に開示されているアレイまたは系のいずれかを、乳腺上皮細胞を含む細胞試料と接触させるステップを含む方法に関する。
【０１８３】
幾つかの実施形態において、本発明は、培養物中に転移性の乳腺上皮細胞を培養する方法であって、本明細書に開示されているアレイまたは系のいずれかを、転移性の乳腺上皮細胞を含む細胞試料と接触させるステップを含む方法に関する。
【０１８４】
幾つかの実施形態において、本発明は、培養物中に正常な乳腺上皮細胞を繁殖させる方法であって、本明細書に開示されているアレイまたは系のいずれかを、乳腺上皮細胞を含む細胞試料と接触させるステップを含む方法に関する。
【０１８５】
幾つかの実施形態において、本発明は、培養物中に転移性の乳腺上皮細胞を繁殖させる方法であって、本明細書に開示されているアレイまたは系のいずれかを、転移性の乳腺上皮細胞を含む細胞試料と接触させるステップを含む方法に関する。
【０１８６】
幾つかの実施形態において、本発明は、ポリスチレンを含む固体支持体に吸着された本明細書に開示されている任意の１個または複数の接着セットからなるアレイまたは系またはキットに関する。
【０１８７】
幾つかの実施形態において、本発明は、本明細書に開示されている同族インテグリンのいずれかの発現を干渉する治療有効量または予防有効量の核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物に関する。幾つかの実施形態において、本発明は、本明細書に開示されている同族インテグリンのいずれかの発現を干渉する治療有効量の核酸分子と、薬学的に許容される担体とを含み、本明細書に開示されている同族インテグリンのいずれかの発現を干渉する治療有効量の核酸分子が、リンパ節から遠位臓器への癌細胞の移動を阻害する、薬学的組成物に関する。
【０１８８】
幾つかの実施形態において、本発明は、本明細書に開示されている同族インテグリンのいずれかの発現または結合を干渉する治療有効量または予防有効量のポリペプチドまたはその機能性と、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物に関する。幾つかの実施形態において、本発明は、本明細書に開示されている同族インテグリンのいずれかの発現または結合を干渉する治療有効量または予防有効量のポリペプチドまたはその機能性フラグメントと、薬学的に許容される担体とを含み、本明細書に開示されている同族インテグリンのいずれかの発現を干渉する治療有効量のポリペプチドまたはその機能性フラグメントが、リンパ節から遠位臓器への癌細胞の移動を阻害する、薬学的組成物に関する。幾つかの実施形態において、本発明は、本明細書に開示されている同族インテグリンのいずれかの発現を干渉する治療有効量または予防有効量のポリペプチドまたはその機能性ファグメントと、薬学的に許容される担体とを含み、本明細書に開示されている同族インテグリンのいずれかの発現を干渉する治療有効量のポリペプチドまたはその機能性フラグメントが、リンパ節から遠位臓器への癌細胞の移動を阻害する、薬学的組成物に関する。幾つかの実施形態において、本発明は、本明細書に開示されている同族インテグリンのいずれかの発現を干渉するポリペプチドまたはその機能性フラグメントは、抗体または抗体フラグメントである。幾つかの実施形態において、組成物は、癌細胞が由来する組織からリンパ節への癌細胞の移動を阻害するポリペプチドまたは核酸配列を含む。
【０１８９】
本発明は、本明細書に開示されているＥＣＭ成分、または本明細書に開示されているインテグリンへの、特定の同族結合対に特異的に結合する抗体または結合組成物の使用を提供する。幾つかの実施形態において、抗体は、哺乳類ポリペプチド、例えば、霊長類、ヒト、ネコ、イヌ、ラット、またはマウスに由来するポリペプチドからのインテグリンに特異的に結合する。抗体は、天然に生じる（全長）形態または合成形態の両方の、個別の多形、対立遺伝子、菌株、または種の変種、およびこれらのフラグメントを含む多様なインテグリンを生じ得る。加えて、抗体は、不活性状態または活性状態の類縁体を生じ得る。抗イディオタイプの抗体を使用することもできる。
【０１９０】
多数の免疫原が、リガンドまたは受容体タンパク質と特異的に反応する抗体を産生するために選択され得る。本明細書に開示される合成インテグリンは、単クローンまたは多クローン抗体の産生に免疫源として役立ち得る。そのような抗体を、天然に生じるインテグリン、または本明細書に開示されている同族インテグリンに関連する疾患状態を調節する標的の拮抗薬または作動薬として使用することができる。本発明により主張される合成ポリペプチドは、また、純粋または不純な形態のいずれかであり得る。適切なタンパク質配列を使用して作成される合成ペプチドも、抗体の産生のための免疫原として使用され得る。適切であれば、天然に折り畳まれた、または変性材料を抗体の産生に使用することができる。単クローンまたは多クローン抗体のいずれかを、例えばタンパク質を測定する免疫アッセイに続けて使用するため、または免疫精製法のために生成することができる。多クローン抗体を産生する方法は、当業者に良く知られている。
【０１９１】
典型的には、本発明の本明細書に開示されている、精製されたインテグリンのような免疫原は、補助薬と混合され、動物はこの混合物で免疫化される。免疫原調製物に対する動物の免疫応答は、試験出血を採取すること、および目的のタンパク質への反応性の力価を決定することによりモニターされる。例えば、免疫原に対する抗体の適切に高い力価が得られる場合、通常は反復免疫化の後、血液が動物から収集され、抗血清が調製される。タンパク質に反応性がある抗体を濃縮するための抗血清の更なる分画を、望ましい場合、実施することができる。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、またはＣｏｌｉｇａｎを参照すること。免疫化は、他の方法、例えばＤＮＡベクター免疫化を介して実施され得る。例えば、Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２２８：２７８−２８４を参照すること。
【０１９２】
単クローン抗体は、当該技術の研究者にとって周知の多様な技術により得ることができる。典型的には、本明細書に開示されている所望のインテグリンにより免疫化された動物からの脾臓細胞は、一般的には骨髄腫細胞との融合により固定化される。Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９を参照すること。免疫化の代替的な方法には、エプスタイン・バーウイルスによる形質転換、癌遺伝子、もしくはレトロウイルス、または当該技術において既知の他の方法が含まれる。例えば、Ｄｏｙｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．１９９４  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．を参照すること。単一の免疫化細胞から生じるコロニーは、抗原に対する所望の特異性および親和性の抗体の産生のためにスクリーンされ、そのような細胞により産生される単クローン抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹膜腔内への注射を含む、多様な技術により増強され得る。あるいは、例えばＨｕｓｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１により概説された一般的なプロトコールに従ってヒトＢ細胞からＤＮＡライブラリーをスクリーンすることにより、単クローン抗体またはその結合フラグメントをコードするＤＮＡ配列を単離することができる。
【０１９３】
本明細書に開示されているインテグリンの所定のフラグメントに対する抗体、二特異性抗体、および三特異性抗体の結合フラグメント、単鎖抗体Ｆｖ、Ｆａｂ、単一ドメインＶＨ、ジスルフィド架橋Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、またはＦ（ａｂ’）２フラグメントを含む抗体または結合組成物は、動物を本明細書に開示されているインテグリンまたは本明細書に開示されているインテグリンの接合体により、免疫化することによって生じ得る。単クローン抗体は、所望の抗体を分泌する細胞から調製される。これらの抗体は、本明細書に開示されているインテグリンへの結合についてスクリーンされ得る。これらの単クローン抗体は、通常、少なくとも約１ｍＭ、通常は少なくとも約３００μＭ、典型的には少なくとも約１０μＭ、少なくとも約３０μＭ、少なくとも約１０μＭ、少なくとも約３μＭ、またはそれ以上のＫＤで結合する。これらの抗体は、抗体が結合する天然に生じるポリペプチドへの結合についてスクリーンされ得る。
【０１９４】
幾つかの場合において、マウス、齧歯類、霊長類、ヒトなどのような多様な哺乳類宿主から単クローン抗体（ｍＡｂ）を調製することが望ましい。そのような単クローン抗体を調製する記述の記載は、例えば、Ｓｔｉｔｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．，ａｎｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｃｉｔｅｄ  ｔｈｅｒｅｉｎ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｄｉｎｇ（１９８６）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、および特にＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７において見いだされ得、これらは、単クローン抗体を精製する１つの方法を考察している。簡潔にまとめると、この方法は、本明細書に開示されているインテグリンに結合するポリペプチドを動物に注射することを伴う。次に動物を殺処分し、細胞を脾臓から取り出し、次にこれを骨髄腫細胞と融合させる。
【０１９５】
薬学的組成物
インテグリン関連転移性癌により演じられる役割、および対象のＥＣＭへの接着における本明細書に記載されている接着プロファイルの解明は、転移性癌の治療および診断に有用な薬学的組成物の開発を促進する。幾つかの実施形態において、インテグリン関連転移性癌により演じられる役割、および対象のＥＣＭへの接着における本明細書に記載されている接着プロファイルの解明は、転移性乳癌または肺癌の治療および診断に有用な薬学的組成物の開発を促進する。これらの組成物は、上記の物質の１つに加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定剤、または当業者に周知の他の材料を含むことができる。そのような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の効力に干渉するべきではない。担体または他の材料の正確な性質は、投与経路、例えば、経口、静脈内、皮膚または皮下、経鼻、筋肉内、腹腔内経路に応じて左右され得る。個体に与えられる本発明のポリペプチド、抗体、ペプチド、核酸分子、小分子、または他の薬学的に有用な化合物であっても、投与は、好ましくは「予防有効量」または「治療有効量」であり（場合によっては、予防は治療と考慮され得る）、これは個体に利益を示すのに十分なものである。
【０１９６】
細胞の特徴決定
本発明は、目的の特定の細胞の接着シグネチャーの特徴が、多様な文脈において、例えば目的の細胞を同定、特徴決定、検出、および／または単離するために有用であるという認識を包含する。
【０１９７】
本発明は、細胞の接着シグネチャーの特徴を決定する系を提供する。特定の実施形態において、系は、細胞を含む試料を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のコレクションと接触させることと、試料中の細胞とコレクション中のＥＣＭ成分との相互作用の存在またはレベルを検出することと、を含む。
【０１９８】
幾つかの実施形態において、系は、細胞をＥＣＭ成分と接触させて、細胞がＥＣＭ成分に接着することを可能にすることを含む。多くの実施形態において、ＥＣＭ成分と特定の細胞との相互作用は、ＥＣＭ成分の所定のコレクションに高い親和性で相互作用する細胞のほうが高い。幾つかの実施形態において、全体的に高い親和性は、個別の高い親和性相互作用を介して達成され得る。幾つかの実施形態において、全体的に高い親和性は、全てのものが特に高い親和性があるかに関わらず、多数の相互作用を介して達成され得る。幾つかの実施形態において、全体的な親和性は、相互作用する実体の複数の別個の対の間の多重相互作用により影響を受ける、または決定される。代替的または追加的に、全体的に高い親和性は、個別の相互作用する実体のコピー数により影響を受け、または決定され、当該技術において理解されるように、相互作用する実体の濃度が高いほど、個別の相互作用が相対的に中程度の親和性であっても、多くの相互作用をもたらし得る。
【０１９９】
幾つかの実施形態において、本明細書に記載されている系は、細胞を含む試料を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させることを含む。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分のコレクションは、単一のＥＣＭ成分を含む。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分のコレクションは、２つのＥＣＭ成分を含む。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分のコレクションは、３、４、５、６、７、８、９、１０、４，０００まで、またはそれ以上のＥＣＭ成分を含む。
【０２００】
幾つかの実施形態において、非小細胞肺癌細胞、ならびに原発性腫瘍、リンパ腫、または臓器部位の転移からの細胞を含む癌細胞を同定、特徴決定、検出、および／または単離するためのＥＣＭ成分のコレクションは、アグリンおよびコラーゲンＩＶ、アグリンおよびフィブリン、ビグリカンおよびコラーゲンＩＩ、ビグリカンおよびフィブリン、コラーゲンＩおよびトロンボスポンジン−４、コラーゲンＩＩおよびデコリン、コラーゲンＩＩおよびテネイシン−Ｃ、コラーゲンＩＩおよびテスチカン２、コラーゲンＩＩＩおよびコラーゲンＶＩ、コラーゲンＩＩＩおよびトロンボスポンジン−４、コラーゲンＩＶおよびガレクチン４、コラーゲンＩＶおよびＳＰＡＲＣ、コラーゲンＩＶおよびビトロネクチン、コラーゲンＶおよびガレクチン１、コラーゲンＶＩおよびガレクチン３、フィブリンおよびガレクチン３ｃ、フィブリンおよびガレクチン４、フィブリンおよびケラチン、フィブリンおよびオステオポンチン、フィブリンおよびＳＰＡＲＣ、ｆ−スポンジンおよびフィブロネクチン、フィブロネクチンおよびガレクチン３、フィブロネクチンおよびガレクチン８、フィブロネクチンおよびラミニン、フィブロネクチンおよびテスチカン１、ならびにまたはこれらの機能性フラグメントから選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む。
【０２０１】
幾つかの実施形態において、乳癌細胞を同定、特徴決定、検出、および／または単離するためのＥＣＭ成分のコレクションは、アグリンおよびコラーゲンＩＩ、アグリンおよびラミニン、ビグリカンおよびコラーゲンＩＩ、ブレビカンおよびフィブロネクチン、コラーゲンＩおよびテスチカン２、コラーゲンＩＩおよびコラーゲンＩＶ、コラーゲンＩＩおよびラミニン、コラーゲンＩＩおよびナイドジェン−１、コラーゲンＩＩおよびテスチカン２、コラーゲンＩＩＩおよびガレクチン８、コラーゲンＩＩＩおよびスーパーフィブロネクチン、コラーゲンＶおよびフィブロネクチン、コラーゲンＶおよびガレクチン１、コラーゲンＶＩおよびフィブロネクチン、コラーゲンＶＩおよびナイドジェン−１、コラーゲンＶＩおよびテネイシン−Ｃ、デコリンおよびフィブロネクチン、デコリンおよびガレクチン８、デコリンおよびラミニン、エラスチンおよびガレクチン４、フィブリンおよびガレクチン３、フィブロネクチンおよびガレクチン１、フィブロネクチンおよびガレクチン３、フィブロネクチンおよびガレクチン４、フィブロネクチンおよびムチン、フィブロネクチンおよびＳＰＡＲＣ、フィブロネクチンおよびテスチカン２、ガレクチン１およびガレクチン３、ガレクチン１およびケラチン、ガレクチン３およびヘパラン硫酸塩、ガレクチン３およびスーパーフィブロネクチン、ガレクチン４およびナイドジェン−１、ガレクチン８およびテネイシン−Ｃ、ケラチンおよびラミニン、ラミニンおよびメロシン、ラミニンおよびトロンボスポンジン−４、ＳＰＡＲＣおよびスーパーフィブロネクチン、ならびに／またはスーパーフィブロネクチンおよびテスチカン１から選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む。
【０２０２】
幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、固相に結合している。幾つかの実施形態において、固相は、任意の固体または半固体表面を含む。幾つかの実施形態において、固相は、ペトリ皿、ビーカー、フラスコ、試験管、マイクロタイタープレート、および／または培養スライドを含む、細胞を増殖または維持する任意の伝統的な実験室材料を含む。幾つかの実施形態において、固相はガラススライドを含む。
【０２０３】
幾つかの実施形態において、コレクション中のＥＣＭ成分は、固相の別個の部位に結合している。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分のコレクションは、固相の複数の別個の部位に結合している。幾つかの実施形態において、複数の別個の部位は、１つのみのＥＣＭ成分を含有する個別の部位を含む。幾つかの実施形態において、複数の別個の部位は、２つ以上の異なるＥＣＭ成分を含有する個別の部位を含む。幾つかの実施形態において、複数の別個の部位は、１つのみのＥＣＭ成分を含有する個別の部位、および２つ以上の異なるＥＣＭ成分を含有する個別の部位を含む。幾つかの実施形態において、複数の部位のうちの異なる部位は、同じ成分（複数可）を含む。幾つかの実施形態において、複数の部位のうちの異なる部位は、異なる成分（複数可）を含む。幾つかの実施形態において、複数の部位は、複数の部位のうちの他の部位と同じ成分（複数可）を含む部位と、複数の部位のうちの他の部位と異なる成分（複数可）を含む部位とを含む。幾つかの実施形態において固相の別個の部位に結合しているコレクション中のＥＣＭ成分は、アレイを含む。
【０２０４】
幾つかの実施形態において、固相を含む固体または半固体表面は、ＥＣＭ成分が結合し得る任意の材料から構成される。幾つかの実施形態において、固相は、ポリアミド、ポリエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリアクリルアミド、ポリビニル化合物（例えば、ポリ塩化ビニル）、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ニトロセルロース、綿、ポリグルコール酸（ＰＧＡ）、セルロース、デキストラン、ゼラチン、ガラス、フルオロポリマー、フッ化エチレンプロピレン、ポリビニリデン、ポリジメチルシロキサン、ポリスチレン、ケイ素基板（例えば、融解石英、ポリシリコン、もしくは単一ケイ素結晶）、またはこれらの組み合わせを含む。
【０２０５】
幾つかの実施形態において、細胞を本発明の系によってＥＣＭ成分のコレクションと接触させることは、細胞をＥＣＭ成分のコレクションと混合することを含む。幾つかの実施形態において、細胞をＥＣＭ成分のコレクションと接触させることは、細胞を、固体支持体上のＥＣＭ成分のコレクションの上に重ねることを含む。幾つかの実施形態において、細胞をＥＣＭ成分のコレクションと接触させることは、固体支持体上のＥＣＭ成分のコレクションを細胞の中に沈めることを含む。幾つかの実施形態において、細胞をＥＣＭ成分のコレクションと接触させることは、細胞を、固体支持体上のＥＣＭ成分のコレクションに接種することを含む。幾つかの実施形態において、細胞をＥＣＭ成分のコレクションと接触させることは、０．１〜１００ｍｌまたは１〜１０ｍｌの細胞を、固体支持体上のＥＣＭ成分のコレクションに接種することを含む。あるいは、細胞を、液体を輸送する任意の他の手段の使用によりＥＣＭ成分と接触させることができる。
【０２０６】
幾つかの実施形態において、細胞は、細胞をＥＣＭ成分と相互作用させるのに十分な条件下および時間にわたってＥＣＭ成分と接触する。幾つかの実施形態において、細胞は、１０分間から４８時間、３０分間から２４時間、または１時間から１２時間にわたってＥＣＭ成分と接触する。特定の例示的な実施形態において、細胞は、２時間にわたってＥＣＭ成分と接触する。
【０２０７】
幾つかの実施形態において、接触させることは、細胞の生存能力および／または代謝機能と一致する範囲内の温度で実施される。幾つかの実施形態において、接触させることは、摂氏１０〜７０、２０〜６０、または２５〜４０度の温度で実施される。特定の例示的な実施形態において、温度は摂氏３７度である。
【０２０８】
幾つかの実施形態において、細胞をＥＣＭ成分のコレクションと接触させることは、ことは、ＥＣＭ成分を洗浄することを更に含む。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、過剰な細胞を除去するために洗浄される。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、相互作用しない細胞を除去するために洗浄される。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、細胞またはＥＣＭ成分を損傷しない任意の溶液で洗浄される。特定の実施形態において、ＥＣＭ成分は、細胞をＥＣＭ成分と接触させるために使用された同じ細胞培養培地で洗浄される。あるいは、ＥＣＭ成分はＰＢＳで洗浄される。
【０２０９】
特定の実施形態において、ＥＣＭ成分は、細胞がＥＣＭ成分と相互作用してＥＣＭ成分との相互作用を維持することを可能にする任意の配置で洗浄される。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、静止配置で洗浄される。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、洗浄の際に機械的に撹拌される。培養物中の細胞を撹拌する方法は、当該技術においてよく知られており、旋回装置、揺動装置、回転装置、および振とう装置の使用が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１０】
幾つかの実施形態において、試料中の細胞と、コレクション中のＥＣＭ成分との間の相互作用のレベルが検出される。幾つかの実施形態において、細胞とＥＣＭの相互作用は、ＥＣＭ成分と相互作用する細胞を定量化することを可能にする任意の技術の使用により検出される。幾つかの実施形態において、細胞とＥＣＭ成分の相互作用は、顕微鏡法により検出される。幾つかの実施形態において、細胞とＥＣＭ成分の相互作用は、共焦点顕微鏡法により検出される。幾つかの実施形態において、細胞とＥＣＭ成分の相互作用は、蛍光顕微鏡法により検出される。幾つかの実施形態において、細胞とＥＣＭ成分の相互作用は、生細胞の顕微鏡法により検出される。幾つかの実施形態において、細胞とＥＣＭ成分の相互作用は、固定された細胞の顕微鏡法により検出される。適切な固定剤は当該技術において良く知られており、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、およびホルマリンが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、細胞とＥＣＭ成分の相互作用は、染色された細胞の顕微鏡法により検出される。顕微鏡法により細胞を計数するのに適切な染色剤は、当該技術において良く知られている。例には、Ｈｏｅｃｈｓｔ、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、およびアクリジンオレンジが含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、細胞とＥＣＭ成分の相互作用は、免疫化学により検出される。
【０２１１】
幾つかの実施形態において、細胞とＥＣＭ成分の相互作用を検出することは、相互作用を定量化することを含む。幾つかの実施形態において、細胞とＥＣＭ成分の相互作用は、ＥＣＭ成分と相互作用する細胞を定量化することを可能にする任意の手段により定量化される。幾つかの実施形態において、顕微鏡法により検出された細胞とＥＣＭ成分の相互作用は、視覚的に定量化される。幾つかの実施形態において、顕微鏡法により検出された細胞とＥＣＭの相互作用は、コンピュータープログラムまたは他の計算装置の助けを借りて定量化される。顕微鏡画像から細胞数を定量化するコンピュータープログラムは、当該技術において良く知られている。顕微鏡法により可視化された細胞を定量化するための数学的プログラムの一例には、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒである（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，Ａ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ：ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，７：Ｒ１００，２００６、これはその全体が参照として本明細書に組み込まれる）。
【０２１２】
幾つかの実施形態において、クラスター分析が、細胞とＥＣＭ成分の定量化された相互作用に対して実施される。アレイのデータを分析することは、当該技術において周知の技術である。アレイのデータを分析するコンピュータープログラムには、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（Ｔｉｂｃｏ）およびＧｅｎｅｓｐｒｉｎｇ（Ａｇｉｌｅｎｔ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２１３】
幾つかの実施形態において、本開示による方法は、特定の細胞を試料中の他の細胞または基準細胞と区別する特定の細胞の接着シグネチャーの特徴を検出することにより細胞型を区別する、診断ツールとして使用され得る。例えば、本出願の実施例４は、それらが誘導される親腫瘍細胞よりも互いに密接にクラスター形成する２つの転移性癌細胞系を示す。しかし同じ細胞がマイクロアレイ分析により特徴決定される場合、それぞれの転移性細胞系は、それが誘導される親系とクラスター形成する。これらのデータは、接着シグネチャーが、マイクロアレイにより検出不可能な癌細胞における転移性変化を検出するために使用され得ることを示唆する。
【０２１４】
特定の実施形態において、１つ以上の特徴が異なる細胞は、接着シグネチャーにより区別される。特定の実施形態において、細胞は、接着シグネチャーにより基準細胞と区別される。特定の実施形態において、異なる疾患進行段階の細胞は、接着シグネチャーにより区別される。特定の実施形態において、異なる転移段階の癌細胞は、接着シグネチャーにより区別される。特定の実施形態において、異なる発生段階の細胞は、接着シグネチャーにより区別される。特定の実施形態において、異なる分化段階の幹細胞は、接着シグネチャーにより区別される。幾つかの実施形態において、異なる分化段階の幹細胞には、骨形成、軟骨形成、または脂肪生成系譜への異なる分化段階の間葉幹細胞が含まれる。幾つかの実施形態において、異なる分化段階の幹細胞には、循環、神経、または免疫系の細胞系譜への異なる分化段階のヒト誘導多能性幹細胞または胚幹細胞が含まれる。
【０２１５】
本発明は、細胞外マトリックス成分と相互作用する細胞に対する効果を決定する系であって、細胞の第１の細胞個体群を、細胞外マトリックス成分のコレクションと接触させることを含む第１セットの条件に曝露することと、第２の細胞個体群が第１の細胞個体群に匹敵している、第２の細胞個体群を、第２セットの条件が、細胞外マトリックス成分の幾つかまたは全てが接触時に不在であることを除いて、第１セットの条件と匹敵している、第２セットの条件に曝露することと、曝露が生じた後に第１および第２の細胞個体群の間で異なる１つ以上の細胞個体群の特徴を決定することと、を含む系も提供する。特定の実施形態において、異なる細胞型と比較して特定の細胞または細胞型を特徴決定する情報を含む、細胞または細胞型についての情報は、細胞がＥＣＭ成分と接触している間に得ることができる。特定の実施形態において、１つ以上のＥＣＭ成分への曝露、および／またはとの相互作用によりもたらされる細胞に対する効果は、例えば、異なるＥＣＭ成分に曝露される細胞において異なる特徴を決定することにより、本発明に従って決定される。幾つかの実施形態において、特徴の存在または程度は、１つ以上のＥＣＭ成分存在もしくはレベル、および／または１つ以上の接着シグネチャーと相関して決定される。特定の実施形態において、細胞はプローブされる。
【０２１６】
特定の実施形態において、細胞の個体群は、細胞の任意のコレクションを含む。特定の実施形態において、細胞の個体群は、細胞型が不明の特定の種類の細胞を含む。特定の実施形態において、細胞の個体群は、既知の細胞型の細胞を含む。幾つかの実施形態において、細胞の個体群は、既知および不明の細胞型の混合物を含む。幾つかの実施形態において、細胞の個体群は、生物学的試料の細胞を含む。
【０２１７】
幾つかの実施形態において、細胞は、異なる特徴の細胞を区別することを可能にする抗体によりプローブされる。プローブとしての抗体の使用は、当業者に良く知られていることが理解される。抗体は、細胞系譜または疾患状態を検出するために利用可能である。例えば、抗ＡＦＰ抗体は、肝臓系譜へ分化する幹細胞から未分化幹細胞を区別するために使用され得、抗Ｐｄｘ１抗体は、膵臓系譜へ分化する幹細胞から未分化幹細胞を区別するために使用され得る。抗体の染色程度は、蛍光もしくは化学発光標識抗体を使用する、または蛍光もしくは化学発光標識二次抗体によりプローブする、当該技術に周知の技術により検出され得る。
【０２１８】
幾つかの実施形態において、細胞は、任意の種類のＤＮＡプローブでプローブされる。幾つかの実施形態において、細胞は、異なる特徴の細胞を遺伝子型により区別することを可能にするＤＮＡプローブによりプローブされる。幾つかの実施形態において、細胞は、異なる特徴の細胞をＲＮＡ転写物により区別することを可能にするＤＮＡプローブによりプローブされる。幾つかの実施形態において、細胞は、任意の種類の標識物質でプローブされる。幾つかの実施形態において、細胞は、異なる特徴の細胞を酵素活性により区別することを可能にする標識物質によりプローブされる。幾つかの実施形態において、細胞は、任意の種類のタンパク質でプローブされる。幾つかの実施形態において、細胞は、異なる特徴の細胞をＥＣＭ成分以外のタンパク質への親和性により区別することを可能にするタンパク質によりプローブされる。
【０２１９】
診断
上記に記載されたように、本発明の特定の実施形態は、異なる癌進行段階の細胞を区別するために使用され得、疾患を診断する有望なツールとなる。この系は、例えば、疾患が存在するかを決定するために患者の細胞を試験する場合、潜在的に有用である。接着シグネチャーの使用により患者を診断することは、例えば、患者の試料の接着シグネチャーを基準細胞の接着シグネチャーと比較することを含む。
【０２２０】
特定の実施形態において、接着シグネチャーは、彼または彼女の細胞が条件の結果として基準細胞と区別される特徴を有することを引き起こす任意の状態を有すると疑われる患者を、診断および／または予測するために使用される。特定の実施形態において、接着シグネチャーは、彼または彼女の細胞の接着シグネチャーに影響を与える任意の疾患を有すると疑われる患者を、診断および／または予測するために使用される。特定の実施形態において、接着シグネチャーは、任意の形態の癌を有すると疑われる患者を診断および／または予測するために使用される。特定の実施形態において、接着シグネチャーは、肺癌を有すると疑われる患者を診断および／または予測するために使用される。特定の実施形態において、接着シグネチャーは、転移性癌を有すると疑われる患者を診断および／または予測するために使用される。特定の実施形態において、接着シグネチャーは、乳癌を有すると疑われる患者を診断および／または予測するために使用される。特定の実施形態において、接着シグネチャーは、結腸癌を有すると疑われる患者を診断および／または予測するために使用される。特定の実施形態において、接着シグネチャーは、前立腺癌を有すると疑われる患者を診断および／または予測するために使用される。特定の実施形態において、接着シグネチャーは、精巣癌を有すると疑われる患者を診断および／または予測するために使用される。特定の実施形態において、接着シグネチャーは、脳癌を有すると疑われる患者を診断および／または予測するために使用される。特定の実施形態において、接着シグネチャーは、白血病を有すると疑われる患者を診断および／または予測するために使用される。
【０２２１】
幾つかの実施形態において、本開示によるキットは、癌の病期を診断する手段を提供する。キット形態で接着シグネチャーによる診断および／または予後のツールを提供することは、接着シグネチャー技術を臨床設定にもたらす。幾つかの実施形態において、癌の病期を診断するキットは、複数の異なる細胞型が少なくとも１つの目的の細胞型を含む、複数の異なる細胞型の細胞を含有する試料を基板と接触させたとき、目的の細胞型の細胞が、目的の細胞型の細胞を試料中の他の細胞から単離するのに十分な相互作用のセットを、コレクション中のＥＣＭ成分と形成することを特徴とする、ＥＣＭ成分のコレクションで被覆されている基板を含む。幾つかの実施形態において、キットは更に培地を含む。幾つかの実施形態において、本開示によるキットは、非小細胞肺癌細胞、および原発性腫瘍、リンパ腺、または臓器部位の転移からの細胞を検出する手段を提供し、本明細書に開示されている少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む。
【０２２２】
幾つかの実施形態において、特定の転移段階の癌細胞の存在は、これらの細胞の増殖により検出される。幾つかの実施形態において、キットは、細胞の増殖または存在量を評価する手段を更に含む。細胞増殖および／または存在量を検出するおよび／または評価する方法は、当該技術において良く知られており、分光光度法、ＦＡＣＳ、顕微鏡法、および／または平板培養法が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態において、細胞の増殖または存在量を評価する手段は、キットを、増殖および／または存在量が評価される施設に送付するための容器を含む。
【０２２３】
細胞型の単離
幾つかの実施形態において、本開示による方法は、目的の細胞を単離するツールとして使用され得る。この系は、例えば、混合型の細胞個体群から特定の細胞型を単離しようと試みる場合に有用である。細胞の複合混合物、例えば部分的に分化した幹細胞、患者の生検材料、または骨髄試料が提供される場合、従来の方法を使用したこの混合物の解析は困難であり得る。一般に、この結果を得るための最も容易な方法の１つは、フローサイトメトリーであると考えられるが、フローサイトメトリーは、この個体群を表すマーカーのパネルを確立するため、何が試料に存在するかについての最初の予測を必要とする。本発明の幾つかの実施形態において、接着シグネチャーの使用は、この過程を簡素化する。例えば実施例７は、通常は骨髄から単離される間葉幹細胞は、ガレクチン−８とトロンボスポンジン−４の組み合わせに高い親和性を有する。幹細胞は、ヒトのものであり得る、または任意の種類の動物から誘導され得る。
【０２２４】
幾つかの実施形態において、特定の細胞型を単離する方法は、細胞を含む試料を、相互作用のセットが試料中の特定の細胞とコレクション中のＥＣＭ成分との間に生じて細胞を試料の他の成分から単離するのに十分な条件下および時間にわたって、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させることを含む。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、他の細胞から細胞を分離するために使用される。幾つかの実施形態において、ＥＣＭ成分は、単離された細胞と異なるセットの相互作用をＥＣＭ成分と行う他の細胞から、細胞を単離するために使用される。幾つかの実施形態において、細胞は、固相に結合しているＥＣＭ成分を使用して単離される。幾つかの実施形態において、細胞は、試料から固相を分離することにより、固相に結合しているＥＣＭ成分を使用して単離される。
【０２２５】
細胞培養物
幾つかの実施形態において、本開示による方法は、目的の細胞もしくは細胞型のために適切な培養条件を同定するため、および／または繁殖のために使用され得る。組織由来の培養物において増殖した任意細胞型は、結合し、繁殖するために固体表面を必要とする。ＥＣＭ成分は表面への結合を促進することが、一般に理解されている。理想的な培養条件が不明のままである多くの細胞型が存在し、ＥＣＭアレイは、この情報を提供する可能性があり得る。
【０２２６】
この系は、幹細胞の培養に特に有用であり、それは、誘導された多能性幹細胞を増殖する現行の方法が、有糸分裂的に不活性化された支持細胞（ＭＥＦ）または不確定の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）ミックス（例えば、マトリゲル）を必要とし、したがって動物要素およびロットの変動要素を導入するからである。確定されたＥＣＭ成分、特に、限定培地と組み合わせたコラーゲンＩＩおよびガレクチン４、コラーゲンＩＶおよびガレクチン８、またはコラーゲンＩおよびラミニンの組み合わせは、動物産物により汚染されることなく多能性幹細胞を生成および維持する可能性を提供し、したがって、ヒト疾患の治療への橋渡し的な示唆を有し得る。
【０２２７】
この系は、培養が困難である細胞型にも特に有用であり、それは、多種多様な条件を同時に試験することを可能にするからである。一例は、肝臓の主な細胞型である肝細胞の培養である。一般に、単離した後に、僅かにほぼ１０％の供与体細胞が平板培養可能である。実施例８に記載されているように、平板培養不可能な肝細胞の６つの異なるロットの全てにおいて、幾つかのＥＣＭマトリックスの組み合わせが細胞接着を促進したことが同定された。コラーゲンＩとアグレカン、およびコラーゲンＩＶとナイドジェン−１の組み合わせは、普遍的な効果を有すると思われる。
【０２２８】
特定の実施形態において、目的の細胞型を培養することは、目的の細胞型を含む試料を、１つ以上の異なる細胞型の細胞と比較して、目的の細胞型の細胞の増殖および／または複製を促進するのに適切な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分のコレクションと接触させることを含む。
【０２２９】
特定の実施形態において、本開示によるも目的の細胞型は、ヒト胚幹細胞またはヒト誘導多能性胚幹細胞を含み、幾つかのそのような実施形態において、ＥＣＭ成分のコレクションは、コラーゲンＩＩおよびガレクチン４、コラーゲンＩＶおよびガレクチン８、またはコラーゲンＩおよびラミニンから選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む。
【０２３０】
特定の実施形態において、本開示による目的の細胞型は、肝細胞を含み、幾つかのそのような実施形態において、ＥＣＭ成分のコレクションは、アグリンおよびコラーゲンＩ、コラーゲンＩおよびラミニン、コラーゲンＩおよびメロシン、コラーゲンＩＩおよびガレクチン８、コラーゲンＩＩおよびＳＰＡＲＣ、ならびに／またはコラーゲンＩＶおよびナイドジェン−１から選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む。
【０２３１】
特定の実施形態にいて、本開示による目的の細胞型は、間葉幹細胞を含み、幾つかのそのような実施形態において、細胞外マトリックス成分のコレクションは、ビグリカンおよびコラーゲンＩＶ、ビグリカンおよびガレクチン４、ブレビカンおよびコラーゲンＩ、ブレビカンおよびコラーゲンＩＶ、ブレビカンおよびガレクチン３ｃ、コラーゲンＩおよびガレクチン１、コラーゲンＩおよびガレクチン３、コラーゲンＩおよびガレクチン３ｃ、コラーゲンＩおよびガレクチン８、コラーゲンＩおよびナイドジェン−２、コラーゲンＩおよびＳＰＡＲＣ、コラーゲンＩおよびテネイシン−Ｃ、コラーゲンＩおよびテスチカン１、コラーゲンＩおよびビトロネクチン、コラーゲンＩＩおよびガレクチン３、コラーゲンＩＩおよびガレクチン８、コラーゲンＩＩおよびナイドジェン−１、コラーゲンＩＩおよびナイドジェン−２、コラーゲンＩＶおよびデコリン、コラーゲンＩＶおよびガレクチン８、コラーゲンＩＶおよびナイドジェン−１、コラーゲンＩＶおよびナイドジェン−２、コラーゲンＩＶおよびテスチカン１、コラーゲンＩＶおよびテスチカン２、コラーゲンＶＩおよびｆ−スポンジン、コラーゲンＶＩおよびガレクチン３、コラーゲンＶＩおよびガレクチン８、コラーゲンＶＩおよびテネイシン−Ｃ、コラーゲンＶＩおよびテスチカン２、コラーゲンＶＩおよびトロンボスポンジン−４、ｆ−スポンジンおよびビトロネクチン、フィブリンおよびガレクチン４、フィブロネクチンおよびガガレクチン４、フィブロネクチンおよびナイドジェン−１、フィブロネクチンおよびテネイシン−Ｃ、フィブロネクチンおよびテスチカン１、フィブロネクチンおよびテスチカン２、ガレクチン３およびビトロネクチン、ガレクチン３ｃおよびメロシン、ガレクチン３ｃおよびスーパーフィブロネクチン、ガレクチン４およびスーパーフィブロネクチン、ガレクチン８およびスーパーフィブロネクチン、ガレクチン８およびビトロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチン、ＳＰＡＲＣおよびテスチカン１、ならびに／またはスーパーフィブロネクチン、ビトロネクチン、あるいはこれらの機能性フラグメントから選択される少なくとも２つのＥＣＭ成分を含む。幾つかの実施形態において、間葉幹細胞は、骨髄、脂肪細胞、臍帯血、または臍帯に由来する。
【０２３２】
特定の実施形態において、目的の細胞型を培養することは、目的の細胞型の増殖を支持することができる任意の種類の培地において細胞を培養することを含む。特定の実施形態において、培地は、細胞培養培地を含む。特定の実施形態において、培地は、複合培地を含む。特定の実施形態において、培地は、無血清培地を含む。多様な細胞型に適した適切な細胞培養培地の選択は、当該技術において良く知られている。
【０２３３】
幾つかの実施形態において、細胞は、細胞の生存能力および／または代謝機能と一致する範囲内の温度で培養される。幾つかの実施形態において、細胞は、摂氏１０〜７０、２０〜６０、または２５〜４０度の温度で培養される。
【０２３４】
幾つかの実施形態において、本開示による系は、目的の細胞もしくは細胞型を培養するため、および／または繁殖させるために使用され得る。幾つかの実施形態において、細胞を培養する系は、複数の異なる細胞型が少なくとも１つの目的の細胞型を含む、複数の異なる細胞型の細胞を含有する試料を基板と接触させたとき、目的の細胞型の増殖を促進することによって、目的の細胞型の細胞が、目的の細胞型の細胞を試料中の他の細胞から単離するのに十分な相互作用のセットを、コレクション中のＥＣＭ成分と形成することを特徴とする、ＥＣＭ成分のコレクションで被覆されている基板を含む。幾つかの実施形態において、本開示による系は、間葉幹細胞、肝細胞、ヒト誘導多能性肝細胞、または胚幹細胞を培養する、および／または繁殖させるために使用され得、本明細書に記載されている少なくとも２つのＥＣＭ成分を含み得る。
【０２３５】
キット
幾つかの実施形態において、本開示によるキットは、目的の細胞もしくは細胞型を培養するため、および／または繁殖させるために使用され得る。幾つかの実施形態において、細胞を培養するキットは、上記に記載された基板を含み、任意に培地および目的の細胞を更に含む。開示されている任意のアレイ、系、またはその成分は、個別または任意の他のアレイ、系、またはその成分との組み合わせのいずれかによってキットに配置され得る。本発明は、本明細書に記載されている方法のいずれかを実施するためのキットを提供する。幾つかの実施形態において、、キットは、細胞外マトリックス成分またはその機能性フラグメントと関連するポリペプチド配列を含む１個または複数のポリペプチドを含む少なくとも１個の容器を含む。幾つかの実施形態において、キットは、本明細書に記載されているポリペプチドまたはその機能性フラグメントのいずれかを含む少なくとも１個の容器を含む。幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、溶液（適切なｐＨおよび／または長期保存の際にポリペプチドの分解を最小限にする他の必要な添加剤を有する緩衝液）中のものである。幾つかの実施形態において、ポリペプチドは、長期保存後に再懸濁する目的で凍結乾燥される。幾つかの実施形態において、キットは、細胞外マトリックス（またはその機能性フラグメント）と関連するポリペプチド配列を含む１個または複数のポリペプチドと、ポリペプチドまたはフラグメントが固定され得る固体支持体とを含む、少なくとも１個の容器を含む。幾つかの実施形態において、キットは、本明細書に記載されている任意の方法のいずれか、または全てを実施するための使用説明書を任意に含む。幾つかの実施形態において、キットは、本明細書に記載されているアレイまたは系と、本明細書に開示されているコンピュータープログラム製品を使用する１つまたは複数のステップを実行するための使用説明書とを含む。本明細書に記載されている方法のいずれかにおける１つまたは複数のステップは、コンピューター記憶媒体にコード化されているコンピュータープログラム製品を、１つ以上のコンピュータープロセッサーにより直接的に、または１つ以上のコンピュータープロセッサーからインターネット接続もしくは他の仮想接続を介して１つ以上のコンピュータープロセッサーへ遠隔的に利用して実施され得ることが理解される。幾つかの実施形態において、キットは、本明細書に記載されているコンピュータープログラム製品、またはコンピューター記憶媒体にコード化されたコンピュータープログラム製品を含むコンピュータープロセッサーを遠隔的に利用するために必要な情報を含む。幾つかの実施形態において、コンピュータープログラム製品は、使用者により実行されると、１つ以上の接着値を計算する、１つ以上の接着値を正規化する、１つ以上の接着シグネチャーもしくは１つ以上の接着プロファイルを生成する、および／または接着値、接着シグネチャー、接着プロファイルのいずれかを使用者に表示する。幾つかの実施形態において、キットは、本明細書に記載されている方法のステップのいずれかを実施するための使用説明書を含むコンピューター読み取り可能記憶媒体にコード化されている、コンピュータープログラム製品を含む。幾つかの実施形態において、本発明は、１つ以上の接着値、１つ以上の正規化接着値、１つ以上の接着プロファイル、１つ位女王の接着シグネチャー、またはこれらの組み合わせを提供するための使用説明書を含むキットに関する。幾つかの実施形態において、キットは、１つまたは複数のコンピュータープロセッサーにより実行されると、接着値を定量化する、接着シグネチャーもしくは接着プロファイルを決定する、ならびに／または接着シグネチャー、接着値、接着シグネチャー、および／もしくはこれらの組み合わせを表示する、コンピューター記憶媒体にコード化されたコンピュータープログラム製品を含む。幾つかの実施形態において、キットは、１つまたは複数のコンピュータープロセッサーにより実行されると、１つ以上の細胞試料の接着値を定量化する、および接着値に少なくとも部分的基づいて接着シグネチャーを決定する、コンピューター記憶媒体にコード化されたコンピュータープログラム製品を含む。幾つかの実施形態において、キットは、コンピューター記憶媒体を利用する、接着値を定量化する、接着値を正規化する、細胞型の接着シグネチャーを決定する、および／またはこれらのステップの任意の組み合わせのための使用説明書を含む。幾つかの実施形態において、コンピューター読み取り可能記憶媒体は、本明細書に記載されている方法のいずれかを実施するための使用説明書を含む。幾つかの実施形態において、キットは、本明細書に開示されているアレイまたは系と、実行されたとき、本明細書に開示されている方法のステップのいずれか、または組み合わせを実施し、この行程のいずれかを実施するための使用説明書を提供する、コンピューター記憶媒体にコード化されているコンピュータープログラム製品とを含む。幾つかの実施形態において、使用説明書は、本明細書に開示されている任意の１つまたは複数のポリペプチドを固体支持体に接着させるための使用説明書を含む。
【０２３６】
本発明は、本明細書に開示されている１つまたは複数のポリペプチドまたはフラグメントを含む１個または複数の容器を含むキットを更に提供する。幾つかの実施形態において、キットは、血清、または細胞の培養もしくは繁殖を増強する動物に基づいた血清の誘導体を含まない細胞培地を含む。幾つかの実施形態において、キットは、本明細書に開示されているアレイ、本明細書に開示されている任意の細胞培地、および本明細書に開示されている任意の方法の任意の１つ以上のステップを実施するための使用説明書を任意に含む本明細書に開示されているコンピュータープログラム製品を含む。幾つかの実施形態において、キットは細胞培地を含まない。幾つかの実施形態において、キットは、本明細書に開示されている任意の個別の一対のポリペプチドを含まない固体支持体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、１個以上の接着セットを固体支持体に固定する装置を含む。
【０２３７】
キットは、アレイの調製のために２個以上の容器、パック、または分配器を使用説明書と一緒に含有し得る。幾つかの実施形態において、キットは、本明細書に記載されているアレイまたは系を含む少なくとも１個の容器、ならびに維持、使用、および／または保存緩衝液のような保存の手段を含む第２の容器を含む。幾つかの実施形態において、キットは、溶液中の、または凍結乾燥もしくは乾燥され、再水和混合物を伴った、本明細書に開示されている任意のポリペプチドを含む組成物を含む。幾つかの実施形態において、ポリペプチドと再水和混合物は、１個以上の追加の容器の中にあり得る。
【０２３８】
キットに含まれる組成物は、異なる成分の保存寿命が保たれ容器の材料に吸着しない、またはにより変更されないような、任意の種類の容器に供給され得る。例えば、適切な容器には、ガラス、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンのような有機ポリマー、セラミック、金属、または試薬もしくは食品を保持するために典型的に用いられる他の材料から作製され得る簡単な瓶、アルミニウムまた合金のような箔で裏打ちされた内側からなり得る封筒が含まれる。他の容器には、試験管、バイアル、フラスコ、およびシリンジが含まれる。容器は、取り外されると組成物の成分が混合するのを可能にする容易に取り外し可能な膜により分けられている、２つの区画を有し得る。取り外し可能な膜は、ガラス、プラスチック、ゴム、または他の不活性材料であり得る。
【０２３９】
キットは、使用説明用の材料と共に供給され得る。使用説明書は、紙もしくは他の基材に印刷され得る、および／またはフロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ジップディスク、ビデオテープ、オーディオテープ、もしくは他の読み取り可能記憶デバイスのような電子的に読み取り可能な媒体として供給され得る。詳細な使用説明書は、キットと物的に関連しないことがあり、代わりに、使用者には、キットの製造者もしくは配給者により特定されたインターネットウエブサイトが指示され得る、または電子メールにより供給され得る。
【０２４０】
本発明は、ポリペプチドのアレイであって、アレイが固体支持体および複数の接着セットを含み、それぞれの接着セットが、細胞外マトリックスまたはその機能性フラグメントと関連するポリペプチド配列を含む２つ以上の異なるポリペプチドを含むポリペプチドのアレイを含み、任意に細胞培養容器を含むキットも提供する。幾つかの実施形態において、キットは、以下：細胞培地、ある量の蛍光染色または色素、細胞試料、および電子媒体を介して遠隔的に利用可能な使用説明書のセットのうちの少なくとも１つを更に含む。
【０２４１】
本明細書に開示されている任意および全ての雑誌記事、特許出願、発行済特許、または他の引用参考文献は、それぞれその全体が参照として組み込まれる。
【実施例】
【０２４２】
実施例１：ＥＣＭアレイの作製
以下の実施例はＥＣＭアレイを記載する。とりわけ、本発明は、細胞または細胞型の接着シグネチャーの１つ以上の特徴を確定、検出、または利用するため、本発明に有用な固体表面に固定されるＥＣＭ成分のコレクションを提供する。幾つかの実施形態において、コレクションはＥＣＭアレイと定義され得る。以下の実施例において、拡大された細胞外マトリックス（ＥＣＭ）アレイが、接着シグネチャーを介して異なる細胞型を同定する目的で開発される。米国特許公開出願第２００６／０１６００６６Ａ１号に記載されているアレイは、顕微鏡スライド１枚あたり全体で４０００個のスポットをもたらす、ＥＣＭアレイに五重に表されている合計で７６８個の組み合わせの３８個の異なるＥＣＭ成分（表１）の全ての単一および対の組み合わせを含むように適合された（図１Ｂ）。
【表Ｄ】
2015514396.tif 000006
【０２４３】
簡潔には、バンテージアクリルスライド（ＣＥＬ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＶＡＣＲ−２５Ｃ）を、以前に記載されたようにポリアクリルアミドで被覆した（Ｆｌａｉｍ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｂｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈ，２（２）：１１９−１２５，２００５）。分子を付着させる前に、スライドをポリアクリルアミドヒドロゲルで被覆し、これを浸けて任意の非重合モノマーを除去した後、乾燥する。脱水ヒドロゲルは、化学修飾の必要なく分子を捕捉するように作用する。次にスライドには、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｐｏｔｔｅｒ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐｉｘｓｙｓ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｐｏｔｔｅｒ  ａｎｄ  ＡｒｒａｙＩｔ  ９４６  Ｐｉｎｓ）を使用して、Ｔｅｃａｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｅｒの使用により調製された供給源プレートからスポットした。分子は、以前に記載された緩衝液（Ｆｌａｉｍ  ｅｔ  ａｌ．）を使用して２００μｇ／ｍｌの濃度で調製した。７６８対の組み合わせを五重にスポットした（図１Ａ）。ローダミンデキストラン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を陰性対照として、画像整列における使用のためにスポットした。以下の分子を使用した：コラーゲンＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、コラーゲンＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、コラーゲンＩＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、コラーゲンＩＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、コラーゲンＶ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、コラーゲンＶＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、フィブロネクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ラミニン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、メロシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、テネイシン−Ｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、コンドロイチン硫酸塩（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、アグレカン（Ｓｉｇｍａ）、エラスチン（Ｓｉｇｍａ）、ケラチン（Ｓｉｇｍａ）、ムチン（Ｓｉｇｍａ）、スーパーフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）、Ｆ−スポンジン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ナイドジェン−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヘパラン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ）、ビグリカン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、デコリン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ガレクチン１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ガレクチン３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ガレクチン３ｃ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ガレクチン４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ガレクチン８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、トロンボスポンジン−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、オステオポンチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、オステオネクチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、テスチカン１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、テスチカン２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、フィブリン（Ｓｉｇｍａ）、テネイシン−Ｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ナイドジェン−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ビトロネクチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ラットアグリン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒアルロナン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ブレビカン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。次にスライドを湿度室に４℃で保存した。それぞれのスポットに結合した細胞を定量化するため、核を従来の蛍光染色プロトコールに従って染色し、スラ���ドを、ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウエアを有する自動化倒立落射蛍光顕微鏡の使用により画像化する。本発明者たちのデータは、約１０ｋＤａより大きな分子は、ヒドロゲルにしっかりと捕捉され得ることを示している（図１Ｃ）。本発明者たちは、捕捉後にＮＨＳ−フルオレセイン標識化または抗体仲介検出を使用してこれらの捕捉を確認した（図１Ｄ）。これらの方法により試験した３８個の分子は、全て、印刷の予測される領域内で優れた再現性および均一性を示した（図１Ｄ）。ＥＣＭの位置への選択的接着を示す、ＥＣＭスポットに接着した細胞の代表的画像（図１Ｅ）。５つのスポットの画像のスケールバーは、２００μｍである。単一スポットの画像のスケールバーは、５０μｍである。
【０２４４】
実施例２：細胞接着シグネチャーをアッセイするためのＥＣＭアレイの使用
この実施例において、ＥＣＭアレイを使用する接着シグネチャーの検出のためのプロトコールが記載される。細胞外マトリックスマイクロアレイの調製。バンテージアクリルスライド（ＣＥＬ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＶＡＣＲ−２５Ｃ）を、Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９光開始剤（Ｃｉｂａ）を含有するプレおポリマーをスライドとガラスカバースリップ２２の間に蓄積させることにより、ポリアクリルアミドで被覆した。重合させた後、スライドをｄｄＨ２Ｏに浸け、カバースリップを取り外した。スライドを、分子を付着させる前に乾燥した。スライドには、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｐｏｔｔｅｒ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐｉｘｓｙｓ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｐｏｔｔｅｒ  ａｎｄ  ＡｒｒａｙＩｔ  ９４６  Ｐｉｎｓ）を使用してスポッとした。７６８の組み合わせを五重にスポットした。ローダミンデキストラン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を陰性対照として、画像整列における使用のためにスポットした。以下の分子を使用した：コラーゲンＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、コラーゲンＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、コラーゲンＩＩＩ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、コラーゲンＩＶ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、コラーゲンＶ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、コラーゲンＶＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、フィブロネクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ラミニン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、メロシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、テネイシン−Ｒ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、コンドロイチン硫酸塩（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、アグレカン（Ｓｉｇｍａ）、エラスチン（Ｓｉｇｍａ）、ケラチン（Ｓｉｇｍａ）、ムチン（Ｓｉｇｍａ）、スーパーフィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）、Ｆ−スポンジン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ナイドジェン−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヘパラン硫酸塩（Ｓｉｇｍａ）、ビグリカン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、デコリン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ガレクチン１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ガレクチン３（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ガレクチン３ｃ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ガレクチン４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ガレクチン８（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、トロンボスポンジン−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、オステオポンチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、オステオネクチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、テスチカン１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、テスチカン２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、フィブリン（Ｓｉｇｍａ）、テネイシン−Ｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ナイドジェン−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ビトロネクチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ラットアグリン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ヒアルロナン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ブレビカン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。使用したラミニンは、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号ＡＧ５６Ｐであり、ベータ１鎖を癌揺するヒトラミニンの混合物である。ｓｐｏｔｔｅｒにより使用された供給源プレートは、Ｔｅｃａｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｅを使用して調製した。分子は、以前に記載された緩衝液２２を使用して２００μｇ  ｍｌ−１の濃度で調製した。スライドを、使用する前、湿度室に４℃で保存した。細胞外マトリックスマイクロアレイの接種および分析。スライドを、細胞を接種する前に、ＰＢＤで洗浄し、ＵＶで処理した。スライドを、細胞を接種するより先に、ＰＢＤで洗浄し、ＵＶで処理した。細胞とＥＣＭの相互作用を測定するため、細胞をアレイの無血清培地に接種し、３７℃で１．５時間かけて接着させた。均一な接種を確実にするため、スライドを１５分毎に扇動した。更に、スライドの上面を、真空封止を用いる特別設計接種装置の使用を介してプレートの底面に対して同一平面に保持する（図２Ａ）。この装置は、実験間の接種変動を最小限にし、スライド表面の下またはスライドの背面への細胞の設置を防止することにより細胞の損失を回避する。個別のアレイおよび複製アレイ間における接種の均一性は、１つ個のマトリックス分子のみから構成される試験スライドを使用して確認した。
【０２４５】
マウス腫瘍細胞の接着シグネチャーを特徴決定した。転移性の進行が、ＥＣＭ成分に接着する癌細胞の能力における別個の変化により特徴決定されるかを決定するため、肺腺癌の遺伝子操作モデルから誘導された細胞系のパネルを使用した。細胞系は、Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｎｋｘ２−１；Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，１０１−１０４  （２０１１）に記載されている。ヒトの肺腺癌細胞は、多くの場合、ＫＲＡＳ癌遺伝子に活性突然変異、ｐ５３遺伝子抑制経路に不活性突然変異を含有する。このマウスモデルにおいて、ｌｏｘＰ−Ｓｔｏｐ−ｌｏｘＰ  Ｋｒａｓノックイン対立遺伝子およびＬｏｘＰ部位によりフランクされている両方のｐ５３対立遺伝子を含有する遺伝子操作マウスＧ１２Ｄ（ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ／＋；ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）によるレンチウイルスＣｒｅリコンビナーゼの吸引は、肺腺癌の発生を開始する（ＤｕＰａｇｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｍｏｕｓｅ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｏｄｅｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｏｒ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃｒｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，４（８）：１０６４１０７２，２００９，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｅ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  Ｋ−ｒａｓ．Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１５（２４）：３２４３−３２４８，２００１）。遠位転移形態は、リンパ節、ならびに二次臓器（腎臓、副腎、肝臓など）において数か月間にわたって形成する。腫瘍を肺および転移部位から切除し、細胞系としてインビトロで培養することができる。転移性個体群を、リンカー仲介ポリメラーゼ連鎖反応（ＬＭＰＣＲ）および組み込み部位への特異的ＰＣＲの使用を介して、元の原発性腫瘍と相関させることができ、それは、レンチウイルスがゲノムに安定して組み込まれるからである（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｍ．  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｎｋｘ２−１．Ｎａｔｕｒｅ，４７３（７３４５）：１０１−１０４，２０１１）。したがって、細胞系は、検出可能な転移を形成しない原発性腫瘍（ＴｎｏｎＭｅｔ）、転移を形成する原発性狩猟（ＴＭｅｔ）、リンパ節転移（ＬＮ）、および他の部位への転移（Ｍｅｔ）から生成された（図２Ｂ）。これらの系を、新規のハイスループットＥＣＭアレイスクリーニングプラットフォームと組み合わせて使用して、接着における表現型の変化が腫瘍進行とどのように相関するかを決定した。簡潔には、腫瘍開始は、レンチウイルスＣｒｅリコンビナーゼの気管内注射を使用した達成した。腫瘍を切除し、消化し、組織培養物処理プラスチックで平板培養して、細胞系を生成した。続いて細胞系を、ダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびグルタミンにおい���培養した。これらの系を、原発性肺腫瘍およびこれらの転移の両方から誘導した。
【０２４６】
これらを、スライドの上面をウエルの底面と同一平面に保持する接種装置に設置した（図２Ａ）。全体で４００，０００個の細胞を、それぞれスライドの６ｍｌの無血清培地（ＤＭＥＭおよびペニシリン／ストレプトマイシン）に接種した。細胞を３７℃で２時間かけて結合させた。結合した後、スライドを３回洗浄し、ｑｕａｄｒｉｐｅｒｍ  ｐｌａｔｅ（ＮＵＮＣ，１６７０６３）に移し、新たな培地を加えた（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児血清、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびグルタミン）。スライドを、染色のために取り外す前に、３７℃で更に２時間放置した。スライドをＰＢＳで２回洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで固定した。核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と０．１％のＴｒｉｔｏｎ−ＸおよびＰＢＳとを組み合わせて使用して染色した。スライドをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ０１００−０１）により取り付け、画像化する前に、４℃で保存した。スライドを、ＮｉｋｏｎＴｉ−Ｅ倒立蛍光顕微鏡およびＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｉｋｏｎ）を使用して画像化した。スライド全体を走査し、このソフトウエアを使用して、画像を作り上げた。画像操作および分析は、ＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）により実施し、核の定量化は、実施例２に開示されているＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒソフトウエアを使用して実施した。クラスター化分析は、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（Ｔｉｂｃｏ）を使用して実施した。それぞれのスライドにおける複製スポットを平均化し、値が複製の平均を＞１上回る、または下回る標準偏差のものを除外した。スライドを、非ゼロ接着値の平均に正規化した。クラスター化は、階層クラスター化アルゴリズムによるりＳｐｏｔｆｉｒｅを使用し、ユークリッド距離に基づいて実施した（正規化接着＞０．０１）。インビトロ接着接種。いんびとろＥＣＭ接着試験は、９６ウエルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６０３）を使用して実施した。プレートを、２０μｇ／ｍｌのフィブロネクチン単独、または２０μｇ／ｍｌのフィブロネクチンと２０μｇ／ｍｌの第２の分子により、ＰＢＳ中において４℃で一晩かけて被服した。次にプレートを、１重量％のＢＡＳにより室温で１時間かけて遮断した。プレートを、ウエル１つあたり温無血清ＤＭＥＭに２×１０４個の細胞を加える前に、乾燥させた。細胞を３７℃で１時間かけて接着させ、１５分毎に振とうして均一の接種を確実にした。細胞をＰＢＳで洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。ウエルを、ＮｉｋｏｎＴｉ−Ｅ倒立落射蛍光顕微鏡を使用して画像化し、Ｎｉｋｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅにより分析した。
【０２４７】
進行および転移性拡大の際の癌細胞の包括的な接着シグネチャーにおける変化を見つけ出すため、正規化原発性腫瘍（ＴｎｏｎＭｅｔ），転移性の原発性腫瘍（ＴＭｅｔ）、ならびにリンパ節（ＬＮ）および肝臓（Ｍｅｔ）からの転移から誘導されたネズミ肺腺癌細胞系のパネルを分析した。技術的には、これらの細胞系の分析は、複製スポット間において極めて高度な再現性接着を示し、全体的に高い品質のＥＣＭスポッティングおよびアッセイの定量的性質が確認された。これらの細胞系の接着シグネチャーの分析は、異なるＥＣＭの組み合わせへのそれぞれの細胞系の多様な接着を強調した（図２Ｂ）。
【０２４８】
細胞が、単離された分子よりもＥＣＭ成分の組み合わせにより多い、または少ない接着を有するかを評価した。図２Ｂは、他の全ての分子と組み合わせた、３つの分子：コラーゲンＩ（上側）、コラーゲンＩＶ（中央）、およびフィブロネクチン（下側）の接着プロファイルを表す。灰色の破線は、単独の分子への接着を表す。矢印は、他の２つの分子または単独のいずれかとの組み合わせを示す。エラーバーは、３枚の複製スライドの平均値の標準誤差である。ここに表されるデータは、対毎の組み合わせの交差の範囲内において、異なるパートナー分子が接着に対して付加的、相乗的、および拮抗的効果を有してことを示唆した。例えば、図２Ｂは、このＴｎｏｎＭｅｔ細胞系において、多くの分子がコラーゲンＩとの接触を改善し、一方、他が、単離された分子と比較してその接着を低減することを表す（図２Ｂ、右上パネル）。コラーゲンＩＶおよびフィブロネクチンを含む他の分子にも、同じことが当てはまる（図２Ｂ、それぞれ中央および下側パネル）。これらの種類の組み合わせ効果は、多くの分子において、および試験した全ての細胞系にわたって現れた。例えば、図２Ｂの下側パネルは、２つの代表的な細胞系の３つの複製スライドの比較を表す。アッセイの反復性は、同じ細胞系の複製スライド間の保存されたプロファイルから明らかであり、（左側パネル）および（右側パネル）のスケールバーは、それぞれ４５０μｍおよび１００μｍである。
【０２４９】
実施例３：肺癌細胞系における接着シグネチャー
上記の実施例２と同様にスポットおよび接種されたＥＣＭアレイを、次に、細胞系の４つの分類のそれぞれの細胞系を分析するために使用した（図３Ａ）。異なる系の接着シグネチャーを比較するため、上記に適用されたデータのクラスター化と類似の方法による接着値の非管理階層クラスター化。縦軸は、異なるＥＣＭの組み合わせを表す。横軸は、異なる細胞系を表す。３９３Ｔ５、４８２Ｔ１、３８９Ｔ２、３９４Ｔ４、および３６８Ｔ１と同定された細胞系は、原発性腫瘍（ＴｎｏｎＭｅｔおよびＴＭｅｔ系）である。他の残りの細胞系は、結節性（Ｎ）または遠位転移（Ｍ）に由来するものである。ここに表されているデータは、１つのリンパ節系を除いて、転移から誘導された全ての細胞系が、原発性肺狩猟から誘導された細胞系と別個にクラスター化されることを示す（図３Ａの接着パターンを参照すること）。
【０２５０】
この結果は、特に驚くべきものであり、それは、これらの転移系のうちの２つ（３８９Ｎ１および３９３Ｍ１）が、スクリーンされた原発系の２つ（３８９Ｔ２および３９３Ｔ５）から直接播種したが、これらの親系より他の転移により密接にクラスター化する腫瘍からものであったからである。この知見は、原発性腫瘍に残ったものに対して、転移部位からの癌細胞のＥＣＭ接着シグネチャーに、保存された表現型変化があることを示唆している。興味深いことに、この差異クラスター化は、これらの系の遺伝子発現の非管理階層クラスター化によって明らかではなかった（Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｕｎｇ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｎｋｘ２−１．Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，１０１−１０４（２０１１））。したがって、本開示は、転移性進行に影響を及ぼし得るこの表現型は、特定のｍＲＮＡ、または特定の遺伝子のタンパク質発現を検査しても検出不可能である。
【０２５１】
ＥＣＭアレイを使用した表現型に基づいた接着のスクリーニングが、遺伝子発現研究による検出できない腫瘍進行の特徴を見つけ出すかを決定するため、接着において見いだされた変化が、関連する分子の発言における変化により説明され得るかを評価した。遺伝子発現プロファイリングは、ＥＣＭアレイを実行している時点で細胞から採取された細胞溶解産物により実施した。
【０２５２】
それぞれのＥＣＭ遺伝子の発現データを、１１個の細胞系のそれぞれのこれらの分子への接着について比較した。幾つかの発現データが接着と十分に相関したが（低接着／低発現、高接着／高発現）、多くの分子は、接着をほとんど有さないで高い発現、または発現をほとんど有さないで高い接着を示した。低、中、または高レベルで発現したＥＣＭ遺伝間で接着に実質的に有意な差はなかった（ｐ＞０．６）。したがって本開示は、おそらく腫瘍発生を促進する方法により腫瘍細胞の接着に必要な分子を提供する、または腫瘍細胞により産生されるＥＣＭ成分と反応する、他の実質または間質細胞との複雑な相互作用が存在する可能性を示す。
【０２５３】
階層クラスター化の結果を考慮すると、本発明者たちは、原発性腫瘍の細胞より転移性細胞により好まれる特定の分子の組み合わせが存在するかという疑問を持った。したがって、それぞれのＥＣＭ組み合わせへの肝臓転移誘導細胞系（Ｍ）の平均接着を、ＴＭｅｔ系の平均接着と比較した（図３Ｃ）。図Ｃは、転移性の原発性腫瘍細胞系（ＴＭｅｔ）と比較した、それぞれの組み合わせへの転移性細胞系（Ｍ）の平均接着を表す（左側）。図３Ｃは、それぞれの組み合わせにおける３９３Ｍ１の接着と、それに対応する原発性腫瘍系３９３Ｔ５との比較も表す（右側）。明灰色ドットは、転移性の原発性腫瘍系よりも転移系による優先的な接着を示す上位のＥＣＭの組み合わせを示す。多くのＭ系が、フィブロネクチンを含有する組み合わせへの高められた結合を示すが、フィブロネクチンと、ガレクチン−３、ガレクチン−８、またはラミニンのいずれかとを組み合わせた対は、系の部類のうちで最高の差異接着を有した。転移性進行における変化と特異的に相関する、接着における変化を探求するため、本発明者たちは、ＴＭｅｔ細胞系３９３Ｔ５およびクローン的に関連する肝臓転移誘導性細胞系３９３Ｍ１を比較した。この系の対は、レンチウイルス組み込み部位の検査により確認されたように、原発性腫瘍、および腫瘍から播種した転移から誘導した。
【０２５４】
更に、上述されたＥＣＭの組み合わせへの差異接着は、群毎の比較（図３Ａ）およびこの原発性腫瘍−肝臓転移の対との直接的な比較（図３Ｃ）の両方において明白であった。まとめると、観察されたパターンは、分子の組み合わせが、ＥＣＭ分子単独のいずれかに結合する傾向よりも、所定の個体群の接着プロファイルにおいてより有意な役割を有し得ることを示唆している。興味深いことに、フィブロネクチン／ガレクチン−３、フィブロネクチン／ラミニン、およびフィブロネクチンおよびガレクチン−８の組み合わせへの増加した結合の傾向は、本発明者たちが、全てのＴｎｏｎＭｅｔ、ＴＭｅｔ、Ｎ、およびＭ細胞系の平均接着を比較したとき、腫瘍進行の全体にわたって一貫していた（図３Ｄ）。これらの分子への結合は、単独で現れたとき、４群の細胞系において最小（フィブロネクチン）または傾向なし（ラミニン、ガレクチン−３、およびガレクチン−８）を示した。しかし、組み合わされると、これらの対は、これらの個別の接着の累積値を超える増強された効果を示す。対照的に、他の組み合わせは、多様なコラーゲンおよびオステオポンチンを含む、比較的より転移性の個体群において低減された接着傾向を示した（図３Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ガレクチン−３、ガレクチン−８、またはラミニンのいずれかとの組み合わせたフィブロネクチンへの接着が、このモデル系において腫瘍進行と高度に関連していることを示唆している。
【０２５５】
全体的に、本開示は、接着シグネチャーが、疾患状態を予測する、且つ利用可能な技術を使用しては予測不可能である細胞状態の決定を可能にすることを示す。このシグネチャーは、臨床試料のＴＮＭ段階を予測し、どの遠位臓器に疾患が最も容易に転移するかを潜在的に同定するので、転移性疾患の診断試験として作用することができる。この知見は、癌の診断において大きな有意性がある。
【０２５６】
実施例4：マウスからヒトの試料における肺癌細胞の接着シグネチャー
次に、本発明者たちは、インビトロ接着プロファイルをインビボでのＥＣＭ発現と相関させることを探求した。同定されたＥＣＭ分子が、天然の腫瘍発生に重要であり得るかを調査するため、原発性の自発性腫瘍を含有する臓器をＫｒａｓＬＳＬ  −  Ｇ１２Ｄ／＋；ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスから切除し、染色した。広範囲の腫瘍量を有する肺のトリクローム染色は、腫瘍担持肺におけるＥＣＭ蓄積の有意な存在を明らかにした（図４Ａ）。以前に本発明者たちは、転移する能力を取得した原発性腫瘍（ＴＭｅｔ腫瘍）が、クロマチン関連タンパク質Ｈｍｇａ２を上方制御することを見いだした。したがって本発明者たちは、組織学的特徴に加えてＨｍｇａ２の免疫組織化学を使用して、高度に侵襲的な癌細胞の領域を同定した。予測されたように、原発性肺腫瘍は、高悪性度腫瘍領域と重複する最も強力な染色を伴って、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、およびオステオポンチンに対して陽性であった（データ示されず）。特に、オステオポンチンの染色は、Ｈｍｇａ２陽性領域と強く共局在化し、増加したオステオポンチン産生が転移性の原発性肺腫瘍と関連することを示唆している。更に、ラミニン、ガレクチン−３、またはガレクチン−８の染色は、原発性腫瘍においてほとんど検出されなかった（図４Ａ）。興味深いことに、腫瘍におけるフィブロネクチン染色は強力であり、転移性個体群の増加と、転移性カスケードの初期におけるフィブロネクチンの存在との相関関係を明らかにした（図４Ａ）。
【０２５７】
本発明者たちは、次に、リンパ節および遠位臓器転移が転移関連ＥＣＭ分子を含有するかという疑問を持った。ここでも、トリクローム染色は、リンパ節内の有意なマトリックス蓄積の存在を明らかにした（データ示されず）。予測されたように、リンパ節腫瘍は、全体として、組織学的に高い悪性度があり、Ｈｍｇａ２陽性であった。リンパ節転移内における４つ全ての転移性関連分子（フィブロネクチン、ラミニン、ガレクチン−３、およびガレクチン−８）の明白な発現もあった（図４Ａ）。更に、実質的にコラーゲンＩまたはコラーゲンＶＩはなかった（データ示されず）。しかしオステオポンチンは、転移に存在し（データ示されず）、浸潤的前面を伴って最高の発現を有した。免疫組織学的データのまとめを図４Ｂに表す。「Ｔ」は、原発性肺腫瘍を示し、「Ｎ」は、リンパ節転移を表し、「Ｍ」は、遠位臓器転移を表し、染色されたＥＣＭ成分は、以下の通りである。「Ｃｏｌｌ  Ｉ」は、コラーゲン１であり、「Ｃｏｌｌ  ＩＶ」は、コラーゲンＩＶであり、「ＯＰＮ」は、オステオポンチンであり、「ＦＮ」は、フィブロネクチンであり、「Ｌａｍ」は、ラミニンであり、「Ｇａｌ−３」は、ガレクチン−３であり、「Ｇａｌ−８」は、ガレクチン８である。
【０２５８】
本発明者たちは、また、転移関連分子の存在について共通の転移部位を検査した（図４Ａ）。ガレクチン−３およびガレクチン−８は、両方とも、これらの部位において明確に目で見える。ラミニンおよびフィブロネクチンは、両方とも、マウスの肝臓の類洞に現れ、また、そこに転移形態で現れた。これらの原発性と転移性の部位の差が、腫瘍細胞により変更されたマトリックス産生に起因するかを決定するため、本発明者たちは、３９３Ｔ５および３９３Ｍ１のＴＭｅｔおよびＭ細胞系にイムノブロットを実施した。Ｍ系は、ＴＭｅｔ系と比較して、フィブロネクチンおよびラミニン産生に僅かな増加を示したが、両方のガレクチンの産生は、一定であった（図５、上側パネル）。更に、コラーゲンＩの産生は一定であり、オステオポンチンの産生は、Ｍ系において実際に増加した。まとめると、これらのデータは、ＥＭＣマイクロアレイが、自発性腫瘍を担持するマウスの生理学的に関連する部位内に見いだされた分子を同定すること、およびこれらの分子の産生が、これらの部位に存在する腫瘍細胞だけでは実施されないことを示唆している。
【０２５９】
インテグリン表面発現はＥＣＭ結合プロファイルと相関する。加えて特定のＥＣＭ成分への接着が、これらの、同族インテグリンの発現と相関するかを評価した。ＥＣＭ成分の発現の場合のように、インテグリンの発現は、多くの場合に、これらの概賃リガンドへの接着と相関しなかった。この知見は、多くのインテグリンの発現における小さな変更は、これらが相互作用する分子への接着に大きな変化をもたらし得ること、またはＥＣＭもしくはインテグリン後処理のようなより複雑な機構が接着に顕著に寄与することを示唆している。
【０２６０】
目的の分子への接着に相関したタンパク質レベルでこれらの分子が提示されるかを評価した。特徴的な原発性系の３９３Ｔ５の溶解産物のウエスタンブロットを、転移性系の３９３Ｍ１と比較した。ここで提示されるデータは、両方のガレクチンの発現が、３９３Ｍ１では接着が増加しているにもかかわらず、系の間では不変であることを示している。したがって本開示は、ガレクチン−３またはガレクチン−８のいずれかのタンパク質レベルが、これらの分子への接着が疾患進行のマーカーまたは代用マトリックスとして十分ではない場合があることを示す。更に、増加したオステオポンチン発現が、３９３Ｍ１系において、その系が低い接着スコアを有するにもかかわらず、検出された。この知見は、分子への接着を欠いているにもかかわらず、転移性個体群からのオステオポンチンによるシグナル伝達の役割を示唆している。したがって本開示は、オステオポンチンが転移適所の発生を促進し得るが、それへの接着の損失は、腫瘍細胞が浸潤し、転移性カスケードを介して進行することを必要とし得ることを示している。
【０２６１】
本発明者たちは、ＥＣＭアレイにおける接着傾向の比較が、同族インテグリンの転写プロファイルと必ずしも相関しないことに注目した（図５、左下パネル）。したがって、本発明者たちの知見を、転移関連ＥＣＭ分子について受容体の存在と相関させるために、クローン的に関連する代表的なＴＭｅｔとＭの細胞系の対を、これらの同族インテグリンの表面発現に関して検査した。ｍＲＮＡ発現パターンは、遺伝子発現マイクロアレイによる、Ｍ系の転移関連インテグリンの有意な上方制御を示さなかったが（図５、右下パネル）、原発性腫瘍関連分子または転移関連分子のいずれかに対応したインテグリンサブユニットのフローサイトメトリー分析は、受容体発現の傾向が、観察された結合パターンと一致したことを明らかにした。具体的には、フィブロネクチン（α５およびαｖ）、ラミニン（α６およびα３）、ならびにガレクチン（α３）に結合することが知られているインテグリンサブユニットは、全て、転移由来系においてより多く存在するが、コラーゲン（α１およびα２）に関連するものは、原発性腫瘍由来系において比較的多かった（図６Ａ）。図６Ａは、３９３Ｔ５（ＴＭｅｔ）および３９３Ｍ１（Ｍ）細胞系におけるインテグリン表面発現のフローサイトメトリーを示す。転写関連分子に結合するインテグリンサブユニットは、代謝系（α５、αｖ、α６、α３）に増加した表面提示を示すが、原発性腫瘍関連分子に結合するものは、減少した提示を示す（α１およびα２）。
【０２６２】
いずれにしても、表面発現傾向は、他のＴＭｅｔおよびＭ系にとっても一定であった（データ示されず）。更に、所定の細胞系内において、本発明者たちは、フローサイトメトリーにより測定したとき、転移関連インテグリンの比較的均質な表面発現を観察し（データ示されず）、系の間の接着の変動が、選択された下位個体群の結合パターンではなく、表面受容体発現の包括的な増加に起因することを示唆している。免疫組織化学は、これらのインテグリンも、自発性腫瘍を担持するマウスの転移に存在するが、近接組織には存在しないことを明らかにした（図６Ｂ）図６Ｂは、肝臓およびリンパ節への自然転移を有する自発性腫瘍を担持するマウスにおける転移関連インテグリンを示す。スケールバーは、１００μｍである。
【０２６３】
インテグリンの転写レベルが接着傾向と一致しないという知見は、インテグリンの転写後制御、変更されたグリコシル化のような翻訳後修飾、または活性化状態の変更が、接着の変化に関与する可能性があることを示唆している。したがって、受容体遺伝子またはタンパク質発現ではなく、特異的ＥＣＭ結合を調査する本発明者たちのプラットフォームを利用することによって、そうでなければ見過ごされていたＥＣＭ相互作用の候補を同定することができる。
【０２６４】
インテグリンα３ベータ１は、接着および接種をインビトロおよびインビボで仲介する。
どの候補受容体／ＥＣＭ相互作用が、観察された結合パターンに参加し得るかを検査するため、本発明者たちは、ＧｅｎｅＧＯソフトウエア（Ｍｅｔａｃｏｒｅ）を使用して、転移関連ＥＣＭ分子の手作業で精選した分子相互作用のコンピューターネットワークマッピングを実施した。最大の疾患関連性を有するハイ腺癌転移ネットワークを「新生物転移」と呼ぶ、ネットワークマップを生成した（Ｐ＝１．０９４×１０−４５、超幾何学的試験、図７Ａ）。同じパラメーターを使用したが、原発性腫瘍関連分子により生成されたネットワークは、転移と疾患関連性を示さなかった（図７Ｂ）。肺腺癌転移ネットワークの分析は、最大数の縁を有する表面受容体としてインテグリンα３β１を同定した。（図７Ａ）。結果は、自己展開アルゴリズムを使用して生成され、転移関連ＥＣＭ分子（ラミニン、フィブロネクチン、ガレクチン−３、およびガレクチン−８）により開始されたＧｅｎｅＧＯ（Ｍｅｔａｃｏｒｅ）において生成された。図７Ａの下側パネルは、肺腺癌ネットワークの疾患関連ランクを表す。Ｐ値は、超幾何学的試験により決定された。この知見に基づいて、本発明者たちは、短ヘアピン仲介ＲＮＡ干渉を使用してα３およびβ１サブユニット（それぞれ、Ｉｔｇａ３およびＩｔｇｂ１）の両方のノックダウンを実施した（図８Ａ）。図８Ａは、ＩＴＧＢ１のノックダウン（上側パネル）およびＩＴＧＡ３のノックダウン（下側パネル）を有するインテグリン表面発現のフローサイトメトリーを表す。グラフの右側の曲線は、ホタルルシフェラーゼに対する対照ヘアピンを表し、一方、グラフの左側の曲線は、インテグリンサブユニットに対するヘアピンを表す。ｓｈＲＮＡによるα３およびβ１インテグリンサブユニットの両方のノックダウンは、ホタルルシフェラーゼ遺伝子を標的にする対照ヘアピンと比較したとき、インビトロにおける転移関連分子への低減された接着も示す。ｓｈＦＦは、ホタルルシフェラーゼを標的にする対照ヘアピンである。（図８Ｂ）。図８Ｂのエラーバーは、標準誤差（ｎ＝３）を表す。チューキーの多重比較試験の一方向ＡＮＯＶＡを使用して、図８Ｂのデータを分析した。
【０２６５】
本発明者たちは、次に、このインテグリン二量体がインビボにおける転移接種に役割を有するかを評価した。したがって、野生型マウスへの３９３Ｍ１−ｓｈα３または３９３Ｍ１−ｓｈＦＦ細胞の脾臓内注射および乾燥腫瘍形成のモニタリングによって、実験的転移アッセイを実施した。本発明者たちは、３９３Ｍ１−ｓｈα３細胞を注射下マウスが、対照より少ない腫瘍小結節を形成したことを見いだした（図８Ｃおよび８Ｄ）。脾臓内注射の２．５週間後に、肝臓の表面の腫瘍小結節の数は、ＺＳｇｒｅｅｎ＋細胞の表面蛍光の分析を介して、または組織学的評価、続くパラフィン包埋、薄切り、ならびにヘマトキシリンおよびエオシンによる染色を介して決定した。マン−ホイットニーの検定（非パラメトリック）試験を使用して、シグネチャーを分析した。まとめると、これらの知見は、α３β１インテグリン二量体が、転移関連ＥＣＭ分子への転移細胞の接着および転移接種において役割を有することを示唆している。
【０２６６】
ガレクチン−３／８は、ヒト肺癌転移に存在する。インビトロ接着データおよびインビトロマウス知見に基づいて、本発明者たちは、ヒト試料における転移関連ＥＣＭ分子の役割を探求した。ヒト遺伝子データセット分析ツールであるＯｎｃｏｍｉｎｅ３２を使用して、本発明者たちは、ＥＣＭ遺伝子発現と疾患重篤度の相関関係（例えば、臨床病期または転移の存在）について検査した。これらの疑問に対する答えは、ＬＧＡＬＳ３またはＬＧＡＬＳ８（それぞれ、ガレクチン−３およびガレクチン−８）の増加した遺伝子発現またはコピー数が、増加した臨床病期または転移の存在と相関することを示している（図９Ａ）。次に、ガレクチン−３タンパク質が、良性非新生物ヒト肺組織と比較して悪性ヒト肺腫瘍に高いレベルで存在するかを、監査の肺およびリンパ節から摂取した試料を使用して調査した。ヒト組織マイクロアレイをガレクチン−３で染色すると、癌を有さないもの（３８％）と比較して、悪性疾患を有する患者のリンパ節に分子が多（８８％）ことを明らかにした（図９Ｂ）。更に、陽性の原発性肺腫瘍試料（４７％）より高い（８８％）ガレクチン−３陽性リンパの画分があり、原発性腫瘍より転移部位への関連が確認される（Ｐ＜０．０５、フィッシャー直接検定）。したがって、ＥＣＭマイクロアレイは、ヒト肺癌において転移と関連する相互作用を同定することができた。
【０２６７】
方法
タンパク質分析。ＥＣＭ分子のウエスタンブロット分析は、以下の抗体により実施した。ガレクチン−３（Ａｂｃａｍ、ａｂ５３０８２、１：５００）、ガレクチン−８（Ａｂｃａｍ、ａｂ６９６３１、１：５００）、オステオポンチン（Ａｂｃａｍ、ａｂ８４４８、１：２，０００）、フィブロネクチン（Ａｂｃａｍ、ａｂ２４１３、１：１，０００）、ラミニン（Ａｂｃａｍ、ｂ１１５７５、１：１，０００）、コラーゲンＩ（Ａｂｃａｍ、ａｂ３４７１０、１：５，０００）、およびα−チューブリン（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、２１２５、１：１，０００）。ＥＣＭ分子の免疫組織化学は、以下の抗体により実施した。ガレクチンｎ−３、ガレクチン−８（１：７５）、オステオポンチン、ラミニン（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１５７５、１：１００）、フィブロネクチン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ２０３３、１：８０）、Ｈｍｇａ２（Ｂｉｏｃｈｅｃｋ、５９１７０ＡＰ、１：１，０００）、コラーゲンＩ（Ａｂｃａｍ、ａｂ３４７１０、１：５００）、およびコラーゲンＶＩ（Ａｂｃａｍ  ａｂ６５８８、１：１００）。インテグリン染色は、以下の抗体：インテグリンαｖ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＡＢ１９３０，１：２００）、インテグリンα５（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＡＢ１９２８、１：２００）を使用して実施し、インテグリンα３は、既知の方法を使用して調製した。組織マイクロアレイは、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＬＳ−ＳＬＵＣＡ５０）から得て、同じガレクチン−３抗体で染色した。ネズミ組織は、ＫｒａｓＬＳＬ−Ｇ１２Ｄ，ｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス２７−２９から採取した。ＩＨＣは、マウスからの切除、ホルマリンによる固定、およびパラフィンによる包埋の後に実施した。インテグリン発現のフローサイトメトリー分析は、以下の抗体を使用して実施した。インテグリンα５（ＡｂｃａｍおよびＢｉｏＬｅｇｅｎｄ−クローン５Ｈ１０−２７、１：１００）、インテグリンαｖ（ＢＤ−クローンＲＭＶ−７、１：１００）、インテグリンα６（ＢＤおよびＢｉｏＬｅｇｅｎｄ−クローンＧｏＨ３、１：１００）、インテグリンα３（Ｒ＆Ｄ、１：１００）、インテグリンα１（ＢＤ−クローンＨａ３１／８およびＢｉｏＬｅｇｅｎｄ−クローンＨＭα１、１：１００）、ならびにインテグリンα２（ＢＤ−クローンＨＭα２、１：１００）。
【０２６８】
ＲＮＡ単離および発現のプロファイリング。細胞溶解産物はＴｒｉｚｏｌ（Ｓｉｇｍａ）を使用して採取した。クロロホルム抽出は、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙスピンカラムを使用したＲＮＡ精製の後に実施した。溶解産物を、ＲＮＡの完全性ついにて分析し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  ＷＴ  Ｓｅｎｓｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔｓキットにより調製し、続いてＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  ３’  Ａｒｒａｙｓ（Ｍｏｕｓｅ  ４３０Ａ  ２．０）とハイブリッド形成した。遺伝子発現マイクロアレイに使用した溶解産物を、ＥＭＣマイクロアレイが、細胞培養物により導入された変動を最小限にするために接種されるのと同時に採取した。Ｒ／Ｂｉｏｃｈｏｎｄｕｃｔｏｒソフトウエアを、アレイ画像の処理に使用した。非管理階層クラスター化分析は、ユークリッド距離を使用して、変動＞０．５および発現＞３．０を有する全てのプローブセットについて、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（Ｔｉｂｃｏ）により実施した。データセットは、受入番号ＧＳＥ４０２２２のレトロウイルス短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）構築物がＮＣＢＩから公的に利用可能である。インテグリンβ１（５’ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＧＧＣＴＣＴＣＡＡＡＣＴＡＴＡＡＡＧＡＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴＴＴＡＴＡＧＴＴＴＧＡＧＡＧＣＣＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３’）、α３（５’−ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＴＧＧＡＣＡＴＴＴＣＡＧＡＧ  ＡＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＴＴＣＴＣＴＧＡＡＡＴＧＴＣＣＡＴＣＣＧＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ−３’）、または対照ホタルルシフェラーゼ（５’−ＡＡＧＧＴＡＴＡＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＴＣＣＣ  ＧＴＧＡ  ＡＴＴＧＧＡＡＴＣＣＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＧＧＡＴＴＣＣＡＡＴＴＣＡＧＣＧＧＧＡＧＣＣＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧ−３’）を標的にするｍｉＲ３０に基づいたｓｈＲＮＡは、Ｋａｔａｈｄｉｎのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｋａｔａｈｄｉｎ．ｃｓｈｌ．ｅｄｕ／ｈｏｍｅｐａｇｅ／ｓｉＲＮＡ／ＲＮＡｉ．ｃｇｉ？ｔｙｐｅ＝ｓｈＲＮＡ）から入手可能なｓｈＲＮＡレトロウイルスソフトウエアを使用して設計し、合成し（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ）、次にＭＳＣＶ−ＺＳＧ−２Ａ−Ｐｕｒｏ−ｍｉＲ３０ベクターにクローンした。レトロウイルスの詰め込み、および細胞の形質導入は、以前に記載されたように実施した。
【０２６９】
全ての動物手順は、ＭＩＴ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのプロトコール０２１１−０１４−１４に従って実施した。細胞注入の研究は、Ｂ６１２９ＳＦ１／Ｊマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号１０１０４３）のより実施した。脾臓内注射は、１００μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に再懸濁した５×１０５個の細胞を使用して実施し、現行のプロトコール２９に従って脾臓の先端部に注射した。動物には、外科手術の前にアベルチンにより麻酔をかけた。動物から被毛を取り除き、ベタジンおよび７０％エタノールで滅菌した。脾臓は、皮膚および体壁に切り込みを入れた後、体外に出した。細胞を２７ゲージのシリンジにより脾臓の末端部に注射し、循環の中を２分間移動させた。次に脾臓の血管を焼灼した後、脾臓を動物から切除した。筋肉壁を５−０溶解性縫合糸の使用により閉鎖し、皮膚を７ｍｍの創傷クリップ（Ｒｏｂｏｚ）の使用により閉鎖した。マウスを、注射の２．５〜４週間後に殺処分し、肝臓を切除した。表面小結節の定量化および肝臓の画像化は、解剖顕微鏡を使用して実施した。組織を、４％パラホルムアルデヒドによる固定に後、パラフィンに包埋し、ヘマトキシリンとエオシンにより染色した。
【０２７０】
考察
ＥＭＣマイクロアレイは、ＥＣＭへの多様な細胞応答を測定することができるハイスループット多重プラットフォームを提供する。ここでは、本発明者たちは、これらが転移性個体群を原発性腫瘍から差異化する接着パターンを同定できることを示す。本発明者たちは、転移性肺癌細胞が、原発性腫瘍に由来する細胞と比較して、ラミニン、ガレクチン−３、またはガレクチン−８と組み合わせたフィブロネクチンに優先的に結合することを見いだした。接着におけるこれらの変化は、多様なインテグリンの表面提示における変化と相関する。特に、α３β１はインビトロでこれらの分子との接着を仲介し、インビボにおける転移接種を許容する。更に、遺伝子操作マウス胚癌モデルおよびヒト肺癌の両方から誘導された転移は、転移関連ＥＣＭ分子を発現する。これらのＥＣＭ成分の組み合わせが、最強の効果を発揮することは注目に値し、個別の分子を超える応答を測定ができるプラットフォームを使用することの重要性を強調している。
【０２７１】
ガレクチンは、β−ガラクトシドに結合するレクチンの部類であり、フィブロネクチンのような他のＥＣＭ分子と会合し得る。ガレクチン−３は、多様な癌において転移と関連し、多くの癌腫により過剰発現されている炭水化物抗原である、癌胎児性トムゼン・フリーデンライヒ抗原に結合することができる。本発明者たちのプラットフォームは、肺腺癌におけるその重要性を確認し、またガレクチン−８を同様の重要性を有すると同定した。ガレクチン−８は、他のマトリックス分子への細胞の接着に影響を与えることが知られているが、癌および転移におけるその役割は、接着および腫瘍発生と負および正の両方の関連性を有することが見出されているので、あまり明らかではない。ＥＣＭマイクロアレイを使用して、本発明者たちは、フィブロネクチンと組み合わせたガレクチン−８への結合が、肺腺癌の転移進行と強く関連することを示した。
【０２７２】
更に、多くのコラーゲンに加えて、オステオポンチンへの結合の損失は、転移進行を伴うことを見いだした。オステオポンチンレベルは、転移性疾患を有する患者における進行と相関し、原発性腫瘍によるオステオポンチンの分泌は、転移適所の確立を助ける、骨髄誘導性間質前駆体の移動をもたらす。転移の部位における転移性分子の存在を確認することに加えて、本発明者たちは、原発性腫瘍の浸潤性部分および転移の浸潤性前面がオステオポンチンを分泌することを見いだした（図４Ｂ）。転移性腫瘍系も、その対応する原発性のものより多くのオステオポンチンを産生する。これらの知見は、幾つかの原発性腫瘍が、本発明者たちのモデルでは、オステオポンチンを分泌することにより、骨髄細胞を活性化し得るが、転移性細胞は、固定化された分子への接着を損失しているにもかかわらず、扇動する原発性のものと匹敵する、またはよりも高いレベルでこの動員に寄与し得ることを示唆している。入院中の患者の層化のための遺伝子発現シグネチャーの使用は広まっているが、ゲノム手法は、候補遺伝子を同定するには有益である一方、多様な知見は、広範囲の治療選択肢の開発をほぼ不可能にしている。しかし、表現型レベルで保存された機構を評価することにより、関連する標的を同定することができ、治療薬を、広範囲の患者のために開発することができる。本発明者たちの結果は、臨床バイオマーカーを同定する表現型スクリーニング手法の有用性を強調する。本発明者たちは、α３β１インテグリンを治療標的と同定するが、ＥＣＭマイクロアレイにより精製される接着シグネチャーが、遺伝子的に類似している個体群を多様な転移可能性から差異化できることも示している。更に、ガレクチンまたはこれらの受容体のｍＲＮＡレベルに増加がないことが、これらの分子と転移の関係性もにかかわらず、Ｍ系における遺伝子発現マイクロアレイにより観察された（図５）。ヒト試料におけるガレクチン−３およびガレクチン−８の存在（図９）は、ヒト疾患におけるこのプラットフォームの関連正を示しており、したがって、これらのアレイは、伝統的なＴＮＭ病期決定を超えて、癌患者の層化に有用な臨床ツールであり得ると想像される。
【０２７３】
ＥＣＭマイクロアレイプラットフォームの価値は、転移性癌の特定の用途を超えて広がっている。この研究は、接着パターンをプロファイルする能力を示しているが、アレイに結合している細胞は、細胞死、繁殖、および遺伝子またはタンパク質発現の変更のようなＥＣＭへの長期応答をモニターするため、数日間にわたって培養物中に保持され得る。その目的のため、多重抗体染色を使用して、幹細胞分化または活性化に対するＥＣＭの効果を精査することができる。直交的スクリーニングを実施して、ＥＣＭの文脈における増殖因子、小細胞、またはＲＮＡ干渉の効果を見ることができる。必要な細胞数の低減は、循環腫瘍細胞または癌幹細胞のような希な細胞個体群をスクリーンするため、および更なる生物学的研究のためにこれらの個体群をインビトロで拡大することを助けるため、小型化アレイを使用して実施することができる。
【０２７４】
実施例６：癌進行の異なる病期におけるヒト乳腺上皮細胞の異なる接着シグネチャー
肺癌転移のタンパク質発現情報を特徴決定することを同定するアレイの知見および有用性を、乳癌のような他の種類の癌に適用することができる。上皮間葉転換（ＥＭＴ）は、典型的には互いに緊密に結合している上皮細胞および基底膜が、増強された移動能力を示す間葉状態への転換を受ける過程を記載する。この過程は、胚発生創傷治癒の際に天然に生じるが、最近の研究は、多様な病理におけるその役割の関与を示している。特に、少なくとも幾つかの場合において、これが新生物の転移性潜在力の取得の裏側にある推進力であることが、現在理解されている。ＥＭＴとして知られているこの胚プログラムを開始する癌腫は、細胞およびその周りに細胞外マトリックス（ＥＣＭ）から自由になることができ、組織、血管、リンパ管を介して浸潤し、最終的に身体の遠位部位に到達する。しかし、これらの遠位部位に二次腫瘍を形成するため、細胞は、その遠位部位にコロニー形成し、臨床的に検出可能な顕性転移に増殖するため、間葉系から上皮への転換（ＭＥＴ）として知られている逆転換を受けなければならないと考えられる。ＴＧＦベータのような多様な細胞外シグナル伝達分子がＥＭＴを誘発することが知られているが、ＭＥＴを推進する要因は、依然として不十分にしか理解されていない。おそらく、癌に関連するとして、ＥＭＴの分野において最も良く研究されている組織は、乳房である。他は、ＥＭＴの文脈において乳癌転移を特徴決定するモデル系を開発した（Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．Ｊａｎｕａｒｙ  １，２００１  １５：５０−６５；Ｙａｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００４）；Ｔｗｉｓｔ，ａ  ｍａｓｔｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｐｌａｙｓ  ａｎ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  １１７，９２７−９３９）。多様な転写因子が、このプログラムを開始させることが知られている。特に、Ｔｗｉｓｔ、Ｓｎａｉｌ、およびＳｌｕｇは、ＥＭＴ表現型の強力なインデューサーである。したがって、この研究において、本発明者たちは、２つの状態を表す一対の細胞系を使用し、上皮細胞（野生型）およびＥＭＴをうけたもの（間葉系）である（それぞれ、図１０Ａおよび１０Ｂを参照すること）。これを達成するため、実験室で正常乳腺上皮細胞を固定化し、続いてＲａｓ癌遺伝子の組み込みにより発癌性にした。間葉型の細胞を作製するため、これらは、ＥＭＴを誘発するＴｗｉｓｔ転写因子を過剰発現した。
【０２７５】
ＥＣＭアレイは、上記に記載された技術を使用して作り出し、７００個を超える異なる対のＥＣＭ成分を含むＥＣＭアレイをもたらして、このプロセスが細胞とＥＣＭの相互作用にどのように影響を与えたかを決定した。本発明者たちは、上皮（ｗｔ）および間葉（Ｔｗｉｓｔ＋）細胞（ＨＭＬＥＲ）の両方をアレイにおいて実行した。これらの相互作用における変更は、より大きな転移潜在力の付与を生じる変化を表す、および悪性のより進行した段階を表す可能性があり得る。特定の細胞の接着値および接着シグネチャーの決定に使用さえるアルゴリズムは、本明細書に予め記載されている。アレイの結果を図１０、１１、および１２に示す。
【０２７６】
図１０は、上皮と間葉細胞の接着における差を記載する。より詳細には、図１０Ａは、前述のアレイにおけるＥＣＭの組み合わせの全てに対する野生型乳腺上皮細胞の接着を示す。挿入グラフは、正規化接着値によると上皮細胞が最大の親和性を有する、ＥＣＭ成分の２０個の組み合わせを示す。ヒアルロン酸およびガレクチン−８。Ｔｗｉｓｔ＋細胞系に基づいたフィルタリングは、ここでは行っていない。接着シグナルを、個別のスポットの（前記のようにＨｏｅｓｃｈｔにより染色された）核の定量化に基づいて収集した。
【０２７７】
図１０Ｂは、図１０Ａに記載されたアレイへの細胞の調製および曝露において実施されたものと同じ方法を記載する。挿入グラフは、ｔｗｉｓｔ＋細胞が最高の親和性を示す、２０個の接着セットを表す。
【０２７８】
［図１０Ｄは、図１０Ａおよび１０Ｂに記載されたアレイと接触した細胞の接着シグネチャーの比較分析に基づいた差異接着ヒートマップを表す。このヒートマップは、２つの細胞型の組み合わせに異なって接着している上位のものを表す。縦列「１」に列記されている組み合わせは、上皮細胞が優先的に接着するＥＣＭの組み合わせであり、一方、縦列「２」のものは、間葉細胞が優先的に接着するＥＣＭ成分の組み合わせである。縦列１の接着セットの接着を失った細胞は、より転移性になる可能性があり、一方、縦列２の組み合わせの接着セットにより親和性を示す細胞は、より転移性の特徴を示すより大きな可能性を有する。更に、これらの接着シグネチャーは、疾患状態を潜在的に示している。］
【０２７９】
図１０Cは、２つの細胞状態の間の接着に最大の差異を示す上位２０個のＥＣＭの組み合わせを示す。暗灰色の棒は、間葉（転移性）細胞がより頻繁に結合する接着セットを表す。明灰色は、非転移性上皮細胞が頻繁に結合する接着セットを例示する。データは、アレイまたは系の使用者が、細胞試料からの細胞を、転移性の特徴または非転移性の特徴を有すると特徴決定することを可能にする。
【０２８０】
特定の接着セットが、特定の細胞個体群の繁殖を刺激し得るのであって、単に接着を刺激し得るのではないことを同定するため、実験は、正常な上皮細胞（図１０〜１２では、「野生型」または「ｗｔ」と表示されている）または乳腺系譜から誘導された転移性上皮細胞（表１０〜１２では、「ｔｗｉｓｔ＋」または「ｔｗ＋」と表示されている）による細胞倍加時間を測定するため、アレイにおいて実施した。この実験の１つの用途は、乳腺細胞の原発性系譜からの正常な上皮細胞の繁殖を刺激すること、ならびに刺激への細胞応答を観察し、同時にそのような細胞が繁殖状態にあることを観察する系として使用され得る細胞培養物を作り出すことができる接着セットを同定することである。細胞を、既に開示されている上記のプロトコールに従って接種した。
【０２８１】
図１０Ａは、  本明細書に開示された系への４８時間の曝露後、上位野生型倍加時間で刺激する接着セットを例示する。図１０Ｂは、接着セットが、４８時間の曝露後に、系またはアレイに曝露後の転移性乳腺上皮細胞の繁殖を促すことを例示する。これらの組み合わせの多くがガレクチン−３を癌柚須得ることは、おそらく注目に値することである。結果は、他のＥＣＭ成分のうちでガレクチン−３が、野生型と転移性の特徴の両方を有する乳腺細胞系譜の繁殖を刺激することを示す。このデータは、ガレクチン−３を別のＥＣＭ結合パートナーと共に含むアレイまたはキットは、培養物中の乳腺細胞の増殖を促すはずであることを示唆している。したがって、ガレクチン−３は、上皮および間葉乳腺癌腫の両方の繁殖を促進すると思われる。試験した両方の細胞系における差異的な乳腺細胞接着を図１０Ｃに表す。正常な上皮細胞に優先的に結合する接着セットは、中空または白色棒により強調されている。転移性細胞に優先的に結合する接着セットは、黒色棒により強調されている。
【０２８２】
野生型乳腺上皮細胞または転移性乳腺細胞の両方に応答するアレイおよび系の差異的または選択的な繁殖能力を研究するため、接着シグネチャーを接種の４８時間後に両方の細胞型から収集した。図１１Ａは、正常な上皮細胞を優先的に繁殖させる接着セットを表す。図１１Ｂは、転移性上皮細胞に優先的に結合する接着セットを表す。次に全ての生接着値を以下のプロトコールにより正規化した。それぞれの組み合わせは、スライド１枚あたり５つの複製を有する。複製の平均を１標準偏差上回る、または下回る任意の複製は、廃棄され、新たな平均が計算される。それぞれの組み合わせの平均が計算された後、計数がゼロを超える全ての組み合わせの平均が、それぞれのスライドにおいて計算される。次にスライドにおける全ての組み合わせが、平均に正規化される。この正規化スキームは、以下の２つの供給源からの偏りを除去するので、接着の分析にとって特に有用である。図１１は、２つの表された細胞型の間の結合計数により大きな差がある、接着セットの代表的なヒートマップを表す。ここで、「計数」は、細胞の初回接種の４８時間後の所定の組み合わせによる細胞の正規化された数を意味する。「１」と表示された接着セットは、野生型乳腺上皮細胞より間葉細胞の繁殖を強く刺激する接着セットである。「２」と表示された縦列の接着セットは、転移性の特徴を有する細胞より野生型乳腺上皮細胞の繁殖をより強く刺激する接着セットである。
【０２８３】
ヒートマップは、異なる生接着値を例示するために生成された（データ示されず）。正規化は以下の通りである。ピペット、計数、または両方の誤差に起因するそれぞれのスライドに置かれた細胞数の変動、ならびに特定のＥＣＭの組み合わせに対する代表的ではない包括的接着変化（すなわち、１つの細胞型は、別のものより一般に粘着性である）
【０２８４】
後者の正規化ステップは、特定の組み合わせへの同じ相対的接着を依然として示す転移性細胞として特に関連性があり、それは、これらの原発性腫瘍の対応物が、単にこれらの細胞が包括的接着変化に接着性が少ない傾向があるので、低減された接着を有すると思われないからである。
【０２８５】
図１２Ａ〜図１２Ｃは、ＭＥＴとして知られている逆転換の誘発に関連する。研究の目的は、遠位部位に到達した細胞（または、細胞のクラスター）に、この部位に実際に腫瘍を形成する能力を付与する可能性がある転移を、任意のＥＣＭの組み合わせが誘発することができるかを決定することである。上皮状態の（間葉系と比較して）最強のマーカーの１つは、Ｅ−カドヘリン（細胞間結合タンパク質）の存在である。したがって、実験は、列記されている全ての異なる接着セットにおける細胞の（細胞毎の基づいた）Ｅ−カドヘリン染色を測定する。
【０２８６】
ＥＣＭマイクロアレイにおける４８時間のＥ−カドヘリン発現：図１２Ａは、本発明者たちのアレイの単一ドットとしてスポットされたそれぞれの接着において、上皮（ｗｔ）細胞の（細胞染色による）カドヘリン発現を示す。細胞を接種した４８時間後、スライドを、ネズミヒト単クローン性抗体（ＢＤ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、クローン３４／Ｅ−カドヘリン）を使用して固定および染色した。ＴｅｘａｓＲｅｄヤギ−マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。画像化を前記のように実施した。それぞれのＥＣＭの組み合わせでは、染色強度をスポットにおいて決定し、細胞１個あたりの染色強度を決定するため、スポットにおける細胞の数を割ることにより正規化した。このスポットにおける各ドットは、上皮細胞の特有のＥＣＭ組み合わせの染色強度を表す。Ｅ−カドヘリン細胞の発現を刺激する接着セット（すなわち、上皮プログラムの最強の活性化）は、対毎のパートナーがいないガレクチン−３であった。
【０２８７】
図１２Ｂは、Ｅ−カドヘリン発現、および転移性乳腺の特徴を有する細胞のコロニー形成能力を誘導する接着セットを表す。灰色に強調されている組み合わせは、ガレクチン−３を含有する。
【０２８８】
ＥＣＭマイクロアレイにおける４８時間のＴＷＩＳＴ＋Ｅ−カドヘリン発現：このグラフは、最初と同じであるが、上皮細胞の代わりに間葉（ｔｗｉｓｔ＋）細胞のものである。ここで、黒色ドットは、ガレクチン−３を含有する組み合わせを表す。Ｅ−カドヘリン強度は（上位の組み合わせであっても）、上皮細胞よりはるかに低いことが注目に値する。これは、これらの（Ｅ−カドヘリン発現を欠いているはずである）間葉状態に起因する。本発明者たちは、ガレクチン−３が、この場合はＥ−カドヘリンのような上皮マーカーの強力な上方制御を誘発すると予測する。それにもかかわらず、上皮細胞の文脈におけるＥ−カドヘリン発現の増加についての強力な証拠は、上皮表現型の誘発におけるその役割、および転移性腫瘍の能力をコロニー形成遠位部位に付与する可能性について極めて説得力がある。
【０２８９】
まとめると、図１０〜１２は、ガレクチン−３およびガレクチン−８単独、ならびに他のＥＣＭ成分との組み合わせが、ＭＥＴを誘発し、続いて、転移性細胞がそれらの二次部位に到達すると繁殖を誘発することを示唆している。
【０２９０】
実施例７：分化ヒト幹細胞の異なる接着シグネチャー
以下の実施例は、幹細胞の分化状態を特徴決定するＥＣＭアレイの使用を示す。幹細胞は、人体において繁殖し、全ての細胞型に分化する固有の能力に起因して、ヒト疾患を治療する有望な手法である。これらの特性は、幹細胞を細胞療法の理想的な細胞供給源にするが、今まで、入手する、ならびに分化幹細胞が実際に非変性細胞に類似するか、および細胞の分化状態を追跡するかを同定する利用可能な方法が今まで存在していない。この問題に対処するため、発癌性および脂肪生成系譜への分化中のヒト間葉幹細胞（図１３、上側パネル）、ならびに肝臓系譜へのヒト誘導多能性幹細胞（図１３、下側パネル）のＥＣＭアレイにより生成された接着シグネチャーを追跡し、このシグネチャーを、特定の組織において非変性細胞に対してベンチマークした。
【０２９１】
ＥＣＭアレイにより生成された接着シグネチャーは、異なる供給源と異なる系譜の幹細胞の分化状態を区別することができ、所定の細胞試料の分化状態を明確に同定し、非変性組織と比較することができる。これらのシグネチャーのうち、本開示によると、混合培養物から特定の分化状態の細胞を単離および培養するために適したＥＣＭ成分を、選択することも可能である。例えば、肝臓の分化の際、ガレクチン−３と組み合わされたビトロネクチンは、内胚葉段階において細胞を制限する。
【０２９２】
これらの細胞を単離および拡大する能力に加えて、分化の誘導は活発な研究分野である。特定の細胞の運命を定義することは、大部分の細胞の運命において依然として不明確であり、細胞外シグナル伝達成分は、これらの努力においてほぼ無視されてきる。特定の系譜への幹細胞の分化を支持および誘導するＥＣＭの能力は、肝臓−膵臓運命切り替えをモデル系として使用して調査した（図１４）。本開示は、ＥＣＭが分化過程の幹細胞の運命選択において重要な役割を演じること、および本明細書に記載されているＥＣＭ接着シグネチャーの決定が、多様な文化段階の細胞の特徴決定を有用に許容することを示唆している。
【０２９３】
実施例８：接着シグネチャーの関数としての増殖速度の決定
本実施例では、接着シグネチャー関数として増殖速度を決定することが記載される。異なるＥＣＭ成分またはその組み合わせにおける細胞の増殖速度を決定することができる。この系は、ＥＣＭアレイへの最高の接着および結合再オブの最大の増殖速度の両方を支持するＥＣＭ成分の選択を可能にする。好ましい実施形態において、目的の細胞型の培養ステップは、ＥＣＭ成分と共にインキュベートされた、したがって増加することを可能した細胞の第２の接着シグネチャーを決定する、または得ること、およびこの接着シグネチャーを、追加のインキュベーションステップを有さない細胞の接着シグネチャーと比較して、結合細胞の増殖速度を決定すること、を含む。特定の実施形態において、両方の接着シグネチャーは、ＥＣＭアレイを使用して得られる。更なる実施形態において、第２のＥＣＭアレイは、３０分間から５日間インキュベートされる。更なる実施形態において、第２のＥＣＭアレイは、１２〜４８時間インキュベートされる。
【０２９４】
実施例9：ＥＣＭアレイによる間葉幹細胞の単離
以下の実施例は、間葉幹細胞の増殖条件を特徴決定するＥＣＭアレイの使用を記載する。成人幹細胞、特に間葉幹細胞（ＭＳＣ）は、それらの免疫調節特性について医療施設において積極的に探求されている。現在、およそ２００の臨床試験が、これらの細胞を使用して進行中である。臨床設定においてこれらの細胞を使用する主な障害は、異物無含有条件でのこれらの単離および培養である。現在、異物無含有培地は利用可能であるが、これらの細胞の単離および培養には、全て複雑な特徴決定されていない動物由来マトリックスに依存している。ＦＤＡは、臨床効力試験にはこれらの細胞のために異物無含有培養系を必要とすることを義務づけた。したがって、現在使用されている動物由来細胞外マトリックスに対する代替案が必要である。
【０２９５】
アレイは、以前に記載されたようにポリアクリルアミドゲル（６０×２２ｍｍ）で被覆されたバンテージアクリルスライド（ＣＥＬ−１  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＶＡＣＲ−２５Ｃ）使用して作製した３０。ＥＣＭアレイには、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｐｏｔｔｅｒ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐｉｘｓｙｓ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｐｏｔｔｅｒ  ａｎｄ  ＡｒｒａｙＩｔ  ９４６  Ｐｉｎｓ）を使用して、Ｔｅｃａｎ  ＥＶＯ１５０  ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｅｒの使用により予め調製された、ＥＣＭの組み合わせを含有する３８４ウエル供給源プレートからスポットした。分子は、以前に記載された緩衝液により２００ｇ／ｍｌの最終濃度で調製した。７４１個の組み合わせを、５重にスポットし、ローダミンデキストランｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を陰性対照および分析の整列基準としてスポットした。ＥＣＭアレイドを、後に使用するまで、湿度室に４℃で保存した。以下のＥＣＭ分子をアレイに組み込んだ。コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、コンドロイチン硫酸塩、メロシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、アグレカン、エラスチン、ケラチン、ムチン、ヘパラン硫酸塩、スーパーフィブロネクチン、フィブリン、ヒアルロナン（Ｓｉｇｍａ）、テネイシン−Ｒ、Ｆ−スポンジン、ナイドジェン−２、ビグリカン、デコリン、ガレクチン１、ガレクチン３、ガレクチン４、ガレクチン８、トロンボスポンジン−４、オステオポンチン、オステオネクチン、テスチカン１、テスチカン２、テネイシン−Ｃ、ナイドジェン−１、ビトロネクチン、ラットアグリン、ブレビカン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびガレクチン３ｃ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０２９６】
細胞を接種する前、スライドをＰＢＳで洗浄し、ＵＶ光線で滅菌した。細胞接種は、スライドの上面をウエルの底面と同一平面に保持し、且つスライドを真空下に確保する特別に設計された装置において行う。細胞を、無血清条件下でＥＣＭアレイに接種し、適切な培地で培養した。接種した後、スライドをｑｕａｄｒｉｐｅｒｍ  ｐｌａｔｅ（ＮＵＮＣ，１６７０６３）に移し、新鮮な培地を加えた。細胞は、これらの条件下で異なる期間にわたって増殖し、長期間研究のために毎日供給した。次にスライドを、核酸およびマーカー発現のために染色した。簡潔には、スライドをＰＢＳで３回洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで固定した。同時に、核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と０．１％のＴｒｉｔｏｎ−ＸおよびＰＢＳとを組み合わせて使用して染色した。次にスライドを、再び洗浄し、二次抗体を１時間かけて生じた動物からの抗血清を含有する遮断溶液の使用により遮断した。遮断した後、スライドを一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ洗浄の後に続いて、二次抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）インキュベーションを４５分間。スライドを最終的に洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により取り付け、画像化するまで、４℃で保存した。スライド全体を、ＮｉｋｏｎＴｉ−Ｅｃｌｉｐｓｅ倒立蛍光顕微鏡およびＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｉｋｏｎ）を使用して画像化した。画像処理および分析は、ＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）により実施し、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，“ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ：ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ７，Ｒ１００（２００６））を使用して核およびマーカー強度の定量化を実施した。それぞれのスライドにおける複製スポットを平均化し、値が複製の平均を１標準偏差上回る、または下回るものを除外した。次にデータを正規化して、個別の実験データポイントの平均化を可能にした。
【０２９７】
細胞培養および分化
ＭＳＣは、ウシ胎児血清およびペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｏｇｅｎ）における接着を介して、健康な提供者からの骨髄の単核画分ｎから単離した。発癌性および脂肪生成系譜へのＭＳＣの分化は、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎの脂肪生成および発癌性分化キットを製造会社の推奨に従って使用して実施した。
免疫染色
【０２９８】
ＥＣＭ分子の存在についてのＥＣＭアレイの免疫染色は、２ステップ免疫蛍光プロトコールにより実施した。最初にスライドをＢＳＡにより１時間遮断し、一次抗体と共に４Ｃで一晩インキュベートした。３回の洗浄ステップの後、スライドを、近ＩＲ色素で標識した二次抗体と共にインキュベートし、Ｌｉｃｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して画像化した。得られた画像をカラー化し、合わせて、３８個の抗体染色ＥＣＭアレイ表示を形成した。細胞を、核含有量についてはＨｏｅｃｈｓｔ染色を使用し、アクチンについてはＡｌｅｘａ４８８結合ファロイジン（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により、供給会社の使用説明書に従って標識した。
【０２９９】
分析
ＥＣＭアレイにおける細胞−ＥＣＭ相互作用を定量化するため、本発明者たちは、公的に利用可能なものと社内開発ソフトウエの両方を組み合わせた画像取得および分析方法を開発および自動化した。従来の蛍光染色プロトコールに従って核および特定のマーカーを染色した後、スライドを画像化し、ＥＣＭ効果を定量化する。最初にスライドを、ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓソフトウエアを有する自動化倒立落射蛍光顕微鏡の使用により画像化する。これは、ＥＣＭアレイ全体（２０×４０ｍｍ）の多チャンネル画像を４×倍率で生成する。次に大きな画像をＭＡＴＬＡＢにインポートし、個別のチャンネルを単離し、個別のスポットを、採取し、指標化する。次に個別の画像をＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒに供給し、そこでは特定の細胞パラメーターが定量化され得る４９７．典型的には、核数、核占有領域、核強度、ならびに特定のマーカー強度および領域としてのパラメーターが計算される。次にＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒ出力データが戻されてＭＡＴＬＡＢにインポートされ、ここでアレイデータが抽出される。最初のステップは、出力データを、ＥＣＭアレイのそれぞれ個別の島を表す４０×１００のマトリックスに転換することである。次に、複製ＥＣＭ組み合わせを平均化して、アレイにおけるそれぞれのＥＣＭ組み合わせの平均ＥＣＭスコアを含む８×１００のマトリックスを生成する。更なる分析の前に、統計検定を実施して、外れ値スポットを除外する。外れ値は、スポットスコアと、アレイに存在する５つの複製の平均との統計的距離が、５つの複製の標準偏差より大きい場合に考慮される。複数の実験の分析は、アレイ１つあたり４０００個の特徴の３％未満が外れポイントであることを明らかにした（データ示されず）。独立した実験の比較を可能にするため、ＥＣＭアレイデータを正規化する。このステップは、実験バッチ間の測定の比較を促進し、画像化過程における（大部分は蛍光灯強度の変動に起因する）全体的な差を修正する。それぞれのＥＣＭ組み合わせにおけるスコアまたは接着値を、以下の式に従ってアレイの平均および標準偏差に対して正規化する。
【数１】
2015514396.tif 000007
【０３００】
得られたデータは０に集中し、個別のＥＣＭスコアは、スライドの平均からの標準偏差の距離を表し、それぞれのＥＣＭ組み合わせに相対スコアを作り出す。アレイに平均値に近いＥＣＭの組み合わせは、０に近いスコアを有し、一方、高いまたは低いスコアの組み合わせは、スライドの平均からの距離に応じて正および負の値を有する。
【０３０１】
ＭＳＣによる初期試験は、細胞−ＥＣＭ相互作用の最適な記載を選択するため、ＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒを使用して画像定量化の際に得られ得る複数のパラメーターに焦点を合わせた。これらの実験において、ＭＳＣは、インビトロで脂肪生成および発癌性系譜へ分化し、細胞−ＥＣＭ相互作用は、ＥＣＭアレイにおける分析により非分化ＭＳＣと比較した場合、これらの分化細胞型の両方の記述子であった。具体的には、接種の１２時間後のアレイを固定し、ＤＮＡ含有量およびアクチンの両方について染色した（図１５Ａ）。この二重染色は、同じ遺伝子背景内の複数の細胞分化段階にわたる所定のＥＣＭ組み合わせにおける細胞数および細胞拡大の定量化を可能にする。
【０３０２】
図１５Ａは、細胞接着および細胞客体の両方に対する異なる効果を有するＥＣＭの組み合わせを強調する。例えば、ガレクチン−８／トロンボスポンジン−４は、ＭＳＣとそれの発癌性後代の両方の高い接着レベルを促進し、一方、脂肪生成分化細胞は、接着に対して有意に少ない傾向を有する。細胞数の差に加えて、細胞拡大表現型は、この組み合わせにおいて顕著に異なり、脂肪生成細胞の全体的な占有領域は、有意に変わらないが、アクチン組織は、異なっていると思われる。ムチン／コラーゲンＩおよびブレビカン／コンドロイチン硫酸塩では、影響が異なる。異なる細胞型に存在する細胞数に有意な差はないが、細胞拡大は、脂肪生成細胞では低減されていると思われる。最後に、アクチン組織は、ＥＣＭ組成に、更には分化段階にも強く依存している。異なるＥＣＭ適所は、異なる細胞骨格組織プロファイルを誘導すると思われる。
【０３０３】
接着核の定量化を使用して、ＭＳＣ接着プロファイルを生成した（図１５Ｂ）。ＭＳＣ接着プロファイルの分析は、ＭＳＣが、コラーゲンまたはラミニンのような基底膜の特徴である少なくとも１つの成分とのＥＣＭの組み合わせに結合する、強い傾向を有することを示す。ＭＳＣは、アレイにおける３０％を超えるＥＣＭの組み合わせに強力な接着スコアを有し、上位接着のＥＣＭ組み合わせを、動物無含有条件下でＭＳＣの単離および培養のために将来的に使用することができる（図１５Ｂ）。ＭＳＣ繁殖も、初期（６時間）および後期の時点（２４時間）での接着プロファイルとの比較を介して、アレイにおいて間接的に測定され得る。したがって、ＭＳＣの動物無含有拡大の有望な候補を表す組み合わせは、培養物における初期および後期時点での接着の両方の強力な仲介物質から選択され得る。
【０３０４】
ＦＤＡ要件に対処するため、ＥＣＭアレイを使用して、ＭＳＣの単離および拡大のための異物無含有細胞外マトリックスを同定した（図１５Ｃ）。本明細書において示されているように、幾つかの組み合わせが、この目的を達成する潜在性を保持すると同定されている。例えば、ガレクチン−８とトロンボスポンジン−４（両方とも、組み換え分子）の組み合わせは、異物無含有環境における最高収量の接着および拡大を許容する。この組み合わせの使用は、開業医が、ＦＤＡのような規制機関により要求されるように、臨床設定において完全合成および限定培養系を成功裏に利用することができる。
【０３０５】
接着プロファイルを、異なる細胞状態を比較および区別するために使用することもできる。例えば、ＭＳＣの脂肪生成および発癌性分化の際、分化細胞の接着プロファイルは経時的に変化する（図１５Ｄ）。ＭＳＣの脂肪生成および発癌性分化の３つの別個の時点（１、３、および４週目）での接着プロファイルの非管理クラスター化は、脂肪生成および発癌性接着プロファイルが、初期時点から互いに離れてクラスター形成することを示す（図１５Ｄ、上側パネル）。発癌性細胞は、フィブロネクチンまたはコラーゲンのようなより硬い組織を形成することが知られているＥＣＭ分子を現すＥＣＭの組み合わせへの優先度を示す。（図１５Ｄ、下側パネル）。注目すべきは、接着プロファイルが、同じ遺伝子背景の細胞における異なる表現型を区別する細胞シグネチャーとして使用される潜在性を有することである。そのような分析は、正および負の接着プロファイルに基づいて分化培養物から特定の発生段階の細胞を単離するために利用される、潜在性も有する。これらのプロファイルを、幹細胞の強力な拡大および分化を可能にする培養条件を同定するため、または単離した原発性細胞を培養するために、使用することもできる。
【０３０６】
下記の表３は、間葉幹細胞の単離、培養、および分化に有用な接着セットの組み合わせのリストである。
【表３−１】
2015514396.tif 000008
【表３−２】
2015514396.tif 000009
【０３０７】
実施例10：ＥＣＭアレイによる、平板培養不可能な肝細胞の平板培養を可能にする接着分子の同定
以下の実施例は、肝細胞の増殖条件を同定するＥＣＭアレイの使用を記載する。肝細胞は、肝臓の主な細胞型である。これらは、人体中の大部分の薬剤の代謝に関与している。肝疾患は、およそ２千万人のアメリカ人に影響を与えている。肝臓疾患を研究するための細胞の利用可能性は、主に、提供者のおよそ１０％の細胞しか単離後に平板培養することができないので、限定されている。平板培養可能性の定義は、肝細胞の培養に伝統的に使用されているＥＣＭ成分のコラーゲンＩへの接着である。人体中のＥＣＭの複雑性は、単独のＥＣＭ成分のものよりも有意に大きく、本発明者たちは、平板培養不可能な肝細胞を平板培養することができる適切なＥＣＭを探求しようと試みた（図１６）。本明細書に記載されている結果は、平板培養不可能な肝細胞の６つの異なるロットにおいて、全てが、細胞接着を促進する幾つかのＥＣＭマトリックスの組み合わせを有し、コラーゲンＩとアグレカン、およびコラーゲンＩＶとナイドジェン−１の組み合わせが包括的な効果を有すると思われる。
【０３０８】
実施例11：ＥＣＭアレイによる、誘導された多能性幹細胞の多能性を維持する接着細胞の同定
ＥＣＭアレイによる細胞多能性
以下の実施例は、幹細胞を維持する条件を同定するＥＣＭアレイの使用を記載する。ヒト胚および誘導多能性幹細胞（ｈＥＳＣ／ｈｉＰＳＣ）は、全ての細胞系譜に分化する能力を有し、したがって、ヒト疾患の治療に極めて有望である。ｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣは、全ての細胞系譜に分化する能力を有し、したがって、ヒト疾患の治療に極めて有望である。しかし、ｈＩＰＳＣを増殖させる現行の方法は、有糸分裂的に不活性化された支持細胞（ＭＥＦ）または不確定の細胞外マトリクス（ＥＣＭ）ミックス（すなわち、マトリゲル）を必要とし、したがって動物要素およびロット毎の変動要素が導入される。ヒトの未変性または組み換えＥＣＭを同定し、多能性の維持におけるＥＣＭの役割を理解するため、本発明者たちは、本明細書に開示されているように特徴決定されたＥＣＭプラットフォームを用いた。
【０３０９】
多能性を維持することができるヒトの非変性または組み換えＥＣＭ成分を同定するため、ＥＣＭアレイにぉけるｈＥＳＣ／ｈｉＰＳＣの接着シグネチャーを探求した（図１７Ａ）。３０継代を超えてｉＰＳＣ自己再生および多能性を支持する少なくとも３つのＥＣＭの組み合わせ（＞８５％ｏｃｔ３／４＋ｔｒａｌ−６０＋ｓｓｅａｌ＋）を同定した。ＥＣＭは、インビトロで胚様体およびインビボで奇形腫を形成する、且つインビトロで肝臓系譜に分化する潜在能力である、正常な核型を維持したｉＰＳＣを拡大した。
【０３１０】
追跡は、特定のＥＣＭへの多能性の依存性を示した。（ｉ）単一マトリックス分子は、多能性表現型を維持することができない。（ｉｉ）ＥＣＭ成分およびシグナル伝達の遮断は、多能性の損失を誘発する。ＥＣＭの組み合わせは、限定培地においてｉＰＳＣを支持することもできる。これらのＥＣＭの組み合わせｈｑ、特定の系譜への細胞の分化も支持する。これらの結果に基づいて、本発明者たちは、ＥＣＭと多能性シグナル化スケードとの関係を研究することもできた。本発明者たちは、異なるＥＣＭの組み合わせが、異なるＳＭＡＤ活性化プロファイルと誘発すること、およびＳＭＡＤレベルがＡＫＴレベルと関係することを示す。多能性の維持は、ＳＭＡＤ２／３の初期活性化を必要とし、このタンパク質は、ＡＫＴと相互作用すると思われる。全体として、不偏およびハイスループットの手法を用いることによって、多能性を支持するＥＣＭの組み合わせを同定すること、およびこれらの結果を単一組織培養系に置き換えることができ、この維持に関与する分子機構の態様を明らかにした。
【０３１１】
ＥＣＭアレイの作製および分析
簡潔には、バンテージアクリルスライド（ＣＥＬ−１  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ＶＡＣＲ−２５Ｃ）を、以前に記載されたようにポリアクリルアミドゲル（６０×２２ｍｍ）で被覆した３０。ＥＣＭアレイには、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｓｐｏｔｔｅｒ（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｐｉｘｓｙｓ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｐｏｔｔｅｒ  ａｎｄ  ＡｒｒａｙＩｔ  ９４６  Ｐｉｎｓ）を使用して、Ｔｅｃａｎ  ＥＶＯ１５０  ｌｉｑｕｉｄ  ｈａｎｄｌｅｒの使用により予め調製された、ＥＣＭの組み合わせを含有する３８４ウエル供給源プレートからスポットした。分子は、以前に記載された緩衝液により２００μｇ／ｍｌの最終濃度で調製した。７４１個の組み合わせを、５重にスポットし、ローダミンデキストランｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を陰性対照および分析の整列基準としてスポットした。ＥＣＭアレイを、後に使用するまで、湿度室に４℃で保存した。以下のＥＣＭ分子をアレイに組み込んだ。コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、ラミニン、コンドロイチン硫酸塩、メロシン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、アグレカン、エラスチン、ケラチン、ムチン、ヘパラン硫酸塩、スーパーフィブロネクチン、フィブリン、ヒアルロナン（Ｓｉｇｍａ）、テネイシン−Ｒ、Ｆ−スポンジン、ナイドジェン−２、ビグリカン、デコリン、ガレクチン１、ガレクチン３、ガレクチン４、ガレクチン８、トロンボスポンジン−４、オステオポンチン、オステオネクチン、テスチカン１、テスチカン２、テネイシン−Ｃ、ナイドジェン−１、ビトロネクチン、ラットアグリン、ブレビカン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびガレクチン３ｃ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０３１２】
細胞を接種する前、スライドをＰＢＳで洗浄し、ＵＶ光線で滅菌した。細胞接種は、スライドの上面をウエルの底面と同一平面に保持し、且つスライドを真空下に確保する特別に設計された装置において行う。百万個の細胞をそれぞれのスライドの５ｍＬの調整培地５１３（マウスＣＦ−１胚線維芽細胞で調整した、他に記載されているｈＥＳＣ培地）に接種し、３７℃で一晩接種した。接種した後、スライドをｑｕａｄｒｉｐｅｒｍ  ｐｌａｔｅ（ＮＵＮＣ，１６７０６３）に移し、新鮮な培地を加えた。細胞は、これらの条件下で増殖し、毎日供給した。次にスライドを、核酸およびマーカー発現のために染色した。簡潔には、スライドをＰＢＳで３回洗浄し、４％のパラホルムアルデヒドで固定した。同時に、核を、Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と０．１％のＴｒｉｔｏｎ−ＸおよびＰＢＳとを組み合わせて使用して染色した。次にスライドを、再び洗浄し、二次抗体を１時間かけて生じた動物からの抗血清を含有する遮断溶液の使用により遮断した。遮断した後、スライドを一次抗体のｏｃｔ３／４（ＢＤ）、ｔｒａ１−６０、およびｓｓｅａ４（ＥＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ洗浄の後に続いて、二次抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）インキュベーションを４５分間。スライドを最終的に洗浄し、Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）により取り付け、画像化するまで、４℃で保存した。スライド全体を、ＮｉｋｏｎＴｉ−Ｅｃｌｉｐｓｅ倒立蛍光顕微鏡およびＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｉｋｏｎ）を使用して画像化した。画像処理および分析は、ＭＡＴＬＡＢ（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ）により実施し、核およびマーカー強度の定量化は、本明細書に記載されているＣｅｌｌＰｒｏｆｉｌｅｒを使用して実施した。それぞれのスライドにおける複製スポットを平均化し、値が複製の平均を１標準偏差上回る、または下回るものを除外した。次にデータを正規化して、個別の実験データポイントの平均化を可能にした。
【０３１３】
ｈＩＰＳＣ／ｈＥＳＣの培養
非分化ｉＰＳＣおよびｈＥＳＣを記載されたように維持した９５。要約すると、ヒトＨ９（ＷＡ０９）ＥＳＣ、ならびにｉＰＳＣ（ＩＰＳＣ２ＡおよびＲＥＣ２）を、有糸分裂的に不活性化されたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）のｈＥＳＣ細胞培地（２０％のノックアウト血清代替物、非必須アミノ酸、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびｂＦＧＦ（４ｎｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ  Ｆ１２培地）において、またはＭＥＦ調整培地を使用したマトリゲル被覆プレートにおいて培養した。あるいは、ｍＴＥＳＲ１培地を、限定培地組成を用いる研究のために使用した。ＥＣＭ組み合わせにより培養されたｈＩＰＳＣおよびｈＥＳＣを、単独細胞として散布し、ＥＣＭ分子を吸着させた通常のＴＣＰプレートに接種した。ＥＣＭ分子を１５ｇ／ｍｌの濃度でｄｉＨ２Ｏに少なくとも６時間吸着させ、次に滅菌のためにＵＶ処理した。他の点では、通常の培養条件を維持した。
【０３１４】
免疫蛍光およびフローサイトメトリー
【０３１５】
培養細胞への免疫蛍光（ＩＦ）は、ＥＣＭアレイスライドのために予め記載されているプロトコールに従い、適切に適合させた。フローサイトメトリー分析では、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共に３７℃で１０分間インキュベートした。次に細胞を、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ溶液（ＢＤ）により１５分間かけて固定、浸透化、および遮断した。細胞を、一次抗体と共に４℃で３０分間インキュベートし、ｐｅｒｍ／ｗａｓｈ緩衝液（ＢＤ）で希釈し、洗浄し、分析するまで氷上に保存した。フローサイトメトリー分析は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒまたはＬＳＲＩＩ系（ＢＤ）を使用して実施した。フローサイトメトリーによるリン酸化タンパク質分析では、細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と共に３７℃で１０分間インキュベートし、次に以前に報告されているように固定、浸透化、および遮断した。簡潔には、ａｃｃｕｔａｓｅ処理の後、細胞を、ホスファターゼ阻害剤含有溶液（Ｒｏｃｈｅ）中で直ちに１．５％のパラホルムアルデヒドにより室温で１０分間固定した。次に細胞をペレット化し、洗浄し、次に氷冷メタノールにより４℃で１０分間浸透化した。細胞を、一次抗体と共に４℃で３０分間インキュベートし、遮断緩衝液（１％のＢＳＡおよびＰＨＯＳＳＴＯＰを有するＰＢＳ）で希釈し、洗浄し、分析するまで氷上に保存した。フローサイトメトリー分析は、ＬＳＲＩＩ系（ＢＤ）を使用して実施した。
【０３１６】
接着遮断アッセイ
【０３１７】
接着遮断実験は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからのαおよびβインテグリンｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒキットを使用して実施した。細胞を、インテグリン遮断抗体（２μｇ／ｍｌ）と共に氷上で３０分間インキュベートした。次に細胞を３７℃で１時間インキュベートし、Ｈｏｅｃｈｓｔ核対比染色を含有する４％のパラホルムアルデヒドで固定した。ウエル全体の走査画像は、ＮｉｋｏｎＴｉ−Ｅｃｌｉｐｓｅ倒立蛍光顕微鏡を使用して得て、ＮＩＳ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｎｉｋｏｎ）で実施した細胞計数。
【０３１８】
奇形腫
全ての動物をＫｏｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ動物施設に収容し、マサチューセッツ工科大学比較医学部動物飼育委員会（Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｆｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｔ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）は、全ての動物手順を承認した。奇形腫を生成するため、細胞は、ａｃｃｕｔａｓｅを使用して回収し、続いて遠心分離し、２５０ｕｌのマトリゲル（ＤＭＥＭ−Ｆ１２中２ｍｇ／ｍｌ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に再懸濁した。細胞を、ヌード雄マウス（Ｔａｃｏｎｉｃ）の背側面に、２７Ｇ針を使用して注射し、奇形腫を、注射の８〜１１週間後に切開し、ヘマトキシリンとエオシンを使用して組織学のために処理した。切片は、熟練の病理学者が分析して、得られた腫瘍の性質を決定した。
【０３１９】
核型決定
核型決定分析は、高解像度Ｇバンド標準プロトコールを使用して、Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）により実施した。
【０３２０】
分化
肝細胞を生成するため、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により採取された単層の多能性細胞を、２ｍｇ／ｍｌのマトリゲル（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を前被覆した６ウエルプレートに、ウエル１つあたりのｈＥＳＣ細胞培地および１０μＭのＹ２７６３２に５．０×１０５細胞の密度で平板培養し、翌日洗浄した。細胞が培養密度に達すると、分化は、周囲酸素／５％ＣＯ２下でＲＰＭＩ／Ｂ２７培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に１００ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を５日間、続いて４％Ｏ２／５％ＣＯ２下でＲＰＭＩ／Ｂ２７中に２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）／１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を５日間、次に４％Ｏ２／５％ＣＯ２下でＲＰＭＩ／Ｂ２７補充中に２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を５日間、最後に周囲酸素／５％ＣＯ２下で、ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（ＥＧＦなし）を補充した肝細胞培養培地（Ｌｏｎｚａ）中に２０ｎｇ／ｍｌのオンコスタチン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を５日間培養して、開始させた。
【０３２１】
心筋細胞を生成するため、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により採取された単層の多能性細胞を、２ｍｇ／ｍｌのマトリゲル（Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｄｕｃｅｄ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を前被覆した６ウエルプレートに、ウエル１つあたりのｈＥＳＣ細胞培地および１０μＭのＹ２７６３２に1．０×１０５細胞の密度で平板培養し、翌日洗浄した。細胞がおよそ１０日間で培養密度に達すると、分化は、周囲酸素／５％ＣＯ２下でＲＰＭＩ／Ｂ２７中培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に５０ｎｇ／ｍｌのアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４を５日間、続いて４％Ｏ２／５％ＣＯ２下でＲＰＭＩ／Ｂ２７中に２０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）／１０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１０日間、次に４％Ｏ２／５％ＣＯ２下でＲＰＭＩ／Ｂ２７補充中に５日間培養して、開始させた。
【０３２２】
ｉＰＳＣは、以前に確立された方法に従って分化させて、神経系譜にした。簡潔には、ｉＰＳＣを、マトリゲル被覆プレートおよびｈＥＳ  ＭＥＦ調整培地で培養した。コロニーをディスパーゼ溶液で取り外し、新鮮なｈＥＳ培地で４日間、神経分化培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Ｎ２補充、および非必須アミノ酸からなる）（全て、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）で３日間懸濁して培養した。次に凝集塊を、ラミニン被覆表面（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で平板培養した。１０日目に、０．１μＭのレチノイン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を神経分化培地に加えた。分化の１５日目に神経管様ロゼットが形成し、次にそれを機械的に取り外し、Ｂ２７、０．１μＭのレチノイン酸、および１μＭのプルモルファミン（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を含有する神経誘導培地に懸濁して培養した。５日後、ニューロスフェアを収集し、ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して分離し、懸濁液で継代した。試料を収集し、ＰＣＲ分析のために溶解した。ニューロスフェアを、Ｂ２７、ＦＧＦ８ｂ  ５０ｎｇ／ｍＬ、ＳＨＨ  １００ｎｇ／ｍＬ、およびアスコルビン酸（２００μＭ）を有する神経誘導培地で７日間培養した。次に、ニューロスフェアを、ａｃｃｕｔａｓｅ／トリプシンで処理し、単独細胞として、ポリオルニチン／ラミニン被覆組織培養プレートの、ＦＧＦ８ｂ  ５０ｎｇ／ｍＬ、ＳＨＨ  １００ｎｇ／ｍＬ、アスコルビン酸（２００μＭ）、ｃＡＭＰ（１．０μＭ）、ＴＧＦβ３（１ｎｇ／ｍＬ）、ＢＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＧＤＮＦ（１０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＧＦ−１（１０ｎｇ／ｍＬ）、およびＷＮＴ３Ａ（１０ｎｇ／ｍＬ）を有する神経分化培地に、２１日間接種した。すべてのサイトカインは、ＷＮＴ３Ａ（Ｒ＆Ｄｓｙｔｅｍｓ）を除いてＰｅｐｒｏｔｅｃｈからのものである試料を収集し、ＰＣＲ分析のために溶解した。
【０３２３】
ウエスタンおよび免疫沈降
【０３２４】
総タンパク質を、ＳＴＯＰプロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を有する放射免疫沈降アッセイ溶解緩衝液により抽出し、試料を、１２％（ｗｔ／ｖｏｌ）ポリアクリルアミドゲルにおける電気泳動により分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に電気泳動的に移動した。ブロットを一次抗体により、続いてＨＲＰ接合二次抗体によりプローブし、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により展開した。
【０３２５】
ＲＴ−ＰＣＲ
【０３２６】
ＲＮＡ全体をＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）により単離した。第一鎖ｃＤＮＡを、モロニーネズミ白血病ウイルスリバーストランスクリプターゼ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の使用により合成した。定量的ＰＣＲは、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含有する供給会社の反応緩衝液中のＴａｑポリメラーゼおよびＳＹＢＲグリーンにより実施した。オリゴヌクレオチドプライマー配列は、必要に応じて入手可能である。アンプリコンを、Ｂｉｏｒａｄ  ＭＹＩＱ  ＱＲＴＰＣＲ機器により両方の融解曲線分析により分析し、２％（ｗｔ／ｖｏｌ）アガロースゲル電気泳動（Ｓｉｇｍａ）により確認した。
【０３２７】
アルブミンおよびα−１−アンチトリプシンＥＬＩＳＡ
消費培地を−２０℃で保存した。α−１−アンチトリプシンおよびアルブミン培地濃度は、ＨＲＰ検出（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および３，３，５，５−テトラメチルベンジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基質として用いてサンドイッチＥＬＩＳ技術の使用により測定した。
【０３２８】
図１７Ａは、ＥＣＭアレイが、ｈＩＰＳＣ自己再生を支持するＥＣＭ組み合わせをどのように明らかにするかを表す。本発明者たちは、多能性状態のおけるＥＣＭの影響に焦点を合わせ、ＰＳＣ自己再生を支持するＥＣＭの組み合わせをスクリーンした。ｈＩＰＳＣを単独細胞として散布し、ＥＣＭアレイに接種し、４８時間培養した。次にアレイを核、ならびに多能性マーカー（ｏｃｔ３／４、ｓｓｅａ４、およびｔｒａ１−６０）で染色し、分析して、ＰＳＣ自己再生を支持するＥＣＭの組み合わせを同定した（図１７Ａ）。この分析は、ｈＩＰＳＣの拡大を支持する、およびこれらの多能性表現型を維持するＥＣＭの組み合わせの能力に焦点を合わせた。アレイにおけるそれぞれのＥＣＭ島を、細胞数（核含有量を介して）および３つ多能性マーカーのそれぞれの発現についてスコアした（図１７Ａ、左下の細胞培養密度）。提示されているデータは、２つの技術的複製において正規化および平均化されており、且つ３回の独立した実験により繰り返されている、１つのアレイに表される５つ五重の平均である（図１７Ａ、上側の散乱プロット）。縦軸に整列しているＥＣＭ組み合わせは、多能性マーカーの強力な発現を有し、横軸の組み合わせは、良好な細胞数を有し、ｘ＝ｙ軸のものは、多能性マーカーの細胞数と発現を組み合わせる。これは、予測されたように、本発明者たちが細胞の運命に対して異なる影響を有するＥＣＭ環境の範囲を同定できたことを意味する。（ｉ）ＰＳＣの結合および増殖を仲介しないＥＣＭ組み合わせ、（ｉｉ）ＰＳＣ結合を促進するが、多能性の維持を支持しないＥＣＭ組み合わせ、（ｉｉｉ）多能性マーカーの高い発現を柚須得るが、細胞繁殖を低減するＥＣＭ組み合わせ、ならびに（ｉｖ）多能性表現がを維持するＰＳＣの拡大を支持するＥＣＭ組み合わせ（図１７Ｂ）である。
【０３２９】
これらの結果を完全に特徴付けるため、本発明者たちは、通常の組織培養戦略に容易に置き換えることができる、および多能性に対するＥＣＭの影響を研究することができる、系において確認されるＥＣＭ組み合わせのセットを選択した。本発明者たちは、８個のＥＣＭ組み合わせを、上記に記述された４つの分野から選択し（図１７Ｂ）、ＥＣＭアレイの知見を、組織培養プラスチックへのＥＣＭ分子の単純な吸着により、培養系に置き換えた。ｈＩＰＳＣを、単独細胞として吸着ＥＣＭ分子に接種し、これらの増殖および多能性発現のマーカーを経時的に追跡した（図１７Ｂ）。選択された８個のＥＣＭ組み合わせのうち、３個（コラーゲンＩ／ラミニン、コラーゲンＩＩ／ガレクチン−４、およびコラーゲンＩＶ／ガレクチン−８）は、ＭＥＦ調整培地（ＣＭ）および化学的限定培地ｍＴｅＳＲ１  ５１５におけるｈＩＰＳＣおよびｈＥＳＣを少なくとも５０継代にわたって、長期間単独細胞の継代を支持することができた（図１７Ｂ）。ＥＣＭ組み合わせにより拡大されたｈＩＰＳＣは、多能性マーカーのｏｃｔ３／４、ｓｓｅａ４、およびｔｒａ１−６０の発現を維持し（図１７Ｂ）、特徴的な細胞形態を保持する（図１７Ｂ）。この戦略の関連性を確実にするため、本発明者たちは、２つの異なるｈＩＰＳＣ系（ＩＰＳＣ２ａおよびＲＣ２）、ならびにｈＥＳＣ系Ｈ９（図１７Ｂ）を使用してアッセイを繰り返した。３つの系は、全て、単独細胞として継代されたとき、ＥＣＭ組み合わせにより強力な自己再生を示した。
【０３３０】
限定培地条件（ｍＴＥＳＲ１）では、全てのＥＣＭ組み合わせは、多能性を維持することができたが、１つのマトリックス組み合わせ（コラーゲンＩおよびラミニン）のみが、多能性幹細胞の強力な発現を維持することができた。コラーゲンＩＩ／ガレクチン−４およびコラーゲンＩＶ／ガレクチン−８による細胞は、ｏｃｔ３／４、ｓｓｅａ４、およびｔｒａ１−６０の発現を維持したが、表面に広がる代わりに、皿から離れて球状コロニーを形成する傾向を有した（図１７Ｂ）。可能な要因を分析すると、本発明者たちは、ＭＥＦ調整培地が、化学限定培地には不在であった追加の接着要因を提供していたと仮定した。ＭＥＦ発現プロファイルの検査は、接着特性が知られているＥＣＭ分子であるフィブロネクチンの強力な分泌が同定された、吸着ＥＣＭ組み合わせへのフィブロネクチンの添加は、ＰＳＣの強力な発現を可能にしたが、自己再生を支持する能力に変更はなかった（図１７Ｂ）。
【０３３１】
多能性は、３つの胚葉の全ての誘導体を形成する細胞の能力として定義される、肝細胞の機能的特性である。Ｏｃｔ３／４、ＳＳＥＡ４、およびＴｒａ１−６０は、多能性細胞の代理マーカーであるが、ＳＳＥＡ４およびＴｒａ１−６０は、多能性ネットワークの直接の原動力と考慮されない８５。それぞれ同定されたＥＣＭの、多能性を支持する能力は、培養細胞が、（ヌードマウス）の背側面に注射された後に奇形腫をインビボで形成する（図１７Ｃ、左側）、および３つ全ての胚葉に寄与する胚様体（ＥＢ）をインビトロで形成する能力を試験して、確認した。奇形腫は、３つの胚葉から誘導され、且つ原形質類器官様構造である呼吸上皮、管状構造、軟骨、骨、および神経外胚葉構造に組織化される、組織の存在により特徴付けられる。ＥＢは、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＲＴ−ＰＣＲ）にょり、３つの胚葉のマーカーを強力に発現する（図１７Ｃ、右側）。拡大された細胞の遺伝子安定性は、マトリゲルおよび他の化学限定ＥＣＭによる培養の際の既知の問題であり、この傾向は、ＰＳＣの長期拡大の化学限定方法の開発を阻止する主な制限である５１７。同定されたＥＣＭ組み合わせにより拡大されたｈＩＰＳＣは、Ｇバンド分析により明らかにされたように、培養中での１０継代（２か月間）後に正常な核型を保持する（図１７Ｃ、中央）。
【０３３２】
したがって本開示は、ＥＣＭ分子が、特定の組み合わせで存在するとき、ｉＰＳＣを支持する信頼性のある限定されたプラットフォームであり、ＭＥＦおよびマトリゲルの潜在的な代替案であることを示す。
【０３３３】
多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、これらの多能性の潜在能力を維持する。ＰＳＣは、細胞モデル形成の供給源として、またはヒト疾患の補充療法として、広く探求されてきた。ＰＳＣの長期培養系の適合は、拡大された細胞が、機能的な体細胞へ直接分化することが依然としてできることを必要とする。本発明者たちは、ＥＣＭ組み合わせにより拡大されたｈＩＰＳＣを、肝細胞（内胚葉系譜）、心筋細胞（中胚葉系譜）、および神経細胞（外胚葉系譜）に、確立されたプロトコールに従って分化させた。ＥＣＭ拡大ｈＩＰＳＣは、肝細胞様細胞を、アクチビンＡ、ＢＭＰ４／ｂＦＧＦ、ＨＧＦ、およびＯＳＭによる刺激の後に強力に生成した。分化細胞は、アルブミンおよびα１アンチトリプシンを、マトリゲル拡大細胞と比較されるレベルで分泌する（図１７Ｄ）。心筋細胞を生成する能力は、心筋細胞に特徴的なマーカーであるアルファ−ミオシン重鎖およびＮＫＸ２．５（図１７Ｄ）を発現し、カルシウムシグナル（図１７Ｄ）に関与する、拍動細胞の存在によって確認された。神経細胞系譜への誘導の後、細胞は、ネスチンのような前駆体段階およびβーチューブリンのような分化状態の特徴的なマーカーを発現する。ＥＣＭ組み合わせをスクリーンすると、当該技術と対照的に、すなわち有糸分裂的に不活性化された支持層または不十分に限定された動物由来ＥＣＭと対照的に、組織培養プラスチックへのＥＣＭ分子の簡単な吸着により強力な培養系に容易に置き換えられる、ＰＳＣの自己再生を支持する特有の環境を同定した（図１７Ｄ）。同定され、完全に特徴決定されたＥＣＭ組み合わせの適合は、限定された再現可能な方法でＰＳＣの産生および分化を可能にする。肝細胞の運命においける特定のＥＣＭ分子の役割の理解、およびこの過程に関与する分子経路の同定は、ＰＳＣのための強力で臨床的に置き換え可能な培養物および分化戦略にとって重要である。
【０３３４】
インビボにおいて、組織は幾つかのＥＣＭ分子の組み合わせを介して形成され、それぞれの組織におけるＥＣＭの特異性を、組織のシグネチャーとして使用することができる。ＥＣＭ組成の差は、組織の構造的な差に相当するが、細胞の運命の調節におけるこれらの役割は不明である。ＥＣＭアレイのデータ（図１７Ｅ）は、ＥＣＭの組み合わせが単独の分子よりも強力な効果を多能性の維持に対して発揮することを示し、このアッセイにより確定された上位２００個のＥＣＭ適所は、全て、２個のＥＣＭ分子により形成された。したがって、本発明者たちは、これらの同定された組み合わせの多能性および特性を支持する、ＥＣＭ組み合わせの単独成分の重要性を評価した。細胞を吸着ＥＣＭ分子に接種し、調整培地で培養密度未満に増殖させ（４〜５日間）多能性マーカーの発現を分析した。個別のＥＣＭ分子は、単一継代での三重陽性（ｏｃｔ３／４−ｓｓｅａ４−ｔｒａ１−６０＋）細胞において劇的に低下したことにより示されているように（図１７Ｅ）、多能性を支持しなかった。コラーゲンＩ、ＩＩ、およびＩＶ、ならびにラミニンＥＣＭ分子の特異性を評価するため、本発明者たちは、３個の的中ＥＣＭ組み合わせのうち２個、コラーゲンＩＩ／ガレクチン−４およびコラーゲンＩＶ／ガレクチン−８が、同じファミリーの分子を共有するという事実を利用した。２個の組み合わせにおいてＥＣＭパートナーを取り替えることにより、本発明者たちは、組み換え対（コラーゲンＩＩとガレクチン−８およびコラーゲンＩＶとガレクチン−４）が別個であるが密接に関係する構造および機能を含むことを考慮して、特異性の問題に取り組んだ。コラーゲンＩＩ／ガレクチン８は、多能性状態を維持しなかったが、コラーゲンＩＶ／ガレクチン４は、ＰＳＣ自己再生を支持した（図１７Ｅ）。この知見は、特定のＥＣＭの組み合わせが多能性を維持するために必要であることを明白にしたＥＣＭアレイの元データと一致する。ガレクチンは、特定の炭水化物認識ドメイン（ＣＲＤ）を介してガラクトースに結合するレクチンのファミリーである。このドメインは、ラクトースにより、またはＣＲＤ領域に不可逆的に結合することが示されている小型二糖であるＬａｃＮａｃにより遮断され得る。ガレクチンＣＲＤの遮断は、ガレクチンを含有するＥＣＭ組み合わせの自己再生支持能力を損ない（図１７Ｅ）、この文脈において、ＣＲＤを介したガレクチンシグナルを実証している。ガレクチンのＣＲＤドメインは、高度にグリコシル化されたα１インテグリンのグリコシル化ドメインと相互作用することが示されている。α１インテグリンの遮断は、的中ＥＣＭ組み合わせへの細胞結合の５０％低減をもたらし（図１７Ｅ）、このインテグリンがこれらの接着およびシグナル伝達プロセスに関与し得ることを示している。
【０３３５】
限定培地条件（例えば、ｍＴＥＳＲ１）における接着を促進するため、フィブロネクチンを的中ＥＣＭ組み合わせに加えた（図１７Ｅ）。しかし、特定のＥＣＭ組み合わせ的中の文脈において、多能性の維持を仲介するフィブロネクチンにより果たされる役割は、不明である。コラーゲンＩおよびラミニンにおいて増殖された細胞は、フィブロネクチンの添加を必要とせず、その添加により改善もせず、悪影響も受けなかった（図１７Ｅ）。特異性について更に調べるため、本発明者たちは、上記に記載されたものと類似した遮断戦略を用いた。（ｉ）ＥＣＭ組み合わせにおけるフィブロネクチンと個別の成分の組み合わせ、および（ｉｉ）ＬａｃＮａｃによるガレクチンシグナル伝達の遮断である。フィブロネクチンとコラーゲンＩＩおよびＩＶ、またはガレクチン４および８との対毎の組み合わせは、多能性を支持することができず（図１７Ｅ）、ＬａｃＮａｃを使用したガレクチンのＣＲＤドメインの遮断は、多能性の維持を防止した（図１７Ｅ）。したがって、本発明者たちは、これらの結果に基づいて、フィブロネクチンが接着を仲介し得るが、多能性を促進するその役割が的中ＥＣＭ組み合わせの影響と比べて二次的であると、結論づけた。この結果は、ＰＳＣの強力な自己再生が多能性に関して特定のＥＣＭ組み合わせのシグナルと、繁殖細胞を保持するのに十分な接着シグナル伝達の両方を必要とすることを例示している。ＥＣＭ組み合わせの特異性は、多能性シグナル伝達を維持するために重要である。このデータは、不偏様式でＥＣＭを研究すること、および個別の成分に焦点を合わせるのではなく、ＥＣＭ分子の複雑な組み合わせを検査することの重要性を強調している。インビボでの複雑性の手法によってのみ、本発明者たちは、細胞微環境のより密接な像を有すること、および多能性シグナル伝達に関与する特有の要因を同定することができる。
【０３３６】
実施例12：固体基板に吸着したＥＣＭ成分における細胞培養
以下の実施例において、ＥＣＭ成分が吸着している固体基板における細胞の増殖が記載される。ヒトＨ９（ＷＡ０９）胚幹細胞、ならびにｉＰＳＣ（ＩＰＳＣ２ＡおよびＲＥＣ２）を、有糸分裂的に不活性化されたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）のｈＥＳＣ細胞培地（２０％のノックアウト血清代替物、非必須アミノ酸、グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン、およびｂＦＧＦ（４ｎｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＤＭＥＭ  Ｆ１２培地）において、またはＭＥＦ調整培地を使用したマトリゲル被覆プレートにおいて培養した。あるいは、ｍＴＥＳＲ１培地を、限定培地組成を用いる研究のために使用した。ＥＣＭ組み合わせにより培養されたｈＩＰＳＣおよびｈＥＳＣを、単独細胞として散布し、ＥＣＭ分子を吸着させた通常のＴＣＰプレートに接種した。ＥＣＭ分子を１５ｇ／ｍｌまたは８μｇ／ｍｌの濃度でｄｉＨ２Ｏに少なくとも６時間吸着させ、次に滅菌のためにＵＶ処理した。他の点では、前の実施例に記載された培養条件を維持した。通常の組織培養手法における確認のために選択されたＥＣＭ組み合わせ（図１７Ｂおよび図１７Ｄ、上記実施例の方法のセクションに基づいた）。
【０３３７】
実施例は、ＴＣＰ（ポリスチレン）へのＥＣＭ成分の吸着が、スライドにスポットされたＥＣＭ成分の多重アレイと類似した様式で機能しうることを示している。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【表１−１４】
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【表１−１５】
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【表１−１６】
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【表１−１７】
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【表１−１８】
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【表１−１９】
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【表１−２０】
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【表１−２１】
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【表１−２２】
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【表１−２３】
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【表１−２４】
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【０３３８】
例示、図、明細書、および他の図面は、試験された多様なＥＣｍ成分の略語を含み得る。略語の意味を、下記の表２に記載する。
【表２】
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【０３３９】
均等物
当業者は、日常的なものを越えない実験を使用して、本明細書に記載されている発明の特定の実施形態に対する多くの同等物を認める、または確かめることができる。本発明の範囲は、上記の記載に限定されることを意図せず、むしろ以下の特許請求の範囲に記載されているとおりである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１５Ｆ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１７Ｇ】
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【図１７Ｈ】
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【図１７Ｉ】
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【図１７Ｊ】
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【図１７Ｋ】
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【図１７Ｌ】
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【図１７Ｍ】
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【図１７Ｎ】
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【図１７Ｏ】
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【図１７Ｐ】
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【図１７Ｑ】
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【図１７Ｒ】
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【図１７Ｓ】
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【図１７Ｔ】
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【図１７Ｕ】
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【図１７Ｖ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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