(57)【要約】本発明は、シアン化水素モノマー単位の重合を可能にする条件下で表面をシアン化水素モノマー単位と接触させて、表面を被覆するポリマーを形成する工程を含む、基材表面の少なくとも一部を被覆する方法を提供する。また、特許請求する方法によるポリマーによって被覆されている基材も提供される。また、シアン化水素モノマー単位及びコモノマーを含む溶液中で共重合する工程を含む、シアン化水素酸ベースのヒドロゲルを形成する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
実質的に一定の厚さである、シアン化水素モノマー単位のポリマーを含む被覆を有する基材。
【請求項２】
細胞接着を促進するように構成されている、請求項１に記載の基材を含む細胞接着性表面。
【請求項３】
被覆が更に銀を含む、請求項１に記載の基材を含む抗菌性表面。
【請求項４】
表面を、シアン化水素モノマー単位の重合を可能にする条件下でシアン化水素モノマー単位と接触させて、表面を被覆するポリマーを形成する工程を含む、基材表面の少なくとも一部を被覆する方法。
【請求項５】
シアン化水素モノマー単位が、シアン化水素、イミノアセトニトリル、アミノマロノニトリル、ジアミノマロノニトリル、アミノアセトニトリル、アジドアセトニトリル、及びこれらのうちのいずれか１つの異性体の１以上からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
シアン化水素モノマー単位が、シアン化水素、アミノマロノニトリル、アミノアセトニトリル、及びこれらのうちのいずれか１つの異性体の１以上からなる群から選択され、酸性溶液中で与えられており、塩基を加えてｐＨを上昇させて重合を可能にする条件を与える、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
シアン化水素モノマー単位がシアン化水素又はアミノマロノニトリルから実質的に構成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
基材の少なくとも一部を、シアン化水素モノマー単位の重合を可能にする条件下でシアン化水素モノマー単位を含む蒸気と接触させて、表面を被覆するポリマーを形成する工程を含む、容器から取り出し可能な基材表面の少なくとも一部を被覆するための、反応容器内における無溶媒蒸着方法。
【請求項９】
シアン化水素モノマー単位がイミノアセトニトリルから実質的に構成される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｉ）シアン化水素モノマー単位の中和を可能にする条件下でシアン化水素モノマー単位の水溶液を与える工程；
（ｉｉ）中和されたシアン化水素モノマー単位を、有機溶媒を用いて抽出する工程；
（ｉｉｉ）表面を、中和されたシアン化水素モノマー単位を含む有機溶媒と接触させる工程；
（ｉｖ）中和されたシアン化水素モノマー単位の重合を可能にする条件下で有機溶媒を蒸発させて、表面を被覆するポリマーを形成する工程；
を含む、基材表面の少なくとも一部を被覆する方法。
【請求項１１】
シアン化水素モノマー単位の溶液又は蒸気が、充填剤、顔料、湿潤剤、粘度調整剤、安定剤、酸化防止剤、リガンド、架橋剤、コモノマー、ナノ粒子、バイオポリマー、及び金属の１以上を含む、請求項４〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
方法が、ポリマー被覆表面を１種類以上の反応性部分と接触させる更なる工程を有し、反応性部分がポリマー被覆表面と反応してそれに結合する、請求項４〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
方法が、表面を更なるポリマーと接触させることによって更なるポリマーをポリマー被覆表面にグラフトする更なる工程を有し、更なるポリマーがポリマー被覆表面又はポリマー被覆表面に結合している任意の反応性部分と反応してそれに結合する、請求項４〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
請求項４〜１３のいずれかに記載の方法によるポリマーによって被覆されている基材。
【請求項１５】
ポリマー被覆が基材表面上に約１〜約１０００ｎｍの範囲の平均厚さで存在している、請求項１４に記載の基材。
【請求項１６】
基材表面への細胞接着性を調節するか、又は基材表面の抗菌特性を向上させるための、請求項１４又は１５に記載の基材の使用。
【請求項１７】
シアン化水素モノマー単位及びコモノマーを含む溶液中で共重合する工程を含む、シアン化水素酸ベースのヒドロゲルを形成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概してポリマー被覆、より詳しくは（有機及び無機基材などの）種々の基材材料の表面を変性するのに好適な方法及びプロセスに関する。本発明は、かかる基材の表面を（直進的（line-of-sight）被覆適用技術によるか又はよらないで）被覆で少なくとも部分的に被覆して、基材の表面に、基材の残りの部分の機能特性とは異なる更なる機能特性を与えることに関する。ポリマー被覆はプレバイオティックポリマーであってよい。
【０００２】
本発明はまたシアン化水素酸ベースのヒドロゲルにも関する。より詳しくは、本発明はかかるヒドロゲルを製造するのに好適な方法及びプロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
多くの用途において、材料又は機器のバルク特性と、その材料又は機器の表面特性との間を差異化することが重要である。バルク又は基材材料は、機械特性又は屈折特性のような所期の用途のために好適な一連のバルク特性を与える。しかしながら多くの用途においては、基材材料の表面特性は所期の用途のために好適でないか又は理想的でない。したがって、これらの基材材料に関しては、基材の表面特性を変性するために表面変性が必要である。
【０００４】
表面変性技術としては、吸着、自己組織化単分子膜（ＳＡＭ）の形成、官能化シラン、ラングミュア−ブロジェット析出、多層（ＬｂＬ）集合体、及び遺伝子操作表面結合性ペプチドの共有結合のような方法が挙げられる。これらの技術は広範囲の実用的用途に関して制限を有する。例えば、吸着被覆は幾つかの条件下で脱着する可能性があり、これによって種々の用途における表面変性技術としての吸着の適切性が制限される。更に、基材の特性は被覆ポリマーを引き寄せて保持するためには好適でないので、単純な吸着は多種多様の基材材料に容易に適用することができない。基材の特性が適当であるかどうかはまた、適用するポリマーのタイプによっても左右される。共有結合による表面変性技術は接着を向上させるが、界面変性剤と基材（例えば、貴金属上のアルカンチオール、及び酸化物上のシラン）との間の化学的特異性が通常は必要である。表面変性化学のために利用できる基材及びポリマーが主に制限される。
【０００５】
ＬｂＬ誘導被覆（Decher G., "Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites", Science, 277, 1232-1237 (1997))は、水溶液から確実に且つ均一に析出させることができ、その後の表面固定化反応のために用いることができる官能基を与えながら良好な接着及び被覆厚さに対する制御を与え、機器内の多孔質材料及び内部表面のような種々の基材形状を被覆するために用いることができる。しかしながら、ＬｂＬアセンブリは実施するためには多段階工程が必要である。
【０００６】
化学、生物学、及び材料科学、並びに応用科学、工学、及び工業技術において用いることができる多目的のポリマー被覆を与えるより単純な一工程プロセスを与えることが有用であろう。このプロセスは基材材料又は形状によって制限されず、且つこのプロセスは（ｉ）酸化性又は非酸化性条件のいずれかの下、（ｉｉ）水溶液又は非水溶液中、及び（ｉｉｉ）気相中で行う能力を有することが望ましい。
【０００７】
Leeらは、ドーパミンがこれを解決するのに幾らか助けになることを示唆している（Lee, H.ら, "Mussel-Inspired Surface Chemistry for Multifunctional Coatings", Science, 318, 426-430 (2007))。高いｐＨにおいてドーパミン塩酸塩を中和することによって遊離ドーパミンが生成し、これは次に自発重合してポリドーパミン被覆を与える。しかしながら、ドーパミン誘導被覆は、実施するためには酸化性条件が必要である。更に、ドーパミン誘導被覆は、液体溶液ベースの化学反応に限定される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Decher G., "Fuzzy Nanoassemblies: Toward Layered Polymeric Multicomposites", Science, 277, 1232-1237 (1997)
【非特許文献２】Lee, H.ら, "Mussel-Inspired Surface Chemistry for Multifunctional Coatings", Science, 318, 426-430 (2007)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、広範囲の適用性及び実用性を有する被覆を与える際の従来技術の欠点を改善しようとするものである。明細書中における従来技術の参照は、この従来技術がオーストラリア又は全ての他の管轄区域における一般的な常識の一部を形成するか、或いはこの従来技術が当業者によって関連するものとして確定され、理解され、且つみなされると妥当に推測することができることを認めるか又はいずれかの形態で示唆するものとして解釈されず、及び解釈すべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、基材の表面上にポリマー被覆を形成する代替の広く適用することができる方法に関する。特に、本発明は、反応条件を制御することによって、表面上にシアン化水素（又はシアン化水素酸）（ＨＣＮ）誘導被覆を与える。かかる被覆は、例えば医療機器の生体適合性被覆、薬物送達キャリア及び組織工学骨格分子の表面変性、バイオセンサー、耐生物付着性被覆、工業用被覆、及び民生用被覆、半導体、金属除去、表面触媒、金属の電子特性（例えば仕事関数を変性するための被覆の析出）、及び次世代電子ディスプレイの開発において有用である。
【００１１】
本発明の一形態においては、基材上に被覆を形成するシアン化水素モノマー単位（又は「ＨＣＭＵ」）のポリマーが提供される。被覆は、一態様においては広範囲の基材に容易に且つ安定して付着し、官能化又はコモノマーの付加などによって異なる用途に適合させることができる。通常は及び有利には、本発明による被覆は基材表面に対して接着性である。本発明は、基材に付着しているかかる被覆を包含する。ＨＣＭＵは、種々の表面形状を有する任意のバルク材料表面（即ち基材）上にポリマー膜を析出させるためのビルディングブロックとして反応する。ＨＣＮそれ自体に加えて、ＨＣＭＵは、広範には、少なくとも１つのニトリル官能基（functionality）、及びＮＨ又はＳＨのような少なくとも１つの求核官能基を含んでいて、自己反応又は重合を起こす化合物として定義される。ＮＨ官能基は、アミン（ＨＮ−）又はイミン（ＨＮ＝）（しかしながらこれらに限定されない）の形態であってよい。本発明のために好ましいＨＣＭＵは、実用的に有用なもの、即ちＨＣＮそれ自体、並びに（ＨＣＮ）２、（ＨＣＮ）３、及び（ＨＣＮ）４など（しかしながらこれらに限定されない）のＨＣＮのマルチマーである。ＨＣＮマルチマーの好ましい異性体形態としては、シアン化水素二量体のイミノアセトニトリル：ＨＮ＝ＣＨ−ＣＮ（ＩＡＮ）、シアン化水素三量体のアミノマロノニトリル：Ｈ２Ｎ−ＣＨ−（ＣＮ）２（ＡＭＮ）、及びシアン化水素四量体のジアミノマロノニトリル（diaminomalononitrile）：Ｈ２ＮＣ（ＣＮ）＝Ｃ（ＣＮ）−ＮＨ２（ＤＡＭＮ）、並びにアミノアセトニトリル化合物：Ｈ２Ｎ−ＣＨ２−ＣＮ（ＡＡＮ）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の態様においては、ＨＣＭＵは、ＨＣＮ、ＩＡＮ、ＡＭＮ、ＤＡＭＮ、ＡＡＮ、アジドアセトニトリル、及びこれらのうちのいずれか１つの異性体からなる群から、通常はＡＭＮ、ＤＡＭＮ、ＡＡＮ、及びこれらのうちのいずれか１つの異性体から選択される１種類以上のモノマーから実質的に構成される。一態様においては、ＨＣＭＵは、ＨＣＮ、ＩＡＮ、ＡＭＮ、ＡＡＮ、アジドアセトニトリル、及びＨＣＮのマルチマーからなる群から選択される１種類以上のモノマーから実質的に構成される。特に好ましい態様においては、ＨＣＭＵはＨＣＮ又はＡＭＮから実質的に構成される。
【００１２】
一態様においては、本発明は、ＨＣＭＵの重合を可能にする条件下で表面をＨＣＭＵと接触させて、表面を被覆するポリマーを形成する工程を含む、基材表面の少なくとも一部を被覆する方法を提供する。したがって、この方法は基材表面を変性することを与える。通常は、ＨＣＭＵは溶液中で与えて、これを表面と接触させる。
【００１３】
重合を可能にする条件は、用いるＨＣＭＵの反応性によって定まる。ＨＣＭＵの異なる反応性及び性質は次の一連の記載で示すことができる。気相中で生成されるＨＣＮ二量体のイミノアセトニトリルは、約−４０℃より低い温度のみで安定である。この温度より高いと、これは自発重合する。ＨＣＮ三量体のアミノマロノニトリルはスルホン酸塩として安定であるが、中和すると重合する。塩基を用いてアミノマロノニトリル塩を中和することができる。しかしながら、重合を開始するために塩基は必ずしも必要ではない。塩基性溶液から抽出された中和アミノマロノニトリルは、もはやプロトン化形態でないので自発重合する。ＨＣＮ四量体のジアミノマレオニトリル（diaminomaleonitrile）は安定な固体化合物であるが、水中で沸騰させるとポリマーを生成する。
【００１４】
１つの好ましい態様においては、ＨＣＭＵの重合はｐＨを調節することによって制御される。これは、室温において安定化されたＨＣＭＵを用いてより容易に達成される。一形態においては、溶液は酸性であり、重合を可能にする条件を与えるためにｐＨを上昇させる。一般に、ＨＣＭＵは酸性条件中においてはさほど重合しない。ｐＨを上昇させてよりアルカリ性の溶液を形成することによってＨＣＭＵの重合を誘発させて、基材表面上に結合させる。塩基の役割は、ＨＣＭＵを、重合を可能にする形態にすることである。プロトン化された安定なＨＣＭＵを中和することが必要である。塩基は、付随的に中和されたＨＣＭＵ又は得られるポリマーのいずれかとの反応を起こす可能性があるが、主には開始剤ではない。好ましい態様においては、表面と接触する時点の溶液のｐＨ値は７より高い。ｐＨは１２より低いことが好ましい。重合のために好ましいｐＨ範囲は８〜９である。例えば、本発明の一形態は、酸性溶液中のＨＣＭＵを与え、これに塩基を加えてｐＨを上昇させてアルカリ性溶液を形成する方法である。好ましくは、酸は強酸である。好適な酸としては、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、硫酸、塩酸、硝酸、トリフルオロメタンスルホン酸（triflic acid）、及びトリフルオロ酢酸が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な酸としては、限定なしに、酢酸、リン酸、及び過塩素酸が挙げられる。好ましくは、酸は、水性又は非水性のＨＣＭＵの溶液を形成するものである。好適な酸は、容易に商業的に入手できる好適な有機酸であるｐ−トルエンスルホン酸である。好適な塩基としては、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化アンモニウム（ＮＨ４ＯＨ）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、水酸化マグネシウム（Ｍｇ（ＯＨ）２）、水酸化バリウム（Ｂａ（ＯＨ）２）、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）、水酸化第一鉄（Ｆｅ（ＯＨ）２）、水酸化第二鉄（Ｆｅ（ＯＨ）３）、水酸化亜鉛（Ｚｎ（ＯＨ）２）、水酸化リチウム（ＬｉＯＨ）、２−アミノ−２−ヒドロキシメチルプロパン−１，３−ジオール（Ｔｒｉｓ）、及びアンモニウムジメチルアミンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、塩基は、これも容易に商業的に入手できる好適な塩基であるＮａＯＨ又はＴｒｉｓである。
【００１５】
本明細書における「接触」とは、基材の少なくとも一部を、ポリマーを形成して基材に付着させるのを可能にする条件下でＨＣＭＵに曝露することを意味する。通常の接触時間は、１分間〜７日間；好ましくは１分間、より好ましくは５分間乃至５０時間、更により好ましくは３０分間〜２４時間の範囲である。反応は通常はほぼ室温において行うが、これは用いるＨＣＭＵによって変化し、より高反応性の二量体は約−４０℃の温度で重合し始める。しかしながら、より安定な四量体は約１００℃までの温度を必要とする可能性がある。好ましい態様においては、基材全体をＨＣＭＵ溶液中に沈下又は浸漬する。下記の例は好ましい接触方法を示す。しかしながら、限定なしにスワビング（swabbing）、浸漬被覆、スピン被覆、ダイ被覆、インクジェット被覆、噴霧、スクリーン印刷（例えばロータリースクリーン印刷）、グラビア印刷、フォトリソグラフィー印刷及びフレキソ印刷、ミクロ接触印刷、及びナノリソグラフィーなどの種々の技術を用いて、基材表面をＨＣＭＵ溶液と接触させる。
【００１６】
「溶液」には蒸気及び液体が含まれる。液体には、水、並びにアセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ジメチルホルムアミド、及びジメチルスルホキシドのような有機溶媒の混和性溶液などの水性及び非水性溶媒の両方が含まれる。好ましくは、溶液は基材と接触させる直前に調製するが、溶液は使用前に少なくとも短時間貯蔵することができる。一態様においては、溶液は水性であり、水性溶媒中に可溶の塩基を加えてｐＨを上昇させてアルカリ性溶液を形成する。別の態様においては、溶液は非水性であり、非水性溶媒中に可溶の塩基を加えてｐＨを上昇させてアルカリ性溶液を形成する。例えば、トルエンスルホン酸は非水性溶媒としてＨＣＭＵを保持することができるが、水と混和性でもある。基材上に被覆を形成するために好適な濃度は、溶媒１ｍＬあたり１００ｍｇのＨＣＭＵである。
【００１７】
重合プロセスの工程は、所望の目的に適合させるために変化させることができる。一態様においては、溶媒（水、又は有機溶媒、或いはこれらの混合物）、塩基、及びＨＣＭＵを混合し、次に被覆する基材を加えることができる。他の態様においては、溶媒及び塩基を被覆する基材と共に加え、次にＨＣＭＵを加えることができる。或いは、ＨＣＭＵ、溶媒、及び基材を混合し、次に塩基を加えて重合を開始させて被覆を得ることができる。他の態様においては、ＨＣＭＵ及び塩基を水性溶媒中で一緒に加えることができる。有機溶媒を加えて、中和したＨＣＭＵを、それを形成させながら抽出することができる。中和したＨＣＭＵは、次に被覆のために基材に移すことができる。この態様においては、まず中和したＨＣＭＵを、次に好適な溶媒（例えば有機溶媒）中に溶解（即ち可溶化）し、材料表面上にキャスト、噴霧、又は他の形態で析出させて被覆を形成する。例えば一態様においては、アミノマロノニトリルトルエンスルホン酸塩を、水のような水性溶媒に加え、中和してアミノマロノニトリルの遊離塩基を解離させる。アミノマロノニトリルの遊離塩基を、ジエチルエーテルのような有機溶媒中に抽出し、基材上にキャストする。次に、有機溶媒を蒸発させてアミノマロノニトリルの膜を残留させ、これは遊離塩基形態で自発重合して、表面を被覆するポリマーを形成する。中和及び被覆工程を分離することによって、膜の形成前に粒子状ポリマーを容易に除去することを可能にすることができる。また、溶液中の中和ＨＣＭＵの正確な濃度を与えて、被覆をより精密にすることもできる。
【００１８】
一態様においては、被覆する基材又は表面は、その中で重合が行われる反応容器から分離しているので、それは被覆されたら容器から取り出すことができ、及び／又は本発明方法によってその表面を変性する。また、基材に、反応容器それ自体としても機能する容器の内表面を含ませることができることも考えられる。この後者の態様においては、容器は、好ましくはガラス又はホウケイ酸ガラス製品を含まない。
【００１９】
ＨＣＭＵはまた、ＨＣＮ二量体のイミノアセトニトリル、アミノマロノニトリル誘導体、ジアミノマロノニトリル誘導体、アミノアセトニトリル誘導体、及びこれらの混合物からなる群から選択することもできる。ｐ−トルエンスルホン酸、塩酸、硫酸、又は他の酸によって安定化された塩として与える場合には、ＨＣＭＵは、アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート、アミノアセトニトリル硫酸水素塩、及びこれらの混合物からなる群から選択することができる。
【００２０】
ＨＣＭＵは基材表面上にポリマー被覆を形成する。ポリマーは必ずしも規則的な構造を有しない。基材表面上のポリマーは表面を変性して、ＨＣＭＵから誘導されるアミノ又はイミノ基によって官能化されている基材表面を与える。水性条件下においては、イミン基はアミン基に加水分解され、一方、非水性条件下においては、重合後により反応性の高いイミン官能基のより大きい割合が保持される。更に、ＨＣＭＵに対する別のコモノマーによって、基材の被覆の更なる官能化を与えることもできる。
【００２１】
他の態様においては、本発明は、基材の少なくとも一部を、ＨＣＭＵの重合を可能にする条件下で、ＨＣＭＵを含む蒸気と接触させて基材表面を変性することを含む、基材表面を変性する無溶媒蒸着方法を提供する。好ましくは、蒸気はＨＣＮ二量体のイミノアセトニトリルを含む。好ましくは、二量体は−４０℃より高い温度において非常に不安定で熱的に重合する（Evans, RAら, JACS 113, 7261 (1991))ので、重合は自発的であり、触媒は必要ない。本明細書において「熱的に重合」とは、化合物が室温に加温することによって自発重合することを意味する。ＨＣＮ二量体のイミノアセトニトリルは、約−４０℃より高い温度において自発重合する。好ましくは、ＩＡＮを用いる重合は、約−３０℃〜約５０℃、より好ましくは約−２０℃〜約４０℃の範囲、更により好ましくはほぼ室温の温度において行う。したがって、二量体は、触媒を用いないで形成される無溶媒ＨＣＮポリマーの供給源である。好ましくは、無溶媒蒸着プロセスによって変性される基材表面はガラスではない。好ましい態様においては、無溶媒蒸着プロセスによって変性される基材表面は、その中で反応を行う反応容器から取り出すことができる。
【００２２】
好適な有機基材としては、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、又はポリエチレンナフタレート）、ポリアクリレート（例えば、ポリメチルメタクリレート又はＰＭＭＡ）、ポリ（酢酸ビニル）（ＰＶＡＣ）、ポリ（ビニルブチラール）（ＰＶＢ）、ポリ（エチルアクリレート）（ＰＥＡ）、ポリ（ジフェノキシホスファゼン（ＰＤＰＰ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、低密度ポリエチレン（ＬＤＰＥ）、ポリスルホン（ＰＳ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリウレタン（ＰＵＲ）、ポリアミド（ＰＡ）、ポリ（ジメチルシロキサン）（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリスチレン（ＰＳｙ）、例えば組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）、ポリエチレンスルフィド、及びこれらの組み合わせなどの熱可塑性プラスチック；並びにセルロース誘導体、ポリイミド、ポリイミドベンゾオキサゾール、ポリベンゾオキサゾール、及びこれらの組み合わせのような熱硬化性プラスチック；から形成されるか、又はこれらである有機基材が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な有機基材としては、限定なしに、グラファイト、カーボンナノチューブ、フラーレン、グラフェン、ポリ（グリコール酸）、ポリ（乳酸）、及びポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、テフロン（登録商標）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。更なる好適な有機基材としては、限定なしに、生体組織、コラーゲン、ケラチン、骨由来の材料、及びこれらの組み合わせのような生物学的基材及び生物学的に誘導された基材が挙げられる。
【００２３】
好適な無機基材としては、石英、ガラス、シリカ、及び他の酸化物、或いはアルミナ、インジウムスズオキシド（ＩＴＯ）、タンタル酸リチウム（ＬｉＴａＯ３）、ニオブ酸リチウム（ＬｉＮｂＯ３）、ヒ化ガリウム（ＧａＡｓ）、炭化ケイ素（ＳｉＣ）、ランガサイト（ＬＧＳ）、酸化亜鉛（ＺｎＯ）、窒化アルミニウム（ＡｌＮ）、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、ケイ素（Ｓｉ）、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）、及びチタン酸ジルコン酸鉛（lead zirconium titanate）（ＰＺＴ）、酸化チタン（ＴｉＯ２）、酸化ニオブ（Ｎｂ２Ｏ５）のようなセラミクス；並びにアルミニウム、銅、金、白金、銀、鉄、銅、水銀、亜鉛、及び鋼のような金属又は合金；から形成されるか、又はこれらである無機基材が挙げられるが、これらに限定されない。他の好適な無機基材としては、限定なしに、マイカ、ダイヤモンド、及びニッケルチタン（ＮｉＴｉ）が挙げられる。
【００２４】
一態様においては、このプロセスは酸素の存在下で行う。通常は、酸素は大気酸素から誘導され、溶液中に自然に溶解する。別の態様においては、このプロセスは酸素を実質的に含まない条件において行う。好ましくは、溶液は、減圧下において不活性ガスでパージ又は脱気することによって酸素を実質的に含まないようにする。好ましくは、不活性ガスは窒素又はアルゴンである。
【００２５】
他の態様においては、本発明は、表面変性基材を１種類以上の反応性部分（reactive moieties）と接触させ、反応性部分を変性表面と反応させてそれに結合させる更なる工程を有する、表面変性基材を更に官能化する方法に関する。好ましくは、反応性部分は、求核試薬、求電子試薬、又は金属を含む。好ましくは、反応性部分は、アミン、チオール、ニトリル、アルデヒド、イミダゾール、アジド、ポリヘキサメチレンジチオカーボネート、水素、ヒドロキシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボキサミド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化ベンジル、エポキシド、チオエポキシド、イソシアネート（有機非プロトン性溶媒）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。このように、表面変性基材を、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）及びバイオポリマーのような更なるポリマーで官能化させることができる。好適なバイオポリマーとしては、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、及び細胞外マトリクスタンパク質のようなタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。更なるポリマーは、被覆の形成前、形成中、又は形成後において、共析によってポリマー被覆中に含ませることができる。一態様においては、更なるポリマーとしては、１種類以上の反応性部分、例えばアミン反応性ＰＥＧ、イミン反応性ＰＥＧ、又はアミン官能化ＰＥＧが挙げられ、これは表面変性基材と反応してそれに結合する。他の態様においては、表面変性基材をまず１種類以上の反応性部分で官能化し、次に１種類又は複数の反応性部分と反応してそれに結合する更なるポリマーで官能化する。例えば、表面変性基材は、２種類以上のアミン成分（例えば、ポリアリルアミン又はアミン末端デンドリマー）を含む化合物で官能化して、アミン成分の少なくとも１つが表面変性基材と反応してそれに結合し、アミン成分の少なくとも１つが更なるポリマーと自由に結合するようにすることができる。好適な更なるポリマーとしては、モノメトキシ−ＰＥＧ−アルデヒド、ＰＥＧ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、カルボキシル変性ＰＥＧ、他のアミン反応性ＰＥＧ、及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。このように、表面変性基材の特性を更に変性することができる。一態様においては、表面変性基材は非細胞接着性である。この態様においては、基材は、上記に記載したプロセスのうちのいずれか１つにしたがって、ＨＣＭＵから形成されるポリマーで被覆して、ＰＥＧのような更なるポリマーで官能化することができる。別の態様においては、表面変性基材は細胞接着性である。この態様においては、基材はＨＣＭＵから形成されるポリマーで被覆する。
【００２６】
また、被覆の形成前、形成中、又は形成後において、ナノ粒子を共析（co-deposition）によってポリマー被覆中に含ませることもできる。ナノ粒子は、独立して生成されるナノ粒子、及びＨＣＭＵによる被覆に加えて形成されるナノ粒子のいずれか又は両方であってよい。好適なナノ粒子としては、架橋ポリスチレン、他の有機ポリマー、シリカ、量子ドット、及び金属粒子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２７】
ＨＣＭＵの溶液で処理した基材は、アミン及びチオール基（適当なイオウ含有コモノマーに由来する）のような有機ヘテロ原子と反応性であり、また、Ａｕ、Ａｇ、Ｐｔ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｈｇ、及びＺｎのような種々の金属に強く結合する。金属は、被覆の形成前、形成中、又は形成後において、共析によってポリマー被覆中に含ませることができる。金属は、種々の酸化状態で表面変性基材上又はその中に析出させることができる。例えば一態様においては、このプロセスは、表面変性基材の少なくとも一部をＡｇＮＯ３の溶液と接触させて、表面変性基材上に銀を導入することを含む。この態様においては、銀は、Ａｇ（０）及びＡｇ（＋）の酸化状態で表面変性基材上に析出する。このようにして、表面変性基材の特性を更に変性することができる。この特定の態様においては、銀を含む被覆は増大した抗菌特性を有する。
【００２８】
本発明のＨＣＭＵの溶液にはまた、１種類以上の充填剤、顔料、湿潤剤、粘度調整剤、安定剤、及び酸化防止剤を含ませることもできる。また、ＨＣＭＵの溶液に、ナノ粒子、バイオポリマー、及び金属の１以上を含ませることもできる。更に、下記においてより詳細に説明するように、ＨＣＭＵ溶液に、リガンドとして（例えば、下記の実施例４において例示されるようなポリマー被覆内の官能基に結合する反応性基として）、架橋剤（例えば、ＨＣＭＵに加えてポリマーネットワークに架橋する）として、及びＨＣＭＵと重合するコモノマーとしても機能させることができる更なる成分を含ませることもできる。ＨＣＭＵはまた、所望の場合にはコモノマーで架橋させることもできる。コモノマーは、ＨＣＭＵ溶液中に存在させることができる。或いは、コモノマーを基材表面上に存在させて、ＨＣＭＵが、基材表面上又はその中に存在するコモノマーを導入した基材表面上にコポリマー被覆を形成するようにすることができる。好適なコモノマーは、一般に、アミン、活性メチレン化合物、又は活性化ニトリルと反応することができるものである。本発明の範囲を限定しないかかるコモノマーの例は、アミン（１級又は２級）、チオール、アクリレート、メタクリレート、エポキシド、チオエポキシド、イソチオシアネートアルキルハロゲン化物、及びアリールメチルハロゲン化物を含む化合物である。
【００２９】
本発明は、上記に記載の方法のうちのいずれか１つによるポリマーで被覆された基材にも及ぶ。好ましい態様においては、ポリマーは、実質的に一定の厚さ（即ち±２０％）を有する平滑で連続的なポリマー被覆を基材表面上に与える。被覆厚さを測定するのに好適な手段は原子間力顕微鏡測定（ＡＦＭ）である。一般的な指針として、ポリマー被覆は、１〜１０００ｎｍの範囲、好ましくは約２〜４００ｎｍの範囲、より好ましくは約５〜２００ｎｍ、より好ましくは約２０〜２００ｎｍ、一態様においては１０〜１００ｎｍの範囲の平均厚さで基材表面上に存在させる。好適な平均厚さは、約４５ｎｍ、５０ｎｍ、又は１７５ｎｍであり、約１０ｎｍ未満の二乗平均平方根（ｒｍｓ）粗さ値を有する。被覆は、そのｒｍｓ値が平均厚さの約±２０％未満であれば実質的に一定の厚さのものである。
【００３０】
一態様においては、本発明は、顕微鏡スライド、細胞培養プレート、及びフラスコなど（しかしながらこれらに限定されない）の実質的に平面状の基材を被覆する方法に関する。他の態様においては、本発明は粒子を被覆する方法に関する。この場合には、ポリマーは、無機又は有機材料から誘導することができる粒子を被覆する。本発明を限定しない粒子の例としては、架橋ポリスチレン、他の有機ポリマー、シリカ、量子ドット、金属粒子等が挙げられる。粒子の直径は、数ナノメートル乃至数ミリメートルの範囲であってよい。粒子はまた、犠牲足場として機能させて、粒子を溶解させることによって被覆が中空カプセルになるようにすることもできる。例えば、本発明のポリマーで被覆したシリカ粒子を、フッ化水素酸を用いて溶解させることができる。
【００３１】
他の態様においては、本発明は多孔質材料を被覆する方法に関する。この場合には、ポリマーは、多孔質構造中に移動してそこで重合を起こすことによって、材料を、多孔質構造全体にわたって、及びＨＣＭＵ溶液が表面と接触する結果として外表面上で均一に被覆する。多孔度はナノメートルスケール乃至センチメートルスケールの範囲であってよい。より大きなスケールの多孔度の好適な材料としては、骨、多孔質金属又は金属合金、ゼオライト、及び相互接続多孔性を有する多孔質ポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
多孔質材料を被覆する能力は種々の分野において有用である。例えば、ゼオライトは、溶液からの金属イオンの選択的除去、又は気体混合物中の成分の選択的除去において使用することが可能である。金属イオン封鎖用途のための骨格材料における二酸化炭素の捕捉及び解離は特に重要である。骨、多孔質金属、金属合金、及び多孔質ポリマーのようなより大きいスケールの多孔度の材料を有利に被覆して、例えば、特に骨に関連する用途における埋込型医療機器における向上した組織応答性を与えることができる。
【００３３】
他の態様においては、本発明は、ＨＣＭＵ及びコモノマーを含む溶液中において共重合することを含む、シアン化水素酸ベースのヒドロゲルを形成する方法に関する。このようにして、基材の必要なしにＨＣＭＵのポリマーが形成される。好ましくは、コモノマーは、アミン、ニトリル、ＨＣＮの重合において形成される任意の中間体、又はこれらの組み合わせと反応する１以上の官能基を含む化合物から選択される。これらのコモノマーは、得られるヒドロゲルに更なる官能性を付与することができる。特に好ましい態様においては、コモノマーは、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される１以上のアミン官能基を含む化合物から選択される。これによって、ヒドロゲルのような材料を生成させるための架橋ポリマーネットワークが形成される。また、ＨＣＭＵ及びコモノマーの溶液に、１種類以上の充填剤、顔料、湿潤剤、粘度調整剤、安定剤、及び酸化防止剤を含ませることもできる。また、ＨＣＭＵ及びコモノマーの溶液に、ナノ粒子、バイオポリマー、及び金属の１以上を含ませることもできる。好ましくは、バイオポリマーは、タンパク質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの組み合わせの１以上からなる群から選択される。例えば、１つのプロセスは、酸性溶液中のＨＣＭＵ及びコモノマーを与え、これに塩基を加えてｐＨを上昇させてアルカリ性溶液を形成する。ナノ粒子はまた、ヒドロゲルの形成中に共重合によって、又はヒドロゲル形成後にヒドロゲル上に析出させることによってヒドロゲル中に含ませることもできる。ナノ粒子は、独立して生成されるナノ粒子、及びＨＣＭＵによる被覆に加えて形成されるナノ粒子のいずれか又は両方であってよい。
【００３４】
本発明は、上記に記載の方法によって形成されるシアン化水素酸ベースのヒドロゲルにまで及ぶ。かかるヒドロゲルは、それに種々の官能性を与える本明細書に記載する更なる成分を有していてよい。本発明はまた、表面をシアン化水素酸ベースのヒドロゲルと接触させて表面の部分を被覆することを含む、基材表面の少なくとも一部を被覆する方法にも及ぶ。
【００３５】
他の態様においては、本発明は、ＨＣＭＵを含む溶液、及び使用のための指示書を含む、基材表面を変性するためのキットに関する。好ましくは、キットはまた、塩基、又は塩基と促進剤も含む。好適な促進剤としては、（ｉ）ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、及びアセトンのようなアルデヒド／ケトン；（ｉｉ）グリコロニトリル、アセトアルデヒド、シアノヒドリン、アセトンシアノヒドリンのような、上記のカルボニル化合物から誘導されるシアノヒドリン類；及び（ｉｉｉ）メタバナジン酸塩のような金属塩；が挙げられるが、これらに限定されない。本発明によるキットには更に、チオール、アミン、ニトリル、アルデヒド、イミダゾール、アジド、ハロゲン化物、ポリヘキサメチレンジチオカーボネート、水素、ヒドロキシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボキサミド、又はこれらの組み合わせからなる群から選択される反応性部分を更に含ませることができる。
【００３６】
本明細書において用いる「含む」という用語、並びに「含み」、「包含する」、及び「含まれる」のようなこの用語の変形型は、記載が他の形態を必要とする場合を除いて、更なる添加剤、成分、整数、又は工程を排除することは意図しない。
【００３７】
本明細書において開示され規定されている発明は、言及されているか又は明細書若しくは図面から明らかな個々の特徴の２以上の全ての別の組み合わせにも及ぶことが理解されるであろう。これらの異なる組合せは全て、本発明の種々の別の形態を構成する。
【００３８】
本発明の更なる形態、及び上記のパラグラフにおいて記載した形態の更なる態様は、例として添付の図面を参照して与えられている以下の記載から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図１は、種々のＨＣＭＵを用いるＨＣＮポリマーの形成に関する反応式を示す。種々のＨＣＮマルチマーの代表的な異性体形態を示す（ＨＣＮ；ＡＡＮ；（ＨＣＮ）２の例としてＩＡＮ；（ＨＣＮ）３の例としてＡＭＮ；（ＨＣＮ）４の例としてＤＡＭＮ）。Ｘ−は、好ましくは酸から誘導される対アニオンである。好適な酸としては、硫酸、塩酸、硝酸、トリフルオロメタンスルホン酸（triflic acid）、トリフルオロ酢酸、ｐ−トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、酢酸、リン酸、及び過塩素酸のような酸が挙げられるが、これらに限定されない。Ｍ＋はカチオンである。好適なカチオンとしては、Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋のようなカチオン、並びに多価カチオンが挙げられるが、これらに限定されない。
【図２】図２は、ＡＦＭによって測定される析出時間の関数としての、マイカ基材上に得られる平均被覆厚さを示す（ｎ＝３）。線は目測で描いた。
【図３】図３は、マイカ上に４８時間析出させたＡＭＮ被覆のＡＦＭ断面解析を示す。断面解析は、被覆プロセス中にマスクを存在させ、その後に取り除いて未処理のマイカ表面を露出させた領域において行った。
【図４】図４は、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）ポリマー、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリスチレン（ＰＳｙ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）、鋼、金、ガラス、及びマイカについて、ＡＭＮポリマーの被覆の前後において得られた平均水接触角測定値を示す（ｎ＝１０）。
【図５】図５は、空気中（Ａ）及び窒素雰囲気中（Ｂ）におけるＡＭＮベースの被覆について得られたＳＥＭ画像を示す。
【図６】図６は、ＴＣＰＳと比べて９６ウェルプレートについて行った比色分析試験から得られた細胞接着結果を示す。
【図７】図７は、ＡＭＮ被覆上の２つの異なる酸化状態のＡｇの析出をＸＰＳによって示す。
【図８】図８は、異なる比のＡＭＮ及びポリアリルアミン（ＰＡＡ）を含む溶液をｐＨ８．５においてインキュベートした後に、基材の必要なしに架橋ゲルの形成が観察されることを示す。
【図９】図９は、ＴＣＰＳと比べた、ＭＴＳ試験から得られた２４時間後のＬ９２９マウス線維芽細胞の接着を示す（ｎ＝８）。
【図１０】図１０は、銀を析出させるために用いたＡｇＮＯ３の溶液濃度による、S. epidermidis及びP. aeruginosaに関する、銀を導入したＡＭＮ被覆上へのバイオフィルム形成のクリスタルバイオレットベースの定量化を示す。
【図１１】図１１は、無血清培地（ＳＦＭ）と比べて測定されたＬ９２９細胞生存率（％）を示す。結果は、ＡＭＮ被覆表面と６６時間接触させたＳＦＭベースの抽出溶液の連続希釈（１００％〜０．３９％）を用いる２０時間のインキュベーションの後において、ＭＴＳを用いて記録した。５％のＰＢＳ及び５％のＤＭＳＯを含むＳＦＭは、それぞれ非毒性及び毒性対照試料として用いた。
【図１２】図１２は、２４時間後の非細胞接着剤超低接着（ＵＬＡ）被覆（Corning,米国）上の細胞接着性ＡＭＮ被覆領域を表すパターン化された表面化学に対するＬ９２９細胞応答性を示す。
【図１３】図１３は、ＴＣＰＳと比べた、ＭＴＳ試験から得られた２４時間後のＬ９２９マウス線維芽細胞の接着を示す（ｎ＝８）。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
幾つかのＨＣＭＵはアルカリ性環境中で自発重合してポリマー生成物を与えることが公知である。ＨＣＭＵの水性重合は、２つのフラクション：（ｉ）着色水溶液、及び（ｉｉ）沈殿物を与える。この溶液は、水溶性のＨＣＮオリゴマーを含んでいると考えられる。沈殿物の一形態は、ＨＣＮポリマーの不溶性粒子である。シアン化水素酸の水性重合から形成される可溶物及び沈殿物フラクションの構造は明確には立証されていない。不溶性粒子は、米国特許２，８９４，９１６及び米国特許２，５７９，０６１において暗色の物質として記載されている。基材表面へのＨＣＮの吸着は、Kozirovski, Yら, "Infrared Spectrum and Surface Poklymerization of Adsorbed HCN", Transactions of the Faraday Society (1964), vol.60, p.1532-1538；及びLow, Mら, "Infrared Spectrum, Surface Reaction, and Polymerization of Adsorbed Hydrogen Cyanide on Porous Glass", J. Phys. Chem. (1968), vol.72, p.2371-2378において研究されている。更に、シリコン基材の表面にＨＣＮを吸着させてＳｉダングリングボンドを不動態化することも、Takahashi, Mら, "Passivation of defect states in surface and edge regions on pn-junction Si Solar cells by use of hydrogen cyanide solutions", Cent. Eur. J. Phys. (2009)において研究されている。
【００４１】
本発明においては、基材を、ＨＣＭＵを含むアルカリ性溶液と接触させて、基材上に被覆された接着性ポリマーＨＣＮ誘導膜を形成する。１つのプロセスは、ＨＣＭＵを酸性溶液中で与え、これに塩基を加えてｐＨを上昇させて、アルカリ性溶液を形成することである。例えば、ＡＭＮトルエンスルホネート溶液のｐＨは、水性ＮａＯＨを用いて例えばｐＨ８〜９に上昇させることができる。酸の中和によって重合反応が開始される。同様に、これは、シアン化カリウム及び塩化アンモニウムを含む溶液を用いて行うことができる。好ましくは、この溶液は等モル量のシアン化カリウム及び塩化アンモニウムを含む。
【００４２】
他のプロセスにおいては、ＨＣＭＵは気相中であり、重合は特定の温度より高い温度において自発的に起こる。この方法は、触媒、即ち塩基を必要としない。
均一なポリマー被覆を形成するためには、基材表面上における粒状物の形成を最小にすることが望ましく、これは次の１以上によって達成することができる。
【００４３】
・重合及び被覆プロセスを短く維持する。ここでは、被覆の形成は、溶液中に粒状物が形成される前の時点まで進行させる。
・重合及び被覆プロセスを繰り返し開始させ、次に洗浄する。それぞれのサイクルにおいて、被覆の形成は、溶液中に粒状物が形成されるまで進行させる。
【００４４】
・暗色の粒状物材料の異なる密度及び移動性を利用して、例えば、基材を溶液中に配置し、裏返しにする（沈殿している粒子を落下させる）か、又は同様のシステムを行う（例えば粒状物に対して遠心力を作用させる）ことによって被覆から粒状物を分離する。
【００４５】
しかしながら幾つかの態様においては、粒子を有することによって与えられる粗さは、基材表面を重合溶液中において上向きに配置して、粒状物が表面上に落下し、表面被覆中に含まれるようにすることによって容易に得られる。
【００４６】
表面粗さはまた、析出条件の性質によって制御することもできる。例えば、不活性雰囲気（酸素非含有）下で析出を行うことによって、増加した被覆の粗さが得られる。被覆粗さを増加させることにより、幾つかの材料科学用途において有益な増加した表面積を有する基材材料が与えられる。また、表面粗さに対する制御は生物学的応答性に影響を与え、これを調節してこの応答を制御することができる。例えば、細胞応答性は表面粗さによって影響を受ける可能性がある。
【００４７】
更なる化合物を加えて重合速度を速くすることができる。これらとしては、（ｉ）ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド、及びアセトンのようなアルデヒド／ケトン；（ｉｉ）グリコロニトリル、アセトアルデヒド、シアノヒドリン、アセトンシアノヒドリンのような、上記のカルボニル化合物から誘導されるシアノヒドリン類；及び（ｉｉｉ）メタバナジン酸塩のような金属塩；が挙げられる。
【００４８】
上記に概説したように、異なるＨＣＭＵを用いることができ、これらの混合物もまた好適である。ＨＣＮ、ＩＡＮ、ＡＭＮ、ＤＡＭＮ、ＡＡＮ、アジドアセトニトリル、及びこれらのうちのいずれか１つの異性体を用いることができる。ＤＡＭＮは分解してＡＭＮを形成する。より大きいモノマー単位は、物理的及び化学的により安定である。異なるが関連する経路を示すために、図１は異なる可能なＨＣＭＵの反応式である。
【００４９】
ポリマー被覆の構造は、
・溶液中に存在する酸素の量−酸素の存在下においてはより均一な被覆が形成され、酸素の不存在下（即ち、Ｎ２又はＡｒのような不活性ガスでパージして＜０．１％の酸素濃度）においては、増加した表面粗さを有する被覆が形成され、粒子が表面上に析出する−；
・重合のための時間／析出時間；
・ＨＣＭＵの溶液濃度；
・用いるバッファー又は溶媒のタイプ；
を変化させることによって制御することができる。
【００５０】
ポリマー被覆は、Ｘ線光電子分光測定（ＸＰＳ）分析によって特性分析することができる。ここでは、特有のＮ／Ｃ比を用いて被覆の存在を確認することができる。また、Ｏ／Ｃ比を測定することもできるが、ポリマー被覆の比較的高い窒素含量を考えるとＮ／Ｃ比が有用である。ＡＭＮに関しては、被覆のＮ／Ｃ比は、約０．４〜０．７の間、好ましくは約０．５５０〜０．６５０の間の範囲である。ＤＡＭＮに関しては、被覆のＮ／Ｃ比は通常はおよそ０．５０８である。
【００５１】
ポリマー被覆はまた、水接触角測定分析によって特性分析することもできる。ここでは、特有の接触角を用いて被覆の存在を確認することができる。被覆の水接触角は、約５０〜６０°の間、好ましくは約５２〜５８°の間、より好ましくは約５３．１〜５７．８°の間の範囲である。
【００５２】
被覆の厚さは、例えば析出時間又は溶液濃度を変化させることによって制御することができる。
上記に概説したように、ＨＣＭＵの溶液には、官能基を含むリガンドを含ませることができる。而して、（ｉ）ＨＣＭＵとのコモノマーとして更なる官能基を含ませること、及び（ｉｉ）表面を更なる官能基と、それを表面被覆と反応させることを可能にする条件下で接触させることのいずれか又は両方によって、更なる官能基を導入することができる。このように、基材表面を、官能基を含むリガンドで更に官能化することができる。好ましくは、官能基は、求核基、求電子基、又は金属を含む。好ましくは、官能基は、アミン、チオール、ニトリル、アルデヒド、イミダゾール、アジド、ポリヘキサメチレンジチオカーボネート、水素、ヒドロキシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボキサミド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化物ベンジル、エポキシド、チオエポキシド、イソシアネート（有機非プロトン性溶媒）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。これらの反応は自発的に起こすことができ、或いは行う反応によって触媒（即ち塩基）が必要な可能性がある。
【００５３】
ヒドロゲル：
或いは、ＨＣＭＵを、複数の（１つより多い）官能基を含むリガンドと共重合してヒドロゲルを形成することができる。コモノマーは、アミン、ニトリル、ＨＣＮの重合において形成される任意の中間体、又はこれらの組み合わせと反応する１以上の官能基を含む化合物から選択することができる。好ましくは、官能基は、チオール、アルデヒド、ケトン、エポキシド、アクリレート、メタクリレート、イソシアネート、ハロゲン化アルキル、アミン、シアノヒドリン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。より好ましくは、官能基はアミンである。好ましくは、アミン官能基は、ポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００５４】
ヒドロゲルは基材の必要なしに形成することができ、その後に基材又はその一部に接着させて被覆を形成することができる。
【実施例】
【００５５】
実施例１：ＰＢＳバッファー溶液中におけるＡＭＮ被覆の析出：
アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）（Aldrich、９８％）を、７．４のｐＨを有するホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ガラスカバースリップ試料を被覆するために、０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて溶液のｐＨを８．５に調節することによって重合を誘発させた後、ガラスカバースリップ試料をこの溶液中において２４時間インキュベートした。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。明褐色の色変化によって被覆の存在が示された。低い粗さを有する表面被覆が所望の場合には、被覆プロセス中に試料を下向きにして、これも溶液中で形成されるポリマーの沈殿を回避した。
【００５６】
被覆は、種々の基材材料上にうまく析出した。これらの被覆は、数回の洗浄サイクルの後に表面に接着していた。表１に、異なる基材材料について、ＡＭＮによる被覆の前後において採取されたＸ線光電子分光測定（ＸＰＳ）データを示す。それぞれの場合において、ＸＰＳの結果は被覆の析出を明確に示しており、元素組成が大きく変化していた。また、異なる基材材料上にＡＭＮ被覆を析出させた後に得られた同様の元素比は、被覆の組成が基材材料によって左右されることを示唆している。更に、幾つかの基材材料について観察された基材材料由来の信号の完全な減衰は、均一なピンホールのない被覆が得られたことを示す。
【００５７】
【表１】
2015523236.tif 000002
【００５８】
この実施例は、塩基性条件下におけるアミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）の重合を利用して、ポリマー及び無機基材材料などの種々の基材材料上に接着性被覆を生成させることができることを示す。
【００５９】
実施例２：被覆厚さに対する制御：
マイカ試料を新しく劈開して、厚さ測定のための平坦な基材を与えた。次に、アセトン中のポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）の１０％（ｗ／ｖ）溶液１滴をマイカ試料上に配置し、層流キャビネット内で溶媒を蒸発させた。アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）（Aldrich、９８％）を、７．４のｐＨを有するホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。マイカ試料を被覆するために、０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて溶液のｐＨを８．５に調節することによって重合を誘発させた後、試料をこの溶液中において異なる時間の間インキュベートした。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。明褐色の色変化によって被覆の存在が示された。被覆プロセス中においては、試料を下向きにして溶液からのポリマーの沈殿を回避した。
【００６０】
ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）マスクを除去して下層のマイカ表面を再び露出させた後、原子間力顕微鏡測定（ＡＦＭ）実験（Asylum Research MFP-3D, Santa Barbara,米国）を用い、断面解析機能を用いて被覆厚さを求めた。得られた厚さ測定値（図２）は、被覆厚さが析出時間の関数であることを明確に示している。
【００６１】
更に、ＡＦＭ断面解析実験によって、調べた析出時間の全部（１２時間、２４時間、４８時間）に関して均一なピンホールのない被覆が示された。これは、４８時間析出させた被覆の断面解析を示す図３において示される。
【００６２】
新しく劈開したマイカ基材に関する原子間力顕微鏡測定（ＡＦＭ）実験によって得られた被覆厚さ測定値（図２）によって、被覆厚さが析出時間の関数であることが明確に示された。したがって、被覆厚さは、好適な析出時間を選択することによって容易に制御することができる。重要なことに、ＡＦＭ断面解析実験はまた、均一なピンホールのない被覆が得られたことも示した。図３における断面解析は、被覆プロセス中にマスクを存在させ、その後に除去して未処理のマイカ表面を再び露出させた領域において、４８時間の析出時間の後に得た。
【００６３】
実施例３：種々の異なる基材材料について均一な被覆を達成することができる：
アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）（Aldrich、９８％）を、７．４のｐＨを有するホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ポリマー、無機材料、及び金属などの種々の基材材料を被覆するために、０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて溶液のｐＨを８．５に調節することによって重合を誘発させた後、異なる基材材料をこの溶液中において２４時間インキュベートした。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。明褐色の色変化によって被覆の存在が示された。被覆プロセス中においては、試料を下向きにして溶液からのポリマーの沈殿を回避した。
【００６４】
自動接触角ゴニオメーター（KSV Instruments LTD）を用いて、被覆の前後において試料上の異なる点にわたる静的接触角を測定した。MilliQ（登録商標）超純水の約５μＬの体積の液滴を実験のために用いた。１０回の測定値（それぞれの測定において、両方の側の上における液滴の接触角を記録した）から平均接触角を計算した。表２及び図４は、異なる基材材料についてＡＭＮポリマーによる被覆の前後において得られた平均水接触角測定値を示す。水接触角は未被覆の試料については相当に変化したが、被覆を施した後に測定した水接触角の間には大きな差は観察されず、これは、被覆法が種々の異なる基材材料の間で転用可能であることを示す。
【００６５】
【表２】
2015523236.tif 000003
【００６６】
ポリマー、金属、及び無機基材などの種々の異なる基材についてＡＭＮ被覆の前後において得られた水接触角測定値は、未処理の基材材料の接触角においては大きな差を示した。しかしながら、ＡＭＮ被覆を施した後に測定された水接触角の間には大きな差は観察されなかった。これは、被覆法が種々の異なる基材材料の間で転用可能であることを示す。
【００６７】
実施例４：アミン官能化化合物のＡＭＮ被覆中への導入：
アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）（Aldrich、９８％）を、７．４のｐＨを有するホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に８０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。この溶液に、２，２，２−トリフルオロエチルアミン（ＴＦＥＡ）（Aldrich）を２０ｍｇ／ｍＬの濃度で加えた。ポリスチレン（ＰＳｙ）ディスクを基材材料として用いた。ポリスチレン（ＰＳｙ）ディスクを被覆するために、次に０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて溶液のｐＨを８．５に調節することによって重合を誘発させた後、ディスクをこの溶液中において２４時間インキュベートした。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。明褐色の色変化によって被覆の存在が示された。被覆プロセス中においては、試料を下向きにしてポリマーが溶液から表面上に沈殿するのを回避した。
【００６８】
ＸＰＳによって被覆中のＴＦＥＡの存在が示された（表３）。被覆中にフッ素が存在することは、アミン官能基を含む化合物を析出プロセス中に被覆中に含ませることができることを示している。
【００６９】
【表３】
2015523236.tif 000004
【００７０】
この実施例は、アミン含有化合物を、単純に被覆析出プロセス中に被覆溶液中に存在させることによってＡＭＮ被覆中に含ませることができることを示す。
実施例５：被覆条件による異なる被覆の形態：
アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）（Aldrich、９８％）を、７．４のｐＨを有するホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。この溶液の一部を、不活性窒素雰囲気（＜０．１％のＯ２）を与えたグローブボックス中に移した。溶液に窒素ガスを１時間バブリングすることによって、この溶液から残留酸素を除去した。ガラスカバースリップ試料を被覆するために、０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いてｐＨを８．５に調節することによって重合を誘発させた後、（ｉ）不活性雰囲気中で貯蔵した溶液、又は（ｉｉ）空気中の溶液のいずれかの中で試料を２４時間インキュベートした。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。酸素を含む雰囲気の場合には明褐色の色変化によって、窒素を含む雰囲気の場合にはより暗色の黒色の色変化によって、被覆の存在が示された。
【００７１】
次に、両面接着導電性カーボンテープを用いて試料をアルミニウムスタブ上に載置した。次に、Polaron SC5750スパッターコーターを用いて試料をイリジウム被覆した。イリジウム被覆の厚さは約１０ｎｍであった。被覆したら、画像化のために試料をPhilips XL30電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）内に配置した。２ｋＶの加速電圧を用いて画像を得た。
【００７２】
ＦＥＳＥＭ実験（図５）は、酸素を含む雰囲気の場合には平滑な表面被覆、窒素を含む雰囲気の場合には実質的により大きい表面積を有する粗い表面被覆を示した。
この実施例は、被覆の析出中の雰囲気条件に応じて異なる被覆形態を得ることができることを示す。表面形態に対する制御は、表面積に対する制御が必要な用途などの広範囲の被覆用途において重要である。
【００７３】
実施例６：向上した細胞接着性のためのＡＭＮ被覆：
アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）（Aldrich、９８％）を、７．４のｐＨを有するホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。超低接着（ＵＬＡ）被覆を有する９６ウェルプレート（Corning,米国）を被覆するために、０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて溶液のｐＨを８．５に調節することによって重合を誘発させた後、プレートをこの溶液中において２４時間インキュベートした。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。明褐色の色変化によって被覆の存在が示された。被覆プロセス中においては、試料を下向きにして溶液からのポリマーの沈殿を回避した。
【００７４】
Ｌ９２９マウス線維芽細胞（細胞株ATCC-CCL-1, Rockville,米国）を用いて、変性表面に対する細胞応答を調べた。細胞は、１０％のウシ胎児血清及び１％の非必須アミノ酸（Invitrogen,米国）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）中で培養した。組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）９６ウェルプレート（Nunclon Δ, Nunc）、超低接着（ＵＬＡ）被覆９６ウェルプレート（Corning,米国）、及びＡＭＮ被覆ＵＬＡ９６ウェルプレート（ＵＬＡ−ＡＭＮ）の上に２．５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で細胞を接種した後、５％のＣＯ２を含む加湿空気中３７℃において試料を２４時間インキュベートした。
【００７５】
次に、基材を最小必須培地（ＭＥＭ）で１回洗浄した後、１００μＬのフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）溶液（ＤＰＢＳ中０．９２ｍｇ／ｍＬ）、２ｍＬの３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＳ）溶液（ＤＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）、及び１０ｍＬのＭＥＭから構成される溶液を加えた。５％のＣＯ２を含む加湿空気中３７℃において基材を３時間インキュベートした後、４９０ｎｍ及び６５５ｎｍにおいて比色分析の読み取りを行った。
【００７６】
表４及び図６は、異なる被覆について得られた比色分析結果を示す。細胞の接着は、ＵＬＡ被覆については、組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）表面と比べて２．６％に減少した。他方において、細胞の接着は、ＡＭＮ被覆ＵＬＡ被覆については、ＴＣＰＳと比べて１３０．０％に増加した。細胞培養実験中において、被覆に起因する細胞毒性効果は観察されなかった。このデータは、高い細胞接着性が必要な用途のためにＡＭＮ被覆を用いることができることを示す。
【００７７】
【表４】
2015523236.tif 000005
【００７８】
細胞培養結果は、ＡＭＮ被覆が高い細胞接着性をもたらし、血清含有培地中で細胞を培養するために好適であることを明確に示す。この高い細胞接着性は、細胞培地からのタンパク質の吸着に関係していると考えられる。また、ＵＬＡ及びＵＬＡ−ＡＭＮ表面について得られた細胞培養結果は、ＡＭＮ被覆が下層の基材材料の特性を非常に有効にマスクすることができることも示している。
【００７９】
上記で概説したように、ポリマー被覆の表面粗さは、析出条件の性質によって制御することができる。例えば、不活性雰囲気（酸素非含有）下で行った析出は増加した被覆の粗さを与え、これは生物学的応答性、例えば細胞応答性の制御において有益である可能性がある。
【００８０】
実施例７：ＡＭＮ基材の金属被覆：
アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）（Aldrich、９８％）を、７．４のｐＨを有するホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ガラスカバースリップ試料を被覆するために、０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて溶液のｐＨを８．５に調節することによって重合を誘発させた後、試料をこの溶液中において２４時間インキュベートした。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。明褐色の色変化によって被覆の存在が示された。
【００８１】
被覆で被覆したカバーガラススリップを、硝酸銀（ＡｇＮＯ３）の５０ｍＭ水溶液（Chem Supply）中において、室温で１６時間インキュベートし、次にMilliQ（登録商標）水中で４時間かけて十分に繰り返し洗浄し、層流キャビネット内で乾燥した。
【００８２】
被覆試料は視認される灰色の変化を示した。これは金属銀が析出したことを示唆している。この観察は、ＸＰＳ実験（０．１８３の平均Ａｇ／Ｃ比が示された（表５））によって確認された。更に、ＸＰＳ実験によって、ＡｇのＭＶＶオージェスペクトル（図７）における異なるピークから示されるように、Ａｇが２つの異なる酸化状態：Ａｇ（０）及びＡｇ（＋）で析出したことも示された。図は、異なる酸化状態と高分解能スペクトルにおいて観察された異なるピークとの関係を示す。
【００８３】
【表５】
2015523236.tif 000006
【００８４】
金属を含む被覆は、電気活性用途などの広範囲の用途において有用である。生物医学用途においては、元素状銀（Ａｇ及び／又はＡｇ（＋））を析出させることは、その広い抗菌特性のために有用である。
【００８５】
実施例８：ゲルの形成：
アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）（Aldrich、９８％）及びポリアリルアミン（ＰＡＡ）（Ｍｗ＝７０，０００、Aldrich）を、１００ｍｇ／ｍＬの全体的な濃度において、（１）１：１、（２）１：２、（３）１：３、（４）１：４、（５）１：５、（６）５：１、（７）４：１、（８）３：１、及び（９）２：１％（ｗ／ｗ）の比で、１０ｍＭのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Tris）溶液中に希釈した。０．１Ｍ−ＮａＯＨを用いてｐＨを８．５に調節することによって重合を誘発させた後、それぞれ１ｍＬのこれらの溶液の１つを充填した付番されたガラス容器を７２時間インキュベートした。試料６〜９においては、これにより図８において示されるようにゲルが形成された。ゲルの形成は、ＡＭＮ及びＰＡＡの両方が関与する反応が重合反応中に起こり、ＰＡＡは架橋剤として有効に作用したことを示す。
【００８６】
ポリアリルアミン（ＰＡＡ）の存在下でのＡＭＮの重合中にゲルが形成されたことは、ＡＭＮ及びＰＡＡの両方が関与する反応が重合反応中に起こり、ＰＡＡは架橋剤として有効に作用したことを示す。かくして形成されたヒドロゲルは、その後に基材に接着させて、それによって基材の少なくとも一部の上に被覆を形成するのに好適である。これらはまた、例えば創傷治癒のための生物学的足場材として用いることもできる。
【００８７】
実施例９：ＡＭＮ被覆の反応性：
アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）（Aldrich、９８％）を、７．４のｐＨを有するホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。ガラスカバースリップ試料を被覆するために、０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて溶液のｐＨを８．５に調節することによって重合を誘発させた後、試料をこの溶液中において２４時間インキュベートした。
【００８８】
次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。明褐色の色変化によって被覆の存在が示された。被覆プロセス中においては、試料を下向きにして溶液からのポリマーの沈殿を回避した。
【００８９】
次に、新しく調製した試料を、５ｍＬのアセトニトリル及び２００μＬの０．１Ｍトリエチルアミン（ＴＥＡ）中の１００ｍｇの４−ブロモベンジルブロミド（ＢＢＢ）（Aldrich）の溶液中において３７℃で一晩インキュベートし、次にアセトニトリル及びMilliQ（登録商標）水中で十分に洗浄し、層流キャビネット内で乾燥した。１００ｍｇの１，４−ジブロモベンゼン（ＤＢＢ)を用い、同一の条件下で、対照試料を同じようにして調製した。
【００９０】
４−ブロモベンジルブロミド（ＢＢＢ）との反応後にＸＰＳ（表６）によって臭素が検出されることは、ＡＭＮ表面のこの化合物との反応性を示す。更に、１，４−ジブロモベンゼン（ＤＢＢ）との反応後に臭素が検出されないことは、ブロモベンゼン官能基がＡＭＮ表面と反応しないことを示す。更に、対照実験は、非共有結合のＢＢＢ又はＤＢＢを完全に除去するためには洗浄手順で十分であることを示す。
【００９１】
【表６】
2015523236.tif 000007
【００９２】
４−ブロモベンジルブロミド（ＢＢＢ）との反応後にＸＰＳによって臭素が検出されることは、ＡＭＮ表面のこの化合物との反応性、及びその共有固定化を示す。更に、１，４−ジブロモベンゼン（ＤＢＢ）との反応後に臭素が検出されないことは、ブロモベンゼン官能基がＡＭＮ表面と反応しないことを示す。更に、対照実験は、非共有結合のＢＢＢ又はＤＢＢを完全に除去するためには洗浄手順で十分であることを示す。
【００９３】
実施例１０：シアン化カリウムを用いる被覆の析出：
等モル量のシアン化カリウム（６５．１ｍｇ、ＫＣＮ、Sigma）及び塩化アンモニウム（５３．５ｍｇ、Sigma）を、２ｍＬのMilliQ（登録商標）水中に溶解した。ガラス試料を被覆するために、試料を室温においてこの溶液中で７日間インキュベートした。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。明褐色の色変化によって被覆の存在が示された。
【００９４】
被覆はガラス基材上にうまく析出した。表７は、等モル量のシアン化カリウム及び塩化アンモニウムを含む溶液で被覆した前後において採取されたＸ線光電子分光測定（ＸＰＳ）データを示す。ＸＰＳの結果は被覆が析出しており、元素比が大きく変化していたことを明確に示している。観察された最も大きな変化は、０．０００から０．６４５へのＮ／Ｃ比の増加、及び１．５３８から０．０７２へのＳｉ／Ｃ比の減少であった。後者は、下層の基材材料からのＳｉ信号のほぼ完全な減衰、及びＸＰＳ法の情報深さに近い被覆厚さを反映している。
【００９５】
【表７】
2015523236.tif 000008
【００９６】
実施例１１：低細胞接着性のためのＡＭＮ変性被覆：
アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）（Aldrich、９８％）を、７．４のｐＨを有するホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に５０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて溶液のｐＨを８．５に調節することによって重合を誘発させた。９６ウェルプレート（NunclonΔ処理、Nunc、デンマーク）を、被覆溶液中において２４時間インキュベートした。被覆プロセス中は、試料を下向きにして、ポリマーが溶液からウェルの表面上に沈殿するのを回避した。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。明褐色の色変化によって被覆の存在が示された。
【００９７】
１ウェルあたり１００μＬの、０．２５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−ＡＬＤ、１１％（ｗ／ｖ）の硫酸カリウム、及び０．３％（ｗ／ｖ）のナトリウムシアノボロヒドリドを含むホスフェートバッファー溶液（ｐＨ６．２）を用いて、個々のウェルにおいて、ＡＭＮ被覆９６ウェルプレート上へのモノメトキシポリ（エチレングリコール）アルデヒド（ＰＥＧ−ＡＬＤ）（分子量＝５，０００、Shearwater Polymers,米国）のグラフトを行った。グラフト反応は、６０℃において２４時間行った。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。
【００９８】
表８は、ＴＣＰＳについて、（ｉ）ＡＭＮ、及び（ｉｉ）ＰＥＧ−ＡＬＤで更に変性したＡＭＮで被覆した前後において収集されたＸＰＳデータを示す。ＡＭＮ被覆を析出させた後において、ＴＣＰＳ基材表面と比較してＯ／Ｃ及びＮ／Ｃ比が大きく増加したことは、この被覆がうまく析出したことを示す。更に、その後にＰＥＧ−ＡＬＤと反応させた後にＯ／Ｃ比が増加し、Ｎ／Ｃ比が大きく減少したことは、ＡＭＮ表面上にＰＥＧ分子がうまくグラフトしたことを示す。
【００９９】
【表８】
2015523236.tif 000009
【０１００】
細胞培養実験の前に、プレートを１５ｋＧｙの線量でγ−滅菌にかけた（Steritech,オーストラリア）。Ｌ９２９マウス線維芽細胞（細胞株ATCC-CCL-1, Rockville,米国）を用いて、変性表面に対する細胞応答を調べた。細胞は、１０％のウシ胎児血清及び１％の非必須アミノ酸（Invitrogen,米国）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）中で培養した。組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）（Nunclon Δ処理, Nunc,米国）、ＡＭＮ被覆、及びＰＥＧ−ＡＬＤ変性ＡＭＮ被覆を示すウェル中に、２．５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で細胞を接種した後、５％のＣＯ２を含む加湿空気中３７℃において試料を２４時間インキュベートした。
【０１０１】
次に、基材を最小必須培地（ＭＥＭ）で１回洗浄した後、１００μＬのフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）溶液（ＤＰＢＳ中０．９２ｍｇ／ｍＬ）、２ｍＬの３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＳ）溶液（ＤＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）、及び１０ｍＬのＭＥＭから構成される溶液を加えた。５％のＣＯ２を含む加湿空気中３７℃において基材を３時間インキュベートした後、４９０ｎｍ及び６５５ｎｍにおいて比色分析の読み取りを行った。
【０１０２】
図９は、異なる表面について得られたＭＴＳアッセイ結果を示す。細胞接着性は、ＴＣＰＳと比べてＡＭＮ被覆表面について向上した。最も重要なことには、細胞接着性は、ＴＣＰＳ及びＡＭＮ表面と比べて、ＰＥＧ−ＡＬＤ変性ＡＭＮ被覆表面について大きく減少した。
【０１０３】
このデータは、還元アミノ化反応を用いて、ＰＥＧ−ＡＬＤ分子をＡＭＮ被覆上に表面固定化することができることを明確に示す。更に、ＰＥＧグラフト反応を用いて細胞応答性を調節することができる。重要なことには、グラフト反応において達成されたＰＥＧグラフト密度は、細胞接着性を大きく減少させるのに十分であることが示された。全体として、このデータは、ＰＥＧ−ＡＬＤ変性ＡＭＮ被覆を、実質的に減少した細胞接着性が必要な用途のために用いることができることを示す。
【０１０４】
実施例１２：抗菌特性を有する被覆：
アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）（Aldrich、９８％）を、７．４のｐＨを有するホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて溶液のｐＨを８．５に調節することによって重合を誘発させた。超低接着（ＵＬＡ）被覆を有する９６ウェルプレート（Corning,米国）を、被覆溶液中において２４時間インキュベートした。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。明褐色の色変化によって被覆の存在が示された。被覆プロセス中は、試料を下向きにして、溶液からのポリマーの沈殿を回避した。
【０１０５】
次に、硝酸銀（ＡｇＮＯ３）を含む水溶液を、１０−９Ｍ〜１０−２Ｍの範囲の濃度で個々のウェルに加え、２４時間インキュベートした。次に、MilliQ（登録商標）水及びピペットを用いてウェルを少なくとも３回洗浄し、最終的に３６０μＬのMilliQ（登録商標）水を充填した後、２４時間浸漬し、層流キャビネット内において空気中で乾燥した。ＸＰＳ実験によって銀の析出が確認された。観察された平均Ａｇ／Ｃ比は、溶液中のＡｇＮＯ３が１０−５Ｍ未満に関しては０、１０−５Ｍに関しては０．００２、１０−４Ｍに関しては０．０２５、１０−３Ｍに関しては０．０６５、及び１０−２Ｍに関しては０．０９６であった。バイオフィルム試験の前に、プレートを１５ｋＧｙの線量でγ−滅菌にかけた（Steritech,オーストラリア）。
【０１０６】
臨床的に意義のあるグラム陽性株（Staphylococcus epidermidis RP62a）及びグラム陰性株（Pseudomonas aeruginosa）を用いて、静的バイオフィルムアッセイを行った。S. epidermidisに関してはトリプティックソイブロス（ＴＳＢ培地）、P. aeruginosaに関してはルリアブロス（ＬＢ培地）を用いて、ブロス培地を単一のコロニーから３７℃において一晩成長させた。次に、希釈のためにそれぞれの培地を用いて、細菌培養物を１０７細胞形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬに希釈した。次に、１００μＬの希釈したブロス培地を用いてそれぞれのウェルに接種した（それぞれの銀濃度に関して４回繰り返し）。また、細菌を有さない２つの異なるタイプの培地を用いて、陰性対照を示す同じ実験も行った（それぞれの銀濃度に関して４回繰り返し）。プレートを３７℃において１８時間インキュベートした。次に、浮遊細菌を除去し、ウェルを２００μＬのＰＢＳバッファーで３回洗浄し、次に空気中で乾燥した。次に、１００μＬの０．１％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレット溶液を用いてそれぞれのウェルをインキュベートすることによってバイオフィルムを染色した。１５分後に染色溶液を除去し、プレートを水中に繰り返し（３回）浸漬して過剰の染料を洗浄除去し、次に空気中で乾燥した。ＵＶ分光光度測定によって定量する目的のために、２００μＬのエタノール中５％（ｖ／ｖ）酢酸を加え、１５分間随時振盪することによって、バイオフィルム中に含まれた染料を溶解した。次に、１００μＬのこの溶液を新しい９６ウェルプレートに移し、６００ｎｍにおいて吸収を測定した。吸収を平均し、陰性対照からの平均読み取り値を用いてバックグラウンドを補正した。図１０は、このアッセイにおいて得られたバイオフィルム定量データを示す。結果は、０．１ｍＭ及びそれ以上のＡｇＮＯ３濃度において、両方の株に関してバイオフィルムの形成が有効に阻止されることを示す。
【０１０７】
実施例１３；中和ＡＭＮの溶媒キャストによって製造される被覆：
１ｇのアミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）（Aldrich、９８％）を６ｍＬのMilliQ（登録商標）水中に溶解した。次に、６ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム溶液を加えて９．０のｐＨに到達させた。次に、この水溶液をジエチルエーテルで抽出した。次に、淡黄色を示す有機相を水相から分離した。次に、ロータリーエバポレーターを用いて真空下で溶媒の量を減少させ、残留した溶液をガラス基材上にキャストし、それぞれ室温において１６時間インキュベート又は１１０℃において５分間インキュベートした後に褐色の被覆を得た。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄した後、層流キャビネット内で空気乾燥した。
【０１０８】
この被覆プロセスは、有機溶媒中でアミノマロノニトリルの遊離塩基を単離し、次にそれを自発重合させることに基づいている。この方法で製造した被覆をＸＰＳによって特性分析した。表９は、ガラス基材に関して、異なる温度における溶媒キャスト中和ＡＭＮ被覆による被覆の前後において採取されたＸＰＳデータを示す。それぞれの場合において、ＸＰＳの結果は、被覆が析出され、未処理のガラス基材と比べて元素組成が大きく変化したことを明確に示している。しかしながら、比較的高いＳｉ／Ｃ比が観察されたという事実は、被覆厚さが約１０ｎｍのＸＰＳ情報深さより小さかったことを示唆している。
【０１０９】
【表９】
2015523236.tif 000010
【０１１０】
これらの結果は、中和ＡＭＮを含む有機溶媒からの簡単な溶媒キャストプロセスで被覆を得ることができることを示す。
実施例１４：ジアミノマロノニトリル（ＤＡＭＮ）を用いて形成される被覆：
０．５ｇのジアミノマロノニトリル（ＤＡＭＮ）を、ガラス試料を含むフラスコ内において、５０ｍＬのMilliQ（登録商標）水中で２４時間還流した。次に、ガラス試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。明褐色の色変化によって、ガラス基材上の被覆の存在が示された。表１０は、未処理のガラス試料について得られた結果と比較した、ＤＡＭＮ被覆ガラス試料について得られたＸＰＳの結果を示す。ＸＰＳの結果は、被覆が析出しており、組成物を被覆した後に元素比が大きく変化したことを明確に示している。また、ＤＡＭＮ被覆表面について低いＳｉ／Ｃ比しか観察されなかったという事実は、約１０ｎｍのＸＰＳ情報深さのオーダーであるか又はこれを超える厚さを有する均一な被覆を示している。
【０１１１】
【表１０】
2015523236.tif 000011
【０１１２】
これらの結果は、ジアミノマロノニトリル（ＤＡＭＮ）から簡単なプロセスで被覆を得ることができることを示す。
実施例１５：ＡＭＮ被覆の細胞毒性：
アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）（Aldrich、９８％）を、７．４のｐＨを有するホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて溶液のｐＨを８．５に調節することによって重合を誘発させた。２４ウェルプレート（NunclonΔ処理, Nunc,デンマーク）を、被覆溶液中において２４時間インキュベートした。被覆プロセス中は、試料を下向きにして、ポリマーが溶液からウェルの表面上に沈殿するのを回避した。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。明褐色の色変化によって被覆の存在が示された。
【０１１３】
国際標準規格ＩＳＯ−１０９９３−５（医療器具の生物学的評価−５部：in vitro細胞毒性に関する試験、及び１２部：試料の調製及び基準物質）にしたがって細胞毒性試験を行った。ウェルの基部及び側壁の表面積によって抽出溶液の体積を定めて（ウェルあたり０．８ｍＬ）、抽出流体に関して６ｍｍの深さを与えた。抽出溶液は無血清培地（ＳＦＭ）であった。抽出溶媒を、２０ｒｐｍに設定した揺動プラットフォーム上において撹拌しながら、試料上で３７℃において６６時間インキュベートした。
【０１１４】
次に、それぞれのウェルからの抽出溶液を室温にし、それぞれのウェルからの抽出流体を、別々に、希釈剤としてＳＦＭを用いて逐次１：２に希釈して、元の抽出溶液の１００％、５０％等から０．３９％までの範囲の試験溶液を与えた。標準対照溶液は、ＳＦＭ単独、５％のＰＢＳを含むＳＦＭ、及び５％のＤＭＳＯを含むＳＦＭを含んでいた。全ての溶液は、滅菌９６ウェルプレート（NunclonΔ処理, Nunc,デンマーク）内で４つ調製した。
【０１１５】
これと並行して、Ｌ９２９マウス線維芽細胞を、新しく調製した１００μＬの血清含有培地中の９６ウェルプレート（NunclonΔ処理, Nunc,米国）中に、２×１０４細胞／ウェルの密度で接種した。５％のＣＯ２を含む加湿空気中３７℃において、細胞を２４時間インキュベートした。
【０１１６】
全てのウェルから血清含有培地を除去した後、これらを１５０μＬのＳＦＭで２回洗浄し、その後１００μＬの試験溶液（元の抽出溶液の１００％、５０％等から０．３９％まで）、又は対照溶液（ＳＦＭ、５％のＰＢＳを含むＳＦＭ、又は５％のＤＭＳＯを含むＳＦＭ）を、個々のウェルに加えた。次に、プレートを３７℃において更に２０時間インキュベートした。
【０１１７】
代謝活性細胞の数を定量するために、３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム（Promega）を用いて比色ＭＴＳアッセイを行った。２０時間目において、製造者の指示書にしたがってＭＴＳ試薬の新しい標準溶液を調製した。プレートから試験溶液及び対照溶液を取り除き、１００μＬのＭＴＳ溶液を加えた。次に、プレートを３７℃において３時間インキュベートした。次に、ELISAプレートリーダー（BioTek,米国）を用いてプレートを読み取った。図１１は、それぞれを複数の繰り返しで調べた４つの異なる試料から得られるＳＦＭベースの抽出溶液の連続希釈（１００％〜０．３９％）によるＭＴＳアッセイを用いる細胞毒性の定量的評価を示す。また、ＳＦＭ、５％のＰＢＳを含むＳＦＭ、及び５％のＤＭＳＯを含むＳＦＭを用い、同じ繰り返しの合計数でＭＴＳアッセイを行った。抽出溶液はいずれも、いずれの希釈度においても細胞毒性応答は示さず、一方、対照試料は予測される応答を与えた。したがって、ＡＭＮ被覆は細胞毒性とは考えられない。
【０１１８】
視認検査によるプレートの定性的評価は、ＳＦＭ及び５％のＰＢＳを含むウェルはいずれも溶液に対する反応性を示さず、全ての細胞は、接着し、扁平な健康な外観を有していたことを示した。また、いずれの試験溶液も全ての希釈度において反応性を示さず、全ての細胞は、接着し、扁平な健康な外観を有していた（グレード０）。これに対して、５％のＤＭＳＯを含むウェルは穏やかな反応を示し、細胞の約２５％が丸みを帯びた外観を有していた（グレード２）。
【０１１９】
細胞毒性の欠如により、広範囲の生物医学用途におけるＡＭＮ被覆の好適さが強調される。
実施例１６：ＡＭＮ被覆を用いる生物学的応答に対する空間的制御：
超低接着（ＵＬＡ）被覆を有する６ウェルプレート（Corning,米国）から、約４ｃｍ２の寸法を有する基材試料を切り出した。
【０１２０】
アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）（Aldrich、９８％）を、７．４のｐＨを有するホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に１００ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて溶液のｐＨを８．５に調節することによって重合を誘発させた。３０分間のインキュベーションの後、１００μＬのこの溶液を９６ウェルプレートの個々のウェルに移し、これをマイクロアレイプリンター（NanoPrint LM60マイクロアレイヤー, ArrayIt,米国）におけるソースプレートとして用いた。３７５μｍの直径を有するピンを用いて溶液をＵＬＡ被覆試料上にアレイパターンでコンタクトプリントした後、試料を層流キャビネット内で４８時間空気乾燥した。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で３回洗浄した後、再び層流キャビネット内で空気乾燥した。細胞接種の前に、試料を１５ｋＧｙの線量でγ−滅菌にかけた（Steritech,オーストラリア）。
【０１２１】
Ｌ９２９マウス線維芽細胞（細胞株ATCC-CCL-1, Rockville,米国）を用いて、パターン化表面化学に対する細胞応答を調べた。細胞は、１０％のウシ胎児血清及び１％の非必須アミノ酸（Invitrogen,米国）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）中で培養した。２．５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で細胞を接種した後、５％のＣＯ２を含む加湿空気中３７℃において試料を１６時間インキュベートした。
【０１２２】
試料を培地で洗浄した後、分子プローブ生死アッセイを行った。このアッセイにおいては、生存している接着細胞は緑色に染色され、死滅した接着細胞は赤色に染色された。次に、Nikon TE2000蛍光顕微鏡を用いて試料を画像化した。図１２において観察される細胞接着パターンは、細胞はＡＭＮ被覆が存在している領域内の基材にのみ接着することができ、一方、ＵＬＡバックグラウンド被覆上においては、細胞接着は妨げられたことを示す。細胞接着は、マイクロアレイプリントプロセスによって与えられたパターンに正確にしたがっていた。更に、ＡＭＮ被覆領域に接着した全ての細胞は緑色の蛍光を示し、これは生細胞を示しており、したがって細胞毒性が無視しうることを示していた。
【０１２３】
これらの結果は、ＡＭＮ被覆析出を用いて、細胞接着のような生物学的応答に対する空間的制御を達成することができることを示す。
実施例１７：ＡＭＮ被覆上へのポリマーのグラフト：
アミノマロノニトリルｐ−トルエンスルホネート（ＡＭＮ）（Aldrich、９８％）を、７．４のｐＨを有するホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に５０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解した。０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を用いて溶液のｐＨを８．５に調節することによって重合を誘発させた。９６ウェルプレート（NunclonΔ処理、Nunc、デンマーク）を、被覆溶液中において２４時間インキュベートした。被覆プロセス中は、試料を下向きにして、ポリマーが溶液からウェルの表面上に沈殿するのを回避した。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。明褐色の色変化によって被覆の存在が示された。
【０１２４】
次に、新しくＡＭＮ被覆したマルチウェル基材を、アミン末端デンドリマー（ＤＭＲ、第４世代、Sigma-Aldrich）又はポリアリルアミン（ＡＬＡ、分子量＝７０，０００、Sigma-Aldrich）のいずれかを含む溶液を用いてインキュベートして、表面において利用できるアミン官能基の数を増加させた。ＡＭＮ被覆した９６ウェルプレートの表面を、ｐＨ６において、それぞれＰＢＳ中に０．３０％（ｗ／ｖ）のＤＭＲ又は０．２５％（ｗ／ｖ）のＡＬＡを含むウェルあたり１００μＬの体積の溶液を用いて２４時間インキュベートした。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。
【０１２５】
０．２５％（ｗ／ｖ）のＰＥＧ−ＡＬＤ、１１％（ｗ／ｖ）の硫酸カリウム、及び０．３％（ｗ／ｖ）のナトリウムシアノボロヒドリドを含むウェルあたり１００μＬのホスフェートバッファー溶液（ｐＨ６．２）を用いて、個々のウェルにおいて、ＡＭＮ−ＤＭＲ及びＡＭＮ−ＡＬＡ被覆９６ウェルプレート上へのモノメトキシポリ（エチレングリコール）アルデヒド（ＰＥＧ−ＡＬＤ）（分子量＝５，０００、Shearwater Polymers,米国）のグラフトを行った。グラフト反応は６０℃において２４時間行った。次に、試料をMilliQ（登録商標）水で５回洗浄し、次にMilliQ（登録商標）水中で一晩インキュベートした後、層流キャビネット内で空気乾燥した。
【０１２６】
ＡＭＮ被覆を析出させた後において、ＴＣＰＳ基材表面と比較してＯ／Ｃ及びＮ／Ｃ比が大きく増加したことは、この被覆がうまく析出したことを示す（表１１）。また、ＡＭＮ表面上にＤＭＲ及びＡＬＡがうまく析出することは、ＡＭＮ被覆基材と比べた、特にＮ／Ｃ比の大きな変化に反映されている。更に、ＡＭＮ−ＤＭＲ及びＡＭＮ−ＡＬＡ被覆表面の両方の上にＰＥＧ−ＡＬＤをグラフトした後においてＯ／Ｃ及びＮ／Ｃ比が大きく変化したことは、これらのアミンに富む表面上にＰＥＧ分子がうまくグラフトしたことを示す（表１１）。
【０１２７】
【表１１】
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【０１２８】
細胞培養実験の前に、プレートを１５ｋＧｙの線量でγ−滅菌にかけた（Steritech,オーストラリア）。Ｌ９２９マウス線維芽細胞（細胞株ATCC-CCL-1, Rockville,米国）を用いて、変性表面に対する細胞応答を調べた。細胞は、１０％のウシ胎児血清及び１％の非必須アミノ酸（Invitrogen,米国）を含む最小必須培地（ＭＥＭ）中で培養した。組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）（Nunclon Δ処理, Nunc,米国）、ＡＭＮ被覆、及びＰＥＧ−ＡＬＤ変性ＡＭＮ被覆を示すウェル中に、２．５×１０４細胞／ｃｍ２の密度で細胞を接種した後、５％のＣＯ２を含む加湿空気中３７℃において試料を２４時間インキュベートした。
【０１２９】
次に、基材を最小必須培地（ＭＥＭ）で１回洗浄した後、１００μＬのフェナジンメトスルフェート（ＰＭＳ）溶液（ＤＰＢＳ中０．９２ｍｇ／ｍＬ）、２ｍＬの３−（４，５−ジメチルチアゾル−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＳ）溶液（ＤＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬ）、及び１０ｍＬのＭＥＭから構成される溶液を加えた。５％のＣＯ２を含む加湿空気中３７℃において基材を３時間インキュベートした後、４９０ｎｍ及び６５５ｎｍにおいて比色分析の読み取りを行った。
【０１３０】
図１３は、異なる表面について得られたＭＴＳアッセイ結果を示す。細胞接着性は、ＴＣＰＳと比べてＡＭＮ被覆表面について向上した。また、ＡＭＮ−ＤＭＲ及びＡＭＮ−ＡＬＡ被覆表面についても高い細胞接着性が観察された。これに対して、ＰＥＧ−ＡＬＤポリマーをグラフトしたＡＭＮ−ＤＭＲ及びＡＭＮ−ＡＬＡ被覆表面については、細胞接着性の大きな減少が観察された。
【０１３１】
このデータは、ＤＭＲ及びＡＬＡのようなポリアミンをＡＭＮ被覆表面上に固定化することができることを明確に示す。更に、この結果は、ＤＭＲ及びＡＬＡのようなポリアミンを、ＰＥＧ−ＡＬＤのようなポリマーをその後にグラフトするための中間層として用いることができ、次にこれを用いて細胞応答性を調節することができることを示す。重要なことには、グラフト反応において達成されたＰＥＧグラフト密度は細胞接着性を大きく減少させるのに十分であることが示された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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