(57)【要約】  封入体からの組み換えポリペチドの生産のための新規方法を開示する。細胞培養条件の調節が、活性形態での組み換えポリペチドの収量に良い影響を与える。本方法は(ａ)宿主細胞を第一の温度で培養し、該宿主細胞は組み換えポリペチドをコードする核酸を含み、(ｂ)培養温度を第一の温度から第二の温度まで低下させ、そして(ｃ)宿主細胞を第二の温度で培養することを含む。
2015514398.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
封入体中での組み換えポリペチドの生産方法であって、
(ａ)  微生物宿主細胞を第一の温度で培養し、該宿主細胞は該組み換えポリペチドをコードする核酸を含み、
(ｂ)  培養温度を第一の温度から第二の温度まで低下させ、そして
(ｃ)  微生物宿主細胞を第二の温度で培養する
ことを含む、方法。
【請求項２】
微生物宿主が大腸菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一の温度が３６℃〜３８℃である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第一の温度が３７℃である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
第二の温度が２５℃〜３６℃である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
第二の温度が３０℃〜３６℃、より好ましくは３０℃〜３５℃、より好ましくは３１℃〜３３℃である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
第一の温度および／または第二の温度で培養中のｐＨが６〜８である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
第一の温度および／または第二の温度で培養中のｐＨが６.８〜７.２である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
温度の低下を、細胞培養物の６００nmにおける光学密度が１０〜５０に達したときに行う、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
温度の低下を、細胞培養物の６００nmにおける光学密度が２７〜３３に達したときに行う、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
組み換えポリペチドが４ヘリックスバンドルポリペチドである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
組み換えポリペチドがＧ−ＣＳＦである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
組み換えポリペチドがＧ−ＣＳＦであり、該Ｇ−ＣＳＦが、所望によりそれぞれ−１位に開始メチオニンアミノ酸残基を有してよいヒトまたはウシＧ−ＣＳＦである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
核酸が誘導性プロモーターに操作可能に結合している、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
工程(ａ)〜(ｃ)の前に宿主細胞該組み換えポリペチドをコードする核酸を含む発現ベクターを導入する工程を含み、ここで、該核酸が誘導性プロモーターに操作可能に結合している、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
誘導性プロモーターがＴ７プロモーターである、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
微生物宿主細胞の染色体が所望によりｌａｃプロモーターに操作可能に結合してよいバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含み、溶原性バクテリオファージ核酸配列を含まない、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼがＴ７ポリメラーゼである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ポリペチドの発現をインデューサーの添加により実施する、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
インデューサーを温度の低下と同時またはその後に添加する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
インデューサーがＩＰＴＧである、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ベクターが配列番号４の配列を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜２２のいずれかに記載の方法であって、該組み換えポリペチドをコードする核酸が次の
(ｉ)  配列番号３または配列番号１のポリペプチドをコードする核酸配列；および
(ii)  配列番号３に記載する配列と少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列
から成る群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ポリペチド生産の分野、特に封入体で組み換えポリペチドを生産する宿主細胞における組み換えポリペチドの生産に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
宿主細胞における組み換えポリペチド発現は、バイオテクノロジーおよび医薬品産業において広く使用されている標準的技術である。特に例えば大腸菌(E. coli)のような微生物宿主が、比較的単純な発現系および細胞培養条件がこれらの宿主細胞に利用可能であるために、一般に使用されている。概して、培養工程はそのために比較的経済的である。
【０００３】
しかしながら、微生物細胞で発現させたとき、可溶性で活性な形態の目的のポリペチドを得ることはしばしば困難である。多くの場合、組み換えポリペチドの発現は、変性形態での難溶性細胞内凝集物であるポリペプチド、いわゆる封入体を生成する[Baneyx, F. and Mujacic, M. (2004) Nat. Biotechnol. 22, 1399-1408 and Sorensen, H.P. and Mortensen, K.K. (2005) Microb. Cell Fact. 4, 1]。後者は、古典的封入体とも呼ばれている。
【０００４】
一般に、古典的封入体は、典型的に中等度の速度での遠心分離による単離が容易である。封入体から、活性な、すなわち正しく折り畳まれた、ポリペチドを回収するために、封入体を可溶化し、単離後タンパク質を再生しなければならない。いくつかの特許出願および特許が、封入体の可溶化および封入体から得たタンパク質の再生を扱っている。例えばＥＰ０５１２０９７、ＥＰ０３６４９２６、ＥＰ０２１９８７４、ＷＯ０１／８７９２５、Rudolph 1996、Rudolph 1990、Marston 1986およびDietrich 2003は、変性タンパク質の可溶化および再生に関する一般的技術を記載する。例えば、ＥＰ０２１９８７４は、大腸菌封入体からの組み換えタンパク質の再折り畳みに関する一般的方法を記載する。可溶化について、カオトロピック剤であるＧｕＨＣｌおよびアルギニンが高ｐＨで使用された。ＥＰ０２１９８７４は、ＧＳＨ／ＧＳＳＧによりもたらされるレドックス条件下のジスルフィド架橋の形成を記載する。
【０００５】
封入体の単離および可溶化のための多くの方法が知られているにも関わらず、結果は必ずしも満足いくものではない。一つの大きな問題は、封入体の構造が変わり得ることである。封入体の形成および構造は、例えば培地組成、増殖温度および生成速度を含む、細胞培養過程のパラメーターによる影響を受け得ることが知られている。ＷＯ２００４／０１５１２４は、培養条件の調節による、“非古典的”封入体の形成を記載する。
【０００６】
封入体から、組み換えタンパク質を、特に活性形態かつ十分な量で得ることは困難であり得る。時として、封入体の構造が柔軟に過ぎ、遠心分離による封入体の単離が困難な状況となる。他方で、封入体がコンパクト過ぎることもある。かかる封入体は、過酷な条件下でも可溶化できないことになる。
【０００７】
これらの不都合を解決するために、本発明は、組み換えタンパク質の収量を上げるために、容易に単離され、可溶化される封入体中で適切に折り畳まれた大量のタンパク質をもたらす、新規細胞培養法を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第０３／０５１９２２Ａ１号明細書
【特許文献２】国際公開第０１／８７９２５Ａ２号明細書
【特許文献３】国際公開第０１／０４１５４Ａ１号明細書
【特許文献４】国際公開第００／０２９０１号明細書
【特許文献５】米国特許第６,４８９,４５０Ｂ２号明細書
【特許文献６】米国特許第５,８４９,８８３号明細書
【特許文献７】米国特許第５,６８１,７２０号明細書
【特許文献８】米国特許第５,０５５,５５５号明細書
【特許文献９】欧州特許第１８３７３４６Ａ２号明細書
【特許文献１０】欧州特許第１６３０１７３Ａ２号明細書
【特許文献１１】欧州特許第０２１９８７４Ａ２号明細書
【特許文献１２】国際公開第２０１０／１４６５９９Ａ１号明細書
【特許文献１３】国際公開第２００８／０９６３７０Ａ３号明細書
【特許文献１４】国際公開第２００６／１３５１７６Ａ１号明細書
【特許文献１５】国際公開第２００６／０９７９４４Ａ２号明細書
【特許文献１６】国際公開第２００４／０１５１２４Ａ１号明細書
【特許文献１７】国際公開第２００４／００１０５６Ａ１号明細書
【特許文献１８】国際公開第９８／５３０７２号明細書
【特許文献１９】国際公開第８９／１０９３２号明細書
【特許文献２０】国際公開第８７／０１１３２号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】R. R. Burgess, 1996 “Purification of over produced E. coli RNA polymerase σ factors by solubilizing inclusion bodies and refolding from sarkosyl”. Methods Enzymol. 273, 145-149
【非特許文献２】David C. Dale, 2002 “Colony-Stimulating Factors for the Management of Neutropenia in Cancer Patients”, Aids International Limited Drugs 2002; 62 Suppl. 1, 1-15
【非特許文献３】P.E. Devlin, 1988, “Alteration of amino-terminal codons of human granulocyte-colony-stimulating factor increases expression levels and allows processing by methionine aminopeptidase in Escherichia coli”, Elsevier Science Publishers B.V. (Biomedical Division) Gene, 65, 13-22
【非特許文献４】Arndt Dietrich et al., Jan 2003 “Industrial Protein Folding”, www.gitverlag.com/go/bioint BIOforum Europe, 1-3
【非特許文献５】European Pharmacopoeia, Jul 2010 “Filgrastim concentrated solution”; 2015-2018
【非特許文献６】Elanders Oestervala, April 2007 “Purification and renaturation of recombinant proteins produced in Escherichia coli as inclusion bodies”, www.gelifesciences.com/protein-purifactoin Application note 18-1112-33 AC, 1-4
【非特許文献７】Glover, D.M. DNA Cloning Volume I: A Practical Approach. IRL Press, Oxford, 1985.
【非特許文献８】M. Heidari et al., May 2001, “Expression, purification, and in vitro biological activities of recombinant bovine granulocyte-colony stimulating factor”, www.elsevier.com/locate/vetimm Veterinary Immunology and Immunopathology 81, 45-57
【非特許文献９】Holloway C.J, 1994, “Applications of Recombinant DNA Technology in the Production of Glycosylated Recombinant Human Granulocyte Colony Stimulating Factor”, European Journal of Cancer Vol. 30 A, Suppl. 3, S2-S6
【非特許文献１０】Soo-Hyung Kang et al., July 1995, “High Level Expression and Simple Purification of Recombinant Human Granulocyte Colony-Stimulating Factor in E. coli”, Biotechnology Letters Volume 17 No. 7 687-692
【非特許文献１１】Khalilzadeh R. et al., July 2008, “Process development for production of human granulocyte-colony stimulating factor by high cell density cultivation of recombinant Escherichia coli”, J. Ind Microbiol Biotechnol, 1643-1650
【非特許文献１２】Fiona A. O. Marston, 1986, “The purification of eukaryotic polypeptides synthesized in Escherichia coli”, Biochem. J. (1986) Vol. 240, 1-12
【非特許文献１３】G. Molineux, 2004, “The Design and Development of Pegfilgrastim”, Current Pharmaceutical Design, 2004, 10, 1235-1244
【非特許文献１４】Dasari Venkata Krishna Rao et al., 2008, “A purification method for improving the process yield and quality of recominant human granulocyte colony-stimulating factor expressed in Escherichia coli and ist characterization”, Biotechnol. Appl. Biochem. (2008) 50, 77-87
【非特許文献１５】Harald Tschesche, 1990, “Modern Methods in Protein- and Nucleic Acid Research”, Walter de Gruyter, Berlin, NY, 149-171
【非特許文献１６】Rainer Rudolph et al., January 1996, “In vitro folding on inclusion body proteins”, The FASEB Journal Vol. 10, 49-56
【非特許文献１７】Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., in Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989)
【非特許文献１８】Ana LS Vanz et al., April 2008, “Human granulocyte colony stimulating factor 8hG-CSF): cloning, overexpression, purification and characterization”, Microbial Cell Factories 2008, www.micorbialcellfactories.com/content/7/1/13, 1-12
【非特許文献１９】Chao Zhan WANG et al., 2005, “Refolding with Simultaneous Purification of Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor from Escherichia coli”, Chinese Chemical Letters Vol. 16 No. 3 www.imm.ac.cn/journal/ccl.html, 389-392
【非特許文献２０】Karl Welte et al., September 1996, “blood”, Blood Vol. 88 No. 8, American Society of Hematology www.bloodjournal.org, 1907-1929
【非特許文献２１】Paul WINGFIELD et al., 1988, “Characterization of recombinant-derived granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF)”, Biochem. J. Vol. 256, 213-218
【非特許文献２２】Krisztina M. Zsebo et al., 1986, “Recombinant Human Granulocyte Colony Stimulating Factor: Molecular and Biological Characterization”, Immunobiol., Vol. 173, 175-184
【非特許文献２３】Lu et al, 1992, The Journal of biological Chemistry, Vol 267:8770-8777
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
発明の要約
本発明は、ポリペチド生産の分野、特に封入体で組み換えポリペチドを生産する宿主細胞における組み換えポリペチドの生産に関する。本発明は、活性タンパク質の収量を上げる、封入体からの組み換えポリペチドの生産のための新規方法を提供する。本発明者らは、ここで、細胞培養条件の調節が活性形態での組み換えポリペチドの収量に良い影響を与えることを証明する。例えば、本発明者らは、第一の高培養温度および第二の低培養温度を含む２段階培養方法が有益であることを発見した。細胞増殖および微生物宿主細胞における組み換えポリペチド発現に良い影響を与える他の培養パラメーターもまたここに記載する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一つの面において、本発明は、封入体での組み換えポリペチドの生産方法であって、
(ａ)  微生物宿主細胞を第一の温度で培養し、該宿主細胞は該組み換えポリペチドをコードする核酸を含み、
(ｂ)  培養温度を第一の温度から第二の温度まで低下させ、そして
(ｃ)  微生物宿主細胞を第二の温度で培養する
ことを含む、方法を提供する。
【００１２】
微生物宿主細胞は大腸菌細胞であり得る。第一の温度は３６℃〜３８℃、好ましくは３７℃であり得る。第二の温度は２５℃〜３６℃、より好ましくは３０℃〜３６℃、さらにより好ましくは３２℃〜３５℃であり得る。第一の温度および／または第二の温度で培養中のｐＨは６〜８、好ましくは６.８〜７.２であり得る。
【００１３】
ある態様において、細胞培養物が６００nmでの光学密度１０〜５０、より好ましくは２７〜３３に達したときに、温度の低下を実施する。
【００１４】
ある態様において、組み換えポリペチドは、４ヘリックスバンドルポリペチドである。組み換えポリペチドはＧ−ＣＳＦであり得る。ある態様において、Ｇ−ＣＳＦは、所望によりそれぞれ−１位に開始メチオニンアミノ酸残基を有してよいヒトまたはウシＧ−ＣＳＦである。
【００１５】
ある態様において、核酸は誘導性プロモーターに操作可能に結合している。核酸は、発現ベクターのようなベクターに包含され得る。ある態様において、工程(ａ)〜(ｃ)の前に、宿主細胞に該組み換えポリペチドをコードする核酸を含む発現ベクターを導入する工程があり、ここで、該核酸は誘導性プロモーターに操作可能に結合している。
【００１６】
誘導性プロモーターはＴ７プロモーターであり得る。微生物宿主細胞の染色体は、所望によりｌａｃプロモーターに操作可能に結合してよい、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含んでよく、溶原性バクテリオファージ核酸配列を含まなくてよい。バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼはＴ７ポリメラーゼであり得る。
【００１７】
ある態様において、組み換えポリペチドの発現をインデューサーの添加により行う。インデューサーを温度低下と同時にまたは低下後に添加し得る。インデューサーはＩＰＴＧであり得る。
【００１８】
好ましい態様において、ベクターは、配列番号４の配列を含む。
【００１９】
ある態様において、該組み換えポリペチドをコードする核酸は、(ｉ)配列番号３または配列番号１のポリペプチドをコードする核酸配列または(ii)配列番号３に記載する配列と少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列から成る群から選択される。
【００２０】
図および表の簡単な説明
表１：種々の第二培養温度での細胞培養からのＧ−ＣＳＦの収量
表２：２回の再折り畳み工程を含む下流プロセシングのための好ましい条件の一覧
表３：洗浄され、凍結された封入体６５０ｇから出発した３回の生産操作での純度および収量。収量の計算は、封入体の湿重量による。
表４：Ｇ−ＣＳＦ精製における総純度および２種の工程依存不純物(サルコシル、エンドトキシン)の値。数値幅は、異なる分析方法を使用した３個のＧ−ＣＳＦ生産ロットの分析の結果を示す。
表５：３個のＧ−ＣＳＦ生産ロットの純度および活性
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】実施例１の発現ベクターの模式図。
【図１Ｂ】Ｇ−ＣＳＦ発現ベクターの配列、配列番号４。
【図２】対照としての市販フィルグラスチム製剤(３Ａ)およびここに記載のとおり精製した生成物の純度を分析したＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラム。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の記載
本発明は、宿主細胞において封入体で発現される組み換えポリペチドの生産方法を提供する。本組み換えポリペチドをコードする核酸を宿主細胞に導入する。次いで、宿主細胞を培養して組み換えポリペチドを発現させ、ここで、該宿主細胞は、該組み換えタンパク質を含有する封入体を形成する。最初の培養期間終了後、培養を継続しながら、培養温度を高温から低温に変更する。次いで、宿主細胞の培養を低温で継続する。
【００２３】
本発明者らは、ここで、細胞培養条件の調節が活性形態での組み換えポリペチドの収量に良好な影響を与えることを証明する。本発明者らは、驚くべきことに、宿主細胞の培養中に細胞培養温度を低下することが、組み換えタンパク質の収量増加を導くことを発見した。本発明者らはまた、誘導モード、ｐＨ、下流プロセシングおよび特に発現系の選択などのような他のパラメーターも、収量に良好な影響をもたらし得ることを発見した。ここに記載する好ましい温度と好ましい発現系の組み合わせが特に有益であることが判明した。
【００２４】
いかなる理論的拘束も受けることなく、本発明者らは、ここに記載する培養温度の調節が封入体の構造を至適化し、封入体において正しく折り畳まれたタンパク質の量を増加させ、そして、封入体からのより多くの活性組み換えタンパク質の回収を容易にすると考える。本発明者らは、封入体の構造および組成が、再生された活性ポリペチドの収量についての制限因子であり得ると考える。さらに、誘導モード、ｐＨ、下流プロセシングおよび特に発現系のようなここに記載するその余のパラメーターは、収量のさらなる向上を促進する。ここに記載する種々の付加的パラメーターは、個々に適用してよく、またここに記載する方法に１個以上のパラメーターを適用して組み合わせてもよい。ここに記載する方法は、細胞増殖の改善および微生物宿主細胞における組み換えポリペチド発現の改善をもたらす。
【００２５】
本発明の第一の面において、封入体で発現された組み換えポリペチドの生産方法が提供され、該方法は、(ａ)微生物宿主細胞の細胞培養物を第一の温度で培養し、ここで、宿主細胞は該組み換えポリペチドをコードする核酸を含み、(ｂ)培養温度を第一の温度から第二の温度へ低下させ、そして(ｃ)微生物宿主細胞の培養物を第二の温度で培養する工程を含む。温度の低下は培養の継続中に行う。核酸は宿主細胞に導入されている。核酸はベクターに包含されていてよい。核酸は誘導性プロモーターに結合され得る。
【００２６】
ここで使用する用語“ポリペチド”および“タンパク質”は、交換可能に使用され、ペプチド結合により他のアミノ酸残基に結合した一連のアミノ酸残基を指称する。
【００２７】
“組み換え核酸”は、他には生物体内で見出されない核酸を生成する、遺伝物質の新規組み合わせを製造する分子工学的方法の使用により得られる核酸である。生存細胞内で組み換え核酸の発現により生成するタンパク質を“組み換えタンパク質”または“組み換えポリペチド”と呼ぶ。組み換えタンパク質をコードする組み換え核酸を宿主細胞に導入する。この方法において使用する“核酸”は異種核酸、すなわち宿主細胞に対して外来の核酸であり得る。または核酸は、宿主由来であってよく、該宿主により自然に発現されるポリペチドをコードし得る。例えば、第二のコピーの導入は発現を増加し得る。あるいは核酸配列が、宿主の該核酸に対して通常作動する転写制御以外の転写制御を受ける。組み換え形態でのタンパク質は、このようにして、異なる発現レベルで発現され、例えばその内因性発現レベルと比較して過剰発現もしくは過少発現され得る。
【００２８】
目的のタンパク質をコードする組み換え核酸配列は、宿主細胞への導入前に１個以上の変異、挿入、欠失および／または置換により修飾されてよいが、このような修飾配列は、目的のタンパク質と同じ生物学的機能を有する活性タンパク質(すなわち目的のタンパク質の機能的等価物である)をコードしていなければならない。ここでいう組み換え核酸配列は、また宿主細胞における発現を最適化するために原核生物宿主の“コドン使用頻度”に従い修飾されていて、例えばヒト配列のような、真核生物(真核起源)のように、生物の異なるドメイン(エンパイア)を起源とする核酸配列も含む。
【００２９】
本発明は、封入体で生産される任意のタンパク質に適用できる。封入体は、一般に比較的疎水性のタンパク質(例えばＧ−ＣＳＦ)により形成され、それゆえに本発明は、比較的疎水性のタンパク質、特に(Ｇ−ＣＳＦに類似して)多すぎるジスルフィド結合を有しないものに容易に適用できる。本発明は、それ故に、Ｇ−ＣＳＦと類似の特性、例えば類似の溶解度、類似の疎水性、類似のシステイン結合数などを有するタンパク質に特に適し得る。ある態様において、本方法は疎水性タンパク質に適用される。
【００３０】
特に、本発明者らは、いわゆる“ヘリックスバンドルタンパク質”、特に“４ヘリックスバンドルタンパク質”が、ここに記載する方法で特に改善された高発現率を示すことを発見した。全てのヘリックスバンドルタンパク質は、共通してコア構造を有する。これらはその二次構造に数個のアルファヘリックスを有し、これは通常、三次構造において互いに平行または逆平行構造に配向されている。４ヘリックスバンドルタンパク質は、本発明の方法で製造するのに特に適している。Ricci et al, 2003およびWeber et al, 1980は、４ヘリックスバンドルファミリーのタンパク質の共通構造およびメンバーを記載している。本発明に特に適するヘリックスバンドルタンパク質の、限定を意図しない例は、Ｇ−ＣＳＦ(顆粒球コロニー刺激因子)、ＧＭ−ＣＳＦ(顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子)、Ｍ−ＣＳＦ(マクロファージ刺激因子)、ｈＧＨ(ヒト成長ホルモン)、インターフェロン類、例えばＩＦＮ−アルファ２(インターフェロンアルファ２)またはインターフェロンベータ、インターロイキン類、例えばＩＬ−２(インターロイキン−２)、ＩＬ−４(インターロイキン−４)、ＩＬ−７(インターロイキン−７)またはＩＬ−９(インターロイキン−９)、エリスロポエチン、レプチン、ＭＧＤＦ(巨核球増殖分化因子)および他のサイトカイン類を含む。好ましい態様において、組み換えポリペチドはＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ｈＧＨ、ＩＦＮ−アルファ２、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７およびＩＬ−９から成る群から選択される。より好ましい態様において、組み換えポリペチドはＧ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＭ−ＣＳＦから成る群から選択される。
【００３１】
これらの組み換えタンパク質をコードする核酸の配列は、微生物宿主細胞、特に大腸菌での発現のためにコドン最適化されていてよい。
【００３２】
ある好ましい態様において、組み換えポリペチドはＧ−ＣＳＦである。ヒト顆粒球コロニー刺激因子(ｈＧ−ＣＳＦ)は、好中球の形成に決定的役割を有する造血性増殖因子に属する。Ｇ−ＣＳＦは、血液学および腫瘍学の分野において医薬として使用される。今日、グリコシル化され、哺乳動物細胞、特にＣＨＯ細胞株で生産されるレノグラスチム(Holloway CJ (1994) Eur J Cancer 30A Suppl 3:S2-S6.、ＥＰ１６９５６６)およびグリコシル化されておらず、大腸菌で生産されるフィルグラスチム(ＥＰ２３７５４５)の２形態の臨床用Ｇ−ＣＳＦが上市されている。
【００３３】
本発明において使用する“Ｇ−ＣＳＦ”は、例えばヒトＧ−ＣＳＦ、ウシＧ−ＣＳＦなどのようなＧ−ＣＳＦの種オルソログを含む。ヒトＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列は：
TPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWA
PLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQ
QMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP
(配列番号１)であり、これは、例えばHolloway, 1994またはDrugbank Accession No DB00099の下に維持されている。
【００３４】
ウシＧ−ＣＳＦのアミノ酸配列は：
TPLGPARSLPQSFLLKCLEQVRKIQADGAELQERLCAAHKLCHPEELMLLRHSLGIPQAP
LSSCSSQSLQLRGCLNQLHGGLFLYQGLLQALAGISPELAPTLDTLQLDVTDFATNIWLQ
MEDLGAAPAVQPTQG AMPTFTSAFQRRAGGVLVASQLHRFLELAYRGLRYLAEP
(配列番号２)であり、これは、例えばＵＳ５８４９８８３の図７またはPDB Accession No: 1BGC-Aの下に維持されている。
【００３５】
ある好ましい態様において、Ｇ−ＣＳＦは哺乳動物Ｇ−ＣＳＦである。特に好ましい態様において、ポリペチドはヒトＧ−ＣＳＦ[Drugbank Accession No: DB00099]、ウシＧ−ＣＳＦ[PDB Accession No: 1BGC-A]またはその機能的変異体である。ある好ましい態様において、組み換えポリペチドはメチオニル−Ｇ−ＣＳＦ(Ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ)、例えばヒトＭｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ(ｒ−ｍｅｔ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ＝フィルグラスチム)である。
【００３６】
フィルグラスチムのアミノ酸配列は：
MTPLGPASSLPQSFLLKCLEQVRKIQGDGAALQEKLCATYKLCHPEELVLLGHSLGIPWA
PLSSCPSQALQLAGCLSQLHSGLFLYQGLLQALEGISPELGPTLDTLQLDVADFATTIWQ
QMEELGMAPALQPTQGAMPAFASAFQRRAGGVLVASHLQSFLEVSYRVLRHLAQP
(配列番号３)である。
【００３７】
ウシＧ−ＣＳＦもメチオニル−ウシＧ−ＣＳＦとして提供され得る。
【００３８】
本発明において使用する“Ｇ−ＣＳＦ”は、Ｇ−ＣＳＦの機能的変異体を含む。ここいう“変異体”は、文脈上これと異なる解釈が必要でない限り、“機能的変異体”を意味する。Ｇ−ＣＳＦタンパク質の変異体は、Ｇ−ＣＳＦタンパク質配列と異なるが、なお同じ生物活性を有するタンパク質を意味する(機能的変異体)。Ｇ−ＣＳＦタンパク質の“変異体”は、１個以上のアミノ酸が対照Ｇ−ＣＳＦタンパク質配列(例えばヒトＧ−ＣＳＦ配列)と異なる、タンパク質をいう。“変異体”は、これとは別にまたはこれに加えて、例えば、メチル化、ペグ化、サクシニル化、タグまたは標識の付加などのような、他の修飾を有し得る。変異体は、酵素的にまたは化学的に修飾されたＧ−ＣＳＦであり得る。それは他のペプチドまたはポリペチドと融合した融合タンパク質であってもよい。好ましい態様において、Ｇ−ＣＳＦはペグ化されている。
【００３９】
変異体は、対立遺伝子変異体を含む天然変異体(例えばZsebo 1986参照)または合成により製造した変異体であり得る。Ｇ−ＣＳＦの修飾形態が封入体で発現されることは先行文献に示されている。それゆえに、変異体を、ここに記載する改善された方法を使用して得ることができる。例えば、ＥＰ０７１９８６０は、実施例２および３に、修飾ウシＧ−ＣＳＦの構成および生産を記載している。
【００４０】
ある態様において、Ｇ−ＣＳＦ変異体は、配列番号３(ｒ−ｍｅｔ−ｈｕ−Ｇ−ＣＳＦ＝フィルグラスチム)と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％,少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９.５％配列同一性を有するタンパク質である。配列同一性は、例えばClustal、BLASTなどのような標準的配列分析ツールまたは例えばニードルマン−ウンシュアルゴリズム、スミス−ウォーターマンアルゴリズムなどのような整列アルゴリズムを使用して決定できる。変異体は１個以上の保存的アミノ酸置換を有し得る。アミノ酸が、類似の特性を有するアミノ酸に置換されたならば(例えば極性アミノ酸が他の極性アミノ酸に、酸性アミノ酸が他の酸性アミノ酸になど)、アミノ酸置換は保存的である。保存的置換は化学的特性に、そしてそれゆえにタンパク質の機能に、影響する可能性が低い。それゆえに、Ｇ−ＣＳＦの“変異体”は、Ｇ−ＣＳＦの変異体がなおＧ−ＣＳＦと同じ生物学的機能を示す限り、配列番号３と比較して１個以上のアミノ酸に１個以上の変異、欠失、置換、挿入および／または修飾を有するタンパク質を含む(機能的等価物)。変異体が同じ生物学的機能を有するか否かは、Ｇ−ＣＳＦの生物活性を決定するアッセイで試験できる(例えば実施例１３に記載する方法参照)。市販Ｇ−ＣＳＦを比較対照として使用できる。変異体は、市販Ｇ−ＣＳＦ対照に対して、例えばフィルグラスチムの少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９.５％の活性を有するならば、“同じ生物活性”を有する、すなわち“生物学的に活性”または“活性”であると見なし得る。
【００４１】
ここで使用する用語“Ｇ−ＣＳＦ”は、それゆえに、ヒトＧ−ＣＳＦの種オルソログおよび変異体、すなわち機能的変異体を含む。
【００４２】
本発明において、細胞培養中に調節し得るパラメーターは、温度、ｐＨ、光学密度、溶存酸素レベル(ＤＯ)、供給速度、炭素源および活性組み換えタンパク質の収量に良い影響を与える他のパラメーターを含む。
【００４３】
温度
本発明のある態様において、細胞培養のインキュベーション温度を、第一の高い温度から第二の低い温度に低下させる。温度の低下を、宿主細胞の培養を継続しながら行う。この低い温度で、細胞は増殖相から生産相に変わる。ある態様において、第一の温度は３６℃〜３８℃である。好ましい態様において、第一の温度は３６.５℃〜３７.５℃または３６.７℃〜３７.２℃であり、より好ましい態様において第一の温度は約３７℃、より好ましい態様において第一の温度は３７℃である。
【００４４】
ここで、数値の範囲が“ｘ〜ｙ”のように示されているとき、数値ｘおよびｙは、他に明示的にこれと異なって特定されていない限り、当該範囲に含まれる。
【００４５】
宿主細胞の細胞培養物を、第一の温度で第一の培養時間中、インキュベーションする。第一の培養時間は６〜４８時間であり得るが、実際の細胞培養状況に依存して、これより短くも、長くもできる。好ましい態様において、第一の培養時間は５〜４０時間または１０〜３６時間または１０〜３２時間または１４〜２８時間または１８〜２４時間であり得る。特に第一の培養時間は、１０時間、１２時間、１２.５時間、１４時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間であってよいが、またこれらの時間の２個の任意の組み合わせにより定義される時間であってもよい。第一の培養時間はまた細胞培養物の光学密度によって決定し得る(下記参照)。
【００４６】
第一の培養時間の経過後、インキュベーション温度を、例えば単に発酵槽温度を第二の低い温度に設定し直すことにより下げる。ある態様において、第二の温度は２５℃〜３６℃または２６℃〜３６℃または２７℃〜３６℃または２８℃〜３６℃または２９℃〜３６℃であり得る。好ましい態様において、第二の温度は３０℃〜３６℃または３０.５℃〜３６℃または３１℃〜３６℃または３２℃〜３６℃または３３℃〜３６℃または３４℃〜３６℃または３５℃〜３６℃または３０℃〜３５℃または３０.５℃〜３５℃または３１℃〜３５℃または３２℃〜３５℃または３３℃〜３５℃または３４℃〜３５℃または３０℃〜３４℃または３０.５℃〜３４℃または３１℃〜３４℃または３２℃〜３４℃または３３℃〜３４℃であり得る。好ましい態様において、第二の温度は３０℃、３０.５℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃または３６℃であり得るが、またこれらの数値の２個の任意の組み合わせにより定義される温度であり得る。好ましくは、第二のインキュベーション温度は３０℃〜３５℃または３０℃〜３４℃である。より好ましくは、第二のインキュベーション温度は約３１℃〜約３４℃または３１℃〜３４℃、より好ましくは３１℃〜３３℃である。最も好ましくは、第二のインキュベーション温度は約３２℃または３２℃である。
【００４７】
宿主細胞の細胞培養を、第二の温度で第二の培養時間中、インキュベートする。第二の培養時間は１〜２０時間であり得るが、実際の細胞培養状況に依存して、これより短くも、長くもできる。好ましい態様において、第二の培養時間は１〜２０時間または２〜１６時間または３〜１４時間または３〜１０時間または３〜８時間または３〜６時間または４〜１４時間または４〜１０時間または４〜８時間または４〜６時間、好ましくは５時間であり得る。特に第二の培養時間は１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７,８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間または２０時間であり得るが、これらの数値の２個の任意の組み合わせにより定義される時間であってもよい。
【００４８】
ｐＨ
ｐＨは、第一および／または第二の培養温度／培養時間中、特定のｐＨ値内に維持される。本発明者らは、６〜８のｐＨが、発現タンパク質の高収量をさらに促進するために特に有益であり、ｐＨ６.８〜７.２が特に好ましいことを発見した。それゆえに、ここに記載する方法は、ｐＨの１回以上の測定操作を含み得る。ｐＨは、第一および／または第二培養温度／培養時間中、６〜８または６.５〜７.８または６.６〜７.４または６.７〜７.３または６.８〜７.２または６.９〜７.１または６.９〜７.０；または６.６〜７.２または６.７〜７.２または６.８〜７.２または６.９〜７.２または７.０〜７.２または７.１〜７.２；または６.６〜７.１または６.７〜７.１または６.８〜７.１または６.９〜７.１または７.０〜７.１；または６.６〜７.０または６.７〜７.０または６.８〜７.０または６.９〜７.０の範囲に維持され得る。ｐＨは、第一および／または第二の培養温度／培養時間中、６.８〜７.２または６.９〜７.２または７.０〜７.２または７.１〜７.２；または６.８〜７.３または６.９〜７.３または７.０〜７.３または７.１〜７.３または７.２〜７.３；または６.８〜７.７または６.９〜７.７または７.０〜７.７または７.１〜７.７または７.２〜７.７または７.３〜７.７または７.４〜７.７または７.５〜７.７または７.６〜７.７の範囲に維持され得る。特にｐＨは(約)６.８、６.９、７.０、７.１、７.２であり得るかまたはこれらの数値の２個の任意の組み合わせにより定義される範囲であり得る。第一の培養温度／培養時間のｐＨは、第二の培養温度／培養時間のｐＨと異なってもよい。
【００４９】
光学密度
培養温度を、細胞培養物の光学密度によって、第一の温度から第二の温度に低下させ得る。本発明者らは、光学密度による温度の変更が、発現タンパク質の収量にさらに好影響を有し得ることを発見した。６００nmで測定した光学密度(ＯＤ)が１０〜５０のときに培養温度を低下させるのが有益であり、２７〜３３で行うのが特に有益であることが判明した。それゆえに、ここに記載する方法は、光学密度の測定を含み得る。６００nmにおける細胞培養物の光学密度が、１０〜５０または１５〜４５または２０〜４０または２４〜３６または２７〜３３に達したときに、培養温度を第一の温度から第二の温度に低下させ得る。６００nmにおける細胞培養物の光学密度が２７〜３２または２７〜３１または２７〜３０または２７〜２９または２７〜２８；または２８〜３２または２８〜３１または２８〜３０または２８〜２９；または２９〜３２または２９〜３２または２９〜３１または２９〜３０または３０〜３２または３０〜３１または３１〜３２に達したときに、培養温度を第一の温度から第二の温度に低下させ得る。６００nmにおける細胞培養物の光学密度が２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５またはこれらの値の任意の２個の組み合わせにより規定される密度に達したときに、温度を第一の温度から第二の培養温度に低下させ得る。
【００５０】
発現系／ベクター／宿主細胞
発現のために、組み換えポリペチドを宿主細胞で発現する。ある態様において、それゆえに、上記方法の工程(ａ)、(ｂ)および(ｃ)の前に、宿主細胞に核酸を導入する工程があってよく、ここで、該核酸は目的の組み換えポリペチドをコードする。核酸をベクターの一部として導入し得る。ある態様において、本方法を、組み換え核酸を既に含む宿主細胞で行う。
【００５１】
微生物細胞におけるタンパク質の組み換え発現に適する種々の発現系および発現ベクターが知られている。任意の適切な発現ベクターおよび発現系を使用し得る。“ベクター”または“発現ベクター”は、宿主細胞中において特定の核酸配列の転写を可能にする一連の特定のポリ核酸エレメントを用いて、組み換えまたは合成により製造したポリ核酸構築物である。典型的に、ベクターは、プロモーターに操作可能に結合した、翻訳されるべき特定の核酸配列を含む、転写単位を包含する。プロモーターは、試薬添加、温度などの外部刺激により活性化され得る誘導性プロモーターであってよい。ベクターは、一般に“転写開始領域”、“転写停止領域”を含み、“エンハンサー”含んでよい。宿主で発現可能なベクターは、例えば自律−または自己−複製プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスまたはレトロウイルスであり得る。適当なベクターの例は、ｐＢＲ３２２(Fermentas)、ｐＥＴ３００ベクター、ｐＤＥＳＴベクターおよびｐＥＴ３９ｂベクター(Novagen)およびそれらの誘導体を含む。さらに適当な発現ベクターは、Laboratory handbook “Sambrook and Russel, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd edition 2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, Chapter 15”に記載されている。ある態様において、ベクターを、宿主細胞のゲノムに組み込み、すなわち組込みベクターである。ある態様において、ベクターをゲノムに組み込まず、細胞内に別に維持される、すなわち自律的または二次ベクターである。
【００５２】
ここで使用する“プロモーター”は、転写単位の発現を制御する核酸配列をいう。“プロモーター領域”は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流(３’方向)コーディング配列の転写を開始できる制御領域である。プロモーター領域は、一般に推定−３５ボックスおよびプリブノーボックス(−１０ボックス)のようなＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン(コンセンサス配列)を含む。さらに、プロモーター領域は、転写開始部位および制御タンパク質の結合部位を含み得る。
【００５３】
“転写開始領域”は、シャイン・ダルガーノ配列のような、転写開始を促進し、リボソーム結合部位のための配列を含むシグナル領域である。典型的に、転写開始領域は、転写開始部位の下流に位置し、発現する核酸／遺伝子に操作可能に結合する。
【００５４】
“転写停止領域”は、ＲＮＡポリメラーゼに転写を停止させる、配列をいう。転写停止領域は、通常他の近隣核酸／遺伝子の望まない転写または他の潜在的プロモーターによる転写を回避し、ｍＲＮＡの安定性を高めることができる、転写単位の一部である。
【００５５】
“エンハンサー”は、転写単位の同一性、転写単位に対する配列の位置または配列の配向と無関係に、転写単位の転写を増強するために作用する核酸配列である。本発明により使用し得るベクターは、所望によりエンハンサーを含んでよい。
【００５６】
核酸配列は、他の核酸配列と機能的関係に置かれたとき、“操作可能に結合する”。例えば、プロモーターは、配列の転写に影響するならばコーディング配列と操作可能に結合し、またはリボソーム結合部位のような転写開始領域は、核酸の転写を促進するように配置されるならば、例えばポリペチドをコードする核酸配列と操作可能に結合する。結合は、例えば好都合な制限部位でのライゲーションにより達成できる。
【００５７】
ここでいう“核酸”または“核酸配列”または“単離および精製した核酸または核酸配列”は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドである。核酸または核酸配列がベクター内に位置するとき、通常ＤＮＡである。ここでいうＤＮＡは、例えば二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、一方または両者の鎖が２個以上のフラグメントから成る二本鎖ＤＮＡ、一方または両者の鎖が中断されていないホスホジエステル主鎖を有する二本鎖ＤＮＡ、１個以上の一本鎖部分および１個以上の二本鎖部分を含むＤＮＡ、ＤＮＡ鎖が十分に相補性である二本鎖ＤＮＡ、ＤＮＡ鎖が一部のみ相補性である二本鎖ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、共有結合により閉じたＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ、共有結合により架橋したＤＮＡ、ｃＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、半合成ＤＮＡ、生合成ＤＮＡ、自然に単離したＤＮＡ、酵素消化ＤＮＡ、剪断ＤＮＡ、放射標識ＤＮＡおよび蛍光色素標識ＤＮＡのような標識ＤＮＡ、核酸の１個以上の天然に存在しない種を含むＤＮＡを含む、ポリデオキシヌクレオチド配列のいずれかであり得る。ＤＮＡ配列は、標準的化学技術により、例えば、ホスホトリエステル方法によりまたは自動化合成方法およびＰＣＲ方法を介して合成できる。精製および単離したＤＮＡ配列は酵素技術によっても製造できる。ここでいうＲＮＡは、例えば一本鎖ＲＮＡ、ｃＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、一方または両者の鎖が２個以上のフラグメントから成る二本鎖ＲＮＡ、一方または両者の鎖が中断されていないホスホジエステル主鎖を有する二本鎖ＲＮＡ、１個以上の一本鎖部分および１個以上の二本鎖部分を含むＲＮＡ、ＲＮＡ鎖が十分に相補性である二本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡ鎖が一部のみ相補性である二本鎖ＲＮＡ、共有結合により架橋したＲＮＡ、酵素消化ＲＮＡ、剪断ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、化学合成ＲＮＡ、半合成ＲＮＡ、生合成ＲＮＡ、自然に単離したＲＮＡ、放射標識ＲＮＡおよび蛍光色素標識ＲＮＡのような標識ＲＮＡ、核酸の１個以上の天然に存在しない種を含むＲＮＡであり得る。
【００５８】
発現系は誘導性発現系であってよく、すなわち組み換えポリペチドの発現がインデューサーに依存し得る。組み換えタンパク質をコードする核酸は、誘導性プロモーターと共に発現ベクターに操作可能に結合し得る。適切なインデューサーを直接的に、例えばそれを添加することによりまたは細胞培養に適用することにより供給でき、または間接的に、すなわち宿主細胞内の第二の構築物を介して供給できる。このような宿主細胞中の第二の構築物は、誘導により、核酸の発現を誘導するシグナルを生じる。第二の構築物は、微生物宿主細胞のゲノムの一部であってよくまたは細胞内に自律的に維持されてもよい。
【００５９】
誘導性発現系は当分野で周知である。知られるインデューサーは、例えば、ＩＰＴＧ、ラクトース、ＮａＣｌ、温度などである。ここに記載する方法で特に好ましいのは、ＩＰＴＧでの誘導である。ＩＰＴＧをインデューサーとして使用するならば、０.１mM〜１mM、より好ましくは０.２〜０.６mM、より好ましくは０.２５〜０.５mMの濃度範囲、より好ましくは０.３〜０.３５mM、より好ましくは０.３３mMの濃度で使用し得る。
【００６０】
好ましい態様において、発現ベクターは、誘導性プロモーター、好ましくはＴ７プロモーターに操作可能に結合した組み換えポリペチドをコードする核酸を含む。核酸の発現はインデューサーの存在により誘導される。Ｔ７プロモーターの場合、発現は、Ｔ７  ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの存在により誘導される。好ましい態様において、発現ベクターは配列番号４の配列からなるか、この配列を含む。
【００６１】
このような発現ベクターに対応して、宿主細胞は適当な発現系を含み得る。例えば、微生物宿主細胞の染色体は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼのようなバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼのための核酸を含み得る。バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼは、例えばｌａｃプロモーター(ｌａｃＺタンパク質ベータ−ガラクトシダーゼプロモーター)のような誘導性プロモーターに操作可能に結合し得る。ｌａｃプロモーターは、ＩＰＴＧ(イソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド)の宿主細胞への添加により誘導できる。微生物宿主細胞の染色体は、好ましくは溶原性バクテリオファージ核酸配列を含まない。本発明者らは、このような発現系／発現ベクターの使用が、ここに記載する方法において特に有益であり、封入体から得られる組み換えタンパク質が高収量となることを発見した。特に、本発明者らは、この発現系／発現ベクターをここに記載する培養スキーム、すなわち(ｉ)該微生物宿主細胞を第一の温度で培養し、ここで、宿主細胞は該組み換えポリペチドをコードする核酸を含み、(ii)培養温度を第一の温度から第二の温度まで低下させ、そして(iii)微生物宿主細胞を第二の温度で培養することと組み合わせて使用することが特に有益であることを発見した。
【００６２】
それゆえに、本発明の一つの面において、封入体(宿主細胞中)において生産される組み換えポリペチドの生産方法であって、(ｉ)組み換えポリペチドをコードする核酸を含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、ここで、該核酸はプロモーター、好ましくは誘導性プロモーターに操作可能に結合し、(ii)該微生物宿主細胞を第一の温度で培養し、ここで、宿主細胞は該組み換えポリペチドをコードする核酸を含み、(iii)培養温度を第一の温度から第二の温度まで低下させ、そして(iv)微生物宿主細胞を第二の温度で培養する工程を含む、方法が提供される。誘導性プロモーターはＴ７プロモーターであり得る。微生物宿主細胞の染色体は、所望により例えばｌａｃプロモーターのような誘導性プロモーターに操作可能に結合してよいバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含んでよく、溶原性バクテリオファージ核酸配列を含まない。バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼはＴ７ポリメラーゼであり得る。ポリペプチドの発現をインデューサー(例えば例えばＩＰＴＧ)の添加により実施する。
【００６３】
上記発現系が、ここに記載する方法で特によく機能するとの発見は驚きであった。当分野では、高温での誘導は、しばしば最も一般的な誘導機構として記載されていた。本発明者らは、しかしながら、上記Ｔ７駆動発現系を記載の２段階温度培養方法で使用して、特に活性形態での発現タンパク質の収量が改善されることを発見した。
【００６４】
最も好ましい態様において、宿主細胞のゲノムは、ｌａｃプロモーターに操作可能に結合したバクテリオファージＲＮＡ  Ｔ７ポリメラーゼをコードする核酸を含み、溶原性バクテリオファージ核酸配列を含まない。ベクターは、組み換えポリペチドをコードする核酸を含み、該核酸はＴ７プロモーターに操作可能に結合する。ＩＰＴＧ添加により、ｌａｃプロモーターはＴ７ポリメラーゼの発現を誘発し、これが続いて、Ｔ７プロモーターを介して組み換えタンパク質の発現を誘発する。
【００６５】
本発明者らは、インデューサーを、インキュベーション中の特定の時点、例えば、第一の温度から第二の温度への培養温度の低下と同時またはその後の添加が、さらに封入体から得られる組み換えタンパク質の高収量を促進することを発見した。インデューサーは、培養温度の第一の温度から第二の低培養温度への低下と同時または低下後添加し得る。換言すると、インデューサーを、温度を下げる時点で添加してよくまたはその後、すなわち第二の温度での第二の培養時間中に添加してよい。好ましくは、インデューサーを、温度を下げる時点で添加する。
【００６６】
核酸の宿主細胞への導入
目的の組み換えポリペチドを含む発現ベクターを、当分野で知られる標準的方法を使用して宿主細胞に導入し得る。
【００６７】
用語“形質転換”、“トランスフォーム”または“宿主細胞への核酸の導入”は、ベクターのような細胞外核酸が、付随する物質を伴いまたは伴わず、宿主細胞に入る過程を言う。用語“形質転換した細胞”または“トランスフォーム細胞”は、核酸が導入されており、それゆえに核酸を保持する細胞またはその子孫をいう。核酸は、該核酸が染色体組み込み体または余剰染色体要素のいずれかとして複製可能なように細胞に導入される。例えば発現ベクターでの適当な宿主細胞の形質転換は、微量注入、エレクトロポレーション、微粒子銃のような周知の方法によりまたは例えばManiatis et al. 1982, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory or in Ausubel et al. 1994, Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sonsに記載されているリン酸カルシウム介在形質転換のような化学方法により達成できる。
【００６８】
宿主細胞
封入体での組み換えタンパク質の発現を可能にする任意の微生物細胞を、本発明により使用し得る。組み換えタンパク質の封入体を生産する微生物細胞は、例えば、細菌および酵母細胞および糸状菌細胞を含む。“宿主細胞”または“宿主”は、細菌、酵母または糸状菌細胞のような任意の微生物細胞であり得る。細菌細胞が好ましい宿主細胞であり、グラム陰性細菌が特に好ましい。例は、Ｃ２５２３、Ｃ２５２３およびＢＬ２１(ＤＥ３)のような細胞を含む(全てNew England Biolabs)。特に好ましい宿主細胞は大腸菌細胞である。特定の発現系の適当な宿主細胞も上に記載している。
【００６９】
用語“宿主”、“宿主細胞”および“組み換え宿主細胞”は、ここでは、１個以上のベクターまたは単離および精製した核酸配列が導入されている微生物細胞を示すために、交換可能に使用する。ここでの単数表現“宿主細胞”の使用はまた、文脈から他の解釈が日必要ではない限り、複数の細胞を使用し得ることも示す。実際には、１組み換え宿主細胞での生産において、多数の宿主細胞を細胞培養に使用する。
【００７０】
用語“単離および精製した核酸配列”は、核酸配列が、自然環境でまたはこのような調製物をインビトロまたはインビボで組み換え技術により製造したとき製造した環境(例えば細胞培養)で共存する他の核酸のような、それが自然に共存している物質を含まないまたは実質的に含まない状態をいう。
【００７１】
用語“宿主”、“宿主細胞”および“組み換え宿主細胞”は特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的子孫もいう。変異または環境的影響によりある種の修飾が後の世代で生じ得るため、このような子孫は、事実、親細胞と同一ではないことがあるが、組み換えタンパク質またはその機能的変異体の活性形態を生産する限り、ここで使用する本用語の範囲内になお包含される(上記機能的変異体に関する記載参照)。
【００７２】
宿主が原核生物種からである場合、組み換え核酸配列は、生物の異なる属または科、異なる目または綱、異なる動物の門(植物の門)または異なるドメイン(エンパイア)由来であり得る。
【００７３】
トランスフォーム宿主細胞を凍結し、保存してよい。マスター細胞バンクおよび作業細胞バンクを調製し、生存能、同一性、純度および安定性について試験し得る。
【００７４】
さらなる細胞培養条件
微生物細胞の培養のための一般的設定および培養条件は十分確立されており、ここで要旨のみを記載する。標準的細胞培養パラメーターを、当分野で共通の一般的知識に基づき調節し得る。
【００７５】
細胞培養培地に、トランスフォーム微生物宿主細胞のサンプルを接種する。適当な培養培地は当分野で知られ、例えばＧＢＡ培地、ＳＯＣ(Super optimal carbon)培地、ＬＢ(ルリア)培地またはＲＢＹ培地を含む。種々の量の培養培地が接種され得る。培養は、例えば実験室使用での小規模培養、例えば１ml〜１Ｌの培養培地であり得る。ここに記載する方法はまた産業規模、すなわち実製造規模までの大きな体積にまで特に有用である。ここに記載する方法は、それゆえに、産業使用のための大規模処理を含む大細胞培養体積で実施できる。培養物は１〜５Ｌまたは１〜１０Ｌまたは１〜１００Ｌまたは１〜５００Ｌまたは１〜１０００Ｌまたはそれ以上の範囲であり得る。培養物は５〜５０００Ｌまたは１０〜５０００Ｌまたは５０〜５０００Ｌまたは１００〜５０００Ｌまたは５〜１０００Ｌまたは１０〜１０００Ｌまたは５０〜１０００Ｌまたは１００〜１０００Ｌの範囲であり得る。
【００７６】
ある態様において、最初に種培地を接種する。種培養物を、特定の光学密度に達するまで培養する。種培養物を、６００nmでの光学密度が０.５〜１.５または０.６〜１.４または０.７〜１.３または０.８〜１.２または０.９〜１.１の範囲内になるまで培養し得る。好ましい光学密度は０.９〜１.１の範囲内である。次いで、種培養物を新鮮培地を仕込んだ大容量バイオリアクターに移す。
【００７７】
当業者には知られているように、効率的細胞増殖を確保にするために、細胞培養物中の、例えば、溶存酸素レベルおよび栄養分をモニターする必要がある。
【００７８】
供給速度は直線的であり得る。ある態様において、溶存酸素(ＤＯ)レベルが、炭素源消費により、設定値から急勾配で上昇し始めたら、供給物の直線的添加を開始し得る。ＤＯ設定値は１０％〜５０％、２０％〜４５％、３０％〜４５％、３５％〜４５％、３７％〜４２％または３９％〜４０％であり得る。ＤＯは３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％または４５％であってよく、またはＤＯはこれらの値の２点の任意の組み合わせであり得る。好ましくは、ＤＯは４０％である。
【００７９】
適当な栄養分は当分野で知られている。炭素源として、糖アルコール、好ましくはグリセロールを培地に使用し得る。本発明者らは、炭素源としてのグリセロールが高増殖率および高バイオマスをもたらすことを発見した。供給培地の組成は、特にアミノ酸(主としてＬ−メチオニン、Ｌ−グルタミンおよびＬ−ロイシン)およびミネラル(例えば塩、リン酸塩、硫酸塩)を含み得る。使用する全物質は非動物源由来である。
【００８０】
１種以上の消泡剤または選択剤を使用し得る。消泡剤としてＰＰＧ２０００、ＪＭ６３３、ＳＢ２０２０を使用し得る。発酵ブロスは、さらに選択剤として硫酸カナマイシン(アミノグリコシド系抗生物質)を含み得る。
【００８１】
使用する実際の宿主細胞によって、さらなる成分が必要となり得る。
【００８２】
下流プロセシング
“下流プロセシング”は、培養物から回収した細胞のさらなる処理を含む。細胞は、組み換えタンパク質を伴う封入体を含む。
【００８３】
トランスフォーム宿主細胞を含む細胞培養物の培養後、細胞を、低速遠心分離または分離器を使用して培養培地から分離できる。細胞溶解後、組み換えタンパク質を含む封入体を得る。ある態様において、本明細書のどこかに記載する方法は、それゆえに、さらに宿主細胞から封入体を得る工程を含み得る。
【００８４】
封入体は標準的方法により得ることができる。宿主細胞から封入体を得る方法は、一般に細胞の溶解および破壊と、その後の遠心分離を含む。封入体は、分離器(例えば遠心分離により、例えば約１１０００ｇ)中で細胞を回収し、細胞を機械的に、例えば高圧ホモジナイザー(例えば約１０００バールで)で破壊し、続いて細胞残屑から封入体を分離器(例えば遠心分離により、例えば約１１０００ｇ)中で分離することにより得ることができる。古典的封入体の大部分を含むペレットを、通常界面活性剤を含む適当な緩衝液で洗浄する。封入体は適当な緩衝液中に保存し得る。適当な緩衝液は、例えばリン酸、クエン酸、酢酸、酒石酸緩衝液または水のような、あらゆる生物学的に許容される緩衝液である。封入体は、適当な緩衝液中、−８０℃で少なくとも８ヶ月保存しても、保存工程を経ずさらに処理してもよい。
【００８５】
Ｇ−ＣＳＦの単離のために、古典的封入体を、例えば１％デオキシコレート(Zsebo KM et al (1986) Immunobiology 172:175-184；ＥＰ２３７５４５；ＵＳ５８４９８８３)または０.１％Ｔｗｅｅｎ  ８０を添加した１.０Ｍ  ＮａＣｌ溶液(Gelunaite L et al (2000) J Chromatogr A 904:131-143)で洗浄するのが好都合であると報告されている。
【００８６】
封入体を得た後、組み換えタンパク質を封入体から可溶化しなければならない。ある態様において、本明細書のどこかにに記載する方法は、さらに(ｉ)封入体を得て、そして(ii)封入体から組み換えタンパク質を得る工程を含み得る。本発明はまたここに記載する方法により得られるまたは得た組み換えタンパク質も提供する。
【００８７】
封入体は、上に示す一般的技術を使用して得ることができる。天然の条件下一般的水性緩衝液または水溶液に不溶性である正しく折り畳まれた生物学的に活性なタンパク質を封入体から生産するために、封入体を細胞から単離し、洗浄し、可溶化し、次いでインビトロで再生を行う。
【００８８】
封入体から組み換えタンパク質を、一般的技術を使用して得ることができる。例えば、ＥＰ０２１９８７４は、大腸菌封入体からの組み換えタンパク質の再折り畳みのための一般的方法を開示する。可溶化のために、カオトロピック剤であるＧｕＨＣｌおよびアルギニンを高ｐＨで用いている。ＥＰ０２１９８７４は、ＧＳＨ／ＧＳＳＧにより提供されるレドックス条件下のジスルフィド架橋の形成を記載する。単量体可溶性Ｇ−ＣＳＦを得る方法は、例えばZsebo 1986、ＷＯ８７／０１１３２、Devlin 1988、Holloway 1994、ＷＯ０１／０４１５４、ＵＳ５０５５５５５に記載されている。さらなる方法が、ＷＯ８９／１０９３２、Lu 1992、Heidari 2001、Wingfield 1988、Kang 1998、ＷＯ９８／５３０７２、Wang 2005、ＷＯ０１／８７９２５、ＷＯ２００４／０１５１２４、ＷＯ２００４／００１０５６、ＷＯ２００６／０９７９４４、ＷＯ２００６／１３５１７６、ＥＰ１６３０１７３、ＥＰ１８３７３４６、Rao 2008、Khalilzadeh 2008、ＷＯ２００８／０９６３７０、ＷＯ２０１０／１４６５９９に記載さている。
【００８９】
例えばＷＯ８９／１０９３２およびＥＰ０７１９８６０は、組み換えＧ−ＣＳＦを微生物から単離および精製する方法を記載する。ＷＯ８９／１０９３２およびＥＰ０７１９８６０に記載の方法は、微生物を溶解し、Ｇ−ＣＳＦを含む不溶性物質を可溶性タンパク質性物質から単離し、可溶化剤および酸化剤存在下でＧ−ＣＳＦを可溶化および酸化し、架橋スチレン−ジビニルベンゼンポリマーマトリックスを有するDOWEXイオン交換樹脂を使用して可溶化剤を除去し、Ｇ−ＣＳＦをイオン交換クロマトグラフィーに付し、精製Ｇ−ＣＳＦを回収することを含む。イオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィー(ＡＥＸ)と、続くカチオン交換クロマトグラフィー(ＣＥＸ)であり得る。細胞溶解は、Gaulinホモジナイザーと、続くペレット回収のための遠心分離により実施し得る。封入体の洗浄は、例えば、デオキシコレートまたは他の胆汁酸塩または非イオン性界面活性剤を用いて実施し得る。可溶化剤はサルコシルであってよく、酸化剤は硫酸銅であってよい。次いで、サルコシルをDowexまたは他のイオン交換樹脂を用いるバッチ吸着を使用して除去する。次いで、ＡＥＸおよび／またはＣＥＸクロマトグラフィーをさらなる精製のために使用してよい。
【００９０】
このような精製方法は、封入体からＧ−ＣＳＦを可溶性の、単量体でかつ正しく折り畳まれた形態で得ることを可能にする。タンパク質を、さらにイオン交換クロマトグラフィーを使用して、単量体および酸化形態のみに使用し得る。凝集物、二量体または他に誤って折り畳まれたタンパク質は沈殿し、フィルターおよびカラム上に残る。Ｇ−ＣＳＦは、正しく折り畳まれた、単量体形態で生物学的に活性である。
【００９１】
それゆえに、ここに記載する方法により得た単量体の可溶化Ｇ−ＣＳＦは正しく折り畳まれ、ゆえに生物学的に活性であることが推定できる。Ｇ−ＣＳＦの生物活性は、実施例１３に示す方法を使用して試験し得る。
【００９２】
本発明者らは、またここに新規かつ進歩性のある下流プロセシング方法を記載し、これは、ここに記載する上流細胞培養(発酵)方法と組み合わせて使用し得る。これは、さらに正しく折り畳まれた組み換えタンパク質の収量を増やす。下流プロセシング方法は、組み換えタンパク質を可溶化し、酸化および１回目の再折り畳み工程を実施し、可溶化剤を除去し、２回目の再折り畳み工程を実施する工程を含む。特に、ここに記載する培養方法は、封入体からの組み換えタンパク質の再折り畳みのための方法と組み合わせて実施でき、該方法は：
ａ)  可溶化剤の存在下で組み換えタンパク質を可溶化し；
ｂ)  酸化剤および可溶化剤の存在下で組み換えタンパク質をインキュベートすることを含む、酸化および１回目の再折り畳み工程を実施し；
ｃ)  イオン交換樹脂吸着および／またはイオン交換クロマトグラフィーにより可溶化剤を除去し、所望により酸沈殿を実施し；そして
ｄ)  工程(ｃ)の組み換えタンパク質を可溶化剤非存在下で希釈およびインキュベートすることを含む、２回目の再折り畳み工程を実施する
ことを含む。
【００９３】
封入体は微生物、好ましくは大腸菌から得ることができる。可溶化剤はＮ−ラウロイルザルコシンであり得る。酸化剤はＣｕＳＯ４であり得る。可溶化はｐＨ７より高いｐＨ値で実施し得る。可溶化剤は、約０.５％〜約１.５％の濃度のＮ−ラウロイルザルコシンであり得る。酸化および１回目の再折り畳み工程は少なくとも２時間実施し得る。酸化および１回目の再折り畳み工程は、通気下、冷却せずに実施し得る。酸化および１回目の再折り畳み工程は、約７〜９のｐＨ値および／または約２０〜２８℃の温度および／または１５〜２５時間実施し得る。
【００９４】
上記工程(ｃ)における可溶化剤は、ＡＥＸ(アニオン交換)およびＣＥＸ(カチオン交換)を、所望によりこの順番で含み得る。上記工程(ｃ)における可溶化剤の除去は：
ａ)  組み換えタンパク質溶液と懸濁樹脂物質の混合によるイオン交換樹脂物質への結合および濾過による樹脂物質の除去および／または
ｂ)  可溶化剤が樹脂と結合し、組み換えタンパク質が通過画分に残る条件下でのイオン交換クロマトグラフィーおよび／または、
ｃ)  組み換えタンパク質が樹脂と結合し、可溶化剤が通過画分に残る条件下でのイオン交換クロマトグラフィー
を含む。
【００９５】
可溶化剤および他の不純物を、次の工程の連続的適用により除去し得る：ＡＥＸ、酸沈殿、ＡＥＸおよびＣＥＸ。可溶化剤および他の不純物を、次の工程の連続的適用により除去し得る：
ａ)  組み換えタンパク質溶液と懸濁樹脂物質の混合による可溶化剤のイオン交換樹脂物質への結合および濾過による樹脂物質の除去；
ｂ)  ｐＨをｐＨ５より低く下げることによる不純物の沈殿および濾過による沈殿の除去；
ｃ)  残留可溶化剤が樹脂に結合し、組み換えタンパク質が通過画分に残る条件下で行うアニオン交換クロマトグラフィー；
ｄ)  組み換えタンパク質が樹脂に結合し、残留可溶化剤が通過画分に残る条件下で行うカチオン交換クロマトグラフィー；および
ｅ)  ｐＨまたは塩濃度を増加させながら溶出緩衝液を使用することによる、段階的または勾配溶出による、カチオン交換樹脂からの結合した組み換えタンパク質の溶出。
【００９６】
２回目の再折り畳み工程は低伝導率緩衝液中および／または冷却条件下および／または１２時間を越える時間で実施し得る。２回目の再折り畳み工程は、２.０mS／cm未満の伝導率および／または約２〜８℃の温度および／または少なくとも２４時間かけて実施し得る。２回目の再折り畳み工程は、ｐＨ７を超えるｐＨ値で実施し得る。
【００９７】
上記の封入体からの組み換えタンパク質を再折り畳みする方法は、さらに１回以上のイオン交換クロマトグラフィーを含み得る、仕上げ工程(Polishing step)を含み得る。仕上げ工程における１回以上のイオン交換クロマトグラフィーは、アニオン交換クロマトグラフィーと、続くカチオン交換クロマトグラフィーを含み得る。
【００９８】
ここで、種々の工程を記載する：
可溶化：封入体(ＩＢ)フラクションの組み換え物を可溶化剤存在下に可溶化する。任意の適当な可溶化剤を使用し得る。このような可溶化剤は、例えば(しかし限定されない)ＧｕＨＣｌまたはウレアのような変性剤またはカオトロピック剤の群または例えば(しかし限定されない)Ｎ−ラウロイルザルコシン(サルコシル)、ラウリン酸、ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)またはＮ−セチルトリメチルアンモニウム塩化物のような洗剤、界面活性剤またはサーファクタントの群から、例えば、選択される(しかしこれらに限定されない)。好ましい態様において、可溶化を、サルコシルをアルカリｐＨで、優先的にｐＨ８で用いて、好ましくは０.２〜２.０％(ｗ／ｖ)、より好ましい態様において約０.５％〜１％(ｗ／ｖ)および最も好ましくは約１％(ｗ／ｖ)または１％(ｗ／ｖ)のサルコシルの濃度で行う。可溶化のための好ましい緩衝液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ８、優先的に４０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ８である。可溶化後、希釈工程を、水または低伝導率(すなわち少なくとも２mS／cmより低い、より好ましくは１mS／cmより低い伝導率)の緩衝液を用いて実施し得る。
【００９９】
１回目の再折り畳み(酸化的折り畳み)：１回目の酸化的再折り畳み工程を、有効量の可溶化剤、例えばサルコシルおよび酸化剤、例えばＣｕＳＯ４(または酸素または気流(通気)、ＧＳＳＧ(グルタチオン−ｏｘ)、金属イオン(Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋..)、過酸化物(Ｈ２Ｏ２)のような他のもの)の存在下で実施する。本発明者らは、可溶化剤、例えばサルコシルの存在下で、組み換えタンパク質の折り畳みは十分には達成できないことを発見した。本発明者らは、可溶化剤の完全な除去と、続く可溶化剤非存在下の２回目の折り畳み工程が組み換えタンパク質の収量を改善することを発見した。
【０１００】
可溶化剤および酸化剤の除去および他の不純物の除去：任意の適当な除去方法を使用し得る。例えば、イオン交換樹脂吸着および／または酸沈殿および／またはイオン交換クロマトグラフィーにより十分な除去が達成できる。これらの技術の任意の一つまたは組み合わせの適用により、サルコシルのような可溶化剤の濃度を、２回目の再折り畳み工程における再折り畳みを妨害しない濃度、好ましくは０.０１mg／ml、好ましくは検出限界未満にする(残留可溶化剤の濃度は、ＨＰＬＣとＵＶでの検出により測定し得る。本方法は、Burgess, R. R. 1996. Purification of over produced E. coli RNA polymerase σ factors by solubilizing inclusion bodies and refolding from sarkosyl. Methods Enzymol. 273:145-149にさらに詳細に記載されている)。これらの精製工程は、可溶化剤の完全な除去に至るならば、任意の順番および／または任意の組み合わせで適用し得る。他の適当な精製方法も使用できる。可溶化剤および他の不純物を、次の工程の連続的適用により除去し得る：ＡＥＸ、酸沈殿、ＡＥＸおよびＣＥＸ。イオン交換樹脂吸着、酸沈殿およびイオン交換クロマトグラフィー、例えばＡＥＸまたはＣＥＸを実施するための適当な物質および条件は当分野で知られ、市販されている。
【０１０１】
２回目の再折り畳み(折り畳みの完了)：２回目の再折り畳み工程は、水または低伝導率緩衝液での、例えば、２倍の希釈、次いで、一部再折り畳みされたＧ−ＣＳＦの、好ましくはｐＨ８のような穏やかなアルカリｐＨでのインキュベートを含む。２回目の再折り畳み工程のための好ましい緩衝液はＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ８、優先的に１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ８である。
【０１０２】
最終精製(仕上げ工程)：さらに、所望により組み換えタンパク質の所望の程度の純度が達成されるまで、ＡＥＸおよび／またはＣＥＸを含む、仕上げ工程を所望により実施してよい。
【実施例】
【０１０３】
実施例１：
Ｇ−ＣＳＦの製造
物質および方法
１. 宿主細胞株の生産
Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼカセットの製造
ｌａｃオペロンの制御ドメインに操作可能に結合した機能的Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ(受託番号AY264774、タンパク質AAP33914.1)を含む４.４４kb遺伝子カセットを単離するために、大腸菌ＢＬ２１(ＤＥ３)株(Novagene)からのゲノムＤＮＡを使用した。ＤＮＡを、標準的プロトコールを使用してQuiagen Genomic tip-20キット(Quiagen, Hilden, Germany)を用いて製造した。次いでＴ７カセットをＰＣＲ反応により増幅した。増幅を、１００μl反応体積で、ＫＯＤ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ(Merck, Darmstadt, Germany)を使用して行った。反応混合物は、ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、５Ｕ  ＫＯＤ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡポリメラーゼ、２mM  ＭｇＣｌ２、２５０μM  ｄＮＴＰｓ、１００ng  ＤＮＡ鋳型、１０μM  順方向プライマー(IntLambd 1)、１０μM  逆方向プライマー(IntLambd 2)を含んだ。反応のために、ＰＣＲサイクラー[MJ Research PTC-200]を次の設定で使用した：変性９８℃で３０秒、続いて３５サイクル３０秒、９８℃(変性)、３０秒、６５℃(アニーリング)、２分、７２℃(合成)。最終合成を１０分、７２℃で行った。
【０１０４】
ラムダファージのＩｎｔ遺伝子からの次のプライマーをＰＣＲ反応に使用した：
IntLambd 1：GTCCGACTTATGCCCGAGAAGATGTTGAGCAAACTTATCGCTTATC
IntLambd 2：TGCAAAGAGATTCTTGGCGGAGAAACCATAATTGCATCTACTCG
【０１０５】
ＤＮＡを、ＰＣＲ溶液からMillipore Montage PCR Cleanup Kitを用いて精製した。Qiaquick Gel Extraction Kitからの３体積ゲル可溶化溶液を反応溶液に添加し、サンプルを遠心分離した。その後４００μlの水およびゲル可溶化溶液混合物(１：３比に混合)を添加した。遠心分離後、フィルター上に保持されたＤＮＡを３×４００μl  ＴＥ緩衝液で洗浄し、ＤＮＡを４５μlの無菌水に取り込んだ。５μlのＢａｍＨＩ緩衝液を単離したＰＣＲ産物に添加し、混合物を１０単位のＢａｍＨＩ制限酵素で４時間、３７℃で消化させ、上記方法に従い精製した。ｐＢＲ３２２プラスミドを、XL1-Blue MRF細胞から、HiSpeed Plasmid Midi Kitを使用して精製した。１μgの精製プラスミドを５単位のＢａｍＨＩ酵素で４時間、３７℃で、ＢａｍＨＩ緩衝液で調製した２０μl反応混合物中で消化させた。ベクターの自己閉鎖を避けるために、末端に結合したリン酸基を０.５単位のＢＡＰ(細菌アルカリホスファターゼ)酵素で消化した(３０分、６０℃でインキュベーション)。ベクターを１％ＴＡＥアガロースゲルで分離し、Qiaquick Gel Extraction Kitの使用により精製した。精製をキットのプロトコールに従い行い、最後にベクターを５０μl体積で溶出した。精製ベクターおよびインサートを混合し、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼで、一夜、１６℃で２００μl反応混合物中処理した。処理後、ＤＮＡを、３体積のエタノールで沈殿させ、蒸発後、５０μlの無菌水に溶解した。
【０１０６】
組込み構築物の製造
上記単離Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼカセットを、修飾ＢＬ２１大腸菌株Ｃ２５２３Ｈ(New England Biolabs)の染色体ＤＮＡに導入するために、上記単離Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼカセットを705-pmjプラスミドにクローン化した。このプラスミドは、温度感受性複製起点を含む。
【０１０７】
組込み構築物の製造のために、HiSpeed Plasmid Midi Kitを使用してXL1-Blue MRF細胞[Stratagene]から得た４μ  ｇｐＢＲ３２２／Ｔ７プラスミドからのインサートを、５０μl  ＳａｌＩ緩衝液中ＣｌａＩ／ＳａｌＩ酵素により開裂した。消化を４時間、３７℃で続けた。消化により、ｐＢＲ３２２のＣｌａ／ＳａｌＩフラグメントおよびＴ７ポリメラーゼ含有フラグメントの２個のフラグメントが得られた。
【０１０８】
ｐＬａｃＺベクターを、HiSpeed Plasmid Midi Kitを使用してXL1-Blue MRF細胞から獲得した。ＬａｃＺ遺伝子の末端を、ＥｃｏＲＩ／ＣｌａＩ酵素を４時間、３７℃適用することにより、ｐＬａｃＺベクターから除去した。HiSpeed Plasmid Midi Kitを使用して精製した２μgのＤＨ５ａ[Invitroge]トランスフォーム705-pMJプラスミド[Gene Bridges GmbH]を、０,０１単位ＥｃｏＲＩ酵素含有ＥｃｏＲＩ緩衝液で３０分消化した。一部消化したプラスミドＤＮＡを、Qiaquick Gel Extraction Kitにより精製し、ＳａｌＩ酵素含有ＳａｌＩ緩衝液で４時間、３７℃で消化し、プラスミドを０,５単位のＢＡＰ酵素(細菌アルカリホスファターゼ)で３０分、６０℃で脱リン酸化した。
【０１０９】
インサートおよびベクターを、それぞれ１％ＴＡＥアガロースゲルで流し、Qiaquick Gel Extraction Kitを使用して精製し、混合し、１６時間、２００ml体積でライゲートした。
【０１１０】
その後、ＤＮＡをエタノールで沈殿させ、蒸発後、ｐＥＴ３ｄに挿入されたＲＦＰタンパク質の遺伝子を含むＤＨ５α細胞に電気穿孔で入れた。ベクター(705-pMJプラスミドおよびその誘導体の増殖のために、適当なでそれを得るためにＤＨ５α細胞を使用した)。赤色細胞の４個を増幅し、プラスミドを、全インサートを含むか否かについて分析した。得られた構築物をpMJ-LacI-LacUV-T7Pol-LacZと命名した。その後、pMJ-LacI-LacUV-T7Pol-LacZプラスミドをHiSpeed Plasmid Midi Kit(Quiagen)で精製し、Ｃ２５２３修飾ＢＬ２１細胞にトランスフォームした。
【０１１１】
２. Ｇ−ＣＳＦ発現ベクターおよびトランスフォーム宿主細胞の製造
Ｇ−ＣＳＦ発現ベクター：
Ｇ−ＣＳＦのための特異的発現ベクターを構築した。Ｎ−(Ｌ−メチオニル)顆粒球−コロニー刺激因子(ｍｅｔＨｕＧ−ＣＳＦ)の５２５bp長完全長ヒトｃＤＮＡ配列は、例えばＥＰ０４０１３８４に公表された付加的Ｎ末端メチオニン残基を有する、ヒトＧ−ＣＳＦの１７４アミノ酸アイソフォームと同一のタンパク質をコードする。
【０１１２】
発現構築物を、ｒ−ｍｅｔＨｕＧ−ＣＳＦ  ＤＮＡ[受託番号AR049895]を修飾ｐＥＴ３９ｂベクター(New England Biolabs)のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ位置することにより製造し、Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1, 2, 3 (1989) and Glover, D.M., IRL Press, Oxford, 1985に記載のとおり、ｐＲＧ／ＧＣＳＦａプラスミドを製造した。
【０１１３】
５２３４bp長ｐＲＧ／ＧＣＳＦａベクターは、抗生物質(カナマイシン)耐性遺伝子(Ｋａｎ)を８２２−７位に、Ｔ７プロモーター、合成ｒ−ｍｅｔＨｕＧ−ＣＳＦ遺伝子(Ｇ−ＣＳＦ)、Ｔ７ターミネーター、ｌａｃＩリプレッサー(ＬａｃＩ)および複製起点(Ｏｒｉ)を含む。本ベクターの模式図を図１に示す。
【０１１４】
本ベクターを、エレクトロポレーションを使用して、項目１の下で得た宿主細胞にトランスフォームした。
【０１１５】
３. 細胞培養
１００mlの無菌種培養培地(ＲＢＹ)に、ＷＣＢ(作業細胞バンク)細菌細胞懸濁液を、無菌条件下接種した。摂取した種培養物を、３７℃で、１８５rpmで一定撹拌しながら２４時間インキュベートした。種培養物の光学密度が、６００nmの光学密度で１.０に達したとき、種培養液を２０Ｌバイオリアクター(可動容積１５Ｌ)に移す。接種した種培養液を、１８時間、３７℃で、４００rpmで一定に撹拌し、１５Ｌ／分の速度で通気しながらインキュベートした。種培養物の６００nmの光学密度が約０.９に達したとき、回収した種培養物を、合成成分および炭素源としてのグリセロールを含むＧＢＡ培地を含む１０００Ｌバイオリアクター(可動容積５００Ｌ)に移す。培養を、３７℃での液内培養により厳密な好気条件(ＤＯ≧３０％)下に行った。全培養期間中、ｐＨ値を６.８〜７.２の範囲に維持した。
【０１１６】
溶存酸素(ＤＯ)レベルが設定値(ＤＯ＝４０％)から急勾配で上昇し始めたら、直線的供給物添加を開始した。培養物の光学密度が、６００nmの光学密度で３０に達したら、発酵温度を３２℃に下げた。温度の低下に続き、ＩＰＴＧを培養に添加して、高レベル標的タンパク質発現を誘導した。５時間の誘導時間後、炭素源供給を止め、撹拌および通気を低下させることにより発酵を停止し、細胞培養物を１５℃未満まで冷却し、細胞を回収した。主発酵は全体で２１時間を要した。
【０１１７】
炭素源として、グリセロールを培地に使用した。炭素源としてのグリセロールは高増殖率および高バイオマスをもたらした。供給培地組成は、アミノ酸(Ｌ−メチオニン、Ｌ−グルタミンおよびＬ−ロイシン)および鉱物(例えば塩、ホスフェート、スルフェート)を含んだ。使用するすべての物質は、非動物源由来であった。消泡剤として、ＳＢ２０２０を使用した。発酵ブロスは、さらに硫酸カナマイシン(アミノグリコシド系抗生物質)を選択剤として含んだ。
【０１１８】
４. 中流プロセシング
１. 封入体(ＩＢ)の調製
発酵後、封入体の調製を実施した。撹拌、通気および炭素源供給を停止し、培養物を１５℃未満に冷却し、細菌を、１１０００ｇで分離することにより回収した。細胞は回転子中に沈降し、水により洗い出した(排出)。細菌細胞濃縮物を回収し、水により半分の体積まで希釈し戻し、０.５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４を１０mMの最終濃度まで添加した。細胞を、ホモジナイザーを３回通すことにより、加圧(１００MPa)下に破壊した。封入体を、分離器中、１１０００ｇでの沈降により細胞残屑から分離した。沈降した封入体を、５mM  ＤＴＴ、１０mM  ＮａＨ２ＰＯ４、５mM  ＥＤＴＡおよび２％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有洗浄緩衝液、ｐＨ７.２に排出した。濃縮ＩＢ懸濁液を同緩衝液で２倍に希釈し、再び沈降させた。この洗浄工程を１０mM  ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液を使用して２回繰り返し、２回目の終了時には希釈しなかった。ＩＢの最終沈降物を−８０℃で保存したものは、８ヶ月安定であった。
【０１１９】
凍結封入体を融解後、Ｇ−ＣＳＦを、当分野で十分に確立されている方法により可溶化、再折り畳みおよびさらなる精製をすることができる。適当な方法は、例えばＵＳ５８４９８８３に記載されている。
【０１２０】
結果
表１は、上記形質転換宿主細胞の発酵の結果を示し、ここで、第一の培養温度は３７℃であり、第二の培養温度はそれぞれ２５℃、３０℃、３２℃、３５℃または３７℃であった。
【０１２１】
結果は、培養中の温度の低下が可溶化Ｇ−ＣＳＦの収量増加に至ることを明らかに示す。特に、３２℃〜３５℃の第二の培養温度でのインキュベーションが収量増加をもたらすことは明らかである。３２℃の第二のインキュベーション温度が特に有効であった。
【０１２２】
実施例２：発酵および発現
Ｇ−ＣＳＦ(フィルグラスチム)を、組み換え大腸菌C2523 T7 pol pRG/GCSFaクローン(Ｇ−ＣＳＦ含有発現ベクターでトランスフォームした大腸菌)を用いて生産した。無菌条件下、調製した種培養培地に、液体窒素中で保存していた融解作業細胞バンクバイアルから得た０.１０〜０.１５cm３細胞懸濁液を接種した。接種した種培養フラスコを、旋回シェーカーインキュベーター中、３７℃で１８５rpmで、２４〜２８時間インキュベートした。６個の振盪フラスコ培養の６００nmでの光学密度(ＯＤ)の平均値が０.９〜１.１に達したとき、フラスコの内容物を、シリコンチューブを備えた無菌５dm３ガラスフラスコに回収した。回収した３dm３体積種培養を、ＷＭ３２３Ｕ／Ｒポンプで、無菌および補給生産培地(ＧＢＡ、合成培地と炭素源としてのグリセロール)で７５dm３を仕込んだ１００dm３発酵槽に移した。培養を、厳しい好気条件下、３７℃での液内培養で行った。培地の炭素源が使い尽くされたら、グリセロール供給溶液を、適当な速度で培養に添加した。溶存酸素濃度を、全培養期中、３０％以下にならないレベルに維持した。培養物のＯＤ値が３０に達したら、温度を３２℃に下げ、０.３３mM  ＩＰＴＧを添加して、Ｇ−ＣＳＦ発現を誘発した。細菌を、さらに５時間、８０〜９５のＯＤまでＧ−ＣＳＦを生産するために培養した。
【０１２３】
実施例３：細菌回収
撹拌、通気および炭素源供給を停止し、培養物を１５℃未満に冷却し、細菌を１１０００ｇでの分離により回収した。細胞は回転子中に沈降し、水により洗い出した(排出)。細菌細胞濃縮物を回収し、水により半分の体積まで希釈し戻し、０.５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４を１０mMの最終濃度まで添加した。湿細菌細胞(バイオマス)の総質量は約１０〜１１.５kgであった。
【０１２４】
実施例４：細菌および封入体調製物の溶解
分離し、洗浄した細菌を、ホモジナイザーを３回通すことにより、加圧(１００MPa)下に破壊した。封入体を、分離器中、１１０００ｇでの沈降により細胞残屑から分離した。沈降した封入体を、５mM  ＤＴＴ、１０mM  ＮａＨ２ＰＯ４、５mM  ＥＤＴＡおよび２％Ｔｗｅｅｎ  ２０含有洗浄緩衝液、ｐＨ７.２に排出した。濃縮ＩＢ懸濁液を同緩衝液で２倍に希釈し、再び沈降させた。この洗浄工程を１０mM  ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液を使用して２回繰り返し、２回目の終了時には希釈しなかった。ＩＢの最終沈降物を−８０℃で保存した。
【０１２５】
実施例５：封入体の可溶化
凍結封入体(６５０ｇ湿質量)を融解し、総体積３２.５dm３で４０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８および１％(ｗ／ｖ)Ｎ−ラウロイルザルコシン(サルコシル)を含む可溶化緩衝液に溶解した。懸濁液を、室温で連続的撹拌下にインキュベートした。
【０１２６】
実施例６：酸化的再折り畳み(１回目の再折り畳み)
可溶化ＩＢ懸濁液を、総体積の６５dm３中最終濃度として０.５％サルコシルおよび２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまで水で２倍濃縮した。ＣｕＳＯ４を、最終濃度４０μMまで添加した。Ｇ−ＣＳＦは、ヘッドスペースに通気しながら、室温で少なくとも２０時間連続的撹拌して酸化することにより、一部再折り畳みされた。酸化を、最終濃度１mMでのＥＤＴＡ添加により停止させた。
【０１２７】
実施例７：ＡＥＸバッチ吸着によるサルコシル除去
サルコシルを、アニオン交換(ＡＥＸ)樹脂にバッチ・モードで吸着させた。サルコシル１ｇあたり２０ｇ  ＡＧ  １−Ｘ８樹脂(BioRad, USA)の量を適用し、溶液に添加した。懸濁液を２時間撹拌して、大部分のサルコシルを結合させた。樹脂を、１００μm細孔径ナイロンバッグフィルターメッシュで濾過した。濾液に残存するサルコシルを、続く精製工程(実施例８および９)により生成物から完全に除去した。
【０１２８】
実施例８：酸ｐＨでの混入物の沈殿
ｐＨ４.３〜４.５での酸性沈殿により、Ｇ−ＣＳＦは溶存したままで、幾分かの不純物は容易に除去された。Ｇ−ＣＳＦの非特異的な、望まない共沈を、最終濃度１Ｍ  ウレアの添加により阻止した。ウレアは、６Ｍ原液として提供され、実施例６の濾液に１dm３／分の速度でゆっくり添加した。その後、ｐＨを１／２０体積の１Ｍ  酢酸ナトリウムｐＨ４.８により低下させた。ｐＨを、５０％酢酸での滴定によりさらに４.３〜４.５まで低下させ、少なくとも１時間沈澱させた。次いで、沈殿物質を、デプスフィルター(Pall K700/KS50 dual layer)による濾過により除去した。
【０１２９】
実施例９：直列接続ＡＥＸ＋ＣＥＸクロマトグラフィーによる残留サルコシル除去および緩衝液交換
酢酸ナトリウム５０mM／ｐＨ４.５緩衝液を、１)DEAE Macro-Prep(Bio-Rad, USA)ＡＥＸ樹脂充填４dm３カラムおよび２)Toyopearl SP-650C(東ソー、日本)ＣＥＸ樹脂充填８dm３カラムの平衡化に使用した。両カラムを、直列配置でAEKTAプロセスクロマトグラフィー系(GE Healthcare, Sweden)と接続した。０.２μm無菌フィルターで浄化後、実施例７の濾液を第一のカラムに載せた。残留サルコシルはＤＥＡＥ樹脂に結合し、一方Ｇ−ＣＳＦは未結合のままであり(非結合モード)、第一のカラムの通過画分に溶出された。この通過画分を直接第二のカラム(ＳＰ樹脂)に乗せ、これはＧ−ＣＳＦと結合した(結合モード)。２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ８での１工程溶出で、樹脂からＧ−ＣＳＦを脱離させた。この二段操作により、残留サルコシルの除去とともに、酢酸Ｎａ／ｐＨ４.５からＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ８への緩衝液交換もこの方法により達成した。
【０１３０】
実施例１０：２回目の再折り畳み(折り畳みの仕上げ)
この段階で、タンパク質フラクションの約半分の折り畳みが完了していたが、残りのタンパク質は不完全に折り畳まれているかまたは誤って折り畳まれていた。Ｇ−ＣＳＦ溶液は、Toyopearl SP-650Cから２０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８中に溶出し、０.２μm無菌フィルターを通してステンレススチール容器に入れた。濾過した溶液を水で２倍に希釈した。タンパク質折り畳み(２回目の再折り畳み)のための２回目のインキュベーションを、低電導率環境(＜１mS／cm)で、ｐＨ８で２〜８℃に冷却下、３２〜４２時間行った。
【０１３１】
実施例１１：ＡＥＸクロマトグラフィーによる精製(仕上げ工程１)
カラムに、DEAE Macro-Prep(Bio-Rad, USA)を充填し、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ８で平衡化した。２回目の再折り畳み(実施例９)由来の溶液をＤＥＡＥカラムに充填した。正しく折り畳まれたＧ−ＣＳＦを、１０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ８中、０mM〜２００mMへの直線的ＮａＣｌ増加勾配で溶出した。溶出Ｇ−ＣＳＦを貯留し、水で２倍に希釈した。ｐＨを、５０％酢酸での滴定により４.５に調節した。
【０１３２】
実施例１２：ＣＥＸクロマトグラフィーによる精製(仕上げ工程２)
最終仕上げ工程のために、正しく折り畳まれたタンパク質から成るＡＥＸクロマトグラフィー(実施例１０)から回収したＧ−ＣＳＦプールを、Toyopearl CM-650S樹脂を充填したＣＥＸカラムに直接載せた。カラムを２０mM  酢酸ナトリウム、ｐＨ５.３で平衡化した。結合したＧ−ＣＳＦを、２４カラム体積内で、ｐＨ５.３の、２０mM〜４００mM  酢酸ナトリウムの直線的ＮａＣｌ増加勾配により溶出した。純粋Ｇ−ＣＳＦを含むフラクションを回収し、製剤のためにプールした。
【０１３３】
実施例１２ｂ：ゲルクロマトグラフィーによる精製Ｇ−ＣＳＦの製剤
ＣＥＸカラム(実施例１１)から溶出した精製Ｇ−ＣＳＦを、０.２μm無菌フィルターで濾過し、製剤緩衝液(１０mM  酢酸ナトリウム、ｐＨ４、５％ソルビトールおよび０.００６％ポリソルベート８０)で平衡化したSephadex G-25ファインレジンを充填した１４dm３カラムを通した。同じ緩衝液をランニング緩衝液として使用した。Ｇ−ＣＳＦは、製剤緩衝液の空隙容積中に溶出した。全バッチ(３５〜４８ｇ  Ｇ−ＣＳＦ)のために、各々、濾過したＣＥＸ溶離液の１／３を用いるSephadex G-25上での３連続製剤ランを行った。製剤したＧ−ＣＳＦを、製剤緩衝液での希釈により０.９〜１.０mg／ml濃度に調製し、最終に０.２μm無菌フィルターカプセルで濾過した。無菌溶液として製剤したＧ−ＣＳＦはきわめて安定であり、２〜８°で、数ヶ月間保存できる（数年は無理でも）。
【０１３４】
実施例１３：分析方法
周知の標準的分析方法を、特定分析方法を記載するフィルグラスチムのモノグラフを含む欧州薬局方(Ph. Eur.)に従って実施した(European Directorate for the Quality of Medicines & Health Care (EDQM) (2010): Filgrastim concentrated solution. European Pharmacopoeia 7.0, 2015-2018)。該モノグラフは、基本的方法について、欧州薬局方内の他の章を相互に引用する。技術についてさらに詳細な記載を提供するこれらの具体的記述部分を、下記実施例中で角括弧内に引用する。利用された対照標準品は、欧州連合により医薬として承認された購入製剤(フィルグラスチム)または該市販対照を使用してキャリブレートした社内標準品であった。国際単位(ＩＵ)による相対力価の分析には、世界保健機関(ＷＨＯ)の国際的Ｇ−ＣＳＦ標準を使用した。純度、特定不純物、Ｇ−ＣＳＦ関連タンパク質および生物活性(力価)の分析に使用した試験方法は、Ph. Eur. モノグラフに則り、わずかな改変のみを施し適用した。以下では、当分野で知られるこれらの標準的分析方法の使用を簡単に記載しない。
【０１３５】
実施例１３.１  −  ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)：[Ph. Eur. 7, 2.2.31]。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、分子サイズ、Ｇ−ＣＳＦの同一性および純度の決定のために使用した。ゲルは１２％ＰＡを有し、ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)を含んだ。本方法を還元および非還元条件下で使用した。ゲルをSypro rubyで染色した。相対的分子量(Ｍｒ)計算のために、既知分子量のマーカータンパク質群を使用した。
【０１３６】
実施例１３.２  −  高速分子ふるいクロマトグラフィー(ＳＥＣ−ＨＰＬＣ)：[Ph. Eur. 7, 2.2.30]。ＳＥＣを使用して、不純物またはフィルグラスチムのものより高い分子量のＧ−ＣＳＦ関連物質(二量体、凝集物)を検出した。タンパク質の検出はＵＶ吸収に基づいた。純度(主ピーク)および不純物(二量体、凝集物)を、各成分に対する活性物質の面積％で表した。試験結果を、反復測定の平均から計算した。図２は、対照標準品(３Ａ)と比較した、精製Ｇ−ＣＳＦバッチ(３Ｂ)のＳＥＣクロマトグラムを示す。凝集物の痕跡量が、主ピークの左に観察される。主ピークの右のピークは溶媒に起因し、不純物ではない。
【０１３７】
実施例１３.３  −  逆相高速液体クロマトグラフィー(ＲＰ−ＨＰＬＣ)：[Ph. Eur. 7, 2.2.29]。ＲＰ−ＨＰＬＣを使用して、Ｇ−ＣＳＦの同一性を決定し、Ｇ−ＣＳＦ含量および純度を計算した。本方法をまた生成物関連物質の同定および定量化に使用した。タンパク質の検出はＵＶ吸収に基づいた。関連タンパク質不純物は活性物質のパーセント(％面積)として表した。試験結果は、反復測定の平均から計算した。
【０１３８】
実施例１３.４  −  分画ゲル電気泳動(ＩＥＦ)：[Ph. Eur. 7, 2.2.54]。この方法を使用して、不純物またはＧ−ＣＳＦと異なる荷電を有する生成物関連物質(例えば脱アミド化Ｇ−ＣＳＦ)を検出した。両性電解質に基づく固定化ｐＨ勾配を含むポリアクリルアミドゲルで分離を行った。さらに、各タンパク質バンドの等電点(ｐＩ)を、定義されたｐＩを有する一連のマーカータンパク質を使用して計算した。
【０１３９】
実施例１３.５  −  酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)：この方法を、大腸菌宿主細胞タンパク質(ＨＣＰ)レベルの定量のために使用した。試験を、市販の(一般的)免疫酵素アッセイキット(Cygnus Technologies, no. F410)を使用して行った。マイクロタイターストリップの固相を、親和性精製ポリクローナル抗大腸菌抗体でコートし、これは、試験サンプルからのＨＣＰを捕獲した。ホースラディッシュペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)で標識したトレーサー抗大腸菌抗体は、同時にＨＣＰに結合し、得られたサンドイッチは洗浄工程に耐えた。結合したＨＣＰのそれぞれ  について、ＨＲＰを過酸化水素存在下、基質であるテトラメチルベンジジン(ＴＭＢ)の酸化により検出した。光学密度をＥＬＩＳＡリーダーにより測定した。種々の濃度でのＨＣＰキャリブレーター(キットに包含)の測定により得た検量線図を用いて定量化した。本方法は、供給者の指示に厳密に従い行った。ＨＣＰ濃度をng／mlまたはng／mg(ppm)で表した。
【０１４０】
実施例１３.６  −  定量的ポリメラーゼ連鎖反応(ｑＰＣＲ)：このアッセイを大腸菌宿主細胞ＤＮＡの決定に使用する。リアルタイムTaqMan(登録商標)ｑＰＣＲ技術(Applied Biosystems)に基づく“resDNASEQTM E. coli Residual DNA Quantitation System”という名の市販キットを適用した。本方法は極めてＤＮＡ混入の検出に感受性であり、特異的である。本アッセイは、配列特異的プライマー(ＳＳＰ)および蛍光標識ハイブリダイゼーションプローブ(TaqMan(登録商標))を使用するポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)による十分に定義されたＤＮＡフラグメントの配列特異的増幅およびリアルタイム蛍光検出に基づく。装置、試薬、サンプリングおよびソフトウェアを利用した計算を含む方法全体を、供給者の指示に従い行った。
【０１４１】
実施例１３.７  −  細菌エンドトキシン：[Ph. Eur. 7, 2.6.14, 方法C]。グラム陰性細菌エンドトキシンの検出は、カブトガニ(リムルス・ポリフェムス(Llimulus polyphemus))からのアメボサイトライセートを利用する世界的に統一された標準的方法である。このリムルス試験(“ＬＡＬ試験”)を、欧州薬局方に従う比濁法(方法Ｃ)を使用して行った。結果を、国際的エンドトキシン標準ＢＲＰに対する国際単位(ＩＵ)として表した。
【０１４２】
実施例１３.８  −  生物活性のアッセイ(相対力価)：Ｇ−ＣＳＦサンプルの生物活性を、フィルグラスチムモノグラフに記載されているものに、次の修飾をした、細胞でのインビトロ増殖アッセイにおいて試験した。生物検定方法は、マウス骨髄芽球性細胞株由来のＮＦＳ−６０細胞の細胞増殖の変化に基づいた。ＮＦＳ−６０細胞を平行で試験サンプルおよび参照溶液の希釈シリーズで処理した。ＮＦＳ−６０細胞の増殖は、Ｇ−ＣＳＦで顕著にかつ特異的に刺激され得る。細胞増殖を、ミクロ試験プレートで７２時間行った。増殖効果を、生存可能細胞により蛍光色素レゾルフィンに変換される基質レサズリン(alamar(登録商標)Blue)を使用して検出した。蛍光シグナルは高感受性で検出可能であった。曲線の直線部分の少なくとも３点を用いる用量応答曲線の平行線アッセイ計算を統計的評価として使用した。許容範囲は、参照溶液に対した８０％〜１２５％であった。相対効力を、フィルグラスチムの国際的ＷＨＯに対して計算した内部標準により定義した国際単位(ＩＵ)として表した。十分に活性な、純粋ヒトＧ−ＣＳＦは、１.０×１０８ＩＵ／mgの特異的生物活性を有する。
【０１４３】
実施例１３.９  −  ペプチドマッピング：[Ph. Eur. 7, 2.2.55]。ペプチドマッピングと続く質量分析(ＭＳ)を、ジスルフィド架橋の分析に使用した。ペプチド結合の酵素開裂の手順は、フィルグラスチムのPh. Eur. モノグラフに基づき開発された。開裂に使用したプロテアーゼはグルタミルエンドペプチダーゼ(ＥｎｄｏＧｌｕ−Ｃ)であった。インキュベーションを３７℃で２４時間行い、８Ｍ  ＧｕＨＣｌ添加および煮沸により停止させた。ペプチドマッピング法を還元および非還元条件で行った。還元および非還元条件でのペプチドプロファイルのＭＳスペクトルにおける得られた差が、ジスルフィド結合の位置を証明した。完全に折り畳まれた無傷のＧ−ＣＳＦ(フィルグラスチム)は、Ｃｙｓ３７−Ｃｙｓ４３およびＣｙｓ６５−Ｃｙｓ７５の位置に２個のジスルフィド架橋を有し、１８位の１個のシステイン残基は遊離していた。
【０１４４】
あるいは、タンパク分解性消化後のＧ−ＣＳＦサンプルから得たペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣ系で分離し、ＵＶで検出してよい。この方法は、試験溶液で得たフィンガープリント様クロマトグラムを参照物質で得たクロマトグラムと比較するため、比較データを提供する。
【０１４５】
表：
【表１】
2015514398.tif 000003
【０１４６】
【表２】
2015514398.tif 000004
【０１４７】
【表３】
2015514398.tif 000005
【０１４８】
【表４】
2015514398.tif 000006
(＃)計算値；ｎ.ｄ.＝検出不可能／検出限界未満；ｎ.ｔ.＝試験せず
【０１４９】
【表５】
2015514398.tif 000007
ｎ.ｄ.＝検出不可能／検出限界未満
【図１Ｂ−２】
2015514398.tif 000008
【図１Ｂ−３】
2015514398.tif 000009
【図１Ａ】
2015514398.tif 000010
【図１Ｂ−１】
2015514398.tif 000011
【図２】
2015514398.tif 000012
【配列表】
2015514398000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成26年11月19日(2014.11.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
封入体中での組み換えポリペチドの生産方法であって、
(ａ)  微生物宿主細胞を第一の温度で培養し、該宿主細胞は該組み換えポリペチドをコードする核酸を含み、
(ｂ)  培養温度を第一の温度から第二の温度まで低下させ、そして
(ｃ)  微生物宿主細胞を第二の温度で培養する
ことを含み、ここで、核酸が誘導性プロモーターに操作可能に結合している、方法。
【請求項２】
微生物宿主が大腸菌である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一の温度が３６℃〜３８℃である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
第一の温度が３７℃である、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
第二の温度が２５℃〜３６℃である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
第二の温度が３０℃〜３６℃、より好ましくは３０℃〜３５℃、より好ましくは３１℃〜３３℃である、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
第一の温度および／または第二の温度で培養中のｐＨが６〜８である、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
第一の温度および／または第二の温度で培養中のｐＨが６.８〜７.２である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
温度の低下を、細胞培養物の６００nmにおける光学密度が１０〜５０に達したときに行う、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
温度の低下を、細胞培養物の６００nmにおける光学密度が２７〜３３に達したときに行う、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
組み換えポリペチドが４ヘリックスバンドルポリペチドである、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
組み換えポリペチドがＧ−ＣＳＦである、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
組み換えポリペチドがＧ−ＣＳＦであり、該Ｇ−ＣＳＦが、所望によりそれぞれ−１位に開始メチオニンアミノ酸残基を有してよいヒトまたはウシＧ−ＣＳＦである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
工程(ａ)〜(ｃ)の前に宿主細胞該組み換えポリペチドをコードする核酸を含む発現ベクターを導入する工程を含み、ここで、該核酸が誘導性プロモーターに操作可能に結合している、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
誘導性プロモーターがＴ７プロモーターである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
微生物宿主細胞の染色体が所望によりｌａｃプロモーターに操作可能に結合してよいバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列を含み、溶原性バクテリオファージ核酸配列を含まない、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼがＴ７ポリメラーゼである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ポリペチドの発現をインデューサーの添加により実施する、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
インデューサーを温度の低下と同時またはその後に添加する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
インデューサーがＩＰＴＧである、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ベクターが配列番号４の配列を含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれかに記載の方法であって、該組み換えポリペチドをコードする核酸が次の
(ｉ)  配列番号３または配列番号１のポリペプチドをコードする核酸配列；および
(ii)  配列番号３に記載する配列と少なくとも９０％配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列
から成る群から選択される、方法。
【国際調査報告】
2015514398.tif 000013
2015514398.tif 000014
2015514398.tif 000015