(57)【要約】  本発明は、抗Nogo-A抗体の投与を含む、神経障害、これに限定するものではないが特に筋萎縮性側索硬化症（ALS）の治療又は予防方法に関する。【選択図】図９
2015521992.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における神経障害の治療又は予防方法であって、抗Nogo-A抗体又はその機能性フラグメントを、該抗体と患者の細胞膜上のヒトNogo-Aとの共局在化のレベルを90％超に達成し、かつ維持する投与量で該患者に投与することを含む、上記方法。
【請求項２】
抗Nogo-A抗体の投与量が0.1mg/kgから300mg/kgの間である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
抗Nogo-A抗体の投与量が15mg/kgである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記90％超の共局在化が8〜22日間にわたり維持される、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記90％超の共局在化が10〜18日間にわたり維持される、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
前記90％超の共局在化が11〜17日間にわたり維持される、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記90％超の共局在化が12〜16日間にわたり維持される、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記90％超の共局在化が13〜15日間にわたり維持される、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
前記90％超の共局在化が14日間にわたり維持される、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
患者における神経障害の治療又は予防方法であって、抗Nogo-A抗体又はその機能性フラグメントを、14日±3日毎に15mg/kgの投与量で患者に投与することを含む、上記方法。
【請求項１１】
抗Nogo-A抗体がモノクローナル抗体である、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
抗Nogo-A抗体がヒト化抗体である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
抗Nogo-A抗体がH28L16を含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
神経障害が、卒中（虚血性又は出血性）、外傷性脳損傷、脊髄損傷、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（タウオパシー）、末梢神経障害、パーキンソン病、クロイツフェルト-ヤコブ病（CJD）、統合失調症、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多発性硬化症、ハンチントン病、多発性硬化症、封入体筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、形態的非特異性筋障害、うっ血性心不全及び神経障害性疼痛から選択される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
神経障害が筋萎縮性側索硬化症（ALS）である、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
さらなる治療剤と組み合わせて投与することをさらに含む、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
さらなる治療剤が筋萎縮性側索硬化症（ALS）に対する効力を有する薬剤である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
筋萎縮性側索硬化症（ALS）に対する効力を有する薬剤がデクスプラミペキソールである、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
さらなる治療剤が抗グルタミン酸活性を有する化合物である、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
抗グルタミン酸活性を有する化合物がリルゾールである、請求項19に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗Nogo-A抗体の投与を含む、神経障害、これに限定するものではないが特に筋萎縮性側索硬化症（ALS）の治療又は予防方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ルー・ゲッリック病又はシャルコー病（Maladie de Charcot）としても知られる筋萎縮性側索硬化症（ALS）は、最も一般的な成人発症型運動ニューロン疾患である。原疾患の特徴は皮質脊髄路の上位及び下位運動ニューロンの進行性変性である。（脳幹及び脊髄の）下位運動ニューロンの機能障害は、全身衰弱、筋肉萎縮症及び麻痺を引き起こす。呼吸筋の不全が一般に致死的事象であり、発症の1〜5年以内に生じる。
【０００３】
ALSは成人の最も一般的な運動ニューロン疾患であり、毎年、米国の約30,000人及び英国の約5,000人が罹患している（Leigh & Swash, 1991）。典型的な発症年齢は50〜70歳の範囲であるが、より若い年齢で発症することもある。ほとんどの症例（90〜95％）は散発性ALS（sALS）として分類され、残りは遺伝的であり、家族性ALS（fALS）と称される。散発性及び家族性型は臨床的かつ病理学的に類似であり、共通の病因が示唆される（Bruijn et al, 2004）。しかし、ほとんどの症例の正確な原因は依然として未知であり、この疾患の過程を停止させるための有効な治療法は存在しない。
【０００４】
Nogoは、レティキュロン-4（Reticulon-4）又は神経突起伸長インヒビターとしても知られ、中枢神経系に特異的な神経突起伸長のインヒビターとして同定された、RTN4遺伝子によりコードされるヒトのタンパク質である。
【０００５】
3つの型のヒトNogo、すなわち1192アミノ酸残基を有するNogo-A（GenBank登録番号AJ251383）、推定細胞外ドメイン中の残基186〜1004を欠くスプライス変異体であるNogo-B（GenBank登録番号AJ251384）、及び、やはり残基186〜1004を欠き、小さい代替のアミノ末端ドメインを有するより短いスプライス変異体であるNogo-C（GenBank登録番号AJ251385）が同定されている（Prinjha R et al (2000) Nature 403, 383-384）。NogoなどのCNS阻害性タンパク質の阻害は、神経ダメージを改善し、神経細胞の修復と成長を促進し、それにより卒中で被った神経損傷などの神経損傷からの回復を補助する可能性のある治療手段を提供しうる。そのようなNogo阻害剤の例としては、小分子、ペプチド及び抗体が挙げられる。
【０００６】
神経突起伸長の強力な阻害剤であるミエリンタンパク質NI-220/250（その後Nogo-Aの断片であることが示された）に対して生起されたマウスモノクローナル抗体IN-1は、軸索再生を促進することが報告されている（Caroni, P and Schwab, ME (1988) Neuron 1 85-96; Schnell, L and Schwab, ME (1990) Nature 343 269-272; Bregman, BS et al (1995) Nature 378 498-501及びThallmair, M et al (1998) Nature Neuroscience 1 124-131）。Nogo-Aは、IN-1の抗原であるとも報告されている（Chen et al(2000) Nature 403 434-439）。IN-1 Fabフラグメント又はヒト化IN-1の投与により、脊髄離断を受けたラットの回復が増強された（Fiedler, M et al (2002) Protein Eng 15 931-941; Brosamle, C et al (2000) J. Neuroscience 20 8061-8068）。
【０００７】
Nogoに結合するモノクローナル抗体は、WO 2004/052932、WO 2005/028508、WO 2005/061544及びWO 2007/068750に記載されている。WO 2004/052932は、いくつかの形態のヒトNogoと高アフィニティで結合するマウス抗体11C7を開示している。WO 2005/061544はまた、マウスモノクローナル抗体2A10などの高アフィニティモノクローナル抗体を開示し、全般的には、そのヒト化バリアント、例えばH1 L11（H1及びL11の配列はそれぞれ配列番号33及び34に示されている（VH又はVL配列のみ））を開示している。開示された抗体はヒトNogo-Aと高アフィニティで結合する。WO 2007/068750は、いくつかの高アフィニティヒト化モノクローナル抗Nogo抗体、例えばH28L16（H28及びL16の配列はそれぞれ配列番号49及び14に示されている（VH又はVL配列のみ））などを開示している。開示された抗体は、神経疾患の治療に有用であることが指摘されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
当該技術分野では神経障害の治療のための高アフィニティ抗Nogo抗体が提供されているにも拘わらず、かかる障害の治療法を最適化することが依然として非常に望ましい目標となっている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の第１の態様において、患者における神経障害の治療又は予防方法であって、抗Nogo-A抗体又はその機能性フラグメントを、該抗体と患者の細胞膜上のヒトNogo-Aとの共局在化のレベルを90％超に達成し、かつ維持する投与量で該患者に投与することを含む、上記方法を提供する。
【００１０】
本発明の第２の態様において、抗Nogo-A抗体又はその機能性フラグメントを、該抗体と患者の細胞膜上のヒトNogo-Aとの共局在化のレベルを90％超に達成し、かつ維持する投与量で投与することを含む、患者における神経障害の治療又は予防に使用するための抗Nogo-A抗体を提供する。
【００１１】
本発明の第３の態様において、抗Nogo-A抗体又はその機能性フラグメントを、該抗体と患者の細胞膜上のヒトNogo-Aとの共局在化のレベルを90％超に達成し、かつ維持する投与量で投与することを含む、患者における神経障害の治療又は予防に使用するための、抗Nogo-A抗体又はその機能性フラグメントを含む医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】レーザー走査型サイトメトリー（LSC）によりウエル走査を行って組織切片（灰色画像）を特定し、4つの領域（シアン色ボックス）を各切片に配置した。高分解能フィールド走査により、3種色素の位置の画像を得た。個々のタンパク質は、青色（γサルコグリカン）、赤色（Nogo A）、及び緑色（H28L16）に着色されている。
【図２】事象集団（投与前生検）のゲーティングを示す。散布図は、蛍光強度に基づいて特徴について色素の画素を区別するように作成した。
【図３】事象集団（投与前生検）のゲーティングを示す。この図は、組織切片上でゲーティングされた事象を示すために用いられる「バックゲーティング（back gating）」のプロセスを示すフィールド画像である。
【図４】事象集団（投与後生検）のゲーティングを示す。散布図は、図2と同様に作成したが、15mg/kgのH28L16の投与後である。
【図５】事象集団（投与後生検）のゲーティングを示す。バックゲーティングは、図3と同様に実施したが、15mg/kgのH28L16の投与後である。
【図６】NogoA/H28L16発現を示す（γサルコグリカンチャンネルは示さない）。個々の蛍光チャンネルを示している。1列目は標的のみ（Nogo A）を示し、2列目はH28L16のみを示し、3列目はNogo AとH28L16を示す。
【図７】H28L16と共局在化している、膜上のNogo Aの割合（％）を示す。H28L16と共局在化している、筋肉繊維膜上のNogo Aの割合（％）を示す。「15mg/kg」と強調されたボックスは、15mg/kgのH28L16の投与後に最大量の共局在化が達成されたことを示す。各バーは1つの切片を表す。
【図８】H28L16と共局在化している膜Nogo-Aの百分率中央値を示す。2.5mg/kg反復投与（左側パネル）、15mg/kg反復投与（中央の3つのパネル）及び15mg/kg単回投与（右側パネル）からのデータである。反復投与コホートからの生検の3つの切片の中央値を、単回投与コホートからの生検の単一切片と共に示す。
【図９】血漿H28L16濃度とH28L16と共局在化した膜Nogo-Aの割合（％）との間のモデル推定関係（Emax）を示す。
【図１０】4週間毎に投与された15mg/kgのH28L16についてH28L16血漿濃度の時間プロフィールの予想中央値（第5及び95パーセンタイル）を示す。
【図１１】2週間毎に投与された15mg/kgのH28L16についてH28L16血漿濃度の時間プロフィールの予想中央値（第5及び95パーセンタイル）を示す。                      [図１２]H28L16抗体の可変重鎖及び可変軽鎖領域を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本発明の第１の態様において、患者における神経障害の治療又は予防方法であって、抗Nogo-A抗体又はその機能性フラグメントを、該抗体と患者の細胞膜上のヒトNogo-Aとの共局在化のレベルを90％超に達成し、かつ維持する投与量で該患者に投与することを含む、上記方法を提供する。
【００１４】
本明細書における「共局在化」についての参照は、抗Nogo-A抗体と会合して又は結合して、局在化した膜結合Nogo-Aの比率（割合）を指すことが理解されるだろう。例えば、100％共局在化の数値は、全ての膜Nogo-Aが抗Nogo-A抗体と共局在化していることに等しい。当業者であれば、共局在化が標的の占有率に等しいものではないが、最適な投与レジメンを確認するために、起こりうる薬力学的効果のきわめて有用な尺度を提供することを理解するだろう。
【００１５】
本明細書に示すデータは、細胞膜上のNogo-Aの抗Nogo-A抗体との90％を超えるレベルでの共局在化が最大の薬力学的効果を達成したことを実証している。
【００１６】
本明細書中で参照される「抗Nogo-A抗体」とは、Nogo-Aに結合可能な任意の抗体、又はそのバリアント形態、例えば限定されるものではないが、抗体フラグメント、ドメイン抗体又は一本鎖抗体などを指す。抗Nogo-A抗体は、中和抗Nogo-A抗体であってよい。抗Nogo-Aは、マウス、キメラ、ヒト化、若しくは完全ヒト抗体、又はそれらのフラグメントであってよい。「中和」及びその文法上のバリエーションは、任意のNogo機能、より具体的には任意のNogo-A機能の全体的又は部分的な阻害を表す。
【００１７】
本明細書中で使用される「治療」の参照は、筋萎縮性側索硬化症に関連しかつ／又は筋萎縮性側索硬化症の原因である疾患症状の低減又は排除を指し、それには、皮質脊髄路でのニューロンの進行性変性、筋線維の除神経、及び／又は筋力低下及び／又は痙縮性の低減又は排除が含まれる。
【００１８】
本明細書中で使用される「予防」の参照は、筋萎縮性側索硬化症に関連する疾患症状の遅延、防止又は最小化を指し、それには、皮質脊髄路でのニューロンの進行性変性、筋線維の除神経、及び／又は筋力低下及び／又は痙縮性の遅延、防止又は最小化が含まれる。
【００１９】
投与すべき抗Nogo-A抗体の量及び頻度は、細胞膜上のNogo-Aとの90％を超える共局在化を達成し維持することが保証されるように選択することが理解されるだろう。
【００２０】
WO 2010/004031は、ヒトにおけるALS又は他の神経疾患の治療のための抗Nogo-A抗体の好適な投与量が、0.1mg/kg〜300mg/kgの範囲内、通常は約2mg/kg〜約40mg/kgであることを開示している。したがって、一実施形態において、抗Nogo-A抗体の投与量は、0.1mg/kg〜300mg/kgである。さらなる実施形態において、抗Nogo-A抗体の投与量は、2mg/kg〜40mg/kgである。
【００２１】
さらに、WO 2007/068750は、ヒトにおける卒中（stroke）及び他の神経疾患の治療のための抗Nogo-A抗体の好適な投与量が、体重70kg当たり700mg〜3500mgの範囲内であることを開示している。したがって、一実施形態において、抗Nogo-A抗体の投与量は、10mg/kg〜50mg/kgである。
【００２２】
本発明の特定の一実施形態において、抗Nogo-A抗体の投与量は15mg/kgである。本明細書に示すデータは、予想外にも、15mg/kgの投与量の有益な結果を示す。特に、この投与量は、細胞膜上のNogo-Aとの90％共局在化という本発明の閾値を超えるために、便利な投与頻度を特に行いやすい。
【００２３】
本発明の特に有利な投与量15mg/kgに関して本明細書に示すデータは、細胞膜上のNogo-Aとの共局在化が、投与後8日間の期間にわたり90％超まで増大し、投与後22〜27日の間におよそ70％まで低下することを示している。したがって、一実施形態において、投与量が15mg/kgである場合、90％超の共局在化を維持するために好適な投与間隔は8〜22日である。さらなる実施形態において、投与量が15mg/kgである場合、90％超の共局在化を維持するために好適な投与間隔は10〜18日である。
【００２４】
本発明の特定の一実施形態において、投与量が15mg/kgである場合、90％超の共局在化を維持するために好適な投与間隔は14日である。14日の投与間隔のわずかな変動が許容可能であり、投与が、14日に、最適な14日の投与間隔の前又は後に3日までの増減で行うことも可能であることが理解されるだろう。したがって、一実施形態において、投与量が15mg/kgである場合、90％超の共局在化を維持するために好適な投与間隔は11〜17日である（すなわち、最適な14日の投与間隔の前又は後に3日）。別の実施形態において、投与量が15mg/kgである場合、90％超の共局在化を維持するために好適な投与間隔は12〜16日である（すなわち、最適な14日の投与間隔の前又は後に2日）。別の実施形態において、投与量が15mg/kgである場合、90％超の共局在化を維持するために好適な投与間隔は13〜15日である（すなわち、最適な14日の投与間隔の前又は後に1日）。
【００２５】
本発明のさらなる態様では、患者における神経障害の治療又は予防方法であって、該患者に、14日（+/- 3日）毎に15mg/kgの投与量で抗Nogo-A抗体を投与することを含む方法を提供する。
【００２６】
本発明において使用することができる抗Nogo-A抗体の例は、WO 2004/052932、WO 2005/028508、WO 2005/061544及びWO 2007/068750に記載されており、その抗Nogo-A抗体を参照により本明細書に組み入れる。
【００２７】
一実施形態において、抗Nogo-A抗体はモノクローナル抗体である。
【００２８】
一実施形態において、抗Nogo-A抗体はヒト化抗体である。本明細書で参照する用語「ヒト化抗体」とは、非ヒトドナー免疫グロブリン由来のそのCDRを有し、分子の残りの免疫グロブリン由来の部分が1種（又はそれ以上）のヒト免疫グロブリン（群）由来である、操作された抗体のタイプを指す。さらに、フレームワーク支持残基を、結合アフィニティを保存するように改変することができる（例えばQueen et al., Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989), Hodgson et al., Bio/Technology, 9:421 (1991)を参照のこと）。好適なヒトアクセプター抗体は、慣用のデータベース、例えばKABAT(登録商標)データベース、Los Alamosデータベース、及びSwiss Proteinデータベースから、ドナー抗体（この場合には、マウスドナー抗体2A10）のヌクレオチド及びアミノ酸配列に対する相同性によって選択されるものとすることができる。ドナー抗体のフレームワーク領域に対する（アミノ酸に基づく）相同性によって特徴付けられるヒト抗体は、ドナーCDRの挿入のための重鎖定常領域及び／又は重鎖可変フレームワーク領域を提供するために好適である。軽鎖定常又は可変フレームワーク領域を提供可能な好適なアクセプター抗体を同様に選択することができる。アクセプター抗体重鎖及び軽鎖は同じアクセプター抗体由来である必要はないことに留意すべきである。中でもEP-A-0239400及びEP-A-054951は、そのようなヒト化抗体を作製するいくつかの方法を記載している。
【００２９】
用語「ドナー抗体」とは、その可変領域、CDR、又は他の機能的フラグメント若しくは類似体のアミノ酸配列をヒト化抗体に与え、それにより、ドナー抗体に特徴的な抗原特異性及び中和活性を有するヒト化抗体を提供する、非ヒト抗体を指す。
【００３０】
用語「アクセプター抗体」とは、その重鎖及び／若しくは軽鎖フレームワーク領域並びに／又はその重鎖及び／若しくは軽鎖定常領域のアミノ酸配列をヒト化抗体に提供する、ドナー抗体と異種の抗体を指す。アクセプター抗体は、ヒトにおいて非免疫原性であれば、任意の哺乳動物由来であってよい。一実施形態において、アクセプター抗体はヒト抗体である。
【００３１】
あるいは、ヒト化は、「ベニアリング（veneering）」の方法によって達成することができる。特有のヒト及びマウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域の統計解析により、露出残基の厳密なパターンがヒト及びマウス抗体で異なり、最も特有の表面位置では、少数の異なる残基が強く優先されることが明らかになった（Padlan E.A. et al; (1991) Mol. Immunol. 28, 489-498及びPedersen J.T. et al (1994) J.Mol.Biol. 235; 959-973を参照のこと）。したがって、ヒト抗体で通常見出されるものと異なるそのフレームワーク領域中の露出残基を置換することによって非ヒトFvの免疫原性を低減することが可能である。タンパク質抗原性は表面接触可能性（アクセッシビリティ）と相関するため、表面残基の置換は、マウス可変領域をヒト免疫系に「不可視に」するために十分である（Mark G.E. et al (1994) Handbook of Experimental Pharmacology vol.113: The pharmacology of monoclonal Antibodies, Springer-Verlag, pp105-134も参照のこと）。このヒト化手順は「ベニアリング」と称される。その理由は、抗体の表面のみを改変し、支持残基は元のままであるからである。さらなる別のアプローチはWO 2004/006955に記載されている。
【００３２】
「CDR」は、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の超可変領域である、抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列として定義される。例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Ed., U.S. Department of Health and Human Services, National Institutes of Health (1987)を参照のこと。免疫グロブリンの可変部分に3つの重鎖CDR及び3つの軽鎖CDR（又はCDR領域）が存在する。ゆえに、本明細書中で使用される「CDR」とは、すべての3つの重鎖CDR、又はすべての3つの軽鎖CDR（あるいは、適切な場合には、すべての重鎖及びすべての軽鎖CDRの両者）を指す。抗体の構造及びタンパク質フォールディングにより、他の残基が抗原結合領域の部分とみなされることになり、そうなることが当業者によって理解される。例えば、Chothia et al., (1989) Conformations of immunoglobulin hypervariable regions; Nature 342, p877-883を参照のこと。
【００３３】
一実施形態において、抗Nogo-A抗体は、中和抗Nogo-A抗体又はそのフラグメント、例えばマウス抗体2A10、15C3及び2C4（WO 2005/016544に記載の通り。その内容をその全体として参照により本明細書に組み入れる）などである。
【００３４】
一実施形態において、抗Nogo-A抗体は、WO 2004/052932（その内容をその全体として参照により本明細書に組み入れる）に記載の抗体のいずれかである。WO 2004/052932に開示された抗体の例は、11C7（そのヒト化バリアントを含む）である。
【００３５】
一実施形態において、抗Nogo-A抗体は、WO 2005/028508及びWO 2009/056509（その内容をその全体として参照により本明細書に組み入れる）に記載のヒト抗Nogo-A抗体のいずれかである。さらなる実施形態において、抗Nogo-A抗体は、WO 2009/056509に記載されているヒト抗Nogo-A抗体6A3である。
【００３６】
一実施形態において、抗Nogo-A抗体は、WO 2007/068750に記載の抗Nogo-A抗体を含む。さらなる実施形態において、抗Nogo-A抗体は、ヒト化抗体、例えば2A10のヒト化バリアントなど、例えばH20L16、H28L16、H28L13及びH27L16（WO 2007/068750に記載の通り。その内容をその全体として参照により本明細書に組み入れる）、ヒト抗体、又はそれらのフラグメントを含む。
【００３７】
さらなる実施形態において、抗Nogo-A抗体は、H27L16（WO 2007/068750の配列番号48及び配列番号14）、H28L13（WO 2007/068750の配列番号49及び配列番号13）、又はH28L16（WO 2007/068750の配列番号49及び配列番号14）を含む。また別の実施形態において、抗Nogo-A抗体は、H28L16（WO 2007/068750の配列番号49及び配列番号14、本明細書中、それぞれ配列番号1及び2）を含む。
【００３８】
さらなる実施形態において、抗Nogo-A抗体は、H27FL L16FL（WO 2007/068750の配列番号54及び配列番号18）、H28FL L13FL（WO 2007/068750の配列番号55及び配列番号17）、又はH28FL L16FL（WO 2007/068750の配列番号55及び配列番号18）を含む。また別の実施形態において、抗Nogo-A抗体は、H28FL L16FL（WO 2007/068750の配列番号55及び配列番号18）を含む。
【００３９】
さらなる実施形態において、抗Nogo-A抗体は、H28L16（WO 2007/068750の配列番号49及び配列番号14）、又はH28FL L16FL（WO 2007/068750の配列番号55及び配列番号18）を含む。また別の実施形態において、抗Nogo-A抗体は、H28L16（WO 2007/068750の配列番号49及び配列番号14）を含む。
【００４０】
さらなる実施形態において、抗Nogo-A抗体又はそのフラグメントは、2A10、H28L16又は6A3のCDRの1つ以上、場合により6つを含む。さらなる実施形態において、抗Nogo-A抗体又はそのフラグメントは、H28L16と同じヒトNogo-Aのエピトープ（ヒトNogo-Aの610〜621アミノ酸、WO 2010/004031からの配列番号6を含む）に結合する、又はヒトNogo-Aに対するH28L16の結合と競合する抗体である。
【００４１】
本発明の投与レジメンにおいて治療することができる神経障害の例は、卒中（虚血性又は出血性）、外傷性脳損傷、脊髄損傷、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症（タウオパシー）、末梢神経障害、パーキンソン病、クロイツフェルト-ヤコブ病（CJD）、統合失調症、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多発性硬化症、ハンチントン病、多発性硬化症、封入体筋炎、多発性筋炎、皮膚筋炎、形態的非特異性筋障害、うっ血性心不全及び神経障害性疼痛から選択される。
【００４２】
一実施形態において、神経障害は筋萎縮性側索硬化症（ALS）である。
【００４３】
本発明の抗Nogo-A抗体又はそのフラグメントの投与方法は、薬剤を宿主に送達する好適な経路のいずれかとすることができる。本発明の抗体及び医薬組成物は、非経口投与、すなわち皮下（s.c）、髄腔内、腹腔内（i.p.）、筋内（i.m.）、静脈内（i.v.）、又は鼻内（i.n.）投与に特に有用である。一実施形態において、抗Nogo-A抗体又はそのフラグメントは静脈内投与される。別の実施形態において、抗Nogo-A抗体又はそのフラグメントは皮下投与される。
【００４４】
本発明の第２の態様において、抗Nogo-A抗体又はその機能性フラグメントを、該抗体と患者の細胞膜上のヒトNogo-Aとの共局在化のレベルを90％超に達成し、かつ維持する投与量で投与することを含む、患者における神経障害の治療又は予防に使用するための抗Nogo-A抗体を提供する。
【００４５】
本発明の第３の態様において、抗Nogo-A抗体又はその機能性フラグメントを、該抗体と患者の細胞膜上のヒトNogo-Aとの共局在化のレベルを90％超に達成し、かつ維持する投与量で投与することを含む、患者における神経障害の治療又は予防に使用するための、抗Nogo-A抗体又はその機能性フラグメントを含む医薬組成物を提供する。
【００４６】
本発明の医薬組成物は、典型的には、薬学的に許容される担体中に活性成分として本発明の抗体の有効量を含有する。本発明の予防剤において、操作された抗体を含む水性懸濁液又は溶液であって、典型的には、即時注射用の形態の、生理学的pHに緩衝化されているものが好ましい。非経口投与用組成物は、本発明の抗体の溶液、又は薬学的に許容される担体（典型的には水性担体）中に溶解されたその混合液を含むことが一般的である。種々の水性担体が使用されており、例えば0.9％生理食塩水、0.3％グリシンなどである。これらの溶液は滅菌であり、一般的に粒子状物質を含まない。これらの溶液は、慣用的な周知の滅菌技法（例えばろ過）により滅菌することができる。組成物は、生理学的条件に近づけるために必要な、薬学的に許容される補助物質、例えばpH調整剤及び緩衝剤などを含んでもよい。かかる医薬製剤における本発明の抗体の濃度は、広く変動可能であり、すなわち約0.5重量％未満、通常は約1重量％又は少なくとも約1重量％から、15又は20重量％程度までであり、主に液体容積、粘度などに基づき、選択した特定の投与方法に応じて選択しうる。
【００４７】
したがって、筋内注射用の本発明の医薬組成物は、1mLの滅菌緩衝用水、及び約1ng〜約100mg、例えば約50ng〜約30mg又はそれ以上、例えば約5mg〜約25mgの本発明の抗体を含むように調製することができる。同様に、静注用の本発明の医薬組成物は、約250mlの0.9％通常生理食塩水（塩化ナトリウム）溶液、及び0.9％通常生理食塩水（塩化ナトリウム）溶液1ml当たり約1〜約30、典型的には5mg〜約25mgの本発明の操作された抗体を含むように調製することができる。非経口投与可能な組成物の実際の調製方法は、周知であるか又は当業者には明らかなものであり、例えば、Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvaniaにより詳細に記載されている。本発明の静脈内投与可能な抗体製剤の調製については、Lasmar U and Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech.today, p.129-137, Vol.3 (3rd April 2000), Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B (編)Ahem T.J., Manning M. C, New York, NY: Plenum Press (1992), Akers.M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J.Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K et al"Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274, lzutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein- structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922. Ha, E Wang W, Wang YJ. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002)を参照されたい（その全内容を参照により本明細書に組み入れ、その読者は具体的に参照される）。
【００４８】
本明細書に記載される抗体は、保存のために凍結乾燥され、使用前に好適な担体で再構成するものであってもよい。この技法は、従来の免疫グロブリンに有効であることが示されており、当技術分野で公知の凍結乾燥及び再構成技法を採用することができる。
【００４９】
一実施形態において、抗Nogo-A抗体は、さらなる治療薬と組み合わせて投与する。さらなる実施形態において、さらなる治療薬は、筋萎縮性側索硬化症（ALS）に対する効力を有する薬剤である。また別の実施形態において、筋萎縮性側索硬化症（ALS）に対する効力を有する薬剤は、デクスプラミペキソールである。デクスプラミペキソール（KNS-760704; (R)-N6-プロピル-4,5,6,7-テトラヒドロベンゾ[d]チアゾール-2,6-ジアミン）は、Knopp Biosciences及びBiogenにより開発中の薬物である。102人の患者を含む2010フェーズII臨床試験では、ALS疾患進行の緩慢化が示され、現在フェーズIII試験が進行中である。
【００５０】
一実施形態では、抗Nogo-A抗体を、抗グルタミン酸活性を有する化合物とともに投与する。特定の実施形態では、抗グルタミン酸活性を有する化合物はリルゾールである。別の実施形態では、抗グルタミン酸活性を有する化合物は、2,3-ベンゾジアゼピン化合物、特に、タランパネル（talampanel）などのAMPA受容体のアンタゴニストである。別の実施形態では、抗グルタミン酸活性を有する化合物はTRO19622又はセフトリアキソンである。抗Nogo-A抗体及び抗グルタミン酸活性を有する化合物は、同時に、連続して又は別々に、患者に投与することができる。抗グルタミン酸活性を有する化合物がリルゾールである場合、約50mg〜約150又は200mgのリルゾールを毎日患者に投与することができ、典型的には100mgのリルゾールを毎日患者に投与する。リルゾールは典型的には経口投与される。抗グルタミン酸活性を有する化合物がタランパネルである場合、約10mg〜約250mgのタランパネルを1日あたり1〜5回、典型的には経口で投与する。一実施形態では、タランパネルを、25mg又は50mgの用量で、1日あたり1〜5回、場合により1日あたり3回、投与する。
【００５１】
本発明を、以下の試験を参照して説明する。
【実施例】
【００５２】
実施例1：Nogo A及びH28L16の共局在化分析
レーザー走査型サイトメトリー（LSC）では、レーザーを使用して蛍光色素を励起することにより、細胞内及び組織切片内の色素位置の画像を生成し、これによりその位置で発現を測定することが可能になる。色素は、標的タンパク質に結合する抗体に結合している。Alexa 647色素に結合させた市販の抗Nogo A抗体を使用して、H28L16の標的を特定した。市販のNogo A抗体を用いて、組織切片中の標的を測定することが可能になった。また、どれだけの標的（Nogo A）が筋肉繊維膜上に位置するか知ることも望まれた。これは、筋肉繊維膜タンパク質に対する抗体である、Alexa 488色素を結合させた抗γサルコグリカンで切片を染色することにより実施した。
【００５３】
これにより、筋肉繊維膜と共局在化している標的（Nogo A）及びその膜と共局在化していない標的（Nogo A）を特定し、その量を測定することが可能になった。次に、投与を受けた筋肉切片中のH28L16の量の定量化及びその標的（Nogo A）との共局在化の量の定量化が必要である。H28L16のこの定量化を可能とするために、Alexa 555色素で標識した、H28L16に対する非中和抗イディオタイプ抗体を使用して、筋肉切片を標識した。それら3種の成分を3種の異なる色素で標識すると、LSCソフトウェアを使用して、それぞれの特徴を区別し、測定することが可能になる。
【００５４】
ウエル走査を実施することで組織切片（灰色画像）を特定し、4つの領域（シアンボックス）を各切片に配置した。高分解能フィールド走査により、3種色素の位置の画像を得た。
【００５５】
図1は、色を各チャンネルに割り当てた、LSC領域画像を示す。例えば、個々のタンパク質は、青色（γサルコグリカン）、赤色（Nogo A）、及び緑色（H28L16）に着色されている。白色で縁取られた長方形ボックスは、領域画像を構成する個々のフィールド画像である。各領域画像に10のフィールド画像が含まれていた。
【００５６】
散布図を作成し、蛍光強度に基づいて特徴について色素の画素を区別した。その画素は、「ゲーティング（gating）」として知られるプロセスを用いる（特異的シグナルからバックグラウンドノイズを分離した）閾値であった。ゲーティングは、着色ラインとして散布図に表示され、ゲートは、ゲートが作成された順にしたがって、R1、R2、及びR3・・・等と標識される（図2）。図2の散布図は、2つのチャンネルを互いにプロットすることにより作成した。組織の膜領域及び非膜領域は、「緑色強度」に対して「緑色マックスピクセル（maxpixel）」をプロットすることで、区別した。R1において最明画素は、γサルコグリカン抗体で標識した膜上にある。R5における減光画素は非標識繊維である。長赤色強度の値をその膜の値（緑色マックスピクセル）に対してプロットし、膜R2と共局在化しているNogo Aの量を求めた。膜上の薬剤量を求めるために、黄色強度に対して緑色マックスピクセルをプロットした。これは投与前生検であるため、もし存在する場合には膜上に薬剤を含むはずであるR3に、事象はない。最後のプロットは、膜上でNogo Aと共局在化していると思われる薬剤を示す。
【００５７】
ゲーティングした集団内の画素のグループを、着色ボックスとして画像に表示することができる。このプロセスは「バックゲーティング法（back gating）」として周知である。それは、ゲートの最も正確な配置を確認する品質管理タスクである（図3）。図2の散布図におけるゲーティングした集団が、図3の画像に表示されている。図3では、これらデータは媒体のみを投与した患者に由来するものであり、したがって、H28L16に対する抗イディオタイプ抗体で染色するバックグラウンドは最小であり、Nogo-A（赤色ボックス）との共局在化の証拠に乏しいことを、留意すべきである。
【００５８】
15mg/kgのH28L16を投与した患者に由来するデータを示す図4及び5と比較すると、バックゲーティングにより、Nogo Aと共局在化していないH28L16の位置を示す緑色ボックス及びH28L16とNogo Aとの共局在化を示す赤色ボックスが示されることに留意されたい。このように、図4及び5は、R3における陽性の薬剤事象及び薬剤とNogo Aの共局在化を示している。
【００５９】
図6は、個々の蛍光チャンネルを示している。投与前生検は赤色であり、H28L16とNogo Aとの共局在化及びNogo Aと共局在化していない過剰のH28L16を示す投与後生検と比較して、橙/黄色蛍光はない。高い共局在化が、繊維膜に沿って生じていた。
【００６０】
図7は、H28L16と共局在化している、筋肉繊維膜上のNogo Aの割合（％）を示すグラフである。3つの切片を切り、各患者の生検材料（薬剤又はプラセボいずれかの投与前及び投与後）ごとに評価した。Nogo-Aと共局在化している抗イディオタイプ抗体で見られる非特異的バックグラウンド染色を表す、やや低レベルの共局在化が、非投与対象（投与前又はプラセボ投与のいずれか）に由来する生検中に見られた。より高レベルの抗イディオタイプ染色及び共局在化が、薬剤投与後のサンプル中に一貫して見られ、共局在化は用量依存的な増加を示した。強調された切片は、筋肉膜上で最も高レベルのH28L16とNogo Aとの共局在化を示し、これは15mg/kgのH28L16を投与後8日目の対象から採取した生検中に見られた。
【００６１】
実施例2：共局在化実験の使用による、筋萎縮性側索硬化症（ALS）のためのH28L16の最適投与レジメンの調査
筋肉中のH28L16への薬力学的反応の直接的尺度がない中で、実施例1に記載のように、用量選択の情報を提供するために、骨格筋細胞膜の標的部位における、Nogo-AとのH28L16の共局在化を使用した。例えば、Nogo-Aの筋肉レベル及びH28L16の骨格筋への生体分布を推定するために、「ヒト初回投与（First Time in Human）」（FTiH）試験における特定のコホートから、筋肉生検を採取した。免疫組織化学分析を支援するのに充分な品質を有する凍結生検材料（まず0.5mg/kgから、2.5mg/kg及び15mg/kgコホート）を、Nogo-Aに対する抗体、H28L16に対する抗イディオタイプ抗体、及び（筋肉膜を特定する）抗γサルコグリカンで染色した。発現は、蛍光標識した二次抗体を使用して可視化し、レーザー走査型サイトメトリー（LSC）を使用して定量化した。本手法を使用して、筋肉膜上のNogo-Aの発現を評価することができ、γサルコグリカンとの共局在化により、細胞内Nogo-Aの発現と区別した。さらに、H28L16の筋肉レベルの推定値も測定され、筋肉膜上でのNogo-AとH28L16との共局在化の程度の推定値も導き出された。
【００６２】
抗イディオタイプ染色を使用してH28L16の筋肉レベルを評価すると、薬剤染色における用量依存的増加が観察され、0.5mg/kgでは測定可能な染色はなく、最も高い染色は、投与後22〜27日目に、15mg/kg投与の対象に由来する生検において見られた（筋肉中薬剤レベルのイムノアッセイ測定と一致する）。15mg/kg反復投与コホート（コホート8）で生検の採取時点を変えることで、投与後の、筋肉への薬剤生体分布の経時変化を評価することが可能になった。これらのデータにより、H28L16の筋肉レベルは、当初は、1日目においてより低く、8日目まで増加した後、23〜24日目までには再び微減することがわかった。
【００６３】
これら生検の膜Nogo-Aレベルを更に測定することにより、投与後の、標的部位でのNogo-AとH28L16との共局在化の程度を評価することも可能になった。図8は、2.5mg/kg及び15mg/kg各コホートから採取した投与後生検中の、筋肉細胞膜においてH28L16と共局在化しているNogo-Aの百分率中央値を示す（ここで100％は、H28L16と共局在化している膜Nogo-A全てに等しいとする）。
【００６４】
共局在化の程度は、筋肉中のH28L16の測定レベルに密接に追従し、15mg/kg処置の対象に由来する生検において2.5mg/kgコホートに由来する生検よりも高いレベルが見られた。15mg/kg反復投与コホートにおいて、共局在化はH28L16のレベルとやはり相関し、1日目で約50％の共局在化中央値、投与後8日目で、試験薬剤と共局在化している、筋肉膜上のNogo-Aが>90％までに上昇した後、22〜27日目で約70％に低減した。
【００６５】
共局在化は標的占有率と同等ではないが、最大の薬力学効果を達成するためには、投与期間全体を通じ、筋肉膜Nogo-AとH28L16との>90％の共局在化が必要であると考えられる。LSCデータに基づいて、投与後8日目で膜Nogo-AとH28L16との>90％の共局在化を達成するには、H28L16の15mg/kg用量レベルを必要とするが、この共局在化の程度は23〜24日までは維持されなかった。生検時のH28L16の推定血漿濃度（集団PKモデルを使用）間で潜在的関係を調査するための、探索的PK-PDモデリングが、共局在化の対応するレベルとともに、図9に示されている。これらデータにEmaxモデルを適用して、約18μg/mL範囲のEC50及び約160μg/mLのEC90を推定した。
【００６６】
EC90を上回るH28L16の血漿濃度を維持する投与レジメンを調査するための集団PKモデリング及び続いて行うシミュレーションから、FTiH試験内で利用された投与レジメン（15mg/kg、4週間毎に1回）では、投与期間にわたって160μg/mLを上回る血漿濃度が、平均して、充分に維持されないと、予測されることが明らかとなった。ところが、投与頻度を15mg/kg、2週間毎に1回へと増加すると、投与期間全体を通じ、160μg/mLを上回る濃度が、平均して、維持されると予測された。2週間毎に及び4週間毎に投与された15mg/kgについてH28L16の予測血漿濃度の時間プロフィールを、以下の図10及び図11に、それぞれ示す。2週間毎に15mg/kgという提案された投与レジメンに関して、H28L16の予測血漿暴露（Cmax及びAUC(0-tau)）を表1に示す。
【００６７】
【表１】
2015521992.tif 000003
【００６８】
2週間毎に1回の頻度での15mg/kgの反復投与後の、定常状態でのヒトの予測全身暴露は、15mg/kgの単回投与後の予測全身暴露のほぼ2倍である。
【００６９】
ALS患者におけるFTiH試験の経験から、H28L16は4週間毎に1回、15mg/kgの用量で充分に耐容性であることが示された。14日毎に静脈内500mg/kgへと用量を増加した、カニクイザル（cynomologous monkey）での12カ月の長期毒物学試験では、有意な毒性は認められなかった。2週間毎に投与される15mg/kgの用量に基づく、提案されたフェーズ2試験において、定常状態での、ヒトの予測血漿暴露を超えるH28L16への暴露のサル対ヒトの限界（margin）は、（i）用量比をベースとして33倍、（ii）定常状態AUC比をベースとして10倍、（iii）定常状態Cmax比をベースとして27倍である。
【００７０】
非臨床試験に由来する安全性及び全身暴露限界、臨床安全性、FTiH試験に由来するPKと共局在化の関係データ、並びに集団PKモデリングに基づき、H28L16に対する最適用量は、2週間毎に1回、15mg/kgであると思われる。臨床試験でこれまでに得られた暴露レベルを超えると予測されるが、本用量は、非臨床安全性データによって充分に裏付けられ、かつALS患者において効力をもたらす機会を最大化する。
【図１】
2015521992.tif 000004
【図２】
2015521992.tif 000005
【図３】
2015521992.tif 000006
【図４】
2015521992.tif 000007
【図５】
2015521992.tif 000008
【図６】
2015521992.tif 000009
【図７】
2015521992.tif 000010
【図８】
2015521992.tif 000011
【図９】
2015521992.tif 000012
【図１０】
2015521992.tif 000013
【図１１】
2015521992.tif 000014
【国際調査報告】
2015521992.tif 000015
2015521992.tif 000016