(57)【要約】本発明は、ヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の類似体、特に、末端シアル酸を含むオリゴ糖を提供するための方法に関する。この方法は、以下の工程を含む：ａ）少なくとも２つの末端結合したβ連結ガラクトース残基を含む非消化性ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の供給源を提供すること；ｂ）（α２−３）シアリル化Ｏグリカンを有するシアル酸供与体を提供すること；ｃ）前記ＧＯＳと前記シアル酸供与体を、酵素反応混合物中のトランスシアリダーゼ活性を有する酵素の存在において接触させること；及びｄ）前記酵素反応混合物から、乾燥物に基づくジシアリル化ガラクトオリゴ糖（ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ）の少なくとも２０重量パーセントを含む分画を単離すること。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアル酸含有オリゴ糖を含む組成物を提供するための方法であって、以下の工程：
ａ）少なくとも２つの末端結合したβ連結ガラクトース残基を含む非消化性ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の供給源を提供すること；
ｂ）（α２−３）シアリル化Ｏグリカンを有するシアル酸供与体を提供すること；
ｃ）前記ＧＯＳと前記シアル酸供与体を、酵素反応混合物中のトランスシアリダーゼ活性を有する酵素の存在において接触させること；及び
ｄ）前記酵素反応混合物から、乾燥物に基づくジシアリル化ガラクトオリゴ糖（ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ）の少なくとも５重量パーセントを含む分画を得ること
を含む、方法。
【請求項２】
ガラクトオリゴ糖の供給源が、βガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）を用いたラクトースの又はラクトース及びトレハロースの混合物の酵素処理により得られる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳが、ＤＰ４からＤＰ１０、好ましくはＤＰ５からＤＰ８の範囲内の重合の程度（ＤＰ）を有する、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
シアル酸供与体が、天然化合物、好ましくは、オリゴ糖、多糖、ポリシアル酸、糖タンパク質、及び糖脂質に結合したシアル酸より選択される、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
シアル酸供与体が、グリコシル化された乳清タンパク質及びカゼイン、ならびにそのフラグメント、好ましくは、κカゼインからのグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）からなる群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項６】
シアル酸供与体が、グリコシル化粘液タンパク質、及びそのフラグメント、好ましくは、ブタ小腸糖タンパク質（ＰＳＭＧ）からなる群より選択される、請求項４記載の方法。
【請求項７】
シアル酸供与体がムチンから得られ、場合により、Ｓｉａ含有ムチンポリマーの濃縮が続く、請求項６記載の方法。
【請求項８】
トランス−シアリダーゼ活性を有する酵素が、トリパノソーマ属、好ましくはトリパノソーマ・クルーズ又はトリパノソーマ・コンゴレンスの微生物からの遺伝子産物によりコードされる、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
酵素を組換え的に産生する、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
酵素反応混合物のｐＨが、４と６の間、好ましくは４．８と５．８の間の範囲である、請求項１〜９のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
工程ｄ）が、分離すべき成分間の電荷における差に基づく分離技術、好ましくは陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、請求項１〜１０のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
工程ｄ）が、分離すべき成分間のサイズにおける差に基づく分離技術、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーを含む、請求項１〜１１のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項記載の方法により入手可能な、少なくとも５重量%のジシアリル化ガラクトオリゴ糖を含む組成物。
【請求項１４】
少なくとも７重量%、好ましくは少なくとも１０重量%のジシアリル化ガラクトオリゴ糖を含む、請求項１３記載の組成物。
【請求項１５】
以下
【表１２】
2015508388.tif 000015
からなる群より選択される１つ又は複数のジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ種を含む、請求項１３又は１４記載の組成物。
【請求項１６】
栄養的、医薬的、又は栄養補助食品添加物としての使用のための、請求項１３〜１５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項１７】
好ましくは、産物が乳児用調合乳である、請求項１３〜１５のいずれか一項記載の組成物を含む栄養産物。
【請求項１８】
好ましくは、飼料産物が子豚又は仔牛用に調合される、請求項１３〜１５のいずれか一項記載の組成物を含む動物飼料産物。
【請求項１９】
請求項１〜１２記載の方法に従い、乾燥物に基づくジシアリル化ガラクトオリゴ糖（ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ）の少なくとも５重量パーセントを含む分画を単離すること、及び、前記分画を、タンパク質源、脂肪源、及び炭水化物源と一緒に乳児用調合乳中に調合することを含む、乳児用調合乳を提供するための方法。
【請求項２０】
それを必要とする被験者、好ましくはヒト被験者、より好ましくは早産児において病原体による感染を処置又は防止する方法における使用のための、請求項１３〜１５のいずれか一項記載の組成物。
【請求項２１】
病原体が、細菌又は原生動物、好ましくは赤痢アメーバである、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
アメーバ症又は壊死性腸炎（ＮＥＣ）を処置又は防止するための、請求項２０記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の類似体、特に、末端シアル酸を含むオリゴ糖（以下：シアル酸含有オリゴ糖）、特にシアリル化ガラクトオリゴ糖（Ｓｉａ−ＧＯＳ）を提供するための方法に関する。また、本発明は、入手可能なシアリル化オリゴ糖、及び、特に乳児食品及び動物飼料におけるその使用に関する。
【０００２】
ヒト乳は、異なる生理学的機能（病原微生物についてのプレバイオティクス成分及び抗接着成分を含む）を伴う多量で多様な（＞１００の構造）オリゴ糖を含む。特に、シアル酸含有オリゴ糖（ＳＯＳ）は、大腸菌及びサルモネラ種を含む、病原性微生物の小腸での接着を阻害することが示された。ＳＯＳはヒト乳に豊富に存在し（０．６〜３．３g/l）、授乳（初乳）の最も初期段階の牛乳中でさらに高濃度に達することができる。牛乳中には、しかし、ＳＯＳは、非常に少量しか存在しない。従って、ヒト乳と牛乳ベースの乳児用調合乳の間での大きな矛盾が、ＳＯＳの豊富さに関して存在する。
【０００３】
ヒト乳のシアリル化オリゴ糖において、Ｎアセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）は、α２−３もしくはα２−６連結を介して後から２番目のガラクトース残基に又はα２−６連結を介して内部Ｎアセチルグルコサミン残基に付着される（シアリルトランスフェラーゼの作用により形成される）。いくつかの病原性微生物（例えばビブリオ・コレラエ、大腸菌、ヘリコバクターピロリ、ならびにインフルエンザウイルスＡ及びＢなど）は、標的細胞上のシアル酸を含む炭水化物受容体構造を認識する；ヒト乳中のシアリル化成分は、従って、可溶性の受容体類似体として機能し、細胞表面受容体へのこれらの病原体の付着を阻害しうる。シアル酸は、乳児の脳ガングリオシド及びシアリル糖タンパク質の合成のために用いられることが提案されている。ヒト乳が、乳児のためのシアル酸の豊かな供給源であるという事実は、産後の最初の月の間での脳ガングリオシドの迅速な形成が、乳シアリル−オリゴ糖及びシアリル複合糖の代謝利用に依存することを示唆する。
【０００４】
ルールとして、その目的は、乳児及び新生児用食品を可能な限りヒト乳に似せることであるため、いくらかの研究者は、そのような食品（特に、乳児用ミルク製剤を伴う）をシアル酸含有オリゴ糖で豊かにする必要性を認識した。
【０００５】
焦点は、主にシアリルラクトースにあった。なぜなら、これらは、他の哺乳動物種と比較し、ヒト乳中に著しく高い濃度で存在するためである。シアリルラクトースは、特定の病原性細菌について抗接着特性を有することが公知である。例えば、シアリルラクトースは、インビトロでコレラ毒素（Idota et al., Biosci. Biotech. Biochem. 59: 417-419, 1995）及びヘリコバクター・ピロリ（Simon et al., Infection and Immunity 65: 750-757, 1997）を阻害するように作用する。
【０００６】
その抗接着特性に照らして、シアリルラクトースは、多くの医学的状態を処置又は防止するために使用されてきた。例えば、US 5,260,280には、細菌エンテロトキシンの効果を中和する、シアル酸含有オリゴ糖を含む組成物が開示されている。US 5,514,660、US 5,753,630、及びUS 5,883,079には、シアル酸含有オリゴ糖の効果的な量を投与することにより、それぞれ、胃又は十二指腸における潰瘍を処置又は防止する、あるいはヘリコバクターピロリ感染を阻害するための方法が開示されている。US 5,620,965は、特定のオリゴ糖の効果的な量を投与することによる、胃又は十二指腸細胞への細菌ヘリコバクターピロリの結合を阻害するための組成物に関する。US 5,834,423には、ビフィズス菌の増殖を促進するシアル酸誘導体及び抗下痢剤としての特定のシアリル化オリゴ糖の効果的な量の使用が記載されている。シアリル化オリゴ糖は、３’シアリルラクトース及び６’シアリルラクトース（シアル酸＝Ｎｅｕ５Ａｃ）を含む。W02001060346には、相乗的に作用し、有益なビフィズス菌の成長を刺激するプレバイオティック物質（オリゴフルクトース及びシアリルラクトース）を含む栄養組成物が開示されている。WO01/60346には、栄養組成物、例えば、オリゴフルクトース及びシアリルラクトースを含む乳児用調合乳などが開示されている。EP1549151には、オリゴフルクトース、シアリルラクトース、及びプロバイオティック細菌の組み合わせによって、病原性細菌、特に腸内病原性大腸菌を伴う腸感染症が根絶され、従って、腸内病原性大腸菌に起因する下痢の予防のために使用してもよいことが記載されている。US20070104843は、特に乳児、小児、及び高齢者について意図された食品、ならびに医療又は食事目的及び他の食品適用のための食品における使用のための乳由来シアリルラクトース濃縮物に関する。それには、また、天然シアリルラクトースを含む乳産物の限外濾過、それに続く限外濾過保持液の透析濾過を含む、シアリルラクトース濃縮物を産生するためのプロセスが開示されている。WO2009/113861は、出願人の名前において、シアル酸含有オリゴ糖、特にシアリルラクトースを、乳流から、特に乳清流から単離するためのプロセスに関する。プロセスは、高含量のシアリルラクトース及び低含量のリン化合物を有する産物をもたらす。この産物は、乳児用食品を補うために高度に適切である。WO 2010/116317は、工業規模でのその使用を許す条件下でのケーニッヒス−クノール反応によるカップリングの工程を含む、シアリル−オリゴ糖の、特に６’シアリルラクトース及びその塩の合成のプロセスに関する。
【０００７】
Thurl et al.（British J. Nutr. 104: 1261-1271, 2010）は、授乳の最初の３ヶ月間に得られた多数のヒト乳サンプルでの乳オリゴ糖組成の詳細な研究を報告した。分析したシアリル化オリゴ糖は、３’シアリルラクトース（３’ＳＬ）、６’シアリルラクトース（６’ＳＬ）、シアリル−ラクト−Ｎ−テトラオースａ−ｃ（ＬＳＴａ−ｃ）、及びジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース（ＤＳＬＮＴ）であった。シアリルラクトースの他、ＤＳＬＮＴが最も顕著なシアリル化オリゴ糖であることが見出された。ＤＳＬＮＴは、産後の最大時間曲線１５日を示した。Asakuma et al.（Biosci. Biotechnol. Biochem., 71: 1447-1451, 2007）は、授乳の最初の３日間でのヒト初乳のシアリル−オリゴ糖中の濃度における変化を研究した。決定した初乳シアリル−オリゴ糖の内、ＬＳＴｃが最も高い濃度で存在し、ＤＳＬＮＴ、３’ＳＬ、及び６’ＳＬが続いた。
【０００８】
故に、本発明の目標は、ジシアリル化ＨＭＯの類似体として使用することができる（人工の）ジシアリル化オリゴ糖の製造のためのプロセスを提供することである。好ましくは、このプロセスを簡単にスケールアップし、工業規模でジシアリル化オリゴ糖を生成することができる。有利なことに、前記プロセスでは、食肉又は酪農産業など、他の種類の産業からの比較的安価な副産物を使用する。
【０００９】
驚くべきことに、上の目標は、シアル酸を用いてガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）を修飾することにより満たすことができることが見出された。ＧＯＳは、ＤＰ２−９の範囲で、複数のガラクトース（Ｇａｌ）単位を含むオリゴ糖であり、酵素βガラクトシダーゼによりラクトースから合成される。ＧＯＳは工業規模で産生され、種々の最終産物（例えば乳児用調合乳及び乳製品ベースの飲料など）での適用を有する。ＧＯＳはヒト小腸中で分解されないため、それらは大部分が無傷で結腸に達し、そこで、有益な細菌（乳酸桿菌及びビフィズス菌など）の成長を刺激するプレバイオティクスとしての役割を果たす。ＧＯＳ中のＧａｌ／Ｇａｌ連結型は、使用されたβガラクトシダーゼの供給源に依存し、（β１−２）、（β１−３）、（β１−４）、及び／又は（β１−６）である。バチルス・サーキュランスからのβガラクトシダーゼの場合において、Ｖｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳ（FrieslandCampina Domo）をもたらし、主要なＧａｌ／Ｇａｌ連結型は（β１−４）であり、より低い程度で（β１−３）及び（β１−６）であり、直鎖及び分枝オリゴ糖の還元中に存在する（表１）。ＧＯＳのグルコース部分は、また、（α１−１β）連結を介して、追加のＧａｌ残基を用いてさらに伸長することができるＧａｌ部分と接続してもよい（Fransen et al., Carbohydr. Res. 314: 101-114, 1998）。本発明者らは、還元分枝オリゴ糖及び非還元直鎖オリゴ糖の両方が、２つの末端Ｇａｌ単位、及び、故に、２つの非還元末端を持つＧＯＳ分子をもたらすことを認識したが、それらの各々は、シアル酸供与体及びトランス−シアリダーゼ（ＴＳ）酵素活性を使用し、シアル酸残基を伴い修飾することができる。
【００１０】
表１．バチルス・サーキュランスβガラクトシダーゼを用いて調製された、解明されたＧＯＳ構造（Yanahira et al., Biosc. Biotech. Biochem. 59: 1021-1026, 1995; Fransen et al., Carbohydr. Res. 314: 101-114, 1998; Fransen, PhD thesis Utrecht University, 1999; Coulier et al., J. Agr. Food Chem. 57: 8488-8495, 2009）
【表１】
2015508388.tif 000002
【００１１】
したがって、一実施態様において、本発明は、シアル酸含有オリゴ糖を含む組成物を提供するための方法に関し、以下の工程：
ａ）少なくとも２つの末端結合したβ連結ガラクトース残基を含む非消化性ガラクトオリゴ糖の供給源を提供すること；
ｂ）シアル酸供与体を提供すること；
ｃ）前記ガラクトオリゴ糖と前記シアル酸供与体を、酵素反応混合物中のトランスシアリダーゼ活性を有する酵素の存在において接触させること；及び
ｄ）前記酵素反応混合物から、乾燥物に基づくジシアリル化ガラクトオリゴ糖（ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ）の少なくとも５重量パーセントを含む分画を得ること
を含む。
【００１２】
一実施態様において、非消化性ガラクトオリゴ糖の供給源は、βガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２３）を用いたラクトースの酵素処理により得られる。異なる供給源（例えば真菌、酵母、及び／又は細菌など）からのβガラクトシダーゼを使用し、変動する鎖長及び異なるグリコシド連結比を伴うオリゴマーの混合物をもたらしうる。例えば、５７%ＧＯＳ、２１%ラクトース、ならびに２２%グルコース及びガラクトースを含む商業的なガラクトオリゴ糖調製物Ｖｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳ（Friesland Campina Domo）を使用することができる。ＧＯＳ部分は、ＤＰ＞２分画中に、２つの末端ガラクトース単位を有する還元分岐及び非還元ガラクトオリゴ糖の妥当な量を含む。一実施態様において、ラクトース及びα，αトレハロース［Ｇｌｃ（α１−１α）Ｇｌｃ］の混合物を、βガラクトシダーゼを用いて処理する。
【００１３】
ＧＯＳ出発材料を前処理し、２つの末端結合したβ連結ガラクトース残基を有するそれらの種について濃縮してもよい。例えば、ＤＰ１及び／又はＤＰ２種は、トランス−シアリダーゼ処理の前に除去してもよい。別の実施態様において、低ラクトース含量を有するＧＯＳ出発組成物（例、Ｖｉｖｉｎａｌ−ＧＯＳ９０）が適切に使用される。個々のＧＯＳ構造は、当技術分野において公知の方法により、ＧＯＳ種の混合物から分離及び単離することができる。例えば、ナノ濾過は、Goulas et al.（J. Membr. Sc. 209: 321-335, 2002）において記載される通りに使用することができる。好ましい実施態様において、ＧＯＳ混合物は、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して分画され、好ましくは、それにおいて、陽イオン交換樹脂の対イオンはカリウムである。WO2008/041843には、ＧＯＳ種の混合物から種々のＤＰ分画を単離するための方法が開示されている。
【００１４】
トランス−シアリダーゼ（図１）は、シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ又はＮｅｕ５Ｇｃ）を、種々の供与体から、端末のβ連結Ｇａｌ残基を含むアクセプター基質へ効率的に転移するユニークな能力を伴う酵素である。最も良く試験されたＴＳは、ヒト寄生虫トリパノソーマ・クルーズ（ＴｃＴＳ）からのものであり、また、ＴＳ酵素は、密接に関連するトリパノソーマ種（例えばトリパノソーマ・ブルーセイ及びトリパノソーマ・コンゴレンスなど）からが公知である（Schauer and Kamerling, ChemBioChem 12: 2246-2264, 2011）。
【００１５】
ＴｃＴＳは、以前に、（α２−３）連結シアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕ５Ｇｃの両方）だけを持つ供与体基質に対して活性であることが示された（Scudder et al., J. Biol. Chem. 268: 9886-9891, 1993；Agusti et al., Carbohydr. Res. 342: 2465-2469, 2007）。この酵素は保持機構を有し、形成された産物は、また、（α２−３）結合シアル酸を有することを意味する（Scudder et al., 1993）。適切なアクセプターの非存在において、ＴｃＴＳはヒドロラーゼ（シアリダーゼ）として作用し、遊離シアル酸をその基質から放出する。そのシアル酸転移能力及び広い基質範囲（供与体及びアクセプターの両方）のため、ＴｃＴＳ酵素が、シアリル化オリゴ糖を合成するための糖鎖生物学において広く使用される（例、Neubacher et al., Org. Biomol. Chem. 3: 1551-1556, 2005）。シアル酸をアクセプター分子に転移することが可能な他の酵素は、シアリルトランスフェラーゼである。これらの酵素は、しかし、活性化したシアル酸（ＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃ）を要求する。ヌクレオチド糖は高価であるため、シアリルトランスフェラーゼは、糖鎖生物学における（大規模）適用のためにはあまり適切ではない。
【００１６】
アクセプター分子のトランス−シアリダーゼを用いた酵素的シアリル化は、当技術分野において公知である。US2007/0004656を参照のこと（トリパノソーマ・コンゴレンスから単離された新規酵素及びワクチン、医薬、食材、又は食品添加物における使用のためのシアリル化産物を産生するためのその適用を開示する）。ＧＯＳは、可能なシアル酸アクセプターのリスト中に含まれているが、ジシアリル化産物中に濃縮された分画の生成及び単離は、開示又は示唆されていない。実際には、ＧＯＳのトランスシアリル化がモノシアリル化ＧＯＳ（モノ−Ｓｉａ−ＧＯＳ）だけでなく、しかし、また、ジシアリル化種（ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ）をもたらすとの本発明の観察は、これまで報告されていない。
【００１７】
本発明に従って入手可能なジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ種の重合（ＤＰ）の程度は、無論、ＤＰ又は使用されるＧＯＳアクセプター分子のＤＰの範囲に依存する。前記の通り、典型的なＧＯＳ調製物は、ＤＰ２〜８の間の範囲のオリゴ糖を含む。Ｖｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳについて、混合物は、Ｇａｌ（β１−ｘ）Ｇａｌ（β１−ｘ）…．Ｇａｌ（β１−ｘ）Ｇｌｃ（主要な量；還元線形及び分岐（ＤＰ＞２）ＧＯＳ成分）、ｘ＝４（主に）、３、及び６を伴う；及びＧａｌ（β１−４）Ｇａｌ（β１−４）…Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ（α１−１β）Ｇａｌ（４−１β）…Ｇａｌ（４−１β）Ｇａｌ（少量；非還元ＧＯＳ成分）としておおまかに記載される（表１）。
【００１８】
一実施態様において、本発明の方法は、乾燥物に基づく、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳの少なくとも５重量パーセント、好ましくは少なくとも７、１０、１２、１８、２０、２２、２５、２７、又は３０重量%を含む分画の単離を含み、それにおいて、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳは、ＤＰ５からＤＰ１１、好ましくはＤＰ６からＤＰ８の範囲内の重合の程度（ＤＰ）を有する。
【００１９】
表１に基づいて形成することができる例示的なジシアリル化ＧＯＳ構造は、以下を含む：
【表２】
2015508388.tif 000003
【００２０】
使用されるトランスシアリダーゼの酵素特異性の観点から、用語「シアル酸供与体」は、１つ又は複数の（α２−３）シアリル化グリカン（糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質）又は合成シアル酸グリコシド（例、２’−（４メチルウンベリフェリル）−α−Ｎ−アセチルノイラミン酸（４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃ）を有する任意の化合物を指す（Schauer and Kamerling, ChemBioChem 12: 2246-2264, 2011）。これらは、（α２−３）連結Ｎアセチルノイラミン酸（Ｓｉａ＝Ｎｅｕ５Ａｃ）供与体及び（α２−３）連結Ｎアセチルノイラミン酸／Ｎグリコリルノイラミン酸（Ｓｉａ＝Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｎｅｕ５Ｇｃ）供与体を含む。ヒト適用のために、好ましくは、シアル酸供与体は（α２−３）連結Ｎｅｕ５Ａｃを含むが、しかし、飼料適用のために、シアル酸供与体は（α２−３）連結Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｎｅｕ５Ｇｃを含んでもよい。異なる供与体の組み合わせも使用することができる。
【００２１】
一実施態様の工程ｂ）において、シアル酸供与体は、好ましくは、オリゴ糖、多糖、ポリシアル酸、糖タンパク質に結合したシアル酸より選択される天然化合物である。例えば、シアル酸供与体は、全動物の血漿又は血漿由来の糖タンパク質（屠殺場での典型的な産物である）、及び酪農産業からの乳糖タンパク質、又は糖脂質より選択される。乳糖タンパク質は、牛乳中の多種類において生じる。Ｎ及びＯ連結炭水化物鎖は、頻繁に、シアル酸（Ｓｉａ）ファミリーのメンバーで終結する。例えば、シアル酸供与体は、グリコシル化された乳清タンパク質及びカゼイン、ならびにそのフラグメントからなる群より選択される。
【００２２】
本発明における使用のための高度に有利なシアル酸供与体は、κカゼインからのグリコマクロペプチド（ＧＭＰ）であり、それは、酪農産業における副産物として産生される。ＧＭＰは、Ｏグリカンを用いて修飾され、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１及びＮｅｕ５Ａｃ（α２−６）ＧａｌＮＡｃ（α１単位の両方を含む（van Halbeek et al., Biochim. Biophys. Acta 623: 295-300, 1980）。本発明の方法における（α２−３）連結Ｎアセチルノイラミン酸（Ｓｉａ＝Ｎｅｕ５Ａｃ）供与体としてＧＭＰを用いて、結果として得られたジ−Ｓｉａ−ＧＯＳでは、とりわけ、乳児用栄養機能性食品においてその方法を見出すであろう。
【００２３】
別の好ましい実施態様において、シアル酸供与体は、グリコシル化された動物性粘液タンパク質、及びそのフラグメントからなる群より選択される。動物性ムチンは、比較的高い炭水化物含量を伴う糖タンパク質である。Ｏ連結炭水化物鎖は、頻繁に、シアル酸（Ｓｉａ）ファミリーのメンバーで終結し、それらの内、Ｎアセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）及びＮグリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）が最も重要なものである。異なるムチンが、異なるシアリル化パターンを有することができる。特に興味深いのは、シアル酸含有材料としての、豚及び牛の小腸ムチン糖タンパク質（屠殺場での典型的な副産物）である。例えば、文献に従い、ブタ小腸ムチン糖タンパク質（ＰＳＭＧ）のシアリル化パターンは、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−、Ｎｅｕ５Ｇｃ（α２−３）Ｇａｌ（β１−、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−６）ＧａｌＮＡｃ（α１−、及びＮｅｕ５Ｇｃ（α２−６）ＧａｌＮＡｃ（α１単位）を含む（Hansson et al., Carbohydr. Res. 221: 179-189, 1991）。（α２−３）連結Ｎアセチルノイラミン酸／Ｎグリコリルノイラミン酸（Ｓｉａ＝Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｎｅｕ５Ｇｃ）供与体としてＰＳＭＧを用いて、結果として得られたジ−Ｓｉａ−ＧＯＳでは、とりわけ、動物飼料産業においてその方法を見出すであろう。例えば、シアル酸供与体は、産生プロセスにおいてムチンから得られ、それにより、豚腸を、ケーシングの産生のために清浄し（胎児糞尿の除去、ムチンの押圧、大網膜の押圧、ケーシングのさらなる処理）、シアル酸含有ムチンバイオポリマーの濃縮及び／又はさらなる精製／酵素分解が続く。
【００２４】
このように、一実施態様において、本発明は、機能性食品を向上するための、屠殺場及び酪農産業からの比較的安価な副産物から得られるシアル酸供与体を使用した酵素的なトランスグリコシル化を含む。
【００２５】
一実施態様において、本明細書において開示する方法の工程ｃ）では、トリパノソーマ属、好ましくはトリパノソーマ・クルーズ又はトリパノソーマ・コンゴレンスの微生物からの遺伝子産物によりコードされるトランス−シアリダーゼ活性を有する酵素が使用される。好ましくは、前記酵素を、宿主細胞（例、大腸菌などの細菌宿主細胞）中で組換え的に産生する。
【００２６】
インキュベーション条件は、酵素源に依存して変動しうる。ＴｃＴＳを使用した一実施態様において、酵素反応混合物のｐＨは、４と６の間、好ましくは４．８と５．８の間の範囲である。好ましい緩衝液は、クエン酸Ｎａ、Ｐｉｐｅｓ、及びＴｒｉｓ  ＨＣｌ、ならびにそれらの混合物を含む。一実施態様においては、酵素インキュベーションは、クエン酸Ｎａ、Ｐｉｐｅｓ、及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（各々２５mM）ｐＨ５．５の混合物中で実施される。水溶液中で酵素反応を行うことも可能である。例えば、水中でのＧＭＰ及びＧＯＳを用いたＴｃＴＳのインキュベーションは、ｐＨ５．０でのクエン酸Ｎａについて観察されたのと同じ高い変換を与えた。酵素は、タンパク質成分、例えば、ウシ血清アルブミンにより安定化されうるが、しかし、糖タンパク質供与体を使用した場合において、これは必要ではない。
【００２７】
供与体からアクセプターへのシアル酸転移は完全ではないであろうため、ＧＯＳ、シアリル化ＧＯＳ、シアル酸供与体、及びアシアロ−供与体の混合物を、理論的には形成することができる。例えば、Ｖｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳがＧＯＳの供給源として適用される場合において、産物の混合物は、ＧＯＳ、シアリル化ＧＯＳ、ラクトース、ガラクトース、グルコース、及びシアリルラクトース（ラクトースもシアル酸のためのアクセプターである）を含むであろう。ＧＭＰの場合において、ＳｉａはＮｅｕ５Ａｃを表し、ＰＳＭＧの場合において、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｎｅｕ５Ｇｃを表す。この混合物は、ジシアリル化ＧＯＳ中に濃縮された分画を単離する工程に先立ち、遠心濾過（スピンフィルター）を介して、高分子糖タンパク質／酵素分画及び低分子量炭水化物分画中に分離してもよい。原則として、Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｎｅｕ５Ｇｃ混合物を、レクチン又は抗体クロマトグラフィーを介して、そのＮｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕ５Ｇｃ成分中に分離することができる。
【００２８】
本発明の方法の工程ｄ）は、前記酵素反応混合物から、乾燥物に基づく、ジシアリル化ガラクトオリゴ糖の少なくとも５重量パーセントを含む分画を単離することを含む。ジシアリル化オリゴ糖は、生理学的ｐＨで１分子当たり２つの負電荷を有するため、それらは、適切には、分離すべき成分間の電荷における差に基づく分離技術、例えば、好ましくは、陰イオン交換クロマトグラフィーなどを使用して単離される。例示的な陰イオン交換樹脂は、Resource Qを含む。例えば、ＧＯＳ  ＤＰ５と人工供与体としてのＴｃＴＳ及び４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃとの２１時間のインキュベーション後、混合物を、中性ＧＯＳ  ＤＰ５、モノ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ５（ＤＰ５の還元線形及び分岐ならびに非還元ＧＯＳ成分のモノシアリル化）、遊離Ｓｉａ、及びジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ５分画（ＤＰ５の還元分枝及び非還元ＧＯＳ成分のジシアリル化）において分離することができる（脱塩後のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ及びＮＭＲ分光法によりチェックされる通り）。
【００２９】
他の適切な分離技術は、分離すべき成分間のサイズにおける差に基づき、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーである。
【００３０】
用いられる分離手順及び意図される適用に依存し、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ濃縮分画は、さらなる清浄処理（例、陰イオン交換クロマトグラフィーを使用した場合における脱塩手順）に供してもよい。
【００３１】
さらなる実施態様は、本発明に従った方法により入手可能なジシアリル化ガラクトオリゴ糖の少なくとも５重量パーセントを含む組成物に関する。組成物は、好ましくは、ジシアリル化ガラクトオリゴ糖の少なくとも７、１０、１２、１８、２０、２２、２５、２７重量%、より好ましくは少なくとも３０重量%を含む。一実施態様において、組成物は、モノ−シアリル化オリゴ糖の８０重量%未満、好ましくは６０重量%未満を含む。ジ−シアリル化とモノ−シアリル化オリゴ糖の重量比は、例えば、１：２０〜１００：１の間、より好ましくは１：１０〜９：１の間である。別の好ましい実施態様において、組成物は、モノ−シアリル化オリゴ糖を本質的に欠く。組成物は、好ましくは、（活性）酵素を含まない。
【００３２】
また、提供されるのは、活性成分としての、例えば、栄養的、医薬的、又は栄養補助食品添加物としてのジシアリル化ガラクトオリゴ糖中に濃縮された組成物の使用である。
【００３３】
一実施態様において、本発明は、本明細書に記載する通りに入手可能なジシアリル化ガラクトオリゴ糖中に濃縮された組成物を含む栄養産物を提供する。ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ種の他、食品産物は、他のオリゴ糖、特に、プレバイオティックオリゴ糖及びオリゴ糖の混合物を含みうる。プロバイオティクスの添加も想定される。
【００３４】
栄養産物は、ヒト又は動物の目的のためでありうる。ヒト適用のために、高濃度のＮｅｕ５Ｇｃの存在を防止すべきである。なぜなら、Ｎｅｕ５Ｇｃはヒトにおいて生じない又はほとんど生じないからである。故に、ヒト産物における使用のために、（α２−３）連結Ｎアセチルノイラミン酸（Ｓｉａ＝Ｎｅｕ５Ａｃ）供与体を、シアル酸供与体、例えばＧＭＰとして使用することが好ましい。シアル酸供与体を、（α２−３）連結Ｎアセチルノイラミン酸／Ｎグリコリルノイラミン酸（Ｓｉａ＝Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｎｅｕ５Ｇｃ）、例えばＰＳＭＧと使用する場合において、Ｎｅｕ５Ｇｃ含有ＧＯＳ種を、例えば、レクチンクロマトグラフィーにより除去すべきである。特定の局面において、栄養産物は乳児用調合乳である。例えば、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ（それにおいてＳｉａはＮｅｕ５Ａｃである）中に濃縮された分画を、ヒト乳の組成により密接に似せるために、サプリメントとして、従来の乳児用調合乳に加え、それにより調合乳の有益な特性を増強する。本発明のジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ濃縮物を用いて、乳児用調合乳を、ヒト乳と一致させた濃度において、ジシアリル化オリゴ糖を用いて濃縮することができ、即ち、ジシアリル化オリゴ糖の濃度は、種々の授乳段階のヒト乳の濃度と一致する２００〜５００mg/lに増加させることができる。無論、濃縮物を、また、適切に使用し、１００〜１５００mg/lまでのオリゴ糖結合シアル酸の全濃度をもたらす。しかし、本発明の範囲は、ヒト乳組成物における大きな変動に起因し、及び、また、他の（食品）適用が、他のオリゴ糖結合（ジ）シアル酸濃度を要求しうるとの事実に起因し、濃縮のこの範囲に限定されない。本発明において、シアリル化オリゴ糖の濃度は、ＵＶ検出システム及びResource Qカラムを備えた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して測定されており、しかし、許容可能な精度を伴う最先端技術を用いてもよい。
【００３５】
本発明のジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ分画は、そのようなものとして使用することができる、あるいは、例えば、逆浸透、結晶化、親和性クロマトグラフィー、又はそれらの組み合わせによりさらに処理し、水及び／又は塩を除去することができる、あるいは、それは、単独で又は１つもしくは複数の担体と一緒に乾燥させることができる。任意の担体を使用することができ、例えば、油、脂肪、乳清、脱ミネラル乳清、乳清タンパク質濃縮物、乳清タンパク質単離物、他の乳清分画、乳清又は乳透過物もしくは濃縮物、スキムミルク、全乳、半スキムミルク、ミルク分画、マルトデキストリン、スクロース、ラクトース、天然及びプレゼラチン化デンプン、グルコースシロップ、カゼイン、及びカゼイン分画などである。
【００３６】
本発明のジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ分画は、その乾燥した濃縮物を含み、任意の栄養組成物（例えば乳児栄養、タンパク質バー、スポーツ栄養、ドリンク、健康補助食品、医療目的及び臨床栄養のための食品など）中で使用することができる。乳児栄養は、乳児用調合乳、後続の調合乳、乳児穀物産物又は成長乳、即ち、１〜３歳の小児のための適切な改変乳又は粉乳に制限することができるが、しかし、されない。
【００３７】
そのような調合乳は、早期産児への投与のために特に適切である。なぜなら、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ濃縮分画は、原生動物、例えば赤痢アメーバ（アメーバ症の原因となる寄生虫）などを含む、有害な微生物による感染症と闘うために有用でありうる。一実施態様において、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ分画を使用し、ヒト腸上皮細胞への微生物病原体の接着を阻害することにより、身体を感染から保護する。例えば、それを使用し、寄生虫のＧａｌ／ＧａｌＮＡｃ−レクチン（接着性及び細胞傷害性を媒介する主要な病原性タンパク質）との相互作用を通じて、宿主細胞への赤痢アメーバの結合を遮断する。故に、また、包含されるのは、乳児用調合乳を提供するための方法であって、乾燥物に基づく、ジシアリルガラクトオリゴ糖の少なくとも５０重量パーセントを含む分画を単離すること、ならびに、前記分画を、タンパク質源、脂肪源、炭水化物源、及び他の従来の成分（例えばビタミン及びミネラルなど）と一緒に、乳児用調合乳中に調合することを含む。治療的又は予防的に効果的な量は、種々の因子（例えば、処置される被験者の年齢及び体重、防止又は処置される疾患、投与形態の型など）に依存する。
【００３８】
本発明は、また、本明細書において開示される通り、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ分画を含む組成物の医学的使用に関する。例えば、それは、被験者、好ましくはヒト被験者、より好ましくは早産児における壊死性腸炎（ＮＥＣ）を処置又は防止する方法において適切に使用される。ＮＥＣは、主に病気の又は未熟な新生児の腸における深刻な細菌感染症である。それは、腸組織の死（壊死）を起こし、血液中毒（敗血症）に進行しうる。それは、特に極低出生体重児の間で高い死亡率を有する。これらの乳児のおよそ２０〜４０パーセントが死亡する。ＮＥＣは、８００g未満（２lbを下回る）の体重の新生児の約１０%において発生する。壊死性腸炎は、ほとんど常に、人生の最初の月に生じる。経管栄養を要求する乳児は、障害についての増加リスクを有しうる。故に、壊死性腸炎についてのリスクが、本明細書において提供する通り、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ含有調合乳を含む経腸栄養を使用することにより減弱されうる。
【００３９】
動物適用について、高濃度のＮｅｕ５Ｇｃの存在は問題を形成しない。それは利点にさえなりうる。なぜなら、それは、特にＮｅｕ５Ｇｃ含有化合物が、子豚及び仔牛において下痢に至る、特定の感染症に対する戦いにおいて効果的であることが報告されているからである。故に、動物飼料産物における使用のために、それは（α２−３）連結Ｎアセチルノイラミン酸及びＮグリコリルノイラミン酸（Ｓｉａ＝Ｎｅｕ５Ａｃ／Ｎｅｕ５Ｇｃ）（例えばＰＳＭＧなど）を含む供与体を使用することが好ましい。本明細書において提供するのは、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ中に濃縮された組成物を含む動物用飼料産物であり、それにおいて、Ｓｉａは、Ｎｅｕ５Ａｃ及び／又はＮｅｕ５Ｇｃ、好ましくはＮｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕ５Ｇｃである。飼料産物は、好ましくは、子豚及び仔牛用に配合されており、動物性能、肉質、及び動物の健康を増強させるための１つ又は複数のさらなる有益な成分を含みうる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】トリパノソーマのトランス−シアリダーゼにより触媒される、Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ−ＯＲ１とＮｅｕ５Ａｃ（α２−３）Ｇａｌ−ＯＲ２の間での（α２−３）連結Ｎアセチルノイラミン酸の可逆的トランスグリコシル化。
【図２】Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ２上での、異なるＤＰの８分画中へのＶｉｖｉｎａｌ−ＧＯＳの分離。脱塩水を、溶出液として、流速１ml/分で、４０℃で使用した。
【図３】モノシアリル化ＧＯＳ  ＤＰ５（１５〜１８分）及びジシアリル化ＧＯＳ  ＤＰ５（２０〜２３分）の形成を示す、ｔ（０）（点線）での及びインキュベーションの２１時間後（実線）の４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃを伴うＧＯＳ  ＤＰ５のＴｃＴＳインキュベーションのＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイル。
【図４】ＮａＣｌ勾配を使用し、２１４nmでモニターされた、Resource Q上でのシアリル化ＧＯＳ  ＤＰ５の分離。
【図５】Ｖｉｖｉｎａｌ−ＧＯＳ  ＤＰ５の５００MHz  １Ｈ  ＮＭＲスペクトル。
【図６】モノ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ５の５００MHz  １Ｈ  ＮＭＲスペクトル。
【図７】ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ５の５００MHz  １Ｈ  ＮＭＲスペクトル。
【００４１】
実施例のセクション
実施例１：トリパノソーマ・クルーズのトランス−シアリダーゼ（ＴｃＴＳ）の異種発現及び精製
Ｎ末端６×Ｈｉｓタグを含むＴｃＴＳのＤＮＡクローンを、A.C.C. Frasch教授（ブエノスアイレス、アルゼンチン）から得た。タンパク質を発現するために、文献（Paris et al., Glycobiology 11: 305-311, 2001）に記載されている通りの成長及び誘導条件をわずかに変更した。コンストラクトｐＴｒｃＴＳ６１１／２を、大腸菌ＴＯＰ１０又はＢＬ２１（ＤＥ３）中に形質転換し、培養物を、アンピシリン（１００μg/ml）及びインデューサーとしての０．１mMイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を用いて補った、テリフィックブロス培地中に接種した。培地に、Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ寒天プレートからの新鮮なコロニーから直接的に接種し、次に、３０℃で２４時間にわたり（ＯＤ６００＝０．６）撹拌（２００rpm）を伴いインキュベートした。細胞を回収した後、ペレットを溶解緩衝液（細菌タンパク質抽出試薬／Ｂ−ＰＥＲ）中に再懸濁し、製造者のプロトコールに従って室温で溶解させた。細胞細片を、３０分にわたる４０，０００gでの超遠心分離により除去し、上清を、重力流Ｎｉ２＋ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）カラム親和性クロマトグラフィーに供した。組換えＴｃＴＳを、１００mMイミダゾールを使用してカラムから溶出し、完全に純粋ではない酵素調製物をもたらした（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。しかし、酵素が、精製形態において不安定になることが公知であるため（Turnbull et al., Tetrahedron 58: 3207-3216, 2002）、さらなる精製工程は省いた。
【００４２】
実施例２：ＴｃＴＳ調製物の活性テスト及び動態試験
部分的に精製されたＴｃＴＳ（２mU/ml）を用いた活性アッセイを、商業的な合成シアル酸モデル供与体としての１mM  ２’−（４メチルウンベリフェリ）−α−Ｎ−アセチルノイラミン酸（４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃ）及びアクセプターとしてのラクトースを用いて行い、産物Ｎｅｕ５Ａｃ（α２−３）ラクトース（３’シアリルラクトース、３’ＳＬ）のその後の形成を伴った。１０倍過剰のラクトースの存在において、４ＭＵ−Ｎｅｕ５ＡｃのＮｅｕ５Ａｃ単位の８０%近くが、ラクトースに移された。
【００４３】
供与体としての部分的に精製されたＴｃＴＳ、４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃ、又は工業的に入手可能なκカゼイン由来グリコマクロペプチド（ＧＭＰ）及びアクセプターとしてのラクトースを用いた動態実験において、３’ＳＬの形成を、パルスアンペロメトリック検出を用いた高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を使用し、１５及び３０分のインキュベーション後に定量的に決定した。両方の供与体について、転移反応のための至適温度（５℃の増分を伴う、１５〜５０℃の範囲の一連の温度から推測）が、２５℃であると判明したが、それは、文献（Scudder et al., J. Biol. Chem. 268: 9886-9891, 1993）において報告された至適温度と同様である。
【００４４】
ＴｃＴＳの熱安定性（５℃の間隔を伴う、１５〜５０℃の範囲において推定）（３０分間の処理；２５℃で決定した残存活性）に関し、酵素は、２５℃まで完全な活性を保持し、次に、着実に減少した。５０℃でのインキュベーション後、最初の活性の６%だけが残った。
【００４５】
供与体として４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃを使用する場合、タンパク質（ＢＳＡ）の添加は、ＴｃＴＳ活性に対する安定化効果を有し；ＧＭＰを使用した場合、ＢＳＡの添加は必要ではない。
【００４６】
転移反応のための至適ｐＨが、５０mMクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５、５．０、５．５）、Ｐｉｐｅｓ緩衝液（ｐＨ６．０、６．５、７．０、７．５）、及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０、８．５、９．０）中で、ＢＳＡの存在において、ＴｃＴＳ、４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃ、及びラクトース（２５℃）のインキュベーションから推定される通り、ｐＨ５．０であることが判明した。緩衝液の型に非依存的な決定は、ｐＨ４．５〜９．０の範囲の、２５mMクエン酸ナトリウム、Ｐｉｐｅｓ、及びＴｒｉ−ＨＣｌを含む混合緩衝液を使用したインキュベーションから推定された通り、至適ｐＨ５．５に至った。
【００４７】
シアル酸供与体基質４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃ及びＧＭＰについてのＴｃＴＳの親和性を、これらの基質の適切な範囲及びアクセプターとしてのラクトースの固定濃度を用いたインキュベーション（４．５mU/ml）を実施することによりテストした。４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃについて、インキュベーション混合物は、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．５、５．０、及び１０．０mMの４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃならびに１mMのラクトースを含んだ；Ｋｍが１．６５mM及びＶｍａｘが１．５U/mgであることが見出された。ＧＭＰについて、インキュベーション混合物は、０．０１、０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．２５、０．５、１．０、２．５、及び５．０mMのＧＭＰならびに５mMのラクトースを含んだ。Ｋｍが０．１８mM及びＶｍａｘが３．０U/mgであることが見出された。
【００４８】
実施例３：供与体ＧＭＰのシアル酸仕様の分析
ＧＭＰ（ＭＷ＝１０kDa）の軽度の酸加水分解では、０．１M  ＨＣｌを使用し（１時間；８０℃）、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによる放出シアル酸の定量分析が続き、４．４%のシアル酸含量をもたらし、９９%Ｎｅｕ５Ａｃ及び１%Ｎｅｕ５Ｇｃから構築された。
【００４９】
文献から、ＧＭＰのＯグリカンは、（α２−３）及び／又は（α２−６）連結シアル酸の両方を伴うオリゴ糖のアレイを含むことが公知である（van Halbeek et al., Biochim. Biophys. Acta 623: 295-300, 1980）。これら２つの連結位置の内、（α２−３）連結シアル酸だけが、ＴｃＴＳについての効果的な供与体として作用する（Schauer and Kamerling, ChemBioChem 12: 2246-2264, 2011）。（α２−３）連結Ｎｅｕ５Ａｃの量は、サルモネラ・チフィリウムからの（α２−３）特異的シアリダーゼとのインキュベーション、それに続くＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析により決定された通り、７２%であることが判明した。
【００５０】
ＧＭＰ（シアル酸含量：４．４%；１mM全シアル酸（α２−３）−及び（α２−６）−連結）及び１０mMラクトースを用いたＴｃＴＳ（８mU/ml）インキュベーションは、３’ＳＬへの全Ｎｅｕ５Ａｃの６０%前後の転移をもたらした（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）（ｔ＝０時間：０%  ３’ＳＬ、０%遊離Ｎｅｕ５Ａｃ；ｔ＝１時間：４２%  ３’ＳＬ、０%遊離Ｎｅｕ５Ａｃ；ｔ＝２  時間：５３%  ３’ＳＬ、０%遊離Ｎｅｕ５Ａｃ；ｔ＝４時間：５８%  ３’ＳＬ、０%遊離Ｎｅｕ５Ａｃ；ｔ＝２４時間：５１%  ３’ＳＬ、５%遊離Ｎｅｕ５Ａｃ）。連結特異性を考慮に入れて、３’ＳＬへの（α２−３）連結Ｎｅｕ５Ａｃの実際の変換効率は、ｔ＝４時間で８１%である。
【００５１】
実施例４：アクセプターＶｉｖｉｎａｌ−ＧＯＳ及び供与体としての４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃを用いて得られたシアリル化産物の評価
商業的に入手可能なＶｉｖｉｎａｌ−ＧＯＳは、異なる重合の程度（ＤＰ）を伴う５７%ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）の混合物（即ち、５７%ＧＯＳ、２１%ラクトース、及び２２%ガラクトース＋グルコース）であり、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ２上でＤＰ分画２〜８に分離された（図２）。分画をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析によりチェックし、別々のＧＯＳ  ＤＰプールを実証し、隣接ＤＰの低汚染を伴った。
【００５２】
組換えＴｃＴＳインキュベーション（２mU/ml）を、アクセプター基質（３μmol）としてのＧＯＳ  ＤＰ２〜ＧＯＳ  ＤＰ６及び供与体基質（６μmol）としての４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃを用いて行った。還元線形オリゴ糖の他、ＤＰ３〜ＤＰ６の部分は、２つの末端結合β連結ガラクトース（Ｇａｌ）残基を含む、還元分枝及び非還元線形オリゴ糖である（表１）。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより実証された通り、全ての場合において、産物形成を観察することができ、ＧＯＳ基質の減少を伴った。より高いＤＰのシアリル化ＧＯＳ産物は、出発材料の他、２つの荷電プール（主要なモノシアリル化プール及び微量のジシアリル化プール）からなる。典型的な例として、図３中に、ＧＯＳ  ＤＰ５についての結果を描写する。クロマトグラムは、１５と２０分の間の保持時間を伴う主要な荷電プール、及び２０と２２分の間の保持時間を伴う微量の荷電プールを示す。これらのプールのさらなる構造解析は、モノシアリル化ＧＯＳ  ＤＰ５（モノ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ５）及びジシアリル化ＧＯＳ  ＤＰ５（ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ５）（Ｓｉａ＝Ｎｅｕ５Ａｃ）の発生を実証した。
【００５３】
実施例５：Ｖｉｖｉｎａｌ−ＧＯＳ  ＤＰ５及び４ＭＵ−Ｎｅｕ５ＡｃのＴｃＴＳ触媒インキュベーション（１Ｈ  ＮＭＲ分光法による分析）
１Ｈ  ＮＭＲ分析のために、ＴｃＴＳ（２mU/ml）を、Ｖｉｖｉｎａｌ−ＧＯＳ  ＤＰ５（１μmol）及び４ＭＵ−Ｎｅｕ５Ａｃ（２μmol）を用いて、１６時間にわたり２５℃及びｐＨ５でインキュベートした。一荷電及び二荷電分画を、陰イオン交換クロマトグラフィーを介して収集し（図４）、その一定分量を、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより、検証のために分析した。
【００５４】
図５、６、及び７は、ＧＯＳ  ＤＰ５、モノ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ５、及びジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ５（Ｓｉａ＝Ｎｅｕ５Ａｃ）の１Ｈ  ＮＭＲスペクトルをそれぞれ提示する。より初期の試験において（Fransen et al., Carbohydr. Res. 314: 101-114, 1998）、ＧＯＳ  ＤＰ５の主要成分は、以下の構造を含むことが示されている（４置換Ｇａｌ残基が６置換のものより優位である）：
【表３】
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【００５５】
しかし、実施例１０において示す通り、また、還元分岐構造が生じる（ＧＯＳ  ＤＰ３及びＤＰ４における還元分岐構造の発生については、実施例８及び９を参照のこと）。
【００５６】
シアリル化ＧＯＳ  ＤＰ５プローブのスペクトルは、（α２−３）連結Ｎｅｕ５Ａｃの存在だけを反映する。Ｇａｌ  Ｈ−３及びＨ−４ならびにＮｅｕ５Ａｃ  Ｈ−３ｅ及びＨ−３ａｘシグナルの表面比率に基づき、モノ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ５及びジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ５プールの割り当てを行うことができた。Resource Q上でのＵＶ応答に基づき、モノ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ５及びジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ５のモル比は約８．５：１である。
【００５７】
実施例６：供与体ＰＳＭＧのシアル酸仕様の分析
小腸をケーシング材料から回収し、４４〜４８℃の水中での押圧及び洗浄により浄化した。
【００５８】
粘液は、その後、設置された装置に応じて、増加する圧力で、２又は３工程で小腸から押し出される。洗浄プロセスの最終工程は、粘膜を除去することである。
【００５９】
これらの押圧工程から得られた粘液を収集し、メタ重亜硫酸ナトリウム水溶液を加える。
【００６０】
工業的に入手可能なブタ小腸ムチン糖タンパク質（ＰＳＭＧ）材料（ＭＷ＝１．７×１０３kDa）の軽度の酸加水分解では、０．１M  ＨＣｌを使用し（１時間；８０℃）、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによる放出シアル酸の定量分析が続き、１．４%のシアル酸含量をもたらし、７２%Ｎｅｕ５Ａｃ及び２８%Ｎｅｕ５Ｇｃから構築された。
【００６１】
文献から、ＰＳＭＧのＯグリカンは、（α２−３）及び／又は（α２−６）連結シアル酸の両方を伴うオリゴ糖のアレイを含むことが公知である（Hansson et al., Carbohydr.Res.221: 179-189, 1991）。これら２つの連結位置の内、（α２−３）連結シアル酸だけが、ＴｃＴＳについての効果的な供与体として作用する。ＰＳＭＧ（０．５mM全Ｎｅｕ５Ａｃ、（α２−３）−及び（α２−６）連結）及び１０mMラクトースを用いたＴｃＴＳ（２〜８mU/ml）インキュベーションは、２４時間後、３’Ｎｅｕ５Ａｃラクトースへの全Ｎｅｕ５Ａｃの１０%までの転移をもたらした（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）。同様のレベルのＮｅｕ５Ｇｃをラクトースに転移し、３’Ｎｅｕ５Ｇｃラクトースをもたらした。部分的に精製されたＰＳＭＧを用いると、セファロースＣＬ−４Ｂクロマトグラフィーを介して得られ、カットオフ値５０kDaを伴うスピンフィルターで濃縮し、又はエタノール沈殿ＰＳＭＧ、ラクトースへの全Ｎｅｕ５Ａｃの転移は、約２０%まで増加し、全Ｎｅｕ５Ｇｃの約１５%まで増加させることができる。連結特異性を考慮に入れて、３’ＳＬ（Ｎｅｕ５Ａｃ）への（α２−３）連結Ｎｅｕ５Ａｃの実際の変換効率は４５%である。
【００６２】
実施例７：供与体としてのＧＭＰ、アクセプターとしてのＶｉｖｉｎａｌ−ＧＯＳ、及び生体触媒としてのＴｃＴＳを使用した、グラムスケールでのＳｉａ−ＧＯＳ（Ｓｉａ＝Ｎｅｕ５Ａｃ）の産生
ｐＴｒｃＴＳ６１１／２を持つ大腸菌ＴＯＰ１０細胞を、０．１mMのＩＰＴＧ及び１００μg/mlのアンピシリンを含むテリフィックブロス培地（５０ml）中に接種し、２０時間にわたり３０℃で、ロータリーシェーカー上で培養した。細胞を遠心分離により回収し、細菌タンパク質抽出試薬（B-PER, Thermo scientific）を使用して化学的に溶解した。ＴｃＴＳタンパク質を、Ｈｉｓタグ付き固定化金属親和性クロマトグラフィー（溶出液、１００mMイミダゾール）を使用して精製した。１０の異なる５０mlの培養物から得られた精製タンパク質分画をプールし、イミダゾールを除去し、その後、洗浄し、Amicon  ５０kDaスピンフィルターを使用して濃縮した。洗浄したタンパク質を、最終的に、１５%グリセロールを含む５０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）中で緩衝化した。
【００６３】
時間中での至適なシアル酸転移を決定するために、テスト実験において、ＴｃＴＳを種々の濃度のＧＭＰ結合Ｎｅｕ５Ａｃ（供与体；商業的なＧＭＰ産物（シアル酸含量：４．０%；１０%（ｗ／ｗ）ＮａＣｌを含む）及びラクトース（アクセプター）に加えた（最終濃２mU/ml）。過剰の供与体基質は、アクセプターの高い変換を導いた。テストされた条件下での４８時間以上にわたるインキュベーションは、産物の加水分解（ＴｃＴＳ酵素の副反応）を導いた。典型的には、Ｎｅｕ５Ａｃ：ラクトースのmM比率＝５：１は、２４時間後に８２%３’ＳＬ（Ｎｅｕ５Ａｃ）、４８時間後に１００%、及び７０時間後に７６%をもたらした；Ｎｅｕ５Ａｃ：ラクトースのmM比率＝５：２は、２４時間後に５６%３’ＳＬ（Ｎｅｕ５Ａｃ）、４８時間後に７５%、及び７０時間後に６１%を与えた。
【００６４】
５０mMクエン酸ナトリウム（ｐＨ５）中に、５mM（α２−３）連結Ｎｅｕ５Ａｃ（〜４６g/l  ＧＭＰ）、２mMＧＯＳ（Ｖｉｖｉｎａｌ−ＧＯＳ）、及び２mU/ml  ＴｃＴＳを含む８００mlの反応混合物を４８にわたり２５℃でインキュベートした。使用前に、比較的高い量のＮａＣｌを含む粗ＧＭＰを、３kDaのカットオフ値を伴うポリエーテルスルホン膜フィルターを介して脱塩した。熱不活化工程（６０℃で２０分間）後、部分的に脱シアリル化された出発ＧＭＰを、濾過工程（３kDa膜フィルター）を介して除去した。穏やかな酸加水分解（Ｎｅｕ５Ａｃの放出）前後での全透過物の定性分析では、ＧＯＳ含量を定量的に測定するためのＡＯＡＣ方法（アスペルギルス・オリゼからのβガラクトシダーゼを用いる）を使用し、４８%非シアリル化ＧＯＳ及び５２%シアリル化ＧＯＳが存在することを示した。全透過液を凍結乾燥し、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２上で、溶出液として脱塩水を使用したゲル濾過により脱塩した。ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤによりチェックされた通り、最初に溶出する分画は、モノ−Ｓｉａ−ＧＯＳ及びジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ（Ｓｉａ＝Ｎｅｕ５Ａｃ）の混合物を含み、ＮａＣｌが本質的になく、遊離Ｎｅｕ５Ａｃ及び非シアリル化ＧＯＳの減少ＤＰが続いた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析は、ＧＯＳからＧＯＳ  ＤＰ７まで得られたシアリル化ＧＯＳ生成物を示した。
【００６５】
実施例８：Ｖｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳ  ＤＰ３及びＧＭＰのＴｃＴＳ触媒インキュベーション
ＧＯＳ  ＤＰ３（３mM）とＧＭＰ（シアル酸含量：４．０%；６mM（α２−３）連結Ｎｅｕ５Ａｃ）のＴｃＴＳ（２．５mU/ml）触媒インキュベーションを、２３時間にわたり２５℃及びｐＨ５で行った。後処理後、オリゴ糖産物を、Resource Q上での陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、２１４nmでの検出を伴い、モル比８８：１２でモノ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ３及びジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ３分画をもたらした。検証は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ及び１Ｈ  ＮＭＲ分光法により行った。「分岐還元」及び「非分岐非還元」形態上に焦点を伴う、ＮａＢＨ４還元工程の使用、それに続くＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ３分画のさらなる分析では、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ３の大部分が分岐構造でなることが示された。
【００６６】
実施例９：Ｖｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳ  ＤＰ４及びＧＭＰのＴｃＴＳ触媒インキュベーション
ＧＯＳ  ＤＰ４（３mM）とＧＭＰ（シアル酸含量：４．０%；６mM（α２−３）連結Ｎｅｕ５Ａｃ）のＴｃＴＳ（２．５mU/ml）触媒インキュベーションを、２３時間にわたり２５℃及びｐＨ５で行った。後処理後、オリゴ糖産物を、Resource Q上での陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、２１４nmでの検出を伴い、モル比９１：９でモノ−Ｓｉａ−ＧＯＳのＤＰ４及びジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ４分画をもたらした。検証は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ及び１Ｈ  ＮＭＲ分光法により行った。「分岐還元」及び「非分岐非還元」形態上に焦点を伴い、ＮａＢＨ４還元工程の使用、それに続くＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳのＤＰ４分画のさらなる分析では、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ４の大部分が分岐構造でなることが示された。
【００６７】
実施例１０：Ｖｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳ  ＤＰ５及びＧＭＰのＴｃＴＳ触媒インキュベーション
ＧＯＳ  ＤＰ５（３mM）とＧＭＰ（シアル酸含量：４．０%；６mM（α２−３）連結Ｎｅｕ５Ａｃ）のＴｃＴＳ（２．５mU/ml）触媒インキュベーションを、２３時間にわたり２５℃及びｐＨ５で行った。後処理後、オリゴ糖産物を、Resource Q上での陰イオン交換クロマトグラフィーに供し、２１４nmでの検出を伴い、モル比８８：１２でモノ−Ｓｉａ−ＧＯＳのＤＰ５及びジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ５分画をもたらした。検証は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ及び１Ｈ  ＮＭＲ分光法により行った。「分岐還元」及び「非分岐非還元」形態上に焦点を伴い、ＮａＢＨ４還元工程の使用、それに続くＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳによる、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳのＤＰ５分画のさらなる分析では、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ５の大部分が分岐構造でなることが示された。
【００６８】
実施例１１：Ｖｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳ  ＤＰ６−８及びＧＭＰのＴｃＴＳ触媒インキュベーション
Ｖｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳ  ＤＰ６、ＤＰ７、及びＤＰ８とＴｃＴＳ及びＧＭＰの個々のインキュベーションが、実施例８〜１０に記載されるプロトコールに従い、モノ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ６及びジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ６分画をモル比８７：１３で、モノ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ７及びジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ７分画をモル比８４：１６で、ならびにモノ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ８及びジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ  ＤＰ８分画をモル比８１：１９でもたらした。
【００６９】
実施例１２：Ｖｉｖｉｎａｌ  ＧＯＳ  ＤＰ３及びＤＰ４ならびにＰＳＭＧのＴｃＴＳ触媒インキュベーション
ＧＯＳ  ＤＰ３（３mM）又はＧＯＳ  ＤＰ４（３mM）とエタノール沈殿ＰＳＭＧ（２mM）のＴｃＴＳ（３mU/ml）触媒インキュベーションを、２３時間にわたり２５℃及びｐＨ５で行った。後処理後、オリゴ糖産物をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ分析に供した、各々の場合において、Ｎｅｕ５Ａｃ及びＮｅｕ５Ｇｃシアリル化を示す。
【００７０】
実施例１３：乳児用の栄養調合乳
表２は、乳児の免疫系を支持又は増強するための、本発明に従った３つの例示的な栄養調合乳（例、０〜６ヶ月の間の年齢群のための乳児用調合乳）の組成（１００ml当たり）を示す。
【００７１】
【表４】
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【００７２】
実施例１４：動物飼料調合乳
動物飼料は、とりわけ、ジシアロ成分が補われた基礎飼料で構成される。
【００７３】
【表５】
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【００７４】
【表６】
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【００７５】
【表７】
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【００７６】
【表８】
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【００７７】
【表９】
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【００７８】
【表１０】
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【００７９】
実施例１５：インビボでの病原体接着に対するＤｉ−Ｓｉａ−ＧＯＳ濃縮分画の効果
壊死性腸炎（ＮＥＣ）の新生仔ラットモデルを使用し、動物の臨床的挙動及び腸の巨視的外観により、ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳ濃縮分画の保護効果を客観的に評価することができる。
【００８０】
材料及び方法：新生仔ラットが期日に出産され、以下のいずれかのコントロール群に割り当てられる：（Ａ）母乳及び無ストレス因子からなる（ＮＥＣ群へ）、（Ｂ）それにおいて、ＮＥＣは、強制経口摂食＋低酸素＋経口リポ多糖（１日１回４mg/kg/日、生後２日間）によって誘導される（又は治療ＮＥＣ群へ）、（Ｃ）それにおいて、ＮＥＣは、強制経口摂食＋低酸素＋経口リポ多糖（１日１回４mg/kg/日、生後２日間）＋ジ−Ｓｉａ−ＧＯＳにより誘導される。臨床状態を、臨床疾患スコアを使用し、４日目に評価する（一般的な外観、触れに対する応答、自然活動、体色、各変数について０−３）。新生仔ラットを４つの異なる時間点で屠殺する：１日目、２日目、３日目、４日目。屠殺時、腸の肉眼的評価を、色（０〜２）、一貫性（０〜２）、及び拡張の程度（０〜２）に基づく点数化システムを使用して実施する。切除腸は、ヘマトキシリン／エオシンで染色し、コンサルタント組織病理学者を含む２人の独立した盲検化採点者により顕微鏡的に評価された。組織学的結果を使用し、巨視的な腸評価を検証することができる。結果を、ＡＮＯＶＡ及び線形回帰分析により比較した。
【００８１】
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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