(57)【要約】  本発明は、血管再構築に関連し、不適切な血管再構築によって特徴づけられる又は引き起こされる症状の治療に関連するものである。また本発明は、そのような症状の治療に用いられる医薬組成物及び治療法にまで拡張するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療又は診断に用いるための、Ｎｋｘ２．５活性阻害剤。
【請求項２】
（ａ）Ｎｋｘ２．５と核酸及び／又は他の転写因子との間の相互作用を低減させる；
（ｂ）核酸の結合及び／又は他の転写因子の結合に対して内因性Ｎｋｘ２．５と競合する；
（ｃ）Ｎｋｘ２．５に結合してその生物活性を減少させる；
（ｄ）Ｎｋｘ２．５の発現を減少させる；又は
（ｅ）Ｎｋｘ２．５の核移行を阻害する、
請求項１に記載の阻害剤。
【請求項３】
Ｎｋｘ２．５の発現を防ぎ又は減少させ、ここでＮｋｘ２．５は実質的に配列番号２、３、若しくは４に示されるアミノ酸配列、又はこれらの機能性変異体若しくは断片を有する、請求項１又は請求項２に記載の阻害剤。
【請求項４】
遺伝子抑制分子である、請求項３に記載の阻害剤。
【請求項５】
前記遺伝子抑制分子がＲＮＡｉ分子である、請求項４に記載の阻害剤。
【請求項６】
前記ＲＮＡｉ分子がｓｉＮＡ分子である、請求項５に記載の阻害剤。
【請求項７】
前記ｓｉＮＡ分子がｓｉＲＮＡである、請求項６に記載の阻害剤。
【請求項８】
前記ｓｉＮＡ分子が以下のものから選ばれる、請求項６又は請求項７に記載の阻害剤。
５’−ＣＣＴＣＡＡＴＣＣＣＴＡＣＧＧＴＴＡＴ−３’（配列番号：５）；
５’−ＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＴＣＧＴＧＡＡ−３’（配列番号：６）；
５’−ＧＣＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＧＧＣＡ−３’（配列番号：７）；及び
５’−ＣＣＧＧＧＡＴＴＣＣＧＣＡＧＡＧＣＡＡ−３’（配列番号：８）
【請求項９】
前記ＲＮＡｉ分子がｍｉＲ−１２５ｂ，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−３６７，ｍｉＲ−３８４，ｍｉＲ−３６３，ｍｉＲ−３２，ｍｉＲ−２５，並びにｍｉＲ−９２ａ及びｂから選ばれるｍｉＲＮＡである、請求項５に記載の阻害剤。
【請求項１０】
カゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ）活性を阻害することができる、請求項１又は請求項２に記載の阻害剤。
【請求項１１】
前記ＣＫＩＩ阻害剤は、ＣＸ−４９４５［ＣＡＳ  ｎｕｍｂｅｒ  １００９８２０−２１−６］；ＣＸ−８１８４；カゼインキナーゼＩＩ阻害剤、（ＴＢＣＡ）［ＣＡＳ  ９３４３５８−００−６］；ＣＫＩＩ阻害剤ＩＶ（ＩＱＡ）［ＣＡＳ  ３９１６７０−４８−７］；カゼインキナーゼＩＩ阻害剤Ｖ、（キナリザリン）［ＣＡＳ  ８１−６１−８］；カゼインキナーゼＩＩ阻害剤ＶＩ、（ＴＭＣＢ）［ＣＡＳ  ９０５１０５−８９−７］、カゼインキナーゼＩＩ阻害剤ＶＩＩ、及びカゼインキナーゼＩＩ阻害剤ＶＩＩＩから選ばれる、請求項１０に記載の阻害剤。
【請求項１２】
前記ＣＫＩＩ阻害剤はＣＸ−４９４５を含む、請求項１０又は請求項１１に記載の阻害剤。
【請求項１３】
不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患の治療、改善、又は予防に用いられる、請求項１〜１２のいずれか１項に記載されるＮｋｘ２．５活性阻害剤。
【請求項１４】
不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患の治療、改善、又は予防に用いられるＮｋｘ２．５遺伝子抑制分子。
【請求項１５】
治療される不適切な血管再構築及び血管細胞外マトリックスの沈着に特徴づけられる疾患が、肺高血圧症（ＰＨ）、結合組織疾患又はＨＩＶに関連する全てのタイプの肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を含む肺動脈高血圧症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、慢性肢虚血若しくは脳卒中、腎動脈疾患、メタボリックシンドローム及び糖尿病、リウマチ疾患（例えば全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、リウマチ性関節炎、血管炎（vasculis））、線維筋性形成異常、又は動脈瘤である、請求項１３に記載の阻害剤又は請求項１４に記載の遺伝子抑制分子。
【請求項１６】
肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）、アテローム性動脈硬化症、慢性肢虚血又は脳卒中の治療のための、請求項１５に記載の阻害剤又は遺伝子抑制分子。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載されるＮｋｘ２．５活性阻害剤及び薬学的に許容される賦形剤を含む、不適切な血管再構築の治療のための組成物。
【請求項１８】
治療上有効な量のＮｋｘ２．５活性阻害剤を薬学的に許容される賦形剤と接触させることを有する、請求項１７に記載の組成物を製造する方法。
【請求項１９】
（ａ）生物系を試験化合物に曝露し；
（ｂ）前記生物系におけるＮｋｘ２．５の活性又は発現を検出し；さらに
（ｃ）前記試験化合物で処理した生物系におけるＮｋｘ２．５の活性又は発現を前記試験化合物で処理していないコントロールの生物系におけるＮｋｘ２．５の活性又は発現と比較することを有し、
前記コントロールの生物系と比較して前記試験化合物存在下でＮｋｘ２．５の活性又は発現のレベルが減少した場合、前記試験化合物は不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患を治療又は防止する能力があることを示す、試験化合物が不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患の治療又は予防における有効性を有するか否かを試験するための試験化合物のスクリーニングを目的とするアッセイ。
【請求項２０】
（ａ）生物系を試験化合物に曝露し；
（ｂ）前記生物系におけるＮｋｘ２．５の活性又は発現を検出し；さらに
（ｃ）前記試験化合物で処理した生物系におけるＮｋｘ２．５の活性又は発現を試験化合物で処理していないコントロールの生物系におけるＮｋｘ２．５の活性又は発現と比較することを有し、
前記コントロールの生物系と比較して前記試験化合物存在下でＮｋｘ２．５の活性又は発現レベルが上昇した場合、試験化合物は不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患を引き起こすことを示す、試験化合物が不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患を引き起こすか否かを試験するための試験化合物のスクリーニングを目的とするアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は血管再構築に関連しており、特に、但しこれに限らないが、不適切な血管再構築に特徴づけられ又は引き起こされる症状の治療に関連している。また、本発明はそのような症状の治療に用いられる薬剤組成物や治療法にまで拡張するものである。
【背景技術】
【０００２】
抵抗動脈の血管再構築は、中膜の肥厚、血管内径の減少及びそれによる中膜／内腔比率の上昇といった構造変化として定義されており、血管病変によって引き起こされる又は起きるものである。いくつかの過程は、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）の成長の変化、遊走、分化、及び細胞外マトリックス量の増加を含むこれらの変化を基礎としている。血管再構築に寄与するもう一方の因子は炎症であり、マクロファージの浸潤、線維症／瘢痕化、プラーク形成、及び還元応答型炎症性遺伝子の発現増加に関連している。血管の再構築は、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、慢性肢虚血、及び脳卒中を含む他の疾患と同様に、肺高血圧及びアテローム性動脈硬化症に関連する血管病変において観察されている。
【０００３】
肺高血圧症（ＰＨ）は、肺血管系として知られる肺の動脈、静脈、又は毛細血管の血圧が平静時に２５ｍｍＨｇ以上又は興奮時に３０ｍｍＨｇ以上上昇する現象である。初めて特定されたのは１８９１年であり、ＰＨはＷＨＯグループＩ：肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を含むグループに分類される。肺高血圧症（ＰＨ）はＰＡＨの特徴であるが、ＰＨはその原因を問わず全てのケースの肺動脈血圧上昇（ＰＡＰ）を含む。現行の治療法は比較的効果が低いため、急速に進行して最終的に死に至るこの疾患の病因学及び病理学は複雑かつ知見に乏しい。小中肺動脈の疾患である肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）は、血管収縮ならびに血管の増殖及び再構築に特徴づけられる。全てのこれらの過程は、ＰＡＨ、右心室肥大、及び最終的には右心不全における肺血管耐性の急進的な増加に寄与すると考えられている。肺動脈の激しい再構築は、マトリックスの沈着及び肺動脈平滑筋（ＰＡＳＭＣｓ）、線維芽細胞、及び血管新生内皮細胞を含む常在細胞の増殖に起因すると考えられている。
【０００４】
多様性を有するにも関わらず、ＰＡＨは病態生理学、歴史学、及び予後像の類似性で定義される症状の混成群を含む。症状の多様性は、先天性心臓欠陥、慢性酸素欠乏、結合組織疾患（全身性硬化症、ＣＲＥＳＴ症候群、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、リウマチ性関節炎、高安動脈炎、多発性筋炎、皮膚筋炎）、並びに炎症（後天性免疫不全症候群及びヒト免疫不全ウイルス感染症）、毒素様物質摂取のように、ＰＡＨの進行をもたらす。最終的に、特発性ＰＡＨ（ＩＰＡＨ）はその他知られる全てのＰＡＨ原因が除外された時に診断される症状である。
【０００５】
アテローム性動脈硬化症も特に先進国で主要な心疾患であり、新興経済国への負担が増加している。アテローム性病斑は、慢性炎症及び慢性脂質異常症の環境において血管壁内で急速に成長する。血管内皮細胞の損傷は、進化性病斑内に蓄積して最終的に内膜で泡沫細胞となる循環単球の侵入を促進する。これらの（泡沫細胞からなる）原始脂肪線条から成熟プラークへの進行は、広範囲にわたる炎症細胞の蓄積及び脂質リッチコアを形成する脂質癒着を伴っている。活性化した血管平滑筋細胞は、脂質コアを覆い隠し、内在性血管修復過程および血管再構築の一環として線維性被膜を形成する。細胞外マトリックスタンパク質は複雑な混合物からなるにも関わらず、コラーゲン、特にＩ型コラーゲンはプラークタンパク質全体の主要成分（〜６０％）を構成している。Ｉ型コラーゲンの大部分は活性化した血管平滑筋細胞で産生され、プラークのショルダー領域（shoulder region）又は線維性被膜内においては、プラークの安定化や破裂保護のために最も重要な成分である。コラーゲンは、生体力学的強度、構造的骨組み、及びプラークの統合性維持を授けるだけでなく、マクロファージ活性、平滑筋細胞の遊走及び増殖にも影響を及ぼし、細胞外マトリックスに組み込まれた際にはサイトカインや成長因子のリザーバーとしても機能する。成熟したＩ型コラーゲンはマトリックス修飾酵素（特にマトリックスメタロプロテアーゼ）によって分解される。
【発明の概要】
【０００６】
ゆえに、上記の点から、アテローム性動脈硬化症や肺高血圧症のような血管再構築に特徴づけられる疾患に対する代替治療法を提供するニーズが明らかにある。この目的を達成するために、本発明者らはそのような疾患における転写因子Ｎｋｘ２．５の役割を調査した。彼らは、正常な血管ではＮｋｘ２．５が発現しないが、驚くことに再構築した血管や血管病変時にはＮｋｘ２．５が発現することを実証した。ゆえに、本発明者らは、Ｎｋｘ２．５が血管再構築の病的進行において不可欠な要素であること、及び前記転写因子の阻害剤が血管再構築を伴う疾患の治療において重要な治療との関連を持つであろうことを実証した初めてのグループである。
【０００７】
従って、本発明の第一の側面において、治療又は診断で用いるためのＮｋｘ２．５活性阻害剤が提供される。
【０００８】
第二の側面において、不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患の治療、改善、又は予防に用いるためのＮｋｘ２．５活性阻害剤が提供される。
【０００９】
第三の側面において、患者における不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患の治療、改善、又は予防の方法が提供され、前記方法は必要によっては治療上有効な量のＮｋｘ２．５活性阻害剤の投与を含む。
【００１０】
Ｎｋｘ２．５は、心臓特異的ホメオボックス（ＣＳＸ）としても知られており、進化において構造的及び機能的に保護されているホメオボックスＤＮＡ結合転写活性化因子のＮＫ−２ファミリーに属する。Ｎｋｘ２．５同族体はゼノパス（ツメガエルの一種）からヒトまで多くの脊椎動物において記載されており、４つの別個のドメインが高度に保護されたタンパク質構造を共有している。前記ホメオドメインはよく特徴づけられている：ヘリックス・ターン・ヘリックスモチーフを通じて共通のＤＮＡ配列に結合し、他の転写因子と相互作用する。転写活性化因子から離れた位置にあるＮｋｘ２．５はタンパク質―タンパク質間相互作用を通じて転写活性を抑制する能力があると知られているにも関わらず、その他のドメインの機能についてはあまり記載されていない。
【００１１】
ヒトＮｋｘ２．５をコードしているゲノムＤＮＡ配列は第５染色体（ＮＣ＿０００００５．９、ＮＴ０２３１３３．１３（１７２６５９１０７．．１７２６６２３１５、補体）に位置しており、３つの転写産物、すなわちＮｋｘ２．５の主要転写産物（アイソフォーム１、受託番号：ＮＭ＿００４３８７）及び２つの潜在的変異転写産物（アイソフォーム２、受託番号：ＮＭ＿００１１６６１７５．１；及びアイソフォーム３、受託番号：ＮＭ＿００１１６６１７６．１）を産生し、以下のように提供される。
【００１２】
Ｎｋｘ２．５の主要転写産物（受託番号：ＮＭ＿００４３８７；ｇｉ｜２２４５８９８１７：ｃ１７２６６２３１５−１７２６５９１０７；ホモサピエンス；第５染色体、ＧＲＣｈ３７−ｐ５、初期集合）は配列番号１で提供される：
【００１３】
【化１】
2015525770.tif 000002
【００１４】
ヒトＮｋｘ２．５のアイソフォーム１のタンパク質配列（受託番号：ＮＰ＿００４３７８．１）は配列番号２で提供され、以下の通りである：
【００１５】
【化２】
2015525770.tif 000003
【００１６】
ヒトＮｋｘ２．５のアイソフォーム２のタンパク質配列（受託番号：ＮＰ＿００１１５９６４７．１；ｇｉ｜２６０８９８７５０｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００１１５９６４７．１｜ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ２．５アイソフォーム２；ホモサピエンス）は配列番号３で提供され、以下の通りである。
【００１７】
【化３】
2015525770.tif 000004
【００１８】
ヒトＮｋｘ２．５のアイソフォーム３のタンパク質配列（受託番号：ＮＰ＿００１１５９６４８．１；ｇｉ｜２６０８９８７５２｜ｒｅｆ｜ＮＰ＿００１１５９６４８．１｜ホメオボックスタンパク質Ｎｋｘ２．５アイソフォーム３；ホモサピエンス）は配列番号４で提供され、以下の通りである。
【００１９】
【化４】
2015525770.tif 000005
【００２０】
本明細書においてＮｋｘ２．５と称されるものは、配列番号２、３、又は４（すなわちアイソフォーム１、２、又は３）のいずれか一つで定義されるタンパク質並びにこれらの機能性変異体及び断片を意味する。しかしながら、Ｎｋｘ２．５のアイソフォーム１（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ．受託番号：ＮＰ＿００４３７８）並びにこの機能性変異体及び断片が好ましい。よって好ましくは、前記阻害剤は実質的に配列番号２、３、若しくは４に示されるアミノ酸配列又はこれらの機能性変異体若しくは断片を含むＮｋｘ２．５の発現を防止又は低減する。
【００２１】
実施例に記載のように、本発明者らは正常な血管ではＮｋｘ２．５は発現しないが再構築した血管及び血管病変時にはＮｋｘ２．５が発現することを示している。Ｎｋｘ２．５は大動脈、冠状動脈、頸動脈、及び大腿動脈におけるヒトアテローム性動脈硬化症において観察されており、肺動脈高血圧症患者の肺血管系においても発現している。ゆえに、この転写因子の阻害剤は血管再構築の構成要素に関わる疾患の治療において有効となるであろう。
【００２２】
例えば、治療される不適切な血管再構築（及び血管細胞外マトリックスの沈着）に特徴づけられる疾患は、肺高血圧症（ＰＨ）、結合組織疾患又はＨＩＶに関連する全てのタイプの肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）を含む肺動脈高血圧症、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、慢性肢虚血若しくは脳卒中、腎動脈疾患、メタボリックシンドローム及び糖尿病、リウマチ疾患（例えば全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、リウマチ性関節炎、血管炎（vasculis））、線維筋性形成異常、又は動脈瘤を含む。
【００２３】
Ｎｋｘ２．５の生物活性を低下させることができる阻害剤は、様々な手段によってこれらの効果を達成できる可能性がある。例えば、
（ａ）Ｎｋｘ２．５と核酸及び／又は他の転写因子との間の相互作用を低減させる；
（ｂ）核酸の結合及び／又は他の転写因子の結合に対して内因性Ｎｋｘ２−５と競合する；
（ｃ）Ｎｋｘ２．５に結合してその生物活性を減少させる；
（ｄ）Ｎｋｘ２．５の発現を減少させる；又は
（ｅ）Ｎｋｘ２．５の核移行を阻害するような阻害剤があるだろう。
【００２４】
実施態様の一つとして、例えば上記（ａ）〜（ｃ）のように前記阻害剤はＮｋｘ２．５と直接相互作用してもよい。本発明に記載の使用する好ましい阻害剤は、低分子ライブラリのハイスループットスクリーニングの一環として特定されうる低分子阻害剤も含む。例えば、前記阻害剤はＮｋｘ２．５中和抗体のようなＮｋｘ２．５に対して提示される抗体を含んでもよい。前記抗体はポリクローナル又はモノクローナルのいずれでもよい。前記抗体を作製するのに、技術的に公知な従来のハイブリドーマ技術を用いてもよい。Ｎｋｘ２．５のホメオドメインはＤＮＡに結合するのに不可欠である。Ｎｋｘ２．５のＣ末端は他の転写因子に結合し相互作用するが、阻害活性も有している。よって、本発明に記載のモノクローナル抗体の産生に用いられる抗原は、Ｎｋｘ２．５タンパク質全体又はその断片でもよい。
【００２５】
他の実施態様として、本発明に記載の阻害剤は、内因性Ｎｋｘ２．５と競合してその活性を低下させるＮｋｘ２．５の不活性ペプチド断片を含んでもよい。例えば、核酸又は他の転写因子に結合せず、またＮｋｘ２．５が核酸に結合する能力を阻害するＮｋｘ２．５欠失変異体も本発明の阻害剤として用いてもよい。
【００２６】
他の実施態様として、前記阻害剤はＮｋｘ２．５の発現を防止又は低減してもよい（すなわち上記（ｄ）のように）。
【００２７】
実施例に記載のように、本発明者らは、‘合成型’の大動脈平滑筋細胞においてｓｉＲＮＡによるＮｋｘ２．５発現阻害が、Ｉ型コラーゲンタンパク質のレベルを下方制御するだけでなく、線維形成応答の一環として上方制御されることが知られる細胞外マトリックス関連タンパク質（ＣＴＧＦ，フィブロネクチン）のレベルも下方制御することを実証した。本発明者らは、Ｎｋｘ２．５ノックダウンが平滑筋細胞の正常に分化した収縮状態に関連するタンパク質（例えばα−ＳＭＡ、ｓｍ−ＭＨＣ、スムーセリン）の発現の上方制御をもたらすことも示した。図１３Ｃに示すように、ヒト大動脈平滑筋細胞の４色免疫蛍光染色は、ｓｉＲＮＡを用いたＮｋｘ２．５阻害がＩ型プロコラーゲンの下方制御、αＳＭＡ線維の上方制御、及び平滑筋細胞の表現型の可視的変化をもたらすことを明らかにしている。これらのデータは、血管の病変、再構築、及び瘢痕化に関連する分化した収縮型表現型から脱分化した合成型表現型への血管平滑筋細胞の脱分化に対してＮｋｘ２．５が直接的に関与していることを示唆している。
【００２８】
従って、本発明に記載の阻害剤は遺伝子抑制分子であってもよい。
【００２９】
「遺伝子抑制分子」とは、Ｎｋｘ２．５遺伝子の発現を干渉するいかなる分子も意味する。そのような分子は、ＲＮＡｉ分子に限らず、ｓｉＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム、及びアンチセンス分子を含む。そのような分子の使用は本発明の重要な側面を表している。
【００３０】
ゆえに、本発明の第４の側面として、不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患の治療、改善、又は予防に用いるためのＮｋｘ２．５遺伝子抑制分子が提供される。
【００３１】
遺伝子抑制分子は、アンチセンス分子（アンチセンスＤＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡ）又はリボザイム分子でもよい。リボザイム及びアンチセンス分子は、Ｎｋｘ２．５遺伝子の転写を阻害するのに用いられる。アンチセンス分子とは、配列特異的にＤＮＡ又はＲＮＡのような核酸に結合するオリゴヌクレオチドである。相補的な配列を有するｍＲＮＡに結合すると、アンチセンスＲＮＡはｍＲＮＡの転写を阻止する。三重らせん（triplex）分子は、ＤＮＡ２重鎖に結合して共線的な三重らせん分子を形成し、それにより転写を阻止するアンチセンスＤＮＡ１本鎖を意味する。特に有用なアンチセンスヌクレオチド及び三重らせん分子は、Ｎｋｘ２．５をコードするセンスＤＮＡ（又はｍＲＮＡ）鎖に対して相補的又は結合するものである。
【００３２】
ＲＮＡ基質の特異的切断を触媒できる酵素的ＲＮＡ分子であるリボザイムの発現も、タンパク質の翻訳を阻止するために用いてもよい。リボザイムの働きのメカニズムは、相補的な標的ＲＮＡに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでエンドヌクレアーゼ的切断を伴い、ハンマーヘッドモチーフリボザイムが例として挙げられる。
【００３３】
遺伝子抑制分子は低分子干渉核酸（ｓｉＮＡ）であることが好ましい。ｓｉＮＡ分子は二重鎖でそれゆえセンス鎖及びアンチセンス鎖を有していてもよい。ｓｉＮＡ分子はｓｉＤＮＡ分子又はｓｉＲＮＡ分子を含んでもよい。但し、ｓｉＮＡ分子はｓｉＲＮＡ分子を含むことが好ましい。ゆえに、本発明に記載のｓｉＮＡ分子はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって遺伝子発現を下方制御する。
【００３４】
ＲＮＡｉは、動植物における配列特異的な転写後遺伝子抑制過程を指す。ＲＮＡｉでは二重鎖で抑制される（標的の）遺伝子に対して配列相同的な低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）を用いる。ゆえに、標的遺伝子の転写によって産生されるｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ分子の配列特異的な結合は、非常に特異的で標的化された遺伝子発現の‘ノックダウン’をもたらす。
【００３５】
好ましくは、遺伝子の下方制御が可能となるよう、前記ｓｉＮＡ分子は少なくともＮｋｘ２．５遺伝子（上記参照）コード配列の領域において実質的に同一である。好ましくは、ｓｉＮＡ分子配列とＮｋｘ２．５遺伝子の標的領域との間における配列同一性は少なくとも６０％であり、好ましくは少なくとも７５％の配列同一性であり、好ましくは８５％の配列同一性であり、好ましくは９５％の配列同一性であり、好ましくは９７％の配列同一性であり、最も好ましくは９９％の配列同一性である。
【００３６】
ｓｉＮＡ分子はおよそ５ｂｐから５０ｂｐまでの間を含んでもよく、好ましくは１０ｂｐから３５ｂｐまでの間を含み、より好ましくは１５ｂｐから３０ｂｐまでの間を含み、さらにより好ましくは１６ｂｐから２５ｂｐまでの間を含む。最も好ましくは、ｓｉＮＡ分子は２２ｂｐより少ないものである。
【００３７】
適切なｓｉＮＡ分子の設計は複雑なプロセスであり、非常に注意を要する標的ｍＲＮＡ分子配列の分析を伴う。本発明者らは、多大な発明の努力を用いることで、核酸塩基の特定組成を有する定義されたｓｉＲＮＡ配列を選択し、ＲＮＡ干渉を引き起こすように求められる親和性及び安定性を有することを示した。前記ｓｉＮＡ分子は初めから合成されたもの又は微生物から産生されたもののいずれでもよい。例えば、前記ｓｉＮＡ分子は大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ．）のようなバクテリアから産生されてもよい。
【００３８】
当然、そのようなｓｉＮＡはウラシル（ｓｉＲＮＡ）又はチミン（ｓｉＤＮＡ）のいずれを含んでもよい。従って、上記で言及したように、核酸Ｕ及びＴは置き換えてもよい。但し、ｓｉＲＮＡを用いることが好ましい。
【００３９】
Ｎｋｘ２．５をコードする遺伝子の発現の下方制御に適応される特に好ましいｓｉＮＡ分子配列は、以下の配列を有してもよい。
【００４０】
５’−ＣＣＴＣＡＡＴＣＣＣＴＡＣＧＧＴＴＡＴ−３’（配列番号：５）；
５’−ＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＴＣＧＴＧＡＡ−３’（配列番号：６）；
５’−ＧＣＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＧＧＣＡ−３’（配列番号：７）；及び
５’−ＣＣＧＧＧＡＴＴＣＣＧＣＡＧＡＧＣＡＡ−３’（配列番号：８）
配列番号５〜８で示す前記ｓｉＲＮＡは、本発明に記載のｓｉＲＮＡ分子として用いられる。
【００４１】
本発明者らは、実施例に記載した方法でこれらの各ｓｉＮＡ分子について試験し、これらの阻害剤がＮｋｘ２．５発現の低減に対して有効であること、ゆえに不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患の治療に対して有効であることを実証した。
【００４２】
本発明者らは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）も本発明に記載の適切なｓｉＮＡ分子として用いてもよいと考えている。前記ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１２５ｂ，ｍｉＲ−１４５，ｍｉＲ−１４３，ｍｉＲ−３６７，ｍｉＲ−３８４，ｍｉＲ−３６３，ｍｉＲ−３２，ｍｉＲ−２５，並びにｍｉＲ−９２ａ及びｂから選択される。
【００４３】
本発明に記載の遺伝子抑制分子は、好ましくは核酸（例えばｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス、又はリボザイム）である。そのような分子は（必須ではないが）治療対象者の細胞のＤＮＡに組み込まれるものであってもよい。未分化の細胞は安定的に遺伝子抑制分子に変換され、遺伝的に修飾された娘細胞の産生につながる（そのようなケースでは前記対象者において発現の制御が要求される、例えば特異的転写因子又は遺伝子活性化因子）。
【００４４】
前記遺伝子抑制分子は、初めから合成されたものでも、標的細胞内で遺伝子抑制（例えばＲＮＡ干渉）を誘発するために十分な量を導入されたものでもよい。その代わりとして、前記分子は、微生物、例えば大腸菌から産生され、それから標的細胞において遺伝子抑制を誘発するために十分な量を導入されたものでもよい。
【００４５】
前記分子は、遺伝子抑制配列をコードする核酸を含むベクターから産生されたものでもよい。前記ベクターは、核酸の発現の制御及び／又は促進が可能な要素を含んでもよい。前記ベクターは、リコンビナントベクターであってもよい。前記ベクターは、例えばプラスミド、コスミッド、ファージ、又はウイルスＤＮＡを含んでもよい。遺伝子抑制分子を合成するため、前記ベクターの使用に加えて又は代わりとして、前記ベクターは標的細胞を遺伝子抑制配列に変換する送達システムとして用いてもよい。
【００４６】
前記リコンビナントベクターは他の機能性要素を有してもよい。例えば、リコンビナントベクターは標的細胞内で自発的に複製するように設計される。この場合において、前記リコンビナントベクター内で核酸の複製を誘発する要素が必要であってもよい。その代わりとして、前記リコンビナントベクターは前記ベクター及びリコンビナント核酸分子が標的細胞のゲノムに融合するよう設計されてもよい。この場合において、標的化された融合を好む核酸配列（例えば相同的組み換え）が望ましい。リコンビナントベクターは、クローニング過程において選択可能なマーカーとして用いられる遺伝子のＤＮＡコードを有していてもよい。
【００４７】
前記リコンビナントベクターは、求められる核酸の発現を制御するプロモーター又はレギュレーター又はエンハンサーを含んでもよい。組織特異的なプロモーター／エンハンサー要素は、特異的な細胞型、例えば血管細胞において、核酸の発現を制御するのに用いられる。前記プロモーターは構成的又は誘導的である。
【００４８】
または、前記遺伝子抑制分子はベクターに組み込まれて又は組み込まれずに対象者の標的細胞又は組織に投与してもよい。例えば、前記分子は、リポソーム又はウイルス粒子（例えば、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ワクチンウイルス、アデノウイルス、レントウイルス、又は同様のもの）に組み込まれてもよい。また、“ｎａｋｅｄ”なｓｉＮＡ又はアンチセンス分子は、適切な手段、例えば直接的なエンドサイトーシス的捕捉によって対象者の細胞に挿入されてもよい。
【００４９】
前記遺伝子抑制分子は、トランスフェクション、感染、マイクロインジェクション、細胞融合、原形質融合、又は衝撃照射（ballistic bombardment）のいずれかの方法で治療対象者の細胞に導入してもよい。例えば、以下の方法によって導入してもよい；被覆された金粒子の衝撃照射；ｓｉＮＡ分子を含むリポソーム；遺伝子抑制配列を含むウイルスベクター、又は遺伝子抑制分子を直接利用した核酸捕捉（例えばエンドサイトーシス）を提供する手段。
【００５０】
本発明の好ましい実施態様として、（ベクターとしてまたは“ｎａｋｅｄ”として）ｓｉＮＡ分子が標的細胞に送達され、複製するために宿主細胞に寄生し、それにより治療上有効なレベルに達してもよい。この場合において、前記ｓｉＮＡは、前記ｓｉＮＡを細胞内で書き換えさせ（Ｎｋｘ２．５をコードする内因性ｍＲＮＡの崩壊を誘発することで）翻訳の妨害を可能にさせる発現カセットに取り込まれてもよい。
【００５１】
その他の実施態様として、前記阻害剤はＮｋｘ２．５の核移行を阻害してもよい（すなわち上記（ｅ））。
【００５２】
実施例に記載したように、本発明者らは、Ｎｋｘ２．５がカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ）によるリン酸化によって制御されること、並びにＮｋｘ２．５のリン酸化はＮｋｘ２．５の核移行及びＤＮＡ結合能の驚くべき低下をもたらすことを示した。
【００５３】
それに基づき、本発明に記載の阻害剤はカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ）の活性を阻害してもよい。
【００５４】
本発明の阻害剤として使用されうる好ましいＣＫＩＩ阻害剤は、ＣＸ−４９４５［ＣＡＳ番号１００９８２０−２１−６］、ＣＸ−８１８４、カゼインキナーゼＩＩ阻害剤ＩＩＩ、（ＴＢＣＡ）［ＣＡＳ  ９３４３５８−００−６］、ＣＫＩＩ阻害剤ＩＶ（ＩＱＡ）［ＣＡＳ  ３９１６７０−４８−７］カゼインキナーゼＩＩ阻害剤Ｖ、（キナリザリン）［ＣＡＳ  ８１−６１−８］、カゼインキナーゼＩＩ阻害剤ＶＩ、（ＴＭＣＢ）［ＣＡＳ  ９０５１０５−８９−７］、カゼインキナーゼＩＩ阻害剤ＶＩＩ、及びカゼインキナーゼＩＩ阻害剤ＶＩＩＩを含む。
【００５５】
実施例で記載したように、ＣＸ−４９４５は１−１０ｎＭの濃度域において血管平滑筋細胞内でのＮｋｘ２．５の核移行を阻害することが示されている。ＣＸ−４９４５は、血管の再構築及び病変に関連する血管平滑筋細胞の正常な‘収縮性’から‘合成型’への表現型修飾を阻止し、血管平滑筋細胞の遊走を阻害する。
【００５６】
従って、最も好ましいＣＫＩＩ阻害剤はＣＸ−４９４５を含む。
【００５７】
本発明に記載の阻害剤は薬剤に用いてもよく、その薬剤は単剤療法、すなわち不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患症状を治療、改善、又は予防のための阻害剤のみの利用（例えば、抗体、ｓｉＮＡ分子、又はＣＸ−４９４５）に用いてもよいと解されるであろう。あるいは、本発明に記載の阻害剤は、不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患を治療、改善、又は予防するための公知の治療法の補助として又は併用として用いてもよい。例えば、本発明の阻害剤は、利尿剤、β遮断薬、又はＡＣＥ阻害剤などのような公知のＰＨ治療剤と組み合わせて用いてもよい。
【００５８】
本発明に記載の阻害剤は、特に、本組成物が用いられる様式に応じて、多様な形態の組成物に組み込まれてもよい。ゆえに、例えば、前記組成物は、粉末、錠剤、カプセル、液体、軟膏、クリーム、ジェル、ヒドロゲル、エアロゾル、スプレー、ミセル溶液、経皮吸収パッチ、リポソーム懸濁液、又はその他治療を必要とするヒト若しくは動物への投与に適した形態であればよい。本発明に記載の薬剤賦形剤は投与される前記対象者にとって耐えられるものであるべきと解されるであろう。
【００５９】
本発明に記載の阻害剤を含む薬剤は、様々な方法で用いられてもよい。例えば、経口投与が求められる場合、前記阻害剤は例えば錠剤、カプセル、又は液体の形態で経口的に摂取される組成物に含まれてもよい。本発明の阻害剤を含む組成物は、（例えば鼻腔内に）吸入投与しても良い。組成物は、局所使用のために処方してもよい。例えば、クリーム又は軟膏は、肌、例えば治療箇所の隣接部位、例えばＰＨ、ＰＡＨ、又はアテローム性動脈硬化症などを提示する動脈又は静脈に適用してもよい。
【００６０】
本発明に記載の阻害剤は、徐放又は遅延放出デバイスに取り込まれてもよい。そのようなデバイスは、例えば、皮膚又は皮下に挿入され、前記薬剤が数週間又は数か月かけて放出されてもよい。前記デバイスは、少なくとも治療箇所の隣接部位に位置してもよい。そのようなデバイスは、本発明に記載の阻害剤を用いた長期治療が求められ、通常的に連続投与（例えば少なくとも連日注射）が求められる場合において特に好適である。
【００６１】
好ましい実施態様として、本発明に記載の阻害剤及び組成物は、血液又は直接治療が必要な部位への注射により対象者に投与してもよい。注射は、静脈（急速静注若しくは点滴）、皮下（急速静注若しくは点滴）、又は皮内（急速静注若しくは点滴）でもよい。
【００６２】
前記阻害剤の必要量はその生物活性及び生体利用効率によって定められ、投与方法、前記阻害剤の物理学的物性、及び単剤治療若しくは複剤治療のいずれに用いるのかということに依存すると解されるであろう。投与頻度は、治療対象者における前記阻害剤の半減期にも影響されるであろう。最適な投与用量は当業者が定めてもよく、使用する特定阻害剤、医薬組成物の強度、投与方法、又は治療する疾患の進行性によって異なるであろう。年齢、体重、性別、食生活、又は投与時間を含む、個々の治療対象者に依存する付加的因子は、用量調節の必要をもたらすであろう。
【００６３】
一般的に、本発明に記載の阻害剤の１日用量は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇから０．５ｇの間で、不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患の治療、改善、又は予防のために用いてもよく、いずれの阻害剤（例えばｓｉＮＡ、抗体、又はＣＸ−４９４５のような低分子阻害剤）を使用するのかに依存する。より好ましくは、阻害剤の１日用量は体重１ｋｇあたり０．０１ｍｇから５００ｍｇの間であり、さらに好ましくは体重１ｋｇあたり０．１ｍｇから２００ｍｇまでの間であり、最も好ましくは体重１ｋｇあたりおよそ１ｍｇから１００ｍｇまでの間である。
【００６４】
前記阻害剤がｓｉＮＡ分子である場合、１日用量は体重１ｋｇあたり１μｇから１００ｍｇまでの間であり、より好ましくは体重１ｋｇあたりおよそ１０μｇから１０ｍｇまでの間であり、さらに好ましくは体重１ｋｇあたり５０μｇから１ｍｇまでの間である。前記阻害剤（例えば抗体又はｓｉＮＡ）が細胞に送達される場合、１日用量は単回投与（例えば１日１回の注射）として与えてもよい。典型的には、治療上有効な用量は、１回投与あたり１ｎｇ／ｋｇから１００μｇ／ｋｇまでの間の阻害剤で提供するべきであり、好ましくは、１回投与あたり２ｎｇから５０ｎｇまでの間である。抗体阻害剤は、１０μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまでの間でも良く、好ましくは１００μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇまでの間であり、より好ましくは１ｍｇ／ｋｇ程度投与しても良い。そのような用量は数日（例えば３日）ごとに投与する場合に特に好適である。
【００６５】
前記阻害剤は、不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患の発症前、中、又は後で投与してよい。１日用量は単回投与（例えば１日１回の注射）で与えてもよい。あるいは、前記阻害剤は１日に２回又はそれ以上の回数の投与を必要としてもよい。一例としては、（すなわち体重７０ｋｇと仮定すれば）２５ｍｇから７０００ｍｇまでの間の１日用量の２倍（又は治療する疾患の重症度に依存してそれ以上の倍数）の阻害剤を投与してもよい。治療を受ける患者は、起床時に第一投与を、（もし２回投与体制なのであれば夕方に又は３時間若しくは４時間のインターバルを設けて第二投与を受けてもよい。あるいは、繰り返し投与が必要でない患者に対しては、本発明に記載の阻害剤を最適な用量で提供するために徐放デバイスを用いてもよい。
【００６６】
前記阻害剤が核酸である場合、前記阻害剤を目的組織に送達するために、従来の分子生物学技術（ベクター導入、リポソーム導入、衝撃照射など）を用いてもよい。
【００６７】
本発明に記載の前記阻害剤を含む特定処方や（前記阻害剤の１日用量や投与頻度といった）正確な治療計画を作成するため、製薬業界で従来的に採用されている公知の手順（例えばｉｎ  ｖｉｖｏ試験、臨床試験など）を用いてもよい。本発明者らは、本発明の阻害剤の使用に基づき不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患の治療のための医薬組成物を記載したのは彼らが初めてであると考えている。
【００６８】
従って、本発明の第五の側面において、Ｎｋｘ２．５活性阻害剤及び薬学的に許容される賦形剤を含む、不適切な血管再構築の治療組成物を提供する。
【００６９】
「不適切な血管再構築の治療組成物」とは、対象者における不適切な（すなわち過多又は過少な）血管の再構築に特徴づけられるいかなる疾患症状の治療上の改善、予防、又は治療に用いられる製剤処方を意味する。
【００７０】
本発明は、第六の側面において、第五の側面に記載した組成物の製造方法についても提供し、この製造方法は治療上有効な量のＮｋｘ２．５活性阻害剤を薬学的に許容される賦形剤に接触させることを含む。
【００７１】
前記阻害剤は、低分子阻害剤、抗体、遺伝子抑制分子（例えばｓｉＮＡ）、又はＣＸ−４９４５のようなＣＫＩＩ阻害剤でもよい。
【００７２】
「対象者」とは、脊椎動物、哺乳類、又は家畜でもよい。従って、本発明に記載の組成物及び薬剤は、いかなる哺乳類、例えば家畜（例えば馬）やペットの治療に用いてもよく、又はその他の獣医学的利用に用いてもよい。但し、前記対象者はヒトであることが最も好ましい。
【００７３】
前記阻害剤の「治療上有効な量」とは、対象者に投与する際に、不適切な血管再構築に特徴づけられる症状を治療する又は望まれる効果を得るために必要とされる、薬剤又は薬の任意の量である。
【００７４】
例えば、治療上有効な阻害剤の使用量は、０．０１ｍｇから８００ｍｇまでの間でもよく、好ましくは０．０１ｍｇから５００ｍｇまでの間である。（さらに、）阻害剤の量は０．１ｍｇから２５０ｍｇまでの間であることが好ましく、最も好ましくは０．１ｍｇから２０ｍｇまでの間である。
【００７５】
ここで言及されている「薬学的に許容される賦形剤」とは、当業者にとって医薬組成物を処方するのに有用であることが知られている、いかなる公知化合物又は公知化合物の組み合わせでもよい。
【００７６】
実施態様の一つとして、前記の薬学的に許容される賦形剤は固体でもよく、前記組成物は粉末状又は錠剤状でもよい。固体の医薬品賦形剤は、香料添加剤、潤滑剤、可溶化剤、懸濁化剤、染料、フィラー、流動促進剤、圧縮補助器具、不活性バインダー、甘味料、防腐剤、染料、コーティング、又は錠剤崩壊剤として作用する一つ又はそれ以上の物質を含んでもよい。前記賦形剤は、封入材料であっても良い。粉末の場合、前記賦形剤は微粉化した本発明記載の活性化剤を混合した微粉化固体である。錠剤の場合、前記活性化剤（例えばＮｋｘ２．５活性阻害剤）は、必須の圧縮特性を有する賦形剤と適切な比率で混合し、望ましい形及びサイズに圧縮してもよい。粉末及び錠剤は、前記活性化剤を最大９９％まで含有するのが好ましい。適切な固体賦形剤は、例えばリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、デキストリン、デンプン、ゼラチン、セルロース、ポリビニルピロリドン、低融点ワックス、及びイオン交換樹脂を含む。その他の実施態様として、前記医薬品賦形剤はゲルでもよく、前記組成物はクリーム又は同類の形態でもよい。
【００７７】
但し、前記医薬品賦形剤は液体でもよく、前記組成物は溶液状でもよい。液体賦形剤は、溶液、懸濁液、エマルション、シロップ、エリキシル剤、及び加圧組成物の調製に用いられる。本発明に記載の阻害剤は、水、有機溶媒、これらの混合物、又は薬学的に許容される油若しくは脂のような薬学的に許容される液体賦形剤に溶解又は懸濁してもよい。前記液体賦形剤は、可溶化剤、乳化剤、緩衝液、防腐剤、甘味料、香料添加剤、懸濁化剤、増粘剤、色素、粘度調整剤、安定化剤、又は浸透圧調節剤のような他の適切な医薬品添加剤を含有してもよい。経口及び非経口投与に用いる液体賦形剤の適切な例としては、水（部分的に上述の添加剤を含有する、例：セルロース誘導体、好ましくはカルボシキメチルセルロースナトリウム溶液）、アルコール（一価及び多価アルコールを含む、例：グリコール）及びこれらの誘導体、並びに油（例：分画されたココナッツ油及びラッカセイ油）を含む。非経口投与の場合、前記賦形剤はオレイン酸エチル及びミリスチン酸イソプロピルのような脂肪酸エステルでもよい。無菌の液体賦形剤は、非経口投与用途の無菌組成物において有用である。加圧組成物に用いる前記液体賦形剤は、ハロゲン化炭化水素又は他の薬学的に許容された推進薬でもよい。
【００７８】
滅菌溶液又は滅菌懸濁液である液体の医薬品賦形剤は、例えば筋肉内、くも膜下、硬膜外、腹腔内、静脈、及び特に皮下への注射に利用できる。前記阻害剤は、投与時に滅菌水、生理食塩水、又はその他適切な無菌で注射可能な溶媒に溶解又は懸濁する無菌固体組成物として調製してもよい。
【００７９】
本発明の阻害剤及び医薬品賦形剤は、他の溶質又は懸濁化剤（例えば、溶液を等浸透圧化させるのに十分な生理食塩水又はグルコース）、胆汁塩、アカシア、ゼラチン、モノオレイン酸ソルビタン、ポリソルベート８０（エチレンオキシドと共重合させたソルビトール及びその無水物のオレイン酸エステル）、及び同類のものを含む滅菌溶液又は滅菌懸濁液の形態で経口投与してもよい。本発明に記載の阻害剤は、液体又は固体いずれの組成物の形態で経口投与してもよい。経口投与に適した組成物は、ピル、カプセル、顆粒、錠剤、及び粉末のような固体、並びに溶液、シロップ、エリキシル剤、及び懸濁液のような液体を含む。非経口投与に適した形態は、滅菌の溶液、エマルション、又は懸濁液を含む。
【００８０】
Ｎｋｘ２．５がＰＨ、ＰＡＨ、アテローム性動脈硬化症、ＣＡＤ，ＰＡＤ，慢性肢虚血、及び脳卒中などのような不適切な血管再構築の疾患に働くという驚くべき役割に関する知見を得たことで、本発明者らは、例えばここに示す医薬組成物に封入する目的で、これらの疾患の治療又は予防に有用な阻害剤として試験化合物が作用するのか否かを特定する新規のスクリーニングアッセイを開発することができた。
【００８１】
従って、第七の側面として、
（ｉ）生物系を試験化合物に曝露し；
（ｉｉ）前記生物系におけるＮｋｘ２．５の活性又は発現を検出し；さらに
（ｉｉｉ）前記試験化合物で処理した生物系におけるＮｋｘ２．５の活性又は発現を前記試験化合物で処理していないコントロールの生物系におけるＮｋｘ２．５の活性又は発現と比較することを有し、
前記コントロールの生物系と比較して前記試験化合物存在下でＮｋｘ２．５の活性又は発現のレベルが減少した場合、前記試験化合物は不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患を治療又は防止する能力があることを示す、試験化合物が不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患の治療又は予防における有効性を有するか否かを試験するための試験化合物のスクリーニングを目的とするアッセイを提供する。
【００８２】
前記第七の側面に記載のアッセイは、試験化合物が実際に不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患を引き起こすのか否かを試験ために利用してもよいと解されるであろう。
【００８３】
従って、本発明の第八の側面として、
（ｉ）生物系を試験化合物に曝露し；
（ｉｉ）前記生物系におけるＮｋｘ２．５の活性又は発現を検出し；さらに
（ｉｉｉ）前記試験化合物で処理した生物系におけるＮｋｘ２．５の活性又は発現を試験化合物で処理していないコントロールの生物系におけるＮｋｘ２．５の活性又は発現と比較することを有し、
前記コントロールの生物系と比較して前記試験化合物存在下でＮｋｘ２．５の活性又は発現レベルが上昇した場合、試験化合物は不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患を引き起こすことを示す、試験化合物が不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患を引き起こすか否かを試験するための試験化合物のスクリーニングを目的とするアッセイを提供する。
【００８４】
本発明のアッセイは、Ｎｋｘ２．５の発現及び／又は活性の範囲が不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患の進行に深く関連しているという本発明者らの認識に基づいている。第七側面のアッセイは、本発明で阻害剤として使われる化合物を特定するために化合物ライブラリをスクリーニングする際に、特に有用である。第八側面のアッセイは、疾患を引き起こす化合物を特定するのに用いてもよい。従って、本発明の第八側面に記載のスクリーニングは、環境モニタリング（例えば工場排水の試験）又は毒性試験（例えば推定される薬剤、化粧品、食品、又は同類のものの安定性試験）のために用いてもよい。
【００８５】
「生物系」という用語は、生理環境下で試験化合物がＮｋｘ２．５の活性又は発現に与える影響について洞察を与えるものであると当業者が理解するいかなる試験系も意味する。前記系は、（ａ）ｉｎ  ｖｉｖｏ試験が採用される場合は被験者である、（ｂ）被験者から採取した生物試料である（例えば血液若しくは血液分画（例：血清、血漿）、リンパ液、又は細胞／生検試料）、（ｃ）細胞株モデル（例えばＮｋｘ２．５を自然発現する細胞又はＮｋｘ２．５を発現するよう開発された細胞）、又は（ｄ）Ｎｋｘ２．５又はその遺伝子を含み、Ｎｋｘ２．５の活性又発現を測定できるように生理環境を模倣したｉｎ  ｖｉｔｒｏ系、という点を含みうる。
【００８６】
スクリーニングは、生物細胞又はそれらの溶解物を分析するのが好ましい。スクリーニングが細胞の分析である場合、その方法がｉｎ  ｖｉｖｏに基づく試験ならば、実験動物（例えばマウス又はラット）を含んでも良い。あるいは、前記細胞は（ｅｘ  ｖｉｖｏに基づく試験のために）組織試料内にあるもの、又は培地内で培養させたものでも良い。そのような細胞は、機能的なＮｋｘ２．５を発現又は発現するために誘導すべきである。発現ベクターで変換されるという条件で、Ｎｋｘ２．５を自然に発現しにくい細胞を用いることも可能であると解されるであろう。そのような細胞は、本発明の第七及び第八の側面に記載した好ましい試験細胞を表している。これは、動物細胞又は原核細胞でさえも、ヒトＮｋｘ２．５を発現し、ヒトの治療に用いる候補薬の有用性を試験するのに良い細胞モデルを表すように変換されてもよいからである。
【００８７】
前記スクリーニングアッセイに用いられる生物細胞は、ＰＨ、ＰＡＨ、又はアテローム性動脈硬化症のような不適切な血管再構築に特徴づけられる疾患の一例を発症している患者から採取したものであることが最も好ましい。
【００８８】
前記スクリーニングアッセイに記載の「Ｎｋｘ２．５の活性又は発現の検出」において、「活性」という用語は、Ｎｋｘ２．５と核酸及び／又は他の転写因子との間の結合の検出；終点生理的効果の転座及び決定（translocation and determination of an end-point physiological effect）の検出を意味しうる。
【００８９】
「発現」という用語は、細胞のあらゆる区画（例えば核内、細胞質、小胞体、若しくはゴルジ体）における、Ｎｋｘ２．５タンパク質の検出、又はＮｋｘ２．５をコードするｍＲＮＡの検出を意味する。
【００９０】
生物系におけるＮｋｘ２．５の発現は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、又は免疫組織化学により検出してもよい。前記スクリーニングアッセイは、Ｎｋｘ２．５を含む細胞抽出物の使用に基づいてもよい。そのような抽出物は上述の細胞から採取するのが好ましい。
【００９１】
Ｎｋｘ２．５の活性又は発現は、当業者にとって公知である多様な従来技術を用いて測定してもよい。前記試験は、免疫測定法に基づいた試験でもよい。例えば、試料内での化合物のＮｋｘ２．５に対する結合を評価するため、免疫測定法で用いられる標識抗体を用いてもよい。Ｎｋｘ２．５を単離し、それに結合した標識量を検出してもよい。（コントロールと比較して）結合した標識量の減少は、Ｎｋｘ２．５に結合するために試験化合物が標識と競合していること、及びそれが疾患治療に用いられる推定医薬化合物であることを示唆している。
【００９２】
あるいは、Ｎｋｘの２．５活性を測定する機能活性を採用してもよい。さらに、スクリーニングにおいてＮｋｘ２．５を検出するために分子生物学技術を用いてもよい。例えば、ｃＤＮＡは、試験細胞又は被験者から抽出したｍＲＮＡ、及びｃＤＮＡから増幅するための定量ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）に用いられる試験配列を増幅するよう設計したプライマーから産生してもよい。
【００９３】
被験者が用いられる場合（例えば動物モデル又はヒトＮｋｘ２．５を発現するよう開発された動物モデル）、前記試験化合物を所定の時間で前記対象者に投与し、Ｎｋｘ２．５の活性又は発現の分析のために前記被験者から試料を採取すべきである。前記試料は、例えば血液又は生検組織でもよい。
【００９４】
本発明は、いかなる核酸若しくはペプチド若しくは変異体、又はその誘導体若しくはアナログにまで拡張し、実質的にここで言及されるアミノ酸配列又は核酸配列を有し、これらの機能性変異体又は機能性断片を含むと解されるであろう。「実質的にアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列」、「機能性変異体」、及び「機能性断片」とは、ここで言及した配列のうちいずれかのアミノ酸／ヌクレオチド／ペプチド配列と少なくとも４０％の配列同一性を有する配列であり、例えば配列番号１で特定されるヌクレオチド配列（すなわちヒトＮｋｘ２．５をコードするＤＮＡ配列）と４０％の同一性、又は配列番号：５−８で特性されるヌクレオチド配列（すなわちＮｋｘ２．５の遺伝子抑制に用いられるｓｉＲＮＡ分子）と４０％の同一性、などである。
【００９５】
言及した配列に対して、５０％より高い、好ましくは６５％、７０％、７５％、より好ましくは８０％より高い配列同一性を有するアミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列も予想される。アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド配列は言及した配列と少なくとも８５％の同一性があることが好ましく、少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％であることがより好ましく、言及したいずれの配列と少なくとも９９％の同一性を有することが最も好ましい。
【００９６】
当業者であれば、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド２配列間における同一性（一致率）を計算する方法を当然理解しているであろう。アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド２配列間における一致率を計算するためには、はじめに２配列のアラインメントを行ってから計算しなければならない。２配列間の一致率は、以下の点に依存して異なる値をとっても良い：（ｉ）配列のアラインメントに用いられる方法、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ（異なるプログラムで実行される）、又は三次元比較からの構造的アライメント、及び（ｉｉ）アラインメント法で用いられるパラメータ、例えばローカル対グローバルアラインメント、ペアスコアマトリックス（例：ＢＬＯＳＵＭ６２，ＰＡＭ２５０，Ｇｏｎｎｅｔなど）、及びギャップペナルティ（例：関数形式及び定数）。
【００９７】
アラインメントを行ったら、２配列間の一致率の計算方法には様々なものがある。例えば、（ｉ）最も短い配列の長さ、（ｉｉ）アラインメントの長さ、（ｉｉｉ）配列の平均長さ、（ｉｖ）非ギャップポジションの数、又は（ｖ）突出部を除いて等価化したポジションの数で一致した数を除してもよい。さらに、当然のことながら、一致率は配列の長さに大きく依存する。従って、配列のペアが短くなるほど、偶然起きると思われる一致率は高くなる。
【００９８】
従って当然のことながら、タンパク質又はＤＮＡの配列の正確なアラインメントは複雑な過程である。本発明に従ってタンパク質又はＤＮＡの多重配列アラインメントを算出するには、一般向けの多重配列アラインメントプログラムであるＣｌｕｓｔａｌＷ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅｒｃｈ、２２、４６７３−４６８０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ  ａｌ．，１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２４、４８７６−４８８２）が好ましい方法である。ＣｌｕｓｔａｌＷのための適切なパラメータは以下の通りである：ＤＮＡアラインメント用途：ギャップ開始ペナルティ＝１５．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、及びマトリックス＝Ｉｄｅｎｔｉｔｙ。タンパク質アラインメント用途：ギャップ開始ペナルティ＝１０．０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．２、及びマトリックス＝Ｇｏｎｎｅｔ。ＤＮＡ及びタンパク質アラインメント用途：ＥＮＤＧＡＰ＝−１、及びＧＡＰＤＩＳＴ＝４。当業者であれば、最適な配列アラインメントのためにこれらと他のパラメータを変えることが必須であることに気付くであろう。
【００９９】
好ましくは、アミノ酸／ポリヌクレオチド／ポリペプチド２配列間の一致率は、（Ｎ／Ｔ）＊１００のようなアラインメントから計算してもよく、ここでＮは配列が同一の残基を共有するポジションの数であり、ここでＴはギャップを含むがオーバーハングは除外して比較したポジションの合計数である。従って、２配列間の一致率を計算するのに最も好ましい方法としては、以下の点を有する：（ｉ）例えば上記で示したように適切なパラメータセットを用いたＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて配列アラインメントを行う、（ｉｉ）Ｎ及びＴの値を次式に挿入する：配列同一性（一致率）＝（Ｎ／Ｔ）＊１００。
【０１００】
類似の配列を特定する代替法は当業者に知られるであろう。例えば、実質的に類似なヌクレオチド配列は、厳しい条件下で配列番号１又は４−８又はこれらの相補体で示される配列にハイブリダイズする配列によってコードされるだろう。厳しい条件とはつまり、前記ヌクレオチドはおよそ４５℃の３×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、ついでおよそ２０−６５℃の０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで少なくとも１回洗浄してもフィルターに結合したＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズすることである。あるいは、実質的に類似なポリペプチドは、配列番号２−４に示した配列と異なるアミノ酸の数が少なくとも１、しかし５、１０、２０、５０、又は１００より少ないものである。
【０１０１】
遺伝子コードの縮退に起因し、ここに記載されているいずれの核酸配列も、コードされるタンパク質配列に対して実質的に作用することなく、その機能性変異体を提供するように変化できることは明らかである。適切なヌクレオチド変異体は、前記配列内で同じアミノ酸をコードする異なるコドンの置換によって変更された配列を有し、静かな変化を生み出している。その他の適切な変異体は、相同性の高いヌクレオチド配列を有するが、保守的変化を生むために、アミノ酸のコドンをそれと類似した生物物理学的特性の側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンに置換することで変えられる配列の全て又は一部を含む。例えば、小さい非極性な疎水性アミノ酸は、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、及びメチオニンを含む。大きい非極性の疎水性アミノ酸は、フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシンを含む。極性の中性アミノ酸は、セリン、スレオニン、システイン、アスパラギン、及びグルタミンを含む。正の電荷を有する（塩基性の）アミノ酸は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンを含む。負の電荷を有する（酸性の）アミノ酸は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。ゆえに、当然のことながら、アミノ酸は類似の生物物理学的特性を有するアミノ酸で置き換えられてもよく、当業者であればこれらのアミノ酸をコードする前記ヌクレオチド配列を知っているであろう。
【０１０２】
（添付した請求項、要約、及び図面を含む）ここで記載した全ての特徴、及び／又は開示されたいかなる方法又は工程の全ての段階で、少なくとも特徴及び／又は段階が互いに排他的である組み合わせを除き、いかなる組み合わせで上述の側面のいずれと結び付けてもよい。
【０１０３】
本発明のより良い理解のため、さらに同じ実施態様がどのように効果を実行するのを示すために、例えば、添付の図面を参照してもよい：
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１−１】ヒトの細胞及び組織におけるＮｋｘ２．５の血管発現を示す。Ｎｋｘ２．５は全身性ＰＡＨ患者の肺血管系で発現するが、健康なコントロールでは発現しない（Ａ）。Ｎｋｘ２．５の発現は血管平滑筋細胞内で観察され（Ｂ）、細胞外マトリックスタンパク質（ＣＯＬ１，ＣＣＮ２，ＦＮ１）の過剰発現及び収縮タンパク質（ＡＣＴＡ２，ＭＹＨ１１）の下方制御（Ｃ，Ｄ）と同時に起こることにより、“合成的な表現型”への表現型修飾を受ける（Ｃ，Ｄ）。ｓｉＲＮＡを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮｋｘ２．５発現阻害は、ＥＣＭタンパク質の減少及び収縮タンパク質発現の増加をもたらす（Ｅ）；
【図１−２】ヒトの細胞及び組織におけるＮｋｘ２．５の血管発現を示す。Ｎｋｘ２．５は全身性ＰＡＨ患者の肺血管系で発現するが、健康なコントロールでは発現しない（Ａ）。Ｎｋｘ２．５の発現は血管平滑筋細胞内で観察され（Ｂ）、細胞外マトリックスタンパク質（ＣＯＬ１，ＣＣＮ２，ＦＮ１）の過剰発現及び収縮タンパク質（ＡＣＴＡ２，ＭＹＨ１１）の下方制御（Ｃ，Ｄ）と同時に起こることにより、“合成的な表現型”への表現型修飾を受ける（Ｃ，Ｄ）。ｓｉＲＮＡを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＮｋｘ２．５発現阻害は、ＥＣＭタンパク質の減少及び収縮タンパク質発現の増加をもたらす（Ｅ）；
【図２−１】慢性酸素欠乏における誘導性コンディショナルＮｋｘ２．５ノックアウトマウスモデルを示す。
【図２−２】慢性酸素欠乏における誘導性コンディショナルＮｋｘ２．５ノックアウトマウスモデルを示す。
【図３−１】ＰＡＨの慢性酸素欠乏モデルにおいて、Ｎｋｘ２．５の欠失が肺血管の再構築を弱めることを示す。
【図３−２】ＰＡＨの慢性酸素欠乏モデルにおいて、Ｎｋｘ２．５の欠失が肺血管の再構築を弱めることを示す。
【図３−３】ＰＡＨの慢性酸素欠乏モデルにおいて、Ｎｋｘ２．５の欠失が肺血管の再構築を弱めることを示す。
【図４−１】ＰＡＨの慢性酸素欠乏モデルにおいて、Ｎｋｘ２．５非存在下で肺のコラーゲンレベルが弱まることを示す。
【図４−２】ＰＡＨの慢性酸素欠乏モデルにおいて、Ｎｋｘ２．５非存在下で肺のコラーゲンレベルが弱まることを示す。
【図５−１】ＰＡＨの慢性酸素欠乏モデルにおいて、コンディショナルＮｋｘ２．５除去がマウスの心臓に与える影響を示す。
【図５−２】ＰＡＨの慢性酸素欠乏モデルにおいて、コンディショナルＮｋｘ２．５除去がマウスの心臓に与える影響を示す。
【図５−３】ＰＡＨの慢性酸素欠乏モデルにおいて、コンディショナルＮｋｘ２．５除去がマウスの心臓に与える影響を示す。
【図６−１】ＣＫＩＩによるＮｋｘ２．５の核移行阻害が、肺動脈平滑筋細胞の表現型修飾、遊走、及び増殖の阻害をもたらすことを示す。
【図６−２】ＣＫＩＩによるＮｋｘ２．５の核移行阻害が、肺動脈平滑筋細胞の表現型修飾、遊走、及び増殖の阻害をもたらすことを示す。
【図６−３】ＣＫＩＩによるＮｋｘ２．５の核移行阻害が、肺動脈平滑筋細胞の表現型修飾、遊走、及び増殖の阻害をもたらすことを示す。
【図６−４】ＣＫＩＩによるＮｋｘ２．５の核移行阻害が、肺動脈平滑筋細胞の表現型修飾、遊走、及び増殖の阻害をもたらすことを示す。
【図７−１】動脈硬化食を摂取したＡｐｏＥ−／−マウスの大動脈のアテローム硬化性病斑ではＮｋｘ２．５が発現するが、正常な血管壁では発現しないことを示す。
【図７−２】動脈硬化食を摂取したＡｐｏＥ−／−マウスの大動脈のアテローム硬化性病斑ではＮｋｘ２．５が発現するが、正常な血管壁では発現しないことを示す。
【図８】脂肪摂取したａｐｏＥ−／−マウスの大動脈の進行性アテローム硬化性病斑におけるＮｋｘ２．５の発現を示す。
【図９】脂肪摂取したａｐｏＥ−／−マウスの大動脈の進行性アテローム硬化性病斑における、コラーゲン産生細胞内のＮｋｘ２．５の発現を示す。
【図１０】脂肪摂取したａｐｏＥ−／−マウスの大動脈の進行性アテローム硬化性病斑における、平滑筋アクチン陽性（細胞）内のＮｋｘ２．５の共発現を示す。
【図１１】血管再構築のｉｎ  ｖｉｖｏ頸動脈結紮モデルのマウスにおいて、Ｎｋｘ２．５の阻害が新生内膜病斑形成の顕著な減少をもたらすことを示す。
【図１２】アテローム硬化性病斑におけるＮｋｘ２．５の発現を示す。
【図１３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏで表現型修飾を受けるヒト大動脈平滑筋細胞におけるＮｋｘ２．５発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング分析を示す。
【図１４】‘合成型’ヒト平滑筋細胞におけるＮｋｘ２．５の核局在を示す。
【図１５−１】Ｎｋｘ２．５の阻害がより収縮的で遊走性に乏しい表現型をもたらすことを示す。
【図１５−２】Ｎｋｘ２．５の阻害がより収縮的で遊走性に乏しい表現型をもたらすことを示す。
【図１６】Ｎｋｘ２．５の核局在がＣＫＩＩアンタゴニストに及ぼす影響を示す。
【図１７】ＰＡＨの前臨床モデルにおいてＣＸ−４９４５の拮抗作用がＲＶＳＰ及び全身血圧に及ぼす影響を示す。
【図１８】大腿動脈結紮モデルにおいてＮｋｘ２．５の除去が血管再構築に及ぼす影響を示す。
【実施例】
【０１０５】
実験手順
肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）法
組織学：パラフィンで包埋した肺組織を切片化し、標準的な組織学的手順に準じて、ヘマトキシリン及びエオシン、ピクリン酸シリウスレッド（コラーゲン染色）、又はワンギーソン染色剤（エラスチン染色）で染色した。肺動脈の筋肉化は、肺の各部位で１００μｍ未満の血管の数を計測し、それらを筋肉化の程度によって定義することで評価した。
【０１０６】
免疫蛍光：２色、３色、及び４色の免疫蛍光標識を用いて、細胞特異的な抗原の共局在を調べた。新鮮な組織をＣｒｙｏ−Ｍ−Ｂｅｄで包埋し、直ちに液体窒素で冷却したイソペンタン内で急速冷凍し、凍結切片化前に−７０℃で保存した。肺の凍結切片は、特異的な一次抗体及び蛍光でタグ標識化された二次抗体とともに用いた。免疫蛍光は、Ａｘｉｏｃａｍデジタルカメラ及びＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアを備えたＡｘｉｏｓｋｏｐ  Ｚ蛍光顕微鏡を用いて、観察及び画像化を行った。免疫蛍光実験では、Ｎｋｘ２．５特異抗体、Ｉ型コラーゲン、平滑筋細胞マーカーであるα−平滑筋アクチン、平滑筋ミオシン重鎖、スムーセリン、内皮マーカー（例：ＣＤ３１）、及び幹細胞マーカー（例：ＣＤ３４）を用いた。画像は、４０倍又は２０倍のＰｌａｎ  Ｎｅｏｆｌｕａｒレンズで捉え、ＫＳ４００ソフトウェアを用いて分析した。
【０１０７】
低酸素によって誘発される肺高血圧症：誘導コンベンショナルノックアウトマウスであるＮｋｘ２．５  ｆｌｏｘ  Ｃｏｌ１  ＣｒｅＥＲＴマウスを、（１）タモキシフェン誘導を伴う低酸素（酸素１０％）Ｎｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｒｅ＋（コントロールグループ）、（２）トウモロコシ油（cornoil）を伴う低酸素（酸素１０％）Ｎｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｒｅ＋、（３）タモキシフェンを伴う低酸素（酸素１０％）Ｎｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｒｅ−、（４）酸素正常（酸素２１％）の４グループに分け、各グループにつき少なくとも動物を１０個体使用した。前記動物に対し、タモキシフェン／トウモロコシ油を３日目から５日間連続で腹腔内に投与した。前記動物を正常酸素状態又は低酸素状態に曝露して３週間後、１．５％イソフルランで麻酔し、３７℃で制御された保温ブランケットの上に仰向けに置いた。はじめに、右頸静脈を分離し、右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を決定するため圧力カテーテル（１．４Ｆの内径を有するＭｉｌｌａｒ  ｍｏｕｓｅ  ＳＰＲ−６７１ＮＲ圧力カテーテル、Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英）を右心室に導入した。圧力カテーテルをネズミ科動物の肺動脈に挿入するのは非常に困難なため、前記ＲＶＳＰは収縮期動脈圧のためのサロゲートとして用いた。次に、左総頸動脈を分離して圧力カテーテルを導入し、平均動脈血圧（ＭＡＢＰ）を測定した。ＲＶＳＰ及びＭＡＢＰの両方をプレキャリブレートしたＰｏｗｅｒＬａｂシステム（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、豪）に記録した。血行動態計測の前に低酸素環境に置かれる時間を最短化するため、動物をチャンバーから個別に取り出して直ちに麻酔した。前記動物を剖検して心臓を除去し、ＲＶ肥大（ＲＶ：ＬＶ＋Ｓ比）を評価するため心臓の各部屋の重量を測定した。血管の筋運動記録法のため、一次／二次肺動脈を除去した。左肺は、パラフィン包埋及び切片化する前に、凍結保存又は１０％ホルマリンリン酸緩衝生理食塩水を用いた膨張による固定を行った。
【０１０８】
筋運動記録法：配線化小血管筋運動記録システムは、収縮機能に関する収縮弛緩応答及び血管等尺性張力を試験するために用いた。フェニレフリン（ＰＥ；１ｎＭ−５０ｍＭ）アゴニストは、正常酸素状態又は低酸素状態に置かれたマウスの肺から解離した肺動脈における血管収縮を誘発するために用いた。ＮＯドナーであるニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ；１ｎＭ−５０ｍＭ）は、内皮非依存的な弛緩を評価するために用いた。血管は同じ基礎張力で試験した。６０分間以上平衡化した後、血管をフェニレフリンで試した。濃度−収縮応答曲線を作成し、ＰＥ濃度又はＳＮＰ弛緩の百分率として表した。各濃度−応答曲線をフィッティングし、最大収縮の５０％を引き起こす濃度を算出した。ニトロプルシドナトリウムの弛緩応答は、フェニレフリン（１−３ｍｏｌ／Ｌ）で予め収縮させたＩＴＡで試験し、その収縮値の百分率として算出した。
【０１０９】
細胞の外植、初期細胞、及び細胞培養：マウス科の肺動脈平滑筋細胞は、以前記述した培地で保たれた成体マウス由来の肺動脈から外植した。簡潔に述べると、麻酔した動物から動脈を採取し、滅菌冷ＰＢＳ（ｐＨ７．６）内に置いた。心臓に接触した状態で主肺動脈（ＰＡ）及び左右動脈分枝を解離させ、脂肪組織を取り除いた。主肺動脈を長手方向に解剖した。内皮は外科用メス刃で血管内腔表面を穏やかに解体して除去し、外膜も同様に血管から除去した。中膜は外科用メス刃で細かく刻み、０．１％コラゲナーゼＩ（Ｓｉｇｍａ）及び０．１％ＢＳＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）を添加したＭ１９９（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬに加えて穏やかに回転させながら３７℃で１時間インキュベートした。肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣｓ）を遠心分離により回収し、１０％熱不活性化ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、１０Ｕ／ｍＬペニシリンＧナトリウム、１０μｇ／ｍＬスルホン酸ストレプトマイシン、０．２５μｇ／ｍＬアムホテリシンＢ、及び０．１ｍｇ／ｍＬスルホン酸ゲンタマイシン（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を含有したＭ１９９内で規定通りに保った。細胞は０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）を用いたトリプシン処理により継代培養した。血平滑筋細胞は、その特徴的なモルフォロジー及びα−平滑筋アクチンの免疫組織化学染色から特定した。全ての実験は、第２継代から第４継代までの細胞を用いて３回行った。
【０１１０】
遊走、ゲル収縮、及び線維症分析：線維症特有の異なる細胞機能におけるＮｋｘ２．５の役割を究明するため、遊走（創傷）、収縮（コラーゲンゲル収縮）、及びＥＣＭ収縮（フィブロネクチン及びＩ型コラーゲンの定量ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング、及び免疫蛍光）に対して確立された分析法を用いて、細胞遊走及びマトリックス収縮におけるＮｋｘ２．５の機能的役割を評価した。
【０１１１】
低酸素Ｓｕｇｅｎプロトコール：全ての動物の処置は、１９８６年施行の英国内務省規制（科学的処置）に従って行った。動物は１２時間の明暗サイクルで飼育し、食料及び水は自由に摂取できるようにした。成体メスＣ５７／Ｂｌ６マウス（各グループあたり少なくとも５体、２０±２．５ｇ）に対し、ＣＭＣ（０．５％［ｗ／ｖ］カルボキシメチルセルロースナトリウム、０．９％［ｗ／ｖ］塩化ナトリウム、０．４％［ｖ／ｖ］ポリソルベート８０、０．９％［ｖ／ｖ］ベンジルアルコールを含有する脱イオン水）に懸濁したＳＵ５４１６を２０ｍｇ／ｋｇで１週間皮下投与した。動物の３グループについては、換気したチャンバー内で慢性的常圧低酸素状態（酸素１０％）に２０日間曝露した。コントロールグループには賦形剤のみ（５％ＤＭＳＯ、４０％ＰＥＧ４００，５５％ｄＨ２Ｏ）を、一方実験グループには賦形剤に封入したＣＸ−４９４５（１日あたり８０ｍｇ／ｋｇ）を２０日間（予防的）又は１３日間（治療的）にわたり毎日強制的に与えた。２グループについては、部屋空気環境（正常酸素状態）に置き、ＣＸ−４９４５（１日あたり８０ｍｇ／ｋｇ）又は賦形剤を２０日間にわたり毎日強制的に与えた。治療期間の最後に、マウスを麻酔して右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）及び平均動脈血圧（ＭＡＢＰ）を測定した。
【０１１２】
血行動態計測：右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）及び平均動脈血圧（ＭＡＢＰ）の血行動態計測は、低酸素状態に曝露して関連薬で治療して６週間経過した動物から得た。前記動物を１．５％イソフルランで麻酔して３７℃で制御された保温ブランケットの上に仰向けに置いた。はじめに、右頸静脈を分離し、右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を決定するため圧力カテーテル（１．４Ｆの内径を有するＭｉｌｌａｒ  ｍｏｕｓｅ  ＳＰＲ−６７１ＮＲ圧力カテーテル、Ｍｉｌｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英）を右心室に導入した。次に、左総頸動脈を分離して圧力カテーテルを導入し、平均動脈血圧（ＭＡＢＰ）を測定した。ＲＶＳＰ及びＭＡＢＰの両方をプレキャリブレートしたＰｏｗｅｒＬａｂシステム（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、豪）に記録した。
【０１１３】
アテローム性動脈硬化症法
動物：全ての動物試験は、英国内務省ライセンスの下、許容される法や規制に従って行った。本試験には、Ｃ５７ＢＬ／６系統のアポリポタンパク質Ｅノックアウトマウス（ａｐｏＥ−／−）及び正常野生型Ｃ５７ＢＬ／６を用いた。加えて、Ｉ型コラーゲンα２レポータートランスジェニックマウス（Ｃｏｌ１α２−ＬａｃＺ−Ｔｇ）を用いた。Ｃｏｌ１α２−ＬａｃＺ−Ｔｇ＋ａｐｏＥ−／−マウスを作製するため、Ｃ５７／Ｂ６系統のＣｏｌ１α２−ＬａｃＺ−ＴｇをａｐｏＥ−／−マウスと交配した。
【０１１４】
細胞：マウス血管平滑筋細胞は、以前記述した適用手順により野生型マウスの大動脈から外植した。市販のヒト大動脈平滑筋細胞（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で用いた。血管平滑筋細胞は、４８ｈかけてコンフルエントになるまで培養した。コンフルエント後の細胞は、ウシ胎児血清非存在下高密度で２〜８日間培養するか（‘収縮型’の表現型が優勢となる条件）、又は１０％ウシ胎児血清存在下低密度で培養した（‘合成型’の表現型が優勢となる条件）。
【０１１５】
免疫組織化学：組織は中性ホルマリン緩衝液で固定してパラフィンで包埋した。標準的な抗原回復を伴う免疫組織化学プロトコールは、有効なＮｋｘ２．５抗体（Ａｂｃａｍ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ）又はアイソタイプが合致したコントロール抗体（Ａｂｃａｍ，ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を用いて行った。Ｎｋｘ２．５シグナルの特異性は、市販のブロッキングペプチドを予め吸着させた抗体コントロールを用いて試験した。
【０１１６】
免疫蛍光：新鮮な組織を凍結し、切断して氷冷アセトンに固定し、標準的なプロトコールを用いて免疫蛍光標識に用いた。加えて、ホルマリン固定してパラフィンで包埋した試料も用いた。一次及びアイソタイプのコントロール抗体に加え、蛍光色素標識二次抗体（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた。
【０１１７】
抗体：本試験で用いたポリクローナルＮｋｘ２．５抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）の特異性は、ウェスタンブロッティングによりバリデーションした。適切な免疫グロブリンのアイソタイプのコントロール抗体は、製造元が推奨するように各抗体に対して用いた。
【０１１８】
画像分析：画像は、４０倍又は２０倍のＰｌａｎ  Ｎｅｏｆｌｕａｒレンズ（ＮＡなど）で捉え、ＫＳ４００ソフトウェア（Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｉｃｅｓｔｅｒ，英）を用いて分析した。レンズ面積はＩｍａｇｅＪソフトウェア分析を用いて定量化した。統計学的分析はＰｒｉｓｍソフトウェアを用いて実行した。
【０１１９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング：タンパク質試料について、標準的なプロトコールに従いトリス−グリシンゲルを用いて変性条件下で（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を実行した。
【０１２０】
定量リアルタイムＰＣＲ：新鮮に採取した組織細胞を発現実験に使用した。トータルＲＮＡは、マウスの細胞からトリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）又はＲＮｅａｓｙ  ｍｉｎｉ−ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造元の指示に従って単離した。ＲＮＡの質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｓ  ＵＫ  Ｌｔｄ，英）で確定した。逆転写は、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて製造元のプロトコールに従って行った。定量ＰＣＲは、Ｒｏｔｏｒｇｅｎｅ−６０００（Ｃｏｒｂｅｔｔ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，豪）を用いたＳＹＢＲグリーン法（Ｑｕａｎｔａｃｅ，英国）により行った。（ＧｅＮｏｒｍ）で推奨される４つの最も安定なリファレンス遺伝子を規格化に用いた。
【０１２１】
Ｎｋｘ２．５のｓｉＲＮＡ干渉：Ｎｋｘ２．５に対するｓｉＲＮＡ（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓＳＭＡＲＴＰｏｏｌ，５’−ＣＣＴＣＡＡＴＣＣＣＴＡＣＧＧＴＴＡＴ−３’（配列番号５）、５’−ＣＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＴＴＣＧＴＧＡＡ−３’（配列番号６）、５’−ＧＣＴＡＣＡＡＧＴＧＣＡＡＧＣＧＧＣＡ−３’（配列番号７）、５’−ＣＣＧＧＧＡＴＴＣＣＧＣＡＧＡＧＣＡＡ−３’（配列番号８）、及びコントロールの非標的オリゴヌクレオチド（ＯＮ−ＴＡＲＧＥＴｐｌｕｓ  Ｎｏｎ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｐｏｏｌ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，米）は、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて製造元の指示に従い血管平滑筋細胞にトランスフェクションした。
【０１２２】
Ａ）肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）
（実施例１）ヒトＰＡＨにおけるＮｋｘ２．５発現
Ｎｋｘ２．５は、正常なヒト肺血管系では発現しなかった。しかしながら、ＰＡＨ患者の肺血管では発現した。Ｎｋｘ２．５は、細動脈の中膜（ｐａ）と同様に大動脈の中膜（矢印、Ｍ）で発現した（図１Ａ）。ヒト正常肺又は連結細胞組織疾患（ＳＳｃ−ＰＡＨ）に続発する全身性ＰＡＨ患者の肺の３色免疫蛍光試験におけるａ−平滑筋アクチン（ＡＣＴＡ２，αＳＭＡ）発現との共局在で見られるように、Ｎｋｘ２．５の大部分は平滑筋細胞で発現している（図１Ｂ）。血管病変は、動脈中膜で正常な‘収縮型’の平滑筋細胞が‘合成型’に脱分化する表現型修飾をしばしば伴い、Ｉ型コラーゲン（ＣＯＬ１）、結合組織成長因子（ＣＣＮ２）、及びフィブロネクチン（ＦＮ１）のような細胞外マトリックス遺伝子の上方制御、並びに平滑筋ミオシン重鎖（ＭＹＨ１１）、α―平滑筋アクチン（ＡＣＴＡ２）及びスムーセリン（ＳＭＴＮ）のような収縮タンパク質の下方制御をもたらす。
【０１２３】
一状態から他状態への進化の模倣によりｉｎ  ｖｉｖｏでの表現型のスイッチングを模倣するため、正常なヒトの肺動脈平滑筋細胞（ＨＰＡＳＭＣ）を‘収縮型’又は‘合成型’の状態が優勢な条件下ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した（図１Ｃ）。収縮型又は合成型の条件で１又は７日間培養したＨＰＡＳＭＣ溶解物のウェスタンブロッティング分析から、収縮型ではＮＫｘ２．５の発現は非常に少なかったが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞がより‘合成型’の状態に脱分化するに従って発現が増加することが示された（図１Ｃ）。（図１Ｃでは）再現実験（ｎ＝６）の代表的なプロットを示し、ローディングコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いている。同様に、収縮型又は合成型の条件下ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長したＨＡＳＭＣを免疫蛍光で可視化した（図１Ｄ）。収縮型のＨＡＳＭＣは、Ｎｋｘ２．５、細胞内Ｉ型プロコラーゲン、及びＦＮ１を発現しなかったが、正常なＡＣＴＡ２線維を有していた。しかし、合成型のＨＡＳＭＣでは、Ｎｋｘ２．５が明らかに核（白矢印）で発現しており、Ｉ型プロコラーゲン及びＦＮ１の発現が上方制御され、ＡＣＴＡ２の発現が下方制御されＡＣＴＡ２線維は崩壊した。
【０１２４】
以前本発明者らは、平滑筋細胞内でＮｋｘ２．５がコラーゲン１α２の発現を活性化することを実証していることから（（２００４）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２４：６１５１−６１６１）、今回は、ｓｉＲＮＡを用いたＮｋｘ２．５発現の阻害並びに収縮型及び収縮型プロファイルマーカーの発現着目により、平滑筋細胞の表現型修飾においてＮｋｘ２．５は主要な役割を担っているという仮説を検証した（図１Ｅ）。Ｎｋｘ２．５を発現する合成型ＨＡＳＭＣについて、未処理、スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＣＯＮ）又はｓｉＮｋｘ２．５（５０ｎＭ若しくは２５０ｎＭ）で処理したものを示す。Ｎｋｘ２．５のノックダウンは、‘合成型’の表現型であるＣＯＬ１、ＣＣＮ２、及びＦＮ１の下方制御をもたらした。しかし、ＭＹＨ１１、ＡＣＴＡ２及びＳＭＮＴのような‘収縮型’の表現型マーカーの発現はＮｋｘ２．５非存在下で増加した。（図１Ｅは）再現試験（ｎ＝３）の代表的なプロットを示し、ローディングコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いている。
【０１２５】
（実施例２）ＰＡＨのマウス慢性酸素欠乏モデルにおけるコンディショナルＮｋｘ２．５除去
ＰＡＨは、肺動脈血圧の増加及び血管再構築をもたらす慢性酸素欠乏により誘発され、周辺動脈の弱体化と同様に、筋動脈の中膜層の肥厚及び末梢血管の筋肉化を伴う。しかし、ひとたび正常酸素状態が回復すれば、前記症状の大部分は元に戻る。慢性酸素欠乏によって誘発されるＰＡＨについては、マウスを用いてモデル化されており、疾患の発症直後に起きる肺平滑筋細胞の増殖及び肥大及び中膜肥厚に起因する再構築のように、ヒトで起きる多くの特徴について繰り返し実証されている。
【０１２６】
誘導性コンディショナルＮｋｘ２．５欠損マウスは、Ｎｋｘ２．５ｆｌｏｘマウス（（２００４）Ｃｅｌｌ．１１７：３７３−３８６）をＩ型コラーゲンα２活性化因子駆動ＣｒｅＥＲＴマウスと交配させて作製した。以前本発明者らは、マウスＣｏｌ１α２遺伝子の間葉系細胞特異的な活性化因子がＣｒｅリコンビナーゼとエストロゲン受容体の変異型リガンド結合ドメインとの融合を構成するポリペプチドの発現に直結するようにトランスジェニックマウスを作製した（（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２３７：７５２−７）（図２Ａ）。これらのＣｏｌ１α２Ｃｒｅ−ＥＲＴ−トランスジェニックマウスに対してタモキシフェン（４−ＯＨＴ）を投与すると、線維芽細胞や血管平滑筋細胞のようなＩ型コラーゲンα２が過剰発現する細胞内でＣｒｅリコンビナーゼが活性化する（（２００２）Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｌ．１６０：１６０９−１７）。ｌｏｘＰ部位の組み換えが起きているのか否か、さらにそれによりＮｋｘ２．５が除去されているのか否かを確かめるため、特異的なプライマー（Ｐ１−Ｐ２及びＰ１−Ｐ３）を用いてポリメラーゼ鎖反応を行った。マウスを低酸素チャンバーに置いて３日目から５日間連続でタモキシフェン（４−ＯＨＴ）を投与したところ、成体Ｎｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｏｌ１α２ＣｒｅＥＲＴ＋（Ｎｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｒｅ＋）マウスの再構築血管においてＮｋｘ２．５がノックアウトされた（図２Ｂ，Ｃ，Ｄ）。
【０１２７】
コントロールマウスとして、タモキシフェンの代わりにトウモロコシ油を注射したＮｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｏｌ１α２ＣｒｅＥＲＴ＋及びタモキシフェンを注射したＮｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｏｌ１α２ＣｒｅＥＲＴ―の２つのグループが用いられた。前記マウスを低酸素状態に２１日置いた後に取り出して剖検した。これと並行して、同一の方法で処理したマウスを正常酸素条件下に置いた。前記マウスから取り出した肺動脈について、ウェスタンブロッティングによるＮｋｘ２．５タンパク質発現分析を行った（図２Ｂ）。（図２Ｂは）再現試験（ｎ＝１２）の代表的なプロットを示し、ローディングコントロールとしてＧＡＰＤＨを用いている。トータルＲＮＡ発現量は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を用いて測定した（図２Ｃ）。最後に、前記マウスから取り出した肺部位をＮｋｘ２．５特異抗体で免疫修飾し、蛍光色素（Ａｌｅｘａ４８８）を用いて可視化した（図２Ｄ）。３つ全ての分析法において同じ結果が得られた。正常酸素状態又は低酸素状態に置かれたＮｋｘ２．５欠損マウス（タモキシフェンで処理したＮｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｏｌ１α２ＣｒｅＥＲＴ＋）の肺動脈からはＮｋｘ２．５は検出されなかった。しかしながら、低酸素コントロールマウスグループ、すなわちタモキシフェンの代わりにトウモロコシ油を注射したＮｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｏｌ１α２ＣｒｅＥＲＴ＋及びタモキシフェンを注射したＮｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｏｌ１α２ＣｒｅＥＲＴ―においては、Ｎｋｘ２．５発現が検出及び上昇した。
【０１２８】
（実施例３）肺血管に対するコンディショナルＮｋｘ２．５除去の効果
小動脈（２０−５０μｍ）、中動脈（４０−７０μｍ）、及び大動脈（７０μｍより大きい）の筋肉化は、両コントロールマウスグループ（トウモロコシ油を注射したＮｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｏｌ１α２ＣｒｅＥＲＴ＋及びタモキシフェンを投与したＮｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｏｌ１α２ＣｒｅＥＲＴ―）を低酸素条件に置いて２１日後に起きる。しかし、低酸素条件に置いたＮｋｘ２．５欠損マウスは、小、中、及び大血管においてごくわずかな筋肉化（ｐ＜０．００００５）しか示さなかった（図３Ａ及びＢ）。正常酸素条件においては、小、中、及び大血管のサイズ及び血管壁厚さは、低酸素条件下のＮｋｘ２．５欠損マウス肺の血管と類似していた（図３Ａ及びＢ）。
【０１２９】
マウスの全左肺葉部位についてα―平滑筋アクチン抗体を用いて免疫組織化学を行い、各血管の中膜を特定した。全部位の全ての血管の外周及び内側の厚さを測定し（１グループあたり５検体で２５０血管以上）、定量化した（図３Ｂ）。サイズの異なる血管の代表的な画像を図３Ａに示す。
【０１３０】
２１日間の低酸素処理を終えた後、直ちに前記マウスを麻酔し、圧力カテーテルを用いて右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）を測定した。正常酸素条件におけるＲＶＳＰは２０±１．４ｍｍＨｇであった。低酸素処理２１日後におけるコントロールグループ（トウモロコシ油を注射したＮｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｏｌ１α２ＣｒｅＥＲＴ＋及びタモキシフェンを投与したＮｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｏｌ１α２ＣｒｅＥＲＴ―）のＲＶＳＰは、それぞれ４０．１８±２．４４ｍｍＨｇ及び３７．６±１．８３ｍｍＨｇに上昇していた。しかし、Ｎｋｘ２．５欠損マウスグループ（タモキシフェンを投与したＮｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｏｌ１α２ＣｒｅＥＲＴ＋）のＲＶＳＰは顕著に低く、２９．１５±２．３ｍｍＨｇであった（ｐ＝０．００７６）。いずれのグループも平均動脈血圧（ＭＡＢＰ）には差が見られなかった（データ非開示）。
【０１３１】
最後に、ＲＶＳＰ測定を行ったマウスの肺から単離した一次及び二次肺動脈について、筋運動記録法を実行した。収縮機能を評価するため、配線化小血管筋運動記録システムを用いて、血管等尺性張力測定による収縮弛緩応答を試験した（図３Ｄ）。血管収縮を誘発するためにフェニレフリン（ＰＥ；１ｎＭ−５０ｍＭ）を用い、弛緩を誘発するためにＮＯドナーであるニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ；１ｎＭ−５０ｍＭ）を用いた。Ｎｋｘ２．５欠損マウスグループ（タモキシフェンで処理したＮｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｏｌ１α２ＣｒｅＥＲＴ＋、実線）の血管の最大収縮応答曲線が左にシフトしたことから、血管がＰＥ及びＳＮＰに対する応答性が上がり、それによりコントロールグループ（点線）の血管と比較して堅さが低減し柔軟性が増したことが示唆される。
【０１３２】
（実施例４）肺のコラーゲンレベルに対するコンディショナルＮｋｘ２．５除去の効果
ＰＡＨの慢性酸素欠乏モデルにおいて、Ｎｋｘ２．５非存在下では肺のコラーゲンレベルが低下した。慢性酸素欠乏状態（酸素１０％）に２１日間置かれたマウスから単離した代表的な肺（ｎ＝８）を、ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）、コラーゲンをピクロシリウスレッド（ＰＳＲ）で染色して偏光（ＰＳＲ−ＰＬ）下で観察すると、初期コラーゲンは黄／緑で示される（図４Ｃ）。ピクロシリウスレッドで染色して偏光で可視化した低酸素肺（ｎ＝８）の左肺葉の画像（図４Ｅ）のデンシメトリー定量から、Ｎｋｘ２．５欠損マウスの肺におけるコラーゲンレベルがコントロールグループに比べて顕著に減少したことがわかった。これらの発見は、ＳＤＳＰＡＧＥ、ウェスタンブロッティングによる分析、及びＣｏｌ１特異抗体を用いた免疫修飾において、低酸素条件の肺のホモジネートで見られたＩ型コラーゲンレベルによっても支持される。ＧＡＰＤＨレベルはローディングコントロールとして用いた。各グループのマウス３体からなる肺ホモジネートを示す（図４Ｅ）。
【０１３３】
（実施例５）心臓肥大に対するコンディショナルＮｋｘ２．５除去の効果
右心室（ＲＶ）肥大は、ＰＡＨの慢性酸素欠乏モデルで良く示される特性である。ＲＶ／ＬＶ＋Ｓ比（図５Ａ）及び右心室のみの個別湿重量（図５Ｂ）の顕著な減少で観察されたように、低酸素処理２１日後のコンディショナルＮｋｘ２．５除去ではＲＶ肥大が低減した。グループを通じて左心室の重量に顕著な変化は見られなかった（図５Ｃ）。本発明者らは、この減少が心臓組織からＮｋｘ２．５を除去したことに起因するのか、又は心臓におけるＮｋｘ２．５発現を評価したことによる肺の変化に起因するのかを試験した。特異的なＮｋｘ２．５抗体を用いた免疫組織化学から、心臓組織ではＮｋｘ２．５はノックダウンしていないことが明らかになった（図５Ｄ）。これは、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現を駆動するコラーゲンタイプＩ活性化因子が、低酸素チャンバーに２１日間置かれたマウスの心臓では活性化しないが肺や肺血管では活性化するという事実によって説明できる（データ非開示）。右心室ホモジネートにおけるＮｋｘ２．５発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティング分析も、グループ間で顕著な差が無いことを明らかにしている（図５Ｅ）。
【０１３４】
（実施例６）Ｎｋｘ２．５の薬理学的制御
Ｎｋｘ２．５は細胞質−核移行によって制御され、これはカゼインキナーゼＩＩ依存的なリン酸化によって部分的に制御されるプロセスである。
【０１３５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで３つのヒト肺平滑筋細胞株を用いたところ、細胞質内でのＮｋｘ２．５の発現は影響を受けなかったが、Ｎｋｘ２．５の核移行は市販のＣＫＩＩ阻害剤によって阻止された（図６Ａ）。他のＣＫＩＩ阻害剤（ＣＸ−４９４５）は、有効濃度１ｎＭで用量依存的にｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＮｋｘ２．５の核移行を阻害し、それにより収縮型から合成型へのヒト肺平滑筋細胞の脱分化を阻害できる（図６Ｂ）。１ｎＭ及び１０ｎＭのＣＸ−４９４５で処理したヒト肺細胞溶解物のウェスタンブロット分析から、ＥＣＭタンパク質（ＣＯＬ１、ＣＣＮ２）発現の下方制御及び収縮タンパク質発現（ＡＣＴＡ２、ＭＹＨ１１）の上方制御が明らかとなり、表現型修飾プロセスに対するＣＸ−４９４５の阻害効果が裏付けられている（図６Ｃ）。血管平滑筋細胞におけるＮｋｘ２．５発現は遊走性の合成型表現型をもたらしている。（増殖を阻止する）マイトマイシン存在下で標準的な遊走スクラッチアッセイを行ったところ、ＣＸ−４９４５のヒト肺平滑筋細胞に対する効果は、用量依存的に阻害的であり、ＣＫＩＩ阻害は平滑筋細胞の脱分化を妨げることが明らかになっている（図６Ｄ）。Ｎｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｏｌ１α２ＣｒｅＥＲＴ＋の動脈から取り出した血管平滑筋細胞を外植し、合成型の表現型が優勢な条件下ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、Ｎｋｘ２．５を発現させた。Ｎｋｘ２．５を除去するため、Ｃｒｅリコンビナーゼを匿うアデノウイルス（又はコントロールのアデノウイルス）を各細胞株に感染させた。Ｎｋｘ２．５存在下／非存在下で細胞増殖を測定した。Ｎｋｘ２．５非存在下では顕著な増殖速度の減少が見られた（図６Ｅ）。加えて、ＣＸ−４９４５（１０ｎＭ及び１ｎＭ）存在下／非存在下で、Ｎｋｘ２．５発現が優勢な（合成型）条件下でのヒト肺平滑筋細胞の増殖を測定した。５日間にわたって極めて顕著に用量依存的な増殖速度の減少が見られた（図６Ｆ）。
【０１３６】
Ｂ）アテローム性動脈硬化症
（実施例７）Ｎｋｘ２．５はａｐｏＥノックアウトマウスのアテローム性硬化大動脈において発現する
アテローム性動脈硬化症でＮｋｘ２．５が発現するのか否かを試験するため、本発明者らはアテローム性動脈硬化症のａｐｏＥ−／−マウスモデルを用いた。大動脈は、高コレステロール食を与えた野生型（ｎ＝１０）及びａｐｏＥ−／−マウス（ｎ＝１０）から採取した。全ＲＮＡ及びタンパク質は、これらのマウスの大動脈から抽出し、それぞれ定量ＰＣＲ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロッティングにより分析した（図７）。この結果は、ａｐｏＥ−／−マウス由来の大動脈がＮｋｘ２．５のｍＲＮＡ（図７Ａ）及びタンパク質（図７Ｂ）を発現しているのに対して、野生型由来の大動脈では発現が検出できないことを示している。Ｉ型コラーゲンレベルについても、ａｐｏＥ−／−マウスの大動脈では上昇している。
【０１３７】
さらに、Ｎｋｘ２．５特異抗体を用いた免疫組織化学的染色は、正常な野生型の血管にはＮｋｘ２．５が無いのに対して、アテローム性動脈硬化症ではＮｋｘ２．５が発現することを裏付けている（図７Ｃ）。特に、Ｎｋｘ２．５＋細胞は中膜内や病斑に拡散しているにも関わらず、線維性被膜では高いＮｋｘ２．５染色が観測されている（図７Ｄ）。（一方）野生型の血管ではＮｋｘ２．５＋細胞は観測されていない（図７Ｃ）。ａｐｏＥ−／−大動脈硬化症の免疫蛍光二重標識は、Ｎｋｘ２．５が核染色剤である４，６−ジアミノ−２−フェニリンドール（ＤＡＰＩ）と共局在することを明らかにした（図７Ｅ）。
【０１３８】
（実施例８）アテローム性プラーク進行下におけるＮｋｘ２．５の発現
ａｐｏＥ欠損マウスにおいて、内膜肥厚及び脂肪線条形成の初期段階でＮｋｘ２．５＋細胞が見られるにも関わらず（図８Ｂ）、正常な非病斑性血管ではＮｋｘ２．５の発現が検出されない（図８Ａ）。脂肪線条が拡張するにつれて、Ｎｋｘ２．５の発現の分布が広がり（図８Ｃ及びＤ）、大部分の細胞で陽性が現れるようになる（図８Ｅ）。明確な輪郭を有する線維性被膜で複雑な病斑が進行するため、Ｎｋｘ２．５の発現は特に被膜に集中するようになる（図８Ｆ、Ｇ）。最後に、後期段階の非常に複雑な病斑では、線維性被膜におけるＮｋｘ２．５発現は保たれるが、わずかに減少が見られる（図８Ｈ）。
【０１３９】
（実施例９）コラーゲン産生細胞によるＮｋｘ２．５の発現
アテローム硬化性病斑内のＮｋｘ２．５を発現する細胞はコラーゲンを生産するという仮説を検証するため、本発明者らは、正常食又は高脂肪食を与えたＣｏｌ１α２−ＬａｃＺ＋ａｐｏＥ−／−マウスにおけるアテローム硬化性病斑について、コラーゲンＩα２トランス遺伝子の発現を示すＮｋｘ２．５及びβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ）トランス遺伝子に対する特異的抗体を用いて免疫蛍光標識試験を行った（図９）。脂肪摂取Ｃｏｌ１α２−ＬａｃＺ＋ａｐｏＥ−／−マウスから採取したアテローム硬化性大動脈においては、外膜及び病斑内にβ−Ｇａｌを発現する細胞が存在し、主に線維性被膜に局在していた（図９Ａ右パネル）。非病斑性大動脈では、β−Ｇａｌの発現は低く、外膜内に制限されていた（図９Ａ左パネル）。Ｎｋｘ２．５、β−Ｇａｌ、及びＤＡＰＩに対する特異的抗体を用いて高倍率で病斑内細胞の詳細な試験を行ったところ、線維性被膜においてＮｋｘ２．５がβ−Ｇａｌと共局在することが明らかになり（ｍｅｒｇｅｄ）、Ｎｋｘ２．５＋細胞がＣｏｌ１α２トランス遺伝子も発現することが裏付けられた（図９Ｂ）。
【０１４０】
β−Ｇａｌ陽性な血管の病斑におけるＮｋｘ２．５＋細胞（Ｎｋｘ２．５＋β−Ｇａｌ＋）の免疫蛍光染色を定量した結果（ｎ＝１６）、中膜を除いて病斑内の全細胞のうち４３．９８±５．４６％を示し、Ｎｋｘ２．５＋β−Ｇａｌ＋である（表１）。さらに、Ｎｋｘ２．５＋（５２．８±３．１２％）とＮｋｘ２．５＋β−Ｇａｌ＋（４３．９８±５．４６％）の間の差は統計学的に有意ではない（ｐ＜０．２７）（表１）。これらのデータは、病斑内のＮｋｘ２．５＋細胞がＩ型コラーゲンを産生するという考えを強く支持する。コラーゲン産生Ｎｋｘ２．５＋細胞がα−平滑筋アクチンも発現するのか（αＳＭＡ＋）否かを確かめるため、本発明者らは４色免疫蛍光も実施した（データ非開示）。本発明者らは、Ｎｋｘ２．５、β−Ｇａｌ、及びα−ＳＭＡ＋、同様にＤＡＰＩに対して特異的な抗体を用いた。
【０１４１】
本試験及び以下に示す後続試験において、各抗体に対する適切なアイソタイプコントロールを全ての免疫蛍光標識に対して行い、個別及び組み合わせの双方の場合において陰性であった。病斑染色の定量の結果（ｎ＝１６）は、病斑内全細胞の３１．４±３．４７％はＮｋｘ２．５＋β−Ｇａｌ＋αＳＭＡ＋であり、Ｎｋｘ２．５＋（５２．８±３．１２％）とＮｋｘ２．５＋β−Ｇａｌ＋αＳＭＡ＋（３１．４±３．４７％）の間の差は統計学的に有意（ｐ＜０．００５）であることを示している（表１）。このデータから、アテローム硬化性病斑におけるＮｋｘ２．５＋細胞の大部分はコラーゲン産生細胞であり、そのうち全てではないが大部分は平滑筋細胞マーカーであるαＳＭＡを発現することが示唆される。
【０１４２】
【表１】
2015525770.tif 000006
【０１４３】
（実施例１０）平滑筋細胞におけるＮｋｘ２．５の発現
アテローム硬化性病斑においてＮｋｘ２．５発現細胞種が血管平滑筋（ＳＭＣ）なのか否かを十分に調査するため、本発明者らはａｐｏＥ−／−マウスの大動脈由来のアテローム硬化性病斑について免疫蛍光三重標識実験を行った。α−ＳＭＡ抗体をＮｋｘ２．５（図１０）及び核染色剤ＤＡＰＩと共に用いた。Ｎｋｘ２．５染色の領域パターンについて大まかに理解するため、低出力倍率で血管病斑の横断面を試験した（図１０Ａ）。中膜内にＮｋｘ２．５＋αＳＭＡ＋細胞が個々に存在するにも関わらず（図３Ａ）、線維性被膜及び病斑のショルダー領域においてＮｋｘ２．５発現はαＳＭＡと共局在している。より高倍率において（図１０Ｂ）、線維性被膜内で核Ｎｋｘ２．５と細胞質αＳＭＡの共局在度が高いことは明らかである。異なる血管の中膜を除いた病斑におけるＮｋｘ２．５＋染色の定量分析（ｎ＝２４）は、病斑内における全細胞の５２．８±３．１２％はＮｋｘ２．５＋であることを示している（表１）。
【０１４４】
特定視野における病斑内（中膜を除く）の全細胞数を定量した。中膜を除いた病斑内のＮｋｘ２．５＋αＳＭＡ＋細胞は、全細胞の４０．１±０．７９％を有する。Ｎｋｘ２．５＋細胞とＮｋｘ２．５＋αＳＭＡ細胞の間に見られた明らかな差は統計学的に有意であり（ｐ＜０．０２８）、病斑内の全てのＮｋｘ２．５＋がαＳＭＡを発現しているわけではないことを示唆している。ｓｍ−ＭＨＣ及びＳｍｔｎを含む他の平滑筋細胞マーカーをＮｋｘ２．５と用いた場合にも、類似のデータが得られた（データ非開示）。病斑内に位置する細胞において、Ｎｋｘ２．５はｓｍ−ＭＨＣ及びＳｍｔｎと共局在する。Ｎｋｘ２．５＋／ｓｍ−ＭＨＣ＋細胞及びＮｋｘ２．５＋／Ｓｍｔｎ＋細胞は、血管の中膜層内と同様に病斑のコア内部及び線維性被膜において観察された。血管壁を除いた大動脈病斑におけるＮｋｘ２．５＋／ｓｍ−ＭＨＣ＋細胞数及びＮｋｘ２．５＋／Ｓｍｔｎ＋細胞数頻度の定量（ｎ＝２４）は、病斑内の全細胞の３０．５±１．９４％はＮｋｘ２．５＋／Ｓｍｔｎ＋であり、３１．８±３．１７％はＮｋｘ２．５＋／ｓｍ−ＭＨＣ＋であることを示している（表１）。病斑内の全細胞の百分率として表したＮｋｘ２．５＋とＮｋｘ２．５＋／Ｓｍｔｎ＋又はＮｋｘ２．５＋／ｓｍ−ＭＨＣ＋との差は統計学的に有意（ｐ＜０．０００４及びｐ＜０．００２）であり、病斑内の全てのＮｋｘ２．５＋がＳＭＣマーカーを発現するわけではない（ことを示している）。
【０１４５】
（実施例１１）アテローム硬化性病斑の他の細胞種におけるＮｋｘ２．５発現
本発明者らは、アテローム硬化性プラーク内の他の細胞種がＮｋｘ２．５を発現するのか否かを調査した。マクロファージマーカーＦ４／８０との共発現が検出されなかったことから、病斑内のＮｋｘ２．５＋細胞は骨髄細胞系統ではないことが示唆される（データ非開示）。しかし本発明者らは、免疫蛍光標識を用いて病斑内の内皮性ＣＤ３１（血小板内因性細胞接着分子）の発現のために試験した。予想外なことに、このデータは病斑内のＮｋｘ２．５＋ＣＤ３１＋細胞の存在を明らかにした。本発明者らは、異なるアテローム硬化性血管における染色を定量し（ｎ＝８）、病斑内の全細胞の７．４１±２．１３％がＮｋｘ２．５＋ＣＤ３１＋であることを見つけた（データ非開示及び表１）。
【０１４６】
近年の報告では、Ｎｋｘ２．５＋である多能性心臓血管前駆幹細胞集団が記述されている。これらは、心臓、内皮、及び血管平滑筋の系統、並びに造血骨髄派生前駆体マーカーであるＣＤ３４を発現する細胞を生み出せるシグネチャーであるＩｓｌ１＋／Ｎｋｘ２．５＋／Ｆｌｋ１＋及びＮｋｘ２．５＋／ｃ−Ｋｉｔ＋を伴う胚性幹細胞派生集団を含む。アテローム硬化性病斑におけるこれらの頻度を調査することにより、これらの潜在的な役割を試験した。Ｎｋｘ２．５、Ｆｌｋ−１（ＶＥＧＦ−Ｒ２）、Ｉｓｌ１（Ｉｓｌｅｔ−１）、及びＤＡＰＩ（データ非開示）に対して特異的な抗体を用いた免疫蛍光標識では、病斑内のＩｓｌ１＋細胞又はＮｋｘ２．５＋／Ｉｓｌ１＋細胞は非常に少なかった（＜１．４±０．７２％）。しかしながら、Ｎｋｘ２．５＋／Ｆｌｋ１＋集団は顕著に存在する。アテローム硬化性病斑における定量（ｎ＝１２）から、細胞の１８．８±３．５％はＮｋｘ２．５＋Ｆｌｋ１＋であることが明らかになった（表１）。（一方、）アテローム硬化性病斑内には、Ｎｋｘ２．５＋／Ｆｌｋ１＋／Ｉｓｌ１＋細胞は存在しなかった。Ｎｋｘ２．５、ｃ−Ｋｉｔ、及びＤＡＰＩに対して特異的な抗体を用いた免疫蛍光標識（表１）は、病斑内にｃ−Ｋｉｔ＋細胞があるが、これらの細胞がＮｋｘ２．５を共発現しないことを示している。最後に本発明者らは、病斑細胞のうち非常に少ない割合（３．３±１．４２％）でＮｋｘ２．５及びＣＤ３４を共発現する細胞を検出した（表１）。
【０１４７】
（実施例１２）血管再構築の頸動脈結紮モデルにおける新生内膜病斑内のＮｋｘ２．５ノックダウン
頸動脈結紮により、本発明者らはマウス頸動脈において新生内膜病斑の形成を誘発することができた。誘導性コンディショナルＮｋｘ２．５欠損マウスは、Ｎｋｘ２．５ｆｌｏｘマウス（（２００４）Ｃｅｌｌ．１１７：３７３−３８６）をＩ型コラーゲンα２活性化因子駆動ＣｒｅＥＲＴマウス（図２Ａ参照）と交配することで作成した。これらのＣｏｌＩα２Ｃｒｅ−ＥＲＴ−トランスジェニックマウスにおいて、タモキシフェン（４−ＯＨＴ）の投与は、線維芽細胞や血管平滑筋細胞のようなＩ型コラーゲンα２が過剰発現する細胞においてＣｒｅリコンビナーゼを活性化する。マウスを麻酔して、総頸動脈を曝露して上述の通り結紮した。Ｎｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｏｌ１α２ＣｒｅＥＲＴ＋（Ｎｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｒｅ＋）マウスは、正常齧歯動物食（コントロールグループ）又はタモキシフェンを含有した正常齧歯動物食（４００ｍｇ／ｋｇ  ４−ＯＨＴ、（（２００７）Ｇｅｎｅｓｉｓ  ４５：１１−１６）（実験グループ）のいずれかにした。前記マウスは、２８日間の猶予を設けて回復してから剖検した。頸動脈を処理し、パラフィンで包埋し、さらに結紮糸から１００μＭの間隔で薄片化した。成体Ｎｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｏｌ１α２ＣｒｅＥＲＴ＋（Ｎｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｒｅ＋）マウスにおいて、結紮糸から５００μＭで採取した部位についてＮｋｘ２．５特異抗体又はアイソタイプコントロール（ＩｇＧ）を用いた免疫組織化学染色から示されるように、コントロールマウスではなくタモキシフェンを与えたマウスの再構築した頸動脈ではＮｋｘ２．５がノックアウトされた。各グループの代表的なマウス２個体を示し、新生内膜病斑の産生において明らかな減少が観察された（図１１Ａ）。
【０１４８】
加えて、マウスのコントロールグループ（ｎ＝１１）及び実験グループ（ｎ＝１０）双方から１００ｍＭのインターバルで採取した頸動脈の全部位について、ヘマトキシリン及びエオシンで染色し、ＩｍａｇｅＪを用いて最大プラーク面積を分析した。頸動脈に沿った距離及び処理（４−ＯＨＴ投与の有無）を２つの変数として、統計学的分析（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を実行した。頸動脈に沿った距離は病斑サイズにとって重要な決定因子ではないが、処理は重要な決定因子であることがわかった。ゆえに、全体的に、タモキシフェエンで処理した動物の病斑サイズはコントロールのものに比べて小さく（−４６．９％、ｐ＜０．０００１）、Ｎｋｘ２．５阻害は病斑サイズに対して極めて顕著な影響を及ぼす（ことを示している）（処理は全分散に対して５９．７５％、Ｆ＝２６．１８．ＤＦｎ＝２１  ＤＦｄ＝３５７）（図１１Ｂ）。
【０１４９】
（実施例１３）ヒトアテローム硬化性病斑におけるＮｋｘ２．５
Ｎｋｘ２．５は、ヒトアテローム性動脈硬化病斑内で発現する（図１２）。Ｎｋｘ２．５は、大動脈（データ非開示）、左冠状動脈（データ非開示）、末梢血管系（図１２Ａ）、及び頸動脈（図１２Ｂ）の病斑において発現が観察される。末梢動脈疾患患者の切断肢から採取した閉塞及び部分的石灰化膝窩動脈（図１２Ａ）、及び頸動脈血管内膜切除術で除去した組織（図１２Ｂ）を、ワンギーソンエラスチン染色剤（ＶＧ−Ｅ，紫）で染色し、細胞外マトリックスはマッソントリクローム（ＭＴ，コラーゲンに対して青）で染色し、ａ−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）及びＮｋｘ２．５を特異的な抗体で免疫染色した。中膜内でＮｋｘ２．５の発現はα−ＳＭＡの発現と共局在したことから、血管平滑筋細胞による発現が確認された。Ｎｋｘ２．５の発現は、新生内膜病斑内部の細胞に加えて、線維性被膜、ショルダーにおいても観察される。また、小動脈壁においても発現は観察される（挿入図１２Ａ及びＢ）。
【０１５０】
（実施例１４）ヒト動脈平滑筋細胞の表現型修飾におけるＮｋｘ２．５
市販のヒト大動脈平滑筋細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで表現型修飾が起きうる条件、すなわち‘収縮型’又は‘合成型’の血管平滑筋表現型のいずれかが優勢となる条件で培養した（（２００７）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００７；２：３６９−９９）。細胞を採取する前に連続的に７日間培養し、試料についてＮｋｘ２．５、Ｉ型コラーゲン、及び平滑筋細胞マーカータンパク質（α−ＳＭＡ、平滑筋ミオシン重鎖（ｓｍＭＨＣ又はＭＹＨ１１）、スムーセリン）のレベルを分析した。‘収縮型’の条件で培養した大動脈平滑筋細胞は、Ｎｋｘ２．５タンパク質をごく少量しか又は全く発現せず、Ｉ型コラーゲンのレベルも低かった。対照的に、収縮タンパク質の発現レベルは高かった。経時的に細胞表現型が‘合成型’になるにつれて、Ｎｋｘ２．５タンパク質発現が明確になり、Ｉ型コラーゲン発現も平行して増加する一方、収縮タンパク質のレベルは下方制御された（図１３Ａ）。タンパク質の変化はｍＲＮＡレベルの変化と酷似している（データ非開示）。‘合成的型’の大動脈平滑筋細胞におけるｓｉＲＮＡによるＮｋｘ２．５発現の阻害は、Ｉ型コラーゲンだけでなく、線維形成応答の一環として上方制御されることが知られる他の細胞外マトリックス関連タンパク質（ＣＴＧＦ，フィブロネクチン）のレベルも下方制御する。同時に、Ｎｋｘ２．５ノックダウンは正常に分化した収縮型平滑筋細胞に関連するタンパク質（α−ＳＭＡ、ｓｍＭＨＣ、スムーセリン）のレベルの上方制御をもたらす（図１３Ｂ）。実際に、ヒト大動脈平滑筋細胞の４色の免疫蛍光染色は、ｓｉＲＮＡを用いたＮｋｘ２．５の阻害が、Ｉ型プロコラーゲンの下方制御、αＳＭＡ線維の上方制御、及び平滑筋細胞表現型の明確な変化をもたらすことを明らかにしている（図１３Ｃ）。これらのデータから、血管の病変、再構築、及び瘢痕化に関連する血管平滑筋細胞の脱分化（収縮型表現型から合成型表現型への脱分化）に対してＮｋｘ２．５が直接的に関与していることが示唆される。
【０１５１】
Ｎｋｘ２．５及びＩ型プロコラーゲン特異的一次抗体を用いて、ヒト平滑筋の３色免疫蛍光染色を実行した。蛍光標識二次抗体（赤及び緑）はＮｋｘ２．５及びＩ型プロコラーゲンをそれぞれ可視化するのに用い、ＤＡＰＩ（青）は細胞核を可視化するのに用いた（図１４）。プロコラーゲン抗体は細胞内のＩ型プロコラーゲンのプロペプチドは検出するが、成熟した細胞外に分泌されたＩ型コラーゲンは検出しない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの収縮型の平滑筋細胞では、Ｎｋｘ２．５及びＩ型プロコラーゲンはいずれも発現せず、ＤＡＰＩで染色した核のみが検出される（図１４Ａ）。合成型の表現型が優勢な条件下で細胞が２日間成長した場合（図１４Ｂ）、Ｎｋｘ２．５は細胞質内及び核内で観察できる。同時に、低レベルのＩ型プロコラーゲンも細胞質内で検出できる（図１４Ｂ）。細胞を合成型の条件で培地内に５日間置いた場合（図１４Ｃ）、Ｎｋｘ２．５の発現は核が大部分を占め、Ｉ型プロコラーゲンのレベルははるかに高い。Ｎｋｘ２．５抗体の特異性は、製造元から提供されたペプチドと予め混合したＮｋｘ２．５抗体を用いることによって制御される（図１４Ｄ）。合成的な条件下で５日間培養後に検出されたＮｋｘ２．５染色は、予め吸着させたＮｋｘ２．５抗体を用いることで妨げられた。（なお、）Ｉ型プロコラーゲンの検出は影響を受けなかった（図１４Ｄ）。
【０１５２】
（実施例１５）血管平滑筋細胞におけるＮｋｘ２．５の機能
血管平滑筋細胞におけるＮｋｘ２．５の発現は反収縮効果を有する。ヒト大動脈平滑筋細胞を‘収縮型’又は‘合成型’いずれかの表現型が優勢となる条件下で培養し、コントロールｓｉＲＮＡ又はｓｉＮｋｘ２．５のいずれかで処理した。これらをＩ型コラーゲンマトリックス内に播種し、Ｔｅｎｓｈｏｎｉｎｇ−Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆｏｒｃｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒ（ｔ−ＣＦＭ）にロードした（ＲＥＦ）。ｔ−ＣＦＭは、３Ｄマトリックスへの生理的負荷を利用し、ａ）インテグリン接着及び細胞骨格形成に起因するマトリックス間の細胞から生み出される初期力、及びｂ）Ｔｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓと呼ばれる細胞間力の維持、すなわち微小管及び周囲のコラーゲンマトリックスによって平衡化されたマイクロフィラメントによって細胞間で生み出される張力を測定する装置である。収縮型の細胞において、Ｎｋｘ２．５をノックダウンした影響は顕著ではなかった（図１５Ａ）。これは、細胞内のＮｋｘ２．５発現レベルが非常に低いためであると考えられる。定義される通り、‘合成型’の細胞は‘収縮型’の細胞に比べて収縮性は低い（図１５Ａ）。（合成型の細胞において、）Ｎｋｘ２．５阻害の影響はコントロールに比べて大きく、張力及び細胞収縮性の顕著な増加をもたらした（図１５Ａ）。
【０１５３】
血管平滑筋細胞におけるＮｋｘ２．５の他の機能として、遊走促進性がある。ヒト大動脈平滑筋細胞を再び‘収縮型’又は‘合成型’いずれかが優勢となる条件下で培養し、コントロールｓｉＲＮＡ又はｓｉＮｋｘ２．５で処理した。（次に、）増殖阻害剤であるマイトマイシンＣ存在下／非存在下で遊走スクラッチ試験を行った。当然のことながら、ｓｉＣｏｎｔｒｏｌ及びＳｓｉＮｋｘ２．５で処理した細胞の間では、創傷箇所への細胞遊走速度に対する顕著な影響は見られなかった。これは、Ｎｋｘ２．５発現レベルがこれらの細胞内では低いためであると考えられる（図１５Ｂ）。実際に、マイトマイシン非存在下での遊走試験において‘合成型’ではＮｋｘ２．５阻害の顕著な影響は見られなかったことから、Ｎｋｘ２．５はこれらの細胞の増殖において役割を果たしていないことが示唆される（図１５Ｃ）。しかしマイトマイシン存在下において、Ｎｋｘ２．５阻害は創傷箇所への細胞遊走速度の顕著な減少をもたらした（図１５Ｃ）。これは、Ｎｋｘ２．５がヒト血管平滑筋細胞において遊走促進的な役割を担っていることを示唆している。
【０１５４】
（実施例１６）ＮＫｘ２．５の核移行に対するＣＫ２アンタゴニストの効果
種々のカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫ２）アンタゴニストについて、初期疾患に関連するヒト肺動脈平滑筋細胞（ｈＰＡＳＭＣｓ）におけるＮｋｘ２．５核移行阻害の有効性を評価した。ｈＰＡＳＭＣをＩＣ８０のＣＫ２アンタゴニスト存在下又は非存在下で２４時間インキュベートし、Ｎｋｘ２．５特異抗体、蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ５９４）及びＤＡＰＩ（核染色）を用いた免疫蛍光により、Ｎｋｘ２．５核移行に対する阻害効果を測定した。試験したアンタゴニストは、ＣＫ２阻害剤ＩＶ〜ＶＩＩＩ（ＣＫ２  Ｉｎｖ  ＩＶ〜ＶＩＩＩ）及びＣＸ−４９４５である。Ｎｋｘ２．５陽性核数は、１処理あたり４つの視野域における全細胞数（ＤＡＰＩで染色された核）の百分率として表した。＊＊＊不対両側スチューデントｔ検定の結果、Ｐ＜０．００１である。（また、）エラーバーは標準誤差である。データを図１６及び表２に示す。（データに）見られるように、全てのＣＫ２化合物はＮｋｘ２．５の核局在を阻害し、特にＣＸ−４９４５が最もＮｋｘ２．５の核局在を抑制することがわかった。
【０１５５】
【表２】
2015525770.tif 000007
【０１５６】
（実施例１７）ＰＡＨの前臨床モデルにおける右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ）及び全身血圧に対するＣＸ−４９４５の拮抗作用効果
Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．２０１１に記述した方法で、肺高血圧の低酸素Ｓｕｇｅｎ前臨床モデルにおけるＣＫ２アンタゴニストＣＸ−４９４５の効果を評価した。メスＣ５７／Ｂｌ６を換気性チャンバー内で正常酸素条件又は低酸素条件（酸素１０％）に２０日間置き、ＣＸ−４９４５（８０ｍｇ／ｋｇ）又は賦形剤を毎日投与した。予防的（ｐｒｏ）投与を全ての２０日間行った後、８日間のＣＸ−４９４５（８０ｍｇ／ｋｇ）の治療的（ｔｈｅｒ）投与試験を開始した。データを図１７に示す。右心室収縮期圧（ＲＶＳＰ，左パネル）及び平均動脈血圧（ＭＡＢＰ，右パネル）を測定してプロットした。データは、１グループあたり５体の平均値±最小の標準誤差であり、統計学的差異を記している。図１７で見られるように、肺高血圧の低酸素Ｓｕｇｅｎ前臨床モデルで予防的（ｐｒｏ）又は治療的（ｔｈｅｒ）に投与した際、ＣＸ−４９４５の投与は低酸素Ｓｕｇｅｎコントロール（左パネル）に比べてＲＶＳＰの上昇を大幅に阻害した。（ちなみに、）ＣＸ−４９４５による全身血圧への顕著な影響は見られなかった（右パネル）。
【０１５７】
（実施例１８）大腿動脈結紮モデルにおける血管再構築に対するＮｋｘ２．５除去効果
本発明者らは、Ｎｋｘ２．５の除去が全身血管系の損傷に続く血管再構築において変化をもたらすのか否かを試験しようと考えた。そこで彼らは、新生内膜過形成をもたらす大腿動脈結紮マウスモデルを利用した。大腿動脈の完全結紮による血流低下は、中膜の血管平滑筋細胞の急速な増殖を誘発し、広範囲にわたる新生内膜病斑の形成をもたらした。彼らは、タモキシフェンを与えたＮｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｒｅ＋若しくはＮｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｒｅ−マウス、又は正常食を与えたＮｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｒｅ＋の大腿動脈を結紮した。データを図１８に示す。結紮して４週間後、コントロールマウスについては、中膜及び新生内膜における高レベルのＮｋｘ２．５発現（Ｂ）、及び新生内膜形成の増加に応じた内腔面積の減少（Ａ）が観察された。（一方、）タモキシフェン添加Ｎｋｘ２．５ｆｌｏｘＣｒｅ＋については、中膜内のＮｋｘ２．５は除去され、内腔面積が大幅に増加し（ｐ＜０．０００１２）、新生内膜病斑は大幅に小さくなった（ｐ＜０．０００００４）。コントロールグループ間では、モルフォロジーに顕著な差は見られなかった。
【０１５８】
要約
本発明者らは、自身の知見を以下のように要約している：
１）Ｎｋｘ２．５は正常な血管では発現しないが、再構築血管及び血管病変時において発現する。
【０１５９】
２）Ｎｋｘ２．５は大動脈、冠状動脈、頸動脈及び大腿動脈のヒトアテローム硬化性病斑において観察され、肺動脈高血圧患者の肺血管系においても発現する。
【０１６０】
３）肺動脈高血圧（ＰＡＨ）の慢性酸素欠乏マウスモデルにおいて、コラーゲン産生細胞内のＮｋｘ２．５のコンディショナルノックアウト（部位特異的ノックアウト）はこのモデルに関連するＰＡＨの特徴を反転させ、肺血管の筋肉化、ＲＶＳＰ、及び右心室肥大の著しい減少をもたらす。加えて、肺血管はより柔軟になる。
【０１６１】
４）アテローム硬化性病斑のａｐｏＥ欠損マウスにおいて、Ｎｋｘ２．５はコラーゲン産生平滑筋細胞から産生するが、マクロファージ又は公知の前駆細胞の集団からは産生しない。Ｎｋｘ２．５は中膜内及び病斑自体においても発現するが、その大部分は病斑の線維性被膜及びショルダー
で発現する。
【０１６２】
５）血管再構築の頸動脈結紮モデルにおいて、コラーゲン産生細胞内のＮｋｘ２．５のコンディショナルノックアウトは非常に顕著な新生内膜形成の減少をもたらす。
【０１６３】
６）血管平滑筋細胞におけるＮｋｘ２．５の発現は、収縮型から合成型への表現型修飾及び脱分化、細胞増殖、並びに細胞外マトリックスの発現を促進し、収縮タンパク質の発現を阻害し、反収縮及び遊走促進効果を有する。
【０１６４】
７）Ｎｋｘ２．５はカゼインキナーゼＩＩ（ＣＫＩＩ）によるリン酸化によって制御される。Ｎｋｘ２．５のリン酸化はＮｋｘ２．５の核移行及びＤＮＡ結合能の減少をもたらす。ＣＫＩＩ阻害剤であるＣＸ−４９４５は、１−１０ｎＭの濃度域で血管平滑筋細胞内でのＮｋｘ２．５の核移行を阻害する。ＣＸ−４９４５は血管の再構築及び病変に関連する正常な‘収縮型’から‘合成型’への血管平滑筋細胞の表現型修飾を妨害し、血管平滑筋細胞の増殖及び遊走を阻害する。
【０１６５】
８）前記データは、肺高血圧／肺動脈高血圧、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、慢性肢虚血及び脳卒中を含む血管再構築を伴う疾患の治療において、ＣＫＩＩ阻害剤（例えばＣＸ−４９４５）によるＮｋｘ２．５活性阻害が重要な治療との関連を持つであろうということを支持する。
【０１６６】
９）前記データは、肢（後肢虚血モデル）の血管再構築においてＮｋｘ２．５が不可欠であるということを支持し、ゆえにＮｋｘ２．５は血管再構築疾患のメディエーターであるという主張を支持する。
【０１６７】
１０）（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価に基づいて）ＣＸ４９４５は最も強力なＣＫＩＩアンタゴニストであることを示す。
【０１６８】
１１）ＣＸ４９４５を用いたＣＫＩＩ拮抗作用は、前臨床モデルにおける肺高血圧の進行を阻害及び反転させる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2015525770.tif 000039
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