(57)【要約】  自己免疫疾患又は炎症性疾患に対して哺乳動物対象を治療する方法であって、  5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットを含むポリマータンパク質の有効量を該哺乳動物対象に投与することを含み；ここで、  各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を含むFc受容体結合部分を含み；  各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含み；  該ポリマータンパク質は、更なる免疫調節部分；又は該哺乳動物対象に投与された場合に抗原特異的免疫抑制を引き起こす抗原部分、を含まない、方法。【選択図】図１Ａ
2015536317.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
自己免疫疾患又は炎症性疾患に対して哺乳動物対象を治療する方法であって、
5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットを含むポリマータンパク質の有効量を該哺乳動物対象に投与することを含み；
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を含むFc受容体結合部分を含み；
各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含み；
該ポリマータンパク質は、更なる免疫調節部分；又は該哺乳動物対象に投与された場合に抗原特異的免疫抑制を引き起こす抗原部分、を含まない、
方法。
【請求項２】
各ポリペプチドモノマーユニットが、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれと融合されるテールピース領域を含み；ここで、各ポリペプチドモノマーユニットのテールピース領域が、該モノマーユニットのポリマーへの集合を促進する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
テールピース領域が、IgM若しくはIgAテールピース、又はそれらのフラグメント若しくはバリアントである、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれが、天然のヒト免疫グロブリンG1重鎖定常領域と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれが、EUナンバリングシステムに従って309位にシステイン残基を含み、かつ好ましくは310位にロイシン残基も含む、アミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれが、少なくとも1つのFc受容体に対するFc受容体結合部分の親和性を修飾するために、天然の免疫グロブリンG重鎖定常領域のアミノ酸配列と比較して修飾されたアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれが、適切には新生児型Fc受容体に対するFc受容体結合部分の親和性を増加させることにより、ポリマータンパク質のin vivo半減期を増加させるために、天然の免疫グロブリンG重鎖定常領域のアミノ酸配列と比較して修飾されたアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項８】
自己免疫疾患又は炎症性疾患が、静注用免疫グロブリン（IVIG）で治療可能である、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
自己免疫疾患又は炎症性疾患が、自己免疫性血球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、喘息、川崎病、ギラン・バレー症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、結腸クローン病、糖尿病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、重症筋無力症、抗第VIII因子自己免疫疾患、皮膚筋炎、血管炎、及びブドウ膜炎又はアルツハイマー病である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
自己免疫疾患又は炎症性疾患に対して哺乳動物対象を治療する方法であって、
5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットからなるポリマータンパク質の有効量を該哺乳動物対象に投与することを含み；
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域；及び任意選択で、一本鎖Fcとして2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を連結するポリペプチドリンカー、からなるFc受容体結合部分からなり；かつ
各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含む、
方法。
【請求項１１】
自己免疫疾患又は炎症性疾患に対して哺乳動物対象を治療する方法であって、
5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットからなるポリマータンパク質の有効量を該哺乳動物対象に投与することを含み；
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、Fc受容体結合部分及びテールピース領域からなり；
該Fc受容体結合部分は、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域；及び任意選択で、一本鎖Fcとして2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を連結するポリペプチドリンカー、からなり；
各修飾ヒト免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの修飾ヒト免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含み；かつ
該テールピース領域は、該ポリペプチドモノマーユニットの2つの修飾ヒト免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれと融合され、該モノマーユニットのポリマーへの集合を促進する、
方法。
【請求項１２】
テールピース領域が、IgM若しくはIgAテールピース、又はそれらのフラグメント若しくはバリアントである、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットを含むポリマータンパク質であって、
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を含むFc受容体結合部分を含み；
各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含み；
該ポリマータンパク質は、更なる免疫調節部分；又は哺乳動物対象に投与された場合に抗原特異的免疫抑制を引き起こす抗原部分、を含まず；
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれと融合されるテールピース領域を含まない、
ポリマータンパク質。
【請求項１４】
5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットからなるポリマータンパク質であって、
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域；及び任意選択で、一本鎖Fcとして2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を連結するポリペプチドリンカー、からなるFc受容体結合部分からなり；かつ
各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含む、
ポリマータンパク質。
【請求項１５】
請求項13又は14で定義するとおりのポリマータンパク質のポリペプチドモノマーユニットをコードするコーディング部分を含む核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫調節機能を有する改変タンパク質、及び自己免疫疾患又は炎症性疾患を治療するためのそれらの医学的用途に関する。特に、前記改変タンパク質は、静注用免疫グロブリン（intravenous immunoglobulin）（IVIG）の代わりとして使用されてよい。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫疾患及び炎症性疾患は、実質的な罹患率及び死亡率に関与している。2003年、自己免疫疾患は、75歳未満のすべての年齢層において、6番目に高頻度の根本的死亡原因であった。重要な治療法の一つは、静注用免疫グロブリン（IVIG）又はIgGである。ヒト血漿由来の免疫グロブリン産物は、最初は免疫不全を治療するために開発された。しかし、現在、処方されるIVIGのうち70％が自己免疫状態又は炎症性状態を治療するために使用されている。IVIGの世界的消費は、1980年の年間300 kgから、2010年には年間100トンまで増加した。IVIGは、長期的かつ高価な製造プロセスに従い、プールされたおよそ3,000人の匿名ドナーの血漿に由来する。ドナー及び提供された血漿をウイルスに対して広範にスクリーニングする必要性が、高コストの一因となっている。需要の高まり及びIVIG製造の厳格な制御を考慮すると、IVIGの不足が生じ得る。IVIG調製物は、不十分な滅菌、不純物の存在及びロット間変動を被る場合がある。それらは、免疫グロブリンA含量が大幅に異なる場合があり、IgAは、IgA欠損レシピエントにおいてアレルギー又はアナフィラキシー反応を引き起こし得ることから、ある患者にとっては不適切なものとなる。非常に高用量のIVIGが患者に与えられなければならず、典型的には体重1 kgあたり2 gであり、これは、ある患者においては副作用を引き起こし得る。これらの制限を考慮すると、定義されたIVIGの代替物が必要とされている。
【０００３】
IVIGに関する作用メカニズムは未だ不明であるが、IVIGに由来するFcフラグメントは、特発性血栓性紫斑病（idiopathic thrombotic purpura）（ITP）に罹患した子供を治療することができる（Debre M et al, 1993）。IgGのFc部分と、単球及びマクロファージで見られる抑制性及び活性化FcγRsの両方との相互作用が重要であると考えられているが、とはいえ、関与する正確な受容体は盛んに議論されており（Samuelsson A. et al, 2001；Bazin R. et al, 2006；Crow. A.R. et al, 2003；Leontyev D. et al, 2012；Siragam. V. et al, 2006）、それらはIVIGが使用される疾患によって異なるのかもしれない（Araujo L.M. et al, 2011；Anthony R.M. et al, 2011）。抑制性Fc受容体FcγRIIbは、ITPのマウスモデルにおいてIVIGの保護効果に必要であることが示されている（Samuelsson et al, 2001）。活性化Fc受容体FcγRIIIaの役割も様々な疾患で実証されている（Mekhaiel et al, 2011bを参照）。血漿におけるFcの長期半減期の維持に関与するFcRnも関わっていると仮定されているが（Roopenian & Akilesh, 2007）、とはいえ、最近の研究では、マウスモデルにおいてITPの改善に関与しないことが示されている（Crow et al, 2011）。Fc部分は、Fc受容体だけでなく、特定のレクチンとも相互作用する。IVIGは、Fc-グリカンの末端シアル酸を介してBリンパ球上のCD22レクチン（Siglec-2）と結合することが知られており（Seite J.F. et al, 2010）、最近の研究により、シアル酸付加されたFcが、DC上のヒトレクチン受容体DC-SIGNとの相互作用の結果として、関節炎マウスモデルにおけるIVIGの抗炎症性効果に関与していることが実証された（Anthony R.M et al, 2011）。
【０００４】
IVIGはまた、注入されたIVIgが患者においてある種の免疫複合体を最初に形成する多段階モデルを介して作用し得る（Clynes et al, 2005；Siragam et al, 2005, 2006；Machino et al, 2012）。これらの免疫複合体が形成されると、それらは受容体と相互作用して、自己免疫疾患又は炎症性状態の重症度を低下させるのに役立つ抗炎症性効果を媒介する（Siragam et al, 2006）。Fcのマルチマーは、抗イディオタイプ相互作用によるか（Machino et al, 2010；Machino et al, 2012；Roux & Tankersley, 1990；Teeling et al, 2001）或いはFcの共有結合性相互作用によって（Yoo et al, 2003）、IVIGにおいて形成される。IgGマルチマーは、上記受容体と結合するアビディティ（avidity）がより高いものを示しており、前記受容体を架橋する性質により、Fcのモノマーによっては誘導されない保護シグナルを誘導すると仮定される。これは、免疫複合体（ICs）によりマウスにおけるITPが好転すること（Bazin et al, 2006）、及びICsがFcγRIIbを介して未熟な樹状細胞の寛容原性を高めてループスの減衰を促進するという観察（Zhang et al, 2011）により支持される。市販のIVIGにおけるマルチマーIgG及び／又はシアル酸付加IgGの割合は極めて低く（それぞれ＜1％及び5％）、これが、多量投与の必要性の一因となっているのかもしれない（Nimmerjahn & Ravetch, 2007）。
【０００５】
他に提案されるIVIGの作用メカニズムは、イディオタイプ-抗イディオタイプネットワークの回復；IVIGにおける特定の抗体によるサイトカインの抑制又は中和；白血球上の接着分子と血管内皮との結合の妨害；標的組織における補体取込みの阻害；微生物毒素の中和；IVIGにおける抗Fas抗体による、Fasリガンド媒介アポトーシスの妨害；高濃度のIVIGでの抗Fas抗体によるアポトーシスの誘導；IVIGにおける抗Siglec-9抗体による好中球アポトーシス；自己抗体クリアランスを高めるためのFcRn受容体の飽和；エフェクターマクロファージにおける抑制性FcγRIIb受容体の誘導；B細胞に対する成長因子（例えばB細胞活性化因子）の中和；T細胞増殖反応の阻害；Treg細胞集団の拡大、活性化又はその両方；樹状細胞の分化及び成熟の阻害；「プライミングされた（primed）」樹状細胞の分化及び成熟の増強である（Ballow, 2011；Mekhaiel et al, 2011bを参照）。
【０００６】
自己免疫疾患の治療に使用するため、及び／又はIVIG代替化合物として使用するための組換えタンパク質が提案されている。US2011/0081345（Moore）は、分子あたり1つのFcユニットであって、2つの連結されたFcドメインアミノ酸鎖から構成されるものを有する一本鎖Fc（scFc）タンパク質を開示しており、これは、自己免疫疾患の治療に有用であり得る。US2004/0062763（Temple University；Mosser）は、自己免疫障害を治療するために、IL-10産生を上方制御するためFcγRIと結合する多価Abs又はその部分の使用を開示する。当該薬剤は、単一の組換えペプチド中で提供されるか、又は一緒に結合される2以上のFcフラグメントであってよい。US2008/0206246（The Rockefeller University；Ravetch）は、シアル酸付加された少なくとも1つのIgG Fc領域を含むポリペプチド、及びIVIG代替化合物としてのその使用を開示する。これらの文献で開示される化合物は、Fc受容体を標的とし得るものの、モノマー又はダイマーのFc含有化合物は、IVIG代替化合物として効果的であるか又は完全に効果的であるのに十分なアビディティでFc受容体と結合しない場合がある。従って、それらは、IVIGのマルチマーフラクションの適したバイオミメティクスではないだろう。より高次のマルチマーはこれらの文献には開示されていない。IVIG代替化合物として活性である、より高次のマルチマーを改変するいずれの手段もされていない。
【０００７】
US2010/0239633（University of Maryland, Baltimore；Strome）は、複数の連結Fc部分を含むIVIG代替化合物を開示する。ポリマー化を達成するため、IgMのCμ4ドメイン及びJ鎖を用いた星形の配置が想定されている。しかしながら、実施例は記載されておらず、本明細書で報告するコンピューターシミュレーションは、例示的分子が効果的にポリマー化しないこと、及び／又はFc部分は、Fc受容体若しくは他の受容体との効果的な結合のために配置されていないことを示唆する。さらに、2以上の異なるポリペプチド鎖を含む複合的な生物製剤は、全てのポリペプチドサブユニットが安定的かつ予測可能な方法で相互作用し得ないことから、均一に製造することがより困難であるかもしれない。例えば、正確な割合の軽鎖及び重鎖を含む活性インタクト抗体を産生する、抗体重鎖及び軽鎖を発現する細胞株はまた、軽鎖と結合しない治療上不活性な重鎖ダイマー、又はハーフマー（halfmer）分子を産生する場合がある。
【０００８】
US2010/0239633において、線形構造も提案されており、ここでは、個々のアミノ酸鎖が、同一のFcドメインアミノ酸鎖間で対合することによりダイマー化し、それによりFc領域を生成する。例えば、ヒンジ領域は、2つの個々のアミノ酸鎖間で鎖間ジスルフィド結合を形成し得る。しかしながら、複数のFcアミノ酸鎖が連続して連結される場合、US2010/0239633の図11及び12で説明するように、これらの鎖が対合し得る方法は複数異なって存在し得る。従って、信頼性があり予測可能な特性を有する均一な生成物は期待されないだろう。この「ジッパリング（zippering）」効果を予防するため、IgE由来の末端重鎖ドメインを含めることが提案されている。しかし、当該分子とIgE受容体との結合は、アナフィラキシーショック又は他のアレルギー反応のリスクを含む、望ましくない結果を有し得る。
【０００９】
US2010/0239633はまた、クラスター分子の作製も示唆しており、ここでは、IgG2aヒンジ又はイソロイシンジッパーなどのマルチマー化領域が、アミノ酸鎖のダイマー化又はマルチマー化を引き起こし、それにより、Fcドメインアミノ酸鎖のペアを一緒にまとめて機能的Fcユニットを形成する。研究の続報として、Jain et al（2012）は、ヒトIgG2ヒンジ配列又はイソロイシンジッパーをマウスIgG2aと融合させた組換えタンパク質の産生を記載する。著者らは、いずれかのマルチマー化領域が、ホモダイマー（すなわち、本明細書においてモノマーと称する単一の機能的Fcユニット）及びマルチマーの形成を引き起こしたと報告している。これらのタンパク質のマルチマーフラクションは、ITPのマウスモデル又はコラーゲン誘導性関節炎マウスモデルの治療においてある程度の効果を有した。しかし、IgG2ヒンジを含む産生タンパク質の大部分は、モノマーであるか、又はダイマー若しくはトリマーとして存在した。より高次のオリゴマーは、少ない割合しか占めておらず、四次構造は未知であった。イソロイシンジッパーを含むタンパク質において、より高次のマルチマーの割合は、より低かった。より高次のマルチマーは、サイズが不均一であるように見え、N297で結合されるグリカンの性質を含むそれらの構造は知られていない。治療的使用のために、これらのマルチマーのいくつか又は全てを単離することは、産生タンパク質におけるそれらの割合が低いことを考慮すれば、実質的には無駄なことを必要としており、商業的に実現可能である可能性は低いと思われる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
自己免疫疾患及び炎症性疾患を治療するために、IVIGの生物学的活性の根底にある適切なメカニズムを効果的に標的とする、定義された構造の化合物が依然として必要とされている。
【００１１】
以前に出版された文献の本明細書中での列挙又は論述は、当該文献が、技術水準の一部であるか又は共通の一般知識であることを認めるものとして解釈されるべきではない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の要旨
本発明の第一の側面は、自己免疫疾患又は炎症性疾患に対して哺乳動物対象を治療する方法であって、
5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットを含むポリマータンパク質の有効量を該哺乳動物対象に投与することを含み；
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を含むFc受容体結合部分を含み；
各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含み；
該ポリマータンパク質は、更なる免疫調節部分；又は該哺乳動物対象に投与された場合に抗原特異的免疫抑制を引き起こす抗原部分、を含まない、
方法を提供する。
【００１３】
本発明の第二の側面は、自己免疫疾患又は炎症性疾患に対して哺乳動物対象を治療する方法であって、
5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットからなるポリマータンパク質の有効量を該哺乳動物対象に投与することを含み；
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域；及び任意選択で、一本鎖Fcとして2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を連結するポリペプチドリンカー、からなるFc受容体結合部分からなり；かつ
各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含む、
方法を提供する。
【００１４】
本発明の第三の側面は、自己免疫疾患又は炎症性疾患に対して哺乳動物対象を治療する方法であって、
5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットからなるポリマータンパク質の有効量を該哺乳動物対象に投与することを含み；
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、Fc受容体結合部分及びテールピース（tailpiece）領域からなり；
該Fc受容体結合部分は、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域；及び任意選択で、一本鎖Fcとして2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を連結するポリペプチドリンカー、からなり；
各修飾ヒト免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの修飾ヒト免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含み；かつ
該テールピース領域は、該ポリペプチドモノマーユニットの2つの修飾ヒト免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれと融合され、該モノマーユニットのポリマーへの集合（assembly）を促進する、
方法を提供する。
【００１５】
本発明の第四の側面は、5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットを含むポリマータンパク質であって、
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を含むFc受容体結合部分を含み；
各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含み；
該ポリマータンパク質は、更なる免疫調節部分；又は哺乳動物対象に投与された場合に抗原特異的免疫抑制を引き起こす抗原部分、を含まず；
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれと融合されるテールピース領域を含まない、
ポリマータンパク質を提供する。
【００１６】
本発明の第五の側面は、5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットからなるポリマータンパク質であって、
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域；及び任意選択で、一本鎖Fcとして2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を連結するポリペプチドリンカー、からなるFc受容体結合部分からなり；かつ
各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含む、
ポリマータンパク質を提供する。
【００１７】
本発明の第六の側面は、本発明の第四又は第五の側面に従って定義されるとおりのポリマータンパク質のポリペプチドモノマーユニットをコードするコーディング部分を含む核酸分子を提供する。
【００１８】
本発明の更なる側面は、本発明の第六の側面の核酸分子を含む発現ベクター；該発現ベクターを含む宿主細胞；及び本発明の第四又は第五の側面のポリマータンパク質を含む治療用組成物である。
【００１９】
本発明の第一から第三の側面の治療方法に対応する医学的用途も想定される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】ヘキサマーFc及び構造キャラクタリゼーション。A）1つのモノマーとそれに隣接するモノマー間で形成されるCys309及びCys360（テールピース）ジスルフィルド結合を示す、ヘキサマーFcモデル（左パネル）。タッピングモード原子間力顕微鏡像（右側パネル）により、ヘキサマーと一致する、バレル形の6倍の対称な複合体が明らかとなる。より小さなスキャンサイズ（2枚の右側パネルの下側）では、これらの複合体は、直径およそ20 nmであると示される（下側パネルのスケールバーは50 nmである）。
【図１Ｂ】ヘキサマーFc及び構造キャラクタリゼーション。B）哺乳動物細胞株から生成されるヘキサマーFcは、サイズ排除クロマトグラフィーによりおよそ312 kDaの分子として検出できる（ヘキサマーとして強調されるトレース）。少ない割合のダイマーも検出される。
【図２】ヒト及びマウスFcγ受容体（FcγRs）とヘキサマーFcの結合。滴定量（50〜0.3 nM）のFcタンパク質をELISAウェル上にコーティングした。示すように、ヒト又はマウスのグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）融合FcγRsによる結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合抗GST抗体を用いて可視化した。値は、3連の測定値を表す。エラーバーは、平均についての標準誤差（SE）である。抗原融合Fcタンパク質は、Mekhaiel et al, 2011aに記載されるように、Fc受容体と十分に結合しなかった。
【図３】ヒトCD19+ ヒトBリンパ球とヘキサマーFcの結合。前方及び側方散乱プロファイルにより表されるヒト白血球の異なる集団を示す、特徴的なフローサイトメトリープロット（左パネル）。抗ヒトCD19-FITCで染色した個々のCD19+ Bリンパ球（囲み、中央パネル）をゲーティングし、ヘキサマーFcの結合について調べた（右パネル）。50 μgのhexa-FcとCD19+ B細胞との結合が、右側の最も離れたトレースにより示される（矢印の付いたhexa-Fc）。FcRL5に対して特異的なモノクローナル抗体509F6と細胞を予めインキュベーションすることにより（矢印の付いたhexa-Fc + FcRL5ブロッキングmAb 509F6）、ヘキサマーFcの結合が除去され、これにより、FcRL5が、ヘキサマーFcとB細胞との結合にある程度関与したことが示された。
【図４】Fcタンパク質との補体結合分析。Fc融合物とのC1q（左パネル）及びC5〜9沈着（右パネル）をELISAにより測定した。各点は、所与のグループ内の各マウスについて2連ウェルの平均光学密度（+/-SD）を表す。3回の反復実験のうちの1つのデータを示す。
【図５】ヘキサマーFcタンパク質は、ITPのマウスモデルにおいて、血小板減少（platelet loss）を防ぐ。Balb/CマウスにHexa-Fc、IVIG（GammaGard）又はPBSをi.p.注入した。1時間後、すべてのマウスでITPを誘導した。処理後の示す時点にて血小板を計数した。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の好ましい実施態様の詳細な説明
本発明の第一の側面によれば、自己免疫疾患又は炎症性疾患に対して哺乳動物対象を治療する方法を提供する。前記対象は、5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットを含むポリマータンパク質を投与することにより治療され；ここで、各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を含むFc受容体結合部分を含む。
【００２２】
用語「免疫グロブリンG重鎖定常領域」とは、天然の免疫グロブリンG重鎖領域、又はそのバリアント若しくはフラグメントを意味する。Fc受容体結合部分は、典型的には、免疫グロブリンGのFc部分、又はそのフラグメント若しくはバリアントを含む。用語「Fc部分」は、IgGのヒンジ領域に作用するパパイン酵素での制限タンパク質分解により得られる、IgG分子のフラグメントを含む。この方法で得られるFc部分は、IgGの重鎖CH2及びCH3ドメイン（それぞれ、Cγ2及びCγ3ドメインとも称される）を含む、2つの同一のジスルフィルド結合されたペプチドを含む。2つのペプチドは、ペプチドのN末端部分においてシステイン残基間の2つのジスルフィド結合により連結される。IgGについて記載されるジスルフィド結合の配置は、天然のヒト抗体に関連する。他の哺乳動物種由来の抗体間にはいくらかのバリエーションが存在し得るが、とはいえ、かかる抗体は、本発明との関連で適したものであり得る。抗体はまた、鳥類、爬虫類及び両性類でも見られ、それらも同様に適したものであり得る。ヒトFc IgGのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えば、Ellison et al.（1982）NUCLEIC ACIDS RES. 10：4071-4079に開示される。マウスFc IgG2aのヌクレオチド及びアミノ酸配列は、例えば、Bourgois et al.（1974）EUR. J. BIOCHEM. 43：423-435に開示される。免疫グロブリンG重鎖定常領域は、典型的には、組換え発現技術により生成されてよく、天然抗体で生じるように、ジスルフィド結合によりモノマーユニットとして関連してよい。或いは、2つの定常領域は、典型的にはこれも組換え発現技術により、介在するリンカー領域を有する単一のアミノ酸鎖として、すなわち一本鎖Fc（scFc）として生成されてよい。scFc分子はUS2011/0081345に記載されており、これには、N末端からC末端へと以下の一般構造を有する実施例が含まれる：ヒンジ-CH2-CH3-リンカー-ヒンジ-CH2-CH3。
【００２３】
典型的には、免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれは、哺乳動物重鎖定常領域、好ましくはヒト重鎖定常領域；又はそのバリアント、のアミノ酸配列を含む。適したヒトIgGサブタイプは、IgG1である。
【００２４】
Fc受容体結合部分は、免疫グロブリンのFc部分以外を含んでもよい。例えば、天然免疫グロブリン中のCH1及びCH2ドメイン間に生じる、免疫グロブリンのヒンジ領域を含んでよい。特定の免疫グロブリンについて、ヒンジ領域は、Fc受容体との結合に必要である。好ましくは、Fc受容体結合部分は、CH1ドメイン及び重鎖可変領域ドメイン（VH）を欠く。Fc受容体結合部分は、対応する免疫グロブリンのFc部分と比較して、C末端及び／又はN末端で切断されてもよい。従って、このようなFc受容体結合部分は、Fc部分の「フラグメント」である。
【００２５】
ポリマータンパク質は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含む各免疫グロブリンG重鎖定常領域によって形成される。IgM及びIgAは天然でポリマーであるが、IgGは天然でモノマーであることから、IgG重鎖定常領域に基づくモノマーユニットがポリマーを形成する能力は、IgG重鎖定常領域の部分を、むしろ対応するIgM又はIgA部分となるように修飾することにより改善され得る。適切には、免疫グロブリン重鎖定常領域又はそのバリアントのそれぞれは、EUナンバリングシステムに従い309位にシステイン残基を含み、好ましくは310位にロイシン残基も含むアミノ酸配列を含むIgG重鎖定常領域である。IgGに関するEUナンバリングシステムは、Kabat EA et al, 1983 Sequences of proteins of immunological interest. US Department of Health and Human Services, National Institutes of Health, Washington DCに記載される。Sorensen et al（1996）J Immunol 156：2858-2865は、ポリマー形成を促進するために、IgMテールピースを含むヒトIgG3分子における、Leu 309のCys 309への変異を記載する。Leu 309は、配列相同性により、IgMのCμ3ドメインにおけるCys 414、及びIgAのCα2ドメインにおけるCys 309と対応する。（アミノ酸残基のナンバリングは、IgM及びIgA又はIgGクラス間で異なる点に留意されたい。）他の変異も有利であり得る。
【００２６】
適切には、各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれと融合されるテールピース領域を含み；ここで、各ポリペプチドモノマーユニットのテールピース領域は、該モノマーユニットのポリマーへの集合を促進する。典型的には、テールピース領域は、2つの免疫グロブリン重鎖定常領域のそれぞれのC末端で融合される。適切には、テールピース領域は、IgM若しくはIgAテールピース、又はそのフラグメント若しくはバリアントである。これらのテールピースは、それぞれIgMのCμ4ドメイン又はIgAのCα3ドメインの最終部分である。
【００２７】
ある領域が、別の領域のC末端で融合されると記載される場合、前者の領域は、後者の領域のC末端と直接融合されてよく、或いは後者の領域のC末端とそれ自身が融合される介在アミノ酸配列と融合されてもよい。N末端融合も同様に理解されてよい。
【００２８】
介在アミノ酸配列が、重鎖定常領域とテールピースとの間に提供されてよく、或いはテールピースは、重鎖定常領域のC末端と直接融合されてよい。例えば、短いリンカー配列が、テールピース領域と免疫グロブリン重鎖定常領域との間に提供されてよい。典型的なリンカー配列は、1〜20アミノ酸長のものであり、典型的には、2、3、4、5、6、又は最大で8、10、12若しくは16アミノ酸長である。重鎖領域とテールピース領域との間に含まれる適したリンカーは、Leu-Val-Leu-Glyをコードする。
【００２９】
好ましいテールピース領域は、ヒトIgMのテールピース領域であり、これは、PTLYNVSLVMSDTAGTCYである（Rabbitts TH et al, 1981. Nucleic Acids Res. 9（18）, 4509-4524；Smith et al（1995）J Immunol 154：2226-2236）。適切には、このテールピースは、最初のThrをProに置換することによりN末端で修飾されてよく、従って、配列PPLYNVSLVMSDTAGTCYが生成される。これは、テールピースがモノマーのポリマー化を促進する能力に影響を及ぼさない。ヒトIgMテールピースの更なる適したバリアントは、Sorensen et al（1996）J Immunol 156：2858-2865に記載される。更なるIgMテールピース配列は、げっ歯類由来のGKFTLYNVSLIMSDTGGTCYである（Abbas and Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, Elsevier Saunders, 5th Edn, 2005）。代替的な好ましいテールピース領域は、ヒトIgAのテールピース領域であり、これは、PTHVNVSVVMAQVDGTCYである（Putnam FW et al, 1979, J. Biol. Chem 254：2865-2874）。他の種のIgM若しくはIgAに由来する他の適したテールピース、又はモノマーユニットのポリマーへの集合を促進する合成配列さえも使用されてよい。免疫グロブリン重鎖定常領域が由来する種と同じ種に由来する免疫グロブリンテールピースを使用する必要はないが、とはいえ、そうすることが好ましい。
【００３０】
「バリアント」及び「フラグメント」は、重鎖定常領域に関連して定義されるとおりである。IgMテールピースのバリアントは、典型的には、18個のうち8、9、10、11、12、13、14、15、16又は17個のアミノ酸の位置でPPLYNVSLVMSDTAGTCYと同一であるアミノ酸配列を有する。IgAテールピースのバリアントは、典型的には、18個のうち8、9、10、11、12、13、14、15、16又は17個のアミノ酸の位置でPTHVNVSVVMAQVDGTCYと同一であるアミノ酸配列を有する。これらのIgM又はIgAテールピースのフラグメントは、典型的には、8、9、10、11、12、13、14、15、16又は17個のアミノ酸を含む。バリアントのフラグメントも想定される。典型的には、IgM又はIgAテールピースのフラグメント及びバリアントは、最後から2番目のシステイン残基が、ポリマータンパク質中、2つのモノマーユニット間でジスルフィド結合を形成すると考えられることから、これを保持する。
【００３１】
所与のテールピース領域が、モノマーユニットのポリマーへの集合を促進する能力は、テールピースを欠くモノマーユニットから形成される場合の高分子サイズ有するタンパク質の割合を、テールピースを含むモノマーユニットの場合と比較することにより試験されてよい。後者は、天然の条件下、高分子サイズのポリマーをより高い割合で形成し得る。天然の分子量は、サイズ排除クロマトグラフィーにより、例えば、AKTA FPLC（Amersham）でのSephadex-200カラム上などで決定され得る。或いは、Smith et al（上記）又はSorensen et al（上記）に記載されるように、非還元ゲル電気泳動を用いてもよい。
【００３２】
モノマーユニットがポリマーへと集合されている場合、Fc受容体結合部分は、各Fc受容体結合部分がFc受容体と結合可能であるように空間的にオリエンテーション（orientated）された平面的なポリマー構造中に配置（arranged）される。IgMは天然ではペンタマー又はヘキサマーであり、IgAは天然ではダイマー、トリマー又はテトラマーを形成する。これらの特性は、少なくとも部分的には、モノマーをポリマーへと集合させるテールピースの能力により決定されると思われる。ペンタマーIgMは、IgMがJ鎖と関連する場合に形成されるが、とはいえ、J鎖の不在下では典型的にはヘキサマーである。J鎖は、本発明のポリマー融合タンパク質の更なる構成成分として含まれてよく、又は含まれなくてもよい。J鎖ポリペプチドを省くことにより作製は単純化されるが、いずれの場合においても、これはIgGのポリマー化には必要とされない（Ghumra et al, 2008）。粘膜表面で見られる分泌型IgM又はIgAは、それらを血液から分泌物中に移行させるのに使用されるポリマーIg受容体の一部である分泌成分（SC）を含む。SCは、本発明のポリマータンパク質の更なる構成成分として含まれてよく、又は含まれなくてもよい。SCを省くことにより作製は単純化されるが、いずれの場合においても、これはポリマー化には必要とされない。
【００３３】
5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットを含むポリマータンパク質は、本発明の第一の側面に従って使用される。本明細書に記載されるヒトIgG1重鎖定常領域及びヒトIgMテールピースを含む例示的なFcタンパク質は、ヘキサマー及びダイマーを形成する。異なるテールピースを含むか又はテールピースを含まない、他のIgG重鎖定常領域に基づくバリアントは、異なる数のモノマーを有するポリマーを形成してよい。特に、それらは、ヘキサマーよりむしろペンタマー又はヘプタマーであってよい。Fcタンパク質が、天然で、異なる数のモノマーユニットを有するポリマーへと会合する場合には、必要な数のモノマーユニットを有するポリマーを分子サイズに従って、例えばゲル濾過により、分離できる。少なくともある割合のタンパク質がペンタマー、ヘキサマー及び／又はヘプタマーの形態である混合物を使用してもよい。適切には、ペンタマー、ヘキサマー及び／又はヘプタマーは、他の数のモノマーユニットを有するタンパク質の不在下で使用される。
【００３４】
本発明の第一の側面に従って使用されるポリマータンパク質において、各モノマーユニットのFc受容体結合部分は、Fc受容体と結合することができる。特定の免疫グロブリンのFc部分を含むFc受容体結合部分は、該特定の免疫グロブリンの結合特異性に依存して、異なるFc受容体と結合するであろうことが理解されるだろう。典型的には、Fc受容体結合部分は、所与のFc受容体に対して、天然のモノマー免疫グロブリン分子の親和性（affinity）と少なくとも同程度である親和性を有するだろう。しかしながら、ポリマータンパク質は、このようなFc受容体結合部分を複数含み、それゆえ、より高いアビディティ（avidity）でFc受容体と結合するであろうことから、より低い親和性も許容され得る。従って、Fc受容体結合部分は、典型的には、所与のFc受容体と結合する、対応する天然のモノマー免疫グロブリン分子の親和性の少なくとも10分の一、適切には少なくとも5分の一、最も適切には少なくとも半分である親和性を有するだろう。
【００３５】
親和定数（affinity constants）は、表面プラズモン共鳴分析（Biacore）により容易に決定できる。Fc受容体結合部分は、Fc受容体とアミンカップリングされたCM5センサーチップからのフローセル上を通過させることができる。等モル濃度のFc受容体結合部分又はインタクトなモノマー抗体を各Fc受容体上に注入してよく、会合及び解離がリアルタイムで観察されてよい。BIAcore X又は3000マシンからのデータをBIAevaluation 3.0ソフトウェアを用いて分析して、正確な親和定数を決定してよい。
【００３６】
ヒトFcγ受容体には3つのクラスが存在する（Gessner et al（1998）Ann Hematol 76：231-48；Raghavan and Bjorkman（1996）Ann Rev Cell Dev Biol 12：181-220）。FcγRI（CD64）は、高親和性でモノマーIgGと結合する。FcγRII（CD32）及びFcγRIII（CD16）はFcに対する低親和性受容体であり、免疫複合体（ICs）として免疫系に提示される抗体とのみ高親和性で相互作用できる。より大きな（＞350 kDa）マルチマーIgG及び循環ICsは、IVIG調製物において大半が除去されるものの、これらは、健康な個体中では一般的であり、血漿Ab濃度全体の10％も貢献し得、これらの健康な個体における免疫ホメオスタシスの維持に生理学的な役割を示す（Nezlin R（2009）Immunol Lett 122,141-4）。
【００３７】
FcγRII及びFcγRIIIは、それらのリガンド結合ドメインの構造において密接に関連する。ヒトでは、3つの別個の遺伝子FcγRIIA、FcγRIIB及びFcγRIIC（そのうち2つは、選択的スプライシングバリアントを生じさせる）が、FcγRIIをコードする。FcγRIIaが活性化シグナルを送達する一方、FcγRIIbは抑制性シグナルを送達する。相違するシグナルに関する機能的な根拠は、受容体の細胞質テール内に位置するシグナリングモチーフに起因する。FcγRIIbの細胞質テールに位置する免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（immunoreceptor tyrosine-based inhibitor motif）（ITIM）は、ネガティブな受容体シグナリングに関与する。ITIMモチーフは、他のいずれのFcγ受容体クラスにも一見存在しないことから、FcγRIIb受容体の独特な特徴である。対照的に、活性化する免疫受容体活性化チロシンモチーフ（activatory immunoreceptor tyrosine-based activation motif）、すなわちITAMは、FcγRIIaの細胞質テールに位置する。ITAMモチーフは、活性化シグナルを伝達する。それらは、FcRγ鎖でも見られ、これは、高親和性IgE受容体（FcεRI）のγ鎖と同一である。FcγRIIa及びFcγRIIbは、骨髄性細胞及びいくつかのT細胞サブセットで広く発現する一方、NK細胞には明白に存在しない。ヒトでは、FcγRIIa受容体について2つのアレルが存在し、His131（H131）及びArg131（R131）と称される。FcγRIIa-Arg131アレルは、IgG2応答を引き起こす被包性細菌、例えば、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）及び髄膜炎菌（Neiserria meningitidis）などによる感染に対する感受性の増加と関連する（Pleass RJ & Woof JM, 2001）。このアレルによりコードされるFc受容体はIgG2と結合できず、それゆえ、IgG2で覆われた細菌のクリアランスを引き起こすことができない。しかしながら、バリアントはともにヒトIgG1と結合する。
【００３８】
ヒトFcγRIIIはまた、2つの異なる遺伝子（FcγRIIIA及びFcγRIIIB）由来の複数のアイソフォームで存在する。FcγRIIIbは、グリコシルホスファチジルアンカーを介して細胞膜と結合するという点で独特である。FcγRIIIbの発現は、好中球に限定されるが、FcγRIIIaは、マクロファージ及びNK細胞により発現される。FcγRIIIaはまた、いくつかのT細胞サブセット及び特定の単球によっても発現される。FcγRIIIaは、細胞表面発現及びシグナル伝達のために、FcRγ鎖又はCD3ζ鎖の存在を必要とする。FcRγ鎖及びCD3ζ鎖は、ダイマーであり、ITAMモチーフを有する。FcγRIIIaは、これらのサブユニットとマルチマー複合体を形成し、シグナリングは、それらを介して伝達される。従って、かなりのFcγR受容体不均一性及び多様な発現が存在する。
【００３９】
FcγRII及びFcγRIIIに対する結合部位は、IgGのCH2ドメインのヒンジ及び隣接領域に位置し、これは、もともとFcγRIに対して同定された領域と同一である（Duncan et al（1988）Nature 332：563-4；Morgan et al（1995）Immunol 86：319-324；Lund et al（1991）J Immunol 147：2657-2662）。
【００４０】
Fcγ受容体（FcγRs）は、活性化及び／又は抑制性シグナリング経路を引き起こし、これは細胞活性化のための閾値を設定し、結果としてバランスのとれた免疫反応となる（Nimmerjahn F & Ravetch JV（2008）Nat. Rev. Immunol. 8：34-47）。活性化及び抑制性FcRsは、造血系にわたって広く発現するが、特にプロフェッショナル抗原提示細胞（APCs）で発現する（Nimmerjahn F & Ravetch JV（2008）（上記））。例えば、ヒトにおいて、FcγRIは、血液骨髄系樹状細胞（DCs）により構成的に発現され、FcγRIIは、今日まで検証されたすべてのDCサブセットで検出されている一方、FcγRI、FcγRIIB及びFcγRIIIの発現は、マウスDCで優位である（Ravetch JV（2003）in Fundamental Immunology（ed. Paul WE）685-700（Lippincott-Raven, Philidelphia）；Bajtay Z et al（2006）Immunol. Lett. 104：46-52）。FcγRsはまた、樹状細胞（DCs）の抗原提示及び免疫複合体媒介性の成熟、並びにB細胞活性化及びプラズマ細胞生存の制御に極めて重要な役割を果たす（Ravetch JV（2003）（上記）；Bajtay Z et al,（2006）（上記））。さらに、DC活性を制御することにより、FcγRsは、DCsの表面上で細胞傷害性T細胞、ヘルパーT細胞及び制御性T細胞に提示された抗原ペプチドの認識後、免疫原性又は寛容原性の反応が開始されるかどうかをコントロールする。FcγRsはまた、重要な制御性サイトカインIL-12及びIL-10のレベルをコントロールする際にToll様受容体（TLRs）と協力する（Polumuri SK, 2007, J. Immunol 179：236-246）。従って、FcγRsは、自然免疫応答及び適応免疫応答の制御に関与しており、新規免疫療法アプローチの開発に対する魅力的な標的となる（Nimmerjahn F & Ravetch JV（2008）（上記））。
【００４１】
抑制性FcγRIIBは、FcγRIIBノックアウトマウス由来のDCsが、より強力かつ長く持続する免疫反応をin vitro及びin vivoで生じることから、免疫反応の大きさをコントロールすることが知られている（Bergtold A, Desai DD, et al（2005）Immunity 23：503-514；Kalergis A M & Ravetch JV.（2002）J. Exp. Med. 195：1653-1659）。より重要なことに、FcγRIIB欠損DCs、又はFcγRIIBと結合する免疫複合体を阻害するmAbとインキュベートしたDCsは、自然成熟（spontaneous maturation）を示した（Boruchov AM, et al（2005）J. Clin. Invest. 115：2914-2923；Dhodapkar KM, et al（2005）Proc. Natl Acad. Sci. USA 102：2910-2915）。これは、抑制性FcγRが、細胞活性化の大きさを制御するだけでなく、非炎症性の定常状態条件下で、自然DC成熟を能動的に予防することを示唆する。実際に、低レベルの免疫複合体が、健康なドナー血清中で見られ、望ましくないDC活性化を予防する制御メカニズムの重要性が強調される（Dhodapkar KM, et al（2005）Proc. Natl Acad. Sci. USA 102：2910-2915）。FcγRIIBの喪失はまた、より抗原特異的なT細胞のプライミングをもたらす（Kalergis A M & Ravetch JV.（2002）J. Exp. Med. 195：1653-1659）。従って、FcγRIIBの複数のコピーとポリマーFcタンパク質との結合は、この受容体を発現する細胞からネガティブな反応を誘導し得る。
【００４２】
FcRL5は、抑制性シグナリングが可能な最近記載されたFc受容体であり、B細胞上に発現し、凝集IgGと結合するが、モノマーIgGとは結合しない（Wilson et al, 2012）。これらの著者らは、IgGが、B細胞上に共発現するFcRL5及びFcγRIIbと協調的に結合し得ることを提案する。実施例3に記載するように、例示的なヘキサマータンパク質は、FcγRIIbとは独立して、FcRL5と結合できる。
【００４３】
Fc受容体結合部分が、ヒトIgGアイソタイプの免疫グロブリン重鎖定常領域又はそのバリアントを含む場合、典型的には、ヒトFcγ受容体（FcγRI、FcγRII及びFcγRIII）及び／又はヒトFcRL5と結合するだろう。上記のような表面プラズモン共鳴分析を用いて、親和定数を決定できる。ヒトIgG1又はIgG3のFcγRIとの結合に関する典型的な親和定数は、約10-9Mであり；FcγRIIについては約0.6〜2.5×10-6Mであり；FcγRIIIAについては約5×10-5 Mであり；FcγRIIIBについては約0.6〜2.5×10-6Mである。FcRL5は、凝集IgGと高アビディティで結合するものの、モノマーIgGは、FcRL5と著しく結合せず、これは、FcRL5が、モノマーIgGに対して、約10-5〜10-6 Mの親和定数を有する低から中程度の親和性受容体であることを示唆する（Wilson et al, 2012から得た）。或いは、実施例3に記載するようにELISAsを基本的には用いて、結合特性の半定量的な指標を得てもよい。
【００４４】
Fc受容体結合部分はまた、典型的には、グリカン受容体とも称されるレクチン、特にシアル酸と結合するレクチンとも結合する。例示的なレクチンは、ヒトDC-SIGN（又はマウスホモログSIGN-R1）及びCD22であり、これらは、IVIGの治療特性の一因となる（Mekhaiel, 2011bを参照）。ポリマータンパク質は、実施例3で説明するように、これらの受容体と相互作用すると予想される。SIGN-R1結合は、Jain et al, 2012に記載されるように、表面プラズモン共鳴により決定できる。類似した方法を用いて、CD22又はDC-SIGNとの結合を測定してよい。ヒト2,6シアル酸付加Fcは、それぞれ、2.7×10-6 M及び3.6×10-6 Mの親和定数でSIGN-R1及びヒトDC-SIGNと結合する（Anthony et al, 2008, PNAS 105：19571-19578）。シアル酸付加Fcは、目に見えては結合しない。マルチマーシアロタンパク質、例えばヘマグルチニンは、10-2 Mで結合するモノマーと比較して、ほぼ10-8M程度の親和性でシアル酸受容体と結合することが知られている（Mammen M, Choi SK, Whitesides GM（1998）Angew Chem Int Edit 37：2755-2794.）。それゆえ、アビディティの増加は、本質的に弱い基質親和性を高めることができるので、ポリマータンパク質上に末端シアル酸残基を提示することは、同様に、シアル酸受容体との結合を有意に高めると期待される。
【００４５】
天然の免疫グロブリン重鎖定常領域のバリアント、又はFc部分のフラグメントを含む、Fc受容体結合部分に関する親和定数の適切な限界及び決定は、上記のとおりである。
【００４６】
「バリアント」とは、1以上の位置にアミノ酸の挿入、欠失又は置換（保存的又は非保存的のいずれか）が存在するタンパク質をいう。
【００４７】
「バリアント」は、修飾アミノ酸を有してよい。適した修飾は、アセチル化、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、ヌクレオチジル化、リン酸化、ADP-リボシル化、及び当分野で公知の他の修飾を含む、かかる修飾は、ペプチドが組換え技術により作製される場合、翻訳後に生じてもよい。別法として、修飾は、当分野で公知の技術を用いて合成ペプチドに作製されてもよい。修飾は、アミノ酸のペプチドへの組み込み前に含まれてよい。カルボン酸基はエステル化されてよく、或いはアミドに変換されてよく、アミノ基は、アルキル化、例えばメチル化されてよい。バリアントも翻訳後に修飾されてよく、例えば、炭水化物側鎖若しくは個々の糖部分（例えばシアル酸基）を除去するために、又はシアル酸基を付加するために修飾されてよい。
【００４８】
「保存的置換」とは、Val、Ile、Leu、Ala、Met；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr、Gly、Ala；Lys、Arg、His；及びPhe、Tyr、Trpなどの組み合わせを意図する。好ましい保存的置換は、Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及びPhe、Tyrを含む。
【００４９】
免疫グロブリンG重鎖定常領域の典型的なバリアントは、天然の免疫グロブリンの対応する免疫グロブリンG重鎖定常領域と少なくとも70％、典型的には少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、又は少なくとも99.5％同一であるアミノ酸配列を有するだろう。適切には、バリアントは、ヒト免疫グロブリンG1重鎖定常領域のバリアントであり、後者と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、又は少なくとも99.5％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００５０】
「フラグメント」とは、1以上の位置に欠失が存在するタンパク質をいう。典型的には、Fc部分のフラグメントは、Fc部分の完全配列の少なくとも60％、より典型的には少なくとも70％、80％、90％、95％又は最大で99％を含む。バリアントのフラグメントも想定される。
【００５１】
2つのポリペプチド間の配列同一性％は、例えば、ウィスコンシン州立大学Genetic Computing GroupのGAPプログラムなどの適したコンピュータープログラムを用いて決定されてよく、同一性％は、配列が最適にアラインされたポリペプチドに関して算出されることが理解されよう。
【００５２】
或いは、アライメントは、Clustal Wプログラム（Thompson et al.,（1994）Nucleic Acids Res., 22（22）, 4673-80）を用いて実施されてよい。使用されるパラメータは以下のようなものであってよい：
-  Fastペアワイズ・アライメント・パラメータ：K-タップル（ワード）サイズ；1、ウィンドウサイズ；5、ギャップ・ペナルティ；3、トップダイアゴナル数；5。スコアリング法：x％。
-  マルチプル・アライメント・パラメータ：ギャップ・オープン・ペナルティ；10、ギャップ・エクステンション・ペナルティ；0.05。
-  スコアリング・マトリックス：BLOSUM。
【００５３】
バリアントは天然であってよく、或いは、当分野で周知であるように、タンパク質工学の方法及び部位特異的突然変異誘発法を用いて作製されてよい。
【００５４】
「ペプチド」は通常、最大で10、20、50又は100個のアミノ酸を含む。ペプチド及びポリペプチドは、エキソタンパク質分解消化(exoproteolytic digestion)に対する感受性を低下させるのを助けるために、そのN末端又はC末端で好都合にブロックされてよい。ペプチド及びポリペプチドは、組換えタンパク質発現又はin vitro翻訳システムにより作製されてよい（Sambrook et al, “Molecular cloning： A laboratory manual”, 2001, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。ペプチドは、Lu et al（1981）J. Org. Chem. 46, 3433及びその中の参考文献により開示されるように、固相ペプチド合成のFmoc-ポリアミドモードにより合成されてよい。
【００５５】
適切には、本発明の第一の側面に従って使用するためのFcタンパク質において、免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれは、少なくとも1つのFc受容体に対するFc受容体結合部分の親和性を修飾するために、天然の免疫グロブリンG重鎖定常領域のアミノ酸配列と比較して修飾されたアミノ酸配列を含む。典型的には、低親和性の抑制性及び／又は活性化Fcγ受容体に対するFc受容体結合部分の親和性が増加されてよい。
【００５６】
IgGとFc受容体との間の相互作用は、野生型及び変異型Fcを用いた生化学的及び構造的研究で分析されている。1つのコンセンサスは、Fc受容体との結合に関する領域のいくつかは、CH2ドメインに最も近いヒンジ領域の一部、及びヒンジに隣接するCH2ドメインのアミノ末端に位置しており、これには、例えば、残基233〜239（Glu-Leu-Leu-Gly-Gly-Pro-Ser）が含まれる。この領域内の変異により、Fc受容体との結合の改変をもたらすことができる。この領域は、Fc受容体との直接的相互作用のいくつかと関与しているようである（Woof JM & Burton D, Nature Reviews Immunology 2004, 4：89-99）。さらにCH2ドメイン中、及びヒンジから離れた他の残基が、少なくとも何らかの関連で、Fc受容体結合の一因となっており、これには、例えば、Fc受容体との直接的な接触に関与するように見えるヒトIgG1のPro-329（EUナンバリング）、及びヒトIgG1のFc領域内のN結合グリコシル化に対する単独の部位であるように見えるAsn-297が含まれる。この残基における炭水化物の存在は、Fc受容体との結合の一因となり得る。
【００５７】
活性化Fcγ受容体は上記のとおりである；ヒトにおいて、低親和性の活性化Fcγ受容体は、FcγRIIA/C及びFcγRIIIAである。FcγRIは、高親和性の活性化受容体である。FcγRIIBは、抑制性ヒトFc受容体である。FcγRIIB及びFcγRIIA/Cのリガンド結合特性は同一であることから、FcγRIIA/Cに対する親和性を増加させながら同時にFcγRIIBに対する親和性を低下させることは可能でないかもしれない。Lazar et al（2006）PNAS 103：4005-10は、異なるFc受容体への結合親和性に影響を及ぼす、ヒトIgGのFc部分における変異を記載する。野生型IgGはFcγRIIIaと252 nMのKDで結合した；I332E変異体のKDは30 nMであり、S239D/I332E変異体のKDは2 nMであった。A330L変異をS239D/I332Eと組み合わせると、FcγRIIIaの親和性が増加し、FcγRIIbの親和性が低下した。Shields RLet al（2001）J. Biol. Chem. 276：6591-6604は、異なるFc受容体への結合親和性に影響を及ぼす、ヒトIgG1のFc部分における変異を記載する。S298A変異は、FcγRIIIaに対する親和性を増加させ、FcγRIIAに対する親和性を低下させた；E333A変異は、FcγRIIIaに対する親和性を増加させ、FcγRIIAに対する親和性を低下させた；変異K334Aは、FcγRIIIaに対する親和性を増加させた。上記変異のいずれか又は全ては、個々に又は組み合わせて使用されてよい。その他の適した変異は、ルーチンな方法により同定されてよい。
【００５８】
CD22又はDC-SIGN/SIGN-R1に対するFc受容体結合部分の親和性は、Fc受容体結合部分における結合シアル酸量を増加させることにより、増加され得る。典型的には、これは、N297グリカンにおける末端シアル酸残基の量又は割合を増加させることにより達成され、これは、翻訳後、小胞体にてFcペプチドに付加されてよい。
【００５９】
他の変異は、適切には、Fc受容体結合部分の有効性を改善するためになされてよい。適切には、免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれは、適切には新生児型Fc受容体（neonatal Fc receptor）に対するFc受容体結合部分の親和性を増加させることにより、ポリマータンパク質のin vivo半減期を増加させるために、天然の免疫グロブリンG重鎖定常領域のアミノ酸配列と比較して修飾されたアミノ酸配列を含む。血清持続性の増進により、より高い循環レベル、投与頻度の低下及び用量の減少が可能となる。これは、Fc領域の新生児型FcR（FcRn）との結合を高めることにより達成できる。内皮細胞の表面上に発現するFcRnは、pH依存性の様式でFcと結合し、これを分解から保護する。実施例に記載するヘキサマーFcは、ヒトFcRnと結合できなかったが、マウスFcRnとは非常に十分に結合した。アミノ酸置換M252Y/S254T/T256E及び／又はH433K/N434FをFc受容体結合部分に導入して、FcγR相互作用に過度の影響を及ぼすことなく、IgGのin vivo半減期を増加させてよい（Vaccaro C, et al（2005）Nat. Biotech. 23：1283-1288）。加えて又は選択的に、H310を再度導入してもよい。
【００６０】
ポリマーFcタンパク質による複数のFc受容体の結合は、モノマーFcタンパク質又はIgGによる単一のFc受容体の結合よりも、異なる細胞内シグナリング現象を引き起こし得る。ポリマータンパク質による複数のFc受容体の結合は、特に低親和性のFc受容体の場合に、Fc受容体の他のリガンドとの結合を阻害するのにより有効であり得る。ポリマータンパク質の有効性は、多くの方法において、ポリマーを形成しないモノマーユニットの有効性と比較することができる。かかる試験において、ポリマーFcタンパク質のモノマーユニットは、個々に、所与のFc受容体に対して、ポリマーを形成しないモノマーユニットと同一の親和性を有することが典型的である。
【００６１】
ポリマータンパク質は、コントロールモノマーユニットよりも、Fc受容体を含む低親和性受容体に対して、より高いアビディティを有するだろう。それらはまた、FcRL、FcRn、CD22、DC-SIGN、又は他のFc受容体に対して、より大きいアビディティを有してよい。アビディティは、多価相互作用の全体的な結合強度である。Fc結合領域とFc受容体間の相互作用は、特徴的な親和性を有する一方、該相互作用のアビディティは、各相互作用に対してほぼ幾何学的に増加する。低親和性Fc受容体に関して、結合強度の増加は、ポリマータンパク質との生物学的に関連する相互作用を可能にし得、これは、モノマー又はダイマーユニットによっては達成できなかった。ポリマータンパク質による多価の結合は、コントロールモノマータンパク質の結合と比較して、平衡定数（L/mol）により測定されるように、かなりの安定性の増加をもたらす。例えば、Fc部分とFc受容体との間の典型的な一価の相互作用は、約104 L/molの平衡定数を有し得る。六価の相互作用は、約1011 L/molの平衡定数を提供し得る。しかしながら、ヘキサマータンパク質は、典型的には、コントロールモノマータンパク質と比較して、最大約104、105若しくは106倍、又はさらには106倍超の結合エネルギーの増加を示すだろう。結合エネルギー及び平衡定数の同様の増加は、FcRL5、FcRn、CD22又はDC-SIGNとの多価相互作用についても期待され得る。アビディティ及び親和性の記述については、テキストブックImmunology by Roitt, Brostoff and Male, 2nd edition 1989を参照。
【００６２】
ポリマータンパク質のFc受容体に対するアビディティは、上記のように、表面プラズモン共鳴分析（Biacore）により、ポリマーを形成しないモノマーユニットのものと比較されてよい。
【００６３】
ポリマータンパク質と大きな（bulky）抗原との融合は、ポリマータンパク質がFc受容体と結合する能力を弱め得ることが発見されている（Mekhaiel et al, 2011a）。適切には、本発明の第一の側面に従って使用するためのポリマータンパク質は、FcγRIIに対する結合アビディティを低下させる部分を含むこと（例えば、融合又はコンジュゲート化により）はない。アビディティに対する効果は、試験されるべき当該部分を含むポリマータンパク質による所与の受容体に対する結合アビディティを、当該部分を欠くポリマータンパク質により達成されるアビディティと比較することにより決定することができる。典型的には、アビディティが、10倍超、又は5倍超、又は2倍超低下する場合、当該部分を含むポリマータンパク質は適切でない場合がある。FcγRIIに対する結合アビディティの低下はまた、FcγRI又はFcγRIIIを含む他のFc受容体に対する結合アビディティの低下を示すだろう。選択的に、これらの他の受容体のいずれか又は両方に対する結合アビディティを試験し得る。
【００６４】
実施例3に記載するように、低親和性受容体に対するポリマータンパク質のアビディティの増加は、IVIG治療の根底にある生物学的メカニズム、特に低親和性受容体FcγRIIB、FcγRIIIA、CD22及びDC-SIGNにより媒介されるものに関与し得る。高親和性IgG受容体FcγRIに対するアビディティの増加も、例示的なヘキサマータンパク質で観察された。FcγRIは、炎症性自己免疫疾患に関与しており（Hussein OA et al, Immunol Invest 2010, 39:699-712）、FcγRIを対象とする免疫毒素は関節炎を抑制する（Van Vuuren AJ et al, J. Immunol 2006 176：5833-8）。また、MicroRNA-127は、FcγRIを標的とすることにより肺炎症を抑制する（Xie T et al, J. Immunol 2012 188, 2437-44）。さらに、US2004/0062763（Temple Univeristy；Mosser）において、抗炎症性サイトカインIL-10の産生を誘導するために、FcγRIのマクロファージへのライゲーションが提案されている。従って、FcγRIのライゲーションは、本発明との関連で有益な効果を有し得るが、とはいえ、FcγRIは、IVIGの効果の基礎となるとは考えられていない。
【００６５】
ポリマータンパク質の免疫調節特性は、Fc受容体結合部分及びFc受容体及び／又はFc部分と相互作用する免疫系の他の受容体及び成分との間の相互作用から生じる。本発明の第一の側面に従って使用するためのポリマータンパク質は、更なる免疫調節部分；又は哺乳動物対象に投与された場合に抗原特異的免疫抑制を引き起こす抗原部分、を含まない。TNF受容体などの免疫抑制剤を提供する治療的アプローチに反して、本明細書に記載のポリマータンパク質は、異なる治療メカニズムに依存しており、それにより、治療においてより広く有用なものとなり得る。ポリマータンパク質は、特定の疾患に対する他の治療的アプローチの適用を制限する抗原特異的免疫抑制効果にも依存していない。
【００６６】
「免疫調節部分」とは、本明細書に記載されるポリマータンパク質と共有結合される場合、又は前記ポリマータンパク質の不在下で存在する場合に、健康又は疾患のある哺乳動物対象において免疫調節活性を有する作用物質である。「免疫調節活性」とは、サイトカイン若しくは抗体などの免疫系の成分を増加若しくは減少させるため；又は抗原提示などの免疫系の機能を上昇若しくは低下させるために、対象において免疫反応を変化させることをいう。「免疫調節」部分は、例えば、ケモカイン若しくはケモカイン受容体、サイトカイン若しくはサイトカイン受容体、Toll様受容体（TLR）、急性期タンパク質、補体成分、免疫受容体、CD分子、又はシグナル伝達分子などであってよい。かかる作用物質は、ポリマータンパク質の不在下、健康又は疾患のある哺乳動物対象において、免疫調節活性を有することが知られている。かかる作用物質の例は、Abbas and Lichtman, Cellular and Molecular Immunology, Elsevier Saunders, 5th Edn, 2005などの免疫学のテキストブックに記載されており、技術者は、関連する文献において更なる例を見つけることができる。従って、これらの作用物質のいずれかとポリマータンパク質とを含むコンジュゲート又は融合タンパク質は本発明から除外される。エタネルセプト、アレファセプト、アバタセプト、ベラタセプト、アタシセプト、ブリオバセプト、リロナセプト、又はアフィルベルセプト（afilbercept）として知られるモノマーFc融合タンパク質で見られる免疫調節部分が特に排除される。Fab又はscFvsなどの抗体フラグメントも「免疫調節部分」とみなされてよい。かかるフラグメントは、免疫系の成分と結合し得、それゆえ免疫調節活性を有し得る。抗体フラグメントは、ポリマータンパク質のモノマーユニットと融合又はコンジュゲート化される場合、完全抗体構造、すなわちFc及び抗原結合領域（antigen-combining regions）を再現（recapitulate）してよい。かかる作用物質は、単離されて存在する場合よりもポリマータンパク質と共有結合された場合に、さらに顕著な免疫調節活性を有する場合がある。TNFαと結合するRemicadeとして知られる抗体などの治療用抗体で見られる免疫調節部分は特に排除される。適切には、ポリマータンパク質は、免疫調節性であろうとなかろうと、免疫グロブリンG重鎖定常領域及び任意選択でヒンジ領域以外のいずれの抗体部分も含まない。
【００６７】
上記のように、ポリマータンパク質の免疫調節特性は、Fc受容体結合部分及びFc受容体及び／又はFc部分と相互作用する免疫系の他の受容体及び成分との間の相互作用から生じる。Fc受容体、レクチン又は他の免疫系成分との結合を修飾する、修飾グリコシル化などのFc受容体結合部分の修飾は、更なる免疫調節部分とはみなされず、Fc受容体結合部分の成分とみなされる。従って、それらは本発明から除外されない。
【００６８】
免疫調節部分に関する適した実験的試験は、推定上の免疫調節部分を欠くポリマータンパク質と、推定上の免疫調節部分を含むポリマータンパク質とを提供し、実施例4に記載するITPマウスモデルにおける有効性についていずれかのタンパク質を試験することである。推定上の免疫調節部分が免疫調節活性を有するならば、該部分は、反応のパラメータを変化させ得る。例えば、該部分は、血小板回復の割合又は程度を変化させ得る。
【００６９】
「抗原」は、抗体又はTCRと特異的に結合する分子である。抗体と結合する抗原は、すべてのクラスの分子を含み、B細胞抗原と称される。例示的な分子の種類は、ペプチド、ポリペプチド、糖タンパク質、多糖、ガングリオシド、脂質、リン脂質、DNA、RNA、それらのフラグメント、それらの部分、及びそれらの組み合わせを含む。TCRは、MHC分子と複合体化されたタンパク質のペプチドフラグメントのみと結合し；ペプチドリガンド及びそれが由来する天然タンパク質はともにT細胞抗原と称される。「エピトープ」とは、B細胞又はT細胞抗原の抗原決定基をいう。B細胞エピトープがペプチド又はポリペプチドである場合、それは、典型的には3個以上のアミノ酸、一般には少なくとも5個、さらに通常は少なくとも8〜10個のアミノ酸を含む。アミノ酸は、ポリペプチドの一次構造において隣接するアミノ酸残基であってよく、或いはフォールディングされたタンパク質において空間的に並置されていてもよい。T細胞エピトープは、MHCクラスI又はMHCクラスII分子と結合してよい。典型的には、MHCクラスI結合T細胞エピトープは、8〜11アミノ酸長である。クラスII分子は、10〜30残基長又はそれ以上、最適には12〜16残基長であってよいペプチドと結合する。MHC分子の特定のアレル型と結合するペプチドは、ペプチドとアレルMHC分子との間の相補的相互作用を可能にするアミノ酸残基を含む。推定上のT細胞エピトープがMHC分子と結合する能力は、実験的に予測及び確認できる（Dimitrov I et al, Bioinformatics. 2010 Aug 15；26（16）:2066-8）。
【００７０】
本発明の第一の側面に従って使用するためのポリマータンパク質は、哺乳動物対象に投与された場合に抗原特異的免疫抑制を引き起こす抗原部分を含まない。「含む」により、ペプチドモノマーユニットの少なくとも1つと、例えば化学的コンジュゲーション又は組換え融合などにより、共有結合された抗原を含む。典型的には、ポリマータンパク質は、哺乳動物対象に投与された場合に、免疫抑制を引き起こすことによるか免疫刺激を引き起こすことによるかにかかわらず、抗原として作用する部分を含まない。
【００７１】
「抗原特異的免疫抑制」により、抗体反応の抑制及び／又はT細胞反応の抑制を含む。T細胞反応は、抗原反応性T細胞のクローン除去、アネルギー又は抑制（例えば、制御性T細胞の導入を介して）により抑制されてよい。T細胞反応はまた、より攻撃性の高い形態から攻撃性の低い形態へと、例えば、Th1タイプの反応からTh2タイプの反応へと逸れてもよい。
【００７２】
抗原特異的免疫抑制を引き起こす抗原部分について適した試験は、抗原部分を欠くポリマータンパク質と、抗原部分を含むポリマータンパク質を提供し、自己免疫疾患又は炎症性疾患について治療されるべき哺乳動物対象において、いずれかのタンパク質を試験することである。抗原を欠くか又は抗原を含むポリマータンパク質は、同じ哺乳動物対象に連続的に投与されてよく、該対象は、いずれかのタンパク質で処置（treatment）した後、抗原に対する免疫反応についてモニタリングされてよい。或いは、同様の対象のグループを、抗原を欠くポリマータンパク質、又は抗原を含むポリマータンパク質のいずれかで処置してよい。従来技術を用いて、抗原に対する免疫反応が、B細胞応答であるかT細胞応答であるかを同定及びモニタリングしてよい。抗原を欠くポリマータンパク質の投与後、対象において、抗原を含むポリマータンパク質と比較して、抗原に対する免疫反応の程度又は種類に差異がない場合、該抗原は、該哺乳動物対象に投与された場合に抗原特異的免疫抑制を引き起こさない。従って、ポリマータンパク質の抗原部分に起因する免疫抑制の抗原特異的手段が排除される。それは、特定の抗原に対する免疫反応が、治療に応答して減少しなくてよいことを意味しない。自己免疫疾患に関与する自己抗原に対する免疫反応は、治療に反応して低下し得るが、これは、抗原を含むポリマータンパク質によるものと同程度に、抗原を欠くポリマータンパク質により達成され得る。類似した試験を用いて、ポリマータンパク質が、哺乳動物対象に投与された場合に抗原として作用する部分を含むかどうかを同定してよい。かかる試験において、ポリマータンパク質の投与の用量、処方及び特性は、有意義な比較を可能にするために同一である。
【００７３】
或いは、ポリマータンパク質は、抗原として作用する部分が存在するかどうかを決定するために、健康な哺乳動物対象において試験されてよい。かかる試験は、抗原特異的免疫刺激を同定するために特に有用である。適切には、抗原特異的免疫刺激は生じない。かかる試験は、ポリマータンパク質の非免疫原性を確認するために有用であり得る。ポリマータンパク質が投与されるべき哺乳動物対象において天然には見られないポリマータンパク質の成分、例えばリンカーペプチドなどは、免疫原性について試験され得、非免疫原性成分が選択され得る。かかる試験において、ポリマータンパク質を投与し、推定上の抗原に対して免疫反応を生じさせるのに適した期間の後、例えば2週間後に、ELISAを用いて、推定上の抗原に対する抗体レベルを測定するために血液サンプルを試験する。
【００７４】
適した動物モデルを用いて、哺乳動物対象に投与された場合に、抗原特異的免疫抑制を引き起こす抗原部分、又は抗原として作用する部分の存在について試験してもよい。例えば、実施例4に記載するITPのマウスモデルを用いてよい。次いで、抗原若しくは推定上の抗原を欠くポリマータンパク質、又は抗原若しくは推定上の抗原を含むポリマータンパク質の投与後に、抗原に対する免疫反応の程度及び種類を試験する。
【００７５】
適切には、本発明の第一の側面に従って使用するためのポリマータンパク質は、補体の古典的経路を活性化しないが、とはいえ、C1qとは結合可能であってよい（Mekhaiel et al, 2011a）。補体結合及び活性化は、Lewis M et al, Mol. Immunol 2008, 45：818-827に記載され、実施例3で実施するように、ポリマータンパク質、又はコントロールIgG若しくはモノマーFcをコーティングしたウェルにおいてELISAにより評価できる。96ウェルプレートのウェルを、炭酸塩バッファー（pH 9）中100 μlのタンパク質で一晩コーティングした。洗浄後、0.5 mM MgCl2、2 mM CaCl2、0.05％ Tween-20、0.1％ゼラチン及び0.5％ BSAを含むベロナール緩衝生理食塩水中1/100希釈したヒト血清（100 μl）とともに室温で1時間プレートをインキュベートする。洗浄後、1/800希釈したヒツジ抗C1q-HRP（Serotec）又は1/500希釈したビオチン結合抗C5b-9（Quidel, Santa Clara, CA）のいずれか100 μlともに、続いて、PBS-T、0.5％BSA中1/1000希釈したストレプトアビジン-HRP（Dako）（100 μl）とともに室温で1時間プレートをインキュベートする。0.4未満の吸光度値をネガティブと考える。C1q結合に関する典型的なアッセイにおいて、0.4超の吸光度値は、プレートを2 μg/ml超、又は4 μg/ml超又は10 μg/ml超のポリマータンパク質でコーティングした場合に達成される。補体活性化を示すC5b〜9沈着に関する典型的なアッセイにおいて、0.4超の吸光度値は、プレートを最大2 μg/ml、最大4 μg/ml、最大10 μg/ml、最大20 μg/ml又は最大50 μg/mlのポリマータンパク質でコーティングした場合に達成されない。
【００７６】
適切には、本発明の第一の側面に従って使用するためのポリマータンパク質は、プロテインG又はプロテインAと、このいずれかの基質がポリマータンパク質精製のための捕捉剤として使用可能となるのに十分なアビディティで結合することができる。プロテインGは、Cγ2〜Cγ3ドメイン間領域で結合し、実施例において、ヘキサマー及びモノマーFcタンパク質を精製するために使用した。同じ領域と結合する他の受容体、例えば、TRIM21などもポリマータンパク質と結合してよい（Mallery DL et al, 2010, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107（46）：19985-19990；McEwan WA et al 2011, BioEssays. 33：803-809）。TRIM21は、ウイルスの除去及びウイルスに対する免疫に重要と考えられている。
【００７７】
適切には、本発明の第一の側面に従って使用するためのポリマータンパク質は、約230〜400 kDの分子量を有する。例えば、それは、約230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390又は400 kDの分子量を有してよい。このサイズ範囲内のポリマーは、典型的には、約750 kDaのIgMのようなより大きな分子量を有する分子、又は2つの異なるポリペプチド鎖（軽鎖及び重鎖）の発現及び集合を必要とする抗体などの複合タンパク質よりも、哺乳動物細胞にとっては合成及び集合させ易い。抗体を含む、複数の異なるポリペプチド鎖を有するタンパク質は、製造の間、均一に作製することがより困難である。
【００７８】
適切には、本発明の第一の側面に従って使用するためのポリマータンパク質は、約20 nm、例えば15〜25 nm、又は最大で30 nmの直径を有する。20 nmの粒子は、45及び100 nmのナノ粒子よりも、リンパ管へとより容易にデリバリーされることが示されており、これは、機能及び組織浸透性（tissue penetration）にとって重要であり得る（Reddy et al, 2007）。より小さな粒子はまた、組換え発現技術により、より容易に製造される。
【００７９】
分子サイズ及び直径の結果として、ポリマータンパク質は、典型的には、良好な程度の組織浸透性を有し、これがその治療効果に役立ち得る（Vollmers & Brandlein, 2006）。低分子又はモノマーと比較すると、ポリマーは、天然で、時間をかけてよりゆっくりとした浸透性を示すが、インタクトなIgM分子（750 kDa）でさえ、i.v.又はi.p.投与後、マウスにおけるインプラントされた腫瘍、並びに患者における原発腫瘍及び転移癌に到達する（Vollmers et al, 1998a,b, Oncol Rep 5：549-552；Oncol Rep 5:35-40）。ペンタマーIgMは、i.p.注入した場合、動物背部に皮下移植された腫瘍に到達でき、該腫瘍を小さくできることが標準的な免疫組織化学的技術により実証できる（すべてVollmers refs（上記））。これは、750 kDaほど大きな分子が、腹腔から離れ、循環に入り、インプラントされた腫瘍に到達可能であることを示す。それらの方法では、分子は、その標的に到達する前に、リンパ管及び血管の複数の内皮バリアを通過しなければならない（Jain et al, 2001 J. Control. Release 74：7-25）。まとめると、例示的なヘキサマーFcタンパク質を含む、本発明に従って使用するためのポリマータンパク質は、より大きなIgM（日）とより小さなIgG（分）との間の中間の浸透時間（時）を示すだろうと予測される。生物学的活性を必要とするITPなどの状態について、中間の浸透性及び蓄積は、急速な浸透度が好ましい担体として抗体を使用する治療に勝る利点を有し得る。
【００８０】
適切には、本発明の第一の側面に従って使用するためのポリマータンパク質は、細胞表面に関して、トランスよりもむしろシスである空間的なオリエンテーション（orientation）を有する（各Fcは、細胞表面に平行な同一平面にあり、各Fcの長軸は、細胞表面に垂直である）。シスオリエンテーションは、受容体結合部分が、同一細胞に全て近接して置かれるため、同一細胞において複数の受容体のライゲーションを可能にする。対照的に、Fcsが細胞表面と垂直な平面にあるトランスオリエンテーションは、同一タンパク質による2つの細胞の架橋をもたらす可能性がある。シスオリエンテーションにおいて、受容体結合の生物学的効果は、特定の細胞にフォーカスされ、従って、生産的である可能性が高い。
【００８１】
ポリマータンパク質は、本発明の第一の側面に従って、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療を目的とする。「自己免疫疾患」は、免疫系が体自身の組織を攻撃する任意の疾患を含む。「炎症性疾患」は、再発性又は慢性であってよく、正常な組織修復と関連しない、破壊的炎症により特徴づけられる任意の疾患を含む。かかる疾患は、特に、自然免疫系が炎症を引き起こす（未知の理由によってよい）、「自己炎症性疾患」を含む。自己炎症性障害は、発熱、発疹、又は関節腫脹のような症状をもたらす、炎症の激しいエピソードを特徴とする。これらの疾患はまた、アミロイドーシスのリスク、重要な臓器における血中タンパク質の死に至る可能性のある増大を伴う。
【００８２】
治療のための適した自己免疫疾患又は炎症性疾患には、静注用免疫グロブリン（IVIG）で治療可能なものが含まれる。これらは、IVIGで現在ルーチンに治療されている疾患、又はIVIGが臨床的に有用であると認められている疾患であってよく、例えば、自己免疫性血球減少症、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、抗第VIII因子自己免疫疾患、皮膚筋炎、血管炎及びブドウ膜炎などである（van der Meche FG et al, Lancet i, 406（1984）；Sultan Y et al, Lancet ii, 765（1984）；Dalakas MC et al, N. Engl. J. Med. 329, 1993（1993）；Jayne DR et al, Lancet 337, 1137（1991）；LeHoang P et al, Ocul. Immunol. Inflamm. 8, 49（2000）を参照）。IVIGは、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）、川崎病、ギラン・バレー症候群及び慢性炎症性脱髄性多発神経炎を治療するために典型的には使用される（Orange et al, 2006, J Allergy Clin Immunol 117：S525-53）。IVIGは、中心となる治療に不応答性である、多種多様な他の自己免疫疾患を治療するためにますます使用されており、これには、関節炎、糖尿病、筋炎、結腸クローン病、及び全身性エリテマトーデスが含まれる。
【００８３】
治療に適した自己免疫疾患又は炎症性疾患は、自己免疫性血球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、喘息、川崎病、ギラン・バレー症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、結腸クローン病、糖尿病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、重症筋無力症、抗第VIII因子自己免疫疾患、皮膚筋炎、血管炎、ブドウ膜炎、又はアルツハイマー病を含む。
【００８４】
治療されるべき状態は、サイトカインネットワークのインバランスを有する炎症性疾患、病原性自己抗体若しくは自己攻撃性T細胞により媒介される自己免疫障害、又は慢性再発性の自己免疫性、炎症性若しくは感染性の疾患若しくはプロセスの急性若しくは慢性期、を含んでよい。さらに、炎症性成分を有する他の医学的状態には、例えば、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、心筋梗塞、脳卒中、B型肝炎、C型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス関連炎症、副腎白質ジストロフィー、及び癲癇性の障害、特に、ラスムッセン症候群、ウエスト症候群、レノックス・ガストー症候群を含むウイルス感染後の脳炎と関連すると考えられているもの、などが含まれる。
【００８５】
治療されるべき状態は、血液免疫学的（hematoimmunological）疾患であってよく、例えば、特発性血小板減少性紫斑病、同種免疫性／自己免疫性血小板減少症、後天性免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少症、自己免疫性溶血性貧血、パルボウイルスB19と関連する赤血球無形成症、後天性抗第VIII因子自己免疫、後天性フォン・ウィルブランド病、多発性骨髄腫及び意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症、再生不良性貧血、赤芽球癆、ダイアモンド・ブラックファン貧血、新生児溶血性疾患、免疫介在性好中球減少、血小板輸血不応状態、新生児輸血後紫斑病、溶血性尿毒症症候群、全身性血管炎、血栓性血小板減少性紫斑病、又はエヴァンズ症候群などであってよい。
【００８６】
或いは、神経免疫学的疾患が治療されてよく、例えば、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、異常タンパク性IgM脱髄性多発ニューロパチー、ランバート・イートン筋無力症候群、重症筋無力症、多巣性運動ニューロパチー、抗GM1抗体と関連する下位運動ニューロン症候群、脱髄、多発性硬化症及び視神経炎、スティッフマン症候群、抗Yo抗体での傍腫瘍性小脳変性症、腫瘍随伴脳脊髄症、抗Hu抗体での感覚性ニューロパチー、癲癇、脳炎、脊髄炎、ヒトT細胞リンパ向性ウイルス-1と特に関連するミエロパチー、自己免疫性糖尿病性ニューロパチー、又は急性特発性自律神経障害ニューロパチー（Acute Idiopathic Dysautonomic Neuropathy）、又はアルツハイマー病などが治療されてよい。
【００８７】
リウマチ性疾患が治療されてよく、例えば、川崎病、関節リウマチ、フェルティ症候群、ANCA陽性血管炎、自然発症性多発性筋炎（Spontaneous Polymyositis）、皮膚筋炎、抗リン脂質症候群、再発性自然発症性堕胎（Recurrent spontaneous abortions）、全身性エリテマトーデス、若年性特発性関節炎、レイノー病、CREST症候群、又はブドウ膜炎などが治療されてよい。
【００８８】
皮膚免疫学的疾患が治療されてよく、例えば、表皮壊死融解症、壊疽、肉芽腫、尋常性天疱瘡、水疱性類天疱瘡及び落葉性天疱瘡を含む自己免疫性水疱形成性皮膚疾患（Autoimmune skin blistering diseases）、白斑、連鎖球菌毒素ショック症候群、強皮症、びまん皮膚硬化型及び限局皮膚硬化型全身性強皮症（diffuse and limited cutaneous systemic sclerosis）を含む全身性強皮症、アトピー性皮膚炎、又はステロイド依存性アトピー性皮膚炎などが治療されてよい。
【００８９】
筋骨格免疫学的疾患が治療されてよく、例えば、封入体筋炎、壊死性筋膜炎、炎症性ミオパチー、筋炎、抗デコリン（BJ抗原）ミオパチー、傍腫瘍性壊死性ミオパチー（Paraneoplastic Necrotic Myopathy）、X連鎖性空胞性ミオパチー、ペナシラミン誘導多発性筋炎（Penacillamine-induced Polymyositis）、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患又は心筋症などが治療されてよい。
【００９０】
胃腸免疫学的疾患が治療されてよく、例えば、悪性貧血、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、セリアック病、疱疹状皮膚炎、原因不明肝硬変、反応性関節炎、クローン病、ホイップル病、潰瘍性大腸炎、又は硬化性胆管炎などが治療されてよい。
【００９１】
疾患は、例えば、感染症後の炎症、喘息、抗β細胞抗体での1型糖尿病、シェーグレン症候群、混合性結合組織病、アジソン病、フォークト・小柳・原田症候群、膜性増殖性糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、グレーブス病、橋本甲状腺炎、ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発動脈炎（micropolyarterits）、チャーグ・ストラウス症候群、結節性多発動脈炎又は多臓器不全などであり得る。
【００９２】
治療のための例示的疾患は、特発性血小板減少性紫斑病（ITP）である。
【００９３】
所与の種で使用するためのポリマータンパク質は、典型的には、当該種のIgGに由来するFc部分を含み、かつ当該種のIgA又はIgMに由来するテールピース部分を含んでもよい。典型的には、治療されるべき哺乳動物対象はヒトであるが、とはいえ、他の哺乳動物、及び実際には鳥類、両生類及び爬虫類が治療されてよい。
【００９４】
ポリマータンパク質は、典型的には、適切に製剤化された治療用組成物として提供される。適切には、それらは、液体溶液又は懸濁液のいずれかのような注入可能なものとして提供され；注入前に、液体中の溶液又は懸濁液に適した固体形態が調製されてもよい。調製物は、乳化されてもよい。さらに、所望する場合、少量の補助物質、例えば、湿潤又は乳化剤、pH緩衝剤などが含まれてよい。
【００９５】
担体（carrier）は、好ましくは、液剤（liquid formulation）であってよく、好ましくは、緩衝化された等張性の水溶液である。適切には、治療用組成物は、生理学的であるpH又はほぼ生理学的であるpHを有する。適切には、それは、生理学的又はほぼ生理学的なオスモル濃度及び塩分濃度のものであり、かつ／又は滅菌性及びエンドトキシンフリーである。それは、塩化ナトリウム及び／又は酢酸ナトリウムを含んでよい。医薬上許容される担体はまた、賦形剤、例えば希釈剤など、及び添加物、例えば、安定化剤、保存剤、可溶化剤などを含んでもよい。本明細書で使用する場合、用語「医薬上許容される」とは、米国若しくは英国若しくは他の政府の監督官庁により認可されていること、又はUS薬局方若しくはヒトでの使用のために一般に認識される他の薬局方に列挙されていることを意味する。
【００９６】
医薬組成物は、例えば、局所（例えば、経皮又は眼）、経口、口腔（buccal）、経鼻、膣内、直腸又は非経口投与などを含む任意の適切な投与様式のために製剤化されてよい。本明細書で使用する場合、用語「非経口」は、皮下、皮内、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、脊髄、頭蓋内、鞘内、眼内、眼周囲、眼窩内、滑液嚢内及び腹腔内への注入、並びに任意の類似の注射（injection）又は注入（infusion）技術を含む。経口使用に適した形態は、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性若しくは油性懸濁液、分散可能な粉末若しくは顆粒、エマルション、ハード若しくはソフトカプセル、又はシロップ若しくはエリキシルなどを含む。本明細書で提供する組成物は、凍結乾燥物として製剤化されてよい。典型的には、組成物は、静脈内投与のために製剤化される。
【００９７】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤の混合物に活性成分（1以上）を含有する。かかる賦形剤は、懸濁化剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴム）；及び分散又は湿潤剤（例えば、レシチンなどの天然に存在するホスファチド、ステアリン酸ポリオキシエチレンなどのアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、ヘプタデカエチレンオキシセタノールなどのエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールなどのエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導される部分エステルとの縮合生成物、又はモノオレイン酸ポリエチレンソルビタンなどのエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物から誘導される部分エステルとの縮合生成物）を含む。水性懸濁液は、例えば、p-ヒドロキシ安息香酸エチル又はn-プロピルなどの1つ以上の保存剤、1つ以上の着色剤、1つ以上の着香剤、及びスクロース又はサッカリンなどの1つ以上の甘味剤を含んでもよい。
【００９８】
製剤は、局部又は局所（local or topical）投与のためであってよく、例えば、皮膚、傷又は眼などの粘膜に局所適用するためであってよい。局所投与用の製剤は、典型的には、活性薬剤（1以上）と混合された局所用ビヒクルを、追加の任意成分と共に又はこれなしで含む。適切な局所用ビヒクル及び追加の成分は、当分野で周知であり、ビヒクルの選択は、特定の物理的形態及びデリバリー方法により決まるものと考えられる。局所用ビヒクルは、水；アルコール（例えば、エタノール又はイソプロピルアルコール）又はグリセリンなどの有機溶媒；グリコール（例えば、ブチレン、イソプレン又はプロピレングリコール）；脂肪族アルコール（例えば、ラノリン）；水と有機溶媒との混合物、及びアルコールなどの有機溶媒とグリセリンとの混合物；脂肪酸、アシルグリセロール（鉱物油などの油、及び天然又は合成の脂肪を含む）、ホスホグリセリド、スフィンゴリピド及びワックスなどの脂質をベースとする材料；コラーゲン及びゼラチンなどのタンパク質をベースとする材料；シリコンをベースとする材料（不揮発性と揮発性の両方）；並びにマイクロスポンジ及びポリマーマトリックスなどの炭化水素をベースとする材料を含む。
【００９９】
医薬組成物は、スプレー、ミスト又はエアロゾルを含む吸入製剤として製剤化されてよい。吸入製剤について、本明細書で提供する化合物は、当業者に公知の任意の吸入方法を介してデリバリーされてよい。かかる吸入方法及び装置は、CFC又はHFAなどの高圧ガス、又は生理学的かつ環境学的に許容される高圧ガスを用いる定量吸入器を含むが、これに限定されない。その他の適した装置は、呼吸操作吸入器（breath operated inhaler）、マルチドーズ（multidose）ドライパウダー吸入器及びエアロゾル噴霧器である。対象の方法で使用するためのエアロゾル製剤は、典型的には、高圧ガス、界面活性剤及び共溶媒を含み、適切な絞り弁により閉じられた通常のエアロゾル容器に充填されてよい。
【０１００】
吸入組成物は、噴霧及び経気管支用途に適する活性成分を含有する液体又は粉末組成物、又は定量用量を調剤するエアロゾルユニット経由で投与されるエアロゾル組成物を含んでよい。適切な液体組成物は、水性の医薬上許容される吸入溶媒（例えば、生理食塩水又は静菌性の水）に活性成分を含む。この溶液は、ポンプ又は圧縮作動噴霧スプレー容器を用いるか、又は必要な用量の液体組成物を患者の肺に吸入されるようにする又は可能にする従来のその他の任意の方法により投与される。担体が液体で、例えば鼻腔用スプレーとして又は点鼻剤として投与するために適切な製剤は、活性成分の水性又は油性溶液を含む。
【０１０１】
担体が固体である経鼻投与に適した製剤又は組成物は、例えば20〜500ミクロンの範囲の粒経を有する粗粉末を含み、これは臭いを嗅ぐような方法（すなわち、鼻の近くに持っている粉末容器から鼻孔を通って速やかに吸入することによる）で投与される。適した粉末組成物は、例えば、ラクトース又は気管支内投与に許容されるその他の不活性粉末と十分に混合した活性成分の粉末化製剤を含む。この粉末組成物は、エアロゾル分配器（dispenser）、又は壊れやすいカプセルを介して投与され得、このカプセルは、カプセルを破裂させ、吸入に適した一定の流れで粉末を吹き出す装置に、患者によって差し込まれてよい。
【０１０２】
哺乳動物対象に投与される組成物の実際の用量は、体重、状態の重症度、治療される疾患の種類、前もって又は同時に使用される治療的介入、患者の特発性疾患、及び投与経路など、身体的及び生理的要因により決定することができる。投与に責任のある医師が、いずれにしても、組成物中の活性成分（1以上）の濃度、及び個々の対象に関する適切な用量（1以上）を決定するだろう。
【０１０３】
医薬組成物は、例えば、少なくとも約0.1％の活性化合物を含んでよい。他の実施態様において、活性化合物は、例えば、単位重量の約2％〜約75％、又は約25％〜約60％、及びそこにデリバリー可能な任意の範囲を含んでよい。他の非限定的な例において、用量は、投与あたり約1ミリグラム/kg/体重、約5ミリグラム/kg/体重、約10ミリグラム/kg/体重、約50ミリグラム/kg/体重、約100ミリグラム/kg/体重から、及びそこにデリバリー可能な任意の範囲を含んでもよい。有効なポリマータンパク質用量は、一般に、有効なIVIG用量の約1％〜約20％である。有効なIVIG用量は、一般に、治療されるべき状態に応じて、約100 mg/Kg〜約2グラム/Kgの範囲であってよい。
【０１０４】
ポリマータンパク質及び治療用組成物の適性は、ヒト患者に投与する前に、動物モデルで試験されてよい。適切である動物モデルについて、動物におけるFc受容体が、ポリマータンパク質のFc受容体結合部分と結合可能であることが重要である。ヒト免疫グロブリンは、マウスFc受容体と結合できることが知られている。例えば、ヒトIgMは、マウスFcμ受容体と結合する。Pleass RJ, 2009 Parasite Immunology 31：529-538は、どのFc受容体が、どの種に由来するどの抗体と結合できるかを報告する。とはいえ、ポリマータンパク質が、ヒト免疫グロブリン重鎖配列に由来するFc結合部分を含む場合、ヒトFc受容体を発現するトランスジェニックマウスの使用が有利であり得る。適したトランスジェニックマウスは、ヒトIgG1及びIgG3と結合するヒトFcγRI受容体（CD64）を発現する（Heijnen IA et al, J Clin Invest. 1996 Jan 15；97（2）:331-8）。FcγRIIA（CD32）などの低親和性FcRsを発現するトランスジェニックマウスも利用可能である（McKenzie SE 2002, Blood Rev 16:3-5）。
【０１０５】
適したマウスモデルは、実施例4に記載するITPのマウスモデルである。他の適したモデルは、マウスにおけるコラーゲン誘導性関節炎（Jain et al, 2012）、又は非肥満糖尿病（NOD）マウスモデル（Inoue, Y. et al.（2007）J. Immunol. 179, 764-774）を含む。
【０１０６】
本発明の第二及び第三の側面によれば、自己免疫疾患又は炎症性疾患について哺乳動物対象を治療するための方法が提供される。
【０１０７】
第二の側面によれば、対象は、5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットを含むポリマータンパク質を投与することにより治療され；
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域；及び任意選択で、一本鎖Fcとして2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を連結するポリペプチドリンカー、からなるFc受容体結合部分からなり；
各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含む。
【０１０８】
第三の側面によれば、対象は、5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットからなるポリマータンパク質を投与することにより治療され；
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、Fc受容体結合部分及びテールピース領域からなり；
該Fc受容体結合部分は、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域；及び任意選択で、一本鎖Fcとして2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を連結するポリペプチドリンカー、からなり；
各修飾ヒト免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの修飾ヒト免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含み；かつ
該テールピース領域は、該ポリペプチドモノマーユニットの2つの修飾ヒト免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれと融合され、該モノマーユニットのポリマーへの集合を促進する。
【０１０９】
第二又は第三の側面のいずれかについて、用語「免疫グロブリンG重鎖定常領域」は、本発明の第一の側面に関して記載されたとおりである。免疫グロブリンG重鎖定常領域は、典型的には、天然抗体で生じるように、ジスルフィド結合によりモノマーユニットとして関連する。或いは、2つの定常領域は、介在するリンカー領域を有する単一のアミノ酸鎖として、すなわち一本鎖Fc（scFc）として生成されてよい。
【０１１０】
本発明の第二の側面に従って使用するためのポリマータンパク質は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含む各免疫グロブリンG重鎖定常領域によって形成される。テールピースは含まれない。対照的に、本発明の第三の側面に従って使用するためのポリマータンパク質は、テールピースを含み、これにより、モノマーユニットのポリマーへの集合が促進される。テールピースは、本発明の第一の側面に関して記載されたとおりである。短いリンカー配列が、テールピース領域と免疫グロブリン重鎖定常領域との間に提供されてよい。
【０１１１】
第二及び第三の側面に関して、モノマーユニットがポリマーへと集合されている場合、Fc受容体結合部分は、各Fc受容体結合部分がFc受容体と結合可能であるように空間的にオリエンテーションされたポリマー構造中に配置される。各モノマーユニットのFc受容体結合部分は、本発明の第一の側面に関して記載されたとおりである。Fc受容体結合部分が、ヒトIgGアイソタイプの免疫グロブリン重鎖定常領域又はそのバリアントを含む場合、典型的には、ヒトFcγ受容体（FcγRI、FcγRII及びFcγRIII）及び／又はヒトFcRL5及び／又はCD22及び／又はDC-SIGNと結合するだろう。ポリマータンパク質は、コントロールモノマーユニット（必要なシステイン残基を欠くためにポリマー化しない）よりも、Fc受容体に対して、より高いアビディティを有するだろう。
【０１１２】
本発明の第二又は第三の側面に従って使用するためのポリマータンパク質の免疫調節特性は、Fc受容体結合部分及びFc受容体及び／又はFc部分と相互作用する免疫系の他の受容体及び成分との間の相互作用から生じる。特に、更なる免疫調節部分はいずれも必要でなく；かつ哺乳動物対象に投与された場合に抗原特異的免疫抑制を引き起こす抗原部分はいずれも必要でない。典型的には、哺乳動物対象に投与された場合に抗原として作用する部分はいずれも存在しない。
【０１１３】
第二又は第三の側面に従って使用するためのポリマータンパク質の他の特徴は、本発明の第一の側面に関して記載される。典型的には、ポリマータンパク質は、補体の古典的経路を活性化するが、とはいえ、C1qと結合してよく；典型的には、プロテインG又はプロテインAと結合でき；典型的には、約230〜400 kDaの分子量を有し；典型的には、約20 nmの直径を有し；典型的には、良好な程度の組織浸透性を有し；かつ典型的には、細胞表面に関してシスである空間的なオリエンテーションを有する。
【０１１４】
本発明の第二又は第三の側面に従って使用するためのポリマータンパク質は、本発明の第一の側面に関して記載されるように、自己免疫疾患又は炎症性疾患の治療を目的とする。
【０１１５】
本発明の第四の側面は、5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットを含むポリマータンパク質であって、
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を含むFc受容体結合部分を含み；
各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含み；
該ポリマータンパク質は、更なる免疫調節部分；又は哺乳動物対象に投与された場合に抗原特異的免疫抑制を引き起こす抗原部分、を含まず；
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれと融合されるテールピース領域を含まない、
ポリマータンパク質を提供する。
【０１１６】
第四の側面のポリマータンパク質は、各ポリペプチドモノマーユニットが、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれと融合されるテールピース領域を含むことを明確に排除していることを除いて、第一の側面に従って使用するためのポリマータンパク質に関して記載されたとおりである。典型的には、モノマーユニットのいずれもテールピース領域を含まない。ポリマータンパク質はテールピース領域を含まない。
【０１１７】
本発明の第五の側面は、5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットからなるポリマータンパク質であって、
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域；及び任意選択で、一本鎖Fcとして2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を連結するポリペプチドリンカー、からなるFc受容体結合部分からなり；かつ
各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含む、
ポリマータンパク質を提供する。
【０１１８】
第五の側面のポリマータンパク質は、本発明の第三の側面に従って使用するためのポリマータンパク質に関して記載されたとおりである。
【０１１９】
本発明の第六の側面は、本発明の第四又は第五の側面に従って定義されるとおりのポリマータンパク質のポリペプチドモノマーユニットをコードするコーディング部分を含む核酸分子を提供する。本発明の第一、第二又は第三の側面に関して記載されたとおりのポリマータンパク質のポリペプチドモノマーユニットをコードする核酸分子。
【０１２０】
例えば、Sambrook et al, “Molecular cloning： A laboratory manual”, 2001, 3rdedition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYに記載されるように、従来の組換えDNA方法論を、ポリマータンパク質を作製するために利用してよい。モノマーユニット構築物は、好ましくは、DNAレベルで作製され、得られたDNAsは発現ベクターへと組み込まれ、これを発現させて、ポリマータンパク質を形成するために集合するモノマーユニットを作製する。
【０１２１】
本発明の第六の側面の核酸分子は、5’から3’方向に、免疫グロブリンG重鎖定常領域又は一本鎖Fc（scFc）に対するコーディング配列を含むコーディング部分を含む。適切な実施態様において、後者は、テールピース領域に対するコーディング配列とインフレームで融合される。コーディング配列をコードするDNAは、そのゲノムの構成（configuration）又はcDNAの構成であってよい。更なるコーディング配列が重鎖とテールピースコーディング配列との間に提供されて、これら成分をリンカー配列により発現タンパク質において相互に分離させてよいことが理解されるだろう。リンカー配列をコードする核酸が、例えば、有用な制限酵素認識部位を含ませるため、並びに／又は重鎖領域及びテールピースコーディング領域をインフレームで転写させるために含まれてよい。適したコーディング領域は、PCRにより増幅でき、標準的な技術を用いて操作できる（Sambrook et al（上記））。天然の核酸配列と比較した変異は、SOEing PCR又は部位特異的突然変異誘発法により作製され得る。
【０１２２】
適切には、核酸分子のコーディング部分は、ポリペプチドモノマーユニットと隣接するシグナルペプチドをコードする。これにより、宿主細胞からの発現モノマーユニットの単離が容易となる。従って、核酸分子は、モノマーユニットのコーディング配列とインフレームで融合されたシグナル配列を5’から3’方向に含むコーディング部分を含むだろう。シグナル配列をコードするDNAの部分は、好ましくは、モノマーユニットの分泌を管理し、その後、残りのモノマーユニットから切断される、ペプチドセグメントをコードする。シグナル配列は、小胞体膜外へのタンパク質の輸送を開始するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。有用であるシグナル配列は、抗体軽鎖シグナル配列、例えば、抗体14.18（Gillies et al.（1989）J. OF IMMUNOL. METH., 125：191）、抗体重鎖シグナル配列、例えば、MOPC141抗体重鎖シグナル配列（Sakano et al.（1980）NATURE 286：5774）、及び当分野で公知の任意の他のシグナル配列（例えば、Watson（1984）NUCLEIC ACIDS RESEARCH 12：5145を参照）を含む。
【０１２３】
本発明の更なる側面は、本発明の第六の側面の核酸分子を含む発現ベクター；該発現ベクターを含む宿主細胞；及び本発明の第四又は第五の側面のポリマータンパク質を含む治療用組成物である。治療用組成物は、本発明の第一の側面に従って使用するためのポリマータンパク質に関して記載されたとおりである。
【０１２４】
本明細書に記載するような核酸分子は、通常、発現ベクターの一部であってよい。本明細書で使用する場合、用語「ベクター」とは、宿主細胞に組み込まれ、宿主細胞ゲノムと再結合されインテグレートされるか、又はエピソームとして自己複製する能力を有するヌクレオチド配列を含む任意の核酸を意味することが理解される。かかるベクターは、直鎖状の核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、RNAベクター、ウイルスベクターなどを含む。ウイルスベクターの非限定的な例は、レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスを含む。本明細書で使用する場合、モノマーユニットの「遺伝子発現」又は「発現」という用語は、DNA配列の転写、mRNA転写物の翻訳、及び任意選択でモノマーユニットの分泌も意味することが理解される。
【０１２５】
典型的には、宿主細胞は、発現ベクターの発現のために提供される。該細胞は、哺乳動物、鳥類、昆虫、爬虫類、細菌、植物又は真菌の細胞であり得る。哺乳動物細胞の例は、ヒト、ウサギ、ニワトリ、齧歯類（例えば、マウス、ラット）の細胞を含むが、これらに限定されない。典型的な哺乳動物細胞は、ミエローマ細胞、Sp2/0細胞、CHO細胞、L細胞、COS細胞、線維芽細胞、MDCK細胞、HT29細胞、HEK細胞又はT84細胞を含む。好ましい宿主細胞はCHO-K1である。発現ベクターは、リン酸カルシウムトランスフェクション、核マイクロインジェクション、DEAE-デキストラントランスフェクション、細菌プロトプラスト融合及びエレクトロポレーションを含む標準的な技術を用いて宿主細胞に導入されてよい。
【０１２６】
ポリマータンパク質は、（1）モノマーユニットをコードする核酸分子を含むベクターを調製すること；（2）該ベクターで宿主細胞をトランスフェクトすること；（3）該宿主細胞を培養して発現を提供すること；及び（4）ポリマータンパク質を回収することを含む方法により調製されてよい。
【０１２７】
ポリマータンパク質は、異なる分子サイズの生成物として回収されてよい。典型的には、5、6又は7個のモノマーユニットを含む所望のポリマータンパク質は、モノマーユニットから構成される全タンパク質の少なくとも40重量％を占める。適切には、それは、モノマーユニットから構成される全タンパク質の少なくとも50重量％、少なくとも60重量％、少なくとも70重量％、少なくとも80重量％、又は少なくとも90重量％を占める。所望のポリマータンパク質として回収できるモノマーユニットの割合が高いことは、生産効率に貢献する。
【０１２８】
ポリマータンパク質が宿主細胞により分泌される場合、Fc結合剤、例えば、プロテインA又はプロテインG、適切にはProtein-G HiTrap（GE healthcare）カラムなどに対するその親和性を利用したアフィニティクロマトグラフィーにより簡便に回収することができる。タンパク質は、低pHによりかかるカラムから中性バッファーへと溶出されてよい。その後、バッファー交換のために透析を実施してよい。宿主細胞がポリマータンパク質を分泌しない場合、細胞を溶解し、続いてアフィニティクロマトグラフィーを行うことにより回収してよい。
【０１２９】
以下の実施例にて本発明をさらに説明するが、これに何ら制限されることはない。
【実施例】
【０１３０】
実施例1：組換えポリマーFcタンパク質の作製
DNA構築物を以下のように調製した。市販のpFUSE-hIgG1-Fc2発現ベクターを、Autogen Bioclear, Wiltshire, UKを介して供給されたInvivoGenから得た。発現ベクターは、IL2由来のシグナル配列に対するコーディング配列と、その下流に、ヒトIgG1由来のFc部分に対するコーディング配列を含む。ポリマータンパク質を作製するために、ヒトIgG1 Fc部分のコーディング配列に2つの変化を施した。IgM由来の18アミノ酸テールピースをFc部分のC末端上にサブクローニングし、Cγ3ドメインにおいて更なる変異を施して、残基309及び310（全体にわたってEUナンバリング）をそれぞれシステイン及びロイシンに変換した。
【０１３１】
IgMテールピース配列を市販のベクターに挿入するために、プライマーを設計し、これは、一緒にアニーリングされた場合に、Nhe1制限酵素認識部位をコードする突出した塩基と二本鎖配列を形成して、FcのC末端でのサブクローニングを可能するものであった。プラスミドによりコードされるタンパク質のリーディングフレームを維持し、既存のストップコドンを除去し、簡便な制限酵素認識部位を可能にするために、追加（extra）のDNA塩基を挿入した。IgMテールピース配列は、4個のアミノ酸Leu-Val-Leu-Glyをコードする短い5’リンカーが先行しており；該リンカーは、IgMテールピースの機能に影響を及ぼさない。
【０１３２】
プライマー1及び2（配列番号1及び2）を、温度勾配を介して一緒にアニーリングして、Nhe1インサートを含む二本鎖IgMテールピースを形成した。
【０１３３】
次いで、pFUSEベクターを制限酵素NheIで消化し、上記IgMテールピースインサートをライゲーションして、中間プラスミドを作製した。IgMテールピースをFc領域後にて翻訳させるために、その後の工程で、Quick Change II Kit（Stratagene, La Jolla, CA, USA）を利用し、部位特異的突然変異誘発法を介して、存在するストップコドンを変異させた。プライマー3及び4（配列番号3及び4）を設計して、このストップコドンを除去し、Fc領域とIgMテールピースとの間にAvrII制限酵素部位を作製した。これにより、pFUSE-hIgG1-Fc-TPと称するプラスミドを作製した。
【０１３４】
ヒトIgMにおいて、309位のシステインは、ペンタマー内において、IgMの2つのモノマー間のジスルフィルド結合の形成と関与する。ヒトIgMのタンパク質配列を十分に模倣するために、プライマー5及び6（配列番号5及び6）を設計して、前記のように、再度部位特異的突然変異誘発法により309位にシステイン残基を導入した。ヒトIgMのタンパク質配列をコードするヌクレオチド配列を、ヒトIgG1-Fcのものとアラインメントした際に、さらに、310位の隣接ヒスチジン残基を中性のロイシン残基で置き換えることを決めた。両方の変異を組み込んだ最終的なプラスミドをpFUSE-hIgG1-Fc-TP-LH309/310CLと名付けた。
【０１３５】
309/310変異及びテールピースを欠くヒトIgG1 Fcのモノマーをコードするコントロールプラスミドも調製した。
【０１３６】
ポリマーへと集合するモノマーユニットに対する核酸コーディング配列は、配列番号7である。
【０１３７】
コーディング配列は、以下の領域を有する：
1〜60      IL2シグナルペプチドに対するコーディング配列
61〜753    ヒトIgG1のFc領域に対するコーディング配列
325〜330   cys-309及びleu-310変異
754〜810   IgMテールピースに対するコーディング配列（リンカー領域及びストップコドンを含む）。
【０１３８】
ポリマーへと集合するモノマーユニットのアミノ酸配列は、配列番号8である。
【０１３９】
アミノ酸配列は、以下の領域を有する：
1〜20      IL2シグナルペプチド
21〜247    ヒトIgG1のFc領域
109〜110   cys-309及びleu-310変異
248〜251   4個のアミノ酸リンカー
252〜269   IgMテールピース。
【０１４０】
発現の間、IL2シグナルペプチドを切断して除くため、最終的なタンパク質生成物は249アミノ酸を有する。
【０１４１】
ポリマーFcタンパク質及びコントロールモノマーFcタンパク質を以下のように調製した。CHO-K1細胞（European Collection of Cell Cultures）をエレクトロポレーションによりプラスミドでトランスフェクトし、ポジティブクローンを選択した。10％ ultra-lowウシIgG FCS、100 IU/mlペニシリン及び100 μgml-1ストレプトマイシン（PAA）を補充したDMEM完全培地中、37℃/5％CO2で細胞を増殖させた。400 μgml-1のゼオシン（Invivogen）を含む培地中、安定したトランスフェクタントを選択した。ヤギ抗ヒトIgG-Fc（Sigma-Aldrich：A0170）を用いたサンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）によりFc融合タンパク質を分泌するクローンを検出した。ultralow IgG含有FBS（Gibco）を補充したDMEMでの大規模培養物から、Fc融合タンパク質を、プロテインG-セファロース（GE Healthcare, Little Chalfont, Bucks, UK）で精製した。アフィニティ精製から溶出されたフラクションをプールし、AKTAFPLCを用いた高性能Superdex-200 10/300GLカラム（GE Healthcare）でのサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。溶出されたフラクションを、既知の高MWゲル濾過スタンダード（Biorad）と比較した。タンパク質の完全性は、ネイティブ6％Tris-グリシンゲルでのSDS-PAGEにより、SeeBlue2で予め染色された分子量マーカー（Novex-Invitrogen）に対して検証した。
【０１４２】
ポリマータンパク質は、約312 kD及び約100 kDの複合体として発現され、これは、ヘキサマー及びダイマーのエンティティとしての発現と一致した。その割合は、図1Bに示すように、サイズ排除クロマトグラフィーに従って、約90％のヘキサマー対10％のダイマー（w/w）であった。
【０１４３】
実施例2：組換えポリマーFcタンパク質の構造キャラクタリゼーション
ヘキサマーFcを、溶液下、タッピングモード原子間力顕微鏡法（AFM）により画像化した。ヘキサマーFcは、十分に定義された構造の高度に均一な集団を形成する。得られたAFM像は、円筒形の構造である複合体を示した（直径18±2 nm（n=51）、高さ5.7±0.4 nm（n=54））。代表的な像を図1Aに示す。得られた像はまた、in silicoモデリング分析から予測された大きさと一致しており、これも図1Aに示す。
【０１４４】
AFMは、以下のようにして、Mekhaiel et al, 2011aに記載されるように実施した。1×HBSSバッファー中、hIgG1-Fc-LH309/310CL-TPのストック溶液を、0.2×HBSSバッファー中10 μgml-1に希釈し、次いで、新たに切断した白雲母マイカのフラグメントに直接適用した。20分間インキュベート後、サンプルを0.2×HBSSバッファーで広範（extensively）にすすいで、非吸着分子を除去した。サンプルは、AFMへの移動及びAFMでの画像化の間、常に溶液下にあった。画像化は、0.5×HBSSバッファー中0.32 N/mのバネ定数で、窒化ケイ素カンチレバー（NP-S, Veeco Probes, Santa Barbara, CA）を用いて、Nanoscope IIIa Multimode AFM（Veeco, Santa Barbara, CA）にてタッピングモードで実施した。典型的なスキャンレート及び最初の振動振幅は、それぞれ3 Hz及び20 nmであり、加えた力は、約0.1 nNまで最小化した。ピエゾスキャナー（9 μm, D scanner, Veeco）は、マイカ及び金のルーリング（ruling）を用いてキャリブレートした。報告した全ての画像は、異なるチップ及び異なるファストスキャン方向で再現可能であった。全ての横寸法は、半分の高さの全幅から測定した。
【０１４５】
分子（in silico）モデリングは、以下のようにして、Mekhaiel et al, 2011aに記載されるように実施した。ヒンジ及びテールピース領域の両方に関するランダム鎖構造を用いて、hIgG1 Fcドメインの結晶構造からモノマーを構築した。各モノマーは、ヘキサマー複合体へと集合される前、エネルギー最小化された。エネルギー計算はすべて、CHARMM27力場を用いたVMD/NAMDを使用して実施した。NAMDは、Urbana-Champaignにあるイリノイ大学のBeckman Institute for Advanced Science and TechnologyのTheoretical Biophysics Groupにより開発された。ヘキサマーを構築するために、2つの実験的観察を検討した：第一に、複合体の化学量論は有限であり（すなわち、オリゴマー化は無限に進行しない）、第二に、オリゴマー化は、Cys309変異を必要とした。前者の観察は、更なる集合を予防するいくつかの物理的理由があることを示唆しており、これは、天然のIgM複合体で見られるものと同様に、複合体がリング状であることによると推論した。後者の観察は、隣接するモノマーが、これらのC309残基を介して連結されることを示唆する。リング状の複合体中で可能であるこれらの結合について、これらの残基は、IgMペンタマー中の相同なシステイン残基の場合と同様に、共通の面内にすべて位置しなければならない。これらのFc融合物では、これらの基準を満たし得るオリゴマーが2種類存在する：星形であって、C309面がFc面と同一であるもの、及びバレル形であって、C309面がFc面と垂直であるもの。両方のモデルを検証して、1つの追加の基準を受ける、より低いエネルギーを有する構造を生成するものを決定した。これらのFc融合物は、互いに相互作用するよう進化しておらず、むしろ変異型C309残基により連結するので、モノマーは、これらの結合を形成するために有意な構造的変化を受けないと仮定し、そのため、いずれかのこのような変化に対しエネルギーペナルティを割り当てた。これは、エネルギー最小化モノマー構造のポジションを中心とするハーモニックウェル（harmonic well）（バネ定数、1 kcal/mol/A2）内で骨格原子を抑制（constraining）することにより達成された。全最小化エネルギーに対するこの抑制ポテンシャルの寄与をモニタリングすることにより、各モノマーが、モノマー形態からコンフォメーションを変化させる程度を評価できた。この抑制を有さない、星形及びバレル形構造（最初のC309-C309距離の範囲で評価される）は、類似した最小化エネルギーのものであった。しかし、抑制を有するものは、全ての距離で、C309-C309ジスルフィド架橋を形成するために、バレル形構造が、星形モデルよりも有意に少ない構造的変化しか必要としないことが明らかであった。従って、抑制を有さない場合、バレル形構造は、星形構造と類似の最小化エネルギーを達成するが、モノマー形態に対してより少ない変化しか必要としない。従って、ヘキサマーについてバレル形構造の方が好ましい。最終的なモデルは、最も近い最初のC309-309距離（モノマー構造に対して最小程度の構造的変化しか存在しなかった）で構築した。これらの計算は、他のモノマーと結合されるテールピースのいずれも有することなく実施した。この最小化モデルでは、テールピースは、複合体内のランダムに選択された他のモノマーと結合され、次いで、複合体全体をTIP3水で溶媒和し、最小化し、最後に��衡化した（タンパク質骨格の平均二乗偏差により判断されるように）。
【０１４６】
実施例3：ポリマーFcタンパク質の免疫系成分との相互作用
1．Fc受容体との相互作用
ヘキサマーFcは、試験した全てのFc受容体、すなわち、ヒトFcγRI、FcγRIIA及びFcγRIIB、並びにマウスFcγRI及びFcγRIIBと結合した。ヘキサマーFcは、低親和性ヒトFcγRs（FcγRIIAR131及びFcγRIIB）と、マイクロモル範囲で同じ受容体と結合するダイマー又はモノマーよりも高い親和性（ナノモル範囲）で結合した。これは、より高次のポリマーが、ITPからの保護に関与することが知られている受容体に対し、改善された結合反応速度を有することを確認する。SPR分析において、ヘキサマーFcは、ヒトFcγRIと1.6×1010のKA（1/M）で結合した。ダイマーは、6.4×109のKA（1/M）で結合した。ELISAによる、ヘキサマー又はモノマーFcのFc受容体との結合を図2に示す。
【０１４７】
ITPに役割を果たし得る別の受容体はFcγRIIIである（Park-Min et al, 2007）。ヘキサマーFcは、IgG上のFcγRIIIに対する結合部位が、FcγRIIB及びFcγRIのものと重複するので、ヒトFcγRIIIと結合すると予想できる（Sondermann et al, 2001）。IgG下部ヒンジ領域は、FcγRI及びFcγRIIとの相互作用に重要な役割を果たしており、FcγRsはすべて、IgGと共通の相互作用様式を共有することがもっともらしく思える（Woof & Burton, 2004）。実際に、FcγRIII-IgG Fc結晶構造に基づいて、IgG FcとFcγRI及びFcγRIIとの間のモデル複合体を作製することが可能であり、それにより、特定の結合特性が論理的に説明される（Sondermann et al, 2001）。FcγRIIIとヘキサマーFc複合体との相互作用を、FcγRIIIの結晶構造を用いて、in silicoでモデル化した。当該モデルは、FcγRIIIに対するヘキサマーにおける結合部位が、明らかに他のFcγRsに対するものであることから、暴露されている可能性が最も高いことを示す。従って、FcγRIIIは、ヘキサマーFcと結合すると予測される。
【０１４８】
Fcタンパク質のFc受容体との結合を、以下及びMekhaiel et al, 2011aに記載されるように、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により測定した。マイクロタイターウェル（Nunc）を、PBS又は炭酸塩バッファーpH 9中、滴定量（titrated amounts）のFcタンパク質（50〜0.3 nM）でコーティングし、4℃で一晩インキュベート後、4％スキムミルク（Acumedia）で室温（RT）、1時間ブロッキングした。PBS/0.005％ Tween 20（PBS/T）pH 7.4でウェルを4回洗浄した後、4％スキムミルクPBS/0.005％ Tween 20（PBS/T）pH 7.4で希釈したGST又はHIS融合hFcγRI、hFcγRIIA、hFcγRIIB、mFcγRI又はmFcγRIIBをウェルに添加した。RTで2時間インキュベーションし、上記のように洗浄後、ヤギ由来のHRP結合ポリクローナル抗GST（1:8000；GE Healthcare）を添加し、RTで1時間インキュベートした。ウェルを上記のように洗浄し、100 μlの基質TMB（Calbiochem）を各ウェルに添加し、45分間インキュベートした後、100 μlの0.25 M HClを添加した。Sunrise TECANスペクトロフォトメーター（TECAN, Maennedorf, Switzerland）を用いて、450 nmで吸光度を測定した。
【０１４９】
ヒトFcγRIとの結合を、FcRnに関して以下に記載する通りに、表面プラズモン共鳴分析によっても分析した。
【０１５０】
2．自己免疫の調節に役割を果たすことが公知のグリカン受容体との相互作用
ヒトDC-SIGN及びマウスにおけるそのホモログ（SIGN-R1）は、IgGのFcのN297で結合するグリカンで見られる末端シアル酸と結合することにより、ITPの調節に関与することが示されている（Anthony et al, 2011；Samuelsson et al, 2001）。ヘキサマーFcタンパク質のシアル酸付加を以下のように実証した。以前に記載されるように（Samuelsson et al, 2001）、還元タンパク質を4〜12％Bis-Trisゲルに流し、PVDFメンブレンへと移し、1％Rocheブロッキング試薬でブロッキングした。次いで、1/200希釈したビオチン化セイヨウニワトコ（Sambucus nigra）バークレクチン（Vector laboratories）とともにメンブレンをインキュベートし、ストレプトアビジン-HRP（Serotec）で発色（developed）させた。In silicoモデリングにより、ヘキサマーFcタンパク質で見られるこれらの末端シアル酸が、DC-SIGN又はSIGN-R1と結合可能であることが予測される（図1）。
【０１５１】
3．自己免疫疾患の調節に役割を果たし得る新たに記載された受容体との相互作用
ヒトB細胞抑制性受容体は、自己免疫疾患の調節に重要である（Pritchard & Smith, 2003）。IgGに対する2つの抑制性受容体が、ヒトB細胞の表面について記載されている：FcγRIIb（Daeron et al, 1995）及びごく最近のFcRL5（Wilson et al, 2012）。FcRL5は、ヒトB細胞においてFcγRIIbと重複する可能性があるものの、FcγRIIbによるSHIP-1及びFcRL5に対するSHP-1の同時補充の可能性は、再発性のB細胞活性化に対する実質的なバリアを提供する。興味深いことに、先天性B細胞上のFcRL5は、ポックスウイルスMHCクラスI様イムノエバシン（immunoevasins）によっても標的化され、これは、免疫の制御にFcRL5が果たす重要な役割を示唆する（Campbell et al, 2010）。FcRL5は、複合体化IgGとのみ結合し、モノマーIgGとは結合しないことから、IVIGは、この受容体と高アビディティで結合する可能性は低いだろうが、とはいえ、IVIGのポリマーフラクションは、高アビディティで結合するかもしれない。まとめると、FcγRIIb及びFcRL5は、慢性的な病原体又は自己反応性抗原に対するB細胞活性化を制限し得、両方の受容体を標的とする可能性があるアプローチは、B細胞活性化の調節を目的とする治療において有益性を証明し得る。
【０１５２】
従って、ヘキサマーIgG1-FcとヒトCD19+ B細胞との結合を検証した（図3）。自己免疫の調節に関与する免疫細胞とヘキサマーIgG1-Fcとの相互作用を評価するための最初のステップとして、ヘキサマーIgG1-FcがヒトB細胞と結合する能力をFACS分析により検証した。ヘキサマーIgG1-Fcは、健康なヒトボランティアの末梢循環から精製したCD19+B細胞と結合したことを示す。フローサイトメトリーは、Mekhaiel et al, 2011aに記載されるように実施した。ヒト白血球は、Polymorphoprep勾配での遠心分離により、製造者の指示に従って全血から精製した。1×105細胞を、50 μgのhexa-Fcを含む200 μlのFACsバッファー（リン酸緩衝生理食塩水、0.2％ウシ血清アルブミン、5％ヤギ血清）又はバッファーのみと室温で1時間インキュベートした。細胞をFACsバッファーで2回洗浄し、200 μlのFACsバッファー中、1/500希釈したF（ab’）2ヤギ抗hIgG-Fc-フィコエリトリン（PE）及びヤギ抗hCD19-フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合Abs（Southern Biotechnology）とともに4℃で1時間インキュベートした。細胞をFACsバッファーで洗浄後、FACScan（BD Biosciences）で分析した。データ収集は、CELLQuestソフトウェア（BD Biosciences）で行い、FlowJo version 9.1で分析を実施した。CD19+ Bリンパ球は、それらの前方及び側方散乱プロファイルを考慮してゲーティングし、Fcタンパク質の結合をPE標識二次抗体で検出した。PE標識二次抗体の結合は、Fcタンパク質不在下ではいずれも検出されなかった。ヘキサマーFcがヒトB細胞表面上でFcRL5と結合していたことは、FcRL5特異的ブロッキングモノクローナル抗体509F6と細胞を予めインキュベーションしたところ、ヘキサマーFcタンパク質の結合が除去されたことにより実証された。
【０１５３】
4．新生児型FcRnとの結合
循環におけるAbsの長期半減期の維持と関与する新生児型FcRnとヘキサマーFcが相互作用する能力を検証した（Mekhaiel et al, 2011a）。FcRnは、ITPに主要な役割を果たさないが、治療のために長期半減期が重要である、より慢性的な自己免疫疾患のヘキサマーFc媒介性の制御に役割を果たし得る。ヘキサマーFcは、ヒトFcRnと結合できなかったが、以前の観察と一致して（Andersen et al, 2010）、マウスFcRnとはnM親和性（pH6で0.1〜10 nM）で結合した。これは、既存の構築物に対するマイナーな修飾、例えば、Leu310のHis310への復帰などが、ヒトFcRnとの結合を回復させ得ることを示唆する。
【０１５４】
Fcタンパク質のFcRnとの結合を、表面プラズモン共鳴分析により、以下及びMekhaiel et al, 2011aに記載されるように測定した。表面プラズモン共鳴（SPR）分析は、Biacore 3000装置（GE Healthcare）を用いて実施した。CM5センサーチップのフローセルを、製造者により提供されるプロトコルに記載されるように、アミンカップリング化学を用いて、組換え型の可溶性ヒト又はマウスFcRn（hFcRn又はmFcRn；約2200〜3000 RU）とカップリングした。カップリングは、10 mMの酢酸ナトリウム（pH 5.0）（GE healthcare）中、2 μgml-1のタンパク質を注入することにより実施した。pH 6.0のリン酸塩バッファー（67 mM リン酸塩バッファー、0.15 M NaCl、0.005％Tween 20）、又はHBS-EPバッファー（0.01 M HEPES、0.15 M NaCl、3 mM EDTA、0.005％界面活性剤P20）をランニングバッファー及び希釈バッファーとして使用した。Fc融合タンパク質のそれぞれ（100 nM）を、固定化した受容体上にpH 6.0又はpH 7.4で25℃、20 μl/分の流速で注入した。表面の再生は、pH 7.4のHBS-EPバッファー（GE Healthcare）を注入することにより実施した。全ての実験において、データはゼロに調整し、リファレンスセルを減算した。BIAevaluation 4.1ソフトウェア（GE Healthcare）を用いてデータを評価した。
【０１５５】
5．補体との結合
今日まで研究されたFc融合物の大半は、C1qと結合せず、次の補体カスケードを活性化できない（Czajkowsky et al, 2012）。このFc融合物が補体を活性化できないことは、おそらく、インタクトIgGとC1qとの相互作用に寄与する、融合物中のFab残基の欠失から生じる（Gaboriaud et al, 2003）。ヘキサマーFcはFab残基を欠くことから、天然抗体で見られる親和性と同じ親和性でC1qと結合できる可能性は低い。とはいえ、ヘキサマーFcがC1qと結合し、古典的経路を活性化する能力を検証した（Mekhaiel et al, 2011a）。ヘキサマーFcは、ダイマーと比較して、C1qと結合しにくく、同様に、インタクトモノマーIgGよりも十分には結合せず、漸次的変化は、C5〜9末端複合体の検出における比例した減少に反映された。また、接種部位での免疫複合体の形成により開始されるIII型過敏性反応であるArthus反応は、これらの試薬をマウスへとi.p.投与した場合、又はミョウバン（alum）と一緒にs.c.投与し、注入時に観察を実施した場合でさえ、完全に欠如していた。補体活性化の欠如は、一般に、自己免疫疾患の治療を目的とする注入型治療において望ましい特性と考えられる。しかし、古典的経路のその後の活性化を伴わないC1q結合性は、DC-SIGN、C1q及びgC1qRが、自己免疫疾患の調節に重要であり得る、単球由来の未熟樹状細胞の表面において三分子受容体複合体を形成するとの発見を考慮すると、有利であり得る（Hosszu et al, Blood 2012；120：1228-1236）。
【０１５６】
Arthus反応は、抗原の皮内注入後、抗原／抗体複合体のin situ形成を伴う（受動免疫で見られるように）。動物／患者が以前に感作された場合（循環抗体を有する）、Arthus反応が生じる。Arthusは、III型過敏症の大半のメカニズムの典型であり、皮膚血管においてIgG系免疫複合体の沈着に起因する局所血管炎として現れる。補体の活性化は、主に、可溶性アナフィラトキシン（anaphylotoxins）C5a及びC3aの切断をもたらし、これが、PMNsの補充及び局所マスト細胞脱顆粒（FcγRIII上への免疫複合体の結合を必要とする）を駆動し、これにより、炎症反応がもたらされる。免疫複合体関連プロセスの更なる凝集は、組織血管壁において、虚血を悪化させる混合型（superimposed）血栓症を伴う局所フィブリノイド壊死を確実にする。最終的な結果は、注入部位において目視により容易に観察可能な局所的な発赤領域であり、持続時間は典型的には1日程度続く。
【０１５７】
実施例4：ヘキサマーFcは、ITPの臨床的に関連するマウスモデルにおいて、血小板数を回復させ得る
ITPについて一般に使用される血小板減少（depletion）モデルにおいて、0.035 g/kgほど少ないヘキサマーFcが、同様の用量である0.035 g/kgのIVIGと比較して、血小板回復に対して有意にポジティブな効果を有することを示すことができた。
【０１５８】
Balb/Cマウスに、Hexa-Fcを0.035 g/kgで、IVIGを0.035 g/kg若しくは2 g/kgで（GammaGard）、又はPBSを最終体積200 μlでi.p.注入した。1時間後、全てのマウスにおいて、200 μl体積の滅菌PBS中、マウスインテグリンβ3鎖に特異的なIgG1-κ/CD61, クローン2C9.G2（BD Pharmingen；Product #：550541）（12.5 μg）をi.p.注入することによりITPを誘導した。APC結合抗CD61抗体を用いたフローサイトメトリーにより、処置後12時間、24時間、36時間及び48時間の時点で血小板を計数した。2つの独立実験から、グループあたりn＝4マウス。グループ平均±SDは、コントロールグループに対するDunnettの多重比較検定を用いた反復ANOVAにより分析した。コントロール vs ヘキサマー：q＝3.13、*P<0.05；コントロール vs IVIG：q＝8.66、***P<0.0001。データは、平均％血小板±SDである。平均％血小板は、減少前に各グループで計測する：ヘキサマーグループ＝9.6％±1.2、高用量IVIGグループ＝9.4％±1.2、低用量IVIGグループ＝9.4％±1.2、PBSグループ＝9.3％±1.2。
【０１５９】
実施例5：ITP患者の治療
開示のヘキサマーFcタンパク質を用いたITPの治療プロトコルは、ITP hIVIG治療の標準的なガイドライン、例えば、原発性免疫性血小板減少性紫斑病の診断及び管理に関するExecutive Committee of the American Society of Hematologyの実務ガイドラインなどを辿る様式で利用されるだろう。George, J N, et al. Idiopathic thrombocytopenic purpura：a practice guideline developed by explicit methods for the American Society of Hematology. Blood. 1996 Jul. 1；88（1）:3-40を参照。或いは、ITP用プロトコルは、上記治療プロトコル投与量の約0.1〜約0.001倍の投与量を用いた初期投与フェーズを含んでよい。低用量の初期フェーズは、長期的な抗炎症作用を誘導するのに依然として十分でありながら、Fcタンパク質投与によるあらゆる短期的な炎症促進性作用を最小限にするよう設計され、これは、その後、第二フェーズの上述した標準投与量により高められ、維持される。この代替的アプローチの理論的根拠は、いくつかのポリマータンパク質は、FcγRIIaの発現を減少させることを介して、短期的な炎症作用と長期的な抗炎症作用の両方を有し得ることである。初期の低用量（1以上）を用いて、短期的な炎症作用を最小限に抑えつつ、長期的な抗炎症作用を刺激することができる。
【０１６０】
Fcタンパク質は静脈内投与され、Fcタンパク質の有効量は、一般に、IVIGの有効量の約1％〜約20％である。ITPにおけるhIVIGの有効量は、一般に、10〜21日ごとに投与される約100 mg/Kg〜約2グラム/Kgの範囲である。
【０１６１】
Fcタンパク質静注製剤は、FDA承認のhIVIG製剤と実質的に同じであるだろうが、いくつかのhIVIG製剤に存在する安定剤は除外されてよい。
【０１６２】
実施例6：Fcタンパク質のin silicoモデリング
Fcタンパク質が自己免疫疾患又は炎症性疾患を調節する能力は、それらが免疫系の適切な成分と相互作用する一方で、不要な反応を引き起こさない能力に依存するだろう。同様に、これは、Fcタンパク質の構造に依存するだろう。オリゴマーの場合、三次及び四次構造は、免疫系成分との結合に対する、タンパク質表面及び暴露部分の利用可能性に重要な影響を及ぼすだろう。均一かつ定義された三次及び四次構造は、不要な反応のリスクを低下させ得、これはそうでなければ複合体混合物内で少数種により引き起こされ得る。均一かつ定義された構造はまた、医薬品のクオリティコントロールをより容易なものとする。
【０１６３】
本発明者は、本明細書に開示のヘキサマーFcが、規則的かつ均一な円筒形を有し（実施例2）、様々な望ましい受容体及び免疫系成分と結合し（実施例3）、かつ補体を活性化しない（実施例3）ことを示している。これらの発見は、実施例1に記載のヘキサマーFcのin silicoモデリングとすべて一致する。
【０１６４】
US2010/0239633（University of Maryland, Baltimore；Strome）は、複数の連結Fc部分を含むIVIG代替化合物を開示する。直鎖状又はペンタマーの配置が想定される。ペンタマー化は、IgMのCμ4ドメイン及びJ鎖の付加により想定される（US2010/0239633の図10A〜D及び18頁の好ましい実施態様で示されるように）。天然のIgMにおいて、重鎖定常領域のCμ4ドメインは、ペンタマー化を行うためにJ鎖と結合する。広範なin silicoモデリング／モレキュラーダイナミクスシミュレーションを行って、US2010/0239633で提案される構造が実行可能かどうかを決定した。
【０１６５】
US2010/0239633の図10A〜Dで示される構造において、Cμ4ドメインは、そのN末端を介して、Cγ3ドメイン（すなわち、IgG分子のCH3ドメイン）のC末端と連結され、Cγ3ドメインはCγ2ドメインと連結される。同様のモノマードメインは、より高次構造のモノマーアームを形成するために一緒にダイマー化するものとして示される。しかし、これは、当該構造についてコンフォメーションの問題を示す。
【０１６６】
天然の免疫グロブリンにおいて、Cμ3、Cμ4、Cγ2及びCγ3ドメインは、「＼／」型又は逆「＼／」型、すなわち「／＼」であるホモダイマーを形成する。1つのモノマーが、「＼／」の「＼」部分を形成し、同様のモノマーが「＼／」の「／」部分を形成するか；又は1つのモノマーが、「／＼」の「／」部分を形成し、同様のモノマーが「／＼」の「＼」部分を形成する。Cγ3又はCμ4ダイマーが「＼／」型である一方、Cμ3及びCγ2は「／＼」型である。天然の免疫グロブリンにおいて、「＼／」及び「／＼」型ダイマーは交互に起こる。例えば、「＼／」型Cγ3ドメインのN末端は、「／＼」型Cγ2のC末端と連続的に配置される。同様に、「＼／」型Cμ4ドメインのN末端は、「／＼」型Cμ3ドメインのC末端と連続的に配置される。
【０１６７】
US2010/0239633で示されるモノマーにおいて、「＼／」型Cγ3ドメインは、別の「＼／」型Cμ4ドメインと直接連結される。これは、Cγ3のC末端残基が、互いに近接する一方、Cμ4のN末端残基が互いに離れることから、問題である。ドメインを一緒に結合するために、リンカーが必要とされる可能性がある。この構造的制限の最も可能性の高い結果は、おそらく用いられるであろうリンカーの長さのために、Cμ4ドメインが、Cγ2-Cγ3ドメインに対して90度回転されなければならないことである。Cμ4ドメインは、回転ひずみ下にあるだろう。Cγ3s内のモノマー内ジスルフィド結合とCμ4s内のモノマー内ジスルフィルド結合は互いに競合する。一方又は両方が弱まるだろう。従って、タンパク質は不安定となる場合があり、或いは適切にフォールディングされない場合がある。
【０１６８】
Cγ2-Cγ3-Cμ4で見られるように、Cμ4ドメインに対するCγ2-Cγ3ドメインの正常なオリエンテーションを模倣するために、IgMのドメインは、20アミノ酸過剰なリンカーを必要とするだろう。リンカー（特定されていない配列）の導入は、これらの構造に対して顕著な問題、特に、不要な免疫原性の可能性が高まるといった問題が生じる。また、製造可能性、及びタンパク質分解的切断の可能性の上昇に対してネガティブな影響も及ぼし得る。Cγ3-Cμ4結合のこの幾何学的制限は、オリゴマーに対して重大な結果を有し、これをヘキサマーFcタンパク質とは根本的に異なるものにさせる。
【０１６９】
Fcγ及びFcμドメイン間のリンカー配列は重要である。しかしながら、用語「リンカー」は柔軟性を含意するものの、現在のケースでは、この柔軟性には制限が存在するだろう。Fab領域とFc領域との間（ヒンジにて）など、単一のポイントでの結合では、実際には、多大な回転柔軟性が存在し得る。US2010/0239633で示されるような実施態様における差は、各Cγ3-Cμ4ペアの間に1つある結合が2つの場所で存在することである。そのため、1つのFcの他のFcに対する回転は、2つのリンカーが一緒になったねじれをもたらし、これは、エネルギー的に望ましくなく、ミスフォールディング又は不安定性のリスクを増加させる。
【０１７０】
US2010/0239633に記載の構造が、Cμ4ドメインによってのみそれらの結合を有する十分に定義されたオリゴマー（IgMと同様に）を形成することはありそうにない。構造化されていない、全てのポリマー抗体で見られる18アミノ酸のC末端テールは、標準的（regular）なペンタマー及び／又はヘキサマー構造に関与できず、それは、Fc内の構造化されたIgドメイン（1以上）の存在に由来しなければならない。構造化されたIg領域を介して生じるポリマー化では、化学量論は、構造化された領域のサイズ及び形状により設定される。ランダムな非構造化領域間の相互作用は、必然的に、広範囲のポリマーサイズを導かなければならない。そのため、IgMで観察されるCμ4ドメインにおける（いくつかの）モノマー間のコンタクトが、ペンタマー化学量論を維持するのに十分であるかどうかを決定するために、まさにこれらの構造化された領域（すなわち、テールピースを欠く）について広範なモレキュラーダイナミクスシミュレーションに着手した。シミュレーションの間、Cμ4の構造化された領域は、それらのペンタマー配置を急速に失い、（見かけ上）一緒に凝集し始める（非特異的）。従って、標準的なペンタマー／ヘキサマー構造は、全く起こりそうにない。これは、天然のIgMと対比されるべきであり、ここでは、Cμ4及びCμ3ドメインの両方が、標準的なペンタマー／ヘキサマー構造に寄与する。US2010/0239633は、ポリマー化を促進するためにJ鎖の使用を示唆しているものの、これが成功するとは期待されないだろう。J鎖は、免疫グロブリン構造を安定化できるが、モノマー又はダイマーをより高次のオリゴマーへと変換できない。例えば、J鎖は、IgAのダイマー化を促進できるが、IgAのIgドメインはより高次のポリマー化に適さないことから、IgMのようなより高次のオリゴマーを形成するのに十分ではない。
【０１７１】
ポリマー化がランダムテールを介して生じ得る場合に形成するかもしれない最も可能性の高い構造は、3d星形の構造であり、ここでは、3dにおいて、テールがセントラルコロナ内に位置し、モノマーのFc領域が放射状に突き出る。非構造化ペプチドを介して生じるポリマー化では、十分に定義されていない化学量論が存在し得、三次元で適合可能なものはいずれも生じるだろう。何個の連結テールが、相互作用するテールの中心スフェア内で適合可能かによって、最大でおそらく20-mersまでダイマーの可能性が存在する。
【０１７２】
また、実験的に、ヒトIgG1のFcへの18アミノ酸テールピースの付加は、マルチマー化を誘導するのに不十分であることを発見していることに留意することも重要である（Mekhaiel, 2011a）。我々はまた、定常ドメインの交換により、Cμ4ドメインの存在が、ペンタマー及び／又はヘキサマーフォーメーションを誘導することができないことを示している（Ghumra et al, 2009）。従って、我々は、US2010/0239633の構造が、起こりそうにはないが、Cμ4ドメインによろうとテールによろうと、実際にポリマー化できる可能性を検討する。
【０１７３】
たとえモデルから生じる予測が誤っており、モノマーにおけるCμ4ドメインが、IgMと同様の構造を形成するために相互作用可能であるとしても、結果として得られる構造は、ヘキサマーFcとは全く異なるものであるだろう。Cμ4が、IgMで行うように相互作用すると仮定すれば（US2010/0239633により仮定される）、Cμ4ドメインが、Cγ2-Cγ3ドメインに対して90度回転される必要性は、モノマーから形成可能な任意のオリゴマーにおいて、Cγ2-Cγ3領域を、互いに（大部分）「向かい合わせる」だろう。すなわち、Cγ2-Cγ3のサイドは、隣接アームにおけるCγ2-Cγ3の反対サイドと直接向かい合うだろう。全体的な構造は、閉じた傘と似るだろう。対照的に、ヘキサマーFcタンパク質においては、これらのサイドは、「バレル」の壁を形成し、従って互いに向き合わず、むしろ外側へ向く。従って、ヘキサマーFcタンパク質においてこれらのサイドと容易に結合可能な受容体は、US2010/0239633のオリゴマーとは結合しないだろう。Cγ2-Cγ3 Fcユニットにおける糖化（sugared）領域は、Fc受容体及びグリカン受容体の両方による結合に重要である。ヘキサマーFcにおいて、糖化領域は外側を向き、そのため、糖化領域と結合する受容体が結合できる。対照的に、US2010/0239633のオリゴマーにおいては、これらのグリカンに対する受容体は、モノマー間に入らなければならず、不可能ではないとはいえ、これは、オリゴマーと重要な受容体との間の全体的な結合強度に影響を及ぼし得る。US2010/0239633のオリゴマーの単一のモノマーは、Cγ2-Cγ3ドメインの単一のペアが受容体とアクセス可能なようにオリエンテーションされている可能性があるものの、オリゴマー中の2以上の他のモノマーが、同一表面上の異なる受容体と結合し得るかどうかは、上記の幾何学的考察及びモノマーの物理的サイズのために、不明である。従って、US2010/0239633のオリゴマーが、1つ／2つを超える受容体と同時に結合可能であるかどうかは不明である。同様の問題は、代替的なポリマー化定常ドメイン、例えばIgAに由来するものを使用しても生じ得る。従って、US2010/0239633で想定される構造中に複数のモノマーユニットが存在しているにも関わらず、重要なFc受容体及び他の免疫系成分との結合は、かかる構造が仮に形成可能であるとしても、モノマー又はダイマーの免疫グロブリンを用いて観察されるものよりも熱心（avid）なものではないだろう。
【０１７４】
このビルディング・ブロックストラテジーは、US2010/0239633に記載する構造の相互作用可能性を深刻に制限する。さらに問題なことは、たとえこれらの分子がマルチマー化することを示し得たとしても、Cμ4ドメインの存在は、本願に記載するようなヘキサマーFcで見られるものとは顕著に異なることが予測される、これらのキメラ分子から起こり得るin vivo相互作用及び生体内分布に対して深刻な影響を及ぼすであろうことである。これらを表1に詳細にまとめる。
【０１７５】
【表１−１】
2015536317.tif 000003
【表１−２】
2015536317.tif 000004
【０１７６】
参考文献
Debre M et al. Lancet 342, 945-9 (1993)
Samuelsson, A., Towers, T.L. & Ravetch, J.V. Science 291, 484-6 (2001)
Bazin, R. et al. Br J Haematol 135, 97-100 (2006)
Crow. A.R. et al. Blood 102, 558-60 (2003)
Clynes, R. et al J. Clin. Invest. 115: 25-7 (2005).
Leontyev D et al. Blood 119: 5261-5264 (2012)
Araujo, L.M. et al. J Immunol 186, 3289-93 (2011)
Roopenian DC, Akilesh S (2007) Nature reviews Immunology 7: 715-725
Crow AR et al (2011) Blood 118: 6403-6406
Machino Y et al. Clin Exp Immunol. 162, 415-24 (2010).
Anthony RM et a.  Proc Natl Acad Sci USA 105, 19571-78 (2008).
Seite, J.F. et al. Blood 116, 1698-704 (2010).
Anthony RM et al Nature 475, 110-116 (2011).
Mekhaiel DN et al (2011a). Scientific reports 1: 124
Mekhaiel DN et al  (2011b) Trends in parasitology 27: 523-529
Machino Y et al (2012) Biochem Biophys Res Commun
Roux KH, Tankersley DL (1990) J Immunol 144: 1387-1395
Teeling JL et al (2001) Blood 98: 1095-1099
Yoo EM et al (2003) J Immunol 170: 3134-3138
Ballow M (2011) The Journal of allergy and clinical immunology 127: 315-323
Jain et al (2012) Arthritis Research & Therapy 14:R192
Zhang Y et al (2011) European journal of immunology 41: 1154-1164
Reddy ST et al (2007) Nature biotechnology 25: 1159-1164
Vollmers HP, Brandlein S (2006) Histology and histopathology 21: 1355-1366
Park-Min KH et al (2007) Immunity 26: 67-78
Sondermann P, Kaiser J, Jacob U (2001) Journal of molecular biology 309: 737-749
Pritchard NR, Smith KG (2003) Immunology 108: 263-273
Daeron M et al (1995) The Journal of clinical investigation 95: 577-585
Wilson TJ, Fuchs A, Colonna M (2012) J Immunol:188
Campbell JA et al (2010) J Immunol 185: 28-32
Bruhns P et al (2009) Blood 113: 3716-3725
Nimmerjahn F, Ravetch JV (2008) Nature Reviews Immunology 8: 34-47
Nimmerjahn & Ravetch (2007) J. Exp. Med 204: 11-15
Davis RS (2007) Annual review of immunology 25: 525-560
Dement-Brown J et al (2012) Journal of leukocyte biology 91: 59-67
Ise T et al (2005) Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 11: 87-96
Czajkowsky DM et al (2012) EMBO molecular medicine
Ghumra A et al (2009) European journal of immunology 39: 1147-1156
Ghumra A et al (2008) Journal of Immunology 181: 1988-2000
Czajkowsky DM, Shao Z (2009) Proc Natl Acad Sci USA 106: 14960-14965
Kubagawa H et al (2009) The Journal of experimental medicine 206: 2779-2793
Andersen J-T et al (2010) The Journal of Biological Chemistry 285: 4826-4836
Gaboriaud, C. et al (2003) The Journal of Biological Chemistry 278: 46974-82
Hosszu, K.K. et al (2012) Blood 120: 1228-1236
Mammen, M. et al (1998) Angew. Chem. Int. Edit. 37: 2755-2794
Inoue, Y. et al. (2007) J. Immunol. 179, 764-774
Siragam, V. et al. J. Clin. Invest. 115: 155-60 (2005)
Siragam, V. et al.  Nat. Med. 12: 688-92 (2006)
Pleass RJ & Woof JM. Trends in Parasitol 17: 545-51 (2001).
【図１Ａ】
2015536317.tif 000005
【図１Ｂ】
2015536317.tif 000006
【図２】
2015536317.tif 000007
【図３】
2015536317.tif 000008
【図４】
2015536317.tif 000009
【図５】
2015536317.tif 000010
【配列表】
2015536317000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成27年10月8日(2015.10.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットを含むポリマータンパク質を含む、哺乳動物対象の自己免疫疾患又は炎症性疾患治療剤；
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を含むFc受容体結合部分を含み；
各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含み；
該ポリマータンパク質は、更なる免疫調節部分；又は該哺乳動物対象に投与された場合に抗原特異的免疫抑制を引き起こす抗原部分、を含まない。
【請求項２】
各ポリペプチドモノマーユニットが、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれと融合されるテールピース領域を含み；ここで、各ポリペプチドモノマーユニットのテールピース領域が、該モノマーユニットのポリマーへの集合を促進する、請求項1に記載の治療剤。
【請求項３】
テールピース領域が、IgM若しくはIgAテールピース、又はそれらのフラグメント若しくはバリアントである、請求項2に記載の治療剤。
【請求項４】
免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれが、天然のヒト免疫グロブリンG1重鎖定常領域と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の治療剤。
【請求項５】
免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれが、EUナンバリングシステムに従って309位にシステイン残基を含み、かつ好ましくは310位にロイシン残基も含む、アミノ酸配列を含む、請求項1に記載の治療剤。
【請求項６】
免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれが、少なくとも1つのFc受容体に対するFc受容体結合部分の親和性を修飾するために、天然の免疫グロブリンG重鎖定常領域のアミノ酸配列と比較して修飾されたアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の治療剤。
【請求項７】
免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれが、適切には新生児型Fc受容体に対するFc受容体結合部分の親和性を増加させることにより、ポリマータンパク質のin vivo半減期を増加させるために、天然の免疫グロブリンG重鎖定常領域のアミノ酸配列と比較して修飾されたアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の治療剤。
【請求項８】
自己免疫疾患又は炎症性疾患が、静注用免疫グロブリン（IVIG）で治療可能である、請求項1に記載の治療剤。
【請求項９】
自己免疫疾患又は炎症性疾患が、自己免疫性血球減少症、特発性血小板減少性紫斑病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、喘息、川崎病、ギラン・バレー症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、結腸クローン病、糖尿病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、重症筋無力症、抗第VIII因子自己免疫疾患、皮膚筋炎、血管炎、及びブドウ膜炎又はアルツハイマー病である、請求項1に記載の治療剤。
【請求項１０】
有効成分として、5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットからなるポリマータンパク質を含む、哺乳動物対象の自己免疫疾患又は炎症性疾患治療剤；
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域；及び任意選択で、一本鎖Fcとして2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を連結するポリペプチドリンカー、からなるFc受容体結合部分からなり；かつ
各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含む。
【請求項１１】
有効成分として、5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットからなるポリマータンパク質を含む、哺乳動物対象の自己免疫疾患又は炎症性疾患治療剤；
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、Fc受容体結合部分及びテールピース領域からなり；
該Fc受容体結合部分は、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域；及び任意選択で、一本鎖Fcとして2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を連結するポリペプチドリンカー、からなり；
各修飾ヒト免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの修飾ヒト免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含み；かつ
該テールピース領域は、該ポリペプチドモノマーユニットの2つの修飾ヒト免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれと融合され、該モノマーユニットのポリマーへの集合を促進する。
【請求項１２】
テールピース領域が、IgM若しくはIgAテールピース、又はそれらのフラグメント若しくはバリアントである、請求項11に記載の治療剤。
【請求項１３】
5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットを含むポリマータンパク質であって、
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を含むFc受容体結合部分を含み；
各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含み；
該ポリマータンパク質は、更なる免疫調節部分；又は哺乳動物対象に投与された場合に抗原特異的免疫抑制を引き起こす抗原部分、を含まず；
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域のそれぞれと融合されるテールピース領域を含まない、
ポリマータンパク質。
【請求項１４】
5、6又は7個のポリペプチドモノマーユニットからなるポリマータンパク質であって、
ここで、
各ポリペプチドモノマーユニットは、2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域；及び任意選択で、一本鎖Fcとして2つの免疫グロブリンG重鎖定常領域を連結するポリペプチドリンカー、からなるFc受容体結合部分からなり；かつ
各免疫グロブリンG重鎖定常領域は、隣接するポリペプチドモノマーユニットの免疫グロブリンG重鎖定常領域のシステイン残基とジスルフィド結合を介して連結されるシステイン残基を含む、
ポリマータンパク質。
【請求項１５】
請求項13又は14で定義するとおりのポリマータンパク質のポリペプチドモノマーユニットをコードするコーディング部分を含む核酸分子。
【国際調査報告】
2015536317.tif 000011
2015536317.tif 000012
2015536317.tif 000013
2015536317.tif 000014