(57)【要約】  本発明は、対象を治療するための方法におけるバイオマーカーとしてのＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の使用であって、治療するための方法が対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含む使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象を治療するための方法におけるバイオマーカーとしてのＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の使用であって、治療するための前記方法が前記対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含む使用。
【請求項２】
ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルがバイオマーカーである、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
対象を治療するための方法の設計におけるバイオマーカーとしてのＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の使用であって、治療するための前記方法が前記対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含む使用。
【請求項４】
ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルがバイオマーカーである、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記ＶＥＧＦＲ１がＶＥＧＦＲ１変異体２、ＶＥＧＦＲ１変異体１、ＶＥＧＦＲ１変異体３およびＶＥＧＦＲ１変異体４を含む群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
ＶＥＧＦＲ１をコードする前記核酸が、ＶＥＧＦＲ１転写物変異体２、ＶＥＧＦＲ１転写物変異体１、ＶＥＧＦＲ１転写物変異体３およびＶＥＧＦＲ１転写物変異体４を含む群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記ＶＥＧＦＲ１が可溶性ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１変異体２である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
前記可溶性ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１変異体２が、配列番号１によるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２によるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ＶＥＧＦＲ１をコードする前記核酸が可溶性ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１変異体２をコードする核酸である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
可溶性ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１変異体２をコードする前記核酸が、配列番号２によるヌクレオチド配列または配列番号１によるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＶＥＧＦＲ１がＶＥＧＦＲ１変異体１である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記ＶＥＧＦＲ１変異体１が、配列番号３によるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４によるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
ＶＥＧＦＲ１をコードする前記核酸がＶＥＧＦＲ１変異体１をコードする核酸である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１４】
ＶＥＧＦＲ１変異体１をコードする前記核酸が、配列番号４によるヌクレオチド配列または配列番号３によるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記ＶＥＧＦＲ１がＶＥＧＦＲ１変異体３である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１６】
前記ＶＥＧＦＲ１変異体３が配列番号５によるアミノ酸配列を含むか、または配列番号６によるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
ＶＥＧＦＲ１をコードする前記核酸がＶＥＧＦＲ１変異体３をコードする核酸である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
ＶＥＧＦＲ１変異体３をコードする前記核酸が配列番号６によるヌクレオチド配列または配列番号５によるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記ＶＥＧＦＲ１がＶＥＧＦＲ１変異体４である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２０】
前記ＶＥＧＦＲ１変異体４が、配列番号７に記載のアミノ酸配列を含むか、または配列番号８によるヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
ＶＥＧＦＲ１をコードする前記核酸がＶＥＧＦＲ１変異体４をコードする核酸である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２２】
ＶＥＧＦＲ１変異体４をコードする前記核酸が、配列番号８によるヌクレオチド配列または配列番号７によるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記バイオマーカーが薬力学的バイオマーカーである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２４】
前記バイオマーカーが予測バイオマーカーである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２５】
前記バイオマーカーが予後バイオマーカーである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２６】
前記バイオマーカーが代替バイオマーカーである、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
前記対象が、疾患に罹患しているか、または疾患に罹患する危険性があり、前記疾患が、ＰＫＮ３阻害剤によって治療、回復および／または治癒することができる疾患である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記疾患が腫瘍疾患、癌疾患および子癇前症を含む群から選択される、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記疾患が、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、神経膠腫、腺癌、子宮内膜増殖症、遺伝性非ポリープ性結腸直腸癌、乳癌−卵巣癌、前立腺癌、胃腸血腫、脂肪腫、甲状腺腺腫、乳房繊維嚢胞病、小脳異形成性神経節細胞腫、乳房および甲状腺の悪性腫瘍、大細胞癌、小細胞癌ならびに扁平上皮癌を含む群から選択される、請求項２７または２８に記載の使用。
【請求項３０】
前記疾患が、癌、転移癌およびＰＩ−３キナーゼ経路が関与する任意の病態を含む群から選択される疾患である、請求項２７または２８に記載の使用。
【請求項３１】
前記疾患が、前記疾患に関与している細胞がＰＴＥＮ活性を欠如しているか、侵襲性挙動の増加を示すか、または後期腫瘍の細胞であることを特徴とする、請求項２７または２８に記載の使用。
【請求項３２】
前記疾患が、転移癌およびＰＩ−３キナーゼ経路が関与する任意の病態を含む群から選択され、このような病態が、子宮内膜癌、結腸直腸癌、神経膠腫、腺癌、子宮内膜増殖症、カウデン症候群、遺伝性非ポリープ性結腸直腸癌、リ−フラウメニ症候群、乳癌−卵巣癌、前立腺癌、バナヤン−ゾナナ症候群、ＬＤＤ（レルミット−デゥクロ症候群）、カウ病（ＣＤ）およびバナヤン−ルバルカバ−リリー症候群（ＢＲＲ）を含む過誤腫性大頭症、毛根鞘腫などの粘膜病変、大頭症、精神遅滞、胃腸過誤腫、脂肪腫、甲状腺腫、乳房繊維嚢胞病、小脳異形成神経節細胞腫ならびに乳房および甲状腺の悪性腫瘍ならびに大細胞癌、小細胞癌ならびに扁平上皮癌からなる、請求項２７または２８に記載の使用。
【請求項３３】
前記ＰＫＮ３阻害剤が、ＰＫＮ３をコードするｍＲＮＡを対象とするｓｉＲＮＡ、ＰＫＮ３をコードするｍＲＮＡを対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＫＮ３をコードするｍＲＮＡを対象とするリボザイム、ＰＫＮ３をコードするｍＲＮＡを対象とするｓｈＲＮＡ、ＰＫＮ３をコードするｍＲＮＡを対象とするｍｉＲＮＡまたはアンタゴミア、ＰＫＮ３を対象とするアプタマー、ＰＫＮ３を対象とするスピーゲルマー、ＰＫＮ３を対象とする抗体、ＰＫＮ３を対象とするアンチカリンおよび低分子を含む群から選択される、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３４】
前記ＰＫＮ３阻害剤がｓｉＲＮＡであり、前記ｓｉＲＮＡが以下：
５’５ｕ８ｕ７ｃ６ｇ８ａ６ｇ５ｃ７ｕ７ａ６ｇ５ｃ５  ３’
３’ａ６ｃ６ｇ８ｕ７ｃ５ｕ７ａ８ｇ６ｇ５ｕ７ａ８ａ  ５’
の通りであり、改変されていないリボヌクレオチドが示した通りであり、改変リボヌクレオチドが以下：
５：２’−Ｏ−メチル−ｕ、
６：２’−Ｏ−メチル−ａ、
７：２’−Ｏ−メチル−ｃ、
８：２’−Ｏ−メチル−ｇ
の通りに表される、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３５】
ＰＫＮ３が配列番号９によるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３６】
ＰＫＮ３が、配列番号１０によるヌクレオチド配列または配列番号９によるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３７】
対象が治療方法に対して応答者であるかどうかを判断するための方法であって、前記治療方法が、前記対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含み、
前記対象が前記治療方法を受ける前に前記対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルを決定する工程と、
前記対象が前記治療方法を受けた後に前記対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルを決定する工程と
を含み、前記対象が前記治療方法を受けた後の前記対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルが、前記対象が前記治療方法を受ける前の前記対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルと比較して減少している場合、前記対象が前記治療方法の応答者である方法。
【請求項３８】
前記減少が、１０％以上、２０％以上、４０％以上、６０％以上または８０％以上の減少である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記対象が疾患に罹患しているか、または疾患に罹患する危険性があり、前記治療方法が前記疾患の治療方法である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含む第１の治療方法を受けている対象が、前記対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含む第２の治療方法を受けるかどうかを判断するための方法であって、
第１の治療方法の前に前記対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルを決定する工程と、
前記第１の治療方法の後の第１の期間の後に前記対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルを決定する工程と、
場合によって、前記第１の治療方法の後の第２の期間の後に前記対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルを決定する工程と
を含み、前記第１の治療方法の後の前記第１または第２の期間の後の前記対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルが、前記第１の治療方法の前の前記対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルと比較して増加している場合、前記対象が前記第２の治療方法を受けるべきである方法。
【請求項４１】
前記増加が、１００％以上、８０％以上、６０％以上または４０％以上である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記対象が疾患に罹患しているか、または疾患に罹患する危険性があり、前記治療方法が前記疾患の治療方法である、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記第１の治療方法の後の第１の期間が、前記第１の治療方法の一部であるＰＫＮ３阻害剤の最後の投与後約２４時間または４８時間である、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１の治療方法の後の前記第２の期間が、前記第１の治療方法の後の前記第１の期間の約１または２カ月後に開始する、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１の治療方法が、前記第２の治療方法と同じであるか、または前記第１の治療方法が前記第２の治療方法と異なる、請求項４０〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
対象が治療方法を受けるかどうかを判断するための方法であって、前記治療方法が、ＰＫＮ３阻害剤の投与を含み、ＶＥＧＦＲ１もしくはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルを決定すること、またはＶＥＧＦＲ１もしくはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルを決定することを含み、前記対象の血液または血漿中のＶＥＧＦ１の力価で表されたＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルが２００ｐｇ／ｍｌ以上である場合、前記患者がＰＫＮ３阻害剤の投与を含む前記治療方法に適している方法。
【請求項４７】
前記対象の血液または血漿中のＶＥＧＦ１の力価で表されたＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルが、４００ｐｇ／ｍｌ以上、好ましくは６００ｐｇ／ｍｌ以上、より好ましくは８００ｐｇ／ｍｌ以上である場合、前記患者がＰＫＮ３阻害剤の投与を含む前記治療方法に適している、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記疾患が、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のいずれかの疾患である、請求項３７〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＰＫＮ３阻害剤が、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のいずれかのＰＫＮ３阻害剤である、請求項３７〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＶＥＧＦＲ１またはそれをコードする核酸が、請求項１〜４９のいずれか１項に記載のいずれかのＶＥＧＦＲ１または前記ＶＥＧＦＲ１をコードする核酸である、請求項３７〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
疾患に罹患している、または疾患に罹患する危険性がある対象の治療方法において使用するためのＰＫＮ３阻害剤であって、前記対象の血液または血漿中のＶＥＧＦ１の力価で表されたＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルが２００ｐｇ／ｍｌ以上である、ＰＫＮ３阻害剤。
【請求項５２】
前記対象の血液または血漿中のＶＥＧＦ１の力価で表されたＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルが、４００ｐｇ／ｍｌ以上、好ましくは６００ｐｇ／ｍｌ以上、より好ましくは８００ｐｇ／ｍｌ以上である、請求項５１に記載のＰＫＮ３阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオマーカーとしてのＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の使用、対象が治療方法に対して応答者であるかどうかを判断するための方法、対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含む第１の治療方法を受けた対象が、対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含む第２の治療方法を受けるかどうかを判断するための方法、ＰＫＮ３阻害剤の投与を含む治療方法を対象が受けるかどうかを判断するための方法、および疾患に罹患している、または疾患に罹患する危険性がある対象を治療するための方法において使用するためのＰＫＮ３阻害剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
発癌は、Ｆｏｕｌｄｓによって多段階の生物学的プロセスであることが報告され（Ｆｏｕｌｄｓ，Ｌ．（１９５８）、Ｊ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｄｉｓ、８、２〜３７）、現在では遺伝子損傷の蓄積により生じることが知られている。分子レベルでは、腫瘍形成の多段階プロセスには、正と負両方の制御エフェクターの破壊が関与する（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．（１９８９）；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、４９、３７１３〜３７２１）。ヒト結腸癌の分子基盤には、いくつかの癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子および修復遺伝子が関与していると、Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎおよび共同研究者らは仮定した（Ｆｅａｒｏｎ，Ｅ．Ｒ．およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（１９９０）、Ｃｅｌｌ、６１、７５９〜７６７）。同様に、網膜芽細胞腫の発生を導く異常は、別の腫瘍抑制遺伝子と関連している（Ｌｅｅ，Ｗ．Ｈ．ら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３５、１３９４〜１３９９）。さらにその他の癌遺伝子および腫瘍抑制因子が、その他の様々な悪性腫瘍において同定された。残念ながら、治療可能な癌の数は依然として少なく、癌の作用は壊滅的であり、米国だけでも毎年５０万人を超える人々が亡くなっている。
【０００３】
癌は、基本的に細胞ＤＮＡへの損傷が細胞増殖を調節する正常な機構の崩壊を招く遺伝病である。腫瘍抑制因子がゲノムの完全性を維持する作用機序の２つは、細胞停止によるものであり、損傷を受けたＤＮＡの修復または損傷を受けたＤＮＡのアポトーシスによる除去を可能にする（Ｅｌｌｉｓｅｎ，Ｌ．Ｗ．およびＨａｂｅｒ，Ｄ．Ａ．（１９９８）、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ、４９、４２５〜４３６）。アポトーシスは、別に「プログラムされた細胞死」とも呼ばれ、不可逆的な損傷を受けた細胞を除去することを目的とする細胞の自殺プログラムとして作用する、生化学的現象の綿密に制御されたネットワークである。アポトーシスは、腫瘍壊死因子の結合、ＤＮＡ損傷、増殖因子の離脱、およびＦａｓ受容体の抗体架橋結合を含む、いくつかの方法で誘発することができる。アポトーシスのプロセスに役割を果たすいくつかの遺伝子が同定されているが、アポトーシスに導く経路はまだ完全には解明されていない。このような遺伝子が腫瘍細胞の選択的なアポトーシスを誘導し、患者の癌を治療する手段を生み出すことを目指して、多くの研究者らが新規アポトーシス促進遺伝子の同定を試みてきた。
【０００４】
癌を治療するための代替的なアプローチには、エンドスタチン（商標）または抗ＶＥＧＦ抗体などの薬剤による血管新生の抑制が関与する。このアプローチでは、目的は、原発腫瘍のさらなる血管新生を防ぐこと、および転移病巣の大きさを、実質的な血管増殖を伴わずに腫瘍細胞の生存を維持することができる大きさまで潜在的に抑えることができることである。
【０００５】
特定の群の癌疾患は、腫瘍の増殖速度、正常な組織への浸潤、化学療法またはその他の従来の治療に対する耐性および全身にわたる転移の形成に関して侵襲性の癌疾患である。より侵襲性の癌の場合、癌組織は正常組織とは一層異なっており、腫瘍が拡大する可能性はより高い。したがって、現在の癌研究の１つの目的は、腫瘍増殖を阻害し、かつ／または癌細胞の全身への拡大を低下させる薬剤を開発することである。
【０００６】
侵襲性の癌疾患がどのようなものであるかという定義は、国立癌研究所のホームページ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／Ｔｅｍｐｌａｔｅｓ／ｄｂ＿ａｌｐｈａ．ａｓｐｘ？ＣｄｒＩＤ＝４６０５３から得ることができる。また、癌疾患の侵襲性の説明に関しては、通常、顕微鏡で調べた場合にそれらがどの程度異常に見えるかという点で癌細胞を分類するためのシステムであるグレード分類（ｇｒａｄｉｎｇ）が用いられる。グレード分類システムの目的は、腫瘍の推定増殖速度およびその拡大傾向についての情報を提供することである。腫瘍をグレード分類するために用いるシステムは、各々の癌の種類によって異なる。グレード分類は、治療の決定において役立つ。
【０００７】
このようなグレード分類システムは、当業者には公知である。そのうちの１つは、グリーソンスコアであり、前立腺癌組織が顕微鏡下でどのように見えるかに基づいて前立腺癌組織をグレード分類するシステムである。グリーソンスコアは２〜１０の範囲で、腫瘍が拡大する可能性がどの程度かを示す。低いグリーソンスコアは、その癌組織が正常な前立腺組織と類似しており、腫瘍が拡大する可能性は少ないことを意味し、高いグリーソンスコアは、その癌組織が正常とは大きく異なり、腫瘍が拡大する可能性が高いことを意味する。
【０００８】
タンパク質キナーゼＮベータまたはＰＫＮベータとも呼ばれるＰＫＮ３は、特にＯｉｓｈｉ  Ｋら（Ｏｉｓｈｉ  Ｋ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２６１（３）：８０８〜１４）またはＳｈｉｂａｔａ，Ｈら（Ｓｈｉｂａｔａ，Ｈ．ら；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（Ｊａｐａｎ）１３０（１）：２３〜３１）によって記載されたことがある。ＰＫＮ３はまた、腫瘍、特に固形腫瘍、癌、特に転移癌および子癇前症における標的分子として同定された。また、国際特許出願公開第２００４／０１９９７３号パンフレットに記載されたように、タンパク質キナーゼＮベータは腫瘍形成および転移に関係のあるＰＩ−３キナーゼ／ＰＴＥＮ経路の下流標的である。特に後者の効果は、抑制因子機能、より具体的にはＰＴＥＮ腫瘍抑制因子機能の消失に強く関連しているように思われる。
【０００９】
いかなる疾患の治療も、いかなる望ましくない副作用またはいかなる有害作用も回避すると同時に、患者に苦痛の緩和または治癒さえも提供するものである。この課題に応じるために、最も広い意味において、このような療法に対する非応答者から療法に対する応答者を区別することを可能にするバイオマーカーが必要である。さらに、バイオマーカーは、例えば、臨床試験の組み入れ基準、最適な薬物、用量および治療計画の確立または同定、ならびに有害作用の危険性が高い患者の同定に必要であり、有用である。
【００１０】
上記に照らして、疾患において、より具体的にはＰＫＮ３阻害剤によって治療することができる疾患に罹患している、または罹患する危険性がある患者に投与することによって治療することができる疾患において、使用できるバイオマーカーを同定することが必要とされる。その限りにおいて、本発明の根底にある一問題は、このようなバイオマーカーを同定することである。
【００１１】
本発明の根底にあるさらなる問題は、患者にＰＫＮ３阻害剤を投与することによって治療することができる疾患に罹患している、または罹患する危険性があるこのような患者の特定群に医薬品を提供することであり、好ましくは、このような特定の患者群には、患者にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含むこのような療法に対する応答者が非常に高い割合で含まれる。
【００１２】
これらおよびさらなる問題は、添付の独立請求項の主題によって解決される。特に好ましい実施形態は、添付の従属請求項から得ることができる。
【００１３】
本発明の根底にある問題はまた、対象を治療するための方法においてＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸をバイオマーカーとして使用することによる第１の態様の第１の実施形態でもある第１の態様において解決され、治療するための方法は、対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含む。
【００１４】
第１の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルはバイオマーカーである。
【００１５】
本発明の根底にある問題はまた、対象を治療するための方法の設計においてＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸をバイオマーカーとして使用することによる第２の態様の第１の実施形態でもある第２の態様において解決され、治療するための方法は対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含む。
【００１６】
第２の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第２態様の第２の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルはバイオマーカーである。
【００１７】
第１の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３の実施形態ならびに第２の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第３の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１はＶＥＧＦＲ１変異体２、ＶＥＧＦＲ１変異体１、ＶＥＧＦＲ１変異体３およびＶＥＧＦＲ１変異体４を含む群から選択される。
【００１８】
第１の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第４の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１をコードする核酸は、ＶＥＧＦＲ１転写変異体２、ＶＥＧＦＲ１転写変異体１、ＶＥＧＦＲ１転写変異体３およびＶＥＧＦＲ１転写変異体４からなる群から選択される。
【００１９】
第１の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第５の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１は可溶性ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１変異体２である。
【００２０】
第１の態様の第５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６の実施形態ならびに第２の態様の第５の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第６の実施形態では、可溶性ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１変異体２は、配列番号１によるアミノ酸配列を含むか、または配列番号２によるヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２１】
第１の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第７の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第７の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１をコードする核酸は、可溶性ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１変異体２をコードする核酸である。
【００２２】
第１の態様の第７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第８の実施形態ならびに第２の態様の第７の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第８の実施形態では、可溶性ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１変異体２をコードする核酸は、配列番号２によるヌクレオチド配列または配列番号１によるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
第１の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第９の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第９の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１はＶＥＧＦＲ１変異体１である。
【００２４】
第１の態様の第９の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１０の実施形態および第２の態様の第９の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第１０の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１変異体１は、配列番号３によるアミノ酸配列を含むか、または配列番号４によるヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２５】
第１の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１１の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第１１の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１をコードする核酸は、ＶＥＧＦＲ１変異体１をコードする核酸である。
【００２６】
第１の態様の第１１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１２の実施形態および第２の態様の第１１の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第１２の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１変異体１をコードする核酸は、配列番号４によるヌクレオチド配列または配列番号３によるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
第１の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１３の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第１３の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１はＶＥＧＦＲ１変異体３である。
【００２８】
第１の態様の第１３の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１４の実施形態および第２の態様の第１３の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第１４の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１変異体３は、配列番号５によるアミノ酸配列を含むか、または配列番号６によるヌクレオチド配列によってコードされる。
【００２９】
第１の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１５の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第１５の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１をコードする核酸は、ＶＥＧＦＲ１変異体３をコードする核酸である。
【００３０】
第１の態様の第１５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１６の実施形態ならびに第２の態様の第１５の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第１６の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１変異体３をコードする核酸は、配列番号６によるヌクレオチド配列または配列番号５によるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３１】
第１の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１７の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第１７の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１はＶＥＧＦＲ１変異体４である。
【００３２】
第１の態様の第１７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１８の実施形態および第２の態様の第１７の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第１８の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１変異体４は、配列番号７によるアミノ酸配列を含むか、または配列番号８によるヌクレオチド配列によってコードされる。
【００３３】
第１の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１９の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３および第４の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第１９の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１をコードする核酸は、ＶＥＧＦＲ１変異体４をコードする核酸である。
【００３４】
第１の態様の第１９の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２０の実施形態および第２の態様の第１９の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２０の実施形態では、ＶＥＧＦＲ１変異体４をコードする核酸は、配列番号８によるヌクレオチド配列または配列番号７によるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２１の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２０の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２１の実施形態では、バイオマーカーは薬力学的バイオマーカーである。
【００３６】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２２の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２０の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２２の実施形態では、バイオマーカーは予測バイオマーカーである。
【００３７】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２３の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２０の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２３の実施形態では、バイオマーカーは予後バイオマーカーである。
【００３８】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２４の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９および第２０の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２４の実施形態では、バイオマーカーは代替バイオマーカーである。
【００３９】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３および第２４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２５の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３および第２４の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２５の実施形態では、対象は疾患に罹患しているか、または罹患する危険性があり、疾患は、ＰＫＮ３阻害剤によって治療、回復および／または治癒することができる疾患である。
【００４０】
第１の態様の第２５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２６の実施形態および第２の態様の第２５の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２６の実施形態では、疾患は、腫瘍疾患、癌疾患および子癇前症を含む群から選択される。
【００４１】
第１の態様の第２５および第２６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２７の実施形態ならびに第２の態様の第２５および第２６の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２７の実施形態では、疾患は、肺癌、膵臓癌、肝臓癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、神経膠腫、腺癌、子宮内膜増殖症、遺伝性非ポリープ性結腸直腸癌、乳癌−卵巣癌、前立腺癌、胃腸血腫、脂肪腫、甲状腺腺腫、乳房繊維嚢胞病、小脳異形成性神経節細胞腫、乳房および甲状腺の悪性腫瘍、大細胞癌、小細胞癌ならびに扁平上皮癌を含む群から選択される。
【００４２】
第１の態様の第２５および第２６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２８の実施形態ならびに第２の態様の第２５および第２６の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２８の実施形態では、疾患は、癌、転移癌およびＰＩ−３キナーゼ経路に関与した任意の病態を含む群から選択される。
【００４３】
第１の態様の第２５および第２６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２９の実施形態ならびに第２の態様の第２５および第２６の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２９の実施形態では、疾患は、前記疾患に関与している細胞がＰＴＥＮ活性を欠如しているか、侵襲性の挙動の増加を示しているか、または後期腫瘍の細胞であることを特徴とする。
【００４４】
第１の態様の第２５および第２６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３０の実施形態ならびに第２の態様の第２５および第２６の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第３０の実施形態では、疾患は、転移癌およびＰＩ−３キナーゼ経路が関与する任意の病態を含む群から選択され、このような病態は、子宮内膜癌、結腸直腸癌、神経膠腫、腺癌、子宮内膜増殖症、カウデン症候群、遺伝性非ポリープ性結腸直腸癌、リ−フラウメニ症候群、乳癌−卵巣癌、前立腺癌、バナヤン−ゾナナ症候群、ＬＤＤ（レルミット−デゥクロ症候群）、カウ病（ＣＤ）およびバナヤン−ルバルカバ−リリー症候群（ＢＲＲ）を含む過誤腫性大頭症、毛根鞘腫などの粘膜病変、大頭症、精神遅滞、胃腸過誤腫、脂肪腫、甲状腺腫、乳房繊維嚢胞病、小脳異形成性神経節細胞腫ならびに乳房および甲状腺の悪性腫瘍ならびに大細胞癌、小細胞癌ならびに扁平上皮癌からなる。
【００４５】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９および第３０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３１の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９および第３０の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第３１の実施形態では、ＰＫＮ３阻害剤は、ＰＫＮ３をコードするｍＲＮＡを対象とするｓｉＲＮＡ、ＰＫＮ３をコードするｍＲＮＡを対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＫＮ３をコードするｍＲＮＡを対象とするリボザイム、ＰＫＮ３をコードするｍＲＮＡを対象とするｓｈＲＮＡ、ＰＫＮ３をコードするｍＲＮＡを対象とするｍｉＲＮＡまたはアンタゴミア（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）、ＰＫＮ３を対象とするアプタマー、ＰＫＮ３を対象とするスピーゲルマー（ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ）、ＰＫＮ３を対象とする抗体、ＰＫＮ３を対象とするアンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）および低分子を含む群から選択される。
【００４６】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０および第３１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３２の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０および第３１の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第３２の実施形態では、ＰＫＮ３阻害剤はｓｉＲＮＡであり、ｓｉＲＮＡは以下：
５’５ｕ８ｕ７ｃ６ｇ８ａ６ｇ５ｃ７ｕ７ａ６ｇ５ｃ５  ３’
３’ａ６ｃ６ｇ８ｕ７ｃ５ｕ７ａ８ｇ６ｇ５ｕ７ａ８ａ  ５’
の通りであり、改変されていないリボヌクレオチドは示した通りであり、改変されたリボヌクレオチドは以下： 
５：２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌ−ｕ、
６：２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌ−ａ、
７：２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌ−ｃ、
８：２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌ−ｇ
の通りに表される。
【００４７】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１および第３２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３３の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１および第３２の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第３３の実施形態では、ＰＫＮ３は配列番号９によるアミノ酸配列を含む。
【００４８】
第１の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１および第３２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３４の実施形態ならびに第２の態様の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、第１２、第１３、第１４、第１５、第１６、第１７、第１８、第１９、第２０、第２１、第２２、第２３、第２４、第２５、第２６、第２７、第２８、第２９、第３０、第３１および第３２の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第３４の実施形態では、ＰＫＮ３は配列番号１０によるヌクレオチド配列または配列番号９によるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によってコードされる。
【００４９】
本発明の根底にある問題はまた、第３の態様の第１の実施形態でもある第３の態様において、対象が治療方法に対して応答者であるかどうかを判断するための方法によって解決され、この治療方法は、対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含み、
対象がこの治療方法を受ける前に対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルを決定する工程と、
対象がこの治療方法を受けた後に対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルを決定する工程と
を含み、対象がこの治療方法を受けた後の対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルが、対象がこの治療方法を受ける前の対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルと比較して減少している場合、対象はこの治療方法の応答者である。
【００５０】
第３の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第３の態様の第２の実施形態では、この減少は、１０％以上、２０％以上、４０％以上、６０％以上または８０％以上の減少である。
【００５１】
第３の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第３の態様の第３の実施形態では、対象は疾患に罹患しているか、または疾患に罹患する危険性があり、治療方法はその疾患の治療方法である。
【００５２】
本発明の根底にある問題はまた、第４の態様の第１の実施形態でもある第４の態様において、対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含む第１の治療方法を受けている対象が、対象にＰＫＮ３阻害剤と投与することを含む第２の治療方法を受けるかどうかを判断するための方法によって解決され、この方法は、
第１の治療方法の前に対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルを決定する工程と、
第１の治療方法の後の第１の期間の後に対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルを決定する工程と、
場合によって、第１の治療方法の後の第２の期間の後に対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルを決定する工程と
を含み、第１の治療方法の後の第１または第２の期間の後の対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルが、第１の治療方法の前の対象の試料中におけるＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルと比較して増加している場合、対象は第２の治療方法を受けるべきである。
【００５３】
第４の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第４の態様の第２の実施形態では、この増加は、１００％以上、８０％以上、６０％以上または４０％以上である。
【００５４】
第４の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第４の態様の第３の実施形態では、対象は疾患に罹患しているか、または疾患に罹患する危険性があり、治療方法はこの疾患の治療方法である。
【００５５】
第４の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある第４の態様の第４の実施形態では、第１の治療方法の後の第１の期間は、第１の治療方法の一部であるＰＫＮ３阻害剤の最後の投与後約２４時間または４８時間である。
【００５６】
第４の態様の第１、第２および第３の実施形態の一実施形態でもある第４の態様の第５の実施形態では、第１の治療方法の後の第２の期間は、第１の治療方法の後の第１の期間の約１または２カ月後に開始する。
【００５７】
第４の態様の第１、第２、第３、第４および第５の実施形態の一実施形態でもある第４の態様の第６の実施形態では、第１の治療方法は、第２の治療方法と同じであるか、または第１の治療方法は第２の治療方法と異なる。
【００５８】
本発明の根底にある問題はまた、第５の態様の第１の実施形態でもある第５の態様において、対象が治療方法を受けるかどうかを判断するための方法によって解決され、この治療方法は、ＰＫＮ３阻害剤の投与を含み、ＶＥＧＦＲ１もしくはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸のレベルを決定すること、またはＶＥＧＦＲ１もしくはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルを決定することを含み、対象の血液または血漿中のＶＥＧＦＲ１の力価で表されたＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルが２００ｐｇ／ｍｌ以上である場合、患者はＰＫＮ３阻害剤の投与を含む治療方法に適している。
【００５９】
第５の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第５の態様の第２の実施形態では、対象の血液または血漿中のＶＥＧＦ１の力価で表されたＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルが４００ｐｇ／ｍｌ以上、好ましくは６００ｐｇ／ｍｌ以上、より好ましくは８００ｐｇ／ｍｌ以上である場合、患者はＰＫＮ３阻害剤の投与を含む治療方法に適している。
【００６０】
第３、第４および第５の態様の任意の実施形態の一実施形態では、疾患は、本発明の任意の態様の実施形態のいずれかで定義されたいずれかの疾患である。
【００６１】
第３、第４および第５の態様の任意の実施形態の一実施形態では、ＰＫＮ３阻害剤は、本発明の任意の態様の実施形態のいずれかで定義されたいずれかのＰＫＮ３阻害剤である。
【００６２】
第３、第４および第５の態様の任意の実施形態の一実施形態では、ＶＥＧＦＲ１またはそれをコードする核酸は、本発明の任意の態様の実施形態のいずれかで定義されたいずれかのＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸である。
【００６３】
本発明の根底にある問題はまた、第６の態様の第１の実施形態でもある第６の態様において、疾患に罹患しているか、または疾患に罹患する危険性がある対象の治療方法において使用するためのＰＫＮ３阻害剤によって解決され、対象の血液または血漿中のＶＥＧＦ１の力価で表されたＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルは、２００ｐｇ／ｍｌ以上である。
【００６４】
第６の態様の第２の実施形態の一実施形態でもある第６の態様の第２の実施形態では、対象の血液または血漿中のＶＥＧＦ１の力価で表されたＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルは、４００ｐｇ／ｍｌ以上、好ましくは６００ｐｇ／ｍｌ以上、より好ましくは８００ｐｇ／ｍｌ以上である。
【００６５】
本発明は、その様々な態様において、血管内皮増殖因子受容体１（ＶＥＧＦＲ１）またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸、すなわち、Ｆｌｔ−１とも呼ばれるＶＥＧＦ受容体１が、血管新生療法とは異なる療法のためのバイオマーカーであるという驚くべき発見に基づいている。より具体的には、本発明は、ＶＥＧＦＲ１は対象を治療するための方法に関連したバイオマーカーであるという驚くべき発見に基づいており、この治療するための方法は、対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含む。この発見に基づいて、ＶＥＧＦＲ１またはそれをコードする核酸は、対象を治療するための方法において、または対象を治療するための方法の設計に関連して、バイオマーカーとして使用され、この治療のための方法には対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することが含まれることは、本発明の範囲内である。このような設計には、中でも、以下：ＰＫＮ３阻害剤を投与することを含む治療方法に対して非応答者から応答者を同定すること、最適な薬物、用量およびこのような治療方法の計画を明確に確立または同定すること、およびこのような治療方法に関連した有害作用の危険性が高い患者を同定することの少なくとも１種を含むことができる。
【００６６】
本明細書で好ましく使用されたように、治療するための方法とは療法を意味し、対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含む治療するための方法とは、抗ＰＫＮ３療法を意味する。
【００６７】
本明細書で好ましく使用されたように、ＰＫＮ３阻害剤は、ＰＫＮ３またはその断片に対応するかまたは標的とする化合物であり、ＰＫＮ３またはその断片を標的とすることによって、ＰＫＮ３阻害剤を投与した対象において治療効果が生じる。
【００６８】
好ましく使用した対象は、脊椎動物、より好ましくは、ほ乳類である。特に好ましい対象はヒトである。
【００６９】
バイオマーカーとしてのＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の使用は、ＶＥＧＦＲ１の発現レベルまたはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルを使用するか、または参照することによって実現するか、または実践することができることは当業者には理解されよう。その限りにおいて、本発明はまた、様々な態様において、対象を治療するための方法におけるバイオマーカーとしてのＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルの使用に関し、この治療するための方法は、対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含み、本発明は、対象を治療するための方法の設計方法または設計におけるバイオマーカーとしてのＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の発現レベルの使用にも関し、この治療するための方法は、対象にＰＫＮ３阻害剤を投与することを含む。
【００７０】
本発明によれば、様々な態様において、ＶＥＧＦＲ１、すなわちそのタンパク質またはＶＥＧＦＲ１をコードする核酸は、バイオマーカーとして使用するか、または本発明の方法および生成物において使用する。核酸のレベルで、ＶＥＧＦＲ１には全部で４種類の異なる転写変異体、いわゆるＶＥＧＦＲ１転写変異体２、ＶＥＧＦＲ１転写変異体１、ＶＥＧＦＲ１  １転写変異体３およびＶＥＧＦＲ１転写変異体４があることは、当業者は認知していよう。ＶＥＧＦＲ１転写物２は可溶性ＶＥＧＦＲ１をコードし、ＶＥＧＦＲ１転写物１は膜結合ＶＥＧＦＲ１をコードすると理解されている。ＶＥＧＦＲ１転写物３および４はＶＥＧＦＲ１の断片をコードする。ＶＥＧＦＲ１転写変異体１から４のいずれも原則として、本発明に関連した用途に適していることは本発明の範囲内である。ＶＥＧＦＲ１変異体１から４のいずれも原則として、本発明の様々な態様に関連した用途に適していることも本発明の範囲内である。本明細書で好ましく使用されたように、ＶＥＧＦＲ１変異体１はＶＥＧＦＲ１スプライシング変異体１によってコードされるタンパク質であり、ＶＥＧＦＲ１変異体２はＶＥＧＦＲ１スプライシング変異体２によってコードされるタンパク質であり、ＶＥＧＦＲ１変異体３はＶＥＧＦＲ１スプライシング変異体３によってコードされるタンパク質であり、ＶＥＧＦＲ１変異体４はＶＥＧＦＲ１スプライシング変異体４によってコードされるタンパク質である。
【００７１】
本発明の任意の態様に関連して、本明細書で好ましく使用されたように、薬力学的バイオマーカーとは、治療後の変化が特定の薬剤による標的調節に関連したバイオマーカーである。
【００７２】
本発明の任意の態様に関連して本明細書で好ましく使用されたように、予測バイオマーカーとは、別の治療と比較して特定の治療に対する特定の患者の応答または生存を推定するために、療法に先立って使用することができるバイオマーカーである。
【００７３】
本発明の任意の態様に関連して本明細書で好ましく使用されたように、予後バイオマーカーとは、療法にかかわらず患者の全体的な疾患の転帰についての情報をもたらすバイオマーカーである。
【００７４】
本発明の任意の態様に関連して本明細書で好ましく使用されたように、代替バイオマーカーとは、臨床エンドポイントの代わりとなることを目的とするバイオマーカーである。
【００７５】
疾患がＰＫＮ３阻害剤による治療、回復および／または治癒することができる疾患であるかどうかは、日常的な方法および日常的な試験を使用して当業者が決定することができる。例えば、当業者であれば、適切な動物モデル、または任意の代替試験系を使用し、このような動物モデルまたは代替試験系にＰＫＮ３阻害剤を適用し、ＰＫＮ３阻害剤の効果（複数可）に伴う必要な読み出し情報を認めることができるかどうかを確認するであろう。例えば、このような試験は、国際特許出願公開第２００８／００９４７７号パンフレットに記載されたマトリゲル試験または標的分子としてＰＫＮ３が関与する任意のその他の腫瘍もしくは癌増殖系であってもよい。
【００７６】
好ましくは、本発明の様々な態様で使用した疾患は、以下を含む群から選択される疾患である：
急性リンパ球性白血病（ＡＬＬ）
急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）
青年期、癌
副腎皮質癌
小児期
ＡＩＤＳ関連癌
カポジ肉腫
リンパ腫
肛門癌
虫垂癌
星状細胞腫、小児期
非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、小児期、中枢神経系
Ｂ
基底細胞癌−皮膚癌（非黒色腫）参照
胆管癌、肝臓外
膀胱癌
小児期
骨癌、骨肉腫および悪性線維性組織球腫
脳幹神経膠腫、小児期
脳腫瘍
星状細胞腫、小児期
脳腫瘍および脊髄腫瘍、小児期
脳幹神経膠腫、小児期
中枢神経系非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、小児期
中枢神経系胚芽腫、小児期
中枢神経系胚細胞腫瘍、小児期
頭蓋咽頭腫、小児期
上位芽細胞腫、小児期
上衣腫、小児期
髄芽腫、小児期
髄上衣腫、小児期
中等度に分化した松果体実質細胞腫、小児期
テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫、小児期
乳癌
小児期
男性
妊婦、乳癌および
気管腫瘍、小児期
バーキットリンパ腫−非ホジキンリンパ腫参照
Ｃ
カルチノイド腫瘍
小児期
胃腸
原発不明の癌
小児期
中枢神経系
非定型奇形腫／ラブドイド腫瘍、小児期
胚芽腫、小児期
胚細胞腫瘍、小児期
リンパ腫、原発
子宮頸癌
小児期
小児癌
脊索腫、小児期
慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）
慢性骨髄増殖性疾患
結腸癌
結腸直腸癌
小児期
頭蓋咽頭腫、小児期
皮膚Ｔ細胞リンパ腫−菌状息肉腫およびセザリー症候群参照
Ｄ
管、胆汁、肝臓外
非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）
Ｅ
胚芽腫、中枢神経系、小児期
子宮内膜癌
上位芽細胞腫、小児期
上衣腫、小児期
食道癌
小児期
感覚神経芽腫、小児期
ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍
頭蓋外胚細胞腫瘍、小児期
性腺外胚細胞腫瘍
肝臓外胆管癌
眼癌
眼球内黒色腫
網膜芽細胞腫
Ｆ
骨の繊維性組織球腫、悪性および骨肉腫
Ｇ
胆嚢癌
胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（Ｓｔｏｍａｃｈ））癌
小児期
消化管カルチノイド腫瘍
消化管間葉系腫瘍（ＧＩＳＴ）−軟部組織肉腫参照
胚細胞腫瘍
中枢神経系、小児期
頭蓋外、小児期
性腺外
卵巣
妊娠性絨毛性腫瘍
神経膠腫−脳腫瘍参照
小児期脳幹
Ｈ
有毛細胞白血病
頭部および頸部癌
小児期
心臓癌、小児期
肝細胞（肝臓）癌
組織球増殖症、ランゲルハンス細胞
ホジキンリンパ腫
下咽頭癌
Ｉ
眼球内黒色腫
膵島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍
Ｋ
カポジ肉腫
腎臓
腎臓細胞
Ｌ
ランゲルハンス細胞組織球症
咽頭癌
小児期
白血病
急性リンパ球性（ＡＬＬ）
急性骨髄球性（ＡＭＬ）
慢性リンパ性（ＣＬＬ）
慢性骨髄性（ＣＭＬ）
ヘアリー細胞
唇および口腔癌
肝臓癌（原発性）
非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）
肺癌
非小細胞性
小細胞性
リンパ腫
ＡＩＤＳ関連
バーキット−非ホジキンリンパ腫参照
皮膚Ｔ細胞−菌状息肉腫およびセザリー症候群参照
ホジキン
非ホジキン
原発性中枢神経系（ＣＮＳ）
Ｍ
マクログロブリン血症、ワルデンストローム
男性乳癌
骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫
髄芽腫、小児期
髄上皮腫、小児期
黒色腫
小児期
眼球内（目）
メルケル細胞癌
中皮腫、悪性
小児期
原発不明の転移性扁平頸部癌
ＮＵＴ遺伝子関連正中管癌
口腔癌
多発性内分泌腫瘍症候群、小児期
多発骨髄腫／形質細胞腫瘍
菌状息肉腫
骨髄異形成症候群
骨髄異形成／骨髄増殖性新生物
骨髄性白血病、慢性（ＣＭＬ）
骨髄球性白血病、急性（ＡＭＬ）
骨髄腫、多発性
骨髄増殖性疾患、慢性
Ｎ
鼻腔および副鼻腔癌
上咽頭癌
小児期
神経芽細胞腫
非ホジキンリンパ腫
非小細胞性肺癌
Ｏ
口腔癌
小児期
口腔癌、唇および
中咽頭癌
骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫
卵巣癌
小児期
上皮
胚細胞腫瘍
低悪性度腫瘍
Ｐ
膵臓癌
小児期
膵神経内分泌腫瘍（膵島細胞腫瘍）
乳頭腫、小児期
傍神経節腫
副鼻腔および鼻腔癌
副甲状腺癌
陰茎癌
咽頭癌
褐色細胞腫
中等度に分化した松果体実質細胞腫、小児期
松果体芽腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児期
下垂体腫瘍
形質細胞新生物／多発性骨髄腫
胸膜肺芽腫、小児期
妊娠および乳癌
原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫
前立腺癌
Ｒ
直腸癌
腎細胞（腎臓）癌
腎盂および尿管、移行上皮癌
網膜芽細胞腫
横紋筋肉腫、小児期
Ｓ
唾液腺癌
小児期
肉腫
ユーイング肉腫ファミリーの腫瘍
カポジ
軟組織
子宮
セザリー症候群
皮膚癌
小児期
黒色腫
メルケル細胞癌
非黒色腫
小細胞性肺癌
小腸癌
軟部組織肉腫
扁平上皮細胞癌−皮膚癌（非黒色腫）参照
原発不明の扁平上皮頸部癌、転移性
胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（Ｇａｓｔｒｉｃ））癌
小児期
テント上原始神経外胚葉性腫瘍、小児期
Ｔ
Ｔ細胞リンパ腫、皮膚−菌状息肉腫およびセザリー症候群参照
精巣癌
小児期
咽頭癌
胸腺腫および胸腺癌
小児期
甲状腺癌
小児期
腎盂および尿管の移行上皮癌
絨毛性腫瘍、妊娠性
Ｕ
原発不明
小児期の癌
小児期の珍しい癌
尿管および腎盂、移行上皮癌
尿道癌
子宮癌、子宮内膜
子宮肉腫
Ｖ
膣癌
小児期
外陰癌
Ｗ
ワルデンストロームマクログロブリン血症
ウィルムス腫瘍
婦人科の癌
Ｙ
若年成人、癌
国立衛生研究所の国立癌病研究所により提供された癌のリストから入手できる通りである。
【００７７】
本発明のそれぞれおよびいずれかの態様において、ＰＫＮ３阻害剤は、ＰＫＮ３をコードするｍＲＮＡを対象とするｓｉＲＮＡ、ＰＫＮ３をコードするｍＲＮＡを対象とするアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＫＮ３をコードするｍＲＮＡを対象とするリボザイム、ＰＫＮ３をコードするｍＲＮＡを対象とするｓｈＲＮＡ、ＰＫＮ３をコードするｍＲＮＡを対象とするｍｉＲＮＡまたはアンタゴミア、ＰＫＮ３を対象とするアプタマー、ＰＫＮ３を対象とするスピーゲルマー、ＰＫＮ３を対象とする抗体、ＰＫＮ３を対象とするアンチカリン、低分子を含む群から選択される化合物であってもよい。上記分類の化合物のそれぞれおよびいずれかは、当業者には公知であり、前記分類のそれぞれおよびいずれかのＰＫＮ３阻害剤は、標準的技術を適用することによって、当業者が生成することができる。
【００７８】
様々な形態のＶＥＧＦＲ１に特異的な抗体の製造は、当業者には公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８８）に記載されている。好ましくは、ＣｅｓａｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎのプロトコールおよびそれらに基づいてさらに応用して製造することができるモノクローナル抗体を、本発明に関連して使用することができる。本明細書で使用したような抗体には、限定はしないが、完全な抗体、本明細書で開示したようなＶＥＧＦＲ１に適していて、ＶＥＧＦＲ１に結合することができる限り、Ｆａｂ断片、Ｆｃ断片および１本鎖抗体などの抗体断片または誘導体が含まれる。モノクローナル抗体とは別に、ポリクローナル抗体も使用することができ、かつ／または生成することができる。ポリクローナル抗体の生成はまた、当業者には公知であり、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８８）に記載されている。好ましくは、治療目的に使用するための抗体は、ヒト化されているか、または上記で定義したヒト抗体である。
【００７９】
本発明に従って使用することができる抗体は、１種または数種のマーカーまたは標識を有していてもよい。このようなマーカーまたは標識は、診断適用またはその治療適用のいずれかにおいて抗体を検出するために有用であり得る。好ましくは、マーカーおよび標識は、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、金およびフルオレセインを含む群から選択され、例えば、ＥＬＩＳＡ法において使用される。これらおよび他のマーカーならびに方法は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８８）に記載されている。
【００８０】
「アンチカリン」は、特に、ドイツ特許出願公開第１９７４２７０６号明細書に記載されている。
【００８１】
アプタマーは、１本鎖または２本鎖のいずれかの、標的分子と特異的に相互作用するＤ核酸である。アプタマーの製造または選択は、例えば、欧州特許第０５３３８３８号明細書に記載されている。基本的に、以下のステップを実現する。第１に、核酸、すなわち潜在的アプタマーの混合物を形成し、各核酸は通常、いくつかの、好ましくは少なくとも８つの、後で無作為化するヌクレオチド部分を含む。この混合物は、その後標的分子と接触し、それによって核酸（複数可）は、候補混合物と比較して標的に対する親和性が大きいことに基づいて、または標的に対してより大きな力などによって標的分子に結合する。結合した核酸（複数可）は、その後、混合物の残部から分離する。場合によって、このようにして得られた核酸（複数可）は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して増幅する。これらのステップは、数回反復してもよく、最後に、標的に特異的に結合する核酸の割合が増加した混合物が得られ、その後最終的に結合した核酸を場合により選択する。これらの特異的に結合した核酸（複数可）は、アプタマーと呼ばれる。アプタマーを生成または同定する方法の任意の段階で、個々の核酸の混合物の試料を採取して、標準的技術を使用してそれらの配列を決定することができることは明らかである。アプタマーが、例えば、アプタマーを生成する当業者にとって公知の確定した化学基を導入することなどによって安定化することができることは本発明の範囲内である。このような改変は、例えば、ヌクレオチドの糖部分の２’位にアミノ基を導入することであってもよい。アプタマーは、現在、治療薬として使用されている。しかし、このように選択または生成されたアプタマーは、標的の確認のため、および／または医薬品、好ましくは低分子に基づいた医薬品の開発のためのリード物質として使用できることも本発明の範囲内である。これは、実際に、標的分子とアプタマーの間の特異的な相互作用が候補薬物によって阻害される競合アッセイによって実施され、このアッセイでは、標的とアプタマーの複合体からアプタマーが置換されると、それぞれの薬物候補が標的とアプタマーの間の相互作用を特異的に阻害することが可能であり、相互作用が特異的であれば、前記候補薬物は、少なくとも原則上、標的をブロックし、したがって、このような標的を含むそれぞれの系における生物学的利用性または活性を減少させるのに適していると推定することができる。このようにして得られた低分子は、次に、毒性、特異性、生分解性および生物学的利用性などのその物理的、化学的、生物学的および／または医学的特性を最適にするために、さらに誘導体化したり、改変したりしてもよい。
【００８２】
本明細書で開示したように、ＶＥＧＦＲ１を使用する本発明によって使用または生成することができるスピーゲルマーの生成または製造は、類似の原則に基づいている。スピーゲルマーの製造は、国際特許出願公開第９８／０８８５６号パンフレットに記載されている。スピーゲルマーはＬ−核酸であり、このことは、それらが、アプタマーのようにＤ−ヌクレオチドから構成されるアプタマーとは異なりＬ−ヌクレオチドから構成されることを意味する。スピーゲルマーは、生物系において非常に高い安定性を有し、アプタマーと同程度に、対象とする標的分子と特異的に相互作用するという事実を特徴とする。スピーゲルマーを生成するという目的で、Ｄ−核酸の不均一な集団を作製し、この集団を標的分子の光学的異性体、本発明の場合では、例えば、タンパク質キナーゼＮベータの天然に生じるＬ−鏡像異性体のＤ−鏡像異性体と接触させる。その後、標的分子の光学的異性体と相互作用しないＤ−核酸を分離する。しかし、標的分子の光学的異性体と相互作用するＤ−核酸を分離し、場合によっては決定および／または配列決定し、その後、対応するＬ−核酸をＤ−核酸から得られた核酸配列情報に基づいて合成する。配列に関して、標的分子の光学的異性体と相互作用する前述のＤ−核酸と同一のこれらのＬ−核酸は、それらの光学的異性体よりも天然に生じる標的分子と特異的に相互作用するだろう。アプタマーを生成する方法と同じように、様々なステップを数回反復し、こうして標的分子の光学的異性体と特異的に相互作用する核酸を濃縮することも可能である。
【００８３】
リボザイムは、基本的に２つの部分を含む、好ましくはＲＮＡから構成される触媒活性のある核酸である。第１の部分は、触媒活性を示すが、第２の部分は、標的核酸、本発明の場合は、本明細書で記載したようなＶＥＧＦＲ１をコードする核酸との特異的な相互作用に関与する。標的核酸とリボザイムの第２の部分との間の相互作用では、通常、２本のハイブリダイズした鎖の本質的に相補的な塩基のストレッチのハイブリダイゼーションおよびワトソン−クリック塩基対によって、触媒活性部分は活性を有するようになることができ、これは、リボザイムの触媒活性がホスホジエステラーゼ活性である場合、分子内または分子間いずれかにおいて標的核酸を触媒することを意味する。その後、標的核酸はさらに分解され、最後に、本明細書で開示したように新たに合成されたＶＥＧＦＲ１の欠如および本明細書で開示したような既在のＶＥＧＦＲ１の代謝回転のため、標的核酸ならびに前記標的核酸から得られたタンパク質の分解が生じる。リボザイム、それらの使用および設計原則は当業者には公知であり、例えば、ＤｏｈｅｒｔｙおよびＤｏｕｄｎａ（Ｒｉｂｏｚｙｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ａｎｎｕ  ｒｅｆ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌｓｔｒｕｃｔ．２００１；３０：４５７〜７５）およびＬｅｗｉｎおよびＨａｕｓｗｉｒｔｈ（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００１  ７：２２１〜８）に記載されている。
【００８４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬品の製造のため、および診断薬としてそれぞれ使用されるように、それら自体同様に当業界で知られている。基本的に、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩基の相補性に基づいて標的ＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡとハイブリダイズし、それによってＲＮアーゼＨを活性化する。ＲＮアーゼＨは、ホスホジエステルおよびホスホロチオエート結合ＤＮＡの両方によって活性化される。しかし、ホスホロジエステル結合ＤＮＡは、ホスホロチオエート結合ＤＮＡを除いて、細胞性ヌクレアーゼによって迅速に分解される。これらの耐性のある、天然には生じないＤＮＡ誘導体は、ＲＮＡとハイブリダイズするとき、ＲＮアーゼＨを阻害しない。言い換えると、アンチセンスポリヌクレオチドは、ＤＮＡ  ＲＮＡハイブリッド複合体としてのみ有効である。この種のアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、特に米国特許第５，８４９，９０２号明細書および第５，９８９，９１２号明細書に記載されている。言い換えると、本発明の場合、本明細書で開示したようなＶＥＧＦＲ１をコードする核酸である標的分子の核酸配列に基づいて、原則としてそれぞれの核酸配列を推定できる標的タンパク質から、または核酸配列自体、特にｍＲＮＡを知ることのいずれかによって、適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドを塩基相補性の原則に基づいて設計することができる。
【００８５】
ｓｉＲＮＡは、通常、約１９から約２３ヌクレオチドの長さの２本鎖ＲＮＡである。２本のＲＮＡ鎖の１本の配列は、分解される標的分子をコードする核酸などの標的核酸の配列に対応する。言い換えると、標的分子、本発明の場合、本明細書で記載した様々な形態のＶＥＧＦＲ１の核酸配列、好ましくはｍＲＮＡ配列を知ることによって、２本鎖の１本が前記の、例えば、標的分子のｍＲＮＡと相補的である２本鎖ＲＮＡを設計することができ、標的分子をコードする遺伝子、ゲノムＤＮＡ、ｈｎＲＮＡまたはｍＲＮＡを含有する系に前記ｓｉＲＮＡを適用すると、それぞれの標的核酸は分解され、したがって、それぞれのタンパク質のレベルが低下する。前記ｓｉＲＮＡをそれぞれ医薬品および診断薬として設計、構築および使用する基本的原則は、特に、国際特許出願公開第００／４４８９５号パンフレットおよび第０１／７５１６４号パンフレットに記載されている。
【００８６】
前述の設計原則に基づいて、標的分子をコードする核酸配列が分かれば、このようなｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムはそれぞれ生成することが可能である。このことは、ゲノム核酸を含むｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡなどの核酸の前駆分子についても当てはまる。もちろん、それぞれのアンチセンス鎖がわかると、塩基対相補性の基本原則を考えれば、好ましくはワトソン−クリック塩基対に基づいて、このような核酸をベースにした化合物の設計が可能になり得る。したがって、本発明のさらなる態様は、タンパク質キナーゼＮベータを対象とする、または特異的な特定のｓｉＲＮＡ、リボザイムおよびアンチセンスヌクレオチドに関する。以下において、ｓｉＲＮＡによってさらにこのことを示すが、当業者には分かるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムにも同様に適用される。
【００８７】
このようなｓｉＲＮＡは、好ましくは１５から２５ヌクレオチドの長さを含み、このことは、実際に１５、１６、１７、１８、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドを含む任意の長さを意味する。さらなる実施形態では、ｓｉＲＮＡはさらにより多くのヌクレオチドを表すことができる。当業界で知られている設計原則に従って、それぞれのｓｉＲＮＡを生成することができる。したがって、本明細書で特許請求したｓｉＲＮＡは、標的分子をコードするセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかに少なくとも部分的に相補的な、１５から２５個の連続したヌクレオチドの好ましくは任意のヌクレオチド長のストレッチ、ならびに第１の鎖、したがって、標的分子をコードするアンチセンス鎖およびセンス鎖それぞれに少なくとも部分的に相補的な第２のリボヌクレオチド鎖を含む。ｓｉＲＮＡの生成または製造の業界で公知のいかなる設計原則もこの種の２本鎖構造に適用することができる。本明細書で開示したｓｉＲＮＡ空間は、アンチセンス鎖が上記で明記した標的分子のヌクレオチド番号１に対応するヌクレオチドで開始するｓｉＲＮＡ分子を含む。さらに、このようなｓｉＲＮＡ分子は、上記で明記した標的分子をコードする配列のヌクレオチド番号２に対応するヌクレオチドで開始する、などである。標的分子を対象とすることができる全ｓｉＲＮＡ分子候補を提供するために、標的分子をコードする配列をこのように綿密に調べることを繰り返す。このように生成したｓｉＲＮＡ分子のいずれかの長さは、ｓｉＲＮＡに適した任意の長さ、より具体的には、上記で明記した任意の長さであってもよい。好ましくは、本明細書で開示したｓｉＲＮＡ分子空間の様々なｓｉＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖またはセンス鎖の最も５’末端のヌクレオチド以外は重複する。このようにして得られたアンチセンス配列は、機能的に活性のあるｓｉＲＮＡに必要な少なくとも部分的に２本鎖構造を形成するために、塩基対によって補完されなければならないことは明らかである。
【００８８】
治療適用で使用するためのマイクロＲＮＡは、例えば、Ｓｏｉｆｅｒ  ＨＳら（Ｓｏｉｆｅｒ  ＨＳら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ、ｖｏｌ．１５、ｎｏ．１２、ｄｅｃ２００７、２０７０〜２０７９ページ）に記載されている。
【００８９】
治療適用で使用するためのアンタゴミアは、例えば、Ｓｔｅｎｖａｎｇ  Ｊ  ＆  Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ  Ｓ（Ｓｔｅｎｖａｎｇ  Ｊ  ＆  Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ  Ｓ、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２００８）８（１）、５９〜８１ページ）に記載されている。
【００９０】
好ましい実施形態では、ＰＫＮ３阻害剤は、それぞれ以下の組成および構造：
５’  ５ｕ８ｕ７ｃ６ｇ８ａ６ｇ５ｃ７ｕ７ａ６ｇ５ｃ５  ３’
３’  ａ６ｃ６ｇ８ｕ７ｃ５ｕ７ａ８ｇ６ｇ５ｕ７ａ８ａ  ５’
を有する２本鎖（ｄｓ２３ｍｅｒ）であるｓｉＲＮＡであり、改変されていないリボヌクレオチドは示した通りであり、改変されたリボヌクレオチドは以下：
５：２’−Ｏ−メチル−ｕ、
６：２’−Ｏ−メチル−ａ、
７：２’−Ｏ−メチル−ｃ、
８：２’−Ｏ−メチル−ｇ
の通りに表される。
【００９１】
本発明の様々な態様のさらに好ましい実施形態では、ＰＫＮ３阻害剤は先行技術および本明細書でＡｔｕ０２７と称した組成物である。Ａｔｕ０２７の活性のある医薬成分（ＡＰＩ）は、ＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、天然に生じる２’−Ｏ−メチル改変を含有する２本鎖ＲＮＡ分子である。
【００９２】
２’−Ｏ−メチル改変は、ヌクレアーゼ攻撃を防御することによってＲＮＡを安定化する。２本鎖（ｄｓ−２３ｍｅｒ）は、以下の配列
５’  ５ｕ８ｕ７ｃ６ｇ８ａ６ｇ５ｃ７ｕ７ａ６ｇ５ｃ５  ３’
３’  ａ６ｃ６ｇ８ｕ７ｃ５ｕ７ａ８ｇ６ｇ５ｕ７ａ８ａ  ５’
から構成され、改変されていないリボヌクレオチドは示した通りであり、改変されたリボヌクレオチドは以下：
５：２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌ−ｕ、
６：２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌ−ａ、
７：２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌ−ｃ、
８：２’−Ｏ−Ｍｅｔｈｙｌ−ｇ
の通りに表される。
【００９３】
Ａｔｕ０２７を作製するには、ＰＫＮ３特異的ｓｉＲＮＡは、リポプレックス型の負に荷電したｓｉＲＮＡに送達するために、３種類の脂質、すなわち、５０／４９／１のモル比のカチオン性ＡｔｕＦｅｃｔ０１、中性膜融合性ＤＰｙＰＥヘルパー脂質およびＰＥＧ化脂質ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥから構成される正に荷電したリポソームで製剤化する。ＡｔｕＦｅｃｔ０１およびＤＰｙＰＥヘルパー脂質は、新規の賦形剤である。３番目の脂質ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥは、公知の賦形剤である。３種類の脂質の構造を以下に表す：
カチオン性脂質ＡｔｕＦｅｃｔ０１：（β−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリ−ハイドロクロライド）
【化１】
2015521041.tif 000002
（ＭＷ：８４３．６ｇ／ｍｏｌ）
膜融合性／ヘルパー脂質ＤＰｙＰＥ：１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
【化２】
2015521041.tif 000003
（ＭＷ：８０４．１９ｇ／ｍｏｌ）
ＰＥＧ−脂質ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ：Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩
【化３】
2015521041.tif 000004
（ＭＷ：約２８００ｇ／ｍｏｌ）
【００９４】
本明細書で開示したＰＫＮ３阻害剤のいずれかが、本発明の方法および本発明の疾患に罹患している、または罹患する危険性がある対象を治療するための方法で使用するためのＰＫＮ３阻害剤を含む、本発明のそれぞれおよびいずれかの態様に関連して使用できることは本発明の範囲内である。
【００９５】
本明細書で開示した疾患のいずれかが、本発明の方法および本発明の疾患に罹患している、または罹患する危険性がある対象を治療するための方法で使用するためのＰＫＮ３阻害剤を含む、本発明のそれぞれおよびいずれかの態様に関連して使用できることは本発明の範囲内である。
【００９６】
本明細書で開示したＶＥＧＦＲ１およびそれをコードする核酸のいずれかが、本発明の方法および本発明の疾患に罹患している、または罹患する危険性がある対象を治療するための方法で使用するためのＰＫＮ３阻害剤を含む、本発明のそれぞれおよびいずれかの態様に関連して使用できることも本発明の範囲内である。
【００９７】
ＶＥＧＦＲ１の検出方法は当業界では公知であり、限定はしないが、抗ＶＥＧＦＲ１抗体が含まれる。本発明の様々な態様の実施形態において、ＶＥＧＦＲ１はＥＬＩＳＡによって検出される。しかし、質量分析などによる検出などその他の手段も当業者には公知である。
【００９８】
本発明の様々な態様に関連して、試料は体液の試料であり、体液は、血液、血漿、髄液、尿および唾液を含む群から選択される。好ましい試料は、血液試料および血漿試料である。
【００９９】
ＶＥＧＦＲ１をコードする核酸の検出方法も当業界では公知であり、限定はしないが、ＰＣＲおよびＲＴ−ＰＣＲが含まれる。
【０１００】
ＶＥＧＦＲ１および可溶性ＶＥＧＦＲ１（ｓＶＥＧＦＲ１）は、当業界では公知であり、特に、Ｃａｉｎｅ  ＧＪら（Ｃａｉｎｅ、ＧＪ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ（２００３）、３３、８８３〜８９０）またはＢａｒｌｅｏｎ  Ｂら（Ｂａｒｌｅｏｎ  Ｂら、Ａｎｇｉｏｎｅｓｉｓ  ４：１４３〜１５４（２００１））に記載されている。Ｂａｒｌｅａｏｎ  Ｂら（上記）はまた、可溶性ＶＥＧＦＲ１の力価は、健常志願者で約１６０ｐｇ／ｍｌであることを開示している。
【０１０１】
本発明はここでさらに、本発明のさらなる特性、実施形態および利点を理解することができる添付の図面および実施例によって例示される。
【０１０２】
以下のリストは、配列番号のいくつかをまとめて示しており、それらが表すことに関する表示を提供する。
【０１０３】
配列番号１  可溶性ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１変異体２のアミノ酸配列
配列番号２  可溶性ＶＥＧＦＲ１またはＶＥＧＦＲ１転写変異体２をコードするヌクレオチド配列
配列番号３  ＶＥＧＦＲ１変異体１のアミノ酸配列
配列番号４  ＶＥＧＦＲ１転写変異体１をコードするヌクレオチド配列
配列番号５  ＶＥＧＦＲ１変異体３のアミノ酸配列
配列番号６  ＶＥＧＦＲ１転写変異体３をコードするヌクレオチド配列
配列番号７  ＶＥＧＦＲ１変異体４のアミノ酸配列
配列番号８  ＶＥＧＦＲ１転写変異体４をコードするヌクレオチド配列
配列番号９  ＰＫＮ３のアミノ酸配列
配列番号１０  ＰＫＮ３をコードするヌクレオチド配列
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】ＰＣ−３細胞におけるＰＫＮ３ノックダウン、ＶＥＧＦＲ１発現およびＶＥＧＦＲ２発現を示す図である。
【図２】ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるＰＫＮ３ノックダウン、ＶＥＧＦＲ１発現およびＶＥＧＦＲ２発現を示す図である。
【図３】ＳＫＢＲ３細胞におけるＰＫＮ３ノックダウン、ＶＥＧＦＲ１発現およびＶＥＧＦＲ２発現を示す図である。
【図４】第Ｉ相臨床試験の設計を示す図である。
【図５】Ａｔｕ０２７で治療した人の血漿におけるバイオマーカー分析の結果を示す図である。
【図６】Ａｔｕ０２７で治療した人の血漿におけるバイオマーカー分析の結果を示す図である：単一分析物−ＶＥＧＦ。
【図７】Ａｔｕ０２７で治療した人の血漿におけるバイオマーカー分析の結果を示す図である：単一分析物−ＶＥＧＦ−Ｂ。
【図８】Ａｔｕ０２７で治療した人の血漿におけるバイオマーカー分析の結果を示す図である：単一分析物−ＶＥＧＦ−Ｃ。
【図９】Ａｔｕ０２７で治療した人の血漿におけるバイオマーカー分析の結果を示す図である：単一分析物−ＶＥＧＦ−Ｄ。
【図１０】Ａｔｕ０２７で治療した人の血漿におけるバイオマーカー分析の結果を示す図である：単一分析物−ＶＥＧＦＲ１（ＶＥＧＦＲ−１とも称する）。
【図１１】Ａｔｕ０２７で治療した人の血漿におけるバイオマーカー分析の結果を示した図である：単一分析物−ＶＥＧＦＲ２（ＶＥＧＦＲ−２とも称する）。
【図１２】Ａｔｕ０２７で治療した人の血漿におけるバイオマーカー分析の結果を示した図である：単一分析物−ＶＥＧＦＲ３（ＶＥＧＦＲ−３とも称する）。
【図１３】配列番号１を表す図である。
【図１４】配列番号２を表す図である。
【図１５】配列番号３を表す図である。
【図１６】配列番号４を表す図である。
【図１７】配列番号５を表す図である。
【図１８】配列番号６を表す図である。
【図１９】配列番号７を表す図である。
【図２０】配列番号８を表す図である。
【図２１】配列番号９を表す図である。
【図２２】配列番号１０を表す図である。
【実施例１】
【０１０５】
インビトロ研究用ＲＮＡｉ分子（ＡｔｕＲＮＡｉ）の合成
本発明のｓｉＲＮＡ分子（ＡｔｕＲＮＡｉ）を表１に記載する。これらの分子は、ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ  ＧｍｂＨ（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ  ａ．Ｍ．、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成された。
【表１】
2015521041.tif 000005
【０１０６】
２’−Ｏ−メチル改変を有するヌクレオチドには下線を引き、「ｓ」はセンス鎖、「ａｓ」はアンチセンス鎖を表す。
【０１０７】
「ＰＫＮ３ａｓ」および「ＰＫＮ３ｓ」、ならびに「ルシフェラーゼａｓ」および「ルシフェラーゼｓ」によって形成された２本鎖は、３’オーバーハングがなく、２’−Ｏ−メチル糖改変を両鎖に交互に行うことによって化学的に安定化され、それによって、改変されていないヌクレオチドが、向かい合っている鎖の改変されたヌクレオチドと面する（表１）。これらの２本鎖はまた、本明細書ではＰＫＮ３およびルシフェラーゼと称され、水に溶解して、１μＭの保存溶液を得た。
【実施例２】
【０１０８】
ＡｔｕＰＬＥＸの製剤
ＡｔｕＰＬＥＸ製剤は、Ｓａｎｔｅｌら（Ｓａｎｔｅｌら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００６）１３、１２２２〜１２３４）に本質的に記載されたように調製した。新規カチオン性脂質ＡｔｕＦＥＣＴ０１（β−Ｌ−アルギニル−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリハイドロクロライド）、中性リン脂質１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）およびＰＥＧ化脂質Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−エタノールアミンナトリウム塩（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ）をモル比５０／４９／１で含むカチオン性リポソームは、ＲＮアーゼを含まない滅菌スクロース溶液２７０ｍＭ中で全脂質濃度が４．３３５ｍｇ／ｍｌになるまで脂質フィルムを再水和することによって調製した。その後、ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ  Ｃ３装置（Ａｖｅｓｔｉｎ、Ｉｎｃ．、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）を使用した高圧ホモジナイゼーションによって、多層分散液をさらに処理した。
【０１０９】
ｓｉＲＮＡ−リポプレックス（ＡｔｕＰＬＥＸ）を生成するために、得られたリポソーム分散液をスクロース２７０ｍＭに溶かした同量のｓｉＲＮＡ０．５６２５ｍｇ／ｍｌ溶液と混合すると、カチオン性脂質窒素原子に対する核酸主鎖リン酸の計算した負荷割合約１：４が生じた。リポソームおよびリポプレックス分散液およびゼータ電位の大きさは、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用して測定した。
【０１１０】
Ａｔｕ０２７の活性のある医薬成分（ＡＰＩ）は、ＰＫＮ３−ｓｉＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、天然に生じる２’−Ｏ−メチル改変を含有する２本鎖ＲＮＡ分子である。２’−Ｏ−メチル改変は、ヌクレアーゼ攻撃を防御することによってＲＮＡを安定化する。
【０１１１】
２本鎖（ｄｓ−２３ｍｅｒ）は、以下の配列から構成される。
５’  ５ｕ８ｕ７ｃ６ｇ８ａ６ｇ５ｃ７ｕ７ａ６ｇ５ｃ５  ３’
３’  ａ６ｃ６ｇ８ｕ７ｃ５ｕ７ａ８ｇ６ｇ５ｕ７ａ８ａ  ５’
改変されていないリボヌクレオチド：ｘ；
改変：５：２’−Ｏ−メチル−ｕ、６：２’−Ｏ−メチル−ａ、７：２’−Ｏ−メチル−ｃ、８：２’−Ｏ−メチル−ｇ
【０１１２】
Ａｔｕ０２７作製には、ＰＫＮ３−ｓｉＲＮＡは、リポプレックス型の負に荷電したｓｉＲＮＡに送達するために、３種類の脂質、すなわち、カチオン性ＡｔｕＦｅｃｔ０１、中性膜融合性ＤＰｙＰＥヘルパー脂質およびＰＥＧ化脂質ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥの５０／４９／１のモル比から構成される正に荷電したリポソームで製剤化する。ＡｔｕＦｅｃｔ０１およびＤＰｙＰＥヘルパー脂質は、新規の賦形剤である。３番目の脂質ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥは、公知の賦形剤である。３種類の脂質の構造を以下に表す：
カチオン性脂質ＡｔｕＦｅｃｔ０１：（β−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリ−ハイドロクロライド）
【化４】
2015521041.tif 000006
８４３．６ｇ／ｍｏｌ
膜融合性／ヘルパー脂質ＤＳＰＥ：１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
【化５】
2015521041.tif 000007
８０４．１９ｇ／ｍｏｌ
ＰＥＧ−脂質ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥ：Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩
【化６】
2015521041.tif 000008
約２８００ｇ／ｍｏｌ
【実施例３】
【０１１３】
ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞におけるヒトＰＫＮ３のインビトロ遺伝子サイレンシングに応答したＶＥＧＦＲ−１の発現
３ｘ１０５個のＰＣ−３細胞を１０ｃｍ皿に播種し、１６時間後、実施例１で記載したようなｓｉＲＮＡ２０ｎＭで遺伝子導入し、リポソーム１μｇ／ｍｌを実施例２で記載したように調製し、リポソームはモル比５０／４９／１のカチオン性脂質β−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリハイドロクロライド（ＡｔｕＦＥＣＴ０１）、膜融合性脂質１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）およびＰＥＧ化脂質ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥから構成された。細胞は、ＲＮＡ抽出のために、遺伝子導入して２４時間後、４８時間後、７２時間後および９６時間後にそれぞれ溶解した。
【０１１４】
全ＲＮＡは、ＩｎｖｉＴｒａｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  ＲＮＡミニキット（Ｉｎｖｉｔｅｋ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で調製した。ＰＫＮ３ｍＲＮＡ発現の阻害、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２ｍＲＮＡの発現は、ＰＫＮ３  ３００ｎＭ、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２特異的フォワードおよびリバースプライマーならびにプローブ１００ｎＭを使用して、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）分析によって検出した。ＴａｑＭａｎにおけるプライマーの配列を以下の表に挙げるが、ＵＰＲは上部プライマー、ＬＷＲは下部プライマー、ＰＲＢはプローブを意味する。
【表２】
2015521041.tif 000009
【０１１５】
反応は、２５μｌで実施し、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で、製造者の指示に従って、以下の条件：４８℃３０分、９５℃１０分、続いて９５℃で１５秒を４０回、および６０℃で１分でアッセイした。ｍＲＮＡの量は、遺伝子導入して２４時間後に溶解した未処理対照に対して示す。
【０１１６】
結果を図１に示すが、ヒト前立腺癌ＰＣ−３細胞に遺伝子導入して７２時間後および９６時間後に、ＰＫＮ３ノックダウンに応答した、インビトロにおけるＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ発現の著しい減少が示されるが、ＶＥＧＦＲ２ｍＲＮＡ発現の減少は示されていない。
【実施例４】
【０１１７】
ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞におけるヒトＰＫＮ３のインビトロ遺伝子サイレンシングに応答したＶＥＧＦＲ−１の発現
３ｘ１０５個のＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を１０ｃｍ皿に播種し、１６時間後、実施例１で記載したようなｓｉＲＮＡ２０ｎＭで遺伝子導入し、リポソーム１μｇ／ｍｌを実施例２で記載したように調製し、リポソームはモル比５０／４９／１のカチオン性脂質β−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリハイドロクロライド（ＡｔｕＦＥＣＴ０１）、膜融合性脂質１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）およびＰＥＧ化脂質ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥから構成された。細胞は、ＲＮＡ抽出のために、遺伝子導入して２４時間後、４８時間後、７２時間後および９６時間後にそれぞれ溶解した。
【０１１８】
全ＲＮＡは、ＩｎｖｉＴｒａｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  ＲＮＡミニキット（Ｉｎｖｉｔｅｋ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で調製した。ＰＫＮ３ｍＲＮＡ発現の阻害、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２ｍＲＮＡの発現は、実施例３で記載したようにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）分析によって検出した。ｍＲＮＡ量は、遺伝子導入して２４時間後に溶解した未処理対照に対して示す。
【０１１９】
結果を図２に示すが、ヒト乳癌ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞において、分析した全時点で（遺伝子導入して２４時間後、４８時間後、７２時間および９６時間後）、ＰＫＮ３ノックダウンに応答した、インビトロにおけるＶＥＧＦＲ１のｍＲＮＡ発現の著しい減少が示されるが、ＶＥＧＦＲ２ｍＲＮＡ発現の減少は示されていない。
【実施例５】
【０１２０】
ヒト卵巣癌ＳＫＢＲ３細胞におけるヒトＰＫＮ３のインビトロ遺伝子サイレンシングに応答したＶＥＧＦＲ−１の発現
３ｘ１０５個のＳＫＢＲ３細胞を１０ｃｍ皿に播種し、１６時間後、実施例１で記載したようなｓｉＲＮＡ２０ｎＭで遺伝子導入し、リポソーム１μｇ／ｍｌを実施例２で記載したように調製し、リポソームはモル比５０／４９／１のカチオン性脂質β−（Ｌ−アルギニル）−２，３−Ｌ−ジアミノプロピオン酸−Ｎ−パルミチル−Ｎ−オレイル−アミドトリハイドロクロライド（ＡｔｕＦＥＣＴ０１）、膜融合性脂質１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｙＰＥ）およびＰＥＧ化脂質ＭＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥから構成された。細胞は、ＲＮＡ抽出のために、遺伝子導入して２４時間後、４８時間後、７２時間後にそれぞれ溶解した。
【０１２１】
全ＲＮＡは、ＩｎｖｉＴｒａｐ（登録商標）Ｓｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  ＲＮＡミニキット（Ｉｎｖｉｔｅｋ、Ｂｅｒｌｉｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で調製した。ＰＫＮ３ｍＲＮＡ発現の阻害、ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２ｍＲＮＡの発現は、実施例３で記載したようにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）分析によって検出した。ｍＲＮＡ量は、遺伝子導入して２４時間後に溶解した未処理対照に対して示す。
【０１２２】
結果を図３に示すが、ヒト卵巣癌ＳＫＢＲ３細胞において、遺伝子導入して７２時間後に、ＰＫＮ３ノックダウンに応答した、インビトロにおけるＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ発現の著しい減少が示されるが、ＶＥＧＦＲ２ｍＲＮＡ発現の減少は示されていない。
【実施例６】
【０１２３】
Ａｔｕ０２７による第１相臨床試験の設計
Ａｔｕ０２７による第１相試験「進行した固形癌を有する対象におけるＡｔｕ０２７（ｓｉＲＮＡ製剤）による前向き非盲検単一施設用量決定第１相試験−Ａｔｕ０２７−Ｉ−０１」（ＥｕｄｒａＣＴ  Ｎｏ．２００８−００５５８８−３２／ＮＣＴ００９３８５７４）を実施した。試験設計は図４に示す。Ａｔｕ０２７による反復４時間静脈注入治療の前（０ｈ）および最後の２４時間後（２４ｈ）に、血液をバイオマーカー分析用に採取した。ＥＤＴＡ血漿は、標準的プロトコールに従って遠心することによって調製し、−２０℃で保存した。
【実施例７】
【０１２４】
Ａｔｕ０２７で治療したヒトの血漿におけるバイオマーカー分析
Ａｔｕ０２７による反復治療の前（０ｈ）および最後の２４時間後（２４ｈ）に、９人の患者から血液を採取し、ＥＤＴＡ血漿を調製した。試料は、ルミネックス技術を使用してそれぞれの分析物の濃度を多重免疫アッセイで分析した。
【０１２５】
図５では、個々の患者における治療後／前の血漿レベルの比（２４ｈレベルを０ｈ値で除する）を、ＶＥＧＦアイソフォームＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄおよびそれらの受容体ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３について示す。ｓｉＲＮＡ含量に基づくＡｔｕ０２７用量を右の表に挙げる。９人の患者のうち７人において、ＶＥＧＦＲ１レベルは、Ａｔｕ０２７治療後著しく減少した。
【０１２６】
図５で示したＡｔｕ０２７用量に加えて、Ａｔｕ０２７  ０．０３６ｍｇ／ｋｇの用量（ｓｉＲＮＡ含量に基づく）を３人の患者に投与したところ、２人の患者が治療後／治療前の可溶性ＦＬＴ−１（ｓＦＬＴ−１）比の著しい減少を示した。
【０１２７】
単一の分析物ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３の絶対的血漿レベルを図６、図７、図８、図９、図１０、図１１および図１２のグラフおよび表に示す。再度、治療後のＶＥＧＦＲ１濃度の著しい減少を検出することができたが（図１０）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ２およびＶＥＧＦＲ３レベルは、ほとんどの患者で変化しないままであり、単一の個体ではわずかに増加または減少した。
【０１２８】
明細書、特許請求の範囲および／または図面で開示した本発明の特徴は、個々に、およびそれらを任意に組み合わせて、様々な形態で本発明を実現するために重要である。
【図１３】
2015521041.tif 000010
【図１４−１】
2015521041.tif 000011
【図１４−２】
2015521041.tif 000012
【図１５】
2015521041.tif 000013
【図１６−１】
2015521041.tif 000014
【図１６−２】
2015521041.tif 000015
【図１６−３】
2015521041.tif 000016
【図１７】
2015521041.tif 000017
【図１８−１】
2015521041.tif 000018
【図１８−２】
2015521041.tif 000019
【図１９】
2015521041.tif 000020
【図２０】
2015521041.tif 000021
【図２１−１】
2015521041.tif 000022
【図２１−２】
2015521041.tif 000023
【図２１−３】
2015521041.tif 000024
【図２１−４】
2015521041.tif 000025
【図２１−５】
2015521041.tif 000026
【図２１−６】
2015521041.tif 000027
【図２２−１】
2015521041.tif 000028
【図２２−２】
2015521041.tif 000029
【図２２−３】
2015521041.tif 000030
【図２２−４】
2015521041.tif 000031
【図１】
2015521041.tif 000032
【図２】
2015521041.tif 000033
【図３】
2015521041.tif 000034
【図４】
2015521041.tif 000035
【図５】
2015521041.tif 000036
【図６】
2015521041.tif 000037
【図７】
2015521041.tif 000038
【図８】
2015521041.tif 000039
【図９】
2015521041.tif 000040
【図１０】
2015521041.tif 000041
【図１１】
2015521041.tif 000042
【図１２】
2015521041.tif 000043
【国際調査報告】
2015521041.tif 000044
2015521041.tif 000045
2015521041.tif 000046