(57)【要約】  ＥＭＰ２発現の低減および／または抗ＥＭＰ２療法は、複数のタイプの癌の癌幹細胞を低減する。たとえば、乳癌幹細胞は、ＨＩＦ−１α、ＣＤ４４、およびＡＬＤＨの存在により定義された。癌幹細胞の数を低減するために抗ＥＭＰ２  ＩｇＧ１を使用することが可能であることが見いだされる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において癌の再発率を低減する方法であって、
ＥＭＰ２と、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＡＢＣＧ２、およびＡＬＤＨからなる群から選択される１種以上のマーカーと、を発現する患者において癌幹細胞を検出することと、
前記患者に有効量の抗体を投与することとを含み、前記抗体は、ＥＭＰ２の第２の細胞外ループ中のエピトープに特異的に結合し、前記エピトープは、アミノ酸配列ＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧを含む、
方法。
【請求項２】
前記抗体が生理学的な許容可能な担体または薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗体と競合する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域と９０％のアミノ酸同一性を共有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーのものと同一のＣＤＲ配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記患者に有効量の少なくとも１種の追加の抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種の追加の抗癌剤が、白金系化学療法薬剤、タキサン、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ２抗体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記少なくとも１種の追加の抗癌剤がＥＧＦＲ阻害剤を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＥＧＦＲ阻害剤が抗ＥＧＦＲ抗体を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗ＥＧＦＲ抗体がセツキシマブを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗ＥＧＦＲ抗体が、マツズマブ、パニツムマブ、およびニモツズマブからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＥＧＦＲ阻害剤がＥＧＦＲシグナル伝達の低分子阻害剤である、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
ＥＧＦＲシグナル伝達の前記低分子阻害剤が、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０、およびＡＧ１４７８からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１種の追加の抗癌剤がＶＥＧＦ阻害剤を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＶＥＧＦ阻害剤が抗ＶＥＧＦ抗体を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記抗体がエフェクター部分とコンジュゲートされる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記エフェクター部分が毒性剤である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記毒性剤がリシンなどである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療が、前記癌の浸潤性をブロックすることを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が前記癌のワクチン療法で使用される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記患者がヒトまたは哺乳動物である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記癌が乳癌である、請求項１〜２２に記載のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が、脳癌、結腸癌、黒色腫、白血病（たとえばＡＭＬ）、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、および胃癌を含む群から選択される癌である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
コンパニオン診断剤をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記コンパニオン診断が抗ＥＭＰ２抗体を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
患者において乳癌の再発率を低減する方法であって、
ＥＭＰ２と、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＡＢＣＧ２、およびＡＬＤＨからなる群から選択される１種以上のマーカーと、を発現する患者において癌幹細胞を検出することと、
前記患者に有効量の抗体を投与することとを含み、前記抗体は、ＥＭＰ２の第２の細胞外ループ中のエピトープに特異的に結合し、前記エピトープは、アミノ酸配列ＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧを含む、
方法。
【請求項２８】
前記抗体が生理学的な許容可能な担体または薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗体と競合する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域と９０％のアミノ酸同一性を共有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーのものと同一のＣＤＲ配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記患者に有効量の少なくとも１種の追加の抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１種の追加の抗癌剤が、白金系化学療法薬剤、タキサン、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ２抗体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記抗ＥＧＦＲ抗体がセツキシマブを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗ＥＧＦＲ抗体が、マツズマブ、パニツムマブ、およびニモツズマブからなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
少なくとも１種の追加の抗癌剤が、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０、およびＡＧ１４７８からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１種の追加の抗癌剤がＶＥＧＦ阻害剤を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
患者において子宮内膜癌の再発率を低減する方法であって、
ＥＭＰ２と、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＡＢＣＧ２、およびＡＬＤＨからなる群から選択される１種以上のマーカーと、を発現する患者において癌幹細胞を検出することと、
前記患者に有効量の抗体を投与することとを含み、前記抗体は、ＥＭＰ２の第２の細胞外ループ中のエピトープに特異的に結合し、前記エピトープは、アミノ酸配列ＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧを含む、
を含む方法。
【請求項３９】
前記抗体が生理学的な許容可能な担体または薬学的に許容可能な担体をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗体と競合する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域と９０％のアミノ酸同一性を共有する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーのものと同一のＣＤＲ配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記患者に有効量の少なくとも１種の追加の抗癌剤を投与することをさらに含む、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１種の追加の抗癌剤が、白金系化学療法薬剤、タキサン、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ２抗体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗ＥＧＦＲ抗体がセツキシマブを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗ＥＧＦＲ抗体が、マツズマブ、パニツムマブ、およびニモツズマブからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
少なくとも１種の追加の抗癌剤が、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０、およびＡＧ１４７８からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも１種の追加の抗癌剤がＶＥＧＦ阻害剤を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
癌幹細胞を検出する方法であって、
癌を有するまたは有する疑いのあるヒトに由来する生物学的サンプルを取得することと、
ＥＭＰ２の発現と、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＡＢＣＧ２、およびＡＬＤＨからなる群から選択される１種以上のマーカーの発現と、を検出することと、
を含む方法。
【請求項５０】
ＥＭＰ２発現が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗体を用いて検出される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体が、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域と９０％のアミノ酸同一性を共有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ヒトが乳癌を有するかまたは有する疑いがある、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ヒトが三重陰性乳癌を有するかまたは有する疑いがある、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ヒトが子宮内膜癌を有するかまたは有する疑いがある、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条第（ｅ）項の規定により２０１２年３月３０日出願の米国特許出願第６１／６１７，９９６号（その開示はその全体が参照により組み込まれる）に基づく特典を主張する。
【０００２】
政府の権利
本研究は、米国退役軍人局（U.S. Department of Veterans Affairs）により支援されたものであり、連邦政府は、本発明に関する一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、抗ＥＭＰ２抗体、その医薬組成物、およびそれらを用いて複数のタイプの癌の癌幹細胞を低減および検出するための方法に関する。より特定的には、本発明はまた、癌幹細胞の同定方法、標的／薬剤発見、抗腫瘍ワクチン、ならびに癌の診断および治療に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
癌死亡者は、米国だけでも毎年何十万人にも達しており、癌は、依然として世界的に死亡の主原因である。手術、放射線療法、および化学療法による特定の形態の癌の治療の進歩にもかかわらず、多くのタイプの癌は、依然として本質的に不治である。外科的切除、放射線療法、および／または化学療法により初期の癌が効果的に治療されたように思われる場合でさえも、通常、癌は再発する。そのような再発癌は、化学療法剤に対してきわめて耐性または不応性になる。化学療法後のそのような急速な再発および不応は、癌幹細胞（ＣＳＣ）により引き起こされると考えられる。
【０００５】
ＣＳＣは、正常幹細胞と共通した特徴を有する癌細胞である。特定的には、すべての幹細胞と同様に、ＣＳＣは、自己再生能と複数の系列への分化能とを有する。したがって、ＣＳＣは、癌細胞に分化可能である（すなわち、ＣＳＣは、腫瘍原性である）。
【０００６】
ＣＳＣは、新生物クローンを発生および維持する能力などの幹細胞様性質を有する腫瘍細胞の一部を含む。これらの細胞は、自己再生能を有するが、そのほかに、表現型が多様な、ただし、より低い腫瘍形成能の癌細胞をもたらす前駆体を生成する。幹細胞様細胞のこのサブ集団は、癌幹細胞でない腫瘍細胞と比較して、腫瘍の形成および転移腫瘍の広がりが効率的である。
【０００７】
過去数年間にわたり、癌幹細胞（ＣＳＣ）の認識および理解は、飛躍的な進歩を遂げてきた。現在では、特異的経路の活性化により一部の腫瘍細胞に「幹細胞様」性質を付与可能であることが、通説となっている。ＣＳＣは、自己再生能またはさらなる「娘」細胞への分化能を有しており、腫瘍の再発および転移の主要な促進要因であると考えられる（１）。これらの細胞は、従来療法により排除されずに実際には富化されるので、新薬開発に向けてＣＳＣにとくに関心が払われている。したがって、これらの細胞を排除するために新しい標的および薬剤を同定することは、患者ケアにきわめて重要である。
【０００８】
ＣＳＣは、多くのタイプの癌個体発生の前提条件である。癌幹細胞は、低い増殖速度、高い自己再生能、活発に増殖する腫瘍細胞への分化傾向を呈し、かつ化学療法または放射線療法に対して耐性を示す（たとえば、Van der Griend et al. 2008を参照されたい）。さらに、ＣＳＣは、たとえば、血液癌、乳癌、脳癌、結腸癌、黒色腫癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、および肺癌をはじめとする多種多様な癌で同定されてきた。特定的には、ＣＳＣは、白血病、膠芽腫、髄芽腫、およびほとんどすべてのタイプの上皮腫瘍（癌腫）に見いだされうる。したがって、ＣＳＣは、おそらく、多種多様な癌において腫瘍の増殖、癌の進行、転移、および再発の一因となっている。
【０００９】
ＣＤ４４＋、ＣＤ２４−、ＥＳＡ＋、およびＡＬＤＨ１発現を含む癌幹細胞上でいくつかの分子が同定されてきたが、これらのタンパク質は、広範に発現されるので、依然として魅力のない標的である（Lobo et al., “The Biology of Cancer Stem Cells,” Annual Review of Cell and Developmental Biology. 2007;23:675-99; Charafe-Jauffret et al., “Breast Cancer Cell Lines Contain Functional Cancer Stem Cells with Metastatic Capacity and a Distinct Molecular Signature," Cancer Research, 2009;69:1302-13; Biddle et al., "Cancer Stem Cells in Squamous Cell Carcinoma Switch between Two Distinct Phenotypes That Are Preferentially Migratory or Proliferative," Cancer Research, 2011;71:5317-26）。さらに、癌幹細胞は、放射線療法および化学療法の両方に対して比較的耐性であることが示されているので、耐性および療法後の再発に有意に寄与する（Charafe-Jauffret et al., “Breast Cancer Cell Lines Contain Functional Cancer Stem Cells with Metastatic Capacity and a Distinct Molecular Signature,” Cancer Research, 2009; 69:1302-13; Biddle et al., "Cancer Stem Cells in Squamous Cell Carcinoma Switch between Two Distinct Phenotypes That Are Preferentially Migratory or Proliferative," Cancer Research,
2011;71:5317-26; Li et al., "Intrinsic Resistance of Tumorigenic Breast Cancer Cells to Chemotherapy," Journal of the National Cancer Institute, 2008;100:672-9; Croker et al., "Inhibition of aldehyde dehydrogenase (ALDH) activity reduces chemotherapy and radiation resistance of stem-like ALDHhiCD44+ human breast cancer cells," Breast Cancer Research and Treatment, 2012;133:75-87; Rich et al., “Chemotherapy and Cancer Stem Cells,” Cell Stem Cell 2007;1:353-5）。実際に、パクリタキセルやエピルビシンなどの化学療法剤は、ＡＬＤＨ陽性細胞の数を増加させることが示されている（Tanei et al., “Association of Breast Cancer Stem Cells Identified by Aldehyde Dehydrogenase 1 Expression with Resistance to Sequential Paclitaxel and Epirubicin-Based Chemotherapy for Breast Cancers,” Clinical Cancer Research, 2009;15:4234-41）。
【００１０】
ＣＳＣは、原発腫瘍内の識別可能な表面マーカーパターンの研究に基づいて特徴付け可能である。提案されたバイオマーカーの数は増加の一途をたどっているが、なかでも、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＡＢＣＧ２、およびＡＬＤＨは、ＣＳＣを同定するために使用されてきた。さらに、異常シグナル経路は、ＣＳＣの他の提案された特徴である。（Hu et al., Am J Cancer Res, 2012, 2(3):340-356）。たとえば、Ｗｎｔ、Ｎｏｔｃｈ、およびＨｅｄｇｅｈｏｇシグナリング経路は、ＣＳＣの提案された特徴である。
【００１１】
ＣＤ４４は、ＣＳＣのロバストなマーカーとして報告された（Chu et al. 2009; Takaishi et al. 2009）。結腸直腸腫瘍由来のＣＤ４４＋単細胞は、ｉｎ  ｖiｔｒｏでスフェアを形成可能であり、かつ原発腫瘍の性質に類似した異種移植腫瘍を発生可能であった（Du et al. 2008）。ＣＤ１３３もまた、ＣＳＣのマーカーである。ＣＤ１３３は、最初は、ヒト造血幹細胞に特異的な表面抗原としてならびにネズミ神経上皮およびいくつかの他の胚上皮に対するマーカーとして記載された（Singh et al. 2004）。いくつかの研究では、結腸、肺、および肝臓の悪性腫瘍からＣＳＣを単離するために、ＣＤ１３３が単独でまたは他のマーカーとの組合せで使用された（Haraguchi et al. 2008）。さらに、ＣＤ１３３＋腫瘍細胞は、ＣＤ１３３−腫瘍細胞よりも効果的に放射線誘発ＤＮＡ損傷を修復する（Bao et al. 2006）。
【００１２】
ＣＳＣは、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）で最初に報告された。（Hu et al., Am J Cancer Res, 2012, 2(3):340-356 and Lapidot et al., Nature, 1994, 367:645-648）。ＡＭＬサンプル中には、１０，０００個中１個未満のＣＳＣが存在する。しかしながら、たとえ１：１０，０００の割合であっても、ＣＳＣは、ＡＭＬ細胞を再増殖する能力を有するので、ＣＳＣの自己再生能および分化能の証拠を提供する。ＡＭＬ中のＣＳＣに関するこの最初の報告以来、ＣＳＣは、固形腫瘍でも同定されてきた。たとえば、固形腫瘍中のＣＳＣに関する最初の報告は、２００３年の乳癌中のものであり、その後の研究では、脳癌、結腸癌、黒色腫癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、肺（lunch）癌、および胃癌（gastric caners）中でもＣＳＣが示された。Hu et al., Am J Cancer Res, 2012, 2(3):340-356 and Al-Hajj et al., PNAS, 2003, 100:3983-3988）。したがって、ＣＳＣは、さまざまな癌に広がっており、ＣＳＣを標的として根絶する治療が必要とされている。
【００１３】
癌幹細胞の存在は、癌療法にとって深い意味を有する。療法は、腫瘍塊を縮小するその能力により同定されるので、既存の療法は、主に、腫瘍細胞のバルク集団に対して開発されてきた。しかしながら、ＣＳＣは、多くの場合、化学療法に対して耐性であり、化学療法の失敗の原因となりうる（Sell et al. 2008）。したがって、バルクの癌細胞を死滅させる従来の化学療法では、多くの場合、従来の化学療法に対して耐性のあるＣＳＣが放置される。したがって、化学療法による非ＣＳＣ癌細胞の低減後にＣＳＣがより速く増殖可能であるので、ＣＳＣは、化学療法後の急速な再発および反復の機序の１つであると考えられる。
【００１４】
さらに、ＣＳＣは、いくつかの異なる起源から生じる。たとえば、ＣＳＣは、ランダム突然変異細胞から、正常脂肪由来間質細胞、前駆細胞、分化細胞、および正常幹細胞まで、生じうる。正常幹細胞は、ＣＳＣ前駆体の主要な標的である。この理由は、正常幹細胞が、ＣＳＣのように自己再生能を有し、理論上、ＣＳＣに形質転換する突然変異をそれほど必要としないと思われることにある。さらに、正常幹細胞由来ＣＳＣは、ＣＳＣの中で最も侵攻性が高いという仮説が立てられてきた。（Park et al., Mol Ther. 2009, 17:219-230）。
【００１５】
したがって、ＣＳＣは、化学療法および放射線療法に対して比較的耐性であることから、治療耐性および再発に寄与しうるので、この細胞集団を標的とすることに成功することがきわめて重要である。ＣＳＣを特異的に標的とするように設計された戦略は、患者の転帰を改善する重要な手段となる。したがって、さらなる好適な癌幹細胞マーカーを同定して、これらのマーカーを診断および予後予測の方法のためにならびに／またはＣＳＣを標的とする療法を開発するために使用できるようにすることがきわめて望ましい。
【００１６】
したがって、ＣＳＣ上に発現される新しい分子標的を同定する必要性が、当技術分野に依然として存在する。本開示は、このおよび他の必要性に対処する。
【００１７】
本明細書に報告されるように、上皮膜タンパク質２（ＥＭＰ２）は、ＣＳＣで過剰発現される。ＥＭＰ２は、増殖停止特異的３（ＧＡＳ３）ファミリーに属する四回膜貫通タンパク質である。機能的には、ＥＭＰ２は、インテグリンαｖβ３および焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）の両方に会合して、それらの局在および活性を変調する。ＥＭＰ２（配列番号１）は、肺、眼、および泌尿生殖管の上皮細胞で高レベルに発現される。いくつかの四回膜貫通タンパク質（ＣＤ９、ＣＤ８１、ＰＭＰ２２）のように、ネズミ線維芽細胞のＥＭＰ２は、脂質ラフトドメインに局在化される。ＥＭＰ２は、特定のインテグリン、ＧＰＩ結合タンパク質、およびＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面輸送および機能を制御し、カベオリン発現を相反的に調節する。（Claas et al., J Biol Chem 276:7974-84 (2001); Hasse et al., J Neurosci Res 69:227-32 (2002); Wadehra et al., Exp Mol Pathol 74:106-12 (2003); Wadehra et al., Mol Biol Cell 15:2073-2083 (2004); Wadehra et al., J Biol Chem 277:41094-41100 (2002); and Wadehra et al., Clin Immunol 107:129-136 (2003)を参照されたい）。
【００１８】
配列番号１（受託番号Ｐ５４８５ｌ）ＭＬＶＬＬＡＦＩＩＡ  ＦＨＩＴＳＡＡＬＬＦ  ＩＡＴＶＤＮＡＷＷＶ  ＧＤＥＦＦＡＤＶＷＲ  ＩＣＴＮＮＴＮＣＴＶ  ＩＮＤＳＦＱＥＹＳＴ  ＬＱＡＶＱＡＴＭＩＬ  ＳＴＩＬＣＣＩＡＦＦ  ＩＦＶＬＱＬＦＲＬＫ  ＱＧＥＲＦＶＬＴＳＩ  ＩＱＬＭＳＣＬＣＶＭ  ＩＡＡＳＩＹＴＤＲＲ  ＥＤＩＨＤＫＮＡＫＦ  ＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧ  ＹＳＹＩＬＡＷＶＡＦ  ＡＣＴＦＩＳＧＭＭＹ  ＬＩＬＲＫＲＫ
【００１９】
ＥＭＰ２は、ポストゴルジエンドソーム区画から適切な形質膜位置への分子の移動を促進することにより、種々のタンパク質および糖脂質の輸送を調節するにように思われる。特定的には、ＥＭＰ２は、糖脂質富化脂質ラフトマイクロドメイン（ＧＥＭ）内への所定の分子の適切な輸送を促進すると考えられる（Wadehra et al., Mol Biol Cell 15:2073-83 (2004)）。ＧＥＭは、多くの場合、シャペロン、レセプトソーム、および効率的シグナル伝達に重要なタンパク質複合体に関連付けられるコレステロールリッチマイクロドメインである（Leitinger et al., J Cell Sci 115:963-72 (2002); Moffett et al., J Biol Chem 275:2191-8 (2000)）。さらに、ＧＥＭは、ゴルジ装置から形質膜に向かうタンパク質の適正な選別に関与する（Abrami et al., J Biol Chem 276:30729-36 (2001); Galbiati et al., Cell 106:403-11 (2001); Gruenberg et al., Curr Opin Cell Biol 7: 552-63 (1995)）。これに関して、形質膜上でのＥＭＰ２発現レベルまたはその位置を変調することにより、インテグリン、焦点接着キナーゼ、クラスＩ主要組織適合性分子、およびＣＤ５４やＧＰＩ結合タンパク質などの他の免疫グロブリンスーパーファミリーメンバーを含むいくつかのクラスの分子の表面レパートリーを変化させる（Wadehra et al., Dev Biol 287:336-45 (2005); Wadehra et al., Clinical Immunology 107:129-36 (2003); Morales et al., Invest Opthalmol Vis Sci (2008)）。
【００２０】
ＥＭＰ２発現は、ＥＭＰ２新形成に関連付けられる（Wadehra et al., Cancer 107:90-8 (2006)）。たとえば、子宮内膜癌では、ＥＭＰ２は、臨床転帰不良の腫瘍に対する独立した予後指標である。ＥＭＰ２陽性腫瘍は、ＥＭＰ２陰性腫瘍と比較して、有意により大きい子宮筋層浸潤性、より重い臨床状態、外科的切除後の再発疾患または持続疾患、およびより早期の死亡を有していた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本明細書に記載の研究に基づいて、現在では、ＥＭＰ２は、さまざまな癌（たとえば乳癌）でＣＳＣの治療標的として使用可能であることが示される。したがって、ＥＭＰ２ポリペプチド、抗ＥＭＰ２抗体、およびＥＭＰ２  ｓｉＲＮＡを用いて、ＣＳＣを診断および治療し、さまざまな癌の治癒を促進することが可能である。以上で考察したように、依然として、癌のＣＳＣの予防、治療、および変調に有用な方法および組成物の必要性が大いに存在する。したがって、本発明は、これらのおよび他の必要性を満たすための新規な組成物および方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
発明の簡単な概要
一実施形態では、本発明は、患者において癌の再発率を低減する方法を含む。特定の実施形態では、本方法は、患者において癌幹細胞を検出することを含む。特定の実施形態では、癌幹細胞は、ＥＭＰ２と、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＡＢＣＧ２、およびＡＬＤＨからなる群から選択される１種以上のマーカーと、を発現する。特定の実施形態では、癌幹細胞が検出された後、有効量の抗ＥＭＰ２抗体が患者に投与される。特定の実施形態では、抗体は、ＥＭＰ２の第２の細胞外ループ中のエピトープに特異的に結合する。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸配列ＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧを含む。
【００２３】
特定の実施形態では、抗体は、生理学的な許容可能な担体または薬学的に許容可能な担体をさらに含む。特定の実施形態では、抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗体と競合する。特定の実施形態では、抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域と９０％のアミノ酸同一性を共有する。特定の実施形態では、抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーのものと同一のＣＤＲ配列を含む。
【００２４】
特定の実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも１種の追加の抗癌剤を患者に投与することをさらに含む。特定の実施形態では、少なくとも１種の追加の抗癌剤は、白金系化学療法薬剤、タキサン、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ２抗体、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００２５】
特定の実施形態では、少なくとも１種の追加の抗癌剤は、ＥＧＦＲ阻害剤を含む。特定の実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体を含む。特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブを含む。特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、マツズマブ、パニツムマブ、およびニモツズマブからなる群から選択される。特定の実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲシグナル伝達の低分子阻害剤である。
【００２６】
特定の実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達の低分子阻害剤は、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０、およびＡＧ１４７８からなる群から選択される。
【００２７】
特定の実施形態では、少なくとも１種の追加の抗癌剤は、ＶＥＧＦ阻害剤を含む。特定の実施形態では、ＶＥＧＦ阻害剤は、抗ＶＥＧＦ抗体を含む。特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブである。
【００２８】
特定の実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、エフェクター部分にコンジュゲートされる。特定の実施形態では、エフェクター部分は、毒性剤である。特定の実施形態では、毒性剤は、リシンなどである。
【００２９】
特定の実施形態では、治療は、癌の浸潤性をブロックすることを含む。
【００３０】
特定の実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、癌に対するワクチン療法に使用される。
【００３１】
特定の実施形態では、患者は、ヒトまたは哺乳動物である。
【００３２】
特定の実施形態では、癌は乳癌である。特定の実施形態では、癌は、脳癌、結腸癌、黒色腫、白血病（たとえばＡＭＬ）、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、および胃癌を含む群から選択される癌である。
【００３３】
特定の実施形態では、本方法は、コンパニオン診断剤をさらに含む。特定の実施形態では、コンパニオン診断剤は、抗ＥＭＰ２抗体を含む。
【００３４】
第２の実施形態では、本発明は、患者において乳癌の再発率を低減する方法を含む。特定の実施形態では、本方法は、患者において癌幹細胞を検出することを含む。特定の実施形態では、癌幹細胞は、ＥＭＰ２と、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＡＢＣＧ２、およびＡＬＤＨからなる群から選択される１種以上のマーカーと、を発現する。特定の実施形態では、癌幹細胞が検出された後、有効量の抗ＥＭＰ２抗体が患者に投与される。特定の実施形態では、抗体は、ＥＭＰ２の第２の細胞外ループ中のエピトープに特異的に結合する。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸配列ＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧを含む。
【００３５】
特定の実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、生理学的な許容可能な担体または薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【００３６】
特定の実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗体と競合する。特定の実施形態では、抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域と９０％のアミノ酸同一性を共有する。特定の実施形態では、抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーのものと同一のＣＤＲ配列を含む。
【００３７】
特定の実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも１種の追加の抗癌剤を患者に投与することをさらに含む。
【００３８】
特定の実施形態では、少なくとも１種の追加の抗癌剤は、白金系化学療法薬剤、タキサン、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ２抗体、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００３９】
特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブを含む。特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、マツズマブ、パニツムマブ、およびニモツズマブからなる群から選択される。
【００４０】
特定の実施形態では、少なくとも１種の追加の抗癌剤は、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０、およびＡＧ１４７８からなる群から選択される。
【００４１】
特定の実施形態では、少なくとも１種の追加の抗癌剤は、ＶＥＧＦ阻害剤を含む。
【００４２】
第３の実施形態では、本発明は、患者において子宮内膜癌の再発率を低減する方法を含む。特定の実施形態では、本方法は、患者において癌幹細胞を検出することを含む。特定の実施形態では、癌幹細胞は、ＥＭＰ２と、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＡＢＣＧ２、およびＡＬＤＨからなる群から選択される１種以上のマーカーと、を発現する。特定の実施形態では、癌幹細胞が検出された後、有効量の抗ＥＭＰ２抗体が患者に投与される。特定の実施形態では、抗体は、ＥＭＰ２の第２の細胞外ループ中のエピトープに特異的に結合する。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸配列ＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧを含む。
【００４３】
特定の実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、生理学的な許容可能な担体または薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
【００４４】
特定の実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗体と競合する。特定の実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域と９０％のアミノ酸同一性を共有する。特定の実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーのものと同一のＣＤＲ配列を含む。
【００４５】
特定の実施形態では、本方法は、有効量の少なくとも１種の追加の抗癌剤を患者に投与することをさらに含む。
【００４６】
特定の実施形態では、少なくとも１種の追加の抗癌剤は、白金系化学療法薬剤、タキサン、チロシンキナーゼ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＥｒｂＢ２抗体、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００４７】
特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、セツキシマブを含む。特定の実施形態では、抗ＥＧＦＲ抗体は、マツズマブ、パニツムマブ、およびニモツズマブからなる群から選択される。
【００４８】
特定の実施形態では、少なくとも１種の追加の抗癌剤は、ゲフィチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ペリチニブ、エルロチニブＨＣＬ、ＰＫＩ−１６６、ＰＤ１５８７８０、およびＡＧ１４７８からなる群から選択される。特定の実施形態では、
【００４９】
特定の実施形態では、少なくとも１種の追加の抗癌剤は、ＶＥＧＦ阻害剤を含む。
【００５０】
第４の実施形態では、本発明は、癌幹細胞を検出する方法を含む。特定の実施形態では、本発明は、癌を有するまたは有する疑いのあるヒトに由来する生物学的サンプルを取得することを含む。特定の実施形態では、本発明は、ＥＭＰ２の発現と、ＣＤ４４、ＣＤ１３３、ＡＢＣＧ２、およびＡＬＤＨからなる群から選択される１種以上のマーカーの発現と、を検出することを含む。
【００５１】
特定の実施形態では、ＥＭＰ２発現は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域を含む抗体を用いて検出される。特定の実施形態では、抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９ダイアボディーの重鎖および軽鎖の可変領域と９０％のアミノ酸同一性を共有する。
【００５２】
特定の実施形態では、ヒトは、乳癌を有するかまたは有する疑いがある。特定の実施形態では、ヒトは、三重陰性乳癌を有するかまたは有する疑いがある。特定の実施形態では、ヒトは、子宮内膜癌を有するかまたは有する疑いがある。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、次のことを表している。（Ａ）１８Ｆ−フルデオキシグルコースを利用した動物におけるＨＳ５７８ｔ細胞の機能的陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）解析による代謝解析。（Ｂ）記載のように治療されたＨＥＣ１ａ細胞における指示マーカーの解析。（Ｃ）治療を行ったときと行わなかったときのＢＴ４７４細胞における指示マーカーの解析。
【図２】図２は、ＨＣＣ１９３７細胞上の指示マーカーへの抗ＥＭＰ２抗体の適用および（Ｂ）指示異種移植細胞への抗ＥＭＰ２抗体の全身適用の結果を表している。
【図３】図３は、抗ＥＭＰ２がＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞において癌幹細胞を枯渇させることを示す実験を表している。
【図４】図４は、抗ＥＭＰ２がＨＥＣ１Ａヒト子宮内膜癌細胞において癌幹細胞を枯渇させることを示す実験を表している。
【図５】図５は、抗ＥＭＰ２＋ドセタキセルがＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞において腫瘍負荷を低減することを示す実験を表している。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
発明の詳細な説明
緒言
癌幹細胞（ＣＳＣ）は、自己再生能を有する腫瘍内細胞である。ＣＳＣはまた、腫瘍を含む異系列の癌細胞の発生を引き起こす。ＣＳＣは、多種多様な癌で同定されてきた。たとえば、ＣＳＣは、乳癌、脳癌、結腸癌、黒色腫癌、膵臓癌、血液癌、前立腺癌、卵巣癌、および肺癌で見いだされてきた。
【００５５】
ＣＳＣは癌細胞に分化するが、ＣＳＣおよび分化癌細胞は、通常の癌療法に対して異なる反応を示す。特定的には、ＣＳＣは、多くの場合、化学療法および放射線療法に対して耐性であるので、化学療法剤および放射線を用いて癌細胞を標的とする通常の癌療法は、ＣＳＣの根絶には有効でない。
【００５６】
出願人は、ＥＭＰ２がＣＳＣで発現されることを発見した。したがって、その第１の態様では、本発明は、癌細胞および非癌細胞においてＣＳＣを検出する、抗ＥＭＰ２抗体の組成物および方法を提供する。他の態様では、本発明は、癌細胞および非癌細胞においてＣＳＣを死滅および破壊する、抗ＥＭＰ２抗体の組成物および方法を提供する。他の態様では、本発明は、癌および癌再発可能性を診断する、抗ＥＭＰ２抗体の組成物および方法を提供する。特定の態様では、本発明は、生理学的に許容可能な担体または薬学的に許容可能な担体中の抗ＥＭＰ２抗体の投与を提供する。他の態様では、本発明は、乳癌においてＣＳＣを検出する、抗ＥＭＰ２抗体の組成物および方法を提供する。他の態様では、本発明は、１種以上の追加の療法剤と共投与する、抗ＥＭＰ２抗体の組成物および方法を提供する。他の態様では、本発明は、本明細書に記載の方法および抗体と併用するための、コンパニオン診断方法および製剤を提供する。
【００５７】
たとえば、ＥＭＰ２を標的とすることにより、乳癌、子宮内膜癌、および眼疾患の治療における治療戦略を提供しうることを以前に報告した。米国特許出願公開第２０１００２７２７３２号、同第２０１２０２６４２０号、同第２０１２００２０９８３号、および同第２０１００１９６５０９号（それらの全体が参照により組み込まれる）。抗ＥＭＰ２抗体治療に加えて、乳癌などの癌を治療するために使用される通常の化学療法薬剤は、血管形成を阻害する抗ＶＥＧＦ療法剤である。たとえば、ＶＥＧＦ療法剤としては、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、Ｓｕｔｅｎｔ（登録商標）（スニチニブ）、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）（ラニビズマブ）、Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標）（ラパチニブ）、Ｎｅｘａｖａｒ（登録商標）（ソラフェニブ）、アキシチニブ、およびパゾパニブが挙げられる。しかしながら、これらの薬剤は、確かに腫瘍を収縮させて癌進行まで時間を遅らせるが、効果は持続せず、癌は、最終的には、再発し、増殖し、そして広がる。したがって、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）やＳｕｔｅｎｔ（登録商標）などの薬剤は、乳癌細胞を死滅させうるが、再増殖および転移を引き起こす根源的な機序が存在する。
【００５８】
Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）やＳｕｔｅｎｔ（登録商標）などの癌治療剤、すなわち、血管の増殖および形成を阻害する治療剤は、癌幹細胞の数を増加させることが示されている。（Conley et al., PNAS, 2012, 109(8):2784-2789）。特定的には、これらの薬剤で治療された腫瘍がより多くの癌幹細胞を発生したマウスにおいて、癌の増殖および広がりを刺激する小数の腫瘍内細胞は、多くの場合、標準的治療に対して耐性であることが判明した。さらに、これらの各療法剤で治療した後、癌幹細胞の数および腫瘍を形成する癌幹細胞の割合は、両方とも増加した。Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）やＳｕｔｅｎｔ（登録商標）などの薬剤は、腫瘍サイズを縮小させて再発の進行を遅らせうるが、腫瘍再発および死亡を防止しえないのはなぜかを、これにより説明することが可能である。したがって、そのような薬剤が再発の防止および死亡率の減少に有効であるためには、ＣＳＣを標的としてその生存を阻害する療法剤。
【００５９】
したがって、本開示は、ＣＳＣを標的とする抗ＥＭＰ２抗体を提供する。本開示はさらに、抗血管形成薬剤と抗ＥＭＰ２抗体とを組み合わせて現在の癌治療の有効性を向上させる方法を提供する。
【００６０】
乳癌
本発明の特定の実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、乳癌に関連付けられるＣＳＣを標的とするために使用可能である（図２〜５）。
【００６１】
三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）を含めて乳癌を治療するのにより有効な療法剤を開発する際の基本的問題は、乳癌の進行、増殖、および転移に決定的に関与する乳癌幹細胞の生存能に影響を及ぼす治療ができないことである（Dick JE, “Breast cancer stem cells revealed,” PNAS, 2003;100:3547-9）。これらの幹細胞は、腫瘍中の全細胞のごく一部を占める。しかしながら、より古典的な幹細胞と同様に、それらは自己再生能を有しており、この性質は、とくに転移時に腫瘍形成の誘発に決定的に関与する。ほとんどの入手可能な抗癌剤は、多くの分化腫瘍細胞を死滅させることにより腫瘍を縮小させるが、癌幹細胞には損傷を与えないことが、いくつかの研究から示唆された。化学療法剤が癌幹細胞に影響を及ぼすことができないのは、幹細胞が活発な増殖細胞になったりより不活発な非分裂細胞になったりする能力に関連付けられうる。ほとんどの化学療法薬剤は、分裂細胞および増殖細胞を標的とするので、静止期の乳癌幹細胞に影響を及ぼしえない。たとえば、化学療法薬剤が乳癌幹細胞の生存に影響を及ぼすと同時に分化腫瘍細胞を死滅させることができないことから、腫瘍収縮が患者の生存の良好な指標になりえないのはなぜかを説明しうることが提案されてきた（Liu et al., “Targeting Breast Cancer Stem Cells,” Journal of Clinical Oncology, 2010;28:4006-12）。乳癌幹細胞を標的とする新しい療法剤は、この疾患の治療でより高い有効性を提供して疾患再発を低減することが、通説となっているが、これらの細胞を効果的かつ安全に標的として死滅させる薬剤は、現在、入手できない。
【００６２】
乳癌は、乳房組織の導管および小葉を裏打ちする細胞の異常増殖であり、癌が導管または小葉で発生するかおよび細胞が導管または小葉を介して浸潤するか（増殖するか、または広がるか）により、ならびに顕微鏡下での細胞の見え方（組織診断）により、分類される。単一の乳房腫瘍が浸潤癌とｉｎ  ｓｉｔｕ癌との混合物を有することは、珍しいことではない。
【００６３】
乳癌の分子分類により、内因性管腔サブタイプ、内因性ＨＥＲ２富化サブタイプ（ＨＥＲ２＋またはＥＲ−／ＨＥＲ２＋サブタイプとしても参照される）、および内因性基底様乳癌（ＢＬＢＣ）サブタイプを含めて、生物学的および臨床的な意味を有する特異的サブタイプ（「内因性」サブタイプと呼ばれることが多い）が同定されてきた。（Perou et al. 2000）。内因性サブタイプの同定は、典型的には、（１）病理組織学的検出と、（２）ＥＲ、ＰＲ、およびＨＥＲ２の発現状態と、（３）特徴的細胞マーカーの検出と、を含む組合せの方法により、達成されてきた。
【００６４】
正常乳腺の基底上皮細胞に特徴的な遺伝子を発現する基底様乳癌は、すべての乳癌の１５％〜２５％までを占め（Kreike et al. 2007）、すべての乳癌タイプの最悪の予後予測に関連付けられる。ＢＬＢＣは、エストロゲンレセプター（ＥＲ−）、プロゲステロンレセプター（ＰＲ−）、およびヒト表皮増殖因子レセプター２（ＨＥＲ２−）を低発現し、いわゆる「三重陰性」（ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２−）乳癌の６０％〜９０％を占める。ほとんどの基底様乳癌は、ＥＲ、ＰＲ、およびＨＥＲ２の発現状態に基づいて三重陰性として参照されることが多いが、すべての基底様乳癌が三重陰性であるとは限らない。
【００６５】
したがって、内因性基底様乳癌サブタイプは、「ハイブリッド」基底様乳癌サブタイプとして本明細書に記載される少なくとも３つの識別可能なサブタイプにさらに細分されうる。ハイブリッド三重陰性サブタイプに加えて、ハイブリッド基底様乳癌サブタイプは、基底様乳癌と少なくとも１つの他の乳癌分子サブタイプとの両方に類似したプロファイルを有する。たとえば、ハイブリッド基底様サブタイプは、ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ＋のレセプタープロファイルを有するハイブリッド基底様／ＨＥＲ２＋サブタイプ、ＥＲ＋／ＰＲ−または＋／ＨＥＲ−または＋のレセプタープロファイルを有するハイブリッド基底様／管腔サブタイプ、およびＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ−のレセプタープロファイルを有するハイブリッド基底様／三重陰性サブタイプを含みうる。
【００６６】
内因性管腔乳癌サブタイプは、ＥＲおよび／またはＰＲの発現または過剰発現（ＥＲ＋および／またはＰＲ＋）により特徴付けられる。管腔サブタイプは、ＨＥＲ２状態に基づいて、ＨＥＲ２の低発現により追加的に特徴付けられる管腔Ａサブタイプ（ＥＲ＋／ＰＲ＋または−／ＨＥＲ−）およびＨＥＲ２を過剰発現させることにより追加的に特徴付けられる管腔Ｂサブタイプ（ＥＲ＋／ＰＲ＋または−／ＨＥＲ＋）にさらに細分可能である。内因性管腔サブタイプは、多くの場合、最も治療可能な乳癌サブタイプであると考えられ、最良の予後予測に関連付けられる。
【００６７】
ＥＲおよびＨＥＲ２は、それぞれ、管腔乳癌およびＨＥＲ２乳癌の治療の指針を与えるが、依然として、化学療法がＢＬＢＣの全身療法の唯一の手段である。より若い女性、とくにアフリカ系アメリカ女性に優先的に影響を及ぼして、ＢＬＢＣは、高い組織学的グレード、侵攻性臨床挙動、ならびに脳および肺への高い転移率に関連付けられる（Carey et al. 2006）。他の乳癌サブタイプとは異なり、ＢＬＢＣでは、腫瘍サイズとリンパ節転移との間に相関が存在しないように思われる（Dent et al. 2007）。
【００６８】
ＢＬＢＣは、基底サイトケラチン（ＣＫ５／６、ＣＫ１４、およびＣＫ１７）、表皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）、ｃ−ｋｉｔ、およびｐ５３の発現に関連付けられるとともに、ＥＲ、ＰＲ、およびＨＥＲ２の発現の不在に関連付けられる。多種多様な関連遺伝子を用いて、ＢＬＢＣは、一群の診断マーカーによりさまざまな研究でさまざまに定義されてきた。たとえば、Ｎｉｅｌｓｅｎらは、基底サイトケラチン陽性、ＥＧＦＲ陽性、および／またはｃ−ｋｉｔ陽性の発現に加えて、ＥＲ陰性およびＨＥＲ２陰性の発現に基づいて、ＢＬＢＣを定義した（Nielsen et al. 2004）。一方、他のグループは、ＥＲ陰性およびＨＥＲ２陰性の発現と、ＣＫ５陽性、Ｐ−カドヘリン陽性、およびｐ６３陽性の発現（Ｅｌｓｈｅｉｋｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００８）またはビメンチン陽性、ＥＧＦＲ陽性、およびＣＫ５／６陽性の発現（Ｌｉｖａｓｙ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６）と、の組合せに基づいて、ＢＬＢＣを定義した。広範にわたるさまざまな患者コホートと組み合わせたこれらのさまざまな技術的手法により、これらのマーカーに対する一貫性のない実験結果を説明しうる。
【００６９】
ホルモンレセプターのみの検出に免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて基底様サブタイプを同定することは、テラノスティックバイオマーカーを検出することほど望ましいことではない。なぜなら、同定が、１種または複数種の特異的腫瘍マーカーの存在に基づくのではなく、エストロゲンレセプター（ＥＲ）、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）、およびヒト表皮増殖因子レセプター２（ＨＥＲ２）に対するＩＨＣ染色の不在に基づくからである。その診断は、選択ではなく２つ以上の除外である。
【００７０】
基底様乳癌は、多くの場合、「三重陰性」（すなわち、ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２−）として同義的に参照されるが、すべての三重陰性乳癌が基底様であるとは限らず、また、すべての基底様乳癌が三重陰性であるとは限らない。他の分子マーカーが以上に記載の基底様乳癌に関連付けられてきたが、そのようなマーカーは、この基底様乳癌に対して排他的ではない。
【００７１】
乳癌の一部は、抗体を用いて、たとえば、本明細書に提供される抗体を用いて、治療可能である。
【００７２】
抗体
本発明に使用される抗体は、伝統的な抗体、さらには抗体の誘導体、フラグメント、ミメティクなどのいくつかの形態をとりうる。本発明の特定の実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９である。これらの抗体およびそれらの使用については、本明細書に記載されている。
【００７３】
伝統的な抗体構造ユニットは、典型的には、四量体を含む。各四量体は、典型的には、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、各対は、１本の「軽」鎖（典型的には約２５ｋＤａの分子量を有する）と１本の「重」鎖（典型的には約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）とを有する。ヒト軽鎖は、κおよびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεとして分類され、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして抗体のアイソタイプを定義する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４をはじめとするいくつかのサブクラスを有するが、これらに限定されるものではない。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２をはじめとするサブクラスを有するが、これらに限定されるものではない。したがって、本明細書で用いられる「アイソタイプ」は、それらの定常領域の化学的および抗原的な特徴により定義される免疫グロブリンのサブクラスのいずれかを意味する。既知のヒト免疫グロブリンのアイソタイプは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭ１、ＩｇＭ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥである。治療用抗体は、アイソタイプおよび／またはサブクラスのハイブリッドをも含みうることを理解すべきである。
【００７４】
各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約１００〜１１０アミノ酸またはそれ以上の可変領域を含む。可変領域では、重鎖および軽鎖のＶドメインのそれぞれで３つのループが集まって、抗原結合部位を形成する。ループのそれぞれは、アミノ酸配列の変化が最も顕著である相補性決定領域（これ以降では「ＣＤＲ」として参照される）として参照される。「可変」とは、可変領域の特定のセグメントの配列が抗体中で広範にわたり異なるという事実を意味する。可変領域内の可変性は、一様に分布していない。その代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９〜１５アミノ酸長またはそれ以上の「超可変領域」と呼ばれるきわめて可変性の大きいより短い領域により分離された１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。
【００７５】
各ＶＨおよびＶＬは、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）および４つのＦＲがアミノ末端からカルボキシ末端方向に次の順序：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４で配置されて構成される。
【００７６】
超可変領域は、一般的には、軽鎖可変領域中のほぼアミノ酸残基２４〜３４（ＬＣＤＲ１、「Ｌ」は軽鎖を表す）、５０〜５６（ＬＣＤＲ２）、および８９〜９７（ＬＣＤＲ３）と、重鎖可変領域中のおよそ３１〜３５Ｂ（ＨＣＤＲ１、「Ｈ」は重鎖を表す）、５０〜６５（ＨＣＤＲ２）、および９５〜１０２（ＨＣＤＲ３）と、からのアミノ酸残基（Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）、ならびに／または軽鎖可変領域中の超可変ループ（たとえば、残基２６〜３２（ＬＣＤＲ１）、５０〜５２（ＬＣＤＲ２）、および９１〜９６（ＬＣＤＲ３）と、重鎖可変領域中の２６〜３２（ＨＣＤＲ１）、５３〜５５（ＨＣＤＲ２）、および９６〜１０１（ＨＣＤＲ３）と、を形成する残基（Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917）を包含する。本発明に係る特異的ＣＤＲは、以下に記載される。
【００７７】
本明細書全体を通じて、可変ドメイン中の残基（およそ軽鎖可変領域の残基１〜１０７および重鎖可変領域の残基１〜１１３）を参照する場合、一般的には、カバット番号付け体系が使用される（たとえば、Kabat et al., supra (1991)）。
【００７８】
ＣＤＲは、抗体の抗原結合部位、より特定的にはエピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」とは、パラトープとして知られる抗体分子の可変領域中の特異的抗原結合部位と相互作用する決定基を意味する。エピトープは、アミノ酸や糖側鎖などの分子の集団であり、通常、特異的構造特性さらには特異的電荷特性を有する。単一抗原は、２つ以上のエピトープを有しうる。たとえば、本明細書に記載されるように、抗体は、ＥＭＰ２の推定の第２の細胞外ドメイン中のエピトープに結合する。
【００７９】
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性成分とも呼ばれる）と、結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、たとえば、特異的に抗原に結合するペプチドにより効果的にブロックされるアミノ酸残基（言い換えれば、アミノ酸残基は、特異的に抗原に結合するペプチドのフットプリント内に存在する）と、を含みうる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、エピトープは、配列番号２に由来する。ただし、配列番号２は、ＥＤＩＨＤＫＮＡＫＦＹＰＶＴＲＥＧＳＹＧであり、ヒトＥＭＰ２の第２の細胞外ループからの２０ｍｅｒポリペプチド配列を表す。
【００８１】
エピトープは、コンフォメーショナルまたは線状でありうる。コンフォメーショナルエピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸により生成される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の近接アミノ酸残基により生成されるものである。コンフォメーショナルエピトープおよび非コンフォメーショナルエピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合が失われるのに対して後者への結合が失われないという点で識別されうる。
【００８２】
エピトープは、ユニークな空間コンフォメーションで、典型的には少なくとも３、より一般的には少なくとも５または８〜１０アミノ酸を含む。同一エピトープを認識する抗体は、一方の抗体が標的抗原への他方の抗体の結合をブロックする能力を示す単純免疫アッセイで検証可能である（たとえば「ビンニング」）。
【００８３】
各鎖のカルボキシ末端部分は、主にエフェクター機能に関与する定常領域を定義する。Ｋａｂａｔらは、重鎖および軽鎖の可変領域の多数の一次配列を収集した。配列の保存度に基づいて、彼らは、個別の一次配列をＣＤＲおよびフレームワークに分類し、そのリストを作成した（SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th edition, NIH publication, No. 91-3242, E.A. Kabat et al.（参照により全体が組み込まれる）を参照されたい）。
【００８４】
免疫グロブリンのＩｇＧサブクラスでは、重鎖中にいくつかの免疫グロブリンドメインが存在する。「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、本明細書では、識別可能な三次構造を有する免疫グロブリンの領域を意味する。本発明で興味深いのは、定常重鎖（ＣＨ）ドメインとヒンジドメインとを含む重鎖ドメインである。ＩｇＧ抗体との関連では、ＩｇＧアイソタイプは、それぞれ、３つのＣＨ領域を有する。したがって、「ＣＨ」ドメインは、ＩｇＧとの関連では、次のとおりである。すなわち、「ＣＨ１」は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づいて位置１１８〜２２０を意味する。「ＣＨ２」は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づいて位置２３７〜３４０を意味し、「ＣＨ３」は、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づいて位置３４１〜４４７を意味する。
【００８５】
重鎖の他のタイプのＩｇドメインは、ヒンジ領域である。「ヒンジ」または「ヒンジ領域」または「抗体ヒンジ領域」または「免疫グロブリンヒンジ領域」とは、本明細書では、抗体の第１および第２の定常ドメイン間のアミノ酸を含むフレキシブルポリペプチドを意味する。構造的には、ＩｇＧ  ＣＨ１ドメインは、ＥＵ位置２２０で終了し、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインは、残基ＥＵ位置２３７で開始される。したがって、ＩｇＧに対して、抗体ヒンジは、本明細書では、位置２２１（ＩｇＧ１中のＤ２２１）から２３６（ＩｇＧ１中のＧ２３６）までを含むように定義される。ただし、番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づく。いくつかの実施形態では、たとえば、Ｆｃ領域との関連では、下側ヒンジが含まれる。この場合、「下側ヒンジ」は、一般的には、位置２２６または２３０に対して参照される。
【００８６】
本発明で興味深いのは、Ｆｃ領域である。本明細書で用いられる「Ｆｃ」または「Ｆｃ領域」または「Ｆｃドメイン」とは、第１の定常領域免疫グロブリンドメインおよびいくつかの場合にはヒンジの一部を除いた抗体の定常領域を含むポリペプチドを意味する。したがって、Ｆｃとは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、およびこれらのドメインのＮ末端のフレキシブルヒンジを意味する。ＩｇＡおよびＩｇＭでは、Ｆｃは、Ｊ鎖を含みうる。ＩｇＧでは、Ｆｃドメインは、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３（Ｃγ２およびＣγ３）と、Ｃγ１（Ｃγ１）とＣγ２（Ｃγ２）との間の下側ヒンジ領域と、を含む。Ｆｃ領域の境界はさまざまでありうるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６またはＰ２３０からそのカルボキシル末端までを含む。ただし、番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスに基づく。いくつかの実施形態では、以下でより完全に説明されるように、たとえば、１つ以上のＦｃγＲレセプターまたはＦｃＲｎレセプターへの結合を変化させるために、Ｆｃ領域にアミノ酸修飾が行われる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、抗体は全長である。「全長抗体」とは、本明細書では、本明細書に概説される１つ以上の修飾を含めて、可変領域と定常領域とを含む抗体の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。
【００８８】
他の選択肢として、抗体は、抗体フラグメント、モノクローナル抗体、二重特異的抗体、ミニボディー、ドメイン抗体、合成抗体（本明細書では「抗体ミメティック」として参照されることもある）、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合体（「抗体コンジュゲート」として参照されることもある）、および対応するそれぞれのフラグメントをはじめとするさまざまな構造でありうるが、これらに限定されるものではない。依然として依存する構造
【００８９】
一実施形態では、抗体は、抗体フラグメントである。特異的抗体フラグメントとしては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント、（ｉｖ）単一可変部からなるｄＡｂフラグメント（Ward et al., 1989, Nature 341:544-546（参照により全体が組み込まれる））、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）２つの結合されたＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント、（ｖｉｉ）２つのドメインを会合させて抗原結合部位の形成を可能にするペプチドリンカーによりＶＨドメインとＶＬドメインとが結合されている一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Bird et al., 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883（参照により全体が組み込まれる））、（ｖｉｉｉ）二重特異的一本鎖Ｆｖ（国際公開第０３／１１１６１号（参照により本明細書に組み込まれる））、ならびに（ｉｘ）遺伝子融合により構築された多価フラグメントまたは多重特異的フラグメントである「ダイアボディー」または「トリアボディー」（Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448（いずれも参照により全体が組み込まれる））が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
いくつかの実施形態では、抗体は、異なる種由来の混合物、たとえば、キメラ抗体および／またはヒト化抗体でありうる。すなわち、本発明では、ＣＤＲセットは、本明細書に配列により特定的に記載されたもの以外のフレームワーク領域および定常領域と併用可能である。
【００９１】
一般的には、「キメラ抗体」および「ヒト化抗体」は両方とも、２つ以上の種由来の領域を組み合わせた抗体を意味する。たとえば、「キメラ抗体」は、伝統的には、マウス（またはいくつかの場合にはラット）由来の可変領域とヒト由来の定常領域とを含む。「ヒト化抗体」は、一般的には、可変ドメインフレームワーク領域をヒト抗体中に見いだされる配列と交換した非ヒト抗体を意味する。一般的には、ヒト化抗体では、ＣＤＲを除く全抗体は、ヒト起源のポリヌクレオチドによりコードされるか、またはそのＣＤＲ内を除けばそのような抗体と同一である。非ヒト生物に由来する核酸により一部または全部がコードされるＣＤＲは、ヒト抗体可変領域のβシートフレームワーク内にグラフトされて抗体を形成し、その特異性は、移植されたＣＤＲにより決定される。そのような抗体の形成については、たとえば、国際公開第９２／１１０１８号、Jones, 1986, Nature 321:522-525、Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536（いずれも参照により全体が組み込まれる）に記載されている。初期のグラフト構築物で失われた親和性を取り戻すために、多くの場合、対応するドナー残基への選択されたアクセプターフレームワーク残基の「復帰突然変異」が必要とされる（米国特許第５５３０１０１号、米国特許第５５８５０８９号、米国特許第５６９３７６１号、米国特許第５６９３７６２号、米国特許第６１８０３７０号、米国特許第５８５９２０５号、米国特許第５８２１３３７号、米国特許第６０５４２９７号、米国特許第６４０７２１３号（いずれも参照により全体が組み込まれる））。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部（典型的には、ヒト免疫グロブリンのもの）を含むであろう。したがって、典型的には、ヒトＦｃ領域を含むであろう。ヒト化抗体はまた、遺伝子工学操作免疫系を有するマウスを用いて発生可能である。Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654（参照により全体が組み込まれる）。非ヒト抗体をヒト化および再構成するためのさまざまな技術および方法が当技術分野で周知である（Tsurushita & Vasquez, 2004, Humanization of Monoclonal Antibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA)、およびそこで引用された参照文献（いずれも参照により全体が組み込まれる）を参照されたい）。ヒト化方法としては、Jones et al., 1986, Nature 321:522-525; Riechmann et al.,1988; Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239:1534-1536; Queen et al., 1989, Proc Natl Acad Sci, USA 86:10029-33; He et al., 1998, J. Immunol. 160: 1029-1035; Carter et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al., 1997, Cancer Res. 57(20):4593-9; Gorman et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4181-4185; O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11:321-8（いずれも参照により全体が組み込まれる）に記載の方法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ヒト化方法または非ヒト抗体可変領域の免疫原性を低減する他の方法としては、たとえば、Roguska et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969-973（参照により全体が組み込まれる）に記載されるリサーフェイシング方法が挙げられうる。一実施形態では、親抗体は、当技術分野で公知のように親和性成熟されたものである。たとえば、米国特許出願第１１／００４，５９０号に記載されるように、ヒト化および親和性成熟のために構造ベースの方法を利用��うる。限定されるものではないが、Wu et al., 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162; Baca et al., 1997, J. Biol. Chem. 272(16):10678-10684; Rosok et al., 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618; Rader et al., 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915; Krauss et al., 2003, Protein Engineering 16(10):753-759（いずれも参照により全体が組み込まれる）に記載の方法を含めて、抗体可変領域をヒト化および／または親和性成熟するために、選択ベースの方法を利用しうる。限定されるものではないが、米国特許出願第０９／８１０，５１０号、Tan et al., 2002, J. Immunol. 169:1119-1125、De Pascalis et al., 2002, J. Immunol. 169:3076-3084（いずれも参照により全体が組み込まれる）に記載の方法を含めて、他のヒト化方法は、ＣＤＲの一部のみをグラフト化することを含みうる。
【００９２】
一実施形態では、本発明に係る抗体は、多重特異的抗体、とくに二重特異的抗体でありうる。これらは、２つ（またはそれ以上）の異なる抗原に結合する抗体であるか、または同一抗原上の異なるエピトープに結合する抗体である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、抗体はダイアボディーである。
【００９４】
一実施形態では、抗体はミニボディーである。ミニボディーは、ＣＨ３ドメインに連結されたｓｃＦｖを含む最小化抗体様タンパク質である。Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061（参照により全体が組み込まれる）。いくつかの場合、ｓｃＦｖは、Ｆｃ領域に連結可能であり、ヒンジ領域の一部または全部を含みうる。
【００９５】
本発明に係る抗体は、一般的には、単離されたものであるかまたは組み換えられたものである。「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味する。たとえば、ＥＭＰ２に特異的に結合する単離された抗体は、ＥＭＰ２以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない。
【００９６】
しかしながら、ヒトＥＭＰ２またはネズミＥＭＰ２のエピトープ、アイソフォーム、または変異体に特異的に結合する単離された抗体は、他の種由来の他の関連抗原、たとえば、ＥＭＰ２種ホモログに対して交差反応性を有しうる。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないものでありうる。
【００９７】
異なる特異性を有する単離されたモノクローナル抗体を、明確に定義された組成で組み合わせることが可能である。したがって、たとえば、抗体ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９のすべての可能な組合せを、所望により、単一製剤で組み合わせることが可能である。
【００９８】
以下のヒト起源抗体配列は、ヒト（ＫＳ４９、ＫＳ８３）ＥＭＰ２およびマウス（ＫＳ８３）ＥＭＰ２に特異的な高結合活性抗体をコードし、本発明のいずれかの態様で使用するのに好適な抗体可変領域の重鎖および軽鎖を有する。
【００９９】
ＫＳ４９重鎖−
ＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＤＲＲＧＲＫＳＡＧＩＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
【０１００】
ＫＳ４９軽鎖−
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＤＹＮＧＷＴＦＧＱＧＴＫＶＤＩＫＲＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡ
【０１０１】
ＫＳ８３重鎖−
ＭＡＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＶＧＡＴＧＡＦＤＩＷＧＱＧＴＭＶＴＶＳＳＳ
【０１０２】
ＫＳ８３軽鎖−
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＴＶＳＡＳＶＧＤＲＶＩＩＰＣＲＡＳＱＳＩＧＫＷＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＫＡＳＳＬＥＧＷＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＥＦＳＬＴＩＳＳＬＱＰＤＤＳＡＴＹＶＣＱＱＳＨＮＦＰＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡ
【０１０３】
本発明のいずれかの態様に従って使用するための他のダイアボディーは、ＫＳ４１およびＫＳ８９を含む。
【０１０４】
ＫＳ４１重鎖−
ＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＦＳＥＹＰＭＨＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＳＶＡＶＩＳＹＤＧＥＹＱＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＩＮＮＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【０１０５】
ＫＳ４１軽鎖−
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＥＬＬＩＹＧＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＬＱＤＹＮＧＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡ
【０１０６】
ＫＳ８９重鎖−
ＭＡＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＬＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＳＦＳＥＹＰＭＨＷＶＲＱＡＰＧＲＧＬＥＳＶＡＶＩＳＹＤＧＥＹＱＫＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＤＳＫＳＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＰＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＴＩＮＮＧＭＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ
【０１０７】
ＫＳ８９軽鎖−
ＤＩＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＥＬＬＩＹＧＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＳＡＴＹＹＣＬＱＤＹＮＧＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡ
【０１０８】
天然抗体に対してフラグメント抗体を含む骨格または合成骨格のタンパク質をコードすべく使用される抗ＥＭＰ−２可変領域配列は、高い結合活性でＥＭＰ−２に結合可能である。この結合を介して、これらのタンパク質は、ＥＭＰ−２の検出のためにおよびＥＭＰ−２機能をブロックするために使用可能である。これらの可変領域配列を天然抗体骨格上でまたは放射性核種で標識されたｓｃＦｖ、トリアボディー、ダイアボディー、もしくはミニボディーとして発現することは、ＥＭＰ−２保有細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ検出にとくに有用である。これらの骨格または天然抗体骨格での発現は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＥＭＰ−２の機能をブロックしたりかつ／またはＥＭＰ−２保有細胞（たとえば、婦人科腫瘍）を死滅させたりするのに有利である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本発明は、図８に示されるように、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１、およびＫＳ８９から選択される抗体のＣＤＲ領域を含む抗ＥＭＰ−２配列を提供する。本発明により提供されるＣＤＲ領域は、抗体、ｓｃＦｖ、トリアボディー、ダイアボディー、ミニボディーなどをはじめとする抗ＥＭＰ−２結合タンパク質を構築するために使用しうるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態では、本発明に係る抗ＥＭＰ−２結合タンパク質は、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１、およびＫＳ８９から選択される抗体からの少なくとも１種のＣＤＲ領域を含むであろう。抗ＥＭＰ−２結合タンパク質は、たとえば、本明細書に提供される抗体からのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３、またはそれらの組合せを含みうる。本発明の特定の実施形態では、抗ＥＭＰ−２結合タンパク質、本明細書に提供される抗体の３つのＣＤＲ−Ｈ配列をすべて、本明細書に提供される抗体の３つのＣＤＲ−Ｌ配列をすべて、またはその両方を含みうる。抗ＥＭＰ２  ＣＤＲ配列は、抗体骨格またはそのフラグメントで使用されうる。同様に、ヒト化抗体またはヒト化配列を含有する抗体を含みうる。これらの抗体は、たとえば、ＥＭＰ−２を検出するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでＥＭＰ−２発現細胞を検出するために、またはＥＭＰ−２機能をブロックするために使用可能である。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ領域は、カバット定義、コチア定義、ＡｂＭ定義、コンタクト定義、または任意の他の好適なＣＤＲ番号付け体系を用いて定義されうる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ＣＤＲは、以下のとおりである。
ＣＤＲ１重鎖
ＳＹＡＭＨ（４９）
ＳＹＡＭＨ（８３）
ＥＹＰＭＨ（４１）
ＥＹＰＭＨ（８９）
【０１１１】
ＣＤＲ２重鎖
ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（４９）
ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（８３）
ＶＩＳＹＤＧＥＹＱＫＹＡＤＳＶＫＧ（４１）
ＶＩＳＹＤＧＥＹＱＫＹＡＤＳＶＫＧ（８９）
【０１１２】
ＣＤＲ１軽鎖
ＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（４９）
ＲＡＳＱＳＩＧＫＷＬＡ（８３）
ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ（４１）
ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ（８９）
【０１１３】
ＣＤＲ２軽鎖
ＡＡＳＳＬＱＳ（４９）
ＫＡＳＳＬＥＧ（８３）
ＧＡＳＳＬＱＳ（４１）
ＧＡＳＳＬＱＳ（８９）
【０１１４】
ダイアボディー配列（ＫＳ４９）
【０１１５】
重鎖、ＫＳ４９
【化１】
2015514708.tif 000002
【０１１６】
ＣＤＲ１  ＳＹＡＭＨ
【０１１７】
ＣＤＲ２  ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ
【０１１８】
軽鎖、ＫＳ４９
【化２】
2015514708.tif 000003
【０１１９】
ＣＤＲ１  ＱＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ
【０１２０】
ＣＤＲ２  ＡＡＳＳＬＱＳ
【０１２１】
ダイアボディー配列（ＫＳ８３）
【０１２２】
重鎖、ＫＳ８３
【化３】
2015514708.tif 000004
【０１２３】
ＣＤＲ１  ＳＹＡＭＨ
【０１２４】
ＣＤＲ２  ＶＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ
【０１２５】
軽鎖、ＫＳ８３
【化４】
2015514708.tif 000005
【０１２６】
ＣＤＲ１  ＲＡＳＱＳＩＧＫＷＬＡ
【０１２７】
ＣＤＲ２  ＫＡＳＳＬＥＧ
【０１２８】
ダイアボディー配列（ＫＳ４１）
【０１２９】
重鎖、ＫＳ４１
【化５】
2015514708.tif 000006
【０１３０】
ＣＤＲ１  ＥＹＰＭＨ
【０１３１】
ＣＤＲ２  ＶＩＳＹＤＧＥＹＱＫＹＡＤＳＶＫＧ
【０１３２】
軽鎖、ＫＳ４１
【化６】
2015514708.tif 000007
【０１３３】
ＣＤＲ１  ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ
【０１３４】
ＣＤＲ２  ＧＡＳＳＬＱＳ
【０１３５】
ダイアボディー配列（ＫＳ８９）
【０１３６】
重鎖、ＫＳ８９
【化７】
2015514708.tif 000008
【０１３７】
ＣＤＲ１  ＥＹＰＭＨ
【０１３８】
ＣＤＲ２  ＶＩＳＹＤＧＥＹＱＫＹＡＤＳＶＫＧ
【０１３９】
軽鎖、ＫＳ８９
【化８】
2015514708.tif 000009
【０１４０】
ＣＤＲ１  ＲＡＳＱＧＩＲＮＤＬＧ
【０１４１】
ＣＤＲ２  ＧＡＳＳＬＱＳ
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１、およびＫＳ８９から選択されるダイアボディーのＣＤＲを有する抗体（たとえば、ダイアボディー、ミニボディー、トリアボディー）またはそのフラグメントを提供する。いくつかの実施形態では、これらの抗体は、ポリヒスチンタグが欠如している。他の実施形態では、ダイアボディーは、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１、またはＫＳ８９ダイアボディーの軽鎖および重鎖を有する。さらに他の実施形態では、抗体は、ポリヒスチジンタグを含むまたは含まないＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１、およびＫＳ８９からなる群から選択されるダイアボディーと配列が実質的に同一である。さらに他の実施形態では、抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１、およびＫＳ８９からなる群から選択されるダイアボディーの軽鎖および重鎖の配列と配列が実質的に同一である。これらの同一性は、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ以上のアミノ酸配列同一性でありうる。以上のいずれかのいくつかのさらなる実施形態では、抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ８３、ＫＳ４１、またはＫＳ８９ダイアボディーのものと同一のＣＤＲ配列を含む。
【０１４３】
本発明に係る抗ＥＭＰ２抗体は、ＥＭＰ２リガンド（たとえば、配列番号１および２のヒトおよびネズミＥＭＰ２タンパク質）に特異的に結合する。
【０１４４】
特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、たとえば、抗原またはエピトープに対するＫＤが少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、他の選択肢としては少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれ以上である抗体により呈示可能である。ここで、ＫＤは、特定の抗体−抗原相互作用の解離速度を意味する。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープに対する対照分子の２０、５０、１００、５００、１０００、５，０００、１０，０００倍、またはそれ以上のＫＤを有するであろう。
【０１４５】
また、特定の抗原またはエピトープに対する特異的結合は、たとえば、抗原またはエピトープに対するＫＡまたはＫａが、エピトープに対する対照と比較して、少なくとも２０、５０、１００、５００、１０００、５，０００、１０，０００倍、またはそれ以上である抗体により呈示可能である。ここで、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を意味する。
【０１４６】
本発明はさらに、変異体抗体を提供する。すなわち、ＣＤＲのアミノ酸修飾（親和性成熟）、Ｆｃ領域のアミノ酸修飾、グリコシル化変異体、他のタイプの共有結合修飾を含めて、本発明に係る抗体に対して行いうるいくつかの修飾が存在する。ただし、これらに限定されるものではない。
【０１４７】
「変異体」とは、本明細書では、少なくとも１つのアミノ酸修飾により親ポリペプチドのものと異なるポリペプチド配列を意味する。アミノ酸修飾は、置換、挿入、および欠失を含みうるが、多くの場合、前者が好ましい。
【０１４８】
一般的には、変異体は、本明細書に記載されるように、タンパク質の機能が存在し続けるかぎり、任意の数の修飾を含みうる。すなわち、たとえば、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９のＣＤＲを用いて発生させたアミノ酸変異体の場合、抗体は、依然として、ヒトおよび／またはネズミＥＭＰ２の両方に特異的に結合するはずである。同様に、たとえば、Ｆｃ領域を用いてアミノ酸変異体を発生させた場合、変異体抗体は、抗体の特定の用途または適応に必要なレセプター結合機能を維持するはずである。
【０１４９】
しかしながら、一般的には、最小数の修飾で機能を変化させることが目的となることが多いので、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のアミノ酸置換が一般には利用される。いくつかの場合、１〜５の修飾が存在するが、多くの実施形態では、１〜２、１〜３、および１〜４でも使用される。
【０１５０】
その数のアミノ酸修飾は、機能ドメイン内でありうることに留意すべきである。すなわち、たとえば、野生型タンパク質または工学操作タンパク質のＦｃ領域に１〜５の修飾、さらには、たとえばＦｖ領域に１〜５の修飾を有することが望ましいこともありうる。変異体ポリペプチド配列は、好ましくは、親配列（たとえば、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９の可変領域、定常領域、ならびに／または重鎖配列および軽鎖配列）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、または９８もしくは９９％までの同一性を有するであろう。配列のサイズに応じて、同一性パーセントは、アミノ酸の数に依存することに留意すべきである。
【０１５１】
「アミノ酸置換」または「置換」とは、本明細書では、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を他のアミノ酸で置き換えることを意味する。たとえば、置換Ｓ１００Ａは、１００位のセリンをアラニンで置き換えた変異体ポリペプチドを意味する。本明細書で用いられる「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置にアミノ酸を追加することを意味する。本明細書で用いられる「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸を除去することを意味する。
【０１５２】
本明細書で用いられる「親ポリペプチド」、「親タンパク質」、「前駆体ポリペプチド」、または「前駆体タンパク質」とは、後続的に修飾されて変異体を発生する非修飾ポリペプチドを意味する。一般的には、本明細書の親ポリペプチドは、Ａｂ７９およびＡｂ１９である。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を意味しうる。したがって、本明細書で用いられる「親Ｆｃポリペプチド」とは、修飾されて変異体を発生するＦｃポリペプチドを意味し、本明細書で用いられる「親抗体」とは、修飾されて変異体抗体を発生する抗体を意味する。
【０１５３】
本明細書の「野生型」または「ＷＴ」または「天然」とは、対立遺伝子変異を含めて、天然に見いだされるアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質、ＷＴポリペプチド、ＷＴ抗体、ＷＴ免疫グロブリン、ＷＴＩｇＧなどは、意図的に修飾されていないアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を有する。
【０１５４】
本明細書の「変異体Ｆｃ領域」とは、少なくとも１つのアミノ酸修飾により野生型Ｆｃ配列のものと異なるＦｃ配列を意味する。Ｆｃ変異体とは、Ｆｃポリペプチド自体、Ｆｃ変異体ポリペプチドを含む組成物、またはアミノ酸配列を意味しうる。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾は、抗体（ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９）のＣＤＲの１つ以上で行われる。一般的には、任意の単一ＣＤＲ中で１または２または３個のアミノ酸のみが置換され、一般的には、一群のＣＤＲ内で４、５、６、７、８、９、または１０以下の変化が行われる。しかしながら、無置換、任意のＣＤＲ中での１、２、または３の置換の任意の組合せは、独立しておよび任意選択で、任意の他の置換と組み合わせることが可能であることを認識すべきである。
【０１５６】
いくつかの場合、ＣＤＲ中のアミノ酸修飾は「親和性成熟」として参照される。「親和性成熟」抗体は、改変を有していない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性の改良をもたらす１つ以上の改変をその１つ以上のＣＤＲ中に有するものである。いくつかの場合、稀ではあるが、抗原に対する抗体の親和性を減少させることが望ましいこともありうる。これは、一般的には、好ましくない。
【０１５７】
親和性成熟を行うことにより、「親」抗体と比較して、抗原に対する抗体の結合親和性を少なくとも約１０％〜５０−１００−１５０％または１〜５倍に増加させることが可能である。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対するナノモル親和性さらにはピコモル親和性を有するであろう。親和性成熟抗体は、既知の手順により生成される。たとえば、可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）ドメインシャフリングによる親和性成熟が記載されているＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３を参照されたい。ＣＤＲおよび／またはフレームワークの残基のランダム突然変異誘発は、たとえば、Barbas, et al. 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Shier et al., 1995, Gene 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol. 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol. 154(7):3310-9; and Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol. 226:889-896に記載されている。
【０１５８】
他の選択肢として、アミノ酸修飾は、「サイレント」な、たとえば、抗原に対する抗体の親和性を有意に変化させない、本発明に係る抗体のＣＤＲの１つ以上で、行うことが可能である。これは、発現の最適化（本発明に係る抗体をコードする核酸に対して行うことが可能である）を含めて、いくつかの理由で役立ちうる。
【０１５９】
したがって、本発明に係るＣＤＲおよび抗体の定義の範囲内には、変異体のＣＤＲおよび抗体が含まれる。すなわち、本発明に係る抗体は、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９の１つ以上のＣＤＲ中にアミノ酸修飾を含みうる。それに加えて、以下に概説されるように、アミノ酸修飾はまた、独立しておよび任意選択で、フレームワークおよび定常領域を含めてＣＤＲ外の任意の領域で行うことが可能である。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本発明に係る抗ＥＭＰ２抗体は、変異体Ｆｃドメインで構成される。当技術分野で公知のように、抗体のＦｃ領域は、いくつかのＦｃレセプターおよびＦｃリガンドと相互作用して、エフェクター機能として参照される一連の重要な機能的能力を付与する。これらのＦｃレセプターとしては、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、およびＦｃγＲＩｃを含めて、（ヒトでは）ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ１およびＦｃγＲＩＩｂ２を含む）、およびＦｃγＲＩＩｃを含めて、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ならびにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に相関付けられるアロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含めて、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、ＦｃＲｎ（新生児レセプター）、Ｃ１ｑ（補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）に関与する補体タンパク質）、およびＦｃＲｎ（血清中半減期に関与する新生児レセプター）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。たとえば、米国特許出願公開第１１／８４１，６５４号およびそこに引用されている参照文献、米国特許出願公開第２００４／０１３２１０号、米国特許出願公開第２００５／００５４８３２号、米国特許出願公開第２００６／００２４２９８号、米国特許出願公開第２００６／０１２１０３２号、米国特許出願公開第２００６／０２３５２０８号、米国特許出願公開第２００７／０１４８１７０号、米国特許出願第１２／３４１，７６９号、米国特許第６，７３７，０５６号、米国特許第７，６７０，６００号、米国特許第６，０８６，８７５号（それらはすべて、それらの全体が参照により明示的に組み込まれる）に、とくに、Ｆｃレセプターへの結合を増加させる特異的アミノ酸置換に関して一般的に概説されているように、１つ以上の位置で好適な修飾を行うことが可能である。
【０１６１】
以上に概説した修飾に加えて、他の修飾を行うことが可能である。たとえば、ＶＨおよびＶＬドメインを結合するジスルフィド架橋の組込みにより、分子を安定化させうる（Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245（参照により全体が組み込まれる））。それに加えて、以下に概説されるように行うことが可能である抗体のさまざまな共有結合修飾が存在する。
【０１６２】
抗体の共有結合修飾は、本発明の範囲内に含まれ、常にというわけではないが、一般的には、翻訳後に行われる。たとえば、抗体のいくつかタイプの共有結合修飾は、抗体の特異的アミノ酸残基と、選択された側鎖またはＮ末端もしくはＣ末端の残基と反応可能な有機誘導体化剤と、を反応させることにより、分子内に導入される。
【０１６３】
システイニル残基は、最も一般的には、クロロ酢酸やクロロアセトアミドなどのα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させると、カルボキシメチル誘導体またはカルボキシアミドメチル誘導体を与える。システイニル残基はまた、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールなどとの反応により、誘導体化されうる。
【０１６４】
それに加えて、システインでの修飾は、以下にさらに説明される抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）適用にとくに有用である。いくつかの実施形態では、抗体の定常領域は、薬剤部分のより特異的かつ制御された配置を可能にするために、とくに「チオール反応性」である１つ以上のシステインを含有するように工学操作することが可能である。たとえば、米国特許第７，５２１，５４１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１６５】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でジエチルピロカーボネートとの反応により誘導体化される。なぜなら、この作用剤は、ヒスチジル側鎖に比較的特異的であるからである。ｐ‐ブロモフェナシルブロミドもまた、有用である。反応は、好ましくは、ｐＨ６．０で０．１Ｍナトリウムカコジレート中で行われる。
【０１６６】
リシニル残基およびアミノ末端残基は、コハク酸または他のカルボン酸の無水物と反応させる。これらの作用剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬としては、イミドエステル、たとえば、メチルピコリンイミデート、ピリドキサールホスフェート、ピリドキサール、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
【０１６７】
アルギニル残基は、１種または複数種の従来の試薬、なかでもとくに、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応により、修飾される。グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルギニン残基の誘導体化は、アルカリ性条件で反応を行うことが必要とされる。さらに、これらの試薬は、リシンの基さらにはアルギニンのε−アミノ基と反応しうる。
【０１６８】
チロシル残基の特異的修飾を行いうるが、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基中へのスペクトル標識の導入は、とくに興味深い。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、それぞれ、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成する。１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてチロシル残基をヨウ素化すると、放射線免疫アッセイに使用するための標識タンパク質が調製される。この場合、以上に記載のクロラミンＴ法が好適である。
【０１６９】
カルボキシル側基（アスパルチルまたはグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）（式中、ＲおよびＲ’は、任意選択で異なるアルキル基である）、たとえば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドとの反応により、選択的に修飾される。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
【０１７０】
二官能剤による誘導体化は、以下に記載の方法に加えて、さまざまな方法に使用するための水不溶性支持体マトリックスまたは表面に抗体を架橋するのに有用である。一般に使用される架橋剤としては、たとえば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、たとえば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性イミドエステル（３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含む）、および二官能性マレイミド、たとえば、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成しうる光活性中間体を生成する。他の選択肢として、反応性水不溶性マトリックス、たとえば、米国特許第３，９６９，２８７号、同第３，６９１，０１６号、同第４，１９５，１２８号、同第４，２４７，６４２号、同第４，２２９，５３７号、および同第４，３３０，４４０号（いずれも参照により全体が組み込まれる）に記載のシノモルグソゲンブロミド活性化炭水化物および反応性基材は、タンパク質の固定化に利用される。
【０１７１】
グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は、多くの場合、それぞれ、対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基に脱アミド化される。他の選択肢として、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も、本発明の範囲内に包含される。
【０１７２】
他の修飾としては、プロリンおよびリシンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、およびヒスチジンの側鎖のα−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 [1983]（参照により全体が組み込まれる））、Ｎ末端アミンのアセチル化、および任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１７３】
それに加えて、当業者であればわかるであろうが、標識（蛍光、酵素、磁気、放射能などを含む）はすべて、抗体（さらには他の本発明に係る組成物）に追加可能である。
【０１７４】
他のタイプの共有結合修飾は、グリコシル化の改変である。他の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、１つ以上の工学操作グリコフォームを含むように修飾可能である。本明細書で用いられる「工学操作グリコフォーム」とは、抗体に共有結合で装着された炭水化物組成物を意味する。ただし、前記炭水化物の組成物は、親抗体のものとは化学的に異なる。工学操作グリコフォームは、エフェクター機能の増強または低減をはじめとするさまざまな目的に有用でありうるが、これらに限定されるものではない。工学操作グリコフォームの好ましい形態は、おそらくＦｃγＲＩＩＩａレセプターへのより密な結合を介して、ＡＤＣＣ機能の増加に関連付けられることが示されているアフコシル化である。これとの関連では、「アフコシル化」とは、宿主細胞で産生された抗体の大部分が、実質的にフコースを欠失していること、たとえば、発生された抗体の９０−９５−９８％が、抗体の炭水化物部分（一般的には、Ｆｃ領域のＮ２９７に装着される）の成分として認知可能なフコースを有していないことを意味する。機能的に定義すると、アフコシル化抗体は、一般的には、ＦｃγＲＩＩＩａレセプターに対して少なくとも５０％以上の親和性を呈する。
【０１７５】
工学操作グリコフォームは、当技術分野で公知のさまざまな方法により発生されうる。（Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473、米国特許第６，６０２，６８４号、米国特許出願第１０／２７７，３７０号、米国特許出願第１０／１１３，９２９号、国際公開第００／６１７３９Ａ１号、国際公開第０１／２９２４６Ａ１号、国際公開第０２／３１１４０Ａ１号、国際公開第０２／３０９５４Ａ１号（いずれも参照により全体が組み込まれる）、（Potelligent（登録商標）技術［Biowa, Inc., Princeton, NJ]; GlycoMAb（登録商標）グリコシル化工学操作技術［Glycart Biotechnology AG, Zuerich, Switzerland］）。これらの技術の多くは、たとえば、工学操作されたまたは他の操作が施された種々の生物または細胞系（たとえば、Ｌｅｃ−１３  ＣＨＯ細胞、ラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞）でＩｇＧを発現させることにより、グリコシル化経路に関与する酵素（たとえば、ＦＵＴ８［α１，６フコシルトランセラーゼ］および／またはβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ［ＧｎＴＩＩＩ］）を調節することにより、またはＩｇＧが発現された後で炭水化物を修飾することにより、Ｆｃ領域に共有結合で装着されるフコシル化および／または二分枝化オリゴ糖のレベルを制御することに基づく。たとえば、産生時にフコシル化を阻害する修飾糖を追加することによるＳｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ機能の「糖工学操作抗体」または「ＳＥＡ技術」、たとえば、２００９０３１７８６９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。工学操作グリコフォームとは、典型的には、異なる炭水化物またはオリゴ糖を意味するので、抗体は、工学操作グリコフォームを含みうる。
【０１７６】
他の選択肢として、工学操作グリコフォームは、異なる炭水化物またはオリゴ糖を含むＩｇＧ変異体を意味しうる。当技術分野で公知のように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（たとえば、以下で考察される特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在または不在）またはタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物の両方に依存しうる。特定の発現系は、以下で考察される。
【０１７７】
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の装着を意味する。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素装着のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を形成する。Ｏ結合グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースの１つの装着を意味するが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用しうる。
【０１７８】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、以上に記載のトリペプチド配列の１つ以上を含有するようにアミノ酸配列を改変することにより、都合よく達成される（Ｎ結合グリコシル化部位に対して）。改変はまた、出発配列に対する１つ以上のセリン残基またはトレオニン残基の付加または置換により、行われうる（Ｏ結合グリコシル化部位に対して）。簡単にするために、抗体アミノ酸配列は、好ましくは、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが発生されるように、とくに、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを所定の塩基で突然変異させることにより、ＤＮＡレベルでの変化を介して改変される。
【０１７９】
抗体上の炭水化物部分の数を増加させる他の手段は、タンパク質にグリコシドを化学的または酵素的に結合させることによりものである。これらの手順は、ＮおよびＯ結合グリコシル化に対するグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としないという点で、有利である。使用されるカップリングモードに依存して、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基、たとえば、システインのもの、（ｄ）遊離ヒドロキシル基、たとえば、セリン、トレオニン、もしくはヒドロキシプロリンのもの、（ｅ）芳香族残基、たとえば、フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファンのもの、または（ｆ）グルタミンのアミド基に装着されうる。これらの方法は、国際公開第８７／０５３３０号およびAplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306（両方とも参照により全体が組み込まれる）に記載されている。
【０１８０】
出発抗体上に存在する炭水化物部分の除去（たとえば翻訳後）は、化学的または酵素的に達成されうる。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸または等価化合物へのタンパク質の暴露を必要とする。この処理は、ポリペプチドをインタクトな状態で残存させて、結合糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外のほとんどまたはすべての糖の切断をもたらす。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 and by Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131（両方とも参照により全体が組み込まれる）により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素切断は、Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350（参照により全体が組み込まれる）により記載されるように、さまざまなエンドおよびエキソグリコシダーゼを用いることにより達成可能である。可能性のあるグリコシル化部位のグリコシル化は、Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105（参照により全体が組み込まれる）により記載されるように、化合物ツニカマイシンを用いることにより防止されうる。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成をブロックする。
【０１８１】
抗体の他のタイプの共有結合修飾は、たとえば、Nektar Therapeuticsの2005-2006 PEG Catalog（Nektarウェブサイトでは入手可能）、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、または同第４，１７９，３３７号（いずれも参照により全体が組み込まれる）に示される方法により、限定されるものではないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレンなどの種々のポリオールをはじめとする種々の非タンパク質ポリマーに抗体を結合することを含む。それに加えて、当技術分野で公知のように、ＰＥＧなどのポリマーの付加を促進するために、抗体内の種々の位置でアミノ酸置換を行いうる。たとえば、（米国特許出願公開第２００５／０１１４０３７Ａ１号（参照により全体が組み込まれる））を参照されたい。
【０１８２】
本発明は、特異的な一式のＣＤＲ（以上に概説したように、いくつかのアミノ酸置換を含む）をそれぞれ有するいくつかの抗体を提供する。以上に概説したように、抗体は、６つのＣＤＲのセットにより、可変領域により、または定常領域を含めて全長の重鎖および軽鎖により、定義が可能である。それに加えて、以上に概説したように、アミノ酸置換も行いうる。一般的には、ＣＤＲ内での変化との関連では、ＣＤＲの長さが比較的短いので、アミノ酸修飾は、一般的には、行いうるアミノ酸修飾の数に基づいて記述される。このことはまた、可変配列、定常配列、または全長配列に導入可能なアミノ酸修飾の数の考察にも当てはまるが、変化の数に加えて、これらの変化を「％同一性」により定義することも好適である。したがって、本明細書に記載されるように、本発明の範囲内に含まれる抗体は、本明細書に記載のＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９に対して、８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の同一性である。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、ヒトＥＭＰ２および／またはネズミＥＭＰ２への結合に関して、本発明に係る抗体（たとえば、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９）と競合する抗体が提供される。２種以上の抗ＥＭＰ２抗体によるＥＭＰ２またはＥＭＰ２の一部への結合の競合は、当技術分野で公知のように、任意の好適な技術により決定されうる。
【０１８４】
本発明との関連での競合とは、本発明に係る抗体（たとえば、ＫＳ４９、ＫＳ４１、ＫＳ８３、またはＫＳ８９）が試験化合物の存在下でその特定の結合パートナー（たとえば、ＥＭＰ２）に結合する傾向が、検出可能に有意に減少することを意味する。典型的には、競合とは、ＥＬＩＳＡアッセイやＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイなどの標準的技術により測定したときに、コンペティターの存在下でＥＭＰ２への本発明に係る抗体の結合が少なくとも約１０〜１００％低減することを意味する。したがって、たとえば、少なくとも約１０％の相対阻害が検出されるか、少なくとも約１５％の相対阻害が検出されるか、または少なくとも約２０％の相対阻害が検出される競合を基準に設定することが可能であり、その後、抗体が十分に競合的であるとみなれる。抗体の競合に関与するエピトープが抗原中に近接して位置する場合、競合は、ＥＭＰ２結合の約４０％超の相対阻害（たとえば、少なくとも約４５％の阻害、たとえば、少なくとも約５０％の阻害、たとえば、少なくとも約５５％阻害、たとえば、少なくとも約６０％の阻害、たとえば、少なくとも約６５％阻害、たとえば、少なくとも約７０％の阻害、たとえば、少なくとも約７５％阻害、たとえば、少なくとも約８０％の阻害、たとえば、少なくとも約８５％阻害、たとえば、少なくとも約９０％の阻害、たとえば、少なくとも約９５％阻害、またはより高レベルの相対阻害）により特徴付けられうる。
【０１８５】
いくつかの場合、競合結合アッセイの成分の１つ以上は、標識される。
【０１８６】
たとえば、ＥＭＰ２の特定の領域の抗体結合性が、そのフラグメント内で維持されている状況では、たとえば、種々の試験フラグメント中に位置する十分に提示される線状エピトープまたは十分に大きいＥＭＰ２フラグメント中さらにはＥＭＰ２中に提示されるコンフォメーショナルエピトープの場合、ＥＭＰ２エピトープの２つ以上および／またはＥＭＰ２の一部に関して、抗ＥＭＰ２抗体間に競合が存在しうる場合もありうる。
【０１８７】
競合の評価は、典型的には、本発明に係る抗体と、ＥＭＰ２（ヒトまたはネズミまたは両方のいずれか）と、試験分子と、を用いた相対阻害結合の評価を必要とする。試験分子は、他の抗体、小分子、ペプチドなどをはじめとする任意の分子を含みうる。化合物は、他の存在分子に対して対象の分子の選択性および／または特異性に関する情報を付与する比較を行うのに十分な量で混合される。
【０１８８】
試験化合物、ＥＭＰ２、および本発明に係る抗体の量は、変化させうる。たとえば、ＥＬＩＳＡ評価では、競合が存在するかを評価するために、約５〜５０μｇ（たとえば、約１０〜５０μｇ、約２０〜５０μｇ、約５〜２０μｇ、約１０〜２０μｇなど）の抗ＥＭＰ２抗体および／またはＥＭＰ２標的が必要とされる。条件はまた、結合に適したものでなければならない。典型的には、生理学的またはほぼ生理学的な条件（たとえば、約２０〜４０℃の温度、約７〜８のｐＨなど）は、抗ＥＭＰ２：ＥＭＰ２結合に適したものである。
【０１８９】
多くの場合、競合は、ＥＬＩＳＡおよび／またはＦＡＣＳ解析により決定したとき、約５％よりも有意に大きい相対阻害により特徴付けられる。特定の状況での競合の好適なレベルである基準／決定因子として、相対阻害のより高い閾値を設定することが望ましいこともありうる（たとえば、競合解析を用いて、ＥＭＰ２に結合する他のペプチドまたは分子（たとえば、ＥＭＰ２の天然結合パートナーまたは天然に存在する抗ＥＭＰ２抗体）の結合をブロックする目標機能を有するように設計された新しい抗体の選択またはスクリーニングを行う場合。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本発明に係る抗ＥＭＰ２抗体は、ＥＭＰ２中の１つ以上の残基または領域に特異的に結合するが、それだけでなく、ＥＭＰ２に対して相同性を有する他のタンパク質と交差反応しない。
【０１９１】
典型的には、交差反応性の欠如とは、好適なアッセイ条件下で十分量の分子を用いてＥＬＩＳＡおよび／またはＦＡＣＳ解析により評価したとき、分子間の相対競合阻害が約５％未満であることを意味する。
【０１９２】
開示された抗体は、リガンド−レセプター相互作用をブロックしたりまたはレセプター成分相互作用を阻害したりする際に使用しうる。本発明に係る抗ＥＭＰ２抗体は、「ブロック性」または「中和性」でありうる。「中和抗体」とは、ＥＭＰ２への結合がＥＭＰ２の生物学的活性、たとえば、リガンドと相互作用するその能力、酵素活性、および／またはシグナリング能力の阻害をもたらす抗体を意味することが意図される。ＥＭＰ２の生物学的活性の阻害は、当技術分野で公知の１つ以上のいくつかの標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのアッセイにより評価可能である。
【０１９３】
結合の阻害」または「結合のブロック」（たとえば、ＥＭＰ２へのＥＭＰ２結合パートナーの結合の阻害／ブロックを参照する場合）は、部分的および完全な阻害／ブロックの両方を包含する。ＥＭＰ２へのＥＭＰ２結合パートナーの結合の阻害／ブロックにより、ＥＭＰ２結合パートナーが阻害またはブロックなしでＥＭＰ２に結合する場合に行われる細胞シグナリングの正常なレベルまたはタイプを減少または改変しうる。阻害およびブロックはまた、抗ＥＭＰ２抗体に接触していないリガンドと比較して、抗ＥＭＰ２抗体に接触したときに、ＥＭＰ２へのＥＭＰ２結合パートナーの結合親和性が測定可能に減少すること、たとえば、ＥＭＰ２へのＥＭＰ２結合パートナーの結合が、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％、または１００％ブロックされることを含むことが意図される。
【０１９４】
本発明はさらに、開示された抗ＥＭＰ２抗体を生成する方法を提供する。この方法は、本発明に係る抗体をコードする単離された核酸を含有する宿主細胞を培養することを包含する。当業者であればわかるであろうが、これは、抗体の性質に依存して、さまざまな方法で行うことが可能である。いくつかの実施形態では、たとえば、本発明に係る抗体が全長の伝統的抗体である場合、抗体が産生されかつ単離可能である条件下の重鎖可変領域および軽鎖可変領域。
【０１９５】
一般的には、本発明に係る抗体をコードする核酸が提供される。そのようなポリヌクレオチドは、重鎖および軽鎖のそれぞれの可変領域および定常領域の両方をコードするが、本明細書に記載の組成物によれば、本発明により他の組合せも考えられる。本発明はまた、これらのポリヌクレオチドに相補的な開示されたポリヌクレオチドおよび核酸配列に由来するオリゴヌクレオチドフラグメントも対象とする。
【０１９６】
ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形態をとりうる。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核酸アナログ、および合成ＤＮＡの形態のポリヌクレオチドは、本発明の範囲内である。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖でありうる。一本鎖である場合、コード（センス）鎖または非コード（アンチセンス）鎖でありうる。ポリペプチドをコードするコード配列は、本明細書に提供されるコード配列と同一でありうるか、または遺伝暗号の重複または縮重の結果として、本明細書に提供されるＤＮＡと同一のポリペプチドをコードする異なるコード配列でありうる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本発明に係る抗体をコードする核酸は、発現ベクター中に組み込まれる。これは、染色体外でありうるか、または導入される宿主細胞のゲノム内に組み込まれるように設計される発現ベクターは、任意の数の適切な調節配列（限定されるものではないが、転写および翻訳の制御配列、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製起点などを含む）または他の成分（選択遺伝子など）を含有することが可能であり、これらはすべて、当技術分野で周知のように作動可能に結合される。いくつかの場合、２つの核酸が使用され、それぞれ異なる発現ベクター（たとえば、第１の発現ベクター）中に重鎖、第２の発現ベクター中に軽鎖）に導入されるか、または他の選択肢として、同一の発現ベクター中に導入可能である。発現ベクターの設計は、調節配列の選択を含めて、宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存しうることは、当業者であればわかるであろう。
【０１９８】
一般的には、核酸分子が１つ以上の発現制御エレメントに機能可能に結合されるように（たとえば、ベクター中に、細胞内プロセスにより形成され宿主細胞ゲノム中に組み込まれる構築物中に）、選択された宿主細胞に適した任意の方法（たとえば、形質転換、形質移入、電気穿孔、感染）を用いて、核酸および／または発現を好適な宿主細胞内に導入し、組換え宿主細胞を形成することが可能である。得られた組換え宿主細胞は、発現に好適な条件下で（たとえば、インデューサーの存在下で、好適な非ヒト動物内で、適切な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補助剤などが追加された好適な培養培地中で）維持することが可能であり、それによりコードポリペプチドが産生される。いくつかの場合、重鎖は、一方の細胞内で産生され、軽鎖は、他方の細胞内で産生される。
【０１９９】
発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は、当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（たとえば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、およびいくつかの他の細胞系をはじめとして、米国培養細胞系統保存機関（American Type Culture Collection）（ATCC）, Manassas, VAから入手可能な多くの不死化細胞系を含む。また、限定されるものではないが、細菌、酵母、昆虫、および植物をはじめとする非哺乳動物細胞を用いて、組換え抗体を発現することも可能である。いくつかの実施形態では、抗体は、ウシやニワトリなどのトランスジェニック動物内で産生可能である。
【０２００】
ＥＭＰ２と相互作用する核酸
阻害剤オリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の配列設計。公知の方法を用いて、薬剤耐性および生存率低減に関連付けられる候補遺伝子を阻害する配列を同定する。そのような阻害剤としては、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド阻害剤、および結合してＰＶＴ１発現および／または機能を阻害するように作用するアプタマー配列が挙げられる。
【０２０１】
低分子二本鎖ＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）阻害剤を発生させて、一般的にはそのコグネイトＲＮＡの切断および破壊により候補遺伝子の発現に影響を及ぼすべく、ＲＮＡ干渉を使用する。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、典型的には、１９〜２２ｎｔの二本鎖ＲＮＡである。ｓｉＲＮＡは、化学合成によりまたはＤＮＡベクターに基づくＲＮＡｉ技術により、取得可能である。ＤＮＡベクターに基づくｓｉＲＮＡ技術を用いて、対象の遺伝子を標的とする低分子ヘアピンＲＮＡをコードする低分子ＤＮＡインサート（約７０ｂｐ）を市販のベクター中にクローニングする。インサート含有ベクターを細胞内に形質移入し、低分子ヘアピンＲＮＡを発現することが可能である。ヘアピンＲＮＡは、細胞機構により１９〜２２ｎｔの二本鎖ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に迅速にプロセシングされる。好ましい実施形態では、合成的に作製されたｓｉＲＮＡは、それほど安定でなく、形質移入に有効でない傾向があるので、ｓｉＲＮＡは、好適なＲＮＡｉベクターに挿入される。
【０２０２】
Wang L, Mu F Y. (2004) A Web-based Design Center for Vector-based siRNA and siRNA cassette. Bioinformatics. (In press); Khvorova A, Reynolds A, Jayasena S D. (2003) Functional siRNAs and miRNAs exhibit strand bias. Cell. 115(2):209-16; Harborth J, Elbashir S M, Vandenburgh K, Manninga H, Scaringe S A, Weber K, Tuschl T. (2003) Sequence, chemical, and structural variation of small interfering RNAs and short hairpin RNAs and the effect on mammalian gene silencing. Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 13(2):83-105; Reynolds A, Leake D, Boese Q, Scaringe S, Marshall W S, Khvorova A. (2004) Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol. 22(3):326-30 and Ui-Tei K, Naito Y, Takahashi F, Haraguchi T, Ohki-Hamazaki H, Juni A, Ueda R, Saigo K. (2004) Guidelines for the selection of highly effective siRNA sequences for mammalian and chick RNA interference. Nucleic Acids Res. 32(3):936-48（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるような方法およびアルゴリズムを用いて、ｓｉＲＮＡを作製するびことが可能である。
【０２０３】
ｓｉＲＮＡ配列を構築するための他のツールは、GenScriptから入手可能なsiRNA Target Finder and Construct Builder（http://www.genscript.com）、Integrated DNA Technologies製のOligo Design and Analysis Tools（URL:<http://www.idtdna.com/SciTools/SciTools.aspx＞）、またはＣenter Dharmacon, Inc.製のsiDESIGN.TM.（URL:<http://design.dharmacon.com/default.aspx?source=0＞）などのウェブツールである。ｓｉＲＮＡは、標的選択領域としてＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）を用いて、好ましくは、開始コドンの５０〜１００ｎｔ下流に構築することが提案されている。ｓｉＲＮＡは、タンパク質レベルではなくｍＲＮＡレベルで機能するので、ｓｉＲＮＡを設計するために、精密な標的ｍＲＮＡヌクレオチド配列が必要とされうる。遺伝暗号およびコドンバイアスに縮重性があるので、（ペプチド配列からの適正ヌクレオチド配列を正確に予測するのは困難である。そのほかに、ｓｉＲＮＡの機能は、ｍＲＮＡ配列を切断することであるので、ｓｉＲＮＡ設計のために、ゲノム配列ではなくｍＲＮＡヌクレオチド配列を使用することが重要であるが、実施例に記載したように、ゲノム配列をｓｉＲＮＡ設計にうまく使用することが可能である。しかしながら、ゲノム情報を用いた設計は、偶発的にイントロンを標的とする可能性があり、結果として、ｓｉＲＮＡは、対応するｍＲＮをサイレンシングするように機能しないであろう。
【０２０４】
また、合理的ｓｉＲＮＡ設計を行えば、意図されない標的に対するセンス鎖またはアンチセンス鎖の部分的相補性から生じることが多いオフターゲット効果は、最小限に抑えられるはずである。この効果は、濃度依存性を有することが知られており、オフターゲット効果を最小限に抑える一方法は、多くの場合、ｓｉＲＮＡ濃度を低減することによる。そのようなオフターゲット効果を最小限に抑える他の方法は、標的特異性に関してｓｉＲＮＡをスクリーニングすることである。
【０２０５】
センス鎖の５’末端上でｓｉＲＮＡを修飾して、蛍光染料、化学基、極性基などの化合物を提示することが可能である。アンチセンス鎖の５’末端での修飾は、ｓｉＲＮＡサイレンシング活性を妨害することが示されているので、この位置は、修飾には推奨されない。他の３つの末端での修飾は、サイレンシング活性に及ぼす影響が最小限に抑えられるかまたはまったくないことが示されている。
【０２０６】
ｓｉＲＮＡ切断部位の１つを囲むようにプライマーを設計することが推奨される。こうすれば、データに生じる可能性のあるバイアスを除去するのに役立つであろう（すなわち、プライマーの一方を切断部位の上流にすべきであり、他方を切断部位の下流にすべきである）。ＰＣＲにより切断部位の５’または３’の一方を増幅した場合、バイアスが実験に入り込む可能性がある。その理由は、部分的には、切断ｍＲＮＡ産物が、分解前、どれほど長く存続しうるかを予想するのが困難なことにある。増幅領域が切断部位を含有する場合、ｓｉＲＮＡがその機能を発揮すれば、増幅は起こりえない。
【０２０７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）は、候補遺伝子機能を阻害するように設計可能である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、短い一本鎖核酸であり、その標的ｍＲＮＡに選択的にハイブリダイズにより機能し、それにより、翻訳をブロックする。翻訳は、ＤＮＡ：ＲＮＡ二本鎖でのＲＮアーゼＨヌクレアーゼ活性によるかまたはリボソーム進行を阻害することによるかのいずれかにより阻害され、それにより、タンパク質合成が阻害される。この結果、合成が中断され、続いて、標的ｍＲＮＡがコードするタンパク質の機能が失われる。
【０２０８】
好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴは、合成および精製の際、ホスホロチオエート化され、通常、１８〜２２塩基長である。候補遺伝子アンチセンスオリゴは、他の修飾、たとえば、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ、メチルホスホネート、キメラオリゴ、修飾塩基、および蛍光オリゴをはじめとする多くの他の修飾を有しうると考えられる。
【０２０９】
好ましい実施形態では、活性アンチセンスオリゴは、アンチセンスオリゴと同一の一般化学、塩基組成、および長さを有する対照オリゴと比較されるべきである。これらは、逆配列、スクランブル配列、およびセンス配列を含みうる。逆およびスクランブルが推奨される。なぜなら、それらは、活性アンチセンスオリゴヌクレオチドと同一の塩基組成を有し、したがって、同一の分子量およびＴｍを有するからである。たとえば、アンチセンスオリゴが意図されないｍＲＮＡにアニールすることもなく、免疫刺激反応を誘発することが知られているモチーフ、たとえば、４隣接Ｇ残基、６塩基以上のパリンドローム、およびＣＧモチーフを含有することもない合理的アンチセンスオリゴ設計を考えるべきである。
【０２１０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ほとんどの細胞タイプにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用して好結果を得ることが可能である。しかしながら、いくつかの細胞タイプは、細胞内への効率的輸送を行うために形質移入試薬の使用を必要とする。ほとんどの場合、形質移入試薬の添加を行って、１〜５μｍの範囲内の異なる最終オリゴヌクレオチド濃度を用いて、最適化実験を行うことが推奨される。機会の窓、すなわち、再現性のあるアンチセンス効果が得られる濃度は、極めて狭く、その範囲を超えると、紛らわしい非特異的非アンチセンス効果に遭遇し、その範囲を下回ると、まったく結果が得られない。好ましい実施形態では、標的化ｍＲＮＡのダウンレギュレーションは、ノーザンブロット、リアルタイムＰＣＲ、ｃＤＮＡ／オリゴアレイ、ウェスタンブロットなどの技術の使用により、実証されるであろう。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験では、同一エンドポイントにすることが可能であるが、行動エンドポイントを評価することも可能である。
【０２１１】
細胞培養では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、無菌ヌクレアーゼフリー水中に再懸濁すべきである（ＤＥＰＣ処理水の使用は推奨されない）。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、精製、凍結乾燥、および再懸濁使用が可能である。懸濁後、アンチセンスオリゴヌクレオチドストック溶液は、−２０℃で凍結され、数週間安定でありうる。
【０２１２】
特異的ＲＮＡまたはＤＮＡ配列に結合するアプタマー配列を作製することが可能である。アプタマー配列は、アプタマーおよびＩｎｖｉｔｒｏ選択方法およびその使用という名称の同時係属の米国特許出願第１０／９３４，８５６号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるような方法により、単離可能である。
【０２１３】
本明細書に記載の配列を変化させて、元のものと同一の機能を維持する実質的に相同な配列をもたらしうると考えられる。本明細書で用いられる場合、ポリヌクレオチドまたはそのフラグメントは、ＢＬＡＳＴＮ（Altschul, S. F., Gish, W. , Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J. (1990) “Basic local alignment search tool.” J. Mol. Biol. 215:403-410）などのアライメントプログラムを用いて、他のポリヌクレオチド（またはその相補鎖）に最適にアライメントしたとき（適切ナヌクレオチドノ挿入または欠失を含む）、他のものと「実質的に相同」（または「実質的に類似」）であり、ヌクレオチド塩基の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５〜９８％にヌクレオチド配列同一性が存在する。
【０２１４】
発現用宿主として利用可能な哺乳動物細胞系は、当技術分野で公知であり、限定されるものではないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（たとえば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、およびいくつかの他の細胞系をはじめとして、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ），  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡから入手可能な多くの不死化細胞系を含む。また、限定されるものではないが、細菌、酵母、昆虫、および植物をはじめとする非哺乳動物細胞を用いて、組換え抗体を発現することも可能である。いくつかの実施形態では、抗体は、ウシやニワトリなどのトランスジェニック動物内で産生可能である。
【０２１５】
治療方法
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与のための抗体組成物
本発明に従って使用される抗体の製剤は、所望の純度を有する抗体を任意選択の薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. [1980]）と混合することにより、凍結乾燥製剤または水性溶液剤の形態で貯蔵用として調製される。許容可能な担体、賦形剤、または安定化剤は、利用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、緩衝液、たとえば、リン酸塩、クエン酸塩、他の有機酸、抗酸化剤、たとえば、アスコルビン酸およびメチオニン、保存剤（たとえば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチルアルコール、またはベンジルアルコール、アルキルパラベン、たとえば、メチルパラベンまたはプロピルパラベン、カテコール、レソルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、たとえば、血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン、親水性ポリマー、たとえば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、たとえば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン、単糖、二糖、および他の炭水化物、たとえば、グルコース、マンノース、またはデキストリン、キレート化剤、たとえば、ＥＤＴＡ、糖、たとえば、スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトール、塩形成性対イオン、たとえば、ナトリウム、金属錯体（たとえば、Ｚｎタンパク質複合体）、および／または非イオン性界面活性剤、たとえば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０２１６】
本明細書の製剤はまた、治療される特定の適応症に対する必要に応じて、２種以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補活性を有するものを含有しうるである。たとえば、他の特異性を有する抗体を提供することが望ましいこともありうる。他の選択肢としてまたは追加として、組成物は、細胞傷害剤、サイトカイン、増殖阻害剤、および／または低分子アンタゴニストを含みうる。そのような分子は、好適には、意図された目的に有効な量で組み合わされて存在する。
【０２１７】
活性成分はまた、たとえば、コアセルベーション技術によりもしくは界面重合により調製されたマイクロカプセル、たとえば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンのマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタシレート）マイクロカプセルに、コロイド薬剤送達システム（たとえば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）に、またはマクロエマルジョンに、閉じ込めうる。そのような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０２１８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、無菌状態またはそれに近い状態であるべきである。これは、無菌濾過膜を通して濾過することにより、容易に達成される。
【０２１９】
持続放出製剤を調製しうる。持続放出製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含む。このマトリックスは、造形品、たとえば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル剤（たとえば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチルＬグルタメートとのコポリマー、非分解性エチレン−ビニルアセテート、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、たとえば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーと酢酸ロイプロリドとで構成された注射用マイクロスフェア）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−ビニルアセテートや乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間超にわたり分子の放出を可能にし、ヒドロゲルは、より短い期間にわたりタンパク質を放出する。
【０２２０】
閉じ込められた抗体が長時間にわたり身体内に残留する場合、３７℃の湿気への暴露の結果として変性または凝集するおそれがあり、生物学的活性の損失および免疫原性の可能な変化をもたらす。関与する機序に依存して、安定化のための合理的戦略を考案することが可能である。たとえば、凝集機序が、チオ−ジスルフィド相互交換を介する分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることがわかれば、スルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、湿分含有率の制御、適切な添加剤の使用、および特異的ポリマーマトリックス組成物の開発により、安定化を達成すしうる。
【０２２１】
投与方式
本発明に係る抗体および化学療法剤は、公知の方法に従って、たとえば、ボーラスとして静脈内投与により、または一定期間にわたり持続注入することにより、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、または吸入の経路により、被験体に投与される。抗体の静脈内投与または皮下投与が好ましい。
【０２２２】
特定の態様では、本発明に係る抗体および化学療法剤は、癌を有する被験体に投与される。特定の態様では、本発明に係る抗体および化学療法剤は、乳癌を有する被験体に投与される。特定の態様では、本発明に係る抗体および化学療法剤は、三重陰性乳癌を有する被験体に投与される。特定の態様では、本発明に係る抗体および化学療法剤は、脳癌、結腸癌、黒色腫、白血病（たとえば、ＡＭＬ）、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、および／または胃癌を有する被験体に投与される。
【０２２３】
治療方式
本発明に係る方法では、療法を用いて疾患または病態に対して陽性療法反応を提供する。「陽性療法反応」とは、疾患もしくは病態の改善および／または疾患もしくは病態に関連付けられる症状の改善が意図される。たとえば、陽性療法反応は、疾患の次の改善、すなわち、（１）新生物細胞数の低減、（２）新生物細胞死亡の増加、（３）新生物細胞生存の阻害、（５）腫瘍増殖の阻害（すなわち、ある程度の減速、好ましくは停止）、（６）患者生存率の増加、および（７）疾患または病態に関連付けられる１つ以上の症状のいくらかの軽減の１つ以上を意味する。
【０２２４】
任意の所与の疾患または病態における陽性療法反応は、その疾患または病態に特異的な標準化反応基準により決定可能である。腫瘍反応は、スクリーニング技術、たとえば、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）スキャン、Ｘ線ラジオグラフィーイメージング、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、骨スキャンイメージング、内視鏡検査、および腫瘍生検サンプリングを用いて、腫瘍モルフォロジー（すなわち、全腫瘍負荷、腫瘍サイズなど）の変化に関して評価可能である。
【０２２５】
これらの陽性療法反応に加えて、療法を受ける被験体は、疾患に関連付けられる症状の改善の有益な効果に遭遇しうる。
【０２２６】
そのような反応は、本発明に係る方法に従って治療した後、少なくとも４〜８週間、ときには６〜８週間で持続しうる。他の選択肢として疾患の改善は、部分反応として分類されうる。「部分反応」とは、４〜８週間または６〜８週間持続しうる病変の不在下で全測定可能腫瘍負荷（すなわち、被験体に存在する悪性細胞の数または腫瘍塊の測定量または異常モノクロナールタンパク質の量）が少なくとも約５０％減少することが意図される。
【０２２７】
本発明に係る治療は、使用される「治療上有効量」の医薬を含む。「治療上有効量」とは、必要な投与および期間で所望の治療結果を達成するのに有効な量を意味する。
【０２２８】
治療上有効量は、疾患状態、個体の年齢、性別、および体重、ならびに個体において所望の反応を誘発する医薬の能力などの因子によって異なりうる。また、治療上有効量は、治療上有益な効果が抗体または抗体部分のいかなる毒性作用または有害作用をも凌ぐ量である。
【０２２９】
腫瘍療法での「治療上有効量」はまた、疾患の進行を安定化させるその能力により測定されうる。癌を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系で評価されうる。
【０２３０】
他の選択肢として、組成物のこの性質は、細胞増殖を阻害するまたは熟練者に公知のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによりアポトーシスを誘導する化合物の能力を調べることにより、評価されうる。治療上有効量の治療用化合物は、腫瘍サイズを減少しうるか、さもなければ被験体の症状を改善しうる。当業者であれば、被験体のサイズ、被験体の症状の重症度、および選択される特定の組成物または投与経路などの因子に基づいて、そのような量を決定できるであろう。
【０２３１】
投与レジメンは、最適な所望の反応（たとえば、療法反応）を提供するように調節される。たとえば、単一ボーラスを投与しうるか、いくつかの分割用量を経時的に投与しうるか、または治療状況の緊急性に応じて比例的に用量を減少もしくは増加させうる。非経口組成物は、投与が容易になるようにかつ投与量が均一になるように投与ユニット形態で製剤化されうる。本明細書で用いられる投与ユニット製剤とは、治療される被験体に対するユニット投与量として適切な物理的に個別のユニットを意味し、各ユニットは、所要の医薬担体と一体化させて所望の治療効果が得られるように計算された所定量の活性化合物を含有する。
【０２３２】
本発明に係る投与ユニット製剤の仕様は、（ａ）活性化合物のユニークな特徴および達成される特定の治療効果、ならびに（ｂ）個体における感受性の治療のためにそのような活性化合物を配合するうえでの当技術分野に固有の制限により、およびにそれらに直接依存して、決定される。
【０２３３】
本発明で使用される抗ＥＭＰ２抗体の効率的な投与量および投与レジメンは、治療対象の疾患または病態に依存し、当業者により決定されうる。
【０２３４】
本発明に使用される抗ＥＭＰ２抗体の治療上有効量の例示的範囲は、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ、たとえば、約０．５、たとえば、０．３、約１、または約３ｍｇ／ｋｇであるが、これらに限定されるものではない。他の実施形態では、抗体は、１ｍｇ／ｋｇ以上の用量、たとえば、１〜２０ｍｇ／ｋｇの用量、たとえば、５〜２０ｍｇ／ｋｇの用量、たとえば、８ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。
【０２３５】
当該通常技術を有する医療専門家であれば、所要の医薬組成物の有効量を容易に決定し処方しうる。たとえば、医師または獣医は、医薬組成物で利用される医薬の用量を所望の治療効果を達成するために必要とされる量よりも低いレベルで開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を漸増させることが可能である。
【０２３６】
一実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、１０〜５００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、２００〜４００ｍｇ／ｋｇの毎週１回の投与量で注入により投与される。そのような投与は、１〜８回、たとえば、３〜５回繰り返されうる。投与は、２〜２４時間、たとえば、２〜１２時間にわたり持続注入により行われうる。
【０２３７】
一実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、毒性を含む副作用を低減する必要があれば、長時間にわたり、たとえば、２４時間超にわたり、低速持続注入により投与される。
【０２３８】
一実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、２５０ｍｇ〜２０００ｍｇ、たとえば、３００ｍｇ、５００ｍｇ、７００ｍｇ、１０００ｍｇ、１５００ｍｇ、または２０００ｍｇの毎週１回の投与量で、８回まで、たとえば、４〜６回投与される。投与は、２〜２４時間、たとえば、２〜１２時間にわたり持続注入により行われうる。そのようなレジメンは、所要により、１回以上繰り返され、たとえば、６ヶ月後または１２ヶ月後に繰り返されうる。投与量は、たとえば、投与後、生物学的サンプルを採取して、抗ＥＭＰ２抗体の抗原結合性領域を標的とする抗イディオタイプ抗体を用いることにより、血液中の本発明に係る化合物の量を測定することにより、決定または調節されうる。
【０２３９】
さらなる実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、２〜１２週間、たとえば、３〜１０週間、たとえば、４〜８週間にわたり、毎週１回投与される。
【０２４０】
一実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、たとえば、６ヶ月超の期間にわたり、毎週１回、維持療法により投与される。
【０２４１】
一実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体は、抗ＥＭＰ２抗体の１回の注入を含むレジメンにより、続いて、放射性同位体にコンジュゲートされた抗ＥＭＰ２抗体の注入により、投与される。レジメンは、たとえば、７〜９日後、繰り返されうる。
【０２４２】
たとえば、本発明に係る治療は、抗体の一日投与量として、約０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ、たとえば、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００ｍｇ／ｋｇ／日の量で、治療の開始後、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０日目の少なくとも１日で、または他の選択肢として、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０週目の少なくとも１週で、またはそれらの任意の組合せで、２４、１２、８、６、４、または２時間ごとに単回用量または分割用量で、またはそれらの任意の組合せで提供されうるが、これらに限定されるものではない。
【０２４３】
組合せ療法
いくつかの実施形態では、抗ＥＭＰ２抗体分子は、１種以上の追加の治療剤、たとえば、化学療法剤と組み合わせて使用される。ＤＮＡ傷害化学療法剤の例としては、トポイソメラーゼＩ阻害剤（たとえば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、およびそれらのアナログまたは代謝物、ならびにドキソルビシン）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（たとえば、エトポシド、テニポシド、およびダウノルビシン）、アルキル化剤（たとえば、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、チオテパ、イホスファミド、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、デカルバジン、メトトレキセート、マイトマイシンＣ、およびシクロホスファミド）、ＤＮＡインターカレーター（たとえば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン）、ＤＮＡインターカレーターおよびフリーラジカルジェネレーター、たとえば、ブレオマイシン、ならびにヌクレオシドミメティック（たとえば、５−フルオロウラシル、カペシチビン、ゲムシタビン、フルダラビン、シタラビン、メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン、およびヒドロキシウレア）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０２４４】
細胞複製を破壊する化学療法剤としては、パクリタキセル、ドセタキセル、および関連するアナログ、ビンクリスチン、ビンブラスチン、および関連するアナログ、サリドマイド、レナリドマイド、および関連するアナログ（たとえば、ＣＣ−５０１３、およびＣＣ−４０４７）、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤（たとえば、イマチニブメシレートおよびゲフィチニブ）、プロテアソーム阻害剤（たとえば、ボルテゾミブ）、ＮＦ−κＢ阻害剤（ＩκＢキナーゼの阻害剤を含む）、癌で過剰発現されるタンパク質に結合する抗体、および癌でアップレギュレート、過剰発現、または活性化されることが知られるタンパク質または酵素（その阻害は細胞複製をダウンレギュレートする）の他の阻害剤が挙げられる。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、本発明に係る抗体は、本明細書に記載されるまたは現時点でもしくは今後知られる化学療法剤のはいずれかで治療する前、その治療と併行して、またはその治療の後、使用されうる。
【０２４６】
本明細書に記載の方法の有効性
本発明の特定の態様では、抗ＥＭＰ２療法の有効性は、腫瘍特異的マーカーの血清中濃度減少、全生存期間の増加、腫瘍サイズの減少、癌寛解、転移マーカー反応の減少、化学療法悪影響の減少により測定される。
【０２４７】
本発明の特定の態様では、有効性は、コンパニオン診断方法および製剤を用いて測定される。コンパニオン診断測定は、抗ＥＭＰ２治療の前、その治療と併行して、またはその治療の後、行うことが可能である。
【０２４８】
コンパニオン診断剤
他の実施形態では、本開示は、コンパニオン診断方法および製剤に関する。一実施形態では、コンパニオン診断方法および製剤は、ＣＳＣの再生および分化をモニターするために使用可能である。一実施形態では、コンパニオン診断方法および製剤は、癌の治療をモニターするために使用可能である。特定の実施形態では、コンパニオン診断方法および製剤は、乳癌の治療をモニターするために使用可能である。特定の実施形態では、コンパニオン診断方法および製剤は、三重陰性乳癌の治療をモニターするために使用可能である。一実施形態では、コンパニオン診断方法および製剤は、脳癌、結腸癌、黒色腫、白血病（たとえば、ＡＭＬ）、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、肺癌、および／または胃癌の治療をモニターするために使用可能である。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、コンパニオン診断方法および製剤は、タンパク質、遺伝子、または特異的遺伝子突然変異のレベルを測定する分子アッセイを含む。そのような測定は、たとえば、抗ＥＭＰ２療法が特定個体に奏効するだろうかを予測するために、抗ＥＭＰ２療法の有効投与を予測するために、抗ＥＭＰ２療法をモニターするために、抗ＥＭＰ２療法を調節するために、抗ＥＭＰ２療法を個体に適合化させるために、およびク癌の進行および寛解を追跡するために、使用可能である。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、コンパニオン診断剤は、組合せ療法をモニターするために使用可能である。
【０２５１】
いくつかの実施形態では、コンパニオン診断剤は、本明細書に記載の抗ＥＭＰ２抗体を含みうる。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、コンパニオン診断剤は、抗ＥＭＰ２療法の前、それと併行して、またはその後、使用可能である。
【０２５３】
製造物品
他の実施形態では、以上に記載の疾患の治療に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器および標識を含む。好適な容器としては、たとえば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が挙げられる。容器は、ガラスやプラスチックなどのさまざまな材料から形成されうる。容器は、病態を治療するために有効な組成物を保持し、無菌アクセスポート（たとえば、容器は、静脈注射溶液バッグ、または皮下注射針を貫通しうる栓を有するバイアル）を有しうる。組成物中の活性剤は抗体である。容器上にあるまたは容器に関連付けられる標識は、組成物が選択された病態を治療するために使用されることを示す。製造物品は、薬学的に許容可能な緩衝液、たとえば、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液などを含む第２の容器をさらに含みうる。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、および使用説明を含む添付文書をはじめとする商業的な観点およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含みうる。
【実施例】
【０２５４】
実施例
実施例１．抗ＥＭＰ２は腫瘍中の癌幹細胞を枯渇させる
腫瘍中の癌幹細胞を枯渇させる抗ＥＭＰ２抗体の能力を例示するために、抗ＥＭＰ２をヒト三重陰性乳房細胞系に投与した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト三重陰性乳房細胞系をヌードマウスに注入して異種移植腫瘍を確立し、ＰＧ−１０１（抗ＥＭＰ２  ＩｇＧ１モノクローナル抗体）または対照ＩｇＧ１のいずれかを用いて腫瘍を非経口的に治療した。左上の線グラフは、抗ＥＭＰ２治療で観測された腫瘍増殖の停止を実証する。治療期間後、腫瘍を切除し、乳癌幹細胞マーカーａｌｄｅｆｌｕｏｒ（ＡＬＤＨ１に対する酵素アッセイ）が陽性の腫瘍細胞の頻度を評価した。
【０２５５】
抗ＥＭＰ２治療は、バイオマーカー陽性癌幹細胞を枯渇させた（図３、右上棒グラフ）。
【０２５６】
実施例２．抗ＥＭＰ２治療は腫瘍形成の再開を防止する
癌幹細胞の重要な特徴は、第二宿主において腫瘍形成を再開する能力である。抗ＥＭＰ２抗体が腫瘍形成の再開を防止できるかを試験するために、抗ＥＭＰ２  ＩｇＧ１または対照ＩｇＧ１で治療した後に単離された生存可能腫瘍細胞を新しいレシピエントヌードマウスに移植し、腫瘍再開の効率を試験した。限定数の移植細胞（５００、５０００または５００００細胞）において、対照ＩｇＧ１治療後の腫瘍細胞では、効率的再開が観測されたが、抗ＥＭＰ２  ＩｇＧ１治療後の腫瘍細胞では、最小限の残存腫瘍再開が観測された。これらの知見から、バイオマーカーによる数え上げまたは腫瘍再開による機能的評価により、抗ＥＭＰ２は癌幹細胞を枯渇させることが実証される。
【０２５７】
癌幹細胞に及ぼす抗ＥＭＰ２の等価な効果は、ＨＥＣ１Ａヒト子宮内膜癌細胞系でも例示される（図４）。これのことから、抗ＥＭＰ２の癌幹細胞効果は、識別可能な組織起源および上皮起源の腫瘍で表われることが実証される。
【０２５８】
実施例３．抗ＥＭＰ２治療は腫瘍形成の再開を防止する
組合せ化学療法との関連で癌幹細胞を枯渇させる抗ＥＭＰ２抗体の作用を例示するために、ドセタキセルと抗ＥＭＰ２抗体との組合せで癌幹細胞を治療した。
【０２５９】
癌幹細胞は、いくつかのカテゴリーの細胞傷害化学療法に対して耐性であり、それにより大きく増大される。この生物学的挙動から、細胞傷害化学療法との関連で癌幹細胞を標的とすると腫瘍抑制にかなり有効であろうと予測される。図５に記載したとおり、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞をヌードマウスに接種して異種移植を確立してから、ドセタキセルと抗ＥＭＰ２  ＩｇＧ１との組合せで治療した（バーは、治療期間を示している）。ドセタキセルまたは抗ＥＭＰ２  ＩｇＧ１のいずれかの存在下で腫瘍増殖は減速された。しかしながら、両方の作用剤の存在下では、腫瘍は後退し、マウスの６０％で腫瘍は検出不能であった。これは、有効な癌療法に向けて癌化学療法（バルク癌細胞を標的とする）と抗ＥＭＰ２（癌幹細胞を標的とする）との相乗作用が予測されることの直接的な証拠を提供する。
【０２６０】
以上の本発明は、明確に理解することを目的として図や例を挙げてある程度詳細に説明されているが、当業者であれば、本発明の教示に照らして、添付の特許請求の趣旨または範囲から逸脱することなく、いくらかの変更および修正を行いうることは容易にわかるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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