(57)【要約】  個々の細胞タンパク質の発現、ならびに単一細胞レベルでの及び臨床組織試料の切片にわたりマップされた１細胞当たりの個々の細胞タンパク質分子数に関する不均一性の定量を可能とする単一細胞に基づく画像解析を組み込む改良されたアッセイが開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織試料の切片中の細胞タンパク質の定量された密度分布の少なくとも二次元（例えば、長さ及び幅）のマップを得るため、前記組織試料の切片における複数の細胞の各々の前記細胞タンパク質のレベルを定量的に計測する方法であって、前記方法が、
組織試料から切片を調製する工程であって、前記切片が識別可能な細胞を含む工程、
前記細胞タンパク質に特異的な第１染色、細胞核に特異的な第２染色、及び標的細胞と非標的細胞とを識別することを可能とする第３染色により前記切片を染色する工程であって、前記染色された切片を画像化する場合に前記第１染色、前記第２染色及び前記第３染色が互いに識別可能である工程、
前記切片の１以上の顕微鏡画像を得る工程であって、前記第１染色、前記第２染色及び前記第３染色を識別し得る工程、
前記第２染色及び前記第３染色による染色に基づいて前記１以上の画像内の標的細胞を同定する工程、
複数の前記同定された標的細胞に対する前記第１染色による染色の強度を測定して、個々の細胞に関する複数の細胞タンパク質の染色強度データを得て、各個別の細胞に関する細胞タンパク質染色強度データと関連する細胞位置座標データを記録する工程、
同定された標的細胞の各々における前記細胞タンパク質の染色強度と複数の標準細胞調製物の各々における前記細胞タンパク質の染色強度とを比較することにより、同定された標的細胞の各々において検出される染色された細胞タンパク質のレベルを確認する工程であって、前記複数が前記細胞タンパク質の異なる既知の発現レベルを有する複数の標準細胞調製物を含む工程、
前記切片の領域内の前記標的細胞の各々における前記細胞タンパク質の数量分布のマップを作成する工程
を含む方法。
【請求項２】
ａ）前記組織試料が腫瘍試料である、
ｂ）前記標的細胞が悪性細胞である、及び
ｃ）前記非標的細胞が間質細胞である、
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞タンパク質が細胞表面受容体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞表面受容体が成長因子受容体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記成長因子受容体がＥＧＦＲファミリー受容体である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＧＦＲファミリー受容体がＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＥＧＦＲである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞タンパク質の数量分布が連続分布である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第１染色が前記細胞タンパク質に特異的な抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記第２染色がＤＮＡ染色である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２染色がＤＡＰＩ及びＨｏｅｃｈｓｔ（登録商標）染色のいずれか又は両方を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第３染色が抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記第３染色に含まれる前記抗体がサイトケラチンに特異的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記マップが相補累積分布の形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記同定工程及び測定工程及び確認工程が自動化画像解析によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記複数の同定された標的細胞が少なくとも５００個の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記複数の同定された標的細胞が少なくとも１，０００個の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記複数の同定された標的細胞が少なくとも２，０００個の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数の標準細胞調製物が染色された標準細胞のアレイの形態である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体が標識化抗体である、請求項８又は１１に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、前記第１抗体の抗体タイプの特性に特異的な標識化二次抗体によって後に標識化される標識化されていない抗体である、請求項８又は１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容が参照により本明細書に援用される、２０１２年６月２０日付で出願された米国仮特許出願番号第６１／６９０，１７０号の利益及びこれに対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２又はＥｒｂＢ２）は、細胞外刺激から細胞内へのシグナルトランスダクションを媒介する細胞表面タンパク質である。細胞表面でＨＥＲ２受容体が異常に高レベルで発現されるＨＥＲ２の過剰発現は多くのヒトがんで起こり、腫瘍細胞におけるそのような異常な高ＨＥＲ２レベルは、疾患再発の増加及び予後不良と関連する。ＨＥＲ２過剰発現は、ＨＥＲ２遺伝子を含有する染色体領域が複製されてＨＥＲ２遺伝子の複数のコピーを生じる腫瘍細胞と関連する病的な現象であるＨＥＲ２遺伝子増幅と関連することが多い。ＨＥＲ２に対して標的化された治療薬として、トラツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体、及びラパチニブ（Ｔｙｋｅｒｂ（登録商標））、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）の両方によるシグナルトランスダクションを阻害する小分子チロシンキナーゼ阻害剤が挙げられる。これらの標的化された薬剤は、ＨＥＲ２陽性（すなわち、ＨＥＲ２過剰発現）の乳がん及び胃がんの患者において、特に特定の化学療法と組み合わされた場合に臨床上有効であることを示した。
【０００３】
腫瘍ＨＥＲ２の状態を特定するために使用される現在の方法は、それらが各腫瘍細胞によって発現されるＨＥＲ２受容体の数の目安をもたらすにすぎず、腫瘍内の細胞の小さなサブセットがこの受容体を過剰発現する場合に測定することも、腫瘍切片における複数の腫瘍細胞にわたる発現数の定量的解析を提供することもできないことから、最適とはいえない。臨床状態においてＨＥＲ２を対象とする治療に対して患者を選択するため、現在、ＨＥＲ２状態は免疫組織化学（タンパク質レベルを測定する「ＩＨＣ」）及び／又は蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＨＥＲ２遺伝子増幅を検出する「ＦＩＳＨ」）により測定される。これらの測定は、ＨＥＲ２標的化治療に対する反応の不正確な予測をもたらす。先行研究は、ＨＥＲ２発現を測定する自動化定量分析（ＡＱＵＡ）の開発を記載した。ＡＱＵＡは、腫瘍組織を同定するためマスクとしてサイトケラチン染色、続いて抗ＨＥＲ２染色、及び免疫蛍光法による検出を利用する。組織平均化方式で細胞株標準に基づいてＨＥＲ２発現の相対的な定量が自動化画像解析を使用して行われ、シンプソンの多様度指数を使用して不均一性を単一の変数まで低減する。
【０００４】
ＨＥＲ２状態を判断する２つのＩＨＣ試験である既存のＩＨＣ及びＦＩＳＨ試験、すなわちＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）及びＰａｔｈｗａｙ（アリゾナ州ツーソンのＶｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）がＦＤＡにより承認されている。これらの試験の両方がＨＥＲ２タンパク質の免疫組織化学染色を使用し、その後、染色の程度を０、１＋、２＋又は３＋に採点する病理学者により解釈される。試料の取り扱い、固定、保存の手法及び染色における相違の全てが、ＩＨＣの抗原回復、安定性及び結果の信頼性に干渉することが示された。試料加工の問題に加えて、病理学者による解釈が主観的である可能性がある。実験室と病理学者にわたる、さらには病理学者自身の再現性における挑戦は、これらの試験の主観的な特徴を伴う問題をさらに繰り返す。１つの兆候における具体的な訓練は、必ずしも他の兆候に対して変換されるものではない。ＨＥＲ２の判断における注意に関する最も大きな必要性は、２＋試料をどのように扱うかということである。複数の研究にわたって２＋と採点された試料の割合の多様性は、乳がん及び胃がんの両方における３＋のもののほぼ５倍であり、そのため、どの患者が抗ＨＥＲ２治療に適格であるかに対して大きな影響を有する。
【０００５】
ＨＥＲ２遺伝子増幅について３つのＦＩＳＨ試験、すなわち、ＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ（登録商標）（イリノイ州アボットパークのＡｂｂｏｔｔ）、ＩＮＦＯＲＭ（アリゾナ州ツーソンのＶＥＮＴＡＮＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、及びＰｈａｒｍＤｘ（登録商標）（カリフォルニア州カーピンテリアのＤＡＫＯ）がＦＤＡにより承認されている。ＨＥＲ２遺伝子増幅は、二人の異なる病理学者によって判断された腫瘍領域における少なくとも２０個の細胞の核内の蛍光ＨＥＲ２細胞巣を計測することにより判断される。ＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ（登録商標）試験では、セントロメア１７（ＣＥＰ１７）細胞巣も計測してＨＥＲ２：ＣＥＰ１７の比を報告する。これは、ＩＨＣ試験では欠如している内部対照として役立つ。しかしながら、最近の報告によれば、ＨＥＲ２と併せてＣＥＰ１７を使用する妥当性が疑問視されている。染色体１７の多染色性はごく稀な事象であるとされ、セントロメア１７のシグナルの増加はＨＥＲ２遺伝子との同時増幅によると考えられる。これらの場合、患者は非増幅として誤って分類される可能性がある。ＡＳＣＯ−ＣＡＰガイドラインに従い、１つの核当たり６を超える遺伝子コピーのＨＥＲ２又は２．２より大きいＨＥＲ２：ＣＥＰ１７比を陽性とする。少数の細胞を計測するため、ＦＩＳＨは腫瘍の不均一性を捕捉しない。さらに、最近の解析は、少数の細胞を見ることで組み入れ基準に影響を及ぼし得る変動を生じる可能性があることを示唆した。ＩＨＣに基づく試験に対するＦＩＳＨの１つの利点は、ＨＥＲ２タンパク質よりもＨＥＲ２  ＤＮＡがより安定であることから、試料の取り扱い及び加工に対してＦＩＳＨ結果の感受性が低いことである。標準的な臨床上の実施では、ＦＩＳＨによる解釈は、いまだ病理学者を必要とする。ＦＩＳＨによる解釈の自動化が試みられてきたが、いまだ標準的な臨床での実施には受け入れられていない。ＦＩＳＨは、ＩＨＣに基づく試験と比べて高価であり、技術的に扱いにくく、時間がかかるという数多くの欠点を有し、少数の実験室しかＦＩＳＨを行うことができない。その結果、集中型の実験室でＦＩＳＨが最も一般的に行われる。
【０００６】
腫瘍の不均一性を抗ＨＥＲ２治療に対する患者の反応の予想又は予測とする程度は知られておらず、現在、ＨＥＲ２の不均一性を定量的に測定することを報告できるＦＤＡにより承認された試験はない。現在の試験方法を用いて、最適な患者反応について特定レベルのＨＥＲ２発現を発現する細胞の割合に対する最適なカットオフを体系的に決定することはできない。乳がんにおいて、ＡＳＣＯ−ＣＡＰガイドラインは、陽性のカットオフとして３０％超の細胞のＩＨＣによる強い染色を推奨する。その反面、胃がんでは、推奨されるカットオフは細胞の１０％超である。さらに、胃腫瘍におけるＨＥＲ２発現はかなりの腫瘍内不均一性を示し、試験の不一致の主な原因となる。
【０００７】
ＨＥＲ２陽性の転移性乳がんでは、トラツズマブを含む投与計画に対する反応率は３６％〜７９％で変化する。さらに、一部のＨＥＲ２陰性患者はトラツズマブに反応する。乳がん及び胃がん以外でＨＥＲ２を過剰発現することが示された特定の膀胱がん、子宮内膜がん及び／又は肺がん等の他の固形腫瘍が存在し、現在、これらは抗ＨＥＲ２治療法によって取り扱われていない。患者の層別化してＨＥＲ２標的とする治療に反応しない患者分集団と反応性の患者分集団とを識別するためのＨＥＲ２タンパク質レベルの正確な判断に対する幾つかの挑戦が残されている。これらは、ＨＥＲ２発現の腫瘍内不均一性及び臨床用途に好適な高精度のＨＥＲ２定量技術の欠如を含む。また、ＨＥＲ２を過剰発現しない腫瘍を解析することができ、治療決定の情報を与えるために結果を使用できるように、ＨＥＲ２以外の腫瘍細胞タンパク質を定量する必要がある。
【０００８】
そのため、現在のＡＱＵＡ技術は１つの細胞当たり又は二次元の腫瘍切片の領域にわたり受容体発現数の測定を提供しないことから、より良好なデータ及びタンパク質を標的とする治療に反応しない患者分集団から反応性の患者分集団を識別するための基準を提供するため、細胞レベルでのタンパク質発現レベル及び腫瘍におけるタンパク質発現レベルの分布のより正確で定量的な測定を可能とするＨＥＲ２及び腫瘍関連タンパク質等の他の細胞タンパク質に対する改良された試験技術が必要とされている。
【０００９】
本発明は、これらの必要性に取り組み、他の利益を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本明細書において、個々の細胞タンパク質（例えば、ＨＥＲ２）の発現、ならびに単一細胞レベルでの及び臨床組織試料（例えば、腫瘍試料）の切片にわたりマップされた１細胞当たりの個々の細胞タンパク質分子数に関する不均一性の定量を可能とする単一細胞に基づく画像解析を組み込む改良されたアッセイが開示される。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
１つの態様では、組織試料の切片にわたる細胞タンパク質の定量された密度分布の少なくとも二次元（例えば、長さ及び幅）のマップを得るため、組織試料の切片における複数の細胞（例えば、標的細胞）の各々の細胞タンパク質のレベルを定量的に計測するため、
組織試料から切片を調製する工程であって、前記切片が識別可能な細胞を含む工程、
前記細胞タンパク質に特異的な第１染色、細胞核に特異的な第２染色、及び標的細胞（例えば、悪性細胞）と非標的細胞（例えば、間質細胞）とを識別することを可能とする第３染色により前記切片を染色する工程であって、前記染色された切片を画像化する場合に第１染色、第２染色及び第３染色が互いに識別可能である工程、
前記切片の１以上の顕微鏡画像を得る工程であって、前記第１染色、第２染色及び第３染色を識別し得る工程、
第２染色及び第３染色による染色に基づいて前記１以上の画像内の標的細胞を同定する工程、
複数の前記同定された標的細胞に対する第１染色による染色の強度を測定して、個々の細胞に関する複数の細胞タンパク質の染色強度データを得て、各個別の細胞に関する細胞タンパク質染色強度データと関連する細胞位置座標データを記録する工程、
同定された標的細胞の各々における前記細胞タンパク質の染色強度と複数の標準細胞調製物の各々における前記細胞タンパク質の染色強度とを比較することにより、同定された標的細胞の各々において検出される染色された細胞タンパク質のレベルを確認する工程であって、前記複数が前記細胞タンパク質の異なる既知レベルの発現を有する複数の標準細胞調製物を含む工程、
前記切片の領域内の標的細胞の各々における細胞タンパク質の数量分布のマップを作成する工程
を（この順で）含む方法が提供される。
【００１２】
１つの実施形態では、組織試料は腫瘍試料、例えば生検試料であり、標的細胞は悪性細胞であり、非標的細胞は間質細胞である。
【００１３】
１つの実施形態では、細胞タンパク質は細胞表面受容体である。１つの実施形態では、細胞表面受容体は成長因子受容体である。１つの実施形態では、成長因子受容体はＥＧＦＲファミリー受容体である。或る例示的な実施形態では、ＥＧＦＲファミリー受容体はＨＥＲ２である。他の実施形態では、ＥＧＦＲファミリーメンバーはＨＥＲ３又はＥＧＦＲである。
【００１４】
１つの実施形態では、細胞タンパク質の数量分布は連続分布である。
【００１５】
１つの実施形態では、第１染色は細胞タンパク質に特異的な抗体を含む。１つの実施形態では、第２染色はＤＮＡ染色である。別の実施形態では、第２染色はＤＡＰＩ及びＨｏｅｃｈｓｔ（登録商標）染色のいずれか又は両方を含む。好適なＨｏｅｃｈｓｔ染色は、例えばＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２又はＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８である。或る実施形態では、ドキソルビシン等の他のＤＮＡ染色分子が使用され得る。さらに別の実施形態では、第３染色は抗体を含む。１つの実施形態では、第３染色により含まれる抗体はサイトケラチンに特異的である。
【００１６】
１つの実施形態では、マップは相補累積分布の形態である。
【００１７】
別の実施形態では、前記同定工程及び測定工程及び確認工程は自動化画像解析によって行われる。
【００１８】
１つの実施形態では、複数の同定された標的細胞は少なくとも５００個の細胞を含む。別の実施形態では、複数の同定された標的細胞は少なくとも１，０００個の細胞を含む。別の実施形態では、複数の同定された標的細胞は少なくとも２，０００個の細胞を含む。別の実施形態では、複数の標準細胞調製物は、染色された標準細胞のアレイの形態である。
【００１９】
１つの実施形態では、前記抗体は標識化抗体である。別の実施形態では、前記抗体は、第１抗体の抗体タイプの特性に特異的な標識化二次抗体により後に標識化される標識化されていない抗体である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】前記アッセイの概要図である。ｑＦＡＣＳにより定量されるＨＥＲ２発現の範囲を伴う細胞株を使用して標準細胞ペレットアレイを作成する。未知のＨＥＲ２発現組織と並行して標準を染色する。標準画像及び組織画像を取得し、自動化画像解析手段により解析する。解析は、未知のＨＥＲ２発現組織に対して細胞ごとにＨＥＲ２数を補間するため使用することができる標準曲線の作成を可能とする。
【図２Ａ】細胞ペレットアレイを抗ＨＥＲ２抗体及び抗サイトケラチン抗体で染色し、ＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で対比染色した。スライドをＡｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＦＬ（登録商標）でスキャンし、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ（登録商標）Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤで解析した。細胞ペレットアレイの種々の細胞株の代表的なコアのオリジナル写真及び分類写真を示す。サイトケラチン層をオリジナル写真から削除し、簡易な可視化のためＨＥＲ２層（赤色）及びＤＡＰＩ層（青色）のみを示す。分類写真では、ＨＥＲ２低発現細胞（１５０，０００ＨＥＲ２／細胞未満）をピンク色で示す。中程度のＨＥＲ２発現細胞（１５０，０００ＨＥＲ２／細胞〜１，０００，０００ＨＥＲ２／細胞）を薄い赤色で示し、高ＨＥＲ２（１，０００，０００ＨＥＲ２／細胞超）を赤色で示す。ＨＥＲ２陰性細胞を灰色で示す。
【図２Ｂ】標準の種々の細胞株に関するＬＯＧ１０（平均ＨＥＲ２膜強度／細胞）の単一細胞分布の表示である。
【図２Ｃ】標準曲線を作成するため、ｑＦＡＣＳにより定量した対応するＬＯＧ１０  ＨＥＲ２受容体数に対して、各細胞株の平均ＨＥＲ２膜強度／コアをプロットする。９５％信頼区間を点線で表す。曲線を線形回帰適合により解析した（Ｒ２＝０．９４）。
【図２Ｄ】回帰残差（９５％信頼区画による）を各細胞株についてプロットする。
【図３Ａ】乳房疾患ＴＭＡをＨＥＲ２（赤色）、サイトケラチン（緑色）及びＤＡＰＩ（青色）で染色し、低（Ｇ１）、中程度（Ｆ８）及び高（Ｄ６）ＨＥＲ２発現の代表的なＴＭＡコアを示す（上部パネル）。対応する細胞セグメント化及び分類を下部パネルに示す。ピンク色は、低ＨＥＲ２発現（１５０，０００ＨＥＲ２／細胞未満）を示し；薄い赤色は中程度のＨＥＲ２発現（１５０，０００ＨＥＲ２／細胞〜１，０００，０００ＨＥＲ２／細胞）を示し；赤色は高ＨＥＲ２発現（１，０００，０００ＨＥＲ２／細胞超）を示し、シアンは非腫瘍細胞／間質を表す。
【図３Ｂ】ＴＭＡと並行して染色された標準細胞ペレットアレイに基づいて補間された平均ＨＥＲ２受容体数／細胞を示す。
【図３Ｃ】種々の集団（ＨＥＲ２高、赤色；ＨＥＲ２中程度、薄い赤色；ＨＥＲ２低、ピンク色；及びＨＥＲ２陰性、白色）間のＨＥＲ２発現の分布を全てのＴＭＡコアについて示す。
【図４Ａ】乳房疾患ＴＭＡの得られた２つの切片を２つの別々の日に標準細胞ペレットアレイと並行して染色した。対応する標準から２つの異なるＴＭＡ切片について各個別のコアに対する平均ＨＥＲ２／細胞を補間し、互いに対してプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）において線形回帰を用いてデータを適合させ、Ｒ２  ０．９８及び傾き＝１．０７を得た。
【図４Ｂ】２つの標準ペレットアレイ（標準Ａ及び標準Ｂ）を同日に染色した。標準の種々の細胞株について、ｑＦＡＣＳにより特定された対応するＬＯＧ  ＨＥＲ２受容体数に対して平均ＨＥＲ２強度／細胞膜をプロットした。線形回帰を用い、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおいて標準を適合させた（標準Ａ及び標準ＢについてそれぞれＲ２  ０．９４及び０．９２）。
【図４Ｃ】乳房疾患ＴＭＡを上記２つの標準細胞ペレットアレイと並行して染色した。ＴＭＡコアに関する平均ＨＥＲ２受容体数をいずれかの標準より補間し、互いに対してプロットした。線形回帰を用い、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）においてデータを適合させた（Ｒ２  １．００；傾き＝０．８５）。
【図５Ａ】２つの代表的な乳がんコアにおけるＨＥＲ２発現の分布（ＨＥＲ２数／細胞）を示す。
【図５Ｂ】逆累積分布を使用して（Ａ）のデータを再度プロットした。Ｙ値が０．５の場合、青色で表されるコア細胞の５０％が１０，０００ＨＥＲ２／細胞超を発現し、赤色で表されるコア細胞の５０％が１，０００，０００ＨＥＲ２／細胞超を発現する。
【図５Ｃ】病理学者によって０／１＋（緑色）、２＋（濃い青色）、及び３＋（赤色）として特定されたＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）スコアに対して平均ＨＥＲ２受容体数／コアをプロットする。
【図５Ｄ】乳房疾患ＴＭＡの各個別のコアの全ての腫瘍細胞でのＨＥＲ２発現を逆累積分布としてプロットし、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）スコアによって（Ｃ）のように色分けする。
【図５Ｅ】周辺領域の組織スライドの染色、及び病理学者によってＦＩＳＨ陽性（陽性、赤色）、ＦＩＳＨ陰性（陰性、緑色）又は境界（青色）とされるスコアリングから得られたＦＩＳＨスコアに対して平均ＨＥＲ２受容体数／コアをプロットする。
【図５Ｆ】乳房疾患ＴＭＡの各個別のコアの全ての腫瘍細胞でのＨＥＲ２発現を逆累積分布としてプロットし、ＦＩＳＨにより（Ｅ）のように色分けする。パネルＤ及びＦの両方において、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）又はＦＩＳＨのいずれかで解析不可能なコアを点線で示す。
【図５Ｇ】従来のＨＥＲ２分類に基づいて、各個別のコアに関するプロットを色分けした。プロットは、任意の所与の試料内においてＨＥＲ２発現のかなりの変動性があることを示す。「ＨＥＲ２陰性」患者試料は、「ＨＥＲ２陽性」試料よりも１細胞当たりのＨＥＲ２受容体が著しく少ないことが明らかである。
【図６】標準細胞ペレットアレイと並行して、胃がん、膀胱がん及び卵巣がんのＴＭＡを実施例に記載されるように染色した。Ａｐｅｒｉｏ  Ｓｃａｎｓｃｏｐｅ  ＦＬ（登録商標）を用いてスライドをスキャンし、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ（登録商標）Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤにより解析した。種々の腫瘍タイプについて代表的なコアのオリジナルの写真を上部パネルに示す（Ｈｅｒ２、赤色；サイトケラチン、緑色；ＤＡＰＩ、青色）。対応する分類写真（ＨＥＲ２高、赤色；ＨＥＲ２中程度、薄い赤色；ＨＥＲ２低、ピンク色；非腫瘍細胞／間質、シアン）と併せて、逆累積分布関数を下部パネルに示す。
【図７Ａ】心臓組織マイクロアレイを抗ＨＥＲ２抗体で染色し、ＤＡＰＩで対比染色した。Ａｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＦＬ（登録商標）を用いてスライドをスキャンし、Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ（登録商標）Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤにより解析した。異なる心臓状態（正常及び疾患）のコアのオリジナル写真及び分類写真を示す。
【図７Ｂ】種々のＴＭＡコアについての平均ＨＥＲ２膜強度／コアがプロットされる。
【図７Ｃ】種々の集団、ＨＥＲ２高（１，０００，０００ＨＥＲ２／細胞超、赤色）、ＨＥＲ２中程度（１５０，０００ＨＥＲ２／細胞〜１，０００，０００ＨＥＲ２／細胞、薄い赤色）、及びＨＥＲ２低（１５０，０００ＨＥＲ２／細胞未満、ピンク色）間のＨＥＲ２発現の分布を示す。
【図８Ａ】ＨＥＲ２陽性試料の３つのサブグループについてのＨＥＲ２発現のヒストグラムを示す。「ＨＥＲ２低且つ不均一」；これらの試料は、臨床の意味でＨＥＲ２陽性であるが、全体的に低い発現であり、低発現細胞の最も高いピークを伴う不均一性を示す。線の色は、各試料のＩＨＣスコアに対応する（赤色＝３＋、濃い青色＝２＋、及び薄い青色＝１＋）。度数は確立密度を表し、密度曲線下の領域が１となるようにｙ軸を正規化する。
【図８Ｂ】ＨＥＲ２陽性試料の３つのサブグループについてのＨＥＲ２発現のヒストグラムを示す。「ＨＥＲ２高且つ不均一」；これらの試料は、高ＨＥＲ２発現細胞により占められるものの、相当量の不均一性を有する、ＨＥＲ２発現を示す。線の色は、各試料のＩＨＣスコアに対応する（赤色＝３＋、濃い青色＝２＋、及び薄い青色＝１＋）。度数は確立密度を表し、密度曲線下の領域が１となるようにｙ軸を正規化する。
【図８Ｃ】ＨＥＲ２陽性試料の３つのサブグループについてのＨＥＲ２発現のヒストグラムを示す。「ＨＥＲ２が明らかに高い」；これらの試料は、不均一性がほとんどない、非常に高く均一なＨＥＲ２発現を示す。線の色は、各試料のＩＨＣスコアに対応する（赤色＝３＋、濃い青色＝２＋、及び薄い青色＝１＋）。度数は確立密度を表し、密度曲線下の領域が１となるようにｙ軸を正規化する。
【図８Ｄ】ＨＥＲ２陽性試料の３つのサブグループについてのＨＥＲ２発現のヒストグラムを示す。円グラフは、「ＩＨＣ３＋、ＦＩＳＨ＋」のカテゴリーにおいてこれらのサブグループの相対的存在量（明らかに高い、濃い赤色；高く且つ不均一、青色；低く且つ不均一、薄い緑色）を示す。
【図８Ｅ】ＨＥＲ２陽性試料の３つのサブグループについてのＨＥＲ２発現のヒストグラムを示す。円グラフは、「ＩＨＣ２＋、ＦＩＳＨ＋」のカテゴリーにおいてこれらのサブグループの相対的存在量（明らかに高い、濃い赤色；高く且つ不均一、青色；低く且つ不均一、薄い緑色）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本明細書において、単一細胞レベルで特定の組織タイプにおける細胞タンパク質の量を特定する方法が開示される。以下に記載されるアッセイは、完全に特性評価された標準曲線に基づく１細胞当たりの分子に関する細胞タンパク質の客観的な定量を可能とすることによる利点を提供する。また、単一細胞に基づく解析は、試料中の細胞タイプの不均一性の可視化を可能とし、例えば、腫瘍の分類及び治療の選択において、広範な治療的意味を有する。さらに、前記標準曲線と併せて自動化画像解析ソフトウェアの使用は、細胞タンパク質レベルの分類から読み取り手の主観性を最小化する可能性があるか、さらには排除することができる。
【００２２】
例示的な実施形態では、本明細書に開示されるアッセイは、腫瘍試料（例えば、生検）における細胞中又は細胞上の細胞タンパク質のレベルを特定するために使用され得る。前記アッセイによる試験に好適な腫瘍試料は、例えば、ＨＥＲ２遺伝子増幅腫瘍及び／又はＨＥＲ２発現腫瘍若しくは過剰発現腫瘍と関連する腫瘍タイプに由来し得る。ＨＥＲ２は、ＥｒｂＢファミリーの受容体に属する細胞表面の膜貫通受容体タンパク質である。ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２とも呼ばれる）は、その細胞内チロシンキナーゼ活性を介し（例えば、別のＥｒｂＢ受容体と二量体化されるＨＥＲ２受容体のリガンド活性化により）、細胞内シグナルを生じる。過剰である場合、かかるシグナルは、例えば、細胞分裂を誘発することにより腫瘍形成を促進し得る。ＨＥＲ２遺伝子は、乳房、卵巣、子宮内膜、膵臓、結腸直腸、前立腺、唾液腺、腎臓、及び肺を含むがこれらに限定されない、多くの種類のヒト悪性腫瘍において増幅及び／又は過剰発現される。ＨＥＲ２を過剰発現するがんは、ＨＥＲ２過剰発現のレベルに応じてＨＥＲ２＋＋＋又はＨＥＲ２＋＋と示され、ＨＥＲ２＋＋＋はＨＥＲ２の最も高い発現レベルを示す。ＨＥＲ２＋＋＋及びＨＥＲ２＋＋の状態は、典型的には、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）（ＨＥＲ２タンパク質過剰発現の特定のための半定量的免疫組織化学アッセイ）等の免疫測定法によって特定される。また、ＨＥＲ２遺伝子増幅は、１細胞当たり２つより多いＨＥＲ２遺伝子コピーを呈する（典型的には、１コピーのＣＥＰ１７ごとに２つのコピー）ＨＥＲ２遺伝子増幅がん、ならびに「ＦＩＳＨ陽性」と呼ばれるＨＥＲ２遺伝子増幅がん細胞を含む細胞及び／又は腫瘍を用いて、例えば、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）により特定され得る。或る実施形態では、腫瘍試料がＨＥＲ２を過剰発現し得るものの、ＦＩＳＨ陽性ではない場合、例えば、腫瘍試料がＨＥＲ２＋＋＋又はＨＥＲ２＋＋（タンパク質レベルで過剰発現されたＨＥＲ２）であっても、ＦＩＳＨ陰性（検出が不可能なＨＥＲ２遺伝子の増幅）の場合がある。
【００２３】
上記アッセイは、がん患者が標的化された抗がん治療薬、例えば、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、又はＥＧＦＲ等の少なくとも１つのＥＧＦＲファミリーメンバーを標的とする抗体に反応し得るかどうかを特定するために使用され得る。１つの実施形態では、前記アッセイは、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）によるＨＥＲ２＋＋のどの患者が、腫瘍細胞のサブセットにおいて高いＨＥＲ２過剰発現であるか、又は腫瘍細胞の大半についてＨＥＲ２の中程度から高い過剰発現であるかのいずれかを特定するのに有用である。また、前記アッセイは、患者を任意のＥｒｂＢ標的化抗がん治療薬、例えば、トラスツズマブ、ペルツズマブ、ラパチニブ、ＭＭ−１１１、ＭＭ−１２１、ＭＭ−１４１、ＭＭ−１５１、又はＭＭ−３０２を用いて処置すべきかどうかを決定するのに使用され得る。
【００２４】
「ＭＭ−１１１」（Ｂ２Ｂ３−１とも呼ばれる）は、例えば、米国特許出願公開第２０１１−００５９０７６号Ａ１、及びＰＣＴ国際公開特許第２００９／１２６９２０号に記載される二重特異性ＨＥＲ２／ＨＥＲ３抗体である。ＨＥＲ２／ＨＥＲ３（ＥｒｂＢ２／ＥｒｂＢ３）発がん性ヘテロ二量体は、相互作用の強度に関して最も強力なＥｒｂＢ受容体ペアリングであり、受容体チロシンリン酸化に影響を及ぼし、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ及びホスホイノシチド−３キナーゼ経路を介して下流のシグナル伝達に作用する。ＨＥＲ３シグナル伝達は、臨床用途においてＨＥＲ２標的化薬剤（トラツズマブ等）及び化学療法（ラパチニブ等）の両方に抵抗性の重要な機構として仮定されている。ＨＥＲ２が高い病態では、ＨＥＲ２シグナル伝達の活性化の１つの機構は、ＨＥＲ２とＨＥＲ３のヘテロ二量体に対するリガンドであるヘレグリンの結合を介する。現在市販されるＨＥＲ２標的化治療は、ヘレグリン活性化ＨＥＲ２／３を効果的に阻害しない。前臨床的にはＭＭ−１１１（ＨＥＲ２の遮断を伴わないＨＥＲ２／３のヘレグリン活性化を阻害する）とトラスツズマブ（ＨＥＲ２を標的とする）の組合せにより腫瘍成長の完全な阻害がもたらされる。
【００２５】
ＭＭ−１１１は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３ヘテロ二量体を特異的に標的とし、リガンド結合を抑制する。ＨＥＲ２＋の胃がん、乳がん、卵巣がん及び肺がんの前臨床モデルでは、ＭＭ−１１１はリガンド誘導性ＨＥＲ３リン酸化、細胞周期進行、及び腫瘍成長を阻害する。
【００２６】
「ＭＭ−１２１」は、がんに関連する細胞表面受容体であるＥｒｂＢ３を標的とする完全ヒトモノクローナル抗体である。ＥｒｂＢ３は、腫瘍の成長及び生存に重要であることが示されており、がん細胞による耐性機構としてのＥｒｂＢ３の使用は患者集団及び腫瘍の種類を超えて共通している。ＭＭ−１２１は、直接的にがんの成長を阻害し、腫瘍が耐性を持つようになる薬物に対する感受性を回復させ、腫瘍による他の薬剤に対する耐性の発達を遅延するように設計される。ＭＭ−１２１は、例えば、米国特許第７，８４６，４４０号及び米国特許出願第１２／４２５，８７４号及び第１２／９０４，４９２号（「ＥｒｂＢ３に対する抗体及びその使用」）に記載されている。
【００２７】
「ＭＭ−１４１」は、ＩＧＦ−１Ｒ及びＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）により制御されるＰ１３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路のシグナル伝達を標的とするように設計された完全ヒト四価抗体である。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル伝達は、化学療法又は標的化された抗がん薬により誘導されるストレスに反応してがんで活性化されることが多く、腫瘍細胞の生存促進に重要な役割を果たすと考えられている。ＭＭ−１４１は、例えば、米国特許出願公開第２０１２−０２６９８１２号及び米国特許出願第１３／７７８，９８４号（「単一特異性及び二重特異性抗ＩＧＦ−ＩＲ抗体及び抗ＥｒｂＢ３抗体」）に記載されている。
【００２８】
「ＭＭ−１５１」は、上皮成長因子受容体、すなわちＥＧＦＲの非重複エピトープに結合するように設計された、３つの完全ヒトモノクローナル抗体の混合物で構成されるオリゴクローナルな治療薬である。ＥＧＦＲは、ＥｒｂＢ１としても知られている。オリゴクローナルな治療薬は、２以上の異なるモノクローナル抗体の混合物である。ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１）は、肺がん、乳がん、結腸がん、膵臓がん及び頭頸部がんを含む幾つかの悪性腫瘍における重要な薬物標的として長く認識されてきた。ＭＭ−１５１は、例えば、ＰＣＴ特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０４２３５号（「上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する抗体及びその使用」）に記載されている。
【００２９】
「ＭＭ−３０２」は、アントラサイクリン抗がん治療薬を含むＨＥＲ２標的化免疫リポソームを指す。免疫リポソームは、それらが抗体によって標的化された細胞表面抗原を伴う細胞によって選択的に内部移行されることから、非免疫リポソーム調製剤に対する利点をもたらす抗体（典型的には抗体フラグメント）標的化リポソームである。かかる抗体及び免疫リポソームは、例えば、以下の米国特許及び米国特許出願：米国特許出願公開第２０１０−００６８２５５号、米国特許第６，２１４，３８８号、第７，１３５，１７７号、及び第７，５０７，４０７号（「標的細胞への内部移行を最適化する免疫リポソーム」）；第６，２１０，７０７号（「タンパク質結合脂質微粒子を形成する方法及びその組成物」）；第７，０２２，３３６号（「高効率で脂質微粒子にタンパク質を付着させる方法」）及び米国特許出願公開第２００８−０１０８１３５号及び米国特許第７，２４４，８２６号（「内部」）に記載されている。
【００３０】
ＨＥＲ２を標的とする免疫リポソームを上述の特許の開示に従って調製することができる。かかるＨＥＲ２標的化免疫リポソームは、Ｆ５抗ＨＥＲ２抗体フラグメントを含み、ドキソルビシンを含有するＭＭ−３０２を含む。ＭＭ−３０２は、１つのリポソーム当たり４５コピーの哺乳類由来Ｆ５−ｓｃＦｖ（抗ＨＥＲ２）を含有する。
【００３１】
ＨＥＲ２レベルの上昇が前記アッセイと相関する兆候は、ＨＥＲ２の測定がいまだ標準化されていない膀胱、子宮内膜又は肺のがん等の適応症において有利に使用され得る。ＨＥＲ２増幅と病期との相関が膀胱がんにおいて見出され、グレード３の腫瘍の約１４．２％（対して、グレード１の腫瘍の１．１％）が増幅を示した。膀胱がんは、ＨＥＲ２タンパク質の過剰発現が常に遺伝子増幅を伴わないがんの種類のようであることから、特に興味深い。かかる場合は、ＨＥＲ２標的化リポソームドキソルビシン（例えば、ＭＭ−３０２）又は抗ＨＥＲ２／ＨＥＲ３二重特異性抗体（例えば、ＭＭ−１１１）等のそれらの作用機構に対するＨＥＲ２シグナル伝達への依存に頼らない、ＨＥＲ２を対象とする治療による処置に特に好適であり得る。
【００３２】
以下の実施例に開示される方法に従って、組織切片からの細胞タンパク質の定量（絶対的又は相対的）は、組織染色を細胞タンパク質レベルと関連付ける標準曲線の作成を必要とする。標準曲線は、細胞株のパネルにおける細胞タンパク質発現レベルを測定し、その後、これらの細胞のペレットからアレイを作って目的の組織試料と並行して染色することにより作成される。或る実施形態では、無細胞タンパク質標準、例えば、基体上の既知の濃度のタンパク質スポットを測定することにより作成された標準曲線が、同様に用いられてもよい。
【００３３】
［実施例］
ホルムアルデヒドで固定され、パラフィン包埋された（ＦＦＰＥ）組織試料における単一細胞レベルでのＨＥＲ２タンパク質発現を測定する定量的免疫蛍光法の開発及び適用が本明細書に開示される。このアッセイを定義し、先行研究と識別する２つの主要な態様は、（ｉ）個々の細胞をセグメント化する自動化画像解析ソフトウェアの使用により単一細胞レベルでＨＥＲ２染色を定量する能力、及び（ｉｉ）完全に特性評価された標準曲線に基づく１細胞当たりの分子に関するＨＥＲ２の客観的定量である。
【００３４】
材料及び方法
［材料］ＲＰＭＩ、Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地、及びＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ改変培地はＬＯＮＺＡ（メリーランド州ウォーカーズビル）により、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）はＴｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（カリフォルニア州シールビーチ）及びペニシリンＧ／ストレプトマイシン硫酸塩混合物はＧＩＢＣＯ（ニューヨーク州グランドアイランドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によるものであった。Ｐｅｒｏｘｉｄａｚｅｄ  １、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｓｎｉｐｅｒ及びＤａ  Ｖｉｎｃｉ  ＧｒｅｅｎはＢｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ（カリフォルニア州コンコード）によるものであった。マウス抗ヒトパンサイトケラチン及びＥｎｖｉｓｉｏｎ抗ウサギＨＲＰはＤａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ（カリフォルニア州カーピンテリア）によるものであった。ウサギ抗ヒトＨＥＲ２（クローンＳＰ３）、ＴＲＩＳ−ＥＤＴＡ緩衝溶液（１００×）及びＴＢＳＴ緩衝溶液（２０×）はＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ペンシルベニア州ピッツバーグ）によるものであった。ＴＳＡ（商標）Ｃｙａｎｉｎｅ  ５  Ｔｙｒａｍｉｄｅ試薬をＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチューセッツ州ウォルサム）より購入した。ヤギ抗マウスＡｌｅｘａ５５５及びＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）ＧｏｌｄはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州カールスバッド）によるものであった。
【００３５】
［組織培養］ＤＵ１４５細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞、ＡＣＨＮ細胞、及びＳＫＯＶ３細胞をＡＴＣＣより入手し、推奨される条件下で育成した。ＩＧＲＯＶ１はＮＣＩ−ＤＴＰによるものであった。ＢＴ４７４−Ｍ３細胞はＢＴ４７４細胞（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−２０（登録商標））に由来するＨＥＲ２を高過剰発現する細胞株である。ＭＣＦ−７クローン１８細胞はＣｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｂｅｎｚ博士（カリフォルニア州ノバートのＢｕｃｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から贈られた。
【００３６】
［細胞株におけるＨＥＲ２の定量］細胞をトリプシン処理し、洗浄し、蛍光標識されたトラツズマブを使用して染色した。トラツズマブを以前に記載されるように標識化した（Ｓｃｈｏｅｂｅｒｌ  Ｂ，Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ  ２００９）。定量的蛍光活性化セルソーティング（ｑＦＡＣＳ）によって蛍光標識されたＨＥＲ２抗体の抗体結合能（ＡＢＣ）を判断することでＨＥＲ２受容体数を特定した。Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｅａｄｓ（インディアナ州フィッシャーズのＢａｎｇｓ  Ｌａｂｓ）を使用し、製造業者の指示書によりＡＢＣを決定した。
【００３７】
［細胞ペレットアレイ］各細胞株について、８０％コンフルエンスで２．５×１０８細胞をＰＢＳですすぎ、室温にて１０分間、穏やかに撹拌しながら１０％の中性緩衝ホルマリンで覆った。細胞をスクレーピングにより回収し、４℃にて１０分間１０００ｒｐｍでペレット化し、７０％エタノール中に再懸濁した。細胞をペレット化し、パラフィンベッドを用いて調製されたエッペンドルフチューブに移した。細胞を室温にて５分間１２，０００ｒｐｍでの遠心分離により包み込み、続いてエタノールを吸引した。エッペンドルフチューブを包埋型に置き、ＴＢＳ中の融解した（５５℃）１％低融点アガロースで囲み、固めて細胞ペレット型を調製した。細胞ペレットをアガロース型の中央に置き、アガロースで密閉した。アガロース包埋細胞ペレットを、パラフィンに包埋して切片を作製する（マサチューセッツ州ウースターのＭａｓｓ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｉｎｃ．）まで４℃にて７０％エタノール中に浸漬した。
【００３８】
［患者試料］乳房疾患スペクトル組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の５ミクロン切片をＦｏｌｉｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（オハイオ州パウエル）から入手した。４８名の患者に由来する重複する１ｍｍの組織コアをＴＭＡ上に提示した。心臓ＴＭＡはＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ（メリーランド州ロックヴィル）によるものであった。
【００３９】
［免疫蛍光染色及び画像取得］細胞ペレットアレイ及び乳がんＴＭＡを、以下のように抗ヒトパンサイトケラチン抗体及び抗ヒトＨＥＲ２抗体で染色した。スライドを６５℃にて３０分間焼成し、キシレン（３０分を２回）、１００％エタノール（２分を２回）、８０％エタノール（２分を２回）に浸漬した後、水に浸漬することにより脱パラフィン化した。前処理モジュールにおいて９５℃にて２５分間、ｐＨ９のＴＲＩＳ−ＥＤＴＡ緩衝溶液中でスライドを加熱することにより、抗原回復を完了した（マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。抗原回復の後、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ（登録商標）３６０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上でスライドを染色した。簡潔には、内因性ペルオキシダーゼ活性をＰｅｒｏｘｉｄａｚｅｄ（登録商標）１（室温にて１０分間）によりブロックし、その後、ＴＢＳＴによる洗浄工程、及びＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｓｎｉｐｅｒ（登録商標）（室温にて１０分間）によるタンパク質ブロッキング工程を行った。次に、室温にて１時間、Ｄａ  Ｖｉｎｃｉ  Ｇｒｅｅｎ中に希釈されたマウス抗ヒトパンサイトケラチン抗体及びウサギ抗ヒトＨＥＲ２抗体と共にスライドをインキュベートした。洗浄後、室温にて３０分間、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ抗ウサギＨＲＰ中に希釈されたヤギ抗マウスＡｌｅｘａ５５５抗体と共にスライドをインキュベートした。洗浄後、続いて室温にて５分間ＴＳＡ（商標）Ｃｙａｎｉｎｅ  ５  Ｔｙｒａｍｉｄｅ試薬と共にインキュベーションを行った。スライドを洗浄し、ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ封入剤で封入した。ヒト心臓組織標本に対するＨＥＲ２の定量のため、正常組織及び疾患組織の両方を含む心臓ＴＭＡ、ならびに細胞ペレットアレイを、サイトケラチン抗体を省略して上述のように染色した。
【００４０】
蛍光ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＦＬ（登録商標）（カリフォルニア州ヴィスタのＡｐｅｒｉｏ）上で０．７５  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ対物レンズを用いて倍率２０倍で細胞ペレットアレイ及びＴＭＡをスキャンした。
【００４１】
［自動化画像解析］Ｄｅｆｉｎｉｅｎｓ（登録商標）Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ  ＸＤ（ドイツ国ミュンヘンのＤＥＦＩＮＩＥＮＳ）に書き込まれた特注のルールセットを使用して自動化画像解析を行った。簡潔には、核をＤＡＰＩ層でセグメント化した。その後、核をサイトケラチンシグナルの端に到達するまで成長させることにより細胞を同定した。サイトケラチンシグナルを使用して腫瘍細胞（サイトケラチン陽性）と非腫瘍細胞／間質（サイトケラチン陰性）とを識別した。ＨＥＲ２膜染色の強度を、（ＨＥＲ２層の内部境界の平均）＋（ＨＥＲ２層の外部境界の平均）として単一細胞に基づき定量した。心臓組織試料、及び相対標準ペレットアレイに対するＨＥＲ２の定量のため、核検出の後、細胞をＨＥＲ２膜染色に到達するまで成長させる上記解析の変法を使用した。ＨＥＲ２染色の強度を定量し、ＨＥＲ２陽性細胞及びＨＥＲ２陰性細胞へと細胞を分類するために使用した。細胞ペレットアレイの場合、種々の細胞株のコアの平均ＨＥＲ２膜強度の値を出力し、ｑＦＡＣＳにより特定された対応するｌｏｇ（ＨＥＲ２受容体数）に対してプロットし、標準曲線を作成した。ＴＭＡの場合、コアの各単一の腫瘍細胞のＨＥＲ２膜染色強度値を出力し、作成した標準に基づいてさらに解析した。結果は請求に応じて入手可能である。
【００４２】
［ＨＥＲ２  ＩＨＣ試験］患者の腫瘍試料を、製造業者の説明書に従ってＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）（カリフォルニア州カーピンテリアのＤＡＫＯ）を用いてＦｏｌｉｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（オハイオ州パウエル）により実施される試験に供した。ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）の解釈についてＡＳＣＯ／ＣＡＰガイドラインを使用してＴＭＡを採点した。
【００４３】
［ＨＥＲ２  ＦＩＳＨ試験］Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ／Ｈａｒｖａｒｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＤＦ／ＨＣＣ）Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（米国マサチューセッツ州ボストンのＢｒｉｇｈａｍ  ＆  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）でＦＩＳＨ解析を行った。ＨＥＲ２／ｎｅｕ領域（ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ）及び染色体１７列挙プローブ、ＣＥＰ１７（ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ）を含有する二色の市販のＦＩＳＨプローブ（Ａｂｂｏｔｔ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ（登録商標）ＨＥＲ２  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｋｉｔ）により乳がんＴＭＡをハイブリダイズした。対照スライド（Ａｂｂｏｔｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を乳がんＴＭＡと同時に実行した。製造業者の指示書に従って前記アッセイを行った。いずれもＡｐｐｌｉｅｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．により供給されたＣＣＤカメラ（ＥＲ３３３９）及びＣｙｔｏ  Ｖｉｓｉｏｎ（登録商標）３．６  Ｂｕｉｌｄ  １６画像化ソフトウェアを使用して、染色したスライドをＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡上で画像化した。最初に１０倍の対物レンズを通して低出力でＤＡＰＩチャネルにてＴＭＡコアを画像化し、腫瘍領域を同定した。その後、１００倍のオイル対物レンズを通した画像化により実際の採点を完了した。Ａｂｂｏｔｔガイドラインに従い、またＡＳＣＯ／ＣＡＰガイドラインと一致して、最小限の２０個の識別可能な腫瘍細胞核を採点することによりＴＭＡコアの解析を行うか、又はコア全体をスキャンした後に明確な腫瘍が同定されなかった場合に２０個の導管細胞を採点した。腫瘍又は導管細胞のいずれも同定できなかった場合、コアを解析不可能（ＮＡ）とした。１．８未満のＨＥＲ２：ＣＥＰ１７比を有するコアを非増幅とし、２．２超のＨＥＲ２：ＣＥＰ１７比を有するコアを増幅とした。１．８〜２．２のＨＥＲ２：ＣＥＰ１７比を有するコアを境界増幅とし、追加の細胞を採点した。１つ又は両方のハイブリダイゼーション色素で見えないシグナルを有するコアは解析不可能（ＮＡ）とした。
【００４４】
［データ解析］患者試料及び細胞ペレットアレイ（標準）の自動化画像解析によるアウトプットをＭＡＴＬＡＢ  Ｒ２０１１ａ（マサチューセッツ州ナティックのＴｈｅ  Ｍａｔｈ  Ｗｏｒｋｓ）を使用して解析した。細胞ペレットアレイによる定量化画像に対する線形回帰を使用して、ｌｏｇ変換ＨＥＲ２受容体数に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の検量線を作成した。各ＴＭＡについて、細胞ペレットアレイを並行して染色し、得られた検量線はそのＴＭＡに固有のものであった。対応する細胞ペレットアレイによる検量線に基づいて、ＴＭＡによる１細胞基準当たりに対するＨＥＲ２膜染色強度を補間した。ＴＭＡコアにおける腫瘍細胞に関するＨＥＲ２受容体数の分布を相補累積分布（すなわち「テイル分布」）により表した。この表示は、所与のＨＥＲ２受容体値を上回ったコア内の細胞割合の同定を容易にした。
【００４５】
実施例１：アッセイの開発
自動化画像解析の使用は、より大きな腫瘍切片の評価を可能とし、これはＨＥＲ２発現レベルのより正確な判断を可能として、改善された臨床上の利益をもたらす可能性がある。抗ＨＥＲ２治療薬はタンパク質レベルで作用することから、アッセイをタンパク質検出用に設計し、定量的且つ客観的な解析方法と組み合わせた。アッセイの高次の概略を図１に示し、以下に詳述する。
【００４６】
単一細胞レベルでの定量は、患者の治療効果に対する腫瘍内でのＨＥＲ２発現の不均一性の影響を判断するのに重要であり、これは現在の臨床的なＨＥＲ２アッセイでは不可能である。さらに、レトロスペクティブに使用される場合、前記アッセイは、ＨＥＲ２を対象とする治療を処方するための診断上のカットポイントとして使用するため、ＨＥＲ２発現の最適度及びＨＥＲ２陽性細胞の割合を客観的に特定でき、このカットポイントは、乳がん及び胃がんの両方において活発に議論されるが、現在利用可能なアッセイを使用して満足に特定することはできない。加えて、自動化画像解析ソフトウェア及び標準曲線の使用により、ＨＥＲ２の状態の分類から読み取り手の主観を除外できる可能性がある。
【００４７】
［細胞ペレットマイクロアレイの作成］組織切片からのＨＥＲ２の定量は、組織染色とＨＥＲ２受容体レベルとを関連付けた標準曲線の作成を必要とする。この標準曲線を、細胞株のパネルにおけるＨＥＲ２発現レベルを測定することにより作成し、その後、目的の組織試料と並行して染色されるこれらの細胞のペレットからアレイを作製した。８つの細胞株（ＡＣＨＮ、ＤＵ１４５、ＩＧＲＯＶ１、ＭＤＡ−ＭＢ−１７５−ＶＩＩ、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、ＭＣＦ７−クローン１８、ＳＫＯＶ３、ＢＴ４７４−Ｍ３）を選択して、ｑＦＡＣＳにより測定される、広範囲のＨＥＲ２発現を測定した（表１）。前記細胞ペレットアレイに含まれる全ての細胞株はＦＡＣＳにより評価される単一のＨＥＲ２集団を有した。各細胞株由来細胞ペレットからのコアを、各々４通りアレイ上に置いた。完成した細胞ペレットマイクロアレイを切片作製に供し、未知のＨＥＲ２発現レベルの組織試料と並行して染色した。
【００４８】
【表１】
2015525358.tif 000002
【００４９】
［染色及び画像解析］染色の整合性を確実にするため、細胞ペレットアレイ標準及び未知のＨＥＲ２レベルの組織マイクロアレイを並行して染色した。腫瘍細胞と非腫瘍細胞を識別するため抗ヒトパンサイトケラチン抗体を用い、ＨＥＲ２を同定するために抗ヒトＨＥＲ２抗体を用いて上述のように染色を行い、また細胞核を同定するためにＤＡＰＩを用いて対比染色を行った。細胞ペレットアレイの全体的な切片の画像を後の解析のためデジタル処理で取得した。種々の細胞株の細胞ペレットアレイコアの代表画像を図２Ａ（左パネル）に示す。
【００５０】
画像取得の後、自動化画像解析ソフトウェアは、細胞ペレットアレイの各細胞のＨＥＲ２染色及び組織マイクロアレイのＨＥＲ２染色を定量した。同一の画像解析アルゴリズムを細胞ペレット標準及び組織マイクロアレイの両方に対して適用した。前記解析は、（１）細胞セグメント化、（２）サイトケラチン染色に基づく腫瘍及び非腫瘍細胞の同定、ならびに（３）同定された腫瘍細胞の全てに関する細胞ごとの膜に沿ったＨＥＲ２染色の定量で構成された。上記アルゴリズムは、使用者の入力の必要性を排除し、完全に客観的な取り扱いを確実にする様式で設計された。細胞ペレットマイクロアレイのセグメント化及び分類を図２Ａ（右パネル）に示す。標準アレイの細胞株全てに関する１細胞当たりのＨＥＲ２膜染色強度の分布を図２Ｂに示し、ＨＥＲ２発現の単一集団はｑＦＡＣＳによる観察と一致することを示す。
【００５１】
アッセイ基準
［標準曲線］細胞ペレットアレイの画像解析は、各細胞株についての平均ＨＥＲ２平均蛍光強度（ＭＦＩ）の算出を可能とする。これらの値をｑＦＡＣＳ測定と組み合わせて、１細胞当たりの受容体に関してＭＦＩ対ＨＥＲ２発現の標準曲線を作成した（図２Ｃ）。適合度及び残差の解析に基づいて、ｌｏｇ線形較正モデルは前記データに対して最も頑健で簡潔な適合を与え（図２Ｄ）、＋／−５０，０００受容体／細胞の測定精度をもたらしたことが特定された。標準曲線に基づき、定量の下限及び上限は、それぞれ、およそ４．８ｅ４受容体／細胞及び１．９ｅ６受容体／細胞である。検出の上限及び下限は、染色の実行によりわずかに変動する。標準曲線の染色及び対応する解析を複数の日（ｎ＝８）で実行すると、得られた標準曲線において有意差は観察されず、このアッセイでは無視できる実行間のエラーが存在することが示された（図４も参照されたい）。
【００５２】
［試料解析］異なるステージの乳がん及び乳がんの種類、ならびに正常な乳房組織（対照として）を含む二重に測定された４８名の患者試料（合計９６コア）を含む乳房疾患ＴＭＡを、ＨＥＲ２、サイトケラチンについて染色し、ＤＡＰＩで対比染色した。乳房疾患ＴＭＡの染色を標準細胞ペレットアレイと並行して実行した。３つの腫瘍コアを図３Ａに示す（上部パネル）。また、自動化画像解析による対応する細胞セグメント化を示す（下部パネル）。ＨＥＲ２陰性腫瘍細胞を灰色で示し、低ＨＥＲ２発現（１５０，０００ＨＥＲ２／細胞未満）を伴う腫瘍細胞をピンク色で示す。中程度（１５０，０００ＨＥＲ２／細胞〜１，０００，０００ＨＥＲ２／細胞）及び高（１，０００，０００ＨＥＲ２／細胞超）ＨＥＲ２発現細胞を、それぞれ、薄い赤色及び赤色で示す。サイトケラチン陰性細胞を非腫瘍／間質細胞と分類し、シアンで表す。標準曲線を使用して、１細胞当たりの平均ＨＥＲ２発現数を各個別のコアについて算出した（図３Ｂ）。各乳房疾患ＴＭＡコアについて種々の腫瘍細胞集団の割合（ＨＥＲ２低、ピンク色；中程度、薄い赤色；高、赤色；及び陰性、白色）を図３Ｃに示す。
【００５３】
［アレイ再現性］本発明者らは、上記乳房腫瘍ＴＭＡのほぼ同一の切片から特定された平均ＨＥＲ２／細胞値を比較することにより、本発明者らのアッセイの技術的な再現性を判断した。腫瘍マイクロアレイの結果生じた切片を、異なる日に対照アレイ標準と並行して染色し、前記アレイの個々のコアに関して個々のＨＥＲ２／細胞レベルを特定した。視覚的な比較を補助するため２つの切片に由来する腫瘍マイクロアレイ上の９６個の各々のコアに関して平均ＨＥＲ２／細胞値を図４Ａに示す。Ｒ２  ０．９８及び傾き＝１．０７を有し、全体的な一致は優れている。
【００５４】
２つの対照アレイを単一の乳がんＴＭＡと並行して染色することにより、算出されたＨＥＲ２／細胞値に対する標準曲線の効果を調査した。２つの対照アレイ（標準Ａ及び標準Ｂ）の染色より得られた２つの標準曲線が図４Ｂに示される。標準Ａ又は標準Ｂのいずれかに由来する９６個の各個別のコアについての平均ＨＥＲ２／細胞の同時補間の後、相関プロットを作成し、図４Ｃに示す。２つの補間の間で全体的な高い一致が観察された（Ｒ２＝１．００；傾き＝０．８５）。これらのデータより、本発明者らは、細胞標準における変動性に由来する平均ＨＥＲ２／細胞の不確実性をおよそ１５％と推定することができ、ＨＥＲ２タンパク質発現が３ｌｏｇ〜４ｌｏｇにわたる範囲であることを考慮すると精度の高い測定である。
【００５５】
実施例２：患者試料の単一細胞解析
［乳房疾患試料］本発明者らのアッセイの分析的検証のため、幅広い疾患スペクトルＴＭＡを利用した。ＴＭＡは、正常乳房及び様々なステージの乳がんに由来する試料を含んだ。その結果、ＨＥＲ２陽性の広範囲にわたる調査によって報告されるように、前記ＴＭＡは、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）及び／又はＦＩＳＨのいずれかに関してＨＥＲ２陽性の典型的な分布を捕捉しない。乳房ＴＭＡを、細胞ペレットアレイと並行して染色し、解析し、ＴＭＡの各コアにおけるＨＥＲ２レベル／細胞をｌｏｇ線形検量線より算出し直した（ｂａｃｋ  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）。２つのＴＭＡコアに関するＨＥＲ２発現分布の代表的なヒストグラムを図５Ａに示す。これらの分布を使用して、本発明者らは、逆累積分布関数として前記データを再度プロットし、所与のＨＥＲ２レベルよりも大きく発現する細胞の画分を強調することができる（図５Ｂ）。この方式でプロットすることにより、本発明者らのアッセイは、２つの主要な測定、すなわちＨＥＲ２発現／細胞及び同一レベルでＨＥＲ２を発現する細胞の割合を定量的に供給することができる。
【００５６】
［ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）との比較］１コア当たりの平均ＨＥＲ２受容体数を、隣接領域の組織スライスにおいてＴＭＡ製造業者により特定されたＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）スコアに対してプロットした（図５Ｃ）。高ＨＥＲ２受容体数と高（３＋）スコアとの全体的な相関が観察された。しかしながら、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）による特定の値に関して採点されたコアは、多様な補間された平均ＨＥＲ２受容体数にも及ぶことに気づいた。解析の次の段階として、組織の不均一性を十分に表さない平均ＨＥＲ２数／コアに注目する代わりに、パネル５Ａ及び５Ｂに記載される逆累積分布関数により各ＴＭＡコアにおける全ての腫瘍細胞間のＨＥＲ２発現の分布を解析した。各個別のコアについて得られたプロットを、その特定のＴＭＡコア（３＋、赤色；２＋、濃い青色；１＋／０、緑色）に対応するＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）スコアに基づいて色分けした。結果を図５Ｄに示す。プロットは、任意の所与の試料内にＨＥＲ２発現のかなりの変動性が存在することを示す。前記試料は、２つの異なる集団、すなわち、１００，０００ＨＥＲ２／細胞未満を発現する９０％の腫瘍細胞／コアを伴い、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ（登録商標）陰性のほとんどと、１＋コア及びわずかな２＋コアを含む、グラフ左側の１集団、ならびに、少なくとも４００，０００ＨＥＲ２／細胞で少なくとも３０％以上の腫瘍細胞／コア発現を伴うグラフ右側の１集団に分かれることが明らかである。この右手側の集団は、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ  ３＋及び２＋のコアの大部分を含む。
【００５７】
［ＦＩＳＨとの比較］また、ＰａｔｈＶｙｓｉｏｎ（登録商標）を使用して、改良されたアッセイの結果をＨＥＲ２増幅に関するＦＩＳＨ試験と比較した。同一の乳房疾患ＴＭＡの近辺組織スライスに対してＦＩＳＨを行った。各個別のコアについてＨＥＲ２：ＣＥＰ１７の比によって測定されるＨＥＲ２増幅を、対応する補間された１コア当たりの平均ＨＥＲ２受容体数に対して図５Ｅにおいてプロットした。また、高レベルの増幅を伴うコアは、本発明者らのアッセイにより特定される高い平均ＨＥＲ２受容体数を特徴とするが、この相関はＦＩＳＨ増幅コアの全てについては有効ではなかった。コアにおける全ての腫瘍細胞の間でＨＥＲ２発現の分布が逆累積分布関数により解析された場合には、前記コアは再び２つの異なる集団に集合した（図５Ｆ）。高ＨＥＲ２レベルを発現する腫瘍細胞を高い割合で含むコアはグラフの右側に集まり、全てＦＩＳＨ増幅された（赤色）。それとは逆に、ＦＩＳＨ非増幅コア（緑色）はグラフの左側に集まり、高ＨＥＲ２レベルを発現する腫瘍細胞の割合は低かった。臨床上のＨＥＲ２分類スキームに従い、ＴＭＡ内の個々の試料を２つの群、すなわち、（ｉ）抗ＨＥＲ２治療に適格ではない群（０／１＋／２＋且つＦＩＳＨ陰性；「ＨＥＲ２陰性」）及び（ｉｉ）抗ＨＥＲ２治療に適格な群（２＋且つＦＩＳＨ陽性及び３＋；「ＨＥＲ２陽性」）に分けた。１コア当たりの平均ＨＥＲ２受容体数を、図５Ｇに示されるＨＥＲ２のこれらの従来の定義に対してプロットした。受容体数の解析より、ＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ及びＦＩＳＨ試験の組合せに基づいて、２つの群間の明確な違いが存在する。要約すると、前記データは、本発明者らのアッセイとＦＩＳＨ増幅との高い一致を示す。
【００５８】
［クラスタリング解析］ＨＥＲ２定量は、図５における逆累積分布関数を使用する可視化されており、患者試料において、特に「ＨＥＲ２陽性」群内で、ＨＥＲ２の分布に実質的な不均一性が存在することを示した。この群内で治療に反応する個々の患者は変化しやすいことから、「ＨＥＲ２陽性」群内の異なる分集団を同定し、従来の試験法による結果と比較した。Ｋ平均アルゴリズムを使用して、ＨＥＲ２陽性群の各患者腫瘍コアに関するＨＥＲ２受容体分布を算出した。この解析は、従来の「ＨＥＲ２陽性」群において、図８Ａ〜図８Ｃに示される３つの異なる分集団を同定した。図８Ａ〜図８Ｃ中の線の色は、各試料に関するＩＨＣスコアに対応する。これらの分集団の目視検査は、３つのパターン、すなわち（１）低且つ不均一−比較的低いＨＥＲ２発現が多数を占める不均一な発現を有するが、なおも従来の手段によりＨＥＲ２陽性と分類される試料（図８Ａ）、（２）高且つ不均一−変動する中間の発現の程度を呈するが、高ＨＥＲ２発現が多数を占める試料（図８Ｂ）、及び（３）明らかに高い−大多数の高レベルのＨＥＲ２を発現する細胞を含む試料（図８Ｃ）を明らかとした。３つの分集団の全てが、従来の「ＨＥＲ２陰性」群を上回るＨＥＲ２発現を示す。図８Ｄ及び図８Ｅでは、定義される分集団の各々割合をＨｅｒｃｅｐＴｅｓｔ３＋試料又は２＋／ＦＩＳＨ陽性試料のいずれかにおいて示す。３＋患者試料は８２％（１４／１７）が明らかに高く、残り１８％（３／１７）が高且つ不均一であった（図８Ｄ）。一方、２＋／ＦＩＳＨ陽性患者は、わずか２３％（５／２２）が明らかに高く、５４％（１２／２２）が高且つ不均一であり、残り２３％（５／２２）が低且つ不均一であるより幅広い分布を呈した（図８Ｅ）。
【００５９】
［他の腫瘍タイプ］乳がん及び胃がんの両方に関し、ＨＥＲ２試験が診療所で既に確立されており、さらなるがんにおけるＨＥＲ２を標的とする治療の使用が調査されていることから、改良されたアッセイが幅広い腫瘍タイプにわたる適用可能性を有することが重要である。前記アッセイ及び画像解析方法論の頑健性を試験するため、胃、膀胱及び卵巣を起源とする腫瘍を染色し、分類し、採点した。代表的な胃、膀胱及び卵巣の腫瘍コアの染色画像を、対応する腫瘍細胞対非腫瘍細胞の分類及びＨＥＲ２染色の強度と共に図６に示す。表されるコアに対応する逆累積分布関数を下部パネルに示す。種々の腫瘍の明らかに異なる形態学は、本明細書に開示される解析方法により巧みに取り扱われる。
【００６０】
［ヒト心臓試料］前記アッセイの正常組織に対する適用可能性を立証するため、ヒト心臓組織を検査した。腫瘍の進行におけるその役割以外に、ＨＥＲ２は、ストレスに暴露された心筋細胞を保護する役割も有することが示されている。ヒト幹細胞由来心筋細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで低レベルのＨＥＲ２を発現することが以前に示されている。正常心臓標本及び疾患心臓標本（病理診断を表２に示す）を含む心臓組織マイクロアレイを、ＨＥＲ２について染色し、上述の細胞ペレットアレイ標準と並行してＤＡＰＩで対比染色した。染色されたコアの代表画像を図７Ａに示す（上部パネル）。心臓ＴＭＡ及び細胞ペレットアレイを、上述の対をなす乳がんＴＭＡとペレットアレイと同様の様式で、上述のように解析した。代表的な心臓コアのセグメント化及び分類の結果を図７Ａ（下部パネル）に示す。解析された各心臓コアに関する平均ＨＥＲ２強度／細胞膜を図７Ｂに表し、種々のＨＥＲ２細胞集団の分布（高、黒色；中程度、灰色；及び低、薄い灰色）を図７Ｃに示す。全ての心臓試料は、最も低いＨＥＲ２発現細胞株（ＡＣＨＮ、４５，０００ＨＥＲ２／細胞、表１）と同じ範囲の低平均ＨＥＲ２強度レベルを示した。解析された全試料について、コア中の９５％を超える細胞が低ＨＥＲ２に分類された。平均ＨＥＲ２受容体数／コアを、線形回帰適合により解析された標準から補間し、表２に示す。様々な種類の疾患心臓組織を含む全てのコアが、５０，０００を下回るＨＥＲ２数を示した。
【００６１】
【表２】
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【００６２】
上記結果は、例としてＨＥＲ２を使用する本明細書に開示されるアッセイ技術の技術能力及び潜在的有用性を立証する。このアッセイを、他のＥｒｂＢファミリーメンバー、他の細胞表面標的及び細胞内タンパク質にも容易に拡大利用することができる。ＨＥＲ２分野は、その測定の臨床的有用性が立証された特別な例であり、したがって、診断アッセイスペースは込み入っている。このアッセイは、新規なＨＥＲ２を対象とする治療薬の解析、ならびに乳房及び胃以外のＨＥＲ２発現腫瘍タイプの研究に使用されるであろう。
【００６３】
後注
本発明はその具体的な実施形態と関連して記載されたが、さらなる改変が可能であり、一般的に、本発明の原理に従って、本出願が本発明の任意の変化、用途、又は適合を包含することを意図し、本発明が属する技術分野での既知の又は通例の実施の範囲内に含まれる本開示からのかかる離脱を含み、また本明細書に述べる必須の特徴に対して適用され得ることが理解されるであろう。本明細書で言及される米国、国際又は他の特許又は特許出願又は公開のいずれの開示もその全体が参照により本明細書に援用される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2015525358.tif 000006
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【国際調査報告】
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