(57)【要約】ＣＤ３７を標的とする癌治療の奏功性を改善する方法が、提供される。更に、この方法において有用な試薬を含むキットが、提供される。一局面において、抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートにより癌治療の有効性を増大させる方法が提供され、この方法は、１つまたは複数の標準試料の染色強度または染色均一性と比較してＣＤ３７を発現する癌性試料の染色強度または染色均一性を識別する検出方法を利用して、対象の癌性試料中のＣＤ３７遺伝子または蛋白質の発現増加が検出された癌を有する対象に、抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートを投与することを含む。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートにより癌治療の有効性を増大させる方法であって、
１つまたは複数の標準試料の染色強度または染色均一性と比較してＣＤ３７を発現する癌性試料の染色強度または染色均一性を識別する検出方法を利用して、対象の癌性試料中のＣＤ３７遺伝子または蛋白質の発現増加が検出された癌を有する対象に、抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートを投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
癌を抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートでの治療に対して感受性があると判定する方法であって、
（ａ）１つまたは複数の標準試料の染色強度または染色均一性と比較してＣＤ３７を発現する癌性試料の染色強度または染色均一性を識別する検出方法の利用を含む、前記癌から得られた癌性試料中のＣＤ３７発現レベルを測定すること；
（ｂ）前記癌性試料のＣＤ３７染色強度または染色均一性スコアを決定すること；および
（ｃ）ステップ（ｂ）で決定された前記ＣＤ３７染色強度または染色均一性スコアを、少なくとも１つの標準試料中のＣＤ３７蛋白質発現を測定することにより決定された相対値に対して比較することであって、
前記少なくとも１つの標準試料が、抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートでの治療に感受性がない組織、細胞、または細胞ペレット試料であり、前記相対値よりも高い、ステップ（ｂ）において決定された前記試料のＣＤ３７染色強度スコアが、前記癌を抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートでの治療に感受性があると判定すること
を含む、前記方法。
【請求項３】
抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートに応答する可能性がある癌を判定する方法であって、
（ａ）前記癌の細胞を含む生物学的試料を、前記細胞表面のＣＤ３７蛋白質に結合する薬剤と接触させること；
（ｂ）（ａ）の前記生物学的試料の細胞表面のＣＤ３７蛋白質に結合する前記薬剤の結合を検出すること；
（ｃ）１つまたは複数の標準試料への比較に基づいて、ステップ（ｂ）の前記結合にスコアを割り付けること；および
（ｄ）ステップ（ｃ）における前記スコアを、標準組織または細胞のスコアと比較することであって、陰性もしくはＣＤ３７発現レベルが低い標準試料のスコアを超える前記癌ＣＤ３７レベルのスコア、またはＣＤ３７発現レベルが高い標準試料のスコア以上となる前記癌ＣＤ３７レベルのスコアにより、前記癌を抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートに応答する可能性があると判定すること
を含む、前記方法。
【請求項４】
癌を有する対象を、低用量の抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲート投与計画に応答する可能性があると判定する方法であって、
（ａ）前記癌の細胞を含む生物学的試料を、細胞表面のＣＤ３７蛋白質に結合する薬剤と接触させること；
（ｂ）（ａ）の前記生物学的試料への前記薬剤の結合を検出すること；
（ｃ）１つまたは複数の標準試料との比較に基づいて、ステップ（ｂ）の前記結合にスコアを割り付けること；および
（ｄ）ステップ（ｃ）における前記スコアを、標準組織または細胞のスコアと比較することであって、陰性もしくはＣＤ３７発現レベルの低い標準試料を超える前記癌ＣＤ３７レベルのスコア、またはＣＤ３７発現レベルの高い標準試料のスコア以上となる前記癌ＣＤ３７レベルのスコアが、前記癌を低用量の抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートに応答する可能性があると判定すること
を含む、前記方法。
【請求項５】
癌を有する対象のための抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートでの治療計画を最適化する方法であって、
（ａ）対象から得られた癌性試料のＣＤ３７発現レベルを検出すること；
（ｂ）前記癌性試料のＣＤ３７発現レベルを標準試料のＣＤ３７発現レベルと比較すること；
（ｃ）前記癌性試料のＣＤ３７染色強度スコアを決定すること；および
（ｄ）前記スコアが低ければ前記対象に高用量の抗ＣＤ３７抗体もしくは抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートを投与し、または前記スコアが高ければ前記対象に低用量の抗ＣＤ３７抗体もしくは抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートを投与すること
を含む、前記方法。
【請求項６】
対象の癌性試料中の癌細胞の細胞表面ＣＤ３７発現を検出する方法であって、
（ａ）ホルマリン固定パラフィン包埋された癌性試料を得ること；
（ｂ）前記試料を、細胞表面ＣＤ３７と特異的に結合する抗体と接触させること；
（ｃ）１つまたは複数の標準試料の染色強度または染色均一性と比較してＣＤ３７発現試料の染色強度または染色均一性を識別し得る検出方法を利用して、前記癌性試料中の前記細胞表面ＣＤ３７への（ｂ）の前記抗体の結合を測定すること；および
（ｄ）前記腫瘍の癌性試料中の細胞表面ＣＤ３７染色強度または染色均一性のレベルを１つまたは複数の標準試料と比較した後、ＣＤ発現スコアを前記ＣＤ３７に割り付けること
を含む、前記方法。
【請求項７】
前記検出が、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によるものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＩＨＣが、異なるＣＤ３７発現レベルを識別し得る、較正されたＩＨＣ（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  ＩＨＣ）である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記検出方法が、細胞表面のＣＤ３７発現レベルが低い、細胞表面のＣＤ３７発現レベルが中程度である、または細胞表面のＣＤ３７発現レベルが高い試料に関して、一定範囲の染色強度を生成する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記検出方法が、標準試料と比較して、ＣＤ３７を発現する癌性試料の染色強度および染色均一性を識別する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌性試料または生物学的試料が、免疫組織化学的検査による、ＣＤ３７発現についての２、３、または３＋の染色強度スコアを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌性試料または生物学的試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋試料での免疫組織化学的検査による、ＣＤ３７発現についての２、３、または３＋の染色強度スコアを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記癌性試料または生物学的試料が、均質であるＣＤ発現の染色均一性を有する、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記癌性試料または生物学的試料が、ＣＤ３７についての２、３、または３＋の染色強度スコア、および不均質または均質である染色均一性を有する、請求項７〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫組織化学的検査が、用手法で実施される、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記免疫組織化学的検査が、自動化システムを利用して実施される、請求項７〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記標準試料が、陽性標準試料または陰性標準試料である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記標準試料が、細胞、細胞ペレット、または組織を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出が、細胞表面ＣＤ３７に特異的に結合する抗体を用いてＣＤ３７発現を検出することを含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、ＣＴ１である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、酵素、フルオロフォア、放射性標識、およびルミノフォアからなる群より選択される検出試薬を更に含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記検出試薬が、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、トリチウム、ローダミン、および西洋ワサビペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体の濃度が、約１〜１０μｇ／ｍＬである、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗体の濃度が、約４〜５μｇ／ｍＬである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗体の濃度が、約４．２μｇ／ｍＬである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記癌が、Ｂ細胞リンパ腫、ＮＨＬ、前駆体Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、低悪性度、中悪性度および高悪性度の濾胞性リンパ腫(ＦＬ)、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴ型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、結節型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）からなる群より選択される、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記癌性試料または前記生物学的試料が、組織、血液、血漿、骨髄、またはリンパである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートと、容器と、前記抗体またはイムノコンジュゲートを用いてＩＨＣによる測定での２、３、または３＋レベルのＣＤ３７発現を特徴とする癌を治療し得ることを示した添付文書またはラベルと、を含む製造品。
【請求項２９】
診断に用いられるネズミ抗ＣＤ３７抗体と、治療に使用される抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートと、を含む診断薬および医薬品混合キット。
【請求項３０】
前記診断抗体が、ＩＨＣによるＣＤ３７発現を検出することが可能である検出抗体である、請求項２９に記載の診断薬および医薬品混合キット。
【請求項３１】
細胞表面ＣＤ３７に特異的に結合する検出抗体と、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）用の試薬と、１つまたは複数の規格標準試料と、を含む診断キットであって、前記規格標準試料が、細胞、細胞ペレット、またはホルマリン固定パラフィン包埋された組織試料を含み、前記１つまたは複数の規格標準試料が、非ＣＤ３７発現、ＣＤ３７発現レベルが低い、またはＣＤ３７発現レベルが高い細胞、細胞ペレット、または組織のものである、前記診断キット。
【請求項３２】
前記ＩＨＣが、異なるＣＤ３７発現レベルを識別し得る較正されたＩＨＣである、請求項２８に記載の製造品または請求項３０もしくは３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記較正されたＩＨＣが、細胞表面のＣＤ３７発現レベルが低い、細胞表面のＣＤ３７発現レベルが中程度である、または細胞表面のＣＤ３７発現レベルが高い試料について一定範囲の染色強度を生成する、請求項３２に記載の製造品またはキット。
【請求項３４】
前記ＩＨＣが、標準試料と比較して、ＣＤ３７発現試料における染色強度および染色均一性を識別する、請求項２８または３０〜３３のいずれか１項に記載の製造品またはキット。
【請求項３５】
前記ＩＨＣが、ホルマリン固定パラフィン包埋試料で実施される、請求項２８または３０〜３３のいずれか１項に記載の製造品またはキット。
【請求項３６】
前記ＩＨＣが、用手法で実施される、請求項２８または３０〜３３のいずれか１項に記載の製造品またはキット。  
【請求項３７】
前記ＩＨＣが、自動化システムを利用して実施される、請求項２８または３０〜３３のいずれか１項に記載の製造品またはキット。
【請求項３８】
前記ＣＤ３７イムノコンジュゲートが、抗ＣＤ３７抗体、リンカー、および細胞毒を含む、請求項２８〜３０または３２〜３７のいずれか１項に記載の製造品またはキット。
【請求項３９】
前記抗ＣＤ３７抗体が、キメラ、またはヒト化ＣＤ３７−３、ＣＤ３７−３８またはＣＤ３７−５０である、請求項３８に記載の製造品またはキット。
【請求項４０】
前記リンカーが、開裂性リンカー、非開裂性リンカー、親水性リンカー、およびジカルボン酸系リンカーからなる群より選択される、請求項３８または３９に記載の製造品またはキット。
【請求項４１】
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ)ペンタノアート（ＳＰＰ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホペンタノアート（スルホ−ＳＰＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＤＢ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル) シクロヘキサンカルボキシラート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル) シクロヘキサンカルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ）；およびＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）からなる群より選択される、請求項４０に記載の製造品またはキット。
【請求項４２】
前記リンカーが、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシラート（ＳＭＣＣ）である、請求項４１に記載の製造品またはキット。
【請求項４３】
前記細胞毒が、メイタンシノイド、メイタンシノイド類似体、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、オーリスタチン、トマイマイシン誘導体およびレプトマイシン誘導体または前記細胞毒のプロドラッグからなる群より選択される、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載の製造品またはキット。
【請求項４４】
前記細胞毒が、メイタンシノイドである、請求項４３に記載の製造品またはキット。
【請求項４５】
前記メイタンシノイドが、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−ｌ−オキソプロピル）−メイタンシンまたはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシンである、請求項４４に記載の製造品またはキット。
【請求項４６】
前記メイタンシノイドが、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−ｌ−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）である、請求項４５に記載の製造品またはキット。
【請求項４７】
前記イムノコンジュゲートが、前記抗体ｈｕＣＤ３７−３、前記リンカーＳＭＣＣ、および前記メイタンシノイドＤＭ１を含む、請求項３８〜４６のいずれか１項に記載の製造品またはキット。
【請求項４８】
１つまたは複数の標準試料を更に含む、請求項２９〜３０および３２〜４７のいずれか１項に記載の診断薬および医薬品混合キット。
【請求項４９】
前記標準試料が、陽性標準試料または陰性標準試料である、請求項４８に記載の診断薬および医薬品混合キット。
【請求項５０】
前記標準試料が、細胞、細胞ペレット、または組織を含む、請求項４８または４９に記載の診断薬および医薬品混合キット。
【請求項５１】
前記検出抗体が、酵素、フルオロフォア、放射性標識、およびルミノフォアからなる群より選択される検出試薬を更に含む、請求項３０〜３７のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５２】
前記検出試薬が、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、トリチウム、ローダミン、および西洋ワサビペルオキシダーゼからなる群より選択される、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記検出抗体の濃度が、約１〜１０μｇ／ｍＬである、請求項３０〜３７または５１〜５２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項５４】
前記検出抗体の濃度が、約４〜５μｇ／ｍＬである、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記検出抗体の濃度が、約４．２μｇ／ｍＬである、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
前記ＣＤ３７発現レベルの低い対照試料が、ナマルバまたはＲＬ腫瘍細胞である、請求項３１に記載のキット。
【請求項５７】
前記ＣＤ３７発現レベルの高い対照試料が、Ｄａｕｄｉ細胞株およびＲａｍｏｓ細胞株、ならびにＣＤ３７を安定的にまたは一過性にトランスフェクトされた細胞株からなる群より選択される、請求項３１に記載のキット。
【請求項５８】
ＣＤ３７を安定的にまたは一過性にトランスフェクトされた前記細胞株が、３００−１９／ＣＤ３７である、請求項５７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明の分野は、一般に、ヒトＣＤ３７の過剰発現を特徴とするＢ細胞疾患に対する治療有効性を増大させることに関する。より詳細には、本発明は、ＣＤ３７アンタゴニスト、例えばＣＤ３７イムノコンジュゲートを用いた遺伝子発現アッセイにより測定するとＢ細胞がＣＤ３７を発現するＢ細胞疾患、例えば癌または自己免疫疾患に罹患し易い患者、またはその疾患と診断された患者のより有効な治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
癌は、先進国の主な死亡原因の１つであり、１００万人を超える人が癌と診断されており、米国だけで１年あたり５０万人が死亡している。全体として、３人中１人を超える人が一生のうちに何らかの形態の癌を発症すると推定される。
【０００３】
ＧＰ５２−４０、テトラスパニン−２６、またはＴＳＰＡＮ２６としても公知の白血病抗原ＣＤ３７（「ＣＤ３７」）は、テトラスパニンスーパーファミリーの膜貫通蛋白質である（Ｍａｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ，１９９７  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１：４２８−４４２）。それは、前Ｂ細胞から末梢成熟Ｂ細胞段階までの間にＢ細胞上で発現されるが、形質細胞への終末分化の際に存在しない４つの膜貫通ドメインを有する高グリコシル化蛋白質（ｈｅａｖｉｌｙ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）である（Ｌｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．１５２：１２−２１）。ＣＤ３７抗原は、Ｔ細胞、骨髄細胞および顆粒球上では弱い発現でしかない（Ｓｃｈｗａｒｔｚ−Ａｌｂｉｅｚ  ｅｔ  ａｌ．１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０（３）９０５−９１４）。しかしＣＤ３７は、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）などに見出されるような悪性Ｂ細胞上でも発現される（Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７（９）：３０１３−８）。この発現プロファイルは、ＣＤ３７がＢ細胞悪性腫瘍の有望な治療ターゲットとなることを示唆しており、現在、Ｂ細胞悪性腫瘍のより効果的治療薬には、未だ適えられていない明白な医学的要望が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍａｅｃｋｅｒら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（１９９７）１１：４２８〜４４２
【非特許文献２】Ｌｉｎｋら、Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．（１９８７）１５２：１２〜２１
【非特許文献３】Ｓｃｈｗａｒｔｚ−Ａｌｂｉｅｚら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１９８８）１４０（３）９０５〜９１４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
発明の概要
本発明は、癌におけるＣＤ３７の発現の動的範囲の発見と、ＣＤ３７発現レベルが高い癌が抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートでの治療に対してより応答性があるという発見と、に基づく。本発明は有利には、治療剤、即ち抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートを高い発現レベルのＣＤ３７を有することが見出された患者に投与することにより、治療に応答する可能性が高い患者の治療を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一実施形態において、本発明は、１つまたは複数の標準試料の染色強度または染色均一性と比較してＣＤ３７を発現する癌性試料の染色強度または染色均一性を識別する検出方法を利用して、対象の癌性試料中にＣＤ３７遺伝子または蛋白質の発現増加が検出された癌を有する対象に、抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートを投与することを含む、抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートにより癌治療の有効性を増大させる方法を提供する。
【０００７】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）１つまたは複数の標準試料の染色強度または染色均一性と比較してＣＤ３７を発現する癌性試料の染色強度または染色均一性を識別する検出方法の利用を含む、対象の癌から得られた癌性試料中のＣＤ３７発現レベルを測定すること；（ｂ）癌性試料のＣＤ３７染色強度または染色均一性スコアを決定すること；および（ｃ）ステップ（ｂ）で決定されたＣＤ３７染色強度または染色均一性スコアを、少なくとも１つの標準試料中のＣＤ３７タンパク質の発現を測定することにより決定された相対値に対して比較すること、を含む、癌を抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートでの治療に対して感受性の可能性があると判定する方法であって、少なくとも１つの標準試料が、抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートでの治療に感受性がない組織、細胞、または細胞ペレット試料であり、相対値よりも高い、ステップ（ｂ）において決定された試料のＣＤ３７染色強度スコアにより、その癌が抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートを用いた治療に感受性があるとする、方法を提供する。
【０００８】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）癌の細胞を含む生物学的試料を、細胞表面のＣＤ３７蛋白質に結合する薬剤と接触させること；（ｂ）（ａ）の生物学的試料の細胞表面のＣＤ３７蛋白質に結合する薬剤の結合を検出すること；（ｃ）１つまたは複数の標準試料への比較に基づいて、ステップ（ｂ）の結合にスコアを割り付けること；および（ｄ）ステップ（ｃ）におけるスコアを、標準組織または細胞のスコアと比較すること、を含む、抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートに応答する可能性がある癌を同定する方法であって、陰性もしくはＣＤ３７発現レベルが低い標準試料のスコアを超える癌ＣＤ３７レベルのスコア、またはＣＤ３７発現レベルが高い標準試料のスコア以上となる癌ＣＤ３７レベルのスコアにより、癌を抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートに応答する可能性があるとする、方法を提供する。
【０００９】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）癌の細胞を含む生物学的試料を、細胞表面のＣＤ３７蛋白質に結合する薬剤と接触させること；（ｂ）（ａ）の生物学的試料への前記薬剤の結合を検出すること；（ｃ）１つまたは複数の標準試料との比較に基づいて、ステップ（ｂ）の結合にスコアを割り付けること；および（ｄ）ステップ（ｃ）におけるスコアを、標準組織または細胞のスコアと比較すること、を含む、癌を有する対象を、低用量の抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲート治療計画に応答する可能性があると判定する方法であって、陰性もしくは低いＣＤ３７発現の標準試料を超える癌ＣＤ３７レベルのスコア、または高ＣＤ３７発現の標準試料のスコア以上となる癌ＣＤ３７レベルのスコアにより、その癌を低用量の抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートに応答する可能性があると判定する、方法を提供する。
【００１０】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）対象から得られた癌性試料のＣＤ発現レベルを検出すること；（ｂ）癌性試料のＣＤ３７発現レベルを標準試料のＣＤ３７発現レベルと比較すること；（ｃ）癌性試料のＣＤ３７染色強度スコアを決定すること；および（ｄ）スコアが低ければ対象に高用量の抗ＣＤ３７抗体もしくは抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートを投与し、またはスコアが高ければ対象に低用量の抗ＣＤ３７抗体もしくは抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートを投与すること、を含む、癌を有する対象のための抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートでの治療計画を最適化する方法を提供する。
【００１１】
別の実施形態において、本発明は、（ａ）ホルマリン固定パラフィン包埋された癌性試料を得ること；（ｂ）癌性試料を、細胞表面ＣＤ３７と特異的に結合する抗体と接触させること；（ｃ）１つまたは複数の標準試料の染色強度または染色均一性と比較してＣＤ３７発現試料の染色強度または染色均一性を識別し得る検出方法を利用して、癌性試料中の細胞表面ＣＤ３７への（ｂ）の抗体の結合を測定すること；および（ｄ）癌性試料中の細胞表面ＣＤ３７の染色強度または染色均一性のレベルを１つまたは複数の標準試料と比較した後、ＣＤ発現スコアをＣＤ３７に割り付けること、を含む、対象の癌性試料中の癌細胞の細胞表面ＣＤ３７発現を検出する方法を提供する。
【００１２】
幾つかの実施形態において、検出は、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）によるものである。ＩＨＣは、異なるＣＤ３７発現レベルを識別し得る、較正されたＩＨＣ（ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ  ＩＨＣ）であってもよい。
【００１３】
幾つかの実施形態において、検出方法は、細胞表面のＣＤ３７発現レベルが低い、細胞表面のＣＤ３７発現が中程度である、または細胞表面のＣＤ３７発現が高い試料に関して、一定範囲の染色強度を生み出す。
【００１４】
幾つかの実施形態において、検出方法は、標準試料と比較して、ＣＤ３７発現癌性試料の染色強度および染色均一性を識別する。
【００１５】
幾つかの実施形態において、癌性試料または生物学的試料は、免疫組織化学的検査による、ＣＤ３７発現について１よりも大きな染色強度スコアを有する。幾つかの実施形態において、癌性試料または生物学的試料は、免疫組織化学的検査による、ＣＤ３７発現についての２、３、または３＋の染色強度スコアを有する。幾つかの実施形態において、癌性試料または生物学的試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋試料での免疫組織化学的検査により、ＣＤ３７発現についての２、３、または３＋の染色強度スコアを有する。幾つかの実施形態において、癌性試料または生物学的試料は、均質であるＣＤ発現の染色均一性を有する。幾つかの実施形態において、癌性試料または生物学的試料は、ＣＤ３７についての２、３、または３＋の染色強度スコア、および不均質または均質である染色均一性を有する。
【００１６】
幾つかの実施形態において、免疫組織化学的検査は、用手法で実施される。幾つかの実施形態において、免疫組織化学的検査は、自動化システムを利用して実施される。
【００１７】
幾つかの実施形態において、標準試料は、陽性標準試料または陰性標準試料である。幾つかの実施形態において、標準試料は、細胞、細胞ペレット、または組織を含む。
【００１８】
幾つかの実施形態において、検出は、細胞表面ＣＤ３７に特異的に結合する抗体を用いてＣＤ３７発現を検出することを含む。幾つかの実施形態において、抗体は、酵素、フルオロフォア、放射性標識、およびルミノフォアからなる群より選択される検出試薬を更に含む。幾つかの実施形態において、検出試薬は、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、トリチウムおよびローダミンからなる群より選択される。幾つかの実施形態において、抗体は、クローンＣＴ１である。
【００１９】
幾つかの実施形態において、抗体の濃度は、約１〜約１０μｇ／ｍＬまたは約２．１〜約８．４μｇ／ｍＬ、約４〜約５μｇ／ｍＬ、または２．１、４．２、もしくは８．４μｇ／ｍＬである。一実施形態において、抗体（例えば、クローンＣＴ１）の濃度は、４．２μｇ／ｍＬである。
【００２０】
幾つかの実施形態において、癌は、Ｂ細胞リンパ腫、ＮＨＬ、前駆体Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、低悪性度、中悪性度および高悪性度の濾胞性リンパ腫(ＦＬ)、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴ型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、結節型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）からなる群より選択される。
【００２１】
本発明は、抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートと、容器と、抗体またはイムノコンジュゲートを用いてＩＨＣによる測定での２、３、または３＋レベルでのＣＤ３７発現を特徴とする癌を治療し得ることを示した添付文書またはラベルと、を含む、製造品も提供する。
【００２２】
本発明は、診断に用いられるネズミ抗ＣＤ３７抗体と、治療に使用される抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートと、を含む診断薬および医薬品混合キットも提供する。幾つかの実施形態において、診断抗体は、ＩＨＣによるＣＤ３７発現を検出することが可能である検出抗体である。
【００２３】
また、本発明は、細胞表面ＣＤ３７に特異的に結合し得る検出抗体と、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）用の試薬と、１つまたは複数の規格標準試料と、を含む診断キットを提供し、規格標準試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋された細胞、細胞ペレット、または組織試料を含み、１つまたは複数の規格標準試料が、非ＣＤ３７発現レベル、ＣＤ３７発現レベルが低い、ＣＤ３７発現レベルが中程度、またはＣＤ３７発現レベルが高い細胞、細胞ペレット、または組織から由来する。そのような標準試料の例は、本明細書においては実施例に記載される。
【００２４】
幾つかの実施形態において、物品製造品またはキットは、ＩＨＣが、異なるＣＤ３７発現レベルを識別し得る較正されたＩＨＣである製造品またはキットである。幾つかの実施形態において、較正ＩＨＣは、細胞表面のＣＤ３７発現レベルが低い、細胞表面のＣＤ３７発現レベルが中程度である、または細胞表面のＣＤ３７発現レベルが高い試料について一定範囲の染色強度を生成する。幾つかの実施形態において、ＩＨＣは、標準試料と比較して、ＣＤ３７発現試料における染色強度と染色均一性を区別する。幾つかの実施形態において、ＩＨＣは、ホルマリン固定パラフィン包埋試料で実施される。ＩＨＣは、用手法で実施することも、または自動化システムを利用して実施することもできる。
【００２５】
幾つかの実施形態において、物品またはキットは、抗ＣＤ３７抗体、リンカー、および細胞毒を含むＣＤ３７イムノコンジュゲートを含む。幾つかの実施形態において、抗ＣＤ３７抗体は、キメラ、またはヒト化ＣＤ３７−３、ＣＤ３７−３８またはＣＤ３７−５０である。幾つかの実施形態において、抗ＣＤ３７抗体は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６のポリペプチドおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３のポリペプチドを含む抗体、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のポリペプチドおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４のポリペプチドを含む抗体、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８のポリペプチドおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４のポリペプチドを含む抗体、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６２のポリペプチドおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８のポリペプチドを含む抗体、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６３のポリペプチドおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９のポリペプチドを含む抗体、ならびにＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６５のポリペプチドおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１のポリペプチドを含む抗体からなる群より選択される抗体である。
【００２６】
幾つかの実施形態において、リンカーは、開裂性リンカー、非開裂性リンカー、親水性リンカー、およびジカルボン酸系リンカーからなる群より選択される。幾つかの実施形態において、リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ)ペンタノアート（ＳＰＰ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホペンタノアート（スルホ−ＳＰＰ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）またはＮ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）−２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＤＢ）；Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル) シクロヘキサンカルボキシラート（ＳＭＣＣ）；Ｎ−スルホスクシンイミジル４−（マレイミドメチル) シクロヘキサンカルボキシラート（スルホ−ＳＭＣＣ）；Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ）；およびＮ−スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ４−マレイミド）からなる群より選択される。幾つかの実施形態において、リンカーは、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシラート（ＳＭＣＣ）である。幾つかの実施形態において、細胞毒は、メイタンシノイド、メイタンシノイド類似体、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５、ＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシン、デュオカルマイシン類似体、カリケアマイシン、ドラスタチン、ドラスタチン類似体、オーリスタチン、トマイマイシン誘導体およびレプトマイシン誘導体または細胞毒のプロドラッグからなる群より選択される。幾つかの実施形態において、細胞毒は、メイタンシノイドである。幾つかの実施形態において、メイタンシノイドは、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−ｌ−オキソプロピル）−メイタンシンまたはＮ（２’）−デアセチル−Ｎ２−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシンである。幾つかの実施形態において、メイタンシノイドは、Ｎ（２’）−デアセチル−Ｎ（２’）−（３−メルカプト−ｌ−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）である。幾つかの実施形態において、イムノコンジュゲートは、抗体ｈｕＣＤ３７−３、ＳＭＣＣ、およびＤＭ１を含む。
【００２７】
幾つかの実施形態において、診断薬および医薬品混合キットは、１つまたは複数の標準試料を更に含む。幾つかの実施形態において、標準試料は、陽性標準試料または陰性標準試料である。幾つかの実施形態において、標準試料は、細胞、細胞ペレット、または組織を含む。
【００２８】
幾つかの実施形態において、本明細書で提供されたキットで用いられる検出抗体は、酵素、フルオロフォア、放射性標識、およびルミノフォアからなる群より選択される検出試薬を更に含む。幾つかの実施形態において、検出試薬は、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、トリチウム、およびローダミンからなる群より選択される。キット内の抗体の濃度は、約１〜約１０μｇ／ｍＬまたは約２．１〜約８．４μｇ／ｍＬ、約４〜約５μｇ／ｍＬ、または２．１、４．２、もしくは８．４μｇ／ｍＬ、または４．２μｇ／ｍＬであってもよい。
【００２９】
幾つかの実施形態において、キットは、ＣＤ３７発現レベルの低い対照試料を含み、ＣＤ３７発現レベルの低い対照試料は、ナマルバ細胞またはＲＬ腫瘍細胞である。幾つかの実施形態において、キットは、ＣＤ３７発現レベルの高い対照試料を含み、ＣＤ３７発現レベルの高い対照試料は、Ｄａｕｄｉ細胞、およびＲａｍｏｓ細胞株、ならびにＣＤ３７を安定的にまたは一過性にトランスフェクトされた細胞株からなる群より選択される。幾つかの実施形態において、ＣＤ３７により安定的にまたは一過性にトランスフェクトされた細胞株は、３００−１９／ＣＤ３７である。
【００３０】
幾つかの実施形態において、抗ＣＤ３７抗体またはイムノコンジュゲートは、全体として参照により本明細書に組み入れられる、国際公開された特許出願ＷＯ２０１１／１１２９７８号またはＷＯ２０１２／１３５７４０号に記載された抗体またはイムノコンジュゲートである。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】非トランスフェクト３００−１９細胞（左）およびヒトＣＤ３７（ｈｕＣＤ３７）でトランスフェクトされた３００−１９細胞上のＣＤ３７の免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色を示す図である。
【図２】１０倍（左）および４０倍（右）の倍率でのヒト脾臓組織の白脾髄中のＣＤ３７のＩＨＣ染色を示す図である。
【図３】Ｄａｕｄｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、およびＲＬ細胞のための最適化された用手法で得られたＣＤ３７についてのＩＨＣ染色結果を示す図である。定量的フローサイトメトリーにより得られたＣＤ３７発現レベルが下の各画像に示される。
【図４】Ｄａｕｄｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、およびＲＬ細胞を用いて、非染色試料（細線）と比較した、ＰＥ標識抗ＣＤ３７抗体（太線）での染色後に得られたフローサイトメトリーヒストグラムを示す図である。
【図５】最適化された用手法で得られたＤａｕｄｉ細胞、細胞上のＣＤ３７およびＲＬ細胞上のＣＤ２０についてのＩＨＣ染色結果を示す図である。同様のＣＤ３７およびＣＤ２０抗原発現レベルの細胞は、同様の染色パターンを示す。
【図６】ＣＤ２０についての染色スコアと比較した、リンパ腫試料について最適化された用手法で得られたＣＤ３７の染色スコアの概要を示す図である。
【図７】最適化された用手法を用いてＣＤ３７について染色されたＮＨＬ患者試料の代表的写真である。
【図８】ＳＵ−ＤＨＬ−４異種移植片を担持する雌ＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性（腫瘍体積中央値、ｍｍ３）を示す図である。
【図９】ＤｏＨＨ２ヒト腫瘍異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＣＤ３７−３抗体、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１および標準化学療法剤の抗腫瘍活性（腫瘍体積中央値、ｍｍ３）を示す図である。
【図１０】ＤｏＨＨ２ヒト腫瘍異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性（腫瘍体積中央値、ｍｍ３）。
【図１１】ＪＶＭ−３ヒト腫瘍異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＣＤ３７−３抗体、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、オファツムマブ、およびベンダムスチンの抗腫瘍活性（腫瘍体積中央値、ｍｍ３）を示す図である。
【図１２】ＪＶＭ−３ヒト腫瘍異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性（腫瘍体積中央値、ｍｍ３）を示す図である。
【図１３】自動化染色法を利用した大細胞型リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）のスコア分布を示す図である
【図１４】自動化染色法を利用した濾胞性リンパ腫(ＦＬ)、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ＭＡＬＴ型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、未分類の（ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ）小細胞型リンパ腫、および未分類の非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）をはじめとする小細胞型リンパ腫の試料のスコア分布を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
本発明は、癌および自己免疫疾患などのＢ細胞疾患を治療する方法、およびＣＤ３７の過剰発現を特徴とする治療疾患への応答有効性または可能性を高める方法を提供する。本発明の方法は、癌におけるＣＤ３７の発現の動的範囲を検出する方法の発見と、ＣＤ３７発現レベルの高いＢ細胞が抗ＣＤ３７抗体または抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートでの治療により応答性があるという発見と、に基づく。本発明の方法を実践するのに有用な１つまたは複数の試薬を含むキットが、更に提供される。
【００３３】
Ｉ．定義
本発明の理解を促すために、複数の用語および語句を、以下に定義する。
【００３４】
本明細書で用いられる用語ＣＤ３７は、他に指示のない限り、任意の天然ＣＤ３７を指す。ＣＤ３７は、ＧＰ５２−４０、白血球抗原ＣＤ３７、およびテトラスパニン−２６とも称される。用語「ＣＤ３７」は、プロセシングされていない「全長」のＣＤ３７および細胞中でのプロセシングにより生じる任意の形態のＣＤ３７を包含する。この用語は、ＣＤ３７の天然由来の変異体、例えばスプライス変異体、対立遺伝子変異体、およびアイソフォームも包含する。本明細書に記載されるＣＤ３７ポリペプチドは、種々の供給源、例えばヒト生物学的試料もしくは他の供給源から単離され得、または組換えもしくは合成方法により調製され得る。
【００３５】
用語、ＣＤ３７の「発現レベルの増大」または「発現レベルが高い」は、陰性もしくは発現レベルが低い標準対照と比較して、または同じ組織もしくは細胞型の正常もしくは非疾患試料と比較して、ＣＤ３７の発現レベルが高い試料を指す。一実施例において、ＣＤ３７発現は、定義されたスコアを示す較正対照と比較することにより、ＩＨＣにより測定され、染色強度スコアまたは染色均一性スコアが与えられる（例えば、強度がレベル３の較正対照と同程度である場合には、３という強度スコアが被験試料に与えられ、強度がレベル２の較正対照と同程度である場合には、２という強度スコアが被験試料に与えられる）。例えば、免疫組織化学的検査によるスコアが１、２、３もしくは３＋以上、好ましくは２、３もしくは３＋以上である場合、ＣＤ３７発現の増加を示す。不均質または均質な染色均一性も、ＣＤ３７発現の増加の指標である。染色強度および染色均一性スコアは、単独で、または併用（例えば、２ホモ、２ヘテロ、３ホモ、３ヘテロなど）で用いることができる。別の実施例において、ＣＤ３７発現の増加は、対照値（例えば、癌を有さない対象、またはＣＤ３７値が高くない癌を有する対象の生物学的試料、組織、または細胞中の発現レベル）に対して少なくとも２倍、少なくとも３倍、または少なくとも５倍の検出増加により決定され得る。
【００３６】
特定の腫瘍、組織、または細胞試料中のＣＤ３７の用語「過剰発現」は、同じ型もしくは起源の非疾患組織もしくは細胞中、または腫瘍もしくは癌の付近の他の細胞中に存在するレベルよりも高レベルで存在するＣＤ３７（ＣＤ３７ポリペプチドまたはそのようなポリペプチドをコードする核酸）を指す。そのような過剰発現は、例えば突然変異、遺伝子増幅、転写増加、または翻訳増加により誘発され得る。
【００３７】
「標準試料」は、被験試料から本発明の方法で得られる結果を相関させる、および比較するために用いることができる。標準試料は、細胞（例えば、細胞株、細胞ペレット）または組織であってもよい。「標準試料」中のＣＤ３７レベルは、ＣＤ３７の絶対もしくは相対量、数量範囲、最小および／もしくは最大量、平均量、ならびに／または中央量であってもよい。本発明の診断方法は、被験試料中のＣＤ３７の発現レベルと「基準値」との比較を必要とする。幾つかの実施形態において、基準値は、標準試料中のＣＤ３７の発現レベルである。基準値は、所定の値であってもよく、被験試料と並行して試験された標準試料（例えば、生物学的対照試料）から決定されてもよい。基準値は、中央値もしくは平均値などの単一カットオフ値、または信頼区間などの値の範囲であってもよい。基準値は、癌に罹患し易い個体、初期もしくは後期ステージの癌を有する個体、男性（雄個体）および／もしくは女性（雌個体）、または癌治療を受けている個体など、個体の様々なサブグループに対して設定することができる。陰性の標準試料または基準値、および陽性標準試料または基準値の例が、本明細書に記載される。
【００３８】
幾つかの実施形態において、標準試料は、健常組織、特に癌に罹患していない対応組織からの試料である。標準試料のこれらの型は、陰性対照試料または標準試料と称される。他の実施形態において、標準試料は、ＣＤ３７を発現する腫瘍からの試料である。標準試料のこれらの型は、陽性対照試料と称される。陽性対照試料は、ＣＤ３７発現レベルと相関する染色強度の型（ヘテロ対ホモ）および／または度合い（０、１、２、３、３＋）の比較指標として用いることもできる。陽性対照比較試料は、較正標準試料とも称される。実施例に示される通り、低ＣＤ３７または非ＣＤ３７の標準は、赤脾髄（例えば、単球および赤血球）およびＴ細胞を含み、高ＣＤ３７発現の標準は、白脾髄（例えば、Ｂリンパ球）を含む。細胞株については、模範的非発現体としては、３００−１９細胞が挙げられ、高発現体としては、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、およびＲＬ細胞が挙げられる。別の陽性高ＣＤ３７標準は、ＣＤ３７で安定的にまたは一過性にトランスフェクトされた細胞株（例えば、3００−１９／ＣＤ３７）である。特定の癌についてのＣＤ３７の適切な陽性および陰性標準レベルは、１または複数の適切な対象においてＣＤ３７レベルを測定することにより決定することができ、そのような標準レベルを、特別な対象集団に適合させてもよい（例えば、特定の年齢の対象から得た試料中のＣＤ３７レベルと、特定の年齢群の特定の疾患状態、表現型、またはそれらが欠如した状態の標準レベルとで、比較を実施し得るように、標準レベルを年齢別にさせてもよい）。そのような標準レベルは、生物学的試料中のＣＤ３７レベルを測定するために用いられる専門の技術（例えば、免疫アッセイなど）に適合させてもよく、その場合、ＣＤ３７レベルが用いられる専門技術に基づいて異なり得る。
【００３９】
本明細書の用語「一次抗体」は、試料中の標的蛋白質抗原に特異的に結合する抗体を指す。一次抗体は一般に、免疫組織化学的（ＩＨＣ）手順で用いられる最初の抗体である。一実施形態において、一次抗体は、ＩＨＣ手順で用いられる唯一の抗体である。本明細書の用語「二次抗体」は、一次抗体に特異的に結合し、それにより一次抗体と次の試薬（存在する場合）の間に架橋を形成する抗体を指す。二次抗体は、一般に免疫組織化学的手順で用いられる二次抗体である。本明細書の用語「三次抗体」は、二次抗体に特異的に結合し、それにより二次抗体と次の試薬（存在する場合）の間に架橋を形成する抗体を指す。
【００４０】
本発明の「試料」は、特異的実施形態において生物学的起源、例えば真核生物のものである。好ましい実施形態において、試料は、ヒト試料であるが、動物試料が本発明の実務に用いられてもよい。本発明において使用される試料の非限定的な供給源としては、例えば、固形組織、生検吸引物、流動性抽出物、血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚の外部切片、呼吸管、腸管および泌尿生殖管、涙液、唾液、乳、腫瘍、臓器、細胞培養物および／または細胞培養成分が挙げられる。「癌性試料」は、癌性細胞を含む試料である。本発明は、入手し得る材料が少量である固形組織試料に有用である。方法は、非限定的に、異なる型の細胞または組織を比較すること、異なる発達段階を比較すること、ならびに疾患または異常の存在および／または型を検出または決定すること、をはじめとする、ＣＤ３７の発現の態様、または試料の状態を検査するために用いることができる。
【００４１】
本明細書での目的では、組織試料の「切片」は、組織試料の単一部分または断片、例えば組織の薄片または組織試料から切断された細胞を指す。組織試料の複数の切片を採取して、本発明による分析に供してもよいことは、理解されよう。幾つかの例では、組織の選択された部分または切片は、均質な細胞集団を含む。他の例において、選択された部分は、組織の領域、例えば非限定的例として管腔を含む。選択された部分は、例えば細胞１つもしくは細胞２つのように小さくてもよく、または何千もの細胞を表すこともできる。ほとんどの例において、細胞の回収は重要であり、本発明が細胞成分の検出での使用について記載された場合、方法は、生物体の非細胞成分（例えば、非限定的例として血液中の可溶性成分）を検出するために用いられてもよい。
【００４２】
「相関する」または「相関すること」は、いずれかの方法で、第一の分析の性能および／または結果を第二の分析の性能および／または結果と比較することを意味する。例えば第二の分析を実施する際に第一の分析の結果を使用してもよく、かつ／または第二の分析が実施されるべきかを決定するために第一の分析の結果を使用してもよく、かつ／または第一の分析の結果を第二の分析の結果と比較してもよい。一実施形態において、ＣＤ３７の発現増加は、ＣＤ３７を標的とする抗癌治療が有効となる可能性の上昇と相関する。
【００４３】
用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはそれらの組み合せなどの標的を認識してこれに特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で用いられる用語「抗体」は、抗体が所望の生物学的活性を示す限り、インタクトのポリクローナル抗体、インタクトのモノクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）突然変異体、多重特異性抗体（例えば少なくとも２つのインタクト抗体から作製された二重特異性抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合蛋白質、および抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれるその重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、それぞれ免疫グロブリンの任意の５つの主要なクラス、即ちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ、またはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）のものであってもよい。異なるクラスの免疫グロブリンは、周知の異なるサブユニット構造および三次元配置を有する。抗体は、ネイキッドであっても、または毒素、放射性同位体などの他の分子にコンジュゲートされていてもよい。
【００４４】
「ブロッキング」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、それが結合する抗原、例えばＣＤ３７の生物学的活性を阻害または低減するものである。特定の実施形態において、ブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的または完全に阻害する。所望なら生物学的活性は、１０％、２０％、３０％、５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％低減される。
【００４５】
用語「抗ＣＤ３７抗体」または「ＣＤ３７に結合する抗体」は、十分な親和性でＣＤ３７に結合することができるため、ＣＤ３７を標的とした診断薬および／または治療薬として有用となる抗体を指す。無関係の非ＣＤ３７蛋白質への抗ＣＤ３７抗体の結合の程度は、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）による測定で、ＣＤ３７への抗体の結合の約１０％未満になる。特定の実施形態において、ＣＤ３７に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。抗ＣＤ３７抗体の例は、当該技術分野で公知であり、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５３号に開示される。
【００４６】
用語「抗体断片」は、インタクト抗体の一部を指し、インタクト抗体の抗原が決定する可変領域を指す。抗体断片の例としては、非限定的に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、抗体断片から形成された直鎖状抗体、単鎖抗体、および多重特異性抗体が挙げられる。
【００４７】
「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基またはエピトープの高度に特異的な認識および結合に関与する均質な抗体集団を指す。これは、典型的には異なる抗原決定基を対象とする異なる抗体を含む、ポリクローナル抗体とは対照的である。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトで、かつ全長のモノクローナル抗体および抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、単鎖（ｓｃＦｖ）突然変異体、抗体部分を含む融合蛋白質、および抗原認識部位を含む任意の他の修飾免疫グロブリン分子を包含する。更に「モノクローナル抗体」は、非限定的にハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、およびトランスジェニック動物をはじめとする任意の複数の手法で作製されたそのような抗体を指す。
【００４８】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、本明細書では同義的に使用され、特定の抗体により認識され特異的に結合され得る抗原の部分を指す。抗原が、ポリペプチドである場合、エピトープは、隣接アミノ酸および蛋白質の三次フォールディングにより近接する非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。隣接アミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、蛋白質変性時に保持されるが、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、典型的には蛋白質変性時に失われる。エピトープは、固有の空間的コンホメーション中に、典型的には少なくとも３個、より通常は少なくとも５または８〜１０個のアミノ酸を含む。
【００４９】
「結合親和性」は、一般に分子（例えば、抗体）の単一結合部位と、その結合相手（例えば、抗原）との非共有結合性相互作用の総和の強度を指す。他に指示のない限り、本明細書で用いられる「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体および抗原）の間の１：１相互作用を反映する本来の結合親和性を指す。分子Ｘの、その相手Ｙに対する親和性は、一般的に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載された方法を含む当該技術分野で公知の一般的な方法により測定することができる。低親和性抗体は、一般的に抗原に緩やかに結合し、即座に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、一般的により急速に抗原と結合し、より長く結合を保持する傾向がある。結合親和性を測定する種々の方法が、当該技術分野で公知であり、そのいずれも本発明の目的に使用され得る。特別な例示的実施形態を、以下に記載する。
【００５０】
結合親和性を指すために本明細書で用いられる場合の「またはより良好な」は、分子とその結合相手とのより強い結合を指す。本明細書中で用いられる場合の「またはより良好な」は、より小さい数値のＫｄ値で表される、より強い結合を指す。例えば、「０．６ｎＭまたはより良好な」抗原への親和性を有する抗体の場合、抗原に対する抗体の親和性は、＜０．６ｎＭ、即ち、０．５９ｎＭ、０．５８ｎＭ、０．５７ｎＭなど、または０．６ｎＭ未満の任意の値である。
【００５１】
本明細書で用いられる語句「実質的に類似した」または「実質的に同じ」は、数値（例えば、Ｋｄ値）により測定される生物学的特性の文脈内で２つの数値（一般に、一方は本発明の抗体に関連し、もう一方は標準／比較抗体に関連する）の差に生物学的および／または統計的有意性がほとんど、または全くないと当業者に見なされるような、２つの数値の間の十分に高い類似性を意味する。２つの値の差は、標準／比較抗体の値の関数として、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、または約１０％未満である。
【００５２】
「単離された」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、天然には見出されない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、もはや天然に見出される形態ではない程度に精製されたそれらのものを包含する。幾つかの実施形態において、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、実質的に純粋である。
【００５３】
本明細書で用いられる「実質的に純粋」は、少なくとも５０％純粋な（即ち、混入物を含まない）、少なくとも９０％純粋な、少なくとも９５％純粋な、少なくとも９８％純粋な、または少なくとも９９％純粋な材料を指す。
【００５４】
本明細書で用いられる用語「イムノコンジュゲート」または「コンジュゲート」は、細胞結合剤（即ち、抗ＣＤ３７抗体またはその断片）に連結した化合物またはその誘導体を指し、一般式：Ｃ−Ｌ−Ａ（式中、Ｃ＝細胞毒、Ｌ＝リンカー、Ａ＝細胞結合剤または抗ＣＤ３７抗体もしくは抗体断片）で定義される。イムノコンジュゲートは、逆順の一般式：Ａ−Ｌ−Ｃにより定義することもできる。
【００５５】
「リンカー」とは、化合物、通常はメイタンシノイドなどの薬物を、抗ＣＤ３７抗体またはその断片などの細胞結合剤に安定した共有結合で連結し得る任意の化学的部分である。リンカーは、化合物または抗体が活性を維持する条件で、酸誘導開裂、光誘導開裂、ペプチダーゼ誘導開裂、エステラーゼ誘導開裂、およびジスルフィド結合の開裂を受け易くすること、またはそれに実質的に抵抗性にすることができる。適切なリンカーは、当該技術分野で周知であり、例えばジスルフィド基、チオエーテル基、酸に不安定な基、光に不安定な基、ペプチダーゼに不安定な基、およびエステラーゼに不安定な基が挙げられる。リンカー、本明細書に記載され、かつ当該技術分野で公知の荷電リンカーおよびその親水性形態も包含する。
【００５６】
用語「癌」および「癌性」は、未制御の細胞成長により細胞集団が特徴づけられる、哺乳動物の生理学的状態を指す、または説明している。癌の例としては、非限定的に、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が挙げられる。「癌」または「腫瘍形成性」疾患のより詳細な例としては、ＮＨＬ、前駆体Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫および成熟Ｂ細胞新生物をはじめとするＢ細胞リンパ腫、例えばＢ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、例えば低悪性度、中悪性度、および高悪性度のＦＬ、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＭＡＬＴ型、節性および脾性）、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ならびに未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）が挙げられる。
【００５７】
「腫瘍」および「新生物」は、良性（非癌性）、または前癌性病変をはじめとする悪性（癌性）のいずれかの、制御なき細胞成長または増殖により生じる任意の塊を指す。
【００５８】
用語「癌細胞」、「腫瘍細胞」、およびその文法的均等物は、腫瘍または前癌性病変に由来する細胞の全集団を指し、腫瘍細胞集団のバルクを含む非腫瘍形成性細胞、および腫瘍形成性幹細胞（癌幹細胞）の両方を包含する。本明細書で用いられる用語「腫瘍細胞」は、これらの腫瘍細胞を癌幹細胞と識別するために、再生および分化する能力を欠く腫瘍細胞のみを指す場合には「非腫瘍形成性」という用語で修飾される。
【００５９】
用語「対象」は、特定の治療のレシピエントとなる、非限定的にヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類をはじめとする任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。典型的には用語「対象」および「患者」は、ヒト対象に関連して本明細書中で同義的に使用される。
【００６０】
１つまたは複数の更なる治療薬と「併用での」投与は、同時（並行した）投与および任意の順序での逐次投与を包含する。
【００６１】
用語「医薬製剤」は、有効成分の生物学的活性を効果的にするような形態であり、配合剤が投与される対象に許容し得ないほど毒性となる追加の成分を含有しない調製物を指す。そのような配合剤は、滅菌されていてもよい。
【００６２】
本明細書に開示される抗体の「有効量」は、具体的に述べられた目的を実施するのに十分な量である。「有効量」は、述べられた目的に関連して、経験的または日常的手法で決定され得る。
【００６３】
用語「治療有効量」は、対象または哺乳動物における疾患または障害を「治療する」のに効果的な抗体または他の薬物の量を指す。癌の場合、薬物の治療有効量は、癌細胞の数を低減し得る、腫瘍のサイズを低減し得る、末梢臓器への癌細胞浸潤を阻害し得る（即ち、ある程度緩徐にする、または停止させる）、腫瘍の転移を阻害する（即ち、ある程度緩徐にする、または停止させる）、腫瘍の成長をある程度阻害する、および／または癌に関連する症状の１つ以上をある程度緩和することができる。「治療すること」の本明細書での定義を参照されたい。薬物が成長を防止し得る程度、および／または既存の癌細胞を死滅させ得る程度まで、薬物は、細胞増殖抑制性および／または細胞毒性であってもよい。「予防有効量」は、所望の予防的結果を実現するのに効果的な量、必要な投与量および期間を指す。必ずではないが典型的には、予防的用量は、疾患に先立ってまたは疾患の初期段階で対象に使用されるため、予防的有効量は、治療有効量よりも少ない。
【００６４】
用語「好適に応答する」は、一般に対象において有益な状況を引き起こすことを指す。癌治療に関連して用語は、対象に治療効果を提供することを指す。癌における正の治療効果は、複数の方法で測定することができる（Ｗ．Ａ．Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．５０：１Ｓ−１０Ｓ（２００９）参照)。例えば、腫瘍成長の阻害、分子マーカーの発現、血清マーカーの発現、および分子画像技術は全て、抗癌治療の治療有効性を評価するのに用いることができる。腫瘍成長の阻害に関連して、ＮＣＩ標準に従ってＴ／Ｃ＜４２％は、抗腫瘍活性の最小レベルである。ＡＴ／Ｃ＜１０％は、高い抗腫瘍活性レベルと見なされる（ここで、Ｔ／Ｃ（％）＝治療される腫瘍体積中央値／対照の腫瘍体積中央値×１００）。進行のない生存（ＰＦＳ）、疾患のない生存（ＤＦＳ）、または全体的生存（ＯＳ）を利用して、抗癌治療薬の治療有効性を評価することもできる。
【００６５】
ＰＦＳ、ＤＦＳ、およびＯＳは、新薬の認可に関する米国国立癌研究センターおよび食品医薬品局により設定された標準により測定することができる。Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２１（７）：１４０４−１４１１を参照されたい。腫瘍進行までの時間（ＹＩＰ）とも称される「進行のない生存」（ＰＦＳ）は、治療の間および治療後の、癌が成長しない期間を示す。進行のない生存は、患者が完全な応答または部分的応答を経験した時間の量、および患者が安定した疾患を経験した時間の量を含む。「疾患のない生存」（ＤＦＳ）は、治療の間、および治療後の患者が疾患を有さない期間を指す。「全体的生存」（ＯＳ）は、ナイーブまたは未治療の個体または患者と比較した、平均寿命の延長を指す。
【００６６】
言語「標識」は、本明細書中で用いられる場合、「標識」抗体を作製するために抗体に直接的または間接的にコンジュゲートされる検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体で検出可能であってもよく（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）、または酵素標識の場合、検出可能な基質化合物または組成物の化学変化を触媒し得る。
【００６７】
「化学療法剤」は、作用機序にかかわらず、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の分類としては、非限定的に、アルキル化剤、代謝拮抗物質、紡錘体毒植物アルカロイド、細胞毒性／抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、抗体、光増感剤およびキナーゼ阻害剤が挙げられる。化学療法剤は、「標的治療」および従来の化学療法において用いられる化合物を包含する。
【００６８】
「治療すること」または「治療」または「治療する」または「軽減すること」または「軽減する」などの用語は、診断された病的状態または障害を治癒する、緩徐にする、症状を低減する、および／または進行を停止させる、治療的手段を指す。つまり治療が必要なものには、既に障害の診断がなされたもの、または障害を有することが疑われているものが含まれる。予防的または防止的手段は、標的とする病的状態または障害の発症を防止するおよび／または緩徐にする治療的手段を指す。つまり予防的または防止的手段が必要なものには、障害を起こし易いものおよび障害が防止されるべきものが含まれる。特定の実施形態において、患者が、以下の１つ以上を示す場合、対象は、本発明の方法により癌の「治療」が奏功している：癌細胞の数の減少もしくは完全に存在しないこと；腫瘍サイズの低減；末梢臓器への癌細胞浸潤、例えば軟組織および骨への癌の拡大の阻害もしくは非存在；腫瘍転移の阻害もしくは非存在；腫瘍成長の阻害もしくは非存在；特定の癌に関連する１つまたは複数の症状の緩和；罹患率および致死率の低下；生活の質の改善；腫瘍の腫瘍形成性、腫瘍形成頻度、もしくは腫瘍形成能の低下；腫瘍中の癌幹細胞の数もしくは頻度の低下；腫瘍形成細胞の非腫瘍形成状態への分化；または幾つかの効果の組合せ。
【００６９】
本開示および特許請求の範囲で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、他に明確に示されない限り、複数の形態を包含する。
【００７０】
実施形態が言語「含む」と共に本明細書に記載されているとしても、「〜からなる」および／または「本質的に〜からなる」の用語で記載された他の類似の実施形態も提供されることを、理解されたい。
【００７１】
本明細書で「Ａおよび／またはＢ」などの語句で用いられる用語「および／または」は、「ＡとＢ」の両方、「ＡまたはＢ」、「Ａ」および「Ｂ」を包含するものとする。同様に「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句で用いられる用語「および／または」は、以下の実施形態のそれぞれを包含するものとする：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）を包含するものとする。
【００７２】
II．生物学的試料
生物学的試料は、多くの場合、固定液で固定される。ホルマリン（ホルムアルデヒド）およびグルタルアルデヒドなどのアルデヒド固定液が、典型的に用いられる。アルコール浸漬などの他の固定技術（Ｂａｔｔｉｆｏｒａ  ａｎｄ  Ｋｏｐｉｎｓｋｉ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．（１９８６）３４：１０９５）を利用して固定された試料も、適している。用いられる試料は、パラフィンに包埋されていてもよい。一実施形態において、試料は、ホルマリン固定と、パラフィン包埋の両方を施される（ＦＦＰＥ）。別の実施形態において、ＦＦＰＥブロックは、ヘマトキシリンおよびエオジン染色された後、ＦＦＰＥコア試料の特異的領域（複数可）を選択する分析のために１つまたは複数の部分を選択する。これらの微粒子標本から組織ブロックを調製する方法は、様々な予知因子の過去のＩＨＣ試験で用いられており、かつ／または当業者に周知である（例えば、Ａｂｂｏｎｄａｎｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９０  Ｍａｙ；９３（５）：６９８−７０２；Ａｌｌｒｅｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｓｕｒｇ．１９９０  Ｊａｎ；１２５（ｌ）：１０７−１３）。
【００７３】
簡潔に述べると、任意の無傷臓器または組織を、相当に小さな断片に切断して、様々な固定液（例えば、ホルマリン、アルコールなど）の中で、組織が「固定」されるまでの様々な期間、インキュベートしてもよい。試料は、身体から手術で摘出された事実上任意の無傷組織であってもよい。試料は、組織病理学的検査室で日常的に用いられる装置に適合する適度に小さな断片（複数可）に切断されてもよい。断片のサイズは、典型的には２、３ミリメートル〜２、３センチメートルの範囲内である。生物学的試料は、流体抽出物、血液、血漿、血清、脊髄液、骨髄吸引物、骨髄生検、リンパ液、または脾臓調製物であってもよい。
【００７４】
III．検出抗体コンジュゲート
本発明は更に、少なくとも１種の薬剤に連結して検出抗体コンジュゲートを形成する、一般にはモノクローナルタイプのＣＤ３７への抗体を提供する。診断薬としての抗体分子の有効性を増大させるために、少なくとも１種の所望の分子または部分に連結または共有結合または複合体化することが、簡便である。そのような分子または部分は、非限定的に、少なくとも１種のレポーター分子であってもよい。レポーター分子は、アッセイを利用して検出され得る任意の部分として定義される。抗体にコンジュゲートされたレポーター分子の非限定的例としては、酵素、放射性標識、ハプテン、蛍光標識、ホスホレセント分子、化学発光分子、発色団、発光分子、光親和性分子、着色粒子および／またはリガンド、例えばビオチンが挙げられる。
【００７５】
十分な選択性、特異性または親和性の任意の抗体が、検出抗体コンジュゲートの主成分として用いられてもよい。そのような特性は、当業者に公知の従来の免疫学的スクリーニング法を利用して評価されてもよい。従来の抗原結合部位に加えて、抗体分子中の生物学的活性分子への結合部位には、抗原に結合し得る可変性ドメイン内に存在する部位が含まれる。加えて、可変性ドメインは、抗体自己結合に関与し（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、抗抗体により認識されるエピトープ（イディオトープ）を含む（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。
【００７６】
抗体コンジュゲートの特定の例は、抗体が検出可能な標識に連結されるそれらのコンジュゲートである。「検出可能な標識」は、特異的官能性、および／または化学的特性により検出され得る化合物および／または要素であり、所望なら、それの使用により、付着した抗体を検出し、かつ／または更に定量することができる。
【００７７】
抗体に付着させる方法など多くの適切な造影剤が、当該技術分野で公知である（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第５，０２１，２３６号；同第４，９３８，９４８号、および同第４，４７２，５０９号を参照されたい）。用いられる造影部分は、例えば常磁性イオン；放射性同位体；蛍光色素；ＮＭＲで検出可能な物質；および／またはＸ線造影であってもよい。
【００７８】
コンジュゲートとしての使用で企図される模範的蛍光標識としては、例えば、Ａｌｅｘａ  ３５０、Ａｌｅｘａ  ４３０、Ａｌｅｘａ  ４８８、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ  ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ  ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５、６−ＦＡＭ、Ｄｙｌｉｇｈｔ  ４８８、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、フィコエリトリン、ＲＥＧ，  ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、Ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、およびこれらの標識の誘導体（即ち、イソチオシアナートまたはコンジュゲートのための他のリンカーで修飾されたハロゲン化類似体）が挙げられる。
【００７９】
本発明において企図される検出抗体コンジュゲートには、インビトロで使用されるものが含まれ、それには抗体が、発色基質と接触させると着色生成物を作製する二次結合リガンドおよび／または酵素（酵素タグ）に連結されている。適切な酵素の例としては、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（西洋ワサビ）ペルオキシダーゼ、および／またはグルコースオキシダーゼが挙げられる。好ましい二次結合リガンドは、ビオチンおよび／またはアビジンおよびストレプトアビジン化合物である。そのような標識の使用は、当業者に周知であり、例えば参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号に記載される。
【００８０】
アジド基を含む分子を用いて、低強度の紫外線により生成される反応性ニトレン中間体を介して蛋白質への共有結合を形成してもよい（Ｐｏｔｔｅｒ  ＆  Ｈａｌｅｙ，１９８３）。特に、プリンヌクレオチドの２−および８−アジド類似体は、粗細胞抽出物中のヌクレオチド結合蛋白質を同定するための部位特異性光プローブとして用いられてきた（Ｏｗｅｎｓ  ＆  Ｈａｌｅｙ，１９８７；Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）。２−および８−アジドヌクレオチドは、精製蛋白質のヌクレオチド結合ドメインをマッピングするのにも用いられており（Ｋｈａｔｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；およびＤｈｏｌａｋｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、抗体結合剤として用いられてもよい。
【００８１】
コンジュゲート部分への抗体の付着またはコンジュゲーションのための複数の方法が、当該技術分野で公知である。幾つかの付着方法は、例えば抗体に付着された、無水ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）などの有機キレート化剤；エチレントリアミン四酢酸；Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド、および／またはテトラクロロ−３ａ−６ａ−ジフェニルグリコウリル−３を用いる金属キレート錯体の使用を必要とする（参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第４，４７２，５０９号および同第４，９３８，９４８号）。モノクローナル抗体は、グルタルアルデヒドまたはペリオダートなどのカップリング剤の存在下で酵素と反応させてもよい。フルオレセインマーカーとのコンジュゲートは、これらのカップリング剤の存在下で、またはイソチオシアナートとの反応により、調製される。米国特許第４，９３８，９４８号において、例えば乳房腫瘍の造影は、モノクローナル抗体を用いて実現され、検出可能な造影部分は、メチル−ｐ−ヒドロキシベンゾイミダートまたはＮ−スクシンイミジル−３−（４−ヒドロキシフェニル）プロピオナートなどのリンカーを利用して抗体に結合される。
【００８２】
別の実施形態において、抗体結合部位を変化させない反応条件を利用して免疫グロブリンのＦｃ領域中のスルフヒドリル基を選択的に導入することによる免疫グロブリンの誘導体化が、企図される。この方法論により作製される抗体コンジュゲートは、有用期限、特異性および感度の改善を示すことが開示されている（参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，１９６，０６６号）。Ｆｃ領域内の炭水化物残基にコンジュゲートされたエフェクターまたはレポーター分子の部位特異的付着も、文献に開示されている（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。
【００８３】
本発明の別の実施形態において、免疫グロブリンは、トリチウムなどの核種で放射性標識されている。追加の実施形態において、ナノゴールド粒子（約０．５ｎｍ〜４０ｎｍのサイズなど）および／またはＱｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔｓ（カリフォルニア州ヘイワード）が、用いられる。
【００８４】
IV．酵素および基質（クロマゲン（Ｃｈｒｏｍａｇｅｎｓ））
例えば以下に示される模範的実施形態など、基質および指示薬の使用が、ＣＤ３７の検出に企図される。
【００８５】
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、最初、過酸化水素と複合体を形成し、その後、過酸化水素を分解させて、水および酸素原子を生成する酵素である。多くの他の酵素と同様に、ＨＲＰおよび一部のＨＲＰ様活性は、過剰な基質により阻害され得る。ＨＲＰと過剰な過酸化水素とで形成された複合体は、触媒に不活性であり、電子供与体（例えば、発色物質）の非存在下で、可逆的に阻害される。それは、過酸化水素が過剰で、内在的ＨＲＰ活性のクエンチングをもたらす電子供与体が存在しない。
【００８６】
ＨＲＰは、アッセイシステムで用いられる場合には、定義された基質を活性化されたクロマゲンに変換して変色させるのに用いることができる。ＨＲＰ酵素は、複数の方法により、抗体、蛋白質、ペプチド、ポリマー、または他の分子にコンジュゲートされてもよい。そのような方法は、当該技術分野で公知である。ＨＲＰと抗体との混和物を含む溶液にグルタルアルデヒドを添加すると、酵素よりも多くの互いにコンジュゲートされた抗体分子が得られる。２段階手順において、ＨＲＰは最初、二官能性試薬と反応する。第二段階で、活性化ＨＲＰのみが抗体と混和されて、かなり効率的な標識が得られ、重合はされない。ＨＲＰは、２段階グルタルアルデヒド手順を利用して、（ストレプト）アビジンにもコンジュゲートされる。この形態は、例えばＬＡＢおよびＬＳＡＢを基質とする手順で用いられる。ビオチンは最初、ビオチニル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたはビオチンヒドラジドに誘導体化された後、ＨＲＰ酵素のεアミノ基と反応し得るため、ビオチンとのコンジュゲーションも、２段階を必要とする。
【００８７】
３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）は、アルコールおよび他の有機溶媒に高度に不溶性の褐色最終生成物を生成するＨＲＰなどの酵素の基質である。ＤＡＢの酸化は、重合も誘発し、四酸化オスミウムと反応する能力を生じ、このため染色強度および電子密度を増加させる。重合されたＤＡＢの光学密度を増強するのに用いられる複数の金属および方法のうち、硫化銀と組み合わせた塩化金が、最も奏功するようである。
【００８８】
３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）は、ＨＲＰなどの酵素の基質であり、酸化により、アルコールに可溶性であるローズレッド色の最終生成物を形成する。それゆえＡＥＣで処理された標本は、アルコールまたはアルコール性溶液（例えば、ハリスヘマトキシリン）に浸漬してはならない。代わりに、水性の対比染色剤および封入剤が、用いられなければならない。ＡＥＣは、残念なことに更なる酸化を受け易く、過剰な光に暴露されると、強度が衰える。そのため暗所での貯蔵が、推奨される。
【００８９】
４−クロロ−１−ナフトール（ＣＮ）は、青色の最終生成物として沈殿するＨＲＰなどの酵素の基質である。ＣＮは、アルコールおよび他の有機溶媒に可溶性であるため、標本は、脱水、アルコール対比染色剤への暴露、または有機溶媒を含む封入剤を用いたカバースリップを行うべきではない。ＤＡＢとは異なり、ＣＮは、沈殿の位置から拡散する傾向がある。
【００９０】
ｐ−フェニレンジアミン二塩酸塩／ピロカテコール（ハンカー・イェーツ（Ｈａｎｋｅｒ−Ｙａｔｅｓ）試薬）は、アルコールおよび他の有機溶媒に不溶性の黒青色の反応生成物を与えるＨＲＰなどの酵素の基質である。重合されたＤＡＢと同様に、この反応生成物は、オスミウム処理することができる。多様な結果は、イムノペルオキシダーゼ技術でハンカー・イェーツ試薬を用いて実現された。
【００９１】
仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（分子量１００ｋＤ）は、Ｐ−Ｏ結合を破壊することにより有機エステルからリン酸基を取り出して（加水分解による）移動させ；中間体の酵素−基質結合が、一時的に形成する。ＡＰの主な金属活性化剤は、Ｍｇ＋＋、Ｍｎ＋＋、およびＣａ＋＋である。
【００９２】
ＡＰは、非標識アルカリホスファターゼ抗アルカリホスファターゼ（ＡＰＡＡＰ）手順が発表されるまで、免疫組織化学で広範に用いられてはいなかった。この手順で用いられる可溶性免疫複合体は、およそ５６０ｋＤの分子量を有する。ＰＡＰ技術と比較したＡＰＡＡＰ手順の主たる利点は、内在性ペルオキシダーゼ活性が引き起こす干渉がないことである。ＰＡＰ染色に対する内在性ペルオキシダーゼ活性の潜在的錯乱のために、ＡＰＡＡＰ技術は、血液および骨髄塗抹標本への使用が推奨される。骨、腎臓、肝臓および一部の白血球細胞の内在性アルカリホスファターゼ活性は、１ｍＭレバミソールを基質溶液に添加することにより阻害することができるが、５ｍＭではより効果的であることが見出された。レバミソールによる腸アルカリホスファターゼの阻害は十分ではない。
【００９３】
免疫アルカリホスファターゼ染色法において、この酵素は、ナフトールリン酸エステル（基質）をフェノール化合物およびリン酸塩に加水分解する。フェノールは、無色のジアゾニウム塩（発色物質）にカップリングして、不溶性の着色アゾ染料を生成する。基質と発色物質との複数の異なる組み合わせをうまく使用してきた。
【００９４】
ナフトールＡＳ−ＭＸリン酸塩ＡＰ基質は、酸形態で、またはナトリウム塩として、用いることができる。発色基質Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  ＴＲおよびＦａｓｔ  Ｂｌｕｅ  ＢＢは、それぞれ鮮赤色または青色の最終生成物を生成する。両者ともアルコール性溶媒および他の有機溶媒に可溶性であり、そのため水性封入剤が、用いられなければならない。Ｆａｓｔ  Ｒｅｄ  ＴＲは、細胞塗抹標本を染色する場合に好ましい。
【００９５】
追加の模範的基質としては、ナフトールＡＳ−ＢＩリン酸、ナフトールＡＳ−ＴＲリン酸および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシルリン酸（ＢＣＩＰ）が挙げられる。他の可能な発色物質としては、例えばファーストレッドＬＢ、ファーストガーネットＧＢＣ、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）およびインドニトロテトラゾリウムバイオレット（ＩＮＴ）が挙げられる。  
【００９６】
Ｖ．免疫検出法
更なる実施形態において、本発明は、本発明により企図されるＣＤ３７などの生物学的成分を結合、精製、除去、定量および／または他の方法で一般に検出するための免疫検出法に関係する。本発明により調製される抗体は、ＣＤ３７を検出するのに用いられてもよい。幾つかの免疫検出法としては、数例を挙げると、免疫組織化学的検査、フローサイトメトリー、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法、化学発光測定法、生物発光測定法、およびウエスタンブロット法が挙げられる。様々な有用な免疫検出法のステップは、例えば参照により本明細書に組み入れられる、Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  Ｍ  Ｈ  および  Ｂｅｎ−Ｚｅｅｖ  Ｏ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９９９；１０９：２１５−３７；Ｇｕｌｂｉｓ  Ｂ  ａｎｄ  Ｇａｌａｎｄ  Ｐ，Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ．１９９３  Ｄｅｃ；２４（１２）：１２７１−８５；およびＤｅ  Ｊａｇｅｒ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．１９９３  Ａｐｒ；２３（２）：１６５−７９などの科学文献に記載されている。
【００９７】
一般に免疫結合法は、リガンド蛋白質、ポリペプチドおよび／またはペプチドを含むことが疑われる試料を得ること、ならびに場合により免疫複合体を形成させるのに効果的な条件下で、試料を本発明による第一の抗リガンド抗体と接触させること、を含む。
【００９８】
抗原検出に関して、分析される生物学的試料は、流動性抽出物、血液、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、組織切片もしくは標本、ホモジナイズされた組織抽出物、生検吸引物、細胞、ＣＤ３７含有組成物の分離および／もしくは精製された形態、または任意の生体液など、ＣＤ３７を検出するのに望ましい任意の試料であってもよい。幾つかの実施形態において、血液、血漿、組織、またはリンパの試料または抽出物が、用いられる。
【００９９】
選択された生物学的試料を、効果的条件下で、免疫複合体（一次免疫複合体）を形成させるのに十分な期間、抗体と接触させることとは、一般に、抗体組成物を試料に単に添加すること、および抗体が存在する任意のリガンド蛋白質抗原と免疫複合体を形成するのに、即ちそれに結合するのに十分長い期間、混合物をインキュベートすること、ある。この時間の後、組織切片、ＥＬＩＳＡプレート、ドットブロットまたはウエスタンブロットなどの試料−抗体組成物は、一般に洗浄され、任意の非特異的結合抗体種を除去されて、一次免疫複合体内に特異的に結合された抗体のみが検出可能になる。
【０１００】
一般に免疫複合体形成の検出は、当該技術分野で周知であり、数多くのアプローチを適用することで実現され得る。これらの方法は、一般に放射性タグ、蛍光タグ、生物学的タグおよび酵素タグのいずれかなど、標識またはマーカーの検出に基づく。そのような標識の使用に関係する米国特許としては、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第３，８１７，８３７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９３９，３５０号；同第３，９９６，３４５号；同第４，２７７，４３７号；同第４，２７５，１４９号および同第４，３６６，２４１号が挙げられる。もちろん、当該技術分野で公知の通り、二次抗体および／またはビオチン／アビジンリガンド結合配列などの二次結合リガンドの使用による更なる利点を見出すこともできる。
【０１０１】
検出において用いられる抗リガンド抗体は、それ自体が検出可能な標識に連結されていてもよく、その場合、その後、この標識を単に検出し、それにより組成物中の一次免疫複合体の量を決定することができる。あるいは一次免疫複合体内で結合するようになる第一の抗体は、抗体への結合親和性を有する第二の結合剤により検出されてもよい。これらの場合、第二の結合剤は、検出可能な標識に連結されてもよい。第二の結合剤は、多くの場合、それ自体が抗体であり、つまり「二次抗体」と呼ぶこともできる。一次免疫複合体は、二次免疫複合体を形成させるのに効果的な条件で十分な期間、標識された二次結合剤、または抗体と接触される。二次免疫複合体は、その後、一般に洗浄され、任意の非特異的結合の標識二次抗体またはリガンドを除去して、二次免疫複合体中の残留する標識が、その後、検出される。
【０１０２】
更なる方法には、２段階アプローチによる一次免疫複合体の検出が挙げられる。抗体への結合親和性を有する抗体などの第二の結合剤を用いて、先に記載された通り二次免疫複合体を形成する。洗浄の後、免疫複合体（三次免疫複合体）を形成させるのに効果的な条件で十分な時間、二次免疫複合体を、二次抗体への結合親和性を有する第三の結合剤または抗体と再度、接触させる。第三のリガンドまたは抗体は、検出可能な標識に連結され、このようにして形成された第三の免疫複合体の検出を可能にする。このシステムは、所望ならシグナル増幅をもたらしてもよい。
【０１０３】
別の実施形態において、ビオチン化モノクローナルまたはポリクローナル抗体を用いて、標的抗原（複数可）を検出し、その後、第二のステップの抗体を用いて、複合体化されたビオチンに付着されたビオチンを検出する。その方法では、試験される試料は最初、第一のステップの抗体を含む溶液中でインキュベートさせる。標的抗原が存在する場合、抗体の一部が抗原に結合して、ビオチン化抗体／抗原複合体を形成する。その後、抗体／抗原複合体は、ストレプトアビジン（またはアビジン）、ビオチン化ＤＮＡ、および／または相補的ビオチン化ＤＮＡの逐次溶液中でインキュベートすることにより増幅され、各ステップで追加のビオチン部位が抗体／抗原複合体に付加される。増幅ステップは、増幅の適切なレベルに達するまで、繰り返し行われ、そのレベルに達した時点で、試料をビオチンに対する第二ステップの抗体を含む溶液中でインキュベートされる。この第二ステップの抗体は、例えば発色基質を利用した組織酵素学的検査により抗体／抗原複合体の存在を検出するために用いられ得る酵素などで、標識される。適切な増幅により、肉眼で見えるコンジュゲートが、生成され得る。
【０１０４】
一実施形態において、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）は、免疫学的検出に用いられる。ＩＨＣを利用して、試料中のＣＤ３７の検出が、プローブ、例えば抗ＣＤ３７抗体を用いた試料の標的化により実現され得る。プローブは、検出可能な標識に直接的もしくは間接的に結合されることができ、または検出可能な標識に直接的もしくは間接的に連結する別のプローブにより検出することができる。
【０１０５】
幾つかの実施形態において、ＩＨＣ、例えば較正されたＩＨＣは、蛋白質発現の異なるレベルを識別することができる。幾つかの実施形態において、ＩＨＣでは、細胞表面のＣＤ３７発現レベルが低い、細胞表面のＣＤ３７発現レベルが中程度である、または細胞表面のＣＤ３７発現レベルが高い試料の染色強度を識別することができる。
【０１０６】
幾つかの実施形態において、ＩＨＣは、染色強度と染色均一性とを識別することができる。一実施形態において、ＣＤ３７の免疫学的検出（免疫組織化学的検査による）は、強度および均一性の両方についてスコア付けされる（染色された細胞／膜のみの割合）。強度についてのＣＤ３７発現の比較スケールで、０は陰性、０〜１は非常に弱い、１は弱い、１〜２は弱い〜中度、２は中度、２〜３は中度〜強い、３は強い、３＋は非常に強い、に相関する。定量的にはスコア０は、染色が観察されないか、または膜の染色が腫瘍細胞の１０％未満で観察されることを表す。スコア１は、ほのかな／かろうじて認知できる膜染色が、腫瘍細胞の１０％を超えて検出されることを表す。細胞が、膜の一部のみで染色されている。スコア２については、中度の全膜染色が、腫瘍細胞の１０％を超えて観察される。最後にスコア３は、強い全膜染色が、腫瘍細胞の１０％を超えて観察されることを表す。ＣＤ３７発現が０または１スコアの試料は、ＣＤ３７を過剰発現していないと特徴づけることができるが、スコア２または３の試料は、ＣＤ３７を過剰発現していると特徴づけることができる。ＣＤ３７を過剰発現している試料は、細胞１個あたりに発現されるＣＤ３７分子の複製数または細胞１個あたりに結合された抗体（ＡＢＣ）に対応する免疫組織化学的スコアにより評価することもでき、生化学的に決定することができる。ＣＤ３７の細胞膜染色均一性％の比較スケールは、以下の通り相関する：０は陰性、限局的は２５％未満、不均質（ヘテロ）は２５〜７５％、均質（ホモ）は７５％を超えている。
【０１０７】
ＩＨＣは、用手法で、または自動化システムを利用して（例えば、自動染色装置を用いて）実施することができる。つまりＩＨＣは、細胞、細胞ペレット、組織、血液由来の調製物、血漿、血清、またはリンパ液で実施することができる。幾つかの実施形態において、試料は、固定された試料である。幾つかの実施形態において、試料は、パラフィン包埋試料である。幾つかの実施形態において、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋の試料である。
【０１０８】
免疫検出の別の公知方法は、イムノＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法を活用している。ＰＣＲ法は、抗体を放出する低ｐＨまたは高塩濃度の緩衝液で洗浄されるＤＮＡ／ビオチン／ストレプトアビジン／抗体複合体を使用する。得られた洗浄溶液を用いて、その後、適当な対照と共に適切なプライマーを用いたＰＣＲを実施する。特別な実施形態において、ＰＣＲのずば抜けた増幅能力および特異性を利用して、単一抗原分子を検出することができる。そのような検出は、リアルタイムで実施してもよい。例えば定量的リアルタイムＰＣＲの利用が、企図される。
【０１０９】
一実施形態において、フローサイトメトリーが、免疫学的検出に用いられる。つまり、例えば細胞１個に結合された抗体数（ＡＢＣ）を、フローサイトメトリーを利用して評価することができる。細胞１個あたりに結合された抗ＣＤ３７抗体の数が多ければ、高度のＣＤ３７発現レベル、および抗ＣＤ３７抗体またはそのイムノコンジュゲートでの処理を受け易くなる可能性が高いことを示すことができる。
【０１１０】
ＶＩ．核酸ハイブリダイゼーション
Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、一般にスライドに固定された細胞または組織切片で実施される。Ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、幾つかの従来法（例えば、Ｌｅｉｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：  ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｇｕｉｄｅ，  Ｏｘｆｏｒｄ  ＢＩＯＳ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｍｉｃｒｏｐｓｃｏｐｅｙ  ｈａｎｄｂｏｏｋｓ  ｖ．２７（１９９４）参照）により実施することができる。あるｉｎ  ｓｉｔｕ手順では、蛍光染料（アルゴンイオンレーザーで励起した時に緑色蛍光を発するフルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）など）が、細胞内の標的ヌクレオチド配列に相補的な核酸配列プローブを標識するために使用される。標的ヌクレオチド配列を含む各細胞は、標識プローブに結合して、使用される特異的蛍光色素の励起に適した波長の光源に細胞を暴露すると、蛍光シグナルを発生する。
【０１１１】
様々な度合いのハイブリダイゼーションストリンジェンシーを、利用することができる。ハイブリダイゼーション条件が、よりストリンジェントになると、安定した二本鎖を形成および維持するように、プローブと標的の間に、より大きな度合いの相補性が必要となる。ストリンジェンシーは、温度を上昇させること、塩濃度を低下させること、またはホルムアミド濃度を上昇させることにより増大する。デキストラン硫酸の添加またはその濃度の上昇も、標識したプローブの効果的濃度を上昇させて、ハイブリダイゼーションの速度および最終的なシグナル強度を増大させる。ハイブリダイゼーションの後、一般的にハイブリダイゼーション溶液に見出されるものと同様の試薬を含有する溶液でスライドを洗浄するが、洗浄時間は必要なストリンジェンシーに応じて数分間から数時間まで様々である。より長時間の、またはよりストリンジェントな洗浄は、典型的には非特異的バックグランドを低下させるが、総合的な感度を減少させるリスクを含む。
【０１１２】
核ハイブリダイゼーション分析に使用されるプローブは、ＲＮＡまたはＤＮＡのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドのいずれかであってもよく、天然由来のヌクレオチドのみならず、例えばジゴキシゲニンｄＣＴＰ、ビオチン、ｄｃＴＰ  ７−アザグアノシン、アジドチミジン、イノシンまたはウリジンなどの類似体が含まれていてもよい。他の有用なプローブとしては、例えばペプチドプローブおよびその類似体、分枝状遺伝子ＤＮＡ、ペプチドメティクス（ｐｅｐｔｉｄｏｍｅｔｉｃｓ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ならびに／または抗体が挙げられる。
【０１１３】
プローブは、安定した特異的結合が標的核酸配列とプローブとの間に生じるように、該当する標的核酸配列と十分な相補性を有さなければならない。安定したハイブリダイゼーションに必要な相同性の度合いは、ハイブリダイゼーション媒体および／または洗浄媒体のストリンジェンシーに応じて様々である。好ましくは、完全に相同的なプローブが、本発明において使用されるが、より低いが十分な相同性を示すプローブが本発明に使用され得ることは、当業者に即座に理解されよう（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）参照）。
【０１１４】
プローブはまた、非限定的に、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、体細胞ハイブリッドパネル、または選別した染色体のスポットブロットによるマッピング、染色体連鎖解析をはじめとする複数の手段により作製および選択することができ；あるいはヒト細胞株もしくはヒト染色体を有する体細胞ハイブリッド、放射性体細胞ハイブリッド、染色体領域の顕微解剖、または固有の染色体座に特異的なＰＣＲプライマーにより同定された酵母人工染色体（ＹＡＣ）もしくは隣接したＹＡＣクローンのような他の適した手段から、クローニングおよび単離することができる。プローブは、プラスミド、ファージ、コスミド、ＹＡＣ、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ウィルスベクター、または任意の他の適切なベクターでクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡであってもよい。プローブは、従来法によりクローニングまたは化学合成されてもよい。クローニングされた場合、単離されたプローブ核酸断片は、典型的にベクター、例えばλファージ、ｐＢＲ３２２、Ｍ１３、またはＳＰ６もしくはＴ７を含むベクターに挿入され、細菌宿主内でライブラリとしてクローニングされる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８９）参照）。
【０１１５】
好ましくは、プローブは、例えばフルオロフォアで標識される。フルオロフォアの例としては、非限定的に、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、テキサスレッド、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、リサミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）、ウンベリフェロン、フィコクリテリン（ｐｈｙｃｏｃｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、または市販のフルオロフォア、例えばＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＯＲＡＮＧＥ（商標）およびＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＧＲＥＥＮ（商標）、ならびに／または上記物質の任意の１つまたは複数の誘導体が挙げられる。アッセイに使用される複数のプローブは、１つを超える識別可能な蛍光または顔料色素で標識されていてもよい。これらの色の違いが、特異的なプローブのハイブリダイゼーション位置を判定する手段を提供する。更に、空間的に離れていないプローブは、２つの他の色素（例えば、明赤色＋緑色＝黄色）、顔料（例えば、青色＋黄色＝緑色）を混合して生じる異なる色の光もしくは顔料により、または一度に１色のみを通すフィルターセットを用いることにより、判定することができる。
【０１１６】
プローブは、当業者に公知の従来法を用いて、フルオロフォアで直接的または間接的に標識することができる。
【０１１７】
ＶＩＩ．検出キットおよび組成物
同じく本発明により提供されるのが、本明細書に開示された本発明の実務において用いられるキットである。そのようなキットは、容器を含んでいてもよく、容器のそれぞれは、例えば既にマーカーに付着された１つまたは複数の結合剤（抗体）、または場合により結合剤を抗体もしくは核酸分子（およびマーカーそのもの）にカップリングさせる試薬；核酸分子の検出に用いられる、緩衝液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＵＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰおよびＵＴＰ）、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、および１つまたは複数の配列特異性もしくは縮重プライマーをはじめとし、この方法で用いられる様々な試薬（典型的には濃縮形態）のうちの１種以上；ならびに／または本発明の実務を支援するための単離（場合により顕微解剖による）のための試薬および機器を含んでいてもよい。本発明のリガンド検出法におけるキット成分を説明するラベルもしくは指示書、またはキット成分の使用説明書のセットも典型的には含まれるが、使用説明書は、キットまたはその成分の添付文書または包装に付随していてもよい。
【０１１８】
更なる実施形態において、本発明は、先に記載された免疫検出法により使用される免疫検出キットに関係する。抗体は、一般にＣＤ３７を検出するために用いられるため、抗体は、好ましくはキットに含まれる。免疫検出キットは、このため適切な容器手段に、ＣＤ３７に結合する第一の抗体、および／または場合により免疫検出試薬、および／または更に場合によりＣＤ３７蛋白質、またはＣＤ３７蛋白質を含む細胞もしくは試料を含む。
【０１１９】
キットの免疫検出試薬は、所与の抗体に会合および／または結合された検出可能な標識をはじめとし、様々な形態のうちの任意の１つを呈していてもよい。第二の結合リガンドに会合および／または付着された検出可能な標識も、企図される。模範的な第二のリガンドは、第一の抗体への結合親和性を有する第二の抗体である。
【０１２０】
本発明のキット内で使用される更に適した免疫検出試薬としては、第一の抗体への結合親和性を有する二次抗体を、その第二の抗体への結合親和性を有する第三の抗体と共に含み、第三の抗体が検出可能な標識に連結されている、２成分試薬が挙げられる。先に述べられた通り、複数の模範的標識が、当該技術分野で公知であり、かつ／またはそのような標識の全てが、本発明に関連して適切に使用され得る。
【０１２１】
キットは、抗ＣＤ３７イムノコンジュゲートおよび／または化学療法剤などの癌治療用の１つまたは複数の治療薬を更に含んでいてもよい。
【０１２２】
キットは、ＣＤ３７検出試薬を含む、対象におけるＣＤ３７発現を測定するのに用いられるＣＤ３７検出試薬と、使用説明書と、を更に含んでいてもよい。一実施形態において、ＣＤ３７検出試薬は、ＣＤ３７結合ペプチド、蛋白質または分子プローブ（即ち、核酸）を含む。別の実施形態において、ＣＤ３７検出試薬は、抗ＣＤ３７抗体である。別の実施形態において、キットは、抗ＣＤ３７抗体に結合する二次抗体を更に含む。一実施形態において、ＣＤ３７特異性抗体は、２．１、４．２、および８．４μｇ／ｍＬの濃度で含まれる。別の実施形態において、抗体は、濃縮溶液中に含まれ、２．１、４．２、および８．４μｇ／ｍＬの最終濃度に達するように希釈する説明書を伴う。別の実施形態において、キットは、酵素、フルオロフォア、放射性標識、およびルミノフォアからなる群より選択される検出試薬を更に含む。別の実施形態において、検出試薬は、ビオチン、ジゴキシゲニン、フルオレセイン、トリチウム、およびローダミンからなる群より選択される。
【０１２３】
キットは、ＣＤ３７発現の検出およびスコア付けのための説明書も含むことができる。キットは、対照または標準試料も含むことができる。対照または標準試料の非限定的例としては、陰性正常組織（陰性対照）または腫瘍（陽性対照）試料から得られた細胞ペレットまたは組織培養細胞株が挙げられる。模範的陽性対照細胞株としては、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、ナマルバが挙げられ、陰性対照としては、Ｃｏｌｏ２０５、およびＣＤ３７を発現する発現ベクターにより安定的にまたは一過性にトランスフェクトされた細胞株が挙げられる。
【０１２４】
ＶＩＩＩ．ＣＤ３７結合剤
ＣＤ３７に結合する任意の抗体を、本発明の検出方法に用いることができる。本発明の方法において用いられ得る治療有効性抗ＣＤ３７抗体の例は、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５３号に見出すことができる。例えば抗ＣＤ３７抗体は、マウス、キメラ、またはヒト化ＣＤ３７−３、ＣＤ３７−１２、ＣＤ３７−３８、ＣＤ３７−５０、ＣＤ３７−５１、ＣＤ３７−５６、またはＣＤ３７−５７であってもよい。ＣＤ３７の全長アミノ酸配列は、当該技術分野で公知であり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１により表される通り、本明細書においても示される。ＣＤ３７の検出のための特に有用な抗体は、マウスモノクローナル抗ｈｕＣＤ３７クローンＣＴ１（Ｌｅｉｃａ＃ＮＣＬ−ＣＤ３７）である。治療有効性抗ＣＤ３７抗体の例は、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１である。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７のポリペプチドは、ｈｕＣＤ３７−３の可変性ドメイン重鎖バージョン１．０に対応する。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８のポリペプチドは、ｈｕＣＤ３７−３の可変性ドメイン重鎖バージョン１．１に対応し、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４のポリペプチドは、ｈｕＣＤ３７−３の可変性ドメイン軽鎖にそれぞれ対応する。特定の実施形態において、ＣＤ３７抗体は、組換えプラスミドＤＮＡ  ｐｈｕＣＤ３７−３ＬＣ（２０１０年３月１８日にＡＴＣＣ（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，バージア州マナサス２０１１０）に寄託されたＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０７２２）によりコードされた軽鎖を含み得る。特定の実施形態において、ＣＤ３７抗体は、組換えプラスミドＤＮＡ  ｐｈｕＣＤ３７−３ＨＣｖ．ｌ０（２０１０年３月１８日にＡＴＣＣに寄託された、ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−１０７２３）によりコードされた重鎖を含み得る。特定の実施形態において、ＣＤ３７抗体は、組換えプラスミドＤＮＡ  ｐｈｕＣＤ３７−３ＬＣ（ＰＴＡ−１０７２２）によりコードされた軽鎖と、組換えプラスミドＤＮＡ  ｐｈｕＣＤ３７−３ＨＣｖ．ｌ．Ｏ（ＰＴＡ−１０７２３）によりコードされた重鎖と、を含み得る。特定の実施形態において、ＣＤ３７抗体は、組換えプラスミドＤＮＡ  ｐｈｕＣＤ３７−３ＬＣ（ＰＴＡ−１０７２２）によりコードされたＶＬ−ＣＤＲと、組換えプラスミドＤＮＡ  ｐｈｕＣＤ３７−３ＨＣｖ．１．０（ＰＴＡ−１０７２３）によりコードされたＶＨ−ＣＤＲと、を含み得る。
【０１２５】
本発明の治療法において有用なＣＤ３７イムノコンジュゲートの例を、以下に示す。
【０１２６】
ＩＸ．ＣＤ３７イムノコンジュゲート
本発明は、細胞毒（薬物）またはプロドラッグに連結またはコンジュゲートされた本明細書に開示の抗ＣＤ３７抗体、抗体断片、機能的均等物、改善された抗体およびそれらの態様を含むコンジュゲート（本明細書ではイムノコンジュゲートとも称される）の有効性を増大させることである。模範的ＣＤ３７抗体およびイムノコンジュゲートは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５３号に見出され得る。本発明の特に効果的な治療用イムノコンジュゲートは、先に記載されたｈｕＣＤ３７−３抗体を含む。
【０１２７】
適切な薬物またはプロドラッグは、当該技術分野で公知である。特定の実施形態において、薬物またはプロドラッグは、細胞毒性剤である。本発明の細胞毒性コンジュゲート中で使用される細胞毒性剤は、細胞死を生じさせる、または細胞死を誘導する、または何らかの手法で細胞生存力を低下させる、任意の化合物であってもよく、例えばメイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体、ベンゾジアゼピン、タキソイド、ＣＣ−１０６５およびＣＣ−１０６５類似体、デュオカルマイシンおよびデュオカルマイシン類似体、エンジイン、例えばカリチアマイシン、ドラスタチンおよびドラスタチン類似体、例えばアウリスタチン、トマイマイシン誘導体、レプトマイシン誘導体、メトトレキサート、シスプラチン、カルボプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムブシル、ならびにモルホリノドキソルビシンが挙げられる。特定の実施形態において、細胞毒性剤は、メイタンシノイドおよびメイタンシノイド類似体である。
【０１２８】
薬物またはプロドラッグは、例えばジスルフィド結合を介してｈｕＣＤ３７−３などの抗ＣＤ３７抗体またはその断片に連結することができる。リンカー分子または架橋剤は、抗ＣＤ３７抗体またはその断片と反応し得る反応性化学基を含む。特定の実施形態において、細胞結合剤との反応のための反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。加えてリンカー分子は、薬物と反応してジスルフィド結合を形成し得る反応性化学基、特定の実施形態においてジチオピリジル基を含む。特定の実施形態において、リンカー分子としては、例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３：７２３−７３７（１９７８）参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノアート（ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）２−スルホブタノアート（スルホ−ＳＰＤＢ）（米国特許出願公開第２００９０２７４７１３号）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）（例えば、ＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６参照）、２−イミノチオラン、またはアセチルコハク酸無水物が挙げられる。
【０１２９】
非開裂性リンカーを含む抗体−メイタンシノイドコンジュゲートが、調製され得る。そのような架橋剤は、当該技術分野で記載されており（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｈａｎｄｂｏｏｋおよび米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３号参照）、非限定的に、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣの「長鎖」類似体（ＬＣ−ＳＭＣＣ）であるＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロアート）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、β−マレイミドプロピオン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＢＭＰＳ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノアート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチラート（ＳＭＰＢ）、Ｎ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾアート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセタート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセタート（ＳＢＡ）、およびＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオナート（ＳＢＡＰ）が挙げられる。特定の実施形態において、抗体は、１〜１０の反応基を導入するために、文献に記載された通り、スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、スルホ−ＳＭＣＣ、マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、スルホ−ＭＢＳまたはスクシンイミジルヨードアセタートなどの架橋試薬で修飾される（Ｙｏｓｈｉｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１：３９５−３９９（１９７９）；Ｈａｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５６−６３（１９８４）；およびＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１８：６９０−６９７（１９７９））。
【０１３０】
本発明は、細胞結合剤・細胞毒性剤コンジュゲート中の細胞結合剤に対する細胞毒性剤（例えば、メイタンシノイド）の平均モル比が約１〜約１０である態様を包含する。用語「ＭＡＲ」、「メイタンシノイド−Ａｂ比」、「薬物負荷」、「ＤＡＲ」、および「薬物−Ａｂ比」は、本明細書において、細胞毒性剤としてのメイタンシノイド化合物と、細胞結合剤としての抗体またはその断片と、を含むコンジュゲート中の細胞結合剤に対する細胞毒性剤の比を特徴づけるために用いることができる。つまり幾つかの実施形態において、ＭＡＲは、約１〜約１０、約２〜約７、約３〜約５、約２．５〜約４．５（例えば、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５）、約３．０〜約４．０、約３．２〜約４．２、約４．５〜約５．５（例えば、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５）である。一態様において、細胞結合剤に付着され得る薬物分子の数は、平均で約２〜約８（例えば、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１）であってもよい。特定の実施形態において、薬物は、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４）である。こうして特定の実施形態において、抗体ｈｕＣＤ３７−３は、ＤＭ１またはＤＭ４にコンジュゲートされる。
【０１３１】
Ｘ．ＣＤ３７発現と治療有効性の相関
特定の実施形態において、本発明は、ＣＤ３７を標的とする抗癌治療に応答する可能性の高い対象を同定する方法を提供する。本発明は、一部として、ＣＤ３７発現レベルの上昇がＣＤ３７を標的とする抗癌治療薬の有効性に相関するという発見と、Ｂ細胞試料中のＣＤ３７発現の動的範囲を検出する方法の発見と、に基づく。
【０１３２】
異種移植片モデルを利用した患者試料の評価およびｉｎ  ｖｉｖｏ有効性への相関から、治療に応答する可能性の高い対象を選択するための発現解析の能力が実証される。ＩＨＣは、腫瘍細胞におけるＣＤ３７発現のスコア：０（発現なし）〜３＋（非常に高レベルの発現）を提供する。ＣＤ３７発現が１、２、３、または３＋（または２、３もしくは３＋）とスコア付けされた試料は、ＣＤ３７イムノコンジュゲートの臨床関連用量でＣＤ３７を標的とする抗癌治療に応答する可能性が高い（例えば、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ異種移植片、またはそれを超えるＣＤ３７イムノコンジュゲートの用量は、患者においておよそ３．０〜４００ｍｇ／ｍ２となり得る）。つまり高いＣＤ３７スコアを有する個体の同定は、臨床関連投与量に応答し得る個体の同定を支援する。以下により詳細に記載される通り、ＣＤ３７治療薬への感度は、２以上、特にレベル３のＣＤ３７スコアに相関し得る。更に、より均一なレベルのＣＤ３７の発現を、ＣＤ３７発現と治療的利益との相関の指標として用いることもできる。つまり均質な染色均一性、または高い強度と不均質な染色均一性との組み合わせは、高いレベルでのＣＤ３７発現を示し得る。例えば２ヘテロを超えるスコアは、ＣＤ３７治療薬での治療の患者選択基準として用いられ得る。
【０１３３】
ＣＤ３７発現の分析は、低レベルのＣＤ３７標的抗癌治療（低用量治療）が抗腫瘍応答を誘発するのに効果的となり得る患者も同定する。当該技術分野で認識される通り、化合物は一般に、所望の治療応答を実現する最小投与量で投与される。これは、臨床上の（多くの場合望ましくない）副作用を誘発する治療薬の場合、特に重要である。ＣＤ３７発現レベルの高い対象を認識する能力は、ＣＤ３７標的治療薬の投与量の最小化を可能にし、こうして治療有効性を維持しながら可能な副作用を低減する。
【０１３４】
ＸＩ．医薬組成物および治療法
ＣＤ３７結合剤（抗体、イムノコンジュゲート、およびポリペプチドを含む）は、非限定的に癌の治療などの治療的投与法をはじめとし、種々の適用例において有用である。特定の実施形態において、薬剤は、腫瘍の成長を阻害すること、分化を誘導すること、腫瘍体積を減少させること、および／または腫瘍の腫瘍形成性を低下させることに有用である。使用方法は、インビトロ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏ方法であってもよい。特定の実施形態において、ＣＤ３７結合剤または抗体またはイムノコンジュゲートまたはポリペプチドは、結合するヒトＣＤ３７のアンタゴニストである。
【０１３５】
特定の実施形態において、ＣＤ３７結合剤またはアンタゴニスト（例えば、ｈｕＣＤ３７−３抗体またはイムノコンジュゲート）で治療される疾患は、癌である。特定の実施形態において、癌は、ＣＤ３７結合剤（例えば、抗体）が結合するＣＤ３７を発現する腫瘍により特徴づけられる。
【０１３６】
本発明は、治療有効量のＣＤ３７結合剤を対象（例えば、治療の必要がある対象）に投与することを含む、癌を治療する方法を提供する。特定の実施形態において、癌は、Ｂ細胞リンパ腫、ＮＨＬ、前駆体Ｂ細胞リンパ芽球性白血病／リンパ腫、成熟Ｂ細胞新生物、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）／小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、Ｂ細胞性前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、低悪性度、中悪性度および高悪性度の濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、皮膚濾胞中心リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ＭＡＬＴ型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、結節型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾臓型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、ヘアリー細胞白血病、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、バーキットリンパ腫（ＢＬ）、形質細胞腫、形質細胞性骨髄腫、移植後リンパ増殖性障害、ワルデンストレームマクログロブリン血症、ならびに未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）からなる群より選択される。特定の実施形態において、対象は、ヒトである。
【０１３７】
本発明は、本明細書に記載された抗体または他の薬剤を使用して腫瘍の成長を阻害する方法を更に提供する。特定の実施形態において、腫瘍の成長を阻害する方法は、インビトロで細胞をＣＤ３７−結合剤（例えば、抗体）と接触させることを含む。例えば、ＣＤ３７を発現する不死化細胞株または癌細胞株を培地で培養し、抗体または他の薬剤を添加して、腫瘍の成長を阻害する。幾つかの実施形態において、腫瘍細胞は、例えば組織生検、胸水、または血液試料などの患者試料から単離され、培地で培養されて、腫瘍の成長を阻害するＣＤ３７結合剤が添加される。
【０１３８】
幾つかの実施形態において、腫瘍成長を阻害する方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍または腫瘍細胞をＣＤ３７結合剤（例えば、抗体）と接触させることを含む。特定の実施形態において、腫瘍または腫瘍細胞をＣＤ３７結合剤と接触させることは、動物モデルにおいて行われる。例えば、ＣＤ３７結合剤は、免疫無防備状態のマウス（例えば、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス）内で成長した１つまたは複数のＣＤ３７を発現する異種移植片に投与して、腫瘍の成長を阻害することができる。幾つかの実施形態において、ＣＤ３７結合剤は、同時に、または腫瘍形成細胞を動物に導入した後、短期間のうちに投与されて、腫瘍成長を予防する。幾つかの実施形態において、ＣＤ３７結合剤は、腫瘍形成細胞が特定のサイズに成長した後、治療薬として投与される。
【０１３９】
特定の実施形態において、腫瘍成長を阻害する方法は、治療有効量のＣＤ３７結合剤を対象に投与することを含む。特定の実施形態において、対象は、ヒトである。特定の実施形態において、対象は腫瘍を有するか、または腫瘍を摘出されている。
【０１４０】
つまり特定の実施形態において、本発明は、ＣＤ３７−３抗体（例えば、キメラ、ヒト化、または完全にヒト）またはそのイムノコンジュゲートを用いて癌を治療する方法であって、癌が、本明細書に記載された方法を利用して、ＣＤ３７発現の増加を同定されている、方法を提供する。特定の実施形態において、ＣＤ３７−３イムノコンジュゲートは、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１である。
【０１４１】
特定の実施形態において、配合剤は、本発明の精製された抗体また薬剤を薬学的に許容し得るビヒクル（例えば、担体、賦形剤）と組み合わせることにより、貯蔵および使用されるために調製される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  ２０００）。適切な薬学的に許容し得るビヒクルとしては、非限定的に、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの非毒性緩衝液；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンをはじめとする抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；ｍ−クレゾール）；低分子量（例えば、約１０未満のアミノ酸残基の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどの蛋白質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、グルコース、マンノース、またはデキストリンなどの炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ蛋白錯体）；およびＴＷＥＥＮ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０１４２】
本発明の医薬組成物は、局所または全身治療のための任意の複数の方法で投与することができる。投与は、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、液体および粉末などの局部投与（膣および直腸送達をはじめとする粘膜などへ）；肺内投与（例えば、ネブライザーなどによる粉末またはエアロゾルの吸入または吹送、気管内、鼻内、表皮および経皮による）；経口投与；静脈内、動脈内、皮下、腹腔内もしくは筋肉内注射もしくは輸注をはじめとする非経口投与；または頭蓋内投与（例えば、髄腔内または脳室内）であってもよい。
【０１４３】
本発明の抗体またはイムノコンジュゲートは、医薬混合製剤中に、または併用療法としての投与計画で、抗癌性を有する第二の化合物を併用することができる。医薬混合製剤または投与計画の第二の化合物は、好ましくは併用のＡＤＣへの補助活性を有するため、互いに有害な影響を及ぼさない。ＣＤ３７結合剤および第二の抗がん剤を含む医薬組成物も、提供される。
【０１４４】
疾患の治療に関して、本発明の抗体または薬剤の適切な投与量は、治療される疾患のタイプ、疾患の重症度および過程、疾患の応答性、抗体または薬剤の投与が治療目的または予防目的にかかわらず、過去の治療、患者の臨床歴などに依存し、全てが治療する医師の裁量による。抗体または薬剤は、一度に投与することができ、数日から数ヶ月間継続するもしくは一連の治療の間、投与することができ、または治癒が実現されるか、もしくは疾患状態の退縮（例えば、腫瘍サイズの縮小）に達するまで投与することができる。最適な投与計画は、患者の体内の薬物蓄積量の測定量から計算することができ、個々の抗体または薬剤の相対的能力に応じて変動する。投与する医師は、最適な投与量、投与方法および繰り返し速度（ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｒａｔｅｓ）を容易に決定することができる。特定の実施形態において、投与量は、０．０１μｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり、１日、１週間、１ヶ月または１年あたり１回以上与えることができる。特定の実施形態において、抗体または他のＣＤ３７結合剤は、１週間に１回、２週間ごとに１回、または３週間ごとに１回与えられる。特定の実施形態において、抗体またはＣＤ３７結合剤の投与量は、約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重である。治療する医師は、体液または組織中で測定された薬物の滞留時間および濃度に基づき、投与の繰り返し速度を推定することができる。
【０１４５】
併用療法は、「相乗作用」をもたらし、「相乗性」（即ち、有効成分を共に用いた場合に実現された作用が化合物を別個に用いて得られた作用の合計よりも大きいこと）を立証することができる。相乗作用は、有効成分が（１）混和された単一投与剤型で共配合されて、同時に投与もしくは送達された場合；（２）別個の配合剤として交互に、もしくは並行して送達された場合；または（３）他の投与計画により送達された場合に、実現され得る。交替療法で送達された場合、相乗作用は、例えば別のシリンジでの異なる注射により、化合物を逐次投与または送達された場合に達成され得る。一般に交替療法の間は、各有効成分の効果的な投与量が逐次、即ち連続して投与されるが、併用療法では、２種以上の有効成分の効果的な投与量が共に投与される。
【０１４６】
本開示の実施形態は、本開示の特定の抗体の調製および本開示の抗体を用いる方法を詳細に記載した以下の非限定的実施例を参照することにより更に定義することができる。材料および方法の両方に加えられる多くの改良が、本開示の範囲を逸脱することなく実践され得ることは、当業者に認識されよう。
【実施例】
【０１４７】
本明細書に記載された実施例および実施形態が、例示目的に過ぎないこと、およびそれを考慮した様々な改良または変更が、当業者に示唆され、本願の主旨および範囲に含まれることは、理解されよう。
【０１４８】
実施例１
細胞試料中のＣＤ３７の免疫組織化学的染色−用手法
ホルマリン固定パラフィン包埋された細胞ペレットおよび組織を、以下の染色試薬および条件と共に被験試料として用いた。
【０１４９】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された患者リンパ腫生検を、ネズミ抗ＣＤ３７抗体クローンＣＴ１（ｍｕｌｇＧＩ、Ｌｅｉｃａ、Ｃａｔ＃  ＮＣＬ−ＣＤ３７）、ネズミ抗ＣＤ２０抗体クローンＬ２６（ｍｕＩｇＧ２ａ、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ、Ｃａｔ＃  Ｍ  ０７  ５５）およびＣｏｕｌｔｅｒからの各アイソタイプ対照ｍｕＩｇＧ１およびｍｕＩｇＧ２ａ抗体で、以下の通り染色した。試料を含むスライドを、乾燥オーブンにおいて６０℃で３０分間焼結させ、以下の溶媒：キシレン、無水ＥＴＯＨ、９５％ＥＴＯＨおよび水、に逐次浸漬することにより脱パラフィンおよび再水和した。Ｄｅｃｌｏａｋｅｒ中ｐＨ９．５のＢｏｒｇバッファー（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）において抗原回復させた後、スライドをＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）で洗浄し、切片を２％正常ウマ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）およびアビジン−ビオチンブロック（４滴／ｍＬ、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）含有ＰＢＳで３０分間ブロッキングした。一次抗体の検量線用溶液を調製するために、ＣＤ３７被験物質およびＣＤ３７アイソタイプ対照物質を、それぞれ希釈液［２％正常ウマ血清およびビオチン（４滴／ｍＬ）含有ＰＢＳ］で４．０μｇ／ｍＬに希釈した。ＣＤ２０被験物質およびＣＤ２０アイソタイプ対照物質を、それぞれ希釈液で０．５μｇ／ｍＬに希釈した。スライドをＰＢＳで洗浄し、被験物質（抗ＣＤ３７または抗ＣＤ２０）または対照物質（ｍｕＩｇＧ１またはｍｕＩｇＧ２ａ）と共に室温で６０分間インキュベートした後、１０μｇ／ｍＬビオチン化ウマ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）と共に３０分間インキュベートした。スライドをＰＢＳで再度洗浄して、アビジン−ビオチンペルオキシダーゼ複合体（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）と共に４０分間インキュベートして、結合した二次抗体を検出した。ＤＡＢ（３，３−ジアミノベンジジン四塩酸塩、Ｄａｋｏ  Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）と共に５分間インキュベートして、カラー信号を得た。発色した組織切片を含むスライドを、ヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を充填した容器に４分間浸漬することにより対比染色させた。スライドの過剰の染色液を洗浄した後、炭酸リチウム溶液（０．１３５Ｍ  Ｌｉ２ＣＯ３水性溶液、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に急速浸漬して、青色の核染色を増強した。スライドを、それぞれ９５％および１００％ＥＴＯＨでの２回のすすぎ洗いを行い、その後のそれぞれ１分間のキシレンでの４回の洗浄により脱水した。封入剤（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａｌｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、カバーガラスをスライドに載せた。
【０１５０】
ＦＦＰＥ試料は、表１に概要された通り、腫瘍マイクロアレイ、および３つの異なるＣＬＬ腫瘍のヒト組織ブロックから得た。
【表１】
2015514716.tif 000003
【０１５１】
ＣＤ３７被験物質であるネズミ抗ＣＤ３７抗体クローンＣＴ１を、ｈｕＣＤ３７抗原への結合特異性を決定するために試験した。報告されたＩＨＣ染色法を利用して、３００−１９、およびｈｕＣＤ３７細胞ペレットでトランスフェクトされた３００−１９（３００−１９／ｈｕＣＤ３７）のＦＦＰＥ切片を染色して、ＣＤ３７について評価した。ＣＤ３７被験物質は、３００−１９／ｈｕＣＤ３７細胞を特異的に染色し、３００−１９細胞における染色を回復しなかった（それぞれ３ホモおよび陰性；図１参照）。これらの結果から、クローンＣＴ１がｈｕＣＤ３７抗原を特異的に標的とすることが、実証された（図１）。ヒト正常脾臓のＦＦＰＥ切片も染色して、ＣＤ３７について評価した。図２に示された通り、白脾髄（Ｂリンパ球が豊富なリンパ濾胞を含む）は強いＣＤ３７染色を示したが、赤脾髄（単球および赤血球を含む）は、ＣＤ３７染色をほとんど、または全く示さなかった。
【０１５２】
各被験物質および対照物質と組織および細胞ペレットとの免疫反応性は、顧問の病理学者Ｄａｖｉｄ  Ｄｏｒｆｍａｎ博士により決定された。試料を最初、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）からなる大細胞、またはマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）からなる小細胞、のいずれかに分類した。小細胞群を更に、各小細胞サブタイプに分類した。
【０１５３】
評価された各組織については、染色強度および染色均一性の説明を、報告した。染色強度スコアおよび均一性スケールを、表２に記載する。評価された各組織試料の最終報告スコアは、被験物質のスコアから各対照物質のスコアを差し引いたものである。各試料のＡＢＣ（細胞１個あたりの結合抗体）レベルは、染色スコアを較正された細胞ペレット対照と比較することにより推定した。
【表２】
2015514716.tif 000004
【０１５４】
腫瘍細胞株中のＣＤ３７発現レベルは、抗ＣＤ３７抗体−ＰＥコンジュゲートおよびＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて決定した。複数のＢ細胞悪性腫瘍細胞株が、試験に含まれた。信頼性のあるＡＢＣ値を得るために、抗体−ＰＥコンジュゲートを用いた結合実験は、飽和濃度（全ての使用可能な結合部位がコンジュゲートに占有された濃度）で実施しなければならない。抗ＣＤ３７抗体−ＰＥコンジュゲートのそのような濃度を決定するために、結合実験を様々なＣＤ３７発現レベルのＣＤ３７陽性細胞株のパネルで実施した。細胞を広い濃度範囲のＰＥコンジュゲートと共に氷上で２時間インキュベートし、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含むＰＢＳ）で洗浄し、ＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒドで固定して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。コンジュゲートが全ての被験細胞株の細胞表面結合部位を飽和する濃度を、決定する。次の結合ＡＢＣ実験において、ＰＥコンジュゲートをその濃度で使用した。各試料を二重測定または三重測定で分析し、各細胞株について複数の独立した実験を実施した。
【０１５５】
細胞１個あたりの結合抗体（ＡＢＣ）値は、細胞を飽和濃度のフィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＣＤ３７抗体（ｈｕＣＤ３７−ＰＥ）で染色することによるフローサイトメトリー法を利用して、陽性対照細胞株、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞およびＲＬのそれぞれでＣＤ３７について決定した。その後、フローサイトメトリーにより均一レベルのＣＤ３７および異なるＡＢＣ値を発現するＤａｕｄｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、およびＲＬ陽性対照細胞が、ＩＨＣにより様々なレベルの染色強度も示すように、免疫組織化学的染色条件をＣＤ３７について最適化した（図３および図４参照）。Ｄａｕｄｉ細胞、およびＲａｍｏｓ細胞は、均質な染色を高強度で示したが、ＲＬの染色は強度がより低く、不均質なパターンであった。細胞ペレットから観察されたＣＤ３７染色強度の傾向は、報告されたＡＢＣ値に対応し、３６０，０００および１２０，０００ＡＢＣより高いＡＢＣ値は、５５，０００のＡＢＣ値よりも強い染色をもたらした。染色の結果および各ＡＢＣ値を、表３に列挙する。それぞれ同様のレベルのＣＤ２０およびＣＤ３７を発現する細胞ペレットでＣＤ２０およびＣＤ３７の染色スコアが同様になるように、ＣＤ２０染色を最適化した（図５参照）。
【表３】
2015514716.tif 000005
【０１５６】
評価された新生物細胞型のうち、Ｂ−ＮＨＬでは、ＣＤ３７が主に発現された（表４）。免疫組織化学的測定により、様々なレベルでの均一なＣＤ３７発現が、ＦＬ、ＭＡＬＴリンパ腫、ＤＬＢＣＬ、ＢＬ、およびＭＣＬなどのサブタイプをはじめとするＢ細胞ＮＨＬにおいて実証された（図６参照）。図６において実証される通り、ほとんどのＮＨＬ試料が、ＩＨＣスコア２以上のＣＤ３７の発現を示す。これは、ＡＢＣ値が５５，０００以上のＤａｕｄｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞およびＲＬなどの対照細胞株ペレットの染色レベルに対応する。ＣＤ３７について染色されたリンパ腫試料を示す代表的写真を、図７に示す。Ｔ細胞リンパ腫および多発性骨髄腫（ＭＭ）試料は、ＣＤ３７またはＣＤ２０のいずれについても染色を示さなかった。
【表４】
2015514716.tif 000006
【０１５７】
実施例２
ＳＵ−ＤＨＬ−４（ヒトＤＬＢＣＬ）異種移植片を担持する雌ＣＢ．１７  ＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＣＤ３７−３抗体およびｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性
この試験において、ＣＤ３７−３抗体およびｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性（腫瘍体積中央値、ｍｍ３）を、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫モデルである皮下ＳＵ−ＤＨＬ−４腫瘍を担持する雌ＳＣＩＤマウスにおいて評価した。マウスを、体重により群に無作為化した（ｎ＝１０匹／群）。治療は、無作為化の翌日であり、群は、ＰＢＳ（２００μＬ／注射）投与対照群、ｈｕＣＤ３７−３抗体投与群、および非開裂性ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート投与群とした。治療は、抗体およびｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の１０ｍｇ蛋白質／ｋｇ／注射を単一静脈内ボーラス投与として施された。治療は全て良好に耐容され、ＰＢＳ対照動物と同様に体重減少はなかった。ＰＢＳ対照動物１０匹中１０匹が腫瘍を発症し（腫瘍生着率１００％）、細胞接種後３７日目の腫瘍体積中央値が１０００ｍｍ３に達した。腫瘍体積の中央値および平均値を、各治療群について計算した。加えて各治療について、各治療群の腫瘍体積中央値をビヒクル投与群の腫瘍体積中央値で割った値に対応する％Ｔ／Ｃ値を計算した。％Ｔ／Ｃ値が４２％以下の治療は活性と見なされ、％Ｔ／Ｃ値が１２％以下の治療は、高活性と見なされる。
【０１５８】
ｈｕＣＤ３７−３抗体（１０ｍ／ｋｇ／注射）の単回静脈内投与は、本試験において３２％Ｔ／Ｃであり活性であったが、無腫瘍生存体（ＴＦＳ）はなかった。ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ／注射）は、％Ｔ／Ｃが１％で高活性であった。単回静脈内投与（１０ｍ／ｋｇ／注射）としてのｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のみの抗腫瘍活性（腫瘍体積中央値、ｍｍ３）を、図８に示す。
【０１５９】
（参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１／０２５６１５３号）の実施例１７に概説される通り、雌皮下ＳＵ−ＤＨＬ−４腫瘍を担持するＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＣＤ３７−３抗体およびｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１を評価するために、追加試験を実施した。動物を体重により投与群に無作為に分けて、細胞接種後１５日目に、１０ｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７−３ＡｂまたはｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のいずれかを１回投与した。細胞接種後３８日目の％Ｔ／Ｃ値は、ｈｕＣＤ３７−３またはｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１でそれぞれ３４％または４％に相当した。細胞接種後７４日目に、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１治療は、１０匹中８匹の無腫瘍生存体をもたらした。ＴＦＳは、ｈｕＣＤ３７−３抗体またはＰＢＳビヒクル対照群では観察されなかった。ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートは、このモデルでの２．５または５ｍｇ／ｋｇの単回投与でも強い有効性を示し、細胞接種後３７日目の％Ｔ／Ｃ値がそれぞれ１８％および６％であった。それゆえ、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１は、１０ｍｇ／ｋｇを単回投与されたＳＵ−ＤＨＬ−４モデルにおいて高活性であり、２．５ｍｇ／ｋｇの単回投与では活性であった。
【０１６０】
実施例３
ヒト濾胞性リンパ腫モデルであるＤｏＨＨ２異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＣＤ３７抗体ｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１および標準治療用化学療法剤の抗腫瘍能
この試験において、ｈｕＣＤ３７−３抗体、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、リツキシマブ（登録商標）、およびＣＶＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）の抗腫瘍活性を、ヒト濾胞性リンパ腫モデルであるＤｏＨＨ２腫瘍を担持する雌ＳＣＩＤマウスにおいて検討した。腫瘍細胞接種後１１日目に、マウス８１匹を腫瘍体積により９群に無作為化した（ｎ＝９匹／群）。治療は、無作為化の翌日（１２日目）に開始し、群には、ＰＢＳ（２００μＬ／注射）を投与された対照群と１０、５、または２．５ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７−３抗体またはｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのいずれかを単回静脈内投与された６群と、２ｍｇ／ｋｇ静脈内リツキシマブ抗体投与を週２回×３で６回投与された１群と、０．２ｍｇ／ｋｇプレドニゾンの１日５回の経口投与と共に、４０ｍｇ／ｋｇシクロホスファミドおよび０．５ｍｇ／ｋｇビンクリスチンを単回静脈内投与された１群と、が含まれた。
【０１６１】
１０、５、および２．５ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７−３抗体およびｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートでの単回投与、ならびに２ｍｇ／ｋｇ／注射でのリツキシマブ抗体の週２回×３での治療は、良好に耐容され、ＰＢＳ対照動物と同様に体重減少はなかった。ＣＶＰでの治療が毒性となり、１匹は、薬物による死亡に関連し、１２％の平均体重減少となった（１８日目が最低点）。この動物は、データ解析から除外した。
【０１６２】
ＰＢＳ対照動物の９匹中９匹が腫瘍を発症し（腫瘍生着率１００％）、細胞接種後１９日目の腫瘍体積中央値が８００ｍｍ３に達した。腫瘍体積の中央値および平均値を、各投与群について計算した。２．５および５ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７−３抗体およびｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートでの単回静脈内投与、ならびにリツキシマブ（登録商標）抗体（２ｍｇ／ｋｇ、週２回投与×３週）は、この試験では４２％Ｔ／Ｃを超えており不活性であった。１０ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７−３抗体およびｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートでの単回静脈内投与は、それぞれ３７％および１６％Ｔ／Ｃで活性であった。投与されたＣＶＰの用量および計画での治療は、２％Ｔ／Ｃで高活性であったが、この投与計画での耐容される用量を超えていた。ＤｏＨＨ２ヒト腫瘍異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＣＤ３７−３抗体、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、および標準化学療法剤の抗腫瘍活性（腫瘍体積中央値、ｍｍ３）を、図９に示す。このモデルにおける単回静脈内投与（１０ｍｇ／ｋｇ／注射）としてのｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のみの抗腫瘍活性（腫瘍体積中央値、ｍｍ３）を、図１０に示す。
【０１６３】
実施例４
ヒトＢ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）モデルであるＪＶＭ−３異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおける抗体ｈｕＣＤ３７−３、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、および標準治療薬の抗腫瘍能
この試験において、ｈｕＣＤ３７−３抗体、非開裂性コンジュゲートｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、および標準治療薬２種：ＣＤ２０を標的とする抗体オファツムマブおよび化学療法剤のベンダムスチンの抗腫瘍活性を、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病モデルおいて、雌ＳＣＩＤマウスに皮下移植されたＪＶＭ−３（ＣＤ３７＋／ＣＤ２０＋）細胞を利用して評価した。腫瘍細胞接種後６日目に、マウス９０匹を腫瘍体積により９群に無作為化された（ｎ＝１０匹／群）。治療は、無作為化の翌日に開始し、群には、ＰＢＳ（２００μＬ／注射）を投与された対照群、ｈｕＣＤ３７−３抗体、非開裂性ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート、オファツムマブ抗体およびベンダムスチンが含まれた。治療は、１０、５、および２．５ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７−３抗体およびｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の単回静脈内投与、５ｍｇ／ｋｇオファツムマブの週２回×３、ならびに５０ｍｇ／ｋｇベンダムスチンの単回投与として施された。
【０１６４】
１０、５、および２．５ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７−３抗体およびｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートでの単回投与、ならびに５ｍｇ／ｋｇ／注射のオファツムマブ抗体の週２回×３の治療は、良好に耐容され、ＰＢＳ対照動物と同様に体重減少はなかった。ベンダムスチンでの治療は耐容され、８％の平均体重減少となった（９日目が最低点）。ＰＢＳ対照動物の１０匹中１０匹が腫瘍を発症し（腫瘍生着率１００％）、細胞接種後１６日目の腫瘍体積中央値が５００ｍｍ３に達した。腫瘍体積の中央値および平均値を、各投与群について計算した。結果は、接種後の日数に対して、腫瘍体積中央値および腫瘍体積平均値をプロットした。標準治療薬オファツムマブ（５ｍｇ／ｋｇ、週２回×３）およびベンダムスチン（５０ｍｇ／ｋｇの静脈内単回投与）での治療は、この試験ではそれぞれ３９％および３１％Ｔ／Ｃで活性であった。２．５ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７−３抗体およびｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートでの単回静脈内投与は、この試験では不活性であり、４２％Ｔ／Ｃを超えていた。１０ｍｇ／ｋｇのｈｕＣＤ３７−３抗体およびｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートでの単回静脈内投与は、それぞれ２９％および２６％Ｔ／Ｃで活性であり、中間の用量（５ｍｇ／ｋｇ単回注射）のｈｕＣＤ３７−３抗体およびｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートでの治療は、それぞれ３１％および１６％Ｔ／Ｃで活性であった。ＪＶＭ−３ヒト異種移植片を担持するＳＣＩＤマウスにおけるｈｕＣＤ３７−３抗体、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、オファツムマブおよびベンダムスチンの抗腫瘍活性（腫瘍体積中央値、ｍｍ３）を、図１１に示す。このモデルにおける単回静脈内投与としてのｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１のみの抗腫瘍活性（腫瘍体積中央値、ｍｍ３）を、図１２に示す。
【０１６５】
実施例５
異種移植片モデルにおける単回静脈内投与（１０ｍｇ／ｋｇ／注射）としてのｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍活性（腫瘍体積中央値、ｍｍ３）と、ＩＨＣ染色スコアとの相関
ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の抗腫瘍効果を、実施例２、３、および４に記載された３種のリンパ腫移植片モデルにおいて評価し、実施例１に記載されたＩＨＣにより決定された各ＣＤ３７発現と相関させた。マウス異種移植片腫瘍モデルから調製されたＦＦＰＥ試料を、実施例１に記載された用手法でのアッセイ方法を利用してＣＤ３７陽性について評価した。以下の細胞株から得られたＦＦＰＥマウス異種移植片組織は、以下の染色パターンを示した：ＳＵ−ＤＨＬ−４は均質な染色パターンでレベル３強度を示し、ＤＯＨＨ−２は均質な染色パターンでレベル２および３強度を示し、ＪＶＭ−３は不均質なパターンでレベル２および３強度を示した。腫瘍異種移植片の代表的な写真と、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１（１０ｍｇ／ｋｇ／注射）の単回静脈内投与での各ｉｎ  ｖｉｖｏ活性を、図８、１０および１２に示す。各異種移植片についてのｉｎ  ｖｉｖｏ活性および各ＣＤ３７染色スコアの概要を、表５に示す。評価された３種の異種移植片のうち、発現が最も高い（３ホモの）腫瘍は、ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１での治療の際に最高の活性も示した。他の２種のモデルは、より低い発現およびより低い活性を示した。
【表５】
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【０１６６】
実施例６
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）された試料におけるＣＤ３７の免疫組織化学的染色  −  自動化法
ＩＨＣ染色アッセイでは、被験物質としてのネズミ抗ＣＤ３７抗体クローンＣＴ１（Ｌｅｉｃａ  Ｃａｔ＃  ＮＣＬ−ＣＤ３７）およびネズミＩｇＧ１アイソタイプ対照（Ｌｅｉｃａ，  Ｃａｔ＃  ＭＯＰＣ２１  ＡＢ）を用い、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  ＲＸ自動染色装置で実施した。試料を含むスライドを６０℃で焼結した後、パラフィンワックスを除去した。その後、過剰のパラフィンワックスを、Ｄｅｗａｘ溶液（Ｌｅｉｃａ）で除去した。ｐＨ６．０のＢｏｎｄ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １（ＥＲ１，Ｌｅｉｃａ）での抗原回復の後、切片を３〜４％過酸化物でブロッキングした。一次抗体の検量線作成用溶液を調製するために、ＣＤ３７被験物質およびアイソタイプ対照物質を、それぞれ抗体希釈液で４．２μｇ／ｍＬに希釈した。スライドを被験物質（抗ＣＤ３７）、または対照物質（ｍｕＩｇＧ１）と共にインキュベートした後、ポスト一次試薬（ｐｏｓｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｒｅａｇｅｎｔ）（ウサギ抗マウスＩｇＧ、Ｌｅｉｃａ）と共にインキュベートし、その後、ポリマー（ヤギ抗ウサギＩｇＧ、Ｌｅｉｃａ）と共にインキュベートした。スライドは、ＤＡＢ（３，３−ジアミノベンジン四塩酸塩、Ｌｅｉｃａ）とのインキュベーションにより発色して、カラー信号が得られた。発色組織切片を含むスライドを、ヘマトキシリン（Ｌｅｉｃａ）で対比染色し、その後、過剰な染料を洗浄して、連続での９５％および１００％ＥＴＯＨ浸漬と、続くキシリンでの浸漬により脱水した。封入剤（Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａｌｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、スライドにカバースリップを載せた。
【０１６７】
染色された試料は全て、評価してスコア付けした。対照試料を最初に評価して、その後、被験試料（組織マイクロアレイからの切片全体および個々のスコア）を評価した。評価された各腫瘍組織または細胞ペレットについて、染色された腫瘍細胞の染色強度および各特性の説明を、報告した。膜関連染色を、各試料について記録した。患者１名から二重測定でスコアを評価した場合、高い方のスコアのみを解析に含めた。スコアが細胞質の染色のみを示している場合、最終的なスコアをゼロ（０）と報告した。強度および均一性スコアを、各試料に表６に記載された通り与えた。染色強度および分布パターンは、対照ＩｇＧ染色（非特異的）に相対的にスコア付けした。強度は０〜３のスケール（０＝染色なし、１＝弱い、２＝中度、および３＝強い）でスコア付けし、分布は限局的（染色細胞が２５％未満）、不均質（染色細胞が２５〜７５％）、および均質（染色細胞が７５％を超える）とスコア付けした。正常な組織では、強度および特性を計算する際には、定義された部分構造のみを評価した。
【表６】
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【０１６８】
ＦＦＰＥ腫瘍試料は、腫瘍マイクロアレイおよびヒト組織ブロックから得られた。
【０１６９】
細胞（腫瘍細胞またはトランスフェクト細胞）を、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）した。フローサイトメトリーにより非常に様々なＣＤ３７発現を呈することが示されたＦＦＰＥ細胞ペレット試料（Ｄａｕｄｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、ナマルバ、およびＣｏｌｏ２０５）、正常なヒト組織（脾臓および扁桃）、および非ホジキンリンパ腫組織試料を用いて、陽性対照および陰性対照を特徴づけ、特異性を分析した。
【０１７０】
アッセイ条件を決定するために、被験物質および対照物質の希釈範囲を、適切なレベルの感度を示す条件を選択するために試験した。実験は、ＣＤ３７−陽性細胞ペレット、正常なヒト組織、およびＣＤ３７陽性非ホジキンリンパ腫試料からなる組織マイクロアレイをはじめとするＦＦＰＥ試料のパネルで実施した。各試料を、被験物質濃度（２．１、４．２、および８．４μｇ／ｍＬ）または対照物質の系列希釈物で染色した。試料は全て、専門医師会認定の病理学者により評価およびスコア付けされ、小細胞型（濾胞性リンパ腫［ＦＬ］、マントル細胞リンパ腫［ＭＣＬ］、ＭＡＬＴ型辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、未分類の小細胞型リンパ腫、未分類の非ホジキンリンパ腫［ＮＨＬ］）、または大細胞型（ＤＬＢＣＬ）のいずれかとして分類した。各希釈での相対的染色強度を、各試料について比較して、最適希釈を同定した。最適希釈の基準は、１）アイソタイプ対照で染色された試料においてバックグランド染色を起こさなかった希釈、２）被験物質で染色された陰性組織対照で染色を起こさなかった希釈、および、３）該当する適応症（例えば、ＤＬＢＣＬ、ＦＬ、ＣＬＬ）を表す被験試料のうち、様々なレベルの膜関連ＣＤ３７発現の間で差異を認めた希釈、であった。４．２μｇ／ｍＬ被験物質濃度が、実験により最適希釈と同定され、それゆえ、特に有用な濃度である。大細胞型リンパ腫試料の染色結果の概要を表７に示し、各濃度のスコア分布のグラフを図１３に示す。小細胞型リンパ腫試料の染色結果の概要を表８に列挙し、各濃度のスコア分布のグラフを図１４に示す。
【表７】
2015514716.tif 000009
【表８】
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【０１７１】
実施例７
アッセイの動的範囲を特徴づける対照の同定および特徴づけ  −  自動化染色法
品質対照：正常なヒト脾臓のマントル層および辺縁帯、ならびに扁桃の胚帯およびマントル層を、各アッセイにおける陽性対照として用いて、染色手順が予測通り実践されたことを検証した。正常なヒト扁桃の濾胞間域および正常なヒト脾臓の赤脾髄を、陰性対照として用いた。これらの対照は、最適化および妥当性検査の際にアッセイ検証対照として用いた。これらの結果は、選択された対照が一貫した結果を与えることを確認するため、そしてそれらがアッセイの動的範囲に及ぶことを確認するためにレビューした。品質対照の模範的染色スコアを４種の染色濃度（２．１、４．２、８．４および１６．７μｇ／ｍＬ）で表９に列挙するが、それらは、一次抗体の濃度が被験試料の染色結果に影響を及ぼすことを示している。
【表９】
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【０１７２】
実施例８
自動化染色法の性能分析
このアッセイの意図する用途は、Ｂ細胞悪性腫瘍において、ＣＤ３７を再現性良く適切な感度で特異的に検出して、膜関連ＣＤ３７発現の様々なレベルおよび均一性（最適な動的範囲）を識別することである。それゆえ、特異性、再現性、および感度が、性能基準として考慮される。
【０１７３】
試験アッセイの特異性および感度は、組織マイクロアレイのパネルを染色および評価することにより特徴づけた。染色を観察して、陽性染色が腫瘍組織に一貫して局在化されていて、基質、血管、および正常臓器組織などの正常な隣接組織成分が予測通り陰性または陽性であることを確認した。Ｂ細胞悪性腫瘍の各サブタイプについて、組織マイクロアレイ間の染色スコアの分布を観察した。同様のスコア分布から、この方法が良好に遂行していて、様々な固定およびプロセシング条件の微小な変動に対して過度に反応しなかったことが示唆される。試験アッセイの正確さも、様々なレベルのＣＤ３７を発現する細胞ペレットからなるＦＦＰＥ試料：Ｄａｕｄｉ細胞、（ＣＤ３７発現レベルが高い）、Ｒａｍｏｓ細胞（ＣＤ３７発現レベルが中程度）、ナマルバ（ＣＤ３７発現レベルが低い）、およびＣｏｌｏ２０５（陰性）、を用いてアッセイの実施内および実施間再現性を評価することにより検討した。加えて、正常なヒト脾臓（２試料）、正常なヒト扁桃、および辺縁帯リンパ腫試料が含まれた。実施内再現性については、それぞれが各対照の切片を含むスライド９枚を、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  ＲＸの無作為な位置に配置させた。実施間再現性については、同じ試料の切片を含むスライド３枚を、３つの異なる実施日に染色した。実施内および実施間の両方の再現性実験のスライド全てを評価して、再現性があることを見出した。
【０１７４】
実施例９
ＩＨＣによるＣＤ３７染色スコアはｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の活性と相関する
ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の能力および特異性を、広範囲のＣＤ３７発現を有するＣＤ３７陽性細胞株に対比して分析する。ＣＤ３７発現レベルを、実施例１に記載された通りフローサイトメトリーにより決定する。あるいはＣＤ３７発現レベルを、実施例１に記載された用手法での染色方法を利用してＩＨＣにより決定するか、または実施例６〜８に記載された自動化染色法を利用してＩＨＣにより決定する。能力は、実施例２〜４に記載された適切なｉｎ  ｖｉｖｏ異種移植片モデルを利用して評価する。ｈｕＣＤ３７−３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１の投与を、１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇまたは２．５ｍｇ／ｋｇなどの用量で静脈内に実施する。加えて、ＣＤ３７発現レベルが低い適切なＣＤ３７陽性細胞、例えばナマルバなどを用いることができる。活性の特異性を検証するために、Ｃｏｌｏ２０５などのＣＤ３７陰性細胞株を実験に含めることができる。
【０１７５】
本明細書に引用された全ての発行物、特許、特許出願、インターネットサイト、およびアクセション番号／データベース配列（ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチド配列の両方を含む）は、個々の発行物、特許、特許出願、インターネットサイト、およびアクセション番号／データベース配列が参照により本明細書に組み入れられることを具体的かつ個別に示したのと同程度に、全ての目的で全体として参照により本明細書に組み入れられる。
配列
【表１０】
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【表１１】
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【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
2015514716.tif 000020
【表１４−４】
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【表１５−１】
2015514716.tif 000022
【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１６−１】
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【表１６−２】
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【表１６−３】
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【表１７−１】
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【表１７−２】
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【表１８−１】
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【表１８−２】
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【表１８−３】
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【表１８−４】
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【表１９−１】
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【表１９−２】
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【表１９−３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2015514716.tif 000041
【図６】
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【図７】
2015514716.tif 000043
【図８】
2015514716.tif 000044
【図９】
2015514716.tif 000045
【図１０】
2015514716.tif 000046
【図１１】
2015514716.tif 000047
【図１２】
2015514716.tif 000048
【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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